(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂｉｘａ  Ｏｒｅｌｌａｎａ種子からの抽出物の精製で得られるビキシンのアルカリ加水分解後に得られる、ノルビキシンを９０重量％を超えて含む加水分解物を含む、哺乳動物において網膜色素上皮（ＲＰＥ）の細胞の光保護に使用するための組成物であって、
哺乳動物に、１日あたり、０．４８ｍｇ／ｋｇ（体重）〜４８ｍｇ／ｋｇ（体重）のノルビキシンの量で投与される、組成物。
【請求項２】
加水分解物が９５重量％を超えるノルビキシンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
加水分解物が９０重量％を超える式（Ｉ）：
【化１】
0006660401.tif 000005
の９’−シス型のノルビキシンを含む、請求項１及び２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４】
亜鉛、ビタミンＣ及びビタミンＥから選択される少なくとも１種の要素を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
栄養補助食品又は薬物の形態である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
経口摂取、眼内注射、又は全身注射が許容可能な担体を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
哺乳動物に、１日あたり、０．６ｍｇ／ｋｇ（体重）〜２０ｍｇ／ｋｇ（体重）のノルビキシンの量で投与される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
可視光スペクトルの青色バンドに対応し、４３５ｎｍ〜４９０ｎｍの波長を有する青色放射線への曝露により引き起こされる前記網膜への損傷の防止に適用するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
哺乳動物において加齢黄斑変性（ＡＲＭＤ）の治療に適用するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
哺乳動物においてシュタルガルト病及び／又は網膜色素変性症の治療に適用するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）の細胞を治療する分野に関係する。
【０００２】
より具体的には、本発明は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）の細胞を保護するため、特には哺乳動物において加齢黄斑変性（ＡＲＭＤ）又はシュタルガルト病及び網膜色素変性症を治療するための組成物の使用をターゲットとする。
【０００３】
本発明の目的は、これらの疾患を患っている個体の視力を改善する又は少なくとも疾患の進行を安定させることである。
【背景技術】
【０００４】
加齢黄斑変性（ＡＲＭＤ）は、特には欧州及び北米の老人層における不可逆的失明の原因である。ＡＲＭＤは、黄斑と呼ばれる網膜の中心部に変化をもたらし、深刻な視力の低下及び中心視野の不可逆的な喪失につながる。
【０００５】
黄斑の機能は中心視野及び視力に関与し、その高い分解能はその高い錐体視細胞密度と関連がある。ＡＲＭＤの初期段階はドルーゼと呼ばれる沈着物を特徴とし、これは視力には殆ど影響しない。続く段階には２つのＡＲＭＤ型：地理的萎縮（乾燥型）又は滲出性萎縮（湿潤又は新生血管型）があり、前者は後者よりはるかに一般的である。これら２つの型の最終段階では黄斑神経感覚網膜の破壊が起きるが、乾燥型ＡＲＭＤの進行は概して緩慢であり、湿潤型ＡＲＭＤは数週間で完全な失明に至る場合がある。
【０００６】
老化は、次第に疾患にかかり易くなることと関連がある（又はその原因である）、長い時間をかけての変化の段階的な蓄積である。網膜においては、緑内障、網膜色素変性症及びＡＲＭＤを含めた一定数の変性疾患が老化に伴って起き得る。網膜色素変性症は多様な遺伝的網膜変性症の１つであり、視細胞及びＲＰＥが関わり、夜間視力とそれに続く中心視野の喪失に至る。網膜の老化に関係した様々なタイプの疾患の発症に関わる具体的なメカニズムは異なるものの、酸化ストレス及びそのせいで起きる炎症が発病に寄与する重要な要素であると考えられる。
【０００７】
ＡＲＭＤの病因に関する理論には、脂質を含有する細胞外物質の段階的な蓄積及びＲＰＥの老化によって引き起こされるブルッフ膜における流体力学的変化が含まれ、ＲＰＥの活動は視細胞の生存にとって極めて重要である。ＲＰＥの細胞は眼内で幾つかの異なる機能を担っており、そのタイトジャンクションでもって血液網膜関門を確立することで眼球内部の免疫特権状態に寄与し、栄養を届けることで視細胞を生かし続け、視覚サイクルに関与する。現時点では、ＲＰＥ細胞の機能の低下がＡＲＭＤの発症原因であると考えられている。老化はＲＰＥ細胞の機能不全並びにその代謝及びその食作用活動の不全を引き起こす。視細胞の外節の消化が不完全だとブルッフ膜を越えての拡散が減少することでドルーゼが発生する可能性があり、これはまず網膜、また知覚した映像の変形を引き起こす。
【０００８】
老化と共に、ＲＰＥに少しずつリポフスチンが溜まっていく。リポフスチンは、ファゴリソソーム、リソソーム及び視細胞由来の脂質及びタンパク質から構成される。リポフスチンはＮ−レチニル−Ｎ−レチニリデンエタノールアミン（Ａ２Ｅ）も含有し、これは２つのレチンアルデヒド分子のエタノールアミンとの縮合により生成される。
【０００９】
老化と共に、網膜にＡ２Ｅが少しずつ蓄積されていく（Ｂｈｏｓａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。青色光線の作用及び酸素の存在下、Ａ２Ｅは、タンパク質、脂質及びＤＮＡに損傷を引き起こす反応種を産生するため、ＲＰＥの老化する細胞における大きな酸化ストレスである（Ｓｐａｒｒｏｗ＆Ｃａｉ，２００１）。この損傷によりＲＰＥの細胞のリソソーム活性は乱れ、老廃物の蓄積が引き起こされ、最期にはあちこちでＲＰＥ細胞死、それに続く関係する視細胞の死を引き起こす。
【００１０】
乾燥型ＡＲＭＤを治療するための薬物は市販されていないものの、抗ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）抗体を硝子体内注射する薬物は販売されており、新生血管の形成を部分的にブロックすることができるため、湿潤型ＡＲＭＤの代替治療となっている。栄養補助食品が一般的な抗酸化化合物、すなわち抗酸化性があるミネラル及びビタミン、例えば実際に治療効果はあるが限定的である亜鉛、ビタミンＡ、Ｃ、Ｅで調合されている。栄養補助食品であるＡＲＥＤＳフォーミュラ１（加齢性眼疾患に関する研究（Ａｇｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｅｙｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｓｔｕｄｙ、ＡＲＥＤＳ  ２００１）は米国において乾燥型ＡＲＭＤの治療に関してケアの標準であるとみなされており、５年間で進行したＡＲＭＤのリスクを２５％、失明のリスクを１９％低下させる。
【００１１】
数多くの製品が共通したベース処方：亜鉛並びにビタミンＣ及びＥを提案しており、これに様々な原料：ルテイン、レスベラトロール、オメガ−３脂肪酸を添加しているが、これら追加の原料に関する又はこれら様々な分子に好適に応答する可能性がある患者のカテゴリーに関する、効力についての説得力のあるデータを提示してはいない（Ｅｌｌｉｏｔ＆Ｗｉｌｌｉａｍｓ，２０１２）。特に、先行技術には国際出願ＷＯ２００５／１１０３７５があり、これは疾患の影響が出た後にそれを制限する又は視力の喪失を防止することを目的とした栄養補助食品に関する。
【００１２】
カロテノイド（食事からしか摂取できない分子）が特によく研究されているが、これは一部のカロテノイド（ルテイン、ゼアキサンチン＝キサントフィル）は黄斑内に天然で存在し（Ｓｕｂｃｚｙｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、これらの化合物は強力な抗酸化力を有すると知られているからである。したがって、これらの化合物がＡＲＥＤＳフォーミュラで試験されてきたのは（単体で又は組み合わせて）当然であるが、得られた結果は限定的であり、カロテノイドの補充はこれらの化合物が不足している患者群にだけ有効であると判明した（Ｐｉｎａｚｏ−Ｄｕｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。これらの分子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、過酸化水素の毒性作用（Ｐｉｎｔｅａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）からＲＰＥ細胞を保護するのに有効である（Ｈｕｍａｎ  Ｄ４０７）。
【００１３】
日本国特許出願ＪＰ２０１０２８５３６４は、クロセチン及びキサントフィルになり得る別のカロテノイド又は別のジアポカロテノイド、すなわちビキシン又はノルビキシンから構成される混合物を提唱している。この混合物は、その抗酸化性により、酸化現象が関係する疾患の緩和又は予防向けに提案されている。
【００１４】
他のキサントフィルの経口での補充も、単体で、あるいはルテイン及び／又はゼアキサンチン（例えば、アスタキサンチン、Ｐａｒｉｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）と組み合わせて研究されている。近年、ジアポカロテノイド（＝両端でトランケートしたカロテノイド−ＩＵＰＡＣ化学命名法）、特にはクロセチン（＝８，８’−ジアポカロテン−８，８’−ジオエート）及びそのグリコシド（クロシン）がｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで試験されている。クロシンはウシ又は霊長類の視細胞（Ｌａａｂｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）の初代培養物に対する体外光保護効果を有し、クロセチンは酸化ストレスから神経節細胞を守る（Ｙａｍａｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。経口投与したサフラン（クロシン／クロセチンが豊富な香辛料）はｉｎ  ｖｉｖｏで網膜の質に対して効力があると判明している（Ｍａｃｃａｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｆａｌｓｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｂｏｉｓｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。しかしながら、サフランは網膜に対して効力を発揮し得る他の分子、例えば他のカロテノイド、またクロセチンと同時に生成されるサフラナールを含有するため（Ｖｅｒｍａ＆Ｍｉｄｄｈａ，２０１０；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、クロセチン単体での効果に関する結論を出すのは困難である。
【００１５】
別のアポカロテノイド、ビキシン（＝メチル水素６，６’−ジアポカロテン−６，６’−ジオエート）又はその特定の誘導体を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで神経節細胞について、また硝子体内注射によりｉｎ  ｖｉｖｏで、小胞体のストレスの影響に対抗させる実験も行った（Ｔｓｕｒｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。そのようにして行った試験は最も一般的には、酸化剤（例えば、過酸化水素）の存在に曝露された網膜の様々な細胞タイプに関する化合物の抗酸化、ひいては保護活性を評価するものであり、したがって直接的にはＡＲＭＤと関わりがない。
【００１６】
これまでに開発されたベニノキ（Ｂｉｘａ  ｏｒｅｌｌａｎａ）の種子からの抽出物（Ｂｉｘｉｌｉａ（登録商標））は、紫外線に曝露されたヒトの皮膚（仏国特許第２９４７１７３号、Ｖｅｉｌｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）及び光酸化ストレスに曝されたＲＰＥ細胞（Ｆｏｎｔａｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）に対して保護効果を示している。Ｂｉｘｉｌｉａ（登録商標）抽出物は、ビキシンが富化されたベニノキの天然抽出物である。Ｂｉｘｉｌｉａ（登録商標）はフェノール系の他の光保護化合物を含有しており、その存在が、ビキシン単体より粗抽出物の光保護活性のほうが高い理由であると考えられる。仏国特許第１１５４１７２（Ｆｏｎｔａｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）においては、Ｂｉｘｉｌｉａ（登録商標）抽出物の化合物の一部がＲＰＥ細胞に及ぼす保護効果を分析している。ビキシン又はノルビキシンを０．１マイクロモル（μＭ）、１μＭ及び１０μＭの濃度で使用した試験の結果から光保護活性は見られず、ビキシン又はノルビキシン濃度が高ければ高いほどＲＰＥ細胞の生存率が低下し、光保護効果が弱くなることを暗に示してさえいる。とりわけ、濃度１０〜２０μＭのシアニジン及びエラグ酸等の物質は、ＲＰＥ細胞に対して有利な光保護効果を有することが注目される。
【００１７】
より綿密な研究により、Ｂｉｘｉｌｉａ（登録商標）抽出物中に存在する活性分子は同定され、その作用機序は特定され、ｉｎ  ｖｉｖｏでのその効力がマウス及びラットで実証された。この研究が本発明につながっている。したがって、本発明は、既存のものに代わる、ＲＰＥ細胞を保護するための治療方法を見つけることを構想している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】国際公開第２００５／１１０３７５号パンフレット
【特許文献２】日本国特許第２０１０２８５３６４号明細書
【特許文献３】仏国特許第２９４７１７３号明細書
【特許文献４】仏国特許第１１５４１７２号明細書
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ｂｈｏｓａｌｅ  Ｐ，Ｓｅｒｂａｎ  Ｂ，Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ＰＳ．２００９．Ｒｅｔｉｎａｌ  ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ  ｃａｎ  ａｔｔｅｎｕａｔｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａ２Ｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｐｉｇｍｅｎｔ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．Ａｒｃｈ  ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ，４８３：１７５−１８１．
【非特許文献２】Ｓｐａｒｒｏｗ  ＪＲ，Ｃａｉ  Ｂ．２００１．Ｂｌｕｅ  ｌｉｇｈｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｆ  Ａ２Ｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＲＰＥ：ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｓｐａｓｅ−３  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｂｃｌ−２．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ，４２：１３５６−１３６２．
【非特許文献３】ＡＲＥＤＳ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｎｏ．８．２００１．Ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｄｏｓｅ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｖｉｔａｍｉｎｓ  Ｃ  ａｎｄ  Ｅ，ｂｅｔａ  ｃａｒｏｔｅｎｅ，ａｎｄ  ｚｉｎｃ  ｆｏｒ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｖｉｓｉｏｎ  ｌｏｓｓ．Ａｒｃｈ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ，１１９：１４１７−１４３６．
【非特許文献４】Ｅｌｌｉｏｔｔ  ＪＧ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＮＳ．２０１２．Ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂａｔｔｌｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｅｙｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｐｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｏｐｔｍ．２０１１．１１．００６
【非特許文献５】Ｓｕｂｃｚｙｎｓｋｉ  ＷＫ，Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋａ  Ａ，Ｗｉｄｏｍｓｋａ  Ｊ．２０１０．Ｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｃｕｌａｒ  ｐｉｇｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｓｔ  ｖｕｌｎｅｒａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｏｕｔｅｒ−ｓｅｇｍｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．Ａｒｃｈ  ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ，５０４：６１−６６．
【非特許文献６】Ｐｉｎａｚｏ−Ｄｕｒａｎ  ＭＤ，Ｇｏｍｅｚ−Ｕｌｌａ  Ｆ，Ａｒｉａｓ  Ｌ，Ａｒａｉｚ  Ｊ，Ｃａｓａｒｏｌｉ−Ｍａｒａｎｏ  Ｒ，Ｇａｌｌｅｇｏ−Ｐｉｎａｚｏ  Ｒ，Ｇａｒｃｉａ−Ｍｅｄｉｎａ  ＪＪ，Ｌｏｐｅｚ−Ｇａｌｖｅｚ  ＭＡ，Ｍａｎｚａｎａｑ  Ｌ，Ｓａｌａｓ  Ａ，Ｚａｐａｒａ  Ｍ，Ｄｉａｚ−Ｌｌｏｐｉｓ  Ｍ，Ｇａｒｃｉａ−Ｌａｙａｎａ  Ａ．２０１４．Ｄｏ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  ｈａｖｅ  ａ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ａｇｅ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ？Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ９０１６８６．
【非特許文献７】Ｐｉｎｔｅａ  Ａ，Ｒｕｇｉｎａ  ＤＯ，Ｐｏｐ  Ｒ，Ｂｕｎｅａ  Ａ，Ｓｏｃａｃｉｕ  Ｃ．２０１１．Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｓ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｐｉｇｍｅｎｔ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｆｏｏｄ  Ｃｏｍｐｏｓ  Ａｎａｌ，２４（６）：８３０−８３６．
【非特許文献８】Ｐａｒｉｓｉ  Ｖ，Ｔｅｄｅｓｃｈｉ  Ｍ，Ｇａｌｌｉｎａｒｏ  Ｇ，Ｖａｒａｎｏ  Ｍ，Ｓａｖｉａｎｏ  Ｓ，Ｐｉｅｒｍａｒｏｃｃｈｉ  Ｓ．２００８．Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ  ｉｎ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌｏｐａｔｈｙ  Ｉｔａｌｉａｎ  ｓｔｕｄｙ：ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｒｅｔｉｎｏｇｒａｍ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｆｔｅｒ  １  ｙｅａｒ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，１１５（２）：３２４−３３３．
【非特許文献９】Ｌａａｂｉｃｈ  Ａ，Ｖｉｓｓｖｅｓｖａｒａｎ  ＧＰ，Ｌｉｅｕ  ＫＬ，Ｍｕｒａｔａ  Ｋ，ＭｃＧｉｎｎ  ＴＥ，Ｍａｎｍｏｔｏ  ＣＣ，Ｓｉｎｃｌａｉｒ  ＪＲ，Ｋａｒｌｉｇａ  Ｉ，Ｌｅｕｎｇ  ＤＷ，Ｆａｗｚｉ  Ａ，Ｋｕｂｏｔａ  Ｒ．２００６．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｒｏｃｉｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｂｌｕｅ  ｌｉｇｈｔ−  ａｎｄ  ｗｈｉｔｅ  ｌｉｇｈｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｉｎ  ｂｏｖｉｎｅ  ａｎｄ  ｐｒｉｍａｔｅ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ，４７：３１５６−３１６３．
【非特許文献１０】Ｙａｍａｕｃｈｉ  Ｍ，Ｔｓｕｒｕｍａ  Ｋ，Ｉｍａｉ  Ｓ，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ  Ｔ，Ｕｍｉｇａｉ  Ｎ，Ｓｈｉｍａｚａｗａ  Ｍ，Ｈａｒａ  Ｈ．２０１１．Ｃｒｏｃｅｔｉｎ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｓｔｒｅｓｓ  ｖｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｓｐａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，６５０：１１０−１１９．
【非特許文献１１】Ｍａｃｃａｒｏｎｅ  Ｒ，Ｄｉ  Ｍａｒｃｏ  Ｓ，Ｂｉｓｌｉ  Ｓ．２００８．Ｓａｆｆｒｏｎ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｍａｉｎｔａｉｎｓ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｔｏ  ｄａｍａｇｉｎｇ  ｌｉｇｈｔ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｒｅｔｉｎａ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ，４９：１２５４−１２６１．
【非特許文献１２】Ｆａｌｓｉｎｉ  Ｂ，Ｐｉｃｃａｒｄｉ  Ｍ，Ｍｉｎｎｅｌｌａ  Ａ，Ｓａｖａｓｔａｎｏ  Ｃ，Ｃａｐｏｌｕｏｎｇｏ  Ｅ，Ｆａｄｄａ  Ａ，Ｂａｌｅｓｔｒａｔｔｉ  Ｅ，Ｍａｃｃａｒｏｎｅ  Ｒ，Ｂｉｓｔｉ  Ｓ．２０１０．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓａｆｆｒｏｎ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｆｌｉｃｋｅｒ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．ＩｎｖｅｓｔＯｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ，５１：６１１８−６１２４．
【非特許文献１３】Ｂｉｓｔｉ  Ｓ，Ｍａｃｃａｒｏｎｅ  Ｒ，Ｆａｌｓｉｎｉ  Ｂ．２０１４．Ｓａｆｆｒｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｔｉｎａ：ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏ−ｋｉｎｅｔｉｃｓ．Ｖｉｓｕａｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，１−７．ｄｏｉ：１０．１０１７／Ｓ０９５２５２３８１４０００１０８．
【非特許文献１４】Ｖｅｒｍａ  ＲＳ，Ｍｉｄｄｈａ  Ｄ．２０１０．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓａｆｆｒｏｎ（Ｃｒｏｃｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）ｓｔｉｇｍａ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｂｙ  ＬＣ−ＭＳ−ＭＳ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ，７１：１１７−１２３．
【非特許文献１５】Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｎｃｈｅｚ  Ｌ，Ｌａｘ  Ｐ，Ｅｓｑｕｉｖａ  Ｇ，Ｍａｒｔｉｎ−Ｎｉｅｔｏ  Ｊ，Ｐｉｎｉｌｌａ  Ｉ，Ｃｕｅｎｃａ  Ｎ．２０１２．Ｓａｆｒａｎａｌ，ａ  ｓａｆｆｒｏｎ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔ，ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｐ２３Ｈ  ｒａｔｓ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，７（８）：ｅ４３０７４．
【非特許文献１６】Ｔｓｕｒｕｍａ  Ｋ，Ｓｈｉｍａｚａｋｉ  Ｈ，Ｎａｋａｓｈｉｍａ  Ｋ，Ｙａｍａｕｃｈｉ  Ｍ，Ｓｕｇｉｔａｎｉ  Ｓ，Ｓｈｉｍａｚａｗａ  Ｍ，Ｉｉｎｕｍａ  Ｍ，Ｈａｒａ  Ｈ．２０１２．Ａｎｎａｔｔｏ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｓｔｒｅｓｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．ＭｏｌＮｕｔｒ  Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓ，５６：７１３−７２４．
【発明の概要】
【００２０】
発明者は、ノルビキシン、特にはその９’−シス型が、Ｎ−レチニル−Ｎ−レチニリデンエタノールアミン（Ａ２Ｅ）で前処理したＲＰＥ細胞の、青色放射線の照射で引き起こされる細胞死を強力に低減できることを発見した。
【００２１】
第１の態様において、本発明は、Ｂｉｘａ  Ｏｒｅｌｌａｎａ種子からの抽出物の精製で得られるノルビキシンを９０重量％を超えて含む、哺乳動物において網膜色素上皮（ＲＰＥ）の細胞の光保護に使用するための組成物をターゲットとする。
【００２２】
本発明において、「Ｂｉｘａ  Ｏｒｅｌｌａｎａ種子の抽出物」という表現は、種子の外部、すなわちＢｉｘａ  Ｏｒｅｌｌａｎａ種子を覆うロウ状物質から調製した抽出物を意味するものとする。このロウ状物質はビキシン及び他の重要でないカロテノイドが豊富であること、また食用色素としてのその使用で知られている。
【００２３】
経口投与後に哺乳動物において生体利用可能なノルビキシンはビキシンよりはるかに良好に吸収され、眼、特には網膜で見られる。
【００２４】
本発明の特定の実施形態において、組成物は９０重量％を超えるノルビキシンを含む。
【００２５】
本発明の特定の実施形態において、組成物は９５重量％を超えるノルビキシンを含む。
【００２６】
本発明の特定の実施形態において、組成物は９０重量％を超える式（Ｉ）：
【００２７】
【化１】
0006660401.tif 000002
【００２８】
の９’−シス型のノルビキシンを含む。
【００２９】
特定の実施形態において、組成物は、亜鉛、ビタミンＣ及びビタミンＥから選択される少なくとも１種の要素を含む。
【００３０】
特定の実施形態において、組成物は、栄養補助食品又は薬物の形態で使用できる。
【００３１】
「栄養補助食品」という語は、本発明の組成物を含有し、欧州指令２００２／４６／ＥＣが定めた定義に従って健康に有益な栄養素を供給することで食事を補う目的を有する製品を意味するものとする。例えば、栄養補助食品は飲み込むゲルカプセル若しくは錠剤又は食品に混ぜる粉末若しくは小さいバイアルになり得て、ＲＰＥ細胞に有益な効果を有する。
【００３２】
「薬物」という語は、欧州指令６５／６５／ＥＣが定めた定義に従って精確な用量のその化合物又は抽出物、すなわちヒト又は動物の疾患に対する治療又は予防特性を有すると示された任意の物質又は組成物を含有する製品を意味するものとする。例えば、治療量でその化合物を含有する薬物はゲルカプセル又は錠剤の形態で経口投与でき、あるいは硝子体内注射でき、あるいは網膜に有益な効果をもたらすことを可能にする他の経路で投与できる。
【００３３】
特定の実施形態において、組成物は、経口摂取、眼内注射、全身注射又は血中への注入が許容可能な担体を含む。
【００３４】
実施形態において、組成物は、哺乳動物に、１日あたり、０．４８ｍｇ／ｋｇ（体重）〜４８ｍｇ／ｋｇ（体重）、好ましくは０．６ｍｇ／ｋｇ（体重）〜２０ｍｇ／ｋｇ（体重）の量で投与される。
【００３５】
本発明の他の特定の実施形態において、組成物は、青色放射線への曝露により引き起こされ得る網膜への損傷を防止することを目的とする。「青色放射線」という語は、可視光スペクトルの青色バンドに対応し、４３５〜４９０ｎｍの波長を有する放射線を意味するものとする。
【００３６】
本発明の特定の実施形態において、組成物は、哺乳動物において加齢黄斑変性（ＡＲＭＤ）を治療するためのものである。
【００３７】
他の特定の実施形態において、組成物は、哺乳動物においてシュタルガルト病及び／又は網膜色素変性症を治療するためのものである。シュタルガルト病又はシュタルガルトシンドロームは遺伝性の病態であり、両眼の視力の低下と黄斑の萎縮とが組み合わさったものであり、乾燥型のＡＲＭＤの症状が若年で出る。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】照射後の、Ｎ−レチニル−Ｎ−レチニリデンエタノールアミン（Ａ２Ｅ）及びＢｉｘｉｌｉａ（登録商標）抽出物又はビキシン（２０μＭ）又はノルビキシン（２０μＭ）の存在下で生存しているＲＰＥ細胞の割合を示す。
【図２】Ａ２Ｅの存在下に置かれた照射後のＲＰＥ細胞に対するベニノキの種子の連続抽出物（Ｃ＝シクロヘキサン、Ｄ＝ジクロロメタン、Ｍ＝メタノール）の光保護活性を示す。
【図３ａ】Ｃ５７ＢＩ／６マウスにおけるビキシン（左）又はノルビキシン（右）の経口摂取後の血漿濃度を示す。
【図３ｂ】Ｃ５７ＢＩ／６マウスにおけるノルビキシンの薬物動態分析を示す。
【図４】腹腔内注射後のダブルＫＯマウス（ＡＢＣＡ４-/-、ＲＤＨ８-/-）の眼内にあるノルビキシンのＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を示す（１０ｍｇ／ｋｇ）。（３：注射したノルビキシン、１及び２：この化合物のモノグルクロニド）
【図５】正常なマウスと比較した、年齢の関数としてのダブルＫＯマウス（ＡＢＣＡ４-/-、ＲＤＨ８-/-）の眼におけるＡ２Ｅ蓄積の動態を示す。
【図６】片眼にノルビキシンを（硝子体における最終濃度が１３０μＭになるように）硝子体内注射し、２４時間にわたって暗所に置き、次に青色光線（４０００ルクス、１時間）に曝露したダブルＫＯマウス（ＡＢＣＡ４-/-、ＲＤＨ８-/-）の網膜電図（左はＡ波、右はＢ波）を示す。網膜電図検査は照射から７日後に行う。
【図７】図６のように処置を施したマウスの眼における視神経からの距離の関数としての視細胞核の層数を示す。
【図８Ａ】「ラット青色光線」モデルの作成の実験プロトコルを示す。
【図８Ｂ】ＰＢＮ（フェニル−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン、５０ｍｇ／ｋｇ、９‰ＮａＣｌ中２０ｍｇ／ｍｌの溶液）をポジティブコントロールとして使用した、ノルビキシン（１００ｍｇ／ｋｇ、ラット１頭あたり９‰ＮａＣｌ中５０ｍＭの溶液を４回注射、４ラット／系列）を注射したラットの網膜電図の結果を示す。網膜電図検査は処置から７日後に行う。
【図９Ａ】アルファ−フェニル−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン（ＰＢＮ）又はノルビキシンの腹腔内注射及び青色光線照射後の、ラットの眼における視神経からの距離の関数としての視細胞核の層数を示す。組織学的分析は処置から７日後に行う。
【図９Ｂ】図９Ａの各曲線下の面積を示す。
【図１０】ノルビキシンを補充した飼料を３ヶ月間にわたって経口摂取した又は経口摂取していないダブルＫＯマウス（ＡＢＣＡ４-/-、ＲＤＨ８-/-）の眼に蓄積されたＡ２Ｅの量を示す。
【図１１】０．３ｍｇ／ｇの純粋なノルビキシンを含有する飼料を３ヶ月間にわたって与えられた又は与えられていないダブルＫＯマウス（ＡＢＣＡ４-/-、ＲＤＨ８-/-）の網膜電図を示す。
【図１２】網膜電図の振幅（Ａ波）とダブルＫＯマウス（ＡＢＣＡ４-/-、ＲＤＨ８-/-）の眼に蓄積されたＡ２Ｅの量との関係を示す。
【図１３】Ｂｉｘａ  Ｏｒｅｌｌａｎａの抽出物から精製したノルビキシンの逆相ＨＰＬＣ分析の結果を示す（異性体はＳｃｏｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８及びＰｏｌａｒ−Ｃａｂｒｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０に準拠して同定した）。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
これまでに発表された研究の大半とは異なり、本発明で使用したモデル（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方）はＮ−レチニル−Ｎ−レチニリデンエタノールアミン（Ａ２Ｅ）及びその光毒性の役割をクローズアップしており、その点でヒトの病態により近い。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで用いた試験は、ヒトＲＰＥ細胞株に対して他の天然物質で用いたものとその原理において類似している（ＡＲＰＥ−１９細胞−Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。
【００４０】
プロトコル及び結果
１：ビキシン及びノルビキシンの調製
９５重量％純粋なビキシンを、ベニノキの種子の有機抽出物由来で８５重量％より高いビキシン濃度の市販品（Ａｎｎａｔｔｏ  Ｂ）から調製する。精製は、連続的な再結晶化により行う。
【００４１】
９５重量％純粋なノルビキシンが、精製したビキシンのアルカリ加水分解後に得られる（５％ＫＯＨ、６０℃、３時間）。得られた溶液を濃塩酸で酸性化し、ノルビキシンを遠心分離により回収する。ペレットを２回、水で洗浄することにより塩を除去し、最終的なペレットを凍結乾燥させる。
【００４２】
化合物の純度を紫外可視分光測光法及び逆相ＨＰＬＣにより評価する。化合物は主に９’−シス異性体を含有する（濃度は９０重量％を超える、図１３）。
【００４３】
２：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験を、Ａ２Ｅの存在下に置かれたＲＰＥ細胞に対する様々な天然物質の光保護効果を研究するために行った。分子の光保護効果を、Ａ２Ｅでの処理、それに続く青色光線の照射により惹起される光毒性の細胞モデルで評価する。「青色放射線」という語は、可視光スペクトルの青色バンドに対応する、すなわち４３５〜４９０ｎｍの波長を有する放射線を意味するものとする。
【００４４】
このモデルは、成体のブタＲＰＥの一次培養物を使用する。細胞の生存を、細胞生存度試験により定量化する。−４８時間で試験対象の化合物（ＤＭＳＯ中の５ｍＭ溶液）を添加して最終濃度を１〜２０μＭにし、次に−１９時間でＡ２Ｅを添加し（最終濃度３０μＭ）、細胞に照射を行う（０時間）。２４時間後、細胞の生存率を測定する。画像の収集及びその処理を、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア及び専用の定量化プログラムで制御した蛍光顕微鏡により行う。実験を９６ウェルマイクロプレートで４重で行い、実験を最低４回繰り返す。結果を、試験対象の分子で処理したウェル内の生細胞の数をコントロールウェル（Ａ２Ｅなしの希釈培地で処理）内の生細胞の数で割った比の形態で表す。
【００４５】
これまで、この試験は、ベニノキの種子のエタノール抽出物の極めて良好な光保護活性の実証を可能にした（Ｂｉｘｉｌｉａ（登録商標）、Ｆｏｎｔａｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１を参照のこと）。過去の研究において、ベニノキの抽出物の活性は実証されていたものの光保護物質の性質は不明なままであり、この抽出物の主要成分（ビキシン）は濃度０．１μＭ、１μＭ及び１０μＭで効果がないとされていた。したがって、活性化合物を同定するために追加の研究を行った。
【００４６】
ａ．ビキシンはＢｉｘｉｌｉａ（登録商標）の光保護活性の大部分を担う
図１は、ビキシン及びノルビキシン（２０μＭ）が、Ａ２Ｅを使用したコントロールと比較して、Ａ２Ｅの存在下で惹起された光毒性からＲＰＥ細胞を効果的に保護することを示す。ベニノキの種子の粗抽出物（ビキシン２０μＭになるまで希釈）は高い光保護活性を有する。極めて純粋な濃度２０μＭのビキシンの使用により、この成分が実際に際立った光保護活性を有すること（図１）、またビキシンと同じ量になるように希釈したＢｉｘｉｌｉａ（登録商標）抽出物の活性のかなりの部分の説明になることを示すことができた。匹敵する活性はノルビキシンでも見られ、ノルビキシンはビキシンの主要循環代謝物である（Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。これらの結果は、同じ化合物の、ヒトの皮膚の光保護について過去に実証された光保護活性と一致している（Ｖｅｉｌｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【００４７】
ｂ：Ｂｉｘｉｌｉａ（登録商標）は他の光保護化合物を含有する
Ｂｉｘｉｌｉａ（登録商標）はフェノール性の他の光保護化合物を含有し、その存在が、ビキシン単体より粗抽出物のほうが活性が高い理由であると考えられる（ある同一ビキシン濃度に関して）。ベニノキの種子の殻の連続抽出を連続的にシクロヘキサン、ジクロロメタン及びメタノール（各１Ｌ／種子１００ｇ）で行った。シクロヘキサンでの抽出後、ビキシン濃度０．６５μＭの画分が得られる。ジクロロメタンでの抽出後、ビキシン濃度１４８５μＭを有する画分が得られ、メタノールでの抽出後、ビキシン濃度４５μＭを有する画分が得られる。次に前回のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験を繰り返す。図２では、９７％のビキシンを含有するジクロロメタン画分は活性が高かったが、フェノール化合物が豊富なメタノール抽出物は極めて高い活性を有することも注目される（Ｃ＝シクロヘキサン、Ｄ＝ジクロロメタン、Ｍ＝メタノール）。
【００４８】
３：ビキシン及びノルビキシンの生体利用能
ビキシン及びノルビキシンの生体利用能についての研究をＣ５７ＢＩ／６マウスで行った。化合物を経口で投与した（５０ｍｇ／ｋｇ）。血液サンプルを０．２５、０．５、１、３、６、８及び２４時間後に採取し、ＨＰＬＣ−ＤＡＤ（ＵＶ４６０ｎｍ）−ＭＳ／ＭＳで分析した。表１及び図３ａは、経口摂取されたビキシンが速やかにノルビキシンに変換され、これら２種の化合物が類似の濃度で循環することを開示している。これらの化合物は８時間後には検出されない。さらに、経口摂取されたノルビキシンの生体利用能はビキシンよりはるかに高いことも注目される。
【００４９】
【表１】
0006660401.tif 000003
【００５０】
腹腔内注射（５ｍｇ／ｋｇ）及び経口投与（５０ｍｇ／ｋｇ）後の血漿分析結果を比較したところ（図３ｂ）、ノルビキシンの生体利用能は５５％であると判明した。
【００５１】
眼におけるノルビキシンの存在を、ノルビキシン（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射から３時間後にダブルＫＯマウス（ＡＢＣＡ４-/-、ＲＤＨ８-/-）で調査した。６頭のマウスの眼を解剖し、サンプルをアセトニトリルで抽出し、プールし、次にＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析したところ（図４）、ＲＰＥ及び網膜中のノルビキシンの存在を明確に検出することができた（表２）。
【００５２】
【表２】
0006660401.tif 000004
【００５３】
図４においては、血漿中、ただし眼においても、ノルビキシンがコンジュゲート形態でも存在することが注目される。実際、最初の化合物から２つのモノグルクロニドが生じ、これらは最初の化合物の前に溶出し、同様のフラグメンテーションを示すが、これが質量分析計のソースにおけるグルクロニドの分解によるものであることは間違いない。グルクロニド化もクロセチンのケースで説明されている（Ａｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。
【００５４】
ノルビキシンのシス−トランス異性化（その度合いは実験の継続時間によって異なる）も観察できる。それは（ポリ）不飽和化合物における通常の現象であり、１つ以上の二重結合のシス−トランス異性化に対応し、ノルビキシンのケースが、Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）によりヒトで観察されている。ここで使用する化合物は市販の化合物（Ａｎｎａｔｔｏ  Ｂ）から精製され、極めて優勢である９−シス型並びに極めて少量のオールトランス型及び他のシス又はジ−シス型を含有する（図１３）。
【００５５】
４：マウスにおける硝子体内注射による光保護活性
Ｍａｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）が開発した遺伝子改変マウスモデルを用いてノルビキシンの光保護活性を試験した。このマウスモデルにおいては、視物質サイクルに関わる２つの遺伝子（ＡＢＣＡ４及びＲＤＨ８）を失活させており、これが眼におけるＡ２Ｅの早期蓄積をもたらす（図５）。結果的に、この動物モデルは、齧歯類と霊長類との眼の構造における違いとの関係で当然限界はあるものの、ヒトの病態に類似している。
【００５６】
したがって、７週齢のマウスの片眼にノルビキシンを硝子体内注射した（硝子体における最終濃度が１３０μＭになるように）。暗所に２４時間置いてから、マウスを青色光線への曝露に供した（４０００ルクス、１時間）。７日後に行った網膜電図検査はノルビキシンの保護効果を示し、ノルビキシンの存在は、図６に示すように、顕著な電気的活性を維持することを可能にした。
【００５７】
外核層の厚さの組織学的分析は、視細胞に対するノルビキシンの保護効果を実証している（図７）。ノルビキシンは事実上、硝子体内注射から２４時間後には排除されているため、照射時、眼内には極めて低レベルでしか存在していないことに注目すべきである。
【００５８】
５：ラットにおける全身（腹腔内）注射による光保護活性
「ラット青色光線」モデルは、ラットを６時間にわたって強力な青色光線に曝露することで眼に損傷を引き起こし、その損傷を網膜電図検査及び組織学的分析を行うことで７日後に評価することから成る。抗酸化化合物であるＰＢＮ（フェニル−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン）をポジティブコントロールとして使用する（Ｒａｎｃｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｔｏｍｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。光保護活性を測定しようとする化合物を、照射フェーズ前及びその最中に注射する（腹腔内）。この照射フェーズは、Ｐｈｉｌｉｐｓブルーネオン管（４．２ｍＷ／ｃｍ2）を使用して６時間にわたって行われる。実験プロトコルを図８Ａに示す。
【００５９】
３系列の実験をノルビキシン（１００ｍｇ／ｋｇ、ラット１頭あたり９‰ＮａＣｌ中５０ｍＭの溶液を４回注射、４ラット／系列）について、ＰＢＮ（フェニル−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン、５０ｍｇ／ｋｇ、９‰ＮａＣｌ中２０ｍｇ／ｍｌの溶液）をポジティブコントロールとして使用して行った。網膜電図の分析結果（Ａ波及びＢ波）を図８Ｂに示す。
【００６０】
この試験はノルビキシンの効力が極めて高く、ＰＢＮのそれに近いことの実証を可能にした。対応する組織学的データ（図９Ａ及び９Ｂ）は、視細胞の生存に対するノルビキシンの光保護作用を裏付けている。
【００６１】
６：マウスにおける慢性的な経口投与による光保護活性
０．３ｍｇ／ｇの純粋なノルビキシンを含有する飼料を用意し、ダブルＫＯマウス（ＡＢＣＡ４-/-、ＲＤＨ８-/-）に３ヶ月間にわたって与えた。
【００６２】
ノルビキシンを補充した飼料を与えられたマウスでは眼におけるＡ２Ｅの蓄積に低下が見られる（図１０）。２つのグループ間の差は極めて有意である（ｐ＝０．０１０９）。
【００６３】
ノルビキシンを補充した飼料は、網膜電図（ＥＲＧ）の振幅に対するポジティブな効果も有する（図１１）。
【００６４】
これらの分析結果は、眼内に蓄積されるＡ２Ｅの量とＥＲＧの振幅との間には逆の相関関係があることも示し（図１２）、Ａ２Ｅの蓄積の病態の発生における役割（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）と、投与により眼内でのＡ２Ｅの蓄積が減少するという分子の利点を裏付けている。
【００６５】
しかしながら、この慢性的な処置の間、眼内でノルビキシンの顕著な蓄積は観察されておらず、これは、キサントフィルとは異なり、この分子が分解されると考えられるという結論につながる。この活性物質が蓄積されないことは利点と見なすことができる。一部のカロテノイド（例えば、カンタキサンチン）の蓄積はＲＰＥ細胞内で沈着物の発生を引き起こす可能性があるからである（Ｇｏｒａｌｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。それは、ルテイン及びゼアキサンチンで仮定できるようなフィルタ又は抗酸化物質の役割というより、ＲＰＥ細胞の活性を変化させる作用の兆候でもある。この結果は、硝子体内注射中に認められたものと一致している（すなわち、照射時のノルビキシンの消失）。
【００６６】
マウスにおいて経口投与後に網膜の変性を著しく鈍化させることを可能にする１日の摂取量は４８ｍｇ／ｋｇ（体重）である。ヒトに置き換えた場合、毎日４．８ｍｇ／ｋｇの積極的な摂取が提案される。さらに、ノルビキシンの１日摂取許容量（ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ  ｄａｉｌｙ  ｉｎｔａｋｅ）すなわちＡＤＩは最高で０．６ｍｇ／ｋｇ／日（体重）（ＪＥＣＦＡ／６７／ＦＣ）であることが知られている。この値は、６９ｍｇ／ｋｇ／日（体重）であるラットにおける無毒性量（ｎｏ  ｏｂｓｅｒｖａｂｌｅ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｌｅｖｅｌ）すなわちＮＯＡＥＬの摂取量に基づいて定められており、２０ｍｇ／ｋｇ／日まで毒性は観察されなかったことから、ヒトにおける１１ｍｇ／ｋｇの無毒性量の１日摂取量に等しい（Ｈａｇｉｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。提案される投与レジメンは０．４８ｍｇ／ｋｇ／日〜４８ｍｇ／ｋｇ／日であり、理想的には０．６ｍｇ／ｋｇ／日〜２０ｍｇ／ｋｇ／日である。
【参考文献】
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Ｇｏｒａｌｃｚｙｋ  Ｒ，Ｂｕｓｅｒ  Ｓ，Ｂａｕｓｃｈ  Ｊ，Ｂｅｅ  Ｗ，Ｚｕｈｌｋｅ  Ｕ，Ｂａｒｋｅｒ  ＦＭ．１９９７．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｂｉｒｅｆｒｉｎｇｅｎｔ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ  ａｆｔｅｒ  ｈｉｇｈ  ｄｏｓｅｓ  ｏｆ  ｃａｎｔｈａｘａｎｔｈｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ，３８：７４１−７５２．
Ｈａｇｉｗａｒａ  Ａ，Ｉｍａｉ  Ｎ，Ｉｃｈｉｈａｒａ  Ｔ，Ｓａｎｏ  Ｍ，Ｔａｍａｎｏ  Ｓ，Ａｏｋｉ  Ｈ，Ｙａｓｕｈａｒａ  Ｋ，Ｋｏｄａ  Ｔ，Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｍ，Ｓｈｉｒａｉ  Ｔ．２００３．Ａ  ｔｈｉｒｔｅｅｎ−ｗｅｅｋ  ｏｒａｌ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ａｎｎａｔｔｏ  ｅｘｔｒａｃｔ（ｎｏｒｂｉｘｉｎ），ａ  ｎａｔｕｒａｌ  ｆｏｏｄ  ｃｏｌｏｒ  ｅｘｔｒａｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｓｅｅｄ  ｏｆ  ａｎｎａｔｔｏ（Ｂｉｘａｏｒｅｌｌａｎａ  Ｌ．），ｉｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ  ｒａｔｓ．Ｆｏｏｄ  ＣｈｅｍＴｏｘｉｃｏｌ，４１：１１５７−１１６４．
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Ｗｕ  Ｌ，Ｕｅｄａ  Ｋ，Ｎａｇａｓａｋｉ  Ｔ，Ｓｐａｒｒｏｗ  ＪＴ．２０１４．Ｌｉｇｈｔ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎ  Ａｂｃａ４  ａｎｄ  Ｒｐｅ６５rd12  ｍｉｃｅ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ，５５：１９１０−１９１８．
Ｙａｍａｕｃｈｉ  Ｍ，Ｔｓｕｒｕｍａ  Ｋ，Ｉｍａｉ  Ｓ，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ  Ｔ，Ｕｍｉｇａｉ  Ｎ，Ｓｈｉｍａｚａｗａ  Ｍ，Ｈａｒａ  Ｈ．２０１１．Ｃｒｏｃｅｔｉｎ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｓｔｒｅｓｓ  ｖｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｓｐａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，６５０：１１０−１１９．
Ｙｏｕｎｇ  ＪＰ，Ｚｈｏｕ  Ｊ，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ  Ｋ，Ｓｐａｒｒｏｗ  ＪＮ．２００５．Ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｓ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ａｇａｉｎｓｔ  Ａ２Ｅ  ｐｈｏｔｏｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｐｉｇｍｅｎｔ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．ＰｈｏｔｏｃｈｅｍＰｈｏｔｏｂｉｏｌ，８１：５２９−５３６．
【図１】
0006660401.tif 000006
【図２】
0006660401.tif 000007
【図３ａ】
0006660401.tif 000008
【図３ｂ】
0006660401.tif 000009
【図４】
0006660401.tif 000010
【図５】
0006660401.tif 000011
【図６】
0006660401.tif 000012
【図７】
0006660401.tif 000013
【図８Ａ】
0006660401.tif 000014
【図８Ｂ】
0006660401.tif 000015
【図９Ａ】
0006660401.tif 000016
【図９Ｂ】
0006660401.tif 000017
【図１０】
0006660401.tif 000018
【図１１】
0006660401.tif 000019
【図１２】
0006660401.tif 000020
【図１３】
0006660401.tif 000021