(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
関節の軟骨欠損を治療する薬物を製造するための医薬組成物の使用であって、当該医薬組成物は３次元ヒドロゲル担体、幹細胞、ヒアルロン酸及びスタチン系化合物を含有し、当該幹細胞、ヒアルロン酸及びスタチン系化合物は当該３次元ヒドロゲル担体によって被覆され、当該医薬組成物は軟骨を形成するために、幹細胞の骨細胞ではなく軟骨細胞への分化を促進して関節の軟骨欠損を治療する、使用。
【請求項２】
当該３次元ヒドロゲル担体はフィブリンによって形成される請求項１に記載の使用。
【請求項３】
当該幹細胞はヒト脂肪幹細胞である請求項１に記載の使用。
【請求項４】
当該スタチン系化合物はシンバスタチンである請求項１に記載の使用。
【請求項５】
シンバスタチンはマイクロスフェア剤形をなす請求項４に記載の使用。
【請求項６】
当該医薬組成物が、オステオカルシンの発現を抑えることで当該軟骨細胞の硬骨化を阻害する請求項１に記載の使用。
【請求項７】
当該幹細胞の当該軟骨細胞への分化促進は、骨形成蛋白質−２の発現増加に起因する請求項１に記載の使用。
【請求項８】
当該幹細胞の当該軟骨細胞への分化促進は、硫酸化グリコサミノグリカンの生成増加に起因する請求項１に記載の使用。
【請求項９】
当該幹細胞の当該軟骨細胞への分化促進は、軟骨分化遺伝子の発現促進に起因し、当該軟骨分化遺伝子は、Ｓｏｘ−９、アグリカン又はＩＩ型コラーゲンを含む請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
前記医薬組成物において、当該ヒアルロン酸の重量パーセント濃度は１％である請求項１に記載の使用。
【請求項１１】
前記医薬組成物において、当該シンバスタチンの濃度は１μＭである請求項４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、軟骨細胞の生成促進薬物を製造するための医薬組成物の用途に関し、特に、ヒアルロン酸及びシンバスタチンを含有する医薬組成物を用いた軟骨細胞の生成促進に関する。
【背景技術】
【０００２】
軟骨組織とは、血管、リンパ系及び神経を有さない結合組織であり、主なものとして硝子軟骨（Ｈｙａｌｉｎｅ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ）がある。硝子軟骨は、主として軟骨細胞、ＩＩ型コラーゲン（ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ）、プロテオグリカン（ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）からなる。軟骨組織は一度損傷すると、近傍の軟骨細胞の数が非常に限られることから損傷を十分に修復できない。更には、細胞外基質により取り囲まれているため、損傷部位への移動が困難との問題もある。現在知られているように、軟骨の自己修復によって生成される新組織の大部分は線維軟骨（ｆｉｂｒｏｃａｒｔｉｌａｇｅ）組織であり、主としてＩ型コラーゲン（ｔｙｐｅ  Ｉ  ｃｏｌｌａｇｅｎ）からなる。しかし、線維軟骨組織には軟骨が備えるべきバイオメカニクス特性が欠如しており、硝子軟骨の機能も備わっていない。そのため徐々に分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）されてゆき、関節を損傷前の正常な運動状態に回復させることは難しい。そこで、近年では組織工学による軟骨組織の修復が急速に成長している。これは、軟骨細胞又は間葉系幹細胞を用いて活性・機能を備えた関節軟骨組織を作製する方式であり、現在のところ、潜在力のある方式として間葉系幹細胞を細胞ソースとして用いる方式が認知されている。一方で、間葉系幹細胞は軟骨細胞への分化機能を有してはいるが、関節軟骨組織の修復に応用する場合には、誘導因子を用いて間葉系幹細胞の軟骨分化を誘導する必要がある。ところが、蛋白質系の誘導因子を用いる場合には、費用の高さや蛋白質変性、病原体の進入といった問題が存在する。また、化学系の誘導因子を用いる場合にはその他の副作用を伴う恐れがある。ここで、骨形成蛋白質−２（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−２，ＢＭＰ−２）は、幹細胞の軟骨化や骨芽細胞の骨化を誘導することが以前より報告されており、関節軟骨や骨の組織工学に応用可能である。ただし、ＢＭＰ−２の発現を誘導して関節軟骨を修復する場合には硬骨化の懸念があり、幹細胞でＢＭＰ−２を大量に発現させて軟骨欠損を治療した過去の研究では、軟骨欠損箇所の修復は可能であったものの、修復箇所に骨棘が発生するとの課題が見つかっている（非特許文献１）。しかし、幹細胞でＢＭＰ−２を大量に発現させて軟骨欠損箇所を修復しつつ、ＢＭＰ−２による骨化を回避する方法についてはいまだ未解決のままである。
【０００３】
シンバスタチン（ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）を含むスタチン（Ｓｔａｔｉｎ）系臨床薬物は、臨床的には主としてコレステロールの低下に応用されているが、軟骨細胞におけるＢＭＰ−２の発現や、軟骨分化遺伝子（Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ＆  Ａｇｇｒｅｃａｎ）及び軟骨細胞外基質の合成を誘導することも可能である。ところが、スタチン系薬物は骨芽細胞でＢＭＰ−２の発現を誘導し、骨化により骨折を修復することも可能である。そのため、スタチン系薬物を用いればＢＭＰ−２の発現を誘導することで軟骨を修復可能ではあるが、幹細胞でＢＭＰ−２を大量に発現させて軟骨欠損箇所を修復しつつ、ＢＭＰ−２による骨化を回避する方法についてはいまだ未解決のままとなっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．Ａｒｔｉｃｕｌａｒ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｒｅｐａｉｒ  ｂｙ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｕｓｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌｓ．２００３Ｆｅｂ；４８（２）：４３０−４１．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ヒアルロン酸を含有する微小環境にシンバスタチン（ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）を組み合わせて脂肪幹細胞を処理すれば、脂肪幹細胞における骨形成蛋白質−２（ＢＭＰ−２）、軟骨分化遺伝子（Ｓｏｘ−９，アグリカン（Ａｇｇｒｅｃａｎ）及びＩＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ  ＩＩ）、関節軟骨の細胞外基質（ｓＧＡＧ）の合成が強化されるほか、シンバスタチンにより誘発されるオステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）の発現が低減し、細胞の硬骨化が減少するため、軟骨欠損の修復に応用可能となることを実験により証明する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明では、シンバスタチンにヒアルロン酸を組み合わせると、幹細胞の軟骨化を誘導する効果があることが見出された。更に、フィブリンで３次元のヒドロゲル担体を作製してヒアルロン酸及び幹細胞を被覆し、シンバスタチン含有マイクロスフェア（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）を当該担体に加えると、ＢＭＰ−２の発現がより効果的に促進される結果、軟骨分化遺伝子の発現量が増加するとともに、脂肪幹細胞における硫酸化グリコサミノグリカン（主な関節軟骨の細胞外基質）の含有量が増加することが見出された。また、ミニブタの軟骨欠損を用いた動物モデルにおいても、当該組み合わせ（脂肪幹細胞とシンバスタチン及びヒアルロン酸の組み合わせ）に関節軟骨欠損を修復する効果があること見出された。
【０００７】
本稿において、「一の」或いは「一種の」との用語は本発明の構成要素や成分を述べるために用いられるが、これらの用語は記載の便宜上及び本発明の基本概念を提示するためのものにすぎない。こうした記載は、一種又は少なくとも一種を含み、別途指定がない限り、単数で示す場合にも複数を含み得ると解釈すべきである。
【０００８】
本発明は、ヒアルロン酸混合物及びスタチン系薬物を含有する医薬組成物、試薬キット及び治療方法を提供する。
【０００９】
本発明は、軟骨細胞の生成促進薬物を製造するための医薬組成物の用途を提供し、当該医薬組成物は、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ，ＨＡ）混合物及びスタチン（ｓｔａｔｉｎ）系化合物を含有する。
【００１０】
本稿でいうところの「軟骨細胞の生成を促進する」とは、細胞の合成、代謝、発現又は軟骨の分化に関係する因子又はホルモンの分泌を促進し、細胞に軟骨細胞を形成させることを指すが、これらに限らない。
【００１１】
具体的実施例において、当該ヒアルロン酸混合物は、ヒアルロン酸、フィブリン及び幹細胞を含む。好ましい具体的実施例において、当該フィブリンはヒドロゲルを形成する。当該フィブリンは３次元ヒドロゲルの足場構造を形成する。即ち、３次元のフィブリンヒドロゲル（３Ｄ  ｆｉｂｒｉｎ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ）を担体として形成し、当該ヒアルロン酸及び当該幹細胞を被覆する。
【００１２】
本稿でいうところの「ヒドロゲル（Ｈｙｄｒｏｇｅｌ）」とは水を分散媒とするゲルであり、網目状の架橋構造を有する水溶性高分子に一部の疎水基及び親水残基を取り込み、親水残基が水分子と結合して水分子を網目内に結合する一方、疎水残基が水に出会うことで膨張する架橋ポリマーとして構成されている。そのため、あらゆる水溶性或いは親水性の高分子が、一定の化学的架橋又は物理的架橋を経ることでヒドロゲルを形成可能である。ヒドロゲルは、物理ゲルと化学ゲルに分けられる。（１）物理ゲルとは、静電的相互作用、水素結合、鎖の絡み合いといった物理的作用によって形成される。この種のゲルには恒久性がなく、加熱されると溶液に変化することから、疑似ゲル又は熱可逆性ゲルとも称される。多くの天然高分子は、ｋ２型カラギーナンや寒天のように常温下で安定的なゲル状態を示す。合成ポリマーのうち典型的な例としてはポリビニルアルコール（ＰＶＡ）があり、凍結溶解処理を経ることで、６０℃以下で安定的なヒドロゲルを得ることができる。（２）化学ゲルとは化学結合により形成される３次元ネットワークポリマーであり、その恒久性から真性ゲルと称される。ヒドロゲルは大きさや形状の違いによってマクロゲルとミクロゲル（マイクロスフェア）に分けられるほか、マクロゲルは形状の違いによって、柱状、多孔海綿状、繊維状、膜状、球状等に分けられる。また、現在製造されているマイクロスフェアはミクロレベルとナノレベルに分けられる。
【００１３】
本稿でいうところの「幹細胞」とは、細胞の自己複製（ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ）能力及び増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）能力を有し、長期的に未分化（ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）の状態を維持可能な細胞のことをいう。「幹細胞」は、適切な誘導刺激を受けた場合に異なる系統の細胞群及び特定の機能組織に分化可能な分化多能性（ｍｕｌｔｉ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｔｉｏｎ）を有する。また、「ヒト間葉系幹細胞」とは、ヒトの間質組織から取得されるあらゆる細胞であり、無限の自己複製能力を有して様々な細胞又は組織形態に分化可能である。例えば、「ヒト間葉系幹細胞」とは、脂肪間葉系幹細胞、骨髄間葉系幹細胞又は臍帯間葉系幹細胞、臍帯血間葉系幹細胞、骨膜間葉系幹細胞、滑膜間葉系幹細胞及び筋肉間葉系幹細胞からなる群のうちの一つであるが、これらに限らない。本発明の実施例では、ヒト脂肪間葉系幹細胞（又はヒト脂肪幹細胞（ｈｕｍａｎ  ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，ｈＡＤＳＣｓ））を例示して説明するが、本発明は以下の実施例に限らない。具体的実施例において、当該幹細胞は、ヒトの皮膚繊維芽細胞（ｈｕｍａｎ  ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）又は脂肪幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）を含む。好ましい具体的実施例において、当該幹細胞はヒト脂肪幹細胞（ｈＡＤＳＣｓ）である。
【００１４】
具体的実施例において、当該ヒアルロン酸の重量パーセント濃度は０．１〜１０％の範囲である。好ましい具体的実施例において、当該ヒアルロン酸の重量パーセント濃度は０．５〜５％の範囲である。より好ましい具体的実施例において、当該ヒアルロン酸の重量パーセント濃度は１％である。
【００１５】
本稿の「スタチン（ｓｔａｔｉｎ）系化合物」は、アトルバスタチン（ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ）、セリバスタチン（ｃｅｒｉｖａｓｔａｔｉｎ）、フルバスタチン（ｆｌｕｖａｓｔａｔｉｎ）、ロバスタチン（ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）、メバスタチン（ｍｅｖａｓｔａｔｉｎ）、ピタバスタチン（ｐｉｔａｖａｓｔａｔｉｎ）、プラバスタチン（ｐｒａｖａｓｔａｔｉｎ）、ロスバスタチン（ｒｏｓｕｖａｓｔａｔｉｎ）又はシンバスタチン（ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）を含むがこれらに限らない。好ましい具体的実施例において、当該スタチン系化合物はシンバスタチン（ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）である。また、当該シンバスタチン（ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）の構造式は式（Ｉ）である。
【００１６】
【化１】
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【００１７】
具体的実施例において、当該シンバスタチンの濃度は０．１〜１０μＭの範囲である。好ましい具体的実施例において、当該シンバスタチンの濃度は０．５〜５μＭの範囲である。更に好ましい具体的実施例において、当該シンバスタチンの濃度は１μＭである。他の具体的実施例において、当該シンバスタチンはマイクロスフェア（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）剤形をなす。マイクロスフェア剤形によれば、シンバスタチンの濃度放出を効果的に制御可能となる。
【００１８】
このように、本発明の医薬組成物は、ヒアルロン酸及び幹細胞を有するフィブリンヒドロゲルと、シンバスタチン含有マイクロスフェアとを含む構成を個体に投与することで、軟骨の生成又は軟骨欠損の修復を促進可能である。また、当該シンバスタチン含有マイクロスフェアは、当該ヒアルロン酸及び幹細胞を有するフィブリンヒドロゲルにそのまま加えられ、一括して当該個体に投与することが可能である。
【００１９】
ここでいう「軟骨欠損」には、関節軟骨の変性や遺伝子の突然変異、或いは外部からの損傷により関節軟骨が欠損／摩耗する疾病が含まれるが、これらに限らない。関節軟骨は、骨の関節面、肋軟骨、気管、耳介、椎間板等に広く存在している。
【００２０】
現在のところ、様々な因子やトリガによって軟骨細胞の合成や代謝を刺激可能なことが知られている。例えば、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）は滑液中の主な合成・代謝成長因子であり、プロテオグリカンとコラーゲンの合成を刺激する。このほか、骨形成蛋白質（ＢＭＰ）ファミリーに属するもの（特に、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６及びＢＭＰ−７）や、ヒトのトランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）ファミリーに属するものも軟骨細胞の合成・代謝刺激を誘導可能である（Ｃｈｕｂｉｎｓｋａｙａ  ＆  Ｋｕｅｔｔｎｅｒ，２００３）。また、近年では、軟骨細胞の合成・代謝刺激を誘導する化合物が識別されている（米国特許第６，５００，８５４号、欧州特許第１３９１２１１号）。そのため、好ましい具体的実施例において、本発明の当該軟骨細胞の生成促進効果については、軟骨細胞の合成・代謝を刺激する関連因子又はホルモンを増加或いは強化し、細胞又は幹細胞の軟骨化を誘発することで得られる。更に具体的な実施例において、当該軟骨細胞の生成促進は、骨形成蛋白質−２（ＢＭＰ−２）の発現増加によりなされる。
【００２１】
このほか、関節軟骨における２種類の主な細胞外基質の構成成分として、プロテオグリカン（ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）とＩＩ型コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩ、Ｃｏｌ  ＩＩ）がある。グリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ，ＧＡＧ）はプロテオグリカンの糖鎖部分であり、構造的特徴として、硫酸化二糖繰り返し単位を備える。ＩＩ型コラーゲンとプロテオグリカンは、足場を形成することで軟骨に安定性と弾性強度を付与する。細胞外基質（ＥＣＭ）は組織の構造的足場となるだけでなく、細胞の情報伝達メカニズムにより軟骨細胞の調整も行う。こうした複雑な相互作用がｍＲＮＡや蛋白質の発現面で軟骨細胞の遺伝子発現に影響し、細胞の内部状態を変化させる。また、細胞外基質の分解は軟骨の病理状態に関係するのが一般的である。この場合、ＩＩ型コラーゲンの発現量が減少するとともに、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の活性が増強する。このほか、ＴＧＦ−β１及びＩＧＦ−１等の成長因子が関節軟骨細胞における細胞外基質の分泌と維持に関係している。そのため、好ましい具体的実施例において、本発明の当該軟骨細胞の生成促進効果については、細胞外基質の生成、発現及び細胞外基質の維持／合成を刺激する関連因子の発現を強化し、細胞又は幹細胞の軟骨化を誘発して軟骨を形成することで得られる。より好ましい具体的実施例において、当該軟骨細胞の生成促進は、硫酸化グリコサミノグリカン（ｓＧＡＧ）の生成増加によりなされる。
【００２２】
軟骨分化遺伝子は細胞の軟骨化を誘発可能である。一般的に、軟骨分化遺伝子は、Ｓｏｘ−９、アグリカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）又はＩＩ型コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩ）を含むがこれらに限らない。具体的実施例において、当該軟骨細胞の生成促進は軟骨分化遺伝子の発現によりなされ、当該軟骨分化遺伝子は、Ｓｏｘ−９、アグリカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）又はＩＩ型コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩ）を含む。
【００２３】
本稿でいうところの「発現」とは、遺伝子、ＲＮＡ又は蛋白質の発現を含むがこれらに限らない。
【００２４】
また、軟骨細胞の合成・代謝を刺激可能なほとんどの化合物には深刻な副作用がある。例えば、ＢＭＰ−２が過度に発現すると骨棘が生成され、硬骨化現象が発生してしまう。そのため、現在のところ、これらの副作用を伴うことなく軟骨細胞の分化を刺激可能な化合物は存在しない。また、一部の骨形成因子や硬骨化誘導因子にはオステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）（ただしこれに限らない）が含まれている。そこで、本発明では、軟骨の生成に関係する各種因子を強化することで軟骨細胞の生成を促進するだけでなく、軟骨形成の過程で発生する硬骨化現象を回避可能とした。具体的実施例において、更に、当該医薬組成物は生成される軟骨細胞の硬骨化を抑制する。好ましい具体的実施例において、当該生成される軟骨細胞の硬骨化抑制は、オステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）の発現を抑えることでなされる。
【００２５】
更に、本発明は、治療有効量の医薬組成物を個体の軟骨欠損部位に投与する軟骨欠損の治療方法を提供する。当該医薬組成物は、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ，ＨＡ）混合物及びスタチン（ｓｔａｔｉｎ）系化合物を含有する。具体的実施例において、当該ヒアルロン酸混合物は、ヒアルロン酸、フィブリン及び幹細胞を含む。好ましい具体的実施例において、当該フィブリンはヒドロゲルを形成する。当該フィブリンは３次元ヒドロゲルの足場構造を形成する。即ち、３次元のフィブリンヒドロゲル（３Ｄ  ｆｉｂｒｉｎ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ）を担体として形成し、当該ヒアルロン酸及び当該幹細胞を被覆する。
【００２６】
他の具体的実施例において、当該スタチン（ｓｔａｔｉｎ）系化合物はシンバスタチンである。本発明におけるシンバスタチンのようなスタチン（ｓｔａｔｉｎ）系化合物は、例えば凝集技術や界面重合により作製されるマイクロカプセル（例えば、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル、及びポリメタクリル酸メチルマイクロカプセル）や、コロイド状ドラッグデリバリーシステム（例えば、リポソーム、マイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子又はナノカプセル）、又はマクロエマルション中に埋包可能である。好ましい具体的実施例において、当該シンバスタチンはマイクロスフェア（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）剤形をなす。マイクロスフェア剤形によれば、シンバスタチンの濃度放出を効果的に制御可能となる。
【００２７】
ここでいう「治療有効量」とは、化合物を個体に投与して疾病を治療するにあたり、当該疾病の治療を実現するために十分な量のことである。「治療有効量」は、化合物、疾病及びその深刻性、治療しようとする個体の年齢、体重等により変化する。具体的実施例において、当該ヒアルロン酸の治療有効量は、重量パーセント濃度で０．１〜１０％の範囲である。好ましい具体的実施例において、当該ヒアルロン酸の治療有効量は、重量パーセント濃度で０．５〜５％の範囲である。より好ましい具体的実施例において、当該ヒアルロン酸の治療有効量は、重量パーセント濃度で１％である。他の具体的実施例において、当該シンバスタチンの治療有効量は０．１〜１０μＭの範囲である。好ましい具体的実施例において、当該シンバスタチンの治療有効量は０．５〜５μＭの範囲である。更に好ましい具体的実施例において、当該シンバスタチンにおける治療有効量は１μＭである。
【００２８】
「治療」とは、何らかの疾病又は病症の改善（即ち、疾病の抑制、又は疾病における少なくとも１つの臨床症状の発現、程度又は深刻性の低減）をいう。
【００２９】
本稿で使用する「個体（ｓｕｂｊｅｃｔ）」とは動物を指す。好ましい具体的実施例において、当該個体は哺乳動物である。更に好ましい具体的実施例において、当該個体はヒトである。
【００３０】
本発明の医薬組成物は、医薬技術において熟知されている方式で製造される。一般的に、本発明の医薬組成物は医薬的に有効な量で投与される。通常、実際に投与される医薬組成物の分量については、処置すべき病状、選択された投薬経路、実際に投与される化合物、患者個々の年齢、体重及び反応、患者の症状の深刻性、及び類似の要因に鑑みて医師が決定する。
【００３１】
本発明における医薬組成物の個体への好ましい投与経路は、関節内投与である。本発明の医薬組成物は、持続放出により投与してもよいし、持続放出型ドラッグデリバリーシステムにより投与してもよい。
【００３２】
更に、本発明は、ヒアルロン酸混合物及びスタチン（ｓｔａｔｉｎ）系化合物を含む試薬キットを提供する。
【００３３】
具体的実施例において、当該ヒアルロン酸混合物は、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ，ＨＡ）、フィブリン及び幹細胞を含有する。好ましい具体的実施例において、当該フィブリンはヒドロゲルを形成する。当該フィブリンは３次元ヒドロゲルの足場構造を形成する。即ち、３次元のフィブリンヒドロゲル（３Ｄ  ｆｉｂｒｉｎ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ）を担体として形成し、当該ヒアルロン酸及び当該幹細胞を被覆する。
【００３４】
他の具体的実施例において、当該スタチン（ｓｔａｔｉｎ）系化合物はシンバスタチンである。好ましい具体的実施例において、当該シンバスタチンはマイクロスフェア（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）剤形をなす。
【００３５】
具体的実施例において、ヒアルロン酸及び幹細胞を含有するフィブリンヒドロゲルと、シンバスタチンを含有するマイクロスフェアは別々の剤形とし、使用時に併用してもよい。或いは、シンバスタチンを含有するマイクロスフェアを当該フィブリンヒドロゲル中に溶解し、単一剤形として投与してもよい。
【発明の効果】
【００３６】
本発明で提供する軟骨細胞の生成促進薬物を製造するための医薬組成物の用途は、その他の常用の技術と比較して以下のような利点がある。
【００３７】
（１）ヒアルロン酸とスタチン（ｓｔａｔｉｎ）系化合物を合わせて使用すると、例えば、骨形成蛋白質（ＢＭＰ）、軟骨細胞外基質（例えば、ｓＧＡＧやＣｏｌ  ＩＩ）、軟骨分化遺伝子（例えば、Ｓｏｘ−９、アグリカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）又はＩＩ型コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩ））といった軟骨の生成又は細胞の軟骨化促進に関係する因子を顕著且つ効果的に強化可能となるため、軟骨欠損／摩耗に関する各種疾病の治療に応用できる。
【００３８】
（２）現在市販されている軟骨欠損を治療又は軟骨の成長を刺激する多くの薬物又は試薬には硬骨化発生の懸念がある。これは、軟骨化因子が過剰に発現するためと考えられる。しかし、本発明の医薬組成物によれば、軟骨の生成や細胞における軟骨化誘導に関係する因子の発現を顕著に向上させられるだけでなく、更に硬骨化因子の発現を抑制可能である。例えば、オステオカルシンの発現量が低減するため、硬骨化現象の発生が回避される。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、ヒアルロン酸塗布（ＨＡ）ウェル又はヒアルロン酸非塗布（Ｎｏｎ−ＨＡ）ウェルで培養したヒト脂肪幹細胞（ｈＡＤＳＣｓ）における硫酸化グリコサミノグリカン（ｓＧＡＧ）の形成に対するシンバスタチン（ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）の影響を表す（＊及び＊＊：ヒアルロン酸及びシンバスタチン処理無し群との比較で、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。＃：シンバスタチン処理群（０μＭ）との比較で、ｐ＜０．０１。実験数＝３）。
【図２Ａ】図２Ａは、ヒアルロン酸有り（ＨＡ）或いはヒアルロン酸無し（Ｎｏｎ−ＨＡ）で培養したヒト脂肪幹細胞における軟骨分化遺伝子Ｓｏｘ−９の発現に対するシンバスタチンの影響を表す（ヒアルロン酸無し群（Ｎｏｎ−ＨＡ）との比較で、＊＊ｐ＜０．０１。実験数＝４）。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ヒアルロン酸有り（ＨＡ）或いはヒアルロン酸無し（Ｎｏｎ−ＨＡ）で培養したヒト脂肪幹細胞における軟骨分化遺伝子Ａｇｇｒｅｃａｎの発現に対するシンバスタチンの影響を表す（ヒアルロン酸無し群（Ｎｏｎ−ＨＡ）との比較で、＊＊ｐ＜０．０１。実験数＝４）。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ヒアルロン酸有り（ＨＡ）或いはヒアルロン酸無し（Ｎｏｎ−ＨＡ）で培養したヒト脂肪幹細胞における軟骨分化遺伝子Ｃｏｌ  ＩＩの発現に対するシンバスタチンの影響を表す（ヒアルロン酸無し群（Ｎｏｎ−ＨＡ）との比較で、＊＊ｐ＜０．０１。実験数＝４）。
【図３Ａ】図３Ａは、ヒアルロン酸有り（ＨＡ）或いはヒアルロン酸無しで培養したヒト脂肪幹細胞における骨形成蛋白質−２（ＢＭＰ−２）遺伝子の発現に対するシンバスタチンの影響を表す（ヒアルロン酸無し群（Ｎｏｎ−ＨＡ）の１日目のデータとの比較で、＊＊ｐ＜０．０１。実験数＝４）。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ヒアルロン酸有り（ＨＡ）或いはヒアルロン酸無しで培養したヒト脂肪幹細胞のオステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）遺伝子の発現に対するシンバスタチンの影響を表す（ヒアルロン酸無し群（Ｎｏｎ−ＨＡ）の１日目のデータとの比較で、＊＊ｐ＜０．０１。実験数＝４）。
【図４】図４は、３次元のヒアルロン酸／フィブリンヒドロゲルで被覆したヒト脂肪幹細胞をシンバスタチンで処理した場合の硫酸化グリコサミノグリカン（ｓＧＡＧ）の形成発現結果を分析したものである（同日のヒアルロン酸群（ＨＡ）とヒアルロン酸＋シンバスタチン群（ＨＡ＋Ｓｉｍ）との比較で、＊＊ｐ＜０．０１。実験数＝３）。
【図５】図５は、３次元のヒアルロン酸／フィブリンヒドロゲルで被覆したヒト脂肪幹細胞をシンバスタチンで処理した場合のＩＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ  ＩＩ）の発現結果を分析したものである（同日のヒアルロン酸群（ＨＡ）とヒアルロン酸＋シンバスタチン群（ＨＡ＋Ｓｉｍ）との比較で、＊＊ｐ＜０．０１。実験数＝３）。
【図６Ａ】図６Ａは、３次元のヒアルロン酸／フィブリンヒドロゲルで被覆したヒト脂肪幹細胞をシンバスタチンで処理した場合の軟骨分化遺伝子Ｓｏｘ−９の発現結果を分析したものである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、３次元のヒアルロン酸／フィブリンヒドロゲルで被覆したヒト脂肪幹細胞をシンバスタチンで処理した場合の軟骨分化遺伝子アグリカン（Ａｇｇｒｅｃａｎ）の発現結果を分析したものである。
【図６Ｃ】図６Ｃは、３次元のヒアルロン酸／フィブリンヒドロゲルで被覆したヒト脂肪幹細胞をシンバスタチンで処理した場合の軟骨分化遺伝子Ｃｏｌ  ＩＩの発現結果を分析したものである。
【図７】図７は、シンバスタチン及びヒト脂肪幹細胞を含有する３次元のヒアルロン酸／フィブリンヒドロゲルでミニブタの膝関節における関節軟骨欠損箇所を処理した結果である（矢印は膝関節の修復箇所を示す）。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明は以下で提示する実施例に限らず、別の内容で実施される場合がある。以下の実施例は、本発明の代表的な方向性及び特徴にすぎない。
【００４１】
実施例１
硫酸化グリコサミノグリカン（ｓＧＡＧ）は関節軟骨における主要な細胞外基質である。シンバスタチン（Ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）がヒト脂肪幹細胞（ｈｕｍａｎ  ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，ｈＡＤＳＣｓ）における硫酸化グリコサミノグリカン（ｓＧＡＧ）の発現を促進し得るか否か、及びシンバスタチンの好ましい濃度を測定するために、本発明ではまずヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ，ＨＡ）塗布ウェルを作製した。即ち、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，１％ｗ／ｗ）に溶解した１ｍｌのヒアルロン酸を２４ウェルプレートに塗布し、３７℃で４８時間静置してからＰＢＳで２度洗浄した。続いて、５００μｌの基礎培地を含有する細胞密度１×１０５のウェルにヒト脂肪幹細胞を接種した。当該基礎培地はＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ，ダルベッコ改変イーグル培地）を含有しており、更に、胎児ウシ血清（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）５％、非必須アミノ酸１％及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）１００Ｕ／ｍｌを別途添加した。培養期間には各種濃度（０．１〜１μＭ）のシンバスタチン（ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）をウェルプレートに添加し、当該培地を２日に１度交換した。培養７日目に細胞を収集し、Ｂｌｙｓｃａｎ硫酸化グリコサミノグリカン測定キット（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ，Ａｎｔｒｉｍ，ＵＫ）でジメチルメチレンブルー（ｄｉｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｂｌｕｅ，ＤＭＭＢ）分析を実施するとともに、形成された硫酸化グリコサミノグリカン（ｓＧＡＧ）をＤＮＡで標準化した。図１にその結果を示す。
【００４２】
本発明では、ヒアルロン酸の有無によって、ヒト脂肪幹細胞における硫酸化グリコサミノグリカン（ｓＧＡＧ）の形成にシンバスタチンがどう影響するかを測定した。図１に示すように、ヒアルロン酸無し（Ｎｏｎ−ＨＡ）の場合に０．１〜１μＭのシンバスタチンで処理すると、ヒト脂肪幹細胞におけるｓＧＡＧの発現量がいずれも促進された（０μＭ：０．３μｇ／μｇ、０．１μＭ：０．５μｇ／μｇ、０．５μＭ：０．５μｇ／μｇ、１μＭ：０．７μｇ／μｇ）。また、ヒアルロン酸１％の場合に０．１〜１μＭのシンバスタチンで処理すると、ｓＧＡＧの発現量がより強化された（０μＭ：１．４μｇ／μｇ、０．１μＭ：１．３μｇ／μｇ、０．５μＭ：２．５μｇ／μｇ、１μＭ：２．８μｇ／μｇ）。本実験では、ヒアルロン酸１％とシンバスタチン１μＭを共に作用させた場合、幹細胞におけるｓＧＡＧの発現が顕著且つ良好に促進されることから、細胞の軟骨化が誘発され、軟骨の生成に有利となることが示された。
【００４３】
実施例２
ヒト脂肪幹細胞（ｈＡＤＳＣｓ）をヒアルロン酸塗布（ＨＡ）ウェル及び非塗布（Ｎｏｎ−ＨＡ）ウェルでそれぞれ培養し、１μＭのシンバスタチン（ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ，ＳＩＭ）を用いた場合又は用いない場合で１〜５日間処理した。即ち、本発明では実験群を次の４つに分けた。
（１）ヒアルロン酸無し（Ｎｏｎ−ＨＡ）群：ヒト脂肪幹細胞をヒアルロン酸非塗布ウェルで培養し、シンバスタチン（１μＭ）による処理も実施しなかった。
（２）ヒアルロン酸無し＋シンバスタチン（Ｎｏｎ−ＨＡ＋Ｓｉｍ）群：ヒト脂肪幹細胞をヒアルロン酸非塗布ウェルで培養し、シンバスタチン（１μＭ）による処理を実施した。
（３）ヒアルロン酸（ＨＡ）群：ヒト脂肪幹細胞をヒアルロン酸塗布ウェルで培養したが、シンバスタチン（１μＭ）による処理は実施しなかった。
（４）ヒアルロン酸＋シンバスタチン（ＨＡ＋Ｓｉｍ）群：ヒト脂肪幹細胞をヒアルロン酸塗布ウェルで培養し、シンバスタチン（１μＭ）による処理を実施した。
【００４４】
所定の日数で細胞を収集し、リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）でＢＭＰ−２及び軟骨分化遺伝子（ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ  ｇｅｎｅｓ）の発現を分析した。また、以下に述べるメーカーのガイドラインに基づき、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を合わせて使用することでこれら細胞のトータルＲＮＡ（ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ）を抽出した。簡単にいうと、０．５〜１μｇのトータルＲＮＡを含む２０μｌの反応体積を取り、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡを逆転写した。続いて、ｉＱ（登録商標）  ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ（登録商標）ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）と定量リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いてリアルタイムＰＣＲ反応を実施し、観測した。当該ｃＤＮＡサンプル（２μｌを取って毎回２５μｌの総体積で反応させた）は、参照遺伝子グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）を対照群とし、関心のある遺伝子を分析するために用いた。各標的遺伝子の発現量は、前述したように２‐ΔΔＣｔで算出した。関心のある各遺伝子については、実験サンプルごとに４つの値を読んだ。また、各実験は少なくとも３回繰り返した。プライマーセット（ａｐｐｌｉｅｄ  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ）としては、（１）骨形成蛋白質−２（ＢＭＰ−２）のフォワード（ｆｏｒｗａｒｄ）：ＣＧＡＡＴＧＡＣＴＧＧＡＴＴＧＴＧＧＣＴ、リバース（ｒｅｖｅｒｓｅ）：ＴＧＡＧＴＴＣＴＧＴＣＧＧＧＡＣＡＣＡＧ、（２）Ｓｏｘ−９のフォワード：ＣＴＴ  ＣＣＧ  ＣＧＡ  ＣＧＴ  ＧＧＡ  ＣＡＴ、リバース：ＧＴＴ  ＧＧＧ  ＣＧＧ  ＣＡＧ  ＧＴＡ  ＣＴＧ、（３）ＩＩ型コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩ，Ｃｏｌ  ＩＩ）のフォワード：ＣＡＡ  ＣＡＣ  ＴＧＣ  ＣＡＡ  ＣＧＴ  ＣＣＡ  ＧＡＴ、リバース：ＴＣＴ  ＴＧＣ  ＡＧＴ  ＧＧＴ  ＡＧＧ  ＴＧＡ  ＴＧＴ  ＴＣＴ、（４）アグリカン（Ａｇｇｒｅｃａｎ）のフォワード：ＡＣＡ  ＣＧＴ  ＧＧＧ  ＧＡＣ  ＡＧＴ  ＡＴＴ  ＧＧ、リバース：ＧＴＧ  ＧＡＡ  ＡＧＡ  ＴＧＣ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＴＴ、（５）ＧＡＰＤＨのフォワード：ＴＣＴ  ＣＣＴ  ＣＴＧ  ＣＡＴ  ＴＣＡ  ＡＣＡ  ＧＣＧＡＣ、リバース：ＣＣＣ  ＴＧＴ  ＴＧＴ  ＴＧＣ  ＡＧＣ  ＣＡＡ  ＡＴＴ  Ｃ、及び（６）オステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）のフォワード：ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＣＣＡ  ＧＣＡ  ＡＡＧ  ＧＴ、リバース：ＣＧＡ  ＴＡＧ  ＧＣＣ  ＴＣＣ  ＴＧＡ  ＡＡＧ  Ｃ、を添加した。図２及び図３に結果を示す。
【００４５】
本発明では、まずヒアルロン酸の有無によって、ヒアルロン酸（ＨＡ）を１％、シンバスタチン（Ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）を１μＭとする構成が、軟骨分化遺伝子（Ｓｏｘ−９、アグリカン（Ａｇｇｒｅｃａｎ等）及びＩＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ  ＩＩ））の発現を刺激し得るか否か、及びこれらの好ましい濃度を測定した。図２Ａ〜図２Ｃに示すように、ヒアルロン酸無し（Ｎｏｎ−ＨＡ）の場合にシンバスタチンを１μＭ加えたとしても、軟骨分化遺伝子の発現を効果的に促進することはできなかった（Ｎｏｎ−ＨＡ＋Ｓｉｍ）。しかし、ヒアルロン酸１％の場合にシンバスタチンを１μＭ加えたところ（ＨＡ＋Ｓｉｍ）、良好な軟骨分化遺伝子の発現量が得られた。即ち、Ｓｏｘ−９、Ａｇｇｒｅｃａｎ及びＣｏｌ  ＩＩの発現量が向上した。本実験では、ヒアルロン酸１％とシンバスタチン１μＭを共に作用させた場合に、幹細胞における軟骨分化遺伝子の発現が顕著且つ良好に促進されることが示された。
【００４６】
また、本発明では、ヒアルロン酸の有無によって、ヒアルロン酸を１％、シンバスタチンを１μＭとする構成が、ＢＭＰ−２及びオステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）の発現を刺激し得るか否かを測定した。図３Ａに示すように、ヒアルロン酸無し（Ｎｏｎ−ＨＡ）群における１日目のＢＭＰ−２発現量を１として比較すると、ヒアルロン酸無し（Ｎｏｎ−ＨＡ）の場合にシンバスタチン１μＭを加えたときには（Ｎｏｎ−ＨＡ＋Ｓｉｍ）、ＢＭＰ−２遺伝子の明らかな発現促進はみられなかった（１日目：Ｎｏｎ−ＨＡ群：１倍、Ｎｏｎ−ＨＡ＋Ｓｉｍ群：１．２倍。３日目：Ｎｏｎ−ＨＡ：０．５倍、  Ｎｏｎ−ＨＡ＋Ｓｉｍ群：０．８倍。５日目：Ｎｏｎ−ＨＡ群：０．２倍、Ｎｏｎ−ＨＡ＋Ｓｉｍ群：１．１倍）。一方、ヒアルロン酸１％の場合にシンバスタチン１μＭを加えると（ＨＡ＋Ｓｉｍ）、ＢＭＰ−２の発現量に明らかな増加がみられた（１日目：ＨＡ：０．５倍、ＨＡ＋Ｓｉｍ：２．８倍。３日目：ＨＡ：１．９倍、ＨＡ＋Ｓｉｍ：５倍。５日目：ＨＡ：０．４倍、Ｎｏｎ−ＨＡ＋Ｓｉｍ：２．１倍）。本実験では、ヒアルロン酸１％とシンバスタチン１μＭを共に作用させた場合に、幹細胞におけるＢＭＰ−２遺伝子の大量発現が促進されることが示された。
【００４７】
一方、オステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）遺伝子の発現量については、図３Ｂに示すように、ヒアルロン酸無し群における１日目のオステオカルシンの発現量を１として比較すると、ヒアルロン酸無し（Ｎｏｎ−ＨＡ）の場合にシンバスタチンを１μＭ加えた場合、１日目から５日目までオステオカルシン遺伝子の発現が明らかに促進された。また、ＨＡ有りの場合（ＨＡ＋Ｓｉｍ）にシンバスタチンを１μＭ加えたところ、１日目から５日目までシンバスタチン（ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）により誘発されるオステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）の発現が効果的に削減された。以上の結果から、ヒアルロン酸とシンバスタチンを共に作用させるとオステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）の発現が低下するため、硬骨化の発生を減少させられることが示された。
【００４８】
実施例３
１％のヒアルロン酸中に浮遊するヒト脂肪幹細胞（５×１０６個）各３０μＬと１２０μｌのフィブリン（ｆｉｂｒｉｎ）溶液（１００ｍｇ／ｍｌ）を混合した後、テフロン（登録商標）金型（ｔｅｆｌｏｎ  ｍｏｌｄ）（深さ５．５ｍｍ、直径５．５ｍｍ）に放置した。次に、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）４０ｍＭに溶解したウシ由来トロンビン（ｂｏｖｉｎｅ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ，３００Ｕ／ｍｌ）溶液４０μｌを金型に加え、細胞／フィブリン溶液と十分に混合した。そして、ヒドロゲル（ｈｙｄｒｏｇｅｌ）が形成されるまで当該混合物を室温で１５分間培養した。ヒドロゲルが形成されると、ヒト脂肪幹細胞とヒアルロン酸を含む当該３次元フィブリンヒドロゲル担体（３Ｄ  ｆｉｂｒｉｎ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ｃａｒｒｉｅｒ）（ヒアルロン酸／フィブリンヒドロゲル）をテフロン金型から取り出し、２４ウェルプレートに移して、１ｍｌの基礎培地（ＤＭＥＭ）を用いた。当該基礎培地はＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ，ダルベッコ改変イーグル培地）を含有しており、更に、胎児ウシ血清（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）５％、非必須アミノ酸１％及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）１００Ｕ／ｍｌを別途添加した。続いて、当該ヒト脂肪幹細胞（ｈＡＤＳＣｓ）をヒアルロン酸／フィブリンヒドロゲル中で培養し、シンバスタチン１μＭを用いる場合と用いない場合とで７日間或いは１４日間処理した。即ち、本発明では実験群を次の２つに分けた。
（１）ヒアルロン酸（ＨＡ）群：ヒト脂肪幹細胞をヒアルロン酸／フィブリンヒドロゲル中で培養したが、シンバスタチン（１μＭ）による処理は実施しなかった。
（２）ヒアルロン酸＋シンバスタチン（ＨＡ＋Ｓｉｍ）群：ヒト脂肪幹細胞をヒアルロン酸／フィブリンヒドロゲル中で培養し、シンバスタチン（１μＭ）による処理を実施した。
７日目及び１４日目にヒドロゲルを収集し、６０℃で１８時間パパイン溶液（ｐａｐａｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ，３００μｇ／ｍｌ）中で培養した。続いて、各実験群から取得した５０μｌの細胞抽出物について、ｓＧＡＧ合成を測定するＤＭＭＢ分析法、又はＩＩ型コラーゲン測定キット（Ｔｙｐｅ  ＩＩ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｃｈｏｎｄｒｅｘ  Ｉｎｃ．ＷＡ，ＵＳＡ）によるＩＩ型コラーゲン分析を実施した。結果を図４及び図５に示す。
【００４９】
３次元のヒアルロン酸ヒドロゲルで被覆した場合にシンバスタチン（ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）１μＭを加えた構成が、間葉系幹細胞における２種類の主要な細胞外基質である硫酸化グリコサミノグリカン（ｓＧＡＧ）及びＩＩ型コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩ、Ｃｏｌ  ＩＩ）の生成を促進し得るか否かを測定した。ｓＧＡＧの発現量については、７日目にヒアルロン酸（ＨＡ）群が１４μｇ／μｇ、ヒアルロン酸＋シンバスタチン（ＨＡ＋Ｓｉｍ）群が１８μｇ／μｇとなった。また、１４日目には、ヒアルロン酸群が１４μｇ／μｇ、ヒアルロン酸＋シンバスタチン群が３０μｇ／μｇとなった（図４参照）。Ｃｏｌ  ＩＩの発現量については、７日目にヒアルロン酸（ＨＡ）群が２ｐｇ／μｇ、ヒアルロン酸＋シンバスタチン（ＨＡ＋ＳＩＭ）群が６ｐｇ／μｇとなった。また、１４日目には、ヒアルロン酸群が６．５ｐｇ／μｇ、ヒアルロン酸＋シンバスタチン群が２７ｐｇ／μｇとなった（図５参照）。上記の結果より、３次元のヒアルロン酸／フィブリンヒドロゲルで被覆した場合にシンバスタチン（ＨＡ＋Ｓｉｍ）を１μＭ加えると、幹細胞における２種類の主要な細胞外基質（ｓＧＡＧ及びＣｏｌ  ＩＩ）の発現が効果的に促進されることが示された。
【００５０】
また、本発明では更に、ヒアルロン酸／フィブリンヒドロゲルを用いて前記ヒト脂肪幹細胞を培養し、シンバスタチン１μＭを用いて１〜５日間処理した場合と処理しなかった場合について、軟骨分化遺伝子（Ｓｏｘ−９、アグリカン（Ａｇｇｒｅｃａｎ）及びＩＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ  ＩＩ））の発現状況を分析した。即ち、本発明では実験群を次の２つに分けた。
（１）ヒアルロン酸（ＨＡ）群：ヒト脂肪幹細胞をヒアルロン酸／フィブリンヒドロゲル中で培養したが、シンバスタチン（１μＭ）による処理は実施しなかった。
（２）ヒアルロン酸＋シンバスタチン（ＨＡ＋Ｓｉｍ）群：ヒト脂肪幹細胞をヒアルロン酸／フィブリンヒドロゲル中で培養し、シンバスタチン（１μＭ）による処理を実施した。
所定の日数で細胞を収集し、リアルタイムＰＣＲで軟骨分化遺伝子の発現を分析した。図６にその結果を示す。
【００５１】
３次元のヒアルロン酸ヒドロゲルで被覆した場合にシンバスタチンを１μＭ加えたとき、間葉系幹細胞における軟骨分化遺伝子の良好な発現を促進し得るか否かを測定した。図６Ａ〜図６Ｃに示すように、幹細胞を３次元のヒアルロン酸／フィブリンヒドロゲルで被覆してからシンバスタチンを１μＭ加えたところ（ＨＡ＋Ｓｉｍ）、軟骨分化遺伝子の良好な発現がみられた。即ち、Ｓｏｘ−９、Ａｇｇｒｅｃａｎ及びＣｏｌ  ＩＩの発現量が向上した。本実験では、３次元のヒアルロン酸ヒドロゲルで被覆してからシンバスタチン１μＭを加えると、幹細胞における軟骨分化遺伝子の発現が良好に促進されることが示された。
【００５２】
実施例４
４０ｍｇのシンバスタチン（Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）を１ｍｌのエタノール（ｅｔｈａｎｏｌ）に溶解した後、１．５ｍｌの０．１Ｎ  ＮａＯＨと混合した。次に、シンバスタチンストック溶液（ｓｔｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を５０℃まで加熱して２時間保持した後、１Ｎの塩酸（ＨＣｌ，ｐＨ＝７．４，Ｓｉｇｍａ―Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）でｐＨ値を中和して１０ｍＭのストック溶液とした。続いて、水中油中水型のダブルエマルション（ｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ（ｗ／ｏ／ｗ）ｄｏｕｂｌｅ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ）技術によってマイクロスフェア（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）を作製した。簡単にいうと、１６ｍｇのヒドロキシアパタイト（ＨＡｐ）粉末をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解して第１水相（ｗａｔｅｒ−ｐｈａｓｅ）溶液を形成した。次に、２５０μｌのシンバスタチンストック溶液と５０ｍｇの界面活性剤Ｓｐａｎ  ８０及びＰＬＧＡ（乳酸−グリコール酸共重合体）５０／５０（Ｐ２１９１，分子量：３０，０００〜６０，０００，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）溶液中で混合し、油相を形成した。そして、第１水相溶液と油相溶液を混合し、１０００ｒｐｍで１５分間攪拌することで第１油中水（ｗ／ｏ）エマルションを形成した。続いて、第１油中水（ｗ／ｏ）エマルションを２０ｍｌの第２水相溶液に加え、１％（ｗ／ｖ）のジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）溶液と混合することで第２ダブルエマルション（ｗ／ｏ／ｗ）を形成した。そして、第２ダブルエマルション（ｗ／ｏ／ｗ）を室温で３０分間攪拌し、当該マイクロスフェアとして硬化した。なお、攪拌過程では、ジクロロメタンを蒸発させて当該マイクロスフェアを硬化させるために抽出器が必須となる。最後に、当該マイクロスフェアを遠心方式で収集し、０．１％のポリビニルアルコール（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ）で３回洗浄してから、冷凍乾燥機で冷凍乾燥した。
【００５３】
すべての実験動物は台東動物繁殖センター（ＴＡＰＳ）から提供された。動物には、手術前にケタミン（Ｋｅｔａｍｉｎｅ）０．１５ｍｇ／ｋｇと鎮静薬キシラジン（ｘｙｌａｚｉｎｅ）を筋肉注射（ＩＭ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）することで麻酔を施した。また、手術中には５％の吸入麻酔薬（ｉｎｈａｌａｔｉｏｎａｌ  Ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）を投与して麻酔を維持した。こうしてミニブタに麻酔を施してから、左下肢に手術を実施した。手術では、軟骨下骨（ｓｕｂｃｈｏｎｄｒａｌ  ｂｏｎｅ）を貫通することのないよう、トレフィンバー（ｔｒｅｐｈｉｎｅ  ｂｕｒ）で左下肢の内顆（ｍｅｄｉａｌ  ｃｏｎｄｙｌｅｓ）に軟骨全層欠損（ｆｕｌｌ−ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｄｅｆｅｃｔｓ）（直径６ｍｍ）を形成した。術後にはシンバスタチン１ｍｇのマイクロスフェアを含有するヒアルロン酸／フィブリンヒドロゲルを軟骨欠損部位に移植した。また、修復構造を縫合するために、脛骨から骨膜を採取して欠損部位の上方を覆い、最後に手術による傷口を一層ずつ縫合した。また、術後には、鎮痛薬ウルトラセト（Ｔｒａｍａｄｏｌ  ３７．５ｍｇ／Ａｃｅｔａｍｉｎｏｐｈｅｎ  ３２５ｍｇ）を１日１回、１回あたり２錠として５日間継続的に経口投与した。そして、１２週目に治療効果を確認すべく観察を実施した。
【００５４】
図７に示すように、間葉系幹細胞とシンバスタチン（Ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）含有マイクロスフェア（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）を含む３次元のヒアルロン酸ヒドロゲルをミニブタの関節軟骨における欠損部位に投与したところ、１２週目に当該部位の関節軟骨欠損が明らかに改善された。上記の結果は、３次元のヒアルロン酸ヒドロゲルで被覆した間葉系幹細胞及びシンバスタチン含有マイクロスフェアが関節軟骨欠損に対し修復及び改善効果を有することを示している。
【００５５】
以上は本発明の好ましい実施形態を具体的且つ詳細に説明するものにすぎず、本発明を限定するものではない。よって、当業者が本発明の主旨及び範囲を逸脱することなく行う等価の実施又は変更はいずれも本発明の請求の範囲に含まれる。
【図１】
0006725806.tif 000003
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【配列表】
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