(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）少なくとも一つの熱ショックエレメントであるHSEと、
（ｉｉ）少なくとも一つのストレス応答エレメントであるSTREと、
（ｉｉｉ）前記HSEおよび前記STREと異なるシスエレメントであって、ストレス条件下で発現が亢進する転写活性因子が結合するシスエレメントと
を含み、
前記(ｉ)熱ショックエレメントであるHSE、および、(ｉｉ)ストレス応答エレメントであるSTREを少なくとも二つ以上含み、
前記HSEと前記STREとが交互に配置されている、ストレス応答プロモーター（ただし、前記ストレス応答プロモーターは、Glucose存在下で抑制的に作用する転写因子が結合するシスエレメント、および、糖新生に関与する転写因子が結合するシスエレメントであって、配列番号２３〜４７のいずれかで示されるコンセンサス配列を含むシスエレメントを含むものではない）。
【請求項２】
（ｉ）少なくとも一つの熱ショックエレメントであるHSEと、
（ｉｉ）少なくとも一つのストレス応答エレメントであるSTREと、
（ｉｉｉ）前記HSEおよび前記STREと異なるシスエレメントであって、ストレス条件下で発現が亢進する転写活性因子が結合するシスエレメントと
を含み、
前記ストレス条件下で発現が亢進する転写活性因子が、Met31/32、 Rgt1、Cad1、Cin5/Yap4、および、Yap1からなる群より選択される少なくとも一つの転写活性因子である、ストレス応答プロモーター（ただし、前記ストレス応答プロモーターは、Glucose存在下で抑制的に作用する転写因子が結合するシスエレメント、および、糖新生に関与する転写因子が結合するシスエレメントであって、配列番号２３〜４７のいずれかで示されるコンセンサス配列を含むシスエレメントを含むものではない）。
【請求項３】
（ｉ）少なくとも一つの熱ショックエレメントであるHSEと、
（ｉｉ）少なくとも一つのストレス応答エレメントであるSTREと、
（ｉｉｉ）前記HSEおよび前記STREと異なるシスエレメントであって、ストレス条件下で発現が亢進する転写活性因子が結合するシスエレメントと
を含み、
前記（ｉ）HSEが、配列番号１６で示されるコンセンサス配列を含むシスエレメントであって、かつ、前記（ｉｉ）STREが、配列番号１７で示されるコンセンサス配列を含むシスエレメントである、ストレス応答プロモーター（ただし、前記ストレス応答プロモーターは、Glucose存在下で抑制的に作用する転写因子が結合するシスエレメント、および、糖新生に関与する転写因子が結合するシスエレメントであって、配列番号２３〜４７のいずれかで示されるコンセンサス配列を含むシスエレメントを含むものではない）。
【請求項４】
（ｉ）少なくとも一つの熱ショックエレメントであるHSEと、
（ｉｉ）少なくとも一つのストレス応答エレメントであるSTREと、
（ｉｉｉ）前記HSEおよび前記STREと異なるシスエレメントであって、ストレス条件下で発現が亢進する転写活性因子が結合するシスエレメントと
を含み、
前記(ｉｉｉ)転写活性因子が結合するシスエレメントが、配列番号１８〜２２で示されるコンセンサス配列からなる群より選択されるコンセンサス配列を含むシスエレメントである、ストレス応答プロモーター（ただし、前記ストレス応答プロモーターは、Glucose存在下で抑制的に作用する転写因子が結合するシスエレメント、および、糖新生に関与する転写因子が結合するシスエレメントであって、配列番号２３〜４７のいずれかで示されるコンセンサス配列を含むシスエレメントを含むものではない）。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のストレス応答プロモーターであって、
前記Glucose存在下で抑制的に作用する転写因子、および、糖新生に関与する転写因子がRap1、Nrg1、Gln3、Hap4/5、Adr1、Mig1、Mot3、および、Snf1である、ストレス応答プロモーター。
【請求項６】
（ｉ）少なくとも一つの熱ショックエレメントであるHSEであって、配列番号１６に示されるコンセンサス配列を含むHSEと、
（ｉｉ）少なくとも一つのストレス応答エレメントであるSTREであって、配列番号１７に示されるコンセンサス配列を含むSTREと、
（ｉｉｉ）ストレス条件下で発現が亢進する転写活性因子が結合するシスエレメントであって、配列番号１８〜２２に示されるコンセンサス配列のいずれかを含むシスエレメントと
を含む、ストレス応答プロモーター（ただし、前記ストレス応答プロモーターは、配列番号２３〜４７に示されるコンセンサス配列を含むシスエレメントを含むものではない）。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のストレス応答プロモーターであって、
さらに(ｉｖ)5’-非翻訳領域に配列番号４９で示されるKozak配列を有する、ストレス応答プロモーター。
【請求項８】
配列番号４８に記載の配列からなるストレス応答プロモーター。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のストレス応答プロモーターを含むベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターであって、大腸菌または真核細胞間のシャトルベクター、
2-ミクロンプラスミドベクター、または、複製起点を保有するベクター。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載のベクターであって、前記ストレス応答プロモーターの下流に作動可能に連結された遺伝子を含む、ベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載のベクターであって、前記遺伝子が、Xylose異性化酵素遺伝子である、ベクター。
【請求項１３】
請求項９〜１２のいずれか一項に記載のベクターの一部または全部が染色体に導入された形質転換体。
【請求項１４】
Xyloseを基質とするバイオエタノールを生産するための微生物であって、
請求項１２に記載のベクターの一部または全部を含む微生物。
【請求項１５】
Xyloseを基質とするバイオエタノールの生産方法であって、
（ａ）請求項１４に記載の微生物を、Xyloseを含む培養液中で培養する工程を含む、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、
前記工程(ａ)が、キシランおよびキシラナーゼの存在下で行われる糖化処理と同時に行われる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、内在および外来の遺伝子を、より効率的に発現するために人工的にデザインされたストレス応答プロモーターに関し、特に、酵母を用いて行う有用物質生産において適用可能なストレス応答プロモーターに関する。
【背景技術】
【０００２】  発酵技術に代表される微生物を用いた有用物質生産は、清酒、焼酎、泡盛、醤油、味噌等の発酵食品から派生し、我が国独自の技術のとして積み重ねられてきた。特に、移動用燃料用途として、すでにブラジル、米国、中国などで商業化が進んでいる第一世代バイオマスエタノールは、でんぷんや糖液などの食料品を原料とし、酵母やエタノール生産細菌などの微生物が保有するエタノール発酵性を基本技術として利用している。しかし、世界人口の爆発的増加に伴い、我々の生活に必須である食料や家畜飼料が枯渇する中、これらの利用に関して直接競合する第一世代バイオマスエタノールの工業生産ではなく、非可食バイオマス、例えば、稲稈、麦稈、トウモロコシ穂軸及び茎葉、サトウキビ搾汁残渣(バガス)といった農産物の非可食部位、食品残渣、間伐材、建築廃材など、食料と競合しない、未利用バイオマス資源を原料とするセルロース系バイオマスエタノール(第二世代バイオマスエタノール)の工業生産技術の確立が求められている。【０００３】  セルロース系バイオマスエタノール生産に必要な第一の要素技術は、植物細胞壁の主成分であるセルロースを微生物が利用可能な六単糖Glucoseに分解する糖化酵素である。ほとんどの生物はGlucoseを最も好ましい炭素源として利用することができ、Ethanol発酵を行う微生物もその例に漏れない。第二の要素技術は、非可食バイオマスには、セルロース以外にも、ヘミセルロースやリグニンといった炭水化物が少なからず存在する。セルロースに由来するGlucoseだけでなく、ヘミセルロースに由来するXyloseやArabinoseのような、これまで利用することができなかった五単糖もエタノール生産に利用することで、より経済的かつ高いエタノール生産効率が期待できる。セルロース系バイオマスエタノールの工業生産技術の確立にはこれらの要素技術が必要不可欠である。【０００４】  出芽酵母Saccharomyces cerevisiae(以下、酵母とする)は、パン酵母として知られる我々に身近な微生物の一つであり、清酒、焼酎、泡盛といった我が国の酒類はこの微生物によってアルコールを生産している。しかし、酵母はGlucoseからEthanolを生産することに長けているけれども、一部の微生物を除き、基本的には五単糖を利用することができない。そのため、遺伝子組換え技術を用いて、Xyloseを本来利用することができない酵母に、外来遺伝子としてXylose代謝に必要な酵素を組み込むことによって、XyloseからEthanol発酵を可能にする技術開発が各国で進められてきている。【０００５】セルロース系バイオマスEthanolの製造プロセスは、大きく分けて２種類に大別できる。一つは糖化と発酵を別々のプロセスとして行うものである。固体バイオマスをあらかじめ糖化し、作製された糖液を基質として液体中で微生物によるEthanol発酵を行うプロセスである(Saccharified Hydrolysate Fermentation、 SHF、糖化液発酵)。もう一つは、糖化と発酵を同時に行うプロセスである。固体バイオマスをそのまま原料とし、糖化酵素と酵母を同時に作用させて、糖化反応と発酵反応を１つの容器内で同時に進めるプロセスである（Simultaneous Saccharification and Fermentation、SSF、同時糖化発酵）。SSFは、同一容器内で同時に２つのプロセスを並行して進めるため、SHFより経済性に優れると考えられている。同時糖化発酵と呼ばれる。���者には、残渣を分離・精製した糖化液を用いる場合とそのまま用いる場合がある。セルロース系バイオマスエタノール生産菌株のEthanol発酵性能を調べる際には、YPDX擬似糖化液が用いられる。これはバイオマス糖化液の代わりに、成分組成が明らかな試薬を混合して作成したものであり、発酵プロセスとしては、SHFの一つである。また、後者では、セルロース系バイオマスの糖化酵素としてXylanからXyloseを生成するキシラナーゼなどの酵素を含む場合には、GlucoseとXyloseの両方が供給されるため、糖化・発酵の同時反応に加えて、GlucoseとXyloseの複発酵プロセスという複雑なプロセスになる(Simultaneous Saccharification and Co-fermentation、SSCF、同時糖化併行複発酵)。さらに、糖化と発酵を同時に行うだけでなく、糖化酵素の生産も同時に微生物に行わせるプロセスも考案されており、CBP (Consolidate BioProcessing、一貫バイオプロセス)と呼ばれている。【０００６】  これまでに、本来Xyloseを利用できない微生物にXylose代謝能を付与する研究については、数多くの微生物を宿主として、様々なXylose代謝遺伝子を導入した研究が行われてきている。Xylose代謝に係わる遺伝子としては、Xylose reductase (XR)、Xylitol dehydrogenase (XDH)、あるいはXylose isomerase (XI)などが挙げられる。また、酵素活性を向上する遺伝子変異に関する報告も多数存在する。しかし、セルロース系バイオマスエタノールの工業生産にあたり、これらの酵素活性を向上や、様々な環境条件であっても耐えうるロバストな酵素であっても、効率的な遺伝子発現を行えなければ、その効果は半減する。【０００７】  真核生物において染色体上にある遺伝子はmRNAとして翻訳領域の上流の塩基配列から転写される。細胞が置かれた状況や環境によって大きく左右される。上記で述べたように、微生物によるエタノール等の有用物質の生産プロセスにおいて、外界の糖をはじめとする栄養源、生育阻害物質等の濃度は変化するため、細胞の状態も刻一刻変化する。すなわち、微生物は周囲の状況に応じて、同一の細胞であっても、遺伝子発現の挙動は大きく変化しうることが知られている。効率的なエタノール発酵には、嫌気的条件が望ましい。微生物のエタノール生産は、Glucose等の資化可能な炭水化物を取込み、解糖系を経て、ピルビン酸を経由し、酢酸、Acetaldehyde、そしてEthanolへと還元する反応である。Ethanolは酵母にとっては利用可能な炭素源の一つであり、好気的な条件下で利用可能な糖が枯渇すると、糖新生によって、エタノールを分解し、利用することで生きながらえる。したがって、好気的な条件下ではEthanol生産効率は十分に向上しえない。また、酵母の遺伝子発現は、十分な酸素が存在下、酸素制限下とでは、大きく異なることが知られている。つまり、通常、十分な酸素とGlucose及び必要な栄養素が供給される理想的な増殖が可能な培養条件において強力な遺伝子発現をもたらす解糖系遺伝子のプロモーターは、Ethanol発酵プロセスにおいては、決して最適な遺伝子発現装置足りえない。しかし、セルロース系バイオマスエタノールの工業生産には、特に、発酵プロセスに適した外来のXylose代謝遺伝子の発現をもたしうるプロモーターが求められる。微生物がそのような特性を持ったプロモーターを内在するかどうかはわからないし、そのようなものは存在しないかもしれない。また、これは、セルロース系バイオマスエタノール生産に限らず、すべての微生物を用いた有用物質生産においても同じことが言える。あるバイオプロセスで目的生産物の代謝に関わるすべての酵素遺伝子の発現を、時空間（発現タイミング）、量（発現強度）をダイナミック最適化することによってはじめて目的生産物の生産効率を最大化することができる。【０００８】  出芽酵母にXylose代謝能を付与するためのXylose代謝酵素遺伝子の発現に際し、酵母の内在性プロモーターHSP12を用いた方法が知られている。HSP(Heat Shock Protein)の名前から分かるように、熱ストレスに応じて遺伝子発現が増強するタンパク質をコードするファミリー遺伝子の一つである。HSPファミリー遺伝子は、熱ストレスのみならず、各種ストレスに応じて遺伝子発現状態を変える。また、ファミリーを構成する遺伝子が多数、しかも重複して存在し、個々の遺伝子産物は、過度なストレスがかかる状況、すなわち微生物本体の危機的な状況下において、微生物の生命を防御するための装置であるとも言える。確かに、HSP12のようなストレス応答遺伝子は熱ストレス、Glucose枯渇の際に、一過的に発現上昇するが、その発現が長続きしない。Wine酵母の例ではあるが、多くのHSPファミリー遺伝子はGlucoseが枯渇し、増殖を停止した停止期の(Stationary phase)の細胞においても、遺伝子発現が知られている。しかし、HSPファミリーメンバーであるにもかかわらず、HSP12はGlucoseが枯渇した状態では、検出できないという報告がある。一方、HSP30やHSP26といった遺伝子は、Stationary phaseにおいて、絶対的・相対的に強い遺伝子発現が認められるという報告がある。したがって、セルロース系バイオマスエタノールの発酵生産のような、高温、高浸透圧、嫌気性(酸素制限)、かつグルコース枯渇条件下でキシロースを利用し、エタノールを生産するというプロセスは、宿主微生物にとっては甚大なストレスをもたらすものであるが、そのような条件で、強力な、継続可能な遺伝子発現装置としてのプロモーターが求められている。遺伝子発現特性をデザインされた人工プロモーターは、このような課題を解決する一つの方法であると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０１５−０３３３４２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】  高温、高浸透圧、嫌気性(酸素制限)、グルコース枯渇条件などのストレス条件下においても、内在および外来の遺伝子を、より効率的に発現可能な人工的にデザインされたストレス応答プロモーターの提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】  上記課題に鑑み、発明者らは、人工的にデザインした、新規の塩基配列からなるストレス応答プロモーターの利用に着目し、480bpからなるストレス応答プロモーターをデザインし、pSynSR480と名づけた。この塩基配列は従来、強力なプロモーターとして知られているPGK1プロモーターより強力なプロモーター活性を有していることを示した。具体的には、実際のエタノール生産プロセスとして、YPDX擬似糖化液を用いたグルコース・キシロースの同時発酵においてキシロース代謝の著しい向上を示し、また、水酸化ナトリウム処理サトウキビバガスを用いた同時糖化併行複発酵プロセスにおいても、優れたエタノール発酵生産が可能であることを示した。これにより、本課題を解決するに至った。  すなわち、本発明は以下に記載の通りである：【００１２】  本発明の一態様は、〔１〕（ｉ）少なくとも一つの熱ショックエレメントであるHSEと、（ｉｉ）少なくとも一つのストレス応答エレメントであるSTREと、（ｉｉｉ）前記HSEおよび前記STREと異なるシスエレメントであって、ストレス条件下で発現が亢進する転写活性因子が結合するシスエレメントとを含む、ストレス応答プロモーター（ただし、前記ストレス応答プロモーターは、Glucose存在下で抑制的に作用する転写因子が結合するシスエレメント、および、糖新生に関与する転写因子が結合するシスエレメントを含むものではない）。  また、本発明のストレス応答プロモーターは、一実施の形態において、〔１〕’ （ｉ）少なくとも一つの熱ショックエレメントであるHSEと、（ｉｉ）少なくとも一つのストレス応答エレメントであるSTREと、（ｉｉｉ）前記HSEおよび前記STREと異なるシスエレメントであって、ストレス条件下で発現が亢進する転写活性因子が結合するシスエレメントとを含む、ストレス応答プロモーターであって、  前記ストレス応答プロモーターは、Glucose存在下で抑制的に作用する転写因子、または、糖新生に関与する転写因子が結合するシスエレメントを含まない、ことを特徴とする。【００１３】  ここで、本発明のストレス応答プロモーターは、一実施の形態において、〔２〕高温、高浸透圧、酸素制限、又は、Glucose飢餓状態のストレスに応答して転写の活性を向上させるものであることを特徴とする。  また、本発明のストレス応答プロモーターは、一実施の形態において、〔３〕上記〔１〕または〔２〕に記載のストレス応答プロモーターであって、  前記(ｉ)熱ショックエレメントであるHSE、および、(ｉｉ)ストレス応答エレメントであるSTREを少なくとも二つ以上含み、  前記HSEと前記STREとが交互に配置されていることを特徴とする。  また、本発明のストレス応答プロモーターは、一実施の形態において、〔４〕上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のストレス応答プロモーターであって、  前記ストレス条件下で発現が亢進する転写活性因子が、Met31/32、 Rgt1、Cad1、Cin5/Yap4、および、Yap1からなる群より選択される少なくとも一つの転写活性因子であることを特徴とする。  なお、本発明のストレス応答プロモーターの一実施の形態においては、  Met31/32、 Rgt1、Cad1、Cin5/Yap4、および、Yap1のそれぞれの転写活性因子が結合するシスエレメントを全て含むものである。  また、本発明のストレス応答プロモーターは、一実施の形態において��〔５〕上記〔１〕〜〔４〕のいずれかいに記載のストレス応答プロモーターであって、  前記（ｉ）HSEが、配列番号１６で示されるコンセンサス配列を含むシスエレメントであって、かつ、前記（ｉｉ）STREが、配列番号１７で示されるコンセンサス配列を含むシスエレメントであることを特徴とする。  また、本発明のストレス応答プロモーターは、一実施の形態において、〔６〕上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のストレス応答プロモーターであって、  前記(ｉｉｉ)転写活性因子が結合するシスエレメントが、配列番号１８〜２２で示されるコンセンサス配列からなる群より選択されるコンセンサス配列を含むシスエレメントであることを特徴とする。【００１４】  また、本発明のストレス応答プロモーターは、一実施の形態において、〔７〕上記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のストレス応答プロモーターであって、  前記Glucose存在下で抑制的に作用する転写因子、および、糖新生に関与する転写因子がRap1、Nrg1、Gln3、Hap4/5、Adr1、Mig1、Mot3、および、Snf1であることを特徴とする。  また、本発明のストレス応答プロモーターは、一実施の形態において、〔８〕上記〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載のストレス応答プロモーターであって、  前記Glucose存在下で抑制的に作用する転写因子が結合するシスエレメント、または、糖新生に関与する転写因子が結合するシスエレメントが、配列番号２３〜４７のいずれかで示されるコンセンサス配列を含むシスエレメントであることを特徴とする。  また、本発明は、別の態様において、〔９〕（ｉ）少なくとも一つの熱ショックエレメントであるHSEであって、配列番号１６に示されるコンセンサス配列を含むHSEと、（ｉｉ）少なくとも一つのストレス応答エレメントであるSTREであって、配列番号１７に示されるコンセンサス配列を含むSTREと、（ｉｉｉ）ストレス条件下で発現が亢進する転写活性因子が結合するシスエレメントであって、配列番号１８〜２２に示されるコンセンサス配列のいずれかを含むシスエレメントとを含む、ストレス応答プロモーター（ただし、前記ストレス応答プロモーターは、配列番号２３〜４８に示されるコンセンサス配列およびそれらに類似する塩基配列を含むシスエレメントを含むものではない）に関する。  また、本発明のストレス応答プロモーターは、一実施の形態において、〔１０〕上記〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載のストレス応答プロモーターであって、  さらに(ｉｖ)5’-非翻訳領域に配列番号４９で示されるKozak配列を有することを特徴とする。  また、本発明のストレス応答プロモーターは、一実施の形態において、〔１１〕配列番号４８に記載の配列からなるストレス応答プロモーターである。【００１５】  また、本発明は、別の態様において、〔１２〕上記〔１〕〜〔１１〕のいずれかに記載のストレス応答プロモーターを含むベクターに関する。  また、本発明のベクターは、一実施の形態において、〔１３〕上記〔１２〕に記載のベクターであって、大腸菌または真核細胞間のシャトルベクターとなりうるベクター、2-ミクロンプラスミドベクター、ならびに、真核細胞のセントロメア及び自律複製配列など複製起点となりうる塩基配列を保有することを特徴とする。  なお、「シャトルベクターとなりうるベクター」とは、例えば、pUC19ベクターなど大腸菌・真核細胞(限局すれば出芽酵母)間のシャトルベクターとなりうるベクターである。また、2-ミクロンプラスミドベクターならびに真核細胞のセントロメア及び自律複製配列など複製起点となりうる塩基配列を保有するベクターとしては、例えば、６番染色体セントロメアと自律複製配列４番CEN6/ARS4を持つpUG35を挙げることができる。  また、本発明のベクターは、一実施の形態において、〔１４〕上記〔１２〕または〔１３〕に記載のベクターであって、前記ストレス応答プロモーターの下流に作動可能に連結された遺伝子を含むことを特徴とする。  また、本発明のベクターは、一実施の形態において、〔１５〕上記〔１４〕に記載のベクターであって、前記遺伝子が、Xylose異性化酵素遺伝子であることを特徴とする。【００１６】  また、本発明は、別の態様において、〔１６〕上記〔１２〕〜〔１５〕のいずれかに記載のベクターの一部もしくは全部が染色体に導入された形質転換体に関する。  また、本発明は、別の態様において、〔１７〕Xyloseを基質とするバイオエタノールを生産するための微生物であって、  上記〔１５〕に記載のベクターの一部または全部を含む微生物に関する。【００１７】  また、本発明は、別の態様において、〔１８〕Xyloseを基質とするバイオエタノールの生産方法であって、  （ａ）上記〔１７〕に記載の微生物を、Xyloseを含む培養液中で培養する工程を含む、方法に関する。  ここで、本発明のバイオエタノールの生産方法は、〔１９〕上記〔１８〕に記載の方法であって、  前記工程(ａ)が、キシランおよびキシラナーゼの存在下で行われる糖化処理と同時に行われることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１８】  本発明のストレス応答プロモーターによれば、内在および外来の遺伝子を、より効率的に発現することが可能である。これにより、有用物質生産に必要な遺伝子発現が増強し、目的とする生産物量及び生産速度が向上する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】［ストレス応答プロモーターpSynSR480に含まれる転写因子が結合すると予測される部位の構成］  480bpのうち、予測される転写開始点は-61位のA。-480〜-62(419bp)の領域が転写調節として機能し、-61〜-1(61bp)は転写されるが翻訳されない5’-非翻訳領域(5’-UTR)として機能すると考えられる。翻訳効率に関与すると考えられるKozak配列。Msn2/4結合部位(STRE)を８箇所、Hsf1結合部位(HSE)を６箇所、Cad1結合部位、Yap1結合部位をそれぞれ２箇所、Rgt1結合部位、Met31/32結合部位、Cin5/Yap4結合部位をそれぞれ１箇所有する。TATA boxは転写開始に必要なTATA-boxと推定される部位、5’-UTRは転写されたmRNAの非翻訳領域を示している。
【図２】［相同性検索の結果pSynSR480に最も類似の既知の塩基配列に含まれる転写因子が結合すると予測される部位の構成］BLAST検索の結果、5’-UTRを除くpSynSR480 419bpの塩基配列に対して、既知の全生物の全塩基配列の中で、最も類似する塩基配列は酵母のHSP26プロモーター領域内の404bpであった。しかし、この配列の中には、基本転写因子の結合部位であるTATA box以外では、Hsf1結合部位(HSE)が１箇所のみであった。
【図３】［プラスミドベクターpAUR101-pHSP12-CpXI-CYC1t-XKS1-pPGK1(プラスミド番号１)の物理地図］pAUR101ベクター(タカラバイオ株式会社)にHSP12プロモーターによりCpXIを発現すると同時に、PGK1プロモーターによりXKS1を発現するプラスミドベクター。このプラスミドベクターは２つの糖代謝酵素遺伝子CpXI及びXKS1のターミネーターとして１つのCYC1tが用いられていた。CYC1tを取り除き、それぞれ遺伝子の転写をそれぞれ別のターミネーターにより終了するような構成に改変するために、図中で示しているPK98及びPK106を用いてinverse-PCRを行い直鎖化するための鋳型として用いた。AUR1-C：Aureobasidin A耐性遺伝子(pAUR101プラスミドベクターに含まれる)、MRP17及びBYE1 partial ORF：酵母染色体上のAUR1遺伝子の上流及び下流の遺伝子(pAUR101プラスミドベクターに含まれる)、AmpR：Ampicillin耐性遺伝子(pAUR101プラスミドベクターに含まれる)、ori：大腸菌内での複製に必要なColE1 origin(pAUR101プラスミドベクターに含まれる)、pPGK1：酵母PGK1プロモーター、XKS1：酵母Xylulokinase遺伝子、CYC1t：酵母CYC1ターミネーター、CpXI：Clostridium phytofermentans由来Xylose異性化酵素遺伝子変異体、pHSP12：酵母HSP12プロモーター
【図４】［プラスミドベクターpAUR101-pHSP12-CpXI-ADH1t-TEF1t-XKS1-pPGK1(プラスミド番号２)の物理地図］プラスミドベクターpAUR101-pHSP12-CpXI-CYC1t-XKS1-pPGK1(プラスミド番号１)のCYC1tをADH1t及びTEF1tに置換したもの。PK99及びPK100を用いてTEF1t断片を、PK107及びPK108を用いてADH1t断片を増幅し、In-Fusion反応によりCYC1tを置換した本ベクターを構築した。ADH1t：酵母ADH1ターミネーター、TEF1t：酵母TEF1ターミネーター。その他の略号は、図２に同じ。
【図５】［プラスミドベクターpAUR101-pPGK1-CpXI-ADH1t-TEF1t-ScXKS1-pPGK1(プラスミド番号３)の物理地図］プラスミドベクターpAUR101-pHSP12p-CpXI-ADH1t-TEF1t-ScXKS1-pPGK1(プラスミド番号２)のpHSP12をpPGK1に置換したもの。PK114及びPK116を用いてpHSP12を除くために、inverse-PCRを行い、直鎖化したプラスミドベクターに、PK97及びPK115を用いてpPGK1断片を増幅し、In-Fusion反応により本ベクターを構築した。このプラスミドベクターをAUR1-C遺伝子内にある制限酵素StuI (894)により直鎖化し、酵母染色体のAUR1部位に挿入した株がKEF205。略号は、図２及び図３に同じ。制限酵素名及び切断部位の塩基番号を括弧内に示す。
【図６】［プラスミドベクターpAUR101-pSynSR480-CpXI-ADH1t-TEF1t-ScXKS1-pPGK1(プラスミド番号４)の物理地図］プラスミドベクターpAUR101-pHSP12p-CpXI-ADH1t-TEF1t-ScXKS1-pPGK1(プラスミド番号２)のpHSP12をpSynSR480に置換したもの。PK114及びPK116を用いてpHSP12を除くために、inverse-PCRを行い、直鎖化したプラスミドベクターに、PK117及びPK118を用いてpSynSR480断片を増幅し、In-Fusion反応により本ベクターを構築した。このプラスミドベクターをAUR1-C遺伝子内にある制限酵素StuI (894)により直鎖化し、酵母染色体のAUR1部位に挿入した株がKEF206。pSynSR480：ストレス応答プロモーター。その他の略号は、図２及び図３に同じ。制限酵素名及び切断部位の塩基番号を括弧内に示す。
【図７】図７は、微好気条件下で行った擬似糖化液を用いた発酵試験の結果を示す。また、表６を図示したものである。◆：Glucose、■：Xylose、▲：Xylitol、×：Glycerol、*：Acetate、●：Ethanolの各濃度(g/L)を示す。
【図８】図８は、酸素制限下で行った水酸化ナトリウム処理サトウキビバガスを用いた同時糖化併行複発酵試験の結果を示す。また、表１０を図示したものである。上のパネルは、KEF205株、下のパネルはKEF206株の結果を示している。1X〜4Xは使用した糖化酵素量で、乾燥水酸化ナトリウム処理サトウキビバガス1 gあたり8.7mgの酵素使用を1Xと規定した。横軸は左からGlucose、Xylose、Glycerol、Xylitol、Acetate、Ethanolを示している。縦軸はそれぞれの成分濃度(g/L)を示す。
【図９】下記実施例に用いたオリゴDNA(プライマー)情報を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】  本発明は、ストレス存在下で強く、長期に遺伝子発現が行えるよう人工的にデザインされたプロモーター塩基配列、及びそのプロモーターを用いて発現させた遺伝子によってXylose異性化酵素遺伝子を有する微生物あるいはその利用に関する。
【００２１】  本発明は、一態様として、（ｉ）少なくとも一つの熱ショックエレメントであるHSEと、（ｉｉ）少なくとも一つのストレス応答エレメントであるSTREと、（ｉｉｉ）前記HSEおよび前記STREと異なるシスエレメントであって、ストレス条件下で発現が亢進する転写活性因子が結合するシスエレメントとを含む、ストレス応答プロモーター（ただし、前記ストレス応答プロモーターは、Glucose存在下で抑制的に作用する転写因子が結合するシスエレメント、および、糖新生に関与する転写因子が結合するシスエレメントを含むものではない）を提供する。  本明細書において、（ｉ）熱ショックエレメントであるHSE（heat shock element）とは、細胞が熱等のストレス条件下にさらされた際、当該ストレスにより発現が上昇する熱ショック転写因子（heat shock transcription factor, HSF）が結合するＤＮＡ上の特定の領域をいう。HSEの配列は公知であり、HSFが結合してシス配列上の転写を制御するものであれば塩基配列は特に制限されない。一実施例において、HSEは、配列番号１６に示されるコンセンサス配列を含むものである。  本明細書において、（ｉｉ）ストレス応答エレメントであるSTRE（stress response element）とは、細胞が高浸透圧などのストレス条件下にさらされた際、当該ストレスにより発現が上昇する転写因子（例えば、MSN2,MSN4などの転写因子が挙げられる）が結合するＤＮＡ上の特定の領域をいう。STREの配列は公知であり、上記転写因子が結合してシス配列上の転写を制御するものであれば塩基配列は特に制限されない。一実施例において、STREは、配列番号１７に示されるコンセンサス配列を含むものである。  本明細書において、（ｉｉｉ）HSEおよび前記STREと異なるシスエレメントであって、ストレス条件下で発現が亢進する転写活性因子が結合するシスエレメントとは、細胞が高温、高浸透圧、酸素制限、又は、Glucose飢餓条件等のストレス条件下にさらされた際、当該ストレスにより発現が上昇する転写因子が結合するＤＮＡ上の特定の領域（ただし、HSE、STREを除く）をいう。前記ストレスに応答して発現が上昇する転写因子としては、MET31、MET32、RGT1、CAD1、CIN5、YAP4、YAP1などを挙げることができる。これらの転写因子に対するシスエレメントの塩基配列は公知であり、また、上記転写因子が結合してシス配列上の転写を制御するものであれば塩基配列は特に制限されない。一実施の形態において、上記転写因子に対するシスエレメントは、配列番号１８〜２２に示されるコンセンサス配列を含むシスエレメント（表３参照）からなる群より選択される少なくとも一つのシスエレメントである。上記（ｉｉｉ）のシスエレメントは、異なるコンセンサス配列を有するものが複数選択されてもよく、また、同じコンセンサス配列を有するものが複数選択されてもよい。より好ましい実施の形態においては、上記転写因子に対するシスエレメントは、配列番号１８〜２２に示されるコンセンサス配列を含むシスエレメントからなる群より選択されるシスエレメントを全て含む。
【００２２】  本発明のストレス応答プロモーターにおいて、（ｉ）〜（ｉｉｉ）のストレス応答エレメントが「特定の配列番号で示されるコンセンサス配列を含む」というとき、本来結合すべき転写因子がストレス応答エレメントへ結合でき、かつ、シス配列上の転写を制御できる限りにおいて、当該コンセンサス配列において１または数個（２個、３個、４個など）の塩基配列に変異（置換、挿入、欠失）を有していてもよい。  なお、本発明のストレス応答プロモーターの一実施の形態においては、(ｉ)熱ショックエレメントであるHSEの数は、ストレスに応じて下流の遺伝子発現を亢進させる限りにおいて限定されず、例えば、二〜十程度(二つ、三つ、四つ、五つ、六つ、七つ、八つ、九つ、十)とすることができる。  また、本発明のストレス応答プロモーターの一実施の形態においては、(ｉｉ)ストレス応答エレメントであるSTREの数は、ストレスに応じて下流の遺伝子発現を亢進させる限りにおいて限定されず、例えば、二〜十程度(二つ、三つ、四つ、五つ、六つ、七つ、八つ、九つ、十)とすることができる。  また、本発明のストレス応答プロモーターの一実施の形態においては、(ｉｉｉ)HSEおよびSTRE以外のストレス応答エレメントの数は、ストレスに応じて下流の遺伝子発現を亢進させる限りにおいて限定されず、例えば、二〜十程度(二つ、三つ、四つ、五つ、六つ、七つ、八つ、九つ、十)とすることができる。
【００２３】  ここで、本発明のストレス応答プロモーターは、Glucose存在下で抑制的に作用する転写因子が結合するシスエレメント、および、糖新生に関与する転写因子が結合するシスエレメントを含まないことを特徴とする。  Glucose存在下で抑制的に作用する転写因子、または、糖新生に関与する転写因子としては、以下に制限されないが、例えば、RAP1、NRG1、GLN3、HAP4、HAP5、ADR1、MIG1、MOT3、SNF1などを挙げることができる。これらGlucose存在下で抑制的に作用する転写因子または糖新生に関与する転写因子が結合するシスエレメントは公知である。例えば、RAP1、NRG1、GLN3、HAP4、HAP5、ADR1、MIG1、MOT3、SNF1が結合するシスエレメントとしては、配列番号２３〜４７に示されるコンセンサス配列を含むシスエレメントを挙げることができる。  ここで、本発明のストレス応答プロモーターは、配列番号２３〜４８に示されるコンセンサス配列に類似する塩基配列を含むシスエレメントも含むものではない。特定の配列番号で示されるコンセンサス配列に類似する塩基配列とは、当該コンセンサス配列に対して１〜数個塩基が変異（置換、欠失、挿入）したものであって、本来結合すべき転写因子が変異後の塩基配列に結合でき、かつ、シス配列上の転写を制御できるものをいう。一実施の形態においては、配列番号２３〜４７に示されるコンセンサス配列に対して少なくとも二以上、好ましくは三以上、より好ましくは四以上の変異を導入することにより当該コンセンサス配列に対する転写因子の結合活性が失われたたものをいう。  なお、一実施の形態において、本発明のストレス応答プロモーターは、配列番号２３〜４７に示されるコンセンサス配列を含むものではない。
【００２４】  本発明のストレス応答プロモーターにおいて、(ｉ)熱ショックエレメントであるHSEおよび(ｉｉ)ストレス応答エレメントであるSTREは、1bp以上、100bp以下の間隔を置いて配置することができる。  また、本発明のストレス応答プロモーターは、(ｉ)熱ショックエレメントであるHSEと(ｉｉ)ストレス応答エレメントであるSTREとが交互に配置されていることが好ましい。HSEまたはSTREを連続して配置するよりも、一定の距離を置いて交互に配置されている方がストレス応答による転写の向上をより促すことができ好ましい。  また、本発明のストレス応答プロモーターにおけるKozak配列は-3位の塩基がAであることが好ましい。また、Kozak配列は5’-非翻訳領域である-1位から-10位が5’-AATATTAAAA-3’（配列番号４９）であることがより好ましい。これらのKozak配列とすることで翻訳活性を向上させることができる。
【００２５】  本発明のストレス応答プロモーターは、一実施の形態において、高温、高浸透圧、酸素制限、又は、Glucose飢餓状態のストレスに応答して転写の活性を向上させるものである。すなわち、いずれかのストレスに応答して、下流の転写の活性を向上させることができる。また、本発明のストレス応答プロモーターは、高温、高浸透圧、酸素制限、および、Glucose飢餓状態のうち二以上のストレスが組み合わされた条件下においても、当該組み合わせされたストレスに応答して下流の遺伝子の発現を向上させることができるものである。より好ましい実施の形態においては、本発明のストレス応答プロモーターは、高温、高浸透圧、酸素制限、及び、Glucose飢餓状態のストレス条件下においても、当該ストレスに応答して転写の活性を向上させるものである。
【００２６】  また、本発明は、別の態様として、ストレス応答プロモーターを含むベクターを提供する。  ベクターとしては、上記に記載するストレス応答プロモーターを保持する限り限定されず、例えば、大腸菌または真核細胞間のシャトルベクターとなりうるベクター、2-ミクロンプラスミドベクター、真核細胞のセントロメアおよび自律複製配列などの複製起点となりうる塩基配列を保有するベクターなどを挙げることができる。これらのベクターは、当業者であれば本願明細書および技術常識に基づいて、用途や導入先の宿主細胞に応じて設計・製造を行うことができる。  また、本発明のベクターは、一実施の形態において、ストレス応答プロモーターの下流に作動可能に連結された遺伝子を含むことができる。これにより、当該遺伝子は、ストレス応答プロモーターの制御によりストレス条件下での発現が亢進される。ストレス応答プロモーターの下流に作動可能に連結される遺伝子は特に制限されない。好ましくは細胞がストレス条件下においても向上した発現を望む遺伝子であり、例えば、バイオエタノール生産のための糖化酵素遺伝子群（セルラーゼ、キシラナーゼなど）や発酵酵素遺伝子群（Xylose reductase (XR)、Xylitol dehydrogenase (XDH)、あるいはXylose isomerase (XI)など）等を挙げることができる。
【００２７】  また、本発明は、別の態様として、上記ベクターの一部（ストレス応答プロモーターおよびその下流に作動可能に連結された遺伝子を含む領域）または全部を含む形質転換体または微生物を提供する。  ストレス応答プロモーターを含むベクターの宿主細胞への導入方法は、公知の方法により行うことができる。ストレス応答プロモーターを含むベクターは、プラスミド等の形態で宿主細胞に導入されてもよいし、ゲノムDNAに組み込まれても良い。ゲノムDNA上に存在するオリジナルの遺伝子と置換してもかまわない。また、プラスミド、ゲノムへの挿入いずれの場合にも導入コピー数は問わない。形質転換の対象となる宿主細胞としては、以下に制限されないが、例えば、出芽酵母属Saccharomyces、分裂酵母属Schizosaccharomyces、耐熱性酵母属Kluyveromycesに含まれる種を挙げることができる。  また、本発明は、別の態様として、Xyloseを基質とするバイオエタノール生産のための微生物であって、ストレス応答遺伝子の下流に作動可能に連結されたXylose異性化酵素遺伝子を有するベクターの一部（ストレス応答プロモーターおよびXylose異性化酵素遺伝子を含む領域）または全部を含む微生物を提供する。また、当該微生物を用いたバイオエタノールの生産方法を提供する。当該微生物を用いたバイオエタノールの生産方法は、公知の方法および条件に準じて行うことができる。  一実施の形態において、Xyloseを基質とするバイオエタノールの生産方法は、（ａ）本発明のストレス応答プロモーターとその下流に作動可能に連結されたXylose異性化酵素遺伝子を含むベクターの一部または全部を含む微生物を、Xyloseを含む培養液中で培養する工程を含む。また、他の実施形態においては、工程(ａ)が、キシランおよびキシラナーゼの存在下で行われる糖化処理と同時に行うことができる。
【実施例】
【００２８】  以下に本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００２９】(１．培地及び培養条件)酵母の増殖には、YPD培地を用いた。YPD培地は、Bacto酵母エキス(BDバイオサイエンス社、米国)10g、Bactoペプトン(BDバイオサイエンス社) 20g、D-(+)-Glucose(以下Glucoseとする。シグマ アルドリッチ社、米国)20gを精製水 1Lに含む。擬似糖化液を用いたEthanol発酵試験には、バイオマス糖化液の糖組成を模倣する液体培地としてYPDX培地を用いた。YPDX培地は、Bacto酵母エキス 10g、Bacto ペプトン 20g、Glucose(シグマアルドリッチ社) 85g/L、D-(+)-Xylose(以下、Xyloseとする。シグマアルドリッチ社)35g/Lを精製水 1Lに含む。野生型酵母株の維持及び管理には、上記のYPD培地1Lに、Bacto寒天(BDバイオサイエンス社)20gを添加した平板培地を用いた。また、遺伝子操作による酵母株の構築、維持及び管理には、以下に記載の抗生物質を各濃度になるように上記組成の培地に適宜添加した。Geneticin(登録商標)(以下、G418とする。サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社、米国) 200ug/mL、Zeocin(登録商標)(サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社)200ug/mL、Aureobasidin A(タカラバイオ株式会社)0.5ug/mL。大腸菌 DH5α株(ニッポンジーン株式会社)の増殖のために、調製済みのLB培地としてDifco LB, Miller 培地(BDバイオサイエンス社)を用いた。野生型大腸菌株の維持及び管理には、DifcoLB Agar, Miller 培地(BDバイオサイエンス社)を用いた。大腸菌 DH5α株を宿主として用いた遺伝子操作を行った形質転換体の構築、維持及び管理には、上記LB培地に抗生物質Ampicillin(和光純薬工業株式会社)100ug/mLを添加した選択培地を用いた。酵母株の培養は、30℃、振とう培養機を用いて、増殖に応じて1-3日間培養を行った。大腸菌の培養は、36℃、静置で一晩培養を行った。【００３０】(２．DNA抽出、PCR、形質転換、塩基配列の決定)  形質転換を行った大腸菌からプラスミドを抽出する場合には、QIAprep Spin Miniprep Kit (キアゲン社、ドイツ)を用い、添付のプロトコルに従い抽出及び精製を行った。酵母株からゲノムDNAを抽出する場合は、Genとるくん(酵母用)High Recovery (タカラバイオ株式会社)を用いて、添付のプロトコルに従い抽出及び精製を行った。特定のDNA断片の増幅は、目的とするDNA断片に合致する一対の塩基配列を遺伝子解析ソフトウェアSnapGene(GSL Biotech社、米国)及びGenetyx(Genetyx株式会社)を用いて設計したものをオリゴDNAとして合成した(ユーロフィンゲノミクス社及びサーモフィッシャーサイエンティフィク社)。本実施例で使用したオリゴDNAを図９に示す。合成したオリゴDNAをプライマーとし、DNA polymeraseはKOD -Plus- Neo(東洋紡株式会社)を用い、添付の反応プロトコルにしたがって、PCR反応を行った。具体的には、PCR反応溶液として、1x PCR buffer for KOD-Plus-Neo、0.2mM dNTPs、1.5mM MgSO4, 0.32uM Forward/Reverseプライマー、鋳型DNA 1ug、KOD-Plus-Neo (1U/50uL)を含む溶液を200uLのPCRチューブに50-100uL調製した。Pre-denature：94℃、2分、Denature：98℃、10秒、Annealing：(Tm)℃、30秒、Extension：68℃、30秒／kbの３ステップPCR反応をサーマルサイクラー(Veriti Thermal Cycler、Applied Bioscience／サーモフィッシャー社)を用いて25〜30サイクルの反応を行った。その際、Annealingの温度はSnapGeneソフトウェアで設計したオリゴDNAのTmに基づいて決定し、また、PCR産物の長さに応じてExtensionの時間を決定した。プラスミドベクターの構築は、バックボーンとなるプラスミドベクターを上記PCR反応により直鎖化し、挿入するDNA断片をそれぞれ増幅・精製したものを用いて、In-Fusion HD Cloning Kit(タカラバイオ株式会社)を用い、添付の反応プロトコルにしたがって、15bpの重複配列を介してシームレスに結合することで行った。具体的には、1x In-Fusion HD Enzyme Premix、100ng／反応 直鎖化ベクター、同モル数の挿入DNA断片のIn-Fusion反応溶液を調製し、サーマルサイクラーを用いて、15分間、50℃にて反応を行った。【００３１】(３．酵母ストレス応答遺伝子の持つプロモーターの分析)  ストレス応答プロモーターの設計に先立ち、酵母の持つ、ストレス応答遺伝子に着目し、その性状について分析を行った。使用する酵母株は、工業用酵母株IR-2であるため、実験室酵母株のゲノム塩基配列との差異が考えられた。そのため、両方の株の相同領域の比較も含めて検討した。Glucose飢餓という酵母にとって強力なストレス下では、細胞の全遺伝子の転写レベルが低下する、すなわち、Glucose存在下で発現しているほとんどすべての遺伝子の転写活性が低下することが知られている。しかし、このような状況下においても、酵母は、特定の遺伝子群を発現することが知られている。これらの遺伝子は、ストレス応答遺伝子と呼ばれる。その多くは、タンパク質の品質管理を行うタンパク質、変性したタンパク質の分解を促進する酵素など、遺伝子産物の機能はさまざまであるが、その発現レベルは一過的に強く応答する。ストレス応答遺伝子としては、HSP12、HSP26、HSP30、HSP42、HSP60、HSP70/SSA1、HSP70/SSA2、HSP70/SSA3、HSP70/SSA4、HSP78、HSP104、SDP1、CPS1、YGP1、ECM10などが挙げられる。基準株酵母株S288cのゲノムデータベース(SGD, Saccharomyces Genome Database, URL http://www.yeastgenome.org/)より、これらのタンパク質をコードするORFの上流に存在するプロモーターを含む非翻訳領域(遺伝子間領域)の塩基配列を取得し、その塩基配列中に含まれるストレス応答要素と呼ばれる転写因子が結合すると予測されるコンセンサス塩基配列(HSE、STRE)、コンセンサス配列に類似するが一致しない不完全な配列(HSEL、STREL)、転写開始に必要なTATA box、推定転写開始点及び翻訳時にリボソーム結合配列(Kozak配列、翻訳開始点を+1、その一塩基上流を-1としたときの-1〜-6塩基)をまとめたものを表１に示す。【００３２】
【表１】
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(表１は、「Glucose飢餓ストレス応答遺伝子プロモーターに存在するストレス応答要素の種類及び数」を示す。実験室酵母S288c株においてストレス応答を示すと考えられる代表的な遺伝子として、Yeast Promoter Atlas(YPA、http://ypa.csbb.ntu.edu.tw/)に登録されている15遺伝子、HSP12、HSP26、HSP30、HSP42、HSP60、HSP70/SSA1、HSP70/SSA2、HSP70/SSA3、HSP70/SSA4、HSP78、HSP104、SDP1、CPS1、YGP1、ECM10を選抜し、プロモーター領域に含まれるシスエレメントの種類と数を比較した。また、Kozak配列として、各遺伝子の翻訳開始点(メチオニンをコードするATG)の直前の６塩基を抽出した。Gene、遺伝子名；Length、推定されるプロモーター領域の塩基長(bp)；HSE、熱ショック応答エレメント；HSEL、HSE コンセンサス配列に類似するが、完全には一致しない配列；STRE、ストレス応答エレメント；STREL、ストレス応答エレメントのコンセンサス配列に類似するが、完全には一致しない配列；TATA-box、必須要素であるTATA-boxの位置；TSS、推定転写開始点；Kozak、Kozak配列(-1〜-6)。翻訳効率は-3位(太字)の塩基により影響を受けるが、酵母の場合Aが最も優れたものとされる。Others、各プロモーター塩基配列内に結合すると考えられるストレス応答以外の転写因子)
【００３３】  表１に示すように、各種ストレスにより、一過的にせよ何らかの応答をすることが知られている遺伝子群を選別した。ストレス応答に関与する転写調節因子HSF1及びMSN2/MSN4の結合するHSE及びSTREの数は、HSP70が最も多く、３個ずつであった。CPS1やECM10のように、HSEL及びSTRELを含めて一つも存在しないプロモーター領域を持つ遺伝子もあった。以上のことから、単にプロモーター領域に含まれるHSEやSTREといったストレス応答に関与すると考えられるシスエレメントが存在するというだけでは、ストレスに応答するプロモーターであると結論付けることはできない。また、ストレスに対し、どのようなタイミングで、どのような強度で遺伝子発現を行うかという、プロモーターの機能を、その塩基配列のみから予測することは不可能である。【００３４】(４．実験室酵母S288cと工業用酵母IR-2のストレス応答遺伝子プロモーターの塩基配列の差異)  次に、HSPファミリー遺伝子について、それぞれの遺伝子のプロモーター領域塩基配列に差異があるかどうかを確かめるために、塩基配列の比較を行った。その結果をまとめたものを表２に示す。【００３５】
【表２】
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(表２は、ストレス応答遺伝子プロモーターの実験室酵母S288c株・工業用酵母IR-2株間の差異を示す。実験室酵母S288c株と工業用酵母株IR-2におけるストレス応答遺伝子HSP12, HSP26, HSP30, HSP42, HSP78, HSP104, HSP70/SSA4, HSP70/SSA1の推定プロモーター塩基配列の差異。Lengthは推定プロモーター領域の塩基数、塩基置換・塩基挿入に記載の数字は、酵母基準株S288cと工業用酵母IR-2の間で異なる塩基の数を示している。NDは完全に一致し、差が無いことを示している)
【００３６】  まったく同一のものもあれば、塩基が異なるもの、挿入及び置換があるものなどが見出されたが、上記表１で推定されたHSE、STRE、HSEL及びSTRELはすべて保存されており、このシスエレメントの中に変異があるものは存在しなかった。また、当該遺伝子プロモーターにおいてS288c株とIR-2株の間に見出された塩基配列の差異により、IR-2において HSE、STRE配列及びその他の既知シスエレメント配列に該当するものが新たに出現することはなかった。【００３７】(５．ストレス応答プロモーターの設計)  上記の結果から、HSE及びSTREの配置及び数に関しては、ストレス応答強度や持続時間との関係は見出せなかった。また、コアプロモーターにHSE及びSTREをタンデムリピートの形式で設計した人工プロモーターが知られているが、その転写活性やストレス応答は高くないことが知られている。HSE及びSTRE配列の中で、HSP104, HSP78, HSP42プロモーターに内在するシスエレメントが長期のストレス応答特性に重要であると仮定した。プロモーターの下流に位置する遺伝子の5’-非翻訳領域(以下、5’-UTRとする)は、内在性のものを利用すればよいが、5’-UTRの末端は翻訳活性を決定することが知られており、Kozak配列と呼ばれる。酵母の場合、Kozak配列は-3位の塩基がAであることが最も翻訳活性が高く、最も高い翻訳活性を有する配列は-1位から-10位が5’-AATATTAAAA-3’(配列番号４９)であることが知られている。また、長期のストレス下において、転写活性を維持し、遺伝子発現をさせるためには、HSE及びSTREが転写メディエータの足場として機能することが重要であるという仮定した。さらに、加えて、Glucose飢餓状態では、酵母は糖新生によって、例えばEthanolや酢酸等、通常エネルギー源として利用しない炭水化物を利用しすることで危機的状況を回避することができる。糖新生はGlucoseから生産するのではなく、逆に生産した物質から糖を作ろうとする、生産物の消費であるため、糖新生によって活性化するシスエレメントは人工プロモーター塩基配列から削除することが望ましい。以上を踏まえて、微生物による有用物質生産プロセスという過程は、高濃度の基質、宿主微生物にとって最適ではない温度、さまざまな阻害的要因、主要炭素源であるGlucoseの取り合いの結果、Glucose飢餓状態になること等から生産を行う微生物には負荷のかかる状態を余儀なくされるものであることを考慮し、そのような状況において強い遺伝子発現を行うことが可能な人工プロモーターの設計基本戦略を以下のとおり考案した。（１）pHSP26をベースに、pHSP42, pHSP78, pHSP104に内在するHSE及びSTRE塩基配列を含む周辺塩基配列を並べて500bpにしたものを出発点とする。（２）長期のストレス応答特性に重要であると仮定した。不完全なHSE及びSTREはすべて完全なHSE及びSTRE配列に置換する。（３）HSE及びSTRE塩基配列は、TATA-boxの上流に配置し、各シスエレメントは直接隣接(タンデムリピート)させるのではなく、1bp以上、100bp以下の間隔を置いて配置する。（４）HSEとSTREは可能な限り交互に配置する（５）翻訳活性を向上するために、プロモーター下流の5’-UTRはHSP26のものを用いることとするが、これである必要は無い。ただし、-1から-10位の塩基配列を酵母において最も高い翻訳効率を有すると考えられる最適Kozak配列5’-AATATTAAAA-3’に置換する（６）一般的に転写活性��向上する可能性があるactivatorと考えられる転写因子Met31/32, Rgt1, Cad1, Cin5/Yap4, Yap1の結合するシスエレメントのコンセンサス配列(表３)を追加する。【表３】
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(表３は結合すると予測される転写因子の遺伝子名とそのコンセンサス配列を示す。転写因子HSF1はHSEに、MSN2/MSN4はSTREにそれぞれ結合すると考えられる)（７）Glucose存在下で抑制的に作用する、また糖新生に関与すると考えられている転写因子Rap1, Nrg1, Gln3, Hap4/5, Adr1, Mig1, Mot3, Snf1の結合するシスエレメントのコンセンサス配列(表４)が生じないように、類似配列も含めて置換あるいは欠損により削除する。
【表４】
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(表４は結合すると予測される転写因子の名称とそのコンセンサス配列を示す)（８）推定される転写開始点とタンパク質のコード領域との間に、予期せぬ翻訳開始アミノ酸であるメチオニンをコードするATG配列が含まれないようにする。もし、不測のATGが生成された場合には、置換あるいは欠損により削除する。（９）改変の仕方は、塩基・領域の置換(replacement)、挿入(insertion)、削除(deletion)、移動(move)の４方法によるものとする。この戦略に従って、37塩基・領域の置換37箇所、挿入9箇所、削除33箇所、移動1箇所の合計80ステップの改変(表５)によって、ストレス応答プロモーターを設計した。
【表５Ａ】
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【表５Ｂ】
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【表５Ｃ】
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(表５は、酵母のHSP26、HSP42、HSP78、HSP104の部分塩基配列を元に、replacement(塩基置換)、insertion(挿入)、deletion(削除)、move(移動)の改変ステップを行うことによって設計された新規ストレス応答プロモーター塩基配列の、設計過程の各段階の履歴を示す。Position/Regionは当該塩基の位置(翻訳開始点メチオニンをコードするATGのAを1位、その一つ上流を-1位とする)；Before、改変前の塩基；After、改変後の塩基。)
【００３８】  419 bpの転写調節領域及び61bpの5’-UTRを含む480 bpの塩基配列をpSynSR480と名づけ、人工遺伝子により合成した(ユーロフィンジェノミクス社)。pSynSR480において、転写因子が結合すると予測される部位の構成については図１に、塩基配列は表６に示す。【表６】
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(表６は、設計された新規ストレス応答プロモーターpSynSR480の塩基配列を示す。非翻訳領域(5’-UTR)は厳密にはプロモーターではないが、下流の遺伝子発現には、転写開始点と翻訳開始点の間に何らかの5’-UTRが必要である。5’-UTRは、本来、下流の遺伝子配列の一部でありまた遺伝子に固有のものであるが、発現させる遺伝子が外来遺伝子である場合、特に細菌等の原核生物の場合、酵母のような真核生物で機能しうる5’-URTが存在しない。また、5’-UTRには、転写制御因子が含まれる可能性もあるため、ストレス応答プロモーターpSynSR480の設計上、無視することはできない。そのため、改変のベースとして用いた酵母HS26, HSP42, HSP78, HSP104遺伝子のうち、HSP26遺伝子の5’-UTRを含めて塩基配列を設計した。すなわち、HSP26遺伝子の予測転写開始点である-64位のAの上流-480〜-62(419 bp)がプロモーター領域として転写調節の機能を、-61〜-1(61 bp)が5’-UTRとしての機能を有すると考えられる。ただし、表５の改変履歴にあるように、Kozak配列の最適化を含め5’-UTRの中にある不要な塩基配列も削除・改変している)
【００３９】(６．ストレス応答プロモーターpSynSR480に最も類似する塩基配列の探索)  上記によって設計された塩基配列に類似の配列が自然界に存在するかどうかを検証するために、61 bpの5’-UTRを除くpSynSR480の転写制御に関与する419 bpの塩基配列を問い合わせ配列として、BLASTプログラム(NCBI: National Center for Biotechnology Information, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)によりデータベースに登録されている全塩基配列の検索を行ったところ、上位50件、すべてSaccharomyces cerevisiaeの株のgenomic DNAが該当したが、いずれも類似する部分は両端に限局していた。【００４０】  問い合わせ配列の最も長い部分169bpに対して、最も高い類似性(Score 118 bits)を示した配列は130bp(77％)であり、23bp(14％)のギャップを含んでいた。次に、候補が酵母に絞られたため、S288c株に対して同様にWU-BLAST検索(SGD)を行ったところ、得られた結果は３件のみであった。【００４１】  最もScoreが高かった結果(Score 81.1bits)に対する相同性(identities)は265bp/419bp(63％)、34bp/419bp(8％)のギャップを含んでいた。この領域は設計の元となっているHSP26遺伝子のプロモーター内の404bpに相当する領域であった。このpHSP26 (404bp)内に予測される転写因子結合部位は、HSE１箇所のみであった(図２)。【００４２】(７．プラスミドベクターの構築)  上記で設計されたストレス応答プロモーターpSynSR480を、我々がすでに取得しているClostridium phytofermentans由来Xylose異性化酵素遺伝子(CpXI；アクセクション番号ABX41597)の高活性型変異体(CpXImut2mut20)を相同組換えによりAUR1染色体部位に導入するためのプラスミドベクターを以下の手順で樹立した。（１）酵母のAUR1染色体領域及びAUR1-C(Aureobasidin A耐性遺伝子、優性)を有するpAUR101ベクター(タカラバイオ)を鋳型とし、PK98及びPK106を用いて、PCR反応により直鎖化したDNA断片を増幅し、精製を行った。Xylose異性化酵素と酵母由来キシルロースリン酸化酵素ScXKS1を発現するためのプラスミドベクターpAUR101-pHSP12-CpXI-CYC1t-XKS1-pPGK1を用いた(プラスミド番号１、図３)。（２）上記プラスミドベクターは双方向性に作用しうるCYC1ターミネーターが用いられているが、ScXKS1遺伝子のターミネーターを、より安定したmRNAとなるようにTEF1 ターミネーターのものに置換するために、IR-2idA30a株より抽出したゲノムDNAを鋳型として、PK99及びPK100を用いて、PCR反応によりDNA断片を増幅し、精製を行った。（３）同様に、CpXIのターミネーターをADH1のものに置換するために、IR-2idA30a株より抽出したゲノムDNAを鋳型として、PK107及びPK108を用いて、PCR反応によりDNA断片を増幅し、精製を行った。（４）In-Fusion反応によって、(２)〜(３)の２断片を(１)の直鎖プラスミドベクターにクローニングし、環状プラスミドベクターpAUR101-pHSP12-CpXI-ADH1t-TEF1t-XKS1-pPGK1(プラスミド番号２、図４)を構築した。（５）In-Fusion反応後、この反応液を用いて大腸菌DH5αの形質転換を行い、Ampicillin添加LB平板培地において一晩培養を行い、形質転換体クローンを取得した。このクローンを一晩Ampicillin添加LB培地において一晩培養を行い、pAUR101-pHSP12-CpXI-ADH1t-TEF1t-XKS1-pPGK1プラスミドDNAを抽出した。また、取得したプラスミドベクターの塩基配列をサンガーシーケンス法により正しいことを確認した。（６）pAUR101-pHSP12-CpXI-ADH1t-TEF1t-XKS1-pPGK1プラスミドDNAを鋳型として、P97及びP107を用いてPCR反応、精製を行い、CpXI遺伝子のプロモーター領域を欠損させた直鎖DNA断片を取得した。（７）Xylose異性化酵素遺伝子変異体CpXIを発現させるためのプロモーターとして、従来用いられてきた強力なプロモーター3-phosphoglycerate kinase 1遺伝子プロモーターpPGK1及び上記により設計した新規ストレス応答プロモーターpSynSR480をXylose異性化酵素遺伝子の上流に挿入するために、それぞれPK97及びPK115ならびにPK117及びPK118を用いてPCR反応を行い、プロモーターDNA断片を取得した。（８）In-Fusion反応によって、(7)で取得したプロモーターDNA断片pPGK1及びpSynSR480を、それぞれ(６)の直鎖プラスミドベクターにクローニングした。（９）In-Fusion反応後、これらの反応液を用いて大腸菌DH5αの形質転換を行い、Ampicillin添加LB平板培地において一晩培養を行い、形質転換体クローンを取得した。このクローンを一晩アンピシリン添加LB培地において一晩培養を行い、pAUR101-pPGK1-CpXI-ADH1t-TEF1t-XKS1-pPGK1(プラスミド番号３、図５)プラスミドDNA及びpAUR101-pSynSR480-CpXI-ADH1t-TEF1t-XKS1-pPGK1(プラスミド番号４、図６)プラスミドDNAを抽出した。取得したプラスミドベクターの塩基配列をサンガーシーケンス法により正しいことを確認した(ユーロフィンゲノミクス社)。（１０）プラスミド番号３及４のプラスミドベクターをAUR1-C遺伝子内に１箇所存在する制限酵素StuIにより直鎖化し、アガロースゲル電気泳動により分離し、当該バンドを切り出した上で、QIAquick Gel Extraction Kit(キアゲン社)を用いて精製した。精製されたDNA 1ugを用いて、酵母KEF180株(MATa hoΔ::loxP gre3Δ::kanMX-loxP、表７：株番号２)の形質転換を行った。形質転換は、酢酸リチウム法により行い、Aureobasidin A添加YPD平板培地によって30℃において3日間培養を行い、形質転換体クローンの選択を行った。これらの株をKEF205(コントロール)、KEF206と名づけた。これら２つの株の差異は、Xylose異性化酵素遺伝子CpXIを発現するためのプロモーターがpPGK1であるか、pSynSR480であるかのみである。【００４３】  本実施例において使用した工業用酵母株の名称とその遺伝型を表７に示す。【表７】
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(表７は本実施例で使用した株とその遺伝型を示したものである。IR-2idA30Aは２倍体であるIR-2からホモタリズムを欠如し、１倍体を維持するためにHO遺伝子をノックアウトした後に、分離したものである。KEF180は、IR-2idA30aを親株とし、内在性のXylose reductase遺伝子(GRE3)を欠損させたものである。GRE3はXyloseをXylitolに変換するXylose reductase酵素をコードする遺伝子である。内在性のGRE3遺伝子が取り込まれたXyloseを基質として生産するXylitolはXylose異性化酵素を阻害すると考えられる。また、Xylitolの生産はEthanol発酵における副産物であり、Ethanol収率を低下させるため、あらかじめ欠損させた。KEF205、KEF206はXylose異性化酵素を発現させるためのプロモーターとしてpPGK1(KEF205)、pSynSR480(KEF206)を構成したプラスミドベクターを染色体上のAUR1部位に挿入したものである。Xylose異性化酵素以外に、酵母では発現が低く、また機能が不十分であると考えられているxyluloseをリン酸化するxylulokinase遺伝子(XKS1)をpPGK1により発現させている。
【００４４】(８．YPDX擬似糖化液を用いた発酵試験)  ストレス応答プロモーターpSynSR480の転写活性を評価するために、酵母において高いXylose異性化活性を有するXylose異性化酵素変異体(以下、CpXI)を当該プロモーターによって発現するKEF206株、コントロールとして従来、強い遺伝子発現が可能とされるPGK1プロモーターによって同様にCpXIを発現するKEF205株を用いて、YPDX擬似糖化液によるEthanol発酵試験を以下の手順に従って行った。【００４５】（１）接種細胞の調製  あらかじめAureobasidin A含有YPD平板培地に展開しておいたKEF205及びKEF206株を、2mLのAureobasidin A含有YPD培地(14mL 試験管)に植菌し、30℃、150rpmで１日間振盪培養を行った(前々培養)。前々培養液全量を20mLのYPD培地(100mLバッフル付きフラスコ)に植菌し、１日間、30℃、135rpm振盪培養を行った(前培養)。前培養液全量を、遠心分離(3,000rpm、5分、4℃)によって酵母細胞を集菌し、10mLのYPDX疑似糖化液に再懸濁し、吸光度A600を測定した(Smart Spec、バイオラッド社)。この数値を元に希釈を行い、最終的な細胞濃度がODA600=30になるように調製した。【００４６】（２）発酵試験  100mLフラスコに、あらかじめ60mLの疑似糖化液YPDXを加え、(１)で調製した細胞懸濁液を7mL接種した。培養液の全量を70mLとし、発酵試験開始時の細胞濃度はODA600=3とした。本発酵試験は、Ethanol生産量を最大にするために、微好気条件で行うこととし、サンプリング及び発酵中に発生する二酸化炭素等のガスを排気するため、サンプリング用注射針(テルモ社、21G, 90mm)及び通気用注射針(テルモ社、21G)を貫通したソフトシリコン栓(無通気)を用いて、フラスコを閉栓し、38℃、135rpm、気相インキュベーター(タイテック社、BR-40LF)において72時間振盪培養を行った。【００４７】（３）サンプリングサンプリング用注射針の上部に三方活栓(テルモ株式会社)を連結し、サンプリング時のみコックを開栓し、2.5mLの注射筒を用いて、培養開始後、1、3、6、13、27、36、48、60、72時間の各時間に無菌的に約0.5mLずつサンプリングを行った。採取した培養液は、すぐさま氷冷し、冷却機付き高速遠心機を用いて、15,000rpm、5分、4℃にて遠心分離を行い、沈殿した菌体を含まないように上澄を約400uLを、新しいエッペンドルフチューブに移し、HPLC測定までの間、-30℃メディカルフリーザーにて凍結保存した。【００４８】(９．HPLCによる糖、糖アルコール、有機酸、アルコールの定量)  サンプリングした培養液中のGlucose、Xylose、Xylitol、Glycerol、AcetateおよびEthanol濃度を定量するため、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いて測定を行った。測定にはAminex HPX-87Cカラム(バイオラッド社)および Cation H Refill Guard カラム(バイオラッド社)、示差屈折計(日本分光株式会社)を装備したHPLC LC-2000Plusシリーズ(日本分光株式会社)を用いた。5mM H2SO4を移動相として、流速0.6mL/分、温度65℃、投入サンプル量25uLの条件で各成分を分離した。Glucose、Xylose、Xylitol、Glycerol、AcetateおよびEthanolを、それぞれ2％ (w/v)、1％ (w/v)、0.1％(w/v)、0.01％(w/v)の濃度で混合した標準物質溶液を用いて同様に測定を行い、各成分のピーク面積より検量線を取得した。培養液サンプル中に含まれる各物質の濃度は、HPLC測定により得られた面積から、検量線を用いて算出した。AcetateおよびEthanolなどの揮発性成分の測定誤差を減らすために、標準物質溶液は必要容量分をエッペンドルフチューブに分注したものを-30℃メディカルフリーザーにおいて冷凍保存したものを用いた。【００４９】(１０．YPDX擬似糖化液発酵試験の結果)  セルロース系バイオマス糖化液を模倣したGlucose(85g/L)、Xylose(35g/L)を含むYPDX擬似糖化液を用いた発酵試験の結果を図７、表８及び表９に示す。【表８】
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(表８は、pPGK1によりXylose異性化酵素を発現する株KEF205の微好気条件下における擬似糖化液を用いて行った発酵試験の結果、発酵溶液に含まれる各時間における各種成分のHPLC分析の結果を示す。hr: 発酵開始からの時間、Glucose, Xylose, Xylitol, Glycerol, Acetate及びEthanolの数値は各時間における各成分の濃度(g/L)。n.d.は、HPLCの検出限界以下であることを示す。)
【表９】
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(表９は、pSynSR480によりXylose異性化酵素を発現する株KEF205の微好気条件下における擬似糖化液を用いて行った発酵試験の結果、発酵溶液に含まれる各時間における各種成分のHPLC分析の結果を示す。hr: 発酵開始からの時間、Glucose, Xylose, Xylitol, Glycerol, Acetate及びEthanolの数値は各時間における各成分の濃度(g/L)。n.d.は、HPLCの検出限界以下であることを示す。)
【００５０】  図７Ａ及びＢを比較すると明らかなように、新規に設計されたストレス応答プロモーターpSynSR480を用いてXylose異性化酵素遺伝子CpXIを発現するKEF206株のXylose消費速度は、PGK1プロモーターを用いて同遺伝子を発現するKEF205株のXylose消費速度に比べて著しく速くなっていた。また、それに応じて、Ethanol生産性も向上していた。発酵72時間において、KEF206株は初期のXylose量36.24 g/Lをすべて消費していたが(表９)、KEF205株はすべてを消費できず、7.20g/L残していた(表８)。同様に、KEF206株の72時間におけるEthanol生産性が0.783g/L/hであったのに対し(表９)、KEF205株は、0.702g/L/hであった(表８)。これはEthanol生産性12％の向上に相当する。KEF206株の投入糖あたりのEthanol変換効率が91％である(表９)のに対し、KEF205株は82％であった(表８)。これは、Ethanol収率11％の向上に相当する。一方、KEF206株の消費糖あたりのEthanol変換効率が91％である(表９)のに対し、KEEF205株は90％であった(表８)。消費糖あたりのEthanol変換効率、すなわち、酵母が取り込んで消費した糖をEthanolに変換する効率は、いずれも同程度であることから、Xylose異性化酵素以外のXylose代謝に関与する代謝酵素の活性には変化がないことが示唆される。以上の結果から、KEF206株におけるEthanol生産性能の向上は、Xylose消費性能の向上の結果、消費されるXyloseの量が増加したことによると考えられる。Xyloseの消費速度の増加は、Xylose代謝経路における最初のXylose代謝遺伝子、Xylose異性化酵素が律速になっており、ストレス応答プロモーターによってXylose異性化酵素遺伝子の転写活性が向上した結果、Xylose異性化酵素量が増加したことによるものと結論付けられ、従来、もっとも高い遺伝子が発現可能とされてきた酵母のPGK1プロモーターよりも、Ethanol発酵生産プロセスに適した、高い転写活性を有することが明らかになった。【００５１】  Ethanol生産性(g/L/h)は、生産されたEthanol濃度を発酵時間で割ったものであり、式[1]により与えられる。ここでは、最大Ethanolを生産する72時間における数値を示している。式[1] Ethanol生産性(g/L/h)＝当該発酵時間のEthanol濃度(g/L)÷発酵時間(h)  また、発酵試験におけるEthanol収率(g/g)は、式[2]により与えられる。式[2] Ethanol収率(g/g)＝生産されたEthanol質量(g)÷投入した糖の総質量(g)  Ethanol変換効率(％)は、Ethanol収率の理論最大値である理論Ethanol収率(g/g)に対する、実際の発酵試験で得られたEthanol収率(g/g)の比に100を乗じたもので、式[3]により与えられる。GlucoseからEthanol、XyloseからEthanolへの理論Ethanol収率(g/g)は、いずれも0.51である。式[3] Ethanol変換効率(％)＝Ethanol収率(g/g)÷理論Ethanol収率(g/g)×100 【００５２】(１１．水酸化ナトリウム処理サトウキビバガスを用いた同時糖化併行複発酵試験)  上記のYPDX擬似糖化液を用いた発酵試験は、セルロース系バイオマスから生成されるバイオマス糖化液を模倣した、糖などの成分組成が明らかな実験用試薬から構成されている糖化液発酵プロセス(SHF)であった。一方、セルロース系バイオマスエタノールの工業生産は、糖化液発酵プロセス以外に、糖化反応と発酵反応を同時に行う工業プロセスとして、同時糖化併行複発酵プロセス(SSCF)があることはすでに述べたとおりである。ストレス応答プロモーターが、セルロース系バイオマスを基質とする発酵プロセスにおいて、高いXylose資化性能及びEthanol生産性の向上をもた��すXylose異性化酵素遺伝子の発現を向上することが可能であることを示すために、以下の実験を行った。【００５３】（１）基質  セルロース系バイオマスの基質としては、トウモロコシ、サトウキビ、ヤシなどさまざまな植物の非可食部位が利用可能であると考えられている。ここでは、代表的な基質として、サトウキビバガス粉砕物を、水酸化ナトリウム水熱処理の後に、水洗浄を行って固体成分を分取したものを使用した(日揮株式会社)。この固体成分は、セルロース53.50％、ヘミセルロース18.60％、リグニンその他灰分など35.95％が含まれ、水分含有率は72.61％であった。Glucoseはセルロース(グルカン)から、Xyloseはヘミセルロース(キシラン)から生成されると仮定すると、これらが糖化酵素(セルラーゼ、ヘミセルラーゼ)によって完全糖化された場合、乾燥固体バイオマスからGlucose及びXyloseが約141g/L供給される量の基質を用いることとした。これは、85％糖化の場合、YPDX擬似糖化液発酵試験で用いた糖濃度120g/Lに相当する糖が供給されることに他ならない。【００５４】（２）糖化酵素  糖化酵素は、セルロース(グルカン)からGlucoseを生成するセルラーゼに加えて、ヘミセルロース(キシラン)からXyloseを生成可能なヘミセルラーゼを含むJN24を用いた(花王株式会社)。乾燥セルロース・ヘミセルロース質量あたり8.7mgのタンパク質を含む酵素液を1Xとして使用した。【００５５】（３）接種細胞の調製  KEF205及びKEF206株を、2mLのAureobasidin A含有YPD培地(14mL 試験管)に植菌し、30℃、150rpmで１日間振盪培養を行った(前々培養)。前々培養液全量を20mLのYPD培地(100mLバッフル付きフラスコ)に植菌し、１日間、30℃、135rpm振盪培養を行った(前培養)。前培養液全量を、遠心分離(3,000rpm、5分、4℃)によって酵母細胞を集菌し、50mLの滅菌水により洗浄、遠心分離の後、10mLの滅菌水に再懸濁し、吸光度A600を測定した(Smart Spec、バイオラッド社)。【００５６】（４）同時糖化併行複発酵試験  赤外線水分計(FD-720、株式会社ケツト科学研究所)を用いてサトウキビバガス前処理物の実験当日水分率(％)を測定し、100から水分率を引いた値により固形分率(％)を求めた。この固形分率から、上記(１)で示したとおり完全糖化時に141g/Lの糖を供給可能な量のサトウキビバガス前処理物を秤量し、プラスティック製細胞培養用フラスコ(疎水性フィルター付キャップ、AGCテクノグラス株式会社)に入れた後、滅菌水、糖化酵素(1X〜4X)、pH調整のために25mM希硫酸(SIGMA)を投入した、最後に、発酵試験開始時の細胞濃度がOD=3になるように細胞溶液を投入し、均一になるように攪拌した。以上により、総溶液量は20mL、スラリー濃度は約20％(w/v)、初期pHは5になるようにセットアップを行った。酸素制限を行うため、これらのフラスコをチャック付の酸素不透過性のビニールバッグ(三菱ガス化学株式会社)に二重に入れ、密封した上で、38℃の気相インキュベーター(TAITEC社、BR-40LF)において同時糖化併行複発酵試験を行った。細胞増殖あるいはEthanol発酵に伴い発生する二酸化炭素等のガスによりビニールバッグが膨らみ、破裂するのを防ぐために、適宜ガス抜きを行った。【００５７】（５）サンプリング  Ethanol発酵は、酸素存在下では著しく生産量・生産性が低下することが知られているため、サンプリングによる酸素流入を極力防ぐために、発酵120時間において、１フラスコあた���１回のサンプリングのみ行った。各時間において、約1.0mLずつ発酵残渣を含む発酵溶液を分取し、エッペンドルフチューブに移したのち、速やかに氷冷し、冷却機付き高速遠心機を用いて、15,000rpm、30分、4℃にて遠心分離を行い、沈殿したバイオマス残渣を含まないように上澄を約 400〜600uLを新しいエッペンドルフチューブに移し、HPLC測定までの間、-30℃メディカルフリーザーにて凍結保存した。また、HPLCによる発酵溶液に含まれる糖、糖アルコール、有機酸、アルコール成分の定量は上記９と同様に行った。【００５８】(１２．水酸化ナトリウム処理サトウキビバガスを用いた同時糖化併行複発酵試験の結果)  KEF205株及びKEF206株による同時糖化併行複発酵試験の結果を図８、表１０に示す。【表１０】
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pPGK1によりXylose異性化酵素を発現するKEF205株とpSynSR480によってXylose異性化酵素を発現するKEF206株を比較すると、発酵120時間のEthanol生産量はどの酵素濃度においても、KEF206株がKEF205株を上回っていた。最大エタノール生産は、4Xの糖化酵素を用いた場合のKEF206株で、Ethanol濃度は61.19g/Lであった。推定糖化率98.4％、推定変換効率90.7％、SSF効率は89.2％であった。1X〜4Xの各酵素濃度の発酵性能を詳細に比較すると、推定変換効率は、KEF206株はKEF205株より、それぞれ5.2％、3.5％、3.0％、0.6％高く、また、推定糖化率は、KEF206株はKEF205株より、それぞれ5.0％、5.1％、2.4％、2.1％高かった。その結果、バイオエタノール生産の指標となるSSF効率は、KEF206株はKEF205株より、それぞれ10.5％、8.7％、5.6％、2.9％高かった。すなわち、YPDX培地を用いたYPDX擬似糖化液発酵試験と同じく、水酸化ナトリウム処理サトウキビバガスを用いた同時糖化併行複発酵試験においても、ストレス応答プロモーターpSynSR480はpPGK1より強くXylose異性化酵素遺伝子を発現しており、その結果として、エタノール生産量の増大につながったと考えられる。同時糖化併行複発酵においては、糖化反応が律速になりうる。すなわち糖が供給されなければ、酵母は発酵することができないため、エタノール生産は頭打ちになる。糖化酵素に含まれる各酵素は、自身の酵素活性によって生成した単糖やオリゴ糖によって、生成物阻害を受けることが知られている。同時糖化併行複発酵プロセスでは、酵母が効率よく糖を消費することによって生成物(糖)の濃度が減少することによって、糖化酵素はリサイクルされ、より効率的に糖化反応が進むという好循環が生まれると考えられる。本実験では、酵母固有の性能である推定変換効率及び推定糖化率のいずれにおいても、KEF206株のほうがKEF205株を上回るという結果が得られた。この結果は、KEF206で用いられているpSynSR480は、単により多くのXylose異性化酵素を発現するだけでなく、KEF206株がより早く糖を消費することができ、その結果、糖化率の向上にも寄与しうることを示唆している。これらの結果をまとめると、発酵プロセスに適したストレス応答プロモーターpSynSR480は、高いXylose異性化酵素発現を通じて、従来強いとされてきたpPGK1を用いるよりも、高い効率でバイオエタノール生産が可能であることを示している。
【００５９】  なお、同時糖化併行複発酵試験では、糖化率を直接測定することは困難である。なぜならば、残渣を含む発酵溶液は、未糖化のセルロース・ヘミセルロースだけでなく、バイオマスに由来する雑多な副成分に加えて、酵母菌体も含まれる泥状のものである。そのため、この発酵溶液中に含まれる未糖化の糖量を直接定量することはできない。そのため、投入したセルロース・ヘミセルロースから生成された糖の量の比率、すなわち糖化率は、フラスコに投入されたバイオマスに含まれる総炭素量とHPLCによって測定された糖・有機酸・アルコール等に含まれる総炭素量の比率として計算することが可能で、次の式[4]によって与えられる。式[4] 推定糖化率＝(発酵溶液中の代謝産物等に含まれる炭素量)÷(投入したバイオマスに含まれる炭素量)  同時糖化併行複発酵プロセスの効率(SSCF効率)は、投入したバイオマスから最大生産されうる理論最大Ethanol量で割ったものであり、式[5]によって与えられる。式[5] SSCF効率＝生産Ethanol量÷理論最大Ethanol量  酵母に固有なEthanol発酵性能である推定変換効率は、次式[6]によって与えられる。式[6] 推定Ethanol変換効率＝SSCF効率÷推定糖化率
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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