(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
モリンダ  シトリフォリアの種子抽出物を含有するAGE由来メラニン産生抑制用組成物。 
【請求項２】
前記AGE由来メラニン産生が、チロシナーゼの活性化由来ではなくAGE化コラーゲンの酸化促進に由来する産生であることを特徴とする、請求項１に記載のAGE由来メラニン産生抑制用組成物。
【請求項３】
前記種子抽出物の抽出溶媒が、有機溶媒を含む溶媒であることを特徴とする請求項１又は２に記載のAGE由来メラニン産生抑制用組成物。 
【請求項４】
前記有機溶媒が、エタノール又はメタノールを含むことを特徴とする請求項３に記載のAGE由来メラニン産生抑制用組成物。
【請求項５】
美白用組成物であることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載のAGE由来メラニン産生抑制用組成物。 
【請求項６】
請求項１から５のいずれか１項に記載の組成物を含有するAGE由来メラニン産生抑制用食品。 
【請求項７】
モリンダ  シトリフォリアの種子抽出物を含有する組成物を対象に投与することからなるAGE由来メラニン産生抑制方法（但し、医療行為を除く。）。 
【請求項８】
前記種子抽出物の抽出溶媒が、有機溶媒を含む溶媒であることを特徴とする請求項７に記載の方法。 
【請求項９】
前記有機溶媒が、エタノール又はメタノールを含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記AGE由来メラニン産生が、チロシナーゼの活性化由来ではなくAGE化コラーゲンの酸化促進に由来する産生であることを特徴とする、請求項７から９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＧＥ由来メラニン産生阻害剤及びＡＧＥ由来メラニン産生方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
たんぱく質や脂質と糖が非酵素的に結合する反応を糖化といい，その反応により終末糖化産物AGE(advanced glycation endproducts)が生じる。具体的には、Nε-カルボキシメチルリシン（CML）、Nε-カルボキシエチルリシン（CEL）、ペントシジン（pentsidine）、ピラリン、クロスリン、GA-ピリジン、Nω-カルボキシメチルアルギニン（CMA）、フロイルフラニルイミダゾール（2-(2-furoyl)-4(5)-(2-furanyl)-1H-imidazole）、グルコスパンなど多数の化合物が存在する。AGEは，さまざまな慢性疾患に関与することが明らかとなってきたことから，近年では抗糖化作用に関する報告が特に増加している。
【０００３】
さらに，AGEの蓄積が肌のくすみや皮膚弾力の低下など，老化の増悪因子となりうることから，美容の観点からも注目が集まっている。一般的に紫外線により皮膚の老化が増悪することはよく知られており，コラーゲンの糖化がシワ形成に関与する報告がある。一方で，シミに対する糖化やAGEの直接的な関係は明らかになっていない。
【０００４】
シミは，皮膚に紫外線や炎症などのストレス刺激が加わると，表皮に存在するケラチノサイトからメラニン産生を促進する，α-メラノサイト刺激ホルモン（α-melanocyte stimulating hormone, α-MSH）やエンドセリン-1（endothelin-1, ET-1），幹細胞因子（Stem cell factor, SCF）など，様々なサイトカインが分泌され，メラノサイトがこれらの活性因子を受容すると，細胞内のシグナル伝達により活性化し，メラニンが合成されることで生じると知られている。メラニンは，メラノサイト内のL-チロシンからチロシナーゼ酵素が触媒することによってドーパキノンに変換され，さらに酸化および重合化の過程を経て生合成される。
【０００５】
これまでの美白の作用メカニズムとしては、チロシナーゼ酵素活性を阻害するものが一般的で，in vitroでのチロシナーゼ酵素活性の評価，α-MSH などのメラニン刺激剤で刺激したメラノーマ細胞中のチロシナーゼの活性評価および遺伝子発現やたんぱく量の評価と実際に細胞から放出されるメラニン量を評価することで美白剤の候補としてあげてきた。例えば、これまで，Morinda citrifolia（モリンダ  シトリフォリア、別名ノニ）のメラニン産生抑制に関する報告はあり，モリンダ  シトリフォリアの果実および葉エキスには美白作用は認められなかったものの，モリンダ  シトリフォリアの種子エキスの美白作用については，in vitro試験によるチロシナーゼ阻害作用および抗酸化作用（DPPHラジカル捕捉作用）が認められている（非特許文献１）。さらに，α-MSH刺激マウスB16メラノーマ細胞を用いたメラニン産生抑制作用および，細胞内のチロシナーゼ阻害作用も有することが報告されている（非特許文献２）。
しかしながら、美白の作用メカニズムについて解明は十分ではなく、新たな知見が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Masuda M., et al.; Inhibitory effect of constituents of Morinda citrifolia seed on elastase and tyrosinase. J. Nat. Med., 63, 267-273 (2009)
【非特許文献２】Masuda M., et al.; Inhibitory effect of Morinda citrifolia extract and its constituents on melanogenesis in murine B16 melanoma cells. Biol. Pharm. Bull., 35, 78-83 (2012)
【発明の概要】
【０００７】
本発明者は、美白の作用メカニズムについて新たな知見を提供することを目的とし、AGEとシミに既知のメカニズムと異なる相互の影響があるのではないかという仮説をもとに、B16F10細胞(B16 murine melanoma cells)を用いて，メラニン促進剤の変わりにさまざまなAGEを添加し，メラニン産生に与える影響を検討した。
【０００８】
実験方法  
1．AGE化コラーゲン（AGE-Collagen）の作成
1.5mlチューブに，200mMのリン酸バッファー（PB; pH 7.4），250μlと2Mのグルコース（Glu）もしくはフルクトース（Fru）の糖溶液および3mg/mlのコラーゲン (collagen type I, bovine skin, pepsin-solubilized) をそれぞれ200μl加え，精製水で全量が1mlになるように調整した。対照として，コラーゲンなしのものと糖なしのものを準備した。それらの反応溶液を60度で0，1，10，24，72，168，240時間(h)と時間を変えてインキュベートさせた。細胞試験の際にはそれぞれの反応液をDMEMで20倍希釈して使用した。
【０００９】
2．メラニン産生試験
AGEがメラニン産生に与える影響をB16F10細胞を用いて検討を行った。
24 ウェルプレート（well-plates）にフェノールレッド抜きのDMEMで2×104 cells/wellになるように調整した細胞を900μl 播種し，24時間後にAGE化コラーゲンもしくは陽性対照としてα-MSH（終濃度; 0.1μM）をそれぞれ100μl添加した。さらに72時間後に細胞培養液の上清を100μlずつ96 ウェルプレートに移し，細胞ペレットはリン酸緩衝液（PBS, pH 7.4）で洗い，1 N NaOH（150 μl）を加え，60度で1時間インキュベートし，溶解させた。溶解液のたんぱく量はBSA（bovine serum albmin）を標準品としたDC protein assay reagent（Bio-Rad Laboratories）を用いて測定した。また，100μlずつ96ウェルプレートに移し，上清（放出）および細胞ペレット（細胞内）それぞれを405nmで吸光度を測定し，合成メラニンの検量線を用いてメラニン産生量を算出した。
AGE化コラーゲンは反応時間（0, 1, 10, 24, 72, 168, 240 hour）を変えて作成し，DMEMで20倍希釈したもの（終濃度；200倍希釈）を実験に用いた。結果を下記表１に示す。
【００１０】
表１  AGE化コラーゲンのB16F10細胞におけるメラニン産生に与える影響
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【００１１】
表１に示されるとおり，AGEは、細胞増殖（WST法）には影響を与えずに，インキュベート時間の長さに依存してメラニン産生が認められた。また、コラーゲンを糖化（特に単糖類による糖化）したものにメラニン産生効果があることが理解できるが、このうち、フルクトースによるAGE化コラーゲンよりもグルコースによるAGE化コラーゲンに、より多くのメラニンが産生されることが認められた。
【００１２】
3．チロシナーゼ活性化試験
（ＡＧＥ化コラーゲンのチロシナーゼ活性に与える影響）
24ウェルプレートにDMEMで2×104 cells/wellになるように調整した細胞を900μl 播種し，24時間後にAGE化コラーゲンもしくは陽性対照としてα-MSH（終濃度; 0.1μM） をそれぞれ100μl添加した。さらに72時間後，上清を除去し，細胞ペレットは冷PBS（pH 7.4）で洗い，0.1% tritonを含むPB（pH 6.8）を200μl加えて，-80度で30分，凍結後に融解し，チューブに移し変えて10000rpmで10分遠心した。DC protein Assay を用いてそれぞれのたんぱく量を求め，50μg/100μlになるように調整後，96 ウェルプレートに移し，0.1% L-DOPA溶液を同量加え，30分間37度でインキュベートさせ，475nmで吸光度を測定した。結果を下記表２に示す。
【００１３】
表２  ＡＧＥ化コラーゲンのチロシナーゼ活性に与える影響
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【００１４】
結論としては、どのAGE化コラーゲンにおいても活性は認められなかった。また，AGEによる細胞毒性も認められなかった。
以上の結果により、AGE化コラーゲンはチロシナーゼを活性化せずに直接メラニンを産生させているという新たな知見が得られた。
すなわち、α-MSHはチロシナーゼを活性化させることで，酸化を促進させるのに対して、AGEはチロシナーゼを活性化させないため、自身による酸化促進により，メラニンの産生が促進されていると考えられる。したがって、チロシナーゼ 活性の抑制だけではメラニン産生の抑制は不十分であることを意味している。
【００１５】
４．CML，CEL， ペントシジン，メチルグリオキサール（MGO），グリオキサール（GO）および3-DG（3-デオキシグルコソン）のメラニン産生に与える影響
上述の通り、AGE化コラーゲンにメラニン産生が認められたため、研究を進め、AGE（CML. CELおよびペントシジン）とその中間体（MGO，GO，3-DG）がメラニン産生に与える影響をB16F10細胞を用いて検討を行った。結果を下記表３に示す。
【００１６】
0006779634.tif 000004
【００１７】
表３に示したとおり，細胞増殖には影響を与えずに，中間体であるMGO，GOおよび3DGに，メラニン産生作用が認められた。しかしながら、AGE化合物単体であるNε-カルボキシメチルリシン（CML）、Nε-カルボキシエチルリシン（CEL）、及びペントシジン（pentsidine）には十分なメラニン産生作用が認めらなかった。
【００１８】
５．ＡＧＥ化コラーゲン中の蛍光性AGE，3DG，MGO，GOの測定
中間体にメラニン産生作用が認められたことから，反応時間（0, 1, 10, 24, 72, 168, 240 hour）を変えて作成したAGE化コラーゲンの蛍光性AGEおよび，3DG，MGO，GOの測定を行った。どの指標においても，グルコースによるAGE化コラーゲンはフルクトースによるAGE化コラーゲンよりも低い値を示し，中間体もしくはAGEが産生されるのに時間がかかり，産生量も少ないことが分かった（下記表４）。
【００１９】
表４  ＡＧＥ化コラーゲン中の蛍光性AGE，3DG，MGO，GOの測定
0006779634.tif 000005
【００２０】
この結果より，中間体がメラニン産生作用への寄与度が高い可能性はあるものの，AGE化コラーゲンに含有している濃度との効果の相関性が取れないことから，コラーゲンの糖化過程により生成される多くの中間体およびAGE類が相互作用することでメラニン産生作用を増強している可能性が考えられる。さらに、AGE化コラーゲンに対し中間体が作用を増強させていると考えられる。いずれにしても、AGE化コラーゲン自身による酸化促進により，メラニンの産生が促進されていると考えられる。
【００２１】
上述の通り、糖化されたコラーゲンであるAGE化コラーゲン（特にグルコース又はフルクトースによる糖化）が、紫外線由来とされるα-MSH刺激や各種サイトカインなどによるメラニン産生メカニズムとは別のメカニズムでメラニン産生を促進させることが示された。本願では、このメカニズムによるメラニン産生をAGE由来メラニン産生メカニズムとする。また、出願人としては、このメカニズムにより産生されたメラニンによるシミ等をＡＧＥ性色素斑と定義することとする。
【００２２】
したがって、本願発明は、コラーゲンが糖化された、AGE化コラーゲンからなるAGE由来メラニン産生用組成物からなる。また、当該組成物を含んだAGE由来メラニン産生剤からなる。さらに、当該組成物がメチルグリオキサール，グリオキサール，又は3-デオキシグルコソンを含むことからなる。また、AGE化コラーゲンを対象に投与することからなるAGE由来メラニン産生方法からなる。糖化は単糖類によるものであることが好適である。単糖類は、少なくともグルコース（ブドウ糖）、ガラクトース、マンノース、フルクトースを含む。糖化のための単糖類としてはグルコース及びフルクトースが好適であるが、特にグルコースが好適である。また、コラーゲンとしては、Ｉ−ＩＶ型のうちＩ型コラーゲンが好適である。Ｉ型コラーゲンは、線維性コラーゲンであり、α1鎖（I型） 2本とα2鎖（I型）1本が集まって形成される。当該組成物及び方法は、新たなメカニズムにより産生したメラニンを獲得することに有用であることから、新たな素材の開発にも有用である。
【００２３】
さらに、上記発見に基づき，新たな美白用素材を提供すべく、イリドイド含有植物である、モリンダ  シトリフォリアの果実，葉および種子と、サンシュユ果実およびオリーブ葉について、AGE由来のメラニン産生抑制の効果を研究した。
【００２４】
実験方法
1．実験材料と被検体の調製
フレンチポリネシアで採取されたモリンダ  シトリフォリアの果実と葉を用いた。原植物の同定はTropical Resources Inc.（UT, USA）により行われた。果実は果肉と種子に分け，果肉は凍結乾燥し，葉および種子は熱風乾燥した。モリンダ  シトリフォリアの果肉，葉および種子の50%エタノール還流抽出エキス（MCF（果肉），MCL（葉），MCS（種子） extract）が準備された。また，中国産のCornus officinalis（サンシュユ）果実は水性エタノール抽出され（COF extract），モロッコ産のOlea europaea（オリーブ）葉はフランスでエタノール抽出された（OEL extract）。
【００２５】
２．AGE化コラーゲンの作成
1.5mlチューブに，200 mMのPB（pH 7.4），250μlと2Mのグルコース溶液および3mg/mlのコラーゲン (collagen type I, bovine skin, pepsin-solubilized) をそれぞれ200μl加え，精製水で全量が1 mlになるように調整した。それらの反応溶液を60度で24時間インキュベートさせた。細胞試験の際にはそれぞれの反応液をDMEMで5倍希釈して使用した。
【００２６】
2．メラニン産生試験
メラニン産生試験はB16F10細胞を用いて行った。
24 ウェルプレートにフェノールレッド抜きのDMEMで2×104 cells/wellになるように調整した，2×104 cells/wellの細胞を800μl 播種し，24時間後にsample（100μl）およびAGE化コラーゲン（100μl）を添加した。sampleはDMSOに溶解し，DMEMで所定の濃度に希釈した（DMSO最終濃度：0.1%）。Control（Cont）およびvehicle control（V-cont）群には0.1%（v/v）DMSO/DMEMを用いた。V-cont群およびsample群にはAGE化コラーゲンを添加した。Sample添加から72時間後に細胞培養液の上清を100μlずつ96 ウェルプレートに移し（放出），細胞ペレットはPBSで洗い，1 N NaOH（150μl）を加え，60度で1時間インキュベートし，溶解させた。その後，溶解液100μlずつを96 ウェルプレートに移し（細胞内），上清（放出）および細胞ペレット（細胞内）それぞれを405nmで吸光度を測定し，合成メラニンの検量線を用いてメラニン産生量を算出した。結果を表５に示す。
【００２７】
表５  メラニン産生試験
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【００２８】
その結果，すべての検体においてAGEによって増加した細胞外への放出および細胞内メラニン量を抑制したが、その中でもモリンダ  シトリフォリアの種子抽出エキスに非常に強いメラニン産生抑制作用を示した。このため、モリンダ  シトリフォリアの種子抽出エキスはAGE由来メラニン産生抑制作用を有する素材として非常に有用であることが示された。
【００２９】
したがって、本発明は、モリンダ  シトリフォリアの種子の抽出物を含有するAGE由来メラニン産生抑制用組成物からなる。抽出物（抽出エキス）は液状又は粉末状（個体状）いずれの態様も採用することができ、様々な公知の態様で組成物に含有させることが可能である。また、当該組成物を含有するAGE由来メラニン産生抑制剤からなる。抑制剤の投与手段は、経口のみならず注射など非経口手段も含みうる。また、当該組成物を含有するAGE由来メラニン産生抑制用食品からなる。食品は、健康食品として知られる公知の形態を広く含み、飲料を含む食品形態・サプリメント形態など様々な経口の形態を含む。さらに、当該組成物を対象に投与することからなるAGE由来メラニン産生抑制方法からなる。また、抽出溶媒はエタノールやメタノールなど、有機溶媒を含むことが好適であり、水と有機溶媒との混合溶媒を採用可能である。組成物としては、液状、粉末状、タブレット状など、様々な公知の態様を採用することが可能である。