(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
共有結合連結された２個の単量体を含有するＣＣＬ２０ロックド二量体ポリペプチドを含有する組成物の治療有効量を含有する乾癬治療剤であって、前記２個の単量体はそれぞれ配列番号１のアミノ酸配列を含む、乾癬治療剤。
【請求項２】
前記乾癬がＩＬ−２３誘導性乾癬である、請求項１に記載の乾癬治療剤。
【請求項３】
共有結合連結された２個の単量体を含有するＣＣＬ２０ロックド二量体ポリペプチドを含有する組成物の治療有効量を含有する乾癬の治療に使用する組成物であって、前記２個の単量体はそれぞれ配列番号１のアミノ酸配列、および医薬的に許容される担体または希釈剤を含む、組成物。
【請求項４】
前記乾癬がＩＬ−２３誘導性乾癬である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
請求項３または４に記載の組成物、および説明資料を含むキット。
【請求項６】
共有結合連結された２個の単量体を含有するＣＣＬ２０ロックド二量体ポリペプチドを含有する組成物の治療有効量を含有するＴｈ１７を介した自己免疫疾患または炎症性疾患の治療に使用する組成物であって、前記２個の単量体はそれぞれ配列番号１のアミノ酸配列、および医薬的に許容される担体または希釈剤を含む、組成物。
【請求項７】
多発性硬化症の治療のための請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
乾癬性関節炎の治療のための請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
共有結合連結された２個の単量体を含有するＣＣＬ２０ロックド二量体ポリペプチドを含有する組成物の治療有効量を含有する炎症性疾患治療剤であって、前記２個の単量体はそれぞれ配列番号１のアミノ酸配列を含み、炎症性疾患はＴｈ１７経路を介して媒介される、炎症性疾患治療剤。
【請求項１０】
前記炎症性疾患が、湿疹および関節リウマチからなる群より選択される、請求項９に記載の炎症性疾患治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年６月３日出願の米国特許仮出願第６２／１７０，３４７号の優先権を主張するものであり、前記仮出願の内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発に関する声明
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与されたＡＩ０５８０７２の下で政府支援を得て為された。連邦政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、一般に新規ＣＣＬ２０ロックド二量体ポリペプチド、その医薬組成物、ならびに乾癬および他の自己免疫疾患と炎症性疾患の処置においてＣＣＬ２０ロックド二量体を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
ケモカインは、主として様々な生物学的応答を調節し、多数の系統の白血球およびリンパ球の体器官組織への動員と移動を促進する働きをする化学誘引物質サイトカインタンパク質のスーパーファミリーである。ケモカインは、タンパク質内の最初の２個のシステイン残基の相対的位置によって４つのファミリーに分類される。１つのファミリーでは、最初の２個のシステインは１個のアミノ酸残基によって分離されており（ＣＸＣケモカイン）、別のファミリーでは最初の２個のシステインは隣接している（ＣＣケモカイン）。３番目のファミリーでは、最初の２個のシステインは３個のアミノ酸によって分離されている（ＣＸ3Ｃケモカイン）。４番目のファミリーではアミノ末端に１個のシステインだけが存在する（Ｃケモカイン）。
【０００５】
ＣＣＬ２０／ＣＣＲ６のケモカイン−受容体対は、インビボで濃度勾配の確立を通して損傷または感染の部位への樹状細胞およびＴ細胞の輸送を調節する（Ｌｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。一般的な炎症応答の間に、約８ｋＤａのケモカインがリンパ系細胞によって細胞外マトリックス中に分泌され、細胞外マトリックスで前記ケモカインはその１個の７回膜貫通Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）に結合してこれを活性化し、ＣＣＲ６が移動細胞の表面に発現される（Ｂａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。
【０００６】
乾癬は、損傷または自己抗原に応答してＴｈ１７細胞が皮膚に浸潤することを特徴とする、世界人口の２〜３％が罹患する（Ｋｕｒｄ  ａｎｄ  Ｇｅｌｆａｎｄ，２００９）慢性炎症性皮膚疾患である。γ−δＴ細胞受容体の低発現を伴うものを含むＴ細胞が、ＣＣＬ２０を含む多くのケモカインによって真皮および表皮に動員される。その受容体であるＣＣＲ６と共に、ＣＣＬ２０はマウスモデルにおいて乾癬様皮膚炎の発症に重要な役割を果たす。
【０００７】
Ｔｈ１７経路のサイトカインおよび腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）を標的とする現在の乾癬治療は、乾癬を有するヒトを処置するのに極めて有効であり得る（Ｌａｎｇｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。しかし、中和抗ＣＣＬ２０モノクローナル抗体は乾癬様炎症を低減し、ＣＣＬ２０／ＣＣＲ６媒介性Ｔ細胞動員の阻害も有用な治療戦略であり得ることを示唆した（Ｍａｂｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【０００８】
ケモカインは、細胞外表面のドメインおよびケモカインＮ末端によって占有される膜貫通ドメイン内の深いポケット（オルソステリック部位）を包含する広範囲のタンパク質−タンパク質界面によってそれらの受容体に係合する（Ｋｕｆａｒｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。天然ケモカインは、典型的には、小胞体からの細胞内カルシウムの放出および細胞移動を含む、特徴的な細胞応答を惹起する完全でバランスの取れたＧＰＣＲアゴニストである。低分子、ペプチドまたは変異したケモカインなどのケモカイン受容体アンタゴニストは、典型的にはオルソステリック部位での活性化を妨げることによってＧＰＣＲシグナル伝達をブロックする（Ｃｒｕｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｈａｓｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｒｏｓｅｎｋｉｌｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【０００９】
ケモカイン受容体の部分的または偏ったアゴニストは有効性の選択的な喪失を特徴とし、例えばＡＯＰ−Ｒａｎｔｅｓは、ＣＣＲ５媒介性カルシウムシグナル伝達を誘導するが、プロ移動性シグナル伝達を欠如し、変化した受容体リサイクルを有する（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｆｒａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。加えて、Ｚａｄｉｒとその同僚研究者達は、ＣＣＲ７の２つのケモカインリガンド、ＣＣＬ２１とＣＣＬ１９によるＣＣＲ７の偏ったアゴニスムは異なるパターンのＧＰＣＲキナーゼ動員をもたらすが、Ｇi/oシグナル伝達には相違を生じないことを示した（Ｚｉｄａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。Ｎ末端修飾は、オルソステリック部位接触を分断させることによってケモカインの薬理学的性質を改変し得るが、ケモカインのオリゴマー状態の操作も潜在的に有用な方法でそのシグナル伝達プロフィールを変化させることができる。
【００１０】
ケモカインは、典型的には単量体状態でそれらのコグネイトＧＰＣＲに結合し、それらを活性化するが、細胞表面のグリコサミノグリカンに結合するため、したがってインビボでのケモカイン機能のためには自己会合が重要である（Ｃａｍｐａｎｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。ＣＸＣおよびＣＣケモカインサブファミリーの成員は、一般に二量体界面に関してβ１鎖（ＣＸＣ）またはＮ末端近傍の残基（ＣＣ）のいずれかを利用した異なる四次構造をとる（Ｊａｎｓｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ケモカインのオリゴマー状態の変化は、受容体結合、活性化および下流シグナル伝達を改変することができる。大部分のＣＣケモカインの二量体化は、鍵となる受容体結合エピトープを閉塞し、それらをＧＰＣＲリガンドとして非機能性にする（Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。構成的に二量体であるように修飾されたいくつかのＣＸＣケモカインは、しかしながら、それらの受容体に結合する能力を有し、部分的アゴニストおよび阻害剤として機能することができる（Ｖｅｌｄｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。構造が解明されているＣＣケモカインの中で、ＣＣＬ２０は２つの高分解能結晶構造においてＣＸＣ型二量体をとり、カノニカルなＣＣ二量体の証拠がなかったという点で独特である（Ｈｏｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｍａｌｉｋ  ａｎｄ  Ｔａｃｋ，２００６）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、乾癬および他の自己免疫疾患または炎症性疾患を処置するための費用効果の高い医薬品および治療方法が今必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明人は、連結された２個の単量体を含有する新規ＣＣＬ２０ロックド二量体ポリペプチドを遺伝子で構築した。この二量体は、癌、自己免疫疾患および炎症性疾患を含む様々な疾病を処置するのに有用である。
【００１３】
１つの好ましい実施形態では、二量体は、一緒に結合された２個の単量体を含み、ここで少なくとも１個の単量体は、配列番号：１に示すアミノ酸配列（ＡＳＮＦＤＣＣＬＧＹＴＤＲＩＬＨＰＫＦＩＶＧＦＴＲＱＬＡＮＥＧＣＤＩＮＡＩＩＦＨＴＫＫＫＬＳＶＣＡＮＰＫＱＴＷＶＫＹＩＶＲＬＬＣＫＫＶＫＮＭ）を有する。ＣＣＬ２０ＷＴ配列は公的に入手可能である。
【００１４】
別の実施形態では、本発明は、ＣＣＬ２０ロックド二量体ポリペプチドおよび医薬的に許容される担体または希釈剤を含有する組成物を提供する。
【００１５】
別の実施形態では、本発明は、単離されたＣＣＬ２０ロックド二量体ポリペプチドを提供し、ここで二量体は、好ましくは配列番号：１に示すアミノ酸配列を有する少なくとも１個の単量体から成る。
【００１６】
別の実施形態では、本発明は、乾癬を有するまたは乾癬を発症する危険性がある被験体において乾癬を処置する方法を提供し、前記方法は、ＣＣＬ２０ロックド二量体を含有する組成物の治療有効量を被験体に投与することを含む。
【００１７】
別の実施形態では、本発明は、自己免疫疾患を有するまたは自己免疫疾患を発症する危険性がある被験体において自己免疫疾患を処置する方法を提供し、前記方法は、ＣＣＬ２０ロックド二量体ポリペプチドを含有する組成物の治療有効量を被験体に投与することを含む。
【００１８】
別の実施形態では、本発明は、炎症性疾患を有するまたは炎症性疾患を発症する危険性がある被験体において炎症性疾患を処置する方法を提供し、前記方法は、ＣＣＬ２０ロックド二量体ポリペプチドを含有する組成物の治療有効量を被験体に投与することを含む。
【００１９】
別の実施形態では、本発明は、ＣＣＬ２０ロックド二量体ポリペプチドを含むキットを提供し、ここで二量体は、好ましくは配列番号：１に示すアミノ酸配列を有する少なくとも１個の単量体、医薬的に許容される担体または希釈剤および使用説明書を含む。
【００２０】
本書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を含む本特許または特許出願公開のコピーは、必要な費用を支払えば請求に応じて特許庁により提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】ジスルフィド結合されたＣＣＬ２０は、安定に折りたたまれた二量体である。天然（青緑色）および非天然（赤色）ジスルフィド結合を有するＣＣＬ２０アミノ酸配列をハイライトする。
【図１Ｂ】ＣＸＣ（β鎖）二量体立体配座および６４位の分子間ジスルフィド結合（赤色）を示すＣＣＬ２０Ｓ６４Ｃのモデル。
【図１Ｃ】ＣＣＬ２０ＷＴおよびＣＣＬ２０Ｓ６４ＣをＣ１８逆相ＨＰＬＣに同時注入したが、溶出時間は約５分の差で分離する。
【図１Ｄ】ＣＣＬ２０Ｓ６４Ｃの質量分析（期待質量＝１６０８０．４ｋＤａ）。
【図１Ｅ】ＣＣＬ２０ＷＴ（橙色）およびＣＣＬ２０Ｓ６４Ｃ（青色）の異核種単一量子コヒーレンススペクトルの重ね合わせ。
【図１Ｆ】還元剤、β−メルカプトエタノールの存在下と不在下でのＣＣＬ２０ＷＴおよびＣＣＬ２０Ｓ６４ＣのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【図２Ａ】ＣＣＬ２０Ｓ６４Ｃは、ＣＣＬ２０ＷＴおよびｈＢＤ２依存性細胞移動をブロックするＣＣＲ６特異的リガンドである。ＣＣＬ２０ＷＴ（ＥＣ50＝７６±１１ｎＭ）およびＣＣＬ２０Ｓ６４Ｃ（ＥＣ50＝７００±７２ｎＭ）に応答したＣＣＲ６+  Ｊｕｒｋａｔ細胞のカルシウム流動を測定した。データ点は別々の２日の６つの複製物の平均±ＳＥＭである。
【図２Ｂ】漸増量のＣＣＬ２０ＷＴ（ＥＣ50約１５ｎＭ）およびＣＣＬ２０Ｓ６４Ｃに応答して測定されたＣＣＲ６+  Ｊｕｒｋａｔ細胞移動。データ点は別々の２日の４つの複製物の平均±ＳＥＭである。
【図２Ｃ】３０ｎＭ  ＣＣＬ２０ＷＴの存在下でのＣＣＬ２０Ｓ６４ＣによるＣＣＲ６+  Ｊｕｒｋａｔ細胞移動の阻害。データ点は別々の２日の４つの複製物の平均±ＳＥＭである。
【図２Ｄ】ｈＢＤ２依存性（１００ｎＭ）ＣＣＲ６+  Ｊｕｒｋａｔ細胞移動のＣＣＬ２０Ｓ６４Ｃによる阻害の測定。データ点は別々の２日の４つの複製物の平均±ＳＥＭである。
【図２Ｅ】ＣＣＬ２ＷＴ（１ｎＭ）またはＣＸＣＬ１２ＷＴ（１０ｎＭ）依存性ＴＨＰ−１細胞移動のＣＣＬ２０Ｓ６４Ｃによる阻害。データ点は別々の２日からの４つの複製物の平均±ＳＥＭである。
【図３Ａ】ＣＣＬ２０ロックド二量体は、ＩＬ−２３誘導性乾癬の予防的治療である。耳腫脹の経時変化。マウスに１日おきにＩＬ−２３を単独で注射するかまたはＩＬ−２３とＣＣＬ２０ＷＴもしくはＣＣＬ２０Ｓ６４Ｃを同時投与した。耳腫脹の値、各時点での０日目との耳厚の差を描画する。データは平均±ＳＥＭとして表している（ｎ＝６）。＊Ｐ＜０．０５。２つの独立した実験で同様の結果を得た。
【図３Ｂ】６日間のＩＬ−２３単独またはＩＬ−２３とＣＣＬ２０ＷＴもしくはＣＣＬ２０Ｓ６４Ｃとの同時投与での処置後、皮膚試料を採取し、皮膚標本をヘマトキシリンとエオシンで染色した。バー＝１００μｍ。データは少なくとも３匹のマウスを代表する。３つの独立した実験で同様の結果を得た。
【図３Ｃ】各々のマウス耳からの表皮細胞懸濁液をフローサイトメトリのためにγδ−ＴＣＲに対するｍＡｂで染色した。数字は側方散乱中γδ低  ＧＤＬ  Ｔ細胞の割合を指示する。代表的な結果を示す。３つの独立した実験で同様の結果を得た。
【図３Ｄ】各群の各耳当たりのＧＤＬ  Ｔ細胞の総数を数えた。データは平均±ＳＥＭとして表している（ｎ＝３）。＊ＩＬ−２３単独群に対してＰ＜０．０５。２つの独立した実験で同様の結果を得た。
【図３Ｅ】各々のマウス耳からの表皮細胞懸濁液を逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）用のＲＮＡ抽出のために処理した。
【図３Ｆ】未処置対照耳皮膚に対するＧａｐｄｈ  ｍＲＮＡに標準化したＩｌ１７ａおよびＩｌ２２  ｍＲＮＡについての倍数変化を計算した。データは平均±ＳＥＭとして表している（ｎ＝３）。＊ＩＬ−２３単独群に対してＰ＜０．０５。２つの独立した実験で同様の結果を得た。
【図４Ａ】ＣＣＬ２０Ｓ６４Ｃの結晶構造はＣＸＣ二量体立体配座を示す。２個のＣＣＬ２０単量体が非対称結晶単位で認められ、各々のαヘリックスは分子間ジスルフィド結合を介して結合されている。
【図４Ｂ】十分な電子密度を示す結晶構造（灰色の網目）が非天然ジスルフィド結合の全長にわたって認められる。
【図４Ｃ】骨格ペプチド相互作用を示す結晶構造は、βシートを形成する一次β１−β１  ＣＸＣ型二量体界面を安定化する。
【図４Ｄ】受容体結合エピトープを表す結晶構造は、ＣＣＬ２０の単量体構造（ＰＤＢコード：２ＪＹＯ）（紫色）とＣＣＬ２０ロックド二量体（小麦色）の間で構造的に保存されている。
【図５Ａ】ＣＣＲ６のＣＣＬ２０  Ｓ６４Ｃ活性化の生化学的特徴を表すグラフ。ＣＣＬ２０タンパク質の結合は、ＣＣＲ６+トランスフェクトＣＯＳ−７細胞からの125Ｉ−ＣＣＬ２０  ＷＴ転位によって認められた。ＣＣＲ６へのＣＣＬ２０  ＷＴおよびＳ６４Ｃ結合についてのＫd値は、−８．１２［−８．５４２、−７．６９８］および−７．１２８［−７．２４５、−７．０１２］という対応するｌｏｇＥＣ50値から、それぞれ７．６ｎＭおよび７４．４ｎＭと算定された。
【図５Ｂ】ＣＣＲ６+  Ｊｕｒｋａｔ細胞に関するＣＣＬ２０  ＷＴおよびＳ６４Ｃの投与が、−７．１２５［−７．２５１、−６．９９９］および−６．１４５［−６．２３４、−６．０５７］のｌｏｇＥＣ50値から、それぞれ７５．０ｎＭおよび７１５．３ｎＭのＥＣ50値で細胞内カルシウム放出を促進したことを示すグラフ。
【図５Ｃ】3Ｈ−ＩＰ3の蓄積を、ＣＣＬ２０  ＷＴおよびＳ６４Ｃに応答したトランスフェクトＣＣＲ６+  ＣＯＳ−７細胞に関する放射性測定によって決定し、−９．３６８［−９．９０３、−８．８３３］および−７．３８４［−７．６２５、−７．１４４］のｌｏｇＥＣ50値から、それぞれ０．４ｎＭおよび４１．３ｎＭのＥＣ50値を生じたことを示すグラフ。
【図５Ｄ】ＣＣＬ２０  ＷＴおよびＳ６４ＣでのＵ２ＯＳ細胞の用量依存的処置は、−８．９５４［−９．３４９、−８．５５８］および−７．０６５［−７．４１９、−６．７１１］という対応するｌｏｇＥＣ50値から、それぞれ１．１ｎＭおよび８６．２ｎＭのＥＣ50値でＣＣＲ６へのβ−アレスチン−２の動員を促進した。
【図５Ｅ】ＣＣＬ２０  Ｓ６４Ｃでの処置はＣＣＲ６の細胞表面発現を低減しなかった（＊Ｐ＜０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
Ｉ．全般
本発明の材料および方法を説明する前に、本発明は記載されている特定の方法、プロトコル、材料および試薬に限定されず、これらは異なり得ることが了解される。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することだけを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は後日に出願される非仮出願によってのみ限定されることも理解されるべきである。
【００２３】
本明細書および付属の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの」および「その」は、文脈上明らかに異なる指示がない限り複数の言及を包含することが留意されねばならない。同様に、「１つの」、「１つ以上の」および「少なくとも１つの」という用語は、本明細書では交換可能に使用することができる。「含む」、「包含する」および「有する」という用語が交換可能に使用できることも留意されるべきである。
【００２４】
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および学術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または等価の任意の方法および材料が本発明の実施または試験において使用できるが、好ましい方法および材料をここで説明する。本明細書で具体的に言及されるすべての出版物および特許は、本発明に関連して使用し得る、出版物中で報告されている材料、装置、統計解析および方法を説明し、開示することを含むすべての目的に関して参照により本明細書に組み込まれる。本明細書中で引用されるすべての参考文献は当分野の技術水準を示すとみなされるべきである。本明細書中のいかなる内容も、本発明が先行発明によるそのような開示に先行する権利を有さないことの承認と解釈されるべきではない。
ＩＩ．発明
【００２５】
ＣＣＬ２０ロックド二量体ポリペプチド。
１つの実施形態では、本発明は、少なくとも２個の単量体を含むＣＣＬ２０ロックド二量体ポリペプチドを提供する。単量体は同一であってもよくまたは同一でなくてもよい。１つの実施形態では、単量体の少なくとも１個は配列番号：１に従うアミノ酸配列を有する。代替的な実施形態では、両方の単量体が配列番号：１に従うアミノ酸配列を有する。
【００２６】
「ロックド」とは、ポリペプチドの単量体成分が少なくとも１つの共有結合によって相互に連結されていることを意味する。「ロックド」、「結合された」、「連結された」および「共有結合的に連結された」または「共有結合された」という用語は交換可能に使用され、一緒になって二量体を形成する単量体成分の共有結合を指示するのに使用される。好ましい共有結合連結はジスルフィド結合である。単量体および二量体形態は相互変換しない。好ましい実施形態では、Ｓ６４はシステイン残基で置換されて、対向するαヘリックス間で少なくとも１つの対称な分子間ジスルフィド結合を創製する。「ロックドＣＣＬ２０二量体」と「ロックドＣＣＬ２０二量体ポリペプチド」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。
【００２７】
ＣＣＬ２０中のＳ６４以外の他の残基は、例えば１番目のβ鎖における残基Ｖ２１／Ｔ２４（配列番号：２）、Ｇ２２／Ｔ２４（配列番号：３）およびＦ２３（配列番号：４）ならびにαヘリックスにおけるＶ６０（配列番号：５）およびＶ６７（配列番号：６）を含む、本発明のものに類似のロックド二量体を形成するためにシステインに変異させ得る。しかし、必要な非天然ジスルフィドを形成することができる残基の他の組合せも有効であり得る。
【００２８】
いくつかの実施形態では、ＣＣＬ２０二量体は、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５もしくは配列番号：６に示すアミノ酸配列またはそのホモログを有する少なくとも１個の単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＣＣＬ２０二量体は配列番号：２のアミノ酸配列またはそのホモログを有する２個の単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＣＣＬ２０二量体は配列番号：３のアミノ酸配列またはそのホモログを有する２個の単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＣＣＬ２０二量体は配列番号：４のアミノ酸配列またはそのホモログを有する２個の単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＣＣＬ２０二量体は配列番号：５のアミノ酸配列またはそのホモログを有する２個の単量体を含む。いくつかの実施形態では、ＣＣＬ２０二量体は配列番号：６のアミノ酸配列またはそのホモログを有する２個の単量体を含む。
【００２９】
ＣＣＬ２０のロックド二量体を作製するさらなる方法は、化学的架橋試薬を含むがこれに限定されない、ジスルフィド結合以外の他の種類の共有結合連結も包含し得る。
【００３０】
好ましい実施形態では、本発明のロックド二量体は実質的に純粋な調製物を含む。「実質的に純粋な」とは、調製物の９０％より多く、例えば９５％、９８％または９９％がロックド二量体のものである調製物を意味する。
【００３１】
好ましい実施形態では、本発明のロックド二量体を含む単量体の少なくとも１個は、配列番号：１に示すアミノ酸配列またはそのホモログもしくはフラグメントを有する。さらなる好ましい実施形態では、二量体は、配列番号：１に示すアミノ酸配列またはそのホモログもしくは変異体を有する２個の単量体を含む。「ホモログ」とは、一般に少なくとも２０個の連続するアミノ酸の領域にわたって配列番号：１のポリペプチドに少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％相同であるアミノ酸配列を意味する。「フラグメント」とは、ひと続きの連続するアミノ酸残基を含み、完全な配列と実質的に類似であるが必ずしも同一ではない機能活性を示すペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質および酵素を意味する。配列番号：１のフラグメントまたはそれらのホモログは、一般に少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５アミノ酸長であり、本明細書で使用される「ＣＣＬ２０単量体」という用語にも包含される。
【００３２】
ロックドＣＣＬ２０二量体はまた、インビボで二量体の半減期を増大させるように機能し得るまたは時限放出送達および／または局所送達のための機構として使用し得る、より大きなタンパク質中に組み込み得るかまたは融合タンパク質に結合し得る（米国特許出願第２００６００８８５１０号）。
【００３３】
別の実施形態では、本発明は、上述した単離されたＣＣＬ２０ロックド二量体ポリペプチドを提供する。「単離された」とは、同定され、その核酸配列が通常結合している少なくとも１つの成分または混在物から分離されている核酸配列を意味する。単離された核酸は、それが自然界で見出されるのとは異なる形態または状況で存在する。これに対し、ＤＮＡおよびＲＮＡなどの単離されていない核酸は、それらが自然界で存在する状態で見出される。例えば、所与のＤＮＡ配列（例えば遺伝子）は、隣接遺伝子に近接して宿主細胞染色体上で見出される；特定のタンパク質をコードする特定のｍＲＮＡ配列などのＲＮＡ配列は、多数のタンパク質をコードする数多くの他のｍＲＮＡとの混合物として細胞中で見出される。しかし、所与のタンパク質をコードする単離された核酸は、例として、核酸が天然細胞のものとは異なる染色体位置に存在するまたは自然界で見出されるものとは異なる核酸配列に隣接する前記所与のタンパク質を通常発現する細胞中の核酸を包含する。単離された核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖形態で存在し得る。単離された核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを、タンパク質を発現させるために利用しようとする場合、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、最小限でもセンス鎖またはコード鎖を含む（すなわちオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは一本鎖であり得る）が、センス鎖とアンチセンス鎖の両方を含むことができる（すなわちオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは二本鎖であり得る）。
【００３４】
本発明のＣＣＬ２０ロックド二量体ポリペプチドは、当分野で公知の標準的な技術によって調製することができる。ＣＣＬ２０のペプチド成分は、少なくとも一部は、Ｂｏｄａｎｓｋｙ，Ｍ．  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９９３）およびＧｒａｎｔ，Ｇ．Ａ．（ｅｄ．）．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）に記載されているような標準的な技術を用いて合成することができるペプチドから成る。自動ペプチド合成装置は市販されている（例えばＡｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ  Ｍｏｄｅｌ  ３９６；Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  ９６００）。加えて、１つ以上の調節基を標準的な方法によって、例えばアミノ基（例えばペプチドのアミノ末端のαアミノ基）、カルボキシル基（例えばペプチドのカルボキシ末端の）、ヒドロキシル基（例えばチロシン、セリンもしくはトレオニン残基上の）またはアミノ酸側鎖上の他の適切な反応基を介した反応のための方法を用いることによって結合することができる（例えばＧｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．ａｎｄ  Ｗｕｔｓ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）参照）。
【００３５】
本発明のペプチドは、Ｂｏｄａｎｓｋｙ，Ｍ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９９３）およびＧｒａｎｔ，Ｇ．Ａ．（ｅｄ．）．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９２）（これらのすべてが参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているような標準的な技術を用いて化学合成し得る。
【００３６】
本発明の別の態様では、ペプチドは、そのペプチドをコードする核酸分子を用いて標準的な組換えＤＮＡ技術に従って調製し得る。ペプチドをコードするヌクレオチド配列は遺伝暗号を用いて決定することができ、このヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド分子は標準的なＤＮＡ合成法によって合成することができる（例えば自動ＤＮＡ合成装置を用いて）。あるいは、ペプチド化合物をコードするＤＮＡ分子を、標準的な分子生物学技術に従って天然前駆体タンパク質遺伝子またはｃＤＮＡから誘導することができる（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および／または制限酵素消化を用いて）。
【００３７】
本発明の他の実施形態では、本発明は、本明細書で述べるポリペプチドの任意のものをコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。任意のそのようなベクターを含む宿主細胞も提供される。例として、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＳＰ９昆虫細胞または酵母であり得る。本明細書で述べるポリペプチドの任意のものを作製する工程がさらに提供され、この工程は、所望のポリペプチドの発現に適した条件下で、ポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を培養し、細胞培養物から所望のポリペプチドを回収することを含む。
【００３８】
ＣＣＬ２０ロックド二量体ポリペプチド医薬組成物。別の実施形態では、本発明は、本発明の実質的に純粋なＣＣＬ２０ロックド二量体ポリペプチドおよび医薬的に許容される担体を含有する組成物を提供する。「医薬的に許容される担体」とは、生理学的に適合性であるありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等を意味する。１つの実施形態では、担体は非経口投与に適し得る。あるいは、担体は、静脈内、腹腔内、筋肉内、舌下または経口投与に適し得る。医薬的に許容される担体には、滅菌注射用溶液または分散液の即時調製のための滅菌水溶液または分散液および滅菌粉末が含まれる。医薬的に活性な物質のためのそのような媒質および作用物質の使用は当分野で周知である。任意の従来の媒質または作用物質が活性化合物と不適合性である場合を除き、本発明の医薬組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性化合物も組成物中に組み込むことができる。
【００３９】
治療用組成物は、典型的には製造および保存の条件下で滅菌および安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、膜ナノ粒子または高薬剤濃度に適した他の秩序構造体として製剤することができる。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）ならびにこれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合は必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖類、マンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムなどの多価アルコールを組成物中に含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、モノステアリン酸塩およびゼラチンなどの、吸収を遅延させる作用物質を組成物中に含めることによってもたらされ得る。
【００４０】
さらに、本発明のＣＣＬ２０ロックド二量体ポリペプチドは、時限放出製剤中で、例えば徐放性ポリマーを含む組成物中で投与することができる。活性化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル送達システムを含む、迅速な放出から化合物を保護する担体、例えば放出制御製剤と共に調製することができる。生分解性で生体適合性のポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸およびポリ乳酸・ポリグリコール酸コポリマー（ＰＬＧ）などが使用できる。そのような製剤の調製のための多くの方法が特許取得されているかまたは一般に当業者に公知である。
【００４１】
滅菌注射用溶液は、必要量の活性化合物（例えばＣＸＣＲ４アンタゴニスト）を、上記で列挙した成分の１つまたは成分の組合せと共に適切な溶媒中に組み込み、必要に応じて、その後ろ過滅菌することによって調製できる。一般に、分散液は、基本的な分散媒および上記で列挙したものの中から必要な他の成分を含む滅菌ビヒクル中に活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、有効成分プラス任意の付加的な所望成分の粉末を、あらかじめ滅菌ろ過されたこれらの溶液から生成する真空乾燥および凍結乾燥である。本発明のＣＣＬ２０ロックド二量体ポリペプチドはまた、ＣＣＬ２０ロックド二量体ポリペプチドの溶解度を高める１つ以上の付加的な化合物と共に製剤し得る。
【００４２】
投与。他の医薬的に活性な化合物を含んでいてもよい、本発明のＣＣＬ２０ロックド二量体ポリペプチドは、経口的、経直腸的、非経口的に（例えば静脈内、筋肉内または皮下経路で）、槽内、膣内、腹腔内、膀胱内経路で、局所的に（例えば粉末、軟膏もしくは点滴剤）、または口腔もしくは鼻スプレーとして患者に投与することができる。他の企図される製剤には、投射ナノ粒子、リポソーム調製物、有効成分を含有する再封入赤血球、および免疫学に基づく製剤が含まれる。
【００４３】
医薬組成物の非経口投与には、ヒトの組織の物理的割れ目の作製および組織中の割れ目を通した医薬組成物の投与を特徴とする任意の投与経路が含まれる。非経口投与には、したがって、組成物の注射、外科的切開を介した組成物の適用、組織を貫通する非外科的創傷を介した組成物の適用等による医薬組成物の投与が含まれる。特に、非経口投与は、皮下、腹腔内、静脈内、動脈内、筋肉内または胸骨内注射、および静脈内、動脈内または腎臓透析注入技術を包含する。
【００４４】
非経口注入に適する組成物は、医薬的に許容される担体、例えば生理学的に許容される滅菌水溶液または非水溶液、分散液、懸濁液またはエマルションと組み合わせた本発明のＣＣＬ２０ロックド二量体を含有するか、または滅菌注射用溶液もしくは分散液への再溶解のための滅菌粉末を含有し得る。適切な水性および非水性の担体、希釈剤、溶媒またはビヒクルの例には、水、等張生理食塩水、エタノール、ポリオール（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール等）、これらの適切な混合物、トリグリセリド、例えばオリーブ油などの植物油またはオレイン酸エチルなどの注入可能な有機エステルが含まれる。適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合は必要な粒径の維持によって、および／または界面活性剤の使用によって維持することができる。そのような製剤は、ボーラス投与または連続投与に適する形態で調製、包装または販売され得る。注入可能な製剤は、アンプルなどの単位剤形中で、防腐剤を含有する多回投与用容器中で、または自動注入もしくは医師による注射用の単回使用装置中で調製、包装または販売され得る。
【００４５】
非経口投与用の製剤には、懸濁液、溶液、油性または水性ビヒクル中のエマルション、ペースト、および植込み可能な持続放出または生分解性製剤が含まれる。そのような製剤は、懸濁化剤、安定剤または分散剤を含む１つ以上の付加的な成分をさらに含有することができる。非経口投与用の製剤の１つの実施形態では、ＣＣＬ２０ロックド二量体ポリペプチドは、再溶解された組成物の非経口投与の前に適切なビヒクル（例えば滅菌発熱物質不含水）で再溶解するための乾燥（すなわち粉末または顆粒）形態で提供される。
【００４６】
医薬組成物は、滅菌注射用水性または油性懸濁液または溶液の形態で調製、包装または販売され得る。この懸濁液または溶液は公知の技術に従って製剤することができる。そのような滅菌注射用製剤は、例えば水または１，３−ブタンジオールなどの、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒を使用して調製できる。他の許容される希釈剤および溶媒には、リンガー液、等張塩化ナトリウム溶液、および合成モノグリセリドまたはジグリセリドなどの固定油が含まれる。有用である他の非経口的に投与可能な製剤には、微結晶形態で、リポソーム調製物中に、または生分解性ポリマー系の成分として有効成分を含有するものが含まれる。持続放出または植込み用の組成物は、医薬的に許容されるポリマー材料または疎水性材料、例えばエマルション、イオン交換樹脂、難溶性ポリマーまたは難溶性の塩を含有し得る。
【００４７】
本発明のＣＣＬ２０ロックド二量体ポリペプチドはまた、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等を含む、懸濁化剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および／または分散剤などのアジュバントも含有し得る。等張剤、例えば糖類、塩化ナトリウム等を含むことも望ましいと考えられる。注射用医薬組成物の持続的吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよび／またはゼラチンなどの、吸収を遅延させることができる作用物質の使用によってもたらされ得る。
【００４８】
剤形は、固体または注射用インプラントまたはデポー剤を包含し得る。好ましい実施形態では、インプラントは、有効量のα2ロックド二量体ポリペプチドおよび生分解性ポリマーを含有する。好ましい実施形態では、適切な生分解性ポリマーは、ポリアスパラギン酸塩、ポリグルタミン酸塩、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ無水物、ポリ（β−ヒドロキシ酪酸）、ポリ（オルトエステル）およびポリホスファゼンから成る群より選択することができる。他の実施形態では、インプラントは、有効量のＣＣＬ２０ロックド二量体ポリペプチドおよびシラスティックポリマーを含有する。インプラントは、約１週間から数年間に及ぶ長期間にわたって有効量のＣＣＬ２０ロックド二量体ポリペプチドの放出を提供する。
【００４９】
経口投与用の固体剤形には、カプセル剤、錠剤、粉末剤および顆粒剤が含まれる。そのような固体剤形では、ＣＣＬ２０ロックド二量体ポリペプチドを少なくとも１つの不活性な慣例的賦形剤（または担体）、例えばクエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウムまたは（ａ）充填剤もしくは増量剤、例としてはデンプン、ラクトース、スクロース、マンニトールもしくはケイ酸；（ｂ）結合剤、例としてはカルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースもしくはアカシア；（ｃ）保湿剤、例としてはグリセロール；（ｄ）崩壊剤、例としては寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、特定の複合ケイ酸塩もしくは炭酸ナトリウム；（ｅ）溶解遅延剤、例としてはパラフィン；（ｆ）吸収促進剤、例としては第四級アンモニウム化合物；（ｇ）湿潤剤、例としてはセチルアルコールもしくはモノステアリン酸グリセロール；（ｈ）吸着剤、例としてはカオリンもしくはベントナイト；および／または（ｉ）潤滑剤、例としては滑石、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、またはこれらの混合物と混合する。カプセルおよび錠剤の場合、剤形は緩衝剤も含有し得る。
【００５０】
有効成分を含有する錠剤は、例えば、場合により１つ以上の付加的な成分と共に、有効成分を圧縮または成形することによって作製できる。圧縮錠剤は、適切な装置中で、場合により結合剤、潤滑剤、賦形剤、界面活性剤および分散剤の１つ以上と混合して、粉末または顆粒調製物などの自由流動形態の有効成分を圧縮することによって調製できる。成形錠剤は、適切な装置中で、有効成分、医薬的に許容される担体および生成された混合物を少なくとも湿らせるのに十分な液体の混合物を成形することによって作製できる。
【００５１】
錠剤は、医薬的に許容される賦形剤、例えば不活性希釈剤、造粒剤および崩壊剤、結合剤、および潤滑剤と共に製造し得る。公知の分散剤には、ジャガイモデンプンおよびデンプングリコール酸ナトリウムが含まれる。公知の界面活性剤にはラウリル硫酸ナトリウムが含まれる。公知の希釈剤には、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、微結晶セルロース、リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウムおよびリン酸ナトリウムが含まれる。公知の造粒剤および崩壊剤には、トウモロコシデンプンおよびアルギン酸が含まれる。公知の結合剤には、ゼラチン、アカシア、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースが含まれる。公知の潤滑剤には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、シリカおよび滑石が含まれる。
【００５２】
錠剤は、被覆されていなくてもよくまたはヒトの胃腸管で遅延崩壊を達成するための公知の方法を用いて被覆することができ、それにより有効成分の持続的放出および吸収を提供する。例として、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの材料が錠剤を被覆するのに使用できる。さらなる例として、錠剤を、米国特許第４，２５６，１０８号、同第４，１６０，４５２号および同第４，２６５，８７４号に記載される方法を用いて被覆し、浸透圧的に放出制御された錠剤を形成することができる。錠剤は、医薬的に洗練された口当たりのよい調製物を提供するために甘味剤、香味剤、着色剤、防腐剤またはこれらの何らかの組合せをさらに含有することができる。
【００５３】
錠剤、糖衣錠、カプセルおよび顆粒剤などの固体剤形は、コーティングまたは外皮、例えば腸溶剤皮および当分野で周知の他のものを用いて調製することができる。それらはまた、不透明化剤を含有してもよく、１つまたは複数の活性化合物を遅延して放出する組成物であってもよい。使用できる包埋組成物の例は、ポリマー物質およびワックスである。活性化合物はまた、適切な場合は、上述した賦形剤の１つ以上と共に、マイクロカプセル化形態であり得る。
【００５４】
同様の種類の固体組成物は、ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコール等のような賦形剤を用いて軟または硬充填ゼラチンカプセルにおける充填剤としても使用し得る。有効成分を含有する硬カプセルは、ゼラチンなどの生理学的に分解性の組成物を用いて作製することができる。そのような硬カプセルは、有効成分を含有し、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンなどの不活性固体希釈剤を含む付加的な成分をさらに含有することができる。有効成分を含有する軟ゼラチンカプセルは、ゼラチンなどの生理学的に分解性の組成物を用いて作製することができる。そのような軟カプセルは、有効成分を含有し、有効成分は水または油性媒質、例えば落花生油、流動パラフィンもしくはオリーブ油と混合することができる。
【００５５】
必要用量。特定の実施形態では、治療的または予防的に有効な用量のＣＣＬ２０ロックド二量体ポリペプチドの好ましい範囲は、０．１ｎＭ〜０．１Ｍ、特に０．１ｎＭ〜０．０５Ｍ、より特には０．０５ｎＭ〜１５μＭ、最も特には０．０１ｎＭ〜１０μＭであり得る。投与量の値は、緩和されるべき疾病の重症度によって、特に多発性硬化症に関して異なり得ることが留意されるべきである。任意の特定の被験体に関して、具体的な投与レジメンは、個体の必要性および組成物を投与するまたは組成物の投与を監督する人物の専門的判断に従って経時的に調整されるべきであること、ならびに本明細書で示す投与量範囲は単なる例示であり、特許請求される組成物の範囲または実施を限定することを意図しないことがさらに理解されるべきである。
【００５６】
組成物中のＣＣＬ２０ロックド二量体ポリペプチドの量は、疾患の状態、個体の年齢、性別および体重などの因子に応じて異なり得る。投与レジメンは、最適な治療応答を提供するように調整し得る。例えば、単回ボーラスを投与してもよく、いくつかの分割用量を経時的に投与してもよく、または治療状況の緊急性によって指示されるように用量を比例的に低減または増大させてもよい。投与の容易さおよび投与量の一様性のために非経口組成物を単位剤形に製剤することは特に有利である。本明細書で使用される単位剤形は、処置される哺乳動物被験体にとっての単位投与量として適した物理的に個別の単位を指し、各々の単位は、必要な医薬担体と共同して所望の治療効果を生じさせるように計算された所定量の活性化合物を含有する。本発明の単位剤形についての仕様は、（ａ）活性化合物の独自の特徴および達成されるべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体における感受性の処置のための活性化合物のような配合の分野における固有の制限によって決定され、これらに直接依存する。
【００５７】
使用方法。本発明はまた、好ましくは二量体が配列番号：１に従うアミノ酸配列を有する少なくとも１個の単量体を含む、ＣＣＬ２０ロックド二量体ポリペプチドの治療有効用量を薬理学的に許容される製剤中で投与する医療処置の方法を含む、対応する使用の方法も提供する。したがって、本発明はまた、上述した、ＣＣＬ２０ロックド二量体ポリペプチドおよび薬理学的に許容される賦形剤または担体を含有する治療用組成物も提供する。治療用組成物は、有利には生理学的に許容されるｐＨで水溶液に可溶性であり得る。
【００５８】
１つの実施形態では、本発明は乾癬を処置する方法を提供し、この方法は、乾癬を有するまたは乾癬を発症する危険性がある被験体にＣＣＬ２０ロックド二量体ポリペプチドを含有する組成物の治療有効量を投与することを含む。
【００５９】
「乾癬」または「尋常性乾癬」とは、通常はかゆみがある、うろこ状の紅斑、丘疹およびプラークを含む皮膚病変を特徴とする一般的な慢性、再発性または寛解型の免疫介在性全身疾患を意味する。乾癬で見られる皮膚病変は、軽度の限局性斑から完全に身体を覆うものまで重症度が異なり得る。５つの主要な種類の乾癬は、プラーク乾癬、滴状乾癬、倒置乾癬、膿疱性乾癬および乾癬性紅皮症である。最も一般的な形態であるプラーク乾癬は、典型的には皮膚の最上層に紅色および白色のうろこ状の斑として発現する。皮膚細胞がこれらのプラーク部位に急速に蓄積し、銀白色の外観を作り出す。
【００６０】
１つの実施形態では、本発明は、炎症性疾患を処置する方法を提供し、この方法は、炎症性疾患を有するまたは炎症性疾患を発症する危険性がある被験体にＣＣＬ２０ロックド二量体ポリペプチドを含有する組成物の治療有効量を投与することを含む。
【００６１】
「炎症性疾患」とは、例えば湿疹、歯周炎、アテローム性動脈硬化症および関節リウマチを含む、炎症によって引き起こされる任意の慢性または急性疾病を意味する。「炎症」とは、病原体、損傷細胞または刺激原などの有害刺激に対する脈管組織の複雑な生物学的応答を意味する。炎症は、有害な刺激を除去すると共に組織の治癒過程を開始するための生物による防御的な試みである。例えば、本発明の組成物および方法は、アレルギー疾患、例えば喘息、蕁麻疹（hives）、蕁麻疹（urticaria）、花粉アレルギー、イエダニアレルギー、毒物アレルギー、化粧品アレルギー、ラテックスアレルギー、化学物質アレルギー、薬物アレルギー、虫刺されアレルギー、動物のフケアレルギー、棘植物アレルギー、ツタウルシアレルギーおよび食物アレルギー；神経変性疾患；心臓血管疾患；消化器疾患；敗血症性ショック；アナフィラキシーショック；トキシックショック症候群：悪液質；壊死；壊疽；月経；潰瘍、例えば皮膚潰瘍、褥瘡、胃潰瘍、消化性潰瘍、口腔潰瘍、鼻咽頭潰瘍、食道潰瘍、十二指腸潰瘍および胃腸潰瘍；損傷、例えば擦過傷、打撲傷、切断、刺創、裂傷、衝撃による創傷、振とう症、挫傷、熱傷、凍傷、化学的熱傷、日焼け、乾燥、放射線熱傷、放射能熱傷、煙吸入、筋断裂、肉離れ、腱裂傷、腱内障、靭帯内障、靭帯断裂、過伸展、軟骨断裂、骨折、ピンチナーブおよび銃創；筋骨格炎症、例えば筋肉炎症、筋炎、腱炎症、腱炎、靭帯炎症、軟骨炎症、関節炎症、滑膜炎症、手根管症候群および骨炎症に関連する炎症を処置するのに使用することができる。ＣＣＬ２０は様々な癌に関係づけられており、特に結腸直腸癌の発症に関与する。
【００６２】
１つの実施形態では、本発明は、自己免疫疾患を処置する方法を提供し、この方法は、自己免疫疾患を有するまたは自己免疫疾患を発症する危険性がある被験体にＣＣＬ２０ロックド二量体ポリペプチドを含有する組成物の治療有効量を投与することを含む。
【００６３】
「自己免疫疾患」とは、特定のＴ細胞を含む、白血球によるサイトカイン、リンホトキシンおよび抗体の過剰産生によって引き起こされると一般的に理解されている疾病を意味する。そのような自己免疫疾患には、多発性硬化症（ＭＳ）、ギヤン−バレー症候群、筋委縮性側索硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、Ｉ型糖尿病、痛風、狼瘡、およびＴ細胞が重要な役割を果たす任意の他のヒト疾病、例えば組織移植拒絶反応が含まれるが、これらに限定されない。加えて、細胞外マトリックスの分解を含む疾患には、乾癬性関節炎、若年性関節炎、早期関節炎、反応性関節炎、変形性関節症、強直性脊椎炎、骨粗しょう症、腱炎のような筋骨格疾患および歯周疾患、癌転移、気道疾患（ＣＯＰＤ、喘息または他の反応性気道疾患）、腎および肝線維症、アテローム性動脈硬化症および心不全のような心臓血管疾患、ならびに神経炎症および多発性硬化症のような神経学的疾患が含まれるが、これらに限定されない。主として関節変性を含む疾患には、関節リウマチ、乾癬性関節炎、若年性関節炎、早期関節炎、反応性関節炎、変形性関節症、強直性脊椎炎が含まれるが、これらに限定されない。眼に関わる疾患には、自己免疫性ブドウ膜炎およびブドウ膜結膜炎およびドライアイ症候群が含まれるが、これらに限定されない。ウイルス性または細菌性疾患の感染後合併症に関わる疾患、例えば糸球体腎炎、脈管炎、髄膜脳炎。消化器系に関わる疾患には、炎症性腸疾患が含まれるが、これに限定されない。
【００６４】
「被験体」とは、哺乳動物および非哺乳動物を意味する。「哺乳動物」は、ヒト、非ヒト霊長動物、例えばチンパンジーおよび他の類人猿およびサル種；農場動物、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギおよびブタ；家畜、例えばウサギ、イヌおよびネコ；げっ歯動物を含む実験動物、例えばラット、マウスおよびモルモット等を含むがこれらに限定されない哺乳綱のクラスの任意の成員を意味する。非哺乳動物の例には鳥類、魚類等が含まれるが、これらに限定されない。「被験体」という用語は特定の年齢および性別を指すものではない。
【００６５】
「処置すること」とは、疾患、疾病または障害と闘うための被験体の管理およびケアを意味する。この用語は、予防的処置および待機療法の両方を包含する。処置することは、症状もしくは合併症の発症を予防する、和らげるおよび／もしくは改善する、症状もしくは合併症を軽減する、または疾患、疾病もしくは障害を除去するための本発明の化合物の投与を含む。
【００６６】
「改善する」、「改善」、「向上」等により、１名の被験体または少なくとも一部の被験体で、例えば少なくとも約２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、１００％またはこれらの値の任意の２つの間の範囲で、検出可能な改善または改善と一致する検出可能な変化が生じることが意味される。そのような改善または変化は、本発明のロックド二量体で処置されていない被験体と比較して処置された被験体で認められ得るが、ここで未処置被験体は、同じまたは類似の疾患、疾病、症状等を有するかまたは発症しやすい。疾患、疾病、症状またはアッセイパラメータの改善は、主観的または客観的に、例えば被験体による自己評価で、臨床医の評価によってまたは、例えばクオリティ・オブ・ライフの評価、疾患もしくは疾病の進行遅延、疾患もしくは疾病の重症度の低下、もしくは生体分子、細胞のレベルもしくは活性についての適切なアッセイを含む、適切なアッセイもしくは測定を実施することによって、または被験体内での細胞移動の検出によって判定し得る。改善は、一過性、持続的または永続的であり得るか、または本発明のロックド二量体が被験体に投与されるかもしくは本明細書中もしくは引用参考文献に記載されたアッセイもしくは他の方法で使用される間もしくはその後の適切な時点で、例えば本発明のロックド二量体の投与もしくは使用の約１時間以内から、被験体が本発明のロックド二量体を摂取した約３、６、９か月後以上までで異なり得る。
【００６７】
例えば症状、分子のレベルまたは生物学的活性、病原体の複製、細胞応答、細胞活性等の「調節」とは、細胞レベルまたは活性が検出可能に増大または減少することを意味する。そのような増大または減少は、本発明のロックド二量体で処置されていない被験体と比較して処置された被験体で認められ得るが、ここで未処置被験体は、同じまたは類似の疾患、疾病、症状等を有するかまたは発症しやすい。そのような増大または減少は、少なくとも約２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、１０００％以上またはこれらの値の任意の２つの間の任意の範囲内であり得る。調節は、主観的または客観的に、例えば被験体の自己評価によって、臨床医の評価によってまたは、例えばクオリティ・オブ・ライフの評価または分子のレベルもしくは活性、被験体内の細胞もしくは細胞移動についての適切なアッセイを含む、適切なアッセイもしくは測定を実施することによって判定し得る。調節は、一過性、持続的または永続的であり得るか、または本発明のロックド二量体が被験体に投与されるかもしくは本明細書中もしくは引用参考文献に記載されたアッセイもしくは他の方法で使用される間もしくはその後の適切な時点で、例えば本発明のロックド二量体の投与もしくは使用の約１時間以内から、被験体が本発明のロックド二量体を摂取した約３、６、９か月後以上までで異なり得る。
【００６８】
「投与すること」とは、本発明のＣＣＬ２０ロックド二量体ポリペプチドを体内、好ましくは全身循環中に導入するための任意の手段を意味する。例としては、経口、口腔内、舌下、肺、経皮、経粘膜投与、ならびに皮下、腹腔内、静脈内および筋肉内注射が含まれるが、これらに限定されない
【００６９】
「治療有効量」とは、必要な投与量および期間で、所望の治療結果、例えば癌の場合は血管新生の低減もしくは逆転、または自己免疫疾患におけるＴ細胞の低減もしくは阻害を達成するのに有効な量を意味する。ＣＣＬ２０ロックド二量体ポリペプチドの治療有効量は、疾患の状態、被験体の年齢、性別および体重、ならびに被験体において所望の応答を惹起するＣＣＬ２０ロックド二量体ポリペプチドの能力などの因子に応じて異なり得る。投与レジメンは、最適な治療応答を提供するように調整し得る。治療有効量はまた、ＣＣＬ２０ロックド二量体ポリペプチドの任意の毒性または有害作用を治療上有益な作用が上回るものである。
【００７０】
「予防有効量」とは、必要な投与量および期間で、所望の予防結果、例えば腫瘍の転移の割合または多発性硬化症の発作もしくはエピソードの発症の防止または阻害を達成するのに有効な量を指す。予防有効量は、治療有効量に関して上述したように決定することができる。典型的には、予防用量は疾患の前にまたは疾患の早期段階で被験体において使用されるので、予防有効量は治療有効量より少ない。
【００７１】
キット。別の実施形態では、本発明は、本発明に従う医薬組成物および使用説明書を含むキットを提供する。「使用説明書」とは、出版物、記録、図表または、ヒトにおいて本明細書で示す目的の１つについての本発明の医薬組成物の有用性を伝えるのに使用される任意の他の表現媒体を意味する。使用説明書はまた、例えば本発明の医薬組成物の適切な用量を説明することもできる。本発明のキットの使用説明書は、例えば本発明の医薬組成物を含む容器に添付するかまたは医薬組成物を含む容器と共に輸送することができる。あるいは、使用説明書は、使用説明書および医薬組成物が受領者によって協力的に使用されることを意図して容器とは別に輸送することができる。
【００７２】
本発明は、組成物を被験体に送達するための送達装置もさらに含み得る。例として、送達装置は、スクイーズスプレーボトル、定量スプレーボトル、エアロゾルスプレー装置、アトマイザ、乾燥粉末送達装置、自力推進型溶媒／粉末分注装置、注射器、針、タンポンまたは用量測定容器であり得る。
【００７３】
配列表：以下は、本発明で使用される適切な単量体のポリペプチド配列である。
配列番号：１（Ｓ６４Ｃ）
（ＡＳＮＦＤＣＣＬＧＹＴＤＲＩＬＨＰＫＦＩＶＧＦＴＲＱＬＡＮＥＧＣＤＩＮＡＩＩＦＨＴＫＫＫＬＳＶＣＡＮＰＫＱＴＷＶＫＹＩＶＲＬＬＣＫＫＶＫＮＭ）
配列番号：２（Ｖ２１Ｃ／Ｔ２４Ｃ）
（ＡＳＮＦＤＣＣＬＧＹＴＤＲＩＬＨＰＫＦＩＣＧＦＣＲＱＬＡＮＥＧＣＤＩＮＡＩＩＦＨＴＫＫＫＬＳＶＣＡＮＰＫＱＴＷＶＫＹＩＶＲＬＬＳＫＫＶＫＮＭ）
配列番号：３（Ｇ２２Ｃ／Ｔ２４Ｃ）
（ＡＳＮＦＤＣＣＬＧＹＴＤＲＩＬＨＰＫＦＩＶＣＦＣＲＱＬＡＮＥＧＣＤＩＮＡＩＩＦＨＴＫＫＫＬＳＶＣＡＮＰＫＱＴＷＶＫＹＩＶＲＬＬＳＫＫＶＫＮＭ）
配列番号：４（Ｆ２３Ｃ）
（ＡＳＮＦＤＣＣＬＧＹＴＤＲＩＬＨＰＫＦＩＶＧＣＴＲＱＬＡＮＥＧＣＤＩＮＡＩＩＦＨＴＫＫＫＬＳＶＣＡＮＰＫＱＴＷＶＫＹＩＶＲＬＬＳＫＫＶＫＮＭ）
配列番号：５（Ｖ６０Ｃ）
（ＡＳＮＦＤＣＣＬＧＹＴＤＲＩＬＨＰＫＦＩＶＧＦＴＲＱＬＡＮＥＧＣＤＩＮＡＩＩＦＨＴＫＫＫＬＳＶＣＡＮＰＫＱＴＷＶＫＹＩＣＲＬＬＳＫＫＶＫＮＭ）
配列番号：６（Ｖ６７Ｃ）
（ＡＳＮＦＤＣＣＬＧＹＴＤＲＩＬＨＰＫＦＩＶＧＦＴＲＱＬＡＮＥＧＣＤＩＮＡＩＩＦＨＴＫＫＫＬＳＶＣＡＮＰＫＱＴＷＶＫＹＩＶＲＬＬＳＫＫＣＫＮＭ）
ＩＩＩ．実施例
【００７４】
材料および方法を説明する以下の実施例は、例示のためにのみ提供されるものであり、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００７５】
ＣＣＬ２０  Ｓ６４Ｃ変異体の構築。二量体化はケモカインのインビボ機能に必須であり、結果として様々なＣＣおよびＣＸＣケモカインの改変された単量体および二量体は、ケモカインシグナル伝達におけるそれらのそれぞれの役割を探索するのに使用されてきた（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。２つの異なるＣＣＬ２０  Ｘ線結晶構造体で認められるＣＸＣ型二量体は、ＣＣケモカインファミリーの成員に関しては異例であり、ＮＭＲ試験はＣＣＬ２０の自己会合が比較的弱く、ｐＨ依存性であることを示す（Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。結晶学的ＣＣＬ２０二量体の機能活性を調べるため、Ｘ線結晶構造体の１つ（ＰＤＢコード２ＨＣＩ）を使用し、分子間ジスルフィド結合を予測するＤｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｙ  Ｄｅｓｉｇｎを用いて架橋二量体を設計した（Ｄｏｍｂｋｏｗｓｋｉ，２００３）。候補物のリストの目視検査から、実験的試験のために２個の単一システイン置換および３個の二重システイン置換ＣＣＬ２０変異体を作製した。これらのシステイン変異体は、１番目のβ鎖（Ｖ２１Ｃ／Ｔ２４Ｃ、Ｇ２２Ｃ／Ｔ２４ＣおよびＦ２３Ｃ）ならびにαヘリックス（Ｖ６０Ｃ／Ｖ６７ＣおよびＳ６４Ｃ）に置換を含んだ。各々の変異体を精製し、リフォールディングして、ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって分析した。相対するαヘリックス間で対称な分子間ジスルフィド結合を形成すると予測される１個の変異体、ＣＣＬ２０  Ｓ６４Ｃだけが（図１Ａ〜Ｂ）、さらなる分析に適した十分に純粋な折りたたまれたタンパク質を生成した。
【００７６】
逆相ＨＰＬＣへのＣＣＬ２０  ＷＴおよびＳ６４Ｃタンパク質の共注入は、２つの異なるピークを有するクロマトグラムを生じた（図１Ｃ）。ＣＣＬ２０  ＷＴまたはＣＣＬ２０  Ｓ６４Ｃ単独の注入は、各タンパク質についての保持時間が共注入におけるものとマッチすることおよび二量体試料中では単量体種が認められないことを明らかにした。四重極オービトラップ質量分析を用いて、ジスルフィド結合ＣＣＬ２０変異体に関して１６０８０．４ｋＤａの分子量を確認した（図１Ｄ）。ＣＣＬ２０  Ｓ６４Ｃの２Ｄ  1Ｈ−15Ｎ異核種単一量子コヒーレンス（ＨＳＱＣ）スペクトルは、野生型ＣＣＬ２０とは異なる均一な折りたたまれたタンパク質と一致する７９の広く分散したピークを示す（図１Ｅ）。ＣＣＬ２０  Ｓ６４Ｃのオリゴマー状態をジスルフィド還元および非還元試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認し、これらはそれぞれ約１０および２０ｋＤａで移動した（図１Ｅ）。生物物理学的データに基づき、システインでのＳｅｒ６４の置換はジスルフィド結合した対称なＣＣＬ２０ホモ二量体を生じると結論する。
【００７７】
ＣＣＬ２０  Ｓ６４Ｃのインビトロ試験。いくつかのＣＸＣケモカイン二量体は、それらの受容体に結合して受容体を活性化することができるが、ＣＣケモカインの二量体化は、典型的には受容体結合をブロックし、それらをＧＰＣＲアゴニストとして非機能性にする（Ｒａｖｉｎｄｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。トランスフェクトしたＣＣＲ６+  Ｊｕｒｋａｔ細胞を使用したカルシウム流動および細胞化学走性アッセイにおいて組換えＣＣＬ２０  ＷＴおよびＣＣＬ２０  Ｓ６４Ｃタンパク質のＣＣＲ６アゴニスト活性を比較した。両方の分子がナノモル濃度でＣＣＲ６媒介性細胞内カルシウム流動を誘導し、ＣＣＬ２０  Ｓ６４Ｃは修飾していないものよりも約９倍作用が弱かった（図２Ａ）。フィルタベースの移動アッセイでは、ＣＣＬ２０は典型的な二相性濃度依存でＣＣＲ６+  Ｊｕｒｋａｔ細胞移動を誘導し、最大応答は１００ｎＭ（ＥＣ50約１５ｎＭ）で認められた（図２Ｂ）。これに対し、同じアッセイでのＣＣＬ２０  Ｓ６４Ｃへの暴露は有意の細胞移動を生じさせなかった（図２Ｂ）。これらの結果は、ジスルフィド結合ＣＣＬ２０二量体がＣＣＲ６に結合する能力を保持し、Ｇタンパク質シグナル伝達を誘導するが、細胞化学走性に必要な他のＣＣＬ２０誘導性シグナル伝達経路を刺激することはできないことを示唆する。
【００７８】
３０ｎＭ  ＣＣＬ２０  ＷＴによって誘導されるＣＣＲ６+  Ｊｕｒｋａｔ細胞移動をブロックするうえでのＣＣＬ２０  Ｓ６４Ｃの作用を観測した。ＣＣＬ２０  Ｓ６４Ｃは、ＩＣ50約１００ｎＭで用量依存的に化学走性を阻害した（図２Ｃ）。ＣＣＬ２０  Ｓ６４Ｃはまた、ＣＣＲ６に結合して細胞移動を促進する別の分泌タンパク質、ヒトβデフェンシン２（ｈＢＤ２）にも応答して化学走性をブロックした（図２Ｄ）。注目すべき点として、ＣＣＬ２０  Ｓ６４Ｃは、それぞれケモカインＣＸＣＬ１２およびＣＣＬ２についてのコグネイト受容体であるＣＸＣＲ４およびＣＣＲ２によって媒介されるＴＨＰ−１細胞移動を阻害しなかった。１０ｎＭ  ＣＸＣＬ１２および１ｎＭ  ＣＣＬ２の存在下で、ＣＣＬ２０  Ｓ６４Ｃ変異体はいずれのケモカインでの処置後もＴＨＰ−１細胞移動への阻害作用を示さず、ＣＣＬ２０  Ｓ６４ＣがＣＣＲ６媒介性化学走性を選択的にブロックすることを示唆した。合わせて考慮すると、これらの結果は、ＣＣＬ２０  Ｓ６４Ｃが、ＣＣＬ２０と直接相互作用するのではなくＣＣＲ６受容体に特異的に結合することによってまたは他の下流の細胞移動シグナル伝達経路をブロックすることによってＣＣＬ２０誘導性化学走性を阻害することを示した
【００７９】
ＩＬ−２３誘導性乾癬におけるＣＣＬ２０  Ｓ６４Ｃの抗炎症活性。インビトロでＣＣＲ６特異的にＣＣＬ２０媒介性細胞移動をブロックする能力に基づき、ＣＣＬ２０  Ｓ６４Ｃはインビボで乾癬様皮膚炎に関連する炎症を減弱できると推測した。インビボでのＣＣＬ２０  Ｓ６４Ｃの潜在的な治療上の役割を同定するため、乾癬様皮膚炎のＩＬ−２３誘導性モデルを使用した。ＩＬ−２３への暴露は、Ｔ細胞をＴｈ１７分化へと駆動し、他の炎症細胞の表皮への移動を刺激して、マイクロメータで経時的に測定できる皮膚炎症を生じさせることが公知である（Ｈｅｄｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ＣＣＬ２０  Ｓ６４ＣとＩＬ−２３、ＣＣＬ２０  ＷＴとＩＬ−２３またはＩＬ−２３単独をマウスの耳皮膚に注射し、１日おきに５日間、耳厚を測定した。予想されたように、ＩＬ−２３とＣＣＬ２０  ＷＴまたはＩＬ−２３単独を注射したマウスは再現可能な耳腫脹を示した。ＩＬ−２３とＣＣＬ２０  Ｓ６４Ｃの添加は、他の群と比較して耳厚の有意の低減をもたらした（図３Ａ）。等モル量のＣＣＬ２０  ＷＴによる予防の欠如は、認められた作用がＣＣＬ２０  Ｓ６４Ｃのジスルフィド結合二量体立体配座に起因するものであり、一般にＣＣＬ２０のレベル上昇によるものではないことを示す。
【００８０】
耳肥厚化の測定に加えて、組織学的レベルでＩＬ−２３モデルにおけるＣＣＬ２０  Ｓ６４Ｃの作用を検討した。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を用いて表皮への免疫細胞浸潤を特徴づけた。ＩＬ−２３単独（またはＣＣＬ２０  ＷＴタンパク質とＩＬ−２３）の注射は、著明な表皮過形成および単核炎症性浸潤物の高密度混合物を生じさせた（図３Ｂ）。これに対し、ＩＬ−２３とＣＣＬ２０  Ｓ６４Ｃで処置したマウスは、表皮過形成の低減および炎症細胞浸潤の減少を示し、これはＰＢＳ対照と同等であった（図３Ｂ）。したがって、ＣＣＬ２０  Ｓ６４Ｃ処置は、乾癬様皮膚炎の２つの重要な特徴である表皮過形成および皮膚炎症を著明に低減した。
【００８１】
次に、表皮におけるＴ細胞輸送とバイオマーカー発現へのＣＣＬ２０処置の特異的作用を評価した。表皮細胞懸濁液をγδ−Ｔ細胞受容体に対するモノクローナル抗体で染色した。マウス皮膚では、高または低γδ−ＴＣＲを発現するγδ−Ｔ細胞の２つの別個の集団が炎症のない皮膚で認識され、そこでは表皮高γδ−Ｔ細胞（樹状表皮Ｔ細胞とも呼ばれる）が低γδ−Ｔ細胞に比べてはるかに高い数で存在する（Ｇｉｒａｒｄｉ，２００６）。ＩＬ−２３で処置した皮膚では、低γδ−Ｔ細胞が真皮および表皮中で著明に増大する（Ｍａｂｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。さらに、動員されたＧＤＬ  Ｔ細胞は、Ｔｈ１７分化を示唆する、高レベルのＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−２２を発現する。先の報告と同様に、ＩＬ−２３単独で処置したマウスは、ＰＢＳ対照と比較して表皮ＧＤＬ  Ｔ細胞集団の増大を示した（ｐ＜０．０５）（図３Ｃおよび３Ｅ）。１００ｎＭ  ＣＣＬ２０  ＷＴを耳に注射した場合、ＧＤＬ  Ｔ細胞集団の有意の低減は認められなかった。意外にも、ＣＣＬ２０  Ｓ６４Ｃで処置したマウスは、表皮中のＧＤＬ  Ｔ細胞集団の有意の欠如を示した（図３Ｃおよび３Ｅ）。これらの結果は、ＣＣＬ２０  Ｓ６４ＣはＧＤＬ  Ｔ細胞の表皮への輸送をブロックすることができるが、野生型ＣＣＬ２０はブロックできないという我々の仮説を確認した。
【００８２】
乾癬バイオマーカーの発現レベルをさらに検討するため、ＧＤＬ  Ｔ細胞の増大と共に増加することが公知である、ＩＬ−１７ＡとＩＬ−２２のＲＴ−ＰＣＲ分析を実施した（Ｓｕｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ＣＣＬ２０  Ｓ６４Ｃで処置した耳からの表皮細胞懸濁液は、ＩＬ−２３単独で処置した耳と比べてＩＬ−２２およびＩＬ−１７Ａ  ｍＲＮＡの発現の有意の低減を示した（図３Ｆ）。しかし、野生型ＣＣＬ２０で処置した耳からの表皮細胞は、ＩＬ−２３単独処置に匹敵するより高いＩＬ−２２およびＩＬ−１７Ａ  ｍＲＮＡレベルを示した。したがって、ＣＣＬ２０  Ｓ６４Ｃは、表皮中のＧＤＬ  Ｔ細胞の蓄積をブロックし、処置マウスの表皮におけるＩＬ−２２およびＩＬ−１７Ａ  ｍＲＮＡの発現を低減した。
【００８３】
いくつかのロックドケモカイン二量体は、正しい三次折りたたみ構造をとるが、ジスルフィド捕捉二量体としてＣＣＲ２に結合するその能力を喪失しているＣＣＬ２の場合のように、それらのコグネイトＧＰＣＲに結合することができない（Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。これに対し、ＣＸＣＬ１選択的二量体は、ＣＸＣ二量体として完全なアゴニスト能力を維持する（Ｒａｖｉｎｄｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。我々が遺伝子改変で構築した変異体は、ほぼ１０倍弱い効力にもかかわらず、ＣＣＲ６と相互作用して、細胞内カルシウム放出を開始させることができる最初のジスルフィド結合ＣＣＬ２０二量体である。Ｃｈａｎ  ｅｔ．ａｌ．は、ＣＣＬ２０の二量体結晶構造および単量体ＮＭＲ構造に関する分子動力学シミュレーションを実施し、Ｎループと３番目のβ鎖によって形成される受容体結合溝が、単量体と比較して二量体では約１Å狭いことを見出した。二量体の狭窄した溝はケモカインと受容体間であまり良好な相互作用を生じさせることができず、ＣＣＬ２０  Ｓ６４Ｃ二量体の効力低下を説明できない。Ｃｈａｎ  ｅｔ．ａｌ．と他の研究者達はまた、ＣＣＬ２０結晶構造（２ＨＣＩ）が、一方の単量体上のケモカインＮ末端の残基（Ｓｅｒ３およびＡｓｎ４）が相対する単量体上で（Ｌｙｓ４３）接触していることを示すことも指摘した。ＣＣＬ２０  Ｓ６４Ｃ変異体は、おそらくロックされた状態のためにこれらの相互作用を促進すると考えられ、ＣＣＲ６のオルソステリックポケットでケモカインＮ末端を異なる方向に位置付けることができ、オリゴマー特異的シグナル伝達を導く。認められたオリゴマー相違をもたらすＣＣＬ２０とＣＣＲ６間の重要な相互作用を見極めるには野生型ＣＣＬ２０およびＳ６４Ｃ変異体のより構造的な試験が必要である。
【００８４】
本試験において、我々は、ＣＣＬ２０  Ｓ６４Ｃ変異体が乾癬様皮膚炎を予防し、ＧＤＬ  Ｔ細胞の表皮への動員をブロックすることを明らかにし、ＣＣＬ２０／ＣＣＲ６経路を中和することがヒト乾癬性疾患において治療的に有用であり得る可能性を提起した。実際に、最近のヒト臨床データは乾癬におけるＣＣＲ６とＧＤＬ  Ｔ細胞の重要性を裏付ける。初期研究は、ＣＣＬ２０をヒト乾癬病変において最も高度に上方調節されるケモカインと特徴づけた（Ｈｏｍｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。加えて、乾癬患者は血液中のＩＬ−１７Ａ+ＣＣＲ６+細胞の循環レベルが上昇していることおよびＩＬ−１７Ａ+ＣＣＲ６+γδ  Ｔ細胞が正常皮膚と比べて乾癬病変中ではより多数存在することが報告されている（Ｋａｇａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｌａｇｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。活性化Ｔ細胞機能におけるＣＣＲ６の役割は、乾癬だけでなくＴｈ１７媒介性経路を利用する他の疾患でもＣＣＬ２０  Ｓ６４Ｃ変異体の治療上の潜在的可能性を強調する。
【００８５】
ＣＣＬ２０ロックド二量体は、静脈内投与を含む全身経路によって活動性乾癬皮膚病変を有する患者に一定間隔で投与される。
【００８６】
ＣＣＬ２０ロックド二量体プラスミドの作製。ＣＣＬ２０Ｓ６４Ｃプラスミドを、ＱｕｉｋＣａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用し、相補的プライマーを用いて部位指定突然変異誘発によって作製した。突然変異体プラスミドをＤＮＡ塩基配列決定によって確認した。
【００８７】
タンパク質精製。ＣＣＬ２０Ｓ６４Ｃ、ＣＣＬ２０ＷＴおよびｈＢＤ２タンパク質を先に記述されているように発現させ、精製した（Ｔａｋｅｋｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。簡単に述べると、大腸菌細胞をフレンチプレスによって溶解し、１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。不溶性画分を６Ｍグアニジン緩衝液に再懸濁し、ニッケルクロマトグラフィで精製した。ＣＣＬ２０Ｓ６４Ｃ溶出物をプールし、２０ｍＭシステイン、０．５ｍＭシスチン、１００ｍＭトリス（ｐＨ８．０）緩衝液中に滴下してリフォールディングした。ＣＣＬ２０ＷＴおよびｈＢＤ２溶出物は、１０ｍＭシステイン、０．５ｍＭシスチン、１００ｍＭトリス（ｐＨ８．０）緩衝液中でリフォールディングした。リフォールディングしたＣＣＬ２０およびｈＢＤ２タンパク質を組換えＵＬＰ１およびＳＵＭＯ−６ＸＨＩＳタグで切断し、カチオン交換クロマトグラフィによって組換えタンパク質から分離した。交換クロマトグラフィ後、溶出物をＨＰＬＣ精製し、凍結乾燥した。純度および分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって確認した。
【００８８】
ＨＰＬＣクロマトグラフィ。組換えＣＣＬ２０Ｓ６４ＣおよびＣＣＬ２０ＷＴタンパク質約１００μｇをＨ2Ｏ中に再懸濁し、Ｃ１８カラム（Ｖｙｄａｃ）を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣに注入した。７０％アセトニトリル（Ｓｉｇｍａ）および０．１％ＴＦＡ（Ｓｉｇｍａ）の５０〜８０％勾配を用いてタンパク質を溶出した。
【００８９】
質量分析法。精製ＣＣＬ２０Ｓ６４Ｃを、０．１％ギ酸を含有する７０％アセトニトリル中で１μＭに希釈した。Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）Ｈｙｂｒｉｄ  Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて直接注入によってタンパク質を分析した。１４０，０００に設定した分解能で分析を実施した。ＱｕａｌＢｒｏｗｓｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でＸｔｒａｃｔおよびＸｃａｌｉｂｕｒ（商標）を用いてデータをデコンボリューションし、脱同位体化した。
【００９０】
還元／酸化ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。ＣＣＬ２０Ｓ６４ＣまたはＣＣＬ２０ＷＴ約３μｇをβ−メルカプトエタノールの不在下または存在下でＳＤＳ緩衝液中に再懸濁した。
【００９１】
ＮＭＲ分光法。［Ｕ−15Ｎ］−ＣＣＬ２０Ｓ６４ＣおよびＣＣＬ２０ＷＴをＨ2Ｏ中に再懸濁し、２５ｍＭ重水素化ＭＥＳ（ｐＨ６．８）、１０％（ｖ／ｖ）Ｄ2Ｏおよび０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ3緩衝液中で５０μＭに希釈した。２９８Ｋで、ＴＣＩクライオプローブを備えたＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ５００ＭＨｚ分光計で1Ｈ−15Ｎ異核種単一量子コヒーレンス実験を実施した。
【００９２】
カルシウム流動アッセイ。トランスフェクトＣＣＲ６+  Ｊｕｒｋａｔ細胞をハンクス緩衝生理食塩水（ＨＢＳＳ）、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）および０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ緩衝液中で２回洗浄し、２×１０5細胞／ウェルをＦＬＩＰＲカルシウム４染料と共に３８４ウェルのＨＴＳプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ）において３７℃、５％ＣＯ2で１時間インキュベートした。ケモカイン希釈物を緩衝液中で作製し、２０秒の基線読み取り後にプレートに添加した。Ｆｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ  ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いてさらに８０秒間、５１５ｎｍでの蛍光を観察した。総蛍光シグナルを測定し、別々の２日からの４つの複製物を測定して、平均±ＳＥＭとして提示する。４パラメータ関数への非線形フィッティングを介してＥＣ50値を計算した。
【００９３】
化学走性アッセイ。ケモカインおよびｈＢＤ２希釈物をＲＰＭＩ  １６４０、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）および０．２％ＢＳＡ緩衝液中で指示されているように調製し、Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＨＴＳ  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）９６ウェルプレート（細孔径５μｍ）の下部ウェルに添加した。トランスフェクトＣＣＲ６+  Ｊｕｒｋａｔ細胞を緩衝液中で洗浄し、３．６×１０4細胞を上部ウェルに添加して、３７℃、５％ＣＯ2で２時間インキュベートした。下部ウェル中の移動細胞をＢＤ（商標）ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメータで定量した。総細胞数は、別々の２日からの４つの複製物の平均であり、平均±ＳＥＭとして提示する。対応のない両側スチューデントＴ検定によって有意性を決定した。
【００９４】
マウス。Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスをＴｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。すべてのマウスを８〜１２週齢で使用した。動物のプロトコルは、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎの動物実験委員会によって承認された。
【００９５】
マウス耳へのサイトカイン注射。ＰＢＳ  ２０μｌ中の組換えマウスＩＬ−２３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）５００ｎｇの皮内注射を、先に記述されているように（Ｍａｂｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）１日おきに６日間、麻酔したマウスの両耳に実施した。同様の方法で、組換えマウスＩＬ−２３  ５００ｎｇと混合した組換えＣＣＬ２０Ｓ６４Ｃ  ３２ｎｇ（０．１μＭ）を含有するＰＢＳ  ２０μｌ、組換えマウスＩＬ−２３  ５００ｎｇと混合した組換えＣＣＬ２０ＷＴ  １６ｎｇ（０．１μＭ）を含有するＰＢＳ  ２０μｌを皮内注射で投与した。ダイヤルシックネスゲージ（Ｏｚａｋｉ）を使用して各注射の前に耳厚を測定した。
【００９６】
マウス耳からの表皮細胞の処理。マウス耳の回収後、皮膚シートを軟骨から分離し、０．５％トリプシン（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を含有するＰＢＳ中、３７℃で４０分間インキュベートして、皮膚シートから表皮シートを分離した。細胞懸濁液を得るため、表皮シートを、記述されているように（Ｍａｂｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）０．０５％ＤＮアーゼＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で処理した。
【００９７】
フローサイトメトリ。抗マウスγδ−ＴＣＲ（クローン：ＧＬ３）をＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した。マウス表皮からの細胞を、Ａｃｕｒｉ  Ｃ６（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて検査した。ＦｌｏｗＪｏバージョン１０．０．７ソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を使用してフローサイトメトリデータを分析した。
【００９８】
定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）。表皮からの指示されているサイトカインのＲＮＡの抽出およびその後のｍＲＮＡ発現の分析を記述されているように実施した（Ｍａｂｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。簡単に述べると、マウス表皮の全ＲＮＡを、製造者の指示に従ってＲＮｅａｓｙ  Ｆｉｂｒｏｕｓ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて調製し、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によってＲＴ−ＰＣＲを実施した。
【００９９】
組織病理学的分析。皮膚標本を採取し、１０％ホルムアルデヒドで固定して、パラフィンに包埋した。これらの組織を４μｍの厚さで切片にし、脱パラフィン化した切片をＨ＆Ｅで染色した。
【０１００】
統計。すべてのデータを平均±ＳＥＭとして表す。カルシウム流動および化学走性のＥＣ50およびＩＣ50値を、ＰｒｏＦｉｔ  ６および社内スクリプトを使用して分析した。インビボデータは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン６（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて分析した。両側スチューデントｔ検定を使用することによってデータの平均およびＳＥＭの単純比較を行い、テューキーの検定を使用して多重比較を行った。０．０５未満のＰ値を統計的に有意とみなす。
【０１０１】
炎症性疾患の処置におけるＣＣＬ２０ロックド二量体の使用。１つの実施形態では、本発明のロックド二量体は、他の公知の抗炎症治療と組み合わせてアゴニストまたはアンタゴニストとして使用し得る。「アゴニスト」とは、最も広い意味で当該リガンドが結合する受容体を刺激するリガンドを意味する。「アゴニスト」または「アンタゴニスト」は、それぞれ、受容体、酵素または別の生物学的分子の活性を検出可能に増大させるまたは減少させる化合物または組成物であり、これらは、調節される遺伝子の転写もしくはｍＲＮＡレベルの増大もしくは減少、または別の測定可能な作用、例えば遺伝子産物もしくはタンパク質のレベルもしくは活性の変化をもたらすことができる。受容体または酵素の活性の増大または減少は、１つ以上の測定可能な活性に関して、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはこれらの値の任意の２つの間の範囲の増大または減少である。受容体、それらの付属因子および関連転写因子は、転写またはｍＲＮＡレベルを検出可能に増大または減少させることによってそれらの標的遺伝子の転写を調節することができる。受容体の生物学的活性は、生物学的応答を調節すること、例えば細胞内のシグナル伝達または細胞膜もしくは細胞小器官膜を横切る、例えばミトコンドリアを横切るイオン流動、例えばナトリウム、カリウムもしくはカルシウムイオン流動も包含し得る。
【０１０２】
本発明の併用療法の抗炎症活性は、当分野で公知であり、Ｃｒｏｆｆｏｒｄ  Ｌ．Ｊ．ａｎｄ  Ｗｉｌｄｅｒ  Ｒ．Ｌ．，“Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  Ａｎｉｍａｌｓ”，ｉｎ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ａｌｌｉｅｄ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，ＭｃＣａｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｈａｐｔｅｒ  ３０（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｆｅｂｉｇｅｒ，１９９３）に記載されている炎症性関節炎の様々な実験動物モデルを使用することによって判定できる。炎症性関節炎および自己免疫性リウマチ疾患の実験および自然発症動物モデルも、本発明の併用療法の抗炎症活性を評価するのに使用することができる。
【０１０３】
当分野で公知であり、広く使用されている関節炎または炎症性疾患の主要な動物モデルには、アジュバント誘発性関節炎のラットモデル、コラーゲン誘発性関節炎のラットおよびマウスモデル、ならびに抗原誘発性関節炎のラット、ウサギおよびハムスターモデルが含まれ、これらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｒｏｆｆｏｒｄ  Ｌ．Ｊ．ａｎｄ  Ｗｉｌｄｅｒ  Ｒ．Ｌ．，“Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  Ａｎｉｍａｌｓ”，ｉｎ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ａｌｌｉｅｄ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，ＭｃＣａｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｈａｐｔｅｒ  ３０（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｆｅｂｉｇｅｒ，１９９３）に記載されている。
【０１０４】
本発明の抗炎症活性は、カラギーナン誘発性関節炎のラットモデルを使用して評価することができる。カラギーナン誘発性関節炎は、慢性関節炎または炎症の試験でウサギ、イヌおよびブタにおいても使用されている。治療効果を判定するには定量的組織形態計測学的評価が用いられる。そのようなカラギーナン誘発性関節炎モデルを使用する方法は、Ｈａｎｓｒａ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｒａｔ，”Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，２４（２）：１４１−１５５，（２０００）に記載されている。当分野で公知であり、記述されているザイモサン誘発性炎症の動物モデルも一般的に使用される。
【０１０５】
本発明の抗炎症活性はまた、Ｗｉｎｔｅｒ  Ｃ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｅｄｅｍａ  ｉｎ  Ｈｉｎｄ  Ｐａｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒａｔ  ａｓ  ａｎ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｄｒｕｇｓ”Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．１１１，５４４−５４７，（１９６２）に記載されている方法の修正法を用いて、ラットにおけるカラギーナン誘発性足浮腫の抑制を測定することによっても評価できる。このアッセイは、大部分のＮＳＡＩＤの抗炎症活性に関する一次インビボスクリーニングとして使用されており、ヒトでの効果を予測するとみなされている。試験予防薬または治療薬の抗炎症活性は、ビヒクルを投与した対照群に対する試験群の後足重量増加の抑制パーセントとして表される。加えて、炎症性腸疾患の動物モデルも本発明の併用療法の効果を評価するのに使用できる。
【０１０６】
加えて、喘息の動物モデルも本発明の併用療法の効果を評価するのに使用できる。１つのそのようなモデルの例は、ＴＨ１またはＴＨ２レシピエントマウスのエアロアレルゲン誘発が気道へのＴＨエフェクター細胞移動をもたらし、強い好中球（ＴＨ１）および好酸球（ＴＨ２）肺粘膜炎症応答に結びつく、マウス養子移入モデルである（Ｃｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６，１７３７−１７４７）。
【０１０７】
自己免疫疾患の処置におけるＣＣＬ２０ロックド二量体の使用。本発明のＣＣＬ２０ロックド二量体は、ＣＣＲ６の発現が罹患組織に浸潤するＴ細胞の顕著な特徴である自己免疫疾患において有益である。処置は、活動性疾患を有する患者に薬剤を全身投与することから成る。自己免疫障害の動物モデルも本発明の併用療法の効果を評価するのに使用できる。１型糖尿病、甲状腺自己免疫、全身性エリテマトーデスおよび糸球体腎炎などの自己免疫障害の動物モデルが開発されている。さらに、当業者に公知の任意のアッセイを使用して、自己免疫および／または炎症性疾患のための本明細書で開示されるコンビナトリアル療法の予防および／または治療上の有用性を評価することができる。
【０１０８】
自己免疫および／または腸炎症の動物モデルも、本発明の併用療法の効果を試験するのに使用できる。１つのそのようなモデルの例は、Ｗｉｒｔｚ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｓ”Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ２，５４１−５４６，（２００７）に記載されているマウスデキストラン硫酸ナトリウム大腸炎モデルである。
【０１０９】
ＣＣＬ２０  Ｓ６４ＣのＸ線結晶構造。
【０１１０】
いくつかのケモカインは、他のケモカインクラスと共有される特徴的な二量体特性を示す、より高次の構造体を形成する。溶液中のＣＣＬ２０のＣＸＣ型二量体立体配座を実証するため、分子置換法を介してＣＣＬ２０  Ｓ６４ＣのＸ線結晶構造を解明した。タンパク質を酢酸アンモニウム緩衝液中で結晶化し、六方晶系空間群（Ｐ６1）に充填して、２．０Åの最終構造分解能を得た。２個のＣＣＬ２０分子が非対称単位中に存在し、予想されるＣＸＣ型二量体を形成する。単量体サブユニット構造は他の以前に解明されているケモカインと類似であり、非構造化Ｎ末端領域に続いて２つの分子内ジスルフィド結合、Ｎループ領域および３本のβ鎖が存在する。両方のサブユニット中のＣ末端αヘリックスは、相対するサブユニットの３０のループ／β鎖と接触し、結合全体にわたって明確に定義された電子密度で、分子間ジスルフィド結合を介して連結されている（図４ａ、ｂ）。
【０１１１】
ロックド二量体構造体は他のＣＣＬ２０構造体に高い類似性を示す。両方のサブユニットにおいて、Ｎ末端は、最初のジスルフィド結合に先行するアミノ酸、Ｄ５で始まる観察された電子密度で極めて柔軟である。構造体は、Ｍ７０の骨格酸素とＫ５２のＮζの間の水素結合のために両方の単量体鎖でＭ７０まで完全な電子密度を有する；他のいずれのＣＣＬ２０結晶構造体においてもこの末端残基は認められない。ＣＣＬ２０  Ｓ６４Ｃはβ１鎖に沿って自己会合し、Ｖ２１、Ｆ２３およびＲ２５の骨格原子間で特徴的な水素結合パターンを形成する（図４ｃ）。加えて、二量体は、単量体ＡのＶ６７と単量体ＢのＦ２３で見られるように、各々のαヘリックスと相対するサブユニットのβ鎖の間の疎水性接触によって安定化されている。ファンデルワールス接触と共に、Ｋ５７  Ｎζと相対するサブユニットのＶ６７骨格酸素の間の水素結合が二量体を安定化し、Ｃ末端の安定化にさらに寄与する。
【０１１２】
単量体およびいくつかの二量体ケモカインの認識は、ケモカイン表面の保存されたＮループ／β３鎖モチーフの認識を介して促進される（Ｂｌａｎｐａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｂａｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｂｏｎｄｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。図４ｄは、ＣＣＬ２０ロックド二量体と単量体ＣＣＬ２０（ＰＤＢ  ＩＤ＝２ＪＹＯ）におけるこの結合裂の重ね合わせを示す。ＣＣＬ２０ロックド二量体は、残基１０〜５０のＣα原子に関してＲＭＳＤ＝０．９７Åで、単量体と同様のポケット立体配座をとる。加えて、単量体および二量体のＲ１３、Ｆ１９およびＶ４７の側鎖はポケット内で類似の配向をとり、Ｒ１３アミノ基はポケット内へとおよびＶ４７にごく近接して配向する。対称な対応物または他のタンパク質−タンパク質相互作用は、二量体Ｘ線構造体においてこのポケット付近では見出されない。
【０１１３】
ＣＣＬ２０  Ｓ６４ＣはＣＣＲ６についての偏ったアゴニストである。
【０１１４】
いくつかのＣＸＣケモカイン二量体は、それらの受容体に結合して活性化することができるが、ＣＣケモカインの二量体化は、典型的には結合をブロックし、それらをＧＰＣＲアゴニストとして非機能性にする（Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｒａｖｉｎｄｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。二量体が生物学的関連性を有するかどうかを調べるため、ロックド二量体と野生型ＣＣＬ２０をＣＣＲ６に結合して活性化する能力に関して比較した。ＣＣＲ６+  ＣＯＳ７細胞上のＩ125−ＣＣＬ２０  ＷＴの放射性リガンド置換は、それぞれ７．６ｎＭおよび７４．４ｎＭのＫd値で、ＣＣＬ２０  ＷＴとＣＣＬ２０  Ｓ６４Ｃの間で親和性の１０倍の変化を示した（図５ａ）。次に、細胞内カルシウム放出を測定することによって、ＣＣＬ２０  ＷＴと比較してＣＣＲ６を活性化する二量体の能力を評価した。ＣＣＲ６+  Ｊｕｒｋａｔ細胞上で、両方の分子がナノモル濃度でＣＣＲ６媒介性カルシウム流動を誘導し、ＣＣＬ２０  Ｓ６４Ｃは修飾していないものよりも約９倍効力が弱かった（図５ｂ）。カルシウムの小胞体放出の結果としておよびＣＣＲ６とＧαiサブユニットの会合に特異的に、Ｇｑｉ４ｍｙｒキメラＧタンパク質でトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞中のＩＰ3蓄積を測定した（Ｒｏｓｅｎｋｉｌｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。ＣＯＳ−７細胞へのＣＣＬ２０  ＷＴおよびＣＣＬ２０  Ｓ６４Ｃの用量依存的投与は、それぞれ０．４ｎＭおよび４１．３ｎＭのＥＣ50値でＣＣＲ６媒介性ＩＰ3蓄積を生じた。Ｇタンパク質シグナル伝達を評価する両方のアッセイにおいて、ＣＣＬ２０  Ｓ６４ＣはＣＣＲ６を活性化する能力を保持する（図５ｃ）。
【０１１５】
ケモカイン受容体のアゴニスト活性化後、Ｇタンパク質受容体キナーゼ（ＧＲＫＳ）はＧＰＣＲ細胞質尾部をリン酸化し、複数のβ−アレスチンアイソタイプを受容体の細胞内面に動員する（Ａｒａｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。トランスフェクトＵ２ＯＳ細胞に関するβ−ガラクトシダーゼルミネセンスアッセイを用いてβ−アレスチン−２を動員する二量体の能力を試験した（図５ｄ）。ＣＣＬ２０  ＷＴおよびＣＣＬ２０  Ｓ６４Ｃに応答したＣＣＲ６へのβ−アレスチン−２動員を測定し、それぞれ１．１ｎＭおよび８６．２ｎＭのＥＣ50値を生じた。
【０１１６】
ＣＣＬ２０  ＷＴおよびＣＣＬ２０  Ｓ６４Ｃに応答したＣＣＲ６インターナリゼーションも評価した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を７０および７００ｎＭの各タンパク質と共に３０分間インキュベートし、細胞表面でのＣＣＲ６発現をフローサイトメトリによって定量化した。カルシウム流動およびβ−アレスチン−２動員のＥＣ50値に等しいまたはそれを上回るＣＣＬ２０  Ｓ６４Ｃ濃度（７００ｎＭ）で処理した場合、有意のＣＣＲ６インターナリゼーションは認められなかった（図５ｅ）。これに対し、ＣＣＬ２０  ＷＴは濃度依存的にＣＣＲ６表面発現を有意に低減した。合わせて考慮すると、すべてではないがいくつかの受容体媒介性シグナル伝達経路の選択的活性化は、ＣＣＬ２０  Ｓ６４ＣをＣＣＲ６についての偏ったアゴニストとして分類する。
【０１１７】
本発明の他の実施形態および使用は、本明細書で開示される本発明の仕様および実施からの考察により当業者に明らかになる。すべての定期刊行物の引用ならびに米国／外国特許および特許出願を含む、何らかの理由により本明細書で引用されるすべての参考文献は、すべての目的に関して参照により明確におよび完全に本明細書に組み込まれる。本発明は、本明細書で例示され、説明される特定の試薬、製剤、反応条件等に限定されるものではなく、以下の特許請求の範囲に含まれるそれらの修正形態を包含することが理解される。
参考文献
Ａｒａｍｏｒｉ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  ｊｏｕｒｎａｌ．１６：４６０６−４６１６．
Ｂａｂａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２７２：１４８９３−１４８９８．
Ｂａｌｙ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１６１：４９４４−４９４９．
Ｂｌａｎｐａｉｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２７８：５１７９−５１８７．
Ｂｏｎｄｕｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ．９８：１３７２２−１３７２７．
Ｃａｍｐａｎｅｌｌａ，Ｇ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１７７：６９９１−６９９８．
Ｃｈａｎ，Ｄ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．２００８．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．５２：８８３−８９４．
Ｃｒｕｍｐ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  ｊｏｕｒｎａｌ．１６：６９９６−７００７．
Ｄｏｍｂｋｏｗｓｋｉ，Ａ．Ａ．２００３．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．１９：１８５２−１８５３．
Ｄｒｕｒｙ，Ｌ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ｐｒｏｃ．  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．１０８：１７６５５−１７６６０．
Ｇｉｒａｒｄｉ，Ｍ．２００６．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ．１２６：２５−３１．
Ｈａｓｓａｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ｉｎｔ．Ｊ．ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｕ  ｃａｎｃｅｒ．１２９：２２５−２３２．
Ｈｅｄｒｉｃｋ，Ｍ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．１１９：２３１７−２３２９．
Ｈｏｍｅｙ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｊ．  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１６４：６６２１−６６３２．
Ｈｏｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２７７：３７６４７−３７６５４．
Ｊａｎｓｍａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｃｈａｐｔｅｒ  ２．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．４６１：３１−５０．
Ｋａｇａｍｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．２０１０．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ．１３０：１３７３−１３８３．
Ｋｕｆａｒｅｖａ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．２０１４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．１１１：Ｅ５３６３−５３７２．
Ｋｕｒｄ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｊ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ．６０：２１８−２２４．
Ｌａｇｇｎｅｒ，Ｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１８７：２７８３−２７９３．
Ｌａｎｇｌｅｙ，Ｒ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．２０１４．Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．３７１：３２６−３３８．
Ｌｉａｏ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．１９９９．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１６２：１８６−１９４．
Ｍａｂｕｃｈｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１８７：５０２６−５０３１．
Ｍａｌｉｋ，Ｚ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．２００６．Ａｃｔａ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ．６２：６３１−６３４．
Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ａ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．１００：１８８５−１８９０．
Ｒａｖｉｎｄｒａｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．２０１３．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２８８：１２２４４−１２２５２．
Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｆｒａｄｅ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．１９９９．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ．１４４：７５５−７６５．
Ｒｏｓｅｎｋｉｌｄｅ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．２００４．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２７９：３０３３−３０４１．
Ｒｏｓｅｎｋｉｌｄｅ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２８１：１３１９９−１３２０８．
Ｓｕｔｔｏｎ，Ｃ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．３１：３３１−３４１．
Ｔａｋｅｋｏｓｈｉ，Ｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１２．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．１１：２５１６−２５２５．
Ｔａｎ，Ｊ．Ｈ  ｅｔ  ａｌ．２０１２．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２８７：１４６９２−１４７０２．
Ｔａｎ，Ｊ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．２０１３．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２８８：１００２４−１００３４．
Ｖｅｌｄｋａｍｐ，Ｃ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．２００８．Ｓｃｉ  Ｓｉｇｎａｌ．１：ｒａ４．
Ｚｉｄａｒ，Ｄ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．１０６：９６４９−９６５４．
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
0006786526.tif 000009
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ−Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【配列表】
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