(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴ糖の製造方法であって、
以下の（ｉ）〜（ｖ）の酵素：
（ｉ）ホスホリラーゼ、
（ｉｉ）アノメリックキナーゼ、
（ｉｉｉ）ピルビン酸オキシダーゼ、
（ｉｖ）カタラーゼ、及び
（ｖ）酢酸キナーゼ、を
リン酸、ならびにＡＴＰ及び／又はＡＤＰの存在下にて、
供与体糖、受容体糖、酸素分子、ならびにピルビン酸と同時に作用させることを含む、上記方法。
【請求項２】
（ｉ）ホスホリラーゼが、１，３−β−ガラクトシル−Ｎ−アセチルヘキソサミンホスホリラーゼ、１，４−β−ガラクトシル−Ｌ−ラムノースホスホリラーゼ、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼ、１，４−β−マンノシルグルコースホスホリラーゼ、１，４−β−マンノオリゴ糖ホスホリラーゼ、１，４−β−マンノシル−Ｎ−アセチルグルコサミンホスホリラーゼ、１，４−β−マンノシル−Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼ、１，２−β−マンノビオースホスホリラーゼ、１，２−β−マンノオリゴ糖ホスホリラーゼ、マルトース転移スターチシンターゼより選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｉｉ）アノメリックキナーゼが、ガラクトキナーゼ、グルクロノキナーゼ、ガラクチュロノキナーゼ、アラビノキナーゼ、フコキナーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミンキナーゼ、Ｎ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ、及びマルトキナーゼより選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
（ｉ）ホスホリラーゼ及び（ｉｉ）アノメリックキナーゼが以下の組み合わせよりなる、請求項１に記載の方法：
１，３−β−ガラクトシル−Ｎ−アセチルヘキソサミンホスホリラーゼ及びガラクトキナーゼ；
１，４−β−ガラクトシル−Ｌ−ラムノースホスホリラーゼ及びガラクトキナーゼ；
Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ；
１，４−β−マンノシルグルコースホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ；
１，４−β−マンノオリゴ糖ホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ；
１，４−β−マンノシル−Ｎ−アセチルグルコサミンホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ；
１，４−β−マンノシル−Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ；
１，２−β−マンノビオースホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ；
１，２−β−マンノオリゴ糖ホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ；あるいは、
マルトース転移スターチシンターゼ及びマルトキナーゼ。
【請求項５】
（ｉ）ホスホリラーゼ及び（ｉｉ）アノメリックキナーゼが以下の組み合わせよりなる、請求項４に記載の方法：
１，３−β−ガラクトシル−Ｎ−アセチルヘキソサミンホスホリラーゼ及びガラクトキナーゼ；
１，４−β−ガラクトシル−Ｌ−ラムノースホスホリラーゼ及びガラクトキナーゼ；あるいは、
Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ。
【請求項６】
さらに、製造されたオリゴ糖を精製する工程を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖１リン酸を生成する反応、オリゴ糖を生成する反応、及び、ＡＴＰを再生させる反応の組み合わせを同時に行うことを含む、オリゴ糖の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
オリゴ糖は、数個の単糖がグリコシド結合によって結合してなるオリゴマーであり、今日、医薬品、化粧品、食品添加物等、様々な分野において利用されている。
【０００３】
オリゴ糖の製造は一般的に、天然に得られる多糖（セルロース、キチン、アガロース、デンプン、グリコーゲン、ペクチン等）の限定分解、又は酵素による糖転移反応によって製造される。また、グリコシド結合を加リン酸分解して糖１リン酸を生成する可逆反応を触媒する酵素であるホスホリラーゼを利用して、特定の糖１リン酸を用いてオリゴ糖を調製する技術も開発・報告されている（特許文献１−３）。
【０００４】
しかしながら、前者は製造効率が十分に高いものとはいえない課題を有し、また後者は特定の糖１リン酸を生成・利用する反応に依拠することから汎用性が乏しく、そのため安価な糖を原料としてオリゴ糖を製造できない場合もあった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平３−１３００８６号公報
【特許文献２】特開２００８−１５４４９５号公報
【特許文献３】特開２０１４−２３９６５１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、簡便かつ効率的であり、また、様々な糖を原料として利用し得る汎用性の高い、オリゴ糖の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意検討した結果、アノメリックキナーゼを用いて糖（供与体糖）より糖１リン酸を生成する反応と、得られた糖１リン酸と受容体糖よりホスホリラーゼを用いてオリゴ糖を生成する反応、ならびに、オリゴ糖生成の際に生じるリン酸を利用して、アノメリックキナーゼの反応に利用されるＡＴＰを再生させる反応を組み合わせ、これらの反応を同時に行うことにより、簡便かつ効率的に、また様々な糖を原料として、オリゴ糖を製造できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の特徴を有する。
［１］  オリゴ糖の製造方法であって、
以下の（ｉ）〜（ｖ）の酵素：
（ｉ）ホスホリラーゼ、
（ｉｉ）アノメリックキナーゼ、
（ｉｉｉ）ピルビン酸オキシダーゼ、
（ｉｖ）カタラーゼ、及び
（ｖ）酢酸キナーゼ、を
リン酸、ならびにＡＴＰ及び／又はＡＤＰの存在下にて、
供与体糖、受容体糖、酸素分子、ならびにピルビン酸と同時に作用させることを含む、上記方法。
［２］  （ｉ）ホスホリラーゼが、１，３−β−ガラクトシル−Ｎ−アセチルヘキソサミンホスホリラーゼ、１，４−β−ガラクトシル−Ｌ−ラムノースホスホリラーゼ、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼ、１，４−β−マンノシルグルコースホスホリラーゼ、１，４−β−マンノオリゴ糖ホスホリラーゼ、１，４−β−マンノシル−Ｎ−アセチルグルコサミンホスホリラーゼ、１，４−β−マンノシル−Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼ、１，２−β−マンノビオースホスホリラーゼ、１，２−β−マンノオリゴ糖ホスホリラーゼ、マルトース転移スターチシンターゼより選択される、［１］の方法。
［３］  （ｉｉ）アノメリックキナーゼが、ガラクトキナーゼ、グルクロノキナーゼ、ガラクチュロノキナーゼ、アラビノキナーゼ、フコキナーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミンキナーゼ、Ｎ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ、及びマルトキナーゼより選択される、［１］又は［２］の方法。
［４］  （ｉ）ホスホリラーゼ及び（ｉｉ）アノメリックキナーゼが以下の組み合わせよりなる、［１］の方法：
１，３−β−ガラクトシル−Ｎ−アセチルヘキソサミンホスホリラーゼ及びガラクトキナーゼ；
１，４−β−ガラクトシル−Ｌ−ラムノースホスホリラーゼ及びガラクトキナーゼ；
Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ；
１，４−β−マンノシルグルコースホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ；
１，４−β−マンノオリゴ糖ホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ；
１，４−β−マンノシル−Ｎ−アセチルグルコサミンホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ；
１，４−β−マンノシル−Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ；
１，２−β−マンノビオースホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ；
１，２−β−マンノオリゴ糖ホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ；あるいは、
マルトース転移スターチシンターゼ及びマルトキナーゼ。
［５］  （ｉ）ホスホリラーゼ及び（ｉｉ）アノメリックキナーゼが以下の組み合わせよりなる、［４］の方法：
１，３−β−ガラクトシル−Ｎ−アセチルヘキソサミンホスホリラーゼ及びガラクトキナーゼ；
１，４−β−ガラクトシル−Ｌ−ラムノースホスホリラーゼ及びガラクトキナーゼ；あるいは、
Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ。
［６］  さらに、製造されたオリゴ糖を精製する工程を含む、［１］〜［５］のいずれかの方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、糖１リン酸を生成する反応、オリゴ糖を生成する反応、ならびに、ＡＴＰを再生させる反応を組み合わせ、これらの反応を同時に行うことにより、一段階でオリゴ糖の製造を行うことができ、また、様々な糖を原料として利用し得ることから、簡便かつ効率的であり、また汎用性の高い、オリゴ糖の製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明はオリゴ糖の製造方法であって、
以下の（ｉ）〜（ｖ）の酵素：
（ｉ）ホスホリラーゼ、
（ｉｉ）アノメリックキナーゼ、
（ｉｉｉ）ピルビン酸オキシダーゼ、
（ｉｖ）カタラーゼ、及び
（ｖ）酢酸キナーゼ、を
リン酸、ならびにＡＴＰ及び／又はＡＤＰの存在下にて、
出発原料である、供与体糖、受容体糖、酸素分子、ならびにピルビン酸と同時に作用・反応させることを含む。
【００１１】
本発明において「ホスホリラーゼ」とは、グリコシド結合を加リン酸分解して糖１リン酸を生成する可逆反応を触媒する酵素を意味し、このような酵素には例えば、１，３−β−ガラクトシル−Ｎ−アセチルヘキソサミンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．２１１）、１，４−β−ガラクトシル−Ｌ−ラムノースホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．２４７）、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．２８０）、１，４−β−マンノシルグルコースホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．２８１）、１，４−β−マンノオリゴ糖ホスホリラーゼ、１，４−β−マンノシル−Ｎ−アセチルグルコサミンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．３２０）、１，４−β−マンノシル−Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼ、１，２−β−マンノビオースホスホリラーゼ、１，２−β−マンノオリゴ糖ホスホリラーゼ、マルトース転移スターチシンターゼ（ＥＣ２．４．９９．１６）等を挙げることができ（Ｍｏｔｏｍｉｔｓｕ  Ｋｉｔａｏｋａ、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，９９（２０），８３７７−８３９０（２０１５））、本発明においては、目的とするオリゴ糖、ホスホリラーゼの反応に用いられる基質（供与体糖より生成される糖１リン酸及び受容体糖）に基づいて、これらより選択されるものを利用することができる。
【００１２】
本発明においては、好ましくは、１，３−β−ガラクトシル−Ｎ−アセチルヘキソサミンホスホリラーゼ、１，４−β−ガラクトシル−Ｌ−ラムノースホスホリラーゼ、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼを利用することができる。
【００１３】
本発明において、ホスホリラーゼは公知のものを利用することができ、その由来は特に限定されず、例えば、ヒト由来、動物由来、細菌（例えば、クロストリジウム属細菌由来、ビブリオ属細菌由来、ビフィドバクテリウム属細菌）由来のもの等を用いることができる。
【００１４】
本発明において「アノメリックキナーゼ」とは、糖とＡＴＰから糖１リン酸とＡＤＰを生成する反応を触媒する酵素を意味し、このような酵素には例えば、ガラクトースを基質として利用することができるガラクトキナーゼ（ＥＣ２．７．１．６）、グルクロン酸を基質として利用することができるグルクロノキナーゼ（ＥＣ２．７．１．４３）、ガラクチュロン酸を基質として利用することができるガラクチュロノキナーゼ（ＥＣ２．７．１．４４）、Ｌ−アラビノースを基質として利用することができるアラビノキナーゼ（ＥＣ２．７．１．４６）、Ｌ−フコースを基質として利用することができるフコキナーゼ（ＥＣ２．７．１．５２）、Ｎ−アセチルガラクトサミンを基質として利用することができるＮ−アセチルガラクトサミンキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１５７）、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン及びマンノースを基質として利用することができるＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ（ＥＣ２．７．１．１６２）、マルトースを基質として利用することができるマルトキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１６５）等を挙げることができ、目的とするオリゴ糖、ホスホリラーゼの反応に必要とされる基質（供与体糖より生成される糖１リン酸及び受容体糖）に基づいて、これらより選択されるものを利用することができる。
【００１５】
本発明においては例えば、ガラクトキナーゼ、Ｎ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ、マルトキナーゼを利用することができ、好ましくは、ガラクトキナーゼ、Ｎ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼを利用することができる。
【００１６】
本発明において、アノメリックキナーゼは公知のものを利用することができ、その由来は特に限定されず、例えば、ヒト由来、動物由来、細菌（例えば、ビフィドバクテリウム属細菌）由来のもの等を用いることができる。
【００１７】
本発明において好ましくは、アノメリックキナーゼは上記ホスホリラーゼと以下の組み合わせで用いることができる：
１，３−β−ガラクトシル−Ｎ−アセチルヘキソサミンホスホリラーゼ及びガラクトキナーゼ；
１，４−β−ガラクトシル−Ｌ−ラムノースホスホリラーゼ及びガラクトキナーゼ；
Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ；
１，４−β−マンノシルグルコースホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ；
１，４−β−マンノオリゴ糖ホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ；
１，４−β−マンノシル−Ｎ−アセチルグルコサミンホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ；
１，４−β−マンノシル−Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ；
１，２−β−マンノビオースホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ；
１，２−β−マンノオリゴ糖ホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ；あるいは、
マルトース転移スターチシンターゼ及びマルトキナーゼ。
【００１８】
より好ましくは、アノメリックキナーゼは上記ホスホリラーゼと以下の組み合わせで用いることができる：
１，３−β−ガラクトシル−Ｎ−アセチルヘキソサミンホスホリラーゼ及びガラクトキナーゼ；
１，４−β−ガラクトシル−Ｌ−ラムノースホスホリラーゼ及びガラクトキナーゼ；あるいは、
Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ。
【００１９】
本発明において「ピルビン酸オキシダーゼ」とは、ピルビン酸をリン酸の存在下に酸素により酸化し、アセチルリン酸と二酸化炭素と過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素を意味する。
【００２０】
本発明において、ピルビン酸オキシダーゼは公知のものを利用することができ、その由来は特に限定されず、例えば、ヒト由来、動物由来、細菌由来のもの等を用いることができる。
【００２１】
本発明において「カタラーゼ」とは、過酸化水素を不均化して、水１分子と酸素（Ｏ２）１／２分子に分解する反応を触媒する酵素を意味する。
【００２２】
本発明において、カタラーゼは公知のものを利用することができ、その由来は特に限定されず、例えば、ヒト由来、動物由来、細菌由来のもの等を用いることができる。
【００２３】
本発明において「酢酸キナーゼ」とは、アセチルリン酸とＡＤＰを酢酸とＡＴＰに変換する反応を触媒する酵素を意味する。
【００２４】
本発明において、酢酸キナーゼは公知のものを利用することができ、その由来は特に限定されず、例えば、ヒト由来、動物由来、細菌（例えば、ビフィドバクテリウム属細菌）由来のもの等を用いることができる。
【００２５】
上記の酵素はいずれも、天然の生物又は遺伝子組換え生物（もしくは細胞）により産生されたもの、あるいは市販されているものを用いることができる。遺伝子組換え生物（もしくは細胞）は、当業者に公知である分子生物学的手法を用いて、各酵素をコードする遺伝子を適当なベクターに組み込み、そのベクターを用いて適当な宿主生物（例えば、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等）を形質転換することにより得ることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ら、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  ＬＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ／Ｆｏｕｒｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２０１２）参照）。
【００２６】
上記生物により産生された酵素は、通常の方法を用いて、当該生物の培養物より単離精製できる。ここで「培養物」とは、培養上清、培養細胞もしくは培養菌体又は細胞もしくは細胞の破砕物を意味する。培養後、目的の酵素が菌体内又は細胞内に生産される場合には、細胞を遠心分離により回収し、適当な緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を回収する。あるいは、目的の酵素が菌体外または細胞外に生産される場合には、遠心分離などにより菌体または細胞を除去し、培養液を回収する。この無細胞抽出液を遠心分離し、得られた上清から、又は上記培養液から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、陰イオン交換クロマトグラフィー法、陽イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用いて、精製酵素を得ることができる。
【００２７】
本発明方法において用いられる酵素は、精製された形態であっても、上記無細胞抽出液又は培養液のような粗製物の形態であってもよい。
【００２８】
また、本発明方法において用いられる酵素は、固定化された状態であってもよい。酵素を固定化することによって、酵素が安定化され、連続反復使用が可能となる点において有効である。酵素の固定化は、担体結合法、架橋法、包括法を用いて行うことができる。担体結合法では、酵素を担体（例えば、セルロース、デキストラン、アガロースなどの多糖類の誘導体、ポリアクリルアミドゲル、ポリスチレン樹脂、多孔性ガラス、金属酸化物など）に、物理的吸着、イオン結合及び共有結合等を用いて結合させることができる。架橋法では、２個又はそれ以上の官能基を持つ試薬を用いて、酵素同士を互いに架橋することによって固定化することができる。架橋試薬としては、Ｓｃｈｉｆｆ塩基をつくるグルタルアルデヒド、ペプチド結合をするイソシアン酸誘導体、Ｎ，Ｎ’−エチレンマレイミド、ジアゾカップリングをするビスジアゾベンジン、あるいはアルキル化するＮ，Ｎ’−ポリメチレンビスヨードアセトアミド等を用いることができる。包括法では、高分子ゲルの細かい格子の中に酵素を取り込む格子型と、半透膜の高分子の皮膜によって酵素を皮膜するマイクロカプセル型を用いる。格子型の方法では、ポリアクリルアミドゲル、ポリビニルアルコール、光硬化性樹脂等の合成高分子物質や、デンプン、コンニャク粉、ゼラチン、アルギン酸、カラギーナン等の天然高分子物質といった高分子化合物を用いることができる。マイクロカプセル型の方法では、ヘキサメチレンジアミン、セバコイルクロリド、ポリスチレン、レシチンなどを用いることができる（福井三郎、千畑一郎、鈴木周一、「酵素工学」東京化学同人発行、１９８１年）。担体には、上記５種の酵素のそれぞれを固定してもよいし、あるいはこれらより選択される２，３，４、又は５種の酵素の組み合わせにて固定してもよい。
【００２９】
本発明において、上記酵素群は、反応液中以下の一連の反応を触媒し、リン酸、ならびにＡＴＰ及び／又はＡＤＰの存在下にて、ホスホリラーゼの基質の一つとなる受容体糖、アノメリックキナーゼの基質となる供与体糖、酸素分子、ならびにピルビン酸より、オリゴ糖を生成する：
【００３０】
【化１】
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【００３１】
すなわち、ピルビン酸オキシダーゼはピルビン酸をリン酸の存在下に酸素により酸化し、アセチルリン酸と二酸化炭素と過酸化水素を生成する。
【００３２】
酢酸キナーゼは、生成されたアセチルリン酸を基質としてＡＤＰをＡＴＰに変換するとともに酢酸を生成する。ここで生じたＡＴＰは、下記アノメリックキナーゼの反応によりＡＤＰに変換され、リサイクルされる。
【００３３】
アノメリックキナーゼは、供与体糖及びＡＴＰより、糖１リン酸とＡＤＰを生成する。ここで生じたＡＤＰは、上記酢酸キナーゼの反応によりＡＴＰに変換されることによりリサイクルされる。
【００３４】
ホスホリラーゼは、生成された糖１リン酸と受容体糖より、目的のオリゴ糖とリン酸を生成する。ここで生じたリン酸は、上記ピルビン酸オキシダーゼの反応により、アセチルリン酸に変換され、上記酢酸キナーゼの反応に利用されリサイクルされる。
【００３５】
カタラーゼは、上記ピルビン酸オキシダーゼの反応により生じた過酸化水素を水１分子と酸素（Ｏ２）１／２分子に分解する。ここで生じた酸素は上記ピルビン酸オキシダーゼの反応に利用される。
【００３６】
本発明においては反応全体として、ピルビン酸、供与体糖、受容体糖、及び酸素を原料として、目的のオリゴ糖、二酸化炭素、水、酢酸を生成することができる。
【００３７】
これら一連の反応は、反応液中、リン酸、ならびにＡＴＰ及び／又はＡＤＰの存在下、上記の５種の酵素群を受容体糖、供与体糖、酸素分子、ならびにピルビン酸と同時に作用させることにより行うことができる。
【００３８】
反応液中に加える各酵素の量は、各反応を触媒可能な量であればよく、特に限定はされないが、例えば、０．０５Ｕ／ｍＬ〜１０００Ｕ／ｍＬの範囲で適宜選択することができる。精製酵素として加える場合はその酵素の比活性にもよるが、１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬの範囲で適宜選択できる。ホスホリラーゼであれば、例えば、０．０５Ｕ／ｍＬ〜１００Ｕ／ｍＬ、好ましくは、０．１Ｕ／ｍＬ〜５０Ｕ／ｍＬの範囲より、アノメリックキナーゼであれば、例えば、０．０５Ｕ／ｍＬ〜２００Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．１Ｕ／ｍＬ〜１００Ｕ／ｍＬの範囲より、ピルビン酸オキシダーゼであれば、例えば、０．１Ｕ／ｍＬ〜１００Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．１Ｕ／ｍＬ〜１０Ｕ／ｍＬの範囲より、カタラーゼであれば、例えば、１Ｕ／ｍＬ〜５００Ｕ／ｍＬ、好ましくは１０Ｕ／ｍＬ〜２００Ｕ／ｍＬの範囲より、酢酸キナーゼであれば、例えば、１０Ｕ／ｍＬ〜１０００Ｕ／ｍＬ、好ましくは１０Ｕ／ｍＬ〜５００Ｕ／ｍＬの範囲より、それぞれ適宜選択して用いることができる。
【００３９】
「供与体糖」は、アノメリックキナーゼの基質となり、上記アノメリックキナーゼの反応によって糖１リン酸を生成できるものであればよく、目的とするオリゴ糖や反応液中に加えるアノメリックキナーゼに応じて適宜選択することができる。このような「供与体糖」としては例えば、ガラクトース、グルクロン酸、ガラクチュロン酸、Ｌ−アラビノース、Ｌ−フコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノース、マルトース等を挙げることができるが、これらに限定はされない。反応液中に加える供与体糖の量は、特に限定されるものではないが、例えば、２５ｍＭ〜２．５Ｍ、８０ｍＭ〜２Ｍより選択される量とすることができる。供与体糖は反応液中に一度に全量を加えても良いし、複数回に分けて、また、間隔をあけて加えても良い。
【００４０】
「受容体糖」は、ホスホリラーゼの基質となり、上記ホスホリラーゼの反応によって糖１リン酸と共に目的とするオリゴ糖を生成できるものであればよく、目的とするオリゴ糖や反応液中に加えるホスホリラーゼに応じて適宜選択することができる。このような「受容体糖」としては例えば、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｌ−ラムノース、グルコース、ガラクトース、マンノース、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオース、１，４−β−マンノオリゴ糖、１，２−β−マンノオリゴ糖、マルトオリゴ糖等を挙げることができるが、これらに限定はされない。「受容体糖」は、上記「供与体糖」と同じであっても良いし、異なっていても良い。反応液中に加える受容体糖の量は、特に限定されるものではないが、例えば、２５ｍＭ〜２．５Ｍ、好ましくは８０ｍＭ〜２Ｍより選択される量とすることができる。受容体糖は反応液中に一度に全量を加えても良いし、複数回に分けて、また、間隔をあけて加えても良い。
【００４１】
本発明において好ましくは、供与体糖及び受容体糖は、以下のアノメリックキナーゼ及びホスホリラーゼとの組み合わせと共に、以下の組合せで用いることができ、生成物として各オリゴ糖を生成することができる：
１，３−β−ガラクトシル−Ｎ−アセチルヘキソサミンホスホリラーゼ及びガラクトキナーゼ、ガラクトース（供与体糖）、Ｎ−アセチルグルコサミン（受容体糖）、ラクト−Ｎ−ビオースＩ（生成物）；
１，３−β−ガラクトシル−Ｎ−アセチルヘキソサミンホスホリラーゼ及びガラクトキナーゼ、ガラクトース（供与体糖）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（受容体糖）、ガラクト−Ｎ−ビオース（生成物）；
１，４−β−ガラクトシル−Ｌ−ラムノースホスホリラーゼ及びガラクトキナーゼ、ガラクトース（供与体糖）、Ｌ−ラムノース（受容体糖）、１，４−β−ガラクトシル−Ｌ−ラムノース（生成物）；
１，４−β−ガラクトシル−Ｌ−ラムノースホスホリラーゼ及びガラクトキナーゼ、ガラクトース（供与体糖）、グルコース（受容体糖）、１，３−β−ガラクトシルグルコース（生成物）；
１，４−β−ガラクトシル−Ｌ−ラムノースホスホリラーゼ及びガラクトキナーゼ、ガラクトース（供与体糖）、ガラクトース（受容体糖）、１，３−β−ガラクトビオース（生成物）；
Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン（供与体糖）、Ｎ−アセチルグルコサミン（受容体糖）、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオース及びＮ，Ｎ’，Ｎ’’−トリアセチルキトトリオース（生成物）；
１，４−β−マンノシルグルコースホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ、マンノース（供与体糖）、グルコース（受容体糖）、１，４−β−マンノシルグルコース（生成物）；
１，４−β−マンノオリゴ糖ホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ、マンノース（供与体糖）、マンノース（受容体糖）、１，４−β−マンノオリゴ糖（生成物）；
１，４−β−マンノシル−Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ、マンノース（供与体糖）、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオース（受容体糖）、１，４−β−マンノシル−Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオース（生成物）；
１，２−β−マンノビオースホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ、マンノース（供与体糖）、マンノース（受容体糖）、１，２−β−マンオビオース及び１，２−β−マンノトリオース（生成物）；
１，２−β−マンノオリゴ糖ホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ、マンノース（供与体糖）、マンノース（受容体糖）、１，２−β−マンノオリゴ糖（生成物）； 
マルトース転移スターチシンターゼ及びマルトキナーゼ、マルトース（供与体糖）、マルトオリゴ糖（受容体糖）、１，４−α−グルカン（生成物）。
【００４２】
反応液中に加えるピルビン酸の量は、特に限定されるものではないが、例えば、５０ｍＭ〜３Ｍ、好ましくは８０ｍＭ〜２Ｍより選択される量とすることができる。ピルビン酸は塩の形態（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等）で反応液中に加えることができる。
【００４３】
反応液中の酸素分子は、気相より供給されるものを利用することができる。このため反応は、反応液中に酸素が供給可能な条件、例えば、通気性を有する、又は比表面積の大きい反応容器を用いて実施することができる。また、反応液気相の酸素分圧を高くすることにより、気液界面の酸素移動速度を高めることができる。
【００４４】
上記反応中、ＡＴＰ、ＡＤＰ、及びリン酸はリサイクルされるため、反応液中にこれらの要素は触媒量存在すれば良く、上記反応の等量となるように加えなくても良い。反応液中に加えるＡＴＰ及びＡＤＰの量はそれぞれ、特に限定されるものではないが、例えば、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは０．２ｍＭ〜５ｍＭより選択される量とすることができる。また、反応液中に加えるリン酸の量は、特に限定されるものではないが、例えば、１ｍＭ〜２００ｍＭ、好ましくは１０ｍＭ〜１００ｍＭより選択される量とすることができる。リン酸は塩の形態（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等）で反応液中に加えることができる。
【００４５】
本発明において「反応液」は、特に限定されるものではないが、水又は緩衝液を利用することができる。緩衝液としては、酵素反応に一般的に用いられるもの、例えば、トリス塩酸緩衝液、トリス酢酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液などを使用できる。使用濃度は、１０ｍＭ〜５００ｍＭ、好ましくは１０ｍＭ〜３００ｍＭより選択される量とすることができる。反応液のｐＨは４〜９、好ましくは、５．５〜８．５とすることができる。
【００４６】
反応液中には必要に応じてさらに、二価金属イオン、チアミン二リン酸、フラビンアデニンジヌクレオチドより選択される一又は複数の因子を加えることができる。二価金属イオンは、酢酸キナーゼ及びアノメリックキナーゼの補因子として作用することができる。二価金属イオンとしては、特に限定されないが、マグネシウムイオン、カルシウムイオン等を利用することができ、塩の形態で反応液中に加えることができる。反応液中に加える二価金属イオンの量は特に限定されるものではないが、例えば、０．１ｍＭ〜５０ｍＭ、好ましくは０．５ｍＭ〜１０ｍＭ、より選択される量とすることができる。チアミン二リン酸及びフラビンアデニンジヌクレオチドは、ピルビン酸オキシダーゼの補因子として作用することができる。反応液中に加えるチアミン二リン酸の量は特に限定されるものではないが、例えば、０．０１ｍＭ〜１ｍＭ、好ましくは０．０５ｍＭ〜０．５ｍＭ、より選択される量とすることができる。また、反応液中に加えるフラビンアデニンジヌクレオチドの量は特に限定されるものではないが、例えば、０．０００５ｍＭ〜０．０５ｍＭ、好ましくは０．００１ｍＭ〜０．０１ｍＭ、より選択される量とすることができる。
【００４７】
反応温度は特に限定されるものではないが好ましくは１５℃〜５０℃、より好ましくは２５℃〜４０℃とすることができる。
【００４８】
反応時間は、１時間〜６０日間、好ましくは１２時間〜４０日間とすることができる。必要に応じて撹拌しながら反応を行っても良い。
【００４９】
生成したオリゴ糖は、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過法など各種のクロマトグラフィー、熱水抽出、硫安分画、結晶化（濃縮、温度低下、溶媒添加（エタノール、メタノール、アセトン等））等の、オリゴ糖の精製に用いられる通常の精製法を単独で、あるいは適宜組み合わせて用いることによって精製することができる。
【００５０】
得られたオリゴ糖は、例えば医薬品、化粧品、食品添加物等の材料として好適に用いることができる。
【実施例】
【００５１】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって
限定されるものではない。
【００５２】
実施例１．各酵素の調製
（ｉ）ホスホリラーゼ
（ｉ−１）１，４−β−ガラクトシル−Ｌ−ラムノースホスホリラーゼ
クロストリジウム・フィトファーメンタンス由来の１，４−β−ガラクトシル−Ｌ−ラムノースホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．２４７）を、公知の手法（Ｍ．Ｎａｋａｊｉｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８４（２９），１９２２０−１９２２７（２００９））に基づいて調製した。
【００５３】
すなわち、クロストリジウム・フィトファーメンタンスのゲノムＤＮＡを鋳型として、１，４−β−ガラクトシル−Ｌ−ラムノースホスホリラーゼをコードする遺伝子を以下のプライマーを用いたＰＣＲ法により増幅した：
フォーワードプライマー：ＡＧＧＡＧＡＡＡＴＣＡＴＡＴＧＧＡＡＣＡＡＣＡＡＡＡＧＧＡＧ（配列番号１）
リバースプライマー：ＡＴＴＡＴＧＴＣＴＣＧＡＧＴＡＡＴＧＧＡＡＧＡＡＴＴＡＣＧＧ（配列番号２）。
【００５４】
得られたＰＣＲ産物は、市販の遺伝子発現用プラスミドに組み込んだ後、これを用いて大腸菌の形質転換体を行い、生産された組換えタンパク質を精製することによって、１，４−β−ガラクトシル−Ｌ−ラムノースホスホリラーゼの精製酵素標品を得た。得られた精製酵素の比活性は４３Ｕ／ｍｇであった。
【００５５】
（ｉ−２）１，３−β−ガラクトシル−Ｎ−アセチルヘキソサミンホスホリラーゼ
ビフィドバクテリウム・ロンガムＪＣＭ１２１７株由来の１，３−β−ガラクトシル−Ｎ−アセチルヘキソサミンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．２１１）を、公知の手法（特開２００５−３４１８８３号公報）に基づいて調製した。
【００５６】
すなわち、ビフィドバクテリウム・ロンガムＪＣＭ１２１７株のゲノムＤＮＡを鋳型として、１，３−β−ガラクトシル−Ｎ−アセチルヘキソサミンホスホリラーゼをコードする遺伝子を以下のプライマーを用いたＰＣＲ法により増幅した：
フォーワードプライマー：ＡＧＣＡＣＣＣＡＴＧＧＣＣＡＧＣＡＣＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＡＣＧＣＴＧＣ（配列番号３）
リバースプライマー：ＣＧＣＧＧＣＴＣＧＡＧＧＧＣＴＴＣＡＣＧＣＣＡＴＧＣＧＡＴＧＣＣＧＣＴＧＴＣ（配列番号４）。
【００５７】
得られたＰＣＲ産物は、市販の遺伝子発現用プラスミドに組み込んだ後、これを用いて大腸菌の形質転換体を行い、生産された組換えタンパク質を精製することによって、１，３−β−ガラクトシル−Ｎ−アセチルヘキソサミンホスホリラーゼの精製酵素標品を得た。得られた精製酵素の比活性は１９Ｕ／ｍｇであった。
【００５８】
（ｉ−３）Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼ
ビブリオ・プロテオリティクス由来のＮ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．２８０）を、公知の手法（Ｙ．Ｈｏｎｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３７７（１），２２５−２３２（２００４）；なお、本論文中において、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼは、「ｃｈｉｔｏｂｉｏｓｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ」として記載される）に基づいて調製した。
【００５９】
すなわち、ビブリオ・プロテオリティクスのゲノムＤＮＡを鋳型として、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼをコードする遺伝子を以下のプライマーを用いたＰＣＲ法により増幅した：
フォーワードプライマー：ＣＡＴＡＴＧＡＡＡＴＡＣＧＧＣＴＡＴＴＴＣＧＡＴＡＡＴＧＡＣＡＡＴ（配列番号５）
リバースプライマー：ＣＴＣＧＡＧＡＣＣＧＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＣ（配列番号６）。
【００６０】
得られたＰＣＲ産物は、市販の遺伝子発現用プラスミドに組み込んだ後、これを用いて大腸菌の形質転換体を行い、生産された組換えタンパク質を精製することによって、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼの精製酵素標品を得た。得られた精製酵素の比活性は３．１Ｕ／ｍｇであった。
【００６１】
（ｉｉ）アノメリックキナーゼ
（ｉｉ−１）Ｎ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ
Ｎ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ（ＥＣ２．７．１．１６２）は、公知の手法（特開２００７−９７５１７号公報）に基づいて調製した。
【００６２】
すなわち、ビフィドバクテリウム・ロンガムＪＣＭ１２１７株のゲノムＤＮＡを鋳型として、Ｎ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼをコードする遺伝子を以下のプライマーを用いたＰＣＲ法により増幅した：
フォーワードプライマー：ＡＡＣＧＧＡＣＣＣＣＡＴＡＴＧＡＣＣＧＡＡＡＧＣＡＡＴＧＡＡＧＴＴＴＴＡＴＴＣ（配列番号７）
リバースプライマー：ＧＣＴＧＡＣＣＴＣＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＧＣＣＴＣＣＡＴＧＡＴＧＴＣＧＧＣＴＡＣ（配列番号８）。
【００６３】
得られたＰＣＲ産物は、市販の遺伝子発現用プラスミドに組み込んだ後、これを用いて大腸菌の形質転換体を行い、生産された組換えタンパク質を精製することによって、Ｎ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼの精製酵素標品を得た。得られた精製酵素の比活性は１．５Ｕ／ｍｇであった。
【００６４】
（ｉｉ−２）ガラクトキナーゼ
ガラクトキナーゼ（ＥＣ２．７．１．６）は、公知の手法（Ｔ．Ｎｉｈｉｒａら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３７１（２），２５９−２６１（２００７））に基づいて調製した。
【００６５】
すなわち、ビフィドバクテリウム・ロンガムＪＣＭ１２１７株のゲノムＤＮＡを鋳型として、ガラクトキナーゼをコードする遺伝子を以下のプライマーを用いたＰＣＲ法により増幅した：
フォーワードプライマー：ＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＴＧＣＴＧＴＴＧＡＡＴＴＣＡＴＴＧＡＧＣ（配列番号９）
リバースプライマー：ＧＡＴＴＴＡＣＴＣＧＡＧＴＧＣＣＴＣＧＣＧＴＧＡＡＧＣＧＧＡＴＴＴＣＧＣＣＧＣ（配列番号１０）。
【００６６】
得られたＰＣＲ産物は、市販の遺伝子発現用プラスミドに組み込んだ後、これを用いて大腸菌の形質転換体を行い、生産された組換えタンパク質を精製することによって、ガラクトキナーゼの精製酵素標品を得た。得られた精製酵素の比活性は１７４Ｕ／ｍｇであった。
【００６７】
（ｉｉｉ）ピルビン酸オキシダーゼ
ピルビン酸オキシダーゼ（ＥＣ１．２．３．３）は東洋紡社製のＰＹＯ−０３１１を用いた。
【００６８】
（ｉｖ）カタラーゼ
カタラーゼ（ＥＣ１．１１．１．６）は和光純薬社製（製品コード０３５−１２９０３）を用いた。
【００６９】
（ｖ）酢酸キナーゼ
ビフィドバクテリウム・ロンガムＪＣＭ１２１７株のゲノムＤＮＡを鋳型として酢酸キナーゼ（ＢＬＬＪ＿０６４３）遺伝子を、以下のプライマーを用いたＰＣＲ法により増幅した：
フォーワードプライマー：ＡＴＧＣＣＣＣＡＴＡＴＧＧＣＧＡＡＡＡＣＣＧＴＣＣＴＴＧＴＣ（配列番号１１）
リバースプライマー：ＣＧＧＴＣＴＣＧＡＧＣＴＴＧＧＣＧＡＡＧＧＴＧＴＴＧＣＣＧＴ（配列番号１２）。
【００７０】
得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで消化後、同様に処理した市販の遺伝子発現用プラスミドｐＥＴ３０（ノバジェン社製）にＤＮＡライゲーションキット（宝酒造株式会社製）を用いて連結した。
【００７１】
次いで、得られたプラスミドを用いてＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第２版”１．７４章Ｖｏ１．１（１９８９）に記載された方法に従い、大腸菌を形質転換した。
【００７２】
得られた形質転換体を用い、常法に従って該遺伝子の発現及び組換えタンパク質の生産を行った。得られた組換えタンパク質はＮｉ−ＮＴＡアガロース（キアゲン社製）を用いたカラムクロマトグラフィーにより精製し、酢酸キナーゼの精製酵素標品を得た。得られた精製酵素の比活性は１２０００Ｕ／ｍｇであった。
【００７３】
以上のようにして得られた（ｉ）ホスホリラーゼ、（ｉｉ）アノメリックキナーゼ、（ｉｉｉ）ピルビン酸オキシダーゼ、（ｉｖ）カタラーゼ、及び（ｖ）酢酸キナーゼの各酵素を以下の実施例に用いた。
【００７４】
実施例２．ラクト−Ｎ−ビオースＩの調製
以下の組成からなる反応液１Ｌを調製した。
反応液：
0006678483.tif 000003
【００７５】
反応液を３３ｍＬずつ内径８５ｍｍのポリスチレン製シャーレ３０枚に分注し、１気圧酸素下において３０℃にて１１日反応を行った。
【００７６】
反応終了後、反応液をＨＰＬＣ（［カラム］Ｓｈｏｄｅｘ  Ａｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ−５０  ４Ｅ；［溶媒］アセトニトリル／水７８：２２；［流速］１ｍＬ／ｍｉｎ；［検出］荷電化粒子検出器）で分析したところ、ラクト−Ｎ−ビオースＩ濃度は２９２ｍＭであり、Ｎ−アセチルグルコサミンの残存濃度は１４ｍＭであった。
この結果、収率９５％でラクト−Ｎ−ビオースＩを合成できたことが確認された。
【００７７】
また、反応液を中空糸膜カートリッジ（旭化成社製ＳＬＰ−００５３）を用いて除タンパクしたのち、マイクロアシラーザーＳ３（アストム社製）を用いＡＣ−２２０−５５０カートリッジ（アストム社製）により脱塩を行った。
【００７８】
得られた除タンパク−脱塩反応液を濃縮することによりラクト−Ｎ−ビオースＩの結晶化を行い、８６．５ｇの結晶ラクト−Ｎ−ビオースＩを得た。
【００７９】
実施例３．１，４−β−ガラクトシル−Ｌ−ラムノースの調製
以下の組成からなる反応液１００ｍＬを調製した。
0006678483.tif 000004
【００８０】
反応液を２０ｍＬずつ内径８５ｍｍのポリスチレン製シャーレ５枚に分注し、１気圧酸素下において３０℃にて６日反応を行った。
【００８１】
反応６日後に、ガラクトース及びＬ−ラムノースともに検出されなくなった。反応液をＨＰＬＣ（［カラム］Ｓｈｏｄｅｘ  ＨＩＬＩＣｐａｋ  ＶＧ−５０  ４Ｅ；［溶媒］アセトニトリル／水８７：１３；［流速］１ｍＬ／ｍｉｎ；［検出］荷電化粒子検出器）で分析したところ、１，４−β−ガラクトシル−Ｌ−ラムノースの濃度は２９２ｍＭであり、原料のＬ−ラムノースはほぼ定量的に１，４−β−ガラクトシル−Ｌ−ラムノースに変換されたことが確認された。
【００８２】
実施例４．１，３−β−ガラクトシル−グルコースの調製
以下の組成からなる反応液１Ｌを調製した。
0006678483.tif 000005
【００８３】
反応液を２５ｍＬずつ内径８５ｍｍのポリスチレン製シャーレ４０枚に分注し、１気圧酸素下において３０℃にて１４日反応を行った。
【００８４】
反応終了後、反応液をＨＰＬＣ（［カラム］Ｓｈｏｄｅｘ  Ａｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ−５０  ４Ｅ；［溶媒］アセトニトリル／水７５：２５；［流速］１ｍＬ／ｍｉｎ；［検出］荷電化粒子検出器）で分析したところ、反応１４日後のガラクトシルグルコース濃度は３７０ｍＭであった。
【００８５】
また、反応液を中空糸膜カートリッジ（旭化成社製ＳＬＰ−００５３）を用いて除タンパクしたのち、マイクロアシラーザーＳ３（アストム社製）を用いＡＣ−２２０−５５０カートリッジ（アストム社製）により脱塩を行った。得られた除タンパク−脱塩反応液に乾燥酵母５ｇを添加し一晩３７℃にて発酵を行うことにより残存している単糖類を除去した。反応液を遠心分離後、固形分濃度６３％までエバポレーターで濃縮し、４℃にて結晶化を行った。得られた結晶を脱水−真空乾燥を行い、純度９２％の１，３−β−ガラクトシル−グルコース７０．５ｇを得た。
【００８６】
実施例５．１，３−β−ガラクトビオースの調製
以下の組成からなる反応液１００ｍＬを調製した。
0006678483.tif 000006
【００８７】
反応液を３３ｍＬずつ内径８５ｍｍのポリスチレン製シャーレ３枚に分注し、１気圧酸素下において３０℃にて３３日反応を行った。
【００８８】
反応終了後、反応液をＨＰＬＣ（［カラム］Ｓｈｏｄｅｘ  Ａｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ−５０  ４Ｅ；［溶媒］アセトニトリル／水７５：２５；［流速］１ｍＬ／ｍｉｎ；［検出］荷電化粒子検出器）で分析したところ、反応３３日後の１，３−β−ガラクトビオース濃度は３２０ｍＭであった。
【００８９】
実施例６．Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオース、及びＮ，Ｎ’，Ｎ’’−トリアセチルキトトリオースの調製
以下の組成からなる反応液５０ｍＬを調製した。
0006678483.tif 000007
【００９０】
反応液を内径８５ｍｍのポリスチレン製シャーレに入れて、１気圧酸素下において３０℃にて反応を行った。反応１，２，３，４，５，６，７，９，１１日時点でそれぞれ２．５ｍｍｏｌのＮ−アセチルグルコサミン（５５３ｍｇ）と２．５ｍｍｏｌのピルビン酸ナトリウム（２７５ｍｇ）とを反応液に追加して、溶解した。Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼは、Ｎ−アセチルグルコサミンによる拮抗基質阻害を受けるため、Ｎ−アセチルグルコサミンを逐次添加して、反応系中のＮ−アセチルグルコサミン濃度を低く抑えることができる。
【００９１】
反応終了後、反応液をＨＰＬＣ（［カラム］Ｓｈｏｄｅｘ  Ａｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ−５０  ４Ｅ；［溶媒］アセトニトリル／水７０：３０；［流速］１ｍＬ／ｍｉｎ；［検出］荷電化粒子検出器）で分析したところ、反応１２日後のＮ，Ｎ’−ジアセチルキトビオース濃度は１３０ｍＭであり、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−トリアセチルキトトリオースの濃度は３９ｍＭであった。この時点でのＮ−アセチルグルコサミンの添加量は合計５５０ｍＭ相当であった。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明によれば、簡便かつ効率的に様々なオリゴ糖を製造することができ、製造されたオリゴ糖は医薬品、化粧品、食品等、様々な分野において利用することができる。
【配列表】
0006678483000001.app