(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲ  ｌｉｇｈｔ  １（ＣＤＲＬ１）、ＣＤＲ  ｌｉｇｈｔ  ２（ＣＤＲＬ２）およびＣＤＲ  ｌｉｇｈｔ  ３（ＣＤＲＬ３）；ならびに３つの重鎖ＣＤＲ：ＣＤＲ  ｈｅａｖｙ  １（ＣＤＲＨ１）、ＣＤＲ  ｈｅａｖｙ  ２（ＣＤＲＨ２）およびＣＤＲ  ｈｅａｖｙ  ３（ＣＤＲＨ３）である６つのＣＤＲのセットを含む、イヌのプログラム死リガンド１（イヌＰＤ−Ｌ１）と特異性を有して結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって：ここで、６つのＣＤＲのセットは、以下の群から選択され；
（ｉ）
ＣＤＲＨ１は、配列番号１３のアミノ酸配列を含み；
ＣＤＲＨ２は、配列番号１４のアミノ酸配列を含み；
ＣＤＲＨ３は、配列番号１５のアミノ酸配列を含み；
ＣＤＲＬ１は、配列番号１６のアミノ酸配列を含み；
ＣＤＲＬ２は、配列番号１７のアミノ酸配列を含み；
ＣＤＲＬ３は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む；及び
（ｉｉ）
ＣＤＲＨ１は、配列番号１９のアミノ酸配列を含み；
ＣＤＲＨ２は、配列番号２０のアミノ酸配列を含み；
ＣＤＲＨ３は、配列番号２１のアミノ酸配列を含み；
ＣＤＲＬ１は、配列番号２２のアミノ酸配列を含み；
ＣＤＲＬ２は、配列番号２３のアミノ酸配列を含み；
ＣＤＲＬ３は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む；
そして
前記抗体およびその抗原結合断片は、イヌＰＤ−Ｌ１と結合し、イヌＰＤ−Ｌ１のイヌプログラム死１（ＰＤ−１）への結合を遮断する、前記抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
抗体がイヌ化抗体である、請求項１の単離された抗体。
【請求項３】
配列番号６６および配列番号６８よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むイヌ結晶性フラグメント領域（ｃＦｃ領域）を含む、請求項２のイヌ化抗体またはその抗原結合断片であって；ここで、１から７個のアミノ酸残基が、Ｐ４、Ｄ３１、Ｎ６３、Ｇ６４、Ｔ６５、Ａ９３およびＰ９５よりなる群から選択される指示された位置で置換されている前記イヌ化抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
置換される１から７個のアミノ酸残基の置換が、Ｐ４Ａ、Ｄ３１Ａ、Ｎ６３Ａ、Ｇ６４Ａ、Ｔ６５Ａ、Ａ９３ＧおよびＰ９５Ａよりなる群から選択される、請求項３のイヌ化抗体。
【請求項５】
２つのアミノ酸置換Ｄ３１Ａ及びＮ６３Ａを含み、そして、Ｐ４、Ｇ６４、Ｔ６５、Ａ９３及びＰ９５のアミノ酸配列は維持される、請求項４のイヌ化抗体。
【請求項６】
配列番号６２および配列番号６４よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むイヌ結晶性フラグメント領域を含む、請求項２のイヌ化抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７および配列番号４８よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むヒンジ領域を含む、請求項６のイヌ化抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
（ｉ）配列番号２６であって、２４２位のアミノ酸がプロリンであり、２６９位のアミノ酸がアラニンであり、３０１位のアミノ酸がアラニンであり、３０２位のアミノ酸がグリシンであり、３０３位のアミノ酸がスレオニンであり、３３１位のアミノ酸がアラニンであり、そして３３３位のアミノ酸がプロリンである、
（ｉｉ）配列番号２８であって、２４０位のアミノ酸がプロリンであり、２６７位のアミノ酸がアラニンであり、２９９位のアミノ酸がアラニンであり、３００位のアミノ酸がグリシンであり、３０１位のアミノ酸がスレオニンであり、３２９位のアミノ酸がアラニンであり、そして３３１位のアミノ酸がプロリンである、
（ｉｉｉ）配列番号３０であって、２４０位のアミノ酸がプロリンであり、２６７位のアミノ酸がアラニンであり、２９９位のアミノ酸がアラニンであり、３００位のアミノ酸がグリシンであり、３０１位のアミノ酸がスレオニンであり、３２９位のアミノ酸がアラニンであり、そして３３１位のアミノ酸がプロリンである、および、
（ｉｖ）配列番号３２であって、２３８位のアミノ酸がプロリンであり、２６５位のアミノ酸がアラニンであり、２９７位のアミノ酸がアラニンであり、２９８位のアミノ酸がグリシンであり、２９９位のアミノ酸がスレオニンであり、３２７位のアミノ酸がアラニンであり、そして３２９位のアミノ酸がプロリンである、
よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項５のイヌ化抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
配列番号３４、配列番号３６、配列番号４０および配列番号４２よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項７のイヌ化抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
配列番号３８および配列番号４４よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むイヌ軽鎖をさらに含む、請求項２、３、４、５、６、７、８または９のイヌ化抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
イヌＰＤ−Ｌ１に結合する際に前記抗体が配列番号８２または配列番号８３のアミノ酸配列内の少なくとも１個のアミノ酸に結合し；前記抗体およびその抗原結合断片がイヌＰＤ−Ｌ１と結合し、イヌＰＤ−Ｌ１のイヌＰＤ−１への結合を遮断する、請求項２、３、４、５、６、７、８、９または１０の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１２】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１の抗体の軽鎖をコードする、単離された核酸。
【請求項１３】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１の抗体の重鎖をコードする、単離された核酸。
【請求項１４】
配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３および２４よりなる群から選択される１または複数のアミノ酸配列をコードする、請求項１２または１３の単離された核酸。
【請求項１５】
請求項１２、１３または１４の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１の抗体、請求項１２、１３または１４の核酸、請求項１５の発現ベクターまたはそれらの任意の組み合わせ、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年９月３０日に出願された米国仮出願第６２／０５７，５４１号および２０１５年６月８日に出願された米国仮出願第６２／１７２，５１１号の利益を主張するものであり、これらの内容はいずれも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、特異的性質を有する抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体に関する。本発明はまた、イヌＰＤ−Ｌ１に対する特異的配列および高い結合アフィニティーを持つイヌＰＤ−Ｌ１に対するイヌ化抗体に関する。本発明はさらに、これらの抗体に結合するイヌＰＤ−Ｌ１のエピトープに関し、並びにこれらのエピトープと結合する抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体に関する。本発明はさらに、がんの処置を包含するイヌの処置における本発明の抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
活性化されたＴ細胞およびＢ細胞上で主に発現する免疫抑制性受容体であるプログラム細胞死受容体１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １）は、プログラム死受容体１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １、ＰＤ−１）とも呼ばれ、ＣＤ２８および細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質−４（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−４、ＣＴＬＡ−４）に関連する免疫グロブリンスーパーファミリーの一員である。ＰＤ−１および同様のファミリーメンバーは、そのリガンドと結合する細胞外Ｉｇ可変型（Ｖ型）ドメインおよびシグナル伝達分子と結合する細胞質側末端を含有するＩ型膜貫通糖タンパク質である。ＰＤ−１の細胞質側末端は、２つのチロシンベースのシグナル伝達モチーフであるＩＴＩＭ（免疫受容体チロシンベース抑制モチーフ、ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ）およびＩＴＳＭ（免疫受容体チロシンベーススイッチモチーフ、ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｓｗｉｔｃｈ  ｍｏｔｉｆ）を含有する。
【０００４】
ＰＤ−１は、プログラム死リガンド１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ  Ｌｉｇａｎｄ  １、ＰＤ−Ｌ１）とも呼ばれるプログラム細胞死リガンド１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｌｉｇａｎｄ  １）および／またはプログラム死リガンド２（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ  Ｌｉｇａｎｄ  ２、ＰＤ−Ｌ２）とも呼ばれるプログラム細胞死リガンド２（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｌｉｇａｎｄ  ２）に結合したとき、Ｔ細胞応答を減弱する。これらのリガンドのいずれかのＰＤ−１への結合は、抗原受容体シグナル伝達を負に調節する。ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合の遮断は、腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫を増強し、同時に免疫系による腫瘍細胞のクリアランスを助ける。マウスＰＤ−１の３次元構造並びにマウスＰＤ−１とヒトＰＤ−Ｌ１との共結晶構造が報告されている［Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２０：３３７−３４７（２００４）；Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０５：３０１１−３０１６（２００８）］。
【０００５】
ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２は、既知のシグナル伝達モチーフを有さない短い細胞質領域を伴う細胞外領域内にＩｇＶ様ドメインおよびＩｇＣ様ドメインの両方を含有するＩ型膜貫通リガンドである。ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２はいずれも非造血組織並びに様々な腫瘍型を包含する種々の細胞型において恒常的に発現しているかまたは誘導され得る。ＰＤ−Ｌ１は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、骨髄細胞および樹状細胞（ＤＣ）上だけでなく、末梢細胞、例えば微小血管内皮細胞など、および非リンパ器官、例えば心臓または肺においても発現する。対照的に、ＰＤ−Ｌ２は、マクロファージおよびＤＣ上でのみ見出される。ＰＤ−１リガンドの発現パターンは、ＰＤ−１が末梢の耐性維持において役割を果たし、さらに末梢における自己反応性のＴ細胞応答およびＢ細胞応答を調節するのに役立ち得ることを示唆する。
【０００６】
いずれにせよ、今やＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１がおそらく免疫回避を仲介することによって少なくともある種のヒトのがんにおいて決定的な役割を果たすことは大いに明らかである。それに応じて、ＰＤ−Ｌ１は多数のマウスおよびヒトの腫瘍上で発現することが示されており、ＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍細胞株の大半においてＩＦＮ−γにより誘導可能である［Ｉｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：１２２９３−１２２９７（２００２）；Ｓｔｒｏｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６３：６５０１−６５０５（２００３）］。そのうえ、リンパ球が浸潤している腫瘍上のＰＤ−１の発現および／または腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１の発現が、多数の原発ヒト腫瘍の生検において確認されている。かかる腫瘍組織としては、肺、肝臓、卵巣、子宮頸部、皮膚、結腸、神経膠腫、膀胱、乳房、腎臓、食道、胃、口腔扁平細胞、尿路上皮細胞および膵臓のがん、並びに頭頸部の腫瘍が挙げられる［Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：１２５７−１２６６（２００３）；Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：７９３−８００（２００２）；Ｗｉｎｔｔｅｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：７４６２−７４６７（２００３）；Ｓｔｒｏｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６３：６５０１−６５０５（２００３）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６：３３８１−５（２００６）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１３：１７５７−１７６１（２００７）；Ｎｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１３：２１５１−２１５７．（２００７）］。より際立ったことに、腫瘍細胞上のＰＤリガンドの発現は、複数の腫瘍型にわたってヒトがん患者の予後不良と相関している［Ｏｋａｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｈｏｎｊｏ，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：８１３−８２４（２００７）中に概説されている］。
【０００７】
さらには、Ｎｏｍｉら［Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１３：２１５１−２１５７（２００７）］は、侵攻性膵臓がんのマウスモデルにおいて、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に対する抗体を投与することを通じて、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合遮断の治療有効性を実証した。これらの抗体は、腫瘍内への腫瘍反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤を効果的に促進し、ＩＦＮ−γ、グランザイムＢおよびパーフォリンといった抗腫瘍エフェクターのアップレギュレーションをもたらした。同様に、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−１の結合を遮断する抗体の使用は、マウス扁平細胞癌モデルにおける腫瘍増殖を顕著に阻害した［Ｔｓｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒａｌ  Ｏｎｃｏｌ．４２：２６８−２７４（２００６）］。
【０００８】
他の研究において、マウスマスト細胞腫株のＰＤ−Ｌ１でのトランスフェクションは、腫瘍特異的ＣＴＬクローンと共培養したときの腫瘍細胞の溶解の減少を導いた。抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体を加えると、溶解は回復した［Ｉｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：１２２９３−１２２９７（２００２）］。インビボでＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を遮断することは、マウス腫瘍モデルにおける養子Ｔ細胞移入治療の有効性を向上させることが示された［Ｓｔｒｏｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：６５０１−６５０５（２００３）］。がん処置におけるＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１の役割についてのさらなる証拠は、ＰＤ−Ｌ１を発現する骨髄腫細胞が野生型動物においてのみ増殖し（腫瘍増殖および付随する動物死をもたらした）、ＰＤ−１欠損マウスにおいては増殖しなかったという、ＰＤ−１ノックアウトマウスを使用して実施された実験から得られる［Ｉｗａｉ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：１２２９３−１２２９７（２００２）］。より近年に、ヒトＰＤ−１に対するヒト化マウスモノクローナル抗体はヒトのがん治療において最初の成功を示している［例えばＵＳ８，３５４，５０９Ｂ２、ＵＳ８，００８，４４９Ｂ２およびＵＳ７，５９５，０４８Ｂ２を参照されたい］。
【０００９】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、慢性ウイルス感染においても有用であり得る。急性ウイルス感染の後に生成されるメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞は高度に機能的であり、防御免疫の重要な構成要素となる。対照的に、慢性感染はしばしば様々な程度のウイルス特異的Ｔ細胞応答の機能的障害（枯渇）を特徴とし、この欠陥は宿主が生き残っている病原体を除去することができないことの主な理由である。感染の初期段階の間に機能的エフェクターＴ細胞が最初に生成されるが、これらは慢性感染の過程の間に徐々に機能を失う。Ｂａｒｂｅｒら［Ｎａｔｕｒｅ  ４３９：６８２−６８７（２００６）］は、ＬＣＭＶの実験室株に感染したマウスは血液および他の組織中に高レベルのウイルスをもたらす慢性感染に罹患したことを示した。これらのマウスは最初は頑強なＴ細胞応答を生じたが、Ｔ細胞が枯渇するとやがて感染に屈した。Ｂａｒｂｅｒらは、慢性感染マウスにおけるエフェクターＴ細胞の数および機能の低下は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用を遮断する抗体を注射することにより元に戻すことができることを見出した。
【００１０】
イヌの抗体（免疫グロブリンＧまたはＩｇＧとも呼ばれる）は、約１５０Ｋｄの大きな４量体タンパク質である。各ＩｇＧタンパク質は、それぞれ約２５Ｋｄの２つの同一の軽鎖およびそれぞれ約５０Ｋｄの２つの同一の重鎖から構成される。イヌＩｇＧには４つの既知のＩｇＧ重鎖サブクラスがあり、それらはＩｇＧＡ、ＩｇＧＢ、ＩｇＧＣおよびＩｇＧＤと呼ばれる。軽鎖には２つのタイプ；カッパ鎖およびラムダ鎖がある。カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖の各々は、１つの可変ドメイン（ＶＬ）および１つの定常ドメイン（ＣＬ）から構成される。２つの重鎖の各々は、１つの可変ドメイン（ＶＨ）、ならびにＣＨ−１、ＣＨ−２およびＣＨ−３と呼ばれる３つの定常ドメインからなる。ＣＨ−１ドメインは、「ヒンジ」あるいは「ヒンジ領域」と呼ばれるアミノ酸配列を通じてＣＨ−２ドメインにつながっている。ヒトにおいて、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４と呼ばれる４つのサブクラスのうちの１つに存する。ＩｇＧのサブクラスは大きくはヒンジ領域の配列により決定されるが、この配列はＩｇＧの４つのサブクラスの中で異なっている。２つの重鎖はジスルフィド結合により互いに連結されていて、各重鎖はまたジスルフィド結合を介して軽鎖の１つとも連結されている。
【００１１】
酵素パパインでのＩｇＧ抗体の消化はヒンジ領域において抗体分子を破壊し、３つの断片の形成をもたらす。これらの断片のうちの２つは同一であり、各々は重鎖のＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインと結び付いた軽鎖からなる。これらの断片は「Ｆａｂ」断片といわれ、抗体の抗原結合部位を含有する。パパインでの消化により生じる第三の断片は「Ｆｃ」といわれ、ジスルフィド結合により結び付いた２つの重鎖の残部を含有する。Ｆｃは、それゆえに、２つの重鎖の各々のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインからなるダイマーを含有する。Ｆａｂは抗体がその同族エピトープに結合することを可能にするのに対し、Ｆｃは抗体が免疫エフェクター機能、例えば抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）および補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）などを仲介することを可能にする。
【００１２】
ＩｇＧ抗体はそれらのＦｃ部分とＦｃγ受容体として知られるタンパク質のファミリーとの結合を介してエフェクター機能、例えばＡＤＣＣおよびＡＤＣＰなどを仲介する一方、ＣＤＣは、Ｆｃと補体第一成分であるＣ１ｑとの結合を介して仲介されることが当該技術分野で周知である。異なるＩｇＧサブクラスはこれらエフェクター機能を仲介する能力が異なることもまた当該技術分野で周知である。例えば、ヒトＩｇＧ１は強いＡＤＣＣおよびＣＤＣを発揮するが、ＩｇＧ４はＡＤＣＣおよびＣＤＣを弱く発揮するか全く発揮しない。加えて、どのＩｇＧサブクラスがエフェクター機能を発揮するまたは欠くのかを確認する方法も当該技術分野で周知である。
【００１３】
治療目的のためのモノクローナル抗体の使用に依拠するアプローチは、所望の治療応答を達成するために目的にかなった抗体または抗体断片の設計を必要とする。例えば、がんのためのいくつかの治療アプローチはエフェクター機能が増強された治療抗体を必要とするが、他のアプローチではエフェクター機能が顕著に低減されるまたは完全に除去されることを必要とする。エフェクター機能の増強または除去は、Ｆｃγ受容体と補体第一成分との結合を増強または低減させるような抗体のＦｃ部分への１または複数のアミノ酸変異（置換）の導入によって達成され得る。従来技術の中には、エフェクター機能を調整するために抗体分子内に導入され得るアミノ酸置換を記述している多数の報告がある。例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓら［Ｊ．  ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（９）：６５９１−６６０４（２００１）］は、アスパラギンからアラニンへの置換（Ｎ２９７Ａ）が糖化されていない抗体をもたらし、いくつかのＦｃγ受容体への抗体の結合を顕著に低減させることを開示した。加えて、Ｓｈｉｅｌｄｓらは、アスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ２６５Ａ）もまたＦｃγ受容体への抗体の結合を顕著に低減させることを開示した。Ｎ２９７Ａ置換およびＤ２６５Ａ置換の各々はまた、ＣＤＣを顕著に減じることも示された。抗体のエフェクター機能を低減または除去するための可能性のある置換を同定した同様の報告は他にもある［例えば、Ｓａｚｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０５：２０１６７−２０１７２（２００８）、Ａｌｅｇｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，５７：１５３７−１５４３（１９９４）、Ｈｕｔｃｈｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９２：１１９８０−１１９８４（１９９４）、ＭｃＥａｒｃｈｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０９：１１８５−１１９２（２００７）］。
【００１４】
本明細書におけるあらゆる参考文献の引用は、かかる参考文献が本出願に対する「従来技術」として利用可能であるという自認として解釈されるべきではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】ＵＳ８，３５４，５０９Ｂ２
【特許文献２】ＵＳ８，００８，４４９Ｂ２
【特許文献３】ＵＳ７，５９５，０４８Ｂ２
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２０：３３７−３４７（２００４）
【非特許文献２】Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０５：３０１１−３０１６（２００８）
【非特許文献３】Ｉｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：１２２９３−１２２９７（２００２）
【非特許文献４】Ｓｔｒｏｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６３：６５０１−６５０５（２００３）
【非特許文献５】Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：１２５７−１２６６（２００３）
【非特許文献６】Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：７９３−８００（２００２）
【非特許文献７】Ｗｉｎｔｔｅｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：７４６２−７４６７（２００３）
【非特許文献８】Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６：３３８１−５（２００６）
【非特許文献９】Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１３：１７５７−１７６１（２００７）
【非特許文献１０】Ｎｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１３：２１５１−２１５７（２００７）
【非特許文献１１】Ｏｋａｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｈｏｎｊｏ，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：８１３−８２４（２００７）
【非特許文献１２】Ｔｓｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒａｌ  Ｏｎｃｏｌ．４２：２６８−２７４（２００６）
【非特許文献１３】Ｂａｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４３９：６８２−６８７（２００６）
【非特許文献１４】Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（９）：６５９１−６６０４（２００１）
【非特許文献１５】Ｓａｚｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０５：２０１６７−２０１７２（２００８）
【非特許文献１６】Ａｌｅｇｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，５７：１５３７−１５４３（１９９４）
【非特許文献１７】Ｈｕｔｃｈｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９２：１１９８０−１１９８４（１９９４）
【非特許文献１８】ＭｃＥａｒｃｈｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０９：１１８５−１１９２（２００７）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、イヌのプログラム死リガンド１（イヌＰＤ−Ｌ１）と特異性を有して結合する抗体およびその抗原結合断片（単離された抗体および単離されたその抗原結合断片を包含する）を提供する。特定の実施形態において、抗体およびその断片は哺乳動物の抗体である。より特定の実施形態において、哺乳動物の抗体は、マウスの（すなわちマウス）抗体である。本発明の関連する態様において、単離された抗体はイヌ化抗体である。具体的な実施形態において、イヌ化抗体は、イヌ化された哺乳動物（例えばマウス）の抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体である。本発明の抗体およびその抗原結合断片は、イヌＰＤ−Ｌ１と結合し、イヌＰＤ−Ｌ１のイヌプログラム死受容体１（ＰＤ−１）への結合を遮断することができる。本発明はさらに、イヌにおける疾患の処置、例えばがんの処置におけるかかる抗体またはその抗原結合断片の使用を提供する。
【００１８】
特定の実施形態において、イヌＰＤ−Ｌ１と特異性を有して結合する抗体またはその抗原結合断片は、３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲ  ｌｉｇｈｔ  １（ＣＤＲＬ１）、ＣＤＲ  ｌｉｇｈｔ  ２（ＣＤＲＬ２）およびＣＤＲ  ｌｉｇｈｔ  ３（ＣＤＲＬ３）；ならびに３つの重鎖ＣＤＲ：ＣＤＲ  ｈｅａｖｙ  １（ＣＤＲＨ１）、ＣＤＲ  ｈｅａｖｙ  ２（ＣＤＲＨ２）およびＣＤＲ  ｈｅａｖｙ  ３（ＣＤＲＨ３）を含む。
【００１９】
ある実施形態において、ＣＤＲＨ１は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、ＣＤＲＨ１は、配列番号１３の保存的改変バリアントを含む。さらに他の実施形態において、ＣＤＲＨ１は、カノニカル構造クラス１を含む配列番号１３のバリアント（例えば機能保存的バリアント）を含む。なお他の実施形態において、ＣＤＲＨ１は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態において、ＣＤＲＨ１は、配列番号１９の保存的改変バリアントを含む。なお他の実施形態において、ＣＤＲＨ１は、カノニカル構造クラス１を含む配列番号１９のバリアント（例えば機能保存的バリアント）を含む。
【００２０】
ある実施形態において、ＣＤＲＨ２は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、ＣＤＲＨ２は、配列番号１４の保存的改変バリアントを含む。なお他の実施形態において、ＣＤＲＨ２は、カノニカル構造クラス３Ｂを含む配列番号１４のバリアント（例えば機能保存的バリアント）を含む。さらに他の実施形態において、ＣＤＲＨ２は、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。なお他の実施形態において、ＣＤＲＨ２は、配列番号２０の保存的改変バリアントを含む。さらに他の実施形態において、ＣＤＲＨ２は、カノニカル構造クラス３Ｂを含む配列番号２０のバリアント（例えば機能保存的バリアント）を含む。
【００２１】
ある実施形態において、ＣＤＲＨ３は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、ＣＤＲＨ３は、配列番号１５の保存的改変バリアントを含む。なお他の実施形態において、ＣＤＲＨ３は、カノニカル構造クラス１０を含む配列番号１５のバリアント（例えば機能保存的バリアント）を含む。さらに他の実施形態において、ＣＤＲＨ３は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。なお他の実施形態において、ＣＤＲＨ３は、配列番号２１の保存的改変バリアントを含む。さらに他の実施形態において、ＣＤＲＨ３は、カノニカル構造クラス８を含む配列番号２１のバリアント（例えば機能保存的バリアント）を含む。
【００２２】
ある実施形態において、ＣＤＲＬ１は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、ＣＤＲＬ１は、配列番号１６の保存的改変バリアントを含む。なお他の実施形態において、ＣＤＲＬ１は、カノニカル構造クラス２を含む配列番号１６のバリアント（例えば機能保存的バリアント）を含む。さらに他の実施形態において、ＣＤＲＬ１のアミノ酸配列は、配列番号２２を含む。なお他の実施形態において、ＣＤＲＬ１は、配列番号２２の保存的改変バリアントを含む。さらに他の実施形態において、ＣＤＲＬ１は、カノニカル構造クラス３を含む配列番号２２のバリアント（例えば機能保存的バリアント）を含む。
【００２３】
ある実施形態において、ＣＤＲＬ２は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、ＣＤＲＬ２は、配列番号１７の保存的改変バリアントを含む。なお他の実施形態において、ＣＤＲＬ２は、カノニカル構造クラス１を含む配列番号１７のバリアント（例えば機能保存的バリアント）を含む。さらに他の実施形態において、ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列は、配列番号２３を含む。なお他の実施形態において、ＣＤＲＬ２は、配列番号２３の保存的改変バリアントを含む。さらに他の実施形態において、ＣＤＲＬ２は、カノニカル構造クラス１を含む配列番号２３のバリアント（例えば機能保存的バリアント）を含む。
【００２４】
ある実施形態において、ＣＤＲＬ３は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、ＣＤＲＬ３は、配列番号１８の保存的改変バリアントを含む。なお他の実施形態において、ＣＤＲＬ３は、カノニカル構造クラス１を含む配列番号１８のバリアント（例えば機能保存的バリアント）を含む。さらに他の実施形態において、ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列は、配列番号２４を含む。なお他の実施形態において、ＣＤＲＬ３は、配列番号２４の保存的改変バリアントを含む。なお他の実施形態において、ＣＤＲＬ３は、カノニカル構造クラス１を含む配列番号２４のバリアント（例えば機能保存的バリアント）を含む。
【００２５】
本発明はさらに、所与の抗体における、本発明のＣＤＲ（またはそのバリアント）のうちの２以上の組み合わせを、例えば配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３および配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３の組み合わせを提供する。
【００２６】
具体的な実施形態において、イヌＰＤ−Ｌ１と結合する抗体およびその抗原結合断片は、配列番号１３、配列番号１３の保存的改変バリアント、またはカノニカル構造クラス１を含む配列番号１３のバリアント（例えば機能保存的バリアント）のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１；配列番号１４、配列番号１４の保存的改変バリアント、またはカノニカル構造クラス３Ｂを含む配列番号１４のバリアント（例えば機能保存的バリアント）のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２；配列番号１５、配列番号１５の保存的改変バリアント、またはカノニカル構造クラス１０を含む配列番号１５のバリアント（例えば機能保存的バリアント）を含むＣＤＲＨ３；配列番号１６、配列番号１６の保存的改変バリアント、またはカノニカル構造クラス２を含む配列番号１６のバリアント（例えば機能保存的バリアント）のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１；配列番号１７、配列番号１７の保存的改変バリアント、またはカノニカル構造クラス１を含む配列番号１７のバリアント（例えば機能保存的バリアント）のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２；および、配列番号１８、配列番号１８の保存的改変バリアント、またはカノニカル構造クラス１を含む配列番号１８のバリアント（例えば機能保存的バリアント）のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む。
【００２７】
関連する実施形態において、イヌＰＤ−Ｌ１と結合する抗体およびその抗原結合断片は、配列番号１９、配列番号１９の保存的改変バリアント、またはカノニカル構造クラス１を含む配列番号１９のバリアント（例えば機能保存的バリアント）のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１；配列番号２０、配列番号２０の保存的改変バリアント、またはカノニカル構造クラス３Ｂを含む配列番号２０のバリアント（例えば機能保存的バリアント）のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２；配列番号２１、配列番号２１の保存的改変バリアント、またはカノニカル構造クラス８を含む配列番号２１のバリアント（例えば機能保存的バリアント）を含むＣＤＲＨ３；配列番号２２、配列番号２２の保存的改変バリアント、またはカノニカル構造クラス３を含む配列番号２２のバリアント（例えば機能保存的バリアント）のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１；配列番号２３、配列番号２３の保存的改変バリアント、またはカノニカル構造クラス１を含む配列番号２３のバリアント（例えば機能保存的バリアント）のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２；および、配列番号２４、配列番号２４の保存的改変バリアント、またはカノニカル構造クラス１を含む配列番号２４のバリアント（例えば機能保存的バリアント）のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む。
【００２８】
したがって、本発明の特定の態様において、本発明はさらに、イヌ化された抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体を提供する。ある実施形態において、イヌ化された抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体は、イヌ化された哺乳動物の（例えばマウスの）抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体である。具体的な実施形態において、イヌ化された抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体（例えばイヌ化された哺乳動物抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体、例えばイヌ化されたマウス抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体など）は、１または複数のエフェクター機能を増大、減少または除去するように遺伝子改変されたｃＦｃを含む。このタイプの特定の実施形態において、遺伝子改変されたｃＦｃは、１または複数のエフェクター機能を減少または除去する。他の特定の実施形態において、遺伝子改変されたｃＦｃは、１または複数のエフェクター機能を増大させる。
【００２９】
ある実施形態において、遺伝子改変されたｃＦｃ領域は、遺伝子改変されたイヌＩｇＧＢ  Ｆｃ領域である。別のかかる実施形態において、遺伝子改変されたｃＦｃ領域は、遺伝子改変されたイヌＩｇＧＣ  Ｆｃ領域である。特定の実施形態において、エフェクター機能は、増大、減少または除去される抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）である。別の他の実施形態において、エフェクター機能は、増大、減少または除去される補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）である。さらなる別の実施形態において、ｃＦｃ領域はＡＤＣＣおよびＣＤＣの両方を増大、減少または除去するように遺伝子改変されている。
【００３０】
本発明はさらに、遺伝子改変されたｃＦｃ領域を含むイヌのフレームおよび／または完全長の重鎖を提供する。したがって、本発明は、本発明の遺伝子改変されたｃＦｃ領域および本発明のＣＤＲを含む抗体の完全長重鎖を提供する。かかる完全長重鎖はまた、完全な抗体を形成させるために対応するイヌ軽鎖（カッパ鎖またはラムダ鎖）と組み合わせることができる。このタイプの特定の実施形態において、結果として得られる抗体はイヌＰＤ−Ｌ１に結合する。
【００３１】
ある実施形態において、遺伝子改変されたｃＦｃ領域は、次のアミノ酸残基：Ｐ４、Ｄ３１、Ｎ６３、Ｇ６４、Ｔ６５、Ａ９３またはＰ９５のうちの１から７個が指し示された位置で別のアミノ酸残基に置き換えられた配列番号６６（または配列番号６８）のアミノ酸配列を含む。Ｐ４、Ｄ３１、Ｎ６３、Ｇ６４、Ｔ６５、Ａ９３および／またはＰ９５を置換するアミノ酸は、下の表１中に収載されているように、その他の１９個の標準的な天然起源のアミノ酸のうちの１つから個々に選択される。本発明はさらに、かかる遺伝子改変されたｃＦｃ領域のアミノ酸配列と９０％、９５％、９８％または９９％同一であるアミノ酸を含み、配列番号６６（または配列番号６８）のアミノ酸配列を含む遺伝子改変されたｃＦｃ領域の少なくとも５０％、７５％、９０％、９５％またはそれより多くのＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣの増強、減少または除去を保持した遺伝子改変されたｃＦｃ領域のバリアントを提供するものであり、ここで次のアミノ酸残基：すなわちＰ４、Ｄ３１、Ｎ６３、Ｇ６４、Ｔ６５、Ａ９３またはＰ９５のうちの１または複数が置き換えられた。
【００３２】
他の実施形態において、次のアミノ酸残基：Ｐ４、Ｄ３１、Ｎ６３、Ｇ６４、Ｔ６５、Ａ９３またはＰ９５のうちの２から５個が、示された位置で別のアミノ酸残基により置き換えられている。このタイプの特定の実施形態において、遺伝子改変されたｃＦｃ領域は、次の置換：Ｐ４Ａ、Ｄ３１Ａ、Ｎ６３Ａ、Ａ９３ＧおよびＰ９５Ａを有する配列番号６６または配列番号６８のアミノ酸配列を含む。関連する実施形態において、遺伝子改変されたｃＦｃ領域は、次の置換：Ｐ４Ａ、Ｄ３１Ａ、Ｎ６３ＡおよびＰ９５Ａを有する配列番号６６または配列番号６８のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、遺伝子改変されたｃＦｃ領域は、Ｄ３１およびＮ６３での置換を有する配列番号６６または配列番号６８のアミノ酸配列を含む。このタイプの特定の実施形態において、３１位のアスパラギン酸残基はグルタミン酸残基、アスパラギン残基またはアラニン残基で置き換えられ、６３位のアスパラギン残基はグルタミン残基、ヒスチジン残基またはアラニン残基で置き換えられる。このタイプのより特定の実施形態において、遺伝子改変されたｃＦｃ領域は、次の置換：Ｄ３１ＡおよびＮ６３Ａを有する配列番号６６または配列番号６８のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、遺伝子改変されたｃＦｃ領域は、それらがコードするアミノ酸配列に対応したヌクレオチド変化を含む配列番号６５または配列番号６７のヌクレオチド配列によりコードされる。
【００３３】
別の実施形態において、遺伝子改変されたｃＦｃ領域は、Ａ９３に置換を有する配列番号６６または配列番号６８のアミノ酸配列を含む。このタイプの特定の実施形態において、置換はＡ９３Ｇである。関連する実施形態において、置換はＡ９３Ｓである。２０１４年７月３０日に出願され、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる米国仮出願第６２／０３０，８１２号中に記載されているように、Ａ９３Ｇの置換は補体Ｃ１ｑの結合亢進を導き、このことはＣＤＣ活性向上を示す。
【００３４】
関連する実施形態において、遺伝子改変されたｃＦｃ領域はさらに、配列番号４５のアミノ酸配列を含むヒンジ領域を含む。他の実施形態において、遺伝子改変されたＦｃ領域はさらに、配列番号４６のアミノ酸配列を含むヒンジ領域を含む。なお他の実施形態において、遺伝子改変されたＦｃ領域はさらに、配列番号４７のアミノ酸配列を含むヒンジ領域を含む。さらに他の実施形態において、遺伝子改変されたＦｃ領域はさらに、配列番号４８のアミノ酸配列を含む遺伝子改変されたヒンジ領域を含む。
【００３５】
代替的実施形態において、本発明は、イヌＩｇＧＤ抗体からの遺伝子改変されたヒンジ領域、イヌＩｇＧＡ抗体からのヒンジ領域、イヌＩｇＧＢ抗体からのヒンジ領域またはイヌＩｇＧＣ抗体からのヒンジ領域を有するイヌＩｇＧＤ  Ｆｃ領域を提供する。さらには、本発明は、イヌＩｇＧＤ抗体からの遺伝子改変されたヒンジ領域、イヌＩｇＧＡ抗体からのヒンジ領域、イヌＩｇＧＢ抗体からのヒンジ領域またはイヌＩｇＧＣ抗体からのヒンジ領域を有する本発明のイヌＩｇＧＤ  Ｆｃ領域を含む、抗体の完全長重鎖を提供する。かかる完全長重鎖はまた、完全な抗体を形成させるために対応するイヌ軽鎖（カッパ鎖またはラムダ鎖）と組み合わせることができる。
【００３６】
したがって、本発明は、イヌＩｇＧＤ抗体からの遺伝子改変されたヒンジ領域をさらに含むイヌＩｇＧＤ  Ｆｃ領域を提供する。このタイプの特定の実施形態において、イヌＩｇＧＤ  Ｆｃ領域および遺伝子改変されたヒンジ領域は、配列番号６のアミノ酸配列または配列番号６のアミノ酸と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含み、これは１０位にプロリン残基（Ｐ１０）を含む。より特定の実施形態において、イヌＩｇＧＤ  Ｆｃ領域および遺伝子改変されたヒンジ領域は、配列番号５のヌクレオチド配列によりコードされる。他の実施形態において、イヌＩｇＧＤ  Ｆｃ領域は、イヌＩｇＧＡ抗体からのヒンジ領域をさらに含む。このタイプの特定の実施形態において、イヌＩｇＧＤ  Ｆｃ領域およびヒンジ領域は、配列番号８のアミノ酸配列または配列番号８のアミノ酸と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む。より特定の実施形態において、イヌＩｇＧＤ  Ｆｃ領域およびヒンジ領域は、配列番号７のヌクレオチド配列によりコードされる。なお他の実施形態において、イヌＩｇＧＤ  Ｆｃ領域は、イヌＩｇＧＢ抗体からのヒンジ領域をさらに含む。このタイプの特定の実施形態において、イヌＩｇＧＤ  Ｆｃ領域およびヒンジ領域は、配列番号１０のアミノ酸配列または配列番号１０のアミノ酸と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む。より特定の実施形態において、イヌＩｇＧＤ  Ｆｃ領域およびヒンジ領域は、配列番号９のヌクレオチド配列によりコードされる。さらに他の実施形態において、イヌＩｇＧＤ  Ｆｃ領域は、イヌＩｇＧＣ抗体からのヒンジ領域をさらに含む。このタイプの特定の実施形態において、イヌＩｇＧＤ  ｃＦｃ領域およびヒンジ領域は、配列番号１２のアミノ酸配列または配列番号１２のアミノ酸と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む。より特定の実施形態において、イヌＩｇＧＤ  Ｆｃ領域およびヒンジ領域は、配列番号１１のヌクレオチド配列によりコードされる。本発明はさらに、これらのイヌＩｇＧＤ  Ｆｃ領域およびヒンジ領域を含むイヌ化抗体を提供する。特定の実施形態において、イヌ化抗体またはその抗原結合断片は、イヌのプログラム死受容体１（イヌＰＤ−１）と特異性を有して結合する。
【００３７】
本発明は、それゆえ、イヌＰＤ−Ｌ１への特異性を有するおよび／または高い結合アフィニティーを持つイヌ化抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体を提供する。特定の実施形態において、イヌ化抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体はまた、イヌＰＤ−Ｌ１のイヌＰＤ−１への結合を遮断する能力を持つ。イヌＰＤ−Ｌ１と特異的に結合するかかるイヌ化抗体またはその抗原結合断片は、本発明のイヌＩｇＧ重鎖およびイヌのカッパ軽鎖またはラムダ軽鎖を含むことができる。特定の実施形態において、イヌ化抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体は、イヌ化マウス抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体である。本発明はまた、疾患、例えばがんおよび／または感染に起因する疾患などの処置における、かかるイヌ化抗体の使用に関する。
【００３８】
特定の実施形態において、イヌ化抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体は、本発明の遺伝子改変されたｃＦｃ領域を含む。代替的実施形態において、イヌ化抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体は、イヌＩｇＧＤ抗体からの遺伝子改変されたヒンジ領域、イヌＩｇＧＡ抗体からのヒンジ領域、イヌＩｇＧＢ抗体からのヒンジ領域またはイヌＩｇＧＣ抗体からのヒンジ領域を有するイヌＩｇＧＤ  Ｆｃ領域を含む。本発明はさらに、マウス抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体から得られるＣＤＲ、すなわち３つの軽鎖ＣＤＲ：ＣＤＲ  ｌｉｇｈｔ  １（ＣＤＲＬ１）、ＣＤＲ  ｌｉｇｈｔ  ２（ＣＤＲＬ２）およびＣＤＲ  ｌｉｇｈｔ  ３（ＣＤＲＬ３）ならびに３つの重鎖ＣＤＲ、ＣＤＲ  ｈｅａｖｙ  １（ＣＤＲＨ１）、ＣＤＲ  ｈｅａｖｙ  ２（ＣＤＲＨ２）およびＣＤＲ  ｈｅａｖｙ  ３（ＣＤＲＨ３）と組み合わせた本発明のイヌのフレームを含む、かかるイヌ化抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体を提供する。
【００３９】
特定の実施形態において、イヌ化マウス抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体は、マウス抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体から得られるＣＤＲと組み合わせた、本発明のＩｇＧＢもしくはＩｇＧＣの遺伝子改変されたｃＦｃ領域、またはあるいはイヌＩｇＧＤ抗体からの遺伝子改変されたヒンジ領域、イヌＩｇＧＡ抗体からのヒンジ領域、イヌＩｇＧＢ抗体からのヒンジ領域もしくはイヌＩｇＧＣ抗体からのヒンジ領域を伴うイヌＩｇＧＤ  Ｆｃ領域、を含む。さらには、本発明は、本明細書中に詳述されている特異的ＣＤＲを有するイヌ化マウス抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体を提供するのみならず、それらのＣＤＲの保存的改変バリアント、並びに同一のカノニカル構造を含む（例えば共有する）バリアントを含むイヌ化マウス抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体をさらに提供する。
【００４０】
したがって、特定の実施形態において、イヌ化抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体は相補性決定領域（ＣＤＲ）をさらに含み、このＣＤＲはそれぞれ重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に関してカノニカル構造：Ｈ１−１、Ｈ２−３ＢおよびＨ３−１０を持つ。よりいっそう特定の実施形態において、対応する軽鎖のＣＤＲは、それぞれ軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に関してカノニカル構造：Ｌ１−２、Ｌ２−１およびＬ３−１を持つ。他の実施形態において、イヌ化抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体は相補性決定領域（ＣＤＲ）をさらに含み、このＣＤＲはそれぞれ重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に関してカノニカル構造：Ｈ１−１、Ｈ２−３ＢおよびＨ３−８を持つ。このタイプのよりいっそう特定の実施形態において、対応する軽鎖のＣＤＲは、それぞれ軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に関してカノニカル構造：Ｌ１−３、Ｌ２−１およびＬ３−１を持つ。
【００４１】
より特定の実施形態において、本発明のイヌ化抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１３または配列番号１９のアミノ酸配列を有する１または複数の重鎖相補性決定領域１（ＶＨ  ＣＤＲ１）を含む。別の実施形態において、重鎖相補性決定領域２（ＶＨ  ＣＤＲ２）は、配列番号１４または配列番号２０のアミノ酸配列を含む。なお別の実施形態において、重鎖相補性決定領域３（ＶＨ  ＣＤＲ３）は、配列番号１５または配列番号２１のアミノ酸配列を含む。このタイプの特定の実施形態において、イヌ化抗体または抗原結合断片は、配列番号１３または配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１および配列番号１４または配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２の両方を含む。
【００４２】
別のかかる実施形態において、イヌ化抗体または抗原結合断片は、配列番号１３または配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１および配列番号１５または配列番号２１のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３の両方を含む。さらに別のかかる実施形態において、イヌ化抗体または抗原結合断片は、配列番号１４または配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２および配列番号１５または配列番号２１のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３の両方を含む。なお別のかかる実施形態において、イヌ化抗体または抗原結合断片は、配列番号１３または配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１４または配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２および配列番号１５または配列番号２１のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含む。
【００４３】
特定の実施形態において、イヌ化抗体または抗原結合断片はまた、配列番号１６または配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＶＬ  ＣＤＲ１）を含む。関連する実施形態において、軽鎖相補性決定領域２（ＶＬ  ＣＤＲ２）は、配列番号１７または配列番号２３のアミノ酸配列を含む。なお別の実施形態において、軽鎖相補性決定領域３（ＶＬ  ＣＤＲ３）は、配列番号１８または配列番号２４のアミノ酸配列を含む。このタイプの特定の実施形態において、イヌ化抗体または抗原結合断片は、配列番号１６または配列番号２２のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１および配列番号１７または配列番号２３のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２の両方を含む。
【００４４】
別のかかる実施形態において、イヌ化抗体または抗原結合断片は、配列番号１６または配列番号２２のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１および配列番号１８または配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３の両方を含む。さらに別のかかる実施形態において、イヌ化抗体または抗原結合断片は、配列番号１７または配列番号２３のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２および配列番号１８または配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３の両方を含む。なお別のかかる実施形態において、イヌ化抗体または抗原結合断片は、配列番号１６または配列番号２２のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１７または配列番号２３のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２および配列番号１８または配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む。
【００４５】
本発明はさらに、配列番号２６のアミノ酸配列もしくは配列番号２６のアミノ酸配列と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列、および配列番号２８のアミノ酸配列もしくは配列番号２８のアミノ酸配列と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むイヌ化抗体、またはこれらのイヌ化抗体の抗原結合断片を提供する。本発明はまた、配列番号３０のアミノ酸配列もしくは配列番号３０のアミノ酸配列と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列、および配列番号３２のアミノ酸配列もしくは配列番号３２のアミノ酸配列と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むイヌ化抗体、またはこれらのイヌ化抗体の抗原結合断片を提供する。
【００４６】
特定の実施形態において、抗体の重鎖は、（ｉ）２４２位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを、（ｉｉ）２６９位にＡ、ＧまたはＳを、（ｉｉｉ）３０１位にＡ、ＧまたはＳを、（ｉｖ）３０２位にＧ、ＰまたはＡを、（ｖ）３０３位にＴ、Ａ、ＧまたはＳを、（ｖｉ）３３１位にＡ、ＧまたはＳを、および（ｖｉｉ）３３３位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを含む、配列番号２６（または配列番号２６と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、抗体の重鎖は、（ｉ）２４０位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを、（ｉｉ）２６７位にＡ、ＧまたはＳを、（ｉｉｉ）２９９位にＡ、ＧまたはＳを、（ｉｖ）３００位にＧ、ＰまたはＡを、（ｖ）３０１位にＴ、Ａ、ＧまたはＳを、（ｖｉ）３２９位にＡ、ＧまたはＳを、および（ｖｉｉ）３３１位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを含む、配列番号２８もしくは３０（または配列番号２８もしくは３０と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態において、抗体の重鎖は、（ｉ）２３８位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを、（ｉｉ）２６５位にＡ、ＧまたはＳを、（ｉｉｉ）２９７位にＡ、ＧまたはＳを、（ｉｖ）２９８位にＧ、ＰまたはＡを、（ｖ）２９９位にＴ、Ａ、ＧまたはＳを、（ｖｉ）３２７位にＡ、ＧまたはＳを、および（ｖｉｉ）３２９位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを含む、配列番号３２（または配列番号３２と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含む。
【００４７】
なお他の実施形態において、抗体の重鎖は、（ｉ）２４２位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを、（ｉｉ）２６９位にＡを、（ｉｉｉ）３０１位にＡを、（ｉｖ）３０２位にＧ、ＰまたはＡを、（ｖ）３０３位にＴ、Ａ、ＧまたはＳを、（ｖｉ）３３１位にＡ、ＧまたはＳを、および（ｖｉｉ）３３３位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを含む、配列番号２６（または配列番号２６と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、抗体の重鎖は、（ｉ）２４０位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを、（ｉｉ）２６７位にＡを、（ｉｉｉ）２９９位にＡを、（ｉｖ）３００位にＧ、ＰまたはＡを、（ｖ）３０１位にＴ、Ａ、ＧまたはＳを、（ｖｉ）３２９位にＡ、ＧまたはＳを、および（ｖｉｉ）３３１位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを含む、配列番号２８もしくは３０（または配列番号２８もしくは３０と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態において、抗体の重鎖は、（ｉ）２３８位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを、（ｉｉ）２６５位にＡを、（ｉｉｉ）２９７位にＡを、（ｉｖ）２９８位にＧ、ＰまたはＡを、（ｖ）２９９位にＴ、Ａ、ＧまたはＳを、（ｖｉ）３２７位にＡ、ＧまたはＳを、および（ｖｉｉ）３２９位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを含む、配列番号３２（または配列番号３２と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含む。
【００４８】
なお他の実施形態において、抗体の重鎖は、（ｉ）２４２位にＡを、（ｉｉ）２６９位にＡを、（ｉｉｉ）３０１位にＡを、（ｉｖ）３０２位にＰを、（ｖ）３０３位にＡを、（ｖｉ）３３１位にＧを、および（ｖｉｉ）３３３位にＡを含む、配列番号２６（または配列番号２６と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、抗体の重鎖は、（ｉ）２４０位にＡを、（ｉｉ）２６７位にＡを、（ｉｉｉ）２９９位にＡを、（ｉｖ）３００位にＰを、（ｖ）３０１位にＡを、（ｖｉ）３２９位にＧを、および（ｖｉｉ）３３１位にＡを含む、配列番号２８もしくは３０（または配列番号２８もしくは３０と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態において、抗体の重鎖は、（ｉ）２３８位にＡを、（ｉｉ）２６５位にＡを、（ｉｉｉ）２９７位にＡを、（ｉｖ）２９８位にＰを、（ｖ）２９９位にＡを、（ｖｉ）３２７位にＧを、および（ｖｉｉ）３２９位にＡを含む、配列番号３２（または配列番号３２と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含む。
【００４９】
さらに他の実施形態において、抗体の重鎖は、（ｉ）２４２位にＰを、（ｉｉ）２６９位にＡ、ＧまたはＳを、（ｉｉｉ）３０１位にＡ、ＧまたはＳを、（ｉｖ）３０２位にＧを、（ｖ）３０３位にＴを、（ｖｉ）３３１位にＡを、および（ｖｉｉ）３３３位にＰを含む、配列番号２６（または配列番号２６と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、抗体の重鎖は、（ｉ）２４０位にＰを、（ｉｉ）２６７位にＡ、ＧまたはＳを、（ｉｉｉ）２９９位にＡ、ＧまたはＳを、（ｉｖ）３００位にＧを、（ｖ）３０１位にＴを、（ｖｉ）３２９位にＡを、および（ｖｉｉ）３３１位にＰを含む、配列番号２８もしくは３０（または配列番号２８もしくは３０と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態において、抗体の重鎖は、（ｉ）２３８位にＰを、（ｉｉ）２６５位にＡ、ＧまたはＳを、（ｉｉｉ）２９７位にＡ、ＧまたはＳを、（ｉｖ）２９８位にＧを、（ｖ）２９９位にＴを、（ｖｉ）３２７位にＡを、および（ｖｉｉ）３２９位にＰを含む、配列番号３２（または配列番号３２と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含む。
【００５０】
なお他の実施形態において、抗体の重鎖は、（ｉ）２４２位にＰを、（ｉｉ）２６９位にＡを、（ｉｉｉ）３０１位にＡを、（ｉｖ）３０２位にＧを、（ｖ）３０３位にＴを、（ｖｉ）３３１位にＡを、および（ｖｉｉ）３３３位にＰを含む、配列番号２６（または配列番号２６と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、抗体の重鎖は、（ｉ）２４０位にＰを、（ｉｉ）２６７位にＡを、（ｉｉｉ）２９９位にＡを、（ｉｖ）３００位にＧを、（ｖ）３０１位にＴを、（ｖｉ）３２９位にＡを、および（ｖｉｉ）３３１位にＰを含む、配列番号２８もしくは３０（または配列番号２８もしくは３０と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態において、抗体の重鎖は、（ｉ）２３８位にＰを、（ｉｉ）２６５位にＡを、（ｉｉｉ）２９７位にＡを、（ｉｖ）２９８位にＧを、（ｖ）２９９位にＴを、（ｖｉ）３２７位にＡを、および（ｖｉｉ）３２９位にＰを含む、配列番号３２（または配列番号３２と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含む。
【００５１】
他の実施形態において、抗体の重鎖は、（ｉ）２４２位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを、（ｉｉ）２６９位にＡ、ＧまたはＳを、（ｉｉｉ）３０１位にＡ、ＧまたはＳを、（ｉｖ）３０２位にＧを、（ｖ）３０３位にＴを、（ｖｉ）３３１位にＡ、ＧまたはＳを、および（ｖｉｉ）３３３位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを含む、配列番号２６（または配列番号２６と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含む。他のかかる実施形態において、抗体の重鎖は、（ｉ）２４０位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを、（ｉｉ）２６７位にＡ、ＧまたはＳを、（ｉｉｉ）２９９位にＡ、ＧまたはＳを、（ｉｖ）３００位にＧを、（ｖ）３０１位にＴを、（ｖｉ）３２９位にＡ、ＧまたはＳを、および（ｖｉｉ）３３１位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを含む、配列番号２８もしくは３０（または配列番号２８もしくは３０と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態において、抗体の重鎖は、（ｉ）２３８位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを、（ｉｉ）２６５位にＡ、ＧまたはＳを、（ｉｉｉ）２９７位にＡ、ＧまたはＳを、（ｉｖ）２９８位にＧを、（ｖ）２９９位にＴを、（ｖｉ）３２７位にＡ、ＧまたはＳを、および（ｖｉｉ）３２９位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを含む、配列番号３２（または配列番号３２と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含む。
【００５２】
なお他の実施形態において、抗体の重鎖は、（ｉ）２４２位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを、（ｉｉ）２６９位にＡを、（ｉｉｉ）３０１位にＡを、（ｉｖ）３０２位にＧを、（ｖ）３０３位にＴを、（ｖｉ）３３１位にＡ、ＧまたはＳを、および（ｖｉｉ）３３３位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを含む、配列番号２６（または配列番号２６と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態において、抗体の重鎖は、（ｉ）２４０位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを、（ｉｉ）２６７位にＡを、（ｉｉｉ）２９９位にＡを、（ｉｖ）３００位にＧを、（ｖ）３０１位にＴを、（ｖｉ）３２９位にＡ、ＧまたはＳを、および（ｖｉｉ）３３１位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを含む、配列番号２８もしくは３０（または配列番号２８もしくは３０と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含む。他のかかる実施形態において、抗体の重鎖は、（ｉ）２３８位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを、（ｉｉ）２６５位にＡを、（ｉｉｉ）２９７位にＡを、（ｉｖ）２９８位にＧを、（ｖ）２９９位にＴを、（ｖｉ）３２７位にＡ、ＧまたはＳを、および（ｖｉｉ）３２９位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを含む、配列番号３２（または配列番号３２と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含む。
【００５３】
なお他の実施形態において、抗体の重鎖は、（ｉ）２４２位にＡを、（ｉｉ）２６９位にＡを、（ｉｉｉ）３０１位にＡを、（ｉｖ）３０２位にＧを、（ｖ）３０３位にＴを、（ｖｉ）３３１位にＧを、および（ｖｉｉ）３３３位にＡを含む、配列番号２６（または配列番号２６と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態において、抗体の重鎖は、（ｉ）２４０位にＡを、（ｉｉ）２６７位にＡを、（ｉｉｉ）２９９位にＡを、（ｉｖ）３００位にＧを、（ｖ）３０１位にＴを、（ｖｉ）３２９位にＧを、および（ｖｉｉ）３３１位にＡを含む、配列番号２８もしくは３０（または配列番号２８もしくは３０と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含む。他のかかる実施形態において、抗体の重鎖は、（ｉ）２３８位にＡを、（ｉｉ）２６５位にＡを、（ｉｉｉ）２９７位にＡを、（ｉｖ）２９８位にＧを、（ｖ）２９９位にＴを、（ｖｉ）３２７位にＧを、および（ｖｉｉ）３２９位にＡを含む、配列番号３２（または配列番号３２と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含む。加えて、本発明は、配列番号３８または配列番号４４のアミノ酸配列を含むイヌ軽鎖をさらに含むイヌ化抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００５４】
したがって、本発明はさらに、配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含むイヌ化抗体またはその抗原結合断片を提供する。関連する実施形態において、イヌ化抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。別の他の実施形態において、イヌ化抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４０のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。関連する実施形態において、イヌ化抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００５５】
さらに別の実施形態において、イヌ化抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。関連する実施形態において、イヌ化抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。なお別の実施形態において、イヌ化抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４０のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。関連する実施形態において、イヌ化抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００５６】
本発明はさらに、配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含むイヌ化抗体またはその抗原結合断片を提供する。関連する実施形態において、イヌ化抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。別の他の実施形態において、イヌ化抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。関連する実施形態において、イヌ化抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００５７】
本発明はさらに、配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含むイヌ化抗体またはその抗原結合断片を提供する。関連する実施形態において、イヌ化抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。別の他の実施形態において、イヌ化抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。関連する実施形態において、イヌ化抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００５８】
本発明はさらに、本発明のイヌ化抗体のＣＤＲ、ｃＦｃ領域、ヒンジ領域を有するｃＦｃ領域ならびに重鎖および軽鎖を包含する本発明のアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸を提供する。本発明はさらに、本発明の１または複数の核酸を含む発現ベクターを提供する。本発明はさらに、本発明の１または複数の発現ベクターを含む宿主細胞、ならびにかかる宿主細胞を用いて本発明のイヌ化抗体のＣＤＲ、および／またはｃＦｃ領域、および／またはヒンジ領域を有するｃＦｃ領域、および／または重鎖、および／または軽鎖を発現させる方法を提供する。本発明はまた、かかるベクターの不存在下で本発明のイヌ化抗体のＣＤＲ、および／またはｃＦｃ領域、および／またはヒンジ領域を有するｃＦｃ領域、および／または重鎖、および／または軽鎖を発現するように遺伝子操作された宿主細胞を提供する。特定の実施形態において、本発明のこれらの核酸、発現ベクター、ポリペプチドまたは宿主細胞は、抗体を作製する方法において有用である。
【００５９】
特定の実施形態において、抗体は、組換え型抗体またはその組換え型抗原結合断片である。関連する実施形態において、可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインは、一本鎖抗体を形成させるために可撓性リンカーによりつながれている。
【００６０】
ある実施形態において、本発明は、イヌＰＤ−Ｌ１と特異性を有して結合する抗体またはその抗原結合断片（例えば単離された抗体または単離されたその抗原結合断片）を提供するものであって、イヌＰＤ−Ｌ１に結合する際にこの抗体またはその抗原結合断片は配列番号８２のアミノ酸配列内の少なくとも１のアミノ酸残基に結合する。関連する実施形態において、イヌＰＤ−Ｌ１と特異性を有して結合する抗体またはその抗原結合断片はまた、配列番号８３のアミノ酸配列内の少なくとも１のアミノ酸残基に結合する。なお他の実施形態において、イヌＰＤ−Ｌ１と特異性を有して結合する抗体またはその抗原結合断片はまた、配列番号８２のアミノ酸配列内の少なくとも１のアミノ酸残基におよび配列番号８３のアミノ酸配列内の少なくとも１のアミノ酸残基に結合する。特定の実施形態において、これらの抗体および／またはその抗原結合断片は、イヌＰＤ−Ｌ１のイヌＰＤ−１への結合を遮断する。関連する実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体である。このタイプの特定の実施形態において、抗体は、モノクローナルなマウス抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体である。より特定の実施形態において、モノクローナル抗体は、イヌ化抗体である。なおより特定の実施形態において、モノクローナル抗体は、イヌ化マウス抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体である。
【００６１】
ある実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号８２のうちの２から５個のアミノ酸残基に結合する。他の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号８２のうちの６から１２個のアミノ酸残基に結合する。さらに他の実施形態において、単離された抗体またはその抗原結合断片は、配列番号８２のうちの１３から２０個のアミノ酸残基に結合する。関連する実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号８３のうちの２から５個のアミノ酸残基に結合する。他の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号８３のうちの６から１１個のアミノ酸残基に結合する。
【００６２】
なお他の実施形態において、イヌＰＤ−Ｌ１との結合について本発明の１または複数の抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体と交差競合（ｃｒｏｓｓ−ｃｏｍｐｅｔｅ）するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片が提供される。特定の実施形態において、交差競合抗体およびその抗原結合断片はイヌＰＤ−Ｌ１と結合し、イヌＰＤ−Ｌ１のイヌＰＤ−１への結合を遮断する。より特定の実施形態において、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、イヌＰＤ−Ｌ１との結合について４Ｆ９（または４Ｆ９の６個のＣＤＲを有する抗体）と交差競合する。他のより特定の実施形態において、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、イヌＰＤ−Ｌ１との結合について５Ｆ１２（または５Ｆ１２の６個のＣＤＲを有する抗体）と交差競合する。さらに他の実施形態において、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、イヌＰＤ−Ｌ１との結合について４Ｆ９および５Ｆ１２の両方と交差競合する。
【００６３】
特定の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体はマウス抗体である。他の実施形態において、モノクローナル抗体はイヌ化抗体である。より特定の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体はイヌ化マウス抗体である。
【００６４】
そのうえ、本発明は、本明細書中に提供される対応するカノニカル構造を持つ本発明のＣＤＲもしくはＣＤＲのバリアントを含み、および／またはＰＤ−Ｌ１の配列番号８２および／または８３のアミノ酸配列に結合する、イヌＰＤ−Ｌ１に対する抗体（例えばイヌ化抗体）を提供する。このタイプの特定の実施形態において、イヌ化抗体−イヌＰＤ−Ｌ１結合の解離定数（Ｋｄ）は、１×１０−５から１×１０−１２Ｍである。より特定の実施形態において、イヌＰＤ−Ｌ１に対するイヌ化抗体は、本明細書中に提供される対応するカノニカル構造を持ち、かつＰＤ−Ｌ１の配列番号８２および／または８３のアミノ酸配列に結合する本発明のＣＤＲのバリアントを含む。本発明は、それゆえ、イヌＰＤ−Ｌ１と特異性を有して結合するイヌ化抗体およびその抗原結合断片を包含するものであって、イヌＰＤ−Ｌ１に結合する際、この抗体はＰＤ−Ｌ１の配列番号８２および／または８３のアミノ酸配列内の少なくとも１のアミノ酸残基に結合する。このタイプの特定の実施形態において、抗体およびその抗原結合断片は、イヌＰＤ−Ｌ１と結合し、イヌＰＤ−Ｌ１のイヌＰＤ−１への結合を遮断する。したがって、特定の実施形態において、イヌＰＤ−Ｌ１に結合する際、イヌ化抗体（１または複数のバリアントＣＤＲ、例えば、限定されるものではないが例えば保存的改変バリアントおよび／または規定されたカノニカル構造クラスを含むバリアントなどのバリアントを有する抗体を包含する）は、ＰＤ−Ｌ１のエピトープ、例えば配列番号８２および／または配列番号８３のアミノ酸配列内の少なくとも１のアミノ酸残基に結合する。
【００６５】
本発明はさらに、１×１０−１２Ｍより低い（例えば１×１０−１３Ｍまたはなお低い）解離定数（Ｋｄ）を有してイヌＰＤ−Ｌ１に結合するイヌ化抗体またはその抗原結合断片を提供する。他の実施形態において、イヌ化抗体またはその抗原結合断片は、１×１０−５Ｍから１×１０−１２Ｍの解離定数を有してイヌＰＤ−Ｌ１に結合する。より特定の実施形態において、イヌ化抗体またはその抗原結合断片は、１×１０−７Ｍから１×１０−１１Ｍの解離定数を有してイヌＰＤ−Ｌ１に結合する。なおより特定の実施形態において、イヌ化抗体またはその抗原結合断片は、１×１０−８Ｍから１×１０−１１Ｍの解離定数を有してイヌＰＤ−Ｌ１に結合する。さらにより特定の実施形態において、イヌ化抗体またはその抗原結合断片は、１×１０−８Ｍから１×１０−１０Ｍの解離定数を有してイヌＰＤ−Ｌ１に結合する。
【００６６】
本発明はまた、１×１０７Ｍ−１ｓ−１より大きい結合速度定数（ｏｎ  ｒａｔｅ、ｋｏｎ）を有してイヌＰＤ−Ｌ１に結合するイヌ化抗体またはその抗原結合断片を提供する。他の実施形態において、イヌ化抗体またはその抗原結合断片は、１×１０２Ｍ−１ｓ−１から１×１０７Ｍ−１ｓ−１の結合速度定数を有してイヌＰＤ−Ｌ１に結合する。より特定の実施形態において、イヌ化抗体またはその抗原結合断片は、１×１０３Ｍ−１ｓ−１から１×１０６Ｍ−１ｓ−１の結合速度定数を有してイヌＰＤ−Ｌ１に結合する。なおより特定の実施形態において、イヌ化抗体またはその抗原結合断片は、１×１０３Ｍ−１ｓ−１から１×１０５Ｍ−１ｓ−１の結合速度定数を有してイヌＰＤ−Ｌ１に結合する。さらにより特定の実施形態において、イヌ化抗体またはその抗原結合断片は、１×１０４Ｍ−１ｓ−１から１×１０５Ｍ−１ｓ−１の結合速度定数を有してイヌＰＤ−Ｌ１に結合する。
【００６７】
本発明はまた、１×１０−７ｓ−１より遅い解離速度定数（ｏｆｆ  ｒａｔｅ、ｋｏｆｆ）を有してイヌＰＤ−Ｌ１に結合するイヌ化抗体またはその抗原結合断片を提供する。特定の実施形態において、イヌ化抗体またはその抗原結合断片は、１×１０−３ｓ−１から１×１０−８ｓ−１の解離速度定数を有してイヌＰＤ−Ｌ１に結合する。より特定の実施形態において、イヌ化抗体またはその抗原結合断片は、１×１０−４ｓ−１から１×１０−７ｓ−１の解離速度定数を有してイヌＰＤ−Ｌ１に結合する。なおより特定の実施形態において、イヌ化抗体またはその抗原結合断片は、１×１０−５ｓ−１から１×１０−７ｓ−１の解離速度定数を有してイヌＰＤ−Ｌ１に結合する。
【００６８】
関連する実施形態において、抗体（例えばイヌ化抗体）またはその抗原結合断片は、腫瘍または病原体に対する抗原特異的なメモリー応答を刺激する。特定の実施形態において、抗体（例えばイヌ化抗体）またはその抗原結合断片は、インビボで抗体応答を刺激する。他の特定の実施形態において、抗体（例えばイヌ化抗体）またはその抗原結合断片は、動物対象において免疫応答を刺激する。より具体的な実施形態において、動物対象はイヌである。関連する実施形態において、動物対象はネコである。
【００６９】
したがって、本発明の抗体（例えばイヌ化抗体）のいずれかは、１、２、３、４、５または全てのこれらの特性、すなわちイヌＰＤ−Ｌ１との前記解離定数、イヌＰＤ−Ｌ１との結合の前記結合速度定数、イヌ化抗体−イヌＰＤ−Ｌ１結合複合体から解離するための前記解離速度定数、腫瘍もしくは病原体に対する抗原特異的なメモリー応答を刺激すること、インビボで抗体応答を刺激すること、および／または動物対象において免疫応答を刺激することを呈すことができる。
【００７０】
より特定の実施形態において、本発明の抗体および／またはその抗原結合断片は、イヌＰＤ−Ｌ１と結合し、またイヌＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合を遮断する。よりいっそう特定の実施形態において、本発明のイヌ化抗体およびその抗原結合断片は、イヌＰＤ−Ｌ１と結合し、イヌＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合を遮断する。
【００７１】
上で示したように、ある一定の前記抗体（およびその抗原結合断片）を包含する本発明の抗体（およびその抗原結合断片）は、モノクローナル抗体（およびその抗原結合断片）、哺乳動物抗体（およびその抗原結合断片）、例えばマウスの（マウス）抗体（およびその抗原結合断片）、イヌ化マウス抗体（およびその抗原結合断片）を包含するイヌ化抗体（およびその抗原結合断片）であることができる。ある実施形態において、抗体（およびその抗原結合断片）は単離されている。
【００７２】
特定の実施形態において、抗体は、組換え型抗体またはその抗原結合断片である。関連する実施形態において、可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインは、一本鎖抗体を形成させるために可撓性リンカーによりつながれている。
【００７３】
特定の実施形態において、抗体または抗原結合断片は、Ｆａｂ断片である。他の実施形態において、抗体または抗原結合断片は、Ｆａｂ’断片である。他の実施形態において、抗体または抗原結合断片は、（Ｆａｂ’）２断片である。なお他の実施形態において、抗体または抗原結合断片は、ダイアボディである。特定の実施形態において、抗体または抗原結合断片は、ドメイン抗体である。特定の実施形態において、抗体または抗原結合断片は、ラクダ化単一ドメイン抗体である。
【００７４】
特定の実施形態において、イヌ化マウス抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体または抗原結合断片は、処置される動物対象（例えばイヌまたはネコ）の免疫応答を向上させる。
【００７５】
本発明はさらに、本発明の抗体およびその部分（ＣＤＲを包含する）のいずれか１をコードする核酸（単離された核酸を包含する）を提供する。ある実施形態において、本発明は、本発明のイヌ化抗体またはその部分の軽鎖のいずれか１をコードする核酸（単離された核酸を包含する）を提供する。同様に、本発明は、本発明のイヌ化抗体またはその部分の重鎖のいずれか１をコードする核酸（単離された核酸を包含する）を提供する。本発明はさらに、本発明の１または複数の核酸（単離された核酸を包含する）を含む発現ベクターを提供する。したがって、本発明は、本発明のイヌ化マウス抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体またはその部分をコードする核酸を提供する。関連する実施形態において、かかる抗体または抗原結合断片は、イヌおよび／またはネコ対象においてがんを処置するための薬剤の調製のために用いることができる。あるいは、またはこれと共に、本発明は、診断的使用のための本発明の抗体または抗体断片のいずれかの使用を提供する。さらに付加的な実施形態において、本明細書中に開示されるイヌ化抗体または抗原結合断片のいずれかを含むキットが提供される。具体的な実施形態において、本発明のイヌ化マウス抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体または抗原結合断片のいずれかをコードする単離された核酸を含む発現ベクターが提供される。本発明はさらに、本発明の１または複数の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。特定の実施形態において、本発明のこれらの核酸、発現ベクターまたはポリペプチドは、抗体を作製する方法において有用である。
【００７６】
本発明はさらに、配列番号８２および／または配列番号８３のアミノ酸配列を含む８０個以下のアミノ酸残基からなる抗原性ペプチド（単離された抗原性ペプチドを包含する）を提供する。関連する実施形態において、抗原性ペプチド（単離されたペプチドを包含する）は、配列番号８２および／または配列番号８３のアミノ酸配列を含む６０個以下のアミノ酸残基からなる。関連する実施形態において、抗原性ペプチド（単離されたペプチドを包含する）は、配列番号８２および／または配列番号８３のアミノ酸配列を含む１１から４５個のアミノ酸残基からなる。さらに他の実施形態において、抗原性ペプチドは、配列番号８３のアミノ酸配列からの５から２０個のアミノ酸残基からなる。なお他の実施形態において、抗原性ペプチドは、配列番号８３のアミノ酸配列からの５から１１個のアミノ酸残基からなる。
【００７７】
本発明はさらに、配列番号８２および／または配列番号８３のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む８０個以下のアミノ酸残基からなり、本発明の単離された哺乳動物抗体またはその抗原結合断片に結合する抗原性ペプチド（単離されたペプチドを包含する）を提供する。関連する実施形態において、抗原性ペプチド（単離された抗原性ペプチドを包含するもの）は、配列番号８２および／または配列番号８３のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む６０個以下のアミノ酸残基からなり、単離された哺乳動物抗体またはその抗原結合断片に結合する。他の実施形態において、ペプチドは、配列番号８２のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一であるアミノ酸配列からの５から２０個のアミノ酸残基からなり、単離された哺乳動物抗体またはその抗原結合断片に結合する。他の実施形態において、ペプチドは、配列番号８３のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一であるアミノ酸配列からの５から１１個のアミノ酸残基からなり、単離された哺乳動物抗体またはその抗原結合断片に結合する。特定の実施形態において、哺乳動物抗体は４Ｅ９である。他の実施形態において、哺乳動物抗体は５Ｆ１２である。
【００７８】
本発明はさらに、前記抗原性ペプチドのいずれかを含む融合タンパク質を提供する。特定の実施形態において、融合タンパク質は、かかる抗原性ペプチドおよび非イヌ哺乳動物ＩｇＧ抗体のＦｃ領域を含む。より特定の実施形態において、融合タンパク質は、非イヌ哺乳動物ＩｇＧ抗体のＦｃ領域を含む。ある実施形態において、非イヌ哺乳動物ＩｇＧ抗体はマウスＩｇＧである。代替的実施形態において、非イヌ哺乳動物ＩｇＧ抗体はヒトＩｇＧである。他の実施形態において、非イヌ哺乳動物ＩｇＧ抗体はウマＩｇＧである。なお他の実施形態において、非イヌ哺乳動物ＩｇＧ抗体はブタＩｇＧである。さらに他の実施形態において、非イヌ哺乳動物ＩｇＧ抗体はウシＩｇＧである。
【００７９】
特定の実施形態において、非イヌ哺乳動物ＩｇＧ抗体はＩｇＧ１である。他の実施形態において、非イヌ哺乳動物ＩｇＧ抗体はＩｇＧ２ａである。なお他の実施形態において、非イヌ哺乳動物ＩｇＧ抗体はＩｇＧ３である。さらに他の実施形態において、非イヌ哺乳動物ＩｇＧ抗体はＩｇＧ４である。
【００８０】
他の実施形態において、融合タンパク質は、前記抗原性ペプチドのいずれかおよびマルトース結合タンパク質を含む。さらに他の実施形態において、融合タンパク質は、前記抗原性ペプチドのいずれかおよびベータ−ガラクトシダーゼを含む。なお他の実施形態において、融合タンパク質は、前記抗原性ペプチドのいずれかおよびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼを含む。さらに他の実施形態において、融合タンパク質は、前記抗原性ペプチドのいずれかおよびチオレドキシンを含む。なお他の実施形態において、融合タンパク質は、前記抗原性ペプチドのいずれかおよびＧｒｏ  ＥＬを含む。さらに他の実施形態において、融合タンパク質は、前記抗原性ペプチドのいずれかおよびＮｕｓＡを含む。
【００８１】
本発明はさらに、本発明の抗原性ペプチドおよび対応する融合タンパク質をコードする核酸（単離された核酸を包含する）を提供する。本発明はまた、これらの核酸を含む発現ベクター、および本発明の１または複数の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００８２】
加えて、本発明は、本発明の抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体もしくはその抗原結合断片、イヌＰＤ−Ｌ１からの抗原性ペプチド（単離された抗原性ペプチドを包含する）、本発明のイヌＰＤ−Ｌ１からの抗原性ペプチドを含む融合タンパク質、本発明の抗原性断片および／もしくは融合タンパク質をコードする核酸（単離された核酸を包含する）、かかる核酸を含む発現ベクターまたはそれらの任意の組み合わせ、ならびに薬学的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物を包含する。
【００８３】
特定の実施形態において、かかる医薬組成物は、抗イヌＰＤ−１抗体またはその抗原結合断片をさらに含む。より特定の実施形態において、抗イヌＰＤ−１抗体は、イヌ化マウス抗イヌＰＤ−１抗体またはイヌ化マウス抗イヌＰＤ−１抗体の抗原結合断片である。関連する実施形態において、かかる医薬組成物は、抗イヌＣＴＬＡ−４抗体またはその抗原結合断片をさらに含む。特定の実施形態において、抗イヌＣＴＬＡ−４抗体は、イヌ化マウス抗イヌＣＴＬＡ−４抗体またはイヌ化マウス抗イヌＣＴＬＡ−４抗体の抗原結合断片である。
【００８４】
したがって、本発明は、抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体、抗イヌＰＤ−１抗体、抗イヌＣＴＬＡ−４抗体、抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体の抗原結合断片、抗イヌＰＤ−１抗体の抗原結合断片または抗イヌＣＴＬＡ−４抗体の抗原結合断片のうちの１、２、３またはそれより多くを含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態において、かかる抗イヌタンパク質（すなわち、抗イヌＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１またはＣＴＬＡ−４）抗体またはその抗原結合断片は、マウス抗イヌタンパク質抗体である。他のかかる抗イヌタンパク質抗体またはその抗原結合断片は、イヌ化抗イヌタンパク質抗体である。より特定の実施形態において、抗イヌタンパク質抗体またはその抗原結合断片は、イヌ化マウス抗イヌタンパク質抗体である。
【００８５】
加えて、本発明は、その必要がある対象に治療的有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む、免疫細胞の活性を向上させる方法を提供する。ある実施形態において、方法は、がんの処置のために用いられる。他の実施形態において、方法は、感染または感染性疾患の処置において用いられる。なお他の実施形態において、本発明のイヌ化抗体またはその抗原結合断片は、ワクチンアジュバントとして用いられる。特定の実施形態において、イヌ化マウス抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合断片を含む医薬組成物は、イヌ化マウス抗イヌＰＤ−１抗体もしくはその抗原結合断片および／またはイヌ化マウス抗イヌＣＴＬＡ−４抗体もしくはその抗原結合断片の前、後またはこれと同時に投与することができる。
【００８６】
本発明のこれらおよび他の態様は、次の図面の簡単な説明および発明の詳細な説明を参照することによって、より良く理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】図１は、イヌＰＤ−Ｌ１に対する２つのマウス抗イヌＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂの反応性についてのＥＬＩＳＡ結果を、対数のｍＡｂ（ｎＭ）に対するＯＤ  ６５０／４９０の関数として示す。４Ｆ９および５Ｆ１２と命名されたｍＡｂはいずれもイヌＰＤ−Ｌ１への強い用量依存的結合を実証している。
【図２】図２は、マウス抗イヌＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂでのリガンド遮断を示す。４Ｆ９および５Ｆ１２と命名された２つのｍＡｂを、ＣＨＯ細胞上に発現したＰＤ−１へのＰＤＬ−１の結合を阻害する能力について試験した。ｍＡｂはいずれもＰＤＬ−１のＰＤ−１への結合を遮断したが、ｍＡｂ  ４Ｆ９は５Ｆ１２よりも強い阻害剤である。
【発明を実施するための形態】
【００８８】
略語
本発明の詳細な説明および実施例の全体にわたって、次の略語が用いられる：
ＡＤＣＣ    抗体依存性細胞傷害活性
ＣＤＣ    補体依存性細胞傷害活性（ｃｙｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）
ＣＤＲ    ヒト抗体に関してＫａｂａｔナンバリングシステムを用いて規定される、免疫グロブリン可変領域内の相補性決定領域
ＣＨＯ    チャイニーズハムスター卵巣
ＥＣ５０    ５０％の有効性または結合をもたらす濃度
ＥＬＩＳＡ    酵素結合免疫吸着アッセイ
ＦＲ    抗体フレームワーク領域：ＣＤＲ領域を除外した免疫グロブリン可変領域
ＨＲＰ    西洋ワサビペルオキシダーゼ
ＩＦＮ    インターフェロン
ＩＣ５０    ５０％阻害をもたらす濃度
ＩｇＧ    免疫グロブリンＧ
Ｋａｂａｔ    Ｅｌｖｉｎ  Ａ．  Ｋａｂａｔが先駆けとなったヒト抗体に関する免疫グロブリンアラインメントおよびナンバリングシステム［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）］
ｍＡｂ    モノクローナル抗体（ＭａｂまたはＭＡｂも）
ＭＥＳ    ２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸
ＭＯＡ    作用メカニズム
ＮＨＳ    正常ヒト血清
ＰＣＲ    ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＫ    薬物動態学的
ＳＥＢ    スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）エンテロトキシンＢ
ＴＴ    破傷風トキソイド
Ｖ領域    異なる抗体間で配列が変わるヒトＩｇＧ鎖のセグメント。軽鎖においてＫａｂａｔ残基１０９まで、重鎖においてＫａｂａｔ残基１１３まで広がっている。
【００８９】
ＶＨ    免疫グロブリン重鎖可変領域
ＶＫ    免疫グロブリンカッパ軽鎖可変領域
定義
本発明がより容易に理解され得るように、ある種の技術用語および科学用語を下に具体的に定義する。本書類のどこかで具体的に定義されないかぎり、本明細書中で用いられる全ての他の技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により通例的に理解される意味を持つ。
【００９０】
添付の特許請求の範囲を包含する本書類中で用いられる言葉の単数形、例えば「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」などは、その内容が明らかに他を指示しないかぎり、それらの対応する複数形の言及を包含する。
【００９１】
細胞または受容体に適用される「活性化」とは、その内容によりまたは明示的に他を指し示さないかぎり、細胞または受容体のリガンドでの活性化または処置をいう。「リガンド」は、天然および合成のリガンド、例えばサイトカイン、サイトカインバリアント、アナログ、変異タンパク質および抗体に由来する結合性の化合物を包含する。「リガンド」はまた、低分子、例えばサイトカインのペプチド模倣物および抗体のペプチド模倣物を包含する。「活性化」とは、内的メカニズムにより、同様に外部因子または環境因子により調節される細胞の活性化をいうことができる。
【００９２】
分子の「活性」は、リガンドまたは受容体への分子の結合、触媒活性；遺伝子発現または細胞シグナル伝達、分化もしくは成熟を刺激する能力；抗原活性、他の分子の活性の調整などを記述し得るものであり、またこれらをいい得る。分子の「活性」はまた、細胞−細胞間相互作用、例えば付着を調整もしくは維持する活性、または細胞の構造、例えば細胞膜もしくは細胞骨格を維持する活性をもいい得る。「活性」はまた、特異的活性、例えば、［触媒活性］／［ｍｇ  タンパク質］または［免疫学的活性］／［ｍｇ  タンパク質］、生物学的区画内での濃度などを意味することもできる。「活性」とは、自然免疫系または獲得免疫系の構成成分の調整をいい得る。
【００９３】
動物、例えばイヌの実験対象、細胞、組織、器官または生物学的液体に適用される「投与」および「処置」とは、動物、例えばイヌ対象、細胞、組織、器官または生物学的液体への外来性の医薬、治療薬、診断薬または組成物の接触をいう。細胞の処置は、細胞への試薬の接触、並びに液体への試薬の接触を包含し、ここで液体は細胞と接触している。「処置する」または「処置すること」は、治療薬、例えば本発明の抗体または抗原結合断片を含有する組成物などを、内的または外的に、この治療薬が治療的活性を持つ１もしくは複数の疾患の症候を持つまたは疾患を持つ疑いがある獣医学対象（例えばイヌまたはネコ）に投与することを意味する。したがって、「投与」および「処置」はまた、試薬、診断、結合性化合物または別の細胞による、例えば細胞のインビトロおよびエクスビボの処置を包含する。
【００９４】
典型的に、治療薬は、何らか臨床的に測定可能な程度にかかる症候（複数可）の退行を誘導するかまたは進行を阻害することにより、処置された対象または集団において１または複数の疾患の症候を緩和するおよび／または寛解させるのに有効な量で投与される。任意の特定の疾患の症候を緩和するのに有効な治療薬の量（「治療的有効量」ともいう）は、例えば対象（例えばイヌ）の疾患の状態、年齢および体重、ならびに対象において所望の応答を誘導する医薬組成物の能力などの因子に応じて変わり得る。疾患の症候が緩和されたかまたは寛解されたかは、その症候の重症度または進行状態を評価するために獣医（ｖｅｔｅｒａｎａｒｉａｎ）または他の熟練した医療提供者により典型的に用いられる任意の臨床的測定により評価することができる。本発明の実施形態（例えば処置方法または製造物品）はあらゆる対象において標的の疾患の症候（複数可）を緩和するのに有効でないかもしれないが、当該技術分野で公知の任意の統計検定、例えばＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定、ｃｈｉ２検定、ＭａｎｎおよびＷｈｉｔｎｅｙによるＵ検定、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定（Ｈ検定）、Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅ−Ｔｅｒｐｓｔｒａ検定およびＷｉｌｃｏｘｏｎ検定などにより決定されるように、統計的に有意な数の対象において標的の疾患の症候（複数可）を緩和するであろう。
【００９５】
用語「免疫応答」とは、例えばリンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、および上記細胞または肝臓により生産される可溶性高分子（抗体、サイトカインおよび補体を包含する）の作用であって、がん性細胞、病原体に感染した細胞もしくは組織または侵入している病原体への選択的ダメージ、破壊または哺乳動物の身体（例えばイヌの身体）からの除去をもたらす作用をいう。
【００９６】
用語「対象」は、任意の生物、好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物（例えばイヌ、ネコまたはヒト）および最も好ましくはイヌを包含する。
【００９７】
本明細書中で用いられる用語「イヌ」は、特に指示がないかぎり、全てのイエイヌ、カニス・ルプス・ファミリアリス（Ｃａｎｉｓ  ｌｕｐｕｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）またはカニス・ファミリアリス（Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）を包含する。
【００９８】
本明細書中で用いられる用語「ネコ」とは、ネコ科の任意のメンバーをいう。この科のメンバーは、野生、動物園および家庭にいるメンバー、例えばネコ亜科の任意のメンバーなど、例えばネコ、ライオン、トラ、ピューマ、ジャガー、ヒョウ、ユキヒョウ、クロヒョウ、北アメリカクーガー（Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｍｏｕｎｔａｉｎ  ｌｉｏｎ）、チーター、オオヤマネコ、ボブキャット、カラカルまたはそれらの任意の交雑種を包含する。ネコはまた、イエネコ、純血種および／または雑種のペットのネコ、ショーキャット、実験動物のネコ、クローンネコ、およびヤマネコまたはノネコを包含する。
【００９９】
イヌＰＤ−１は、配列番号５０のアミノ酸配列を含むことが見出されている［２０１３年１２月２０日に出願された米国仮出願第６１／９１８，９４６号、その内容はここにその全体が本明細書中に組み込まれる］。具体的な実施形態において、イヌＰＤ−１は、配列番号４９のヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる。
【０１００】
イヌＰＤ−Ｌ１は、配列番号５６のアミノ酸配列を含むことが見出されている［上記の２０１３年１２月２０日に出願された米国仮出願第６１／９１８，９４６号］。具体的な実施形態において、イヌＰＤ−１は、配列番号５５を含むヌクレオチド配列によりコードされる。
【０１０１】
本明細書中で用いられる、例えば抗体のアミノ酸配列における別のアミノ酸残基での「アミノ酸残基の置換」は、別のアミノ酸残基で「アミノ酸残基を置き換えること」と等価であり、アミノ酸配列における特定位置の特定のアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基により置き換えられている（または置換される）ことを表す。例えば、１つのかかる置換（置き換え）は、ＩｇＧＢまたはＩｇＧＣアミノ酸配列のＦｃ領域のＰ４Ａとして表され、この場合、ＩｇＧＢのＦｃ領域またはＩｇＧＣのＦｃ領域のアミノ酸配列のアミノ酸４位におけるプロリン残基がアラニン残基により置換されている（置き換えられている）。
【０１０２】
したがって、かかる置換、すなわち例えば組換えＤＮＡ技術によりアミノ酸配列中の特定位置で意図的にアラニンをセリンで置き換えることを具体的に設計することができる。あるいは、抗体の特定のアミノ酸残基またはアミノ酸残基の一続きを、より天然の選抜プロセスを通じて１または複数のアミノ酸残基によって置き換えることができ、これは、例えば細胞により生産される抗体がその抗原上の所与の領域、例えばエピトープまたはその部分を含有する領域に結合する能力に基づく、および／またはそれが置き換えようとしているＣＤＲと同一のカノニカル構造を保持した特定のＣＤＲを含む抗体の能力に基づくものである。かかる置換／置き換えは、「バリアント」ＣＤＲおよび／またはバリアント抗体を導くことができる。
【０１０３】
配列同一性とは、２つのポリペプチドのアミノ酸がこれら２つの配列を最適に並べたときに等価の位置で同じである程度をいう。本明細書中で用いられるように、両配列のアミノ酸残基が同一であるときに、１のアミノ酸配列は第二のアミノ酸配列と１００％「同一」である。したがって、２つのアミノ酸配列の５０％が同一であるときに、アミノ酸配列は第二のアミノ酸配列と５０％「同一」である。配列比較は、所与のタンパク質、例えば比較されるタンパク質またはポリペプチドの部分に含まれるアミノ酸残基の近接するブロックに対して実施される。特定の実施形態において、２つのアミノ酸配列間の対応関係を異なるように変え得る選択された欠損または挿入が考慮される。
【０１０４】
配列類似性は、同一の残基および同一でない生化学的に関連するアミノ酸を包含する。類似した特性を共有し、交換可能であり得る生化学的に関連するアミノ酸は、下に論じられる。
【０１０５】
次の参考文献は、配列解析のためにしばしば用いられるＢＬＡＳＴアルゴリズムに関する：ＢＬＡＳＴ  ＡＬＧＯＲＩＴＨＭＳ：Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）；Ｇｉｓｈ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２（１９９３）；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１（１９９６）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７）；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６４９−６５６（１９９７）；Ｗｏｏｔｔｏｎ，Ｊ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１７：１４９−１６３（１９９３）；Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０：６７−７０（１９９４）；ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ  ＳＣＯＲＩＮＧ  ＳＹＳＴＥＭＳ：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．”  ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３．  Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（ｅｄ．），ｐｐ．３４５−３５２，（１９７８）；Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．”  ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３．”（１９７８），Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（ｅｄ．），ｐｐ．３５３−３５８（１９７８），Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：５５５−５６５（１９９１）；Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３：６６−７０（１９９１）；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：２９０−３００（１９９３）；ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ  ＳＴＡＴＩＳＴＩＣＳ：Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８（１９９０）；Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７（１９９３）；Ｄｅｍｂｏ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｐｒｏｂ．  ２２：２０２２−２０３９（１９９４）；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．  “Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．”  ｉｎ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓ．Ｓｕｈａｉ，ｅｄ．），ｐｐ．１−���４，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９７）。
【０１０６】
イヌ化抗イヌ抗原抗体
本明細書中で用いられる抗体は、それがイヌ抗原、例えばイヌＰＤ−Ｌ１のアミノ酸配列のその部分を含むポリペプチドに結合するが、イヌ抗原、例えばイヌＰＤ−Ｌ１の配列のその部分を欠いた他のイヌタンパク質に結合しない場合に、所与の抗原配列（この場合、イヌ抗原、例えばイヌＰＤ−Ｌ１のアミノ酸配列の部分）を含むポリペプチドに特異的に結合するといわれる。例えば、イヌＰＤ−Ｌ１を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体は、ＦＬＡＧ（登録商標）タグを付加した形態のイヌＰＤ−Ｌ１に結合し得るが、他のＦＬＡＧ（登録商標）タグを付加したイヌタンパク質に特異性を有して結合しない。抗体または抗体の抗原結合部位に由来する結合性化合物は、そのイヌ抗原またはそのバリアントもしくは変異タンパク質へのアフィニティーが試験された任意の他のイヌ抗原へのアフィニティーよりも少なくとも１０倍大きい、より好ましくは少なくとも２０倍大きい、およびよりいっそう好ましくは少なくとも１００倍大きいとき、そのイヌ抗原またはそのバリアントもしくは変異タンパク質に「特異性を有して」結合する。
【０１０７】
本明細書中で用いられる用語「抗体」とは、所望の生物学的活性を呈する任意の形態の抗体をいう。それゆえに、これは最も広い意味で用いられ、具体的には、限定されるものではないが、モノクローナル抗体（完全長のモノクローナル抗体を包含する）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、イヌ化抗体、完全イヌ抗体、キメラ抗体およびラクダ化単一ドメイン抗体に及ぶ。「親抗体」は、意図される使用のための抗体の改変に先立って、例えばイヌ治療抗体としての使用のための抗体のラクダ化などに先立って、免疫系の抗原への曝露により得られる抗体である。
【０１０８】
本明細書中で用いられる「抗体断片」または「抗原結合断片」とは、特に指示がないかぎり、抗体の抗原結合断片、すなわち完全長の抗体が結合する抗原に特異的に結合する能力を保持した抗体断片、例えば１または複数のＣＤＲ領域を保持した断片をいう。抗原結合断片の例としては、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片；ダイアボディ；リニア抗体（ｌｉｎｅａｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）；一本鎖抗体分子、例えばｓｃ−Ｆｖ；抗体断片から形成されるナノボディおよび多重特異性抗体が挙げられる。
【０１０９】
「Ｆａｂ断片」は、１つの軽鎖ならびに１つの重鎖のＣＨ１領域および可変領域から構成される。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。「Ｆａｂ断片」は、抗体のパパイン切断産物であることができる。
【０１１０】
「結晶性フラグメント」（「Ｆｃ」）領域は、抗体のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む２つの重鎖断片（すなわち２つの同一のポリペプチド）を含有する。２つの重鎖断片は、２以上のジスルフィド結合により、およびＣＨ３ドメインの疎水性相互作用により結び付いている。本発明において、４つのイヌＩｇＧ  Ｆｃ断片の各々に対するアミノ酸配列は、Ｔａｎｇら［Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．８０：２５９−２７０（２００１）］により決定された、ＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメインの同定された境界に基づくものである。
【０１１１】
「Ｆａｂ’断片」は、２つのＦａｂ’断片の２つの重鎖間に鎖間ジスルフィド結合が形成されることでＦ（ａｂ’）２分子を形成することができるように、１つの軽鎖、ならびにＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインおよびまたＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインの間の領域を含有する１つの重鎖の部分または断片を含有する。
【０１１２】
「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２つの重鎖間に鎖間ジスルフィド結合が形成されるように、２つの軽鎖およびＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインの間の定常領域の部分を含有する２つの重鎖を含有する。Ｆ（ａｂ’）２断片は、それゆえに、２つの重鎖間のジスルフィド結合により結び付けられた２つのＦａｂ’断片から構成される。「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、抗体のペプシン切断産物であることができる。
【０１１３】
「Ｆｖ領域」は、重鎖および軽鎖の両方からの可変領域を含むが、定常領域を欠いている。
【０１１４】
用語「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体とは、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む抗体断片であって、一本のポリペプチド鎖内に存在するドメインを含む抗体断片をいう。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のために所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーをＶＨドメインとＶＬドメインの間にさらに含む［Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ＴＨＥ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ  ＯＦ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，ｖｏｌ．１１３  Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）；ＷＯ８８／０１６４９；ならびにＵ．Ｓ．４，９４６，７７８およびＵ．Ｓ．５，２６０，２０３を参照されたい］。
【０１１５】
本明細書中で用いられる用語「カノニカル構造」とは、それらが存するフレームワーク内にある抗体の重鎖および軽鎖の各々の高可変領域に取り入れることができる局所立体構造をいう。各高可変領域に対して少数のカノニカル構造（一般に、例えば１または２などの単純整数により表される）があり、これは対応する高可変領域のアミノ酸配列から（具体的には、対応するイヌ化マウス抗イヌＰＤ−Ｌ１可変ドメインについて下に与えられるように、そのフレームワークのアミノ酸配列との関連の中で）高い精度で予測することができる。これらのカノニカル構造は、所与のＣＤＲのアミノ酸配列の改変がその抗原結合相手に結合する能力の保持をもたらすか喪失をもたらすかに関して決定的であることができる［Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉｂａｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ，Ｎａｔｕｒｅ，３４：８７７−８８３（１９８９）；およびＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８（１９９７）を参照されたい］。
【０１１６】
「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域のみを含有する免疫学的な機能的免疫グロブリン断片である。いくつかの例において、２以上のＶＨ領域がペプチドリンカーと共有結合することで、二価のドメイン抗体が生み出される。二価ドメイン抗体の２つのＶＨ領域は、同じまたは異なった抗原を標的とし得る。
【０１１７】
「二価抗体」は、２つの抗原結合部位を含む。いくつかの例において、２つの結合部位は同じ抗原特異性を持つ。一方、二価抗体は二重特異性であってもよい（下を参照されたい）。
【０１１８】
ある実施形態において、本明細書中のモノクローナル抗体はまた、ラクダ化された単一ドメイン抗体を包含する［例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２６：２３０（２００１）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：２５（１９９９）；ＷＯ９４／０４６７８；ＷＯ９４／２５５９１；Ｕ．Ｓ．６，００５，０７９を参照されたい］。１の実施形態において、本発明は、単一ドメイン抗体が形成されるような改変を有する２つのＶＨドメインを含む単一ドメイン抗体を提供する。
【０１１９】
本明細書中で用いられる用語「ダイアボディ」とは、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片であって、断片は、同じポリペプチド鎖内（ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ）に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）につなげられた重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間のペアリングを可能にするには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは別の鎖の相補ドメインと対にされて、２つの抗原結合部位が生み出される［ＥＰ０４０４０９７Ｂ１；ＷＯ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照されたい］。操作された抗体バリアントの総説については、一般的に、［Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１１２６−１１３６（２００５）］を参照されたい。
【０１２０】
典型的に、本発明の抗体または抗原結合断片は、その活性をモルベースで表すと、（親抗体と比べた場合に）イヌＰＤ−Ｌ１結合活性の少なくとも１０％を保持している。好ましくは、本発明の抗体または抗原結合断片は、親抗体のイヌ抗原（例えばＰＤ−Ｌ１）結合アフィニティーの少なくとも２０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％またはそれ以上を保持している。本発明のイヌ化抗体または抗原結合断片は、その生物学的活性を実質的に変えない保存的または非保存的なアミノ酸置換を包含することができる（抗体の「保存的バリアント」または「機能保存バリアント」と呼ばれる）ことも意図される。
【０１２１】
「単離された抗体」とは精製状態をいい、かかる状況においてその分子が他の生物学的分子、例えば核酸、タンパク質、脂質、炭水化物または例えば細胞デブリおよび増殖培地などの他の物質を実質的に含まないことを意味する。一般に、用語「単離された」は、本明細書中に記載されている結合性化合物の実験的または治療的な使用を実質的に妨げる量で存在しないかぎり、かかる物質の完全な不存在または水、バッファーもしくは塩の不存在をいうことは意図されない。
【０１２２】
本明細書中で用いられる「キメラ抗体」は、第一の抗体からの可変ドメインおよび第二の抗体からの定常ドメインを持つ抗体であって、ここで第一の抗体および第二の抗体は異なる種からのものである［Ｕ．Ｓ．４，８１６，５６７；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５（１９８４）］。典型的に、結果として得られるキメラ抗体が親（例えばげっ歯類）抗体よりもイヌ対象において有害な免疫応答を誘導する可能性がより低くなるよう、可変ドメインは例えばげっ歯類などの実験動物からの抗体（「親抗体」）から得られ、定常ドメイン配列は動物対象の抗体、例えばイヌの抗体から得られる。
【０１２３】
本明細書中で用いられる用語「イヌ化抗体」とは、イヌ抗体および非イヌ（例えばマウス）抗体の両方からの配列を含有する形態の抗体をいう。一般的に、イヌ化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで高可変ループの全てまたは実質的に全ては（例えば、下に例示される６つのマウス抗イヌＰＤ−Ｌ１  ＣＤＲを含む）非イヌ免疫グロブリンのそれに相当し、およびイヌのフレームの全てまたは実質的に全てを含む。
【０１２４】
用語「完全イヌ抗体」とは、イヌ免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体をいう。完全イヌ抗体は、マウス内、マウス細胞内、またはマウス細胞に由来するハイブリドーマ内で生産された場合、マウスの糖鎖を含有し得る。同様に、「マウス抗体」とは、マウス免疫グロブリン配列のみを含む抗体をいう。あるいは、完全イヌ抗体は、ラット内、ラット細胞内、またはラット細胞に由来するハイブリドーマ内で生産された場合、ラットの糖鎖を含有し得る。同様に、「ラット抗体」とは、ラット免疫グロブリン配列のみを含む抗体をいう。
【０１２５】
各軽鎖／重鎖のペアの可変領域は、抗体結合部位を形成する。それゆえに、一般的に、インタクトな抗体は２つの結合部位を持つ。二機能性抗体または二重特異性抗体を除いて、２つの結合部位は一般的に同一である。
【０１２６】
典型的に、重鎖および軽鎖の両方の可変ドメインは、比較的保存されているフレームワーク領域（ＦＲ）内に位置する相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる３つの高可変領域を含む。ＣＤＲは通常フレームワーク領域に隣接しており、特異的なエピトープへの結合を可能にする。一般的に、Ｎ末端からＣ末端までに、軽鎖および重鎖の可変ドメインはいずれも、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。ヒト抗体についての各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、一般に、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．；５ｔｈ  ｅｄ．；ＮＩＨ  Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１）；Ｋａｂａｔ，Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．３２：１−７５（１９７８）；Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６０９−６６１６（１９７７）；Ｃｈｏｔｈｉａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）またはＣｈｏｔｈｉａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３（１９８９）］の定義に従う。
【０１２７】
本明細書中で用いられる用語「高可変領域」とは、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基をいう。高可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」（すなわち軽鎖可変ドメインにおけるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３、ならびに重鎖可変ドメインにおけるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３）からのアミノ酸残基を含む［配列によりヒト抗体のＣＤＲ領域を規定しているＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照されたい；また構造により抗体のＣＤＲ領域を規定しているＣｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）も参照されたい］。本明細書中で用いられる用語「フレームワーク」または「ＦＲ」残基とは、本明細書中でＣＤＲ残基として規定される高可変領域残基以外の可変ドメイン残基をいう。
【０１２８】
本明細書中で用いられる用語「イヌフレーム」とは、本明細書中でＣＤＲ残基として規定される高可変領域残基以外のイヌ抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列をいう。両方の鎖において、天然のイヌＣＤＲのアミノ酸配列は、対応する外来ＣＤＲ（例えば、マウス抗体からのもの）で置き換えられている。場合により、イヌ抗体の重鎖および／または軽鎖は、下に例示されるように、イヌ抗体内で外来ＣＤＲの立体構造を保存するためおよび／またはＦｃ機能を改変するため、いくつかの外来の非ＣＤＲ残基を含有してもよい。
【０１２９】
本明細書中で用いられる「抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体」とは、（例えば哺乳動物、例えばマウスまたはウサギなどにおいて）イヌＰＤ−Ｌ１に対して産生された、イヌＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗体をいう。「イヌＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する」または「配列番号５６のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する」抗体は、他の抗原と比べてイヌＰＤ−Ｌ１への優先的な結合を呈する、例えばイヌＰＤ−Ｌ１に「特異性を有して」結合する抗体である。結合は、完全な結合特異性を必要としない。抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体は、その結合が試料中のイヌＰＤ−Ｌ１の存在を決定する場合またはイヌ試料中で他の分子の活性を過度に妨げることなく、例えば診断との関連での偽陽性または治療との関連での副作用などの望まれない結果を生じることなくイヌＰＤ−Ｌ１の活性を変える能力がある場合、イヌＰＤ−Ｌ１に「特異的」であると考えられる。抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体に必要な特異性の程度は、抗体の意図される使用に依存し得るものであり、何にしても意図された目的のための使用へのその適合性により規定される。意図された方法の抗体または抗体の抗原結合部位に由来する結合性化合物は、その抗原またはそのバリアントもしくは変異タンパク質に、任意の他の抗原とのアフィニティーよりも少なくとも２倍大きい、好ましくは少なくとも１０倍大きい、より好ましくは少なくとも２０倍大きい、および最も好ましくは少なくとも１００倍大きいアフィニティーを有して結合する。
【０１３０】
したがって、本発明は、イヌＰＤ−Ｌ１と（例えば特異性を有して）結合するイヌ化抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合断片（単離された形態のものを包含する）、およびかかる抗体またはその断片の使用を提供する。具体的な実施形態において、イヌＰＤ−Ｌ１への結合、およびイヌＰＤ−Ｌ１のその受容体例えばイヌＰＤ−１への結合の遮断、の両方を示したマウス抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体からのマウス抗イヌＰＤ−Ｌ１  ＣＤＲが提供される。本明細書中に例示されているように、これらのＣＤＲを本発明の改変イヌフレーム内に挿入することで、イヌ化マウス抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体を作製することができる。
【０１３１】
より詳細には、本発明の「イヌ化マウス抗ＰＤ−Ｌ１抗体」とは、マウス抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体からの３つの重鎖ＣＤＲおよび３つの軽鎖ＣＤＲをイヌフレームまたは改変イヌフレームと共に含む抗体をいう。改変イヌフレームは、例えば抗体エフェクター機能を増大、低減もしくは除去するように、イヌ抗原、例えばイヌＰＤ−Ｌ１へのその結合を向上させるように、および／またはイヌ抗原、例えばイヌＰＤ−Ｌ１のその天然の結合相手（例えば抗原がイヌＰＤ−Ｌ１である場合はイヌＰＤ−１）への結合を遮断するその能力を向上させるように、イヌ化抗体の有効性をさらに最適化する、本明細書中に例示されているような１または複数のアミノ酸変化を含む。
【０１３２】
「相同性」とは、最適に並べられたときの２つのポリヌクレオチド配列間または２つのポリペプチド配列間の配列類似性をいう。２つの比較される配列の両方における位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットにより占められているとき、例えば２つのＤＮＡ分子の各々における位置がアデニンにより占められている場合、その分子はその位置において相同である。相同性のパーセントは、２つの配列が共有する相同的位置の数を比較される位置の総数で除算したものの１００倍である。例えば、配列が最適に並べられたときに２つの配列中の１０個の位置のうちの６個がマッチしているまたは相同であるなら、２つの配列は６０％相同である。一般に、比較は、２つの配列が最大パーセント相同性を付与するように配列されたときに行われる。
【０１３３】
「単離された核酸分子」は、天然においてその中に単離ポリヌクレオチドが見出されるポリヌクレオチドの全てもしくは部分を伴わない、または天然において連結されていないポリヌクレオチドに連結されている、ゲノムのＤＮＡもしくはＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡもしくは合成起源のものまたはそれらのいくつかの組み合わせを意味する。本開示の目的のため、特定のヌクレオチド配列「を含む核酸分子」はインタクトな染色体を包含しないことが理解されるべきである。指定された核酸配列を「含む」単離された核酸分子は、指定された配列に加えて、１０個まで、もしくはなお２０個まで、もしくはそれより多くの他のタンパク質もしくはその部分もしくは断片に対するコーディング配列を包含してもよく、または列挙された核酸配列のコーディング領域の発現を制御する作動可能に連結された調節配列を包含してもよく、および／またはベクター配列を包含してもよい。
【０１３４】
フレーズ「制御配列」とは、特定の宿主生物内での作動可能に連結されたコーディング配列の発現に必要なＤＮＡ配列をいう。原核生物に適した制御配列は、例えば、プロモーター、場合によりオペレーター配列、およびリボソーム結合部位を包含する。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを用いることが知られている。
【０１３５】
核酸は、別の核酸配列との機能的関係に置かれたときに「作動可能に連結」されている。例えば、プレ配列もしくは分泌リーダーのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するタンパク質前駆体として発現する場合ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結されており；プロモーターもしくはエンハンサーは、それが配列の転写に影響する場合コーディング配列に作動可能に連結されており；またはリボソーム結合部位は、それが翻訳を促すように配置されている場合コーディング配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結された」は、連結されているＤＮＡ配列が近接していること、及び分泌リーダーの場合は近接していて読み取り期（ｒｅａｄｉｎｇ  ｐｈａｓｅ）にあることを意味する。一方、エンハンサーは近接している必要はない。連結は、好都合な制限部位におけるライゲーションにより達成される。かかる部位が存在しない場合、合成のオリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが慣用的実務に従って用いられる。
【０１３６】
本明細書中で用いられる表現「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」は、交換可能に用いられ、全てのかかる名称は後代を包含する。それゆえに、言葉「形質転換体」および「形質転換細胞」は、初代の対象細胞および継代回数に関係なくそれに由来する培養物を包含する。意図的なまたは偶然の変異のために、全ての後代が正確に同一のＤＮＡの中身を持つわけではないことも理解される。元の形質転換細胞の中からスクリーニングされた同じ機能または生物学的活性を持つ変異後代が包含される。別個の名称が意図される場合は、文脈から明らかであろう。
【０１３７】
本明細書中で用いられる「生殖系列配列」とは、再構成されていない免疫グロブリンＤＮＡ配列の配列をいう。再構成されていない免疫グロブリン配列の任意の好適な供給源が用いられ得る。ヒト生殖系列配列は、例えばｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ  ａｎｄ  Ｓｋｉｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈのウェブサイト上のＪＯＩＮＳＯＬＶＥＲ（登録商標）生殖系列データベースから入手し得る。マウス生殖系列配列は、例えばＧｉｕｄｉｃｅｌｌｉら［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：Ｄ２５６−Ｄ２６１（２００５）］中に記載されているように入手し得る。
【０１３８】
イヌ化抗体の特性
イヌにおいては、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤと呼ばれる４つのＩｇＧ重鎖がある。これらの重鎖はイヌＩｇＧの４つの異なるサブクラスを表し、ＩｇＧＡ、ＩｇＧＢ、ＩｇＧＣおよびＩｇＧＤと呼ばれる。これら４つの重鎖のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は、Ｔａｎｇら［Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．８０：２５９−２７０（２００１）］により最初に同定された。これらの重鎖に対するアミノ酸配列およびＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースからも入手可能である。例えば、ＩｇＧＡ重鎖のアミノ酸配列のアクセッション番号はＡＡＬ３５３０１．１であり、ＩｇＧＢのアクセッション番号はＡＡＬ３５３０２．１であり、ＩｇＧＣのアクセッション番号はＡＡＬ３５３０３．１であり、ＩｇＧＤのアクセッション番号は（ＡＡＬ３５３０４．１）である。イヌ抗体はまた２つのタイプの軽鎖、カッパおよびラムダを含有する。これらの軽鎖のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースから入手することができる。例えば、カッパ軽鎖のアミノ酸配列のアクセッション番号はＡＢＹ  ５７２８９．１であり、ラムダ軽鎖のアクセッション番号はＡＢＹ  ５５５６９．１である。本発明において、４つのイヌＩｇＧ  Ｆｃ断片の各々に対するアミノ酸配列は、上のＴａｎｇらにより決定された、ＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメインの同定された境界に基づくものである。
【０１３９】
治療的モノクローナル抗体の開発は、所望の抗体を作成するために複雑な一連の活性の協調を必然的に伴う複雑なプロセスである。これらは、抗体特異性の最適化、アフィニティー、機能的活性、操作された細胞株における発現レベル、長期安定性、エフェクター機能の除去または増強、ならびに商業的に実行可能な製造方法および精製方法の開発を包含する。本発明の目的を考慮すると、免疫系の細胞を活性化する能力は別にして、イヌＰＤ−Ｌ１に対するイヌ化またはイヌのモノクローナル抗体は、最適には、３つの付加的な特質：
１．エフェクター機能、例えば抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）などの欠如
２．インビボでの比較的長い半減期；および
３．工業的な標準技術、例えばプロテインＡクロマトグラフィーに基づくものなどを用いて大規模で容易に精製されること
を持つ。
【０１４０】
天然起源のイヌＩｇＧサブクラスはいずれもこれら全ての判断基準を満たさない。例えば、ＩｇＧＢはプロテインＡを用いて精製することができるが、高レベルのＡＤＣＣ活性を持つ。ＩｇＧＣもまた、相当なＡＤＣＣ活性を持つ。他方、ＩｇＧＡはプロテインＡに弱く結合するが、望ましくないＡＤＣＣ活性を発揮する。さらには、ＩｇＧＤはＡＤＣＣ活性を発揮しないが、ＩｇＧＣもＩｇＧＤもいずれもプロテインＡカラム上で精製することができない。加えて、ＩｇＧＣはイヌＦｃＲｎ受容体に結合しないことから、血清半減期が短い。本発明は、イヌ抗原、例えばイヌＰＤ−Ｌ１、に特異的な改変イヌＩｇＧ抗体を提供することによりこの困難を克服するものであり；かかる抗体はエフェクター機能、例えばＡＤＣＣおよびＣＤＣなどを欠いており、比較的長い半減期を発揮し、工業的な標準的プロテインＡクロマトグラフィーを用いて容易に精製することができる。
【０１４１】
今までに、ＡＤＣＣおよびＣＤＣエフェクター機能の両方を欠き、加えてプロテインＡクロマトグラフィーにより精製することができる遺伝子改変イヌＩｇＧは以前に記載されていなかった。本明細書中に開示されるように、例えばＮ２９７ＡまたはＤ２６５ＡのようなヒトおよびマウスのＩｇＧのそれと類似したイヌＩｇＧの位置における単一の置換は、対応するイヌ抗体においてＡＤＣＣおよびＣＤＣエフェクター機能の両方を完全には除去しない。例えば、ヒトまたはマウスの抗体における置換Ｎ２９７およびＤ２６５の各々はＦｃγ受容体およびＣ１ｑへの結合の抑止をもたらすが、いずれの置換も単独ではイヌ抗体のＣ１ｑへの結合を完全には抑止しなかった。代わりに、下にさらに開示されるように、ＩｇＧＢまたはＩｇＧＣサブクラスのイヌ抗体においてＡＤＣＣおよびＣＤＣの両方を除去するためには、アスパラギンからアラニンへの置換およびアスパラギン酸からアラニンへの置換の両方を組み合わせた二重置換をイヌ抗体のＦｃ内に作ることが必要であることが判明した。さらには、全く意外なことに、ヒト抗体においてエフェクター機能を低減させることが示されていた１つの置換は、実際には、対応するイヌＩｇＧのＦｃγＲおよびＣ１ｑへの結合の向上をもたらした。
【０１４２】
エフェクター機能を欠いたイヌＩｇＧＢおよびＩｇＧＣのバリアントを作成するために、改変イヌＩｇＧＢ重鎖または改変イヌＩｇＧＣ重鎖を作成することができる。これらのイヌ結晶性フラグメント領域（ｃＦｃ）の両方の中に存在する合計７個のアミノ酸残基が、かかる可能性のある置換のために同定された。これらの７個のアミノ酸残基は、イヌＩｇＧＢのＦｃに関する配列番号６６のアミノ酸配列；およびイヌＩｇＧＣのＦｃに関する配列番号６８のアミノ酸配列の両方について：Ｐ４、Ｄ３１、Ｎ６３、Ｇ６４、Ｔ６５、Ａ９３およびＰ９５である。したがって、配列番号２のアミノ酸配列は、配列番号６６のアミノ酸配列においてそれぞれプロリン（Ｐ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、グリシン（Ｇ）、スレオニン（Ｔ）、アラニン（Ａ）およびプロリン（Ｐ）である４位、３１位、６３位、６４位、６５位、９３位および９５位のアミノ酸残基を、７個全ての位置について「Ｘ」（または３文字表記では「Ｘａａ」）として持つことにより配列番号６６のそれと異なっており、これら７個のアミノ酸位置が２０個の天然アミノ酸（下の表１のカラム１中のリストを参照されたい）のうちのいずれかであることができることを意味する。同様に、配列番号４のアミノ酸配列は、４位、３１位、６３位、６４位、６５位、９３位および９５位のアミノ酸残基が、７個全ての位置について「Ｘ」（または３文字表記では「Ｘａａ」）として載っていることにより配列番号６８のそれと異なっており、これら７個のアミノ酸位置が２０個の天然アミノ酸のうちのいずれかであることができることを意味する。配列番号２のアミノ酸配列は配列番号１のヌクレオチド配列によりコードされ、配列番号４のアミノ酸配列は配列番号３のヌクレオチド配列によりコードされる。
【０１４３】
１の実施形態において、ｃＦｃは、次の置換Ｐ４（Ａ、ＧまたはＳ）、Ｄ３１（Ａ、ＧまたはＳ）、Ｎ６３（Ａ、ＧまたはＳ）、Ｇ６４（ＡまたはＰ）、Ｔ６５（Ａ、ＧまたはＳ）、Ａ９３（ＧまたはＳ）およびＰ９５（Ａ、ＧまたはＳ）を有する配列番号６６のアミノ酸配列を含み；ここでＰ４（Ａ、ＧまたはＳ）は４位のプロリン残基がアラニン残基、グリシン残基またはセリン残基のいずれかにより置き換えられることを意味し、同様にＧ６４（ＰまたはＡ）は６４位のグリシン残基がプロリン残基またはアラニン残基のいずれかにより置き換えられることを意味する、などである。特定の実施形態において、ｃＦｃは、次の置換：Ｐ４Ａ、Ｄ３１Ａ、Ｎ６３Ａ、Ｇ６４Ｐ、Ｔ６５Ａ、Ａ９３ＧおよびＰ９５Ａを有する配列番号６６のアミノ酸配列を含む。
【０１４４】
関連する実施形態において、ｃＦｃは、次のアミノ酸残基：Ａ４、Ａ３１、Ａ６３、Ｇ６４、Ｔ６５、Ｇ９３およびＡ９５を有する、Ｘａａと名付けられた７個のアミノ酸を含有する配列番号４のアミノ酸配列を、すなわち、次の５個のアミノ酸残基変化：Ｐ４Ａ、Ｄ３１Ａ、Ｎ６３Ａ、Ａ９３ＧおよびＰ９５Ａを有し、７個のうち残りの２個のアミノ酸残基であるＧ６４およびＴ６５は配列番号６８のアミノ酸配列から保持されている配列番号６８のアミノ酸配列を含む。
【０１４５】
配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０および配列番号３２のアミノ酸配列は全て、７個のアミノ酸位置において「Ｘ」（または３文字表記では「Ｘａａ」）を含有し、これら７個のアミノ酸位置が下の表１のカラム１中に載っている２０個の天然アミノ酸のうちのいずれかであることができることを意味する。注目すべきことに、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０および配列番号３２は、それぞれの配列内に配列番号２のアミノ酸配列または配列番号４のアミノ酸配列のいずれかを含む。アミノ酸配列のこれら７個の位置のうちの１または複数におけるアミノ酸残基の具体例は、上および下に叙述されており、それゆえ、配列番号２、配列番号４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０および配列番号３２の個々のアミノ酸配列の種類の中に、並びにこれらの配列を含むイヌ化抗体の中に包含される。
【０１４６】
下に与えられた表１０は、本明細書中に開示されているように置き換えることができる、ｃＩｇＧＢ  Ｆｃ（配列番号６６および配列番号２）およびｃＩｇＧＣ  Ｆｃ（配列番号６８および配列番号４）の７個のアミノ酸位置と、これらのｃＦｃアミノ酸配列、すなわち配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０および配列番号３２を含む完全長のイヌ重鎖のそれとの相互関係を具体的に示す。したがって、完全長配列ＩｇＧＢまたはＩｇＧＣにおける実際の位置は、下の表１０の使用を通じてそれが含むｃＦｃのそれと容易に整合することができる。
【０１４７】
特定の実施形態において、抗体の重鎖は、（ｉ）２４２位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを、（ｉｉ）２６９位にＤ、Ａ、ＧまたはＳを、（ｉｉｉ）３０１位にＮ、Ａ、ＧまたはＳを、（ｉｖ）３０２位にＧ、ＰまたはＡを、（ｖ）３０３位にＴ、Ａ、ＧまたはＳを、（ｖｉ）３３１位にＡ、ＧまたはＳを、および（ｖｉｉ）３３３位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを含む、配列番号２６のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、抗体の重鎖は、（ｉ）２４０位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを、（ｉｉ）２６７位にＤ、Ａ、ＧまたはＳを、（ｉｉｉ）２９９位にＮ、Ａ、ＧまたはＳを、（ｉｖ）３００位にＧ、ＰまたはＡを、（ｖ）３０１位にＴ、Ａ、ＧまたはＳを、（ｖｉ）３２９位にＡ、ＧまたはＳを、および（ｖｉｉ）３３１位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを含む、配列番号２８または３０のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、抗体の重鎖は、（ｉ）２３８位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを、（ｉｉ）２６５位にＤ、Ａ、ＧまたはＳを、（ｉｉｉ）２９７位にＮ、Ａ、ＧまたはＳを、（ｉｖ）２９８位にＧ、ＰまたはＡを、（ｖ）２９９位にＴ、Ａ、ＧまたはＳを、（ｖｉ）３２７位にＡ、ＧまたはＳを、および（ｖｉｉ）３２９位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを含む、配列番号３１のアミノ酸配列を含む。
【０１４８】
本発明はまた、天然のＩｇＧＤヒンジ領域の代わりにＩｇＧＡ、ＩｇＧＢまたはＩｇＧＣのいずれかからのヒンジ領域を含む改変イヌＩｇＧＤを提供する。あるいは、ＩｇＧＤヒンジ領域は、表５中に示されているようにセリン残基をプロリン残基で置き換えることにより遺伝子改変することができる。かかる改変は、ｆａｂアーム交換を欠いたイヌＩｇＧＤを導くことができる。改変イヌＩｇＧＤは、組換えＤＮＡ技術の標準的方法［例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）］を用いて構築することができる。これらのバリアントを構築するため、イヌＩｇＧＤのアミノ酸配列をコードする核酸は、改変ＩｇＧＤをコードするように改変することができる。改変された核酸配列は次いでタンパク質発現用の発現プラスミド内にクローニングされる。置換ヒンジ領域を有するイヌＩｇＧＤ  Ｆｃをコードする核酸は、配列番号８、１０および１２のアミノ酸配列をコードする配列番号７、９および１１のヌクレオチド配列により例示される。改変ＩｇＧＤヒンジ領域を有するイヌＩｇＧＤ  Ｆｃをコードする核酸は、配列番号６のアミノ酸配列をコードする配列番号５のヌクレオチド配列を含む。
【０１４９】
本発明はさらに、イヌ化抗体を作製するために対応する軽鎖と調和することができる完全長のイヌ重鎖を提供する。したがって、本発明はさらに、イヌ化マウス抗イヌ抗原抗体（単離されたイヌ化マウス抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体を包含する）およびイヌにおける疾患の処置、例えば、がんの処置における抗体またはその抗原結合断片の使用方法を提供する。
【０１５０】
さらには、本発明は、イヌＰＤ−Ｌ１に結合し、イヌＰＤ−１のイヌＰＤ−Ｌ１への結合を遮断するイヌ化マウス抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体または抗原結合断片を提供する。ある実施形態において、イヌ化マウス抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体は、本明細書中に記載されている改変イヌＩｇＧＢ  Ｆｃ、改変イヌＩｇＧＣ  Ｆｃまたはｆａｂアーム交換を欠いた改変イヌＩｇＧＤを含む。
【０１５１】
イヌ抗原、例えばイヌＰＤ−Ｌ１と結合する抗体またはその抗原結合断片は、１、２、３、４、５または６個の、本明細書中に記載されているマウス抗イヌ抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。１、２、３、４、５または６個のＣＤＲは、下に提供されているもののＣＤＲ配列から独立して選択され得る。さらなる実施形態において、イヌＰＤ−Ｌ１と結合する抗体またはその抗原結合断片は、マウス軽鎖ＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２および／またはＣＤＲ−３を含むイヌ抗体カッパ軽鎖ならびにマウス重鎖ＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２および／またはＣＤＲ−３を含むイヌ抗体重鎖ＩｇＧを含む。したがって、本発明はさらに、イヌ化抗体を作製するために例として対応する軽鎖と調和することができる完全長のイヌ重鎖を提供する［マウス抗イヌＰＤ−Ｌ１、例えば４Ｆ９および５Ｆ１２の２セットのＣＤＲの配列が提供されている下の表２を参照されたい］。
【０１５２】
他の実施形態において、本発明は、ＰＤ−Ｌ１と特異性を有して結合し、配列番号１６、１７、１８、２２、２３および／または２４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を含む１から６個の異なるＣＤＲを含むイヌ抗体カッパ軽鎖ならびに配列番号１３、１４、１５、１９、２０および／または２１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を含む１から６個の異なるＣＤＲを含むイヌ抗体重鎖ＩｇＧを持ちながらも、所望の結合特性および機能的特性をなお呈する抗体またはその抗原結合断片を提供する。別の他の実施形態において、本発明の抗体または抗原結合断片は、ＩｇＧ重鎖配列と０、１、２、３、４または５個の保存的または非保存的なアミノ酸置換を有する１または複数の上述のＣＤＲアミノ酸配列を持つカッパ軽鎖との組み合わせを含み、所望の結合特性および機能的特性をなお呈するイヌフレームを含む。
【０１５３】
「保存的改変バリアント」または「保存的置換」とは、タンパク質の生物学的活性を変えることなくたびたび変化させることができるような、タンパク質におけるアミノ酸の、類似した特性（例えば電荷、側鎖サイズ、疎水性／親水性、骨格立体構造および剛性など）を持つ他のアミノ酸での置換をいう。一般的に、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換は生物学的活性を実質的に変えないことをこの技術分野の当業者は認識している［例えば、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４（４ｔｈ  Ｅｄ．；１９８７）を参照されたい］。加えて、構造的または機能的に類似したアミノ酸の置換は、生物学的活性を壊す可能性がより低い。例示的な保存的置換を直下の表Ｉ中に表す。
【０１５４】
表１
例示的な保存的アミノ酸置換
【表１】
0006797111.tif 000002
【０１５５】
本発明の抗体の機能保存的バリアントもまた、本発明により意図される。本明細書中で用いられる「機能保存的バリアント」とは、１または複数のアミノ酸残基が所望の特性、例えば抗原アフィニティーおよび／または特異性などを変えることなく変化している抗体または断片をいう。かかるバリアントとしては、限定されるものではないが、類似した特性を持つアミノ酸でのアミノ酸の置き換え、例えば上の表Ｉの保存的アミノ酸置換などが挙げられる。
【０１５６】
核酸
本発明はさらに、本明細書中に開示されているイヌ化マウス抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体およびその抗原結合断片の免疫グロブリン鎖をコードする核酸を含む（下の実施例を参照されたい）。
【０１５７】
本発明中にまた包含されるのは、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより比較が実施されたときに、本明細書中に提供されているＣＤＲおよび／またはイヌｃＦｃおよび／または抗体のアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一である、好ましくは少なくとも約８０％同一である、より好ましくは少なくとも約９０％同一である、および最も好ましくは少なくとも約９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）同一であるアミノ酸を含む免疫グロブリンポリペプチドをコードする核酸であり、ここでアルゴリズムのパラメーターはそれぞれの参照配列の全長に対してそれぞれの配列との間で最大マッチを付与するように選択される。本発明はさらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムで比較が実施されたときに、参照アミノ酸配列のいずれかと少なくとも約７０％類似している、好ましくは  少なくとも約８０％類似している、より好ましくは少なくとも約９０％類似している、および最も好ましくは少なくとも約９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）類似しているアミノ酸配列を含む免疫グロブリンポリペプチドをコードする核酸を提供するものであり、ここでアルゴリズムのパラメーターはそれぞれの参照配列の全長に対してそれぞれの配列との間で最大マッチを付与するように選択される。
【０１５８】
本発明はまた、本発明の核酸（単離された核酸を包含する）を含む発現ベクターを提供し、ここで核酸は、宿主細胞がベクターでトランスフェクトされたときに宿主細胞により認識される制御配列に作動可能に連結している。また提供されるのは、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞、ならびに、抗体または抗原結合断片をコードする発現ベクターを内部に持つ宿主細胞を培養培地中で培養すること、および宿主細胞または培養培地から抗原またはその抗原結合断片を単離することを含む、本明細書中に開示されている抗体またはその抗原結合断片を生産する方法である。
【０１５９】
イヌ化マウス抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体は、例えば、当該分野で公知の方法により組換え的に生産することができる。本明細書中に開示されている抗体または断片の発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は当該技術分野で周知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から利用可能な多くの不死化細胞株を包含する。これらとしては、なかでも、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、Ｈｅｌａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えばＨｅｐ  Ｇ２）、Ａ５４９細胞、３Ｔ３細胞、ＨＥＫ−２９３細胞および多数の他の細胞株が挙げられる。哺乳動物宿主細胞としては、ヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマおよびハムスターの細胞が挙げられる。とりわけ好ましい細胞株は、いずれの細胞株が高い発現レベルを持つかを決定することを通じて選択される。用いられ得る他の細胞株は、昆虫細胞株、例えばＳｆ９細胞など、両生類細胞、細菌細胞、植物細胞および真菌細胞である。重鎖またはその抗原結合部分もしくは断片、軽鎖および／またはその抗原結合断片をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞内に導入されたとき、宿主細胞内で抗体を発現させるのにまたはより好ましくは宿主細胞が増殖した培養培地内に抗体を分泌させるのに十分な時間、宿主細胞を培養することにより、抗体が生産される。
【０１６０】
抗体は、標準的なタンパク質精製方法を用いて培養培地から回収することができる。さらに、産生細胞株からの本発明の抗体（またはそれに由来する他の部分）の発現は、多数の公知の技術を用いて増強することができる。例えば、グルタミン合成酵素遺伝子発現系（ＧＳ系）は、ある条件下で発現を増強させるために通例的なアプローチである。ＧＳ系は、欧州特許第０２１６８４６号、第０２５６０５５号および第０３２３９９７号ならびに欧州特許出願第８９３０３９６４．４号との関連で全体的にまたは部分的に論じられている。
【０１６１】
一般的に、特定の細胞株または遺伝子導入動物において生産される糖タンパク質は、その細胞株または遺伝子導入動物において生産される糖タンパク質に特徴的なグリコシル化パターンを持つ。それゆえ、抗体の特定のグリコシル化パターンは、抗体を生産するために用いられる特定の細胞株または遺伝子導入動物に依存するであろう。しかしながら、本明細書中に提供される核酸分子によりコードされるまたは本明細書中に提供されるアミノ酸配列を含む全ての抗体は、抗体が持ち得るグリコシル化パターンと無関係に本発明を構成する。同様に、特定の実施形態において、非フコシル化Ｎ−グリカンのみを含むグリコシル化パターンを有する抗体は有利であり得るが、その理由は、これらの抗体はインビトロおよびインビボの両方においてそれらのフコシル化対応物よりも強力な有効性を典型的に呈することが示されているためである［例えば、Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３４６６−３４７３（２００３）；米国特許第６，９４６，２９２号および第７，２１４，７７５号を参照されたい］。
【０１６２】
本発明はさらに、本明細書中に開示されているイヌ化マウス抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体の抗体断片を包含する。抗体断片はＦ（ａｂ）２断片を包含し、これは例えばペプシンによるＩｇＧの酵素的切断によって生産され得る。Ｆａｂ断片は、例えばジチオスレイトールまたはメルカプトエチルアミンでのＦ（ａｂ）２の還元により生産され得る。Ｆａｂ断片は、ジスルフィド架橋によりＶＨ−ＣＨ１鎖に付加されたＶＬ−ＣＬ鎖である。Ｆ（ａｂ）２断片は、今度は２つのジスルフィド架橋により付加された２つのＦａｂ断片である。Ｆ（ａｂ）２分子のＦａｂ部分は、その間にジスルフィド架橋が位置するＦｃ領域の部分を包含する。ＦＶ断片は、ＶＬ領域またはＶＨ領域である。
【０１６３】
１の実施形態において、抗体または抗原結合断片は、重鎖定常領域、例えばイヌ定常領域、例えばＩｇＧＡ、ＩｇＧＢ、ＩｇＧＣおよびＩｇＧＤイヌ重鎖定常領域など、またはそのバリアントを含む。別の実施形態において、抗体または抗原結合断片は、軽鎖定常領域、例えばイヌ軽鎖定常領域、例えばラムダまたはカッパ  イヌ軽鎖領域など、またはそのバリアントを含む。限定されない例として、イヌ重鎖定常領域はＩｇＧＢからのものであることができ、イヌ軽鎖定常領域はカッパからのものであることができる。
【０１６４】
抗体エンジニアリング
本発明のイヌ化マウス抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体は、下に詳述されているように、例えば抗体の特性を改良するため、親の（すなわちイヌの）モノクローナル抗体のイヌフレーム内に改変を包含するように操作することができる。
【０１６５】
交差遮断（ｃｒｏｓｓ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ）抗体およびエピトープ結合
４Ｆ９および／または５Ｆ１２と交差競合する交差遮断抗体およびその抗原結合断片は、イヌ化交差遮断抗体およびその抗原結合断片を包含するものであって、本発明の一部である。加えて、本発明の抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体または断片のいずれかと同じエピトープに結合する抗体およびその抗原結合断片もまた、本発明の一部を形成する。交差遮断抗体および抗原結合断片は、標準的な結合アッセイ（例えば、ＢＩＡＣｏｒｅ（登録商標）、ＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリー）において４Ｆ９および／または５Ｆ１２と交差競合するそれらの能力に基づいて同定することができる。例えば、組換えイヌＰＤ−Ｌ１タンパク質をプレート上に固定化し、抗体のうちの１つを蛍光標識し、競合して標識抗体の結合を外す非標識抗体の能力を調べる標準的なＥＬＩＳＡアッセイを用いることができる。加えて、またはあるいは、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）解析を用いてその抗体の交差競合する能力を評価することもできる。試験抗体の、例えば４Ｆ９および／または５Ｆ１２のイヌＰＤ−Ｌ１への結合を阻害する能力は、試験抗体がイヌＰＤ−Ｌ１への結合について４Ｆ９および／または５Ｆ１２と競合することができ、それゆえに、いくつかの場合において４Ｆ９および／または５Ｆ１２と同じイヌＰＤ−Ｌ１上のエピトープに結合し得ることを実証するものである。より特定の実施形態において、４Ｆ９および／または５Ｆ１２と交差競合し、また４Ｆ９および／または５Ｆ１２と同じイヌＰＤ−Ｌ１上のエピトープに結合する交差遮断抗体およびその抗原結合断片も本発明の一部である。
【０１６６】
ペプチドおよび融合タンパク質ワクチン
抗イヌＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂにより認識されるエピトープ（またはその部分）を含むペプチドおよびかかるペプチドを含む融合タンパク質は、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合を遮断してＴ細胞活性化および免疫応答の亢進をもたらす抗体を誘導するためのワクチンとして用いられ得る。かかるワクチンは、疾患、例えばがんなどのための治療ワクチンとして、または他のワクチンへの免疫応答のエンハンサーとして作用させるのに有用であり得る。これらのペプチドをワクチンとして用いるため、１または複数のこれらのペプチドは、これらのペプチドの免疫原性を増強してペプチド特異的抗体を誘導するために化学的にまたは組換えＤＮＡ技術を通じてキャリアタンパク質にカップリングされ得る。ペプチドをキャリアタンパク質にカップリングする技術は、当業者に公知である。ペプチド（および対応する融合タンパク質）ワクチンは、例えば筋肉内（ＩＭ）、皮下（Ｓ／Ｃ）、経口、噴霧または卵内経路により、動物にワクチン接種するために用いられ得る（下も参照されたい）。かかるワクチンは、細菌、ウイルス、酵母またはバキュロウイルスのウイルス系から発現されたサブユニットタンパク質として用いられ得る。あるいはかかるペプチド（または融合タンパク質）ワクチンは、当業者に公知の方法により実行することができる、かかるペプチドまたは融合タンパク質を発現する種々のウイルスベクターまたは細菌ベクターの投与の後に送達され得る。ペプチドまたは融合タンパク質ワクチンは、１〜１０００μｇの用量で投与され得るものであり、アジュバントおよび許容される薬学的担体を含有してもよい。
【０１６７】
医薬組成物および投与
イヌ化マウス抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合断片の医薬組成物または滅菌組成物を調製するため、これを薬学的に許容される担体または賦形剤と混合することができる［例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８４）を参照されたい］。
【０１６８】
治療薬および診断薬の製剤は、許容される担体、賦形剤または安定剤と混合し、例えば凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液または懸濁液の形態で調製され得る［例えば、Ｈａｒｄｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ａｖｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９３）  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０）  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０）  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｗｅｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｋｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００）  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照されたい］。１の実施形態において、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、酢酸ナトリウム溶液  ｐＨ５〜６中で適切な濃度に希釈され、浸透圧のためにＮａＣｌまたはショ糖が加えられる。安定性を高めるために、付加的な剤、例えばポリソルベート２０またはポリソルベート８０などを加えてもよい。
【０１６９】
単独でまたは別の剤と組み合わせて投与される抗体組成物の毒性および治療的有効性は、例えばＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な用量）を決定するための細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手法により決定することができる。毒性効果と治療効果の間の用量比は治療指数（ＬＤ５０／ＥＤ５０）である。特定の態様において、高い治療指数を呈する抗体が望ましい。これらの細胞培養アッセイおよび動物試験から得られる結果は、イヌにおける使用のための投薬量の範囲の策定において用いることができる。かかる化合物の投薬量は、好ましくは、毒性がほとんどまたは全くないＥＤ５０を包含する循環濃度の範囲内にある。投薬量は、使用される剤形および投与経路に応じて、この範囲内で変わり得る。
【０１７０】
投与様式は変えることができる。好適な投与経路としては、経口、直腸、経粘膜、腸、非経口；筋肉内、皮下、皮内、髄内、髄腔内、直接的脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、眼球内、吸入、吹送、局所、皮膚、経皮または動脈内が挙げられる。特定の実施形態において、イヌ化マウス抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合断片は、侵襲的経路、例えば注射などにより投与することができる。本発明のさらなる実施形態において、マウス抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体もしくはその抗原結合断片、またはそれらの医薬組成物は、静脈内、皮下、筋肉内、動脈内、腫瘍内に、または吸入、エアロゾル送達により投与される。非侵襲的経路（例えば経口；例えば、丸剤、カプセルまたは錠剤中）による投与もまた本発明の範囲内である。
【０１７１】
本明細書中に開示されている医薬組成物はまた、注入によっても投与され得る。医薬組成物を投与する周知のインプラントおよびモジュール形態の例としては：制御された速度で薬物を投薬するための移植可能なマイクロインフュージョンポンプを開示している米国特許第４，４８７，６０３号；精密な注入速度で薬物を送達するための薬物注入ポンプを開示している米国特許第４，４４７，２３３号；連続的薬剤送達のための可変流量の移植可能な注入装置を開示している米国特許第４，４４７，２２４号；マルチチャンバー区画を持つ浸透ドラッグデリバリーシステムを開示している米国特許第４，４３９，１９６号が挙げられる。多くの他のかかるインプラント、送達システムおよびモジュールが当業者に周知である。
【０１７２】
あるいは、例えば免疫病理学により特徴付けられる関節炎を起こした関節または病原体が誘発した病変の中に、抗体、しばしばデポー剤または持続放出製剤中の抗体を直接注射することによって、イヌ化マウス抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体を全身性様式よりもむしろ局所に投与してもよい。そのうえ、標的化ドラッグデリバリーシステム中にある抗体、例えば免疫病理学により特徴付けられる関節炎を起こした関節または病原体が誘発した病変を標的とする組織特異的抗体でコーティングされたリポソーム中にある抗体を投与してもよい。リポソームは冒された組織を標的とし、選択的に取り込まれる。
【０１７３】
投与レジメンは、治療抗体の血清または組織での代謝回転速度、症候のレベル、治療抗体の免疫原性および生物学的マトリックス内にある標的細胞のアクセス性といったいくつかの因子に依存する。好ましくは、投与レジメンは、標的の疾患状態の改善をもたらし、同時に望まれない副作用を最小化するのに十分な治療抗体を送達する。したがって、送達される生物製剤の量は、具体的な治療抗体および処置される症状の重症度に部分的に依存する。治療抗体の適切な用量選択におけるガイダンスが利用可能である［例えば、Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂ．Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ（１９９６）；Ｋｒｅｓｉｎａ（ｅｄ．）  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９１）；Ｂａｃｈ（ｅｄ．）  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９３）；Ｂａｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：６０１−６０８（２００３）；Ｍｉｌｇｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４１：１９６６−１９７３（１９９９）；Ｓｌａｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：７８３−７９２（２００１）；Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２：６１３−６１９（２０００）；Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：２４−３２（２００３）；Ｌｉｐｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３：１５９４−１６０２（２０００）を参照されたい］。
【０１７４】
適切な用量の決定は、獣医（ｖｅｔｅｒａｎａｒｉａｎ）により、例えば当該分野において処置に影響することが知られているまたは疑われているパラメーターまたは因子を用いて行われる。一般に、用量は、最適用量よりいくらか少ない量で開始し、その後に少ない増加量で、何らかのネガティブな副作用と比較して所望のまたは最適な効果が達成されるまで増やしていく。重要な診断的測定値としては、例えば炎症の症候のそれ、または生産される炎症性サイトカインのレベルが挙げられる。
【０１７５】
本明細書中に開示されている抗体またはその抗原結合断片は、連続注入により、または、例えば毎日、１週間に１〜７回、毎週、隔週、毎月、隔月、四半期ごと、半年ごと、毎年などに投与される用量により与えられ得る。用量は、例えば静脈内、皮下、局所、経口、経鼻、直腸内、筋肉内、脳内、脊髄内に、または吸入により与えられ得る。週の合計用量は、一般に少なくとも０．０５μｇ／ｋｇ体重、より一般には少なくとも０．２μｇ／ｋｇ、０．５μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇまたはそれより多い［例えば、Ｙａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４９：４２７−４３４（２００３）；Ｈｅｒｏｌｄ，ｅｔ  ａｌ．  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：１６９２−１６９８（２００２）；Ｌｉｕ，ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈ．６７：４５１−４５６（１９９９）；Ｐｏｒｔｉｅｌｊｉ，ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：１３３−１４４（２００３）を参照されたい］。用量はまた、対象の血清中のイヌ化マウス抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体の予め決められた標的濃度、例えば０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００、３００μｇ／ｍｌまたはそれより高い濃度を達成するように与えられ得る。他の実施形態において、本発明のイヌ化マウス抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体は、皮下または静脈内に、毎週、隔週、「４週間ごと」、毎月、隔月または四半期ごとに、１０、２０、５０、８０、１００、２００、５００、１０００または２５００ｍｇ／対象で投与される。
【０１７６】
本明細書中で用いられる「阻害する」または「処置する」または「処置」は、障害に関連した症候の進展の延期および／またはかかる障害の症候の重症度の低減を包含する。この用語はさらに、現在する制御されないまたは望まれない症候を寛解させること、付加的な症候を防ぐこと、およびかかる症候の根底にある原因を寛解させるまたは防ぐことを包含する。それゆえに、この用語は、障害、疾患もしくは症候を有する、またはかかる障害、疾患もしくは症候を患う可能性がある脊椎動物対象に対して有益な結果が授与されたことを表す。
【０１７７】
本明細書中で用いられる用語「治療的有効量」、「治療的有効用量」および「有効量」とは、単独でまたは付加的な治療薬と組み合わせて細胞、組織または対象に投与されたときに、１または複数の疾患もしくは症状の症候またはかかる疾患もしくは症状の進行に測定可能な改善を引き起こすのに有効な本発明のイヌ化マウス抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合断片の量をいう。治療的有効用量はさらに、症候の少なくとも部分的な寛解、例えば関連のある医学的症状の処置、治癒、予防もしくは寛解、またはかかる症状の処置、治癒、予防もしくは寛解の速度の向上をもたらすのに十分な結合性化合物の量をいう。単独で投与される個々の活性成分に適用されるとき、治療的有効用量とは、その成分単独をいう。組み合わせに適用されるとき、治療的有効用量とは、組み合わせ、逐次的または同時のいずれで投与されたものであっても治療効果をもたらす活性成分の合わせた量をいう。治療有効量は、診断的な測定値またはパラメーターに、少なくとも１０％；通常は少なくとも２０％；好ましくは少なくとも約３０％；より好ましくは少なくとも４０％、および最も好ましくは少なくとも５０％の改善をもたらす。有効量はまた、主観的測定値が疾患の重症度を評価するために用いられる場合、主観的測定値の改善をもたらすこともできる。
【０１７８】
他の組み合わせ治療
先に記載したように、イヌ化マウス抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合断片は、１または複数の他の治療薬（例えば化学療法薬など）と共に投与され得る。抗体は、治療薬と連結されていてもよく（免疫複合体として）、または治療薬と別に投与することもできる。後者（別投与）の場合、抗体は、治療薬の前、後もしくは同時に投与することができ、または他の公知の治療と共に投与することができる。
【０１７９】
特定の組み合わせ治療において、イヌ化マウス抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合断片は、イヌ化マウス抗イヌＰＤ−１抗体もしくはその抗原結合断片［例えば、２０１３年１２月２０日に出願された米国仮出願シリアル番号第６１／９１８，９４６号、および２０１４年７月３０日に出願された米国仮出願シリアル番号第６２／０３０，８１２号、２０１４年１２月１６日に出願された仮出願シリアル番号第６２／０９２，４９６号、ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０７８６５５（ＷＯ２０１５０９１９１１）およびＰＣＴ  ＥＰ２０１４／０７８６５３（ＷＯ２０１５／０９１９１０）中に開示されたもの。これらの文献の内容は全て参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる］および／またはイヌ化マウス抗イヌ細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質−４（ＣＴＬＡ−４）抗体もしくはその抗原結合断片と共に投与され得る。したがって、これら３つのイヌ化マウス抗イヌタンパク質（すなわち抗イヌＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１またはＣＴＬＡ−４）抗体またはその抗原結合断片の任意の組み合わせを共に投与することができる。例えば、イヌ化マウス抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合断片は、イヌ化マウス抗イヌＰＤ−１抗体もしくはその抗原結合断片および／またはイヌ化マウスＣＴＬＡ−４抗体もしくはその抗原結合断片の前、後または同時に投与することができる。加えて、イヌ化マウス抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合断片とイヌ化マウス抗イヌＰＤ−１抗体もしくはその抗原結合断片および／またはイヌ化マウスＣＴＬＡ−４抗体もしくはその抗原結合断片との組み合わせはまた、他の公知の治療と共に、すなわち前、後または同時に投与することができる。
【０１８０】
キット
さらに提供されるのは、１または複数の構成成分を含むキットであって、これは、限定されるものではないが、本明細書中に論じられているＰＤ−Ｌ１と特異的に結合する抗体または抗原結合断片（例えばイヌ化マウス抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合断片）を１または複数の付加的な構成成分を伴って包含するものであり、この付加的な構成成分には、限定されるものではないが本明細書中に論じられているイヌ化マウス抗イヌＰＤ−１抗体もしくはその抗原結合断片、および／またはイヌ化マウス抗イヌＣＴＬＡ−４抗体もしくはその抗原結合断片、薬学的に許容される担体および／または化学療法薬を包含するものである。代替的実施形態において、キットは、上で論じられているように、抗イヌＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂにより認識されるエピトープもしくはその部分（またはエピトープもしくはその部分を含む融合タンパク質）を含む１または複数のペプチドを含むことができる。結合性組成物および／または化学療法薬もしくはエピトープもしくはその部分を含むペプチド（またはエピトープもしくはその部分を含む融合タンパク質）は、医薬組成物中で、純粋な組成物としてまたは薬学的に許容される担体と組み合わせて製剤化することができる。
【０１８１】
１の実施形態において、キットは、本発明の結合性組成物、例えばイヌ化マウス抗イヌＰＤ−Ｌ１（もしくはその抗原結合断片）もしくはその医薬組成物を１つの容器内に（例えば滅菌ガラスまたはプラスチックのバイアル内に）、および／またはその医薬組成物および／または化学療法薬を別の容器内に（例えば滅菌ガラスまたはプラスチックのバイアル内に）、および／またはイヌ化マウス抗イヌＰＤ−１（もしくはその抗原結合断片）および／またはイヌ化マウス抗イヌＣＴＬＡ−４（もしくはその抗原結合断片）もしくはその医薬組成物を１または複数の他の容器内に（例えば滅菌ガラスまたはプラスチックのバイアル内に）包含する。
【０１８２】
キットが対象への非経口投与のための医薬組成物を包含する場合、そのキットはまたかかる投与を実施するためのデバイスを包含することができる。例えば、キットは、上で論じられている１または複数の皮下注射針および他の注射デバイスを包含することができる。キットはまた、キット中の医薬組成物および剤形に関する情報を包含する添付文書を包含することもできる。一般に、かかる情報は、ペットの飼い主および獣医（ｖｅｔｅｒａｎａｒｉａｎ）が同封された医薬組成物および剤形を効果的かつ安全に用いることを助ける。例えば、本発明の組み合わせに関する次の情報が挿入物に供給され得る：薬物動態、薬力学、臨床試験、有効性パラメーター、適応症および用法、禁忌、警告、注意、有害反応、過量、適量および投与、供給法、適した保存条件、参考文献、製造者／販売業者情報および特許情報。
【０１８３】
便宜上、本明細書中に開示されている抗体または特異的結合剤は、キットで、すなわち、診断または検出アッセイを実施するための説明書を伴った予め決められた量の試薬のパッケージ化された組み合わせで提供することができる。抗体が酵素で標識されている場合、キットは酵素が必要とする基質および補因子（例えば検出可能な発色団または蛍光団を提供する基質前駆体）を包含するであろう。加えて、他の添加物、例えば安定剤、バッファー（例えばブロッキングバッファーまたは溶解バッファー）などが包含され得る。様々な試薬の相対量は、アッセイの感度を実質的に最適化する試薬溶液濃度を与えるために幅広く変えられ得る。詳細には、試薬は、溶解すると適切な濃度の試薬溶液を提供する賦形剤を包含する乾燥粉末、通常は凍結乾燥されたものとして提供され得る。
【０１８４】
［実施例］
実施例１
イヌＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１
イヌＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１の配列：
２０１３年１２月２０日に出願された米国仮出願第６１／９１８，９４６号および２０１４年７月３０日に出願された第６２／０３０，８１２号は、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれ、配列番号４９のイヌＰＤ−１（ｃＰＤ−１）に対する完全長ヌクレオチド配列［配列番号６９はシグナル配列を包含する］；配列番号５０の対応する翻訳されたアミノ酸配列［配列番号７０はシグナル配列を包含する］；イヌＰＤ−１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をコードするヌクレオチド配列、配列番号５１；イヌＰＤ−１のＥＣＤのアミノ酸配列、配列番号５２；イヌＰＤ−１  ＥＣＤ＋ＧＴリンカーおよびヒトＩｇＧ１  Ｆｃ遺伝子のＦｃ部のヌクレオチド配列、配列番号５３；ならびにイヌＰＤ−１  ＥＣＤ＋ＧＴリンカーおよびヒトＩｇＧ１  Ｆｃ遺伝子のＦｃ部のアミノ酸配列、配列番号５４［配列番号８１はシグナル配列を包含する］を提供する。
【０１８５】
２０１３年１２月２０日に出願された米国仮出願第６１／９１８，９４６号および２０１４年７月３０日に出願された第６２／０３０，８１２号は、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれ、配列番号５５のイヌＰＤ−１（ｃＰＤ−１）に対する完全長ヌクレオチド配列［配列番号７１はシグナル配列を包含する］；配列番号５６の対応する翻訳されたアミノ酸配列［配列番号７２はシグナル配列を包含する］；イヌＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をコードするヌクレオチド配列、配列番号５７；イヌＰＤ−Ｌ１のＥＣＤのアミノ酸配列、配列番号５８；イヌＰＤ−Ｌ１  ＥＣＤ＋ＧＴリンカーおよびヒトＩｇＧ１  Ｆｃ遺伝子のＦｃ部のヌクレオチド配列、配列番号５９；ならびにＰＤ−Ｌ１  ＥＣＤ＋ＧＴリンカーおよびヒトＩｇＧ１  Ｆｃ遺伝子のＦｃ部のアミノ酸配列、配列番号６０をさらに提供する。
【０１８６】
イヌＰＤ−１の同定およびクローニング：
完全長イヌＰＤ−１（ｃＰＤ−１）をコードする核酸を、ＮＣＢＩ遺伝子バンクデータベースの検索を通じて同定した（アクセッション番号  ＸＭ＿５４３３３８．４）。推定イヌＰＤ−１タンパク質に相当する翻訳されたアミノ酸配列（アクセッション番号  ＸＰ＿５４３３３８．３）を、遺伝子バンク（ＮＣＢＩ）タンパク質データベースの検索および同定されたアミノ酸配列とマウス、ネコおよびヒトのＰＤ−１アミノ酸配列とのアラインメントを通じてさらに同定した。ＣＨＯ細胞のためにコドン最適化された完全長イヌＰＤ−１遺伝子に相当するＤＮＡ配列を合成し、ｐ９６７９３と名付けたプラスミド中にクローニングした。予測イヌＰＤ−１のＤＮＡ配列およびタンパク質配列と既知のＰＤ−１  ＤＮＡ配列およびタンパク質配列との比較は、イヌＰＤ−１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をコードするＤＮＡ配列およびイヌＰＤ−１のＥＣＤのアミノ酸配列の同定を導いた。
【０１８７】
ＧＴリンカーおよび８個のヒスチジン残基に加えてイヌＰＤ−１のＥＣＤをコードするＤＮＡ配列を合成し、ＬＰＤ２７２６と名付けたプラスミド中にクローニングした。イヌＰＤ−１  ＥＣＤ＋ＧＴリンカーおよびヒトＩｇＧ１  Ｆｃ遺伝子のＦｃ部に相当する核酸配列を化学合成し、ＬＰＤ２７２７と名付けたプラスミド中にクローニングした。イヌＰＤ−１  ＥＣＤおよびヒトＩｇＧ１  ＦｃのＦｃ部は、配列番号８１のアミノ酸配列（シグナル配列を包含するもの）を含む。
【０１８８】
イヌＰＤ−Ｌ１の同定およびクローニング：
完全長のイヌＰＤ−Ｌ１をコードする核酸を、ＮＣＢＩ遺伝子バンクデータベースの検索を通じて同定した（アクセッション番号  ＸＭ＿５４１３０２．４）。推定イヌＰＤ−Ｌ１タンパク質に相当する翻訳されたアミノ酸配列（アクセッション番号  ＸＰ−５４１３０２．４）を、遺伝子バンク（ＮＣＢＩ）タンパク質データベースの検索および同定された配列と既知のＰＤ−Ｌ１マウスおよびヒト配列とのアラインメントにより同定した。
【０１８９】
イヌＰＤ−Ｌ１をコードするＤＮＡと既知のＰＤ−Ｌ１配列との比較は、イヌＰＤ−Ｌ１のＥＣＤドメインに相当するＤＮＡ配列（ＣＨＯ細胞のためにコドン最適化されたもの）を同定した。イヌＰＤ−Ｌ１のＥＣＤの予測アミノ酸配列は配列番号５８である。ＰＤ−Ｌ１  ＥＣＤ＋ＧＴリンカーおよび８個のヒスチジン残基をコードするＤＮＡを合成し、ＬＰＤ２６９５と名付けたプラスミド中にクローニングした。
【０１９０】
イヌＰＤ−Ｌ１  ＥＣＤのアミノ酸配列＋ＧＴリンカーおよびヒトＩｇＧ１  ＦｃのＦｃ部をコードするＤＮＡ配列を化学合成し、ＬＰＤ２６９７と名付けたプラスミド中にクローニングした。イヌＰＤ−Ｌ１  ＥＣＤ＋ＧＴリンカーおよびヒトＩｇＧ１のＦｃ部は、配列番号６０のアミノ酸配列を含む。
【０１９１】
ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１タンパク質の発現：
ＰＤ−１ＥＣＤ−ＨＩＳ、ＰＤ−１ＥＣＤ−Ｆｃ、ＰＤ−Ｌ１  ＥＣＤ−ＨＩＳおよびＰＤ−Ｌ１ＥＣＤ−Ｆｃタンパク質をコードする発現プラスミドをＨＥＫ２９３細胞内にトランスフェクトし、Ｆｃ融合タンパク質に対してプロテインＡを、またはＨＩＳタグ付加タンパク質に対してニッケル（Ｎｉ２＋）カラムクロマトグラフィーを用いて、トランスフェクト細胞の上清からタンパク質を精製した。精製されたタンパク質を、下に詳述されているＥＬＩＳＡまたは結合アッセイのために用いた。発現したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより分析した。
【０１９２】
完全長イヌＰＤ−１  ＤＮＡ配列：シグナル配列は下線および太字
ヌクレオチド配列  配列番号４９はシグナル配列を伴わない。
【０１９３】
atggggagccggcgggggccctggccgctcgtctgggccgtgctgcagctgggctggtggccaggatggctcctagactcccctgacaggccctggagcccgctcaccttctccccggcgcagctcacggtgcaggagggagagaacgccacgttcacctgcagcctggccgacatccccgacagcttcgtgctcaactggtaccgcctgagcccccgcaaccagacggacaagctggccgccttccaggaggaccgcatcgagccgggccgggacaggcgcttccgcgtcatgcggctgcccaacgggcgggacttccacatgagcatcgtcgctgcgcgcctcaacgacagcggcatctacctgtgcggggccatctacctgccccccaacacacagatcaacgagagtccccgcgcagagctctccgtgacggagagaaccctggagccccccacacagagccccagccccccacccagactcagcggccagttgcaggggctggtcatcggcgtcacgagcgtgctggtgggtgtcctgctactgctgctgctgacctgggtcctggccgctgtcttccccagggccacccgaggtgcctgtgtgtgcgggagcgaggacgagcctctgaaggagggccccgatgcagcgcccgtcttcaccctggactacggggagctggacttccagtggcgagagaagacgccggagcccccggcgccctgtgccccggagcagaccgagtatgccaccatcgtcttcccgggcaggccggcgtccccgggccgcagggcctcggccagcagcctgcagggagcccagcctccgagccccgaggacggacccggcctgtggcccctctga
完全長イヌＰＤ−１  アミノ酸配列：シグナル配列は下線および太字
アミノ酸配列  配列番号５０はシグナル配列を伴わない。
【０１９４】
MGSRRGPWPLVWAVLQLGWWPGWLLDSPDRPWSPLTFSPAQLTVQEGENATFTCSLADIPDSFVLNWYRLSPRNQTDKLAAFQEDRIEPGRDRRFRVMRLPNGRDFHMSIVAARLNDSGIYLCGAIYLPPNTQINESPRAELSVTERTLEPPTQSPSPPPRLSGQLQGLVIGVTSVLVGVLLLLLLTWVLAAVFPRATRGACVCGSEDEPLKEGPDAAPVFTLDYGELDFQWREKTPEPPAPCAPEQTEYATIVFPGRPASPGRRASASSLQGAQPPSPEDGPGLWPL
イヌＰＤ−１細胞外ドメイン  ＤＮＡ配列：配列番号５１（ＣＨＯ細胞内での発現のためにコドン最適化されている）
ctggattcccccgacagaccctggagccctctcaccttctcccctgcccagctgaccgtccaggaaggcgagaatgccaccttcacctgcagcctcgccgacatccccgacagcttcgtgctgaactggtacagactgagccccaggaaccagaccgacaagctggccgctttccaggaggacaggatcgaacccggcagggacaggaggtttagggtcatgaggctgcccaacggcagggacttccacatgtccatcgtggccgccagactgaacgactccggcatctacctgtgcggcgctatctacctgccccccaacacccagatcaacgagagccccagggccgaactgagcgtgacagagagaaccctggaacctcccacccagagcccttcccctcctcctagactgagcggacagctgcagggcctggtg
イヌＰＤ−１細胞外ドメイン：配列番号５２
LDSPDRPWSPLTFSPAQLTVQEGENATFTCSLADIPDSFVLNWYRLSPRNQTDKLAAFQEDRIEPGRDRRFRVMRLPNGRDFHMSIVAARLNDSGIYLCGAIYLPPNTQINESPRAELSVTERTLEPPTQSPSPPPRLSGQLQGLV
イヌＰＤ−１細胞外ドメイン−ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ  ＤＮＡ配列：配列番号５３（ＨＥＫ−２９３細胞内での発現のためにコドン最適化されている）
ctggattcccccgacagaccctggagccctctcaccttctcccctgcccagctgaccgtccaggaaggcgagaatgccaccttcacctgcagcctcgccgacatccccgacagcttcgtgctgaactggtacagactgagccccaggaaccagaccgacaagctggccgctttccaggaggacaggatcgaacccggcagggacaggaggtttagggtcatgaggctgcccaacggcagggacttccacatgtccatcgtggccgccagactgaacgactccggcatctacctgtgcggcgctatctacctgccccccaacacccagatcaacgagagccccagggccgaactgagcgtgacagagagaaccctggaacctcccacccagagcccttcccctcctcctagactgagcggacagctgcagggcctggtgggtaccgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
イヌＰＤ−１細胞外ドメイン−ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質：シグナル配列は下線および太字：アミノ酸配列番号５４はシグナル配列を伴わない。
【０１９５】
MNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQALDSPDRPWSPLTFSPAQLTVQEGENATFTCSLADIPDSFVLNWYRLSPRNQTDKLAAFQEDRIEPGRDRRFRVMRLPNGRDFHMSIVAARLNDSGIYLCGAIYLPPNTQINESPRAELSVTERTLEPPTQSPSPPPRLSGQLQGLVGTDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
完全長イヌＰＤ−Ｌ１  ＤＮＡ配列：シグナル配列は下線および太字
ヌクレオチド配列  配列番号５５はシグナル配列を伴わない。
【０１９６】
atgagaatgtttagtgtctttacattcatggcctactgccatttgctaaaagcatttacgatcacagtttctaaggacctgtatgtggtagagtatggtggcaatgtgacaatggaatgcaaattcccggtggaaaaacagttaaacttgtttgcactaatcgtctactgggaaatggaggataaaaaaattatacaatttgtgaatggaaaggaagacctgaaagttcagcacagcagctacagccagagggctcagctattgaaggaccagctcttcttggggaaggctgcgcttcagatcacagatgtgagattgcaggatgcaggggtttactgctgcttgatcggctatggcggtgctgactacaagcggattactttgaaagttcatgccccgtaccgcaacatcagccaaagaatttctgtggatcctgtcacctctgaacatgaactaatgtgtcaggctgagggttaccctgaggctgaagtcatctggacaagcagtgaccaccgagtcctgagtggcaaaaccaccatcactaattccaatagggaagagaagcttttcaatgtgaccagcacgctgaacatcaatgcaacagctaatgagattttctactgcacttttcaaagatcaggtcctgaggaaaacaatactgccgagttggtcatcccagaacgactgcccgttccagcaagtgagaggactcatttcatgattctgggacctttcctgttgcttcttggtgtagtcctggcagtcactttctgtctaaaaaaacatgggagaatgatggatgtggaaaaatgttgcacccgagataggaactcaaagaaacgaaatgatatacaatttgaagagacataa
完全長イヌＰＤ−Ｌ１：シグナル配列は下線および太字
アミノ酸配列  配列番号５６はシグナル配列を伴わない。
【０１９７】
MRMFSVFTFMAYCHLLKAFTITVSKDLYVVEYGGNVTMECKFPVEKQLNLFALIVYWEMEDKKIIQFVNGKEDLKVQHSSYSQRAQLLKDQLFLGKAALQITDVRLQDAGVYCCLIGYGGADYKRITLKVHAPYRNISQRISVDPVTSEHELMCQAEGYPEAEVIWTSSDHRVLSGKTTITNSNREEKLFNVTSTLNINATANEIFYCTFQRSGPEENNTAELVIPERLPVPASERTHFMILGPFLLLLGVVLAVTFCLKKHGRMMDVEKCCTRDRNSKKRNDIQFEET
イヌＰＤ−Ｌ１細胞外ドメイン  ＤＮＡ配列：配列番号５７（ＣＨＯ細胞内での発現のためにコドン最適化されている）
tttaccatcaccgtgtccaaggacctgtacgtggtcgagtacggcggcaatgtgaccatggagtgcaagttccccgtggagaagcagctgaacctgttcgccctcatcgtgtactgggagatggaggacaagaagatcatccagttcgtgaacggcaaggaggacctgaaggtgcagcactccagctactcccagagagcccagctgctgaaggaccagctgttcctgggcaaggccgccctgcagatcaccgacgtgagactgcaggacgccggcgtgtattgctgcctgatcggctacggaggcgccgactacaagaggatcaccctgaaggtgcatgcaccctacaggaacatcagccagaggatcagcgtcgatcccgtgaccagcgagcacgagctgatgtgccaagccgagggctatcccgaggccgaagtgatctggaccagcagcgaccacagggtcctgagcggcaagaccaccatcaccaacagcaacagggaggagaagctgttcaacgtgaccagcaccctcaacatcaacgccaccgccaacgagatcttctactgcaccttccagaggagcggccccgaagagaacaacaccgccgagctggtgatccccgagagactgcctgtgcctgccagcgagaggacccac
イヌＰＤ−Ｌ１細胞外ドメインタンパク質：配列番号５８
FTITVSKDLYVVEYGGNVTMECKFPVEKQLNLFALIVYWEMEDKKIIQFVNGKEDLKVQHSSYSQRAQLLKDQLFLGKAALQITDVRLQDAGVYCCLIGYGGADYKRITLKVHAPYRNISQRISVDPVTSEHELMCQAEGYPEAEVIWTSSDHRVLSGKTTITNSNREEKLFNVTSTLNINATANEIFYCTFQRSGPEENNTAELVIPERLPVPASERTH
イヌＰＤ−Ｌ１細胞外ドメイン−ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ  ＤＮＡ配列：配列番号５９（ＨＥＫ−２９３細胞内での発現のためにコドン最適化されている）
tttaccatcaccgtgtccaaggacctgtacgtggtcgagtacggcggcaatgtgaccatggagtgcaagttccccgtggagaagcagctgaacctgttcgccctcatcgtgtactgggagatggaggacaagaagatcatccagttcgtgaacggcaaggaggacctgaaggtgcagcactccagctactcccagagagcccagctgctgaaggaccagctgttcctgggcaaggccgccctgcagatcaccgacgtgagactgcaggacgccggcgtgtattgctgcctgatcggctacggaggcgccgactacaagaggatcaccctgaaggtgcatgcaccctacaggaacatcagccagaggatcagcgtcgatcccgtgaccagcgagcacgagctgatgtgccaagccgagggctatcccgaggccgaagtgatctggaccagcagcgaccacagggtcctgagcggcaagaccaccatcaccaacagcaacagggaggagaagctgttcaacgtgaccagcaccctcaacatcaacgccaccgccaacgagatcttctactgcaccttccagaggagcggccccgaagagaacaacaccgccgagctggtgatccccgagagactgcctgtgcctgccagcgagaggacccacggtaccgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
イヌＰＤ−Ｌ１細胞外ドメイン−ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ  融合タンパク質：配列番号６０
FTITVSKDLYVVEYGGNVTMECKFPVEKQLNLFALIVYWEMEDKKIIQFVNGKEDLKVQHSSYSQRAQLLKDQLFLGKAALQITDVRLQDAGVYCCLIGYGGADYKRITLKVHAPYRNISQRISVDPVTSEHELMCQAEGYPEAEVIWTSSDHRVLSGKTTITNSNREEKLFNVTSTLNINATANEIFYCTFQRSGPEENNTAELVIPERLPVPASERTHGTDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
【０１９８】
実施例２
マウス抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体
抗イヌＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体の作成：
計３匹のＢａｌｂ／ｃマウスに１７日の期間にわたって複数回の免疫（毎回１０μｇを使用）を行った。免疫した抗原はイヌＰＤ−Ｌ１  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質であった。免疫の後、血清を各マウスから採取し、イヌＰＤ−Ｌ１  ＥＣＤ−ＨＩＳタグ付加タンパク質との反応性を試験した。血清抗ＰＤ−Ｌ１  ＥＣＤ−ＨＩＳ力価が最も高かったマウスの脾臓細胞を、骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞株と融合した。融合の約２週間後、推定ハイブリドーマ細胞からの上清を、ＰＤ−Ｌ１  ＥＣＤ−ＨＩＳタグ付加タンパク質へのそれらの反応性についてＥＬＩＳＡにより試験した。ＥＬＩＳＡにおいて強陽性シグナルを生じたハイブリドーマを限界希釈によりサブクローニングし、イヌＰＤ−Ｌ１  ＥＣＤ−ＨＩＳタグ付加タンパク質への反応性を再度試験した。
【０１９９】
モノクローナル抗体のイヌＰＤ−Ｌ１に対する反応性の確認：
ハイブリドーマにより分泌された抗体の、イヌＰＤ−Ｌ１のＥＣＤへの反応性をＥＬＩＳＡにより確認した。ハイブリドーマ細胞を、１０〜３０日間、ＣＥＬＬｉｎｅバイオリアクタ（Ｉｎｔｅｇｒａ−ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて培養した。最初に細胞を、４ｍＭのＬ−グルタミンおよび１０％のＧｉｂｃｏからのＵｌｔｒａ  Ｌｏｗ  ＩｇＧウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したＤＭＥＭ中で維持した。ハイブリドーマ細胞を、ＦＢＳ濃度を２０％まで増加させた１５ｍＬの同培地中で約２×１０６細胞／ｍＬの細胞密度で、ＣＥＬＬｉｎｅバイオリアクタ細胞チャンバー内に接種した。外部チャンバーを１Ｌの栄養培地（４ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび２％標準的ＦＢＳを有するＤＭＥＭ）で満たした。細胞チャンバー内のハイブリドーマ細胞を３〜７日かけて約２．５×１０７細胞／ｍＬまで増やした。次いで、１０ｍＬの細胞懸濁液を細胞チャンバーから回収し、新たな培地で置き換えて細胞を再度増やし、その後に回収した。この手法を、各ハイブリドーマのクローンから適当量のｍＡｂを得るために必要なだけ繰り返した。回収した細胞懸濁液を遠心分離し、上清を０．２ミクロンろ過膜を通してろ過した。抗体精製のため、各クローンの上清を、自然流下によってＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔフロー５ｍＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＴＥ）バッファー  ｐＨ８．０での洗浄後、結合した抗体を０．１Ｍグリシンバッファー、ｐＨ２．７を用いて希釈し、その後に１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０を用いてｐＨ中和を行った。Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  ＹＭ−１０，１０ｋＤａ  ＮＭＷＬ遠心ろ過ユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて抗体を濃縮し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にバッファー交換した。抗体濃度を分光光度法を用いて定量した。
【０２００】
精製された抗イヌＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂは、次のようにＥＬＩＳＡによってイヌＰＤ−Ｌ１−ｈＦｃ融合タンパク質との反応性を試験した：イヌＰＤ−Ｌ１−ｈＦｃ融合タンパク質をコーティングバッファー（炭酸塩／重炭酸塩  ｐＨ９．０）中で１０μｇ／ｍＬに希釈し、９６ウェル平底ＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ）内に１００μｌ／ウェルで分注する。プレートを４℃で一晩インキュベートする。プレートを次いで０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳＴ）で３回洗浄する。次に、２００μｌのブロッキングバッファー（ＰＢＳＴ中５％のスキムミルク）を各ウェルに加え、プレートを３７℃で６０分間インキュベートする。プレートを次いでＰＢＳＴで３回洗浄する。次に、ブロッキングバッファー中で希釈された１００μｌの試験ｍＡｂを適切な列の最初のウェルに加える。試験ｍＡｂを次いで、適切なプレート位置に２倍希釈する。３７℃で６０分間のプレートのインキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄する。次に、１００μｌ／ウェルの西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（ＫＰＬ）の１：２，０００希釈物をプレートに加え、次いで３７℃で６０分間インキュベートする。次いでプレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、１００μｌ／ウェルの３，３’，５，５’  テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（ＫＰＬより）をプレートに加える。３７℃で５〜２０分間、呈色反応を展開させた後、６５０ｎｍでの吸光度を測定する。
【０２０１】
イヌＰＤ−１タンパク質を発現するＣＨＯ細胞：
完全長イヌＰＤ−１遺伝子をプラスミドｐ９６７９３内にクローニングした。このプラスミドにおいて、ＰＤ−１タンパク質の発現はｈＣＭＶプロモーターにより駆動される。ＣＨＯ  ＤＸＢ１１細胞（ｄｈｆｒ−）を、１０％ウシ胎仔血清を補充したＭＥＭ−アルファ（Ｇｉｂｃｏ）中で維持した。プラスミドｐ９６７９３でのＣＨＯ細胞のトランスフェクションは、リポフェクトアミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたリポソームを介した遺伝子送達によって、約６×１０６細胞を含有する７５ｃｍ２フラスコ中で行った。４８時間後、細胞を、１０％  ＦＢＳおよび４００μｇ／ｍＬ  ハイグロマイシンＢを補充したヌクレオシドを含まないＭＥＭ−アルファ培地（選択培地）へと植え継いだ。限界希釈クローニングを、ｄｈｆｒ＋、ハイグロマイシン抵抗性細胞のプールに対して実施した。イヌＰＤ−１の発現について、免疫蛍光アッセイによりクローンを評価した。簡潔には、細胞単層を９６ウェルプレート中で、８０％アセトンで固定した。固定、乾燥させた細胞単層を次いでポリクローナルヤギ抗ヒトＰＤ−１抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と共に１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで洗浄し、次いでフルオレセイン標識ウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体（ＫＰＬ）と共に１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで洗浄した。蛍光を呈したクローンを増やし、細胞ストックを樹立した。
【０２０２】
マウス抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂによるリガンド遮断：
イヌＰＤ−１を発現するＣＨＯ細胞株を基にした細胞ベースのＥＬＩＳＡ（ＣＥＬＩＳＡ）アッセイを用いて、イヌＰＤ−Ｌ１とその受容体のイヌＰＤ−１の間の相互作用を遮断する（例えば結合を遮断する）マウス抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体の能力を実証した。リガンド遮断は、イヌＰＤ−Ｌ１／ｈＦｃタンパク質と共にこのアッセイを用いて次のように確認した：
１．９６ウェルプレート内にｃＰＤ−１  ＣＨＯ細胞を播種し、９５〜１００％コンフルエントまで細胞を増殖させる。
【０２０３】
ＣＨＯ細胞を播くための一般的ガイドライン
−３日目：１×１０３ｃ／ウェル（１×１０５ｃ／ｍＬ）
−２日目：２×１０４ｃ／ウェル（２×１０５ｃ／ｍＬ）
−１日目：４×１０４ｃ／ウェル（４×１０５ｃ／ｍＬ）
２．ＣＨＯ培地中で抗ｃＰＤＬ１  ｍＡｂを３倍希釈する、３０μｇ／ｍＬから開始、１００μＬ／ウェル。１００μＬ／ウェルのＣＨＯ培地中にｃＰＤ−Ｌ１−ｈＦｃを４μｇ／ｍｌになるように加え、希釈プレート中で３７℃、５％  ＣＯ２で振とうしながら６０分間、共インキュベートする。
【０２０４】
３．細胞で覆われたプレートから細胞培養培地を吸引し、プレートを３×ＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０および１×ＣＨＯ培地で洗浄する。
【０２０５】
４．希釈プレートからの共インキュベートしたｃＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ／ＰＤ−Ｌ１  Ｆｃを、細胞で覆われたプレートに加える。１００ｕＬ／ウェル。３７℃、５％  ＣＯ２で振とうしながら６０分間インキュベートする。
【０２０６】
５．プレートを６×ＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０で（手動洗浄プロトコールを用いて）洗浄する。
【０２０７】
６．１００ｕｌ／ウェルのＣＨＯ培地中に抗ヒトＦｃ−ＨＲＰ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）（１：２５００）を加え、３７℃／５％  ＣＯ２で３０〜６０分間インキュベートする。
【０２０８】
７．プレートを５×ＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で（手動洗浄プロトコールを用いて）洗浄する。
【０２０９】
８．１００μｌ／ウェルのＴＭＢマイクロウェル（ｍｉｒｃｏｗｅｌｌ）基質を加える。室温で１０分間インキュベートする。Ｐｉｅｒｃｅからの１ステップ基質を用いる。
【０２１０】
９．１００μｌ／ウェルの１．５Ｍリン酸で停止する。
【０２１１】
１０．ＥＬＩＳＡリーダー上でＡ４５０−Ａ６２０を測定する。
【０２１２】
マウス抗イヌＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ可変領域に相当するＤＮＡ配列のクローニングおよび同定：
マウスＶＨ鎖およびＶＬ鎖のＤＮＡ配列ならびにそれらのＣＤＲをコードするＤＮＡ配列を、標準的な分子生物学的方法を用いて、各ハイブリドーマからのｍＲＮＡの分離後に同定する。本明細書中に例示されている２つの抗体の軽鎖および重鎖の可変領域の配列は、下の表１２中に与えられる。これらのハイブリドーマからのＣＤＲの予測アミノ酸配列の配列番号は下の表２に収載される：
表２
ＣＤＲのアミノ酸配列
【表２】
0006797111.tif 000003
【０２１３】
実施例３
イヌ化およびイヌ化抗体の性質決定
イヌ化抗体を生産するため、イヌＩｇＧの重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡ配列を同定することが必要であった。イヌ重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ遺伝子データベースおよびタンパク質データベースから入手することができる。イヌＩｇＧには４つの既知のＩｇＧサブクラス：ＩｇＧＡ、ＩｇＧＢ、ＩｇＧＣおよびＩｇＧＤ、ならびに２つのタイプの軽鎖：カッパおよびラムダがある。表７は、改変されていないイヌＦｃ断片のアミノ酸およびヌクレオチドの配列番号を収載している。
【０２１４】
何らかの具体的アプローチに拘束されることなく、様々な内容のイヌおよびマウスの配列を有する抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体のバリアントを生産するプロセスは、一般的な次のスキームを伴った：
ｉ）マウスｍＡｂのＶＨ鎖およびＶＬ鎖のヌクレオチド配列を決定する；
ｉｉ）マウスｍＡｂのＨ鎖ＣＤＲおよびＬ鎖ＣＤＲを同定する；
ｉｉｉ）イヌＩｇＧの好適なＨ鎖およびＬ鎖を同定する；
ｉｖ）イヌＩｇＧ  Ｈ鎖およびＬ鎖のヌクレオチド配列を決定する；
ｖ）内因性のイヌＨ鎖ＣＤＲおよびＬ鎖ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列を、それぞれのマウスＣＤＲをコードするヌクレオチド配列で置き換える。また、いくつかのイヌフレームワーク残基をマウスフレームワーク領域から選択される残基で置き換えてもよい；
ｖｉ）ステップ（ｖ）からのヌクレオチドを合成し、好適な発現プラスミド内に挿入し；適切な細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞内にプラスミドをトランスフェクトする；
ｖｉｉ）ＨＥＫ２９３上清からの発現抗体を精製する；そして
ｖｉｉｉ）イヌＰＤ−Ｌ１への結合について精製抗体を試験する。
【０２１５】
実施例４
遺伝子改変イヌＩｇＧ
エフェクター機能を欠いたイヌＩｇＧのバリアントを作成するため、多数の変異イヌＩｇＧＢ重鎖を作成した［２０１４年７月３０日に出願され、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる米国仮出願第６２／０３０，８１２号を参照されたい］。これらのバリアントは、重鎖アミノ酸配列のＦｃ部分中に、次の単一のまたは組み合わせた置換のうちの１つを包含し得る：Ｐ４Ａ、Ｄ３１Ａ、Ｎ６３Ａ、Ｇ６４Ｐ、Ｔ６５Ａ、Ａ９３ＧおよびＰ９５Ａ。バリアント重鎖（すなわちかかるアミノ酸置換を含有するもの）を発現プラスミド内にクローニングし、軽鎖をコードする遺伝子を含有するプラスミドと共にＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。ＨＥＫ２９３細胞から発現され精製されたインタクトな抗体を、それらが免疫エフェクター機能を仲介する可能性を評価するため、ＦｃγＲＩおよびＣ１ｑへの結合について調べた。表３は、遺伝子改変されたイヌ化重鎖、イヌ化重鎖；およびこれらの重鎖における遺伝子改変体をコードするプラスミドの例を収載している。バリアント重鎖を、遺伝子改変されたｍＡｂにおけるエフェクター機能の評価のために用いた。全ての重鎖は、マウス抗イヌＰＤ−１抗体からのＣＤＲで構成されていた［上の米国仮出願第６２／０３０，８１２号を参照されたい］。
【０２１６】
表３
【表３】
0006797111.tif 000004
【０２１７】
表４
ヒンジ配列を有する改変ｃＦｃまたは野生型Ｆｃ
【表４】
0006797111.tif 000005
【０２１８】
＊置換は、配列番号２および４のアミノ酸配列のＰ４、Ｄ３１、Ｎ６３、Ｇ６４、Ｔ６５、Ａ９３およびＰ９５におけるもの；またはそれらのアミノ酸をコードするヌクレオチド配列  配列番号１および３のヌクレオチドにおけるものである。＃下の表５中に示されるＩｇＧＤのヒンジ領域における単一アミノ酸置換。
【０２１９】
表５
ヒンジ領域配列
【表５】
0006797111.tif 000006
【０２２０】
＃太字および下線はセリンからプロリンへの単一アミノ酸置換。
【０２２１】
表６
イヌＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１配列
【表６】
0006797111.tif 000007
【０２２２】
表７
野生型ｃＦｃ配列
【表７】
0006797111.tif 000008
【０２２３】
表８
ＣＤＲアミノ酸配列
【表８】
0006797111.tif 000009
【０２２４】
表９
個々の置換イヌ化重鎖
【表９】
0006797111.tif 000010
【０２２５】
可能性のある特定置換はＰ４、Ｄ３１、Ｎ６３、Ｇ６４，Ｔ６５、Ａ９３およびＰ９５におけるものである。
【０２２６】
表１０
アミノ酸残基位置の相関＃
【表１０】
0006797111.tif 000011
【０２２７】
＃野生型ｃＦｃおよび置換ｃＦｃのアミノ酸残基位置と対応する置換イヌ重鎖のそれとの相関。最初の列は配列番号を；残りの列は対応するアミノ酸位置を収載している。２つの野生型アミノ酸配列（配列番号６６および６８）について、天然アミノ酸残基の１文字表記も与えられている。
【０２２８】
表１１
個々の置換されていないイヌ化重鎖および軽鎖
【表１１】
0006797111.tif 000012
【０２２９】
表１２
重鎖および軽鎖の可変領域
【表１２】
0006797111.tif 000013
【０２３０】
改変Ｆｃ
ｃＩｇＧＢ  Ｆｃ［配列番号２］
LGGXSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVXLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFXXXYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKXLXSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPGK
ｃＩｇＧＢ  Ｆｃ［配列番号１］
ctgggcggcnnnagcgtgtttatttttccgccgaaaccgaaagataccctgctgattgcgcgcaccccggaagtgacctgcgtggtggtgnnnctggatccggaagatccggaagtgcagattagctggtttgtggatggcaaacagatgcagaccgcgaaaacccagccgcgcgaagaacagtttnnnnnnnnntatcgcgtggtgagcgtgctgccgattggccatcaggattggctgaaaggcaaacagtttacctgcaaagtgaacaacaaannnctgnnnagcccgattgaacgcaccattagcaaagcgcgcggccaggcgcatcagccgagcgtgtatgtgctgccgccgagccgcgaagaactgagcaaaaacaccgtgagcctgacctgcctgattaaagatttttttccgccggatattgatgtggaatggcagagcaacggccagcaggaaccggaaagcaaatatcgcaccaccccgccgcagctggatgaagatggcagctattttctgtatagcaaactgagcgtggataaaagccgctggcagcgcggcgatacctttatttgcgcggtgatgcatgaagcgctgcataaccattatacccaggaaagcctgagccatagcccgggcaaa
ｃＩｇＧＣ  Ｆｃ［配列番号４］
LGGXSVFIFPPKPKDILVTARTPTVTCVVVXLDPENPEVQISWFVDSKQVQTANTQPREEQSXXXYRVVSVLPIGHQDWLSGKQFKCKVNNKXLXSPIEEIISKTPGQAHQPNVYVLPPSRDEMSKNTVTLTCLVKDFFPPEIDVEWQSNGQQEPESKYRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQISLSHSPGK
ｃＩｇＧＣ  Ｆｃ［配列番号３］
ctgggcggcnnnagcgtgtttatttttccgccgaaaccgaaagatattctggtgaccgcgcgcaccccgaccgtgacctgcgtggtggtgnnnctggatccggaaaacccggaagtgcagattagctggtttgtggatagcaaacaggtgcagaccgcgaacacccagccgcgcgaagaacagagcnnnnnnnnntatcgcgtggtgagcgtgctgccgattggccatcaggattggctgagcggcaaacagtttaaatgcaaagtgaacaacaaannnctgnnnagcccgattgaagaaattattagcaaaaccccgggccaggcgcatcagccgaacgtgtatgtgctgccgccgagccgcgatgaaatgagcaaaaacaccgtgaccctgacctgcctggtgaaagatttttttccgccggaaattgatgtggaatggcagagcaacggccagcaggaaccggaaagcaaatatcgcatgaccccgccgcagctggatgaagatggcagctattttctgtatagcaaactgagcgtggataaaagccgctggcagcgcggcgatacctttatttgcgcggtgatgcatgaagcgctgcataaccattatacccagattagcctgagccatagcccgggcaaa
ｃＩｇＧＤ  Ｆｃ（ＤヒンジのＳ−−＞Ｐ）ｆａｂアーム交換［配列番号６］
PKESTCKCIPPCPVPESLGGPSVFIFPPKPKDILRITRTPEITCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQPREQQFNSTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIGLPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSPKELSSSDTVTLTCLIKDFFPPEIDVEWQSNGQPEPESKYHTTAPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDTFTCAVMHEALQNHYTDLSLSHSPGK
ｃＩｇＧＤ  Ｆｃ（ＤヒンジのＳ−−＞Ｐ）ｆａｂアーム交換［配列番号５］
ccgaaagaaagcacctgcaaatgcattccgccgtgcccggtgccggaaagcctgggcggcccgagcgtgtttatttttccgccgaaaccgaaagatattctgcgcattacccgcaccccggaaattacctgcgtggtgctggatctgggccgcgaagatccggaagtgcagattagctggtttgtggatggcaaagaagtgcataccgcgaaaacccagccgcgcgaacagcagtttaacagcacctatcgcgtggtgagcgtgctgccgattgaacatcaggattggctgaccggcaaagaatttaaatgccgcgtgaaccatattggcctgccgagcccgattgaacgcaccattagcaaagcgcgcggccaggcgcatcagccgagcgtgtatgtgctgccgccgagcccgaaagaactgagcagcagcgataccgtgaccctgacctgcctgattaaagatttttttccgccggaaattgatgtggaatggcagagcaacggccagccggaaccggaaagcaaatatcataccaccgcgccgcagctggatgaagatggcagctattttctgtatagcaaactgagcgtggataaaagccgctggcagcagggcgatacctttacctgcgcggtgatgcatgaagcgctgcagaaccattataccgatctgagcctgagccatagcccgggcaaa
ｃＩｇＧＤ  Ｆｃ（Ａヒンジ）ｆａｂアーム交換［配列番号８］
FNECRCTDTPPCPVPEPLGGPSVFIFPPKPKDILRITRTPEITCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQPREQQFNSTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIGLPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSPKELSSSDTVTLTCLIKDFFPPEIDVEWQSNGQPEPESKYHTTAPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDTFTCAVMHEALQNHYTDLSLSHSPGK
ｃＩｇＧＤ  Ｆｃ（Ａヒンジ）ｆａｂアーム交換［配列番号７］
tttaacgaatgccgctgcaccgataccccgccgtgcccggtgccggaaccgctgggcggcccgagcgtgtttatttttccgccgaaaccgaaagatattctgcgcattacccgcaccccggaaattacctgcgtggtgctggatctgggccgcgaagatccggaagtgcagattagctggtttgtggatggcaaagaagtgcataccgcgaaaacccagccgcgcgaacagcagtttaacagcacctatcgcgtggtgagcgtgctgccgattgaacatcaggattggctgaccggcaaagaatttaaatgccgcgtgaaccatattggcctgccgagcccgattgaacgcaccattagcaaagcgcgcggccaggcgcatcagccgagcgtgtatgtgctgccgccgagcccgaaagaactgagcagcagcgataccgtgaccctgacctgcctgattaaagatttttttccgccggaaattgatgtggaatggcagagcaacggccagccggaaccggaaagcaaatatcataccaccgcgccgcagctggatgaagatggcagctattttctgtatagcaaactgagcgtggataaaagccgctggcagcagggcgatacctttacctgcgcggtgatgcatgaagcgctgcagaac
cattataccgatctgagcctgagccatagcccgggcaaa
ｃＩｇＧＤ  Ｆｃ（Ｂヒンジ）ｆａｂアーム交換［配列番号１０］
PKRENGRVPRPPDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDILRITRTPEITCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQPREQQFNSTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIGLPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSPKELSSSDTVTLTCLIKDFFPPEIDVEWQSNGQPEPESKYHTTAPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDTFTCAVMHEALQNHYTDLSLSHSPGK
ｃＩｇＧＤ  Ｆｃ（Ｂヒンジ）ｆａｂアーム交換［配列番号９］
ccgaaacgcgaaaacggccgcgtgccgcgcccgccggattgcccgaaatgcccggcgccggaaatgctgggcggcccgagcgtgtttatttttccgccgaaaccgaaagatattctgcgcattacccgcaccccggaaattacctgcgtggtgctggatctgggccgcgaagatccggaagtgcagattagctggtttgtggatggcaaagaagtgcataccgcgaaaacccagccgcgcgaacagcagtttaacagcacctatcgcgtggtgagcgtgctgccgattgaacatcaggattggctgaccggcaaagaatttaaatgccgcgtgaaccatattggcctgccgagcccgattgaacgcaccattagcaaagcgcgcggccaggcgcatcagccgagcgtgtatgtgctgccgccgagcccgaaagaactgagcagcagcgataccgtgaccctgacctgcctgattaaagatttttttccgccggaaattgatgtggaatggcagagcaacggccagccggaaccggaaagcaaatatcataccaccgcgccgcagctggatgaagatggcagctattttctgtatagcaaactgagcgtggataaaagccgctggcagcagggcgatacctttacctgcgcggtgatgcatgaagcgctgcagaaccattataccgatctgagcctgagccatagcccgggcaaa
ｃＩｇＧＤ  Ｆｃ（Ｃヒンジ）ｆａｂアーム交換［配列番号１２］
AKECECKCNCNNCPCPGCGLLGGPSVFIFPPKPKDILRITRTPEITCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQPREQQFNSTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIGLPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSPKELSSSDTVTLTCLIKDFFPPEIDVEWQSNGQPEPESKYHTTAPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDTFTCAVMHEALQNHYTDLSLSHSPGK
ｃＩｇＧＤ  Ｆｃ（Ｃヒンジ）ｆａｂアーム交換［配列番号１１］
gccaaggagtgcgagtgcaagtgcaactgcaacaactgcccctgccccggctgcggcctgctgggcggccccagcgtgttcatcttcccccccaagcccaaggacatcctgagaatcaccagaacccccgagatcacctgcgtggtgctggacctgggcagagaggaccccgaggtgcagatcagctggttcgtggacggcaaggaggtgcacaccgccaagacccagcccagagagcagcagttcaacagcacctacagagtggtgagcgtgctgcccatcgagcaccaggactggctgaccggcaaggagttcaagtgcagagtgaaccacatcggcctgcccagccccatcgagagaaccatcagcaaggccagaggccaggcccaccagcccagcgtgtacgtgctgccccccagccccaaggagctgagcagcagcgacaccgtgaccctgacctgcctgatcaaggacttcttcccccccgagatcgacgtggagtggcagagcaacggccagcccgagcccgagagcaagtaccacaccaccgccccccagctggacgaggacggcagctacttcctgtacagcaagctgagcgtggacaagagcagatggcagcagggcgacaccttcacctgcgccgtgatgcacgaggccctgcagaaccactacaccgacctgagcctgagccacagccccggcaag
野生型Ｆｃ
ｃＩｇＧＡ  Ｆｃ［配列番号６２］
LGGPSVLIFPPKPKDILRITRTPEVTCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQSREQQFNGTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIDLPSPIERTISKARGRAHKPSVYVLPPSPKELSSSDTVSITCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPERKHRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDPFTCAVMHETLQNHYTDLSLSHSPGK
ｃＩｇＧＡ  Ｆｃ［配列番号６１］
ctgggcggccccagcgtgctgatcttcccccccaagcccaaggacatcctgagaatcaccagaacccccgaggtgacctgcgtggtgctggacctgggcagagaggaccccgaggtgcagatcagctggttcgtggacggcaaggaggtgcacaccgccaagacccagagcagagagcagcagttcaacggcacctacagagtggtgagcgtgctgcccatcgagcaccaggactggctgaccggcaaggagttcaagtgcagagtgaaccacatcgacctgcccagccccatcgagagaaccatcagcaaggccagaggcagagcccacaagcccagcgtgtacgtgctgccccccagccccaaggagctgagcagcagcgacaccgtgagcatcacctgcctgatcaaggacttctacccccccgacatcgacgtggagtggcagagcaacggccagcaggagcccgagagaaagcacagaatgacccccccccagctggacgaggacggcagctacttcctgtacagcaagctgagcgtggacaagagcagatggcagcagggcgaccccttcacctgcgccgtgatgcacgagaccctgcagaaccactacaccgacctgagcctgagccacagccccggcaag
ｃＩｇＧＤ  Ｆｃ［配列番号６４］
LGGPSVFIFPPKPKDILRITRTPEITCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQPREQQFNSTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIGLPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSPKELSSSDTVTLTCLIKDFFPPEIDVEWQSNGQPEPESKYHTTAPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDTFTCAVMHEALQNHYTDLSLSHSPGK
ｃＩｇＧＤ  Ｆｃ［配列番号６３］
ctgggcggccccagcgtgttcatcttcccccccaagcccaaggacatcctgagaatcaccagaacccccgagatcacctgcgtggtgctggacctgggcagagaggaccccgaggtgcagatcagctggttcgtggacggcaaggaggtgcacaccgccaagacccagcccagagagcagcagttcaacagcacctacagagtggtgagcgtgctgcccatcgagcaccaggactggctgaccggcaaggagttcaagtgcagagtgaaccacatcggcctgcccagccccatcgagagaaccatcagcaaggccagaggccaggcccaccagcccagcgtgtacgtgctgccccccagccccaaggagctgagcagcagcgacaccgtgaccctgacctgcctgatcaaggacttcttcccccccgagatcgacgtggagtggcagagcaacggccagcccgagcccgagagcaagtaccacaccaccgccccccagctggacgaggacggcagctacttcctgtacagcaagctgagcgtggacaagagcagatggcagcagggcgacaccttcacctgcgccgtgatgcacgaggccctgcagaaccactacaccgacctgagcctgagccacagccccggcaag
ｃＩｇＧＢ  Ｆｃ［配列番号６６］
LGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPGK
ｃＩｇＧＢ  Ｆｃ［配列番号６５］
ctgggcggccccagcgtgttcatcttcccccccaagcccaaggacaccctgctgatcgccagaacccccgaggtgacctgcgtggtggtggacctggaccccgaggaccccgaggtgcagatcagctggttcgtggacggcaagcagatgcagaccgccaagacccagcccagagaggagcagttcaacggcacctacagagtggtgagcgtgctgcccatcggccaccaggactggctgaagggcaagcagttcacctgcaaggtgaacaacaaggccctgcccagccccatcgagagaaccatcagcaaggccagaggccaggcccaccagcccagcgtgtacgtgctgccccccagcagagaggagctgagcaagaacaccgtgagcctgacctgcctgatcaaggacttcttcccccccgacatcgacgtggagtggcagagcaacggccagcaggagcccgagagcaagtacagaaccacccccccccagctggacgaggacggcagctacttcctgtacagcaagctgagcgtggacaagagcagatggcagagaggcgacaccttcatctgcgccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccaggagagcctgagccacagccccggcaag
ｃＩｇＧＣ  Ｆｃ［配列番号６８］
LGGPSVFIFPPKPKDILVTARTPTVTCVVVDLDPENPEVQISWFVDSKQVQTANTQPREEQSNGTYRVVSVLPIGHQDWLSGKQFKCKVNNKALPSPIEEIISKTPGQAHQPNVYVLPPSRDEMSKNTVTLTCLVKDFFPPEIDVEWQSNGQQEPESKYRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQISLSHSPGK
ｃＩｇＧＣ  Ｆｃ［配列番号６７］
ctgggcggccccagcgtgttcatcttcccccccaagcccaaggacatcctggtgaccgccagaacccccaccgtgacctgcgtggtggtggacctggaccccgagaaccccgaggtgcagatcagctggttcgtggacagcaagcaggtgcagaccgccaacacccagcccagagaggagcagagcaacggcacctacagagtggtgagcgtgctgcccatcggccaccaggactggctgagcggcaagcagttcaagtgcaaggtgaacaacaaggccctgcccagccccatcgaggagatcatcagcaagacccccggccaggcccaccagcccaacgtgtacgtgctgccccccagcagagacgagatgagcaagaacaccgtgaccctgacctgcctggtgaaggacttcttcccccccgagatcgacgtggagtggcagagcaacggccagcaggagcccgagagcaagtacagaatgacccccccccagctggacgaggacggcagctacttcctgtacagcaagctgagcgtggacaagagcagatggcagagaggcgacaccttcatctgcgccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagatcagcctgagccacagccccggcaag
個々の置換重鎖
４Ｆ９−ＶＨ３  ｃＩｇＧＢ［配列番号２６］
EVQLVQSGGDLVKPGGSVRLSCVASGFTFSYAMSWVRQAPGKGLQWMGTISDGGSYTHYPDNLMGRFTFSLDTAKNTAYLQLNSLRAEDTAVYYCARESYDGYYVANWGQGTLVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSMVTVPSSRWPSETFTCNVAHPASKTKVDKPVPKRENGRVPRPPDCPKCPAPEMLGGXSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVXLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFXXXYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKXLXSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPGK
４Ｆ９−ＶＨ３  ｃＩｇＧＢ  ＤＮＡ［配列番号２５］
gaggtgcagctggtgcagagcggcggcgacctggtgaagcccggcggcagcgtgagactgagctgcgtggccagcggcttcaccttcagctacgccatgagctgggtgagacaggcccccggcaagggcctgcagtggatgggcaccatcagcgacggcggcagctacacccactaccccgacaacctgatgggcagattcaccttcagcctggacaccgccaagaacaccgcctacctgcagctgaacagcctgagagccgaggacaccgccgtgtactactgcgccagagagagctacgacggctactacgtggccaactggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcgccagcaccaccgcccccagcgtgttccccctggcccccagctgcggcagcaccagcggcagcaccgtggccctggcctgcctggtgagcggctacttccccgagcccgtgaccgtgagctggaacagcggcagcctgaccagcggcgtgcacaccttccccagcgtgctgcagagcagcggcctgtacagcctgagcagcatggtgaccgtgcccagcagcagatggcccagcgagaccttcacctgcaacgtggcccaccccgccagcaagaccaaggtggacaagcccgtgcccaagagagagaacggcagagtgcccagaccccccgactgccccaagtgccccgcccccgagatgctgggcggcnnnagcgtgttcatcttcccccccaagcccaaggacaccctgctgatcgccagaacccccgaggtgacctgcgtggtggtgnnnctggaccccgaggaccccgaggtgcagatcagctggttcgtggacggcaagcagatgcagaccgccaagacccagcccagagaggagcagttcnnnnnnnnntacagagtggtgagcgtgctgcccatcggccaccaggactggctgaagggcaagcagttcacctgcaaggtgaacaacaagnnnctgnnnagccccatcgagagaaccatcagcaaggccagaggccaggcccaccagcccagcgtgtacgtgctgccccccagcagagaggagctgagcaagaacaccgtgagcctgacctgcctgatcaaggacttcttcccccccgacatcgacgtggagtggcagagcaacggccagcaggagcccgagagcaagtacagaaccacccccccccagctggacgaggacggcagctacttcctgtacagcaagctgagcgtggacaagagcagatggcagagaggcgacaccttcatctgcgccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccaggagagcctgagccacagccccggcaag
４Ｆ９−ＶＨ３  ｃＩｇＧＣ［配列番号２８］
EVQLVQSGGDLVKPGGSVRLSCVASGFTFSYAMSWVRQAPGKGLQWMGTISDGGSYTHYPDNLMGRFTFSLDTAKNTAYLQLNSLRAEDTAVYYCARESYDGYYVANWGQGTLVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSQSGSTVALACLVSGYIPEPVTVSWNSVSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSMVTVPSSRWPSETFTCNVAHPATNTKVDKPVAKECECKCNCNNCPCPGCGLLGGXSVFIFPPKPKDILVTARTPTVTCVVVXLDPENPEVQISWFVDSKQVQTANTQPREEQSXXXYRVVSVLPIGHQDWLSGKQFKCKVNNKXLXSPIEEIISKTPGQAHQPNVYVLPPSRDEMSKNTVTLTCLVKDFFPPEIDVEWQSNGQQEPESKYRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQISLSHSPGK
４Ｆ９−ＶＨ３  ｃＩｇＧＣ  ＤＮＡ［配列番号２７］
gaggtgcagctggtgcagagcggcggcgacctggtgaagcccggcggcagcgtgagactgagctgcgtggccagcggcttcaccttcagctacgccatgagctgggtgagacaggcccccggcaagggcctgcagtggatgggcaccatcagcgacggcggcagctacacccactaccccgacaacctgatgggcagattcaccttcagcctggacaccgccaagaacaccgcctacctgcagctgaacagcctgagagccgaggacaccgccgtgtactactgcgccagagagagctacgacggctactacgtggccaactggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcgccagcaccaccgcccccagcgtgttccccctggcccccagctgcggcagccagagcggcagcaccgtggccctggcctgcctggtgagcggctacatccccgagcccgtgaccgtgagctggaacagcgtgagcctgaccagcggcgtgcacaccttccccagcgtgctgcagagcagcggcctgtacagcctgagcagcatggtgaccgtgcccagcagcagatggcccagcgagaccttcacctgcaacgtggcccaccccgccaccaacaccaaggtggacaagcccgtggccaaggagtgcgagtgcaagtgcaactgcaacaactgcccctgccccggctgcggcctgctgggcggcnnnagcgtgttcatcttcccccccaagcccaaggacatcctggtgaccgccagaacccccaccgtgacctgcgtggtggtgnnnctggaccccgagaaccccgaggtgcagatcagctggttcgtggacagcaagcaggtgcagaccgccaacacccagcccagagaggagcagagcnnnnnnnnntacagagtggtgagcgtgctgcccatcggccaccaggactggctgagcggcaagcagttcaagtgcaaggtgaacaacaagnnnctgnnnagccccatcgaggagatcatcagcaagacccccggccaggcccaccagcccaacgtgtacgtgctgccccccagcagagacgagatgagcaagaacaccgtgaccctgacctgcctggtgaaggacttcttcccccccgagatcgacgtggagtggcagagcaacggccagcaggagcccgagagcaagtacagaatgacccccccccagctggacgaggacggcagctacttcctgtacagcaagctgagcgtggacaagagcagatggcagagaggcgacaccttcatctgcgccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagatcagcctgagccacagccccggcaag
５Ｆ１２−ＶＨ３  ＣＩｇＧＢ［配列番号３０］
EVQLVQSGGDLVKPGGSVRLSCVASFTFDYYMNWVRQAPGKGLQWIGRWIFPGSGATYYNERFMGKATISADTAKNTAYMQLNSLRAEDTAVYYCLRSDWDVGDFWGQGTLVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSMVTVPSSRWPSETFTCNVAHPASKTKVDKPVPKRENGRVPRPPDCPKCPAPEMLGGXSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVXLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFXXXYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKXLXSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPGK
５Ｆ１２−ＶＨ３  ＣＩｇＧＢ  ＤＮＡ［配列番号２９］
gaggtgcagctggtgcagagcggcggcgacctggtgaagcccggcggcagcgtgagactgagctgcgtggccagcttcaccttcgactactacatgaactgggtgagacaggcccccggcaagggcctgcagtggatcggcagatggatcttccccggcagcggcgccacctactacaacgagagattcatgggcaaggccaccatcagcgccgacaccgccaagaacaccgcctacatgcagctgaacagcctgagagccgaggacaccgccgtgtactactgcctgagaagcgactgggacgtgggcgacttctggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcgccagcaccaccgcccccagcgtgttccccctggcccccagctgcggcagcaccagcggcagcaccgtggccctggcctgcctggtgagcggctacttccccgagcccgtgaccgtgagctggaacagcggcagcctgaccagcggcgtgcacaccttccccagcgtgctgcagagcagcggcctgtacagcctgagcagcatggtgaccgtgcccagcagcagatggcccagcgagaccttcacctgcaacgtggcccaccccgccagcaagaccaaggtggacaagcccgtgcccaagagagagaacggcagagtgcccagaccccccgactgccccaagtgccccgcccccgagatgctgggcggcnnnagcgtgttcatcttcccccccaagcccaaggacaccctgctgatcgccagaacccccgaggtgacctgcgtggtggtgnnnctggaccccgaggaccccgaggtgcagatcagctggttcgtggacggcaagcagatgcagaccgccaagacccagcccagagaggagcagttcnnnnnnnnntacagagtggtgagcgtgctgcccatcggccaccaggactggctgaagggcaagcagttcacctgcaaggtgaacaacaagnnnctgnnnagccccatcgagagaaccatcagcaaggccagaggccaggcccaccagcccagcgtgtacgtgctgccccccagcagagaggagctgagcaagaacaccgtgagcctgacctgcctgatcaaggacttcttcccccccgacatcgacgtggagtggcagagcaacggccagcaggagcccgagagcaagtacagaaccacccccccccagctggacgaggacggcagctacttcctgtacagcaagctgagcgtggacaagagcagatggcagagaggcgacaccttcatctgcgccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccaggagagcctgagccacagccccggcaag
５Ｆ１２−ＶＨ３−ｃＩｇＧＣ  Ｆｃ［配列番号３２］
EVQLVQSGGDLVKPGGSVRLSCVASFTFDYYMNWVRQAPGKGLQWIGRWIFPGSGATYYNERFMGKATISADTAKNTAYMQLNSLRAEDTAVYYCLRSDWDVGDFWGQGTLVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSQSGSTVALACLVSGYIPEPVTVSWNSVSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSMVTVPSSRWPSETFTCNVAHPATNTKVDKPVAKECECKCNCNNCPCPGCGLLGGXSVFIFPPKPKDILVTARTPTVTCVVVXLDPENPEVQISWFVDSKQVQTANTQPREEQSXXXYRVVSVLPIGHQDWLSGKQFKCKVNNKXLXSPIEEIISKTPGQAHQPNVYVLPPSRDEMSKNTVTLTCLVKDFFPPEIDVEWQSNGQQEPESKYRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQISLSHSPGK
５Ｆ１２−ＶＨ３−ｃＩｇＧＣ  Ｆｃ  ＤＮＡ［配列番号３１］
gaggtgcagctggtgcagagcggcggcgacctggtgaagcccggcggcagcgtgagactgagctgcgtggccagcttcaccttcgactactacatgaactgggtgagacaggcccccggcaagggcctgcagtggatcggcagatggatcttccccggcagcggcgccacctactacaacgagagattcatgggcaaggccaccatcagcgccgacaccgccaagaacaccgcctacatgcagctgaacagcctgagagccgaggacaccgccgtgtactactgcctgagaagcgactgggacgtgggcgacttctggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcgccagcaccaccgcccccagcgtgttccccctggcccccagctgcggcagccagagcggcagcaccgtggccctggcctgcctggtgagcggctacatccccgagcccgtgaccgtgagctggaacagcgtgagcctgaccagcggcgtgcacaccttccccagcgtgctgcagagcagcggcctgtacagcctgagcagcatggtgaccgtgcccagcagcagatggcccagcgagaccttcacctgcaacgtggcccaccccgccaccaacaccaaggtggacaagcccgtggccaaggagtgcgagtgcaagtgcaactgcaacaactgcccctgccccggctgcggcctgctgggcggcnnnagcgtgttcatcttcccccccaagcccaaggacatcctggtgaccgccagaacccccaccgtgacctgcgtggtggtgnnnctggaccccgagaaccccgaggtgcagatcagctggttcgtggacagcaagcaggtgcagaccgccaacacccagcccagagaggagcagagcnnnnnnnnntacagagtggtgagcgtgctgcccatcggccaccaggactggctgagcggcaagcagttcaagtgcaaggtgaacaacaagnnnctgnnnagccccatcgaggagatcatcagcaagacccccggccaggcccaccagcccaacgtgtacgtgctgccccccagcagagacgagatgagcaagaacaccgtgaccctgacctgcctggtgaaggacttcttcccccccgagatcgacgtggagtggcagagcaacggccagcaggagcccgagagcaagtacagaatgacccccccccagctggacgaggacggcagctacttcctgtacagcaagctgagcgtggacaagagcagatggcagagaggcgacaccttcatctgcgccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagatcagcctgagccacagccccggcaag
個々の置換されていないイヌ化重鎖および軽鎖
４Ｆ９−ＶＨ３−ｃＩｇＧＡ  Ｆｃ［配列番号３４］
EVQLVQSGGDLVKPGGSVRLSCVASGFTFSYAMSWVRQAPGKGLQWMGTISDGGSYTHYPDNLMGRFTFSLDTAKNTAYLQLNSLRAEDTAVYYCARESYDGYYVANWGQGTLVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLHSLSSMVTVPSSRWPSETFTCNVVHPASNTKVDKPVFNECRCTDTPPCPVPEPLGGPSVLIFPPKPKDILRITRTPEVTCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQSREQQFNGTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIDLPSPIERTISKARGRAHKPSVYVLPPSPKELSSSDTVSITCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPERKHRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDPFTCAVMHETLQNHYTDLSLSHSPGK
４Ｆ９−ＶＨ３−ｃＩｇＧＡ  Ｆｃ［配列番号３３］
gaggtgcagctggtgcagagcggcggcgacctggtgaagcccggcggcagcgtgagactgagctgcgtggccagcggcttcaccttcagctacgccatgagctgggtgagacaggcccccggcaagggcctgcagtggatgggcaccatcagcgacggcggcagctacacccactaccccgacaacctgatgggcagattcaccttcagcctggacaccgccaagaacaccgcctacctgcagctgaacagcctgagagccgaggacaccgccgtgtactactgcgccagagagagctacgacggctactacgtggccaactggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcgccagcaccaccgcccccagcgtgttccccctggcccccagctgcggcagcaccagcggcagcaccgtggccctggcctgcctggtgagcggctacttccccgagcccgtgaccgtgagctggaacagcggcagcctgaccagcggcgtgcacaccttccccagcgtgctgcagagcagcggcctgcacagcctgagcagcatggtgaccgtgcccagcagcagatggcccagcgagaccttcacctgcaacgtggtgcaccccgccagcaacaccaaggtggacaagcccgtgttcaacgagtgcagatgcaccgacacccccccctgccccgtgcccgagcccctgggcggccccagcgtgctgatcttcccccccaagcccaaggacatcctgagaatcaccagaacccccgaggtgacctgcgtggtgctggacctgggcagagaggaccccgaggtgcagatcagctggttcgtggacggcaaggaggtgcacaccgccaagacccagagcagagagcagcagttcaacggcacctacagagtggtgagcgtgctgcccatcgagcaccaggactggctgaccggcaaggagttcaagtgcagagtgaaccacatcgacctgcccagccccatcgagagaaccatcagcaaggccagaggcagagcccacaagcccagcgtgtacgtgctgccccccagccccaaggagctgagcagcagcgacaccgtgagcatcacctgcctgatcaaggacttctacccccccgacatcgacgtggagtggcagagcaacggccagcaggagcccgagagaaagcacagaatgacccccccccagctggacgaggacggcagctacttcctgtacagcaagctgagcgtggacaagagcagatggcagcagggcgaccccttcacctgcgccgtgatgcacgagaccctgcagaaccactacaccgacctgagcctgagccacagccccggcaag
４Ｆ９−ＶＨ３  ｃＩｇＧＤ  Ｆｃ［配列番号３６］
EVQLVQSGGDLVKPGGSVRLSCVASGFTFSYAMSWVRQAPGKGLQWMGTISDGGSYTHYPDNLMGRFTFSLDTAKNTAYLQLNSLRAEDTAVYYCARESYDGYYVANWGQGTLVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSTVTVPSSRWPSETFTCNVVHPASNTKVDKPVPKESTCKCISPCPVPESLGGPSVFIFPPKPKDILRITRTPEITCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQPREQQFNSTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIGLPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSPKELSSSDTVTLTCLIKDFFPPEIDVEWQSNGQPEPESKYHTTAPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDTFTCAVMHEALQNHYTDLSLSHSPGK
４Ｆ９−ＶＨ３  ｃＩｇＧＤ  Ｆｃ［配列番号３５］
gaggtgcagctggtgcagagcggcggcgacctggtgaagcccggcggcagcgtgagactgagctgcgtggccagcggcttcaccttcagctacgccatgagctgggtgagacaggcccccggcaagggcctgcagtggatgggcaccatcagcgacggcggcagctacacccactaccccgacaacctgatgggcagattcaccttcagcctggacaccgccaagaacaccgcctacctgcagctgaacagcctgagagccgaggacaccgccgtgtactactgcgccagagagagctacgacggctactacgtggccaactggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcgccagcaccaccgcccccagcgtgttccccctggcccccagctgcggcagcaccagcggcagcaccgtggccctggcctgcctggtgagcggctacttccccgagcccgtgaccgtgagctggaacagcggcagcctgaccagcggcgtgcacaccttccccagcgtgctgcagagcagcggcctgtacagcctgagcagcaccgtgaccgtgcccagcagcagatggcccagcgagaccttcacctgcaacgtggtgcaccccgccagcaacaccaaggtggacaagcccgtgcccaaggagagcacctgcaagtgcatcagcccctgccccgtgcccgagagcctgggcggccccagcgtgttcatcttcccccccaagcccaaggacatcctgagaatcaccagaacccccgagatcacctgcgtggtgctggacctgggcagagaggaccccgaggtgcagatcagctggttcgtggacggcaaggaggtgcacaccgccaagacccagcccagagagcagcagttcaacagcacctacagagtggtgagcgtgctgcccatcgagcaccaggactggctgaccggcaaggagttcaagtgcagagtgaaccacatcggcctgcccagccccatcgagagaaccatcagcaaggccagaggccaggcccaccagcccagcgtgtacgtgctgccccccagccccaaggagctgagcagcagcgacaccgtgaccctgacctgcctgatcaaggacttcttcccccccgagatcgacgtggagtggcagagcaacggccagcccgagcccgagagcaagtaccacaccaccgccccccagctggacgaggacggcagctacttcctgtacagcaagctgagcgtggacaagagcagatggcagcagggcgacaccttcacctgcgccgtgatgcacgaggccctgcagaaccactacaccgacctgagcctgagccacagccccggcaag
４Ｆ９−ＶＬ３−ｃＬ−カッパ［配列番号３８］
DIVMTQTPLSLSVSPGEPASMSCRASQSISNNLHWYRQKPGQSPQVLVKYASQSISGVPDRFIGSGSGTDFTLRISRVEADDLGVYYCQQSNSWPQTFGQGTKLELKRNDAQPAVYLFQPSPDQLHTGSASVVCLLNSFYPKDINVKWKVDGVIQDTGIQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTMSSTEYLSHELYSCEITHKSLPSTLIKSFQRSECQRVD
４Ｆ９−ＶＬ３−ｃＬ−カッパ［配列番号３７］
gacatcgtgatgacccagacccccctgagcctgagcgtgagccccggcgagcccgccagcatgagctgcagagccagccagagcatcagcaacaacctgcactggtacagacagaagcccggccagagcccccaggtgctggtgaagtacgccagccagagcatcagcggcgtgcccgacagattcatcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgagaatcagcagagtggaggccgacgacctgggcgtgtactactgccagcagagcaacagctggccccagaccttcggccagggcaccaagctggagctgaagagaaacgacgcccagcccgccgtgtacctgttccagcccagccccgaccagctgcacaccggcagcgccagcgtggtgtgcctgctgaacagcttctaccccaaggacatcaacgtgaagtggaaggtggacggcgtgatccaggacaccggcatccaggagagcgtgaccgagcaggacagcaaggacagcacctacagcctgagcagcaccctgaccatgagcagcaccgagtacctgagccacgagctgtacagctgcgagatcacccacaagagcctgcccagcaccctgatcaagagcttccagagaagcgagtgccagagagtggac
５Ｆ１２−ＶＨ３−ｃＩｇＧＡ  Ｆｃ［配列番号４０］
EVQLVQSGGDLVKPGGSVRLSCVASFTFDYYMNWVRQAPGKGLQWIGRWIFPGSGATYYNERFMGKATISADTAKNTAYMQLNSLRAEDTAVYYCLRSDWDVGDFWGQGTLVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLHSLSSMVTVPSSRWPSETFTCNVVHPASNTKVDKPVFNECRCTDTPPCPVPEPLGGPSVLIFPPKPKDILRITRTPEVTCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQSREQQFNGTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIDLPSPIERTISKARGRAHKPSVYVLPPSPKELSSSDTVSITCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPERKHRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDPFTCAVMHETLQNHYTDLSLSHSPGK
５Ｆ１２−ＶＨ３−ｃＩｇＧＡ  Ｆｃ［配列番号３９］
gaggtgcagctggtgcagagcggcggcgacctggtgaagcccggcggcagcgtgagactgagctgcgtggccagcttcaccttcgactactacatgaactgggtgagacaggcccccggcaagggcctgcagtggatcggcagatggatcttccccggcagcggcgccacctactacaacgagagattcatgggcaaggccaccatcagcgccgacaccgccaagaacaccgcctacatgcagctgaacagcctgagagccgaggacaccgccgtgtactactgcctgagaagcgactgggacgtgggcgacttctggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcgccagcaccaccgcccccagcgtgttccccctggcccccagctgcggcagcaccagcggcagcaccgtggccctggcctgcctggtgagcggctacttccccgagcccgtgaccgtgagctggaacagcggcagcctgaccagcggcgtgcacaccttccccagcgtgctgcagagcagcggcctgcacagcctgagcagcatggtgaccgtgcccagcagcagatggcccagcgagaccttcacctgcaacgtggtgcaccccgccagcaacaccaaggtggacaagcccgtgttcaacgagtgcagatgcaccgacacccccccctgccccgtgcccgagcccctgggcggccccagcgtgctgatcttcccccccaagcccaaggacatcctgagaatcaccagaacccccgaggtgacctgcgtggtgctggacctgggcagagaggaccccgaggtgcagatcagctggttcgtggacggcaaggaggtgcacaccgccaagacccagagcagagagcagcagttcaacggcacctacagagtggtgagcgtgctgcccatcgagcaccaggactggctgaccggcaaggagttcaagtgcagagtgaaccacatcgacctgcccagccccatcgagagaaccatcagcaaggccagaggcagagcccacaagcccagcgtgtacgtgctgccccccagccccaaggagctgagcagcagcgacaccgtgagcatcacctgcctgatcaaggacttctacccccccgacatcgacgtggagtggcagagcaacggccagcaggagcccgagagaaagcacagaatgacccccccccagctggacgaggacggcagctacttcctgtacagcaagctgagcgtggacaagagcagatggcagcagggcgaccccttcacctgcgccgtgatgcacgagaccctgcagaaccactacaccgacctgagcctgagccacagccccggcaag
５Ｆ１２−ＶＨ３−ｃＩｇＧＤ  Ｆｃ［配列番号４２］
EVQLVQSGGDLVKPGGSVRLSCVASFTFDYYMNWVRQAPGKGLQWIGRWIFPGSGATYYNERFMGKATISADTAKNTAYMQLNSLRAEDTAVYYCLRSDWDVGDFWGQGTLVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSTVTVPSSRWPSETFTCNVVHPASNTKVDKPVPKESTCKCISPCPVPESLGGPSVFIFPPKPKDILRITRTPEITCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQPREQQFNSTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIGLPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSPKELSSSDTVTLTCLIKDFFPPEIDVEWQSNGQPEPESKYHTTAPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDTFTCAVMHEALQNHYTDLSLSHSPGK
５Ｆ１２−ＶＨ３−ｃＩｇＧＤ  Ｆｃ［配列番号４１］
gaggtgcagctggtgcagagcggcggcgacctggtgaagcccggcggcagcgtgagactgagctgcgtggccagcttcaccttcgactactacatgaactgggtgagacaggcccccggcaagggcctgcagtggatcggcagatggatcttccccggcagcggcgccacctactacaacgagagattcatgggcaaggccaccatcagcgccgacaccgccaagaacaccgcctacatgcagctgaacagcctgagagccgaggacaccgccgtgtactactgcctgagaagcgactgggacgtgggcgacttctggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcgccagcaccaccgcccccagcgtgttccccctggcccccagctgcggcagcaccagcggcagcaccgtggccctggcctgcctggtgagcggctacttccccgagcccgtgaccgtgagctggaacagcggcagcctgaccagcggcgtgcacaccttccccagcgtgctgcagagcagcggcctgtacagcctgagcagcaccgtgaccgtgcccagcagcagatggcccagcgagaccttcacctgcaacgtggtgcaccccgccagcaacaccaaggtggacaagcccgtgcccaaggagagcacctgcaagtgcatcagcccctgccccgtgcccgagagcctgggcggccccagcgtgttcatcttcccccccaagcccaaggacatcctgagaatcaccagaacccccgagatcacctgcgtggtgctggacctgggcagagaggaccccgaggtgcagatcagctggttcgtggacggcaaggaggtgcacaccgccaagacccagcccagagagcagcagttcaacagcacctacagagtggtgagcgtgctgcccatcgagcaccaggactggctgaccggcaaggagttcaagtgcagagtgaaccacatcggcctgcccagccccatcgagagaaccatcagcaaggccagaggccaggcccaccagcccagcgtgtacgtgctgccccccagccccaaggagctgagcagcagcgacaccgtgaccctgacctgcctgatcaaggacttcttcccccccgagatcgacgtggagtggcagagcaacggccagcccgagcccgagagcaagtaccacaccaccgccccccagctggacgaggacggcagctacttcctgtacagcaagctgagcgtggacaagagcagatggcagcagggcgacaccttcacctgcgccgtgatgcacgaggccctgcagaaccactacaccgacctgagcctgagccacagccccggcaag
５Ｆ１２−ＶＬ３−ｃＬカッパ［配列番号４４］
DIVMTQTPLSLSVSLGEPASISCRSSRSLLHTNGITYLSWYRQKPGQIPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCAQTLGLPRTFGQGTKVEIKRNDAQPAVYLFQPSPDQLHTGSASVVCLLNSFYPKDINVKWKVDGVIQDTGIQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTMSSTEYLSHELYSCEITHKSLPSTLIKSFQRSECQRVD
５Ｆ１２−ＶＬ３−ｃＬカッパ［配列番号４３］
gacatcgtgatgacccagacccccctgagcctgagcgtgagcctgggcgagcccgccagcatcagctgcagaagcagcagaagcctgctgcacaccaacggcatcacctacctgagctggtacagacagaagcccggccagatcccccagctgctgatctaccagatgagcaacctggccagcggcgtgcccgacagattcagcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgagaatcagcagagtggaggccgacgacgccggcgtgtactactgcgcccagaccctgggcctgcccagaaccttcggccagggcaccaaggtggagatcaagagaaacgacgcccagcccgccgtgtacctgttccagcccagccccgaccagctgcacaccggcagcgccagcgtggtgtgcctgctgaacagcttctaccccaaggacatcaacgtgaagtggaaggtggacggcgtgatccaggacaccggcatccaggagagcgtgaccgagcaggacagcaaggacagcacctacagcctgagcagcaccctgaccatgagcagcaccgagtacctgagccacgagctgtacagctgcgagatcacccacaagagcctgcccagcaccctgatcaagagcttccagagaagcgagtgccagagagtggac
マウス抗イヌＰＤＬ−１：４Ｆ９の可変領域
重鎖：ＤＮＡ配列［配列番号７３］
gaagtgcagctggtggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctctggattcactttcagtagctatgccatgtcttgggttcgccagactccggacaagagactggagtgggtcgcaaccattagtgatggtggaagttacacccactaccccgacaatttaatgggccgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaacctgtacctgcaaatgagccatctgaagtctgacgacacagccatgtattactgtgcacgagagagctatgatggttactacgtggctaactggggccaagggactctggtcactgtctcagca
重鎖：アミノ酸配列［配列番号７４］
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPDKRLEWVATISDGGSYTHYPDNLMGRFTISRDNAKNNLYLQMSHLKSDDTAMYYCARESYDGYYVANWGQGTLVTVSA
軽鎖：ＤＮＡ配列［配列番号７５］
gatattgtgctaactcagtctccagccaccctgtctgtgaatccaggagatagcgtcagtctttcctgcagggccagccaaagtattagcaacaacctacactggtatcaacaaaaatcacatgagtctccaaggcttctcatcaagtatgcttcccagtccatctctgggatcccctccaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcactctcagtatcaacagtgtggagactgaagattttggaatgtatttctgtcaacagagtaacagctggcctcagacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa
軽鎖：アミノ酸配列［配列番号７６］
DIVLTQSPATLSVNPGDSVSLSCRASQSISNNLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWPQTFGGGTKLEIK
マウス抗イヌＰＤＬ−１：抗ＰＤＬ−１  ５Ｆ１２の可変領域
重鎖：ＤＮＡ配列［配列番号７７］
caggtccagctacagcagtctggacctgagctggtgaagcctggggcttcagtgaagatatcctgcaaggcttctggctacaccttcactgactactatatgaattgggtgaaacagaggcctggacagggacttgagtggattggatggatttttcccggaagtggtgctacttactacaatgagaggttcatgggcaaggccacacttactgtggataaatcttccaacacagcctacatgttgttcagtagcctgacctctgaggactctgcggtctatttctgtttaagatctgactgggacgtcggggacttctggggccaaggcaccactctcacagtctcctca
重鎖：アミノ酸配列［配列番号７８］
QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQRPGQGLEWIGWIFPGSGATYYNERFMGKATLTVDKSSNTAYMLFSSLTSEDSAVYFCLRSDWDVGDFWGQGTTLTVSS
軽鎖：ＤＮＡ配列［配列番号７９］
gatattgtgatgacgcaggctgcattctccaatccagtcactcttggaacatcagcttccatctcctgcaggtctagtaggagtctcctacatactaatggcatcacttatttgtcttggtttctgcagaagccaggccagtctcctcagctcctgatttatcagatgtccaaccttgcctcaggagtcccagacaggttcagtagcagtgggtcaggaactgatttcacactgagaatcagtagagtggaggctgaggatgtgggtatttattactgtgctcaaactctaggacttcctcggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa
軽鎖：アミノ酸配列［配列番号８０］
DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSRSLLHTNGITYLSWFLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGIYYCAQTLGLPRTFGGGTKLEIK
【０２３１】
実施例５
抗イヌＰＤ−Ｌ１抗体のエピトープマッピング
抗体とそれらの同族タンパク質抗原との相互作用は、抗体の特定アミノ酸（パラトープ）と標的抗原の特定アミノ酸（エピトープ）の結合を通じて仲介される。エピトープは、免疫グロブリンによる特異的反応を引き起こす抗原性決定基である。エピトープは、抗原の表面上のアミノ酸のグループからなる。目的タンパク質は、異なる抗体により認識されるいくつかのエピトープを含有し得る。抗体により認識されるエピトープは、線状エピトープまたは立体構造エピトープとして分類される。線状エピトープはタンパク質中のアミノ酸の一続きの連続配列により形成されるが、立体構造エピトープは一次アミノ酸配列中では不連続である（例えば遠く離れている）が、３次元タンパク質フォールディングの際には集合するアミノ酸から構成される。
【０２３２】
エピトープマッピングとは、それらの標的抗原上の抗体により認識されるアミノ酸配列（すなわちエピトープ）を同定するプロセスをいう。標的抗原上のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）により認識されるエピトープの同定には、重要な用途がある。例えば、これは、新たな治療薬、診断薬およびワクチンの開発を助けることができる。エピトープマッピングはまた、最適化治療ｍＡｂの選択を助け、それらの作用メカニズムの解明を援助することができる。ＰＤ−Ｌ１上のエピトープ情報はまた、固有のがんエピトープを解明し、ワクチンの予防効果または病原性作用を明らかにすることができる。エピトープ同定はまた、同定されたペプチドエピトープのキャリアタンパク質または他の免疫刺激剤との化学的または遺伝子的カップリングに基づくサブユニットワクチンの開発を導くことができる。
【０２３３】
エピトープマッピングはポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いて行うことができ、エピトープの考えられる特質（すなわち線状対立体構造）に応じてエピトープ同定のためのいくつかの方法が使用される。線状エピトープのマッピングはより単純で、比較的実施が容易である。この目的のため、線状エピトープマッピングのための商業的サービスはしばしばペプチドスキャニングを使用する。この場合、標的タンパク質の短いペプチド配列の重なり合うセットを化学合成し、目的抗体に結合するそれらの能力を試験する。この戦略は迅速でハイスループットであり、比較的実施が高価でない。他方、不連続エピトープのマッピングは技術的により挑戦的であり、より専門的な技術、例えばモノクローナル抗体とその標的タンパク質とのＸ線共結晶、水素−重水素（Ｈ／Ｄ）交換、酵素消化と併せた質量分析など、並びに当業者に公知のいくつかの他の方法を必要とする。
【０２３４】
質量分析を用いたＰＤ−Ｌ１エピトープのマッピング：
化学的架橋および質量分析検出に基づく方法を使用して、抗イヌＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂにより認識されるエピトープを同定した［ＣｏｖａｌＸ（登録商標）  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ］。イヌＰＤ−Ｌ１のエピトープマッピングへのこの技術の適用は、表１３中に収載されている示されたｍＡｂにより認識されるエピトープの同定をもたらした。ｍＡｂ  ４Ｆ９を使用したイヌＰＤ−Ｌ１のエピトープマッピングの結果は、このｍＡｂが配列番号８２により表されるアミノ酸配列および配列番号８３により表されるアミノ酸配列から構成されるイヌＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメイン内に位置するエピトープを認識することを示す［表１３を参照されたい］。さらには、ｍＡｂ  ５Ｆ１２を使用したエピトープマッピング実験の結果は、このｍＡｂが配列番号８２により表されるアミノ酸配列から構成されるイヌＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメイン内に位置するエピトープを認識することを示す。注目すべきことに、本明細書中で同定されたイヌＰＤ−Ｌ１上のエピトープの位置は、対応するヒトＰＤ−Ｌ１について近年報告された位置と合理的に一致しており［Ｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．２８：２６９−２７６（２０１５）］、これは上で与えられた決定へのさらなる信頼を与えるものである。
【０２３５】
表１３
抗イヌＰＤ−Ｌ１  ＭＡＢにより認識されるＰＤ−Ｌ１エピトープ
【表１３】
0006797111.tif 000014
【０２３６】
本明細書中で引用されている全ての参考文献は、各々の個別の刊行物、データベースエントリー（例えばＧｅｎｂａｎｋ配列またはＧｅｎｅＩＤエントリー）、特許出願または特許が参照により組み込まれると具体的かつ個別に指示されていた場合と同程度に、参照により組み込まれる。参照による組み込みについてのこの記述は、出願人により、米国連邦規則法典第３７巻第１．５７条第（ｂ）項第（１）号（３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．  §１．５７（ｂ）（１））に従って、その各々がかかる引用が参照による組み込みについての専用の記述に直接隣接していなくとも米国連邦規則法典第３７巻第１．５７条第（ｂ）項第（２）号（３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．  §１．５７（ｂ）（２））に従って明確に同定されているあらゆる個別の刊行物、データベースエントリー（例えばＧｅｎｂａｎｋ配列またはＧｅｎｅＩＤエントリー）、特許出願または特許と関連付けることが意図されたものである。明細書の中に参照による組み込みについての専用の記述を含めることは、もしあったとしても、参照による組み込みについてのこの一般的な記述を何ら弱めるものではない。本明細書中の参考文献の引用は、参考文献が関連する従来技術であるという自認とは意図されず、これらの刊行物または文書の内容および日付に関して何らの自認を構成するものではない。
【０２３７】
本発明は、本明細書中に記載されている具体的な実施形態により範囲を限定されるものではない。実際に、本明細書中に記載されているものに加えて、本発明の様々な改変が、前述の記載および添付の図から当業者に明らかになるであろう。かかる改変は添付の特許請求の範囲の中に含むことが意図される。
【０２３８】
前述の書面の明細書は、当業者に本発明を実施させることができるのに十分であると考えられる。本明細書中に示されて記載されているものに加えて、本発明の様々な改変が前述の記載から当業者に明らかになり、これらは添付の特許請求の範囲の中に入る。
【図１】
0006797111.tif 000015
【図２】
0006797111.tif 000016
【配列表】
0006797111000001.app