(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えデルマトポンチンを有効成分として含む、対象の代謝疾患を処置するための薬剤であって、該代謝疾患が体重増加、食事起因性体重増加、肥満、病的肥満、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、および心血管疾患からなる群から選択される薬剤。
【請求項２】
前記組換えデルマトポンチンが、ヒト、ウシ、ブタ、またはネズミ起源のものである、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
前記組換えデルマトポンチンが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号４からなる群から選択される配列を含む、請求項１または２に記載の薬剤。
【請求項４】
前記組換えデルマトポンチンが、配列番号１を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項５】
前記組換えデルマトポンチンが、翻訳後修飾されている、請求項１から４のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項６】
前記組換えデルマトポンチンが、Ｃ末端またはＮ末端にて修飾されているか、任意に検出タグおよび／または特徴付けタグを含む、請求項１から5のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項７】
前記組換えデルマトポンチンが、そのＮ末端の分泌シグナルを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項８】
前記分泌シグナルが、配列番号６、配列番号７、および配列番号８からなる群から選択される配列を含む、請求項７に記載の薬剤。
【請求項９】
前記組換えデルマトポンチンの核酸配列が、配列番号５からなる、請求項１から８のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項１０】
前記組換えデルマトポンチンが、少なくとも１種、または２種以上の治療剤とともに投与されることになる、請求項１から９のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項１１】
前記投与が、同時に、別々に、または連続してなされる、請求項１0に記載の薬剤。
【請求項１２】
前記組換えデルマトポンチンが、０．１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇの量にて投与されることになる、請求項１から１１のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項１３】
前記組換えデルマトポンチンが、毎日、毎週、週２回、週３回、２週毎、または毎月投与されることになる、請求項１から１２のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項１４】
前記対象がヒトである、請求項１から１３のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項１５】
代謝疾患が、体重増加、食事起因性体重増加、肥満、病的肥満、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、および心血管疾患からなる群から選択される、前記代謝疾患を処置するための薬剤の製造における前記請求項１から９のうちのいずれか一項に記載された組換えデルマトポンチンの使用。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１５年２月１１日出願のシンガポール仮特許出願第１０２０１５０１０５３Ｑ号明細書の優先権の利益を主張し、その内容は、全ての目的について、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、概して、バイオテクノロジーの分野に関する。特に、本発明は、タンパク質バイオテクノロジーの分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
代謝疾患、例えば、心血管疾患、糖尿病、および肥満が、世界的に流行しており、糖尿病だけで約３億８２００万人が罹患している。現在、糖尿病と闘うのに有効な薬物は、限られている。一アプローチとして、血液中の循環因子の生物学的影響を乗っ取って、全身の代謝を向上させるものがある。肝臓、筋肉、および脂肪組織から分泌される、それぞれＦＧＦ−２１、イリシン、およびアディポネクチン等の因子が、エネルギーホメオスタシスの種々な様相を調節することによって、全身の代謝を向上させることが以前に実証されている。
【０００４】
したがって、代謝関連疾患の処置のための新たな治療標的を同定する必要がある。
【発明の概要】
【０００５】
一態様において、本発明は、対象の代謝疾患を処置する方法に言及し、当該方法は、対象への組換えデルマトポンチンの投与を含む。
【０００６】
別の態様において、本発明は、代謝疾患および肥満に対する対象の感受性を判定または予測する方法に言及し、当該方法は、対象から得られたサンプル中の循環デルマトポンチンのレベルを測定することと；得られた循環デルマトポンチンのレベルを、コントロールにおいて先に判定されたデルマトポンチンのレベルと比較することと；循環デルマトポンチンのレベルと、コントロールにおけるデルマトポンチンのレベルとの差異に基づいて、代謝疾患および肥満に対する対象の感受性を判定することとを含む。
【０００７】
別の態様において、本発明は、代謝疾患を処置する方法であって、本明細書中で定義される組換えデルマトポンチンを含む方法に言及する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
詳細な説明を参照して、非限定的な実施例および添付の図面と併せて考慮した場合に、本発明はよりよく理解されるであろう。
【０００９】
【図１】図１は、肥満マウスモデルにおける組換えデルマトポンチン（ｒＤＰＴ）の効果を要約する概略図を示す。この要約は、肥満モデルマウスに組換えデルマトポンチンを投与すると、コントロール（生理食塩水）を投与した肥満モデルマウスと比較して、体脂肪が減少し、体重増加がより小さくなり、グルコースクリアランスがより良好になり、インスリン感受性がより高くなり、エネルギー消費が増大し、そして代謝が向上することを示している。
【００１０】
図２は、マウスモデルにおける組換えデルマトポンチン（ｒＤＰＴ）の投与の結果を示す。まとめると、このデータは、ビヒクル（生理食塩水）を投与したマウスと比較して、組換えデルマトポンチンの注射が、全身のエネルギー消費を増大させて、全身の代謝を向上させることを示している。
【図２Ａ】図２Ａは、ヒトＤＰＴ遺伝子を発現するように操作された酵母系において産生された組換えデルマトポンチンのクーマシブルー染色（左側の列）およびウェスタンブロット（右側の列）を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ビヒクル（ネガティブコントロール）または組換えデルマトポンチン（ｒＤＰＴ）で処置されたマウスの体重の変化を示す折れ線グラフであり、ｒＤＰＴ処置マウスが、より小さい体重増加を経時的に示したことを示している。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ビヒクル注射マウスまたは組換えデルマトポンチン（ｒＤＰＴ）注射マウスにおける総除脂肪量（ｌｅａｎ  ｍａｓｓ）および総脂肪量の分布を（パーセンテージで）示す棒グラフである。これは、ｒＤＰＴで処置したマウスが、ビヒクルで処置したマウスと比較して、除脂肪量のパーセンテージがより高いことを示している。
【図２Ｄ】図２Ｄは、処置後４週目にビヒクル注射したマウスまたは組換えデルマトポンチン（ｒＤＰＴ）注射したマウスに実行したグルコース耐性試験（ＧＴＴ）の結果を示す折れ線グラフであり、ｒＤＰＴ処置マウスは、ビヒクル処置マウスと比較して、グルコース摂取後の血中グルコースレベルが全体的により低いことを示している。
【図２Ｅ】図２Ｅは、先に図２Ｄで示したグルコース耐性試験（ＧＴＴ）データについての曲線下面積（ＡＵＣ）を表す棒グラフを示しているが、それによるとｒＤＰＴ処置マウスについて判定したＡＵＣは、ビヒクル処置マウスについて判定したＡＵＣ未満である。
【図２Ｆ】図２Ｆは、処置後９週目にビヒクルで処置したマウス群および組換えデルマトポンチン（ｒＤＰＴ）で処置したマウス群に実行したインスリン耐性試験（ＩＴＴ）の結果を示す折れ線グラフである。このデータは、ｒＤＰＴで処置したマウスが、ビヒクルで処置したマウスよりも血中グルコースレベルが低いことを示している。
【図２Ｇ】図２Ｇは、先に図２Ｆで示したインスリン耐性試験の曲線上面積（ＡＡＣ）を表す棒グラフを示す。曲線上面積（ＡＡＣ）は、「曲線下面積」と類似の数学的概念であり（定積分である）、一定期間にわたって観察された変数の総濃度を判定するのに一般的に用いられている。当該例についての曲線上面積（ＡＡＣ）を得るには、最初に、曲線下面積（ＡＵＣ）値を算出する。ＡＵＣを算出するために、台形面積の合計を、１５、３０、４５、６０、および９０分の時点について算出する。ＡＡＣを算出するために、グラフの総面積からＡＵＣ値を減算する（例えば、ｘ軸上の０から１２に、ｙ軸の０から９０を掛ける）。この例では、ＡＡＣを用いて、インスリン注射後の血流中のグルコース濃度を判定する。
【図２Ｈ】図２Ｈは、処置後１１週目にビヒクル（生理食塩水）で処置したマウス群または組換えデルマトポンチン（ｒＤＰＴ）で処置したマウス群のエネルギー消費を示す折れ線グラフ（各データ点について算出した個々の標準偏差を含む）を示す。このグラフは、ｒＤＰＴ処置マウスが、生理食塩水処置マウスと比較して、明期間および暗期間の双方でエネルギー消費の増大を示すことを示している。
【図２Ｉ】図２Ｉは、先に図２Ｈで示したエネルギー消費の、定量化した平均エネルギー消費を示す棒グラフであり、さらに、ｒＤＰＴ処置マウスの平均エネルギー消費が、ビヒクル処置マウスの平均エネルギー消費と比較して、全体的に高いことを示している。以下の基準を、図２の全てに用いている：ビヒクル注射群についてはｎ＝４であり、ｒＤＰＴ注射群についてはｎ＝５である。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５。
【００１１】
図３は、デルマトポンチンが皮下脂肪において高度に発現されて、脂肪細胞によって分泌されていることを示すデータを示す。ケラチン１０（成熟皮膚マーカ）をポジティブコントロールとして用いて、デルマトポンチンの相対的ｍＲＮＡレベルを、図３Ａおよび図３Ｂの棒グラフにそれぞれ示す。
【図３Ａ】図３Ａは、皮下組織中に存在するデルマトポンチンの最も高い発現を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、皮膚のみに限定されているケラチン１０（皮膚マーカ、ポジティブコントロール）の発現を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、デルマトポンチン（ＤＰＴ）に対する抗体、グルコーストランスポータタイプ４（ＧＬＵＴ４）、およびタンパク質１４−３−３を用いて、野生型マウスおよびデルマトポンチンノックアウト（ＤＰＴ  ＫＯ）マウスの種々の組織から単離した細胞溶解物のウェスタンブロット画像を示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、デルマトポンチン（ＤＰＴ）に対する抗体、およびタンパク質１４−３−３を用いて、野生型マウスおよびデルマトポンチンノックアウト（ＤＰＴ  ＫＯ）マウスの種々の組織から単離した細胞溶解物のウェスタンブロット画像を示す。このデータは、図３Ａにおいて定量的に判定したのと同じサンプルにおける、局在化することになるデルマトポンチンの発現を示し、デルマトポンチンノックアウトマウスにおいてデルマトポンチン発現が効果的に妨げられていることも確認される。
【図３Ｅ】図３Ｅは、デルマトポンチン（ＤＰＴ）に対する抗体、褐色脂肪組織マーカ脱カップリングタンパク質１（ＵＣＰ１）、脂肪組織マーカグルコーストランスポータタイプ４（ＧＬＵＴ４）、および遍在タンパク質１４−３−３を用いてイムノブロットした、３つの異なる脂肪蓄積物からの一次脂肪細胞由来の溶解物のウェスタンブロットを示し、単離した脂肪蓄積物が褐色脂肪組織を含むことを確認する同定コントロール（ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ）として、ＵＣＰ１が提供されている。ＧＬＵＴ４は、全ての脂肪組織において高度に発現されるので、単離した組織が脂肪組織であるというポジティブコントロールとして機能する。遍在タンパク質１４−３−３は、全般的タンパク質マーカとして機能する。
【図３Ｆ】図３Ｆは、３Ｔ３−Ｌ１線維芽細胞の、脂肪細胞への時間経過分化のウェスタンブロットの画像を示す。細胞溶解物を、指示した時点にて収穫して、デルマトポンチン（ＤＰＴ）に対する抗体、グルコーストランスポータタイプ４（ＧＬＵＴ４）、およびタンパク質１４−３−３でイムノブロットした。ここに示すデータは、脂肪細胞中に存在するＤＰＴのレベルが、時間経過とともに細胞が分化するにつれて増大することを示している。
【図３Ｇ】図３Ｇは、デルマトポンチン（ＤＰＴ）に対する抗体でイムノブロットした、野生型またはデルマトポンチンノックアウト（ＤＰＴ  ＫＯマウス）から単離した血清サンプルのウェスタンブロットを示す。ここに示す非特異的なバンドは、ローディングコントロールとして機能する。
【図３Ｈ】図３Ｈは、血清フリー培地中でインキュベートした、デルマトポンチン（ＤＰＴ）−ｍｙｃを発現する３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞のウェスタンブロット分析の結果を示す画像を示す。培地および細胞溶解物を、指示した時点にて収穫して、ｍｙｃおよび脂肪酸結合タンパク質４（ＦＡＢＰ４、脂肪細胞における脂質輸送タンパク質）についてイムノブロットした。このデータは、デルマトポンチンが細胞中にも存在すると同時に、主に培地中に分泌されている一方で、ＦＡＢＰ４は、細胞溶解物中に主に存在することを示し、ＦＡＢＰ４が細胞外に分泌されないことを示している。
【図３Ｉ】図３Ｉは、示した化合物で６時間処理した、ＤＰＴ−ｍｙｃを発現する３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞のウェスタンブロットを示す。ブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）は、小胞体およびゴルジの機能を阻害する化合物である。インスリン（Ｉｎｓ）は、多くのシグナル伝達事象を誘発するホルモンであり、脂肪細胞において多くの分泌事象を誘導することが実証されている。細胞溶解物および培地を収穫して、ｍｙｃに対する抗体、アディポネクチン、脂肪酸結合タンパク質４（ＦＡＢＰ４、脂肪細胞における脂質輸送タンパク質）、およびプロテインキナーゼｂ（ＡＫＴ）を用いてイムノブロットした。アディポネクチンおよびＦＡＢＰ４は双方とも、この実験において実行したそれぞれの処理について、コントロールタンパク質として機能する。アディポネクチンは、ブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）処理に感受性である脂肪細胞から分泌される既知の因子である（すなわち、ＢＦＡの存在下では、アディポネクチンは培地中に分泌されない）。アディポネクチンの存在または不在は、既知の分泌タンパク質に及ぼすＢＦＡの効果について、コントロールとして機能する。ゆえに、ＢＦＡ処理はまた、分泌タンパク質でもあるデルマトポンチンに有効であることも示される。ＦＡＢＰ４分泌は、ＢＦＡによって影響を受けないことが知られているので、ＢＦＡ処理のネガティブコントロールとして機能する。インスリンは、アディポネクチン分泌の既知のトリガーであり、本実験において実証した。デルマトポンチンのレベルは、インスリンの存在下で変化しないことが分かる。プロテインキナーゼｂ（ＡＫＴ）は、総細胞溶解物についてのローディングコントロールとして機能し、そしてまた、細胞培養培地が死細胞破片を含有しないことを示すコントロールとしても機能する。細胞破片が細胞培養培地中に存在する場合、ＡＫＴは、培地パネルについてのウェスタンブロット分析において、検出可能であろう。
【００１２】
図４は、２つの脂肪蓄積物および血清におけるデルマトポンチン（ＤＰＴ）レベルが、マウスの体重と相関することを示すデータを示す。
【図４Ａ】図４Ａは、ＣＨＯＷマウス、食物制限マウス、および高脂肪食（ＨＦＤ）マウスの皮下および内臓脂肪組織のウェスタンブロット、ならびに対応する、デルマトポンチン（ＤＰＴ）およびヒートショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）の、結果として生じた発現の結果をそれぞれ示す画像を示している。デルマトポンチンレベルは、高脂肪食（ＨＦＤ）マウスの場合にはより高く、食物制限マウスの場合にはより低く、ＣＨＯＷ飼育マウスでは中間のＤＰＴレベルを示すことが示されている。
【図４Ｂ】図４Ｂは、図４Ａに示すデータの定量化を表す棒グラフを示している。
【図４Ｃ】図４Ｃは、それぞれの体重に対する皮下（左のパネル）、内臓（中央のパネル）脂肪、および血清（右のパネル）のデルマトポンチン（ＤＰＴ）レベルの折れ線グラフの相関を示す。この図では、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５である。
【００１３】
図５は、高脂肪食を与えたマウスにおいて、血清中のデルマトポンチン（ＤＰＴ）レベルが経時的に増大していることを示す。
【図５Ａ】図５Ａは、標準的なＣＨＯＷ食または高脂肪食（ＨＦＤ）をそれぞれ与えたマウスの体重の増加を示す折れ線グラフである。ＨＦＤ飼育マウスは、ＣＨＯＷ飼育マウスと比較して、同じ期間内でより大きな体重増加を示した。
【図５Ｂ】図５Ｂは、示した週にて採血して、デルマトポンチン（ＤＰＴ）についてイムノブロットしたマウスの血清のウェスタンブロットを示し、ＨＦＤマウスにおいて検出したＤＰＴの量は、ＣＨＯＷ飼育マウスについて検出したＤＰＴレベルと比較して、増大していることを示している。
【図５Ｃ】図５Ｃは、先に図５Ｂ）で示したデルマトポンチン（ＤＰＴ）レベルの定量化を示す折れ線グラフを示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５。
【００１４】
図６は、高脂肪食を出した場合に、全身デルマトポンチンノックアウトマウス系統の体重が増加し、かつエネルギー消費が低下したことを示すデータを示す。
【図６Ａ】図６Ａは、野生型（ＷＴ）マウス対デルマトポンチンノックアウト（ＫＯ）マウスの体重を示す折れ線グラフを示し、ＫＯマウスは、ＷＴマウスと比較して、より大きな体重増加を示したことを示している。
【図６Ｂ】図６Ｂは、野生型マウス対デルマトポンチンノックアウト（ＤＰＴ  ＫＯ）マウスの除脂肪量および脂肪量の分布を示す棒グラフを示す。このグラフは、マウスに存在する除脂肪量が、ＤＰＴ  ＫＯマウスとＷＴマウスとの間で類似しているが、ＤＰＴ  ＫＯマウスは、ＷＴマウスと比較して、より高い脂肪量を示すことを示している。
【図６Ｃ】図６Ｃは、野生型（ＷＴ）マウス対デルマトポンチンノックアウト（ＤＰＴ  ＫＯ）マウスの、明期間（ｘ軸上の白色の水平バー）および暗期間（ｘ軸上の黒色の水平バー）におけるエネルギー消費を示す折れ線グラフを示す。このグラフは、ＤＰＴ  ＫＯマウスの全体的なエネルギー消費が、ＷＴマウスのエネルギー消費よりも低かったことを示している。
【図６Ｄ】図６Ｄは、先に図６Ｃで示したマウスの平均エネルギー消費を示す棒グラフを示し、これは、図６Ｃで提供したデータの定量化である。図６について、以下の基準を用いる：１群あたりｎ＝４、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００５。
【図７】図７は、ヒト、ネズミ、ウシ、およびブタのデルマトポンチンのアライメント分析を示し、タンパク質配列が互いにいかに密接に関連しているかを示している。マウス、ウシ、ヒト、およびブタのデルマトポンチン配列を、標準的なタンパク質アライメントプログラムを用いて比較したところ、当該配列が様々な種にわたって高度に保存されていることを示している。
【００１５】
図８は、高脂肪食のマウスへの組換えデルマトポンチン（ｒＤＰＴ）注射の効果を示すデータを示す。
【図８Ａ】図８Ａは、マウスから得た種々の測定値、例えば呼吸商（ＲＥＲ）を示すヒストグラムを示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ビヒクルまたは組換えデルマトポンチン（ｒＤＰＴ）を注射したマウスのＸ軸運動示すヒストグラムを示す。
【図８Ｃ】図８Ｃは、ビヒクルまたは組換えデルマトポンチン（ｒＤＰＴ）を注射したマウスのＹ軸運動を示すヒストグラムを示す。
【図８Ｄ】図８Ｄは、ビヒクルまたは組換えデルマトポンチン（ｒＤＰＴ）を注射したマウスの食物摂取量を示すヒストグラムを示す。
【図８Ｅ】図８Ｅは、ビヒクルまたは組換えデルマトポンチン（ｒＤＰＴ）を注射したマウスの水摂取量を示すヒストグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
定義
【００１７】
本明細書中で用いられる用語「組換え」は、天然に存在しない、または人工的に作製された核酸配列またはペプチド配列を指す。化学合成によって、またはより一般的には、核酸の単離セグメントの人為的操作によって、例えば遺伝子工学技術によって、人工的な組合せが多くの場合達成される。同様に、組換えタンパク質は、組換え核酸分子によってコードされ得るタンパク質である。例えば、ヒトの体によって産生され、かつ単離されたデルマトポンチンは、組換え体であるとはみなされない。
【００１８】
本明細書中で定義される用語「ペプチド」、「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「アミノ酸配列」は、本明細書中で互換的に用いられて、あらゆる長さのアミノ酸残基のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖であっても分枝鎖であってもよく、修飾アミノ酸を含んでもアミノ酸類似体を含んでもよく、アミノ酸以外の化学部分によって中断されていてもよい。当該用語はまた、天然に、または介入によって修飾された（例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または他のあらゆる操作もしくは修飾、例えば標識成分または生物活性成分との結合）アミノ酸ポリマーを包含する。用語ペプチドは、共有結合（例えばアミド結合）によって連結されている、２つ以上の天然に存在するアミノ酸または合成アミノ酸を包含する。アミノ酸残基は、アミド結合を介して結合する。アミノ酸がアルファ−アミノ酸である場合、Ｌ−光学異性体またはＤ−光学異性体のいずれかが用いられ得、Ｌ−異性体が事実上好ましい。本明細書中で用いられる用語ポリペプチドまたはタンパク質は、あらゆるアミノ酸配列を包含し、限定されなくてよいが、糖タンパク質等の修飾配列を含む。用語ポリペプチドは具体的に、天然に存在するタンパク質、および組換えまたは合成により生産されるタンパク質をカバーすることが意図される。本明細書中で用いられる実質的に精製されたポリペプチドは、他のタンパク質、脂質、炭水化物、または天然では結合している他の物質を実質的に含まないポリペプチドを指す。一実施形態において、ポリペプチドは、他のタンパク質、脂質、炭水化物、または天然では結合している他の物質を少なくとも５０％、例えば少なくとも８０％含まない。別の実施形態において、ポリペプチドは、他のタンパク質、脂質、炭水化物、または天然では結合している他の物質を少なくとも９０％含まない。さらに別の実施形態において、ポリペプチドは、他のタンパク質、脂質、炭水化物、または天然では結合している他の物質を少なくとも９５％含まない。
【００１９】
機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的アミノ酸置換の表が、当業者に周知である。以下の６つのグループは、互いに保存的な置換であると考えられているアミノ酸の例である：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）である。
【００２０】
非保存的アミノ酸置換は：（ａ）置換領域におけるアミノ酸骨格の構造；（ｂ）アミノ酸の電荷もしくは疎水性；または（ｃ）アミノ酸側鎖の大きさの変化に由来し得る。タンパク質特性の最大の変化をもたらすと一般に予想される置換は、以下のような置換である：（ａ）親水性残基が疎水性残基と置換される；（ｂ）プロリンが他のあらゆる残基と置換される；（ｃ）側鎖が大きな残基、例えばフェニルアラニンが、側鎖を持たない残基、例えばグリシンと置換される；または（ｄ）電気陽性側鎖を有する残基、例えばリシル、アルギニル、もしくはヒスタジルが、電気陰性残基、例えばグルタミルもしくはアスパルチルと置換される。
【００２１】
変異アミノ酸配列は、例えば、天然のアミノ酸配列と８０、９０、９５、または９８％同一であり得る。同一性のパーセンテージを判定するプログラムおよびアルゴリズムは、当該技術において知られている方法に従って実施され得る。
【００２２】
本明細書中で用いられる用語「処置」は、疾患状態または症状を改善し、疾患の確立を予防し、またはそれ以外では疾患もしくは他の不所望の症状の進行を何らかの形で予防する、阻害する、遅らせる、もしくは回復に向かわせる全ての使用を指す。
【００２３】
本明細書中で用いられる用語「処置する」または「処置すること」は、疾患状態および／または疾患状態の症状、ならびに弱まった状態および／または不健康な状態を軽減または排除するために、予防的に作用して、弱まった状態および／または不健全な状態の進行を予防するのに十分な、医薬的に有効な量のペプチドまたはそのそれぞれの医薬組成物もしくは医薬を提供すること；ならびに／あるいは対象に、十分な量の複合体、またはその医薬組成物もしくは医薬を提供することを指すことが意図される。
【００２４】
本明細書中で用いられる用語「翻訳後修飾」は、通常リボソームによる翻訳が完了した後の、一般に酵素によって触媒される、タンパク質上で起こる修飾を指す。翻訳後修飾は一般に、例えばリン酸化およびネディレーション（ｎｅｄｄｙｌａｔｉｏｎ）における、タンパク質への官能基の共有結合的な付加を指すが、タンパク質が機能的に成熟するのに必要なタンパク質分解プロセシングおよび折畳みプロセスをも指す。タンパク質の翻訳後修飾は、官能基もしくはタンパク質の共有結合的付加、調節サブユニットのタンパク質分解開裂、またはタンパク質全体の分解によって、プロテオームの機能的多様性を増大させる。当該修飾として、リン酸化、グリコシル化、硫酸化、ビオチン化、ヒドロキシル化、アセチル化、ユビキチン化、ニトロシル化、メチル化、アセチル化、脂質化、およびタンパク質分解が挙げられるが、これらに限定されず、そして当該修飾は、正常な細胞の生物学および病因のほぼ全ての様相に影響を及ぼす。翻訳後修飾は、タンパク質の「ライフサイクル」におけるあらゆる段階にて起こり得る。例えば、多くのタンパク質は、翻訳が完了して、適切なタンパク質の折畳みもしくは安定性を媒介し、または新生タンパク質を、別個の細胞コンパートメントに（例えば、核または細胞膜に）導いた直後に、修飾される。折畳みおよび局在化が完了して、触媒活性を活性化もしくは不活化し、またはそれ以外ではタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼした後に、他の修飾が起こる。タンパク質は通常、分解のためにタンパク質を標的とするタグに共有結合している。単一の修飾の他に、タンパク質は多くの場合、タンパク質の成熟または活性化の段階的な機構を通した、翻訳後開裂と官能基の付加との組合せを通じて、修飾される。タンパク質の翻訳後修飾はまた、修飾の性質に応じて可逆的であり得る。例えば、キナーゼは、特定のアミノ酸側鎖にてタンパク質をリン酸化するが、これは、触媒的な活性化または不活化の普通にみられる方法である。逆に、ホスファターゼは、リン酸基を加水分解して、リン酸基をタンパク質から除去することによって、前記タンパク質の生物学的活性を逆にし得る。ペプチド結合のタンパク質分解開裂は、熱力学的に有利な反応であるので、ペプチド配列または調節ドメインを永久に除去する。
【００２５】
本開示において、他のタンパク質修飾もまた考慮される。例えば、タンパク質タグとしても知られている外来ペプチド配列の、タンパク質への付加による、タンパク質の修飾。当該ペプチド配列は、組換えタンパク質の末端上に遺伝的に付与され、化学物質を用いて、または酵素的手段、例えばタンパク質分解もしくはインテインスプライシングによって除去され得る。タンパク質タグは、例えば、検出、特徴付け、精製、またはこれらの目的のあらゆる組合せといった種々の目的で、タンパク質に付着する。例えば、抗体を用いて検出することが普通であれば困難であるタンパク質に、エピトープタグが加えられてよい。また、他の用途として、そのようなタンパク質タグによって推論される物理化学的性質に基づいた、小規模タンパク質精製または大規模タンパク質精製が挙げられる。タンパク質タグの例として、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）タグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、エピトープタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、ポリアルギニンタグ、ポリヒスチジンタグ、ヘキサヒスチジンタグ、ポリ−ＦＬＡＧタグ、ＦＬＡＧタグ、ｃ−ｍｙｃタグ、ヒトインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、ＲＮＡ（Ｓ−）タグのＳ−フラグメント、天然ヒスチジン親和性（ＨＡＴ）タグ、ストレプトアビジン（ＳＢＰ）タグ、カルモジュリン結合タンパク質タグ、セルロース結合タンパク質タグ、蛍光タンパク質タグ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）タグが挙げられるが、これらに限定されない。一例において、本明細書中に記載されるタンパク質は、ヒスチジンタグを含む。別の例において、タンパク質タグは、ヘキサヒスチジンタグである。当該タンパク質タグは、タンパク質のＮ末端もしくはＣ末端のいずれか、またはＮ末端およびＣ末端の双方に付着し得る。一例において、タグは、タンパク質のＮ末端に付着する。別の例において、タグは、タンパク質のＣ末端に付着する。さらに別の例において、本明細書中に記載されるタンパク質は、そのＣ末端にヘキサヒスチジンタグを含む。
【００２６】
本開示の文脈において、用語「投与すること」、ならびに「投与する」および「投与」が挙げられる当該用語の変形は、化合物または組成物を、生物または表面に、適切なあらゆる手段によって、接触させ、塗布し、送達し、または提供することを含む。
【００２７】
本明細書中で用いられる用語「生体利用性」は、物質、例えば薬物、ペプチド、またはホルモンが、生理学的活性部位にて利用可能になる程度および速度を指す。薬理学の分野において、用語「生体利用性」は、薬物の主要な薬物動態学的特性の１つである、全身循環に到達する不変の薬物、化合物、または医薬の、投与される用量の割合を指すと理解される。定義上、医薬品が静脈内投与される場合、その生体利用性は１００％である。しかしながら、化合物が他の経路（例えば、経口または筋肉内）を介して投与される場合、その生体利用性は一般に、不完全な吸収および初回通過代謝等の要因により、低下する。これらの要因は、例えば個々の代謝の違いにより、患者によって異なり得る。
【００２８】
本明細書中で用いられる用語「取込み」は、何か（例えば、化合物、薬物、または医薬）が生物、例えば哺乳類の体、または植物によって取り込まれるプロセスを指す。
【００２９】
本明細書中で用いられる用語「アディポカイン」は、脂肪組織によって分泌される特定のタイプのサイトカイン（細胞シグナル伝達タンパク質）を指す。同様に、用語「サイトカイン」は、サイズがおおよそ約５から２０ｋＤａの、広くて曖昧なカテゴリの小タンパク質である、細胞シグナル伝達タンパク質を指す。当該サイトカインは、種々のタイプの細胞によって放出されて、他の細胞の挙動に影響を及ぼす。当該細胞は、隣接する細胞であってもよいし、より遠く離れた細胞であってもよい。サイトカインはまた、自己分泌シグナル伝達に関与し得る。サイトカインとして、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、および腫瘍壊死因子が挙げられ得るが、これらに限定されない。サイトカインは一般に、当該技術において用いられる専門用語における若干の重複にもかかわらず、ホルモンも成長因子も含まない。サイトカインは、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、および肥満細胞のような免疫細胞、ならびに内皮細胞、線維芽細胞、および種々の間質細胞が挙げられるが、これらに限定されない、広範囲の細胞によって産生される。所与のサイトカインが、複数のタイプの細胞によって産生され得ることが考えられる。
【００３０】
本明細書中で用いられる用語「高い発現」は、対象の他の部分から単離または培養された脂肪細胞内に見出されるレベルを超える、例えば皮下脂肪蓄積物内のデルマトポンチンの発現レベルを示す。例えば、白色脂肪組織内に見出され得るデルマトポンチンの量は、同じ対象由来の褐色脂肪組織内に見出され得るデルマトポンチンの量と比較して、より高くなり得る。
【００３１】
本明細書中で用いられる用語「ホモログ（相同）」は、例えば位置または構造の、類似性の程度を指す。本開示に関して、相同ペプチドは、例えば種間で、共通の起源を示し得るペプチドである。通常、相同タンパク質は、共通の構造的特徴および機能を共有する。しかしながら、これは、相同タンパク質が同一または類似のペプチド配列を有することを必ずしも意味しない。相同ペプチドは、標的比較タンパク質と同一の配列を有し得る。また、相同ペプチドは、標的比較タンパク質とは程度が様々に異なる配列を有し得ることも考えられる。ゆえに、相同性の決定要因は、ホモログの官能性である。
【００３２】
本明細書中で用いられる「実質的に純粋な」または「混入物を実質的に含まない」は、対象種が、存在する主たる種であり（例えば、モル基準で、組成物内の他のあらゆる個々の種よりも豊富である）、好ましくは、実質的に精製された画分が、存在する全ての高分子種の少なくとも約５０％（モル基準）を対象種が構成する組成物であることを意味する。一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物内に存在する全ての高分子種の約８０％超を対象種が構成することとなる。一例において、実質的に純粋な組成物は、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％超を対象種が構成する。最も好ましくは、対象種は、本質的に均一になる（混入物種が、従来の検出法によって組成物内で検出され得ない）まで精製されて、組成物は、単一の高分子種から本質的になる。
【００３３】
本明細書中で用いられる用語「保存された」は、偶然のみによるよりも高い類似性を示す傾向がある、様々なヌクレオチド（またはタンパク質）の比較可能なセグメント内の塩基（またはアミノ酸）のあらゆる配列を指す。例えば、ある位置が、全ての比較可能なＤＮＡ配列内で、同じ塩基によって占有されているならば、その位置は、完全に保存されていると言われる。同じ塩基が、例えば、調査されたサンプルの７５％において、所与の位置に存在するならば、部分的に保存されていると記載されることとなる。拡張により、配列内の他の位置の保存が、通常コンピュータ分析によって、同様に評価される。配列が保存される程度は、異なる遺伝子間または異なるタンパク質間の構造的類似性および機能的類似性の程度を示し得、それらの考えられる進化的な関係の手がかりを提供する。用語「保存された」は、用語「高度に」が付され得、これは、問題の保存配列が、それらの間で最小の変異しか含有しないことを示す。それらの間でいかなる類似性も示さない配列は、「保存された」配列であるとみなされることはない。
【本発明の詳細な説明】
【００３４】
心血管疾患、糖尿病、肥満、および他の代謝疾患が、世界的に流行しており、糖尿病だけでおよそ３億８２００万人が罹患している。一例として、現在、糖尿病と闘うのに有効な薬物は、限られている。代謝疾患の新しい処置を求めて、血液中の循環因子の生物学的影響を乗っ取って、全身の代謝を向上させるアプローチがある。
【００３５】
デルマトポンチンは、脂肪細胞マーカであることも知られており、これは、白色脂肪細胞の蓄積物内で高度に発現されるが、褐色脂肪細胞の蓄積物内では発現されない。しかしながら、脂肪組織でのデルマトポンチンの生物学的役割は記載されていない。本発明は、脂肪組織でのデルマトポンチンの役割を解明して、デルマトポンチンが全身の代謝を制御する役割を果たしていることを見出だした。デルマトポンチンはアディポカインであり、皮下脂肪の蓄積物内で高度に発現される。マウスにおいて、デルマトポンチンの投与が、食物摂取および運動等の他のパラメータに影響を及ぼすことなく、対象のエネルギー消費を増大させることが示されているが、例えば、比較として、全身デルマトポンチンノックアウトマウスは、その逆を示した。すなわち、デルマトポンチンを発現する遺伝子が不可逆的に除去されたデルマトポンチンノックアウトマウスにおいて、当該マウスは、デルマトポンチンの欠失により、（組換え）デルマトポンチンで処置したマウスと比較して、エネルギー消費量が低下したことを示す。したがって、デルマトポンチンの分子標的、およびデルマトポンチンの発現の生理学的調節因子を同定することで、デルマトポンチンおよびその誘導体が、代謝関連疾患の治療化合物または治療生物製剤としてどのように用いられるかに影響を与え、そしてこれを示す。
【００３６】
ゆえに、一例において、本開示は、代謝疾患の処置用の医薬の製造における、デルマトポンチンまたはその誘導体の使用を記載する。別の例において、対象の代謝疾患を処置する方法が開示される。さらに別の例において、デルマトポンチンは組換えデルマトポンチンである。更なる例において、代謝疾患は、体重増加、食事起因性体重増加、脂肪量の減少、体重増加関連肥満、肥満、病的肥満、メタボリックシンドローム、グルコースホメオスタシス、インスリン抵抗性、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、および心血管疾患であり得るが、これらに限定されない。
【００３７】
ウシの皮膚において最初に同定された２２ｋＤａの細胞外マトリックスタンパク質であるデルマトポンチン（ＤＰＴ）は、細胞の接着および増殖に関与することが、当該技術において知られている。ゆえに、一例において、組換えデルマトポンチンは、哺乳類起源のものである。別の例において、組換えデルマトポンチンは、ヒト、ウシ、ブタ、またはネズミ起源のものである。さらに別の例において、組換えデルマトポンチンは、ヒト起源のものである。一例において、組換えデルマトポンチンは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号１２であり得るが、これらに限定されない配列を含む。さらに別の例において、組換えデルマトポンチンは、配列番号１を含む。
【００３８】
デルマトポンチンは、当該技術において、多くの哺乳動物および一部の無脊椎動物の全体にわたってよく保存されているタンパク質であることが知られている。したがって、本開示はまた、本明細書中に記載される種以外の他の種由来のデルマトポンチンの使用も記載する。これは、一例において、本明細書中に記載される使用であり、組換えデルマトポンチンは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号１２のいずれか１つのホモログであり、配列同一性は、６０％から９９％、８０％から９５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、約６７％、約７７％、約８２％、約８８％、約９３％、または約９８％である。
【００３９】
本開示はまた、組換えデルマトポンチンタンパク質の翻訳後修飾バージョンを記載する。翻訳後修飾は、アミノ酸側鎖上で、またはタンパク質のＣ末端もしくはＮ末端にて起こり得る。翻訳後修飾は、リン酸基、酢酸基、アミド基、またはメチル基等の新しい官能基を導入することによって、２０個の標準的なアミノ酸の化学レパートリを拡張することができる。リン酸化が、酵素の活性を調節する非常に一般的な機構として当該技術において知られており、最も一般的な翻訳後修飾である。多くの真核生物タンパク質はまた、グリコシル化と呼ばれるプロセスにおいて炭水化物分子が付着しており、これが、タンパク質の折畳みを促進し、安定性を向上させ、かつ種々の調節機能を果たし得る。脂質化として知られている脂質分子の付着は、多くの場合、タンパク質またはタンパク質の一部を、細胞膜に向ける。ゆえに、一例において、組換えデルマトポンチンは、そのＣ末端またはＮ末端が修飾されている。別の例において、組換えデルマトポンチンは、翻訳後修飾されている。さらに別の例において、翻訳後修飾は、グリコシル化、硫酸化、リン酸化、ユビキチン化、メチル化、脂質化、ビオチン化、ヒドロキシル化、およびアセチル化から選択されるが、これらに限定されない。別の例において、ペプチドは、以下に限定されないが、ヒドロキシル、ホスフェート、アミン、アミド、サルフェート、スルフィド、ビオチン部分、炭水化物部分、脂肪酸由来の酸基、蛍光部分、発色団部分、放射性同位体、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカー、親和性標識、標的化部分、抗体、細胞浸透性ペプチド、または前記リガンドの組合せから選択される１つまたは複数のリガンドを含むように修飾される。
【００４０】
また、本明細書に記載されるのは、付加的な分泌シグナルまたはシグナル伝達ペプチドの添加によってＣ末端またはＮ末端が修飾されている組換えデルマトポンチンである。当該技術において知られている一例が、新生タンパク質を細胞質から細胞の核中に導入するように向ける核局在化配列（ＮＬＳ）の付加である。核局在化配列には多くの異なるバージョンがあり、それらの長さおよび組成は、それらが単離されたセル型に依存する。例えば、ヌクレオプラスミンの核局在化配列は、「ＡＶＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫＬＤ」（配列番号９）であり、ｃ−ｍｙｃの核局在化配列は、「ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ」（配列番号１０）である。当該技術において知られているシグナル伝達ペプチドの別の例が、核外輸送シグナル（ＮＥＳ）であり、これは、細胞核から細胞質中に輸送されることになる新生タンパク質上にタグ付けされている。当該核外輸送シグナル（ＮＥＳ）は、通常、４つの疎水性残基の短いアミノ酸配列である。したがって、一例において、組換えデルマトポンチンは、そのＮ末端に、高度に保存された分泌シグナルからなる。別の例において、分泌シグナルは、配列番号６、配列番号７、および配列番号８からなる群から選択される配列を含む。
【００４１】
デルマトポンチンへのあらゆる修飾が、対象への投与後に必要とされる活性の部位にて最終的に利用可能なデルマトポンチンの量である、デルマトポンチンの生体利用性に影響を及ぼしてもよいし、及ぼさなくてもよい。また、デルマトポンチンへのあらゆる修飾は、対象の標的細胞におけるデルマトポンチンの取込みの効果があってもよいし、なくてもよい。また、デルマトロポンチンを与えられた対象の体の代謝は、作用部位にてどれだけのデルマトポンチンが利用可能にされるかを判定することによって、例えば組換えデルマトポンチンまたは修飾デルマトポンチンの、個々の薬物動態を判定することとなる。ペプチドおよびタンパク質の生体利用性に影響を及ぼすことが知られている因子は、意図される投与経路に応じて特有である。例えば、血流中に入るために（例えば腸膜およびその後の基底膜を）ペプチドが通過するための、ペプチドの酵素安定性、水溶解度、および脂質層の浸透力が、とりわけ、経口送達用のタンパク質組成物を製剤化する場合に対処される必要がある因子の一部である。ゆえに、一例において、組換えデルマトポンチンは、前記デルマトポンチンの取込みまたは生体利用性に影響を及ぼすように修飾される。
【００４２】
本明細書中に開示される核酸分子は、本明細書中に開示されるペプチドの鋳型として機能するペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得、これは、核酸分子の発現を可能にするように調節配列に作動可能に連結され得る。転写情報および翻訳情報を含有する調節ヌクレオチド配列を含有し、かつそのような配列が、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に「作動可能に連結される」ならば、ＤＮＡ等の核酸分子が、「核酸分子もしくはコーディングヌクレオチド配列を発現することができる」、または「ヌクレオチド配列の発現を可能にする」ことができるとみなされる。作動可能な連結は、調節ＤＮＡ配列、および発現されることが求められるＤＮＡ配列が、遺伝子配列発現を可能にするように連結されている連結である。遺伝子配列の発現に必要とされる調節領域の正確な性質は、生物ごとに異なり得るが、一般に、プロモータ領域を含むはずであり、これは、原核生物において、ＲＮＡ転写の開始を指示するプロモータのみ、またはプロモータ、および、ＲＮＡに転写される場合に、合成の開始を合図することとなるＤＮＡ配列の双方を含有する。そのような領域は、通常、発現されることになるヌクレオチド配列の５’および３’に位置決めされ、かつ転写および翻訳の開始に関与する非コード領域を含むこととなり、例えば、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、およびＣＡＡＴ配列である。当該領域はまた、例えば、エンハンサ配列、または、先に記載されるペプチドを産生するのに用いられる宿主細胞の特定の区画に、産生されたポリペプチドを標的化するために翻訳されるシグナル配列およびリーダ配列を含有し得る。
【００４３】
本明細書中に開示されるペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子は、ベクター、例えば発現ベクター内に含まれてよい。そのようなベクターは、先で言及される調節配列、および先に記載されるペプチドをコードする核酸配列の他に、５’方向に、かつ／または３’方向にペプチドをコードする核酸配列に隣接する制限開裂部位をコードする配列を含んでよい。当該ベクターはまた、発現されることになるタンパク質またはタンパク質部分をコードする別の核酸配列の導入を可能にし得る。発現ベクターはまた、好ましくは、発現に用いられる宿主と適合する種に由来する複製部位および制御配列を含有する。発現ベクターは、当業者に周知のプラスミド、例えばｐＢＲ３２２、ｐｕＣ１６、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等に基づいてよい。
【００４４】
核酸分子を含有するベクターは、遺伝子を発現することができる宿主細胞に形質転換され得る。形質転換は、標準的な技術に従って実行され得る。ゆえに、本開示はまた、先で定義される核酸分子を含有する（組換え）宿主細胞に関する。これに関連して、形質転換された宿主細胞は、先に記載されるペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現に適した条件下で培養され得る。宿主細胞は、無血清条件下で、そして場合によっては、動物起源のいかなるタンパク質／ペプチドも含まない培地内で、確立され、適応し、かつ完全に培養され得る。市販の培地、例えばＲＰＭＩ−１６４０（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  １６４０）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ、無血清ＣＨＯ培地、および無タンパク質ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞）培地が、例示的な適切な栄養溶液である。培地はいずれも、必要に応じて、種々の化合物が補われてよく、その例として、ホルモンおよび／または他の成長因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、上皮成長因子、インスリン様成長因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、リン酸塩）、バッファ（例えば、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸））、ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン）、グルタミン、グルコースまたは他の同等のエネルギー源、抗生物質、微量元素がある。また、他の必要なあらゆるサプリメントが、当業者に知られている適切な濃度にて含まれてもよい。したがって、一例において、本開示は、本明細書中に記載される組換えデルマトポンチンを発現することができる核酸配列を記載する。別の例において、組換えデルマトポンチンの核酸配列は、配列番号５からなる。
【００４５】
本明細書中に記載されるペプチド、またはその医薬組成物または医薬が、局所投与または全身投与が所望されるかに応じて、そして処置されることになる領域に応じて、多くの方法で投与され得る。例えば、ペプチドまたはそのそれぞれの医薬組成物は患者に、経口的に、経直腸的に、経粘膜的に、腸内に、筋肉内に、皮下に、髄内に、くも膜下腔内に、直接脳室内に、静脈内に、硝子体内に、腹腔内に、鼻腔内に、または眼内に、投与され得る。ゆえに、一例において、本開示は、本明細書中に記載されるタンパク質の、医薬としての使用を記載し、医薬は、経口的に、脂肪内に、動脈内に、関節内に、頭蓋内に、皮内に、病変内に、筋肉内に、鼻腔内に、眼内に、心膜内に、腹腔内に、胸膜内に、前立腺内に、直腸内に、くも膜下腔内に、気管内に、腫瘍内に、臍帯内に、静脈内に、膀胱内に、硝子体内に、リポソームに、局所的に、経粘膜的に、経口的に、経腸的に、非経口的に、経直腸的に、結膜下に、皮下に、舌下に、局所的に、経口腔内的に、経皮的に、経膣的に、クリームで、脂質組成物で、カテーテルを介して、洗浄を介して、持続注入を介して、注入を介して、吸入を介して、注射を介して、局所送達を介して、局所灌流を介して、またはそれらのあらゆる組合せにより、投与されることになる。
【００４６】
ペプチドそれ自体は、組成物内に、様々なあらゆる形態で存在してよい。例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のペプチドが、単に一緒に混合されていてもよいし、錯体化、結晶化、またはイオン結合もしくは共有結合によって、より密に結合していてもよい。ペプチドはまた、医薬的に許容可能なあらゆる塩、エステル、もしくはそのようなエステルの塩、または他のあらゆる化合物を包含してよく、これらは、ヒトが挙げられる動物に投与されると直ぐに、その生物学的に活性な代謝物質または残基を提供することができる。したがって、本明細書に記載されるのはまた、プロドラッグおよびそのようなプロドラッグの医薬的に許容可能な塩、ならびに他の生物学的同等物である。したがって、一例において、例えば医薬として、本明細書に開示されるタンパク質は、少なくとも１つまたは２つ以上の治療剤とともに投与されることになる。
【００４７】
本開示はまた、併用療法および組成物を記載する。すなわち、本明細書中に記載されるペプチドは、更なる治療化合物または治療剤と同時に、これに引き続いて、もしくはこれとは別に、またはそれらを組み合わせて、投与され得る。ゆえに、一例において、投与は同時である。すなわち、組換えデルマトポンチンおよび更なる治療剤の双方が、同時に投与されることになる。別の例において、組換えデルマトポンチンおよび更なる治療剤は、別々に投与されることになる。さらに別の例において、組換えデルマトポンチンおよび更なる治療剤は、連続して投与される。すなわち、例えば、組換えデルマトポンチンが最初に投与されてから、更なる治療化合物が投与されてよい。代替で、別の例において、更なる治療剤が最初に投与されてから、組換えデルマトポンチンが投与されてよい。さらに別の例において、第１の治療剤が投与されることになり、その後、組換えデルマトポンチンが投与されてから、第２の治療剤が投与される。更なる例において、ある治療剤が投与されてから、組換えデルマトポンチンが第２の治療剤と同時に投与されることになる。治療剤として、小分子、生物製剤、化学療法剤、サプリメント、またはバイオテクノロジー由来製品；オルリスタット、ロカセリン、シブトラミン、リモナバン、メトホルミン、エクセナチド、プラムリンチド、フェンテルミン、トピラメート；インスリン、アセチルサリチル酸、アカルボース、ミグリトール、アログリプチン、リナグリプチン、ピオグリタゾン、サクサグリプチン、シタグリプチン、シンバスタチン、アルビグルチド、デュラグルチド、リラグルチド、ナテグリニド、レパグリニド、ダパグリフロジン、カナグリフロジン、エンパグリフロジン、グリメピリド、ロシグリタゾン、グリクラジド、グリピジド、グリブリド、クロルプロパミド、トラザミド、トルブタミド、およびそれらの組合せがあり得るが、これらに限定されない。
【００４８】
本明細書中に、そして先に記載されるペプチド、単離された核酸分子、またはベクターは、投与に適した組成物、例えば医薬組成物に製剤化されてよい。該当する場合には、ペプチドは、医薬的に許容可能な担体とともに投与されてよい。「担体」として、医薬的に許容可能なあらゆる担体が挙げられ得る。但し、当該担体が製剤の他の成分と適合し、かつ患者に有害でない場合に限る。したがって、用いられる医薬組成物は、医薬的に用いられ得る製剤への活性化合物の加工を容易にする賦形剤および助剤を含む、１つまたは複数の生理学的に許容可能な担体を用いた従来の方法で、製剤化され得る。適切な製剤は、選択される投与経路に依存的である。ゆえに、一例において、本開示は、以下に限定されないが、本明細書中に記載されるペプチド、本明細書中に記載される単離された核酸分子、または本明細書中に記載されるベクターを含む医薬組成物を記載した。別の例において、本開示は、本明細書中に記載されるペプチドをコードする、単離された核酸分子を記載する。さらに別の例において、本開示は、本明細書中に記載される単離された核酸分子を含むベクターを記載する。一例において、医薬組成物は、本明細書中に記載されるペプチドを含む。さらに別の例において、医薬組成物はさらに、１つまたは複数の医薬的に許容可能な賦形剤、ビヒクル、または担体を含む。したがって、一例において、本明細書中に開示されるペプチドはさらに、以下に限定されないが、医薬的に許容可能な担体、リポソーム担体、賦形剤、アジュバント、またはそれらの組合せから選択される化合物を含んでよい。
【００４９】
本明細書中に開示されるペプチドの剤形の組成、形状、およびタイプは典型的に、意図される用途に応じて変わることとなる。例えば、疾患または関連疾患の急性処置に用いられる剤形は、それが含む活性化合物の１つまたは複数を、同じ疾患の慢性処置に用いられる剤形よりも多量に含有してよい。同様に、非経口剤形は、それが含む活性化合物の１つまたは複数を、同じ疾患または障害を処置するのに用いられる経口剤形よりも少量含有してよい。本発明によって包含される特定の剤形が互いに異なることとなる、これらの、そして他の方法は、当業者に容易に明らかとなろう。剤形の例として：錠剤；カプレット；カプセル、例えば軟質弾性ゼラチンカプセル；カシェ；トローチ；ロゼンジ；分散系；座薬；軟膏；湿布（パップ剤）；ペースト；粉末；膏薬；クリーム；絆創膏；溶液；パッチ；エアゾール（例えば、鼻スプレーまたは吸入製剤）；ゲル；懸濁液（例えば、水性または非水性の液体懸濁液、水中油エマルジョンまたは油中水液体エマルジョン）、溶液、およびエリキシルが挙げられる、患者への経口投与または粘膜投与に適した液体剤形；患者への非経口投与に特に適した液体剤形；および患者への非経口投与に適した液体剤形を提供するために再構成され得る滅菌固体（例えば、結晶固体または非晶質固体）が挙げられるが、これらに限定されない。ゆえに、一例において、本明細書中に開示されるペプチドは、以下に限定されないが、錠剤、カプレット、カプセル、硬カプセル、軟カプセル、軟弾性ゼラチンカプセル、硬ゼラチンカプセル、カシェ、トローチ、ロゼンジ、分散系、坐薬、軟膏、湿布、パップ剤、ペースト、粉末、膏薬、クリーム、絆創膏、溶液、パッチ、エアゾール、鼻スプレー、吸入製剤、ゲル、懸濁液、水性液体懸濁液、非水性液体懸濁液、水中油エマルジョン、油中水液体エマルジョン、溶液、滅菌固体、結晶性固体、非晶質固体、再構成用の固体、またはそれらの組合せから選択される形態で提供されて、０．１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇから２．５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇから７．５ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１．８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２．８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも３．２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも３．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも４．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも５．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも６．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも７．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも８．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも９ｍｇ／ｋｇ、少なくとも９．５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも１０ｍｇ／ｋｇの量にて投与される。一例において、本明細書中に記載される、投与されることになる量は、１日あたりの投与計画として理解されるべきである。別の例において、医薬は対象に、毎日、毎週、週２回（２週間に１回（ｂｉ−ｗｅｅｋｌｙ））、週３回、２週毎、月１回（すなわち１ヶ月に１回）、またはそれらのあらゆる組合せで、投与されることになる。例えば、医薬は、最初の週について毎日、そしてその後の４週について週に２回、投与されてよい。または、医薬は対象に、処置の最初の２週について２週間に１回、そしてその後の更なる３ヶ月について毎月、投与されてよい。
【００５０】
賦形剤の量およびタイプと同様に、剤形中の活性化合物の量および具体的なタイプは、限定されないが、患者に投与されることになる経路等の要因に応じて、異なってよい。しかしながら、本開示の典型的な剤形は、組換えデルマトポンチン、またはその医薬的に許容可能な塩、水和物もしくは立体異性体を含み、そしてさらに、１日あたり０．０１ｍｇ／ｋｇから２００ｍｇ／ｋｇの用量を提供するために、投与単位あたり０．１ｍｇから１５００ｍｇを含んでよい。一例において、本明細書中に記載されるタンパク質の１日用量は、０．１ｍｇから５ｍｇ、５ｍｇから５０ｍｇ、５０ｍｇから１００ｍｇ、１００ｍｇから５００ｍｇ、５００ｍｇから１０００ｍｇ、１０００ｍｇから１５００ｍｇ、約２０ｍｇ、約３０ｍｇ、約３５ｍｇ、約４５ｍｇ、約５５ｍｇ、約７０ｍｇ、約８０ｍｇ、約８５ｍｇ、約１２０ｍｇ、約２５０ｍｇ、約３２０ｍｇ、約４５０ｍｇ、約５２０ｍｇ、約６８０ｍｇ、約７５０ｍｇ、約８００ｍｇ、約９９０ｍｇ、約１２００ｍｇ、少なくとも５００ｍｇ、少なくとも６００ｍｇ、少なくとも８００ｍｇ、少なくとも１３００ｍｇ、または少なくとも１４００ｍｇである。
【００５１】
本明細書中に記載される医薬は、医薬を必要とする対象に投与されてよい。一例において、処置されることになる対象は、哺乳動物である。別の例において、対象はヒトである。
【００５２】
本明細書中に記載されるタンパク質はまた、代謝疾患および肥満に対する対象の感受性を判定または予測する方法に用いられる。対象における標的タンパク質のレベルを分析する方法は、当該技術において知られている方法を用いて実施され得る。したがって、一例において、本明細書中で開示されるのは、代謝疾患および肥満に対する対象の感受性を判定または予測する方法であり、当該方法は、対象から得られたサンプル中の循環デルマトポンチンのレベルを測定することと；先で得られた循環デルマトポンチンのレベルを、コントロールにおいて先に判定されたデルマトポンチンのレベルと比較することと；循環デルマトポンチンのレベルと、コントロールにおけるデルマトポンチンのレベルとの差異に基づいて、代謝疾患および肥満に対する対象の感受性を判定することとを含む。別の例において、代謝疾患および肥満に対する対象の感受性を判定または予測する方法は、本明細書中に記載される方法に基づいて、処置が必要と考えられる対象に、例えば組換えデルマトポンチンを投与することをさらに含んでよい。
【００５３】
対象における標的タンパク質または分析物の濃度またはレベルの比較は、対象において判定された標的分析物のレベルと、コントロール群またはコントロール個体において判定された標的分析物のレベルとの比較に基づいて、決定される。本開示において、コントロールは無病である対象である。すなわち、コントロールは、試験が行われる疾患が認められない対象である。通常、用語無病は、対象が健康であることを意味する。
【００５４】
別の例において、本開示は、代謝疾患を処置する方法であって、処置を必要とする対象に、本明細書中で定義されるデルマトポンチン、組換えデルマトポンチン、またはそれらの誘導体を投与することを含む方法を記載する。さらに別の例において、処置されることになる代謝疾患は、以下に限定されないが、体重増加、食事起因性体重増加、脂肪量の減少、肥満、病的肥満、メタボリックシンドローム、グルコースホメオスタシス、インスリン抵抗性、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、および心血管疾患から選択される。
【００５５】
本明細書中に例示的に記載される本発明は、本明細書中に具体的に開示されていない何らかの要素、限定が不在の場合も、適切に実施され得る。ゆえに、例えば、用語「含む」、「挙げられる」、「含有する」等は、広範に、かつ制限なしに読まれるものとする。さらに、本明細書中で使用される用語および表現は、限定ではなく説明の用語として用いられており、そのような用語および表現の使用において、示され、かつ記載される特徴またはその一部のあらゆる等価物を排除する意図はなく、特許請求される本発明の範囲内で種々の変更が可能であることが認識される。ゆえに、本発明は、好ましい実施形態、およびあったりなかったりする特徴によって具体的に開示されているが、本明細書中に開示される、具体化されている本発明の変更および変形が、当業者によって採用され得ること、そしてそのような変更および変形は、本発明の範囲内にあるとみなされることが理解されるべきである。
【００５６】
本発明は、本明細書中で広く、かつ包括的に記載されている。包括的な開示に含まれるより狭い種および準包括的（ｓｕｂ−ｇｅｎｅｒｉｃ）グループもまたそれぞれ、本発明の一部を形成する。これは、切り出される材料が本明細書中に具体的に列挙されているか否かにかかわらず、属からいずれかの主題を取り除くという条件または否定的限定付きの、本発明の包括的な記載を含む。
【００５７】
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲および非限定的な実施例の範囲内にある。また、本発明の特徴または態様が、マーカッシュ群によって記載されている場合、当業者であれば、本発明が、マーカッシュ群のあらゆる個々のメンバーまたはメンバーのサブグループに関して説明されることを認識するであろう。
実験の節
【００５８】
組換えデルマトポンチン（ｒＤＰＴ）が、高脂肪食によって誘導される体重増加を減少させる
【００５９】
マウスにおける組換えデルマトポンチン（ｒＤＰＴ）の効果を判定するために、組換えデルマトポンチンを最初に産生させて、その純度を判定した。産生したタンパク質は、約２２ｋＤａのタンパク質である天然のデルマトポンチンと類似の大きさであると判定された。デルマトポンチンに対して特異的な抗体を用いたウェスタンブロットまたはイムノブロッティングを介して、組換えデルマトポンチンを検出した（図２Ａ）。クーマシブルー染色は、産生した組換えデルマトポンチンが実質的に、いかなる混入タンパク質も含まないことを示した（図２Ａ）。
【００６０】
組換えデルマトポンチンが代謝に何らかの効果を及ぼすか否かを判定するために、１週間の期間について、マウスに組換えデルマトポンチンを、２ｍｇ／マウス体重ｋｇにて１週間に３回注射した。コントロールマウスに、同容量のビヒクル（すなわち生理食塩水）を注射した。注射を施した後、全てのマウスに、標準的なＣＨＯＷ食を２週間与えた。注射を受けさせる前に、全てのマウスに高脂肪食を与えて体重増加を加速させて、インスリン抵抗性を誘導した。組換えデルマトポンチンを注射したマウス群は、ビヒクルコントロール群と比較して、体重増加がより小さいことを示した（図２Ｂ）。理論に拘束されることを望むものではないが、これは、組換えデルマトポンチンで処置した群における脂肪量の減少によるものであることが理解される（図２Ｃ）。
【００６１】
組換えデルマトポンチン（ｒＤＰＴ）は、グルコースクリアランスおよびインスリン感受性を向上させる
【００６２】
組換えデルマトポンチンが対象の代謝に何らかの影響を及ぼすかを試験するために、組換えデルマトポンチン処置群およびビヒクル処置群の双方に、腹腔内注射を介したグルコースのボーラス投与を行った（ＩＰ−ＧＴＴ；図２Ｄおよび図２Ｅ）。データは、組換えデルマトポンチン注射群が、コントロールマウスと比較して、グルコースクリアランスの向上を示したことを示している（図２Ｄおよび図２Ｅ）。
【００６３】
理論に拘束されることを望むものではないが、グルコース負荷試験（ＧＴＴ）の結果に基づく、グルコース処理の向上は、膵臓によるインスリン分泌の向上、または末梢組織（例えば、インスリン応答性の筋肉、肝臓、および脂肪）のインスリン感受性の増大のいずれかによるものである。グルコースクリアランスの向上を仲介するのが前者であるか後者であるかを判定するために、インスリン負荷試験（ＩＴＴ）を行った。組換えデルマトポンチン注射群は、インスリン負荷試験中にグルコース処分の向上を示し（ＩＴＴ；図２Ｆおよび図２Ｇ）、組換えデルマトポンチンが、末梢のインスリン感受性を向上させる原因となることを示唆している。
【００６４】
組換えデルマトポンチン（ｒＤＰＴ）は、食物摂取および運動に影響を及ぼすことなく、エネルギー消費を増大させる
【００６５】
エネルギー消費、動物の運動、食物摂取等が挙げられる種々の代謝パラメータを判定することができるＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＡＭＳ）を用いて、全身代謝に及ぼす組換えデルマトポンチンの効果を分析した。データは、組換えデルマトポンチンが注射されたマウスが、通常は運動がより少ない期間中に（明サイクル）、そしてまた、マウスが通常、より活動的な期間中に（暗サイクル；図２Ｈおよび図２Ｉ）、エネルギー消費が増大していることを示している。食物摂取量、水分摂取量、および運動に、変化は検出されなかった（図８）。これらの結果は、組換えデルマトポンチンが、少なくとも部分的に、エネルギー消費の増大によって、その効果を発揮していることを示している。
【００６６】
ゆえに、例えばヒトから単離した組換えデルマトポンチンは、体重増加に対する治療剤として用いることができ、脂肪量の増大を引き下げ、グルコースクリアランスおよび末梢のインスリン感受性を向上させ、かつエネルギー消費を増大させる。発明者らは、対象の体重増加と闘うための治療薬としてｒＤＰＴを用いることができるので、肥満および糖尿病のリスクを引き下げることができると提唱した。糖尿病および／または肥満が、心血管疾患等の他の代謝障害と密接に関連していることを考えると、これらおよび他の代謝障害または代謝関連疾患の治療薬として、組換えデルマトポンチンを用いることができる。
【００６７】
デルマトポンチンは、脂肪細胞において高度に発現され、そして循環系において見出だされる
【００６８】
組織でのデルマトポンチン（ＤＰＴ）の役割を調べるために、最初に、マウスから単離した様々な組織のパネルにおけるデルマトポンチンのｍＲＮＡ発現を検証した。デルマトポンチンは最初に、皮膚で発見されて単離されたが、ｍＲＮＡ発現データは、デルマトポンチン転写物がほとんどの場合、皮下脂肪蓄積物に続いて、内臓脂肪、皮膚、褐色脂肪組織、および筋肉において発現されていることを示している（図３Ａ）。図３Ｂに示すように、成熟皮膚マーカであるケラチン１０のレベルを判定することによって、皮膚の単離法を検証した。皮膚単離物に皮下脂肪層が含有されていることを考えると、デルマトポンチンは皮下脂肪において高度に発現されていることが間接的に示される。次に、デルマトポンチンに対して生成した特異的抗体を用いて、種々の組織におけるデルマトポンチンのタンパク質発現を測定した。全身デルマトポンチンノックアウトマウス系統をネガティブコントロールとして用いた。デルマトポンチンｍＲＮＡ発現と同様に、デルマトポンチンタンパク質レベルは、皮下脂肪に続いて、内臓脂肪、皮膚、筋肉、および褐色脂肪蓄積物において高度に発現されていることが示された（図３Ｃおよび図３Ｄ）。残りの組織型は、存在するデルマトポンチン発現量が最小であることを示した（図３Ｄ）。
【００６９】
デルマトポンチンが実際に脂肪細胞に存在し脂肪蓄積物内の他の細胞型には存在しないかをさらに判定するために、脂肪組織由来の一次脂肪細胞を単離した。デルマトポンチンは、一次脂肪細胞、特に一次皮下脂肪細胞において、高度に発現されていることが見出だされた（図３Ｅ）。一般的に用いられる脂肪細胞系統、３Ｔ３−Ｌ１を用いて、３Ｔ３−Ｌ１線維芽細胞の、脂肪細胞への分化過程の間のデルマトポンチンレベルを判定した。デルマトポンチンレベルは、分化とともに増大し、これは、脂肪細胞マーカ、グルコーストランスポータタイプ４（ＧＬＵＴ４；図３Ｆ）のレベルと類似した。このデータは、デルマトポンチンが、脂肪蓄積物において、より具体的には脂肪細胞において高度に発現されていることを示す。
【００７０】
哺乳類のデルマトポンチンが、そのＮ末端にて高度に保存された１８アミノ酸の古典的分泌シグナルを有すること、そして予測（データは示さず）に基づいて、いかなる膜貫通ドメインも有していないことを考えて、細胞からのデルマトポンチンの分泌を分析した。Ｃ末端のｍｙｃエピトープタグ付きデルマトポンチンタンパク質を用いて、その分泌についての時間経過アッセイを実行した。デルマトポンチン−ｍｙｃ融合タンパク質（ＤＰＴ−ｍｙｃ）が、無血清培地交換の４時間以内の培地において観察されたので、細胞が、培地中に分泌されるデルマトポンチン−ｍｙｃ融合タンパク質（ＤＰＴ−ｍｙｃ）を安定して発現していることが示された。デルマトポンチン−ｍｙｃ融合タンパク質（ＤＰＴ−ｍｙｃ）は、２４時間後の培地中に豊富に存在した（図３Ｈ）。小胞体（ＥＲ）／ゴルジ阻害剤であるブレフェルジンＡによる細胞の処理により、ＤＰＴ−ｍｙｃの分泌が阻止され、これは、別の知られている分泌タンパク質であるアディポネクチンのものと類似した（図３Ｉ）。さらに、野生型マウスから単離した血清中の内在性デルマトポンチンを検出することは可能であったが、全身デルマトポンチンノックアウトマウス由来の血清では検出されなかった（図３Ｇ）。まとめると、このデータは、デルマトポンチンが、古典的ＥＲ−ゴルジ経路を介して脂肪細胞から分泌されていることを示している。
【００７１】
体重と相関する脂肪レベルおよび循環デルマトポンチンレベル
【００７２】
次のステップは、循環系において見出だされるデルマトポンチンの量と、対象の体重増加との関係を判定することであった。この目的のために、３群のマウスを以下のように設計した：マウスの１群に、標準的なＣＨＯＷ食を与え、マウスの第２の群に、高脂肪食（ＨＦＤ）を与え、マウスの第３の群に、高脂肪食を与えたが、ここでのマウスについて、ＣＨＯＷ飼育マウス（ＦＲ）と比較してより体重が減る点まで、食物を制限した。これらのマウスのそれぞれから皮下脂肪および内臓脂肪を単離して、デルマトポンチンについてイムノブロットした。脂肪蓄積物（皮下および内臓）の双方のタイプにおいて、デルマトポンチンレベルは、高脂肪食（ＨＦＤ）マウスの場合で高く、食物制限（ＦＲ）マウスの場合でより低かった（図４Ａおよび図４Ｂ）。個々のマウスの体重に対してプロットすると、デルマトポンチンレベルは、それぞれのマウスの体重と正の相関があった（図４Ｃ）。血清中の循環デルマトポンチンレベルは、理論的な回帰線に示すデータ点の相関に関して、決定係数Ｒ２がより低いにもかかわらず、脂肪デルマトポンチンレベルで見られるのと類似の傾向を示した（図４Ａから図４Ｃ）。
【００７３】
デルマトポンチンによる食事起因性体重増加の時間的効果を判定するために、循環デルマトポンチンレベルを経時的に分析した。高脂肪食（ＨＦＤ）マウスの場合、デルマトポンチンレベルは、ＨＦＤの開始から２週以内に上昇した。このレベルの増大は、ＣＨＯＷ飼育群よりも高いレベルにて維持され（図５Ａから図５Ｃ）、循環系におけるデルマトポンチンレベルの上昇は、マウスにおける食事起因性体重増加の早期マーカであることを示している。
【００７４】
組換えデルマトポンチンは、脂肪が高い食事によって誘導される体重増加を引き下げ、かつエネルギー消費を増大させる
【００７５】
デルマトポンチンが脂肪組織から分泌され、かつ循環系において見出されることを考えれば、次のステップは、デルマトポンチンをマウスに注射することによって、デルマトポンチンの役割を判定し、かつその効果を判定することであった。組換えデルマトポンチン（ｒＤＰＴ；図２Ａ）またはビヒクルコントロールを、標準的なＣＨＯＷ食のＣ５７ＢＬ６マウスに、２ｍｇ／体重ｋｇにて週３回、２週間注射した。これを２週間行ってから、脂肪が高い食事（高脂肪食；ＨＦＤ）に食事を変えて、注射レジメンを継続した。注射後６週目に、組換えデルマトポンチン注射群において、体重増加の有意な減少が観察された（図２Ｂ）。この体重減少は主に、脂肪量の減少によるものである。グルコース耐性試験（ＧＴＴ）は、組換えデルマトポンチン注射群がグルコースクリアランスを向上させたことを明らかにした（図２Ｄおよび図２Ｅ）。グルコースクリアランスのこの増大は、インスリン耐性試験（ＩＴＴ；図２Ｆおよび図２Ｇ）の結果に基づけば、末梢組織のインスリン感受性の増大に起因する。間接熱量測定分析により、組換えデルマトポンチン注射マウスは、例えば食物および水の摂取量、ならびに運動等のパラメータに影響を及ぼすことなく（図８）、昼と夜の双方のサイクルの間に、エネルギー消費が増大していることが明らかとなった（図２Ｈおよび図２Ｉ）。まとめると、このデータは、組換えデルマトポンチン注射が、対象の代謝に、全体的に有益な効果を及ぼすことを示している。具体的には、組換えデルマトポンチンは、グルコース接種の間に、グルコースクリアランスを向上させることができる。これは、より高い安静時（昼間）エネルギー消費、そしてまた、活動的（夜間）エネルギー消費の増大に起因しており、これが、周辺組織のインスリン感受性の向上に寄与する。また、全身デルマトポンチンノックアウトマウス系統は、食事起因性体重増加に対して、より感受性であることも示される（図６Ａ）。
【００７６】
デルマトポンチンの生物学的効果を検証するために、全身ＤＰＴノックアウト（ＫＯ）マウス系統を分析した。野生型マウスまたはデルマトポンチンノックアウトマウス（ＤＰＴ  ＫＯ）に、高脂肪食を与えた。デルマトポンチンノックアウトマウスは、高脂肪食（ＨＦＤ、図６Ａ）を与えた場合に、主に脂肪量の増大により、体重の増加を示した（図６Ｂ）。間接熱量測定分析は、昼間および夜間の双方で、調査した他のパラメータにいかなる影響も与えることなく（データは示さず）、デルマトポンチンノックアウトマウスのエネルギー消費がより低いことを示した（図６Ｃおよび図６Ｄ）。デルマトポンチンノックアウトマウスのデータ、および組換えデルマトポンチンの効果は、デルマトポンチンが基礎エネルギー消費に影響を及ぼすことを確認した。これは、先で考察した図２Ｈでも示された。
【００７７】
相関研究
【００７８】
８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、標準的なＣＨＯＷ食または高脂肪（６０％ｋｃａｌ脂肪）食を８週間与えた。体重測定を毎週実行した。食事の９週目に、高脂肪食のマウスを２つの群に分けた：第１の群は高脂肪食を続けたが、第２の群は、１日の摂取量の１６．５％を朝に１回、そして夕方に１回与えた（通常の摂取量の合計３３％；摂取量の制限）。１０日後、３つ全ての群（標準的なＣＨＯＷマウス、ＨＦＤマウス、および制限ＨＦＤマウス）由来のマウスを、頚椎脱臼を介して屠殺した。心穿刺を介して血液を採取して、血液を氷上で１時間凝固させた後に、血清を得た。別個のマウスコホートにＣＨＯＷ食または高脂肪食（ＨＦＤ）を与えて、尾出血を介して血液を２週毎に得て、デルマトポンチンを検出した。内臓脂肪を、副睾丸蓄積物から得、皮下脂肪を、背面側の脂肪蓄積物から得た。ウェスタンブロット分析を以下のように実行した：組織を、プロテアーゼ阻害剤を有する放射線免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）バッファ中でホモジナイズして、生じたタンパク質濃度を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイを用いて定量化した。当該技術において知られている類似の単離法およびタンパク質濃度判定法を利用してもよい。組織溶解物２０μｇまたは血清１μｌをサンプルローディングバッファと混合して、ポリアクリルアミドゲル上にロードして、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離した。タンパク質をポリビニリデンジフルオリド膜に移した後、膜をブロックし（ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中５％スキムミルク）、続いてデルマトポンチンに対する抗体またはヒートショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）で、４℃にて一晩、イムノブロットした。抗体を、２％ＢＳＡ  ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で１：１０００の比率に希釈した。インキュベーション後、膜を洗浄して、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識二次抗体とインキュベートしてから、化学発光基質のインキュベーションに続く、フィルムの露光によって、検出した。生じたウェスタンブロットを、ＩｍａｇｅＪプログラムを用いて定量化した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを用いて、相関グラフおよびＲ２をプロットし、かつ算出した。
【００７９】
組換えデルマトポンチン研究
【００８０】
８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、標準的なＣＨＯＷ食を２週間与えてから、先に示すＰＢＳ（コントロールビヒクル）または組換えデルマトポンチンを、２ｍｇ／体重ｋｇにて週に３回、２週間注射した。最初の組換えデルマトポンチン注射の２週後、マウスに高脂肪食を出した。腹腔内グルコース耐性試験（ＧＴＴ）を、６時間の絶食後のマウスに実行した。マウスに、２ｇ／ｋｇの最終用量にて、２０（ｗ／ｖ）％グルコース溶液を注射した。Ａｃｃｕ−Ｃｈｅｃｋ  ＩＩグルコメータにより、示した時点にて尾の先端から血液をサンプリングすることによって、血中グルコースを測定した（図２Ｄ）。腹腔内インスリン耐性試験（ＩＴＴ）を、２時間の絶食後のマウスに実行した。マウスに、体重１ｋｇあたり２Ｕのインスリンを注射した。先に述べたグルコース耐性試験（ＧＴＴ）に従って、血中グルコースを測定した。Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｌａｂ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＡＭＳ）を用いて、エネルギー消費、安静時の呼吸数、食物および水の摂取量、運動、酸素および二酸化炭素の測定を実行した。エコー磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を用いて、除脂肪量および脂肪量の組成を測定した。
【００８１】
表１配列表
【表１】
0006697474.tif 000002
【表２】
0006697474.tif 000003
【図１】
0006697474.tif 000004
【図２Ａ】
0006697474.tif 000005
【図２Ｂ】
0006697474.tif 000006
【図２Ｃ】
0006697474.tif 000007
【図２Ｄ】
0006697474.tif 000008
【図２Ｅ】
0006697474.tif 000009
【図２Ｆ】
0006697474.tif 000010
【図２Ｇ】
0006697474.tif 000011
【図２Ｈ】
0006697474.tif 000012
【図２Ｉ】
0006697474.tif 000013
【図３Ａ】
0006697474.tif 000014
【図３Ｂ】
0006697474.tif 000015
【図３Ｃ】
0006697474.tif 000016
【図３Ｄ】
0006697474.tif 000017
【図３Ｅ】
0006697474.tif 000018
【図３Ｆ】
0006697474.tif 000019
【図３Ｇ】
0006697474.tif 000020
【図３Ｈ】
0006697474.tif 000021
【図３Ｉ】
0006697474.tif 000022
【図４Ａ】
0006697474.tif 000023
【図４Ｂ】
0006697474.tif 000024
【図４Ｃ】
0006697474.tif 000025
【図５Ａ】
0006697474.tif 000026
【図５Ｂ】
0006697474.tif 000027
【図５Ｃ】
0006697474.tif 000028
【図６Ａ】
0006697474.tif 000029
【図６Ｂ】
0006697474.tif 000030
【図６Ｃ】
0006697474.tif 000031
【図６Ｄ】
0006697474.tif 000032
【図７】
0006697474.tif 000033
【図８Ａ】
0006697474.tif 000034
【図８Ｂ】
0006697474.tif 000035
【図８Ｃ】
0006697474.tif 000036
【図８Ｄ】
0006697474.tif 000037
【図８Ｅ】
0006697474.tif 000038