(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイブリダイゼーションに使用するための組成物であって、前記組成物は、
（ａ）少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブ（「成分（ａ）」）と；
（ｂ）組成物に対して５〜２０体積％または重量％の範囲の量の、環状分子構造を有する少なくとも１つの極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒（「成分（ｂ）」）と；
（ｃ）組成物に対して１５〜３０体積％の範囲の量の少なくとも１つのカルボン酸アミドおよび／またはその塩（「成分（ｃ）」）と；
（ｄ）組成物に対して１０〜２０重量％の硫酸デキストラン（「成分（ｄ）」）とを含む、組成物。
【請求項２】
前記少なくとも１つの極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒が、ラクトン官能性、スルホン官能性、カーボネート官能性および／またはアミド官能性を有する溶媒からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記環状分子構造がヘテロ環、好ましくは１つ以上の環を形成する窒素原子、硫黄原子および／または酸素原子を含むヘテロ環を含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物が、核酸の変性をもたらさない量の少なくとも１つの極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が、ホルムアミドおよび／またはその塩を、組成物に対して１５〜３０体積％の範囲の量で含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物が、成分（ｂ）および成分（ｃ）、または前記少なくとも１つの極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒と、前記少なくとも１つのカルボン酸アミドおよび／またはその塩、特にホルムアミドおよび／またはその塩とを、１：２５〜１０：１の範囲の体積比で含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物が、少なくとも１つの洗剤および／または界面活性剤を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
ハイブリダイゼーションに使用するための組成物、好ましくは、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物であって、前記組成物が、
（ａ）少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブ（「成分（ａ）」）と；
（ｂ）組成物に対して５〜２０体積％または重量％の範囲の量の、環状分子構造を有する少なくとも１つの極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒（「成分（ｂ）」）と；
（ｃ）組成物に対して１５〜３０体積％の範囲の量の少なくとも１つのカルボン酸アミドおよび／またはその塩（「成分（ｃ）」）、特にホルムアミドおよび／またはその塩と；
（ｄ）組成物に対して１０〜２０重量％の硫酸デキストラン（「成分（ｄ）」）と；
（ｅ）場合により、少なくとも１つの化学バッファー系（「成分（ｅ）」）と；
（ｆ）場合により、少なくとも１つのブロッキング剤および／または安定化剤および／または安定化剤（「成分（ｆ）」）と；
（ｇ）場合により、少なくとも１つの無機塩（「成分（ｇ）」）と；
（ｈ）場合により、少なくとも１つの洗剤および／または界面活性剤（「成分（ｈ）」）とを含む組成物。
【請求項９】
ハイブリダイゼーションに使用するための組成物、好ましくは、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物であって、前記組成物が、
（ａ）少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブ（「成分（ａ）」）と；
（ｂ）組成物に対して５〜２０体積％または重量％の範囲の量の、環状分子構造を有する少なくとも１つの極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒（「成分（ｂ）」）と；
（ｃ）組成物に対して１５〜３０体積％の範囲のホルムアミドおよび／またはその塩（「成分（ｃ）」）と；
（ｄ）組成物に対して１０〜２０重量％の硫酸デキストラン（「成分（ｄ）」）と；
（ｅ）場合により、少なくとも１つの化学バッファー系と；
（ｆ）場合により、少なくとも１つのブロッキング剤および／または安定化剤および／または安定化剤（「成分（ｆ）」）と；
（ｇ）場合により、少なくとも１つの無機塩（「成分（ｇ）」）と；
（ｈ）場合により、少なくとも１つのポリアルキレングリコールエーテル（「成分（ｈ）」）とを含む組成物。
【請求項１０】
ハイブリダイゼーションにおける請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物の使用であるハイブリダイゼーションによって、生体サンプル中の核酸および／または染色体異常を検出するための方法。
【請求項１２】
生体サンプル中の核酸および／または染色体異常を検出するための方法、特に、請求項１１に記載の方法であって、前記方法は、以下の工程：
（ａ）ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのために１つ以上の細胞および／または１つ以上の核に基づき、単離された生体サンプルを提供する工程と；
（ｂ）ハイブリダイゼーションに使用するための組成物、特に、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物を提供する工程と、ここで、前記組成物が、少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブ（「成分（ａ）」）；組成物に対して５〜２０体積％または重量％の範囲の量の、環状分子構造を有する少なくとも１つの極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒（「成分（ｂ）」）；組成物に対して１５〜３０体積％の範囲の量の少なくとも１つのカルボン酸アミドおよび／またはその塩、特に、ホルムアミドおよび／またはその塩（「成分（ｃ）」）；および（ｄ）組成物に対して１０〜２０重量％の硫酸デキストラン（「成分（ｄ）」）を含み；
（ｃ）方法工程（ａ）からの生体サンプルを、方法工程（ｂ）からの組成物と接触させる工程と；
（ｄ）方法工程（ａ）からの生体サンプルと、方法工程（ｂ）からの組成物とを変性させる工程と、ここで、前記生体サンプルおよび組成物が、特に、方法工程（ｃ）を行う前に、互いに別々に変性されるか、または、特に、方法工程（ｃ）を行った後に、合わせて変性され；
（ｅ）続いて、前記組成物に含まれる少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブと、前記生体サンプルに含まれる核酸をハイブリダイズする工程と；
（ｆ）続いて、ハイブリダイズしたハイブリダイゼーションプローブおよび／または前記生体サンプル中で検出されるべき前記核酸を検出する工程とを含む、方法。
【請求項１３】
前記方法が、自動化システムで、および／または自動的に実施され、および／または方法工程（ｅ）が１０分〜２４０分の範囲の時間にわたって実施される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ハイブリダイゼーションによって、生体サンプル中、好ましくは１つ以上の細胞中および／または１つ以上の核中の核酸および／または染色体異常を検出するためのキット（部品またはシステムのキット）であって、前記キットは、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物を含み、および／または前記キットは、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法を実施することを意図しており、および／または請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法を実施するために使用される、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸、特にＤＮＡおよび／またはＲＮＡの検出方法の技術分野に関する。
【０００２】
特に、本発明は、ハイブリダイゼーション、特に核酸の同定および／または検出に使用するための組成物、および本発明に係るその使用に関する。さらに、本発明は、核酸または染色体異常を検出するための方法に関する。最後に、本発明は、核酸または染色体異常を検出するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００３】
多くの腫瘍疾患は、転座、逆位、部分的重複、欠失、挿入、重複、異数体および増幅などの構造的および数値的な染色体突然変異に基づく。これらの変化は、一般に、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を介して、予測的、予後的または示差的な診断マーカーとして検出される。
【０００４】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、特異的な核酸配列をサンプル中、特に組織または細胞調製物中で検出することができるような、核酸一本鎖、特にＤＮＡ一本鎖の相補的塩基のハイブリダイゼーションまたは対形成に基づく。この目的のために、直接的または間接的に標識された合成的に産生されたプローブは、サンプルの核酸一本鎖とハイブリダイズされ、続いて検出される。
【０００５】
検出目的のために、とりわけ、蛍光標識核酸断片または蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブ（蛍光ＩＳＨ（ＦＩＳＨ））を使用することができる。さらに、抗原標識プローブ、特にハプテン標識プローブを使用することが可能であり、その後、色反応によって抗体を用いて可視化され、それによって光学顕微鏡（明視野ＩＳＨ（ＢｒＩＳＨ）、発色ＩＳＨ（ＣＩＳＨ）、銀増強ＩＳＨ（ＳＩＳＨ））が可能である。
【０００６】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施するためには、通常、最初に試験すべき生体サンプル、特に、調製物、好ましくは、組織切片または細胞学的調製物に基づく調製物が提供される。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのための調製のために、サンプルをガラススライド上に固定し、脱水する。標識されたプローブを細胞または核内の核酸、特にＲＮＡまたはＤＮＡにハイブリダイズさせるために、まず、検出されるべき核酸または検出されるべき核酸セグメント、さらに、使用されるハイブリダイゼーションプローブがサンプル中に一本鎖形態で存在するように、変性工程が行われる。サンプルとハイブリダイゼーションプローブを互いに別々に、または共変性の意味内で一緒に変性させることが可能である。その後、使用されるハイブリダイゼーションプローブは、サンプルに含まれる核酸にハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションプローブは、通常、ハイブリダイゼーション溶液中に溶解または安定化された形態で含まれ、ハイブリダイゼーションのために試験されるサンプルに適用される。ハイブリダイゼーションされたハイブリダイゼーションプローブまたは標的核酸にアニーリングされたハイブリダイゼーションプローブは、すでに上に述べたように最終的に検出することができる。
【０００７】
以下に詳述するように、ハイブリダイゼーションプローブの結合の特異性およびハイブリダイゼーションプロセスのストリンジェンシーに影響するハイブリダイゼーション条件は、良好に評価され得る結果を得る上で決定的な役割を果たす。
【０００８】
ハイブリダイゼーションプロセス、またはハイブリダイゼーションプロセスの成功、特にサンプルおよびハイブリダイゼーションプローブの変性、ならびにその後の核酸、特にＤＮＡの再生、すなわちハイブリダイゼーションプローブの核酸一本鎖を用いたサンプル中の一本鎖核酸のハイブリダイゼーションは、特に重要である。
【０００９】
二本鎖核酸分子の一本鎖核酸への分離、または変性は、特に約９０〜１００℃の高温で起こり得る。しかしながら、この高い温度は、生体サンプルの形態、特に好ましくは使用される組織切片または細胞の形態にとって有害である。
【００１０】
サンプルの形態を保存し、さらにハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを向上させるために、従来技術におけるｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、通常、生体サンプル中の二本鎖核酸を変性させるためにホルムアミド含有溶液を用いて行われる。ハイブリダイゼーションに利用される溶液中でホルムアミドを使用することにより、二本鎖核酸、特にＤＮＡ−ＤＮＡおよびＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖の融点は、一般に９０〜１００℃の範囲であるが、６５〜８０℃まで低下する。
【００１１】
しかしながら、従来技術から公知のハイブリダイゼーション溶液のいくつかは、以下に記載されるように、特定の欠点と関係がある。
【００１２】
ホルムアミド含有ハイブリダイゼーション溶液を使用すると、ＤＮＡの融点が下がるために、使用されるサンプルの形態が改善され、したがってハイブリダイゼーションの結果も改善されるが、ホルムアミド含有ハイブリダイゼーション溶液は、通常、非常に長い反応時間を伴う。その理由は、一方では、ホルムアミドが再生プロセス（すなわち、ハイブリダイゼーションプローブのアニーリングまたは結合）を顕著に遅らせ、他方では、試験され、かつ、検出されるべきサンプルに含まれる核酸のアニーリングまたは結合を顕著に遅らせるからである。従来技術は、通常、１０〜２４時間のハイブリダイゼーション時間または再生時間を提供する。別の例では、７２時間までのハイブリダイゼーション時間または再生時間が必要な場合もある。
【００１３】
長いハイブリダイゼーション時間の問題を克服するために、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドを他の溶媒で置き換える手法が従来技術から知られている。例えば、国際公開第９１／０２０８８号パンフレットは、ハイブリダイゼーション溶液中にラクタム系溶媒を使用する。国際公開第００／６９８９９号パンフレットには、核酸を溶解するためにホルムアミドとは異なる溶媒を含む、バイオテクノロジー用途のための核酸または核酸類似体を安定化するための組成物が記載されている。しかしながら、しばしば、これらのホルムアミドを含まない溶液で達成されるシグナルパターンは、満足のいくものではなく、または評価するのが困難である。
【００１４】
さらに、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに必要な遺伝子座特異的ハイブリダイゼーションプローブを含む従来技術からこれまでに知られているハイブリダイゼーション溶液は、以下に記載するように、さらなる欠点を有する。
【００１５】
しばしば、既知のハイブリダイゼーション溶液によって得られたシグナルは、迅速な試験としてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施する場合には強くなく、その間に短いハイブリダイゼーション時間を使用したときでさえ十分に評価することができるシグナルパターンが作られ、この観点で、例えば、出生前診断または出生後診断または腫瘍細胞遺伝学の迅速試験を実施するために、需要が存在する。
【００１６】
さらに、従来技術から公知のハイブリダイゼーション溶液は、自動化されたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションプロセスでの使用にはあまり適していないか、または非常に限定された程度でのみ適している。自動化されていないか、または手動で実施されたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションプロセスと比較して、より多くの量または容量のハイブリダイゼーション溶液を、自動化された方法でサンプルに適用しなければならない。従来技術から公知のハイブリダイゼーション溶液を用いて、大容量溶液中または非常に希釈された形態で、良好なハイブリダイゼーション結果を達成することができる様式で、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに必要とされる量のハイブリダイゼーションプローブを溶解または安定化させることはこれまで不可能であった。しかし、ハイブリダイゼーションプローブは非常に高価であるため、いままでに、従来技術から、経済的側面を考慮して実施することができる自動化されたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのための手法は知られていないか、またはハイブリダイゼーション組成物は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】国際公開第９１／０２０８８号パンフレット
【特許文献２】国際公開第００／６９８９９号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
したがって、本発明の目的は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、特に生体サンプル中の核酸の検出に使用するのに適しており、上に記載した従来技術の欠点を少なくとも実質的に回避するか、または少なくとも軽減する組成物を提供することである。
【００１９】
特に、本発明の目的は、自動化されたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションプロセスに使用するのにも適しており、および／または自動化されたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを優れた費用対効果で実施することを可能にする、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのための組成物またはハイブリダイゼーション溶液を提供することである。さらに、本発明の目的は、良好な結果を生じさせるｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのための組成物を提供すること、または短いハイブリダイゼーション時間または再生時間および長いハイブリダイゼーション時間または再生時間の両方で十分に評価することができるシグナルパターンを得ることである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
上述の目的を達成するために、本発明は、請求項１に記載の組成物を提案し、さらなる有利な実施形態は、関連する従属請求項の主題である。
【００２１】
本発明はさらに、関連する独立請求項に係る本発明の組成物の使用に関する。
【００２２】
本発明はさらに、関連する独立請求項に係る核酸または染色体異常を検出するための方法に関する。
【００２３】
最後に、本発明は、関連する独立請求項に係る核酸または染色体異常を検出するためのキットまたは部品またはシステムのキットに関する。さらに有利な特性は、関連する独立請求項の主題である。
【００２４】
本発明の一態様に関連してのみ説明した以下の特定の構成、実施形態なども、明示的に言及する必要なく、本発明の他の態様に関して同様に適用されることは言うまでもない。
【００２５】
さらに、全ての相対量またはパーセントに関し、特に、以下に言及する重量基準または体積基準の量情報に関し、これらの量は、それぞれの成分、活性薬剤、添加剤または補助剤などの合計が常に１００重量％の１００％となるように、当業者によって本発明において選択されるべきであることに留意すべきである。しかしながら、これは当業者にとっては、言うまでもない。
【００２６】
さらに、当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、その用途に基づいて、または個々の状況によって必要とされる場合には、以下に記載される図、範囲または量から逸脱してもよい。
【００２７】
さらに、以下に記載される全てのパラメータ情報などは、標準化された決定手順または明示的に記載された決定手順によって、または当業者によって一般に使用される決定方法によって、本質的に決定または確認されてもよい。
【００２８】
したがって、本発明による第１の態様によれば、本発明は、組成物、特に、ハイブリダイゼーション（特に、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、好ましくは、自動化されたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）に使用するための、生体サンプル（好ましくは、１つ以上の細胞および／または１つ以上の核）における、特に、核酸（好ましくは、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）の同定および／または検出のための組成物に関し、この組成物は、
（ａ）少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブ（「成分（ａ）」）と；
（ｂ）好ましくは環状分子構造を有する、少なくとも１つの極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒（「成分（ｂ）」）と；
（ｃ）組成物に対して１０体積％を超える量の少なくとも１つのカルボン酸アミドおよび／またはその塩（「成分（ｃ）」）、特にホルムアミドおよび／またはその塩とを含む。
【００２９】
言い換えると、本発明によれば、ハイブリダイゼーションプローブが、少なくとも１つの意図的に選択された極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒と、少なくとも１つのカルボン酸アミドまたはその塩（好ましくはホルムアミド）との組み合わせに基づき、組成物に対して１０体積％を超える量で安定化された形態または溶解された形態で含まれる、ハイブリダイゼーションのための組成物（同義語として、ハイブリダイゼーション溶液とも呼ばれる）を提供する。
【００３０】
本発明によれば、まったく驚くべきこととして、一方で少なくとも１つの特定的に選択された極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒と、他方で少なくとも１つのカルボン酸アミドまたはその塩、特にホルムアミドまたはその塩との意図的な組み合わせが、それぞれ定義される量で、ハイブリダイゼーションプローブが少量であっても（いわゆる非常に希釈されたハイブリダイゼーションプローブ）、高容量のハイブリダイゼーション溶液中で安定化させることができることを発見した。驚くべきことに、非常に希釈された形態のハイブリダイゼーションプローブを含む本発明によるこれらの高容量ハイブリダイゼーション溶液によって、自動化されたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法において優れたシグナルパターンも達成される。これまでのところ、これは従来技術では成功していない。
【００３１】
さらに、本発明のハイブリダイゼーション溶液は、自動化されたハイブリダイゼーションプロセスでの使用に適しているばかりでなく、短いハイブリダイゼーション時間または再生時間、長いハイブリダイゼーション時間または再生時間の両方で優れた結果またはシグナルパターンをもたらすことは、さらにまったく驚くべきことであった。したがって、本発明のハイブリダイゼーション溶液は、高速ＩＳＨまたは高速ＦＩＳＨのような迅速試験、またはハイブリダイゼーション時間を変えることができるいわゆる「フレキシブル」ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションでの使用にも適している。
【００３２】
本発明は、全体的に、以下に非限定的な様式で論じられる多くの利点および特別な特徴に関連し、本発明の特許性を示すものとみなされるべきである。
【００３３】
上述したように、驚くべきことに、本発明において、大容積のハイブリダイゼーション溶液または組成物中の少量のハイブリダイゼーションプローブでさえも安定化させることが可能であり、自動の、または自動化されたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションプロセスが、手動または確立されたハイブリダイゼーションプロセスと比較してより多くのプローブ量を使用する必要なく、十分に評価することができ、強いシグナルを有することができるシグナルパターンを得ることも行われるだろう。
【００３４】
したがって、本発明の組成物またはハイブリダイゼーション溶液は、自動化されたハイブリダイゼーションプロセスを費用対効果の高い様式で実施することが今や可能であるため、ハイブリダイゼーションプロセスの経済的側面に関して特に有利である。さらに、自動化されたプロセスは、より高いサンプルスループットを伴うため、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションプロセス全体の効率が向上する。
【００３５】
さらに、本発明のハイブリダイゼーション溶液は、異なるｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションプロセスに適しているので、その用途が多用途である。特に、本発明の組成物は、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、明視野ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＢｒＩＳＨ）、発色ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）および／または銀増強ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）に使用することができる。
【００３６】
さらに、この組成物は、長いハイブリダイゼーション時間または再生期間、短いハイブリダイゼーション時間または再生時間を有するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにも適している。特に迅速なＩＳＨ法またはハイブリダイゼーション時間を変えることができるフレキシブルｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのような短いハイブリダイゼーション時間を有する迅速試験において、本発明の組成物は優れた結果をもたらす。これは驚くべきことであり、特に、本発明の組成物が少なくとも１０重量％の量でホルムアミドを含み、ホルムアミドが通常長いハイブリダイゼーション時間を必要とするという背景に対して、驚くべきことである。ホルムアミドの使用にもかかわらず、短いハイブリダイゼーション時間は、少なくとも１つのカルボン酸アミド、特にホルムアミドと、少なくとも１つの極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒とをそれぞれの定義された量で含む本発明の意図的な組み合わせによってのみ可能になる。
【００３７】
本発明の組成物は、全体として、その優れた安定性、特にそこに含まれるハイブリダイゼーションプローブによって特徴付けられる。組成物の安定性は、安定化剤またはブロッキング剤、特に核酸および／または核酸類似体に基づくものが、ハイブリダイゼーションプローブの早すぎる分解を防止するので、組成物がこれらを含む場合にさらに高まるだろう。驚くべきことに、少なくとも１つの極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒と、ホルムアミドとの本発明の組み合わせは、本発明の組成物に大量の安定化剤またはブロッキング剤、特に核酸に基づくものを溶解させる。
【００３８】
最後に、本発明の組成物によって得られたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのシグナルパターンは、全体的に優れた品質という点で際立っている。十分に評価することができる明確なシグナルが生成される。さらに、非特異的シグナルまたは非特異的バックグラウンド染色を少なくとも実質的に最小化することも可能であり、すなわち、本発明のハイブリダイゼーション組成物は、その優れたストリンジェンシーによって特徴付けられる。
【００３９】
本発明のより良い理解を提供するために、本発明の組成物の中心的な用語および名称を以下に定義する。
【００４０】
本発明により使用されるｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、核酸一本鎖の相補的塩基、特にＤＮＡ一本鎖のハイブリダイゼーションまたは対形成に基づいているので、特定の核酸配列、すなわち、検出される染色体またはＤＮＡ部分を、組織または細胞調製物のようなサンプル中で検出することができる。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて、直接的または間接的に標識され、合成的に生成され、特に遺伝子座特異的な核酸ベースのハイブリダイゼーションプローブは、サンプルの核酸一本鎖にハイブリダイズされ、続いて検出される。
【００４１】
原理的には、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、試験される細胞または核の周期の様々な段階で行われてもよく、または実行されてもよく、ここで、染色体が凝縮状態で含まれる中期の間に、または染色体が凝縮していない状態で含まれる間期の間に、これを実行するための確立された手順となる。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの目標または目的に依存して、中期の間、特に染色体異常について固形腫瘍の細胞を試験する場合に、凝縮染色体上でこのプロセスを実行することは常に可能というわけではない。これらの場合、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは間期の細胞で行われる。
【００４２】
ハイブリダイゼーションプローブは、好ましくは遺伝子座特異的である。本発明において、遺伝子座特異的ハイブリダイゼーションプローブとは、検出されるべき染色体部分またはＤＮＡ部分に特異的なプローブ、または試験されるサンプル中のＤＮＡ物質または遺伝物質の検出されるべき染色体部分もしくはＤＮＡ部分に相補的なプローブを意味すると理解されるべきである。好ましくは、個々の遺伝子のＲＮＡを検出するか、好ましくは個々の遺伝子のＲＮＡに特異的な遺伝子座特異的ハイブリダイゼーションプローブを使用することも提供されてもよい。通常、本発明に従って使用されるハイブリダイゼーションプローブは、核酸または核酸断片および／または核酸類似体に基づいており、検出されるべき染色体部分またはＤＮＡ部分に特異的に結合またはハイブリダイズすることができる。核酸および／または核酸類似体は、特に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはペプチド核酸（ＰＮＡ）であってもよい。検出目的のために、遺伝子座特異的ハイブリダイゼーションプローブは、さらに、検出標識で直接的または間接的に標識される。検出される染色体部分またはＤＮＡ部分は可変長であってもよい。特に、検出されるべき染色体部分またはＤＮＡ部分、または検出されるべきＲＮＡが、部分的にまたは完全に単一の遺伝子であるか、単一の遺伝子を含むことが提供されてもよい。同様に、部分的または完全に検出される染色体部分またはＤＮＡ部分は、複数の遺伝子、特に隣接する遺伝子、好ましくは２つの遺伝子を含むように提供されてもよい。さらに、使用されるハイブリダイゼーションプローブが、複数の異なる遺伝子座特異的ハイブリダイゼーションプローブを含む全染色体ペインティング（ＷＣＰ）ハイブリダイゼーションプローブまたは部分染色体ペインティング（ＰＣＰ）プローブであることが、本発明において提供されてもよく、それぞれ少なくとも１つの検出標識で標識され、全染色体および／または染色体切片を検出することができる。ハイブリダイゼーションプローブ自体の構成に関しては、当業者はそのような構成に精通しているので、この点に関して追加の情報は必要とされない。
【００４３】
さらに「生体サンプル」という用語に関しては、これは、特に試験すべき組織または組織成分、特に組織切片であってもよい。しかし、さらに、個々の細胞または細胞凝集体または単離された核を生体サンプルとして使用することが提供されてもよい。
【００４４】
本発明において、極性非プロトン性溶媒は、分子中にイオン化可能なプロトンを含まない、特に非水性溶媒を意味すると理解されるべきである。言い換えると、非プロトン性溶媒は、特に、水素原子がプロトンの形態で放出または解離することができる官能基を含まない分子に基づく。さらに、本発明において、非プロトン性極性溶媒は、その基礎となる溶媒分子が双極子モーメントを有するように、カルボニル基、ニトリル基またはチオール基などの高度に分極する官能基で置換されることが好ましい。極性非プロトン性溶媒は、脂肪族形態および芳香族または環状の形態の両方で存在することができる。本発明によれば、環状分子構造を有する極性非プロトン性溶媒を使用することが特に有利であることが判明している。さらに、本発明の組成物は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有しないか、またはＤＭＳＯフリーであることも、本発明において提供される。極性非プロトン性溶媒の定義に関するより詳細な詳細については、ＲＯＭＰＰ  Ｃｈｅｍｉｅｌｅｘｉｋｏｎ、第１０版、Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９６年、２４１頁、キーワード：「Ａｐｒｏｔｉｓｃｈｅ  Ｌｏｓｕｎｇｓｍｉｔｔｅｌ（Ａｐｒｏｔｉｃ  ｓｏｌｖｅｎｔｓ）」およびその中の参考文献を参照してもよく、これは、完全に参考として本明細書の一部をなすものとする。
【００４５】
対照的に、本発明において、極性プロトン性溶媒は、特に、分子中にイオン化可能なタンパク質を含み、および／またはおよび／またはイオン性タンパク質を供与することができ、および／または水素結合を形成することができる非水性溶媒を意味すると理解されるべきである。言い換えると、本発明において、極性プロトン性溶媒は、特に、水素原子がプロトンの形態で放出または解離することができる官能基を含む分子に基づくか、または水素原子がプロトンの形態で放出または解離することができるような様式で官能基化された、官能基を含む分子に基づく。極性プロトン性溶媒は、極性両親媒性溶媒とも呼ばれる。極性プロトン性溶媒の定義についてのより詳細な詳細については、ＲＯＭＰＰ  Ｃｈｅｍｉｅｌｅｘｉｋｏｎ、第１０版、Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９６年、３５９７頁、キーワード「Ｐｒｏｔｉｓｃｈｅ  Ｌｏｓｕｎｇｓｍｉｔｔｅｌ（Ｐｒｏｔｉｃ  ｓｏｌｖｅｎｔｓ）」およびその参考文献が参照されてもよく、完全に参考として本明細書の一部をなすものとする。
【００４６】
本発明において、カルボン酸アミドは、窒素の１つ以上の水素原子がカルボン酸部分で置換されているか、またはカルボン酸部分によって置換されている、アンモニアおよび第１級および第２級アミンの誘導体を意味すると理解されるべきである。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに関して特に良好な結果は、本発明の組成物がカルボン酸アミドとしてホルムアミドを含み、これはギ酸由来のアミドであり、したがって最も単純なカルボン酸アミドである場合に達成される。したがって、特に好ましい実施形態において、カルボン酸アミドは、ホルムアミドである。さらに、カルボン酸アミド、特にホルムアミドの使用量に関しては、本発明によれば、この量は１０体積％を超えており、言い換えれば正確に１０体積％の量は、除外されている。
【００４７】
本発明の組成物は、様々な様式で構成することができる。以下、好ましい実施形態を詳細に説明する。
【００４８】
本発明において、驚くべきことに、使用される容量に基づき、ハイブリダイゼーションプローブを低濃度で、および／または少量のみ含むか、または少量のハイブリダイゼーションプローブを含む高容量ハイブリダイゼーション組成物を使用する場合でさえ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて十分に評価することができるシグナルパターンを得ることが可能である。
【００４９】
組成物（ａ）が、組成物に関し、０．１ｎｇ／μｌ〜５０ｎｇ／μｌ、特に０．５ｎｇ／μｌ〜５０ｎｇ／μｌ、特に０．７ｎｇ／μｌ〜８ｎｇ／μｌ、好ましくは１ｎｇ／μｌ〜５ｎｇ／μｌの濃度で少なくとも１つの好ましくは遺伝子座特異的なハイブリダイゼーションプローブを含む場合、本発明によって良好な結果が達成される。本発明において、好ましくは遺伝子座特異的なハイブリダイゼーションプローブを、本発明のハイブリダイゼーション溶液中で上述の濃度で安定化することができ、したがって、自動化されたハイブリダイゼーションプロセスで使用された場合でも、優れたシグナルパターンを得ることができることは完全に驚くべきことである。これまで、自動化されたハイブリダイゼーションプロセスを経済的または高い費用対効果で実施することを可能にするハイブリダイゼーション溶液を提供することは、従来技術では成功していない。具体的には、少なくとも１つの極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒、好ましくは、環状分子構造を有するものに関し、この溶媒は、好ましくは、ラクトン官能性、スルホン官能性、ニトリル官能性、カーボネート官能性および／またはアミド官能性を有する溶媒からなる群から選択され、より好ましくは、ラクトン官能性、スルホン官能性、カーボネート官能性および／またはアミド官能性を有する溶媒からなる群から選択される。本文脈における用語「官能性」は、分子内の官能基の存在を記載する。言い換えると、極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒は、好ましくは、少なくとも１つの官能性のラクトン基、スルホン基、ニトリル基、カーボネート基および／またはアミド基を有する溶媒からなる群から選択される。
【００５０】
特に、少なくとも１つの極性非プロトン性または極性プロトン性溶媒が、エチレンカーボネート、ピロリドン、ラクタム、エチレンサルファイト、γ−ブチロラクトン、エチレントリチオカーボネート、プロピレンカーボネートおよび／またはスルホランからなる群から選択され、特に好ましくは、エチレンカーボネートおよび／またはピロリドンであり、より好ましくはエチレンカーボネートである。
【００５１】
少なくとも１つの溶媒、好ましくは、環状分子構造を有するものが、極性非プロトン性溶媒であり、特に環状カーボネート（環状カーボネートエステル）、特に、アルキレングリコールの環状カーボネートエステル、好ましくは、エチレンカーボネート（１，３−ジオキソラン−２−オン）およびプロピレンカーボネート、特に好ましくはエチレンカーボネート、および環状モノチオカーボネート、ジチオカーボネートおよびトリチオカーボネート、特にエチレンサルファイトおよびエチレントリチオカーボネートから選択されることも本発明において提供されてもよい。
【００５２】
さらに、少なくとも１つの溶媒、好ましくは、環状分子構造を有するものが、極性非プロトン性溶媒であり、特に、非プロトン性環状アミド（ラクタム）、特に、Ｎ−アルキル置換ピロリドンから選択され、好ましくは、ｎ−メチル−２−ピロリドンおよび／またはＮ−エチル−２−ピロリドンである場合に、本発明によって良好な結果が達成される。
【００５３】
本発明によれば、少なくとも１つの溶媒、好ましくは、環状分子構造を有するものが、極性プロトン性溶媒であり、特に、プロトン性環状アミド（ラクタム）、特に、アミド窒素（ラクタム窒素）上に水素原子を有するプロトン性環状アミド（ラクタム）から選択され、好ましくは、２−ピロリドン（γ−ブチロラクタム）、３−ピロリドン、カプロラクタムおよび／または２−ピペリドン（バレロラクタム）からなる群から選択され、特に好ましくはピロリドンであり、最も特に好ましくは２−ピロリドン（γ−ブチロラクタム）であることも提供されてもよい。
【００５４】
少なくとも１つの極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒は、好ましくは、環状分子構造を有する。好ましい環状分子構造は、５個または６個の環原子を含む環系を有するものである。環状分子構造は、ホモ環またはヘテロ環であってもよく、ヘテロ環であることが好ましい。ヘテロ環は、少なくとも２種類の異なる元素の環形成原子を含む化合物である。環を形成する炭素原子に加えて、ヘテロ環は、好ましくは、１以上の環を形成する窒素原子、硫黄原子および／または酸素原子、好ましくは１以上の窒素原子（Ｎ−ヘテロ環）および／または１以上の酸素原子も含む。さらに、少なくとも１つの溶媒が、環状分子構造を有する極性プロトン性溶媒であり、環状分子構造が、窒素原子に遊離水素原子を有するＮ−ヘテロ環であることも、本発明において提供されてもよい。
【００５５】
環状分子構造は、好ましくは、ラクトン官能性、スルホン官能性、ニトリル官能性、カーボネート官能性および／またはアミド官能性、より好ましくは、ラクトン官能性、スルホン官能性、カーボネート官能性および／またはアミド官能性を含む。したがって、好ましい実施形態において、本発明は、（ａ）少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブ（「成分（ａ）」）と；（ｂ）環状分子構造を有し、この環状分子構造が、ラクトン官能性、スルホン官能性、カーボネート官能性および／またはアミド官能性を有する、少なくとも１つの極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒（「成分（ｂ）」）と；組成物に対して１０体積％を超える量の少なくとも１つのカルボン酸アミドおよび／またはその塩（「成分（ｃ）」）とを含むか、またはこれらからなる組成物に関する。
【００５６】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、少なくとも１つの極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒が、エチレンカーボネート、２−ピペリドン（バレロラクタム）、２−ピロリドン（γ−ブチロラクタム）、３−スルホレン（「ブタジエンスルホン」）および／またはγ−ブチロラクトンからなる群から選択されることも提供されてもよい。極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒がγ−ブチロラクトン、２−ピロリドン（γ−ブチロラクタム）および／またはエチレンカーボネートである場合、最良の結果が本発明により達成される。これに関連して、本発明の組成物中の上述の極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒の優れた特性を示す、本出願人によって実行され、以下に記載される例示的な実施形態も参照される。
【００５７】
本発明の組成物中の少なくとも１つの極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒を、特に少なくとも１つのカルボン酸アミド、好ましくはホルムアミドと組み合わせて用いることによって、長いハイブリダイゼーション時間のような、ハイブリダイゼーション溶液におけるホルムアミドの使用に伴う欠点を補うことが可能である。さらに、この理論に拘束されるつもりはないが、本発明の組成物に極性プロトン性または非プロトン性溶媒を使用すると、核酸全体の溶解度が増加し、これにより、本発明のハイブリダイゼーション組成物の安定性が改善する。核酸の良好な溶解能力の結果として、大量のハイブリダイズしない、非特異的な核酸、特に安定化ＤＮＡを、いわゆるブロッキング剤または安定化剤として組成物に導入することができ、ハイブリダイゼーションプローブ、好ましくは遺伝子座特異的なもの分解を防ぎ、さらに、全体的なシグナルパターンを改善し、シグナルが非特異的な結合またはハイブリダイゼーションをするのを防ぎ、すなわち、ストリンジェンシーが増加する。
【００５８】
少なくとも１つの極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒の使用量に関しては、これは広い範囲で変化し得る。本発明によれば、組成物（ｂ）が、少なくとも１つの極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒、好ましくは環状分子構造を有するものを、核酸の変性をもたらさない量で含むことが特に提供されてもよい。本発明においては、少なくとも１つの極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒を用い、本発明の組成物において核酸を溶解および安定化することが特に提供されるが、ここで、溶媒は、単独で、すなわち、少なくとも１つのカルボン酸アミドおよび／またはさらなる変性剤を追加的に使用することなく、核酸の変性をもたらさない量で使用される。
【００５９】
特に、本発明の組成物は、少なくとも１つの極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒、好ましくは環状分子構造を有するものを、組成物に対して０．５〜４０体積％または重量％、特に１〜３５体積％または重量％、特に２〜３０体積％または重量％、好ましくは５〜２０体積％または特に好ましくは７〜１５体積％または重量％の量で含んでいてもよい。
【００６０】
組成物（ｂ）が、少なくとも１つの極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒、好ましくは環状分子構造を有するものを、少なくとも０．５体積％または重量％、特に、少なくとも１体積％または重量％、特に少なくとも２体積％または重量％、好ましくは少なくとも５体積％または重量％、特に好ましくは少なくとも７体積％または重量％、最も特に好ましくは少なくとも１０体積％または重量％の量で含むとき、本発明においてさらに好ましい。同様に、組成物（ｂ）が、少なくとも１つの極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒、好ましくは環状分子構造を有するものを、５０体積％または重量％以下、特に４０体積％または重量％以下、特に３０体積％または重量％以下、好ましくは２０体積％またはそれ以下、特に好ましくは１５体積％または重量％以下、最も特に好ましくは１３体積％または重量％の量で含むことが提供されてもよい。
【００６１】
少なくとも１つの極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒に関する上述のパーセントの情報は、好ましくは重量％での情報である。言い換えれば、本発明の組成物は、好ましくは、少なくとも１つの極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒、好ましくは環状分子構造を有するものを、組成物に対して０．５〜４０重量％、特に１〜３５重量、特に２〜３０重量％、好ましくは５〜２０重量％、特に好ましくは７〜１５重量％の量で含む。
【００６２】
本発明の範囲内において、前述の量範囲を遵守すれば、得られるシグナルパターンが著しく改善されることが全体的に示されている。少なくとも１つのカルボン酸アミドまたはその塩、特にホルムアミドまたはその塩の量もまた、シグナル強度およびシグナルパターンに関して重要な因子であることが見出されている。一方で少なくとも１つの極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒の量、および他方では少なくとも１つのカルボン酸アミド、特にホルムアミドの量に関連して、出願人によって実施され、以下に詳細に記載される例示的な実施形態も参照され、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、特に、自動化されたシステムを実施するとき、または短いハイブリダイゼーション時間またはフレキシブルなハイブリダイゼーション時間を有する迅速試験として、特定的に選択した量の溶媒およびカルボン酸アミドを使用したときのみ、優れたシグナルパターンが得られることを示す。
【００６３】
本発明において、組成物（ｃ）が、少なくとも１つのカルボン酸アミドおよび／またはその塩、特にホルムアミドおよび／またはその塩を、核酸の変性をもたらす量で含むことが特に提供されてもよい。好ましい実施形態において、組成物（ｃ）は、ホルムアミドおよび／またはその塩を、核酸の変性をもたらすか、または核酸の変性に適した量で含む。したがって、言い換えれば、本発明において、組成物が、少なくとも１つのカルボン酸アミド、特にホルムアミドを単独で、すなわち極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒を使用せずとも、核酸の変性をすでにもたらすであろう量で含むことが提供されてもよい。
【００６４】
少なくとも１つのカルボン酸アミドの使用量に関する限り、組成物（ｃ）が、少なくとも１つのカルボン酸アミドおよび／またはその塩、特にホルムアミドおよび／またはその塩を、組成物に対して１０〜６０体積％、特に１５〜５０体積％、特に１７〜４０体積％、好ましくは２０〜３０体積％の範囲の量で含むことが有利であることが判明した。好ましい実施形態において、本発明の組成物は、少なくとも１つのカルボン酸アミドおよび／またはその塩、特にホルムアミドおよび／またはその塩を１７〜４０体積％の範囲の量で含む。さらにより好ましい実施形態において、本発明の組成物は、少なくとも１つのカルボン酸アミドおよび／またはその塩、特にホルムアミドおよび／またはその塩を２０〜３０体積％の範囲の量で含む。
【００６５】
さらに、組成物（ｃ）が、少なくとも１つのカルボン酸アミドおよび／またはその塩、特にホルムアミドおよび／またはその塩を、組成物に対して少なくとも１０体積％、特に少なくとも１５体積％、特に少なくとも１７体積％、好ましくは少なくとも２０体積％の量で含むことが提供されてもよい。同様に、組成物（ｃ）が、少なくとも１つのカルボン酸アミドおよび／またはその塩、特にホルムアミドおよび／またはその塩を、組成物に対して６０体積％以下、特に５０体積％以下、特に４０体積％以下、好ましくは３０体積％以下の量で含むことが提供されてもよい。好ましい実施形態において、本発明の組成物は、少なくとも１つのカルボン酸アミドおよび／またはその塩、特にホルムアミドおよび／またはその塩を、組成物に対して少なくとも１７体積％の量で含む。さらにより好ましい実施形態において、本発明の組成物は、少なくとも１つのカルボン酸アミドおよび／またはその塩、特にホルムアミドおよび／またはその塩を、組成物に対して少なくとも２０体積％の量で含む。
【００６６】
上述のように、カルボン酸アミドおよび／またはその塩の量は、１０％を超えると特に有用であることが判明している。したがって、本発明によれば、組成物（ｃ）が、少なくとも１つのカルボン酸アミドおよび／またはその塩、特にホルムアミドおよび／またはその塩を、組成物に対して１０〜６０体積％、特に１５〜５０体積％、特に１７〜４０体積％、好ましくは２０〜３０体積％の量で含むことが特に好ましい。特に好ましい実施形態において、組成物（ｃ）は、ホルムアミドおよび／またはその塩を１７〜４０体積％の量で含む。
【００６７】
さらに、組成物（ｃ）が、少なくとも１つのカルボン酸アミドおよび／またはその塩、特にホルムアミドおよび／またはその塩を、組成物に対して１０体積％を超える量、特に１５体積％を超える量、特に１７体積％を超える量、好ましくは２０体積％を超える量で含むことが特に好ましい。特に好ましい実施形態において、組成物（ｃ）は、ホルムアミドおよび／またはその塩を、１７体積％を超える量で含む。
【００６８】
一実施形態において、本発明の組成物は、１０体積％を超えるカルボン酸アミドおよび／またはその塩、好ましくはホルムアミドおよび／またはその塩を含む。１つのより好ましい実施形態において、本発明の組成物は、２０体積％を超えるカルボン酸アミドおよび／またはその塩、好ましくはホルムアミドおよび／またはその塩を含む。使用される絶対量に加えて、一方では少なくとも１つの極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒、他方では少なくとも１つのカルボン酸アミド、特にホルムアミドを、お互いに対して規定された量の比率で使用する場合、本発明による組成物によって得られるシグナルパターンに関して有利であることが判明している。
【００６９】
組成物が、成分（ｂ）および成分（ｃ）、または少なくとも１つの極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒、好ましくは環状分子構造を有するものと、少なくとも１つのカルボン酸アミドおよび／またはその塩、特にホルムアミドとを１：１００〜５０：１、特に１：５０〜２０：１、特に１：２５〜１０：１、好ましくは１：１０〜５：１、特に好ましくは１：５〜１：１、最も特に好ましくは１：３〜１：２の体積比で含むとき、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて特に良好な結果が達成される。
【００７０】
さらに、組成物が、少なくとも１つの多糖類（「成分（ｄ）」）、特にバイオ多糖類、特に中性のバイオ多糖類、好ましくはデキストランおよび／またはその誘導体または塩、特に好ましくは硫酸デキストランを含む場合に有利であることが判明している。本発明において、驚くべきことに、本発明の組成物が少なくとも１つの多糖類を含む場合、特に安定化のために、本発明の組成物によってハイブリダイゼーションの結果をここでもさらに改善することができることが判明した。これに関して、組成物中の多糖類の効果を証明する本発明の例示的な実施形態が参照される。使用した多糖類が硫酸デキストランである場合、特に良好な結果が達成される。
【００７１】
組成物中の少なくとも１つの多糖類の量に関する限り、組成物が、成分（ｄ）を、組成物に対して０．１〜５０重量％、特に１〜４０重量％、特に５〜３０重量％、好ましくは１０〜２０重量％の範囲の量で含む場合に特に有利であることが判明した。好ましい実施形態において、組成物は、５〜３０重量％の少なくとも１つの多糖類、特に好ましくは、５〜３０重量％の硫酸デキストランを含む。
【００７２】
さらに、本発明において、組成物が少なくとも１つの化学バッファー系を、特にバッファー塩の形態で含む（「成分（ｅ）」）ことが提供されてもよい。特に、化学バッファー系を用いて、組成物のｐＨ値を一定に設定するか、または維持する。
【００７３】
化学バッファー系の使用量は、広い範囲内で変えることができる。本発明においては、組成物（ｅ）が組成物に対して化学バッファー系を含み、化学バッファー系の全成分の合計として計算して、０．００１〜５重量％、特に０．０１〜４重量％、特に０．１〜３重量％、好ましくは０．５〜２重量％、特に好ましくは１〜１．５重量％の量で含むことが有利であることが判明した。
【００７４】
バッファー系の選択に関する限り、これは当業者の習慣的な技術の一部である。化学バッファー系が、少なくとも１つの塩、特に少なくとも１つのカルボン酸塩、特にクエン酸塩、および／または少なくとも１つの無機塩、特に少なくとも１つのアルカリ塩および／またはアルカリ土類塩、好ましくは少なくとも１つのアルカリ塩化物および／またはアルカリ土類塩化物、特に好ましくは塩化ナトリウムを含むとき、本発明において特に良好な結果が達成される。化学バッファー系が、クエン酸系のバッファー系、またはクエン酸三ナトリウム／塩化三ナトリウムに基づくクエン酸系のバッファー系であれば、特に好ましい。
【００７５】
好ましい実施形態によれば、当業者に公知の化学バッファー系、例えば、クエン酸三ナトリウム（２０倍濃縮ＳＣＣで０．３Ｍ）および塩化ナトリウム（２０倍濃縮ＳＣＣで３Ｍ）に基づくＳＳＣ（生理食塩水−クエン酸ナトリウム）バッファー系が使用される。さらに、ＨＥＰＥＳ［２−（４−（２−ヒドロキシエチル）１−ピペラジニル）−エタンスルホン酸］、ＳＳＰＥ［塩化ナトリウム／リン酸ナトリウム／ＥＤＴＡ］、ＰＩＰＥＳ［ピペラジン−Ｎ、Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）］、ＴＭＡＣ［テトラメチルアンモニウムクロリド］、ＴＲＩＳ［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］またはＳＥＴバッファーなどの当業者に周知の他のバッファー系を使用することも可能である。
【００７６】
本発明の範囲内の特に良好な結果は、組成物が５．０〜９．０の範囲、特に５．５〜８．５の範囲、特に６．０〜８．０の範囲、好ましくは６．５〜７．５の範囲のｐＨ値を有するときにさらに達成される。本発明の化学バッファー系は、このｐＨ値を設定し、貯蔵中およびハイブリダイゼーション反応中にその値を維持するのに特に適している。
【００７７】
本発明の好ましい実施形態によれば、組成物が、少なくとも１つのブロッキング剤および／または安定化剤（「成分（ｆ）」）を含み、ブロッキング剤および／または安定剤が、特に核酸および／または核酸類似体、好ましくはＤＮＡおよび／またはＲＮＡに基づくことがさらに提供されてもよい。ブロッキング剤および／または安定化剤として使用される核酸および／または核酸類似体は、特に、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはペプチド核酸（ＰＮＡ）であってもよい。使用されるハイブリダイゼーションプローブを安定化し、プローブの早すぎる崩壊または早すぎる分解を防止することができるので、少なくとも１つのブロッキング剤または安定化剤の使用はいくつかの点で有利である。さらに、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのシグナルパターンにおける非特異的バックグラウンドシグナルを最小化することが可能である。
【００７８】
本発明の成分に起因して、特に、一方で少なくとも１つの極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒と、他方で少なくとも１つのカルボン酸アミド、特にホルムアミドとのそれぞれ規定された量の本発明の組み合わせに起因して、本発明の組成物に大量のブロッキング剤および／または安定化剤を溶解させることが可能である。したがって、組成物（ｆ）が、少なくとも１つのブロッキング剤および／または安定化剤を、組成物に対して０．００１μｇ／μｌ〜１００μｇ／μｌ、特に０．００５μｇ／μｌ〜８０μｇ／μｌ、特に０．０１μｇ／μｌ〜４０μｇ／μｌ、好ましくは０．０５μｇ／μｌ〜２０μｇ／μｌ、特に好ましくは０．１μｇ／μｌ〜１０μｇ／μｌの濃度で含むことが本発明によって提供されてもよい。
【００７９】
さらに、本発明の組成物に関して、組成物が、少なくとも１つの無機塩（「成分（ｇ）」）、特にアルカリ塩および／またはアルカリ土類塩、好ましくはアルカリ塩化物および／またはアルカリ土類塩化物、特に好ましくは塩化ナトリウムを含むことが有利である。
【００８０】
少なくとも１つの無機塩の使用量は、広い範囲で変えることができる。組成物（ｇ）が、少なくとも１つの無機塩を、組成物に対して０．０１〜１５重量％、特に０．０５〜１０重量％、特に０．１〜１０重量％、好ましくは０．５〜５重量％、特に好ましくは１〜３重量％の量で含む場合、本発明の組成物によって特に良好な結果が達成される。
【００８１】
さらに、驚くべきことに、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて得られたシグナルパターンは、本発明の組成物またはハイブリダイゼーション溶液が少なくとも１つの洗剤および／または界面活性剤（「成分（ｈ）」）を含むときにさらに向上させることができることが示された。本発明の範囲内の洗剤または界面活性剤は、液体の表面張力または２つの相の間の界面張力を低下させることができる物質を意味すると理解されるべきである。これは、分散液または溶液の形成を促進または改善するための基礎を形成する。
【００８２】
本発明の組成物またはハイブリダイゼーション溶液に少なくとも１つの洗剤または界面活性剤を用いることにより、この理論に拘束されるつもりはないが、サンプルおよびハイブリダイゼーションプローブにおける核酸の特異的ハイブリダイゼーションが改善されるか、または増強される。再び、この理論に拘束されるつもりはないが、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションサンプルまたは調製物の評価または分析において通常実施される細胞核の核染色または染色は弱められ、バックグラウンドに対するシグナルのコントラストが改善し、全体として、より大きなシグナル強度が得られる。
【００８３】
洗剤および／または界面活性剤が、非イオン性界面活性剤、好ましくはポリアルキレングリコールエーテル、特に好ましくはラウリルアルコールおよび／またはセチルアルコールおよび／またはセチルステアリルアルコールおよび／またはオレイルアルコールのポリアルキレングリコールエーテル、特に、ラウリルアルコールのポリアルキレングリコールエーテルから選択される場合、本発明において特に良好な結果が達成される。これに関連して、洗剤および／または界面活性剤がポリオキシエチレン（４）ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（９）ラウリルエーテルおよび／またはポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル、特にポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテルから選択される場合、特に好ましい。
【００８４】
使用される洗剤または界面活性剤の量は可変である。組成物が、少なくとも１つの洗剤および／または界面活性剤を、組成物に対して０．００１〜５重量％、特に０．０１〜３重量％、特に０．０５〜２重量％、好ましくは０．１〜１．５重量％、特に好ましくは０．１２〜１重量％の量で含むことが特に有利であることが判明した。
【００８５】
洗剤および界面活性剤の有利な特性に関して、ハイブリダイゼーション結果および／またはシグナル強度に対する肯定的な効果を証明する、本発明の例示的な実施形態も参照される。
【００８６】
本発明による組成物の構成に関しては、特にこれが水溶液であることが提供されてもよい。これに関連して、組成物は、水、特に精製水を、組成物に対して１０〜９９重量％の範囲、特に２０〜９５重量％の範囲、好ましくは３０〜９０重量％の範囲、特に好ましくは４０〜８５重量％の範囲の量で含むことが有利である。
【００８７】
さらに、本発明において、組成物が、全ての成分を含む合計が組成物に対して常に１００％または１００重量％となるような量で水を含むものとして提供されてもよい。
【００８８】
さらに、組成物が、担体または賦形剤としての水を含むものとして提供されてもよい。同様に、組成物が水性であることが提供されてもよい。
【００８９】
したがって、特に好ましい実施形態によれば、本発明は、ハイブリダイゼーション（特に、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、好ましくは、自動化されたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）に使用するための、生体サンプル（好ましくは、１つ以上の細胞および／または１つ以上の核）における、特に、核酸（好ましくは、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）の同定および／または検出のための組成物、特に、上述の組成物であって、この組成物は、
（ａ）特に、組成物に対して０．１ｎｇ／μｌ〜５０ｎｇ／μｌ、特に０．５ｎｇ／μｌ〜５０ｎｇ／μｌ、特に０．７ｎｇ／μｌ〜８ｎｇ／μｌ、好ましくは１ｎｇ／μｌ〜５ｎｇ／μｌの濃度の、好ましくは遺伝子座特異的な、少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブ、（「成分（ａ）」）と；
（ｂ）特に、組成物に対して０．５〜４０体積％、特に１〜３５体積％、特に２〜３０体積％、好ましくは５〜２０体積％、特に好ましくは７〜１５体積％の濃度の、好ましくは環状分子構造を有する、少なくとも１つの極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒（「成分（ｂ）」）と；
（ｃ）特に、組成物に対して１０〜６０体積％、特に１５〜５０体積％、特に１７〜４０体積％、好ましくは２０〜３０体積％の量の少なくとも１つのカルボン酸アミドおよび／またはその塩（「成分（ｃ）」）、特にホルムアミドおよび／またはその塩と；
（ｄ）場合により、特に、組成物に対して０．１〜５０重量％、特に１〜４０重量％、特に５〜３０重量％、好ましくは１０〜２０重量％、特に好ましくは１３〜１８重量％の量の少なくとも１つの多糖類（「成分（ｄ）」）、特に、中性のバイオ多糖、好ましくはデキストランおよび／またはその誘導体または塩と；
（ｅ）場合により、化学バッファー系の全成分の合計として計算される場合、組成物に対して、特に０．００１〜５重量％、特に０．０１〜４重量％、特に０．１〜３重量％、好ましくは０．５〜２重量％、特に好ましくは１〜１．５重量％の量の、特に、バッファー塩の形態の、少なくとも１つの化学バッファー系（「成分（ｅ）」）と；
（ｆ）場合により、特に、組成物に対して０．００１μｇ／μｌ〜１００μｇ／μｌ、特に０．００５μｇ／μｌ〜８０μｇ、特に０．０１μｇ／μｌ〜４０μｇ／μｌ、好ましくは０．０５μｇ／μｌ〜２０μｇ／μｌ、特に好ましくは０．１μｇ／μｌ〜１０μｇ／μｌの濃度の少なくとも１つのブロッキング剤および／または安定化剤（「成分（ｆ）」）と；
（ｇ）場合により、特に、組成物に対して、０．０１〜１５重量％、特に０．０５〜１０重量％、特に０．１〜１０重量％、好ましくは０．５〜５重量％、特に好ましくは１〜３重量％の量の少なくとも１つの無機塩（「成分（ｇ）」）、特にアルカリ塩および／またはアルカリ土類塩、好ましくはアルカリ塩化物および／またはアルカリ土類塩化物、特に好ましくは塩化ナトリウムと；
（ｈ）場合により、特に、組成物に対して０．００１〜５重量％、特に０．０１〜３重量％、特に０．０５〜２重量％、好ましくは０．１〜１．５重量％、特に好ましくは０．１２〜１重量％の量の少なくとも１つの洗剤および／または界面活性剤（「成分（ｈ）」）とを含む、組成物に関する。
【００９０】
さらに特に好ましい実施形態によれば、本発明はさらに、ハイブリダイゼーション（特に、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、好ましくは、自動化されたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）に使用するための、生体サンプル（好ましくは、１つ以上の細胞および／または１つ以上の核）における、特に、核酸（好ましくは、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）の同定および／または検出のための組成物、好ましくは、上述の組成物であって、この組成物は、
（ａ）特に、組成物に対して０．１ｎｇ／μｌ〜５０ｎｇ／μｌ、特に０．５ｎｇ／μｌ〜５０ｎｇ／μｌ、特に０．７ｎｇ／μｌ〜８ｎｇ／μｌ、好ましくは１ｎｇ／μｌ〜５ｎｇ／μｌの濃度の、好ましくは遺伝子座特異的な、少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブ（「成分（ａ）」）と；
（ｂ）特に、組成物に対して０．５〜４０体積％、特に１〜３５体積％  、特に２〜３０体積％、好ましくは５〜２０体積％、特に好ましくは７〜１５体積％の量の、好ましくは環状分子構造を有する、少なくとも１つの極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒（「成分（ｂ）」）、好ましくは、γ−ブチロラクトン、２−ピロリドン（γ−ブチロラクタム）および／またはエチレンカーボネート、特に好ましくはエチレンカーボネートと；
（ｃ）特に、組成物に対して１０〜６０体積％、特に１５〜５０体積％、特に１７〜４０体積％、好ましくは２０〜３０体積％の量のホルムアミドおよび／またはその塩（「成分（ｃ）」）と；
（ｄ）場合により、特に、組成物に対して０．１〜５０重量％、特に１〜４０重量％、特に５〜３０重量％、好ましくは１０〜２０重量％、特に好ましくは１３〜１８重量％の量のデキストランおよび／またはその誘導体または塩（「成分（ｄ）」）と；
（ｅ）場合により、化学バッファー系の全成分の合計として計算される場合、組成物に対して、特に０．００１〜５重量％、特に０．０１〜４重量％、特に０．１〜３重量％、好ましくは０．５〜２重量％、特に好ましくは１〜１．５重量％の量の少なくとも１つの化学バッファー系、特に、バッファー塩の形態のもの、好ましくはクエン酸塩および／または塩化ナトリウム（「成分（ｅ）」）と；
（ｆ）場合により、特に、組成物に対して０．００１μｇ／μｌ〜１００μｇ／μｌ、特に０．００５μｇ／μｌ〜８０μｇ、特に０．０１μｇ／μｌ〜４０μｇ／μｌ、好ましくは０．０５μｇ／μｌ〜２０μｇ／μｌ、特に好ましくは０．１μｇ／μｌ〜１０μｇ／μｌの濃度の少なくとも１つのブロッキング剤および／または安定化剤（「成分（ｆ）」）と；
（ｇ）場合により、特に、組成物に対して、０．０１〜１５重量％、特に０．０５〜１０重量％、特に０．１〜１０重量％、好ましくは０．５〜５重量％、特に好ましくは１〜３重量％の量の少なくとも１つの無機塩（「成分（ｇ）」）、特にアルカリ塩および／またはアルカリ土類塩、好ましくはアルカリ塩化物および／またはアルカリ土類塩化物、特に好ましくは塩化ナトリウムと；
（ｈ）場合により、特に、組成物に対して０．００１〜５重量％、特に０．０１〜３重量％、特に０．０５〜２重量％、好ましくは０．１〜１．５重量％、特に好ましくは０．１２〜１重量％の量の少なくとも１つのポリアルキレングリコールエーテル（「成分（ｈ）」）とを含む、組成物に関する。
【００９１】
上記から明らかなように、本発明による意図的な組み合わせに基づいて、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに使用するための組成物中の低濃度のハイブリダイゼーションプローブまたはハイブリダイゼーションプローブを少量でも安定化させることが初めて可能となる。本発明の組成物は、自動化されたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションプロセスと、短いハイブリダイゼーション時間またはフレキシブルなハイブリダイゼーション時間を有するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションプロセス（例えば、高速ＩＳＨ）の両方に使用するのに適しており、十分に評価することができ、強いシグナルを含むシグナルパターンが得られる。この種の組成物は、従来技術からはまだ分かっていない。
【００９２】
本発明の組成物は、特に、疾患、特に悪性腫瘍、好ましくは癌腫、肉腫および／または白血病の診断および／または予後と関連したｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに使用することができる。
【００９３】
この関連で調べられる遺伝子は、好ましくは、ＡＬＫ、ＲＯＳ１、ＲＥＴ、ＮＲＧ１、ＮＴＲＫ１、ＣＡＲＳ、ＥＭＬ４、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＫＩＦ５Ｂ、ＴＧＦ、ＢＣＲ、ＡＢＬ、ＡＬＫ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＢＩＲＣ３、ＣＣＮＤ１、ＥＧＲ１、ＥＴＶ６、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３、ＩＧＨ、ＫＭＴ２Ａ、ＭＹＣ、ＰＭＬ、ＲＡＲＡ、ＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ１Ｔ１、ＥＷＳＲ１、ＣＨＯＰ、ＦＵＳ、ＣＯＬ１Ａ１、ＤＤＩＴ３、ＪＡＺＦ１、ＮＲ４Ａ３、ＦＯＸＯ１、ＦＵＳ、ＰＡＸ３、ＰＡＸ７、ＰＤＧＦＢ、ＳＳ１８、ＴＦＥ３、ＵＳＰ６、ＷＴ１、ＨＥＲ２／ＥＲＢＢ２、ＦＧＦＲ１、ＡＬＫ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤ２７４、ＰＤＣＤ１ＬＧ２、ＥＧＲ１、ＥＧＦＲ、ＥＳＲ１、ＥＴＶ１、ＦＧＦ３、４、１９、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＨＩＴ（ＲＣＣ）、ＫＲＡＳ、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＥＴ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＮ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＯＸ２、ＴＥＲＴ、ＴＯＰ２Ａ、ＴＰ５３、ＴＹＭＳおよび／またはＶＨＬからなる群から選択される。
【００９４】
本発明の組成物を使用して逆位および／または転座に基づく染色体異常を検出する場合、本発明において特に良好な結果が達成される。
【００９５】
これに関連して、本発明の組成物は、特に、異なる転座および／または逆位を、特に肺腫瘍において検出するために使用することができ、特に、ＡＬＫ、ＲＯＳ１、ＲＥＴ、ＮＲＧ１、ＮＴＲＫ１、ＣＡＲＳ、ＥＭＬ４、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＫＩＦ５Ｂおよび／またはＴＧＦといった遺伝子が影響を受ける。
【００９６】
さらに、本発明の組成物が、異なる転座および／または逆位を、特にリンパ腫および白血病において検出するために使用されることが提供されてもよく、特に、ＢＣＲ、ＡＢＬ、ＡＬＫ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＢＩＲＣ３、ＣＣＮＤ１、ＥＧＲ１、ＥＴＶ６、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３、ＩＧＨ、ＫＭＴ２Ａ、ＭＹＣ、ＰＭＬ、ＲＡＲＡ、ＲＵＮＸ１および／またはＲＵＮＸ１Ｔ１といった遺伝子が影響を受ける。
【００９７】
本発明のさらなる好ましい実施形態によれば、本発明の組成物は、異なる転座および／または逆位を、特に肉腫において検出するために使用することができ、特に、ＥＷＳＲ１、ＣＨＯＰ、ＦＵＳ、ＣＯＬ１Ａ１、ＤＤＩＴ３、ＪＡＺＦ１、ＮＲ４Ａ３、ＦＯＸＯ１、ＦＵＳ、ＰＡＸ３、ＰＡＸ７、ＰＤＧＦＢ、ＳＳ１８、ＴＦＥ３、ＵＳＰ６および／またはＷＴ１といった遺伝子が影響を受ける。
【００９８】
逆位および／または転座を検出するための組成物を使用することも本発明によって提供されてもよく、特に、ＡＬＫおよびＲＯＳ１といった遺伝子が影響を受ける。
【００９９】
本発明の好ましい実施形態において、本発明の組成物は、異なる転座および／または逆位を、特に肺腫瘍において検出するために使用することもでき、特に、ＡＬＫ、ＲＯＳ１、ＲＥＴ、ＮＲＧ１、ＮＴＲＫ１、ＣＡＲＳ、ＥＭＬ４、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＫＩＦ５Ｂおよび／またはＴＧＦといった遺伝子が影響を受ける。
【０１００】
さらに、本発明の組成物が、異なる転座および／または逆位を、特にリンパ腫および白血病において検出するために使用されることが提供されてもよく、特に、ＢＣＲ、ＡＢＬ、ＡＬＫ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＢＩＲＣ３、ＣＣＮＤ１、ＥＧＲ１、ＥＴＶ６、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３、ＩＧＨ、ＫＭＴ２Ａ、ＭＹＣ、ＰＭＬ、ＲＡＲＡ、ＲＵＮＸ１および／またはＲＵＮＸ１Ｔ１といった遺伝子が影響を受ける。
【０１０１】
本発明のさらなる好ましい実施形態によれば、本発明の組成物は、異なる転座および／または逆位を、特に肉腫において検出するために使用され、特に、ＥＷＳＲ１、ＣＨＯＰ、ＦＵＳ、ＣＯＬ１Ａ１、ＤＤＩＴ３、ＪＡＺＦ１、ＮＲ４Ａ３、ＦＯＸＯ１、ＦＵＳ、ＰＡＸ３、ＰＡＸ７、ＰＤＧＦＢ、ＳＳ１８、ＴＦＥ３、ＵＳＰ６および／またはＷＴ１といった遺伝子が影響を受ける。
【０１０２】
転座および／または逆位を検出するための本発明の組成物を使用することが本発明によって提供されてもよく、特に、ＡＬＫおよびＲＯＳ１といった遺伝子が影響を受ける。
【０１０３】
さらに、本発明による第２の態様によれば、本発明は、ハイブリダイゼーション（特に、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、好ましくは、自動化されたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）の間に、生体サンプル（好ましくは、１つ以上の細胞および／または１つ以上の核）における、特に、核酸（好ましくは、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）の同定および／または検出のための上述の組成物の使用に関する。
【０１０４】
本発明の使用に関するさらに深い詳細については、本発明の組成物に関連して、本発明の第１の態様に関する上の記載を参照してもよく、これを本発明の使用に関して適用する。
【０１０５】
本発明の第３の態様によれば、本発明はさらに、上述の組成物を用い、ハイブリダイゼーション（特に、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、好ましくは、自動化されたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）によって、生体サンプル（好ましくは、１つ以上の細胞および／または１つ以上の核）において、核酸（好ましくは、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）および／または染色体異常を検出するための方法に関する。
【０１０６】
本発明において、驚くべきことに、本発明の組成物、特に本発明の自動化されたハイブリダイゼーション方法、特にｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法における本発明の組成物を使用すると、良好に評価することができる強いシグナルを有する良好なシグナルパターンが得られる。さらに、本発明の第１の態様に係る組成物を用いると、核酸を検出するための本発明の方法は、驚くべきことに、シグナル強度の低下をもたらすことなく、短いハイブリダイゼーション時間で実施することもできる。
【０１０７】
本発明のこの態様によれば、本発明は、特に、ハイブリダイゼーション（特に、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、好ましくは、自動化されたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）によって、生体サンプル（好ましくは、１つ以上の細胞および／または１つ以上の核）において、核酸（好ましくは、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）および／または染色体異常を検出するための方法であって、
この方法が、以下の工程：
（ａ）ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのために、特に１つ以上の細胞および／または１つ以上の核に基づき、好ましくは、組織の形態で、生体サンプルを提供する工程と；
（ｂ）ハイブリダイゼーションに使用するための組成物、特に、上述の組成物を提供する工程と、ここで、この組成物が、少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブ、好ましくは遺伝子座特異的なもの（「成分（ａ）」）；少なくとも１つの極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒、好ましくは環状分子構造を有するもの（「成分（ｂ）」）；および組成物に対して１０体積％を超える量の少なくとも１つのカルボン酸アミドおよび／またはその塩、特に、ホルムアミドおよび／またはその塩（「成分（ｃ）」）を含み；
（ｃ）方法工程（ａ）からの生体サンプルを、方法工程（ｂ）からの組成物と接触させる工程と；
（ｄ）方法工程（ａ）からの生体サンプルと、方法工程（ｂ）からの組成物とを変性させる工程と、ここで、この生体サンプルおよび組成物が、特に、方法工程（ｃ）を行う前、または合わせて、特に、方法工程（ｃ）を行った後に、互いに別に変性され；
（ｅ）続いて、前記組成物に含まれる少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブ、好ましくは遺伝子座特異的なものと、前記生体サンプルに含まれる核酸をハイブリダイズする工程と；
（ｆ）続いて、好ましくは遺伝子座特異的な、ハイブリダイズしたハイブリダイゼーションプローブおよび／または前記生体サンプル中で検出されるべき核酸を検出する工程とを含む、方法に関する。
【０１０８】
本発明の方法の特に好ましい実施形態によれば、この方法は、自動化されたシステムで、またはその中で、および／または自動的に実施されることが提供されてもよい。これに基づいて、ハイブリダイゼーションプロセス、特にｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの効率またはサンプルスループットを大幅に高めることができる。
【０１０９】
具体的には、特にｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおける方法工程（ａ）、すなわち、本発明の方法を実施するための生体サンプルの提供に関しては、当業者に知られている様式で行われ、すなわち生体サンプルは、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのための既知の様式で調製される。特に、方法工程（ａ）は、細胞または組織に基づいてサンプルを固定および包埋することと、適切な担体にサンプルを塗布することと、サンプルを前処理することと、サンプルを乾燥させることとを含む。当業者であれば、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションプロセスのためのサンプルの提供または準備に本質的に精通しているので、この時点でさらなる記載は必要ない。
【０１１０】
方法工程（ｂ）、すなわち、組成物の提供に関連して、不必要な反復を避けるために、本発明の上述の態様、特に本発明の組成物に関する記載が参照される。
【０１１１】
その他に、方法工程（ｂ）に関しては、組成物が０．１〜５，０００μｌ、特に１〜２，５００μｌ、特に２〜１，５００μｌ、好ましくは５〜１０００μｌ、特に好ましくは１０〜５００μｌ、最も特に好ましくは２０〜２５０μｌ、さらに好ましくは４０〜１５０μｌの範囲の量で使用されるとき、有利であることが判明した。上述の組成物の量は、自動化されたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションまたは自動ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、短いハイブリダイゼーション時間を有するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの両方で、十分に評価することができる高品質のシグナルパターンが得られる。組成物は、特に、試験されるサンプル領域を覆うのに十分な量で使用される。
【０１１２】
生体サンプル中および組成物中の核酸を変性させるための方法工程（ｄ）は、当業者に本質的に知られている様式で行われる。本発明による方法においては、一方では生体サンプル、他方では組成物は、互いに接触する前に、互いに別個に方法工程（ｅ）の変性プロセスを受けてもよい。同様に、方法工程（ｃ）が実施された後に、生体サンプルおよび組成物に共変性プロセスを行うことが提供されてもよい。変性条件、特に必要な温度の設定は、当業者にそれ自体公知であり、さらなる記載を必要としない。特に、方法工程（ｄ）の温度は、６０〜９０℃の範囲、好ましくは７０〜８５℃の範囲であってもよい。
【０１１３】
方法工程（ｅ）は、一方ではハイブリダイゼーション組成物中に存在するハイブリダイゼーションプローブ、好ましくは遺伝子座特異的なもの、他方では生体サンプル中に存在する検出されるべきＤＮＡまたは染色体部分をハイブリダイズするために使用され、この方法工程（ｅ）は、本質的に当業者に知られている様式で実施される。特に、適切なハイブリダイゼーション温度の設定に関する限り、この時点では記載は必要ない。
【０１１４】
方法工程（ｅ）に関連して、さらに、驚くべきことに、本発明において、ハイブリダイゼーション、すなわち、ハイブリダイゼーションプローブ、好ましくは遺伝子座特異的なものを、検出されるべきＤＮＡまたは染色体切片へとアニーリングすることは、方法工程（ｅ）が、動かしつつ、特に波状におよび／または連続して動かしつつ行われるとき、ここでもさらに改善されるだろう。
【０１１５】
本発明において、さらに、驚くべきことに、本発明の方法は、本発明の組成物を用い、短いハイブリダイゼーション時間（「高速ＩＳＨ」）（例えば、１０〜２４０分間）と、一般的に使用される長いハイブリダイゼーション時間（例えば、４〜１００時間）との両方で優れた結果をもたらすことが示された。
【０１１６】
本発明の方法において、本発明の方法におけるハイブリダイゼーションまたは方法工程（ｅ）は、１０分〜２４０分の範囲、特に３０分〜１８０分の範囲、特に６０分〜１５０分の範囲、好ましくは９０分〜１３０分の範囲の時間にわたって行われる。さらに、ハイブリダイゼーションまたは方法工程（ｅ）は、１時間〜１００時間、特に２時間〜８０時間、特に３時間〜５０時間、好ましくは４時間〜３０時間、特に好ましくは５時間〜２５時間、さらに好ましくは８時間〜２０時間の時間にわたって行われる。
【０１１７】
生体サンプル中の結合またはハイブリダイズした、好ましくは遺伝子座特異的な、ハイブリダイゼーションプローブの検出は、同様に、ハイブリダイゼーションプローブの標識の機能として、当業者にそれ自体公知の方法によって行われる。この点に関して、これ以上の記載は必要ない。本発明の方法において、好ましくは、蛍光顕微鏡または抗原標識プローブ、特にハプテン標識プローブによって検出される蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブ（蛍光ＩＳＨ（ＦＩＳＨ））が使用され、着色反応によって抗体を用いて視覚化され、光学顕微鏡によって検出される（明視野ＩＳＨ（ＢｒＩＳＨ）、発色ＩＳＨ（ＣＩＳＨ）および／または銀増強ＩＳＨ（ＳＩＳＨ））。使用される標識されたハイブリダイゼーションプローブの検出が本発明の方法においてどのくらい正確に行われるかは、当業者に明らかである。
【０１１８】
本発明の使用に関するさらに深い詳細については、本発明の上述の態様に関する上の記載を参照してもよく、これを本発明の方法に適応する。
【０１１９】
最後に、本発明の第４の態様によれば、本発明は、ハイブリダイゼーション（特に、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、好ましくは、自動化されたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）によって、生体サンプル（好ましくは、１つ以上の細胞および／または１つ以上の核）において、核酸（好ましくは、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）および／または染色体異常を検出するためのキット、または部品またはシステムのキットであって、このキットが、上述の組成物を含み、および／またはキットが、上述の方法を実施することを意図しており、および／またはこの方法を実施するために使用される、キットに関する。
【０１２０】
好ましい実施形態によれば、本発明のキットは、共有貯蔵容器または適用装置、または空間的に分離され、互いに異なる貯蔵容器および／または適用装置において、上述のような組成物の成分を含むことが本発明によって提供されてもよい。
【０１２１】
本発明のキットに関するさらに深い詳細については、本発明の上述の態様に関する上の記載を参照してもよく、これを本発明のキットに適応する。
【０１２２】
本発明のさらなる特徴、利点および特有の特徴は、図１〜４に基づく以下の好ましい実施形態の説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】図１は、シグナルパターン、特にシグナル強度に関するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション結果の概略図を示す。
【図２】図２は、染色装置を使用してｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいてＦＩＳＨプローブ「Ａｕｔｏ  ＡＬＫ  Ｂｒｅａｋ  Ａｐａｒｔ  Ｐｒｏｂｅ」を使用する場合のシグナルパターン、特にシグナル強度の概略図を示す。
【図３】図３は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいてフレキシブルＦＩＳＨプローブ「Ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ＲＯＳ１  Ｂｒｅａｋ  Ａｐａｒｔ  Ｐｒｏｂｅ」を使用する場合のシグナルパターン、特にシグナル強度の概略図を示す。
【図４】図４は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいてフレキシブルＦＩＳＨプローブ「Ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ＨＥＲ２／ＣＥＮ１７  Ｐｒｏｂｅ」を使用する場合のシグナルパターン、特にシグナル強度の概略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１２４】
黒と白の描写を強調するために、ここに示す図面は、以下に説明する試験結果の蛍光画像ではなく、特に、それぞれの観察結果に基づいて作成された図である。
【０１２５】
図１は、得られたシグナルパターン、特に、シグナル強度の結論を引き出すことができる、（例えば、ＦＩＳＨ、ＢｒＩＳＨおよびＣＩＳＨの例としての）ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション結果の概略図を示す。使用され得る遺伝子座特異的ハイブリダイゼーションプローブは、特に、ヒト遺伝子ＨＥＲ２、ＡＬＫまたはＲＯＳ１のゲノム領域に特異的に使用されるプローブである。
【０１２６】
本発明において、原則としては二倍体細胞であると仮定され、すなわち、検出されたゲノム領域ごとに異常のない細胞において２つのシグナルが得られるか、または二重シグナルが得られる。得られるシグナル強度は、次の５段階の段階に分けられる。（ａ）非常に強いシグナル、（ｂ）強いシグナル、（ｃ）平均強度のシグナル、（ｄ）弱いシグナル、（ｅ）シグナルなし。図１を参照されたい。以下に、シグナルパターン（特に、シグナル強度）の例、一方では標準的なハイブリダイゼーション溶液を用いたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの例、他方では本発明のハイブリダイゼーション溶液を用いたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの例、または本発明の方法を用いたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの例、標準的な方法を用いたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの例が示される。
【０１２７】
特定の濃度のホルムアミドおよび環状分子構造を有する極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒に基づく本発明の方法および組成物は、非常に強いシグナルまたは強いシグナルを生じる（図１（ａ）および１（ｂ））。これらの優れたシグナルパターンは、フレキシブルｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、すなわち、２時間のハイブリダイゼーション時間を有するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（「高速ＩＳＨ」）、または、１６時間のハイブリダイゼーション時間を有するものが、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行うための自動化された方法を用いて観察される。シグナル強度は、バックグラウンドに対する輝度およびコントラストの両方の結果として見ることができる（例えば、バックグラウンドが強いほどコントラストが弱くなり、結果としてシグナルが弱くなる）。
【０１２８】
環状分子構造を有する極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒を含むが、ホルムアミドを含まない組成物またはハイブリダイゼーション溶液は、ハイブリダイゼーションシグナルを生じない（図１ｅ））。ホルムアミドを含むが、環状分子構造を有する極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒を含まない組成物またはハイブリダイゼーション溶液は、同様にハイブリダイゼーションシグナルを生じないか、またはせいぜいハイブリダイゼーションシグナルが非常に弱いか、またはほとんど検出されない（図１ｅ）およびｆ））。
【０１２９】
図２は、染色装置にＦＩＳＨプローブ「Ａｕｔｏ  ＡＬＫ  Ｂｒｅａｋ  Ａｐａｒｔ  Ｐｒｏｂｅ」を用いて実施したｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのシグナルパターンおよびシグナル強度の概略図を示す。この遺伝子座特異的ハイブリダイゼーションプローブは、２ｐ２３においてＡＬＫ切断点領域に近接して配置される配列に指向する緑色標識ポリヌクレオチド（５０３ｎｍで励起、５２８ｎｍで発光）と、２ｐ２３においてＡＬＫ切断点領域の遠位に配置される配列に指向するオレンジ色標識ポリヌクレオチド（５４７ｎｍで励起、５７２ｎｍで発光）から構成される。ハイブリダイゼーション溶液または組成物は、以下に列挙される成分に基づく。それぞれ、ハイブリダイゼーション溶液または組成物を基準として、１８重量％の硫酸デキストラン、６００ｍＭのＮａＣｌ、２２体積％のホルムアミド、１倍濃縮ＳＳＣバッファー、１２．５重量％のエチレンカーボネート、０．１μｇ／μｌの濃度のブロッキングかつ安定化ＤＮＡ、２ｎｇ／μｌの濃度の遺伝子座特異的ハイブリダイゼーションプローブ。
【０１３０】
変性プロセス（７５℃で２０分）の後、ハイブリダイゼーションプローブは、細胞および組織サンプルを含むガラススライドを一定速度で波状運動させつつ、自動化システム（Ｃｅｌｅｒｕｓ  Ｗａｖｅ  ＲＰＤ  Ｓｙｓｔｅｍ）中、４５℃で１２０分間のハイブリダイゼーション時間または再生時間にわたってハイブリダイズされる。
【０１３１】
適切なフィルターセットが使用される場合、再構成されていないＡＬＫ遺伝子のハイブリダイゼーションシグナルは、緑色とオレンジ色の蛍光融合シグナルとして現れる。正常細胞（ＡＬＫ異常なし）の中間期には、適切な緑色／オレンジ色の二重バンドバスフィルターセットを使用すると、２つの緑色／オレンジ色の二重シグナルまたは融合シグナルが現れる（図２  Ｉａ）。ＡＬＫ転座によって影響を受ける２ｐ２３遺伝子座は、別個の緑色シグナルおよび別個のオレンジ色シグナルによって示される（図２  Ｉｂ）。
【０１３２】
得られたシグナル強度、したがって結果を評価する能力は、基礎となるハイブリダイゼーションプローブのハイブリダイゼーション溶液中の環状分子構造（ＣＰＡＬ）を有する極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒のおよびホルムアミドの特異的な濃度に決定的に依存する。環状分子構造（ＣＰＡＬ）を有する極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒（ここではエチレンカーボネート）の濃度が５重量％〜１３重量％と低く、ホルムアミド濃度が１０体積％を超えると、非常に強い蛍光シグナルと、非常に低いバックグラウンドが生じる（図２  Ｉ）。ホルムアミドを含有しない比較組成物は、評価することができない結果、すなわち遺伝子特異的シグナルを生成することができないという結果をもたらす（図２  ＩＩ）。環状分子構造を有する極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒（例えばエチレンカーボネート）を含有しない比較組成物は、非常に弱いシグナルをもたらし、その結果、評価が困難である（図２  ＩＩＩ）。
【０１３３】
図３は、ＦＩＳＨプローブ「Ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ＲＯＳ１  Ｂｒｅａｋ  Ａｐａｒｔ  Ｐｒｏｂｅ」を用いて実施したｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのシグナルパターンおよびシグナル強度の概略図を示す。この遺伝子座特異的ハイブリダイゼーションプローブは、２６ｑ２２においてＲＯＳ１切断点領域に近接して配置される配列に指向する緑色標識ポリヌクレオチド（５０３ｎｍで励起、５２８ｎｍで発光）と、６ｑ２２においてＲＯＳ１切断点領域の遠位に配置される配列に指向するオレンジ色標識ポリヌクレオチド（５４７ｎｍで励起、５７２ｎｍで発光）から構成される。ハイブリダイゼーション溶液または組成物は、以下に列挙される成分に基づく。それぞれ、ハイブリダイゼーション溶液または組成物を基準として、１５重量％の硫酸デキストラン、５００ｍＭのＮａＣｌ、２７体積％のホルムアミド、１倍濃縮ＳＳＣバッファー、９．７５重量％のエチレンカーボネート、０．２μｇ／μｌの濃度のブロッキングかつ安定化ＤＮＡ、５ｎｇ／μｌの濃度の遺伝子座特異的ハイブリダイゼーションプローブ。変性プロセス（７５℃で１０分）後、ハイブリダイゼーションプローブは、細胞および組織のサンプルとともに、３７℃で２時間または３７℃で１６時間のいずれかで、１０分間のハイブリダイゼーション時間または再生時間にわたってハイブリダイズされる。
【０１３４】
適切なフィルターセットが使用される場合、再構成されていないＲＯＳ１遺伝子のハイブリダイゼーションシグナルは、緑色／オレンジ色の蛍光シグナルとして現れる。正常細胞（ＲＯＳ１異常なし）の中間期には、適切な緑色／オレンジ色の二重バンドバスフィルターセットを使用すると、２つの緑色／オレンジ色の融合シグナルまたは二重シグナルが現れる（図３  Ｉａ）。ＲＯＳ１転座によって影響を受ける２ｐ６ｑ２２遺伝子座は、別個の緑色シグナルおよび別個のオレンジ色シグナルによって示される（図３  Ｉｂ）。
【０１３５】
得られたシグナル強度、したがって結果を評価する能力は、基礎となる遺伝子座特異的ハイブリダイゼーションプローブのハイブリダイゼーション溶液中の環状分子構造（ＣＰＡＬ）を有する極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒のおよびホルムアミドの特異的な濃度に決定的に依存する。環状分子構造（ＣＰＡＬ）を有する極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒（ここではエチレンカーボネート）の濃度が５重量％〜１３重量％の範囲と低く、ホルムアミド濃度が１０体積％を超えると、２時間および１６時間のハイブリダイゼーション時間の後に、両者とも非常に強い蛍光シグナルと、非常に低いバックグラウンドが生じる（図３  Ｉ）。ハイブリダイゼーション溶液は、短いハイブリダイゼーション時間および長いハイブリダイゼーション時間の両方で、シグナル強度に関して優れた結果を達成する。
【０１３６】
環状分子構造を有する極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒を含むが、ホルムアミドを含まない比較組成物は、２時間および１６時間のハイブリダイゼーション時間の後に、両者とも評価することができる結果をもたらさない。言い換えれば、遺伝子特異的シグナルを生成することはできない（図３  ＩＩ）。ホルムアミドを含有するが、環状分子構造（ＣＰＡＬ）を有する極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒を含有しない比較組成物は、非常に弱いシグナルをもたらす（図３  ＩＩＩ）。
【０１３７】
図４は、フレキシブルＦＩＳＨプローブ「Ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ＨＥＲ２／ＣＥＮ１７  Ｐｒｏｂｅ」を用いて実施したｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのシグナルパターンおよびシグナル強度の概略図を示す。このプローブは、ＨＥＲ２遺伝子の領域１７ｑ１１．２−ｑ１２領域に指向する緑色標識ポリヌクレオチド（５０３ｎｍで励起、５２８ｎｍで発光）と、１７番染色体（Ｄ１７Ｚ１）のアルファサテライトセントロメア領域に指向するオレンジ色標識ポリヌクレオチド（５４７ｎｍで励起、５７２ｎｍで発光）とから構成される。ハイブリダイゼーション溶液は、以下に列挙する成分を含む。それぞれ、ハイブリダイゼーション溶液または組成物を基準として、１５重量％の硫酸デキストラン、５００ｍＭのＮａＣｌ、２７体積％のホルムアミド、１倍濃縮ＳＳＣバッファー、１０．５重量％のエチレンカーボネート、２μｇ／μｌの濃度のブロッキングかつ安定化ＤＮＡ、５ｎｇ／μｌ  プローブＤＮＡの濃度の遺伝子座特異的ハイブリダイゼーションプローブ。変性（７５℃で１０分）後、ハイブリダイゼーションプローブは、細胞および組織のサンプルとともに、３７℃で２時間または３７℃で１６時間にわたってハイブリダイズされる。
【０１３８】
適切なフィルターセットを使用する場合、再構成されていないＨＥＲ２遺伝子のハイブリダイゼーションシグナルは、生成されたシグナルパターンに２つの緑色蛍光シグナルとして現れ、１７番染色体の再構成されていないセントロメア領域のハイブリダイゼーションシグナルは２つのオレンジ色蛍光シグナルとして現れる。ＨＥＲ２異常および１７番染色体異常がない正常細胞の中間期には、適切な緑色／オレンジ色の二重バンドバスフィルターセットを使用すると、２つの緑色および２つのオレンジ色のシグナルが現れる（図４  ＩａおよびＩＩａ）。ＨＥＲ２増幅によって影響を受ける１７ｑ１１．２−ｑ１２遺伝子座は、さらなる緑色のシグナルによって示される（図４  ＩｂおよびＩＩｂ）。
【０１３９】
得られたシグナル強度、したがって結果を評価する能力は、基礎となるハイブリダイゼーション溶液または組成物中の硫酸デキストランの存在に決定的に依存する。環状分子構造を有する極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒（例えば、エチレンカーボネート）を５重量％〜１３重量％の範囲の量で含み、ホルムアミドを少なくとも１０重量％の量で、硫酸デキストランを１５重量％の量で含むハイブリダイゼーション溶液は、２時間および１６時間の短いハイブリダイゼーション時間および長いハイブリダイゼーション時間の両方で、それぞれ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて非常に強い蛍光シグナルおよび非常に低いバックグラウンドを達成することができる（図４  ＩおよびＩＩ）。硫酸デキストランを含有しないハイブリダイゼーション溶液は、評価することができない結果、すなわち遺伝子特異的シグナルを生成することができないという結果をもたらす（図４  ＩＩＩ）。
【０１４０】
＜例示的な実施形態＞
（Ａ）本発明の個々の特に殊に好ましい例示的な実施形態を説明する前に、最初に基礎をなすｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法自体について説明する。
【０１４１】
実施例Ａ．１    ＩＳＨ手順Ｉ（２時間または１６時間のハイブリダイゼーション時間を有するフレキシブルＦＩＳＨ）
「フレキシブル」高速ＦＩＳＨを実施するために使用される試薬は、ＺｙｔｏＬｉｇｈｔ  Ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ＦＩＳＨ−Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｚ−２１８２−２０、ＺｙｔｏＶｉｓｉｏｎ  ＧｍｂＨ、ブレーマーハーフェン、ドイツ）から得た。このキットは、ホルマリン固定され、パラフィン包埋された組織切片にＦＩＳＨを行うために必要な試薬（熱前処理溶液クエン酸、ペプシン溶液、５倍濃縮フレキシブルＦＩＳＨ洗浄バッファーおよびＤＡＰＩ／ＤｕｒａＴｅｃｔＴＭ（商標）溶液）を含む。
【０１４２】
ＦＩＳＨは、乳癌、肺組織、リンパ節組織、腎臓組織、前立腺組織および胎盤組織からのホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織の切片（厚さ３〜５μｍ）で実施した。組織切片を、コーティングしたガラススライド上に乗せ、５８℃で一晩焼いた。
【０１４３】
パラフィンを除去するために、調製物を１００％キシレン中、室温（ＲＴ）でそれぞれ５分間かけて２回インキュベーションした。その後、室温で２分間（９６％、９０％、７０％の変性エタノールを２回ずつ）、濃度を下げていく一連のエタノール処理を実施した。超純水中、それぞれ２分間続く２回の室温でのインキュベーション工程の後、Ｈｅａｔ  Ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｉｔｒｉｃ中、９８℃で２０分間、熱前処理を行い、次いで、超純水中、ＲＴでさらに２回のインキュベーション工程を２分間行った。タンパク質分解前処理は、調製物にペプシン溶液（ＲＴＵ）をグラフト化し、続いて３７℃の高湿チャンバ内で５〜３０分間インキュベーションすることによって行った。消化工程に続いて、超純水中、ＲＴでそれぞれ２分間続く２回のインキュベーション工程、それぞれＲＴで１分間の濃度を上げていく一連のエタノール処理（７０％、９０％、９６％）を行った。
【０１４４】
調製物を風乾した後、蛍光標識されたハイブリダイゼーションプローブを含むハイブリダイゼーション溶液１０μｌを切片上に直接ピペットで加えた。適切なカバースリップを置いた後、調製物をＦｉｘｏｇｕｍを用いて密封し、共変性のために７５℃で１０分間、加熱プレート上で保存した。ハイブリダイゼーションのために、調製物を予熱した高湿チャンバに移し、３７℃で２時間または一晩（約１６時間）インキュベーションした。
【０１４５】
ストリンジェンシー洗浄の前に、Ｆｉｘｏｇｕｍを除去し、調製物を１倍濃度のフレキシブル洗浄バッファー中、室温で約２分間インキュベーションした。その後、カバースリップを除去し、１倍濃度のフレキシブル洗浄バッファー中、７２℃で１０分間かけてインキュベーションし、さらにＲＴで３分間インキュベーションすることによって実際の洗浄を行った。その後、調製物を風乾させる前に、それぞれＲＴで１分間、濃度を上げていく一連のエタノール処理（７０％、９０％、９６％）を行い、乾燥は光が存在しない条件で行った。その後、ＤＡＰＩ  ＤｕｒａＴｅｃｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを塗布し、調性物にカバースリップを乗せた。
【０１４６】
評価は、蛍光顕微鏡（照明ユニットＨＸＰ１２０Ｖを有するＡｘｉｏ  Ｓｃｏｐｅ．Ａ１、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ＧｍｂＨ）と、それぞれの励起および発光範囲に基づいて適切なフィルターセットを用いて行った。
【０１４７】
実施例Ａ．２    ＩＳＨ手順ＩＩ（自動化されたシステムＣｅｌｅｒｕｓ  Ｗａｖｅ  ＲＰＤシステムの自動化ＦＩＳＨ）
自動化ＦＩＳＨ（Ｃｅｌｅｒｕｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、カリフォルニア、ＵＳＡ製の自動化されたＣｅｌｅｒｕｓ  Ｗａｖｅ  ＲＰＤ  Ｓｙｓｔｅｍ）を実施するために使用した試薬は、ＬＲＭ  Ｂｉｎ（Ｃｅｌｅｒｕｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、カリフォルニア、ＵＳＡ）に含まれていた。ＬＲＭ（Ｌｉｎｅａｒ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｍａｇａｚｉｎｅ）には、熱前処理、タンパク質分解に必要な全ての試薬と、必要な洗浄工程のための洗浄バッファーが含まれていた。ＤＡＰＩ／ＤｕｒａＴｅｃｔ（商標）（ＺｙｔｏＶｉｓｉｏｎ  ＧｍｂＨ、ブレーマーハーフェン、ドイツ）を使用して調製物をカバーし、細胞核を染色した。自動化されたシステムプローブは、ＰＡＣ  Ｂｉｎに配置されており、これをＬＲＭ  Ｂｉｎに挿入した。
【０１４８】
自動化ＦＩＳＨは、哺乳類の癌、肺、リンパ節、腎臓、前立腺および／または胎盤から得られた厚さ３〜５μｍのホルマリン固定されパラフィン包埋された（ＦＦＰＥ）ヒト組織切片で行われ、これをコーティングされたガラススライドに取り付け、５８℃で一晩焼いた。パラフィンを除去するために、調製物をＣｅｌｅｒｕｓ  Ｗａｖｅ（登録商標）ＲＰＤ  Ｓｙｓｔｅｍの所定のプログラムに従って処理した。これに続いて、９５℃で１５分間の熱前処理、続いて４０°で６分間の洗浄バッファー中での２回のインキュベーション工程が行われた。４５℃で１０分間乾燥させた後、タンパク質分解前処理を行った。これは、ペプシンを用いて、調製物を６０℃で５〜４０分の範囲の時間にわたってインキュベーションすることによって行った。消化ステップの後に、それぞれ３７℃の超純水中で４分間続く２回のインキュベーション工程と、５０℃で７分間の乾燥工程を行った。
【０１４９】
乾燥後、ハイブリダイゼーション溶液に含まれる蛍光標識遺伝子座特異的ハイブリダイゼーションプローブを適用した。この目的のために、ガラススライド当たり１３０μｌのハイブリダイゼーション溶液を調製物に適用した。８０℃で１０分間にわたって共変性が起こり、続いて４２℃で１２０分間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションには、ガラススライドの永久的な移動、ひいてはハイブリダイゼーション溶液の波状の移動が伴っていた。ハイブリダイゼーション後、洗浄工程を３７℃で４分間、洗浄バッファーを用いて実施した。
【０１５０】
ストリンジェンシー洗浄は、４５℃で１５分間行った。その後の洗浄工程は、再び３７℃で４分間行った。その後、自動化されたシステムで、４５℃で５分間乾燥処理を行った。これらの工程が自動的に実施された後、自動化されたシステムから調製物を取り出した。その後、調製物を光が存在しない条件で風乾させる前に、それぞれＲＴで１分間、濃度を上げていく一連のエタノール処理（７０％、９０％、９６％）を行った。最後に、細胞核を、ＤＡＰＩ  ＤｕｒａＴｅｃｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＺｙｔｏＶｉｓｉｏｎ  ＧｍｂＨ、ブレーマーハーフェン）を適用することによって染色４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を用いて染色し、調製物にカバースリップ乗せた。
【０１５１】
評価は、蛍光顕微鏡（照明ユニットＨＸＰ１２０Ｖを有するＡｘｉｏ  Ｓｃｏｐｅ．Ａ１、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ＧｍｂＨ）と、それぞれの励起および発光範囲に基づいて適切なフィルターセットを用いて行った。
【０１５２】
例Ａ．３    ＩＳＨ手順ＩＩＩ（自動化されたシステムＰａｔｈｃｏｍ  Ｓｔａｉｎｅｒの自動化ＦＩＳＨ）
自動ＦＩＳＨ（Ｐａｔｈｃｏｍ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア、ＵＳＡ製の自動化されたシステムＰａｔｈｃｏｍ  Ｓｔａｉｎｅｒ）を実行するために使用される試薬は、ＩＳＨ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＰａｔｈＣｏｍ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｉｅｒｒａ  Ｃｔ、Ｄｕｂｌｉｎ、ＵＳＡ）から得た。このキットには、自動化ＦＩＳＨを実行するために必要な反応（Ｄｅｗａｘ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｐｅｐｓｉｎ、ｄｉＨ２Ｏ）が全て含まれていた。さらに、ＩＨＣおよびＩＳＨのためのＰａｔｈＣｏｍ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒが必要であった。ＤＡＰＩ／ＤｕｒａＴｅｃｔa（商標）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＺｙｔｏＶｉｓｉｏｎ  ＧｍｂＨ、ブレーマーハーフェン、ドイツ）を使用して調製物をカバーし、細胞核を染色した。
【０１５３】
自動化ＦＩＳＨは、哺乳類の癌、肺、リンパ節、腎臓、前立腺および／または胎盤のような、厚さ３〜５μｍのホルマリン固定されパラフィン包埋された（ＦＦＰＥ）ヒト組織切片で行われ、これをコーティングされたガラススライドに取り付け、５８℃で一晩焼いた。
【０１５４】
パラフィンを除去するために、調製物を最初に６５℃で６分間にわたり第１のＤｅｗａｘ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理した。その後、調製物を６２℃でそれぞれ６分間、４個のさらなるＤｅｗａｘ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理し、さらに最終的に５０℃で６分間、最後のＤｅｗａｘ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理した。これに続いて、Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いて最初に９８℃で１５分間、その後６５℃で８分間の熱前処理を行い、熱前処理全体が約２３分間持続するようにした。４０℃で６分間の洗浄バッファー（「Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ」）を用いた２回のインキュベーション工程の後、乾燥工程を４５℃で１０分間行う。乾燥プロセスに続いて、タンパク質分解前処理を行った。これは、３７℃、５〜４０分の範囲の時間にわたって、ペプシン中で調製物をインキュベーションすることによって行われた。消化工程の後に、それぞれ３７℃の超純水中で３分間続く３回のインキュベーション工程と、続いて５０℃で１０分間の乾燥工程を行った。
【０１５５】
乾燥後、蛍光標識座特異的ハイブリダイゼーションプローブを含む１１０μｌのハイブリダイゼーション溶液を調製物に塗布した。サンプルおよびハイブリダイゼーション溶液を７５℃で２０分間にわたって共変性させた。変性後のハイブリダイゼーションまたは再生は、自動化されたシステムにおける反応チャンバの誘導された移動の結果としてハイブリダイゼーション溶液を連続的に移動させつつ、４５℃で１２０分間にわたって実施した。
【０１５６】
ハイブリダイゼーション後、洗浄工程を３７℃で４分間、洗浄バッファー（「Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ」）を用いて実施した。ストリンジェンシー洗浄は、４５℃で１５分間行った。その後の洗浄工程は、再び３７℃で４分間行った。その後、自動化されたシステムで、４５℃で５分間乾燥処理を行った。これらの工程が自動的に実施された後、自動化されたシステムから調製物を取り出した。その後、調製物を光が存在しない条件で風乾させる前に、それぞれＲＴで１分間、濃度を上げていく一連のエタノール処理（７０％、９０％、９６％）を行った。最後に、細胞核を、ＤＡＰＩ  ＤｕｒａＴｅｃｔa（商標）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＺｙｔｏＶｉｓｉｏｎ  ＧｍｂＨ、ブレーマーハーフェン）を適用することによって染色４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を用いて染色し、調製物にカバースリップ乗せた。
【０１５７】
評価は、蛍光顕微鏡（照明ユニットＨＸＰ１２０Ｖを有するＡｘｉｏ  Ｓｃｏｐｅ．Ａ１、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ＧｍｂＨ）と、それぞれの励起および発光範囲に基づいて適切なフィルターセットを用いて行った。
【０１５８】
（Ｂ）以下、本発明の実施形態、特に本発明の特に好ましい実施形態および比較ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションについて説明する。
【０１５９】
実施例Ｂ．１    「フレキシブル」高速ＦＩＳＨプロセスにおいて遺伝子特異的ＨＥＲ２シグナルを検出するためのＦＩＳＨ
遺伝子座特異的ハイブリダイゼーションプローブ「Ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ＨＥＲ２／ＣＥＮ１７  Ｐｒｏｂｅ」を用いて、遺伝子特異的ＨＥＲ２シグナルは、２時間の短いハイブリダイゼーション時間と、１６時間続く一晩のハイブリダイゼーションを用いて行うことができる「フレキシブル」高速ＦＩＳＨプロセスによって、作成または検出された。ハイブリダイゼーションそのものは、上述のＩＳＨ手順Ｉ（２時間または１６時間のハイブリダイゼーション時間を有するフレキシブルＦＩＳＨ）に従って実施した。
【０１６０】
ハイブリダイゼーションプローブは、ＨＥＲ２遺伝子の領域１７ｑ１１．２−ｑ１２に指向する緑色標識ポリヌクレオチド（５０３ｎｍで励起、５２８ｎｍで発光）と、第１７染色体（Ｄ１７Ｚ１）のアルファサテライトセントロメア領域に指向するオレンジ色標識されたポリヌクレオチド（５４７ｎｍで励起、５７２ｎｍで発光）から構成されていた。
【０１６１】
ハイブリダイゼーション溶液Ｉ：それぞれ組成物に対し、１５重量％の硫酸デキストラン、５００ｍＭのＮａＣｌ、２７体積％のホルムアミド、１倍濃縮ＳＳＣバッファー、１２重量％のエチレンカーボネート、２μｇ／μｌのブロッキング安定化ＤＮＡおよび５ｎｇ／μｌの遺伝子座特異的ハイブリダイゼーションプローブ。
【０１６２】
ハイブリダイゼーション溶液ＩＩ：それぞれ組成物に対し、１５重量％の硫酸デキストラン、５００ｍＭのＮａＣｌ、２７体積％のホルムアミド、１倍濃縮ＳＳＣバッファー、１０．５重量％のエチレンカーボネート、２μｇ／μｌのブロッキング安定化ＤＮＡおよび５ｎｇ／μｌの遺伝子座特異的ハイブリダイゼーションプローブ。
【０１６３】
２種類のハイブリダイゼーション溶液ＩおよびＩＩは、優れた結果、すなわち、同程度の非常に強いシグナルをもたらした。同様に、２時間の短いハイブリダイゼーション時間および１６時間の長いハイブリダイゼーション時間の両方で、非常に強いＣＥＮ１７特異的シグナル、非常に低いバックグラウンド、十分に保存された細胞および組織の構造に加え、非常に強い遺伝子特異的ＨＥＲ２シグナルが見出された。これは、正常細胞／組織または染色体１７上の異常のない細胞／組織のみならず、ＨＥＲ２増幅を有する細胞／組織、特に哺乳動物の癌でも観察された。このようにして、複数のＨＥＲ２特異的シグナルまたはＨＥＲ２シグナルクラスタの発生に基づいてシグナルパターンにおいて同定されたハイブリダイゼーションプローブによって、同定されるべきＨＥＲ２増幅を明確に検出することが可能であった（図４参照）。
【０１６４】
実施例Ｂ．２    フレキシブル高速ＦＩＳＨプロセスに対するホルムアミド濃度の影響
上述のＩＳＨ手順Ｉの遺伝子座特異的ハイブリダイゼーションプローブ「Ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ＨＥＲ２／ＣＥＮ１７  Ｐｒｏｂｅ」を用いて、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミド濃度がシグナル強度に及ぼす影響を調べた。
【０１６５】
ハイブリダイゼーションプローブは、ＨＥＲ２遺伝子の領域１７ｑ１１．２−ｑ１２に指向する緑色標識ポリヌクレオチド（５０３ｎｍで励起、５２８ｎｍで発光）と、第１７染色体（Ｄ１７Ｚ１）のアルファサテライトセントロメア領域に指向するオレンジ色標識されたポリヌクレオチド（５４７ｎｍで励起、５７２ｎｍで発光）から構成されていた。
【０１６６】
ハイブリダイゼーション溶液Ｉ：それぞれ組成物に対し、１５重量％の硫酸デキストラン、５００ｍＭのＮａＣｌ、２７体積％のホルムアミド、１倍濃縮ＳＳＣバッファー、１０．５重量％のエチレンカーボネート、２μｇ／μｌのブロッキング安定化ＤＮＡおよび５ｎｇ／μｌの遺伝子座特異的ハイブリダイゼーションプローブ。
【０１６７】
ハイブリダイゼーション溶液ＩＩ〜Ｖは、ハイブリダイゼーション溶液Ｉと比較して、ホルミアミド濃度が、１４体積％（ＩＩ）、１１体積％（ＩＩＩ）、７重量％（ＩＶ）および０体積％（Ｖ）と異なっている。
【０１６８】
ハイブリダイゼーション溶液Ｉ〜Ｖは、それぞれ、２時間の短いハイブリダイゼーション時間および１６時間の長いハイブリダイゼーション時間の両方を使用して、上述のＩＳＨ手順Ｉにおいて使用され、ハイブリダイゼーションプローブ「Ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ＨＥＲ２／ＣＥＮ１７  Ｐｒｏｂｅ」が用いられた。これに関して得られたシグナルパターンは、特に達成されたそれぞれのシグナル強度に関して、互いに比較された。
【０１６９】
同様に、ハイブリダイゼーション溶液Ｉ（２７体積のホルムアミド）を用いて、短いハイブリダイゼーション時間および長いハイブリダイゼーション時間の両方で、非常に強いＣＥＮ１７特異的シグナル、非常に低いバックグラウンド、十分に保存された細胞および組織の構造に加え、非常に強い遺伝子特異的ＨＥＲ２シグナルが見出された。
【０１７０】
２時間のハイブリダイゼーション時間の後、ホルムアミド濃度が低くなると、ＨＥＲ２特異的シグナルが弱くなったり、消失したりした。１４体積％のホルムアミド（溶液ＩＩ）では、強いシグナルが生成され、これは依然として非常に良好に評価することができた。対照的に、１１体積％のホルムアミド（溶液ＩＩＩ）では、平均強度のシグナルのみがシグナルパターンにおいて生成された。７体積％のホルムアミド（溶液ＩＶ）を含むハイブリダイゼーション溶液は弱いシグナルしか生じず、これはもはや評価が可能ではなかった。ホルムアミドを含まないハイブリダイゼーション溶液（溶液Ｖ）でシグナルは得られなかった。
【０１７１】
１６時間の長いハイブリダイゼーション時間であっても、ホルムアミド濃度を減少させると、ＨＥＲ２特異的シグナルに関してハイブリダイゼーション溶液中のシグナル強度が低下した。１４体積％のホルムアミド（溶液ＩＩ）では、非常に強いシグナルが生成され、これは依然として非常に良好に評価することができた。１１体積％のホルムアミド（溶液ＩＩＩ）では、同様に、依然として良好に評価することができる強いシグナルがシグナルパターンにおいて生成された。７体積％のホルムアミド（溶液ＩＶ）を含むハイブリダイゼーション溶液は弱いシグナルしか生じず、これはもはや評価が可能ではなかった。ホルムアミドを含まないハイブリダイゼーション溶液（溶液Ｖ）でシグナルは得られなかった。
【０１７２】
例Ｂ．３    フレキシブル急速ＦＩＳＨプロセスに対するエチレンカーボネート濃度の影響
上述のＩＳＨ手順Ｉの遺伝子座特異的ハイブリダイゼーションプローブ「Ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ＨＥＲ２／ＣＥＮ１７  Ｐｒｏｂｅ」を用いて、ハイブリダイゼーション溶液中のエチレンカーボネート濃度がシグナル強度に及ぼす影響を調べた。
【０１７３】
ハイブリダイゼーションプローブは、ＨＥＲ２遺伝子の領域１７ｑ１１．２−ｑ１２に指向する緑色標識ポリヌクレオチド（５０３ｎｍで励起、５２８ｎｍで発光）と、第１７染色体（Ｄ１７Ｚ１）のアルファサテライトセントロメア領域に指向するオレンジ色標識されたポリヌクレオチド（５４７ｎｍで励起、５７２ｎｍで発光）から構成されていた。
【０１７４】
ハイブリダイゼーション溶液Ｉ：それぞれ組成物に対し、１５重量％の硫酸デキストラン、５００ｍＭのＮａＣｌ、２７体積％のホルムアミド、１倍濃縮ＳＳＣバッファー、１０．５重量％のエチレンカーボネート、２μｇ／μｌのブロッキング安定化ＤＮＡおよび５ｎｇ／μｌのプローブＤＮＡ。
【０１７５】
ハイブリダイゼーション溶液ＩＩ〜ＩＶは、ハイブリダイゼーション溶液Ｉと比較して、エチレンカーボネート濃度が、７体積％（ＩＩ）、５重量％（ＩＩＩ）、０重量％（ＩＶ）と異なっていた。
【０１７６】
ハイブリダイゼーション溶液Ｉ〜Ｖは、それぞれ、２時間の短いハイブリダイゼーション時間および１６時間の長いハイブリダイゼーション時間の両方を使用して、上述のＩＳＨ手順Ｉにおいて使用され、ハイブリダイゼーションプローブ「Ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ＨＥＲ２／ＣＥＮ１７  Ｐｒｏｂｅ」が用いられた。これに関して得られたシグナルパターンは、特に達成されたそれぞれのシグナル強度に関して、互いに比較された。
【０１７７】
同様に、ハイブリダイゼーション溶液Ｉ（１０．５重量％のエチレンカーボネート）を用いて、短いハイブリダイゼーション時間および長いハイブリダイゼーション時間の両方で、非常に強いＣＥＮ１７特異的シグナル、非常に低いバックグラウンド、十分に保存された細胞および組織の構造に加え、非常に強い遺伝子特異的ＨＥＲ２シグナルが見出された。
【０１７８】
２時間のハイブリダイゼーション時間の後、エチレンカーボネート濃度が低くなると、ＨＥＲ２特異的シグナルが弱くなったり、消失したりした。７重量％のエチレンカーボネート（溶液ＩＩ）では、強いシグナルが生成され、これは依然として非常に良好に評価することができた。対照的に、５重量％のエチレンカーボネート（溶液ＩＩＩ）では、平均強度のシグナルのみがシグナルパターンにおいて生成された。エチレンカーボネートを含まないハイブリダイゼーション溶液（溶液ＩＶ）を用いると、もはや評価することができない非常に弱いシグナルのみが得られた。
【０１７９】
１６時間の長いハイブリダイゼーション時間であっても、エチレンカーボネート濃度を減少させると、ＨＥＲ２特異的シグナルに関してハイブリダイゼーション溶液中のシグナル強度が低下した。７重量％のエチレンカーボネート（溶液ＩＩ）では、非常に強いシグナルが生成した。５体積％のエチレンカーボネート（溶液ＩＩＩ）では、同様に非常に強いシグナルがシグナルパターンに生成した。エチレンカーボネートを含まないハイブリダイゼーション溶液（溶液ＩＶ）で、平均強度のシグナルのみが得られた。
【０１８０】
実施例Ｂ．４    フレキシブル急速ＦＩＳＨプロセスに対する硫酸デキストランの影響
上述のＩＳＨ手順Ｉの遺伝子座特異的ハイブリダイゼーションプローブ「Ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ＨＥＲ２／ＣＥＮ１７  Ｐｒｏｂｅ」を用いて、ハイブリダイゼーション溶液中の硫酸デキストランがシグナル強度に及ぼす影響を調べた。プローブのハイブリダイゼーションおよび特異性の実行に関連して、上の記載が参照された。
【０１８１】
ハイブリダイゼーション溶液Ｉ：それぞれ組成物に対し、１５重量％の硫酸デキストラン、５００ｍＭのＮａＣｌ、２７体積％のホルムアミド、１倍濃縮ＳＳＣバッファー、１０．５重量％のエチレンカーボネート、２μｇ／μｌのブロッキング安定化ＤＮＡおよび５ｎｇ／μｌのプローブＤＮＡ。
【０１８２】
ハイブリダイゼーション溶液ＩＩ：それぞれ組成物に対し、５００ｍＭのＮａＣｌ、２７体積％のホルムアミド、１倍濃縮ＳＳＣバッファー、１０．５重量％のエチレンカーボネート、２μｇ／μｌのブロッキング安定化ＤＮＡおよび５ｎｇ／μｌのプローブＤＮＡ。
【０１８３】
ハイブリダイゼーション溶液ＩおよびＩＩで受け取ったシグナルパターンを、特に達成されたそれぞれのシグナル強度に関して互いに比較した。
【０１８４】
同様に、短いハイブリダイゼーション時間および長いハイブリダイゼーション時間の両方で、非常に強いＣＥＮ１７特異的シグナル、非常に低いバックグラウンド、十分に保存された細胞および組織の構造に加え、非常に強い遺伝子特異的ＨＥＲ２シグナルが、ハイブリダイゼーション溶液Ｉを用いて得られたシグナルパターンに見出された。硫酸デキストランを含まないハイブリダイゼーション溶液ＩＩは、短いハイブリダイゼーション時間では、可視または検出可能なシグナルをもたらさなかった。長いハイブリダイゼーション時間では、ハイブリダイゼーション溶液ＩＩを用いると、非常に弱いか、または可視または検出が可能ではないシグナルのみが得られた。
【０１８５】
実施例Ｂ．５    フレキシブル高速ＦＩＳＨプロセスに対する、環状分子構造を有する種々の極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒の影響
上述のＩＳＨ手順Ｉの遺伝子座特異的ハイブリダイゼーションプローブ「Ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ＨＥＲ２／ＣＥＮ１７  Ｐｒｏｂｅ」を用いて、ハイブリダイゼーション溶液中の環状分子構造を有する種々の極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒がシグナル強度に及ぼす影響を調べた。プローブのハイブリダイゼーションおよび特異性の実行に関連して、上の記載が参照される。
【０１８６】
ハイブリダイゼーション溶液Ｉ：それぞれ組成物に対し、１５重量％の硫酸デキストラン、５００ｍＭのＮａＣｌ、２７体積％のホルムアミド、１倍濃縮ＳＳＣバッファー、１０．５重量％のエチレンカーボネート（Ｉ）、２μｇ／μｌのブロッキング安定化ＤＮＡおよび５ｎｇ／μｌのプローブＤＮＡ。
【０１８７】
ハイブリダイゼーション溶液ＩＩ：エチレンカーボネートの代わりに１０．５重量％の２−ピペリドン（バレロラクタム）。
【０１８８】
ハイブリダイゼーション溶液ＩＩＩ：エチレンカーボネートの代わりに１０．５体積％の２−ピロリドン（γ−ブチロラクタム）。
【０１８９】
ハイブリダイゼーション溶液ＩＶ：エチレンカーボネートの代わりに１０．５体積％の３−スルホレン（ブタジエンスルホン）。
【０１９０】
ハイブリダイゼーション溶液Ｖ：エチレンカーボネートの代わりに１０．５体積％のγ−ブチロラクトン。
【０１９１】
ハイブリダイゼーション溶液Ｉ〜Ｖで受け取ったシグナルパターンを、特に達成されたそれぞれのシグナル強度に関して互いに比較した。
【０１９２】
同様に、全てのハイブリダイゼーション溶液Ｉ〜Ｖを用いて（すなわち、環状分子構造を有する全ての試験した極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒を用いて）、短いハイブリダイゼーション時間および長いハイブリダイゼーション時間の両方で、非常に強いＣＥＮ１７特異的シグナル、非常に低いバックグラウンド、十分に保存された細胞および組織の構造に加え、非常に強い遺伝子特異的ＨＥＲ２シグナルが見出された。最良の結果は、２−ピロリドン（γ−ブチロラクタム）、γ−ブチロラクトンおよびエチレンカーボネートで達成された。しかし、２−ピペリドン（バレロラクタム）および３−スルホレン（「ブタジエンスルホン」）でも非常に良好な結果が達成された。
【０１９３】
これらの結果は、正常細胞／組織または染色体１７上の異常のない細胞／組織、およびＨＥＲ２増幅を有する細胞／組織、特に哺乳動物癌の両方で観察された。このようにして同定されるべきＨＥＲ２増幅もまた、環状分子構造を有する個々に使用される極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒それぞれを用いて明確に同定することができる。
【０１９４】
実施例Ｂ．６    自動化ＦＩＳＨプロセスにおいて遺伝子特異的ＡＬＫシグナルを検出するためのＦＩＳＨ
遺伝子座特異的ハイブリダイゼーションプローブとして「Ａｕｔｏ  ＡＬＫ  Ｂｒｅａｋ  Ａｐａｒｔ  Ｐｒｏｂｅ」を含み、ホルムアミドおよびエチレンカーボネートに基づくハイブリダイゼーション溶液を用いて、自動化ＦＩＳＨプロセスにおいてＡＬＫ特異的シグナルを検出した。ＦＩＳＨそれ自体は、上述のＩＳＨ手順ＩＩ（自動化システムＣｅｌｅｒｕｓ  Ｗａｖｅ  ＲＰＤ  Ｓｙｓｔｅｍの自動化ＦＩＳＨ）に従って実施した。
【０１９５】
この遺伝子座特異的ハイブリダイゼーションプローブは、２ｐ２３においてＡＬＫ切断点領域に近接して配置される配列に指向する緑色標識ポリヌクレオチド（５０３ｎｍで励起、５２８ｎｍで発光）と、２ｐ２３においてＡＬＫ切断点領域の遠位に配置される配列に指向するオレンジ色標識ポリヌクレオチド（５４７ｎｍで励起、５７２ｎｍで発光）から構成された。
【０１９６】
ハイブリダイゼーション溶液：それぞれ組成物に対し、１８重量％の硫酸デキストラン、６００ｍＭのＮａＣｌ、２２体積％のホルムアミド、１倍濃縮ＳＳＣバッファー、１２．７５重量％のエチレンカーボネート、０．１μｇ／μｌのブロッキング安定化ＤＮＡおよび２ｎｇ／μｌの遺伝子座特異的ハイブリダイゼーションプローブ。
【０１９７】
得られたシグナルパターンにおいて、非常に強いＡＬＫ特異的シグナル、非常に低いバックグラウンドおよび細胞および組織の十分に保存された構造が見出された。これは、正常細胞／組織または第２染色体上に異常のない細胞／組織と、ＡＬＫ異常を伴う細胞／組織の両方で観察された。このようにして、ハイブリダイゼーションプローブ（すなわち、緑−オレンジ融合シグナルの事象を分解する）によって同定されるべきＡＬＫ異常を明確に同定することが可能であった。
【０１９８】
実施例Ｂ．７    自動化ＦＩＳＨプロセスに対するホルムアミド濃度の影響
上述のＩＳＨ手順ＩＩＩの遺伝子座特異的ハイブリダイゼーションプローブ「Ａｕｔｏ  ＨＥＲ２／ＣＥＮ１７  Ｐｒｏｂｅ」を用いて、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミド濃度がシグナル強度に及ぼす影響を調べた。
【０１９９】
ハイブリダイゼーションプローブは、ＨＥＲ２遺伝子の領域１７ｑ１１．２−ｑ１２に指向するオレンジ色標識ポリヌクレオチド（５４７ｎｍで励起、５７２ｎｍで発光）と、第１７染色体（Ｄ１７Ｚ１）のアルファサテライトセントロメア領域に指向する緑色標識されたポリヌクレオチド（５０３ｎｍで励起、５２８ｎｍで発光）から構成されていた。
【０２００】
ハイブリダイゼーション溶液Ｉ：それぞれ組成物に対し、１８重量％の硫酸デキストラン、６００ｍＭのＮａＣｌ、２１体積％のホルムアミド、１倍濃縮ＳＳＣバッファー、１２．７５重量％のエチレンカーボネート、０．１μｇ／μｌのブロッキング安定化ＤＮＡおよび２ｎｇ／μｌのハイブリダイゼーションプローブ。
【０２０１】
ハイブリダイゼーション溶液ＩＩ〜Ｖは、ハイブリダイゼーション溶液Ｉと比較して、ホルミアミド濃度が、１７体積％（ＩＩ）、１３体積％（ＩＩＩ）、９体積％（ＩＶ）および０体積％（Ｖ）と異なっていた。
【０２０２】
同様に、非常に強い遺伝子特異的ＨＥＲ２シグナル（同様に非常に強いＣＥＮ１７特異的シグナルに加えて）、非常に低いバックグラウンド、十分に保存された細胞および組織の構造が、ハイブリダイゼーション溶液Ｉを用いて検出された。ハイブリダイゼーション溶液ＩＩ（１７体積％のホルミアミド）を用い、非常に強いシグナルも得られた。１３体積％のホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液ＩＩＩは依然として強いシグナルを生じたが、９体積％を含有するもの（ハイブリダイゼーション溶液ＩＶ）は平均強度のシグナルのみを生じた。ホルムアミドを含まないハイブリダイゼーション溶液（ハイブリダイゼーション溶液Ｖ）ではシグナルは得られなかった。
【０２０３】
例Ｂ．８    自動化ＦＩＳＨプロセスにおけるエチレンカーボネート濃度の影響
上述のＩＳＨ手順ＩＩＩの遺伝子座特異的ハイブリダイゼーションプローブ「Ａｕｔｏ  ＨＥＲ２／ＣＥＮ１７  Ｐｒｏｂｅ」を用いて、ハイブリダイゼーション溶液中のエチレンカーボネート濃度がシグナル強度に及ぼす影響を調べた。プローブのハイブリダイゼーションおよび特異性の実行に関連して、ハイブリダイゼーションプローブ「Ａｕｔｏ  ＨＥＲ２／ＣＥＮ１７  Ｐｒｏｂｅ」に関連して、上の記載が参照された。
【０２０４】
ハイブリダイゼーション溶液Ｉ：それぞれ組成物に対し、１８重量％の硫酸デキストラン、６００ｍＭのＮａＣｌ、２１体積％のホルムアミド、１倍濃縮ＳＳＣバッファー、１２．７５重量％のエチレンカーボネート、０．１μｇ／μｌのブロッキング安定化ＤＮＡおよび２ｎｇ／μｌのハイブリダイゼーションプローブ。
【０２０５】
ハイブリダイゼーション溶液ＩＩ〜ＩＶは、ハイブリダイゼーション溶液Ｉと比較して、エチレンカーボネート濃度が、９体積％（ＩＩ）、６重量％（ＩＩＩ）、０重量％（ＩＶ）と異なっていた。
【０２０６】
同様に、非常に強い遺伝子特異的ＨＥＲ２シグナル（同様に非常に強いＣＥＮ１７特異的シグナルに加えて）、非常に低いバックグラウンド、十分に保存された細胞および組織の構造が、ハイブリダイゼーション溶液Ｉを用いて検出された。ハイブリダイゼーション溶液ＩＩ（９体積％のエチレンカーボネート）を用い、平均強度のシグナルのみが得られた。６体積％のエチレンカーボネートを含み、エチレンカーボネートを含まないハイブリダイゼーション溶液ＩＩＩおよびＩＶは、もはや評価することができない弱いシグナルのみを生じた。
【０２０７】
実施例Ｂ．９    自動化ＦＩＳＨ処理に対する硫酸デキストランの影響
上述のＩＳＨ手順ＩＩ（自動システムＣｅｌｅｒｕｓ  Ｗａｖｅ  ＲＰＤ  Ｓｙｓｔｅｍの自動化ＦＩＳＨ）の遺伝子座特異的ハイブリダイゼーションプローブ「Ａｕｔｏ  ＲＯＳ１  Ｂｒｅａｋ  Ａｐａｒｔ  Ｐｒｏｂｅ」を用いて、ハイブリダイゼーション溶液中の硫酸デキストランがシグナル強度に及ぼす影響を調べた。ハイブリダイゼーションの実施に関連する手順ＩＩに関する上の記載を参照する。
【０２０８】
このハイブリダイゼーションプローブは、２６ｑ２２においてＲＯＳ１切断点領域に近接して配置される配列に指向する緑色標識ポリヌクレオチド（５０３ｎｍで励起、５２８ｎｍで発光）と、６ｑ２２においてＲＯＳ１切断点領域の遠位に配置される配列に指向するオレンジ色標識ポリヌクレオチド（５４７ｎｍで励起、５７２ｎｍで発光）から構成された。
【０２０９】
ハイブリダイゼーション溶液Ｉ：それぞれ組成物に対し、１８重量％の硫酸デキストラン、６００ｍＭのＮａＣｌ、２２体積％のホルムアミド、１倍濃縮ＳＳＣバッファー、１２．７５重量％のエチレンカーボネート、０．１μｇ／μｌのブロッキング安定化ＤＮＡおよび２ｎｇ／μｌの遺伝子座特異的ハイブリダイゼーションプローブ。
【０２１０】
ハイブリダイゼーション溶液Ｉと比較して、ハイブリダイゼーション溶液ＩＩは硫酸デキストランを含まなかった。
【０２１１】
非常に強い遺伝子特異的ＲＯＳ１シグナル、非常に低いバックグラウンド、および細胞および組織の十分に保存された構造が、ハイブリダイゼーション溶液Ｉによって達成された。硫酸デキストランを含まない組成物中にハイブリダイゼーションプローブを含むハイブリダイゼーション溶液ＩＩを用い、可視または検出可能なシグナルは達成されなかった。
【０２１２】
実施例Ｂ．１０    自動化ＦＩＳＨプロセスに対する、環状分子構造を有する様々な選択した極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒の影響
上述のＩＳＨ手順ＩＩＩ（自動化システムＰａｔｈｃｏｍ  Ｓｔａｉｎｅｒの自動化ＦＩＳＨ）の遺伝子座特異的ハイブリダイゼーションプローブ「Ａｕｔｏ  ＨＥＲ２／ＣＥＮ１７  Ｐｒｏｂｅ」を用いて、ハイブリダイゼーション溶液中の環状分子構造を有する様々な極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒がシグナル強度に及ぼす影響を調べた。自動化システムＰａｔｈｃｏｍ  Ｓｔａｉｎｅｒを使用して、ＩＳＨ手順ＩＩＩ（上述のＩＳＨ手順ＩＩＩに関する意見を参照）を実施した。不必要な反復を避けるために、ハイブリダイゼーションプローブ「Ａｕｔｏ  ＨＥＲ２／ＣＥＮ１７  Ｐｒｏｂｅ」の特異性およびラベリングに関して上の記載が参照される。
【０２１３】
ハイブリダイゼーション溶液Ｉ〜Ｖ：それぞれ組成物に対し、１８重量％の硫酸デキストラン、６００ｍＭのＮａＣｌ、２２体積％のホルムアミド、１倍濃縮ＳＳＣバッファー、１２．７５重量％または体積％（使用物質に依存する）の環状構造を有する極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒、０．１μｇ／μｌのブロッキング安定化ＤＮＡおよび２ｎｇ／μｌのハイブリダイゼーションプローブ。使用した環状構造を有する極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒は、エチレンカーボネート（Ｉ、重量％）、２−ピペリドン（バレロラクタム）（ＩＩ、重量％）、２−ピロリドン（γ−ブチロラクトン）（ＩＩＩ、体積％）、３−スルホレン（「ブタジエンスルホン」）（ＩＶ、重量％）、γ−ブチロラクトン（Ｖ、体積％）のいずれかであった。
【０２１４】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて、環状構造を有する全ての試験した極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒を用い、強い遺伝子特異的ＨＥＲ２シグナルから、非常に強い遺伝子特異的ＨＥＲ２シグナル（同様に強いＣＥＮ１７特異的シグナルから非常に強いＣＥＮ１７特異的シグナルに加えて）、非常に低いバックグラウンド、十分に保存された細胞および組織の構造が見出された。それぞれ、非常に強いものから、わずかな弱いものまで、以下の徐々に変化する段階におけるシグナル強度に関してわずかな差しか見出されなかった。γ−ブチロラクトン、２−ピロリドン（γ−ブチロラクタム）、エチレンカーボネート、２−ピペリドン（バレロラクタム）および３−スルホレン（「ブタジエンスルホン」）。これらの結果は、正常細胞／組織または染色体１７上の異常のない細胞／組織、およびＨＥＲ２増幅を有する細胞／組織、特に哺乳動物癌の両方で観察することができた。このようにして、検出されるべきＨＥＲ２増幅（すなわち、複数のＨＥＲ２特異的シグナルまたはＨＥＲ２シグナルクラスタのいずれか）もまた、環状構造を有する個々に使用される全ての極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒のそれぞれと明確に区別することができた。
【０２１５】
実施例Ｂ．１１    自動化ＦＩＳＨプロセスにおけるハイブリダイゼーションに対する動きの影響
上述のＩＳＨ手順ＩＩＩの遺伝子座特異的ハイブリダイゼーションプローブ「Ａｕｔｏ  ＨＥＲ２／ＣＥＮ１７  Ｐｒｏｂｅ」を使用して、自動化されたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのハイブリダイゼーション工程中の特に波状の動きが、得られたシグナルパターンに及ぼす影響を調べた。この目的のために、ハイブリダイゼーションプローブ「Ａｕｔｏ  ＨＥＲ２／ＣＥＮ１７  Ｐｒｏｂｅ」を用いた自動システム「Ｐａｔｈｃｏｍ  Ｓｔａｉｎｅｒ」上で、上述のＩＳＨ手順ＩＩＩを実施した。
【０２１６】
プローブの特異性に関連して、ハイブリダイゼーションプローブ「Ａｕｔｏ  ＨＥＲ２／ＣＥＮ１７プローブ」に関連して上の記載が参照される。
【０２１７】
ハイブリダイゼーション溶液は、１８重量％の硫酸デキストラン、６００ｍＭのＮａＣｌ、２１体積％のホルムアミド、１倍濃縮ＳＳＣバッファー、１２．７５重量％のエチレンカーボネート、０．１μｇ／μｌのブロッキング安定化ＤＮＡおよび２ｎｇ／μｌの遺伝子座特異的ハイブリダイゼーションプローブを含んでいた。
【０２１８】
比較目的のために、ＩＳＨ手順ＩＩＩは、ハイブリダイゼーションの間、サンプルおよびハイブリダイゼーション組成物または溶液の移動、特に波状運動を伴いつつ、また、サンプルおよびハイブリダイゼーション組成物または溶液の移動を伴わずに実施した。ハイブリダイゼーションはいずれの場合も４５℃で１２０分間行った。
【０２１９】
サンプルまたはハイブリダイゼーション溶液の移動は、自動化システムの反応チャンバを運動させることによって連続的に行われた。反応チャンバの運動は、１５秒、２分および１０分の間隔で誘導され、ハイブリダイゼーションチャンバーのカバーのそれぞれの開放時間は１秒間であった。比較のために、サンプルのハイブリダイゼーションは、運動させずに、ハイブリダイゼーションチャンバーを開かずに行った。
【０２２０】
移動しつつ、ハイブリダイゼーションチャンバーの開放により実施された全ての手法は、非常に強い遺伝子特異的ＨＥＲ２シグナル（同様に非常に強いＣＥＮ１７特異的シグナルに加えて）、非常に低いバックグラウンドおよび細胞および組織の十分に保存された形態をもたらした。優れた結果は、１５秒、２分、および１０分の運動間隔について同等に得られた。ハイブリダイゼーション溶液またはサンプルを移動させずに、評価が容易なシグナルまたはシグナルパターンも同様に得られた。しかし、シグナルは、ハイブリダイゼーション溶液またはサンプルを移動させつつ行われたハイブリダイゼーションよりも弱いことが判明した。
【０２２１】
実施例Ｂ．１２    自動化ＦＩＳＨプロセスにおけるハイブリダイゼーションに対する洗剤の影響
上述のＩＳＨ手順ＩＩＩ（自動システムＰａｔｈｃｏｍ  Ｓｔａｉｎｅｒ上の自動化ＦＩＳＨ）の遺伝子座特異的ハイブリダイゼーションプローブ「Ａｕｔｏ  ＲＯＳ１  Ｂｒｅａｋ  Ａｐａｒｔ  Ｐｒｏｂｅ」を使用して、ハイブリダイゼーション溶液中のポリアルキレングリコールエーテルＢｒｉｊ（登録商標）−３５（同義語として、Ｂｒｉｊ（登録商標）−Ｌ２３またはポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテルとも呼ばれる）が、シグナル強度に及ぼす影響を調べた。ＩＳＨ手順ＩＩＩによるハイブリダイゼーションの実行およびハイブリダイゼーションプローブ「Ａｕｔｏ  ＲＯＳ１  Ｂｒｅａｋ  Ａｐａｒｔ  Ｐｒｏｂｅ」の特異性に関して、上の記載が参照される。
【０２２２】
ハイブリダイゼーション溶液Ｉ：それぞれ組成物に対し、１８重量％の硫酸デキストラン、６００ｍＭのＮａＣｌ、２２体積％のホルムアミド、１倍濃縮ＳＳＣバッファー、９．９５重量％のエチレンカーボネート、０．１μｇ／μｌのブロッキング安定化ＤＮＡおよび２ｎｇ／μｌの遺伝子座特異的ハイブリダイゼーションプローブ。
【０２２３】
ハイブリダイゼーション溶液ＩＩ〜ＩＶは、ハイブリダイゼーション溶液Ｉと比較して、Ｂｒｉｊ（登録商標）−３５濃度が、組成物に対して０．１２５重量％（ＩＩ）、０．２重量％（ＩＩＩ）、０．４重量％（ＩＶ）、０．９重量％（Ｖ）および１．８重量％（ＶＩ）と異なっていた。
【０２２４】
ハイブリダイゼーション溶液Ｉ（Ｂｒｉｊ（登録商標）−３５なし）を用いて、強力な遺伝子特異的ＲＯＳ１シグナル、低バックグラウンドおよび十分に保存された細胞および組織の構造が達成された。
【０２２５】
ハイブリダイゼーション溶液ＩＩ〜Ｖ（０．１２５重量％〜０．９重量％のＢｒｉｊ（登録商標）−３５濃度）で非常に強いシグナルが得られた。ハイブリダイゼーション溶液Ｉ（Ｂｒｉｊ（登録商標）−３５なし）と比較して、これらのより強いシグナルは、この理論に拘束されるつもりはないが、洗剤の使用に伴うより弱い核染色、したがってより良好なコントラスト（シグナル対バックグラウンド）に寄与するだろう。
【０２２６】
組成物に対して１．８重量％の濃度の洗剤Ｂｒｉｊ（登録商標）−３５を含有するハイブリダイゼーション溶液（ハイブリダイゼーション溶液ＶＩ）について平均強度のシグナルのみが得られた。
【０２２７】
＜好ましい実施形態＞
本発明の好ましい実施形態において、本発明は、以下のものに関する。
【０２２８】
１．組成物、特に、ハイブリダイゼーション（特に、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、好ましくは、自動化されたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）に使用するための、生体サンプル（好ましくは、１つ以上の細胞および／または１つ以上の核）における、特に、核酸（好ましくは、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）の同定および／または検出のための組成物であって、この組成物は、
（ａ）好ましくは遺伝子座特異的な、少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブ（「成分（ａ）」）と；
（ｂ）好ましくは環状分子構造を有する、少なくとも１つの極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒（「成分（ｂ）」）と；
（ｃ）組成物に対して１０体積％を超える量の少なくとも１つのカルボン酸アミドおよび／またはその塩（「成分（ｃ）」）、特にホルムアミドおよび／またはその塩とを含む、組成物。
【０２２９】
２．組成物（ａ）が、組成物に対して０．１ｎｇ／μｌ〜５０ｎｇ／μｌ、特に０．５ｎｇ／μｌ〜５０ｎｇ／μｌ、特に０．７ｎｇ／μｌ〜８ｎｇ／μｌ、好ましくは１ｎｇ／μｌ〜５ｎｇ／μｌの濃度の、好ましくは遺伝子座特異的な、少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブを含み；および／または
（ｂ）少なくとも１つの極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒が、ラクトン官能性、スルホン官能性、ニトリル官能性、カーボネート官能性および／またはアミド官能性を有する溶媒からなる群から選択され；および／または
（ｂ）少なくとも１つの極性非プロトン性または極性プロトン性溶媒が、エチレンカーボネート、ピロリドン、ラクタム、エチレンスルファイト、γ−ブチロラクトン、エチレントリチオカーボネート、プロピレンカーボネートおよび／またはスルホランからなる群から選択され、特に、エチレンカーボネートおよび／またはピロリドン、好ましくはエチレンカーボネートであり；および／または
（ｂ）好ましくは環状分子構造を有する、少なくとも１つの溶媒が、極性非プロトン性溶媒であり、特に、環状カーボネート（環状カーボネートエステル）、特に、アルキレングリコールの環状カーボネートエステル、好ましくはエチレンカーボネート（１，３−ジオキソラン−２−オン）およびプロピレンカーボネート、特に好ましくは、エチレンカーボネートおよび環状モノチオカーボネート、ジチオカーボネートおよびトリチオカーボネート、特にエチレンサルファイトおよびエチレントリチオカーボネートから選択され；および／または
（ｂ）好ましくは環状分子構造を有する、少なくとも１つの溶媒が、極性非プロトン性溶媒であり、特に、非プロトン性環状アミド（ラクタム）、特にＮ−アルキル置換ピロリドン、好ましくは、ｎ−メチル−２−ピロリドンおよび／またはＮ−エチル−２−ピロリドンから選択され；および／または
（ｂ）好ましくは環状分子構造を有する、少なくとも１つの溶媒が、極性プロトン性溶媒であり、特に、プロトン性環状アミド（ラクタム）、特にアミド窒素（ラクタム窒素）上に水素原子を有するプロトン性環状アミド（ラクタム）から選択され、好ましくは、２−ピロリドン（γ−ブチロラクタム）、３−ピロリドン、カプロラクタムおよび／または２−ピペリドン（バレロラクタム）からなる群から選択され、特に好ましくはピロリドン、最も特に好ましくは２−ピロリドン（γ−ブチロラクタム）であり；および／または
（ｂ）少なくとも１つの溶媒が、環状分子構造を有する極性プロトン性溶媒であり、前記環状分子構造が、窒素原子上に遊離水素原子を有するＮ−ヘテロ環を含み；
（ｂ）、好ましくは環状分子構造を有する、少なくとも１つの極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒が、γ−ブチロラクトン、２−ピロリドン（γ−ブチロラクタム）および／またはエチレンカーボネートからなる群から選択される、実施形態１に記載の組成物。
【０２３０】
３．前記組成物（ｂ）が、好ましくは環状分子構造を有する、少なくとも１つの極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒を核酸の変性を生じない量で含み、および／または前記組成物（ｂ）が、好ましくは環状分子構造を有する、少なくとも１つの極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒を、組成物に対して０．５〜４０体積％または重量％、特に、１〜３５体積％または重量％、特に２〜３０体積％または重量％、好ましくは、５〜２０体積％または重量％、特に好ましくは７〜１５体積％または重量％の範囲の量で含み、
組成物（ｂ）が、好ましくは環状分子構造を有する、少なくとも１つの極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒を少なくとも０．５体積％または重量％、特に、少なくとも１体積％または重量％、特に、少なくとも２体積％または重量％、好ましくは、少なくとも５体積％または重量％、特に好ましくは少なくとも７体積％または重量％、最も特に好ましくは少なくとも１０体積％または重量％の量で含み、および／または組成物（ｂ）は、好ましくは環状分子構造を有する、少なくとも１つの極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒を、組成物に対して５０体積％または重量％以下、特に、４０体積％または重量％以下、特に、３０体積％または重量％以下、好ましくは２０体積％または重量％以下、特に好ましくは１５体積％または重量％以下、最も特に好ましくは１３体積％または重量％以下の量で含む、実施形態１または２に記載の組成物。
【０２３１】
４．前記組成物（ｃ）が、少なくとも１つのカルボン酸アミドおよび／またはその塩、特にホルムアミドおよび／またはその塩を核酸の変性を生じない量で含み、および／または組成物（ｃ）が、少なくとも１つのカルボン酸アミドおよび／またはその塩、特にホルムアミドおよび／またはその塩を、組成物に対して１０〜６０体積％、特に１５〜５０体積％、特に、１７〜４０体積％、好ましくは２０〜３０体積％の範囲の量で含み；および／または
組成物（ｃ）が、少なくとも１つのカルボン酸アミドおよび／またはその塩、特にホルムアミドおよび／またはその塩を、組成物に対して少なくとも１０体積％、特に少なくとも１５体積％、特に少なくとも１７体積％、好ましくは少なくとも２０体積％の量で含み、および／または組成物（ｃ）が、少なくとも１つのカルボン酸アミドおよび／またはその塩、特にホルムアミドおよび／またはその塩を、組成物に対して６０体積％以下、特に５０体積％以下、特に４０体積％以下、好ましくは３０体積％以下の量で含み；および／または
組成物が、成分（ｂ）および成分（ｃ）、または少なくとも１つの極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒、好ましくは環状分子構造を有するもの、および少なくとも１つのカルボン酸アミドおよび／またはその塩、特にホルムアミドおよび／またはその塩を、１：１００〜５０：１、特に１：５０〜２０：１、特に１：２５〜１０：１、好ましくは１：１０〜５：１、特に好ましくは１：５〜１：１、最も特に好ましくは１：３〜１：２の範囲の体積比で含む、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の組成物。
【０２３２】
５．前記組成物が、少なくとも１つの多糖類（「成分（ｄ）」）、特にバイオ多糖類、特に中性のバイオ多糖類、好ましくはデキストランおよび／またはその誘導体または塩、特に好ましくは硫酸デキストランを含み、特に、組成物が、成分（ｄ）を、組成物に対して０．１〜５０重量％、特に１〜４０重量％、特に５〜３０重量％、好ましくは１０〜２０重量％、特に好ましくは１３〜１８重量％の量で含む、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の組成物。
【０２３３】
６．前記組成物が、少なくとも１つの化学バッファー系を、特にバッファー塩の形態で含み（「成分（ｅ）」）；
特に、化学バッファー系を使用して組成物のｐＨ値を一定に設定し、および／または保ち；および／または
特に、組成物（ｅ）は、化学バッファー系を、組成物に対し、化学バッファー系の全ての成分の合計として計算すると、０．００１〜５重量％、特に０．０１〜４重量％、特に０．１〜３重量％、好ましくは０．５〜２重量％、特に好ましくは１〜１．５重量％の量で含み；および／または
特に、化学バッファー系は、少なくとも１つの塩、特に、少なくとも１つのカルボン酸塩、特にクエン酸塩および／または少なくとも１つの無機塩、特に少なくとも１つのアルカリ塩および／またはアルカリ土類塩、好ましくは少なくとも１つのアルカリ塩化物および／またはアルカリ土類塩化物、特に好ましくは塩化ナトリウムを含み；および／または
化学バッファー系は、クエン酸系バッファー系および／またはクエン酸三ナトリウム／塩化三ナトリウムに基づくクエン酸系バッファー系であり；および／または
組成物は、ｐＨ値が５．０〜９．０の範囲、特に５．５〜８．５の範囲、特に６．０〜８．０の範囲、好ましくは６．５〜７．５の範囲である、実施形態１〜５のいずれか１つに記載の組成物。
【０２３４】
７．前記組成物が、少なくとも１つのブロッキング剤および／または安定化剤（「成分（ｆ）」）を含み、特に、ブロッキング剤および／または安定化剤が、核酸、好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡに基づき、特に、組成物（ｆ）は、少なくとも１つのブロッキング剤および／または安定化剤を、組成物に対して０．００１μｇ／μｌ〜１００μｇ／μｌ、特に０．００５μｇ／μｌ〜８０μｇ／μｌ、特に０．０１μｇ／μｌ〜４０μｇ／μｌ、好ましくは０．０５μｇ／μｌ〜２０μｇ／μｌ、特に好ましくは０．１μｇ／μｌ〜１０μｇ／μｌの濃度で含み；および／または
組成物は、少なくとも１つの無機塩（「成分（ｇ）」）、特にアルカリ塩および／またはアルカリ土類塩、好ましくはアルカリ塩化物および／またはアルカリ土類塩化物、特に好ましくは塩化ナトリウムを含み、特に、組成物（ｇ）は、少なくとも１つの無機塩を、組成物に対して０．０１〜１５重量％、特に０．０５〜１０重量％、特に０．１〜１０重量％、好ましくは０．５〜５重量％、特に、好ましくは１〜３重量％の量で含む、実施形態１〜６のいずれか１つに記載の組成物。
【０２３５】
８．前記組成物が、少なくとも１つの洗剤および／または界面活性剤（「成分（ｈ）」）を含み、特に、洗剤および／または界面活性剤が、非イオン性界面活性剤、ポリアルキレングリコールエーテル、特に好ましくはラウリルアルコールおよび／またはセチルアルコールおよび／またはセチルステアリルアルコールおよび／またはオレイルアルコールのポリアルキレングリコールエーテル、特にラウリルアルコールのポリアルキレングリコールエーテルから選択され、および／または特に、洗剤および／または界面活性剤は、ポリオキシエチレン（４）ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（９）ラウリルエーテルおよび／またはポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル、特にポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテルから選択され、および／または特に、組成物は、少なくとも１つの洗剤および／または界面活性剤を、組成物に対して０．００１〜５重量％、特に０．０１〜３重量％、特に０．０５〜２重量％、好ましくは０．１〜１．５重量％、特に好ましくは０．１２〜１重量％の範囲の量で含み；および／または
前記組成物は、水、特に精製水を、組成物に対して１０〜９９重量％、特に２０〜９５重量％、好ましくは３０〜９０重量％、特に好ましくは４０〜８５重量％の量で含み、および／または前記組成物は、担体（賦形剤）として水を含み、および／または前記組成物は水性であり、および／または前記組成物は、水を、全ての成分を含む合計が組成物に対して常に１００％または１００重量％となるような量で含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の組成物。
【０２３６】
９．組成物、特に、ハイブリダイゼーション（特に、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、好ましくは、自動化されたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）に使用するための、生体サンプル（好ましくは、１つ以上の細胞および／または１つ以上の核）における、特に、核酸（好ましくは、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）の同定および／または検出のための組成物、好ましくは、実施形態１〜８のいずれか１つに記載の組成物であって、この組成物は、
（ａ）特に、組成物に対して０．１ｎｇ／μｌ〜５０ｎｇ／μｌ、特に０．５ｎｇ／μｌ〜５０ｎｇ／μｌ、特に０．７ｎｇ／μｌ〜８ｎｇ／μｌ、好ましくは１ｎｇ／μｌ〜５ｎｇ／μｌの濃度の、好ましくは遺伝子座特異的な、少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブ（「成分（ａ）」）と；
（ｂ）特に、組成物に対して０．５〜４０体積％、特に１〜３５体積％、特に２〜３０体積％、好ましくは５〜２０体積％、特に好ましくは７〜１５体積％の濃度の、好ましくは環状分子構造を有する、少なくとも１つの極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒（「成分（ｂ）」）と；
（ｃ）特に、組成物に対して１０〜６０体積％、特に１５〜５０体積％、特に１７〜４０体積％、好ましくは２０〜３０体積％の量の少なくとも１つのカルボン酸アミドおよび／またはその塩（「成分（ｃ）」）、特にホルムアミドおよび／またはその塩と；
（ｄ）場合により、特に、組成物に対して０．１〜５０重量％、特に１〜４０重量％、特に５〜３０重量％、好ましくは１０〜２０重量％、特に好ましくは１３〜１８重量％の量の少なくとも１つの多糖類（「成分（ｄ）」）、特に、中性のバイオ多糖、好ましくはデキストランおよび／またはその誘導体または塩と；
（ｅ）場合により、化学バッファー系の全成分の合計として計算される場合、組成物に対して、特に０．００１〜５重量％、特に０．０１〜４重量％、特に０．１〜３重量％、好ましくは０．５〜２重量％、特に好ましくは１〜１．５重量％の量の、特に、バッファー塩の形態の、少なくとも１つの化学バッファー系（「成分（ｅ）」）と；
（ｆ）場合により、特に、組成物に対して０．００１μｇ／μｌ〜１００μｇ／μｌ、特に０．００５μｇ／μｌ〜８０μｇ、特に０．０１μｇ／μｌ〜４０μｇ／μｌ、好ましくは０．０５μｇ／μｌ〜２０μｇ／μｌ、特に好ましくは０．１μｇ／μｌ〜１０μｇ／μｌの濃度の少なくとも１つのブロッキング剤および／または安定化剤（「成分（ｆ）」）と；
（ｇ）場合により、特に、組成物に対して、０．０１〜１５重量％、特に０．０５〜１０重量％、特に０．１〜１０重量％、好ましくは０．５〜５重量％、特に好ましくは１〜３重量％の量の少なくとも１つの無機塩（「成分（ｇ）」）、特にアルカリ塩および／またはアルカリ土類塩、好ましくはアルカリ塩化物および／またはアルカリ土類塩化物、特に好ましくは塩化ナトリウムと；
（ｈ）場合により、特に、組成物に対して０．００１〜５重量％、特に０．０１〜３重量％、特に０．０５〜２重量％、好ましくは０．１〜１．５重量％、特に好ましくは０．１２〜１重量％の量の少なくとも１つの洗剤および／または界面活性剤（「成分（ｈ）」）とを含む、組成物。
【０２３７】
１０．組成物、特に、ハイブリダイゼーション（特に、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、好ましくは、自動化されたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）に使用するための、生体サンプル（好ましくは、１つ以上の細胞および／または１つ以上の核）における、特に、核酸（好ましくは、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）の同定および／または検出のための組成物、好ましくは、実施形態１〜９のいずれか１つに記載の組成物であって、この組成物は、
（ａ）特に、組成物に対して０．１ｎｇ／μｌ〜５０ｎｇ／μｌ、特に０．５ｎｇ／μｌ〜５０ｎｇ／μｌ、特に０．７ｎｇ／μｌ〜８ｎｇ／μｌ、好ましくは１ｎｇ／μｌ〜５ｎｇ／μｌの濃度の、好ましくは遺伝子座特異的な、少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブ（「成分（ａ）」）と；
（ｂ）特に、組成物に対して０．５〜４０体積％、特に１〜３５体積％、特に２〜３０体積％、好ましくは５〜２０体積％、特に好ましくは７〜１５体積％の量の、好ましくは環状分子構造を有する、少なくとも１つの極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒（「成分（ｂ）」）、好ましくは、γ−ブチロラクトン、２−ピロリドン（γ−ブチロラクタム）および／またはエチレンカーボネートと；
（ｃ）特に、組成物に対して１０〜６０体積％、特に１５〜５０体積％、特に１７〜４０体積％、好ましくは２０〜３０体積％の量のホルムアミドおよび／またはその塩（「成分（ｃ）」）と；
（ｄ）場合により、特に、組成物に対して０．１〜５０重量％、特に１〜４０重量％、特に５〜３０重量％、好ましくは１０〜２０重量％、特に好ましくは１３〜１８重量％の量のデキストランおよび／またはその誘導体または塩（「成分（ｄ）」）と；
（ｅ）場合により、化学バッファー系の全成分の合計として計算される場合、組成物に対して、特に０．００１〜５重量％、特に０．０１〜４重量％、特に０．１〜３重量％、好ましくは０．５〜２重量％、特に好ましくは１〜１．５重量％の量の、特に、バッファー塩の形態の、少なくとも１つの化学バッファー系、好ましくはクエン酸塩および／または塩化ナトリウム（「成分（ｅ）」）と；
（ｆ）場合により、特に、組成物に対して０．００１μｇ／μｌ〜１００μｇ／μｌ、特に０．００５μｇ／μｌ〜８０μｇ、特に０．０１μｇ／μｌ〜４０μｇ／μｌ、好ましくは０．０５μｇ／μｌ〜２０μｇ／μｌ、特に好ましくは０．１μｇ／μｌ〜１０μｇ／μｌの濃度の少なくとも１つのブロッキング剤および／または安定化剤（「成分（ｆ）」）と；
（ｇ）場合により、特に、組成物に対して、０．０１〜１５重量％、特に０．０５〜１０重量％、特に０．１〜１０重量％、好ましくは０．５〜５重量％、特に好ましくは１〜３重量％の量の少なくとも１つの無機塩（「成分（ｇ）」）、特にアルカリ塩および／またはアルカリ土類塩、好ましくはアルカリ塩化物および／またはアルカリ土類塩化物、特に好ましくは塩化ナトリウムと；
（ｈ）場合により、特に、組成物に対して０．００１〜５重量％、特に０．０１〜３重量％、特に０．０５〜２重量％、好ましくは０．１〜１．５重量％、特に好ましくは０．１２〜１重量％の量の少なくとも１つのポリアルキレングリコールエーテル（「成分（ｈ）」）とを含む、組成物。
【０２３８】
１１．ハイブリダイゼーション（特に、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、好ましくは、自動化されたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）を用いた、生体サンプル（好ましくは、１つ以上の細胞および／または１つ以上の核）における、特に、核酸（好ましくは、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）の同定および／または検出のための実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の組成物の使用。
【０２３９】
１２．実施例１〜１０のいずれか１つに記載の組成物を用い、ハイブリダイゼーション（特に、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、好ましくは、自動化されたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）によって、生体サンプル（好ましくは、１つ以上の細胞および／または１つ以上の核）において、核酸（好ましくは、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）および／または染色体異常を検出するための方法。
【０２４０】
１３．ハイブリダイゼーション（特に、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、好ましくは、自動化されたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）によって、生体サンプル（好ましくは、１つ以上の細胞および／または１つ以上の核）において、核酸（好ましくは、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）および／または染色体異常を検出するための方法、特に、実施形態１２に記載の方法であって、
この方法が、以下の工程：
（ａ）ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのために、特に１つ以上の細胞および／または１つ以上の核に基づき、好ましくは、組織の形態で、生体サンプルを提供する工程と；
（ｂ）ハイブリダイゼーションに使用するための組成物、特に、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の組成物を提供する工程と、ここで、この組成物が、好ましくは遺伝子座特異的な、少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブ（「成分（ａ）」）；少なくとも１つの極性プロトン性溶媒または極性非プロトン性溶媒、好ましくは環状分子構造を有するもの（「成分（ｂ）」）；および組成物に対して１０体積％を超える量の少なくとも１つのカルボン酸アミドおよび／またはその塩、特に、ホルムアミドおよび／またはその塩（「成分（ｃ）」）を含み；
（ｃ）方法工程（ａ）からの生体サンプルを、方法工程（ｂ）からの組成物と接触させる工程と；
（ｄ）方法工程（ａ）からの生体サンプルと、方法工程（ｂ）からの組成物とを変性させる工程と、ここで、この生体サンプルおよび組成物が、特に、方法工程（ｃ）を行う前、または合わせて、特に、方法工程（ｃ）を行った後に、互いに別に変性され；
（ｅ）続いて、前記組成物に含まれる、好ましくは遺伝子座特異的な、少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブと、前記生体サンプルに含まれる核酸をハイブリダイズする工程と；
（ｆ）続いて、好ましくは遺伝子座特異的な、ハイブリダイズしたハイブリダイゼーションプローブおよび／または前記生体サンプル中で検出されるべき核酸を検出する工程とを含む、方法。
【０２４１】
１４．前記方法が、自動化されたシステムおよび／または自動で実施され；および／または
方法工程（ｃ）の組成物が、０．０１〜５，０００μｌ、特に０．１〜２，５００μｌ、特に１〜１，５００μｌ、好ましくは２〜１，０００μｌ、特に好ましくは１〜５００μｌ、最も好ましくは２０〜２５０μｌ、さらにより好ましくは４０〜１５０μｌの範囲の量で使用され；および／または
方法工程（ｅ）が、移動しつつ、特に、波状および／または連続的な移動で行われ；および／または
方法工程（ｅ）が、短いハイブリダイゼーション時間および長いハイブリダイゼーション時間で行われ；および／または
方法工程（ｅ）が、１０分間〜２４０分間、特に３０分〜１８０分、特に６０分〜１５０分、好ましくは９０分〜１３０分の範囲内の時間で実施されるか、または方法工程（ｅ）が、１時間〜１００時間、特に２時間〜８０時間、特に３時間〜５０時間、好ましくは４時間〜３０時間、特に好ましくは５時間〜２５時間、さらにより好ましくは８時間〜２０時間の範囲内の時間で実施される、実施形態１３に記載の方法。
【０２４２】
１５．ハイブリダイゼーション（特に、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、好ましくは、自動化されたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）によって、生体サンプル（好ましくは、１つ以上の細胞および／または１つ以上の核）において、核酸（好ましくは、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）および／または染色体異常を検出するためのキット（部品またはシステムのキット）であって、このキットが、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の組成物を含み、および／またはキットが、実施形態１２〜１４のいずれか１つに記載の方法を実施することを意図しており、および／またはこの方法を実施するために使用される、キット。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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