(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
部分的にまたは完全に反応キャビティ中に浸漬することができる少なくとも１つの物体を含む、核酸を自動的に抽出する装置であって、少なくとも、反応キャビティ中に浸漬する部分が、粗さのある表面または構造化された表面を有し、粗さのある物品または構造化された物品が外側に装着されている平滑な中空体であることを特徴とする装置。
【請求項２】
前記装置は、少なくとも部分的に粗さのある中空体または構造化された中空体を含むことを特徴とする、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
嵌めることができる前記物品は、粗さのある表面または構造化された表面を有するリングまたはシースであることを特徴とする、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
嵌めることができる前記物品は、粗さのあるポリマー材料もしくは構造化されたポリマー材料、粗さのある表面もしくは構造化された表面を有する複合材料、または３Ｄプリントによって作製された材料であることを特徴とする、請求項３に記載の装置。
【請求項５】
前記中空体は、反応キャビティ中に存在する液体を受け入れることができることを特徴とする、請求項３に記載の装置。
【請求項６】
請求項１から５までのいずれか１項に記載の装置を少なくとも１つ含む、核酸を自動的に抽出するためのウォークアウェイ原理による機器。
【請求項７】
自動ピペッティング装置または自動抽出装置であることを特徴とする、請求項６に記載の機器。
【請求項８】
核酸を自動的に抽出する方法であって、
ｆ）溶解された生物学的試料を反応キャビティ中に入れて、そこに水溶液の極性を低下させる少なくとも１種の物質を加えるか、または核酸を固相に結合させるための手段を加えるステップ、
ｇ）請求項１から４までのいずれか１項に記載の装置をこのキャビティ中に浸漬させることで、核酸をこの装置の粗さのある部分または構造化された部分に結合させるステップと、
ｈ）該装置を、少なくともさらなるキャビティ中に移して、結合された核酸を洗浄するステップと、
ｉ）結合された核酸を乾燥させるステップと、
ｊ）乾燥した結合された核酸を、さらなるキャビティ中に移して、核酸を溶出させるステップと、
を特徴とする方法。
【請求項９】
前記水溶液の極性を低下させるための物質として、有機溶剤が使用されることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項２から４までのいずれか１項に記載された装置であって、溶出キャビティ中での核酸の溶出後に、溶出物は、反応キャビティから中空体によって貯蔵容器中に移されることを特徴とする、装置。
【請求項１１】
溶解された生物学的試料は、中空体によって反応キャビティ中に入れられることを特徴とする、請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
自動ピペッティング装置または自動抽出装置による、請求項８または９に記載の自動的な方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、核酸を迅速かつ高効率に、そして定量的に自動化された形式で単離し、精製することができる装置および方法である。
【０００２】
古典的な条件下では、細胞および組織からのＤＮＡの単離は、核酸を含有する出発材料を強力に変性し還元する条件下で、部分的にタンパク質分解酵素を使用して可溶化させ、出てきた核酸フラクションをフェノール／クロロホルム抽出ステップを介して精製し、核酸を透析またはエタノール沈殿によって水相から取得することによって行われる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，１９８９，ＣＳＨ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”）。核酸を細胞から、特に組織から単離するためのこれらの「古典的な方法」は、非常に時間がかかるものであり（一部では４８時間より長い）、かなりの装置上のコストが必要となり、さらにまた現場条件下で実現することもできない。さらに、そのような方法は、僅かではない規模で使用されるフェノールおよびクロロホルム等の化学薬品に基づき健康を脅かすものである。
【０００３】
核酸の単離のための次世代の方法は、ＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎおよびＧｉｌｌｅｓｐｉｅ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９７９，７６，６１５−６１９）によって開発され初めて記載されたアガロースゲルからのＤＮＡ断片の分取的および分析的な精製のための方法を基礎としている。該方法は、単離すべきＤＮＡバンドを含むアガロースをカオトロピック塩（ＮａＩ）の飽和溶液中で溶解させることと、ＤＮＡをガラス粒子に結合させることを組み合わせている。ガラス粒子上に固定されたＤＮＡは、引き続き、洗浄溶液（２０ｍＭのＴｒｉｓ塩酸［ｐＨ７．２］；２００ｍＭのＮａＣｌ；２ｍＭのＥＤＴＡ；５０％（容量／容量）のエタノール）で洗浄され、次いで担体粒子から引き離される。この方法は、今日まで一連の改変を経ており、現時点までに様々な起源由来の核酸の抽出および精製の様々な方法のために使用され、最終的には、核酸の手動式の単離と自動化された形式の単離を問わないほぼ全ての市販のキットのための基礎となっている。さらに、ＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎおよびＧｉｌｌｅｓｐｉｅによって最初に公表された、場合によりさらなる利点を持つ核酸の単離の基本原理に関連する多くの特許および公開公報が存在する。これらの別形は、種々な無機担体材料が使用されることにも、核酸の結合のために使用されるバッファーの種類にも関係している。それらの例は、とりわけ、担体材料として微粉砕されたガラス粉末（ＢＩＯ  １０１、カリフォルニア州ラホヤ）、珪藻土（Ｓｉｇｍａ社）またはシリカゲルもしくはシリカ懸濁液またはガラス繊維フィルタまたは鉱物粘土（独国特許出願公開第４１３９６６４号明細書、米国特許第５，２３４，８０９号明細書、国際公開第９５／３４５６９号パンフレット、独国特許第４３２１９０４号明細書、独国特許第２０２０７７９３号明細書）が使用される、種々のカオトロピック塩の溶液の存在下での無機担体への核酸の結合である。これら全ての特許は、核酸をガラスまたはケイ素を基礎とする無機担体材料へと、カオトロピック塩溶液の存在下で結合させることを基礎としている。より新しい特許文献においては、核酸を、当業者に公知の使用される無機材料への吸着のために、溶解バッファー／結合バッファー系の成分として、いわゆるアンチカオトロピック塩が非常に効率的かつ効果的に使用することができることが開示されている（欧州特許第１１３５４７９号明細書）。まとめると、先行技術は、つまり核酸を無機材料へと、カオトロピック塩もしくはアンチカオトロピック塩を含有するバッファーの存在下で、またはカオトロピック塩およびアンチカオトロピック塩の混合物を含むバッファーの存在下で結合させ、このようにしてさらに単離することもできるという旨で説明することができる。この場合に、追加で脂肪族アルコールを結合を媒介するために使用する好ましい別形も存在する。核酸の単離および精製のための全ての慣用の市販製品がこの原理に基づいていることも当業者には公知である。この場合に、使用される無機担体は、緩い充填物の形で、濾過膜の形で、または懸濁液の形でも存在する。自動化された抽出過程の実施のために、しばしば常磁性粒子または磁性粒子が使用される。この粒子は、例えば���磁性コアもしくは常磁性コアを有するケイ酸塩系材料であるが、さもなくばまた表面が核酸の結合のために必要な官能性を有するように表面変性された酸化鉄粒子である。特に、自動化された抽出をより簡単に実施し得るために、改変されたピペットチップが使用された。これらのピペットチップは、それらが核酸の結合のために必要とされる担体材料（多孔質無機担体材料または多孔質アニオン交換体等）を既に収容していることを特徴とする。ここで独国特許第３７１７２１１号明細書といった特許文献は、核酸の単離のために多孔質クロマトグラフィー材料を有するピペットチップを記載している。欧州特許第１９５１９０４号明細書といった特許文献は、上方部および下方部からなり、それらの間に同様に多孔質クロマトグラフィー担体材料が存在するピペットチップであって、核酸の自動化された単離のために使用されるというピペットチップを開示している。核酸の抽出のための改変されたピペットチップは、米国特許出願公開第２０１３／００７８６１９号明細書といった特許文献においても開示されている。このピペットチップにおいても、核酸の直接的な結合のために多孔質無機担体材料（多孔質ガラス）が存在する。これらの改変されたピペットチップに共通していることは、多孔質クロマトグラフィー材料を扱うことである（緩い充填物または固い多孔質体）。これらの担体材料は、ピペットチップ内で常に水平に存在する。処理されるべき液体は、使用される多孔質材料中を通じて流れる。抽出過程は、試料を溶解させ、核酸の担体材料への吸着のために必要な結合条件を調整した後に、このバッチをピペッティング操作過程によって多孔質担体材料中に通すことを基礎としている。核酸は、その担体材料へと結合する。その後に、洗浄バッファーを、該担体材料中を通じてピペッティング操作する。その後に、乾燥ステップが行われる（しばしば、出し入れするピペッティング操作を行うか、または真空をかける）。最後に、溶出剤が、該担体材料中を通じてピペッティング操作される。この場合に、結合された核酸は、担体材料から引き離される。担体材料を収容しているピペットチップの使用は、核酸抽出の（特に）自動化された過程をかなり簡単にするということである。これらの着想が既に一部は比較的古いにもかかわらず（１９８７年５月２２日付けの独国特許第３７１７２１１号明細書といった特許文献）、そのような方法は定着しなかった。その原因となっているのは、この場合に、幾つかの根本的な問題である。
【０００４】
１）核酸を含有する高粘度の溶解物のピペッティング操作は、制限されて機能するにすぎないか、またはそれにより、クロマトグラフィー材料の完全な閉塞がもたらされる。そのため、抽出は不可能である。
【０００５】
２）多孔質材料を介した溶解物のピペッティング操作は、気泡形成をもたらす。気泡形成は、ピペッティング操作ステップの回数が増えるほど激しくなり、同様に抽出プロセスを不可能にし得る。
【０００６】
３）多孔質材料からのアルコール性成分の除去は困難であり、しばしば十分に取り出されない。
【０００７】
したがって、本発明の課題は、既知の問題点を解決することと、それにより核酸の自動化された抽出を、従来よりも明らかに簡単かつ迅速に実施し得ることであった。本発明のさらなる目的は、既存の液体ハンドリング機器プラットフォームを自動化された核酸抽出のために利用することを可能にすることにある。それは、簡単な手段で汎用的に可能であるべきである。
【０００８】
前記課題は、特許請求の範囲の特徴によって解決された。請求項１によれば、部分的にまたは完全に反応キャビティ中に浸漬することができる物体を含む、核酸を自動的に抽出する装置であって、少なくとも反応キャビティ中に浸漬する部分が、粗さのある表面または構造化された表面を有する装置が記載される。好ましくは、粗面化されているか、または粗さのある物品もしくは構造化された物品が外側に嵌められている、相応のピペットチップが使用される。この物品上には、溶液の極性が低下されたときに、核酸の沈着が起こる。それは、好ましくは有機溶剤（アルコール）の添加によるか、または先行技術で知られる結合バッファーによって生ずる。この物品上への核酸の結合は、この物品が平滑な表面を有する場合には起こらないことが明らかになった。請求項２〜請求項６は、本発明の好ましい実施形態である。
【０００９】
また、本発明の主題は、本発明による装置を有する、ウォークアウェイ原理による機器、例えば自動ピペッティング装置または自動抽出装置である。
【００１０】
本発明は、構造化された材料または粗さのある材料（例えばポリマー材料）の表面上に核酸が吸着するという知見を基礎とするものである。そのためには、核酸を含有する生物学的試料を溶解して、核酸を遊離させることだけが必要とされる。それは、当業者に公知のバッファーを用いて行うことができる。溶解後に、その試料に、水溶液の極性を低下させる物質、好ましくは有機溶剤、例えばアルコールまたはケトンを加える。それから、このバッチを、平滑でない表面を特徴とする材料と接触させる。これらの必要条件下で、核酸は、使用される材料の表面上に吸着する。その後に、場合により既知のアルコール性洗浄溶液による洗浄ステップが行われる。乾燥後に、吸着された核酸は、水または低塩バッファー（例えば、１０ｍＭのＴｒｉｓ塩酸）の添加によって該材料から引き離され、そして後続用途のために使用することができる。本発明による装置および本発明による方法は、簡単かつ自動化可能な抽出法のためのこの可能性を利用している。この場合に、該装置は、部分的に反応キャビティ中に浸漬することができる物体であって、この反応キャビティ中に浸漬する部分が平滑でない表面を有する物体からなる。好ましくは、液体を取り込んで放出することができる中空体が使用される。特に好ましくは、ピペットチップが使用される。ピペットチップは、その外面に下方終端から三分の一のところに構造化された材料または粗さのある材料が存在するように構成されている。それは、例えば適切なリングを嵌めることによって行うことができる（例えば、そのようなリングを、通常のピペットチップに嵌めることができ、これにより汎用性が際立つ）。しかしながら、中空体自体が同様にそのような構造的特徴（粗さ）を有してもよく、したがって、１つの部材からなってよく、そして射出成形工具内で製造することもできる。図１において、本発明による装置が、例として改変されたピペットチップについて描かれている。
【００１１】
本発明には、核酸を自動的に抽出する方法であって、以下のステップ：
ａ）溶解された生物学的試料を反応キャビティ中に入れて、そこに少なくとも、水溶液の極性を低下させる物質を加えるか、または核酸を固相に結合させるための手段を加えるステップ、
ｂ）請求項１から５までのいずれか１項に記載の装置をこのキャビティ中に浸漬させることで、核酸をこの装置の粗さのある部分または構造化された部分に結合させるステップ、
ｃ）場合により、該装置を、少なくともさらなるキャビティ中に移して、結合された核酸を洗浄するステップ、
ｄ）場合により、結合された核酸を乾燥させるステップ、
ｅ）乾燥した結合された核酸を、さらなるキャビティ中に移して、核酸を溶出させるステップ
を特徴とする方法も含まれる。
【００１２】
概念「粗さのある表面」とは、表面に触れるかまたは表面を見ることによって、この表面が平滑でないと認識できるものと理解されるべきである。しかしながら、この表面は、ある構造（例えば複数の溝）を有する表面であってもよい。この構造によって、該構造自体、つまり複数の溝自体が平滑であり得るとしても、表面の平滑性は相殺される。本発明によれば、そのような表面は、「構造化された表面」と呼ばれる。その表面を見るかまたは触れることによって、該表面が平滑かまたは粗さがあるかを認識可能でない場合に、レーザ光線をこの表面に当てる試験を実施することができる。平滑な表面の場合に、レーザは、表面上で主方向でのみ反射される。粗さのある表面の場合には、あらゆる空間方向に散乱が起こる。そのような一つの試験は、キール大学のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｆ．ｕｎｉ−ｋｉｅｌ．ｄｅ／ｍａｔｗｉｓ／ａｍａｔ／ｓｅｍｉｔｅｃｈ＿ｅｎ／ｋａｐ＿３／ｉｌｌｕｓｔｒ／ｏｂｅｒｆｌａｅｃｈｅｎｓｔｒｕｋｔｕｒｅ．ｐｄｆ）に記載されている。
【００１３】
本発明による装置は、本発明による核酸を自動的に抽出する方法に、以下のように使用される。好ましくは、古典的なウォークアウェイ原理が利用される、すなわち抽出のために必要とされる溶液が装入され、逐次抽出プロセスに取り入れられる。本発明の目的設定に相応して、自動化された抽出過程のために市販の自動抽出装置または自動ピペッティング装置さえも、これらが必要とされる技術的必要条件がある場合にも使用することができる。試料は、反応キャビティ中に入れられ、そこに溶解バッファーおよび場合によりタンパク質溶解酵素が加えられる。その後に、試料溶解が行われる。試料を既知の溶解バッファーで溶解した後に、溶解物に有機成分が添加される。この溶液に本発明による装置が浸漬され、その溶液中で垂直に数回上下に動かされる。このとき、核酸は前記装置上に存在する。その後に、該装置を溶液から取り出し、新たな反応キャビティ中に移動させる。この中には、アルコール性洗浄バッファー（ここでも、既知の洗浄バッファーを使用することもできる）またはアルコールのみが存在する。この溶液中に本発明による手段が浸漬され、その溶液中で垂直に数回上下に動かされる。洗浄ステップは、数回繰り返すことができる。最後の洗浄ステップの後に、該装置を溶液から取り出し、キャビティの外部で短時間乾燥させ、それにより残りのアルコールが除去される。最終ステップにおいて、本発明による装置を、水またはその他の低塩バッファーが存在するさらなるキャビティ中に浸漬させる。このキャビティ中に本発明による装置が浸漬され、その溶液中で垂直に数回上下に動かされる。それにより、結合された核酸が引き離される。この一般的な進行プロトコールから、今や自動化された抽出がどれほど簡単かは明白である。磁性粒子を用いる自動化された抽出の場合に該当する磁性粒子の分離は、もはや行う必要はない。該方法は、濾過プレートを利用する場合に必要とされるような真空濾過ステップを必要としない。本発明による装置およびピペッティングプラットフォームだけが必要とされるにすぎない。この場合にもちろん、本発明による装置が汎用的かつ簡単であることが好ましい。それというのも、市販の標準的なピペットチップを選ぶことができるからである。これらのピペットチップは、例えば、核酸の単離のために必要な特定の表面特性を有するリングを嵌めることによって、本発明による装置となり、したがって核酸の単離のための任意のピペッティングプラットフォームで使用することができるように改変される。
【００１４】
さらに、抽出のために必要とされる試薬は、相応の反応キャビティ中に既に装入されていてよいので、抽出プロセスは、ウォークアウェイ原理により進めることができる。さらなる具体的な利点は、本発明による手段が、核酸の結合を可能にするだけでなく、さらに個別の様式で液体を移動させることもできるということを通じて明らかにされる。この組み合わされた機能において、抽出過程は、なおもさらに最適化され得る。こうして、試料の溶解は既に、自動装置において行うことができる。溶解の間に必要とされる試料の連続的な運動は、本発明による装置のピペッティング機能によって達成される。さらに、最後の溶出ステップの後に、溶出物は、溶出キャビティからピペッティング機能によって取り出すことができ、そして貯蔵容器に移すことができる。本発明による手段の前記の簡単に実行可能な２つの機能によって、それにより自動化の度合いを、柔軟に高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】中空体に嵌められるリングの例示的な一実施形態である。
【図２】単離された核酸のゲル電気泳動的分離を示す図である。
【図３】単離された核酸のゲル電気泳動的分離を示す図である。
【００１６】
以下で本発明を、実施例をもとにより詳細に説明するつもりである。この場合に、それらの実施例は、本発明をなんら制限するものではない。
【００１７】
実施例
改変されたピペットチップを使用して、市販の自動抽出装置を使用した、本発明による方法によるＮＩＨ  ３Ｔ３細胞からの核酸の自動化された抽出
変法Ａ：  半自動式の抽出過程（試料溶解は個別に行う）
標準的な自動抽出装置のための例として、ＩｎｎｕＰｕｒｅ  Ｃ１６（Ａｎａｌｙｔｉｋ  Ｊｅｎａ  ＡＧ社）を使用した。このシステムは、磁性粒子ベースの抽出システムであり、本発明による方法の実施のために目的を外れて使用された。ＩｎｎｕＰｕｒｅ  Ｃ１６自動装置のために使用されるピペットチップの下端に、外側からピペッティング機能が損なわれないようにリングを嵌めた。この場合に、外側から嵌められたリングは、ポリマーからなり、そして構造化された表面を有する。中空体とその上に固定されたリングからの組み合わせは、本発明による方法を実施するための手段を構成する。
【００１８】
核酸抽出のために、種々の量のＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を使用した。核酸の単離のために使用される抽出用化学薬品は、この場合に、部分的には、市販の抽出キットｉｎｎｕＰＲＥＰ  Ｂｌｏｏｄ  ＤＮＡ  Ｋｉｔ／ＩＰＣ１６Ｘ（Ａｎａｌｙｔｉｋ  Ｊｅｎａ  ＡＧ社）から採用された。溶解バッファー（溶解溶液ＣＢＶ）およびプロテイナーゼＫによって、細胞を６０℃で１５分間にわたって２．０ｍｌの反応容器中で溶解させた。この場合に、溶解は、自動抽出装置中で行わなかった。引き続き、核酸の精製のためには、ＩｎｎｕＰｕｒｅ  Ｃ１６の自動化された方法を使用した。抽出のために必要な溶液は、予め充填されたＤｅｅｐ  Ｗｅｌｌプレート中に存在していた。上記の溶解物を、４００μｌのイソプロパノールで充填されたキャビティ中に入れた。リングを備えたピペットチップ（本発明による手段）は、これらのキャビティ中への垂直の浸漬運動を８０回実行し、ここで、キャビティの底で、それぞれ１回の２秒間のインキュベーションが終わるのを待った。その後に、リングで改変されたピペットチップを、逐次それぞれ１０回、アルコール性洗浄バッファー（洗浄溶液ＬＳ、８０％エタノール、８０％エタノール）を収容している３個のさらなるキャビティに浸漬した。
【００１９】
最後の洗浄ステップに引き続き、中空体上にあるリングをキャビティの外側で１０分間にわたって乾燥させ、それにより残留エタノールを除去した。核酸の溶出は、機器によって事前に５０℃に温度調節された２００μｌの溶出バッファー中で浸して浮き上がらせる運動を３０回繰り返すことによって行った。それに引き続き、同じキャビティ中で、４０℃で１００μｌの８０回のピペッティング操作によって混合ステップを行った。そのために、本発明による手段の本発明による２つの機能を利用した。
【００２０】
該方法は、実施が極めて簡単であり、それによって極めて迅速である。核酸抽出の標準的方法を、ＩｎｎｕＰｕｒｅ  Ｃ１６を用いた場合および磁性粒子を用いた場合と比較すると、５０％を上回る時間の節約となる。
【００２１】
単離された核酸の検出は、分光測光的測定と、アガロースゲル上でのゲル電気泳動図によって行われた。
【００２２】
分光測光的測定の結果：
【表１】
0006797185.tif 000002
【００２３】
それらの結果が示しているように、本発明による手段で、標準的な抽出用化学薬品および市販の抽出プラットフォームを使用して、核酸を結合させて単離することが可能である。収率は極めて高く、かつ使用される細胞量に依存して、収率に段階が見られることが明らかになる。
【００２４】
図２は、単離された核酸のゲル電気泳動的分離を示している。示されているのは、本発明による方法によって単離された核酸を、０．８％アガロースゲル中で電気泳動により分離したものである。試料は、試料１から始めて左から右へと施与した。施与された容量は、５μｌであった。
【００２５】
変法Ｂ：  全自動式の抽出過程（試料溶解は該機器中で行う）
さらなる実施形態においては、試料の溶解は、同様に自動化された形式で行われる。したがって、利用者によっては試料およびプロテイナーゼＫのみが添加されるべきであり、さらなる調製は、ＩｎｎｕＰｕｒｅ  Ｃ１６の技術を用いて完全に自動的に行われる。試料の溶解のために、試料は、ＩｎｎｕＰｕｒｅ  Ｃ１６によって５０℃に加熱され、２５０回の出し入れするピペッティング操作によって、その溶解はさらに強化される。引き続き、中空体のピペッティング機能によって、４００μｌのイソプロパノールを、予め充填されたキャビティから溶解物を有するキャビティ中への移動が行われる。全てのさらなるステップは、上記のように行われた。
【００２６】
【表２】
0006797185.tif 000003
【００２７】
図３は、単離された核酸のゲル電気泳動的分離を示している。示されているのは、本発明による方法および内部での溶解によって単離された核酸を、０．８％アガロースゲル中で電気泳動により分離したものである。試料は、試料１から始めて左から右へと施与した。施与された容量は、５μｌであった。
【００２８】
図１は、中空体に嵌められるリングの例示的な一実施形態である。その図は、大きく拡大されている。
【００２９】
示されているのは、本発明による方法による核酸抽出のために使用することができるリングの例示的な一実施形態である。この平滑でない表面を有する成形体は、これがその際に下方終端から三分の一のところに存在するように、任意の市販のピペットチップに嵌めることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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