(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列がそれぞれ配列番号５〜７で示され、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列がそれぞれ配列番号１４〜１６で示されることと、
２）重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列がそれぞれ配列番号２３〜２５で示され、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列がそれぞれ配列番号３２〜３４で示されることと、
３）重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列がそれぞれ配列番号４１〜４３で示されるか、又は、Ｈ３３位でＳがＧに変異、Ｈ９６位でＮがＤに変異及びＨ６５位でＳがＮに変異からなる群より選択される少なくとも１つの変異を含む該領域の変異体であり、
軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列がそれぞれ配列番号５０〜５２で示されるか、又は、Ｌ３０位でＳがＧに変異及びＬ９０位でＬがＱに変異からなる群より選択される少なくとも１つの変異を含む該領域の変異体であること、
からなる群より選択されるＣＤＲ領域を含むことを特徴とする、抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２】
１）重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列がそれぞれ配列番号５〜７で示され、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列がそれぞれ配列番号１４〜１６で示されることと、
２）重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列がそれぞれ配列番号２３〜２５で示され、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列がそれぞれ配列番号３２〜３４で示されることと、
３）重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列がそれぞれ配列番号４１〜４３で示され、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列がそれぞれ配列番号５０〜５２で示されることと、
４）重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列がそれぞれ配列番号６３、４２、４３で示され、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列がそれぞれ配列番号５０〜５２で示されることと、
５）重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列がそれぞれ配列番号４１、６７、４３で示され、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列がそれぞれ配列番号５０〜５２で示されることと、
６）重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列がそれぞれ配列番号４１、４２、７０で示され、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列がそれぞれ配列番号５０〜５２で示されることと、
７）重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列がそれぞれ配列番号６３、６７、７０で示され、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列がそれぞれ配列番号７５〜７７で示されることと、
８）重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列がそれぞれ配列番号４１、４２、７０で示され、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列がそれぞれ配列番号７５〜７７で示されることと、
からなる群より選択されるＣＤＲ領域を含むことを特徴とする、抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合部分。
【請求項３】
配列が配列番号４、２２及び４０で示されることからなる群より選択される重鎖可変領域か、又は、
配列番号４０で示される重鎖可変領域の変異体であって、Ｈ２８位でＳがＮに変異、Ｈ３３位でＳがＧに変異、Ｈ９６位でＮがＤに変異及びＨ６５位でＳがＮに変異からなる群より選択される少なくとも１つの変異を含む該領域の変異体、
を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合部分。
【請求項４】
配列が配列番号４、２２、４０、６２、６６、６９、７２及び７９で示されることからなる群より選択される重鎖可変領域を含むことを特徴とする、請求項３に記載の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合部分。
【請求項５】
配列が配列番号１３、３１及び４９で示されることからなる群より選択される軽鎖可変領域か、又は、
配列番号４９で示される軽鎖可変領域の変異体であって、Ｌ３０位でＳがＧに変異及びＬ９０位でＬがＱに変異からなる群より選択される少なくとも１つの変異を含む該領域の変異体、
を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合部分。
【請求項６】
配列が配列番号１３、３１、４９及び７４で示されることからなる群より選択される軽鎖可変領域を含むことを特徴とする、請求項５に記載の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合部分。
【請求項７】
完全抗体、二重特異性抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又はＦｖであることを特徴とする、請求項１に記載の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合部分。
【請求項８】
抗ＯＸ４０抗体の重鎖可変領域をコード可能な核酸配列、及び該抗体の軽鎖可変領域をコード可能な核酸配列を含み、
該重鎖可変領域が、ＣＤＲ１〜３として、配列番号５〜７で示されるアミノ酸配列を含み、該軽鎖可変領域が、ＣＤＲ１〜３として、配列番号１４〜１６で示されるアミノ酸配列を含むか、
該重鎖可変領域が、ＣＤＲ１〜３として、配列番号２３〜２５で示されるアミノ酸配列を含み、該軽鎖可変領域が、ＣＤＲ１〜３として、配列番号３２〜３４で示されるアミノ酸配列を含むか、
該重鎖可変領域が、ＣＤＲ１〜３として、配列番号４１〜４３で示されるアミノ酸配列を含み、該軽鎖可変領域が、ＣＤＲ１〜３として、配列番号５０〜５２で示されるアミノ酸配列を含む
ことを特徴とする、核酸分子。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸分子を含むことを特徴とする、ベクター。
【請求項１０】
請求項８に記載の核酸分子、又は請求項９に記載のベクターを含むことを特徴とする、宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合部分と、他の生物活性物質とを含み、該抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合部分が、直接又はリンカーフラグメントを通じて他の生物活性物質に共役していることを特徴とする、複合体。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体若しくはその抗原結合部分、又は請求項１１に記載の複合体と、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤と、他の生物活性物質とを含むことを特徴とする、組成物。
【請求項１３】
腫瘍を予防又は治療するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体若しくはその抗原結合部分、請求項１１に記載の複合体、又は請求項１２に記載の組成物。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品・バイオ分野に関し、特に、抗ＯＸ４０抗体及びその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ細胞の活性化には、２つのシグナルの共同作用が必要である。１つ目のシグナルは、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）により抗原の発生が認識され、ＣＤ３分子を介して細胞内に伝達されるものであり、１つ目のシグナルがＴ細胞の適応免疫応答における特異性を決定する。２つ目のシグナルは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）又は標的細胞の表面の共刺激分子（costimulator）と、対応するＴ細胞表面の共刺激分子受容体との相互作用により発生するものである。共刺激シグナルの刺激により、抗原特異的Ｔ細胞が増殖し、エフェクターＴ細胞に分化する。共刺激シグナルが不足していると、Ｔ細胞は反応しなくなるか、又は自身が免疫寛容の状態になり、さらには、プログラム細胞死となる。
【０００３】
ＯＸ４０（ＴＮＦＲＳＦ４、ＡＣＴ３５、ＣＤ１３４、ＩＭＤ１６又はＴＸＧＰ１Ｌとも称する）は、ＴＮＦＲ受容体スーパーファミリーのメンバーであり、Ｉ型膜貫通タンパク質であり、主に、活性化したＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞とに発現する（非特許文献１）。その細胞外領域は、３つのシステインリッチドメインと、Ｃ末端が不完全な１つのＣＲＤとにより組成されている（非特許文献２）。ＯＸ４０は、副共刺激分子である。ＣＤ２８とは異なり、ＯＸ４０は、休止したＴ細胞の表面には発現せず、Ｔ細胞の活性化後、２４時間〜７２時間で比較的高く発現する。そのリガンドのＯＸ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ４、ＴＸＧＰ１、ＯＸ−４０Ｌ、ｇｐ３４又はＣＤ２５２）は、ＩＩ型膜貫通タンパク質であり、樹状細胞、Ｂ細胞等の活性化した抗原提示細胞に発現する（非特許文献３）。ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌシグナルは、Ｔ細胞の活性化、増殖及びアポトーシス阻害のプロセスにおいて非常に重要な役割を果たす。アゴニストタイプのＯＸ４０抗体はＴ細胞の増殖及び活性化を効果的に促進し、良好な抗腫瘍作用を生じさせることが可能であることが研究により明らかになっている（非特許文献４）。
【０００４】
Stefanie N. Linch他により、ＯＸ４０アゴニスト抗体と腫瘍を治療する他の方法との併用について詳細に整理され、説明されている（非特許文献５）。放射線治療とＯＸ４０アゴニスト抗体との併用時にはマウスの生存期間が著しく延長され得ることも報告されている（非特許文献６）。
【０００５】
この分野では、ＯＸ４０と高親和的に結合可能な、ＯＸ４０アゴニスト活性を有する抗ＯＸ４０抗体が依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Paterson他、(1987) MolImmunol 24:1281-1290
【非特許文献２】Deanne M他、(2006) Structure 14:1321-1330
【非特許文献３】Godfrey、W.R他、(1994) JExpMed 180:757-762
【非特許文献４】Brendan D. Curti他、(2013) CancerRes 73:7189-7198
【非特許文献５】Stefanie N. Linch他、(2015) frontiers in oncology 5:1-14
【非特許文献６】Gough M J他、(2010) J Immunother 33(8):798-809、Kjaergaard J他、(2005) 103(1):156-164
【発明の概要】
【０００７】
上述した技術的課題を解決するために、本発明は、良好な特異性と比較的高い親和性と安定性とを備えた抗ＯＸ４０抗体及びその応用を提供することを目的とする。
【０００８】
本発明の第１の態様は、
１）重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列がそれぞれ配列番号５〜７で示され、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列がそれぞれ配列番号１４〜１６で示されるか、又は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が該配列に比べて、ａ）同じ抗原エピトープに結合する配列と、ｂ）同一性が７０％、８０％、８５％、９０％又は９７％を超える配列との両者のうち少なくとも１つを満たすことと、
２）重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列がそれぞれ配列番号２３〜２５で示され、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列がそれぞれ配列番号３２〜３４で示されるか、又は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が該配列に比べて、ａ）同じ抗原エピトープに結合する配列と、ｂ）同一性が７０％、８０％、８５％、９０％又は９７％を超える配列との両者のうち少なくとも１つを満たすことと、
３）重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列がそれぞれ配列番号４１〜４３で示され、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列がそれぞれ配列番号５０〜５２で示されるか、又は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が該配列に比べて、ａ）同じ抗原エピトープに結合する配列と、ｂ）同一性が７０％、８０％、８５％、９０％又は９７％を超える配列との両者のうち少なくとも１つを満たすことと、
からなる群より選択されるＣＤＲ領域を含む、抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合部分に関する。
【０００９】
本発明の第１の態様のいずれか一項の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合部分は、
１）重鎖可変領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４の配列がそれぞれ配列番号８〜１１で示されることと、
２）重鎖可変領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４の配列がそれぞれ配列番号２６〜２９で示されることと、
３）重鎖可変領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４の配列がそれぞれ配列番号４４〜４７で示されることと、
からなる群より選択される重鎖可変領域のフレームワーク領域を更に含む。
【００１０】
本発明の第１の態様のいずれか一項の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合部分は、
１）軽鎖可変領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４の配列がそれぞれ配列番号１７〜２０で示されることと、
２）軽鎖可変領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４の配列がそれぞれ配列番号３５〜３８で示されることと、
３）軽鎖可変領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４の配列がそれぞれ配列番号５３〜５６で示されることと、
からなる群より選択される軽鎖可変領域のフレームワーク領域を更に含む。
【００１１】
本発明の第１の態様のいずれか一項の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合部分は、配列が配列番号４、２２及び４０で示されることからなる群より選択される重鎖可変領域か、又は、該配列に比べて、ａ）同じ抗原エピトープに結合する配列と、ｂ）同一性が７０％、８０％、８５％、９０％又は９７％を超える配列との両者のうち少なくとも１つを満たす重鎖可変領域を含む。
【００１２】
さらに、配列が配列番号４、２２及び４０で示されることからなる群より選択される重鎖可変領域、又は、該配列に比べて、ａ）同じ抗原エピトープに結合する配列と、ｂ）突然変異したアミノ酸の個数が３以下である配列との両者のうち少なくとも１つを満たすことからなる群より選択される重鎖可変領域のＣＤＲ領域を含む。
【００１３】
さらに、配列が配列番号４、２２、４０、６２、６６、６９、７２及び７９で示されることからなる群より選択される重鎖可変領域を含む。
【００１４】
本発明の第１の態様のいずれか一項の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合部分は、配列が配列番号１３、３１及び４９で示されることからなる群より選択される軽鎖可変領域か、又は、該配列に比べて、ａ）同じ抗原エピトープに結合する配列と、ｂ）同一性が７０％、８０％、８５％、９０％又は９７％を超える配列との両者のうち少なくとも１つを満たす軽鎖可変領域のＣＤＲ領域を含む。
【００１５】
さらに、配列が配列番号１３、３１及び４９で示されることからなる群より選択される軽鎖可変領域か、又は、該配列に比べて、ａ）同じ抗原エピトープに結合する配列と、ｂ）突然変異したアミノ酸の個数が３以下である配列との両者のうち少なくとも１つを満たす軽鎖可変領域を含む。
【００１６】
さらに、配列が配列番号１３、３１、４９及び７４で示されることからなる群より選択される軽鎖可変領域を含む。
【００１７】
本発明の第１の態様のいずれか一項の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合部分は、完全抗体、二重特異性抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又はＦｖである。
【００１８】
本発明の一実施の形態において、ｓｃＦｖである場合に、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間にリンカーペプチドが含まれていてもよく、該リンカーペプチドの配列が、配列番号１で示される。
【００１９】
本発明の第１の態様のいずれか一項の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合部分では、重鎖定常領域が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ及びＩｇＡから選択される。
【００２０】
本発明の実施の形態において、重鎖定常領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４から選択される。
【００２１】
本発明の具体的な実施の形態において、重鎖定常領域が、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４である。
【００２２】
本発明の第１の態様のいずれか一項の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合部分では、軽鎖定常領域が、κ又はλである。
【００２３】
本発明の第２の態様は、抗体の重鎖可変領域をコード可能な核酸配列を含み、該重鎖可変領域が、
（１）配列番号５〜７と、
（２）配列番号２３〜２５と、
（３）配列番号４１〜４３と、
（４）前記（１）〜（３）の配列に比べて、ａ）同じ抗原エピトープに結合する配列と、ｂ）同一性が７０％、８０％、８５％、９０％又は９７％を超える配列との両者のうち少なくとも１つを満たすことと、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、核酸分子に関する。
【００２４】
さらに、前記重鎖可変領域が、
配列番号４、２２及び４０、又は、該配列に比べて、ａ）同じ抗原エピトープに結合する配列と、ｂ）同一性が７０％、８０％、８５％、９０％又は９７％を超える配列との両者のうち少なくとも１つを満たすこと、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２５】
さらに、配列が配列番号４、２２及び４０で示されることからなる群より選択される重鎖可変領域か、又は、該配列に比べて、ａ）同じ抗原エピトープに結合する配列と、ｂ）突然変異したアミノ酸の個数が３以下である配列との両者のうち少なくとも１つを満たす重鎖可変領域を含む。
【００２６】
さらに、配列が配列番号４、２２、４０、６２、６６、６９、７２及び７９で示されることからなる群より選択される重鎖可変領域を含む。
【００２７】
本発明の実施の形態において、前記核酸分子が、抗体の重鎖定常領域をコード可能な核酸配列を更に含み、該重鎖定常領域が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ及びＩｇＡから選択される。
【００２８】
本発明の実施の形態において、重鎖定常領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４から選択される。
【００２９】
本発明の具体的な実施の形態において、重鎖定常領域が、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４である。
【００３０】
本発明の第２の態様は、抗体の軽鎖可変領域をコード可能な核酸配列を含み、該軽鎖可変領域が、
（１）配列番号１４〜１６と、
（２）配列番号３２〜３４と、
（３）配列番号５０〜５２と、
（４）前記（１）〜（３）の配列に比べて、ａ）同じ抗原エピトープに結合する配列と、ｂ）同一性が７０％、８０％、８５％、９０％又は９７％を超える配列との両者のうち少なくとも１つを満たすことと、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、核酸分子に関する。
【００３１】
さらに、前記重鎖可変領域が、
配列番号１３、３１及び４９、又は、該配列に比べて、ａ）同じ抗原エピトープに結合する配列と、ｂ）同一性が７０％、８０％、８５％、９０％又は９７％を超える配列との両者のうち少なくとも１つを満たすこと、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００３２】
さらに、配列が配列番号１３、３１及び４９で示されることからなる群より選択される軽鎖可変領域か、又は、該配列に比べて、ａ）同じ抗原エピトープに結合する配列と、ｂ）突然変異したアミノ酸の個数が３以下である配列との両者のうち少なくとも１つを満たす軽鎖可変領域を含む。
【００３３】
さらに、配列が配列番号１３、３１、４９及び７４で示されることからなる群より選択される軽鎖可変領域を含む。
【００３４】
本発明の実施の形態において、前記核酸分子が、抗体の軽鎖定常領域をコード可能な核酸配列を更に含み、該軽鎖定常領域が、κ型又はλ型である。
【００３５】
本発明の第４の態様は、本発明の第２の態様又は第３の態様のいずれか一項の核酸分子を含む、ベクターに関する。
【００３６】
本発明の第４の態様のいずれか一項のベクターは、本発明の第２の態様のいずれか一項の核酸分子と、第３の態様のいずれか一項の核酸分子とを含む。
【００３７】
本発明の第５の態様は、本発明の第２の態様若しくは第３の態様のいずれか一項の核酸分子、又は本発明の第４の態様のいずれか一項のベクターを含む、宿主細胞に関する。
【００３８】
本発明の第６の態様は、本発明の第１の態様のいずれか一項の抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合部分と、他の生物活性物質とを含み、該抗ＯＸ４０抗体又はその抗原結合部分が、直接又はリンカーフラグメントを通じて他の生物活性物質に共役している、複合体に関する。
【００３９】
本発明の実施の形態において、前記他の生物活性物質が、腫瘍細胞の増殖を間接的に阻害するか、又は有機体の免疫反応を活性化することによって細胞を阻害若しくは死滅させて、腫瘍を治療することが可能な、例えばインターロイキン類、腫瘍壊死因子、ケモカイン、ナノ粒子等の化学物質、ポリペプチド、酵素、サイトカイン、又は生物活性を有する他の単一物質若しくは混合物質から選択される。
【００４０】
本発明の第７の態様は、本発明の第１の態様のいずれか一項の抗ＯＸ４０抗体若しくはその抗原結合部分、第２の態様若しくは第３の態様のいずれか一項の核酸分子、第４の態様のいずれか一項のベクター、第５の態様のいずれか一項の宿主細胞、又は本発明の第６の態様のいずれか一項の複合体と、任意選択の薬学的に許容可能な担体又は賦形剤と、任意選択の他の生物活性物質とを含む、組成物（例えば医薬組成物）に関する。本発明の第７の態様のいずれか一項の組成物（例えば医薬組成物）では、前記他の生物活性物質が、制限されないが、他の抗体、融合タンパク質、又は医薬品（例えば放射線、化学療法の薬剤等の抗腫瘍薬）を含む。
【００４１】
さらに、本発明は、本発明の第１の態様のいずれか一項の抗ＯＸ４０抗体若しくはその抗原結合部分、第２の態様若しくは第３の態様のいずれか一項の核酸分子、第４の態様のいずれか一項のベクター、第５の態様のいずれか一項の宿主細胞、第６の態様のいずれか一項の複合体、又は第７の態様のいずれか一項の組成物を、腫瘍を予防又は治療する調製に用いる、用途に関する。
【発明の効果】
【００４２】
上述した形態によれば、本発明は、少なくとも次の利点を有する。
【００４３】
本発明は、酵母ディスプレイ技術を用い、スクリーニングと更なる親和性成熟とによって、良好な特異性と比較的高い親和性と安定性とを備えた抗ＯＸ４０抗体が得られるものであり、この抗体は、特異的にヒトＯＸ４０と結合することができ、活性化したＴ細胞との結合によってＴ細胞の活性化作用を更に増強させることができ、腫瘍の増殖に対して著しい阻害作用を有している。また、本発明の抗ＯＸ４０抗体は、完全ヒト抗体であり、従来のマウス由来、キメラ抗体及びヒト化抗体に比べて、免疫原性がより低く、患者の拒絶反応が低減され、医薬品化により適している。
【００４４】
上述の説明は、本発明の実施態様の概述にすぎず、本発明の技術的手段をより明確に理解し、明細書の内容通りに実施することができるように、以下に、図面を参照して本発明のより好ましい実施形態を詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ｈＯＸ４０に対する精製された抗ｈＯＸ４０ｓｃＦｖの結合の結果を示す図であり、なお、ｘ軸はＥＧＦＰの蛍光強度を示し、Ｙ軸は抗ｈｌｇ−ＰＥの蛍光強度を示している。
【図２】抗ＯＸ４０抗体の特異性の検出を示す図であり、なお、ｘ軸はＥＧＦＰの蛍光強度を示し、Ｙ軸は抗ｈｌｇ−ＰＥの蛍光強度を示している。
【図３】親和性が向上された酵母単クローンの染色結果を示す図である。
【図４】ＥＬＩＳＡ法により検出された３種類の抗体とｈＯＸ４０との結合能を示す図である。
【図５】ＥＬＩＳＡ法により検出された親和性成熟後のそれぞれの重鎖変異体とｈＯＸ４０との結合能を示す図である。
【図６】ＥＬＩＳＡ法により検出された親和性成熟後のＨ９６位重鎖変異体及びそれぞれの軽鎖変異体とｈＯＸ４０との結合能を示す図である。
【図７】抗ｈＯＸ４０抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏアゴニスト活性の検出結果を示す図である。
【図８】Ｈ９６−Ｌ８０の３種類のＩｇＧサブタイプのｉｎ  ｖｉｔｒｏアゴニスト活性を示す比較図である。
【図９】抗ＯＸ４０抗体とヒト及びアカゲザルのＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞との結合能の検出を示す図である。
【図１０】Ｏ２１ｓｃＦｖ抗体のアゴニスト活性の検出結果を示す図である。
【図１１】Ｏ２１ｓｃＦｖ及びｌｇＧの２つの形態のアゴニスト活性の検出結果を示す図である。
【図１２】Ｈ９６−Ｌ８０のＩｇＧ１及びＩｇＧ４の２種類のサブタイプのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＴ細胞サブタイプに対する影響を示す図である。
【図１３】Ｏ２１ｍＡｂのｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍（ＰＣ−３）増殖阻害作用の結果を示す図である。
【図１４】Ｏ２１ｍＡｂのｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍（Ａ３７５）増殖阻害作用の結果を示す図である。
【図１５】４５℃の加速安定性試験により抗ＯＸ４０抗体の安定性を評価した結果を示す図であり、Ａは濃度検出、Ｂはモノマー含有量の検出、Ｃはｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性に対するＮＦ−κｂ系の検出を示している。
【図１６】Ｈ９６−Ｌ８０抗体の薬物動態の検出結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
以下、図面及び実施例を参照しながら、本発明の具体的な実施形態を詳細に説明する。以下の実施例は、本発明の説明に用いられるものであるが、これにより本発明の範囲を限定するものではない。
【００４７】
以下、本発明を更に説明する。本発明において、特に断らない限り、本文で用いられる科学技術的用語は、当業者が通常理解する意味を有するものとする。また、本文で用いられるタンパク質及び核酸化学、分子生物学、細胞及び組織培養、微生物学、免疫学に関連する用語及び実験室の操作手順は、いずれも該当分野において広く用いられる用語及び通常の手順であるものとする。また、本発明の更なる理解のために、以下、関連する用語の定義及び解釈を提供する。
【００４８】
本発明において、「抗体」という用語は、一般に２対の同じポリペプチド鎖（各対が１本の「軽」（Ｌ）鎖と１本の「重」（Ｈ）鎖とを有する）からなる免疫グロブリン分子を指す。抗体の軽鎖はκ軽鎖とλ軽鎖とに分けることができる。重鎖はμ、δ、γ、α又はεに分けることができ、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥと定義する。軽鎖及び重鎖では、可変領域と定常領域とが約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結されており、重鎖には約３つ以上のアミノ酸の「Ｄ」領域が更に含まれている。各重鎖は重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖定常領域（ＣＨ）とからなる。重鎖定常領域は３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）からなる。各軽鎖は軽鎖可変領域（ＶＬ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とからなる。軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬからなる。抗体の定常領域は免疫グロブリンと宿主組織又は宿主因子とを媒介することができ、これには免疫系の各種細胞（例えば、エフェクター細胞）と代表的な補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）との結合が含まれる。ＶＨ領域及びＶＬ領域は更に、変化しやすい領域（相補性決定領域（ＣＤＲ））に細分することができ、その間には保存的なフレームワーク領域（ＦＲ）という領域が分散している。各ＶＨ及びＶＬは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順でＮ末端からＣ末端まで配列された３つのＣＤＲと４つのＦＲとからなる。各重鎖／軽鎖対の可変領域（ＶＨ及びＶＬ）はそれぞれ、抗体結合部位を形成している。アミノ酸から各領域又はドメインまでの割り当ては、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))、又はChothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia他(1989) Nature 342:878-883の定義に従うものとする。本発明に記載されたアミノ酸の位置は、オンラインツールのａｂｙｓｉｓに基づいて比較して得られたものであり（http://www.bioinf.org.uk/abysis/index.html）、アミノ酸の配列における実際の順位を表しているわけではない。
【００４９】
「抗体」という用語は、いずれかの特定の抗体生産方法に制限されるものではない。抗体には特に、例えば、組換え抗体と、モノクローナル抗体と、ポリクローナル抗体とが含まれる。抗体は、異なるアイソタイプの抗体、例えば、ＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のサブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭ抗体とすることができる。
【００５０】
本発明において、抗体の「抗原結合部分」という用語は、全長抗体の１つ以上の部分を指し、上記部分は抗体により結合される同一抗原（例えばＯＸ４０）を結合する能力を保持しており、抗原に対する特異的結合が完全抗体と競合する。一般に、Fundamental Immunology, Ch.7 (Paul, W., ed.、第２版、Raven Press, N.Y. (1989))は、全ての目的で引用することにより本明細書の一部をなす。組換えＤＮＡ技術又は完全抗体の酵素触媒作用若しくは化学的切断によって抗原結合部分を産生することができる。いくつかの場合では、抗原結合部分には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ及び相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、一本鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）、キメラ抗体、二重特異性抗体（diabody）、並びにこのようなポリペプチドが含まれており、ポリペプチドに特異的抗原結合能を与えるのに十分な抗体の少なくとも一部分が含まれる。
【００５１】
本発明において、「ベクター」という用語は、或るタンパク質をコードするポリヌクレオチドが挿入され、タンパク質を発現させることが可能な核酸を運ぶ手段を指す。ベクターは、宿主細胞の形質転換、伝達又はトランスフェクションによって、ベクターが持つ遺伝物質エレメントを宿主細胞内で発現させることができる。例示すると、ベクターには、プラスミド；ファージミド；コスミド；例えば酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）又はＰ１由来の人工染色体（ＰＡＣ）のような人工染色体；例えばλファージ又はＭ１３ファージのようなファージ、及び動物ウイルス等が含まれる。ベクターとして用いられる動物ウイルスの種類には、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス（例えばＳＶ４０）がある。ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択要素及びレポーター遺伝子が含まれる発現を制御する複数の要素を含み得る。また、ベクターは、複製開始部位を含んでいてもよい。ベクターは、例えばウイルス粒子、リポソーム又はタンパク膜のような細胞への進入を助ける成分を更に含む可能性があるが、これらに限られるものではない。
【００５２】
本発明において、「宿主細胞」という用語は、ベクターが導入される細胞を指し、例えば、大腸菌若しくは枯草菌等の原核細胞、酵母細胞若しくはアスペルギルス等の真菌細胞、ショウジョウバエＳ２細胞若しくはＳｆ９等の昆虫細胞、又は線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞若しくはヒト細胞等の動物細胞のような多くの種類が含まれる。
【００５３】
本発明において、「特異的結合」とは、例えば抗体と当該抗体を産生させる抗原との間の反応のような２つの分子間の非ランダムな結合反応をいう。ここで、第１の抗原に結合する抗体の第２の抗原に対する結合親和性は、検出されないか、又は弱いものである。或るいくつかの実施形態において、或る１つの抗原特異的抗体とは、親和性（ＫＤ）≦１０−５Ｍ（例えば１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ等）で当該抗原に結合するものをいい、式中、ＫＤは、解離率と結合率との比（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）とし、当業者に既知の方法によって測定することができる。
【実施例】
【００５４】
実施例１  組換えヒトＯＸ４０の発現及び関連するＥＧＦＰ細胞の調製
Ｓ１．１
タンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔにおけるヒトＯＸ４０のアミノ酸配列（Ｐ４３４８９）に基づいて、ヒトＯＸ４０の細胞外ドメインのアミノ酸配列（ｈＯＸ４０）（すなわち、Ｐ４３４８９における１位の残基〜２１６位の残基）を取得した。
【００５５】
Ｓ１．２
タンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔにおけるヒト免疫グロブリンｇａｍｍａ１（ＩｇＧ１）の定常領域のアミノ酸配列（Ｐ０１８５７）に基づいて、ヒトＩｇＧ１−Ｆｃ（ｈＦｃ）のドメインのアミノ酸配列（すなわち、Ｐ０１８５７における１０４位の残基〜３３０位の残基）を取得した。
【００５６】
Ｓ１．３
タンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔにおけるマウス免疫グロブリンｇａｍｍａ１（ＩｇＧ１）の定常領域のアミノ酸配列（Ｐ０１８６８）に基づいて、マウスＩｇＧ１−Ｆｃ（ｍｕＦｃ）のドメインのアミノ酸配列（すなわち、Ｐ０１８６８における９８位の残基〜３２４位の残基）を取得した。
【００５７】
Ｓ１．４
人工合成の手法によってステップＳ１．１〜Ｓ１．３におけるＤＮＡ断片を取得し、合成された遺伝子配列は、それぞれFermentas社のＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩのダブルダイジェストによって市販のベクターｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ−ＨｉｓＡ（Invitrogen、Ｖ８６３−２０）にサブクローニングし、プラスミド構築の正確性をシークエンシングして検証し、組換えプラスミドＤＮＡ、すなわち、ｐｃＤＮＡ４−ｈＯＸ４０−ｈＦｃ、ｐｃＤＮＡ４−ｈＯＸ４０−ｍｕＦｃを取得した。
【００５８】
Ｓ１．５
タンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔにおける情報に基づいて、高感度緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰのアミノ酸配列（Ｃ５ＭＫＹ７）、ヒトＯＸ４０のアミノ酸配列（Ｐ４３４８９）、マウスＯＸ４０のアミノ酸配列（Ｐ４７７４１）、ヒトＣＤ１３７のアミノ酸配列（Ｑ０７０１１）、ヒトＣＤ２７のアミノ酸配列（Ｐ２６８４２）を取得した。
【００５９】
Ｓ１．６
人工合成の手法によってステップＳ１．５におけるＤＮＡ断片を取得し、合成された遺伝子配列は、それぞれFermentas社のＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩのダブルダイジェストによって市販のベクターｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ−ＨｉｓＡ（Invitrogen、Ｖ８６３−２０）にサブクローニングし、プラスミド構築の正確性をシークエンシングして検証し、組換えプラスミドＤＮＡ、すなわち、ｐｃＤＮＡ４−ｈＯＸ４０−ＥＧＦＰ、ｐｃＤＮＡ４−ｈＣＤ１３７−ＥＧＦＰ、ｐｃＤＮＡ４−ｍＯＸ４０−ＥＧＦＰ、及びｐｃＤＮＡ４−ｈＣＤ２７−ＥＧＦＰを取得した。
【００６０】
Ｓ１．７
ステップＳ１．６におけるＥＧＦＰ組換えプラスミドをＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１５７３（商標））細胞にトランスフェクションし、トランスフェクションの４８時間後に蛍光活性化シグナルソーター（ＦＡＣＳ）によってｈＯＸ４０、ｈＣＤ１３７、ｍＯＸ４０、ｈＣＤ２７の発現を確認した。
【００６１】
Ｓ１．８
ｐｃＤＮＡ４−ｈＯＸ４０−Ｆｃ、ｐｃＤＮＡ４−ｈＯＸ４０−ｍｕＦｃをタンパク質産生用のＨＥＫ２９３細胞に一過性トランスフェクションした。組換え発現プラスミドをＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地で希釈して形質転換に必要なＰＥＩ（ポリエチレンイミン）溶液に加え、プラスミド／ＰＥＩ混合物をグループ毎にそれぞれ細胞懸濁液に加え、３７℃で静置し、１０％のＣＯ２、９０ｒｐｍで培養した。５日〜６日培養した後に一過性発現培養上清を集め、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーによってｈＯＸ４０−Ｆｃ、ｈＯＸ４０−ｍｕＦｃのタンパク質サンプルを予備精製し、以下の各実施例に用いた。得られたタンパク質サンプルはＳＤＳ−ＰＡＧＥによって一次検出を行い、目的のバンドをはっきりと見ることができた。
【００６２】
実施例２  酵母ディスプレイライブラリーからの抗ｈＯＸ４０抗体のスクリーニング、クローニング、発現及び同定
２．１  方法
ヒトＯＸ４０を対象とした完全ヒト抗体を酵母ディスプレイ技術によってスクリーニングした。健康な１５０人に由来するＰＢＭＣのＩｇＭ及びＩｇＧのｃＤＮＡにおけるＶＨ及びＶＬ遺伝子を特定のベクターにクローニングすることによって、容量５×１０８のｓｃＦＶ酵母ディスプレイライブラリーを構築した（ＶＨとＶＬとの間の結合配列はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１）リンカーペプチドである）。１０倍の容量の酵母バンクを回復させ、酵母表面での抗体発現を誘導し、１００ｎＭのビオチン化ｈＯＸ４０抗原を用いて磁気分離の手法によって２回濃縮し、その後、ビオチン化ｈＯＸ４０を用いてフローサイトメトリー分離によって更に２回濃縮した。得られた酵母コーティングプレートは、単クローンを選択した。単クローン酵母は増殖及び誘導によって発現した後、抗ｍｙｃ抗体及びビオチン化ｈＯＸ４０又は対照抗原ｈＣＤ１３７を用いて染色、分析し、抗原陽性／対照抗原陰性の酵母を陽性酵母とした。
【００６３】
ＦＡＣＳによって確認された酵母クローンについて酵母コロニーのＰＣＲ及びシークエンシングを行った。ＰＣＲプライマーは配列Ｆ：ＣＧＴＡＧＡＡＴＣＧＡＧＡＣＣＧＡＧＧＡＧＡ（配列番号２）、配列Ｒ：ＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＣＴＡＧＣ（配列番号３）とし、シークエンシングプライマーは配列Ｒとした。シークエンシングの結果を得て、ソフトウェアＢｉｏＥｄｉｔを用いて配列を比較分析した。
【００６４】
このようにして得られた一本鎖抗体のｓｃＦｖ遺伝子を上述したヒトＩｇＧ１−Ｆｃ遺伝子と融合させた後、Fermentas社のＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩのダブルダイジェストによって市販のベクターｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ−ＨｉｓＡにクローニングし、分子クローニングの標準操作通りにクローニングしてプラスミドを小量抽出した。抽出したプラスミドは、ＨＥＫ２９３細胞で一過性発現させ、ｐｒｏｔｅｉｎＡカラムで精製した。
【００６５】
ｈＯＸ４０−ＥＧＦＰ細胞を０．５％のＰＢＳ−ＢＳＡバッファーに再懸濁し、上述の精製した２μｇの抗ｈＯＸ４０ｓｃＦｖ抗体を加え、同時に、関連の対照をセットした。陰性対照は、２μｇのｈＩｇＧ１タンパク質とした。二次抗体は、eBioscienceの抗ｈＩｇ−ＰＥとした。染色が終わってからフローサイトメーターで検出した。細胞表面のｈＯＸ４０抗原に結合可能な抗体をこの手法で同定した。
【００６６】
スクリーニング及び同定によって得られた比較的特性が良い３株の抗体は、それぞれＯ３ｓｃＦｖ、Ｏ１９ｓｃＦｖ、Ｏ２１ｓｃＦｖであった。図１に示すように、３株の抗ｈＯＸ４０抗体はいずれも細胞表面のｈＯＸ４０と結合することができ、陰性対照は細胞表面のｈＯＸ４０と結合することができなかった。上述した抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間には、リンカーペプチド配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１）が含まれる。
【００６７】
２．２  配列
２．２．１  Ｏ３ｓｃＦｖの重鎖可変領域のアミノ酸配列
ＱＶＱＬＱＱＷＧＡＧＬＬＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＧＦＮＧＥＹＦＴＤＹＦＷＴＷＶＲＱＰＰＧＥＡＬＥＷＬＡＬＩＹＷＤＤＤＥＲＹＳＰＳＬＫＮＲＬＩＩＴＫＤＩＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＨＭＥＰＡＤＴＧＴＹＹＣＡＲＷＧＧＳＬＭＮＡＦＤＶＷＧＰＧＴＭＶＴＶＳＳ（配列番号４）
下線部分はそれぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３であり、その配列番号をそれぞれ配列番号５〜７とし、下線を引いていない部分はそれぞれＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４であり、その配列番号をそれぞれ配列番号８〜１１とする。
【００６８】
その対応するＤＮＡ配列
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＡＣＡＧＣＡＧＴＧＧＧＧＣＧＣＡＧＧＡＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＣＴＴＣＧＧＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＣＡＣＣＴＧＣＧＧＴＴＴＣＡＡＴＧＧＡＧＡＡＴＡＣＴＴＣＡＣＴＧＡＴＴＡＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＧＴＣＣＧＧＣＡＧＣＣＣＣＣＣＧＧＡＧＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＴＧＣＡＣＴＣＡＴＴＴＡＴＴＧＧＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＧＣＧＣＴＡＣＡＧＣＣＣＡＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＡＣＡＧＡＣＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＴＴＴＣＣＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＴＧＧＴＣＣＴＴＡＣＡＡＴＧＡＣＣＣＡＣＡＴＧＧＡＧＣＣＴＧＣＧＧＡＣＡＣＡＧＧＣＡＣＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＴＧＧＧＧＴＧＧＴＴＣＴＴＴＡＡＴＧＡＡＣＧＣＴＴＴＴＧＡＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＣＡＧＧＧＡＣＡＡＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＴＴＣＡ（配列番号１２）
【００６９】
その軽鎖可変領域のアミノ酸配列
ＱＳＡＬＩＱＰＡＳＶＳＧＳＰＧＱＳＩＴＩＳＣＴＧＴＳＳＤＶＧＧＹＮＹＶＳＷＹＱＲＨＰＧＫＡＰＲＬＭＩＹＤＶＴＫＲＰＳＧＶＳＮＲＦＳＧＳＫＳＧＮＴＡＳＬＴＩＳＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＳＳＹＴＳＳＳＩＡＶＦＧＧＧＴＱＬＴＶＬ（配列番号１３）
なお、下線部分はそれぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３であり、その配列番号をそれぞれ配列番号１４〜１６とし、下線を引いていない部分はそれぞれＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４であり、その配列番号をそれぞれ配列番号１７〜２０とする。
【００７０】
その対応するＤＮＡ配列
ＣＡＧＴＣＴＧＣＣＣＴＧＡＴＴＣＡＧＣＣＴＧＣＣＴＣＣＧＴＧＴＣＴＧＧＧＴＣＴＣＣＴＧＧＡＣＡＧＴＣＧＡＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＣＴＧＧＡＡＣＣＡＧＴＡＧＴＧＡＣＧＴＴＧＧＴＧＧＴＴＡＴＡＡＴＴＡＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＡＣＧＡＣＡＣＣＣＡＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＣＣＡＧＡＣＴＣＡＴＧＡＴＴＴＡＴＧＡＴＧＴＣＡＣＴＡＡＧＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡＴＣＧＣＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＧＴＣＴＧＧＣＡＡＣＡＣＧＧＣＣＴＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＧＧＧＣＴＣＣＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＣＧＡＧＧＣＴＧＡＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＡＴＡＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＴＴＧＣＴＧＴＧＴＴＣＧＧＡＧＧＡＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＣＣＴＣ（配列番号２１）
【００７１】
２．２．２  Ｏ１９ｓｃＦｖの重鎖可変領域のアミノ酸配列
ＱＶＱＬＶＥＳＥＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＲＦＴＦＳＮＹＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＮＩＫＱＤＧＳＥＫＹＹＭＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＦＬＱＭＮＴＬＲＡＥＤＴＡＭＹＹＣＴＲＶＳＦＧＶＰＴＹＤＤＦＷＲＳＹＡＴＰＡＷＹＦＤＦＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２２）
下線部分はそれぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３であり、その配列番号をそれぞれ配列番号２３〜２５とし、下線を引いていない部分はそれぞれＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４であり、その配列番号をそれぞれ配列番号２６〜２９とする。
【００７２】
その対応するＤＮＡ配列
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＡＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＣＧＣＡＧＣＣＴＣＴＡＧＡＴＴＣＡＣＧＴＴＴＡＧＴＡＡＣＴＡＴＴＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＣＣＡＡＴＡＴＡＡＡＧＣＡＡＧＡＴＧＧＡＡＧＴＧＡＧＡＡＡＴＡＴＴＡＴＡＴＧＧＡＣＴＣＴＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＴＣＡＣＴＧＴＴＴＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＡＣＣＣＴＡＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＡＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＡＣＧＡＧＧＧＴＴＡＧＴＴＴＣＧＧＡＧＴＧＣＣＧＡＣＧＴＡＴＧＡＣＧＡＴＴＴＴＴＧＧＡＧＧＡＧＴＴＡＣＧＣＧＡＣＧＣＣＣＧＣＴＴＧＧＴＡＣＴＴＣＧＡＴＴＴＴＴＧＧＧＧＣＣＧＴＧＧＴＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号３０）
【００７３】
その軽鎖可変領域のアミノ酸配列
ＱＳＡＬＩＱＰＡＳＶＳＧＳＰＧＱＳＩＴＩＳＣＴＧＩＳＳＤＤＧＹＹＫＹＶＳＷＹＱＱＹＰＧＫＡＰＫＬＭＩＹＤＶＳＫＲＰＳＧＩＳＦＲＦＳＧＳＫＳＧＮＴＡＳＬＴＩＳＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＳＳＹＴＳＮＭＴＰＹＶＦＧＴＧＴＫＶＴＶＬ（配列番号３１）
なお、下線部分はそれぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３であり、その配列番号をそれぞれ配列番号３２〜３４とし、下線を引いていない部分はそれぞれＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４であり、その配列番号をそれぞれ配列番号３５〜３８とする。
【００７４】
その対応するＤＮＡ配列
ＣＡＧＴＣＴＧＣＴＣＴＧＡＴＴＣＡＧＣＣＴＧＣＣＴＣＣＧＴＧＴＣＴＧＧＧＴＣＴＣＣＴＧＧＡＣＡＧＴＣＧＡＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＣＴＧＧＡＡＴＴＡＧＴＡＧＴＧＡＣＧＡＴＧＧＴＴＡＴＴＡＴＡＡＧＴＡＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡＴＡＴＣＣＡＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＣＣＡＡＡＣＴＣＡＴＧＡＴＴＴＡＴＧＡＴＧＴＣＡＧＴＡＡＧＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＧＡＴＴＴＣＴＴＴＴＣＧＣＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＧＴＣＴＧＧＣＡＡＣＡＣＧＧＣＣＴＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＴＧＧＧＣＴＣＣＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＣＧＡＧＧＣＴＧＡＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＡＴＡＣＡＡＧＴＡＡＣＡＴＧＡＣＣＣＣＣＴＡＴＧＴＣＴＴＣＧＧＣＡＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＡ（配列番号３９）
【００７５】
２．２．３  Ｏ２１ｓｃＦｖの重鎖可変領域のアミノ酸配列
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＩＳＧＤＳＶＳＳＮＳＶＳＷＤＷＩＲＱＳＰＳＲＧＬＥＷＬＧＲＴＹＹＲＳＫＷＹＮＥＹＡＶＳＶＥＳＲＩＴＩＮＰＤＴＳＫＮＱＦＳＬＱＬＮＳＶＴＰＥＤＴＡＩＹＦＣＶＲＮＮＹＦＦＤＬＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号４０）
下線部分はそれぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３であり、その配列番号をそれぞれ配列番号４１〜４３とし、下線を引いていない部分はそれぞれＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４であり、その配列番号をそれぞれ配列番号４４〜４７とする。
【００７６】
その対応するＤＮＡ配列
ＣＡＧＧＴＡＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＡＧＧＴＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＣＴＣＧＣＡＧＡＣＣＣＴＣＴＣＡＣＴＣＡＣＣＴＧＴＧＣＣＡＴＣＴＣＣＧＧＧＧＡＣＡＧＴＧＴＣＴＣＴＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＴＣＴＣＴＴＧＧＧＡＣＴＧＧＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＣＣＣＣＣＴＣＧＡＧＧＧＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＣＴＧＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴＡＣＴＡＴＡＧＧＴＣＣＡＡＧＴＧＧＴＡＴＡＡＴＧＡＧＴＡＴＧＣＡＧＴＡＴＣＴＧＴＧＧＡＡＡＧＴＣＧＡＡＴＡＡＣＣＡＴＣＡＡＣＣＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＴＣＴＣＣＣＴＧＣＡＡＣＴＧＡＡＣＴＣＴＧＴＧＡＣＴＣＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＡＴＡＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＴＡＡＧＡＡＡＴＡＡＣＴＡＣＴＴＣＴＴＣＧＡＴＣＴＣＴＧＧＧＧＣＣＧＴＧＧＴＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号４８）
【００７７】
その軽鎖可変領域のアミノ酸配列
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＤＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＬＲＳＮＷＰＰＧＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号４９）
なお、下線部分はそれぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３であり、その配列番号をそれぞれ配列番号５０〜５２とし、下線を引いていない部分はそれぞれＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４であり、その配列番号をそれぞれ配列番号５３〜５６とする。
【００７８】
その対応するＤＮＡ配列
ＧＡＡＡＴＴＧＴＧＴＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＴＡＣＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＡＴＧＣＡＴＣＣＧＡＣＡＧＧＧＣＣＡＣＴＧＧＣＡＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＴＧＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＴＧＣＧＴＡＧＣＡＡＣＴＧＧＣＣＴＣＣＧＧＧＧＴＡＣＡＣＴＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡ（配列番号５７）
【００７９】
実施例３  ３株の抗体のｓｃＦｖ型抗体からＩｇＧ型抗体へのフォーマット化
タンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔにおけるヒト免疫グロブリンｇａｍｍａ４（ＩｇＧ４）の定常領域のアミノ酸配列（Ｐ０１８６１）に基づいて、ヒトＩｇＧ４の定常領域のアミノ酸配列を取得した。スクリーニングして得られたＯ３、Ｏ１９、Ｏ２１の重鎖可変領域ＶＨの配列をヒトＩｇＧ４の定常領域の遺伝子配列と一緒にアセンブリングし、アセンブリングされた遺伝子を合成し、Fermentas社のＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩのダブルダイジェストによってベクターｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ−ＨｉｓＡにサブクローニングし、ｐｃＤＮＡ４−Ｏ２１ＨＣ、ｐｃＤＮＡ４−Ｏ３ＨＣ、ｐｃＤＮＡ４−Ｏ１９ＨＣを取得した。
【００８０】
タンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔにおけるヒト免疫グロブリンＫａｐｐａの定常領域のアミノ酸配列（Ｐ０１８３４）に基づいて、ヒトＫａｐｐａの軽鎖定常領域のアミノ酸配列を取得した。スクリーニングして得られたＯ２１の軽鎖可変領域ＶＬの配列をヒトＫａｐｐａの軽鎖定常領域の遺伝子配列と一緒にアセンブリングした。タンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔにおけるヒト免疫グロブリンｌａｍｂｄａの定常領域のアミノ酸配列（Ａ０Ｍ８Ｑ６）に基づいて、ヒトｌａｍｂｄａの軽鎖定常領域のアミノ酸配列を取得し、スクリーニングして得られたＯ３、Ｏ１９の軽鎖可変領域ＶＬの配列をヒトｌａｍｂｄａの軽鎖定常領域の遺伝子配列と一緒にアセンブリングした。アセンブリングされた遺伝子を合成し、Fermentas社のＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩのダブルダイジェストによってベクターｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ−ＨｉｓＡにサブクローニングし、ｐｃＤＮＡ４−Ｏ２１ＬＣ、ｐｃＤＮＡ４−Ｏ３ＬＣ、ｐｃＤＮＡ４−Ｏ１９ＬＣを取得した。
【００８１】
このようにして得られた重鎖及び軽鎖のプラスミドをAidLab社の提供するプラスミド大量抽出キット（ＰＬ１４）を用いて大量抽出した。組み換えられ、構築された軽鎖及び重鎖のプラスミドの共トランスフェクションＨＥＫ２９３細胞について抗体を発現させた。組換え発現プラスミドをＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地で希釈して形質転換に必要なＰＥＩ（ポリエチレンイミン）溶液に加え、プラスミド／ＰＥＩ混合物をグループ毎にそれぞれ細胞懸濁液に加え、３７℃で静置し、１０％のＣＯ２、１２０ｒｐｍで培養し、５日〜６日培養した後に一過性発現培養上清を集め、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーによって抗ｈＯＸ４０抗体、すなわちＯ３ｍＡｂ、Ｏ１９ｍＡｂ及びＯ２１ｍＡｂを精製して得た。
【００８２】
実施例４  抗ｈＯＸ４０抗体の特性の同定
抗体のｈＯＸ４０に対する特異的認識の有無の同定
精製された抗ｈＯＸ４０抗体と、ｈＯＸ４０、ｈＣＤ１３７及びｈＣＤ２７タンパク質との結合
ｈＯＸ４０−ＥＧＦＰ、ｈＣＤ１３７−ＥＧＦＰ及びｈＣＤ２７−ＥＧＦＰを発現した実施例１で構築されたＨＥＫ２９３細胞を０．５％のＰＢＳ−ＢＳＡバッファーに再懸濁し、抗ｈＯＸ４０ｍＡｂタンパク質を加え、氷上で２０分インキュベートした。洗浄後、eBioscienceの二次抗体の抗ｈＩｇ−ＰＥを加え、氷上で２０分。洗浄後、細胞を５００μｌの０．５％のＰＢＳ−ＢＳＡバッファーに再懸濁し、フローサイトメーターで検出した。結果は図２に示す通りであり、３株の抗体（Ｏ３ｍＡｂ、Ｏ１９ｍＡｂ及びＯ２１ｍＡｂ）はいずれもｈＯＸ４０−ＥＧＦＰ細胞と結合することができ、他のいくつかの種類のＥＧＦＰ細胞（ｈＣＤ１３７−ＲＧＦＰ−２９３Ｆ、ｈＣＤ２７−ＲＧＦＰ−２９３Ｆ）とは結合することができず、良好な特異性が示された。
【００８３】
実施例５  抗ＯＸ４０抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける親和性の向上
３株の抗体（Ｏ３ｍＡｂ、Ｏ１９ｍＡｂ及びＯ２１ｍＡｂ）はいずれもｈＯＸ４０−ＥＧＦＰ細胞と特異的に結合することができ、試験により、Ｏ２１ｓｃＦｖとｈＯＸ４０とにはより高い親和性があり、また、一過性トランスフェクションでは安定的で高い発現量があることがわかったので、Ｏ２１ｓｃＦｖ抗体を選択して更にｉｎ  ｖｉｔｒｏ親和性向上試験を行った。なお、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ親和性向上試験は抗体親和性に対する変異率の影響の研究を目的としており、試験の結果はＯ２１ｓｃＦｖの判定に限らないものとし、Ｏ３ｓｃＦｖ、Ｏ１９ｓｃＦｖ及びＯ２１ｓｃＦｖを含む抗体の変異率の抗体親和性に対する影響として理解するものとする。
【００８４】
５．１  抗ＯＸ４０  ２１＃ＳｃＦｖの親和性改善の酵母ライブラリーの構築
実施例１で構築されたｐｃＤＮＡ４−ＯＸ４０−２１−Ｆｃプラスミドをテンプレートとし、ｐｃＤＮＡ４−Ｆ：ＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＣＴＡＧＣ（配列番号５８）及びｃＭｙｃ−ＢＢＸｈｏＩ：ＧＣＣＡＧＡＴＣＴＣＧＡＧＣＴＡＴＴＡＣＡＡＧＴＣＴＴＣＴＴＣＡＧＡＡＡＴＡＡＧＣＴＴＴＴＧＴＴＣＴＡＧＡＡＴＴＣＣＧ（配列番号５９）をプライマーとして標準的なＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物は、Fermentas社のＮｈｅＩ及びＢｇｌＩＩ酵素消化によって組換えプラスミドを構築した。続いて、文献Ginger他、(2006) Nat Protoc 1(2):755-68の方法を参照し、エラープローンＰＣＲ法によって、ｓｃＦｖがランダム変異したＰＣＲ産物を得た。使用するプライマーは、ｅｐ−Ｆ：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ（配列番号６０）及びｅｐ−Ｒ：ＧＧＣＡＧＣＣＣＣＡＴＡＡＡＣＡＣＡＣＡＧＴＡＴ（配列番号６１）とした。得られたＰＣＲ産物は、Fermentas社のＧｅｎｅＪＥＴ  ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔで精製してからエタノール沈殿で濃度が１μｇ／μｌを超えるまで濃縮した。残りの操作方法は、文献Ginger他、(2006) Nat Protoc 1(2):755-68の方法を参照し、酵母電気穿孔法及びｉｎ  ｖｉｖｏ組換え法によって、親和性が成熟した酵母バンクを得た。
【００８５】
５．２  生産され、親和性が改善した酵母の抗ＯＸ４０  ２１＃ｓｃＦｖのスクリーニング
このようにして得られた親和性成熟後の酵母バンクを１０ｎＭ及び１ｎＭのｈＯＸ４０−Ｆｃタンパク質を用いて２回のフローサイトメトリーによって分離した。分離して得られた酵母産物のコーティングプレートは、単クローンを選択して同定した。低濃度の抗原染色法によって、事前に得られた野生型酵母を対照として、フローサイトメトリー染色で親和性が向上した酵母単クローンを特定し、ＦＡＣＳで確認された酵母クローンに対して、上述した方法と同様に酵母コロニーＰＣＲとシークエンシングとを行った。シークエンシングして得られた配列について、ソフトウェアＢｉｏＥｄｉｔによって変異部位を分析した。
【００８６】
抗体親和性に対して影響がなく、更には親和性が向上したＯ２１ｓｃＦｖの変異部位を整理した。結果は表１に示す通りである。表１の結果から、Ｏ２１ｓｃＦｖでは表１に示されるように１つ以上の変異が発生しており、親和性に対して影響がなく、更には或る程度向上していることがわかる。これに対応するスクリーニングされた酵母単クローンの配列の分析結果は、表２に示す通りである。表２から、表１で列記された変異部位に表２に示されたいくつかの変異の組合せがある場合には抗体の親和性を向上させることができるとわかる。表２に示された酵母染色の結果は図３に示す通りであり、Ｏ２１ｓｃＦｖと比べると、抗体の親和性向上の程度が異なっていることがわかる。
【００８７】
【表１】
0006771551.tif 000002
【００８８】
【表２】
0006771551.tif 000003
【００８９】
表２からわかるように、Ｏ２１ｓｃＦｖの重鎖ＣＤＲ領域及び軽鎖ＣＤＲ領域については、既存の実験では、３つのアミノ酸及び２つのアミノ酸をそれぞれ変異させても（実施例６における抗ＯＸ４０  ２１＃Ｈ９６−Ｌ８０ｍＡｂ、その軽鎖の変異は３つのアミノ酸まで可能）、抗体の親和性を維持し、更には向上させることができると指摘されており、一方、Ｏ２１ｓｃＦｖの重鎖可変領域には１１９個のアミノ酸（なお、ＣＤＲ領域の３２個のアミノ酸、ＦＲ領域の８７個のアミノ酸）が、軽鎖可変領域には１０９個のアミノ酸（なお、ＣＤＲ領域の２９個のアミノ酸、ＦＲ領域の８０個のアミノ酸）が含まれることが現在知られており、そこで、重鎖ＣＤＲ領域又は軽鎖ＣＤＲ領域との相同性が９０％以上である場合には、抗体親和性を維持し、更には向上させる能力が依然としてあると考えられる。実際には、抗体の親和性と配列の相同性のパーセンテージとの間に決定的な関係はなく、抗体エピトープ（又は「抗原決定部位」という）を決定可能なキーアミノ酸残基の影響をより大きく受け、これらのキーアミノ酸残基では変異が生じていないか、又は変異に決定的な改変作用がないことを前提として、配列相同性は７０％まで下げることができる。
【００９０】
実施例６  ｓｃＦｖ型抗体からＩｇＧ型抗体へのフォーマット化
実施例３の方法に従って、親和性成熟後のｓｃＦｖ型抗体をＩｇＧ型抗体にフォーマット化し、一連の抗ＯＸ４０  ２１＃ｍＡｂの変異体を得た。具体的な配列情報は、次の通りである。
【００９１】
0006771551.tif 000004
【００９２】
0006771551.tif 000005
【００９３】
その軽鎖可変領域のアミノ酸配列
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＤＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＬＲＳＮＷＰＰＧＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号４９）
なお、下線部分はそれぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３であり、その配列番号をそれぞれ配列番号５０〜５２とし、下線を引いていない部分はそれぞれＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４であり、その配列番号をそれぞれ配列番号５３〜５６とする。
【００９４】
その対応するＤＮＡ配列
ＧＡＡＡＴＴＧＴＧＴＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＴＡＣＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＡＴＧＣＡＴＣＣＧＡＣＡＧＧＧＣＣＡＣＴＧＧＣＡＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＴＧＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＴＧＣＧＴＡＧＣＡＡＣＴＧＧＣＣＴＣＣＧＧＧＧＴＡＣＡＣＴＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡ（配列番号５７）
【００９５】
0006771551.tif 000006
【００９６】
0006771551.tif 000007
【００９７】
その軽鎖可変領域のアミノ酸配列
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＤＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＬＲＳＮＷＰＰＧＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号４９）
なお、下線部分はそれぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３であり、その配列番号をそれぞれ配列番号５０〜５２とし、下線を引いていない部分はそれぞれＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４であり、その配列番号をそれぞれ配列番号５３〜５６とする。
【００９８】
その対応するＤＮＡ配列
ＧＡＡＡＴＴＧＴＧＴＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＴＡＣＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＡＴＧＣＡＴＣＣＧＡＣＡＧＧＧＣＣＡＣＴＧＧＣＡＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＴＧＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＴＧＣＧＴＡＧＣＡＡＣＴＧＧＣＣＴＣＣＧＧＧＧＴＡＣＡＣＴＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡ（配列番号５７）
【００９９】
0006771551.tif 000008
【０１００】
0006771551.tif 000009
【０１０１】
その軽鎖可変領域のアミノ酸配列
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＤＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＬＲＳＮＷＰＰＧＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号４９）
なお、下線部分はそれぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３であり、その配列番号をそれぞれ配列番号５０〜５２とし、下線を引いていない部分はそれぞれＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４であり、その配列番号をそれぞれ配列番号５３〜５６とする。
【０１０２】
その対応するＤＮＡ配列
ＧＡＡＡＴＴＧＴＧＴＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＴＡＣＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＡＴＧＣＡＴＣＣＧＡＣＡＧＧＧＣＣＡＣＴＧＧＣＡＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＴＧＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＴＧＣＧＴＡＧＣＡＡＣＴＧＧＣＣＴＣＣＧＧＧＧＴＡＣＡＣＴＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡ（配列番号５７）
【０１０３】
0006771551.tif 000010
【０１０４】
0006771551.tif 000011
【０１０５】
0006771551.tif 000012
【０１０６】
0006771551.tif 000013
【０１０７】
0006771551.tif 000014
【０１０８】
0006771551.tif 000015
【０１０９】
0006771551.tif 000016
【０１１０】
0006771551.tif 000017
【０１１１】
実施例７  抗ｈＯＸ４０抗体の特性同定
７．１  精製された抗ｈＯＸ４０抗体とｈＯＸ４０との結合能の検出（ＥＬＩＳＡ法）
コーティングバッファー（５０ｍＭ、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）でｈＯＸ４０−ｍｕＦｃを２μｇ／ｍｌに希釈し、１００μＬ／ウェル、４℃で一晩静置した。プレート洗浄後、３％のＢＳＡ−ＰＢＳ、３７℃で１時間密閉した。抗ｈＯＸ４０抗体をそれぞれ２０００ｎｇ／ｍｌから始めて合計１１個の濃度で２倍段階希釈を行い、希釈液（１％のＢＳＡ−ＰＢＳ）を対照とし、３７℃で２時間インキュベートした。ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Goat anti-human IgG-HRP conjugated）を加え、３７℃で１時間インキュベートした。可溶性で単一成分のＴＭＢ基質発色液を加え、室温、遮光下で５分〜１０分発色させた。２ＮのＨ２ＳＯ４、５０μＬ／ウェルで発色反応を終了させた。マイクロプレートリーダーＭＤ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ３８４に置いてＯＤ４５０ｎｍ〜６５０ｎｍにおける値を読み取り、ソフトウェアＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ  ｖ５．４でデータを処理し、作図、解析した。結果は図４〜図６に示す通りである。図４からわかるように、ＳｃＦｖからＩｇＧ型抗体に転換された後、Ｏ１９ｍＡｂの親和性は依然として比較的低く、Ｏ２１ｍＡｂの親和性はあまり変化せず、比較的良好であり、Ｏ３ｍＡｂの親和性は著しく向上した。図５及び図６から分かるように、上述した抗ＯＸ４０  ２１＃ｍＡｂの変異体はいずれもＯＸ４０と結合することができ、また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで親和性が成熟された抗ＯＸ４０  ２１＃ＶＨｎｅｗ−Ｌ８０ｍＡｂ、抗ＯＸ４０  ２１＃Ｈ９６−Ｌ８０ｍＡｂは、抗ＯＸ４０  ２１＃ｍＡｂと比較すると、親和性が略２倍向上した。
【０１１２】
７．２  表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるａ−ｈＯＸ４０ｍＡｂｓとｈＯＸ４０との動力学親和性定数の解析
組換えヒトＯＸ４０に対する抗ｈＯＸ４０抗体の結合反応速度は、表面プラズモン共鳴（ＳＲＰ：surface plasmon resonance）法によって計測器ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｘ１００を用いて測定した。チップＣＭ５に抗ヒトＦｃ抗体（マウスＦｃを交差認識しない）をカップリングし、被験抗体をランニングバッファーで５ｎＭに希釈し、リガンドとしてチップ上の抗体により捕獲した。ＯＸ４０−ｍｕＦｃは、ランニングバッファーで１０００ｎＭから１．３７ｎＭに２倍希釈した。注入時間は１８０秒とし、解離時間は１８００秒とし、再生時間は６０秒とした。ランニングバッファーはＨＢＳ−ＥＰ＋とし、再生バッファーは１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．０）とした。シンプルな１対１のＬａｎｇｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ評価ソフトウェア３．２版（BIAcore Evaluation Software version 3.2））によって結合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（ｋＤ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比率で算出した。表３からわかるように、親和性成熟後の抗ＯＸ４０  ２１＃Ｈ９６−Ｌ８０ｍＡｂの親和性は、略２倍向上した。
【０１１３】
【表３】
0006771551.tif 000018
【０１１４】
７．３  ＮＦ−κｂ系の抗ｈＯＸ４０抗体ｉｎ  ｖｉｔｒｏアゴニスト活性の検出
ＯＸ４０−ＣＤ４０プラスミドの構築
タンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔにおけるヒトＯＸ４０のアミノ酸配列（Ｐ４３４８９）に基づいて、ヒトＯＸ４０の細胞外ドメイン及び膜貫通領域のアミノ酸配列（すなわち、Ｐ４３４８９における１位の残基〜２３５位の残基）を取得した。タンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔにおけるヒトＣＤ４０のアミノ酸配列（Ｐ２５９４２）に基づいて、ヒトＣＤ４０の細胞内領域のアミノ酸配列（すなわち、Ｐ２５９４２における２１６位の残基〜２７７位の残基）を取得した。遺伝子合成法によって両者を一緒にアセンブリングし、Fermentas社のＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩのダブルダイジェストによって市販のベクターｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ−ＨｉｓＡ（Invitrogen、Ｖ８６３−２０）にサブクローニングし、プラスミド構築の正確性をシークエンシングして検証し、組換えプラスミドＤＮＡ、すなわち、ｐｃＤＮＡ４−ＯＸ４０−ＣＤ４０（すなわち、下記で指摘するＯＸ４０−ＣＤ４０）を取得した。
【０１１５】
２９３Ｔ−ＮＦ−κＢ安定発現株
２９３Ｔ細胞を２４ウェルプレートに１×１０５／ウェル、１ウェル当たり２００μｌのＤＭＥＭ完全培地で播種し、同時にＭＯＩ＝２で２０μｌのＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼ−レンチウイルス（Qiagen、ｃａｔ：ＣＬＳ−０１３Ｌ）を加えた。感染の２４時間後に上清を捨て、ＤＭＥＭ完全培地を１ｍｌ加えて培養を続け、２４時間後にｐｒｏｍｙｃｉｎを０．３μｇ／ｍｌ含むＤＭＥＭ完全培地に交換して培養を続け、細胞を培養、増幅させて凍結保存した。ｐｒｏｍｙｃｉｎでスクリーニングされた２９３Ｔ−ＮＦ−κＢ細胞を２４ウェルプレートに１×１０５／ウェルで播種し、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αで６時間刺激した後に、溶解した細胞についてルシフェラーゼを検出した。その結果、ＴＮＦ−αで刺激された細胞のルシフェラーゼの値は刺激されていない細胞よりも明らかに高いことがわかり、ＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼが既に２９３Ｔ細胞に安定的に発現されていることが証明された。
【０１１６】
ペニシリン−ストレプトマイシン混合溶液を含まない培地で５×１０５の２９３Ｔ−ＮＦ−κＢ細胞を再懸濁し、６ウェルプレートに播種した。２４時間後、上清を捨て、ＰＢＳで１回洗浄し、ペニシリン−ストレプトマイシン混合溶液がなく無血清の培養液を１．８ｍｌ加えた。プラスミド：リポソームが１：３の割合で、０．２μｇのＯＸ４０−ＣＤ４０プラスミドをトランスフェクションした。トランスフェクションの４時間後、上清を捨て、新鮮な完全培養液に交換し、培養を続けた。トランスフェクションの翌日、細胞を５×１０４／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種し、一連の濃度段階の抗体（初濃度１０μｇ／ｍｌ、１０倍希釈で７段階）を加え、同じ濃度のｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋ（Jackson Immuno Research Laboratories、１０９−００６−００８）を同時に加えて培養を６時間続け、溶解された細胞についてルシフェラーゼを検出した。図７に示すように、図７のＡ、Ｃ、Ｅ及びＧはそれぞれＯ３ｍＡｂ、Ｏ２１ｍＡｂ、抗ＯＸ４０  ２１＃ＶＨｎｅｗ−Ｌ８０ｍＡｂ及び抗ＯＸ４０  ２１＃Ｈ９６−Ｌ８０ｍＡｂのそれぞれの濃度におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏアゴニスト活性の検出結果を示しており、図７のＢ、Ｄ、Ｆ及びＨはそれぞれ対数（log）を取ったｉｎ  ｖｉｔｒｏアゴニスト活性の検出結果を示す図であり、その結果、Ｏ３ｍＡｂ及びＯ２１ｍＡｂがいずれもｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて良好なアゴニスト活性を有することが示され、良好な用量依存性が示された。親和性が向上した抗ＯＸ４０  ２１＃ＶＨｎｅｗ−Ｌ８０ｍＡｂ、抗ＯＸ４０  ２１＃Ｈ９６−Ｌ８０ｍＡｂは、アゴニスト活性が略２倍向上した。
【０１１７】
実施例８  抗体アゴニスト活性に対するそれぞれのサブタイプの影響
抗ＯＸ４０  ２１＃ｍＡｂの各種変異体はいずれもｈＯＸ４０に対して特異的な高親和性を有しており、ｈＯＸ４０との結合反応速度の結果がいずれも良好であり、このうちの抗ＯＸ４０  ２１＃Ｈ９６−Ｌ８０ｍＡｂはアゴニスト活性が略２倍向上したので、本願では抗ＯＸ４０  ２１＃Ｈ９６−Ｌ８０ｍＡｂ（以下、「Ｈ９６−Ｌ８０」と略称する）を例として更に説明するものとし、その他の各変異体については説明を省略する。なお、以降の各実施例ではＨ９６−Ｌ８０についてのみ説明をしているが、抗ＯＸ４０  ２１＃ｍＡｂの各種変異体にその特性がないか、又は他の２種類の抗体（Ｏ３ｍＡｂ、Ｏ１９ｍＡｂ）にその特性がないと理解するものではない。以降の各実施例におけるＨ９６−Ｌ８０についての更なる実験データは、本発明の方法により得られる各種抗ＯＸ４０抗体が比較的高い活性、親和性、機能性又は安定性を有することを証明するためのみに使用される。
【０１１８】
タンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔにおけるヒト免疫グロブリンｇａｍｍａ１（ＩｇＧ１）及びヒト免疫グロブリンｇａｍｍａ２（ＩｇＧ２）の定常領域のアミノ酸配列（それぞれＰ０１８５７及びＰ０１８５９）に基づいて、ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ２の定常領域のアミノ酸配列を取得した。その他は上述した方法に従って操作し、抗ＯＸ４０  ２１＃Ｈ９６−Ｌ８０ＩｇＧ１ｍＡｂ及び抗ＯＸ４０  ２１＃Ｈ９６−Ｌ８０ＩｇＧ２ｍＡｂを取得した。実施例７の方法に従って実験し、結果は図８に示す通りである。なお、図８のＡ及び図８のＢはそれぞれＩｇＧ１及びＩｇＧ２の２種類のサブタイプのそれぞれの濃度におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏアゴニスト活性の検出結果であり、図８のＣはＩｇＧ１及びＩｇＧ２の２種類のサブタイプの対数を取った比較結果を示す図であり、図８のＤは０．１ｕｇ／ｍｌの濃度におけるものであり、Ｈ９６−Ｌ８０の３種類のサブタイプの抗体アゴニスト活性が略同じであることがわかる。
【０１１９】
実施例９  精製されたＨ９６−Ｌ８０抗体と、ヒト及びアカゲザルの活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞との結合能の検出
ヒトリンパ球分離溶液（Tianjin Hanyang）の密度勾配遠心によって健康なボランティアの末梢血濃縮白血球から末梢血単核球ＰＢＭＣを分離し、ＲＰＭＩ完全培地に播種した。終濃度５ｕｇ／ｍｌのＰＨＡを用いてＰＢＭＣを４８時間活性化した。細胞を０．５％のＰＢＳ−ＢＳＡバッファーに再懸濁し、Ｈ９６−Ｌ８０タンパク質を加え、氷上で２０分インキュベートした。洗浄後、biolegendの二次抗体ＦＩＴＣ抗ｈＩｇＧ（Ｃａｔ＃４０９３１０）又はBiolegendの抗体ＰＥ抗ｈＯＸ４０（Ｃａｔ＃３５０００３）と、biolegendの抗体ＡＰＣ抗ヒトＣＤ４（Ｃａｔ＃３１７４１６）とを加え、氷上で２０分インキュベートした。洗浄後、細胞を５００μｌ、０．５％のＰＢＳ−ＢＳＡバッファーに再懸濁し、フローサイトメーターで検出した。結果は図９のＡに示す通りであり、Ｈ９６−Ｌ８０は活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞に対して良好に結合することができた。
【０１２０】
Ｈ９６−Ｌ８０とＣＤ４＋細胞におけるＴｒｅｇ及びＴｅｆｆとの結合能を検出するために、上述の活性化されたヒトＰＢＭＣを用いて染色した。細胞を０．５％のＰＢＳ−ＢＳＡバッファーに再懸濁し、Ｈ９６−Ｌ８０タンパク質を加え、氷上で２０分インキュベートした。洗浄後、biolegendの二次抗体ＦＩＴＣ抗ｈＩｇＧと、biolegendの抗体ＡＰＣ抗ヒトＣＤ４とを加え、氷上で２０分インキュベートし、洗浄後、膜透過固定液（BD、５１−２０９０ＫＺ）を１時間作用させ、膜透過液（eBioscience、００−８３３３−５６）で洗浄した後に再び膜透過液で再懸濁し、ＰＥ抗ヒトＦｏｘｐ３（Ｃａｔ＃３２０２０８）を加え、４℃で染色して一晩静置し、洗浄後、細胞を５００μｌ、０．５％のＰＢＳ−ＢＳＡバッファーに再懸濁し、フローサイトメーターで検出した。結果は図９のＢに示す通りであり、Ｈ９６−Ｌ８０は活性化されたＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞及びＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−Ｔｅｆｆ細胞に対して良好に結合することができた。
【０１２１】
Ｈ９６−Ｌ８０とアカゲザルＯＸ４０との結合能を検出するために、上述したステップによって、活性化されたアカゲザルの末梢血単核球ＰＢＭＣを取得した。細胞を０．５％のＰＢＳ−ＢＳＡバッファーに再懸濁し、Ｈ９６−Ｌ８０タンパク質を加え、氷上で２０分インキュベートした。洗浄後、biolegendの二次抗体ＦＩＴＣ抗ｈＩｇＧと、biolegendの抗体ＡＰＣ抗ヒトＣＤ４及びＰＥ抗ヒトＣＤ８ａ（Ｃａｔ＃３０１００８）とを加え、氷上で２０分インキュベートした。洗浄後、細胞を５００μｌ、０．５％のＰＢＳ−ＢＳＡバッファーに再懸濁し、フローサイトメーターで検出した。結果は図９のＣに示す通りであり、Ｈ９６−Ｌ８０は活性化されたアカゲザルのＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞に対して良好に結合することができ、Ｈ９６−Ｌ８０がアカゲザルＯＸ４０と結合可能であることが示された。
【０１２２】
実施例１０  抗ＯＸ４０抗体によるＴ細胞の活性化及び増殖の促進
１０．１  Ｔ細胞の活性化及び増殖による抗ＯＸ４０ｓｃＦｖ抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性の研究及びそのアゴニスト機能の評価。
ヒトリンパ球分離溶液（Tianjin Hanyang）の密度勾配遠心によって健康なボランティアの末梢血濃縮白血球から末梢血単核球ＰＢＭＣを分離し、ＲＰＭＩ完全培地に播種した。予め５０μｌ、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３で９６ウェルプレートをコーティングして４℃で一晩静置した。実験群は５０μｌ、２μｇ／ｍｌのＯ２１ｓｃＦｖを用いて３７℃で２時間コーティングし、可溶性で終濃度２μｇ／ｍｌのＯ２１ｓｃＦｖ＋終濃度４μｇ／ｍｌのｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋ（Jackson Immuno Research Laboratories、１０９−００６−００８）を同時に加え、陰性対照はＲＰＭＩ完全培地とした。ＰＢＭＣの量は２×１０５／ウェルとし、５日間培養した後に上清を取った。図１０に示すように、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＡ検出キット（ebioscience）によって上清中のＩＦＮ−γのレベルを検出し（図１０のＡ）、ＢｒｄＵ染色キット（Roche、１１６４７２２９００１）によってＴ細胞の増殖を検出した（図１０のＢ）。このことからわかるように、Ｏ２１ｓｃＦｖは、コーティングとｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋとの２種類の方法のいずれにおいても、良好にＰＢＭＣを活性化させるとともにＴ細胞の増殖を促進する活性を有している。
【０１２３】
１０．２  ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＰＢＭＣ及びＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化によるＯ２１ｓｃＦｖ及びＩｇＧの２種類の形式のアゴニスト活性の評価
ヒトリンパ球分離溶液（Tianjin Hanyang）の密度勾配遠心によって健康なボランティアの末梢血濃縮白血球から末梢血単核球ＰＢＭＣを分離し、ＲＰＭＩ完全培地に播種した。ＣＤ４＋Ｔ細胞分離キット（Miltenyi、ｃａｔ＃１３０−０９６−５３３）を用いてＰＢＭＣからＣＤ４＋Ｔ細胞を分離した。予め５０μｌ、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３で９６ウェルプレートをコーティングして４℃で一晩静置した。実験群は５０μｌ、２μｇ／ｍｌのＯ２１ｓｃＦｖ又はＯ２１ｍＡｂを用いて３７℃で２時間コーティングし、陰性対照は同等の用量のｈＩｇＧ−Ｆｃとした。ＰＢＭＣ及びＣＤ４＋Ｔ細胞の量は２×１０５／ウェルとし、５日間培養した後に上清を取り、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＡ検出キット（ebioscience）によって上清中のＩＦＮ−γのレベルを検出した。
【０１２４】
図１１に示すように、ＰＢＭＣ（図１１のＡ）及びＣＤ４＋Ｔ細胞（図１１のＢ）に関して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＯ２１抗体の完全抗体であるｍａｂ型がｓｃＦｖ型よりも良好なアゴニスト活性を有することがわかる。
【０１２５】
実施例１１  Ｔ細胞亜群に対するＩｇＧ１及びＩｇＧ４のサブタイプの抗ＯＸ４０抗体Ｈ９６−Ｌ８０の影響
実施例１０の操作に従ってヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を取得し、溶解した抗ＣＤ２８（０．５μｇ／ｍｌ）と、結合プレートの抗ＣＤ３（３μｇ／ｍｌ）と、抗ヒトＯＸ４０ｍＡｂ  Ｈ９６−Ｌ８０ＩｇＧ１又はＩｇＧ４（１０μｇ／ｍｌ）とを用いてＰＢＭＣを刺激した。４８時間後に細胞を採取した。biolegendの抗体ＡＰＣ抗ヒトＣＤ４及びＰＥ抗ヒトＣＤ８ａ（Ｃａｔ＃３０１００８）で染色するか、又はbiolegendの抗体ＡＰＣ抗ヒトＣＤ４及びＰＥ抗ヒトＦｏｘｐ３（Ｃａｔ＃３２０２０８）で染色して、フローサイトメーターで検出した。結果は図１２のＡ及びＢに示す通りであり、Ｏ２１ｍＡｂ  Ｈ９６−Ｌ８０ＩｇＧ１及びＩｇＧ４の２種類のサブタイプはＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの比率を減少させることができたが（図１２Ａ）、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との比率には影響がなかった（図１２Ｂ）。
【０１２６】
実施例１２  マウスｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍増殖に対する抗ＯＸ４０抗体の阻害作用
１２．１  腫瘍細胞ＰＣ−３及びヒトＰＢＭＣを移植したＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス腫瘍モデルを用いた抗ＯＸ４０抗体のｉｎ  ｖｉｖｏにおける薬効の評価
０日目にＰＣ−３（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１４３５（商標））をヒトの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）と共にマウスに皮下（ＳＣ）注射し、０日目及び７日目に１０ｍｇ／ｋｇのＯ２１ｍＡｂ又はＰＢＳを、ＰＢＳを陰性対照として各グループ５匹ずつのマウスに腹腔内注射により投与した。腫瘍の形成を毎週２回観察し、腫瘍の長径及び短径をノギスで測定し、腫瘍体積を算出して、腫瘍増殖曲線を作図した。結果は図１３に示す通りであり、抗体Ｏ２１ｍＡｂが腫瘍の増殖を著しく阻害可能であることがわかる。
【０１２７】
１２．２  腫瘍細胞Ａ３７５及びヒトＰＢＭＣを移植したＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス腫瘍モデルを用いた抗ＯＸ４０抗体のｉｎ  ｖｉｖｏにおける薬効の評価
０日目に７×１０６のＡ３７５（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１６１９（商標））を１×１０６のヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）と共にマウスに皮下（ＳＣ）注射し、０日目及び７日目に１ｍｇ／ｋｇのＯ２１ｍＡｂ又はＰＢＳを、ＰＢＳを陰性対照として各グループ５匹ずつのマウスに腹腔内注射により投与した。腫瘍の形成を毎週２回観察し、腫瘍の長径及び短径をノギスで測定し、腫瘍体積を算出して、腫瘍増殖曲線を作図した。図１４に示すように、抗体Ｏ２１ｍＡｂが腫瘍の増殖を著しく阻害可能であることがわかる。
【０１２８】
実施例１３  抗ＯＸ４０抗体の安定性の検出
抗ｈＯＸ４０抗体Ｏ２１ｍＡｂの安定性について４５℃の加速安定性試験により検出した。具体的な試験方法は、抗Ｏ２１ｍＡｂ抗体を約１０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、４５℃で水浴させ、０日目、１０日目、２０日目、３０日目に試料を採取して、濃度、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、ＮＦ−κｂの解析試験を行った。島津製作所のＬＣ２０ＡＴによるＨＰＬＣ（液体クロマトグラフィー）を採用したＳＥＣ−ＨＰＬＣによって解析試験を行い、試料を１ｍｇ／ｍｌに濃縮し、流速を０．５ｍｌ／分として添加し、総添加量を５０ｕｇとし、添加後に３０分間勾配溶離した。ＮＦ−κｂは、実施例７に従って操作した。結果は図１５に示す通りであり、抗ｈＯＸ４０抗体Ｏ２１ｍＡｂがｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて良好な安定性を有することがわかる。
【０１２９】
実施例１４  抗ｈＯＸ４０抗体Ｏ２１ｍＡｂの薬物動態の評価
１０ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇの用量でＨ９６−Ｌ８０ＩｇＧ１抗体の薬物動態を評価した。８週齢の雌のＢａｌｂ／Ｃマウスを１６匹用い、それぞれの用量をＡ／Ｂの２グループに分けて各グループ４匹ずつとした。全てのマウスに対してＨ９６−Ｌ８０ＩｇＧ１抗体を２００μｇ（１０ｍｇ／ｋｇ）又は２０ｕｇ（１ｍｇ／ｋｇ）静脈注射し、投与後、１４個の時点に分け、２グループ交互に各時点で１グループのマウスからそれぞれ１００μｌずつ採血した。血清を分離した。血清中の被験タンパク質の濃度をＥＬＩＳＡ法によって検出した。ｈＯＸ４０−ｍｕＦｃコーティングプレートに対して、希釈度が適切な血清サンプルを加えた後に、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  ＨＲＰ（Sigma、ＣａｔＮＯ：Ａ０１７０）を加え、ＴＭＢで発色させた。標準タンパク質としてＨ９６−Ｌ８０ＩｇＧ１抗体を用い、標準曲線を作成した。ソフトウェアＷｉｎＮｏｌｉｎを用いて薬物動態パラメータを算出した。平均Ｃ−Ｔ曲線は図１６に示す通りであり、検出の結果、本発明のＨ９６−Ｌ８０ＩｇＧ１抗体は比較的安定しており、用量１ｍｇ／ｋｇのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期が平均２０５時間であり、用量１０ｍｇ／ｋｇのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期が平均３７１時間であった。検出の結果、抗Ｈ９６−Ｌ８０の抗体産生はなかった。
【０１３０】
以上の記載は本発明の好ましい実施形態にすぎず、本発明を制限するものではない。なお、当業者にとって、本発明の技術的原理を逸脱しない限り、いくつかの改良及び変形を行ってもよく、これらの改良及び変形も本発明の保護範囲とみなされるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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