(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むヒトＯＸ４０と結合する単離された抗体であって、ここで、
ＶＨのＣＤＲ１が配列番号８７の配列を含み、ＶＨのＣＤＲ２が配列番号３１７の配列を含み、かつＶＨのＣＤＲ３が配列番号８９の配列を含み、かつ
ＶＬのＣＤＲ１が配列番号９０の配列を含み、ＶＬのＣＤＲ２が配列番号９１の配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ３が配列番号９２の配列を含む、
単離された抗体。
【請求項２】
配列番号３１８の配列を含む重鎖可変領域および配列番号９４の配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
配列番号１２４の配列を含む重鎖および配列番号１１６の配列を含む軽鎖を含む、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
重鎖および軽鎖定常領域を含む、請求項１−３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
重鎖定常領域が、Ｃ末端リシンを欠くか、またはＣ末端にリシン以外のアミノ酸を含む、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
Ｂｉａｃｏｒｅによって測定される場合、可溶性ヒトＯＸ４０と、１ｎＭ以下のＫＤで結合する、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
ヒトＯＸ４０(配列番号２)の配列ＤＶＶＳＳＫＰＣＫＰＣＴＷＣＮＬＲ(配列番号１７８)の全てまたは一部分と結合する、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
ＩｇＧ１アイソタイプである、請求項１から８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
ヒト抗体である、請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
請求項２から１０のいずれか一項に記載の抗体の重鎖および軽鎖可変領域をコードする、核酸。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項１３】
（ｉ）請求項１２に記載の発現ベクター、または（ｉｉ）請求項２−１０のいずれか一項に記載の抗体の重鎖可変領域をコードする核酸を含む発現ベクターおよび請求項２−１０のいずれか一項に記載の抗体の軽鎖可変領域をコードする核酸を含む別個の発現ベクター、で形質転換された細胞。
【請求項１４】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体と、担体とを含む、組成物。
【請求項１５】
１以上のさらなる治療薬をさらに含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
１以上のさらなる治療薬が、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、ＣＴＬＡ−４抗体およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
癌を治療するための医薬の製造における、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項１８】
癌を治療するための医薬の製造における、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１９】
癌が、子宮頸癌、結腸直腸癌、膀胱癌および卵巣癌からなる群から選択される、請求項１７または１８に記載の使用。
【請求項２０】
癌を治療するための医薬の製造における抗ＰＤ−１抗体ニボルマブと組み合わせる、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項２１】
癌を治療するための医薬の製造における抗ＣＴＬＡ−４抗体イピリムマブと組み合わせる、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項２２】
癌を治療するための医薬の製造における抗ＰＤ−１抗体ニボルマブおよび抗ＣＴＬＡ−４抗体イピリムマブと組み合わせる、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項２３】
請求項１３に記載の細胞を適した条件下で培養することおよび抗体を単離することを含む、ヒトＯＸ４０と結合する抗体を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本出願は、それぞれ、２０１６年５月９日、２０１６年４月２５日、２０１５年１２月８日、２０１５年１０月９日および２０１５年５月２９日に出願された、米国仮出願第６２／３３３,５５６号、同第６２／３２７,１４０号、同第６２／２６４,６９１号、同第６２／２３９,５７４号および同第６２／１６８,３７７号の優先権を主張する。前述の出願の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、配列表を含む。２０１６年５月２６日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピーは、MXI_543PC_Sequence_Listing.txtという名称であり、サイズが４１７,５２８バイトである。
【背景技術】
【０００３】
ＡＣＴ３５、ＩＭＤ１６、ＴＸＧＰ１ＬおよびＣＤ１３４としても知られるＯＸ４０(ＴＮＦＲＳＦ４)は、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞上に発現される共刺激受容体のＴＮＦＳＦＲファミリーの５０ｋＤのＩ型膜貫通糖タンパク質である。癌の状況においては、ＯＸ４０を発現する活性化Ｔ細胞は、腫瘍浸潤リンパ球において見出される。ＯＸ４０およびそのリガンドであるＯＸ４０−Ｌは、Ｔ細胞応答の誘導および維持において重要な役割を果たす。最近の研究によって、癌と闘うために抗腫瘍Ｔ細胞機能を増強することの有用性が実証されており、有効な応答の重要な構成要素には、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化ならびにメモリーＴ細胞およびエフェクターＴ細胞を通じた生存シグナルの促進が含まれる。Ｔ細胞応答などの免疫応答を増強させることを通じて癌などの疾患を治療するための改善された戦略に対する現在継続中の必要性を考慮すると、ＯＸ４０を標的とするものなど、Ｔ細胞応答を調節する新規な薬剤、ならびにそのような薬剤を使用する治療法(例えば、併用療法)が、治療的に有用であると予想される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＯＸ４０と特異的に結合し、望ましい機能的特性を有する、ヒトモノクローナル抗体などの抗体が、本明細書において提供される。これらの特性として、ヒトＯＸ４０およびカニクイザルＯＸ４０との高親和性結合、ならびに例えば腫瘍を有する対象において抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する能力が挙げられる。サンプル中のＯＸ４０を検出する方法もまた、本明細書において提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一態様では、ＯＸ４０と特異的に結合し、以下の特性：
(１)例えば、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定される場合、可溶性ヒトＯＸ４０と、例えば、１０ｎＭ以下(例えば、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ)のＫＤで結合すること、
(２)例えば、ＦＡＣＳによって測定される場合、膜結合型ヒトＯＸ４０と、例えば、１ｎＭ以下(例えば、０.０１ｎＭ〜１ｎＭ)のＥＣ５０で結合すること、
(３)例えば、ＦＡＣＳによって測定される場合、例えば、１０ｎＭ以下(例えば、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ)のＥＣ５０でカニクイザルＯＸ４０と結合すること、例えば、膜結合型カニクイザルＯＸ４０と結合すること、
(４)(ｉ)ＯＸ４０発現Ｔ細胞におけるＩＬ−２および／もしくはＩＦＮ−γ産生の増大ならびに／または(ii)Ｔ細胞増殖の増強によって示されるように、Ｔ細胞活性化を誘導または増強すること、
(５)例えば、ｈＯＸ４０−２９３細胞を用いたアッセイにおいて、ＦＡＣＳによって測定される場合、例えば、１ｎＭ以下のＥＣ５０で、ＯＸ４０リガンドのＯＸ４０との結合を阻害すること、
(６)成熟ヒトＯＸ４０の細胞外部分(配列番号２)のエピトープ、例えば、領域ＤＶＶＳＳＫＰＣＫＰＣＴＷＣＮＬＲ(配列番号１７８)内またはＤＳＹＫＰＧＶＤＣＡＰＣＰＰＧＨＦＳＰＧＤＮＱＡＣＫＰＷＴＮＣＴＬＡＧＫ(配列番号１７９)内のエピトープと結合すること、
(７)ヒトＯＸ４０との結合について、３Ｆ４、１４Ｂ６−１、１４Ｂ６−２、２３Ｈ３、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３および２０Ｃ１と競合すること、
(８)ヒトＯＸ４０との結合について、６Ｅ１−１、６Ｅ１−２、１４Ａ２−１および１４Ａ２−２と競合すること、
のうちの少なくとも１つを示す、抗体またはその抗原結合部分が、本明細書において提供される。
【０００６】
ある実施形態では、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合部分は、抗腫瘍免疫応答、例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する。ある実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、ＯＸ４０発現Ｔ細胞におけるサイトカイン産生(例えば、ＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ)を増大するおよび／またはＴ細胞増殖を増大する。ある実施形態では、抗体は、ヒト補体のＣ１ｑ成分と結合する。ある実施形態では、抗体は、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞のＮＫ細胞媒介性溶解を誘導する。ある実施形態では、抗体は、ＯＸ４０発現細胞のマクロファージ媒介性食作用を促進する。ある実施形態では、抗体は、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖の調節Ｔ細胞媒介性抑制を阻害する。
【０００７】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合部分は、１以上の活性化ＦｃγＲなど、Ｆｃ受容体と結合する。ある実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、多価架橋を通じてＴ細胞活性化を誘導または増強する。
【０００８】
ＯＸ４０と特異的に結合し、配列番号３１８および９４、配列番号１７および１８、２８および２９、２８および３０、３７および３８、４８および４９、４８および５０、５７および５８、６５および６６、７３および７４、８４および８５、８４および８６、９３および９４から選択される、可変重鎖および可変軽鎖の対となった、３つの可変重鎖ＣＤＲおよび３つの可変軽鎖ＣＤＲを含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分が、本明細書において提供される。
【０００９】
ＯＸ４０と結合し、
(ａ)それぞれ、配列番号８７、３１７および８９を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号９０〜９２を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｂ)それぞれ、配列番号１１〜１３を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号１４〜１６を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｃ)それぞれ、配列番号１９〜２１を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号２２〜２４を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｄ)それぞれ、配列番号１９〜２１を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号２５〜２７を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｅ)それぞれ、配列番号３１〜３３を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号３４〜３６を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｆ)それぞれ、配列番号３９〜４１を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号４２〜４４を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｇ)それぞれ、配列番号３９〜４１を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号４５〜４７を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｈ)それぞれ、配列番号５１〜５３を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号５４〜５６を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｉ)それぞれ、配列番号５９〜６１を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号６２〜６４を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｊ)それぞれ、配列番号６７〜６９を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号７０〜７２を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｋ)それぞれ、配列番号７５〜７７を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号７８〜８０を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｌ)それぞれ、配列番号７５〜７７を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号８１〜８３を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、または
(ｍ)それぞれ、配列番号８７〜８９を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号９０〜９２を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列
を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分もまた、本明細書において提供される。
【００１０】
ＯＸ４０と結合し、重鎖および軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分が本明細書において提供され、ここで、重鎖可変領域は、配列番号３１８、１７、２８、３７、４８、５７、６５、７３、８４および９３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００１１】
ＯＸ４０と結合し、重鎖および軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分が本明細書において提供され、ここで、軽鎖可変領域は、配列番号９４、１８、２９、３０、３８、４９、５０、５８、６６、７４、８５、８６および９４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００１２】
ＯＸ４０と結合し、配列番号３１８および９４、１７および１８、２８および２９、２８および３０、３７および３８、４８および４９、４８および５０、５７および５８、６５および６６、７３および７４、８４および８５、８４および８６、９３および９４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、例えば、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である重鎖および軽鎖可変領域配列を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分が、本明細書において提供される。
【００１３】
ＯＸ４０と結合し、配列番号１２４および１１６、９５および９６、９７および９８、９９および１００、１０１および１０２、１０３および１０４、１０５および１０６、１０７および１０８、１０９および１１０、１１１および１１２、１１３および１１４、１１５および１１６、１１７および１１８、１１９および１２０、１２１および１２２、１２３および１１６、１２４および１１６ならびに１２５および１１６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である重鎖および軽鎖配列を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分が、本明細書において提供される。
【００１４】
ある実施形態では、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、(ａ)３Ｆ４、１４Ｂ６−１、１４Ｂ６−２、２３Ｈ３、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３もしくは２０Ｃ１と同一のＯＸ４０上のエピトープと結合するか、または６Ｅ１−１、６Ｅ１−２、１４Ａ２−１もしくは１４Ａ２−２と同一のＯＸ４０上のエピトープと結合し、(ｂ)例えば、ＦＡＣＳによって測定される場合、３Ｆ４、１４Ｂ６−１、１４Ｂ６−２、２３Ｈ３、６Ｅ１−１、６Ｅ１−２、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３、１４Ａ２−１、１４Ａ２−２および／または２０Ｃ１の、活性化Ｔ細胞上のＯＸ４０との結合を、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％阻害する。
【００１５】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合部分は、成熟したヒトＯＸ４０の細胞外部分(配列番号２)の領域ＤＶＶＳＳＫＰＣＫＰＣＴＷＣＮＬＲ(配列番号１７８)または領域ＤＳＹＫＰＧＶＤＣＡＰＣＰＰＧＨＦＳＰＧＤＮＱＡＣＫＰＷＴＮＣＴＬＡＧＫ(配列番号１７９)内で結合する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合部分は、ヒトおよびカニクイザルの両方のＯＸ４０と結合する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合部分は、マウスおよび／またはラットのＯＸ４０とは結合しない。
【００１６】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４抗体またはそれらの変異体である。ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合部分のＣＤＲ領域中のメチオニン残基が、酸化を受けていないアミノ酸残基と置換されている。ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合部分は、ヒト抗体またはヒト化抗体である。ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、活性化ＦｃγＲへの結合を増強したＦｃを含む。
【００１７】
ＩｇＧ２ヒンジ、ならびにＩｇＧ２アイソタイプのものではないＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３のうちの少なくとも１つを含む、修飾された重鎖定常領域を含む、ＯＸ４０と結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分が、本明細書において提供される。
【００１８】
ある実施形態では、重鎖は、配列番号９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２４および１２５からなる群から選択されるアミノ酸配列、または多くとも１０個のアミノ酸がそれらとは異なる重鎖、または配列番号９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２４および１２５のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である重鎖を含む。
【００１９】
ある実施形態では、軽鎖は、配列番号９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０および１２２からなる群から選択されるアミノ酸配列、または多くとも１０個のアミノ酸がそれらとは異なる軽鎖、または配列番号９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０および１２２のアミノ酸配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である軽鎖を含む。
【００２０】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合部分は、免疫原性ではない。
【００２１】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合部分は、異性化を受けるアミノ酸配列を欠く。例えば、アミノ酸配列Ａｓｐ−Ｇｌｙが、抗体の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ配列中に存在している場合、この配列は、異性化を受けていないアミノ酸配列と置換されている。ある実施形態では、抗体は、配列番号７６に記載される重鎖可変領域ＣＤＲ２配列を含むが、ここで、Ａｓｐ−Ｇｌｙ配列
【化１】
0006797137.tif 000002
中のＡｓｐまたはＧｌｙは、異性化を受けていないアミノ酸配列、例えば、Ａｓｐ−ＳｅｒまたはＳｅｒ−Ｇｌｙ配列と置換されている。別の実施形態では、抗体は、配列番号８８に記載される重鎖可変領域ＣＤＲ２配列を含むが、ここで、Ａｓｐ−Ｇｌｙ配列
【化２】
0006797137.tif 000003
中のＡｓｐまたはＧｌｙは、異性化を受けていないアミノ酸配列、例えば、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ、Ａｓｐ−ＡｌａまたはＳｅｒ−Ｔｈｒ配列と置換されている。
【００２２】
配列番号２８２〜２９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＯＸ４０と結合する抗体が、本明細書において提供される。ある実施形態では、抗体は、配列番号２８２〜２９６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる重鎖を含む。
【００２３】
第２の結合特異性を有する分子と連結している抗ＯＸ４０抗体を含む、二重特異性分子が、本明細書において提供される。
【００２４】
抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合部分の重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする核酸、核酸分子を含む発現ベクターならびに発現ベクターで形質転換された細胞が本明細書において提供される。
【００２５】
薬剤と連結している、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体を含むイムノコンジュゲートが本明細書において提供される。
【００２６】
抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合部分と、担体とを含む医薬組成物が本明細書において提供される。
【００２７】
抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合部分および使用のための説明書を含むキットが本明細書において提供される。ある実施形態では、キットは、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体をさらに含む。
【００２８】
抗ＯＸ４０抗体を細胞において発現させ、細胞から抗体を単離することを含む、抗ＯＸ４０抗体を調製する方法が、本明細書において提供される。
【００２９】
抗原特異的Ｔ細胞応答が刺激されるように、Ｔ細胞を、抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合部分と接触させることを含む、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する方法が、本明細書において提供される。
【００３０】
Ｔ細胞、例えば、エフェクターＴ細胞を活性化または共刺激する方法であって、細胞、例えば、エフェクターＴ細胞を、抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合部分およびＣＤ３と接触させることを含み、エフェクターＴ細胞が、活性化または共刺激される、方法が本明細書において提供される。
【００３１】
Ｔ細胞を有効量の抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合部分と接触させることを含む、Ｔ細胞におけるＩＬ−２および／もしくはＩＦＮ−γ産生ならびに／またはＴ細胞の増殖を増大する方法が本明細書において提供される。
【００３２】
対象においてＴ細胞におけるＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生を増大する方法であって、Ｔ細胞からのＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生を増大するために、有効量の抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合部分、抗ＯＸ４０抗体を含む二重特異性分子もしくはコンジュゲートまたは抗ＯＸ４０抗体を含む組成物を投与することを含む、方法が、本明細書において提供される。
【００３３】
処置を必要とする対象の腫瘍におけるＴ調節細胞の数を低減または枯渇させる方法であって、腫瘍におけるＴ調節細胞の数を低減するために、有効量の抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはコンジュゲートを投与することを含み、抗体またはその抗原結合部分が、エフェクター機能または増強されたエフェクター機能を有する、方法が、本明細書において提供される。
【００３４】
対象における免疫応答を刺激する方法であって、対象における免疫応答が刺激されるように、対象に、有効量の抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはコンジュゲートを投与することを含む、方法が、本明細書において提供される。ある実施形態では、対象は、腫瘍を有し、腫瘍に対する免疫応答が刺激される。
【００３５】
対象における腫瘍細胞の成長を阻害する方法であって、対象において腫瘍の成長が阻害されるように、対象に、抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはコンジュゲートを投与することを含む、方法が、本明細書において提供される。
【００３６】
例えば、免疫療法によって癌を治療する方法であって、癌を治療するために、それを必要とする対象に、治療上有効な量の抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合部分、抗ＯＸ４０抗体を含む二重特異性分子もしくはコンジュゲートまたは抗ＯＸ４０抗体を含む組成物を投与することを含む、方法が、本明細書において提供される。ある実施形態では、癌は、膀胱癌、乳癌、子宮／子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、食道癌、胃腸癌、膵臓癌、結腸直腸癌、結腸癌、腎臓癌、頭頸部癌、肺癌、胃癌、生殖細胞癌、骨癌、肝臓癌、甲状腺癌、皮膚癌、中枢神経系の新生物、リンパ腫、白血病、骨髄腫、肉腫およびウイルス関連癌からなる群から選択される。ある実施形態では、癌は、転移性癌、難治性癌または再発性癌である。
【００３７】
ある実施形態では、本明細書に記載される方法は、抗ＯＸ４０抗体とともに、１以上のさらなる治療薬、例えば、抗ＰＤ１抗体、ＬＡＧ−３抗体、ＣＴＬＡ−４抗体および／またはＰＤ−Ｌ１抗体を投与することをさらに含む。
【００３８】
抗体またはその抗原結合部分とＯＸ４０との複合体の形成を可能にする条件下で、サンプルを抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合部分と接触させること、および複合体の形成を検出することを含む、サンプル内のＯＸ４０の存在を検出する方法が本明細書において提供される。
【００３９】
癌の治療、対象における免疫応答の刺激、抗原特異的Ｔ細胞応答の刺激、Ｔ細胞の活性化もしくは共刺激、Ｔ細胞におけるＩＬ−２および／もしくはＩＦＮ−γなどのサイトカインの産生および／またはＴ細胞の増殖の増大、腫瘍におけるＴ調節細胞数の低減もしくは枯渇、ならびに／または腫瘍細胞の成長の阻害のための、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体の使用が、本明細書において提供される。対象における免疫応答の刺激、抗原特異的Ｔ細胞応答の刺激、Ｔ細胞の活性化もしくは共刺激、Ｔ細胞におけるＩＬ−２および／もしくはＩＦＮ−γ産生および／またはＴ細胞の増殖の増大、腫瘍におけるＴ調節細胞数の低減もしくは枯渇、ならびに／または腫瘍細胞の成長の阻害のための医薬の調製のための、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体の使用もまた、本明細書において提供される。
【００４０】
ヒト対象における固形腫瘍を治療する方法であって、対象に、有効量の、配列番号３１８に記載される配列を有する重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインならびに配列番号９４に記載される配列を有する軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む抗ＯＸ４０抗体を投与することを含み、方法が、少なくとも１回の投与サイクルを含み、このサイクルが、２週間の期間であり、少なくとも１回のサイクルのそれぞれについて、抗ＯＸ４０抗体の１回の用量が、１ｍｇ／体重１ｋｇの用量、２０、４０、８０、１６０もしくは３２０ｍｇの固定用量、約１ｍｇ／体重１ｋｇの用量、または約２０、４０、８０、１６０もしくは３２０ｍｇの固定用量で投与される、方法が、本明細書において提供される。
【００４１】
ある実施形態では、方法は、配列番号３０１に記載される配列を有する重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインならびに配列番号３０２に記載される配列を有する軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む抗ＰＤ−１抗体を投与することをさらに含み、ここで、方法は、少なくとも１回の投与サイクルを含み、このサイクルが、２週間、３週間または４週間の期間であり、少なくとも１回のサイクルのそれぞれについて、抗ＯＸ４０抗体の１回の用量が、１ｍｇ／体重１ｋｇの用量、２０、４０、８０、１６０もしくは３２０ｍｇの固定用量、約１ｍｇ／体重１ｋｇの用量、または約２０、４０、８０、１６０もしくは３２０ｍｇの固定用量で投与され、抗ＰＤ−１抗体の１回の用量が、２４０、３６０もしくは４８０ｍｇの用量または約２４０、３６０もしくは４８０ｍｇの用量で投与される。
【００４２】
別の実施形態では、方法は、配列番号３０９に記載される配列を有する重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインならびに配列番号３１０に記載される配列を有する軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む抗ＣＴＬＡ−４抗体を投与することをさらに含み、ここで、方法は、少なくとも１回の投与サイクルを含み、このサイクルが、３週間の期間であり、少なくとも１回のサイクルのそれぞれについて、抗ＯＸ４０抗体の１回の用量が、１ｍｇ／体重１ｋｇの用量、２０、４０、８０、１６０もしくは３２０ｍｇの固定用量、約１ｍｇ／体重１ｋｇの用量、または約２０、４０、８０、１６０もしくは３２０ｍｇの固定用量で投与され、抗ＣＴＬＡ−４抗体の１回の用量が、１ｍｇ／ｋｇの用量または約１ｍｇ／ｋｇの用量で投与され、
抗ＯＸ４０抗体が、少なくとも１回のサイクルで抗ＣＴＬＡ−４抗体と一緒に投与された後に、少なくとも１回のサイクルの抗ＯＸ４０抗体の単剤治療が続く。いくつかの実施形態では、治療は、８回のサイクルからなる。ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、最初の４回のサイクルは抗ＣＴＬＡ−４抗体と一緒に投与され、最後の４回のサイクルは抗ＯＸ４０抗体の単剤治療が続く。
【００４３】
いくつかの実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、それぞれ、配列番号１２４および１１６に記載される重鎖および軽鎖配列を含む。
【００４４】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体または抗ＯＸ４０抗体および抗ＰＤ−１抗体もしくは抗ＣＴＬＡ−４抗体は、静脈内投与用に製剤化される。いくつかの実施形態では、抗ＯＸ４０抗体および抗ＰＤ−１抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体は、一緒に製剤化される。他の実施形態では、抗ＯＸ４０抗体および抗ＰＤ−１抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体は、別個に製剤化される。
【００４５】
いくつかの実施形態では、治療は、８回のサイクルからなる。ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体または抗ＯＸ４０抗体および抗ＰＤ−１抗体もしくは抗ＣＴＬＡ−４抗体は、各サイクルの１日目に投与される。
【００４６】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、抗ＰＤ−１抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体の投与の前に投与される。ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、抗ＰＤ−１抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体の投与の約３０分前に投与される。他の実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、抗ＰＤ−１抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体の投与の後に投与される。さらに他の実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、抗ＰＤ−１抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体と同時に投与される。
【００４７】
ある実施形態では、治療は、腫瘍サイズの低減、転移病変数の経時的な低減、完全な応答、部分的な応答および疾患の安定から選択される少なくとも１つの治療効果をもたらす。いくつかの実施形態では、腫瘍は、子宮頸癌、膀胱癌、結腸直腸癌および卵巣癌からなる群から選択される癌と関連している。
【００４８】
本開示のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および実施例から明らかとなるが、これらは制限と解釈されてはならない。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１Ａは、３Ｆ４ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１２６)およびアミノ酸配列(配列番号１７)を示す。ＣＤＲ１(配列番号１１)、ＣＤＲ２(配列番号１２)およびＣＤＲ３(配列番号１３)領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源(derivation)を示す。図１Ｂは、３Ｆ４ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１２７)およびアミノ酸配列(配列番号１８)を示す。ＣＤＲ１(配列番号１４)、ＣＤＲ２(配列番号１５)およびＣＤＲ３(配列番号１６)領域を線で示し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。
【００５０】
【図２】図２Ａは、１４Ｂ６(１４Ｂ６−１および１４Ｂ６−２)ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１２８)およびアミノ酸配列(配列番号２８)を示す。ＣＤＲ１(配列番号１９)、ＣＤＲ２(配列番号２０)およびＣＤＲ３(配列番号２１)領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源(derivation)を示す。図２Ｂは、１４Ｂ６−１ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１２９)およびアミノ酸配列(配列番号２９)を示す。ＣＤＲ１(配列番号２２)、ＣＤＲ２(配列番号２３)およびＣＤＲ３(配列番号２４)領域を線で示し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。図２Ｃは、１４Ｂ６−２ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１３０)およびアミノ酸配列(配列番号３０)を示す。ＣＤＲ１(配列番号２６)、ＣＤＲ２(配列番号２７)およびＣＤＲ３(配列番号２８)領域を線で示し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。
【００５１】
【図３】図３Ａは、２３Ｈ３ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１３１)およびアミノ酸配列(配列番号３７)を示す。ＣＤＲ１(配列番号３１)、ＣＤＲ２(配列番号３２)およびＣＤＲ３(配列番号３３)領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。図３Ｂは、２３Ｈ３ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１３２)およびアミノ酸配列(配列番号３８)を示す。ＣＤＲ１(配列番号３４)、ＣＤＲ２(配列番号３５)およびＣＤＲ３(配列番号３６)領域を線で示し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。
【００５２】
【図４】図４Ａは、６Ｅ１(６Ｅ１−１および６Ｅ１−２)ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１３３)およびアミノ酸配列(配列番号４８)を示す。ＣＤＲ１(配列番号３９)、ＣＤＲ２(配列番号４０)およびＣＤＲ３(配列番号４１)領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。図４Ｂは、６Ｅ１−１ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１３４)およびアミノ酸配列(配列番号４９)を示す。ＣＤＲ１(配列番号４２)、ＣＤＲ２(配列番号４３)およびＣＤＲ３(配列番号４４)領域を線で示し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。図４Ｃは、６Ｅ１−２ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１３５)およびアミノ酸配列(配列番号５０)を示す。ＣＤＲ１(配列番号４５)、ＣＤＲ２(配列番号４６)およびＣＤＲ３(配列番号４７)領域を線で示し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。
【００５３】
【図５】図５Ａは、１８Ｅ９ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１３６)およびアミノ酸配列(配列番号５７)を示す。ＣＤＲ１(配列番号５１)、ＣＤＲ２(配列番号５２)およびＣＤＲ３(配列番号５３)領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。図５Ｂは、１８Ｅ９ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１３７)およびアミノ酸配列(配列番号５８)を示す。ＣＤＲ１(配列番号５４)、ＣＤＲ２(配列番号５５)およびＣＤＲ３(配列番号５６)領域を線で示し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。
【００５４】
【図６】図６Ａは、８Ｂ１１ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１３８)およびアミノ酸配列(配列番号６５)を示す。ＣＤＲ１(配列番号５９)、ＣＤＲ２(配列番号６０)およびＣＤＲ３(配列番号６１)領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。図６Ｂは、８Ｂ１１ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１３９)およびアミノ酸配列(配列番号６６)を示す。ＣＤＲ１(配列番号６２)、ＣＤＲ２(配列番号６３)およびＣＤＲ３(配列番号６４)領域を線で示し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。
【００５５】
【図７】図７Ａは、２０Ｂ３ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１４０)およびアミノ酸配列(配列番号７３)を示す。ＣＤＲ１(配列番号６７)、ＣＤＲ２(配列番号６８)およびＣＤＲ３(配列番号６９)領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。図７Ｂは、２０Ｂ３ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１４１)およびアミノ酸配列(配列番号７４)を示す。ＣＤＲ１(配列番号７０)、ＣＤＲ２(配列番号７１)およびＣＤＲ３(配列番号７２)領域を線で示し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。
【００５６】
【図８】図８Ａは、１４Ａ２(１４Ａ２−１および１４Ａ２−２)ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１４２)およびアミノ酸配列(配列番号８４)を示す。ＣＤＲ１(配列番号７５)、ＣＤＲ２(配列番号７６)およびＣＤＲ３(配列番号７７)領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。図８Ｂは、１４Ａ２−１ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１４３)およびアミノ酸配列(配列番号８５)を示す。ＣＤＲ１(配列番号７８)、ＣＤＲ２(配列番号７９)およびＣＤＲ３(配列番号８０)領域を線で示し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。図８Ｃは、１４Ａ２−２ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１４４)およびアミノ酸配列(配列番号８６)を示す。ＣＤＲ１(配列番号８１)、ＣＤＲ２(配列番号８２)およびＣＤＲ３(配列番号８３)領域を線で示し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。
【００５７】
【図９】図９Ａは、２０Ｃ１ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１４５)およびアミノ酸配列(配列番号９３)を示す。ＣＤＲ１(配列番号８７)、ＣＤＲ２(配列番号８８)およびＣＤＲ３(配列番号８９)領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。図９Ｂは、２０Ｃ１ヒトモノクローナル抗体のカッパ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号１４６)およびアミノ酸配列(配列番号９４)を示す。ＣＤＲ１(配列番号９０)、ＣＤＲ２(配列番号９１)およびＣＤＲ３(配列番号９２)領域を線で示し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示す。
【００５８】
【図１０】図１０Ａは、ＯＸ４０.２１ヒトモノクローナル抗体の重鎖のヌクレオチド配列(配列番号１７６)およびアミノ酸配列(配列番号１２４)を示す。軽鎖のヌクレオチド配列(配列番号１６８)およびアミノ酸配列(配列番号１１６)は、図１０Ｂに示される。
【００５９】
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｄは、ＦＡＣＳによって評価される場合の、活性化ヒトＴ細胞に対する種々の抗ＯＸ４０抗体の結合曲線およびＥＣ５０(ｎＭ単位)を、対照として機能するｈＩｇＧ１および二次抗体とともに示す。
【００６０】
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｃは、ＦＡＣＳによって評価される場合の、活性化カニクイザルＴ細胞に対する種々の抗ＯＸ４０抗体の結合曲線およびＥＣ５０(ｎＭ単位)を、対照として機能するｈＩｇＧ１および二次抗体とともに示す。
【００６１】
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｃは、スキャッチャード解析法によって評価される場合の、活性化ヒトＴ細胞、ヒトＯＸ４０を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞およびカニクイザルＯＸ４０を過剰発現するＣＨＯ細胞に対する抗ＯＸ４０抗体ＯＸ４０.２１の結合曲線およびＫＤを示す。
【００６２】
【図１４】図１４Ａは、抗ＯＸ４０抗体ＯＸ４０.８、ＯＸ４０.６およびＯＸ４０.１６による種々のアセトン固定凍結ヒト組織切片の免疫組織学的染色を示す。画像は、過形成扁桃腺については１μｇ／ｍｌおよび他の組織については５μｇ／ｍｌの抗体濃度での代表的な染色を示すが、心内膜および心臓弁については例外でＯＸ４０.１６が１０μｇ／ｍｌである。３種全ての抗体が、扁桃腺における小サブセットのリンパ球を陽性に染色したが、ＯＸ４０.８は、心臓における筋フィラメント様構造体も陽性に染色し、ＯＸ４０.６は、心筋、扁桃腺における小動脈の心内膜／内皮下基質ならびに心臓における心内膜および心臓弁を陽性に染色した。ＧＣは胚中心、ＭＺは外套帯。図１４Ｂは、抗ＯＸ４０抗体ＯＸ４０.２１(ＯＸ４０.１６の変異体)による種々のアセトン固定凍結ヒト組織切片の免疫染色を示す。画像は、５μｇ／ｍｌの抗体濃度での代表的な染色を示す。抗体は、扁桃腺および胸腺における小サブセットのリンパ球を陽性に染色した。扁桃腺における陽性細胞は、胚中心、外套帯および卵胞間(inter-follicular)領域に分布していたが、胸腺における陽性細胞は、主に、髄質内に局在化していた。心臓、肝臓、腎臓および肺においては、特異的な染色は観察されなかった。ＧＣは胚中心、ＭＥは髄質、ＭＺは外套帯。
【００６３】
【図１５】図１５Ａは、肝細胞癌腫(ＨＣＣ)、結腸直腸癌腫(ＣＲＣ)、頭頸部の扁平上皮細胞癌腫(ＨＮＳＣＣ)および黒色腫(Ｍｅｌ)におけるＯＸ４０＋腫瘍浸潤リンパ球の分布を示す。各腫瘍型について１２〜２０症例の手作業でのスコア付けを、２０倍の対物レンズの顕微鏡下における陽性細胞数の概算によって行った。最小限、２０倍の対物レンズ視野による細胞数が１未満；軽度、２０倍の対物レンズ視野による細胞数が１〜１０未満；中等度、２０倍の対物レンズ視野による細胞数が１０〜５０未満；顕著、２０倍の対物レンズ視野による細胞数が５０〜２００未満；強力、２０倍の対物レンズ視野による細胞数が２００を上回る。図１５Ｂおよび１５Ｃは、結腸直腸癌腫(ＣＲＣ)および頭頸部の扁平上皮細胞癌腫(ＨＮＳＣＣ)のサンプルからの隣接するＦＦＰＥ切片でのＣＤ３、ＦｏｘＰ３およびＯＸ４０についての免疫組織学的染色を示す。図１５Ｂは、低倍率表示であり、ＯＸ４０＋ＴＩＬおよびＦｏｘＰ３＋ＴＩＬはいずれも、ＣＤ３＋ＴＩＬの一部であり、主に腫瘍間質に分布していることを示す。図１５Ｃは、高倍率表示であり、ＣＲＣにおけるＯＸ４０＋ＴＩＬおよびＦｏｘＰ３＋(Ｔｒｅｇ)ＴＩＬの部分的共局在化の可能性を示す。
【００６４】
【図１６】図１６は、種々の抗ＯＸ４０抗体が、ＯＸ４０リガンド(ＯＸ４０−Ｌ)のヒトＯＸ４０トランスフェクト２９３細胞(「ｈＯＸ４０−２９３細胞」)との結合を阻害する能力を、ｈＩｇＧ１を対照として用いて示す。
【００６５】
【図１７】図１７は、種々の抗ＯＸ４０抗体間のＯＸ−４０Ｌ遮断の関係性を要約する。
【００６６】
【図１８】図１８は、ＦＡＣＳによって評価される場合の、種々の抗ＯＸ４０抗体が、抗ＯＸ４０抗体クローンＬ１０６のｈＯＸ４０−２９３細胞との結合を阻害する能力を、ＰＥ標識Ｌ１０６のみ、ＰＥ標識ｍＩｇＧ１および未染色細胞を対照として用いて示す。
【００６７】
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｃは、ＦＡＣＳによって評価される場合の、種々の抗ＯＸ４０抗体が、アロフィコシアニン(ＡＰＣ)コンジュゲートＯＸ４０.１抗体のｈＯＸ４０−２９３細胞との結合(図１９Ａおよび１９Ｂ)またはｈＯＸ４０−ＨＴ１０８０細胞との結合(図１９Ｃ)を阻害する能力を示す。ｈＩｇＧ１および／またはｈＩｇＧ４を対照として使用した。図１９Ｄ〜１９Ｇは、種々の抗ＯＸ４０抗体が、ビオチンコンジュゲートＯＸ４０.４またはＯＸ４０.５抗体のｈＯＸ４０−２９３細胞との結合を阻害する能力を示す。ｈＩｇＧ１およびストレプトアビジン−ＡＰＣを対照として使用した。図１９Ｈは、図１９Ａ〜１９Ｃに示される結果に基づくＯＸ４０.１と関連するエピトープビンを要約する。図１９Ｉは、図１９Ｄ〜１９Ｇに示される結果に基づくＯＸ４０.５またはＯＸ４０.４と関連するエピトープビンを要約する。
【００６８】
【図２０】図２０Ａは、ＯＸ４０.２１が、Ｎ結合型糖の存在に関係なく、非還元型ＯＸ４０のみと結合することを示す。図２０Ｂおよび２０Ｃは、脱グリコシル化の後にペプチドマッピングによって同定された２つのＮ−グリコペプチドを示す：ＡｓｐＮ１１８(図２０Ｂ)およびＡｓｐＮ１２(図２０Ｃ)のいずれについても、６０％占有率。図２０Ｄは、ＯＸ４０.１６、ＯＸ４０.２１およびＯＸ４０.８によって結合されたＯＸ４０の領域を示す。図２０Ｅは、ＬＣ−ＭＳによる、ＯＸ４０.１６、ＯＸ４０.２１およびＯＸ４０.８によって認識されるペプチドの同定を示す。
【００６９】
【図２１】図２１Ａ〜２１Ｄは、ＣＨＯ−ＣＤ３−ＣＤ３２Ａ細胞と共培養した場合のヒト初代ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖に対する種々の抗ＯＸ４０抗体の効果を示す。ＣＨＯ細胞のみ、Ｔ細胞のみ、Ｔ細胞のみと共培養したＣＨＯ細胞およびｈＩｇＧ１を、対照として使用した。
【００７０】
【図２２】図２２Ａ〜２２Ｄは、ＣＨＯ−ＣＤ３−ＣＤ３２Ａ細胞と共培養したヒト初代ＣＤ４＋Ｔ細胞からのインターフェロンガンマ(ＩＦＮ−γ)分泌に対する種々の抗ＯＸ４０抗体の効果を示す。ＣＨＯ細胞のみ、Ｔ細胞のみ、Ｔ細胞のみと共培養したＣＨＯ細胞およびｈＩｇＧ１を、対照として使用した。
【００７１】
【図２３】図２３Ａ〜２３Ｆは、異なるドナーから単離されたブドウ球菌エンテロトキシンＢ(ＳＥＢ)活性化ヒト末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)の培養物中における、初代Ｔ細胞からのＩＬ−２分泌の刺激に対する種々の抗ＯＸ４０抗体の効果を示す。
【００７２】
【図２４】図２４は、活性化ＣＤ４＋細胞のＮＫ９２細胞誘導溶解に対する種々の抗ＯＸ４０抗体の効果を示す。
【００７３】
【図２５】図２５Ａおよび２５Ｂは、２人のドナーから単離された活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞の初代ＮＫ細胞媒介性溶解に対する種々の抗ＯＸ４０抗体の効果を、ＮＫ：標的細胞比で示す。
【００７４】
【図２６】図２６は、初代ヒトマクロファージによるｈＯＸ４０−２９３細胞の食作用に対する種々の抗ＯＸ４０抗体の効果を示す。
【００７５】
【図２７】図２７は、ヒト補体Ｃ１ｑ成分のＯＸ４０.２１との結合のレベルを示す。ＩｇＧ１およびＩｇＧ１.１(エフェクターレス)を、対照として使用した。
【００７６】
【図２８】図２８Ａ〜２８Ｃは、ＯＸ４０が、通常はＣＤ４＋細胞に限定され、ＣＤ８＋細胞での発現が最小限であるパターンで、腫瘍浸潤リンパ球に発現されることを示す。図２８Ｄは、ＯＸ４０が、マウスＳａ１Ｎ腫瘍において、ＣＤ４＋Ｔ細胞および調節Ｔ細胞によって発現されることを示す。図２８Ｅは、ＯＸ４０が、マウスＭＣ３８腫瘍において、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞および調節Ｔ細胞によって発現されることを示す。
【００７７】
【図２９】図２９は、種々の抗ＯＸ４０抗体が、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の調節Ｔ(Ｔｒｅｇ)細胞媒介性抑制を逆転させる能力を示す。Ｔｒｅｇ細胞の存在下および不在下のいずれにおいても、抗ＯＸ４０抗体は、Ｔ応答(Ｔｒｅｓｐ)細胞の増殖を、ＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較して増大した。
【００７８】
【図３０】図３０Ａおよび３０Ｂは、静脈内投与されたＯＸ４０.６抗体のサルからのクリアランスを示す。サルのうちの２匹は、クリアランスの加速を示し、これは、抗薬物抗体の形成と関連していた。
【００７９】
【図３１】図３１は、種々の抗ＯＸ４０抗体ならびに品質管理サンプルＱＣ−１、ＱＣ−２およびＱＣ−３の抗原性の割合についてのＴ細胞増殖の結果を示すグラフである。
【００８０】
【図３２】図３２Ａ〜３２Ｃは、キメラＯＸ８６抗体(ＯＸ８６のラット可変領域およびマウス定常領域を有する、ＯＸ４０とＯＸ４０−Ｌとの間の相互作用を遮断しない抗体、すなわち、非遮断抗体)の異なるアイソタイプの抗腫瘍活性に対する効果を示し、これは、ＭＣ３８結腸腺癌モデルにおいてこれらのアイソタイプ(ｍＩｇＧ１およびｍＩｇＧ２アイソタイプ)で処置した個々のマウスにおける腫瘍量の変化によって測定される：(図３２Ａ)対照マウスＩｇＧ１抗体(「対照」)、(図３２Ｂ)ＯＸ８６  ｍＩｇＧ１抗体(「ＯＸ−４０  ｍＩｇＧ１」)、(図３２Ｃ)ＯＸ８６  ｍＩｇＧ２抗体(「ＯＸ−４０  ｍＩｇＧ２ａ)。
【００８１】
【図３３】図３３Ａ〜３３Ｃは、ＯＸ８６抗体の異なるアイソタイプ(ｍＩｇＧ１およびｍＩｇＧ２ａ)の、腫瘍および末梢におけるＣＤ４＋調節Ｔ細胞数ならびに脾臓における細胞数に対する効果を示す。
【００８２】
【図３４】図３４Ａ〜３４Ｃは、ヒトＩｇＧ１を有するキメラＯＸ８６抗体の、ＭＣ３８結腸腺癌モデルにおいて示される抗体で処置した個々のマウスにおける腫瘍量の変化によって測定される、抗腫瘍活性に対する効果を示す：(図３４Ａ)ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照(「アイソタイプ」)、(図３４Ｂ)ＯＸ８６−ｈＩｇＧ１キメラ抗体(「ＯＸ８６−ｈＧ１」)、(図３４Ｃ)ＯＸ８６−ｈＩｇＧ１−Ｓ２６７Ｅ抗体(「ＯＸ８６−ｈＧ１−Ｓ２６７Ｅ」)。ｈＩｇＧ１におけるＳ２６７Ｅ置換は、ＦｃＲとの結合を増大することによってそのエフェクター機能を増大する(ＣＤ３２ＡおよびＣＤ３２Ｂ)。ＯＸ８６−ｈＩｇＧ１は、強力な抗腫瘍活性を示した。
【００８３】
【図３５】図３５Ａ〜３５Ｄは、キメラＯＸ８６  ｈＩｇＧ１抗体の調節Ｔ細胞枯渇に対する効果を示す。
【００８４】
【図３６】図３６Ａ〜３６Ｅは、異なる投与量での遮断(すなわち、ＯＸ４０とＯＸ４０リガンドとの間の相互作用を遮断する)ハムスター抗マウスＯＸ４０抗体(８Ｅ５)の、抗腫瘍活性に対する効果を、皮下マウスＣＴ−２６腫瘍モデルにおいて示される抗体で処置した個々のマウスにおける腫瘍量の変化により示す。(図３６Ａ)ハムスターＩｇ対照、(図３６Ｂ)１０ｍｇ／ｋｇでの８Ｅ５、(図３６Ｃ)３ｍｇ／ｋｇでの８Ｅ５、(図３６Ｄ)１ｍｇ／ｋｇでの８Ｅ５、(図３６Ｅ)０.３ｍｇ／ｋｇでの８Ｅ５。
【００８５】
【図３７】図３７Ａ〜３７Ｄは、ＯＸ８６−ｒＧ１抗体および抗ＰＤ１抗体を用いた併用療法の、ＭＣ３８結腸腺癌モデルにおいて示される抗体および組合せで処置した個々のマウスにおける腫瘍量の変化によって測定される、抗腫瘍活性に対する効果を示す：(図３７Ａ)アイソタイプ対照、(図３７Ｂ)抗ＰＤ１抗体、(図３７Ｃ)ＯＸ８６−ｒＧ１(「抗ＯＸ４０」)、(図３６Ｄ)ＯＸ８６−ｒＧ１＋抗ＰＤ１抗体(「抗ＯＸ４０＋抗ＰＤ１」)。
【００８６】
【図３８】図３８Ａおよび３８Ｂは、それぞれ、２２日目および４１日目におけるＣＤ６９＋発現ＣＤ４＋ＣＤ８−Ｔ細胞のＫＬＨに対するエキソビボリコール応答を示す。動物は、研究１日目にＫＬＨで免疫処置した。データ点は、個々の動物(雄および雌)の結果を、ＣＤ４＋ＣＤ８−Ｔ細胞の割合として表す。水平バーは、群平均を表す。
【００８７】
【図３９】図３９は、抗ｈｉｓ  Ｆａｂ捕捉ＦｃγＲ−ｈｉｓタンパク質との抗体結合を示す。結合応答は、ｍＡｂ：ＦｃγＲの結合の化学量論が１：１であると仮定して、理論上のＲｍａｘの割合としてプロットする。各抗体のバーは、スライドの下部の色凡例が提供されている順で示されている。
【００８８】
【図４０】図４０は、抗ｈｉｓ  Ｆａｂ捕捉ＦｃｇＲ−ｈｉｓタンパク質との抗体結合を示す。結合応答は、ｍＡｂ：ＦｃγＲの結合の化学量論が１：１であると仮定して、理論上のＲｍａｘの割合としてプロットする。各抗体のバーは、スライドの下部の色凡例が提供されている順で示されている。
【００８９】
【図４１】図４１Ａ〜４１Ｄは、アゴニスト抗ＯＸ４０抗体(ＯＸ８６−ｒＧ１)および抗ＣＴＬＡ−４抗体(９Ｄ９−ｍＧ２ｂ)を用いた併用療法の、ＣＴ２６結腸腺癌モデルにおいて示される抗体および組合せで処置した個々のマウスにおける腫瘍量の変化によって測定される、抗腫瘍活性に対する効果を示す：(図４１Ａ)アイソタイプ対照、(図４１Ｂ)抗ＣＴＬＡ−４抗体、(図４１Ｃ)ＯＸ８６−ｒＧ１、(図４１Ｄ)ＯＸ８６−ｒＧ１＋抗ＣＴＬＡ−４抗体。
【００９０】
【図４２】図４２は、フェーズ１／２ａ臨床試験プロトコールの概要である。
【００９１】
【図４３】図４３は、フェーズ１／２ａ臨床試験の研究来院スケジュールの概要である。
【発明を実施するための形態】
【００９２】
ＯＸ４０と特異的に結合し、それによって、下流のＯＸ４０シグナル伝達を活性化する、単離された抗体、特に、モノクローナル抗体、例えば、ヒトモノクローナル抗体(「アゴニスト抗ＯＸ４０抗体」)が、本明細書に記載される。ある実施形態では、本明細書に記載される抗体は、特定の機能的特徴によって特徴付けられる、および／または特定のアミノ酸配列を含むＣＤＲ領域など、特定の構造的特徴を含む。単離された抗体、このような抗ＯＸ４０抗体、イムノコンジュゲート、このような抗体を含む二重特異性分子および抗体を含有するよう製剤化された医薬組成物を作製する方法が、本明細書において提供される。また、抗体を、免疫応答増強のために、単独でまたはその他の免疫賦活剤(例えば、抗体)および／または癌治療と組み合わせて使用する方法も本明細書において提供される。したがって、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体は、例えば、腫瘍成長の阻害およびウイルス性感染症の治療を含めた、様々な治療適用における治療において使用され得る。
【００９３】
定義
本明細書において説明がより容易に理解され得るために、特定の用語をまず定義する。さらなる定義は詳細な説明を通じて示されている。
【００９４】
用語「ＯＸ４０」とは、本明細書において、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーであり、ＯＸ４０リガンド(ＯＸ４０−Ｌ)と結合する、受容体を指す。ＯＸ４０はまた、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー４(ＴＮＦＲＳＦ４)、ＡＣＴ３５、ＩＭＤ１６、ＴＸＧＰ１ＬおよびＣＤ１３４とも呼ばれる。用語「ＯＸ４０」は、細胞によって天然に発現される、ＯＸ４０の任意の変異体またはアイソフォームを含む。したがって、本明細書に記載される抗体は、ヒト以外の種に由来するＯＸ４０(例えば、カニクイザルＯＸ４０)と交差反応し得る。あるいは、抗体は、ヒトＯＸ４０に特異的であり得、他の種とのいずれの交差反応性も示さない可能性がある。ＯＸ４０またはその任意の変異体およびアイソフォームは、それらを天然に発現する細胞もしくは組織から単離され得るか、または当技術分野で周知の技術および／もしくは本明細書に記載されるものを使用して組換えにより産生され得るかのいずれであってもよい。
【００９５】
ヒトＯＸ４０前駆体のアミノ酸配列(受託番号ＮＰ＿００３３１８.１)は、配列番号１に記載されている。成熟ヒトＯＸ４０の細胞外ドメインのアミノ酸配列は、配列番号２に記載されている。カニクイザルＯＸ４０のアミノ酸配列は、配列番号３に記載されている。ヒトＯＸ４０−Ｌのアミノ酸配列は、配列番号４に記載されている
【００９６】
用語「プログラム死１」、「プログラム細胞死１」、「タンパク質ＰＤ−１」、「ＰＤ−１」、「ＰＤ１」、「ＰＤＣＤ１」、「ｈＰＤ−１」および「ｈＰＤ−Ｉ」は、本明細書において、同義的に使用され、ヒトＰＤ−１の変異体、アイソフォーム、種間相同体(species homologs)およびＰＤ−１と共通のエピトープを少なくとも１つ有する類似体を含む。完全なＰＤ−１配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ６４８６３に見出すことができる。
【００９７】
用語「細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４」、「ＣＴＬＡ−４」、「ＣＴＬＡ４」、「ＣＴＬＡ−４抗原」および「ＣＤ１５２」(例えば、Murata (1999) Am. J. Pathol. 155:453-460を参照のこと)は、同義的に使用され、ヒトＣＴＬＡ−４の変異体、アイソフォーム、種間相同体およびＣＴＬＡ−４と共通のエピトープを少なくとも１つ有する類似体を含む(例えば、Balzano (1992) Int. J. Cancer Suppl. 7:28-32を参照のこと)。ヒトＣＴＬＡ−４の完全な配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌｌ  ５００６に記載されている。
【００９８】
本明細書において用語「抗体」とは、全抗体および任意の抗原結合断片(すなわち「抗原結合部分」)またはその単一鎖を含み得る。「抗体」とは、ある実施形態では、ジスルフィド結合によって相互接続している少なくとも２つの重(Ｈ)鎖および２つの軽(Ｌ)鎖を含む糖タンパク質またはその抗原結合部分を指す。各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書において、ＶＨと略される)および重鎖定常領域からなる。特定の天然に存在するＩｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＡ抗体では、重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる。特定の天然に存在する抗体では、各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書において、ＶＬと略される)および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬからなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域(ＣＤＲ)と呼ばれ、フレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる、より保存されている領域に散在している超可変性の領域にさらに細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端に配置される、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの、宿主組織または因子、例えば、免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクター細胞)および伝統的な補体系の第１の成分(Ｃｌｑ)との結合を媒介し得る。
【００９９】
抗体は、通常、そのコグネイト抗原と、１０−７〜１０−１Ｍ以下の解離定数(ＫＤ)によって反映される高親和性で特異的に結合する。約１０−６Ｍより大きい任意のＫＤは、一般に、非特異的結合を示すと考えられる。本明細書において、抗原と「特異的に結合する」抗体とは、抗原および実質的に同一の抗原と、１０−７Ｍ以下、好ましくは、１０−８Ｍ以下、さらにより好ましくは、５×１０−９Ｍ以下、最も好ましくは、１０−８Ｍから１０−１０Ｍ以下の間のＫＤを有することを意味する高親和性で結合するが、無関係の抗原とは高親和性で結合しない抗体である。抗原は、所与の抗原に対して高度の配列同一性を示す場合には、例えば、所与の抗原の配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９７％、またはさらにより好ましくは、少なくとも９９％の配列同一性を示す場合に、所与の抗原と「実質的に同一」である。例として、ヒトＯＸ４０と特異的に結合する抗体は、特定の非ヒト霊長類種(例えば、カニクイザル)に由来するＯＸ４０と交差反応し得るが、その他の種(例えば、マウスＯＸ４０)に由来するＯＸ４０と、またはＯＸ４０以外の抗原とは交差反応し得ない。
【０１００】
免疫グロブリンは、それだけには限らないがＩｇＡ、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭを含めた、よく知られているアイソタイプのいずれかに由来し得る。ＩｇＧアイソタイプは、特定の種ではサブクラスに分けられる：ヒトでは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４ならびにマウスでは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３。ある実施形態では、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２サブタイプのものである。免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ１は、多くても２、３個のアミノ酸で互いに異なるいくつかのアロタイプで存在する。「抗体」は、例として、天然に存在する抗体および天然に存在しない抗体の両方、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、キメラおよびヒト化抗体、ヒトおよび非ヒト抗体、完全合成抗体ならびに一本鎖抗体を含み得る。
【０１０１】
本明細書において、用語、抗体の「抗原結合部分」は、抗原(例えば、ヒトＯＸ４０)と特異的に結合する能力を保持する抗体の１以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片によって実施され得ることが示されている。抗体、例えば、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例は、(ｉ)ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片であるＦａｂ断片、(ii)ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片であるＦ(ａｂ’)２断片、(iii)ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、(iv)抗体の一本のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、(ｖ)ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546)、ならびに(vi)単離された相補性決定領域(ＣＤＲ)、または(vii)適宜合成リンカーによって接続され得る２つ以上の単離されたＣＤＲの組合せを含む。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、ＶＬおよびＶＨ領域対が、一価の分子(一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)として知られる；例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426;およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照のこと)を形成する単一のタンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによる組換え方法を使用して接続され得る。このような一本鎖抗体はまた、用語、抗体の「抗原結合部分」内に包含されるものとする。これらおよびその他の可能性のあるコンストラクトは、Chan & Carter (2010) Nat. Rev. Immunol. 10:301に記載されている。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技術を使用して得られ、断片は、インタクトな抗体と同様の方法で有用性についてスクリーニングされる。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術によって、またはインタクトな免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的切断によって生産され得る。
【０１０２】
「二重特異性」または「二機能性抗体」は、２つの異なる重鎖／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結を含めた種々の方法によって生産できる。例えば、Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992)を参照のこと。
【０１０３】
本明細書において、用語「モノクローナル抗体」とは、特定のエピトープに対する単一結合特異性および親和性を示す抗体または全ての抗体が特定のエピトープに対する単一結合特異性および親和性を示す抗体の組成物を指す。通常、このようなモノクローナル抗体は、抗体をコードする単一細胞または核酸に由来し、任意の配列変更を意図的に導入することなく増殖され得る。したがって、用語「ヒトモノクローナル抗体」とは、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および適宜定常領域を有するモノクローナル抗体を指す。ある実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、例えば、トランスジェニックまたは導入染色体非ヒト動物(例えば、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖を含むゲノムを有するトランスジェニックマウス)から得られたＢ細胞を不死化された細胞と融合することによって得られたハイブリドーマによって産生される。
【０１０４】
本明細書において、用語「組換えヒト抗体」は、組換え手段によって調製され、発現され、作製されるか、または単離された全てのヒト抗体、例えば、(ａ)ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニックまたは導入染色体またはそれから調製されたハイブリドーマである動物(例えば、マウス)から単離された抗体、(ｂ)抗体を発現するよう形質転換された宿主細胞から、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体、(ｃ)組換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体および(ｄ)ヒト免疫グロブリン遺伝子配列のその他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意のその他の手段によって調製され、発現され、作製されるか、または単離された抗体を含む。このような組換えヒト抗体は、生殖系列遺伝子によってコードされる特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列を利用する可変および定常領域を含むが、その後の再編成および例えば、抗体成熟の間に起こる突然変異を含む。当技術分野で公知のように(例えば、Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9):1117-1125を参照のこと)、可変領域は、外来抗原に対して特異的な抗体を形成するよう再編成する種々の遺伝子によってコードされる抗原結合ドメインを含有する。可変領域は、再配列に加えて、外来抗原に対する抗体の親和性を増大するよう、複数の単一アミノ酸変更(体細胞突然変異または高頻度突然変異とも呼ばれる)によってさらに修飾され得る。定常領域は、抗原にさらに応じて変化する(すなわち、アイソタイプスイッチ)。したがって、抗原に応じた、軽鎖および重鎖免疫グロブリンポリペプチドをコードする再編成され、体細胞突然変異された核酸配列は、元の生殖系列配列と同一ではない場合があるが、代わりに、実質的に同一または同様となる(すなわち、少なくとも８０％の同一性を有する)。
【０１０５】
「ヒト」抗体(ＨｕＭＡｂ)とは、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方が、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を指す。さらに、抗体が定常領域を含有する場合には、定常領域はまた、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。本明細書に記載される抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基(例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的突然変異誘発によって、またはインビボでの体細胞突然変異によって導入された突然変異)を含み得る。しかし、本明細書において、用語「ヒト抗体」はマウスなどの別の哺乳類種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列にグラフトされている抗体を含むよう意図されない。用語「ヒト」抗体および「完全ヒト」抗体は、同義的に使用される。
【０１０６】
「ヒト化」抗体とは、非ヒト抗体のＣＤＲドメインの外側のアミノ酸の一部、ほとんどまたは全てが、ヒト免疫グロブリンに由来する対応するアミノ酸で置換されている抗体を指す。抗体のヒト化形態のある実施形態では、ＣＤＲドメインの外側のアミノ酸の一部、ほとんどまたは全てが、ヒト免疫グロブリンに由来するアミノ酸で置換されているが、１つまたは複数のＣＤＲ領域内の一部、ほとんどまたは全てのアミノ酸は変更されていない。アミノ酸の小さい付加、欠失、挿入または置換または修飾は、抗体の特定の抗原と結合する能力を抑制しない限り許容される。「ヒト化」抗体は、元の抗体のものと同様の抗原特異性を保持する。
【０１０７】
「キメラ抗体」とは、可変領域がマウス抗体に由来し、定常領域がヒト抗体に由来する抗体などの、可変領域がある種に由来し、定常領域が別の種に由来する抗体を指す。
【０１０８】
本明細書において、「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥ抗体)を指す。
【０１０９】
「アロタイプ」とは、特定のアイソタイプ群内の天然に存在する変異体を指し、これらの変異体は、２、３個のアミノ酸で異なっている(例えば、Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1を参照のこと)。本明細書に記載される抗体は、任意のアロタイプのものであり得る。本明細書において、「ＩｇＧ１ｆ」または「ＩｇＧ１.１ｆ」アイソタイプと呼ばれる抗体は、それぞれ、アロタイプ「ｆ」の、すなわち、例えば、配列番号５に示されるような、ＫａｂａｔにおけるＥＵ指数に従って２１４Ｒ、３５６Ｅおよび３５８Ｍを有する(表２３の配列番号５において下線で示される残基を参照のこと)、ＩｇＧ１およびエフェクターレスＩｇＧ１.１抗体である。
【０１１０】
語句「抗原を認識する抗体」および「抗原に対して特異的な抗体」は、本明細書において、用語「抗原と特異的に結合する抗体」と同義的に使用される。
【０１１１】
本明細書において「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有するその他の抗体を実質的に含まない抗体を指すものとする(例えば、ＯＸ４０と特異的に結合する単離された抗体は、ＯＸ４０以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない)。しかし、ＯＸ４０のエピトープと特異的に結合する単離された抗体は、異なる種に由来するその他のＯＸ４０タンパク質と交差反応性を有し得る。
【０１１２】
本明細書において、「ＯＸ４０−ＬのＯＸ４０との結合を阻害する」抗体は、例えば、ｈＯＸ４０−２９３細胞を使用した結合アッセイにおいて、当技術分野で認識される方法、例えば、本明細書に記載されるＦＡＣＳベースの結合アッセイにおいて、約０.９μｇ／ｍＬ以下、約０.８５μｇ／ｍＬ以下、約０.８μｇ／ｍＬ以下、約０.７５μｇ／ｍＬ以下、約０.７μｇ／ｍＬ以下、約０.６５μｇ／ｍＬ以下、約０.６μｇ／ｍＬ以下、約０.５５μｇ／ｍＬ以下、約０.５μｇ／ｍＬ以下、約０.４５μｇ／ｍＬ以下、約０.４μｇ／ｍＬ以下、約０.３５μｇ／ｍＬ以下、約０.３μｇ／ｍＬ以下、約０.２５μｇ／ｍＬ以下、約０.２μｇ／ｍＬ以下、約０.１５μｇ／ｍＬ以下、または約０.１μｇ／ｍＬ以下など、約１μｇ／ｍＬ以下のＥＣ５０で、ＯＸ４０−ＬのＯＸ４０との結合を阻害する、抗体を指すものとする。
【０１１３】
「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域とＦｃ受容体もしくはリガンドとの相互作用、またはそれにより生じる生化学的事象を指す。例示的「エフェクター機能」は、Ｃｌｑ結合、補体依存性細胞傷害性(ＣＤＣ)、Ｆｃ受容体結合、ＡＤＣＣおよび抗体依存性細胞媒介性食作用(ＡＤＣＰ)などのＦｃγＲ媒介性エフェクター機能ならびに細胞表面受容体(例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ)の下方制御を含む。このようなエフェクター機能は、一般に、結合ドメイン(例えば、抗体可変ドメイン)と組み合わされるＦｃ領域を必要とする。
【０１１４】
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、免疫グロブリンのＦｃ領域と結合する受容体である。ＩｇＧ抗体と結合するＦｃＲは、対立遺伝子変異体およびこれらの受容体の別法としてスプライシングされた形態を含めたＦｃγＲファミリーの受容体を含む。ＦｃγＲファミリーは、３種の活性化(マウスではＦｃγＲＩ、ＦｃγＲIIIおよびＦｃγＲIV；ヒトではＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲIIＡおよびＦｃγＲIIIＡ)および１種の阻害性(ＦｃγＲIIＢ)受容体からなる。ヒトＦｃγＲの種々の特性は、表１に要約されている。先天性エフェクター細胞種の大部分は、１以上の活性化ＦｃγＲおよび阻害性ＦｃγＲIIＢを同時に発現するが、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞は、１種の活性化Ｆｃ受容体(マウスではＦｃγＲIIIおよびヒトではＦｃγＲIIIＡ)を選択的に発現するが、マウスおよびヒトにおいて阻害性ＦｃγＲIIＢを発現しない。ヒトＩｇＧ１は、ほとんどのヒトＦｃ受容体と結合し、結合する活性化Ｆｃ受容体の種類に関してマウスＩｇＧ２ａと同等と考えられる。
【０１１５】
【表１】
0006797137.tif 000004
【０１１６】
「Ｆｃ領域」(結晶化可能断片領域)または「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ」とは、免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクター細胞)上に位置するＦｃ受容体とのまたは伝統的な補体系の第１の成分(Ｃ１ｑ)との結合を含めた、免疫グロブリンの宿主組織または因子との結合を媒介する抗体の重鎖のＣ末端領域を指す。したがって、Ｆｃ領域は、第１の定常領域免疫グロブリンドメイン(例えば、ＣＨ１またはＣＬ)を含まない抗体の定常領域を含む。ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤ抗体アイソタイプでは、Ｆｃ領域は、抗体の２つの重鎖の各々中にＣＨ２およびＣＨ３定常ドメインを含む；ＩｇＭおよびＩｇＥ  Ｆｃ領域は、各ポリペプチド鎖中に３つの重鎖定常ドメイン(ＣＨドメイン２〜４)を含む。ＩｇＧについては、Ｆｃ領域は、免疫グロブリンドメインＣγ２およびＣγ３ならびにＣγ１およびＣγ２の間にヒンジを含む。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変わり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、位置Ｃ２２６またはＰ２３０のアミノ酸残基(またはこれら２個のアミノ酸の間のアミノ酸)から重鎖のカルボキシ末端に伸びるよう規定され、ここで、番号付けは、ＫａｂａｔにおけるようなＥＵ指数に従う、Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD；米国特許出願公開第２００８／０２４８０２８号の図３Ｃ〜３Ｆも参照のこと。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインは、約アミノ酸２３１〜約アミノ酸３４０に広がるが、ＣＨ３ドメインは、Ｆｃ領域中のＣＨ２ドメインのＣ末端側に位置する、すなわち、ＩｇＧの約アミノ酸３４１〜約アミノ酸４４７に広がる。本明細書において、Ｆｃ領域は、任意のアロタイプ変異体または変異体Ｆｃ(例えば、天然に存在しないＦｃ)を含めた天然配列Ｆｃであり得る。Ｆｃはまた、単離において、または「Ｆｃ融合タンパク質」(例えば、抗体またはイムノアドヘシン)とも呼ばれる、「Ｆｃ領域を含む結合タンパク質」などのＦｃを含むタンパク質ポリペプチドに関連して、この領域を指し得る。
【０１１７】
「ヒンジ」、「ヒンジドメイン」または「ヒンジ領域」または「抗体ヒンジ領域」とは、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに接続する、重鎖定常領域のドメインを指し、ヒンジの上部、中部および下部を含む(Roux et al. J. Immunol. 1998 161:4083)。ヒンジは、抗体の結合領域とエフェクター領域との間に多様なレベルの可動性をもたらし、２つの重鎖定常領域間での分子間ジスルフィド結合のための部位も提供する。本明細書において、ヒンジは、全てのＩｇＧアイソタイプについて、Ｇｌｕ２１６で開始し、Ｇｌｙ２３７で終了する(Roux et al., 1998 J Immunol 161:4083)。野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のヒンジの配列は、表２および２３に示されている。
【０１１８】
【表２】
0006797137.tif 000005
* CH1ドメインのC末端アミノ酸配列
【０１１９】
用語「ヒンジ」は、野生型ヒンジ(表２３に記載されるものなど)、ならびにその変異体(例えば、天然に存在しないヒンジまたは修飾されたヒンジ)を含む。例えば、用語「ＩｇＧ２ヒンジ」は、表２３に示されるような野生型ＩｇＧ２ヒンジならびに１個、２個、３個、４個、５個、１〜３個、１〜５個、３〜５個および／または多くとも５個、４個、３個、２個もしくは１個の突然変異、例えば、置換、欠失または付加を有する変異体を含む。例示的ＩｇＧ２ヒンジ変異体として、１個、２個、３個または４個全てのシステイン(Ｃ２１９、Ｃ２２０、Ｃ２２６およびＣ２２９)が、別のアミノ酸に変化しているＩｇＧ２ヒンジが挙げられる。具体的な実施形態では、ＩｇＧ２は、Ｃ２１９Ｓ置換を含む。ある実施形態では、ヒンジは、少なくとも２種のアイソタイプに由来する配列を含む、ハイブリッドヒンジである。例えば、ヒンジは、１種のアイソタイプに由来する上部、中部または下部ヒンジを含み、ヒンジの残りの部分が１以上のアイソタイプに由来してもよい。例えば、ヒンジは、ＩｇＧ２／ＩｇＧ１ヒンジであってもよく、例えば、ＩｇＧ２の上部および中部ヒンジならびにＩｇＧ１の下部ヒンジを含み得る。ヒンジは、エフェクター機能を有してもよく、またはエフェクター機能が欠けていてもよい。例えば、野生型ＩｇＧ１の下部ヒンジは、エフェクター機能を提供する。
【０１２０】
用語「ＣＨ１ドメイン」とは、重鎖定常ドメインにおいて可変ドメインをヒンジと連結する重鎖定常領域を指す。本明細書において、ＣＨ１ドメインは、Ａ１１８で開始し、Ｖ２１５で終了する。用語「ＣＨ１ドメイン」は、野生型ＣＨ１ドメイン(ＩｇＧ１については配列番号２０２およびＩｇＧ２については配列番号２０３を有するものなど；表２３)ならびにそれらの変異体(例えば、天然に存在しないＣＨ１ドメインまたは修飾されたＣＨ１ドメイン)を含む。例えば、用語「ＣＨ１ドメイン」は、野生型ＣＨ１ドメインならびに１個、２個、３個、４個、５個、１〜３個、１〜５個、３〜５個および／または多くとも５個、４個、３個、２個もしくは１個の突然変異、例えば、置換、欠失または付加を有する変異体を含む。例示的ＣＨ１ドメインとして、ＡＤＣＣ、ＣＤＣまたは半減期など、抗体の生物活性を修飾する、突然変異を有するＣＨ１ドメインが挙げられる。抗体の生物活性に影響を及ぼすＣＨ１ドメインへの修飾が、本明細書において提供される。
【０１２１】
用語「ＣＨ２ドメイン」とは、重鎖定常ドメインにおいてヒンジをＣＨ３ドメインに連結する重鎖定常領域を指す。本明細書において、ＣＨ２ドメインは、Ｐ２３８で開始し、Ｋ３４０で終了する。用語「ＣＨ２ドメイン」は、野生型ＣＨ２ドメイン(ＩｇＧ１については配列番号２０４およびＩｇＧ２については配列番号２０５を有するものなど；表２３)ならびにそれらの変異体(例えば、天然に存在しないＣＨ２ドメインまたは修飾されたＣＨ２ドメイン)を含む。例えば、用語「ＣＨ２ドメイン」は、野生型ＣＨ２ドメインならびに１個、２個、３個、４個、５個、１〜３個、１〜５個、３〜５個および／または多くとも５個、４個、３個、２個もしくは１個の突然変異、例えば、置換、欠失または付加を有する変異体を含む。例示的ＣＨ２ドメインとして、ＡＤＣＣ、ＣＤＣまたは半減期など、抗体の生物活性を修飾する、突然変異を有するＣＨ２ドメインが挙げられる。ある実施形態では、ＣＨ２ドメインは、エフェクター機能を低減する置換Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓを含む。抗体の生物活性に影響を及ぼすＣＨ２ドメインへの他の修飾が、本明細書において提供される。
【０１２２】
用語「ＣＨ３ドメイン」とは、重鎖定常ドメインにおいてＣＨ２ドメインに対してＣ末端側である、重鎖定常領域を指す。本明細書において、ＣＨ３ドメインは、Ｇ３４１で開始し、Ｋ４４７で終了する。用語「ＣＨ３ドメイン」は、野生型ＣＨ３ドメイン(ＩｇＧ１については配列番号２０６およびＩｇＧ２については配列番号２０７を有するものなど；表２３)ならびにそれらの変異体(例えば、天然に存在しないＣＨ３ドメインまたは修飾されたＣＨ３ドメイン)を含む。例えば、用語「ＣＨ３ドメイン」は、野生型ＣＨ３ドメインならびに１個、２個、３個、４個、５個、１〜３個、１〜５個、３〜５個および／または多くとも５個、４個、３個、２個もしくは１個の突然変異、例えば、置換、欠失または付加を有する変異体を含む。例示的ＣＨ３ドメインとして、ＡＤＣＣ、ＣＤＣまたは半減期など、抗体の生物活性を修飾する、突然変異を有するＣＨ３ドメインが挙げられる。抗体の生物活性に影響を及ぼすＣＨ３ドメインへの修飾が、本明細書において提供される。
【０１２３】
「天然配列Ｆｃ領域」または「天然配列Ｆｃ」は、自然界において見られるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む。天然配列ヒトＦｃ領域は、天然配列ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域、天然配列ヒトＩｇＧ２  Ｆｃ領域、天然配列ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域および天然配列ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ならびにそれらの天然に存在する変異体を含む。天然配列Ｆｃは、Ｆｃの種々のアロタイプを含む(例えば、Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1を参照のこと)。
【０１２４】
用語「エピトープ」または「抗原決定基」とは、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する抗原(例えば、ＯＸ４０)上の部位を指す。タンパク質抗原内のエピトープは、連続アミノ酸(通常、直鎖エピトープ)またはタンパク質の三次元フォールディングによって並置された非連続アミノ酸(通常、コンホメーションエピトープ)の両方から形成され得る。連続アミノ酸から形成されるエピトープは、通常、必ずではないが、変性溶媒に対する曝露の際に保持されるが、三次元フォールディングから形成されるエピトープは、通常、変性溶媒を用いる処理の際に失われる。エピトープは、通常、独特の空間コンホメーション中に少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸を含む。所与の抗体(すなわち、エピトープマッピング)によって結合されるエピトープを決定する方法は、当技術分野で周知であり、例えば、(例えば、ＯＸ４０に由来する)重複ペプチドまたは連続ペプチドが、所与の抗体(例えば、抗ＯＸ４０抗体)との反応性について試験される、免疫ブロット法および免疫沈降アッセイが挙げられる。エピトープの空間コンホメーションを決定する方法として、当技術分野における技術および本明細書に記載される技術、例えば、Ｘ線結晶学、２次元核磁気共鳴およびＨＤＸ−ＭＳ(例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)を参照のこと)が挙げられる。
【０１２５】
用語「エピトープマッピング」とは、抗体抗原認識に関与する抗原上の分子決定基の同定のプロセスを指す。
【０１２６】
２種以上の抗体に関して、用語「同一エピトープと結合する」は、所与の方法によって決定されるように、抗体がアミノ酸残基の同一群と結合することを意味する。本明細書に記載される抗体を用いて、抗体が「ＯＸ４０上の同一エピトープ」と結合するか否かを調べる技術として、エピトープの原子分解を提供する抗原：抗体複合体の結晶のＸ線分析および水素／重水素交換質量分析(ＨＤＸ−ＭＳ)などの当技術分野で認識されるエピトープマッピング方法が挙げられる。その他の方法は、抗体の抗原断片(例えば、タンパク質分解断片)との、または抗原の突然変異された変動との結合をモニタリングし、これでは、抗原配列内のアミノ酸残基の修飾による結合の喪失が、エピトープ成分の指標と考えられることが多い(例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発 - Cunningham & Wells (1985) Science 244:1081)。さらに、エピトープマッピングのための計算コンビナトリアル法を使用してもよい。これらの方法は、対象の抗体の、コンビナトリアルファージディスプレイペプチドライブラリーから特異的な短いペプチドを親和性単離する能力に依存する。同一または密接に関連するＶＨおよびＶＬまたは同一のＣＤＲ１、２および３配列を有する抗体は、同一エピトープと結合すると予想される。
【０１２７】
「標的との結合について別の抗体と競合する」抗体とは、その他の抗体の標的との結合を(部分的にまたは完全に)阻害する抗体を指す。２種の抗体が、標的との結合について互いに競合するか否か、すなわち、ある抗体が、その他の抗体の標的との結合を阻害するか否か、およびどの程度阻害するかは、公知の競合実験を使用して調べてもよい。ある実施形態では、抗体は、別の抗体の標的との結合と、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％競合する、阻害する。阻害または競合のレベルは、どの抗体が「ブロッキング抗体」であるか(すなわち、標的とともに最初にインキュベートされるコールド抗体)に応じて異なり得る。競合アッセイは、例えば、Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.1101/pdb.prot4277 or in Chapter 11 of “Using Antibodies” by Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA 1999に記載されるように実施できる。競合抗体は、同一エピトープと、重複エピトープとまたは隣接するエピトープ(例えば、立体障害によって証明されるような)と結合する。
【０１２８】
その他の当技術分野で認識される競合結合アッセイとして、固相直接または間接ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)、固相直接または間接酵素イムノアッセイ(ＥＩＡ)、サンドイッチ競合アッセイ(Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983)を参照のこと)；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ(Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986)を参照のこと)；固相直接標識化アッセイ、固相直接標識化サンドイッチアッセイ(Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)を参照のこと)；Ｉ−１２５標識を使用する固相直接標識ＲＩＡ(Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988)を参照のこと)；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ(Cheung et al., Virology 176:546 (1990))；および直接標識化ＲＩＡ(Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990))が挙げられる。
【０１２９】
本明細書において、用語「特異的結合」、「選択的結合」、「選択的に結合する」および「特異的に結合する」とは、所定の抗原上のエピトープとの、その他の抗原とではない抗体結合を指す。通常、抗体は、(ｉ)例えば、分析物として所定の抗原、例えば、組換えヒトＯＸ４０およびリガンドとして抗体を使用したＢＩＡＣＯＲＥ２０００表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)機器における表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)技術によって決定される場合に、およそ１０−７Ｍ未満、例えば、およそ１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍまたはさらにそれより小さい平衡解離定数(ＫＤ)で結合し、(ii)所定の抗原または密接に関連する抗原以外の非特異的抗原(例えば、ＢＳＡ、カゼイン)との結合に対するその親和性よりも、少なくとも２倍大きい親和性で所定の抗原と結合する。したがって、「ヒトＯＸ４０と特異的に結合する」抗体とは、１０−７Ｍ以下、例えば、およそ１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満またはさらにそれより小さいＫＤで、可溶性または細胞結合型ヒトＯＸ４０と結合する抗体を指す。「カニクイザルＯＸ４０と交差反応する」抗体とは、１０−７Ｍ以下、例えば、およそ１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満またはさらにそれより低いＫＤでカニクイザルＯＸ４０と結合する抗体を指す。ある実施形態では、非ヒト種由来のＯＸ４０(例えば、マウスＯＸ４０)と交差反応しない抗体は、標準結合アッセイにおいて、これらのタンパク質に対して本質的に検出不可能な結合を示す。
【０１３０】
本明細書において、用語「ｋａｓｓｏｃ」または「ｋａ」とは、特定の抗体抗原相互作用の会合速度定数を指すものとするのに対し、本明細書において、用語「ｋｄｉｓ」または「ｋｄ」は、特定の抗体抗原相互作用の解離速度定数を指すものとする。用語「ＫＤ」は、本明細書において、平衡解離定数を指すものとし、これはｋａに対するｋｄの割合(すなわち、ｋｄ／ｋａ)から得られ、モル濃度(Ｍ)として表される。抗体のＫＤ値は、当技術分野で十分に確立された方法を使用して決定できる。抗体のＫＤを決定する好ましい方法として、好ましくは、ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)ＳＰＲシステムなどのバイオセンサーシステムを使用する表面プラズモン共鳴またはフローサイトメトリーおよびスキャッチャード解析法を使用することによる。
【０１３１】
本明細書において、用語、ＩｇＧ抗体の「高親和性」とは、標的抗原に対して１０−８Ｍ以下、より好ましくは、１０−９Ｍ以下、さらにより好ましくは、１０−１０Ｍ以下のＫＤを有する抗体を指す。しかし、「高親和性」結合は、その他の抗体アイソタイプについては変わり得る。例えば、ＩｇＭアイソタイプの「高親和性」結合は、１０−７Ｍ以下、より好ましくは、１０−８Ｍ以下のＫＤを有する抗体を指す。
【０１３２】
用語、抗体またはその抗原結合断片を使用するインビトロまたはインビボアッセイに関連して「ＥＣ５０」とは、最大応答の５０％、すなわち、最大応答とベースラインの間の中間である応答を誘導する抗体またはその抗原結合部分の濃度を指す。
【０１３３】
用語「固定化されたＯＸ４０と結合する」とは、本明細書に記載された抗体の、例えば、細胞の表面に発現されたか、または固相支持体と結合しているＯＸ４０と結合する能力を指す。
【０１３４】
本明細書において、用語「交差反応する」とは、本明細書に記載された抗体の、異なる種に由来するＯＸ４０と結合する能力を指す。例えば、ヒトＯＸ４０と結合する本明細書に記載される抗体はまた、別の種に由来するＯＸ４０(例えば、カニクイザルＯＸ４０)と結合し得る。本明細書において、交差反応性は、結合アッセイ(例えば、ＳＰＲ、ＥＬＩＳＡ)において精製抗原との特異的反応性またはＯＸ４０を生理学的に発現する細胞との結合もしくはそうでなければ、それとの機能的相互作用を検出することによって測定してもよい。交差反応性を調べるための方法として、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)２０００ＳＰＲ機器(Biacore AB、Uppsala、Sweden)を使用するＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)分析またはフローサイトメトリー技術による、本明細書に記載されるような標準結合アッセイが挙げられる。
【０１３５】
用語、本明細書において対象物に適用されるような「天然に存在する」とは、対象物が自然界において見出され得るという事実を指す。例えば、実験室において人によって意図的に修飾されていない、自然界における供給源から単離され得る生物(ウイルスを含む)中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列が天然に存在する。
【０１３６】
「ポリペプチド」とは、少なくとも２個の連続して連結しているアミノ酸残基を含む鎖を指し、鎖の長さに上限はない。タンパク質中の１個または複数のアミノ酸残基は、それだけには限らないが、グリコシル化、リン酸化またはジスルフィド結合などの修飾を含有し得る。「タンパク質」は、１つまたは複数のポリペプチドを含み得る。
【０１３７】
用語「核酸分子」とは、本明細書において、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むものとする。核酸分子は、一本鎖であっても、二本鎖であってもよく、ｃＤＮＡであり得る。
【０１３８】
本明細書、例えば、表２３に記載される配列の「保存的配列修飾」、すなわち、ヌクレオチド配列によってコードされるか、またはアミノ酸配列を含有する抗体の、抗原との結合を抑制しない、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列修飾も提供される。このような保存的配列修飾として、保存的ヌクレオチドおよびアミノ酸置換ならびにヌクレオチドおよびアミノ酸付加および欠失が挙げられる。例えば、修飾は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発などの当技術分野で公知の標準技術によって表２３に記載される配列に導入され得る。保存的配列修飾として、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基と置換される保存的アミノ酸置換が挙げられる。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で規定されている。これらのファミリーとして、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、β分枝側鎖(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸が挙げられる。したがって、抗ＯＸ４０抗体中の予想される非必須アミノ酸残基は、同一側鎖ファミリーに由来する別のアミノ酸残基と置換されることが好ましい。抗原結合を排除しないヌクレオチドおよびアミノ酸保存的置換を同定する方法は、当技術分野で周知である(例えば、Brummel et al., Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999);およびBurks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997)を参照のこと)。あるいは、別の実施形態では、突然変異は、飽和突然変異誘発などによって抗ＯＸ４０抗体コード配列の全てかまたは一部に沿って無作為に導入され得、得られた修飾された抗ＯＸ４０抗体は、改善された結合活性についてスクリーニングされ得る。
【０１３９】
核酸については、用語「実質的な相同性」は、２種の核酸またはその指定された配列は、最適にアラインされ、比較される場合に、ヌクレオチドの少なくとも約８０％、通常、少なくとも約９０％〜９５％、より好ましくは、ヌクレオチドの少なくとも約９８％〜９９.５％において適当なヌクレオチド挿入または欠失を用いて同一であることを示す。あるいは、セグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件下で、鎖の相補体とハイブリダイズする場合に、実質的な相同性が存在する。
【０１４０】
ポリペプチドについては、用語「実質的な相同性」は、２種のポリペプチドまたはその指定された配列が、最適にアラインされ、比較される場合に、アミノ酸の少なくとも約８０％、通常、少なくとも約９０％〜９５％、より好ましくは、アミノ酸の少なくとも約９８％〜９９.５％において適当なアミノ酸挿入または欠失を用いて同一であることを示す。
【０１４１】
２種の配列間の同一性パーセントは、配列が最適にアラインされる場合に配列によって共有される同一位置の数の関数であり(すなわち、相同性％＝同一位置の数／位置の総数×１００)、最適アラインメントは、２種の配列の最適アラインメントのために導入される必要があるギャップの数、各ギャップの長さを考慮して決定される。２種の配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、以下の限定されない例に記載されるように、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。
【０１４２】
２種のヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ(http://www.gcg.comで入手可能)中のＧＡＰプログラムを使用して、ＮＷＳｇａｐｄｎａ.ＣＭＰマトリックスおよび４０、５０、６０、７０または８０のギャップ加重および１、２、３、４、５または６の長さ加重を使用して決定できる。２種のヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の同一性パーセントはまた、ＡＬＩＧＮプログラム(バージョン２.０)に組み込まれているE. MeyersおよびW. Millerのアルゴリズム(CABIOS, 4:11-17 (1989))を使用し、ＰＡＭ１２０加重残基表、１２のギャップ長ペナルティーおよび４のギャップペナルティーを使用して決定できる。さらに、２種のアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ(http://www.gcg.comで入手可能)中のＧＡＰプログラム中に組み込まれたNeedlemanおよびWunsch(J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970))アルゴリズムを使用し、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかおよび１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップ加重および１、２、３、４、５または６の長さ加重を使用して決定できる。
【０１４３】
本明細書に記載される核酸およびタンパク質配列は、例えば、関連配列を同定するための公開データベースに対する検索を実施するための「クエリー配列」としてさらに使用され得る。このような検索は、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム(バージョン２.０)を使用して実施され得る。本明細書に記載された核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るために、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実施できる。本明細書に記載されたタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長(wordlength)＝３を用いて実施できる。比較目的でギャップ付きアラインメント得るために、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載されるようなギャップ付きＢＬＡＳＴを利用できる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合には、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーター(例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ)を使用できる。www.ncbi.nlm.nih.govを参照のこと。
【０１４４】
核酸は、全細胞中に、細胞溶解物中に、または部分精製されたかもしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当技術分野で周知のその他のものを含めた標準技術によって、その他の細胞成分またはその他の夾雑物、例えば、その他の細胞性核酸(例えば、染色体のその他の部分)またはタンパク質から精製された場合に「単離される」かまたは「実質的に純粋にされる」。F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)を参照のこと。
【０１４５】
核酸、例えば、ｃＤＮＡは、遺伝子配列を提供するための標準技術に従って突然変異してもよい。コード配列については、これらの突然変異は、所望されるアミノ酸配列に影響を及ぼし得る。特に、天然のＶ、Ｄ、Ｊ、定常、スイッチおよび本明細書に記載される他のそのような配列と実質的に相同であるか、またはそれらに由来する、ＤＮＡ配列が考慮される。
【０１４６】
本明細書において、用語「ベクター」は、それに連結している別の核酸を輸送可能な核酸分子を指すものとする。ある種のベクターは、「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターは、ウイルスベクターであり、これでは、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノム中にライゲーションされ得る。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自己複製可能である(例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター)。その他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それによって、宿主ゲノムとともに複製され得る。さらに、特定のベクターは、作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示可能である。このようなベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」(または単に「発現ベクター」)と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。プラスミドは、ベクターの最もよく使用される形態であるので、本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」は、同義的に使用され得る。しかし、同等の機能を果たす、ウイルスベクター(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)などのその他の形態の発現ベクターもまた含まれる。
【０１４７】
用語「組換え宿主細胞」(または単に「宿主細胞」)は、本明細書において、細胞中に天然に存在しない核酸を含み、組換え発現ベクターが導入されている細胞であり得る細胞を指すものとする。このような用語は、特定の対象細胞を指すだけではなく、このような細胞の後代も指すということは理解されなければならない。特定の修飾は、突然変異または環境的影響のいずれかによって後世において起こり得るので、このような後代は実際、親の細胞と同一ではない場合もあるが、本明細書において、用語「宿主細胞」の範囲内に依然として含まれる。
【０１４８】
本明細書において、用語「抗原」とは、タンパク質、ペプチドまたはハプテンなど、任意の天然または合成の免疫原性物質を指す。抗原は、ＯＸ４０またはその断片であり得る。抗原はまた、保護的または治療的免疫応答が所望される腫瘍抗原、例えば、腫瘍細胞によって発現される抗原(例えば、抗ＯＸ４０抗体と組み合わせて投与される腫瘍ワクチンとして使用するためのもの)であり得る。抗原には、癌の予防または治療のための腫瘍関連抗原が含まれる。腫瘍関連抗原の例として、それだけには限らないが、βｈＣＧ、ｇｐ１００またはＰｍｅｌ１７、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＷＴ１、メソテリン、ＣＥＡ、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ１、ＴＲＰ−２、メラン−Ａ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＮＹ−ＢＲ−１、ＮＹ−ＣＯ−５８、ＭＮ(ｇｐ２５０)、イディオタイプ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−Ａ３、チロシナーゼ、テロメラーゼ、ＳＳＸ２およびＭＵＣ−１抗原、ならびに生殖細胞由来の腫瘍抗原の配列の全てまたは一部を含む配列が挙げられる。腫瘍関連抗原として、血液型群抗原、例えば、Ｌｅａ、Ｌｅｂ、ＬｅＸ、ＬｅＹ、Ｈ−２、Ｂ−１、Ｂ−２抗原も挙げられる。あるいは、１種を上回る抗原が、１つのコンストラクトに含まれてもよい。例えば、ＭＡＧＥ抗原を、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−１２などのアジュバントともに、メラニンＡ(melanin A)、チロシナーゼおよびｇｐ１００などの他の抗原と組み合わせ、抗ＡＰＣ抗体に連結してもよい。
【０１４９】
前述の抗原の配列は、当技術分野で周知である。例えば、ＭＡＧＥ−３  ｃＤＮＡ配列の例は、ＵＳ６,２３５,５２５(Ludwig Institute for Cancer Research)に提供されており、ＮＹ−ＥＳＯ−１の核酸およびタンパク質配列の例は、ＵＳ５,８０４,３８１およびＵＳ６,０６９,２３３(Ludwig Institute for Cancer Research)に提供されており、メラン−Ａの核酸およびタンパク質配列の例は、ＵＳ５,６２０,８８６およびＵＳ５,８５４,２０３(Ludwig Institute for Cancer Research)に提供されており、ＮＹ−ＢＲ−１の核酸およびタンパク質配列の例は、ＵＳ６,７７４,２２６およびＵＳ６,９１１,５２９(Ludwig Institute for Cancer Research)に提供されており、ＮＹ−ＣＯ−５８の核酸およびタンパク質配列の例は、ＷＯ０２／９０９８６(Ludwig Institute for Cancer Research)に提供されており、ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質のアミノ酸配列の例は、ＧＥＮＢＡＮＫ(登録商標)受託番号ＡＡＡ５８６３７で入手可能であり、ヒト癌胎児性抗原様１(ＣＥＡ−１)のヌクレオチド配列(ｍＲＮＡ)は、ＧＥＮＢＡＮＫ(登録商標)受託番号ＮＭ０２０２１９で入手可能である。
【０１５０】
「免疫応答」とは、外来作用物質に対する脊椎動物内の生物学的応答を指し、この応答が、これらの作用物質およびそれらによって引き起こされる疾患から生物を保護する。免疫応答は、免疫系の細胞(例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、樹状細胞または好中球)およびこれらの細胞のいずれかまたは肝臓によって産生される可溶性高分子(抗体、サイトカインおよび補体を含む)の作用によって媒介され、これは、進入する病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、癌性もしくはその他の異常な細胞、または自己免疫もしくは病的炎症の場合には、正常なヒト細胞もしくは組織との選択的標的化、結合、損傷、破壊および／またはそれらの脊椎動物の身体からの排除をもたらす。免疫反応は、例えば、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞などのエフェクターＴ細胞もしくはＴｈ細胞の活性化もしくはＴｒｅｇ細胞の阻害を含む。
【０１５１】
「免疫調節物質(immunomodulator)」または「免疫制御物質(immunoregulator)」とは、免疫応答の調節、制御または修飾に関与し得る作用物質、例えば、シグナル伝達経路の成分を指す。免疫応答の「調節」、「制御」または「修飾」とは、免疫系の細胞における、またはこのような細胞(例えば、エフェクターＴ細胞)の活性における任意の変更を指す。このような調節は、免疫系の刺激または抑制を含み、種々の細胞型の数の増大もしくは減少、これらの細胞の活性の増大もしくは減少または免疫系内で起こり得る任意のその他の変化によって示され得る。阻害的および刺激的免疫調節物質の両方とも同定されており、その一部は、腫瘍微小環境において増強された機能を有し得る。好ましい実施形態では、免疫調節物質は、Ｔ細胞の表面に位置する。「免疫調節性標的」または「免疫制御性標的」は、物質、作用物質、部分、化合物または分子による結合に対して標的化される免疫調節物質であり、その活性は、物質、作用物質、部分、化合物または分子の結合によって変更される。免疫調節性標的は、例えば、細胞の表面の受容体(「免疫調節性受容体」)および受容体リガンド(「免疫調節性リガンド」)を含む。
【０１５２】
「免疫療法」とは、免疫応答を誘導、増強、抑制またはそうでなければ修飾することを含む方法によって、疾患の再発に苦しむまたは、それを起こすまたは患う危険にある対象の治療を指す。
【０１５３】
「免疫賦活性(immunostimulating)療法」または「免疫賦活性(immunostimulatory)療法」とは、例えば、癌を治療するための、対象における免疫応答の増大(誘導または増強)をもたらす療法を指す。
【０１５４】
「内因性免疫応答を増強する」とは、対象における既存の免疫応答の有効性または効力を増大することを意味する。この有効性および効力の増大は、例えば、内因性宿主免疫応答を抑制する機序を克服することによって、または内因性宿主免疫応答を増強する機序を刺激することによって達成され得る。
【０１５５】
「Ｔエフェクター」(「Ｔｅｆｆ」)細胞とは、サイトカインを分泌し、その他の免疫細胞を活性化し、指示する、細胞溶解活性を有するＴ細胞(例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞)ならびにＴヘルパー(Ｔｈ)細胞を指すが、調節Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ細胞)を含まない。本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体は、Ｔｅｆｆ細胞、例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔｅｆｆ細胞を活性化する。
【０１５６】
免疫応答または免疫系を刺激する能力の増大は、Ｔ細胞共刺激受容体の増強されたアゴニスト活性および／または阻害性受容体の増強されたアンタゴニスト活性に起因し得る。免疫応答または免疫系を刺激する能力の増大は、免疫応答を測定するアッセイ、例えば、サイトカインまたはケモカイン放出、細胞溶解活性(標的細胞上で直接的にまたはＣＤ１０７ａもしくはグランザイムの検出を介して間接的に決定される)および増殖における変化を測定するアッセイにおける、ＥＣ５０または最大活性レベルの倍増が反映され得る。免疫応答または免疫系の活性を刺激する能力は、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上増強され得る。
【０１５７】
本明細書において、用語「連結している」とは、２つ以上の分子の会合を指す。連結は、共有結合である場合も、非共有結合である場合もある。連結はまた、遺伝的であり(すなわち、組換えによって融合され)得る。このような連結は、化学的コンジュゲーションおよび組換えタンパク質生産などの様々な当技術分野において認識される技術を使用して達成され得る。
【０１５８】
本明細書において、「投与すること」は、当業者に公知の種々の方法および送達システムのいずれかを使用して、治療薬を含む組成物の対象への物理的導入を指す。本明細書に記載される抗体の好ましい投与経路は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、脊髄または例えば、注射もしくは注入によるその他の非経口投与経路を含む。本明細書において、語句「非経口投与」とは、経腸および局所投与以外の、通常、注射による投与様式を意味し、制限するものではないが、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ内、病巣内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および注入ならびにインビボエレクトロポレーションを含む。あるいは、本明細書に記載される抗体は、局所、上皮または粘膜投与経路などの非経口ではない経路によって、例えば、鼻腔内に、経口的に、経膣的に、直腸性に、舌下にまたは局所的に投与され得る。投与することは、例えば、１回、複数回および／または１回もしくは複数回の長期間にわたって実施され得る。
【０１５９】
本明細書において、用語「Ｔ細胞媒介性応答」とは、エフェクターＴ細胞(例えば、ＣＤ８＋細胞)およびヘルパーＴ細胞(例えば、ＣＤ４＋細胞)を含めたＴ細胞によって媒介される応答を指す。Ｔ細胞媒介性応答は、例えば、Ｔ細胞・細胞傷害性および増殖を含む。
【０１６０】
本明細書において、用語「細胞傷害性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)応答」とは、細胞傷害性Ｔ細胞によって誘導される免疫応答を指す。ＣＴＬ応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって主に媒介される。
【０１６１】
本明細書において、用語「阻害する」または「遮断する」(例えば、細胞上でのＯＸ４０−ＬのＯＸ４０との結合の阻害／遮断を指す)は、同義的に使用され、部分的および完全阻害／遮断の両方を包含する。ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、例えば、本明細書にさらに記載されるように判定される場合、ＯＸ４０−ＬのＯＸ４０との結合を、少なくとも約５０％、例えば、約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％阻害する。ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、本明細書にさらに記載されるように判定される場合、ＯＸ４０−ＬのＯＸ４０との結合を、５０％以下、例えば、約４０％、３０％、２０％、１０％、５％または１％阻害する。
【０１６２】
本明細書において、腫瘍の「成長を阻害する」という用語は、腫瘍の成長における何らかの測定可能な減少、例えば、腫瘍の成長の少なくとも約１０％、例えば、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９９％または１００％の阻害を含む。
【０１６３】
本明細書において、「癌」は、身体中での異常な細胞の制御されない成長を特徴とする疾患の広い群を指す。未制御細胞分裂は、隣接する組織へ浸潤し、リンパ系または血流によって身体の遠隔部位へ転移し得る悪性腫瘍または細胞の形成をもたらし得る。
【０１６４】
用語「治療する」、「治療すること」および「治療」とは、本明細書において、症状の進行、発生、重症度もしくは再発、合併症、疾病と関連している状態または生化学的兆候を逆転させ、軽減し、寛解し、阻害し、または減速することを目的とした、対象で実施される任意の種類の介入もしくはプロセスまたは対象へ活性薬剤を投与することを指す。予防とは、疾患が発生するのを防ぐため、またはそれが起こる場合にはその効果を最小化するための、疾患を有していない対象への投与を指す。
【０１６５】
「血液悪性腫瘍」は、リンパ腫、白血病、骨髄腫またはリンパ系悪性腫瘍ならびに脾臓およびリンパ節の癌を含む。例示的リンパ腫として、Ｂ細胞リンパ腫(Ｂ細胞性血液癌)およびＴ細胞リンパ腫の両方が挙げられる。Ｂ細胞リンパ腫は、ホジキンリンパ腫およびほとんどの非ホジキンリンパ腫の両方を含む。Ｂ細胞リンパ腫の限定されない例として、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、小細胞リンパ性リンパ腫(慢性リンパ性白血病と重複する)、マントル細胞リンパ腫(ＭＣＬ)、バーキットリンパ腫、縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症が挙げられる。Ｔ細胞リンパ腫の限定されない例として、節外性Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫および血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫が挙げられる。血液悪性腫瘍としてまた、それだけには限らないが、続発性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病および急性リンパ性白血病などの白血病も挙げられる。血液悪性腫瘍として、さらにそれだけには限らないが、多発性骨髄腫およびくすぶり型多発性骨髄腫などの骨髄腫も挙げられる。その他の血液系および／またはＢ細胞もしくはＴ細胞関連癌が、用語血液悪性腫瘍によって包含される。
【０１６６】
用語「有効用量」または「有効投与量」は、所望の効果を達成または少なくとも部分的に達成するのに十分な量と定義される。薬物または治療薬の「治療上有効な量」または「治療上有効な投与量」は、単独で、または別の治療薬と組み合わせて使用される場合に、疾患症状の重症度の低減、疾患症状のない期間の頻度および期間の増大または疾患苦痛による機能障害もしくは能力障害の防止によって証明される疾患退縮を促進する薬物の任意の量である。
【０１６７】
固形腫瘍に関して、有効量は、腫瘍の縮小を引き起こすおよび／または腫瘍の成長速度を減少させる(腫瘍成長を抑制するためなど)または他の望ましくない細胞増殖を防止もしくは遅延するのに十分な量を含む。ある実施形態では、有効量は、腫瘍の発達を遅延するのに十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量は、腫瘍の再発を防止または遅延するのに十分な量である。有効量は、１回または複数回の投与で投与され得る。薬物または組成物の有効量は、(ｉ)癌細胞の数を低減する、(ii)腫瘍のサイズを低減する、(iii)癌細胞が末梢器官に浸潤するのをある程度阻害、妨害、減速する、およびそれを停止する場合もある、(iv)腫瘍の転移をある程度阻害、すなわち減速する、およびそれを停止する場合もある、(ｖ)腫瘍成長を阻害する、(vi)腫瘍の発生および／もしくは再発を防止もしくは遅延する、ならびに／または(vii)癌と関連する症状のうちの１種もしくは複数をある程度緩和する。一実施例では、「有効量」は、癌における有意な減少または進行固形腫瘍などの癌の進行の有意な減速をもたらすことが臨床的に証明されている、組合せでの、抗ＯＸ４０抗体の量および抗ＰＤ−１抗体(例えば、ニボルマブ)または抗ＣＴＬＡ−４抗体(例えば、イピリムマブ)の量である。本明細書において、用語「固定用量」、「一定用量」および「一定固定用量」は、同義的に使用され、患者の体重または体表面積(ＢＳＡ)に関係なく、患者に投与される用量を指す。固定または一定用量は、したがって、ｍｇ／ｋｇ用量ではなく、薬剤の絶対量として提供される。
【０１６８】
本明細書において、「体表面積(ＢＳＡ)に基づく用量」とは、個々の患者の体表面積(ＢＳＡ)に合わせて調整された用量を指す。ＢＳＡに基づく用量は、ｍｇ／ｋｇ体重として提供され得る。直接的な測定を行わずにＢＳＡを得る様々な計算が公開されており、中でもＤｕ  Ｂｏｉｓの式が最も広く使用されている(Du Bois D, Du Bois EF (Jun 1916) Archives of Internal Medicine 17 (6): 863-71およびVerbraecken, J. et al. (Apr 2006). Metabolism - Clinical and Experimental 55 (4): 515-24を参照のこと)。他の例示的ＢＳＡ式として、Ｍｏｓｔｅｌｌｅｒの式(Mosteller RD. N Engl J Med., 1987; 317:1098)、Ｈａｙｃｏｃｋの式(Haycock GB, et al., J Pediatr 1978, 93:62-66)、ＧｅｈａｎおよびＧｅｏｒｇｅの式(Gehan EA, George SL, Cancer Chemother Rep 1970, 54:225-235)、Ｂｏｙｄの式(Current, JD (1998), The Internet Journal of Anesthesiology 2 (2); and Boyd, Edith (1935), University of Minnesota. The Institute of Child Welfare, Monograph Series, No. x. London: Oxford University Press)、Ｆｕｊｉｍｏｔｏの式(Fujimoto S, et al., Nippon Eiseigaku Zasshi 1968;5:443-50)、Ｔａｋａｈｉｒａの式(Fujimoto S, et al., Nippon Eiseigaku Zasshi 1968;5:443-50)、ならびにＳｃｈｌｉｃｈの式(Schlich E, et al., Ernaehrungs Umschau 2010;57:178-183)が挙げられる。
【０１６９】
薬物の「予防的有効量」または「予防的有効投与量」は、単独で、または別の治療薬と組み合わせて、疾患を発生するか、または疾患の再発を患うリスクにある対象に投与される場合に、疾患の発生または再発を阻害する薬物の量である。治療薬または予防薬の疾患退縮を促進する能力または疾患の発生もしくは再発を阻害する能力は、臨床治験の際にヒト対象において、ヒトにおける有効性を予測する動物モデル系において、インビトロアッセイにおいて薬剤の活性をアッセイすることによってなど、当業者に公知の種々の方法を使用して評価できる。
【０１７０】
例として、抗癌剤は、対象において、癌進行を減速するか、または癌退縮を促進する薬物である。好ましい実施形態では、治療上有効な量の薬物は、癌を排除するところまで癌退縮を促進する。「癌退縮を促進すること」とは、有効量の薬物を、単独でまたは抗新生物剤と組み合わせて投与することが、患者において、腫瘍成長または大きさの低減、腫瘍の壊死、少なくとも１種の疾患症状の重症度の低下、疾患症状のない期間の頻度および期間の増大、疾患苦痛による機能障害もしくは能力障害の防止またはそうでなければ疾患症状の寛解をもたらすことを意味する。薬理学的有効性とは、薬物の患者において癌退縮を促進する能力を指す。生理学的安全性とは、薬物の投与に起因する、容認できるほど低レベルの毒性または細胞、臓器および／または生物レベルでのその他の有害な生理学的効果(有害効果)を指す。
【０１７１】
腫瘍の治療の例として、薬物の治療上有効な量または投与量は、未治療の対象と比較して、好ましくは、細胞成長または腫瘍成長を少なくとも約２０％、より好ましくは、少なくとも約４０％、一層より好ましくは、少なくとも約６０％、さらにより好ましくは、少なくとも約８０％阻害する。最も好ましい実施形態では、薬物の治療上有効な量または投与量は、細胞成長または腫瘍成長を完全に阻害し、すなわち好ましくは、細胞成長または腫瘍成長を１００％阻害する。化合物の腫瘍成長を阻害する能力は、以下に記載されるアッセイを使用して評価できる。あるいは、この組成物の特性は、化合物の細胞成長を阻害する能力を調べることによって評価でき、このような阻害は、当業者に公知のアッセイによってインビトロで測定され得る。本明細書に記載されるその他の好ましい実施形態では、腫瘍退縮が観察され得、少なくとも約２０日、より好ましくは、少なくとも約４０日または一層より好ましくは、少なくとも約６０日の期間継続し得る。
【０１７２】
用語「患者」および「対象」とは、予防的または治療的処置のいずれかを受ける任意のヒトまたは非ヒト動物を指す。例えば、本明細書に記載される方法および組成物は、進行固形腫瘍などの癌を有する対象または患者を治療するために使用され得る。用語「非ヒト動物」は、全ての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリなどの哺乳動物および非哺乳動物、両生類、爬虫類などを含む。
【０１７３】
本明細書に記載される種々の態様は、以下のサブセクションにおいてさらに詳細に記載される。
【０１７４】
Ｉ. 抗ＯＸ４０抗体
特定の機能的特徴または特性を特徴とする抗体、例えば、完全ヒト抗体が、本明細書に記載される。例えば、抗体は、ヒトＯＸ４０と特異的に結合する。さらに、抗体は、カニクイザルＯＸ４０など、１以上の非ヒト霊長類由来のＯＸ４０と交差反応し得る。このような抗体は、単剤治療として使用される場合、または抗ＰＤ−１抗体(例えば、ニボルマブ)もしくは抗ＣＴＬＡ−４抗体(例えば、イピリムマブ)などの免疫−腫瘍学薬剤と組み合わせて使用される場合に、癌の治療において有用である。
【０１７５】
本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体は、以下の機能的特徴：
(１)例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)ＳＰＲ分析によって測定される場合、可溶性ヒトＯＸ４０と、例えば、１０ｎＭ以下(例えば、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ)のＫＤで結合すること、
(２)例えば、ＦＡＣＳによって測定される場合、膜結合型ヒトＯＸ４０と、例えば、１ｎＭ以下(例えば、０.０１ｎＭ〜１ｎＭ)のＥＣ５０で結合すること、
(３)例えば、ＦＡＣＳによって測定される場合、例えば、１０ｎＭ以下(例えば、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ)のＥＣ５０でカニクイザルＯＸ４０と結合すること、例えば、膜結合型カニクイザルＯＸ４０と結合すること、
(４)(ｉ)ＯＸ４０発現Ｔ細胞におけるＩＬ−２および／もしくはＩＦＮ−γ産生の増大ならびに／または(ii)Ｔ細胞増殖の増強によって示されるように、Ｔ細胞活性化を誘導または増強すること、
(５)例えば、ｈＯＸ４０−２９３細胞を用いたアッセイにおいて、ＦＡＣＳによって測定される場合、例えば、１ｎＭ以下のＥＣ５０で、ＯＸ４０リガンドのＯＸ４０との結合を阻害すること、
(６)成熟ヒトＯＸ４０の細胞外部分(配列番号２)のエピトープ、例えば、領域ＤＶＶＳＳＫＰＣＫＰＣＴＷＣＮＬＲ(配列番号１７８)内またはＤＳＹＫＰＧＶＤＣＡＰＣＰＰＧＨＦＳＰＧＤＮＱＡＣＫＰＷＴＮＣＴＬＡＧＫ(配列番号１７９)内のエピトープと結合すること、
(７)ヒトＯＸ４０との結合について、３Ｆ４、１４Ｂ６−１、１４Ｂ６−２、２３Ｈ３、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３および２０Ｃ１と競合すること、
(８)ヒトＯＸ４０との結合について、６Ｅ１−１、６Ｅ１−２、１４Ａ２−１および１４Ａ２−２と競合すること
のうちの１以上または全てを示す。
【０１７６】
好ましくは、抗体は、高親和性で、例えば、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ以下、１０−１０Ｍ以下、１０−１１Ｍ以下、１０−１２Ｍ以下、１０−１２Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−７Ｍまたは１０−９Ｍ〜１０−７ＭのＫＤで、ＯＸ４０と結合する。ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)ＳＰＲ分析によって判定される場合、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ(１ｎＭ)以下、１０−１０Ｍ以下、１０−１２Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−７Ｍまたは１０−８Ｍ〜１０−７ＭのＫＤで、可溶性ヒトＯＸ４０と結合する。ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、例えば、フローサイトメトリーによって判定される場合、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ(１ｎＭ)以下、１０−１０Ｍ以下、１０−１２Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ〜１０−９ＭのＫＤで、活性化ヒトＴ細胞上などの結合型(例えば、細胞膜結合型)ヒトＯＸ４０と結合する。ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、例えば、ＦＡＣＳによって判定される場合、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ(１ｎＭ)以下、１０−１０Ｍ以下、１０−１２Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ〜１０−９ＭのＥＣ５０で、活性化ヒトＴ細胞上などの結合型(例えば、細胞膜結合型)ヒトＯＸ４０と結合する。ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ(１ｎＭ)以下、１０−１０Ｍ以下、１０−１２Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−７Ｍまたは１０−８Ｍ〜１０−７ＭのＫＤで、可溶性ヒトＯＸ４０と結合し、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ(１ｎＭ)以下、１０−１０Ｍ以下、１０−１２Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ〜１０−９ＭのＫＤまたはＥＣ５０で、細胞膜結合型ヒトＯＸ４０と結合する。
【０１７７】
本明細書に記載される抗ＯＸ４０は、例えば、ＦＡＣＳによって測定される場合(例えば、実施例に記載されるように)、例えば、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１００ｎＭ〜０.０１ｎＭ、１００ｎＭ〜０.１ｎＭ、１００ｎＭ〜１ｎＭまたは１０ｎＭ〜１ｎＭのＥＣ５０で、カニクイザルＯＸ４０と結合し得る、例えば、膜結合型カニクイザルＯＸ４０と結合し得る。
【０１７８】
本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体は、例えば、Ｔｅｆｆ細胞を活性化する、Ｔｒｅｇ細胞によるＴエフェクター細胞の抑制を制限する、腫瘍Ｔｒｅｇ細胞を枯渇および／もしくは阻害する、ならびに／または例えば腫瘍においてＮＫ細胞を活性化することによって、免疫応答を刺激または増強し得る。例えば、抗ＯＸ４０抗体は、例えば、サイトカイン(例えば、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ)分泌の増強および／またはその増殖の増強によって示されるように、Ｔｅｆｆ細胞を活性化または共刺激し得る。ある実施形態では、ＣＤ３刺激も提供される。ある実施形態では、ＯＸ４０抗体は、例えば、初代ヒトＴ細胞またはヒトＯＸ４０発現Ｔ細胞において測定される場合(例えば、実施例にさらに記載されるように)、５０％、１００％(すなわち、２倍)、３倍、４倍、５倍以上、適宜、最大１０倍、３０倍、１００倍の倍率で、ＩＬ−２分泌を増大する。ある実施形態では、ＯＸ４０抗体は、例えば、初代ヒトＴ細胞またはヒトＯＸ４０発現Ｔ細胞において測定される場合(例えば、実施例にさらに記載されるように)、５０％、１００％(すなわち、２倍)、３倍、４倍、５倍以上、適宜、最大１０倍、３０倍、１００倍の倍率で、ＩＦＮ−γ分泌を増大する。
【０１７９】
本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体は、例えば、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ、０.１ｎＭ〜１０ｎＭまたは０.１ｎＭ〜１ｎＭのＥＣ５０で、ヒトＯＸ４０Ｌの、細胞、例えば、ヒトＯＸ４０を発現する２９３細胞(すなわち、ｈＯＸ４０−２９３細胞)上のヒトＯＸ４０との結合を阻害し得る(実施例６を参照のこと)。
【０１８０】
本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体は、例えば、ヒトＯＸ４０の断片との結合によって判定されるように、ＯＸ４０上のエピトープと結合する。例えば、ある実施形態では、抗体は、例えば、ＨＤＸによって、または抗体のヒトＯＸ４０の断片との結合、それに続く酵素切断によって判定されるように、ヒトＯＸ４０(配列番号２)の配列ＤＶＶＳＳＫＰＣＫＰＣＴＷＣＮＬＲ(配列番号１７８)の全てまたは一部分と結合する(実施例１１を参照のこと)。他の実施形態では、抗体は、ヒトＯＸ４０(配列番号２)の配列ＤＳＹＫＰＧＶＤＣＡＰＣＰＰＧＨＦＳＰＧＤＮＱＡＣＫＰＷＴＮＣＴＬＡＧＫ(配列番号１７９)の全てまたは一部分と結合する。
【０１８１】
ある実施形態では、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体は、配列ＳＱＮＴＶＣＲＰＣＧＰＧＦＹＮＤＶＶＳＳＫＰＣＫＰＣＴＷＣＮＬＲ(配列番号１８２)の全てまたは一部分と結合する。
【０１８２】
他の実施形態では、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体は、配列ＰＣＫＰＣＴＷＣＮＬＲ(配列番号１８３)の全てまたは一部分と結合する。
【０１８３】
さらに他の実施形態では、配列ＤＶＶＳＳＫＰＣＫＰＣＴＷＣＮＬＲ(配列番号１７８)の全てまたは一部分と結合する抗ＯＸ４０抗体は、配列ＱＬＣＴＡＴＱＤＴＶＣＲ(配列番号１８４)の全てまたは一部分とさらに結合する。
【０１８４】
さらなる実施形態では、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体は、配列ＳＱＮＴＶＣＲＰＣＧＰＧＦＹＮ(配列番号１８５)の全てまたは一部分と結合する。
【０１８５】
本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体は、ＯＸ４０との結合について、本明細書に記載されるＣＤＲまたは可変領域を含む抗ＯＸ４０抗体、例えば、３Ｆ４、１４Ｂ６−１、１４Ｂ６−２、２３Ｈ３、６Ｅ１−１、６Ｅ１−２、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３、１４Ａ２−１、１４Ａ２−２および／または２０Ｃ１と競合し得る(またはその結合を阻害し得る)。ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、３Ｆ４、１４Ｂ６−１、１４Ｂ６−２、２３Ｈ３、６Ｅ１−１、６Ｅ１−２、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３、１４Ａ２−１、１４Ａ２−２および／または２０Ｃ１のヒトＯＸ４０との結合を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害する。ある実施形態では、３Ｆ４、１４Ｂ６−１、１４Ｂ６−２、２３Ｈ３、６Ｅ１−１、６Ｅ１−２、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３、１４Ａ２−１、１４Ａ２−２および２０Ｃ１は、抗ＯＸ４０抗体のヒトＯＸ４０との結合を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害する。
【０１８６】
ある実施形態では、抗体は、例えば、ＦｃＲ結合を通じた多価架橋によりＴ細胞活性化を誘導または増強する。ある実施形態では、抗体は、多価、例えば、二価である。ある実施形態では、抗体は、一価ではない。
【０１８７】
ある実施形態では、抗体は、以下の特徴：
(１)例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)ＳＰＲ分析によって測定される場合、可溶性ヒトＯＸ４０と、例えば、１０ｎＭ以下(例えば、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ)のＫＤで結合すること、
(２)例えば、ＦＡＣＳによって測定される場合、膜結合型ヒトＯＸ４０と、例えば、１ｎＭ以下(例えば、０.０１ｎＭ〜１ｎＭ)のＥＣ５０で結合すること、
(３)例えば、ＦＡＣＳによって測定される場合、例えば、１０ｎＭ以下(例えば、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ)のＥＣ５０でカニクイザルＯＸ４０と結合すること、例えば、膜結合型カニクイザルＯＸ４０と結合すること、
(４)(ｉ)ＯＸ４０発現Ｔ細胞におけるＩＬ−２および／もしくはＩＦＮ−γ産生の増大ならびに／または(ii)Ｔ細胞増殖の増強によって示されるように、Ｔ細胞活性化を誘導または増強すること、
(５)例えば、ｈＯＸ４０−２９３細胞を用いたアッセイにおいて、ＦＡＣＳによって測定される場合、例えば、１ｎＭ以下のＥＣ５０で、ＯＸ４０リガンドのＯＸ４０との結合を阻害すること、
(６)成熟ヒトＯＸ４０の細胞外部分(配列番号２)のエピトープ、例えば、領域ＤＶＶＳＳＫＰＣＫＰＣＴＷＣＮＬＲ(配列番号１７８)内またはＤＳＹＫＰＧＶＤＣＡＰＣＰＰＧＨＦＳＰＧＤＮＱＡＣＫＰＷＴＮＣＴＬＡＧＫ(配列番号１７９)内のエピトープと結合すること、
(７)ヒトＯＸ４０との結合について、３Ｆ４、１４Ｂ６−１、１４Ｂ６−２、２３Ｈ３、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３および２０Ｃ１と競合すること、
(８)ヒトＯＸ４０との結合について、６Ｅ１−１、６Ｅ１−２、１４Ａ２−１および１４Ａ２−２と競合すること、
のうちの１種、２種、３種、４種、５種または６種を有する。
【０１８８】
したがって、当技術分野で公知および本明細書に記載される手法に従って判定されるこれらの機能的特性(例えば、生化学活性、免疫化学活性、細胞活性、生理学活性または他の生物活性など)のうちの１以上を示す抗体は、特定の活性において、抗体の不在時(または例えば、無関係な特異性の対照抗体が存在する場合)に見られるものと比べた統計学的に有意な相違と関連することが理解される。好ましくは、抗ＯＸ４０抗体は、測定されたパラメーター(例えば、Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生)を、測定されたパラメーターの少なくとも１０％、より好ましくは、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％(すなわち、２倍)、３倍、５倍または１０倍増大させる。逆に、抗体は、測定されたパラメーター(例えば、腫瘍体積、ＯＸ４０−ＬのＯＸ４０との結合、腫瘍における調節Ｔ細胞の数)を、測定されたパラメーターの少なくとも１０％、より好ましくは、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％、９５％または９９％減少させる場合もある。
【０１８９】
例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットおよびＲＩＡを含む、種々の種のＯＸ４０に対する抗体の結合能力を評価するための標準アッセイは、当技術分野で公知である。好適なアッセイは、実施例において詳細に記載されている。抗体の結合動態(例えば、結合親和性)もまた、ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)ＳＰＲ分析などの当技術分野で公知の標準アッセイによって評価することができる。ＯＸ４０の機能的特性(例えば、リガンド結合、Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生)に対する抗体の効果を評価するためのアッセイは、以下および実施例においてさらに詳細に記載されている。
【０１９０】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、天然の抗体ではない、または天然に存在する抗体ではなく、例えば、より多い、より少ないもしくは異なる種類の翻訳後修飾を有するなど、天然に存在する抗体のものとは異なる翻訳後修飾を有する抗ＯＸ４０抗体である。
【０１９１】
II. 例示的抗ＯＸ４０抗体
本明細書に記載される特定の抗体は、例えば、実施例１に記載のように単離され、構造的に特徴付けられた抗体３Ｆ４、１４Ｂ６−１、１４Ｂ６−２、２３Ｈ３、６Ｅ１−１、６Ｅ１−２、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３、１４Ａ２−１、１４Ａ２−２および２０Ｃ１のＣＤＲおよび／または可変領域配列を有するモノクローナル抗体、ならびに抗体３Ｆ４、１４Ｂ６−１、１４Ｂ６−２、２３Ｈ３、６Ｅ１−１、６Ｅ１−２、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３、１４Ａ２−１、１４Ａ２−２および２０Ｃ１の可変領域またはＣＤＲ配列に対して少なくとも８０％の同一性(例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の同一性)を有する抗体である。３Ｆ４、１４Ｂ６(１４Ｂ６−１および１４Ｂ６−２)、２３Ｈ３、６Ｅ１(６Ｅ１−１および６Ｅ１−２)、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３、１４Ａ２(１４Ａ２−１および１４Ａ２−２)ならびに２０Ｃ１のＶＨアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１７、２８、３７、４８、５７、６５、７３、８４および９３に記載されている。３Ｆ４、１４Ｂ６−１、１４Ｂ６−２、２３Ｈ３、６Ｅ１−１、６Ｅ１−２、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３、１４Ａ２−１、１４Ａ２−２および２０Ｃ１のＶＬアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１８、２９、３０、３８、４９、５０、５８、６６、７４、８５、８６、および９４に記載されている。
【０１９２】
したがって、重鎖可変領域が配列番号１７、２８、３７、４８、５７、６５、７３、８４および９３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を含む、抗体またはその抗原結合部分が、本明細書において提供される。
【０１９３】
また、軽鎖可変領域が配列番号１８、２９、３０、３８、４９、５０、５８、６６、７４、８５、８６および９４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を含む、抗体またはその抗原結合部分が、提供される。
【０１９４】
配列番号１７および１８、２８および２９、２８および３０、３７および３８、４８および４９、４８および５０、５７および５８、６５および６６、７３および７４、８４および８５、８４および８６、９３および９４を含む重鎖および軽鎖可変領域配列を含む、抗体またはその抗原結合部分が、本明細書において提供される。
【０１９５】
本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体は、３Ｆ４、１４Ｂ６−１、１４Ｂ６−２、２３Ｈ３、６Ｅ１−１、６Ｅ１−２、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３、１４Ａ２−１、１４Ａ２−２および２０Ｃ１の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはそれらの組合せを含み得る。３Ｆ４、１４Ｂ６(１４Ｂ６−１および１４Ｂ６−２)、２３Ｈ３、６Ｅ１(６Ｅ１−１および６Ｅ１−２)、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３、１４Ａ２(１４Ａ２−１および１４Ａ２−２)ならびに２０Ｃ１のＶＨ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１１、１９、３１、３９、５１、５９、６７、７５および８７に記載されている。３Ｆ４、１４Ｂ６(１４Ｂ６−１および１４Ｂ６−２)、２３Ｈ３、６Ｅ１(６Ｅ１−１および６Ｅ１−２)、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３、１４Ａ２(１４Ａ２−１および１４Ａ２−２)ならびに２０Ｃ１のＶＨ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１２、２０、３２、４０、５２、６０、６８、７６および８８に記載されている。３Ｆ４、１４Ｂ６(１４Ｂ６−１および１４Ｂ６−２)、２３Ｈ３、６Ｅ１(６Ｅ１−１および６Ｅ１−２)、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３、１４Ａ２(１４Ａ２−１および１４Ａ２−２)ならびに２０Ｃ１のＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号１３、２１、３３、４１、５３、６１、６９、７７および８９に記載されている。３Ｆ４、１４Ｂ６−１、１４Ｂ６−２、２３Ｈ３、６Ｅ１−１、６Ｅ１−２、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３、１４Ａ２−１、１４Ａ２−２および２０Ｃ１のＶＬ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１４、２２、２５、３４、４２、４５、５４、６２、７０、７８、８１および９０に記載されている。３Ｆ４、１４Ｂ６−１、１４Ｂ６−２、２３Ｈ３、６Ｅ１−１、６Ｅ１−２、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３、１４Ａ２−１、１４Ａ２−２および２０Ｃ１のＶＬ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１５、２３、２６、３５、４３、４６、５５、６３、７１、７９、８２および９１に記載されている。３Ｆ４、１４Ｂ６−１、１４Ｂ６−２、２３Ｈ３、６Ｅ１−１、６Ｅ１−２、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３、１４Ａ２−１、１４Ａ２−２および２０Ｃ１のＶＬ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１６、２４、２７、３６、４４、４７、５６、６４、７２、８０、８３および９２に記載されている。ＣＤＲ領域は、カバットシステム(Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)を使用して描写される。
【０１９６】
これらの抗体のそれぞれがＯＸ４０と結合すること、および抗原結合特異性が、主に、ＣＤＲ１、２および３領域によって提供されることを考慮すると、ＶＨ  ＣＤＲ１、２および３配列ならびにＶＬ  ＣＤＲ１、２および３配列は、他の抗ＯＸ４０結合抗体を作製するために、「混合および対応させる」ことができる(すなわち、異なる抗体に由来するＣＤＲを、混合および対応させることができるが、各抗体は、ＶＨ  ＣＤＲ１、２および３ならびにＶＬ  ＣＤＲ１、２および３を含有しなければならない)。このような「混合および対応させた」抗体のＯＸ４０結合は、上記および実施例に記載の結合アッセイ(例えば、ＥＬＩＳＡ)を使用して試験することができる。好ましくは、ＶＨ  ＣＤＲ配列を混合および対応させる場合、特定のＶＨ配列に由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列が、構造的に類似のＣＤＲ配列と置換されている。同様に、ＶＬ  ＣＤＲ配列を混合および対応させる場合、特定のＶＬ配列に由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列が、好ましくは、構造的に類似のＣＤＲ配列と置換されている。新規なＶＨおよびＶＬ配列を、１つまたは複数のＶＨおよび／またはＶＬ  ＣＤＲ領域配列をモノクローナル抗体３Ｆ４、１４Ｂ６−１、１４Ｂ６−２、２３Ｈ３、６Ｅ１−１、６Ｅ１−２、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３、１４Ａ２−１、１４Ａ２−２および２０Ｃ１に関して本明細書に開示されるＣＤＲ配列に由来する構造的に類似の配列と置換することによって作製できることが、当業者には容易に明らかであると予想される。本明細書において開示される特定の抗体と同等またはそれより優れた、結合親和性、生理活性および／またはその他の特性を有する「混合および対応させた」抗体が、本発明の方法において使用するために選択され得る。
【０１９７】
(ａ)配列番号１１、１９、３１、３９、５１、５９、６７、７５および８７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
(ｂ)配列番号１２、２０、３２、４０、５２、６０、６８、７６および８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
(ｃ)配列番号１３、２１、３３、４１、５３、６１、６９、７７および８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
(ｄ)配列番号１４、２２、２５、３４、４２、４５、５４、６２、７０、７８、８１および９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
(ｅ)配列番号１５、２３、２６、３５、４３、４６、５５、６３、７１、７９、８２および９１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、ならびに
(ｆ)配列番号１６、２４、２７、３６、４４、４７、５６、６４、７２、８０、８３および９２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む、単離された抗体またはその抗原結合部分が、本明細書において提供され、
ここで、抗体は、ヒトＯＸ４０と特異的に結合する。
【０１９８】
ある実施形態では、抗体は、重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで、重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域は、それぞれ、配列番号１１〜１３、１９〜２１、３１〜３３、３９〜４１、５１〜５３、５９〜６１、６７〜６９、７４〜７７、８７〜８９ならびに８７、３１７および８９を含み、
ここで、抗体は、ヒトＯＸ４０と特異的に結合する。
【０１９９】
別の実施形態では、抗体は、重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域は、それぞれ、配列番号１４〜１６、２２〜２４、２５〜２７、３４〜３６、４２〜４４、４５〜４７、５４〜５６、６２〜６４、７０〜７２、７８〜８０、８１〜８３および９０〜９２を含み、
ここで、抗体は、ヒトＯＸ４０と特異的に結合する。
【０２００】
具体的な実施形態では、抗体は、重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで、抗体は、
(ａ)それぞれ、配列番号８７、３１７および８９を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号９０〜９２を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｂ)それぞれ、配列番号１１〜１３を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号１４〜１６を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｃ)それぞれ、配列番号１９〜２１を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号２２〜２４を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｄ)それぞれ、配列番号１９〜２１を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号２５〜２７を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｅ)それぞれ、配列番号３１〜３３を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号３４〜３６を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｆ)それぞれ、配列番号３９〜４１を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号４２〜４４を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｇ)それぞれ、配列番号３９〜４１を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号４５〜４７を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｈ)それぞれ、配列番号５１〜５３を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号５４〜５６を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｉ)それぞれ、配列番号５９〜６１を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号６２〜６４を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｊ)それぞれ、配列番号６７〜６９を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号７０〜７２を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｋ)それぞれ、配列番号７５〜７７を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号７８〜８０を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｌ)それぞれ、配列番号７５〜７７を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号８１〜８３を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、または
(ｍ)それぞれ、配列番号８７〜８９を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号９０〜９２を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列
を含み、
ここで、抗体は、ヒトＯＸ４０と特異的に結合する。
【０２０１】
別の実施形態では、抗体は、重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで、抗体は、
(ａ)それぞれ、配列番号８７、３１７および８９からなる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号９０〜９２からなる軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｂ)それぞれ、配列番号１１〜１３からなる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号１４〜１６からなる軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｃ)それぞれ、配列番号１９〜２１からなる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号２２〜２４からなる軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｄ)それぞれ、配列番号１９〜２１からなる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号２５〜２７からなる軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｅ)それぞれ、配列番号３１〜３３からなる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号３４〜３６からなる軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｆ)それぞれ、配列番号３９〜４１からなる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号４２〜４４からなる軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｇ)それぞれ、配列番号３９〜４１からなる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号４５〜４７からなる軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｈ)それぞれ、配列番号５１〜５３からなる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号５４〜５６からなる軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｉ)それぞれ、配列番号５９〜６１からなる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号６２〜６４からなる軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｊ)それぞれ、配列番号６７〜６９からなる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号７０〜７２からなる軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｋ)それぞれ、配列番号７５〜７７からなる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号７８〜８０からなる軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｌ)それぞれ、配列番号７５〜７７からなる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号８１〜８３からなる軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、または
(ｍ)それぞれ、配列番号８７〜８９からなる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号９０〜９２からなる軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列
を含む。
【０２０２】
本明細書に記載されるＶＨドメインまたはその１つもしくは複数のＣＤＲは、重鎖、例えば、全長重鎖を形成するために定常ドメインと連結され得る。同様に、本明細書に記載されるＶＬドメインまたはその１つもしくは複数のＣＤＲは、軽鎖、例えば、全長軽鎖を形成するために定常ドメインと連結され得る。全長重鎖(不在の場合もあるＣ末端リシン(Ｋ)は除外またはＣ末端グリシンおよびリシン(ＧＫ)は除外)および全長軽鎖を組み合わせて、全長抗体が形成される。Ｎ末端グルタミン残基およびグルタミン酸残基もまた、軽鎖および重鎖の両方でピログルタミン酸残基に変換される場合がある。
【０２０３】
本明細書に記載されるＶＨドメインは、例えば、本明細書にさらに記載されるように、天然に存在するかまたは修飾されているかのいずれかであるヒトＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の定常ドメインに融合され得る。例えば、重鎖は、配列番号５に記載されるヒトＩｇＧ１アミノ酸配列に融合された本明細書に記載される任意のＶＨドメインのアミノ酸配列を含み得る。
【０２０４】
ヒトＩｇＧ１定常ドメインはまた、アロタイプ変異体のものであってもよい。例えば、ＩｇＧ１のアロタイプ変異体は、Ｒ１０７Ｋ、Ｅ１８９ＤおよびＭ１９１Ｌを含む(上記に下線で示し、番号付けは配列番号６のものに従う)。全長重鎖領域内において、これらのアミノ酸置換は、Ｒ２１４Ｋ、Ｅ３５６ＤおよびＭ３５８Ｌと番号付けされている。
【０２０５】
本明細書に記載されるＶＬドメインは、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖の定常ドメインに融合され得る。例えば、軽鎖は、配列番号７に記載されるヒトＩｇＧ１カッパ軽鎖アミノ酸配列に融合された本明細書に記載される任意のＶＬドメインのアミノ酸配列を含み得る。
【０２０６】
ある実施形態では、重鎖定常領域は、リシンまたは別のアミノ酸をＣ末端に含み、例えば、次の末端アミノ酸：ＬＳＰＧＫ(配列番号８)を重鎖に含む。ある実施形態では、重鎖定常領域は、Ｃ末端で１つまたは複数のアミノ酸が欠けており、例えば、Ｃ末端配列ＬＳＰＧ(配列番号９)またはＬＳＰを有する。
【０２０７】
例示的重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は、表２３に記載されており、重鎖については配列番号９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２４および１２５ならびに軽鎖については配列番号９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０および１２２に対応する。
【０２０８】
表２３に記載される重鎖または軽鎖(またはそれらの可変領域)、例えば、配列番号９５および９６、９７および９８、９９および１００、１０１および１０２、１０３および１０４、１０５および１０６、１０７および１０８、１０９および１１０、１１１および１１２、１１３および１１４、１１５および１１６、１１７および１１８、１１９および１２０、１２１および１２２、１２３および１１６、１２４および１１６ならびに１２５および１１６のうちのいずれかと少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％または７０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖が、所望される特徴、例えば、本明細書にさらに記載されるものを有する抗ヒトＯＸ４０抗体を形成するために使用され得る。例示的変異体は、例えば、定常ドメインにアロタイプ変異体を含む、および／または可変領域もしくは定常領域に本明細書に開示される突然変異などの突然変異を含むものである。表２３に記載される重鎖または軽鎖(またはそれらの可変領域)のいずれかと多くとも１〜３０個、１〜２５個、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜５個、１〜４個、１〜２個または１個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列(置換、付加または欠失による)を含む重鎖および軽鎖が、所望される特徴、例えば、本明細書にさらに記載されるものを有する抗ヒトＯＸ４０抗体を形成するために使用され得る。
【０２０９】
種々の実施形態では、上記の抗体は、以下の機能的特性：
(１)例えば、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定される場合、可溶性ヒトＯＸ４０と、例えば、１０ｎＭ以下(例えば、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ)のＫＤで結合すること、
(２)例えば、ＦＡＣＳによって測定される場合、膜結合型ヒトＯＸ４０と、例えば、１ｎＭ以下(例えば、０.０１ｎＭ〜１ｎＭ)のＥＣ５０で結合すること、
(３)例えば、ＦＡＣＳによって測定される場合、例えば、１０ｎＭ以下(例えば、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ)のＥＣ５０でカニクイザルＯＸ４０と結合すること、例えば、膜結合型カニクイザルＯＸ４０と結合すること、
(４)(ｉ)ＯＸ４０発現Ｔ細胞におけるＩＬ−２および／もしくはＩＦＮ−γ産生の増大ならびに／または(ii)Ｔ細胞増殖の増強によって示されるように、Ｔ細胞活性化を誘導または増強すること、
(５)例えば、ｈＯＸ４０−２９３細胞を用いたアッセイにおいて、ＦＡＣＳによって測定される場合、例えば、１ｎＭ以下のＥＣ５０で、ＯＸ４０リガンドのＯＸ４０との結合を阻害すること、
(６)成熟ヒトＯＸ４０の細胞外部分(配列番号２)のエピトープ、例えば、領域ＤＶＶＳＳＫＰＣＫＰＣＴＷＣＮＬＲ(配列番号１７８)内またはＤＳＹＫＰＧＶＤＣＡＰＣＰＰＧＨＦＳＰＧＤＮＱＡＣＫＰＷＴＮＣＴＬＡＧＫ(配列番号１７９)内のエピトープと結合すること、
(７)ヒトＯＸ４０との結合について、３Ｆ４、１４Ｂ６−１、１４Ｂ６−２、２３Ｈ３、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３および２０Ｃ１と競合すること、
(８)ヒトＯＸ４０との結合について、６Ｅ１−１、６Ｅ１−２、１４Ａ２−１および１４Ａ２−２と競合すること、
のうちの１種もしくは複数、２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種または全てを示す
【０２１０】
このような抗体には、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体が含まれる。
【０２１１】
ある実施形態では、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体は、成熟ヒトＯＸ４０(配列番号２)のアミノ酸残基４６〜６２に対応する、成熟ヒトＯＸ４０(配列番号２)の以下の領域：
ＤＶＶＳＳＫＰＣＫＰＣＴＷＣＮＬＲ(配列番号１７８)
内のアミノ酸残基と結合する。
【０２１２】
ある実施形態では、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体は、成熟ヒトＯＸ４０(配列番号２)のアミノ酸残基８９〜１２４に対応する、成熟ヒトＯＸ４０(配列番号２)の以下の領域：
ＤＳＹＫＰＧＶＤＣＡＰＣＰＰＧＨＦＳＰＧＤＮＱＡＣＫＰＷＴＮＣＴＬＡＧＫ(配列番号１７９)
と結合する。
【０２１３】
ある実施形態では、配列ＤＶＶＳＳＫＰＣＫＰＣＴＷＣＮＬＲ(配列番号１７８)の全てまたは一部分と結合する本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体は、配列ＳＱＮＴＶＣＲＰＣＧＰＧＦＹＮＤＶＶＳＳＫＰＣＫＰＣＴＷＣＮＬＲ(配列番号１８２)の全てまたは一部分と結合する。
【０２１４】
他の実施形態では、配列ＤＶＶＳＳＫＰＣＫＰＣＴＷＣＮＬＲ(配列番号１７８)の全てまたは一部分と結合する本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体は、配列ＰＣＫＰＣＴＷＣＮＬＲ(配列番号１８３)の全てまたは一部分と結合する。
【０２１５】
さらに他の実施形態では、配列ＤＶＶＳＳＫＰＣＫＰＣＴＷＣＮＬＲ(配列番号１７８)の全てまたは一部分と結合する抗ＯＸ４０抗体は、配列ＱＬＣＴＡＴＱＤＴＶＣＲ(配列番号１８４)の全てまたは一部分とさらに結合する。
【０２１６】
さらなる実施形態では、配列ＤＶＶＳＳＫＰＣＫＰＣＴＷＣＮＬＲ(配列番号１７８)の全てまたは一部分と結合する本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体は、配列ＳＱＮＴＶＣＲＰＣＧＰＧＦＹＮ(配列番号１８５)の全てまたは一部分とさらに結合する。
【０２１７】
修飾された重鎖定常ドメイン
本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体の重鎖定常領域は、任意のアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４、またはそれらの組合せおよび／もしくはそれらの修飾形のものであり得る。ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、抗体の特性を変更する修飾された重鎖定常領域を含む。
【０２１８】
本明細書および実施例においてさらに論じられるように、抗ＯＸ４０抗体と修飾されていないｈＩｇＧ１定常領域(ｈＩｇＧ１アイソタイプ抗体)との架橋は、ＯＸ４０シグナル伝達を誘導し、Ｔ細胞活性化を促進し、特に、Ｔ細胞増殖、ＩＦＮ−γ分泌およびＩＬ−２分泌を促進する。架橋は、例えば、ＣＨＯ−ＣＤ３−ＣＤ３２Ａ細胞およびヒト初代ＣＤ４  Ｔ細胞の共培養を用いるアッセイにおいて、トランスフェクトしたＣＨＯ細胞の表面上に発現するヒトＣＤ３２Ａ  Ｆｃγ受容体(ＦｃγＲ)との結合によって生じ得る。架橋はまた、例えば、可溶性ポリクローナル抗ヒトＦｃγ抗体を、ブドウ球菌(staphyloccus)エンテロトキシンＢ(ＳＥＢ)活性化ヒト末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)の培養物中に添加することによっても生じ得る。
【０２１９】
修飾された重鎖定常領域(例えば、ＣＨ１／ヒンジ領域がｈＩｇＧ２  ＣＨ１／ヒンジ領域と置換されたＩｇＧ１定常領域)を有する抗ＯＸ４０抗体は、完全ＩｇＧ１重鎖定常領域を有する抗体と比べて、抗体の活性を変更する能力を有し得る。変更され得る例示的活性として、それだけには限らないが、(１)架橋の存在下もしくは不在下におけるＴ細胞活性化、(２)架橋の存在下もしくは不在下におけるＴ細胞増殖および／または(３)架橋の存在下もしくは不在下におけるサイトカイン分泌(例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２)が挙げられる。実施例に記載される方法を使用して、修飾された重鎖定常領域を有する抗ＯＸ４０抗体が、これらの変更された活性を示すかどうかを判定することができる(例えば、実施例２７を参照のこと)。好ましい実施形態では、これらの変更された活性は、例えば、ＦＡＣＳ、ＳＰＲ)を使用して評価することができる抗体の抗原結合特性に著しく影響を及ぼすことはない。
【０２２０】
したがって、抗ＯＸ４０抗体の活性を変更する方法であって、非ＩｇＧ２ヒンジを有する抗ＯＸ４０抗体を提供することおよび非ＩｇＧ２ヒンジをＩｇＧ２ヒンジと置換することを含む、方法が、本明細書において提供される。ある実施形態では、修飾された重鎖定常領域は、ＩｇＧ２アイソタイプのヒンジ(「ＩｇＧ２ヒンジ」)ならびにＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。ある実施形態では、修飾された重鎖定常領域は、ＩｇＧ２ヒンジならびにＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含み、ここで、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインのうちの少なくとも１つは、ＩｇＧ２アイソタイプのものではない。ＩｇＧ２ヒンジは、野生型ＩｇＧ２ヒンジ、例えば、野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジ(例えば、ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧ、配列番号２０８)またはその変異体であってもよいが、ただし、ＩｇＧ２ヒンジが、非ＩｇＧ２ヒンジを含む同一抗体と比べて変更された活性を抗体に与える能力を保持することが条件である。ある実施形態では、ＩｇＧ２ヒンジ変異体は、野生型ＩｇＧ２ヒンジのものと類似の強度または剛性を保持する。ヒンジの強度は、例えば、コンピュータモデリング、電子顕微鏡法、分析法、例えば、核磁気共鳴(ＮＭＲ)、Ｘ線結晶学(Ｂ因子)または沈降速度解析超遠心分離(ＡＵＣ)によってヒンジを含む抗体の旋回の半径を測定または比較することによって判定することができる。ヒンジは、ヒンジを含む抗体が、異なるヒンジ、例えば、ＩｇＧ１ヒンジを有する同一抗体の値と、５％、１０％、２５％、５０％、７５％または１００％以内で異なる、前の文章に記載される試験のうちの１つにより得られた値を有する場合、別のヒンジと比べて類似または高い強度を有し得る。当業者であれば、これらの試験の結果を解釈することにより、ヒンジが、別のヒンジのものに少なくとも類似する強度を有するかどうかを、これらの試験から判定することができると予想される。例示的ヒトＩｇＧ２ヒンジ変異体は、４つのシステイン残基(すなわち、Ｃ２１９、Ｃ２２０、Ｃ２２６およびＣ２２９)のうちの１つまたは複数の置換を含むＩｇＧ２ヒンジである。システインは、セリンと置換され得る。例示的ＩｇＧ２ヒンジは、Ｃ２１９Ｓ突然変異(例えば、ＥＲＫＳＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧ、配列番号２０９)を含むヒトＩｇＧ２ヒンジである。使用され得る他のＩｇＧ２ヒンジとして、Ｃ２２０、Ｃ２２６および／またはＣ２２９置換、例えば、Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６ＳまたはＣ２２９Ｓ突然変異(Ｃ２１９Ｓ突然変異との組合せであってもよい)を含むヒトＩｇＧ２ヒンジが挙げられる。ＩｇＧ２ヒンジはまた、ヒンジの一部分が、別のアイソタイプのものであるＩｇＧ２ヒンジであってもよい(すなわち、これはキメラヒンジである)が、ただし、キメラヒンジの強度が、野生型ＩｇＧ２ヒンジのものと少なくとも類似することを条件とする。例えば、ＩｇＧ２ヒンジは、下部ヒンジ(表２に定義される)が、ＩｇＧ１アイソタイプのものである、例えば、野生型ＩｇＧ１下部ヒンジである、ＩｇＧ２ヒンジであってもよい。ＩｇＧ２ヒンジにおいて使用され得るさらなるＩｇＧ２ヒンジ突然変異として、ＳＥ(Ｓ２６７Ｅ)、ＳＥＬＦ(Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ)、ＳＤＩＥ(Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３��Ｅ)、ＳＥＦＦおよびＧＡＳＤＡＬＩＥ(Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ)突然変異が挙げられる。
【０２２１】
「ハイブリッド」または「キメラ」ヒンジは、ヒンジの連続したアミノ酸のうちの半分を上回るものが、特定のアイソタイプに由来する場合、そのアイソタイプのものであると呼ばれる。例えば、ＩｇＧ２の上部ヒンジおよび中部ヒンジならびにＩｇＧ１の下部ヒンジを有するヒンジは、ＩｇＧ２ヒンジと見なされる。
【０２２２】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、以下の配列のうちの１つ、
ERKCCVECPPCPAPPVAG(配列番号２０８)；
ERKSCVECPPCPAPPVAG(配列番号２０９)；
ERKCSVECPPCPAPPVAG(配列番号２１０)；
ERKXCVECPPCPAPPVAG(配列番号２１１)；
ERKCXVECPPCPAPPVAG(配列番号２１２)；
ERKCCVECPPCPAPPVAGX(配列番号２１３)；
ERKSCVECPPCPAPPVAGX(配列番号２１４)；
ERKCSVECPPCPAPPVAGX(配列番号２１５)；
ERKXCVECPPCPAPPVAGX(配列番号２１６)；
ERKCXVECPPCPAPPVAGX(配列番号２１７)；
ERKCCVECPPCPAPELLGG(配列番号２１８)；
ERKSCVECPPCPAPELLGG(配列番号２１９)；
ERKCCSVECPPCPAPELLGG(配列番号２２０)；
ERKXCVECPPCPAPELLGG(配列番号２２１)；
ERKCXVECPPCPAPELLGG(配列番号２２２)；
ERKCCVECPPCPAPELLG(配列番号２２３)；
ERKSCVECPPCPAPELLG(配列番号２２４)；
ERKCCSVECPPCPAPELLG(配列番号２２５)；
ERKXCVECPPCPAPELLG(配列番号２２６)；
ERKCXVECPPCPAPELLG(配列番号２２７)；
ERKCCVECPPCPAP(配列番号２２８)；
ERKSCVECPPCPAP(配列番号２２９)；
ERKCSVECPPCPAP(配列番号２３０)；
ERKXCVECPPCPAP(配列番号２３１)；または
ERKCXVECPPCPAP(配列番号２３２)、
(式中、Ｘは、システイン以外の任意のアミノ酸である)
または１〜５個、１〜３個、１〜２個もしくは１個のアミノ酸が、アミノ酸残基ＣＶＥおよびＣＰＰの間に挿入されている、上記配列のうちのいずれかを含むＩｇＧ２ヒンジを含む、修飾された重鎖定常領域を含む。ある実施形態では、ＴＨＴまたはＧＧＧが挿入されている。ある実施形態では、１個、１〜２個または１〜３個のアミノ酸が、ヒンジとＣＨ２ドメインとの間に挿入されている。例えば、グリシンが、ヒンジとＣＨ２ドメインとの間に挿入されている。
【０２２３】
ある実施形態では、ヒンジは、配列番号２０８、２０９、２１０、２１１または２１２を含み、ここで、１個、２個、３個または４個全てのアミノ酸Ｐ２３３、Ｖ２３４、Ａ２３５およびＧ２３７(Ｃ末端の４個のアミノ酸「ＰＶＡＧ」(配列番号２３３に対応する)が、欠失しているか、または別のアミノ酸、例えば、ＩｇＧ１ヒンジのＣ末端のアミノ酸(ＥＬＬＧ(配列番号２３４)もしくはＥＬＬＧＧ(配列番号２３５)と置換されている。ある実施形態では、ヒンジは、配列番号２０８、２０９、２１０、２１１または２１２を含み、ここで、Ｖ２３４、Ａ２３５およびＧ２３７が欠失しているか、または別のアミノ酸と置換されている。ある実施形態では、ヒンジは、配列番号２０８、２０９、２１０、２１１または２１２を含み、ここで、Ａ２３５およびＧ２３７が欠失しているか、または別のアミノ酸と置換されている。ある実施形態では、ヒンジは、配列番号２０８、２０９、２１０、２１１または２１２を含み、ここで、Ｇ２３７が欠失しているか、または別のアミノ酸と置換されている。ある実施形態では、ヒンジは、配列番号４４７、４４８、４４９、４５０または４５１を含み、ここで、Ｖ２３４およびＡ２３５が欠失しているか、または別のアミノ酸と置換されている。例えば上記で示したようなハイブリッドヒンジを得るための、ＩｇＧ２のＰＶＡＧ(配列番号２３３)の、ＩｇＧ１ヒンジの対応するアミノ酸での置換、すなわち(ＥＬＬＧ(配列番号２３４)またはＥＬＬＧＧ(配列番号２３５))での置換は、例えば、ＩｇＧ２ヒンジの利点およびＩｇＧ１ヒンジのエフェクター機能を有するヒンジを提供する。
【０２２４】
ある実施形態では、修飾された重鎖定常領域は、上記の配列のうちの１つ、例えば、配列番号２０８〜２３２のうちのいずれかからなるかまたは本質的になるヒンジを含み、ある実施形態では、さらなるヒンジアミノ酸残基を含まない。
【０２２５】
ある実施形態では、修飾された重鎖定常領域は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２アイソタイプの野生型ＣＨ１ドメイン(それぞれ、「ＩｇＧ１  ＣＨ１ドメイン」または「ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメイン」)である、ＣＨ１ドメインを含む。アイソタイプＩｇＧ３およびＩｇＧ４のＣＨ１ドメイン(それぞれ、「ＩｇＧ３  ＣＨ１ドメイン」および「ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメイン」)もまた、使用され得る。ＣＨ１ドメインはまた、野生型ＣＨ１ドメインの変異体、例えば、野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４  ＣＨ１ドメインの変異体であってもよい。ＣＨ１ドメインの例示的変異体として、Ａ１１４ＣおよびＴ１７３Ｃならびに／またはＣ１３１、例えば、Ｃ１３１Ｓが挙げられる。
【０２２６】
ある実施形態では、修飾された重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプの野生型ＣＨ２ドメイン(それぞれ、「ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン」、「ＩｇＧ２  ＣＨ２ドメイン」、「ＩｇＧ３  ＣＨ２ドメイン」または「ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメイン」)である、ＣＨ２ドメインを含む。ＣＨ２ドメインはまた、野生型ＣＨ２ドメインの変異体、例えば、野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインの変異体であってもよい。ＣＨ２ドメインの例示的変異体として、ＡＤＣＣもしくはＣＤＣなど、抗体のＦｃ領域の生物活性を調節するか、または抗体の半減期もしくはその安定性を調節する、変異体が挙げられる。ある実施形態では、ＣＨ２ドメインは、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ突然変異を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインであり、ここで、ＣＨ２ドメインは、突然変異を有さない同一のＣＨ２突然変異体と比べて、低減されたエフェクター機能を有する。他の突然変異が、本明細書の他の箇所にさらに記載されている。
【０２２７】
ある実施形態では、修飾された重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプの野生型ＣＨ３ドメイン(それぞれ、「ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメイン」、「ＩｇＧ２  ＣＨ３ドメイン」、「ＩｇＧ３  ＣＨ３ドメイン」または「ＩｇＧ４  ＣＨ３ドメイン」)である、ＣＨ３ドメインを含む。ＣＨ３ドメインはまた、野生型ＣＨ３ドメインの変異体、例えば、野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４  ＣＨ３ドメインの変異体であってもよい。ＣＨ３ドメインの例示的変異体として、ＡＤＣＣもしくはＣＤＣなど、抗体のＦｃ領域の生物活性を調節するか、または抗体の半減期もしくはその安定性を調節する、変異体が挙げられる。
【０２２８】
一般に、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインの変異体は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個もしくはそれ以上の突然変異ならびに／または多くとも１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個もしくは１個の突然変異または１〜１０個もしくは１〜５個の突然変異を含み得るか、あるいは対応する野生型ドメイン(それぞれ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３ドメイン)のものと少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み得るが、ただし、特定の変異体を含む重鎖定常領域が、必要な生物活性を保持することを条件とする。
【０２２９】
表３は、ヒトＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを含む例示的ヒト重鎖定常領域を記載しており、ここで、各ドメインは、野生型ドメインまたは重鎖定常領域に所望される生物活性を提供するその変異体のいずれかである。表３内の空白のセルは、そのドメインが存在するかまたは存在しないことを示し、存在する場合には、どのアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のものであってもよいことを示す。例えば、表３において重鎖定常領域１を含む抗体は、少なくともＩｇＧ２ヒンジを含み、ＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインも含んでもよい重鎖定常領域を含む抗体であり、これらのＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインは、存在する場合には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプのものである。表３を理解するための別の例として、重鎖定常領域８を含む抗体は、ＩｇＧ１  ＣＨ１ドメイン、およびＩｇＧ２ヒンジ、ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインを含み、ＣＨ３ドメインも含んでも含まなくてもよい重鎖定常領域を含む抗体であり、ＣＨ３ドメインは、存在する場合には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプのものであり得る。
【０２３０】
【表３】
0006797137.tif 000006
*修飾された重鎖定常領域
【０２３１】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、表３に示される重鎖定常領域を含み、その特定の重鎖定常領域を含まない重鎖定常領域を含む同一抗体と比べて、変更された活性を有し得る。ある実施形態では、表３または４に示される重鎖定常領域を含む抗体は、ＩｇＧ２ヒンジまたは同一のＩｇＧ２ヒンジを含まない重鎖定常領域を含む同一抗体と比べて、変更された活性を有し得る。ある実施形態では、表３または４に示される重鎖定常領域を含む抗体は、非ＩｇＧ２ヒンジを含み、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４ヒンジを含む、重鎖定常領域を含む同一抗体と比べて、変更された活性を有し得る。ある実施形態では、表３または４に示される重鎖定常領域を含む抗体は、同一のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインのうちの１つまたは複数を含まない重鎖定常領域を含む、同一抗体と比べて、変更された活性を有し得る。例えば、ある実施形態では、表３または４に示される重鎖定常領域を含む抗体は、ＩｇＧ２ヒンジならびに特定のアイソタイプのＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを含まない重鎖定常領域を含む同一抗体と比べて、変更された活性を有し得る。例えば、表３に示される重鎖定常領域２２を含む抗体は、(ｉ)ＩｇＧ２ヒンジを含まず、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジ(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４ヒンジ)を含む重鎖定常領域を含む同一抗体、(ii)ＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ１  ＣＨ１を含まず、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジおよび／または非ＩｇＧ１  ＣＨ１を含む重鎖定常領域を含む同一抗体、(iii)ＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ２  ＣＨ２を含まず、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジおよび／または非ＩｇＧ２  ＣＨ２を含む重鎖定常領域を含む同一抗体、(iv)ＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ１  ＣＨ３を含まず、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジおよび／または非ＩｇＧ１  ＣＨ３を含む重鎖定常領域を含む同一抗体、(ｖ)ＩｇＧ２ヒンジ、ＩｇＧ１  ＣＨ１およびＩｇＧ２  ＣＨ２を含まず、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジおよび／または非ＩｇＧ１  ＣＨ１および／または非ＩｇＧ２  ＣＨ２を含む重鎖定常領域を含む同一抗体、(vi)ＩｇＧ２ヒンジ、ＩｇＧ１  ＣＨ１およびＩｇＧ１  ＣＨ３を含まず、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジおよび／または非ＩｇＧ１  ＣＨ１および／または非ＩｇＧ１  ＣＨ３を含む重鎖定常領域を含む同一抗体、(vii)ＩｇＧ２ヒンジ、ＩｇＧ２  ＣＨ２およびＩｇＧ１  ＣＨ３を含まず、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジおよび／または非ＩｇＧ２  ＣＨおよび／または非ＩｇＧ１  ＣＨ３を含む重鎖定常領域を含む同一抗体、(viii)ＩｇＧ２ヒンジ、ＩｇＧ１  ＣＨ１、ＩｇＧ２  ＣＨ２およびＩｇＧ１  ＣＨ３を含まず、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジおよび／または非ＩｇＧ１  ＣＨ１および／または非ＩｇＧ２  ＣＨ２および／または非ＩｇＧ１  ＣＨ３を含む重鎖定常領域を含む同一抗体と比べて、変更された活性を有し得る。
【０２３２】
抗ＯＸ４０可変領域、例えば、本明細書に記載される可変領域に連結され得る例示的な修飾された重鎖定常領域は、表４に提供されており、この表は、ドメインのそれぞれの同一性について記載している。
【表４】
0006797137.tif 000007
【０２３３】
さらなる例示的な修飾された重鎖定常領域が、表５に提供される。
【表５】
0006797137.tif 000008
【０２３４】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、配列番号２３８、２３９、２４０、２４１および２０８〜２３２またはそれらの変異体のうちのいずれか１つを含むＩｇＧ２ヒンジ、例えば、(ｉ)配列番号２３８、２３９、２４０、２４１および２０８〜２３２のうちのいずれか１つとは、１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸置換、付加もしくは欠失が異なるアミノ酸配列、(ii)配列番号２３８、２３９、２４０、２４１および２０８〜２３２のうちのいずれか１つとは、多くとも５個、４個、３個、２個もしくは１個のアミノ酸置換、付加もしくは欠失が異なるアミノ酸配列、(iii)配列番号２３８、２３９、２４０、２４１および２０８〜２３２のうちのいずれか１つとは、１〜５個、１〜３個、１〜２個、２〜５個もしくは３〜５個のアミノ酸置換、付加もしくは欠失が異なるアミノ酸配列、ならびに／または(iv)配列番号２３８、２３９、２４０、２４１および２０８〜２３２のうちのいずれか１つと少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を含む、ＩｇＧ２ヒンジを含む、修飾された重鎖定常領域を含み、ここで、(ｉ)〜(iv)のいずれにおいても、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換であり得、修飾された重鎖定常領域は、別の重鎖定常領域、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジを含む重鎖定常領域と比べて、または非ＩｇＧ２ヒンジを含む同一の修飾された重鎖定常領域と比べて、変更された活性を抗ＯＸ４０抗体に提供する。
【０２３５】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、配列番号２０２を含むＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインまたは配列番号２０３を含むＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインまたは配列番号２０２もしくは２０３の変異体を含む修飾された重鎖定常領域を含み、この変異体は、(ｉ)配列番号２０２もしくは２０３とは、１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸置換、付加もしくは欠失が異なる、(ii)配列番号２０２もしくは２０３とは、多くとも５個、４個、３個、２個もしくは１個のアミノ酸置換、付加もしくは欠失が異なる、(iii)配列番号２０２もしくは２０３とは、１〜５個、１〜３個、１〜２個、２〜５個もしくは３〜５個のアミノ酸置換、付加もしくは欠失が異なる、および／または(iv)配列番号２０２もしくは２０３と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、(ｉ)〜(iv)のいずれにおいても、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換であり得、修飾された重鎖定常領域を含む抗ＯＸ４０抗体は、別の重鎖定常領域、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジを含む重鎖定常領域を有する抗ＯＸ４０抗体のものと比べて、または非ＩｇＧ２ヒンジを含む同一の修飾された重鎖定常領域と比べて、変更された活性を有し得る。
【０２３６】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、配列番号２０４もしくは２９８または配列番号２０４もしくは２９８の変異体を含むＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインを含む修飾された重鎖定常領域を含み、この変異体は、(ｉ)配列番号２０４もしくは２９８とは、１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸置換、付加もしくは欠失が異なる、(ii)配列番号２０４もしくは２９８とは、多くとも５個、４個、３個、２個もしくは１個のアミノ酸置換、付加もしくは欠失が異なる、(iii)配列番号２０４もしくは２９８とは、１〜５個、１〜３個、１〜２個、２〜５個もしくは３〜５個のアミノ酸置換、付加もしくは欠失が異なる、および／または(iv)配列番号２０４もしくは２９８と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、(ｉ)〜(iv)のいずれにおいても、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換であり得、修飾された重鎖定常領域は、別の重鎖定常領域、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジを含む重鎖定常領域のものと比べて、または非ＩｇＧ２ヒンジを含む同一の修飾された重鎖定常領域と比べて、変更された活性を抗ＯＸ４０抗体に提供し得る。
【０２３７】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、配列番号２０６または配列番号２０６の変異体を含むＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含む修飾された重鎖定常領域を含み、この変異体は、(ｉ)配列番号２０６とは、１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸置換、付加もしくは欠失が異なる、(ii)配列番号２０６とは、多くとも５個、４個、３個、２個もしくは１個のアミノ酸、付加もしくは欠失が異なる、(iii)配列番号２０６とは、１〜５個、１〜３個、１〜２個、２〜５個もしくは３〜５個のアミノ酸置換、付加もしくは欠失が異なる、および／または(iv)配列番号２０６と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含み、(ｉ)〜(iv)のいずれにおいても、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換であり得、修飾された重鎖定常領域は、別の重鎖定常領域、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジを含む重鎖定常領域のものと比べて、または非ＩｇＧ２ヒンジを含む同一の修飾された重鎖定常領域と比べて、変更された活性を提供し得る。
【０２３８】
修飾された重鎖定常領域はまた、上記のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの組合せを含んでもよい。
【０２３９】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、配列番号２４４〜２８１のうちのいずれか１つまたは配列番号２４４〜２８１のいずれか１つの変異体を含む修飾された重鎖定常領域を含み、この変異体は、(ｉ)配列番号２４４〜２８１のうちのいずれか１つとは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個もしくはそれ以上のアミノ酸置換、付加もしくは欠失が異なる、(ii)配列番号２４４〜２８１のうちのいずれか１つとは、多くとも１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個もしくは１個のアミノ酸置換、付加もしくは欠失が異なる、(iii)配列番号２４４〜２８１のうちのいずれか１つとは、１〜５個、１〜３個、１〜２個、２〜５個、３〜５個、１〜１０個もしくは５〜１０個アミノ酸置換、付加もしくは欠失が異なる、および／または(iv)配列番号２４４〜２８１のうちのいずれか１つと少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、(ｉ)〜(iv)のいずれにおいても、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換であり得、修飾された重鎖定常領域は、別の重鎖定常領域、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジを含む重鎖定常領域のものと比べて、または非ＩｇＧ２ヒンジを含む同一の修飾された重鎖定常領域と比べて、変更された活性を提供し得る。
【０２４０】
修飾された重鎖定常領域は、(ｉ)野生型重鎖定常領域と比べて類似、低減されたもしくは増大したエフェクター機能(例えば、ＦｃγＲとの結合)、ならびに／または(ii)野生型重鎖定常領域と比べて、類似、低減されたもしくは増大した半減期(もしくはＦｃＲｎ受容体との結合)を有し得る。
【０２４１】
III. 特定の生殖系列配列を有する抗体
ある実施形態では、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体は、特定の生殖系列重鎖免疫グロブリン遺伝子に由来する重鎖可変領域および／または特定の生殖系列軽鎖免疫グロブリン遺伝子に由来する軽鎖可変領域を含む。
【０２４２】
本開示の実施例において論じられるように、ヒト生殖系列ＶＨ  １−０８遺伝子、ＶＨ  ６−６遺伝子、ＶＨ  ５−５１遺伝子、ＶＨ  ３−９遺伝子、ＶＨ  ＤＰ４４遺伝子、ＶＨ  ３−３０.３遺伝子、ＶＨ  ３−１０遺伝子および／またはＶＨ  ３−１３遺伝子の産物であるかまたはそれらに由来する重鎖可変領域を含む、ＯＸ４０に特異的なヒト抗体を調製した。したがって、ＶＨ  １−０８遺伝子、ＶＨ  ６−６遺伝子、ＶＨ  ５−５１遺伝子、ＶＨ  ３−９遺伝子、ＶＨ  ＤＰ４４遺伝子、ＶＨ  ３−３０.３遺伝子、ＶＨ  ３−１０遺伝子およびＶＨ  ３−１３遺伝子からなる群から選択されるヒトＶＨ生殖系列遺伝子の産物であるかまたはそれらに由来する重鎖可変領域を含む、ヒトＯＸ４０に特異的な単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分が、本明細書において提供される。
【０２４３】
ヒト生殖系列ＶＫ  Ｌ５遺伝子、ＶＫ  Ｌ６遺伝子、ＶＫ  Ｌ１５遺伝子、ＶＫ  Ａ２７遺伝子および／またはＶＫ  Ｏ１４／Ｏ４遺伝子の産物であるか、またはそれらの由来する軽鎖可変領域を含む、ＯＸ４０に特異的なヒト抗体を、調製した。したがって、ＶＫ  Ｌ５遺伝子、ＶＫ  Ｌ６遺伝子、ＶＫ  Ｌ１５遺伝子、ＶＫ  Ａ２７遺伝子およびＶＫ  Ｏ１４／Ｏ４遺伝子からなる群から選択されるヒトＶＫ生殖系列遺伝子の産物であるか、またはそれらに由来する軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分が、本明細書において提供される。
【０２４４】
本明細書に記載される好ましい抗体は、上記に列挙されたヒト生殖系列ＶＨ遺伝子のうちの１つの産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含み、上記に列挙されたヒト生殖系列ＶＫ遺伝子のうちの１つの産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域も含むものである。
【０２４５】
抗体の可変領域が、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られる場合には、本明細書において、ヒト抗体は、特定の生殖系列配列「の産物」であるまたはそれに「由来する」重鎖または軽鎖可変領域を含む。このような系は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保持するトランスジェニックマウスを、対象の抗原を用いて免疫処置することまたは対象の抗原を用いてファージ上にディスプレイされたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることを含む。ヒト生殖系列免疫グロブリン配列の「産物である」またはそれに「由来する」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較することおよびヒト抗体の配列に対して配列が最も近い(すなわち、最大同一性パーセント)ヒト生殖系列免疫グロブリン配列を選択することなどによって同定できる。特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列の「産物である」またはそれに「由来する」ヒト抗体は、生殖系列配列と比較した場合に、例えば、天然に存在する体細胞突然変異または部位特異的突然変異の意図的な誘導によるアミノ酸の相違を含有し得る。しかし、選択されたヒト抗体は、通常、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対してアミノ酸配列において少なくとも９０％同一であり、その他の種の生殖系列免疫グロブリンアミノ酸配列(例えば、マウス生殖系列配列)と比較した場合に、ヒト抗体をヒトであると同定するアミノ酸残基を含有する。特定の場合には、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列において少なくとも９５％、またはさらに少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。通常、特定のヒト生殖系列配列に由来するヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列から１０個以下のアミノ酸の相違を示す。特定の場合には、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列から５個以下、またはさらに４、３、２もしくは１個以下のアミノ酸の相違を示し得る。
【０２４６】
IV. 相同な抗体
本明細書に記載される好ましい抗体のアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を有する抗体が、本明細書において提供され、ここで、この抗体は、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体の所望される機能的特性を保持する。
【０２４７】
例えば、単離された抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合部分は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み得、ここで、
(ａ)重鎖可変領域は、配列番号３１８、１７、２８、３７、４８、５７、６５、７３、８４および９３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または配列番号３１８、１７、２８、３７、４８、５７、６５、７３、８４および９３からなる群から選択されるアミノ酸配列と比べて１個、２個、３個、４個、５個、１〜２個、１〜３個、１〜４個、１〜５個、１〜１０個、１〜１５個、１〜２０個、１〜２５個もしくは１〜５０個のアミノ酸の変更(すなわち、アミノ酸置換、付加もしくは欠失)を含む、アミノ酸配列を含む、
(ｂ)軽鎖可変領域は、配列番号１８、２９、３０、３８、４９、５０、５８、６６、７４、８５、８６および９４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または配列番号１８、２９、３０、３８、４９、５０、５８、６６、７４、８５、８６および９４からなる群から選択されるアミノ酸配列と比べて１個、２個、３個、４個、５個、１〜２個、１〜３個、１〜４個、１〜５個、１〜１０個、１〜１５個、１〜２０個、１〜２５個もしくは１〜５０個のアミノ酸の変更(すなわち、アミノ酸置換、付加もしくは欠失)を含む、アミノ酸配列を含む、
(ｃ)抗体は、ＯＸ４０と特異的に結合する、ならびに
(ｄ)抗体は、以下の特性：
(１)例えば、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定される場合、可溶性ヒトＯＸ４０と、例えば、１０ｎＭ以下(例えば、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ)のＫＤで結合すること、
(２)例えば、ＦＡＣＳによって測定される場合、膜結合型ヒトＯＸ４０と、例えば、１ｎＭ以下(例えば、０.０１ｎＭ〜１ｎＭ)のＥＣ５０で結合すること、
(３)例えば、ＦＡＣＳによって測定される場合、例えば、１０ｎＭ以下(例えば、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ)のＥＣ５０でカニクイザルＯＸ４０と結合すること、例えば、膜結合型カニクイザルＯＸ４０と結合すること、
(４)(ｉ)ＯＸ４０発現Ｔ細胞におけるＩＬ−２および／もしくはＩＦＮ−γ産生の増大ならびに／または(ii)Ｔ細胞増殖の増強によって示されるように、Ｔ細胞活性化を誘導または増強すること、
(５)例えば、ｈＯＸ４０−２９３細胞を用いたアッセイにおいて、ＦＡＣＳによって測定される場合、例えば、１ｎＭ以下のＥＣ５０で、ＯＸ４０リガンドのＯＸ４０との結合を阻害すること、
(６)成熟ヒトＯＸ４０の細胞外部分(配列番号２)のエピトープ、例えば、領域ＤＶＶＳＳＫＰＣＫＰＣＴＷＣＮＬＲ(配列番号１７８)内またはＤＳＹＫＰＧＶＤＣＡＰＣＰＰＧＨＦＳＰＧＤＮＱＡＣＫＰＷＴＮＣＴＬＡＧＫ(配列番号１７９)内のエピトープと結合すること、
(７)ヒトＯＸ４０との結合について、３Ｆ４、１４Ｂ６−１、１４Ｂ６−２、２３Ｈ３、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３および２０Ｃ１と競合すること、
(８)ヒトＯＸ４０との結合について、６Ｅ１−１、６Ｅ１−２、１４Ａ２−１および１４Ａ２−２と競合すること、
のうちの１種、２種、３種、４種、５種、６種または全てを示す。
【０２４８】
抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。
【０２４９】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合部分は、重鎖および軽鎖を含み得、ここで、
(ａ)重鎖は、配列番号９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２４および１２５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または配列番号９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２４および１２５からなる群から選択されるアミノ酸配列と比べて、１個、２個、３個、４個、５個、１〜２個、１〜３個、１〜４個、１〜５個、１〜１０個、１〜１５個、１〜２０個、１〜２５個もしくは１〜５０個のアミノ酸の変更(すなわち、アミノ酸置換、付加もしくは欠失)を含む、アミノ酸配列を含む、
(ｂ)軽鎖は、配列番号９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０および１２２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または配列番号９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０および１２２からなる群から選択されるアミノ酸配列と比べて、１個、２個、３個、４個、５個、１〜２個、１〜３個、１〜４個、１〜５個、１〜１０個、１〜１５個、１〜２０個、１〜２５個もしくは１〜５０個のアミノ酸の変更(すなわち、アミノ酸置換、付加もしくは欠失)を含む、アミノ酸配列を含む、
(ｃ)抗体は、ＯＸ４０と特異的に結合する、ならびに
(ｄ)抗体は、以下の特性：
(１)例えば、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定される場合、可溶性ヒトＯＸ４０と、例えば、１０ｎＭ以下(例えば、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ)のＫＤで結合すること、
(２)例えば、ＦＡＣＳによって測定される場合、膜結合型ヒトＯＸ４０と、例えば、１ｎＭ以下(例えば、０.０１ｎＭ〜１ｎＭ)のＥＣ５０で結合すること、
(３)例えば、ＦＡＣＳによって測定される場合、例えば、１０ｎＭ以下(例えば、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ)のＥＣ５０でカニクイザルＯＸ４０と結合すること、例えば、膜結合型カニクイザルＯＸ４０と結合すること、
(４)(ｉ)ＯＸ４０発現Ｔ細胞におけるＩＬ−２および／もしくはＩＦＮ−γ産生の増大ならびに／または(ii)Ｔ細胞増殖の増強によって示されるように、Ｔ細胞活性化を誘導または増強すること、
(５)例えば、ｈＯＸ４０−２９３細胞を用いたアッセイにおいて、ＦＡＣＳによって測定される場合、例えば、１ｎＭ以下のＥＣ５０で、ＯＸ４０リガンドのＯＸ４０との結合を阻害すること、
(６)成熟ヒトＯＸ４０の細胞外部分(配列番号２)のエピトープ、例えば、領域ＤＶＶＳＳＫＰＣＫＰＣＴＷＣＮＬＲ(配列番号１７８)内またはＤＳＹＫＰＧＶＤＣＡＰＣＰＰＧＨＦＳＰＧＤＮＱＡＣＫＰＷＴＮＣＴＬＡＧＫ(配列番号１７９)内のエピトープと結合すること、
(７)ヒトＯＸ４０との結合について、３Ｆ４、１４Ｂ６−１、１４Ｂ６−２、２３Ｈ３、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３および２０Ｃ１と競合すること、
(８)ヒトＯＸ４０との結合について、６Ｅ１−１、６Ｅ１−２、１４Ａ２−１および１４Ａ２−２と競合すること、
のうちの１種、２種、３種、４種、５種、６種または全てを示す。
【０２５０】
３Ｆ４、１４Ｂ６−１、１４Ｂ６−２、２３Ｈ３、６Ｅ１−１、６Ｅ１−２、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３、１４Ａ２−１、１４Ａ２−２および／または２０Ｃ１の対応するＣＤＲとは、１個、２個、３個、４個、５個、１〜２個、１〜３個、１〜４個もしくは１〜５個のアミノ酸の変更(すなわち、アミノ酸置換、付加もしくは欠失)が異なるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２および／またはＶＬＣＤＲ３を含む抗ＯＸ４０抗体も提供される。ある実施形態では、抗体は、３Ｆ４、１４Ｂ６−１、１４Ｂ６−２、２３Ｈ３、６Ｅ１−１、６Ｅ１−２、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３、１４Ａ２−１、１４Ａ２−２および／または２０Ｃ１における対応する配列と比べて、ＣＤＲのうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのそれぞれに、１〜５個のアミノ酸の変更を含む。ある実施形態では、抗体は、３Ｆ４、１４Ｂ６−１、１４Ｂ６−２、２３Ｈ３、６Ｅ１−１、６Ｅ１−２、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３、１４Ａ２−１、１４Ａ２−２および／または２０Ｃ１におけるＣＤＲと比べて、全てのＣＤＲにわたり、合計で１〜５個のアミノ酸の変更を含む。
【０２５１】
３Ｆ４、１４Ｂ６(１４Ｂ６−１および１４Ｂ６−２)、２３Ｈ３、６Ｅ１(６Ｅ１−１および６Ｅ１−２)、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３、１４Ａ２(１４Ａ２−１および１４Ａ２−２)ならびに２０Ｃ１のもの、例えば、それぞれ、配列番号１７および１８、２８および２９、２８および３０、３７および３８、４８および４９、４８および５０、５７および５８、６５および６６、７３および７４、８４および８５、８４および８６、９３および９４のＶＨおよびＶＬ領域、またはそれぞれ、配列番号９５および９６、９７および９８、９９および１００、１０１および１０２、１０３および１０４、１０５および１０６、１０７および１０８、１０９および１１０、１１１および１１２、１１３および１１４、１１５および１１６、１１７および１１８、１１９および１２０、１２１および１２２、１２３および１１６、１２４および１１６ならびに１２５および１１６の重鎖および軽鎖重鎖、またはＣＤＲと相同性を有する配列を有する抗体は、配列番号１７、２８、３７、４８、５７、６５、７３、８４および９３ならびに／または配列番号１８、２９、３０、３８、４９、５０、５８、６６、７４、８５、８６および９４または配列番号９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２４および１２５ならびに／または配列番号９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０および１２２をコードする核酸分子の突然変異誘発(例えば、部位特異的突然変異誘発もしくはＰＣＲ媒介突然変異誘発)、続いて、本明細書に記載される機能性アッセイを使用して、コードされた変更された抗体を保持機能(すなわち、上記の(１)から(７)に記載される機能)に関して試験することによって得ることができる。
【０２５２】
Ｖ. 保存的修飾を有する抗体
本明細書に提供される抗ＯＸ４０抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含み得、ここで、これらのＣＤＲ配列のうちの１つまたは複数は、本明細書に記載される抗体(例えば、３Ｆ４、１４Ｂ６−１、１４Ｂ６−２、２３Ｈ３、６Ｅ１−１、６Ｅ１−２、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３、１４Ａ２−１、１４Ａ２−２および２０Ｃ１)に基づく指定のアミノ酸配列またはそれらの保存的修飾形態を含み、抗体は、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体の所望される機能的特性を保持する。したがって、抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合部分は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含み得、ここで、
(ａ)重鎖可変領域ＣＤＲ３配列は、配列番号１３、２１、３３、４１、５３、６１、６９、７７および８９のアミノ酸配列ならびにそれらの保存的修飾、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、１〜２個、１〜３個、１〜４個もしくは１〜５個の保存的アミノ酸置換からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、
(ｂ)軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列は、配列番号１６、２４、２７、３６、４４、４７、５６、６４、７２、８０、８３および９２のアミノ酸配列ならびにそれらの保存的修飾、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、１〜２個、１〜３個、１〜４個もしくは１〜５個の保存的アミノ酸置換からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、
(ｃ)抗体は、ＯＸ４０と特異的に結合する、ならびに
(ｄ)抗体は、以下の機能的特性：
(１)例えば、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定される場合、可溶性ヒトＯＸ４０と、例えば、１０ｎＭ以下(例えば、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ)のＫＤで結合すること、
(２)例えば、ＦＡＣＳによって測定される場合、膜結合型ヒトＯＸ４０と、例えば、１ｎＭ以下(例えば、０.０１ｎＭ〜１ｎＭ)のＥＣ５０で結合すること、
(３)例えば、ＦＡＣＳによって測定される場合、例えば、１０ｎＭ以下(例えば、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ)のＥＣ５０でカニクイザルＯＸ４０と結合すること、例えば、膜結合型カニクイザルＯＸ４０と結合すること、
(４)(ｉ)ＯＸ４０発現Ｔ細胞におけるＩＬ−２および／もしくはＩＦＮ−γ産生の増大ならびに／または(ii)Ｔ細胞増殖の増強によって示されるように、Ｔ細胞活性化を誘導または増強すること、
(５)例えば、ｈＯＸ４０−２９３細胞を用いたアッセイにおいて、ＦＡＣＳによって測定される場合、例えば、１ｎＭ以下のＥＣ５０で、ＯＸ４０リガンドのＯＸ４０との結合を阻害すること、
(６)成熟ヒトＯＸ４０の細胞外部分(配列番号２)のエピトープ、例えば、領域ＤＶＶＳＳＫＰＣＫＰＣＴＷＣＮＬＲ(配列番号１７８)内またはＤＳＹＫＰＧＶＤＣＡＰＣＰＰＧＨＦＳＰＧＤＮＱＡＣＫＰＷＴＮＣＴＬＡＧＫ(配列番号１７９)内のエピトープと結合すること、
(７)ヒトＯＸ４０との結合について、３Ｆ４、１４Ｂ６−１、１４Ｂ６−２、２３Ｈ３、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３および２０Ｃ１と競合すること、
(８)ヒトＯＸ４０との結合について、６Ｅ１−１、６Ｅ１−２、１４Ａ２−１および１４Ａ２−２と競合すること、
のうちの１種、２種、３種、４種、５種、６種または全てを示す、
【０２５３】
好ましい実施形態では、重鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、配列番号１２、２０、３２、４０、５２、６０、６８、７６、８８および３１７のアミノ酸配列ならびにそれらの保存的修飾、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、１〜２個、１〜３個、１〜４個もしくは１〜５個の保存的アミノ酸置換からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、配列番号１５、２３、２６、３５、４３、４６、５５、６３、７１、７９、８２および９１のアミノ酸配列ならびにそれらの保存的修飾、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、１〜２個、１〜３個、１〜４個もしくは１〜５個の保存的アミノ酸置換からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。別の好ましい実施形態では、重鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、配列番号１１、１９、３１、３９、５１、５９、６７、７５および８７のアミノ酸配列ならびにそれらの保存的修飾、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、１〜２個、１〜３個、１〜４個または１〜５個の保存的アミノ酸置換からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、配列番号１４、２２、２５、３４、４２、４５、５４、６２、７０、７８、８１および９０のアミノ酸配列ならびにそれらの保存的置換、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、１〜２個、１〜３個、１〜４個または１〜５個の保存的アミノ酸置換からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０２５４】
種々の実施形態では、抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。
【０２５５】
保存的アミノ酸置換は、ＣＤＲ以外の抗体の部分に行われてもよく、またはＣＤＲに加えて行われてもよい。例えば、保存的アミノ酸修飾は、フレームワーク領域またはＦｃ領域に行われてもよい。可変領域または重鎖もしくは軽鎖は、本明細書に提供される抗ＯＸ４０抗体配列と比べて、１個、２個、３個、４個、５個、１〜２個、１〜３個、１〜４個、１〜５個、１〜１０個、１〜１５個、１〜２０個、１〜２５個または１〜５０個の保存的アミノ酸置換を含み得る。ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、保存的アミノ酸修飾および非保存的アミノ修飾の組合せを含む。
【０２５６】
VI. 競合抗体および同一エピトープ結合抗体
ＯＸ４０との結合について、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体(例えば、抗体３Ｆ４、１４Ｂ６−１、１４Ｂ６−２、２３Ｈ３、６Ｅ１−１、６Ｅ１−２、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３、１４Ａ２−１、１４Ａ２−２および２０Ｃ１)と競合する抗体もまた、本明細書において提供される。このような競合抗体は、標準ＯＸ４０結合アッセイにおいて、モノクローナル抗体３Ｆ４、１４Ｂ６−１、１４Ｂ６−２、２３Ｈ３、６Ｅ１−１、６Ｅ１−２、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３、１４Ａ２−１、１４Ａ２−２および２０Ｃ１のうちの１以上のＯＸ４０との結合を競合的に阻害するそれらの能力に基づいて、同定することができる。例えば、標準ＥＬＩＳＡアッセイまたは競合的ＥＬＩＳＡアッセイを使用でき、これでは、組換えヒトＯＸ４０タンパク質を、プレート上に固定化し、種々の濃度の非標識試験抗体を添加し、プレートを洗浄し、標識された参照抗体を添加し、洗浄し、結合している標識の量を測定する。増大する濃度の非標識(第１の)抗体(「遮断抗体」とも呼ばれる)が、標識された(第２の)抗体の結合を阻害する場合には、第１の抗体は、第２の抗体のプレート上の標的との結合を阻害するといわれるか、または第２の抗体の結合と競合するといわれる。これに加えてまたはこれとは別に、ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)ＳＰＲ分析を実施して、抗体の競合する能力を評価してもよい。試験抗体の、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体のＯＸ４０との結合を阻害する能力は、試験抗体がＯＸ４０との結合について抗体と競合し得ることを実証する。
【０２５７】
したがって、例えば、実施例に記載されるＦＡＣＳを使用することによって、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体の、細胞、例えば、活性化されたＴ細胞上のＯＸ４０との結合を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％阻害する抗ＯＸ４０抗体が、本明細書において提供される。
【０２５８】
他の実施形態では、以下に記載されるものなど、当技術分野で認識されるエピトープマッピング技術を使用して判定される場合に、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体(例えば、３Ｆ４、１４Ｂ６−１、１４Ｂ６−２、２３Ｈ３、６Ｅ１−１、６Ｅ１−２、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３、１４Ａ２−１、１４Ａ２−２および２０Ｃ１)のうちの１以上と同一のエピトープと結合する抗ＯＸ４０抗体が、本明細書において提供される。
【０２５９】
当技術分野で認識されるエピトープマッピング技術として、例えば、Ｘ線結晶構造決定(例えば、ＷＯ２００５／０４４８５３)、分子モデリングおよび遊離している場合および対象の抗体との複合体中に結合されている場合には、ＯＸ４０中の不安定なアミド水素のＨ−Ｄ交換速度のＮＭＲ決定を含めた核磁気共鳴(ＮＭＲ)分光法などの構造的方法が挙げられる(Zinn-Justin et al. Biochemistry 1992;31:11335-47、Zinn-Justin et al. Biochemistry 1993;32,6884-91)。
【０２６０】
Ｘ線結晶学について、結晶化は、マイクロバッチ(例えば、Chayen, Structure 19976; 5:1269-74)、懸滴蒸気拡散(例えば、McPherson, J Biol Chem 1976; 251:6300-3)、シーディングおよび透析を含めた当技術分野で公知の方法を使用して達成され得る(例えば、Giege et al. Acta Crystallogr 1994; D50:339-50;McPherson, Eur J Biochem 1990; 189:1-23)。少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬの濃度を有するタンパク質調製物を使用することが望ましい。結晶化は、約１０％〜約３０％(ｗ／ｖ)の範囲の濃度を有する、ポリエチレングリコール１０００〜２０,０００(ＰＥＧ；約１０００〜約２０,０００Ｄａの範囲の平均分子量)、好ましくは、約５０００〜約７０００Ｄａ、より好ましくは、約６０００Ｄａを含有する沈殿剤溶液中で最良に達成され得る。タンパク質分解防止剤、例えば、グリセロールを約０.５％〜約２０％の範囲の濃度で含むことが望ましいものであり得る。塩化ナトリウム、塩化リチウムまたはクエン酸ナトリウムなどの適した塩はまた、好ましくは、約１ｍＭ〜約１０００ｍＭの範囲の濃度の沈殿剤溶液中にあることが望ましいものであり得る。沈殿剤は、好ましくは、約３.０〜約５.０、好ましくは、約４.０のｐＨに緩衝される。沈殿剤溶液において有用な特定のバッファーは、変わり得、当技術分野で周知である(Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Third ed., (1994) Springer-Verlag, New York)。有用なバッファーの例として、それだけには限らないが、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ、ＭＥＳおよび酢酸が挙げられる。結晶は２℃、４℃、８℃および２６℃を含めた様々な温度で成長させてもよい。抗体：抗原結晶は、周知のＸ線回折技術を使用して研究され得、Ｘ−ＰＬＯＲ(Yale University、1992、Molecular Simulations、Inc.によって配布された;例えば、Blundell & Johnson, Meth. Enzymol. 1985; 114 & 115, H. W. Wyckoff et al., eds., Academic Press；米国特許出願公開第２００４／００１４１９４号を参照のこと)およびＢＵＳＴＥＲ(Bricogne, Acta Cryst 1993; D49:37-60; Bricogne, Meth Enzymol 1997; 276A:361-423; Carter & Sweet, eds.;Roversi et al., Acta Cryst. 2000; D56:1313-23)などのコンピュータソフトウェアを使用して洗練され得る。
【０２６１】
その他のエピトープマッピング方法は、抗体の抗原断片または抗原の突然変異された変動との結合をモニタリングし、これでは、抗原配列内のアミノ酸残基の修飾による結合の喪失は、エピトープ成分を示すと考えられることが多い。他のそのような方法は、例えば、Cunningham and Wells, Science 1989;244:1081-5により説明されているような、アラニンスキャニング突然変異誘発である。別の好適な方法は、高深度突然変異スキャニング(deep mutational scanning)である(例えば、Araya et al., Trends in Biotechnology 2011;29:435-42、Forsyth et al., mAbs 2013;5:523-32を参照のこと)。
【０２６２】
これに加えてまたはこれとは別に、コンホメーション的に不連続なエピトープのマッピングを含む、エピトープマッピングのための計算コンビナトリアル法を使用してもよい。
【０２６３】
これに加えてまたはこれとは別に、エピトープマッピングは、抗体の、ＯＸ４０の断片、例えば、非変性断片または変性断片を含むペプチドとの結合を試験することによって達成できる。ＯＸ４０(例えば、ヒトＯＸ４０)の配列を包含する一連の重複するペプチドは、合成し、例えば、直接ＥＬＩＳＡ、競合的ＥＬＩＳＡ法(ペプチドが、抗体の、マイクロタイタープレートのウェルと結合しているＯＸ４０との結合を防ぐその能力について評価される)においてまたはチップ上で結合についてスクリーニングしてもよい。他の方法は、対象の抗体の、コンビナトリアルファージディスプレイペプチドライブラリーから、特異的な短いペプチド(天然の三次元形態または変性された形態のいずれか)を親和性単離する能力に頼る。そこで、ペプチドは、ペプチドライブラリーをスクリーニングするために使用される抗体によって認識されるエピトープの定義のためのリードと見なされる。
【０２６４】
エピトープはまた、水素／重水素交換質量分析(ＨＤＸ−ＭＳ)およびタンパク質の迅速光化学酸化(Fast Photochemical Oxidation of Proteins)(ＦＰＯＰ)などのＭＳベースのタンパク質フットプリント法によって同定してもよい。ＨＤＸ−ＭＳは、例えば、本明細書の実施例においておよびWei et al., Drug Discovery Today 2014;19:95によって説明されるように、実施され得る。ＦＰＯＰは、例えば、Hambley et al.(J American Soc Mass Spectrometry 2005;16:2057)によって説明されるように、実施され得る。
【０２６５】
本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体との結合について競合する抗体は、当技術分野で公知の方法を使用して産生され、同定され得る。例えば、本明細書に記載されるヒトＯＸ４０を用いてマウスを免疫処置し、ハイブリドーマを産生し、得られたモノクローナル抗体を、上記の方法を使用して、ＯＸ４０との結合について本明細書に記載される抗体と競合する能力についてスクリーニングしてもよい。
【０２６６】
本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体と同一のエピトープと結合する抗体は、抗体が結合するエピトープを含有するＯＸ４０の小断片を用いてマウスを免疫処置することによって産生され得る。エピトープまたはエピトープを含む領域は、上記の方法を使用して同定され得る。あるいは、Jespers et al. (Biotechnology 1994;12:899)の方法を使用して、同一エピトープを認識する、したがって、本明細書に記載される抗ＯＸ４０に対して同様の特性を示す抗体の選択を導いてもよい。例えば、ファージディスプレイを使用して、まず、抗ＯＸ４０抗体の重鎖を、(好ましくは、ヒト)軽鎖のレパートリーと対形成して、ＯＸ４０結合性抗体を選択し、次いで、新規軽鎖を(好ましくは、ヒト)重鎖のレパートリーと対形成して、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体と同一エピトープまたはＯＸ４０上のエピトープ領域を認識する(好ましくは、ヒト)ＯＸ４０結合性抗体を選択する。抗体の重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡの突然変異誘発によって、本明細書に記載される抗体の別法としての変異体を得ることができる。
【０２６７】
いくつかの実施形態では、実施例の方法によって判定される場合、成熟ヒトＯＸ４０(配列番号２)のアミノ酸残基４６〜６２に対応する配列ＤＶＶＳＳＫＰＣＫＰＣＴＷＣＮＬＲ(配列番号１７８)の全てまたは一部分と結合する抗体が、本明細書において提供される。
【０２６８】
ある実施形態では、実施例の方法によって判定される場合、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体は、配列ＳＱＮＴＶＣＲＰＣＧＰＧＦＹＮＤＶＶＳＳＫＰＣＫＰＣＴＷＣＮＬＲ(配列番号１８２)の全てまたは一部分と結合する。
【０２６９】
他の実施形態では、実施例の方法によって判定される場合、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体は、配列ＰＣＫＰＣＴＷＣＮＬＲ(配列番号１８３)の全てまたは一部分と結合する。
【０２７０】
さらに他の実施形態では、配列ＤＶＶＳＳＫＰＣＫＰＣＴＷＣＮＬＲ(配列番号１７８)の全てまたは一部分と結合する抗ＯＸ４０抗体は、実施例の方法によって判定される場合、配列ＱＬＣＴＡＴＱＤＴＶＣＲ(配列番号１８４)の全てまたは一部分とさらに結合する。
【０２７１】
さらなる実施形態では、実施例の方法によって判定される場合、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体は、配列ＳＱＮＴＶＣＲＰＣＧＰＧＦＹＮ(配列番号１８５)の全てまた一部分と結合する。
【０２７２】
さらなる実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、実施例の方法によって判定される場合、成熟ヒトＯＸ４０(配列番号２)のアミノ酸残基８９〜１２４に対応する領域ＤＳＹＫＰＧＶＤＣＡＰＣＰＰＧＨＦＳＰＧＤＮＱＡＣＫＰＷＴＮＣＴＬＡＧＫ(配列番号１７９)内で結合する。
【０２７３】
VII. 遺伝子操作された、および修飾された抗体
ＶＨおよびＶＬ領域
修飾された抗体を遺伝子操作するために、出発材料として本明細書において開示されるＶＨおよび／またはＶＬ配列のうち１以上を有する抗体を使用して調製され得る、遺伝子操作された、および修飾された抗体もまた本明細書において提供され、この修飾された抗体は、出発抗体から変更された特性を有し得る。抗体は、一方または両方の可変領域(すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ)内の、例えば、１つまたは複数のＣＤＲ領域内の、および／または１つまたは複数のフレームワーク領域内の１個または複数の残基を修飾することによって、遺伝子操作され得る。これに加えてまたはこれとは別に、抗体は、例えば、抗体のエフェクター機能(単数または複数)を変更するために、定常領域(単数または複数)内の残基を修飾することによって遺伝子操作され得る。
【０２７４】
実施され得る１種の可変領域遺伝子操作として、ＣＤＲグラフティングがある。抗体は、主に６つの重鎖および軽鎖相補性決定領域(ＣＤＲ)中に位置するアミノ酸残基を介して標的抗原と相互作用する。このため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲの外側の配列よりも個々の抗体間でより多様である。ＣＤＲ配列は、ほとんどの抗体抗原相互作用に関与しているので、異なる特性を有する異なる抗体に由来するフレームワーク配列上にグラフトされた特定の参照抗体に由来するＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することによって、特定の参照抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である(例えば、Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033;Winterの米国特許第５,２２５,５３９号およびQueen et alの米国特許第５,５３０,１０１号；同５,５８５,０８９号；同５,６９３,７６２号および同６,１８０,３７０号を参照のこと)。
【０２７５】
したがって、別の実施形態は、それぞれ、配列番号１１〜１３、１９〜２１、３１〜３３、３９〜４１、５１〜５３、５９〜６１、６７〜６９、７４〜７７および８７〜８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、重鎖可変領域ならびにそれぞれ、配列番号１４〜１６、２２〜２４、２５〜２７、３４〜３６、４２〜４４、４５〜４７、５４〜５６、６２〜６４、７０〜７２、７８〜８０、８１〜８３および９０〜９２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。したがって、このような抗体は、モノクローナル抗体３Ｆ４、１４Ｂ６−１、１４Ｂ６−２、２３Ｈ３、６Ｅ１−１、６Ｅ１−２、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３、１４Ａ２−１、１４Ａ２−２および２０Ｃ１のＶＨおよびＶＬ  ＣＤＲ配列を含み、異なるフレームワーク配列をさらに含み得る。
【０２７６】
このようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公開ＤＮＡデータベースまたは公開参考文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベース(インターネット上でwww.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbaseにおいて利用可能)に、ならびにKabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992) “The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops” J. Mol. Biol. 227:776-798; and Cox, J. P. L. et al. (1994) “A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage” Eur. J. Immunol. 24:827-836に見い出すことができ、それらの各々の内容は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【０２７７】
本明細書において記載される抗体において使用するための好ましいフレームワーク配列は、本明細書に記載される抗体によって使用されるフレームワーク配列と構造的に同様であるものである。ＶＨ  ＣＤＲ１、２および３配列ならびにＶＬ  ＣＤＲ１、２および３配列は、フレームワーク配列が由来する生殖系列免疫グロブリン遺伝子において見られるものと同一配列を有するフレームワーク領域上にグラフトされ得るか、またはＣＤＲ配列は、生殖系列配列と比較した場合に最大２０個の好ましくは保存的なアミノ酸置換を含有するフレームワーク領域上にグラフトされ得る。例えば、特定の場合には、抗体の抗原結合能力を維持または増強するために、フレームワーク領域内の残基を突然変異させることが有益であることがわかっている(例えば、Queen et alの米国特許第５,５３０,１０１号；同５,５８５,０８９号；同５,６９３,７６２号および同６,１８０,３７０号を参照のこと)。
【０２７８】
本明細書に記載された遺伝子操作された抗体は、例えば、抗体の特性を改善するために、ＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に修飾が行われているものを含む。通常、このようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を低下させるよう行われる。例えば、１つのアプローチとして、１個または複数のフレームワーク残基を、対応する生殖系列配列に「復帰突然変異」することがある。より詳しくは、体細胞突然変異を起こしている抗体は、抗体が由来する生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含有し得る。このような残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体が由来する生殖系列配列に対して比較することによって同定できる。フレームワーク領域配列をその生殖系列立体配置に戻すために、例えば、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発によって、体細胞突然変異を生殖系列配列に「復帰突然変異する」ことができる。このような「復帰突然変異された」抗体も包含されるものとする。別の種類のフレームワーク修飾は、Ｔ細胞エピトープを除去し、それによって、抗体の免疫原性の可能性を低減するために、フレームワーク領域内の、またはさらには１つもしくは複数のＣＤＲ領域内の１個または複数の残基を突然変異することを含む。このアプローチはまた、「脱免疫化」と呼ばれ、Carr et alによる米国特許公開第２００３０１５３０４３号にさらに詳細に記載されている。
【０２７９】
別の種類の可変領域修飾は、対象の抗体の１以上の結合特性(例えば、親和性)を改善するためにＣＤＲ領域内のアミノ酸残基を突然変異することである。部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発を実施して、抗体結合または対象のその他の機能的特性に対して突然変異および効果を導入でき、本明細書に記載され実施例において提供されるインビトロまたはインビボでのアッセイにおいて評価することができる。保存的修飾(上記で論じられるような)が導入されることが好ましい。突然変異は、アミノ酸付加、欠失または好ましくは、置換であり得る。さらに、通常、ＣＤＲ領域内の１、２、３、４または５個以下の残基が変更される。
【０２８０】
したがって、(ａ)配列番号１１、１９、３１、３９、５１、５９、６７、７５および８７からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号１１、１９、３１、３９、５１、５９、６７、７５および８７と比較して１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含む、ＶＨ  ＣＤＲ１領域、(ｂ)配列番号１２、２０、３２、４０、５２、６０、６８、７６、８８および３１７からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号１２、２０、３２、４０、５２、６０、６８、７６および８８と比較して１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含む、ＶＨ  ＣＤＲ２領域、(ｃ)配列番号１３、２１、３３、４１、５３、６１、６９、７７および８９からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号１３、２１、３３、４１、５３、６１、６９、７７および８９と比較して１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含む、ＶＨ  ＣＤＲ３領域、(ｄ)配列番号１４、２２、２５、３４、４２、４５、５４、６２、７０、７８、８１および９０からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号１４、２２、２５、３４、４２、４５、５４、６２、７０、７８、８１および９０と比較して１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含む、ＶＬ  ＣＤＲ１領域、(ｅ)配列番号１５、２３、２６、３５、４３、４６、５５、６３、７１、７９、８２および９１からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号１５、２３、２６、３５、４３、４６、５５、６３、７１、７９、８２および９１と比較して１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含む、ＶＬ  ＣＤＲ２領域、ならびに(ｆ)配列番号１６、２４、２７、３６、４４、４７、５６、６４、７２、８０、８３および９２からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号１６、２４、２７、３６、４４、４７、５６、６４、７２、８０、８３および９２と比較して、１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸配列、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含む、ＶＬ  ＣＤＲ３領域を含む、重鎖可変領域を含む、抗ＯＸ４０モノクローナル抗体またはその抗原結合部分もまた、本明細書において提供される。
【０２８１】
抗体のＣＤＲ中のメチオニン残基は、酸化され、その結果、化学的分解の可能性および結果としての抗体の効力の低減をもたらし得る。したがって、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ中の１個または複数のメチオニン残基は、酸化分解を受けないアミノ酸残基と置換され得る。
【０２８２】
同様に、抗体から、特に、ＣＤＲ中の脱アミド化部位も除去され得る。
【０２８３】
抗原結合を干渉し得るグリコシル化を防ぐために、抗原結合ドメイン内の可能性あるグリコシル化部位が排除されることが好ましい。例えば、米国特許第５,７１４,３５０号を参照のこと。
【０２８４】
標的化される抗原結合
種々の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、抗原結合が有害である組織および環境において抗原結合を選択的に遮断するが、有益である抗原結合を可能にするよう修飾される。ある実施形態では、抗体の抗原結合表面と特異的に結合し、抗原結合を干渉する遮断ペプチド「マスク」が生じ、このマスクは、ペプチダーゼ切断可能リンカーによって抗体の結合アームの各々と連結している。例えば、ＣｙｔｏｍＸの米国特許第８,５１８,４０４号を参照のこと。このようなコンストラクトは、非腫瘍組織と比較して、腫瘍微小環境においてプロテアーゼレベルが大幅に増大されている癌の治療にとって有用である。腫瘍微小環境における切断可能なリンカーの選択的切断によって、マスキング／遮断ペプチドの解離が可能となり、これが、抗原結合が不要な副作用を引き起こし得る末梢組織においてではなく腫瘍における抗原結合選択性を可能にする。
【０２８５】
あるいは、関連実施形態では、(二価)抗体の両方の抗原結合表面と結合し、抗原結合を干渉する、２つの抗原結合ドメインを含む二価結合化合物(「マスキングリガンド」)が開発され、これでは、２つの結合ドメインマスクは、切断可能なリンカー、例えば、ペプチダーゼによって切断可能なリンカーによって互いに(抗体ではなく)連結される。例えば、Ｔｅｇｏｐｈａｒｍ  Ｃｏｒｐの国際特許出願公開ＷＯ２０１０／０７７６４３を参照のこと。マスキングリガンドは、抗体が結合するよう意図される抗原を含み得るか、もしくはそれに由来し得るか、または独立に作製され得る。このようなマスキングリガンドは、非腫瘍組織と比較して、腫瘍微小環境においてプロテアーゼレベルが大幅に増大されている癌の治療にとって有用である。腫瘍微小環境における切断可能なリンカーの選択的切断によって、２つの結合ドメインの互いからの解離が可能となり、抗体の抗原結合表面の結合力を低下させる。結果として生じる、抗体からのマスキングリガンドの解離が、抗原結合が不要な副作用を引き起こし得る末梢組織においてではなく腫瘍における抗原結合選択性を可能にする。
【０２８６】
Ｆｃおよび修飾されたＦｃ
抗原結合ドメインの抗原との結合(例えば、アンタゴニスト抗体の場合には、同族リガンドもしくは受容体タンパク質またはアゴニスト抗体の場合には、誘導されるシグナル伝達の遮断)に起因する治療用抗体の活性に加えて、抗体のＦｃ部分は、複雑な方法で全体的に免疫系と相互作用して、任意の数の生物学的効果を誘発する。免疫グロブリンのＦｃ領域などのエフェクター機能は、抗原依存性細胞性細胞傷害性(ＡＤＣＣ)、補体依存性細胞傷害性(ＣＤＣ)および抗体依存性細胞媒介性食作用(ＡＤＣＰ)などの多数の重要な抗体機能に関与しており、異なる機序によってではあるが、標的細胞の死滅をもたらす。重鎖定常領域の５種の主要なクラスまたはアイソタイプ(ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ)があり、各々は、特徴的なエフェクター機能を有する。これらのアイソタイプは、サブクラスにさらに細分され得、例えば、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４として知られる４つのサブクラスに分けられる。ＩｇＧ分子は、抗体のＩｇＧクラスに対して特異的な３つのクラスのＦｃγ受容体(ＦｃγＲ)、すなわち、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲIIおよびＦｃγＲIIIと相互作用する。ＩｇＧのＦｃγＲ受容体との結合にとって重要な配列は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン中に位置すると報告されている。抗体の血清半減期は、その抗体の新生児Ｆｃ受容体(ＦｃＲｎ)と結合する能力によって影響を受ける。
【０２８７】
本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体は、意図される使用のために抗体の生物活性(あるとすれば)に基づいて選択された、異なるＦｃ領域を含む定常ドメインと組み合わされた本発明の可変ドメインを含み得る。Salfeld (2007) Nat. Biotechnol. 25:1369。例えば、ヒトＩｇＧは、４つのサブクラス、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に分類され得、これらの各々は、１以上のＦｃγ受容体(活性化受容体ＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲIIＡ、ＦｃγＲIIＣ(ＣＤ３２)；ＦｃγＲIIIＡおよびＦｃγＲIIIＢ(ＣＤ１６)ならびに阻害性受容体ＦｃγＲIIＢ)との結合について、ならびに補体の第１の成分(Ｃ１ｑ)について独特のプロフィールを有するＦｃ領域を含む。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、全てのＦｃγ受容体と結合し；ＩｇＧ２は、ＦｃγＲIIＡＨ１３１と結合し、ＦｃγＲIIＡＲ１３１  ＦｃγＲIIIＡＶ１５８に対してより低い親和性を有し；ＩｇＧ４は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲIIＡ、ＦｃγＲIIＢ、ＦｃγＲIIＣおよびＦｃγＲIIIＡＶ１５８と結合し；阻害性受容体ＦｃγＲIIＢは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３に対して、全てのその他のＦｃγ受容体よりも低い親和性を有する。Bruhns et al. (2009) Blood 113:3716。研究によって、ＦｃγＲＩは、ＩｇＧ２と結合せず、ＦｃγＲIIIＢは、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４と結合しないことが示された。同著。一般に、ＡＤＣＣ活性に関して、ヒトＩｇＧ１≧ＩｇＧ３≫ＩｇＧ４≧ＩｇＧ２。結果として、例えば、ＡＤＣＣが望まれる薬物における使用のためには、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４ではなく、ＩｇＧ１定常ドメインが選択され得；ＦｃγＲIIIＡ発現ＮＫ細胞、単球またはマクロファージの活性化の場合には、ＩｇＧ３が選択され得；アレルギー患者を脱感作するために抗体が使用されるべきである場合にはＩｇＧ４が選択され得る。抗体が全てのエフェクター機能を欠くことが望まれる場合にも、ＩｇＧ４が選択され得る。
【０２８８】
したがって、本明細書に記載される抗ＯＸ４０可変領域は、Ｆｃ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４  Ｆｃと連結され得(例えば、共有結合によって連結されるか、または融合される)、これは、例えば、ＩｇＧ１の任意のアロタイプまたはイソアロタイプ：Ｇ１ｍ、Ｇ１ｍ１(ａ)、Ｇ１ｍ２(ｘ)、Ｇ１ｍ３(ｆ)、Ｇ１ｍ１７(ｚ)；ＩｇＧ２の任意のアロタイプまたはイソアロタイプ：Ｇ２ｍ、Ｇ２ｍ２３(ｎ)；ＩｇＧ３の任意のアロタイプまたはイソアロタイプ：Ｇ３ｍ、Ｇ３ｍ２１(ｇ１)、Ｇ３ｍ２８(ｇ５)、Ｇ３ｍ１１(ｂ０)、Ｇ３ｍ５(ｂ１)、Ｇ３ｍ１３(ｂ３)、Ｇ３ｍ１４(ｂ４)、Ｇ３ｍ１０(ｂ５)、Ｇ３ｍ１５(ｓ)、Ｇ３ｍ１６(ｔ)、Ｇ３ｍ６(ｃ３)、Ｇ３ｍ２４(ｃ５)、Ｇ３ｍ２６(ｕ)、Ｇ３ｍ２７(ｖ)であり得る；例えば、Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1)を参照のこと。アロタイプの選択は、例えば、抗薬物抗体の形成を最小化するために、可能性ある免疫原性の懸念によって影響を受け得る。
【０２８９】
ある実施形態では、本明細書に記載される抗ＯＸ４０可変領域は、１以上の活性化Ｆｃ受容体(ＦｃγＩ／ＣＤ６４、ＦｃγIIａ／ＣＤ３２またはＦｃγIIIａ／ＣＤ１６)と結合するＦｃと連結され、それによって、ＡＤＣＣを刺激し、Ｔ細胞枯渇を引き起こし得る。具体的な実施形態では、本明細書に記載される抗ＯＸ４０可変領域は、枯渇を引き起こすＦｃと連結されている。他の実施形態では、本明細書に記載される抗ＯＸ４０可変領域は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３  Ｆｃと連結され、すなわち、抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプのものである。他の実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、枯渇性抗体である。例えば、それらは、腫瘍微小環境に存在するＴｒｅｇ細胞を枯渇させ得る(それによって、抗腫瘍活性を増強する)が、腫瘍微小環境に存在するＴｅｆｆ細胞は大幅に枯渇させず、抗腫瘍効果を媒介する、および／または腫瘍外、例えば、末梢に存在するＴｒｅｇおよびＴｅｆｆ細胞を大幅に枯渇させない。その他の実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、腫瘍部位でのＴｒｅｇ細胞枯渇または排除およびＴｅｆｆ細胞の同時活性化を刺激するアイソタイプ、天然に存在するか、または天然に存在しない(例えば、突然変異(単数または複数)を含む)いずれかのアイソタイプのものである。その他の実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、腫瘍部位でのＴｅｆｆ対Ｔｒｅｇ比の上昇をもたらし、これは、強力な抗腫瘍活性を示し、好ましくは、腫瘍の外側、例えば、末梢では、ＴｒｅｇおよびＴｅｆｆ細胞を大幅に枯渇しない。
【０２９０】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性を遮断する。その他の実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、ＦｃＲ結合が減少または排除された、例えば、活性化ＦｃＲとの結合が低減したＦｃ受容体を有する。ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、ＦｃＲIIｂと結合するかまたはＦｃＲIIｂへの結合を増強したＦｃを有し、これにより増強されたアゴニズムがもたらされ得る。例えば、ＷＯ２０１２／０８７９２８、Li & Ravetch (2011) Science 333:1030; Wilson et al. (2011) Cancer Cell 19:101; White et al. (2011) J. Immunol. 187:1754を参照のこと。
【０２９１】
本明細書に記載される抗ＯＸ４０可変領域は、例えば、腫瘍環境におけるＴｒｅｇ枯渇を増強するために、天然に存在しないＦｃ領域、例えば、エフェクターレスまたはほとんどエフェクターレスＦｃ(例えば、ヒトＩｇＧ２またはＩｇＧ４)、あるいは、１以上の活性化Ｆｃ受容体(ＦｃγＩ、ＦｃγIIａまたはＦｃγIIIａ)との結合が増強されたＦｃと連結され得る。
【０２９２】
本明細書に記載される可変領域は、通常、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合および／または抗原依存性細胞性細胞傷害性などの、抗体の１以上の機能的特性を変更するために、１つまたは複数の修飾を含むＦｃと連結され得る。さらに、本明細書に記載される抗体は、化学的に修飾され得る(例えば、１以上の化学部分は、抗体と結合され得る)か、またはそのグリコシル化を変更するよう、抗体の１以上の機能的特性を変更するよう修飾され得る。これらの実施形態の各々は、以下に詳細に記載される。Ｆｃ領域中の残基の番号付けは、カバットのＥＵ指数のものである。本明細書において開示される配列変異体は、残基番号と、それに続く、天然に存在するアミノ酸の代わりに置換されるアミノ酸に関連して、任意選択で、その位置の天然に存在する残基が先行して提供される。所与の位置に複数のアミノ酸が存在し得る場合、例えば、配列が天然に存在するアイソタイプ間で異なる場合、または複数の突然変異がその位置で置換され得る場合には、それらは／によって分けられる(例えば、「Ｘ／Ｙ／Ｚ」)。
【０２９３】
例えば、親のＦｃに対して、(ａ)抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性(ＡＤＣＣ)が増大もしくは減少した、(ｂ)補体媒介性細胞傷害性(ＣＤＣ)が増大もしくは減少した、(ｃ)Ｃ１ｑに対する親和性が増大もしくは減少した、および／または(ｄ)Ｆｃ受容体に対する親和性が増大もしくは減少したＦｃ変異体を作製するために、Ｆｃ領域中に修飾を行ってもよい。このようなＦｃ領域変異体は、一般に、Ｆｃ領域中に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。アミノ酸修飾を組み合わせることは、特に望ましいと考えられる。例えば、変異体Ｆｃ領域は、中に、本明細書において同定される特定のＦｃ領域位置の２、３、４、５つなどの置換を含み得る。例示的Ｆｃ配列変異対は、本明細書において開示されており、また、米国特許第５,６２４,８２１号、同６,２７７,３７５号、同６,７３７,０５６号、同６,１９４,５５１号、同７,３１７,０９１号、同８,１０１,７２０号、ＰＣＴ特許公開ＷＯ００／４２０７２、ＷＯ０１／５８９５７、ＷＯ０４／０１６７５０、ＷＯ０４／０２９２０７、ＷＯ０４／０３５７５２、ＷＯ０４／０７４４５５、ＷＯ０４／０９９２４９、ＷＯ０４／０６３３５１、ＷＯ０５／０７０９６３、ＷＯ０５／０４０２１７、ＷＯ０５／０９２９２５およびＷＯ０６／０２０１１４で提供されている。
【０２９４】
エフェクター機能を低減すること
ＡＤＣＣ活性は、Ｆｃ領域を修飾することによって低減され得る。ある実施形態では、Ｆｃ受容体との結合に影響を及ぼす部位、好ましくは、サルベージ受容体結合部位以外の部位が除去され得る。その他の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＡＤＣＣ部位を除去するよう修飾され得る。ＡＤＣＣ部位は、当技術分野で公知である、例えば、ＩｇＧ１中のＡＤＣＣ部位に関しては、Sarmay et al. (1992) Molec. Immunol. 29 (5): 633-9を参照のこと。ある実施形態では、ヒトＩｇＧ１のＧ２３６ＲおよびＬ３２８Ｒ変異体は、ＦｃγＲ結合を効率的に排除する。Horton et al. (2011) J. Immunol. 186:4223およびChu et al. (2008) Mol. Immunol. 45:3926。その他の実施形態では、ＦｃγＲとの結合が低減されているＦｃは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＥおよびＧ２３７Ａを含んでいた。Gross et al. (2001) Immunity 15:289。
【０２９５】
ＣＤＣ活性はまた、Ｆｃ領域を修飾することによって低減され得る。ＩｇＧ１位置での突然変異、Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３２９およびＰ３３１、具体的には、アラニン突然変異Ｄ２７０Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｐ３２９ＡおよびＰ３３１Ａは、対応する抗体の、Ｃ１ｑと結合し、補体を活性化する能力を大幅に低減する。Idusogie et al. (2000) J. Immunol. 164:4178；ＷＯ９９／５１６４２。ＩｇＧ１の位置３３１の修飾(例えば、Ｐ３３１Ｓ)は、補体結合を低減すると示されている。Tao et al. (1993) J. Exp. Med. 178:661およびCanfield & Morrison (1991) J. Exp. Med. 173:1483。別の例では、アミノ酸位置２３１〜２３９内の１個または複数のアミノ酸残基が変更され、それによって、抗体の補体を固定する能力を低減する。ＷＯ９４／２９３５１。
【０２９６】
いくつかの実施形態では、補体結合が低減したＦｃは、アミノ酸置換Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを有する。Gross et al. (2001) Immunity 15:289。
【０２９７】
エフェクター機能が完全に避けられるべき使用のために、例えば、所望の治療的利益を生じさせるのに抗原結合単独で十分である場合およびエフェクター機能が、望ましくない副作用につながる(そのリスクを増大する)だけである場合には、ＩｇＧ４抗体を使用してもよく、またはＦｃ領域もしくはそのかなりの部分を欠く抗体もしくは断片を考案することができ、またはＦｃを、グリコシル化を完全に排除するよう突然変異してもよい(例えば、Ｎ２９７Ａ)。あるいは、エフェクター機能を欠き、ＦｃγＲと結合する能力を欠き(ＩｇＧ２のように)、補体を活性化することができない(ＩｇＧ４のように)、ヒトＩｇＧ２のハイブリッドコンストラクト(ＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域)およびヒトＩｇＧ４(ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン)が作製されてきた。Rother et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25:1256。Mueller et al. (1997) Mol. Immunol. 34:441;Labrijn et al. (2008) Curr. Op. Immunol. 20:479(エフェクター機能を全般的に低減するためのＦｃ修飾を論じる)も参照のこと。
【０２９８】
その他の実施形態では、Ｆｃ領域は、抗体の全てのエフェクター機能を低減するよう、少なくとも１個のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基と置換することによって変更される。例えば、抗体が、エフェクターリガンドに対して低減した親和性を有するが、親抗体の抗原結合能力は保持するよう、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および３２２から選択される１個または複数のアミノ酸が、異なるアミノ酸残基と置換され得る。それに対する親和性が変更されるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体(残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７)または補体のＣ１成分(残基２９７、３１８、３２０、３２２)であり得る。両方ともWinter et alによる米国特許第５,６２４,８２１号および同５,６４８,２６０号。
【０２９９】
ある先行特許出願は、ＦｃγＲＩとの結合を低減して、ＡＤＣＣを低減するため(２３４Ａ；２３５Ｅ；２３６Ａ；Ｇ２３７Ａ)または補体成分Ｃ１ｑとの結合を遮断して、ＣＤＣを排除するために(Ｅ３１８ＡまたはＶ／Ｋ３２０ＡおよびＫ３２２Ａ／Ｑ)、ＩｇＧ  Ｆｃ領域中の修飾を提案した。ＷＯ８８／００７０８９。Duncan & Winter (1988) Nature 332:563;Chappel et al. (1991) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 88:9036;およびSondermann et al. (2000) Nature 406:267(ＦｃγＲIII結合に対するこれらの突然変異の効果を論じる)も参照のこと。
【０３００】
エフェクター機能を低減するＦｃ修飾はまた、位置２３４、２３５、２３６、２３７、２６７、２６９、３２５および３２８での置換、挿入および欠失、例えば、２３４Ｇ、２３５Ｇ、２３６Ｒ、２３７Ｋ、２６７Ｒ、２６９Ｒ、３２５Ｌおよび３２８Ｒを含む。Ｆｃ変異体は、２３６Ｒ／３２８Ｒを含み得る。ＦｃｙＲおよび補体相互作用を低減するためのその他の修飾は、置換２９７Ａ、２３４Ａ、２３５Ａ、２３７Ａ、３１８Ａ、２２８Ｐ、２３６Ｅ、２６８Ｑ、３０９Ｌ、３３０Ｓ、３３１Ｓ、２２０Ｓ、２２６Ｓ、２２９Ｓ、２３８Ｓ、２３３Ｐおよび２３４Ｖを含む。これらおよびその他の修飾は、Strohl (2009) Current Opinion in Biotechnology 20:685-691に概説されている。ＩｇＧ１中、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、適宜、Ｇ２３６Δ、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ；ＩｇＧ４中、Ｅ２３３Ｐ、Ｆ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、適宜、Ｇ２３６Δ；およびＩｇＧ２中、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓなど、位置２３３〜２３６および３２７〜３３１のうち１つまたは複数でＩｇＧ残基を突然変異することによって、エフェクター機能(ＡＤＣＣおよび補体活性化の両方)は、新生児ＦｃＲ結合を維持しながら(半減期を維持しながら)低減され得る。Armour et al. (1999) Eur. J. Immunol. 29:2613；ＷＯ９９／５８５７２を参照のこと。エフェクター機能を低減するその他の突然変異として、ＩｇＧ１中のＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ(Alegre et al. (1994) Transplantation 57:1537)；ＩｇＧ２中のＶ２３４ＡおよびＧ２３７Ａ(Cole et al. (1997) J. Immunol. 159:3613；米国特許第５,８３４,５９７号も参照のこと)；ならびにＩｇＧ４のＳ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅ(Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164:1925)が挙げられる。ヒトＩｇＧ１においてエフェクター機能を低減するための突然変異の別の組合せとして、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５ＥおよびＰ３３１Ｓが挙げられる。Oganesyan et al. (2008) Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 64:700。全般的に、Labrijn et al. (2008) Curr. Op. Immunol. 20:479を参照のこと。Ｆｃ(ＩｇＧ１)融合タンパク質(アバタセプト)に関連してエフェクター機能を減少させるとわかっているさらなる突然変異として、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９ＳおよびＰ２３８Ｓ(ＥＵ残基番号付け)がある。Davis et al. (2007) J. Immunol. 34:2204。
【０３０１】
ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを低減させたその他のＦｃ変異体は、Glaesner et al. (2010) Diabetes Metab. Res. Rev. 26:287(ＩｇＧ４においてＡＤＣＣおよびＡＤＣＰを減少させるためのＦ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ)；Hutchins et al. (1995) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 92:11980(ＩｇＧ４におけるＦ２３４Ａ、Ｇ２３７ＡおよびＥ３１８Ａ)；An et al. (2009) MAbs 1:572および米国特許出願公開第２００７／０１４８１６７号(ＩｇＧ２におけるＨ２６８Ｑ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ)；McEarchern et al. (2007) Blood 109:1185(ＩｇＧ１におけるＣ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ)；Vafa et al. (2014) Methods 65:114(ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ｖ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ)に開示されている。
【０３０２】
ある実施形態では、本質的にエフェクター機能を有さない、すなわち、ＦｃγＲとの結合が低減され、補体結合が低減されたＦｃが、選択される。エフェクターレスである例示的Ｆｃ、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃは、以下の５つの突然変異を含む：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ。Gross et al. (2001) Immunity 15:289。これらの突然変異を含む例示的重鎖は、表２３に詳細に示されるように、配列表に記載されている(例えば、配列番号１１)。これらの５つの置換は、同様にグリコシル化を排除するためのＮ２９７Ａと組み合わされ得る。
【０３０３】
エフェクター機能を増強すること
あるいは、Ｆｃ領域を修飾することによって、ＡＤＣＣ活性は増大され得る。ＡＤＣＣ活性に関して、ヒトＩｇＧ１≧ＩｇＧ３＞＞ＩｇＧ４≧ＩｇＧ２であり、そのため、ＡＤＣＣが望まれる薬物における使用のためには、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４ではなく、ＩｇＧ１定常ドメインが選択され得る。あるいは、Ｆｃ領域は、以下の位置：２３４、２３５、２３６、２３８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６２、２６３、２６４、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１３、３１５、３２０、３２２、３２４、３２５、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８または４３９で１個または複数のアミノ酸を修飾することによって、抗体依存性細胞性細胞傷害性(ＡＤＣＣ)を増大するよう、および／またはＦｃγ受容体に対する親和性を増大するよう修飾され得る。ＷＯ２０１２／１４２５１５を参照のこと；ＷＯ００／４２０７２も参照のこと。例示的置換として、２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６８Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｅ、２６８Ｆ、３２４Ｔ、３３２Ｄおよび３３２Ｅが挙げられる。例示的変異体として、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３６Ａ／２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６８Ｆ／３２４Ｔ、２６７Ｅ／２６８Ｆ、２６７Ｅ／３２４Ｔおよび２６７Ｅ／２６８Ｆ／３２４Ｔが挙げられる。例えば、任意選択で、Ｉ３３２Ｅと組み合わされ得る、Ｇ２３６Ａ変異体を含むヒトＩｇＧ１Ｆｃは、ＦｃγIIＡ／ＦｃγIIＢ結合親和性比をおよそ１５倍増大するとわかった。Richards et al. (2008) Mol. Cancer Therap. 7:2517;Moore et al. (2010) mAbs 2:181。ＦｃｙＲおよび補体相互作用を増強するためのその他の修飾として、それだけには限らないが、置換２９８Ａ、３３３Ａ、３３４Ａ、３２６Ａ、２４７Ｉ、３３９Ｄ、３３９Ｑ、２８０Ｈ、２９０Ｓ、２９８Ｄ、２９８Ｖ、２４３Ｌ、２９２Ｐ、３００Ｌ、３９６Ｌ、３０５Ｉおよび３９６Ｌが挙げられる。これらおよびその他の修飾は、Strohl (2009) Current Opinion in Biotechnology 20:685-691に概説されている。具体的には、ＡＤＣＣおよびＣＤＣの両方は、ＩｇＧ１の位置Ｅ３３３の変更、例えば、Ｅ３３３Ａによって増強され得る。Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591。ＩｇＧ１においてエフェクター機能を増強するためのＰ２４７ＩおよびＡ３３９Ｄ／Ｑ突然変異の使用は、ＷＯ２００６／０２０１１４に開示されており、Ｄ２８０Ｈ、Ｋ２９０Ｓ±Ｓ２９８Ｄ／Ｖは、ＷＯ２００４／０７４４５５に開示されている。ヒトＩｇＧ１におけるＫ３２６Ａ／ＷおよびＥ３３３Ａ／Ｓ変異体およびＩｇＧ２におけるＥ３３３Ｓは、エフェクター機能を増大するとわかっている。Idusogie et al. (2001) J. Immunol. 166:2571。
【０３０４】
具体的には、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲII、ＦｃγＲIIIおよびＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位がマッピングされており、結合が改善された変異体が記載されている。Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604。組合せ突然変異体Ｔ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４ＡおよびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ(ＦｃγＲIIIａ結合およびＡＤＣＣ活性が増強されている)を含めた、位置２５６、２９０、２９８、３３３、３３４および３３９での特定の突然変異は、ＦｃγＲIIIとの結合を改善すると示された。Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２ＥおよびＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ突然変異を有する変異体を含めた、ＦｃγＲIIIａとの結合が強力に増強されたその他のＩｇＧ１変異体が同定されており、これは、ＦｃγＲIIIａに対する親和性の最大の増大、ＦｃγＲIIｂ結合の減少およびカニクイザルにおける強力な細胞傷害性活性を示した。Lazar et al.(2006) Proc. Nat'l Acad Sci. (USA) 103:4005;Awan et al. (2010) Blood 115:1204;Desjarlais & Lazar (2011) Exp. Cell Res. 317:1278。アレムツズマブ(ＣＤ５２特異的)、トラスツズマブ(ＨＥＲ２／ｎｅｕ特異的)、リツキシマブ(ＣＤ２０特異的)およびセツキシマブ(ＥＧＦＲ特異的)などの抗体中への三重突然変異の導入は、インビトロで大きく増強されたＡＤＣＣ活性に変換され、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ変異体は、サルにおいてＢ細胞を枯渇させる増強された能力を示した。Lazar et al. (2006) Proc. Nat'l Acad Sci. (USA) 103:4005。さらに、Ｂ細胞悪性腫瘍および乳癌のモデルにおいてヒトＦｃγＲIIIａを発現するトランスジェニックマウスにおいて、ＦｃγＲIIIａとの増強された結合および同時に増強されたＡＤＣＣ活性を示した、Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５ＩおよびＰ３９６Ｌ突然変異を含有するＩｇＧ１突然変異体が同定された。Stavenhagen et al. (2007) Cancer Res. 67:8882；米国特許第８,６５２,４６６号；Nordstrom et al. (2011) Breast Cancer Res. 13:R123。
【０３０５】
種々のＩｇＧアイソタイプはまた、差次的ＣＤＣ活性を示す(ＩｇＧ３＞ＩｇＧ１＞＞ＩｇＧ２≒ＩｇＧ４)。Dangl et al. (1988) EMBO J. 7:1989。増強されたＣＤＣが望まれる使用のためには、Ｃ１ｑとの結合を増大する突然変異を導入することも可能である。補体(ＣＤＣ)を補充する能力は、Ｃ１ｑ、補体カスケードの第１の成分との結合を増大するための、ＩｇＧ２におけるＫ３２６および／またはＥ３３３での突然変異、例えば、Ｋ３２６Ｗ(ＡＤＣＣ活性を低減する)およびＥ３３３Ｓによって増強され得る。Idusogie et al. (2001) J. Immunol. 166:2571。ヒトＩｇＧ１へのＳ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ(単独または任意の組合せの)導入は、Ｃ１ｑ結合を増強する。Moore et al. (2010) mAbs 2:181。Natsume et al. (2008) Cancer Res. 68:3863(その中の図１)のＩｇＧ１／ＩｇＧ３ハイブリッドアイソタイプ抗体のＦｃ領域「１１３Ｆ」は、増強されたＣＤＣを与える。Michaelsen et al. (2009) Scand. J. Immunol. 70:553およびRedpath et al. (1998) Immunology 93:595も参照のこと。
【０３０６】
エフェクター機能を増大または減少し得るさらなる突然変異は、Dall'Acqua et al. (2006) J. Immunol. 177:1129に開示されている。Carter (2006) Nat. Rev. Immunol. 6:343;Presta (2008) Curr. Op. Immunol. 20:460も参照のこと。
【０３０７】
阻害性受容体ＦｃｙＲIIｂに対する親和性を増強するＦｃ変異体は、例えば、アポトーシス誘導またはアジュバント活性を増強するためにも使用され得る。Li & Ravetch (2011) Science 333:1030;Li & Ravetch (2012) Proc. Nat'l Acad. Sci (USA) 109:10966；米国特許出願公開第２０１４／００１０８１２号。このような変異体は、例えば、Ｂ細胞および単球を含めたＦｃｙＲIIｂ＋細胞と関連する免疫調節性活性を有する抗体を提供し得る。ある実施形態では、Ｆｃ変異体は、１以上の活性化受容体と相対的に、ＦｃｙＲIIｂに対する選択的に増強された親和性を提供する。ＦｃｙＲIIｂに対する結合を変更するための修飾として、ＥＵ指数に従って、２３４、２３５、２３６、２３７、２３９、２６６、２６７、２６８、３２５、３２６、３２７、３２８および３３２からなる群から選択される位置での１つまたは複数の修飾が挙げられる。ＦｃｙＲIIｂ親和性を増強するための例示的置換として、それだけには限らないが、２３４Ｄ、２３４Ｅ、２３４Ｆ、２３４Ｗ、２３５Ｄ、２３５Ｆ、２３５Ｒ、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３６Ｎ、２３７Ｄ、２３７Ｎ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６６Ｍ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２７Ｄ、３２７Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗ、３２８Ｙおよび３３２Ｅが挙げられる。例示的置換として、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３９Ｄ、２６６Ｍ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗおよび３２８Ｙが挙げられる。ＦｃｙＲIIｂとの結合を増強するためのその他のＦｃ変異体として、２３５Ｙ／２６７Ｅ、２３６Ｄ／２６７Ｅ、２３９Ｄ／２６８Ｄ、２３９Ｄ／２６７Ｅ、２６７Ｅ／２６８Ｄ、２６７Ｅ／２６８Ｅおよび２６７Ｅ／３２８Ｆが挙げられる。具体的には、ヒトＩｇＧ１のＳ２６７Ｅ＋Ｌ３２８Ｆ二重変異体を含めたＳ２６７Ｅ、Ｇ２３６Ｄ、Ｓ２３９Ｄ、Ｌ３２８ＦおよびＩ３３２Ｅ変異体は、具体的には、阻害性ＦｃｙＲIIｂ受容体に対する親和性の増強において特に価値がある。Chu et al. (2008) Mol. Immunol. 45:3926；米国特許出願公開第２００６／０２４２９８号；ＷＯ２０１２／０８７９２８。ＦｃγＲIIｂに対する増強された特異性(ＦｃγＲIIａＲ１３１とは区別されるような)は、Ｐ２３８Ｄ置換を付加することによって得ることができる。Mimoto et al. (2013) Protein. Eng. Des. & Selection 26:589；ＷＯ２０１２／１１５２４１。
【０３０８】
ある実施形態では、抗体は、その生物学的半減期を増大するよう修飾される。種々のアプローチが可能である。例えば、これは、Ｆｃ領域のＦｃＲｎに対する結合親和性を増大することによって行うことができる。ある実施形態では、抗体は、Presta et alによって米国特許第５,８６９,０４６号および同６,１２１,０２２号に記載されるようにＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループからとられるサルベージ受容体結合エピトープを含有するようＣＨ１またはＣＬ領域内で変更される。ＦｃＲｎとの結合を増大し、および／または薬物動態特性を改善するその他の例示的Ｆｃ変異体は、位置２５９、３０８および４３４での置換を含み、例えば、２５９Ｉ、３０８Ｆ、４２８Ｌ、４２８Ｍ、４３４Ｓ、４３４Ｈ、４３４Ｆ、４３４Ｙおよび４３４Ｍが挙げられる。ＦｃＲｎとのＦｃ結合を増大するその他の変異体として、２５０Ｅ、２５０Ｑ、４２８Ｌ、４２８Ｆ、２５０Ｑ／４２８Ｌ(Hinton et al., 2004、J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216、Hinton et al. 2006 Journal of Immunology 176:346-356)、２５６Ａ、２７２Ａ、３０５Ａ、３０７Ａ、３１１Ａ、３１２Ａ、３７８Ｑ、３８０Ａ、３８２Ａ、４３４Ａ(Shields et al, Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(9):6591-6604)、２５２Ｆ、２５２Ｙ、２５２Ｗ、２５４Ｔ、２５６Ｑ、２５６Ｅ、２５６Ｄ、４３３Ｒ、４３４Ｆ、４３４Ｙ、２５２Ｙ／２５４Ｔ／２５６Ｅ、４３３Ｋ／４３４Ｆ／４３６Ｈ(Dall Acqua et al. Journal of Immunology, 2002, 169:5171-5180, Dall'Acqua et al., 2006, Journal of Biological Chemistry 281:23514-23524)が挙げられる。米国特許第８,３６７,８０５号を参照のこと。
【０３０９】
Ｎ４３４Ａ変異体(Yeung et al. (2009) J. Immunol. 182:7663)などの、ＩｇＧ  Ｆｃ中の特定の保存された残基(Ｉ２５３／Ｈ３１０／Ｑ３１１／Ｈ４３３／Ｎ４３４)の修飾は、ＦｃＲｎ親和性を増大し、したがって、循環における抗体の半減期を増大する方法として提案されている。ＷＯ９８／０２３２８９。Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓを含む組合せＦｃ変異体は、ＦｃＲｎ結合を増大し、血清半減期を最大５倍まで増大すると示されている。Zalevsky et al. (2010) Nat. Biotechnol. 28:157。Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０ＡおよびＮ４３４Ａ修飾を含む組合せＦｃ変異体もまた、ＩｇＧ１抗体の半減期を延長する。Petkova et al. (2006) Int. Immunol. 18:1759。さらに、Ｍ２５２Ｙ／Ｍ４２８Ｌ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｈ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｆ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｙ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ａ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４ＭおよびＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ変異体を含む組合せＦｃ変異体もまた、半減期を延長すると示されている。ＷＯ２００９／０８６３２０。
【０３１０】
さらに、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅを含む組合せＦｃ変異体は、半減期を４倍近く増大する。Dall'Acqua et al. (2006) J. Biol. Chem. 281:23514。増大したＦｃＲｎ親和性を提供するが、ｐＨ依存が低下した関連ＩｇＧ１修飾(Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ)を使用して、その他の抗体のＦｃＲｎとの結合を防ぎ、その結果、そのその他の抗体、内因性ＩｇＧ(例えば、自己免疫状況における)または別の外因性(治療用)ｍＡｂのいずれかのクリアランスの増大をもたらすための競合物質として使用するためのＩｇＧ１コンストラクト(「ＭＳＴ−ＨＮ  Ａｂｄｅｇ」)を作製した。Vaccaro et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23:1283；ＷＯ２００６／１３０８３４。
【０３１１】
ＦｃＲｎ結合を増大するためのその他の修飾は、Yeung et al. (2010) J. Immunol. 182:7663-7671；第６,２７７,３７５号；同６,８２１,５０５号；ＷＯ９７／３４６３１；ＷＯ２００２／０６０９１９に記載されている。
【０３１２】
ある実施形態では、ＦｃＲｎ結合を増大し、半減期を潜在的に増大するためにハイブリッドＩｇＧアイソタイプが使用され得る。例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ３ハイブリッド変異体は、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域中のＩｇＧ１位置を、２種のアイソタイプが異なる位置でＩｇＧ３に由来するアミノ酸と置換することによって構築され得る。このようにして、１つまたは複数の置換、例えば、２７４Ｑ、２７６Ｋ、３００Ｆ、３３９Ｔ、３５６Ｅ、３５８Ｍ、３８４Ｓ、３９２Ｎ、３９７Ｍ、４２２Ｉ、４３５Ｒおよび４３６Ｆを含むハイブリッド変異体ＩｇＧ抗体が、構築され得る。本明細書に記載されるその他の実施形態では、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域中のＩｇＧ２位置を、２種のアイソタイプが異なる位置でＩｇＧ１に由来するアミノ酸と置換することによって、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ハイブリッド変異体が構築され得る。このようにして、１つまたは複数の置換、例えば、以下のアミノ酸置換：２３３Ｅ、２３４Ｌ、２３５Ｌ、−２３６Ｇ(位置２３６でのグリシンの挿入を指す)および３２７Ａのうち１つまたは複数を含むハイブリッド変異体ＩｇＧ抗体が構築され得る。米国特許第８,６２９,１１３号を参照のこと。血清半減期に増大し、発現を改善するといわれているＩｇＧ１／ＩｇＧ２／ＩｇＧ４配列のハイブリッドが作製された。米国特許第７,８６７,４９１号(その中の配列番号１８)。
【０３１３】
本発明の抗体の血清半減期はまた、ペグ化によって増大され得る。抗体を、例えば、抗体の生物学的(例えば、血清)半減期を増大するようペグ化してもよい。抗体をペグ化するために、通常、抗体またはその断片を、１つまたは複数のＰＥＧ基が、抗体または抗体断片と結合するようになる条件下で、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体などのポリエチレングリコール(ＰＥＧ)試薬と反応させる。好ましくは、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子(または類似の反応性水溶性ポリマー)とのアシル化反応またはアルキル化反応によって実施される。本明細書において、用語「ポリエチレングリコール」は、モノ(Ｃ１〜Ｃ１０)アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドなどの、その他のタンパク質を誘導体化するために使用されたＰＥＧの任意の形態を包含するものとする。ある実施形態では、ペグ化されるべき抗体は、非グリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化するための方法は、技術分野で公知であり、本明細書に記載される抗体に適用され得る。例えば、Nishimura et al.によるＥＰ０１５４３１６およびIshikawa et al.によるＥＰ０４０１３８４を参照のこと。
【０３１４】
あるいは、いくつかの状況かでは、抗体の半減期を増大するのではなく、減少することが望ましい場合がある。ヒトＩｇＧ１のＦｃにおけるＩ２５３Ａ(Hornick et al. (2000) J. Nucl. Med. 41:355)およびＨ４３５Ａ／Ｒ  Ｉ２５３ＡまたはＨ３１０Ａ(Kim et al. (2000) Eur. J. Immunol. 29:2819)などの修飾は、医用画像のような迅速なクリアランスが好ましい状況において使用するために、ＦｃＲｎ結合を減少させ、ひいては、半減期を減少(クリアランスを増大)させ得る。Kenanova et al. (2005) Cancer Res. 65:622も参照のこと。クリアランスを増強するためのその他の手段として、本発明の抗原結合ドメインを、Ｆａｂ断片などのＦｃＲｎと結合する能力を欠く抗体断片としてフォーマットすることが挙げられる。このような修飾は、抗体の循環半減期を２、３週間から数時間に減少させ得る。次いで、抗体断片の選択的ペグ化を使用して、必要に応じて、抗体断片の半減期を微調整(増大)できる。Chapman et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17:780。半減期を増大するために、抗体断片をまた、ヒト血清アルブミンと融合して、例えば、融合タンパク質コンストラクトにしてもよい。Yeh et al. (1992) Proc. Nat'l Acad. Sci. 89:1904。あるいは、ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)と結合する、本発明の第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを用いて、二重特異性抗体を構築してもよい。国際特許出願公開ＷＯ２００９／１２７６９１およびその中で引用される特許参考文献を参照のこと。あるいは、半減期を増大するために、特殊化ポリペプチド配列、例えば、「ＸＴＥＮ」ポリペプチド配列を抗体断片に添加することができる。Schellenberger et al. (2009) Nat. Biotechnol. 27:1186;国際特許出願公開ＷＯ２０１０／０９１１２２。
【０３１５】
さらなるＦｃ変異体
ＩｇＧ４定常ドメインを使用する場合には、ＩｇＧ１中のヒンジ配列を模倣し、それによって、例えば、治療されている患者において、治療用抗体と内因性ＩｇＧ４の間のＦａｂアーム交換を低減しながら、ＩｇＧ４分子を安定化する置換Ｓ２２８Ｐを含むことが好ましい。Labrijn et al. (2009) Nat. Biotechnol. 27:767;Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164:1925。
【０３１６】
ＩｇＧ１コンストラクトのヒンジ中の可能性あるプロテアーゼ切断部位を、Ｄ２２１ＧおよびＫ２２２Ｓ修飾によって排除し、抗体の安定性を増大することができる。ＷＯ２０１４／０４３３４４。
【０３１７】
Ｆｃ変異体のそのリガンド(Ｆｃ受容体)に対する親和性および結合特性は、それだけには限らないが、平衡方法(例えば、酵素結合免疫吸着測定法(ＥＬＩＳＡ)またはラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ))または速度論(例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)ＳＰＲ分析)および間接結合アッセイ、競合阻害アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動(ＦＲＥＴ)、ゲル電気泳動およびクロマトグラフィー(例えば、ゲル濾過)などのその他の方法を含めた、当技術分野で公知の種々のインビトロアッセイ法(生化学または免疫学ベースのアッセイ)によって決定され得る。これらおよびその他の方法は、調べられている１種もしくは複数の成分上の標識を利用してもよく、および／またはそれだけには限らないが、クロマトグラフィー、蛍光、発光もしくは同位体標識を含めた種々の検出方法を使用してもよい。結合親和性および速度論の詳細な説明は、抗体免疫原相互作用に焦点を当てる、Paul, W. E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999)に見い出すことができる。
【０３１８】
さらにその他の実施形態では、抗体のグリコシル化は、エフェクター機能を増大または低減するよう修飾される。例えば、位置２９７の保存されたアスパラギン残基を突然変異し(例えば、Ｎ２９７Ａ)、ひいては、補体およびＦｃγＲＩ結合を消滅させることによって、全てのエフェクター機能を欠く非グリコシル化抗体を作製できる。Bolt et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:403。Tao & Morrison (1989) J. Immunol. 143:2595(ＩｇＧ１中のＮ２９７Ｑを使用して、位置２９７でのグリコシル化を排除する)も参照のこと。
【０３１９】
非グリコシル化抗体は、一般に、エフェクター機能を欠くが、その機能を回復させるよう、突然変異を導入することができる。非グリコシル化抗体、例えば、Ｎ２９７Ａ／Ｃ／Ｄ／またはＨ突然変異に起因するものか、またはタンパク質をグリコシル化しない系(例えば、大腸菌)において産生されたものを、ＦｃγＲ結合を回復させるよう、さらに突然変異することができる、例えば、Ｓ２９８Ｇおよび／またはＴ２９９Ａ／Ｇ／もしくはＨ(ＷＯ２００９／０７９２４２)またはＥ３８２ＶおよびＭ４２８Ｉ(Jung et al. (2010) Proc. Nat'l Acad. Sci (USA) 107:604)。
【０３２０】
さらに、グリコシル化を変更することによって、ＡＤＣＣが増強された抗体を製造できる。例えば、重鎖Ａｓｎ２９７が連結したオリゴ糖からのフコースの除去は、ＦｃγＲIIIａとの改善された結合に基づいてＡＤＣＣを増強すると示された。Shields et al. (2002) JBC 277:26733;Niwa et al. (2005) J. Immunol. Methods 306:151;Cardarelli et al. (2009) Clin. Cancer Res.15:3376 (MDX-1401);Cardarelli et al. (2010) Cancer Immunol. Immunotherap. 59:257(MDX-1342)。このような低フコース抗体は、例えば、フコシルトランスフェラーゼ(ＦＵＴ８)を欠くノックアウトチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞において(Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol. Bioeng. 87:614)、または非フコシル化抗体を生成するその他の細胞において産生され得る。例えば、Zhang et al. (2011) mAbs 3:289およびLi et al. (2006) Nat. Biotechnol. 24:210(両方とも、糖鎖操作されたピキア・パストリス(Pichia pastoris)における抗体産生を説明する)；Mossner et al. (2010) Blood 115:4393;Shields et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733; Shinkawa et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:3466;EP1176195B1を参照のこと。ＡＤＣＣはまた、フコースの、Ａｓｎ(２９７)が連結した炭化水素と結合する能力が低下した変異体ＣＨＯ細胞系統、Ｌｅｃ１３の使用を開示する、ＰＣＴ公開ＷＯ０３／０３５８３５に記載されるように増強され得、また、宿主細胞において発現された抗体の低フコシル化をもたらした(Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照のこと)。あるいは、フコース類似体を、フコースが抗体上の炭水化物中に組み込まれることを阻害するために抗体産生の際に培養培地に添加してもよい(例えば、ＷＯ２００９／１３５１８１を参照のこと)。
【０３２１】
抗体が連結したオリゴ糖における二分ＧｌｃＮａｃ構造の増大もまた、ＡＤＣＣを増強する。Umana et al.によるＰＣＴ公開ＷＯ９９／５４３４２は、糖タンパク質修飾性グリコシルトランスフェラーゼ(例えば、β(１,４)−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(ＧｎＴIII))を発現するよう遺伝子操作された細胞系統を記載し、その結果、遺伝子操作された細胞系統において発現された抗体は、二分ＧｌｃＮａｃ構造の増大を示し、これは、抗体のＡＤＣＣ活性の増大をもたらす(Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180も参照のこと)。
【０３２２】
ＡＤＣＣおよびＡＤＣＰの増強を示すが、ＣＤＣを減少する、ガラクトース、シアル酸、フコースおよびキシロース残基(いわゆるＧＮＧＮグリコフォーム)を欠くさらなるグリコシル化変異体ならびにＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよびＣＤＣの増強を示す、シアル酸、フコースおよびキシロース(いわゆるＧ１／Ｇ２グリコフォーム)を欠くその他のものが開発されている。米国特許出願公開第２０１３／０１４９３００号。これらのグリコシル化パターンを有する抗体は、任意選択で、内因性キシロシルおよびフコシルトランスフェラーゼ遺伝子がノックアウトされている、遺伝子修飾されたベンサミアナタバコ(N. benthamiana)植物において産生される。
【０３２３】
糖鎖操作はまた、Ｆｃ領域のＡｓｎ２９７で結合している炭水化物鎖のα２,６シアリル含量を変更することによって、ＩｇＧコンストラクトの抗炎症特性を修飾するために使用され得、これでは、α２,６シアリル化形態の割合の増加が、抗炎症効果の増強をもたらす。Nimmerjahn et al. (2008) Ann. Rev. Immunol. 26:513を参照のこと。逆に、α２,６シアリル化炭化水素を有する抗体の割合の減少は、抗炎症特性が望まれない場合には有用であり得る。例えば、α２,６シアリル化形態の選択的精製によって、または酵素的修飾によって、抗体のα２,６シアリル化含量を修飾する方法は、米国特許出願公開第２００８／０２０６２４６号に提供されている。その他の実施形態では、Ｆｃ領域のアミノ酸配列は、例えば、Ｆ２４１Ａ修飾を含めることによって、α２,６シアリル化の効果を模倣するよう修飾され得る(例えば、ＷＯ２０１３／０９５９６６を参照のこと)。
【０３２４】
VIII. 抗体物理的特性
本明細書に記載される抗体は、軽鎖または重鎖可変領域のいずれかに１つまたは複数のグリコシル化部位を含有し得る。このようなグリコシル化部位は、抗体の免疫原性の増大または変更された抗原結合による抗体のｐＫの変更をもたらし得る(Marshall et al (1972) Annu. Rev Biochem 41:673-702;Gala and Morrison (2004) J. Immunol. 172:5489-94;Wallick et al (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7;Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697-706)。グリコシル化は、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を含有するモチーフで起こると知られている。いくつかの実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、可変領域グリコシル化を含有しない。これは、可変領域中にグリコシル化モチーフを含有しない抗体を選択することによってか、またはグリコシル化領域内の残基を突然変異させることによって達成され得る。
【０３２５】
ある実施形態では、本明細書に記載される抗体は、アスパラギン異性部位を含有しない。アスパラギンの脱アミド化は、Ｎ−ＧまたはＤ−Ｇ配列で起こり得、その結果、ポリペプチド鎖中にねじれを導入し、その安定性を低減する(イソアスパラギン酸効果)イソアスパラギン酸残基を生成する。例えば、アミノ酸配列Ａｓｐ−Ｇｌｙが、抗体の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ配列中に存在している場合、この配列は、異性化を受けていないアミノ酸配列と置換されている。ある実施形態では、抗体は、配列番号７６に記載される重鎖可変領域ＣＤＲ２配列を含むが、ここで、Ａｓｐ−Ｇｌｙ配列
【化３】
0006797137.tif 000009
中のＡｓｐまたはＧｌｙは、異性化を受けていないアミノ酸配列、例えば、Ａｓｐ−ＳｅｒまたはＳｅｒ−Ｇｌｙ配列と置換されている。別の実施形態では、抗体は、配列番号８８に記載される重鎖可変領域ＣＤＲ２配列を含むが、ここで、Ａｓｐ−Ｇｌｙ配列
【化４】
0006797137.tif 000010
中のＡｓｐまたはＧｌｙは、異性化を受けていないアミノ酸配列、例えば、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ、Ａｓｐ−ＡｌａまたはＳｅｒ−Ｔｈｒ配列と置換されている。
【０３２６】
各抗体は、独特の等電点(ｐＩ)を有し、これは、一般に、６から９.５の間のｐＨ範囲に入る。ＩｇＧ１抗体のｐＩは、通常、７〜９.５のｐＨ範囲内に入り、ＩｇＧ４抗体のｐＩは、通常、６〜８のｐＨ範囲内に入る。正常範囲の外側のｐＩを有する抗体は、インビボ条件下で幾分かのアンフォールディングおよび不安定性を有し得るという推測がある。したがって、正常範囲内に入るｐＩ値を含有する抗ＯＸ４０抗体を有することが好ましい。これは、正常範囲のｐＩを有する抗体を選択することによってか、または電荷を有する表面残基を突然変異させることによって達成され得る。
【０３２７】
各抗体は、特徴的な融解温度を有し、融解温度が高いほど、インビボで全体的な安定性が大きいことを示す(Krishnamurthy R and Manning M C (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71)。一般に、ＴＭ１(最初のアンフォールディングの温度)は、６０℃超、好ましくは、６５℃超、さらにより好ましくは、７０℃超であることが好ましい。抗体の融点は、示差走査熱量測定(Chen et al (2003) Pharm Res 20:1952-60;Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68:47-52)または円偏光二色性(Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9)を使用して測定できる。好ましい実施形態では、迅速に分解しない抗体が選択される。抗体の分解は、キャピラリー電気泳動(ＣＥ)およびＭＡＬＤＩ−ＭＳ(Alexander A J and Hughes D E (1995) Anal Chem 67:3626-32)を使用して測定できる。ある実施形態では、本明細書に開示される抗ＯＸ４０抗体(例えば、ＯＸ４０.２１抗体)は、増大した安定性を有する。
【０３２８】
したがって、その他の実施形態では、最小の凝集効果を有する抗体が選択され、凝集効果は、不要な免疫応答および／または変更されたか、もしくは不都合な薬物動態特性の誘発につながり得る。一般に、抗体は、２５％以下、好ましくは、２０％以下、さらにより好ましくは、１５％以下、さらにより好ましくは、１０％以下およびさらにより好ましくは、５％以下の凝集を有しても許容される。凝集は、サイズ排除カラム(ＳＥＣ)、高性能液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)および光散乱を含めた、いくつかの技術によって測定できる。
【０３２９】
IX. 抗体を遺伝子操作する方法
本明細書において論じられるように、本明細書に開示されるＶＨおよびＶＬ配列を有する抗ＯＸ４０抗体を使用して、抗体のＶＨおよび／もしくはＶＬ配列または定常領域を修飾することによって、新しい抗ＯＸ４０抗体を作製することができる。したがって、別の実施形態では、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体、例えば、３Ｆ４、１４Ｂ６−１、１４Ｂ６−２、２３Ｈ３、６Ｅ１−１、６Ｅ１−２、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３、１４Ａ２−１、１４Ａ２−２および２０Ｃ１の構造的特徴を使用して、ヒトＯＸ４０およびカニクイザルＯＸ４０との結合など、本明細書に記載される抗体の少なくとも１つの機能的特性を保持する、構造的に関連する抗ＯＸ４０抗体を作製する。例えば、３Ｆ４、１４Ｂ６−１、１４Ｂ６−２、２３Ｈ３、６Ｅ１−１、６Ｅ１−２、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３、１４Ａ２−１、１４Ａ２−２および２０Ｃ１またはそれらの突然変異体の１つまたは複数のＣＤＲ領域は、公知のフレームワーク領域および／または他のＣＤＲと組換えにより組み合わされて、上記で論じたように、組換えにより遺伝子操作されたさらなる抗ＯＸ４０抗体が作製される。他の種類の修飾として、前述の節に記載されているものが挙げられる。遺伝子操作方法の出発材料は、本明細書に提供されるＶＨおよび／またはＶＬ配列のうちの１つもしくは複数またはそれらの１つもしくは複数のＣＤＲ領域である。遺伝子操作された抗体を作製するために、必ずしも、本明細書に提供されるＶＨおよび／またはＶＬ配列のうちの１つもしくは複数またはそれらの１つもしくは複数のＣＤＲ領域を有する抗体を実際に調製する(すなわち、タンパク質を発現させる)必要はない。むしろ、配列に含まれる情報は、元の配列に由来する「第２世代」の配列を作製するために出発材料として使用され、次に、この「第２世代」の配列が、調製され、タンパク質として発現される。
【０３３０】
したがって、抗ＯＸ４０抗体を生成するための方法であって、
(ａ)(ｉ)配列番号１１、１９、３１、３９、５１、５９、６７、７５および８７からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号１２、２０、３２、４０、５２、６０、６８、７６、８８および３１７からなる群から選択されるＣＤＲ２配列ならびに／または配列番号１３、２１、３３、４１、５３、６１、６９、７７および８９からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む、重鎖可変領域抗体配列、ならびに(ii)配列番号１４、２２、２５、３４、４２、４５、５４、６２、７０、７８、８１および９０からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号１５、２３、２６、３５、４３、４６、５５、６３、７１、７９、８２および９１からなる群から選択されるＣＤＲ２配列ならびに／または配列番号１６、２４、２７、３６、４４、４７、５６、６４、７２、８０、８３および９２からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む、軽鎖可変領域抗体配列を提供すること、
(ｂ)重鎖可変領域抗体配列および／または軽鎖可変領域抗体配列内の少なくとも１つのアミノ酸残基を変更して、少なくとも１つの変更された抗体配列を作製すること、ならびに
(ｃ)変更された抗体配列をタンパク質として発現させることを含む、方法が本明細書において提供される。
【０３３１】
標準分子生物学技術を使用して、変更された抗体配列を調製し、発現することができる。
【０３３２】
好ましくは、変更された抗体配列によってコードされる抗体は、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体の機能的特性のうちの１種、いくつかまたは全てを保持するものであり、この特性としては、次のものが挙げられる：
(１)例えば、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定される場合、可溶性ヒトＯＸ４０と、例えば、１０ｎＭ以下(例えば、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ)のＫＤで結合すること、
(２)例えば、ＦＡＣＳによって測定される場合、膜結合型ヒトＯＸ４０と、例えば、１ｎＭ以下(例えば、０.０１ｎＭ〜１ｎＭ)のＥＣ５０で結合すること、
(３)例えば、ＦＡＣＳによって測定される場合、例えば、１０ｎＭ以下(例えば、０.０１ｎＭ〜１０ｎＭ)のＥＣ５０でカニクイザルＯＸ４０と結合すること、例えば、膜結合型カニクイザルＯＸ４０と結合すること、
(４)(ｉ)ＯＸ４０発現Ｔ細胞におけるＩＬ−２および／もしくはＩＦＮ−γ産生の増大ならびに／または(ii)Ｔ細胞増殖の増強によって示されるように、Ｔ細胞活性化を誘導または増強すること、
(５)例えば、ｈＯＸ４０−２９３細胞を用いたアッセイにおいて、ＦＡＣＳによって測定される場合、例えば、１ｎＭ以下のＥＣ５０で、ＯＸ４０リガンドのＯＸ４０との結合を阻害すること、
(６)成熟ヒトＯＸ４０の細胞外部分(配列番号２)のエピトープ、例えば、領域ＤＶＶＳＳＫＰＣＫＰＣＴＷＣＮＬＲ(配列番号１７８)内またはＤＳＹＫＰＧＶＤＣＡＰＣＰＰＧＨＦＳＰＧＤＮＱＡＣＫＰＷＴＮＣＴＬＡＧＫ(配列番号１７９)内のエピトープと結合すること、
(７)ヒトＯＸ４０との結合について、３Ｆ４、１４Ｂ６−１、１４Ｂ６−２、２３Ｈ３、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３および２０Ｃ１と競合すること、
(８)ヒトＯＸ４０との結合について、６Ｅ１−１、６Ｅ１−２、１４Ａ２−１および１４Ａ２−２と競合すること。
【０３３３】
変更された抗体は、上記の(１)から(７)に記載される機能的特性のうちの１種もしくは複数、２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種または全てを示し得る。変更された抗体の機能的特性は、当技術分野で利用可能であるおよび／または本明細書に記載される標準アッセイ、例えば実施例に記載されるもの(例えば、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ)を使用して評価することができる。
【０３３４】
本明細書に記載される抗体を遺伝子操作する方法のある実施形態では、突然変異を、抗ＯＸ４０抗体コード配列の全てまたは一部に沿って無作為または選択的に導入することができ、得られた修飾された抗ＯＸ４０抗体を、結合活性および／または本明細書に記載される他の機能的特性についてスクリーニングすることができる。突然変異の方法は、当技術分野で説明されている。例えば、ShortによるＰＣＴ公開ＷＯ０２／０９２７８０は、飽和突然変異誘発、合成ライゲーションアセンブリまたはこれらの組合せを使用した抗体突然変異体の作製およびスクリーニング方法について記載している。あるいは、Lazar et al.によるＰＣＴ公開ＷＯ０３／０７４６７９は、コンピュータによるスクリーニング方法を使用して抗体の生理化学特性を最適化する方法について記載している。
【０３３５】
Ｘ. 核酸分子
本明細書に記載される抗体をコードする核酸分子も本明細書において提供される。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、制限酵素、アガロースゲル電気泳動および当技術分野で周知のその他のものを含めた標準技術によって、その他の細胞成分またはその他の夾雑物、例えば、その他の細胞性核酸(例えば、その他の染色体ＤＮＡ、例えば、自然界では単離されたＤＮＡと連結している染色体ＤＮＡ)またはタンパク質から精製された場合に、全細胞中に、細胞溶解物中に、または部分精製されたかもしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、「単離される」かまたは「実質的に純粋にされる」。F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New Yorkを参照のこと。核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、イントロン配列を含有する場合も、含有しない場合もある。ある実施形態では、核酸は、ｃＤＮＡ分子である。
【０３３６】
本明細書において提供される核酸は、標準分子生物学技術を使用して得ることができる。ハイブリドーマ(例えば、以下にさらに記載されるようなヒト免疫グロブリン遺伝子を保持するトランスジェニックマウスから調製されたハイブリドーマ)によって発現される抗体については、ハイブリドーマによって作製された抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準ＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術によって得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから(例えば、ファージディスプレイ技術を使用して)から得られる抗体については、抗体をコードする核酸は、ライブラリーから回収され得る。
【０３３７】
好ましい核酸分子は、３Ｆ４、１４Ｂ６−１、１４Ｂ６−２、２３Ｈ３、６Ｅ１−１、６Ｅ１−２、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３、１４Ａ２−１、１４Ａ２−２および２０Ｃ１のＶＨおよびＶＬ配列をコードするものである。３Ｆ４、１４Ｂ６、２３Ｈ３、６Ｅ１、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３、１４Ａ２および２０Ｃ１のＶＨ配列をコードする例示的ＤＮＡ配列は、それぞれ、配列番号１２６、１２８、１３１、１３３、１３６、１３８、１４０、１４２および１４５に記載されている。３Ｆ４、１４Ｂ６−１、１４Ｂ６−２、２３Ｈ３、６Ｅ１−１、６Ｅ１−２、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３、１４Ａ２−１、１４Ａ２−２および２０Ｃ１のＶＬ配列をコードする例示的ＤＮＡ配列は、それぞれ、配列番号１２７、１２９、１３０、１３２、１３４、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４４および１４６に記載されている。重鎖配列をコードする例示的ＤＮＡ配列は、配列番号１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９１７１、１７３、１７５、１７６および１７７に記載されている。軽鎖配列をコードする例示的ＤＮＡ配列は、配列番号１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２および１７４に記載されている。
【０３３８】
抗ＯＸ４０抗体の成熟ＶＨおよびＶＬドメインをコードする例示的ヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号１４５および１４６に記載されている。抗ＯＸ４０抗体の重鎖をコードする例示的ヌクレオチド配列は、配列番号１７７に記載されている。ＯＸ４０抗体の軽鎖をコードする例示的ヌクレオチド配列は、配列番号１６８に記載されている。
【０３３９】
本明細書に提供される抗ＯＸ４０抗体を作製するための方法は、重鎖および軽鎖をコードするヌクレオチド配列をシグナルペプチドとともに含む細胞株において、重鎖および軽鎖を発現することを含み得る。これらのヌクレオチド配列を含む宿主細胞もまた、本明細書において提供される。
【０３４０】
ＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られると、例えば、可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子に、Ｆａｂ断片遺伝子に、またはｓｃＦｖ遺伝子に変換するよう、標準組換えＤＮＡ技術によってこれらのＤＮＡ断片をさらに操作できる。これらの操作では、ＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡ断片は、抗体定常領域または可動性リンカーなどの別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片と作動可能に連結している。この文脈において使用されるような、用語「作動可能に連結された」は、２種のＤＮＡ断片がコードするアミノ酸配列がインフレームのままであるような、２種のＤＮＡ断片の接続を指す。
【０３４１】
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域(ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３)をコードする別のＤＮＡ分子と作動可能に連結することによって、全長重鎖遺伝子に変換され得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野で公知であり(例えば、Kabat, E. A., el al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照のこと)、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準ＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域、例えば、ＩｇＧ１領域であり得る。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子については、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子と作動可能に連結され得る。
【０３４２】
ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域、ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子と作動可能に連結することによって、全長軽鎖遺伝子(ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子)に変換され得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野で公知であり(例えば、Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照のこと)、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準ＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、κまたはλ定常領域であり得る。
【０３４３】
ｓｃＦｖ遺伝子を作製するために、ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡ断片を、例えば、アミノ酸配列(Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ)３をコードする可動性リンカーをコードする別の断片に作動可能に連結し、その結果、ＶＨおよびＶＬ配列が、可動性リンカーによって接続されたＶＬおよびＶＨ領域を有する連続一本鎖タンパク質として発現され得る(例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426;Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883;McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554を参照のこと)。
【０３４４】
さらに、３Ｆ４、１４Ｂ６−１、１４Ｂ６−２、２３Ｈ３、６Ｅ１−１、６Ｅ１−２、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３、１４Ａ２−１、１４Ａ２−２および２０Ｃ１モノクローナル抗体のものと相同であるＶＨおよびＶＬ配列をコードする核酸分子が、本明細書において提供される。例示的核酸分子は、３Ｆ４、１４Ｂ６−１、１４Ｂ６−２、２３Ｈ３、６Ｅ１−１、６Ｅ１−２、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３、１４Ａ２−１、１４Ａ２−２および２０Ｃ１モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ配列をコードする核酸分子と少なくとも７０％同一である、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一である、ＶＨおよびＶＬ配列をコードする。さらに、例えば、コドン最適化のために、保存的置換(すなわち、核酸分子の翻訳時に得られるアミノ酸配列を変更しない置換)を有する核酸分子が、本明細書において提供される。
【０３４５】
XI. 抗体作製
本明細書に開示される抗ＯＸ４０抗体は、Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)によって記載される標準体細胞ハイブリダイゼーション技術などの種々の公知の技術を使用して産生できる。体細胞ハイブリダイゼーション手順は好ましいが、原理上、モノクローナル抗体を産生するためのその他の技術、例えば、Ｂリンパ球のウイルス性または発癌性形質転換、ヒト抗体遺伝子のライブラリーを使用するファージディスプレイ技術も使用できる。
【０３４６】
ハイブリドーマを調製するための好ましい動物系として、マウス系がある。マウスにおけるハイブリドーマ産生は、極めて十分に確立された手順である。免疫処置プロトコールおよび技術および融合のために免疫処置された脾細胞を単離するための技術は、当技術分野で公知である。融合パートナー(例えば、マウス骨髄腫細胞)および融合手順も公知である。
【０３４７】
本明細書に記載されるキメラまたはヒト化抗体は、上記のように調製したマウスモノクローナル抗体の配列に基づいて調製できる。標準分子生物学技術を使用して、重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡを、対象のマウスハイブリドーマから得、非マウス(例えば、ヒト)免疫グロブリン配列を含有するよう遺伝子操作できる。例えば、当技術分野で公知の方法を使用して、キメラ抗体を作製するために、マウス可変領域をヒト定常領域に連結できる(例えば、Cabilly et al.の米国特許第４,８１６,５６７号を参照のこと)。ヒト化抗体を作製するために、当技術分野で公知の方法を使用して、ヒトフレームワーク中にマウスＣＤＲ領域を挿入できる(例えば、Winterの米国特許第５,２２５,５３９号およびQueen et al.の米国特許第５,５３０,１０１号；同５,５８５,０８９号；同５,６９３,７６２号および同６,１８０,３７０号を参照のこと)。
【０３４８】
ある実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。このようなＯＸ４０に対して向けられたヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫系の部分を保持する、トランスジェニックまたはトランスクロモソミック(transchromosomic)マウスを使用して作製できる。これらのトランスジェニックおよびトランスクロモソミック(transchromosomic)マウスは、本明細書において、それぞれＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスと呼ばれるマウスを含み、本明細書において、まとめて「ヒトＩｇマウス」と呼ばれる。
【０３４９】
ＨｕＭＡｂマウス(登録商標)(Medarex, Inc.)は、再編成されていないヒト重鎖(μおよびγ)およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座(miniloci)を、内因性μおよびκ鎖遺伝子座を不活性化する標的化された突然変異とともに含有する(例えば、Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859を参照のこと)。したがって、マウスは、マウスＩｇＭまたはκの発現の低下を示し、免疫処置に応じて、導入されたヒト重鎖および軽鎖 導入遺伝子は、クラススイッチおよび体細胞突然変異を受けて、高親和性ヒトＩｇＧκモノクローナルを生成する(Lonberg, N. et al. (1994)、前掲; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101;Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93およびHarding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546に概説されている)。ＨｕＭａｂマウスの調製および使用ならびにこのようなマウスによって保持されるゲノム修飾は、Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295;Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656;Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724;Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830;Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920;Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591;およびFishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851にさらに記載されており、それらの開示内容は、その全文が参照により本明細書に組み込まれる。さらに、全てLonbergおよびKayの米国特許第５,５４５,８０６号；同５,５６９,８２５号；同５,６２５,１２６号；同５,６３３,４２５号；同５,７８９,６５０号；同５,８７７,３９７号；同５,６６１,０１６号；同５,８１４,３１８号；同５,８７４,２９９号；および同５,７７０,４２９号；Surani et al.の米国特許第５,５４５,８０７号；全てLonbergおよびKayのＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９７／１３８５２、ＷＯ９８／２４８８４およびＷＯ９９／４５９６２ならびにKorman et al.のＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／１４４２４を参照のこと。
【０３５０】
ある実施形態では、本明細書に記載される抗体は、導入遺伝子および導入染色体上にヒト免疫グロブリン配列を保持するマウス、例えば、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を保持するマウスを使用して作製される。本明細書において「ＫＭマウス」と呼ばれるこのようなマウスは、Ishida et al.のＰＣＴ公開ＷＯ０２／４３４７８に詳細に記載されている。
【０３５１】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替トランスジェニック動物系が、当技術分野で利用可能であり、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体を作製するために使用できる。例えば、Xenomouse(Abgenix、Inc.)と呼ばれる代替トランスジェニック系を使用でき、このようなマウスは、例えば、Kucherlapati et al.の米国特許第５,９３９,５９８号；同６,０７５,１８１号；同６,１１４,５９８号；同６、１５０,５８４号および同６,１６２,９６３号に記載されている。
【０３５２】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替トランスクロモソミック(transchromosomic)動物系は、当技術分野で利用可能であり、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体を作製するために使用できる。例えば、「ＴＣマウス」と呼ばれる、ヒト重鎖導入染色体(transchromosome)およびヒト軽鎖導入染色体の両方を保持するマウスを使用でき、このようなマウスは、Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727に記載されている。さらに、ヒト重鎖および軽鎖導入染色体(transchromosome)を保持するウシが、当技術分野で記載されており(Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894)、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体を作製するために使用できる。
【０３５３】
ヒト抗体、例えば、ヒト抗ＯＸ４０抗体を作製するための当技術分野において記載されるさらなるマウス系として、(ｉ)内因性マウス重鎖および軽鎖可変領域が、相同組換えによって、内因性マウス定常領域に作動可能に連結された、ヒト重鎖および軽鎖可変領域と置換されており、その結果、マウスにおいてキメラ抗体(ヒトＶ／マウスＣ)が作製され、次いで、その後、標準組換えＤＮＡ技術を使用して完全ヒト抗体に変換される、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ(登録商標)マウス(Regeneron Pharmaceuticals, Inc.)ならびに(ii)マウスが再編成されていないヒト重鎖可変領域、しかし単一の再変性されたヒト共通軽鎖可変領域を含有するＭｅＭｏ(登録商標)マウス(Merus Biopharmaceuticals, Inc.)が挙げられる。このようなマウスおよび抗体を作製するためのその使用は、例えば、ＷＯ２００９／１５７７７、ＵＳ２０１０／００６９６１４、ＷＯ２０１１／０７２２０４、ＷＯ２０１１／０９７６０３、ＷＯ２０１１／１６３３１１、ＷＯ２０１１／１６３３１４、ＷＯ２０１２／１４８８７３、ＵＳ２０１２／００７０８６１およびＵＳ２０１２／００７３００４に記載されている。
【０３５４】
本明細書に記載されるヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ法を使用して調製できる。ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ法は、当技術分野で確立されている。例えば、Ladner et al.の米国特許第５,２２３,４０９号；同５,４０３,４８４号；および同５,５７１,６９８号；Dower et al.の米国特許第５,４２７,９０８号および同５,５８０,７１７号； McCafferty et al.の米国特許第５,９６９,１０８号および同６,１７２,１９７号；ならびにGriffiths et al.の米国特許第５,８８５,７９３号；同６,５２１,４０４号；同６,５４４,７３１号；同６,５５５,３１３号；同６,５８２,９１５号および同６,５９３,０８１号を参照のこと。
【０３５５】
本明細書に記載されるヒトモノクローナル抗体はまた、免疫処置の際にヒト抗体応答が生じ得るようヒト免疫細胞が再構成されているＳＣＩＤマウスを使用して調製できる。このようなマウスは、例えば、Wilson et alの米国特許第５,４７６,９９６号および同５,６９８,７６７号に記載されている。
【０３５６】
免疫処置
ＯＸ４０に対する完全ヒト抗体を作製するために、例えば、Lonberg et al. (1994) Nature 368(6474): 856−859;Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851およびＷＯ９８／２４８８４によって、その他の抗原について記載されるように、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含有するトランスジェニックまたはトランスクロモソーマルマウス(例えば、ＨＣｏ１２、ＨＣｏ７またはＫＭマウス)を、ＯＸ４０抗原および／またはＯＸ４０またはその断片を発現する細胞の精製または濃縮された調製物を用いて免疫処置できる。あるいは、マウスをヒトＯＸ４０またはその断片をコードするＤＮＡを用いて免疫処置できる。好ましくは、マウスは、第１の注入の際に６〜１６週齢とする。例えば、ＨｕＭＡｂマウスを腹膜内に免疫処置するために、組換えＯＸ４０抗原の精製または濃縮された調製物(５〜５０μｇ)を使用できる。ＯＸ４０抗原の精製または濃縮された調製物を使用する免疫処置が抗体をもたらさない事象では、ＯＸ４０を発現する細胞、例えば、細胞系統を用いてマウスを免疫処置して、免疫応答を促進することもできる。例示的細胞系統として、ＯＸ４０過剰発現性安定ＣＨＯおよびＲａｊｉ細胞系統が挙げられる。
【０３５７】
種々の抗原を用いる累積的経験は、ＨｕＭＡｂトランスジェニックマウスは、Ｒｉｂｉアジュバント中の抗原を用いる最初に腹膜内(ＩＰ)または皮下(ＳＣ)免疫処置と、それに続く、Ｒｉｂｉアジュバント中の抗原を用いる隔週でのＩＰ／ＳＣ免疫処置(最大合計１０)の際に最良に応答することを示した。免疫応答は、後眼窩出血によって得られている血漿サンプルを用いて、免疫処置プロトコールの過程にわたってモニタリングできる。血漿は、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳによってスクリーニングでき(以下に記載されるように)、抗ＯＸ４０ヒト免疫グロブリンの十分な力価を有するマウスを融合のために使用できる。マウスを、抗原を用いて静脈内に追加免疫し、３日後に、屠殺し、脾臓およびリンパ節を採取できる。各免疫処置のために２〜３回の融合が実施されることが必要であり得ると予測される。各抗原について、６から２４匹の間のマウスが、通常免疫処置される。通常、ＨＣｏ７、ＨＣｏ１２およびＫＭ系統が使用される。さらに、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２導入遺伝子は両方とも、２種の異なるヒト重鎖導入遺伝子を有する(ＨＣｏ７／ＨＣｏ１２)単一マウスに一緒に育種され得る。
【０３５８】
ＯＸ４０に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製
本明細書に記載される抗体を産生するハイブリドーマを作製するために、免疫処置されたマウスから脾細胞および／またはリンパ節細胞を単離し、マウス骨髄腫細胞系統などの適当な不死化細胞系統と融合できる。得られたハイブリドーマを抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングできる。例えば、５０％  ＰＥＧを用いて、免疫処置マウス由来の脾臓リンパ球の単細胞懸濁液を、Ｓｐ２／０非分泌性マウス骨髄腫細胞(ＡＴＣＣ、ＣＲＬ  １５８１)と融合できる。細胞を、およそ２×１０５で平底マイクロタイタープレートにプレーティングし、続いて、１０％胎児クローン血清、１８％「６５３」コンディショニング培地、５％オリゲン(origen)(ＩＧＥＮ)、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０.０５５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、５０ユニット／ｍｌペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび１Ｘ  ＨＡＴ(Ｓｉｇｍａ)を含有する選択培地で２週間インキュベートする。およそ２週間後、細胞をＨＡＴがＨＴと置換されている培地で培養できる。次いで、個々のウェルを、ヒトモノクローナルＩｇＭおよびＩｇＧ抗体についてＥＬＩＳＡによってスクリーニングできる。広範なハイブリドーマ成長が起こると、１０〜１４日後に通常に培地を観察できる。抗体を分泌するハイブリドーマを再プレーティングし、再度スクリーニングでき、ヒトＩｇＧについて依然として陽性である場合に、制限希釈によってモノクローナル抗体を少なくとも２回サブクローニングできる。次いで、安定なサブクローンをインビトロで培養して、特性決定のために組織培養培地において少量の抗体を作製できる。
【０３５９】
抗体を精製するために、選択されたハイブリドーマを、モノクローナル抗体精製のために２リットルのスピナーフラスコ中で成長させることができる。プロテインＡ−セファロース(Pharmacia、Piscataway、Ｎ.Ｊ.)を用いるアフィニティークロマトグラフィーの前に、上清を濾過し、濃縮できる。溶出されたＩｇＧを、ゲル電気泳動および高性能液体クロマトグラフィーによって調べ、純度を確実にすることができる。バッファー溶液は、ＰＢＳに交換でき、１.４３吸光係数を使用してＯＤ２８０によって濃度を決定できる。次いで、抗体をアリコートにし、−８０℃で保存できる。
【０３６０】
ＯＸ４０に対するモノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの作製
抗体を、当技術分野で周知であるように、例えば、組換えＤＮＡ技術および遺伝子トランスフェクション法の組合せを使用して宿主細胞トランスフェクトーマにおいて産生できる(Morrison, S. (1985) Science 229:1202)。
【０３６１】
例えば、抗体またはその抗体断片を発現させるために、部分または全長軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを、標準分子生物学技術(例えば、ＰＣＲ増幅または対象の抗体を発現するハイブリドーマを使用するｃＤＮＡクローニング)によって得ることができ、遺伝子が、転写および翻訳制御配列に作動可能に連結されるように、ＤＮＡを発現ベクター中に挿入することができる。これに関連して、用語「作動可能に連結された」は、ベクター内の転写および翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するというその意図される機能を果たすよう、抗体遺伝子がベクター中にライゲーションされることを意味するものとする。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するよう選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、別個のベクター中に挿入されてもよく、または両遺伝子は、同一発現ベクター中に挿入される。抗体遺伝子は、標準方法(例えば、抗体遺伝子断片上の相補的制限部位およびベクターの連結または制限部位が存在しない場合には平滑末端連結)によって、発現ベクター(単数または複数)中に挿入される。本明細書に記載される抗体の軽鎖および重鎖可変領域を使用し、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメント(単数または複数)と作動可能に連結され、ＶＬセグメントが、ベクター内のＣＬセグメントと作動可能に連結されるように、それらを所望のアイソタイプの重鎖定常および軽鎖定常領域をすでにコードする発現ベクター中に挿入することによって任意の抗体アイソタイプの全長抗体遺伝子を作製できる。
【０３６２】
これに加えてまたはこれとは別に、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードし得る。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが、抗体鎖遺伝子のアミノ末端とインフレームで連結されるように、ベクター中にクローニングできる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド(すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド)であり得る。抗体の重鎖および軽鎖において使用するための例示的シグナル配列として、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体に元々見出されるシグナル配列が挙げられる。
【０３６３】
組換え発現ベクターは、抗体鎖遺伝子に加えて、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を保持し得る。用語「調節配列」とは、プロモーター、エンハンサーおよび抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するその他の発現制御エレメント(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含むものとする。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ(Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990))に記載されている。調節配列の選択を含めた発現ベクターの設計は、形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどのような因子に応じて変わり得る当業者には明らかである。哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい調節配列として、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)、サルウイルス４０(ＳＶ４０)、アデノウイルス(例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター(ＡｄＭＬＰ)およびポリオーマ由来のプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルスエレメントが挙げられる。あるいは、ユビキチンプロモーターまたはβ−グロビンプロモーターなどの非ウイルス調節配列を使用してもよい。なおさらに、ＳＶ４０初期プロモーター由来の配列およびヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長い末端反復配列を含有する、ＳＲαプロモーター系などの異なる供給源に由来する配列からなる調節エレメント(Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472)。
【０３６４】
組換え発現ベクターは、抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列(例えば、複製の起点)などのさらなる配列および選択マーカー遺伝子を保持し得る。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を促進する(例えば、全てAxel et al.による米国特許第４,３９９,２１６号、同４,６３４,６６５号および同５,１７９,０１７号を参照のこと)。例えば、通常、選択マーカー遺伝子は、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を、ベクターが導入されている宿主細胞に付与する。好ましい選択マーカー遺伝子として、ジヒドロホレートレダクターゼ(ＤＨＦＲ)遺伝子(メトトレキサート選択／増幅とともに、ｄｈｆｒ−宿主細胞において使用するための)およびｎｅｏ遺伝子(Ｇ４１８選択のための)が挙げられる。
【０３６５】
軽鎖および重鎖の発現のために、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクター(単数または複数)を、標準技術によって宿主細胞にトランスフェクトする。用語「トランスフェクション」の種々の形態は、原核生物または真核生物宿主細胞への外因性ＤＮＡの導入のためによく使用される様々な技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを包含するものとする。原核生物または真核生物宿主細胞のいずれかにおいて本明細書に記載される抗体を発現させることは理論上可能であるが、真核細胞、最も好ましくは、哺乳動物宿主細胞における抗体の発現が、最も好ましいが、これは、このような真核細胞、特に、哺乳動物細胞は、適切にフォールディングされ、免疫学的に活性な抗体を組み立て、分泌する可能性が原核細胞よりも高いからである。抗体遺伝子の原核生物発現は、活性な抗体の高効率の産生にとっては有効ではないと報告されている(Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13)。本明細書に開示される抗体はまた、酵母ピキア・パストリス(Pichia pastoris)の糖鎖操作された株においても産生できる。Li et al. (2006) Nat. Biotechnol. 24:210。
【０３６６】
本明細書に記載される組換え抗体を発現させるための好ましい哺乳動物宿主細胞として、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ細胞)(例えば、R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621に記載されるように、ＤＨＦＲ選択マーカーとともに使用される、Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記載されたｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む)、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞が挙げられる。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞とともに使用するためには、別の好ましい発現系として、ＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６およびＥＰ３３８,８４１に開示されるＧＳ遺伝子発現系がある。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターは、哺乳動物宿主細胞中に導入され、抗体は、宿主細胞を、宿主細胞における抗体の発現、またはより好ましくは、宿主細胞が成長した培養培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間培養することによって産生される。抗体は、標準タンパク質精製法を使用して培養培地から回収できる。
【０３６７】
本発明の抗体ポリペプチド鎖のＮおよびＣ末端は、よく観察される翻訳後修飾によって予測される配列とは異なることもある。例えば、Ｃ末端リシン残基は、抗体重鎖から失われていることが多い。Dick et al. (2008) Biotechnol. Bioeng. 100:1132。N末端グルタミン残基およびより少ない程度であるが、グルタミン酸残基は、治療用抗体の軽鎖および重鎖の両方でピログルタミン酸残基に変換されることが頻繁にある。Dick et al. (2007) Biotechnol. Bioeng. 97:544;Liu et al. (2011) JBC 28611211;Liu et al. (2011) J. Biol. Chem. 286:11211。
【０３６８】
XII. アッセイ
本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体は、ＯＸ４０との結合について、例えば、標準ＥＬＩＳＡによって試験できる。簡潔には、マイクロタイタープレートを精製されたＯＸ４０を、ＰＢＳ中１〜２μｇ／ｍＬで用いてコーティングし、次いで、ＰＢＳ中５％ウシ血清アルブミンを用いてブロッキングする。各ウェルに抗体の希釈物(例えば、ＯＸ４０免疫処置マウスから得た血漿の希釈物)を添加し、３７℃で１〜２時間インキュベートする。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎを用いて洗浄し、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)とコンジュゲートしている二次試薬(例えば、ヒト抗体、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的ポリクローナル試薬)とともに３７℃で１時間インキュベートする。洗浄した後、プレートをＡＢＴＳ基質(Ｍｏｓｓ  Ｉｎｃ、ｐｒｏｄｕｃｔ：ＡＢＴＳ−１０００)を用いて発色させ、ＯＤ４１５〜４９５で分光光度計によって分析する。次いで、免疫処置されたマウスから得た血清を、ＯＸ４０を発現しない対照細胞株とではなく、ヒトＯＸ４０を発現する細胞株との結合についてフローサイトメトリーによってさらにスクリーニングする。簡潔には、抗ＯＸ４０抗体の結合を、ＯＸ４０発現性ＣＨＯ細胞を１：２０希釈の抗ＯＸ４０抗体とともにインキュベートすることによって評価する。細胞を洗浄し、結合を、ＰＥ標識された抗ヒトＩｇＧ  Ａｂを用いて検出する。ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー(Becton Dickinson、San Jose、ＣＡ)を使用してフローサイトメトリー分析を実施する。最高の力価を発生するマウスが、融合に使用されることが好ましい。
【０３６９】
上記のようなＥＬＩＳＡアッセイを使用して、抗体、ひいては、ＯＸ４０免疫原と陽性の反応性を示す抗体を産生するハイブリドーマについてスクリーニングできる。好ましくは、高親和性でＯＸ４０と結合する抗体を産生するハイブリドーマを、サブクローニングし、さらに特性決定できる。細胞バンクを作製するために、抗体精製のために、親細胞の反応性を保持する(ＥＬＩＳＡによって)各ハイブリドーマから１つのクローンを選択できる。
【０３７０】
抗ＯＸ４０抗体を精製するために、モノクローナル抗体精製のために２リットルのスピナーフラスコ中で選択されたハイブリドーマを成長させることができる。プロテインＡ−セファロース(Pharmacia、Piscataway、ＮＪ)を用いるアフィニティークロマトグラフィーの前に、上清を濾過し、濃縮できる。溶出されたＩｇＧを、ゲル電気泳動および高性能液体クロマトグラフィーによって調べ、純度を確実にすることができる。バッファー溶液は、ＰＢＳに交換でき、１.４３吸光係数を使用してＯＤ２８０によって濃度を決定できる。モノクローナル抗体をアリコートにし、−８０℃で保存できる。
【０３７１】
選択された抗ＯＸ４０抗体が独特のエピトープと結合するか否かを調べるために、市販の試薬(Pierce、Rockford、ＩＬ)を使用して各抗体をビオチン化できる。ビオチン化ＭＡｂ結合は、ストレプトアビジン標識されたプローブを用いて検出できる。上記のように、ＯＸ４０コーティングされたＥＬＩＳＡプレートを使用して、非標識モノクローナル抗体およびビオチン化モノクローナル抗体を使用する競合研究を実施できる。
【０３７２】
精製された抗体のアイソタイプを調べるために、特定のアイソタイプの抗体に対して特異的な試薬を使用してアイソタイプＥＬＩＳＡを実施できる。例えば、ヒトモノクローナル抗体のアイソタイプを調べるために、１μｇ／ｍＬの抗ヒト免疫グロブリンを用いてマイクロタイタープレートのウェルを、４℃で一晩コーティングできる。１％  ＢＳＡを用いてブロッキングした後、プレートを、１μｇ／ｍｌ以下の試験モノクローナル抗体または精製されたアイソタイプ対照と周囲温度で１〜２時間反応させる。次いで、ウェルをヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＭ特異的アルカリホスファターゼがコンジュゲートしているプローブのいずれかと反応させる。プレートを上記のように発色させ、分析する。
【０３７３】
抗体の、ＯＸ４０を発現する生存細胞との結合を調べるために、実施例に記載されるようにフローサイトメトリーを使用できる。簡潔には、膜結合性ＯＸ４０を発現する細胞株(標準成長条件下で成長させた)を、０.１％  ＢＳＡを含有するＰＢＳ中、種々の濃度のモノクローナル抗体と４℃で１時間混合する。洗浄した後、細胞を、一次抗体染色と同一条件下でフルオレセイン標識された抗ＩｇＧ抗体と反応させる。サンプルを光および側方散乱特性を使用するＦＡＣＳｃａｎ機器によって分析して、単細胞でゲート開閉し、標識された抗体の結合を調べる。フローサイトメトリーアッセイ(に加えて、または代わりに)、蛍光顕微鏡を使用する代替アッセイを使用してもよい。上記のように細胞を正確に染色し、蛍光顕微鏡によって調べることができる。この方法によって、個々の細胞の可視化が可能となるが、抗原の密度に応じて減少した感受性を有し得る。
【０３７４】
抗ＯＸ４０抗体は、ウエスタンブロッティングによってＯＸ４０抗原との反応性についてさらに試験できる。簡潔には、ＯＸ４０を発現する細胞から細胞抽出物を調製し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に付すことができる。電気泳動後、分離された抗原をニトロセルロースメンブランにトランスファーし、２０％マウス血清を用いてブロッキングし、試験されるべきモノクローナル抗体を用いてプロービングする。抗ＩｇＧアルカリホスファターゼを使用してＩｇＧ結合を検出し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質錠剤を用いて発色させることができる(Sigma Chem. Co.、St. Louis、ＭＯ)。
【０３７５】
結合親和性、交差反応性および結合速度論を解析する方法は、当技術分野で公知の標準アッセイ、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)２０００ＳＰＲ機器(Biacore AB、Uppsala、Sweden)を使用するＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)ＳＰＲ分析を含む。
【０３７６】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、ヒトＯＸ４０の細胞外領域と特異的に結合する。例えば、抗体は、ＯＸ４０の細胞外ドメイン内の特定のドメイン(例えば、機能的ドメイン)と特異的に結合し得る。ある実施形態では、抗体は、ＯＸ４０−Ｌが結合するＯＸ４０上の部位と特異的に結合する。その他の実施形態では、抗体は、ヒトＯＸ４０の細胞外領域およびカニクイザルＯＸ４０の細胞外領域と特異的に結合する。
【０３７７】
XIII. イムノコンジュゲート、抗体誘導体および診断薬
本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体は、サンプルの試験およびインビボ撮像を含む診断目的で使用することができ、この目的で、抗体(またはその結合断片)は、適当な検出可能な薬剤とコンジュゲートして、イムノコンジュゲートを形成することができる。診断目的では、適当な薬剤は、全身撮像のための放射性同位体ならびにサンプルの試験のための放射性同位体、酵素、蛍光標識および他の好適な抗体タグを含む、検出可能な標識である。
【０３７８】
検出可能な標識は、コロイド金などの金属ゾルを含む粒子標識、例えばＮ２Ｓ２、Ｎ３ＳもしくはＮ４型のペプチド性キレート剤とともに提示されるＩ１２５またはＴｃ９９などの同位体、蛍光マーカー、ビオチン、発光マーカー、リン光マーカーなどを含む発色団ならびに所与の基質を検出可能なマーカーに変換する酵素標識およびポリメラーゼ連鎖反応などの増幅後に示されるポリヌクレオチドタグを含め、インビトロ診断の分野において現在使用されている様々な種類のうちのいずれかであり得る。ビオチン化抗体は、次いで、アビジンまたはストレプトアビジンの結合によって検出可能となる。好適な酵素標識として、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼなどが挙げられる。例えば、標識は、アダマンチルメトキシホスホリルオキシフェニルジオキセタン(ＡＭＰＰＤ)、ジナトリウム３−(４−(メトキシスピロ｛１,２−ジオキセタン−３,２’−(５’−クロロ)トリシクロ｛３.３.１.１  ３,７｝デカン｝−４−イル)フェニルホスフェート(ＣＳＰＤ)などの１,２ジオキセタン基質ならびにＣＤＰおよびＣＤＰ−ｓｔａｒ(登録商標)または当業者に周知の他の発光性基質、例えば、テルビウム(III)およびユーロピウム(III)などの好適なランタニドのキレートの変換後の化学発光の存在または形成を測定することによって検出される、酵素アルカリホスファターゼであり得る。検出手段は、選択された標識によって決定される。標識またはその反応産物の出現は、標識が粒子であり、適当なレベルで蓄積する場合には、裸眼で、または分光光度計、ルミノメーター、蛍光光度計などの機器を使用して、達成され得るが、全て標準的な慣例に従う。
【０３７９】
好ましくは、コンジュゲーション法は、実質的に(またはほぼ)非免疫原性である結合、例えば、ペプチド(すなわち、アミド)結合、スルフィド結合(立体障害)、ジスルフィド結合、ヒドラゾン結合およびエーテル結合を生じる。これらの結合は、ほぼ非免疫原性であり、血清内で妥当な安定性を示す(例えば、Senter, P. D., Curr. Opin. Chem. Biol. 13 (2009) 235-244、ＷＯ２００９／０５９２７８、ＷＯ９５／１７８８６を参照のこと)。
【０３８０】
部分および抗体の生化学的性質に応じて、異なるコンジュゲーション戦略を用いることができる。部分が、５０〜５００個のアミノ酸の天然に存在するポリペプチドまたは組換えポリペプチドである場合、標準的な手順は、タンパク質コンジュゲートの合成のための化学反応について記載した教則本にあり、当業者であれば容易に従うことができる(例えば、Hackenberger, C. P. R., and Schwarzer, D., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 47 (2008) 10030-10074を参照のこと)。ある実施形態では、抗体または部分内のマレイミド部分とシステイン残基との反応が使用される。これは、例えば、抗体のＦａｂまたはＦａｂ’断片が使用される場合に、特に好適なカップリング化学反応である。あるいは、ある実施形態では、抗体または部分のＣ末端へのカップリングが行われる。タンパク質、例えば、Ｆａｂ断片のＣ末端修飾は、例えば、記載されるように行われ得る(Sunbul, M. and Yin, J., Org. Biomol. Chem. 7 (2009) 3361-3371)。
【０３８１】
一般に、部位特異的反応および共有結合カップリングは、天然のアミノ酸を、存在する他の官能基の反応性に直交性である反応性を有するアミノ酸に変換することに基づく。例えば、稀な配列構成内の特定のシステインは、アルデヒドに酵素変換され得る(Frese, M. A., and Dierks, T., ChemBioChem. 10 (2009) 425-427を参照のこと)。所与の配列構成における特定の酵素の、天然のアミノ酸との特異的酵素反応性を利用することによって、所望されるアミノ酸修飾を得ることもまた可能である(例えば、Taki, M. et al., Prot. Eng. Des. Sel. 17 (2004) 119-126、Gautier, A. et al. Chem. Biol. 15 (2008) 128-136、およびProtease-catalyzed formation of C--N bonds is described in Bordusa, F., Highlights in Bioorganic Chemistry (2004) 389-403を参照のこと)。
【０３８２】
部位特異的反応および共有結合カップリングはまた、末端アミノ酸の、適当な修飾試薬との選択的反応によっても達成され得る。
【０３８３】
Ｎ末端システインの、ベンゾニトリルとの反応性(Ren et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48 (2009) 9658-9662を参照のこと)を使用して、部位特異的共有結合カップリングを達成することができる。
【０３８４】
天然の化学的ライゲーションはまた、Ｃ末端システイン残基に依存し得る(Taylor, E. Vogel; Imperiali, B, Nucleic Acids and Molecular Biology (2009), 22 (Protein Engineering), 65-96)。
【０３８５】
ＥＰ１  ０７４  ５６３は、負に荷電したアミノ酸のストレッチ内のシステインの、正に荷電したアミノ酸のストレッチ内に位置するシステインよりも早い反応に基づくコンジュゲーション法について記載している。
【０３８６】
部分はまた、合成ペプチドまたはペプチド模倣体であってもよい。ポリペプチドが化学合成される場合、直交性化学反応性を有するアミノ酸は、このような合成中に組み込まれ得る(例えば、de Graaf et al., Bioconjug. Chem. 20 (2009) 1281-1295を参照のこと)。多種多様な直交性官能基が問題となっており、合成ペプチドに導入され得るため、このようなペプチドの、リンカーとのコンジュゲーションは、標準化学反応である。
【０３８７】
単一標識ポリペプチドを得るために、１：１の化学量論のコンジュゲートを、他のコンジュゲーション副産物からクロマトグラフィーによって分離してもよい。この手順は、色素標識した結合対メンバーおよび荷電リンカーを使用することにより容易となり得る。この種類の標識および高度に負に荷電した結合対メンバーを使用することにより、モノコンジュゲートしたポリペプチドは、非標識ポリペプチドおよび１種を上回るリンカーを有するポリペプチドから容易に分離されるが、これは、電荷および分子量における相違を分離に使用できるためである。蛍光色素は、標識した一価結合剤などの未結合成分から複合体を精製するのに有用であり得る。
【０３８８】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体と結合する部分は、結合部分、標識部分および生物学的に活性な部分からなる群から選択される。
【０３８９】
本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体はまた、抗体−薬物コンジュゲート(ＡＤＣ)などのイムノコンジュゲートを形成するように、治療剤とコンジュゲートされ得る。好適な治療剤として、抗代謝剤、アルキル化剤、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ架橋剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、核外輸送阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼＩまたはII阻害剤、熱ショックタンパク質阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗生物質および抗有糸分裂剤が挙げられる。ＡＤＣにおいて、抗体および治療剤は、好ましくは、ペプチジル、ジスルフィドまたはヒドラゾンリンカーなどの切断可能なリンカーを介してコンジュゲートされる。より好ましくは、リンカーは、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ(配列番号１８０)、Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ、Ｃｉｔ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、ＳｅｒまたはＧｌｕなどのペプチジルリンカーである。ＡＤＣは、米国特許第７,０８７,６００号、同第６,９８９,４５２号および同第７,１２９,２６１号、ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０９６９１０、ＷＯ０７／０３８６５８、ＷＯ０７／０５１０８１、ＷＯ０７／０５９４０４、ＷＯ０８／０８３３１２およびＷＯ０８／１０３６９３、米国特許公開第２００６００２４３１７号、同第２００６０００４０８１号および同第２００６０２４７２９５号に記載されるように調製することができ、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０３９０】
より具体的には、ＡＤＣにおいて、抗体は、薬物とコンジュゲートされ、抗体が、ＡＤＣを癌細胞などのその抗原を発現する標的細胞へ指向するための標的化剤として機能する。好ましくは、抗原は、腫瘍関連抗原、すなわち、癌細胞によって固有に発現されるかまたは過剰発現されるものである。そこに到達すると、標的細胞の内部またはその付近のいずれかで、薬物が放出されて、治療剤として作用する。癌治療法におけるＡＤＣの作用および使用の機序に関する考察については、Schrama et al., Nature Rev. Drug Disc. 2006, 5, 147を参照のこと。
【０３９１】
癌の治療のために、薬物は、標的とされる癌細胞の死を引き起こす細胞傷害性薬物であることが好ましい。ＡＤＣにおいて使用することができる細胞傷害性薬物として、以下の種類の化合物ならびにそれらの類似体および誘導体が挙げられる：
(ａ)カリケアマイシン(例えば、Lee et al., J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 3464 and 3466を参照のこと)およびアンキアラマイシン(uncialamycin)(例えば、Davies et al.のＷＯ２００７／０３８８６８Ａ２(２００７)およびChowdari et al.のＵＳ８,７０９,４３１Ｂ２(２０１２)を参照のこと)などのエンジイン、
(ｂ)チューブリシン(例えば、Domling et al.のＵＳ７,７７８,８１４Ｂ２(２０１０)、Cheng et al.のＵＳ８,３９４,９２２Ｂ２(２０１３)および２０１４年２月１１日に出願されたCong et al.のＵＳ１４／１７７３７６)を参照のこと)、
(ｃ)ＣＣ−１０６５およびデュオカルマイシン(例えば、BogerのＵＳ６,５４５８,５３０Ｂ１(２００３)、Sufi et al.のＵＳ８,４６１,１１７Ｂ２(２０１３)およびZhang et al.のＵＳ２０１２／０３０１４９０Ａ１(２０１２)を参照のこと)、
(ｄ)エポチロン(例えば、Vite et al.のＵＳ２００７／０２７５９０４Ａ１(２００７年)およびＵＳＲＥ４２９３０Ｅ(２０１１年)を参照のこと)、
(ｅ)オーリスタチン(例えば、Senter et al.のＵＳ６,８４４,８６９Ｂ２(２００５)およびDoronina et al.のＵＳ７,４９８,２９８Ｂ２(２００９)を参照のこと)、
(ｆ)ピロロベンゾジアゼピン(ＰＢＤ)二量体(例えば、Howard et al.のＵＳ２０１３／００５９８００Ａ１(２０１３)、ＵＳ２０１３／００２８９１９Ａ１(２０１３)およびＷＯ２０１３／０４１６０６Ａ１(２０１３)を参照のこと)、ならびに
(ｇ)ＤＭ１およびＤＭ４などのマイタンシノイド(例えば、Chari et al.のＵＳ５,２０８,０２０(１９９３)およびAmphlett et al.のＵＳ７,３７４,７６２Ｂ２(２００８)を参照のこと)。
【０３９２】
ＡＤＣにおいて、リンカーは、抗体と薬物とを共有結合で接続する。通常、各リンカーには１つの薬物分子が結合するが、リンカーは分岐していてもよく、１つのＡＤＣ当たりの送達される薬物ペイロードを増大させるために、複数の薬物分子の結合が可能となる。さらに、各抗体に、１つを上回るリンカーが結合していてもよい。ＡＤＣに担持される薬物分子の数は、薬物−抗体比(ＤＡＲ)と称される。例えば、抗体のそれぞれの重鎖に１つのリンカーが結合し、そのリンカーに１つの薬物分子が結合している場合、ＤＡＲは２である。好ましくは、ＤＡＲは１〜５であり、より好ましくは、２〜４である。当業者であれば、それぞれ個別のＡＤＣにおいて、抗体は、整数個の薬物分子とコンジュゲートされるが、全体として、ＡＤＣの調製物は、統計学的平均を反映して、整数ではない数のＤＡＲを分析する場合があることも理解すると予想される。要約すると、ＡＤＣの構造は、以下の式
［抗体］−［リンカー−(薬物)ｎ］ｍ
によって表すことができ、式中、通常、ｍは、１、２、３、４、５または６(好ましくは、２、３または４)であり、ｎは、１、２または３である。
【０３９３】
いくつかの実施形態では、リンカーは、薬物を放出するために、標的細胞の内部またはその付近で切断される、切断可能な基を含有する。他の実施形態では、リンカーは切断可能な基を含有せず、むしろ、ＡＤＣは、薬物を放出するのを抗体の異化に頼る。
【０３９４】
切断可能な基の１つの種類は、ｐＨ感受性基である。血漿中のｐＨは、中性よりもわずかに高いが、標的細胞内でほとんどのＡＤＣが内部移行後に到達することになるリソソーム内部のｐＨは、約５の酸性である。したがって、切断が酸に触媒される切断可能な基は、血漿中よりもリソソーム内で数桁早い速度で切断される。酸感受性基の例として、Shen et al.のＵＳ４,６３１,１９０(1986)、Shen et al.のＵＳ５,１４４,０１１(1992)、Shen et al.,Biochem. Biophys. Res. Commun. 1981, 102, 1048およびYang et al., Proc. Nat’l Acad. Sci (USA), 1988, 85, 1189に記載されているシス−アコニチル(cis-aconityl)アミドおよびヒドラゾンが挙げられ、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０３９５】
別の実施形態では、切断可能な基は、ジスルフィドである。ジスルフィドは、チオール−ジスルフィド交換機序によって、周囲チオール濃度に応じた速度で切断され得る。グルタチオンおよび他のチオールの細胞内濃度は、血清中濃度よりも高いため、ジスルフィドの切断速度は、細胞内で、すなわち、ＡＤＣの内部移行後には、より高くなる。さらに、チオール−ジスルフィド交換の速度は、ジスルフィドの立体的および電子的特徴の調整によって調節することができ(例えば、アルキル−アリールジスルフィドに対して、アルキル−アルキルジスルフィド、アリール環の置換など)、増強された血清安定性または特定の切断速度を有するジスルフィド結合の設計が可能となる。コンジュゲートにおけるジスルフィド切断可能な基に関するさらなる開示については、例えば、Thorpe et al., Cancer Res. 1988, 48, 6396、Santi et al.のＵＳ７,５４１,５３０Ｂ２(2009)、Ng et al.のＵＳ６,９８９,４５２Ｂ２(2006)、Ng et al.のＷＯ２００２／０９６９１０Ａ１(2002)、Boyd et al.のＵＳ７,６９１,９６２Ｂ２(2010)およびSufi et al.のＵＳ２０１０／０１４５０３６Ａ１(2010)を参照されたく、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０３９６】
好ましい切断可能な基は、血清中のプロテアーゼとは対照的に、標的細胞内のプロテアーゼによって選択的に切断されるペプチドである。通常、切断可能なペプチド基は、１〜２０個のアミノ酸、好ましくは、１〜６個のアミノ酸、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を含む。アミノ酸は、天然および／または非天然のα−アミノ酸であり得る。天然のアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるもの、ならびにそれらに由来するアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、シトルリンおよびＯ−ホスホセリンである。この文脈において、用語「アミノ酸」はまた、アミノ酸類似体および模倣体も含む。類似体は、天然のアミノ酸の同一の一般構造Ｈ２Ｎ(Ｒ)ＣＨＣＯ２Ｈを有する化合物であるが、Ｒ基が天然のアミノ酸において見出されるものではないことを除く。類似体の例として、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン−スルホキシドおよびメチオニンメチルスルホニウムが挙げられる。アミノ酸模倣体は、α−アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、それと類似の様式で機能する化合物である。アミノ酸は、遺伝子コードされるアミノ酸の「Ｌ」立体化学のものであってもよく、同様に、エナンチオマーの「Ｄ」立体化学のものであってもよい。
【０３９７】
好ましくは、切断可能なペプチド基は、プロテアーゼの切断認識配列であるアミノ酸配列を含有する。多数の切断認識配列が、当技術分野で公知である。例えば、Matayoshi et al. Science 247: 954 (1990)、Dunn et al. Meth. Enzymol. 241: 254 (1994)、Seidah et al. Meth. Enzymol. 244: 175 (1994)、Thornberry, Meth. Enzymol. 244: 615 (1994)、Weber et al. Meth. Enzymol. 244: 595 (1994)、Smith et al. Meth. Enzymol. 244: 412 (1994)およびBouvier et al. Meth. Enzymol. 248: 614 (1995)を参照されたく、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０３９８】
より好ましくは、切断可能なペプチド基は、エンドソーム性プロテアーゼおよびリソソーム性プロテアーゼ、特に後者による切断のために選択されるアミノ酸配列を含む。このようなプロテアーゼの例として、カテプシンＢ、Ｃ、Ｄ、Ｈ、ＬおよびＳ、特にカテプシンＢが挙げられる。カテプシンＢは優先的に、配列−ＡＡ２−ＡＡ１−でペプチドを切断し、ここで、ＡＡ１は、塩基性または強力に水素結合するアミノ酸(リシン、アルギニンまたはシトルリンなど)であり、ＡＡ２は、疎水性アミノ酸(フェニルアラニン、バリン、アラニン、ロイシンまたはイソロイシンなど)であり、例えば、ＮからＣの方向で記述してＶａｌ−Ｃｉｔ(ここで、Ｃｉｔはシトルリンを示す)またはＶａｌ−Ｌｙｓで切断する。カテプシン切断可能な基に関するさらなる情報については、Dubowchik et al., Biorg. Med. Chem. Lett. 1998, 8, 3341、Dubowchik et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 3347およびDubowchik et al., Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855を参照されたく、これらの開示は参照により組み込まれる。ペプチジルリンカーの切断に利用することができる別の酵素は、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎで優先的に切断するリソソーム性システインプロテアーゼであるレグマインである。
【０３９９】
好ましい実施形態では、ＡＤＣにおけるリンカーは、標的細胞内に位置するプロテアーゼによって優先的に切断されるジペプチドまたはトリペプチドを含む。好ましくは、ジペプチドまたはトリペプチドは、カテプシンＢによって切断可能であり、より好ましくは、Ｖａｌ−ＣｉｔまたはＶａｌ−Ｌｙｓジペプチドである。
【０４００】
Chen et al.のＵＳ２０１０／０１１３４７６Ａ１(2010)に開示されるような単一アミノ酸切断可能なペプチド基もまた、使用することができ、この開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０４０１】
細胞によって内部移行されることが意図されないコンジュゲートについては、標的細胞付近の細胞外基質に存在するプロテアーゼによって、例えば、隣接する死が近い細胞によって放出されるプロテアーゼまたは腫瘍関連プロテアーゼによって切断されるような切断可能な基が選択され得る。例示的な細胞外腫瘍関連プロテアーゼは、マトリックスメタロプロテアーゼ(ＭＭＰ)、プラスミン、チメットオリゴペプチダーゼ(thimet oligopeptidase)(ＴＯＰ)およびＣＤ１０である。例えば、Trouet et al.のＵＳ５,９６２,２１６(1999)およびＵＳ７,４０２,５５６Ｂ２(2008)、Dubois et al.のＵＳ７,４２５,５４１Ｂ２(2008)ならびにBebbington et al.のＵＳ６,８９７,０３４Ｂ２(2005)を参照されたく、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０４０２】
リンカーは、抗体と薬物とを共有結合することに加えて、その他の機能を行うことができる。例えば、リンカーは、ポリ(エチレングリコール)(ＰＥＧ)基を含み得、これは、コンジュゲーション化学反応の実行中または最終的なＡＤＣ産物のいずれかにおいて可溶性を増大させる。
【０４０３】
リンカーは、切断可能なペプチド基に隣接して位置する自壊性(self-immolating)部分をさらに含み得る。自壊性基は、抗体および／または薬物部分がプロテアーゼによるペプチド基の切断を立体的に妨害することを防止するが、その後で、薬物の作用を妨害しないように、それ自体を自発的に放出する(すなわち、自壊する)、スペーサーとして機能する。Carl et al., J. Med. Chem. 1981, 24 (3), 479、Carl et al.のＷＯ８１／０１１４５(1981)、Dubowchik et al., Pharmacology & Therapeutics 1999, 83, 67、Firestone et al.のＵＳ６,２１４,３４５Ｂ１(2001)、Toki et al., J. Org. Chem. 2002, 67, 1866、Doronina et al., Nature Biotechnology 2003, 21 (7), 778 (erratum, p. 941)、de Groot et al., . Org. Chem. 2001, 66, 8815、Boyd et al.のＵＳ７,６９１,９６２Ｂ２(2010)、Boyd et al.のＵＳ２００８／０２７９８６８Ａ１(2008)、Sufi et al.のＷＯ２００８／０８３３１２Ａ２(2008)、FengのＵＳ７,３７５,０７８Ｂ２(2008)、JeffreyのＵＳ８,０３９,２７３Ｂ２(2011)およびSenter et al.のＵＳ２００３／００９６７４３Ａ１(2003)を参照されたく、これらの開示は、参照により組み込まれる。
【０４０４】
好ましい自壊性基は、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル(ＰＡＢＣ)基であり、その構造および作用機序は、以下に示される。
【０４０５】
【化５】
0006797137.tif 000011
【０４０６】
したがって、好ましい実施形態では、ＡＤＣは、標的細胞内に位置するプロテアーゼによって優先的に切断されるジペプチドまたはトリペプチドを含むリンカーならびにジペプチドまたはトリペプチドに隣接する自壊性基を有する。好ましくは、ジペプチドまたはトリペプチドは、カテプシンＢによって切断可能である。好ましくは、自壊性基は、ＰＡＢＣ基である。
【０４０７】
抗体と薬物とをコンジュゲートするために、多数の技術を使用することができる。好ましいものでは、遊離チオール(−ＳＨ)基を導入するために、抗体のリシン残基の側鎖のε−アミノ基を、２−イミノチオランと反応させる。チオール基は、マレイミドまたは他の求核性受容基と反応して、以下に例示されるコンジュゲーションが実行され得る。
【０４０８】
【化６】
0006797137.tif 000012
【０４０９】
通常、抗体１つ当たり２〜３つのチオールのチオール化レベルが達成される。代表的な手順については、Chowdari et al.のＵＳ８,７０９,４３１Ｂ２(2014)を参照されたく、この開示は、参照により本明細書に組み込まれる。したがって、ある実施形態では、本発明の抗体は、イミノチオランとの反応によって修飾された１つまたは複数のリシン残基(好ましくは２つまたは３つ)を有する。
【０４１０】
代替コンジュゲーション技術では、銅不在の「クリック化学反応」を利用し、ここでは、アジド基をシクロオクチンの歪んだアルキン結合に付加し、１,２,３−トリアゾール環を形成する。例えば、Agard et al., J. Amer. Chem. Soc. 2004, 126, 15046、Best, Biochemistry 2009, 48, 6571を参照されたく、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。アジドが抗体に位置し、シクロオクチンが薬物部分に位置してもよく、またはその逆であってもよい。好ましいシクロオクチン基は、ジベンゾシクロオクチン(ＤＩＢＯ)である。ＤＩＢＯ基を有する種々の試薬が、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎから入手可能である。以下の反応は、例えば、ＤＩＢＯ基を抗体に結合させるクリック化学反応コンジュげーションを例示する。
【化７】
0006797137.tif 000013
この技術により作製されたＡＤＣにおいて、リンカーは、１,２,３−トリアゾール環を含む。
【０４１１】
さらなるコンジュゲーション技術は、非天然のアミノ酸を抗体に導入することを含み、非天然のアミノ酸が、薬物部分の反応性官能基とのコンジュゲーションのための官能性を提供する。例えば、非天然のアミノ酸であるｐ−アセチルフェニルアラニンは、Tian et al.のＷＯ２００８／０３０６１２Ａ２(2008)に教示されるように、抗体または他のポリペプチドに組み込むことができる。ｐ−アセチルフェニアラニン(p-acetylphenyalanine)中のケトン基は、オキシムの形成によって、リンカー−薬物部分のヒドロキシアミノ基とのコンジュゲーション部位となり得る。あるいは、非天然のアミノ酸であるｐ−アジドフェニルアラニンは、抗体に組み込まれて、上記のようにクリック化学反応を介したコンジュゲーションのためのアジド官能基を提供し得る。非天然のアミノ酸はまた、Goerke et al.のＵＳ２０１０／００９３０２４Ａ１(2010)およびGoerke et al., Biotechnol. Bioeng. 2009, 102 (2), 400-416に教示されるように、細胞不含法を使用して、抗体または他のポリペプチドに組み込むこともできる。前述の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。したがって、ある実施形態では、抗体は、１つまたは複数のアミノ酸が、好ましくはｐ−アセチルフェニルアラニンまたはｐ−アジドフェニルアラニン、より好ましくはｐ−アセチルフェニルアラニンである非天然のアミノ酸と置換されている。
【０４１２】
なおさらなるコンジュゲーション技術は、Jeger et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 9995に教示されるように、トランスグルタミナーゼ酵素(好ましくは、細菌性トランスグルタミナーゼまたはＢＴＧ)を使用する。ＢＴＧは、グルタミンのカルボキシアミド側鎖とアルキレンアミノ基との間でアミド結合を形成し、これは、例えば、リシンのε−アミノ基または５−アミノ−ｎ−ペンチル基であり得る。通常のコンジュゲーション反応では、以下に示されるように、グルタミン残基は、抗体に位置し、一方でアルキレンアミノ基は、リンカー−薬物部分に位置する。
【化８】
0006797137.tif 000014
【０４１３】
ポリペプチド鎖におけるグルタミン残基の配置は、ＢＴＧに媒介されるアミド基転移に対するその感受性に大きな影響を有する。抗体上のグルタミン残基はいずれも、通常、ＢＴＧ基質ではない。しかしながら、抗体が脱グリコシル化されると(グリコシル化部位はアスパラギン２９７(Ｎ２９７)である)、近接するグルタミン２９５(Ｑ２９５)が、ＢＴＧ感受性となる、あるいは、抗体は、Ｎ２９７グリコシル化部位を排除するためにＮ２９７Ａ突然変異を定常領域に導入することによって、グリコシドなしで合成することができる。さらに、抗体におけるＮ２９７Ｑ置換は、グリコシル化を排除するだけでなく、同様にＢＴＧ媒介性アミド基転移に感受性である第２のグルタミン残基(２９７位)も導入する。したがって、ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、脱グルコシル化されている。別の実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、Ｎ２９７Ｑ置換を有する。当業者であれば、合成後の修飾によるかまたはＮ２９７Ａ突然変異の導入による脱グリコシル化によって、１つの抗体当たり２つのＢＴＧ反応性グルタミン残基(重鎖毎に１つ、２９５位)が生じるが、Ｎ２９７Ｑ置換を有する抗体は、４つのＢＴＧ反応性グルタミン残基(重鎖毎に２つ、２９５位および２９７位)を有することを理解すると予想される。
【０４１４】
さらに、別のコンジュゲーション技術は、Levary et al., PLoS One 2011, 6(4), e18342、Proft, Biotechnol. Lett. 2010, 32, 1-10、Ploegh et al.のＷＯ２０１０／０８７９９４Ａ２(2010)およびMao et al.のＷＯ２００５／０５１９７６Ａ２(2005)に教示されるように、ソルターゼＡ酵素を使用し、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ソルターゼＡ認識モチーフ(通常、ＬＰＸＴＧ(配列番号１８１)、ここで、Ｘは任意の天然のアミノ酸である)は抗体に結合されてもよく、求核性受容体モチーフ(通常、ＧＧＧ)は薬物部分に位置してもよく、または逆であってもよい。
【０４１５】
本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体はまた、ヒトＯＸ４０などのＯＸ４０、例えば、組織または組織サンプル中のヒトＯＸ４０を検出するために使用することができる。抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイまたはフローサイトメトリーにおいて使用され得る。ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体を、細胞、例えば、組織中の細胞と、特異的な結合が生じるのに適当な時間接触させ、次いで、試薬、例えば、抗ＯＸ４０抗体を検出する抗体を添加する。例示的アッセイは、実施例に提供されている。抗ＯＸ４０抗体は、完全ヒト抗体であってもよく、またはヒト可変領域およびマウス定常領域またはその一部分を有する抗体などのキメラ抗体であってもよい。サンプル(細胞または組織サンプル)中のＯＸ４０、例えば、ヒトＯＸ４０を検出するための例示的方法は、(ｉ)サンプルを、抗ＯＸ４０抗体と試料中のＯＸ４０との特異的な結合を可能にするのに十分な時間、抗ＯＸ４０抗体と接触させること、および(２)サンプルを、検出試薬と、例えば、抗ＯＸ４０抗体のＦｃ領域などの抗ＯＸ４０抗体と特異的に結合する抗体と接触させ、それによって、抗ＯＸ４０抗体が結合したＯＸ４０を検出することを含む。洗浄工程が、抗体および／または検出試薬とのインキュベーションの後に含まれてもよい。これらの方法において使用するための抗ＯＸ４０抗体は、別個の検出剤を使用できるため、必ずしも標識または検出剤と結合している必要はない。
【０４１６】
XIV. 二重特異性分子
本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体は、二重特異性分子の形成のために使用され得る。例えば、抗体またはその抗原結合部分は、誘導体化されるか、または別の機能的分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質(例えば、別の抗体または受容体のリガンド)と連結されて、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子と結合する二重特異性分子を生成し得る。ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、本明細書に記載されるタンパク質など、併用治療のための可能性のある標的として使用され得る任意のタンパク質と特異的に結合する抗体またはｓｃＦｖ(例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１またはＬＡＧ−３に対する抗体)と連結され得る。あるいは、抗体は、誘導体化されるか、２種以上のその他の機能的分子と連結されて、２種以上の異なる結合部位および／または標的分子と結合する多重特異性分子を生成し得る。このような多重特異性分子もまた、本明細書において、用語「二重特異性分子」に包含されるものとする。本明細書に記載される二重特異性分子を作製するために、抗ＯＸ４０抗体を、二重特異性分子が結果として生じるような別の抗体、抗体断片、ペプチドまたは結合模倣物などの１以上のその他の結合分子と機能的に連結することができる(例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合による結合または別の方法で)。
【０４１７】
したがって、少なくとも１つのＯＸ４０に対する第１の結合特異性および第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性を含む二重特異性分子が本明細書において提供される。ある実施形態において、二重特異性分子が多重特異性である、例えば、分子は、第３の結合特異性をさらに含む。
【０４１８】
ある実施形態では、二重特異性分子は、結合特異性として少なくとも１種の抗体または例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆｖもしくは一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦＶ)を含めたその抗体断片を含む。参照によりその開示内容が明確に組み込まれるLadner et al.米国特許第４,９４６,７７８号に記載されるように、抗体はまた、軽鎖または重鎖二量体またはＦｖもしくは一本鎖コンストラクトなどのその任意の最小断片であり得る。
【０４１９】
ヒトモノクローナル抗体が好ましいが、本明細書に記載される二重特異性分子において使用され得るその他の抗体として、例えば、マウス、キメラおよびヒト化抗体が挙げられる。
【０４２０】
本明細書で提供される二重特異性分子は、当技術分野で公知の方法を使用して成分結合特異性をコンジュゲートすることによって調製できる。例えば、二重特異性分子の各結合特異性を、別個に作製し、次いで、互いにコンジュゲートできる。結合特異性がタンパク質またはペプチドである場合には、共有結合コンジュゲーションのために種々のカップリングまたは架橋剤を使用できる。架橋剤の例として、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート(ＳＡＴＡ)、５,５’−ジチオビス(２−ニトロ安息香酸)(ＤＴＮＢ)、ｏ−フェニレンジマレイミド(ｏＰＤＭ)、Ｎ−スクシンイミジル−３−(２−ピリジルジチオ)プロピオネート(ＳＰＤＰ)およびスルホスクシニミジル４−(Ｎ−マレイミドメチル)シクロヘキサン−１−カルボキシレート(スルホ−ＳＭＣＣ)が挙げられる(例えば、Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686;Liu、MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648を参照のこと)。その他の方法として、Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132;Brennan et al. (1985) Science 229:81-83)およびGlennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375)に記載されるものが挙げられる。好ましいコンジュゲート剤として、ＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣがあり、両方とも、Pierce Chemical Co.(Rockford、ＩＬ)から入手可能である。
【０４２１】
結合特異性が抗体である場合には、それらを、２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合によってコンジュゲートできる。特に好ましい実施形態では、ヒンジ領域は、コンジュゲーションに先立って奇数のスルフヒドリル残基、好ましくは、１を含有するよう修飾される。
【０４２２】
あるいは、両結合特異性は、同一ベクター中にコードされ、同一宿主細胞において発現され、アセンブルされ得る。この方法は、二重特異性分子がｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、ｍＡｂ×(ｓｃＦｖ)２、Ｆａｂ×Ｆ(ａｂ’)２またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に特に有用である。二重特異性抗体は、各重鎖のＣ末端にｓｃＦｖを含む抗体を含み得る。本明細書に記載される二重特異性分子は、１つの一本鎖抗体および結合決定基を含む一本鎖分子または２つの結合決定基を含む一本鎖二重特異性分子であり得る。二重特異性分子は、少なくとも２つの一本鎖分子を含み得る。二重特異性分子を調製するための方法は、例えば、米国特許第５,２６０,２０３号；同５,４５５,０３０号；同４,８８１,１７５号；同５,１３２,４０５号；同５,０９１,５１３号；同５,４７６,７８６号；同５,０１３,６５３号；同５,２５８,４９８号および同５,４８２,８５８号に記載されている。
【０４２３】
二重特異性分子の、その特異的標的との結合は、酵素結合免疫吸着測定法(ＥＬＩＳＡ)、ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)、ＦＡＣＳ分析、生物検定法(例えば、成長阻害)またはウエスタンブロットアッセイなどの当技術分野で認識される方法を使用して確認され得る。これらのアッセイは各々、一般に、対象の複合体に対して特異的な標識試薬(例えば、抗体)を使用することによって、特に対象とされるタンパク質−抗体複合体の存在を検出する。
【０４２４】
XV. 組成物
１以上の抗ＯＸ４０抗体を、単独または他の標的に対する抗体との組み合わせで含有する、医薬上許容される担体とともに製剤化された組成物、例えば、医薬組成物が、さらに提供される。このような組成物は、(例えば、２種以上の異なる)本明細書に記載される抗体またはイムノコンジュゲートまたは二重特異性分子のうち１種または組合せを含み得る。例えば、組成物は、ＯＸ４０上の異なるエピトープと結合するか、または補完的活性を有する、本明細書に記載される抗体(またはイムノコンジュゲートまたは二重特異性)の組合せを含み得る。
【０４２５】
ある実施形態では、組成物は、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、１５０ｍｇ／ｍｌ、２００ｍｇ／ｍｌ、１〜３００ｍｇ／ｍｌもしくは１００〜３００ｍｇ／ｍｌの濃度で抗ＯＸ４０抗体を含む。
【０４２６】
本明細書に記載される医薬組成物はまた、併用療法において、すなわち、その他の薬剤と組み合わせて投与できる。例えば、併用療法は、少なくとも１種のその他の抗癌剤および／またはＴ細胞刺激(例えば、活性化)剤と組み合わせた、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体の投与を含み得る。併用療法において使用され得る治療薬の例は、本明細書に記載される抗体の使用に関する節において以下により詳細に記載される。
【０４２７】
ある実施形態では、本明細書において開示される治療用組成物は、癌の治療のために使用されるその他の化合物、薬物および／または薬剤を含む。このような化合物、薬物および／または薬剤として、例えば、所与の癌に対する免疫応答を刺激する化学療法薬、小分子薬または抗体が挙げられる。いくつかの場合には、治療用組成物は、例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤＬ−１抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＣＤ１３７抗体または抗ＬＡＧ−３抗体のうち１以上を含み得る。
【０４２８】
本明細書において、「医薬上許容される担体」として、生理学的に適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または上皮投与(例えば、注射または注入による)に適している。投与経路に応じて、化合物を、酸および化合物を不活性化し得るその他の天然条件作用から保護するために、材料において、活性化合物、すなわち、抗体、免疫複合体または二重特異性分子をコーティングしてもよい。
【０４２９】
本明細書に記載される医薬組成物は、１以上の医薬上許容される塩を含み得る。「医薬上許容される塩」とは、親化合物の所望の生物活性を保持し、何らかの望ましくない毒物学的影響を付与しない塩を指す(例えば、Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19を参照のこと)。このような塩の例として、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩として、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などといった非毒性無機酸に由来するものならびに脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などといった非毒性有機酸に由来するものが挙げられる。塩基付加塩として、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどといったアルカリ土類金属に由来するものならびにＮ,Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどといった非毒性有機アミンに由来するものが挙げられる。
【０４３０】
本明細書に記載される医薬組成物はまた、医薬上許容される抗酸化物質を含み得る。医薬上許容される抗酸化物質の例として、(１)アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどといった水溶性抗酸化物質、(２)パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール(ＢＨＡ)、ブチル化ヒドロキシトルエン(ＢＨＴ)、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなどといった油溶性抗酸化物質および(３)クエン酸、エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)、ソルビトール、酒石酸、リン酸などといった金属キレート化剤が挙げられる。
【０４３１】
本明細書に記載される医薬組成物において使用され得る、適した水性および非水性担体の例として、水、エタノール、ポリオール(グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどといった)およびそれらの適した混合物、オリーブオイルなどの植物油およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散物の場合には必要な粒径の維持によって、また界面活性剤の使用によって維持できる。
【０４３２】
これらの組成物はまた、保存料、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントを含有し得る。微生物の存在の防止は、滅菌法手順、前掲によって、また種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含めることの両方によって確実にできる。糖、塩化ナトリウムなどといった等張剤を組成物中に含めることが望ましい場合もある。さらに、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延する薬剤を含めることによって、注射用医薬品形態の長期の吸収を引き起こすことができる。
【０４３３】
医薬上許容される担体として、滅菌水溶液または分散物および滅菌注射用溶液または分散物の即時調製のための滅菌散剤が挙げられる。医薬上活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で公知である。任意の従来の媒体または薬剤が、活性化合物と不適合である場合を除いて、本明細書に記載される医薬組成物におけるその使用が考慮される。医薬組成物は、保存剤を含んでもよく、または保存剤を含まなくてもよい。補足活性化合物は、組成物中に組み込まれ得る。
【０４３４】
治療用組成物は、通常、製造および貯蔵の条件下で無菌で、安定でなくてはならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソームまたは高薬物濃度に適したその他の秩序構造として製剤化できる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど)およびそれらの適した混合物を含有する、溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散物の場合には必要な粒径の維持によって、また界面活性剤の使用によって維持できる。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムなどのポリアルコールを含めることが好ましいであろう。組成物中に吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを含めることによって、注射用組成物の長期吸収を引き起こすことができる。
【０４３５】
滅菌注射用溶液は、必要に応じて、上記で列挙された成分のうち１種または組合せとともに、適当な溶媒中に必要な量の活性化合物を組み込むことと、それに続く、滅菌精密濾過によって調製できる。一般に、分散物は、基本分散媒および本明細書で列挙されたものから必要なその他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌散剤の場合には、調製の好ましい方法として、その前もって滅菌濾過された溶液から有効成分および任意のさらなる所望の成分の粉末が得られる、真空乾燥およびフリーズドライ(凍結乾燥)がある。
【０４３６】
単一投与形を生産するための担体材料と組み合わされ得る有効成分の量は、治療されている対象および特定の投与様式に応じて変わる。単一投与形を生産するための担体材料と組み合わされ得る有効成分の量は、一般に、治療効果を生産する組成物の量となる。一般に、医薬上許容される担体との組合せにおいて、この量は、１００パーセントのうち、有効成分の約０.０１パーセント〜約９９パーセント、好ましくは、約０.１パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは、有効成分の約１パーセント〜約３０パーセントの範囲となる。
【０４３７】
投与計画は、最適の所望の応答(例えば、治療的応答)を提供するよう調整される。例えば、単回ボーラスを投与してもよく、いくつかの分割用量を経時的に投与してもよく、または治療状況の緊急事態によって示されるように、用量を比例的に低減または増大してもよい。投与の容易性および投与形の均一性のための投与単位形に非経口組成物を製剤化することは特に有利である。本明細書において、投与単位形とは、治療されている対象の単位投与量として適している物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な医薬担体と関連して所望の治療効果を生産するよう算出された所定の量の活性化合物を含有する。本明細書に記載される投与単位形の仕様は、(ａ)活性化合物の独特の特徴および達成されるべき特定の治療効果ならびに(ｂ)個体における感受性の治療のためのこのような活性化合物の配合の技術分野に固有の制限によって決定され、それらに直接左右される。
【０４３８】
抗ＯＸ４０抗体の投与のために、投与量は、約０.０００１〜１００ｍｇ／宿主体重１ｋｇ、約０.０１〜５ｍｇ／宿主体重１ｋｇ、約０.０１〜１０ｍｇ／宿主体重１ｋｇ、約０.１〜１ｍｇ／宿主体重１ｋｇ、約０.１〜０.５ｍｇ／宿主体重１ｋｇまたは約０.５〜０.８ｍｇ／宿主体重１ｋｇの範囲である。例えば、投与量は、０.２ｍｇ／体重１ｋｇ、０.３ｍｇ／体重１ｋｇ、０.５ｍｇ／体重１ｋｇ、１ｍｇ／体重１ｋｇ、３ｍｇ／体重１ｋｇ、５ｍｇ／体重１ｋｇまたは１０ｍｇ／体重１ｋｇまたは１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。ある実施形態では、投与量は、０.２ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、投与量は、０.２５ｍｇ／ｋｇである。他の実施形態では、投与量は、０.５ｍｇ／ｋｇである。例示的治療計画は、週に１回、２週に１回、３週に１回、４週に１回、月に１回、３〜６カ月に１回の投与を必要とする。本明細書に記載される抗体の例示的投与計画として、静脈内投与による１ｍｇ／体重１ｋｇまたは３ｍｇ／体重１ｋｇが挙げられ、抗体は、以下の投与スケジュール：(ｉ)６投与形に対して４週間毎、次いで、３カ月毎、(ii)３週間毎、(iii)３ｍｇ／体重１ｋｇを１回と、それに続く１ｍｇ／体重１ｋｇを３週間毎のうち１種を使用して与えられる。
【０４３９】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体および抗ＰＤ−１抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体での併用治療のために、抗体は、固定用量で投与される。したがって、いくつかの実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、約２５〜約３２０ｍｇ、例えば、約２５〜約１６０ｍｇ、約２５〜約８０ｍｇ、約２５〜約４０ｍｇ、約４０〜約３２０ｍｇ、約４０〜約１６０ｍｇ、約４０〜約８０ｍｇ、約８０〜約３２０ｍｇ、約３０〜約１６０ｍｇまたは約１６０〜約３２０ｍｇの固定用量で投与される。ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、２０ｍｇまたは約２０ｍｇの用量で投与される。別の実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、４０ｍｇまたは約４０ｍｇの用量で投与される。別の実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、８０ｍｇまたは約８０ｍｇの用量で投与される。別の実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、１６０ｍｇまたは約１６０ｍｇの用量で投与される。別の実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、３２０ｍｇまたは約３２０ｍｇの用量で投与される。
【０４４０】
いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、約１００〜３００ｍｇの固定用量で投与され、例えば、免疫−腫瘍学薬剤の投与量は、２４０ｍｇもしくは約２４０ｍｇ、３６０ｍｇもしくは約３６０ｍｇまたは４８０ｍｇもしくは約４８０ｍｇであり得る。ある実施形態では、抗ＰＤ１抗体の用量は、約０.０００１〜１００ｍｇ／宿主体重１ｋｇ、より通常は０.０１〜５ｍｇ／宿主体重１ｋｇの範囲である。例えば、投与量は、０.３ｍｇ／体重１ｋｇもしくは約０.３ｍｇ／体重１ｋｇ、１ｍｇ／体重１ｋｇもしくは約１ｍｇ／体重１ｋｇ、３ｍｇ／体重１ｋｇもしくは約３ｍｇ／体重１ｋｇ、５ｍｇ／体重１ｋｇもしくは約５ｍｇ／体重１ｋｇまたは１０ｍｇ／体重１ｋｇもしくは約１０ｍｇ／体重１ｋｇ、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体の投与量は、２４０ｍｇまたは約２４０ｍｇであり、２週間に１回投与される(Ｑ２Ｗ)。この投与量は、より長期または短期に合わせて比例で(１週間に１２０ｍｇ)調整され得、例えば、３６０ｍｇが３週間に１回(Ｑ３Ｗ)投与されるかまたは４８０ｍｇが４週間に１回(Ｑ４Ｗ)投与されてもよい。
【０４４１】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、約０.１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。例えば、投与量は、１ｍｇ／宿主体重１ｋｇもしくは約１ｍｇ／宿主体重１ｋｇまたは３ｍｇ／宿主体重１ｋｇもしくは約３ｍｇ／宿主体重１ｋｇであり得る。
【０４４２】
抗ＯＸ４０抗体および抗ＰＤ−１抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体での併用治療の例示的投与計画は、「使用および方法」と題される節で後述される。
【０４４３】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、約１５分間〜約６０分間、例えば、約３０分間の注入期間で患者に投与される。
【０４４４】
ある実施形態では、抗ＰＤ−１抗体(例えば、ニボルマブ)は、３ｍｇ／ｋｇの用量で投与される場合、約１５分間〜約６０分間、例えば、約３０分間の注入期間で患者に投与される(０.１ｍｇ／ｋｇ／分)。ある実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される場合、約４５分間〜７５分間、例えば、約６０分間の注入期間で患者に投与される。
【０４４５】
ある実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４抗体(例えば、イピリムマブ)は、３ｍｇ／ｋｇの用量で投与される場合、約１５分間〜１２０分間、例えば、約３０分間の注入期間で患者に投与される。ある実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される場合、約１５分間〜１２０分間、例えば、９０分間の注入期間で患者に投与される。
【０４４６】
ある実施形態では、同日に投与される場合、抗ＯＸ４０抗体は、抗ＰＤ−１抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体の前に投与される。ある実施形態では、同日に投与される場合、抗ＯＸ４０抗体は、抗ＰＤ−１抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体の後に投与される。ある実施形態では、同日に投与される場合、抗ＯＸ４０抗体は、抗ＰＤ−１抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体と同時に投与される。
【０４４７】
ある実施形態では、同日に投与される場合、抗ＯＸ４０抗体は、抗ＰＤ−１抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体の約１５〜４５分(例えば、約３０分)前に投与される。ある実施形態では、同日に投与される場合、抗ＯＸ４０抗体は、抗ＰＤ−１抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体の約１５〜４５分(例えば、約３０分)後に投与される。
【０４４８】
あるいは、本明細書に提供される抗ＯＸ４０抗体は、一定用量で投与してもよい(一定用量計画)。
【０４４９】
いくつかの場合では、異なる結合特異性を有する２種以上のモノクローナル抗体が同時に投与され、このような場合には、投与される各抗体の投与量は、上記の範囲内に入る。さらに、抗体は、通常、複数の機会で投与される。単一投与量の間隔は、例えば、毎週、毎月、３カ月毎または毎年であり得る。間隔はまた、患者における標的抗原に対する抗体の血液レベルを測定することによって示されるように、不規則である場合もある。いくつかの方法において、投与量は、約１〜１０００μｇ／ｍＬ、いくつかの方法では、約２５〜３００μｇ／ｍＬの血漿抗体濃度を達成するよう調整される。
【０４５０】
本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体は、他の抗体の投与計画で、別の抗体とともに投与され得る。例えば、抗ＯＸ４０抗体は、ニボルマブ(ＯＰＤＩＶＯ)などの抗ＰＤ−１抗体とともに、疾患の進行または許容できない毒性が生じるまで、６０分間にわたる静脈内注入として、２週間に１回投与され得る。あるいは、抗ＯＸ４０抗体は、ペンブロリズマブ(ＫＥＹＴＲＵＤＡ)とともに投与され得る。疾患の進行または許容できない毒性が生じるまで、３０分間にわたる静脈内注入として、３週間に１回投与され得る。
【０４５１】
抗体は、持続放出製剤として投与でき、この場合には、あまり頻繁ではない投与が必要とされる。投与量および頻度は、患者における抗体の半減期に応じて変わる。一般に、ヒト抗体は、最長の半減期を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト抗体が続く。投与の投与量および頻度は、治療が予防的であるか、治療的であるかに応じて変わり得る。予防的適用では、比較的少ない投与量が、比較的頻繁ではない間隔で長期間にわたって投与される。一部の患者は、生涯治療を受け続ける。治療的適用では、疾患の進行が低減または終結されるまで、好ましくは、患者が疾患の症状の部分的または完全寛解を示すまで、比較的短い間隔の比較的多い投与量が時には必要である。その後、患者は、予防的投与計画を投与されることがある。
【０４５２】
本明細書に記載される医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、患者とって毒性ではなく、特定の患者、組成物および投与様式について所望の治療応答を達成するのに有効である有効成分の量を得るよう変えてもよい。選択される投与量レベルは、使用される本明細書に記載される特定の組成物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与の時間、使用されている特定の化合物の排出速度、治療期間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用されるその他の薬物、化合物および／または材料、治療されている患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康および先の病歴および医薬の技術分野において周知の同様の因子を含めた種々の薬物動態因子に応じて変わる。
【０４５３】
本明細書に記載される抗体の「治療上有効な投与量」は、好ましくは、疾患症状の重症度の低減、疾患症状のない期間の頻度および期間の増大または疾患苦痛による機能障害もしくは能力障害の防止をもたらす。癌に関連して、治療上有効な用量は、好ましくは、生存の増大および／または癌と関連する身体症状のさらなる増悪の防止をもたらす。癌の症状は、当技術分野で周知であり、例えば、通常ではない黒子の特徴、非対称、境界、色および／または直径を含めた黒子の外観の変化、新規に着色した皮膚領域、異常な黒子、爪の下の黒くなった領域、乳房のしこり、乳頭の変化、乳房嚢胞、乳房疼痛、死亡、体重減少、脱力感、過度の疲労、摂食障害、食欲の喪失、慢性の咳、息切れの悪化、喀血、血尿、血便、悪心、嘔吐、肝臓転移、肺転移、骨転移、腹部膨満、鼓腸、腹膜腔中の流体、膣出血、便秘、腹部膨隆、結腸の穿孔、急性腹膜炎(感染、発熱、疼痛)、疼痛、吐血、多量の発汗、発熱、高血圧症、貧血、下痢、黄疸、めまい、悪寒、筋痙攣、結腸転移、肺転移、膀胱転移、肝臓転移、骨転移、腎臓転移および膵臓転移、嚥下困難などが挙げられる。
【０４５４】
疾患の早期または先行する徴候が存在する場合に望まれ得るような治療上有効な用量は、癌の発生を防ぐかまたは遅延し得る。癌の診断において使用される実験室試験は、化学(ＯＸ４０レベルの測定を含む)、血液学、血清学および放射線学を含む。したがって、前記のうちいずれかをモニタリングする任意の臨床または生化学アッセイを使用して、特定の治療が、癌を治療するための治療上有効な用量であるか否かを調べてもよい。当業者ならば、対象の大きさ、対象の症状の重症度および特定の組成物または選択された投与経路のような因子に基づいてこのような量を決定できるであろう。
【０４５５】
本明細書に記載される抗体および組成物は、当技術分野で公知の１以上の種々の方法を使用して、１以上の投与経路によって投与できる。当業者には明らかであろうが、投与経路および／または投与様式は、所望の結果に応じて変わる。本明細書に記載される抗体の好ましい投与経路として、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または例えば、注射もしくは注入によるその他の非経口投与経路が挙げられる。本明細書において、語句「非経口投与」とは、経腸および局所投与以外の、通常、注射による投与様式を意味し、制限するものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および注入が挙げられる。
【０４５６】
あるいは、抗体は、局所、上皮または粘膜投与経路、例えば、鼻腔内、経口、経膣、直腸性、舌下にまたは局所になど、非経口ではない経路によって投与できる。
【０４５７】
留置用剤、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達系を含めた徐放性製剤など、活性化合物を、化合物を迅速な放出から保護する担体を用いて調製できる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用できる。このような製剤を調製するための多数の方法が、特許権をとられているか、または一般的に、当業者に公知である。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照のこと。
【０４５８】
抗体組成物は、当技術分野で公知の医療装置を用いて投与できる。例えば、ある実施形態では、組成物は、米国特許第５,３９９,１６３号；同５,３８３,８５１号；同５,３１２,３３５号；同５,０６４,４１３号；同４,９４１,８８０号；同４,７９０,８２４号；または同４,５９６,５５６号に開示される装置などの無針皮下注射装置を用いて投与される。抗体投与を使用するための周知の留置用剤およびモジュールの例として、制御された速度で医薬を分配するための埋め込み可能な微量注入ポンプを開示する米国特許第４,４８７,６０３号が挙げられる。；皮膚を通って医薬を投与するための治療用装置を開示する同４,４８６,１９４号；正確な注入速度で医薬を送達するための医薬注入ポンプを開示する同４,４４７,２３３号；連続薬物送達のための可変流動埋め込み可能注入器具を開示する同４,４４７,２２４号；マルチチャンバーコンパートメントを有する浸透圧薬物送達システムを開示する同４,４３９,１９６号；および浸透圧薬物送達システムを開示する同４,４７５,１９６号が挙げられる。これらの特許は、参照により本明細書に組み込まれる。多数のその他のこのような留置用剤、送達系およびモジュールが、当業者に公知である。
【０４５９】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、インビボでの適切な分布を確実にするよう製剤化される。例えば、血液脳関門(ＢＢＢ)は、多数の高親水性化合物を排除する。抗体が、ＢＢＢを通過することを確実にするために(必要に応じて、例えば、脳癌)、それらを例えば、リポソーム中に製剤化できる。リポソームを作製する方法については、例えば、米国特許第４,５２２,８１１号；同５,３７４,５４８号；および同５,３９９,３３１号を参照のこと。リポソームは、特定の細胞または臓器中に選択的に輸送され、したがって、標的化された薬物送達を増強する１つまたは複数の部分を含み得る(例えば、V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685を参照のこと)。例示的標的化部分として、葉酸またはビオチン(例えば、Low et al.の米国特許第５,４１６,０１６号を参照のこと)；マンノシド(Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038);抗体(P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180)；界面活性剤プロテインＡ受容体(Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134)；ｐ１２０(Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090)が挙げられ、K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273も参照のこと。
【０４６０】
XVI. 使用および方法
本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体および抗体組成物は、例えば、活性化ＯＸ４０シグナル伝達による免疫応答の増強またはＯＸ４０の検出に絡む多数のインビトロおよびインビボ適用を有する。好ましい実施形態では、抗体は、ヒト抗体である。例えば、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体は、インビトロもしくはエキソビボで培養細胞に接触させられ、または種々の疾患において免疫性を増強するために、例えば、インビボでヒト対象に投与できる。したがって、対象において免疫応答が修飾されるように、対象に、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合部分を投与することを含む、対象において免疫応答を修飾する方法が、本明細書において提供される。好ましくは、応答は増強され、刺激され、上方制御される。
【０４６１】
好ましい対象として、免疫応答の増強が望ましいであろうヒト患者が挙げられる。方法は、免疫応答(例えば、Ｔ細胞媒介性免疫応答、例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答)を増大することによって治療され得る障害を有するヒト患者を治療するために特に適している。ある実施形態では、方法は、インビボでの癌の治療のために特に適している。免疫性の抗原特異的増強を達成するために、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体を、対象の抗原と一緒に投与でき、または抗原が、治療されるべき対象においてすでに存在していてもよい(例えば、腫瘍を有するか、またはウイルスを有する対象)。抗ＯＸ４０抗体を、別の薬剤と一緒に投与する場合には、２種は、別個に投与することも、同時に投与することもできる。
【０４６２】
また、サンプルおよび対照サンプルを、ヒトＯＸ４０と特異的に結合する本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体(またはその抗原結合部分)と、抗体またはヒトＯＸ４０との複合体の形成を可能にする条件下で接触させることを含む、サンプルにおけるヒトＯＸ４０抗原の存在を検出するか、またはヒトＯＸ４０抗原の量を測定するための方法も包含される。次いで、複合体の形成を検出し、これでは、対照サンプルと比較した、サンプル間の複合体形成の相違が、サンプルにおけるヒトＯＸ４０抗原の存在を示す。本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体は、イムノアフィニティー精製によってヒトＯＸ４０を精製するためにも使用できる。
【０４６３】
本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体の、Ｔ細胞応答、例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答の刺激または共刺激を遮断する能力を考えると、抗原特異的Ｔ細胞応答、例えば、抗腫瘍Ｔ細胞応答を刺激、増強または上方制御するために、抗体を使用するインビトロおよびインビボ法も本明細書において提供される。ある実施形態では、ＣＤ３刺激も含まれ(例えば、膜ＣＤ３を発現する細胞との同時インキュベーションによって)、その刺激は、抗ＯＸ４０抗体を用いる治療と同時に、その前に、またはその後に提供され得る。ある実施形態において、方法は、例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答が例えば刺激されるように、Ｔ細胞を、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体と、および任意選択で、抗ＣＤ３抗体と接触させることを含む。抗原特異的Ｔ細胞応答の任意の適した指標を使用して、抗原特異的Ｔ細胞応答を測定できる。このような適当な指標の限定されない例として、抗体の存在下でのＴ細胞増殖の増大および／または抗体の存在下でのサイトカイン生産の増大が挙げられる。好ましい実施形態では、インターロイキン−２および／または抗原特異的Ｔ細胞によるインターフェロン−γ生産が刺激される。
【０４６４】
抗ＯＸ４０抗体を用いて増強または共刺激することができるＴ細胞として、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞が挙げられる。Ｔ細胞は、Ｔｅｆｆ細胞、例えば、ＣＤ４＋Ｔｅｆｆ細胞、ＣＤ８＋Ｔｅｆｆ細胞、Ｔヘルパー(Ｔｈ)細胞およびＴ細胞傷害性(Ｔｃ)細胞であり得る。
【０４６５】
対象における免疫応答(例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答)が刺激されるように、治療上有効な量の本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体を対象に投与することを含む、対象における免疫応答(例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答)を刺激する方法も提供される。好ましい実施形態では、対象は、腫瘍を有する対象であり、腫瘍に対する免疫応答が刺激される。腫瘍は、固形腫瘍または液体腫瘍、例えば、血液悪性腫瘍であり得る。ある実施形態では、腫瘍は、免疫原性腫瘍である。ある実施形態では、腫瘍は、非免疫原性である。ある実施形態では、腫瘍は、ＰＤ−Ｌ１陽性である。ある実施形態では、腫瘍は、ＰＤ−Ｌ１陰性である。対象はまた、ウイルスを有する対象であり得、ウイルスに対する免疫応答が刺激される。
【０４６６】
対象において腫瘍の成長が阻害されるように、対象に、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体の治療的有効量を投与することを含む、対象における腫瘍細胞の成長を阻害するための方法がさらに提供される。また、対象において慢性ウイルス感染が治療されるように、対象に、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体を投与することを含む、対象においてウイルス感染を治療する方法も提供される。
【０４６７】
また、対象に、治療上有効な量の、腫瘍微小環境におけるＴｒｅｇ細胞の枯渇を刺激するＦｃを含む本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体を投与することを含む、腫瘍、例えば、癌性腫瘍を有する対象の腫瘍微小環境からＴｒｅｇ細胞を枯渇させる方法も本明細書に包含される。Ｆｃは、例えば、１以上の活性化Ｆｃ受容体との結合または増強された結合を有するなど、エフェクター機能または増強されたエフェクター機能を有するＦｃであり得る。好ましい実施形態では、Ｔｒｅｇ枯渇は、腫瘍微小環境、例えば、末梢においてＴｅｆｆの大幅な枯渇または阻害を伴わずに、また腫瘍微小環境の外側のＴｅｆｆ細胞およびＴｒｅｇ細胞の大幅な枯渇または阻害を伴わずに起こる。ある実施形態では、対象は、例えば、腫瘍微小環境においてＴｅｆｆ細胞よりもＴｒｅｇ細胞でより高レベルのＯＸ４０を有する。
【０４６８】
ある実施形態では、対象は、アゴニズムを増強する、例えば、阻害性ＦｃＲIIｂと結合するかまたはそれとに増強された結合を有する、Ｆｃを有する抗ＯＸ４０抗体で治療される。抗ＯＸ４０抗体は、腫瘍においてＴｒｅｇを、および／または腫瘍浸潤リンパ球(ＴＩＬ)においてＴｒｅｇを枯渇させ得る。
【０４６９】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、補助的療法として対象に与えられる。癌を有する対象の、抗ＯＸ４０抗体を用いる治療は、例えば、現在の標準治療と比較して長期間耐久性のある応答、少なくとも３カ月、６カ月、９カ月、１、２、３、４、５、１０年またはそれ以上の長期間の生存、少なくとも３カ月、６カ月、９カ月、１、２、３、４、５または１０年またはそれ以上の再発のない生存の延長につながり得る。ある実施形態では、癌を有する対象の、抗ＯＸ４０抗体を用いる治療は、癌の再発を防ぐか、または癌の再発を、例えば、３カ月、６カ月、９カ月、１、２、３、４、５もしくは１０年もしくはそれ以上遅延する。抗ＯＸ４０抗体治療は、第一次治療、第二次治療または第三次治療として使用できる。
【０４７０】
好ましい実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、著しく毒性ではない。例えば、抗体は、例えば、臨床試験において判定される場合、ヒトの臓器、例えば、肝臓、腎臓、脳、肺および心臓のうちの１以上に対して、著しく毒性ではない。ある実施形態では、抗体は、望ましくない免疫応答、例えば、自己免疫性または炎症を著しく引き起こすことはない。
【０４７１】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体での対象の治療は、対象の免疫系が対象自身を攻撃する(例えば、自己免疫応答)か、または例えば、アナフィラキシーをもたらすほどの免疫系の過剰刺激をもたらさない。したがって、抗体は、好ましくは、アナフィラキシーを引き起こさない。
【０４７２】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体での対象の治療は、著しい炎症反応、例えば、免疫媒介性肺炎、免疫媒介性大腸炎、免疫媒介性肝炎、免疫媒介性腎炎もしくは腎不全、免疫媒介性下垂体炎、免疫媒介性甲状腺機能低下症および甲状腺機能亢進症または他の免疫応答性有害反応を引き起こさない。
【０４７３】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、免疫系を刺激する化合物(例えば、免疫−腫瘍学薬剤)、例えば、本明細書に記載される化合物または本明細書に記載される標的を調節する化合物など、別の癌治療法との組合せで、相乗的抗腫瘍効果を提供する。
【０４７４】
本明細書に記載されるこれらおよびその他の方法は、以下にさらに詳述される。
【０４７５】
癌
抗ＯＸ４０抗体によるＯＸ４０の活性化は、患者における癌性細胞に対する免疫応答を増強し得る。したがって、対象が治療されるように、例えば、癌性腫瘍の成長が阻害もしくは低減されるおよび／または腫瘍が退縮するおよび／または生存の延長が達成されるように、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体を対象に投与することを含む、癌を有する対象を治療するための方法が、本明細書において提供される。抗ＯＸ４０抗体は、癌性腫瘍の成長を阻害するために単独で使用できる。あるいは、抗ＯＸ４０抗体は、別の薬剤、例えば、以下に記載されるような、別の免疫原性剤、標準癌治療または別の抗体とともに使用できる。
【０４７６】
したがって、対象に、治療上有効な量の本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体を投与することを含む、例えば、対象において腫瘍細胞の成長を阻害することによって癌を治療する方法が、本明細書において提供される。抗体は、ヒト抗体であり得る。これに加えてまたはこれとは別に、抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体であり得る。
【０４７７】
腫瘍(例えば、進行固形腫瘍)を有する対象を治療するための、抗ＯＸ４０抗体および抗ＰＤ−１抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体の投与を含む、併用療法もまた、本明細書において提供される。
【０４７８】
ある実施形態では、癌を治療する方法であって、抗ＯＸ４０抗体および抗ＰＤ−１抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体が、規定の臨床投与計画に従って、腫瘍(例えば、進行固形腫瘍)を有する患者に投与される、方法が、本明細書において提供される。ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、ＯＸ４０.２１である。ある実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ＢＭＳ−９３６５５８(ニボルマブ)である。ある実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、イピリムマブ(Ｙｅｒｖｏｙ(登録商標))である。ある実施形態では、投与計画は、最適な所望の応答(例えば、有効な応答)を提供するように調整される。
【０４７９】
本明細書において、補助的投与または組合せ投与(共投与)には、同じかもしくは異なる剤形での化合物の同時投与または化合物の別個の投与(例えば、逐次投与)が含まれる。したがって、抗ＯＸ４０抗体および抗ＰＤ−１抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体は、単一の製剤において同時に投与され得る。あるいは、抗ＯＸ４０抗体および抗ＰＤ−１抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体は、別個の投与のために製剤化でき、同時または逐次的に投与される(例えば、１つの抗体が、第２の抗体の投与の約３０分前に投与される)。
【０４８０】
例えば、抗ＰＤ１抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体がまず投与され、続いて(例えば、直後に続いて)抗ＯＸ４０抗体の投与が行われてもよく、またはその逆であってもよい。ある実施形態では、抗ＰＤ−１抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体は、抗ＯＸ４０抗体の投与の前に投与される。別の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体は、抗ＯＸ４０抗体の投与の後に投与される。別の実施形態では、抗ＯＸ４０抗体および抗ＰＤ−１抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体は、同時に投与される。このような同時投与または逐次投与は、好ましくは、治療される患者に、両方の抗体が同時に存在することをもたらす。
【０４８１】
成長が抗ＯＸ４０抗体または抗ＯＸ４０および抗ＰＤ−１もしくは抗ＣＴＬＡ−４抗体での併用療法を用いて阻害され得る癌には、通常免疫療法に応答性である癌および通常は免疫療法に応答性ではないものが含まれる。癌は、固形腫瘍または血液悪性腫瘍(液性腫瘍)を有する癌であり得る。治療のための癌の限定されない例として、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、扁平非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)および非扁平上皮ＮＳＣＬＣ、神経膠腫、胃腸癌、腎癌(例えば、明細胞癌)、卵巣癌、肝臓癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌(例えば、腎細胞癌(ＲＣＣ))、前立腺癌(例えば、ホルモン難治性前立腺腺癌)、甲状腺癌、神経芽細胞腫、膵臓癌、神経膠芽腫(神経膠芽腫多形)、子宮頸癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌腫および頭頸部癌(または癌腫)、胃癌(gastric cancer)、生殖細胞腫瘍、小児肉腫、副鼻腔ナチュラルキラー、黒色腫(例えば、皮膚または眼球内悪性黒色腫などの転移性悪性黒色腫)、骨癌、皮膚癌、子宮癌、肛門領域の癌、精巣癌、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頸部の癌腫、膣の癌腫、外陰部の癌腫、食道の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、上皮小体腺の癌、副腎の癌、柔組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、小児の固形腫瘍、尿管の癌、腎盂の癌腫、中枢神経系(ＣＮＳ)の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄の軸の腫瘍、脳癌、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストによって誘導されるものを含めた環境誘導性癌、ウイルス関連癌またはウイルス起源の癌(例えば、ヒトパピローマウイルス(ＨＰＶ関連または起源の腫瘍)および２種の主要な血液細胞系統のいずれか、すなわち、骨髄系細胞株(顆粒球、赤血球、血小板、マクロファージおよび肥満細胞を産生する)またはリンパ球系細胞株(Ｂ、Ｔ、ＮＫおよび形質細胞を産生する)に由来する血液悪性腫瘍、例えば、全ての種類の白血病、リンパ腫および骨髄腫、例えば、急性白血病(ＡＬＬ)、急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)および慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、未分化ＡＭＬ(Ｍ０)、骨髄芽球性白血病(Ｍ１)、骨髄芽球性白血病(Ｍ２；細胞成熟を伴う)、前骨髄球性白血病(Ｍ３またはＭ３変異体［Ｍ３Ｖ］)、骨髄単球性白血病(Ｍ４または好酸球増加症を伴うＭ４変異体［Ｍ４Ｅ］)、単球性白血病(Ｍ５)、赤白血病(Ｍ６)、巨核芽球性白血病(Ｍ７)、単離された顆粒球性肉腫および緑色腫などの急性、慢性、リンパ性および／または骨髄性白血病；ホジキンリンパ腫(ＨＬ)、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、Ｂ細胞血液悪性腫瘍、例えば、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、単球様Ｂ細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ球系組織(ＭＡＬＴ)リンパ腫、未分化(例えば、Ｋｉ  １＋)大細胞型リンパ腫、成人Ｔ細胞リンパ腫／白血病、マントル細胞リンパ腫、血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫、腸管Ｔ細胞リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、前駆体Ｔリンパ芽球性リンパ腫、Ｔリンパ芽球性およびリンパ腫／白血病(Ｔ−Ｌｂｌｙ／Ｔ−ＡＬＬ)、末梢Ｔ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、移植後リンパ増殖性障害、真性組織球性リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、リンパ芽球��リンパ腫(ＬＢＬ)、リンパ球系統の造血器腫瘍、急性リンパ性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性組織球性リンパ腫(ＤＨＬ)、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆体Ｂリンパ芽球性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫(ＣＴＬＣ)(菌状息肉症またはセザリー症候群とも呼ばれる)およびワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症を伴うリンパ形質細胞性リンパ腫(ＬＰＬ)などのリンパ腫；ＩｇＧ骨髄腫、軽鎖骨髄腫、非分泌性骨髄腫、くすぶり型骨髄腫(低悪性度骨髄腫とも呼ばれる)、孤立性形質細胞腫および多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)、ヘアリー細胞リンパ腫などの骨髄腫；骨髄系統の造血器腫瘍、線維肉腫および横紋筋肉腫(rhabdomyoscarcoma)を含めた間葉系起源の腫瘍；セミノーマ、奇形癌腫、星状細胞腫、シュワン腫を含めた中枢および末梢神経の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫(rhabdomyoscarcoma)および骨肉腫を含めた間葉系起源の腫瘍；ならびに黒色腫、色素性乾皮症、ケラトアカントーマ、セミノーマ、甲状腺濾胞性癌および奇形癌腫を含めたその他の腫瘍、リンパ球系統の造血器腫瘍、例えば、それだけには限らないが、小細胞および大脳様細胞型を含めたＴ前リンパ球性白血病(Ｔ−ＰＬＬ)などのＴ細胞障害を含めたＴ細胞およびＢ細胞腫瘍；好ましくは、Ｔ細胞型の大顆粒リンパ球性白血病(ＬＧＬ)；ａ／ｄ  Ｔ−ＮＨＬ肝脾リンパ腫；末梢／成熟Ｔ細胞リンパ腫(多形性および免疫芽球性亜種)；血管中心性(鼻腔の)Ｔ細胞リンパ腫；頭頸部の癌、腎癌、直腸癌、甲状腺の癌；急性骨髄系リンパ腫ならびに前記の癌の任意の組合せが挙げられる。本明細書に記載される方法はまた、転移性癌、切除不能および／または難治性癌(例えば、遮断性ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１抗体を用いる、例えば、これまでの免疫療法に対して難治性の癌)および再発性癌の治療のために使用してもよい。
【０４８２】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体または抗ＯＸ４０抗体および抗ＰＤ−１抗体もしくは抗ＣＴＬＡ−４抗体の組合せを用いて治療される患者は、進行固形腫瘍を有する。例えば、ある実施形態では、治療される患者は、子宮頸癌を有する。別の実施形態では、治療される患者は、結腸直腸(ＣＲＣ)癌を有する。別の実施形態では、治療される患者は、膀胱癌(例えば、切除不能な局所進行性または転移性膀胱癌)を有する。別の実施形態では、治療される患者は、卵巣癌(例えば、切除不能な局所進行性または転移性卵巣癌)を有する。
【０４８３】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体または抗ＯＸ４０抗体および抗ＰＤ−１抗体もしくは抗ＣＴＬＡ−４抗体の組合せを用いて治療される患者は、非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)を有する。別の実施形態では、治療される患者は、頭頸部の扁平上皮細胞癌腫(ＳＣＣＨＮ)を有する。別の実施形態では、治療される患者は、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫(Ｂ−ＮＨＬ)を有する。別の実施形態では、治療される患者は、骨髄腫を有する。別の実施形態では、患者は、黒色腫を有する。別の実施形態では、治療される患者は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫(ＤＬＢＣＬ)を有する。
【０４８４】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、以前の治療、例えば、免疫−腫瘍学薬物を用いた以前の治療に対して不十分な応答を示した癌を有する患者、あるいは難治性もしくは耐性であるか、本質的に難治性もしくは耐性のいずれかである(例えば、ＰＤ−１経路アンタゴニストに対して難治性)かまたは耐性もしくは難治性状態が獲得される癌を有する患者に投与される。例えば、第１の治療法に対して応答性ではないかもしくは応答性が不十分である対象、または治療、例えば、抗ＰＤ−１治療の後に疾患の進行が見られる対象が、抗ＯＸ４０抗体の単独でのまたは別の治療法(例えば、抗ＰＤ−１療法)と組み合わせた投与によって治療され得る。
【０４８５】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、免疫−腫瘍学薬剤、例えば、ＰＤ−１経路アンタゴニストを以前に受容していない(すなわち、それを用いて治療されていない)患者に投与される。
【０４８６】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、標準治癒治療(例えば、外科手術、放射線および化学療法)とともに投与され得る。他の実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、維持療法、例えば、腫瘍の発生または再発を防止することが意図される治療法として投与され得る。
【０４８７】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、別の治療、例えば、放射線、外科手術または化学療法とともに投与され得る。例えば、抗ＯＸ４０抗体補助療法は、微小転移が存在し得るリスクがある場合および／または再発のリスクを低減するために、投与され得る。
【０４８８】
ある実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、単剤治療として、または唯一の免疫賦活性療法として投与できる。他の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、癌性細胞、精製された腫瘍抗原(組換えタンパク質、ペプチドおよび炭水化物分子を含む)、細胞、および免疫刺激性サイトカインをコードする遺伝子を用いてトランスフェクトされた細胞などの免疫原と組み合わせることもできる(He et al (2004) J. Immunol. 173:4919-28)。使用できる腫瘍ワクチンの限定されない例として、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２、ＭＡＲＴ１および／もしくはチロシナーゼのペプチドなどの黒色腫抗原のペプチドまたはサイトカインＧＭ−ＣＳＦを発現するようトランスフェクトされた腫瘍細胞が挙げられる。(以下にさらに論じられる)。
【０４８９】
ヒトにおいて、黒色腫などの一部の腫瘍は、免疫原性であることが示されている。ＯＸ４０の活性化を通じてＴ細胞活性化の閾値を低下させることにより、宿主における腫瘍応答が活性化され、非免疫原性腫瘍または限定された免疫原性を有するものの治療が可能となり得る。
【０４９０】
いくつかの実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、ワクチン接種プロトコールとともに使用することができる。腫瘍に対するワクチン接種のための多数の実験戦略が考案されている(Rosenberg, S., 2000, Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62;Logothetis, C., 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302;Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428;Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738を参照のこと; DeVita et al. (eds.), 1997, Cancer: Principles and Practice of Oncology, Fifth Edition中のRestifo, N. and Sznol, M., Cancer Vaccines, Ch. 61, pp. 3023-3043も参照のこと)。これらの戦略のうちの、このような１つの戦略では、ワクチンは、自己または同種腫瘍細胞を使用して調製される。これらの細胞性ワクチンは、腫瘍細胞がＧＭ−ＣＳＦを発現するよう形質導入される場合に最も有効であるとわかっている。ＧＭ−ＣＳＦは、腫瘍ワクチン接種のための抗原提示の強力なアクチベーターであるとわかっている(Dranoff et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 3539-43)。
【０４９１】
種々の腫瘍における遺伝子発現および大規模遺伝子発現パターンの研究は、いわゆる腫瘍特異的抗原の定義につながった(Rosenberg, S A (1999) Immunity 10: 281-7)。多くの場合には、これらの腫瘍特異的抗原は、腫瘍において、また腫瘍が生じた細胞において発現される分化抗原、例えば、メラノサイト抗原ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原およびＴｒｐ−２である。より重要なことに、これらの抗原の多くは、宿主における腫瘍特異的Ｔ細胞の標的であると示され得る。これらのタンパク質に対する免疫応答を生じさせるために、ＯＸ４０活性化は、腫瘍において発現される組換えタンパク質および／またはペプチドの収集物とともに使用できる。これらのタンパク質は、正常には、自己抗原として免疫系によって見なされ、したがって、それらに対して寛容である。腫瘍抗原は、染色体のテロメアの合成に必要であり、ヒト癌の８５％超において、および限定された数の体細胞組織のみにおいて発現されるタンパク質テロメラーゼを含み得る(Kim et al. (1994) Science 266: 2011-2013)。腫瘍抗原はまた、タンパク質配列を変更するか、または２種の無関係の配列間の融合タンパク質(すなわち、フィラデルフィア染色体中のｂｃｒ−ａｂｌ)もしくはＢ細胞腫瘍からのイディオタイプを作製する体細胞突然変異のために癌細胞において発現される「ネオ抗原」であり得る。
【０４９２】
その他の腫瘍ワクチンは、ヒトパピローマウイルス(ＨＰＶ)、肝炎ウイルス(ＨＢＶおよびＨＣＶ)およびカポジヘルペス肉腫ウイルス(ＫＨＳＶ)のようなヒト癌に関わるウイルスに由来するタンパク質を含み得る。ＯＸ４０活性化とともに使用できる腫瘍特異的抗原の別の形態として、腫瘍組織自体から単離された精製された熱ショックタンパク質(ＨＳＰ)がある。これらの熱ショックタンパク質は、腫瘍細胞に由来するタンパク質の断片を含有し、これらのＨＳＰは、腫瘍免疫を誘発するための抗原提示細胞への送達で高度に効率的である(Suot & Srivastava (1995) Science 269:1585-1588;Tamura et al. (1997) Science 278:117-120)。
【０４９３】
樹状細胞(ＤＣ)は、抗原特異的応答をプライムするために使用できる強力な抗原提示細胞である。ＤＣは、エキソビボで生産され、種々のタンパク質およびペプチド抗原ならびに腫瘍細胞抽出物を搭載させることができる(Nestle et al. (1998) Nature Medicine 4: 328-332)。ＤＣはまた、同様にこれらの腫瘍抗原を発現するよう遺伝的手段によって形質導入できる。ＤＣはまた、免疫処置を目的として腫瘍細胞と直接融合されている(Kugler et al. (2000) Nature Medicine 6:332-336)。ワクチン化の方法として、より強力な抗腫瘍応答を活性化するよう、ＤＣ免疫処置を、ＯＸ４０活性化と効率的に組み合わせることができる。
【０４９４】
本明細書に記載されるＯＸ４０抗体はまた、化学療法治療計画と組み合わせることができる。これらの場合には、投与される化学療法試薬の用量を低減することが可能であり得る(Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304)。例えば、抗ＯＸ４０抗体は、黒色腫の治療のためのデカルバジン(decarbazine)と組み合わせて使用することができる。別の例として、抗ＯＸ４０抗体は、黒色腫の治療のためのインターロイキン−２(ＩＬ−２)と組み合わせて使用することができる。抗ＯＸ４０抗体および化学療法の組合せ使用の背後の科学的論拠は、ほとんどの化学療法薬化合物の細胞傷害性作用の結果である細胞死が、抗原提示経路における腫瘍抗原のレベルの増大をもたらすはずであるということである。細胞死による、抗ＯＸ４０抗体との相乗作用をもたらし得るその他の併用治療として、放射線照射、手術およびホルモン欠乏がある。これらのプロトコールの各々は、宿主において腫瘍抗原の供給源を作製する。血管新生阻害剤もまた、抗ＯＸ４０抗体と組み合わせて使用することができる。血管新生の阻害は、腫瘍細胞死につながり、これが、腫瘍抗原を宿主抗原提示経路に供給し得る。
【０４９５】
本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体はまた、ＦｃαまたはＦｃγ受容体を発現する、腫瘍細胞に対するエフェクター細胞を標的とする二重特異性抗体と組み合わせて使用できる(例えば、米国特許第５,９２２,８４５号および同５,８３７,２４３号を参照のこと)。２種の別個の抗原を標的とするよう二重特異性抗体を使用できる。例えば、抗Ｆｃ受容体／抗腫瘍抗原(例えば、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ)二重特異性抗体が、腫瘍の部位に対するマクロファージを標的とするために使用されている。この標的化は、腫瘍特異的応答を効率的に活性化し得る。これらの応答のＴ細胞アームは、ＯＸ４０の活性化によって増強される。あるいは、抗原は、腫瘍抗原および樹状細胞特異的細胞表面マーカーと結合する二重特異性抗体の使用によってＤＣに直接送達され得る。
【０４９６】
腫瘍は、多種多様な機序によって宿主免疫監視を回避する。これらの機序のうち多くは、腫瘍によって発現され、免疫抑制であるタンパク質の不活性化によって克服され得る。これらは、中でも、ＴＧＦ−β(Kehrl et al. (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050)、ＩＬ−１０(Howard & O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200)およびＦａｓリガンド(Hahne et al. (1996) Science 274: 1363-1365)を含む。これらの実体の各々に対する抗体は、免疫抑制剤の効果に対抗し、宿主による腫瘍免疫応答に有利に働くよう、抗ＯＸ４０抗体と組み合わせて使用できる。
【０４９７】
宿主免疫応答性を活性化するその他の抗体を、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体と組み合わせて使用できる。これらは、ＤＣ機能および抗原提示を活性化する樹状細胞の表面上の分子を含む。抗ＣＤ４０抗体は、効率的に、Ｔ細胞ヘルパー活性の代わりとなることができ(Ridge et al. (1998) Nature 393: 474-478)、抗ＯＸ４０抗体とともに使用できる。ＣＴＬＡ−４(例えば、米国特許第５,８１１,０９７号)ＯＸ−４０(Weinberg et al. (2000) Immunol 164: 2160-2169)、４−１ＢＢ(Melero et al. (1997) Nature Medicine 3: 682-685 (1997)およびＩＣＯＳ(Hutloff et al. (1999) Nature 397: 262-266)などのＴ細胞共刺激分子に対する抗体を活性化することはまた、Ｔ細胞活性化のレベルの増大を提供し得る。ＰＤ１もしくはＰＤ−Ｌ１の阻害剤もまた、抗ＯＸ４０抗体とともに使用してもよい。
【０４９８】
造血起源の種々の腫瘍を治療するために、骨髄移植が現在使用されている。移植片対宿主病は、この治療の結果であるが、治療利益は、移植片対腫瘍応答から得られ得る。抗ＯＸ４０抗体は、ドナーから移植された腫瘍特異的Ｔ細胞の有効性を増大できる。
【０４９９】
抗原特異的Ｔ細胞のエキソビボ活性化および増大ならびに腫瘍に対する抗原特異的Ｔ細胞を刺激するための、これらの細胞のレシピエントへの養子移植を含む、いくつかの実験的治療プロトコールもある(Greenberg & Riddell (1999) Science 285: 546-51)。これらの方法はまた、ＣＭＶなどの感染性因子に対するＴ細胞応答を活性化するために使用できる。抗ＯＸ４０抗体の存在下でのエキソビボ活性化は、養子導入されたＴ細胞の頻度および活性を増大し得る。
【０５００】
感染性疾患
特定の毒素または病原体に曝露された患者を治療するための方法もまた、本明細書において提供される。したがって、対象が感染性疾患について治療されるように、対象に本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体を投与することを含む、対象における感染性疾患を治療する方法が、本明細書において提供される。ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体である。
【０５０１】
上記で論じられるような腫瘍へのその適用と同様に、病原体、毒素および自己抗原に対する免疫応答を刺激するために、抗ＯＸ４０抗体を、単独で、またはアジュバントとして、ワクチンと組み合わせて使用できる。この治療的アプローチが特に有用であり得る病原体の例として、現在有効なワクチンが存在しない病原体または従来のワクチンが完全に有効とまではいかない病原体が挙げられる。これらは、それだけには限らないが、ＨＩＶ、肝炎(Ａ、ＢおよびＣ)、インフルエンザ、ヘルペス、ジアルジア、マラリア、リーシュマニア、黄色ブドウ状球菌(staphylococcus aureus)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)が挙げられる。抗ＯＸ４０抗体は、感染の経過にわたって変更された抗原を示すＨＩＶなどの因子による確立された感染に対して有用であり得る。これらの新規エピトープは、抗ＯＸ４０抗体投与の時点で外来性として認識され、したがって、強力なＴ細胞応答を引き起こす。
【０５０２】
本明細書に記載される方法によって治療可能な感染症を引き起こす病原性ウイルスのいくつかの例として、ＨＩＶ、肝炎(Ａ、ＢまたはＣ)、ヘルペスウイルス(例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ−１、ＨＡＶ−６、ＨＳＶ−IIおよびＣＭＶ、エプスタイン・バーウイルス)、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デングウイルス、パピローマウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルスおよびアルボウイルス脳炎ウイルスが挙げられる。
【０５０３】
本明細書に記載される方法によって治療可能な感染症を引き起こす病原性細菌のいくつかの例として、クラミジア、リケッチア細菌、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌(pneumonococci)、髄膜炎菌および淋菌、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ、バチルス、コレラ、テタヌス、ボツリヌス中毒、炭疽菌、ペスト、レプトスピラ症およびライム病細菌が挙げられる。
【０５０４】
本明細書に記載される方法によって治療可能な感染症を引き起こす病原性真菌のいくつかの例として、カンジダ(Candida)(アルビカンス(albicans)、クルゼイ(krusei)、グラブラータ(glabrata)、トロピカリス(tropicalis)など)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、アスペルギルス(Aspergillus)(フミガツス(fumigatus)、ニガー(niger)など)、ケカビ目(Mucorales)の属(ケカビ属(mucor)、ユミケカビ属(absidia)、クモノスカビ属(rhizopus))、スポロトリックス・シェンキイ(Sporothrix schenkii)、ブラストミセス・デルマチチジス(Blastomyces dermatitidis)、南アメリカ分芽菌(Paracoccidioides brasiliensis)、コクシジオイデス・イミチス(Coccidioides immitis)およびヒストプラズマ・カプスラーツム(Histoplasma capsulatum)が挙げられる。
【０５０５】
本明細書に記載される方法によって治療可能な感染症を引き起こす病原性寄生生物のいくつかの例として、赤痢アメーバ(Entamoeba histolytica)、大腸バランチジウム(Balantidium coli)、フォーラーネグレリア(Naegleriafowleri)、アカントアメーバ属(Acanthamoeba)の種、ランブル鞭毛虫(Giardia lambia)、クリプトスポリジウム属(Cryptosporidium)の種、ニューモシスチス・カリニ(Pneumocystis carinii)、三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)、ネズミバベシア(Babesia microti)、トリパノソーマ・ブルセイ(Trypanosoma brucei)、トリパノソーマ・クルージ(Trypanosoma cruzi)、ドノバンリーシュマニア(Leishmania donovani)、トキソプラズマ原虫(Toxoplasma gondii)、ブラジル鉤虫(Nippostrongylus brasiliensis)が挙げられる。
【０５０６】
上記の方法の全てにおいて、抗ＯＸ４０抗体を、サイトカイン治療(例えば、インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２)または腫瘍抗原の提示の増強を提供する二重特異性抗体療法(例えば、Holliger (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak (1994) Structure 2:1121-1123を参照)などのその他の形態の免疫療法と組み合わせることができる。
【０５０７】
自己免疫反応
抗ＯＸ４０抗体は、自己免疫応答を引き起こし、増幅させ得る。実際に、腫瘍細胞およびペプチドワクチンを使用した抗腫瘍応答の誘導により、多くの抗腫瘍応答には、抗自己反応性が関与することがわかっている(van Elsas et al. (2001) J. Exp. Med. 194:481-489、Overwijk, et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 2982-2987、Hurwitz, (2000)前掲、Rosenberg & White (1996) J. Immunother Emphasis Tumor Immunol 19 (1): 81-4)。したがって、抗ＯＸ４０抗体は、疾患の治療のためのこれらの自己タンパク質に対する免疫応答を効率的に生成するワクチン接種プロトコールを考案するために、これらの自己タンパク質とともに使用できる。例えば、アルツハイマー病は、脳内でのアミロイド沈着におけるＡβペプチドの不適切な蓄積を伴い、アミロイドに対する抗体応答により、これらのアミロイド沈着を除去することができる(Schenk et al., (1999) Nature 400: 173-177)。
【０５０８】
他の自己タンパク質もまた、アレルギーおよび喘息の治療についてはＩｇＥおよびリウマチ性関節炎についてはＴＮＦｃなど、標的として使用することができる。最終的には、種々のホルモンに対する抗体応答が、抗ＯＸ４０抗体の使用によって誘導され得る。生殖ホルモンに対する抗体応答の中和は、受胎調節に使用できる。ホルモンおよび特定の腫瘍の成長に必要とされる他の可溶性因子に対する抗体応答の中和もまた、可能性のあるワクチン接種標的と考えることができる。
【０５０９】
抗ＯＸ４０抗体の使用についての上記のような類似の方法は、アルツハイマー病におけるＡβを含むアミロイド沈着、ＴＮＦαなどのサイトカインおよびＩｇＥなど他の自己抗原の不適切な蓄積を有する患者を治療するための治療的自己免疫応答の誘導に使用できる。
【０５１０】
ワクチン
本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体を使用して、この抗体の、対象の抗原(例えば、ワクチン)との同時投与によって、抗原特異的免疫応答を刺激することができる。したがって、対象における抗原に対する免疫応答が増強されるように、対象に、(ｉ)抗原、(ii)抗ＯＸ４０抗体を投与することを含む、対象において抗原に対する免疫応答を増強する方法が、本明細書に提供される。抗体は、ヒト抗ＯＸ４０抗体(本明細書に記載されるヒト抗ＯＸ４０抗体のうちのいずれかなど)であり得る。他の実施形態では、抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体であり得る。抗原は、例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原または病原体に由来する抗原であり得る。このような抗原の限定されない例として、上記で論じられた腫瘍抗原(または腫瘍ワクチン)または上記のウイルス、細菌もしくはその他の病原体に由来する抗原などの上記の節において論じられたものが挙げられる。
【０５１１】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体が結合するエピトープを含むペプチドまたは融合タンパク質が、抗ＯＸ４０抗体の代わりに、または抗ＴＩＧＩＴ抗体に加えて、ワクチンとして使用される。
【０５１２】
インビボおよびインビトロで、本明細書に記載される、抗体組成物(例えば、ヒトモノクローナル抗体、多重特異性および二重特異性分子およびイムノコンジュゲート)を投与する適当な経路は、当技術分野で周知であり、当業者ならば選択できる。例えば、抗体組成物は、注射(例えば、静脈内または皮下)によって投与できる。使用される分子の適した投与量は、対象の年齢および体重ならびに抗体組成物の濃度および／または製剤化に応じて変わる。
【０５１３】
これまでに記載したように、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体は、１種またはその他の複数の治療薬、例えば、細胞傷害性薬剤、放射性毒性薬剤(radiotoxic agent)または免疫抑制剤と同時投与できる。抗体は、薬剤と連結できる(免疫複合体として)か、または薬剤と別個に投与できる。後者の場合には(別個の投与)、抗体を、薬剤の前に、後にもしくは同時に投与できるか、またはその他の既知療法、例えば、抗癌療法、例えば、放射線照射と同時投与できる。このような治療薬として、中でも、それ自体では、患者とって毒性または準毒性であるレベルでのみ有効である、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、シスプラチンブレオマイシン硫酸塩、カルムスチン、クロラムブシル、ダカルバジンおよびシクロホスファミドヒドロキシ尿素などの抗腫瘍、抗新生物薬剤が挙げられる。シスプラチンは、１００ｍｇ／ｍｌの用量で４週間に１回、静脈内に投与され、アドリアマイシンは、６０〜７５ｍｇ／ｍｌの用量で２１日に１回静脈内に投与される。本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合断片の、化学療法薬との同時投与は、ヒト腫瘍細胞に細胞傷害性効果をもたらす異なる機序によって作動する２種の抗癌剤を提供する。このような同時投与は、薬物に対する耐性の発生または抗体と非反応性にする腫瘍細胞の抗原性の変化に関連する問題を解決し得る。
【０５１４】
また、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体組成物(例えば、ヒト抗体、二重特異性もしくは多重特異性分子またはイムノコンジュゲート)および使用のための説明書を含むキットが本明細書において提供される。キットは、少なくとも１種のさらなる試薬または１種もしくは複数のさらなる本明細書に記載されるヒト抗体(例えば、第１のヒト抗体とは別個のＯＸ４０中のエピトープと結合する相補活性を有するヒト抗体)をさらに含有し得る。キットは、通常、キットの内容物の意図される使用を示す表示を含む。用語表示は、キット上にもしくはキットとともに供給された、またはそうでなければキットに添付されている任意の文書または記録材料を含む。
【０５１５】
治療プロトコール
ヒト患者における固形腫瘍(例えば、進行固形腫瘍)を治療するのに好適なプロトコールは、例えば、患者に、配列番号３１８に記載される配列を有する重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインならびに配列番号９４に記載される配列を有する軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む、有効量の抗ＯＸ４０抗体を投与することを含み、ここで、この方法は、少なくとも１回の投与サイクルを含み、サイクルが、２週間の期間であり(Ｑ２Ｗ)、少なくとも１回のサイクルのそれぞれについて、抗ＯＸ４０抗体の少なくとも１回の用量が、１ｍｇ／体重１ｋｇの用量、２０、４０、８０、１６０もしくは３２０ｍｇの固定用量、約１ｍｇ／体重１ｋｇの用量、または約２０、４０、８０、１６０もしくは３２０ｍｇの固定用量で投与される。
【０５１６】
ヒト患者における固形腫瘍を治療するのに好適な別のプロトコールは、例えば、患者に、
(ａ)配列番号３１８に記載される配列を有する重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインならびに配列番号９４に記載される配列を有する軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む、抗ＯＸ４０抗体、ならびに
(ｂ)配列番号３０１に記載される配列を有する重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインならびに配列番号３０２に記載される配列を有する軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む、抗ＰＤ−１抗体を、それぞれの有効量で投与することを含み、
ここで、この方法は、少なくとも１回の投与サイクルを含み、サイクルが、２週間の期間であり、少なくとも１回のサイクルのそれぞれについて、抗ＯＸ４０抗体の少なくとも１回の用量が、１ｍｇ／体重１ｋｇの用量、２０、４０、８０、１６０もしくは３２０ｍｇの固定用量、約１ｍｇ／体重１ｋｇの用量、または約２０、４０、８０、１６０もしくは３２０ｍｇの固定用量で投与され、抗ＰＤ−１抗体の少なくとも１回の用量が、２４０ｍｇの一定用量または約２４０ｍｇの一定用量で投与される。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、３週間に１回(ｑ３ｗ)３６０ｍｇの固定用量で投与されるか、または４週間に１回(ｑ４ｗ)４８０ｍｇの用量で投与される。
【０５１７】
ヒト患者における固形腫瘍を治療するのに好適な別のプロトコールは、例えば、患者に、
(ａ)配列番号３１８に記載される配列を有する重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインならびに配列番号９４に記載される配列を有する軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む、抗ＯＸ４０抗体、ならびに
(ｂ)配列番号３０９に記載される配列を有する重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインならびに配列番号３１０に記載される配列を有する軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む、抗ＣＴＬＡ−４抗体を、それぞれの有効量で投与することを含み、
ここで、この方法は、少なくとも１回の投与サイクルを含み、サイクルが、３週間の期間であり(ｑ３ｗ)、少なくとも１回のサイクルのそれぞれについて、抗ＯＸ４０抗体の少なくとも１回の用量が、１ｍｇ／体重１ｋｇの用量、２０、４０、８０、１６０もしくは３２０ｍｇの固定用量、約１ｍｇ／体重１ｋｇの用量、または約２０、４０、８０、１６０もしくは３２０ｍｇの固定用量で投与され、抗ＣＴＬＡ−４抗体の少なくとも１回の用量が、１ｍｇ／体重１ｋｇの一定用量または約１ｍｇ／体重１ｋｇの一定用量で投与される。ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体が、少なくとも１回のサイクルで抗ＣＴＬＡ−４抗体と一緒に投与された後に、少なくとも１回のサイクルの抗ＯＸ４０抗体の単剤治療が続く。ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、最初の４回のサイクルはイピリムマブと一緒に投与され、後続のサイクルは抗ＯＸ４０抗体の単剤治療が続く。
【０５１８】
いくつかの実施形態では、抗ＯＸ４０抗体および抗ＰＤ−１抗体は、以下の用量：
(ａ)１ｍｇ／ｋｇの抗ＯＸ４０抗体および２４０ｍｇ、３６０ｍｇもしくは４８０ｍｇの抗ＰＤ−１抗体、
(ｂ)２０ｍｇの抗ＯＸ４０抗体および２４０ｍｇ、３６０ｍｇもしくは４８０ｍｇの抗ＰＤ−１抗体、
(ｃ)４０ｍｇの抗ＯＸ４０抗体および２４０ｍｇ、３６０ｍｇもしくは４８０ｍｇの抗ＰＤ−１抗体、
(ｄ)８０ｍｇの抗ＯＸ４０抗体および２４０ｍｇ、３６０ｍｇもしくは４８０ｍｇの抗ＰＤ−１抗体、
(ｅ)１６０ｍｇの抗ＯＸ４０抗体および２４０ｍｇ、３６０ｍｇもしくは４８０ｍｇの抗ＰＤ−１抗体、または
(ｆ)３２０ｍｇの抗ＯＸ４０抗体および２４０ｍｇ、３６０ｍｇもしくは４８０ｍｇの抗ＰＤ−１抗体
で投与される。
【０５１９】
いくつかの実施形態では、抗ＯＸ４０抗体および抗ＣＴＬＡ−４抗体は、以下の用量：
(ａ)１ｍｇ／ｋｇの抗ＯＸ４０抗体および１ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ−４抗体、
(ｂ)２０ｍｇの抗ＯＸ４０抗体および１ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ−４抗体、
(ｃ)４０ｍｇの抗ＯＸ４０抗体および１ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ−４抗体、
(ｄ)８０ｍｇの抗ＯＸ４０抗体および１ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ−４抗体、
(ｅ)１６０ｍｇの抗ＯＸ４０抗体および１ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ−４抗体、または
(ｆ)３２０ｍｇの抗ＯＸ４０抗体および１ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ−４抗体
で投与される。
【０５２０】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体および／または抗ＰＤ−１抗体もしくは抗ＣＴＬＡ−４抗体の用量は、体重当たりで、例えば、ｍｇ／体重１ｋｇで計算される。別の実施形態では、抗ＯＸ４０抗体および／または抗ＰＤ−１抗体もしくは抗ＣＴＬＡ−４抗体の用量は、一定固定用量である。別の実施形態では、抗ＯＸ４０抗体および／または抗ＰＤ−１抗体もしくは抗ＣＴＬＡ−４抗体の用量は、経時的に変動する。例えば、抗ＯＸ４０抗体および／または抗ＰＤ−１抗体もしくは抗ＣＴＬＡ−４抗体は、最初は高用量で投与され得、経時的に減量され得る。別の実施形態では、抗ＯＸ４０抗体および／または抗ＰＤ−１抗体もしくは抗ＣＴＬＡ−４抗体は、最初は低用量で投与され、経時的に増量される。
【０５２１】
別の実施形態では、投与される抗ＯＸ４０抗体および／または抗ＰＤ−１抗体もしくは抗ＣＴＬＡ−４抗体の量は、各用量で一定である。別の実施形態では、投与される抗体の量は、各用量毎に変動する。例えば、抗体の維持(または継続)用量は、最初に投与されるローディング用量よりも高いかまたは同一であり得る。別の実施形態では、抗体の維持用量は、ローディング用量よりも低いかまたは同一であり得る。
【０５２２】
いくつかの実施形態では、抗ＯＸ４０抗体および／または抗ＰＤ−１抗体もしくは抗ＣＴＬＡ−４抗体は、静脈内投与用に製剤化される。いくつかの実施形態では、抗ＯＸ４０抗体または抗ＯＸ４０抗体および抗ＰＤ−１抗体もしくは抗ＣＴＬＡ−４抗体は、各サイクルの１日目に投与される。
【０５２３】
いくつかの実施形態では、抗ＯＸ４０抗体および／または抗ＰＤ−１抗体もしくは抗ＣＴＬＡ−４抗体は、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、または４週間に１回、または臨床上の利点が観察される限りまたは完全な応答、進行疾患の確認もしくは管理不能な毒性があるまで、投与される。
【０５２４】
ある実施形態では、投与のサイクルは、２週間であり、これが、必要に応じて反復され得る。別の実施形態では、サイクルは、３週間である。いくつかの実施形態では、治療は、最大８回のサイクルからなる。他の実施形態では、治療は、最大１２回のサイクルからなる。
【０５２５】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体および抗ＰＤ−１抗体のそれぞれ１回の用量が、２週間毎のサイクルで投与される。別の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体および抗ＯＸ４０抗体のそれぞれ１回の用量が、３週間毎のサイクルで投与される。別の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体および抗ＯＸ４０抗体のそれぞれ１回の用量が、４週間毎のサイクルで投与される。
【０５２６】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体および抗ＣＴＬＡ−４抗体のそれぞれ１回の用量が、３週間毎のサイクルで投与される。いくつかの実施形態では、抗ＯＸ４０抗体および抗ＣＴＬＡ−４抗体のそれぞれ１回の用量が、最初の４回のサイクルは３週間毎に投与され、５回目から８回目のサイクルは抗ＯＸ４０抗体の単剤治療が続く。
【０５２７】
別の実施形態では、抗ＯＸ４０抗体および抗ＰＤ−１抗体もしくは抗ＣＴＬＡ−４抗体は、第１選択の治療(例えば、初期または第１の治療)として投与される。別の実施形態では、抗ＯＸ４０抗体および抗ＰＤ−１抗体もしくは抗ＣＴＬＡ−４抗体は、第２選択の治療(例えば、再発後および／または第１の治療が成功しなかった場合を含め、初期または第１の治療の後)として投与される。
【０５２８】
別の態様では、本発明は、抗ＰＤ−１抗体が、抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗ＰＤ−Ｌ２抗体と置き換えられたか、または組み合わされた、前述の実施形態のいずれかを特徴とする。
【０５２９】
いくつかの実施形態では、ヒト患者は、子宮頸癌、膀胱癌、結腸直腸癌および卵巣癌からなる群から選択される癌を有する。
【０５３０】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、配列番号８７に記載される配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号３１７に記載される配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号８９に記載される配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号９０に記載される配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号９１に記載される配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号９２に記載される配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、それぞれ、配列番号３１８および９４に記載される配列を含む、重鎖および軽鎖可変領域を含む。ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、それぞれ、配列番号１２４および１１６に記載される配列を含む、重鎖および軽鎖配列を含む。
【０５３１】
ある実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、それぞれ、配列番号３０３〜３０５に記載される配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびにそれぞれ、配列番号３０６〜３０８に記載される配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、それぞれ、配列番号３０１および３０２に記載される重鎖および軽鎖可変領域配列を含む。ある実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、それぞれ、配列番号２９９および３００に記載される重鎖および軽鎖配列を含む。
【０５３２】
ある実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、それぞれ、配列番号３１１〜３１３に記載される配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびにそれぞれ、配列番号３１４〜３１６に記載される配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ある実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、それぞれ、配列番号３０９および３１０に記載される重鎖および軽鎖可変領域配列を含む。
【０５３３】
結果
標的病変部に関して、治療法に対する応答として、以下のものを挙げることができる。
【表６】
0006797137.tif 000015
【０５３４】
非標的病変部に関して、治療法に対する応答として、以下のものを挙げることができる。
【表７】
0006797137.tif 000016
【０５３５】
本明細書に開示される方法により治療される患者は、好ましくは、癌の少なくとも１つの兆候における改善を経験する。ある実施形態では、改善は、測定可能な腫瘍病変部の数および／またはサイズの低減によって測定される。別の実施形態では、病変部は、胸部ｘ線またはＣＴもしくはＭＲＩフィルムで測定できる。別の実施形態では、細胞学または組織学を使用して、治療法に対する応答性を評価できる。
【０５３６】
ある実施形態では、治療される患者は、完全な応答(ＣＲ)、部分的な応答(ＰＲ)、安定な疾患(ＳＤ)、免疫関連の全疾患(immune-related complete disease)(ｉｒＣＲ)、免疫関連の部分的な応答(ｉｒＰＲ)または免疫関連の安定な疾患(ｉｒＳＤ)を示す。別の実施形態では、治療される患者は、腫瘍縮小および／または成長速度の減少、すなわち、腫瘍成長の抑制を経験する。別の実施形態では、望ましくない細胞増殖が、低減または阻害される。さらに別の実施形態では、以下のうちの１以上が生じ得る：癌細胞の数が低減され得る、腫瘍サイズが低減され得る、末梢器官への癌細胞浸潤が阻害、妨害、減速または停止され得る、腫瘍転移が減速または阻害され得る、腫瘍成長が阻害され得る、腫瘍の再発が防止または遅延され得る、癌と関連する症状のうちの１以上がある程度緩和され得る。
【０５３７】
他の実施形態では、本明細書に提供される方法のうちのいずれかによる有効量の抗ＯＸ４０抗体および抗ＰＤ−１抗体もしくは抗ＣＴＬＡ−４抗体の投与は、腫瘍サイズの低減、出現する転移病変部の数の経時的な低減、完全な寛解、部分的な寛解、または安定な疾患からなる群から選択される少なくとも１種の治療効果をもたらす。さらに他の実施形態では、治療の方法は、抗ＯＸ４０抗体または抗ＰＤ−１抗体もしくは抗ＣＴＬＡ−４抗体単独で達成されるものよりも良好な比較臨床有用率(clinical benefit rate)(ＣＢＲ＝ＣＲ＋ＰＲ＋６カ月以上のＳＤ)をもたらす。他の実施形態では、臨床有用率の改善は、抗ＯＸ４０抗体または抗ＰＤ−１抗体もしくは抗ＣＴＬＡ−４抗体単独と比較して、約２０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％またはそれ以上である。
【０５３８】
併用療法
上記で提供された併用療法に加えて、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体は、以下に記載されるように併用療法において使用できる。
【０５３９】
併用療法の方法として、抗ＯＸ４０抗体または抗ＯＸ４０抗体および抗ＰＤ−１または抗ＣＴＬＡ−４抗体の組合せが、１以上のさらなる薬剤、例えば、小分子薬または抗体もしくはその抗原結合部分と同時投与されるもの、ならびに免疫応答を刺激し、それによって対象において免疫応答をさらに増強、刺激または上方制御するのに有効であるものが挙げられる。例えば、実施例に示されるように、マウスへの抗ＯＸ４０抗体およびアンタゴニスト抗ＰＤ−１抗体の投与は、腫瘍成長の阻害において相乗効果をもたらし得る。
【０５４０】
抗ＯＸ４０抗体は、(ｉ)刺激(例えば、共刺激)分子のアゴニスト(例えば、受容体もしくはリガンド)および／または(ii)Ｔ細胞などの免疫細胞における阻害シグナルもしくは分子のアンタゴニスト(例えば、受容体もしくはリガンド)と組み合わせることができ、これらのいずれも、抗原特異的Ｔ細胞応答など、免疫応答の増幅をもたらす。特定の態様では、免疫−腫瘍学薬剤は、(ｉ)刺激(共刺激を含む)分子のアゴニスト(例えば、受容体もしくはリガンド)または(ii)先天免疫に関与する細胞、例えば、ＮＫ細胞における阻害(共阻害を含む)分子のアンタゴニスト(例えば、受容体もしくはリガンド)であり、ここで、免疫−腫瘍学薬剤は、先天免疫を増強する。このような免疫−腫瘍学薬剤は、免疫チェックポイント制御因子、例えば、免疫チェックポイント阻害因子または免疫チェックポイント刺激因子と呼ばれることが多い。
【０５４１】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、免疫グロブリンスーパーファミリー(ＩｇＳＦ)のメンバーである刺激分子または阻害分子を標的とする薬剤とともに投与される。例えば、抗ＯＸ４０抗体は、免疫応答を増大するために、ＩｇＳＦファミリーのメンバーを標的とする薬剤とともに対象に投与され得る。他の実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−Ｈ１(ＰＤ−Ｌ１)、Ｂ７−ＤＣ(ＰＤ−Ｌ２)、Ｂ７−Ｈ２(ＩＣＯＳ−Ｌ)、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ５(ＶＩＳＴＡ)およびＢ７−Ｈ６を含む膜結合リガンドのＢ７ファミリーのメンバーを標的とする(もしくはそれらに特異的に結合する)薬剤、またはＢ７ファミリーのメンバーに特異的に結合する共刺激もしくは共阻害受容体とともに投与され得る。
【０５４２】
抗ＯＸ４０抗体はまた、ＣＤ４０およびＤ４０Ｌ、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲ−Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＣＤ１３７、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２−Ｌ、ＴＲＡＩＬＲ１／ＤＲ４、ＴＲＡＩＬＲ２／ＤＲ５、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４、ＯＰＧ、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫＲ／Ｆｎ１４、ＴＷＥＡＫ、ＢＡＦＦＲ、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＡＣＩ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ、ＬＴβＲ、ＬＩＧＨＴ、ＤｃＲ３、ＨＶＥＭ、ＶＥＧＩ／ＴＬ１Ａ、ＴＲＡＭＰ／ＤＲ３、ＥＤＡ１、ＥＤＡ２、ＴＮＦＲ１、リンホトキシンα／ＴＮＦβ、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＬＴβＲ、リンホトキシンα  １β２、ＦＡＳ、ＦＡＳＬ、ＲＥＬＴ、ＤＲ６、ＴＲＯＹならびにＮＧＦＲなどのＴＮＦおよびＴＮＦＲファミリーのメンバーの分子を標的とする薬剤(リガンドまたは受容体)とともに投与され得る(例えば、Tansey (2009) Drug Discovery Today 00:1を参照のこと)。
【０５４３】
Ｔ細胞応答は、抗ＯＸ４０抗体および以下の薬剤のうちの１以上の組合せによって刺激できる：
(１)上記のＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２およびＬＡＧ−３、ならびに次のタンパク質：ＴＩＭ−３、ガレクチン９、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＢＴＬＡ、ＣＤ６９、ガレクチン−１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１１３、ＧＰＲ５６、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、２Ｂ４、ＣＤ４８、ＧＡＲＰ、ＰＤ１Ｈ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ−１およびＴＩＭ−４のうちのいずれかなど、Ｔ細胞活性化を阻害するタンパク質(例えば、免疫チェックポイント阻害因子)のアンタゴニスト(阻害剤もしくは遮断剤)、ならびに／または
(２)Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ２８、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、４−１ＢＢＬ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲ−Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＤＲ３およびＣＤ２８Ｈなど、Ｔ細胞活性化を刺激するタンパク質のアゴニスト。
【０５４４】
上記のタンパク質のうちの１つを調節し、癌を治療するために抗ＯＸ４０抗体と組み合わせることができる例示的薬剤として、Ｙｅｒｖｏｙ(商標)(イピリムマブ)またはトレメリムマブ(ＣＴＬＡ−４に対する)、ガリキシマブ(Ｂ７.１に対する)、ＢＭＳ−９３６５５８(ＰＤ−１に対する)、ＭＫ−３４７５(ＰＤ−１に対する)、ＡＭＰ２２４(Ｂ７ＤＣに対する)、ＢＭＳ−９３６５５９(Ｂ７−Ｈ１に対する)、ＭＰＤＬ３２８０Ａ(Ｂ７−Ｈ１に対する)、ＭＥＤＩ−５７０(ＩＣＯＳに対する)、ＡＭＧ５５７(Ｂ７Ｈ２に対する)、ｍｇＡ２７１(Ｂ７Ｈ３に対する)、ＩＭＰ３２１(ＬＡＧ−３に対する)、ＢＭＳ−６６３５１３(ＣＤ１３７に対する)、ＰＦ−０５０８２５６６(ＣＤ１３７に対する)、ＣＤＸ−１１２７(ＣＤ２７に対する)、アタシセプト(ＴＡＣＩに対する)、ＣＰ−８７０８９３(ＣＤ４０に対する)、ルカツムマブ(ＣＤ４０に対する)、ダセツズマブ(ＣＤ４０に対する)、ムロモナブ−ＣＤ３(ＣＤ３に対する)、イピリムマブ(ＣＴＬＡ−４に対する)が挙げられる。
【０５４５】
抗ＯＸ４０抗体はまた、ピディリズマブ(ＣＴ−０１１)とともに投与してもよい。
【０５４６】
癌の治療のために抗ＯＸ４０抗体と組み合わせることができるその他の分子として、ＮＫ細胞上の阻害性受容体のアンタゴニストまたはＮＫ細胞上の活性化受容体のアゴニストが挙げられる。例えば、抗ＯＸ４０抗体を、ＫＩＲのアンタゴニスト(例えば、リリルマブ(lirilumab))と組み合わせることができる。
【０５４７】
Ｔ細胞活性化は、可溶性サイトカインによっても制御され、抗ＯＸ４０抗体は、Ｔ細胞活性化を阻害するサイトカインのアンタゴニストまたはＴ細胞活性化を刺激するサイトカインのアゴニストとともに、例えば癌を有する対象に投与され得る。
【０５４８】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体を、(ｉ)Ｔ細胞活性化を阻害する、ＩｇＳＦファミリーもしくはＢ７ファミリーもしくはＴＮＦファミリーのタンパク質のアンタゴニスト(または阻害剤もしくは遮断剤)またはＴ細胞活性化を阻害するサイトカイン(例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦ「免疫抑制サイトカイン」)のアンタゴニストおよび／または(ii)免疫応答を刺激するための、例えば、癌などの増殖性疾患を治療するためのＩｇＳＦファミリー、Ｂ７ファミリーもしくはＴＮＦファミリーの、またはＴ細胞活性化を刺激するサイトカインの刺激性受容体のアゴニストと組み合わせて使用できる。
【０５４９】
併用療法のためのさらにその他の薬剤として、マクロファージまたは単球を阻害または枯渇させる薬剤、それだけには限らないが、ＲＧ７１５５(ＷＯ１１／７００２４、ＷＯ１１／１０７５５３、ＷＯ１１／１３１４０７、ＷＯ１３／８７６９９、ＷＯ１３／１１９７１６、ＷＯ１３／１３２０４４)またはＦＰＡ−００８(ＷＯ１１／１４０２４９、ＷＯ１３１６９２６４、ＷＯ１４／０３６３５７)を含めたＣＳＦ−１Ｒアンタゴニスト抗体などのＣＳＦ−１Ｒアンタゴニストが挙げられる。
【０５５０】
抗ＯＸ４０抗体はまた、ＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する薬剤とともに投与してもよい。
【０５５１】
本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体と組み合わせることができるさらなる薬剤として、腫瘍抗原提示を増強する薬剤、例えば、樹状細胞ワクチン、ＧＭ−ＣＳＦ分泌細胞性ワクチン、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびイミキモド、または腫瘍細胞の免疫原性を増強する治療法(例えば、アントラサイクリン)が挙げられる。
【０５５２】
抗ＯＸ４０抗体と組み合わせることができるさらなる他の治療法として、Ｔｒｅｇ細胞を枯渇または遮断する治療法、例えば、ＣＤ２５に特異的に結合する薬剤が挙げられる。
【０５５３】
抗ＯＸ４０抗体と組み合わせることができる別の治療法は、インドールアミンジオキシゲナーゼ(ＩＤＯ)、ジオキシゲナーゼ、アルギナーゼまたは一酸化窒素シンテターゼなどの代謝酵素を阻害する治療法である。
【０５５４】
抗ＯＸ４０抗体とともに使用され得る別のクラスの薬剤として、アデノシンの形成を阻害する薬剤またはアデノシンＡ２Ａ受容体を阻害する薬剤が挙げられる。
【０５５５】
癌を治療するために抗ＯＸ４０抗体と組み合わせることができる他の治療法として、Ｔ細胞アネルギーまたはＴ細胞消耗を逆転／防止する治療法ならびに腫瘍部位における先天免疫活性化および／または炎症を引き起こす治療法が挙げられる。
【０５５６】
抗ＯＸ４０抗体は、１種を上回る免疫−腫瘍学薬剤と組み合わせてもよく、例えば、次の：腫瘍抗原の提示を増強する治療法(例えば、樹状細胞ワクチン、ＧＭ−ＣＳＦ分泌細胞性ワクチン、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、イミキモド)；例えば、ＣＴＬＡ−４および／もしくはＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２経路を阻害するならびに／またはＴｒｅｇもしくは他の免疫抑制細胞を枯渇もしくは遮断することによって、負の免疫制御を阻害する治療法；例えば、ＣＤ−１３７および／もしくはＧＩＴＲ経路を刺激するアゴニストならびに／またはＴ細胞エフェクター機能を刺激するアゴニストを用いて、正の免疫調節を刺激する治療法；抗腫瘍Ｔ細胞の頻度を全身的に増大させる治療法；例えば、ＣＤ２５のアンタゴニスト(例えば、ダクリズマブ)を使用してまたはエキソビボでの抗ＣＤ２５ビーズ枯渇によって腫瘍におけるＴｒｅｇなどのＴｒｅｇを枯渇または阻害する治療法；腫瘍における抑制骨髄系細胞の機能に影響を及ぼす治療法；腫瘍細胞の免疫原性を増強する治療法(例えば、アントラサイクリン)；遺伝子修飾された細胞、例えば、キメラ抗原受容体によって修飾された細胞(ＣＡＲ−Ｔ療法)を含む、養子Ｔ細胞またはＮＫ細胞移入；インドールアミンジオキシゲナーゼ(ＩＤＯ)、ジオキシゲナーゼ、アルギナーゼまたは一酸化窒素シンテターゼなどの代謝酵素を阻害する治療法；Ｔ細胞アネルギーまたはＴ細胞消耗を逆転／防止する治療法；腫瘍部位における先天免疫活性化および／または炎症を引き起こす治療法；免疫刺激サイトカインの投与；あるいは免疫抑制サイトカインの遮断のうちの１以上など、免疫経路の複数の要素を標的とするコンビナトリアルアプローチと組合せてもよい。
【０５５７】
抗ＯＸ４０抗体は、１以上の、陽性共刺激性受容体をライゲーションするアゴニスト剤、阻害性受容体によるシグナル伝達を減弱する遮断薬、アンタゴニストならびに１以上の、抗腫瘍Ｔ細胞の頻度を全身性に増大する薬剤、腫瘍微小環境内のそれぞれの免疫抑制経路に克服する(例えば阻害性受容体の関与(例えば、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用)を遮断しＴｒｅｇを枯渇または阻害し(例えば、抗ＣＤ２５モノクローナル抗体(例えば、ダクリズマブ)を使用して、またはエキソビボ抗ＣＤ２５ビーズ枯渇によって)、ＩＤＯなどの代謝酵素を阻害するか、またはＴ細胞アネルギーもしくは消耗を逆転させる／防ぐ)薬剤および先天性免疫活性化および／または腫瘍部位での炎症の引き金を引く薬剤と一緒に使用できる。
【０５５８】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、対象が、ＢＲＡＦ  Ｖ６００突然変異に関して陽性である場合、ＢＲＡＦ阻害剤と一緒に対象に投与される。
【０５５９】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、別の免疫刺激抗体と一緒に投与される。
【０５６０】
例えば、腫瘍成長を阻害するよう、または抗ウイルス性応答を刺激するよう、対象において免疫応答が刺激されるように、対象に、抗ＯＸ４０抗体ならびに抗ＰＤ−１アンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体、抗ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体、アンタゴニスト抗ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体および／または抗ＬＡＧ３アンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体などの１以上のさらなる免疫賦活性抗体を投与することを含む、対象において免疫応答を刺激するための方法が本明細書において提供される。ある実施形態では、対象は、抗ＯＸ４０抗体およびアンタゴニスト抗ＰＤ−１抗体を投与される。ある実施形態では、対象は、抗ＯＸ４０抗体およびアンタゴニスト抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与される。ある実施形態では、対象は、抗ＯＸ４０抗体およびアンタゴニスト抗ＣＴＬＡ−４抗体を投与される。ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、ヒト抗体である。あるいは、抗ＯＸ４０抗体は、例えば、キメラ抗体またはヒト化抗体であり得る。ある実施形態では、少なくとも１種のさらなる免疫賦活性抗体(例えば、アンタゴニスト抗ＰＤ−１、アンタゴニスト抗ＰＤ−Ｌ１、アンタゴニスト抗ＣＴＬＡ−４および／またはアンタゴニスト抗ＬＡＧ３抗体)は、ヒト抗体である。あるいは、少なくとも１種のさらなる免疫賦活性抗体は、例えば、キメラまたはヒト化抗体(例えば、マウス抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＬＡＧ３抗体から調製された)であり得る。
【０５６１】
抗ＯＸ４０抗体と、アンタゴニストＰＤ−１抗体、アンタゴニスト抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体または抗ＬＡＧ３抗体を対象に投与することを含む、過剰増殖性疾患(例えば、癌)を治療するための方法が本明細書において提供される。ある実施形態では、一方または両方の抗体が、治療量以下の用量で投与される。また、抗ＯＸ４０抗体および治療量以下の用量の抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＣＴＬＡ−４または抗ＬＡＧ３抗体を、対象(例えば、ヒト)に投与することを含む、免疫賦活性薬剤を用いる過剰増殖性疾患の治療と関連する有害事象を変更するための方法が本明細書において提供される。ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、３Ｆ４、１４Ｂ６−１、１４Ｂ６−２、２３Ｈ３、６Ｅ１−１、６Ｅ１−２、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３、１４Ａ２−１、１４Ａ２−２および２０Ｃ１のＣＤＲもしくは可変領域を含むか、本明細書に記載される別のアゴニスト抗ＯＸ４０抗体である。
【０５６２】
本明細書に記載される方法において使用するための適したＰＤ−１アンタゴニストとして、制限するものではないが、リガンド、抗体(例えば、モノクローナル抗体および二重特異性抗体)および多価薬剤が挙げられる。ある実施形態では、ＰＤ−１アンタゴニストは、融合タンパク質、例えば、ＡＭＰ−２４４などのＦｃ融合タンパク質である。ある実施形態では、ＰＤ−１アンタゴニストは、抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。
【０５６３】
例示的抗ＰＤ−１抗体として、ニボルマブ(ＢＭＳ−９３６５５８)またはＷＯ２００６／１２１１６８に記載される抗体１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、７Ｄ３、５Ｆ４および４Ａ１１のうち１種のＣＤＲもしくは可変領域を含む抗体がある。ある実施形態では、抗ＰＤ１抗体は、ＷＯ２０１２／１４５４９３に記載されるＭＫ−３４７５(ランブロリズマブ)；およびＷＯ２０１２／１４５４９３に記載されるＡＭＰ−５１４である。さらに公知のＰＤ−１抗体およびその他のＰＤ−１阻害剤として、ＷＯ２００９／０１４７０８、ＷＯ０３／０９９１９６、ＷＯ２００９／１１４３３５、ＷＯ２０１１／０６６３８９、ＷＯ２０１１／１６１６９９、ＷＯ２０１２／１４５４９３、米国特許第７,６３５,７５７号および同８,２１７,１４９号ならびに米国特許公開第２００９／０３１７３６８号に記載されるものが挙げられる。ＷＯ２０１３／１７３２２３に開示される抗ＰＤ−１抗体のいずれかも使用してもよい。これらの抗体のうち１種と同様に、結合についてＰＤ−１上の同一エピトープと競合する、および／またはＰＤ−１上の同一エピトープと結合する抗ＰＤ−１抗体も、併用治療において使用してもよい。ＰＤ−１受容体を標的とする別のアプローチは、ＡＭＰ−２２４と呼ばれる、ＩｇＧ１のＦｃ部分に融合されたＰＤ−Ｌ２(Ｂ７−ＤＣ)の細胞外ドメインから構成される組換えタンパク質である。ある実施形態では、抗体は、上述の抗体との少なくとも約９０％の可変領域アミノ酸配列同一性を有する。
【０５６４】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、それぞれ、配列番号２９９および３００に示される配列を含む重鎖および軽鎖を含むニボルマブまたはその抗原結合断片と組み合わせて使用される。ある実施形態では、抗体は、ニボルマブの重鎖および軽鎖ＣＤＲまたは可変領域を有する。したがって、ある実施形態では、抗体は、配列番号３０１に記載される配列を有するニボルマブのＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインならびに配列番号３０２に記載される配列を有するニボルマブのＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む。ある実施形態では、抗体は、それぞれ、配列番号３０３〜３０５に記載される配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインならびにそれぞれ、配列番号３０６〜３０８に記載される配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む。ある実施形態では、抗体は、それぞれ、配列番号３０１および／または配列番号３０２に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび／またはＶＬ領域を含む。ある実施形態では、抗体は、配列番号３０１または配列番号３０２との少なくとも約９０％、例えば、少なくとも約９０％、９５％または９９％の可変領域同一性を有する。
【０５６５】
例示的抗ＰＤ−Ｌ１抗体として、ＢＭＳ−９３６５５９(ＷＯ２００７／００５８７４および米国特許第７,９４３,７４３号では１２Ａ４と呼ばれる)、またはＰＣＴ公開ＷＯ０７／００５８７４および米国特許第７,９４３,７４３号に記載される３Ｇ１０、１２Ａ４、１０Ａ５、５Ｆ８、１０Ｈ１０、１Ｂ１２、７Ｈ１、１１Ｅ６、１２Ｂ７および１３Ｇ４のＣＤＲもしくは可変領域を含む抗体が挙げられる。ある実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＭＥＤＩ４７３６(また、抗Ｂ７−Ｈ１としても知られる)、ＭＰＤＬ３２８０Ａ(ＲＧ７４４６としても知られる)、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ(ＷＯ２０１３／７９１７４)またはｒＨｉｇＭ１２Ｂ７である。ＷＯ２０１３／１７３２２３、ＷＯ２０１１／０６６３８９、ＷＯ２０１２／１４５４９３、米国特許第７,６３５,７５７号および同８,２１７,１４９号および米国特許公開第２００９／１４５４９３号において開示される抗ＰＤ−Ｌ１抗体のいずれも使用してもよい。
【０５６６】
例示的抗ＣＴＬＡ−４抗体として、Ｙｅｒｖｏｙ(商標)(ＰＣＴ公開ＷＯ０１／１４４２４に記載されるイピリムマブまたは抗体１０Ｄ１)、トレメリムマブ(以前は、チシリムマブ、ＣＰ−６７５,２０６)または以下の刊行物：ＷＯ９８／４２７５２；ＷＯ００／３７５０４；米国特許第６,２０７,１５６；Hurwitz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(17):10067-10071;Camacho et al. (2004) J. Clin. Oncology 22(145):Abstract No. 2505(antibody CP-675206);およびMokyr et al. (1998) Cancer Res. 58:5301-5304のいずれかに記載される抗ＣＴＬＡ−４抗体が挙げられる。ＷＯ２０１３／１７３２２３に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体のいずれも、使用してよい。
【０５６７】
例示的抗ＬＡＧ３抗体として、米国特許公開ＵＳ２０１１／０１５０８９２、ＷＯ１０／１９５７０およびＷＯ２０１４／００８２１８に記載されている、抗体２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２または１７Ｅ５のＣＤＲもしくは可変領域を含む抗体が挙げられる。ある実施形態では、抗ＬＡＧ−３抗体は、ＢＭＳ−９８６０１６である。使用できる、その他の当技術分野で認識される抗ＬＡＧ−３抗体として、ＵＳ２０１１／００７０２３、ＷＯ０８／１３２６０１およびＷＯ０９／４４２７３に記載されるＩＭＰ７３１およびＩＭＰ−３２１が挙げられる。
【０５６８】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、イピリムマブと組み合わせて使用される。ある実施形態では、抗体は、イピリムマブの重鎖および軽鎖ＣＤＲまたは可変領域を有する。したがって、ある実施形態では、抗体は、配列番号３０９に記載される配列を有するイピリムマブのＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインならびに配列番号３１０に記載される配列を有するイピリムマブのＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む。ある実施形態では、抗体は、それぞれ、配列番号３１１〜３１３に記載される配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインならびにそれぞれ、配列番号３１４〜３１６に記載される配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む。ある実施形態では、抗体は、それぞれ、配列番号３０９および／または配列番号３１０に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび／またはＶＬ領域を含む。ある実施形態では、抗体は、配列番号３０９または配列番号３１０との少なくとも約９０％、例えば、少なくとも約９０％、９５％または９９％の可変領域同一性を有する。
【０５６９】
抗ＯＸ４０抗体およびアンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体の、ＬＡＧ−３および／またはＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１などの１以上の第２の標的抗原への投与は、患者における癌性細胞に対する免疫応答を増強し得る。成長が抗ＯＸ４０抗体を使用して阻害され得る癌には、通常免疫療法に応答性である癌および通常は免疫療法に応答性ではないものが含まれる。本開示の併用療法を用いる治療のための癌の代表例として、本明細書において列挙された癌が挙げられる。
【０５７０】
ある実施形態では、本明細書において論じられる治療用抗体の組合せを、医薬上許容される担体中の単一組成物として同時に、または医薬上許容される担体中の各抗体を有する別個の組成物として同時に投与できる。別の実施形態では、治療用抗体の組合せを別個に投与できる。さらに、２以上の用量の併用療法が逐次投与される場合には、逐次投与の順序は、各投与時点で逆転させることができ、同一順序で維持することができ、逐次投与は、同時投与またはその任意の組合せと組み合わせることができる。例えば、抗ＯＸ４０抗体および抗ＰＤ１抗体(および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または抗ＬＡＧ−３抗体)の組合せの第１の投与は、同時であり得、第２の投与は、抗ＰＤ１抗体が第１および抗ＯＸ４０抗体が第２で逐次であり得、第３の投与は、抗ＯＸ４０抗体が第１および抗ＰＤ１抗体が第２で逐次であり得る、など。別の代表的な投薬スキームは、抗ＯＸ４０が第１および抗ＰＤ１抗体(および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または抗ＬＡＧ−３抗体)が第２で逐次である第１の投与を含み、その後の投与は同時であってもよい。
【０５７１】
ある実施形態では、免疫系の刺激により利益を得ることができる疾患、例えば、癌または感染性疾患を有する対象は、対象への抗ＯＸ４０抗体および免疫−腫瘍学薬剤の投与によって治療される。例示的免疫−腫瘍学薬剤として、ＣＤ１３７(４−１ＢＢ)アゴニスト(例えば、ウレルマブまたはＰＦ−０５０８２５６６などのアゴニストＣＤ１３７抗体(ＷＯ１２／３２４３３))；ＧＩＴＲアゴニスト(例えば、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体)、ＣＤ４０アゴニスト(例えば、アゴニストＣＤ４０抗体)；ＣＤ４０アンタゴニスト(例えば、ルカツムマブ(ＨＣＤ１２２)、ダセツズマブ(ＳＧＮ−４０)、ＣＰ−８７０,８９３もしくはＣｈｉ  Ｌｏｂ  ７／４などのアンタゴニストＣＤ４０抗体)；ＣＤ２７アゴニスト(例えば、バルリムマブ(varlilumab)(ＣＤＸ−１１２７)などのアゴニストＣＤ２７抗体)、ＭＧＡ２７１(Ｂ７Ｈ３に対する)(ＷＯ１１／１０９４００))；ＫＩＲアンタゴニスト(例えば、リリルマブ(lirilumab))；ＩＤＯアンタゴニスト(例えば、ＩＮＣＢ−０２４３６０(ＷＯ２００６／１２２１５０、ＷＯ０７／７５５９８、ＷＯ０８／３６６５３、ＷＯ０８／３６６４２)、インドキシモド(indoximod)、ＮＬＧ−９１９(ＷＯ０９／７３６２０、ＷＯ０９／１１５６６５２、ＷＯ１１／５６６５２、ＷＯ１２／１４２２３７)またはＦ００１２８７)；Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト(例えば、ＴＬＲ２／４アゴニスト(例えば、カルメット・ゲラン桿菌(Bacillus Calmette-Guerin))；ＴＬＲ７アゴニスト(例えば、ヒルトノール(Hiltonol)またはイミキモド)；ＴＬＲ７／８アゴニスト(例えば、レシキモド)；またはＴＬＲ９アゴニスト(例えば、ＣｐＧ７９０９))；ならびにＴＧＦ−β阻害剤(例えば、ＧＣ１００８、ＬＹ２１５７２９９、ＴＥＷ７１９７もしくはＩＭＣ−ＴＲ１)が挙げられる。
【０５７２】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、第２の薬剤、例えば、免疫−腫瘍学薬剤の投与の前に投与される。別の実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、第２の薬剤、例えば、免疫−腫瘍学薬剤と同時に投与される。さらに別の実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、第２の薬剤の投与後に投与される。２つの薬剤の投与は、例えば、３０分間、６０分間、９０分間、１２０分間、３時間、６時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、３日間、５日間、７日間、または１週間もしくは数週間離れた時点で開始してもよく、または第２の薬剤の投与は、例えば、第１の薬剤を投与した３０分後、６０分後、９０分後、１２０分後、３時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、３日後、５日後、７日後、または１週間後もしくは数週間後に開始してもよい。
【０５７３】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体および第２の薬剤、例えば、免疫−腫瘍学薬剤は、患者に、例えば、３０分間または６０分間の期間にわたって、同時に投与される、例えば、同時に注入される。抗ＯＸ４０抗体は、第２の薬剤、例えば、免疫−腫瘍学薬剤と共製剤化されてもよい。
【０５７４】
適宜、唯一の免疫治療薬としての抗ＯＸ４０抗体または抗ＯＸ４０抗体および１以上のさらなる免疫治療用抗体(例えば、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３遮断)の組合せを、癌性細胞などの免疫原、精製された腫瘍抗原(組換えタンパク質、ペプチドおよび炭水化物分子を含む)、細胞および免疫刺激性サイトカイン(He et al. (2004) J. Immunol. 173:4919-28)をコードする遺伝子を用いてトランスフェクトされた細胞とさらに組み合わせることができる。使用できる腫瘍ワクチンの限定されない例として、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２、ＭＡＲＴ１および／またはチロシナーゼのペプチドなどの黒色腫抗原のペプチドまたはサイトカインＧＭ−ＣＳＦを発現するようトランスフェクトされた腫瘍細胞が挙げられる(以下にさらに論じられる)。抗ＯＸ４０抗体および１以上のさらなる抗体(例えば、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断)の組合せはまた、標準癌治療とさらに組み合わせることができる。例えば、抗ＯＸ４０抗体および１以上のさらなる抗体(例えば、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断)の組合せを、化学療法治療計画と効率的に組み合わせることができる。これらの場合には、組合せとともに投与されるその他の化学療法試薬の用量を低減することが可能である(Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304)。例えば、このような組合せとして、黒色腫の治療のためのデカルバジン(decarbazine)またはインターロイキン−２(ＩＬ−２)とさらに組み合わせた、さらなる抗体(例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または抗ＬＡＧ−３抗体)を伴うか、または伴わない、抗ＯＸ４０抗体が挙げられる。アゴニスト抗ＯＸ４０抗体と、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断の、化学療法と組み合わせることの背後の科学的論拠は、ほとんどの化学療法薬化合物の細胞傷害性作用の結果である細胞死が、抗原提示経路における腫瘍抗原のレベルの増大をもたらすはずであるということである。細胞死によるＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断を伴うか、または伴わない、抗ＯＸ４０抗体との組合せとの相乗作用をもたらし得るその他の併用療法として、放射線照射、手術またはホルモン欠乏がある。これらのプロトコールの各々は、宿主において腫瘍抗原の供給源を作製する。血管新生阻害剤もまた、抗ＯＸ４０抗体およびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断の組合せと組み合わせることができる。血管新生の阻害は、腫瘍細胞死につながり、これが、宿主の抗原提示経路に供給される腫瘍抗原の供給源であり得る。
【０５７５】
ある実施形態では、唯一の免疫治療薬として抗ＯＸ４０抗体を使用でき、または抗ＯＸ４０抗体およびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断抗体の組合せをまた、腫瘍細胞に対するＦｃαまたはＦｃγ受容体発現性エフェクター細胞を標的とする二重特異性抗体と組み合わせて使用することができる(例えば、米国特許第５,９２２,８４５号および同５,８３７,２４３号参照)。２種の別個の抗原を標的とするよう二重特異性抗体を使用できる。これらの応答のＴ細胞アームは、抗ＯＸ４０抗体およびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断の組合せの使用によって増強される。
【０５７６】
別の実施例では、唯一の免疫治療薬として抗ＯＸ４０抗体を使用でき、または抗ＯＸ４０抗体およびさらなる免疫賦活性薬剤、例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはＬＡＧ−３薬剤(例えば、抗体)の組合せを、リツキサン(登録商標)(リツキシマブ)、ヘルセプチン(登録商標)(トラスツズマブ)、ベキサール(登録商標)(トシツモマブ)、ゼバリン(登録商標)(イブリツモマブ)、キャンパス(登録商標)(アレムツズマブ)、Ｌｙｍｐｈｏｃｉｄｅ(登録商標)(エプルツズマブ(eprtuzumab))、アバスチン(登録商標)(ベバシズマブ)およびＴａｒｃｅｖａ(登録商標)(エルロチニブ)などの抗腫瘍、抗新生物抗体とともに使用できる。例として、理論に捉われようとは思わないが、抗癌抗体または毒素とコンジュゲートしている抗癌抗体を用いる治療は、癌細胞死(例えば、腫瘍細胞)につながり得、これは、免疫賦活性薬剤(例えば、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１またはＬＡＧ−３薬剤、例えば、抗体)によって免疫応答媒介性を増強する。例示的実施形態では、過剰増殖性疾患(例えば、癌腫瘍)の治療は、抗癌剤(例えば、抗体)を、同時にまたは逐次またはそれらの任意の組合せで、抗ＯＸ４０抗体および適宜、さらなる免疫賦活性薬剤、例えば、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３薬剤(例えば、抗体)と組み合わせて含み得、これは、宿主による抗腫瘍免疫応答を増強し得る。
【０５７７】
腫瘍は、多種多様な機序によって宿主免疫監視を回避する。これらの機序のうち多くは、腫瘍によって発現され、免疫抑制であるタンパク質の不活性化によって克服され得る。これらは、中でも、ＴＧＦ−β(Kehrl et al. (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050)、ＩＬ−１０(Howard & O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200)およびＦａｓリガンド(Hahne et al. (1996) Science 274: 1363-1365)を含む。これらの実体の各々に対する抗体は、免疫抑制剤の効果に対抗し、宿主による抗腫瘍免疫応答に有利に働くよう、さらなる免疫賦活性薬剤、例えば、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３薬剤、例えば、抗体を伴ってか、または伴わずに、抗ＯＸ４０抗体とさらに組み合わせることができる。
【０５７８】
宿主免疫応答性を活性化するために使用できるその他の薬剤(例えば、抗体)を、さらなる免疫賦活性薬剤、例えば、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３抗体などを伴ってか、または伴わずに、抗ＯＸ４０抗体と組み合わせてさらに使用できる。これらは、ＤＣ機能および抗原提示を活性化する樹状細胞の表面上の分子を含む。抗ＣＤ４０抗体(Ridge et al., 前掲)は、抗ＯＸ４０抗体および適宜、さらなる免疫賦活性薬剤、例えば、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３薬剤、例えば、抗体とともに使用できる。Ｔ細胞共刺激分子Weinberg et al.、前掲、Melero et al.、前掲、Hutloff et al.、前掲に対するその他の活性化抗体はまた、Ｔ細胞活性化のレベルの増大を提供する。
【０５７９】
上記で論じたように、骨髄移植は現在、造血起源の種々の腫瘍を治療するために現在使用されている。抗ＯＸ４０免疫療法は、単独で、またはＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断と組み合わせて使用して、ドナーから移植された腫瘍特異的Ｔ細胞の有効性を増大することができる。
【０５８０】
いくつかの実験治療プロトコールは、抗原特異的Ｔ細胞のエキソビボ活性化および拡大および腫瘍に対する抗原特異的Ｔ細胞のための、これらの細胞のレシピエントへの養子移植を含む(Greenberg & Riddell、前掲)。これらの方法はまた、ＣＭＶなどの感染性病原体に対するＴ細胞応答を活性化するよう使用できる。抗ＯＸ４０抗体の存在下でのエキソビボ活性化は、さらなる免疫賦活性療法、例えば、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３抗体を伴ってか、または伴わずに、養子導入されたＴ細胞の頻度および活性を増大すると予測することができる。
【０５８１】
抗ＯＸ４０抗体を、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３薬剤(例えば、抗体)を伴ってか、または伴わずに、対象に投与することを含む、免疫賦活性薬剤を用いる過剰増殖性疾患(例えば、癌)の治療と関連する有害事象を変更するための方法が、本明細書において提供される。例えば、本明細書に記載される方法は、患者に非吸収性ステロイドを投与することによって、免疫賦活性治療用抗体誘導性大腸炎または下痢の罹患率を低減する方法を提供する。本明細書において、「非吸収性ステロイド」は、広範な初回通過代謝を示し、その結果、肝臓における代謝後に、ステロイドのバイオアベイラビリティが低い、すなわち、約２０％未満であるグルココルチコイドである。ある実施形態では、非吸収性ステロイドは、ブデソニドである。ブデソニドは、経口投与後に広範に、主に肝臓によって代謝される局所活性糖質コルチコイドである。ＥＮＴＯＣＯＲＴ  ＥＣ(登録商標)(Ａｓｔｒａ−Ｚｅｎｅｃａ)は、回腸および結腸全体への薬物送達を最適化するために開発されたブデソニドのｐＨおよび時間依存性経口製剤である。ＥＮＴＯＣＯＲＴ  ＥＣ(登録商標)は、回腸および／または上行結腸が関与する軽度から中程度のクローン病の治療のために米国において承認されている。クローン病の治療のためのＥＮＴＯＣＯＲＴ  ＥＣ(登録商標)の通常の経口投与量は、６〜９ｍｇ／日である。ＥＮＴＯＣＯＲＴ  ＥＣ(登録商標)は、腸管において放出され、その後、腸粘膜において吸収され、保持される。腸粘膜標的組織を通過すると、ＥＮＴＯＣＯＲＴ  ＥＣ(登録商標)は、肝臓においてシトクロムＰ４５０系によって、無視できるほどのグルココルチコイド活性を有する代謝産物に広範に代謝される。したがって、バイオアベイラビリティは低い(約１０％)。ブデソニドの低いバイオアベイラビリティは、あまり広範ではない初回通過代謝を有するその他のグルココルチコイドと比較して改善された治療可能比をもたらす。ブデソニドは、全身活性化コルチコステロイドよりも少ない視床下部−下垂体抑制を含め、より少ない有害作用しかもたらさない。しかし、ＥＮＴＯＣＯＲＴ  ＥＣ(登録商標)の慢性投与は、全身性高コルチコイド症(hypercorticism)および副腎抑制などの全身グルココルチコイド作用をもたらし得る。PDR 58th ed. 2004; 608-610を参照のこと。
【０５８２】
さらなる実施形態では、非吸収性ステロイドとともに、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断(すなわち、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３抗体)を伴うか、または伴わない抗ＯＸ４０抗体を、サリチル酸とさらに組み合わせることができる。サリチル酸として、例えば、スルファサラジン(ＡＺＵＬＦＩＤＩＮＥ(登録商標)、Pharmacia & UpJohn)；オルサラジン(ＤＩＰＥＮＴＵＭ(登録商標)、Pharmacia & UpJohn)；バルサラジド(ＣＯＬＡＺＡＬ(登録商標)、Salix Pharmaceuticals, Inc.)；およびメサラミン(ＡＳＡＣＯＬ(登録商標)、Procter & Gamble Pharmaceuticals；ＰＥＮＴＡＳＡ(登録商標)、Shire US；ＣＡＮＡＳＡ(登録商標)、Axcan Scandipharm,Inc.；ＲＯＷＡＳＡ(登録商標)、Ｓｏｌｖａｙ)などの５−ＡＳＡ薬剤が挙げられる。
【０５８３】
本明細書に記載される方法に従って、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３抗体および非吸収性ステロイドを伴うか、または伴わない、抗ＯＸ４０抗体と組み合わせて投与されるサリチル酸として、免疫賦活性抗体によって誘発される大腸炎の発生率の低減を目的とした、サリチル酸および非吸収性ステロイドの任意の重複または逐次投与を挙げることができる。したがって、例えば、本明細書に記載される免疫賦活性抗体によって誘発される大腸炎の発生率を低減するための方法は、サリチル酸および非吸収性を同時にまたは逐次投与すること(例えば、サリチル酸は、非吸収性ステロイドの６時間後に投与される)、またはその任意の組合せを包含する。さらに、サリチル酸および非吸収性ステロイドを、同一経路によって(例えば、両方を経口投与する)、または異なる経路によって(例えば、サリチル酸を経口投与し、非吸収性ステロイドを直腸に投与する)投与でき、これは、抗ＯＸ４０抗体および抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３抗体を投与するために使用される経路(単数または複数)とは異なり得る。
【０５８４】
本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体および組合せ抗体療法を、治療されている適応症(例えば、癌)に対するその特定の有用性について選択されるその他の周知の療法とともに使用してもよい。抗ＯＸ４０抗体の組合せを、公知の医薬上許容される薬剤(単数または複数)と逐次使用してもよい。
【０５８５】
例えば、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体および組合せ抗体療法は、放射線照射、化学療法(例えば、カンプトテシン(ＣＰＴ−１１)、５−フルオロウラシル(５−ＦＵ)、シスプラチン、ドキソルビシン、イリノテカン、パクリタキセル、ゲムシタビン、シスプラチン、パクリタキセル、カルボプラチン−パクリタキセル(タキソール)、ドキソルビシン、５−ｆｕまたはカンプトテシン＋ａｐｏ２ｌ／ＴＲＡＩＬ(６Ｘ  ｃｏｍｂｏ)を使用する)、１以上のプロテアソーム阻害剤(例えば、ボルテゾミブまたはＭＧ１３２)、１以上のＢｃｌ−２阻害剤(例えば、ＢＨ３Ｉ−２’(ｂｃｌ−ｘｌ阻害剤)、インドールアミンジオキシゲナーゼ−１阻害剤(例えば、ＩＮＣＢ２４３６０、インドキシモド、ＮＬＧ−９１９またはＦ００１２８７)、ＡＴ−１０１(Ｒ−(−)−ゴシポール誘導体)、ＡＢＴ−２６３(小分子)、ＧＸ−１５−０７０(オバトクラックス(ｏｂａｔｏｃｌａｘ))またはＭＣＬ−１(骨髄系白血病細胞分化タンパク質−１)アンタゴニスト)、ｉＡＰ(アポトーシスタンパク質の阻害剤)アンタゴニスト(例えば、ｓｍａｃ７、ｓｍａｃ４、小分子ｓｍａｃミメティック、合成ｓｍａｃペプチド(Fulda et al., Nat Med 2002;8:808-15)、ＩＳＩＳ２３７２２(ＬＹ２１８１３０８)またはＡＥＧ−３５１５６(ＧＥＭ−６４０))、ＨＤＡＣ(ヒストンデアセチラーゼ)阻害剤、抗ＣＤ２０抗体(例えば、リツキシマブ)、血管新生阻害剤(例えば、ベバシズマブ)、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲを標的化する抗血管新生剤(例えば、アバスチン)、合成トリテルペノイド(Hyer et al., Cancer Research 2005;65:4799-808を参照のこと)、ｃ−ＦＬＩＰ(細胞性ＦＬＩＣＥ阻害性タンパク質)モジュレーター(例えば、ＰＰＡＲγ(ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ)の天然および合成リガンド、５８０９３５４または５５６９１００)、キナーゼ阻害剤(例えば、ソラフェニブ)、トラスツズマブ、セツキシマブ、テムシロリムス、ラパマイシンおよびテムシロリムスなどのｍＴＯＲ阻害剤、ボルテゾミブ、ＪＡＫ２阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ阻害剤、レナリドマイド(Lenalildomide)、ＧＳＫ３β阻害剤、ＩＡＰ阻害剤および／または遺伝毒性薬物などのさらなる治療と組み合わせて(例えば、同時または別個に)使用できる。
【０５８６】
本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体および組合せ抗体療法は、１以上の抗増殖性細胞傷害性薬剤と組み合わせてさらに使用できる。抗増殖性細胞傷害性薬剤として使用してもよい化合物のクラスとして、それだけには限らないが、以下が挙げられる：
【０５８７】
アルキル化剤(制限するものではないが、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソ尿素およびトリアゼンを含む)：ウラシルマスタード、クロルメチン、シクロホスファミド(ＣＹＴＯＸＡＮ(商標))ホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホラミン、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジンおよびテモゾロミド。
【０５８８】
代謝拮抗剤(制限するものではないが、葉酸アンタゴニスト、ピリミジン類似体、プリン類似体およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤を含む)：メトトレキサート、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、６−メルカププリン、６−チオグアニン、フルダラビンホスフェート、ペントスタチンおよびゲムシタビン。
【０５８９】
当技術分野で公知のその他のマイクロチューブリン分解防止剤に加えて、抗ＯＸ４０抗体、制限するものではないが、タキサン、パクリタキセル(パクリタキセルは、ＴＡＸＯＬＴＭとして市販されている)、ドセタキセル、ディスコデルモリド(ＤＤＭ)、ジクチオスタチン(ＤＣＴ)、ペロルシド(Peloruside)Ａ、エポチロン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、エポチロンＤ、エポチロンＥ、エポチロンＦ、フラノエポチロンＤ、デスオキシエポチロンＢｌ、［１７］−デヒドロデスオキシエポチロンＢ、［１８］デヒドロデスオキシエポチロンＢ、Ｃ１２,１３−シクロプロピル−エポチロンＡ、Ｃ６−Ｃ８架橋エポチロンＡ、トランス−９,１０−デヒドロエポチロンＤ、シス−９,１０−デヒドロエポチロンＤ、１６−デスメチルエポチロンＢ、エポチロンＢ１０、ディスコデルモリド(discoderomolide)、パツピロン(patupilone)(ＥＰＯ−９０６)、ＫＯＳ−８６２、ＫＯＳ−１５８４、ＺＫ−ＥＰＯ、ＡＢＪ−７８９、ＸＡＡ２９６Ａ(ディスコデルモリド(discoderomolide))、ＴＺＴ−１０２７(ソブリドチン)、ＩＬＸ−６５１(タシドチン塩酸塩(tasidotin hydrochloride))、ハリコンドリンＢ、エリブリンメシル酸塩(Eribulin mesylate)(Ｅ−７３８９)、ヘミアステリン(ＨＴＩ−２８６)、Ｅ−７９７４、クリプトフィシン、ＬＹ−３５５７０３、マイタンシノイドイムノコンジュゲート(ＤＭ−１)、ＭＫＣ−１、ＡＢＴ−７５１、Ｔ１−３８０６７、Ｔ−９００６０７、ＳＢ−７１５９９２(イスピネシブ(ispinesib))、ＳＢ−７４３９２１、ＭＫ−０７３１、ＳＴＡ−５３１２、エリュテロビン、１７β−アセトキシ−２−エトキシ−６−オキソ−Ｂ−ホモ−エストラ−１,３,５(１０)−トリエン−３−オール、シクロストレプチン、イソラウリマリド、ラウリマリド、４−エピ−７−デヒドロキシ−１４,１６−ジデメチル−(＋)−ディスコデルモリドおよびクリプトチロン(cryptothilone)１と組み合わせるための適した抗増殖性薬剤。
【０５９０】
抗ＯＸ４０抗体を用いる治療とともに、またはそれに先立って異常に増殖性の細胞を静止状態にすることが望ましい場合には、１７ａ−エチニルエストラジオール、ジエチルスチルベストロール、テストステロン、プレドニゾン、フルオキシメステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトン、メゲストロールアセテート、メチルプレドニゾロン、メチル−テストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、メドロキシプロゲステロンアセテート、リュープロリド、フルタミド、トレミフェン、ＺＯＬＡＤＥＸＴＭなどのホルモンおよびステロイド(合成類似体を含む)も、患者に投与できる。本明細書に記載される方法または組成物を使用する場合には、鎮吐剤などの、臨床設定において腫瘍成長または転移の調節において使用されるその他の薬剤も、望まれるように投与できる。
【０５９１】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、癌、例えば、結腸直腸癌または膀胱癌を有する患者を治療するために、ニボルマブと組み合わせて(同時または別個に)投与される。
【０５９２】
ある実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、癌、例えば、卵巣癌、膀胱癌または前立腺癌を有する患者を治療するために、イピリムマブと組み合わせて(同時または別個に)投与される。
【０５９３】
化学療法薬の安全および有効な投与のための方法は、当業者に公知である。さらに、その投与は標準的な文献に記載される。例えば、多数の化学療法薬の投与は、その開示内容が、参照により本明細書に組み込まれる、Physicians' Desk Reference (PDR)、例えば、1996年版(Medical Economics Company、Montvale、N.J. 07645-1742、USA)に記載されている。化学療法薬(単数または複数)および／または放射線療法を、当技術分野で周知の治療用プロトコールに従って投与できる。化学療法薬(単数または複数)および／または放射線療法の投与は、治療されている疾患およびその疾患に対する化学療法薬(単数または複数)および／または放射線療法の公知の効果に応じて変わり得るということは、当業者には明らかであろう。また、熟練した臨床医の知識に従って、患者に対する投与された治療薬の観察された効果を考慮して、また投与された治療薬に対する疾患の観察された応答を考慮して、治療プロトコール(例えば、投与の投与量および時間)を変えることができる。
【０５９４】
以下の実施例によって本開示をさらに例示するが、これは、さらなる制限と解釈されてはならない。本願を通じて引用された、全ての図および全ての参考文献の内容、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、特許および公開特許出願は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【０５９５】
XVII. キットおよび単位剤形
抗ＯＸ４０抗体(例えば、ＯＸ４０.２１)および抗ＰＤ−１抗体(例えば、ニボルマブ)または抗ＣＴＬＡ−４抗体(イピリムマブ)と、医薬上許容される担体とを、前述の方法における使用に適合された治療上有効な量で含有する医薬組成物を含むキットもまた、本明細書において提供される。キットは、適宜、従事者(例えば、医師、看護師または患者)が、癌(例えば、固形腫瘍)を有する患者に組成物を投与するために、中に含まれる組成物を投与できるように、例えば、投与スケジュールを含む説明書も含み得る。キットは、シリンジも含み得る。
【０５９６】
キットは、上記で提供された方法による単回投与のための、有効量の抗ＯＸ４０抗体または抗ＰＤ−１抗体もしくは抗ＣＴＬＡ−４抗体をそれぞれが含有する、単回用量の医薬組成物を複数パッケージ含んでもよい。医薬組成物の投与に必要な機器またはデバイスもまた、キットに含まれ得る。例えば、キットは、ある量の抗ＯＸ４０抗体または抗ＰＤ−１もしくは抗ＣＴＬＡ−４抗体を格納した１つまたは複数の事前充填済みシリンジを提供し得る。
【０５９７】
ある実施形態では、本発明は、ヒト患者における固形腫瘍を治療するためのキットであって、配列番号３１８に記載される配列を有する重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインならびに配列番号９４に記載される配列を有する軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む、ある用量の抗ＯＸ４０抗体と、本明細書に記載される方法において使用するための説明書とを含む、キットを提供する。ある実施形態では、キットは、(ａ)配列番号３０１に記載される配列を有する重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインならびに配列番号３０２に記載される配列を有する軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む、ある用量の抗ＰＤ−１抗体、または(ｂ)配列番号３０９に記載される配列を有する重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインならびに配列番号３１０に記載される記載される配列を有する軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む、ある用量の抗ＣＴＬＡ−４抗体をさらに含む。
【０５９８】
実施形態
１. ヒトＯＸ４０と結合し、以下の特性：
(ａ)膜結合型ヒトＯＸ４０と結合すること、
(ｂ)カニクイザルＯＸ４０と結合すること、
(ｃ)可溶性ヒトＯＸ４０と結合すること、
(ｄ)Ｔ細胞活性化を誘導または増強すること、
(ｅ)ＯＸ４０リガンドとＯＸ４０との結合を阻害すること、
(ｆ)ヒトＯＸ４０との結合について、抗体３Ｆ４、１４Ｂ６−１、１４Ｂ６−２、２３Ｈ３、６Ｅ１−１、６Ｅ１−２、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３、１４Ａ２−１、１４Ａ２−２および２０Ｃ１のうちの１以上と競合すること
を示す、単離された抗体またはその抗原結合部分。
【０５９９】
２. 抗体が、マウスおよび／またはラットのＯＸ４０とは結合しない、実施形態１に記載の抗体。
【０６００】
３. 抗体が、抗腫瘍免疫応答を刺激する、実施形態１または２に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６０１】
４. 抗体が、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する、実施形態１から３のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６０２】
５. 抗体が、ＯＸ４０発現Ｔ細胞におけるＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生を増大する。実施形態１から４のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６０３】
６. 抗体が、Ｔ細胞増殖を増大する、実施形態１から５のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合部分。
【０６０４】
７. 抗体が、Ｆｃ受容体と結合する、実施形態１から６のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６０５】
８. 抗体が、１以上の活性化ＦｃγＲと結合する、実施形態７に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６０６】
９. 抗体が、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定される場合、可溶性ヒトＯＸ４０と、約１ｎＭ以下、例えば０.５ｎＭ以下または０.１ｎＭ以下などのＫＤで結合する、実施形態１から８のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６０７】
１０. 抗体が、ＦＡＣＳによって測定される場合、膜結合型ヒトＯＸ４０と、５０ｎＭ以下、例えば１０ｎＭ以下または１ｎＭ以下などのＥＣ５０で結合する、実施形態１から９のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６０８】
１１. 抗体が、ＦＡＣＳによって測定される場合、膜結合型カニクイザルＯＸ４０と、５０ｎＭ以下、例えば１０ｎＭ以下または１ｎＭ以下などのＥＣ５０で結合する、実施形態１から１０のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６０９】
１２. 抗体が、多価架橋を通じてＴ細胞活性化を誘導または増強する、実施形態１から１１のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６１０】
１３. 抗体が、ヒト補体のＣ１ｑ成分と結合する、実施形態１から１２のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６１１】
１４. 抗体が、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞のＮＫ細胞媒介性溶解を誘導する、実施形態１から１３のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６１２】
１５. 抗体が、ＯＸ４０発現細胞のマクロファージ媒介性食作用を促進する、実施形態１から１４のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合部分
【０６１３】
１６. 抗体が、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖の調節Ｔ細胞媒介性抑制を阻害する、実施形態１から１５のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６１４】
１７. 抗体が、ヒトＯＸ４０(配列番号２)の配列ＤＶＶＳＳＫＰＣＫＰＣＴＷＣＮＬＲ(配列番号１７８)と結合する、実施形態１から１６のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６１５】
１８. 抗体が、ヒトＯＸ４０(配列番号２)の配列ＤＳＹＫＰＧＶＤＣＡＰＣＰＰＧＨＦＳＰＧＤＮＱＡＣＫＰＷＴＮＣＴＬＡＧＫ(配列番号１７９)と結合する、実施形態１から１６のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６１６】
１９. ＯＸ４０と特異的に結合し、以下：
(ａ)配列番号３１８および９４、
(ｂ)配列番号１７および１８、
(ｃ)配列番号２８および２９、
(ｄ)配列番号２８および３０、
(ｅ)配列番号３７および３８、
(ｆ)配列番号４８および４９、
(ｇ)配列番号４８および５０、
(ｈ)配列番号５７および５８、
(ｉ)配列番号６５および６６、
(ｊ)配列番号７３および７４、
(ｋ)配列番号８４および８５、
(ｌ)配列番号８４および８６、ならびに
(ｍ)配列番号９３および９４
からなる群から選択される可変重鎖および可変軽鎖の対になっている、３つの可変重鎖ＣＤＲおよび３つの可変軽鎖ＣＤＲを含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【０６１７】
２０. ＯＸ４０と結合し、以下：
(ａ)それぞれ、配列番号８７、３１７および８９を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号９０〜９２を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｂ)それぞれ、配列番号１１〜１３を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号１４〜１６を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｃ)それぞれ、配列番号１９〜２１を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号２２〜２４を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｄ)それぞれ、配列番号１９〜２１を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号２５〜２７を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｅ)それぞれ、配列番号３１〜３３を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号３４〜３６を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｆ)それぞれ、配列番号３９〜４１を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号４２〜４４を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｇ)それぞれ、配列番号３９〜４１を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号４５〜４７を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｈ)それぞれ、配列番号５１〜５３を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号５４〜５６を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｉ)それぞれ、配列番号５９〜６１を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号６２〜６４を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｊ)それぞれ、配列番号６７〜６９を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号７０〜７２を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｋ)それぞれ、配列番号７５〜７７を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号７８〜８０を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｌ)それぞれ、配列番号７５〜７７を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号８１〜８３を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、または
(ｍ)それぞれ、配列番号８７〜８９を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号９０〜９２を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列
を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【０６１８】
２１. ＯＸ４０と結合し、以下：
(ａ)それぞれ、配列番号８７、３１７および８９からなる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号９０〜９２からなる軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｂ)それぞれ、配列番号１１〜１３からなる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号１４〜１６からなる軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｃ)それぞれ、配列番号１９〜２１からなる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号２２〜２４からなる軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｄ)それぞれ、配列番号１９〜２１からなる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号２５〜２７からなる軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｅ)それぞれ、配列番号３１〜３３からなる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号３４〜３６からなる軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｆ)それぞれ、配列番号３９〜４１からなる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号４２〜４４からなる軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｇ)それぞれ、配列番号３９〜４１からなる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号４５〜４７からなる軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｈ)それぞれ、配列番号５１〜５３からなる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号５４〜５６からなる軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｉ)それぞれ、配列番号５９〜６１からなる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号６２〜６４からなる軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｊ)それぞれ、配列番号６７〜６９からなる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号７０〜７２からなる軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｋ)それぞれ、配列番号７５〜７７からなる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号７８〜８０からなる軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
(ｌ)それぞれ、配列番号７５〜７７からなる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号８１〜８３からなる軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、または
(ｍ)それぞれ、配列番号８７〜８９からなる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに／またはそれぞれ、配列番号９０〜９２からなる軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列
を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【０６１９】
２２. ＯＸ４０と結合し、重鎖および軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、重鎖可変領域が、配列番号１７、２８、３７、４８、５７、６５、７３、８４および９３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【０６２０】
２３. ＯＸ４０と結合し、重鎖および軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、軽鎖可変領域が、配列番号１８、２９、３０、３８、４９、５０、５８、６６、７４、８５、８６および９４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【０６２１】
２４. ＯＸ４０と結合し、
(ａ)配列番号３１８および９４、
(ｂ)配列番号１７および１８、
(ｃ)配列番号２８および２９、
(ｄ)配列番号２８および３０、
(ｅ)配列番号３７および３８、
(ｆ)配列番号４８および４９、
(ｇ)配列番号４８および５０、
(ｈ)配列番号５７および５８、
(ｉ)配列番号６５および６６、
(ｊ)配列番号７３および７４、
(ｋ)配列番号８４および８５、
(ｌ)配列番号８４および８６、ならびに
(ｍ)配列番号９３および９４
からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である重鎖および軽鎖可変領域配列を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【０６２２】
２５. 重鎖および軽鎖可変領域が、実施形態２４の(ａ)〜(ｌ)からなる群から選択される重鎖および軽鎖可変領域と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態２４に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６２３】
２６. 重鎖および軽鎖可変領域が、実施形態２４の(ａ)〜(ｌ)からなる群から選択される重鎖および軽鎖可変領域と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態２５に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６２４】
２７. 重鎖および軽鎖可変領域が、実施形態２４の(ａ)〜(ｌ)からなる群から選択される重鎖および軽鎖可変領域を含む、実施形態２６に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６２５】
２８. ＯＸ４０と結合し、
(ａ)それぞれ、配列番号１２４および１１６、
(ｂ)それぞれ、配列番号９５および９６、
(ｃ)それぞれ、配列番号９７および９８、
(ｄ)それぞれ、配列番号９９および１００、
(ｅ)それぞれ、配列番号１０１および１０２、
(ｆ)それぞれ、配列番号１０３および１０４、
(ｇ)それぞれ、配列番号１０５および１０６、
(ｈ)それぞれ、配列番号１０７および１０８、
(ｉ)それぞれ、配列番号１０９および１１０、
(ｊ)それぞれ、配列番号１１１および１１２、
(ｋ)それぞれ、配列番号１１３および１１４、
(ｌ)それぞれ、配列番号１１５および１１６、
(ｍ)それぞれ、配列番号１１７および１１８、
(ｎ)それぞれ、配列番号１１９および１２０、
(ｏ)それぞれ、配列番号１２１および１２２、
(ｐ)それぞれ、配列番号１２３および１１６、ならびに
(ｑ)それぞれ、配列番号１２５および１１６
からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖および軽鎖配列を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【０６２６】
２９. 重鎖および軽鎖が、実施形態２８の(ａ)〜(ｒ)からなる群から選択される重鎖および軽鎖を含む、実施形態２８に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６２７】
３０. (ａ)実施形態２７に記載の抗体と同一のＯＸ４０上のエピトープと結合する、および／または(ｂ)ＦＡＣＳによって測定される場合、実施形態２７に記載の抗体の、活性化Ｔ細胞上のＯＸ４０との結合を少なくとも９５％阻害する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【０６２８】
３１. 抗体が、ヒトＯＸ４０(配列番号２)の配列ＤＶＶＳＳＫＰＣＫＰＣＴＷＣＮＬＲ(配列番号１７８)と結合する、実施形態１９から３０のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６２９】
３２. 抗体が、ヒトＯＸ４０(配列番号２)の配列ＤＳＹＫＰＧＶＤＣＡＰＣＰＰＧＨＦＳＰＧＤＮＱＡＣＫＰＷＴＮＣＴＬＡＧＫ(配列番号１７９)と結合する、実施形態１９から３０のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６３０】
３３. 抗体が、ヒトおよびカニクイザルの両方のＯＸ４０と結合する、実施形態１９〜３１のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６３１】
３４. 抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそれらの変異体からなる群から選択される、実施形態１から３３のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６３２】
３５. 抗体が、ＩｇＧ１抗体である、実施形態３４に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６３３】
３６. 抗体またはその抗原結合部分が、活性化ＦｃγＲへの結合を増強したＦｃを含む、実施形態３５に記載の抗体。
【０６３４】
３７. ＣＤＲ領域中の１つまたは複数のメチオニン残基が、酸化を受けていないアミノ酸残基と置換されている、実施形態１から３６のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６３５】
３８. 抗体またはその抗原結合部分が、ヒト抗体またはヒト化抗体である、実施形態１から３７のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６３６】
３９. 抗体が、実施例２１に従って評価される場合、免疫原性ではない、実施形態１から３８のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６３７】
４０. アミノ酸配列Ａｓｐ−Ｇｌｙが、重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ配列中に存在している場合、異性化を受けていないアミノ酸配列と置換されている、実施形態１から３９のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６３８】
４１. 抗体が、配列番号７６に記載される重鎖可変領域ＣＤＲ２配列を含むが、Ａｓｐ−Ｇｌｙ配列は、異性化を受けていないアミノ酸配列と置換されている、実施形態４０に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【０６３９】
４２. Ａｓｐ−Ｇｌｙ配列中のＡｓｐまたはＧｌｙが、Ｓｅｒと置換されている、実施形態４１に記載の抗体。
【０６４０】
４３. 第２の結合特異性を有する分子と連結している実施形態１から４２のいずれか１つに記載の抗体を含む、二重特異性分子。
【０６４１】
４４. 実施形態１から４２のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合部分の重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする、核酸。
【０６４２】
４５. 実施形態４４に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【０６４３】
４６. 実施形態４５に記載の発現ベクターで形質転換された細胞。
【０６４４】
４７. 薬剤と連結している実施形態１から４２のいずれか１つに記載の抗体を含む、イムノコンジュゲート。
【０６４５】
４８. 実施形態１から４３および４７のいずれか１つに記載の抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートと、担体とを含む、組成物。
【０６４６】
４９. 実施形態１から４３および４７のいずれか１つに記載の抗体もしくはその抗原結合部分または二重特異性分子またはイムノコンジュゲートと、使用説明書とを含む、キット。
【０６４７】
５０. ＯＸ４０抗体またはその抗原結合部分を調製する方法であって、実施形態４６に記載の細胞において抗体またはその抗原結合部分を発現すること、および細胞から抗体またはその抗原結合部分を単離することを含む、方法。
【０６４８】
５１. 抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する方法であって、抗原特異的Ｔ細胞応答が刺激されるように、Ｔ細胞を、実施形態１から４３および４７のいずれか１つに記載の抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートと接触させることを含む、方法。
【０６４９】
５２. エフェクターＴ細胞を活性化または共刺激する方法であって、エフェクターＴ細胞を、実施形態１から４３および４７のいずれか１つに記載の抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートならびにＣＤ３と接触させることを含み、エフェクターＴ細胞が活性化または共刺激される、方法。
【０６５０】
５３. Ｔ細胞におけるＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生を増大する方法であって、Ｔ細胞を、有効量の実施形態１から４３および４７のいずれか１つに記載の抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートと接触させることを含む、方法。
【０６５１】
５４. Ｔ細胞増殖を増大する方法であって、細胞を、有効量の実施形態１から４３および４７のいずれか１つに記載の抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートと接触させることを含む、方法。
【０６５２】
５５. 対象においてＴ細胞におけるＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生を増大する方法であって、Ｔ細胞からのＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ産生を増大するために、有効量の実施形態１から４３および４７のいずれか１つに記載の抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを投与することを含む、方法。
【０６５３】
５６. それを必要とする対象の腫瘍におけるＴ調節細胞の数を低減または枯渇させる方法であって、腫瘍におけるＴ調節細胞の数を低減するために、有効量の実施形態１から４３および４７に記載の抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを投与することを含み、抗体またはその抗原結合部分は、エフェクター機能または増強されたエフェクター機能を有する、方法。
【０６５４】
５７. 対象における免疫応答を刺激する方法であって、対象における免疫応答が刺激されるように、対象に、実施形態１から４３および４７のいずれか１つに記載の抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを投与することを含む、方法。
【０６５５】
５８. 対象が腫瘍を有し、腫瘍に対する免疫応答が刺激される、実施形態５７に記載の方法。
【０６５６】
５９. 対象における腫瘍細胞の成長を阻害する方法であって、腫瘍の成長が阻害されるように、対象に、実施形態１から４３および４７のいずれか１つに記載の抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを投与することを含む、方法。
【０６５７】
６０. 癌を治療する方法であって、癌を治療するために、それを必要とする対象に、治療有効量の実施形態１から４３および４７のいずれか１つに記載の抗体もしくはその抗原結合部分、二重特異性分子またはイムノコンジュゲートを投与することを含む、方法。
【０６５８】
６１. 癌が、膀胱癌、乳癌、子宮／子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、食道癌、胃腸癌、膵臓癌、結腸直腸癌、結腸癌、腎臓癌、頭頸部癌、肺癌、胃癌、生殖細胞癌、骨癌、肝臓癌、甲状腺癌、皮膚癌、中枢神経系の新生物、リンパ腫、白血病、骨髄腫、肉腫およびウイルス関連癌からなる群から選択される、実施形態６０に記載の方法。
【０６５９】
６２. 癌が、転移性癌、難治性癌または再発性癌である、実施形態６０または６１に記載の方法。
【０６６０】
６３. １以上のさらなる治療薬を投与することをさらに含む、実施形態５６から６２のいずれか１つに記載の方法。
【０６６１】
６４. １以上のさらなる治療薬が、抗体または小分子である、実施形態６３に記載の方法。
【０６６２】
６５. さらなる治療薬が、抗ＰＤ１抗体、ＬＡＧ−３抗体、ＣＴＬＡ−４抗体、ＰＤ−Ｌ１抗体または抗ＴＧＦβ抗体である、実施形態６４に記載の方法。
【０６６３】
６６. ヒト対象における固形腫瘍を治療する方法であって、対象に、配列番号３１８に記載される配列を有する重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインならびに配列番号９４に記載される配列を有する軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む有効量の抗ＯＸ４０抗体を投与することを含み、方法が、少なくとも１回の投与サイクルを含み、サイクルが、２週間の期間であり、少なくとも１回のサイクルのそれぞれについて、抗ＯＸ４０抗体の１回の用量が、１ｍｇ／体重１ｋｇの用量、２０、４０、８０、１６０もしくは３２０ｍｇの固定用量、約１ｍｇ／体重１ｋｇの用量、または約２０、４０、８０、１６０もしくは３２０ｍｇの固定用量で投与される、方法。
【０６６４】
６７. ヒト対象における固形腫瘍を治療する方法であって、対象に、
(ａ)配列番号３１８に記載される配列を有する重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインならびに配列番号９４に記載される配列を有する軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む、抗ＯＸ４０抗体、
(ｂ)配列番号３０１に記載される配列を有する重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインならびに配列番号３０２に記載される配列を有する軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む、抗ＰＤ−１抗体を、それぞれの有効量で投与することを含み、
方法が、少なくとも１回の投与サイクルを含み、サイクルが、２週間、３週間または４週間の期間であり、少なくとも１回のサイクルのそれぞれについて、抗ＯＸ４０抗体の１回の用量が、１ｍｇ／体重１ｋｇの用量、２０、４０、８０、１６０もしくは３２０ｍｇの固定用量、約１ｍｇ／体重１ｋｇの用量、または約２０、４０、８０、１６０もしくは３２０ｍｇの固定用量で投与され、抗ＰＤ−１抗体の１回の用量が、２４０、３６０もしくは４８０ｍｇの用量または約２４０、３６０もしくは４８０ｍｇの用量で投与される、方法。
【０６６５】
６８. 抗ＯＸ４０抗体および抗ＰＤ−１抗体が、以下の用量：
(ａ)１ｍｇ／体重１ｋｇの抗ＯＸ４０抗体および２４０ｍｇ、３６０ｍｇもしくは４８０ｍｇの抗ＰＤ−１抗体、
(ｂ)２０ｍｇの抗ＯＸ４０抗体および２４０ｍｇ、３６０ｍｇもしくは４８０ｍｇの抗ＰＤ−１抗体、
(ｃ)４０ｍｇの抗ＯＸ４０抗体および２４０ｍｇ、３６０ｍｇもしくは４８０ｍｇの抗ＰＤ−１抗体、
(ｄ)８０ｍｇの抗ＯＸ４０抗体および２４０ｍｇ、３６０ｍｇもしくは４８０ｍｇの抗ＰＤ−１抗体、
(ｅ)１６０ｍｇの抗ＯＸ４０抗体および２４０ｍｇ、３６０ｍｇもしくは４８０ｍｇの抗ＰＤ−１抗体、または
(ｆ)３２０ｍｇの抗ＯＸ４０抗体および２４０ｍｇ、３６０ｍｇもしくは４８０ｍｇの抗ＰＤ−１抗体
で投与される、実施形態６７に記載の方法。
【０６６６】
６９. ヒト対象における固形腫瘍を治療する方法であって、対象に
(ａ)配列番号３１８に記載される配列を有する重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインならびに配列番号９４に記載される配列を有する軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む、抗ＯＸ４０抗体、
(ｂ)配列番号３０９に記載される配列を有する重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインならびに配列番号３１０に記載される配列を有する軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む、抗ＣＴＬＡ−４抗体を、それぞれの有効量で投与することを含み、
方法が、少なくとも１回の投与サイクルを含み、サイクルが、３週間の期間であり、少なくとも１回のサイクルのそれぞれについて、抗ＯＸ４０抗体の１回の用量が、１ｍｇ／体重１ｋｇの用量、２０、４０、８０、１６０もしくは３２０ｍｇの固定用量、約１ｍｇ／体重１ｋｇの用量、または約２０、４０、８０、１６０もしくは３２０ｍｇの固定用量で投与され、抗ＣＴＬＡ−４抗体の１回の用量が、１ｍｇ／ｋｇの用量または約１ｍｇ／ｋｇの用量で投与され、
抗ＯＸ４０抗体が、少なくとも１回のサイクルで抗ＣＴＬＡ−４抗体と一緒に投与された後に、少なくとも１回のサイクルの抗ＯＸ４０抗体の単剤治療が続く、方法。
【０６６７】
７０. 抗ＯＸ４０抗体および抗ＣＴＬＡ−４抗体が、以下の用量：
(ａ)１ｍｇ／体重ｋｇの抗ＯＸ４０抗体および１ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ−４抗体、
(ｂ)２０ｍｇの抗ＯＸ４０抗体および１ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ−４抗体、
(ｃ)４０ｍｇの抗ＯＸ４０抗体および１ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ−４抗体、
(ｄ)８０ｍｇの抗ＯＸ４０抗体および１ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ−４抗体、
(ｅ)１６０ｍｇの抗ＯＸ４０抗体および１ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ−４抗体、または
(ｆ)３２０ｍｇの抗ＯＸ４０抗体および１ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ−４抗体
で投与される、実施形態６７に記載の方法。
【０６６８】
７１. 抗ＯＸ４０抗体または抗ＯＸ４０抗体および抗ＰＤ−１抗体もしくは抗ＣＴＬＡ−４抗体が、静脈内投与用に製剤化される、実施形態６６から７０のいずれか１つに記載の方法。
【０６６９】
７２. 抗ＯＸ４０抗体および抗ＰＤ−１抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体が、一緒に製剤化される、実施形態６７から７１のいずれか１つに記載の方法。
【０６７０】
７３. 抗ＯＸ４０抗体および抗ＰＤ−１抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体が、別個に製剤化される、実施形態６７から７１のいずれか１つに記載の方法。
【０６７１】
７４. 治療が、最大１２回のサイクルからなる、実施形態６６から６８および７１から７３のいずれか１つに記載の方法。
【０６７２】
７５. 治療が、８回のサイクルからなる、実施形態６９から７３のいずれか１つに記載の方法。
【０６７３】
７６. 抗ＯＸ４０抗体が、最初の４回のサイクルは抗ＣＴＬＡ−４抗体と一緒に投与され、最後の４回のサイクルは抗ＯＸ４０抗体の単剤治療が続く、実施形態７５に記載の方法。
【０６７４】
７７. 抗ＯＸ４０抗体または抗ＯＸ４０抗体および抗ＰＤ−１抗体もしくは抗ＣＴＬＡ−４抗体が、各サイクルの１日目に投与される、実施形態６６から７６のいずれか１つに記載の方法。
【０６７５】
７８. 抗ＯＸ４０抗体が、抗ＰＤ−１抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体の投与の前に投与される、実施形態６７から７７のいずれか１つに記載の方法。
【０６７６】
７９. 抗ＯＸ４０抗体が、抗ＰＤ−１抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体の投与の約３０分前に投与される、実施形態７８に記載の方法。
【０６７７】
８０. 抗ＯＸ４０抗体が、抗ＰＤ−１抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体の投与の後に投与される、実施形態６７から７７のいずれか１つに記載の方法。
【０６７８】
８１. 抗ＯＸ４０抗体が、抗ＰＤ−１抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体と同時に投与される、実施形態６７から７７のいずれか１つに記載の方法。
【０６７９】
８２. 治療が、腫瘍サイズの低減、転移病変数の経時的な低減、完全な応答、部分的な応答および疾患の安定から選択される少なくとも１つの治療効果をもたらす、実施形態６６から８１のいずれか１つに記載の方法。
【０６８０】
８３. 固形腫瘍が、子宮頸癌、膀胱癌、結腸直腸癌および卵巣癌からなる群から選択される癌と関連している、実施形態６６から８２のいずれか１つに記載の方法。
【０６８１】
８４. 抗ＯＸ４０抗体が、それぞれ、配列番号８７、３１７および８９ならびに９０〜９２に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域ＣＤＲを含む、実施形態６６から８３のいずれか１つに記載の方法。
【０６８２】
８５. 抗ＯＸ４０抗体が、それぞれ、配列番号３１８および９４に記載される重鎖および軽鎖可変領域配列を含む、実施形態６６から８４のいずれか１つに記載の方法。
【０６８３】
８６. 抗ＯＸ４０抗体が、それぞれ、配列番号１２４および１１６に記載される重鎖および軽鎖配列を含む、実施形態６６から８５のいずれか１つに記載の方法。
【０６８４】
８７. 抗ＰＤ−１抗体が、それぞれ、配列番号３０３〜３０５および３０６〜３０８に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域ＣＤＲを含む、実施形態６７、６８および７１から８６のいずれか１つに記載の方法。
【０６８５】
８８. 抗ＰＤ−１抗体が、それぞれ、配列番号３０１および３０２に記載される重鎖および軽鎖可変領域配列を含む、実施形態６７、６８および７１から８７のいずれか１つに記載の方法。
【０６８６】
８９. 抗ＣＴＬＡ−４抗体が、それぞれ、配列番号３１１〜３１３および３１４〜３１６に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域ＣＤＲを含む、実施形態６９から８６のいずれか１つに記載の方法。
【０６８７】
９０. 抗ＣＴＬＡ−４抗体が、それぞれ、配列番号３０９および３１０に記載される重鎖および軽鎖可変領域配列を含む、実施形態６９から８６および８９のいずれか１つに記載の方法。
【０６８８】
９１. ヒト対象における固形腫瘍を治療するためのキットであって、配列番号３１８に記載される配列を有する重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインならびに配列番号９４に記載される配列を有する軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む、ある用量の抗ＯＸ４０抗体と、使用説明書とを含む、キット。
【０６８９】
９２. (ａ)配列番号３０１に記載される配列を有する重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインならびに配列番号３０２に記載される配列を有する軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む、ある用量の抗ＰＤ−１抗体、または(ｂ)配列番号３０９に記載される配列を有する重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインならびに配列番号３１０に記載される記載される配列を有する軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む、ある用量の抗ＣＴＬＡ−４抗体をさらに含む、実施形態９１に記載のキット。
【０６９０】
９３. サンプル中のＯＸ４０の存在を検出する方法であって、抗体または抗原結合との複合体の形成を可能にする条件下で、サンプルを、実施形態１から３８のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合部分と接触させることを含む、方法。
【０６９１】
９４. 配列番号２８２〜２９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＯＸ４０と結合する抗体。
【０６９２】
９５. 抗体が、配列番号２８２〜２９６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる重鎖を含む、実施形態９４に記載の抗体。
【０６９３】
９６. ＯＸ４０と結合し、それぞれ、配列番号８７、３１７および８９を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号９０〜９２を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、単離されたモノクローナル抗体。
【０６９４】
９７. ＯＸ４０と結合し、それぞれ、配列番号３１８および９４のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体。
【０６９５】
９８. ＯＸ４０と結合し、それぞれ、配列番号１２４および１１６のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を含む、単離されたモノクローナル抗体。
【０６９６】
９９. ＯＸ４０と結合する単離されたモノクローナル抗体であって、ヒトＯＸ４０(配列番号２)の配列ＤＶＶＳＳＫＰＣＫＰＣＴＷＣＮＬＲ(配列番号１７８)の全てまたは一部分と結合する、抗体。
【０６９７】
１００. 実施形態９６から９９のいずれか１つに記載の単離されたモノクローナル抗体と、担体とを含む、組成物。
【０６９８】
１０１. 実施形態９６もしくは９７に記載の抗体の重鎖および／もしくは軽鎖可変領域または実施形態９８に記載の重鎖および／もしくは軽鎖をコードする、核酸。
【０６９９】
１０２. 実施形態９６から９９のいずれか１つに記載の抗体を含む、キット。
【０７００】
１０３. 抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する方法であって、Ｔ細胞を、実施形態９６から９９のいずれか１つに記載の抗体と接触させることを含む、方法。
【０７０１】
１０４. 癌を治療する方法であって、癌を治療するために、それを必要とする対象に、治療上有効な量の実施形態９６から９９のいずれか１つに記載の抗体を投与することを含む、方法。
【０７０２】
１０５. 癌または固形腫瘍が、子宮頸癌、膀胱癌、結腸直腸癌、卵巣癌、非小細胞肺癌および頭頸部の扁平上皮細胞癌腫からなる群から選択される、実施形態１０４に記載の方法。
【実施例】
【０７０３】
実施例１：抗ＯＸ４０抗体の作製
ヒト抗ＯＸ４０モノクローナル抗体を、ＨｕＭＡｂ(登録商標)トランスジェニックマウス(「ＨｕＭＡｂ」は、Medarex, Inc.、Princeton、New Jerseyの商標である)のＨｃｏ７、Ｈｃｏ１２、Ｈｃｏ１７およびＨｃｏ３８株ならびにＫＭマウス(ＫＭ  Ｍｏｕｓｅ(登録商標)株は、ＰＣＴ公開ＷＯ０２／４３４７８に記載されているようにＳＣ２０導入染色体を含む)において、組換えヘキサヒスチジン−ＯＸ４０抗原を使用して作製した。
５種類の遺伝子型のトランスジェニックマウス(ＫＭ、Ｈｃｏ７、Ｈｃｏ１２、Ｈｃｏ１７およびＨｃｏ３８)を含む、合計５２匹のマウスを、異なる免疫処置戦略を用いて免疫処置した。免疫原は、社内で調製したｈｕＯＸ４０−６ｘｈｉｓであり、２.０ｍｇ／ｍＬで、マウス１匹当たり合計２０μｇの用量で使用した。投与の経路には、尾部付け根への注射、Ｈｏｃｋの免疫化、腹腔内(ｉｐ)および皮下(ｓｃ)注射ならびにアジュバント(Ｒｉｂｉ、カタログ番号Ｓ６３２２、Ｓｉｇｍａ)が含まれた。３０匹のマウスから２７回の融合を行い、スクリーニングした。これらの２７回の融合から、ＥＬＩＳＡ抗原陽性抗体を５４１個同定し、さらになる特徴付けにより、３Ｆ４、１４Ｂ６−１、１４Ｂ６−２、２３Ｈ３、６Ｅ１−１、６Ｅ１−２、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３(ＯＸ４０.１７とも呼ばれる)、１４Ａ２−１、１４Ａ２−２および２０Ｃ１と示される抗体を含む、特に関心のある抗体の単離に至った。それらの可変領域アミノ酸配列およびアイソタイプを、図１〜９に記載する。３Ｆ４の重鎖および軽鎖可変領域は、配列番号１７および１８のアミノ酸配列からなる。１４Ｂ６−１の重鎖および軽鎖可変領域は、配列番号２８および２９のアミノ酸配列からなる。１４Ｂ６−２の重鎖および軽鎖可変領域は、配列番号２８および３０のアミノ酸配列からなる。２３Ｈ３の重鎖および軽鎖可変領域は、配列番号３７および３８のアミノ酸配列からなる。６Ｅ１−１の重鎖および軽鎖可変領域は、配列番号４８および４９のアミノ酸配列からなる。６Ｅ１−２の重鎖および軽鎖可変領域は、配列番号４８および５０のアミノ酸配列からなる。１８Ｅ９の重鎖および軽鎖可変領域は、配列番号５７および５８のアミノ酸配列からなる。８Ｂ１１の重鎖および軽鎖可変領域は、配列番号６５および６６のアミノ酸配列からなる。２０Ｂ３の重鎖および軽鎖可変領域は、配列番号７３および７４のアミノ酸配列からなる。１４Ａ２−１の重鎖および軽鎖可変領域は、配列番号８４および８５のアミノ酸配列からなる。１４Ａ２−２の重鎖および軽鎖可変領域は、配列番号８４および８６のアミノ酸配列からなる。２０Ｃ１の重鎖および軽鎖可変領域は、配列番号９３および９４のアミノ酸配列からなる。
【０７０４】
ｃＤＮＡの配列決定により、抗体３Ｆ４、２３Ｈ３、１８Ｅ９、８Ｂ１１、２０Ｂ３(ＯＸ４０.１７とも呼ばれる)および２０Ｃ１のそれぞれについては１つの重鎖および１つの軽鎖が同定され、抗体１４Ｂ６、１４Ａ２および６Ｅ１のそれぞれについては、１つの重鎖および２つの軽鎖(軽鎖１または「Ｌ１」および軽鎖２または「Ｌ２」)が同定された。タンパク質分析により、抗体１４Ｂ６、６Ｅ１および１４Ａ２について単一の軽鎖が同定され、Ｎ末端配列決定および分子量決定により、それが、１４Ｂ６および１４Ａ２については軽鎖Ｌ１であり、６Ｅ１については軽鎖Ｌ２であったことが示された。抗体１４Ｂ６−１および１４Ｂ６−２は、それぞれ、軽鎖Ｌ１およびＬ２を有する抗体１４Ｂ６に対応している。抗体１４Ａ２−１および１４Ａ２−２は、それぞれ、軽鎖Ｌ１およびＬ２を有する抗体１４Ａ２に対応している。抗体６Ｅ１−１および６Ｅ１−２は、それぞれ、軽鎖Ｌ１およびＬ２を有する抗体６Ｅ１に対応している。これらの３つの抗体の軽鎖のそれぞれのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、表２３に提供されている。
【０７０５】
上記の抗体のうちのいくつかについては、異性化部位(ＤＧ)の存在を除去するために、親抗体にはＨＣＤＲ２における置換を行い、フレームワークを一般に発現される抗体のもののようにするために、フレームワーク置換(ＤＰ４４生殖系列に由来することに起因する)を、導入した。２０Ｃ１に基づく抗体については、３つのさらなる通常外フレームワーク残基を、生殖系列(Ａ２Ｖ、Ｄ２４ＧおよびＧ８２ｂＳ)に復帰させた。Ｇ８２ｂＳフレームワーク復帰もまた、脱アミド化部位(ＮＧ)を排除する。親ハイブリッドクローン配列に導入した種々の置換の概要を、表６に提供する。
【０７０６】
【表８】
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【０７０７】
実施例２：抗ＯＸ４０抗体の活性化初代ヒトＴ細胞との結合
実施例１において作製したヒトモノクローナル抗ＯＸ４０抗体を、活性化初代ヒトＴ細胞と結合する能力について試験した。
細胞を、ＯＸ４０発現を誘導するために、結合アッセイの前に数日間活性化した。簡潔には、ＰＢＭＣを、組換えヒトＩＬ−２の存在下において、抗ヒトＣＤ３に加えて抗ヒトＣＤ２８でコーティングした磁気ビーズとともに、３日間または４日間培養した。アッセイの日に、ビーズを除去し、細胞を、各抗ＯＸ４０抗体の滴定物で染色した。結合した抗体を、蛍光コンジュゲートした抗ヒトＩｇＧポリクローナル二次抗体を用いて検出し、細胞を、ＣＤ４およびＣＤ２５について共染色して、活性化ＣＤ４  Ｔ細胞を検出した。染色の蛍光強度は、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  IIフローサイトメーター(Becton Dickinson)を使用して測定した。抗ＯＸ４０抗体染色の幾何平均蛍光強度(ＧＭＦＩ)または中央値蛍光強度(ＭｅｄＦＩ)を、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋集団について計算した(ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア)。抗体結合のＥＣ５０を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して計算した。
【０７０８】
図１１Ａに示されるように、抗ＯＸ４０抗体は、ナノモル未満のＥＣ５０で活性化ヒトＴ細胞と結合した。注目すべきことに、ＯＸ４０.５が、試験した抗ＯＸ４０抗体の中で最も低い結合を示した。同一の実験を、可変領域置換を有する抗ＯＸ４０抗体を用いて実施した。最初の実験は、組換え抗体発現ベクターをトランスフェクトした宿主細胞の培養物から得た上清の形態で抗体を使用して行った。図１１Ｂに示されるように、特定の置換により著しい結合の喪失が、すなわち、抗体ＯＸ４０.７、ＯＸ４０.９、ＯＸ４０.１４およびＯＸ４０.１５について、もたらされた。可変領域置換を有する抗体のセットを、精製された抗体材料を使用して、さらに分析した。
図１１Ｃおよび１１Ｄに示されるように、３Ｆ４ハイブリドーマ親クローンよりも低い結合を示したＯＸ４０.１８を除き、試験した全ての抗体が、ナノモル未満のＥＣ５０でＯＸ４０と結合した。ＯＸ４０.５が、図１１Ｂにおいて試験した抗体パネルの中では最も低い結合を示したが、ＯＸ４０.１が、図１１Ｃにおいて試験した抗体パネルの中では最も低い結合を示した。ＥＣ５０値の概要を、以下の表７に提示する。
【０７０９】
【表９】
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【０７１０】
実施例３：抗ＯＸ−４０抗体の活性化初代カニクイザルＴ細胞との結合
実施例１において活性化初代ヒトＴ細胞との結合について試験したヒトモノクローナル抗ＯＸ−４０抗体を、活性化初代カニクイザルＴ細胞と結合する能力について試験した。
簡潔には、細胞を、ＯＸ４０発現を誘導するために、結合アッセイの前に数日間活性化した。全白血球を、塩化アンモニウム緩衝液を使用して、赤血球の溶解により、カニクイザル末梢血から単離した。白血球は、次いで、Ｔ細胞を増殖し、活性化するために、組換えヒトＩＬ−２の存在下において、カニクイザルと交差反応する抗ヒトＣＤ３抗体に加えて抗ヒトＣＤ２８抗体で事前コーティングしたフラスコ内で４〜５日間培養した。アッセイの日に、細胞を採取し、各抗ＯＸ４０抗体の滴定物で染色した。結合した抗体を、蛍光コンジュゲートした抗ヒトＩｇＧポリクローナル二次抗体を用いて検出し、細胞を、ＣＤ４およびＣＤ２５について共染色して、活性化ＣＤ４  Ｔ細胞を検出した。染色の蛍光強度は、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  IIフローサイトメーター(Becton Dickinson)を使用して測定した。抗ＯＸ４０抗体染色の幾何平均蛍光強度(ＧＭＦＩ)または中央値蛍光強度(ＭｅｄＦＩ)を、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋集団について計算した(ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア)。用量応答曲線を作製し、抗体結合のＥＣ５０を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して計算した。
【０７１１】
図１２Ａおよび１２Ｂに示されるように、試験した抗ＯＸ４０抗体は、活性化カニクイザルＣＤ４  Ｔ細胞と高い効力で結合し、ＥＣ５０は０.０６８ｎＭ(２０Ｃ１)〜１.４ｎＭ(２０Ｂ３)の範囲であった。１８Ｅ９および２０Ｂ３は、１〜１.５ｎＭのＥＣ５０で結合したが、残りの抗体は、１ｎＭ未満のＥＣ５０で結合した。ＯＸ４０.１が、図１２Ａにおいて試験した抗ＯＸ４０抗体の中では最も低い結合を示し、ＯＸ４０.５が、図１２Ｂにおいて試験した抗ＯＸ４０抗体の中では最も低い結合を示した。同一の実験を、可変領域置換を有する抗ＯＸ４０抗体を用いて実施した。図１２Ｃに示されるように、ＯＸ４０.６、ＯＸ４０.８およびＯＸ４０.２１抗体が、最も高い結合効力を示し、ＥＣ５０は０.１２ｎＭ以下であった。ＯＸ４０.１は、カニクイザルＣＤ４  Ｔ細胞とのさらに低い結合を示した。ＯＸ４０.２１抗体は、活性化マウスまたはラットＣＤ４＋Ｔ細胞では結合が検出されなかった。ＥＣ５０値の概要を、以下の表８に提示する。
【０７１２】
【表１０】
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【０７１３】
実施例４：抗ＯＸ４０抗体の、活性化初代Ｔ細胞ならびにヒトおよびカニクイザルＯＸ４０を過剰発現する細胞との結合についてのスキャッチャード解析
ＯＸ４０.２１(ＩｇＧ１アイソタイプ)の活性化ヒトＴ細胞との結合を、スキャッチャード解析を使用してさらに評価した。簡潔には、ＩＯＤＯ−ＧＥＮ(登録商標)固相ヨウ素化試薬(１,３,４,６−テトラクロロ−３ａ−６ａ−ジフェニルグリコウリル、Pierceカタログ２８６０１)を使用して、ＯＸ４０.２１を１２５Ｉ−Ｎａ(１ｍＣｉ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒカタログＮＥＺ０３３Ｈ００１  ＭＣ)で放射ヨウ素標識した。活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋから購入した末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)、Ｄｏｎｏｒ  Ｗ−３２６４７０から単離した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、陰性選択(ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ(商標)ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞富化カクテル、Stemcell Technologiesカタログ１５０６２)によって単離し、凍結させた。単離したＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＯＸ４０の発現を誘導するために、結合アッセイの前に、次のように４日間活性化した。解凍した細胞を、抗ＣＤ３に加えて抗ヒトＣＤ２８(ヒトＴ−Ｅｘｐａｎｄｅｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ１１１.４１Ｄ)でコーティングした磁気ビーズとともに、ビーズと細胞との比１：１で、２００ＩＵ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−２(Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈカタログ２００−０２)の存在下において、４日間培養した。
【０７１４】
放射ヨウ素標識したＯＸ４０.２１  ＩｇＧ１の、活性化ヒトＴ細胞との結合は、活性化ヒトＴ細胞を１２５Ｉ−ＯＸ４０.２１  ＩｇＧ１の滴定物とともにインキュベートすることによって示した。１００倍モル過剰の未標識抗体の滴定物の存在下における結合によって非特異的結合を決定し、これを総ＣＰＭから差し引いて特異的結合を計算した。ＣＰＭに対する１２５Ｉ−ＯＸ４０.２１  ＩｇＧ１の濃度の線形標準曲線を使用して、特異的活性、最大のｎＭでの１２５Ｉ−ＯＸ４０.２１  ＩｇＧ１の結合を外挿し、それによって細胞１個当たりの受容体数を計算した。
表９および図１３Ａに示されるように、内因的にＯＸ４０を発現する活性化ヒトＴ細胞において、ＯＸ４０.２１  ＩｇＧ１の可飽和結合が観察され、ＫＤは、２人のＴ細胞ドナーのそれぞれについて、０.０５ｎＭであった。
【０７１５】
【表１１】
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【０７１６】
ヒトＯＸ４０を過剰発現するＨＥＫ２９３(「ｈＯＸ４０−２９３」)を使用して、同一のアッセイを行った。簡潔には、ｈＯＸ４０−２９３細胞を１２５Ｉ−ＯＸ４０.２１の滴定物とともにインキュベートすることによって、放射ヨウ素標識したＯＸ４０.２１の、過剰発現したヒトＯＸ４０との結合を決定した。１００倍モル過剰の未標識抗体の滴定物の存在下における結合によって非特異的結合を示し、これを総ＣＰＭから差し引いて特異的結合を計算した。ＣＰＭに対する１２５Ｉ−ＯＸ４０.２１の濃度の線形標準曲線を使用して、最大のｎＭでの１２５Ｉ−ＯＸ４０.２１の結合を外挿し、それによって細胞１個当たりの受容体数を計算した。図１３Ｃおよび表１０に示されるように、ｈＯＸ４０−２９３細胞上に発現するＯＸ４０との結合について、ＯＸ４０.２１  ＩｇＧ１の可飽和結合が観察された。１サンプル当たり異なる数のｈＯＸ４０−２９３細胞を使用した２回の試験条件からの平均結合ＫＤは、０.２２ｎＭであった。
【０７１７】
【表１２】
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【０７１８】
カニクイザルＯＸ４０を過剰発現するＣＨＯ細胞(「ｃｙｎｏＯＸ４０−ＣＨＯ」)を使用して、同一のアッセイを行った。簡潔には、ｃｙｎｏＯＸ４０−ＣＨＯ細胞を１２５Ｉ−ＯＸ４０.２１の滴定物とともにインキュベートすることによって、放射ヨウ素標識したＯＸ４０.２１の、過剰発現したカニクイザルＯＸ４０との結合を示した。１００倍モル過剰の未標識抗体の滴定物の存在下における結合によって非特異的結合を決定し、これを総ＣＰＭから差し引いて特異的結合を計算した。ＣＰＭに対する１２５Ｉ−ＯＸ４０.２１の濃度の線形標準曲線を使用して、最大のｎＭでの１２５Ｉ−ＯＸ４０.２１の結合を外挿し、それによって細胞１個当たりの受容体数を計算した。図１３Ｃおよび表１１に示されるように、ｃｙｎｏＯＸ４０−ＣＨＯ細胞上に発現するカニクイザルＯＸ４０との結合について、ＯＸ４０.２１  ＩｇＧ１の可飽和結合が観察された。１サンプル当たり異なる数の細胞を使用した２回の試験条件からの平均結合ＫＤは、０.６３ｎＭであった。
【０７１９】
【表１３】
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【０７２０】
実施例５：抗ＯＸ４０抗体のリンパ球との特異的結合
種々のＯＸ４０抗体の特異性を、免疫組織化学によって、脾臓、扁桃腺、胸腺、大脳、小脳、心臓、肝臓、肺、腎臓、膵臓、下垂体、末梢神経、胃、結腸、小腸、甲状腺、皮膚、骨格筋、前立腺、子宮、精巣および胎盤を含む、２２種類の正常ヒト組織型パネルで試験した。
新しい凍結および／またはＯＣＴ包埋ヒト組織を、複数の商業的組織ネットワーク／ベンダー(Asterand Inc. Detroit、MI; Cooperative Human Tissue Network、Philadelphia、PA; ProteoGenex Inc、Culver City、CA)から購入した。組織結合を検出するために、一連の抗ＯＸ４０抗体(ＯＸ４０.６−ＦＩＴＣ、ＯＸ４０.８−ＦＩＴＣ、６Ｅ１−ＦＩＴＣ、ＯＸ４０.１６−ＦＩＴＣ、ＯＸ４０.１７−ＦＩＴＣ、ＯＸ４０.２０−ＦＩＴＣおよびＯＸ４０.２１−ＦＩＴＣ)を、フルオレセイン標識し(fluoresceinated)、アセトン固定クリオスタット切片に適用した後、抗ＦＩＴＣ架橋抗体を適用し、ＥｎＶｉｓｉｏｎ＋  Ｓｙｓｔｅｍによる視覚化を行った。非特異的フルオレセイン標識ヒトＩｇＧ１を、アイソタイプ対照抗体として使用した。ヒトＯＸ４０を安定に発現するＨＴ１０８０細胞(ＨＴ１０８０／ｈｕＯＸ４０)および過形成ヒト扁桃腺組織切片を、陽性対照の細胞および組織として使用した。ＦＩＴＣコンジュゲーションが、結合特性に何らかの影響を有するかどうかを判定するために、抗ｈｕＩｇＧを架橋抗体として使用して、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＯＸ４０抗体および未コンジュゲート抗ＯＸ４０抗体の両方を、ＨＴ１０８０／ｈｕＯＸ４０細胞において比較した。染色したスライドを、光学顕微鏡下で評価した。
【０７２１】
最初の試験により、未コンジュゲート抗ＯＸ４０抗体およびＦＩＴＣコンジュゲート抗ＯＸ４０抗体のいずれも、ヒトＯＸ４０トランスフェクト細胞の細胞質および膜を特異的に染色したが、親ＨＴ１０８０細胞は染色しなかったことがわかった。未コンジュゲート抗ＯＸ４０抗体とＦＩＴＣコンジュゲート抗ＯＸ４０抗体との間に差はなかった。これらの結果は、これらの抗体が、免疫組織化学分析に好適であったこと、およびＦＩＴＣコンジュゲーションが組織結合特性にいかなる影響も有さないことを示唆する。
試験した全ての抗ＯＸ４０抗体が、リンパ球系組織(扁桃腺、脾臓および胸腺)およびリンパ球に富む組織(結腸、胃および小腸)における単核細胞(ＭＮＣ)の散乱クラスターまたは小クラスターとして、ならびに複数の組織(肺、皮膚および甲状腺)における微散乱ＭＮＣとして、小サブセットでの陽性染色を示した。形態学に基づくと、これらの陽性細胞は、主としてリンパ球である。
【０７２２】
リンパ球のサブセットを染色することに加えて、リガンド遮断物質であるＯＸ４０.６抗体は、試験した実質的に全ての組織(図１４Ａ)、ならびに精巣における精細管の周囲の鞘様間質などの特化した間質組織要素において、内皮／内皮下基質および間質要素のサブセットにおいて強力な染色を示し、小動脈および脈管外膜ならびにその周囲の結合組織と関連していることが多かった。リガンド非遮断物質であるＯＸ４０.８抗体は、心臓の心筋における筋フィラメント様構造体(図１４Ａ)および腎臓の糸球体におけるメサンギウム様細胞を陽性に標識した。別のリガンド非遮断物質、すなわち、６Ｅ１抗体での染色によっても、心筋細胞、ならび大脳および小脳のニューロンおよび神経網ならびに腎臓における細管上皮細胞のサブセットでの染色が明らかとなった。一般に、非リンパ球の染色は、抗体を、比較的高い濃度(３または５μｇ／ｍｌ)で使用した場合にのみ検出され、低い濃度(１μｇ／ｍｌ)では検出されず、低親和性結合または標的外結合の可能性を示唆する。
他のリガンド遮断抗体ＯＸ４０.１６(図１４Ａ)およびＯＸ４０.１７のさらなる試験により、試験した全ての組織について、他の組織要素の特異的な染色を有することなく、リンパ球のサブセットの鮮明な染色が明らかとなった。ＯＸ４０.１６抗体の変異体であるＯＸ４０.２１抗体は、ＯＸ４０.１６抗体と類似の結合パターンを有していた(図１４Ｂ)。正常なカニクイザル組織の類似のパネルにおける免疫組織化学により、ヒトに非常に類似する染色パターンが明らかとなり、関連する前臨床種としてのカニクイザルの有用性が示された。
【０７２３】
実施例６：癌におけるＯＸ４０の発現
ＦＦＰＥ(ホルマリン固定パラフィン包埋)腫瘍組織サンプルを、商業的組織ベンダーから購入した(各腫瘍型についてｎ＝１２〜２０)。組織との結合を検出するために、Ｌｅｉｃａ  ＢｏｎｄＲＸプラットフォームを使用して、市販の抗ヒトＯＸ４０抗体を用いた自動化ＩＨＣアッセイを開発した。簡潔には、熱誘導抗原賦活化(heat-induced antigen retrieval)(ＨＩＥＲ)を、９５℃で２０分間、ｐＨ９のＥＲ２緩衝液(Ｌｅｉｃａ)中において行った。マウス抗ヒトＯＸ４０モノクローナル抗体クローンＡＣＴ３５(BD Pharmingen)を、５μｇ／ｍｌで６０分間インキュベートした後、Ｎｏｖｏｌｉｎｋ  Ｍａｘポリマー(Ｌｅｉｃａ)を加えて３０分間インキュベートした。最後に、スライドをＤＡＢ基質−色素体溶液と６分間反応させ、マイヤーヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、清浄し、Ｐｅｒｍｏｕｎｔとともにカバーガラスをかけた。Ｄａｋｏタンパク質遮断剤を、一次抗体の希釈剤として使用した。
ＴＩＬをプロファイリングするために、市販の抗ＣＤ３(Ｔ細胞マーカー)モノクローナル抗体および抗ＦｏｘＰ３(Ｔｒｅｇマーカー)モノクローナル抗体を使用して、隣接する切片を染色した。市販のマウスＩｇＧ１を陰性対照として使用し、過形成ヒト扁桃腺組織を陽性対照として使用した。免疫染色後に、スライドを光学顕微鏡下でにおいて手作業で評価し、スコア付けした。
試験した４種類の腫瘍型では、ＣＤ３＋ＴＩＬが、試験した全てのサンプルに存在し、ＴＩＬの量はサンプル全体で多様であり、同一組織内での分布は不均一であった。一部の事例では、ＴＩＬは、予測通り、腫瘍と宿主との境界部により重点的に分布していた。大半の組織サンプルにおいて、ほとんどのＴＩＬが腫瘍間質に局在していた。しかしながら、それらは、多くの事例において腫瘍内巣に容易に見出された。陽性ＯＸ４０染色が、ＴＩＬのごく一部に観察され、主に腫瘍間質に分布していた。一般に、ＯＸ４０＋ＴＩＬの存在度は、ＣＤ３＋ＴＩＬの存在度に比例していた。試験した４種の腫瘍型の中では、ＯＸ４０＋ＴＩＬは、ＨＣＣおよびＣＲＣにおいてより豊富であった(図１５Ａ〜１５Ｃ)。
【０７２４】
実施例７：ＯＸ−４０ＬのＯＸ−４０との結合を遮断するヒトモノクローナル抗ＯＸ４０抗体
いくつかの抗ＯＸ４０抗体を、組換え可溶性ＯＸ４０Ｌの、ヒトＯＸ４０トランスフェクト２９３細胞との結合を遮断する能力について試験した。簡潔には、ヒトＯＸ４０を安定にトランスフェクトした２９３細胞を、まず、種々の濃度の抗ＯＸ４０抗体とともに事前インキュベートした。次いで、固定濃度(０.２μｇ／ｍＬ)の組換え可溶性ｈｉｓタグヒトＯＸ４０Ｌ(ＯＸ４０Ｌ−Ｈｉｓ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ)を添加し、サンプルをさらにインキュベートした。細胞を洗浄した後、社内でＡＰＣ標識した抗Ｈｉｓタグ抗体を使用して、結合したＯＸ４０Ｌ−Ｈｉｓを検出した。染色の蛍光強度は、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  IIフローサイトメーター(Becton Dickinson)を使用して測定した。細胞集団のＡＰＣ抗Ｈｉｓタグ抗体／ＯＸ４０Ｌ−Ｈｉｓ染色の幾何平均蛍光強度(ＧＭＦＩ)を、計算した(ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア)。用量応答曲線を作製し、抗体によるＯＸ４０Ｌ結合の遮断のＥＣ５０を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して計算し、このＥＣ５０を表１２に示す。
【０７２５】
【表１４】
0006797137.tif 000023
【０７２６】
図１６に示されるように、６Ｅ１、ＯＸ４０.４およびＯＸ４０.５を除き、試験した抗ＯＸ４０抗体のほとんどが、トランスフェクト細胞の表面上での可溶性ヒトＯＸ４０ＬのヒトＯＸ４０との結合を完全に遮断した。ＯＸ４０.５による不完全な遮断は、試験した他の抗体よりも、ヒト４０との結合効力が低いこと、または重複はしているが別のものであるエピトープとの結合に起因し得る。対照的に、６Ｅ１およびＯＸ４０.４は、ヒトＯＸ−４０ＬのＯＸ４０との結合を遮断しなかった。この遮断の欠如は、残りの抗体とは異なるエピトープと結合することに起因する可能性が高い。
【０７２７】
実施例８：抗体の競合／ビニング
抗体ビニング実験を以下のように行った。１以上の抗ＯＸ４０抗体を、アミンカップリング化学反応を使用してＢｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５チップに直接コーティングした。開始濃度６０μｇ／ｍＬから連続希釈(１：３)した抗ＯＸ４０抗体を、２０ｎＭのＯＸ４０−６Ｘ−Ｈｉｓ抗原とともに少なくとも１時間インキュベートした。インキュベートした複合体を、抗体結合表面に流し、交差遮断について観察した。表面上の複数の抗体を用いて実験を反復して、全ての抗体の相互の交差遮断に基づくエピトープマップを作製した。ＯＸ４０−ＯＸ４０Ｌ相互作用を遮断できた抗体を同定しビニングするために、ＯＸ４０Ｌもまた表面上にコーティングした。実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００またはＢｉａｃｏｒｅ  ３０００  ＳＰＲ機器において行った。
図１７に要約されるように、抗体２０Ｃ１、２０Ｂ３、８Ｂ１１、２３Ｈ３、１８Ｅ９、１４Ｂ６、ＯＸ４０.１およびＯＸ４０.２は、リガンド遮断薬であり、抗体３Ｆ４は、部分的リガンド遮断物質であり、１４Ａ２、６Ｅ１およびＯＸ４０.５は、リガンド非遮断物質であった。
【０７２８】
実施例９：ＯＸ４０抗体の生物物理学的特徴
可溶性ヒトＯＸ４０に対する複数のＯＸ４０抗体の親和性を、ＳＰＲ分析によって試験した。簡潔には、抗ヒトＣＨ１でコーティングしたＣＭ５チップにそれぞれの抗体を１〜１０μｇ／ｍＬ捕捉することによって、親和性測定を行った。ヒトＯＸ４０−６ＸＨＩＳ抗原を、単一濃度４００ｎＭまたは４００ｎＭからの１：２連続希釈のいずれかで使用した。実験は、ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)Ｔ２００またはＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)３０００  ＳＰＲ機器において行った。データを、１：１モデルに当てはめた。
表１３に示されるように、試験した抗ＯＸ４０抗体は、１０−８Ｍ〜１０−９Ｍの範囲の解離定数(ＫＤ)を有していた。
【表１５】
0006797137.tif 000024
【０７２９】
ＯＸ４０.２１抗体の熱安定性もまた試験し、結果を表１４に要約する。熱安定性は、GE Healthcare  ＣＡＰ−ＤＳＣを使用して判定した。サンプルは、ＰＢＳ中２５０μｇ／ｍＬの濃度で流した。スキャン速度は、６０℃／時間であった。データを、非２状態モデルに当てはめた。ＯＸ４０.２１抗体は、他の属性(例えば、低い標的外作用、免疫原性など)を一緒に考慮すると、試験した中でより安定な抗体の１つであると判定された。
【表１６】
0006797137.tif 000025
【０７３０】
カニクイザルへの単回静脈内投与後におけるＯＸ４０.２１抗体の薬物動態もまた試験した。ＯＸ４０.２１抗体は、カニクイザルへの単回静脈内(IV)投与後に、許容できる薬物動態(ＰＫ)を示し、線形ＰＫ(０.４〜４ｍｇ／ｋｇ)および長期半減期(６日間)を示した。
【表１７】
0006797137.tif 000026
ＰＫパラメーターは、非コンパートメント法により計算した。値は、平均±標準偏差である。
＊ＰＫパラメーターは、最大１０日間、血漿濃度を使用して計算したが、サル２については０.４ｍｇ／ｋｇで最大７日間であったことを除く。
＊％ＡＵＣｅｘｔｒａは、２４％〜４２％の範囲であった。
【０７３１】
ＯＸ４０.２１のヒトＰＫパラメーターを、アロメトリースケーリング(出力指数(power exponent)をＣＬＴについては０.８５、Ｖｓｓについては１と想定)を使用して、カニクイザルＰＫデータから算出した。算出したヒトｔ１／２は、１０日間であった(表１６)。ＰＫパラメーターを、２コンパートメント法によって計算した。
【表１８】
0006797137.tif 000027
【０７３２】
実施例１０：未標識抗ＯＸ４０抗体パネルによる、ＰＥ標識した抗ＯＸ４０抗体クローンＬ１０６のＦＡＣＳ交差遮断
いくつかの抗ＯＸ４０抗体を、ＰＥ標識した抗ＯＸ４０抗体クローンＬ１０６の、ヒトＯＸ４０トランスフェクト２９３細胞との結合を遮断する能力について試験した。簡潔には、ヒトＯＸ４０を安定にトランスフェクトした２９３細胞を、まず、種々の濃度の未標識抗ＯＸ４０抗体とともにインキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、２.５μｇ／ｍＬの固定濃度のＰＥ標識Ｌ１０６抗体(BD Biosciences)とともにインキュベートした。染色の蛍光強度は、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  IIフローサイトメーター(Becton Dickinson)を使用して測定した。細胞集団のＰＥ−Ｌ１０６染色の幾何平均蛍光強度(ＧＭＦＩ)を計算した(ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア)。Ｌ１０６結合の遮断についての用量応答曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して作製した。
図１８に示されるように、１８Ｅ９抗体およびＯＸ４０.１抗体は、Ｌ１０６のヒトＯＸ４０トランスフェクト細胞との結合を完全に遮断したが、２０Ｂ３は、部分的な遮断を示した。残りの抗体は、遮断をほとんどまたは全く示さず、１８Ｅ９およびＯＸ４０.１が、試験した他の抗体とは異なるＯＸ４０上のエピトープと結合することを示す。
【０７３３】
実施例１１：抗ＯＸ４０抗体の交差遮断分析
この実験は、種々の抗ＯＸ４０抗体の交差遮断特性を試験して、結合特異性を評価するために行った。簡潔には、ＯＸ４０抗体ＯＸ４０.１を、アロフィコシアニン(ＡＰＣ)とコンジュゲートし、ヒトＯＸ４０抗体ＯＸ４０.４およびＯＸ４０.５をビオチン化した。未コンジュゲートヒトＯＸ４０抗体のパネルを、ヒトＯＸ４０タンパク質を表面上に過剰発現する遺伝子操作型２９３またはＨＴ１０８０細胞株に投薬で適用し、４℃で３０分間結合させた。未コンジュゲート抗体を洗浄せずに、ＡＰＣ−ＯＸ４０.１(１μｇ／ｍＬ)、ビオチン−ＯＸ４０.４(０.４μｇ／ｍＬ)またはビオチン−ＯＸ４０.５(０.４μｇ／ｍＬ)をアッセイウェルに適用し、４℃で３０分間結合させた。細胞を洗浄し、必要に応じて、ストレプトアビジン−ＡＰＣコンジュゲートの存在下において同一条件下でさらにインキュベートした。最後の洗浄後、細胞をＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーター(BD Bioscience、San Jose、ＣＡ)で分析した。平均蛍光強度(ＭＦＩ)シグナルは、結合したコンジュゲート抗体に比例した。
【０７３４】
図１９Ａ〜１９Ｃに示されるように、ＡＰＣ−ＯＸ４０.１のヒトＯＸ−４０タンパク質を過剰発現する細胞との結合は、ＯＸ４０.２およびＯＸ４０.５によって遮断されたが、ＯＸ４０.４によっては、遮断が存在したとしてもわずかであった。ＡＰＣ−ＯＸ４０.１の結合は、８Ｂ１１.Ｈ９、３Ｆ４.Ｇ１１、２０Ｂ３.Ｇ２および１４Ｂ６.Ｃ５によって遮断されたが、６Ｅ１.Ａ１２および１４Ａ２.Ｂ９によっては遮断されなかった。図１９Ａ〜１９Ｃにおいて評価した抗体間で観察された結合関係性の図を、図１９Ｈに示す。
図１９Ｄ〜１９Ｅは、ビオチン−ＯＸ４０.４の結合が、２０Ｂ３.Ｇ２によっては強力に遮断され、２０Ｃ１.Ｆ２によっては中等度に遮断され、３Ｆ４.Ｇ１１および２３Ｈ３.Ｃ６によっては遮断されたとしても微弱に遮断され、１４Ａ２.Ｂ９によっては遮断されなかったことを示す。ビオチン−ＯＸ４０.５の結合は、２０Ｂ３.Ｇ２、２３Ｈ３.Ｃ６および２０Ｃ１.Ｆ２によっては強力に遮断され、３Ｆ４.Ｇ１１によっては中等度に遮断され、１４Ａ２.Ｂ９によっては微弱に遮断された。
図１９Ｆ〜１９Ｇは、ビオチン−ＯＸ４０.４の結合が、ＯＸ４０.１またはＯＸ４０.８によっては遮断されず、ＯＸ４０.５またはＯＸ４０.６によっては遮断されたとしてもごく微弱であったことを示す。ビオチン−ＯＸ４０.５の結合は、ＯＸ４０.１によって遮断され、ＯＸ４０.６によっては中等度に遮断され、ＯＸ４０.４またはＯＸ４０.６によっては遮断されたとしても非常に微弱であった。
図１９Ｄ〜１９Ｇにおいて評価した抗体間で観察された結合関係性の図を、図１９Ｉに示す。
【０７３５】
実施例１２：抗ＯＸ４０抗体はコンホメーションエピトープと結合する／エピトープマッピング
この実施例は、ＯＸ４０.２１が、非変性ヒトＯＸ４０と結合するが、変性ヒトＯＸ４０とは結合せず、その結合が、Ｎ−グリコシル化によって影響を受けないことを示す。
ＯＸ４０.２１の、Ｎ結合型グリコシル化を有するかまたは有さない天然または変性ＯＸ４０との結合を、以下のように判定した。天然(すなわち、非変性)および変性のヒトＯＸ４０のサンプルを、酵素Ｎ−グリカナーゼＰＮＧａｓｅ  Ｆありまたはなしでインキュベートして、Ｎ−グリコシル化を除去した。Ｎ結合型グリコシル化ありまたはなしの天然のヒトＯＸ４０のサンプルを、ＳＤＳゲル電気泳動に供し、Ｎ結合型グリコシル化ありまたはなしの変性ヒトＯＸ４０のサンプルを、変性ＳＤＳゲル電気泳動に供した。
図２０Ａに示されるように、ＯＸ４０.２１は、天然のＯＸ４０とのみ結合し、変性形態とは結合せず、グリコシル化の存在または不在は、ＯＸ４０との結合に影響を及ぼさない。図２０Ｂおよび２０Ｃは、２つのＮ−グリコペプチドが、脱グリコシル化の後にペプチドマッピングによって同定されたことを示す(ＡｓｐＮ１１８およびＡｓｐＮ１２の両方で６０％占有率)。
【０７３６】
これらのデータは、ＯＸ４０.２１が、コンホメーション的であり、Ｎ結合型グリコシル化とは関係のないエピトープと結合することを示唆する。
質量分析法を使用して、エピトープマッピング研究もまた行った。ｈｉｓタグヒトＯＸ４０(「ｈＯＸ４０」)のペプチド断片を、エンドプロテイナーゼを用いた酵素消化によって作製した。ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ５６００  Ｔｒｉｐｌｅ−ＴＯＦを使用して、ＬＣ−ＭＳを行った。
図２０Ｄおよび２０Ｅに示されるように、制限されたタンパク質分解による天然のｈＯＸ４０による結合実験により、ＯＸ４０.１６およびＯＸ４０.２１が、主として、成熟ヒトＯＸ−４０の細胞外部分(配列番号２)のアミノ酸４６〜６２に対応するペプチドＤＶＶＳＳＫＰＣＫＰＣＴＷＣＮＬＲ(配列番号１７８)と結合したことがわかった。ＯＸ４０.８は、成熟ヒトＯＸ４０の細胞外部分(配列番号２)のアミノ酸８９〜１２４に対応するペプチドＤＳＹＫＰＧＶＤＣＡＰＣＰＰＧＨＦＳＰＧＤＮＱＡＣＫＰＷＴＮＣＴＬＡＧＫ(配列番号１７９)と結合した。ＯＸ４０.２１によって結合されたエピトープの位置は、ヒトＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ複合体の結晶構造によって判定されるＯＸ４０リガンドの結合部位の一部と重複していた(Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ(ＰＤＢ)ＩＤコード２ＨＥＶ)。ＯＸ４０.２１の質量分析によって同定されたさらなるペプチドを、図２０Ｅの上部パネルに示し、これには、ＱＬＣＴＡＴＱＤＴＶＣＲ(配列番号１８４)、ＳＱＮＴＶＣＲＰＣＧＰＧＦＹＮ(配列番号１８５)、ＳＱＮＴＶＣＲＰＣＧＰＧＦＹＮＤＶＶＳＳＫＰＣＫＰＣＴＷＣＮＬＲ(配列番号１８２)およびＰＣＫＰＣＴＷＣＮＬＲ(配列番号１８３)が含まれる。
【０７３７】
実施例１３：抗ＯＸ−４０抗体は、Ｔ細胞増殖を促進し、Ｔ細胞からのＩＦＮ−γおよびＩＬ−２分泌を誘導する
抗ＯＸ−４０抗体を、抗体とともにインキュベートしたＴ細胞の増殖ならびにそのＴ細胞によって分泌されるＩＬ−２およびＩＦＮ−γの量を測定することによって、インビトロでＴ細胞活性化を誘導する能力について試験した。
初代Ｔ細胞活性化アッセイにおいて人工抗原提示細胞として使用するためのトランスフェクトＣＨＯ細胞株を作製した。ＣＨＯ−ＣＤ３−ＣＤ３２Ａ細胞株は、一本鎖Ｆｖ形式で抗ヒトＣＤ３抗体を、ヒトＦｃ受容体ＣＤ３２Ａとともに発現して、ＣＨＯ細胞表面上の抗ＯＸ４０抗体に提示する。簡潔には、ヒト初代ＣＤ４  Ｔ細胞を、陰性選択(ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ(商標)、Stemcell Technologies)によって単離し、照射したＣＨＯ−ＣＤ３−ＣＤ３２Ａ細胞とともに、８：１のＴ：ＣＨＯ比で、段階的な用量の抗ＯＸ４０抗体またはアイソタイプ対照抗体の存在下において、共培養した。３７℃で３〜４日間培養した後、製造業者の推奨に従って、ＥＬＩＳＡ(BD Biosciences)またはＨＴＲＦアッセイ(Cisbio)のいずれかによる分泌されたヒトＩＦＮγの測定を用いたＴ細胞活性化の評価のために上清を採取した。その後で、滴定したチミジンを、培養の最後のおよそ１８時間添加し、Ｔ細胞活性化のさらなる評価として、滴定したチミジンの組込みによって、Ｔ細胞増殖を測定した。
図２１Ａ〜２１Ｄおよび２２Ａ〜２２Ｄに示されるように(また、以下の表１７に要約されるように)、試験した抗ＯＸ４０抗体のほとんどは、増殖およびＩＦＮγ分泌によって測定される場合、用量依存的様式で、ＣＨＯ−ＣＤ３−ＣＤ３２細胞によって刺激されるヒトＣＤ４  Ｔ細胞活性化を強力に高めた。このアッセイにおいて試験した抗体のパネルは、ＯＸ４０.１、ＯＸ４０.４およびＯＸ４０.５と少なくとも同程度、またはそれよりも良好に、Ｔ細胞活性化を共刺激した。
【０７３８】
【表１９】
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【０７３９】
抗ヒトＯＸ４０抗体はまた、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ(ＳＥＢ)活性化ヒト末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)の培養物中における初代Ｔ細胞の刺激に対する影響についても試験した。ヒト全血を、AllCells, Inc.(Berkeley、ＣＡ)から、または社内瀉血プログラムの援助下でBristol-Myers Squibb、Redwood City、ＣＡのドナーから入手した。ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅクッションでの勾配精製によって単離し、段階的な用量のＯＸ４０抗体またはアイソタイプ対照抗体が２〜５μｇ／ｍＬの可溶性架橋抗体Ｆ(ａｂ’)２ヤギ抗ヒトＦｃγと一緒に存在する状況において、固定の準最適量(８５ｎｇ／ｍＬ)のスーパー抗原ブドウ球菌エンテロトキシンＢ(ＳＥＢ、Toxin Technologies、Sarasota、ＦＬ)を補充した培養培地で３日間培養した。３７℃３日間培養した後、分泌されるヒトＩＬ−２のＥＬＩＳＡ測定によるＴ細胞活性化の評価のために、上清を採取した。簡潔には、培養上清を、１：１０でサンプル希釈液中に希釈し、ヒトＩＬ−２の存在について、製造業者が推奨するプロトコールに従ってＥＬＩＳＡ(BD Bioscience)によって試験した。ＴＭＢ基質を添加した後、アッセイプレートを、６５０ｎｍの波長でＳｏｆｔｍａｘオペレーティングソフトウェアを使用して、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  ３４０ＰＣリーダーで読み取った。測定した発色基質の光学密度は、結合した検出抗体に比例していた。
異なるドナーから単離したＰＢＭＣからのデータを、図２３Ａ〜２３Ｆに示す。一般に、可溶性架橋クローン２０Ｃ１.Ｆ２は、可溶性架橋クローン２３Ｈ３.Ｃ６、８Ｂ１１.Ｈ９、３Ｆ４.Ｇ１１、１８Ｅ９.Ｇ５、６Ｅ１.Ａ１２および２０Ｂ３.Ｇ２と比較して、より強力なサイトカイン応答(１.３〜２.０ｎＭのＥＣ５０)を誘発した(図２３Ａ〜２３Ｃ)。可変領域突然変異を有する抗体に関して、ＯＸ−４０.２１は、一般に、可溶性架橋抗体ＯＸ−４０.１７、ＯＸ４０.１８、ＯＸ４０.６およびＯＸ４０.８と比較して、より強力なサイトカイン応答を誘発した(図２３Ｄ〜２３Ｆ)。これらのドナーからのデータを、さらなる抗ＯＸ４０抗体を試験した８人のさらなるドナーからのデータと合わせると、平均して、ＯＸ４０.２１は、ＯＸ４０.１、ＯＸ４０.２、ＯＸ４０.４、ＯＸ４０.５、ＯＸ４０.１７およびＯＸ４０.１８と比較して、Ｔ細胞応答の強化において全体として優れた効力を示したことを示す。これらの結果は、ＯＸ４０.２１が、ＯＸ４０.６およびＯＸ４０.８によって誘発されるものに匹敵する応答を誘発することをさらに示す(表１８)。
【０７４０】
【表２０】
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【０７４１】
実施例１４：抗ＯＸ４０抗体による、細胞株を使用したＮＫ９２媒介細胞溶解の促進
カルセイン放出を読取り値として使用して、複数の抗ヒトＯＸ４０抗体を、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞のＮＫ９２細胞媒介性溶解を促進する能力について試験した。簡潔には、標的細胞として使用するためのＣＤ４＋Ｔ細胞を、磁気ビーズを使用した陰性選択によって分離し、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８でコーティングしたビーズを用いて７２時間活性化した。３日後に、ＮＫ９２細胞を、カルセインＡＭ標識したＣＤ４＋細胞とともに、５対１の比で播種した。各抗ＯＸ４０抗体の滴定物を添加し、細胞を２時間インキュベートした。Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー(Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ)を使用して培地の蛍光強度を読み取ることによって、カルセイン放出を測定した。抗体依存性細胞溶解の割合を、以下の式を用いて平均蛍光強度(ＭＦＩ)に基づいて計算した：［(試験ＭＦＩ−平均バックグラウンド)／(平均最大値−平均バックグラウンド)］×１００。
図２４に示されるように、ＯＸ４０.８およびＯＸ４０.１６が、標的細胞の特異的溶解を最も多い量で誘導した(それぞれ、６０％および３０％)。ＯＸ４０.８のＥＣ５０は１６ｎｇ／ｍＬであり、ＯＸ４０.１６のＥＣ５０は４ｎｇ／ｍＬであった。試験した他の抗体は全て、誘導したＡＤＣＣが正確に計量するには低すぎるレベルであった。
【０７４２】
実施例１５：抗ＯＸ４０抗体による、初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞のＮＫ媒介性細胞溶解の促進
複数の抗ヒトＯＸ４０抗体を、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞の初代ＮＫ細胞媒介性溶解を促進する能力について試験した。簡潔には、標的細胞として使用するためのＣＤ４＋Ｔ細胞を、磁気選択によって２人のドナー由来のＰＢＭＣから分離し、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８でコーティングしたビーズを用いて７２時間活性化した。ＮＫ細胞を、エフェクターとして使用するために、磁気ビーズを使用した陰性選択によって別個のドナーから分離し、ＩＬ−２を用いて２４時間活性化した。活性化期間の後、ＮＫエフェクター細胞を、１μｇ／ｍｌの抗体の存在下において２時間、カルセイン標識した標的Ｔ細胞と２０：１、１０：１または５：１の比で混合した。溶解した標的細胞によって放出されるカルセインのレベルを、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー(Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ)を使用して、培地の蛍光強度を読み取ることによって測定した。抗体依存性細胞溶解の割合を、以下の式を用いて平均蛍光強度(ＭＦＩ)に基づいて計算した：［(試験ＭＦＩ−平均バックグラウンド)／(平均最大値−平均バックグラウンド)］×１００。
図２５Ａおよび２５Ｂに示されるように、２人のドナーに由来する活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞標的は、ＯＸ４０.８によって最も効果的に溶解された。ＯＸ４０.２１およびＯＸ４０.１の両方で、より低いレベルのＡＤＣＣ活性が確認された。
【０７４３】
実施例１６：ＯＸ４０抗体による、ＯＸ４０発現ＨＥＫ２９３細胞のマクロファージ媒介性細胞食作用の促進
複数のＯＸ４０抗体の抗体媒介性食作用活性を判定するために、初代ヒトマクロファージをＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ標識ＨＥＫ２９３／ＯＸ４０細胞および抗ＯＸ４０抗体の滴定物とともに４時間培養した。４時間後に、細胞を採取し、抗ＣＤ６４−ＡＰＣで染色し、フローサイトメーターに流した。ＣＤ６４およびＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔの二重陽性に染色した細胞は、貪食されたと見なした。貪食された標的細胞の割合を、以下の式を使用して計算した：１００×(二重陽性細胞の数／ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ陽性細胞の総数)。
図２６に示されるように、試験した全ての抗ＯＸ４０抗体が、用量依存的様式で、ＯＸ４０発現標的細胞の食作用を誘導した。ＯＸ４０.８は、全体的な食作用レベルが最も高く、ＥＣ５０濃度は最も低く６.２ｎｇ／ｍＬであった。これは、ヒトＩｇＧ１  抗ＯＸ４０抗体が、用量依存的様式で、ＦｃＲ媒介性食作用を誘導することを示す。
【０７４４】
実施例１７：抗ＯＸ４０抗体はヒト補体のＣ１ｑ成分と結合する
ヒト血清補体のＣ１ｑ成分がＯＸ４０.２１抗体と結合するかどうかを評価するために、比色ＥＬＩＳＡアッセイを開発した。試験した全ての抗体は、１０μｇ／ｍＬで高結合免疫アッセイプレートにコーティングした。占有されていないタンパク質結合部位をブロッキングした後、段階的な用量のヒトＣ１ｑ(３.１２５〜２００μＭ)を、ブロッキングした空のウェルを含め、ウェルに添加し、この空のウェルは、アッセイプレートとの非特異的なバックグラウンドのＣ１ｑ結合の対照として機能した。ビオチン化マウス抗Ｃ１ｑ抗体およびストレプトアビジン−ポリ−ＨＲＰをテトラメチルベンジジン基質と一緒に使用して、Ｃ１ｑの固定化抗体との結合を検出した。結果は、４５０ｎｍでの光学密度読取り値から６３０ｎｍでのものを引いたものとして報告する。
図２７に示されるように、Ｃ１ｑは、用量依存的様式で、ＯＸ４０.２１(黒四角)およびヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照(白丸)と結合した。しかしながら、Ｃ１ｑのＯＸ４０.２１との結合レベルは、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体とのものよりも低かった。予測した通り、バックグラウンドシグナル(灰色の丸)はほとんどなく、Ｃ１ｑのＩｇＧ１.１アイソタイプ対照との明白な結合(黒丸)はなかった。ＩｇＧ１.１抗体は、Ｃ１ｑ結合およびＦｃＲ相互作用を排除するように設計された５つの突然変異をＦｃ部分に含む。この結果は、ヒト血清補体のＣ１ｑ成分が、ＯＸ４０.２１と結合できることを示し、ＯＸ４０.２１が、インビボでＯＸ４０発現細胞の補体媒介性溶解を誘導し得ることを示す。
【０７４５】
実施例１８：ＯＸ４０は腫瘍浸潤リンパ球に発現する
ＯＸ−４０は、通常はＣＤ４＋細胞に限定され(図２８Ａ)、ＣＤ８＋Ｔ細胞上での発現は最小限である(図２８Ｂ)パターンで、結腸直腸癌、肺癌および卵巣癌(図２８Ｃ)の腫瘍浸潤リンパ球に発現する。
同様に、ＯＸ４０は、マウスＳａ１Ｎ腫瘍(図２８Ｄ)およびマウスＭＣ３８腫瘍(図２８Ｅ)において、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇによって発現される。腫瘍におけるマウスＯＸ−４０の発現を試験するために、２×１０６個のＳＡ１Ｎ肉腫細胞または２×１０６個のＭＣ３８細胞を、それぞれ、ＡＪまたはＢ６マウスの皮下に埋め込んだ。埋込み後１５日目に、腫瘍を採取し、単一細胞懸濁液中に解離させ、フローサイトメトリーのために染色した。Ｔ細胞集団を、ＣＤ８、ＣＤ４およびＦｏｘｐ３の発現に基づいて同定した。Ｓａ１Ｎ腫瘍については、腫瘍由来のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞を赤色のヒストグラムで示し、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ４−細胞を青色のヒストグラムで示し、ＣＤ８＋細胞をオレンジ色のヒストグラムで示す(図２８Ｄ)。アイソタイプ対照で染色した細胞は、緑色のヒストグラムで示す。ＭＣ３８腫瘍については、Ｔｒｅｇを青色のヒストグラムで示し、ＣＤ４＋細胞を緑色のヒストグラムで示し、ＣＤ８＋細胞を赤色のヒストグラムで示す(図２８Ｅ)。
【０７４６】
実施例１９：抗ＯＸ４０抗体による、Ｔｒｅｇ細胞媒介性抑制の逆転
複数の抗ヒトＯＸ４０抗体を、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞集団の調節Ｔ(Ｔｒｅｇ)細胞媒介性抑制を逆転させる能力について試験した。簡潔には、ＴｒｅｇおよびＴ応答(Ｔｒｅｓｐ)細胞を、磁気ビーズ分離によりＰＢＭＣをＣＤ４＋細胞富化した後、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏＴｒｅｇおよびＣＤ４＋ＣＤ２５ｌｏＣＤ１２７ｈｉＣＤ４５ＲＯ＋Ｔｒｅｓｐ細胞を分離することによって、単離した。Ｔｒｅｓｐ細胞を、次いで、増殖色素で標識し、滴定数のＴｒｅｇ細胞を１：１の比で開始して播種した。培養物を、３μｇ／ｍＬのプレート結合型抗ＣＤ３、１μｇ／ｍＬの可溶性抗ＣＤ２８および２μｇ／ｍＬのプレート結合型抗ＯＸ４０またはアイソタイプ対照で刺激した。９６時間後に、Ｔｒｅｓｐ細胞増殖を、フローサイトメトリーを使用して色素希釈を評価することによって測定した。
図２９に示されるように、Ｔｒｅｇ細胞の存在下および不在下のいずれにおいても、抗ＯＸ４０抗体は、Ｔｒｅｓｐ細胞の増殖を、アイソタイプ対照と比較して増大した。これは、試験した抗ＯＸ４０抗体が、Ｔｒｅｓｐ細胞増殖に対するＴｒｅｇ細胞の抑制効果を逆転させたことを示唆する。
【０７４７】
実施例２０：毒性研究
ＯＸ４０.６(２ｍｇ／ｋｇ)を、任意の関連毒性を評価するために、１日目(図３０Ａ)および２９日目(図３０Ｂ)にサルに静脈内投与した。耐容性の問題または臨床病理異常の兆候は観察されなかった。ＯＸ４０.６は、エキソビボＫＬＨリコールアッセイでのＣＤ４＋Ｔ細胞における増強されたＣＤ６９発現の傾向によって特徴付けられるように、ＫＬＨに対する増強された免疫応答を刺激した。４匹のサルのうちの２匹は、クリアランスの加速を示し、これは、抗薬物抗体の形成と関連していた。
上記の実験のカニクイザル血清サンプル中のＯＸ４０.６の濃度を、化学発光(ＣＬ)免疫アッセイによって分析した。ＯＸ４０.６抗体を使用して、キャリブレーターおよび品質管理(ＱＣ)サンプルを調製した。ビオチン化ヒトＯＸ４０−ｈｉｓを、ＯＸ４０.６の捕捉分子として、ストレプトアビジンコーティングマイクロプレート(Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ)に固定化した。最終的な基質のカニクイザル血清を１０％にしたサンプル、標準物および品質管理サンプルを、プレートでインキュベートした。２％マウス血清を含有する１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０(ＰＴＢ)中に最低必要希釈１０％で、サンプルを分析した。未結合材料を洗い流し、ＨＲＰ標識マウスモノクローナル抗ヒトＩｇＧ抗体を検出分子として使用して、捕捉されたＯＸ４０.６抗体を検出した。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ(Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)を添加した後、カニクイザル血清中のＯＸ４０.６の濃度を、Ｍ５プレートリーダーによって測定される発光強度から、ＯＸ４０.６抗体キャリブレーターから作製した４パラメーターロジスティック(４−ＰＬ)キャリブレーション曲線を使用して計算した。ＯＸ４０.６抗体キャリブレーション曲線の範囲は、カニクイザル血清中５〜５,０００ｎｇ／ｍＬであった。定量化の上限および下限は、それぞれ、５,０００および１０ｎｇ／ｍＬであった(すなわち、ＵＬＯＱ  ５０００ｎｇ／ｍＬ、ＬＬＯＱ  １０ｎｇ／ｍＬ)。品質管理サンプルを、カニクイザル血清中３７５０、４００および２０ｎｇ／ｍＬで調製し、各プレートで分析して、許容されるアッセイ性能を確保した。キャリブレーター、ＱＣおよびサンプルを、２％マウス血清を含有するＰＴＢ中に５倍希釈した。４つのストレプトアビジンプレートを使用して、サンプルを分析した。アッセイ性能は、許容される範囲内であった：標準物のプレート間ＣＶ％は、２５％未満であり、ＱＣ回収は、公称値±３０％以内であった。
【０７４８】
上記の実験におけるカニクイザル血清中のＯＸ４０.６に対する抗薬物抗体の存在を、電気化学発光(ＥＣＬ)架橋免疫アッセイによって判定した。具体的には、マウスモノクローナル抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体を使用して、陽性対照を調製した。ビオチン化抗ＯＸ４０：抗ｈＯＸ４０−ｈｉｓを、捕捉分子として２５ｎｇ／ｍＬで使用し、ルテニウム標識(ruthenylated)抗ＯＸ４０：抗ｈＯＸ４０−ｈｉｓを、検出分子として２５ｎｇ／ｍＬで使用した。サンプルを、捕捉分子および検出分子を含有する１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０(ＰＴＢ)中への１００倍希釈で分析した。ポリプロピレンプレートにおいて２時間インキュベートした後、サンプルミックスをストレプトアビジンコーティングＭＳＤプレートに移した。１時間のインキュベーションの後、未結合材料を洗い流し、ＭＳＤ読取り緩衝液を添加し、ＥＣＬを、ＭＳＤプレートリーダーＳＩ６０００を用いて測定した。陽性対照(マウス抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ)を、カニクイザル血清中１０００(ＨＰＣ)、１００(ＭＰＣ)および１０ｎｇ／ｍＬ(ＬＰＣ)で調製した。プールしたカニクイザル血清を陰性対照(ＮＣ)として使用した。ＮＣに対するＨＰＣ、ＭＰＣおよびＬＰＣのシグナル比は、それぞれ、１０２、１０および２であった。１つのストレプトアビジンプレートを使用して、サンプルを分析した。アッセイ性能は、許容される範囲内であった：ＰＣに対するＣＶ％は、１０％未満であり、陰性対照の未加工シグナル(５４ＲＬＵ)は、投与前のサンプルの未加工シグナル(４８〜５５ＲＬＵ)と同程度であった。
【０７４９】
実施例２１：免疫原性リスク評価研究
数種類の抗ヒトＯＸ４０抗体のインビトロＴ細胞増殖アッセイを行って、それらのヒト免疫原性の可能性を評価した。簡潔には、健常な志願者に由来する末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を、Ｆｉｃｏｌｌ(GE Healthcare)および勾配遠心分離によって単離し、ヒトリンパ球抗原(ＨＬＡ)クラスIIを、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)増幅およびオリゴヌクレオチドプローブ(ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ)によるハイブリダイゼーションによって特徴付けた。
世界人口の頻度にほぼ一致するＨＬＡクラスII型を有する４０人のＰＢＭＣドナーのパネルを、アッセイ実施に使用した。ＰＢＭＣを、増殖をモニタリングするためにＣＦＳＥ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)で標識し、１０％ヒトＡＢ(Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ)、非必須アミノ酸(Ｇｉｂｃｏ)およびｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ(Ｇｉｂｃｏ)を含有するＲＰＭＩ(Ｌｏｎｚｏ)において、１ウェル当たり２００,０００個の細胞で、６つの複製物で９６ウェルプレートに播種した。抗ヒトＯＸ４０抗体、対照タンパク質、参照抗体およびＣｏｎＡを、ＰＢＭＣとともに１μＭで７日間培養し、その後、培地を洗い流し、細胞を抗ヒトＣＤ４  ＡＰＣ(ＢＤ  ｓｃｉｅｎｃｅ)モノクローナル抗体で標識した。未結合の抗ＣＤ４抗体を洗浄工程により除去した後、細胞を、ＰＢＳ中３.７％ホルマリン(Ｓｉｇｍａ)で固定し、フローサイトメトリーによって分析して、増殖ＣＤ４＋細胞の割合を判定した。
４０人のドナーのうち、異なる抗ヒトＯＸ４０抗体に対する陽性応答(培地インキュベートＰＢＭＣと比べた増殖ＣＤ４＋Ｔ細胞の有意な増大として定義される)を示した割合を、図３１に示す。抗ヒトＯＸ４０抗体の全ての変異体が、このアッセイにおいて低ＱＣタンパク質と同程度の低いＣＤ４＋細胞活性化の可能性を示したが、ＯＸ４０.１６およびＯＸ４０.２１は例外であり、これらは、４０人のドナーのいずれにおいてもＣＤ４増殖の陽性応答を示さなかった。これらの結果は、これらの抗ヒトＯＸ４０抗体が、ヒトにおいて抗薬物抗体応答を誘発する可能性が低いことを示唆する。
【０７５０】
実施例２２：活性化Ｆｃ受容体との結合は、結腸癌腫モデルにおいて抗ｍＯＸ４０活性を増強する
マウス腫瘍モデルでの抗マウスＯＸ４０抗体の活性におけるＦｃＲ結合の役割を試験するために、異なるアイソタイプの抗ＯＸ４０抗体を試験した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、２百万個のＭＣ３８腫瘍細胞を皮下注射した。７日後に、腫瘍量を判定し、マウスを、平均腫瘍量が同程度となるように治療群に無作為化した。ＰＢＳ中に製剤化した抗体を、７日目、１０日目および１４日目に、１用量当たり２００μｌ体積中２００μｇで腹腔内投与した。
同一遺伝子マウス腫瘍モデルにおいて、抗マウスＯＸ４０抗体(例えば、ＯＸ８６、ラットＩｇＧ１)は、抗腫瘍活性を示す。Ｔ細胞表面受容体(共刺激および供阻害の両方)に特異的な多数の抗体のアイソタイプを変化させることにより、これらの抗体の抗腫瘍活性を変更できるため、ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ相互作用を遮断しない抗体であるＯＸ８６のマウスＦｃアイソタイプ変異体を作製した。図３２Ａ〜３２Ｃに示されるように、マウスＩｇＧ２ａ  ＦｃとしてフォーマットされたＯＸ８６(図３２Ｃ)は、マウスＩｇＧ１としてフォーマットされたＯＸ８６(図３２Ｂ)と比較して、優れた抗腫瘍活性をもたらす。これは、腫瘍部位におけるＴｒｅｇ細胞の枯渇およびＯＸ４０の抗体媒介性アゴニズムによるＴエフェクター細胞増大の両方に起因する可能性が高い。
【０７５１】
腫瘍浸潤Ｔ細胞集団に対する異なる抗体アイソタイプの効果を確認するために、異なるアイソタイプで処置したＭＣ３８マウス由来の腫瘍を、フローサイトメトリーによって評価した。腫瘍埋込み後１５日目に、分析のために選択されたマウスを屠殺し、腫瘍および脾臓を採取した。腫瘍およびリンパ節を２４ウェルプレートにおいてシリンジの後ろで解離することによって、単一細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液を、７０μｍのフィルターに通し、ペレット化し、再懸濁し、計数した。細胞を、次いで、染色のために１ウェル当たり１×１０６個の細胞で９６ウェルプレートに播種した。サンプルを、次いで、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏフローサイトメーター(ＢＤ)で分析した。抗ＯＸ４０抗体で処置した腫瘍保持マウスの脾臓および腫瘍の分析は、ＩｇＧ２ａアイソタイプが、腫瘍においてＣＤ４＋Ｔｒｅｇを枯渇できること(図３３Ａ)、ならびにＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａアイソタイプが、末梢においてＴ細胞増殖を活性化でき(図３３Ｂ)、脾臓において細胞数の増大をもたらす(図３３Ｃ)ことを示す。これらの結果は、ＯＸ４０のアゴニズム(しかしながら、必ずしもＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ相互作用を遮断するとは限らない)およびＯＸ８６抗体のＦｃ受容体結合が、抗腫瘍活性を促進することを示唆する。
【０７５２】
マウスＦｃＲがノックアウトされ、ヒトＦｃＲと置き換えられているマウスを使用して、ヒトＦｃおよびＦｃＲの役割を試験した。これらの実験は、ＣＤ４５.１コンジェニック宿主に照射した後、ヒトＦｃＲトランスジェニック骨髄細胞で再構築した骨髄キメラ系を使用して行った。次いで、これらのマウスを、８週間再構築させた後、２×１０６個のＭＣ３８腫瘍細胞を接種した。７日後に、腫瘍量を判定し、マウスを、平均腫瘍量が同程度となるように治療群に無作為化した。ＰＢＳ中に製剤化した抗体を、７日目、１０日目および１４日目に、１用量当たり２００μｌ体積中２００μｇで腹腔内投与した。マウスを、対照ヒトＩｇＧ１(図３４Ａ)、キメラＯＸ−８６ヒトＧ１ハイブリッドＡｂ(図３４Ｂ)またはＳ２６７Ｅ突然変異を有するＯＸ−８６ヒトＧ１ハイブリッド(図３４Ｃ)のいずれかで処置した。結果は、マウスアイソタイプで観察されたものと類似であった、すなわち、ヒトＩｇＧ１抗体は、活性化ＦｃＲと結合できるため有意な抗腫瘍効果を有したが、ＣＤ３２ＢおよびＣＤ３２Ａの両方との結合を増大するＳ２６７Ｅ突然変異が、より高い活性を有した(図３４Ａ〜３４Ｃ)。この高いレベルの活性は、エフェクターＴ細胞に対するアゴニズムの増大ならびに腫瘍部位におけるＴｒｅｇ枯渇の増大に起因する可能性が高い。
【０７５３】
腫瘍保持マウスの腫瘍部位および脾臓におけるＴ細胞集団を、前述のように試験した。Ｔｒｅｇは、Ｇ１またはＧ１  Ｓ２６７Ｅ抗体のいずれかで処置したマウスではあまり多くなく、Ｓ２６７Ｅアイソタイプではより大きな効果が見られた(図３５Ａ)。ＣＤ８＋Ｔ細胞(図３５Ｂ)およびＣＤ４＋エフェクター(図３５Ｃ)の割合の増大ならびに腫瘍部位における増大もまた、明らかであり、これらの増大は、Ｇ１  Ｓ２６７Ｅ抗体ではより大きかった。抗ＯＸ−４０抗体で処置したマウスの脾臓における細胞充実度の増大もまた、確認された(図３５Ｄ)。これらの結果は、ＯＸ８６−ｈＩｇＧ１抗体が、強力な抗腫瘍活性(図３４Ａ〜３４Ｃ)および測定できるほどのＴｒｅｇ枯渇(図３５Ａ〜３５Ｄ)を示したことを示唆する。
【０７５４】
実施例２３：遮断抗ＯＸ４０抗体は、マウス腫瘍モデルにおいて抗腫瘍活性を示す
以下の実験を行って、ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ間の相互作用を遮断する抗体が、強力な抗腫瘍活性を示すかどうかを判定する。この目的で、ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ相互作用を遮断するハムスター抗マウスＯＸ４０抗体(ハムスターＩｇＧ１  ８Ｅ５抗体)を作製し、皮下マウスＣＴ−２６腫瘍モデルにおいて、その抗腫瘍活性について試験した。ＣＴ−２６は、細胞を皮下に移植した場合に固形腫瘍成長をＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてモニタリングできる、マウス結腸腺癌腫瘍細胞株である。
雌のＢＡＬＢ／ｃマウス(Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ)を、研究の開始前に最低３日間、順化させた。マウスを１ケージ当たり５匹で収容し、ケージを、排気型マイクロアイソレーターラックに入れた。収容部は、１８〜２６℃、相対湿度５０＋２０％で１時間当たり少なくとも１２回の室内空気の入れ替えがあった。１２時間の明／暗サイクルを維持した。動物には、衛生処理した研究室用のげっ歯類食および水道水を自由に与えた。
【０７５５】
ＣＴ−２６細胞を、１０％ウシ胎児血清(ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３００７１.０３)を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地(Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３００９６.０１)中に維持した。１週間におよそ２回、単一のＴ１７５フラスコ内に入れた細胞を、１：５希釈で４つのＴ１７５フラスコに分けて、腫瘍埋込みに十分な数の細胞が得られるまで増殖させた。細胞を、およそ８０％のコンフルエンスで採取し、洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁した。
０日目に、１×１０６個のＣＴ−２６細胞を、１ｃｃのシリンジ(Becton Dickinson、Franklin Lakes、ＮＪ)および２７ゲージの５／８インチの針を使用して、マウスに埋め込んだ。次いで、腫瘍を、週２回、電子キャリパー(Mitutoyo、Aurora、Illinois)を用いて３次元で測定し、記録した。腫瘍量(ｍｍ３)を、式：幅×長さ×高さ×０.５を使用して計算した。埋込み後６日目の腫瘍量測定後に、マウスを、腫瘍量に応じて段階付けした。２６ｍｍ３の平均腫瘍量を有したマウスを、群に無作為化し、表１９に示されるように処置した。
【０７５６】
ハムスターアイソタイプ対照抗体は、ＧＳＴに対する不活性アメリカンハムスターＩｇＧモノクローナル抗体(ｍＡｂ)である(クローンＰＩＰ、カタログ番号ＢＥ０２６０、BioXcell、West Lebanon、ＮＨ)。これは、表１９に示されるように、６日目、１０日目および１４日目に腹腔内(ＩＰ)注射によりマウス１匹当たり１０ｍｇ／ｋｇの用量をもたらすように、投与の直前にＰＢＳ中に調製した。
マウスＯＸ４０に対するモノクローナル抗体(クローン８Ｅ５)は、表１９に示されるように、６日目、１０日目および１３日目にＩＰ注射により１０、３、１または０.３ｍｇ／ｋｇの用量をもたらすように、投与の直前にＰＢＳ中に調製した。
【０７５７】
【表２１】
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【０７５８】
動物は、姿勢、グルーミングおよび呼吸変化ならびに嗜眠状態について、毎日調べた。動物の体重を週２回測定し、体重減少が２０％以上であった場合には安楽死させた。マウスを、死亡または安楽死まで週２回腫瘍の存在およびサイズについて調べた。腫瘍を、電子キャリパー(Mitutoyo、Aurora、Illinois)を用いて３次元で測定し、記録した。治療化合物に対する応答を、腫瘍成長の関数として測定した。腫瘍が１５００ｍｍ３以上の体積に達した場合または潰瘍化が現れた場合、動物は安楽死させた。
図３６Ａ〜３６Ｅに示されるように、ハムスター抗マウスＯＸ４０  ｍＡｂ(クローン８Ｅ５、図３６Ｂ〜３６Ｅは異なる用量の８Ｅ５での処置を示す)は、皮下ＣＴ−２６モデルにおいて、ハムスターＩｇＧアイソタイプ対照群(図３６Ａ)と比較して、強力な抗腫瘍活性を示した。８Ｅ５抗体を、０.３〜１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与し、評価した最も低い用量(０.３ｍｇ／ｋｇ)でさえも、１２匹中１０匹のマウスが、研究期間の終わり(７２日目)に腫瘍なし(ＴＦ)となった。腫瘍のないマウスの数は、各用量群間で著しく異なることはなかったが、各群、研究期間の終わりまでに腫瘍のないマウスが９匹または１０匹となり、最も高い２つの用量(３または１０ｍｇ／ｋｇ)のいずれかで処置したマウスは、最も低い２つの用量(０.３または１ｍｇ／ｋｇ)で処置したマウスと比較して、さらなる腫瘍成長の遅延を示した。アイソタイプ対照で処置した群には腫瘍のないマウスは存在せず、この群内の全てのマウスは、潰瘍化または腫瘍量(＞１５００ｍｍ３)の結果として、３９日目までに殺処分された。
これらのデータは、ＯＸ４０とＯＸ４０−Ｌとの間の相互作用を遮断する抗ＯＸ４０抗体が、皮下マウスＣＴ−２６腫瘍モデルにおいて、腫瘍が確立されたマウスに投与した時に、強力な抗腫瘍活性を示すことを示す。
【０７５９】
実施例２４：ＯＸ４０アゴニズムは、マウスＭＣ３８結腸癌腫モデルにおいて、ＰＤ−１遮断と相乗作用する
抗ＯＸ−４０抗体処置と抗ＰＤ−１抗体処置との間の相乗作用を試験するために、これらの抗体の組合せを、ＭＣ３８マウス腫瘍モデルにおいて試験した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、２百万個のＭＣ３８腫瘍細胞を皮下注射した。７日後に、腫瘍量を判定し、マウスを、平均腫瘍量が同程度となるように治療群に無作為化した。ＰＢＳ中に製剤化した抗体を、７日目、１０日目および１４日目に、１用量当たり２００μｌ体積中２００μｇで腹腔内投与した。
図３７Ａ〜３７Ｄに示されるように、抗ＰＤ−１抗体(図３７Ｂ)および抗ＯＸ４０抗体(図３７Ｃ)のいずれも、単独で使用した場合には最小限の活性しか示さなかったが、組み合わせた場合には有意な抗腫瘍活性を有し(図３７Ｄ)、８匹中５匹のマウスが、腫瘍なしとなった。
【０７６０】
実施例２５：ＯＸ４０アゴニズムは、カニクイザルにおいてワクチンに対する応答を増強する
ワクチンに対する免疫応答の増強を測定して、ＯＸ４０.６抗体がカニクイザルにおいて免疫応答を刺激する能力を評価した。所望される効果、すなわち、腫瘍に対する免疫応答の増強が、健常な非ヒト霊長類では腫瘍がないため評価できないために、このアプローチを選択した。
サルに、１日目にキーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)で免疫処置し(１０ｍｇ、筋肉内)、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原(ＨＢｓＡｇ)(ＥＮＧＥＲＩＸ−Ｂ)で免疫処置した(２０μｇ、筋肉内、１日目および２９日目)。ワクチンの投与後、１日目および２９日目に、サルに０または２ｍｇ／ｋｇのＯＸ４０.６抗体を静脈内投与した。２２日目および４１日目に、エキソビボでのＫＬＨに対するＴ細胞応答ならびにＫＬＨおよびＨＢｓＡｇに対するＴ細胞依存性抗体応答によって、免疫応答を測定した。図３８Ａおよび３８Ｂに示されるように、２２日目(図３８Ａ)および４１日目(図３８Ｂ)における２ｍｇ／ｋｇでのＯＸ４０.６に関連する所見には、ＣＤ６９＋、ＩＦＮ−ガンマ＋およびＴＮＦ−アルファ＋発現ＣＤ４＋ＣＤ８−Ｔ細胞の平均パーセントにおける増大によって特徴付けられる、ＫＬＨに対するエキソビボリコール応答の増大が含まれた。
【０７６１】
実施例２６：遺伝子操作された定常ドメインを有する抗体のＦｃ受容体結合
この実施例は、ＩｇＧ２  のＣＨ１およびヒンジを含む修飾された重鎖定常領域を有する抗体が、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む場合に、ＦｃγＲと結合することを実証する。
可変ドメインによる抗原結合に加えて、抗体は、定常ドメインとの相互作用を通じてＦｃガンマ受容体(ＦｃｇＲ)と結合する。これらの相互作用は、抗体依存性細胞傷害性(ＡＤＣＣ)および抗体依存性細胞食作用(ＡＤＣＰ)などのエフェクター機能を媒介する。エフェクター機能活性は、ＩｇＧ１アイソタイプでは高いが、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４では、これらのアイソタイプはＦｃｇＲに対する親和性が低いことに起因して、非常に低いかまたは存在しない。加えて、ＩｇＧ１のエフェクター機能は、定常領域内のアミノ酸残基の突然変異を通じて、ＦｃｇＲの親和性および選択性を変更するように修飾することができる。
抗体のＦｃガンマ受容体(ＦｃγＲまたはＦｃｇＲ)との結合について、Ｂｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)およびＦｏｒｔｅｂｉｏ  Ｂｉｏｌａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ(ＢＬＩ)を含むバイオセンサー技術を使用して研究した。ＳＰＲ研究は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００機器(GE Healthcare)において２５℃で行った。マウス抗６ｘＨｉｓ抗体に由来するＦａｂ断片を、約３０００ＲＵの密度まで、ＥＤＣ／ＮＨＳを使用してＣＭ５センサーチップに固定化した。種々のｈｉｓタグＦｃｇＲ(７ｕｇ／ｍｌ)を、１０ｕｌ／分で３０秒の接触時間を使用してＣ末端ｈｉｓタグにより捕捉し、１.０ｕＭの抗体の結合を、１０ｍＭ  ＮａＰＯ４、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、０.０５％ｐ２０(ＰＢＳ−Ｔ)ｐＨ７.１の泳動緩衝液において評価した。これらの実験に使用したＦｃｇＲには、ＣＤ６４(ＦｃｇＲＩ)、ＣＤ３２ａ−Ｈ１３１(ＦｃｇＲIIａ−Ｈ１３１)、ＣＤ３２ａ−Ｒ１３１(ＦｃｇＲIIａ−Ｒ１３１)、ＣＤ３２ｂ(ＦｃｇＲIIｂ)、ＣＤ１６ａ−Ｖ１５８(ＦｃｇＲIIIａ−Ｖ１５８)、ＣＤ１６ｂ−ＮＡ１(ＦｃｇＲIIIｂ−ＮＡ１)およびＣＤ１６Ｂ−ＮＡ２(ＦｃｇＲIIIｂ−ＮＡ２)が含まれた。ＢＬＩ実験は、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ機器(Pall、Fortebio)において２５℃で、１０ｍＭ  ＮａＰＯ４、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、０.０５％ｐ２０(ＰＢＳ−Ｔ)ｐＨ７.１において行った。抗体を、プロテインＡコーティングセンサーで未希釈の発現上清から捕捉した後、１μＭのｈＣＤ３２ａ−Ｈ１３１、ｈＣＤ３２ａ−Ｒ１３１、ｈＣＤ３２ｂ、ｈＣＤ１６ａ−Ｖ１５８または０.１μＭのｈＣＤ６４の検体を結合させた。
【０７６２】
まず、置換Ｓ２６７Ｅ(ＳＥ)およびＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ(ＳＥＬＦ)、ならびにＶ４、Ｖ７、Ｖ８、Ｖ９およびＶ１２と呼ばれる突然変異Ｐ２３８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、Ｈ２６８Ｄ、Ａ３３０Ｒ、Ｇ２３７Ｄ、Ｅ２３３Ｄの種々の組合せを含む、修飾されたＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む抗体を作製した。これらの抗体の結合について、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＳＰＲによって、ＩｇＧ１ｆ、ＩｇＧ２.３(ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ)およびＩｇＧ４.１(ＩｇＧ４−Ｓ２２８Ｐ)抗体、ならびに全てのＦｃｇＲとの結合を低減させるように遺伝子操作されているＩｇＧ１.１ｆ抗体と比較して、研究した。図７０に示される結果は、ＳＥおよびＳＥＬＦについてはＣＤ３２ａ−Ｈ１３１、ＣＤ３２ａ−Ｒ１３１およびＣＤ３２ｂの結合の増大、ならびにＣＤ３２ａ−Ｈ１３１およびＣＤ３２ａ−Ｒ１３１と比較してＣＤ３２ｂに対するＶ４、Ｖ７、Ｖ８、Ｖ９およびＶ１２突然変異体の選択性の増大(図３９)を含む、ＩｇＧ１ｆ、ＩｇＧ２.３およびＩｇＧ４.１、ならびに突然変異ＩｇＧ１抗体の予測されたＦｃｇＲ結合特性を示す。
次のコンストラクトのセットを使用して、通常はエフェクター機能が陰性のＩｇＧ２アイソタイプにエフェクター機能を遺伝子操作した。この研究では、上記の突然変異を、ＩｇＧ２.３の定常領域またはＩｇＧ２.３Ｇ１−ＡＹと呼ばれるＩｇＧ２.３／ＩｇＧ１ｆハイブリッドに導入した(表２０)。抗体を、小規模で上清として発現させ、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  ＢｉｏＬａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙバイオセンサー技術を使用してＦｃｇＲとの結合について試験した。抗体は上清中に低濃度で存在していたため、この実験は、プロテインＡコーティングセンサーを使用して上清から抗体を捕捉した後、溶液中のＦｃｇＲ検体と結合させることによって行った。野生型ＩｇＧ１、ＳＥ、Ｐ２３８Ｄ、Ｖ４およびＶ１２抗体を含む精製された上清対照ＩｇＧ１ｆもまた、比較のために含まれており、これらの対照抗体のそれぞれが、予測されたＦｃｇＲ結合特性を示した(図４０)。ＩｇＧ２.３抗体はまた、予測された結合プロファイルを示し、認識できる結合がＣＤ３２ａ−Ｈ１３１とのものだけであった。しかしながら、Ｓ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ｐ２３８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、Ｈ２６８Ｄ、Ａ３３０Ｒ、Ｇ２３７ＤまたはＥ２３３Ｄ突然変異をＩｇＧ２.３に導入した全ての突然変異型は、対応する遺伝子操作されたＩｇＧ１  ｍＡｂのＦｃｇＲ親和性を再現することができなかった(図４０)。対照的に、ＩｇＧ２.３Ｇ１−ＡＹコンストラクトは、ＩｇＧ２.３のＣＨ１およびヒンジ領域を保持しながらも、野生型ＩｇＧ１のＦｃｇＲ結合特性を完全に保持した。加えて、Ｓ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ｐ２３８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、Ｈ２６８Ｄ、Ａ３３０Ｒ、Ｇ２３７ＤおよびＥ２３３Ｄを含む全てのＩｇＧ２.３Ｇ１−ＡＹ突然変異体は、同一の突然変異を含むＩｇＧ１バージョンのｍＡｂと同程度のＦｃｇＲ結合特性を示した(図４０)。これは、野生型または突然変異型ＩｇＧ１のエフェクター機能と組み合わせた、ＩｇＧ２のＣＨ１およびヒンジ領域を有する抗体の遺伝子操作に成功したことを示す。
【０７６３】
【表２２】
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【０７６４】
この遺伝子操作戦略を、ＩｇＧ２.３Ｇ１−ＡＹ、ＩｇＧ２.３Ｇ１−ＡＹ−Ｓ２６７Ｅ(ＩｇＧ２.３Ｇ１−ＡＹ−Ｖ２７)、ならびにＩｇＧ２−Ｂ形式の変異体(ＩｇＧ２.５Ｇ１−ＡＹおよびＩｇＧ２.５Ｇ１−ＡＹ−Ｖ２７)でフォーマットされた他の抗体、ならびにＩｇＧ１およびＩｇＧ２定常ドメインの異なる組合せを含む他のハイブリッド抗体を生成し、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＳＰＲ技術を使用してこれらの抗体の抗−ｈｉｓ  Ｆａｂ捕捉ｈｉｓ−タグＦｃｇＲとの結合について試験することによって、さらに検討した。８連の上清データと合致して、ＳＰＲデータは、ＩｇＧ２.３Ｇ１−ＡＹ抗体およびＩｇＧ２.３Ｇ１−ＡＹ−Ｖ２７抗体が、Ａ−形式のＩｇＧ２抗体(ＩｇＧ２.３)のＣＨ１およびヒンジ領域を含むにもかかわらず、それぞれ、ＩｇＧ１ｆおよびＩｇＧ１ｆ−Ｓ２６７Ｅと同程度のＦｃｇＲ結合特性を有したことを示す(表２１)。ＩｇＧ２.５Ｇ１−ＡＹ抗体およびＩｇＧ２.５Ｇ１−ＡＹ−Ｖ２７抗体を使用して同様のデータも得られ、ＩｇＧ１ｆおよび修飾されたＩｇＧ１ｆ様エフェクター機能を有するＢ−形式のＩｇＧ２抗体(ＩｇＧ２.５と呼ばれる、Ｃ１３１Ｓ突然変異を含む)の遺伝子操作の成功が示された。ＩｇＧ２.３Ｇ１−ＡＹ、ＩｇＧ２.３Ｇ１−ＡＹ−Ｖ２７、ＩｇＧ２.５Ｇ１−ＡＹまたはＩｇＧ２.５Ｇ１−ＡＹ−Ｖ２７定常領域を有するが、異なる可変領域を有するいくつかの他の抗体のデータは、この遺伝子操作戦略が、可変ドメインに関係なく他の抗体に広く適用できることを示す(表２１)。
【０７６５】
【表２３】
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【表２４】
0006797137.tif 000033
【０７６６】
実施例２７：修飾された重鎖定常領域を有する抗ＯＸ４０抗体の、架橋ありまたはなしでのＴ細胞増殖ならびにＴ細胞からのＩＦＮ−γおよびＩＬ−２分泌に対する効果
修飾されたＩｇＧ２  ＣＨ１／ヒンジ領域を有する抗ＯＸ４０抗体は、架橋の不在下においてＴ細胞活性化を促進する能力を有し得、したがって、ＦｃγＲを発現する細胞型の不在下または低発現下においてインビボでＴ細胞活性化を促進でき、ＩｇＧ１アイソタイプ抗体よりも広い範囲の腫瘍型において抗腫瘍活性を促進できる可能性がある。
あるいは、修飾されたＣＨ１／ヒンジ領域抗体は、Ｔ細胞活性化を促進するために依然として架橋を必要とする可能性があるが、ＦｃγＲと結合した場合には、ＩｇＧ１アイソタイプ抗体と比較して増大したアゴニスト活性を有し得、したがって、Ｔ細胞活性化および抗腫瘍活性の促進がより強力であり得る。
【０７６７】
表２２に示される配列を含む修飾された重鎖定常領域を有する抗ＯＸ４０抗体を作製し、以下に記載されるアッセイを使用して、架橋ありまたはなしで、Ｔ細胞増殖ならびにＴ細胞からのＩＦＮ−γおよびＩＬ−２分泌に対するそれらの効果について試験した。抗体ＯＸ４０.６、４０.８、４０.１６および４０.２１の軽鎖配列は、それぞれ、配列番号９６、１１０ならびに１１６(ＯＸ４０.１６および４０.２１の両方について)に対応する。
【０７６８】
【表２５】
0006797137.tif 000034
【０７６９】
ＣＨＯ−ＣＤ３＋／−ＣＤ３２アッセイ
表２２に示される配列を有する抗ＯＸ−４０抗体を、抗体とともにインキュベートしたＴ細胞の増殖ならびにそのＴ細胞によって分泌されるＩＬ−２およびＩＦＮ−γの量を測定することによって、インビトロでＴ細胞活性を誘導する能力について試験する。
初代Ｔ細胞活性化アッセイにおいて人工抗原提示細胞として使用するためのトランスフェクトＣＨＯ細胞株を作製する。ＣＨＯ−ＣＤ３−ＣＤ３２Ａ細胞株は、一本鎖Ｆｖ形式で抗ヒトＣＤ３抗体を、ヒトＦｃ受容体(ＦｃＲ)ＣＤ３２Ａとともに発現して、ＣＨＯ細胞表面上の抗ＯＸ４０抗体に提示する。ＣＨＯ−ＣＤ３細胞株は、抗ヒトＣＤ３抗体を、ＦｃＲなしで、一本鎖Ｆｖ形式で発現する。
簡潔には、ヒト初代ＣＤ４  Ｔ細胞を、陰性選択(ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ(商標)、Stemcell Technologies)によって単離し、照射したＣＨＯ−ＣＤ３−ＣＤ３２Ａ細胞または照射したＣＨＯ−ＣＤ３細胞とともに、８：１のＴ：ＣＨＯの比で、段階的な用量の抗ＯＸ４０抗体またはアイソタイプ対照抗体の存在下において、共培養する。３７℃で３〜４日間培養した後、製造業者の推奨に従って、ＥＬＩＳＡ(BD Biosciences)またはＨＴＲＦアッセイ(Cisbio)のいずれかによる分泌されたヒトＩＦＮ−γの測定を用いたＴ細胞活性化の評価のために上清を採取する。その後で、滴定したチミジンを、培養の最後のおよそ１８時間添加し、Ｔ細胞活性化のさらなる評価として、滴定したチミジンの組込みによって、Ｔ細胞増殖を測定する。
【０７７０】
ＳＥＢ  ＰＢＭＣアッセイ
表２２に示される配列を有する抗ＯＸ−４０抗体を、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ(ＳＥＢ)活性化ヒト末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)の培養物中において初代Ｔ細胞の刺激に対するそれらの効果について試験する。ヒト全血サンプルを、AllCells, Inc.(Berkeley、ＣＡ)から、または社内瀉血プログラムの援助下でBristol-Myers Squibb、Redwood City、ＣＡのドナーから入手する。ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅクッションでの勾配精製によって単離し、段階的な用量のＯＸ４０抗体またはアイソタイプ対照抗体の存在下において、固定の準最適量の(８５ｎｇ／ｍＬ)のスーパー抗原ブドウ球菌エンテロトキシンＢ(ＳＥＢ、Toxin Technologies、Sarasota、ＦＬ)を補充した培養培地で３日間培養する。一部の事例では、２〜５μｇ／ｍＬの可溶性架橋抗体Ｆ(ａｂ’)２ヤギ抗ヒトＦｃγもまた、培養物に添加する。３７℃３日間培養した後、分泌されるヒトＩＬ−２のＥＬＩＳＡ測定によるＴ細胞活性化の評価のために、上清を採取する。簡潔には、培養上清を、１：１０でサンプル希釈液中に希釈し、ヒトＩＬ−２の存在について、製造業者が推奨するプロトコールに従ってＥＬＩＳＡ(BD Bioscience)によって試験する。ＴＭＢ基質を添加した後、アッセイプレートを、６５０ｎｍの波長でＳｏｆｔｍａｘオペレーティングソフトウェアを使用して、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  ３４０ＰＣリーダーで読み取る。測定した発色基質の光学密度は、結合した検出抗体に比例していた。
【０７７１】
ＭＬＲアッセイ
表２２に示される配列を有する抗ＯＸ−４０抗体を、Ｔ細胞：樹状細胞同種混合リンパ球反応(Ｔ：ＤＣ  ＡｌｌｏＭＬＲ)において、初代ヒトＴ細胞増殖およびＩＦＮ−γ分泌を増強するそれらの能力について試験した。全Ｔ細胞を、陰性選択(ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ、Stemcell Technologies)によって、健常なヒトドナー由来の末梢血から単離する。単球を、ＣＤ１４マイクロビーズ(Miltenyi)を使用して、健常なヒトドナー由来の末梢血から単離し、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下において６日間培養して、未成熟樹状細胞(ＤＣ)を誘導する。ＤＣおよびＴ細胞を、段階的な用量のＯＸ４０抗体またはアイソタイプ対照抗体の存在下において共培養する。一部の事例では、２〜５μｇ／ｍＬの可溶性架橋抗体、例えばＦ(ａｂ’)２ヤギ抗ヒトＦｃγもまた、培養物に添加する。４日目から７日目に、製造業者の推奨に従って、ＥＬＩＳＡ(BD Biosciences)またはＨＴＲＦアッセイ(Cisbio)による分泌されたＩＦＮ−γの測定のために、各サンプルからの上清を採取する。上清採取の後、細胞培養物に、培養の最後の１６〜１８時間、１μＣｉ／ウェルの３［Ｈ］−チミジンをパルス投与する。細胞を、フィルタープレートに採取し、１分間当たりの細胞に取り込まれた３［Ｈ］−チミジンの３［Ｈ］計数を、Ｔ細胞増殖の測定値として読み取る。
【０７７２】
実施例２８：ＣＴ２６モデルにおけるＣＴＬＡ−４遮断によるＯＸ４０アゴニストｍＡｂの抗腫瘍活性
抗ＯＸ−４０抗体処置と抗ＣＴＬＡ−４抗体処置との間の相乗作用を試験するために、これらの抗体の組合せを、ＣＴ２６マウス腫瘍モデルにおいて試験した。マウスに、ＣＴ２６腫瘍を接種し、ｍＡｂ投与を、図４１Ａ〜４１Ｄに示される抗体２００μｇ／マウスで、接種後３日目に開始した(３日目、７日目および１０日目に投与)。
図４１Ａ〜４１Ｄに示されるように、抗ＣＴＬＡ−４抗体(図４１Ｂ)および抗ＯＸ４０抗体(図４１Ｃ)のいずれも、単独で使用した場合には最小限の活性しか示さなかったが(いずれの処置についても８匹中１匹のマウスが腫瘍なし)、組み合わせた場合には有意な抗腫瘍活性を有し(図４１Ｄ)、８匹中４匹のマウスが腫瘍なしとなった。
【０７７３】
実施例２９：固形腫瘍を有する対象におけるフェーズ１／２ａ臨床試験
ＯＸ４０.２１を単独またはニボルマブもしくはイピリムマブと組み合わせて投与することの有効性を実証するために、単独またはニボルマブもしくはイピリムマブと組み合わせて投与されるＯＸ４０.２１のフェーズ１／２ａ研究を、進行固形腫瘍を有する対象において行う。
【０７７４】
１. 目的
この研究の主な目的は、進行悪性腫瘍を有する対象において、単独またはニボルマブもしくはイピリムマブと組み合わせて投与されるＯＸ４０.２１の安全性、耐容性、用量限定毒性(ＤＬＴ)および最大耐用量(ＭＴＤ)／推奨フェーズ２用量(ＲＰ２Ｄ)を評価することである。
二次目的として、進行悪性腫瘍を有する対象において単独またはニボルマブもしくはイピリムマブと組み合わせて投与されるＯＸ４０.２１の予備的抗腫瘍活性を調査すること；単独またはニボルマブもしくはイピリムマブと組み合わせて投与されるＯＸ４０.２１のＰＫを特徴付けること；ならびに単独またはニボルマブもしくはイピリムマブと組み合わせて投与されるＯＸ４０.２１の免疫原性およびＯＸ４０.２１とともに投与されるニボルマブまたはイピリムマブの免疫原性を特徴付けることが挙げられる。さらなる探求目的として、治療の前およびＯＸ４０.２１単独またはニボルマブもしくはイピリムマブと組み合わせて投与した後の腫瘍生検標本および末梢血における、抗腫瘍活性と選択バイオマーカー測定値との関連性の可能性を探求すること；ＱＴｃ間隔でＯＸ４０.２１単剤治療および併用療法の効果の可能性を評価すること；ニボルマブおよびＯＸ４０.２１の組合せを受容した対象においてニボルマブＰＫを特徴付けること；イピリムマブおよびＯＸ４０.２１の組合せを受容した対象においてイピリムマブＰＫを特徴付けること；ＯＸ４０.２単独およびニボルマブまたはイピリムマブと組み合わせて治療した対象における全体的な生存率(ＯＳＭＯＴＩＣ)を評価すること；ならびに用量／曝露および抗腫瘍活性、薬力学(ＰＤ)効果(末梢血および腫瘍生検標本における選択されたバイオマーカー)ならびにＯＸ４０.２１単独およびニボルマブまたはイピリムマブとの組合せにより治療された対象の重要な安全対策の間の関係性の可能性を探求することが挙げられる。
【０７７５】
２. 研究の設計および期間
これは、進行固形腫瘍を有する対象におけるＯＸ４０.２１のフェーズ１／２ａの非盲検研究であり、初期のＯＸ４０.２１単剤治療が、後期のニボルマブまたはイピリムマブとの併用療法とともに組み込まれる。
研究セクション(用量漸増および用量拡大)は、研究に伴う安全性、ＰＫおよびＰＤデータに基づいて、段階的なアプローチで進める。第１の研究セクションは、ＯＸ４０.２１単剤治療の用量漸増コホートで開始する。最初の３つの単剤治療用量コホートからの臨床データが、ニボルマブとの組合せでＯＸ４０.２１の用量漸増を開始するための基礎として機能する。最初の３つの単剤治療用量コホートからの臨床データに、ニボルマブとの組合せのＯＸ４０.２１の最初のコホートからの臨床データを加えたものが、イピリムマブとの組合せでＯＸ４０.２１の用量漸増を開始するための基礎として機能する。用量漸増のセクションにおいてＯＸ４０.２１の耐容性であり薬理学的に活性であるＲＰ２Ｄを確立した後に、特定の腫瘍コホートにおける用量拡大を開始する。
【０７７６】
３. 用量漸増
パート１Ａの研究設計の概要を、図４２に示す。
研究の用量漸増段階では、進行固形腫瘍を有する対象において、単独またはニボルマブもしくはイピリムマブと組み合わせたＯＸ４０.２１の安全性および耐容性を評価する。
ＯＸ４０.２１の初回用量レベルは、２０ｍｇである。後期用量についての用量漸増決定は、ＢＬＲＭモデル(ＯＸ４０.２１単剤治療)またはＢＬＲＭ(−コピュラ)モデル(ニボルマブもしくはイピリムマブと組み合わせたＸ４０.２１)を使用したＤＬＴに基づく。ＤＬＴ期間は、単剤治療および併用療法のいずれの用量漸増パートでも、２８日間である。ＤＬＴ率は、ＤＬＴ期間内に生じ、他に代替的な原因を特定することができない、ＡＥの発生、重篤度および持続期間に基づいて判定する。次の単剤治療コホート／用量レベルの用量の選択は、ＢＬＲＭ(−コピュラ)推奨を、全ての治療対象からの全ての利用可能なＰＫ、ＰＤならびに臨床および研究室での安全性データとともに考慮する。パート２ＡのＯＸ４０.２１開始用量の選択は、臨床および研究室での安定性評価、ＰＫ／ＰＤデータならびに階層ベイズモデリングフレームワーク内でのモデリング推奨を含む、パート１Ａから入手可能なデータを使用して、ＯＸ４０.２１(パート１Ａ)およびニボルマブ(ＣＡ２０９−００３)の両方の単剤毒性プロファイルを組み込むことによって判定する。パート３ＡのＯＸ４０.２１の開始用量の選択は、臨床および研究室での安全性評価、ＰＫ／ＰＤデータ、ならびにベイズモデリングフレームワーク内でのモデリング推奨を含む、パート１Ａおよび２Ａからの全ての利用可能なデータを使用して、ＯＸ４０.２１(パート１Ａ)およびイピリムマブ(ＣＡ１８４−０２２)の両方の単剤毒性プロファイルを組み込むことによって判定する。実際の用量は、ＢＬＲＭ(−コピュラ)に従って修正できるが、以前に試験した用量の２倍を超えることはない。
【０７７７】
全ての用量コホートの用量漸増中に、最初の対象(センチネル対象)を、５日間観察した後、そのコホート内のさらなる対象を研究薬物で治療する。
およそ３０人の対象を、各用量漸増パートに採用する。各用量漸増コホートの対象の数は、ＢＬＲＭ(−コピュラ)推奨に応じて変動する。まず、およそ３人の対象を、開始用量レベルのＯＸ４０.２１またはニボルマブもしくはイピリムマブと組み合わせたＯＸ４０.２１で治療する。さらにおよそ３人の評価可能対象のコホートを、用量漸増段階中に、ＢＬＲＭ(−コピュラ)に従った推奨用量レベルで治療する。ＤＬＴの評価が可能な少なくとも６人の対象を、ＭＴＤで治療する。
【０７７８】
パート１Ａ：採用は、パート１ＡのＯＸ４０.２１単剤治療の用量漸増で開始する。パート１ＡでのＯＸ４０.２１の開始用量は、２０ｍｇであり、予測される後期用量は４０、８０、１６０および３２０ｍｇである。実際の用量は、ＢＬＲＭに従って修正できるが、以前に試験した用量の２倍を超えることはない。
【０７７９】
パート２Ａ：パート２Ａは、ＯＸ４０.２１とニボルマブとの組合せアームであり、単剤治療での用量漸増において少なくとも３つの用量レベルが耐容されることが見出された後または単剤治療での用量漸増においてＭＴＤが判定された後(パート１Ａ)に開始される。パート２ＡにおけるＯＸ４０.２１の開始用量は、組合せのさらなる安全性を確保するために、パート１Ａで耐容されることが示された用量よりも少なくとも１用量レベル低い。パート２Ａでは、いずれの時点においても、ＯＸ４０.２１の用量が、パート１Ａでの最高耐用量を超えることはない。ニボルマブは、２４０ｍｇの一定用量で投与する。各治療サイクルは、長さが２週間であり、研究薬物は、各サイクルの１日目に開始して、２週間毎に、最大１２サイクル投与される。
【０７８０】
パート３Ａ：パート３Ａは、ＯＸ４０.２１とイピリムマブとの組合せアームであり、単剤治療での用量漸増において少なくとも３つの用量レベルが耐容されることが見出された後または単剤治療での用量漸増においてＭＴＤが判定された後(パート１Ａ)および少なくとも１つの用量コホートがＯＸ４０.２１とニボルマブとの用量漸増パートにおいて耐容されることが見出された後にのみ、開始される。パート３ＡにおけるＯＸ４０.２１の開始用量は、パート１Ａにおいて耐容されることが示された用量よりも少なくとも１用量レベル低い。治療される対象における組合せ用量の安全性をさらに確保するために、パート３Ａでは、いずれの時点においても、ＯＸ４０.２１の用量が、パート１Ａでの最高耐用量を超えることはない。イピリムマブは、１ｍｇ／ｋｇの用量で投与する。各治療サイクルは、長さが３週間である。ＯＸ４０.２１は、１サイクル目の１日目に開始して３週間毎に最大８サイクルまで投与され、イピリムマブは、１サイクル目に開始して４サイクルの間、３週間毎に投与される。最後の４サイクルは、ＯＸ４０.２１のみが投与される。
【０７８１】
用量拡大：
用量拡大コホートにおける治療は、ＭＴＤ／ＲＰ２Ｄが、利用可能な臨床上の安全性(ＤＬＴ、ＤＬＴ期間後に生じる有意なＡＥ)、ＰＫ、ＰＤ、および用量漸増からのモデリングデータ(パート１Ａ、２Ａおよび３Ａ)の全体的な評価に基づいて判定されると、開始される。およそ１１０人の対象を、全ての用量拡大コホートにおいて治療する。
【０７８２】
パート１Ｂは、パート１Ａにおいて判定されたＭＴＤ／ＲＰ２Ｄでの子宮頸癌を有する対象におけるＯＸ４０.２１単剤治療の用量拡大コホートである。ＯＸ４０.２１の投与は、各サイクルの１日目に開始し、２週間毎に最大１２サイクル投与される。およそ１２人の対象を、この拡大コホートにおいて治療する。
【０７８３】
パート２Ｂは、パート２Ａにおいて判定されたＭＴＤ／ＲＰ２ＤでのＣＲＣを有する対象における併用療法(ＯＸ４０.２１とニボルマブ)の用量拡大パートである。ニボルマブは、２４０ｍｇの一定用量で投与する。各治療サイクルは、長さが２週間であり、研究薬物は、各サイクルの１日目に開始して、２週間毎に、最大１２サイクル投与される。およそ３５人の対象を、この拡大コホートにおいて治療する。
【０７８４】
パート２Ｃは、パート２Ａにおいて判定されたＭＴＤ／ＲＰ２ＤでのＢＣを有する対象における併用療法(ＯＸ４０.２１とニボルマブ)の用量拡大パートである。各治療サイクルは、長さが２週間であり、研究薬物は、各サイクルの１日目に開始して、２週間毎に、最大１２サイクル投与される。およそ２７人の対象を、この拡大コホートにおいて治療する。
【０７８５】
パート３Ｂは、パート３Ａにおいて判定されたＭＴＤ／ＲＰ２ＤでのＯＣを有する対象における併用療法(ＯＸ４０.２１とイピリムマブ)の用量拡大パートである。各治療サイクルは、長さが３週間である。イピリムマブは、最初の４サイクル、ＯＸ４０.２１と組み合わせて投与される。次いで、対象は、ＯＸ４０.２１の単独治療をさらに最大４サイクル続け、合計で最大２４週間(８サイクル)の治療となる。ＯＣを有するおよそ３５人の対象を、この拡大コホートにおいて治療する。
【０７８６】
研究期間の概要：
対象は、この研究において最大５つの期間を完了する：以下に記載のように、スクリーニング(最大２８日間)、治療(最大２４週間)、安全性フォローアップ(最低１００日間)、応答フォローアップ、ならびに長期生存フォローアップ(最大で最初の投与からおよそ２年間)。研究訪問の概要を、図４３に示す。
【０７８７】
スクリーニング期間：
スクリーニング期間は、最大２８日間続く。スクリーニング期間は、対象の最初の適格性を確立し、告知に基づく同意書に署名することによって開始する。対象は、双方向自動応答技術(Interactive Response Technology)(ＩＲＴ)を使用して採用する。
【０７８８】
治療期間：
治療期間は、最大２４週間の投与からなる。各治療サイクルの後に、対象を、最大２４週間の治療である次の研究治療サイクルで治療するかの決定を、リスク／ベネフィットおよび腫瘍の評価に基づいて行う。腫瘍評価は、２週間に１回(ｑ２ｗ)の投与計画については８週間毎に行い、３週間に１回(ｑ３ｗ)の投与計画については９週間毎に行う。部分応答(ＰＲ)および完全応答(ＣＲ)の評価を、初回評価の少なくとも４週間後に確認する。腫瘍進行または応答のエンドポイントは、Response Evaluation Criteria In Solid Tumors(RECIST)ｖ１.１を使用して評価する。
【０７８９】
所与のサイクルの終了時に疾患の安定(ＳＤ)、ＰＲまたはＣＲの応答性を有する対象は、次の治療サイクルを継続する。対象は、一般に、次のうちの１つが最初に発生するまで、研究治療を継続することが許容される：１)最大数のサイクルの完了、２)疾患の進行、３)治療によりさらなる利益が得られない可能性が高いことを示唆する臨床的増悪、４)治療に対する不耐容性または５)研究治療の中止基準に合致。
【０７９０】
安全性フォローアップ：
研究治療の完了後に、対象は、安全性フォローアップ期間に入る。治療終了(ＥＯＴ)の来院後に、対象を、最後の治療投与後少なくとも１００日間、全ての新たな有害事象(ＡＥ)に関して評価する。フォローアップの来院は、最後の投与または中止日の後３０日、６０日および１００日に発生する。対象(研究参加の同意を取り下げたものは除く)は、新しい抗癌療法を開始するかどうかにかかわらず、３回の臨床安全性フォローアップ来院を完了する。
【０７９１】
生存フォローアップ：
安全性フォローアップ期間の完了後に、対象は、生存フォローアップ期間に入る。対象を、死亡、フォローアップ消滅、同意の取下げ、または研究の終結のいずれかが最初に発生するまで、およそ３カ月(１２週間)毎に追跡する。この段階の継続期間は、研究薬物の最初の投与後最大２年間である。
【０７９２】
応答性フォローアップ：
安全性フォローアップ期間の完了後に、ＥＯＴ来院の時点で継続したＳＤ、ＰＲまたはＣＲを有する全ての患者は、応答性フォローアップ期間に入り、これは、生存フォローアップ期間と同時に起こる。これらの対象は、応答性フォローアップ期間の間、または疾患進行もしくは研究の同意を取り下げるまで、３カ月(１２週間)毎に放射線学的および臨床的腫瘍評価を受け続ける。継続した臨床的利点を有する対象の放射線学的腫瘍評価は、対象が、研究の生存段階を完了した後も収集が継続される。研究治療の最初の過程の後に疾患進行を有する対象は、ＥＯＴ来院を過ぎた後に応答性について評価されることはなく、必要に応じて他の腫瘍指向性療法を受けることが許容される。
【０７９３】
研究の継続期間：
任意の個々の対象の研究時間の合計継続期間は、およそ２年間である。研究は、最後の対象が最後の研究来院を完了すると終了し、これは、研究の開始後およそ４年である。
【０７９４】
対象の数：
およそ２２５人の対象を採用し、およそ２００人の対象を研究において治療する。
【０７９５】
研究集団：
対象は、少なくとも１８歳であり、ＲＥＣＩＳＴ  ｖ１.１により測定可能な疾患を伴って進行した(転移性、再発性、難治性および／または切除不能な)悪性腫瘍が組織学的または細胞学的に確認されている。
【０７９６】
用量漸増および停止の規定
パート１Ａ、２Ａおよび３Ａでは、ＢＬＲＭおよびＢＬＲＭ(−コピュラ)モデルを、ＤＬＴ情報が対象の各コホートに利用可能となった後に、用量漸増推奨に利用する。次のコホート／用量レベルのＯＸ４０.２１用量選択は、ＢＬＲＭ(−コピュラ)推奨を、臨床推奨ならびに全ての治療対象からの全ての利用可能なＰＫ、ＰＤならびに臨床および研究室での安全性データとともに考慮する。
【０７９７】
用量限定毒性
用量漸増を導くために、ＤＬＴを、他に明らかな原因が特定されていないＡＥの発生、強さおよび持続期間に基づいて定義する。ＤＬＴ期間は、研究薬物の開始２８日間である。対象管理のために、ＤＬＴ基準に合致するＡＥは、発生するサイクルにかかわらず、研究薬物の中止となる。ＤＬＴ評価間隔中に、ＤＬＴではない理由で研究から辞退した対象は、同一の投与レベルで新しい対象と置き換えてもよい。ＤＬＴ評価期間中のＤＬＴの発生は、用量漸増決定において、およびＭＴＤを定義するために使用される。ＤＬＴ期間後に生じたＡＥは、ＡＥが他に明らかな原因がなく、疾患進行に関連していない場合には、ＭＴＤを定義する目的で考慮する。ＤＬＴを経験した対象は、研究薬物での再治療は行わず、研究の安全性フォローアップ期間に入る。ＡＥを、National Cancer Institute(NCI)Common Terminology Criteria for Adverse Events(CTCAE)ｖ４.０３により段階付ける。
【０７９８】
非血液系ＤＬＴ：
Ａ. 肝臓系ＤＬＴ
・ＡＳＴ、ＡＬＴまたは総ビリルビンの上昇でグレード３以上のもの
・ＡＳＴ、ＡＬＴまたは総ビリルビン
・肝臓炎症の兆候(例えば、右上腹部の圧痛、黄疸、掻痒)を伴うグレード２のＡＳＴまたはＡＬＴ
・胆汁うっ滞(血清アルカリホスファターゼ［ＡＬＰ］の上昇)の初期所見(例えば、薬物により誘導される肝臓損傷の可能性またはｐＤＩＬＩに関するＨｙの法則またはＦＤＡの定義と一致する所見)を伴わず、ＡＳＴまたはＡＬＴがＵＬＮの３倍を上回り、同時に総ビリルビンがＵＬＮの２倍を上回る
Ｂ. 非肝臓系ＤＬＴ
・グレード２以上のブドウ膜炎、上強膜炎または虹彩炎
・局所治療に応答せず、２週間以内に重症度がグレード１まで改善されないかまたは全身治療を必要とする、任意の他のグレード２の目の疼痛または視界のぼやけ
・グレード３以上の肺炎、気管支痙攣、神経毒性、過敏反応または輸注反応
・任意のグレード３以上の非皮膚非肝臓毒性は、以下を特定の例外としてＤＬＴと見なす：
・関連する臨床上の有害な経験により悪化せず、７２時間未満持続し、自然に解決するかまたは従来的な医療介入に応答する、グレード３またはグレード４の電解質異常
・７２時間未満持続し、自然に解決するかまたは従来的な医療介入に応答する、グレード３の吐き気、嘔吐または下痢
・膵炎の臨床上または放射線撮影による兆候と関連しない、グレード３または４のアミラーゼまたはリパーゼの上昇
・血液動態の悪化(例えば、低血圧、終末器官の灌流の損傷の臨床上または研究室上の兆候)と関連しない独立したグレード３の発熱
・ホルモン置換によって良好に制御されるグレード３の内分泌疾患
・グレード３の腫瘍フレア(腫瘍が判明しているか疑われる部位に局在する疼痛、刺激または発疹として定義される)
・７日未満のグレード３の疲労感
・６時間未満でグレード１に回復するグレード３の輸注反応
【０７９９】
皮膚系ＤＬＴ
・グレード４の発疹
・輸注を１〜２週間遅らせた後に改善(すなわち、グレード１以下への解消)が見られないグレード３の発疹グレード３の皮膚ＡＥを経験していない対象は、グレード２の皮膚毒性の存在下で治療を再開してもよい。
【０８００】
血液系ＤＬＴ
・持続期間が５日間以上のグレード４の好中球減少症
・グレード４の血小板減少症または臨床的に有意な出血を伴うかもしくは任意の血小板輸注要件を伴うグレード３の血小板減少症
・根底にある疾患によっては説明されないグレード４の貧血
・グレード４の発熱性好中球減少症
・４８時間を上回って持続するグレード３の発熱性好中球減少症
・グレード３以上の溶血(すなわち、輸血またはステロイドなどの医療介入を必要とする)
【０８０１】
２４週間を過ぎた後のさらなるサイクルでの治療
対象は、早期に研究薬物の中止基準に合致しない限り、２４週間治療される。疾患制御(ＣＲ、ＰＲまたはＳＤ)が継続しながらおよそ２４週間の治療を完了した対象は、リスク／ベネフィット評価が研究治療の継続に好ましい場合、最初の２４週間が過ぎた後、単剤治療(パート１)および併用療法(パート２および３)でのさらなる２４週間の研究治療に適格となる。さらなる２４週間の研究治療の完了後に、対象は、安全性フォローアップ期間に入る。
【０８０２】
進行以降の治療
ベネフィット／リスク評価が研究治療の投与の継続に好ましい(例えば、対象は、臨床的利点を経験し、治療に耐容性であり、他の基準を満たし続けている)と判定された後、当初のＲＥＣＩＳＴ  ｖ１.１に定義された疾患進行を有する選択された対象において、進行以降の治療が許容される。
【０８０３】
再治療
疾患進行の確認が応答フォローアップ期間中に生じた場合には、再治療が許容される。およそ２４週間(または、適切な場合にはさらなる治療サイクル)の治療が完了し、いずれの有意な毒性も伴うことなく疾患制御(ＣＲ、ＰＲまたはＳＤ)が継続しながら応答フォローアップ期間に入る対象は、再治療に適格である。このような対象は、評価およびリスク／ベネフィット比がさらなる研究治療の投与を支持するかどうかの判定後に、事例毎の基準に基づいて再治療に適格とされ、対象は、研究治療による治療の適格基準を満たし続ける。再治療の基準を満たす対象は、用量およびスケジュールが後ほどＭＴＤを上回ることがわかった場合を除き、元々割り当てられていた単剤治療または併用療法の計画(例えば、最初の２４週間の間に投与されるものと同一の用量および投与スケジュール)で治療され、ＭＴＤを上回っていた場合には、対象は、耐容／安全と見られる、次に低い用量で治療される。
【０８０４】
組入れ基準
１)告知に基づく同意書への署名
ａ)対象は、ＳＯＣの一部とは見なされない全ての研究関連手順の実施前に、告知に基づく同意に署名しなければならない
ｂ)腫瘍生検サンプルについての同意(治療前および治療中の生検義務は、用量拡大コホート、ならびに以前に完了した用量漸増コホートのいずれかに追加されるさらなる対象では必須であり、用量漸増コホートでは任意である)。
２)標的集団
対象は、少なくとも１８歳であり、ＲＥＣＩＳＴ  ｖ１.１により測定可能な疾患を伴って進行した(転移性、再発性、難治性および／または切除不能な)悪性腫瘍が組織学的または細胞学的に確認されている必要がある。
【０８０５】
Ａ. 用量漸増：
対象は、標準的な治療が存在する場合に、そのような治療計画を少なくとも１回、進行または転移の状況で受けており、その後、進行したか、またはそれに対して難治性または非耐容性となっている必要がある。いずれの標準治療にも不適格である対象は、不適格性が医療記録で文書化されている限り、採用することが許容される。原発性中枢神経系(ＣＮＳ)腫瘍を有するかまたはＣＮＳ転移を活動性疾患の唯一の部位として有する対象を除き、以下の腫瘍組織学が許容される。
(ｉ)黒色腫：ＢＲＡＦ突然変異状態は、判明している場合、文書化されている必要がある。
(ii)ＮＳＣＬＣ：ＥＧＦＲ、ＡＬＫ、ＫＲＡＳおよびＲＯＳ１突然変異状態は、判明している場合、文書化されている必要がある。
(iii)扁平上皮細胞癌腫に限定される頭頸部癌。ＨＰＶの状態は、判明している場合、文書化されている必要がある。
(iv)泌尿生殖器の移行上皮癌腫
(ｖ)腎細胞癌腫
(vi)膵臓腺癌
(vii)ＣＲＣ：ＭＳＩ、ＫＲＡＳおよびＢＲＡＦの状態は、判明している場合、文書化されている必要がある。
(viii)子宮頸癌：ＨＰＶの状態は、判明している場合、文書化されている必要がある。
(ix)トリプルネガティブ乳癌、ＨＥＲ２、ＥＲおよびＰＲの状態は、文書化されている必要がある。
(ｘ)子宮内膜の腺癌
(xi)卵巣癌
(xii)前立腺癌
(xiii)肝細胞癌−チャイルド・ピューＡのみ
(xiv)小細胞肺癌
(xv)胃癌および胃食道連結部の癌：ＨＥＲ２の状態は、判明している場合、文書化されている必要がある。
【０８０６】
Ｂ. 用量拡大：パート１Ｂ、２Ｂ、２Ｃおよび３Ｂ
以下の腫瘍型が許容される：
(ａ)子宮頸癌−パート１Ｂ
(ｉ)疾患進行が文書化されている、切除不能、転移性または再発性である、組織学的に確認された子宮頸癌
(ii)判明している場合、腫瘍ＨＰＶの状態を文書化すること。判明していない場合、対象は、提出保管済みの腫瘍組織サンプル(ブロックまたは未染色スライド)を試験するのを認めることに同意する必要がある。
(iii)治療前の要件：
１. 転移性および／または切除不能な疾患について、少なくとも１回の標準全身治療(例えば、パクリタキセル／シスプラチン、パクリタキセル／シスプラチン／ベバシズマブ)を受けており、その後、進行したか、またはそれに対して難治性もしくは非耐容性となっている必要がある。放射線療法の完了後に行われる一次放射線またはアジュバント化学療法と同時に投与される化学療法は、全身化学療法計画として数えない。
(ｂ)結腸直腸癌−パート２Ｂ
(ｉ)疾患進行が文書化されている、転移性または再発性である、組織学的に確認されたＣＲＣ
(ii)判明している場合、ＭＳＩ、ＭＭＲ、ＫＲＡＳおよびＢＲＡＦの状態を文書化すること。判明していない場合、対象は、提出保管済みの腫瘍組織サンプル(ブロックまたは未染色スライド)を試験するのを認めることに同意する必要がある。
(iii)治療前の要件：
対象は、転移性および／または切除不能な疾患について、少なくとも１回の標準全身治療を受けており、その後、進行したか、またはそれに対して難治性もしくは非耐容性となっている(またはアジュバント療法の６カ月以内に進行した)必要がある。
(ｃ)膀胱癌−パート２Ｃ
(ｉ)組織学的または細胞学的に確認された、進行疾患または難治性疾患を伴う腎盂、尿管、膀胱または尿道の尿路上皮癌腫(尿路上皮癌腫と他のサブタイプの要素との混合組織学を含む)
(ii)治療前の要件：
対象は、転移性(ステージIV)または局所進行性切除不能疾患について、少なくとも１回の標準全身治療(例えば、白金系の化学療法)を受けており、その後、進行したか、またはそれに対して難治性もしくは非耐容性となっている必要がある。
(ｄ)卵巣−パート３Ｂ
(ｉ)疾患進行が文書化されている、組織学的または細胞学的に確認された卵巣癌腫(上皮ＯＣ、原発性腹膜癌腫または卵管癌腫を含む)
(ii)判明している場合、生殖系ＢＲＣＡ突然変異の状態が文書化されていること。判明していない場合、対象は、提出保管済みの腫瘍組織サンプル(ブロックまたは未染色スライド)を試験するのを認めることに同意する必要がある。
(iii)治療前の要件：
対象は、転移性および／または切除不能な疾患について、少なくとも１回の標準全身治療(例えば、白金系の化学療法)を受けており、その後、進行したか、それに対して非耐容性もしくは難治性となっている必要がある。
３)米国東海岸臨床試験グループ(ＥＣＯＧ)のパフォーマンス状態が１以下である。
４)応答評価のためのＲＥＣＩＳＴ  ｖ１.１により定義される、測定可能な疾患に伴う少なくとも１つの病変部の存在。測定可能な疾患の単一の部位として以前に照射された領域に病変部を有する対象は、病変部が明らかな進行を示しており、正確に測定できる限り、許容される。
５)新しい腫瘍生検を必要とする対象については、対象は、応答評価に必要とされる最低１つのＲＥＣＩＳＴ  ｖ１.１測定可能病変部に加えて、治療前および治療中の生検で採取できる少なくとも１つの病変部を有している必要がある。この病変部は、放射線応答について評価されているインデックス病変部とは区別する必要がある。
６)チェックポイント経路阻害を特異的に標的とする任意の薬剤(抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、抗ＬＡＧ−３抗体および抗ＣＴＬＡ−４抗体)での治療に以前に曝露されている対象は、最後の治療から４週間以上の任意の洗浄期間後に、許容される。
【０８０７】
注記：(ｉ)補給により治療される内分泌疾患以外に以前にグレード１〜２のチェックポイント療法関連免疫媒介性ＡＥを経験した対象は、研究へのエントリーの時点で、全ての関連臨床症状、身体検査での異常な所見および／または関連する研究室での異常の解消によって文書化されるこれらの事象からの回復を確認する必要がある。適宜、これらの対象は、研究治療での治療を開始する最低１４日前までに、これらのＡＥの治療のためのステロイドの減量も完了している必要がある。(ii)以前にグレード３以上のチェックポイント療法関連免疫ＡＥを有した対象の適格性は、医療モニターによる考察後に事例毎に考慮される(例えば、膵炎の臨床的または放射線による兆候を伴わない無症状の独立したグレード３のリパーゼ評価は、採用が許容される)。
７)抗ＯＸ４０抗体、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＧＩＴＲ抗体および抗ＣＤ２７を除くＴ細胞共刺激経路を特異的に標的とする任意の薬剤で以前に治療を受けた対象は、最後の治療から４週間を上回る任意の洗浄期間後に、許容される。
８)以前の一時緩和の放射線療法は、研究薬物の最初の投与の少なくとも２週間前に完了している必要がある。研究薬物の最初の投与の４週間以内に一時緩和の放射線療法を必要とし得るベースラインで症状のある腫瘍病変部を有する対象は、採用前に一時緩和の放射線療法を受けておくことが強く勧められる。
９)用量漸増および拡大コホートに採用される対象は、相関研究の実施のために、ブロックまたは最低１５枚の未染色スライド(好ましくは２５枚のスライド)のいずれかで既存のホルマリン固定パラフィン包埋(ＦＦＰＥ)腫瘍組織を取得することに同意する必要がある。保管されているサンプルが利用できない場合、対象は、治療前腫瘍生検に同意する必要がある。保管されている腫瘍サンプルを提供できない対象および治療前腫瘍生検に同意しないまたは採取可能な病変部を有さない対象は、適格ではない。(しかしながら、治療前生検により量または質が不十分な組織が得られた対象は、この基準単独では不適格とはならない。)以前に完了した用量漸増コホートのいずれかに追加される任意のさらなる対象に対しては、義務的な治療前および治療中の生検が必要とされる。
１０)用量拡大に採用される対象または任意の以前に完了した用量漸増コホートに追加される対象は、許容できる臨床上のリスクで、義務的な治療前および治療中の生検を受けることが必要とされる。(ａ)固形腫瘍組織標本は、コア針による切除または切開生検である必要がある。細針生検、サイトスピンを用いた胸水ドレナージまたはパンチ生検は、バイオマーカーの考察に適切とは見なされない。軟組織成分を有さない骨病変部の生検または脱灰した骨腫瘍サンプルもまた、許容されない。(ｂ)生検される病変部は、放射線応答について評価されているインデックス病変部とは区別するべきである。
【０８０８】
１１)対象の適切な器官機能は以下の通り定義される：
(ａ)好中球が１５００／μＬ以上(初回の研究薬物投与から４週間以内は全ての成長因子が安定して存在しない)
(ｂ)血小板が８０×１０３／μＬ以上(最初の研究薬物投与から２週間以内はこのレベルを達成するための輸血は許容されない)
(ｃ)ヘモグロビンが８ｇ／ｄＬ以上(最初の研究薬物投与から２週間以内はこのレベルを達成するための輸血は許容されない)
(ｄ)ＡＬＴおよびＡＳＴが正常上限(ＵＬＮ)の３倍以下
(ｅ)総ビリルビンがＵＬＮの１.５倍以下(正常な直接ビリルビンを有するはずのジルベール症候群を有する対象を除く)
(ｆ)調査者の評価による正常な甲状腺機能またはホルモン補給での安定
(ｇ)アルブミンが２ｍｇ／ｄｌ以上
(ｈ)血清クレアチニンがＵＬＮの１.５倍以下またはクレアチニンクリアランス(ＣｒＣｌ)が４０ｍｌ／分以上(以下のＣｏｃｋｃｒｏｆｔ−Ｇａｕｌｔを使用して測定)：
女性のＣｒＣｌ＝(１４０−年齢)×体重ｋｇ×０.８５
７２×血清クレアチニンｍｇ／ｄＬ
男性のＣｒＣｌ＝(１４０−年齢)×体重ｋｇ×１.００
７２×血清クレアチニンｍｇ／ｄＬ
１２)治療、ＰＫおよびＰＤサンプル採取、ならびに必要とされる研究フォローアップに従う能力
【０８０９】
年齢および生殖の状況
ａ)告知に基づく同意の時点で１８歳以上である男性および女性。
ｂ)妊娠可能な女性(ＷＯＣＢＰ)は、研究薬物の開始前２４時間以内の血清または尿による妊娠検査で陰性である必要がある(最低感度２５ＩＵ／Ｌまたは同等の単位のヒト絨毛性ゴナドトロピン［ｈＣＧ］)。
ｃ)女性は授乳中であってはならない。
ｄ)ＷＯＣＢＰは、研究薬物ＯＸ４０.２１での治療継続期間に加え、研究薬物の５半減期に加えて３０日間、避妊方法についての指示に従うことに同意する必要がある。この継続期間は、パート１および３の対象では１２週間(５０日間に加えて３０日間)となり、またはパート２の対象では２３週間(１３０日間に加えて３０日間［排卵周期の期間］)となり、治療後完了まで合計で最大１６０日間となるはずである。
ｅ)ＷＯＣＢＰとの性交渉がある男性は、研究薬物ＯＸ４０.２１での治療継続期間に加え、研究薬物の５半減期に加えて９０日間、避妊方法についての指示に従うことに同意する必要がある。この継続期間は、パート１および３の対象では２０週間(５０日＋９０日)となり、パート２の対象では３１週間となるはずである(１３０日間完了。加えて、男性対象は、この期間、精子の提供は控える必要がある。
ｆ)無精子の男性は、避妊要件から除外される。継続的に異性との性交渉がないＷＯＣＢＰもまた、避妊要件から除外されるが、依然として妊娠検査は受けるものとする。
【０８１０】
除外基準
１)標的疾患の除外
ａ)ＣＮＳ転移もしくは未治療のＣＮＳ転移が判明しているかもしくはその疑いがあるか、またはＣＮＳが唯一の疾患部位である対象は、除外される。しかしながら、制御されている脳転移を有する対象は、採用が許容される。制御されている脳転移は、放射線および／または外科手術による治療後少なくとも４週間(または介入が臨床的に示されていない場合は４週間の観察の間)、放射線撮影による進行が確認されておらず、少なくとも２週間ステロイドを使用しておらず、新たなまたは進行性の神経学的兆候および症状がないとして定義される。
ｂ)癌性髄膜炎を有する対象
ｃ)卵巣癌について：
ｉ)過去６カ月以内に腸閉塞の病歴を有するか、またはテンコフカテーテルを有する卵巣癌対象は除外される。
ii)これまでの抗癌治療は最大４回まで許容される(すなわち、化学療法、放射線療法、ホルモン療法または免疫療法)。休薬後の同一計画の再開は、１つの計画と見なすことができるが、その間に任意の他の計画が存在する場合は２つの計画として数える。
【０８１１】
２)病歴および共発疾患
ａ)この研究の採用に使用されたものとは異なり、研究のエントリー前２年以内に診断された悪性腫瘍をこれまでに有する対象は、除外される(非黒色腫の皮膚癌、ならびに膀胱癌、結腸癌、子宮頸癌／異形成、黒色腫または乳癌などの上皮内癌は除く)。加えて、２年よりも前に診断された他の二次悪性腫瘍を有し、治癒を目的とした治療を受けており、休止期間中に疾患の兆候がなく、再発のリスクが低いと見られる対象は、適格である。
ｂ)同時介入を必要とする他の活動性悪性腫瘍
ｃ)臓器同種移植の経験
ｄ)これまでの治療：
ｉ)これまでの抗癌治療は許容される(すなわち、化学療法、放射線療法、ホルモン療法または免疫療法)
ii)これまでの抗癌療法および／または外科手術に関連する毒性(脱毛は除く)は、解消されているか、ベースラインもしくはグレード１に戻っているか、または不可逆と見られているかのいずれかである必要がある
iii)細胞傷害性薬剤については、以前の抗癌療法の最後の投与と研究治療の開始との間に少なくとも４週間が経過している必要がある
iv)非細胞傷害性薬剤については、以前の抗癌療法の最後の投与と研究治療の開始との間に少なくとも４週間または５半減期(いずれか短い方)が経過している必要がある。
ｅ)これまでの抗ＯＸ４０抗体での治療
ｆ)活動性、判明している、または疑いのある自己免疫疾患を有する対象は、除外される。白斑症、１型真性糖尿病、ホルモン置換が必要なだけの自己免疫状態に起因する後遺症性(residual)甲状腺機能低下症、グレーブス病の病歴のある甲状腺機能正常対象(自己免疫甲状腺障害の疑いのある対象は、研究薬物の初回投与前に、サイログロブリンおよび甲状腺ペルオキシダーゼ抗体および甲状腺刺激免疫グロブリンに陰性である必要がある)、全身治療を必要としない乾癬、または外部トリガーの不在下において再発が予測されない状態を有する対象は、採用が許容される。十分に制御された喘息および／または軽度なアレルギー性鼻炎(季節性アレルギー)を有する対象は、適格である。
ｇ)標準的な対応策(例えば、副腎クリーゼ後のホルモン置換)により再発する可能性が低いものを除き、これまでの免疫療法(例えば、抗ＣＴＬＡ−４もしくは抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１治療またはＴ細胞共刺激もしくは免疫チェックポイント経路を特異的に標的とする任意の他の抗体もしくは薬物)に関連して生命に関わる毒性の病歴を有する対象
ｈ)症状があるか、または薬物関連の肺毒性の疑いの検出もしくは管理を妨害する可能性のある、間質性肺疾患を有する対象
ｉ)反復的なステロイドバーストまたは１０ｍｇ／日を上回る用量のプレドニゾンまたは同等物での慢性的なステロイドを必要とする慢性閉塞性肺疾患
ｊ)活動性自己免疫疾患の不在下における１日１０ｍｇを上回るプレドニゾン同等物の副腎置換ステロイドの投与を除き、研究薬物の投与から１４日以内にコルチコステロイド(１日１０ｍｇを上回るプレドニゾン同等物)または他の免疫抑制薬での全身治療を必要とする状態を有する対象。注記：研究薬物開始前最大７日までの短期間のステロイドでの治療(５日間未満)は、許容される。
ｋ)それだけには限らないが、以下のうちのいずれかを含む、無制御または重篤な心臓血管疾患：
ｉ)過去６カ月以内の心筋梗塞または卒中／一過的虚血性発作
ii)過去３カ月以内の無制御な狭心症
iii)臨床的に重篤な不整脈(心室性頻拍、心室性細動または多発性心室頻拍など)の任意の病歴
iv)他の臨床的に重篤な心臓疾患(例えば、心筋症、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎの機能的分類III〜IVのうっ血性心不全、心膜炎、有意な心膜液貯留)の病歴
ｖ)心臓血管疾患に関連する毎日の酸素補充療法要件
vi)Ｆｒｉｄｅｒｉｃｉａの式を使用した心拍の補正ＱＴ間隔(ＱＴｃＦ)の延長が４８０ミリ秒を上回る
【０８１２】
ｌ)以下によって証明されるような任意の慢性肝炎の病歴：
ｉ)Ｂ型肝炎表面抗原の試験で陽性
ii)定性的Ｃ型肝炎ウイルス負荷(ＰＣＲによる)の試験で陽性
注記：Ｃ型肝炎の抗体が陽性であり、ＰＣＲによる定量的Ｃ型肝炎が陰性の対象は、適格である。Ａ型肝炎ウイルス感染の解消の病歴は、除外基準ではない。機関ガイドラインに従った感染を除外するためのさらなる試験または代替的な試験が、許容される。
ｍ)研究薬物治療の開始前７日以内に全身的な抗菌療法、抗ウイルス療法または抗真菌療法を必要とする活動性感染の兆候(研究エントリーに必要とされる根底にある腫瘍型と関連することが想定されるウイルス感染には適用されない)
ｎ)ＨＩＶの試験で陽性の履歴が判明しているか、または後天的免疫不全症候群が判明している。
ｏ)最近陽性となったＰＰＤ；感染による浸潤の兆候を伴う胸部ｘ線；最近の説明できない発熱／悪寒パターンの変化を含む、活動性結核または潜伏結核の感染の兆候または病歴
ｐ)研究薬投与の４週間以内の任意の大手術。対象は、研究薬物の最初の投与の少なくとも１４日前に、大手術または重大な外傷の影響から回復している必要がある。
ｑ)研究薬物の前４週間以内の感染性疾患の予防のための生ウイルスを含有する非腫瘍学ワクチンの使用。不活性化季節性インフルエンザワクチン、例えば、Ｆｌｕｚｏｎｅ(登録商標)の使用は、許容される。
ｒ)研究薬物の最初の投与前２週間以内のｐＲＢＣまたは血小板輸注の使用
ｓ)研究薬物の投与が対象にとって危険となり得るか、または対象が研究に従うもしくは研究に耐える能力に有害な影響を及ぼし得る、医療的もしくは精神的状態および／または社会的理由が判明しているか根底にある。
３)アレルギーおよび薬物有害反応
ａ)ニボルマブまたはイピリムマブに対するアレルギーの病歴(それぞれ、パート２および３のみ)
ｂ)これまでの抗癌免疫調節療法(例えば、チェックポイント阻害剤、Ｔ細胞共刺激抗体)に対する任意の重大な薬物アレルギーの病歴(アナフィラキシーまたは肝臓毒性など)
【０８１３】
研究評価：
身体検査、バイタルサイン測定、１２誘導心電図(ＥＣＧ)および臨床研究室評価を、投与間隔全体を通じて選択された時間において行う。対象は、研究を通して、ＡＥに関して緊密にモニタリングされる。
・安全性評価：ＡＥを、研究の間および最後の治療後１００日間、評価する。ＡＥは、ＮＣＩ  ＣＴＣＡＥ  ｖ４.０３に従って評価する。対象は、治療に関連する全てのＡＥがベースラインまで回復するか、または不可逆と見なされるまで、追跡される。
・有効性評価：適宜、ＣＴおよび／またはＭＲＩによる疾患評価を、治療の中止または研究からの辞退まで、ベースライン、ならびにｑ２ｗ投与計画については８週間毎(±１週間)およびｑ３ｗ投与計画については９週間毎(±１週間)で行い、その後、治療および応答フォローアップ段階中は１２週間毎に行う。他の時点における腫瘍評価は、腫瘍進行が懸念される場合に行う。腫瘍応答の評価は、悪性腫瘍を有する対象についてはＲＥＣＩＳＴ  ｖ１.１に従って行う。
・薬物動態および免疫原性の評価：ＰＫおよび免疫原性の評価のためにサンプルを、ＯＸ４０.２１を単独またはニボルマブもしくはイピリムマブと組み合わせて受容した対象から採取する。ＯＸ４０.２１のＰＫを、非コンパートメント解析(ＮＣＡ)法によって特徴付ける。免疫原性サンプルを、有効な免疫アッセイによって、抗ＯＸ４０.２１抗体および／または抗ニボルマブ抗体および／または抗イピリムマブ抗体について分析する。
・試験的バイオマーカー評価：用量およびＰＫと関連してＯＸ４０.２１に対する臨床応答の可能性のある予測マーカーを調べるために、３種類の標本を、バイオマーカー試験のために全ての対象から採取する：(ｉ)全血、(ii)血清／血漿、および(iii)腫瘍組織。
【０８１４】
統計学的考察
サンプルサイズの決定
用量漸増
フェーズ１の用量漸増試験として、各用量漸増コホートのサンプルサイズは、観察された毒性および後続の推論に依存する。およそ３０人の対象を、各用量漸増パート(ＯＸ４０.２１単剤治療［パート１Ａ］、ＯＸ４０.２１とニボルマブとの組合せ［パート２Ａ］およびＯＸ４０.２１とイピリムマブとの組合せ［パート３Ａ］)において、パート１Ａ、２Ａおよび３Ａを合わせて合計約９０人の対象で、治療する。まず、およそ３人の対象を、開始用量レベルのＯＸ４０.２１またはニボルマブもしくはイピリムマブと組み合わせたＯＸ４０.２１で治療する。さらにおよそ３人の評価可能対象のコホートを、用量漸増段階中に、ＢＬＲＭ(−コピュラ)推奨に従った推奨用量レベルで治療する。ＤＬＴの評価が可能な少なくとも６人の対象を、ＭＴＤで治療する。
【０８１５】
用量拡大：
一般的に言うと、拡大段階のサイズ決定は、標的応答率(標的全体応答率)およびケアの標準(これまでの全体応答率)を上回るような臨床応答のシグナルを特定する能力に基づく。
およそ１２人の対象を、パート１Ｂの用量拡大コホートにおいて治療する。およそ３５人の対象を、パート２Ｂの用量拡大コホートにおいて治療する。およそ２７人の対象を、パート２Ｃの用量拡大コホートにおいて治療する。およそ３５人の対象を、パート３Ｂの用量拡大コホートにおいて治療する。
【０８１６】
エンドポイント
一次エンドポイント
安全性の評価は、ＡＥの兆候、重篤なＡＥ、中止につながるＡＥおよび死亡に基づく。加えて、臨床研究室試験での異常を試験する。
【０８１７】
二次エンドポイント
有効性：ＯＸ４０.２１単独およびニボルマブまたはイピリムマブと組み合わせたＯＸ４０.２１の抗腫瘍活性を、ＯＲＲ、応答の持続期間、およびＲＥＣＩＳＴ  ｖ１.１に基づく２４週間での進行なしの生存率(ＰＦＳＲ)によって測定する。上記は、ベースライン、治療期間中はｑ２ｗの投与計画では８週間毎(±１週間)およびｑ３ｗの投与計画では９週間毎(±１週間)、ならびに生存フォローアップ期間中は３カ月毎(１２週間)に発生する腫瘍測定に基づいて判定する。
・最高の全体的な応答率(ＢＯＲ)を、ＲＥＣＩＳＴ  １.１基準に従って評価する。
・ＯＲＲは、ＢＯＲがＣＲまたはＰＲのいずれかである全ての治療対象の比率である。
・ＣＲまたはＰＲのＢＯＲである全ての治療対象について計算される応答の持続期間は、最初の応答の日と、疾患進行または死亡のうち早く生じたもの日との間の期間である。
・２４週でのＰＦＳＲは、進行がないままであり、２４週間生存した治療対象の比率として定義される。この比率は、カプラン・マイヤー法の推定によって計算され、この方法は、中途打切りデータを考慮に入れる。
【０８１８】
薬物動態
Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、ＡＵＣ(０−ｔ)およびＡＵＣ(ＴＡＵ)などの選択されたパラメーターを、単剤治療またはニボルマブもしくはイピリムマブとの組合せのスケジュールに応じて、２回のサイクルで評価する。著しいＰＫが収集された場合には、Ｃｔａｕ、ＣＬＴ、Ｃｓｓ−ａｖｇ、蓄積インデックス(ＡＩ)および有効な排出半減期(Ｔ−ＨＡＬＦｅｆｆ)などのパラメーターを、第２のサイクルで評価する。
【０８１９】
免疫原性
免疫原性の二次目的は、ＯＸ４０.２１またはニボルマブもしくはイピリムマブに対するＡＤＡ陽性の頻度によって評価する。
【０８２０】
試験的エンドポイント
ＯＳと関連する試験的目的は、特定の時点(例えば、２年)でのＯＳ率によって評価する。ＯＳ率は、その時点で生存している対象の比率である。対象のＯＳは、研究薬の最初の投与の日から、何らかの原因による死亡の日までの期間として定義される。バイオマーカーと関連する試験的目的は、末梢血(例えば、それだけには限定されないが、サイトカインおよびケモカインを含む、可溶性因子)または腫瘍組織(例えば、腫瘍浸潤リンパ球)におけるベースラインまたはベースラインレベルのバイオマーカーの測定値からの変化によって評価する。
複数のＥＣＧ測定を有する対象については、以下のパラメーター：ベースラインからのＥＣＧのＱＴ間隔、ＱＴｃ間隔、ＱＲＳ間隔およびＰ−Ｒ間隔の変化を評価してもよい。
【０８２１】
分析
安全性分析：全ての記録されたＡＥを列挙し、器官別大分類、優先用語および治療毎に表にする。バイタルサインおよび臨床試験結果を列挙し、治療毎に要約する。あらゆる有意な身体検査の所見および臨床試験結果もまた注記する。ＥＣＧ読取り値を評価し、異常がある場合は注記する。
【０８２２】
有効性分析：腫瘍測定値の一覧を、対象ならびに各アームにおける研究日および用量レベル毎に提供する。個々の対象のＢＯＲを、ＲＥＣＩＳＴ  １.１に基づいて列挙する。単独またはニボルマブもしくはイピリムマブと組み合わせたＯＸ４０.２１の抗腫瘍活性を説明するために、ＯＲＲを計算する。ＯＲＲおよびＣｌｏｐｐｅｒ−Ｐｅａｒｓｏｎ法による対応する両側９５％ＣＩを、治療および／または用量レベルならびに腫瘍型毎に提供する。中央値の応答の持続期間および対応する両側９５％ＣＩを、治療および／または用量レベルならびに腫瘍型毎に報告する。応答の持続期間を、カプラン・マイヤー法を使用して分析する。加えて、ＰＦＳＲ、２４週間まで進行なしのままであるかまたは生存している対象の確率を、カプラン・マイヤー法により、治療、腫瘍型および用量レベル毎に推定する。対応する９５％ＣＩは、グリーンウッドの式に基づいて導出する。ＯＳを、カプラン・マイヤー法を使用してプロットする。中央値ＯＳおよび対応する両側９５％ＣＩを報告する。
【０８２３】
薬物動態分析：全ての個々のＰＫパラメーターを、要約からのあらゆる除外および除外の理由を含め、各検体について列挙する。要約統計量を、各ＰＫパラメーターについて、治療毎に表にする。Ｃｍａｘ、ＡＵＣ(０−ｔ)、ＡＵＣ(ＴＡＵ)、Ｃｔａｕ、ＣＬＴ、ＣｓｓａｖｇおよびＡＩの幾何平均および変動係数を示す。Ｔｍａｘの中央値および範囲を示す。全ての他のＰＫパラメーター(例えば、Ｔ−ＨＡＬＦｅｆｆ)の平均および標準偏差を示す。
【０８２４】
ＯＸ４０.２１の用量依存性を、用量漸増単剤治療において評価する。ＯＸ４０.２１の用量に対する依存性を説明するために、用量に対するＣｍａｘ、ＡＵＣ(０−ｔ)、およびＡＵＣ(ＴＡＵ)の散布図を、各測定日で提供する。出力モデルおよび出力係数付近のＣＩに基づく用量比例性の試験的評価を行う。ニボルマブおよびイピリムマブの注入後およびトラフ(Ｃｔｒｏｕｇｈ)濃度ならびにＯＸ４０.２１のトラフ濃度を、要約統計量を使用して治療および研究日数毎に表にする。これらのデータは、集団ＰＫ分析のために他のデータセットとともに保管してもよい。
【０８２５】
免疫原性分析：全ての利用可能な免疫原性データを、治療、用量および免疫原性状態毎に提供する。ＯＸ４０.２１、ニボルマブおよびイピリムマブのＡＤＡ評価が陽性の対象の頻度を判定する。
【０８２６】
試験的バイオマーカー分析：バイオマーカーおよびそれらの対応するベースラインからの変化の統計的要約(または変化パーセント)を、各アームにおいて、計画された研究日および用量毎に表にする。バイオマーカー測定の時間過程を、グラフで表す。経時的に有意義なパターンが示された場合は、さらなる分析(例えば、線形混合モデルによる)を行って、関係性を特徴付ける。それだけには限定されないが、ロジスティック回帰分析などを使用して末梢血または腫瘍生検からのバイオマーカー測定値と臨床予後との間の可能性のある関連性を調べる。
【０８２７】
【表２６】
0006797137.tif 000035
【表２７】
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【０８２８】
【表２８】
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【表２９】
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【０８２９】
【表３０】
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【表３１】
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【０８３０】
【表３２】
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【表３３】
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【０８３１】
【表３４】
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【表３５】
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【０８３２】
【表３６】
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【表３７】
0006797137.tif 000046
【０８３３】
【表３８】
0006797137.tif 000047
【表３９】
0006797137.tif 000048
【０８３４】
【表４０】
0006797137.tif 000049
【表４１】
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【０８３５】
【表４２】
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【表４３】
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【０８３６】
【表４４】
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【表４５】
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【０８３７】
【表４６】
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【表４７】
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【０８３８】
【表４８】
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【表４９】
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【０８３９】
【表５０】
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【表５１】
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【０８４０】
【表５２】
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【表５３】
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【０８４１】
【表５４】
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【表５５】
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【０８４２】
【表５６】
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【表５７】
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【０８４３】
【表５８】
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【表５９】
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【０８４４】
【表６０】
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【表６１】
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【０８４５】
【表６２】
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【表６３】
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【０８４６】
表２３は、成熟可変領域ならびに重鎖および軽鎖の配列を提供し、表示がある場合は、シグナルペプチドを有する配列を提供する。
【０８４７】
等価物：
当業者ならば、本明細書において開示される具体的な実施形態の多くの等価物を認識するであろうし、または単に慣例的な実験を使用すれば確かめることができる。このような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されるものとする。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ−１】
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【図１０Ａ−２】
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【図１０Ａ−３】
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【図１０Ｂ−１】
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【図１０Ｂ−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図１９−４】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２１−１】
0006797137.tif 000121
【図２１−２】
0006797137.tif 000122
【図２２−１】
0006797137.tif 000123
【図２２−２】
0006797137.tif 000124
【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２３Ｆ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２８−３】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
0006797137.tif 000140
【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３４−１】
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【図３４−２】
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【図３５−１】
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【図３５−２】
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【図３６−１】
0006797137.tif 000150
【図３６−２】
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【図３６−３】
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【図３７−１】
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【図３７−２】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【配列表】
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