(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非小細胞肺癌の治療であってさらに化学療法剤の投与を含む治療での使用のための６つのｍＲＮＡを含む組成物であって、
各ｍＲＮＡは、
・５Ｔ４（栄養芽層糖タンパク質（Trophoblast glycoprotein）、ＴＰＢＧ）、
・サバイビン（バキュロウイルスＩＡＰ反復含有タンパク質５（Baculoviral IAP repeat-containing protein 5）、ＢＩＲＣ５）、
・ＮＹ−ＥＳＯ−１（ニューヨーク食道扁平上皮細胞癌１（New York esophageal squamous cell carcinoma 1）、ＣＴＡＧ１Ｂ）、
・ＭＡＧＥ−Ｃ１（メラノーマ抗原ファミリーＣ１（Melanoma antigen family C1））、
・ＭＡＧＥ−Ｃ２（メラノーマ抗原ファミリーＣ２（Melanoma antigen family C2））、および、
・ＭＵＣ１（ムチン−１）、
からなるグループから選択される異なる抗原をコードしており、かつ、
上記各ｍＲＮＡは、配列番号１９〜２４のＲＮＡ配列から選択される異なるＲＮＡ配列と同一または少なくとも８０％同一である、組成物。
【請求項２】
１つのｍＲＮＡは、５Ｔ４をコードし、かつ配列番号１９と同一または少なくとも８０％同一であり、
１つのｍＲＮＡは、サバイビンをコードし、かつ配列番号２０と同一または少なくとも８０％同一であり、
１つのｍＲＮＡは、ＮＹ−ＥＳＯ−１をコードし、かつ配列番号２１と同一または少なくとも８０％同一であり、
１つのｍＲＮＡは、ＭＡＧＥ−Ｃ１をコードし、かつ配列番号２２と同一または少なくとも８０％同一であり、
１つのｍＲＮＡは、ＭＡＧＥ−Ｃ２をコードし、かつ配列番号２３と同一または少なくとも８０％同一であり、かつ、
１つのｍＲＮＡは、ＭＵＣ１をコードし、かつ配列番号２４と同一または少なくとも８０％同一である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
上記少なくとも１つのｍＲＮＡは、１つ以上のポリカチオン、好ましくはプロタミンまたはオリゴフェクトアミン、もっとも好ましくはプロタミンと、複合体化している、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
上記１つ以上のポリカチオンに対する上記少なくとも１つのｍＲＮＡのＮ／Ｐ比は、約０．１から１０の範囲にあり、好ましくは、当該範囲は、約０．３から４の範囲、または約０．５から２の範囲、または約０．７から２の範囲、または約０．７から１．５の範囲である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
１つ以上のポリカチオンと複合体化した少なくとも１つのＲＮＡ、および少なくとも１つの遊離ＲＮＡを含み、上記複合体化ＲＮＡを構成するＲＮＡは、好ましくは上記遊離ＲＮＡと同一である、請求項１〜４の何れか１項に記載の組成物。
【請求項６】
上記組成物は、少なくとも１つのアジュバントをさらに含み、
上記少なくとも１つのアジュバントは、好ましくは
カチオン性またはポリカチオン性の化合物であって、上記カチオン性またはポリカチオン性の化合物は、カチオン性もしくはポリカチオン性のペプチドまたはカチオン性もしくはポリカチオン性のタンパク質を含み、これらのペプチドまたはタンパク質は、プロタミン、ヌクレオリン、スペルミンもしくはスペルミジン、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ポリ−アルギニン、塩基性ポリペプチド、ＨＩＶ結合ペプチドを含む細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、Ｔａｔ、ＨＩＶ−１  Ｔａｔ（ＨＩＶ）、Ｔａｔ由来ペプチド、ペネトラチン、ＶＰ２２由来ペプチドもしくはＶＰ２２アナログペプチド、ＨＳＶ  ＶＰ２２（単純ヘルペス）、ＭＡＰ、ＫＡＬＡもしくはタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）、ＰｐＴ６２０、プロリンリッチペプチド、アルギニンリッチペプチド、リジンリッチペプチド、ＭＰＧ−ペプチド、Ｐｅｐ−１、Ｌ−オリゴマー、カルシトニンペプチド、アンテナペディア由来ペプチド（特に、ショウジョウバエアンテナペディア由来）、ｐＡｎｔｐ、ｐｌｓｌ、ＦＧＦ、ラクトフェリン、トランスポータン、ブホリン−２、Ｂａｃ７１５−２４、ＳｙｎＢ、ＳｙｎＢ（１）、ｐＶＥＣ、ｈＣＴ由来ペプチド、ＳＡＰ、プロタミン、スペルミン、スペルミジン、もしくはヒストン、キトサンを含むカチオン性ポリサッカリド、ポリブレン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含むカチオン性ポリマー、ＤＯＴＭＡ：１−（２，３−シオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリドを含むカチオン性脂質、ＤＭＲＩＥ、ジ−Ｃ１４−アミジン、ＤＯＴＩＭ、ＳＡＩＮＴ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＢＧＴＣ、ＣＴＡＰ、ＤＯＰＣ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＰＥ：ジオレイルホスファチジルエタノール−アミン、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＤＡＢ、ＤＯＩＣ、ＤＭＥＰＣ、ＤＯＧＳ：ジオクタデシルアミドグリシル（ｇｌｉｃｙｌ）スペルミン、ＤＩＭＲＩ：ジミリスト−オキシプロピルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、ＤＯＴＡＰ：ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン、ＤＣ−６−１４：Ｏ，Ｏ−ジテトラデカノイル−Ｎ−（−トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド、ＣＬＩＰ１：ｒａｃ−（２，３−ジオクタデシルオキシプロピル）（２−ヒドロキシエチル）−ジメチル塩化アンモニウム、ＣＬＩＰ６：ｒａｃ−２（２，３−ジヘキサデシルオキシプロピル−オキシメチルオキシ）エチルトリメチルアンモニウム、ＣＬＩＰ９：ｒａｃ−２（２，３−ジヘキサデシルオキシプロピル−オキシスクシニルオキシ）エチル−トリメチルアンモニウム、オリゴフェクトアミン）、または、−アミノ酸−ポリマーまたは逆ポリアミドを含む修飾ポリアミノ酸を含むカチオン性もしくはポリカチオン性のポリマー、ＰＶＰ（ポリ（Ｎ−エチル−４−ビニルピリジニウムブロミド））を含む修飾ポリエチレン、ｐＤＭＡＥＭＡ（ポリ（ジメチルアミノエチルメチルアクリラート））を含む修飾アクリラート、ｐＡＭＡＭ（ポリ（アミドアミン））を含む修飾アミドアミン、ジアミン末端修飾１，４ブタンジオールジアクリラート−コ−５−アミノ−１−ペンタノールポリマーを含む修飾ポリβアミノエステル（ＰＢＡＥ）、ポリプロピルアミンデンドリマーまたはｐＡＭＡＭベースのデンドリマーを含むデンドリマー、ＰＥＩ：ポリ（エチレンイミン）を含むポリイミン、ポリ（プロピレンイミン）、ポリアリルアミン、シクロデキストリンベースのポリマーを含む糖骨格ベースのポリマー、デキストランベースのポリマー、キトサンなど、ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳコポリマーなどのシラン骨格ベースのポリマー、上記のカチオン性ポリマーから選択される１つ以上のカチオン性ブロックと１つ以上の親水性または疎水性ブロック（例えば、ポリエチレングリコール）との組み合わせからなるブロックポリマー、を含んでいるような、カチオン性またはポリカチオン性の化合物；
または、
以下の全体的な式（Ｉ）（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘを有する以下のタンパク質またはペプチドから選択されるカチオン性もしくはポリカチオン性のタンパク質、またはカチオン性もしくはポリカチオン性のペプチドであって、ｌ＋ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｘ＝８〜１５であり、かつ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＨｉｓおよびＯｒｎの全体的な含有量がオリゴペプチドの全アミノ酸の少なくとも５０％を示すという条件で、ｌ、ｍ、ｎまたはｏは、互いに独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５から選択される任意の数であってもよく、Ｘａａは、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＨｉｓまたはＯｒｎ以外のネイティブな（＝天然に存在する）アミノ酸またはネイティブではないアミノ酸から選択される任意のアミノ酸であってもよく、かつ、Ｘａａの全体的な含有量が上記オリゴペプチドの全アミノ酸の５０％を超えないという条件で、ｘは、０、１、２、３または４から選択される任意の数であってもよい、カチオン性もしくはポリカチオン性のタンパク質、またはカチオン性もしくはポリカチオン性のペプチド；
または、
式（ＩＩ）：ＧｌＸｍＧｎを有する核酸であって、Ｇは、グアノシン、ウラシル、またはグアノシンもしくはウラシルのアナログであり、Ｘは、グアノシン、ウラシル、アデノシン、チミジン、シトシン、またはこれらのヌクレオチドのアナログであり、ｌは、１から４０までの整数であり、ｌ＝１の場合、Ｇは、グアノシンまたはそのアナログであり、ｌ＞１の場合、少なくとも５０％のヌクレオチドは、グアノシンまたはそのアナログであり、ｍは、整数であり、かつ少なくとも３であり、ｍ＝３の場合、Ｘは、ウラシルまたはそのアナログであり、ｍ＞３の場合、少なくとも３つの連続したウラシルまたはウラシルのアナログが生じ、ｎは、１から４０までの整数であり、ｎ＝１の場合、Ｇは、グアノシンまたはそのアナログであり、ｎ＞１の場合、少なくとも５０％のヌクレオチドは、グアノシンまたはそのアナログである、核酸；
または、
式（ＩＩＩ）：ＣｌＸｍＣｎを有する核酸であって、Ｃは、シトシン、ウラシル、またはシトシンもしくはウラシルのアナログであり、Ｘは、グアノシン、ウラシル、アデノシン、チミジン、シトシン、またはこれらのヌクレオチドのアナログであり、ｌは、１から４０までの整数であり、ｌ＝１の場合、Ｃは、シトシンまたはそのアナログであり、ｌ＞１の場合、少なくとも５０％のヌクレオチドは、シトシンまたはそのアナログであり、ｍは、整数であり、かつ少なくとも３であり、ｍ＝３の場合、Ｘは、ウラシルまたはそのアナログであり、ｍ＞３の場合、少なくとも３つの連続したウラシルまたはウラシルのアナログが生じ、ｎは、１から４０までの整数であり、ｎ＝１の場合、Ｃは、シトシンまたはそのアナログであり、ｎ＞１の場合、少なくとも５０％のヌクレオチドは、シトシンまたはそのアナログである、核酸；
からなる群から選択される、請求項１〜５の何れか１項に記載の組成物。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか１項に記載の組成物を含む、非小細胞肺癌の治療であってさらに化学療法剤の投与を含む治療での使用のためのワクチンであって、
上記ワクチンは、好ましくは薬学的に許容され得るキャリアをさらに含む、ワクチン。
【請求項８】
上記治療は、さらなる活性薬学的成分の投与を含み、
上記さらなる活性薬学的成分は、好ましくは化学療法剤、またはキナーゼ阻害剤であり、
上記治療は、放射線治療をさらに含む、請求項１〜６の何れか１項に記載の組成物。
【請求項９】
上記さらなる活性薬学的成分は、ＰＤ−１経路阻害剤である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
上記さらなる活性薬学的成分は、チロシンキナーゼ阻害剤、好ましくは上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）チロシンキナーゼ阻害剤、好ましくはエルロチニブ、ゲフィチニブおよびアファチニブのグループから選択されるチロシンキナーゼ阻害剤である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
上記さらなる活性薬学的成分は、白金ベースの化学療法剤である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１２】
６つのｍＲＮＡを含み、
各々のｍＲＮＡは、５Ｔ４（栄養芽層糖タンパク質、ＴＰＢＧ）、サバイビン（バキュロウイルスＩＡＰ反復含有タンパク質５、ＢＩＲＣ５）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（ニューヨーク食道扁平上皮細胞癌１、ＣＴＡＧ１Ｂ）、ＭＡＧＥ−Ｃ１（メラノーマ抗原ファミリーＣ１）、ＭＡＧＥ−Ｃ２（メラノーマ抗原ファミリーＣ２）およびＭＵＣ１（ムチン−１）からなる群から選択される異なる抗原をコードし、かつ、各々のｍＲＮＡは、配列番号１９、２０、２１、２２、２３または２４に従ったＲＮＡ配列から選択される異なるＲＮＡ配列と同一または少なくとも８０％同一である、非小細胞肺癌の治療であってさらに化学療法剤の投与を含む治療での使用のための６つのｍＲＮＡの組み合わせ。
【請求項１３】
６つのｍＲＮＡを含み、
１つのｍＲＮＡは、５Ｔ４をコードし、かつ、配列番号１９と同一または少なくとも８０％同一であり、１つのｍＲＮＡは、サバイビンをコードし、かつ、配列番号２０と同一または少なくとも８０％同一であり、１つのｍＲＮＡは、ＮＹ−ＥＳＯ−１をコードし、かつ、配列番号２１と同一または少なくとも８０％同一であり、１つのｍＲＮＡは、ＭＡＧＥ−Ｃ１をコードし、かつ、配列番号２２と同一または少なくとも８０％同一であり、１つのｍＲＮＡは、ＭＡＧＥ−Ｃ２をコードし、かつ、配列番号２３と同一または少なくとも８０％同一であり、１つのｍＲＮＡは、ＭＵＣ１をコードし、かつ、配列番号２４と同一または少なくとも８０％同一である、請求項１２に記載の組み合わせ。
【請求項１４】
上記６つのｍＲＮＡの各々は、別々に投与される、請求項１２または１３に記載の組み合わせ。
【請求項１５】
上記ｍＲＮＡは、皮内注射により投与される、請求項１２〜１４の何れか１項に記載の組み合わせ。
【請求項１６】
上記治療は、さらなる活性薬学的成分の投与を含み、
上記さらなる活性薬学的成分は、好ましくは化学療法剤、またはキナーゼ阻害剤であり、
上記治療は、放射線治療をさらに含む、請求項１２〜１５の何れか１項に記載の組み合わせ。
【請求項１７】
上記さらなる活性薬学的成分は、ＰＤ−１経路阻害剤である、請求項１６に記載の組み合わせ。
【請求項１８】
上記さらなる活性薬学的成分は、チロシンキナーゼ阻害剤、好ましくは上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）チロシンキナーゼ阻害剤、好ましくはエルロチニブ、ゲフィチニブおよびアファチニブのグループから選択されるチロシンキナーゼ阻害剤である、請求項１６に記載の組み合わせ。
【請求項１９】
上記さらなる活性薬学的成分は、白金ベースの化学療法剤である、請求項１６に記載の組み合わせ。
【請求項２０】
上記治療は、放射線治療をさらに含む、請求項１９に記載の組み合わせ。
【請求項２１】
請求項１〜６の何れか１項に記載の組成物、ならびに／または、請求項７に記載のワクチン、ならびに、随意的に、可溶化するための液体賦形剤、ならびに、随意的に、上記組成物および／もしくは上記ワクチンの投与および投与量の情報を伴った技術的指示書、を含む、非小細胞肺癌の治療であってさらに化学療法剤の投与を含む治療での使用のためのキット、好ましくはパーツのキット。
【請求項２２】
上記キットは、パーツのキットであり、かつ、上記キットの各パーツは、少なくとも１つのｍＲＮＡを含み、当該少なくとも１つのｍＲＮＡは、好ましくは、請求項１に規定された抗原から選択される異なる抗原をコードしており、パーツのキットのすべてのパーツは、請求項１〜６の何れか１項に記載の組成物または請求項７に記載のワクチンを形成する、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
上記キットは、６つのｍＲＮＡを含む少なくとも２つのパーツを含む、請求項２１または２２に記載のキット。
【請求項２４】
６つのすべてのｍＲＮＡは、別々のパーツ中の凍結乾燥形態で提供される、請求項２１〜２３の何れか１項に記載のキット。
【請求項２５】
上記キットは、一部分として、乳酸リンガー溶液を含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
上記キットは、６つのパーツを含み、各々のパーツは、上記６つのｍＲＮＡの１つを含む、請求項２１〜２５の何れか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類において（適応性）免疫応答を誘発することのできる抗原の組み合わせをコードする、少なくとも一つのｍＲＮＡを含む組成物であって、前記抗原は５Ｔ４（栄養芽層糖タンパク質（Trophoblast glycoprotein）、ＴＰＢＧ）、サバイビン（バキュロウイルスＩＡＰ反復含有タンパク質５（Baculoviral IAP repeat-containing protein 5）、ＢＩＲＣ５）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（ニューヨーク食道扁平上皮癌１（New York esophageal squamous cell carcinoma 1）、ＣＴＡＧ１Ｂ）、ＭＡＧＥ−Ｃ１（メラノーマ抗体ファミリーＣ１（Melanoma antigen family C1））、ＭＡＧＥ−Ｃ２（メラノーマ抗体ファミリーＣ２（Melanoma antigen family C2））およびＭＵＣ１（ムチン−１）から成る群から選択されることを特徴とする組成物に関する。本発明はさらに、そのような抗原の組み合わせをコードする少なくとも一つのｍＲＮＡを含むワクチンならびに、（ワクチン調整のための）前記組成物および／または前記ワクチンを使用することにより、（適応性ある）免疫応答を誘発し、肺癌、好ましくは非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ, non-small cell lung cancer)およびそれに関する疾患または異常を処置することに関する。最後に、前記発明は用具、特に、前記組成物および／またはワクチンを収容するパートの用具に関する。
【背景技術】
【０００２】
全悪性腫瘍のうち２５％が気管支癌（肺癌）である。世界的に、気管支癌は男性における最も一般的な癌に関する死因であり、女性においては２番目に一般的である。ドイツ国内では気管支癌は、前立腺癌および直腸結腸癌に続いて、３番目に多い癌の種類である。気管支癌により世界中で年間１３０万人が亡くなっている。中央ヨーロッパでは発生率はおおよそ１００，０００人の住人に対して６０人であり、新たに肺癌と診断される住人の数も安定して増加している（ドイツ国内では現在おおよそ毎年５０，０００人）。肺癌と診断されてから、満５年後の平均生存確率はわずか５％である。しかしながら、患者一人ひとりの余命は完全に発見時の癌（肺癌）の亜類型および疾患段階（ＴＭＮ分類）に依存する（下記参照）。
【０００３】
顕微鏡視下の悪性細胞の大きさおよび発現によってカテゴライズされる肺癌の主要な亜類型は、小細胞肺癌（２０％）および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ、８０％）である。この分類は、単純な歴史的分類に基づいているが、疾患の臨床管理および予後にとって大変重要な含意を有する。小細胞肺癌は通常化学療法で処置されるが、非小細胞肺癌はたいてい第一選択処置として手術を必要とする。
【０００４】
種々の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）は、予後および管理が大まかに同一であるため、同じグループとされる。３つの主要な亜類型がある。すなわち、肺扁平上皮癌、腺癌および肺大細胞癌である。手術が処置の頼みの綱であるが、たった４分の１の患者しか成功する切除を体験することはなく、再発の可能性は５０パーセントである。進行した疾患における治療上のアプローチは―手術の後に―補助的な化学療法および／または補助的な放射線治療の両方を含むが、単独療法（第一選択療法）としての化学療法は比較的わずかな効果につながるアプローチのようである。４つの一般的に用いられる併用化学療法措置を比較しても、突出しているものはない。奏効率は１５％から２２％まで差があり、１年後の生存率は３１％から３６％であった（例えば、O'Mahony, D., S. Kummarら (2005年). "Non-small-cell lung cancer vaccine therapy: a concise review." J Clin Oncol 23(35): 9022-8を見よ）。したがって、手術前の化学療法は余命延長に効果がないようであっても、補助的な化学療法は―または放射線療法との組み合わされた化学療法は―余命において有意な増進を見せた。
【０００５】
今日用いられている化学療法的アプローチの１つは、第一選択療法としてすら白金ベースの物質と例えばゲムシタビンなどの組み合わせであり、例えばペメトレキセドなどは第二選択療法として用いられる。
【０００６】
ＮＳＣＬＣに対して用いられる処置のもう一つの選択肢は、分子レベルで特定の標的癌の構造に働きかけることで古典的な細胞毒性化学療法の成果を高めようとする、いわゆる「標的療法」である。用いられる物質は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ，epidermal growth factor receptor）のチロキシンキナーゼにおいて狙われるベバシズマブ（脈管形成阻害因子）またはエルロチニブを含む。
【０００７】
確かに現在の治療法上のアプローチにおいていくらかの改善が見られるものの、高い死亡率を考慮に入れると、肺癌、特にＮＳＣＬＣの処置は、いまだに険しい道であり、更なる代替のまたは改善された処置の方法が強く必要とされている。
【０００８】
従って、ＮＳＣＬＣの処置のためのアプローチにおいて、免疫システムを用いることが示唆される。免疫システムは多数の疾患の処置および予防において重要な役割を果たしている。現在分かっている段階の知識によれば、例えば癌細胞などを特定し殺すことにより生体を保護するために多種のメカニズムが哺乳動物によって提供されている。これらの癌細胞は検出され、生体の正常な細胞および組織から識別されなければならない。
【０００９】
人間など脊椎動物の免疫システムは、精巧かつダイナミックなネットワークの中で相互に作用し合う多くの種類のタンパク質、細胞、器官、および組織からなる。このより複雑な免疫応答の一部として、脊椎システムは、特定の病原体あるいは癌細胞をより効果的に認識するよう、時間をかけて適応してきた。適応プロセスは免疫記憶を作り出し、今後の（異物との）遭遇の間のより効果的な保護をも可能にする。適応されたあるいは獲得された免疫のこのプロセスは、予防接種戦略のための基盤を形成している。
【００１０】
適応性免疫システムは抗原特異的であり、抗原提示と呼ばれるプロセスのあいだ、特定の「自己」または「非自己」抗原の認識を必要とする。抗原特異性は、特定の病原体、または病原体の影響を受けた細胞、または癌細胞に対して調整された応答の生成を可能にする。これらの調整された応答の搭載を可能にする能力は、体内においていわゆる「記憶細胞」によって維持されている。人体が病原体に２回以上感染する際は、これら特定の記憶細胞が速やかにその病原体を排除するために用いられる。順応性の免疫システムは従って、免疫的記憶だけでなくより強力な免疫応答も可能にし、そこでは各病原体および癌細胞は、１つまたはそれ以上の標識抗原により「記憶」される。
【００１１】
脊椎動物における適応性免疫システムの主要な構成要素は優勢的に、細胞レベルではリンパ球を、分子レベルでは抗体を含む。適応性免疫システムの、細胞質構成要素としてのリンパ球は、骨髄中の造血幹細胞に由来するＢ細胞およびＴ細胞を含む。Ｂ細胞は体液性応答に関与し、Ｔ細胞は細胞性媒介免疫応答に関与する。Ｂ細胞とＴ細胞の両方は、特定の標的を認識する受容分子を運搬する。Ｔ細胞は抗原（例えば、病原体の小さな破片）が処理され、主要組織適合複合体（major histocompatibility complex, ＭＨＣ）分子と呼ばれる「自己」受容体とともに結合した状態となってはじめて、病原体標的構造などの「非自己」の標識を認識する。対照的に、Ｂ細胞抗原特異性受容体はＢ細胞表面抗体分子であり、Ｂ細胞表面上の抗体が特定の異物の抗原と結びついたとき、病原体を病原体として認識する。この抗原／抗体複合体はＢ細胞によって回収され、タンパク質加水分解によってペプチドに加工される。Ｂ細胞はその後これらの抗原ペプチドを自身の表面ＭＨＣクラスＩＩ分子上に配列する。このＭＨＣと抗原の結合体はマッチするヘルパーＴ細胞を引き付け、ヘルパーＴ細胞はリンホカインを放出しＢ細胞を活性化する。活性化されたＢ細胞がその後分裂を始めると、その子孫細胞は、この抗原を認識する抗体の何百万ものコピーを内包する。これらの抗体は血漿およびリンパの中を循環し、病原体あるいは癌細胞と結びついて抗原を発現し、補足的な活性化による破壊あるいは食細胞による取り込みおよび破壊のために、病原体や癌細胞をマークする。
【００１２】
適応性の免疫システムの細胞質組成物としての細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋）は、ＣＴＬ応答を形成しうる。細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋）は内因性の病原菌およびＭＨＣタイプ１分子によって結合された自己抗原から、ペプチドを識別できる。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、細胞中で傷害性タンパク質を放出することで殺傷機能を発揮する。
【００１３】
免疫システムのメカニズムは、治効のある処置のための標的を形成する。適切な方法は一般的に、先天性免疫応答を誘発するためのアジュバントの投与、あるいは、適応性免疫システムを引き出すための抗原または免疫原の投与に基づく。抗原は一般的に、病原体の特定の組成物（例えば、表面タンパク質）またはその破片に基づくように、望ましいポリペプチド、タンパク質または抗原の発現に続く患者への核酸の投与も計画される。
【００１４】
今まで、免疫応答、免疫作用またはワクチン接種を誘発するための従来の方法は、細胞内に必要な遺伝情報を組み込むためにＤＮＡ分子の使用に基づいている。ＤＮＡを細胞内に導入するための様々な方法が開発されている。例えば、リン酸カルシウム法、ポリプレン遺伝子導入、プロトプラスト融合、電気穿孔、顕微注射、およびリポフェクション法などである。リポフェクション法は特に好適な方法であることが分かっている。ＤＮＡウイルスも同様に、ＤＮＡビヒクルとし用いられ得る。その伝染性の性質により、そうしたウイルスは非常に高い遺伝子導入率を達成する。用いられるウイルスは、遺伝子導入された細胞中にいかなる機能性伝染性粒子も形成されないように遺伝的に改変されている。しかしながら、こういった予防手段にも関わらず、例えば起こり得る再結合などが原因で、制御されない導入された遺伝子およびウイルスの遺伝子が増殖するリスクを排することはできない。このことはまた、例えばホスト細胞のゲノムの無傷の遺伝子中に、ＤＮＡが挿入され、結果このゲノムが変異ししたがって完全にまたは部分的に不活性化する恐れがある、あるいは誤報を引き起こす恐れがあるというリスクを包含する。言い換えれば、細胞にとって必須である遺伝子産物の合成が、完全に抑制されてしまうか、またはその代わりに、変性したまたは不正な遺伝子産物が発現される恐れがある。ＤＮＡが細胞の成長制御に関与する遺伝子に統合される場合、特にリスクが生じる。この場合、ホスト細胞が変質し癌や腫瘍形成につながる恐れがある。さらに、細胞内に導入されたＤＮＡが発現することになる場合は、対応するＤＮＡビヒクルが、ウイルスＣＭＶプロモーターなどの強力なプロモーターを含んでいることが必要である。このようなプロモーターの、被処置細胞への遺伝子内への組み込みは、細胞内での遺伝子発現の望まない制御変容に結びつく恐れがある。免疫応答を誘発するための因子として（例えば、ワクチンとして）ＤＮＡを用いるもう一つのリスクは、外部のＤＮＡが導入された患者内で、病原性抗ＤＮＡ抗体が導入され、（場合によっては死に至る）免疫反応を引き起こすことである。
【００１５】
したがって、効果的に免疫システムを刺激して、ＤＮＡベースの組成物に起因する導入遺伝子の非制御増殖の問題を避けつつ、肺癌の処置を可能にするために、ＲＮＡベースの組成物が開発されている。ＷＯ２００９／０４６７３８は、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ−Ｃ１、およびＭＡＧＥ−Ｃ２を含む群から選択される少なくとも一つの抗原をコードし、さらにｈＴＥＡＴ、ＷＴ１、ＭＥＧＡ−Ａ２、５Ｔ４、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＵＣ１、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＣＥＡ、サバイビン、ＭＡＧＥ−Ｃ１および／またはＭＡＧＥ−Ｃ２から成る群から選択される少なくとも一つのコードする少なくとも一つのＲＮＡを含む組成物を提供する。前述の組成物における、少なくとも２つの抗体の組み合わせは、肺癌に対抗する活発な免疫療法に向かっての重要な一歩を意味するが、なお医師は、個別の被験者に対する処置の選択肢を考えた場合に、両方効果的かつ耐性に優れた好適な抗原の組み合わせの選択に直面する。
【００１６】
したがって全体的に、従来技術において知られている組成物を用いる際に遭遇する問題を避けながら、肺癌、特に非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の処置を可能にするように免疫システムを効果的に刺激するために用いられる、有効なシステムに対する余地およびニーズが存在する。
【００１７】
したがって、本発明の目的は、ａ）免疫システムを刺激することで肺癌の処置を可能にする組成物で、ｂ）上に述べた欠点を避ける組成物を提供することである。
【００１８】
したがって、本発明の目的は、肺癌ワクチンまたは、免疫システムを刺激することで肺癌の処置を可能にする組成物を提供することである。
【００１９】
本発明の根底にある目的は、請求する内容によって解決される。
【発明の概要】
【００２０】
この目的は、本発明の対象によって、特に、少なくとも１つのｍＲＮＡを含む組成物によって解決され、ここで、上記少なくとも１つのｍＲＮＡは：
・５Ｔ４（栄養芽層糖タンパク質（Trophoblast glycoprotein）、ＴＰＢＧ）、
・サバイビン（バキュロウイルスＩＡＰ反復含有タンパク質５（Baculoviral IAP repeat-containing protein 5）、ＢＩＲＣ５）、
・ＮＹ−ＥＳＯ−１（ニューヨーク食道扁平上皮細胞癌１（New York esophageal squamous cell carcinoma 1）、ＣＴＡＧ１Ｂ）、
・ＭＡＧＥ−Ｃ１（メラノーマ抗原ファミリーＣ１（Melanoma antigen family C1））、
・ＭＡＧＥ−Ｃ２（メラノーマ抗原ファミリーＣ２（Melanoma antigen family C2））、および、
・ＭＵＣ１（ムチン−１）、
または、これらのフラグメントをコードしており、かつ、上記少なくとも１つのｍＲＮＡは、モノシストロニック、バイシストロニックまたはマルチシストロニックである。
【００２１】
驚くべきことに、抗原、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡによってコードされている上述の群の抗原性タンパク質または抗原性ペプチド、の特定の組み合わせは、肺癌の治療、好ましくは、非小細胞肺癌の治療、およびそれに関連した疾患または障害の治療、を可能にする（適応）免疫システムを効果的に刺激することが可能である。本発明に係る抗原の組み合わせが、単一の組成物として適用されるか、または個々の抗原の別々の投与によって適用されるかにかかわらず、上述の疾患および障害の治療に対して有益な効果が達成される。従って、本明細書に記載されている抗原の任意の組み合わせ、例えば、６つに分けられたｍＲＮＡの調合形態のものは、まさに同一の目的を満たし、かつ、所望の効果を達成するであろう。そのようなワクチン接種の戦略への応答者の数は、他のアプローチと比較して顕著に増加することが期待される。本明細書において、用語、抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドは、同義語として使用されるであろう。本発明に関し、発明の組成物は、免疫反応、好ましくは、組成物に含まれる成分の少なくとも１つに起因して、または、むしろ、組成物の少なくとも１つの成分によって、すなわち、上記で規定された抗原をコードしている少なくとも１つのｍＲＮＡによって、コードされている抗原の少なくとも１つに起因して、本明細書で規定される適応免疫反応を誘発することができる組成物としてさらに理解されるであろう。本発明によると、抗原の組み合わせは、別々に投与されるか（例えば、同時に）、または単一の組成物として投与されるかにかかわらず、所望の免疫反応を誘発することができる。別々の投与とは、異なるｍＲＮＡが、実質的に同時であるように、例えば１０分以内であるか、または、延長期間を超えて、例えば、３０分より長く、時間差があることを意味してもよい。
【００２２】
以下において、本発明に係る抗原の組み合わせは、抗原の組み合わせをコードしている少なくとも１つのｍＲＮＡを含む組成物の記述によって示されるであろう。本発明に係る少なくとも１つのｍＲＮＡは、それが１つの単一組成物として投与されるか、または別々の調合の形態、例えば、それぞれが１つの抗原をコードし、かつ別々に（例えば、同時に）投与される６つの別々のｍＲＮＡとして調合されている形態で投与されるかにかかわらず、本明細書に記載されている特徴によって特徴づけられることが理解される。
【００２３】
本発明によると、肺癌細胞で発現される多くの抗原の中で、本明細書で規定される６つの抗原、すなわち、５Ｔ４、サバイビン、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２およびＭＵＣ１が選択された。これらの抗原は、免疫療法において可能性のある標的として特定された。本発明によると、上記の抗原の１つ以上は、少なくとも１つのｍＲＮＡによって与えられた少なくとも１つのＯＲＦ／コード領域／コード配列によってコードされている。これに関し、メッセンジャーＲＮＡは、典型的な一本鎖ＲＮＡであり、当該一本鎖ＲＮＡは、（少なくとも）いくつかの構造要素、例えば、任意の５’ＵＴＲ領域、コード領域が後に続く上流側に位置するリボソーム結合サイト、任意の３’ＵＴＲ領域から構成されている。当該任意の３’ＵＴＲ領域は、ポリＡテール（および／またはポリＣテール）が後に続いてもよい。本発明によると、組成物は、上記で規定された少なくとも６つの抗原をコードしている少なくとも１つのｍＲＮＡを含む。その点で、上記組成物それ自体が、上記で規定された少なくとも６つの抗原を与える限り、１つのｍＲＮＡが、１つ以上の抗原をコードしてもよい。従って、組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、１つより多いＯＲＦ／コード領域／コード配列を含んでもよく、組成物は、全体として、上記で規定された少なくとも６つの各抗原のための少なくとも１つのコード領域を含む。あるいは、少なくとも６つの各抗原のためのコード領域は、組成物の別々のｍＲＮＡ上に配置されてもよい。少なくとも１つのｍＲＮＡのためのさらに好ましい実施形態は、下記で提供される。
【００２４】
本発明によると、組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、５Ｔ４をコードしている。“５Ｔ４”は、栄養芽層糖タンパク質である。ヒト胎児腫瘍性抗原５Ｔ４は、７２ｋＤａのロイシンリッチ膜糖タンパク質であり、当該ロイシンリッチ膜糖タンパク質は、胎盤において、また、結腸直腸癌、胃癌、腎癌および卵巣癌を含むヒトカルチノーマの広範囲においても高レベルで発現されるが、正常な組織では発現されることは稀であることを、Harrop, Connolly et al. (2006)は報告した（Harrop, R., N. Connolly, et al. (2006). "Vaccination of colorectal cancer patients with modified Vaccinia Ankara delivering the tumor antigen 5T4 (TroVax) induces immune responses which correlate with disease control: a phase I/II trial." Clin Cancer Res 12(11 Pt 1): 3416-24を参照）。５Ｔ４の過剰発現は、結腸直腸癌、胃癌および卵巣癌に罹った患者の予後不良に関連している。そのような複合的な因子にもかかわらず、５Ｔ４特異的細胞免疫反応および／または５Ｔ４特異的体液性免疫反応は、ＴｒｏＶａｘ免疫法に従った患者の大多数（１７分の１６、９４％）で誘発された。これは、他の多くの癌免疫治療試験と比較して有望である。要約すると、これらは、筋肉内投与経路および皮内投与経路を介して送達されたＴｒｏＶａｘの安全性および免疫抗原性を示した。Zhao and Wang (2007) (Zhao, Y. and Y. Wang (2007). "5T4 oncotrophoblast glycoprotein: janus molecule in life and a novel potential target against tumors." Cell Mol Immunol 4(2): 99-104)は、５Ｔ４栄養芽層糖タンパク質は、胚組織および種々の悪性腫瘍細胞表面上で発現された膜貫通タンパク質であることを報告した。それは、胚発生間の細胞大移動、移植に関連する細胞浸潤、および腫瘍形成の進行における腫瘍転移を含む生物学的プロセスおよび病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たしている。Kopreski, Benko et al. (2001)によると、５Ｔ４は、癌治療のための可能性のある標的を与える上皮悪性腫瘍で頻繁に過剰発現される栄養芽層糖タンパク質である（Kopreski, M. S., F. A. Benko, et al. (2001). "Circulating RNA as a tumor marker: detection of 5T4 mRNA in breast and lung cancer patient serum." Ann N Y Acad Sci 945: 172-8を参照）。血清は、進行性乳癌（５人の患者）または非小細胞肺癌（１４人の患者）に罹った１９人の患者から収集され、また、増幅可能なＲＮＡを有する２５人の正常な対照実験志願者から収集された。血清から抽出されたＲＮＡは、ゲル電気泳動によって検出された生成物で、ヘミネステッド二段階反応（heminested, two-stage reactions）を用いてＲＴ−ＰＣＲ増幅された。５Ｔ４のｍＲＮＡは、２／５の乳癌患者の血清と６／１４の肺癌患者の血清とを含む８／１９（４２％）の癌患者の血清において再現可能で検出されたが、対照実験の正常な血清では、３／２５（１２％）で検出された（ｐ＝０．０３５）。
【００２５】
この発明に関し、５Ｔ４抗原をコードしている少なくとも１つのｍＲＮＡの好ましい配列は、図３に示されているコード配列（配列番号２）、より好ましくは、図４に示されているコード配列（配列番号３）を含んでもよい。さらにより好ましくは、少なくとも１つのｍＲＮＡは、図１または２に示されている配列（配列番号１または１９）を含むか、または、図１または２に示されている配列（配列番号１または１９）からなる。さらに好ましい実施形態によると、組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、代わりに、５Ｔ４のフラグメント、変異体またはエピトープから選択される５Ｔ４抗原をコードしてもよく、ここで、少なくとも１つのｍＲＮＡは、図１、２、３または４の何れか１つで示される配列（配列番号１、２、３または１９）のフラグメントまたは変異体を含む。
【００２６】
なお、少なくとも１つのｍＲＮＡは、好ましくは、図２８に示されているアミノ酸配列（配列番号７５）をコードしている配列、または、そのフラグメント、変異体もしくはエピトープを含む。
【００２７】
組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、サバイビンをさらにコードしている。“サバイビン”は、バキュロウイルスＩＡＰ反復含有タンパク質５（サバイビン）である。Grube, Moritz et al. (2007)は、サバイビンを説明した（Grube, M., S. Moritz, et al. (2007). "CD8+ T cells reactive to survivin antigen in patients with multiple myeloma." Clin Cancer Res 13(3): 1053-60を参照）。サバイビンは、アポトーシス阻害分子ファミリーのメンバーであり、種々のタイプの悪性腫瘍で過剰発現される。サバイビンのエピトープを認識する細胞障害性Ｔ細胞が、白血病、乳癌およびメラノーマに罹った患者におけるワクチン接種によってインビトロで誘発され得る。サバイビン特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が、複数の骨髄腫を有する患者で発生したかどうかが調査され、ＨＬＡ−Ａ２.１−結合サバイビンペプチドを認識するＴ細胞が、患者２３人中９人で検出され、健康な志願者では、２１人中１人で検出された。サバイビン反応性Ｔ細胞は、最終分化エフェクターＴ細胞（ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、およびＣＣＲ７−）として特定された。骨髄標本における骨髄腫細胞の陽性のサバイビン発現が、患者１１人中７人で示された。サバイビンは、上皮由来および造血由来の、ヒトのほとんどの癌細胞で多く発現され、過剰発現は、癌の進行、予後不良、抵抗力、および患者の短い生存と関連している。Duffy, O’Donovan (2007)は、サバイビンが、１６．５ｋＤａのタンパク質であり、当該タンパク質は、ほとんどの悪性腫瘍において過剰発現するが、生体の分化した正常な組織では検出されることが稀であることを説明した（Duffy, M. J., N. O'Donovan, et al. (2007). "Survivin: a promising tumor biomarker." Cancer Lett 249(1): 49-60を参照）。機能的に、サバイビンは、アポトーシスを阻害し、細胞増殖を促進し、かつ、血管形成を増強することが示された。これらのプロセスにおけるその役割と一致して、サバイビンは、癌の進行において重要な役割を果たしているものとして説明された。正常組織と悪性組織との間の、発現における大きな差異、および癌の進行におけるその因果的役割のために、現在、サバイビンは、可能性のある腫瘍マーカーとして集中的に研究されている。新しく出てきたデータは、サバイビンの測定が、膀胱癌の早期診断を援助し、複数の癌のタイプにおいて予後を決定し、かつ、種々の抗癌療法に対する反応を予測し得ることを示唆している。Zeis, Siegel et al. (2003)は、サバイビンＲＮＡが形質移入された自己由来の樹状細胞を用いた刺激によってＰＢＭＣから発生したヒトサバイビン特異的ＣＴＬｓが、急性骨髄性白血病に罹った患者から単離された種々の造血悪性細胞株および原発腫瘍細胞に対して細胞障害性であったことを証明した（Zeis, M., S. Siegel, et al. (2003). "Generation of cytotoxic responses in mice and human individuals against hematological malignancies using survivin-RNA-transfected dendritic cells." J Immunol 170(11): 5391-7を参照）。また、サバイビンＲＮＡ形質移入樹状細胞を用いた、マウスのワクチン接種が、サバイビン発現リンパ腫による攻撃に対する長期の抵抗に導くことが示され、腫瘍拒絶抗原（tumor rejection Ag）としてのサバイビンの可能性を証明した。
【００２８】
この発明に関し、サバイビンをコードしている少なくとも１つのｍＲＮＡの好ましい配列は、図７に示されているコード配列（配列番号５）、より好ましくは、図８に示されているコード配列（配列番号６）を含む。さらにより好ましくは、少なくとも１つのｍＲＮＡは、図５または６に示されている配列（配列番号４または２０）を含むか、または、図５または６に示されている配列（配列番号４または２０）からなる。さらに好ましい実施形態によると、組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、代わりに、サバイビンのフラグメント、変異体またはエピトープから選択されるサバイビン抗原をコードし、ここで、少なくとも１つのｍＲＮＡは、図５、６、７または８の何れか１つで示される配列（配列番号４、５、６または２０）のフラグメントまたは変異体を含む。
【００２９】
なお、少なくとも１つのｍＲＮＡは、好ましくは、図２９または３０で示されるアミノ酸配列をコードしている配列（配列番号７６または７７）、または、そのフラグメント、変異体もしくはエピトープを含む。
【００３０】
組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、ＮＹ−ＥＳＯ−１をさらにコードしている。“ＮＹ−ＥＳＯ−１”は、癌／精巣抗原１Ｂである。メラノーマで２３／６７、卵巣癌で２／８、乳癌で１０／３３、甲状腺癌で２／５、前立腺癌で４／１６、膀胱癌で４／５、大腸癌で０／１６、バーキットリンパ腫で１／２、グリオーマで０／１５、基底細胞癌で０／２、胃がんで０／１２、平滑筋肉腫で０／２、肺癌で２／１２、他の肉腫で０／２、腎癌で０／１０、膵臓癌で０／２、リンパ腫で０／１０、セミノーマで０／１、肝癌で２／７、脊髄腫瘍で０／１、ＲＴ−ＰＣＲにより発見し、種々のヒト腫瘍におけるＮＹ−ＥＳＯ−１のｍＲＮＡ発現を、Chen, Scanlan et al. (1997)は報告した（Chen, Y. T., M. J. Scanlan, et al. (1997). "A testicular antigen aberrantly expressed in human cancers detected by autologous antibody screening." Proc Natl Acad Sci U S A 94(5): 1914-8を参照）。Jager, Karbach et al. (2006)は、ＮＹ−ＥＳＯ−１が、種々のヒト悪性腫瘍で発現される癌／精巣抗原であることを報告し、ＮＹ−ＥＳＯ−１を標的とする多くのワクチン戦略が開発されてきたことを報告した（Jager, E., J. Karbach, et al. (2006). "Recombinant vaccinia/fowlpox NY-ESO-1 vaccines induce both humoral and cellular NY-ESO-1-specific immune responses in cancer patients." Proc Natl Acad Sci U S A 103(39): 14453-8を参照）。この公開された研究において、組換えワクシニアＮＹ−ＥＳＯ−１（recombinant vaccinia-NY-ESO-1）の安全性および免疫抗原性、ならびに組換え鶏痘ＮＹ−ＥＳＯ−１の安全性および免疫抗原性は、種々の異なる腫瘍型を有する一連の３６人の患者において分析された。各々の構成物は、最初に、２つの異なる投与量レベルで個別に試験され、次に、組換えワクシニアＮＹ−ＥＳＯ−１を用い、組換え鶏痘ＮＹ−ＥＳＯ−１が後に続くプライムブースト法の設定で試験された。ワクチンは、個別でも、または一緒であっても、良好な忍容性を示した。広範囲のＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープに向けられたＮＹ−ＥＳＯ−１特異的抗体反応ならびに／またはＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＣＤ８およびＣＤ４Ｔ細胞反応は、月１回の間隔をおいた少なくとも４回のワクチン接種の過程によって、患者の高い割合で誘発された。ワクチン接種された５人の患者に由来するＣＤ８Ｔ細胞クローンは、ＮＹ−ＥＳＯ−１発現性メラノーマの標的細胞を溶解することが示された。メラノーマを有するいくらかの患者において、疾患の自然経過は、順調にワクチン接種の影響を受けていたという強い印象があった。Davis, Chen et al. (2004)は、皮内注射されたＨＬＡ−Ａ２制限ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドは、安全であり、かつ、免疫抗原性を有することが示されたことを、報告した（Davis, I. D., W. Chen, et al. (2004). "Recombinant NY-ESO-1 protein with ISCOMATRIX adjuvant induces broad integrated antibody and CD4(+) and CD8(+) T cell responses in humans." Proc Natl Acad Sci U S A 101(29): 10697-702）。これらの試みは、安全性および免疫抗原性を決定するためだけに設計されたが、いくらかの患者では、腫瘍の退縮、および疾患の安定化を示した。切除されたＮＹ−ＥＳＯ−１発現性メラノーマを有する患者において、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸアジュバント（CSL Ltd., Parkville, オーストラリア、ビクトリア）と組み合わせた組換えＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質で免疫処置をした後に、抗体およびＣＤ４Ｔ細胞およびＣＤ８���細胞を含む広範なＮＹ−ＥＳＯ−１特異的免疫反応が見られたことが、Jager, Gnjatic et al. (2000)によってさらに表明された（Jager, E., S. Gnjatic, et al. (2000). "Induction of primary NY-ESO-1 immunity: CD8+ T lymphocyte and antibody responses in peptide-vaccinated patients with NY-ESO-1+ cancers." Proc Natl Acad Sci U S A 97(22): 12198-203を参照）。ワクチンに対するこの免疫反応は、長期の無病生存率に関連付けられるように思われた。なお、Odunsi, Qian et al. (2007)は、ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドを用いたワクチン接種が、卵巣癌における統合された体液性およびＴ細胞の反応（integrated humoral and T cell responses）を誘発することを報告した（Odunsi, K., F. Qian, et al. (2007). "Vaccination with an NY-ESO-1 peptide of HLA class I/II specificities induces integrated humoral and T cell responses in ovarian cancer." Proc Natl Acad Sci U S A 104(31): 12837-42を参照）。
【００３１】
本発明に関し、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡの好ましい配列は、図１１に示されているコード配列（配列番号８）、より好ましくは、図１２に示されているコード配列（配列番号９）を含んでもよい。さらにより好ましくは、少なくとも１つのｍＲＮＡは、図９または１０に示されている配列（配列番号７または２１）を含むか、または、少なくとも１つのｍＲＮＡは、図９または１０に示されている配列（配列番号７または２１）からなる。さらに好ましい実施形態によると、組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、代わりに、ＮＹ−ＥＳＯ−１のフラグメント、変異体またはエピトープから選択されるＮＹ−ＥＳＯ−１抗原をコードしてもよく、ここで、少なくとも１つのｍＲＮＡは、図９、１０、１１または１２の何れか１つで示される配列（配列番号７、８、９または２１）のフラグメントまたは変異体を含む。
【００３２】
なお、少なくとも１つのｍＲＮＡは、好ましくは、図３１に示されているアミノ酸配列（配列番号７８）をコードしている配列、または、そのフラグメント、変異体もしくはエピトープを含む。
【００３３】
組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、ＭＡＧＥ−Ｃ１をさらにコードしている。“ＭＡＧＥ−Ｃ１”は、メラノーマ抗原ファミリーＣ１である。Lucas, De Smet et al. (1998)は、最近、ＲＤＡを実施することにより、ＭＡＧＥ−Ｃ１を特定した（Lucas, S., C. De Smet, et al. (1998). "Identification of a new MAGE gene with tumor-specific expression by representational difference analysis." Cancer Res 58(4): 743-52を参照）。ＭＡＧＥ−Ｃ１は、精巣を除いて試験された正常な組織のパネルでは発現されなかった。腫瘍サンプルのうち、ＭＡＧＥ−Ｃ１は、セミノーマ、メラノーマ、および膀胱癌では頻繁に発現された。また、それは、頭頸部癌、乳癌、非小肺癌、前立腺腺癌および肉腫のかなりの割合で発現された。Jungbluth, Chen et al. (2002)は、乳癌、卵巣癌、肝臓癌、精巣癌、膀胱癌、メラノーマおよび非小細胞肺癌（３９％）における発現について記載した（Jungbluth, A. A., Y. T. Chen, et al. (2002). "CT7 (MAGE-C1) antigen expression in normal and neoplastic tissues." Int J Cancer 99(6): 839-45を参照）。Gure, Chua et al. (2005)は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の５２３人の患者からの腫瘍を、癌−精巣抗原の発現に関して分析した（Gure, A. O., R. Chua, et al. (2005). "Cancer-testis genes are coordinately expressed and are markers of poor outcome in non-small cell lung cancer." Clin Cancer Res 11(22): 8055-62を参照）。ＭＡＧＥ−Ｃ１は、１８．８％存在した。Scanlan, Altorki et al. (2000)は、３３例の非小細胞肺癌におけるＣＴ抗原の発現をさらに報告した：ＭＡＧＥ−Ｃ１：３０％（Scanlan, M. J., N. K. Altorki, et al. (2000). "Expression of cancer-testis antigens in lung cancer: definition of bromodomain testis-specific gene (BRDT) as a new CT gene, CT9." Cancer Lett 150(2): 155-64を参照）。
【００３４】
本発明に関し、ＭＡＧＥ−Ｃ１抗原をコードしている少なくとも１つのｍＲＮＡの好ましい配列は、図１５に示されているコード配列（配列番号１１）、より好ましくは、図１６に示されているコード配列（配列番号１２）、または、さらにより好ましくは、図１７に示されているコード配列（配列番号２５）を含んでもよい。さらにより好ましくは、少なくとも１つのｍＲＮＡは、図１３または１４で示される配列（配列番号１０または２２）を含むか、または、図１３または１４で示される配列（配列番号１０または２２）からなる。さらに好ましい実施形態によると、組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、代わりに、ＭＡＧＥ−Ｃ１のフラグメント、変異体またはエピトープから選択されるＭＡＧＥ−Ｃ１抗原をコードしてもよく、ここで、少なくとも１つのｍＲＮＡは、図１３、１４、１５、１６または１７の何れか１つで示される配列（配列番号１０、１１、１２、２２または２５）のフラグメントまたは変異体を含む。
【００３５】
なお、少なくとも１つのｍＲＮＡは、好ましくは、図３２に示されているアミノ酸配列（配列番号７９）をコードしている配列、または、そのフラグメント、変異体もしくはエピトープを含む。
【００３６】
組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、ＭＡＧＥ−Ｃ２をさらにコードしている。“ＭＡＧＥ−２”は、メラノーマ抗原ファミリーＣ２である。Lucas, De Plaen et al. (2000)は、最近、メラノーマ細胞株においてＲＤＡを実施することにより、ＭＡＧＥ−Ｃ２を特定した（Lucas, S., E. De Plaen, et al. (2000). "MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-C2, and MAGE-C3: four new members of the MAGE family with tumor-specific expression." Int J Cancer 87(1): 55-60を参照）。ＭＡＧＥ−Ｃ２は、精巣を除いて試験された正常な組織のパネルでは発現されなかった。腫瘍サンプルのうち、ＭＡＧＥ−Ｃ２は、セミノーマ、メラノーマ、および膀胱癌では頻繁に発現された。また、それは、頭頸部癌、乳癌、非小肺癌および肉腫のかなりの割合で発現された。Scanlan, Altorki et al. (2000)は、３３例の非小細胞肺癌におけるＣＴ抗原の発現を報告した：ＭＡＧＥ−Ｃ２：３０％（Scanlan, M. J., N. K. Altorki, et al. (2000). "Expression of cancer-testis antigens in lung cancer: definition of bromodomain testis-specific gene (BRDT) as a new CT gene, CT9." Cancer Lett 150(2): 155-64を参照）。
【００３７】
この発明に関し、ＭＡＧＥ−Ｃ２抗原をコードしている少なくとも１つのｍＲＮＡの好ましい配列は、図２０に示されているコード配列（配列番号１４）、より好ましくは、図２１に示されているコード配列（配列番号１５）を含んでもよい。さらにより好ましくは、少なくとも１つのｍＲＮＡは、図１８または１９で示される配列（配列番号１３または２３）を含むか、または、図１８または１９で示される配列（配列番号１３または２３）からなる。さらに好ましい実施形態によると、組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、代わりに、ＭＡＧＥ−Ｃ２のフラグメント、変異体またはエピトープから選択されるＭＡＧＥ−Ｃ２抗原をコードしてもよく、ここで、少なくとも１つのｍＲＮＡは、図１８、１９、２０または２１の何れか１つで示される配列（配列番号１３、１４、１５または２３）のフラグメントまたは変異体を含む。
【００３８】
なお、少なくとも１つのｍＲＮＡは、好ましくは、図３３に示されているアミノ酸配列（配列番号８０）をコードしている配列、または、そのフラグメント、変異体もしくはエピトープを含む。
【００３９】
最後に、組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、ＭＵＣ１をコードしている。“ＭＵＣ１”は、ムチン−１である。癌関連ムチンは、内皮細胞表面への悪性細胞の接着を容易にすることにより、転移を促進すると考えられている。Denda-Nagai and Irimura (2000)によると（Denda-Nagai, K. and T. Irimura (2000). "MUC1 in carcinoma-host interactions." Glycoconj J 17(7-9): 649-58）、ＭＵＣ−１は、乳房、肺、膵臓、前立腺、胃、結腸および卵巣を含む全てのアデノカルチノーマのうちの９０％で過剰発現される。Kontani, Taguchi et al. (2001)は、ＭＵＣ−１が、６０％の肺癌で発現されていることが認められることを発見し（Kontani, K., O. Taguchi, et al. (2001). "Modulation of MUC1 mucin as an escape mechanism of breast cancer cells from autologous cytotoxic T-lymphocytes." Br J Cancer 84(9): 1258-64を参照）、一方で、Kontani, Taguchi et al. (2003)は、ＭＵＣ１陽性癌における細胞免疫を誘導するために、ＭＵＣ１抗原パルスＤＣの使用を分析する研究において、臨床的に、９分の７のＭＵＣ−１陽性患者が、腫瘍マーカーレベルの低下、または悪性胸水の消失のいずれかを伴った治療に反応したことを発見した（Kontani, K., O. Taguchi, et al. (2003). "Dendritic cell vaccine immunotherapy of cancer targeting MUC1 mucin." Int J Mol Med 12(4): 493-502を参照）。これらの反応する患者のうちの３人は、ＮＳＣＬＣに罹っていた。Palmer, Parker et al. (2001)は、ステージＩＩＩ／ＩＶのＮＳＣＬＣにおいてＭＵＣ１ペプチドを使用した第１期臨床試験において、この薬剤の安全性および忍容性が確立されたことを報告した（Palmer, M., J. Parker, et al. (2001). "Phase I study of the BLP25 (MUC1 peptide) liposomal vaccine for active specific immunotherapy in stage IIIB/IV non-small-cell lung cancer." Clin Lung Cancer 3(1): 49-57; discussion 58を参照）。１２分の５の患者（４２％）は、免疫反応を示し、１２分の４の患者（３３％）は、安定した病状になった。Wierecky, Mueller et al. (2006)は、種々の血液学的悪性腫瘍および上皮悪性腫瘍で過剰発現されるＴＡＡ  ＭＵＣ１の２つのＨＬＡ−Ａ２結合新規９ｍｅｒペプチドをさらに特定した（Wierecky, J., M. Mueller, et al. (2006). "Dendritic cell-based cancer immunotherapy targeting MUC-1." Cancer Immunol Immunother 55(1): 63-7を参照）。これらのペプチドを用いてＤＣをパルスした後に生じた細胞障害性Ｔ細胞は、ＭＵＣ１を発現する腫瘍細胞の溶解を、抗原特異的およびＨＬＡ制限的に誘導することができた。２つの臨床研究では、ＭＵＣ１由来ペプチドパルスＤＣを用いた、進行癌に罹った患者のワクチン接種は、深刻な副作用無しで、良好な忍容性を示し、かつ、免疫反応を誘導することができることが実証された。転移性腎細胞癌に罹った２０人の患者のうち、６人の患者が、３例の客観的反応を伴った転移の退縮を示した（１ＣＲ、２ＰＲ）。
【００４０】
この発明に関し、ＭＵＣ１抗原をコードしている少なくとも１つのｍＲＮＡの好ましい配列は、図２４または３６に示されるコード配列（配列番号１７または８３）、より好ましくは、図２５に示されているコード配列（配列番号１８）を含んでもよい。さらにより好ましくは、少なくとも１つのｍＲＮＡは、図２２または２３で示される配列（配列番号１６または２４）を含むか、または、図２２または２３で示される配列（配列番号１６または２４）からなる。さらに好ましい実施形態によると、組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、代わりに、ＭＵＣ１のフラグメント、変異体またはエピトープから選択されるＭＵＣ１抗原をコードしてもよく、ここで、少なくとも１つのｍＲＮＡは、図２２、２４、２５、２３または３６の何れか１つで示される配列（配列番号１６、１７、１８、２４または８３）のフラグメントまたは変異体を含む。
【００４１】
なお、少なくとも１つのｍＲＮＡは、好ましくは、図３４または３５に示されているアミノ酸配列（配列番号８１または８２）をコードしている配列、または、そのフラグメント、変異体もしくはエピトープを含む。
【００４２】
本発明に関し、抗原、または、そのフラグメント、エピトープもしくは変異体を参照する場合、当該参照は、本発明で提供されるｍＲＮＡ配列のうちの１つ以上によってコードされている抗原またはペプチドに関係している。なお、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡによってコードされている上記で規定された抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドは、それらの配列のフラグメントまたは変異体を含んでもよい。そのようなフラグメントまたは変異体は、通常、核酸レベルもしくはアミノ酸レベルのいずれかで、野生型の全配列に対して少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、好ましくは、少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８０％、同程度により好ましくは、少なくとも８５％、さらにより好ましくは、少なくとも９０％、最も好ましくは、少なくとも９５％、もしくは、さらに９７％の上述された抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドまたは抗原性配列またはこれらコード核酸配列のうちの１つに配列相同性を有する配列を含んでもよい。
【００４３】
本発明に関する抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドの“フラグメント”は、そのアミノ酸配列（または、そのコードされた核酸配列）に関して、元の（天然の）タンパク質（または、そのコードされた核酸配列）のアミノ酸配列と比較して、Ｎ末端で切断されたか、Ｃ末端で切断されたか、または、配列内で切断された、上記で規定された抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドの配列を含んでもよい。従って、そのような切断は、アミノ酸レベルまたは同様に核酸レベルのいずれかにおいて発生してもよい。従って、上記で規定されたそのようなフラグメントに関する配列相同性は、好ましくは、上記で規定された全ての抗原、抗原性タンパク質もしくは抗原性ペプチドを示すか、または、上記の抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドのすべての（コード）核酸配列を示す。
【００４４】
本発明に関する抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドのフラグメントは、上記で規定された抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドの配列をさらに含んでもよく、当該配列は、約６個から約２０個のアミノ酸の長さ、またはさらに多くのアミノ酸の長さを有し、例えば、ＭＨＣクラスＩ分子によって処理され、かつ提示されるフラグメントであり、好ましくは、約８個から約１０個のアミノ酸、例えば、８個、９個または１０個（または、６個、７個、１１個もしくは１２個のアミノ酸）のアミノ酸の長さを有しているか、または、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって処理され、かつ提示されるフラグメントであり、好ましくは、約１３個以上、例えば１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個以上のアミノ酸の長さを有しており、ここで、これらのフラグメントは、アミノ酸配列の任意の部分から選択されてもよい。これらのフラグメントは、一般的に、ペプチドフラグメントおよびＭＨＣ分子からなる複合体の形態で、Ｔ細胞により認識される。すなわち、フラグメントは、一般的に、これらの元々の形態では認識されない。
【００４５】
また、本明細書で規定される抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドのフラグメントは、それらの抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドのエピトープを含む。本発明に関するエピトープ（“抗原決定基”とも呼ばれる）は、一般的に、本明細書で規定される（天然の）抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドの外部表面上に配置されたフラグメントであり、好ましくは、５個から１５個のアミノ酸を有し、より好ましくは、５個から１２個のアミノ酸を有し、さらにより好ましくは、６個から９個のアミノ酸を有し、抗体、またはＢ細胞の受容体によって認識される、すなわち、これらの元々の形態で認識されてもよい。抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドの上記のエピトープは、上記の抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドの、本明細書で言及される何れかの変異体からさらに選択されてもよい。これに関し、抗原決定基は、立体配置的エピトープ、または非連続的エピトープであり得て、当該エピトープは、本明細書で規定される抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドのセグメントからなり、当該セグメントは、本明細書で規定される抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドのアミノ酸配列において非連続的であるが、三次元構造においてまとめられるか、または、単一のポリペプチド鎖からなる直鎖状エピトープである。
【００４６】
上記で規定された抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドの“変異体”は、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡによってコードされてもよく、ここで、上記で規定された抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドをコードしている少なくとも１つのｍＲＮＡの核酸は交換される。それにより、抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドは、１つ以上の置換されたアミノ酸、挿入されたアミノ酸および／または欠失したアミノ酸などの１つ以上の変異のために元の配列とは異なるアミノ酸配列を有して、生成されてもよい。好ましくは、これらのフラグメントおよび／または変異体は、全長の天然抗原または天然抗原性タンパク質、例えば、その特異的抗原性の性質と比較して、同一の生物学的機能または特異的活性を有する。
【００４７】
また、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、上記で規定された抗原または抗原性タンパク質をコードしており、ここで、コードされたアミノ酸配列は、その生理的配列と比較して保存的なアミノ酸置換を含む。それらのコードされたアミノ酸配列、およびコードしているこれらのヌクレオチド配列は、特に、上記で規定された用語である変異体のうちに入る。同一のクラスに由来するアミノ酸が互いに交換される置換は、保存的置換と呼ばれる。特に、これらは、脂肪族側鎖、正または負に荷電した側鎖、側鎖またはアミノ酸における芳香族基、水素結合の一部となり得る側鎖、例えば、ヒドロキシル官能基を有している側鎖、を有しているアミノ酸である。これは、例えば、極性側鎖を有するアミノ酸が、同様の極性側鎖を有する別のアミノ酸によって置換されるか、または、例えば、疎水性側鎖により特徴づけられるアミノ酸が、同様の疎水性側鎖を有する別のアミノ酸によって置換されること（例えば、スレオニン（セリン）によってセリン（スレオニン）が置換されるか、またはイソロイシン（ロイシン）によってロイシン（イソロイシン）が置換される）を意味する。挿入および置換は、特に、三次元構造に変形をもたらさないそれらの配列位置において、または結合領域に影響を与えないそれらの配列位置において、可能である。挿入または欠失による三次元構造に対する変形は、例えばＣＤスペクトル（円偏光二色性スペクトル）を用いて容易に決定され得る（Urry, 1985, Absorption, Circular Dichroism and ORD of Polypeptides, in: Modern Physical Methods in Biochemistry, Neuberger et al. (ed.), Elsevier, Amsterdam）。
【００４８】
なお、また、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡによってコードされてもよい上記で規定された抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドの変異体は、それらの配列を含んでもよく、ここで、少なくとも１つのｍＲＮＡの核酸は、抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドの各アミノ酸配列の変更を導くことなく、遺伝暗号の縮重によって交換される。すなわち、アミノ酸配列、または、それらの少なくとも一部は、上記の意味の範囲内で、１つ以上の変異において元の配列とは異なってもよい。
【００４９】
なお、また、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡによってコードされてもよい上記で規定された抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドの変異体は、本明細書で規定されたＲＮＡ配列に対応するそれらのＤＮＡ配列を含んでもよく、また、本明細書で規定されたＤＮＡ配列に対応するさらなるＲＮＡ配列を含んでもよい。当業者は、ＤＮＡ配列へのＲＮＡ配列の翻訳（または、逆も同様である）、または、相補鎖配列の作製（すなわち、Ｔ残基を用いて、Ｕ残基を置換することにより、および／または、所定の配列に関する相補鎖を構成することにより）に精通している。
【００５０】
２つの配列（核酸配列、例えば、上記で規定されたＲＮＡ配列もしくはｍＲＮＡ配列、または、アミノ酸配列、好ましくはコードされたこれらのアミノ酸配列、例えば、上記で規定された抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドのアミノ酸配列）が同一であるパーセンテージを決定するために、配列は、その後、互いに比較される目的で整列され得る。第１の配列における位置が、第２の配列における位置の場合と同じ成分によって占有されている場合、２つの位置は、この位置において同一である。２つの配列が同一であるパーセンテージは、位置の総数で割った同一位置の数の関数である。２つの配列が同一であるパーセンテージは、数学的アルゴリズムを用いて決定され得る。使用され得る数学的アルゴリズムの好ましい例ではあるが、限定されない例は、Karlin et al. (1993), PNAS USA, 90:5873-5877のアルゴリズム、または、Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res., 25:3389-3402のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴプログラムで統合される。本発明の配列と、ある程度同一である配列は、このプログラムによって特定され得る。
【００５１】
本明細書で使用される用語“組成物”は、少なくとも１つのｍＲＮＡを示し、必要に応じて、さらなる賦形剤を示す。従って、用語“組成物”は、ｍＲＮＡがモノシストロニック、バイシストロニックまたはマルチシストロニックであるかにかかわらず、上記で規定された抗原をコードしているｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ種）の任意の混合物を含む。また、本発明の意味の範囲内で、用語“組成物”は、上記で規定された６つ全ての抗原をコードしているマルチシストロニックｍＲＮＡからなる実施形態を示す。好ましくは、組成物は、各ｍＲＮＡ種が上記の抗原のうちの１つをコードすることにより、少なくとも６つの異なるｍＲＮＡ種を含む。用語“組成物”は、好ましくは、少なくとも１つの他の好適な物質を伴った少なくとも１つのｍＲＮＡに関する。一般的に、組成物は、医療分野における使用のために設計されている医薬組成物であってもよい。従って、一般的に、組成物は、少なくとも１つのさらなる賦形剤を含み、当該賦形剤は、薬学的に許容されるものであり、例えば、キャリア、ビヒクルなどから選択されてもよい。組成物は、液体組成物または乾燥組成物であってもよい。組成物が液体である場合、それは、少なくとも１つのｍＲＮＡの水溶液または分散液である。“組成物”が乾燥組成物である場合、一般的に、それは、少なくとも１つのｍＲＮＡの乾燥凍結された組成物である。本明細書で使用される用語“組成物”は、さらなる活性成分と組み合わされた本発明の少なくとも１つのｍＲＮＡをさらに示す。好ましくは、組成物は、免疫賦活性組成物、すなわち、少なくとも１つの成分を含む組成物であり、当該成分は、免疫反応を誘導し得るか、または、それから、免疫反応を誘導し得る成分が導きだせる。これに関し、免疫反応は、適応免疫システムの結果、および／または先天性免疫システムの結果であってもよい。
【００５２】
上記抗原の特定の組み合わせが、効果的に（適応）免疫システムを刺激することができ、従って、肺癌の治療、好ましくは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療を可能にすることが見出されたため、本発明に係る組成物は、上記で規定された少なくとも６つの抗原をコードしている少なくとも１つのｍＲＮＡを含む。
【００５３】
要約すると、本発明の目的は、本明細書で規定される抗原の新規な組み合わせをコードしている少なくとも１つのｍＲＮＡを含む組成物を提供することによって解決される。好ましい実施形態では、組成物は、６つの抗原（５Ｔ４（栄養芽層糖タンパク質（Trophoblast glycoprotein）、ＴＰＢＧ）、サバイビン（バキュロウイルスＩＡＰ反復含有タンパク質５（Baculoviral IAP repeat-containing protein 5）、ＢＩＲＣ５）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（ニューヨーク食道扁平上皮細胞癌１（New York esophageal squamous cell carcinoma 1）、ＣＴＡＧ１Ｂ）、ＭＡＧＥ−Ｃ１（メラノーマ抗原ファミリーＣ１（Melanoma antigen family C1））、ＭＡＧＥ−Ｃ２（メラノーマ抗原ファミリーＣ２（Melanoma antigen family C2））、および、ＭＵＣ１（ムチン−１））を含み、当該６つの抗原は、６つのモノシストロニックｍＲＮＡによってコードされ、これら各々のｍＲＮＡは、規定された抗原の群から選択される異なる抗原をコードしている。あるいは、組成物は、モノシストロニックｍＲＮＡ、バイシストロニックｍＲＮＡおよび／またはマルチシストロニックｍＲＮＡの組み合わせ物を含んでもよく、ここで、６つの抗原のうちの１つより多くのものが、バイシストロニックｍＲＮＡまたはマルチシストロニックｍＲＮＡによってコードされている。本発明によると、モノシストロニックｍＲＮＡ、バイシストロニックｍＲＮＡまたはマルチシストロニックｍＲＮＡの任意の組み合わせは、本明細書で規定された６つ全ての抗原をコードしているものが想定され、例えば、各々のバイシストロニックｍＲＮＡが上記の６つの抗原のうち２つをコードしている３つのバイシストロニックｍＲＮＡ、または、２つのバイシストロニックｍＲＮＡおよび２つのモノシストロニックｍＲＮＡが想定される。
【００５４】
好ましい実施形態によると、組成物は、少なくとも１つのｍＲＮＡを含み、当該少なくとも１つのｍＲＮＡは、配列番号２、５、８、１１、１４または１７のＲＮＡ配列と同一または少なくとも８０％同一であるＲＮＡ配列から選択される少なくとも１つのコード配列を含む。さらにより好ましくは、組成物は、６つのｍＲＮＡを含み、ここで、各々のｍＲＮＡにおけるコード配列は、配列番号２、５、８、１１、１４または１７のＲＮＡ配列のうちの１つと同一または少なくとも８０％同一である。
【００５５】
好ましい実施形態において、本発明の組成物の少なくとも６つの各抗原は、１つの（モノシストロニック）ｍＲＮＡによってコードされていてもよい。言い換えると、本発明の組成物は、６つの（モノシストロニック）ｍＲＮＡを含んでもよく、これら６つの各々の（モノシストロニック）ｍＲＮＡは、上記で規定されたただ１つの抗原をコードしていればよい。
【００５６】
より好ましい実施形態において、組成物は、６つのｍＲＮＡを含み、ここで、それぞれのｍＲＮＡにおいて、１つのｍＲＮＡは、５Ｔ４（配列番号７５）をコードしており、１つのｍＲＮＡは、サバイビン（配列番号７６または７７）をコードしており、１つのｍＲＮＡは、ＮＹ−ＥＳＯ−１（配列番号７８）をコードしており、１つのｍＲＮＡは、ＭＡＧＥ−Ｃ１（配列番号７９）をコードしており、１つのｍＲＮＡは、ＭＡＧＥ−Ｃ２（配列番号８０）をコードしており、また、１つのｍＲＮＡは、ＭＵＣ１（配列番号８１もしくは８２）、または、それらのフラグメントもしくは変異体をコードしている。
【００５７】
さらにより好ましい実施形態において、組成物は、６つのｍＲＮＡ、および、必要に応じて、さらなる賦形剤を含み、ここで、１つのｍＲＮＡは、５Ｔ４をコードし、かつ、配列番号２と同一または少なくとも８０％同一のコード配列を含み、１つのｍＲＮＡは、サバイビンをコードし、かつ、配列番号５と同一または少なくとも８０％同一のコード配列を含み、１つのｍＲＮＡは、ＮＹ−ＥＳＯ−１をコードし、かつ、配列番号８と同一または少なくとも８０％同一のコード配列を含み、１つのｍＲＮＡは、ＭＡＧＥ−Ｃ１をコードし、かつ、配列番号１１と同一または少なくとも８０％同一のコード配列を含み、１つのｍＲＮＡは、ＭＡＧＥ−Ｃ２をコードし、かつ、配列番号１４と同一または少なくとも８０％同一のコード配列を含み、また、１つのｍＲＮＡは、ＭＵＣ１をコードし、かつ、配列番号１７と同一または少なくとも８０％同一のコード配列（または、これらの各配列のフラグメントもしくは変異体）を含む。
【００５８】
さらにより好ましい実施形態において、組成物は、６つのｍＲＮＡを含み、ここで、それぞれのｍＲＮＡにおいて、１つのｍＲＮＡは、５Ｔ４をコードし、かつ、配列番号２のコード配列を含み、１つのｍＲＮＡは、サバイビンをコードし、かつ、配列番号５のコード配列を含み、１つのｍＲＮＡは、ＮＹ−ＥＳＯ−１をコードし、かつ、配列番号８のコード配列を含み、１つのｍＲＮＡは、ＭＡＧＥ−Ｃ１をコードし、かつ、配列番号１１のコード配列を含み、１つのｍＲＮＡは、ＭＡＧＥ−Ｃ２をコードし、かつ、配列番号１４のコード配列を含み、また、１つのｍＲＮＡは、ＭＵＣ１をコードし、かつ、配列番号１７のコード配列、または、それのフラグメントを含む。
【００５９】
特定の好ましい実施形態、発明によると、組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、３’ＵＴＲ領域にヒストンステムループを含む。好ましくは、組成物は、６つのｍＲＮＡを含み、ここで、各ｍＲＮＡは、上記で規定されたヒストンステムループを含む。
【００６０】
別の特に好ましい実施形態によると、本発明の組成物は、（少なくとも）１つのバイシストロニックｍＲＮＡまたはマルチシストロニックｍＲＮＡ、すなわち、本発明に係る６つの抗原のうちの２つ以上のコード配列を運ぶ（少なくとも）１つのｍＲＮＡを含む。（少なくとも）１つのバイシストロニックｍＲＮＡまたはマルチシストロニックｍＲＮＡに属する２つ以上の抗原の上記コード配列は、下記で規定される少なくとも１つのＩＲＥＳ（内部リボソーム進入サイト）配列によって隔離されてもよい。従って、用語“２つ以上の抗原をコードする”は、それに限定されることなく、（少なくとも）１つの（バイシストロニックまたはマルチシストロニック）ｍＲＮＡが、例えば、上記の定義の範囲内で、上記で言及された抗原の少なくとも２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つの（好ましくは、異なる）抗原、またはこれらのフラグメントもしくは変異体をコードしてもよいことを意味し得る。より好ましくは、それに限定されることなく、（少なくとも）１つの（バイシストロニックまたはマルチシストロニック）ｍＲＮＡは、例えば、上記の定義の範囲内で、上記で言及された抗原の少なくとも２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つの（好ましくは、異なる）抗原、または、これらのフラグメントもしくは変異体をコードしてもよい。これに関し、上記で規定された、いわゆるＩＲＥＳ（内部リボソーム進入サイト）配列は、単独のリボソーム結合サイトとして機能することができるが、また、それは、いくつかのタンパク質をコードしている上記で規定されたバイシストロニックｍＲＮＡまたはマルチシストロニックｍＲＮＡを供給するように機能することができ、当該バイシストロニックｍＲＮＡまたはマルチシストロニックｍＲＮＡは、互いに独立してリボソームによって翻訳される。本発明によって使用され得るＩＲＥＳ配列の例は、ピコルナウイルス（例えばＦＭＤＶ）、ペスチウイルス（ＣＦＦＶ）、ポリオウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）またはコオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）からのＩＲＥＳ配列である。
【００６１】
さらなる特に好ましい実施形態によると、本発明の組成物は、上記で規定された少なくとも１つのモノシストロニックｍＲＮＡの混合物と、上記で規定された少なくとも１つのバイシストロニックｍＲＮＡまたはマルチシストロニックｍＲＮＡとを含んでもよい。少なくとも１つのモノシストロニックｍＲＮＡ、および／または、少なくとも１つのバイシストロニックｍＲＮＡもしくはマルチシストロニックｍＲＮＡは、好ましくは、上記の定義の範囲内の種々の抗原またはこれらのフラグメントもしくは変異体をコードしている。しかし、また、少なくとも１つのモノシストロニックｍＲＮＡ、および少なくとも１つのバイシストロニックｍＲＮＡまたはマルチシストロニックｍＲＮＡは、本発明の組成物が全体として上記で規定された６つの抗原を供給するという条件で、好ましくは、上記で言及された抗原から選択される（部分的に）同一の抗原をコードしてもよい。当該抗原のうちの１つ以上の複数のコピーを備えることにより、上記の１つ以上の抗原の相対的なタンパク質量が増加し得る。すなわち、６つの各抗原の量間の比は、調整され得る。さらに、上記の実施形態は、本発明の組成物を、それを必要としている患者に、時間をずらして、例えば、時間依存的に投与することに対して有益であり得る。本発明に係る上記の組成物の成分、特に、少なくとも６つの抗原をコードしている種々のｍＲＮＡは、例えば、パーツ組成物のキット（の種々のパーツ）に含まれてもよく、または、例えば、本発明に係る種々の組成物の成分として、別々に投与されてもよい。
【００６２】
好ましくは、６つの抗原のうちの少なくとも１つをコードしている、組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、一般的に、約５０ヌクレオチドから約２００００ヌクレオチドの長さ、または、約１００ヌクレオチドから約２００００ヌクレオチドの長さ、好ましくは、約２５０ヌクレオチドから約２００００ヌクレオチドの長さ、より好ましくは、約５００ヌクレオチドから約１００００ヌクレオチドの長さ、さらにより好ましくは、約５００ヌクレオチドから約５０００ヌクレオチドの長さを含む。
【００６３】
一実施形態によると、６つの抗原のうちの少なくとも１つをコードしている、組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、修飾されたｍＲＮＡの形態のものであり、本明細書で規定される任意の修飾は、組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡに導入されてもよい。本明細書で規定される修飾は、好ましくは、本発明の組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡを安定化に導く。
【００６４】
従って、一実施形態によると、本発明の組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、“安定化ｍＲＮＡ”として提供されてもよく、当該安定化ｍＲＮＡとは、インビボでの分解（例えば、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによる）に対して本質的に耐性を有するｍＲＮＡということである。そのような安定化は、例えば、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡの修飾されたリン酸主鎖によって影響され得る。本発明に関連する主鎖の修飾は、ｍＲＮＡに含まれるヌクレオチドの主鎖のリン酸が化学的に修飾される修飾である。これに関連して好ましく使用され得るヌクレオチドは、例えば、ホスホロチオネート修飾リン酸主鎖、好ましくは、硫黄原子によって置換されているリン酸主鎖に含まれるリン酸酸素のうちの少なくとも１つを含む。安定化ｍＲＮＡは、例えば、アルキルホスホネートおよびアリールホスホネートなどの、例えば、非イオン性ホスホネートアナログをさらに含んでもよく、ここでは、荷電したホスホネート酸素は、アルキル基またはアリール基またはホスホジエステルおよびアルキルホスホトリエステルによって置換されており、ここでは、荷電した酸素残基が、アルキル化された形態で存在している。いかなる限定も意味することなく、そのような主鎖の修飾は、一般的に、メチルホスホネート、ホスホロアミデートおよびホスホロチオネート（例えば、シチジン−５’−Ｏ−（１−チオリン酸））からなる群からの修飾を含む。
【００６５】
また、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、糖修飾を、さらに、または代わりに含む。本発明に関連する糖修飾は、少なくとも１つのｍＲＮＡにおけるヌクレオチドの糖の化学的修飾であり、また、いかなる限定を意味することなく、一般的に、２’−デオキシ−２’−フルオロ−オリゴリボヌクレオチド（２’−フルオロ−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸、２’−フルオロ−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸）、２’−デオキシ−２’−デアミンオリゴリボヌクレオチド（２’−アミノ−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸、２’−アミノ−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸）、２’−Ｏ−アルキルオリゴリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−Ｃ−アルキルオリゴリボヌクレオチド（２’−Ｏ−メチルシチジン−５’−三リン酸、２’−メチルウリジン−５’−三リン酸）、２’−Ｃ−アルキルオリゴリボヌクレオチド、およびそれらの異性体である（２’−アラシチジン−５’−三リン酸、２’−アラウリジン−５’−三リン酸）、またはアジド三リン酸（２’−アジド−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸、２’−アジド−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸）からなる群から選択される糖修飾を含む。
【００６６】
また、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、少なくとも１つの塩基修飾をも、追加として、または代替として含んでもよく、当該少なくとも１つの塩基修飾は、好ましくは、改変されていないｍＲＮＡ配列、すなわち、自然の（＝天然の）ｍＲＮＡ配列と比較して、コードされているタンパク質の発現を増加させるのに適している。この場合における「かなり」とは、天然のｍＲＮＡ配列の発現と比較して、少なくとも２０％、好ましくは、少なくとも３０％、４０％、５０％または６０％、より好ましくは、少なくとも７０％、８０％、９０％または１００％、最も好ましくは、少なくとも１５０％、２００％または３００％以上、タンパク質の発現が増加していることを意味する。本発明に関して、上記の塩基修飾を有するヌクレオチドは、好ましくは、２−アミノ−６−クロロプリンリボシド−５’−三リン酸、２−アミノアデノシン−５’−三リン酸、２−チオシチジン−５’−三リン酸、２−チオウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５−アミノアリルシチジン−５’−三リン酸、５−アミノアリルウリジン−５’−三リン酸、５−ブロモシチジン−５’−三リン酸、５−ブロモウリジン−５’−三リン酸、５−ヨードシチジン−５’−三リン酸、５−ヨードウリジン−５’−三リン酸、５−メチルシチジン−５’−三リン酸、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、６−アザシチジン−５’−三リン酸、６−アザウリジン−５’−三リン酸、６−クロロプリンリボシド−５’−三リン酸、７−デアザアデノシン−５’−三リン酸、７−デアザグアノシン−５’−三リン酸、８−アザアデノシン−５’−三リン酸、８−アジドアデノシン−５’−三リン酸、ベンズイミダゾール−リボシド−５’−三リン酸、Ｎ１−メチルアデノシン−５’−三リン酸、Ｎ１−メチルグアノシン−５’−三リン酸、Ｎ６−メチルアデノシン−５’−三リン酸、Ｏ６−メチルグアノシン−５’−三リン酸、シュードウリジン−５’−三リン酸、またはピューロマイシン−５’−三リン酸、キサントシン−５’−三リン酸からなる塩基修飾ヌクレオチドの群から選択される。特に、５−メチルシチジン−５’−三リン酸、７−デアザグアノシン−５’−三リン酸、５−ブロモシチジン−５’−三リン酸、およびシュードウリジン−５’−三リン酸からなる塩基修飾ヌクレオチドの群から選択される塩基修飾のためのヌクレオチドが好ましい。
【００６７】
別の実施形態によると、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、同様に、これらのリボースまたは塩基部分の修飾を含むさらに修飾されたヌクレオチドを導入することにより修飾され得る（また、好ましくは、安定化される）。通常、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、任意の天然の（＝自然発生的な）ヌクレオチド、例えば、グアノシン、ウラシル、アデノシンおよび／またはシトシンまたはそのアナログを含んでもよい。これに関連して、ヌクレオチドアナログは、自然発生的なヌクレオチドの非自然発生的な変異体として規定される。従って、アナログは、非自然発生的な官能基で化学的に誘導体化されたヌクレオチドであり、当該官能基は、好ましくは、付加されるか、もしくは自然発生的なヌクレオチドから脱離されるか、または、ヌクレオチドの自然発生的な官能基と置換する。従って、自然発生的なヌクレオチドの各成分、すなわち、ＲＮＡ配列の主鎖（上記参照）を形成する塩基成分、糖（リボース）成分および／またはリン酸成分は、修飾されてもよい。グアノシン、ウラシル、アデノシンおよびシトシンのアナログは、いかなる限定も意味することなく、例えば、アセチル化、メチル化、ヒドロキシル化などによって化学的に改変された任意の自然発生的または非自然発生的なグアノシン、ウラシル、アデノシン、チミジンまたはシトシンを含み、これらは、１−メチル−アデノシン、１−メチル−グアノシン、１−メチル−イノシン、２，２−ジメチル−グアノシン、２，６−ジアミノプリン、２’−アミノ−２’−デオキシアデノシン、２’−アミノ−２’−デオキシシチジン、２’−アミノ−２’−デオキシグアノシン、２’−アミノ−２’−デオキシウリジン、２−アミノ−６−クロロプリンリボシド、２−アミノプリン−リボシド、２’−アラアデノシン、２’−アラシチジン、２’−アラウリジン、２’−アジド−２’−デオキシアデノシン、２’−アジド−２’−デオキシシチジン、２’−アジド−２’−デオキシグアノシン、２’−アジド−２’−デオキシウリジン、２−クロロアデノシン、２’−フルオロ−２’−デオキシアデノシン、２’−フルオロ−２’−デオキシシチジン、２’−フルオロ−２’−デオキシグアノシン、２’−フルオロ−２’−デオキシウリジン、２’−フルオロチミジン、２−メチル−アデノシン、２−メチル−グアノシン、２−メチル−チオ−Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン、２’−Ｏ−メチル−２−アミノアデノシン、２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシアデノシン、２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシシチジン、２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシグアノシン、２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシウリジン、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルイノシン、２’−Ｏ−メチルシュードウリジン、２−チオシチジン、２−チオ−シトシン、３−メチル−シトシン、４−アセチル−シトシン、４−チオウリジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）−ウラシル、５，６−ジヒドロウリジン、５−アミノアリルシチジン、５−アミノアリル−デオキシ−ウリジン、５−ブロモウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウラシル、５−カルボキシメチルアモノメチル−ウラシル、５−クロロ−アラ−シトシン、５−フルオロ−ウリジン、５−ヨードウリジン、５−メトキシカルボニルメチル−ウリジン、５−メトキシ−ウリジン、５−メチル−２−チオ−ウリジン、６−アザシチジン、６−アザウリジン、６−クロロ−７−デンザ−グアノシン、６−クロロプリンリボシド、６−メルカプト−グアノシン、６−メチル−メルカプトプリン−リボシド、７−デンザ−２’−デオキシ−グアノシン、７−デンザアデノシン、７−メチル−グアノシン、８−アザアデノシン、８−ブロモ−アデノシン、８−ブロモ−グアノシン、８−メルカプト−グアノシン、８−オキソグアノシン、ベンズイミダゾール−リボシド、ベータ−Ｄ−マンノシル−キュエオシン、ジヒドロ−ウラシル、イノシン、Ｎ１−メチルアデノシン、Ｎ６−（［６−アミノヘキシル］カルバモイルメチル）−アデノシン、Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン、Ｎ６−メチル−アデノシン、Ｎ７−メチル−キサントシン、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ピューロマイシン、キュエオシン、ウラシル−５−オキシ酢酸、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ワイブトキシン、キサントシン、およびキシロ−アデノシンを含む。上記のアナログの調製法は、例えば、米国特許第４，３７３，０７１号、米国特許第４，４０１，７９６号、米国特許第４，４１５，７３２号、米国特許第４，４５８，０６６号、米国特許第４，５００，７０７号、米国特許第４，６６８，７７７号、米国特許第４，９７３，６７９号、米国特許第５，０４７，５２４号、米国特許第５，１３２，４１８号、米国特許第５，１５３，３１９号、米国特許第５，２６２，５３０号、および米国特許第５，７００，６４２号によって当業者に知られている。本発明によると、上記に記載されたアナログの場合、本発明に係る組成物のｍＲＮＡの免疫抗原性を上昇させ、および／または、導入されたｍＲＮＡのさらなる修飾を妨害しない、それらのアナログが特に好ましい。
【００６８】
特定の実施形態によると、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、脂質修飾を含み得る。そのような脂質修飾ｍＲＮＡは、一般的に、本明細書で規定されたｍＲＮＡを含み、上記で規定された６つの抗原のうちの少なくとも１つをコードしている。そのような脂質修飾ｍＲＮＡは、一般的に、そのｍＲＮＡと共有結合により連結された少なくとも１つのリンカーと、各々のリンカーと共有結合により連結された少なくとも１つの脂質と、をさらに含む。第３の選択肢によると、脂質修飾ｍＲＮＡは、本明細書で規定されるｍＲＮＡ、そのｍＲＮＡと共有結合により連結された少なくとも１つのリンカー、および、各リンカーと共有結合により連結された少なくとも１つの脂質を含み、また、そのｍＲＮＡと共有結合により連結された（リンカー無しで）少なくとも１つの（二官能）脂質も含む。
【００６９】
一般的に、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡに含まれる脂質（複合体化しているか、または、それに共有結合により結合している）は、好ましくは、それ自身、生物学的に活性を有する脂質または親油性残基である。そのような脂質は、好ましくは、例えば、ビタミン、例えば、ＲＲＲ−α−トコフェロール（以前は、Ｄ−α−トコフェロール）を含むα−トコフェロール（ビタミンＥ）、Ｌ−α−トコフェロール、ラセミ体Ｄ，Ｌ−α−トコフェロール、ビタミンＥコハク酸（ＶＥＳ）、またはビタミンＡおよびその誘導体、例えば、レチノイン酸、レチノール、ビタミンＤおよびその誘導体、例えば、ビタミンＤ、および、また、そのエルゴステロール前駆体、ビタミンＥおよびその誘導体、ビタミンＫおよびその誘導体、例えば、ビタミンＫおよび関連するキノンまたはフィトール化合物、または、胆汁酸などのステロイド、例えば、コール酸、デオキシコール酸、デヒドロコール酸、コルチゾン、ジゴキシゲニン、テストステロン、コレステロールまたはチオコレステロール、などの天然物質または天然化合物を含む。本発明の範囲内のさらなる脂質または親油性残基は、いかなる限定を意味することなく、ポリアルキレングリコール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533）、例えば、Ｃ１−Ｃ２０−アルカン化合物、Ｃ１−Ｃ２０−アルケン化合物またはＣ１−Ｃ２０−アルカノール化合物などの脂肪族基、例えば、ドデカンジオール残基、ヘキサデカノール残基またはウンデシル残基などの脂肪族基（Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10, 111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49）、例えば、ホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール、スフィンゴ脂質、セレブロシド、ガングリオシドまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート、などのリン脂質（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777）、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、などのポリアミンまたはポリアルキレングリコール（Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969）、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）、パルミチンまたはパルミチル残基（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229）、オクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール残基（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923）、および、また、ワックス、テルペン、脂環式炭化水素、飽和モノ不飽和脂肪酸残基または飽和ポリ不飽和脂肪酸残基（saturated and mono- or poly-unsaturated fatty acid residues）、などを含む。
【００７０】
本発明の組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、同様に、インビボでｍＲＮＡの分解を防止するために、種々のアプローチにより安定化されてもよい。一般的に、インビボでのｍＲＮＡまたはＲＮＡの不安定性および（高速）分解は、ＲＮＡに基づいた組成物の応用における深刻な問題を代表し得ることが、当該技術分野で知られている。ＲＮＡのこの不安定性は、一般的に、ＲＮＡ分解酵素“ＲＮアーゼ”（リボヌクレアーゼ）に起因し、ここで、そのようなリボヌクレアーゼを伴ったコンタミネーションは、たまに、溶液中のＲＮＡを完全に分解し得る。従って、細胞の細胞質中のｍＲＮＡの自然分解は、とても細かく調節され、また、ＲＮアーゼコンタミネーションは、通常、上記の組成物を使用する前に、特に、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）を用いて、特別な処理によって除去されてもよい。自然分解の多くのメカニズムが、これに関連して、従来技術において知られており、当該メカニズムも同様に利用されてもよい。例えば、末端構造は、一般的に、インビボにおけるｍＲＮＡに対して非常に重要である。例として、自然発生ｍＲＮＡの５’末端には、通常、いわゆる“キャップ構造”（修飾されたグアノシンヌクレオチド）があり、また、３’末端には、一般的に、２００個に達するアデノシンヌクレオチド（いわゆるポリＡテール）の配列がある。
【００７１】
従って、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、いわゆる“５’キャップ”構造の付加によって、ＲＮアーゼによる分解に対して安定化され得る。これに関連して、５’キャップ構造として、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’（Ａ，Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＡまたはＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇが特に好ましい。しかし、修飾、例えば、脂質修飾が、本発明に係る組成物のｍＲＮＡの５’末端にまだ導入されていない場合、または、修飾が、（修飾されていない、または、化学的に修飾された）ｍＲＮＡの免疫抗原性に干渉しない場合にのみ、上記の修飾が導入される。
【００７２】
さらに好ましい実施形態によると、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、一般的に、約１０個から２００個のアデノシンヌクレオチドの３’末端、好ましくは、約１０個から１００個のアデノシンヌクレオチドの３’末端、より好ましくは、約４０個から８０個のアデノシンヌクレオチドの３’末端、または、さらにより好ましくは、約５０個から７０個のアデノシンヌクレオチドの３’末端に、ポリＡテールを含んでもよい。
【００７３】
さらに好ましい実施形態によると、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、一般的に、約１０個から２００個のシトシンヌクレオチドの３’末端、好ましくは、約１０個から１００個のシトシンヌクレオチドの３’末端、より好ましくは、約２０個から７０個のシトシンヌクレオチドの３’末端、または、さらにより好ましくは、約２０個から６０個、もしくは約１０個から４０個のシトシンヌクレオチドの３’末端に、ポリＣテールを含んでもよい。
【００７４】
本発明に係る少なくとも１つのｍＲＮＡは、好ましくは、少なくとも１つのヒストンステムループを含む。本発明に関し、そのような通常のヒストンステムループ（それがヒストンステムループであるかないかにかかわらず）は、一般的に、ヒストン遺伝子に由来し、かつ、２つの隣り合った完全または部分的な逆相補的配列の分子内塩基対を含み、それにより、ステムループを形成する。ステムループは、一本鎖ＤＮＡにおいて、または、より一般的には、ＲＮＡにおいて生じ得る。
【００７５】
本願に関し、ヒストンステムループは、そのＤＮＡによって、または、その対応するＲＮＡ配列によって記述され得る。従って、本願全体にわたって、本明細書でＤＮＡ配列（例えば、配列番号３８乃至６７および７１）によって示される、ヒストンステムループ配列に対するいかなる参照でも、対応するＲＮＡ配列を含む。これは、特に、本発明に係る少なくとも１つのｍＲＮＡに含まれるヒストンステムループ配列に適用される。従って、ヒストンステムループを規定する具体的なＤＮＡ配列を参照することにより、対応するＲＮＡ配列も規定される。
【００７６】
また、構造は、ヘアピンまたはヘアピンループとして知られ、通常、連続した配列内のステムおよび（末端）ループからなり、ここで、ステムは、ある種のスペーサーとしての短い配列によって分け隔たれた２つの隣り合った完全または部分的な逆相補的配列によって形成され、これは、ステムループ構造のループを作り出す。２つの隣り合った完全または部分的な逆相補的配列は、例えば、ステムループエレメントのステム１およびステム２として規定されてもよい。これら２つの隣り合った完全または部分的な逆相補的配列、例えば、ステムループエレメントのステム１およびステム２が、互いに塩基対を形成し、連続配列におけるステムループエレメントのステム１とステム２との間に位置する短い配列によって形成されたその末端の終わりに不対ループを含む二本鎖核酸配列の伸長を導いた場合に、ステムループが形成される。それに関して、不対ループは、一般的に、これらのいずれのステムループエレメントとも塩基対を形成することができない核酸の領域を示す。結果として生じたロリポップ状の構造は、多くのＲＮＡ二次構造の主要な構築ブロックである。従って、ステムループ構造の形成は、結果として生じたステム領域およびループ領域の安定性による。ここで、第１の必要条件は、一般的に、それ自身で折り曲がり、対になった二本鎖を形成することができる配列が存在することである。対になったステムループエレメントの安定性は、長さ、それが含むミスマッチまたはバルジの数（一般的に、少ない数のミスマッチは、特に、長い二本鎖伸長部分において許容できる。）、および、対になった領域の塩基組成物によって決定される。本発明に関し、３塩基から１５塩基のループの長さが想定される一方で、より好ましいループの長さは、３塩基〜１０塩基、より好ましくは、３から８、３から７、３から６、または、さらにより好ましくは、４塩基から５塩基、また、最も好ましくは、４塩基である。ヒストンステムループにおけるステム領域を形成する配列は、一般的に、５塩基から１０塩基の長さ、より好ましくは、５塩基から８塩基の長さを有し、ここで、好ましくは、塩基のうちの少なくとも１つは、ミスマッチを示す、すなわち、塩基対を形成しない。
【００７７】
本発明に関し、ヒストンステムループは、一般的に、ヒストン遺伝子（例えば、ヒストンファミリーＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４からの遺伝子）に由来し、かつ、２つの隣り合った完全または部分的な逆相補的配列の分子内塩基対を含み、それによって、ステムループを形成する。一般的に、ヒストン３’ＵＴＲステムループは、ヒストンｍＲＮＡの核細胞質間の輸送と、細胞質における安定性および翻訳効率の調節と、に関連しているＲＮＡエレメントである。後生動物のヒストン遺伝子のｍＲＮＡは、ポリアデニル化およびポリＡテールを欠いており、その代わりに、３’末端プロセシングが、この高度に保存されたステムループと、２０ヌクレオチド下流付近のプリンリッチ領域（ヒストン下流エレメント、またはＨＤＥ）との間のサイトで発生する。ヒストンステムループは、３１ｋＤａのステムループ結合タンパク質と結合する（ＳＬＢＰ、ヒストンヘアピン結合タンパク質またはＨＢＰとも呼ばれる）。そのようなヒストンステムループ構造は、好ましくは、他の配列エレメントおよび配列構造と組み合わせた本発明によって使用され、それは、ヒストン遺伝子において、自然（これは、非形質転換生物／細胞を意味する）には発生しないが、本発明によれば、組み合わされ、人工的な非相同的核酸を提供する。従って、本発明は、ヒストンステムループ構造と、他の非相同的配列エレメントとの人工的な（非天然の）組み合わせを提供し、当該組み合わせは、ヒストン遺伝子または後生動物ヒストン遺伝子では発生せず、また、ヒストン以外のタンパク質をコードしている遺伝子の機能配列領域および／または調節配列領域（転写および／または翻訳に影響を与える）から隔離されており、有益な効果を与える。従って、本発明の一実施形態は、ヒストンステムループと、ポリ（Ａ）配列、またはポリアデニル化シグナルを示す配列（コード領域の３’末端）との組み合わせを提供し、当該組み合わせは、後生動物ヒストン遺伝子では発生しない。本発明の別の好ましい態様によると、好ましくは、後生動物ヒストン遺伝子では発生しない、ヒストンステムループ構造と、上記で規定された本発明に係る抗原の少なくとも１つをコードしているコード領域との組み合わせが、本明細書と共に提供される（コード領域およびヒストンステムループ配列は、非相同的である）。
【００７８】
従って、ヒストンステムループは、本明細書に記載されているステムループ構造であり、当該ステムループ構造は、好ましくは、機能的に規定される場合は、その天然結合パートナー、ステムループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ、ヒストンヘアピン結合タンパク質またはＨＢＰとも呼ばれる）に結合する性質を示す／保持する。
【００７９】
好ましい実施形態において、ヒストンステムループ配列は、マウスヒストンタンパク質に由来しない。より具体的には、ヒストンステムループ配列は、マウスヒストン遺伝子Ｈ２Ａ６１４に由来しなくてもよい。また、本発明に係る少なくとも１つのｍＲＮＡは、マウスヒストンステムループ配列を含まなくてもよく、また、マウスヒストン遺伝子Ｈ２Ａ６１４も含まなくてもよい。さらに、本発明によれば、少なくとも１つのｍＲＮＡが少なくとも１つの哺乳類ヒストン遺伝子を含んでいる場合であっても、少なくとも１つのｍＲＮＡは、ステムループプロセシングシグナル、より具体的には、マウスヒストンプロセシングシグナルを含まなくてもよく、最も具体的には、マウスステムループプロセシングシグナルＨ２ｋＡ６１４を含まなくてもよい。しかし、少なくとも１つの哺乳類ヒストン遺伝子は、ＷＯ０１／１２８２４の配列番号７ではなくてもよい。
【００８０】
上記で規定された少なくとも１つのｍＲＮＡは、好ましくは、５’ＵＴＲ、上記で規定された抗原をコードしているコード領域、またはそれらのフラグメント、変異体もしくは誘導体、および／または、好ましくは、少なくとも１つのヒストンステムループを含む３’ＵＴＲ領域を含む。上記で規定された抗原に加えて、さらなるペプチドまたはタンパク質が、少なくとも１つのｍＲＮＡによってコードされる場合、コードされるペプチドまたはタンパク質は、好ましくは、上記で規定されたヒストンタンパク質、レポータータンパク質および／またはマーカータンパク質もしくは選択タンパク質ではない。少なくとも１つのｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、好ましくは、本明細書と共に規定されるポリ（Ａ）配列および／またはポリ（Ｃ）配列も含む。３’ＵＴＲの個々のエレメントは、少なくとも１つのｍＲＮＡの配列に沿った５’から３’の任意の順序で、そこに存在してもよい。さらに、また、本明細書に記載されるさらなるエレメントが含まれてもよく、当該さらなるエレメントは、本明細書と共に規定される安定化配列（例えば、グロビン遺伝子のＵＴＲに由来する）、ＩＲＥＳ配列などである。また、各々のエレメントは、本発明に係る少なくとも１つのｍＲＮＡにおいて、少なくとも１回（特に、ジシストロニックな構成物またはマルチシストロニックな構成物において）、好ましくは、２回以上、繰り返されてもよい。例として、個々のエレメントは、下記の順序で、少なくとも１つのｍＲＮＡに存在してもよい：
５’−コード領域−ヒストンステムループ−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−３’、または、
５’−コード領域−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−ヒストンステムループ−３’、または、
５’−コード領域−ヒストンステムループ−ポリアデニル化シグナル−３’、または、
５’−コード領域−ポリアデニル化シグナル−ヒストンステムループ−３’、または、
５’−コード領域−ヒストンステムループ−ヒストンステムループ−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−３’、または、
５’−コード領域−ヒストンステムループ−ヒストンステムループ−ポリアデニル化シグナル−３’、または、
５’−コード領域−安定化配列−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−ヒストンステムループ−３’、または、
５’−コード領域−安定化配列−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−ヒストンステムループ−３’など。
【００８１】
これに関し、上記で規定された抗原に加えて、さらなるペプチドまたはタンパク質が、少なくとも１つのｍＲＮＡによってコードされている場合、コードされているペプチドまたはタンパク質は、好ましくは、ヒストンタンパク質、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、βガラクトシダーゼ、特に、ＥＧＦＰ）、および／または、マーカータンパク質もしくは選択タンパク質（例えば、α−グロブリン、ガラクトキナーゼおよびキサンチン：グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ））ではない。
【００８２】
好ましい実施形態において、本発明に係るｍＲＮＡは、レポーター遺伝子またはマーカー遺伝子を含まない。好ましくは、本発明のｍＲＮＡは、例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびその変異体（ｅＧＦＰ、ＲＦＰまたはＢＦＰなど）、α−グロビン、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）、β−ガラクトシダーゼ、ガラクトキナーゼ、アルカリホスファターゼ、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、または、耐性遺伝子（ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシンおよびゼオシンに対して耐性を有する遺伝子など）をコードしていない。好ましい実施形態では、本発明に係るｍＲＮＡは、ルシフェラーゼをコードしていない。別の実施形態において、本発明に係るｍＲＮＡは、ＧＦＰまたはその変異体をコードしていない。
【００８３】
さらに好ましい実施形態では、本発明に係るｍＲＮＡは、ウイルス由来のタンパク質（または、タンパク質のフラグメント）、好ましくは、オルソミクソウイルス科のファミリーに属するウイルスに由来するタンパク質をコードしていない。好ましくは、ｍＲＮＡは、インフルエンザウイルスに由来するタンパク質、より好ましくは、インフルエンザＡ型ウイルスに由来するタンパク質をコードしていない。好ましくは、本発明に係るｍＲＮＡは、赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１、ＮＳ２（ＮＥＰ：核外輸送タンパク質）、ＰＡ、ＰＢ１（ポリメラーゼベイシック１（polymerase basic 1））、ＰＢ１−Ｆ２およびＰＢ２からなる群から選択されるインフルエンザＡ型タンパク質をコードしていない。別の好ましい実施形態において、本発明に係るｍＲＮＡは、そのオボアルブミン（ＯＶＡ）またはそのフラグメントをコードしていない。好ましくは、本発明に係るｍＲＮＡは、インフルエンザＡ型タンパク質またはオボアルブミンをコードしていない。
【００８４】
好ましい一実施形態によると、本発明に係る少なくとも１つのｍＲＮＡは、少なくとも１つのヒストンステムループ配列、好ましくは、下記の式（Ｉ）または式（ＩＩ）のうちの少なくとも１つに係るヒストンステムループ配列を含む。
【００８５】
式（Ｉ）（ステム境界エレメント無しのステムループ配列）
【００８６】
【化１】
0006678582.tif 000002
【００８７】
式（ＩＩ）（ステム境界エレメントを有するステムループ配列）
【００８８】
【化２】
0006678582.tif 000003
【００８９】
ここで、
ステム１境界エレメントＮ１〜６、またはステム２境界エレメントＮ１〜６は、１つから６つのＮの連続配列、好ましくは、２つから６つのＮの連続配列、より好ましくは、２つから５つのＮの連続配列、さらにより好ましくは、３つから５つのＮの連続配列、もっとも好ましくは、４つから５つのＮの連続配列、または、５つのＮの連続配列であり、各々のＮは、別のＮとは独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、ＧおよびＣから選択されるヌクレオチド、またはそれらのヌクレオチドアナログから選択され、
ステム１〔Ｎ０−２ＧＮ３−５〕は、エレメントステム２と逆相補的であるか、または部分的に逆相補的であり、かつ、５ヌクレオチドから７ヌクレオチドの連続配列であり、
Ｎ０−２は、０から２つのＮの連続配列、好ましくは０から１つのＮの連続配列、より好ましくは１つのＮの連続配列であり、各々のＮは、別のＮとは独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、ＧおよびＣから選択されるヌクレオチド、またはそれらのヌクレオチドアナログから選択され、
Ｎ３−５は、３つから５つのＮの連続配列、好ましくは４つから５つのＮの連続配列、より好ましくは４つのＮの連続配列であり、各々のＮは、別のＮとは独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、ＧおよびＣから選択されるヌクレオチド、またはそのヌクレオチドアナログから選択され、かつ、
Ｇは、グアノシンまたはそのアナログであり、ステム２中のその相補的ヌクレオチドであるシチジンがグアノシンによって置換されている条件で、シチジンまたはそのアナログによって必要に応じて置換されていてもよく、
ループ配列［Ｎ０−４（Ｕ／Ｔ）Ｎ０−４］は、エレメントステム１とエレメントステム２との間に位置し、かつ、３つから５つのヌクレオチドの連続配列、より好ましくは４つのヌクレオチドの連続配列であり、
ここで、各々のＮ０−４は、別の連続配列とは独立して、０から４つのＮの連続配列、好ましくは、１つから３つのＮの連続配列、より好ましくは、１つから２つのＮの連続配列であり、ここで、各々のＮは、別のＮとは独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、およびＣから選択されるヌクレオチド、またはそれらのヌクレオチドアナログから選択され、かつ、
ここで、Ｕ／Ｔは、ウリジン、または必要に応じてチミジンを示し、
ステム２［Ｎ３−５ＣＮ０−２］は、エレメントステム１と逆相補的であるか、または部分的に逆相補的であり、かつ５ヌクレオチドから７ヌクレオチドの連続配列であり、
ここで、Ｎ３〜５は、３つから５つのＮの連続配列、好ましくは４つから５つのＮの連続配列、より好ましくは４つのＮの連続配列であり、各々のＮは、別のＮとは独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、ＧおよびＣから選択されるヌクレオチド、またはそれらのヌクレオチドアナログから選択され、
ここで、Ｎ０〜２は、０から２つのＮの連続配列、好ましくは０から１つの連続配列、より好ましくは１つのＮの連続配列であり、各々のＮは、別のＮとは独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、ＧおよびＣから選択されるヌクレオチド、またはそれらのヌクレオチドアナログから選択され、また、
ここで、Ｃは、シチジンまたはそのアナログであり、ステム１中のその相補的ヌクレオチドであるグアノシンがシチジンに置換されている条件で、グアノシンまたはそのアナログに必要に応じて置換されていてもよく、
ここで、ステム１およびステム２は、互いに塩基対合し、逆相補的配列を形成することができ、例えば、ヌクレオチドＡおよびＵ／ＴもしくはＧおよびＣのワトソン−クリック型塩基対によって、または、非ワトソン−クリック型塩基対、例えば、揺らぎ塩基対、逆ワトソン−クリック型塩基対、フーグスティーン型塩基対、逆フーグスティーン型塩基対によって、塩基対がステム１とステム２との間で生じ得るか、または、互いに塩基対合し、部分的に逆相補的配列を形成することができ、一方のステム中の１つ以上の塩基が、もう一方のステムの逆相補的配列における相補的塩基を有してないことに起因して、不完全な塩基対がステム１とステム２との間で生じ得る。
【００９０】
上記に関し、揺らぎ塩基対は、一般的に、２つのヌクレオチド間の非ワトソン−クリック塩基対である。これに関し、用いられてもよい４つの主要な揺らぎ塩基対は、グアノシン−ウリジン、イノシン−ウリジン、イノシン−アデノシン、イノシン−シチジン（Ｇ−Ｕ／Ｔ、Ｉ−Ｕ／Ｔ、Ｉ−Ａ、およびＩ−Ｃ）およびアデノシン−シチジン（Ａ−Ｃ）である。
【００９１】
従って、本発明に関し、揺らぎ塩基は、上記で説明したように、さらなる塩基と揺らぎ塩基対を形成する塩基である。従って、非ワトソン−クリック塩基対、例えば、揺らぎ塩基対は、本発明に係る少なくとも１つのｍＲＮＡにおけるヒストンステムループ構造のステムで生じ得る。
【００９２】
上記に関し、部分的な逆相補的配列は、ステム１とステム２との塩基対によって形成されたステムループ配列のステム構造において、最大で２つのミスマッチ、好ましくは、１つだけのミスマッチを含む。言い換えると、ステム１およびステム２は、好ましくは、ステム１とステム２との全体の配列にわたって、互いに（完全な）塩基対合が可能であり（１００％の可能で正確なワトソン−クリック塩基対または非ワトソン−クリック塩基対）、それにより、逆相補的配列を形成し、ここで、各々の塩基は、相補的結合パートナーとして、その正確なワトソン−クリック塩基対の相手、または、その正確な非ワトソン−クリック塩基対の相手を有する。あるいは、ステム１およびステム２は、好ましくは、ステム１とステム２との全体の配列にわたって、互いに、部分的な塩基対合が可能であり、ここで、１００％の可能で正確なワトソン−クリック塩基対または非ワトソン−クリック塩基対のうちの少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％は、正確なワトソン−クリック塩基対または非ワトソン−クリック塩基対で占有され、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％または約５％の残りの塩基は、対になっていない。
【００９３】
好ましい実施形態によると、本明細書で定義された少なくとも１つのｍＲＮＡの少なくとも１つのヒストンステムループ配列（ステム境界エレメントを有する）は、約１５ヌクレオチドから約４５ヌクレオチドの長さ、好ましくは、約１５ヌクレオチドから約４０ヌクレオチドの長さ、好ましくは、約１５ヌクレオチドから約３５ヌクレオチドの長さ、好ましくは、約１５ヌクレオチドから約３０ヌクレオチドの長さ、また、さらにより好ましくは、約２０から約３０の長さ、また、最も好ましくは、約２４ヌクレオチドから約２８ヌクレオチドの長さを含む。
【００９４】
さらに好ましい実施形態によると、本明細書で規定される少なくとも１つのｍＲＮＡの少なくとも１つのヒストンステムループ配列（ステム境界エレメント）は、約１０ヌクレオチドから約３０ヌクレオチドの長さ、好ましくは、約１０ヌクレオチドから約２０ヌクレオチドの長さ、好ましくは、約１２ヌクレオチドから約２０ヌクレオチドの長さ、好ましくは、約１４ヌクレオチドから約２０ヌクレオチドの長さ、また、さらにより好ましくは、約１６ヌクレオチドから約１７ヌクレオチドの長さ、また、最も好ましくは、約１６ヌクレオチドの長さを含む。
【００９５】
さらに好ましい実施形態によると、本発明に係る少なくとも１つのｍＲＮＡは、下記の具体的な式（Ｉａ）または式（ＩＩａ）のうちの少なくとも１つに従った少なくとも１つのヒストンステムループ配列を含んでもよい。
【００９６】
式（Ｉａ）（ステム境界エレメント無しのステムループ配列）
【００９７】
【化３】
0006678582.tif 000004
【００９８】
式（ＩＩａ）（ステム境界エレメントを有するステムループ配列）
【００９９】
【化４】
0006678582.tif 000005
【０１００】
ここで、
Ｎ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＵは、上記で規定された通りである。
【０１０１】
第１の態様に係る特にさらにより好ましい実施形態によると、少なくとも１つのＲＮＡは、下記の具体的な式（Ｉｂ）または式（ＩＩｂ）のうちの少なくとも１つに従った少なくとも１つのヒストンステムループ配列を含むか、またはコードしてもよい。
【０１０２】
式（Ｉｂ）（ステム境界エレメント無しのステムループ配列）
【０１０３】
【化５】
0006678582.tif 000006
【０１０４】
式（ＩＩｂ）（ステム境界エレメントを有するステムループ配列）
【０１０５】
【化６】
0006678582.tif 000007
【０１０６】
ここで、
Ｎ、Ｃ，Ｇ、ＴおよびＵは、上記で規定された通りである。
【０１０７】
さらにより好ましい実施形態によると、本発明に係る少なくとも１つのｍＲＮＡは、そのステムループ構造で、ヒストンステムループ配列を表す直鎖配列として示された下記の具体的な式（Ｉｃ）から式（Ｉｈ）または（ＩＩｃ）から（ＩＩｈ）のうちの少なくとも１つに従った少なくとも１つのヒストンステムループ配列を含んでもよい。
【０１０８】
式（Ｉｃ）（ステム境界エレメント無しの後生動物ヒストンステムループ共通配列および原生動物ヒストンステムループ共通配列）
【０１０９】
【化７】
0006678582.tif 000008
【０１１０】
式（ＩＩｃ）（ステム境界エレメントを有する後生動物ヒストンステムループ共通配列および原生動物ヒストンステムループ共通配列）
【０１１１】
【化８】
0006678582.tif 000009
【０１１２】
式（Ｉｄ）（ステム境界エレメント無し）
【０１１３】
【化９】
0006678582.tif 000010
【０１１４】
式（ＩＩｄ）（ステム境界エレメント有り）
【０１１５】
【化１０】
0006678582.tif 000011
【０１１６】
式（Ｉｅ）（ステム境界エレメント無しの原生動物ヒストンステムループ共通配列）
【０１１７】
【化１１】
0006678582.tif 000012
【０１１８】
式（ＩＩｅ）（ステム境界エレメントを有する原生動物ヒストンステムループ共通配列）
【０１１９】
【化１２】
0006678582.tif 000013
【０１２０】
式（Ｉｆ）（ステム境界エレメント無しの後生動物ヒストンステムループ共通配列）
【０１２１】
【化１３】
0006678582.tif 000014
【０１２２】
式（ＩＩｆ）（ステム境界エレメントを有する後生動物ヒストンステムループ共通配列）
【０１２３】
【化１４】
0006678582.tif 000015
【０１２４】
式（Ｉｇ）（ステム境界エレメント無しの脊椎動物ヒストンステムループ共通配列）
【０１２５】
【化１５】
0006678582.tif 000016
【０１２６】
式（ＩＩｇ）（ステム境界エレメントを有する脊椎動物ヒストンステムループ共通配列）
【０１２７】
【化１６】
0006678582.tif 000017
【０１２８】
式（Ｉｈ）（ステム境界エレメント無しのヒトヒストンステムループ共通配列（ホモサピエンス））
【０１２９】
【化１７】
0006678582.tif 000018
【０１３０】
式（ＩＩｈ）（ステム境界エレメントを有するヒトヒストンステムループ共通配列（ホモサピエンス））
【０１３１】
【化１８】
0006678582.tif 000019
【０１３２】
ここで、上記の各々の式（Ｉｃ）から式（Ｉｈ）または式（ＩＩｃ）から式（ＩＩｈ）において、
Ｎ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＵは、上記で規定した通りであり、
各々のＵは、Ｔによって置換されてもよく、
ステムエレメント１およびステムエレメント２において（高度に）保存された各々のＧまたはＣは、対応するステムにおけるその相補的なヌクレオチドがその相補的ヌクレオチドにより並行して置換されるという条件で、その相補的ヌクレオチド塩基ＣまたはＧによって置換されてもよく、および／または、
Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｕ、Ｃ、Ｒ、Ｙ、Ｍ、Ｋ、Ｓ、Ｗ、Ｈ、Ｂ、Ｖ、ＤおよびＮは、下記の表で規定されるヌクレオチド塩基である。
【０１３３】
【表１】
0006678582.tif 000020
【０１３４】
これに関し、上記の式（Ｉ）もしくは式（Ｉａ）から（Ｉｈ）、または式（ＩＩ）もしくは式（ＩＩａ）から式（ＩＩｈ）、のうちの少なくとも１つに従ったヒストンステムループ配列が、自然発生ヒストンステムループ配列から選択され、特により好ましくは、原生動物ヒストンステムループ配列または後生動物ヒストンステムループ配列から選択され、また、特にさらにより好ましくは、脊椎動物から選択され、また、最も好ましくは、哺乳類ヒストンステムループ配列から選択され、特に、ヒトヒストンステムループ配列から選択されることが、特に好ましい。
【０１３５】
特に好ましい実施形態によると、本発明の具体的な式（Ｉ）もしくは式（Ｉａ）から（Ｉｈ）、または式（ＩＩ）もしくは式（ＩＩａ）から式（ＩＩｈ）、のうちの少なくとも１つに従ったヒストンステムループ配列は、後生動物および原生動物、原生動物、後生動物、脊椎動物およびヒトにおける自然発生ヒストンステムループ配列のうちで、最も頻繁に発生するヌクレオチド、または、最も頻繁に発生するヌクレオチドもしくは２番目に頻繁に発生するヌクレオチドを、各々のヌクレオチドの位置に含むヒストンステムループ配列である。これに関し、すべてのヌクレオチドのうちの、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５％、最も好ましくは、少なくとも９０％は、自然発生ヒストンステムループ配列のうちで最も頻繁に発生するヌクレオチドに一致することが特に好ましい。
【０１３６】
さらに特定の実施形態において、上記の具体的な式（Ｉ）または式（Ｉａ）から式（Ｉｈ）のうちの少なくとも１つに従ったヒストンステムループ配列は、下記のヒストンステムループ配列（ステム境界エレメント無し）から選択される：
ＶＧＹＹＹＹＨＨＴＨＲＶＶＲＣＢ（式（Ｉｃ）に従った配列番号３８）
ＳＧＹＹＹＴＴＹＴＭＡＲＲＲＣＳ（式（Ｉｃ）に従った配列番号３９）
ＳＧＹＹＣＴＴＴＴＭＡＧＲＲＣＳ（式（Ｉｃ）に従った配列番号４０）
ＤＧＮＮＮＢＮＮＴＨＶＮＮＮＣＨ（式（Ｉｅ）に従った配列番号４１）
ＲＧＮＮＮＹＨＢＴＨＲＤＮＮＣＹ（式（Ｉｅ）に従った配列番号４２）
ＲＧＮＤＢＹＨＹＴＨＲＤＨＮＣＹ（式（Ｉｅ）に従った配列番号４３）
ＶＧＹＹＹＴＹＨＴＨＲＶＲＲＣＢ（式（Ｉｆ）に従った配列番号４４）
ＳＧＹＹＣＴＴＹＴＭＡＧＲＲＣＳ（式（Ｉｆ）に従った配列番号４５）
ＳＧＹＹＣＴＴＴＴＭＡＧＲＲＣＳ（式（Ｉｆ）に従った配列番号４６）
ＧＧＹＹＣＴＴＹＴＨＡＧＲＲＣＣ（式（Ｉｇ）に従った配列番号４７）
ＧＧＣＹＣＴＴＹＴＭＡＧＲＧＣＣ（式（Ｉｇ）に従った配列番号４８）
ＧＧＣＴＣＴＴＴＴＭＡＧＲＧＣＣ（式（Ｉｇ）に従った配列番号４９）
ＤＧＨＹＣＴＤＹＴＨＡＳＲＲＣＣ（式（Ｉｈ）に従った配列番号５０）
ＧＧＣＹＣＴＴＴＴＨＡＧＲＧＣＣ（式（Ｉｈ）に従った配列番号５１）
ＧＧＣＹＣＴＴＴＴＭＡＧＲＧＣＣ（式（Ｉｈ）に従った配列番号５２）。
【０１３７】
さらに、これに関し、具体的な式（ＩＩ）または（ＩＩａ）から（ＩＩｈ）のうちの１つに従った下記のヒストンステムループ配列（ステム境界エレメントを有する）が特に好ましい：
Ｈ＊Ｈ＊ＨＨＶＶＧＹＹＹＹＨＨＴＨＲＶＶＲＣＢＶＨＨ＊Ｎ＊Ｎ＊（式（ＩＩｃ）に従った配列番号５３）
Ｍ＊Ｈ＊ＭＨＭＳＧＹＹＹＴＴＹＴＭＡＲＲＲＣＳＭＣＨ＊Ｈ＊Ｈ＊（式（ＩＩｃ）に従った配列番号５４）
Ｍ＊Ｍ＊ＭＭＭＳＧＹＹＣＴＴＴＴＭＡＧＲＲＣＳＡＣＨ＊Ｍ＊Ｈ＊（式（ＩＩｃ）に従った配列番号５５）
Ｎ＊Ｎ＊ＮＮＮＤＧＮＮＮＢＮＮＴＨＶＮＮＮＣＨＮＨＮ＊Ｎ＊Ｎ＊（式（ＩＩｅ）に従った配列番号５６）
Ｎ＊Ｎ＊ＨＨＮＲＧＮＮＮＹＨＢＴＨＲＤＮＮＣＹＤＨＨ＊Ｎ＊Ｎ＊（式（ＩＩｅ）に従った配列番号５７）
Ｎ＊Ｈ＊ＨＨＶＲＧＮＤＢＹＨＹＴＨＲＤＨＮＣＹＲＨＨ＊Ｈ＊Ｈ＊（式（ＩＩｅ）に従った配列番号５８）
Ｈ＊Ｈ＊ＭＨＭＶＧＹＹＹＴＹＨＴＨＲＶＲＲＣＢＶＭＨ＊Ｈ＊Ｎ＊（式（ＩＩｆ）に従った配列番号５９）
Ｍ＊Ｍ＊ＭＭＭＳＧＹＹＣＴＴＹＴＭＡＧＲＲＣＳＭＣＨ＊Ｈ＊Ｈ＊（式（ＩＩｆ）に従った配列番号６０）
Ｍ＊Ｍ＊ＭＭＭＳＧＹＹＣＴＴＴＴＭＡＧＲＲＣＳＡＣＨ＊Ｍ＊Ｈ＊（式（ＩＩｆ）に従った配列番号６１）
Ｈ＊Ｈ＊ＭＡＭＧＧＹＹＣＴＴＹＴＨＡＧＲＲＣＣＶＨＮ＊Ｎ＊Ｍ＊（式（ＩＩｇ）に従った配列番号６２）
Ｈ＊Ｈ＊ＡＡＭＧＧＣＹＣＴＴＹＴＭＡＧＲＧＣＣＶＣＨ＊Ｈ＊Ｍ＊（式（ＩＩｇ）に従った配列番号６３）
Ｍ＊Ｍ＊ＡＡＭＧＧＣＴＣＴＴＴＴＭＡＧＲＧＣＣＭＣＹ＊Ｍ＊Ｍ＊（式（ＩＩｇ）に従った配列番号６４）
Ｎ＊Ｈ＊ＡＡＨＤＧＨＹＣＴＤＹＴＨＡＳＲＲＣＣＶＨＢ＊Ｎ＊Ｈ＊（式（ＩＩｈ）に従った配列番号６５）
Ｈ＊Ｈ＊ＡＡＭＧＧＣＹＣＴＴＴＴＨＡＧＲＧＣＣＶＭＹ＊Ｎ＊Ｍ＊（式（ＩＩｈ）に従った配列番号６６）
Ｈ＊Ｍ＊ＡＡＡＧＧＣＹＣＴＴＴＴＭＡＧＲＧＣＣＲＭＹ＊Ｈ＊Ｍ＊（式（ＩＩｈ）に従った配列番号６７）。
【０１３８】
さらに好ましい実施形態によると、少なくとも１つのｍＲＮＡは、具体的な式（Ｉ）もしくは（Ｉａ）から（Ｉｈ）、または、（ＩＩ）もしくは（ＩＩａ）から（ＩＩｈ）、のうちの少なくとも１つに従ったヒストンステムループ配列の１００％保存されていないヌクレオチド、または、自然発生ヒストンステムループ配列、との少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、または、さらにより好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、を示す少なくとも１つのヒストンステムループ配列を含む。
【０１３９】
特に好ましいヒストンステムループ配列は、配列番号７１のＣＡＡＡＧＧＣＴＣＴＴＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡに従った配列、または、より好ましくは、配列番号７１の核酸配列の対応するＲＮＡ配列のＡＡＡＧＧＣＵＣＵＵＵＵＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡ（配列番号７２）である。
【０１４０】
好ましい実施形態において、ヒストンステムループ配列は、ループ配列５’−ＵＵＵＣ−３’を含まない。より具体的には、ヒストンステムループは、それぞれ、ステム１配列５’−ＧＧＣＵＣＵ−３’、および／または、ステム２配列５’−ＡＧＡＧＣＣ−３’を含まない。別の好ましい実施形態では、ステムループ配列は、ループ配列５’−ＣＣＵＧＣＣＣ−３’、または、ループ配列５’−ＵＧＡＡＵ−３’を含まない。より具体的には、ステムループは、ステム１配列５’−ＣＣＵＧＡＧＣ−３’を含まないか、または、それぞれ、ステム１配列５’−ＡＣＣＵＵＵＣＵＣＣＡ−３’、および／もしくは、ステム２配列５’−ＧＣＵＣＡＧＧ−３’もしくは５’−ＵＧＧＡＧＡＡＡＧＧＵ−３’を含まない。また、ステムループ配列は、好ましくは、哺乳動物のインシュリンレセプター３’−非翻訳領域に由来しない。また、好ましくは、本発明に係る少なくとも１つのｍＲＮＡは、ヒストンステムループプロセシングシグナル、特に、マウスのヒストン遺伝子Ｈ２Ａ６１４遺伝子（Ｈ２ｋＡ６１４）に由来するヒストンステムループプロセシングシグナルを含まなくてもよい。
【０１４１】
好ましくは、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、リボザイム（好ましくは自己スプライシングリボザイム）、ウイルス核酸配列、ヒストンステムループプロセシングシグナル、特に、マウスヒストンＨ２Ａ６１４遺伝子に由来するヒストンステムループプロセシング配列、ｎｅｏ遺伝子、不活性化プロモーター配列および不活性化エンハンサー配列からなる群の成分のうちの、１つ、または２つ、または少なくとも１つもしくは全て、または１つもしくは全てを除いて、含まない。さらにより好ましくは、本発明に係る少なくとも１つのｍＲＮＡは、リボザイム、好ましくは、自己スプライシングリボザイムを含まない、かつ、ｎｅｏ遺伝子、不活性化プロモーター配列、不活性化エンハンサー、ヒストンステムループプロセシングシグナル、特に、マウスヒストンＨ２Ａ６１４遺伝子に由来するヒストンステムループプロセシング配列、からなる群のうちの１つを含まない。従って、ｍＲＮＡは、好ましい態様では、リボザイム、好ましくは自己スプライシングリボザイムまたはｎｅｏ遺伝子の何れも含まないか、または、あるいは、リボザイム、好ましくは、自己スプライシングリボザイムまたは任意の耐性遺伝子（例えば、通常、選抜するために適用される）の何れも含まない。別の好ましい態様では、本発明の少なくとも１つのｍＲＮＡは、リボザイム、好ましくは、自己スプライシングリボザイムまたはヒストンステムループプロセシングシグナル、特に、マウスヒストンＨ２Ａ６１４遺伝子に由来するヒストンステムループプロセシング配列の何れも含まなくてもよい。
【０１４２】
あるいは、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、特定のタンパク質因子（例えば、切断ポリアデニル化特異因子（ＣＰＳＦ）、切断刺激因子（ＣｓｔＦ）、切断因子ＩおよびＩＩ（ＣＦＩおよびＣＦＩＩ）、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＰＡＰ））によって（転写）ｍＲＮＡにポリアデニル化を伝達するシグナルとして本明細書で規定されるポリアデニル化シグナルを必要に応じて含む。これに関し、共通ポリアデニル化シグナルは、好ましくは、ＮＮ（Ｕ／Ｔ）ＡＮＡ共通配列を含んでいる。特に好ましい態様では、ポリアデニル化シグナルは、以下の配列のうちの１つを含む：ＡＡ（Ｕ／Ｔ）ＡＡＡ、または、Ａ（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）ＡＡＡ（ここで、ウリジンは、通常、ＲＮＡ中に存在し、また、チミジンは、通常、ＤＮＡ中に存在する）。いくつかの実施形態において、本発明に係る少なくとも１つのｍＲＮＡで使用されるポリアデニル化シグナルは、Ｕ３のｓｎＲＮＡ、Ｕ５、ヒト遺伝子Ｇ−ＣＳＦからのポリアデニル化プロセシングシグナル、またはＳＶ４０のポリアデニル化シグナル配列に一致しない。特に、上記のポリアデニル化シグナルは、何れの抗生物質耐性遺伝子（または何れの他のレセプター、マーカーまたは選抜遺伝子）と組み合わされず、特に、耐性ｎｅｏ遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）と組み合わされない。また、好ましくは、上記のポリアデニル化シグナルの何れもが、本発明に係る少なくとも１つのｍＲＮＡ中のマウスヒストン遺伝子Ｈ２Ａ６１４からのヒストンステムループまたはヒストンステムループプロセシングシグナルと組み合わされない。
【０１４３】
別の実施形態によると、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、ｍＲＮＡのＧ／Ｃ含有量、好ましくは、少なくとも１つのｍＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含有量を変更することにより、改変されてもよく、それに伴い、安定化されてもよい。
【０１４４】
本発明の特に好ましい実施形態において、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡにおけるコード領域のＧ／Ｃ含有量は、その特定の野生型ｍＲＮＡ、すなわち改変されていないｍＲＮＡにおけるコード領域のＧ／Ｃ含有量と比較して、変更され、特に増加される。少なくとも１つのｍＲＮＡによってコードされているアミノ酸配列は、好ましくは、特定の野生型ｍＲＮＡによってコードされているアミノ酸配列と比較して改変されていない。本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡにおけるこの改変は、翻訳される任意のｍＲＮＡ領域の配列がそのｍＲＮＡの効率的な翻訳に関して重要であるという事実に基づいている。従って、種々のヌクレオチドの組成物および配列が重要である。特に、増加したＧ（グアノシン）／Ｃ（シトシン）含有量を有する配列は、増加したＡ（アデノシン）／Ｕ（ウラシル）含有量を有する配列よりも安定である。従って、本発明によると、ｍＲＮＡのコドンは、これらが増加したＧ／Ｃヌクレオチド量を含むように、各々の野生型ｍＲＮＡと比較して変更される一方で、翻訳されるアミノ酸配列を維持する。完全に同一のアミノ酸（いわゆる遺伝コードの縮退）をコードしているいくつかのコドンに関して、安定性に関して最も好ましいコドンが決定され得る（いわゆる代替コドン利用）。少なくとも１つのｍＲＮＡによってコードされているアミノ酸に従って、その野生型配列と比較したｍＲＮＡ配列の改変に関して種々の可能性がある。独占的にＧヌクレオチドまたはＣヌクレオチドを含むコドンによってコードされているアミノ酸の場合、コドンの改変は必要ない。従って、Ｐｒｏ（ＣＣＣまたはＣＣＧ）、Ａｒｇ（ＣＧＣまたはＣＧＧ）、Ａｌａ（ＧＣＣまたはＧＣＧ）およびＧｌｙ（ＧＧＣまたはＧＧＧ）のコドンは、ＡまたはＵが存在しないため、改変を必要としない。反対に、Ａヌクレオチドおよび／またはＵヌクレオチドを含むコドンは、同一のアミノ酸をコードしているが、Ａおよび／またはＵを含まない他のコドンの置換によって改変され得る。これらの例としては、Ｐｒｏのコドンが、ＣＣＵまたはＣＣＡから、ＣＣＣまたはＣＣＧに改変され得ること、Ａｒｇのコドンが、ＣＧＵまたはＣＧＡまたはＡＧＡまたはＡＧＧから、ＣＧＣまたはＣＧＧに改変され得ること、Ａｌａのコドンが、ＧＣＵまたはＧＣＡから、ＧＣＣまたはＧＣＧに改変され得ること、Ｇｌｙのコドンが、ＧＧＵまたはＧＧＡから、ＧＧＣまたはＧＧＧに改変され得ることが挙げられる。他のケースでは、ＡヌクレオチドまたはＵヌクレオチドを、コドンから除去することができないが、しかし、より少ないＡヌクレオチド含有量および／またはＵヌクレオチド含有量を含むコドンを使用することにより、Ａ含有量およびＵ含有量を減少させることが可能である。これらの例としては、Ｐｈｅのコドンが、ＵＵＵからＵＵＣに改変され得ること、Ｌｅｕのコドンが、ＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵまたはＣＵＡから、ＣＵＣまたはＣＵＧに改変され得ること、Ｓｅｒのコドンが、ＵＣＵまたはＵＣＡまたはＡＧＵから、ＵＣＣ、ＵＣＧまたはＡＧＣに改変され得ること、Ｔｙｒのコドンが、ＵＡＵからＵＡＣに改変され得ること、Ｃｙｓのコドンが、ＵＧＵからＵＧＣに改変され得ること、Ｈｉｓのコドンが、ＣＡＵからＣＡＣに改変され得ること、Ｇｌｎのコドンが、ＧＡＡからＣＡＧに改変され得ること、Ｉｌｅのコドンが、ＡＵＵまたはＡＵＡから、ＡＵＣに改変され得ること、Ｔｈｒのコドンが、ＡＣＵまたはＡＣＡから、ＡＣＣまたはＡＣＧに改変され得ること、Ａｓｎのコドンが、ＡＡＵからＡＡＣに改変され得ること、Ｌｙｓのコドンが、ＡＡＡからＡＡＧに改変され得ること、Ｖａｌのコドンが、ＧＵＵまたはＧＵＡから、ＧＵＣまたはＧＵＧに改変され得ること、Ａｓｐのコドンが、ＧＡＵからＧＡＣに改変され得ること、Ｇｌｕのコドンが、ＧＡＡからＧＡＧに改変され得ること、ストップコドンであるＵＡＡが、ＵＡＧまたはＵＧＡに改変され得ることが挙げられる。これに反して、Ｍｅｔ（ＡＵＧ）のコドン、およびＴｒｐ（ＵＧＧ）のコドンの場合、配列改変の可能性はない。本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡのＧ／Ｃ含有量を、その特定の野生型ｍＲＮＡ（すなわち、元の配列）と比較して増加させるために、上記に列記された置換が、個々、または全ての可能な組み合わせの何れかで、使用され得る。従って、例えば、野生型の配列で生じるＴｈｒのすべてのコドンは、ＡＣＣ（またはＡＣＧ）に改変され得る。しかし、好ましくは、例えば、上記の置換可能性の組み合わせが使用される：
元の配列（野生型ｍＲＮＡ）においてＴｈｒをコードしている全てのコドンの、ＡＣＣ（またはＡＣＧ）への置換、および、
Ｓｅｒをもともとコードしている全てのコドンの、ＵＣＣ（またはＵＣＧまたはＡＧＣ）への置換、元の配列においてＩｌｅをコードしているすべてのコドンの、ＡＵＣへの置換、および、
Ｌｙｓをもともとコードしている全てのコドンの、ＡＡＧへの置換、および、
Ｔｙｒをもともとコードしている全てのコドンの、ＵＡＣへの置換、元の配列においてＶａｌをコードしているすべてのコドンの、ＧＵＣ（またはＧＵＧ）への置換、および、
Ｇｌｕをもともとコードしている全てのコドンの、ＧＡＧへの置換、および、
Ａｌａをもともとコードしている全てのコドンの、ＧＣＣ（またはＧＣＧ）への置換、および、
Ａｒｇをもともとコードしている全てのコドンの、ＣＧＣ（またはＣＧＧ）への置換、元の配列においてＶａｌをコードしているすべてのコドンの、ＧＵＣ（またはＧＵＧ）への置換、および、
Ｇｌｕをもともとコードしている全てのコドンの、ＧＡＧへの置換、および、
Ａｌａをもともとコードしている全てのコドンの、ＧＣＣ（またはＧＣＧ）への置換、および、
Ｇｌｙをもともとコードしている全てのコドンの、ＧＧＣ（またはＧＧＧ）への置換、および、
Ａｓｎをもともとコードしている全てのコドンの、ＡＡＣへの置換、元の配列においてＶａｌをコードしているすべてのコドンの、ＧＵＣ（またはＧＵＧ）への置換、および、
Ｐｈｅをもともとコードしている全てのコドンの、ＵＵＣへの置換、および、
Ｃｙｓをもともとコードしている全てのコドンの、ＵＧＣへの置換、および、
Ｌｅｕをもともとコードしている全てのコドンの、ＣＵＧ（またはＣＵＣ）への置換、および、
Ｇｌｎをもともとコードしている全てのコドンの、ＣＡＧへの置換、および、
Ｐｒｏをもともとコードしている全てのコドンの、ＣＣＣ（またはＣＣＧ）への置換など。好ましくは、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡにおけるコード領域のＧ／Ｃ含有量は、本明細書で規定される抗原、抗原性タンパク質もしくは抗原性ペプチド、またはそのフラグメント、もしくはその変異体、をコードしている野生型ｍＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含有量と比較して、少なくとも７％、より好ましくは、少なくとも１５％、特に好ましくは、少なくとも２０％、増加される。具体的な実施形態によると、本明細書で規定される抗原、抗原性タンパク質もしくは抗原性ペプチド、またはそのフラグメント、その変異体、または野生型ｍＲＮＡ配列の全配列、をコードしている領域における置換可能なコドンのうちの、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、より好ましくは、少なくとも７０％、さらにより好ましくは、少なくとも８０％、また、最も好ましくは、少なくとも９０％、９５％、または１００％は、置換され、それにより、上記の配列のＧＣ／含有量を上昇させる。これに関し、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡにおけるＧ／Ｃ含有量を、特に、タンパク質をコードする領域において、野生型配列と比較して極限まで（すなわち置換可能なコドンの１００％）増加させる。本発明によると、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡにおけるさらに好ましい改変は、翻訳効率も、細胞におけるｔＲＮＡの発生の異なる頻度によって決定されるという発見に基づいている。従って、いわゆる“稀なコドン”が、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡにおいて、増加した程度に存在する場合、対応する改変された少なくとも１つのｍＲＮＡ配列は、比較的に“頻度が高い”ｔＲＮＡをコードしているコドンが存在する場合より、有意に劣る程度で翻訳される。本発明によると、本発明に係る組成物の改変された少なくとも１つのｍＲＮＡにおいて、細胞中では比較的に稀であるｔＲＮＡをコードしている、野生型配列のうちの少なくとも１つのコドンが、細胞中で比較的に頻度が高く、かつ比較的に稀なｔＲＮＡと同一のアミノ酸を送達する、ｔＲＮＡをコードしているコドンと交換されるように、上記で規定された抗原のうちの１つをコードしている領域は、野生型ｍＲＮＡの対応する領域と比較して改変される。この改変によって、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡの配列は、頻繁に発生するｔＲＮＡが利用することができるコドンが挿入されるように改変される。言い換えると、本発明によると、この改変によって、細胞中で比較的に稀であるｔＲＮＡをコードしている野生型配列のすべてのコドンは、細胞中で比較的に頻度が高く、かつ、各ケースにおいて、比較的に稀なｔＲＮＡと同一のアミノ酸を送達する、ｔＲＮＡをコードしているコドンと、各ケースにおいて交換され得る。どのｔＲＮＡが細胞中で比較的に頻繁に発生するか、また、反対に、どのｔＲＮＡが比較的に稀に発生するかは、当業者に知られている。例えば、Akashi, Curr. Opin. Genet. Dev. 2001, 11(6): 660-666を参照すること。最も頻繁に発生するｔＲＮＡを特定のアミノ酸のために使用するコドン、例えば、（ヒト）細胞中で最も頻繁に発生するｔＲＮ��を使用するＧｌｙコドンが特に好ましい。本発明によると、ｍＲＮＡのコード領域によってコードされたタンパク質のアミノ酸配列を改変することなく、本発明に係る組成物の改変された少なくとも１つのｍＲＮＡにおいて、増加された連続的Ｇ／Ｃ含有量、特に、最大化された連続的Ｇ／Ｃ含有量と、“頻度の高い”コドンとを関連付けることが特に好ましい。この好ましい実施形態は、本発明に係る組成物の、特に効率的に翻訳および安定化された（改変された）少なくとも１つのｍＲＮＡの提供を可能にする。上記で説明された本発明（増加されたＧ／Ｃ含有量、ｔＲＮＡの交換）に係る組成物の改変された少なくとも１つのｍＲＮＡの測定は、ＷＯ０２／０９８４４３で説明されているコンピュータプログラムを使用して実施され得る。当該開示内容は、その全範囲が本発明に含まれる。このコンピュータプログラムを使用することで、細胞中で可能な限り頻繁に発生するｔＲＮＡをコードしているコドン、改変されていない配列と比較して好ましくは改変されていない、少なくとも１つの改変ｍＲＮＡによってコードされているアミノ酸配列、の使用を組み合わせて、最大限のＧ／Ｃ含有量が生じるように、任意で所望のｍＲＮＡのヌクレオチド配列が、遺伝コードの援助、またはその変性の性質の援助により改変され得る。あるいは、元の配列と比較して、Ｇ／Ｃ含有量だけ、またはコドン使用頻度だけ、改変することも可能である。また、Visual Basic 6.0（development environment used: Microsoft Visual Studio Enterprise 6.0 with Servicepack 3）のソースコードは、ＷＯ０２／０９８４４３で説明されている。本発明のさらに好ましい実施形態において、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡのリボソーム結合サイトの環境におけるＡ／Ｕ含有量は、その特定の野生型ｍＲＮＡのリボソーム結合サイトの環境におけるＡ／Ｕと比較して増加される。この改変（リボソーム結合サイト周辺で増加したＡ／Ｕ含有量）は、少なくとも１つのｍＲＮＡへのリボソーム結合の効率を上昇させる。リボソーム結合サイト（コザック配列：ＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＵＧＧ（配列番号６８）、ＡＵＧは、開始コドンを形成する）へのリボソームの効果的な結合もまた、少なくとも１つのｍＲＮＡの効率的な翻訳の効果を有する。本発明のさらなる実施形態によると、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、潜在的に不安定化させる配列エレメントに関して改変されてもよい。特に、この少なくとも１つのｍＲＮＡのコード領域ならびに／または５’および／もしくは３’非翻訳領域は、それが、不安定化配列エレメント、その特定の野生型ｍＲＮＡと比較して好ましくは改変されていない、少なくとも１つの改変ｍＲＮＡによってコードされたアミノ酸配列、を含まないように、特定の野生型ｍＲＮＡと比較して改変されていてもよい。例えば、真核生物のＲＮＡの配列において、不安定化配列エレメント（ＤＳＥ）が発生し、これに対して、シグナルタンパク質は、インビボで結合し、ＲＮＡの酵素分解を調節することが知られている。改変された少なくとも１つのｍＲＮＡのさらなる安定化のために、本明細書で規定される抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドをコードしている領域において、不安定化配列エレメントがこ���に含まれないか、または実質的に含まれないように、野生型ｍＲＮＡの対応する領域と比較した１つ以上の上記の改変が、必要に応じて実施され得る。また、本発明によると、非翻訳領域（３’−ＵＴＲおよび／または５’−ＵＴＲ）に存在するＤＳＥも、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡから、上記の改変によって除去され得る。上記の不安定化配列は、例えば、ＡＵリッチ配列（ＡＵＲＥＳ）であり、当該ＡＵリッチ配列は、多くの不安定なＲＮＡの３’−ＵＴＲセクションで生じる（Caput et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986, 83: 1670 to 1674）。従って、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、好ましくは、少なくとも１つのｍＲＮＡが上記の不安定化配列を含まないように、野生型ｍＲＮＡと比較して改変されている。また、これは、可能性のあるエンドヌクレアーゼによって認識されるそれらの配列モチーフ、例えば、配列ＧＡＡＣＡＡＧに適用される。当該配列モチーフは、トランスフェリン受容体をコードしている遺伝子の３’−ＵＴＲセグメントに含まれる（Binder et al., EMBO J. 1994, 13: 1969 to 1980）。また、これらの配列モチーフは、好ましくは、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡで取り除かれる。また、好ましくは、本発明によると、改変された形態で、例えば、リボソーム結合を向上するために、または、本発明に係る組成物の少なくとも１つ（バイシストロニックまたはマルチシストロニック）のｍＲＮＡに位置するコードされた種々の抗原の発現を可能にするために、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、改変された形態で、上記で規定された少なくとも１つのＩＲＥＳ、ならびに／または、少なくとも１つの５’安定化配列および／もしくは３’安定化配列を有する。また、好ましくは、本発明によると、例えば、リボソーム結合を向上するために、または、本発明に係る組成物の少なくとも１つ（バイシストロニックまたはマルチシストロニック）のｍＲＮＡに位置するコードされた種々の抗原の発現を可能にするために、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、改変された形態で、上記で規定された少なくとも１つのＩＲＥＳ、ならびに／または、少なくとも１つの５’安定化配列および／または３’安定化配列を有する。
【０１４５】
本発明によると、組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、さらに好ましくは、少なくとも１つの５’安定化配列および／または３’安定化配列を有する。５’非翻訳領域および／または３’非翻訳領域におけるこれらの安定化配列は、サイトゾル中の少なくとも１つのｍＲＮＡの半減期を増大させる効果を有する。これらの安定化配列は、自然発生配列に対して１００％の配列相同性を有し得る。当該安定化配列は、ウイルス、バクテリアおよび真核生物で発生し得るが、これも、部分的または完全に合成であり得る。例えば、ホモサピエンスまたはアメリカツメガエルからのβ−グロビン遺伝子の非翻訳配列（ＵＴＲ）は、安定化配列の例として言及され得る。当該安定化配列は、安定化されたｍＲＮＡのための本発明で使用され得る。安定化配列の別の例は、一般式（Ｃ／Ｕ）ＣＣＡＮｘＣＣＣ（Ｕ／Ａ）ＰｙｘＵＣ（Ｃ／Ｕ）ＣＣ（配列番号６９）を有し、当該安定化配列は、α−グロブリン、α（Ｉ）−コラーゲン、１５−リポキシゲナーゼをコードしている非常に安定的なｍＲＮＡの３’ＵＴＲに、または、チロシンヒドロキシラーゼをコードしている非常に安定的なｍＲＮＡの３’ＵＴＲに、含まれる（Holcik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94: 2410 to 2414を参照すること）。上記の安定化配列は、当然、個々に使用されるか、または、互いに組み合わされて使用されるか、また、当業者に知られている他の安定化配列と組み合わせて使用され得る。従って、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、好ましくは、グロビンＵＴＲ（非翻訳領域）安定化ｍＲＮＡとして、特に、α−グロビンＵＴＲ安定化ｍＲＮＡとして存在する。好ましくは、組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、好ましくは、配列番号７０に従ったヒトα−グロビン遺伝子などのα−グロビン遺伝子の３’ＵＴＲのα−複合体−結合中心部位に由来する３’−ＵＴＲ中の安定化配列を含む：
α−グロビン遺伝子のα−複合体−結合中心部位（本明細書では“muag”とも呼ばれる）
ＧＣＣＣＧＡＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＡＡＣＧＧＧＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＣＣＵＵＧＣＡＣＣＧ（配列番号７０）。
【０１４６】
それにもかかわらず、好ましくは、よく知られた部位特異的突然変異誘発の技術による、または、オリゴヌクレオチドライゲーション法を用いた、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡの調製のためのＤＮＡマトリックスを使用して、塩基の置換、付加または脱離は、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡと共に実施される（例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd ed., Cold Spring Harbor, NY, 2001を参照）。そのようなプロセスにおいて、少なくとも１つのｍＲＮＡの調製のために、対応するＤＮＡ分子は、インビトロで転写されてもよい。このＤＮＡマトリックスは、好ましくは、インビトロでの転写のために、好適なプロモーター、例えば、Ｔ７プロモーターまたはＳＰ６プロモーターを含み、当該プロモーターの後には、調整される少なくとも１つのｍＲＮＡのための所望のヌクレオチド配列と、インビトロでの転写のための終止シグナルとが続く。目的の、少なくとも１つのｍＲＮＡのマトリックスを形成するＤＮＡ分子は、バクテリア中で複製され得るプラスミドの一部として、発酵による増殖とその後の単離とによって調整されてもよい。本発明に好適なものとして言及され得るプラスミドは、例えば、プラスミドｐＴ７Ｔｓ（GenBank accession number U26404; Lai et al., Development 1995, 121: 2349 to 2360）、ｐＧＥＭ（登録商標）シリーズ、例えば、ｐＧＥＭ（登録商標）−１（Promega のGenBank accession number X65300）、およびｐＳＰ６４（GenBank accession number X65327）である。また、Mezei and Storts, Purification of PCR Products, in: Griffin and Griffin (ed.), PCR Technology: Current Innovation, CRC Press, Boca Raton, FL, 2001を参照すること。
【０１４７】
カチオン性化合物、特に、ポリカチオン性化合物、例えば、（ポリ）カチオン性ペプチドまたは（ポリ）カチオン性タンパク質、と少なくとも１つのｍＲＮＡとを会合させるか、もしくは複合体化することにより、または、これらに少なくとも１つのｍＲＮＡを結合することにより、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡの安定化は、同様に実施され得る。特に、ＲＮＡに対するポリカチオン性核酸結合タンパクとして、プロタミン、ヌクレオリン、スペルミンまたはスペルミジンを使用することは、特に効果的である。さらに、ポリ−Ｌ−リジンまたはヒストンなどの、他のカチオン性ペプチドまたはカチオン性タンパク質を使用することが、同様に可能である。ｍＲＮＡを安定化するためのこの手段は、ＥＰ−Ａ−１０８３２３２で説明されており、この開示は、その全文が参照により本発明に組み込まれる。本発明に係る組成物のｍＲＮＡを安定化するために使用され得るさらに好ましいカチオン性物質は、カチオン性多糖類、例えば、キトサン、ポリブレン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）などを含む。本発明の組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡと、カチオン性化合物、例えばカチオン性タンパク質またはカチオン性脂質、例えば、脂質に基づく複合体形成試薬としてのオリゴフェクタミン、との会合または複合体化は、好ましくは、処理される細胞または処理される有機体への薬学的活性成分として存在する少なくとも１つのｍＲＮＡの転移を増加させる。また、ｍＲＮＡの安定化のために保持する、複合体化による本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡに対する安定化効果に関する、本明細書における開示で、それは参照される。
【０１４８】
特に好ましい実施形態によると、組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、分泌シグナルペプチドを、さらに、または代わりにコードしてもよい。そのようなシグナルペプチドは、一般的に、約１５個から３０個のアミノ酸の長さを示し、かつ、好ましくは、コードされたペプチドのＮ末端に位置する、配列であるが、これらに限定されない。本明細書で規定されるシグナルペプチドは、好ましくは、組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡによってコードされている抗原、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドの、画定された細胞のコンパートメントへの輸送、好ましくは、細胞表面への輸送、小胞体（ＥＲ）への輸送、または、エンドソーム−リソソームコンパートメントへの輸送を可能にする。本明細書で規定される分泌シグナルペプチドの例は、古典的ＭＨＣ分子または非古典的ＭＨＣ分子のシグナル配列（例えば、ＭＨＣＩ分子およびＭＨＣＩＩ分子のシグナル配列、例えば、ＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ−Ａ＊０２０１のシグナル配列）、本明細書で規定されるサイトカインまたは免疫グロブリンのシグナル配列、本明細書で規定される免疫グロブリンまたは抗体のインバリアント鎖のシグナル配列、Ｌａｍｐ１、タパシン、Ｅｒｐ５７、カルレティキュリン、カルネキシンおよびさらなる膜関連タンパク質のシグナル配列、または、小胞体（ＥＲ）もしくはエンドソーム−リソソームコンパートメントに関連したタンパク質のシグナル配列を含むが、これらに限定されない。特に好ましくは、ＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ−Ａ＊０２０１のシグナル配列は、本発明に従って使用されてもよい。
【０１４９】
上記の改変のうちの何れかは、本発明に係る組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡに適用されてもよく、また、さらに、本発明に関して使用されている何れかのＲＮＡに適用されてもよく、また、適している場合または必要な場合、改変のこれらの組み合わせが、各々の少なくとも１つのｍＲＮＡにおいて、互いに干渉しないという条件で、上記の改変のうちの何れかは、任意の組み合わせで互いに組み合わされてもよい。当業者は、適宜、自由に選択することができる。
【０１５０】
好ましい実施形態によると、組成物は、本明細書に記載されたように改変された少なくとも１つのｍＲＮＡを含み、当該少なくとも１つのｍＲＮＡは、配列番号３、６、９、１２、１５、１８または２５のＲＮＡ配列と同一または少なくとも８０％同一であるＲＮＡ配列から選択される少なくとも１つのコード配列を含む。さらにより好ましくは、組成物は、６つのｍＲＮＡを含み、ここで、各ｍＲＮＡにおけるコード配列は、配列番号３、６、９、１２、１５、１８または２５のＲＮＡ配列のうちの１つと同一または少なくとも８０％同一である。
【０１５１】
好ましい実施形態において、本発明に係る組成物の６つの各抗原は、１つの（モノシストロニック）ｍＲＮＡによってコードされてもよい。言い換えると、本発明の組成物は、６つの（モノシストロニック）ｍＲＮＡを含んでもよく、ここで、各々のこれら６つの（モノシストロニック）ｍＲＮＡは、上記で規定されたちょうど１つの抗原をコードしてもよい。
【０１５２】
さらにより好ましい実施形態において、組成物は、６つのｍＲＮＡを含み、各々の当該６つのｍＲＮＡは、本明細書に記載されているように改変されており、ここで、各ｍＲＮＡでは、１つのｍＲＮＡは、５Ｔ４をコードしており、１つのｍＲＮＡは、サバイビンをコードしており、１つのｍＲＮＡは、ＮＹ−ＥＳＯ−１をコードしており、１つのｍＲＮＡは、ＭＡＧＥ−Ｃ１をコードしており、１つのｍＲＮＡは、ＭＡＧＥ−Ｃ２をコードしており、また、１つのｍＲＮＡは、ＭＵＣ１、または、そのフラグメントもしくはその変異体をコードしている。
【０１５３】
さらにより好ましい実施形態において、組成物は、６つのｍＲＮＡを含み、ここで、１つのｍＲＮＡは、５Ｔ４をコードし、かつ、配列番号３と同一または少なくとも８０％同一のコード配列を含み、１つのｍＲＮＡは、サバイビンをコードし、かつ、配列番号６と同一または少なくとも８０％同一のコード配列を含み、１つのｍＲＮＡは、ＮＹ−ＥＳＯ−１をコードし、かつ、配列番号９と同一または少なくとも８０％同一のコード配列を含み、１つのｍＲＮＡは、ＭＡＧＥ−Ｃ１をコードし、かつ、配列番号１２と同一または少なくとも８０％同一のコード配列を含み、１つのｍＲＮＡは、ＭＡＧＥ−Ｃ２をコードし、かつ、配列番号１５と同一または少なくとも８０％同一のコード配列を含み、また、１つのｍＲＮＡは、ＭＵＣ１をコードし、かつ、配列番号１８と同一または少なくとも８０％同一のコード配列（または、これらの各配列のフラグメントもしくは変異体）、および、必要に応じてさらなる賦形剤を含む。
【０１５４】
一実施形態において、組成物は、少なくとも１つのｍＲＮＡを含み、当該少なくとも１つのｍＲＮＡは、配列番号１、４、７、１０、１３または１６のＲＮＡ配列と同一または少なくとも８０％同一である。さらにより好ましくは、組成物は、６つのｍＲＮＡを含み、ここで、各々のｍＲＮＡは、配列番号１、４、７、１０、１３または１６のＲＮＡ配列のうちの１つと同一または少なくとも８０％同一である。
【０１５５】
さらにより好ましい実施形態において、組成物は、６つのｍＲＮＡを含み、ここで、１つのｍＲＮＡは、５Ｔ４をコードし、かつ、配列番号１と同一または少なくとも８０％同一のコード配列を含み、１つのｍＲＮＡは、サバイビンをコードし、かつ、配列番号４と同一または少なくとも８０％同一のコード配列を含み、１つのｍＲＮＡは、ＮＹ−ＥＳＯ−１をコードし、かつ、配列番号７と同一または少なくとも８０％同一のコード配列を含み、１つのｍＲＮＡは、ＭＡＧＥ−Ｃ１をコードし、かつ、配列番号１０と同一または少なくとも８０％同一のコード配列を含み、１つのｍＲＮＡは、ＭＡＧＥ−Ｃ２をコードし、かつ、配列番号１３と同一または少なくとも８０％同一のコード配列を含み、また、１つのｍＲＮＡは、ＭＵＣ１をコードし、かつ、配列番号１６と同一または少なくとも８０％同一のコード配列（または、これらの各配列のフラグメントもしくは変異体）、および、必要に応じてさらなる賦形剤を含む。
【０１５６】
本発明によると、上記で説明した組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、３’ＵＴＲ領域にヒストンステムループを含む。好ましくは、組成物は、６つのｍＲＮＡを含み、ここで、各々のｍＲＮＡは、本明細書で規定されるヒストンステムループを含む。
【０１５７】
好ましい実施形態において、組成物は、６つのｍＲＮＡを含み、ここで、１つのｍＲＮＡは、５Ｔ４をコードし、かつ、配列番号１９と同一または少なくとも８０％同一のコード配列を含み、１つのｍＲＮＡは、サバイビンをコードし、かつ、配列番号２０と同一または少なくとも８０％同一のコード配列を含み、１つのｍＲＮＡは、ＮＹ−ＥＳＯ−１をコードし、かつ、配列番号２１と同一または少なくとも８０％同一のコード配列を含み、１つのｍＲＮＡは、ＭＡＧＥ−Ｃ１をコードし、かつ、配列番号２２と同一または少なくとも８０％同一のコード配列を含み、１つのｍＲＮＡは、ＭＡＧＥ−Ｃ２をコードし、かつ、配列番号２３と同一または少なくとも８０％同一のコード配列を含み、また、１つのｍＲＮＡは、ＭＵＣ１をコードし、かつ、配列番号２４と同一または少なくとも８０％同一のコード配列（または、これらの各配列のフラグメントもしくは変異体）、および、必要に応じてさらなる賦形剤を含む。
【０１５８】
別の実施形態によると、本発明に係る組成物は、組成物の免疫賦活性を高めるために、アジュバントを含んでもよい。これに関し、アジュバントは、本発明に係る組成物の投与および送達を補助するのに適している任意の化合物として理解されてもよい。さらに、そのようなアジュバントは、組成物に結合することなく、先天性免疫システムの免疫反応、すなわち非特異的免疫反応を開始または増進させる。言い換えると、投与されたとき、本発明に係る組成物は、一般的に、本発明の組成物に含まれる少なくとも１つのｍＲＮＡによってコードされている少なくとも６つの抗原に起因した適応免疫反応を開始させる。さらに、本発明に係る組成物は、本発明に係る組成物への、本明細書で規定されるアジュバントの添加に起因した（支持的な）先天性免疫反応を発生させてもよい。
【０１５９】
かかるアジュバントは技術者にとって既知の、および本事例に対して好適な、すなわち、哺乳類における免疫応答の誘導を支持する、いかなるアジュバントから選択されてもよい。望ましくは、アジュバントは以下から成る群から選択されてよいが、これに限定されない：ＴＤＭ、ＭＤＰ、ムラミルジペプチド、プルロニクス、ミョウバン溶液、アルミニウム水酸化物、ＡＤＪＵＭＥＲＴＭ（ポリホスファゼン）、リン酸アルミニウムジェル、藻類由来のグルカン、アルガムリン、アルミニウム水酸化物ジェル（ミョウバン）、高タンパク質吸収アルミニウム水酸化物ジェル、低粘着アルミニウム水酸化物ジェル、ＡＦまたはＳＰＴ（スクアレンエマルジョン）（５％）、Ｔｗｅｅｎ８０（０．２％）、プルロニックＬ１２１（１．２５％）リン酸緩衝サリンｐＨ７．４），ＡＶＲＩＤＩＮＥＴＭ（パラペンジアミン）、ＢＡＹ  Ｒ１００５ＴＭ（Ｎ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ルクシラミノ−ｂ−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシル−アミド  ヒドロアセテート）、ＣＡＬＣＩＴＲＩＯＬＴＭ（１−アルファ，２５−ジヒドロロキシ−ビタミンＤ３）、リン酸カルシウムジェル、ＣＡＰＴＭ（リン酸カルシウムナノ粒子）、コレラヘロトキシン、コレラ−トキシンＡ１−タンパク質−Ａ−Ｄ−フラグメント融合タンパク質、コレラトキシンのサブユニットＢ、ＣＲＬ１００５（ブロックコポリマーＰ１２００５），サイトカイン含有リポソーム、ＤＤＡ（ジメチルヂオクタデシルアンモニウム臭化物）、ＤＨＥＡ（デヒドロエピアンドロステロン）、ＤＭＰＣ（ジミリストイルホスファチジルコリン）、ＤＭＰＧ（ジミリストイルホスファチジルグリセロール）、ＤＯＣ／ミョウバン複合体（デオキシコール酸ナトリウム塩）、フロインド完全アジュバント、フロインド不完全アジュバント、ガンマイヌリン、Ｇｅｒｂｕアジュバント（ｉ）Ｎ−アセチルグルコサミル−（Ｐ１−４）−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミン（ＧＭＤＰ）、ｉｉ）ジメチルジオクタデシルアンモニウム塩化物（ＤＤＡ）、ｉｉｉ）亜鉛−Ｌ−プロリン塩複合体（ＺｎＰｒｏ−８）の複合物、ＧＭ−ＣＳＦ）、ＧＭＤＰ（Ｎ−アセチルグルコサミニル−（ｂ１−４）−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン）、イミクイモド（１−（２−メチルプロピル）−１Ｈイミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン）、ＩｍｍＴｈｅｒＴＭ（Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−イソＧｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−グリセロール  ジパルミテート）、ＤＲＶ（脱水−再水和ベシクルから調整される免疫リポソーム）、インターフェロンガンマ、インターロイキン１−ベータ、インターロイキン−２、インターロイキン７、インターロイキン１２、ＩＳＣＯＭＳＴＭ、ＩＳＣＯＰＲＥＰ７．０．３ＴＭ、リポソーム、ＬＯＸＯＲＩＢＩＮＥＴＭ（７−アリル−８−オキソグアノシン）、ＬＴ経口アジュバント（大腸菌レイビルエンテロトキシン−プロトキシン）、任意の組成物のミクロ球体およびミクロ粒子、ＭＦ５９ＴＭ（スクアレン−水エマルジョン）、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ  ＩＳＡ  ５１ＴＭ、（精製フロインド不完全アジュバント）、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ  ＩＳＡ  ７２０ＴＭ（代���転換可能油アジュバント）、ＭＰＬＴＭ（３−Ｑ−デサシル−４’−モノホスホリル液Ａ）、ＭＴＰ−ＴＭおよびＭＴＰ−ＴＭリポソーム（（Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−（ヒドロキシホスホリロキシ））−エチラミド、モノナトリウム塩）、ＭＵＲＡＭＥＴＩＤＥＴＭ（Ｎａｃ−Ｍｕｒ−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｎ−ＯＣＨ３）、ＭＵＲＡＰＡＬＭＩＴＩＮＥＴＭおよびＤ−ＭＵＲＡＰＡＬＭＩＴＩＮＥＴＭ（Ｎａｃ−Ｍｕｒ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｄ−イソＧｌｎ−ｓｎ−グリセロールジパルミトイル）、ＮＡＧＯ（ノイラミニダーゼ−ガラクトースオキシダーゼ）、任意の組成物のナノ球体およびナノ粒子、ＮＩＳＶ（non-ionic surfactant vesicles、非イオン性界面活性剤ベシクル）、ＰＬＥＵＲＡＮＴＭ（β−グルカン）、ＰＬＧＡ、ＰＧＡおよびＰＬＡ（乳酸およびグリコール酸のホモポリマーおよびコポリマー、ミクロ球体／ナノ球体）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｌ１２１ＴＭ、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）、ＰＯＤＤＳＴＭ（プロテノイドミクロ球体）、ポリエチレンカルバミン酸塩誘導体、ポリ−ｒＡ・ポリ−ｒＵ（ポリアデニル酸−ポリウリジル酸複合体）、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、タンパク質コクリエート（アラバマ州アラバスター、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社）、ＳＴＩＭＵＬＯＮＴＭ（ＱＳ−２１）、Ｑｕｉｌ−Ａ（Ｑｕｉｌ−Ａサポニン）、Ｓ−２８４６３（４−アミノ−ｏｔｅｃ−ジメチル−２−エトキシメチル−一水素イミダゾ［４，５  ｃ］キノリン−１−エタノール）、ＳＡＦ−１ＴＭ（”Ｓｙｎｔｅｘ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ”）、センダイタンパク質リポソーム、センダイ含有脂質マトリクス、スパン−８５（ソルビタントリオレート）、スペコール（Ｍａｒｃｏｌ５２、Ｓｐａｎ８５、Ｔｗｅｅｎ８５）、スクアレンまたはＲｏｂａｎｅ（登録商標）（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチルテトラコサンおよび２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサン）、ステアリルチロシン（オクタデシルチロシンヒドロクロライド）、Ｔｈｅｒａｍｉｄ（登録商標）（Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−イソＧｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピラミド）、スレオニル−ＭＤＰ（ＴｅｒｍｕｒｔｉｄｅＴＭまたは［ｔｈｒ  １］−ＭＤＰ、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン）、Ｔｙ粒子（Ｔｙ−ＶＬＰまたはウイルス様粒子）、ウォルターリードリポソーマ（アルミニウム水酸化物に吸着した脂質Ａを含有するリポソーム）およびリポペプチド（Ｐａｍ３Ｃｙｓ、特に、Ａｄｊｕ−ｐｈｏｓ、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ、Ｒｅｈｙｄｒｏｇｅｌのようなアルミニウム塩、を含む）、エマルジョン（ＣＦＡ、ＳＡＦ、ＩＦＡ、ＭＦ５９、Ｐｒｏｖａｘ、ＴｉｔｅｒＭａｘ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ、Ｖａｘｆｅｃｔｉｏｎを含む）、コポリマー（Ｏｐｔｉｖａｘ（ＣＲＬ１００５）、Ｌ１２１（Ｐｏｌｏａｘｉｍｅｒ４０１０）などを含む）、リポソーム（Ｓｔｅａｌｔｈおよび、ＢＩＯＲＡＬなどのコクリエートを含む）���植物由来のアジュバント（ＱＳ２１、Ｑｕｉｌ  Ａ、Ｉｓｃｏｍａｔｒｉｘ、ＩＳＣＯＭ）、同時刺激のために好適なアジュバント（Ｔｏｍａｔｉｎｅおよび、ＰＬＧ、ＰＭＭ、イヌリンなどの生体高分子を含む）、微生物由来のアジュバント（Ｒｏｍｕｒｔｉｔｉｄｅ、ＤＥＴＯＸ、ＭＰＬ、ＣＷＳ、マンノース、ＣｐＧ核酸配列、ＣｐＧ７９０９、ヒトＴＬＲ１−１０のリガンド、ネズミＴＬＲ１−１３のリガンド、ＩＳＳ−１０１８、ＩＣ３１、イミダゾキノリン類、Ａｍｐｌｉｇｅｎ、Ｒｉｂｉ５２９、ＩＭＯｘｉｎｅ、ＩＲＩＶ類、ＶＬＰ類、コレラ毒素、熱不安定性毒素、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ、ＧＰＩアンカー、ＬＮＦＰＩＩＩ／ＬｅｗｉｓＸ、抗菌ペプチド、ＵＣ−１Ｖ１５０、ＲＳＶ融合タンパク質、ｃｄｉＧＭＰ、を含む）、および、拮抗剤として好適なアジュバント（ＣＧＲＰ神経ペプチドを含む）。
【０１６０】
好適なアジュバントは、カチオン性あるいはポリカチオン性の化合物から選択されてもよく、その場合は本発明の組成物の少なくとも一つのｍＲＮＡと前記カチオン性あるいはポリカチオン性の化合物とを複合することによりアジュバントを調整することが好ましい。発明組成物の少なくとも一つのｍＲＮＡとここに定めるカチオン性あるいはポリカチオン性の化合物との結合あるいは複合が、アジュバントの特性を提供し、発明組成物の少なくとも一つのｍＲＮＡに対して安定した効果を授与することが望ましい。特に、かかる望ましい、かかるカチオン性あるいはポリカチオン性の化合物は、カチオン性あるいはポリカチオン性のペプチドまたはタンパク質（プロタミン、ヌクレオリン、スペルミンまたはスペルミジン、あるいはその他のペプチドあるいはタンパク質（例えば、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ポリアルギニン、塩基ポリペプチド、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ：例えばＨＩＶ誘導ペプチド、Ｔａｔ、ＨＩＶ−１  Ｔａｔ（ＨＩＶ）、Ｔａｔ由来ペプチド、ペネトラチン、ＶＰ２２由来ペプチドまたは類似ペプチド、ＨＳＶ  ＶＰ２２（単純ヘルペス）、ＭＡＰ、ＫＡＬＡまたはタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ類、ＰｐＴ６２０、プロリンリッチペプチド類、アルギニンリッチペプチド類、リジンリッチペプチド類、ＭＰＧ−ペプチド（類）、Ｐｅｐ−１、Ｌ−オリゴノマー、カルシトニンペプチド（類）、アンテナペディア由来ペプチド類（特にショウジョウバエアンテナペディア由来）、ｐＡｎｔｐ、ｐｌｓｌ、ＦＧＦ、ラクトフェリン、トランスポータン、ブホリン−２、Ｂａｃ７１５−２４、ＳｙｎＢ、ＳｙｎＢ（１）、ｐＶＥＣ、ｈＣＴ由来ペプチド類、ＳＡＰ、プロタミン、スペルミン、スペルミジン、あるいはヒストン））を含む）。望ましいカチオン性あるいはポリカチオン性の化合物はさらに、以下を含んでもよい：カチオン性多糖類（例えば、キトサン、ポリブレン、カチオン性ポリマー類（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、カチオン性脂質（例えば、ＤＯＴＭＡすなわち１−（２，３−シオレイロキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム塩化物、ＤＭＲＩＥ、ジ−Ｃ１４−アミジン、ＤＯＴＩＭ、ＳＡＩＮＴ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＢＧＴＣ、ＣＴＡＰ、ＤＯＰＣ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＰＥすなわちジオニルホスファチジルエタノールアミン、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＤＡＢ、ＤＯＩＣ、ＤＭＥＰＣ、ＤＯＧＳすなわちジオクタデシルアミドグリシルスペルミン、ＤＩＭＲＩすなわち、ジミリスト−オキシプロピルジメチルヒドロキシエチルアンモニウム臭化物、ＤＯＴＡＰすなわちジオレオイロキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン、ＤＣ−６−１４すなわちＯ，Ｏ−ジテトラデカノイル）−Ｎ−（−トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミン塩化物、ＣＬＩＰ１すなわちｒａｃ−（２，３−ジオクタデシルオキシプロピル）（２−ヒドロキシエチル）−ジメチルアンモニウム塩化物、ＣＬＩＰ６すなわちｒａｃ−２（２，３−ジヘキサデシルオキシプロピル−オキシメチルオキシ）エチルトリメチルアンモニウム）、ＣＬＩＰ９すなわちｒａｃ−２（２，３）ジヘキサデシルオキシプロピル−オキシサクシニルオキシ）エチル−トリメチルアンモニ��ム、オリゴフェクタミン）、あるいは、カチオン性またはポリカチオン性のポリマー類（例えば、−アミノ酸−ポリマー類または逆性ポリアミド類などの変性ポリアミノ酸）、ＰＶＰ（ポリ（Ｎ−エチル−４−ビニルピリジニウム臭化物））などのような変性ポリエチレン類）、ｐＤＭＡＥＭＡ（ポリ（ジメチルアミノエチル）メチルラクリレート））などのような変性アクリレート類、ｐＡＭＡＭ（ポリ（アミドアミン））などの変性アミノアミン類、ジアミン端末変性１，４ブタンジオールジアクリレート−ｃｏ−５−アミノ−１−ペンタノールポリマー類などのような変性ポリベータアミノエステル（ＰＢＡＥ）、ポリプロピルアミンデンドリマー類やｐＡＭＡＭベースデンドリマー類などのようなデンドリマー類、ポリアミン（類）、ＰＥＩすなわちポリ（エチレンイミン）、ポリ（プロピレンイミン）などのようなポリイミン（類）、ポリアリラミン、糖骨格ベースポリマー類（シクロデキストリンベースポリマー類、デキストランベースポリマー類、キトサン、など）、ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳコポリマー類などのシラン骨格ベースポリマー類、１つまたはそれ以上のカチオン性ブロック（例えば、上記のカチオン性のポリマーから選択される）および、１つまたはそれ以上の親水性または疎水性ブロック（例えばポリエチレングリコール）の組み合わせから成るブロックポリマー類、など。
【０１６１】
加えて、本発明の組成物のｍＲＮＡの少なくとも一つと複合することによってアジュバントとして使用できる、望ましいカチオン性またはポリカチオン性のタンパク質またはペプチドは、以下のタンパク質またはペプチドから選択されてよく、以下の全体式（ＩＩＩ）を有する：（Ａｒｇ）ｌ（Ｌｙｓ）ｍ（Ｈｉｓ）ｎ（Ｏｒｎ）ｏ（Ｘａａ）ｘ、ただしｌ＋ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｘ＝８〜１５、かつｌ、ｍ、ｎ、ｏはそれぞれ独立して、０、１、２、３，４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５のうちから選択され、（ただしＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｏｒｎ、Ｘａａの全体的な含有量がオリゴペプチドの全アミノ酸の最低でも５０％を占めることが条件）、また、Ｘａａは、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｏｒｎ以外の天然型（天然に存在する）アミノ酸または非天然型任意のアミノ酸から選択される任意のアミノ酸でよく、また、ｘは０、１、２、３、４から選択される任意の数字でよい（ただし、Ｘａａの全体的な含有量がオリゴペプチドの全アミノ酸の５０％を越えないことが条件）。この状況において特に特に好ましいオリゴアルギニンは、例えば、Ａｒｇ７、Ａｒｇ８、Ａｒｇ９、Ａｒｇ７、Ｈ３Ｒ９、Ｒ９Ｈ３、Ｈ３Ｒ９Ｈ３、ＹＳＳＲ９ＳＳＹ、（ＲＫＨ）４、Ｙ（ＲＫＨ）２Ｒ、などである。
【０１６２】
ｍＲＮＡの、アジュバント構成物中のカチオン性またはポリカチオン性の化合物に対する比率は、ｍＲＮＡ複合体全体の窒素／リン酸比率（Ｎ／Ｐ比率）すなわち、カチオン性あるいはポリカチオン性の化合物の正に帯電した（窒素）原子の、核酸の負に帯電したリン酸原子に基づいて算出されてもよい。例えば、ＲＮＡが塩基(bases)の統計的な分散を示す場合、１μｇのＲＮＡは典型的にはおよそ３ｎｍｏｌのリン酸残基を含有する。加えて、分子量および塩基性アミノ酸の数に依って、１μｇのペプチドは典型的におよそｘｍｏｌの窒素残基を含有する。（Ａｒｇ）９（分子量１４２４ｇ／ｍｏｌ、９窒素原子）について模範的に算出する場合、１μｇの（Ａｒｇ）９はおよそ７００ｐｍｏｌの（Ａｒｇ）９、したがって７００×９＝６３００ｐｍｏｌの塩基性アミノ酸＝６．３ｎｍｏｌの窒素原子を含有する。ＲＮＡ／（Ａｒｇ）９質量比およそ１：１に対し、Ｎ／Ｐ比率はおよそ２と算出することができる。プロタミン（鮭由来プロタミン使用の場合、分子量およそ４２５０ｇ／ｍｏｌ、２１窒素原子）について模範的に算出する場合、２μｇのＲＮＡでおよそ２：１の質量比であり、ＲＮＡ中に６ｎｍｏｌのリン酸が算出されることとなり、１μｇのプロタミンはおよそ２３５ｐｍｏｌのプロタミン分子、したがって２３５×２１＝４９３５ｐｍｏｌの塩基性窒素原子＝４．９ｎｍｏｌの窒素原子を含有する。ＲＮＡ／プロタミン９質量比およそ２：１に対し、Ｎ／Ｐ比率はおよそ０．８１と算出することができる。ＲＮＡ／プロタミン９質量比およそ８：１に対し、Ｎ／Ｐ比率はおよそ０．２と算出することができる。本発明の状況において、Ｎ／Ｐ比率はおよそ０．１〜１０の範囲にあることが望ましい。複合体中のＲＮＡ対ペプチドの比率を考えるとＮ／Ｐ比率はおよそ０．３〜４の範囲にあることがより望ましく、およそ０．５〜２または０．７〜２の範囲にあることが最も望ましい。Ｎ／Ｐ比率はおよそ０．７〜１．５の範囲にあることが最も望ましい。
【０１６３】
望ましい実施形態において、効果的な免疫活性化効果および、発明による少なくとも一つのｍＲＮＡの効果的な翻訳の両方を得るために、当該組成物は、２つの別々の工程において得られる。ここで、いわゆる「アジュバント構成物」は、―第一工程において―前記アジュバント構成物の少なくとも一つのｍＲＮＡと、カチオン性またはポリカチオン性の化合物を、安定な複合体を形成するための特定の比率で複合することによって調整される。この状況において、ｍＲＮＡの複合の後、アジュバント構成物中には、自由なカチオン性またはポリカチオン性の化合物は全く残っていないか、無視すべきほど少量が残っているだけであることが重要である。よって、アジュバント構成物中の、ｍＲＮＡおよび、カチオン性またはポリカチオン性の化合物の比率は、ｍＲＮＡが全体的に複合され、化合物中に自由なカチオン性またはポリカチオン性の化合物が全く残っていないか、無視できるほど少量が残るだけとなるような範囲の中から選択されることが典型的である。アジュバント構成物すなわちカチオン性またはポリカチオン性の化合物に対するｍＲＮＡの比率は、およそ６：１（ｗ／ｗ）からおよそ０．２５：１（ｗ／ｗ）の範囲から選択されることが望ましく、およそ５：１（ｗ／ｗ）から０．５：１（ｗ／ｗ）の範囲から選択されることがより望ましく、およそ４：１（ｗ／ｗ）からおよそ１：１（ｗ／ｗ）、あるいはおよそ３：１（ｗ／ｗ）からおよそ１：１（ｗ／ｗ）の範囲から選択されることが更により望ましく、およそ３：１（ｗ／ｗ）からおよそ２：１（ｗ／ｗ）の範囲の中から選択されることが最も望ましい。
【０１６４】
好ましい実施形態によれば、本発明の（免疫活性）組成物を形成するために、本発明による抗原をコードする少なくとも一つのｍＲＮＡが第二工程において、アジュバント構成物の複合ｍＲＮＡに添加される。ここにおいて、本発明の少なくとも一つのｍＲＮＡは遊離ｍＲＮＡ、すなわち、他の化合物と複合していないｍＲＮＡとして添加される。添加に先立って、前記少なくとも一つの遊離ｍＲＮＡは複合されず、望ましくは、アジュバント構成物添加における如何なる検出可能または重大な複合反応も経験しない。このことは、カチオン性またはポリカチオン性の化合物の、アジュバント構成物中の上述の少なくとも一つのｍＲＮＡとの強い結合が原因である。言い換えれば、本発明による少なくとも一つの抗原をコードする、前記少なくとも一つの遊離ｍＲＮＡが「アジュバント構成物」に添加される際に、自由な少なくとも一つの遊離ｍＲＮＡとの複合物を形成し得る自由なカチオン性またはポリカチオン性の化合物が存在しないまたは実質的に存在しないことが望ましい。よって、本発明の組成物の少なくとも一つの遊離ｍＲＮＡの効果的な翻訳がインビボで可能である。ここにおいて、前記少なくとも一つの遊離ｍＲＮＡはモノ、ジ、または多シストロンｍＲＮＡ、すなわち一つまたはそれ以上のコード配列を伝えるＲＮＡとして発現し得る。ジ、さらにあるいは多シストロンｍＲＮＡにおける、かかるコード配列は、ここに定義するような少なくとも一つのＩＲＥＳ配列によって分けられてもよい。
【０１６５】
特に望ましい実施形態において、本発明の組成物に含まれる前記少なくとも一つの遊離ｍＲＮＡは、治療の特定の要求に依って、本発明の組成物のアジュバント構成物の少なくとも一つのｍＲＮＡと、同一でもよいし、異なっていいてもよい。さらにより望ましくは、本発明の組成物に含まれる前記少なくとも一つのｍＲＮＡは、本発明の組成物のアジュバント構成物の少なくとも一つのｍＲＮＡと同一であるとよい。
【０１６６】
特に望ましい実施形態において、前記組成物は少なくとも一つのｍＲＮＡを含み、少なくとも一つのｍＲＮＡは上記に定義したように抗体をコードすることと、前記ｍＲＮＡは前記組成物中に、一部は遊離ｍＲＮＡとして、一部は複合したｍＲＮＡとして存在する。望ましくは、上記に定義したように一つまたはそれ以上の抗原をコードする前記少なくとも一つのｍＲＮＡは上述のように複合され、その後同少なくとも一つのｍＲＮＡは、遊離ｍＲＮＡとして添加され、ここで望ましくは、ｍＲＮＡを複合するために用いられる前記化合物は、前記遊離ｍＲＮＡ組成物の添加の瞬間は前記組成物中に自由な形態では存在しないことを特徴とする。
【０１６７】
第一構成物（すなわち、カチオン性またはポリカチオン性の化合物と複合した少なくとも一つのｍＲＮＡを含む、または、から成るアジュバント構成物）と第二構成物（すなわち、前記少なくとも一つの１つの遊離ｍＲＮＡ）の比率は、本発明の化合物において、ある治療の特定の要求にしたがって、選択されればよい。典型的には、本発明の組成物の前記アジュバント構成物中の前記ｍＲＮＡおよび、前記少なくとも一つの遊離ｍＲＮＡ（前記アジュバント構成物中のｍＲＮＡ：遊離ｍＲＮＡ）の比率は、前記アジュバント構成物によって先天性免疫システムの有意な刺激が誘発されるように選択される。並行して、前記比率は、有意な量の前記少なくとも一つの遊離ｍＲＮＡがインビボで提供されることができ、インビボでの発現タンパク質（例えば、上記で定義したように、ａｔｓｉｘ抗原など）の効果的な翻訳および凝集につながるように選択される。前記アジュバント構成物中の前記ｍＲＮＡ：本発明の組成物中のｍＲＮＡは、およそ５：１（ｗ／ｗ）からおよそ１：１０（ｗ／ｗ）の範囲から選択されることが望ましく、およそ４：１（ｗ／ｗ）からおよそ１：８（ｗ／ｗ）の範囲から選択することがより望ましく、およそ３：１（ｗ／ｗ）からおよそ１：５（ｗ／ｗ）またはおよそ１：３（ｗ／ｗ）の範囲から選択することが更により望ましく、アジュバント構成物中のｍＲＮＡ：本発明の組成物中の遊離ｍＲＮＡの比率はおよそ１：１の比率から選択されることが最も望ましい。
【０１６８】
加えて、または代わりに、第一構成物（すなわち、カチオン性またはポリカチオン性の化合物と複合した少なくとも一つのｍＲＮＡを含む、または、から成るアジュバント構成物）と第二構成物（前記少なくとも一つの１つの遊離ｍＲＮＡ）の比率は、ｍＲＮＡ複合物全体の窒素／リン酸比率（Ｎ／Ｐ比率）に基づいて算出されてもよい。本発明の状況において、複合物中のｍＲＮＡ：ペプチドの比率を考慮して、Ｎ／Ｐ比率はおよそ０．１〜１０の範囲にあることが望ましく、およそ０．３〜４の範囲にあることが望ましく、およそ０．５〜２または０．７〜２の範囲にあることが最も望ましく、およそ０．７〜１．５の範囲にあることが最も望ましい。
【０１６９】
加えて、または代わりに、第一構成物（すなわち、カチオン性またはポリカチオン性の化合物と複合した少なくとも一つのｍＲＮＡを含む、または、から成るアジュバント構成物）と第二構成物（前記少なくとも一つの１つの遊離ｍＲＮＡ）の比率はまた、本発明の組成物において、カチオン性またはポリカチオン性の化合物と複合したｍＲＮＡそれぞれ（すなわち、アジュバント構成物のｍＲＮＡ）および、第二構成物の少なくとも一つの遊離ｍＲＮＡの両方のｍｏｌ比に基づいて選択されてもよい。典型的には、第二構成物の前記少なくとも一つの遊離ｍＲＮＡに対する、アジュバント構成物のｍＲＮＡのｍｏｌ比は、前記ｍｏｌ比が上記の（ｗ／ｗ）および／またはＮ／Ｐ定義を満足するように選択されればよい。より望ましくは、第二構成物の前記少なくとも一つの遊離ｍＲＮＡに対する、アジュバント構成物のｍＲＮＡのｍｏｌ比は、例えば、およそ０．００１：１、０．０１：１、０．１：１、０．２：１、０．３：１、０．４：１、０．５：１、０．６：１、０．７：１、０．８：１、０．９：１、１：１、１：０．９、１：０．８、１：０．７、１：０．６、１：０．５、１：０．４、１：０．３、１：０．２、１：０．１、１：０．０１、１：０．００１、などのｍｏｌ比から選択されればよい。または、上記の値の任意の２つからなる任意の範囲を形成してもよく、例えばおよそ０．００１：１から１：０．００１（およそ０．０１：１から１：０．００１、０．１：１から１：０．００１、０．２：１から１：０．００１、０．３：１から１：０．００１、０．４：１から１：０．００１、０．５：１から１：０．００１、０．６：１から１：０．００１、０．７：１から１：０．００１、０．８：１から１：０．００１、０．９：１から１：０．００１、１：１から１：０．００１、１：０．９から１：０．００１、１：０．８から１：０．００１、１：０．７から１：０．００１、１：０．６から１：０．００１、１：０．５から１：０．００１、１：０．４から１：０．００１、１：０．３から１：０．００１、１：０．２から１：０．００１、１：０．１から１：０．００１、１：０．０１から１：０．００１の範囲、または、およそ０．０１：１から１：０．０１、０．１：１から１：０．０１、０．２：１から１：０．０１、０．３：１から１：０．０１、０．４：１から１：０．０１、０．５：１から１：０．０１、０．６：１から１：０．０１、０．７：１から１：０．０１、０．８：１から１：０．０１、０．９：１から１：０．０１、１：１から１：０．０１、１：０．９から１：０．０１、１：０．８から１：０．０１、１：０．７から１：０．０１、１：０．６から１：０．０１、１：０．５から１：０．０１、１：０．４から１：０．０１、１：０．３から１：０．０１、１：０．２から１：０．０１、１：０．１から１：０．０１、１：０．０１から１：０．０１、の範囲を含む。あるいは、およそ０．００１：１から１：０．０１、０．００１：１から１：０．１、０．００１：１から１：０．２、０．００１：１から１：０．３、０．００１：１から１：０．４、０．００１：１から１：０．５、０．００１：１から１：０．６、０．００１：１から１：０．７、０．００１：１から１：０．８、０．００１：１から１：０．９、０．００１：１から１：１、０．００１：０．９：１、０．００１から０．８：１、０．００１から０．７：１、０．００１から０．６：１、０．００１から０．５：１、０．００１から０．４：１、０．００１から０．３：１、０．００１から０．２：１、０．００１から０．１：１、または、およそ０．０１：１から１：０．０１、０．０１：１から１：０．１、０．０１：１から１：０．２、０．０１：１から１：０．３、０．０１：１から１：０．４、０．０１：１から１：０．５、０．０１：１から１：０．６、０．０１：１から１：０．７、０．０１：１から、１：０．８、０．０１：１から１：０．９、０．０１：１から１：１、０．００１から０．９：１、０．００１から０．８：１、０．００１から０．７：１、０．００１から０．６：１、０．００１から０．５：１、０．００１から０．４：１、０．００１から０．３：１、０．００１から０．２：１、０．００１から０．１：１などの範囲を含む）などである。
【０１７０】
更により望ましくは、第二構成物の前記少なくとも一つの遊離ｍＲＮＡに対する、アジュバント構成物のｍＲＮＡのｍｏｌ比は、例えばおよそ０．０１：１から１：０．０１の範囲から選択されればよい。最も望ましくは、第二構成物の前記少なくとも一つの遊離ｍＲＮＡに対する、アジュバント構成物のｍＲＮＡのｍｏｌ比は、例えばおよそ１：１のｍｏｌ比から選択されればよい。（ｗ／ｗ）およびＮ／Ｐ比率に関して、いかなる上記の定義も適応される。
【０１７１】
適したアジュバントはさらに、式（ＩＶ）：ＧｌＸｍＧｎを有する核酸であって、Ｇは、グアノシン、ウラシル、またはグアノシンもしくはウラシルのアナログであり、Ｘは、グアノシン、ウラシル、アデノシン、チミジン、シトシン、またはこれらのヌクレオチドのアナログであり、ｌは、１から４０までの整数であり、ｌ＝１の場合、Ｇは、グアノシンまたはそのアナログであり、ｌ＞１の場合、少なくとも５０％のヌクレオチドは、グアノシンまたはそのアナログであり、ｍは、整数であり、かつ少なくとも３であり、ｍ＝３の場合、Ｘは、ウラシルまたはそのアナログであり、ｍ＞３の場合、少なくとも３つの連続したウラシルまたはウラシルのアナログが生じ、ｎは、１から４０までの整数であり、ｎ＝１の場合、Ｇは、グアノシンまたはそのアナログであり、ｎ＞１の場合、少なくとも５０％のヌクレオチドは、グアノシンまたはそのアナログである、核酸、から選択されてもよい。
【０１７２】
他の適したアジュバントはさらに、式（Ｖ）：ＣｌＸｍＣｎを有する核酸であって、Ｃは、シトシン、ウラシル、またはシトシンもしくはウラシルのアナログであり、Ｘは、グアノシン、ウラシル、アデノシン、チミジン、シトシン、またはこれらのヌクレオチドのアナログであり、ｌは、１から４０までの整数であり、ｌ＝１の場合、Ｃは、シトシンまたはそのアナログであり、ｌ＞１の場合、少なくとも５０％のヌクレオチドは、シトシンまたはそのアナログであり、ｍは、整数であり、かつ少なくとも３であり、ｍ＝３の場合、Ｘは、ウラシルまたはそのアナログであり、ｍ＞３の場合、少なくとも３つの連続したウラシルまたはウラシルのアナログが生じ、ｎは、１から４０までの整数であり、ｎ＝１の場合、Ｃは、シトシンまたはそのアナログであり、ｎ＞１の場合、少なくとも５０％のヌクレオチドは、シトシンまたはそのアナログである、核酸、から選択されてもよい。
【０１７３】
さらなる態様では、本発明は、少なくとも１つのｍＲＮＡに基づくワクチンを提供することができ、好ましくは、少なくとも６つの異なるｍＲＮＡ種に基づいており、各々のｍＲＮＡは、少なくとも上で規定された抗原、すなわち、５Ｔ４、サバイビン、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２およびＭＵＣ１（ムチン−１）をコードする。したがって、本発明のワクチンは、上で規定されたような組成物と同じ成分に基づいている。その限りにおいて、本発明の組成物を規定する上の記載を参照してもよい。しかしながら、本発明のワクチンは、物理的に別々の形態で提供することができ、また、別々の投与段階で投与することができる。ｍＲＮＡ成分が１つの単一の組成物によって提供されるのであれば、本発明のワクチンは、本発明の組成物に対応する。しかしながら、本発明のワクチンは、例えば、物理的に別々に提供される。例えば、ｍＲＮＡ種は、２つの別々の組成物であって、３つの異なる抗原を各々コードする少なくとも１つのｍＲＮＡ種（例えば３つの異なるｍＲＮＡ種）を含んでよい組成物が提供されるように、提供することができ、これは、組み合わされていてもされていなくてもよい。また、本発明のワクチンは、３つの異なる組成物の組み合わせであってよく、各組成物は、上記６つの抗原のうちの２つをコードする少なくとも１つのｍＲＮＡを含んでいる。または、ワクチンは、少なくとも１つのｍＲＮＡ、好ましくは６つのｍＲＮＡ、の組み合わせとして提供され、各々が、上記６つの抗原のうちの一つをコードする。ワクチンは、使用前に単一の組成物を提供するために組み合わせてもよく、また、上記６つの異なる抗原をコードするために異なるｍＲＮＡ種を投与するのに１つ以上の投与が必要であるように使用してもよい。もしワクチンが、上記６つの異なる抗原をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ分子、典型的には少なくとも２つのｍＲＮＡ分子を含有していれば、例えば、単一の投与（すべてのｍＲＮＡ種を組み合わせる）によって、２つの別々の投与（例えば、上記６つの異なる抗原のうちの３つをコードするｍＲＮＡ分子を投与する各投与）によって、３、４、５または６個の投与（ｍＲＮＡ種のすべてが上記６つの抗原のうちの一つをコードし、物理的に別々に提供されるような場合）によって、投与が可能である。したがって、別個の実体（１つのｍＲＮＡ種を含有する）または組み合わせられた実体（１つ以上のｍＲＮＡ種を含有する）として提供されて、上記６つの抗原をコードする、モノシストロニック、バイシストロニックまたはマルチシストロニックのｍＲＮＡは、本発明に係るワクチンとして理解される。本発明のワクチンの特に好ましい実施形態によれば、本発明に係る抗原の各々は、個々の（モノシストロニックな）ｍＲＮＡとして提供され、別々に投与される。
【０１７４】
本発明の組成物と同様に、ワクチンの実体も、液体または乾燥（例えば凍結乾燥）形式で提供することができる。これらは、さらなる成分、特に、薬学的使用を許可する成分を含んでもよい。本発明のワクチンまたは本発明の組成物は、例えば、さらに、薬学的に許容され得るキャリアおよび／またはさらなる補助物質および添加物および／またはアジュバントをさらに含んでもよい。
【０１７５】
本発明の組成物またはワクチンは、典型的には、上記抗原をコードする上記のような組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡを安全で効果的な量だけ含有する。ここで用いられる「安全で効果的な量」は、上記組成物またはワクチンの少なくとも１つのｍＲＮＡの量であって、肺癌、好ましくは非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、の治療に関する状況、より好ましくは、限定されないが肺扁平上皮癌、腺癌および肺大細胞癌を含むＮＳＣＬＣの３つのメインサブタイプに関する状況、の陽性の改変を顕著に誘導するのに十分な量を意味する。しかしながら、同時に、「安全で効果的な量」は、深刻な副作用を避けるのには充分小さい。すなわち、利点と危険性との顕著な関係を許可している。これらの制限の決定は、典型的には、顕著な医学的判断の範囲内である。本発明の組成物またはワクチンに関し、「安全で効果的な量」との表現は、好ましくは、過剰またはダメージを与える免疫反応は起きずに、好ましくは、測定可能レベル以下のような免疫反応も起きないように、適応性免疫システムを刺激するのに適したｍＲＮＡ（およびそれによりコードされる抗原）の量を意味する。このような、上記のような組成物またはワクチンの少なくとも１つのｍＲＮＡの「安全で効果的な量」は、さらに、ｍＲＮＡの、例えばモノシストロニック、バイシストロニックまたはさらにはマルチシストロニックなｍＲＮＡの、タイプに応じて選択してよく、これは、バイシストロニックまたはさらにはマルチシストロニックなｍＲＮＡが、モノシストロニックなｍＲＮＡの等量の使用よりも顕著に高い、コードされる抗原の発現を生むからである。上記の組成物またはワクチンの少なくとも１つのｍＲＮＡの「安全で効果的な量」は、さらに、特定の治療状況、年齢、治療を受ける患者の身体状況、状況の深刻度、治療期間、併用治療の性質、用いられる特定の薬学的に許容できるキャリアの性質、同様の因子、と関連して、同伴医師の知識と経験の範囲内で変化する。本発明の組成物またはワクチンは、本発明に応じて、ヒトに対し、または獣医の医学目的で、薬学的な組成物またはワクチンとして、用いることができる。
【０１７６】
好ましい実施形態によれば、本発明に係る組成物、ワクチンまたはパーツのキットの少なくとも１つのｍＲＮＡは、凍結乾燥の形式で提供される。好ましくは、少なくとも１つの凍結乾燥されたｍＲＮＡは、適したバッファ中で、有利には水性キャリアに基づいて、投与前に再構成され、例えばリンガー乳酸溶液は好ましく、リンガー溶液、リン酸バッファ液である。好ましい実施形態によれば、本発明に係る組成物、ワクチンまたはパーツのキットの少なくとも１つのｍＲＮＡは、６つのｍＲＮＡを含み、これは、凍結乾燥の形式で別々に提供され（必要に応じて、少なくとも１つの別の添加剤と共に提供される）、これは、好ましくは、使用前に（リンガー乳酸溶液などの）適したバッファにて別々に再構成されて、６つの（モノシストロニックな）ｍＲＮＡのそれぞれの個々の投与を可能にする。
【０１７７】
本発明の組成物またはワクチンは、典型的には、薬学的に許容され得るキャリアを含んでもよい。「薬学的に許容され得るキャリア」との表現は、ここでは、好ましくは、本発明のワクチンの液体または非液体ベースを含む。本発明のワクチンが液体形状で提供されるのであれば、キャリアは、水、典型的には発熱物質の無い水、生理食塩水またはバッファ（水性）液、例えばリン酸塩、クエン酸塩などのバッファ液である。特に、本発明のワクチンの注射には、水または好ましくはバッファ、より好ましくは水性バッファを用いてよく、これは、ナトリウム塩、好ましくは少なくとも５０ｍＭのナトリウム塩を含み、カルシウム塩、好ましくは少なくとも０．０１ｍＭのカルシウム塩を含み、および随意的に、カリウム塩、好ましくは少なくとも３ｍＭのカリウム塩を含む。好ましい実施形態によれば、ナトリウム、カルシウムおよび随意的にカリウム塩は、そのハロゲン化物の形であってもよく、例えば、塩化物、ヨード化物またはホウ素化物であり、また、その水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩または硫酸塩などである。限定されないが、ナトリウム塩の例は、例えば、ＮａＣｌ、ＮａＩ、ＮａＢｒ、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＳＯ４であり、随意的なカリウム塩の例は、例えば、ＫＣｌ、ＫＩ、ＫＢｒ、Ｋ２ＣＯ３、ＫＨＣＯ３、Ｋ２ＳＯ４であり、カルシウム塩の例は、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＩ２、ＣａＢｒ２、ＣａＣＯ３、ＣａＳＯ４、Ｃａ（ＯＨ）２である。さらに、上記カチオンの有機アニオンは、バッファ内に含まれていてもよい。より好ましい実施形態によれば、上記のような注射目的に適したバッファは、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）および随意的に塩化カリウム（ＫＣｌ）から選択される塩を含んでいてよく、上記塩化物に加えてさらなるアニオンが存在していてもよい。ＣａＣｌ２は、ＫＣｌのような他の塩で置き換えてもよい。典型的には、注射バッファ内の塩は、少なくとも５０ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、少なくとも３ｍＭの塩化カリウム（ＫＣｌ）、および、少なくとも０．０１ｍＭの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、の濃度で存在している。注射バッファは、特定の基準溶媒に対して高張、等張または低張であってよく、すなわち、バッファは、特定の基準溶媒に対して高い塩濃度、等しい塩濃度または低い塩濃度であってよく、ここで、好ましくは、上述のような濃度を用いてもよく、これにより、浸透作用や他の濃度効果による細胞のダメージにつながらない。基準溶媒は、例えば、血液、リンパ液、細胞液または他の体液などの、「in vivo」法で発生する液体であり、または、例えば、一般のバッファや液体のような、「in vitro」法での基準溶媒として使われうる液体である。このような一般のバッファや液体は当業者に公知である。液体ベースとしてはリンガー乳酸溶液が特に好ましい。
【０１７８】
しかしながら、互換性のある１つ以上の固体または液体充填物または希釈剤またはカプセル化化合物も同様に使用可能であり、これらは、ヒトへの投与に適する。「互換性」との用語は、ここでは、典型的な使用条件で本発明のワクチンの薬学的効果を実質的に減じるような相互作用を起こさずに、本発明のワクチンの構成成分が、組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡと混合されることができ、上記の少なくとも６つの抗原をコードすることができることを意味する。薬学的に許容できるキャリア、充填物および希釈剤は、もちろん、治療される人への投与に適するよう、充分高純度で充分低毒性である必要がある。薬学的に許容できるキャリア、充填物またはその構成成分として用いうる化合物のいくつかの例は、糖、例えばラクトース、グルコース、トレハロースおよびスクロース；でんぷん、例えばコーンスターチまたはポテトスターチ；デキストロース；セルロースおよびその誘導体、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、酢酸セルロース；粉状トラガカント；モルト；ゼラチン；獣脂；固体潤滑剤、例えばステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム；硫酸カルシウム；野菜油、例えば落花生油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油およびカカオ脂からの油；ポリオール、例えばポリプロピレングリコール、グリセロール、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール；アルギン酸である。
【０１７９】
薬学的に許容できるキャリアの選択は、原則的に、本発明のワクチンが投与される方法によって決定される。本発明のワクチンは、例えば、全身性または局所性に投与できる。一般に、全身性投与は、例えば、経皮、経口、腸管外経路を含み、皮下、静脈、筋肉内、腹腔内、皮内および腹膜内の注射および／または鼻腔内の投与経路を含む。一般に、局所性投与の経路は、例えば、局所的投与経路ではあるが皮内、経皮、皮下または筋肉内の注射または病巣内、頭蓋内、肺内、心臓内、および舌下注射を含む。より好ましくは、ワクチンは、皮内、皮下または筋肉内の経路で、好ましくは注射によって、投与してもよく、これは、針無しおよび／または針のある注射であってよい。それゆえ、組成物／ワクチンは、液体または固体形式で処方される。本発明のワクチンの適量は、動物モデルでのルーチン実験により決定しうる。このようなモデルは、限定されないが、うさぎ、ひつじ、マウス、ラット、犬およびヒトでない霊長類のモデルである。注射用の好ましい単位投与形式は、滅菌水溶液、生理食塩水またはそれらの混合物を含む。このような溶液のｐＨは７．４に調整すべきである。注射に適したキャリアは、ヒドロゲル、放出を制御されたまたは遅延させたデバイス、ポリ乳酸およびコラーゲンマトリクスを含む。局所適用のために適した薬学的に許容できるキャリアは、ローション、クリーム、ゲルなどでの使用に適したものを含む。もし本発明のワクチンが、経口投与すべきものであれば、錠剤、カプセル剤などが好ましい単位投与形式である。経口投与に用いる単位投与形式の準備のための薬学的に許容できるキャリアは、従来公知である。その選択は、味、コスト、および安定性などの二次的な考慮事項に左右され、これらは本発明の目的には重要ではなく、当業者によって容易に行える。
【０１８０】
本発明の組成物またはワクチンは、さらに、免疫原性をさらに増大させるための１つ以上の補助物質を含むことができる。上記組成物またはワクチンの少なくとも１つのｍＲＮＡと、補助物質との相乗作用は、上記本発明の組成物またはワクチンを用いて随意的に共同処方(co-formulated)（または別々に処方）されるが、好ましくはそれによって達成される。補助物質の種々のタイプに応じて、この点について種々の機構を考慮することができる。例えば、樹状細胞（ＤＣｓ）、例えばリポ多糖類、ＴＮＦ−αまたはＣＤ４０リガンド、の、成熟を許可する化合物は、適した補助物質の第１クラスを形成する。一般に、補助物質としては、「危険信号」（ＬＰＳ、ＧＰ９６など）またはサイトカイン、例えばＧＭ−ＣＦＳなど、のような様態で免疫システムに影響を与えるような任意の薬剤を使用でき、これらは、本発明に係る免疫刺激アジュバントによって生成される免疫応答が、促進され、および／または、目的に沿った影響を受けることを可能にする。特に好ましい補助物質は、サイトカインであり、例えばモノカイン、リンホカイン、インターロイキンまたはケモカインであり、これらは、コード化される少なくとも６つの抗原による適応性免疫応答の誘発に加えて、生来の免疫応答を促進し、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＮＦ−α、ＩＦＮ−β、ＩＮＦ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＬＴ−βまたはＴＮＦ−α、成長因子、例えばｈＧＨである。好ましくは、免疫原性を増加させるこのような薬剤または化合物は、別々に提供され（本発明の組成物またはワクチンと共同処方されない）、別々に投与される。
【０１８１】
本発明の組成物またはワクチンに含んでもよいさらなる添加剤は、乳化剤、例えばＴｗｅｅｎ；界面活性剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム；着色剤；味付与剤、薬学的キャリア；錠剤形成剤；安定化剤；酸化防止剤；保存剤である。
【０１８２】
本発明の組成物またはワクチンはまた、これらは、ヒトの鐘(Toll)形レセプターＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０への（リガンドとして）その結合親和性により、または、これらは、マウスの鐘(Toll)形レセプターＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２またはＴＬＲ１３への（リガンドとして）その結合親和性により、または、免疫刺激性であることが知られているさらなる化合物を含むことができる。
【０１８３】
これに関し、本発明の組成物またはワクチンに加えてよい他のクラスの化合物は、ＣｐＧ核酸、特にＣｐＧ−ＲＮＡまたはＣｐＧ−ＤＮＡである。ＣｐＧ−ＲＮＡまたはＣｐＧ−ＤＮＡは、１本鎖ＣｐＧ−ＤＮＡ（ｓｓ  ＣｐＧ−ＤＮＡ）、２本鎖ＣｐＧ−ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、１本鎖ＣｐＧ−ＲＮＡ（ｓｓ  ＣｐＧ−ＲＮＡ）または２本鎖ＣｐＧ−ＲＮＡ（ｄｓ  ＣｐＧ−ＲＮＡ）とすることができる。ＣｐＧ核酸は、好ましくは、ＣｐＧ−ＲＮＡの形であり、より好ましくは、１本鎖ＣｐＧ−ＲＮＡ（ｓｓ  ＣｐＧ−ＲＮＡ）の形である。ＣｐＧ核酸は、好ましくは、少なくとも１つまたはそれ以上の（マイトジェニックな）シトシン／グアニンジヌクレオチド配列（ＣｐＧモチーフ）を含む。第１の好ましい代替物によれば、これらの配列に含まれる少なくとも１つのＣｐＧモチーフは、すなわちＣｐＧモチーフのＣ（シトシン）およびＧ（グアニン）は、メチル化されていない。これらの配列に随意的に含まれるさらなるすべてのシトシンまたはグアニンは、メチル化されていてもされていなくてもよい。しかしながら、さらなる好ましい代替物によれば、ＣｐＧモチーフのＣ（シトシン）およびＧ（グアニン）は、メチル化された形で存在してもよい。
【０１８４】
好ましくは、上記の化合物は、上記少なくとも６つの抗原をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡを含有する（本発明の）ワクチンまたは組成物とは別個に処方されて投与される。
【０１８５】
本発明のさらなる好ましい目的によれば、本発明の組成物またはワクチンは、肺癌およびそれに関する疾病または障害、好ましくは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、の治療に関する状況、より好ましくは、限定されないが肺扁平上皮癌、腺癌および肺大細胞癌を含むＮＳＣＬＣの３つのメインサブタイプに関する状況、の治療のための（薬剤の調製のための）本発明に応じて用いることができる。
【０１８６】
本発明のさらなる好ましい目的によれば、上記抗原をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡを含む本発明の組成物またはワクチンは、肺癌およびそれに関する疾病または障害、好ましくは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、の治療に関する状況、より好ましくは、限定されないが肺扁平上皮癌、腺癌および肺大細胞癌を含むＮＳＣＬＣの３つのメインサブタイプに関する状況、の治療に用いることができる。
【０１８７】
これに関し、薬学的に効果的な量の本発明のワクチンまたは薬学的に効果的な量の本発明の組成物を、それを必要とする対象者に投与することによって、肺癌およびそれに関する疾病または障害、好ましくは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、の治療に関する状況、より好ましくは、限定されないが肺扁平上皮癌、腺癌および肺大細胞癌を含むＮＳＣＬＣの３つのメインサブタイプに関する状況、を、治療する方法が、本発明に含まれる。このような方法は、典型的には、本発明の組成物またはワクチンを調製する随意的な第１のステップと、（薬学的に効果のある量の）本発明の組成物またはワクチンを、それを必要とする対象者に投与する第２のステップとを含んでいる。必要とする対象者は、典型的には、哺乳類である。本発明に関し、哺乳類は、好ましくは、限定されないが、例えば、ヤギ、牛、豚、犬、猫、ロバ、猿、類人猿、齧歯類、例えばマウス、ハムスター、ウサギ、および、特に、ヒト、を含むグループから選択され、ここで、哺乳類は、典型的には、肺癌およびそれに関する疾病または障害、好ましくは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、の治療に関する状況、より好ましくは、限定されないが肺扁平上皮癌、腺癌および肺大細胞癌を含むＮＳＣＬＣの３つのメインサブタイプに関する状況、を罹患する。
【０１８８】
本発明はまた、好ましくは、哺乳類の免疫応答を誘発し、好ましくは、肺癌の治療、より好ましくは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）に関するここに記載の状況、の治療のために、本発明の組成物すなわちここに記載の抗原をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡの使用にも関する。
【０１８９】
好ましくは、本発明の組成物またはワクチンを受ける対象者は、ステージ０、Ｉ（ＩＡおよび／またはＩＢ）、ステージＩＩ（ＩＩＡおよび／またはＩＩＢ）、ステージＩＩＩ（ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢ）、またはステージＩＶの、非小細胞肺癌の患者である。
【０１９０】
特定の実施形態では、本発明の組成物またはワクチンを受ける対象者は、ステージＩＩＩまたはステージＩＶの非小細胞肺癌の患者である。
【０１９１】
さらに、本発明の組成物またはワクチンを受ける対象者は、化学療法（例えば第１選択または第２選択の化学療法）、放射線治療、化学照射（化学療法と放射線治療の組み合わせ）、チロシンキナーゼ阻害剤（例えばＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤）、抗体療法、および／または、ＰＤ１経路阻害剤を受ける、非小細胞肺癌の患者、または、上記特定の治療を１つ以上受けた後に部分応答に達したまたは疾病が安定した患者である。
【０１９２】
これに関し、ＰＤ−１経路阻害剤は、好ましくは、ＰＤ−１経路の信号伝達、好ましくは、ＰＤ−１レセプターによって媒介される信号伝達、を損なうことができる化合物としてここに規定される。それゆえ、ＰＤ−１経路阻害剤は、ＰＤ−１経路の信号伝達のアンタゴニストとなることができるＰＤ−１経路の任意のメンバーに対する任意の阻害剤であってよい。これに関し、阻害剤は、アンタゴニスト的な抗体であってよく、ＰＤ−１経路の任意のメンバー、好ましくは、ＰＤ−１レセプター、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を、標的にする。このアンタゴニスト的抗体は、核酸によってコードされてもよい。また、ＰＤ−１経路阻害剤は、ＰＤ−１レセプターのフラグメントまたはＰＤ１リガンドの活性をブロックするＰＤ−１レセプターであってもよい。Ｂ７−１またはそのフラグメントも、ＰＤ−１阻害リガンドとして働く。さらに、ＰＤ−１経路阻害剤は、ＰＤ−１経路、好ましくは、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２、のメンバーに対するｓｉＲＮＡ（小干渉ＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡであってもよい。さらに、ＰＤ−１経路阻害剤は、ＰＤ−１と結合可能だが、例えばＰＤ−１とＢ７−Ｈ１またはＢ７−ＤＬとの相互作用を阻害することによってＰＤ−１信号伝達の遮断が可能なアミノ酸配列を含むタンパク質（またはアミノ酸配列をコードする核酸）であってもよい。さらに、ＰＤ−１経路阻害剤は、ＰＤ−１経路の信号伝達を阻害可能な小さい分子、例えばＰＤ−１結合ペプチドまたは小さい有機分子、からなる阻害剤であってもよい。
【０１９３】
これに関し、さらに、チロシンキナーゼ阻害剤は、好ましくは、１つ以上のチロシンキナーゼ、特に、１つまたはそれ以上成長因子チロシンキナーゼ、の信号伝達を損なうことができる化合物としてここに規定される。好ましくは、これに関して用いられるチロシンキナーゼ阻害剤は、上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）チロシンキナーゼの阻害剤である。好ましい実施形態によれば、ここに用いられるチロシンキナーゼ阻害剤は、経口のＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤である。さらに好ましい実施形態によれば、チロシンキナーゼ阻害剤は、エルロチニブ、ゲフィチニブまたはアファチニブのグループから選択される。他の実施形態では、これに関して用いられるチロシンキナーゼ阻害剤は、ＡＬＫ阻害剤であり、好ましくはクリゾチニブまたはセリチニブである。
【０１９４】
ここで用いられるとき、抗体療法で用いられる抗体は、好ましくは、成長因子または成長因子レセプターに対するものであり、これは、好ましくは、チロシンキナーゼと機能的に結合する。好ましくは、これに関し、抗体は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）または表皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）に対する。好ましい実施形態によれば、抗体療法にはベバシズマブが用いられる。他の実施形態によれば、抗体療法にはセツキシマブが用いられる。
【０１９５】
好ましい実施形態によれば、本発明の組成物またはワクチンを受ける対象者は、外科手術前（例えば肺葉切除）または後の患者であり、患者は、好ましくは、ステージＩまたはＩＩでＮＳＣＬＣである。
【０１９６】
さらなる好ましい実施形態によれば、本発明の組成物またはワクチンを受ける対象者は、放射線治療を受ける患者、または、放射線治療後に部分応答（ＰＲ）に達したまたは疾病が安定（ＳＤ）した患者であり、患者は、好ましくは、ステージＩまたはＩＩでＮＳＣＬＣである。
【０１９７】
特に好ましい実施形態によれば、本発明の組成物またはワクチンを受ける対象者は、化学治療、好ましくは白金ベースの化学療法または白金ベースの組み合わせ化学療法（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、シスプラチンとビノレルビンとの組み合わせ、シスプラチンとエトポシドとの組み合わせ、シスプラチンとゲムシタビンとの組み合わせ、シスプラチンとタキサンとの組み合わせ、シスプラチンまたはカルボプラチンとプレメトレキスドとの組み合わせ、または、カルボプラチンとパクリタキセルとの組み合わせ）を受ける患者、または、化学治療後に部分応答（ＰＲ）に達したまたは疾病が安定（ＳＤ）した患者であり、患者は、好ましくは、ステージＩＩＩまたはＩＶでＮＳＣＬＣである。
【０１９８】
他の好ましい実施形態によれば、本発明の組成物またはワクチンを受ける対象者は、化学治療、好ましくは白金ベースの化学療法または白金ベースの組み合わせ化学療法（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、シスプラチンとビノレルビンとの組み合わせ、シスプラチンとエトポシドとの組み合わせ、シスプラチンとゲムシタビンとの組み合わせ、シスプラチンとタキサンとの組み合わせ、シスプラチンまたはカルボプラチンとプレメトレキスドとの組み合わせ、または、カルボプラチンとパクリタキセルとの組み合わせ）と放射線治療との組み合わせ（化学照射）を受ける患者、または、化学治療後に部分応答（ＰＲ）に達したまたは疾病が安定（ＳＤ）した患者であり、患者は、好ましくは、ステージＩＩＩ（好ましくは局所的に進んだ）またはＩＶでＮＳＣＬＣである。
【０１９９】
さらなる好ましい実施形態によれば、本発明の組成物またはワクチンを受ける対象者は、ただ一つの化学治療を受ける患者であって、好ましくは、ゲムシタビン、タキサン、プレメトレキスド、パクリタキセル、ビノレルビン、またはエトポシドを受ける患者であって、好ましくは、第２選択または第３選択の治療としてこれらを受ける患者、または、このような第２選択または第３選択の治療後に部分応答（ＰＲ）に達したまたは疾病が安定（ＳＤ）した患者である。
【０２００】
好ましい実施形態によれば、本発明の組成物またはワクチンを受ける対象者は、第１選択および随意的な第２選択の化学療法（例えば白金ベースの化学療法または白金ベースの組み合わせ化学療法（白金ベースの化学療法と少なくとも１つの別の化学療法剤））または第１選択および随意的な第２選択の化学照射後にステージＩＩＩまたはステージＩＶの非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の患者であり、患者は、好ましくは、第１選択および随意的な第２選択の化学療法の後に部分応答（ＰＲ）に達したまたは疾病が安定（ＳＤ）した患者である。
【０２０１】
好ましい実施形態によれば、本発明の組成物またはワクチンを受ける対象者は、ステージＩＩＩまたはステージＩＶの非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）であって肺扁平上皮癌ではない組織学の患者であり、表皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）の変異の活性化があるまたは無い患者である。
【０２０２】
他の好ましい実施形態によれば、本発明の組成物またはワクチンを受ける対象者は、ステージＩＩＩまたはステージＩＶの非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）であって肺扁平上皮癌の組織学の患者であり、表皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）の変異の活性化があるまたは無い患者である。
【０２０３】
特に好ましい実施形態によれば、本発明の組成物またはワクチンを受ける対象者は、ステージＩＩＩまたはステージＩＶの非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）であって肺扁平上皮癌ではない組織学の患者であり、好ましくは、表皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）の変異の活性化が無く、好ましくは、白金または白金ベースの組み合わせ化学療法（例えば白金とペメトレキスド）を用いた第１選択の化学療法の後に部分応答（ＰＲ）に達したまたは疾病が安定（ＳＤ）した患者である。
【０２０４】
他の実施形態によれば、本発明の組成物またはワクチンを受ける対象者は、ステージＩＩＩまたはステージＩＶのＮＳＣＬＣであって肺扁平上皮癌の組織学の患者であり、好ましくは、白金または白金ベースの組み合わせ化学療法（例えば白金とペメトレキスド）を用いた第１選択の化学療法の後に部分応答（ＰＲ）に達したまたは疾病が安定（ＳＤ）した患者である。
【０２０５】
さらにより好ましくは、本発明の組成物またはワクチンを受ける対象者は、転移性の肺癌を罹患している患者であり、好ましくは、転移性の非小細胞肺癌を罹患している患者である。
【０２０６】
さらに好ましい実施形態によれば、本発明の組成物またはワクチンを受ける対象者は、ステージＩＩＩの運動領域的に進んだＮＳＣＬＣの患者であり、好ましくは、併用化学照射（例えば上述のもの）で治療を受ける患者、または、化学照射（ここに記載のもの）後に応答に達したまたは疾病が安定（進行がない）した患者である。
【０２０７】
さらに好ましい実施形態によれば、本発明の組成物またはワクチンを受ける対象者は、組織学または分子サブタイプにかかわらず、ステージＩＩＩまたはステージＩＶのＮＳＣＬＣの患者であり、また、好ましくは、ＰＤ−１経路阻害剤で併用治療を受ける患者であり、または、ＰＤ−１経路阻害剤での治療後に応答に達したまたは疾病が安定（進行がない）した患者である。
【０２０８】
さらに、特定の実施形態によれば、本発明の組成物またはワクチンを受ける対象者は、抗体または化学療法と抗体との組み合わせを受ける患者であり、好ましくは、ベバシズマブまたはベバシズマブと化学療法との組み合わせを受ける患者であり、好ましくは、白金ベースの化学療法を受ける患者であり、または、この治療の後に応答に達したまたは疾病が安定した患者である。
【０２０９】
他の特定の好ましい実施形態によれば、本発明の組成物またはワクチンを受ける対象者は、チロシンキナーゼ阻害剤を受ける患者であり、好ましくは、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（例えばエルロチニブ、ゲフィチニブまたはアファチニブ）を受ける患者であり、また、好ましくは、第１選択の化学療法の後に第２選択を受ける患者であり、または、チロシンキナーゼ阻害剤での治療の後に応答に達したまたは疾病が安定した患者である。
【０２１０】
他の特定の好ましい実施形態によれば、本発明の組成物またはワクチンを受ける対象者は、活性ＥＧＦＲ変異を抱いて、チロシンキナーゼ阻害剤を受ける患者であり、好ましくは、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（例えばエルロチニブ、ゲフィチニブまたはアファチニブ）を受ける患者であり、または、チロシンキナーゼ阻害剤での治療の後に応答に達したまたは疾病が安定した患者である。
【０２１１】
他の好ましい実施形態によれば、本発明の組成物またはワクチンを受ける対象者は、ステージＩＩＩまたはステージＩＶのＮＳＣＬＣであって好ましくは肺扁平上皮癌ではない組織学の患者であり、好ましくは、活性ＥＧＦＲ変異を抱いて、好ましくは、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤で併用治療を受ける患者であり、または、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（例えばエルロチニブ、ゲフィチニブまたはアファチニブまたは他のＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤）での治療の後に応答に達したまたは疾病が安定した患者である。
【０２１２】
他の実施形態によれば、本発明の組成物またはワクチンを受ける対象者は、チロシンキナーゼ阻害剤のクリゾチニブまたはセリチニブまたは他のＡＬＫ阻害剤を受ける患者である。
【０２１３】
同様に、本発明は、本発明のワクチン自体の使用にも関し、または、哺乳類の適応性免疫応答を誘発する、ここに記載の抗原をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡに関し、好ましくは、肺癌の治療のためのものに関し、より好ましくは、ここに記載の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）に関連する状況の治療のためのものに関する。
【０２１４】
それを必要とする患者における肺癌の予防または治療は、好ましくは、それを必要とする患者における非小細胞肺癌とそれに関連する疾病と障害の予防または治療は、本発明の組成物および／または本発明のワクチンを、一度にまたは時間をずらして投与することによって行ってもよい。例えば、パーツのキットとして投与し、各パーツは、少なくとも１つの好ましくは異なる抗原を含有している。好ましくは、抗原のそれぞれは、別々に投与され、すなわち、各抗原は、治療される対象者の身体の異なる部位または領域に投与され、好ましくは、同時に、または、それぞれ同じ短いタイムフレーム以内で投与される。好ましい実施形態によれば、個々のｍＲＮＡは、対象者の四肢（すなわち左／右の腕と脚）じゅうに分布するように投与される。好ましくは、（すべての少なくとも１つのｍＲＮＡの）投与は、１時間以内に行われ、より好ましくは、３０分以内に行われ、さらに好ましくは、１５、１０、５、４、３、２分以内に行われ、あるいは１分以内に行ってもよい。
【０２１５】
投与時に、好ましくは任意の投与経路が上記のようにして用いられてもよい。特に、本発明の組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡによりコードされる抗原に基づいた適応性免疫応答を誘発または促進することによって、肺癌、好ましくは非小細胞肺癌およびそれに関連する疾病および障害の治療に適した投与経路が用いられる。本発明のワクチンおよび／または組成物の投与は、異なる抗原をコードする別のｍＲＮＡ組成物をさらに含んでもよいようなここに記載の本発明の他のワクチンおよび／または組成物の投与の、前、同時、および／またはその後であってもよく、ここで、本発明の組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡによってコードされる各抗原は、好ましくは、肺癌、好ましくは非小細胞肺癌およびそれに関連する疾病および障害の治療に適していてもよい。これに関し、ここに記載の療法はまた、肺癌、好ましくは非小細胞肺癌およびそれに関連する疾病および障害に関連する疾病の変調を含んでもよい。
【０２１６】
さらなる観点によれば、本発明はさらに、本発明の組成物、すなわち、変調のための（（本発明の）ワクチンの調製のための）ここに記載の抗原をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡの使用を含んでおり、好ましくは、ここに記載の哺乳類の免疫応答を誘発または促進するための使用であり、より好ましくは、肺癌、好ましくは非小細胞肺癌およびそれに関連する疾病および障害を治療するおよび／または治療をサポートするための使用である。これに関し、肺癌の治療のサポートは、外科手術、放射線治療、化学療法（例えば第１選択または第２選択の化学療法）、化学照射、チロシンキナーゼ阻害剤での治療、ＰＤ−１経路阻害剤での治療、抗体治療またはこれらのいくつかの組み合わせ、などの従来の肺癌治療方法と、ここに記載の本発明の組成物を使う療法との任意の組み合わせとしてもよい。肺癌の治療のサポートは、ここに記載の他の実施形態のうちの任意のものにて考えてよい。したがって、本発明の組成物またはワクチンの任意の使用と、上記療法的アプローチのうちの任意のものとの併用療法は、特に、外科手術、放射線治療、化学療法、化学照射、および／またはチロシンキナーゼ阻害剤または抗体との組み合わせは、本発明の範囲内である。
【０２１７】
好ましい実施形態によれば、本発明の組成物またはワクチンは、肺癌の治療に用いられ、それはさらに、化学療法（例えば第１選択または第２選択の化学療法）、放射線治療、化学照射（化学療法と放射線治療の組み合わせ）、チロシンキナーゼ阻害剤（例えばＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤）、抗体療法、および／または、ＰＤ１経路阻害剤、または、上記特定の治療を１つ以上受けた後に部分応答に達したまたは疾病が安定した患者を含んでいる。
【０２１８】
これに関し、ＰＤ−１経路阻害剤は、好ましくは、ＰＤ−１経路の信号伝達、好ましくは、ＰＤ−１レセプターによって媒介される信号伝達、を損なうことができる化合物としてここに規定される。それゆえ、ＰＤ−１経路阻害剤は、ＰＤ−１経路の信号伝達のアンタゴニストとなることができるＰＤ−１経路の任意のメンバーに対する任意の阻害剤であってよい。これに関し、阻害剤は、アンタゴニスト的な抗体であってよく、ＰＤ−１経路の任意のメンバー、好ましくは、ＰＤ−１レセプター、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を、標的にする。このアンタゴニスト的抗体は、核酸によってコードされてもよい。また、ＰＤ−１経路阻害剤は、ＰＤ−１レセプターのフラグメントまたはＰＤ１リガンドの活性をブロックするＰＤ−１レセプターであってもよい。Ｂ７−１またはそのフラグメントも、ＰＤ−１阻害リガンドとして働く。さらに、ＰＤ−１経路阻害剤は、ＰＤ−１経路、好ましくは、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２、のメンバーに対するｓｉＲＮＡ（小干渉ＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡであってもよい。さらに、ＰＤ−１経路阻害剤は、ＰＤ−１と結合可能だが、例えばＰＤ−１とＢ７−Ｈ１またはＢ７−ＤＬとの相互作用を阻害することによってＰＤ−１信号伝達の遮断が可能なアミノ酸配列を含むタンパク質（またはアミノ酸配列をコードする核酸）であってもよい。さらに、ＰＤ−１経路阻害剤は、ＰＤ−１経路の信号伝達を阻害可能な小さい分子、例えばＰＤ−１結合ペプチドまたは小さい有機分子、からなる阻害剤であってもよい。
【０２１９】
ここで用いられるとき、抗体療法で用いられる抗体は、好ましくは、成長因子または成長因子レセプターに対するものであり、これは、好ましくは、チロシンキナーゼと機能的に結合する。好ましくは、これに関し、抗体は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）または表皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）に対する。好ましい実施形態によれば、抗体療法にはベバシズマブが用いられる。他の実施形態によれば、抗体療法にはセツキシマブが用いられる。
【０２２０】
好ましくは、本発明の組成物またはワクチンは、肺癌の治療に用いられ、それはさらに放射線治療を含み、ここで、少なくとも１つの腫瘍病変が照射に適している。好ましい実施形態によれば、照射に適している腫瘍病変は、骨転移、両方の鎖骨のリンパ節、腋窩または頚部、皮膚または皮下転移および胸部の病変（中央に位置する肺癌、肺の門部または縦隔のリンパ節）からなるグループから選択される。好ましくは、照射は、１週間以内にそれぞれ投与されるべき５ＧＹの４つの毎日の分画にて投与され、好ましくは９日目ないし１２日目から投与される。
【０２２１】
さらに好ましい実施形態によれば、本発明の組成物またはワクチンは、肺癌の治療に用いられ、それはさらに、キナーゼ阻害剤の投与を含む。ここで、キナーゼ阻害剤は、好ましくはチロシンキナーゼ阻害剤であり、さらに好ましくは、成長因子チロシンキナーゼ阻害剤であり、もっとも好ましくは、経口のＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤であり、例えば、ゲフィチニブ、エルロチニブまたはアファチニブである。さらに、これに関し、チロシンキナーゼ阻害剤は、好ましくは、１つ以上のチロシンキナーゼ、好ましくは、１つ以上の成長因子チロシンキナーゼ、の信号伝達を損なうことができる化合物としてここに記載されている。別の実施形態では、これに関し、用いられるようなチロシンキナーゼ阻害剤は、ＡＬＫ阻害剤であり、好ましくはクリゾチニブまたはセリチニブである。
【０２２２】
別の実施形態では、本発明の組成物またはワクチンは、肺癌の治療に用いられ、それはさらに、化学療法剤の投与を含み、例えば、白金ベースの化合物（例えばシスプラチン、カルボプラチン）、ペメトレキスド、ゲムシタビン、タキサン、ビノレルビン、エトポシドドセタキセル、またはパクリタキセルである。さらにより好ましくは、本発明の組成物またはワクチンは、化学療法、好ましくは、好ましくは上述の白金ベースの組み合わせ化学療法を受ける対象者に用いられ、好ましくは、放射線治療とさらに組み合わされる（化学照射）。
【０２２３】
好ましくは、本発明の組成物またはワクチンは、肺癌の治療に用いられ、ここで、患者は、ステージ０、Ｉ（ＩＡおよび／またはＩＢ）、ステージＩＩ（ＩＩＡおよび／またはＩＩＢ）、ステージＩＩＩ（ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢ）、またはステージＩＶを持っている。
【０２２４】
さらなる好ましい実施形態によれば、本発明の組成物またはワクチンは、外科手術前（例えば肺葉切除）または後の患者であり、患者は、好ましくは、ステージＩまたはＩＩでＮＳＣＬＣであるような患者の、肺癌の治療に用いられる。
【０２２５】
さらなる好ましい実施形態によれば、本発明の組成物またはワクチンは、放射線治療を受ける患者、または、放射線治療後に部分応答（ＰＲ）に達したまたは疾病が安定（ＳＤ）した患者であり、患者は、好ましくは、ステージＩまたはＩＩでＮＳＣＬＣであるような患者の、肺癌の治療に用いられる。
【０２２６】
特に好ましい実施形態によれば、本発明の組成物またはワクチンは、化学治療、好ましくは白金ベースの化学療法または白金ベースの組み合わせ化学療法（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、シスプラチンとビノレルビンとの組み合わせ、シスプラチンとエトポシドとの組み合わせ、シスプラチンとゲムシタビンとの組み合わせ、シスプラチンとタキサンとの組み合わせ、シスプラチンまたはカルボプラチンとプレメトレキスドとの組み合わせ、または、カルボプラチンとパクリタキセルとの組み合わせ）を受ける患者、または、化学治療後に部分応答（ＰＲ）に達したまたは疾病が安定（ＳＤ）した患者であり、患者は、好ましくは、ステージＩＩＩまたはＩＶでＮＳＣＬＣであるような患者の、肺癌の治療に用いられる。
【０２２７】
別の好ましい実施形態によれば、本発明の組成物またはワクチンは、化学治療、好ましくは白金ベースの化学療法または白金ベースの組み合わせ化学療法（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、シスプラチンとビノレルビンとの組み合わせ、シスプラチンとエトポシドとの組み合わせ、シスプラチンとゲムシタビンとの組み合わせ、シスプラチンとタキサンとの組み合わせ、シスプラチンまたはカルボプラチンとプレメトレキスドとの組み合わせ、または、カルボプラチンとパクリタキセルとの組み合わせ）と放射線治療との組み合わせ（化学照射）を受ける患者、または、化学治療後に部分応答（ＰＲ）に達したまたは疾病が安定（ＳＤ）した患者であり、患者は、好ましくは、ステージＩＩＩ（好ましくは局所的に進んだ）またはＩＶでＮＳＣＬＣであるような患者の、肺癌の治療に用いられる。
【０２２８】
さらなる好ましい実施形態によれば、本発明の組成物またはワクチンは、ただ一つの化学治療を受ける患者であって、好ましくは、ゲムシタビン、タキサン、プレメトレキスド、パクリタキセル、ビノレルビン、またはエトポシドを受ける患者であって、好ましくは、第２選択または第３選択の治療としてこれらを受ける患者、または、このような第２選択または第３選択の治療後に部分応答（ＰＲ）に達したまたは疾病が安定（ＳＤ）した患者の、肺癌の治療に用いられる。
【０２２９】
好ましい実施形態によれば、本発明の組成物またはワクチンは、第１選択および随意的な第２選択の化学療法（例えば白金ベースの化学療法または白金ベースの組み合わせ化学療法（白金ベースの化学療法と少なくとも１つの別の化学療法剤））または第１選択および随意的な第２選択の化学照射後にステージＩＩＩまたはステージＩＶの非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の患者であり、患者は、好ましくは、第１選択および随意的な第２選択の化学療法の後に部分応答（ＰＲ）に達したまたは疾病が安定（ＳＤ）した患者の、肺癌の治療に用いられる。
【０２３０】
好ましい実施形態によれば、本発明の組成物またはワクチンは、ステージＩＩＩまたはステージＩＶの非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）であって肺扁平上皮癌ではない組織学の患者であり、表皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）の変異の活性化があるまたは無い患者の、肺癌の治療に用いられる。
【０２３１】
他の好ましい実施形態によれば、本発明の組成物またはワクチンは、ステージＩＩＩまたはステージＩＶの非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）であって肺扁平上皮癌の組織学の患者であり、表皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）の変異の活性化があるまたは無い患者の、肺癌の治療に用いられる。
【０２３２】
特に好ましい実施形態によれば、本発明の組成物またはワクチンは、ステージＩＩＩまたはステージＩＶの非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）であって肺扁平上皮癌ではない組織学の患者であり、好ましくは、表皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）の変異の活性化が無く、好ましくは、白金または白金ベースの組み合わせ化学療法（例えば白金とペメトレキスド）を用いた第１選択の化学療法の後に部分応答（ＰＲ）に達したまたは疾病が安定（ＳＤ）した患者の、肺癌の治療に用いられる。
【０２３３】
別の実施形態によれば、本発明の組成物またはワクチンは、ステージＩＩＩまたはステージＩＶのＮＳＣＬＣであって肺扁平上皮癌の組織学の患者であり、好ましくは、白金または白金ベースの組み合わせ化学療法（例えば白金とペメトレキスド）を用いた第１選択の化学療法の後に部分応答（ＰＲ）に達したまたは疾病が安定（ＳＤ）した患者の、肺癌の治療に用いられる。
【０２３４】
さらに好ましくは、本発明の組成物またはワクチンは、転移性の肺癌を罹患している患者であり、好ましくは、転移性の非小細胞肺癌を罹患している患者の、肺癌の治療に用いられる。
【０２３５】
さらに好ましい実施形態によれば、本発明の組成物またはワクチンは、ステージＩＩＩの運動領域的に進んだＮＳＣＬＣの患者であり、好ましくは、併用化学照射（例えば上述のもの）で治療を受ける患者、または、化学照射（ここに記載のもの）後に応答に達したまたは疾病が安定（進行がない）した患者の、肺癌の治療に用いられる。
【０２３６】
さらに好ましい実施形態によれば、本発明の組成物またはワクチンは、組織学または分子サブタイプにかかわらず、ステージＩＩＩまたはステージＩＶのＮＳＣＬＣの患者であり、また、好ましくは、ＰＤ−１経路阻害剤で併用治療を受ける患者であり、または、ＰＤ−１経路阻害剤での治療後に応答に達したまたは疾病が安定（進行がない）した患者の、肺癌の治療に用いられる。
【０２３７】
さらに、特定の実施形態によれば、本発明の組成物またはワクチンは、抗体または化学療法と抗体との組み合わせを受ける患者であり、好ましくは、ベバシズマブまたはベバシズマブと化学療法との組み合わせを受ける患者であり、好ましくは、白金ベースの化学療法を受ける患者であり、または、この治療の後に応答に達したまたは疾病が安定した患者の、肺癌の治療に用いられる。
【０２３８】
好ましい実施形態によれば、本発明の組成物またはワクチンは、チロシンキナーゼ阻害剤を受ける患者であり、好ましくは、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（例えばエルロチニブ、ゲフィチニブまたはアファチニブ）を受ける患者であり、また、好ましくは、第１選択の化学療法の後に第２選択を受ける患者であり、または、チロシンキナーゼ阻害剤での治療の後に応答に達したまたは疾病が安定した患者の、肺癌の治療に用いられる。
【０２３９】
好ましい実施形態によれば、本発明の組成物またはワクチンは、活性ＥＧＦＲ変異を抱いて、チロシンキナーゼ阻害剤を受ける患者であり、好ましくは、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（例えばエルロチニブ、ゲフィチニブまたはアファチニブ）を受ける患者であり、または、チロシンキナーゼ阻害剤での治療の後に応答に達したまたは疾病が安定した患者の、肺癌の治療に用いられる。
【０２４０】
好ましい実施形態によれば、本発明の組成物またはワクチンは、ステージＩＩＩまたはステージＩＶのＮＳＣＬＣであって好ましくは肺扁平上皮癌ではない組織学の患者であり、好ましくは、活性ＥＧＦＲ変異を抱いて、好ましくは、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤で併用治療を受ける患者であり、または、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（例えばエルロチニブ、ゲフィチニブまたはアファチニブまたは他のＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤）での治療の後に応答に達したまたは疾病が安定した患者の、肺癌の治療に用いられる。
【０２４１】
好ましい実施形態によれば、本発明の組成物またはワクチンは、チロシンキナーゼ阻害剤のクリゾチニブまたはセリチニブまたは他のＡＬＫ阻害剤を受ける患者の、肺癌の治療に用いられる。
【０２４２】
ここに記載の少なくとも６個の抗原の組み合わせに対して対象者に免疫を付与する免疫付与プロトコルは、典型的には、本発明の組成物またはワクチンの一連の単回投与または用量を含む。ここに記載の単回用量は、それぞれ、初期／第１用量、第２用量またはさらなる任意の用量を参照し、これは好ましくは、免疫反応を「促進する」ために投与される。これに関し、各単回用量は、本発明に係る少なくとも６個の抗原すべての投与を含み、ここで、２つの単回用量同士の間隔は、少なくとも１日、好ましくは２、３、４、６または７日、から、少なくとも１週間、好ましくは２、３、４、６、７または８週間、まで変更できる。単回用量同士の間隔は、一定でもよいし、免疫付与プロトコルに沿って変化してもよく、例えば、間隔は、プロトコルの初期には短く、終わりに向かって長くしてもよい。単回用量の総数と単回用量同士の間隔とに応じて、免疫付与プロトコルは、期間を延長してもよく、好ましくは、少なくとも１週間、より好ましくは、数週間（例えば２、３、４、６、７、８、９、１０、１１または１２週間）、さらにより好ましくは、数ヶ月（例えば３、４、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８または２４ヶ月）、続ける。各単回用量は、ここに記載の少なくとも６個の抗原のすべての投与を含み、それゆえ、少なくとも１、好ましくは１、２、３、４、６、７、８、９、１０、１１または１２回の注射を必要としてもよい。この場合に、本発明の組成物を投与する場合、単回用量は典型的には１回の注射を含む。この場合に、本発明に係る各抗原をコードする個々のｍＲＮＡ処方をワクチンが含む場合、単回用量の投与中に行われる注射の最小回数は、ワクチンの個々の成分の数に対応する。ある実施形態では、単回用量の投与は、ワクチンの各成分の１回より多い注射を含む（例えば、本発明に係る６個の抗原のうちの例えば１つをコードするｍＲＮＡを含む特定のｍＲＮＡ処方）。例えば、ワクチンの個々の成分の総容量の一部は、異なる身体部位に注射してもよく、それゆえ、１回より多い注射を必要とする。より詳細な実施例では、６個の個々のｍＲＮＡ処方を含むワクチンの単回用量で、それの各々が２つの異なる身体部位に投与されるものは、１２回の注射を含む。典型的には、単回用量は、ワクチンのすべての成分を投与するのに必要なすべての注射を含み、ここで、単回分の成分は、上で概略を述べたような１回より多い注射を必要とする。この場合に、本発明のワクチンの単回用量の投与が１回より多い注射を含んでいる場合、注射は、基本的に、同時に行われ、すなわち、典型的には、単回の注射ステップを行うのに実務者に必要なタイムフレーム以内で時間差を設けて次から次へと行われる。それゆえ、好ましくは、単回用量の投与は、数分、例えば２、３、４、５、１０、１５、３０または６０分延長する。
【０２４３】
本発明の組成物の投与または本発明のワクチンのここに記載の抗原をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡの投与は、時間差を設けた治療で行ってもよい。時間差治療は、例えば、本発明の組成物の投与または本発明のワクチンのここに記載の抗原をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡの投与を、肺癌の、好ましくは非小細胞肺癌の、およびそれに関連する疾病および障害の、従来の療法の前に、同時に、および／または、その後に、行ってもよく、例えば、本発明の医薬品または本発明の組成物またはワクチンの投与を、肺癌の、好ましくは非小細胞肺癌の、およびそれに関連する疾病および障害の、従来の療法の前に、同時に、および／または、その後に、行ってもよい。このような時間差治療は、キットを用いて、好ましくは下記のようなパーツのキットを用いて、行ってもよい。
【０２４４】
時間差治療は、上記の抗原をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡが、好ましくは本発明の組成物またはワクチンの一部を形成し、上記の抗原をコードする別の少なくとも１つのｍＲＮＡの前に、同時に、および／または、その後に、投与されるような形で、本発明の組成物またはワクチンの投与を、好ましくは、上記の抗原をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡの投与を、追加として、または代替として、含んでもよい。好ましくは、（少なくとも１つのｍＲＮＡの）投与は、１時間以内に、より好ましくは３０分以内に、さらにより好ましくは１５、１０、５、４、３または２分以内に、さらには１分以内に、行われる。このような時間差治療は、キットを用いて、好ましくは下記のようなパーツのキットを用いて、行ってもよい。
【０２４５】
好ましい実施形態によれば、組成物またはワクチンは、繰り返し投与され、ここで、各投与は、好ましくは、本発明に係る少なくとも１つのｍＲＮＡの個々の投与を含む。各投与時点において、少なくとも１つのｍＲＮＡは、１回より多い回数（例えば２または３回）投与してもよい。本発明の特に好ましい実施形態によれば、６個のｍＲＮＡ（それぞれ、上記抗原の一つをコードする）を各時点で投与し、ここで、各ｍＲＮＡは、注射によって２回投与され、それゆえ、結果として、１２回の注射が四肢に分配される。
【０２４６】
最後の実施形態によれば、本発明は、キット、特にパーツのキットをも提供し、このキットは、活性の（免疫刺激性の）本発明の組成物、および／または、本発明のワクチンを含み、随意的に、可溶化するための液体賦形剤、ならびに、随意的に、本発明の組成物および／または本発明のワクチンの投与および投与量の情報を有する技術的指示書、を含む。技術的指示書は、本発明の組成物および／または本発明のワクチンの投与および投与量の情報を含んでいてよい。このようなキット、好ましくはパーツのキットは、例えば上述の適用または使用のうちの任意のものに適用でき、好ましくは、肺癌の、好ましくは非小細胞肺癌の、およびそれに関連する疾病および障害の治療のための、（本発明の医薬品、好ましくはワクチンの調製のための）少なくとも１つの本発明の組成物の使用に適用できる。このキットは、肺癌の、好ましくは非小細胞肺癌の、およびそれに関連する疾病および障害の治療のための、（本発明のワクチンの調製のための）少なくとも１つの本発明の組成物の使用に適用でき、ここで、コードされる少なくとも６個の抗原に起因する本発明の組成物および／またはワクチンは、上述のような哺乳類の免疫応答を誘発または促進することができてもよい。このようなキットは、さらに、上述のような哺乳類の免疫応答を変調、好ましくは誘発するための、例えば誘導および促進するための、また、好ましくは、肺癌の、好ましくは非小細胞肺癌の、およびそれに関連する疾病および障害の治療をサポートするための、（本発明の医薬品、好ましくはワクチンの調製のための）少なくとも１つの本発明の組成物の使用に適用されてもよい。キットの特別な形式としての、パーツのキットは、キットにおける異なるパーツにおいて、１つまたはそれより多い同一または異なる、活性の本発明の（免疫刺激性）組成物、および／または、１つまたはそれより多い同一または異なる、活性の本発明の（免疫刺激性）ワクチンを、含んでいてよい。パーツのキットは、また、キットにおける異なるパーツにおいて、（例えば１つの）活性の本発明の組成物を、（例えば１つの）活性の本発明のワクチンを、および／または、上述の少なくとも１つの抗原をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡを、含んでいてよく、例えば、キットの各パーツが、好ましくは異なる抗原をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡを含む。さらに、パーツのキットの両タイプの組み合わせも可能である。パーツのキットは、in vivoで同じ治療をしている中で、例えば時間差治療を考えるとき、例えば本発明の組成物またはワクチンおよび／または上述の少なくとも１つの抗原をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡの異なる処方を用いるときや濃度を増加させるとき、に用いてもよい。パーツのキットはまた、本発明の組成物の（すなわち、パーツ内で）抗原のうちの少なくとも１つの個別の処方または投与を考慮または要するとき（例えば技術上の理由）であるが例えば、in vivoで異なる抗原の組み合わせられた存在がまだ達成すべきときにも使用してよい。特に、キットの特別な形式としてのパーツのキットは考慮され、このとき、キットの各パーツは、上述の少なくとも１つの好ましくは異なる抗原を含み、パーツのキットのすべての部分���、ここに記載の本発明の組成物またはワクチンを形成する。このような特定のパーツのキットは、例えば、異なるパーツのキットとして異なる抗原が個別に処方されたがそのとき、必要上、哺乳類に同時にまたは時間差的に投与されるのであれば、特に適する。後者の場合、このようなキットの異なるパーツのすべての投与は、典型的には短い時間制限で行われ、それによって、キットの残りの部分の投与に続いてほぼ同時に、すべての抗原が哺乳類中に存在する。好ましい実施形態によれば、キットは、本発明に係る６個のｍＲＮＡを含む少なくとも２つの部分を含んでいる。好ましくは、６個のｍＲＮＡのすべてが、キットの別々の部分にて提供され、ここで、ｍＲＮＡは、好ましくは凍結乾燥される。さらに好ましくは、パーツのキットはさらに、少なくとも１つのｍＲＮＡを可溶化する賦形剤を含有し、この賦形剤は、好ましくは、リンガー乳酸溶液である。上記キットのいずれも、上述の治療に用いることができる。
【０２４７】
〔本発明の利点〕
本発明は、肺癌の治療のための組成物を提供し、ここで、この組成物は、哺乳類の（適応性）免疫応答を誘発できる少なくとも６個の抗原をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡを含み、ここで、抗原は、５Ｔ４（栄養芽層糖タンパク質、ＴＰＢＧ）、サバイビン（バキュロウイルスＩＡＰ反復含有タンパク質５、ＢＩＲＣ５）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（ニューヨーク食道扁平上皮癌１、ＣＴＡＧ１Ｂ）、ＭＡＧＥ−Ｃ１（メラノーマ抗体ファミリーＣ１）、ＭＡＧＥ−Ｃ２（メラノーマ抗体ファミリーＣ２）およびＭＵＣ１（ムチン−１）から成る群から選択される。このような組成物は、肺癌の効果的な治療または従来の療法を用いるときの補足的治療を可能にする。これはさらに、治療方法のためのアプローチとしてＲＮＡの使用により、誘導されたＤＮＡ配列の非制御の成長の問題を回避する。本発明の組成物で用いられるｍＲＮＡは、ＤＮＡ発現システムに関するさらなる顕著な利点を有し、例えば、免疫応答、免疫付与またはワクチン接種である。これらの利点は、特に、細胞中に導入されるＲＮＡがゲノム中に統合されないことを含んでいる。これは、さもなければ完全にまたは部分的に不活化されまたは誤情報を導くような、この遺伝子の変異の危険を回避する。これはさらに、患者に他者のＤＮＡが導入されて（致命的となる可能性のある）免疫応答をもたらすような該患者への病原性の抗ＤＮＡ抗体の誘導などの免疫応答を誘導するための薬剤として（例えばワクチンとして）ＤＮＡを用いることの他の危険を回避する。一方、抗ＲＮＡ抗体は検出されていない。
【０２４８】
次の図は、本発明をさらに例証することを意図したものである。それに加えて、該図は、本発明の主題を制限するように意図されたものではない。
【図面の簡単な説明】
【０２４９】
【図１】５Ｔ４（栄養芽層糖タンパク質、ＴＰＢＧ）をコードしている、ｍＲＮＡ配列５Ｔ４（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ６４−Ｃ３０（配列番号：１）を示し、該ｍＲＮＡは、次の配列エレメントを含む：Ａ５’−ＣＡＰ、配列番号３に従い５Ｔ４をコードしている安定化およびより良いコドン使用のためのＧＣ−最適化コード配列、配列番号７０に従う３’−ＵＴＲにおける安定化配列“ｍｕａｇ”、３’−末端（ポリ−Ａ−末端）における〜６４アデノシン、３’−末端（ポリ−Ｃ−末端）における〜３０シトシン。
【図２】５Ｔ４（栄養芽層糖タンパク質、ＴＰＢＧ）をコードしている、ｍＲＮＡ配列５Ｔ４（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（配列番号：１９）を示し、該ｍＲＮＡは、次の配列エレメントを含む：Ａ５’−ＣＡＰ、配列番号３に従い５Ｔ４をコードしている安定化およびより良いコドン使用のためのＧＣ−最適化コード配列、配列番号７０に従う３’−ＵＴＲにおける安定化配列“ｍｕａｇ”、３’−末端（ポリ−Ａ−末端）における〜６４アデノシン、３’−末端（ポリ−Ｃ−末端）における〜３０シトシン；および配列番号７２に従うヒストンステムループ配列。
【図３】配列番号２に従い、５Ｔ４（栄養芽層糖タンパク質、ＴＰＢＧ）をコードしている野生型コード配列、すなわちＧＣ−最適化コード配列なしで５Ｔ４（栄養芽層糖タンパク質、ＴＰＢＧ）をコードしているコード配列（ＣＤＳ）を示している。
【図４】配列番号３に従い５Ｔ４（栄養芽層糖タンパク質、ＴＰＢＧ）をコードしているＧＣ−最適化コード配列を示している。
【図５】サバイビン（バキュロウイルスＩＡＰ反復含有タンパク質５；ＢＩＲＣ５）をコードしているｍＲＮＡ配列サバイビン（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ６４−Ｃ３０（配列番号：４）を示し、該ｍＲＮＡは、次の配列エレメントを含む：Ａ５’−ＣＡＰ、配列番号６に従いサバイビンをコードしている安定化およびより良いコドン使用のためのＧＣ−最適化コード配列、配列番号７０に従う３’−ＵＴＲにおける安定化配列“ｍｕａｇ”、３’−末端（ポリ−Ａ−末端）における〜６４アデノシン、３’−末端（ポリ−Ｃ−末端）における〜３０シトシン。
【図６】サバイビン（バキュロウイルスＩＡＰ反復含有タンパク質５；ＢＩＲＣ５）をコードしている、ｍＲＮＡ配列サバイビン（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（配列番号：２０）を示し、該ｍＲＮＡは、次の配列エレメントを含む：Ａ５’−ＣＡＰ、配列番号６に従いサバイビンをコードしている安定化およびより良いコドン使用のためのＧＣ−最適化コード配列、配列番号７０に従う３’−ＵＴＲにおける安定化配列“ｍｕａｇ”、３’−末端（ポリ−Ａ−末端）における〜３０シトシン、３’−末端（ポリ−Ｃ−末端）における〜３０シトシン；および配列番号７２に従うヒストンステムループ配列。
【図７】配列番号５に従いサバイビンをコードしている野生型コード配列、すなわちＧＣ−最適化コード配列なしでサバイビンをコードしているコード配列（ＣＤＳ）を示している。
【図８】配列番号６に従いサバイビンをコードしているＧＣ−最適化コード配列を示している。
【図９】ＮＹ−ＥＳＯ−１（ニューヨーク食道扁平上皮癌１１、ＣＴＡＧ１Ｂ）をコードしている、ｍＲＮＡ配列ＮＹ−ＥＳＯ−１（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ６４−Ｃ３０（配列番号：７）を示し、該ｍＲＮＡは、次の配列エレメントを含む：Ａ５’−ＣＡＰ、配列番号６に従いＮＹ−ＥＳＯ−１をコードしている安定化およびより良いコドン使用のためのＧＣ−最適化コード配列、配列番号７０に従う３’−ＵＴＲにおける安定化配列“ｍｕａｇ”、３’−末端（ポリ−Ａ−末端）における〜６４アデノシン、３’−末端（ポリ−Ｃ−末端）における〜３０シトシン。
【図１０】ＮＹ−ＥＳＯ−１（ニューヨーク食道扁平上皮癌１、ＣＴＡＧ１Ｂ）をコードしている、ｍＲＮＡ配列ＮＹ−ＥＳＯ−１（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（配列番号：２１）を示し、該ｍＲＮＡは、次の配列エレメントを含む：Ａ５’−ＣＡＰ、配列番号９に従いＮＹ−ＥＳＯ−１をコードしている安定化およびより良いコドン使用のためのＧＣ−最適化コード配列、配列番号７０に従う３’−ＵＴＲにおける安定化配列“ｍｕａｇ”、３’−末端（ポリ−Ａ−末端）における〜６４アデノシン、３’−末端（ポリ−Ｃ−末端）における〜３０シトシン；および配列番号７２に従うヒストンステムループ配列。
【図１１】配列番号８に従いＮＹ−ＥＳＯ−１（ニューヨーク食道扁平上皮癌１，ＣＴＡＧ１Ｂ）をコードしている野生型コード配列、すなわちＧＣ−最適化コード配列なしでＮＹ−ＥＳＯ−１をコードしているコード配列（ＣＤＳ）を示している。
【図１２】配列番号９に従いＮＹ−ＥＳＯ−１（ニューヨーク食道扁平上皮癌１，ＣＴＡＧ１Ｂ）をコードしているＧＣ−最適化コード配列を示している。
【図１３】野生型タンパク質ＭＡＧＥ−Ｃ１のアミノ酸配列ａａ６１３−１１４２を含んでいるＭＡＧＥ−Ｃ１をコードしている、ｍＲＮＡ配列ＭＡＧＥ−Ｃ１（ａａ６１３−１１４２）（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ６４−Ｃ３０（配列番号：１０）を示し、該ｍＲＮＡは、次の配列エレメントを含む：Ａ５’−ＣＡＰ、配列番号２５に従いＭＡＧＥ−Ｃ１（ａａ６１３−１１４２）をコードしている安定化およびより良いコドン使用のためのＧＣ−最適化コード配列、配列番号７０に従う３’−ＵＴＲにおける安定化配列“ｍｕａｇ”、３’−末端（ポリ−Ａ−末端）における〜６４アデノシン、３’−末端（ポリ−Ｃ−末端）における〜３０シトシン。
【図１４】ＭＡＧＥ−Ｃ１（ａａ６１３−１１４２）をコードしている、ｍＲＮＡ配列ＭＡＧＥ−Ｃ１（ａａ６１３−１１４２）（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（配列番号：２２）を示し、該ｍＲＮＡは、次の配列エレメントを含む：Ａ５’−ＣＡＰ、配列番号２５に従いＭＡＧＥ−Ｃ１（ａａ６１３−１１４２）をコードしている安定化およびより良いコドン使用のためのＧＣ−最適化コード配列、配列番号７０に従う３’−ＵＴＲにおける安定化配列“ｍｕａｇ”、３’−末端（ポリ−Ａ−末端）における〜６４アデノシン、３’−末端（ポリ−Ｃ−末端）における〜３０シトシン；および配列番号７２に従うヒストンステムループ配列。
【図１５】配列番号１１に従いＭＡＧＥ−Ｃ１の全長タンパク質をコードしている野生型コード配列、すなわちＧＣ−最適化コード配列なしでＭＡＧＥ−Ｃ１をコードしているコード配列（ＣＤＳ）を示している。
【図１６】配列番号１２に従いＭＡＧＥ−Ｃ１の全長タンパク質をコードしているＧＣ−最適化コード配列を示している。
【図１７】配列番号２５に従いＭＡＧＥ−Ｃ１（ａａ６１３−１１４２）をコードしているＧＣ−最適化コード配列を示している。
【図１８】ＭＡＧＥ−Ｃ２をコードしている、ｍＲＮＡ配列ＭＡＧＥ−Ｃ２（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ６４−Ｃ３０（配列番号：１３）を示し、該ｍＲＮＡは、次の配列エレメントを含む：Ａ５’−ＣＡＰ、配列番号１５に従いＭＡＧＥ−Ｃ２をコードしている安定化およびより良いコドン使用のためのＧＣ−最適化コード配列、配列番号７０に従う３’−ＵＴＲにおける安定化配列“ｍｕａｇ”、３’−末端（ポリ−Ａ−末端）における〜６４アデノシン、３’−末端（ポリ−Ｃ−末端）における〜３０シトシン。
【図１９】ＭＡＧＥ−Ｃ２をコードしている、ｍＲＮＡ配列ＭＡＧＥ−Ｃ２（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（配列番号：２１）を示し、該ｍＲＮＡは、次の配列エレメントを含む：Ａ５’−ＣＡＰ、配列番号９に従いＭＡＧＥ−Ｃ２をコードしている安定化およびより良いコドン使用のためのＧＣ−最適化コード配列、配列番号７０に従う３’−ＵＴＲにおける安定化配列“ｍｕａｇ”、３’−末端（ポリ−Ａ−末端）における〜６４アデノシン、３’−末端（ポリ−Ｃ−末端）における〜３０シトシン；および配列番号７２に従うヒストンステムループ配列。
【図２０】配列番号１４に従い、ＭＡＧＥ−Ｃ２をコードしている野生型コード配列、すなわちＧＣ−最適化コード配列なしでＭＡＧＥ−Ｃ２をコードしているコード配列（ＣＤＳ）を示している。
【図２１】配列番号１５に従いＭＡＧＥ−Ｃ２をコードしているＧＣ−最適化コード配列を示している。
【図２２】５タンデムリピートを含んでいるＭＵＣ１（ムチン−１）をコードしている、ｍＲＮＡ配列ＭＵＣ１５ｘＶＮＴＲ（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ６４−Ｃ３０（配列番号：１６）を示し、該ｍＲＮＡは、次の配列エレメントを含む：Ａ５’−ＣＡＰ、配列番号１８に従いＭＵＣ１５ｘＶＮＴＲをコードしている安定化およびより良いコドン使用のためのＧＣ−最適化コード配列、配列番号７０に従う３’−ＵＴＲにおける安定化配列“ｍｕａｇ”、３’−末端（ポリ−Ａ−末端）における〜６４アデノシン、３’−末端（ポリ−Ｃ−末端）における〜３０シトシン。
【図２３】５タンデムリピートを含んでいるＭＵＣ１（ムチン−１）をコードしている、ｍＲＮＡ配列ＭＵＣ１５ｘＶＮＴＲ（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ６４−Ｃ３０−ヒストンＳＬ（配列番号：２４）を示し、該ｍＲＮＡは、次の配列エレメントを含む：Ａ５’−ＣＡＰ、配列番号１８に従いＭＵＣ１５ｘＶＮＴＲをコードしている安定化およびより良いコドン使用のためのＧＣ−最適化コード配列、配列番号７０に従う３’−ＵＴＲにおける安定化配列“ｍｕａｇ”、３’−末端（ポリ−Ａ−末端）における〜６４アデノシン、３’−末端（ポリ−Ｃ−末端）における〜３０シトシン；および配列番号７２に従うヒストンステムループ配列。
【図２４】配列番号１７に従いＭＵＣ１５ｘＶＮＴＲをコードしている野生型コード配列、すなわちＧＣ−最適化コード配列なしでＭＵＣ１をコードしているコード配列（ＣＤＳ）を示している。
【図２５】配列番号１８に従いＭＵＣ１５ｘＶＮＴＲをコードしているＧＣ−最適化コード配列を示している。
【図２６】ＥＬＩＳＰＯＴによるＭＵＣ１特有の細胞免疫反応を示したものであり、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１、５、８、１２および１５日目において３２μｇのＭｕｃ１−ＲＮＡｃｔｉｖｅ（登録商標）（配列番号１６）をワクチン接種し、ワクチン接種されたマウスおよびコントロールマウスの脾臓細胞におけるＩＦＮ−γの分泌の体外ＥＬＩＳｐｏｔ分析を、最後のワクチン接種後６日目において行い、細胞を、ＭＵＣ１由来ペプチド（予測されるＭＨＣ−クラスＩエピトープ）またはコントロールペプチドを用いてプレート上で刺激し、グラフは、各マウスについての単一のデータポイントを示している。
【図２７】低い免疫原性および放射線抵抗性ルイス肺癌（ＬＬＣ）の治療において、放射線治療を伴うｍＲＮＡ免疫療法の組み合わせの結果を示している。
【図２８】配列番号７５に従う５Ｔ４ＮＰ＿００１１５９８６４．１のタンパク質配列を示している。
【図２９】配列番号７６に従うサバイビン（ＢＩＲＣ５）Ｏ１５３９２のタンパク質配列を示している。
【図３０】配列番号７７に従うサバイビン（ＢＩＲＣ５）ＮＰ＿００１１５９．２のタンパク質配列を示している。
【図３１】配列番号７８に従うＮＹ−ＥＳＯ−１ＮＰ＿００１３１８．１のタンパク質配列を示している。
【図３２】配列番号７９に従うＭＡＧＥ−Ｃ１ＮＰ＿００５４５３．２のタンパク質配列を示している。
【図３３】配列番号８０に従うＭＡＧＥ−Ｃ２ＮＰ＿０５７３３３．１のタンパク質配列を示している。
【図３４】配列番号８１に従うＭＵＣ１タンパク質Ｊ０５５８２．１のタンパク質配列を示している。
【図３５】配列番号８２に従うＭＵＣ１タンパク質５ｘＶＮＴＲのタンパク質配列を示している。
【図３６】配列番号８３に従いＭＵＣ１をコードしている野生型コード配列、すなわちＧＣ−最適化コード配列なしでＭＵＣ１をコードしている全長コード配列（ＣＤＳ）を示している。
【発明を実施するための形態】
【０２５０】
（実施例）
次の実施例は、本発明をさらに例証することを意図している。これらは、本発明の主題を制限することを意図してはいない。
【０２５１】
〔１．ＭＵＣ１に基づいたｍＲＮＡワクチンの調製および抗原特有の細胞傷害性Ｔ細胞の導入〕
〔１．１  ＭＵＣ１に基づいたｍＲＮＡワクチンの調製〕
ｍＲＮＡワクチンは、ＭＵＣ１（配列番号１６）をコードしているＧＣ最適化ｍＲＮＡから構成される。ｍＲＮＡを、比（１：２）（ｗ／ｗ）（アジュバント成分）において、ｍＲＮＡへのプロタミンの添加によってプロタミンと複合体化した。１０分間のインキュベーションの後、抗原提供のｍＲＮＡとして用いた同様の量の遊離ｍＲＮＡを添加した。
【０２５２】
結果として生じた組成物を、８０％（ｖ／ｖ）リンガー乳酸液中に溶解した。
【０２５３】
〔１．２  ワクチン接種〕
上記１．１下に記載されているように、ｍＲＮＡワクチンの１つを３２μｇ用いてＣ５７ＢＬ／６マウスの皮内にワクチン接種した。コントロールマウスの皮内に、バッファ（リンガー乳酸）を注射した。ワクチン接種は、１週間当たり２つの免疫を伴い５つの免疫を含んだ。免疫反応を、ワクチン接種サイクルの完了から５日後または６日後に分析した。
【０２５４】
〔１．３  ＣＴＬ（細胞傷害性Ｔ細胞）反応のＥＬＩＳＰＯＴ検出〕
ＣＴＬ（細胞傷害性Ｔ細胞）反応の検出のために、特異的な刺激に対する反応におけるＩＦＮ−γ分泌の分析を、ＥＬＩＳＰＯＴ技術を用いて単細胞レベルにおいて視覚化し得る。
【０２５５】
上記１．１下において記載されたｍＲＮＡワクチンをワクチン接種したマウスおよびコントロールマウスの脾臓細胞を、最後のワクチン接種から５日後または６日後に単離し、ＩＦＮ−γ捕捉抗体をコートした９６ウェルＥＬＩＳＰＯＴプレート中に移した。そして該細胞を、次のペプチドを用いて３７℃において２４時間刺激した。
【０２５６】
【表２】
0006678582.tif 000021
【０２５７】
インキュベーション期間の後、細胞をプレートから洗浄し、ストレプトアビジン−ＡＫＰが続く、ｍｕｒｉｎｅＩＦＮ−γに対してビオチン化された第二抗体を用いて、細胞によって分泌されたＩＦＮ−γを検出した。スポットを、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質を用いて視覚化し、自動ＥＬＩＳＰＯＴリーダー（免疫スポットアナライザー、ＣＴＬアナライザーｓＬＬＣ）を用いて計測した。
【０２５８】
ＥＬＩＳｐｏｔにおいてＩＦＮ−γの分泌によって示されているように、ＭＵＣ１をコードしているｍＲＮＡを用いた皮内ワクチン接種は、抗原特有ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化をもたらした。
【０２５９】
〔２．  低い免疫原性（ＬＬＣ）腫瘍を有するマウスにおけるｍＲＮＡワクチン接種および放射線照射の組み合わせ〕
この研究は、低い免疫原性（ＬＬＣ）腫瘍を有する、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるワクチン接種および放射線照射組み合わせの有効性を調査した。
【０２６０】
０日目、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝グループにつき１０）に、右後方肢において、同系の３ＬＬｅｌｌｓ（腫瘍抗原ＥＧＦＲおよびコネキシンを発現しているＬＬＣ細胞）を皮下に注射した。腫瘍が５０ｍｍ３に達した時点で治療を開始した。マウスに、図２８において示されているように、ＥＧＦＲおよびコネキシンをコードしているｍＲＮＡをワクチン注射（１週間に２回）するか、腫瘍に３日間連続で３つの等しい量において３６Ｇｙを照射するか、または組み合わせ治療（第二照射の６時間前に初めのワクチン注射を行った）を行った。未治療のマウスをコントロールとして扱った。腫瘍成長を、キャリパを用いて三次元において測定することによって監視した。
【０２６１】
ＭＨＣクラスＩ発現の欠如により、免疫療法のみでは腫瘍成長の阻止において効果がなく、また放射線治療も一時的な腫瘍の制御のみの結果をもたらした。一方、放射線治療と組み合わせたｍＲＮＡワクチンは、強い相乗抗腫瘍効果をもたらした。
【０２６２】
〔３．  臨床：ｍＲＮＡ由来癌ワクチンおよびＮＳＣＬＣの治療としての局所放射線治療〕
〔研究薬〕
配列番号１９に従い５Ｔ４（栄養芽層糖タンパク質、ＴＰＢＧ）をコードするｍＲＮＡ、配列番号２０に従いサバイビン（バキュロウイルスＩＡＰ反復含有タンパク質５；ＢＩＲＣ５）をコードするｍＲＮＡ、配列番号２１に従いＮＹ−ＥＳＯ−１（ニューヨーク食道扁平上皮癌１；ＣＴＡＧ１Ｂ）をコードするｍＲＮＡ、配列番号２２に従いＭＡＧＥ−Ｃ１（メラノーマ抗原ファミリーＣ１）をコードするｍＲＮＡ、配列番号２３に従いＭＡＧＥ−Ｃ２（メラノーマ抗原ファミリーＣ２）をコードするｍＲＮＡ、および配列番号２４に従いＭＵＣ１（ムチン−１）をコードするｍＲＮＡを含んでいる組成物を、実施例１．１に従いプロタミンと複合体化し、ワクチンとして用いた。各抗体提供のｍＲＮＡを、無菌凍結乾燥物として提供した。リンガー乳酸における再構成は、皮内注射のための溶液を提供する。臨床研究において用いられる製剤は、ＣＶ９２０２と称される。それは、６つの製剤構成要素を含んでいるワクチンであり、それぞれの要素が異なる抗原提供のｍＲＮＡを含んでいる。
【０２６３】
〔研究対象集団〕
層１：ステージＩＶ非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）および非扁平上皮組織像を有し、表皮成長因子受容器（ＥＧＦＲ）突然変異の活性化がなく、白金およびペメトレキセドベースのファーストライン化学療法の少なくとも４サイクル後の部分寛解（ＰＲ）または不変（ＳＤ）を達成し、ペメトレキセドを用いた維持療法のための指標を有する患者。
層２：ステージＩＶＮＳＣＬＣおよび扁平上皮細胞組織像を有し、白金ベースおよび非白金化合物ファーストライン化学療法（白金ベースの組み合わせ化学療法）の少なくとも４サイクル後のＰＲまたはＳＤを達成した患者。
層３：ステージＩＶＮＳＣＬＣおよび非扁平上皮組織像、活性化したＥＧＦＲ突然変異を有し、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）を用いた治療の６カ月後までＰＲを達成した患者。
【０２６４】
〔研究対象集団：包含基準〕
１．患者：組織学的にまたは細胞学的に確認されたステージＩＶＮＳＣＬＣ、および非扁平上皮細胞組織像の場合において確認されたＥＧＦＲ突然変異状態を有する１８歳を超える患者。
層１：活性化されたＥＧＦＲ突然変異なしの非扁平上皮ＮＳＣＬＣ
層２：扁平上皮ＮＳＣＬＣ
層３：活性化したＥＧＦＲ突然変異を有している非扁平上皮ＮＳＣＬＣ
２．ファーストライン療法後のＲＥＣＩＳＴＶｅｒｓｉｏｎ１．１に従うＰＲまたはＳＤ、ファーストライン療法は以下から構成されるべきである：
層１：シスプラチンまたはカルボプラチンおよびペメトレキセド治療（少なくとも４サイクル）後のＰＲまたはＳＤ
層２：シスプラチンまたはカルボプラチンおよび非白金化合物治療（少なくとも４サイクル）後のＰＲまたはＳＤ
層３：６カ月後までのゲフィチニブ、エルロチニブまたはアファチニブ治療後のＰＲ
３．層１における患者については、ペメトレキセドを用いる維持療法が、研究者の意見として示唆されるべきである。
４．４ｘ５ＧＹによる放射線のために望ましい少なくとも１つの腫瘍部位の存在、およびＲＥＣＩＳＴ  Ｖｅｒｓｉｏｎ１．１に従う少なくとも１つのさらなる測定可能な腫瘍部位
放射線のために望ましい腫瘍部位：
骨移転
鎖骨側、腋下または頸部におけるリンパ節
皮膚または皮下移転
層１および層２のみにおける患者について：胸部（肺門または縦隔において中心に位置する肺腫瘍リンパ節）
５．活動指標：米国東海岸癌臨床研究グループ（ＥＣＯＧ）０から１
６．適切な臓器機能：
骨髄機能：ワクチン接種の開始における血液学的な価値：９５ｇ／Ｌ以上のヘモグロビン、７５０００／μＬ以上の血小板数、２０００／μＬ以上の白血球数、１０００／μＬ以上の絶対好中球、０．８×１０９／Ｌ以上のリンパ球数
肝臓：ＡＬＴおよびＡＳＴ肝移転を伴わない患者における２．５倍以下のＵＬＮおよび肝移転を伴う患者における５倍以下のＵＬＮ
腎臓：２ｍｇ／ｄＬ以下の血清クレアチニン、およびＭＤＲＤ化学式に従う４５ｍＬ／分以上のクレアチニンクリアランス
７．研究に参加している間、出産可能性のある患者における非常に効果的な避妊薬の使用および最後の免疫化の後１ヵ月間
８．処置に関連する任意の研究を行う前の文章によるインフォームド・コンセント
・治療期間：各患者において、疾患進行までワクチンを投与し、その後の全身セカンドライン治療、または容認できない毒性の出現、どちらでも初めに起こったものを認める。
・スクリーニングのタイミング：患者の２週間のスクリーニングを、ファーストライン化学療法（層１および２）の最終サイクルの１日後、またはＥＧＦＲＴＫＩ（エルロチニブまたはゲフィチニブ）（層３）を用いた治療の開始後６ヶ月のうちに開始する。
【０２６５】
〔投与の方法〕
各抗原提供のｍＲＮＡを、合計１２の注射で与えた各々２００μｌの２回の皮内注射と同日に、個別的に与える。
【０２６６】
研究プロトコルに記載されたように、初めの３つのワクチン接種を、週毎の間隔（１、８、１５日目）、続いて５７日目まで２または３週、６ヶ月まで３週毎およびその後６週毎の間隔で行う。ワクチン接種を、容認できない毒性の出現、または全身セカンドライン治療の開始を必要とする腫瘍発達の出現まで投与する。
【０２６７】
層１および３において、ＣＶ９２０２を、初めに１、８、１５、３６、および５７日目において投与する。ペメトレキセド（層１）を用いた治療の間、ワクチン接種を、ペメトレキセドの次の予定された容量の前、４〜７日前に投与する。この予定を選択するのは、好中球最下点中のワクチン接種および抗炎症ステロイドによる干渉を避けるためである。
【０２６８】
層２において、ＣＶ９２０２を、始めに１、８、１５、３６、および５７日において投与する。この強化予定を選択するのは、併用の抗癌治療を患者が受けないので患者の疾患進行までの時間がより短くなると予測されるからである。
【０２６９】
全ての層において、患者が治療中断の基準を満たさなかった場合において、５７日目の後のワクチン接種を継続する。５７日目の後、初めのワクチン接種の日から６ヶ月まで、３週間ごとにワクチン接種を投与する。６ヶ月の期間の後、中断の基準が満たされるまでワクチン接種を６週間ごとに行う。
【０２７０】
〔治療中断のための基準〕
１．治療の半永久的な中断を必要とする毒性の出現
２．後の全身治療の開始を必要とする疾患発達。
【０２７１】
〔ワクチンの投与〕
各々１回のワクチン接種の時点において、各６つの薬物構成要素を、同日において別々に投与する。各２００μＬの２回の皮内（ｉ．ｄ．）注射を、構成要素ごとに行い、結果として合計１２回の注射とする。
【０２７２】
〔放射線照射〕
放射線治療を、好ましくは９〜１２日目から、５ＧＹを１日４回の割合で行い、各々を一週間以内に行う。
【０２７３】
〔放射線のための腫瘍部位の選択〕
放射線照射のために選択される部位は、最も長い直径において少なくとも２センチあるべきで、試行部位における放射線腫瘍医は、このプロトコルに従いそれぞれの部位が放射線照射のために望ましいことを、患者が登録される前に確認しなければならない。
【０２７４】
以下の部位は、潜在的に望ましく、以下の階層に従い選択されるべきである：
第一優先：骨転移
第二優先：鎖骨側におけるリンパ節、腋下または頸部
第三優先：皮膚または皮下移転
第四優先（層１および２における患者のみ）：胸部（肺門または縦隔における中心に位置する肺腫瘍リンパ節）。
【０２７５】
層３における患者において、ＥＧＦＲＴＫＩｓと併用の治療のため、胸部の放射線照射の後の放射線肺炎について高いリスクが存在するため、胸部を放射線照射のために選択するべきではない。
【０２７６】
アブスコパル反応の評価のために測定可能な病変が存続している限り、４ｘ５ＧＹと同様の計画を用いる１より多い病変の放射線照射（例えば多数の骨移転）を、臨床的に示唆されれば許可する。１より多い病変の放射線照射は、同じ時間窓内で行うべきである。
【図１】
0006678582.tif 000022
【図２】
0006678582.tif 000023
【図３】
0006678582.tif 000024
【図４】
0006678582.tif 000025
【図５】
0006678582.tif 000026
【図６】
0006678582.tif 000027
【図７】
0006678582.tif 000028
【図８】
0006678582.tif 000029
【図９】
0006678582.tif 000030
【図１０】
0006678582.tif 000031
【図１１】
0006678582.tif 000032
【図１２】
0006678582.tif 000033
【図１３】
0006678582.tif 000034
【図１４】
0006678582.tif 000035
【図１５】
0006678582.tif 000036
【図１６】
0006678582.tif 000037
【図１７】
0006678582.tif 000038
【図１８】
0006678582.tif 000039
【図１９】
0006678582.tif 000040
【図２０】
0006678582.tif 000041
【図２１】
0006678582.tif 000042
【図２２】
0006678582.tif 000043
【図２３】
0006678582.tif 000044
【図２４】
0006678582.tif 000045
【図２５】
0006678582.tif 000046
【図２６】
0006678582.tif 000047
【図２７】
0006678582.tif 000048
【図２８】
0006678582.tif 000049
【図２９】
0006678582.tif 000050
【図３０】
0006678582.tif 000051
【図３１】
0006678582.tif 000052
【図３２】
0006678582.tif 000053
【図３３】
0006678582.tif 000054
【図３４】
0006678582.tif 000055
【図３５】
0006678582.tif 000056
【図３６】
0006678582.tif 000057
【配列表】
0006678582000001.app