(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の間充織幹細胞（ＭＳＣ）を調製する方法であって、
ａ）前記哺乳類の骨格筋組織からマイクロバイオプシーを収集する工程と、
ｂ）収集後、前記マイクロバイオプシーを適切な培地にセットする工程と、
ｃ）培養中、前記マイクロバイオプシーから出現する細胞を収集する工程と、
ｄ）工程ｃ）で得られた前記細胞をコンフルエンシー近くまで成長させる工程と、
ｅ）工程ｄ）から前記細胞を解離する工程と、
ｆ）密度勾配分画により他の細胞から間充織幹細胞（ＭＳＣ）を分離し、間充織幹細胞
（ＭＳＣ）を取得する工程と、
を備える方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記培地は、約２０％のウシ胎児血清、約５ｍｌのペニシリン（１０００Ｕ／ｍｌ）−
ストレプトマイシン（１００００μｇ／ｍｌ）、約２．５ｍｌのアンフォテリシンＢ（２
５０μｇ／ｍｌ）、及び約５ｍｌのＨＥＰＥＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２を備える方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法であって、
前記哺乳類は、たとえばネズミ、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモッ
ト、畜牛、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、及び、たとえばサルや類人猿等の霊長類のような
、家畜、動物園の動物、スポーツ用の動物、ペット、コンパニオン・アニマル、及び実験
動物を含むグループから選択される方法。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか１項に記載に記載の方法であって、さらに、
前記ＭＳＣをそれぞれ適切な脂質生成、骨形成、軟骨形成、筋原性、造血、内皮、ニュ
ーロン、心臓、又は肝細胞の分化培地において培養することにより、前記細胞を脂肪細胞
、骨細胞、軟骨細胞、筋原細胞、造血細胞、内皮細胞、神経細胞、心臓細胞、又は肝細胞
に分化させる工程を備える方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、筋組織由来の哺乳類幹細胞の産生及び損傷組織の治療におけるこのような幹細胞の利用に関する。より具体的には、本発明は、哺乳類筋組織由来の間充織幹細胞（ＭＳＣ）の産生及び損傷組織の治療におけるこのような幹細胞の獣医学的使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ウマの医学等の獣医学における幹細胞の使用は、損傷組織の最適な再生を促進することにより幅広い治療機会を切り開く。確かに、腱炎及び骨関節炎は、ウマの医学において非常によくある病状であり、残念ながら予後不良を有する。実際、筋骨格損傷は、競争馬で最も一般的な損傷の原因である。（ほとんどの）成体組織が何らかの組織特異的前駆細胞を有することはよく知られているが、多くの場合、効果的な修復には十分ではないことが多い。このように、効果的な再生医療には、通常、組織内に存在する細胞より多数の細胞の外からの入力が必要とされる。これらの細胞は、治癒プロセスを調整するのと同様に損傷を修復可能とするべきである。
【０００３】
現在のウマの獣医学診療において、最も一般に利用されている幹細胞は、ホウォートンゼリーＭＳＣ（Ｓｃｈｎａｂｅｌ他、２０１３、ｌａｃｏｎｏ他、２０１２）と同様に、成体骨髄由来及び脂肪組織由来の間充織幹細胞（ＭＳＣ）である。骨髄穿刺液は、一般的に胸骨（髄空間３−５）又は腸骨から収集され（Ａｄａｍｓ他、２０１２）、脂肪組織は、一般に尾根領域から収集される（Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ−Ｎｉｂｅｙｒｏ、２０１  １）。ホウォートンゼリーは、臍帯から分離される（ｌａｃｏｎｏ他、２０１２）。これらの抽出法は非常に侵襲的であり、多くの場合、競争馬の所有者に理解されず、何らかの感染症を引き起こす可能性がある。
【０００４】
獣医学研究にとっての２番目の欠点は、市販の特異抗体の不足である。このため、ヒト抗体を利用する必要があり、ウマのような動物におけるこれらの交差反応を検査する必要がある。一例として、たった４％のヒト抗体が、同等のウマのタンパク質と反応する。有効な免疫表現型検査のためには、さらに非特異的抗体反応を除くための制御アイソタイプ及び、たとえばウマにおける交差反応を確認するための陽性の制御細胞の適正使用を必要とする。従って、市販の動物又はウマの幹細胞の品質を確保する標準の仕様又はマーカーは存在しない。とは言っても、いくつかの研究グループは、骨髄、脂肪組織、臍帯、臍帯血、ホウォートンゼリー、末梢血、及び、つい最近では骨膜組織及び筋肉（Ｒａｄｔｋｅ他、２０１３）のような、様々な動物起源から効果的に間充織幹細胞（ＭＳＣ）のキャラクタリゼーションを行おうとしている。Ｒａｄｔｋｅと共働者は、この点に関し、ウマの筋肉由来の間充織幹細胞（ＭＳＣ）の生成に関するプロセスにおいて、大量の筋肉バイオプシー（重さ６ｇ）はウマの死体から採取すると報告した。この方法は、従って非常に侵襲的であり、生きている競争馬に対しては有用でない。第二に、取得される幹細胞は、酵素消化技術を用いてバイオプシーから分離されるが、酵素消化技術は可能性が限られる。第三に、Ｒａｄｔｋｅと共働者のプロセスにより得られる細胞は、ＣＤ９０及びＣＤ４４には陽性だが、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４６、及びＣＤ１０５には陰性である。このＣＤ１０５に対する陰性は、Ｒａｄｔｋｅ他、２０１３により、ウマの間充織幹細胞（ＭＳＣ）において一般的であるとして報告された。
【０００５】
上記から、最小の侵襲的試みを伴うウマ等の哺乳類からの間充織幹細胞（ＭＳＣ）の産生のためには、新しい方法が必要とされているのは明白である。
【発明の概要】
【０００６】
要約すれば、再生医療において利用される幹細胞は、多量に存在し、最小限の侵襲的手順により採取、収集でき、再現可能な方法で多数の細胞系統経路に沿って分化でき、安全で効果的に自己、同種異系、又は異種のいずれかで移植される必要がある。実際、これらの基準は、現在の獣医学再生医療では満たされていない。
【０００７】
本発明は、そのため、マイクロバイオプシーから哺乳類由来の多能性間充織幹細胞（ＭＳＣ）を生成する新しいプロセスを提供する。非侵襲的な筋肉マイクロバイオプシー（１０−２０ｍｇ）は、培養を開始するため、ウマの筋組織からなど、生きている動物で収集され、培養され、外植片として利用される。外植片から発現した細胞は、（不連続の）密度勾配で遠心分離され、多能性細胞の割合が最大である培養された細胞集団の一部が選ばれた。免疫表現型検査及び三血球系分化は、予想外にも、密度勾配遠心分離により選ばれた細胞集団が間充織幹細胞（ＭＳＣ）であり、適切な分化培地において培養された場合、脂肪細胞、骨細胞、及び軟骨細胞に分化できることが判明したことを示した。
【０００８】
本発明の間充織幹細胞（ＭＳＣ）は、ＣＤ４４、ＣＤ９０、及びＣＤ１０５に陽性で、ＣＤ４５、ＭＨＣII、及びＣＤ２９に陰性である。これは、ＣＤ１０５陰性と報告されたＲａｄｔｋｅ他、２０１３により得られた幹細胞と対照的である。幹細胞に対するＩＳＣＴ推奨事項（Ｄｏｍｉｎｉｃｉ他、２００６）を考慮すると、本明細書で得られるＭＳＣ集団は、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びＣＤ４４に高度に陽性で、ＣＤ４５、ＭＨＣII、及び予想外にＣＤ２９に陰性であるため、多能性幹細胞として効果的に分類できる。
【０００９】
本発明のＭＳＣは、さらに、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３３Ｂ、及びｍｉＲ−８０２に陽性、ｍｉＲ−２１８にわずかに陽性、及びｍｉＲ−６５６に陰性である。これは、ホウォートンゼリーＭＳＣ又は骨髄ＭＳＣ等、当技術分野の他のＭＳＣと対照的である。ホウォートンゼリーＭＳＣは、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３３Ｂ、ｍｉＲ−２１８、及びｍｉＲ−８０２に陰性で、ｍｉＲ−６５６に陽性である。骨髄ＭＳＣは、ｍｉＲ−２１８及びｍｉＲ−８０２に陽性で、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３３Ｂ、及びｍｉＲ−６５６に陰性である（例セクション参照）。従って、本発明のＭＳＣと当技術分野で開示されたＭＳＣの性質には、明らかな違いが存在する。
【００１０】
さらに、これらの細胞は、その多能性を失うことなく複数の凍結融解サイクルをサポートする。
【００１１】
本発明は、従って、文献にすでに記載されている方法より効果的で、有望な代替を提供し、初めて、その最小限の侵襲的性質によりウマ等の生きている動物での実施の可能性を提供する。
【００１２】
これに加えて、細胞培養は、これまで利用された酵素消化技術（Ｒａｄｔｋｅ他、２０１３）より簡単な方法で開始される。このため、筋肉マイクロバイオプシーは、外植片として利用され、前駆細胞はそのうちに自然発生的に出現する。そうすることにより、操作回数が減り、汚染の潜在源を避けることになる。外部の成長因子の追加が不要なのは、筋肉マイクロバイオプシー（外植片）により自然に分泌される成長因子で十分なためである。
【００１３】
筋肉由来の細胞は、異なる系統及び異なる発達段階を形成する亜集団の混合物である。これらの密度に基づき、これらの特異的分子マーカーの発現に関連し、（不連続の）密度勾配の結果、発明の方法によれば、筋肉外植片から多能性間充織幹細胞の３つの実質的に純粋な亜集団を選択することができる。
【００１４】
３つの亜集団は全て、ＣＤ４４陽性である＞９０％の細胞を備える。ＣＤ９０に関し、発現率は２５−３５％分画では３６％、＜１５％分画では４８％、及び１５−２５％分画では７３％である。ＣＤ１０５に関し、発現率は、３つの集団において８５〜９５％の間で変化する。３つの集団は、また、異なるＣＦＵ−Ｆ及び増殖性質を示す（例セクション参照）。
【００１５】
これに加えて、前記間充織幹細胞（ＭＳＣ）は培養で線維芽細胞に似たコロニーを形成することができることが示された。さらに、他の間充織幹細胞源で通常観察されるものと異なり、前記細胞は、また、脂肪細胞、軟骨細胞、及び骨細胞に分化でき、その多能性を失うことなく複数の凍結融解サイクルをサポートできる。
【００１６】
動物の筋肉由来の間充織幹細胞（ＭＳＣ）を生成するための低侵襲的プロセスを提供しようとして、本発明者は、筋肉マイクロバイオプシーの結合、外植片の培養、さらに、（不連続の）密度勾配遠心分離により外植片から出現した細胞の濃縮により、予想外にＭＳＣ細胞が生成されることを発見した。培養中に自然発生的に外植片から発現し、さらに勾配遠心分離により濃縮され、新たに生成された細胞が間充織幹細胞（ＭＳＣ）であったことは完全に予想外であった。
【００１７】
発明のプロセスは、酵素消化工程がなくても、非常に小さいバイオプシー（マイクロバイオプシー）からの多量の間充織幹細胞（ＭＳＣ）の生成を可能にする。酵素消化後の培養のために必要な組織の量は約１〜５ｇであると発表した、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｒ．Ｉ．他、２００５（動物細胞の培養：基本技術マニュアル第５版、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）で確認されているように、このような酵素消化工程は、どんな場合でもマイクロバイオプシーに適用することは不可能である。
【００１８】
本発明に従った方法により得られるＭＳＣは、ＣＤ１０５を発現する。ＣＤ１０５は、関節／関節レベルにおける血管形成及び成長誘導のような様々な重要な生物学的機能を持つＴＧＦ  ｂｅｔａ１錯体の要素である。軟骨におけるＴＧＦベータシグナル伝達の包括的レビューは、Ｆｉｎｎｓｏｎ  ＫＷ他、２０１２（Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ（Ｓｃｈｏｌ  Ｅｄ）．Ｊａｎ  １；４：２５１−６８）を参照のこと。ＴＧＦ  ｂｅｔａ１は、軟骨基質合成と同様に軟骨細胞分割を刺激する。これは、多血小板血漿、すなわち血小板で濃縮された血漿（ＰＲＰ）のような、血小板派生物において、さらに発見された（Ｌｕｂｋｏｗｓｋａ  Ａ他、２０１２、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｇｕｌ  Ｈｏｍｅｏｓｔ  Ａｇｅｎｔｓ．Ａｐｒ−Ｊｕｎ；２６（２  Ｓｕｐｐｌ  １）：３Ｓ−２２Ｓ）。自己血小板の濃縮源として、ＰＲＰは、いくつかの異なる成長因子と、骨及び軟組織の治癒を刺激する他のサイトカインを含む（及び、脱顆粒を経由して解放する）。さらにＴＧＦ  ｂｅｔａ１は、骨関節炎の滑膜線維芽細胞によるＰＧＥ２の解放を減少させ、その結果、骨関節炎におけるＰＧＥ２に刺激される基質分解を減少させる（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ  Ｊ．Ｃ．他、２００２、Ｂｉｏｒｈｅｏｌｏｇｙ、３９、２３７−４６）。発明のＭＳＣにおけるＣＤ１０５発現は、従って、得られた幹細胞に優れた組織再生特性を与えるようである。
【００１９】
発明は、従って、以下の態様を提供する。
態様１
哺乳類の間充織幹細胞（ＭＳＣ）を調製する方法であって、
ａ）前記哺乳類からマイクロバイオプシーを収集する工程と、
ｂ）収集後、前記マイクロバイオプシーを適切な培地にセットする工程と、
ｃ）培養中、前記マイクロバイオプシーから出現する細胞を収集する工程と、
ｄ）工程ｃ）で得られた細胞をコンフルエンシー近くまで成長させる工程と、
ｅ）工程ｄ）から前記細胞を解離する工程と、
ｆ）密度勾配分画により他の細胞から間充織幹細胞（ＭＳＣ）を分離させ、間充織幹細胞（ＭＳＣ）を取得する工程と、
を備える方法。前記細胞は、１以上の継代培養又は継代工程により任意でさらに精製できる。
【００２０】
態様２
態様１に記載の方法であって、
前記マイクロバイオプシーは、首、肩、胸、背、尾、手足、後肢、前肢、後四半部、後脚等の筋肉から等の、好ましくは上腕三頭筋組織から、より好ましくは上腕三頭筋の長頭から取得される、骨格筋組織から得られる方法。
【００２１】
態様３
態様２に記載の方法であって、
前記マイクロバイオプシーは、上腕三頭筋の長頭の長頭において、約５ｃｍの深さで採取される方法。
【００２２】
態様４
態様１乃至３のいずれかに記載の方法であって、
前記マイクロバイオプシーは、約１５〜約２０ｍｇの組織を含む方法。
【００２３】
態様５
態様１乃至４のいずれかに記載の方法であって、
前記培地は、約２０％のウシ胎児血清、約５ｍｌのペニシリン（１０００Ｕ／ｍｌ）−ストレプトマイシン（１００００μｇ／ｍｌ）、約２．５ｍｌのアンフォテリシンＢ（２５０μｇ／ｍｌ）、及び約５ｍｌのＨＥＰＥＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２を備える方法。
【００２４】
態様６
態様１乃至５のいずれかに記載の方法であって、
工程ｄ）において、３５％未満の密度分画からの細胞が得られる方法。
【００２５】
態様７
態様６に記載の方法であって、
工程ｄ）において、＜１５％、１５−２５％、及び／又は２５−３５％の密度分画からの細胞が得られる方法。
【００２６】
態様８
態様１乃至７のいずれかに記載の方法であって、
前記哺乳類は、たとえばネズミ、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、畜牛、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、及び、たとえばサルや類人猿等の霊長類のような、家畜、動物園の動物、スポーツ用の動物、ペット、コンパニオン・アニマル、及び実験動物を含むグループから選択される方法。
【００２７】
態様９
態様１乃至８のいずれかに記載の方法により得られる間充織幹細胞集団。
【００２８】
態様１０
間充織幹細胞集団、又は態様９に記載の間充織幹細胞集団であって、
前記細胞がＣＤ１０５を発現させ、好ましくは前記細胞がＣＤ４４及び／又はＣＤ９０と共にＣＤ１０５を発現させることを特徴とする間充織幹細胞集団。
【００２９】
態様１１
態様９又は１０に記載の間充織幹細胞集団であって、
前記細胞は以下のマーカー、ＣＤ４５、ＭＨＣII及びＣＤ２９を発現させないことを特徴とする間充織幹細胞集団。
【００３０】
態様１２
態様９乃至１１のいずれかに記載の間充織幹細胞集団であって、
前記細胞がｍｉＲ−１２８及びｍｉＲ−１３３Ｂを備えるグループから選択された少なくとも１つのマイクロＲＮＡを発現させることを特徴とする間充織幹細胞集団。
【００３１】
態様１３
態様９乃至１２のいずれかに記載の間充織幹細胞集団であって、
前記細胞が以下のマイクロＲＮＡ、ｍｉＲ−６５６を発現させないことを特徴とする間充織幹細胞集団。
【００３２】
態様１４
医薬又は獣医学組成物であって、
態様１乃至８のいずれかに記載の方法に従って得られた間充織幹細胞を備える、又は態様９乃至１３のいずれかに記載の間充織幹細胞集団を備える組成物。
【００３３】
態様１５
態様９乃至１３のいずれかに記載の間充織幹細胞集団、又は態様１４の医薬又は獣医学組成物であって、
薬剤として若しくは医薬品又は獣医薬品として利用する間充織幹細胞集団又は組成物。
【００３４】
態様１６
態様９乃至１３のいずれかに記載の間充織幹細胞集団、又は態様１４の医薬又は獣医学組成物であって、
哺乳類の対象における以下の疾患、靱帯炎、骨軟骨症、関節炎、骨粗鬆症、腱炎、蹄葉炎、腱及び靱帯の炎症、骨折、及び治癒不可の１以上の治療において利用する間充織幹細胞集団又は組成物。
【００３５】
態様１７
態様１５又は１６に記載の使用のための間充織幹細胞集団であって、
自己、同種異系、又は異種の間充織幹細胞（ＭＳＣ）が利用される間充織幹細胞集団。
【００３６】
態様１８
態様１乃至８のいずれかに記載の方法であって、さらに、
前記ＭＳＣをそれぞれ適切な脂質生成、骨形成、軟骨形成、筋原性、造血、内皮、ニューロン、心臓、又は肝細胞分化培地において培養することにより、前記細胞を脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋原細胞、造血細胞、内皮細胞、神経細胞、心臓細胞、又は肝細胞に分化させる工程を備える方法。好ましくは、態様１乃至８のいずれかに記載の方法であって、
前記ＭＳＣをそれぞれ適切な脂質生成、骨形成、又は軟骨形成分化培地において培養することにより、前記細胞を脂肪細胞、骨細胞、又は軟骨細胞に分化させる工程を備える方法。
【００３７】
態様１９
態様１８に記載の方法により得られる分化した脂肪細胞、骨細胞又は軟骨細胞、筋原細胞、造血細胞、内皮細胞、神経細胞、心臓細胞、又は肝細胞。
【００３８】
態様２０
医薬又は獣医学組成物であって、
態様１９に記載の分化した脂肪細胞、骨細胞、又は軟骨細胞を備える組成物。
【００３９】
態様２１
態様１９に記載の分化した脂肪細胞、骨細胞、又は軟骨細胞、又は態様２０に記載の医薬又は獣医学組成物であって、
哺乳類の対象における以下の疾患、靱帯炎、骨軟骨症、関節炎、骨粗鬆症、腱炎、蹄葉炎、腱及び靱帯の炎症、骨折、及び治癒不可の１以上の治療において利用する細胞又は組成物。
【００４０】
態様２２
哺乳類の対象における以下の疾患、靱帯炎、骨軟骨症、関節炎、骨粗鬆症、腱炎、蹄葉炎、腱及び靱帯の炎症、骨折、及び治癒不可の１以上を治療する方法であって、
前記対象に治療効果のある量の態様１乃至８のいずれかの方法で得られたＭＳＣ、又は態様１４に記載の獣医学又は医薬組成物を投与し、前記哺乳類の対象における前記１以上の疾患を治療する工程を備える方法。
【００４１】
態様２３
哺乳類の対象における以下の疾患、靱帯炎、骨軟骨症、関節炎、骨粗鬆症、腱炎、蹄葉炎、腱及び靱帯の炎症、骨折、及び治癒不可の１以上を治療する方法であって、
治療効果のある量の態様１８の方法で得られた分化した脂肪細胞、骨細胞又は軟骨細胞、筋原細胞、造血細胞、内皮細胞、神経細胞、心臓細胞、又は肝細胞、若しくは態様２０に記載の獣医学又は医薬組成物を投与し、前記哺乳類の対象における前記１以上の疾患を治療する工程を備える方法。
【００４２】
態様２４
態様２２又は２３に記載の方法であって、
前記投与された細胞は自己、同種異系、又は異種である方法。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
本発明は、以下の図面により示されるが、これらの図面は例示の目的のみに考慮されるものであり、決して発明を本明細書で開示される実施形態に限定するものではない。
【００４４】
【図１】低密度（５０００００細胞／フラスコ）で播種され、１０日間育てられた各パーコール分画からの細胞で得られたユニットを形成する線維芽細胞似のコロニーの形態学的側面の代表的な顕微鏡写真撮影（Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ  Ｇｉｅｍｓａ染色；Ａ：１００ｘ；Ｂ：４００ｘ倍率）。
【００４５】
【図２】ウマの骨髄の単核細胞における選択された抗体の交差反応を示す制御ＦＡＣＳ画像。
【００４６】
【図３】１５−２５％パーコール分画（ウマ２）の細胞の代表的な流動サイトメトリーヒストグラム。これらの細胞は、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、及びＣＤ４４には高度に陽性だが、ＣＤ４５には陰性である。
【００４７】
【図４】分化培地において７日後にウマ２で得られた脂肪細胞の分化の代表的な顕微鏡写真（オイルレッドＯ溶液染色、４００ｘ倍率）。＜１５％、１５−２５％、２５−３５％は３パーコール分画の細胞を表し、制御は分化が誘発されていない細胞を表す。
【００４８】
【図５】軟骨形成分化培地における３週間の培養後に得られる軟骨細胞球（Ａ）、又は制御ペレット（Ｂ；軟骨形成分化培地で培養されていない細胞）の、アルシアンブルーでの薄切り染色の代表的な写真。
【００４９】
【図６】分化培地において７日後にウマ２で得られた骨形成分化の代表的な顕微鏡写真（アリザリンレッド溶液染色、４００ｘ倍率）。＜１５％、  １５−２５％、  ２５−３５％は３パーコール分画の細胞を表し、制御は分化が誘発されていない細胞を表す。
【００５０】
【図７】３つのソースのウマの間充織幹細胞（ＭＳＣ）、すなわちホウォートンゼリーＭＳＣ、骨髄ＭＳＣ、及び本発明による筋肉由来のＭＳＣにおける５つのｍｉＲＮＡの異なるレベルの発現（認識されたコピーの回数）を表す。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本明細書で利用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、内容で明確に指示がない限り、単数及び複数両方の指示対象を含む。例として、「ａ  ｃｅｌｌ」は１つ又は１以上の細胞を示す。
【００５２】
本明細書で利用されているように、用語「備えている」、「備える」、及び「から成る」は、「含んでいる」、「含む」又は「含有している」、「含有する」の同意語であり、全てを含む、又は制約がない、そして、追加の、列挙されていない部材、要素、又は方法工程を除外しない。
【００５３】
端点による数域の記述には、列挙された端点と同様に、各範囲内に組み込まれる全ての数及び分画が含まれる。
【００５４】
パラメータ、量、一時的な持続時間などのような測定可能な値を参照する場合に本明細書で利用されるような、用語「約」は、ばらつきが開示された発明で実行するのに適切である限り、特定の値からの＋／−１０％以下、好ましくは＋／−５％以下、より好ましくは＋／−１％以下、及びさらにより好ましくは＋／−０．１％以下のばらつきを包含するように意図されている。修飾語句「約」が帰する値がそれ自身、具体的にも、好ましくも開示されていることを理解されるべきである。
【００５５】
本明細書で引用されている全ての参照文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれている。特に、本明細書で具体的に言及された全ての参照の教示は、参照により組み込まれている。
【００５６】
別途定義されていない限り、技術及び科学用語を含む、発明の開示で利用されている全ての用語は、本発明が属す当業者により通常、理解されるような意味を持つ。さらなる助言により、用語定義には、本発明の教示をより正しく評価することが含まれる。
【００５７】
発明に関連する一般的な方法に関し、本明細書中の参照により組み込まれている、たとえば、「分子クローニング：実験マニュアル、第二版」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９）、動物細胞培養（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）、酵素学方法シリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、哺乳類細胞の遺伝子導入ベクター（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ＆Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）、「分子生物学における現行プロトコル及び分子生物学における短期プロトコル、第三版」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ他編、１９８７＆１９９５）、組み換えＤＮＡ方法論II（Ｒ．Ｗｕ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）を含む、既知の教科書により参照がなされる。
【００５８】
本発明の実行に役立つ一般的な技術のさらなる精緻化のため、実行者は、細胞生物学、組織培養、及び発生学における標準的な教科書及び報告を参照できる。これには、「奇形腫及びＥＳ細胞：実践的アプローチ」（Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．１９８７）、「マウス発育における技術ガイド」（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓｅｒｍａｎ他編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９３）、「ＥＳ細胞体外分化」（Ｍ．Ｖ．Ｗｉｌｅｓ、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２５：９００、１９９３）、「ＥＳ細胞の性質及び利用：ヒト生物学及び遺伝子治療への適用見通し」（Ｐ．Ｄ．Ｒａｔｈｊｅｎ他、他、１９９３）が含まれる。幹細胞の分化は、本明細書中の参照により組み込まれている、たとえば、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ．１９９７．Ｍｅｔｈ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ７５：１７３、及びＰｅｄｅｒｓｅｎ．１９９８  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｆｅｒｔｉｌ  Ｄｅｖ  １０：３１、及びＵｓａｓ他、２０１  １で概説されている。
【００５９】
細胞培養及び培地収集における一般的な技術は、本明細書中の参照より組み込まれている、大型哺乳類細胞培養（Ｈｕ他  １９９７．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ８：１４８）、無血清培地（Ｋ．Ｋｉｔａｎｏ．１９９１．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：７３）、大型哺乳類細胞培養（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２：３７５、１９９１）、において概説される。
【００６０】
用語「幹細胞」は、自己再生可能な、一般に未分化、又は相対的により分化しておらず、増殖コンピテントな細胞を指し、たとえば、分化すること無く急速に増殖でき、それ自身又はその子孫が少なくとも１つの相対的により分化した細胞タイプを生じさせ得る。この用語は、たとえば、幹細胞の子孫又はそれ自身の一部の能力が、さらなる増殖及び／又は分化に関し、母細胞と比較して明らかに減少している、限られた自己再生を示す幹細胞と同様、たとえば、幹細胞の子孫又はそれ自身の少なくとも一部が、母幹細胞の未分化又は相対的に分化していない表現型、分化能、及び増殖能を実質的に保持している、実質的に無制限の自己再生が可能な幹細胞も包含する。例として、制限することなく、幹細胞は、だんだん相対的により分化する細胞を産生させるため、１以上の系統に沿って分化できる子孫を生じさせる可能性があり、このような子孫及び／又はだんだん相対的により分化する細胞は、それら自身、本明細書に定義されるような幹細胞であり、また、たとえば、有糸分裂後の可能性がある充分に分化した細胞のような、最終分化した細胞を産生させることさえある。
【００６１】
本明細書で利用されている用語「間充織幹細胞」又は「ＭＳＣ」は、哺乳類の成体の、間葉系統の細胞、つまり、たとえば、骨細胞（骨）、軟骨細胞（軟骨）、筋細胞（筋肉）、腱細胞（腱）、線維芽細胞（結合組織）、脂肪細胞（脂肪）及びストロモジェニック（骨髄基質）系統等、間葉系統のうち２つ、好ましくは３つ以上の典型的な細胞を生成できる中胚葉由来の幹細胞を指す。一般に、しかし制限なく、たとえば、Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ他  １９９９（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：１４３−７）又はＢａｒｂｅｒｉ他、２００５（ＰＬｏＳ  Ｍｅｄ  ２：ｅ１６１）、及びＵｓａｓ他、２０１  １において記載されているような、標準的で、当技術分野で受け入れられる分化状態、及び細胞表現型評価方法を使用して、細胞は脂肪細胞、軟骨細胞、及び骨細胞の系統の各細胞を形成できるかどうか考慮されたＭＳＣであってもよい。
【００６２】
用語ＭＳＣは、また、たとえば、対象の生体サンプルから得られるＭＳＣの体外又は体外で得られる子孫等、ＭＳＣの子孫を包含する。
【００６３】
特定の要素に関する用語「分離する」は、要素がその結果そこから「分離される」組成物の少なくとも１つの他の要素から前記要素を離すことを指す。任意の細胞、細胞のグループ、又は細胞集団に関して利用される用語「分離される」は、また、このような細胞、細胞のグループ、又は細胞集団が動物の体の一部を形成しないことを意味する。
【００６４】
ＩＳＣＴは、良質な細胞は、以下のような間充織幹細胞（ＭＳＣ）として定義されるものでなければならないと厳密に決定した。つまり、細胞は、プラスチックに接着し、マーカーＣＤ７３、ＣＤ９０、及びＣＤ１０５に陽性、マーカーＣＤ１４（又はＣＤ１１ｂ）、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ７９ａ（又はＣＤ１９）、及びＭＨＣ−IIに陰性でなければならず、また、骨芽細胞、軟骨芽細胞、及び脂肪細胞のような中胚葉由来の細胞に分化する能力を示さなければならない（Ｄｏｍｉｎｉｃｉ他、２００６）。ＣＤ２９又はＣＤ４４のような他のＭＳＣマーカーの使用もまた、報告されている（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ他、１９９９）。ＩＳＣＴ基準は、本明細書の発明にまで拡張される。本発明の哺乳類のＭＳＣ細胞は、従って、それらが少なくとも間葉マーカーＣＤ１０５、及び、好ましくは以下のマーカー、ＣＤ４４及びＣＤ９０の１以上もまた発現、又は同時発現させる（たとえば、陽性である）というように定義される。本発明の哺乳類のＭＳＣ細胞は、また、それらが以下のマイクロＲＮＡ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３３Ｂ、ｍｉＲ−２１８、又はｍｉＲ−８０２の１以上を発現、又は同時発現させる（たとえば、陽性である）というように定義される。本発明の哺乳類のＭＳＣ細胞は、また、それらがｍｉＲ−６５６を発現させないというように定義される。
【００６５】
本明細書を通して、「同時発現させる」とは、細胞が細胞のキャラクタリゼーションを行う特定の列挙されたマーカー又はマイクロＲＮＡに加えて、他のマーカー又はマイクロＲＮＡを発現させることができるように、「〜の同時発現を含む」という意味をカバーする意図がある。
【００６６】
用語、マイクロＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ、又はｅｃａ−ｍｉＲは、本明細書で区別しないで利用され、動物等の生体の内在性遺伝子由来の、１９−２５ヌクレオチド成熟非コードＲＮＡ、又はその前駆体、又はその断片を指す。成熟マイクロＲＮＡは、より長いヘアピンのような前駆体と呼ばれる、約７５ヌクレオチドの長さを持つプレマイクロＲＮＡ（プレｍｉＲ）から処理される。
【００６７】
細胞が特定のマーカー又はマイクロＲＮＡに陽性であると言われた場合、これは、当業者が適切な制御に比較して、適切な測定を実行する際、そのマーカー又はマイクロＲＮＡに対し、たとえば、抗体検出可能又は逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法による検出等の、明らかなシグナルの存在又は証拠を断定するであろうことを意味する。方法がマーカー又はマイクロＲＮＡの定量的評価を可能にする場合、陽性細胞は、制御とは著しく異なる、及び制御より高度、又は強いシグナルを発生させる。たとえば、制限はないが、制御細胞により生成されたこのような信号より少なくとも１．５倍高度な、たとえば、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍高度な、又はさらに高度なシグナルである。
【００６８】
細胞特異的なマーカーの発現は、免疫の細胞化学又はアフィニティー吸着、ウエスタンブロット解析、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ、等のような当技術分野で既知の任意の適切な免疫学的技術を使用して、又は酵素活性の任意の適切な生化学アッセイにより、又はたとえば、ノーザンブロット、半定量的又は定量的ＲＴ−ＰＣＲ等の、マーカーｍＲＮＡの量の測定の任意の適切な技術により認識可能である。
【００６９】
マイクロＲＮＡの発現は、たとえば、包括的な遺伝子発現のアッセイ（たとえば、マイクロＲＮＡ発現プロファイリング解析、既製のマイクロＲＮＡ  ｑＰＣＲプレート、又はＲＮＡシークエンシングのマイクロアレイアッセイを使用して）、又は定量的ＰＣＲ、定量的逆転写（リアルタイム）ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）リアルタイムＰＣＲ、又はノーザンブロッティング等だが、これに限定されない特異的検出アッセイにより決定されてもよい。特に、マイクロＲＮＡの発現の測定は、前記マイクロＲＮＡの検出に特有のオリゴヌクレオチドプローブで実施されてもよい。前記オリゴヌクレオチドプローブは、直接及び特にマイクロＲＮＡに結合してもよいし、特に前記マイクロＲＮＡを逆転写させてもよい。代わりに、前記オリゴヌクレオチドプローブは、前記マイクロＲＮＡから得られるｃＤＮＡに結合してもよい。前記オリゴヌクレオチドプローブは、また、前記マイクロＲＮＡから得られるｃＤＮＡを増幅させてもよい。
【００７０】
本開示に記載されているマーカータンパク質に対する核及びアミノ酸配列データは、一般に既知であり、とりわけ、ＮＩＨ「ウェブ上タンパク質レビュー」データベース（ｈｔｔｐ：／／ｍｐｒ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｗ／）、ＮＩＨ「Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ」データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ｇｅｎｅ）、又はＵｎｉｐｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）のような公開データベースから取得できる。前記マーカーに適切な検出試薬及び方法は、このような配列情報のいずれかに基づいて設計でき、またより一般的には、市販されている（たとえば、標識モノクローナル抗体試薬）。
【００７１】
用語「ＣＤ１０５」は、ＣＤ１０５として知られる抗原、又はエンドグリン等、そのシノニムを包含する。ＣＤ１０５は、細胞表面に位置する膜糖タンパク質であり、既知の間充織幹細胞マーカーである。一例として、ウマのＣＤ１０５抗原の部分アミノ酸配列は、受入番号ＡＧＷ１６３４５．１のもと、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースで見つけることができる。
【００７２】
用語「ＣＤ９０」は、抗原ＣＤ９０、又はＴｈｙ−１膜糖タンパク質等、そのシノニムを包含する。一例として、ウマのＣＤ９０抗原のアミノ酸配列は、受入番号ＡＣＧ６１２２３．１のもと、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースで見つけることができる。
【００７３】
用語「ＣＤ４４」は、一般にＣＤ４４として知られる抗原、又は細胞外マトリックス受容体ＩＩＩ、ＧＰ９０リンパ球ホーミング／接着受容体、ＨＵＴＣＨ−Ｉ、Ｈｅｒｍｅｓ抗原、ヒアルロン酸受容体、又は食細胞糖タンパク質１のようなそのシノニムを包含する。一例として、ウマのＣＤ４４抗原のアミノ酸配列は、受入番号ＣＡＡ４７３３１．１のもと、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースで見つけることができる。
【００７４】
前記ＭＳＣマーカー検出用の典型的な市販の抗体試薬には、特に、モノクローナル抗体、抗ＣＤ１０５−ＲＰＥ（ＡＢＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）、抗ＣＤ４４−ＡＰＣ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）、及び抗ＣＤ９０（ＶＭＤＲ）が含まれる。特にＣＤ１０５、ＣＤ４４、又はＣＤ９０に結合する代替の抗体は、当業者であれば識別できる。
【００７５】
実施形態において、ＭＳＣは、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、及びＣＤ４４から選択される少なくとも１つの間葉マーカーを出現させる。好ましくは、ＭＳＣは、少なくとも間葉マーカーＣＤ１０５を出現させる。発明では、ＣＤ１０５及びＣＤ４４を同時発現させる細胞と同様に、ＣＤ１０５及びＣＤ９０を同時発現させるＭＳＣ細胞、ＣＤ９０及びＣＤ４４を同時発現させる細胞を観察する。また、細胞、特にＣＤ１０５、ＣＤ９０、及びＣＤ４４を同時発現させるＭＳＣ細胞が対象となる。例で示されるように、上記マーカープロファイルのＭＳＣ細胞は、また、他のマーカーを同時発現させてもよい。
【００７６】
他の実施形態において、ＭＳＣは、ｍｉＲ−１２８及びｍｉＲ−１３３Ｂを備えるグループから選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡを発現させる。発明では、少なくともｍｉＲ−１２８を発現させるＭＳＣ、又は少なくともｍｉＲ−１３３Ｂを発現させるＭＳＣを観察する。また、ｍｉＲ−１２８及びｍｉＲ−１３３Ｂを同時発現させるＭＳＣも対象となる。さらなる実施形態においては、ＭＳＣは、以下のマイクロＲＮＡ、ｍｉＲ−６５６を発現させない。
【００７７】
本開示で記載されるマイクロＲＮＡは、一般に既知であり、とりわけ、ｍｉＲＢａｓｅデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ）のような公開データベースから取得できる。
【００７８】
用語「ｍｉＲ−１２８」は、ｍｉＲ−１２８として知られるマイクロＲＮＡ、又はその前駆体を包含する。一例として、ウマのｍｉＲ−１２８のヌクレオチド配列は、受入番号ＭＩ００１２８２１のもと、ｍｉＲＢａｓｅデータベースで見つけることができる。
【００７９】
用語「ｍｉＲ−１３３Ｂ」は、ｍｉＲ−１３３Ｂとして知られるマイクロＲＮＡ、又はその前駆体を包含する。一例として、ウマのｍｉＲ−１３３Ｂのヌクレオチド配列は、受入番号ＭＩ００１２８４４のもと、ｍｉＲＢａｓｅデータベースで見つけることができる。
【００８０】
用語「ｍｉＲ−６５６」は、ｍｉＲ−６５６として知られるマイクロＲＮＡ、又はその前駆体を包含する。一例として、ウマのｍｉＲ−６５６のヌクレオチド配列は、受入番号ＭＩ００１２９１５のもと、ｍｉＲＢａｓｅデータベースで見つけることができる。
【００８１】
当業者は、マイクロＲＮＡが異なる名称、又はシノニムにより呼ばれてもよいことを十分承知している。
【００８２】
ＭＳＣ細胞は、さらに、組織培養プラスチックへの付着、単分子層での成長、及び顕著な核小体を有する円形〜だ円形の核を持つ単核の卵形、星形、又は紡錘形のうち、任意の１以上のような、特定の形態学的特徴を示してもよい。
【００８３】
用語「細胞集団」は、一般に細胞のグルーピングを指す。細胞集団は、少なくとも、共通のタイプ、又は共通の特徴を持つ細胞の分画から構成されても、分画を備えてもよい。このような特徴には、制限なく、形態学的特徴、分化の可能性（たとえば、多能性、多能性、分化単能等、たとえば、多能性又は分化単能である場合、特定の細胞タイプに分化する能力）、又はたとえば、表面抗原等、１つ、２つ、３つ、又はそれ以上の細胞関連マーカーの存在及び／又はレベルを含めてもよい。このような特徴は、よって、細胞集団又はその分画を定義してもよい。好ましくは、このような細胞集団は間充織幹細胞集団、より好ましくは、実質的に均質な間充織幹細胞の集団である。
【００８４】
用語「実質的に均質」又は「実質的に純粋」な間充織幹細胞の集団は、上記で定義したようなＭＳＣの分画を備える細胞集団を示し、前記細胞集団における前記分画は、少なくとも５０％であり、たとえば、少なくとも５５％、好ましくは、少なくとも６０％、たとえば、少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、たとえば、少なくとも７５％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、たとえば、少なくとも８５％、最も好ましくは、少なくとも９０％、たとえば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はさらに１００％に近いか１００％と同等である。
【００８５】
表現「密度勾配遠心分離」は、全てのタイプの細胞分離技術、又は密度に基づいた細胞の分離を含む製品を包含する。非限定的例には、スクロースポリマー、又はコロイド状シリカの勾配における密度勾配遠心分離があり得る。市販の勾配の非限定的例には、パーコール（ポリビニルピロリドン又はシランでコーティングされたコロイド状シリカ）、フィコール（高分子量スクロースポリマー）、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（フィコールプラスジアトリゾエートナトリウム及びエデト酸）、浮遊密度溶液（ＢＤＳ、コロイド状シリカを備える）、リンホプレップ（ジアトリゾエートナトリウム及び多糖）、等がある。当業者であれば、本発明による方法で得られる幹細胞を分離する適切な勾配を選択できるであろうことは明白である。本発明の方法を使用すると、間充織幹細胞（ＭＳＣ）は、一般的に１２５０ｘｇ（２５℃、２０分）での遠心分離後、＜１５％、１５−２５％、又は２５−３５％パーコール密度境界面で見られる。所望のマーカータンパク質を同時発現させる間充織幹細胞は、続いて、たとえば、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞分類（ＭＡＣＳ）、親和性に基づく技術、とりわけ親和性クロマトグラフィー、又はプレプレート技術、及びその組み合わせのような、それ自体既知の方法により分離され、任意に拡大された細胞の一般的な集団から、選択、濃縮、又は分離され得る。例となる方法は、Ｗｕ他、２０１０（細胞組織研究、Ｊｕｎ；３４０（３）：５４９−６７参照）に報告されている。
【００８６】
所望の発現プロファイルを有する生細胞は、各マーカー特有の試薬（たとえば、モノクローナル抗体のような最も一般的な免疫学的試薬）と結合でき、前記試薬は、それほど結合されていない細胞からの前記試薬により結合された細胞の選択又は捕獲を容易にするように、（たとえば、フルオロフォアにより、もしくは磁性粒子又は他のタイプの固定相における固定により）順番に修正される。これらの方法についての一般的なアドバイスは、とりわけ、フローサイトメトリー及び細胞分類、第二版、Ａｎｄｒｅａｓ  Ｒａｄｂｒｕｃｈ（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  １９９９（ＩＳＢＮ  ３５４０６５６３０８）、現実のままに：フローサイトメトリー及び細胞分類におけるプロトコル、第一版、ＲＡ  Ｄｉａｍｏｎｄ  ａｎｄ  Ｓ  Ｄｅｍａｇｇｉｏ（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  ２０００（ＩＳＢＮ  ３５４０６５１４９７）、フローサイトメトリープロトコル（分子生物学における方法）、第二版、ＴＳ  Ｈａｗｌｅｙ  ａｎｄ  ＲＧ  Ｈａｗｌｅｙ（編）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  ２００４（ＩＳＢＮ  １５８８２９２３５５）、アフィニティー分離：実践的アプローチ、Ｐ  Ｍａｔｅｊｔｓｃｈｕｋ（編）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７（ＩＳＢＮ  ０１９９６３５５０１）、及びＤａｉｎｉａｋ他  ２００７．Ａｄｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｅｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １０６：１−１８を参照のこと。
【００８７】
表現「適切な培地」は、細胞、間充織幹細胞（ＭＳＣ）又は間充織幹細胞集団の生存及び／又は成長をサポートする全ての細胞培養培地を包含する。非制限的な例には、一般的に少なくとも抗生物質及びウシ胎児血清（ＦＢＳ）、及び任意に抗真菌薬及び緩衝剤が補充される、ＤＦ２０、ＤＭＥＭ−Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２、ＤＭＥＭ、Ａｌｐｈａ−ＭＥＭ等がある。
【００８８】
一例としてのみだが、以下の培地は、例として利用されてきている。約２０％のウシ胎児血清、約５ｍｌのペニシリン（１０００Ｕ／ｍｌ）−ストレプトマイシン（１００００μｇ／ｍｌ）、約２．５ｍｌのアンフォテリシンＢ（２５０μｇ／ｍｌ）、及び約５ｍｌのＨＥＰＥＳを備えるＤＭＥＭ／Ｆ１２を含むＤＦ２０培地。
【００８９】
たとえば脂肪細胞、骨細胞、及び軟骨細胞への分化に対する、適切な「分化培地」において培養された発明のＭＳＣ又は間充織幹細胞集団。前記分化培地は、たとえば、脂質生成分化用のＮＨ  ＡｄｉｐｏＤｉｆｆ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）、軟骨形成分化用の軟骨細胞分化培地（ＮＨ  ＣｈｏｎｄｒｏＤｉｆｆ培地；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）、骨形成分化用の骨形成培地（ＮＨ  ＯｓｔｅｏＤｉｆｆ培地；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）であり得る。本明細書に記載される培地は、単に例となる培地として示されており、当業者であれば任意の他の市販の、又は特別に開発された分化培地を利用することもできるであろう。筋原細胞、造血細胞、内皮細胞、神経細胞、心臓細胞、又は肝細胞等の他の細胞用の適切な分化培地の他の例は、ＭＳＣをそれぞれ適切な筋原性、造血、内皮、ニューロン、心臓、又は肝細胞分化培地において培養することによりなされ得る。その例は、たとえば、Ｕｓａｓ他、２０１  １に見つけられる。
【００９０】
細胞を「分離する」、「分散させる」、「解離する」、又は「切り離す」適切な方法は、当技術分野において一般に既知であり、本発明で利用してもよい。これらには、たとえば、タンパク質分解酵素、二価イオンのキレート化、機械的分解、又は上記何れかの組み合わせでの処置が含まれる。好ましくは、前記細胞解離には、このように処置された細胞の、都合よくは（たとえば、上述のような）トリプシンを使用した、任意に二価イオンのキレート化と組み合わせた、都合よくは（たとえば、上述のような）ＥＤＴＡを使用した、酵素消化、及び／又は機械的解離を含めてもよい。後者には、たとえば、小口径ピペット（たとえば、１０００μΙマイクロピペットチップ）を通した細胞の繰り返しの通過、及び／又は固体表面に接する（たとえば、培養容器の壁に接する）細胞を含有する懸濁液の流れをピペットで取得することを含めてもよい。このようにして、発明のＭＳＣを含む細胞懸濁液を取得できる。
【００９１】
用語「マイクロバイオプシー」は、組織サンプルの最小限に侵襲的で、望ましい縫合不要の皮下収集方法を全て包含する。マイクロバイオプシーのサンプルサイズは、その用語が定義するように、非常に小さく、一般的に約１５〜約２０ｍｇの組織を備える。マイクロバイオプシー収集に適した任意の可能性のある技術又は装置が利用できる。非限定的な例には、当技術分野で既知のマイクロバイオプシーニードル、甲介鋏、又はばねで留められたマイクロバイオプシーシステムがある。一例としてのみであるが、１４ゲージのマイクロバイオプシーニードル、及びマイクロバイオプシーピストルが利用できる。
【００９２】
間充織幹細胞（ＭＳＣ）を分離するために本発明の方法で利用されるマイクロバイオプシーのソースは、好ましくは、哺乳類の骨格筋関連組織である。骨格筋関連組織の例として、首、肩、胸、背、尾、手足、後肢、前肢、後四半部、後脚等の筋肉がある。例において、例として利用されている筋組織は、ウマの上腕三頭筋であり、より好ましくは、上腕三頭筋の長頭から取得され、最も好ましくは、上腕三頭筋の長頭の長頭の約５ｃｍの深さで取得されたものである。採取する筋組織は、量のためだけでなく、この供与部位における筋組織へのアクセスの容易さ、及び低罹患率のため、たとえば、骨髄又は骨膜組織が望ましい。胚組織は、マイクロバイオプシーのソースとしては、明確に除外される。Ｖｏｔｉｏｎ他、２０１０により行われた研究は、臨床診療において獣医が行うマイクロバイオプシーが実行可能であることを証明した。さらに、副作用がないことが、まさに競争中である、激しい運動を行うウマにおいて利用サンプルを収集する本方法の検討を可能にし（Ｖｏｔｉｏｎ他、２０１０）、外植片方法により、ウマの骨格筋芽細胞の一次培養をうまく開始させるために既に利用されている（Ｃｅｕｓｔｅｒｓ他、２０１２）。
【００９３】
表現「哺乳類」又は「哺乳類の」は、たとえば、ネズミ、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、畜牛、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、及びサル及び類人猿等の霊長類のような、家畜、動物園の動物、スポーツ用の動物、ペット、コンパニオン・アニマル、及び実験動物を含むが、これに限定されるものではない全ての哺乳類を指す。好適な哺乳類は、ウマ、イヌ、又はネコである。
【００９４】
本明細書で説明されているように、前記マイクロバイオプシーから得られる間充織幹細胞は、請求項に記載されているような方法に従って培養された場合、マイクロバイオプシーの周囲に自然発生的に出現する細胞である。用語「出現する」は、たとえば、バイオプシーの操作不要な、又は追加的な成長、分化、もしくは他の因子又は薬剤の追加不要な、細胞の自然発生を包含する。この段階では外植片とも呼ばれる、マイクロバイオプシーの培養工程は、本明細書で定義されるように、さらに二次培養し、精製し、たとえば低温保存により保存することができる間充織幹細胞を、予想外に、そして自然発生的に生成する。前記マイクロバイオプシーの前記培養に適切な培地は、ＤＦ２０、ＤＭＥＭ−Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２、ＤＭＥＭ、Ａｌｐｈａ−ＭＥＭ等である。前記媒体は、一般的に、少なくとも抗生物質及びウシ胎児血清（ＦＢＳ）、及び、任意に抗真菌薬及び緩衝剤を含有している、又は補充されている。
【００９５】
本発明は、また、特にそれらを必要とする対象に与えられる、本明細書に定義されるような分化又は非分化ＭＳＣ、もしくは分化又は非分化間充織幹細胞集団を投与することによる処置の方法を提供する。これらを必要とする対象という言葉には、筋肉関節骨疾患のような、与えられる条件の処置が有益な対象が含まれる。このような対象には、前記条件で診断されたもの、前記条件を発症しやすいもの、及び／又は前記条件が予防されるべきものを、制限なく、含めてもよい。
【００９６】
用語「対象」は、たとえば、ネズミ、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、畜牛、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、及びサル及び類人猿等の霊長類のような、家畜、動物園の動物、スポーツ用の動物、ペット、コンパニオン・アニマル、及び実験動物を含むが、これに限定されるものではない全ての哺乳類を包含する。好適な対象は、ウマ、イヌ、又はネコである。
【００９７】
用語「処置する」又は「処置」は、共に、靱帯炎、骨軟骨症、関節炎、骨粗鬆症、腱炎、腱及び靱帯の炎症、骨折、及び治癒不可等だが、これに限定されるものではない筋肉関節骨疾患の罹患及び進行の可能性を防ぐため等、望ましくない苦痛の発生の可能性を防ぐ、又は減少させることを目的とした、予防的又は予防的手段と同様に、発症済みの筋肉関節骨疾患の治療等、発症済みの疾患の治療処置を包含する。このような処置の有益、又は所望の臨床結果には、１以上の症状又は１以上の生物学的マーカーの緩和、病気の程度の軽減、病気の状態の安定化（たとえば、悪化しない）、病気の進行の遅れ又は緩徐化、病状の改善又は緩和、等を、制限なく、含めてもよい。「処置」は、また、処置を受けない場合に予想される生存と比較して長く生存することを意味することができる。
【００９８】
用語「予防的に効果的な量」は、研究者又は獣医が求めているような、対象における疾患の発現を抑制又は遅延させる、発明に従った獣医学又は医薬組成物の量を指す。本明細書で利用されているような、用語「治療効果のある量」は、とりわけ治療される病気又は疾患の症状の緩和を含む可能性のある、研究者又は獣医が求める、対象における生物学的又は医薬反応を引き起こす、発明に従った獣医学又は医薬組成物の量を指す。方法は、治療的に、及び予防的に効果的な服用を決定するため、当技術分野では既知である。
【００９９】
処置は、本明細書で定義されるような、自己（たとえば、治療される対象由来の細胞）、同種異系（たとえば、治療される対象以外だが、同種に属している対象由来の細胞）、又は異種（たとえば、治療される対象以外の種に属している対象由来の細胞）ＭＳＣ、分化されたＭＳＣ、又はそれら各々の細胞集団を用いてもよい。
【０１００】
獣医学又は医薬組成物は、一般的に、活性成分、及び１以上の医薬的に許容可能な担体／補形薬のような、発明の間充織幹細胞、分化した間充織幹細胞、又は各々の（分化した）間充織幹細胞集団を備えるであろう。本明細書で利用されているように、「担体」又は「補形薬」は、任意、及び全ての溶剤、希釈剤、（たとえば、中性緩衝食塩水又はリン酸塩緩衝食塩水のような）緩衝剤、可溶化剤、コロイド、分散媒、賦形剤、充填剤、（たとえば、ＥＤＴＡ又はグルタチオンのような）キレート剤、（たとえば、グリシンのような）アミノ酸、タンパク質、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色剤、調味料、芳香族化、増粘剤、デポー効果を得る薬剤、コーティング、抗真菌薬、防腐剤、安定剤、酸化防止剤、等張化調整剤、吸着遅延剤、等を含む。このような獣医学又は医薬活性物質のための媒体及び薬剤の使用は、当技術分野において周知である。このような物質は、無毒であるべきで、細胞の活動を妨げるべきではない。獣医学での利用では、細胞は、飼料サプリメントで処方しても、飼料サプリメントとして投与されてもよい。
【０１０１】
担体又は補形薬、又は他の物質の特徴は、投与の経路次第であろう。たとえば、組成物は、非経口的に許容可能な水溶液状でもよい。医薬処方における一般的な原則に関しては、読者は、細胞治療：幹細胞移植、遺伝子治療、及び細胞免疫療法、Ｇ．Ｍｏｒｓｔｙｎ＆Ｗ．Ｓｈｅｒｉｄａｎ編、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６、及び造血幹細胞治療、Ｅ．Ｄ．Ｂａｌｌ、Ｊ．Ｌｉｓｔｅｒ＆Ｐ．Ｌａｗ、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、２０００を参照のこと。
【０１０２】
このような獣医学又は医薬組成物には、さらに、（分化した）間充織幹細胞又はその中の細胞集団の生存能力を確保する要素を含めてもよい。たとえば、組成物は、望ましいｐＨ、より多くの場合、中性に近いｐＨを実現するため、適切な緩衝系（たとえば、リン酸塩又は炭酸塩緩衝系）を備えてもよく、浸透圧を防ぐためにＭＳＣの等浸透圧状態を確保するため、十分な塩を備えてもよい。たとえば、これらの目的に適切な溶液は、当技術分野で既知なように、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）、塩化ナトリウム溶液、リンガー液、又は乳酸加リンガー液でもよい。さらに、組成物は、ＭＳＣの生存能力を高める可能性のある、アルブミン等の担体タンパク質を備えてもよい。
【０１０３】
獣医学又は医薬組成物は、さらに、骨の傷及び欠損の修復に役立つ要素を備えてもよい。たとえば、このような要素には、骨形成タンパク質、骨基質（たとえば、発明の細胞により、又は他の方法により体外で産生される骨基質）、ヒドロキシアパタイト／リン酸三カルシウム粒子（ＨＡ／ＴＣＰ）、ゼラチン、ポリ乳酸、ポリ乳酸・グリコール酸、ヒアルロン酸、キトサン、ポリエルリジン、及びコラーゲンを、制限なく、含めてもよい。たとえば、骨芽細胞は、骨誘導と同様に合成骨形成（それ自体での骨形成）をするため、脱塩骨基質（ＤＢＭ）又は他の基質と結合してもよい。同種異系ＤＢＭと共に自己骨髄細胞を使用する類似の方法は、良好な結果を生み出している。
【０１０４】
獣医学又は医薬組成物は、さらに、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、又はＢＭＰ−４のような骨形態形成タンパク質等の補完生物活性因子、又は任意の他の成長因子を含める、又は併用することができる。他の可能性のある付随要素には、骨再生を補助するために適切なカルシウム又はリン酸塩の無機源が含まれる（ＷＯ  ００／０７６３９）。望まれれば、細胞標品は、改良された組織再生を提供する担体基質又は物質で処理できる。たとえば、物質は、粒状セラミック、又はゼラチン、コラーゲン、オステオネクチン、フィブリノゲン、又はオステオカルシン等の生体高分子であり得る。多孔質母材は、標準的な方法（たとえば、Ｍｉｋｏｓ他、生体材料１４：３２３、１９９３；）に従って合成され得る。
【０１０５】
獣医学又は医薬組成物は、さらに、ＭＳＣの導入又は投与部位で感染症及び又は炎症による合併症を回避するために、殺菌、抗菌、抗生物質、又は抗真菌剤等の補完殺菌、無菌、又は微生物破壊薬剤、及び／又は抗炎症薬を含める、又は併用することができる。
【０１０６】
さらなる態様において、発明は、たとえば、全身的に、局所的に、又は損傷の部位において等、対象へＭＳＣ含有組成物を投与する手術器具を備え、さらに、発明のＭＳＣ又は細胞集団、もしくは前記ＭＳＣ又は細胞集団を備える獣医学又は医薬組成物を備える手配に関連し、その手配は、たとえば、全身的に、局所的に、又は骨損傷の部位における獣医学又は医薬組成物の投与に適応している。たとえば、適切な手術器具は、たとえば、全身的に、又は骨損傷の部位において、本発明のＭＳＣ又は細胞集団を備える液体組成物を注入できてもよい。
【０１０７】
ＭＳＣ又は細胞集団は、対象とする組織部位に移植又は移動させ、機能的に不足した領域を再構成又は再生させることを可能にする方法で投与され得る。組成物の投与は、修復される筋肉関節骨格部位次第である。たとえば、ＭＳＣ又は細胞集団は、直接、（たとえば、腱又は靱帯における）損傷に、又は（たとえば、腱又は関節滑液のような）滑膜関節のいずれかに投与できる。
【０１０８】
たとえば、骨形成は、組織の再構築、もしくは継代の挿入の外科的手順、又は人工器官に従って容易化できる。状況が違えば、侵襲的手術は必要なく、組成物は、超音波ガイド下の注射等の注入により、又はガイド可能な内視鏡を使用して投与できる。
【０１０９】
他の実施形態において、発明の分化又は未分化のＭＳＣ又は間充織幹細胞集団は、移植のために提供する適切な基質に移され、及び／又は基質で培養されてもよい。細胞が塗布及び培養され得る基質は、チタニウム、コバルト／クロム合金、又はステンレス鋼等の金属、リン酸カルシウム等の生物活性表面、ポリエチレン等のポリマー表面、等であり得る。あまり好まれないが、ガラスセラミック等のシリカ材も基質として利用できる。リン酸カルシウムは基質の必須要素ではないが、最も好まれるのは、チタニウム等の金属、及びリン酸カルシウムである。基質は、浸透性でも非浸透性でもよい。基質は、生分解性でも生体吸収性でもよい。
【０１１０】
たとえば、急速に増殖した、又は培養皿で分化している発明のＭＳＣは、必要であれば、発明の液状培養液内で固体支持体を培養することにより、分化プロセスを拡大、及び／又は継続させるために、３次元の固体支持体に移すことができる。たとえば、前記細胞を含有する懸濁液に前記支持体を含浸させることにより、３次元の固体支持体に細胞を移すことができる。このようにして得られた含浸された支持体は、対象に移植することができる。このような含浸された支持体は、また、最終的に移植される前に、それらを液状培地に浸すにより再培養できる。
【０１１１】
３次元の固体支持体は、対象に移植できるように生体適合性である必要がある。３次元の固体支持体は、円柱、球、板、又は任意の形状の一部等の任意の適切な形状のいずれかであり得る。生体適合性のある３次元の固体支持体に適切な物質には、特に言及すると、炭酸カルシウム、及び特にアラゴナイト製、具体的には、サンゴ骨格、アルミナ、ジルコニア、リン酸三カルシウム、及び／又はヒドロキシアパタイトを基にする浸透性セラミック、炭酸カルシウムをヒドロキシアパタイトに転換可能な熱水変換により得られる模造サンゴ骨格、又はリン灰石−ケイ灰石ガラスセラミック、バイオガラス（ＴＭ）ガラス等の生物活性ガラスセラミックの形態であり得る。
【０１１２】
本発明は、さらに、以下の例により示されるが、決して発明の適用範囲を限定するものではない。
［例］
物質及び方法
１．抽出法：筋肉マイクロバイオプシー
【０１１３】
マイクロバイオプシーの手順は、起立して、目が覚めているウマで実施された。マイクロバイオプシーの検査サンプルは、各ウマ（ｎ＝３）の上腕三頭筋（長頭、三頭筋稜から延びている縦線と肩甲骨及び腕橈の関節間のラインの交点）から得られた。
【０１１４】
マイクロバイオプシーの検査サンプルは、１４ゲージのマイクロバイオプシーニードル及びマイクロバイオプシーピストルで採取された。手短に言えば、サンプリング部位は、（１ｃｍ四方）剃られ、無菌で調製された。各サンプル（約１５〜２０ｍｇの組織）は、手術用メスの刃ｎｒ１１のチップでなされた皮膚切開を経て、上腕三頭筋の長頭深さ５ｃｍで採取された。皮膚切開を閉じる必要はなく、マイクロバイオプシーの全手順は、１５分以内に完了した。採集の直後、各サンプルは、２０％のウシ胎児血清、５ｍｌのペニシリン（１０００Ｕ／ｍｌ）−ストレプトマイシン（１００００μｇ／ｍｌ）、２．５ｍｌのアンフォテリシンＢ（２５０μｇ／ｍｌ）、及び５ｍｌのＨＥＰＥＳ［ＤＦ２０］から成るＤＭＥＭ／Ｆ１２で構成される６ｍｌの培地に置かれた。マイクロバイオプシーの検査サンプルは、利用するまで４℃の成長培地で保持された。
２．マイクロバイオプシーの検査サンプルを外植片として使用する細胞培養の開始
【０１１５】
培養調製は、層流フードの下、無菌装置を使用して実施された。マイクロバイオプシーの検査サンプルは、３７℃に予熱された５ｍｌのＤＦ２０で２回洗浄された。各マイクロバイオプシー検査サンプルは、１３７ｍＭのＮａＣＩ及び２．７ｍＭのＫＣＩを含有する１０ｍＭのＰＢＳ溶液（ｐＨ、７．４）で慎重に解離され（出来るだけ筋組織のみを保持するようにして）、その後、小片（手術用メスの刃のチップのサイズ）にカットされた。そして、各片は２４マルチウェルディッシュの１６の中央のウェルに個別に置かれ、１００μΙのＤＦ２０が各ウェルに追加され、培養ディッシュは制御された雰囲気下（５％のＣＯ２及び２１％のＯ２）、３７℃で培養された。外植片を含有したウェルの乾燥を防ぐため、外側のウェルはＰＢＳ（１ｍｌ／ウェル）で満たされた。外植片を含有したウェルは毎日観察され、必要な場合、（ウェル内の成長因子を保持するため）新しいＤＦ２０を単純に追加して育てられた。
【０１１６】
組織の周りに細胞の輪が見えると（約１０日）、筋肉片は、個別に別の２４マルチウェルディッシュ（筋肉片用の１６の中央のウェル、及びＰＢＳで満たされた外側のウェル）に移され、マイクロバイオプシーから分離された細胞は、８０％のコンフルエンスまで育てられた（約２０日）。
３．細胞のトリプシン処理及び多能性幹細胞分離：不連続のパーコール密度勾配遠心分離
【０１１７】
外植片から得られるほぼコンフルエントな細胞は、トリプシン−ＥＤＴＡを使用して切り離され、遠心分離され（２００ｘｇ、１０分、３７℃）、ペレットは１ｍｌのＨＢＳＳで再懸濁された。細胞懸濁液は、その後、以下のように調製された不連続のパーコール密度勾配に置かれた：１５％、２５％、及び３５％のパーコールの塩化ナトリウム溶液が調製された。そして、その上に１ｍｌの細胞懸濁液が置かれた不連続のパーコール密度勾配を形成するため、それぞれ２ｍｌのパーコール溶液が１５ｍｌの培養チューブに追加された。１２５０ｘｇ（２５℃、２０分）の遠心分離後、異なる密度の細胞分画が各パーコール分画間の界面に現れた。各分画（＜１５％、１５−２５％、２５−３５％）は、個別に採取され、ＨＢＳＳ（１ｍｌ／分画）で一度洗浄され、２００ｘｇ、３７℃で１０分遠心分離された。上澄みは捨てられ、ペレットは１ｍｌのＤＦ２０／分画で再懸濁された。各分画は、その後、Ｔ−２５ｃｍ２フラスコで８０％のコンフルエンスまで別々に培養され、最終的に、各分画の細胞は、Ｔ−１７５−ｃｍ２フラスコでトリプシン−ＥＤＴＡを使用して解離された。一旦８０％のコンフルエンスに到達すると（約４０日）、＜１５％、１５−２５％、及び２５−３５％の分画の細胞は、液体窒素で凍結され、さらにキャラクタリゼーションに引き継がれる可能性がある。
４．細胞のキャラクタリゼーション
【０１１８】
＜１５％、１５−２５％、及び２５−３５％の分画の細胞は、数で（項目４．１．参照）、それらのクローン原性に関し（項目４．２．参照）、適切な分化培地に置かれた場合のそれらの脂肪細胞、軟骨細胞、及び骨細胞に分化する能力に関して（項目４．４．参照）、及びそれらの流動サイトメトリーでのＣＤ２９、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ４５、及びＭＨＣIIの発現に関し（項目４．３．参照）、キャラクタリゼーションが行われた。これらの全試験は、液状窒素で細胞を凍結させる前後で実施された。１５−２５％及び２５−３５％の分画の細胞は、それらの免疫調節能力も検査された（項目５参照）。細胞は、また、ＲＮＡシーケンス法による、これらの発現ｍｉＲＮＡに関し、ホウォートンゼリー及び骨髄ＭＣＳと比較された（項目６乃至８参照）。
４．１．細胞の数
【０１１９】
一旦これらがコンフルエントすると、Ｔ−１７５ｃｍ２のフラスコに含有される細胞の数は、細胞分画ごとに評価された。
４．２．クローン原性
【０１２０】
細胞のクローン原性は、「線維芽細胞−コロニー形成単位」アッセイ（ＣＦＵ−Ｆ）で評価された。各分画の細胞は、第１培養又は１つの継代以降、低密度（５０００００細胞／フラスコ）で播種され、１０日間育てられた。Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ  Ｇｉｅｍｓａ染色は、肉眼的にコロニー形成単位を視覚化するために利用され、コロニー／フラスコの合計が集計された。
４．３．免疫表現型検査
【０１２１】
採取された細胞は、フローサイトメトリーにより解析された。手短に言えば、細胞（１０５）はＰＢＳで洗浄され、以下のモノクローナル抗体で培養された。
ＣＤ２９−ＦＩＴＣ（Ｉｍｍｕｎｏｓｔｅｐ）
ＣＤ１０５−ＲＰＥ（ＡＢＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）
ＣＤ４４−ＡＰＣ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）
ＭＣＨ  II（ＡＢＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）
ＣＤ４５−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（ＡＢＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）
ＣＤ９０（ＶＭＤＲ）
【０１２２】
ＭＡＣＳＱｕａｎｔ  Ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で洗浄後、細胞は、４％のホルムアルデヒド溶液で固定された。データは、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して取得され、ＦＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ４  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して評価された。
４．４．細胞の多分化能
【０１２３】
分離された細胞の分化能は、Ｐ１乃至Ｐ３で収集された細胞を使用して検査された。脂質生成、骨形成、及び軟骨形成分化は、適用された培地（ＮＨ培地、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）でメーカーの指示に従って実施された。
−脂質生成分化
【０１２４】
脂質生成分化に関し、５０００細胞／ウェルがＮＨ  ＡｄｉｐｏＤｉｆｆ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）の２４ウェルプレートに固定された。７、１４、及び２１日後、細胞は、オイルレッドＯを使用して着色された。手短に言えば、細胞はオイルレッドＯ溶液（Ｓｉｇｍａ）で染色される前に、ＰＢＳで洗浄され、８％のホルムアルデヒドで固定された。
−軟骨形成分化
【０１２５】
軟骨形成を誘発するため、細胞は、１５ｍｌの円錐管の底に移され、１ｍｌの特定の軟骨細胞分化培地（ＮＨ  ＣｈｏｎｄｒｏＤｉｆｆ培地；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）においてペレット培養（２５００００細胞／ペレット）で軟骨細胞に分化された。管は５％のＣＯ２インキュベーター内で３７℃で２１日間培養され、培地は毎週、取り替えられた。手短に言えば、２１日後、微小質量はメタノールで固定され、全組織標本がアルシアンブルーで着色された。アルシアンブルーは、６ｍｏｌ／Ｌの塩酸グアニジンで抽出され、吸収度は６２０ｎｍと読み取られた。
−骨形成分化
【０１２６】
骨形成分化に関し、細胞は、５０００細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートのＤＭＥＭに固定された。２４−４８時間後、骨形成培地（ＮＨ  ＯｓｔｅｏＤｉｆｆ培地；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）が、接着細胞に追加された。毎週、細胞は培地を完全に交換して育てられた。７、１４、及び２１日目、わずかに修正した、Ｍｅｌｏａｎ他により説明されているような、アリザリンレッド（Ｓｉｇｍａ）での着色により、カルシウム石化が評価された。細胞はＰＢＳで洗浄され、Ｈ２Ｏでの複数回の洗浄に続いて、５分間室温で７０％のエタノールで固定された。細胞は、室温で１５分間、４０ｍＭのアリザリンレッド（Ｓｉｇｍａ）ｐＨ４．２で染色され、Ｈ２Ｏですすがれ、その後、空気乾燥された。赤染色は光学顕微鏡検査により検査された。
【０１２７】
カルシウム蓄積も測定された（定量的判定）。カルシウム沈着を評価するため、基質は、２００μＬの０．６Ｎ  ＨＣＩの追加、及び夜通しの３７℃での培養により脱塩された。溶液は、その後、採取され、５分間２０００ｇで遠心分離された。上澄みのカルシウム濃度は、メーカーにより説明されているように比色解析（ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍ  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ａｓｓａｙｓ  Ｋｉｔ；ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により決定された。手短に言えば、５ｍＬのサンプルが２００ｍＬのカルシウム試薬と結合され、室温で５分間培養された。吸収度は、プレートリーダー（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ  Ｃａｐｐｅｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を使用して６１０ｎｍで培養直後に測定された。
５．筋肉由来ＭＳＣの免疫調節能力の評価
【０１２８】
ＣＤ２  Ｔリンパ球（ＴＬ）は、電磁ビーズを使用することによりＥＤＴＡチューブに採取されたウマの血液から精製された。得られたＣＤ２  ＴＬ集団は、９９％の純度（図示せず）を示した。ＣＤ２  ＴＬは、その後、カルボキシフルオレスセイン・サクシニミジル・エステル（ＣＦＳＥ）で蛍光マーカーを付けられ、フィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）で刺激され、異なる比率のＭＳＣ／ＣＤ２  ＴＬ：４／１、２／１、１／１、１／２、１／４、及び１／８で、本発明に従った方法により調製された１５−２５％又は２５−３５％の分画のＭＳＣで置かれた、又は置かれなかった。ＭＳＣにより引き起こされたＣＤ２  ＴＬ増殖の抑制（％）は、観察された蛍光の変化により評価され、ＭＳＣの免疫調節能力を表す。
６．ホウォートンゼリーからの間充織幹細胞の分離
【０１２９】
ウマ臍帯分節（５−１０ｃｍ）をホウォートンゼリーが露出するように縦方向に区分した。いくつかの切り口は、プラスチック表面と接触するため、組織のより広い領域を露出するように滅菌メスで基質上に調製された。帯部分は、その後、１０ｃｍ２のペトリ皿に移され、１５％のウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ）、２ｍＭのＬ−グルタミン酸（Ｌｏｎｚａ）、及び０．５％の抗真菌性抗生物質溶液（Ｌｏｎｚａ）が補充されたＬ−グルタミン酸（ＤＭＥＭ；Ｌｏｎｚａ）なしに、１．０ｇ／Ｌのグルコースでダルベッコ改変イーグル培地において５日間固定された。培養は、３７℃で５％のＣＯ２の湿気のある環境で維持された。５日後、帯分節が捨てられ、培地が更新された。細胞は、その後、培地を毎週変更して、サブコンフルエンス（８０−９０％）に到達するまで拡大された。サブコンフルエンスでは、細胞は、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ溶液（Ｌｏｎｚａ）で１０分間の培養により分離された後、収集された。継代に関しては、５ｘ１０４の細胞が、サブコンフルエンスまで同一の培養条件の７５ｃｍ２のフラスコ（Ｆａｌｃｏｎ）で固定された。細胞は、Ｐ４まで継代された。
７．骨髄由来間充織幹細胞の分離
【０１３０】
手短に言えば、（ウマの骨髄サンプルからの）単核細胞（ＭＮＣ）は、密度勾配遠心分離（ＬｉｎｆｏＳｅｐ；Ｂｉｏｍｅｄｉｃｓ、Ｍａｄｒｉｄ、Ｓｐａｉｎ）により分離され、ＨＢＳＳ培地（Ｂｉｏ−Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）で洗浄された。我々は１５％のＦＢＳ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、２ｍＭのＬ−グルタミン酸（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、０．５％の抗生物質／抗真菌溶液（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）が補充されたアルファ最小必須培地（α−ＭＥＭ；ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）で、０．５ｘ１０６細胞／ｍｌを播種した。これが完成したα−ＭＥＭ培地である。プラスチック接着により選択された場合、ＭＳＣは、細胞播種後４８時間で培地を取り替えることにより、非接着細胞の脱離を必要とする。培養が８０％のコンフルエンスに到達すると、細胞はトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）で切り離され、１ｘ１０４細胞／ｍｌで継代培養された。
８．トランスクリプトーム解析
方法
【０１３１】
ＲＮＡシークエンシング（ＲＮＡ−ｓｅｑ）方法が利用された。全てのＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、２頭の異なるウマから（１５−２５％の分画から）本発明の方法に従って調製された２０００万のＭＳＣ、１頭のウマからの２０００万のホウォートンゼリー幹細胞、及び１頭のウマからの２０００万の骨髄由来幹細胞から抽出された。細胞は、ベータ−メルカプトエタノールを含有するＲＬＴバッファーで溶解され、その後、ＲＮＡはメーカーの推奨事項を受けたカラムで精製された。
【０１３２】
ＲＮＡの完全性は、ＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏチップを用いたＢｉｏａｎａｌｙｓｅｒ  ２１００で確認されており、ＲＩＮのスコアは、全てのサンプルにおいて＞８であった。
【０１３３】
ＩｌｌｕｍｉｎａのＴｒｕｓｅｑ  ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｍＲＮＡサンプル調整キットは、１マイクログラムの総ＲＮＡからライブラリーを調整するために使われた。ポリＡ  ＲＮＡは、ポリＴでコーティングされた電磁ビーズで精製され、約２００のヌクレオチドに化学的に分断された。これらは、無作為の六量体が存在する第１鎖合成、その後の第２鎖合成のための鋳型として利用される。つづいて、二本鎖ｃＤＮＡの端は、インデックスを含有するアダプターへのライゲーション前に、３’ＯΗ端でアデニル化された。最終的に、アダプターにライゲーションされたライブラリー断片は、ｌｌｌｕｍｉｎａのプロトコルを受けたＰＣＲにより濃縮され、Ａｍｐｕｒｅ  ＸＰ電磁ビーズで精製された。ライブラリーは、Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒ  ＤＮＡ  １０００チップで有効化され、ＫＡＰＡライブラリー定量キットでｑＰＣＲにより定量化された。シークエンシングは、ペアエンド２ｘ７５ベースプロトコルでＩｌｌｕｍｉｎａのＮｅｘｔＳｅｑ５００において実施されている。
データ解析
【０１３４】
Ｆａｓｔｑファイルは、アダプター配列のために整えられた。読み取りは、ウマのゲノム（ＵＣＳＣからのＥｑｕｕｓ  ｃａｂａｌｌｕｓ（ウマ）ＥｑｕＣａｂ２）へのＴｏｐｈａｔ２．０．９に連携させた。Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ２．２．０スイートは、ＦＰＫＭ値を生成するために利用され、ＣｕｆｆＤｉｆｆは、発現した遺伝子を著しく特異的に識別するために利用された。
［結果］
１．抽出法
【０１３５】
マイクロバイオプシー技術は、培養を容易に開始するために十分な量のウマの筋組織の取得を可能にした。実験室でのサンプリング又は処置のいずれかの間、汚染は観察されなかった。よって、我々の作業環境は有効である。各マイクロバイオプシーを２つの片に切断したように、たった１５−２０ｍｇの組織で２つの分かれた培養を開始することが可能であった。
２．外植片による培養
【０１３６】
培養の３、４日後、最初の細胞がサンプリングされた筋肉の周囲に現れ始めた。約９、１０日後、細胞の数は外植片の移植に十分になり、細胞を単体で育てられた（いわゆる第１細胞）。移植する外植片は、コンフルエンスまで同様に培養された第２のプールの細胞（いわゆる第２細胞）の取得を可能にした。第３のプールの細胞も取得できた。さらに、第２細胞は、第１細胞より速く、筋肉片の周囲に現れ始めた。
３．多能性幹細胞分離
【０１３７】
３頭のウマそれぞれに対し、及び各パーコール分画（たとえば、＜１５％、１５−２５％、２５−３５％）において、我々は重要な量の細胞を培養及び凍結させることに成功した。
【０１３８】
培養の開始から約２０日、細胞の数は、トリプシン処理をし、分離プロセスを開始するのに十分となった。これプロセスより前に、我々はウマ２及びウマ３からそれぞれ、１０２００００及び１３４００００の第１細胞を取得した。第２細胞は、ウマ２及びウマ３からそれぞれ３３３３３３及び７５００００であった。
４．培養された細胞のキャラクタリゼーション
４．１．細胞の数
0006713412.tif 000002
４．２．クローン原性
0006713412.tif 000003
【０１３９】
ＣＦＵで観察された形態学的側面は、骨髄又はホウォートンゼリーから分離された多能性幹細胞でいつも観察されているものとは異なっていた（表１）。
【０１４０】
上記のセクション４．１及び４．２では、Ｐは「ｐａｓｓａｇｅ（継代）」、Ｐ１は「ｐａｓｓａｇｅ  １」、Ｐ２は「ｐａｓｓａｇｅ  ２」を意味する。用語、継代は、通常、「１つの培養容器から他への細胞の移動又は二次培養を指すが、必ずしも細胞系又は細胞株の増殖を可能にする、増殖性細胞集団の細分化を含まない。
【０１４１】
継代数は、培養が二次培養される回数である。
５．免疫表現型検査
【０１４２】
得られた細胞は、ＣＤ４４、ＣＤ９０、及びＣＤ１０５に陽性で、ＣＤ４５、ＭＨＣII、及びＣＤ２９に陰性であった。ウマのこれら全ての抗体の交差反応は、ＣＤ２９を除いて、ウマの骨髄からの単核細胞でチェックされた（図２及び３）。
【０１４３】
３つのパーコール分画それぞれに対し、８５−９５％の細胞はＣＤ１０５を発現させ、＞９０％の細胞はＣＤ４４及びＣＤ９０を発現させた（図３）。
６．細胞の多分化能
【０１４４】
３つのパーコール分画のそれぞれから得られた細胞は、各分化培地で培養された場合、脂肪細胞（図４）、軟骨細胞（図５）、及び骨細胞（図６）に分化することができた。
７．細胞の臨床用途
【０１４５】
本発明に従った方法により得られたウマのＭＳＣは、跛行を減少させ、靱帯炎、腱炎、及び骨関節炎等の運動系の深刻な病状にかかったウマの治癒を促進させることができる。ＭＳＣは、損傷（腱、靱帯）、若しくは腱又は関節滑液のいずれかに直接投与できる。
１／ＭＳＣの腱内注入
【０１４６】
競走馬（雌馬、９歳、サラブレッド）は、レース後、浅指屈筋腱の深刻な腱炎を発症した。馬は、休息を取ったが、他の処置はなかった。負傷の３ヶ月後、馬はグレードＩＩＩの左前肢跛行を示し、下肢及び手根骨の屈曲が明白だった。画像診断調査は、強い血管新生及びコア損傷を伴う、ポストアキュートで、治癒しつつある浅指屈筋腱（ＳＤＦＴ）腱障害を示した。本発明に従った方法が雌馬の筋肉マイクロバイオプシーから自己ＭＳＣを取得するために利用された。制御は６週間後になされた。跛行に顕著な改善はなかったが、超音波検査は、左前のＳＤＦＴ治療の軽度の好ましい進化とコア損傷の柔軟さを示した。雌馬は、ＳＤＦＴのコア損傷における１０７の自己ＭＳＣの超音波ガイド下の注入を受けた。雌馬は、また、２０分の歩行／日とともに、ボックスレストを取った。６週間後、雌馬は左前肢跛行に顕著な改善を示した。超音波検査は、エコー輝度が向上して、極めてよくなっていた（下記の表１参照）。リハビリテーションプログラムが推進された。
【０１４７】
跳躍馬（７歳、Ｚａｎｇｅｒｓｈｅｉｄｅ、雄）は、右前肢ＳＤＦＴ腱炎を発症した。馬は、休息とＮＳＡＩ（非ステロイド性抗炎症薬）によく反応した。馬は、４ヶ月後に以前のレベルの能力に戻ったが、３週間後、右前肢に別の掌の腫れを発症した。馬は、腫れに関連したグレードＩＩＩの跛行を示した。超音波検査は、広範囲の低エコー、５＊１＊０．７ｃｍ、第３中手骨の末端の３分の１のＳＤＦＴの外側面における高エコーの中隔でのドップラーネガティブ領域を示した。馬は、矯正削蹄、整形外科的装蹄、及び超音波ガイド下の病巣内ＰｒＰ注入を受けた。リハビリテーションプログラムが提案された。筋肉マイクロバイオプシーは、本発明の方法に従ったＭＳＣの調整のために成された。第１の制御は、８週間後に行われた。腫れは、完全に再吸収され、跛行の２段階の改善が記された。超音波検査は、同様に改善を示した。損傷はより良い線維方向で２（２．５＊０．５＊０．７ｃｍ）まで減少し、より小さい低エコーであった。馬は、ＳＤＦＴの損傷に１０７の自己ＭＳＣの超音波ガイド下での注入を受けた。リハビリテーションプログラムが推進された。第２の制御において（２ヶ月後）、馬は、全く跛行を示さず、超音波検査法は、はっきりしない小さな低エコー域を示した（下記の表１参考）。馬は、トリミングを受け、整形外科的装蹄は維持され、リハビリテーションプログラムが推進された。最後の制御において（第２の制御の２ヶ月後）、超音波画像に顕著な変化はなかった。リハビリテーションプログラムは終了し、整形外科的装蹄は維持された。
２／ＭＳＣの腱内及び滑膜内注入
【０１４８】
レジャー用のウマ（去勢馬、１６歳、混血）は、蹴爪下に位置する左前肢のグレードＩＩＩの跛行を示した。画像検査は、深指屈筋腱（ＤＤＦＴ）の中葉の前両側の腱障害及び左遠位指節間関節の軽度から軽度の変形性関節疾患を示した。従来の関節内及び矯正靴が適用されたが、６週間後、顕著な改善はなかった。本発明に従った方法は、去勢馬の筋肉マイクロバイオプシーから自己ＭＳＣを取得するために利用された。４週間後、馬は、左前の深指屈筋腱の中葉、及び対応する指部腱鞘に、１０７の自己ＭＳＣの超音波ガイド下での注入を受けた。馬は、幹細胞投与の２日後に注入部位に局所的な中程度の腫れを示した。６週間後、制御が行われ、跛行の軽度の改善、及び超音波画像の軽度の改善を示した。リハビリテーションプログラムが開始され、第２の制御において、馬は明らかに回復した（下記の表１参照）。身体活動の進行的な強化が提案された。
３／ＭＳＣの靭帯内及び関節内注射
【０１４９】
レジャー用ポニー（去勢馬、５歳）は、６ヶ月から右足根下腿関節の外側側副靱帯の深刻な靱帯炎、及び変形性関節疾患の中程度の兆候にかかった。跛行ＩＩＩ／Ｖ、関節腫脹、限られた範囲に痛みを伴う屈曲。事故後に取られた従来の処置では、跛行の顕著な改善はなかった。本発明に従った方法がポニーの筋肉マイクロバイオプシーから自己ＭＳＣを取得するために利用された。１ヶ月後、1回分の１０７のＭＳＣが靱帯に注入され、１０７のＭＳＣが足根下腿関節の滑液嚢に注入された。６週間後、関節の腫れの明確な縮小、及び通常の屈曲と共に、跛行の臨床改善が観察された（グレードＩ／Ｖ）（下記の表１参照）。リハビリテーションのプログラムが指示され、ポニーは身体活動を引き継いだ。
表１：異なる骨関節の病気の４頭のウマの跛行スコア［０：跛行がないこと〜Ｖ：ウマは影響を受けた肢の使用不可］における本発明の方法に従って調製されたウマの自己ＭＳＣの特定の部位での注入（１０７／注入部位）効果
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８．細胞の免疫調節能力
【０１５０】
ウマのＣＤ２  Ｔリンパ球（ＴＬ）の増殖抑制（％）が観察された。１５−２５％分画からのＭＳＣに関し、より強い抑制が１／８の比率ＭＳＣ／ＣＤ２  ＴＬで観察された。２５−３５％分画からの細胞に関し、ＭＳＣ／ＣＤ２  ＴＬの最適な比率は１／２だった（下記表２参照）。
表２：異なる比率のＭＳＣ／ＣＤ２  ＴＬ（すなわち、４／１、２／１、１／１、１／２、１／４、１／８）における１５−２５％又は２５−３５％分画からのＭＳＣで培養された場合の２頭のウマのＣＤ２  ＴＬの増殖抑制（％）
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９．トランスクリプトーム解析−本発明の方法に従って調製されたウマＭＳＣ（筋肉由来ＭＳＣと略）、ウマのホウォートンゼリーＭＳＣ及びウマの骨髄ＭＳＣ間の５つのｍｉＲＮＡの差次的発現
【０１５１】
我々は、幹細胞の３つのソース間の５６の遺伝子に関し顕著な差次的発現を観察した。我々はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）に焦点を当てることを選択した。５つのｍｉＲＮＡ、すなわちｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３３Ｂ、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−６５６、及びｍｉＲ−８０２、は、幹細胞の３つのソース間で顕著な差次的発現を示した。おそらく利用された技術のため、観察されたｍｉＲＮＡは、対応するｍｉＲＮＡの前駆体である。本実験によれば、ｍｉＲ−１２８及びｍｉＲ−１３３Ｂは、ホウォートンゼリーＭＳＣ及び骨髄ＭＳＣと比較して、筋肉由来ＭＳＣにおいて、著しく過剰発現した。ｍｉＲ−２１８及びｍｉＲ−８０２も筋肉由来ＭＳＣにより発現したが、ｍｉＲ−２１８はホウォートンゼリーＭＳＣ及び筋肉由来のＭＳＣと比較して、骨髄ＭＳＣで著しく多く発現した。それに対し、ｍｉＲ−８０２は、ホウォートンゼリーＭＳＣと比較して、骨髄ＭＳＣ及び筋肉由来ＭＳＣで著しく過剰発現した。ｍｉＲ−６５６は、骨髄ＭＳＣ及び筋肉由来のＭＳＣと比較して、ホウォートンゼリーＭＳＣで著しく過剰発現した（図７）。
［略語］
ＤＦ２０：２０％のウシ胎児血清、５ｍｌのペニシリン（１０００Ｕ／ｍｌ）−ストレプトマイシン（１００００μｇ／ｍｌ）、２．５ｍｌのアンフォテリシンＢ（２５０μｇ／ｍｌ）、及び５ｍｌのＨＥＰＥＳを備えるＤＭＥＭ／Ｆ１２で構成される成長培地。
ＨＢＳＳ：Ｈａｎｋの平衡塩溶液
［参照］
Ａｄａｍｓ、Ｍ．Ｋ．、Ｇｏｏｄｒｉｃｈ、Ｌ．Ｒ．、Ｒａｏ、Ｓ．、Ｏｌｅａ−Ｐｏｐｅｌｋａ、Ｆ．、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ、Ｎ．、Ｋｉｓｉｄａｙ、Ｊ．Ｄ．、Ｍｃｌｌｗｒａｉｔｈ、Ｃ．Ｗ．  腸骨及び胸骨からのウマの骨髄由来の間葉系間質細胞（ＢＭＤＭＳＣ）：差異はあるか？  Ｅｑｕｉｎｅ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２０１２、４５、３７２−３７５．
Ｃｅｕｓｔｅｒｓ  Ｊ．、Ｍｏｕｉｔｈｙｓ−Ｍｉｃｋａｌａｄ  Ａ．、Ｄｅ  Ｌａ  Ｒｅｂｉｅｒｅ  Ｄｅ  Ｐｏｕｙａｄｅ  Ｇ．、Ｆｒａｎｃｋ  Ｔ．、Ｖｏｔｉｏｎ  Ｄ．、Ｄｅｂｙ−Ｄｕｐｏｎｔ  Ｇ．、Ｓｅｒｔｅｙｎ  Ｄ．  ペルオキシダーゼへの暴露の有無にかかわらない再酸素負荷に続く無酸素条件に応じた培養されたウマの骨格筋芽細胞における活性酸素種産生評価  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１２、７３、４２６−４３４．
Ｄｏｍｉｎｉｃｉ、Ｍ．、Ｌｅ  Ｂｌａｎｃ、Ｋ．、Ｍｕｅｌｌｅｒ、Ｉ．、  Ｓｌａｐｅｒ−Ｃｏｒｔｅｎｂａｃｈ、Ｉ．、Ｍａｒｉｎｉ、Ｆ．、Ｋｒａｕｓｅ、Ｄ．、Ｄｅａｎｓ、Ｒ．、Ｋｅａｔｉｎｇ、Ａ．、Ｐｒｏｃｋｏｐ、Ｄ．Ｊ．、Ｈｏｒｗｉｔｚ、Ｅ．  多能性間葉系間質細胞を定義する最小基準、国際細胞療法学会意見書  Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ、２００６、８（４）、３１５−３１７．
Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ−Ｎｉｂｅｙｒｏ、Ｓ．Ｄ．  ウマの筋骨格損傷向けの市販の細胞ベース治療  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｃｌｉｎｉｃｓ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ：  Ｅｑｕｉｎｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、２０１  １、２７、３６３−３７１．
ｌａｃｏｎｏ、Ｅ、Ｂｒｕｎｏｒｉ、Ｌ、Ｐｉｒｒｏｎｅ、Ａ、Ｐａｇｌｉａｒｏ、Ｐ、Ｒｉｃｃｉ、Ｆ、Ｔａｚｚａｒｉ、ＰＬ、Ｍｅｒｌｏ、Ｂ．  ウマの羊水、臍帯血、及びホウォートンゼリーからの間充織幹細胞の分離、キャラクタリゼーション、及び分化  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、２０１２、１４３、４５５−４６８．
Ｍｅｌｏａｎ、Ｓ．Ｎ．、Ｐｕｃｈｔｌｅｒ、Ｈ．、Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ、Ｌ．Ｓ．  アルカリ溶解性及びアルカリ不溶性カルシウム沈着のアルカリ及び酸アリザリンレッドＳ染色  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、１９７２、９３（３）、１９０−１９７．
Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ、Ｍ．Ｆ．、Ｍａｃｋａｙ、Ａ．Ｍ．、Ｂｅｃｋ、Ｓ．Ｃ．、Ｊａｉｓｗａｌ、Ｒ．Ｋ．、Ｄｏｕｇｌａｓ、Ｒ．、Ｍｏｓｃａ、Ｊ．Ｄ．、Ｍｏｏｒｍａｎ、Ｍ．Ａ．、Ｓｉｍｏｎｅｔｔｉ、Ｄ．Ｗ．、Ｃｒａｉｇ、Ｓ．、Ｍａｒｓｈａｋ、Ｄ．Ｒ．  成体ヒト間充織幹細胞（ＭＳＣ）の多分化能  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９、２８４（５４１１）、１４３−１４７．
Ｒａｄｔｋｅ、Ｃ．Ｌ．、Ｎｉｎｏ−Ｆｏｎｇ、Ｒ．、Ｅｓｐａｒｚａ  Ｇｏｎｚａｌｅｚ、Ｂ．Ｐ．、Ｓｔｒｙｈｎ、Ｈ．、ＭｃＤｕｆｆｅｅ、Ｌ．Ａ．  骨髄及び脂肪組織由来の間充織幹細胞（ＭＳＣ）と比較したウマの筋組織及び骨膜組織由来の間充織幹細胞（ＭＳＣ）のキャラクタリゼーション及び骨形成能  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１３、７４（５）、７９０−８００．
Ｓｃｈｎａｂｅｌ  Ｌ．Ｖ．、Ｆｏｒｔｉｅｒ  Ｌ．Ａ．、Ｗａｙｎｅ  Ｍｃｌｌｗｒａｉｔｈ  Ｃ、Ｎｏｂｅｒｔ  Ｋ．Ｍ．  ウマの幹細胞の治療的使用：どのタイプ、どのように、いつ？  Ｔｈｅ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２０１３、１９７（３）、５７０−５７７．
Ｕｓａｓ、Ａ．、Ｍａｃｉｕｌａｉｔｉｓ、Ｊ．、Ｍａｃｉｕｌａｉｔｉｓ、Ｒ．、Ｊａｋｕｂｏｎｉｅｎｅ、Ｎ．、Ｍｉｌａｓｉｕｓ、Ａ．、Ｈｕａｒｄ、Ｊ．  骨格筋由来の幹細胞：細胞媒介治療の影響  Ｍｅｄｉｃｉｎａ（Ｋａｕｎａｓ）、２０１  １、４７（９）、４６９−４７９．
Ｖｏｔｉｏｎ  Ｄ．Ｍ．、Ｆｒａｉｐｏｎｔ  Ａ．、Ｇｏａｃｈｅｔ  Ａ．Ｇ．、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｃ、Ｖａｎ  Ｅｒｃｋ  Ｅ．、Ａｍｏｒｙ  Ｈ．、Ｃｅｕｓｔｅｒｓ  Ｊ．、Ｄｅ  Ｌａ  Ｒｅｂｉｅｒｅ  Ｄｅ  Ｐｏｕｙａｄｅ  Ｇ．、Ｆｒａｎｃｋ  Ｔ．、Ｍｏｕｉｔｈｙｓ−Ｍｉｃｋａｌａｄ  Ａ．、Ｎｉｅｓｔｅｎ  Ａ．、Ｓｅｒｔｅｙｎ  Ｄ．  耐久訓練及び耐久レースに応じたミトコンドリア呼吸機能の変化  Ｅｑｕｉｎｅ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｊｏｕｒｎａl、２０１０、４２（ｓｕｐｐｌ  ３８）、２６８−２７４．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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