(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆａｍｉｌｙ Ｃ ｇｒｏｕｐ ５ ｍｅｍｂｅｒ Ｃ：Ｇタンパク質共役受容体、ファミリーＣ、グループ５、メンバーＣ）を測定することを特徴とする、被検者が膵臓癌に罹患している可能性を試験する方法。
【請求項２】
被検者から採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃの濃度を測定する測定工程；
前記測定工程で測定したＧＰＲＣ５Ｃ濃度が、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度よりも高い場合には該被検者は膵臓癌に罹患している可能性が高いことを示し、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度と同じか又は低い場合には該被検者は膵臓癌に罹患している可能性は低いことを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記測定工程において、前記検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃの濃度の測定が、検体より単離されたエクソソームを用いて行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記測定工程が免疫学的測定法によって行われる、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記免疫学的測定法が、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片を用いて行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記免疫学的測定法が、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片、及びエクソソームに特異的に発現する抗原（以下、エクソソーム特異的抗原という）に結合する抗体又は該抗体断片を用いて行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記エクソソーム特異的抗原が、ＣＤ６３、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ８２、ＣＤ１３、ＣＤ１１、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ−１（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１：細胞間接着分子−１）、Ｒａｂ５、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ、又はＬＡＭＰ１（ｌｙｓｏｓｏｍｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １：リソソーム膜タンパク質１）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記検体が、血液である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
膵臓疾患患者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆａｍｉｌｙ Ｃ ｇｒｏｕｐ ５ ｍｅｍｂｅｒ Ｃ：Ｇタンパク質共役受容体、ファミリーＣ、グループ５、メンバーＣ）を測定することを特徴とする、膵臓疾患患者において、膵臓癌と膵臓癌以外の膵臓疾患とを鑑別するための方法。
【請求項１０】
膵臓疾患患者から採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃの濃度を測定する測定工程を含み 
前記測定工程で測定したＧＰＲＣ５Ｃ濃度が、膵臓癌以外の膵臓疾患患者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度よりも高い場合には該被検者は膵臓癌に罹患している可能性が高いことを示し、膵臓癌以外の膵臓疾患患者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度と同じか又は低い場合には該被検者は膵臓癌以外の膵臓疾患に罹患している可能性が高いことを示す、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記測定工程において、前記検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃの濃度の測定が、検体より単離されたエクソソームを用いて行われる、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記測定工程が免疫学的測定法によって行われる、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記免疫学的測定法が、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片を用いて行われる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記免疫学的測定法が、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片、及び、エクソソームに特異的に発現する抗原（以下、エクソソーム特異的抗原という）に結合する抗体又は該抗体断片を用いて行われる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記エクソソーム特異的抗原が、ＣＤ６３、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ８２、ＣＤ１３、ＣＤ１１、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ−１（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１：細胞間接着分子−１）、Ｒａｂ５、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ、又はＬＡＭＰ１（ｌｙｓｏｓｏｍｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １：リソソーム膜タンパク質１）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記膵臓癌以外の膵臓疾患が、膵炎である、請求項９〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記検体が、血液である、請求項９〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
被検者より経時的に採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆａｍｉｌｙ Ｃ ｇｒｏｕｐ ５ ｍｅｍｂｅｒ Ｃ：Ｇタンパク質共役受容体、ファミリーＣ、グループ５、メンバーＣ）を測定することを特徴とする、被検者が膵臓癌に罹患している可能性をモニタリングする方法。
【請求項１９】
被検者から経時的に採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃの濃度を測定する測定工程を含み 
前記測定工程で測定したＧＰＲＣ５Ｃ濃度が、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度よりも高い濃度で維持されている場合には該被検者は膵臓癌に罹患している可能性が高いことを示し、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度と同じか又は低い濃度で維持されている場合には該被検者は膵臓癌に罹患している可能性は低いことを示す、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記測定工程において、前記検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃの濃度の測定が、検体より単離されたエクソソームを用いて行われる、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記測定工程が免疫学的測定法によって行われる、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記免疫学的測定法が、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片を用いて行われる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記免疫学的測定法が、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片、及びエクソソームに特異的に発現する抗原（以下、エクソソーム特異的抗原という）に結合する抗体又は該抗体断片を用いて行われる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記エクソソーム特異的抗原が、ＣＤ６３、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ８２、ＣＤ１３、ＣＤ１１、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ−１（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１：細胞間接着分子−１）、Ｒａｂ５、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ、又はＬＡＭＰ１（ｌｙｓｏｓｏｍｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １：リソソーム膜タンパク質１）である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記検体が、血液である、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
被検者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆａｍｉｌｙ Ｃ ｇｒｏｕｐ ５ ｍｅｍｂｅｒ Ｃ：Ｇタンパク質共役受容体、ファミリーＣ、グループ５、メンバーＣ）測定試薬を含むことを特徴とする、被検者が膵臓癌に罹患している可能性を試験するための試薬。
【請求項２７】
前記ＧＰＲＣ５Ｃ測定試薬が、免疫学的測定試薬である、請求項２６に記載の試薬。
【請求項２８】
前記免疫学的測定試薬が、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片を含む、請求項２７に記載の試薬。
【請求項２９】
前記免疫学的測定試薬が、さらに、エクソソームに特異的に発現する抗原（以下、エクソソーム特異的抗原という）に結合する抗体又は該抗体断片を含む、請求項２８に記載の試薬。
【請求項３０】
前記エクソソーム特異的抗原が、ＣＤ６３、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ８２、ＣＤ１３、ＣＤ１１、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ−１（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１：細胞間接着分子−１）、Ｒａｂ５、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ、又はＬＡＭＰ１（ｌｙｓｏｓｏｍｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １：リソソーム膜タンパク質１）である、請求項２９に記載の試薬。
【請求項３１】
さらに、エクソソーム単離試薬を含む、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項３２】
前記検体が、血液である、請求項２６〜３１のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項３３】
膵臓疾患患者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆａｍｉｌｙ Ｃ ｇｒｏｕｐ ５ ｍｅｍｂｅｒ Ｃ：Ｇタンパク質共役受容体、ファミリーＣ、グループ５、メンバーＣ）測定試薬を含むことを特徴とする、膵臓癌患者と膵臓癌以外の膵臓疾患患者とを鑑別するための試薬。
【請求項３４】
前記ＧＰＲＣ５Ｃ測定試薬が、免疫学的測定試薬である、請求項３３に記載の試薬。 
【請求項３５】
前記免疫学的測定試薬が、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片を含む、請求項３４に記載の試薬。
【請求項３６】
前記免疫学的測定試薬が、さらに、エクソソームに特異的に発現する抗原（以下、エクソソーム特異的抗原という）に結合する抗体又は該抗体断片を含む、請求項３５に記載の試薬。
【請求項３７】
前記エクソソーム特異的抗原が、ＣＤ６３、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ８２、ＣＤ１３、ＣＤ１１、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ−１（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１：細胞間接着分子−１）、Ｒａｂ５、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ、又はＬＡＭＰ１（ｌｙｓｏｓｏｍｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １：リソソーム膜タンパク質１）である、請求項３６に記載の試薬。
【請求項３８】
さらに、エクソソーム単離試薬を含む、請求項３３〜３７のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項３９】
前記膵臓癌以外の膵臓疾患が、膵炎である、請求項３３〜３８のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項４０】
前記検体が、血液である、請求項３３〜３９のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項４１】
被検者より経時的に採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆａｍｉｌｙ Ｃ ｇｒｏｕｐ ５ ｍｅｍｂｅｒ Ｃ：Ｇタンパク質共役受容体、ファミリーＣ、グループ５、メンバーＣ）測定試薬を含むことを特徴とする、被検者が膵臓癌に罹患している可能性をモニタリングするための試薬。
【請求項４２】
前記ＧＰＲＣ５Ｃ測定試薬が、免疫学的測定試薬である、請求項４１に記載の試薬。
【請求項４３】
前記免疫学的測定試薬が、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片を含む、請求項４２に記載の試薬。
【請求項４４】
前記免疫学的測定試薬が、さらに、エクソソームに特異的に発現する抗原（以下、エクソソーム特異的抗原という）に結合する抗体又は該抗体断片を含む、請求項４３に記載の試薬。
【請求項４５】
前記エクソソーム特異的抗原が、ＣＤ６３、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ８２、ＣＤ１３、ＣＤ１１、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ−１（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１：細胞間接着分子−１）、Ｒａｂ５、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ、又はＬＡＭＰ１（ｌｙｓｏｓｏｍｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １：リソソーム膜タンパク質１）である、請求項４４に記載の試薬。
【請求項４６】
さらに、エクソソーム単離試薬を含む、請求項４１〜４５のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項４７】
前記検体が、血液である、請求項４１〜４６のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項４８】
ＧＰＲＣ５Ｃ（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆａｍｉｌｙＣ ｇｒｏｕｐ ５ ｍｅｍｂｅｒ Ｃ：Ｇタンパク質共役受容体、ファミリーＣ、グループ５、メンバーＣ）又はＧＰＲＣ５Ｃ遺伝子からなることを特徴とする、膵臓癌マーカー。
【請求項４９】
ＧＰＲＣ５Ｃ（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆａｍｉｌｙＣ ｇｒｏｕｐ ５ ｍｅｍｂｅｒ Ｃ：Ｇタンパク質共役受容体、ファミリーＣ、グループ５、メンバーＣ）に対する特異的結合物質、ＧＰＲＣ５Ｃ遺伝子を増幅可能なプライマーセット、又はＧＰＲＣ５Ｃ遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブを含むことを特徴とする、膵臓癌診断薬。
【請求項５０】
前記ＧＰＲＣ５Ｃに対する特異的結合物質が、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片である、請求項４９記載の診断薬。
【請求項５１】
生体試料中のＧＰＲＣ５Ｃ（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｆａｍｉｌｙ Ｃ ｇｒｏｕｐ ５ ｍｅｍｂｅｒ Ｃ：Ｇタンパク質共役受容体、ファミリーＣ、グループ５、メンバーＣ）の存在量を測定する工程と、
測定されたＧＰＲＣ５Ｃの存在量が、健常者又は膵臓癌以外の膵臓疾患患者の生体試料中のＧＰＲＣ５Ｃタンパク質の存在量と比較して多い場合に、前記生体試料は膵臓癌患者のものであると判定する工程と、
を含むことを特徴とする、生体試料の判定方法。
【請求項５２】
生体試料中のＧＰＲＣ５Ｃ（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｆａｍｉｌｙ Ｃ ｇｒｏｕｐ ５ ｍｅｍｂｅｒ Ｃ：Ｇタンパク質共役受容体、ファミリーＣ、グループ５、メンバーＣ）遺伝子の発現量を測定する工程と、
測定された前記遺伝子の発現量が、健常者又は膵臓癌以外の膵臓疾患患者の生体試料中のＧＰＲＣ５Ｃ遺伝子の発現量と比較して多い場合に、前記生体試料は膵臓癌患者のものであると判定する工程と、
を含むことを特徴とする、生体試料の判定方法。
【請求項５３】
前記膵臓癌以外の膵臓疾患が、膵炎である、請求項５１又は５２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検者が膵臓癌に罹患している可能性を試験する方法、膵臓癌と膵臓癌以外の膵臓疾患とを鑑別する方法、被検者が膵臓癌に罹患している可能性をモニタリングする方法、被検者が膵臓癌に罹患している可能性を試験するための試薬、膵臓癌と膵臓癌以外の膵臓疾患とを鑑別するための試薬、被検者が膵臓癌に罹患している可能性をモニタリングするための試薬、膵臓癌マーカー、膵臓癌診断薬、及び生体試料の判定方法に関する。
本願は、２０１７年１月１２日に、日本に出願された特願２０１７−００３７０９号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
エクソソームは、生体内の体液中に存在する小胞顆粒である。エクソソーム表面には、一般的な細胞表面と同様に、種々の膜タンパク質が存在することが知られている。また、エクソソームは、種々の細胞、例えば免疫系の細胞や各種がん細胞から分泌されることが報告されており、生体内の細胞間コミュニケーションの媒介役として機能し生理現象と関連することや、がんなどの疾患との関連性が注目されている。【０００３】
近年、エクソソーム表面に特定抗原（ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ１４７）を発現するエクソソーム量を測定することによる大腸がんの検出方法（特許文献１）、卵巣がん患者において、がんの進行に伴い血液中のエクソソーム量が増大すること（非特許文献１）等が報告されている。【０００４】
また、エクソソームが有する成分の測定方法としては、エクソソームが有する第１抗原と特異的に結合する第１抗体、及び、エクソソームが有する第２抗原と特異的に結合する第２抗体を用いる免疫測定方法が知られている（特許文献２）。
ＧＰＲＣ５Ｃ（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆａｍｉｌｙＣ ｇｒｏｕｐ ５ ｍｅｍｂｅｒ Ｃ：Ｇタンパク質共役受容体、ファミリーＣ、グループ５、メンバーＣ）は、７回膜貫通型のＧタンパク質共役受容体で、副腎、甲状腺、膵臓等の内分泌系で高発現しており、内分泌系疾患の診断に利用され得ることが報告されている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１４／１６７９６９号
【特許文献２】国際公開第２０１３／０９４３０７号
【特許文献３】国際公開第２００５／１０１００１号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Taylor., et al., Gynecologic  Oncol, 100(2008)  pp13-21
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、被検者が膵臓癌に罹患している可能性を試験するための方法及び試薬、膵臓癌と膵臓癌以外の膵臓疾患とを鑑別するための方法及び試薬、被検者が膵臓癌に罹患している可能性をモニタリングするための方法及び試薬、膵臓癌マーカー、膵臓癌診断薬、並びに生体試料の判定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、被検者より採取した検体中の、ＧＰＲＣ５Ｃ、特にエクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃを測定することにより、被検者が膵臓癌に罹患している可能性を判定でき、さらに膵臓癌患者と膵臓癌以外の膵臓疾患患者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃを測定することにより、膵臓癌と膵臓癌以外の膵臓疾患とを鑑別でき、さらに、被検者が膵臓癌に罹患している可能性をモニタリングすることができることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、以下の［１］〜［５３］に関する。【０００９】
［１］被検者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃを測定することを特徴とする、被検者が膵臓癌に罹患している可能性を試験する方法。
［２］以下の工程を含むことを特徴とする、［１］に記載の方法。
（１）被検者より検体を採取する工程；
（２）工程（１）で採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃの濃度を測定する工程；
（３）工程（２）で測定したＧＰＲＣ５Ｃ濃度が、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度よりも高い場合には該被検者は膵臓癌に罹患している可能性が高いと判定し、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度と同じか又は低い場合には該被検者は膵臓癌に罹患している可能性は低いと判定する工程
［３］前記工程（２）において、前記工程（１）で採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃの濃度の測定が、検体より単離されたエクソソームを用いて行われる、［２］に記載の方法。
［４］前記工程（２）が免疫学的測定法によって行われる、［２］又は［３］に記載の方法。
［５］前記免疫学的測定法が、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片を用いて行われる、［４］に記載の方法。
［６］前記免疫学的測定法が、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片、及びエクソソームに特異的に発現する抗原（以下、エクソソーム特異的抗原という）に結合する抗体又は該抗体断片を用いて行われる、［４］に記載の方法。
［７］前記エクソソーム特異的抗原が、ＣＤ６３、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ８２、ＣＤ１３、ＣＤ１１、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ−１（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１：細胞間接着分子−１）、Ｒａｂ５、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ、又はＬＡＭＰ１（ｌｙｓｏｓｏｍｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １：リソソーム膜タンパク質１）である、［６］に記載の方法。
［８］前記検体が、血液である、［１］〜［７］のいずれか一つに記載の方法。【００１０】
［９］膵臓疾患患者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃを測定することを特徴とする、膵臓疾患患者において、膵臓癌と膵臓癌以外の膵臓疾患とを鑑別する方法。
［１０］以下の工程を含むことを特徴とする、［９］に記載の方法。
（１）膵臓疾患患者より検体を採取する工程；
（２）工程（１）で採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃの濃度を測定する工程；
（３）工程（２）で測定したＧＰＲＣ５Ｃ濃度が、膵臓癌以外の膵臓疾患患者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度よりも高い場合には該被検者は膵臓癌に罹患している可能性が高いと判定し、膵臓癌以外の膵臓疾患患者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度と同じか又は低い場合には該被検者は膵臓癌以外の膵臓疾患に罹患している可能性が高いと判定する工程
［１１］前記工程（２）において、前記工程（１）で採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃの濃度の測定が、検体より単離されたエクソソームを用いて行われる、［１０］記載の方法。
［１２］前記工程（２）が免疫学的測定法によって行われる、［１０］又は［１１］に記載の方法。
［１３］前記免疫学的測定法が、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片を用いて行われる、［１２］に記載の方法。
［１４］前記免疫学的測定法が、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片、及び、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片を用いて行われる、［１２］に記載の方法。
［１５］前記エクソソーム特異的抗原が、ＣＤ６３、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ８２、ＣＤ１３、ＣＤ１１、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ−１、Ｒａｂ５、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ、又はＬＡＭＰ１である、［１４］に記載の方法。
［１６］前記膵臓癌以外の膵臓疾患が、膵炎である、［９］〜［１５］のいずれか一つに記載の方法。
［１７］前記検体が、血液である、［９］〜［１６］のいずれか一つに記載の方法。【００１１】
［１８］被検者より経時的に採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃを測定することを特徴とする、被検者が膵臓癌に罹患している可能性をモニタリングする方法。
［１９］以下の工程を含むことを特徴とする、［１８］に記載の方法。
（１）被検者より経時的に検体を採取する工程；
（２）工程（１）で採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃの濃度を測定する工程；
（３）工程（２）で測定したＧＰＲＣ５Ｃ濃度が、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度よりも高い濃度で維持されている場合には該被検者は膵臓癌に罹患している可能性が高いと判定し、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度と同じか又は低い濃度で維持されている場合には該被検者は膵臓癌に罹患している可能性は低いと判定する工程。
［２０］前記工程（２）において、前記工程（１）で採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃの濃度の測定が、検体より単離されたエクソソームを用いて行われる、［１９］記載の方法。
［２１］前記工程（２）が免疫学的測定法によって行われる、［１９］又は［２０］に記載の方法。
［２２］前記免疫学的測定法が、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片を用いて行われる、［２１］に記載の方法。
［２３］前記免疫学的測定法が、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片、及びエクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片を用いて行われる、［２１］に記載の方法。
［２４］前記エクソソーム特異的抗原が、ＣＤ６３、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ８２、ＣＤ１３、ＣＤ１１、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ−１、Ｒａｂ５、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ、又はＬＡＭＰ１である、［２３］に記載の方法。
［２５］前記検体が、血液である、［１８］〜［２４］のいずれか一つに記載の方法。【００１２】
［２６］被検者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ測定試薬を含むことを特徴とする、被検者が膵臓癌に罹患している可能性を試験するための試薬。
［２７］前記ＧＰＲＣ５Ｃ測定試薬が、免疫学的測定試薬である、［２６］に記載の試薬。
［２８］前記免疫学的測定試薬が、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片を含む、［２７］に記載の試薬。
［２９］前記免疫学的測定試薬が、さらに、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片を含む、［２８］に記載の試薬。
［３０］前記エクソソーム特異的抗原が、ＣＤ６３、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ８２、ＣＤ１３、ＣＤ１１、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ−１、Ｒａｂ５、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ、又はＬＡＭＰ１である、［２９］に記載の試薬。
［３１］さらに、エクソソーム単離試薬を含む、［２６］〜［３０］のいずれか一つに記載の試薬。
［３２］前記検体が、血液である、［２６］〜［３１］のいずれか一つに記載の試薬。【００１３】
［３３］被検者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ測定試薬を含むことを特徴とする、膵臓癌患者と膵臓癌以外の膵臓疾患患者とを鑑別するための試薬。
［３４］前記ＧＰＲＣ５Ｃ測定試薬が、免疫学的測定試薬である、［３３］に記載の試薬。
［３５］前記免疫学的測定試薬が、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片を含む、［３４］に記載の試薬。
［３６］前記免疫学的測定試薬が、さらに、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片を含む、［３５］に記載の試薬。
［３７］前記エクソソーム特異的抗原が、ＣＤ６３、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ８２、ＣＤ１３、ＣＤ１１、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ−１、Ｒａｂ５、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ、又はＬＡＭＰ１である、［３６］に記載の試薬。
［３８］さらに、エクソソーム単離試薬を含む、［３３］〜［３７］のいずれか一つに記載の試薬。
［３９］前記膵臓癌以外の膵臓疾患が、膵炎である、［３３］〜［３８］のいずれか一つに記載の試薬。
［４０］前記検体が、血液である、［３３］〜［３９］のいずれか一つに記載の試薬。【００１４】
［４１］被検者より経時的に採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ測定試薬を含むことを特徴とする、被検者が膵臓癌に罹患している可能性をモニタリングするための試薬。
［４２］前記ＧＰＲＣ５Ｃ測定試薬が、免疫学的測定試薬である、［４１］に記載の試薬。
［４３］前記免疫学的測定試薬が、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片を含む、［４２］に記載の試薬。
［４４］前記免疫学的測定試薬が、さらに、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片を含む、［４３］に記載の試薬。
［４５］前記エクソソーム特異的抗原が、ＣＤ６３、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ８２、ＣＤ１３、ＣＤ１１、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ−１、Ｒａｂ５、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ、又はＬＡＭＰ１である、［４４］に記載の試薬。
［４６］さらに、エクソソーム単離試薬を含む、［４１］〜［４５］のいずれか一つに記載の試薬。
［４７］前記検体が、血液である、［４１］〜［４６］のいずれか一つに記載の試薬。【００１５】
［４８］ＧＰＲＣ５Ｃ又はＧＰＲＣ５Ｃ遺伝子からなることを特徴とする、膵臓癌マーカー。
［４９］ＧＰＲＣ５Ｃに対する特異的結合物質、ＧＰＲＣ５Ｃ遺伝子を増幅可能なプライマーセット、又はＧＰＲＣ５Ｃ遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブを備えたことを特徴とする、膵臓癌診断薬。
［５０］前記ＧＰＲＣ５Ｃに対する特異的結合物質が、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片である、［４９］記載の診断薬。
［５１］生体試料中のＧＰＲＣ５Ｃの存在量を測定する工程と、
測定された前記タンパク質の存在量が、健常者又は膵臓癌以外の膵臓疾患患者の生体試料中のＧＰＲＣ５Ｃの存在量と比較して多い場合に、前記生体試料は膵臓癌患者のものであると判定する工程と、
を含むことを特徴とする、生体試料の判定方法。
［５２］生体試料中のＧＰＲＣ５Ｃ遺伝子の発現量を測定する工程と、
測定された前記遺伝子の発現量が、健常者又は膵臓癌以外の膵臓疾患患者の生体試料中のＧＰＲＣ５Ｃ遺伝子の発現量と比較して多い場合に、前記生体試料は膵臓癌患者のものであると判定する工程と、
を備えたことを特徴とする、生体試料の判定方法。
［５３］膵臓癌以外の膵臓疾患が、膵炎である、［５１］又は［５２］記載の方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、被検者が膵臓癌に罹患している可能性を試験するための方法及び試薬、膵臓癌と膵臓癌以外膵臓疾患とを鑑別する方法及び試薬、被検者が膵臓癌に罹患している可能性をモニタリングする方法及び試薬、膵臓癌マーカー、膵臓癌診断薬、並びに生体試料の判定方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】健常人（４検体）、膵炎患者（４検体）、膵臓癌患者（４検体）から採取された血清中のエクソソームを用いて、ウェスタンブロッティングにより、ＧＰＲＣ５Ｃ（４８ｋＤ）、及び、エクソソーム特異的抗原であるＣＤ６３を検出した結果である。
【図２】健常人（10検体）、膵炎患者（10検体）、及び膵臓癌患者（23検体）から採取した血清中のエクソソームを用いて、それぞれの血清中のエクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度を比較した結果である。縦軸は、ウェスタンブロッティングで得られたＧＰＲＣ５Ｃのシグナル及びＣＤ６３のシグナルから算出した、ＧＰＲＣ５Ｃ／ＣＤ６３のシグナル比を示す。
【図３】手術前及び手術後の膵臓癌患者（ステージIB：1検体、ステージIIB：2検体、ステージIII：2検体）から採取した血清中のエクソソームを用いて、ウェスタンブロッティングにより、ＧＰＲＣ５Ｃ（４８ｋＤ）を検出した結果である。
【図４】再発した膵臓癌患者（22検体）及び健常人（2検体）から採取した血清中のエクソソームを用いて、それぞれの血清中のエクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度を比較した結果である。縦軸は、ウェスタンブロッティングで得られたＧＰＲＣ５Ｃのシグナル及びＣＤ９のシグナルから算出した、ＧＰＲＣ５Ｃ／ＣＤ９のシグナル比を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
１．被検者が膵臓癌に罹患している可能性を試験する方法
本発明の、被検者が膵臓癌に罹患している可能性を試験する方法は、被検者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃの濃度を測定することを特徴とする方法である。
【００１９】
本発明におけるエクソソームとは、動物細胞から分泌される直径３０〜１００ｎｍの脂質二重膜で覆われた膜小胞である。
本発明における検体としては、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃが測定され得る検体であれば特に制限はなく、例えば血液、尿、唾液、乳汁、鼻汁、脳脊髄液等が挙げられ、血液が好ましい。前記血液としては、例えば、全血、血清、血漿等が挙げられ、血清が好ましい。
【００２０】
本発明において、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃとは、エクソソームに内包されているＧＰＲＣ５Ｃ、エクソソームの膜表面に存在しているＧＰＲＣ５Ｃ、エクソソームの膜を貫通しているＧＰＲＣ５Ｃ等の何れの形態のＧＰＲＣ５Ｃをも意味する。
本発明において、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度とは、単位容量あたりの量又はモル数のみならず、単位容量あたりのシグナル強度をも包含する。
【００２１】
［測定方法１］
本発明において、被検者が膵臓癌に罹患している可能性を試験する方法は、以下の工程を含む方法により行うことができる。
（１）被検者より検体を採取する工程；
（２）工程（１）で採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃの濃度を測定する工程；
（３）工程（２）で測定したＧＰＲＣ５Ｃ濃度が、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度よりも高い場合には被検者は膵臓癌に罹患している可能性が高いと判定し、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度と同じか又は低い場合には被検者は膵臓癌に罹患している可能性は低いと判定する工程。
以下、各工程について詳細に説明する。
【００２２】
＜工程（１）＞
工程（１）において、被検者より採取された検体としては、前述の検体等が挙げられる。
【００２３】
＜工程（２）＞
工程（２）は、工程（１）で採取された検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度を測定する工程である。工程（１）で採取された検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度は、例えば、免疫学的測定法によって測定することができる。免疫学的測定法としては、検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃの濃度を抗原抗体反応を用いて測定できる方法であれば如何なる方法でも用いることができ、例えば、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片を用いる方法、及び、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片と、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片とを用いる方法等が挙げられる。
【００２４】
工程（２）におけるＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体としては、ＧＰＲＣ５Ｃを測定できる抗体であれば特に制限はなく、例えば、Ａｎｔｉ−ＧＰＲＣ５Ｃ抗体−Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ（ａｂ１３７４８２）（アブカム社製）、ＧＰＲＣ５Ｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ  （Ｎ−１４）（サンタクルズ  バイオテクノロジー社製）等が挙げられる。
【００２５】
工程（２）におけるエクソソーム特異的抗原としては、例えば、ＣＤ６３、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ８２、ＣＤ１３、ＣＤ１１、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ−Ｉ、Ｒａｂ５、ＡｎｎｅｘｉｎＶ、ＬＡＭＰ１等が挙げられる。
【００２６】
エクソソーム特異的抗原に結合する抗体としては、エクソソーム特異的抗原に結合できる抗体であれば特に制限はなく、例えばＰｕｒｉｆｉｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−ＨｕｍａｎＣＤ６３（日本ベクトン・ディッキンソン社製、クローン：Ｈ５Ｃ６）、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ９（日本ベクトン・ディッキンソン社製、クローン：Ｍ−Ｌ１３）、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ８１（日本ベクトン・ディッキンソン社製、クローン：ＪＳ−８１）、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ３７（日本ベクトン・ディッキンソン社製、クローン：Ｍ−Ｂ３７１）、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ５３（日本ベクトン・ディッキンソン社製、クローン：ＨＩ２９）、Ａｎｔｉ−ＣＤ８２ ａｎｔｉｂｏｄｙ［Ｃ３３］（アブカム社製）、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ１３（日本ベクトン・ディッキンソン社製、クローン：ＷＭ１５）、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ１１ａ（日本ベクトン・ディッキンソン社製、クローン：２７／ＣＤ１１ａ）、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ１１ｂ／Ｍａｃ−１（日本ベクトン・ディッキンソン社製、クローン：ＩＣＲＦ４４）、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ１１ｃ（日本ベクトン・ディッキンソン社製、クローン：３．９）、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＭｏｕｓｅＡｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ８６（日本ベクトン・ディッキンソン社製、クローン：２３３１ (ＦＵＮ−１)）、Ａｎｔｉ−ＩＣＡＭ１ ａｎｔｉｂｏｄｙ［ＨＭ１］（アブカム社製）、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｒａｂ５（日本ベクトン・ディッキンソン社製、クローン：１／Ｒａｂ５）、Ａｎｔｉ−Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ ａｎｔｉｂｏｄｙ［ＥＰＲ３９７９］（アブカム社製）、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  Ｌａｍｐ−１（日本ベクトン・ディッキンソン社製、クローン：２５／Ｌａｍｐ−１）等が挙げられる。
【００２７】
工程（２）におけるＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体断片、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体断片としては、それぞれＧＰＲＣ５Ｃ、エクソソーム特異的抗原を測定できる抗体断片であれば特に制限はなく、例えば抗体をパパイン処理により得られるＦａｂ、ペプシン処理により得られるＦ（ａｂ’）２、ペプシン処理−還元処理により得られるＦａｂ’等のＦｃ部分が除去された抗体断片、遺伝子工学的手法によりＦｃ部分が除去された抗体断片等が挙げられる。
【００２８】
工程（２）の、検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度は、サンドイッチＥＬＩＳＡや後述のエクソスクリーン法等により測定することができる。サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の測定に用いる上記２種類の抗体のうち、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片を固相用抗体として、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片を標識用抗体として用いることができる。あるいは、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片を固相用抗体として、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片を標識用抗体として用いることもできる。固相用抗体及び標識用抗体の調製は、特に限定はなく、公知の方法に従って行うことができる。
【００２９】
エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃの測定方法は、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃを測定し得る方法であれば、如何なる方法を用いて行うことができ、例えば免疫学的測定法等の方法を用いて行うことができる。
【００３０】
具体的には、固相用抗体として、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片を用い、標識用抗体として、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片を用いる場合は、固相に固定化されたＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片に、検体中の、ＧＰＲＣ５Ｃを有するエクソソームを結合させ、次いで、標識化された、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片を添加して、固相上に、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片、エクソソーム、及び、標識化された、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片の複合体を形成させ、形成した該複合体中の該標識を測定することにより、該検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃを測定することができる。
また、固相用抗体として、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片を用い、標識用抗体として、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片を用いる場合は、固相に固定化されたエクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片に、検体中のエクソソームを結合させ、次いで、標識化された、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片を添加して、固相上に、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片、エクソソーム、及び、標識化された、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片の複合体を形成させ、形成した該複合体中の該標識を測定することにより、該検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃを測定することができる。
【００３１】
上記において、固相としては、例えば、マイクロタイタープレート、ガラス製又は合成樹脂製の粒状物（ビーズ）、ガラス製又は合成樹脂製の球状物（ボール）、ラテックス、磁性粒子、ニトロセルロース膜等の各種メンブレン、合成樹脂製の試験管等を用いることができる。標識としては、例えば酵素、蛍光物質、発光物質、放射性同位元素、ビオチン、ジゴキシゲニン、タグ配列を含むポリペプチド、金属コロイド粒子、着色ラテックス粒子等を用いることができる。
【００３２】
酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ等が挙げられる。
蛍光物質としては、例えば、フルオレッセイン  イソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、ローダミンＢ−イソチオシアナート（ＲＩＴＣ）等が挙げられる。その他の蛍光物質としては、例えば、ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔ（Ｓｃｉｅｎｃｅ, ２８１, ２０１６−２０１８,１９９８）、フィコエリスリン等のフィコビリ蛋白質、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＲＦＰ（Ｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＹＦＰ  （Ｙｅｌｌｏｗ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＢＦＰ（Ｂｌｕｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）等の蛍光を発する蛋白質が挙げられる。
発光物質としては、例えば、アクリジニウム及びその誘導体、ルテニウム錯体化合物、ロフィン等が挙げられる。ルテニウム錯体化合物としては、電子供与体と共に電気化学的に発光する、Ｃｌｉｎ.Ｃｈｅｍ.３７,９,１５３４−１５３９, １９９１に示されたものが好ましい。
放射性同位元素としては、例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、３２Ｐ、１２５Ｉ、１３１Ｉ等が挙げられる。
タグ配列を含むポリペプチドとしては、ＦＬＡＧペプチド（ＦＬＡＧタグ、Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｌｙｓ）、ポリヒスチジン（Ｈｉｓタグ、Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｈｉｓ）、ｍｙｃエピトープペプチド（ｍｙｃタグ、Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ）、ヘマグルチニンエピトープペプチド（ＨＡタグ、Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｌａ）等が挙げられる。
【００３３】
工程（２）において、検体中のエクソソームを破壊せずに、検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃの濃度を測定する場合には、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片として、上記ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片のうち、エクソソーム表面に存在するＧＰＲＣ５Ｃのエピトープに結合する抗体又は抗体断片を用いることが好ましい。
【００３４】
工程（２）における免疫学的測定法としては、前述のサンドイッチＥＬＩＳＡの他に、エクソスクリーン法が挙げられる。エクソスクリーン法 は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社が開発したＡｌｐｈａＬＩＳＡを応用したものである。本方法においては、エピトープの異なる２種類の抗体を用いて、片方の抗体にはビオチンを結合させたビオチン化抗体を、もう片方にはＡｌｐｈａＬＩＳＡアクセプタービーズを結合させた抗体を用いて解析試料と反応させる。その後、ストレプ卜アビジンが結合したドナービーズを添加することで、ビオチン化抗体とドナービーズがストレプ卜アビジンを介して結合し、アクセプタービーズとドナービーズが隣接する。２００ｎｍ以内に隣接した状態で、６８０ｎｍ励起により、ドナービーズから一重項酸素が発生し、アクセプタービーズに一重項酸素が到達すると６１５ｎｍの光を発してシグナルとして検出することができる。
【００３５】
具体的には、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片にビオチンを結合させたビオチン化抗体、及び、ＡｌｐｈａＬＩＳＡアクセプタービーズを結合させた、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は抗体断片を、検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃと反応させ、その後、ストレプ卜アビジンが結合したドナービーズを添加することで、該アクセプタービーズ、エクソソーム、及び、該ドナービーズの複合体を形成させる。該複合体のドナービーズに励起光を照射し一重項酸素を発生させ、発生した一重項酸素と該アクセプタービーズとの反応により生成する光を測定する。
また、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片にビオチンを結合させたビオチン化抗体、及びＡｌｐｈａＬＩＳＡアクセプタービーズを結合させたＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は抗体断片を、検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃと反応させ、その後、ストレプ卜アビジンが結合したドナービーズを添加することで、該アクセプタービーズ、エクソソーム、及び、該ドナービーズの複合体を形成させる。該複合体のドナービーズに励起光を照射し一重項酸素を発生させ、発生した一重項酸素と該アクセプタービーズとの反応により生成する光を測定する。
【００３６】
＜工程（３）＞
工程（３）は、工程（２）で得られた、被検者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度と、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度とを対比する工程であり、被検者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度が、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度よりも高い場合には該被検者は膵臓癌に罹患している可能性が高いと判定され、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度と同じか又は低い場合には、該被検者は膵臓癌に罹患している可能性は低いと判定される。
【００３７】
健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度は、該被検者が膵臓癌に罹患している可能性を判定するための基準値であり、複数の健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度を測定し、その統計から健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度を設定することができる。
健常者より採取した検体としては、被検者より採取した検体と同種の試料であることが好ましく、例えば、被検者より採取した検体が血液である場合、健常者より採取した検体も血液を用いることが好ましい。
被検者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度と、健常者より採取した検体中のエクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度とを対比する方法としては、特に限定はなく、公知の方法(Ｓｔｅｅｌ法、ｔ検定、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定等)を用いることができる。該解析により、被検者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度が、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度よりも高いことが示された場合は、該被検者は膵臓癌に罹患している可能性が高いと判定され、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度と同じか又は低いことが示された場合は、該被検者は膵臓癌に罹患している可能性は低いと判定される。
また、被検者が膵臓癌に罹患している可能性を判定するための基準値として、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の代わりに、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の、エクソソーム特異抗原濃度に対する割合を用いることもできる。この場合、被検者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の、エクソソーム特異抗原濃度に対する割合を、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の、エクソソーム特異抗原濃度に対する割合と比較する。エクソソーム特異抗原としては、例えば前述のエクソソーム特異抗原等が挙げられる。
【００３８】
また、前記測定方法１の工程（２）において、被検者より採取した検体より単離したエクソソームを用いて、検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度を測定することもできる。具体的には、以下の工程を含む方法が挙げられる。
［測定方法２］
（１Ａ）被検者より検体を採取する工程；
（２Ａ）工程（１Ａ）で採取した検体からエクソソームを単離する工程；
（３Ａ）工程（２Ａ）で単離したエクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度を測定する工程；
（４Ａ）工程（３Ａ）で測定したＧＰＲＣ５Ｃ濃度から、該検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度を決定する工程；
（５Ａ）工程（４Ａ）で決定したＧＰＲＣ５Ｃ濃度が、健常者から採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度よりも高い場合には該被検者は膵臓癌に罹患している可能性が高いと判定し、健常者から採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度と同じか又は低い場合には該被検者は膵臓癌に罹患している可能性は低いと判定する工程。
以下、各工程について詳細に説明する。
【００３９】
＜工程（１Ａ）＞
工程（１Ａ）において、被検者より採取された検体としては、前述の検体等が挙げられる。
【００４０】
＜工程（２Ａ）＞
工程（２Ａ）における、エクソソームを単離する方法としては、検体中のエクソソームを単離できる方法であれば特に制限はなく、例えば超遠心法（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２１，５３３（２０１５））、エクソソーム単離キットＥＸＯ−Ｐｒｅｐ（コスモバイオ社製）を用いる方法等が挙げられる。
【００４１】
＜工程（３Ａ）＞
工程（３Ａ）におけるエクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の測定方法は、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃの濃度を測定し得る方法であれば、如何なる方法を用いて行うことができ、例えば免疫学的測定法等の方法を用いて行うことができる。免疫学的測定法によるエクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の測定方法としては、以下の態様が挙げられる。
【００４２】
・態様１
ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片を用いる方法。
・態様２
ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片、及びエクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片を用いる方法。
【００４３】
ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片としては、例えば前述のＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片等が挙げられる。エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片としては、例えば、前述のエクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片等が挙げられる。
【００４４】
態様１の方法としては、例えばウェスタンブロッティング等が挙げられる。ウェスタンブロッティングとしては、例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Pｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ, Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ, Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （１９９６）に記載の方法等が挙げられる。
態様２の方法としては、単離したエクソソームを破壊せずに測定する場合には、上記測定方法１に記載した免疫学的測定方法、例えば、エクソスクリーン法等が挙げられ、単離したエクソソームを破壊して測定する場合には、サンドイッチＥＬＩＳＡ法等が挙げられる。エクソスクリーン法としては、例えば、前述のエクソスクリーン法等が挙げられる。
単離したエクソソームを破壊せずに測定する場合は、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片は、前記ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片のうち、エクソソーム表面に存在するＧＰＲＣ５Ｃのエピトープに結合する抗体又は抗体断片を用いる。
単離したエクソソームを破壊する方法としては、例えば、超音波を用いる方法等が挙げられる。サンドイッチＥＬＩＳＡ法としては、例えば、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片を固相用抗体として、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片を標識用抗体として用いても、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片を固相用抗体として、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片を標識用抗体として用いてもよい。固相及び標識としては、例えば公知の固相及び標識がそれぞれ挙げられ、例えば、前記の固相及び標識がそれぞれ用いられる。固相用抗体及び標識用抗体の調製方法としては、例えば公知の調製方法が挙げられる。
【００４５】
＜工程（４Ａ）＞
工程（４Ａ）は、工程（３Ａ）で測定したＧＰＲＣ５Ｃ濃度から、該検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度を決定する工程である。該検体の容量と、工程（３Ａ）で測定したＧＰＲＣ５Ｃ濃度とから、該検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度を決定することができる。
【００４６】
＜工程（５Ａ）＞
工程（５Ａ）は、工程（４Ａ）で決定された、該被検者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度と、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度とを対比する工程であり、被検者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度が、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度よりも高い場合には該被検者は膵臓癌に罹患している可能性が高いと判定され、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度と同じか又は低い場合には、該被検者は膵臓癌に罹患している可能性は低いと判定される。
【００４７】
健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度は、該被検者が膵臓癌に罹患している可能性を判定するための基準値であり、複数の健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度を測定し、その統計から健常者より採取した検体中の、クソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度を設定してもよい。
健常者の検体としては、被検者の検体と同種の試料であることが好ましく、例えば、被検者の検体が血液である場合、健常者の検体も血液を用いることが好ましい。
【００４８】
被検者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度と、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度とを対比する方法としては、前述の方法を用いることができる。該解析により、被検者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度が、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度よりも高いことが示された場合は、該被検者は膵臓癌に罹患している可能性が高いと判定され、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度と同じか又は低いことが示された場合は、該被検者は膵臓癌に罹患している可能性は低いと判定される。
また、被検者が膵臓癌に罹患している可能性を判定するための基準値として、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の代わりに、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の、エクソソーム特異抗原濃度に対する割合を用いることもできる。この場合、被検者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の、エクソソーム特異抗原濃度に対する割合を、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の、エクソソーム特異抗原濃度に対する割合と比較する。エクソソーム特異抗原としては、例えば前述のエクソソーム特異抗原等が挙げられる。
【００４９】
２．膵臓疾患患者において、膵臓癌と膵臓癌以外の膵臓疾患とを鑑別する方法
本発明の、膵臓疾患患者より採取した検体中のエクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃの濃度を測定することを特徴とする方法である。
本発明の鑑別方法における検体としては、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃが測定され得る検体であれば特に制限はなく、例えば前述の検体等が挙げられる。
本発明の鑑別方法において、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃは、エクソソームに内包されていても、エクソソームの膜表面に存在していても、エクソソームの膜を貫通していても、何れの形態で存在していてもよい。
本発明の鑑別方法において、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度とは、単位容量あたりの質量又はモル数のみならず、単位容量あたりのシグナル強度をも包含する。
【００５０】
［測定方法３］
本発明の、膵臓疾患患者において、膵臓癌と膵臓癌以外膵臓疾患とを鑑別する方法は、以下の工程を含む方法により行うことができる。
（１Ｂ）被検者より検体を採取する工程；
（２Ｂ）工程（１Ｂ）で採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃの濃度を測定する工程；
（３Ｂ）工程（２Ｂ）で測定したＧＰＲＣ５Ｃ濃度が、膵臓癌以外の膵臓疾患患者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度よりも高い場合には該被検者は膵臓癌に罹患している可能性が高いと判定し、膵臓癌以外の膵臓疾患患者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度と同じか又は低い場合には該被検者は膵臓癌以外の膵臓疾患に罹患している可能性が高いと判定する工程。
以下、各工程について詳細に説明する。
【００５１】
＜工程（１Ｂ）＞
工程（１Ｂ）において、被検者より採取された検体としては、前述の検体等が挙げられる。
【００５２】
＜工程（２Ｂ）＞
工程（２Ｂ）におけるエクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の測定方法は、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃの濃度を測定し得る方法であれば、如何なる方法を用いて行うことができ、例えば免疫学的測定法等の方法を用いて行うことができる。免疫学的測定法によるエクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の測定方法としては、以下の態様が挙げられる。
・態様１
ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片を用いる方法。
・態様２
ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片、及びエクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片を用いる方法。
【００５３】
工程（２Ｂ）におけるＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片としては、ＧＰＲＣ５Ｃを測定できる抗体又は該抗体断片であれば特に制限はなく、例えば前述の抗体又は該抗体断片等が挙げられる。
工程（２Ｂ）におけるエクソソーム特異的抗原としては、例えば前述の抗原等が挙げられる。
【００５４】
工程（２Ｂ）におけるエクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片としては、エクソソーム特異的抗原に結合できる抗体又は該抗体断片であれば特に制限はなく、例えば前述の抗体又は該抗体断片等が挙げられる。  工程（２Ｂ）において、上記２種類の抗体又は該抗体断片を用いる場合は、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片を固相用抗体として、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片を標識用抗体として用いて、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度を測定することができる。または、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片を固相用抗体として、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片を標識用抗体として用いて、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度を測定することもできる。固相用抗体及び標識用抗体の調製は、特に限定はなく、公知の方法に従って行うことができる。
【００５５】
エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃの測定方法は、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃを測定し得る方法であれば、如何なる方法を用いて行うことができ、例えば前述のサンドイッチＥＬＩＳＡ、エクソスクリーン法等の免疫学的測定法等を用いて行うことができる。
工程（２Ｂ）において、検体中のエクソソームを破壊せずに、検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃの濃度を測定する場合には、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片として、上記ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片のうち、エクソソーム表面に存在するＧＰＲＣ５Ｃのエピトープに結合する抗体又は抗体断片を用いることが好ましい。
【００５６】
＜工程（３Ｂ）＞
工程（３Ｂ）は、工程（２Ｂ）で得られた、膵臓疾患患者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度と、膵臓癌以外の膵臓疾患患者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度とを対比する工程であり、膵臓疾患患者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度が、膵臓癌以外の膵臓疾患患者より採取した検体中の、ＧＰＲＣ５Ｃ濃度よりも高い場合には該膵臓疾患患者は膵臓癌に罹患している可能性が高いと判定し、膵臓癌以外の膵臓疾患患者より採取した検体中の、ＧＰＲＣ５Ｃ濃度と同じか又は低い場合には該膵臓疾患患者は膵臓癌以外の膵臓疾患に罹患している可能性が高いと判定する工程である。
【００５７】
膵臓癌以外の膵臓疾患としては、膵炎が挙げられ、膵炎としては、急性膵炎、慢性膵炎が挙げられる。
【００５８】
膵臓癌以外の膵臓疾患患者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度は、該検者が膵臓癌に罹患しているか、膵臓癌以外の膵臓疾患に罹患しているかを鑑別するための基準値であり、複数の膵臓癌以外の膵臓疾患患者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度を測定し、その統計から膵臓癌以外の膵臓疾患患者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度を設定することができる。
膵臓癌以外の膵臓疾患患者より採取した検体としては、被検者より採取した検体と同種の試料であることが好ましく、例えば、被検者より採取した検体が血液である場合、膵臓癌以外の膵臓疾患患者より採取した検体も血液を用いることが好ましい。
被検者より採取した検体中のエクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度と、膵臓癌以外の膵臓疾患患者より採取した検体中のエクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度とを対比する方法としては、特に限定はなく、例えば前述の方法等を用いることができる。該解析により、被検者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度が、膵臓癌以外の膵臓疾患患者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度よりも高いことが示された場合は、該被検者は膵臓癌に罹患している可能性が高いと判定され、膵臓癌以外の膵臓疾患患者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度と同じか又は低いことが示された場合は、該被検者は膵臓癌以外の膵臓疾患に罹患している可能性が高いと判定される。
また、膵臓疾患患者において、膵臓癌と膵臓癌以外の膵臓疾患とを鑑別するための基準値として、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の代わりに、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の、エクソソーム特異抗原濃度に対する割合を用いることもできる。この場合、膵臓疾患患者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の、エクソソーム特異抗原濃度に対する割合を、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の、エクソソーム特異抗原濃度に対する割合と比較する。エクソソーム特異抗原としては、例えば前述のエクソソーム特異抗原等が挙げられる。
【００５９】
また、前記測定方法３の工程（２Ｂ）において、被検者より採取した検体より単離したエクソソームを用いて、検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度を測定することもできる。具体的には、以下の工程を含む方法が挙げられる。
［測定方法４］
（１Ｃ）膵臓疾患患者より検体を採取する工程；
（２Ｃ）工程（１Ｃ）で採取した検体からエクソソームを単離する工程；
（３Ｃ）工程（２Ｃ）で単離したエクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度を測定する工程；
（４Ｃ）工程（３Ｃ）で測定したＧＰＲＣ５Ｃ濃度から、該検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度を決定する工程；
（５Ｃ）工程（４Ｃ）で決定したＧＰＲＣ５Ｃ濃度が、膵臓癌以外の膵臓疾患より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度よりも高い場合には該被検者は膵臓癌に罹患している可能性が高いと判定し、膵臓癌以外の膵臓疾患より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度と同じか又は低い場合には該被検者は膵臓癌以外の膵臓疾患に罹患している可能性が高いと判定する工程。
【００６０】
＜工程（１Ｃ）＞
工程（１Ｃ）において、被検者より採取された検体としては、前述の検体等が挙げられる。
【００６１】
＜工程（２Ｃ）＞
工程（２Ｃ）における、エクソソームを単離する方法としては、検体中のエクソソームを単離できる方法であれば特に制限はなく、例えば前述の方法等が挙げられる。
【００６２】
＜工程（３Ｃ）＞
工程（３Ｃ）におけるエクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の測定方法は、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃの濃度を測定し得る方法であれば、如何なる方法を用いて行うことができ、例えば免疫学的測定法等の方法を用いて行うことができる。免疫学的測定法によるエクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の測定方法としては、以下の態様が挙げられる。
【００６３】
・態様１
ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片を用いる方法。
・態様２
ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片、及びエクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片を用いる方法。
【００６４】
ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片としては、例えば前述のＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片等が挙げられる。エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片としては、例えば前述のエクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片等が挙げられる。
【００６５】
態様１の方法としては、例えばウェスタンブロッティング等が挙げられる。ウェスタンブロッティングとしては、例えば前述の方法等が挙げられる。
態様２の方法としては、単離したエクソソームを破壊せずに測定する場合には、上記測定方法１に記載した免疫学的測定方法、例えば、エクソスクリーン法等が挙げられ、単離したエクソソームを破壊して測定する場合には、サンドイッチＥＬＩＳＡ法等が挙げられる。エクソスクリーン法としては、例えば前述のエクソスクリーン法等が挙げられる。
【００６６】
単離したエクソソームを破壊せずに測定する場合は、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片は、前記ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片のうち、エクソソーム表面に存在するＧＰＲＣ５Ｃのエピトープに結合する抗体又は抗体断片を用いる。
単離したエクソソームを破壊する方法としては、例えば前述の方法等が挙げられる。
サンドイッチＥＬＩＳＡ法としては、例えばＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片を固相用抗体として、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片を標識用抗体として用いても、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片を固相用抗体として、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片を標識用抗体として用いてもよい。固相及び標識としては、例えば公知の固相及び標識がそれぞれ挙げられ、例えば前述の固相及び標識がそれぞれ用いられる。固相用抗体及び標識用抗体の調製方法としては、例えば公知の調製方法が挙げられる。
【００６７】
＜工程（４Ｃ）＞
工程（４Ｃ）は、工程（３Ｃ）で測定したＧＰＲＣ５Ｃ濃度から、該検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度を決定する工程である。該検体の容量と、工程（３Ｃ）で測定したＧＰＲＣ５Ｃ濃度とから、該検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度を決定することができる。
【００６８】
＜工程（５Ｃ）＞
工程（５Ｃ）は、工程（４Ｃ）で決定された、該膵臓疾患患者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度と、膵臓癌以外の膵臓疾患より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度とを対比する工程であり、膵臓疾患患者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度が、膵臓癌以外の膵臓疾患より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度よりも高い場合には該膵臓疾患患者は膵臓癌に罹患している可能性が高いと判定され、膵臓癌以外の膵臓疾患より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度と同じか又は低い場合には、該膵臓疾患患者は膵臓癌以外の膵臓疾患に罹患している可能性が高いと判定される。
【００６９】
膵臓癌以外の膵臓疾患患者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度は、該膵臓疾患患者が膵臓癌に罹患しているか、膵臓癌以外の膵臓疾患に罹患しているかを鑑別するための基準値であり、複数の膵臓癌以外の膵臓疾患患者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度を測定し、その統計から膵臓癌以外の膵臓疾患患者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度を設定することができる。
この場合、基準値を設定する際に用いた膵臓癌以外の膵臓疾患患者の検体は、被検者である膵臓疾患患者の検体と同種の試料であることが好ましく、例えば、被検者である膵臓疾患患者の検体が血液である場合、膵臓癌以外の膵臓疾患患者の検体も血液を用いることが好ましい。
被検者のエクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度と、膵臓癌以外の膵臓疾患患者のエクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度とを対比する方法としては、前述の方法を用いることができる。該解析により、被検者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度が、膵臓癌以外の膵臓疾患患者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度よりも高いことが示された場合は、該被検者は膵臓癌に罹患している可能性が高いと判定され、膵臓癌以外の膵臓疾患患者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度と同じか又は低いことが示された場合は、該被検者は膵臓癌以外の膵臓疾患患者に罹患している可能性が高いと判定される。
また、膵臓疾患患者において、膵臓癌と膵臓癌以外の膵臓疾患とを鑑別するための基準値として、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の代わりに、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の、エクソソーム特異抗原濃度に対する割合を用いることもできる。この場合、膵臓疾患患者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の、エクソソーム特異抗原濃度に対する割合を、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の、エクソソーム特異抗原濃度に対する割合と比較する。エクソソーム特異抗原としては、例えば前述のエクソソーム特異抗原等が挙げられる。
【００７０】
３．被検者が膵臓癌に罹患している可能性をモニタリングする方法
本発明の、被検者が膵臓癌に罹患している可能性をモニタリングする方法は、被検者より経時的に採取した検体中のエクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃの濃度を測定することを特徴とする方法である。
【００７１】
本発明における検体としては、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃが測定され得る検体であれば特に制限はなく、例えば前述の検体等が挙げられる。
本発明において、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃは、エクソソームに内包されていても、エクソソームの膜表面に存在していても、エクソソームの膜を貫通していても、何れの形態で存在していてもよい。
本発明において、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度とは、単位容量あたりの質量又はモル数のみならず、単位容量あたりのシグナル強度をも包含する。
【００７２】
［測定方法５］
本発明において、被検者が膵臓癌に罹患している可能性をモニタリングする方法は、以下の工程を含む方法により行うことができる。
（１Ｄ）被検者より経時的に検体を採取する工程；
（２Ｄ）工程（１Ｄ）で採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃの濃度を測定する工程；
（３Ｄ）工程（２Ｄ）で測定したＧＰＲＣ５Ｃ濃度が、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度よりも高い濃度で維持されている場合には該被検者は膵臓癌に罹患している可能性が高いと判定し、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度と同じか又は低い濃度で維持されている場合には該被検者は膵臓癌に罹患している可能性が低いと判定する工程。
【００７３】
＜工程（１Ｄ）＞
工程（１Ｄ）において、被検者より採取された検体としては、前述の検体等が挙げられる。
【００７４】
＜工程（２Ｄ）＞
工程（２Ｄ）におけるエクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の測定方法は、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃの濃度を測定し得る方法であれば、如何なる方法を用いて行うことができ、例えば免疫学的測定法等の方法を用いて行うことができる。免疫学的測定法によるエクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の測定方法としては、以下の態様が挙げられる。
・態様１
ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片を用いる方法。
・態様２
ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片、及びエクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片を用いる方法。
工程（２Ｄ）におけるＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片としては、ＧＰＲＣ５Ｃを測定できる抗体又は該抗体断片であれば特に制限はなく、例えば前述の抗体又は該抗体断片等が挙げられる。
工程（２Ｄ）におけるエクソソーム特異的抗原としては、例えば前述の抗原等が挙げられる。
【００７５】
工程（２Ｄ）におけるエクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片としては、エクソソーム特異的抗原に結合できる抗体又は該抗体断片であれば特に制限はなく、例えば前述の抗体又は該抗体断片等が挙げられる。
工程（２Ｄ）において、上記２種類の抗体又は該抗体断片を用いる場合は、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片を固相用抗体として、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片を標識用抗体として用いて、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度を測定することができる。または、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片を固相用抗体として、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片を標識用抗体として用いて、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度を測定することもできる。固相用抗体及び標識用抗体の調製は、特に限定はなく、公知の方法に従って行うことができる。
エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃの測定方法は、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃを測定し得る方法であれば、如何なる方法を用いて行うことができ、例えば前述のサンドイッチＥＬＩＳＡ、エクソスクリーン法等の免疫学的測定法等を用いて行うことができる。
工程（２Ｄ）において、検体中のエクソソームを破壊せずに、検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃの濃度を測定する場合には、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片として、上記ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片のうち、エクソソーム表面に存在するＧＰＲＣ５Ｃのエピトープに結合する抗体又は抗体断片を用いることが好ましい。
【００７６】
＜工程（３Ｄ）＞
工程（３Ｄ）は、工程（２Ｄ）で得られた、被検者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度と、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度とを対比する工程であり、被検者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度が、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度よりも高い場合には該被検者は膵臓癌に罹患している可能性が高いと判定し、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度と同じか又は低い場合には該被検者は膵臓癌に罹患している可能性が低いと判定する。
【００７７】
健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度は、該検者が膵臓癌に罹患している可能性を判定するための基準値であり、複数の健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度を測定し、その統計から健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度を設定することができる。
健常者より採取した検体としては、被検者より採取した検体と同種の試料であることが好ましく、例えば、被検者より採取した検体が血液である場合、健常者より採取した検体も血液を用いることが好ましい。
被検者より経時的に採取した検体中のエクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度と、健常者より採取した検体中のエクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度とを対比する方法としては、特に限定はなく、例えば前述の方法等を用いることができる。該解析により、被検者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度が、健常者により採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度よりも高い濃度で維持されている場合は、該被検者は膵臓癌に罹患している可能性が高いと判定され、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度と同じか又は低い濃度で維持されている場合は、該被検者は膵臓癌に罹患している可能性が低いと判定される。
また、被検者が膵臓癌に罹患している可能性をモニタリングするための基準値として、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の代わりに、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の、エクソソーム特異抗原濃度に対する割合を用いることもできる。この場合、被検者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の、エクソソーム特異抗原濃度に対する割合を、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の、エクソソーム特異抗原濃度に対する割合と比較する。エクソソーム特異抗原としては、例えば前述のエクソソーム特異抗原等が挙げられる。
【００７８】
また、前記測定方法５の工程（２Ｄ）において、被検者より採取した検体より単離したエクソソームを用いて、検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度を測定することもできる。具体的には、以下の工程を含む方法が挙げられる。
［測定方法６］
（１Ｅ）被検者より経時的に検体を採取する工程；
（２Ｅ）工程（１Ｅ）で採取した検体からエクソソームを単離する工程；
（３Ｅ）工程（２Ｅ）で単離したエクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度を測定する工程；
（４Ｅ）工程（３Ｅ）で測定したＧＰＲＣ５Ｃ濃度から、該検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度を決定する工程；
（５Ｅ）工程（４Ｅ）で決定したＧＰＲＣ５Ｃ濃度が、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度よりも高いで維持されている場合には該被検者は膵臓癌に罹患している可能性が高いと判定し、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度と同じか又は低い濃度で維持されている場合には該被検者は膵臓癌に罹患している可能性が低いと判定する工程。
【００７９】
＜工程（１Ｅ）＞
工程（１Ｅ）において、被検者より採取された検体としては、前述の検体等が挙げられる。
【００８０】
＜工程（２Ｅ）＞
工程（２Ｅ）における、エクソソームを単離する方法としては、検体中のエクソソームを単離できる方法であれば特に制限はなく、例えば前述の方法等が挙げられる。
【００８１】
＜工程（３Ｅ）＞
工程（３Ｅ）におけるエクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の測定方法は、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃの濃度を測定し得る方法であれば、如何なる方法を用いて行うことができ、例えば免疫学的測定法等の方法を用いて行うことができる。免疫学的測定法によるエクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の測定方法としては、以下の態様が挙げられる。
【００８２】
・態様１
ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片を用いる方法。
・態様２
ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片、及びエクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片を用いる方法。
【００８３】
ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片としては、例えば前述のＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片等が挙げられる。エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片としては、例えば前述のエクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片等が挙げられる。
【００８４】
態様１の方法としては、例えばウェスタンブロッティング等が挙げられる。ウェスタンブロッティングとしては、例えば前述の方法等が挙げられる。
【００８５】
態様２の方法としては、単離したエクソソームを破壊せずに測定する場合には、上記測定方法１に記載した免疫学的測定方法、例えば、エクソスクリーン法等が挙げられ、単離したエクソソームを破壊して測定する場合には、サンドイッチＥＬＩＳＡ法等が挙げられる。エクソスクリーン法としては、例えば前述のエクソスクリーン法等が挙げられる。
単離したエクソソームを破壊せずに測定する場合は、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片は、前記ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片のうち、エクソソーム表面に存在するＧＰＲＣ５Ｃのエピトープに結合する抗体又は抗体断片を用いる。
単離したエクソソームを破壊する方法としては、例えば前述の方法等が挙げられる。
サンドイッチＥＬＩＳＡ法としては、例えばＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片を固相用抗体として、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片を標識用抗体として用いても、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片を固相用抗体として、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片を標識用抗体として用いてもよい。固相及び標識としては、例えば公知の固相及び標識がそれぞれ挙げられ、例えば前述の固相及び標識がそれぞれ用いられる。固相用抗体及び標識用抗体の調製方法としては、例えば公知の調製方法が挙げられる。
【００８６】
＜工程（４Ｅ）＞
工程（４Ｅ）は、工程（３Ｅ）で測定したＧＰＲＣ５Ｃ濃度から、該検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度を決定する工程である。該検体の容量と、工程（３Ｅ）で測定したＧＰＲＣ５Ｃ濃度とから、該検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度を決定することができる。
【００８７】
＜工程（５Ｅ）＞
工程（５Ｅ）は、工程（４Ｅ）で決定された、該被検者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度と、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度とを対比する工程であり、被検者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度が、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度よりも高い濃度で維持されている場合には該被検者は膵臓癌に罹患している可能性が高いと判定され、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度と同じか又は低い濃度で維持されている場合には、該被検者は膵臓癌に罹患している可能性が低いと判定される。
【００８８】
健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度は、該検者が膵臓癌に罹患している可能性を判定するための基準値であり、複数の健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度を測定し、その統計から健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度を設定することができる。
健常者の検体としては、被検者の検体と同種の試料であることが好ましく、例えば、被検者の検体が血液である場合、健常者の検体も血液を用いることが好ましい。
被検者のエクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度と、健常者のエクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度とを対比する方法としては、前述の方法を用いることができる。該解析により、被検者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度が、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度よりも高い濃度で維持されている場合は、該被検者は膵臓癌に罹患している可能性が高いと判定され、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度と同じか又は低い濃度で維持されている場合は、該被検者は膵臓癌に罹患している可能性が低いと判定される。
また、被検者が膵臓癌に罹患している可能性をモニタリングするための基準値として、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の代わりに、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の、エクソソーム特異抗原濃度に対する割合を用いることもできる。この場合、被検者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の、エクソソーム特異抗原濃度に対する割合を、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の、エクソソーム特異抗原濃度に対する割合と比較する。エクソソーム特異抗原としては、例えば前述のエクソソーム特異抗原等が挙げられる。
【００８９】
実施例にて後述するように、本発明によれば、手術前から手術後の膵臓癌患者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度を測定することで、手術を施した際の治療効果、癌部の縮小等の膵臓癌患者の状態をモニタリングすることができる。
また、本発明によれば、治療中の膵臓癌患者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度を測定することで、膵臓癌の再発を予測することができる。
また、本発明によれば、被検者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度を測定することで、被検者が膵臓癌に罹患している可能性をモニタリングすることができる。
【００９０】
４．被検者が膵臓癌に罹患している可能性を試験するための試薬
本発明の、被検者が膵臓癌に罹患している可能性を試験するための試薬は、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ測定試薬を含有することを特徴とする試薬であり、本発明の、被検者が膵臓癌に罹患している可能性を試験する方法に用いることができる。
【００９１】
また、本発明の、被検者が膵臓癌に罹患している可能性を試験するための試薬には、さらに、被検者より採取された検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度が、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度より高い場合には、該被検者は膵臓癌に罹患している可能性が高く、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度と同じか又は低い場合には、該被検者は膵臓癌に罹患している可能性が低い、という基準が記載された基準表が含まれていてもよい。この基準表に記載される基準として、被検者より採取された検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の、エクソソーム特異抗原濃度に対する割合が、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の、エクソソーム特異抗原濃度に対する割合より高い場合には、該被検者は膵臓癌に罹患している可能性が高く、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の、エクソソーム特異抗原濃度に対する割合と同じか又は低い場合には、該被検者は膵臓癌に罹患している可能性が低い、という基準を用いることもできる。エクソソーム特異抗原としては、例えば前述のエクソソーム特異抗原等が挙げられる。
【００９２】
本発明の、被検者が膵臓癌に罹患している可能性を試験するための試薬における、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ測定試薬は、前述のエクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃの測定方法に使用される試薬である。エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ測定試薬としては、検体中のエクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃを測定し得る試薬であれば特に制限はなく、例えば免疫学的測定試薬等が挙げられる。免疫学的測定試薬としては、例えば前述の免疫学的測定方法に基づく試薬等が挙げられる。
免疫学的測定法に基づいた、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ測定試薬の具体的態様を以下に示す。
【００９３】
・測定試薬１
ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片を含む試薬。
・測定試薬２
標識が結合した、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片を含む試薬。
・測定試薬３
ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片、及び、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片を含む試薬。
・測定試薬４
固相に固定化された、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片、及び、標識が結合した、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片を含む試薬。
・測定試薬５
固相に固定化された、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片、及び、標識が結合した、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片を含む試薬。
・測定試薬６
固相に固定化された、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する第１抗体又は該抗体断片、及び、標識が結合した、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する第２抗体又は該抗体断片を含む試薬。
ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片、及び、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片としては、それぞれ前述のＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片、及び、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片等が挙げられる。
【００９４】
標識が結合した、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片、及び、標識が結合した、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片における標識としては、例えば前述の標識等が挙げられる。標識が結合した、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片、及び、標識が結合した、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片の調製は、例えば公知の標識化抗体の調製方法に従って行うことができる。
固相に固定化された、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片、及び、固相に固定化された、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片における固相としては、例えば前述の固相等が挙げられる。ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片の固相への固定化、及び、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片の固相への固定化は、例えば公知の方法に従って行うことができる。
測定試薬６において、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する第１抗体又は該抗体断片が結合するエピトープと、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する第２抗体又は該抗体断片が結合するエピトープは異なっていても同じでもよいが、異なっている方が好ましい。
前記測定試薬１〜６には、さらにエクソソーム単離試薬が含まれていてもよい。エクソソーム単離試薬としては、検体からエクソソームを単離できる試薬であれば特に制限はなく、例えば前述のエクソソーム単離キット等が挙げられる。
【００９５】
５．膵臓疾患患者において、膵臓癌と膵臓癌以外の膵臓疾患とを鑑別するための試薬
本発明の、膵臓疾患患者において、膵臓癌と膵臓癌以外の膵臓疾患とを鑑別するための試薬は、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ測定試薬を含有することを特徴とする試薬であり、本発明の、膵臓疾患患者において、膵臓癌と、膵臓癌以外の膵臓疾患とを鑑別する方法に用いることができる。
【００９６】
また、本発明の、膵臓疾患患者において、膵臓癌と膵臓癌以外の膵臓疾患とを鑑別するための試薬には、さらに、膵臓疾患患者より採取された検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度が、膵臓癌以外の膵臓疾患患者の検体中のエクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度より高い場合には、該膵臓疾患患者は膵臓癌に罹患している可能性が高く、膵臓癌以外の膵臓疾患患者の検体中のエクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度と同じか又は低い場合には、該膵臓疾患患者は膵臓癌以外の膵臓疾患に罹患している可能性が高い、という基準が記載された基準表が含まれていてもよい。この基準表に記載される基準として、膵臓疾患患者より採取された検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の、エクソソーム特異抗原濃度に対する割合が、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の、エクソソーム特異抗原濃度に対する割合より高い場合には、該被検者は膵臓癌に罹患している可能性が高く、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の、エクソソーム特異抗原濃度に対する割合と同じか又は低い場合には、該膵臓疾患患者は膵臓癌以外の膵臓疾患に罹患している可能性が高い、という基準を用いることもできる。エクソソーム特異抗原としては、例えば前述のエクソソーム特異抗原等が挙げられる。
【００９７】
本発明の、膵臓疾患患者において、膵臓癌と膵臓癌以外の膵臓疾患とを鑑別するための試薬における、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ測定試薬は、前述のエクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃの測定方法に使用される試薬である。エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ測定試薬としては、検体中のエクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃを測定し得る試薬であれば特に制限はなく、例えば免疫学的測定試薬等が挙げられる。免疫学的測定試薬としては、例えば前述の免疫学的測定方法に基づく試薬等が挙げられる。
免疫学的測定法に基づいた、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ測定試薬の具体的態様を以下に示す。
【００９８】
・測定試薬７
ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片を含む試薬。
・測定試薬８
標識が結合した、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片を含む試薬。
・測定試薬９
ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片、及び、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片を含む試薬。
・測定試薬１０
固相に固定化された、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片、及び、標識が結合した、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片を含む試薬。
・測定試薬１１
固相に固定化された、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片、及び、標識が結合した、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片を含む試薬。
・測定試薬１２
固相に固定化された、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する第１抗体又は該抗体断片、及び、標識が結合した、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する第２抗体又は該抗体断片を含む試薬。
【００９９】
ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片、及び、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片としては、それぞれ前述のＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片、及び、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片等が挙げられる。
標識が結合した、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片、及び、標識が結合した、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片における標識としては、例えば前述の標識等が挙げられる。標識が結合した、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片、及び、標識が結合した、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片の調製は、例えば公知の標識化抗体の調製方法に従って行うことができる。
固相に固定化された、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片、及び、固相に固定化された、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片における固相としては、例えば前述の固相等が挙げられる。ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片の固相への固定化、及び、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片の固相への固定化は、例えば公知の方法に従って行うことができる。
測定試薬１２において、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する第１抗体又は該抗体断片が結合するエピトープと、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する第２抗体又は該抗体断片が結合するエピトープは異なっていても同じでもよいが、異なっている方が好ましい。
前記測定試薬７〜１２には、さらにエクソソーム単離試薬が含まれていてもよい。エクソソーム単離試薬としては、検体からエクソソームを単離できる試薬であれば特に制限はなく、例えば前述のエクソソーム単離キット等が挙げられる。
【０１００】
６．被検者が膵臓癌に罹患している可能性をモニタリングするための試薬
本発明の、被検者が膵臓癌に罹患している可能性をモニタリングするための試薬は、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ測定試薬を含有することを特徴とする試薬であり、本発明の、被検者が膵臓癌に罹患している可能性をモニタリングする方法に用いることができる。
【０１０１】
また、本発明の、被検者が膵臓癌に罹患している可能性をモニタリングするための試薬には、さらに、被検者より経時的に採取された検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度が、健常者の検体中のエクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度より高い濃度で維持されている場合には、該被検者は膵臓癌に罹患している可能性が高く、健常者の検体中のエクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度と同じか又は低い濃度で維持されている場合には、該被検者は膵臓癌に罹患している可能性が低い、という基準が記載された基準表が含まれていてもよい。この基準表に記載される基準として、被検者より採取された検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の、エクソソーム特異抗原濃度に対する割合が、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の、エクソソーム特異抗原濃度に対する割合より高い場合には、該被検者は膵臓癌に罹患している可能性が高く、健常者より採取した検体中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の、エクソソーム特異抗原濃度に対する割合と同じか又は低い場合には、該被検者は膵臓癌に罹患している可能性が低い、という基準を用いることもできる。エクソソーム特異抗原としては、例えば前述のエクソソーム特異抗原等が挙げられる。
【０１０２】
本発明の、被検者が膵臓癌に罹患している可能性をモニタリングするための試薬における、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ測定試薬は、前述のエクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃの測定方法に使用される試薬である。エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ測定試薬としては、検体中のエクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃを測定し得る試薬であれば特に制限はなく、例えば免疫学的測定試薬等が挙げられる。免疫学的測定試薬としては、例えば前述の免疫学的測定方法に基づく試薬等が挙げられる。
免疫学的測定法に基づいた、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ測定試薬の具体的態様を以下に示す。
【０１０３】
・測定試薬１３
ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片を含む試薬。
・測定試薬１４
標識が結合した、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片を含む試薬。
・測定試薬１５
ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片、及び、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片を含む試薬。
・測定試薬１６
固相に固定化された、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片、及び、標識が結合した、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片を含む試薬。
・測定試薬１７
固相に固定化された、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片、及び、標識が結合した、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片を含む試薬。
・測定試薬１８
固相に固定化された、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する第１抗体又は該抗体断片、及び、標識が結合した、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する第２抗体又は該抗体断片を含む試薬。
【０１０４】
ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片、及び、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片としては、それぞれ前述のＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片、及び、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片等が挙げられる。
標識が結合した、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片、及び、標識が結合した、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片における標識としては、例えば前述の標識等が挙げられる。標識が結合した、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片、及び、標識が結合した、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片の調製は、例えば公知の標識化抗体の調製方法に従って行うことができる。
固相に固定化された、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片、及び、固相に固定化された、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片における固相としては、例えば前述の固相等が挙げられる。ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体又は該抗体断片の固相への固定化、及び、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体又は該抗体断片の固相への固定化は、例えば公知の方法に従って行うことができる。
測定試薬１８において、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する第１抗体又は該抗体断片が結合するエピトープと、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する第２抗体又は該抗体断片が結合するエピトープは異なっていても同じでもよいが、異なっている方が好ましい。
前記測定試薬１３〜１８には、さらにエクソソーム単離試薬が含まれていてもよい。エクソソーム単離試薬としては、検体からエクソソームを単離できる試薬であれば特に制限はなく、例えば前述のエクソソーム単離キット等が挙げられる。
【０１０５】
７．膵臓癌マーカー
本発明の膵臓癌マーカーは、ＧＰＲＣ５Ｃ又はＧＰＲＣ５Ｃ遺伝子からなることを特徴とする。ヒトＧＰＲＣ５ＣのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号は、ＮＰ＿０７１３１９．２；ＮＰ＿０６１１２３．３である。また、ヒトＧＰＲＣ５ＣのｍＲＮＡのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号は、ＮＭ＿０２２０３６．２；ＮＭ＿０１８６５３．３である。
【０１０６】
８．膵臓癌診断薬
本発明の膵臓癌診断薬は、ＧＰＲＣ５Ｃに対する特異的結合物質、ＧＰＲＣ５Ｃ遺伝子を増幅可能なプライマーセット、又はＧＰＲＣ５Ｃ遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブを備えたことを特徴とする。
【０１０７】
（特異的結合物質）
特異的結合物質としては、ＧＰＲＣ５Ｃに結合する抗体、該抗体断片、ＧＰＲＣ５Ｃに結合するアプタマー等が挙げられる。抗体又は該抗体断片としては、前述したものが挙げられる。
【０１０８】
アプタマーとは、標的物質に対する特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。標的ペプチドに特異的結合能を有する核酸アプタマーは、例えば、ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）法等により選別することができる。また、標的ペプチドに特異的結合能を有するペプチドアプタマーは、例えば酵母を用いたＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法等により選別することができる。
【０１０９】
（プライマーセット）
ＧＰＲＣ５Ｃ遺伝子を増幅可能なプライマーセットとは、これらの遺伝子のｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ等により増幅することができるものであれば特に制限されない。
【０１１０】
これらの遺伝子のｍＲＮＡは、上述したアクセッション番号で特定されるＧｅｎＢａｎｋデータベースのエントリーに記載された塩基配列を有している。なお、ｍＲＮＡにはスプライシングバリアント等が存在する場合があるため、これらの遺伝子のｍＲＮＡは上述したアクセッション番号で特定されるものに限られるものではない。
【０１１１】
例えば、被検者の組織等を試料に用い、本プライマーセットを用いたＲＴ−ＰＣＲ等を行うことにより、試料中の、ＧＰＲＣ５Ｃ遺伝子のｍＲＮＡを検出することができる。
【０１１２】
（プローブ）
プローブとしては、ＧＰＲＣ５Ｃ遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするものであれば特に限定されない。プローブは、担体上に固定されてＤＮＡマイクロアレイ等を構成していてもよい。例えば、上記のＤＮＡマイクロアレイに、被検者の組織から抽出したｍＲＮＡを接触させ、プローブにハイブリダイズしたＧＰＲＣ５Ｃ遺伝子のｍＲＮＡを検出することにより、被検者が膵臓癌に罹患しているか否かを判定することができる。担体としては、例えば前述の担体等が挙げられる。
【０１１３】
９．生体試料の判定方法
本発明の生体試料の判定方法は、生体試料中のＧＰＲＣ５Ｃの存在量を測定する工程と、測定されたＧＰＲＣ５Ｃの存在量が、対照と比較して多い場合に、前記生体試料は膵臓癌患者より採取されたものであると判定する工程と、を含む。
【０１１４】
本発明の判定方法により、生体試料が膵臓癌患者より採取されたものであるか否かを判定することができる。本発明の判定方法によれば、膵臓癌を特異的に検出することができる。
【０１１５】
本発明の判定方法において、生体試料は、前述のとおり、血清、血漿又は血清若しくは血漿から精製されたエクソソームであってもよい。生体試料中のＧＰＲＣ５Ｃを測定する工程は、上述した特異的結合物質を用いた、サンドイッチＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、逆相タンパク質アレイを用いた検出、免疫組織化学染色等により行うことができる。
ここで、測定したＧＰＲＣ５Ｃは、段階希釈した既知濃度のＧＰＲＣ５Ｃを標準品として用いて作成された検量線に基づいて、定量値に換算してもよい。
【０１１６】
本発明の判定方法では、生体試料中のＧＰＲＣ５Ｃが、対照試料中のＧＰＲＣ５Ｃの存在量と比較して多い場合に、前記生体試料は膵臓癌患者より採取されたものであると判定する。対照としては、例えば健常者又は膵臓癌以外の膵臓疾患患者より採取された生体試料が挙げられる。あるいは、予め健常人より採取された生体試料中に存在する、ＧＰＲＣ５Ｃの量に基づいて基準値を設定しておき、該基準値と比較してＧＰＲＣ５Ｃの量が多い場合に、生体試料は膵臓癌患者より採取されたものであると判定してもよい。
【０１１７】
本発明の判定方法は、生体試料中のＧＰＲＣ５Ｃ遺伝子の発現量を測定する工程と、測定された前記遺伝子の発現量が、対照と比較して多い場合に、前記生体試料は膵臓癌患者より採取されたものであると判定する工程と、を含むものであってもよい。
【０１１８】
本発明の判定方法において、生体試料は、被検者の組織等であってもよい。生体試料中のＧＰＲＣ５Ｃ遺伝子の発現量を測定する工程は、上述したプライマーセットを用いたＲＴ−ＰＣＲ、定量的ＲＴ−ＰＣＲ等により行うことができる。あるいは、上述したプローブを用いたＤＮＡマイクロアレイ解析、ノーザンブロッティング等により、ＧＰＲＣ５Ｃ遺伝子の発現量を測定してもよい。ここで、測定したＧＰＲＣ５Ｃ遺伝子の発現量は、段階希釈した既知濃度の各遺伝子の断片等を標準品として用いて作成された検量線に基づいて、定量値に換算してもよい。
【０１１９】
また、本発明の判定方法では、生体試料中のＧＰＲＣ５Ｃ遺伝子の発現量が、対照試料中の上記遺伝子の発現量と比較して多い場合に、前記生体試料は膵臓癌患者より採取されたものであると判定する。対照としては、例えば健常者又は膵臓癌以外の膵臓疾患患者より採取された生体試料が挙げられる。あるいは、予め健常人より採取された生体試料におけるＧＰＲＣ５Ｃ遺伝子の発現量に基づいて基準値を設定しておき、該基準値と比較して上記遺伝子の発現量が多い場合に、生体試料は膵臓癌患者より採取されたものであると判定してもよい。
【実施例】
【０１２０】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。【０１２１】
[実施例１]
各血清中のエクソソームが有するＧＲＰＣ５Ｃの検出
健常人から採取した血清（4検体）、膵炎患者から採取した血清（4検体）、及び膵臓癌患者から採取した血清（4検体：ステージＩＩＡが2種類、ステージＩＩＢが１種類、ステージＩＩＩが１種類）を、スイングロータにて100,000×ｇ以上で（4 ℃）で70分間超遠心分離後、上清を捨てて、PBS［0.15 mol/L塩化ナトリウムを含有する10 mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.2)］を加えて沈殿させ、この沈殿画分をエクソソーム画分とした。このエクソソーム画分をPBS（総量100 μL）で溶解した。１wellにつき血清100 μL相当量のエクソソーム画分溶液に、該溶液と1/3量の4×サンプルバッファー（4%ドデシル硫酸ナトリウム、10% スクロース、0.01％ ブロモフェノールブルー、10％ 2-メルカプトエタノールを含む、0.125 mol/L トリス緩衝液［pH6.8］）を加えて混合し、95℃で5分間保温した後、氷冷した。該処理液を、4-15％ミニプロティアンTGXゲル(バイオラッド社製)のウェルにアプライし、SDS-PAGEを行った。SDS-PAGE後のゲルをPVDF  メンブレンに転写した後、該メンブレンを、Nacalai  Blocking  One  solution［ナカライテスク社製］を用いて、室温(25℃)で1時間ブロッキングした。次に、室温(25℃)で1時間、一次抗体反応を行った（Anti-GPRC5C antibody C-terminal Rabbit polyclonal［アブカム社製］  1:500)。続いて室温(25℃)で1時間、二次抗体反応を行った（Rabbit IgG HRP［GEヘルスケア社製］  1:5000）。最後に、ImmunoStar LD（和光純薬工業社製）を用いて発色反応（室温［25℃］5分）を行い、ブロッティング画像を撮影し、それぞれの血清中のエクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃのシグナルを検出した。ブロッティング画像の結果を図１に示す。【０１２２】
また、上記方法に従い、Purified Mouse Anti-Human CD63（日本ベクトン・ディッキンソン社製、クローン：H5C6）を用いて、各血清中のエクソソームが有するCD63の発現量をウェスタンブロッティングにて評価した。その結果を図１に示す。
図１から明らかなように、健常人と膵臓癌患者と比較して、膵臓癌患者において、顕著に、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃが高発現していることが判明した。【０１２３】
[実施例２]
健常人から採取した血清（10検体）、膵炎患者から採取した血清（10検体）、及び膵臓癌患者から採取した血清（23検体）を用いて、それぞれの血清中のエクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度を比較するため、実施例１の方法に従い、それぞれの血清中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃのシグナル及びＣＤ６３のシグナルを、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度及びＣＤ６３濃度として検出した。ＧＰＲＣ５Ｃ／ＣＤ６３のシグナル比を図２に示す。
図２から明らかなように、健常人から採取した血清中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度に比べ、膵臓癌患者から採取した血清中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度が高値であることが判明した。また、膵炎患者から採取した血清中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度に比べ、膵臓癌患者から採取した血清中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度が高値であることが判明した。【０１２４】
［実施例３］
膵臓癌患者（５症例）について、手術前と手術後における、それぞれの血清中のエクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度を、実施例１の方法に従い、ウェスタンブロッティングを用いて比較した。ブロッティング画像の結果を図３に示す。
図３から明らかなように、手術前に比較して、手術後では顕著に、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度が低下していることが判明した。【０１２５】
［実施例４］
再発した膵臓癌患者より採取した血清中のエクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度、及び、健常人より採取した血清中のエクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度を、ウェスタンブロッティングを用いる実施例１の方法により測定し、両ＧＰＲＣ５Ｃ濃度を比較した。また、同時に、各血清中の、エクソソームが有するＣＤ９濃度を、抗CD9抗体（8A12）（コスモバイオ社製）をビオチン化したビオチン化抗CD9抗体（1000倍希釈）及びHRP結合ストレプトアビジン (CST社製)（2000倍希釈）を用いる、ウェスタンブロッティングにより測定した。測定したＧＰＲＣ５Ｃ濃度及びＣＤ９濃度から、ＣＤ９濃度に対するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の割合を算出し、ＧＰＲＣ５Ｃ／ＣＤ９のシグナル比とした。当該ＧＰＲＣ５Ｃ／ＣＤ９のシグナル比を図４に示す。
図４から明らかなように、健常人より採取した血清中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度と比較して、再発した膵臓癌患者より採取した血清中の、エクソソームが有するＧＰＲＣ５Ｃ濃度の方が高値であることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【０１２６】
本発明の、被検者が膵臓癌に罹患している可能性を試験するための方法及び試薬、膵臓癌と膵臓癌以外の膵臓疾患とを鑑別するための方法及び試薬、被検者が膵臓癌に罹患している可能性をモニタリングするための方法及び試薬、膵臓癌マーカー、膵臓癌診断薬、並びに生体試料の判定方法は、臨床診断において有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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