(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）又は（３）で表される化合物又はその塩を含む、ＮＡＤＰＨ酸化酵素活性化剤であって、
前記ＮＡＤＰＨ酸化酵素が、ヒトＤＵＯＸ１又はヒトＤＵＯＸ２である、剤。
【化１】
0006697861.tif 000007
（上記式（１）及び（３）中、Ｒは、各々独立して、水素原子、炭素原子数１〜１０の置換基、アルカリ金属を示す。）
【請求項２】
前記式１で表される化合物がピロロキノリンキノンジナトリウムである、請求項１に記載の剤。
【請求項３】
ＮＡＤＰＨ酸化酵素であるヒトＤＵＯＸ１又はヒトＤＵＯＸ２を活性化させる剤の製造のための、下記式（１）又は（３）で表される化合物又はその塩の使用。
【化２】
0006697861.tif 000008
（上記式（１）及び（３）中、Ｒは、各々独立して、水素原子、炭素原子数１〜１０の置換基、アルカリ金属を示す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なＮＡＤＰＨ酸化酵素活性化剤及びその製造方法、並びにＮＡＤＰＨ酸化酵素の活性化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＮＡＤＰＨ酸化酵素は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(ＮＡＤＰＨ)を酸化して活性酸素種であるスーパーオキシドおよび過酸化水素を発生させる酵素である。ヒトではＮｏｘ１から５およびＤｕｏｘ１，２がＮＡＤＰＨ酸化酵素として知られており、Ｎｏｘファミリーと呼ばれている。これらの酵素群から産生される活性酸素種はシグナル伝達分子として利用され、恒常性の維持をはじめとする様々な生体応答を誘導する。この酵素はＮｏｘファミリーと呼ばれ、Ｎｏｘ１から５およびＤｕｏｘ１，２がヒトで知られている。この酵素は活性酸素種であるスーパーオキシドおよび過酸化水素を発生させ、これらを細胞のシグナルとして使用するための働きを行っていると考えている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】再表２００４／０８９４１２号公報
【特許文献２】特表２００６−５２０３２６号公報
【特許文献３】特表２０１０−５２１５２２号公報
【特許文献４】特開２００８−２３１０６０号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】酸化ストレスの医学改定第２版ｐ１０−２０、２０１４、株式会社診断と治療社
【非特許文献２】Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２０１５  ＤＯＩ：  １０．１０８０／０９１６８４５１．２０１５．１０６２７１５
【非特許文献３】Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎａｌｙｔ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  （１９９７）  ２５３，  １６２−１６８．
【非特許文献４】Ｍｏｒｉｂｅ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＬＯＳ  Ｇｅｎｅｔ．  （２０１２）  ８，  ｅ１００２９５７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
活性酸素種は血圧上昇への関与・感染防御・甲状腺ホルモン合成など、体内の様々な場面で働いており、この酵素の働きの低下は、血圧異常・日和見感染・ホルモン異常を引き起こす危険性がある。そのため、ＮＡＤＰＨ酸化酵素を活性化する物質が求められている。特に、Ｄｕｏｘ２が産生する過酸化水素は甲状腺ホルモンの合成に必須であり、これが異常になると甲状腺機能異常になる（非特許文献１）。また、この酵素は呼吸器系や消化器系などの上皮細胞に存在し、それぞれの局所で感染防御の一旦を担っている。ＮＡＤＰＨ酸化酵素活性化剤の機能としては免疫強化・甲状腺機能正常化・血圧正常化が期待できる。これまでにＮＡＤＰＨ酸化酵素阻害剤に関してはジフェニレンアイオドニウム（ＤＰＩ）や多くの化合物が知られている（特許文献１から４）が、活性化剤についてほとんど研究されていない。そこでＮＡＤＰＨ酸化酵素の働きを活性化でき、かつ安価で安全性の高い物質、方法が求められている。
【０００６】
ピロロキノリンキノン（以下、「ＰＱＱ」ともいう。）は、微生物から見出された補酵素分子であり、さまざまな機能が知られている（非特許文献２）。しかしながら、現在までに明らかにされているＰＱＱの持つ多様な生理活性作用として、ＮＡＤＰＨ酸化酵素を活性化することは知られていない。
【０００７】
ＮＡＤＰＨ酸化酵素の活性は文献（非特許文献３，４）に記載の方法で定量することが可能である。この方法によってＮＡＤＰＨ酸化酵素の活性化剤を探すことが可能になった。
【０００８】
本発明は、上記ＰＱＱを用いて、新規なＮＡＤＰＨ酸化酵素活性化剤及びその製造方法、並びにＮＡＤＰＨ酸化酵素の活性化方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ＰＱＱが生体に与える影響について鋭意検討した。その結果、本発明者らがヒト細胞を用いて検討した結果、ＰＱＱが、ＮＡＤＰＨ酸化酵素の活性化に関与することが見出された。本発明は、当該知見によりなされたものである。
【００１０】
すなわち、本発明は以下に示すとおりである。
〔１〕
下記式（１）又は（３）で表される化合物又はその塩を含む、ＮＡＤＰＨ酸化酵素活性化剤であって、
前記ＮＡＤＰＨ酸化酵素が、ヒトＤＵＯＸ１又はヒトＤＵＯＸ２である、剤。
【化１】
0006697861.tif 000002
（上記式（１）及び（３）中、Ｒは、各々独立して、水素原子、炭素原子数１〜１０の置換基、アルカリ金属を示す。）
〔２〕
前記式１で表される化合物がピロロキノリンキノンジナトリウムである、〔１〕に記載の剤。
〔３〕
ＮＡＤＰＨ酸化酵素であるヒトＤＵＯＸ１又はヒトＤＵＯＸ２を活性化させる剤の製造のための、下記式（１）又は（３）で表される化合物又はその塩の使用。
【化２】
0006697861.tif 000003
（上記式（１）及び（３）中、Ｒは、各々独立して、水素原子、炭素原子数１〜１０の置換基、アルカリ金属を示す。）
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、新規なＮＡＤＰＨ酸化酵素活性化剤及びその製造方法、並びにＮＡＤＰＨ酸化酵素の活性化方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例Ａにおける過酸化水素発生量の測定結果を示す図である。
【図２】実施例Ｂにおける過酸化水素発生量の時間的変化を示す図である。
【図３】実施例ＣにおけるヒトＤｕａｌ  Ｏｘｉｄａｓｅ発現細胞における過酸化水素発生量の測定結果を示す図である。
【図４】実施例Ｄにおける過酸化水素発生量の時間的変化を示す図である。
【図５】実施例Ｄにおけるウエスタンブロットにて解析した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施形態」という。）について詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で様々な変形が可能である。
【００１４】
〔ＮＡＤＰＨ酸化酵素活性化剤〕
本実施形態のＮＡＤＰＨ酸化酵素活性化剤は、下記式（１）、（２）、又は（３）で表される化合物又はその塩を含む。
【化１】
0006697861.tif 000004
（上記式（１）、（２）、及び（３）中、Ｒは、各々独立して、水素原子、炭素原子数１〜１０の置換基、アルカリ金属を示し、Ｒ’は、炭素原子数１〜１０の置換基を示す。）
【００１５】
本明細書において、「活性化」とは、特定の因子を上方調節することを指す。また、「上方調節」とは、例えば、あるシグナル又は作用因子に応答して、１つ又は複数の遺伝子、及びその結果としてのそれらの遺伝子によってコードされるタンパク質（複数可）の発現または活性が、増加すること指す。
【００１６】
以下、ＮＡＤＰＨ酸化酵素活性化剤において用いられ得る化合物又はその塩としては、上記式（１）、（２）、又は（３）で表される化合物又はその塩が挙げられる。塩としては、特に限定されないが、例えば、アルカリ金属塩が挙げられる。このなかでも、ピロロキノリンキノンモノナトリウム塩、ピロロキノリンキノンジナトリウム塩、及びピロロキノリンキノントリナトリウム塩等のピロロキノリンキノンナトリウム塩が好ましく、ピロロキノリンキノンジナトリウムがより好ましい。このような塩を用いることにより、ＮＡＤＰＨ酸化酵素活性化効果がより向上する傾向にある。以下、下記式（１）、（２）、又は（３）で表される化合物及びその塩についてより詳細に説明する。
【００１７】
Ｒで示される炭素原子数１〜１０の置換基としては、特に限定されないが、例えば、アルキル、アリルが挙げられる。この中でも、合成の観点から、アルキルが好ましい。なお、Ｒで示される炭素原子数１〜１０の置換基は、炭素原子のほか、酸素原子、窒素原子、水素原子、硫黄原子、リン原子を含んでもよい。
【００１８】
〔式（１）で表される化合物又はその塩〕
上記式（１）中、Ｒが全て水素原子である化合物は、酸化型ピロロキノリンキノンという。該酸化型ピロロキノリンキノンの塩としては、特に限定されないが、例えば、トリカルボン酸、トリカルボン酸ジ塩、トリカルボン酸モノ塩、トリカルボン酸トリ塩が挙げられる。塩としては、特に限定されないが、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩のようなアルカリ金属塩；カルシウム塩、ストロンチウム塩、バリウム塩のようなアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩のようなカチオン性化合物との塩が挙げられる。
【００１９】
上記式（１）中、１つ以上のＲが水素原子であることが好ましい。１以上のＲが水素原子である化合物は、溶液中において塩をつくり、イオン性になるためにトリカルボン酸の形態よりも水溶性が向上する傾向にある。
【００２０】
上記式（１）で表される化合物又はその塩としては、特に限定されないが、例えば、酸化型ピロロキノリンキノン；酸化型ピロロキノリンキノンモノナトリウム、酸化型ピロロキノリンキノンジナトリウム、酸化型ピロロキノリンキノントリナトリウム、酸化型ピロロキノリンキノンジカリウム、酸化型ピロロキノリンキノントリカリウムのような酸化型ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩が挙げられる。
【００２１】
このなかでも、入手しやすさの観点から、酸化型ピロロキノリンキノンモノナトリウム、酸化型ピロロキノリンキノンジナトリウム、酸化型ピロロキノリンキノントリナトリウムのような酸化型ピロロキノリンキノンナトリウム塩が好ましい。
【００２２】
〔式（２）で表される化合物又はその塩〕
上記式（２）で表される化合物又はその塩は、ピロロキノリンキノンの誘導体である。Ｒ’で示される炭素原子数１〜１０の置換基としては、特に限定されないが、例えば、アセチル基、エトキシ基、ケトアルキル、ヒドロキシアルキルが挙げられる。この中でも、安定性の観点から、アセチル基、ケトアルキル基が好ましい。なお、Ｒ’で示される炭素原子数１〜１０の置換基は、炭素原子以外に酸素原子、窒素原子、水素原子、硫黄原子、リン原子を含んでもよい。
【００２３】
式（２）で表される化合物の塩としては、特に限定されないが、例えば、トリカルボン酸、トリカルボン酸ジ塩、トリカルボン酸モノ塩、トリカルボン酸トリ塩が挙げられる。塩としては、特に限定されないが、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩のようなアルカリ金属塩；カルシウム塩、ストロンチウム塩、バリウム塩のようなアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩のようなカチオン性化合物との塩が挙げられる。
【００２４】
上記式（２）で表される化合物又はその塩としては、特に限定されないが、例えば、Ｒ’がアセチル基又はエトキシ基である、トリカルボン酸、トリカルボン酸ジナトリウム塩、トリカルボン酸トリナトリウム塩、トリカルボン酸ジカリウム塩、トリカルボン酸トリカリウム塩が挙げられる。
【００２５】
〔式（３）で表される化合物又はその塩〕
上記式（３）中、Ｒが全て水素原子である化合物は、酸価型ピロロキノリンキノンが還元されてできた還元型ピロロキノリンキノンという。還元型ピロロキノリンキノンの塩としては、特に限定されないが、例えば、トリカルボン酸、トリカルボン酸ジ塩、トリカルボン酸モノ塩、トリカルボン酸トリ塩が挙げられる。塩としては、特に限定されないが、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩のようなアルカリ金属塩；カルシウム塩、ストロンチウム塩、バリウム塩のようなアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩のようなカチオン性化合物との塩が挙げられる。
【００２６】
上記式（３）中、１つ以上のＲが水素原子であることが好ましい。式（３）中１以上のＲが水素原子である化合物は、溶液中において塩をつくり、イオン性になるためにトリカルボン酸の形態よりも水溶性が向上する傾向にある。
【００２７】
上記式（３）で表される化合物又はその塩としては、特に限定されないが、例えば、還元型ピロロキノリンキノン；還元型ピロロキノリンキノンモノナトリウム、還元型ピロロキノリンキノンジナトリウム、還元型ピロロキノリンキノントリナトリウム、還元型ピロロキノリンキノンジカリウム、還元型ピロロキノリンキノントリカリウムのような還元型ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩が挙げられる。
【００２８】
このなかでも、製造しやすさの観点から、還元型ピロロキノリンキノンモノナトリウム、還元型ピロロキノリンキノンジナトリウム、還元型ピロロキノリンキノントリナトリウムのような還元型ピロロキノリンキノンジナトリウムが好ましい。
【００２９】
式（１）、（２）、及び（３）で表される化合物のなかでも、ＮＡＤＰＨ酸化酵素活性化効果の観点から、酸化型ピロロキノリンキノンジナトリウム、還元型ピロロキノリンキノン、ピロロキノリンキノンモノメチルエステル、ピロロキノリンキノントリメチルエステルが好ましく、ピロロキノリンキノンモノメチルエステル、ピロロキノリンキノントリメチルエステルがより好ましい。
【００３０】
〔上記化合物又はその塩の製造方法〕
ピロロキノリンキノンの製造方法としては、特に限定されないが、例えば、有機化学的に合成する方法又は発酵法が挙げられる。このなかで発酵法とは、例えば、メタノール資化性を有し、かつピロロキノリンキノンを生産する能力を有する細菌を、炭素源としてメタノールを使用して培養することによりＰＱＱを製造する方法である。
【００３１】
ピロロキノリンキノンの誘導体、具体的にはピロロキノリンキノンのエステル体等又はピロロキノリンキノンの塩（上記化合物又はその塩）は、このようにして得られたピロロキノリンキノンを出発物質として、常法に従って合成することができる。ピロロキノリンキノン及びその誘導体は、カラムクロマトグラフィー、再結晶法、又は溶媒抽出法等の通常の方法により、反応液中から分離、精製することができる。また、それらの同定には、元素分析、ＮＭＲスペクトル、ＩＲスペクトル、質量分析等の各種手段が用いられる。
【００３２】
〔用途：ＰＱＱの使用〕
本実施形態は、ＮＡＤＰＨ酸化酵素活性化剤の製造のための、上記化合物又はその塩の使用を含む。
【００３３】
ＮＡＤＰＨ酸化酵素活性化剤は、ヒト用又は動物用の、食品、機能性食品、医薬品又は医薬部外品として使用することができる。ここでいう機能性食品とは、健康食品、栄養補助食品、栄養機能食品、栄養保険食品等、健康の維持あるいは食事にかわり栄養補給の目的で摂取する食品を意味する。具体的な形態としてはカプセル剤、タブレット、チュアブル、錠剤、ドリンク剤等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３４】
医薬品用途としては、ＮＡＤＰＨ酸化酵素活性化剤は、経口投与、注射、皮膚吸収等の方法で使用することができる。経口投与の場合、ＮＡＤＰＨ酸化酵素活性化剤はハードカプセル、ソフトカプセル、錠剤の形で他の物質と混合して用いることができる。また、ＮＡＤＰＨ酸化酵素活性化剤は、その高い水溶性を利用して、飲料、点滴液、注射液として使用することもできる。さらに、ＮＡＤＰＨ酸化酵素活性化剤は乳化物と混合し、化粧用クリーム、ケーキに配合すること、または、米、麦の粉と混合も容易でそれを利用した食品に使用することができる。
【００３５】
ＮＡＤＰＨ酸化酵素活性化剤を研究用モデル生物である線虫に対して使用する場合は、培地中に混合する方法が挙げられる。具体的にはアミノ酸を多く含むペプトン、コレステロール、無機イオンを含む培地に、ＮＡＤＰＨ酸化酵素活性化剤を溶かし、その状態で生育するえさの大腸菌を介して、線虫に、ＮＡＤＰＨ酸化酵素活性化剤を、経口吸収、もしくは培地からの経皮吸収させることができる。培地中に混合する量としては、好ましくは１〜１００ｍＭであり、より好ましくは１〜１５ｍＭである。
【００３６】
ＮＡＤＰＨ酸化酵素活性化剤を動物に対して使用する場合、その投与量は、対象動物により変化する。対象動物が人である場合には、その投与量は、適用疾患、患者の年齢、性別又は体重、症状の重篤度、投与経路など、様々な要因により変化する。対象動物が人である場合においては、典型的には、体重約６０ｋｇの成人に対し、１日当たり０．２５〜１０００ｍｇ、好ましくは１〜２５０ｍｇ、より好ましくは１０〜１００ｍｇのＮＡＤＰＨ酸化酵素活性化剤が投与される。ＮＡＤＰＨ酸化酵素活性化剤は１日１回又は複数回投与することができる。ＮＡＤＰＨ酸化酵素活性化効果は、真核生物に有効であり、好ましくは動物である。
【００３７】
本実施形態のＮＡＤＰＨ酸化酵素活性化方法によれば、血圧上昇への関与・感染防御・甲状腺ホルモン合成等、ＮＡＤＰＨ酸化酵素に関する症状及び疾患を改善することができる。
【００３８】
具体的な方法としては、特に限定されないが、例えば、上記ＮＡＤＰＨ酸化酵素活性化剤を動物又は患者に対して上記〔用途〕で記載したような方法により、治療又は処置を目的として投与する方法が挙げられる。すなわち、被検対象者又は動物に対し、ＮＡＤＰＨ酸化酵素活性化剤を投与することにより、被検対象者又は動物のＮＡＤＰＨ酸化酵素を活性化する方法が挙げられる。
【００３９】
なお、本明細書で「動物」又は「患者」とは、鳥類、魚類、哺乳類などの脊椎動物、昆虫、線虫などの無脊椎動物に使用可能である。なお、本実施形態のＮＡＤＰＨ酸化酵素活性化方法が治療方法に当たる場合には、対象動物からヒトを除く。
【００４０】
本明細書で「治療」又は「処置」とは、以下のものが挙げられるが特に制限されない。
（ａ）哺乳動物において病態が生じることを予防するステップ、具体的にはそのような哺乳動物が病態を罹患しやすいが、罹患しているとまだ診断されていない場合；
（ｂ）病態を抑制するステップ、例えばその進行を止めるステップ；及び／又は
（ｃ）病態を軽減するステップ、例えば病態の退行を所望の終点に至るまで生じさせるステップ、を含む哺乳動物における病態の処置を含む。治療は、疾患の症状の回復（例えば疼痛又は不快感の緩和）も含み、そのような回復は、疾患に直接効果を与える又は与えない場合がある（例えば原因、伝染、発現など）。
【００４１】
〔ＮＡＤＰＨ酸化酵素の活性化方法〕
本実施形態のＮＡＤＰＨ酸化酵素活性化方法は、上記式（１）、（２）、及び（３）で表される化合物又はその塩を使用する。
【００４２】
具体的な活性化方法としては、特に限定されないが、例えば、上記ＮＡＤＰＨ酸化酵素活性化剤を動物に対して上記〔用途〕で記載したような方法により使用（投与）する方法が挙げられる。
【００４３】
ＮＡＤＰＨ酸化酵素活性化方法は、ＮＡＤＰＨ酸化酵素に関する症状及び疾患に有効である。より具体的には、血圧上昇への関与・感染防御・甲状腺ホルモン合成等に寄与し得る。また、ＮＡＤＰＨ酸化酵素活性化方法は、ＮＡＤＰＨ酸化酵素の発現及び／又は機能に関連する、疾患又は障害を、予防又は治療するために使用される。ここで疾患又は障害とは、ＮＡＤＰＨ酸化酵素の変異体又は正常なＮＡＤＰＨ酸化酵素の、異常な発現及び／又は機能に関連するものを含む。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明を実施例及び比較例を用いてより具体的に説明する。本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
【００４５】
本実施例で用いるＰＱＱジナトリウム塩としては、三菱瓦斯化学製ＢｉｏＰＱＱを使用した。なお、その他の化合物については、特に断りがない限り、和光純薬製の試薬（特級）を用いた。また、ＰＱＱフリー体（塩を形成していないもの）はピロロキノリンキノンジナトリウム水溶液に濃塩酸を加えてｐＨを１としたときに析出した固体を乾燥することにより得た。
【００４６】
〔製造例１：ＰＱＱＴＭＥ（ＰＱＱトリメチルエステル）〕
ＰＱＱフリー体３２ｇを、３０℃程度に加温したＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド３００ｇに溶解させた。この溶液に炭酸カリウム３０ｇを加え、硫酸ジメチル３５０ｇを混合すると３０分後に溶液温度が５０℃に上昇した。溶液温度が室温に下がったところで、炭酸カリウム３０ｇをさらに混合した。この溶液を３日間室温で攪拌し、水１Ｌ中に得られた溶液を加え、２ＮＨＣｌ３０ｇを混合した。溶液を濾過し、ろ物（ＰＱＱＴＭＥ）をイソプロパノールで洗浄した。ＮＭＲの結果を以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：３．９８ｐｐｍ，４．０１ｐｐｍ，４．１８ｐｐｍ，７．４９ｐｐｍ，８．９０ｐｐｍ
【００４７】
〔製造例２：モノメチルＰＱＱ〕
特開平５−７０４５８に記載の方法を改良してモノメチルＰＱＱを得た。具体的には、ＰＱＱＴＭＥ４ｇをアセトニトリル４００ｇに混合し、Ｋ２ＣＯ３５．５ｇを含む水４００ｇ溶液をこれに加えた。その後、２日間室温で混合し、得られた溶液に濃塩酸１２．５ｇを加え、続いてエバポレーターでアセトニトリルを除去した。溶液中に析出した固体をろ過し、減圧乾燥して４．０７ｇの固体を得た。ＮＭＲの結果を以下に示す。得られた固体のＮＭＲは、文献（特開平５−７０４５８）と一致した。
１Ｈ−ＮＭＲ  （ｄｍｓｏ−ｄ６）：３．８７（Ｍｅ）ｐｍｍ，７．２７ｐｍｍ，８．６１ｐｍｍ
【００４８】
〔製造例３：還元型ＰＱＱ〕
ＰＱＱジナトリウム塩（三菱瓦斯化学製ＢｉｏＰＱＱ）３．０ｇと水１．２Ｌとを混合して水溶液を調製した。他方、アスコルビン酸３０ｇと水１２０ｇと２Ｎ塩酸２．５ｇとを混合し、温度を１２℃にした。ここに水溶液を２時間かけて攪拌しながら加えた。混合終了後、２０℃で１８時間攪拌した。得られた溶液に２Ｎ塩酸２．５ｇを混合し、１時間攪拌した。その後水溶液中に析出した固体を濾過し、２Ｎ塩酸５ｍＬ，５０％エタノール，水８ｍＬで洗った。減圧乾燥を室温２０時間行い、下記式（６）で表される還元型ピロロキノリンキノンの含水結晶３．３５ｇ得た。
【化２】
0006697861.tif 000005
【００４９】
〔細胞によるＮＡＤＰＨ酸化酵素活性の測定方法〕
細胞としてはヒトｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａであるＨＴ１０８０を用いた。過酸化水素の測定にはペルオキシダーゼ存在下で過酸化水素と反応し蛍光性のＲｅｓｏｒｕｆｉｎとなるＡｍｐｌｅｘ  ｒｅｄ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。各遺伝子を安定的に発現する細胞株やＡｍｐｌｅｘ  ｒｅｄを用いた過酸化水素測定方法に関しては非特許文献３および４を元に実験を行った。試薬培地はナカライテスク特級を用いた。
【００５０】
まず、非特許文献３に従い、線虫Ｄｕａｌ  ＯｘｉｄａｓｅであるＢＬＩ−３とその活性化に必要であるＴＳＰ−１５およびＤＯＸＡ−１を安定的発現する細胞株を作製した（細胞株Ａ）。次いで、ヒトＤｕａｌ  Ｏｘｉｄａｓｅ  １とその活性化に必要であるＤｕａｌ  Ｏｘｉｄａｓｅ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  １、もしくはＤｕａｌ  Ｏｘｉｄａｓｅ  ２とその活性化に必要であるＤｕａｌ  Ｏｘｉｄａｓｅ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ２を安定的発現する細胞株を作製した（細胞株Ｂ）。
【００５１】
細胞株Ａ及びＢを５×１０４／１００μＬの濃度で９６穴黒色プレートにまき、ウシ血清１０％を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ  （ＤＭＥＭ）培地にて一晩培養した。ネガティブコントロールとしては遺伝子を導入していないＨＴ１０８０細胞を使用した。
【００５２】
緩衝液として、０．９ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．４９ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｇ／Ｌ  ｇｌｕｃｏｓｅを含むダルベッコ組成Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ  （Ｄ−ＰＢＳ）、あるいは１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４を含むＨａｎｋｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）を用意した。
【００５３】
培養後、培地を除き、上記緩衝液で細胞を数回洗浄した。そして、終濃度５０μＭ  Ａｍｐｌｅｘ  ｒｅｄ、０．１Ｕ／ｍＬ  ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  （ＨＲＰ）を含む緩衝液に、各測定濃度でサンプルを加え、３７℃で１時間培養した。ヒトＤｕａｌ  Ｏｘｉｄａｓｅにはカルシウム刺激が必要であるため、終濃度１μＭとなるようにｉｏｎｏｍｙｃｉｎを加えた。
【００５４】
波長５４４ｎｍの励起光を照射し、波長５９０ｎｍの蛍光を測定した。なお、各実験で予め濃度の分かっている過酸化水素水を用いて標準検量線を作製した。そして、各ウェルの蛍光値から培養上清中に存在する過酸化水素濃度を検量線を用いて換算した。
【００５５】
〔実施例Ａ〕
〔実施例Ａ１：ピロロキノリンキノンジナトリウム１０μＭでのＮＡＤＰＨ酸化酵素発現細胞〕
線虫のＮＡＤＰＨ酸化酵素であるＤｕａｌ  Ｏｘｉｄａｓｅの遺伝子ＢＬＩ−３と、ＢＬＩ−３と結合しその活性化に必要であるテトラスパニンをコードするｔｓｐ−１５遺伝子と、Ｄｕａｌ  Ｏｘｉｄａｓｅ  活性化蛋白質をコードするｄｏｘａ−１遺伝子を共発現させたＨＴ１０８０細胞（ＴＳＰ／ＤＯＸ／ＢＬＩ）にピロロキノリンキノンジナトリウム１０μＭを添加して、過酸化水素発生量を測定した。その結果、過酸化水素が１１．８μＭ発生していた，一方、これらの遺伝子群を発現していないＨＴ１０８０細胞（ｎｏｎ−ｔｒｆ）では、過酸化水素が２．２μＭ発生していた。
【００５６】
〔比較例Ａ１：ピロロキノリンキノンジナトリウムを添加しないＮＡＤＰＨ酸化酵素発現細胞〕
実施例Ａ１で用いたＨＴ１０８０細胞（ＴＳＰ／ＤＯＸ／ＢＬＩ）に添加物は加えず、過酸化水素発生量を行った。その結果、過酸化水素が１．９μＭ発生していた。
【００５７】
〔比較例Ａ２：イミダゾロキノンを添加したＮＡＤＰＨ酸化酵素発現細胞〕
実施例１で用いたＨＴ１０８０細胞（ＴＳＰ／ＤＯＸ／ＢＬＩ）にイミダゾロキノン１０μＭを添加して、過酸化水素発生量を測定した。その結果、過酸化水素が２．５μＭ発生していた。
【００５８】
上記実施例Ａ１及び比較例Ａ１の結果より、細胞に対してピロロキノリンキノンジナトリウムを添加すると、細胞が通常で発生している過酸化水素量の５倍以上の過酸化水素が発生することが分かった。また、上記実施例Ａ１及び比較例Ａ２の結果より、ピロロキノリンキノンの類似体であるにもかかわらず、イミダゾロキノンは過酸化水素発生を促進する効果はほぼないこともわかった。
【００５９】
〔実施例Ａ２：ピロロキノリンキノンジナトリウム５０μＭにおけるＮＡＤＰＨ酸化酵素発現細胞〕
実施例Ａ１で用いたＨＴ１０８０細胞（ＴＳＰ／ＤＯＸ／ＢＬＩ）にピロロキノリンキノンジナトリウム５０μＭを添加して、過酸化水素発生量を測定した。その結果、過酸化水素が１２．４μＭ発生していた。一方、これらの遺伝子群を発現していないＨＴ１０８０細胞（ｎｏｎ−ｔｒｆ）では、過酸化水素が３．４μＭ発生していた。
【００６０】
〔実施例Ａ３：ＮＡＤＰＨ酸化酵素阻害剤  ＤＰＩ添加時〕
実施例Ａ１で用いたＨＴ１０８０細胞（ＴＳＰ／ＤＯＸ／ＢＬＩ）に、ピロロキノリンキノンジナトリウム５０μＭと、ＮＡＤＰＨ酸化酵素阻害剤（ＤＰＩ）とを添加して、過酸化水素発生量を測定した。その結果、過酸化水素が０．９μＭ発生していた。
【００６１】
上記実施例Ａ２とＡ３を比較するとＮＡＤＰＨ酸化酵素阻害剤により過酸化水素の発生が大きく阻害されていることがわかった。この結果は、本実施形態のＮＡＰＨ酸化酵素活性化剤がＮＡＤＰＨ酸化酵素を活性化していることを示している。
【００６２】
〔実施例Ａ４−７：濃度を変えた実験〕
実施例Ａ１で用いたＨＴ１０８０細胞（ＴＳＰ／ＤＯＸ／ＢＬＩ）にピロロキノリンキノン０．１〜２．５μＭを添加して、各々の細胞の過酸化水素発生量を測定した。
【００６３】
その他、ＨＴ１０８０細胞（ＴＳＰ／ＤＯＸ／ＢＬＩ）にピロロキノリンキノン０〜５０μＭ又はイミダゾロキノン０〜５０μＭを添加して、各々の細胞の過酸化水素発生量を測定した結果、ＨＴ１０８０細胞（ＴＳＰ／ＤＯＸ／ＢＬＩ）にピロロキノリンキノン５０μＭ又はイミダゾロキノン５０μＭとＮＡＤＰＨ酸化酵素阻害剤（ＤＰＩ）とを添加した結果、及び、ＨＴ１０８０細胞（ＴＳＰ／ＤＯＸ／ＢＬＩ）にＮＡＤＰＨ酸化酵素阻害剤（ＤＰＩ）のみを添加した結果を図１にまとめて示す。
【００６４】
〔実施例Ａ８−１５、比較例Ａ３，４〕
ＮＡＤＰＨ酸化酵素であるＤｕａｌ  Ｏｘｉｄａｓｅの遺伝子ＢＬＩ−３と、ＢＬＩ−３と結合しその活性化に必要であるｄｏｘａ−１遺伝子、を発現させたＨＴ１０８０細胞（ＤＯＸ／ＢＬＩ）を用意した。ＨＴ１０８０細胞（ＤＯＸ／ＢＬＩ）にピロロキノリンキノンジナトリウム０〜５０μＭを添加して、各々の細胞の過酸化水素発生量を測定した。また、比較例Ａ３として、ピロロキノリンキノンジナトリウムを添加していない細胞の過酸化水素発生量を測定し、比較例Ａ４として、ピロロキノリンキノンジナトリウムに代えてイミダゾロキノン０〜５０μＭを添加した細胞の過酸化水素発生量を測定した。その結果を図１に示す。このＨＴ１０８０細胞（ＤＯＸ／ＢＬＩ）においても、ピロロキノリンキノンジナトリウムは過酸化水素の発生を促進することがわかった。
【００６５】
その他、ＨＴ１０８０細胞（ＤＯＸ／ＢＬＩ）にピロロキノリンキノン０〜５０μＭ又はイミダゾロキノン０〜５０μＭを添加して、各々の細胞の過酸化水素発生量を測定した結果、及び、ＨＴ１０８０細胞（ＤＯＸ／ＢＬＩ）にピロロキノリンキノン５０μＭ又はイミダゾロキノン５０μＭとＮＡＤＰＨ酸化酵素阻害剤（ＤＰＩ）とを添加した結果を図１にまとめて示す。
【００６６】
また、ＨＴ１０８０細胞（ｎｏｎ−ｔｒｆ）にピロロキノリンキノン０〜５０μＭ又はイミダゾロキノン０〜５０μＭを添加して、各々の細胞の過酸化水素発生量を測定した結果、及び、ＨＴ１０８０細胞（ＤＯＸ／ＢＬＩ）にピロロキノリンキノン５０μＭ又はイミダゾロキノン５０μＭとＮＡＤＰＨ酸化酵素阻害剤（ＤＰＩ）とを添加した結果を図１にまとめて示す。
【００６７】
〔実施例Ｂ〕
〔実施例Ｂ１〜４、比較例Ｂ１：時間変化の影響〕
実施例１で用いたＨＴ１０８０細胞（ＴＳＰ／ＤＯＸ／ＢＬＩ）を使用して、ピロロキノリンキノンジナトリウムの濃度に応じた過酸化水素発生量の時間変化、及び、ピロロキノリンキノンジナトリウムとＮＡＤＰＨ酸化酵素阻害剤（ＤＰＩ）とを添加したときの過酸化水素発生量の時間変化を測定した。その結果を図２に示す。図２に示すとおり、非常に短時間で過酸化水素の発生が起こっていることがわかった。これはＮＡＤＰＨ酸化酵素の活性をピロロキノリンキノンが直接増加させている可能性が高いことを示している。酵素の活性化方法としてはその酵素の発現量を上げる方法もあるが、本実施形態では、ＰＱＱが直接、酵素機能を上げていることがわかる。
【００６８】
〔実施例Ｃ〕
ヒト由来のＤｕａｌ  Ｏｘｉｄａｓｅ１とその活性化に必要なＤｕａｌ  Ｏｘｉｄａｓｅ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  １遺伝子を発現したＨＴ１０８０細胞（Ｄ１Ａ１）を用意した。同時にＤｕａｌ  Ｏｘｉｄａｓｅ２と、その活性化に必要なＤｕａｌ  Ｏｘｉｄａｓｅ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ２遺伝子と、を発現したＨＴ１０８０細胞（Ｄ２Ａ２）も用意した。ＨＴ１０８０細胞（Ｄ１Ａ１）及びＨＴ１０８０細胞（Ｄ２Ａ２）それぞれに対して、ピロロキノリンキノン０〜５０μＭを添加して、各々の細胞の過酸化水素発生量を測定した。また、ピロロキノリンキノン又はイミダゾロキノンと、ＮＡＤＰＨ酸化酵素阻害剤（ＤＰＩ）とを添加した細胞の過酸化水素発生量、及び、ピロロキノリンキノンに代えてイミダゾロキノン０〜５０μＭを添加した細胞の過酸化水素発生量を測定した。その結果を図３に示す。この結果からもわかるように、ピロロキノリンキノンは濃度依存的に過酸化水素を発生させており、ヒトの遺伝子でもＮＡＤＰＨ酸化酵素を活性化させていることがわかる。
【００６９】
〔実施例Ｄ〕
実施例１で用いたＨＴ１０８０細胞（ＴＳＰ／ＤＯＸ／ＢＬＩ）を使用して、ピロロキノリンキノンジナトリウムの濃度に応じた過酸化水素発生量の時間変化、及び、ピロロキノリンキノンジナトリウムとタンパク質合成阻害剤（シクロヘキシミド、ＣＨＸ）１０μｇ／ｍｌを添加したときの過酸化水素発生量の時間変化を測定した。その結果を図４に示す。図４に示すとおり、タンパク質合成阻害剤により過酸化水素産生促進は阻害されないことから、ピロロキノリンジナトリウムは新規タンパク合成を促進しているのではないことが示唆される。
【００７０】
実施例Ａで用いたＨＴ１０８０細胞（ＴＳＰ／ＤＯＸ／ＢＬＩ）およびその比較例ＨＴ１０８０細胞（ｎｏｎ−ｔｒｆ、ｎＴｒｆ）、実施例Ｃで用いたＨＴ１０８０細胞（Ｄ１Ａ１）、ＨＴ１０８０細胞（Ｄ２Ａ２）にピロロキノリンジナトリウム１０μＭを添加して１時間培養後の細胞抽出液（ｌｙｓａｔｅ）からＢＬＩ−３、ＴＳＰ−１５、ＤＯＸＡ−１、ヒトＤＵＯＸ１、ヒトＤＵＯＸ２、ヒトＤＵＯＸＡ１、ヒトＤＵＯＸＡ２の細胞膜上の発現量をウエスタンブロットにて解析した結果を図５（Ａ）と（Ｂ）に示す。また細胞表面分子を細胞膜非透過性のビオチンで標識し、ストレプトアビジン担体にてプルダウンした沈降物（ＳｔＡｖ）をそれぞれの抗体でブロットし、細胞表面発現量として解析した結果も併せて示す。細胞内在性コントロール分子としてＧＡＰＤＨを、細胞表面コントロール分子としてＮａＫＡＴＰａｓｅを示す。いずれもピロロキノリンジナトリウム非添加（−）および添加サンプル（＋）に差が見られないことから、ピロロキノリンジナトリウムはこれらの過酸化水素合成酵素やその機能関連タンパク質のタンパク合成を促進しているのではないことが示唆される。
【００７１】
〔実施例Ｅ〕
〔実施例Ｅ１−３、比較例Ｅ１−２：ＰＱＱ誘導体によるＮＡＤＰＨ酸化酵素の活性化〕
実施例１で用いたＢＬＩ−３の細胞（ＴＳＰ／ＤＯＸ／ＢＬＩ）にＰＱＱ誘導体１０μＭ又はアスコルビン酸若しくはイミダゾロキノン（ＩＰＱ）１０μＭを添加して、過酸化水素発生量を測定した結果を表１に示す。表１に示すとおり、ＰＱＱ誘導体においてもＮＡＤＰＨ酸化酵素の活性化が認められた。
【００７２】
【表１】
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【００７３】
還元型ＰＱＱ、モノメチルＰＱＱ、ＰＱＱＴＭＥは過酸化水素を発生する能力を有している。これらの物質は生体内でピロロキノリンキノンに戻ることが予想され、細胞への吸収性、初期構造の差で過酸化水素発生力が変わっている。これと対照的に過酸化水素を発生させる可能性があるといわれるアスコルビン酸では発生していなかった。また、キノンが壊れているＩＰＱでは微量であり、酵素活性機能はないことが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明のＮＡＤＰＨ酸化酵素活性化剤及びＮＡＤＰＨ酸化酵素を活性化する方法は、食品、医薬品などの用途において産業上の利用可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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