(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料（２）の分子分光分析用顕微鏡であって、該顕微鏡は、
赤外線（ＩＲ）放射する少なくとも１つの量子カスケードレーザー（ＱＣＬ）（３）と、
前記量子カスケードレーザー（ＱＣＬ）（３）と前記試料（２）との間に配置された位相変調器（５）と、
前記位相変調器（５）と前記試料（２）との間に配置された少なくとも１つの光学素子（６）と、
前記試料（２）を透過したおよび／または前記試料（２）によって反射された赤外線（ＩＲ）放射を検出するセンサ（４）と
を有するビーム経路を有するものあり、
前記位相変調器（５）は、回転自在な赤外線（ＩＲ）透過散乱板（２１）または赤外線（ＩＲ）放射を反射する回転自在な散乱ミラー（２５）であり、
前記位相変調器（５）は分析中連続して回転され、前記位相変調器（５）の中心部において散乱した赤外線（ＩＲ）放射が前記試料（２）に衝突しないように、前記顕微鏡（１）のビーム経路に配置されることを特徴とする、
顕微鏡。
【請求項２】
請求項１記載の顕微鏡（１）において、前記位相変調器（５）は、前記位相変調器（５）の中心部が前記赤外線（ＩＲ）放射に含まれないように、前記顕微鏡（１）のビーム経路に配置されることを特徴とする顕微鏡。
【請求項３】
請求項１または２記載の顕微鏡（１）において、前記量子カスケードレーザー（ＱＣＬ）（３）は外部共振器型量子カスケードレーザー（３）（ＥＣ−ＱＣＬ）であることを特徴とする顕微鏡。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１つに記載の顕微鏡（１）において、前記量子カスケードレーザー（ＱＣＬ）（３）は分析中連続して調整されることを特徴とする顕微鏡。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１つ記載の顕微鏡（１）において、前記量子カスケードレーザー（ＱＣＬ）（３）は、分析中５ｃｍ−１／ｓ〜３０ｃｍ−１／ｓの速度で調整されることを特徴とする顕微鏡。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１つ記載の顕微鏡（１）において、前記センサ（４）は温度センサであることを特徴とする顕微鏡。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１つ記載の顕微鏡（１）において、前記位相変調器（５）は、前記センサ（４）よりもフレームレートの少なくとも５％速い速度で回転することを特徴とする顕微鏡。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１つ記載の顕微鏡（１）において、さらに、第二の静的位相変調器を有するものである顕微鏡。
【請求項９】
試料（２）を分子分光分析する方法であって、
量子カスケードレーザー（ＱＣＬ）（３）を用いて赤外線（ＩＲ）を前記試料（２）に対して放射する工程であって、前記ＩＲ放射は位相変調器（５）と少なくとも１つの光学素子（６）を通して前記試料（２）に向けられるものである、前記放射する工程と、
前記試料（２）によって反射されたおよび／または前記試料（２）を透過した赤外線（ＩＲ）放射を検出する工程とを有し、
前記位相変調器（５）は、回転自在な赤外線（ＩＲ）透過散乱板（２１）または赤外線（ＩＲ）放射を反射する回転自在な散乱ミラー（２５）であり、
前記位相変調器（５）は前記検出する工程中に連続して回転されることにより、前記位相変調器（５）の中心部で散乱される赤外線（ＩＲ）が前記試料（２）に対して放射されないことを特徴とする、
方法。
【請求項１０】
請求項９記載の方法において、前記位相変調器（５）の中心部は前記赤外線（ＩＲ）放射には含まれないことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項９または１０記載の方法において、少なくとも２つの異なる波長を有する透過したおよび／または反射された赤外線（ＩＲ）放射が検出されることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか１つ記載の方法において、前記ＩＲ放射は、１ｃｍ−１〜８ｃｍ−１のスペクトル分解能で検出されることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれか１つ記載の顕微鏡（１）において、前記量子カスケードレーザー（ＱＣＬ）（３）は、分析中１０ｃｍ−１／ｓ〜２０ｃｍ−１／ｓの速度で調整されることを特徴とする顕微鏡。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれか１つ記載の顕微鏡（１）において、前記量子カスケードレーザー（ＱＣＬ）（３）は、分析中約１０ｃｍ−１／ｓの速度で調整されることを特徴とする顕微鏡。
【請求項１５】
請求項６記載の顕微鏡（１）において、前記温度センサはマイクロボロメータ（２０）であることを特徴とする顕微鏡。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか１つ記載の顕微鏡（１）において、前記位相変調器（５）は、前記センサ（４）よりもフレームレートの少なくとも８％速い速度で回転することを特徴とする顕微鏡。
【請求項１７】
請求項１〜６のいずれか１つ記載の顕微鏡（１）において、前記位相変調器（５）は、前記センサ（４）よりもフレームレートの少なくとも２０％速い速度で回転することを特徴とする顕微鏡。
【請求項１８】
請求項９または１０記載の方法において、２〜１０の異なる波長を有する透過したおよび／または反射された赤外線（ＩＲ）放射が検出されることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項９または１０記載の方法において、２〜６の異なる波長を有する透過したおよび／または反射された赤外線（ＩＲ）放射が検出されることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項９または１０記載の方法において、２から４の異なる波長を有する透過したおよび／または反射された赤外線（ＩＲ）放射が検出されることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項９〜１１のいずれか１つ記載の方法において、前記ＩＲ放射は、２ｃｍ−１〜８ｃｍ−１のスペクトル分解能で検出されることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項９〜１１のいずれか１つ記載の方法において、前記ＩＲ放射は、４ｃｍ−１〜８ｃｍ−１のスペクトル分解能で検出されることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本発明は、試料の分子分光分析用顕微鏡に関し、該顕微鏡は、赤外線（ＩＲ）放射する少なくとも１つの量子カスケードレーザー（ＱＣＬ）と、ＱＣＬと試料との間に配置された位相変調器と、位相変調器と試料との間に配置された少なくとも１つの光学素子と、試料を透過したおよび／またはそれによって反射されたＩＲ放射を検出するセンサとを有するビーム経路を有する。更に、本発明は、試料の分子分光分析方法にも関し、該方法は、量子カスケードレーザー（ＱＣＬ）を用いて赤外線（ＩＲ）を放射する工程であって、該ＩＲが位相変調器および少なくとも１つの光学素子を経て試料に向けられる工程と、試料によって反射されたおよび／またはそれを透過するＩＲを検出する工程とを有する。
【背景技術】
【０００２】
病気を有効かつ効果的に治療するには、信頼できる診断が最重要な場合が多い。病気を単に対症療法として治療するだけでなく、根本療法または治癒が求められる場合には特にそうである。異なる病気すなわち医学的に異なる原因に由来するものであったとしても、部分的に重なり合う類似の症状を呈するものであるから、症状だけに基づいて病気を区別するのは不可能な場合がしばしばである。従って、異なる器官の機能不全によって引き起こされる組織変化が、類似または同一の症状を呈する場合があり得る。治療を成功させるには、特に根本療法を実現するには、斯かる違いを考慮に入れなければならない。
【０００３】
斯かる医学的要求に応えるため、診断には生検、化学分析／生物学的分析あるいは内視鏡検査が伴うものであり、斯かる手段により、病気の原因となる機能不全が同定されるはずである。この場合、生検を従来の方法で行って薄切片を形成し、組織または細胞を適切な化学物質で染色する。しかし、斯かるやり方で染色された薄切片が有意義となるか否かは組織と染料との相互作用に実質的にかかっているのであるから、染色が不完全なものであれば、明確で信頼の置ける診断を下すのは困難な場合が多い。更に、斯かるやり方は相対的に膨大な数の工程に関係しており、従って、比較的多くの時間が費やされる。それ故に、操作を伴う分析に斯かる方法が使用される場合、それは限定されたやり方で行うしかない。
【０００４】
斯かる理由により、最近、組織および細胞を検査するための染料を使わない方法が開発されている。特に、フーリエ変換赤外線（ＦＴＩＲ）分析が確立されており、この方法では、天然のＩＲ透過または反射スペクトルに基づいて生物学的試料が分析される。この場合、ポイントフォーポイントマッピング（ＦＴＩＲマッピング）を用いて、あるいは焦点面配列を有する赤外線検出器を用いた複数のＦＴＩＲスペクトルを並列に記録すること（ＦＴＩＲイメージング）により、試料の完全なＩＲスペクトルが記録される。しかし、ポイントフォーポイントマッピングを使用するので、従来のＦＴＩＲマッピングは時間がかかる。複数のスペクトルを並列に記録するのでこの方法の加速は可能であるが、この目的に必要なセンサは極めて高価である。
【０００５】
従って、確立されたＦＴＩＲ方法の代替方法として、１若しくはそれ以上の量子カスケードレーザーＱＣＬ）の使用が論議されている。これには、高いスペクトルエネルギー密度を有し一般的に狭い周波数範囲の規定のＩＲを放射する狭帯域赤外線（ＩＲ）ラジエータが関係する。しかし、より最近の装置は数百波長に調整が可能なので、より幅広いＩＲスペクトルを有する。以前も斯かる装置によって信頼できる結果は達成できているが、コストの高い半導体検出器（例えば、水銀／カドミウム／亜テルル酸塩（ＭＣＴ）ＦＰＡ）を使用しなければならないので、この点に関しては、従来のＦＴＩＲ技術を実質的に超える利点は達成されていない。
【０００６】
従って、費用対効果が高く迅速なＩＲ分析装置および方法の必要性が、特に生物学的試料の検査において、求められている。
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある（国際出願日以降国際段階で引用された文献及び他国に国内移行した際に引用された文献を含む）。
（先行技術文献）
（特許文献）
（特許文献１）  米国特許出願公開第２００８／０２１０８７３号明細書
（特許文献２）  米国特許出願公開第２０１２／０１２２０８４号明細書
（非特許文献）
（非特許文献１）  ＭＡＴＴＨＥＷ  Ｒ．ＫＯＬＥ  ＥＴ  ＡＬ："Ｄｉｓｃｒｅｔｅ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｍｉｃｒｏｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  ａｎｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｔｕｎａｂｌｅ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｃａｓｃａｄｅ  Ｌａｓｅｒ"，ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，ｖｏｌ．８４，ｎｏ．  ２３，４  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０１２（２０１２−１２−０４），ｐａｇｅｓ  １０３６６−１０３７２
（非特許文献２）  ＬＯＷＥＮＴＨＡＬ  Ｓ  ＥＴ  ＡＬ："ＳＰＥＣＫＬＥ  ＲＥＭＯＶＡＬ  ＢＹ  Ａ  ＳＬＯＷＬＹ  ＭＯＶＩＮＧ  ＤＩＦＦＵＳＥＲ  ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ  ＷＩＴＨ  Ａ  ＭＯＴＩＯＮＬＥＳＳ  ＤＩＦＦＵＳＥＲ"，ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＯＰＴＩＣＡＬ  ＳＯＣＩＥＴＹ  ＯＦ  ＡＭＥＲＩＣＡ，ＡＭＥＲＩＣＡＮ  ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ  ＯＦ  ＰＨＹＳＩＣＳ，ＮＥＷ  ＹＯＲＫ；ＵＳ，ｖｏｌ．  ６１，ｎｏ．７，１  Ｊｕｌｙ  １９７１（１９７１−０７−０１），ｐａｇｅｓ  ８４７−８５１
（非特許文献３）  ＦＲＡＮＫ  ＦＵＣＨＳ  ＥＴ  ＡＬ："Ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｔａｎｄ−ｏｆｆ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｐｌｏｓｉｖｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｕｎａｂｌｅ  ＭＩＲ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｃａｓｃａｄｅ  ｌａｓｅｒｓ"，  ＯＰＴＩＣＡＬ  ＳＥＮＳＩＮＧ  ＩＩ，  ｖｏｌ．  ７６０８，  ２３  Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１０  （２０１０−０１−２３），  ｐａｇｅ  ７６０８０９
（非特許文献４）  Ｍ．Ｃ．Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ａｎｄ  Ｂ．Ｅ．Ｂｅｒｎａｃｋｉ，Ｈｙｐｅｒｓｐｅｃｔｒａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｏｆ  ｅｘｐｌｏｓｉｖｅｓ  ｐａｒｔｉ−ｃｌｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｃａｖｉｔｙ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｃａｓｃａｄｅ  ｌａｓｅｒ，Ｏｐｔ．Ｅｎｇ．５２，２０１３，０６１３０２
（非特許文献５）  Ｋ．Ｙｅｈ，Ｓ．Ｋｅｎｋｅｌ，Ｊ．−Ｎ．Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｒ．Ｂｈａｒｇａｖａ，Ｆａｓｔ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｃａｓｃａｄｅ  Ｌａｓｅｒ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８７，２０１５，ｐｐ  ４８５−４９３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第一の観点において、本発明は、試料の分子分光分析用顕微鏡に関し、該顕微鏡は、赤外線（ＩＲ）放射する少なくとも１つの量子カスケードレーザー（ＱＣＬ）と、ＱＣＬと試料との間に配置された位相変調器と、位相変調器と試料との間に配置された少なくとも１つの光学素子と、試料を透過したおよび／または試料によって反射されたＩＲ放射を検出するセンサとを有するビーム経路を有しており、位相調整器は、回転自在なＩＲ透過散乱板またはＩＲ放射を反射する回転自在な散乱ミラーであり、位相変調器は分析中連続して回転され、位相変調器の中心部で散乱したＩＲ放射が試料に衝突しないように、顕微鏡のビーム経路に配置されている。
【０００８】
第二の観点において、本発明は、試料を分子分光分析する方法に関し、量子カスケードレーザー（ＱＣＬ）を用いて赤外線（ＩＲ）を試料に対して放射する工程であって、ＩＲ放射は位相変調器と少なくとも１つの光学素子を通して試料に向けられるものである、前記放射する工程と、試料によって反射されたおよび／または試料を透過したＩＲ放射を検出する工程とを有し、位相調整器は、回転自在なＩＲ透過散乱板またはＩＲ放射を反射する回転自在な散乱ミラーであり、検出中連続して回転されることにより、位相変調器の中心部で散乱されるＩＲは試料に対して放射されない。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本発明のＩＲ顕微鏡の概略図である。
【図２Ａ】図２は、ＩＲ放射を試料上で結像させることによる、本発明のＩＲ顕微鏡のビーム経路について種々の実施形態を示す。
【図２Ｂ】図２は、ＩＲ放射を試料上で結像させることによる、本発明のＩＲ顕微鏡のビーム経路について種々の実施形態を示す。
【図２Ｃ】図２は、ＩＲ放射を試料上で結像させることによる、本発明のＩＲ顕微鏡のビーム経路について種々の実施形態を示す。
【図２Ｄ】図２は、ＩＲ放射を試料上で結像させることによる、本発明のＩＲ顕微鏡のビーム経路について種々の実施形態を示す。
【図２Ｅ】図２は、ＩＲ放射を試料上で結像させることによる、本発明のＩＲ顕微鏡のビーム経路について種々の実施形態を示す。
【図２Ｆ】図２は、ＩＲ放射を試料上で結像させることによる、本発明のＩＲ顕微鏡のビーム経路について種々の実施形態を示す。
【図２Ｇ】図２は、ＩＲ放射を試料上で結像させることによる、本発明のＩＲ顕微鏡のビーム経路について種々の実施形態を示す。
【図２Ｈ】図２は、ＩＲ放射を試料上で結像させることによる、本発明のＩＲ顕微鏡のビーム経路について種々の実施形態を示す。
【図２Ｉ】図２は、ＩＲ放射を試料上で結像させることによる、本発明のＩＲ顕微鏡のビーム経路について種々の実施形態を示す。
【図２Ｊ】図２は、ＩＲ放射を試料上で結像させることによる、本発明のＩＲ顕微鏡のビーム経路について種々の実施形態を示す。
【図２Ｋ】図２は、ＩＲ放射を試料上で結像させることによる、本発明のＩＲ顕微鏡のビーム経路について種々の実施形態を示す。
【図２Ｌ】図２は、ＩＲ放射を試料上で結像させることによる、本発明のＩＲ顕微鏡のビーム経路について種々の実施形態を示す。
【図３Ａ】図３は、単一（Ａ）および４倍（Ｂ）の倍率を有する、本発明のＩＲ顕微鏡のビーム経路について種々の実施形態を示す。図Ａの実施形態においては、ＩＲ放射は絞り上で結像する。
【図３Ｂ】図３は、単一（Ａ）および４倍（Ｂ）の倍率を有する、本発明のＩＲ顕微鏡のビーム経路について種々の実施形態を示す。図Ａの実施形態においては、ＩＲ放射は絞り上で結像する。
【図４】図４は、実験１〜４から画素単位で計算されたゼロ吸光ラインのスペクトル標準偏差分布を示す。比較として、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ等、２０１３による全画素の標準偏差の平均値を示す。
【図５】図５は、ランダムに選択された画素のゼロ吸光ライン（Ａ）、ランダムに選択された１０画素（Ｂ）、１０００のゼロ吸光ラインの平均値（Ｃ）、および実験４のデータについて計算された空間二乗平均平方根値（Ｄ）を示す。
【図６】図６は、実験５から画素単位で計算された（自然対数を用いて計算された）スペクトル標準偏差を示す。
【図７】図７は、図６に関して、スペクトル標準偏差と列番号との関係を示す。
【図８】図８は、ＱＣＬの非散乱レーザービームプロファイル、および散乱板または散乱ミラーで散乱させた後のレーザービームプロファイルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
第一態様において、本発明は、試料の分子分光分析用顕微鏡に関しており、該顕微鏡は、赤外線（ＩＲ）放射する少なくとも１つの量子カスケードレーザー（ＱＣＬ）と、ＱＣＬと試料との間に配置された位相変調器と、位相変調器と試料との間に配置された少なくとも１つの光学素子と、試料を透過したおよび／またはそれによって反射されたＩＲ放射を検出するセンサとを有するビーム経路を有している。位相調整器は、回転自在なＩＲ透過散乱板またはＩＲ放射を反射する回転自在な散乱ミラーである。位相変調器は分析中連続して回転し、位相変調器の中心で散乱したＩＲ放射が試料に衝突しないようにして、顕微鏡のビーム経路に配置されているので、各画素の吸収スペクトルのスペクトル標準偏差すなわち測定誤差は大幅に減少する。従って、従来のフーリエ変換（ＦＴ）ＩＲベースシステムの正確度に類似の正確度を有し、しかも測定時間が大幅に短いＱＣＬを用いて、分子分光分析を行うことが可能である。
【００１１】
平均以上の大規模な干渉は、特にビーム経路の光学素子において生じるものであるが、これは通常ＱＣＬの高度な干渉性の結果生じるものである。斯かる干渉の発生は、通常はブランク測定を参照することにより数学的に排除される。しかし、干渉パターンは波長に依存するので、斯かる参照は個々の波長に関して行わなければならない。これは、試料測定と基準測定を各波長について行うことにより、あるいは波長の全範囲について基準測定を記録することにより可能である。各波長について試料測定および基準測定を行うには、試料を各波長についてビーム経路から除去し、その後再びそれを挿入しなければならない。その結果、膨大な時間が費されるだけでなく、試料の位置に関する実質的な不確実性も生じる。しかし、最初に全波長に関してブランク測定を記録しその後全波長に関して再び測定を行う連続参照は、ＱＣＬの技術的条件の故に、目下のところ可能ではない。ＱＣＬが放射する波長の調整は、一般的に、ステッピングモーターにより、外部共振器（リトロー構成）のグリッドの傾きを選択角度範囲に関してまたは段階的に準連続的に傾斜させることにより行われる。この場合、ステッピングモーターの位置決め精度により必ずグリッドの角位置に誤差が生じ、それがレーザーの波長の不正確な調整の原因となる。その結果、ブランク測定を参照することによって純粋に数学的に排除することができない干渉パターンの変動が生じる。
【００１２】
しかし、位相変調器を回転させると、位相変調器の位置の関数であり回転によって変化する特定の干渉パターンすなわちスペックルパターンが生じる。しかし、個々の回転位置に関してそれは一定している。従って、ＩＲ放射の空間干渉性およびその結果の干渉効果は平均時間に関して大幅に減少するので、一定の位相変調および散乱が生じる。
【００１３】
位相変調器は回転自在なＩＲ透過散乱板またはＩＲ放射を反射する回転自在な散乱ミラーであるので、光子は空間の異なる方向に自由に分散される。これは、散乱板または散乱ミラーがＱＣＬに面する側に粗面を有しているからである。均一な位相変移は生じないので、試料に衝突するＩＲ放射は画定された位相を有しない。すなわち、ＩＲ放射のビームは、異なる変調位相で試料に衝突する。
【００１４】
更に、位相変調器の中心は照射から外れているので、試料に衝突する全ＩＲ放射が変調により検出される。自ら回転しない散乱板の中心（経路速度ゼロ）がＩＲ放射に含まれ試料上で結像すれば、試料の個々の点が非変調ＩＲ放射により照射されることになる。斯かる個々の点において、ＱＣＬによって生じる最初の干渉が測定を妨害することになるであろう。それに対し、本発明の顕微鏡で分析した場合、各画素のゼロ吸光ラインは絶対ゼロラインの近くであり、しかもＱＣＬの干渉性の結果他で観察されるような（Ｙｅｈ等、２０１５）実質的な潜在的周期変動は生じない。すなわち、０．０１ａ．ｕ．（吸光度単位）未満のスペクトル標準偏差平均値が達成できる。斯かる特定の測定精度により、吸光度が極めて低く微細な構造を有する複雑な試料、例えば生物学的試料の分子分光分析が可能となる。
【００１５】
更に、測定精度の高度化により、２０μｍ未満の空間分解能による試料のハイパースペクトルイメージングが可能である。これは、例えばＰｈｉｌｌｉｐｓ等、２０１３に記載されているような従来の装置では達成できない。干渉の残留発生およびその結果の信号対雑音比により、小さい吸光度ジャンプの登録が可能ではないからである。しかし、高度な空間分解能は病理組織学的検査においては不可欠な場合が多い。更に、試料に生じるハイパースペクトルイメージングは、固定波長の自動記録に使用されるような、あるいは波長を調整して高空間分解能で測定する場合のような約２０ミリ秒の極めて短い測定時間でさえも、測定時間からは独立している。従って、空間分解能が２０μｍ未満であれば、生物学的試料の赤外線透過の変化を実時間で観察するのが可能である。
【００１６】
ＱＣＬ、位相変調器、少なくとも１つの光学機器、およびセンサが、顕微鏡のビーム経路に前後して配置してあり、ＱＣＬおよびセンサが、ビーム経路の開始または末端を形成する（図１、３Ｂ）。レーザービームを拡大して試料を照明するには、少なくとも１つの光学素子を使用するのが好ましい。更に、追加の顕微鏡要素、特に複数の光学素子をビーム経路に配列してもよい。例えば、回転する位相変調器を振動減衰要素によって顕微鏡の残りのコンポーネントから切り離せる程度に、位相変調器と試料を空間的に相互に分離してもよい。更に、照明プロファイルを種々の顕微鏡要件、例えば異なる拡大段階に適合させてもよい。更に、顕微鏡の構造次第であるが、分析は透過、反射、または半透過によって行ってもよい（図２）。半透過の測定に関しては、ＩＲ放射を反射するオブジェクトキャリアに試料をあてがえば、試料を通過した放射は該オブジェクトキャリアで反射され、再び試料を通過した後、反射測定により検出される。
【００１７】
ＱＣＬはＩＲ放射をパルス状で行ってもよいし、連続的に行ってもよい。本発明の顕微鏡においては、パルス状のＩＲ放射と連続的ＩＲ放射の両方が使用可能である。
【００１８】
本発明の顕微鏡によれば、数多くの画素、例えば約３０万画素が並列（イメージング）で測定される。従って、ポイントフォーポイントマッピングよりも速い分析が可能である。本発明の顕微鏡に適したセンサ例えばマイクロボロメータでは、約１０００画素から約１３０万画素の並列測定が現在可能であり、更に多いフォーマットが開発されつつある。
【００１９】
好ましい実施形態によれば、顕微鏡は高視野顕微鏡である。高視野顕微鏡によれば、画像セクションは比較的大きく、多くの干渉を含んでいる。回転する位相変調器を使用すれば、斯かる干渉の発生は数学的に最小化および排除可能である。
【００２０】
好ましい実施形態によれば、試料は非染色の試料であり、好ましくは非染色の組織試料である。本発明の顕微鏡は、試料に固有の生化学的性質に基づく試料の検査、すなわちそのＩＲ透過または反射に基づく試料の検査に特に適している。試料のＩＲ透過または反射はその生化学的組成に直接依存しているので、例えば細胞用染料または抗体による試料の染色は不要である。その結果、操作工程および操作時間が大幅に節約できる。これは操作を伴う分析の場合には特に重要である。操作は可能な限り、外部操作工程によって拡張されるべきではないからである。
【００２１】
位相変調器の中心で散乱されたＩＲ放射が試料に衝突しない状態を達成するため、顕微鏡またはそのビーム経路は、異なるやり方での適合が可能である。好ましい実施形態では、位相変調器は、位相変調器の中心がＩＲ放射に含まれないようなやり方で、顕微鏡のビーム経路に配置されている。従って、位相変調器の中心で散乱されるＩＲ放射は一切生成されない。
【００２２】
別の実施形態によれば、ビーム経路は、位相変調器の中心の背後および試料の前方に配置された覆いを有しており、該覆いは、位相変調器の中心で散乱されたＩＲ放射をブロックする。
【００２３】
別の実施形態によれば、ビーム経路は位相変調器と試料との間に配置されたレンズ構成を有しており、該レンズ構成は、位相変調器の中心の外側で散乱するＩＲ放射だけを試料に向ける。
【００２４】
好ましい実施形態によれば、位相変調器の表面の内側３分の１で散乱するＩＲ放射は試料に一切衝突しない。斯かる目的のため、位相変調器の表面の内側３分の１の外側領域だけがＩＲ放射に含まれるのが好ましい。位相変調器の中心では経路速度はゼロに等しいので、位相変調器の回転（中心）の中心部では、位相変調が全く生じない。経路速度は外側に向かって連続的に増大する。従って、中心の近くでは緩慢な位相変調のみが生成される。しかし、経路速度が最高に達する位相変調器の縁領域では、それに対応したより速い位相変調が生じる。特に好ましい実施形態では、位相変調器の表面の外側３分の１で散乱したＩＲ放射だけが試料に衝突する。斯かる目的のため、位相変調器の表面の内側３分の２の外側にある領域だけがＩＲ放射に含まれるのが好ましい。
【００２５】
好ましい実施形態では、位相変調器の中心から少なくとも１ｍｍ、好ましくは少なくとも２ｍｍ、更に好ましくは少なくとも５ｍｍ、更に好ましくは少なくとも１０ｍｍ、更に好ましくは少なくとも２０ｍｍの領域で散乱したＩＲ放射は一切試料に衝突しない。これは、位相変調器の中心から少なくとも１ｍｍ、好ましくは少なくとも２ｍｍ、更に好ましくは少なくとも５ｍｍ、更に好ましくは少なくとも１０ｍｍ、更に好ましくは少なくとも２０ｍｍ外側にある領域だけがＩＲ放射に含まれることにより達成されるのが好ましい。位相変調器をガウシアン赤外線ビームで照明する場合、位相変調器の中心から少なくとも１ｍｍ、好ましくは少なくとも２ｍｍ、更に好ましくは少なくとも５ｍｍ、更に好ましくは少なくとも１０ｍｍ、更に好ましくは少なくとも２０ｍｍ外側にある位相変調器の領域に、赤外線ビームのビーム中心が衝突するのが好ましい。位相変調器の中心近傍は、緩慢な位相変調しか生成されない。位相変調器の中心からの距離が大きければ大きいほど経路速度は増大し、それに対応したより速い位相変調が生じる。
【００２６】
好ましい実施形態では、ＱＣＬはＩＲ放射をレーザービーム形態で行い、位相変調器への衝撃点における斯かるビームの直径は、位相変調器の半径よりも小さい。従って、位相変調器の中心の外側領域にレーザービームを選択的に向けることが可能であり、しかも位相変調器の手段により、それを試料上に完全に結像できる。斯かる目的のため、例えば、レーザービームに対応してそれよりも大きい直径を有する位相変調器を使用してもよい。あるいは、位相変調器の位置に対応してそれよりも小さい直径を有するように、光学素子を用いてＱＣＬビームを位相変調器に集束させてもよい。
【００２７】
特に好ましい実施形態では、レーザービームの直径は、位相変調器の衝撃点において、位相変調器の半径の８０％以下、好ましくは７０％以下である。従って、位相変調器の表面の内側３分の１よりも外側の領域にビームを精確に向けることができる。位相変調器の半径が例えば２５．４ｍｍの場合、位相変調器の中心を照明することなく、１０ｍｍ未満の直径を有するＱＣＬビームをその縁領域に向けることができる。
【００２８】
好ましい実施形態では、顕微鏡は少なくとも２つ、好ましくは３つ、更に好ましくは４つのＱＣＬを有する。ＱＣＬは中赤外線あるいは遠赤外線を生成する半導体レーザーである。放射は画定された波長範囲（一般的に１ｃｍ−１から２ｃｍ−１）に固定してもよいし、調整により変化させてもよい。特に、外部共振器のＱＣＬは調整に適しており（外部共振器型量子カスケードレーザー／ＥＣ−ＱＣＬ）、一般的に数百ｃｍ−１の幅を有するスペクトル範囲をカバーする。斯かるＱＣＬにより、ＩＲスペクトルの更に大きい部分が記録される。分子分光分析の種類次第であるが、１つまたはそれ以上のＱＣＬが使用できる。ある状況下では、僅かの数、例えば僅か２つの異なる波長の記録が、生物学的試料の分析にとって十分な場合もある。帯域幅次第であるが、斯かる目的に１つまたは２つのＱＣＬが使用でき、従って、比較的迅速な測定が可能である。しかし、より広いスペクトル範囲をカバーする場合には、調整可能なＱＣＬを１若しくはそれ以上連続的に使用してもよい。
【００２９】
好ましい実施形態では、ＱＣＬは外部共振器型ＱＣＬ（ＥＣ−ＱＣＬ）である。斯かるＱＣＬは、高輝度および高スペクトルエネルギー密度で特徴付けられる。更に、比較的広い波長範囲に調整可能である。従って、広いスペクトル範囲を記録し迅速で比較的高分解能のＩＲ測定を行うには、ＥＣ−ＱＣＬが特に好ましい。
【００３０】
好ましい実施形態では、分析中ＱＣＬは継続的に調整される。本発明による位相変調器の使用は、基準測定および試料測定が全波長範囲にわたって別々に記録されるのを可能にする。その結果、１つには基準測定のため、もう１つには試料測定のために、ＩＲスペクトルの連続部分が記録できる。組織の化学組成および生物学的組成に関する詳細な情報を入手するのにスペクトルの広い範囲を記録しなければならない場合、これは特に有利である。
【００３１】
好ましい実施形態では、ＱＣＬは分析中、５ｃｍ−１／ｓから３０ｃｍ−１／ｓの速度で、好ましくは１０ｃｍ−１／ｓから２０ｃｍ−１／ｓの速度で、更に好ましくは約１０ｃｍ−１／ｓの速度で調整される。干渉のない結果を得るには、調整は必要な限り迅速に、そして可能な限りゆっくりと実行されるべきである。その場合、最低速度は望ましいスペクトル分解能によって決定される。例えば、４波数の分解能を有するのが望ましい場合、２波数毎に独立した測定点を有する必要がある。１秒間に１０波数の調整速度の場合、０．２秒毎に独立した測定点が含まれることをこれは意味する。センサ速度に従えば、試料の分光再生にこれは十分であろう。例えば、５０Ｈｚのフレームレートを有するマイクロボロメータカメラは、０．２秒間に１０画像を記録できる。その後、斯かる画像について結果を平均できる。しかしフレームレートが５Ｈｚしかないカメラの場合は、０．２秒に１つの画像しか記録できないので、より遅い調整速度が好ましい。反対に、ＭＣＴ−ＦＰＡ検出器のフレームレートはキロヘルツの範囲なので、その場合、位相変調器の回転速度が最高調整速度を決定する。平均時間中に独立の照明プロファイルを得るには、各測定に関して、位相変調器の回転は少なくとも１回でなければならない。従って、例えば、回転速度が１０００Ｈｚの場合、検出器のフレームレートが可能であれば、理論的には、ミリ秒毎に新しい独立の測定点を含み得ることになる。独立の測定点が２波数毎に生成されるように意図されている場合、レーザーはミリ秒当たり２波数すなわち毎秒２０００波数で調整可能である。
【００３２】
好ましい実施形態では、ＱＣＬが発するＩＲ放射は５μｍから１２．５μｍの範囲にある。これは８００ｃｍ−１から２０００ｃｍ−１の波数に対応しており、生物学的情報の大半を含むＩＲ放射スペクトル範囲を網羅している。加えて、約２．７μｍから３．７μｍの波長範囲（約３０００波数に対応）の脂質も検出可能である。測定は、例えば、個々の固定レーザーモジュールに基づいて実施可能であり、組織試料の詳細な再生にとっては、２つの独立した波長の測定で十分である。斯かる測定は、波長次第であるが１つまたは２つのＱＣＬで行うことができるので、特に費用対効果が高い。測定は、調整可能レーザーを用いて個々に選択された波長でも実施でき、その場合、記録されるべき画像数はより広いスペクトルに対して大幅に減少し、従って分析は加速される。
【００３３】
好ましい実施形態では、センサは温度センサであり、マイクロボロメータであるのが好ましい。顕微鏡に本発明の位相変調器を使用することにより、検出速度および使用されるセンサの感度とは独立にＱＣＬを使用できる。ＱＣＬの干渉性により生じる測定誤差を減少させるため、窒素冷却の高感度かつ迅速なＭＣＦ−ＦＰＡを用いた実験が過去に行われたことがある。しかし、該機器は非常に高価である。更に、ＱＣＬを使用する際の系統的測定誤差はＭＣＦ−ＦＰＡによっては完全に補正できないので、個々の画素のゼロ吸光ラインは絶対ゼロラインの周りで大きく変動する（Ｙｅｈ等、２０１５）。しかし、位相変調器の中心がＱＣＬによる照明から外れている回転位相変調器を使用すれば、比較的遅い熱検出器（例えば時定数が５マイクロ秒超の検出器）でさえも、特異性の高い測定が可能である。
【００３４】
特に、焦電検出器およびマイクロボロメータは、遅い速度の故に従来のＦＴ−ＩＲ測定には使用できない温度センサであると考え得る。特に、非冷却マイクロボロメータの使用が可能であり、いわゆる「焦点面アレイ」（ＦＰＡ）の形態のマイクロボロメータが好ましい。マイクロボロメータＦＰＡ検出器は、エネルギー集約的冷却や維持用の真空ポンプを必要としないので、取得の面でも操作面でも費用対効果が比較的高い。しかし、該検出器には特にＱＣＬ使用の場合いくつかの欠点があり、それが分子分光分析における該検出器の使用をこれまで妨げてきた。マイクロボロメータＦＰＡ検出器は画素の加熱を通して入射ＩＲ放射を測定するが、それには電気抵抗の変化を伴う。ＭＣＴ−ＦＰＡ検出器と比較すると、時定数の面で、該検出器は７ミリ秒から１０ミリ秒の範囲で相対的に遅い。従って、迅速マイクロボロメータＦＰＡでさえ、一般的に、現在５０Ｈｚまでに限定されている。更に、画素は商業用のマイクロボロメータでは直接得ることができず、斯かる理由により、フレームレート５０ＨｚのマイクロボロメータＦＰＡ検出器の場合には、該当する場合、画像は「望ましい取得時間」よりも２ミリ秒から５ミリ秒遅れて記録される。しかし、斯かる最小の遅延でも、ＱＣＬの位相連続調整中に干渉像のシーケンスを変化させるのに十分であり、従って、単一のブランク測定を参照することによる従来の数学的な干渉補正には誤差が生じやすい。これは、本発明の位相変調器を使用する場合には生じない。更に、本発明の顕微鏡の構造によれば、マイクロボロメータＦＰＡの比較的大きい表面を完全に使用できる。斯かる目的のため、１００ｍｍ２を超えることもあるマイクロボロメータＦＰＡの表面を完全に均一な状態で照明する必要がある。ＱＣＬの使用中には干渉がとても生じやすいので、位相変調器を使用しなければこれは可能ではない。更に、ＱＣＬおよび位相変調器の使用による測定時間の減少は、マイクロボロメータＦＰＡ検出器の使用の成功に実質的に寄与するものである。検出器は非冷却であるので、その廃熱は検査対象の試料に反射されセンサにより信号として感知され得る（いわゆるナルキッソス効果）。しかし、記録中のセンサの温度変化は、測定時間の長さに伴って誤差も増大するという限定はあるが、数学的に排除可能である。
【００３５】
好ましい実施形態では、マイクロボロメータは３０Ｈｚから６０Ｈｚ、好ましくは４０Ｈｚから６０Ｈｚ，更に好ましくは約５０Ｈｚのフレームレートを有する。従来のボロメータ画素要素の熱時定数は大体７ミリ秒から１０ミリ秒である。従って、大体３０Ｈｚから５０Ｈｚのフレームレートが可能である。斯かるフレームレートは、試料を精確かつ詳細に並びに信頼を持って再生するのに適している。
【００３６】
好ましい実施形態では、位相変調器の面法線は回転軸に平行である。従って、回転位相に依存するビームオフセットが生じることもないし、基準測定および試料測定に異なって影響を及ぼし測定誤差を生むということもない。
【００３７】
これは、位相変調器の回転速度が比較的遅い場合には特に有利である。
【００３８】
位相変調器は、回転自在なＩＲ透過散乱板またはＩＲ放射を反射する回転自在な散乱ミラーである。本発明の顕微鏡の構成に散乱板を使用するか散乱ミラーを使用するかにより、顕微鏡のビーム経路は異なってくる。従って、ＱＣＬのＩＲ放射は散乱板および少なくとも１つの光学素子を通過して試料上に至るが、散乱ミラーはＱＣＬの放射を反射し、それから該放射を少なくとも１つの光学素子を通して試料上に向ける。ＩＲ透過散乱板は、珪素、ゲルマニウム、ＫＲＳ６タリウムブロモクロリド、赤外線を透過する非晶材料（ＡＭＴＩＲ），フッ化バリウム、フッ化カルシウム、ハロゲン化銀（臭化銀、塩化銀）、セレン化亜鉛、硫化亜鉛、ダイアモンド、または臭化カルシウムを有するのが好ましい。斯かる素材の表面には、例えばフォトリソグラフィまたは等方性ウェットエッチングにより緻密な均質構造が形成できるので、画像フィールドの各画素における位相変調器上の散乱は、固定時間中、平均して同一である。従って、測定間の分散は減少する。ＩＲ放射を反射する、考慮の対象となり得る散乱ミラーには、金ミラー（特に中赤外線で好ましい）および銀ミラーの両方が含まれる。更に、珪素、ゲルマニウム等、特に高い屈折率を有する素材も使用し得る。
【００３９】
好ましい実施形態では、散乱板を透過するまたは散乱ミラーで反射されるＩＲ放射の角分布の幅は、少なくとも１°、好ましくは少なくとも２°、更に好ましくは少なくとも５°、更に好ましくは少なくとも８°、更に好ましくは少なくとも１０°、更に好ましくは少なくとも１２°、更に好ましくは少なくとも１５°である。
【００４０】
角分布とは、空間において異なる方向に放射を分布することを言う。ＩＲ放射の角分布は、散乱板または散乱ミラーによって変えられる（図８）。ＱＣＬのＩＲ放射は、散乱板または散乱ミラーに衝突する前は、狭い角分布を有する（図８のレーザービームプロファイル）。散乱板または散乱ミラーによって散乱が生じ、その結果、ＩＲ放射の角分布が拡張される（図８の散乱レーザー光）。散乱板を透過するまたは散乱ミラーで反射されるＩＲ放射の角分布の幅が大きくなる結果、無秩序な位相変調が達成される。
【００４１】
好ましい実施形態では、散乱板は粗面処理した珪素板である。
【００４２】
好ましい実施形態では、位相変調器はＱＣＬに面する側に構造化表面を有する。ＱＣＬの方向に向いている表面を構造化することにより、レーザービームが直接反射されてレーザー源に損傷を与えると言うような事態は決して生じない。構造化表面は、例えば、化学エッチングまたはサンドブラストにより形成できる。斯かる処理操作は、特にレーザービームの出口と散乱板との間の距離が少なくとも１ｍある場合、一般的に、レーザー源を確実に保護するのに十分である。
【００４３】
好ましい実施形態では、位相変調器は、ＱＣＬの放射に対して少なくとも０．５°の角度に位置付けられている。放射源へのＱＣＬの反射を防止するため、位相変調器はレーザービームに対して斜めの位置へ移動してもよい。斜め配置は、位相変調器の表面構造化の代わりに用いてもよいし、あるいはそれと一緒に用いてもよい。あるいは、放射源を保護するのにファラデーアイソレータを用いてもよい。
【００４４】
好ましい実施形態では、位相変調器はセンサのフレームレートよりも少なくとも５％、好ましくは少なくとも８％速い速度で回転する。センサのフレームレートよりも少なくとも５％速い速度で連続的に位相変調器を回転させることにより、各画素の吸収スペクトルのスペクトル標準偏差が更に減少し、従って、測定精度が更に増大することを本発明者達は確立している。センサのフレームレートと比較して位相変調器の回転速度を速くすることにより、平均時間中のＩＲ放射の空間干渉性が、特に迅速かつ同時に減少する。従って、一般的に、高いレベルの測定精度が短い測定時間で可能となる。操作を伴う生物学的試料の分析にとって、これは特に重要である。
【００４５】
例えば、５０Ｈｚのフレームレートを有するセンサは、０．２秒で１０の画像を記録する。斯かる画像の結果は後に平均し得る。センサのフレームレート５０Ｈｚにおける位相変調器の回転速度は少なくとも５２．５Ｈｚである。５Ｈｚのフレームレートを有するセンサの場合、位相変調器の回転速度は少なくとも５．２５Ｈｚである。
【００４６】
特に好ましい実施形態では、位相変調器は、センサのフレームレートの少なくとも１５％、好ましくは少なくとも２０％速い速度で回転する。従って、測定誤差は更に減少する。例えば、センサのフレームレート５０Ｈｚ並びに位相変調器の回転速度６０Ｈｚにおいて、本発明者達は、各画素の吸収スペクトルのスペクトル標準偏差を大幅に減少できた。センサのフレームレート５０Ｈｚに対する位相変調器の回転速度６２．５Ｈｚでも、極めて正確な測定結果を提供している。
【００４７】
好ましい実施形態では、位相変調器は少なくとも１０Ｈｚ、好ましくは少なくとも２０Ｈｚ、更に好ましくは少なくとも３０Ｈｚ、更に好ましくは少なくとも５０Ｈｚ、更に好ましくは少なくとも５０Ｈｚから２００Ｈｚの速度で回転する。最小測定時間を得るには、位相変調器および散乱は測定点において可能な限り一定であるべきである。そうすることにより、複数の測定が行われ、それが各波長に関して統合され、その結果、測定時間が実質的に増大するというような事態が防止される。測定点に関して十分一定した位相変調を得るには、測定中の位相変調器の回転は少なくとも１回必要である。顕微鏡の構成によって、例えば、最大直径が２インチで最高速度が２００Ｈｚの位相変調器の使用が可能である。位相変調器のサイズ次第であるが、平均時間中の空間干渉性を最小にするため、回転速度の遅い位相変調器の縁領域において十分速い経路速度を得ることも可能である。特に均質で干渉のないハイパースペクトル画像を得るには、経路速度が５ｍ／ｓから３５ｍ／ｓであれば特に有利であることが分かっている。毎秒３０ｃｍ−１までの調整速度および空間分解能２ｃｍ−１（独立測定点当たり約３０ミリ秒）で測定するには、５０Ｈｚと１００Ｈｚの間の回転速度で十分である。従って、特に好ましい実施形態では、位相変調器は５０Ｈｚから１００Ｈｚの速度で回転する。ＱＣＬが例えば毎秒１０ｃｍ−１で調整され、独立測定点が１ｃｍ−１毎に利用可能であれば、位相変調と散乱は平均０．１秒の時間範囲で同等でなければならない。回転速度５０Ｈｚの場合、これは位相変調器の５回転に相当するので、正確な測定が可能である。
【００４８】
別の実施形態では、位相変調器は少なくとも５０Ｈｚ、好ましくは少なくとも５４Ｈｚ、更に好ましくは少なくとも６０Ｈｚ、更に好ましくは６０Ｈｚから２００Ｈｚ、更に好ましくは８０Ｈｚから１８０Ｈｚ，更に好ましくは１００Ｈｚから１５０Ｈｚの速度で回転する。
【００４９】
特に好ましい実施形態では、位相変調器の回転速度はセンサのフレームレートの整数倍または半整数倍ではない。すなわち、位相変調器はｎ＝ｘ＊ｍ（ここでｍはセンサのフレームレート、ｘは全自然数を除く（正）の実数）の回転速度（ｎ）で回転する。特に比較的長い測定時間においては、位相変調器とセンサによって記録される画像との間に位相変移が生じる。特にこのリスクは、特に遅いフレームレートを有する温度センサが一定の機能を果たさない場合に生じる。位相変移は測定誤差の原因となり、結果にマイナスの影響を及ぼしかねない。斯かる場合、位相変調器の回転速度は、検出器のフレームレートの整数倍または半整数倍であるべきである。しかし、検出器が非常に一定した速いフレームレートで機能するならば（例えば、ＭＣＴ−ＦＰＡ）、位相変調器の回転には対応する制限は必要ではない。更に、比較的遅い検出器（例えばマイクロボロメータ）の場合、個々の測定時間の長さを短くすることによっても（０．５秒未満に短縮するのが好ましい）、位相変移の問題は回避できる。これは、とりわけ、全スペクトルを記録するのではなく、個々の波長のみを検出することによって達成できる。５０Ｈｚのフレームレートの単一の検出器を用いて単一の波長で１９の画像を記録するのに、０．３８秒しか必要ではない。斯かる短い測定時間においては、検出と位相を同じくする位相変調器の回転が可能であるだけでなく、目標とする最高レベルの測定精度が達成できるので、これは有利でもある。
【００５０】
好ましい実施形態では、試料と検出器の両方が完全かつ均質に照明されるように、少なくとも１つの光学素子が構築される。この場合、対物レンズの受光角が完全に照明され試料から出るＩＲ放射の検出ができるように、該少なくとも１つの光学素子は位相変調器と試料との間に位置付けられるのが好ましい。
【００５１】
好ましい実施形態では、該少なくとも１つの光学素子は、コンデンサの焦点面に位置する絞り上にＩＲ放射が結像するように構築される。ケラー照明に対応するこの構成により、並外れて均質で干渉のないハイパースペクトル画像が生成されるので、特に正確な試料の再生が可能となる。
【００５２】
代替実施形態において、該少なくとも１つの光学素子は、ＩＲ放射で照明された位相変調器の領域が試料上に結像されるように構築される。ＩＲ放射で照明された位相変調器の領域が試料上に直接結像される場合、結像は０．７から１．３の比率、好ましくは０．８から１．２の比率、更に好ましくは約１の比率であるのが有利である。放射スポットが位相変調器からの放射によって約１対１で試料上に結像するならば、試料は完全かつ均質に照明されるので、干渉の形成すなわち測定誤差が減少する。
【００５３】
好ましい実施形態では、顕微鏡は、ＱＣＬと位相変調器との間に配置される追加の光学素子を少なくとも１つ有する。該追加の光学素子は、例えば、拡大したレーザービームの並列化をもたらす。
【００５４】
位相変調器上の照明スポットの大きさを調節するため、位置調節が可能な光学素子をＱＣＬと位相変調器との間に配置してもよい。位相変調器に対して光学素子の位置をシフトすることにより位相変調器上の照明スポットの大きさを調節できるが、その場合、該追加の光学素子は、検出に使用される対物レンズの受光角が完全に照明されるように位置付けられるのが好ましい。  
好ましい実施形態では、各光学素子は互いに独立したレンズまたは対物レンズである。
【００５５】
好ましい実施形態では、各レンズは、互いに独立して、セレン化亜鉛、硫化亜鉛、珪素、ゲルマニウム、塩化ナトリウム、塩化バリウム、フッ化カルシウム、臭化カリウム、ハロゲン化銀（臭化銀／塩化銀）、ＫＲＳ６タリウムブロモクロリド、赤外線を透過する非晶材料（ＡＭＴＩＲ）、およびダイアモンドから成る群から選択される材料を有する。ＱＣＬのＩＲ放射の波長に基づいて、異なる材料を使用するのが有利な場合がある。例えば、セレン化亜鉛は特に広いスペクトルを記録するのにとりわけ適している。顕微鏡は複数の異なるレンズを有してもよい。従って、位相変調器の放射スポットを試料上に結像するのに、複数の個々のレンズ（例えば図２を参照）またはミラー対物レンズを使用し得る。
【００５６】
好ましい実施形態では、顕微鏡は第二の静的位相変調器を有する。この第二の位相変調器は、回転する位相変調器の下流側のビーム経路に配置される、すなわちＱＣＬの光がまず回転する位相変調器に入り、その後、静的位相変調器に入るように配置されるのが好ましい。静的位相変調器は、回転しないという点で第一の位相変調器とは異なる。第二の位相変調器を使用することにより、回転する位相変調器によって生じる回転アーチファクト（「渦巻パターン」）が大幅に減少し、その結果、ＱＣＬレーザーの空間干渉性が平均時間中に更に減少する。従って、追加の静的位相変調器を使用すると、回転する位相変調器の回転速度が遅くても、干渉を大幅に減少させるのに十分である。ＱＣＬを例えば毎秒僅か約２ｃｍ−１で調整する場合、１ｃｍ−１毎すなわち半秒毎に、望ましい空間分解能２ｃｍ−１用に独立測定点を記録しなければならない。回転する散乱板の回転速度が遅い場合、２つの位相変調器を使用することにより、位相変調器と散乱は平均時間中０．５秒間同等であるので、２Ｈｚの回転周波数すなわち測定点当たりの位相変調器の完全な回転は、信頼できる測定を行うのに既に十分である。その結果、回転する位相変調器のベアリングの摩耗が減少するだけでなく、費用対効果が実質的により高いボールサポート位相変調器の使用も可能となる。  
好ましい実施形態では、顕微鏡は参照用の装置を有する。参照により、測定中のレーザーパワーおよび波長の制御が可能となる。それは例えば、位相依存干渉計またはスペクトル測定範囲で吸収するガス（例えばエタノール）で満たされた耐熱性のガスセルによって行われてもよい。
【００５７】
好ましい実施形態では、位相変調器は、精確に支持された回転軸上に据え付けられる。従って、位相変調器の精確な位置づけが実現し、連続的な干渉パターンの再現性ある生成が可能である。例えば、回転軸の精密な軸受には、平軸受、ころ軸受、玉軸受、アンギュラ玉軸受、４点玉軸受、トロイダルころ軸受、球面ころ軸受、針軸受、円筒ころ軸受、自動調心玉軸受、自動調心ころ軸受、玉ころ軸受、円錐ころ軸受、深溝玉軸受、ハイブリッド軸受、クロニドールころ軸受、空気軸受、静圧平軸受、動圧平軸受、または磁気軸受が適している。斯かる軸受は位相変調器の高回転速度に耐えられる。しかし、位相変調器の高回転速度に適さない軸受が使用された場合、短時間内に該軸受への損傷が生じる。
【００５８】
アンギュラ玉軸受の中では、スピンドル軸受が好ましい。
【００５９】
好ましい玉軸受は、窒化珪素（セラミック素材）を含むローラー要素と、スチールを含む軸受リングとを有するハイブリッド軸受である。斯かる軸受はハイブリッドセラミック軸受とも呼ばれる。
【００６０】
複数の軸受の組み合わせ、例えば、固定軸受が軸を軸方向に導き、固定および可動軸受が軸を半径方向に支持する固定／可動軸受などが好ましい。
【００６１】
好ましい実施形態では、回転軸は高速軸受で支持されている。高速軸受は長時間にわたって一定の回転速度を可能にするので、高回転速度の位相変調器において有利であり、特に測定時間が長い場合に有利である。他の軸受を使用する場合、時間の経過に伴い軸受が加熱されることにより減速する場合がしばしば生じるので、長時間使用する場合、位相変調器の回転速度が十分一定しないリスクがある。従って、そういう軸受は長時間測定には適していない。更に、高速軸受の耐用年数は数年なので、本発明者達は斯かる軸受が故障するのを今まで観察したことがない。高速軸受の耐用年数が長いので、顕微鏡の保守点検の複雑性は減少する。
【００６２】
好ましい実施形態では、回転軸は高速軸受を有する固定／可動軸受で支持される。従って、回転軸の加熱中に軸受が損傷を受けるようなことはない。高回転速度の位相変調器の場合、これは有利である。あるいは、相互隣接軸受およびフローティングベアリングを用いた配列も回転軸の軸受として使用可能であり、それを用いた測定も成功している。
【００６３】
非密封軸受を使用すると、高速操作中の軸受の耐用年数は数日に限定される。従って、好ましい実施形態では、軸受は両側が密封された潤滑済み軸受である。
【００６４】
ハイブリッドセラミック軸受、特に密封されたハイブリッドセラミック軸受は、位相変調器を高回転速度で使用する場合に長い耐用年数を有しており、特に好ましい。従って、顕微鏡の保守点検の複雑性が減少する。
【００６５】
位相変調器は、連続操作中、廃熱と摩擦損失との間にバランスが生じるまで数時間加熱される。バランスが生じると、位相変調器の温度は約８０℃で安定する。ハイブリッドセラミック軸受は、斯かる高操作温度に連続して耐えることができる。他の軸受を使用する場合、約８０℃の操作温度で定期的に交換しなければならないので、長時間測定には温度管理が必要である。
【００６６】
位相変調器を位置付けするための回転自在な軸は、例えば、ベルト、Ｖ−ベルト、圧縮空気、空気タービン駆動または歯車により、電磁的に駆動できる。
【００６７】
好ましい実施形態では、本発明の顕微鏡は温度制御機能を有している。位相変調器を回転する装置の温度が十分低いままであれば、回転軸の軸受の耐用年数は特に長い。赤外線分光によって試料の化学組成を確立するには、検査対象のスペクトル範囲および試料サイズ次第ではあるが、数時間かかる場合がある。更に、考え得る大量処理アプリケーションも存在しており、その場合、赤外線顕微鏡は連続操作において数日以上使用される。位相変調器を高回転速度で連続して回転させると、回転軸は、顕微鏡の操作中に、摩擦および／または電力損失により加熱される。従って、温度制御が重要である。温度制御を行うことにより、位相変調器を回転させる装置の温度変動により生じる顕微鏡の測定信号の変動は防止される。従って、特に長時間測定中、測定精度は増大する。
【００６８】
温度制御は、例えば、位相変調器を回転させる装置を水冷却を有する冷却回路に連結することにより行える。
【００６９】
温度制御の結果、連続操作であっても、顕微鏡コンポーネント特に位相変調器を回転させる装置のコンポーネントに損傷を全く与えない温度で、当該位相変調器を回転させる装置を更に調整できる。従って、位相変調器を回転させる装置の耐用年数は延び、顕微鏡の保守点検の複雑性も減少する。
【００７０】
好ましい実施形態では、温度制御は受動ラビリンス空冷により行われる。斯かる目的に使用されるパージ用の空気は、ＦＴＩＲ「パージガス」発生器によって供給される乾燥圧縮空気に対応しているのが好ましい。従って、乾燥圧縮空気が赤外線顕微鏡に供給されるが、これは同時に、変動する気湿が測定に及ぼす影響を最小化するのにも有利である。パージ用の空気としては窒素または酸素も適している。
【００７１】
好ましい実施形態では、位相変調器を位置付けするための軸および位相変調器を方向付けする装置は、何らの不均衡なしに回転軸に対して回転する。これは、例えば、回転対象な構造形式により達成できるであろう。不均衡が回避されなければ、回転する位相変調器による顕微鏡への機械的荷重が明確に確認できるであろう。顕微鏡は振動を開始し、それが高倍率において試料の震えとして明白になるであろう。その結果、光学分解能は減少する。不均衡を回避することにより、顕微鏡による測定に及ぼす斯かる望ましくない機械的影響は最小化される。更に、使用される軸受の耐用年数も延長する。
【００７２】
好ましい実施形態では、顕微鏡は位相変調器の回転周波数の範囲には固有周波数を有しておらず、その代り振動減衰特性を有している。従って、回転する位相変調器による顕微鏡を用いる測定への機械的影響は更に減少する。
【００７３】
好ましい実施形態では、位相変調器を位置付けするための軸と位相変調器の駆動軸は同一である。従って、位相変調器を回転させる装置の構造形式は減少する。特に好ましい実施形態では、軸は中空軸であり、その中を赤外線放射が行われることにより、顕微鏡の試料を照明する。
【００７４】
別の態様において、本発明は試料の分子分光分析方法に関し、量子カスケードレーザー（ＱＣＬ）を用いて赤外線（ＩＲ）を前記試料に対して放射する工程であって、ＩＲ放射が位相変調器と少なくとも１つの光学素子を通して試料に向けられる工程と、試料によって反射されたおよび／またはそれを透過したＩＲ放射を検出する工程とを有する。位相調整器は、回転自在なＩＲ透過散乱板またはＩＲ放射を反射する回転自在な散乱ミラーである。位相変調器は検出中連続して回転され、位相変調器の中心で散乱されるＩＲ放射は試料には全く向けられないので、複雑な試料の分子分光分析にＱＣＬを使用するのが可能となる。従来の方法と比較して、高分解能で正確な測定が極めて短時間で実施可能である。類似の分解能を有するＦＴ−ＩＲ測定には数分から数時間必要であるが、本発明の方法を用いる分析は数秒でそれを完結できる。ＱＣＬを迅速ＭＣＴ−ＦＰＡと一緒に使用する測定ではＦＴ−ＩＲシステムよりも短時間で測定が可能であるが、位相変調がなければ、複雑な試料を高信頼度で分析するのに、極端に大きい測定誤差が生じる（Ｙｅｈ等、２０１５）。
【００７５】
位相変調器の中心で散乱するＩＲ放射が試料に向けられない状況を達成するのに、種々の方法が採用可能である。好ましい実施形態では、位相変調器の中心はＩＲ放射には含まれない。従って、位相変調器の中心で散乱するＩＲ放射は全く生じない。
【００７６】
別の実施形態では、ＩＲ放射は位相変調器の中心の下流側に配置される覆いを通して試料に向けられ、該覆いが位相変調器の中心で散乱するＩＲ放射をブロックする。
【００７７】
別の実施形態では、ＩＲ放射は位相変調器と試料との間に配置されるレンズ配列を通して試料に向けられ、該レンズ配列が、位相変調器の中心の外側で散乱したＩＲ放射だけを試料に向けるようにする。
【００７８】
好ましい実施形態では、透過したおよび／または反射したＩＲ放射のうち少なくとも２つ、好ましくは２から１０、更に好ましくは２から６、更に好ましくは２から４の異なる波長が検出される。生物学的試料の分析には、組織構造、特に細胞の位置および状態を撮像するのに、２つの異なる波長の記録があれば十分である。全スペクトルを分析する代わりに、僅かな数の個々の波長の画像を記録できるので、記録時間は大幅に減少する。例えば、センサのフレームレート５０Ｈｚ並びに波長当たり１９の画像を記録する場合、２つの異なる波長で測定するのにかかる時間は僅か２．５秒である。
【００７９】
好ましい実施形態では、ＩＲ放射は１ｃｍ−１から８ｃｍ−１、好ましくは２ｃｍ−１から８ｃｍ−１、更に好ましくは４ｃｍ−１から８ｃｍ−１の空間分解能で検出される。スペクトルを複数の波長に関して記録する場合、１ｃｍ−１から８ｃｍ−１の分解能が好ましい。ＱＣＬのスペクトル線幅は０．５ｃｍ−１なので、１ｃｍ−１未満の分解能は一般的に可能ではない。従って、線幅がスペクトル分解能の下限である。しかし、試料次第であるが、分解能が低くても適切な場合があり、その場合、記録速度は増大する。例えば、生物学的試料は、ＩＲスペクトルにおいて、高分解能を要求する特定の性質は通常有さない。従って、生物学的試料においては、４ｃｍ−１から８ｃｍ−１の分解能で十分である。４ｃｍ−１の分解能に関しては、２ｃｍ−１の間隔幅を有するＱＣＬが調整可能である。従って、８ｃｍ−１の分解能に関しては、４ｃｍ−１の間隔幅が可能である。４ｃｍ−１から８ｃｍ−１の分解能においては、複数の連続画像を更に統合できるので、信号対背景雑音の比は大幅に改善できる。従って、分解能４ｃｍ−１（すなわち間隔幅２ｃｍ−１）、毎秒１０ｃｍ−１の調整速度並びに５０Ｈｚのフレームレートにおいて、１０の画像がそれぞれ統合できる（２ｃｍ−１／１０ｃｍ−１／ｓ＊５０Ｈｚ＝０．２秒＊５０Ｈｚ＝１０）。従って、分解能８ｃｍ−１（すなわち間隔幅４ｃｍ−１）、毎秒１０ｃｍ−１の調整速度並びに５０Ｈｚのフレームレートにおいては、２０の画像が統合できる。
【００８０】
好ましい実施形態では、当該方法は、ＱＣＬのＩＲ放射の波長に従って試料の焦点合わせを行う工程を更に有する。検出器上の試料の撮像は、入射光の波長に依存する場合が多い。ＱＣＬは実質的に個別の波長を放射するので、それに従って検出器の焦点を調整することが可能である。ＱＣＬを調整することにより複数の波長についてスペクトルを記録する間、検出器に導入される放射の波長は連続的に変化し、その結果、焦点が外れる場合がある。従って、ＱＣＬの波長に従って焦点を調整する方法は有利である。これは、例えば、試料または検出器の同期変位により実行できる。この場合、検出器の変位の方が一般的に実行し易い。拡大の場合、変位すべき距離が試料の場合よりも大きいので、位置決め精度の面で許容度が高いからである。ＱＣＬが放射する波長に従って検出器または試料の位置決めを行う場合、その位置はコンピュータユニットで制御可能である。コンピュータユニットは、波長参照装置、例えば位相依存干渉計を更に有する。放射された波長との関係で波長参照装置により導入される情報はコンピュータユニットにより処理され、それに従って検出器または試料の位置が調整される。斯かる方法により、試料は、各波長について、検出器上で明瞭に結像される。
【００８１】
好ましい実施形態では、当該方法は、試料のハイパースペクトル画像を生成する工程を更に有する。「ハイパースペクトル画像」と言う用語は、少なくとも２つの異なる波長の測定に基づく、好ましくは部分的または完全なＩＲスペクトルに基づく試料の視覚表現を意味する。試料の生化学的組成に基づいてその構造を再生するので、例えば、組織試料の場合、細胞および他の組織構造体（例えば結合組織）の配列および状態が同定できる。
【００８２】
好ましい実施形態では、位相変調器は検出器（センサ）のフレームレートよりも少なくとも５％、好ましくは少なくとも８％、更に好ましくは少なくとも２０％速い速度で回転する。フレームレートよりも少なくとも５％速い速度で連続的に回転する位相変調器により、測定精度を更に向上できることを本発明者達は確立している。従って、一般的に、短い測定時間で高レベルの測定精度が可能である。操作を伴う生物学的試料の分析の場合、これは特に重要である。
【００８３】
実施例
１．好ましい実施態様
図１は本発明の顕微鏡１の一般的な第一実施形態を示す。顕微鏡１は２つのＱＬＣ３を有しており、そのレーザービームは、方向変換ミラー１２およびビームスプリッタを通して、回転する位相変調器へ放射される。その後、放射はレンズ６を通過し、試料ホルダ８に固定されている試料２に至る。試料２が発するＩＲ放射はセンサ４により検出される。同時に、ＱＣＬ３のレーザー放射の一部は、ビームスプリッタ２４を通して波長参照装置７へ供給される。顕微鏡１の制御および検証は、レーザー制御装置９、記録装置１０、およびロックイン増幅器１１を通して行われる。
【００８４】
図２は、透過中（図２Ａ〜Ｄ、Ｉ、およびＪ）および反射中（図２Ｅ〜Ｈ、Ｋ，およびＬ）に顕微鏡１を通過するビーム経路の実施形態を示しており、ＩＲ放射は試料に直接結像される。回転するＩＲ透過散乱板２１（図２Ａ〜Ｈ）および回転するＩＲ反射散乱ミラー２５（図２Ｉ〜Ｌ）の両方が、位相変調器として使用できる。位相変調器５に加えて、追加の非可動性散乱板２３またはＩＲを反射する散乱ミラー２６（図２Ｂ、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｊ、およびＬ）が使用できる。更に、ビーム経路には、異なるレンズすなわち位相変調器５の放射点を試料上に結像するのに使用されるレンズ（レンス２２）、ＱＣＬ３の焦点を回転する位相変調器５に合わせるのに使用されるレンズ（レンズ２７）、または試料が発する放射の焦点をセンサ４に合わせるのに使用されるレンズ（レンズ２８）が配置できる。
【００８５】
図３は、透過中に顕微鏡１を通過するビーム経路に関する２つの実施形態を示している。図３Ａによれば、ＩＲ放射は、セレン化亜鉛レンズ（ｆ＝５０ｍｍ）３１、非可動性のＩＲ透過散乱レンズ２３、およびコレクタレンズ（セレン化亜鉛、ｆ＝２５ｍｍ）３０を通して、回転するＩＲ透過散乱板２１により絞り３３上に結像される。この配置は、単一の倍率で並外れて均質で干渉のない画像を生成するケラー照明に対応する。図３Ｂは、４倍の倍率の構成を示す。この例では、ＩＲ放射は、セレン化亜鉛レンズ（ｆ＝２５ｍｍ）３０、コンデンサレンズ（フッ化バリウム、ｆ＝３０／２２．８ｍｍ）３２、およびセレン化亜鉛レンズ（ｆ＝５０ｍｍ）３１を通して、回転するＩＲ透過散乱板２１により非可動性のＩＲ透過散乱レンズ２３に向けられる。ＩＲ放射は、このレンズ２３から、セレン化亜鉛レンズ（ｆ＝２５ｍｍ）３０により試料２の下流側に結像される。
【００８６】
２．位相変調器の構成
位相変調器の構成を確立するため２つのブランク測定の参照操作が行われたが、その場合、散乱板の回転速度および照明は様々であった。全ての測定が、１０２７ｃｍ−１から１０８７ｃｍ−１のスペクトル範囲を有するＱＣＬで行われた。照明の光学構成が図３Ｂに示してある。散乱板は両方とも直径２５．４ｍｍを有していた。レーザービームの直径は約１０ｍｍであった。各ブランク測定において、１０２７ｃｍ−１から１０８７ｃｍ−１まで、約１１秒間に３回ＱＣＬの調整が行われた。検出は、有効画素サイズ３．６５μｍを用いて撮像スケール４：１で行われた。マイクロボロメータはフレームレート５０Ｈｚで作動した。
【００８７】
第一ブランク測定を第二ブランク測定に対して参照した後、各画素について吸収スペクトルのスペクトル標準偏差が計算できる。この特徴的変数は、測定精度を評価するため、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ等、２０１３により導入された。この場合、吸光度は相対透過の負の自然対数として定義される。スペクトル標準偏差は、第一ブランク測定を別のブランク測定に対して参照し画素毎に計算され、各画素におけるゼロ吸光ラインの幅として解釈できる。最初、図３Ｂに示される構成で測定が行われ、その場合、移動する位相変調器の回転の中心がレーザーで照明され検出器の視野に撮像された（実験１および２）。実験３および４に関しては、移動する位相変調器の中心が照明されないように、移動する散乱板は数ミリメートル移動された。４つの実験を評価するため、データは平均２．４ｃｍ−１のスペクトル間隔幅を用いて平均された。
【００８８】
異なる回転速度および照明によるスペクトル標準偏差
【表１】
0006779982.tif 000002
【００８９】
散乱板の中心がレーザービームに含まれておらず、従って、検出器の視野に結像されていない場合には、スペクトル標準偏差が大幅に減少することを、実験１から４が示している。
【００９０】
更に、検出器のフレームレートよりも２０％速い回転速度（マイクロボロメータのフレームレート５０Ｈｚにおける回転速度は６０Ｈｚ）を移動する散乱板に選択すると、測定精度は大幅に向上する。
【００９１】
実験５〜９は、改善された光学照明装置、すなわちより多くの光を検出器に当てる装置で行われた。従って、より大きい信号が到達でき、信号対背景雑音が改善されていた。実験１〜４と違いレーザービームが広がらなかったので、より多くの光が検出器に衝突するという事実が達成された。あるいは、より小さい直径のレーザーまたはより小さいエタンデュのレーザーを使用してもよい。エタンデュとはビーム束の広がりを測るものである。エタンデュは断面積と空間角とを有し、ビーム束が光学システムを通過する際に変化しない。
【００９２】
実験５において、１０２７ｃｍ−１から１０８７ｃｍ−１までのスペクトル範囲における５ブランク測定値を有する平均ハイパースペクトル画像を同一のスペクトル範囲における５つの追加ブランク測定値の平均ハイパースペクトル画像に対して参照することにより、測定精度が計算された。移動する散乱板の回転速度は６２．５Ｈｚであった。検出器のフレームレートは５０Ｈｚであった。図６は画素毎に計算された（自然対数を用いて計算された）空間標準偏差を示す。散乱板の中心または回転中心は右側すなわち画像の視野の外側にある。従って、左側の画像縁の経路速度が最高で右側の画像縁のそれが最低である。白い領域が左の画像縁から右の画像縁にかけて増大しているが、これは、測定精度が右側の画像縁の方向に向かって増大していることを示している。ＩＲ放射の衝突が散乱板の回転中心に近ければ近いほど測定精度が増大することをそれは意味する。従って、散乱板の中心からの空間が大きければ大きいほど、散乱板の中心からの空間が小さい場合よりも優れた測定精度が達成される。右側すなわち画像視野の外側にある散乱板の回転中心または中心の位置は、図６の環状構造体により示されている。
【００９３】
図６の画像は列に細分された。各列は７．３μｍの幅を有している。列番号は左から右へ増大している。散乱板の回転中心が右側すなわち画像の視野の外側にあるので、より小さい列番号は、散乱板の回転中心に対してより大きい空間、すなわちより速い経路速度に対応している。画像の列を平均化することにより、測定精度と列番号との間に略直線状の関係が得られた（図７）。図７において、右画像縁に対する回転板の中心間隔に２００の列（１．４６ｍｍに対応）が採用された。線形関数の近似により、以下の近似パラメータが得られた。
関数：ｙ  ＝  ｂ１  ＊（２＊π＊７．３  μｍ＊  （（３５０−ｘ）＋ｂ２）  ＊  ６２．５  Ｈｚ  ＋  ｂ３
（ここで、ｙは平均空間標準偏差（ａ．ｕ．）であり、ｘは列番号であり、ｂ１は経路速度と平均空間標準偏差との間の比例定数（ａ．ｕ．／（ｍ／ｓ））であり、ｂ２は右側画像縁からの、散乱板の中心間隔であり、ｂ３は経路速度から独立した、平均空間標準偏差の割合（ａ．ｕ．）である。）
右側画像縁からの散乱板の中心間隔として、２００列または１０００列（１．４６ｍｍおよび７．３ｍｍに対応）が採用された。１つの列は７．３μｍの間隔に対応する。
【００９４】
【表２】
0006779982.tif 000003
【００９５】
図６の画像フィールドは約３ｍｍの幅を有している。左側画像縁における平均スペクトル標準偏差は、右側画像縁におけるそれよりも大幅に小さいが、それは散乱板の中心からの間隔が３ｍｍ大きいからである。従って、散乱板の中心から可能な限り最大の間隔を置いてＩＲ放射が散乱板に衝突することにより、最高の測定精度が達成できることを結果が示している。
【００９６】
実験６〜９は、３つのブランク測定に対して３つが参照され回転中心が画像から更に引き離された点を除き、実験５の場合と同じパラメータを用いて行われた。測定精度への回転速度の影響を調べるため、回転速度を変化させた。
【００９７】
異なる回転速度および照明によるスペクトル標準偏差
【表３】
0006779982.tif 000004
【００９８】
実験６は、移動している散乱板を検出器のフレームレートよりも８％速い回転速度で回転させる（マイクロボロメータカメラのフレームレート５０Ｈｚに対して５４Ｈｚの回転速度）と、非常に高レベルの測定精度が達成される。実験６〜９は、散乱板の回転速度を増大すると測定精度が更に増すことを示している。
【００９９】
図４は、実験１および４について画素毎に計算したスペクトル標準偏差の柱状図である。スペクトル標準偏差は、両実験とも従来の方法（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ等、２０１３）より大幅に小さい。平均時間中に空間干渉性を減少させることにより測定精度が大幅に改善されることをこれは示している。
【０１００】
測定誤差を確立する別の方法がＹｅｈ等、２０１５によって最近提案された。この場合、画素値の二乗平均平方根は固定波長の画素から計算される。Ｙｅｈ等、２０１５は吸光度を常用対数で定義しているので、結果を更に良く比較するため、斯かる定義をこのセクションにおいて採用する。窒素冷却ＭＣＴ検出器が検出に使用された。斯かる検出器はマイクロボロメータカメラよりもかなり高価であるが、画像の記録速度ははるかに速い。平均時間中の空間干渉性の削減は行われなかった。その結果、１０００画素のゼロ吸光ラインの平均の変動と比較して、ＱＣＬ測定から無作為に選択された画素のゼロ吸光ラインの変動はかなりのものであった（Ｙｅｈ等、２０１５）。ＱＣＬベースの測定には系統的な測定誤差が存在することをこの発散が示している。
【０１０１】
Ｙｅｈ等、２０１５が記載している顕微鏡構造とは異なり、実験４のゼロ吸光ラインも、個々の画素を観察すると絶対ゼロラインに近いものである。明らかに周期的な変動はゼロラインの周りには見られなかった。加えて、正確性すなわち絶対ゼロラインからの測定ゼロ吸光ラインの隔たりは、実験４において、Ｙｅｈ等、２０１５で考察された全ケースよりも小さい。記録品質が原理的にＭＣＴ−ＦＰＡよりもかなり低いマイクロボロメータを実験４で検出に使用したのであるが、斯かる場合にこれは特に目立った。従って、ＱＣＬの空間干渉性は、非常に感度が高くしかも高価なＭＣＴ−ＦＰＡを使用してさえも容易に修正できない系統的測定誤差をもたらすものである。しかし、実験４で使用されたマイクロボロメータカメラを用いるＱＣＬベースの顕微鏡システムは、平均時間中に空間干渉性を減少させるのに散乱板を使用することにより、斯かる測定誤差を最小化できる。斯かる方法により得られる測定精度はＦＴＩＲベースのシステムに匹敵し、しかも測定時間は大幅に短縮される。
【０１０２】
３．大腸の非染色薄切片におけるビーカー状細胞の同定
３．１  機器および方法
大腸の試料を健康なＣ５７ＢＬ／６成熟マウスから取り出し固定した。該組織から厚さ８μｍのパラフィン切片を得て、ＩＲ顕微鏡で検査した。
【０１０３】
斯かる目的のため、１０２７ｃｍ−１から１０８７ｃｍ−１および１１６７ｃｍ−１から１３１９ｃｍ−１（波長範囲９．７４μｍから９．２０μｍおよび８．５７μｍから７．５８μｍに対応）を調整可能な２つの量子カスケードレーザー（Ｄａｙｌｉｇｈｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．，  ＵＳＡ）が使用された。測定にあたり、全範囲にわたって１１．３秒内に２０回各レーザーが調整された。６４０ｘ４８０画素を有するマイクロボロメータアレイ（ＩｎｆｒａＴｅｃ  ＧｍｂＨ，ドイツ）が、試料を透過したＩＲ放射の検出に使用された。フレームレートは５０Ｈｚであった。散乱板の回転速度はマイクロボロメータのフレームレートよりも速かった。３．６５μｍの試料平面における画素の投影中心距離（「投影画素ピッチ」）によって全測定が記録された。４：１倍率に２つの赤外線レンズが使用され、視野は２．８ｘ３．１ｍｍ２であった。局所分解能は（１０６５ｃｍ−１において）９．４＋／−１．８μｍであった。
【０１０４】
調整時間とボロメータのフレームレートの同期化により４ｃｍ−１の空間分解能が得られるが、これは組織の薄切片の中赤外線スペクトルの分析には十分である。レーザーの全調整幅におけるＩＲ画像の絶対記録時間は、検査された６つの試料の各々に関して７．５分であった。追加の１．９分間に単一のブランク測定が記録され、６つのハイパースペクトル画像の全てに参照として使用された。吸光スペクトルが、各画素に関して個別に、透過スペクトルの負の自然対数として計算された。背景補正、スペクトル範囲の平均化（スペクトルビニング）（平均範囲幅２．４ｃｍ−１による）、吸水補正、およびガウシアンぼかしフィルタ以外は、追加の予備処理操作は行わなかった。
【０１０５】
平均ＩＲスペクトル情報を分析するため、以下の４つの工程が実施された。
１．いわゆるトレーニングサンプルとして使用された６つの薄切片の１つを無作為に選択。
２．トレーニングサンプルの情報のみを用いたサンプルデータの非監視分類。トレーニングデータにｋ平均アルゴリズムを適用し、全部で１０のグループを選別し、その中で３つをパラフィンスペクトルまたはブランクサブストレートに対応づけ、７つを組織に対応付けた。分類方法をトレーニングするのに、全部で３２３，３００の個々のスペクトルが使用された。  
３．工程２に基づく分類方法のトレーニング（ランダムデシジョンフォーレスト）。トレーニングサンプルだけが使用された。全部で１００のデシジョンツリーが創出された。
４．工程１〜３の後、追加のトレーニング（「再訓練」）または変更は受け付けなかった。トレーニングされた分類方法はその後残りの薄切片に適用され（ブラインドバリデーション）、分析結果として使用された。
【０１０６】
分析は全てＭＡＴＬＡＢ（Ｒ２０１４ａ、Ｔｈｅ  ＭａｔｈＷｏｒｋｓ  Ｉｎｃ．，  ＵＳＡ）を用いて行われた。
３．２  結果
取得画像の品質に関する第一印象を得るには単一波長の分析で既に十分であった。完全な大腸切片に関する１２１８ｃｍ−１（＋／−１．２ｃｍ−１）での透過記録は、大腸上皮および筋肉組織（粘膜筋層）によって囲まれた中央ルーメンを明瞭に示している。デジタルズームにより上皮の下部構造も同定できた。単一波長の記録から驚くほど広範囲な情報が得られたが、データ分析の第二工程（ｋ平均）による全スペクトルも追加検査として使用された。得られたＩＲ画像は、組織形態並びに大腸内部のムチン層を明瞭に示していた。ムチン層はビーカー状細胞により生成されるムチンを特に含んでおり、非常にグリコシル化されたペプチドの割合が大きいので、炭水化物の範囲（１０００ｃｍ−１から１１００ｃｍ−１）に顕著なＩＲ吸収を有する。ハイパースペクトル記録の各画素を特定の組織に対応付けるため、１０７９ｃｍ−１および１１８１ｃｍ−１における吸光率並びに１０２７ｃｍ−１から１０８７ｃｍ−１までの吸光全体が計算された（表１）。従って、ムチン層およびビーカー状細胞だけでなく、筋層、固有層、およびビーカー状細胞を取り囲んでいる上皮細胞も同定できた。
【０１０７】
【表４】
0006779982.tif 000005
【０１０８】
（参照文献）
Ｍ．Ｃ．  ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ａｎｄ  Ｂ．Ｅ．Ｂｅｒｎａｃｋｉ，  Ｈｙｐｅｒｓｐｅｃｔｒａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｏｆ  ｅｘｐｌｏｓｉｖｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｃａｖｉｔｙ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｃａｓｃａｄｅ  ｌａｓｅｒ，  Ｏｐｔ．  Ｅｎｇ．  ５２，  ２０１３，  ０６１３０２．
Ｋ．  Ｙｅｈ，  Ｓ．  Ｋｅｎｋｅｌ，  Ｊ．Ｎ．  Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｒ．  Ｂｈａｒｇａｖａ，  Ｆａｓｔ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｃａｓｃａｄｅ  Ｌａｓｅｒ，  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ８７，  ２０１５，  ｐｐ．  ４８５−４９３．
【符号の説明】
【０１０９】
１  顕微鏡
２  試料
３  ＱＣＬ
４  センサ
５  位相変調器
６  光学素子
７  波長参照装置
８  試料ホルダ
９  レーザー制御装置
１０  記録装置
１１  ロックイン増幅器
１２  方向変換ミラー
２０  マイクロボロメータＦＰＡ
２１  ＩＲ透過散乱板（可動）
２２  試料上で位相変調器を結像させるためのレンズ
２３  ＩＲ透過散乱板（非可動）
２４  ビームスプリッタ
２５  ＩＲ反射散乱ミラー（可動）
２６  ＩＲ反射散乱ミラー（非可動）
２７  回転している位相変調器にＱＣＬ放射の焦点を合わせるためのレンズ
２８  試料からの放射の焦点を検出器に合わせるためのレンズ
２９  レーザー放射
３０  コレクタレンズ（セレン化亜鉛、ｆ＝２５ｍｍ）
３１  セレン化亜鉛レンズ（ｆ＝５０ｍｍ）
３２  コンデンサレンズ（フッ化バリウム、ｆ＝３０／２２．８ｍｍ）
３３  絞り
３４  明視野絞り
【図１】
0006779982.tif 000006
【図２Ａ】
0006779982.tif 000007
【図２Ｂ】
0006779982.tif 000008
【図２Ｃ】
0006779982.tif 000009
【図２Ｄ】
0006779982.tif 000010
【図２Ｅ】
0006779982.tif 000011
【図２Ｆ】
0006779982.tif 000012
【図２Ｇ】
0006779982.tif 000013
【図２Ｈ】
0006779982.tif 000014
【図２Ｉ】
0006779982.tif 000015
【図２Ｊ】
0006779982.tif 000016
【図２Ｋ】
0006779982.tif 000017
【図２Ｌ】
0006779982.tif 000018
【図３Ａ】
0006779982.tif 000019
【図３Ｂ】
0006779982.tif 000020
【図４】
0006779982.tif 000021
【図５】
0006779982.tif 000022
【図６】
0006779982.tif 000023
【図７】
0006779982.tif 000024
【図８】
0006779982.tif 000025