(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＳＰＧ４と結合する免疫グロブリンを含む第１の抗原結合部位、および、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、好中球、間葉幹細胞および神経幹細胞からなる群より選択される免疫細胞と結合するｓｃＦｖを含む第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体であって、前記免疫グロブリンは、
配列番号８または１０に示される、Ｋａｂａｔに従って定義された重鎖の３個全ての相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むヒト化重鎖可変領域および
配列番号１２または１４に示される、Ｋａｂａｔに従って定義された軽鎖の３個全てのＣＤＲを含むヒト化軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗ＣＳＰＧ４抗体であり、前記ｓｃＦｖは前記免疫グロブリンの前記軽鎖のＣ末端に連結されている、二重特異性抗体。
【請求項２】
前記ヒト化抗体が、配列番号１２の軽鎖可変領域配列を含む、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項３】
前記ヒト化抗体が、配列番号１４の軽鎖可変領域配列を含む、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項４】
前記ヒト化抗体が、配列番号８の重鎖可変領域配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項５】
前記ヒト化抗体が、配列番号１０の重鎖可変領域配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項６】
前記免疫グロブリンが末端マンノース、Ｎ−アセチルグルコース、またはグルコースでグリコシル化されているが、フコースでグリコシル化されていない、請求項１から５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項７】
前記免疫グロブリンがヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４である、請求項１から５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項８】
前記免疫グロブリンがバリアントグリコシル化を有するヒトＩｇＧ１である、請求項７に記載の二重特異性抗体。
【請求項９】
前記バリアントグリコシル化が、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃの残基２９７におけるアミノ酸置換から生じる、請求項８に記載の二重特異性抗体。
【請求項１０】
前記第２の抗原結合部位が、ＣＤ３と結合する、請求項１から９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１１】
配列番号２２の配列を含む、請求項１０に記載の二重特異性抗体。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体のポリペプチド鎖についてのコード配列を含む単離核酸分子。
【請求項１３】
前記コード配列が、コドン最適化されている、請求項１２に記載の単離核酸分子。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を含む組成物。
【請求項１７】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を含む医薬組成物。
【請求項１８】
被験体における医学的状態を処置するための組成物であって、前記医学的状態はＣＳＰＧ４発現によって特徴付けられ、前記組成物は治療有効量の請求項１から１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を含む、組成物。
【請求項１９】
前記医学的状態がＣＳＰＧ４陽性腫瘍を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
請求項１９に記載の被験体における医学的状態を処置するための組成物であって、前記医学的状態が黒色腫、乳がん、骨肉腫、頭頸部がん、多形性神経膠芽腫、肉腫、および中皮腫より選択される、組成物。
【請求項２１】
前記二重特異性抗体が細胞傷害性剤にコンジュゲートされている、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２２】
腫瘍細胞を殺滅するための組成物であって、
請求項１から１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を含み、前記組成物が前記腫瘍細胞と接触させられることを特徴とし、前記接触は、前記二重特異性抗体が結合したＴ細胞が前記腫瘍細胞の殺滅を媒介するのに十分な条件下および時間にわたって実施される、組成物。
【請求項２３】
腫瘍増殖を阻害するための組成物であって、
請求項１から１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を含み、前記組成物が前記腫瘍細胞と接触させられることを特徴とし、前記接触は、前記二重特異性抗体が結合したＴ細胞が腫瘍の増殖を阻害するのに十分な条件下および時間にわたって実施される、
組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
抗体に基づく治療薬は、特にがん処置において、顕著な見込みを提供する。モノクローナル、マウス、キメラ、ヒト化、ヒト、全長、Ｆａｂ、ＰＥＧ化、放射性標識、薬物コンジュゲート、多重特異性などを含む種々のフォーマットが開発されている。２０１２年の総説論文は、３４種の治療用抗体剤が、米国または欧州で市販の認可を受けていることを報告した（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ、ｍＡｂｓ  ４：３、４１３、２０１２年５月／６月、参考として本明細書に援用される）。依然として、特定の有効な抗体剤の開発は、困難なままである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
本発明は、とりわけ、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ｃｈｏｎｄｒｏｔｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ４）（ＣＳＰＧ４）と結合し、マウス抗体７６３．７４（本明細書では７６３と呼ぶ）の１つまたは複数の構造的特徴（例えば、１つまたは複数のＣＤＲ）を含有する改善されたヒト化抗体を提供する。一部の実施形態では、提供される抗体剤は、親マウス抗体７６３．７４と比較して高い親和性および著しく遅いＫｏｆｆ速度を実証する。一部の実施形態では、提供される抗体剤は、ＣＳＰＧ４に対する高親和性を有し、その結果、前記抗体剤は、親和性の障壁の問題を示さない。
【０００３】
本発明は、特定の標的と相互作用する結合部分を含む改善された多重特異性結合剤も提供する。多くの実施形態では、このような結合部分は、抗体要素であり、またはそれを含む。一部の実施形態では、本発明の多重特異性結合剤は、ヒト化７６３抗体の結合エレメントを含む。一部の実施形態では、本発明の多重特異性結合剤は、ヒト化７６３抗体に基づく第１の結合部分および免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）と相互作用する第２の結合部分を含む。このような提供される作用物質は、本明細書に記載の要素を欠く親結合剤と比較して改善された機能特性を有する。
【０００４】
一部の実施形態では、本発明は、ＣＳＰＧ４と結合するヒト化もしくはキメラ抗体またはその断片であって、マウス抗体７６３の軽鎖可変領域内で見出される相補決定領域（ＣＤＲ）のうちの少なくとも１、少なくとも２、または３つおよび／またはマウス抗体７６３の重鎖可変領域内で見出されるＣＤＲのうちの少なくとも１、少なくとも２、もしくは３つを含む、ヒト化もしくはキメラ抗体またはその断片を提供する。一部の実施形態では、本発明のヒト化またはキメラ抗体は、マウス抗体７６３の軽鎖可変領域内で見出される３つのＣＤＲおよびマウス抗体７６３の重鎖可変領域内で見出される３つのＣＤＲを含む。
【０００５】
一部の実施形態では、本発明の抗体は、ヒト化されている。一部のある特定の実施形態では、本発明のヒト化抗体は、配列番号１２または配列番号１４の軽鎖可変領域配列を含む。一部のある特定の実施形態では、本発明のヒト化抗体は、配列番号８、配列番号１０、配列番号１６、または配列番号１８の重鎖可変領域を含む。
【０００６】
一部の実施形態では、本発明のヒト化抗体は、配列番号８の重鎖可変領域および配列番号１２の軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、本発明のヒト化抗体は、配列番号１０の重鎖可変領域および配列番号１４の軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、本発明のヒト化抗体は、配列番号１６の重鎖可変領域および配列番号１２の軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、本発明のヒト化抗体は、配列番号１８の重鎖可変領域および配列番号１４の軽鎖可変領域を含む。
【０００７】
一部の実施形態では、本発明のヒト化抗体は、配列番号８の重鎖可変領域および配列番号１４の軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、本発明のヒト化抗体は、配列番号１０の重鎖可変領域および配列番号１２の軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、本発明のヒト化抗体は、配列番号１６の重鎖可変領域および配列番号１４の軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、本発明のヒト化抗体は、配列番号１８の重鎖可変領域および配列番号１２の軽鎖可変領域を含む。
【０００８】
一部の実施形態では、本発明のヒト化抗体は、配列番号８の重鎖および配列番号１２の軽鎖を含む。一部の実施形態では、本発明のヒト化抗体は、配列番号１０の重鎖および配列番号１４の軽鎖を含む。一部の実施形態では、本発明のヒト化抗体は、配列番号１６の重鎖および配列番号１２の軽鎖を含む。一部の実施形態では、本発明のヒト化抗体は、配列番号１８の重鎖および配列番号１４の軽鎖を含む。
【０００９】
一部の実施形態では、本発明のヒト化抗体は、配列番号８の重鎖および配列番号１４の軽鎖を含む。一部の実施形態では、本発明のヒト化抗体は、配列番号１０の重鎖および配列番号１２の軽鎖を含む。一部の実施形態では、本発明のヒト化抗体は、配列番号１６の重鎖および配列番号１４の軽鎖を含む。一部の実施形態では、本発明のヒト化抗体は、配列番号１８の重鎖および配列番号１２の軽鎖を含む。
【００１０】
一部の実施形態では、本発明の抗体は、キメラである。一部のある特定の実施形態では、本発明のキメラ抗体は、配列番号６の軽鎖可変領域配列を含む。一部のある特定の実施形態では、本発明のキメラ抗体は、配列番号４の重鎖可変領域を含む。一部のある特定の実施形態では、本発明のキメラ抗体は、配列番号４の重鎖および配列番号６の軽鎖を含む。
【００１１】
様々な実施形態では、本発明のヒト化またはキメラ抗体は、これが参照抗体と比較して、ＳＫＭＥＩ−２８ゼノグラフト（ｘｅｎｏｇｒａｐｈ）の腫瘍取込みを約５０％阻害することを特徴とする。
【００１２】
様々な実施形態では、本発明のヒト化またはキメラ抗体は、末端マンノース、Ｎ−アセチルグルコース、またはグルコースでグリコシル化されているが、フコースでグリコシル化されていない。
【００１３】
様々な実施形態では、本発明のヒト化またはキメラ抗体は、ヒトＩｇＧ１もしくはヒトＩｇＧ４であり、またはそれを含む。
【００１４】
様々な実施形態では、本発明のヒト化またはキメラ抗体は、バリアントグリコシル化を有するヒトＩｇＧ１であり、またはそれを含む。一部のある特定の実施形態では、バリアントグリコシル化は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃの残基２９７におけるアミノ酸置換から生じる。一部のある特定の実施形態では、バリアントグリコシル化は、操作された細胞株における発現から生じる。一部の実施形態では、操作された細胞株は、ＣＨＯ細胞を含み、一部のある特定の実施形態では、操作された細胞株は、ＧｎＴ１−欠損ＣＨＯ細胞を含む。
【００１５】
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のアミノ酸配列をコードする単離核酸分子を提供する。一部の実施形態では、本発明の単離核酸配列は、コドン最適化されている。一部のある特定の実施形態では、単離核酸配列は、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、および配列番号２１のいずれか１つであり、またはそれを含む。
【００１６】
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の核酸分子を含む組換えまたは発現ベクターを提供する。
【００１７】
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の組換えまたは発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００１８】
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のヒト化もしくはキメラ抗体またはその断片を含む組成物を提供する。
【００１９】
一部の実施形態では、本発明のヒト化またはキメラ抗体は、細胞傷害性剤にコンジュゲートされている。
【００２０】
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のヒト化もしくはキメラ抗体またはその断片あるいは本明細書に記載の組成物を含み、薬学的に許容される担体または希釈剤をさらに含む医薬組成物を提供する。
【００２１】
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のヒト化もしくはキメラ抗体またはその断片を生産するための方法であって、ヒト化もしくはキメラ抗体またはその断片の発現を可能にする条件下で、培養培地中で本明細書に記載の宿主細胞を培養するステップと、ヒト化もしくはキメラ抗体またはその断片を培養培地から分離するステップとを含む、方法を提供する。
【００２２】
一部の実施形態では、本発明は、被験体におけるＣＳＰＧ４発現によって特徴付けられる医学的状態を処置または防止する方法であって、治療有効量の本明細書に記載の抗体またはその断片を前記被験体に投与することを含む、方法を提供する。様々な実施形態では、医学的状態は、ＣＳＰＧ４陽性腫瘍を含む。様々な実施形態では、医学的状態としては、黒色腫、乳がん、骨肉腫、頭頸部がん、多形性神経膠芽腫、肉腫、および／または中皮腫がある。
【００２３】
一部の実施形態では、本発明は、第１および第２の抗原結合部位を含む二重特異性結合剤（例えば、二重特異性抗体）も提供する。多くの実施形態では、第１の抗原結合部位は、本明細書に記載のヒト化７６３抗体に由来する抗体要素であり、またはそれを含む。多くの実施形態では、第２の抗原結合部位は、免疫エフェクター細胞に結合する抗体要素であり、またはそれを含む。
【００２４】
一部の実施形態では、本発明は、ヒト化７６３抗体に由来する第１の抗原結合部位、および第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供する。多くの実施形態では、ヒト化７６３抗体は、本明細書に記載のヒト化７６３抗体であり、またはそれに基づく。
【００２５】
一部の実施形態では、第１および第２の抗原結合部位は、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であり、またはそれを含む。一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、免疫グロブリン分子から構成され、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ、またはＦｖから構成される。一部のある特定の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖである。一部のある特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、免疫グロブリン分子から構成され、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖであり、ｓｃＦｖは、免疫グロブリンの重鎖のＣ末端に連結されている。一部のある特定の実施形態では、第１の抗原結合部位は、免疫グロブリン分子から構成され、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖであり、ｓｃＦｖは、免疫グロブリンの軽鎖のＣ末端に連結されている。
【００２６】
様々な実施形態では、第２の抗原結合部位は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、好中球、間葉幹細胞、および神経幹細胞からなる群より選択される免疫細胞と結合する。様々な実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＣＤ３と結合する。
【００２７】
様々な実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、配列番号２０または配列番号２２の配列を含む。一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の二重特異性抗体のポリペプチド鎖の一部またはすべてについてのコード配列を含む単離核酸を提供する。一部のある特定の実施形態では、コード配列は、コドン最適化されている。
【００２８】
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の二重特異性抗体を含む組成物を提供する。
【００２９】
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の二重特異性抗体を含む組成物または本明細書に記載の二重特異性抗体を含む医薬組成物を提供する。
【００３０】
一部の実施形態では、本発明は、ヒト化７６３抗体の抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体を提供する。多くの実施形態では、ヒト化７６３抗体は、本明細書に記載のこのような抗体を含む。一部の実施形態では、抗原結合部位は、ｓｃＦｖを含む。
【００３１】
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のキメラ抗原受容体を発現する免疫エフェクター細胞を提供する。
【００３２】
一部の実施形態では、本発明は、ＣＳＰＧ４発現に関連した状態の処置または検出のための本明細書に記載のキメラ抗原受容体の使用を提供する。
【００３３】
一部の実施形態では、本発明は、ヒト化７６３抗体に基づく抗原結合部位を含む二重特異性Ｔ細胞係合モノクローナル抗体（Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｎｇａｇｉｎｇ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を提供する。多くの実施形態では、ヒト化７６３抗体は、本明細書に記載のこのような抗体を含む。
【００３４】
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍細胞を殺滅する方法であって、腫瘍細胞を、ヒト化７６３抗体に基づく第１の抗原結合部位およびＣＤ３と結合する第２の抗原結合部位から構成される二重特異性抗体と接触させるステップであって、接触は、二重特異性抗体が結合したＴ細胞が腫瘍細胞の殺滅を媒介するのに十分な条件下および時間にわたって実施される、ステップを含む、方法を提供する。
【００３５】
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍増殖を阻害する方法であって、腫瘍を、ヒト化７６３抗体に基づく第１の抗原結合部位およびＴ細胞上のＣＤ３と結合する第２の抗原結合部位から構成される二重特異性抗体と接触させるステップであって、接触は、二重特異性抗体が結合したＴ細胞が腫瘍の増殖を阻害するのに十分な条件下および時間にわたって実施される、ステップを含む、方法を提供する。
【００３６】
様々な実施形態では、第１および第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖである。
【００３７】
様々な実施形態では、第１の抗原結合部位は、免疫グロブリン分子から構成され、第２の抗原結合部位は、ｓｃＦｖから構成される。一部のある特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、重鎖のＣ末端で免疫グロブリン分子に連結されている。一部のある特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、軽鎖のＣ末端で免疫グロブリン分子に連結されている。
【００３８】
一部の実施形態では、本発明は、ＣＳＰＧ４と結合する免疫グロブリン分子およびＴ細胞上のＣＤ３に結合するｓｃＦｖから構成される二重特異性抗体であって、参照二重特異性抗体と比較して、腫瘍細胞のＴ細胞殺滅を媒介する効率が増大していることによって特徴付けられる、二重特異性抗体を提供する。様々な実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、腫瘍細胞を殺滅する高い効力および非常に低いＥＣ５０によって特徴付けられる。様々な実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、参照二重特異性抗体と比較して増強された腫瘍ＣＳＰＧ４＋腫瘍標的化によって特徴付けられる。様々な実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、参照二重特異性抗体と比較して凝集なしまたは実質的に凝集なしによって特徴付けられる。様々な実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、参照二重特異性抗体と比較してより大きい結合アビディティによって特徴付けられる。
【００３９】
一部の実施形態では、本発明の二重特異性抗体の免疫グロブリン分子は、マウス７６３抗体に基づく。
【００４０】
一部の実施形態では、本発明の二重特異性抗体のｓｃＦｖは、ヒト化ＯＫＴ３抗体に基づく。一部のある特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、重鎖または軽鎖のＣ末端で免疫グロブリン分子に連結されている。
【００４１】
様々な実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、配列番号２０および配列番号１４を含む。様々な実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、配列番号２０および／または配列番号１２を含む。
【００４２】
様々な実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、配列番号２２と、配列番号８、配列番号１０、配列番号１６、または配列番号１８の重鎖可変領域とを含む。様々な実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、配列番号２２と、配列番号８、配列番号１０、配列番号１６、または配列番号１８のうちの１つとを含む。
【００４３】
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のヒト化７６３抗体または二重特異性抗体を含むキットを提供する。
一部の実施形態では、本発明は、医学における使用のための医薬の製造における本明細書に記載のヒト化７６３抗体または二重特異性抗体の使用を提供する。一部の実施形態では、本発明は、診断検査またはアッセイにおける使用のための医薬の製造における本明細書に記載のヒト化７６３抗体または二重特異性抗体の使用を提供する。一部の実施形態では、本発明は、がんの診断のための医薬の製造における本明細書に記載のヒト化７６３抗体または二重特異性抗体の使用を提供する。一部の実施形態では、本発明は、がんの処置のための医薬の製造における本明細書に記載のヒト化７６３抗体または二重特異性抗体の使用を提供する。一部の実施形態では、本発明は、黒色腫、乳がん、骨肉腫、頭頸部がん、多形性神経膠芽腫、肉腫、または中皮腫の処置のための医薬の製造における本明細書に記載のヒト化７６３抗体または二重特異性抗体の使用を提供する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
ＣＳＰＧ４と結合するヒト化抗体もしくはキメラ抗体またはその断片であって、マウス抗体７６３の軽鎖可変領域内で見出される相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも１つおよび／またはマウス抗体７６３の重鎖可変領域内で見出されるＣＤＲの少なくとも１つを含む、ヒト化抗体もしくはキメラ抗体またはその断片。
（項目２）
ヒト化されている、項目１に記載の抗体。
（項目３）
前記ヒト化抗体が、配列番号１２の軽鎖可変領域配列を含む、項目２に記載の抗体。
（項目４）
前記ヒト化抗体が、配列番号１４の軽鎖可変領域配列を含む、項目２に記載の抗体。
（項目５）
前記ヒト化抗体が、配列番号８の重鎖可変領域配列を含む、項目２に記載の抗体。
（項目６）
前記ヒト化抗体が、配列番号１０の重鎖可変領域配列を含む、項目２に記載の抗体。
（項目７）
キメラである、項目１に記載の抗体。
（項目８）
前記キメラ抗体が、配列番号６の軽鎖可変領域配列を含む、項目７に記載の抗体。
（項目９）
前記キメラ抗体が、配列番号４の重鎖可変領域配列を含む、項目７に記載の抗体。
（項目１０）
参照抗体と比較して、ＳＫＭＥＩ−２８ゼノグラフトの腫瘍取込みを約５０％阻害することを特徴とする、項目１から９のいずれか一項に記載の抗体。
（項目１１）
末端マンノース、Ｎ−アセチルグルコース、またはグルコースでグリコシル化されているが、フコースでグリコシル化されていない、項目１から９のいずれか一項に記載の抗体。
（項目１２）
ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４である、項目１から９のいずれか一項に記載の抗体。
（項目１３）
バリアントグリコシル化を有するヒトＩｇＧ１である、項目１２に記載の抗体。
（項目１４）
前記バリアントグリコシル化が、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃの残基２９７におけるアミノ酸置換から生じる、項目１３に記載の抗体。
（項目１５）
配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、および２２のいずれか１つをコードする単離核酸分子。
（項目１６）
コード配列が、コドン最適化されている、項目１５に記載の単離核酸分子。
（項目１７）
項目１５または１６に記載の核酸分子を含む組換えベクター。
（項目１８）
項目１７に記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
（項目１９）
項目１から１４のいずれか一項に記載のヒト化抗体もしくはキメラ抗体またはその断片を生産するための方法であって、
前記ヒト化抗体もしくはキメラ抗体またはその断片の発現を可能にする条件下で、培養培地中で項目１８に記載の宿主細胞を培養するステップと、
前記ヒト化抗体もしくはキメラ抗体またはその断片を前記培養培地から分離するステップと
を含む、方法。
（項目２０）
項目１から１４のいずれかに記載のヒト化抗体もしくはキメラ抗体またはその断片を含む組成物。
（項目２１）
前記抗体が、細胞傷害性剤にコンジュゲートされている、項目２０に記載の組成物。
（項目２２）
項目２０または２１に記載の抗体または断片、組成物を含み、薬学的に許容される担体または希釈剤をさらに含む、医薬組成物。
（項目２３）
被験体におけるＣＳＰＧ４発現によって特徴付けられる医学的状態を処置する方法であって、
治療有効量の項目１から１４のいずれか一項に記載の抗体またはその断片を前記被験体に投与することを含む、方法。
（項目２４）
前記医学的状態が、ＣＳＰＧ４陽性腫瘍を含む、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
項目２３に記載の被験体における医学的状態を処置する方法であって、前記医学的状態が、黒色腫、乳がん、骨肉腫、頭頸部がん、多形性神経膠芽腫、肉腫、および中皮腫である、方法。
（項目２６）
ヒト化７６３抗体に由来する第１の抗原結合部位、および第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体。
（項目２７）
前記第１の抗原結合部位および前記第２の抗原結合部位が、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、項目２６に記載の二重特異性抗体。
（項目２８）
前記第１の抗原結合部位が、免疫グロブリン分子から構成され、前記第２の抗原結合部位が、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ、またはＦｖから構成される、項目２６に記載の二重特異性抗体。
（項目２９）
前記第２の抗原結合部位が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、好中球、間葉幹細胞、および神経幹細胞からなる群より選択される免疫細胞と結合する、項目２６に記載の二重特異性抗体。
（項目３０）
前記第２の抗原結合部位が、ＣＤ３と結合する、項目２６に記載の二重特異性抗体。
（項目３１）
前記第２の抗原結合部位が、ｓｃＦｖである、項目２８に記載の二重特異性抗体。
（項目３２）
前記ｓｃＦｖが、前記免疫グロブリンの重鎖のＣ末端に連結されている、項目３１に記載の二重特異性抗体。
（項目３３）
配列番号２０の配列を含む、項目３２に記載の二重特異性抗体。
（項目３４）
前記ｓｃＦｖが、前記免疫グロブリンの軽鎖のＣ末端に連結されている、項目３１に記載の二重特異性抗体。
（項目３５）
配列番号２２の配列を含む、項目３４に記載の二重特異性抗体。
（項目３６）
項目２６から３５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体のポリペプチド鎖の一部またはすべてについてのコード配列を含む単離核酸分子。
（項目３７）
前記コード配列が、コドン最適化されている、項目３６に記載の単離核酸分子。
（項目３８）
項目３６または３７に記載の核酸配列を含む発現ベクター。
（項目３９）
項目３８に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
（項目４０）
項目２６から３５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を含む組成物。
（項目４１）
項目４０に記載の組成物または項目２６から３５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を含む医薬組成物。
（項目４２）
ヒト化７６３抗体の抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体。
（項目４３）
前記抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖである、項目４２に記載のキメラ抗原受容体。
（項目４４）
項目４２または４３に記載のキメラ抗原受容体を発現する免疫エフェクター細胞。
（項目４５）
ＣＳＰＧ４発現に関連した状態の処置または検出のための項目４２または４３に記載のキメラ抗原受容体の使用。
（項目４６）
ヒト化７６３抗体に基づく抗原結合部位を含む二重特異性Ｔ細胞係合モノクローナル抗体。
（項目４７）
腫瘍細胞を殺滅する方法であって、
前記腫瘍細胞を、ヒト化７６３抗体に基づく第１の抗原結合部位およびＣＤ３と結合する第２の抗原結合部位から構成される二重特異性抗体と接触させるステップであって、前記接触させるステップは、前記二重特異性抗体が結合したＴ細胞が前記腫瘍細胞の殺滅を媒介するのに十分な条件下および時間にわたって実施される、ステップ
を含む、方法。
（項目４８）
前記第１の抗原結合部位および前記第２の抗原結合部位が、ｓｃＦｖである、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記第１の抗原結合部位が、免疫グロブリン分子から構成され、前記第２の抗原結合部位が、ｓｃＦｖから構成される、項目４７に記載の方法。
（項目５０）
前記ｓｃＦｖが、重鎖のＣ末端で前記免疫グロブリン分子に連結されている、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記ｓｃＦｖが、軽鎖のＣ末端で前記免疫グロブリン分子に連結されている、項目４９に記載の方法。
（項目５２）
腫瘍増殖を阻害する方法であって、
腫瘍を、ヒト化７６３抗体に基づく第１の抗原結合部位およびＴ細胞上のＣＤ３と結合する第２の抗原結合部位から構成される二重特異性抗体と接触させるステップであって、前記接触させるステップは、前記二重特異性抗体が結合したＴ細胞が腫瘍の増殖を阻害するのに十分な条件下および時間にわたって実施される、ステップ
を含む、方法。
（項目５３）
前記第１の抗原結合部位および前記第２の抗原結合部位が、ｓｃＦｖである、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記第１の抗原結合部位が、免疫グロブリン分子から構成され、前記第２の抗原結合部位が、ｓｃＦｖから構成される、項目５２に記載の方法。
（項目５５）
前記ｓｃＦｖが、重鎖のＣ末端で前記免疫グロブリン分子に連結されている、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記ｓｃＦｖが、軽鎖のＣ末端で前記免疫グロブリン分子に連結されている、項目５４に記載の方法。
（項目５７）
ＣＳＰＧ４と結合する免疫グロブリン分子、
Ｔ細胞上のＣＤ３に結合するｓｃＦｖから構成される二重特異性抗体であって、参照二重特異性抗体と比較して、腫瘍細胞のＴ細胞殺滅を媒介する効率が増大していることによって特徴付けられる、二重特異性抗体。
（項目５８）
免疫グロブリン分子が、マウス７６３抗体に基づくヒト化抗体である、項目５７に記載の二重特異性抗体。
（項目５９）
前記ｓｃＦｖが、ヒト化ＯＫＴ３抗体に基づく、項目５７または５８に記載の二重特異性抗体。
（項目６０）
前記ｓｃＦｖが、重鎖のＣ末端で前記免疫グロブリン分子に連結されている、項目５７から５９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
（項目６１）
前記ｓｃＦｖが、軽鎖のＣ末端で前記免疫グロブリン分子に連結されている、項目５７から５９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
（項目６２）
配列番号２０を含む、項目５７から５９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
（項目６３）
配列番号２２を含む、項目５７から５９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【００４４】
以下の図から構成される本明細書に含まれる図面は、限定のためでなく、単に例証目的のためである。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、洗浄緩衝液（２ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）で複数回洗浄した後のＣＳＰＧ４＋  Ｍ１４腫瘍細胞への抗ＣＳＰＧ４抗体結合の例示的な平均蛍光強度を示す。
【００４６】
【図２】図２は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）およびＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラフィー（Ｂ）によるヒト化７６３抗体の例示的な生化学分析を示す。ＳＥ−ＨＰＬＣにおける主要ピーク（１６．７分付近）は、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４のメインピークである。２５分は、塩緩衝液ピークに対応する。
【００４７】
【図３】図３は、キメラおよびヒト化７６３抗体の例示的な抗原結合を示す。Ａ〜Ｃは、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ−１００）によって測定した、抗原Ｄ２．８．１１コートチップ（Ａ）または抗７６３イディオタイプ抗体ＭＫ２−２３コートチップ（ＢおよびＣ）上のキメラならびにヒト化７６３抗体の結合を示す複合センソグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）である。Ｄ〜Ｅは、ヒト化７６３抗体の腫瘍抗原結合である。Ｄは、Ｍ１４細胞に対するヒト化またはマウス７６３抗体のＦＡＣＳ分析である。ｈｕ７６３−ＩｇＧ１を、凍結および解凍プロセスの５回のサイクルにも供した。ヒト化７６３  ＩｇＧ１について、結合は、ＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗ヒト二次抗体を用いて検出した。マウス７６３について、結合は、ＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗マウス二次抗体を用いて検出した。抗原結合は、５μｇにおける最大結合のＭＦＩの％として表現した。Ｅは、Ｍ１４細胞コートプレート上のｈｕ７６３−ＩｇＧ１およびｈｕ７６３−ＩｇＧ１ｎのＥＬＩＳＡ分析である。結合は、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒト二次抗体を用いて検出した。ｈｕ７６３−ＩｇＧ１ｎを、凍結および解凍プロセスの５回のサイクルに供した。
【００４８】
【図４】図４は、ヒト化７６３抗体の存在下でのＮＫ９２Ｍｉ（ＣＤ１６）の例示的な抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示す。Ａは、Ｍ１４細胞の比溶解（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｙｓｉｓ）である。Ｂは、Ｕ２ＯＳ細胞の比溶解である。Ｅ：Ｔ比は、２０：１であった。
【００４９】
【図５】図５は、１２４Ｉ−標識ヒト化７６３抗体のＳＫＭＥＬ−２８ゼノグラフトへの例示的な標的化を示す。
【００５０】
【図６】図６は、本明細書に記載のヒト化７６３抗体を使用するヒト化二重特異性抗体フォーマット（例えば、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ）の、一定の拡大比ではない、略図を示す。
【００５１】
【図７】図７は、ＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラフィー（Ａ）および還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｂ）によるヒト化７６３二重特異性抗体（ｈｕ７６３−ＢｓＡｂ）の例示的な生化学分析を示す。ｈｕ７６３−ＨＣ（１５．４９４分）およびｈｕ７６３−ＬＣ（１５．９１２分）フォーマットの主要ピークが示されている。２５分は、塩緩衝液ピークである。
【００５２】
【図８Ａ】図８は、ヒト化７６３二重特異性抗体のＭ１４細胞（Ａ）およびＴ細胞（Ｂ）への例示的な抗原結合を示す。対照抗体：ＣＳＰＧ４ともＴ細胞とも結合しない単一特異性抗体。フィコエリトリンコンジュゲートヤギ抗ヒト抗体を二次抗体として使用し、結合をＦＡＣＳ分析によって分析した。
【図８Ｂ】図８は、ヒト化７６３二重特異性抗体のＭ１４細胞（Ａ）およびＴ細胞（Ｂ）への例示的な抗原結合を示す。対照抗体：ＣＳＰＧ４ともＴ細胞とも結合しない単一特異性抗体。フィコエリトリンコンジュゲートヤギ抗ヒト抗体を二次抗体として使用し、結合をＦＡＣＳ分析によって分析した。
【００５３】
【図９】図９は、ヒト化７６３二重特異性抗体によるＣＳＰＧ４陽性腫瘍細胞の例示的な再誘導された（ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ）Ｔ細胞殺滅を示す。活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ）を、異なる濃度の二重特異性抗体の存在下で、５１Ｃｒで標識した標的細胞（１０：１のＥ：Ｔ）とともにインキュベートした。細胞傷害性は、γ−カウンターによってカウントした上清中の５１Ｃｒの放出によって測定した。対照ＢｓＡｂ：ＣＳＰＧ４および有機化合物と結合する対照二重特異性抗体。
【００５４】
【図１０−１】図１０は、ヒト化７６３二重特異性抗体を使用する黒色腫ゼノグラフトモデルにおける例示的な腫瘍増殖を示す。ＢＡＬＢＲａｇ２−／−ＩＬ−２Ｒ−ｒＣ−ＫＯ（ＤＫＯ）マウスに１×１０６  Ｍ１４（黒色腫）細胞を植え込んだ。処置は、４日目に開始した。スケジュールが示されている（Ａ）。腫瘍増殖は、４日目にスタートして１週間に１回生物発光によって評価した。Ａは、異なる処置群についてのルシフェリンの生物発光定量化である。Ｂは、２４日目における異なる処置群中のマウスの蛍光イメージングである。
【図１０−２】図１０は、ヒト化７６３二重特異性抗体を使用する黒色腫ゼノグラフトモデルにおける例示的な腫瘍増殖を示す。ＢＡＬＢＲａｇ２−／−ＩＬ−２Ｒ−ｒＣ−ＫＯ（ＤＫＯ）マウスに１×１０６  Ｍ１４（黒色腫）細胞を植え込んだ。処置は、４日目に開始した。スケジュールが示されている（Ａ）。腫瘍増殖は、４日目にスタートして１週間に１回生物発光によって評価した。Ａは、異なる処置群についてのルシフェリンの生物発光定量化である。Ｂは、２４日目における異なる処置群中のマウスの蛍光イメージングである。
【図１０−３】図１０は、ヒト化７６３二重特異性抗体を使用する黒色腫ゼノグラフトモデルにおける例示的な腫瘍増殖を示す。ＢＡＬＢＲａｇ２−／−ＩＬ−２Ｒ−ｒＣ−ＫＯ（ＤＫＯ）マウスに１×１０６  Ｍ１４（黒色腫）細胞を植え込んだ。処置は、４日目に開始した。スケジュールが示されている（Ａ）。腫瘍増殖は、４日目にスタートして１週間に１回生物発光によって評価した。Ａは、異なる処置群についてのルシフェリンの生物発光定量化である。Ｂは、２４日目における異なる処置群中のマウスの蛍光イメージングである。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
定義
本発明は、特定の方法および記載した実験条件に限定されない。なぜなら、このような方法および条件は、様々となり得るためである。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を記述する目的のためだけであり、限定的であるように意図されていないとやはり理解されるべきであり、その理由は、本発明の範囲は、特許請求の範囲によって規定されるためである。
【００５６】
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての用語および語句は、反対のことが明示されない限り、または用語または語句が使用されている文脈から明確に明らかでない限り、用語および語句が当技術分野において獲得した意味を含む。本明細書に記載のものと同様のまたは等価な任意の方法および材料を本発明の実施または試験で使用できるが、ここでは特定の方法および材料を記載する。本願全体にわたり引用されるすべての引用参考文献（非特許文献、発行された特許、公開された特許出願、および同時係属特許出願を含む）の内容は、参照により本明細書に明白に組み込まれる。
【００５７】
本発明がより容易に理解されるために、ある特定の用語を最初に以下で定義する。以下の用語および他の用語の追加の定義は、明細書を通じて示す。
【００５８】
「親和性」：当技術分野で公知であるように、「親和性」は、特定のリガンドがそのパートナーに結合する堅さの尺度である。親和性は、様々なやり方で測定することができる。一部の実施形態では、親和性は、定量アッセイによって測定される。一部のそのような実施形態では、結合パートナー濃度は、生理的条件を模倣するために過剰量のリガンド濃度にあるように固定することができる。代替としてまたは追加的に、一部の実施形態では、結合パートナー濃度および／またはリガンド濃度は、変動し得る。一部のそのような実施形態では、親和性は、同等の条件（例えば、濃度）下で参照と比較され得る。
【００５９】
「親和性成熟した」（または「親和性成熟抗体」）は、本明細書で使用する場合、その１つまたは複数のＣＤＲにおける１つまたは複数の変更を伴った抗体を指し、この変更は、こうした変更を有しない親抗体と比較して抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす。一部の実施形態では、親和性成熟抗体は、標的抗原に対してナノモル濃度またはさらにはピコモル濃度の親和性を有することになる。親和性成熟抗体は、当技術分野で公知の様々な手順のいずれかによって生産され得る。Ｍａｒｋｓら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻：７７９〜７８３頁（１９９２年）には、ＶＨおよびＶＬドメインシャッフリングによる親和性成熟が記載されている。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダム変異誘発は、Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ、９１巻：３８０９〜３８１３頁（１９９４年）；Ｓｃｈｉｅｒら、Ｇｅｎｅ、１６９巻：１４７〜１５５頁（１９９５年）；Ｙｅｌｔｏｎら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５５巻：１９９４〜２００４頁（１９９５年）；Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５４巻（７号）：３３１０〜９頁（１９９５年）；およびＨａｗｋｉｎｓら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２６巻：８８９〜８９６頁（１９９２年）によって記載されている。
【００６０】
「好転（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ）」は、本明細書で使用する場合、状態の防止、低減、もしくは緩和、または被験体の状態の改善を指す。しかし、好転は、疾患、障害、または状態（例えば、放射線傷害）の完全な回復または完全な防止を含むが、それが必須ではない。
【００６１】
「動物」は、本明細書で使用する場合、動物界の任意のメンバーを指す。一部の実施形態では、「動物」は、いずれかの性別のおよび発生の任意の段階におけるヒトを指す。一部の実施形態では、「動物」は、発生の任意の段階における非ヒト動物を指す。ある特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、および／またはブタ）である。一部の実施形態では、動物としては、それだけに限らないが、哺乳動物、トリ、爬虫類、両生類、魚、昆虫（ｉｎｓｅｃｔ）、および／または虫（ｗｏｒｍ）がある。ある特定の実施形態では、動物は、ＤＶによる感染に感受性である。一部の実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子操作された動物、および／またはクローンであり得る。
【００６２】
「抗体」は、本明細書で使用する場合、その技術分野で理解されている意味を有し、特定の抗原に特異的に結合する免疫グロブリン（Ｉｇ）を指す。当業者によって公知であるように、自然に産生される抗体は、典型的には４本のポリペプチド鎖、２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖から構成されている。それぞれの重鎖ならびに軽鎖は、可変領域（それぞれＨＣＶＲまたはＶＨおよびＬＣＶＲまたはＶＬと本明細書で省略）ならびに定常領域から構成されている。重鎖の定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメイン（ならびにＩｇＭおよびＩｇＥの場合では任意選択でＣＨ４ドメイン）を含む。軽鎖の定常領域は、１つのドメイン、ＣＬから構成されている。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在した相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域をさらに含有する。それぞれのＶＨおよびＶＬは、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端に配列された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成されている。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはサブクラスのものであり得る。
【００６３】
抗体剤：本明細書で使用する場合、用語「抗体剤」は、特定の抗原に特異的に結合する作用物質を指す。一部の実施形態では、本用語は、特異的結合を付与するのに十分な免疫グロブリン構造エレメントを有する任意のポリペプチドを包含する。様々な実施形態では、適当な抗体剤として、それだけに限らないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、二重特異性または多重特異性抗体、単一ドメイン抗体（例えば、サメ単一ドメイン抗体（例えば、ＩｇＮＡＲまたはその断片））、コンジュゲート抗体（すなわち、他のタンパク質、放射性標識、細胞毒にコンジュゲートまたは融合した抗体）、小モジュラー免疫薬（「ＳＭＩＰｓＴＭ」）、単鎖抗体、ラクダ（ｃａｍｅｌｏｉｄ）抗体、抗体断片などを挙げることができる。一部の実施形態では、本用語は、ステープルペプチド（ｓｔａｐｌｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を指すことができる。一部の実施形態では、本用語は、抗体様結合ペプチド模倣体を指すことができる。一部の実施形態では、本用語は、抗体様結合足場タンパク質を指すことができる。一部の実施形態では、本用語は、モノボディ（ｍｏｎｏｂｏｄｙ）またはアドネクチン（ａｄｎｅｃｔｉｎ）を指すことができる。多くの実施形態では、抗体剤は、そのアミノ酸配列が相補性決定領域（ＣＤＲ）として当業者によって認識される１つまたは複数の構造エレメントを含むポリペプチドであり、またはそれを含み、一部の実施形態では、抗体剤は、そのアミノ酸配列が参照抗体に見出されるものと実質的に同一である少なくとも１つのＣＤＲ（例えば、少なくとも１つの重鎖ＣＤＲおよび／または少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ）を含むポリペプチドであり、またはそれを含む。一部の実施形態では、含まれるＣＤＲは、参照ＣＤＲと比較して配列が同一であり、または１〜５個の間のアミノ酸置換を含有する点で参照ＣＤＲと実質的に同一である。一部の実施形態では、含まれるＣＤＲは、それが、参照ＣＤＲと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を示す点で参照ＣＤＲと実質的に同一である。一部の実施形態では、含まれるＣＤＲは、それが、参照ＣＤＲと少なくとも９６％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を示す点で参照ＣＤＲと実質的に同一である。一部の実施形態では、含まれるＣＤＲは、含まれるＣＤＲ内の少なくとも１個のアミノ酸が、参照ＣＤＲと比較して欠失、付加、または置換されているが、含まれるＣＤＲが、参照ＣＤＲのものとその他は同一であるアミノ酸配列を有する点で参照ＣＤＲと実質的に同一である。一部の実施形態では、含まれるＣＤＲは、含まれるＣＤＲ内の１〜５個のアミノ酸が、参照ＣＤＲと比較して欠失、付加、または置換されているが、含まれるＣＤＲが、参照ＣＤＲとその他は同一であるアミノ酸配列を有する点で参照ＣＤＲと実質的に同一である。一部の実施形態では、含まれるＣＤＲは、含まれるＣＤＲ内の少なくとも１個のアミノ酸が、参照ＣＤＲと比較して置換されているが、含まれるＣＤＲが、参照ＣＤＲのものとその他は同���であるアミノ酸配列を有する点で参照ＣＤＲと実質的に同一である。一部の実施形態では、含まれるＣＤＲは、含まれるＣＤＲ内の１〜５個のアミノ酸が、参照ＣＤＲと比較して欠失、付加、または置換されているが、含まれるＣＤＲが、参照ＣＤＲとその他は同一であるアミノ酸配列を有する点で参照ＣＤＲと実質的に同一である。一部の実施形態では、抗体剤は、そのアミノ酸配列が免疫グロブリン可変ドメインとして当業者によって認識される構造エレメントを含むポリペプチドであり、またはそれを含む。一部の実施形態では、抗体剤は、免疫グロブリン結合ドメインと相同または概ね相同である結合ドメインを有するポリペプチドタンパク質である。一部の実施形態では、抗体剤は、１つまたは複数の特定の参照抗体鎖（例えば、重鎖および／または軽鎖）に見出されるすべてのＣＤＲを含むポリペプチドであり、またはそれを含む。
【００６４】
「抗体要素」は、本明細書で使用する場合、エピトープまたは抗原に特異的に結合し、１つまたは複数の免疫グロブリン構造的特徴を含むポリペプチドエレメント（それは、完全なポリペプチド、または例えば、本明細書に記載の融合ポリペプチドなどのより大きいポリペプチドの一部であり得る）を指す。一般に、抗体要素は、そのアミノ酸配列が抗体結合領域（例えば、任意選択で１つまたは複数のフレームワーク領域の存在下で、抗体軽鎖または可変領域もしくはその１つもしくは複数の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）、あるいは抗体重鎖または可変領域もしくはその１つを超えるＣＤＲ）に特徴的なエレメントを含む任意のポリペプチドである。一部の実施形態では、抗体要素は、全長抗体であり、またはそれを含む。一部の実施形態では、抗体要素は、全長未満であるが、少なくとも１つの結合部位（公知の抗体「可変領域」の構造を伴った少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つの配列を含む）を含む。一部の実施形態では、用語「抗体要素」は、免疫グロブリン結合ドメインと相同または概ね相同である結合ドメインを有する任意のタンパク質を包含する。特定の実施形態では、含まれる「抗体要素」は、免疫グロブリン結合ドメインと少なくとも９９％の同一性を示す結合ドメインを有するポリペプチドを包含する。一部の実施形態では、含まれる「抗体要素」は、免疫グロブリン結合ドメイン、例えば、参照免疫グロブリン結合ドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％の同一性を示す結合ドメインを有する任意のポリペプチドである。含まれる「抗体要素」は、天然供給源に見出される抗体（またはその部分、例えば、その抗原結合部分）のものと同一のアミノ酸配列を有し得る。抗体要素は、単一特異性、二重特異性、または多重特異性であり得る。抗体要素は、ヒトクラス：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥのいずれかを含めた任意の免疫グロブリンクラスに特徴的な構造エレメントを含み得る。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片によって実施され得ることが示されている。このような抗体実施形態も、２つまたはそれ超の異なる抗原に特異的に結合する二重特異性、デュアル特異性、または多重特異性フォーマットであり得る。用語抗体の「抗原結合部分」内に包含される結合断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＨ、ＶＬ、ＣＨ１、およびＣＬドメインからなる一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＨおよびＶＬドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）単一可変ドメインを含むｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら（１９８９年）、Ｎａｔｕｒｅ、３４１巻：５４４〜５４６頁）；ならびに（ｖｉ）単離相補性決定領域（ＣＤＲ）がある。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＨおよびＶＬは、別個の遺伝子によってコードされるが、これらは、組換え法を使用して、合成リンカーによって接合され得、リンカーは、ＶＨおよびＶＬ領域が対合して一価分子を形成する単一タンパク質鎖としてこれらが作製されることを可能にする（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２巻：４２３〜４２６頁；およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８５巻：５８７９〜５８８３頁を参照）。一部の実施形態では、本明細書に記載の「抗体要素」は、このような単鎖抗体であり、またはそれを含む。一部の実施形態では、「抗体要素」は、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）であり、またはそれを含む。ダイアボディは、二価の二重特異性抗体であり、ＶＨおよびＶＬドメインは、単一ポリペプチド鎖上であるがリンカーを使用して発現され、リンカーは、短すぎて同じ鎖上の２つのドメイン間で対形成を可能にすることができず、それによってドメインを別の鎖の相補的ドメインと強制的に対合させ、２つの抗原結合部位を創製する（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，  Ｐ．ら（１９９３年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９０巻：６４４４〜６４４８頁；Ｐｏｌｊａｋ，  Ｒ．  Ｊ．（１９９４年）、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２巻（１２号）：１１２１〜１１２３頁を参照）。このような抗体結合部分は、当技術分野で公知である（ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ編、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、（２００１年）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、７９０頁（ＩＳＢＮ３−５４０−４１３５４−５）。一部の実施形態では、抗体要素は、１対のタンデムＦｖセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む単鎖「線状抗体」であり、またはそれを含み、このセグメントは、相補的な軽鎖ポリペプチドと一緒に、１対の抗原結合領域を形成する（Ｚａｐａｔａら（１９９５年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、８巻（１０号）：１０５７〜１０６２頁；および米国特許第５，６４１，８７０号）。一部の実施形態では、抗体要素は、キメラまたはヒト化抗体に特徴的な構造エレメントを有し得る。一般に、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）、例えば、マウス、ラット、またはウサギなどのＣＤＲ由来の残基に置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の実施形態では、抗体要素は、ヒト抗体に特徴的な構造エレメントを有し得る。
【００６５】
「生物活性」は、本明細書で使用する場合、観察可能な生物学的効果、または目的の作用物質もしくは実体によって達成される結果を指す。例えば、一部の実施形態では、特異的結合相互作用は、生物活性である。一部の実施形態では、生物学的経路または事象のモジュレーション（例えば、誘導、増強、または阻害）は、生物活性である。一部の実施形態では、生物活性の存在または程度は、目的の生物学的経路または事象によって産生される直接または間接産物の検出によって評価される。
【００６６】
「二重特異性抗体」は、本明細書で使用する場合、結合部分の少なくとも一方、典型的には両方が、抗体要素であり、またはそれを含む二重特異性結合剤を指す。様々な異なる二重特異性抗体構造が当技術分野で公知である。一部の実施形態では、抗体要素であり、またはそれを含む二重特異性抗体におけるそれぞれの結合部分は、ＶＨおよび／またはＶＬ領域を含み、一部のそのような実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬ領域は、特定のモノクローナル抗体に見出されるものである。一部の実施形態では、二重特異性抗体が２つの抗体要素の結合部分を含有する場合、それぞれは、異なるモノクローナル抗体由来のＶＨおよび／またはＶＬ領域を含む。一部の実施形態では、二重特異性抗体が２つの抗体要素の結合部分を含有する場合、２つの抗体要素の結合部分の一方は、第１のモノクローナル抗体由来のＣＤＲを含有するＶＨおよび／またはＶＬ領域を有する免疫グロブリン分子を含み、２つの抗体要素の結合部分の一方は、第２のモノクローナル抗体由来のＣＤＲを含有するＶＨおよび／またはＶＬ領域を有する抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡＢ、ｓｃＦｖなど）を含む。
【００６７】
「二重特異性結合剤」は、本明細書で使用する場合、それぞれが別個の標的と結合する２つの個別の結合部分を有するポリペプチド剤を指す。一部の実施形態では、二重特異性結合剤は、単一ポリペプチドであり、またはそれを含み、一部の実施形態では、二重特異性結合剤は、複数のペプチドであり、またはこれらを含み、これらは、一部のそのような実施形態では、例えば、架橋によって互いに共有結合的に会合されている場合がある。一部の実施形態では、二重特異性結合剤の２つの結合部分は、同じ標的（例えば、抗原）の異なる部位（例えば、エピトープ）を認識し、一部の実施形態では、これらは、異なる標的を認識する。一部の実施形態では、二重特異性結合剤は、異なる構造のものである２つの標的に同時に結合することができる。
【００６８】
「担体」は、本明細書で使用する場合、それとともに組成物が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。一部の例示的な実施形態では、担体は、滅菌液体、例えば、水、および石油、動物、植物、または合成起源の油を含めた油、例えば、ラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などを含み得る。一部の実施形態では、担体は、１種または複数の固体要素であり、またはそれを含む。
【００６９】
「ＣＤＲ」は、本明細書で使用する場合、抗体可変領域内の相補性決定領域を指す。重鎖および軽鎖の可変領域のそれぞれにおいて３つのＣＤＲが存在し、これらは、可変領域のそれぞれについてＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と指定される。「ＣＤＲのセット」または「ＣＤＲセット」は、抗原と結合することができる単一可変領域、または抗原と結合することができる同族の重鎖および軽鎖可変領域のＣＤＲにおいて存在する３または６つのＣＤＲの群を指す。ＣＤＲ境界を定義するためのある特定のシステムが当技術分野で確立されており（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａなど）、当業者は、これらのシステム間のおよびこれらの中での差異を認識し、請求項に係る発明を理解および実施するのに要求される程度にＣＤＲ境界を理解することができる。
【００７０】
「ＣＤＲグラフト抗体」は、本明細書で使用する場合、アミノ酸配列が１つの種由来の重鎖および軽鎖可変領域配列を含むが、ＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ領域の１つまたは複数の配列が別の種のＣＤＲ配列と置き換えられている抗体、例えば、マウスＣＤＲの１つまたは複数（例えば、ＣＤＲ３）がヒトＣＤＲ配列と置き換えられたマウスＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体などを指す。同様に、「ＣＤＲグラフト抗体」は、ヒトＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ３）の１つまたは複数がマウスＣＤＲ配列と置き換えられたヒトＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体を指すこともできる。
【００７１】
「キメラ抗体」は、本明細書で使用する場合、アミノ酸配列が第１の種に見出されるＶＨおよびＶＬ領域配列ならびに第１の種と異なる第２の種に見出される定常領域配列を含む抗体を指す。多くの実施形態では、キメラ抗体は、ヒト定常領域に連結されたマウスＶＨおよびＶＬ領域を有する。一部の実施形態では、非ヒト定常領域（例えば、マウス定常領域）に連結されたヒトＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体は、「リバースキメラ抗体（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」と呼ばれる。
【００７２】
「同等の」は、本明細書で使用する場合、互いに同一でない場合があるが、これらの間の比較を可能にするのに十分同様であり、その結果結論を観察される差異または類似性に基づいて合理的に引き出すことができる、２つまたはそれ超の作用物質、実体、状況、条件のセットなどを指す。当業者は、どの程度の同一性が、２つまたはそれ超のこのような作用物質、実体、状況、条件のセットなどが同等と見なされるのに任意に所与の環境において要求されるかを文脈において理解するであろう。
【００７３】
「〜に対応する」は、本明細書で使用する場合、目的のポリペプチド中のアミノ酸残基の位置／同一性を指定する。当業者は、単純性の目的で、ポリペプチド中の残基は、参照関連ポリペプチドに基づいて標準的な番号付けシステムを使用して指定されることが多く、その結果、例えば、１９０位の残基「に対応する」アミノ酸は、実際に特定のアミノ酸鎖中の１９０番目のアミノ酸である必要はないが、参照ポリペプチド中の１９０に見出される残基に対応することを認識していると予想される。当業者は、どのように「対応する」アミノ酸を同定するかを容易に認識している。
【００７４】
「剤形」および「単位剤形」、本明細書で使用する場合、用語「剤形」は、処置される被験体（例えば、ヒト患者）のための治療剤の物理的に個別の単位を指す。それぞれの単位は、適切な投薬レジメンによって該当する集団に投与されるとき、所望の治療効果を生じさせると計算または実証された所定量の活性材料を含有する。例えば、一部の実施形態では、このような量は、該当する集団に投与されるとき（すなわち、治療的投薬レジメンにより）所望のまたは有益な転帰と相関すると決定された投薬レジメンによる投与に適切な単位投与量（またはその画分全体）である。しかし、任意の特定の患者に投与される合計投与量は、適切な医学的判断の範囲内で医療専門家（例えば、医師）によって選択されることになることが理解されるであろう。
【００７５】
「投薬レジメン」（または「治療レジメン」）は、本明細書で使用する場合、典型的には複数期間で分離されて被験体に個々に投与される１セットの単位用量（典型的には１回を超える）である。一部の実施形態では、所与の治療剤は、推奨される投薬レジメンを有し、それは、１回または複数回の用量を伴い得る。一部の実施形態では、投薬レジメンは、それぞれが同じ長さの期間によって互いに分離された複数の用量を含み、一部の実施形態では、投薬レジメンは、複数の用量および個々の用量を分離する少なくとも２つの異なる期間を含む。一部の実施形態では、治療剤は、所定の期間にわたって連続的に投与される（例えば、注入によって）。一部の実施形態では、治療剤は、１日１回（ＱＤ）または１日２回（ＢＩＤ）投与される。一部の実施形態では、投薬レジメンは、それぞれが同じ長さの期間によって互いに分離された複数の用量を含み、一部の実施形態では、投薬レジメンは、複数の用量および個々の用量を分離する少なくとも２つの異なる期間を含む。一部の実施形態では、投薬レジメン内のすべての用量は、同じ単位用量量（ｕｎｉｔ  ｄｏｓｅ  ａｍｏｕｎｔ）のものである。一部の実施形態では、投薬レジメン内の異なる用量は、異なる量のものである。一部の実施形態では、投薬レジメンは、第１の用量量での最初の用量、その後の第１の用量量と異なる第２の用量量での１回または複数回の追加の用量を含む。一部の実施形態では、投薬レジメンは、第１の用量量での最初の用量、その後の第１の用量量と同じ第２の用量量での１回または複数回の追加の用量を含む。一部の実施形態では、投薬レジメンは、該当する集団にわたって投与されるとき所望のまたは有益な転帰と相関する（すなわち、治療的投薬レジメンである）。
【００７６】
「エフェクター機能」は、本明細書で使用する場合、抗体Ｆｃ領域のＦｃ受容体またはリガンドとの相互作用から生じる生化学的事象を指す。エフェクター機能としては、それだけに限らないが、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介食作用（ＡＤＣＰ）、および補体媒介細胞障害（ＣＭＣ）がある。一部の実施形態では、エフェクター機能は、抗原の結合後に作動するもの、抗原結合と独立して作動するもの、または両方である。
【００７７】
「エフェクター細胞」は、本明細書で使用する場合、１つまたは複数のＦｃ受容体を発現し、１つまたは複数のエフェクター機能を媒介する免疫系の細胞を指す。一部の実施形態では、エフェクター細胞としては、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、肥満細胞、血小板、大型顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球のうちの１つまたは複数を挙げることができるが、これらに限定されない場合があり、それだけに限らないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルを含めた任意の生物由来であり得る。
【００７８】
「エピトープ」は、本明細書で使用する場合、免疫グロブリン（例えば、抗体または受容体）結合要素によって特異的に認識される任意の部分を含む。一部の実施形態では、エピトープは、抗原上の複数の化学原子または基から構成される。一部の実施形態では、このような化学原子または基は、抗原が該当する３次元コンフォメーションを採用するとき表面露出される。一部の実施形態では、このような化学原子または基は、抗原がこのようなコンフォメーションを採用するとき、空間において互いに物理的に近い。一部の実施形態では、少なくとも一部のこのような化学原子または基は、抗原が代替のコンフォメーションを採用する（例えば、直線化している）とき、互いに物理的に分離されている。
【００７９】
「賦形剤」は、本明細書で使用する場合、例えば、所望のコンシステンシーまたは安定化効果をもたらし、またはそれに寄与するために医薬組成物中に含めることができる非治療剤を指す。適当な薬学的賦形剤としては、例えば、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどがある。
【００８０】
「Ｆｃリガンド」は、本明細書で使用する場合、抗体のＦｃ領域に結合してＦｃ−リガンド複合体を形成する任意の生物由来の分子、好ましくはポリペプチドを指す。Ｆｃリガンドとしては、それだけに限らないが、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）、ＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６Ｂ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃεＲＩＩ（ＣＤ２３）、ＦｃＲｎ、Ｃｌｑ、Ｃ３、ブドウ球菌プロテインＡ、連鎖球菌プロテインＧ、およびウイルスＦｃγＲがある。Ｆｃリガンドは、Ｆｃと結合する未発見分子を含み得る。
【００８１】
「フレームワーク」または「フレームワーク領域」は、本明細書で使用する場合、ＣＤＲを抜いた可変領域の配列を指す。ＣＤＲ配列は、異なるシステムによって決定され得るので、同様に、フレームワーク配列は、相応に異なる解釈を受ける。６つのＣＤＲは、重鎖および軽鎖上のフレームワーク領域をそれぞれの鎖上で４つのサブ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）に分割し、ＣＤＲ１は、ＦＲ１とＦＲ２との間に位置し、ＣＤＲ２は、ＦＲ２とＦＲ３との間に位置し、ＣＤＲ３は、ＦＲ３とＦＲ４との間に位置する。特定のサブ領域をＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、またはＦＲ４と指定しない場合、フレームワーク領域は、別の者によって参照される通り、天然に存在する単一の免疫グロブリン鎖の可変領域内の組み合わされたＦＲを表す。本明細書で使用する場合、ＦＲは、４つのサブ領域のうちの１つを表し、ＦＲ１は、例えば、可変領域のアミノ末端およびＣＤＲ１に対して５’に最も近い第１のフレームワーク領域を表し、ＦＲは、フレームワーク領域を構成するサブ領域の２つまたはそれ超を表す。
【００８２】
「宿主細胞」は、本明細書で使用する場合、外因性ＤＮＡ（組換え型のまたはその他）が導入されている細胞を指す。当業者は、本開示を読むと、このような用語は、特定の対象細胞を指すだけではなく、このような細胞の子孫も指すことを理解するであろう。ある特定の修飾が変異または環境的な影響に起因して後に続く世代において起こり得るので、このような子孫は、実際に親細胞と同一でない場合があるが、依然として本明細書で使用する用語「宿主細胞」の範囲に含められる。一部の実施形態では、宿主細胞は、外因性ＤＮＡ（例えば、組換え核酸配列）を発現するのに適した生命の界のいずれかから選択される原核および真核細胞が挙げられる。例示的な細胞としては、原核生物および真核生物（単細胞もしくは多細胞）のもの、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．などの株）、マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａなど）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ−９、ＳＦ−２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉなど）、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、または細胞融合物、例えば、ハイブリドーマもしくはクアドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａ）などがある。一部の実施形態では、細胞は、ヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラット、またはマウス細胞である。一部の実施形態では、細胞は、真核生物のものであり、以下の細胞：ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ  Ｋｌ、ＤＸＢ−１  １  ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜細胞、ベロ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ＥＢＮＡ、ＭＳＲ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ８０６５、ＨＬ−６０、（例えば、ＢＨＫ２１）、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）、ダウジ（Ｄａｕｄｉ）、Ａ４３１（表皮）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ０６０５６２、セルトリ細胞、ＢＲＬ  ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞、および上述の細胞に由来する細胞株から選択される。一部の実施形態では、細胞は、１つまたは複数のウイルス遺伝子を含み、例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞）である。
【００８３】
「ヒト抗体」は、本明細書で使用する場合、ヒト免疫グロブリン配列から生成される（またはアセンブルされる）可変および定常領域を有する抗体を含むように意図されている。一部の実施形態では、抗体（または抗体要素）は、これらのアミノ酸配列が、例えば、１つまたは複数のＣＤＲ、特に、ＣＤＲ３においてヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされない残基またはエレメントを含む（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのランダムもしくは部位特異的変異誘発によって、またはｉｎ  ｖｉｖｏでの体細胞変異によって（最初に）導入され得る配列バリエーションを含む）ことがあっても「ヒト」と見なされ得る。
【００８４】
当技術分野で公知である「ヒト化された」、用語「ヒト化された」は、アミノ酸配列が、非ヒト種（例えば、マウス）において生じた参照抗体由来のＶＨおよびＶＬ領域配列を含むが、これらをより「ヒト様」、すなわち、ヒト生殖系列可変配列とより同様にするように意図された、参照抗体と比べてこれらの配列において修飾も含む抗体（または抗体要素）を指すように一般に使用される。一部の実施形態では、「ヒト化」抗体（または抗体要素）は、目的の抗原に免疫特異的に結合し、ヒト抗体のものと実質的にアミノ酸配列を有するフレームワーク（ＦＲ）領域、および非ヒト抗体のものと実質的にアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する抗体である。ヒト化抗体は、すべてのまたは実質的にすべてのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリン（すなわち、ドナー免疫グロブリン）のものに対応し、すべてのまたは実質的にすべてのフレームワーク領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂＣ、Ｆｖ）のうちの実質的にすべてを含む。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリン定常領域のものも含む。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、軽鎖と、重鎖の少なくとも可変ドメインとの両方を含有する。抗体は、重鎖定常領域のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、および任意選択でＣＨ４領域も含み得る。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト化ＶＬ領域のみを含有する。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト化ＶＨ領域のみを含有する。一部のある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト化ＶＨおよびＶＬ領域を含有する。
【００８５】
本明細書で使用する「改善する」、「増大する」、もしくは「低減する」、またはこれらの文法的な等価物は、ベースライン測定値、例えば、本明細書に記載の処置の開始前の同じ個体における測定値、または本明細書に記載の処置の非存在下での対照個体（または複数の対照個体）における測定値などと比べた値を示す。「対照個体」は、処置されている個体と同じ形態の疾患または傷害に罹患している個体である。
【００８６】
「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」は、本明細書で使用する場合、多細胞生物内ではなく、人工環境で、例えば、試験管または反応容器内で、細胞培養物内などで行われる事象を指す。
【００８７】
「ｉｎ  ｖｉｖｏ」は、本明細書で使用する場合、ヒトおよび非ヒト動物などの多細胞生物内で行われる事象を指す。細胞ベースシステムとの関連で、この用語は、生細胞内で行われる（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏシステムとは対照的に）事象を指すのに使用することができる。
【００８８】
「単離された」は、本明細書で使用する場合、（１）最初に生産されたとき（自然に、および／または実験的設定で）付随していた要素の少なくとも一部から分離された、ならびに／または（２）ヒトの手で設計、生産、調製、および／もしくは製造された物質ならびに／または実体を指す。単離された物質および／または実体は、これらが最初に付随していた他の要素の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超から分離されている場合がある。一部の実施形態では、単離された作用物質は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超、純粋である。本明細書で使用する場合、物質は、他の要素を実質的に含まない場合、「純粋」である。一部の実施形態では、当業者によって理解されることになるように、物質は、ある特定の他の要素、例えば、１つまたは複数の担体または賦形剤（例えば、緩衝液、溶媒、水など）などと組み合わされた後、依然として「単離された」、またはさらには「純粋」と見なされる場合があり、このような実施形態では、物質の単離または純度パーセントは、このような担体または賦形剤を含めないで計算される。しかし一例を挙げると、一部の実施形態では、自然に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの生物学的ポリマーは、ａ）その起源または派生の供給源によって、自然にその天然の状態でそれに随伴する要素の一部またはすべてと付随しない；ｂ）それが、自然にそれを産生する種由来の同じ種の他のポリペプチドまたは核酸を実質的に含まない；ｃ）自然にそれを産生する種のものでない細胞または他の発現系によって発現されるか、またはこの細胞または他の発現系由来の要素と他の点で付随しているとき、「単離された」と見なされる。したがって、例えば、一部の実施形態では、化学合成され、または自然にそれを産生するものと異なる細胞系において合成されるポリペプチドは、「単離された」ポリペプチドであると見なされる。代替としてまたは追加的に、一部の実施形態では、１または複数の精製技法に供されたポリペプチドは、そのポリペプチドが、ａ）それが自然に付随している；および／またはｂ）それが最初に生産されたとき付随していた他の要素から分離された程度に「単離された」ポリペプチドであると見なされ得る。
【００８９】
「ＫＤ」は、本明細書で使用する場合、結合剤（例えば、抗体またはその結合要素）の、そのパートナー（例えば、抗体またはその結合要素が結合するエピトープ）との複合体からの解離定数を指す。
【００９０】
「Ｋｏｆｆ」は、本明細書で使用する場合、結合剤（例えば、抗体またはその結合要素）の、そのパートナー（例えば、抗体またはその結合要素が結合するエピトープ）との複合体からの解離についてのオフ速度定数を指す。
【００９１】
「Ｋｏｎ」は、本明細書で使用する場合、結合剤（例えば、抗体またはその結合要素）の、そのパートナー（例えば、抗体またはその結合要素が結合するエピトープ）との会合についてのオン速度定数を指す。
【００９２】
「リンカー」は、本明細書で使用する場合、互いに異なるエレメントを接続する複数のエレメントのポリペプチド部分を指すのに使用される。例えば、当業者は、構造が２つまたはそれ超の機能的または組織的なドメインを含むポリペプチドは、このようなドメイン間にこれらを互いに連結するアミノ酸のストレッチを含むことが多いことを認識している。一部の実施形態では、リンカーエレメントを含むポリペプチドは、一般的な形態Ｓ１−Ｌ−Ｓ２の全体的な構造を有し、Ｓ１およびＳ２は、同じであっても異なっていてもよく、リンカーによって互いに会合した２つのドメインを表す。一部の実施形態では、リンカーは、長さが少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、またはそれ超のアミノ酸である。一部の実施形態では、リンカーは、剛性の３次元構造を取らない傾向を有し、むしろポリペプチドの柔軟性をもたらすことを特徴とする。ポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）を操作するとき適切に使用することができる様々な異なるリンカーエレメントは当技術分野で公知である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，  Ｐ．ら（１９９３年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９０巻：６４４４〜６４４８頁；Ｐｏｌｊａｋ，  Ｒ．  Ｊ．ら（１９９４年）、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２巻：１１２１〜１１２３頁を参照）。
【００９３】
「多価結合剤」は、本明細書で使用する場合、同じ分子上にあり得、または異なる分子上にあり得る２つまたはそれ超の抗原に結合することができる結合剤を指す。本明細書に記載の多価結合剤は、一部の実施形態では、３つまたはそれ超の抗原結合部位を有するように操作されており、典型的には、天然に存在するタンパク質ではない。本明細書に記載の多価結合剤は、２つまたはそれ超の関係したまたは無関係の標的と結合することができる結合剤を指す。多価結合剤は、単一抗体要素の複数のコピーまたは異なる抗体要素の複数のコピーから構成され得る。このような結合剤は、２つまたはそれ超の抗原に結合することができ、四価または多価結合剤である。多価結合剤は、その上、治療剤、例えば、免疫モジュレーター、毒素、またはＲＮａｓｅなどを含み得る。本明細書に記載の多価結合剤は、一部の実施形態では、異なる構造のものである少なくとも２つの標的、例えば、２つの異なる抗原、同じ抗原上の２つの異なるエピトープ、あるいはハプテンおよび／または抗原もしくはエピトープに同時に結合することができる。多くの実施形態では、本発明の多価結合剤は、本明細書に記載の多価結合剤の特性を有するように操作されたタンパク質である。本発明の多価結合剤は、単一特異性（１つの抗原に結合することができる）または多重特異性（２つまたはそれ超の抗原に結合することができる）であり得、２つの重鎖ポリペプチドおよび２つの軽鎖ポリペプチドから構成され得る。それぞれの結合部位は、一部の実施形態では、抗原結合部位１つ当たり合計６つの抗原結合に関与するＣＤＲを伴って重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインから構成される。
【００９４】
「核酸」は、本明細書で使用する場合、その最も広い意味において、オリゴヌクレオチド鎖中に組み込まれている、またはそれに組み込まれ得る任意の化合物および／または物質を指す。一部の実施形態では、核酸は、ホスホジエステル連結を介してオリゴヌクレオチド鎖中に組み込まれている、またはそれに組み込まれ得る化合物および／または物質である。文脈から明らかとなるように、一部の実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）を指し、一部の実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を指す。一部の実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡであり、またはそれを含み、一部の実施形態では、「核酸」は、ＤＮＡであり、またはそれを含む。一部の実施形態では、核酸は、１個または複数の天然核酸残基であり、これらを含み、またはこれらからなる。一部の実施形態では、核酸は、１種または複数の核酸類似体であり、これらを含み、またはこれらからなる。一部の実施形態では、核酸類似体は、それがホスホジエステル骨格を利用しない点で核酸と異なる。例えば、一部の実施形態では、核酸は、１種または複数の「ペプチド核酸」であり、これらを含み、またはこれらからなり、ペプチド核酸は、当技術分野で公知であり、骨格中にホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を有し、本発明の範囲内と見なされる。代替としてまたは追加的に、一部の実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合ではなく１個または複数のホスホロチオエートおよび／または５’−Ｎ−ホスホラミダイト連結を有する。一部の実施形態では、核酸は、１個または複数の天然のヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）であり、これらを含み、またはこれらからなる。一部の実施形態では、核酸は、１種または複数のヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５プロピニル−シチジン、Ｃ−５プロピニル−ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、２−チオシチジン、メチル化塩基、介在塩基、およびこれらの組合せ）であり、これらを含み、またはこれらからなる。一部の実施形態では、核酸は、天然核酸におけるものと比較して１種または複数の修飾糖（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＲＮＡまたはタンパク質などの機能的遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、核酸は、１種または複数のイントロンを含む。一部の実施形態では、核酸は、天然供給源からの単離、相補的な鋳型（ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ）に基づ��重合による酵素合成、組換え細胞またはシステムにおける複製、および化学合成の１または複数によって調製される。一部の実施形態では、核酸は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２０、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、またはそれ超の残基の長さである。一部の実施形態では、核酸は、一本鎖であり、一部の実施形態では、核酸は、二本鎖である。一部の実施形態では、核酸は、ポリペプチドをコードする少なくとも１つのエレメントを含むヌクレオチド配列を有し、またはポリペプチドをコードする配列の相補体である。一部の実施形態では、核酸は、酵素活性を有する。
【００９５】
「作動可能に連結した」は、本明細書で使用する場合、記載した要素が、これらがこれらの意図された様式で機能することを可能にする関係にある並置を指す。コード配列に「作動可能に連結した」制御配列は、コード配列の発現が制御配列に適合する条件下で達成されるやり方でライゲートされる。「作動可能に連結した」配列は、目的の遺伝子と連続した発現制御配列、および目的の遺伝子を制御するためにトランスでまたはある距離をおいて作用する発現制御配列の両方を含む。用語「発現制御配列」は、本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチド配列であって、これらがライゲートされるコード配列の発現およびプロセシングを行うのに必要である、ポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列としては、適切な転写開始、終止、プロモーター、およびエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えば、スプライシングおよびポリアデニル化シグナルなど；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を増強する配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）；タンパク質安定性を増強する配列；ならびに望まれる場合、タンパク質分泌を増強する配列がある。このような制御配列の性質は、宿主生物に応じて異なる。例えば、原核生物では、このような制御配列は一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含み、一方、真核生物では、典型的には、このような制御配列は、プロモーターおよび転写終結配列を含む。用語「制御配列」は、その存在が発現およびプロセシングに本質的である要素を含むように意図されており、その存在が有利である追加の要素、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列も含むことができる。
【００９６】
「生理的条件」は、本明細書で使用する場合、細胞または生物が生存し、および／または繁殖する条件を参照するその当技術分野で理解されている意味を有する。一部の実施形態では、この用語は、生物または細胞系について自然に起こり得る外部または内部環境の条件を指す。一部の実施形態では、生理的条件は、ヒトまたは非ヒト動物の体内に存在する条件、特に、手術部位に、および／または手術部位内に存在する条件である。生理的条件は、典型的には、例えば、２０〜４０℃の温度範囲、１の大気圧、６〜８のｐＨ、１〜２０ｍＭのグルコース濃度、大気レベルの酸素濃度、およびそれが地球上で遭遇する重力を含む。一部の実施形態では、実験室内の条件は、生理学的条件で操作および／または維持される。一部の実施形態では、生理的条件は、生物において遭遇する。
【００９７】
「ポリペプチド」は、本明細書で使用する場合、アミノ酸の任意のポリマー鎖を指す。一部の実施形態では、ポリペプチドは、自然に存在するアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、自然に存在しないアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、それがヒトの手の行為によって設計および／または生産される点で操作されているアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、または両方を含み、またはそれからなることができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、天然アミノ酸のみ、または非天然アミノ酸のみを含み、またはそれからなることができる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、Ｄ−アミノ酸、Ｌ−アミノ酸、または両方を含み得る。一部の実施形態では、ポリペプチドは、Ｄ−アミノ酸のみを含み得る。一部の実施形態では、ポリペプチドは、Ｌ−アミノ酸のみを含み得る。一部の実施形態では、ポリペプチドは、例えば、ポリペプチドのＮ末端、ポリペプチドのＣ末端、またはこれらの任意の組合せにおいて１つまたは複数のアミノ酸側鎖を修飾する、またはこれらに取り付けられた１つまたは複数のペンダント基または他の修飾を含み得る。一部の実施形態では、このようなペンダント基または修飾は、その組合せを含めたアセチル化、アミド化、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）、メチル化、ＰＥＧ化などからなる群より選択され得る。一部の実施形態では、ポリペプチドは、環状であり得、および／または環状部分を含み得る。一部の実施形態では、ポリペプチドは、環状でなく、および／またはいずれの環状部分も含まない。一部の実施形態では、ポリペプチドは、線形である。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ステープルドポリペプチドであり得、またはそれを含み得る。一部の実施形態では、用語「ポリペプチド」は、参照ポリペプチド、活性、または構造の名称に添えることができ、このような事例では、これは、該当する活性または構造を共有し、よって、ポリペプチドの同じクラスまたはファミリーのメンバーであると見なすことができるポリペプチドを指すのに本明細書で使用される。それぞれのこのようなクラスについて、そのアミノ酸配列および／または機能が公知であるクラス内の例示的なポリペプチドを、本明細書は提供し、および／または当業者は知ることになり、一部の実施形態では、このような例示的なポリペプチドは、ポリペプチドクラスの参照ポリペプチドである。一部の実施形態では、ポリペプチドクラスまたはファミリーのメンバーは、クラスの参照ポリペプチドと、一部の実施形態では、そのクラス内のすべてのポリペプチドと、かなりの配列相同性もしくは同一性を示し、共通配列モチーフ（例えば、特徴的配列エレメント）を共有し、および／または共通の活性を（一部の実施形態では、同等のレベルで、もしくは指定された範囲内で）共有する。例えば、一部の実施形態では、メンバーポリペプチドは、少なくとも約３０〜４０％であり、多くの場合、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％超、またはそれ超である参照ポリペプチドとの配列相同性または同一性の全体的な程度を示し、および／または多くの場合９０％超、またはさらには９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の非常に高い配列同一性を示す少なくとも１つの領域（すなわち、一部の実施形態では、特徴的配列エレメントであり得、またはそれを含み得る保存領域）を含む。このような保存領域は通常、少なくとも３〜４、多くの場合、最大で２０またはそれ超のアミノ酸を包含し、一部の実施形態では、保存領域は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ超の連続したアミノ酸の少なくとも１つのストレッチを包含する。一部の実施形態では、有用なポリペプチドは、親ポリペプチドの断片を含み得、またはそれからなり得る。一部の実施形態では、有用なポリペプチドは、複数の断片を含み得、またはそれからなり得、そのそれぞれは、目的のポリペプチドに見出されるものと互いに対して異なる空間的配置で同じ親ポリペプチドに見出され（例えば、親において直接連結されている断片は、目的のポリペプチドにおいて空間的に分離されている場合があり、もしくは逆の場合も同様であり、および／または断片は、目的のポリペプチドにおいて親の場合とは異なる順序で存在し得る）、その結果目的のポリペプチドは、その親ポリペプチドの誘導体である。
【００９８】
「防止する」または「防止」は、本明細書で使用する場合、疾患、障害、および／または状態の存在に関連して使用されるとき、疾患、障害、および／もしくは状態を発生させるリスクを低減すること、および／または疾患、障害、もしくは状態の１つもしくは複数の特性もしくは症状の発症を遅延させることを指す。防止は、疾患、障害、または状態の発症が、既定の期間にわたって遅延されたとき、完了したと見なすことができる。
【００９９】
「組換えの」は、本明細書で使用する場合、組換え手段によって設計、操作、調製、発現、創製、または単離されるポリペプチド（例えば、本明細書に記載の抗体もしくは抗体要素、または多重特異性結合剤）、例えば、宿主細胞内にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現されるポリペプチド、組換えコンビナトリアルヒトポリペプチドライブラリーから単離されポリペプチド（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  Ｈ．  Ｒ．（１９９７年）、ＴＩＢ  Ｔｅｃｈ．、１５巻：６２〜７０頁；Ａｚｚａｚｙ  Ｈ．およびＨｉｇｈｓｍｉｔｈ  Ｗ．  Ｅ．、（２００２年）、Ｃｌｉｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３５巻：４２５〜４４５頁；Ｇａｖｉｌｏｎｄｏ  Ｊ．  Ｖ．およびＬａｒｒｉｃｋ  Ｊ．  Ｗ．（２００２年）、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２９巻：１２８〜１４５頁；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  Ｈ．およびＣｈａｍｅｓ  Ｐ．（２０００年）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、２１巻：３７１〜３７８頁）、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ，  Ｌ．  Ｄ．ら（１９９２頁）、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２０巻：６２８７〜６２９５頁；Ｌｉｔｔｌｅ  Ｍ．ら（２０００年）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、２１巻：３６４〜３７０頁；Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ  Ｓ−Ａ．およびＧｒｅｅｎ  Ｌ．  Ｌ．、（２００２年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３巻：５９３〜５９７頁；Ｍｕｒｐｈｙ，  Ａ．Ｊ．ら（２０１４年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、１１１巻（１４号）：５１５３〜５１５８頁を参照）、あるいは互いに選択された配列エレメントをスプライシングすることを伴う任意の他の手段によって調製、発現、創製、もしくは単離されたポリペプチドなどを指すように意図されている。一部の実施形態では、このような選択された配列エレメントの１つまたは複数は、自然に見出される。一部の実施形態では、このような選択された配列エレメントの１つまたは複数は、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで設計される。一部の実施形態では、１つまたは複数のこのような選択された配列エレメントは、例えば、天然供給源または合成供給源由来の公知の配列エレメントの変異誘発（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ）から生じる。例えば、一部の実施形態では、組換え抗体ポリペプチドは、目的の供給源生物（例えば、ヒト、マウスなど）の生殖系列に見出される配列から構成される。一部の実施形態では、組換え抗体は、変異誘発から生じた（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば、トランスジェニック動物において）アミノ酸配列を有し、その結果、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し、それに関連する一方、ｉｎ  ｖｉｖｏで生殖系列抗体レパートリー内に天然に存在しない場合がある配列である。
【０１００】
「回収すること」は、本明細書で使用する場合、作用物質または実体を、例えば、単離によって、例えば、当技術分野で公知の精製技法を使用して、他の以前に付随した要素を実質的に含まないようにするプロセスを指す。一部の実施形態では、作用物質または実体は、天然供給源および／または細胞を含む供給源から回収される。
【０１０１】
「参照」は、本明細書で使用する場合、目的の作用物質、動物、個体、集団、試料、配列、または値が比較される標準もしくは対照作用物質、動物、個体、集団、試料、配列、または値を記述する。一部の実施形態では、参照作用物質、動物、個体、集団、試料、配列、または値は、目的の作用物質、動物、個体、集団、試料、配列、または値の試験または決定と実質的に同時に試験および／または決定される。一部の実施形態では、参照作用物質、動物、個体、集団、試料、配列、または値は、有形媒体中に任意選択で具体化された歴史的な参照である。典型的には、当業者が理解すると予想されるように、参照作用物質、動物、個体、集団、試料、配列、または値は、目的の作用物質、動物、個体、集団、試料、配列、または値を決定し、または特徴付けるのに利用される条件と同等の条件下で決定され、または特徴付けられる。
【０１０２】
「リスク」、文脈から理解されることになるように、疾患、障害、および／または状態の「リスク」は、特定の個体が疾患、障害、および／または状態（例えば、放射線傷害）を発生させる見込みを含む。一部の実施形態では、リスクは、パーセンテージとして表現される。一部の実施形態では、リスクは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、最大で１００％である。一部の実施形態では、リスクは、参照試料または参照試料の群に関連したリスクと比べたリスクとして表現される。一部の実施形態では、参照試料または参照試料の群は、疾患、障害、状態、および／または事象（例えば、放射線傷害）の既知のリスクを有する。一部の実施形態では、参照試料または参照試料の群は、特定の個体と同等の個体由来である。一部の実施形態では、相対リスクは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ超である。
【０１０３】
「特異的結合」は、本明細書で使用する場合、結合が起こるべきである環境内の可能なパートナーを区別する結合剤の能力を指す。１つの特定の標的と相互作用する結合剤は、他の潜在的な標的が存在するとき、それが相互作用する標的に「特異的に結合する」と言われる。一部の実施形態では、特異的結合は、結合剤とそのパートナーとの間の会合の程度を検出または決定することによって評価され；一部の実施形態では、特異的結合は、結合剤−パートナー複合体の解離の程度を検出または決定することによって評価され；一部の実施形態では、特異的結合は、結合剤の、そのパートナーと別の実体との二者択一的な相互作用と競合する能力を検出または決定することによって評価される。一部の実施形態では、特異的結合は、一連の濃度にわたってこのような検出または決定を実施することによって評価される。
【０１０４】
「被験体」は、本明細書で使用する場合、ヒトを含めた任意の哺乳動物を意味する。本発明のある特定の実施形態では、被験体は、成人、青年、または乳児である。一部の実施形態では、用語「個体」または「患者」は、「被験体」と互換性であるように使用され、意図される。子宮内での医薬組成物の投与および／または処置の方法の実施も本発明によって企図されている。
【０１０５】
「実質的に」：本明細書で使用する場合、用語「実質的に」は、目的の特性または性質を完全な範囲（ｅｘｔｅｎｔ）もしくは程度（ｄｅｇｒｅｅ）またはほぼ完全な範囲もしくは程度に呈する定性的な状態を指す。生物学的技術分野における当業者は、仮にあるとしても、生物学的および化学的現象が、完了まで進み、および／もしくは完全性まで進行し、または絶対的な結果を達成もしくは回避することがほとんどないことを理解するであろう。したがって、用語「実質的に」は、多くの生物学的および化学的現象において固有の完全性の潜在的な欠如を捕捉するのに本明細書で使用される。
【０１０６】
「実質的な配列相同性」は、本明細書で使用する場合、アミノ酸または核酸配列間の比較を指す。当業者であれば認識すると予想されるが、２つの配列は、一般に、これらが対応する位置において相同残基を含有する場合、「実質的に相同」であると見なされる。相同残基は、同一残基であり得る。あるいは、相同残基は、適切に同様の構造的および／または機能的特性を伴った非同一残基であり得る。例えば、当業者が周知であるように、ある特定のアミノ酸は、典型的には、「疎水性」または「親水性」アミノ酸と、および／または「極性」または「非極性」側鎖を有すると分類される。１つのアミノ酸の同じタイプの別のアミノ酸に対する置換は、しばしば「相同」置換と見なされ得る。典型的なアミノ酸分類を表１および２に要約する。
【表１】
0006779873.tif 000002
【表２】
0006779873.tif 000003
【０１０７】
当技術分野で周知であるように、アミノ酸または核酸配列は、市販のコンピュータープログラム、例えば、ヌクレオチド配列についてのＢＬＡＳＴＮ、ならびにアミノ酸配列についてのＢＬＡＳＴＰ、ギャップ付きＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなどにおいて利用可能なものを含めた様々なアルゴリズムのいずれかを使用して比較することができる。例示的なこのようなプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２１５巻（３号）：４０３〜４１０頁、１９９０年；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、「Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：  ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５巻：３３８９〜３４０２頁、１９９７年；Ｂａｘｅｖａｎｉｓら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｗｉｌｅｙ、１９９８年；およびＭｉｓｅｎｅｒら（編）、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１３２巻）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９年に記載されており、これらの上記のもののすべては参照により本明細書に組み込まれている。相同配列を同定することに加えて、上述したプログラムは、典型的には、相同性の程度の指標を提供する。一部の実施形態では、２つの配列は、これらの対応する残基の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ超が、残基の該当するストレッチにわたって相同である場合、実質的に相同であると見なされる。一部の実施形態では、該当するストレッチは、完全な配列である。一部の実施形態では、該当するストレッチは、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２２５、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００、少なくとも３２５、少なくとも３５０、少なくとも３７５、少なくとも４００、少なくとも４２５、少なくとも４５０、少なくとも４７５、少なくとも５００、またはそれ超の残基である。
【０１０８】
「実質的な同一性」は、本明細書で使用する場合、アミノ酸または核酸配列間の比較を指す。当業者であれば認識すると予想されるが、２つの配列は、一般に、これらが対応する位置において同一残基を含有する場合、「実質的に同一」であると見なされる。当技術分野で周知であるように、アミノ酸または核酸配列は、市販のコンピュータープログラム、例えば、ヌクレオチド配列についてのＢＬＡＳＴＮ、ならびにアミノ酸配列についてのＢＬＡＳＴＰ、ギャップ付きＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなどにおいて利用可能なものを含めた様々なアルゴリズムのいずれかを使用して比較することができる。例示的なこのようなプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２１５巻（３号）：４０３〜４１０頁、１９９０年；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５巻：３３８９〜３４０２頁、１９９７年；Ｂａｘｅｖａｎｉｓら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｗｉｌｅｙ、１９９８年；およびＭｉｓｅｎｅｒら（編）、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１３２巻）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９年に記載されている。同一配列を同定することに加えて、上述したプログラムは、典型的には、同一性の程度の指標を提供する。一部の実施形態では、２つの配列は、これらの対応する残基の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ超が、残基の該当するストレッチにわたって同一である場合、実質的に同一であると見なされる。一部の実施形態では、該当するストレッチは、完全な配列である。一部の実施形態では、該当するストレッチは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、またはそれ超の残基である。ＣＤＲとの関連で、「実質的な同一性」への言及は、典型的には、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、参照ＣＤＲのものと同一のアミノ酸配列を有するＣＤＲを指す。
【０１０９】
「表面プラズモン共鳴」は、本明細書で使用する場合、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデンおよびＰｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用することなどによって、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出によって、リアルタイムで特異的結合相互作用の分析を可能にする光学現象を指す。さらなる記載については、Ｊｏｎｓｓｏｎ，  Ｕ．ら（１９９３年）、Ａｎｎ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｌｉｎ．、５１巻：１９〜２６頁；Ｊｏｎｓｓｏｎ，  Ｕ．ら（１９９１年）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１１巻：６２０〜６２７頁；Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，  Ｂ．ら（１９９５年）、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．、８巻：１２５〜１３１頁；およびＪｏｈｎｎｓｏｎ，  Ｂ．ら（１９９１年）、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９８巻：２６８〜２７７頁を参照。
【０１１０】
「治療有効量」は、本明細書で使用する場合、投与目的の所望の効果をもたらす量を意味する。一部の実施形態では、この用語は、疾患、障害、および／または状態を処置するために、治療的投薬レジメンに従って、疾患、障害、および／または状態に罹患している、またはこれらに感受性である集団に投与されるとき、十分である量を指す。一部の実施形態では、治療有効量は、疾患、障害、および／または状態の１つまたは複数の症状の発生数および／もしくは重症度を低減し、および／またはその発症を遅延させるものである。当業者は、用語「治療有効量」は、実際に、特定の個体において成功裏の処置が達成されることを要求しないことを認識していると予想される。むしろ、治療有効量は、このような処置を必要とする患者に投与されるとき、被験体のかなりの数において特定の所望の薬理学的応答をもたらす量であり得る。一部の実施形態では、治療有効量への言及は、１種もしくは複数の具体的な組織（例えば、疾患、障害、もしくは状態によって影響された組織）または流体（例えば、血液、唾液、血清、汗、涙、尿など）において測定される量への言及であり得る。当業者は、一部の実施形態では、治療有効量の特定の作用物質または療法を単回用量で処方および／または投与することができることを認識していると予想される。一部の実施形態では、治療上有効な作用物質は、例えば、投薬レジメンの一部として複数の用量で処方および／または投与することができる。
【０１１１】
「形質転換」は、本明細書で使用する場合、外因性ＤＮＡが宿主細胞内に導入される任意のプロセスを指す。形質転換は、当技術分野で周知の様々な方法を使用して天然または人工条件下で行うことができる。形質転換は、原核生物または真核生物宿主細胞内に外来核酸配列を挿入するための任意の公知の方法に依拠し得る。一部の実施形態では、特定の形質転換の方法論が、形質転換される宿主細胞に基づいて選択され、この方法論として、それだけに限らないが、ウイルス感染、電気穿孔、交配、リポフェクションを挙げることができる。一部の実施形態では、「形質転換された」細胞は、挿入されたＤＮＡが自律複製プラスミドとして、または宿主染色体の一部として複製することができる点で安定に形質転換されている。一部の実施形態では、形質転換細胞は、限定された期間にわたって導入された核酸を一過性に発現する。
【０１１２】
「ベクター」は、本明細書で使用する場合、それが連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターの１つのタイプは、「プラスミド」であり、これは、追加のＤＮＡセグメントがライゲートされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。ベクターの別のタイプは、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノム中にライゲートされ得るウイルスベクターである。ある特定のベクターは、これらが導入されている宿主細胞内で自律複製することができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞内に導入された際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ得、それによって宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある特定のベクターは、これらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターは、「発現ベクター」と本明細書で呼ばれる。
【０１１３】
標準技法を、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、および組織培養、および形質転換（例えば、電気穿孔、リポフェクション）のために使用することができる。酵素反応および精製技法は、製造者の仕様に従って、または当技術分野で一般に達成される通りもしくは本明細書に記載の通り実施することができる。上記の技法および手順は、一般に、当技術分野で周知の従来法に従って、ならびに本明細書全体にわたって引用され、論じられている様々な一般的なおよびより具体的な参考文献において記載されている通り実施することができる。例えば、任意の目的に関して参照により本明細書に組み込まれている、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年））を参照。
【０１１４】
特定の実施形態の詳細な説明
本発明は、確立された黒色腫関連腫瘍抗原と結合するマウス抗体の成功裏のヒト化を実証する。したがって本発明は、とりわけ、黒色腫細胞表面プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）およびニューロン−グリアタンパク質２（ＮＧ２）としても公知のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）または高分子量−黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）に結合するヒト化抗体を提供する。本発明は、マウス抗ＣＳＰＧ４抗体、マウス７６３．７４（マウス７６３、ｍ７６３、または７６３と本明細書で呼ばれる）の最初の成功裏のヒト化を具体的に提供し、その複数のヒトＩｇＧフォーマット（例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４）をさらに提供する。
【０１１５】
とりわけ、本開示は、本明細書に記載のヒト化７６３抗体が、親マウス７６３抗体と比較して、ヨウ素化（ｉｏｄｉｎａｔｉｏｎ）後に著しく遅いＫｏｆｆ速度、高親和性（例えば、ナノモル濃度）、および免疫反応性を保持することを具体的に実証する。さらに、本開示は、ヒト化７６３抗体がｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍を標的化することにおいて高度に効率的であることを具体的に実証する。一具体例を挙げると、本開示は、任意の他の抗ＣＳＰＧ４抗体と異なり、ヒト化７６３抗体の特異的に操作されたバリアントグリコフォームが、効率的な抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介することを実証する。
【０１１６】
本発明者らは、ＣＳＰＧ４＋腫瘍へとＴ細胞を再標的化（ｒｅｔａｒｇｅｔ）し、したがってがん療法において有用である高度に強力な完全ヒト化二重特異性抗体（ｈｕ７６３−ＢｓＡｂと本明細書で呼ばれる）の最初の成功裏の構築も本明細書で実証する。さらに、本明細書に記載するように、本発明の二重特異性抗体は、Ｔ細胞と係合し、本分野における一般的な問題に対処する既存の二重特異性抗体に対して改善をもたらす。二重特異性抗体によるＣＤ３の係合から生じるＴ細胞の過剰刺激は、サイトカインの放出に寄与することが報告されており、サイトカインは、Ｆｃ受容体結合および後続の補体の活性化と組み合わせて、サイトカインカスケードから生じる患者における悪影響を有する。本明細書に記載するように、本発明の二重特異性抗体は、腫瘍細胞の存在下でのみＴ細胞上でＣＤ３と係合することによってサイトカインの放出を促し、したがって、安全性プロファイルが改善された治療的二重特異性抗体をもたらす。
【０１１７】
理論に束縛されることを望まないが、本発明者らは、本明細書に提供されるデータが、一部の実施形態では（例えば、マウス抗体のヒト化が、典型的には、抗原への親和性の喪失をもたらす場合）、親和性に対する検出可能な悪影響が観察されなかったことを実証することを指摘する。さらに、本開示は、とりわけ、本明細書に記載のマウス７６３抗体のヒト化は、親マウス抗体と比較して、結合したコンフォメーショナルエピトープ（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ）への結合に悪影響を及ぼさなかったことを実証する。本開示は、腫瘍抗原への二価結合およびＴ細胞への一価結合を組み合わせる特異的なフォーマットを利用する二重特異性抗体の設計および構築も実証する。本発明者らは、本明細書に提供されるデータが、一部の実施形態では（例えば、ＦｃＲと結合せず、したがって補体を活性化しないバリアントＦｃ領域を含む）、このようなフォーマットが、サイトカインカスケード（「サイトカインストーム」）の有害作用を伴うことなくＴ細胞のＣＳＰＧ４＋腫瘍への効率的で強力な標的化をもたらすことを実証することを指摘する。したがって少なくとも一部の実施形態では、本開示は、Ｔ細胞を過剰刺激する可能性を排除し、腫瘍標的化の増強を達成する二重特異性抗体フォーマットの選択、および親マウス抗体のコンフォメーショナルエピトープへの高親和性結合を保持するヒト化抗体を包含する。
【０１１８】
腫瘍
一部の実施形態では、ＣＳＰＧ４を発現する任意の腫瘍をＣＳＰＧ４＋腫瘍と見なすことができる。一部の実施形態では、ＣＳＰＧ４＋腫瘍は、任意の組織型から発生し得る。一部の実施形態では、ＣＳＰＧ４＋腫瘍は、固形腫瘍であり得る。一部の実施形態では、ＣＳＰＧ４＋腫瘍は、軟部組織肉腫、脳腫瘍、骨腫瘍、乳癌、扁平上皮癌、膵臓腫瘍、胃腫瘍、黒色腫、および／または中皮腫を包含するかまたは含むことができる。一部の実施形態では、ＣＳＰＧ４＋腫瘍は、線維肉腫、平滑筋肉腫、多形性肉腫、脂肪肉腫、滑膜肉腫、軟骨肉腫、神経膠芽腫、脊索腫、小葉乳癌、ＴＮＢＣ乳癌、ＥＲ＋乳癌、ＨＥＲ２＋乳癌、乳管癌（ｄｕｃｔａｌ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、口腔扁平上皮癌、膵嚢胞腺腫（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃｙｓｔａｄｅｍｏｎａ）、膵管内乳頭粘液性新生物（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｎｔｒａｄｕｃｔａｌ  ｐａｐｉｌｌａｒｙ  ｍｕｃｉｎｏｕｓ  ｎｅｏｐｌａｓｍ）、膵管悪性疾患、ブドウ膜黒色腫、ＮＳ黒色腫、肢端黒子型黒色腫、結節性黒色腫、表在拡大型黒色腫、結膜黒色腫、線維形成性黒色腫（ｄｅｓｍｏｐｌａｓｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ）、肉腫様中皮腫（ｓａｃｒｏｍａｔｏｉｄ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｏｍａ）、類上皮中皮腫（ｅｐｉｔｈｅｌｉｏｉｄ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ）、二相性中皮腫（ｂｉｐｈａｓｉｃ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ）、骨肉腫、頭頸部がん、多形性神経膠芽腫、肉腫、腺癌、または結腸直腸腺癌を包含するかまたは含むことができる。一部の実施形態では、ＣＳＰＧ４＋腫瘍は、黒色腫、骨肉腫、頭頸部腫瘍、多形性神経膠芽腫、肉腫、および／または中皮腫である。
【０１１９】
黒色腫
世界的な黒色腫の発生数は、３〜７％の年間増加を伴って急速に上昇している。米国では、発生数は、１９７３年から１９９７年の間に男性の間でほぼ３倍となり、女性の間で２倍超となり、男性１００，０００人当たりおよそ２２人および女性１００，０００人当たり１４人に影響している。これは、米国がん協会によれば、２００５年単独でおよそ５９，５８０件の新しい診断および７７７０件の黒色腫による死亡となる。黒色腫の早期では、手術が潜在的な治癒モダリティを代表する。しかし、切除不能な病期ＩＩＩまたはＩＶ悪性黒色腫では、予後は、非常に芳しくないままである。病期ＩＶ疾患の生存期間中央値は、およそ６〜１０カ月であり、約４〜６％のみが５年まで生存する。５年未満前の２０１０年の時点で、全身化学療法が処置の主力であるが、これは一般に、治癒的ではなく対症的と見なされる。最近まで、２０％超の奏効率を生じさせた治療剤はほとんどない。メタ分析では、ダカルバジン単剤療法に対する応答は、５．３％から２８．０％の範囲であった（平均は１５．３％であった）。高用量の化学療法がインターフェロンまたはインターロイキン−２（ＩＬ−２）と組み合わされた生化学療法は、生存時間を改善しなかった。先の１０年において、自己抗原を使用する７件の完全ランダム化第ＩＩＩ相アジュバント黒色腫ワクチン治験のうち、どれも利益を示さなかった。細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の誘導は、典型的には、腫瘍の部位にホーミングすることができない。さらに、これらの標的抗原は、黒色腫にとって本質的ではないので、単一標的ワクチン後の腫瘍エスケープが予期される。
【０１２０】
２つの最近の開発、すなわち、低分子阻害剤（例えば、ＢＲＡＦ阻害剤）および免疫チェックポイント操作（例えば、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＰＤ１）が、高リスク黒色腫の予後を変化させ始めた。ヒト抗ＣＴＬＡ−４ＩｇＧ１モノクローナル抗体イピリムマブおよびトレメリムマブはともに、自己免疫性副作用をいくらか伴って、黒色腫および他のがんにおける持続的な臨床応答を生じた。養子Ｔ細胞療法も、最近多くの関心を受けており、骨髄破壊的療法と組み合わせたとき、著しく高い奏効率を生じた。これらのヒト実験は、黒色腫を制御および／または好転させることにおけるＴ細胞の潜在性を繰り返して示してきた。
【０１２１】
モノクローナル抗体は、細胞死を誘導し、シグナル伝達経路の遮断を促し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導することができる。それぞれＧＤ３（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，  Ａ．Ｎ．ら（１９８５年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、８２巻：１２４２〜１２４６頁）、ＨＭＷ−ＭＡＡ（またはＣＳＰＧ４；Ｒａｊａ，  Ｃ．ら（２００７年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．  Ｔｈｅｒ．、６巻：８４６〜８５２頁）、ＧＤ２（Ｃｈｅｕｎｇ，  Ｎ．Ｋ．ら（１９８７年）、Ｏｎｃｏｌ．、５巻：１４３０〜１４４０頁）、およびＬ１ＣＡＭ（Ｍｅｉｅｒ，  Ｆ．ら（２００６年）、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ、１１９巻：５４９〜５５５頁；Ｎｏｖａｋ−Ｈｏｆｅｒ，  Ｉ．、（２００７年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ．  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．、２２巻：１７５〜１８４頁）を標的化するいくつかの抗体（Ｒ２４、９．２．２７、３Ｆ８、およびＣＥ７）が、黒色腫に対して臨床において成功裏に試験されている。
【０１２２】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４
コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４、また、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＭＣＳＰ、ＭＣＳＰＧ、ＭＥＬ−ＣＳＰＧ、ＭＳＫ１６、ＮＧ２としても公知）は、高レベルで、黒色腫の８５％超（Ｋａｎｔｏｒ，  Ｒ．Ｒ．ら（１９８２年）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１巻：４７３〜４８２頁）、神経膠腫の７０％、軟骨腫および軟骨肉腫の５０％、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）の５５％、中皮腫の１００％（Ｒｉｖｅｒａ，  Ｚ．ら（２０１２年）、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１８巻：５３５２〜５３６３頁）、浸潤性乳管癌の７７％、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、神経膠芽腫、明細胞腎癌、神経芽細胞腫、および肉腫の５０％（Ｇｅｌｄｒｅｓ，  Ｃ．ら（２０１４年）、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２０巻：９６２〜９７１頁）において発現される２５０ｋＤ糖タンパク質である。マウスおよびヒトＣＳＰＧ４の例示的なアミノ酸配列を以下に提示する（シグナルペプチドをイタリック体にしている）。
【化１】
0006779873.tif 000004
【化２】
0006779873.tif 000005
【化３】
0006779873.tif 000006
【０１２３】
ＣＳＰＧ４タンパク質の生物学は、広範に注解されている。ＣＳＰＧ４は、軸索再生中に神経突起伸長および成長円錐崩壊を阻害することが報告されている（Ｂｒａｄｂｕｒｙ，  Ｅ．Ｊ．ら（２００２年）、Ｎａｔｕｒｅ、４１６巻：６３６〜６４０頁）。コラーゲンアルファ２（ＶＩ）の細胞表面受容体として、ＣＳＰＧ４は、細胞にその支持体（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）上で遊走する能力を付与する。ＣＳＰＧ４は、その細胞外Ｎ末端増殖因子を通じて、細胞外マトリックスプロテアーゼと結合し、これらの活性をモジュレートする（Ｓｔａｌｌｃｕｐ，  Ｗ．Ｂ．ら（２００８年）、Ｃｅｌｌ  Ａｄｈ．  Ｍｉｇｒ．、２巻：１９２〜２０１頁）。ＣＳＰＧ４は、黒色腫細胞浸潤性質に参加するＩ型コラーゲンのＭＰＰ１６依存分解および浸潤も調節する（Ｉｉｄａ，  Ｊ．ら（２００１年）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７６巻：１８７８６〜１８７９４頁）。ＣＳＰＧ４は、プラスミノーゲン活性化の増強およびアンギオスタチンの阻害によってプラスミノーゲン系をモジュレートすることが報告された（Ｋｉｒｓｃｈ，  Ｍ．ら（２００４年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ．  Ｒｅｓ．、１１７巻：２８５〜３０４頁）。さらに、ＣＳＰＧ４は、その細胞質Ｃ末端を通じて足場およびシグナリングタンパク質と結合することによってシグナル伝達タンパク質として機能することが報告された（Ｂａｒｒｉｔｔ，  Ｄ．Ｓ．ら（２０００年）、Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、７９巻：２１３〜２２４頁；Ｓｔｅｇｍｕｌｌｅｒ，  Ｊ．ら（２００２年）、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ．、３１巻：４９７〜５０５頁；Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ，  Ｎ．ら（２００８年）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２８３巻：８３１０〜８３１７頁）。ＣＳＰＧ４はまた、Ｒｈｏ  ＧＴＰａｓｅ活性化によって退縮線維（ｒｅｔｒａｃｔｉｏｎ  ｆｉｂｅｒ）形成および細胞分極を促し（Ｃａｍｐｏｌｉ，  Ｍ．Ｒ．ら（２００４年）、Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４巻：２６７〜２９６頁）、ＣＤＣ４２、ＡＣＫ１、およびＢＣＡＲ１．１７によってシグナリングカスケードを動員および活性化することによってアルファ−４、ベータ−１インテグリン媒介接着および拡散を刺激する（Ｅｉｓｅｎｍａｎｎ，  Ｋ．Ｍ．ら（１９９９年）、Ｎａｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１巻：５０７〜５１３頁）。さらに他者が、ＣＳＰＧ４がＦＡＫおよびＥＲＫ１／ＥＲＫ２シグナリングカスケードを活性化することを報告した（Ｙａｎｇ，  Ｊ．ら（２００４年）、Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１６５巻：８８１〜８９１頁）。
【０１２４】
ＣＳＰＧ４は、進化を通じて高度に保存され、正常組織において高度に制限された黒色腫および腫瘍活性化周皮細胞上の接着および遊走タンパク質である。ＣＳＰＧ４は、基底乳がん細胞株によって発現されるが、管腔乳がん細胞株によって発現されない。ＣＳＰＧ４は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍増殖および転移を阻害した抗ＣＳＰＧ４抗体（ｍＡｂ２２５．２２８）によって示される通り、原発性トリプルネガティブ乳がん腫瘍および細胞株の７３％において発現されることが報告された（Ｗａｎｇ，  Ｘ．ら（２０１０年）、Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．、１０２巻：１４９６〜１５１２頁）。ＣＳＰＧ４は、イヌ悪性黒色腫の５７％に見出され（Ｍａｙａｙｏ，  Ｓ．Ｌ．ら（２０１１年）、Ｖｅｔ．  Ｊ．、１９０巻：ｅ２６〜３０頁）、最近のワクチン治験により、全体的なおよび無疾患生存時間が有意に延長された（Ｒｉｃｃａｒｄｏ，  Ｆ．ら（２０１４年）、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２０巻：３７５３〜３７６２頁）。記載されたヒトＨＭＷ−ＭＡＡ（ＣＳＰＧ４）に対する最初の抗体は、９．２．２７であった。これは、マウスＩｇＧ２ａ抗体である。最大で２００ｍｇが、発熱以外の主要な副作用を伴うことなくヒトに注入された（Ｏｌｄｈａｍ，  Ｒ．Ｋ．ら（１９８４年）、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．、２巻：１２３５〜１２４４頁）。後続の研究は、放射性イメージングおよび放射免疫療法において主に注目され、この場合、９．２．２７抗体は、アルファ−エミッターにコンジュゲートされた（Ｄｅｌ  Ｖｅｃｃｈｉｏ，  Ｓ．ら（１９８９年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、４９巻：２７８３〜２７８９頁）。静脈内２１３Ｂｉ−９．２．２７で処置された病期ＩＶ／イントランジット転移性黒色腫を有する２２名の患者の中で（１．５〜２５．８ｍＣｉ；Ｒａｊａ，  Ｃ．ら（２００７年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．  Ｔｈｅｒ．、６巻：８４６〜８５２頁）、１４％がＰＲを有し、５０％がＳＤを有し、毒性は、無視できた。抗体９．２．２７はまた、免疫毒素として（Ｇｏｄａｌ，  Ａ．ら（１９９２年）、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ、５２巻：６３１〜６３５頁）、骨肉腫微小転移を検出するために（Ｂｒｕｌａｎｄ，  Ｏ．Ｓ．ら（２００５年）、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１１巻：４６６６〜４６７３頁）成功裏に使用されている。マウス抗ＣＳＰＧ４抗体７６３．７４は、１９８０年代に最初に記載され（Ｎａｔａｌｉ，  Ｐ．Ｇ．ら（１９８９年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、４９巻：１２６９〜１２７４頁）、皮膚およびブドウ膜黒色腫の両方と反応することが示された。マウス７６３．７４抗体のエピトープは、ファージディスプレイによってアミノ酸配列に対してマッピングされた（Ｌｕｏ，  Ｗ．ら（２００５年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７４巻：７１０４〜７１１０頁）。７６３に対する抗イディオタイプ抗体は、臨床治験においてワクチンとして使用されている（Ｍｉｔｔｅｌｍａｎ，  Ａ．ら（１９９５年）、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１巻：７０５〜７１３頁）。マウス７６３抗体は、基底乳房腫瘍実験的および手術後肺転移の両方、ならびにマウスにおけるマウスゼノグラフト中の局所的腫瘍再発を有意に阻害することが報告された（Ｗａｎｇ，  Ｘ．ら、上記）。マウス７６３抗体から構築されたｓｃＦｖを使用するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も記載された（Ｒｅｉｎｈｏｌｄ，  Ｕ．ら（１９９９年）、Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、１１２巻：７４４〜７５０頁）。ＣＳＰＧ４−ＣＡＲ修飾Ｔ細胞（抗体２２５．２８または７６３に由来）は、ヒト黒色腫、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、および乳癌を異種移植されたＮＳＧマウスにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍増殖を制御する能力を実証した（Ｇｅｌｄｒｅｓ，  Ｃ．ら、上記；Ｂｕｒｎｓ，  Ｗ．Ｒ．ら（２０１０年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、７０巻：３０２７〜３０３３頁）。ファージライブラリーに由来するヒトｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ−ＦｃＣ２１）が最近記載され、黒色腫に対してｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで活性を示すｓｃＦｖ−Ｆｃ形態として操作された（Ｗａｎｇ，  Ｘ．ら（２０１１年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、７１巻：７４１０〜７４２２頁）。抗ＣＳＰＧ４×抗ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）抗体が報告によれば開発された（Ｂｌｕｅｍｅｌ，  Ｃ．ら（２０１０年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、５９巻：１１９７〜１２０９頁；Ｔｏｒｉｓｕ−Ｉｔａｋｕｒａ，  Ｈ．ら（２０１１年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３４巻：５９７〜６０５頁）が、この治療剤の臨床ステータスは未知である。現在、いかなるマウス７６３．７４に由来する二重特異性抗体も、成功裏に開発されていない。
【０１２５】
本明細書に記載するように、本発明者らは、マウス７６３．７４に基づくヒト化抗ＣＳＰＧ４抗体（マウス７６３またはｍ７６３と本明細書で呼ばれる）を開発した。１２種の特定のこのようなヒト化抗ＣＳＰＧ４抗体を本明細書で明示的に例示する。いずれの特定の理論にも束縛されることを望むことなく、本発明者らは、マウス７６３は、高親和性でペプチドエピトープ（炭水化物エピトープではない）と結合し（以下の実施例セクションで記載される通り）、他の抗ＣＳＰＧ４抗体と比較して正常および黒色腫組織において同様の染色パターンを有する（表３および４を参照；ｎｅｇ：陰性、１：陽性＋、２：陽性＋＋、３：陽性＋＋＋）という洞察に対して本明細書に提供されるヒト化抗ＣＳＰＧ４抗体を開発した。生成し、本明細書に記載した様々な重鎖および軽鎖ヒト化配列の中で、１つのＶＨおよび１つのＶＬ配列を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗原親和性および安定性に基づいて選択した。３種のヒト化抗体フォーマットを成功裏に操作した（ｈｕ７６３−ＩｇＧ１、ｈｕ７６３−ＩｇＧ４、およびｈｕ７６３−ＩｇＧ１ｎ［特別なグリコフォーム］）。本発明者らは、本明細書に提供されるデータが、ヒト化抗体は、マウス７６３と同等の抗原結合を実証し、特に、ヒト化７６３抗体は、遅いｋｏｆｆ速度および高度に好都合なＫＤを実証したことを実証することを指摘する。さらに、本発明者らは、公開された抗ＣＳＰＧ４抗体または融合タンパク質のいずれとも異なり、本明細書に提供されるヒト化７６３抗体は、黒色腫細胞（例えば、ｈｕ７６３−ＩｇＧ１ｎ）に対して高度に効率的な抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介することを指摘する。
【０１２６】
本発明はさらに、ヒト化７６３抗体配列に基づく二重特異性抗体、特に、黒色腫細胞の表面上のＣＳＰＧ４を標的化するようにＴ細胞を再誘導する二重特異性抗体を提供する。２つの具体例を挙げると、本開示は、ｈｕ７６３−ＨＣ−ＯＫＴ３と本明細書で呼ばれる抗ＣＳＰＧ４×抗ＣＤ３二重特異性抗体を創製するためのヒト化７６３重鎖のカルボキシル終端への、またはｈｕ７６３−ＬＣ−ＯＫＴ３と本明細書で呼ばれる抗ＣＳＰＧ４×抗ＣＤ３二重特異性抗体を創製するためのヒト化７６３軽鎖のカルボキシル終端への抗ＣＤ３抗体要素（例えば、ヒト化ＯＫＴ３  ｓｃＦｖ）の成功裏の連結を実証する。二重特異性抗体へのさらなる修飾を行って追加のエフェクター機能を操作した。例えば、Ｎ２９７Ａ変異をＦｃ領域中に導入し、それによってグリコシル化を排除した。グリコシル化のこの排除は、Ｆｃ受容体結合の無効に起因して補体活性化の低減をもたらし、それは、Ｔ細胞の係合に伴うと報告されている非特異的サイトカインストームを回避する。本発明者らは、本明細書に提供されるデータが、ヒト化抗ＣＳＰＧ４×抗ＣＤ３二重特異性抗体は、Ｔ細胞および誘導されたＴ細胞を有効に活性化して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒト腫瘍細胞株を溶解することを具体的に実証することを指摘する。さらに、本明細書に提供される二重特異性抗体は、マウス黒色腫ゼノグラフトモデルにおける腫瘍増殖を有意に阻害した。本明細書に提供されるデータにより、本明細書に記載のヒト化単一特異性および二重特異性抗体が、有効性および安全性プロファイルの改善によって特徴付けられるがん治療剤を代表することが確認される。
【表３】
0006779873.tif 000007
【表４】
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【０１２７】
本発明の例示的なヒト化およびキメラＣＳＰＧ４抗体を表５に提示する。Ｃｈ：キメラ；Ｈｕ：ヒト化；ＨＣ：重鎖；ＬＣ：軽鎖。
【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【表５−４】
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【表５−５】
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【表５−６】
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【表５−７】
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【表５−８】
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【０１２８】
様々な実施形態では、本発明によるヒト化抗ＣＳＰＧ４抗体は、重鎖および軽鎖可変領域から構成され、重鎖可変領域は、マウス７６３抗体の重鎖可変領域内で見出されるＣＤＲのうちの少なくとも１つを含有し、軽鎖可変領域は、マウス７６３抗体の軽鎖可変領域内で見出されるＣＤＲのうちの少なくとも１つを含有する。
【０１２９】
様々な実施形態では、本発明によるヒト化抗ＣＳＰＧ４抗体は、重鎖および軽鎖可変領域から構成され、重鎖可変領域は、マウス７６３抗体の重鎖可変領域内で見出されるＣＤＲのうちの少なくとも２つを含有し、軽鎖可変領域は、マウス７６３抗体の軽鎖可変領域内で見出されるＣＤＲのうちの少なくとも２つを含有する。
【０１３０】
様々な実施形態では、本発明によるヒト化抗ＣＳＰＧ４抗体は、重鎖および軽鎖可変領域から構成され、重鎖可変領域は、マウス７６３抗体の重鎖可変領域内で見出される３つのＣＤＲを含有し、軽鎖可変領域は、マウス７６３抗体の軽鎖可変領域内で見出される３つのＣＤＲを含有する。
【０１３１】
様々な実施形態では、本発明によるヒト化抗ＣＳＰＧ４抗体は、重鎖および軽鎖可変領域から構成され、重鎖可変領域は、マウス７６３抗体の重鎖可変領域内で見出される３つのＣＤＲを含有する。
【０１３２】
様々な実施形態では、本発明によるヒト化抗ＣＳＰＧ４抗体は、重鎖および軽鎖可変領域から構成され、重鎖可変領域は、３つのＣＤＲを含有し、ＣＤＲはそれぞれ、表５に現れる重鎖ＣＤＲと少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）同一である配列を有する。
【０１３３】
様々な実施形態では、本発明によるヒト化抗ＣＳＰＧ４抗体は、重鎖および軽鎖可変領域から構成され、重鎖可変領域は、３つのＣＤＲを含有し、ＣＤＲはそれぞれ、表５に現れる重鎖ＣＤＲと同一である配列を有する。
【０１３４】
様々な実施形態では、本発明によるヒト化抗ＣＳＰＧ４抗体は、重鎖および軽鎖可変領域から構成され、軽鎖可変領域は、マウス７６３抗体の軽鎖可変領域内で見出される３つのＣＤＲを含有する。
【０１３５】
様々な実施形態では、本発明によるヒト化抗ＣＳＰＧ４抗体は、重鎖および軽鎖可変領域から構成され、軽鎖可変領域は、３つのＣＤＲを含有し、ＣＤＲはそれぞれ、表５に現れる軽鎖ＣＤＲと少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）同一である配列を有する。
【０１３６】
様々な実施形態では、本発明によるヒト化抗ＣＳＰＧ４抗体は、重鎖および軽鎖可変領域から構成され、軽鎖可変領域は、３つのＣＤＲを含有し、ＣＤＲはそれぞれ、表５に現れる軽鎖ＣＤＲと同一である配列を有する。
【０１３７】
様々な実施形態では、本発明によるヒト化抗ＣＳＰＧ４抗体は、重鎖および軽鎖可変領域から構成され、重鎖可変領域は、表５に現れる重鎖可変領域と少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）同一である配列を有する。
【０１３８】
様々な実施形態では、本発明によるヒト化抗ＣＳＰＧ４抗体は、重鎖および軽鎖可変領域から構成され、重鎖可変領域は、表５に現れる重鎖可変領域と同一である配列を有する。
【０１３９】
様々な実施形態では、本発明によるヒト化抗ＣＳＰＧ４抗体は、重鎖および軽鎖可変領域から構成され、軽鎖可変領域は、表５に現れる軽鎖可変領域と少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）同一である配列を有する。
【０１４０】
様々な実施形態では、本発明によるヒト化抗ＣＳＰＧ４抗体は、重鎖および軽鎖可変領域から構成され、軽鎖可変領域は、表５に現れる軽鎖可変領域と同一である配列を有する。
【０１４１】
様々な実施形態では、本発明によるヒト化抗ＣＳＰＧ４抗体は、重鎖および軽鎖可変領域から構成され、重鎖可変領域は、表５に現れる重鎖可変領域と少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）同一である配列を有し、軽鎖可変領域は、表５に現れる軽鎖可変領域と少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）同一である配列を有する。
【０１４２】
様々な実施形態では、本発明によるヒト化抗ＣＳＰＧ４抗体は、重鎖および軽鎖可変領域から構成され、重鎖可変領域は、表５に現れる重鎖可変領域と同一である配列を有し、軽鎖可変領域は、表５に現れる軽鎖可変領域と同一である配列を有する。
【０１４３】
様々な実施形態では、本発明によるヒト化抗ＣＳＰＧ４抗体は、表５に現れる重鎖および軽鎖可変領域配列から選択される重鎖および軽鎖可変領域から構成される。
【０１４４】
様々な実施形態では、本発明による二重特異性結合剤（例えば、二重特異性抗体）は、第１の結合要素および第２の結合要素から構成される。多くの実施形態では、本明細書に記載の二重特異性結合剤の第１および第２の結合要素は、それぞれ、異なる特異性によって特徴付けられる抗体要素から構成される。多くの実施形態では、抗体要素は、表５から選択される。
【０１４５】
様々な実施形態では、本発明による二重特異性結合剤は、第１の結合要素、第２の結合要素を含む。様々な実施形態では、本発明による二重特異性結合剤は、第１の結合要素、第２の結合要素、ならびに第１および第２の結合要素の両方に接続された（例えば、第１および第２の結合要素の間に位置した）リンカーを含む。
【０１４６】
様々な実施形態では、本明細書に記載の第１および／または第２の結合要素は、抗体要素を含み、またはそれである。様々な実施形態では、本明細書に記載の第１および／または第２の結合要素は、リンカー配列を含む。
【０１４７】
様々な実施形態では、本明細書に記載の第１および／または第２の結合要素は、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）を含み、またはそれである。様々な実施形態では、本明細書に記載の第１および／または第２の結合要素は、抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）を含み、またはそれである。様々な実施形態では、本明細書に記載の第１の結合要素は、免疫グロブリンを含み、またはそれであり、第２の結合要素は、抗体断片を含み、またはそれである。一部のある特定の実施形態では、第１の結合要素は、免疫グロブリンであり、第２の結合要素は、抗体断片である。一部のある特定の実施形態では、第１の結合要素は、ＩｇＧであり、第２の結合要素は、ｓｃＦｖである。
【０１４８】
一部のある特定の実施形態では、本発明による二重特異性結合剤は、重鎖および軽鎖を含む免疫グロブリン、ならびにｓｃＦｖを含む。一部のある特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、免疫グロブリンの重鎖のＣ末端に連結されている。一部のある特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、免疫グロブリンの軽鎖のＣ末端に連結されている。様々な実施形態では、ｓｃＦｖは、リンカー配列を介して重鎖または軽鎖に連結されている。
【０１４９】
一部の実施形態では、本発明の二重特異性結合剤は、表５に現れる配列と少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）同一の配列を含む。
【０１５０】
一部の実施形態では、本発明の二重特異性結合剤は、表５に現れる配列と実質的に同一である配列を含む。
【０１５１】
一部の実施形態では、本発明の二重特異性結合剤は、表５に現れる配列と同一である配列を含む。
【０１５２】
一部の実施形態では、本発明の二重特異性結合剤は、表５に現れる配列から選択される。
【０１５３】
様々な実施形態では、本明細書に記載の二重特異性結合剤の第１の結合要素は、表５に現れる抗体要素と少なくとも５０％（例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ超）同一の配列を有する抗体要素を含む。
【０１５４】
様々な実施形態では、本明細書に記載の二重特異性結合剤の第１の結合要素は、表５に現れる抗体要素と同一である配列を有する抗体要素を含む。
【０１５５】
様々な実施形態では、本明細書に記載の二重特異性結合剤の第２の結合要素は、表５に現れる抗体要素と少なくとも５０％（例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ超）同一の配列を有する抗体要素を含む。
【０１５６】
様々な実施形態では、本明細書に記載の二重特異性結合剤の第２の結合要素は、表５に現れる抗体要素と同一である配列を有する抗体要素を含む。
【０１５７】
ヒト化抗体
一部の実施形態では、本発明により提供される抗体は、モノクローナル抗体、特に、他の種に由来する同族の抗ＣＳＰＧ４抗体のヒト化バーションである。ヒト化抗体は、一部の実施形態では、組換えＤＮＡ技術により生産される抗体であり、ここでは、抗原結合に要求されないヒト免疫グロブリン軽鎖または重鎖のアミノ酸の一部またはすべて（例えば、可変ドメインの定常領域およびフレームワーク領域）は、同族の非ヒト抗体の軽鎖または重鎖由来の対応するアミノ酸の代わりに使うのに使用される。例として、所与の抗原に対するマウス抗体のヒト化バージョンは、その重鎖および軽鎖の両方上に（１）ヒト抗体の定常領域；（２）ヒト抗体の可変ドメイン由来のフレームワーク領域；および（３）マウス抗体由来のＣＤＲを有する。必要な場合、ヒトフレームワーク領域内の１つまたは複数の残基を、抗原に対するヒト化抗体の結合親和性を保存するようにマウス抗体における対応する位置の残基に変更することができる。この変更は時に、「復帰変異」と呼ばれる。同様に、所望の理由、例えば、安定性または抗原に対する親和性のために、正変異（ｆｏｒｗａｒｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）を行ってマウス配列に復帰することができる。ヒト化抗体は一般に、キメラヒト抗体と比較してヒトにおいて免疫応答を誘発する可能性が低く、その理由は、ヒト化抗体が相当により少ない非ヒト要素を含有するためである。
【０１５８】
本発明のヒト化抗体を作製するための適当な方法は、例えば、Ｗｉｎｔｅｒ、ＥＰ０２３９４００；Ｊｏｎｅｓら（１９８６年）、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻：５２２〜５２５頁；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８年）、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３〜３２７頁；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻：１５３４〜１５３６頁；Ｑｕｅｅｎら（１９８９年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、８６巻：１００２９頁；米国特許第６，１８０，３７０号；およびＯｒｌａｎｄｉら（１９８９年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、８６巻：３８３３頁に記載されており、これらのすべての開示は、その全体が本明細書に参照により組み込まれている。一般に、ヒト抗体へのマウス（または他の非ヒト）ＣＤＲの移植は、以下の通り達成される。重鎖および軽鎖可変ドメインをコードするｃＤＮＡをハイブリドーマから単離する。ＣＤＲを含めた可変ドメインのＤＮＡ配列を配列決定によって決定する。ＣＤＲをコードするＤＮＡを、ヒト抗体重鎖または軽鎖可変ドメインコード配列の対応する領域内に挿入し、所望のアイソタイプ（例えば、ＣＨについてγ１およびＣＬについてκ）のヒト定常領域遺伝子セグメントに取り付け、遺伝子合成する。ヒト化重鎖および軽鎖遺伝子を哺乳動物宿主細胞（例えば、ＣＨＯまたはＮＳＯ細胞）内で共発現させて可溶性ヒト化抗体を生産する。抗体の大規模生産を促進するために、産生株内でＤＨＦＲ遺伝子またはＧＳ遺伝子を使用して高発現体を選択することが望ましいことが多い。これらの産生細胞株をバイオリアクター、または中空糸培養系、またはＷＡＶＥ技術で培養し、可溶性抗体のバルク培養物を生産し、または乳汁中に抗体を発現するトランスジェニック哺乳動物（例えば、ヤギ、ウシ、またはヒツジ）を生産する（例えば、米国特許第５，８２７，６９０号を参照）。
【０１５９】
上述した手法を使用して、マウス７６３抗体のヒト化およびキメラバージョンを生成した。以前に記載した通り、軽鎖および重鎖のマウス７６３可変領域をコードするｃＤＮＡを使用して、マウス７６３可変領域がヒトＩｇＧ１（重鎖について）およびヒトカッパ（軽鎖について）定常領域に連結されたマウス−ヒトキメラの発現のためのベクターを構築した。さらに、Ｆｃ受容体の結合を増強し、抗原親和性を増強するために、バリアントグリコシル化を有するヒト化７６３の新規形態を創製した。
【０１６０】
ヒト化７６３抗体を生成するために、ヒトアクセプターフレームワークドメインを、ヒト生殖系列配列への相同性マッチングによって選択した。これらの選択したヒトアクセプターフレームワークを使用して、実施例において以下に記載するように、軽鎖および重鎖可変ドメインを設計し、それぞれのいくつかのバリアント／バージョンを作製し、発現させた。
【０１６１】
完全ヒト抗体が、ヒト患者の治療的処置にとって特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用して上述したファージディスプレイ法を含めた当技術分野で公知の様々な方法によって作製することができる。米国特許第４，４４４，８８７号および同第４，７１６，１１１号；ならびに国際特許出願公開第ＷＯ９８／４６６４５号、同第ＷＯ９８／６０４３３号、同第ＷＯ９８／２４８９３号、同第ＷＯ９８／１６６６４号、同第ＷＯ９６／３４０９６号、同第ＷＯ９６／３３７３５号、および同第ＷＯ９１／１０７４１号も参照。これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。ＣｏｌｅらおよびＢｏｅｒｄｅｒらの技法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である（Ｃｏｌｅら（１９８５年）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒ．Ａ．  ＲｅｉｓｆｅｌｄおよびＳ．  Ｓｅｌｌ編、７７〜９６頁、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ；Ｂｏｅｒｎｅｒら（１９９１年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４７巻（１号）：８６〜９５頁）。
【０１６２】
他の技法を使用して生産されるが、本発明の抗ＣＳＰＧ４抗体の可変領域を保持するヒト抗体は、本明細書に含まれる。ヒト抗体はまた、機能的内因性マウス免疫グロブリンを発現することができないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを使用して生産することができる（例えば、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ（１９９５年）、Ｉｎｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３巻：６５〜９３頁；Ｔａｙｌｏｒ，  Ｌ．  Ｄ．ら（１９９２年）、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２０巻：６２８７〜６２９５頁；Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ  Ｓ−Ａ．およびＧｒｅｅｎ  Ｌ．  Ｌ．（２００２年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３巻：５９３〜５９７頁；Ｌｉｔｔｌｅ  Ｍ．ら（２０００年）、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ、２１巻：３６４〜３７０頁；Ｍｕｒｐｈｙ，  Ａ．Ｊ．ら（２０１４年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ．、１１１巻（１４号）：５１５３〜５１５８頁を参照）。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を生産するためのこの技術ならびにこのような抗体を生産するためのプロトコールの詳細な考察については、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ９８／２４８９３号；同第ＷＯ９２／０１０４７号；同第ＷＯ９６／３４０９６号；同第ＷＯ９６／３３７３５号；欧州特許第０５９８８７７号；米国特許第５，４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８８６，７９３号；同第５，９１６，７７１号；同第５，９３９，５９８号；および同第８，５０２，０１８号を参照。これらは、その全体が本明細書に参照により組み込まれている。
【０１６３】
また、ヒトモノクローナル抗体は、ヒト末梢血白血球、脾細胞、または骨髄を移植されたマウスを免疫化することによって作製することができる（例えば、ＸＴＬのトリオーマ技法）。選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「ガイド付き選択（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる技法を使用して生成することができる。この手法では、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウス抗体が、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択をガイドするのに使用される（Ｊｅｓｐｅｒｓら（１９８８年）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１２巻：８９９〜９０３頁）。
【０１６４】
本明細書で使用する場合、「抗ＣＳＰＧ４抗体」、「抗ＣＳＰＧ４抗体部分」、もしくは「抗ＣＳＰＧ４抗体断片」、および／または「抗ＣＳＰＧ４抗体バリアント」などは、本発明の抗体中に組み込むことができる非マウス起源、好ましくはヒト起源の重鎖もしくは軽鎖可変領域、重鎖もしくは軽鎖定常領域、フレームワーク領域、またはこれらの任意の部分と組み合わせて、本明細書に記載のモノクローナル抗体のいずれかに由来する重鎖もしくは軽鎖またはそのリガンド結合部分の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含む分子を含有する任意のタンパク質またはペプチドを含む。あるいは、用語「抗ＣＳＰＧ４抗体」は、ｈｕ７６３ＩｇＧ１  Ｈ１−Ｌ１、ｈｕ７６３ＩｇＧ１  Ｈ２−Ｌ２、ｈｕ７６３ＩｇＧ４  Ｈ１−Ｌ１、ｈｕ７６３ＩｇＧ４  Ｈ２−Ｌ２、ｈｕ７６３ＩｇＧ１ｎ  Ｈ１−Ｌ１、ｈｕ７６３ＩｇＧ１ｎ  Ｈ２−Ｌ２、ｈｕ７６３ＩｇＧ１  Ｈ１−Ｌ２、ｈｕ７６３ＩｇＧ４  Ｈ１−Ｌ２、ｈｕ７６３ＩｇＧ１ｎ  Ｈ１−Ｌ２、ｈｕ７６３ＩｇＧ１  Ｈ２−Ｌ１、ｈｕ７６３ＩｇＧ４  Ｈ２−Ｌ１、ｈｕ７６３ＩｇＧ１ｎ  Ｈ２−Ｌ１、およびこれらの組合せ、その上これらの断片および領域、例えば、ｈｕ７６３Ｈ１−Ｌ１  ｓｃＦｖ、ｈｕ７６３Ｈ２−Ｌ２  ｓｃＦｖ、ｈｕ７６３Ｈ１−Ｌ２  ｓｃＦｖ、ｈｕ７６３Ｈ２−Ｌ１  ｓｃＦｖ、およびこれらの組合せを含めた本発明の単鎖可変断片などを集合的に、または個々に指すものとする。このようなヒト化抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕ、および／またはｉｎ  ｖｉｖｏで少なくとも１つの細胞機能をモジュレートし、低下させ、拮抗し、緩和し、軽減し、遮断し、阻害し、抑止し、および／または妨害することができ、前記細胞は、ＣＳＰＧ４を発現する。非限定的な例として、本発明の適当な抗ＣＳＰＧ４抗体、指定された部分またはバリアントは、ヒトＣＳＰＧ４のエピトープ、特にペプチドエピトープに高親和性を伴って結合することができる。
【０１６５】
抗体断片は、当技術分野で公知であるように、および／または本明細書に記載するように、酵素的切断、合成または組換え技法によって生産することができる。抗体は、１種または複数の停止コドンが天然の停止部位の上流に導入された抗体遺伝子を使用して様々なトランケート型で生産することもできる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２重鎖部分をコードする組合せ遺伝子を設計して、重鎖のＣＨ１ドメインおよび／またはヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含めることができる。抗体の様々な部分を、慣例的な技法によって化学的に一緒に接合することができ、または遺伝子操作技法を使用して連続タンパク質として調製することができる。
【０１６６】
一部の実施形態では、本発明のキメラまたはヒト化抗体は、ＣＤＲが、本明細書に記載の抗ＣＳＰＧ４抗体および少なくとも一部の１種または複数に由来し、または抗体の残りが１種または複数のヒト抗体に由来するものを含む。したがって、抗体のヒト部分は、ヒトにおいて実質的に非免疫原性であるフレームワーク、ＣＬ、ＣＨドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）、ヒンジ、ＶＬ、ＶＨ領域を含み得る。ヒト抗体に由来する抗体の領域は、ヒト抗体と１００％の同一性を有する必要はない。一部の実施形態では、可能な限り多くのヒトアミノ酸残基が、免疫原性が無視できるために保持されるが、ヒト残基は、抗体のヒト化を同時に最大にしながらＣＤＲによって形成される抗原結合部位を支持するために必要に応じて修飾され得る。このような変更またはバリエーションは、一部の実施形態では、非修飾抗体と比べてヒトまたは他の種における免疫原性を保持または低減する。ヒト化抗体は、機能的に再配列されたヒト免疫グロブリン（例えば、重鎖および／または軽鎖）遺伝子を発現することができる非ヒト動物または原核細胞もしくは真核細胞によって産生され得ることが指し示される。さらに、抗体が単鎖抗体であるとき、これは、天然のヒト抗体に見出されないリンカーペプチドを含み得る。例えば、Ｆｖは、２〜約２０グリシンまたは他のアミノ酸残基、好ましくは８〜１５グリシンまたは他のアミノ酸残基などのリンカーペプチドを含むことができ、これは、重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域を接続する。このようなリンカーペプチドは、ヒト起源のものと見なされる。
【０１６７】
抗体のヒト化は、例えば、個々のヒトフレームワークのプールにインフレームで融合した非ヒト標的モノクローナル抗体の６つのＣＤＲを含むコンビナトリアルライブラリーを合成することによって実施することができる。すべての公知の重鎖および軽鎖ヒト生殖系列遺伝子を代表する遺伝子を含有するヒトフレームワークライブラリーを利用することができる。次いで得られるコンビナトリアルライブラリーを、目的の抗原への結合についてスクリーニングすることができる。この手法は、親抗体への結合活性を維持する観点から完全ヒトフレームワークの最も好都合な組合せの選択を可能にすることができる。次いでヒト化抗体を様々な技法によってさらに最適化することができる。
【０１６８】
抗体のヒト化を使用して、マウスまたは他の非ヒト抗体を「完全ヒト」抗体へと進化させることができる。得られる抗体は、ヒト配列のみを含有し、マウスまたは非ヒト抗体配列を含有せず、一方、出発抗体と同様の結合親和性および特異性を維持する。
【０１６９】
一部の実施形態では、本発明の抗ＣＳＰＧ４ヒト化またはキメラ抗体は、バリアントＦｃ領域を含み、前記バリアントＦｃ領域は、野生型Ｆｃ領域（または親Ｆｃ領域）と比べて少なくとも１つのアミノ酸修飾を有し、その結果前記分子は、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲ）に対する変更された親和性を有するが、ただし、前記バリアントＦｃ領域は、Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎら（その全体が参照により本明細書に組み込まれている、２０００年、Ｎａｔｕｒｅ、４０６巻：２６７〜２７３頁）によって開示されたものなどのＦｃ−Ｆｃ受容体相互作用の結晶解析および構造解析に基づいてＦｃ受容体と直接接触する位置で置換を有しないことを条件とする。ＦｃγＲなどのＦｃ受容体と直接接触するＦｃ領域内の位置の例は、アミノ酸２３４〜２３９（ヒンジ領域）、アミノ酸２６５〜２６９（Ｂ／Ｃループ）、アミノ酸２９７〜２９９（Ｃ’／Ｅループ）、およびアミノ酸３２７〜３３２（Ｆ／Ｇ）ループである。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域を含む本発明の抗ＣＳＰＧ４抗体は、構造解析および結晶解析に基づいてＦｃγＲと直接接触する少なくとも１個の残基の修飾を含む。
【０１７０】
一部の実施形態では、本発明の抗ＣＳＰＧ４抗体は、１つまたは複数のアミノ酸修飾を有するバリアントＦｃ領域を有する、受容体を活性化する、および／または受容体を阻害するための変更された親和性を有するヒト化７６３抗体を含み、前記１つまたは複数のアミノ酸修飾は、２９７位におけるアラニンとの置換；一部の実施形態では、ＦｃＲ親和性を増強するための２３９Ｄ、３３０Ｌ、３３２Ｅにおける置換である。一部の実施形態では、本発明の抗ＣＳＰＧ４抗体は、親Ｆｃ領域と比較してバリアントグリコシル化を有するＦｃ領域を有し、一部の実施形態では、バリアントグリコシル化は、フコースの非存在を含み、一部の実施形態では、バリアントグリコシル化は、ＧｎＴ１欠損ＣＨＯ細胞内の発現から生じる。
【０１７１】
一部の実施形態では、本発明は、エフェクター機能を変更し、またはＦｃＲに対する抗体の親和性を増強し、もしくは減少させるために、本発明の抗体のＦｃ領域内の１つまたは複数のアミノ酸への付加、欠失、および／または置換を伴ったバリアントＦｃ領域を含む分子を含む。これらの変異は、当業者の技術内である。したがって、本発明は、１つまたは複数のＦｃγＲにより大きい親和性を伴って結合するバリアントＦｃ領域を含む分子を含む。このような分子は、好ましくは、以下に論じる通り、より有効にエフェクター機能を媒介する。一部の実施形態では、本発明は、１つまたは複数のＦｃγＲにより弱い親和性を伴って結合するバリアントＦｃ領域を含む分子を含む。エフェクター機能の低減または排除は、ある特定の場合では、例えば、作用機序が標的抗原を持つ細胞の遮断または拮抗作用を伴うが、殺滅を伴わない抗体の場合では望ましい。さらに、エフェクター機能の排除は、以下に論じる通り二重特異性抗体を作製するとき、一部の実施形態では望ましい。エフェクター機能の低減または排除は、エフェクター細胞内のＦｃγＲ活性化受容体を遮断すると予想される（このタイプの機能は、宿主細胞内に存在すると予想される）自己免疫疾患の場合では望ましいと予想される。一般に、エフェクター機能の増大は、腫瘍および異質細胞に誘導される場合があり、一部の実施形態では、エフェクター機能は、腫瘍細胞から離れて誘導され得る。
【０１７２】
本発明のＦｃバリアントは、それだけに限らないが、エフェクター機能を変更する修飾を含めた他のＦｃ修飾と組み合わせることができる。本発明は、本発明のＦｃバリアントを他のＦｃ修飾と組み合わせて、抗体またはＦｃ融合物において相加的、相乗的、または新規性質をもたらすことを包含する。好ましくは、本発明のＦｃバリアントは、これらが組み合わされる修飾の表現型を増強する。例えば、Ｆｃバリアントが、野生型Ｆｃ領域を含む同等の分子より高い親和性を伴ってＦｃγＲＩＩＩＡと結合することが公知の変異体と組み合わされるとき、変異体との組合せは、ＦｃγＲＩＩＩＡ親和性のより大きい倍率の増強をもたらす。一部の実施形態では、本発明のＦｃバリアントは、１つまたは複数の操作されたグリコフォーム、すなわち、Ｆｃ領域を含む分子に共有結合的に付着している炭水化物組成を含む抗体またはＦｃ融合物中に組み込まれ、前記炭水化物組成は、Ｆｃ領域を含む親分子のものと化学的に異なる。一部の実施形態では、本発明のＦｃバリアントは、バリアントグリコシル化を含む抗体またはＦｃ融合物中に組み込まれる。例えば、抗体は、グリコシル化欠損細胞株（例えば、ＧｎＴ１欠損ＣＨＯ細胞）内で発現される場合があり、その結果抗体は、野生型Ｆｃ領域またはグリコシル化が欠損していない細胞株内で発現されるＦｃ領域と比較してグリコシル化を欠損しているＦｃ領域を伴って産生される。
【０１７３】
本発明は、好ましくは抗体の機能性、例えば、ＣＳＰＧ４の結合活性を変更することなく修飾グリコシル化部位を有する抗体を含む。本明細書で使用する場合、「グリコシル化部位」は、オリゴ糖（すなわち、一緒に連結した２つまたはそれ超の単糖（ｓｉｍｐｌｅ  ｓｕｇａｒ）を含有する炭水化物）が特異的および共有結合的に付着することになる抗体中に任意の特定のアミノ酸配列を含む。オリゴ糖側鎖は、典型的には、Ｎ−またはＯ−連結を介して抗体の骨格に連結されている。Ｎ結合型グリコシル化は、アスパラギン残基の側鎖へのオリゴ糖部分の付着を指す。Ｏ結合型グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、例えば、セリン、トレオニンへのオリゴ糖部分の付着を指す。例えば、フコースおよび末端Ｎ−アセチルグルコサミンを含むある特定のオリゴ糖を欠いたＦｃ−グリコフォーム、ｈｕ７６３−Ｈ２Ｌ２−ＩｇＧ１ｎ（またはｈｕ７６３−ＩｇＧ１ｎ）は、特別なＣＨＯ細胞内で産生され、ＡＤＣＣエフェクター機能の増強を呈した。
【０１７４】
一部の実施形態では、本発明は、グリコシル化部位を付加し、または欠失させることによって本発明の抗体の炭水化物含有量を改変する方法を包含する。抗体の炭水化物含有量を改変するための方法は、当技術分野で周知であり、本発明内に含まれる。例えば、米国特許第６，２１８，１４９号；ＥＰ０３５９０９６Ｂ１；米国特許公開第ＵＳ２００２／００２８４８６号；国際特許出願公開第ＷＯ０３／０３５８３５号；米国特許公開第２００３／０１１５６１４号；米国特許第６，２１８，１４９号；米国特許第６，４７２，５１１号を参照。これらのすべては、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。一部の実施形態では、本発明は、抗体の１つまたは複数の内因性炭水化物部分を欠失させることによって本発明の抗体の炭水化物含有量を改変する方法を含む。一部のある特定の実施形態では、本発明は、アスパラギンからアラニンに２９７位を修飾することによって抗体のＦｃ領域のグリコシル化部位を欠失させることを含む。
【０１７５】
操作されたグリコフォームは、それだけに限らないが、エフェクター機能の増強または低減を含めた様々な目的に有用であり得る。操作されたグリコフォームは、当業者に公知の任意の方法によって、例えば、操作された、もしくはバリアント発現株を使用することによって、１種もしくは複数の酵素、例えば、ＤＩＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）との共発現によって、様々な生物もしくは様々な生物由来の細胞株内でＦｃ領域を含む分子を発現させることによって、またはＦｃ領域を含む分子が発現された後に炭水化物を修飾することによって生成することができる。操作されたグリコフォームを生成するための方法は、当技術分野で公知であり、これらとしては、それだけに限らないが、Ｕｍａｎａら（１９９９年）、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７巻：１７６〜１８０頁；Ｄａｖｉｅｓら（２００１年）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．、７４巻：２８８〜２９４頁；Ｓｈｉｅｌｄｓら（２００２年）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７７巻：２６７３３〜２６７４０頁；Ｓｈｉｎｋａｗａら（２００３年）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７８巻：３４６６〜３４７３頁）米国特許第６，６０２，６８４号；米国特許出願第１０／２７７，３７０号；米国特許出願第１０／１１３，９２９号；国際特許出願公開ＷＯ００／６１７３９Ａ１；ＷＯ０１／２９２２４６Ａ１；ＷＯ０２／３１１１４０Ａ１；ＷＯ０２／３０９５４Ａ１；ＰＯＴＩＬＬＥＧＥＮＴ（商標）技術（Ｂｉｏｗａ，Ｉｎｃ．Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）；ＧＬＹＣＯＭＡＢ（商標）グリコシル化操作技術（ＧＬＹＣＡＲＴ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＡＧ、Ｚｕｒｉｃｈ、スイス）に記載されたものがあり、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。例えば、国際特許出願公開第ＷＯ００／０６１７３９号；ＥＡ０１２２９１２５；米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号；Ｏｋａｚａｋｉら（２００４年）、ＪＭＢ、３３６巻：１２３９〜４９頁を参照。これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０１７６】
多価結合剤
当業者が知っているように、多価結合剤は、２つまたはそれ超の標的（例えば、エピトープ）に特異的に結合する結合要素を含む分子実体または複合体である。このような多価結合剤は、治療的使用を含めて当技術分野において様々な使用を見出す。しかし一例を挙げると、当業者が知っているように、多価結合剤は、細胞傷害性Ｔ細胞を腫瘍部位に誘導する（または動員する）ことによって腫瘍細胞の殺滅を促進するように操作されている。腫瘍抗原の例としては、それだけに限らないが、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＣＡ１５−３、ＣＡ２７−２９、ＣＡ１９−９、ＣＡ−１２５、カルレチニン、癌胎児性抗原、ＣＤ３４、ＣＤ９９、ＣＤ１１７、クロモグラニン、サイトケラチン、デスミン、上皮膜タンパク質（ＥＭＡ）、第ＶＩＩＩ因子、ＣＤ３１  ＦＬ１、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、総嚢胞性疾患液体タンパク質（ｇｒｏｓｓ  ｃｙｓｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｆｌｕｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＧＣＤＦＰ−１５）、ＨＭＢ−４５、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、インヒビン、ケラチン、ＣＤ４５、リンパ球マーカー、ＭＡＲＴ−１（メラン−Ａ）、Ｍｙｏ  Ｄ１、筋肉特異的アクチン（ＭＳＡ）、神経フィラメント、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、前立腺特異的抗原、Ｓ１００タンパク質、平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、シナプトフィジン、サイログロブリン、甲状腺転写因子−１、腫瘍Ｍ２−ＰＫ、およびビメンチンがある。
【０１７７】
Ｔ細胞と係合する多重特異性結合剤の潜在的有効性は、これらの作用物質のＴ細胞をＴ細胞媒介殺滅のために腫瘍部位に誘導する能力にある。Ｔ細胞は、異常な細胞の殺滅において免疫系における最も強力なエフェクター細胞であり、Ｆｃ媒介抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の能力がない。このような多価結合剤がＴ細胞を腫瘍部位に誘導する機構は、腫瘍の表面上の腫瘍抗原およびＴ細胞の表面上の共受容体ＣＤ３の結合によるものである。ＣＤ３は、すべての成熟Ｔ細胞の表面上に発現される３つの鎖（γ、δ、およびε）の複合体である。ＣＤ３の発現は、Ｔ細胞にほとんどもっぱら制限される。二重特異性結合剤の抗ＣＤ３要素は、以前に未刺激および拘束されていない（ｕｎｃｏｍｉｔｔｅｄ）非クローナルＴ細胞を腫瘍細胞の強力な連続キラーとなるように形質転換することができる（Ｗｏｌｆら（２００５年）、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ、１０巻：１２３７〜１２４４頁）。このタイプの結合剤は、他の標的に加えて上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）抗原を発現する固形腫瘍の動物ゼノグラフト研究において有効性を実証した（Ｂａｒｇｏｕら（２００８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２１巻：９７４〜９７７頁；Ｂｒｉｓｃｈｗｅｉｎら（２００６年）、Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４３巻：１１２９〜１１４３頁；ＢａｅｕｅｒｌｅおよびＲｅｉｎｈａｒｄｔ（２００９年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６９巻：４９４１〜４９４４頁）。
【０１７８】
一部の実施形態では、本発明による使用のための多価結合剤は、二重特異性結合剤である。多くの実施形態では、このような二重特異性結合剤は、Ｔ細胞に結合することができる。多くの実施形態では、このような二重特異性結合剤は、Ｔ細胞上のＣＤ３に結合することができる。
【０１７９】
一部の実施形態では、本発明による使用のための多価または二重特異性結合剤は、抗体要素であり、またはそれを含む。抗体要素を含む多重特異性または二重特異性結合剤を設計、構築、および／または生産するための様々な技術が当技術分野で公知である。
【０１８０】
例えば、完全免疫グロブリンフレームワーク（例えば、ＩｇＧ）、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、またはこれらの組合せを利用する二重特異性結合剤が構築されている。タンデム状の２つのｓｃＦｖ単位から構成される二重特異性結合剤は、最も臨床的に成功した二重特異性抗体フォーマットの１つであることが示された。抗腫瘍免疫療法の場合では、タンデム状の２つの単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む二重特異性結合剤が、腫瘍抗原と結合するｓｃＦｖがＣＤ３と結合することによってＴ細胞と係合するｓｃＦｖと連結されるように設計された。このように、Ｔ細胞は、これらが、ある特定のＴ細胞が有する細胞傷害性性質によって腫瘍を構成している腫瘍細胞の殺滅を媒介することができることを期待して腫瘍部位に動員される。リンパ腫のＣＤ１９およびＣＤ３を標的化するこのような二重特異性結合剤の一例が作製され（二重特異性Ｔ細胞係合またはＢｉＴＥと呼ばれる；例えば、Ｄｒｅｉｅｒら（２００３年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７０巻：４３９７〜４４０２頁；Ｂａｒｇｏｕら（２００８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２１巻：９７４〜９７７頁を参照）、これは、動物ゼノグラフト研究における腫瘍増殖の防止において成功した。ヒト研究では、この二重特異性結合剤は、５つの部分的なおよび２つの完全な寛解を含む客観的な腫瘍応答を実証した。
【０１８１】
本発明の二重特異性結合剤（例えば、二重特異性抗体）は、ある特定のフォーマットが、ＣＤ３を介してＴ細胞と係合するとき、ある特定の標的（例えば、腫瘍抗原）にとってより有益となり得るという特定の洞察に基づく。例えば、本明細書に提供される二重特異性抗体は、完全ＩｇＧおよびｓｃＦｖの組合せを利用する。このような二重特異性抗体は、ＩｇＧ要素（例えば、抗ＣＳＰＧ４）を介する二価結合およびｓｃＦｖ要素（例えば、抗ＣＤ３）を介する一価結合を実証する。本明細書に記載するように、このフォーマットを有する二重特異性抗体は、腫瘍細胞を殺滅する非常に高い効力を実証する（すなわち、非常に低いＥＣ５０を有する）。この高い効力は、一部には、単一分子内への二価および一価の結合要素の組合せから生じるアビディティの増大に起因し、Ｔ細胞の腫瘍細胞への標的化を増強する。さらに、抗ＣＤ３要素について一価結合を使用することによって、腫瘍の非存在下でのＴ細胞の過剰刺激が回避され、それによって、患者にとって極めて大きい安全性への懸念であり、Ｔ細胞上のＣＤ３を標的化する二重特異性作用物質の非常に一般的な副作用であるサイトカインストームを排除する。
【０１８２】
例示的な二重特異性結合剤としては、腫瘍抗原に特異的な第１の抗体要素および細胞傷害性マーカー、例えば、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩなど）またはＴ細胞マーカー（例えば、ＣＤ３、ＣＤ２８など）に特異的な第２の抗体要素を有するものがある。さらに、第２の抗体要素は、異なる所望の特異性を有する抗体要素と置換することができる。例えば、腫瘍抗原に特異的な第１の抗体要素および毒素に特異的な第２の抗体要素を有する二重特異性結合剤を、毒素（例えば、サポリン、ビンカアルカロイドなど）を腫瘍細胞に送達するように対形成することができる。他の例示的な二重特異性結合剤としては、活性化受容体（例えば、Ｂ細胞受容体、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩ、Ｔ細胞受容体など）に特異的な第１の抗体要素および阻害性受容体（例えば、ＦｃγＲＩＩＢ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７２、ＣＤ３００ａなど）に特異的な第２の抗体要素を有するものがある。さらに別の例は、第１の抗体要素が特異的である同じ細胞型上の異なる抗原、例えば、Ｂ細胞上のＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ４６、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ７４、ＭＵＣ１、およびＣＤ２２に特異的な第２の抗体要素を含む。このような二重特異性結合剤は、細胞活性化に関連した治療的状態（例えば、アレルギーおよび喘息）のために構築することができる。二重特異性結合剤は、例えば、同じまたは異なる抗原の異なるエピトープを認識する重鎖および／または軽鎖を組み合わせることによって作製することができる。一部の実施形態では、分子機能によって、二重特異性結合剤は、その２つの結合アームの一方（一方のＶＨ／ＶＬ対）で１つの抗原（またはエピトープ）と結合し、その第２のアーム（異なるＶＨ／ＶＬ対）で異なる抗原（またはエピトープ）と結合する。この定義によって、二重特異性結合剤は、２つの別個の抗原結合アーム（特異性およびＣＤＲ配列の両方において）を有し、それが結合するそれぞれの抗原について一価である。
【０１８３】
一部の実施形態では、本発明の二重特異性結合剤は、異なる構造のものである２つの標的に同時に結合することができる能力によって特徴付けられる。一部の実施形態では、本発明の二重特異性結合剤は、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、骨髄、血漿、または肥満細胞抗原もしくはエピトープに特異的に結合する少なくとも１つの要素、および治療剤または診断剤を持つ標的化可能なコンジュゲートに特異的に結合する少なくとも１つの他の要素を有する。
【０１８４】
腫瘍抗原ＣＳＰＧ４は、いくつかの黒色腫において高度に発現され、成功裏のヒト化抗体もマウス７６３抗体に基づく二重特異性ヒト化抗体も存在していない。本明細書に記載のヒト化７６３抗体は、ＣＳＰＧ４に対して高親和性を実証し、非炭水化物（ペプチド）エピトープに結合し、通常、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定した場合低いＫｏｆｆ速度である。また、本明細書に記載のヒト化７６３抗体を使用する二重特異性結合タンパク質は、ＣＳＰＧ４への二価結合およびＣＤ３への一価結合が可能であり、それは、ＣＳＰＧ４＋腫瘍を殺滅する効力を増強し、ＣＤ３の過剰刺激の欠如から安全性を増大させる。したがって、本明細書に記載の二重特異性結合タンパク質のフォーマットを使用するためのストラテジーは、腫瘍殺滅の増強、有害作用の低減のためのユニークな手法を代表し、いくつかのＣＳＰＧ４陽性がんを処置するための強力な治療剤を実証する。
【０１８５】
標的
とりわけ、本発明は、多重特異性結合剤、特に二重特異性抗体などの二重特異性結合剤が、細胞殺滅を促進するのに特に有用および／または有効であるという認識を包含する。特に、本発明は、標的−細胞関連エピトープ（例えば、黒色腫関連腫瘍抗原）およびリンパ球関連エピトープ（例えば、Ｔ細胞表面タンパク質）の両方に特異的に結合する多価結合剤の活性が黒色腫関連がんの有効な免疫療法であり得ることを実証する。
【０１８６】
例えば、本発明の一部の実施形態では、多価結合剤は、腫瘍−細胞関連エピトープおよびＴ細胞エピトープに特異的に結合する。このような実施形態によれば、多価結合剤は、その標的エピトープの一方もしくは両方への該多価結合剤の結合を促進することができ、および／または標的Ｔ細胞によって媒介される場合、標的腫瘍細胞の殺滅を増強することができる。
【０１８７】
一部の実施形態では、殺滅される標的細胞は、例えば、腫瘍抗原（例えば、黒色腫関連腫瘍抗原）を発現する細胞を含む。当業者は、本明細書に記載の多価結合剤が望ましくは結合するそのような細胞に対する適切な標的エピトープを知っているであろう。
【０１８８】
一部の実施形態では、本明細書に記載の標的細胞の殺滅を媒介することができるリンパ球細胞としては、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋  Ｔ細胞）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、顆粒球、および抗体依存性細胞傷害性細胞がある。当業者は、本明細書に記載の多価結合剤が望ましくは結合するそのようなリンパ球に対する適切な標的エピトープを知っているであろう。代表的なこのようなエピトープは、抗原、例えば、ＩｇＧのＦｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩＩＢ）、ＣＤ  Ｉｄ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３１、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＭＡＣ−１／ＭＡＣ−３、ＩＬ−２Ｒａ、ＯＸ４０、Ｌｙ４９、およびＣＤ９４などにおいて見出すことができる。
【０１８９】
核酸構築および発現
本明細書に記載のヒト化抗体および多重特異性結合剤（例えば、二重特異性抗体）は、当技術分野で公知の分子生物学的方法を使用して核酸分子から生産することができる。核酸分子は、適切な宿主細胞内に導入されたとき融合タンパク質を発現することができるベクター内に挿入される。適切な宿主細胞としては、それだけに限らないが、細菌、酵母、昆虫、および哺乳動物細胞がある。ベクター内にＤＮＡ断片を挿入するための当業者に公知の方法のいずれかを使用して、転写／翻訳制御シグナルの制御下にある本発明の融合タンパク質をコードする発現ベクターを構築することができる。これらの方法として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡおよび合成技法ならびにｉｎ  ｖｉｖｏ組換えを挙げることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．  Ａｓｓｏｃ．、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹを参照）。
【０１９０】
本発明による核酸分子の発現は、分子が組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主内で発現されるように第２の核酸配列によって調節することができる。例えば、本発明の核酸分子の発現は、当技術分野で公知であるプロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントによって制御され得る。
【０１９１】
核酸構築物は、抗体および／または抗体要素から生成される多重特異性結合タンパク質をコードする領域を含む。典型的には、このような多重特異性結合タンパク質は、ＶＨおよび／またはＶＬ領域から生成されることになる。所望の結合および／または機能的性質を呈する抗体が同定および選択された後、それぞれの抗体の可変領域が、単離、増幅、クローニング、および配列決定される。アミノ酸をコードし、および／もしくは制限部位を担持するヌクレオチド配列の付加、アミノ酸をコードするヌクレオチド配列の欠失、またはアミノ酸をコードするヌクレオチド配列の置換を含めた修飾をＶＨおよびＶＬヌクレオチド配列に行うことができる。抗体および／または抗体要素は、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体から生成され得る。
【０１９２】
本発明の核酸構築物は、当技術分野に公知の方法によって発現ベクターまたはウイルスベクター内に挿入され、核酸分子は、発現制御配列に作動可能に連結される。
【０１９３】
適切な場合、本明細書に記載のヒト化抗体および多重特異性結合剤をコードする核酸配列を、特定の細胞型または生物内での発現に最適化されたコドンを含むように修飾することができる（例えば、米国特許第５，６７０，３５６号および同第５，８７４，３０４号を参照）。コドン最適化配列は、合成配列であり、好ましくは非コドン最適化親ポリヌクレオチドによってコードされる同一のポリペプチド（または全長ポリペプチドと同じ活性を実質的に有する全長ポリペプチドの生物学的活性断片）をコードする。一部の実施形態では、抗体要素をコードする遺伝物質のコード領域は、全体的または部分的に、特定の細胞型（例えば、真核細胞または原核細胞）のコドン使用を最適化するように、変更された配列を含み得る。例えば、本明細書に記載のヒト化重（または軽）鎖可変領域のコード配列は、細菌細胞内での発現のために最適化され得る。あるいは、コード配列は、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ）内での発現のために最適化され得る。このような配列は、コドン最適化配列として記述され得る。
【０１９４】
核酸分子を含有する発現ベクターは、適当な宿主細胞内に形質転換されて、核酸構築物によってコードされるタンパク質の生産を可能にする。例示的な宿主細胞としては、原核生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）および真核生物（例えば、ＣＯＳまたはＣＨＯ細胞）がある。発現ベクターで形質転換された宿主細胞は、本発明のヒト化抗体または多重特異性結合剤の生産、その後のヒト化抗体または多重特異性結合剤の回収を可能にする条件下で増殖される。
【０１９５】
本発明のヒト化抗体および／または多重特異性結合剤は、安定な抗体または結合剤分子の後続の形成を可能にする任意の技法によって精製することができる。例えば、理論によって束縛されることを望むことなく、抗体および／または多重特異性結合剤は、これらを８Ｍグアニジウム塩酸塩および透析によって定量的に抽出することができる可溶性ポリペプチドまたは封入体として細胞から回収することができる。本発明の抗体および／または多重特異性結合剤をさらに精製するために、慣例的なイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、またはゲル濾過を使用することができる。本発明のヒト化抗体および／または多重特異性結合剤は、真核細胞または原核細胞から分泌された後馴化培地から回収することもできる。
【０１９６】
スクリーニングおよび検出法
本発明のヒト化抗体および／または多重特異性結合剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニング法において使用することもでき、この場合、１つまたは複数の細胞の１つまたは複数の活性（例えば、アポトーシスまたは細胞増殖）を検出および／または測定することが望ましい。スクリーニング法は、当技術分野で周知であり、無細胞アッセイ、細胞ベースのアッセイ、および動物アッセイを含む。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、標的分子（例えば、細胞表面抗原）に結合しているヒト化抗体または多重特異性結合剤を同定することができる標識または検出可能な基の使用を含めた当技術分野で公知のいくつかのやり方で達成され得る固体状態または可溶性標的分子検出であり得る。検出可能な標識は、本発明のヒト化抗体または多重特異性結合剤を使用するアッセイと併せて使用することができる。
【０１９７】
治療法
本発明のヒト化抗体および／または多重特異性結合剤の、標的抗原の１つに対して高親和性結合を呈する能力は、これらを、標的抗原を発現する細胞を効率的に標的化するのに治療的に有用にする。したがって、一部の実施形態では、１つの標的抗原に対するヒト化抗体または多重特異性結合剤の親和性を増大させ、その多重特異性結合剤（またはヒト化抗体の場合ではＦｃ受容体）によって同様に結合される他の標的抗原に対するその親和性を増大させないことが望ましい場合がある。例えば、腫瘍殺滅との関連で、ある特定の条件は、腫瘍の殺滅を媒介することができる細胞（例えば、Ｔ細胞）の表面上の抗原に対してではなく、腫瘍抗原に対して親和性を増大させることから利益を受けることができる。したがって、本明細書に記載のヒト化抗体または多重特異性結合剤の使用によって腫瘍抗原を発現する腫瘍を有する患者における腫瘍抗原に対するヒト化抗体または多重特異性結合剤の結合親和性を増大させることが有益であり得る。
【０１９８】
本発明は、このような多重特異性結合剤によって結合され得る抗原を発現する腫瘍を有する患者の処置のための治療剤としての本明細書に記載のヒト化抗体および／または多重特異性結合剤を提供する。このようなヒト化抗体および／または多重特異性結合剤は、ヒトもしくは動物の体を処置する方法において、または診断の方法において使用することができる。
【０１９９】
投与
本発明は、処置の必要のある被験体に有効量の本明細書に記載の治療活性剤（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｃｔｉｖｅ）（例えば、ヒト化抗体または多重特異性結合剤）を投与する方法を提供する。
【０２００】
本明細書に記載のヒト化抗体または多重特異性結合剤は、作用物質、例えば、ヒト化抗体もしくは多重特異性結合剤の治療的送達に使用することができるタンパク質もしくは核酸、または被験体における標的細胞を殺滅しもしくはその増殖を阻害するための本発明のヒト化抗体もしくは多重特異性結合剤をコードする核酸などの治療的送達のための当技術分野で公知の様々な方法、例えば、細胞トランスフェクション、遺伝子療法、送達ビヒクルまたは薬学的に許容される担体を用いた直接投与、本発明の多重特異性結合剤をコードする核酸を含む組換え細胞を提供することによる間接送達によって投与することができる。
【０２０１】
様々な送達システム、例えば、リポソームでの被包、微粒子、マイクロカプセル、化合物を発現することができる組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシス（例えば、ＷｕおよびＷｕ、１９８７年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６２巻：４４２９〜４４３２頁を参照）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築などが公知であり、本発明のヒト化抗体または多重特異性結合剤を投与するのに使用することができる。投与経路は、経腸または非経口であり得、投与経路として、それだけに限らないが、静脈内、皮下、筋肉内、非経口、経皮、または経粘膜（例えば、口もしくは鼻）を挙げることができる。一部の実施形態では、本発明の多重特異性結合剤は、静脈内投与される。一部の実施形態では、本発明の多重特異性結合剤は、皮下投与される。一部の実施形態では、多重特異性結合剤は、他の生物学的活性剤と一緒に投与される。
【０２０２】
医薬組成物
本発明は、本発明のヒト化抗体または多重特異性結合剤および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物をさらに提供する。組成物は、所望される場合、１種または複数の追加の治療的活性物質も含有し得る。
【０２０３】
本明細書に提供される医薬組成物の記載は、ヒトへの倫理的投与に適している医薬組成物を主に対象とするが、このような組成物は一般に、すべての種類の動物への投与に適していることが当業者によって理解されるであろう。組成物を様々な動物への投与に適したものにするためのヒトへの投与に適した医薬組成物の修飾は、よく理解されており、通常の技術の獣医薬理学者は、もしあれば単に通常の実験を用いてこのような修飾を設計および／または実施することができる。
【０２０４】
本明細書に記載の医薬組成物の製剤は、薬理学の技術分野で公知のまたは今後開発される任意の方法によって調製することができる。一般に、このような調製方法は、活性成分を希釈剤もしくは別の賦形剤および／または１種もしくは複数の他の副成分と会合させるステップと、次いで必要な場合および／または望ましい場合、生成物を所望の単回または複数回用量単位に成形および／または包装するステップとを含む。
【０２０５】
本発明による医薬組成物は、バルクで、単一単位用量としておよび／または複数の単一単位用量として、調製、包装、および／または販売することができる。本明細書で使用する場合、「単位用量」は、所定量の活性成分を含む医薬組成物の個別の量である。活性成分の量は一般に、被験体に投与される活性成分の投与量、および／またはこのような投与量の好都合な画分、例えば、このような投与量の２分の１もしくは３分の１などに等しい。
【０２０６】
本発明による医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤、および／または任意の追加の成分の相対量は、処置される被験体の正体、サイズ、および／または状態に応じて、さらに、組成物が投与されることになる経路に応じて変動する。例として、組成物は、０．１％から１００％（ｗ／ｗ）の間の活性成分を含み得る。
【０２０７】
医薬製剤はその上、薬学的に許容される賦形剤を含むことができ、この賦形剤として、本明細書で使用する場合、望まれる特定の剤形に適している場合、任意のすべての溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散助剤もしくは懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、防腐剤、固体バインダー、滑沢剤などが挙げられる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、２１版、Ａ．  Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ、２００６年；参照により本明細書に組み込まれている）には、医薬組成物の製剤化に使用される様々な賦形剤、およびこれらの調製のための公知の技法が開示されている。任意の慣例的な賦形剤媒体が何らかの望ましくない生物学的効果を生じさせる、または医薬組成物の任意の他の要素と有害な様式で別の方法で相互作用するなどによって物質またはその誘導体と不適合である場合を除いて、その使用は、本発明の範囲内であるように企図される。
【０２０８】
一部の実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％純粋である。一部の実施形態では、賦形剤は、ヒトにおける使用および獣医学的な使用のために承認されている。一部の実施形態では、賦形剤は、米国食品医薬品局によって承認されている。一部の実施形態では、賦形剤は、医薬品グレードである。一部の実施形態では、賦形剤は、米国薬局方（ＵＳＰ）、欧州薬局方（ＥＰ）、英国薬局方、および／または国際薬局方の標準を満たす。
【０２０９】
医薬組成物の製造において使用される薬学的に許容される賦形剤としては、それだけに限らないが、不活性な希釈剤、分散剤および／もしくは顆粒化剤、表面活性剤、ならびに／または乳化剤、崩壊剤、結合剤、防腐剤、緩衝剤、潤滑剤、ならびに／または油がある。このような賦形剤は、任意選択で医薬製剤中に含めることができる。賦形剤、例えば、カカオバターおよび坐剤ワックス、着色剤、被覆剤、甘味料、矯味矯臭剤、および／または芳香剤などは、配合者の判断によって組成物中に存在し得る。
【０２１０】
医薬剤の製剤および／または製造における一般的な考察は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、２１版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００５年（参照により本明細書に組み込まれている）に見出すことができる。
【０２１１】
キット
本発明はさらに、本明細書に記載の少なくとも１種のヒト化抗体または多重特異性結合剤（例えば、二重特異性抗体）で満たされた１つまたは複数の容器を含む医薬品パックまたはキットを提供する。キットは、例えば、診断的になど、任意の適用可能な方法で使用され得る。医薬品または生物学的製品の製造、使用、または販売を規制する行政機関が指示した形態での通知をこのような容器に任意選択で付随させることができ、この通知は、（ａ）ヒト投与のための製造、使用、もしくは販売の機関による認可、（ｂ）使用のための指示、または両方を反映する。
【０２１２】
本発明の他の特徴は、本発明を例証するために与えられており、本発明を限定するように意図されていない例示的な実施形態の以下の記載の過程で明らかとなる。
【実施例】
【０２１３】
以下の実施例は、本発明の方法および組成物をどのように作製および使用するかを当業者に説明するように提供されており、本発明者らの発明として本発明者らが認めるものの範囲を限定するように意図されていない。別段の指定がない限り、温度は、セ氏で示されており、圧力は、大気におけるものであり、または大気付近である。
【０２１４】
（実施例１．目的の抗ＣＳＰＧ４抗体としてのマウス７６３の選択）
とりわけ、本発明は、７６３（クローン７６３．７４の略語としての）として公知のマウス抗ＣＳＰＧ４が、ヒト化について特に興味深いものであったという洞察を包含する。いずれの特定の理論にも束縛されることを望むことなく、本発明者らは、高親和性（特に１桁のナノモル濃度（ｎａｎｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ）の親和性）および遅いｋｏｆｆ（望ましくは１０−５またはそれより遅い）が、ヒト化され、および／または多重特異性フォーマットに組み込まれる抗体にとって特に望ましいと予想されると提案した。
【０２１５】
本発明者らは、ＣＳＰＧ４＋腫瘍細胞株Ｍ１４に結合した後の、そのリーキング（ｌｅａｋｉｎｇ）について重複しないエピトープ特異性を有する４つの候補抗ＣＳＰＧ４抗体を試験した。表６および図１に示した通り、７６３は、ＢＩＯＣＯＲＥ  Ｔ−１００装置を使用して決定した場合の結合動力学に基づいて最も遅いＫｏｆｆ速度を有することが判明した。抗体の遅いｋｏｆｆは、抗体がＣＳＰＧ４＋  Ｍ１４腫瘍細胞と反応され、次いで洗浄緩衝液で複数回洗浄された場合、より遅いウォッシュオフ（ｗａｓｈ  ｏｆｆ）に変換した。それぞれの洗浄について、細胞表面上の残っている抗体を、二次ＦＩＴＣ−標識ヤギ抗マウス抗体を使用して検出し、平均蛍光強度をフローサイトメトリーによって決定した。ＭＦＩに基づいて、７６３および２２５．２８ｓは、Ｄ２．８．５または９．２．２７と比較してより強い反応性を有していた。
【０２１６】
本発明者らはまた、選択パラメータとして、ヒト化に望ましいマウス抗体は、過剰な親和性（例えば、９．２．２７）を有しないと定義した。その理由は、０．０３ｎＭの親和性は、親和性障壁問題に至り得るためである（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら（１９９２年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５２巻：２７４７ｓ〜２７５１ｓ頁）。
【０２１７】
なおさらに、本発明者らは、選択パラメータとして、ヒト化に望ましいマウス抗体は、炭水化物（９．２．２７；Ｈｗａｎｇら（１９８５年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、４５巻：４１５０〜４１５５頁）または線状ペプチド（２２５．２８ｓ）エピトープではなく、ペプチドエピトープ（特にコンフォメーショナルエピトープ）に結合すると定義した。本発明者らは、７６３と反応したペプチド模倣体の以前の報告は、ＣＳＰＧ４と相同性（２８９〜２９４位）を有したが、非常に低い親和性を有し（Ｇｅｉｓｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５９巻：９０５頁、１９９９年）、したがって７６３によって認識される同族エピトープでなかったことを指摘する。
【表６】
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【０２１８】
（実施例２．マウス抗ＣＳＰＧ４抗体７６３のヒト化）
ＣＳＰＧ４（コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４）またはＨＭＷ−ＭＡＡ（高分子量黒色腫関連抗原）は、確立された黒色腫関連腫瘍抗原である。新鮮な黒色腫組織において、これは、均質に強く発現され、それでも正常なヒト組織内で高度に制限される。より最近、ＣＳＰＧ４は、トリプルネガティブ乳がん幹細胞内で過剰発現されることが判明した（Ｗａｎｇら、ＪＮＣＩ、１０２巻：１４９６〜１５１２頁）。ＣＳＰＧ４は、黒色腫の患者において、α放射同位体を担持するモノクローナル抗体を使用して成功裏に標的化された（Ｒａｊａ，  Ｃ．ら（２００７年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．  Ｔｈｅｒ．、６巻：８４６〜８５２頁）。本実施例は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）に特異的であるマウス抗体７６３に基づくヒト化抗体の生産を記載する。マウス７６３抗体は、以前に記載されているが、これは、キメラまたはヒト化抗体の構築の基礎として使用されていなかった。本明細書に提示したデータは、操作されたＣＨＯ細胞内で発現された複数のフォーマットでのいくつかのヒト化７６３抗体、例えば、ヒト化７６３ＩｇＧ１、ヒト化７６３ＩｇＧ４、およびヒト化ＩｇＧ１ｎ（特別なグリコフォーム）などの成功裏の生産を記述する。
【０２１９】
本明細書に提示する追加の実施例は、すべてのヒト化７６３抗体フォーマットが、マウス７６３と同等の抗原結合を示したこと、好都合なＫＤおよび異常にＫｏｆｆを保持したこと、黒色腫細胞に対して高い効力で抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介すること（例えば、ヒト化７６３−ＩｇＧ１ｎ）、および二重特異性抗体の文脈にある場合、ＣＳＰＧ４＋腫瘍細胞を特異的に標的化するようにＴ細胞と係合することができることを実証する。
【０２２０】
簡単に言えば、マウス７６３抗体のヒト化フォーマット（ヒト化７６３−ＩｇＧ１、ヒト化７６３−ＩｇＧ４、およびヒト化７６３−ＩｇＧ１ｎ）を構築した。配列設計は、極めて重要なマウスアミノ酸残基を保存しながらヒトＩｇＧ相同性計算に基づいた。マウス７６３の重鎖および軽鎖のＣＤＲを、それぞれヒトフレームワークＩｇＧＨＶ３−３３およびＩＧＬＫＶ３−１５とのその相同性、およびそれぞれアロタイプＫｍ３およびＧ１ｍ３に基づいてヒトＩｇＧ１フレームワーク上にグラフトした。２つの異なる重鎖および２つの異なる軽鎖配列を完全ＩｇＧとして発現させ、結合および安定性について試験した。凍結／解凍サイクルの繰り返しに対してＨＰＬＣによって凝集体を形成しない最も安定な組合せ（Ｈ２／Ｌ２）を実験の残りのヒト化７６３の最終形態に関して選択した。追加の構築物を、ヒトＩｇＧ４フレームワークを使用して作製した。さらに、キメラ７６３抗体を、カッパ（κ）軽鎖のヒトＣＬおよびガンマ１重鎖定常領域のヒトＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を使用して作製した。この実施例によって作製した例示的な抗体を表７に示す。
【０２２１】
ヒト化７６３抗体を単一ベクター中にパッケージし（バランスのとれた重鎖および軽鎖分泌のために）、ブルースクリプトベクターを使用してＣＨＯ−ＤＧ４４細胞内に形質導入した。ｈｕ７６３−ＩｇＧ１ｎは、ＧｎＴ１欠損由来のバリアントグリコシル化を有するＣＨＯ細胞内で発現されるヒト化７６３ＩｇＧ１抗体グリコフォームである（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，  Ｒ．（２００９年）、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ、８巻：２２６〜２３４頁；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ，  Ｅ．Ｅ．ら（２０００年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６４巻：４１７８〜４１８４頁）。ヒト化７６３ＩｇＧ１、ヒト化７６３ＩｇＧ４、およびヒト化７６３ＩｇＧ１ｎを、標準的なプロテインＡ親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。糖分析により、ヒト化７６３ＩｇＧ１ｎは、７８．３％（Ｍｏｌ％）マンノース、２０．５％（Ｍｏｌ％）Ｎ−アセチルグルコサミン、および１．２％（Ｍｏｌ％）グルコースを有することが確認された。ＳＤＳゲルで、ヒト化７６３は、適切なサイズの重鎖および軽鎖を有するＩｇＧとして移動し、ＨＰＬＣによって、これらはすべて、５％未満の凝集体形成を伴って全ＩｇＧとして溶出した（図２）。
【表７】
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【０２２２】
（実施例３．ヒト化７６３抗体の抗原結合動力学）
この実施例は、ＣＳＰＧ４への機能的親和性に対する実施例１によって作製したヒト化の効果を例証する。一部の場合では、ヒト化７６３抗体は、ＣＳＰＧ４に短期間結合することができる（例えば、サイズに起因する乏しい保持）。本実施例では、ヒト化７６３抗体は、好都合なＫＤおよび著しく遅いｋｏｆｆ速度を実証する。
【０２２３】
簡単に言えば、抗原（Ｄ２．８．１１、マウス７６３のペプチドエピトープ）または抗７６３イディオタイプ抗体ＭＫ２−２３をＣＭ５チップ上に固定化し、抗体結合の動力学（ｋｏｎ、ｋｏｆｆ、およびＫＤ）を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ−１００を使用して表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）によって比較した（図３Ａ）。Ｄ２．８．１１への結合について、ヒト化ＩｇＧ１およびＩｇＧ４を含むヒト化７６３抗体は、マウス７６３より遅いＫｏｆｆおよびマウス７６３より良好なＫＤを実証した（表８を参照；マウス７６３について１．３４ｐＭ、ｈｕ７６３−ＩｇＧ１について１．２９ｐＭ、ｈｕ７６３−ＩｇＧ１ｎについて１．１５ｐＭ、およびｈｕ７６３−ＩｇＧ４について１．２２ｐＭ）。同様に、ＭＫ２−２３への結合について、キメラ７６３ならびにヒト化７６３抗体はともに、マウス７６３と同等の結合（図３Ｂおよび３Ｃ）、ならびにわずかに良好なＫＤを示した（表９および１０）。
【０２２４】
抗原結合も、ＣＳＰＧ４陽性黒色腫Ｍ１４細胞を使用してＦＡＣＳ分析によって分析した。ヒト化７６３抗体について、細胞結合を、ＦＩＴＣ−標識ヤギ抗ヒト二次抗体を使用して決定した。マウス７６３について、ＦＩＴＣ−標識ヤギ抗マウス二次抗体を使用した（図３Ｄ）。データを、フローサイトメトリーによって決定した平均蛍光強度として表現し、使用した抗体の最高濃度（５μｇ／１０６細胞）の結合のパーセンテージとして正規化した。ｈｕ７６３−ＩｇＧ１は、マウス７６３のもの（０．０７μｇ／細胞１００万個）より良好なＥＣ５０（０．０２μｇ／細胞１００万個）を示した。ｈｕ７６３−ＩｇＧ１は、かなり安定であり、抗原結合のそのＥＣ５０は、凍結および解凍プロセスの５サイクルに供した後０．０３μｇ／細胞１００万個である。
【０２２５】
抗原としてコートされたＭ１４を使用するＥＬＩＳＡ法も、ｈｕ７６３−ＩｇＧ１およびｈｕ７６３−ＩｇＧ１ｎ結合をアッセイするのに使用した（図３Ｅ）。ｈｕ７６３−ＩｇＧ１およびｈｕ７６３−ＩｇＧ１はともに、Ｍ１４細胞への同等の結合を示した。ｈｕ７６３−ＩｇＧ１ｎは、凍結および解凍プロセスの５サイクルに供した後でも依然としてよくＭ１４細胞に結合した。
【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【０２２６】
（実施例４．ヒト化７６３抗体による抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ））
本実施例は、標的細胞に対してＮＫ細胞を介してＡＤＣＣを媒介するヒト化７６３抗体の能力の増強を実証する。さらに、本実施例に記載したデータは、マウス７６３のヒト化の利益は、単に免疫原性を低減することではないことを例証する。
【０２２７】
マウス７６３抗体は、マウスＩｇＧ１であり、これは、ヒトＦｃ受容体への結合の欠如に起因してＡＤＣＣを媒介しない。ヒト化７６３抗体のＡＤＣＣ潜在性を決定するために、ＣＤ１６形質導入ＮＫ９２Ｍｉ細胞株を、最初に生成した。このＮＫ９２細胞にＩＬ−２およびヒトＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩＡ）（活性化Ｆｃ受容体）の両方を形質導入した。使用したヒトＣＤ１６は、高親和性多型（Ｆ１５８Ｖ）を含有していた。それは、ＡＤＣＣの増強およびＩｇＧ１ベース免疫療法に対する臨床応答をもたらす。ヒト化７６３のＡＤＣＣを、上述したＮＫ９２Ｍｉ細胞株を使用して評価した。ヒト化７６３抗体によって活性化されたＮＫ細胞による標的細胞の比溶解を図４に示す。
【０２２８】
図４に示した通り、ｈｕ７６３−ＩｇＧ１ｎのみがＡＤＣＣを媒介することができた。Ｍ１４細胞のＥＣ５０は、０．１μｇ／ｍＬであった一方、Ｕ２ＯＳ細胞のＥＣ５０は、０．６５μｇ／ｍＬであった。毒性を肝実質細胞および心筋細胞に対して試験したとき、ｈｕ７６３−ＩｇＧ４もｈｕ７６３−ＩｇＧ１ｎも、１ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬの抗体濃度で、ＰＢＭＣまたはＮＫ９２Ｍｉ（ＣＤ１６）細胞の存在下でＡＤＣＣまたはＣＭＣを誘発しなかった。
【０２２９】
（実施例５．腫瘍ゼノグラフトを持つマウスにおけるヒト化７６３抗体の生体内分布）
先の実施例で記載したヒト化７６３抗体を、そのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性について試験した。ＳＫＭＥＬ−２８腫瘍細胞を植え込まれたマウスにおける放射ヨウ素標識抗体の生体内分布を決定した。
【０２３０】
ｈｕ７６３−ＩｇＧ１、ｈｕ７６３−ＩｇＧ４、およびｈｕ７６３−ＩｇＧ１ｎを、１３１Ｉまたは１２４Ｉで放射性標識した。すべてが約８０〜９０％の同等の免疫反応性を実証した。４８時間におけるヒト化７６３抗体の生体内分布を、皮下ＳＫＭＥＬ−２８ゼノグラフトを持つマウスを使用して分析した。腫瘍取込みを％ＩＤ／ｇｍによって測定した。マウス７６３抗体による処置は、２７．４％、ｈｕ７６３−ＩｇＧ１は、１３．５５％、ｈｕ７６３−ＩｇＧ４は、１０．２４％、ｈｕ７６３−ＩｇＧ１ｎは、１０．３８％をもたらした（図５）。腫瘍  対  非腫瘍の比は、試験した抗体の中で同等であった。
【０２３１】
（実施例６．ヒト化７６３に基づく二重特異性抗体の設計、構築、および発現）
本実施例は、ヒト化７６３抗体に基づく第１の抗原結合部位およびＴ細胞に結合する第２の抗原結合部位から構成される二重特異性抗体の生産を記載する。本明細書に提示したデータは、Ｔ細胞を黒色腫細胞に再標的化するための二重特異性抗体（ｈｕ７６３−ＢｓＡｂと呼ばれる）の成功裏の生産を記述する。本明細書に記載した通り、ヒト化ＯＫＴ３抗体に基づく抗ＣＤ３単鎖Ｆｖ断片（ＳｃＦｖ）を、ヒト化７６３重鎖のカルボキシル終端に連結し（ｈｕ７６３−ＨＣ−ＯＫＴ３）、または軽鎖のカルボキシル終端に連結した（ｈｕ７６３−ＬＣ−ＯＫＴ３）。二重特異性抗体と係合するＴ細胞の発生の主要な欠点は、ＣＤ３係合から生じるＴ細胞の過剰刺激であった。このような係合は、サイトカインの過剰放出（サイトカインストームとして公知）に至り得、それは、患者における深刻な有害作用をもたらす。したがって、本発明者らは、Ｆｃ領域内にＮ２９７Ａ置換を導入してグリコシル化を除去し、したがってＦｃ受容体結合を排除した。これは、補体活性化も低減し、それによってサイトカインストームを低減する。以下で実証する通り、本明細書に記載のｈｕ７６３−ＢｓＡｂは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ細胞を有効に再誘導してＣＳＰＧ４＋腫瘍細胞を溶解し、マウス黒色腫ゼノグラフトにおける腫瘍増殖を有意に阻害した。このようなｈｕ７６３−ＢｓＡｂは、黒色腫などの転移性腫瘍のためのＦｃ依存性およびＴ細胞依存性免疫療法の可能性の両方をもたらす。
【０２３２】
本発明者らは、図６に示したＩｇＧ−ｓｃＦｖフォーマットを使用してｈｕ７６３−ＢｓＡｂを設計した。ｈｕ７６３−ＨＣ−ＯＫＴ３フォーマットについて、軽鎖は、ｈｕ７６３−ＩｇＧ１のものと同一であり、重鎖は、ｈｕ７６３  ＩｇＧ１重鎖をＣ末端（Ｇ４Ｓ）３リンカー、その後ｈｕＯＫＴ３  ｓｃＦｖで伸長することによって構築した。ｈｕ７６３−ＬＣ−ＯＫＴ３フォーマットについて、重鎖は、ｈｕ７６３  ＩｇＧ１のものと同一であり、軽鎖は、ｈｕ７６３軽鎖をＣ末端（Ｇ４Ｓ）３リンカー、その後ｈｕＯＫＴ３  ｓｃＦｖで伸長することによって構築した。両フォーマットについて、Ｎ２９７Ａ変異をｈＩｇＧ１  Ｆｃ領域に導入してグリコシル化を除去した（上述の通り）。重鎖および軽鎖の両方をコードするＤＮＡを哺乳動物発現ベクター内に挿入し、ＣＨＯ−Ｓ細胞内にトランスフェクトし、発現が最も高い安定クローンを選択した。上清をシェーカーフラスコから収集し、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーで精製した。タンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィーによって９０％超のモノマーまでさらに精製した。
【０２３３】
ＢｓＡｂの生化学的な純度分析を図７に示す。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ条件下で、ｈｕ７６３−ＨＣ−ＯＫＴ３フォーマットは、２つのバンドを生じた（約７５ＫＤａおよび約２５ＫＤａ；ｈｕ７６３重鎖へのｈｕＯＫＴ３  ｓｃＦｖ融合は、分子量を約７５ＫＤａに増大させる）。ｈｕ７６３−ＬＣ−ＯＫＴ３フォーマットは、約５０ＫＤａにおいて２つのバンドを生じた（ｈｕ７６３軽鎖へのｈｕＯＫＴ３  ｓｃＦｖ融合は、分子量を約５０ＫＤａに増大させる）。ＳＥＣ−ＨＰＬＣは、両フォーマットについて２１０ｋＤａのおおよその分子量を伴った主要ピーク（ＵＶ分析により９７％）およびゲル濾過によって脱着可能な多量体の軽微なピークを示した。
【０２３４】
（実施例７．ヒト化７６３に基づく二重特異性抗体は、腫瘍細胞およびＴ細胞に結合する）
本実施例は、本明細書に記載の二重特異性抗体が、腫瘍細胞およびＴ細胞に結合し、それによってエフェクターＴ細胞を、標的腫瘍細胞を殺滅するように誘導することによって特徴付けられることを実証する。本実施例に提示したデータにより、このような二重特異性抗体は、腫瘍細胞を殺滅し、および／またはその増殖を阻害することに有用であることが確認される。
【０２３５】
標的細胞およびエフェクター細胞の両方へのｈｕ７６３−ＢｓＡｂの結合を、ＦＡＣＳ免疫染色によって試験した。図８Ａに示した通り、ｈｕ７６３−ＢｓＡｂはともに、親ｈｕ７６３と同様に良好にＣＳＰＧ４＋乳癌細胞Ｍ１４に結合した。さらに、図８Ｂに示した通り、ｈｕ７６３−ＢｓＡｂは、ＣＤ３＋  Ｔ細胞に同様に結合したが、ｈｕ７６３−ＨＣ−ＯＫＴ３は、ヒト化ＯＫＴ３  ＩｇＧ１よりわずかに劣って結合し、ｈｕ７６３−ＬＣ−ＯＫＴ３は、親ｈｕ７６３またはｈｕ７６３−ＨＣ−ＯＫＴ３よりも２０〜３０分の１弱く結合した。これらのデータは、軽鎖固定化ｓｃＦｖが、標的腫瘍細胞の非存在下でサイトカイン放出を最小限にするように意図的に設計された通常のヒト化ＯＫＴ３  ＩｇＧ１よりＴ細胞に対する低いアビディティを有するという本発明者らの観察結果と一致する。
【０２３６】
Ｔ細胞に対するｈｕ７６３−ＢｓＡｂのより低いアビディティを、以前に記載したＢｉａｃｏｒｅによる結合親和性分析によってさらに確認した（表１１；Ｃｈｅｕｎｇ，  Ｎ．Ｋ．ら（２０１２年）、ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１巻：４７７〜４８６頁；Ｌａｗ，  Ｃ．Ｌ．ら（２００２年）、Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４巻：３８９〜４００頁）。ＣＤ３抗原について、ｈｕ７６３−ＨＣ−ＯＫＴ３は、３．０２×１０５Ｍ−１Ｓ−１のｋｏｎ、６．９６×１０−２ｓ−１のｋｏｆｆ、および２３１ｎｍの全体的なＫＤを有した。これは、ｋｏｆｆ（１．０５×１０−１ｓ−１）において親ヒト化ＯＫＴ３ＩｇＧ１−ａＧｌｙｃｏと同等であるが、ｋｏｎ（１．７１×１０６Ｍ−１Ｓ−１）および全体的なＫＤ（６１．７ｎＭ）においてより低い。ｈｕ７６３−ＬＣ−ＯＫＴ３は、１．７５×１０５Ｍ−１Ｓ−１のｋｏｎ、９．０１×１０−２ｓ−１のｋｏｆｆ、および５１５ｎｍの全体的なＫＤを有した。総合すると、ｈｕ７６３−ＢｓＡｂ、特に、ｈｕ７６３−ＬＣ−ＯＫＴ３は、親ヒト化ＯＫＴ３−ａＧｌｙｃｏよりはるかに低いｋｏｎ、およびより大きい全体的なＫＤを有した。これは、ｈｕ７６３ＢｓＡｂが、ＣＤ３と結合するはるかに低いアビディティを有し、したがって、同じ条件下でＴ細胞と結合し、活性化する可能性がより低いことを示唆する。こうした環境下で、したがってｈｕ７６３ＢｓＡｂは、より少ないサイトカイン放出を生じ、患者に改善された安全性利益をもたらすと予想される。
【表１１】
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【０２３７】
（実施例８．ヒト腫瘍細胞株のヒト化７６３二重特異性抗体に誘導されたＴ細胞殺滅）
本実施例は、ヒト化７６３に基づく二重特異性抗体の、Ｔ細胞によって媒介される腫瘍細胞殺滅を開始する増強された能力を実証する。典型的には、Ｔ細胞と係合する二重特異性結合タンパク質は、腫瘍のＴ細胞媒介殺滅のためにＴ細胞を腫瘍部位に誘導することができる。本実施例では、例示的な二重特異性抗体は、対照二重特異性抗体と比較してより有効に腫瘍細胞のＴ細胞殺滅を有効に媒介することが示される。
【０２３８】
簡単に言えば、ｈｕ７６３−ＢｓＡｂがＴ細胞を、腫瘍細胞を殺滅するように再誘導することができるか否かを評価するために、ＣＳＰＧ４＋がん細胞株（Ｍ１４、ＨＴＢ−６３、およびＳＫＭＥＬ−２８）に対するＴ細胞細胞傷害性を４時間５１Ｃｒ放出アッセイにおいて試験した。例示的な結果を図９に提示する。
【０２３９】
対照ＢｓＡｂ（ＣＳＰＧ４に特異的な１つの抗原結合ドメインおよび有機化合物に特異的な１つの抗原結合ドメイン）と比較して、ｈｕ７６３−ＨＣ−ＯＫＴ３およびｈｕ７６３−ＬＣ−ＯＫＴ３はともに、Ｔ細胞の存在下で腫瘍細胞の３つすべてのタイプの実質的な殺滅を媒介することができた。
【０２４０】
本実施例は、とりわけ、Ｔ細胞にも結合するヒト化７６３に基づく二重特異性抗体が、ＣＳＰＧ４を発現する複数種の腫瘍細胞のＴ細胞殺滅を有効に媒介することができることをまさに確認する。
【０２４１】
（実施例９．ＣＳＰＧ４二重特異性抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性）
本実施例は、先の実施例に記載のヒト化７６３二重特異性抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を例証する。
【０２４２】
簡単に言えば、ＢＡＬＢ−Ｒａｇ２−ＫＯ−ＩＬ−２Ｒ−γｃ−ＫＯマウスを使用して、ヒト化７６３二重特異性抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ効果を評価した。Ｍ１４−ルシフェラーゼ細胞を静脈内に接種して転移モデルを模倣した。ヒト化７６３二重特異性抗体（ｈｕ７６３−ＨＣ−ＯＫＴ３）による処置を、植え込んで４日後に、合計２週間にわたって１週間当たり２回の用量で開始した。エフェクター細胞ＡＴＣを、２週間にわたって１週間当たり１回の用量（５×１０６細胞）で６日目に静脈内投与した。腫瘍ルシフェリン生物発光信号を毎週記録および定量化した。例示的な結果を図１０に提示する。
【０２４３】
図１０に示した通り、ｈｕ７６３−ＢｓＡｂ単独で処置したマウスは、対照処置マウスと等価な腫瘍増殖を実証した。ＡＴＣのみ（Ｔ細胞のみ）は、腫瘍増殖に対して中等度の効果を有した。ＡＴＣおよびｈｕ７６３−ＨＣ−ｈｕＯＫＴ３を組み合わせたとき、腫瘍増殖の実質的な抑制が記録された。２４日目に、ｈｕ７６３−ＨＣ−ｈｕＯＫＴ３による処置は、腫瘍細胞の完全に近い根絶を実証した。
【０２４４】
実施例のための材料および方法
ｈｕ７６３−ＩｇＧ１、ｈｕ７６３−ＩｇＧ４、ｈｕ７６３−ＩｇＧ１ｎ抗体産生株の構築
マウス７６３のヒト相同体に基づいて、ヒト化７６３の重鎖および軽鎖の両方のＣＤＲ配列をヒトＩｇＧ１フレームワーク中にグラフトし、最適化した。ヒト化７６３遺伝子をＣＨＯ細胞のために合成した（Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｏｔｈｈｅｌｌ、ＷＡまたはＧｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＹ）。ブルースクリプトベクター（Ｅｕｒｅｋａ、ＣＡ）を使用して、ヒト化７６３の重鎖および軽鎖遺伝子をＤＧ４４細胞内にトランスフェクトし、Ｇ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）で選択した。同様に、ヒトＶＨおよびＶＬ配列をＩｇＧ４フレームワーク上にグラフトしてヒト化７６３−ＩｇＧ４組換え抗体を作製した。
【０２４５】
ヒト化７６３の精製
ヒト化７６３産生株をＯｐｔｉｃｈｏ無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）中で培養し、成熟した上清を収集した。プロテインＡ親和性カラムを、０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む２５ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．２で事前に平衡化した。結合したヒト化７６３を０．１Ｍクエン酸／クエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ３．９により溶出し、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ８．５でアルカリ化した（１：１０ｖ／ｖ比）。これを、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ−Ｑ膜を通過させ、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．２中で５〜１０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。タンパク質のそれぞれ２μｇを、４〜１５％トリス−グリシンＲｅａｄｙ  Ｇｅｌシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用して非還元または還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２  Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ標準物質をタンパク質分子量マーカーとして使用した。電気泳動後、ゲルを、ＰＩＥＲＣＥのＧｅｌＣｏｄｅ  Ｂｌｕｅ染色試薬を使用して染色した。ゲルを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｆｌｕｏｒ−Ｓ  ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してスキャンし、バンド強度をＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により定量化した。
【０２４６】
ヒト化７６３二重特異性抗体の設計、生産、および精製分析
ヒト化７６３二重特異性抗体フォーマットを、ヒト化７６３−ＩｇＧ１の重鎖のＣ末端（ｈｕ７６３−Ｈｃ−ＯＫＴ３）または軽鎖のＣ末端（ｈｕ７６３−Ｌｃ−ＯＫＴ３）へのヒト化ＯＫＴ３  ｓｃＦｖ融合物として設計した。ｈｕ７６３−Ｈｃ−ＯＫＴ３フォーマットについて、ＶＬは、ヒト化７６３ＩｇＧ１のものと同一であった一方、重鎖は、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ領域内にＮ２９７Ａ変異を含むＶＨ−Ｃκ−（Ｇ４Ｓ）３−（ｈｕＯＫＴ３）ｓｃＦｖとして構築する。ｈｕ７６３−Ｌｃ−ＯＫＴ３フォーマットについて、ＶＨは、野生型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域内のＮ２９７Ａ変異を除いてヒト化７６３ＩｇＧ１のものと同一であった一方、軽鎖は、ＶＬ−Ｃκ−（Ｇ４Ｓ）３−（ｈｕＯＫＴ３）ｓｃＦｖとして構築する。ヒト化７６３由来のＶＨおよびＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列、ならびにヒト化ＯＫＴ３  ｓｃＦｖを、適切な隣接制限酵素部位とともにＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって合成し、標準的な哺乳動物発現ベクター中にサブクローニングした。二重特異性抗体の安定な生産のために、直線化プラスミドＤＮＡを使用してＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をトランスフェクトした。２×１０６細胞にヌクレオフェクション（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）（Ｌｏｎｚａ）によってプラスミドＤＮＡ５μｇをトランスフェクトし、次いで６ウェル培養プレートにおいて３７℃で２日間、８ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に回収した。安定プールを、およそ２週間にわたって５００μｇ／ｍＬハイグロマイシンで選択し、次いで単一クローンを限界希釈により選出した。ヒト化７６３二重特異性抗体力価を、それぞれＣＳＰＧ４＋  Ｍ１４細胞およびＣＤ３＋ジャーカット細胞ＥＬＩＳＡによって決定し、発現が最も高い安定クローンを選択した。二重特異性抗体産生株をＯｐｔｉＣＨＯ培地中で培養し、成熟した上清を収集した。プロテインＡ親和性カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む２５ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ  ８．２で事前に平衡化した。結合した二重特異性抗体を０．１Ｍクエン酸／クエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ３．９により溶出し、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ８．５で中和した（１：１０ｖ／ｖ比）。貯蔵のために、二重特異性抗体を２５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．２中に透析し、−８０℃で、アリコートで凍結させた。タンパク質２マイクログラムを、４〜１５％トリス−グリシンＲｅａｄｙ  Ｇｅｌシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ヒト化７６３二重特異性抗体の純度も、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）によって評価した。タンパク質およそ２０μｇを、０．５ｍＬ／分の流量で０．４Ｍ  ＮａＣｌＯ４、０．０５Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．０緩衝液を用いてＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ  ７．８ｍｍ×３０ｃｍ、５μｍカラム（ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中に注入し、２８０ｎｍでＵＶ検出した。ゲル濾過標準物質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）１０マイクロリットルを、ＭＷマーカーについて並行して分析した。
【０２４７】
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ−１００バイオセンサーによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合動力学
ＣＭ５センサーチップ（研究グレード）および関連試薬を、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＵＳＡ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）から購入した。抗原Ｄ２．８．１１または抗７６３イディオタイプ抗体ＭＫ２−２３を、疎水性相互作用を介してＣＭ５センサーチップ上に直接固定化した。システムを最初に緩衝液のみで２０×サイクル、試行（ｒｕｎ）させて安定ベースラインレベルを得た。精製抗体（マウス７６３、ヒト化７６３−ＩｇＧ１、ヒト化７６３−ＩｇＧ１ｎ、ヒト化７６３−ＩｇＧ４）を、様々な濃度（４１．７〜６６６．７ｎＭ）で２５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有するＨＢＳ−Ｅ緩衝液で希釈した後、分析した。試料（６０μＬ）を、２分にわたって３０μＬ／分の流量でセンサー表面上に注入した。会合時間を１分間に設定し、解離時間を５分〜３０分間に設定した。会合フェーズの完了後、解離を、同じ流量で２５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有するＨＢＳ−Ｅ緩衝液でモニターした。それぞれのサイクルの最後に、１分にわたる５０μＬ／分の流量の２０ｍＭ  ＮａＯＨ  ５０μＬおよび２分にわたる５０μＬ／分の流量の４Ｍ  ＭｇＣｌ２  １００μＬを使用して、表面を再生した。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ−１００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデンのＢｉａｃｏｒｅ  ＡＢ）評価ソフトウェアを使用して、二価分析物モデル（抗原Ｄ２．８．１１結合について）または一価分析物モデル（抗７６３イディオタイプ抗体ＭＫ２−２３結合について）、および速度定数についてデフォルトのパラメータ設定によってデータを分析し、見かけ上の会合オン速度定数（ｋｏｎ）、解離オフ速度定数（ｋｏｆｆ）、および平衡解離定数（ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を計算した。
【０２４８】
ＦＡＣＳ分析
細胞を、異なる濃度の一次抗体（ヒト化７６３−ＩｇＧ１、ｈｕ７６３−Ｈｃ−ＯＫＴ３、ｈｕ７６３−Ｌｃ−ＯＫＴ３、およびヒト化ＯＫＴ３）とともにＰＢＳ中４℃で３０分間インキュベートし、ヒトＦｃに特異的な二次フィコエリトリン標識抗体を、過剰の一次抗体を洗浄した後使用した。細胞を１％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定した後、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ血球計算器（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。対照は、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を５に設定した、対照ヒトＩｇＧ１抗体（ＣＳＰＧ４またはＴ細胞に非特異的）を含む細胞であった。
【０２４９】
５１クロム放出アッセイ
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）について、エフェクター細胞は、ヒトＣＤ１６  Ｆｃ受容体を安定にトランスフェクトしたＮＫ−９２ＭＩ細胞であった。Ｅ：Ｔ比は、２０：１であった。Ｔ細胞細胞傷害性アッセイについて、エフェクターＴ細胞を、約１４日間抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の存在下でｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、１０：１のＥ：Ｔ比で使用した。すべての標的腫瘍細胞をＰＢＳ中２ｍＭ  ＥＤＴＡにより収集し、５１Ｃｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔ、ＩＬ）を用いて１００μＣｉ／１０６細胞で３７℃にて１時間標識した。５０００標的細胞／ウェルを、９６ウェルポリスチレン丸底プレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で５０，０００エフェクター細胞および二重特異性抗体と混合して２５０μＬ／ウェルの最終体積にした。プレートを３７℃で４時間インキュベートした。上清中の放出された５１Ｃｒをγ−カウンター（Ｐａｃｋｅｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｄｏｗｎｅｒｓ  Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ）でカウントした。比放出のパーセンテージを、式：（実験ｃｐｍ−バックグラウンドｃｐｍ）／（総ｃｐｍ−バックグラウンドｃｐｍ）×１００％を使用して計算した。式中、ｃｐｍは、放出された５１Ｃｒの１分当たりのカウントを表した。総放出を１０％  ＳＤＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ）による溶解によって評価し、バックグラウンド放出をエフェクター細胞の非存在下で測定した。ＥＣ５０は、Ｓｉｇｍａｐｌｏｔソフトウェアを使用して計算した。
【０２５０】
免疫組織化学検査（ＩＨＣ）
病期４黒色腫腫瘍および正常組織を、施設内審査委員会の認可を伴ってＭｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒにおいて得た。スナップ凍結組織の５〜７マイクロメートル切片をアセトン中−２０℃で３０分間固定した。内因性ビオチン結合活性を、それぞれ２０分間アビジンおよびビオチンによる逐次の処理（ベクターアビジン−ビオチンブロッキングキット；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってブロックし、その後１０％ウマ血清を用いて室温で１時間ブロックした。次いで切片を一次抗体、ビオチン化されたウマ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、およびアビジン−ビオチン複合体（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣキット）と室温でそれぞれ６０分間順次反応させ、それぞれの反応間で洗浄した。引き続いて、切片を色素（ＤＡＢペルオキシダーゼ基質キット）で２分間染色し、洗浄し、Ｍｙｅｒヘマトキシリンで対比染色し、洗浄し、９５％エチルアルコールで脱水した。
【０２５１】
動物およびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ
ｉｎ  ｖｉｖｏ試験のために、ＢＡＬＢ−Ｒａｇ２−ＫＯ−ＩＬ−２Ｒ−γｃ−ＫＯ（ＤＫＯ）マウス（Ｍａｍｏｒｕ  Ｉｔｏ博士、ＣＩＥＡ、川崎、日本のコロニーから得た；Ｋｏｏ  ＧＣら（２００９年）、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．  Ｖａｃｃｉｎｅｓ、８巻：１１３〜１２０頁；Ａｎｄｒａｄｅ，  Ｄ．ら（２０１１年）、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．、６３巻：２７６４〜２７７３頁；Ｃｈｅｎｇ，  Ｍ．ら（２０１４年）、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ）。ルシフェラーゼを発現するＭ１４細胞をＤＫＯマウスに静脈内投与した。投与して４日後に、マウスをｈｕ７６３−Ｈｃ−ＯＫＴ３  ２０μｇで、１×１０６についてのＡＴＣの静脈内投与とともに処置した。腫瘍増殖を１週間に１回のルシフェリン生物発光によって評価した。生物発光イメージングを、Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＶＩＳ）２００（Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して行った。簡単に言えば、マウスに、Ｄ−ルシフェリンの溶液（Ｇｏｌｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３０ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ中のストック）０．１ｍＬを静脈内注射した。画像を、以下のパラメータ：１０〜６０秒曝露時間、ミディアムビニング、および８ｆ／ストップを使用して、注射から１〜２分後に収集した。生物発光画像解析をＬｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ２．６（Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して実施した。
【０２５２】
異種移植されたマウスにおける抗体生体内分布
雌胸腺欠損ヌードマウスをＨａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．から購入した。すべての手順は、Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコールおよび研究における動物の適切で人道的な使用のための施設ガイドラインに従って実行した。ＳＫＭＥｌ−２８腫瘍細胞を収集し、マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に再懸濁させた。細胞（２〜１０×１０６）を、２２ゲージ針を使用して０．１ｍＬの体積でマウスの側腹部に、皮下に（ｓｃ）植え込んだ。腫瘍を約２００ｍｍ３のサイズまで増殖させた後、処置を開始した。腫瘍が確立されたマウスを処置群にランダムに分離した。マウス１匹当たり放射ヨウ素標識抗体１００μＣｉを静脈内注射し、動物を通常４８時間において屠殺し、これらの臓器を取り出し、ガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）でカウントした。これらの臓器は、皮膚、肝臓、脾臓、腎臓、副腎、胃、小腸、大腸、膀胱、大腿骨、筋肉、腫瘍、心臓、肺、脊椎、および脳を含んでいた。臓器内に蓄積されたμＣｉおよび臓器重量に基づいて、マウスの％注射用量（ＩＤ）／ｇｍを計算した。％ＩＤ／ｇｍの腫瘍  対  非腫瘍の比も計算した。
【０２５３】
本発明の少なくとも１つの実施形態のいくつかの態様をこうして記載してきたので、様々な変更、改変、および改善が、当業者に容易に明らかとなることが認識されると予想される。このような変更、改変、および改善は、本開示の一部であるように意図され、本発明の趣旨および範囲内であるように意図されている。したがって、上記の記載および図面は、単なる例としてのものであり、本発明は、以下に続く特許請求の範囲によって詳細に記載される。
【０２５４】
均等物
請求項の要素を修飾するための請求項における順序の用語、例えば、「第１の」、「第２の」、「第３の」などの使用は、それ自体、１つの請求項の要素の別の請求項の要素に対するいずれの優先、優位、もしくは順序、または方法の行為が実施される時間的順序を暗示せず、ある特定の名称を有する１つの請求項の要素を同じ名称を有する（順序の用語の使用を別にすれば）別の請求項の要素を区別して請求項の要素を区別するための単に標識として使用されている。
【０２５５】
本明細書で使用する場合、冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、本明細書および特許請求の範囲において、それとは反対に明確に示されていない限り、複数形の指示対象を含むと理解されるべきである。群の１つまたは複数のメンバー間に「または」を含む請求項または記載は、それとは逆のことが示されない限り、または文脈からそうではないことが明白でない限り、群メンバーのうちの１つ、１つ超、またはすべてが、所与の生成物またはプロセスにおいて存在する、使用される、または他の点で関連している場合、満たされていると見なされる。本発明は、群の正確に１つのメンバーが所与の生成物またはプロセスにおいて存在する、使用される、または他の点で関連する実施形態を含む。本発明は、１つ超、または群メンバー全体が所与の生成物またはプロセスにおいて存在する、使用される、または他の点で関連する実施形態も含む。さらに、本発明は、別段の指定がない限り、または矛盾もしくは不一致が生じると予想されることが当業者に明白でない限り、列挙された請求項の１つまたは複数からの１つまたは複数の限定事項、要素、条項、記述用語などが、同じ基本請求項（または該当する場合、任意の他の請求項）に従属する別の請求項に導入されるすべてのバリエーション、組合せ、および並び換えを包含することが理解されるべきである。要素がリストとして提示されている場合（例えば、マーカッシュ群または同様の形式で）、要素のそれぞれの亜群も開示されており、任意の要素がその群から除去され得ることが理解されるべきである。一般に、本発明または本発明の態様が、特定の要素、特徴などを含むと言及されている場合、本発明のある特定の実施形態または本発明の態様は、このような要素、特徴などからなり、または本質的になることが理解されるべきである。単純性の目的で、こうした実施形態は、あらゆる場合において、そのような多くの単語で本明細書に具体的に示されているわけではない。本発明の任意の実施形態または態様は、具体的な除外が明細書に列挙されているか否かにかかわらず請求項から明示的に除外され得ることも理解されるべきである。本発明の背景を説明するため、およびその実施に関する追加の詳細を提供するために本明細書に参照された刊行物、ウェブサイト、および他の参考資料は、参照により本明細書に組み込まれている。
【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【配列表】
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