(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
末梢血液単核球の培養０日目に、末梢血液単核球をＩＦＮ−γとウイルス抗原ペプチド混合物とで処理する段階と、
培養４日目に、前記末梢血液単核球をＩＬ−２で処理する段階と、を含み、
前記末梢血液単核球を抗ＣＤ３（ａｎｔｉ−ＣＤ３）抗体で処理しないことを特徴とする、
二重活性Ｔ細胞の誘導および増殖方法。
【請求項２】
末梢血液単核球は、正常人または患者から得たものである、請求項１に記載の二重活性Ｔ細胞の誘導および増殖方法。
【請求項３】
ＩＦＮ−γは、５００Ｕ／ｍＬ〜１，０００Ｕ／ｍＬの濃度で使用される、請求項１に記載の二重活性Ｔ細胞の誘導および増殖方法。
【請求項４】
ＩＬ−２は、２００Ｕ／ｍＬ〜１，０００Ｕ／ｍＬの濃度で使用される、請求項１に記載の二重活性Ｔ細胞の誘導および増殖方法。
【請求項５】
二重活性Ｔ細胞の誘導および増殖は、合計２０日間以上行われる、請求項１に記載の二重活性Ｔ細胞の誘導および増殖方法。
【請求項６】
二重活性Ｔ細胞の誘導および増殖は、合計２１日間行われる、請求項５に記載の二重活性Ｔ細胞の誘導および増殖方法。
【請求項７】
ウイルス抗原は、サイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ，ＣＭＶ）、エプスタイン・バール・ウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ，ＥＢＶ）、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ，ＡＤＶ）およびＢＫウイルス（ＢＫ  ｖｉｒｕｓ，ＢＫＶ）よりなる群から選択されたものの抗原である、請求項１に記載の二重活性Ｔ細胞の誘導および増殖方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法を含む、ウイルス媒介疾患の予防および治療での使用のための、二重活性Ｔ細胞を含む医薬組成物の製造方法。
【請求項９】
ウイルス媒介疾患は、バーキットリンパ（Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、移植後リンパ増殖性疾患（Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ，ＰＴＬＤ）、ホジキンリンパ腫（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫（ＮＫ／Ｔ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（Ｄｉｆｆｕｓｅ  ｌａｒｇｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ，ＤＬＢＣＬ）、原発性滲出性リンパ腫（Ｐｒｉｍａｒｙ  ｅｆｆｕｓｉｏｎ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、肺炎（Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、網膜炎（Ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ）、腸炎（Ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ）、骨髄抑制（ｍｙｅｌｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）、膀胱炎（Ｃｙｓｔｉｔｉｓ）、肺炎（Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、肝炎（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）、腎機能障害（Ｒｅｎａｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）および出血性膀胱炎（Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｃｙｓｔｉｔｉｓ）よりなる群から選択された一つ以上である、請求項８に記載の医薬組成物の製造方法。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか一項に記載の方法において使用するための、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびウイルス抗原のペプチド混合物を含む二重活性Ｔ細胞製造用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス抗原特異的Ｔ細胞の誘導および増殖方法ならびにこれを含むウイルス媒介疾患の予防および治療用医薬組成物に関する。本発明を支援した国家研究開発事業は、韓国保健福祉部の先導型特性化研究開発事業であって、研究課題番号ＨＩ１４Ｃ３４１７、低分子遊離基除去剤基盤免疫および非免疫組織損傷治療のための新薬開発であり、主管機関であるカトリック大学校産学協力団が支援した。
【背景技術】
【０００２】
サイトカイン誘導キラー細胞（ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ，ＣＩＫ  ｃｅｌｌ）は、Ｔ細胞マーカーであるＣＤ３と自然キラー細胞（ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ，ＮＫ  ｃｅｌｌ）マーカーであるＣＤ５６分子を同時に発現する免疫細胞である。サイトカイン誘導キラー細胞（以下、ＣＩＫ細胞という）は、Ｔ細胞に由来し、ＮＫ細胞の特徴および機能を共に有するので、主要組織適合複合体（Ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ，ＭＨＣ）と関係なく腫瘍細胞を死滅する。ＣＩＫ細胞は、細胞表面のＮＫＧ２Ｄ受容体と腫瘍細胞で発現するＮＫＧ２Ｄ配位子の結合を利用して細胞死滅を誘導して、細胞毒性Ｔリンパ球（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，ＣＴＬｓ）のような一般的なＴ細胞の致死過程とは異なって、樹枝状細胞の抗原を提示することなく可能である。したがって、ＣＩＫ細胞の体外増幅および培養方法は、他の抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ，ＡＰＣ）と共培養を必要とせず、サイトカインの刺激だけでも確保することができ、生産過程が容易である。また、ＭＨＣと関係なく作用するので、多様な種類の癌細胞を除去することができると知られていて、広範囲に適用可能である。国内外で既にリンパ腫、すい臓癌、肝細胞癌、骨髄種、腎細胞癌、非小細胞肺癌、胃癌および進行性すい臓癌などに臨床試験中であるか、試験完了したものと知られている。他方、ＣＴＬｓは、ＡＰＣの生産および遺伝子変形過程が必須なので、生産過程が複雑であるが、ＭＨＣに依存的な方法で腫瘍に特異的反応を誘導するので、ＣＩＫ細胞と比較した時、抗腫瘍効能が非常に高い。また、ＣＴＬｓは、ＣＩＫ細胞と比較して生産コストが高く、遺伝子変形およびウイルスの使用に起因して安全性および安定性が比較的低い短所がある。
【０００３】
本発明者らは、Ｔ細胞活性化過程で適切な抗原提示と活性化信号を伝達すると、ＣＩＫ細胞のように非特異的ＮＫ細胞の機能だけでなく、ＭＨＣ依存的な抗原特異的ＣＴＬの機能も同時に付与できるという新しい仮設を立てた。
【０００４】
本発明では、Ｔ細胞の活性化過程でウイルス抗原ペプチドを処理して二重活性Ｔ細胞を誘導した。その結果、既存のＣＩＫ細胞の生産方法に比べて最終細胞生産物でウイルス抗原に特異的Ｔ細胞が測定されたことを確認した。また、既存のＣＩＫ細胞よりＭＨＣ−非依存的な抗腫瘍効果が向上したことを確認した。本発明の発明者らは、このような新しい結果に基づいてＭＨＣ非依存的な抗腫瘍効果だけでなく、ＭＨＣ依存的な抗ウイルス性Ｔ細胞機能を追加して、独創的な免疫細胞治療剤の開発に寄与しようとする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、末梢血液単核球の培養時に標的ウイルスの抗原ペプチド混合物を処理してＴ細胞を生産することにより、ウイルス抗原特異的Ｔ細胞を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記課題を解決するための手段として、本発明は、末梢血液単核球の培養時にＩＦＮ−γおよびウイルス抗原ペプチド混合物を処理する段階と、ＩＬ−２を処理する段階とを含むウイルス抗原特異的二重活性Ｔ細胞（ｄｕａｌ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ）の誘導および増殖方法を提供する。
【０００７】
前記課題を解決するための他の手段として、本発明は、前記二重活性Ｔ細胞の誘導および増殖方法による二重活性Ｔ細胞を含むウイルス媒介疾患の予防および治療用医薬組成物を提供する。
【０００８】
前記課題を解決するためのさらに他の手段として、本発明は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびウイルス抗原のペプチド混合物を含むウイルス抗原特異的二重活性Ｔ細胞製造用キットを提供する。
【０００９】
また、前記課題を解決するための手段として、本発明は、末梢血液単核球の培養時にＩＦＮ−γおよびウイルス抗原ペプチド混合物を処理する段階と、ａｎｔｉ−ＣＤ３およびＩＬ−２を処理する段階とを含むウイルス抗原特異的サイトカイン誘導キラー細胞（ＣＩＫ  ｃｅｌｌ）の誘導および増殖方法を提供する。
【００１０】
前記課題を解決するための他の手段として、本発明は、前記サイトカイン誘導キラー細胞の誘導および増殖方法によるサイトカイン誘導キラー細胞（ＣＩＫ）細胞を含むウイルス媒介疾患の予防および治療用医薬組成物を提供する。
【００１１】
前記課題を解決するためのさらに他の手段として、本発明は、ＩＦＮ−γ、ａｎｔｉ−ＣＤ３、ＩＬ−２およびウイルス抗原のペプチド混合物を含むウイルス抗原特異的サイトカイン誘導キラー細胞製造用キットを提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、標的ウイルス抗原に特異的二重活性Ｔ細胞およびＣＩＫ細胞の誘導および増殖方法に関し、末梢血液から分離した単核球を、サイトカインとウイルス抗原ペプチド混合物を共に処理して培養することにより、標的ウイルス抗原に特異的二重活性Ｔ細胞およびＣＩＫ細胞を生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ＣＭＶ抗原に特異的ＣＩＫ細胞の培養過程を示す図である。
【図２】図２は、フローサイトメトリーを利用してＣＭＶ抗原に特異的二重活性Ｔ細胞数を測定した結果を示す図である。
【図３】図３は、ＣＭＶ抗原に特異的二重活性Ｔ細胞をペンタマー分析（ｐｅｎｔａｍｅｒ  ａｓｓａｙ）を用いて測定した結果を示す図である。
【図４】図４は、２１日間培養した後、二重活性Ｔ細胞の表現型を比較した結果を示す図である。
【図５】図５は、二重活性Ｔ細胞とＣＩＫ細胞をＣＭＶ抗原ペプチドで刺激した後、これによるＩＦＮ−γ分泌量を測定した結果である。
【図６】図６は、腫瘍細胞に対する二重活性Ｔ細胞の致死効果を示す結果である。
【図７】図７は、フローサイトメトリーを利用してＣＭＶ抗原に特異的ＣＩＫ細胞数を測定した結果を示す図である。
【図８】図８は、２１日間培養した後、ＣＩＫ細胞の表現型を比較した結果を示す図である。
【図９】図９は、ＣＭＶ抗原に特異的ＣＩＫ細胞をペンタマー分析を用いて測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の構成を具体的に説明する。
【００１５】
本発明は、末梢血液単核球の培養時にＩＦＮ−γおよびウイルス抗原ペプチド混合物を処理する段階と、ＩＬ−２を処理する段階とを含むウイルス抗原特異的二重活性Ｔ細胞の誘導および増殖方法を提供する。
【００１６】
本発明において用語「ウイルス抗原特異的二重活性Ｔ細胞」は、Ｔ細胞の培養時にウイルス抗原ペプチド混合物を処理して、標的ウイルスの抗原に特異的特徴を示すようにするＴ細胞であって、ＭＨＣ非依存的な抗腫瘍効果とＭＨＣ依存的な抗ウイルス性Ｔ細胞の機能を全部示すＴ細胞を意味する。本発明による二重活性Ｔ細胞は、ＣＤ３＋Ｔ細胞とＣＤ３＋ＣＤ５６＋ＮＫＴ細胞が存在するが、前記ＣＤ３＋Ｔ細胞のうちウイルス抗原に特異的Ｔ細胞が高い割合で含有されている。したがって、本発明による二重活性Ｔ細胞は、このような一般的なＴ細胞の機能に標的ウイルス抗原に特異的特徴を追加に有していて、ウイルス媒介疾患の予防または治療効果を示すことができる。
【００１７】
本発明において用語「末梢血液単核球（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌ，ＰＢＭＣ）」、「ＰＢＭＣ」または「単核球」は、抗癌免疫治療のために通常使用される末梢血液から分離した単核球を意味する。末梢血液単核球は、採血したヒトの血液をフィコール・ハイパック密度勾配分離法（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ）のような公知の方法を使用して収得することができる。
【００１８】
本発明の一具体例で、末梢血液単核球は、正常人または患者から得たものであってもよい。本発明において使用される末梢血液単核球は、必ず自己由来である必要はなく、同種由来の末梢血液単核球であれば、本発明によるウイルス抗原特異的二重活性Ｔ細胞の誘導および増殖のために使用することができる。
【００１９】
本発明による二重活性Ｔ細胞は、末梢血液単核球の培養時にサイトカインおよびウイルス抗原ペプチド混合物が処理されて誘導および増殖される。
【００２０】
本発明において「ウイルス抗原」は、二重活性Ｔ細胞を移植して治療しようとする目的対象の疾患を誘発するウイルスの膜タンパク質のような抗原タンパク質またはその一部であるペプチドを意味する。例えば、サイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ，ＣＭＶ）、エプスタイン・バール・ウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ，ＥＢＶ）、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ，ＡＤＶ）、ＢＫウイルス（ＢＫＶ）等のヒト潜伏ウィルス（ｈｕｍａｎ  ｌａｔｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）の抗原であってもよい。
【００２１】
本発明において「ペプチド混合物」のペプチドは、抗原として機能するウイルスタンパク質を構成し、長さは、アミノ酸１０〜２０個のペプチドを意味する。したがって、「ペプチド混合物」は、前記ペプチドの混合物を意味する。
【００２２】
本発明において末梢血液単核球の培養時にＩＦＮ−γおよびウイルス抗原ペプチド混合物を処理する段階は、ヒトの末梢血液から単核球を分離する段階をさらに含んでいてもよい。
【００２３】
これに制限されるものではないが、前記末梢血液単核球の培養時にＩＦＮ−γおよびウイルス抗原ペプチド混合物を処理する段階は、培養０日目に行われてもよい。
【００２４】
本発明において前記ＩＬ−２を処理する段階は、培養４日目に行われてもよい。前記サイトカインの処理時期、特定温度などの具体的な培養条件は、ウイルス抗原の種類によって変わることができる。
【００２５】
本発明において「サイトカイン」は、末梢血液単核球をサイトカイン由来キラー細胞に誘導するのに使用可能な免疫活性化サイトカインを意味する。本発明においてこのようなサイトカインとしては、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γを使用する。
【００２６】
前記ＩＦＮ−γの濃度は、５００Ｕ／ｍＬ〜１，０００Ｕ／ｍＬ、例えば８００Ｕ／ｍＬ〜１０００Ｕ／ｍＬの濃度で使用でき、前記ＩＬ−２の濃度は、２００Ｕ／ｍＬ〜１，０００Ｕ／ｍＬ、例えば２００Ｕ／ｍＬ〜８００Ｕ／ｍＬの濃度で使用できる。
【００２７】
本発明によって末梢血液単核球にサイトカインと標的ウイルス抗原に対するペプチドを処理して培養すると、標的ウイルスに特異的二重活性Ｔ細胞を得ることができる。このように得た二重活性Ｔ細胞は、ウイルス媒介疾患または癌の治療のために処置することができる。
【００２８】
前記ウイルス媒介疾患は、ウイルス感染による疾患またはウイルス誘発性癌を含むことができる。前記ウイルス感染による疾患は、例えば、組織適合抗原（ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ  ａｎｔｉｇｅｎ，ＨＬＡ）が不一致な場合、移植片の操作で免疫システムが損傷した免疫欠乏移植患者に現れる疾患であって、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）、ＢＫウイルス（ＢＫＶ）等のヒト潜伏ウィルスにより媒介される疾患を含むことができる。前記ウイルス誘発性癌は、例えば、ＥＢＶによるバーキットリンパ（Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、移植後リンパ増殖性疾患（Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ，ＰＴＬＤ）、ホジキンリンパ腫（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫（ＮＫ／Ｔ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（Ｄｉｆｆｕｓｅ  ｌａｒｇｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ，ＤＬＢＣＬ）、原発性滲出性リンパ腫（Ｐｒｉｍａｒｙ  ｅｆｆｕｓｉｏｎ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）などを含むことができるが、これに制限されるものではない。
【００２９】
本発明において、末梢血液単核球の培養時に使用可能な培地は、末梢血液単核球のＴ細胞への誘導および増殖に使用している通常の培地を制限なしに使用することができる。このような培地としては、例えば、ＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ、ｘ−ｖｉｖｏ１０、ｘ−ｖｉｖｏ２０、ｃｅｌｌｇｒｏ  ＳＣＧＭなどの培地を使用することができる。その他温度などの培養条件は、通常の末梢血液単核球の培養条件による。
【００３０】
本発明による抗原特異的末梢血液単核球由来二重活性Ｔ細胞の誘導および増殖は、１０日〜３０日、例えば１０日〜２５日、１２日〜２５日、１２日〜２１日、１５日〜２１日、１８日〜２１日、２０日〜２１日間行われてもよい。
【００３１】
一具体例で、ＣＭＶ抗原に特異的二重活性Ｔ細胞の培養時に培養０日目にＩＦＮ−γとペプチド混合物を処理し、培養４日目にＩＬ−２を処理し、その後、２１日になるまで２〜３日ごとにＩＬ−２を処理する方法を含むことができる。
【００３２】
また、本発明は、前記方法によって得られた抗原特異的二重活性Ｔ細胞を含む医薬組成物を提供する。
【００３３】
下記実施例では、単核球にペプチド混合物と共にＩＬ−２の存在下で培養した群（実施例）、単核球をペプチド混合物なしにＩＬ−２の存在下で培養した群（比較例）に対して各群でＣＭＶのｐｐ６５抗原に特異的Ｔ細胞を測定した。その結果、ペプチド混合物を処理した実験群のみにおいてＣＭＶのｐｐ６５抗原に特異的Ｔ細胞が増幅されたことを確認した（図２）。
【００３４】
したがって、本発明の方法によって得られたウイルス抗原に特異的二重活性Ｔ細胞は、ウイルス媒介疾患の予防および治療のための用途に有用に使用できる。
【００３５】
具体的に、前記ウイルス媒介疾患は、ＥＢＶによる疾患としては、移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、原発性滲出性リンパ腫等が含まれ得、ＣＭＶによる疾患としては、肺炎（Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、網膜炎（Ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ）、腸炎（Ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ）、骨髄抑制（ｍｙｅｌｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）等が含まれ得、ＡＤＶによる疾患としては、 膀胱炎（Ｃｙｓｔｉｔｉｓ）、肺炎（Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、肝炎（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）等が含まれ得、ＢＫＶによる疾患としては、 腎機能障害（Ｒｅｎａｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）、出血性膀胱炎（Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｃｙｓｔｉｔｉｓ）等が含まれ得るが、これに制限されるものではない。
【００３６】
本発明において、対象体は、ウイルス媒介疾患の予防および／または治療を必要とするヒトであってもよい。対象体には、患者または正常人も含まれる。
【００３７】
本発明による二重活性Ｔ細胞を含む医薬組成物は、必要に応じて適切な成分を含有する水溶液（例えば、リン酸塩緩衝液、通常の注射剤用水溶液など）に適切な濃度で二重活性Ｔ細胞が懸濁されている形態で製剤化され得る。
【００３８】
本発明による医薬組成物は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、胸骨内などの経路を介して通常の方式で投与することができる。
【００３９】
本発明の医薬組成物に含まれる二重活性Ｔ細胞の有効量は、ウイルス媒介疾患の予防または治療効果を達成するのに要求される量を意味する。したがって、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含有された他の成分の種類および含量、および患者の年齢、体重、一般健康状態、性別および食餌、投与時間、投与経路、治療期間、同時に使用される薬物を含めた多様な因子によって調節され得る。これに制限されるものではないが、例えば、成人の場合、１日１回〜数回投与時、本発明のＣＩＫ細胞は、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇ〜１×１０１１ｃｅｌｌｓ／ｋｇ、例えば１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇ〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｋｇの用量で投与することができる。
【００４０】
これより、本発明は、前記ウイルス抗原二重活性Ｔ細胞を、これを必要とする対象体に投与することを含むウイルス媒介疾患の治療方法を提供する。
【００４１】
また、本発明は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびウイルス抗原のペプチド混合物を含むウイルス抗原特異的二重活性Ｔ細胞製造用キットを提供する。
【００４２】
本発明によれば、高価の装備や高価の多様なサイトカインを使用しないながらも、少ない量の末梢血液単核球から多量の二重活性Ｔ細胞を誘導および増殖させることができるので、二重活性Ｔ細胞を利用したウイルス媒介疾患の予防および治療の効率および効能を画期的に増進させることができる。
【００４３】
また、本発明は、末梢血液単核球の培養時にＩＦＮ−γおよびウイルス抗原ペプチド混合物を処理する段階と、ａｎｔｉ−ＣＤ３およびＩＬ−２を処理する段階とを含むウイルス抗原特異的サイトカイン誘導キラー細胞（ＣＩＫ  ｃｅｌｌ）の誘導および増殖方法を提供する。
【００４４】
前記ＣＩＫ細胞の誘導および増殖方法において、末梢血液単核球、ウイルス抗原、ペプチド混合物、サイトカイン、サイトカインの濃度および末梢血液単核球の培養培地は、二重活性Ｔ細胞の誘導および増殖方法にて記述したすべての内容を適用または準用することができる。
【００４５】
本発明において用語「ウイルス抗原特異的サイトカイン誘導キラー細胞」は、上記で記述した二重活性Ｔ細胞の誘導および増殖時にＩＦＮ−γ、ウイルス抗原ペプチド混合物、ＩＬ−２とともにａｎｔｉ−ＣＤ３を追加に処理して得た細胞を意味する。
【００４６】
本発明において、これに制限されるものではないが、前記末梢血液単核球の培養時にＩＦＮ−γおよびウイルス抗原ペプチド混合物を処理する段階は、培養０日目に行われてもよい。
【００４７】
本発明においてａｎｔｉ−ＣＤ３およびＩＬ−２を処理する段階は、培養１日目に行われてもよい。前記サイトカインおよびａｎｔｉ−ＣＤ３の処理時期、温度などの具体的な培養条件は、ウイルス抗原の種類によって変わることができる。
【００４８】
前記ＩＦＮ−γの濃度は、５００Ｕ／ｍＬ〜１，０００Ｕ／ｍＬ、例えば８００Ｕ／ｍＬ〜１，０００Ｕ／ｍＬの濃度で使用でき、前記ＩＬ−２の濃度は、２００Ｕ／ｍＬ〜１，０００Ｕ／ｍＬ、例えば２００Ｕ／ｍＬ〜８００Ｕ／ｍＬの濃度で使用できる。
【００４９】
本発明において「Ａｎｔｉ−ＣＤ３」は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と会合して抗原認識複合体を形成する分子群であるＣＤ３抗原に特異的に反応するタンパク質を意味し、前記ＣＤ３分子は、ＴＣＲと比較して細胞内領域が長く、抗原認識信号を細胞内に伝達する役割を担当している。
【００５０】
前記ａｎｔｉ−ＣＤ３は、３０ｎｇ／ｍＬ〜１５０ｎｇ／ｍＬの濃度で、例えば５０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用できる。
【００５１】
本発明によって末梢血液単核球にサイトカインと標的ウイルス抗原に対するペプチドを処理して培養すると、標的ウイルスに特異的ＣＩＫ細胞を得ることができる。このように得たＣＩＫ細胞は、ウイルス媒介疾患または癌の治療のために処置することができる。      
【００５２】
前記ウイルス媒介疾患は、ウイルス感染による疾患またはウイルス誘発性癌を含むことができる。前記ウイルス感染による疾患は、組織適合抗原（ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ  ａｎｔｉｇｅｎ，ＨＬＡ）が不一致である場合、移植片の操作で免疫システムが損傷した免疫欠乏移植患者に現れる疾患であって、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）、ＢＫウイルス（ＢＫＶ）等のヒト潜伏ウィルスにより媒介される疾患を含むことができる。前記ウイルス誘発性癌は、例えば、ＥＢＶによるバーキットリンパ、移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、ホジキンリンパ腫、ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、原発性滲出性リンパ腫などを含むことができるが、これらに制限されるものではない。
【００５３】
本発明によるウイルス抗原特異的ＣＩＫ細胞の誘導および増殖は、１０〜３０日、例えば１０日〜２５日、１２日〜２５日、１２日〜２１日、１５日〜２１日、１８日〜２１日、２０日〜２１日間行われてもよい。
【００５４】
一具体例で、ＣＭＶ抗原に特異的ＣＩＫ細胞の培養時に培養０日目にＩＦＮ−γとペプチド混合物を処理し、培養１日目にａｎｔｉ−ＣＤ３とＩＬ−２を処理し、その後、２１日になるまで２〜３日ごとにＩＬ−２を処理する方法を含むことができる。前記ＣＩＫ細胞の全体的な培養過程を図１に示す。
【００５５】
また、本発明は、前記方法によって得られたウイルス抗原特異的ＣＩＫ細胞を含む医薬組成物を提供する。
【００５６】
本発明の一実施例では、単核球にペプチド混合物と共にＩＬ−２の存在下で培養した群（実施例）、単核球をペプチド混合物なしにＩＬ−２の存在下で培養した群（比較例）に対して各群でＣＭＶのｐｐ６５抗原に特異的Ｔ細胞を測定した。その結果、ペプチド混合物を処理した実験群のみにおいてＣＭＶのｐｐ６５抗原に特異的Ｔ細胞が増幅されたことを確認することができた（図７）。
【００５７】
したがって、本発明の方法によって得られたウイルス抗原に特異的ＣＩＫ細胞はウイルス媒介疾患の予防および治療のための用途に有用に使用できる。
【００５８】
具体的に、前記ウイルス媒介疾患は、ＥＢＶによる疾患としては、移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、原発性滲出性リンパ腫などが含まれ得、ＣＭＶによる疾患としては、肺炎、網膜炎、腸炎、骨髄抑制などが含まれ得、ＡＤＶによる疾患としては、膀胱炎、肺炎、肝炎等が含まれ得、ＢＫＶによる疾患としては、腎機能障害、出血性膀胱炎などが含まれることがあるが、これらに制限されるものではない。
【００５９】
本発明において、対象体は、ウイルス媒介疾患の予防および／または治療を必要とするヒトであってもよい。対象体には、患者または正常人も含まれる。
【００６０】
本発明によるＣＩＫ細胞を含む医薬組成物は、必要に応じて適切な成分を含有する水溶液（例えば、リン酸塩緩衝液、通常の注射剤用水溶液など）に適切な濃度でＣＩＫ細胞が懸濁されている形態で製剤化され得る。
【００６１】
本発明による医薬組成物は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、胸骨内などの経路を介して通常の方式で投与することができる。
【００６２】
本発明の医薬組成物に含まれるＣＩＫ細胞の有効量は、ウイルス媒介疾患の予防または治療効果を達成するのに要求される量を意味する。したがって、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含有された他の成分の種類および含量、および患者の年齢、体重、一般健康状態、性別および食餌、投与時間、投与経路、治療期間、同時に使用される薬物を含めた多様な因子によって調節され得る。これらに制限されるものではないが、例えば、成人の場合、１日１回〜数回投与時、本発明のＣＩＫ細胞は、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇ〜１×１０１１ｃｅｌｌｓ／ｋｇ、例えば１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇ〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｋｇの用量で投与することができる。
【００６３】
これより、本発明は、前記ウイルス抗原ＣＩＫ細胞を、これを必要とする対象体に投与することを含むウイルス媒介疾患の治療方法を提供する。
【００６４】
また、本発明は、ＩＦＮ−γ、ａｎｔｉ−ＣＤ３、ＩＬ−２およびウイルス抗原のペプチド混合物を含むウイルス抗原特異的サイトカイン誘導キラー細胞（ＣＩＫ細胞）製造用キットを提供する。
【００６５】
本発明によれば、高価の装備や高価の多様なサイトカインを使用しないながらも、少ない量の末梢血液単核球から多量のＣＩＫ細胞を誘導および増殖させることができるので、ＣＩＫ細胞を利用したウイルス媒介疾患の予防および治療の効率および効能を画期的に増進させることができる。
【００６６】
本発明の利点および特徴、そしてそれらを達成する方法は、詳細に後述されている実施例を参照すると明確になる。しかし、本発明は、以下で開示される実施例に限定されるものではなく、互いに異なる多様な形態で具現され、単に本実施例は、本発明の開示が完全になるようにし、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものであり、本発明は、請求項の範疇により定義されるだけである。
【実施例】
【００６７】
実施例１．ＣＭＶ抗原に特異的二重活性Ｔ細胞の製造
ヒトの末梢血液からフィコール密度勾配遠心分離法（Ｆｉｃｏｌｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ−ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）で単核球細胞を分離した後、インターフェロンガンマ組換えタンパク質（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇａｍｍａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）１，０００Ｕ／ｍＬとサイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ；ＣＭＶ）抗原ｐｐ６５に対するペプチベータ（ｐｅｐｔｉｖａｔｏｒ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を１ｕｇ／ｍＬ処理した。４日後にインターロイキン−２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２；ＩＬ−２）組換えタンパク質３００Ｕ／ｍＬを処理し、２１日間培養して、ＣＭＶ抗原に特異的二重活性Ｔ細胞を生産した。ＩＬ−２は、２〜３日に一回ずつ３００Ｕ／ｍＬを追加した。
【００６８】
比較例１．ＣＩＫ細胞の製造
ヒトの末梢血液からフィコール密度勾配遠心分離法で単核球細胞を分離した後、インターフェロンガンマ組換えタンパク質１，０００Ｕ／ｍＬを処理した。２４時間後に、ａｎｔｉ−ＣＤ３抗体５０ｎｇ／ｍＬとインターロイキン−２（ＩＬ−２）組換えタンパク質３００Ｕ／ｍＬを処理し、２１日間培養して、一般的なＣＩＫ細胞を生産した。ＩＬ−２は、２〜３日に一回ずつ３００Ｕ／ｍＬを追加した。
【００６９】
実験例１．ＣＭＶ抗原に特異的Ｔ細胞およびＮＫ細胞の測定
前記実施例および比較例により誘導された二重活性Ｔ細胞およびＣＩＫ細胞のＴ細胞マーカーであるＣＤ３、ＣＤ８とＮＫ細胞マーカーであるＣＤ５６に対する蛍光−結合抗体を細胞の表面に染色した後、フローサイトメトリーを利用して測定した。ＣＭＶ抗原に特異的二重活性Ｔ細胞を測定するためには、抗原ｐｐ６５とＭＨＣ複合体に結合された蛍光抗体を細胞の表面に染色した後、フローサイトメトリーを利用して測定した。この際、ｐｐ６５−ＭＨＣ複合体に結合するＴ細胞がＣＭＶ抗原ｐｐ６５に特異的二重活性Ｔ細胞であると言える。フローサイトメトリーを利用して測定した結果を図２に示し、ＣＭＶ抗原に特異的Ｔ細胞をペンタマー分析を用いて測定した結果を図３に示す。
【００７０】
図２および図３から分かるように、ペプチベータを処理しない対照群と比較してペプチベータを処理した実験群の場合、ＣＭＶのｐｐ６５抗原に特異的二重活性Ｔ細胞が顕著に多く測定されたことを確認することができた。
【００７１】
実験例２．ＣＭＶに特異的二重活性Ｔ細胞の表現型の分析
前記実施例および比較例により生産された二重活性Ｔ細胞およびＣＩＫ細胞を培養した後、２１日目の細胞の表現型を比較した。その結果を図４に示す。
【００７２】
図４から分かるように、ｐｐ６５に対するペプチベータを追加したものと関係なく、二つの細胞は、類似した表現型を示すことを確認することができる。２１日間培養された二重活性Ｔ細胞およびＣＩＫ細胞は、全部ＣＤ３陽性Ｔ細胞であって、大部分のＴ細胞は、ＣＤ８に陽性であるＣＴＬ細胞であり、最終生産物で約１５％は、ＣＤ３とＣＤ５６を同時に発現するＮＫ／Ｔ細胞の表現型を有していることが分かった。
【００７３】
実験例３．ＣＭＶに特異的ＩＦＮ−ｇａｍｍａ分泌能の測定
前記実施例および比較例によって生産された細胞を回収して、抗原ｐｐ６５のペプチベータで刺激した後、これに特異的に分泌されるＩＦＮ−ｇａｍｍａを測定した。その結果を図５に示す。
【００７４】
図５から分かるように、ペプチベータを処理しない場合、二重活性Ｔ細胞とＣＩＫ細胞は、両方共にＩＦＮ−ｇａｍｍａが分泌されなかったが、ペプチベータを処理した場合、二重活性Ｔ細胞でＩＦＮ−ｇａｍｍａ分泌量が顕著に増加したことを確認することができた。
【００７５】
実験例４．腫瘍細胞に対する致死効果の分析
前記実施例１および比較例１によって生産された細胞を回収して、慢性骨髄性白血病由来Ｋ５６２細胞と４時間共培養した後、Ｋ５６２細胞に対する致死効果を測定して、図６に示す。
【００７６】
図６から分かるように、二重活性Ｔ細胞とＣＩＫ細胞は、両方共にＫ５６２細胞に対してＭＨＣ−非依存的な致死効果を示したが、培養過程でｐｐ６５ペプチベータが処理された二重活性Ｔ細胞では、ＣＩＫ細胞と比較して前記効果が向上したことを確認することができた。
【００７７】
実施例２．ＣＭＶ抗原に特異的ＣＩＫ細胞の製造
ヒトの末梢血液からフィコール密度勾配遠心分離法で単核球細胞を分離した後、インターフェロンガンマ組換えタンパク質１，０００Ｕ／ｍＬとサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原ｐｐ６５に対するペプチベータ（ｐｅｐｔｉｖａｔｏｒ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を１ｕｇ／ｍＬ処理した。２４時間後、ａｎｔｉ−ＣＤ３抗体５０ｎｇ／ｍＬとインターロイキン−２（ＩＬ−２）組換えタンパク質３００Ｕ／ｍＬを処理して、２１日間ＣＭＶ抗原に特異的ＣＩＫ細胞を生産した。ＩＬ−２は、２〜３日に一回ずつ３００Ｕ／ｍＬを追加した。培養過程を簡略に図式化して図１に示す。
【００７８】
実験例５．ＣＭＶ抗原に特異的ＣＩＫ細胞およびＮＫ細胞の測定
前記実施例２および比較例１によって誘導されたＣＩＫ細胞のＴ細胞マーカーであるＣＤ３、ＣＤ８とＮＫ細胞マーカーであるＣＤ５６に対する蛍光−結合抗体を細胞の表面に染色した後、フローサイトメトリーを利用して測定した。ＣＭＶ抗原に特異的Ｔ細胞を測定するためには、抗原ｐｐ６５とＭＨＣ複合体に結合された蛍光抗体を細胞の表面に染色した後、フローサイトメトリーを利用して測定した。この際、ｐｐ６５−ＭＨＣ複合体に結合するＴ細胞がＣＭＶ抗原ｐｐ６５に特異的Ｔ細胞であると言える。フローサイトメトリーを利用して測定した結果を図７に示す。
【００７９】
図７から分かるように、ペプチベータを処理しない対照群と比較してペプチベータを処理した実験群の場合、ＣＭＶのｐｐ６５抗原に特異的Ｔ細胞が顕著に多く測定されたことを確認することができた。
【００８０】
実験例６．ＣＭＶに特異的ＣＩＫ細胞の表現型の分析
前記実施例２および比較例１によって生産されたＣＩＫ細胞を培養した後、２１日目のＣＩＫ細胞の表現型を比較した。その結果を図８に示す。
【００８１】
図８から分かるように、ｐｐ６５に対するペプチベータを追加したものと関係なく、類似した表現型を示すことを確認することができる。２１日間培養されたＣＩＫ細胞は、全部ＣＤ３陽性Ｔ細胞であって、多くのＴ細胞は、ＣＤ８に陽性であるＣＴＬ細胞であり、最終生産物で約１５％は、ＣＤ３とＣＤ５６を同時に発現するＮＫ／Ｔ細胞の表現型を有していることが分かる。
【００８２】
実験例７．ＣＭＶに特異的ＣＩＫ細胞の抗原ｐｐ６５に特異的細胞の測定
前記実施例２および比較例１によって生産されたＣＩＫ細胞を回収して、抗原ｐｐ６５に特異的Ｔ細胞をペンタマー分析を用いて測定した。その結果を図９に示す。
【００８３】
図９から分かるように、培養する前に、末梢血液では、極少量（０．１％以下）のＣＭＶに特異的Ｔ細胞が存在することを観察した。すなわち、培養過程でこのようなＣＭＶに特異的Ｔ細胞が増幅されたことを確認することができた。図９によれば、ペプチベータを処理しない対照群の場合、ＣＭＶに特異的Ｔ細胞の増幅は、変化がほとんど現れなかったが、ペプチベータを処理した実験群では、対照群に比べて約９倍以上増幅されたことを確認することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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