(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）  配列番号１のアミノ酸残基１２３−１４０または配列番号２のアミノ酸残基１２４−１４１、または
ｂ）  Ｅ１２５、Ｅ１２６、Ｄ１２７、Ｎ１２９およびＳ１３８からなる群から選択される１以上の保守的アミノ酸置換を有する配列番号１のアミノ酸残基１２３−１４０、またはＩ１２６、Ｋ１２７、Ｓ１２８、Ｄ１３０およびＮ１３９からなる群から選択される１以上の保守的アミノ酸置換を有する配列番号２のアミノ酸残基１２４−１４１、
を含む、２５までのアミノ酸残基からなる抗血管新生ペプチド。
【請求項２】
ペプチドは、ａ）  配列番号１のアミノ酸残基１２３−１４０または配列番号２のアミノ酸残基１２４−１４１、または
ｂ）  Ｅ１２５、Ｅ１２６、Ｄ１２７、Ｎ１２９およびＳ１３８からなる群から選択される１以上の保守的アミノ酸置換を有する配列番号１のアミノ酸残基１２３−１４０、またはＩ１２６、Ｋ１２７、Ｓ１２８、Ｄ１３０およびＮ１３９からなる群から選択される１以上の保守的アミノ酸置換を有する配列番号２のアミノ酸残基１２４−１４１、
を含む、１８または１９のアミノ酸残基からなる、請求項１記載の抗血管新生ペプチド。
【請求項３】
ペプチドは、ａ）  配列番号１のアミノ酸残基１２３−１４０または配列番号２のアミノ酸残基１２４−１４１、または
ｂ）  Ｅ１２５、Ｅ１２６、Ｄ１２７、Ｎ１２９およびＳ１３８からなる群から選択される１以上の保守的アミノ酸置換を有する配列番号１のアミノ酸残基１２３−１４０、またはＩ１２６、Ｋ１２７、Ｓ１２８、Ｄ１３０およびＮ１３９からなる群から選択される１以上の保守的アミノ酸置換を有する配列番号２のアミノ酸残基１２４−１４１、
から選択される連続する２５までのアミノ酸残基を含む、請求項１記載の抗血管新生ペプチド。
【請求項４】
ペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基１２３−１４０または配列番号２のアミノ酸残基１２４−１４１から成る、請求項３記載の抗血管新生ペプチド。
【請求項５】
抗血管新生ペプチドは、異種のペプチドに融合している、請求項１から４のいずれか１項記載の抗血管新生ペプチド。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか１項記載の抗血管新生ペプチドをコードする、核酸。
【請求項７】
請求項６記載の核酸を含むベクター。
【請求項８】
請求項７記載のベクターを含む細胞。
【請求項９】
薬学的に受理可能なキャリアーおよび、請求項１から５のいずれか１項記載の抗血管新生ペプチドまたは請求項６記載の核酸を含む医薬品組成物。
【請求項１０】
さらに抗血管新生化合物を含む請求項９記載の医薬品組成物。
【請求項１１】
スラミン、ソラフェニブおよびスニチニブから成る群から抗血管新生化合物が選ばれる、請求項１０記載の医薬品組成物。
【請求項１２】
血管形成に関連した疾病の治療での使用のための、請求項１から５のいずれか１項記載の抗血管新生ペプチド、請求項６に記載の核酸、または請求項９から１１のいずれか１項記載の医薬品組成物。
【請求項１３】
疾病が、癌、関節炎、乾癬、喘息およびアテローム性動脈硬化、または糖尿病性網膜症、滲出（湿潤性）または非滲出性（乾式）の加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、角膜移植後拒絶反応、角膜血管新生、末熟児網膜症（ＲＯＰ）、網膜動脈または静脈閉塞、血管新生緑内障と鎌状赤血球網膜症である、請求項１から５のいずれか１項記載の抗血管新生ペプチド、請求項６に記載の核酸、または請求項９から１１のいずれか１項記載の医薬品組成物。
【請求項１４】
請求項１から５のいずれか１項記載の抗血管新生ペプチド、請求項６に記載の核酸、または請求項９から１１のいずれ１項記載の医薬品組成物を含むキット。
【請求項１５】
血管形成に関連した疾病の治療のために使用される、請求項１４記載のキット。
【請求項１６】
疾病が、癌、関節炎、乾癬、喘息およびアテローム性動脈硬化、または糖尿病性網膜症、滲出（湿潤性）または非滲出性（乾式）の加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、角膜移植後拒絶反応、角膜血管新生、末熟児網膜症（ＲＯＰ）、網膜動脈または静脈閉塞、血管新生緑内障と鎌状赤血球網膜症である、請求項１５記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗血管新生ペプチドおよび血管形成に関連した疾病を治療する際のそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管形成は、新しい血管を形成する特定の生物学的信号に応じて、静止した状態からミグラトリーおよび増殖性の表現型（ｍｉｇｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）への内皮細胞の活性化を含む生理的なプロセスである。成長および発展の基本的な特徴は、心臓および腎臓機能および創傷の治癒である。病理学の血管形成は多くの疾病、たとえば癌、炎症性の状態、たとえば慢性関節リウマチおよびアテローム性動脈硬化に関係する。それは癌の成長および拡大に重大な役割を果たし、したがって、癌治療での重要な目標である。
【０００３】
新しい血管新生は、内皮細胞の増殖および細胞間マトリックス（ＥＣＭ）のリモデリングを要する。インテグリンは、この反応で主な役割を果たし、細胞表面で様々な活性化状態で存在し、ＥＣＭとの相互作用によって細胞のミグラトリーおよび接着性の特性を調整する。他の細胞表面レセプターもＥＣＭリガンドと相互作用し、インテグリンの活性化状態を変更することができるカスケードを示すことに導く。シンデカン（ｓｙｎｄｅｃａｎｓ）はそのような分子の例である。多くの禁止剤が血管形成を抑えるために開発されている。例えば、小分子、たとえばソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）とパゾパニブ（ｐａｚｏｐａｎｉｂ）は、血管形成を促進するキナーゼを阻害する；ベバシズマブは血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、有力な脈管新生促進の信号分子をターゲットとする。しかしながら、抗血管新生化合物は、例えば出血、高血圧症、リンパ球減少、下痢という、使用に一般に関連した多くの重大な副作用がある。さらに、ＶＥＧＦターゲティング療法の場合には、かなりの数の免疫不応答患者（約４５％）がいる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、血管形成に関連した疾病の代替療法の必要がある。
【０００５】
シンデカンは、細胞接着、移動および成長因子信号中の役割を備えた膜内外のレセプターファミリーである。シンデカン分子はそれぞれ短い高度に保存された細胞質領域、膜貫通領域およびより大きな細胞外領域（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）を含む。哺乳動物では、４つのシンデカン・ファミリーメンバー、シンデカン−１、−２、−３、および−４がある。他のファミリーメンバーと同様に、シンデカン−２には短い細胞質の領域、単一パス膜貫通領域、およびヘパラン硫酸（ＨＳ）側鎖を備えたＮ末端の方へ置換され、細胞表面からシェデングされることができるより大きな細胞外の領域がある。シンデカンシェディング（ｓｙｎｄｅｃａｎ  ｓｈｅｄｄｉｎｇ）は多くの細胞タイプの特徴で、たとえば炎症伝達物質および成長因子などの刺激に応じて生じる。シンデカン−２およびＣＤ１４８は脈管構造に緊密に関連した分子である。シンデカン−２は繊維芽細胞、白血球およびＥＣ上で発現される。また、ゼブラフィッシュでの研究は、シンデカン−２は血管形成を枝分かれさせるために不可欠であることを明らかにした。
【０００６】
多くの研究グループは、シンデカン−２が血管形成に重要な役割を果たすことを示した。例えばＣｈｅｎら（Ｂｌｏｏｄ；１０３（５）；１７１０−９；２００４）は、シンデカン−２がゼブラフィッシュでの脈管原性の新芽形成にとって不可欠なことを示した。Ｎｏｇｕｅｒら（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ３１５：５，７９５−８０８，Ｍａｒｃｈ  ２００９）は、シンデカン−２のダウンレギュレーションが人間の微小血管の内皮細胞中の血管形成を害することを実証した。
【０００７】
発明者は、シンデカン−２分子の一部が予期しない抗血管新生効果を有することを驚くべき事に発見した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要約
本発明は、抗血管新生活性を有するペプチド、およびこれらのペプチドをコードする核酸を提供する。その発明は、さらに血管形成に関連した疾病を治療するための方法、医薬品組成物およびキットを提供する。
【０００９】
第１の態様では、発明は、配列番号１のアミノ酸残基１２３−１４０または配列番号２のアミノ酸残基１２４−１４１に対して少なくとも７０％の同一性を持っているアミノ酸配列を含む抗血管新生ペプチドを提供する。
【００１０】
詳細な記述
「血管形成」は、新しい血管形成のプロセスを示す。血管形成は、新しい血管を形成するのに必要な内皮細胞の活性化信号を提供する多数のプローおよび抗血管新生要素の集団的な行動を必要とする。脈管原性のプロセスは、毛細血管基底膜の酵素による分解、内皮細胞（ＥＣ）増殖および移動、細胞間マトリックスを通る侵入および細管形成（ｔｕｂｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）を含む課程を含んでいる。
【００１１】
「細管形成」または「細管新生」は、本明細書で使用される時には、血管新生促進の信号に応じて細胞の極性化された動きによって生成された内部ルーメンを備えた内皮細胞チューブの発現をいう。
【００１２】
「抗血管新生活性」は、血管形成の抑制または禁止をいう。「抗血管新生ペプチド」は抗血管新生活性を有するペプチドである。
【００１３】
「ペプチド」は、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸残基鎖をいう。「ペプチド」、「ポリペプチド」という用語は交換可能に使用される。
【００１４】
本明細書の全体にわたって、アミノ酸は、以下の３文字および１文字のコードを使用して言及されることができる：グリシン（ＧまたはＧｌｙ）、アラニン（ＡまたはＡｌａ）、バリン（ＶまたはＶａｌ）、ロイシン（ＬまたはＬｅｕ）、イソロイシン（ＩまたはＩｌｅ）、プロリン（ＰまたはＰｒｏ）、フェニルアラニン（ＦまたはＰｈｅ）、チロシン（ＹまたはＴｙｒ）、トリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）、リジン（ＫまたはＬｙｓ）、アルギニン（ＲまたはＡｒｇ）、ヒスチジン（ＨまたはＨｉｓ）、アスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）、グルタミン酸（ＥまたはＧｌｕ）、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）、グルタミン（ＱまたはＧｌｎ）、システイン（ＣまたはＣｙｓ）、メチオニン（ＭまたはＭｅｔ）、セリン（ＳまたはＳｅｒ）およびトレオニン（ＴまたはＴｈｒ）。残基がアスパラギン酸またはアスパラギンである場合、シンボルＡｓｘまたはＢが使用されることができる。残基がグルタミン酸またはグルタミンである場合、シンボルＧｌｘまたはＺが使用されることができる。もし文脈が他のものを指定しなければ、アスパラギン酸への言及はアスパルテートを含み、また、グルタミン酸への言及はグルタメートを含む。
【００１５】
発明の実施態様では、ここに定義されるように、ペプチドは、配列番号１または配列番号２に表されたシーケンスまたはそのフラグメントに対して、アミノ酸レベルで、少なくとも７０％の同一性を持っている。
【００１６】
配列番号１は、ヒトのシンデカン−２分子のアミノ酸配列を表す。配列番号２は、マウスのシンデカン−２分子のアミノ酸配列を表す。
【００１７】
発明の実施態様では、抗血管新生ペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基１１９−１４６、または、配列番号２のアミノ酸残基１２１−１４７に対して少なくとも７０％の配列同一性を持っているアミノ酸配列を含む。好ましい実施態様では、抗血管新生ペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基１２０−１４４、または配列番号２のアミノ酸残基１２１−１４５に対して少なくとも７０％の配列同一性を持っているアミノ酸配列を含む。好ましい実施態様では、抗血管新生ペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基１２１−１４４、または配列番号２のアミノ酸残基１２４−１４５に対して少なくとも７０％の配列同一性を持っているアミノ酸配列を含む。さらに好ましい実施態様では、抗血管新生ペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基１２３−１４０、または配列番号２のアミノ酸残基１２４−１４１に対して少なくとも７０％の配列同一性を持っているアミノ酸配列を含む。
【００１８】
発明の別の実施態様では、ペプチドは本明細書に記載されたアミノ酸配列のうちのどれに対しても、アミノ酸レベルで少なくとも７０％の同一性を持っている。たとえば、上述の配列番号１または配列番号２のフラグメント、および以下に記述する配列番号３または配列番号４に表されたアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を持っている。より好ましくは、ペプチドは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％およびより好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、または、９８％（さらに好ましくは少なくとも９９％）の同一性を、アミノ酸レベルで、本明細書に記載されたすべてのアミノ酸配列、たとえば上述の配列番号１または配列番号２のフラグメント、および以下に記述する配列番号３または配列番号４に表されたアミノ酸配列に対して同一性を持っている。
【００１９】
当該技術分野で知られている「同一性」は、シーケンスの比較により決定される２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の関係である。当該技術分野では、同一性はさらに、シーケンスのストリング間のマッチによって決定される、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのシーケンス間のシーケンス関係性（相同）の程度を意味する。２つのポリペプチドまたは２つのポリヌクレオチド・シーケンスの間の同一性を測定する多くの方法が存在しているが、同一性を決定するために一般に使用される方法はコンピュータ・プログラムで決定するものである。２つのシーケンス間の同一性を決定する好ましいコンピュータ・プログラムとしては、非限定的に、ＧＣＧプログラムパッケージ（（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２，３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３（１９９０））が挙げられる。
【００２０】
本発明で使用されるペプチドは、１つ以上の他のアミノ酸で１つ以上のアミノ酸を置換した、ここに開示したアミノ酸配列の１つ以上と同一であることができる。当業者は、様々なアミノ酸に同様の特性があることに気づいている。タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのそのような１つ以上のアミノ酸は、しばしば、そのタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの希望の活性を除去せずに、１つ以上の他のそのようなアミノ酸によって置換することができる。
【００２１】
したがって、アミノ酸グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンは、しばしば互いに（脂肪族の側鎖があるアミノ酸）代わりに用いることができる。これらの可能な置換のうち、互い（それらに比較的短い側鎖があるので）の代わりになるために、グリシンとアラニンが使用され、バリン、ロイシンおよびイソロイシンが互い（それらに疎水性の大きな脂肪族の側鎖があるので）の代わりになるために使用されることが好ましい。互いの代わりにしばしば用いることができる他のアミノ酸としては次のものを含んでいる：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン（芳香族側鎖があるアミノ酸）；リジン、アルギニン、およびヒスチジン（塩基性側鎖があるアミノ酸）；アスパルテート、およびグルタメート（酸性の側鎖があるアミノ酸）；アスパラギン、およびグルタミン（アミド側鎖があるアミノ酸）；またシステイン、およびメチオニン（硫黄を含む側鎖があるアミノ酸）。
【００２２】
この性質の置換は「保守的な」、「半保守的な」アミノ酸置換としばしば呼ばれる。したがって、本発明は上記のアミノ酸配列を含むペプチドの使用に及ぶが、１つ以上の保存的置換がされたアミノ酸配列であって少なくとも７０％の同一性を持つものの使用にも及ぶ。
【００２３】
発明のペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基１１９−１４６、１２０−１４４、１２１−１４４または１２３−１４０に対して少なくとも７０％の配列同一性を持っているか、または配列番号２のアミノ酸残基１２１−１４７、１２１−１４５、１２４−１４５または１２４−１４１に対して少なくとも７０％の配列同一性を持っている。好ましい実施態様では、配列同一性は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％およびより好ましくは少なくとも９５％、９６％  、９７％または９８％であり、さらに好ましくは少なくとも９９％である。
【００２４】
別の実施態様では、抗血管新生ペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基１２３−１４０に対して少なくとも７０％の同一性を持っているか、配列番号２のアミノ酸残基１２４−１４１に対して少なくとも７０％の同一性を持っているアミノ酸配列から成る。
【００２５】
別の実施態様では、ペプチドは２５までのアミノ酸残基を含むかまたはこれから成り、配列番号１のアミノ酸残基１２３−１４０に対して少なくとも７０％の同一性を持っているか、配列番号２のアミノ酸残基１２４−１４１に対して少なくとも７０％の同一性を持っているアミノ酸配列を含んでいる。
【００２６】
本明細書で使用される時、用語「含む」は、請求項が記載されたすべての要素または方法のステップを含むが、さらに追加の記載されていない要素または方法ステップを含むことができることを意味する。ペプチドは本明細書に開示したアミノ酸配列のうちのいずれかを含むかまたはそれらから成ってもよい。
【００２７】
さらなる実施態様では、ペプチドは、次のものから選ばれた連続２５までのアミノ酸残基に対して少なくとも７０％の同一性を持っているアミノ酸配列を含むかそれらから成る：配列番号１のアミノ酸残基１２０−１４４または配列番号２のアミノ酸残基１２１−１４５。
【００２８】
さらなる実施態様では、ペプチドは、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、または１６のアミノ酸残基を有するアミノ酸残基、典型的には典型的に連続するアミノ酸残基であって、配列番号１のアミノ酸残基１１９−１４６または配列番号２のアミノ酸残基１２１−１４７から選ばれたアミノ酸残基に対して少なくとも７０％の同一性を持っているアミノ酸配列から成る。
【００２９】
さらなる実施態様では、ペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基１２３−１４０に対して少なくとも７０％の同一性を持っているか、配列番号２のアミノ酸残基１２４−１４１に対して少なくとも７０％の同一性を持っているアミノ酸配列から成る。
【００３０】
すべての本明細書に記載された実施態様では、配列同一性は、少なくとも７５％  ８０％  ８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％であることができ、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％または９８％、そしてさらに好ましくは少なくとも９９％であることができる。
【００３１】
発明のペプチドは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５の長さのアミノ酸残基であることができる。好ましい実施態様では、ペプチドは、１６、１７の、１８または１９の長さのアミノ酸残基である。もっとも好ましい実施態様では、ペプチドは１８の長さのアミノ酸残基である。
【００３２】
発明の第１の態様の実施態様では、抗血管新生ペプチドは分離される。「分離される」とは、そのオリジナルの環境から物質が取り除かれることをいう。オリジナルの環境は、たとえば細胞の内部のような自然環境でありえる。ここに使用される時、「分離されたペプチド」は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定される純度で、少なくとも２０％の純度、少なくとも４０％の純度、より好ましくは少なくとも６０％の純度、さらに好ましくは少なくとも８０％の純度、最も好ましくは少なくとも９０％の純度、そして最も好ましくは少なくとも９５％の純度のペプチドをいう。
【００３３】
別の実施態様では、発明の抗血管新生ペプチドは異種のペプチドに融合されてもよい。ここに使用される時、「異種のペプチド」は、抗血管新生ペプチドに希望の特性、例えば、高められた安定性、増加された輸送性、あるいは単純化された浄化または検知を与えるペプチドを指す。異種のペプチドは典型的にはシンデカンまたはシンデカン由来物ではない。
【００３４】
本発明の目的のために意図される異種のペプチドの例は、たとえばグルタチオンＳ転移酵素、ポリヒスチジン（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）または親和性クロマトグラフィーによるポリペプチドの純化を促進するためのｍｙｃタグを含む。別の実施態様では、異種のペプチドは蛍光性のポリペプチドである。蛍光性のポリペプチドは、非制限的に、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光蛋白質、黄色蛍光蛋白質、シアン蛍光蛋白質およびそれらの派生物を含む。
【００３５】
発明のペプチドは組み換え手段、たとえば適切なベクターの中での核酸構成物の発現により、または固相法によって生産されることができる。
【００３６】
本明細書に記載されたシーケンスへの、自然発生または非自然発生のアミノ酸を使用したアミノ酸置換または挿入は、本発明の範囲内であることが認識されるべきである。例えば、Ｄ−アミノ酸は、本発明のペプチドに組み入れることができる。
【００３７】
発明のペプチドは変性され、特性、たとえば半減期を改善するのにＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）によって変性されることができる。
【００３８】
第２の態様では、発明は、第１の態様の抗血管新生ペプチドをコードする核酸構成物を提供する。
【００３９】
用語「核酸構成物（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）」は、一般に任意の長さの核酸をいい、たとえばクローニングにより得られたかまたは化学合成によって生産されたＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｍＲＮＡであることができる。ＤＮＡは、一本鎖または２本鎖であることができる。一本鎖ＤＮＡはコーディングセンス鎖であることができ、またはノンコーディング、またはアンチセンス鎖であることができる。治療での使用のためには、核酸構成物は好ましくは治療される被検者の中で発現することができる形式である。
【００４０】
発明の別の実施態様では、核酸は本明細書に記載された核酸配列のうちの全てに対して、核酸レベルで少なくとも７０％の同一性を持っている。たとえば配列番号８またはその配列番号９またはそれらの任意のフラグメントに表されたシーケンス、たとえば図８中の太字および下線を付して示されたシークエンス（配列番号８のヌクレオチド３６７−４２０または配列番号９のヌクレオチド３７０−４２３）と少なくとも７０％の同一性を持っている。より好ましくは、核酸は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％およびさらに好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、または９８％、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性を、核酸レベルで、本明細書に記載された核酸配列の全てに対して、例えば配列番号８または配列番号９に示されたシーケンス、またはそのフラグメント、たとえば図８中の太字および下線を付して示されたシークエンス（配列番号８のヌクレオチド３６７−４２０または配列番号９のヌクレオチド３７０−４２３）と同一性を持っている。
【００４１】
第２の態様の核酸構成物は発現カセットの一部であることができる。発現カセットはベクターの一部である。それはプロモータ、オープン・リーディング・フレームおよび３’の翻訳されていない領域を含む。
【００４２】
発明の第２の態様の核酸構成物は、ベクターの形式であるか、あるいはベクター内に含まれることができる。本明細書に使用される時、ベクターは、発現または複製のために、細胞またはウイルスへ核酸配列を導入するための構成物を指す。それは組み換え構成物、例えば、細胞またはウイルスの中へのイントロダクションの際に核酸配列の発現または複製をすることができるプラスミド、ウイルス他の構成物を指す。
【００４３】
ベクターの例は特に、染色体のベクター、エピゾームのベクターおよびウイルス由来のベクターを含んでいる。一般に、宿主の中にポリペプチドを発現するために核酸を維持するか、広めるか、発現するのに適切な任意のベクターが、発現に関して使用されることができる。
【００４４】
発明の核酸構成物およびベクターは細胞内に存在してもよい。本明細書に使用される時、細胞は原核細胞、たとえば細菌細胞または真核細胞、たとえば動物、植物または酵母細胞を指す。
【００４５】
疾病
本発明の組成物または方法によって治療予防することができる疾病は、異常または過度の血管形成に関連した任意の疾病であることができる。広範囲のそのような疾病はＣａｒｍｅｌｉｅｔ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ９，６５３−６６０（２００３））によってリストされる。例としては癌、関節炎、乾癬、喘息およびアテローム性動脈硬化を含んでいる。血管形成はさらに視覚の疾病の特徴で、失明の主な原因である。それは、糖尿病性網膜症、滲出（湿潤性）または非滲出性（乾式）の加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、角膜移植後拒絶反応、角膜血管新生、末熟児網膜症（ＲＯＰ）、網膜動脈または静脈閉塞、血管新生緑内障と鎌状赤血球網膜症の重要な要因である。従って、本発明の組成物または方法によって治療／予防することができる疾病は、これらの疾病のいずれかでありえる。
【００４６】
医薬品組成物
第３の態様では、薬学的に受理可能なキャリアーおよび第１の態様の抗血管新生ペプチドまたは第２の態様の核酸を含む医薬品組成物を提供する。
【００４７】
別の実施態様では、医薬品組成物はさらに抗血管新生化合物を含む。抗血管新生化合物の例は公知で有り、たとえばスラミン、ソラフェニブおよびスニチニブ（ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）である。
【００４８】
発明の医薬品組成物は、過度または異常な血管形成、例えば癌、関節炎、乾癬、喘息、アテローム性動脈硬化、および眼科の疾病、たとえば糖尿病性網膜症、滲出（湿潤）もしくは非滲出（乾式）の黄斑変性（ＡＭＤ）、角膜移植後拒絶反応、角膜血管新生、血管新生緑内障、末熟児網膜症（ＲＯＰ）、網膜動脈または静脈閉塞および鎌状赤血球網膜症、に関連した疾病の治療で使用されることができる。発明の実施態様では、発明の医薬品組成物は癌の治療のために使用される。
【００４９】
本発明による医薬品組成物は、即時に使用の準備ができる形式で提供されてもよい。あるいは、組成物は、適用に先立ってある準備を要求する形式で提供されてもよい。発明の医薬品組成物は、たとえば経口（バッカルまたは舌下剤を含む）、局所的（バッカル、舌下剤または経皮剤を含む）、非経口投与薬（皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内、または皮内）のような任意の適切なルートによる適用に適するものであることができる。
【００５０】
発明の医薬品組成物中の薬学的に受理可能なキャリアーは、公知の任意の適切な薬学的に受理可能なキャリアーまたは補形薬であることができる。
【００５１】
非経口投与に適した医薬品組成物は、水性または非水性の無菌の注入溶液を含んでいてもよく、これは酸化防止剤、バッファー、静菌剤および配合物を受容体の血液と本質的に等張にする溶質を含むことができ；また沈澱防止剤と粘稠化剤を含むことのできる水性または非水性の無菌の懸濁液であることができる。
【００５２】
注射剤に使用されることができる添加剤としては、例えば水、アルコール、多価アルコール、グリセリンおよび植物油が挙げられる。組成物は、ユニット投与量あるいは複数投与量容器、例えば密封したアンプル、ガラス瓶中に存在し、凍結乾燥された状態で貯蔵され、例えば使用の直前に、注入のために水などの無菌の液体の追加だけを要求するようにすることができる。注入溶液および懸濁液は無菌の散剤、顆粒およびタブレットから調製されていてもよい。
【００５３】
医薬品組成物は保存剤、可溶性化剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色剤、香料、塩類（本発明の物質はそれら自身薬学的に受理可能な塩の形で提供されてもよい）、バッファー、コーティング剤または酸化防止剤を含むことができる。さらに、それらは本発明の物質に加えて治療上活性な作用薬を含んでもよい。
【００５４】
治療法
第４の態様では、発明は、必要とされる対象に第１の態様の抗血管新生ペプチド、または第２の態様の核酸構成物、または第３の態様の医薬品組成物のの治療上有効な量を適用することを含む、（異常か過度の）血管形成に関連した疾病を治療する方法を提供する。治療上有効な量は血管形成を低減するか阻害するのに十分な投与量である。
【００５５】
発明の実施態様は、治療法は本発明のペプチド、核酸構成物および／または医薬品組成物を他の抗血管新生療法と組み合わせてを適用することを含む。
【００５６】
発明の実施態様では、方法は、例えば癌、関節炎、乾癬、喘息、アテローム性動脈硬化、および眼科の疾病、たとえば糖尿病性網膜症、滲出（湿潤）もしくは非滲出（乾式）の黄斑変性（ＡＭＤ）、角膜移植後拒絶反応、角膜血管新生、血管新生緑内障、末熟児網膜症（ＲＯＰ）、網膜動脈または静脈閉塞および鎌状赤血球網膜症、に関連した疾病の治療のためにある。さらなる実施態様では、方法は癌の治療のためにある。
【００５７】
ここに使用される時、被検者は人間を含む動物を指す。動物としては、ハツカネズミ、ネズミ、家禽、たとえば鶏、反芻動物、たとえば雌牛、ヤギ、鹿、羊および他の動物、たとえばブタ、猫、犬および霊長類、たとえば人間、チンパンジー、ゴリラおよび猿を含む。好ましくは、被検者は人間である。
【００５８】
発明のこの態様は、さらに次のものまで及ぶ：
血管形成に関連した疾病の治療で使用される、第１の態様の抗血管新生ペプチド、第２の態様の核酸構成物または第３の態様の医薬品組成物。
第１の態様の抗血管新生ペプチド、第２の態様の核酸構成物または第３の態様の医薬品組成物の、血管形成に関連した疾病の治療のための医薬品の製造における使用。
ここに使用される時、「治療」は防止的治療（つまり予防）をカバーするように意図される。
【００５９】
投与量
治療上有効な量は血管形成を低減するか阻害するのに十分な投与量である。デリバリーと適用のための投与量は経験的に決定されて、家畜病モデルあるいは人間の臨床試験の結果を使用して、現在の既存のプロトコルに基づいて決定することができる。例えば、最初の研究投与量はマウスの動物研究に基づくことができる。
【００６０】
投与量は治療が予防的か治療かどうか、タイプ、発症しているか否か、進行度、厳しさ、頻度、期間、あるいはその病気の進行の可能性、希望の臨床の終了点、前の治療あるいは同時の治療、健康状態、年齢、ジェンダー、被検者の人種あるいは免疫学的能力、および他の要因に応じて変わる場合があり、それは当業者によって評価されるだろう。任意の悪い副作用、合併症あるいは治療または療法、および被検者のステータスの他の危険要因に応じて、投与量、数、度数あるいは期間は比例して増加されるか低減されてることができる。当業者は、治療または予防的な利点を提供するために十分な量を提供するのに必要な量およびタイミングに影響を及ぼす要因を理解するだろう。
【００６１】
併用治療
血管形成に関連した疾病の治療は、他の抗血管新生作用薬と発明のペプチドを組み合わせることにより実行されてもよい。例えば、腫瘍は、ペプチド療法とともに化合物、たとえばスラミン、ソラフェニブ、ソニチニブ（ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）、パゾパニブ、エベロリマス（ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ）、ベバシズマブ、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−α、血液造成阻害剤およびプロラクチンを投与することにより治療されることができる。このリストは非網羅的である。また、選択肢は当該技術分野において公知である。ペプチド療法は他の療法、例えば化学療法、放射線療法、免疫療法と組み合わされてもよい。
【００６２】
キット
第５の態様では、発明は、本発明のペプチド、核酸構成物および／または医薬品組成物）を含むキットまたはキットの部分を提供する。
【００６３】
発明の実施態様では、キットは、ここに定義されるように、血管形成に関連した疾病の治療で使用するためのものである。好ましい実施態様では、キットは癌の治療で使用するためのものである。
【００６４】
キットは、凍結乾燥された粉末としての本発明のペプチドを含むシール容器、および溶剤を含む第２の容器を含んでいてもよい。ペプチドは凍結乾燥することができる。さらなる成分が固体または液体部分に含まれることができる。したがって、キットはペプチドを含む第１の容器と、等張の食塩水を含む第２の容器、またはペプチドおよびマンニトールを含む第１の容器、および滅菌水を含む第２の容器の含むことができる。適用に先立って、注入溶液を与えるために溶剤が容器中の固体成分に加えられる。
キットは、使用のための指示を含んでいてもよい。
【００６５】
本発明の第２およびその後の好ましい特徴は、発明の第１の態様のために記述されたものに準ずる。
【００６６】
発明は、以下の例を参照して説明されるが、これらは例示の目的のみで示され、本発明を限定するものではない。多くの図面が言及される。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図１は掻創細胞移動分析を示す。この分析では、スクラッチがＨＵＶＥＣＳのコンフリューエントな単層に形成され、ヒトのシンデカン−２ペプチドの異なる濃度が存在する状態または存在しない状態で培養された。細胞移動は、３７℃、１０％のＣＯ２でセットされた制御環境チャンバーを備えたオリンパスＩＸ８１顕微鏡を使用して、タイムラスプ顕微鏡検査によって測定された。イメージはＨａｍａｍａｔｓｕ  Ｏｒｃａ  ＥＲディジタルカメラを使用して、３０分ごとに記録され、Ｃｅｌｌ＾Ｍソフトウェア（オリンパス）を使用して処理した。（Ａ）  スクラッチ後９時間のインキュベーションの後のスクラッチ傷の位相コントラスト顕微鏡写真図。（Ｂ）  ＨＵＶＥＣによって移動させられたエリアは、時間＝０および時間＝９時間で移動させられたエリアを測定し、ＩＭＡＧＥＪソフトウェアを使用して計算された。その後、０時間での値が９時間での値から引かれた。
【図２】図２は異なるネズミ科のシンデカン−２融合蛋白質に応じたネズミ科のＥＣ細胞の中での細胞移動を示す。スクラッチ傷移動分析は、脳ＥＣの上に示された融合蛋白質の０．５μＭが存在する状態で行なわれた。細胞移動は、３７℃、１０％のＣＯ２でセットされた制御環境チャンバーを備えたオリンパスＩＸ８１顕微鏡を使用して、タイムラスプ顕微鏡検査によって測定された。イメージはＨａｍａｍａｔｓｕ  Ｏｒｃａ  ＥＲディジタルカメラを使用して、３０分ごとに記録され、Ｃｅｌｌ＾Ｍソフトウェア（オリンパス）を使用して処理した。（Ａ）  スクラッチが作られた９時間後の位相コントラスト画像。（Ｂ）  ＥＣ移動速度は、１８ａａの規定された領域を含むＳ２ＥＤタンパク質が存在する状態で低減される。  細胞速度データは、１つの治療当たりのリーディングエッジで少なくとも２５個の個々の細胞からの平均の測定値を表わす。
【図３】図３はヒトＥＣの中での微小管形成を示す。１００μｌ／ウエルで、成長因子の除去されたＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコーティングされた２４ウェルプレートへ、ヒトのシンデカン−２ペプチドｓｃｒまたは示された濃度のｈＳ２ｐｅｐが存在する状態で８０，０００ＨＵＶＥＣがシードされた（ｓｃｒはスクランブルドコントロール・ペプチドに相当する）。細管形成は、３７℃、１０％のＣＯ２でセットされた制御環境チャンバーを備えたオリンパスＩＸ８１顕微鏡を使用して、タイムラスプ顕微鏡検査によってモニターされた。イメージはＨａｍａｍａｔｓｕ  Ｏｒｃａ  ＥＲディジタルカメラを使用して、３０分ごとに記録され、Ｃｅｌｌ＾Ｍソフトウェア（オリンパス）を使用して処理した。（Ａ）  培地中の６時間後の細管の位相コントラスト画像。（Ｂ）  分岐点は少なくとも４つの代表的なイメージ上で数えられた。  分岐点は２つ以上の細管が交わる点として定義される。
【図４】図４はネズミＥＣの中での脈管原性の新芽形成を示す。（Ａ）  この研究の中で使用されるネズミ科のシンデカン−２突然変異蛋白質の図。（Ｂ）  上記のようなＧＳＴ（コントロール）、Ｓ２ＥＤまたはＳ２ＥＤの突然変異体の０．５μＭを含むコラーゲンＩマトリックス中に、ネズミ大動脈がシードされた。  １つの条件当たり８つの輪からの芽が数えられ、平均が計算された。エラーバーはＳＥＭを表わす。また、有意性はＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ多重比較（ｐ＊＊＊＜０．００５およびｐ＊＊＊＊＜０．０００１）により一元ＡＮＯＶＡを使用して計算された。
【図５】図５は、コラーゲンＩを通るネズミ科の皮膚ＥＣ侵入を示す。８μトランスウエルの中で１μＭのヒトのシンデカン−２ペプチド（ｈＳ２ｐｅｐ）およびコントロール（ｓｃｒ）を含むコラーゲンＩのマトリックス（Ｅ４メディア中の１ｍｇ／ｍｌ）の１０μｌが調製された。５０，０００の皮膚ＥＣがシードされ、マトリックスを通り抜けた細胞が２４時間の後に数えられた。細胞はカルセイン（５μＭ）で染色され、オリンパスＩＸ８１倒立顕微鏡およびＨａｍａｍａｔｓｕ  Ｏｒｃａ  ＥＲディジタルカメラを使用して細胞のイメージが撮られた。蛍光性の細胞は（Ａ）に示される。また、処理していないコントロールと比較して、移動した細胞の％をＢに示した。４つの独立したイメージから細胞数が数えられ、エラーバーはＳＥＭを表わす。有意性は、Ｔｕｋｅｙの多重比較（ｐ＜０．０００１）を使用して一元ＡＮＯＶＡにより計算された。
【図６】図６は、血管形成に帰着する、ＣＤ１４８とのＳ２ＥＤ相互作用を示す。（Ａ）ｂＥＮＤ３．１、ＭＬＥＣおよびｓＥＮＤ細胞はＣＤ１４８を発現する。ＣＤ１４８またはβ−チューブリンの抗体で、示されたＥＣラインからの溶解物のウェスタンブロットが調べられた。（Ｂ）  ＣＤ１４８はネズミ科のシンデカン細胞外のコア蛋白質（Ｓ２ＥＤ）と相互作用する。  ｓＥＮＤ細胞からの細胞溶解物は、ＧＳＴ（コントロール）、Ｓ２ＥＤ、Ｓ２ＥＤΔＰ１２４−Ｆ１４１またはＳ２ＥＤΔＬ７３−Ｇ１２３でコーティングされたビーズでインキュベートされた。沈殿はＣＤ１４８の存在についてウェスタンブロットによって分析された。ＣＤ１４８は、単にＣ末端１８アミノ酸接着調節領域（ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｄｏｍａｉｎ）を含んでいる、Ｓ２ＥＤの形式によってプルダウンされた。ブロットは４つの実験を示す。
【図７】図７は、本明細書に引用されたペプチドのアミノ酸配列を示す。配列番号１は、全長のヒトのシンデカン−２分子のアミノ酸配列を表す。配列番号２は、全長のマウス・シンデカン−２分子のアミノ酸配列を表す。配列番号１のアミノ酸残基１２３−１４０および配列番号２のアミノ酸残基１２４−１４１は、太字で示される。配列番号３〜７は例の中で使用されるペプチドとタンパク質に対応する。配列番号３〜５では、ＧＳＴ  ＋リンカーのアミノ酸配列には下線が付され、配列番号３および５では１８アミノ酸ペプチド（配列番号２のアミノ酸残基１２４−１４１に対応する）が、太字で示される。
【図８】図８は、ヒトのシンデカン−２（配列番号８）およびネズミ科のシンデカン−２（配列番号９）の暗号配列（核酸配列）を示す。配列番号８中の太字および下線を付したＤＮＡ塩基配列は、配列番号１のアミノ酸残基１２３−１４０のアミノ酸配列を有する本発明のペプチド（コード）に対応し、配列番号９中の太字および下線を付したＤＮＡ塩基配列は、配列番号２のアミノ酸残基１２４−１４１のアミノ酸配列を有する本発明のペプチド（コード）に対応する。配列番号１０〜１２は、例の中で使用されるペプチドとタンパク質のＤＮＡ塩基配列である。
【図９】図９は、ＱＭ１０７（ＨＳ２ｐｅｐ；配列番号６）がマウス大動脈輪モデル中の脈管原性の芽形成を阻害することを示す。
【図１０】図１０は、ＱＭ１０７（ＨＳ２ｐｅｐ；配列番号６）が膜状の外植片モデル中の脈管原性の芽形成を阻害することを示す。
【図１１】図１１は、ＱＭ１０７（ＨＳ２ｐｅｐ；配列番号６）が脈絡膜の新血管化を生体内で阻害することを示す。
【図１２】図１２は、ＱＭ１０７（ＨＳ２ｐｅｐ；配列番号６）がマトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）プラグ分析中の血管形成を阻害することを示す。
【００６８】
実施例
１．  内皮細胞移動の抑制
内皮細胞（ＥＣ）移動は血管形成における重要なプロセスである。実験の次のシリーズは、この反応に対するヒトおよびネズミ科のシンデカン−２ペプチドの影響を調査することを目標とする。
【００６９】
１つの分析では、スクラッチがＨＵＶＥＣのコンフリューエント単層に作られ、ｈＳ２ｐｅｐ（ヒトのシンデカン−２ペプチド）およびスクランブルドペプチドの異なる濃度が存在する状態または存在しない状態で培養された（図１Ａ）。ｈＳ２ｐｅｐは、培養の４時間の後にＨＵＶＥＣ細胞移動を著しく阻害した。スクラッチ創傷閉鎖は、１μＭ  ｈＳ２ｐｅｐで処理された細胞で大幅に低減され、ＥＣ移動の抑制を示した（図１Ｂ）。移動分析も、Ｓ２ＥＤまたはこのタンパク質のトランケートされた形体（Ｓ２ＥＤΔＰ１２４−Ｆ１４１およびＳ２ＥＤΔＬ７３−Ｇ１２３）のいずれかの、ネズミ科のシンデカン−２  ＧＳＴ融合蛋白質が存在する状態で脳ＥＣ上で行なわれた。全長のタンパク質で見られるように、接着調節領域のみを含むトランケートされた融合蛋白質（Ｓ２ＥＤΔＬ７３−Ｇ１２３）は、ＥＣ細胞移動を阻害した（図２ＡおよびＢ）。対照的に、シンデカン−２接着調節領域を欠く突然変異蛋白質は、細胞移動に影響しなかった。またＧＳＴだけで処理された細胞のものと等価な創傷閉鎖を示した。
【００７０】
２．  毛細血管網形成の抑制
血液を供給し、かつ廃棄物を除去する毛細血管網を形成する能力は、固形腫瘍の成功する成長にとって不可欠である。従って、Ｍａｔｒｉｇｅｌ上にシードされた時、ＥＣが毛細血管網を形成する能力も、細胞の脈管原性の可能性のよい指標であると提案されている。
【００７１】
ヒトのシンデカン−２由来のペプチドの妨害作用を調査するために、１００ｕｌ／ウエルで成長因子の除去されたＭａｔｒｉｇｅｌでコーティングされた２４ウェルプレートへ、ｓｃｒまたはｈＳ２ｐｅｐが存在する状態で８０，０００ＨＵＶＥＣがシードされた。細管形成はタイムラスプ顕微鏡検査によってモニターされた（図３Ａ）。図３Ｂは、特に分岐点の数が尺度とされた時、毛細血管網形成がｈＳ２ｐｅｐ（１μｍ）が存在する状態で阻害されたことを示す。
【００７２】
ネズミ科のペプチドでの別の分析では、全長Ｓ２ＥＤ、Ｓ２ＥＤΔＰ１２４−Ｆ１４１（接着調節領域を欠く）またはＳ２ＥＤΔＬ７３−Ｇ１２３（接着調節残基のみを含むトランケートされた形式）は、大動脈輪部分が埋め込まれたコラーゲン・マトリックスに組み入れられた（図４ＡおよびＢ）。脈管原性の芽が処理していないものおよびＧＳＴコントロールで観察された。一方、輪が、両方が規定１８アミノ酸モチーフ・モチーフを含んでいるＳ２ＥＤまたはＳ２ＥＤΔＬ７３−Ｇ１２３を備えたマトリックスに埋め込まれていた時、芽形成は厳しく損なわれた（図４Ｂ）。これらのデータは、Ｓ２ＥＤの抗血管新生特性が、ネズミ科のシンデカン−２のＰ１２４とＦ１４１の間に位置する接着調節領域に依存することを示す。
【００７３】
３．  内皮細胞侵入の抑制
細胞間マトリックスを通る侵入は血管形成の別の指標である。１ｕＭのｈＳ２ｐｅｐおよびｓｃｒを含むコラーゲンＩのマトリックスは、８ｕｌ  トランスウエルの中で調製された。５０，０００のネズミ科の皮膚ＥＣがシードされ、マトリックスを通り抜けた細胞が２４時間の後に数えられた。図５は、コラーゲンＩを通る侵入がｈＳ２ｐｅｐ（１ｕＭ）の存在によって阻害されたことを示す。
【００７４】
４．  Ｓ２ＥＤによる血管形成の抑制は、ＣＤ１４８によって駆動され、β１インテグリン活性化の変化に導く。
繊維芽細胞では、チロシンホスファターゼタンパク質レセプターＣＤ１４８は、Ｓ２ＥＤの接着調節領域と直接相互作用し、β１インテグリンを介した細胞付着と伸展に導く（Ｗｈｉｔｅｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ，２２（１９）：３６０９−２４）。ＣＤ１４８がＳ２ＥＤに対するＥＣ反応のための媒介物質かどうか判断するために、脳、肺および皮膚からのＥＣ上のＣＤ１４８の発現が確認された。ＣＤ１４８の細胞質の領域に向けられた抗体を使用するウエスタンブロット解析は、３つの細胞株がすべてこのレセプターを発現することを明らかにした（図６Ａ）。ＣＤ１４８とシンデカン−２  エクトドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）の間の相互作用は、ベイトとしてＧＳＴ−Ｓ２ＥＤビーズを使用して、プルダウン分析を行なうことにより実証された。ＣＤ１４８は、ＧＳＴまたはＧＳＴＳ２ＥＤΔＰ１２４−Ｆ１４１がコーティングされたビーズを使用した場合に、沈殿には明らかではなかった（図６Ｂ）。両方ともＣ末端１８ａａ接着調節領域を含むＳ２ＥＤおよびＳ２ＥＤΔＬ７３−Ｇ１２３は、ＥＣ溶解物から成功裡にＣＤ１４８をプルダウンし、ＣＤ１４８とＳ２ＥＤの間の相互作用ポイントが分子のこの領域に存在することを示した。
【００７５】
材料と方法
融合蛋白質と抗体：
ネズミ科のシンデカン−２由来のペプチド：Ｓ２ＥＤ（配列番号３）、Ｓ２ＥＤΔＰ１２４−Ｆ１４１（配列番号４）、およびＳ２ＥＤΔＬ７３Ｇ１２３（配列番号５）。人間のシンデカン−２由来のペプチド：ｈＳ２ｐｅｐ（配列番号６）、およびｓｃｒ（配列番号７）。「ｓｃｒ」はネガティブコントロールとして使用される、スクランブルドペプチド（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ）である。ペプチドのシーケンスは図７に示される。
【００７６】
先に記述されたように（Ｗｈｉｔｅｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）して、ペプチドおよび可溶性ＣＤ１４８は清浄化された。使用された抗体は抗ＣＤ１４８（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）および抗−β−チューブリン（ｃｌｏｎｅ  ＴＵＢ２．１，Ｓｉｇｍａ）、ファロイジン５６８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ）だった。
【００７７】
細胞培養
この研究の中で使用された細胞はすべて、３７℃、１０％ＣＯ２で、１０％のＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１％の非必須アミノ酸、１ｍＭナトリウム・ピルベートおよび５μＭβ−メルカプトエタノールでサプリメントされたＤＭＥＭ（ＰＡＡ）（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の中で成長された。Ｒｅｙｎｏｌｄｓら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ８：２７−３４，２００２）に述べられているようにして、主要なネズミ科の肺ＥＣは分離され維持された。ＨＵＶＥＣ（ＨＰＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は成長され、上記のように内皮増殖培地（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＨＰＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））の中で維持された。
【００７８】
シンデカン−２発現細胞株の生成：
完全なネズミ科のシンデカン−２  ｃＤＮＡ、およびシンデカン−２  エクトドメイン暗号配列だけをコードするｃＤＮＡの遺伝子合成は、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって行なわれた。ＨＡエピトープがＤ２７とＫ２８の間に挿入されるように、全長およびトランケートされたシンデカン−２  ｃＤＮＡが変異させられた。ＢａｍＨＩ部位も２つの合成遺伝子の５’および３’に組込まれた。ｃＤＮＡは、レンチウイルスベクターｐＬＮＴ−ＳＦＦＶ−ＭＣＳ−ＥＧＦＰ（Ｔ．Ｒ  Ｍｃｋａｙ，Ｓｔ  Ｇｅｏｒｇｅｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ，Ｌｏｎｄｏｎにより提供された）のＢａｍＨＩ部位へクローンされた。レンチウイルスはＨＥＫ２９３ｔ細胞の中で生産され、従来の手続きを使用して、ＶＳＶＧコートへパッケージされた。ＨＥＫ２９３ｔ細胞は上澄み転写法（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｍｅｔｈｏｄ）を使用してトランスフェクトされた。ハイ・レベルのｅＧＦＰを発現する細胞が、流動細胞計測法によってソートされ、これらは記述されたようにして、ＤＭＥＭ内で培養された。
【００７９】
Ｍａｔｒｉｇｅｌプラグ分析：
オスのＣ５７ＢＬ／６ハツカネズミ（６週齢）は、１００ナノグラム／ｍｌのＶＥＧＦ、１００ナノグラム／ｍｌのＦＧＦ、ヘパリンの２０Ｕ／ｍｌ、およびＧＳＴまたはＳ２ＥＤのいずれかの０．５μＭを含むＰＢＳの１００μｌと混合されたＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の６００μｌから成る皮膚下の腹部の注射剤を投与された（Ｐａｓｓａｎｉｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ６７：５１９−５２８，１９９２に述べられていた方法に従う）。３日後にハツカネズミを殺し、プラグを除去し、写真を撮り、ＰＢＳ中で一晩インキュベートした。ヘモグロビンはメーカーによって記述されるようにして、Ｄｒａｂｋｉｎ試薬（Ｓｉｇｍａ）を使用して定量された。実験はすべて動物の保護のための英国の法律の下で行なわれた。また、麻酔を伴うすべての生体内の手続きの終わりに、動物は英国ホームオフィスの規定に従う頸椎脱臼によって人道的に殺された。削除されたプラグは液体窒素中で冷凍され、続いて氷冷ＯＣＴ内に置かれ、１５μｍのセクションが−２０℃で低温保持装置を使用して作られた。５分間の４％ＰＦＡでの固着に続き、１５分間、１０％のＮｏｒｍａｌ  Ｇｏａｔ  Ｓｅｒｕｍでブロッキングし、セクションは核（ＤＲＡＱ５）およびＥＣマーカーＣＤ３１について一晩染色された。イメージは、ＰＡＳＣＡＬレーザー走査共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、１０ｘ倍）を使用して撮られた。定量化はＩＭＡＲＩＳソフトウェアおよびＰｈｏｔｏｓｈｏｐ（アドビ）を使用して行なわれた、ＥＣはＣＤ３１染色された核の共−局在化（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）によって同定された。
【００８０】
大動脈輪分析：
１８０−２００ｇの頸椎脱臼されたオスのｗｉｓｔａｒネズミ（ＨａｒｌａｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）または６週齢のＣ５７ＢＬ／６ハツカネズミ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）の頚部から切り分けられた胸大動脈は、０．５ｍｍのセクションにスライスされ、３７℃で血清を含まないＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で一晩インキュベートされた。大動脈輪は４８のウェルプレート中で、ＧＳＴ、シンデカン−２突然変異蛋白質または腹膜滲出液を含む、Ｅ４メディア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中のタイプＩコラーゲン（１ｍｇ／ｍｌ）に埋め込まれた。ウェルは、１％のＦＢＳおよび１０ナノグラム／ｍｌのＶＥＧＦ（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，ネズミの輪に対して３０ｎｇ／ｍｌ）を備えたＯｐｔｉＭＥＭでサプリメントされ、３７℃、１０％のＣＯ２でインキュベートされた。ネズミとマウスの大動脈からの脈管原性芽は、（Ｎｉｃｏｓｉａ  ａｎｄ  Ｏｔｔｉｎｅｔｔｉ（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ６３：１１５−１２２，１９９０）の方法、およびＤｅ  Ｒｏｓｓｉらの改良法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｙｄｒｏｍｅｓ  ＆  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４，２０１３）に基づいて、それぞれ４日後と８日後に数えられた。
【００８１】
生体外の細管形成分析：
ＨＵＶＥＣおよび人間の皮膚の繊維芽細胞は、Ｃｅｌｌ  Ｗｏｒｋｓ  Ｖ２ａ  キット（メーカーによって記述されるようなＣａｌｔａｇ  Ｍｅｄｉａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して共培養された。コントロール化合物、ＧＳＴまたはＳ２ＥＤを含むミディアムは１日おきに変えられ、１４日目に、ＥＣがＣＤ３１について染色され、チューブ形成を評価した。画像診断はオリンパスＩＸ８１倒立顕微鏡（１０ｘ倍）を使用して行われ、チューブ長さおよび分岐点をＰｈｏｔｏｓｈｏｐ（アドビ）を使用して定量した。分岐点は２つ以上の細管が交わる点として定義される。また、細管長さは分岐点間の細管の長さである。第２のタイプの細管形成分析では、ｓＥＮＤ細胞（５ｘ１０４）を、ＧＳＴまたはＳ２ＥＤのいずれかが存在する状態でＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の１５０μｌでコーティングされた２４ウェルプレートへシードされた。Ｃｅｌｌ−ＩＱ人工気候室（ＣＭＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、プレートは３７℃、１０％のＣＯ２でインキュベートされた。イメージは１５分ごとに１６時間、撮られた。
【００８２】
掻創移動分析（Ｓｃｒａｔｃｈ  ｗｏｕｎｄ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ）：
掻創移動分析はＥＣのコンフリューエントな単層上で行なわれた。傷はピペットチップを使用して作られた。また、融合蛋白質はミディアムに加えられた。イメージはオリンパスＩＸ８１顕微鏡を使用して、タイムラスプ顕微鏡検査によって３０分ごとに１２時間撮られた。創傷閉鎖パーセンテージが計算され、個々の細胞はイメージＪを使用して追跡された。
【００８３】
侵入分析：
コラーゲンおよびＭａｔｒｉｇｅｌマトリックスを通る侵入分析は、トランスウエル挿入物（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；  ８μｍ細孔径、ポリエステル（ＰＥＴ）薄膜）を備えた２４−ウエルプレートの中で行なわれた。薄膜は０．５μＭ  ＧＳＴまたはＳ２ＥＤを含むコラーゲン・タイプＩ混合物（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；  Ｅ４ミディアム中の１ｍｇ／ｍｌ）の１０μｌでコーティングされた。ｓＥＮＤ細胞は、ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳの２００μｌの中、５，０００個細胞／挿入物の均質の単個細胞浮遊液の中でゲル上にシードされた；１ｍｌの同じミディアムがボトムウエルに加えられた。侵入が６時間後に測定され、その後綿球でゲルが除去され、フィルターはＰＢＳで洗われ、カルセイン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色され、フィルタに付着した細胞の数が数えられた。
【００８４】
増殖：
細胞増殖は、メーカー（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって記述されるようにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｃｅｌｌ増殖分析キットを使用して測定された。
ＣＤ１４８プルダウンおよびウェスタンブロット：コンフリューエントなｂＥＮＤ３．１細胞は、ＨＡＬＴプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤（Ｐｉｅｒｃｅ）を含むＴＢＳ中の１％トリトン  Ｘ１００で溶解された。ＧＳＴとＳ２ＥＤはグルタチオン−セファロース・ビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に結び付けられ、細胞溶解物に加えられ、１時間インキュベートされた。ビーズは遠心分離によって分離され、ＴＢＳの中で２度洗われ、Ｌａｅｍｍｌｉバッファー中でインキュベートされ、標準手順を使用してウェスタンブロットにより分析された。
【００８５】
ドットブロット法：
サンプルは、ブロッティングバッファー（５０ｍＭ酢酸ナトリウムでｐＨ  ４．５でバッファーされた０．１５ＭのＮａＣｌ、および０．１％のトリトンＸ−１００）で薄められ、真空下でカチオンナイロン薄膜（ＧＥ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｈｙｂｏｎｄ（登録商標）−Ｎ＋）に適用された。薄膜はブロッティングバッファーで３回洗われ、ブロッティングバッファー（３％のミルク、０．５％のＢＳＡ、１０ｍＭ  ＴＲＩＳ中の０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ  ７．４）中で１時間ブロックされ、ブロッティングバッファー・プラス０．３％のトゥイーン−２０中で、主要な抗体と一晩インキュベートされた。洗浄の後、ブロットは適切なＨＲＰと結合した第２の抗体で２時間でインキュベートされた。また、信号はケミ−ルミネセンス使用する従来の手続きによって検知された。信号の強度の定量化はＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して行なわれた。
【００８６】
活性インテグリン用のＦＡＣＳおよびイムノ−蛍光染色：
コンフリューエントなｂＥＮＤ３．１細胞はトリプシン処理された。また、ＢＳＡによりトリプシンが不活性化された。細胞は前記の処理剤（０．５μＭ  ＧＳＴまたはＳ２ＥＤ）を含むＨａｎｋ’ｓ緩衝剤（カルシウムとマグネシウムのない）の中で再懸濁され、３７℃で３０分間インキュベートされた。その後、細胞は２％のＰＦＡ中で固着され、合計および活性なβ１インテグリンについてＦＡＣＳ分析され、活性なβ１を発現する細胞のパーセンテージが計算された。活性なβ１インテグリンのイムノ−蛍光染色のために、ｓＥＮＤ細胞のコンフリューエントな単層を顕微鏡スライドガラスの上で成長させた。また、掻創が行なわれ、０．５μＭ  ＧＳＴまたはＳ２ＥＤのいずれかが加えられた。３０分後、細胞が４％のパラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）で固着され、ＰＢＳ中の０．１％のトリトンＸ１００（Ｓｉｇｍａ）中で透過性にされた。サンプルは、４℃で、ＰＢＳ中の１％の正常なヤギ血清中の活性なβ１インテグリン特異抗体９ＥＧ７で一晩インキュベートされた。スライドはＰＢＳ中で洗われ、抗ウサギＩｇＧ  ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ  ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）およびＤＡＰＩ中でインキュベートされた。イメージはオリンパスＩＸ８１倒立顕微鏡上で撮られた。結果として生ずるイメージからの蛍光強度プロフィールはＩＭＡＧＥＪを使用して計算された。より高い解像度のイメージのために、細胞は、６３ｘ倍のＰＡＳＣＡＬレーザー走査共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を使用してイメージが撮られた。結果として生ずるスタックはＩＭＡＲＩＳソフトウェアを使用して処理された。０．１％のゼラチンの中のフィブロネクチン（１０μｇ／ｍｌ）およびコラーゲンＩ（３０μｇ／ｍ）でコーティングされたカバーガラス上にＨＵＶＥＣＳがシードされた。一度約６０％のコンフリューエントにされ、細胞はＳＦ  ＯｐｔｉＭＥＭで洗われ、次いで、０．５μＭ  ＧＳＴまたはＳ２ＥＤのいずれかが存在する状態で、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２有り、またはＭｎＣｌ２なしで処理した。その後、細胞は２％のＰＦＡ中で固着され、モノクローナル活性β１インテグリン特異抗体（ｃｌｏｎｅ  ＨＵＴＳ４，ｄｉｌ．１：３００）を使用して染色された。洗浄の後、細胞は、ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ  ５９４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）に結合された抗マウスＩｇＧで染色された。細胞は上に記述されるようにして、共焦点顕微鏡検査によって分析された。
【００８７】
５．  ＱＭ１０７（ＨＳ２ｐｅｐ）は、マウス大動脈輪モデル中の脈管原性の芽形成を阻害する。
方法論：既述
結果：図９では、我々は、血管形成のネズミ科の大動脈輪モデルを使用して、ＱＭ１０７（ペプチドａｋａ  ＨＳ２ｐｅｐの開発名）の０．５μＭが存在する状態で脈管原性の芽形成が阻害されることを示す。ペプチドはミディアムに加えられた。また、芽は培養後７日目に数えられた。データは、少なくとも１５の輪の平均を示し、エラーバーはＳＥＭを表わす。有意性は非ペアスチューデントｔテスト（ｐ＊＊＊＜０．００１）に基づいて示される。
【００８８】
６：  ＱＭ１０７（ＨＳ２ｐｅｐ）は、脈絡膜の外植片モデル中の脈管原性の芽形成を阻害する。
方法論：１８日齢のＣ５７ＢＬ６ハツカネズミが頸椎脱臼によって殺され、目が摘出された。虹彩の１ｍｍ下を切開し、虹彩、角膜レンズおよび網膜を取り出した。その後、脈絡膜は平らにされ、除去され、１ｍｍの片に切断され、血清を含まないＯｐｔｉＭＥＭ  ｏ／ｎ中で、３７℃でインキュベーションされた。その後、脈絡膜の外植片は、スクランブルドまたは実験のペプチドを含み、１０ナノグラム／ｍｌのネズミ科のＶＥＧＦＡを含むＯｐｔｉＭＥＭでサプリメントされたコラーゲンＩマトリックスに埋め込まれてた。脈管原性の芽は７日後に数えられた。
【００８９】
結果：
脈絡膜は網膜色素上皮の下の血管床で、外部の網膜に酸素と栄養素を供給する。脈絡膜は、容易にネズミ科の目から分離することができる、また、適切なメディアに置かれた時、培養器での４−６日後に新芽形成が生じて定量することができる。この分析は脈絡膜血管新生を、ウェットの加齢黄斑変性での中心視力喪失の原因として要約した。図１０は０．１μＭから１μＭまで及ぶ投与量で、このモデル中での脈管原性の芽の形成を阻害することを示す。データは、合計８匹の動物からの少なくとも６つの膜状の外植片での芽の平均の数である。エラーバーはＳＥＭを表わす。また、有意性がスチューデントｔテストｐ＜０．０５を使用して計算された。
【００９０】
７：  ＱＭ１０７（ＨＳ２ｐｅｐ）は脈絡膜の新血管化を生体内で阻害する。
方法論：０日目（２７／７）：６週齢のＣ５７ＢＬハツカネズミは０日と３日に麻酔をかけられ、レーザー熱傷を両眼に適用した。３日目においては、４μＭ  ＱＭ１０７（ｈＳ２ｐｅｐ）、ＰＢＳまたは４μＭのスクランブルドコントロールの１μｌが、動物の両眼に注射された。７日目に、レーザー病変に応じた脈絡膜血管新生が、螢光眼底血管造影法によって観察された。その後、脈絡膜の血管新生のエリアはＩＭＡＧＥＪを使用して、イメージ分析によって計算された。
【００９１】
結果：
ＱＭ１０７（ｈＳ２ｐｅｐ）は脈絡膜血管新生の生体内のモデルの中で効能を示す。上に記述されるようにしてＣ５７ＢＬハツカネズミは処理された。図１１から、ＰＢＳまたはスクランブルドコントロールで処理された動物と比較して、レーザー損傷の７日後において、ＱＭ１０７の１μＭで処理されたハツカネズミは、約３０％少ない脈絡膜血管新生が生じることが明らかである。Ｎ＝１０で、スチューデントｔテストを使用して、各条件において有意性について計算された。
【００９２】
８：  ＱＭ１０７（ｈｓ２ｐｅｐ）は、ｍａｔｒｉｇｅｌプラグ分析で血管形成を阻害する：
方法論：既述
結果：図１２に示されるように、スクランブルドペプチド・コントロールまたはＰＢＳと比較して、５０μＭ  ＱＭ１０７が組込まれる場合、Ｃ５７ＢＬ６ハツカネズミのひ腹の中の皮膚下に注射されたＭａｔｒｉｇｅｌプラグのヘモグロビン含有率は、大幅に低減される。データは１匹の動物当たり２つのプラグからで、２つの測定の平均である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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