(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
−  少なくとも１つの抗原またはその断片、
−  前記抗原のＮ末端の前の小胞体（ＥＲ）移行シグナル配列、ならびに
−  前記抗原のＣ末端の後のエンドソーム／リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメイン
を含む少なくとも１つの融合タンパク質を発現する(i)樹状細胞と、
−  前記抗原またはその断片のＮ末端の前の小胞体（ＥＲ）移行シグナル配列、ならびに
−  前記抗原またはその断片のＣ末端の後のエンドソーム／リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメイン
を含まない少なくとも１つの抗原またはその断片を発現する(ii)樹状細胞と、
を含む樹状細胞組成物であって、
前記(i)樹状細胞における抗原と前記(ii)樹状細胞における抗原とが同じ抗原である、前記樹状細胞組成物。
【請求項２】
前記融合タンパク質および前記抗原が、一過性または安定に発現される、請求項１に記載の樹状細胞組成物。
【請求項３】
前記一過性発現が、ｉｖｔ−ＲＮＡを導入することによって実施される、請求項２に記載の樹状細胞組成物。
【請求項４】
前記エンドソーム／リソソームターゲティング配列がＤＣ−ＬＡＭＰに由来する、請求項１から３のいずれか一項に記載の樹状細胞組成物。
【請求項５】
前記エンドソーム／リソソームターゲティング配列がヒトである、請求項１から４のいずれか一項に記載の樹状細胞組成物。
【請求項６】
前記エンドソーム／リソソームターゲティング配列が、配列番号３の配列またはその断片を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の樹状細胞組成物。
【請求項７】
前記エンドソーム／リソソームターゲティング配列が、配列番号１４の配列またはその断片を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の樹状細胞組成物。
【請求項８】
前記ＥＲ移行シグナル配列が、エンドソーム／リソソーム関連タンパク質に由来する、請求項１から７のいずれか一項に記載の樹状細胞組成物。
【請求項９】
前記エンドソーム／リソソーム関連タンパク質が、ＬＡＭＰ１、ＬＡＭＰ２、ＤＣ−ＬＡＰ、ＣＤ６８およびＣＤ１ｂを含む群から選択される、請求項８に記載の樹状細胞組成物。
【請求項１０】
前記ＥＲ移行シグナル配列がＬＡＭＰ１に由来する、請求項１から９のいずれか一項に記載の樹状細胞組成物。
【請求項１１】
前記ＥＲ移行シグナル配列が、配列番号１の配列またはその断片を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の樹状細胞組成物。
【請求項１２】
前記樹状細胞が、以下のステップ：
（ｉ）単球の準備、
（ｉｉ）ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦとのステップｉ）の前記単球のインキュベーション、
（ｉｉｉ）成熟カクテルと組み合わせたＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦとのステップｉｉ）の前記単球のインキュベーション
を含む方法によって生成された成熟樹状細胞である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の樹状細胞組成物。
【請求項１３】
前記成熟カクテルが、ＩＦＮ−γ、ＴＬＲ７／８アゴニスト、ＰＧＥ２および任意選択でＴＬＲ３アゴニストの組合せを含む、請求項１２に記載の樹状細胞組成物。
【請求項１４】
前記成熟カクテルが、ＩＬ−β、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＴＬＲ７／８アゴニスト、ＰＧＥ２およびＴＬＲ３アゴニストの組合せを含む、請求項１３に記載の樹状細胞組成物。
【請求項１５】
ステップｉｉ）のインキュベーションが、少なくとも２日継続する、請求項１２から１４に記載の樹状細胞組成物。
【請求項１６】
ステップｉｉｉ）のインキュベーションが、少なくとも１２時間継続する、請求項１２から１５に記載の樹状細胞組成物。
【請求項１７】
前記ＴＬＲ７／８アゴニストがＲ８４８であり、前記ＴＬＲ３アゴニストがポリ（Ｉ：Ｃ）である、請求項１３から１６に記載の樹状細胞組成物。
【請求項１８】
前記抗原がＭＥＬＡＮ−Ａである、請求項１から１７のいずれか一項に記載の樹状細胞組成物。
【請求項１９】
請求項１から１８のいずれかに記載の樹状細胞組成物を含む樹状細胞ワクチン。
【請求項２０】
前記樹状細胞が自己細胞である、請求項１９に記載の樹状細胞ワクチン。
【請求項２１】
薬学的に許容される流体組成物である、請求項２０に記載の樹状細胞ワクチン。
【請求項２２】
医薬として使用するための、請求項１から１８に記載の樹状細胞組成物または請求項１９から２１に記載の樹状細胞ワクチン。
【請求項２３】
がんの治療に使用するための、請求項１から１８に記載の樹状細胞組成物または請求項１９から２１に記載の樹状細胞ワクチン。
【請求項２４】
黒色腫関連抗原に対する免疫応答を刺激する際に使用するための、請求項１から１８に記載の樹状細胞組成物または請求項１９から２１に記載の樹状細胞ワクチン。
【請求項２５】
前記黒色腫関連抗原がＭＥＬＡＮ−Ａである、請求項２４に記載の使用のための樹状細胞組成物または樹状細胞ワクチン。
【請求項２６】
ａ）
−  ヒトＥＲ移行シグナル配列、
−  エンドソーム／リソソームターゲティング配列を含むヒト膜貫通および細胞質ドメイン、ならびに
−  少なくとも１つの抗原またはその断片
を含む発現ベクター、ならびに
ｂ）少なくとも１つの抗原またはその断片を含むが、ＥＲ移行シグナル配列ならびにエンドソーム／リソソームターゲティング配列を含むヒト膜貫通および細胞質ドメインを欠いている発現ベクター
を含む組成物であって、
前記ａ)発現ベクターにおける抗原と前記ｂ)発現ベクターにおける抗原とが同じ抗原である、前記組成物。
【請求項２７】
ａ）
−  ヒトＥＲ移行シグナル配列、
−  エンドソーム／リソソームターゲティング配列を含むヒト膜貫通および細胞質ドメイン、ならびに
−  少なくとも１つの抗原またはその断片
を含む発現ベクター、ならびに
ｂ）少なくとも１つの抗原またはその断片を含むが、ＥＲ移行シグナル配列ならびにエンドソーム／リソソームターゲティング配列を含むヒト膜貫通および細胞質ドメインを欠いている発現ベクター
を含むキットであって、
前記ａ)発現ベクターにおける抗原と前記ｂ)発現ベクターにおける抗原とが同じ抗原である、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、樹状細胞組成物を企図する。樹状細胞組成物は、抗原またはその断片のＭＨＣＩＩ提示を得るために抗原またはその断片と融合したＭＨＣクラス−ＩＩターゲティングシグナルを利用する。特に、本発明は、抗原またはその断片と融合したＭＨＣクラス−ＩＩターゲティングシグナルを発現する樹状細胞を含む樹状細胞ワクチンを指す。黒色腫関連抗原に対する免疫応答を刺激するための樹状細胞ワクチンも記載される。
【背景技術】
【０００２】
樹状細胞は、それらが、Ｔ細胞媒介性免疫の発生の間にナイーブＴ細胞を効果的にプライミングでき、適応免疫応答を刺激できるために、免疫療法において非常に有効な薬剤となる。樹状細胞は、病原体に対抗するだけでなく、悪性細胞にも対抗する免疫応答を活性化する能力を有する。ｉｎ  ｖｉｖｏで、未成熟または中間段階の樹状細胞は、抗原を捕捉し、プロセシングするために末梢組織をパトロールする。局所サイトカインおよび危険シグナルの影響下で、樹状細胞は複雑な成熟プロセスを受け、所属リンパ節に移動し、そこでそれらはＴ細胞と共に免疫学的シナプスを形成し、ＭＨＣクラス−Ｉまたは−ＩＩ分子と関連して、収集した抗原に由来するペプチドを提示する。ＣＤ４＋Ｔ細胞活性化はＭＨＣ−ＩＩ複合体結合に依存するが、ＣＤ８＋相互作用はＭＨＣＩ結合に依存する。
【０００３】
樹状細胞ライセンスモデルは、樹状細胞が共刺激シグナルを提供できるようにする相互作用媒介性活性化によってＣＤ８＋Ｔ細胞に対する間接的なＣＤ４＋Ｔ細胞の援助を表している。したがって、腫瘍に対する効果的な免疫応答のために、ＣＤ４＋Ｔ細胞の援助は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖および記憶生成のためのそれらの重要な役割についてますます知られるようになっているので、欠くことのできない役割を獲得している。さらに、腫瘍抗原は、大部分が、病原性抗原（例えば、ＰＡＭＰ：病原体関連分子パターン）のような「危険シグナル」を与えない自己抗原であるので、ＣＤ４＋Ｔ細胞の援助はＣＤ８＋Ｔ細胞記憶の誘発のために不可欠である。
【０００４】
結果として、患者の免疫系が患者独自の腫瘍細胞を攻撃でき、長く続く免疫を構築できることを促進する改善された樹状細胞ワクチンが必要とされる。ワクチンが、Ｔ細胞のより多くの増殖を誘発し、Ｔ細胞の活性化誘発性ＩＦＮγ分泌およびＴ細胞のより高度な腫瘍死滅能力を増強することが望まれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、本発明の目的は、ＭＨＣＩＩ複合体上で抗原の提示を可能にする進化した樹状細胞ワクチンを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、本発明の第１の態様は、
−  少なくとも１つの抗原またはその断片、
−  抗原のＮ末端の前の小胞体（ＥＲ）移行シグナル配列、ならびに
−  抗原のＣ末端の後のエンドソーム／リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメイン
を含む少なくとも１つの融合タンパク質を発現する樹状細胞を含む樹状細胞組成物を企図する。
【０００７】
さらに、改善された免疫応答のための抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のさらなる刺激が望まれる。
【０００８】
したがって、好ましい実施形態において、樹状細胞組成物は、少なくとも１つの抗原またはその断片を発現する樹状細胞をさらに含み、抗原は、抗原またはその断片のＭＨＣＩＩ提示を促進するターゲティングシグナル配列と融合していない。
【０００９】
典型的に、ＭＨＣＩＩ提示を促進するターゲティングシグナル配列は、
−  抗原のＮ末端の前の小胞体（ＥＲ）移行シグナル配列、ならびに
−  抗原のＣ末端の後のエンドソーム／リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメイン
からなる群から選択される少なくとも１つである。
【００１０】
通常、融合タンパク質および抗原（これはターゲティングシグナル配列と融合していない）は、一過性または安定に発現され、好ましくは安定に発現される。例えば、一過性発現はｉｖｔ−ＲＮＡを導入することによって実施され得る。
【００１１】
いくつかの実施形態において、エンドソーム／リソソームターゲティング配列はＤＣ−ＬＡＭＰに由来する。好ましくは、エンドソーム／リソソームターゲティング配列はヒトである。一実施形態は本明細書に記載される樹状細胞組成物を指し、エンドソーム／リソソームターゲティング配列は配列番号３の配列またはその断片を含む。特定の実施形態において、エンドソーム／リソソームターゲティング配列は配列番号１４の配列またはその断片を含む。
【００１２】
ＥＲ移行シグナル配列はエンドソーム／リソソーム関連タンパク質に由来してもよい。好ましくは、ＥＲ移行シグナル配列はＬＡＭＰ１に由来する。より好ましくは、ＥＲ移行シグナル配列は配列番号１の配列またはその断片を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態において、樹状細胞は、以下のステップ：
（ｉ）単球の準備、
（ｉｉ）ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦとのステップｉ）の単球のインキュベーション、
（ｉｉｉ）成熟カクテルと組み合わせたＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦとのステップｉｉ）の単球のインキュベーション
を含む方法によって生成された成熟樹状細胞である。
【００１４】
例えば、成熟カクテルは、ＩＬ−β、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＴＬＲ７／８アゴニスト、ＰＧＥ２およびＴＬＲ３アゴニストの組合せを含む。ステップｉｉ）のインキュベーションは少なくとも２日継続してもよい。ステップｉｉｉ）のインキュベーションは、少なくとも１２時間、好ましくは２４時間継続してもよい。好ましくは、ＴＬＲ７／８アゴニストはＲ８４８であり、ＴＬＲ３アゴニストはポリ（Ｉ：Ｃ）である。
【００１５】
特定の実施形態において、抗原はＭＥＬＡＮ−Ａである。
【００１６】
本発明の別の態様は、本明細書に記載される樹状細胞組成物を含む樹状細胞ワクチンを指す。好ましくは、樹状細胞は自己細胞である。
【００１７】
典型的に、樹状細胞組成物および樹状細胞ワクチンは薬学的に許容される流体組成物である。
【００１８】
本発明の別の態様は、医薬として使用するための本発明による樹状細胞組成物または本発明による樹状細胞ワクチンを指す。
【００１９】
本発明の一実施形態は、がんの治療に使用するための本明細書に記載される樹状細胞ワクチンを指す。
【００２０】
特定の実施形態は、黒色腫関連抗原に対する免疫応答を刺激する際に使用するための本発明による樹状細胞組成物または樹状細胞ワクチンを指す。特定の実施形態において、黒色腫関連抗原はＭＥＬＡＮ−Ａである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ワクチン接種手順の実験概要を示す図である。１日目に、４つの異なる群に分けた１６匹のマウスの各々に、健常なＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性ドナー由来の１０×１０６個のヒトＰＢＭＣを移植した。末梢Ｔ細胞レパートリーを次の１４日以内に再構成した。ワクチン接種を１４日目および２１日目に適用し、従来のｉｖｔ−ＲＮＡ（２）またはＣｒｏｓｓＴＡｇ−ｉｖｔ−ＲＮＡ（３）のいずれかをトランスフェクトした１×１０６個の成熟樹状細胞を投与した。さらに、１つの群は、ＣｒｏｓｓＴＡｇ−または従来のｉｖｔ−ＲＮＡ（４）のいずれかをトランスフェクトした成熟樹状細胞の１：１の混合物を受けた。対照群はワクチン接種しなかった（１）。２８日目に、脾臓細胞を単離し、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１−Ｍｅｌａｎ−Ａ特異的多量体を使用した多量体染色によってＭｅｌａｎ−Ａ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞をスクリーニングした。残存脾臓細胞を適切な樹状細胞によりｉｎ  ｖｉｔｏｒｏで再刺激し、さらに１０日間増殖させた。対照群から単離した脾臓細胞は、さらなるｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養のためにヒトＩＬ−２のみを受けた。Ｍｅｌａｎ−Ａ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の定量化ならびにＩＦＮ−γ分泌アッセイおよび細胞傷害性アッセイのような機能性試験を３８日目に行った。
【図２】樹状細胞の成熟化およびエレクトロポレーションを示す図である。１４日目（１．ワクチン接種）および２１日目（２．ワクチン接種）にワクチン接種のために使用した成熟樹状細胞は、後でＩＬ−β、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＴＬＲ７／８アゴニストＲ８４８、ＰＧＥ２およびＴＬＲ３を含む３ｄ  ＤＣプロトコールに従って成熟した健常なＨＬＡ−Ａ＊０２：０１献血者由来の単球の単離によって生成した。（Ａ）成熟状態を検証するために、樹状細胞を、成熟（ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＣＲ７、ＣＤ２０９およびＨＬＡ−ＤＲ）または未成熟（ＣＤ１４）細胞のいずれかに特異的な異なる表面マーカーと結合するモノクローナル抗体により染色し、ＦＡＣＳ分析によって分析した。アイソタイプ対照抗体を陰性対照として与えた。（Ｂ）投与前に、成熟樹状細胞に、ＣｒｏｓｓＴＡｇ−Ｍｅｌａｎ−Ａ−または従来のＭｅｌａｎ−Ａ−ｉｖｔ−ＲＮＡのいずれかをトランスフェクトした。６時間のインキュベーション後、Ｍｅｌａｎ−Ａ発現を、Ｍｅｌａｎ−Ａタンパク質の細胞内染色（ＡＰＣ）によって実証した。
【図３】単離したｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させた脾細胞の多量体染色を示す図である。（Ａ）多量体染色の概略図：ＭＨＣ分子（ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１）を連結し、蛍光マーカー（フィコエリトリン（phycoerythrine）、ＰＥ）によって標識化した。異なるＤＣワクチンの誘発効率の比較のために、ＣＤ８−および多量体−二重陽性細胞を考慮に入れた。脾臓集団におけるＭｅｌａｎ−Ａ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数を、（Ｂ）ｅｘ  ｖｉｖｏで、ならびに（Ｃ）対応する樹状細胞およびＩＬ−２（対照群はＩＬ−２のみで処理した）とさらに１０日間、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させた後に測定した。細胞をＣＤ８についてＨＬＡ−Ａ＊０２：０１−Ｍｅｌａｎ−Ａ−多量体およびモノクローナル抗体により染色した。各グラフは、例示的な実験において各ＮＳＧレシピエント由来のＭｅｌａｎ−Ａ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージをまとめている。１回の実験につき合計１６匹のマウスで３回の個別の実験を分析した。
【図４】Ｍｅｌａｎ−Ａ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞によるサイトカイン分泌の能力を示す図である。（Ａ）Ｍｅｌａｎ−Ａ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の反応性を、脾細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの再刺激の１０日後、ＩＦＮ−γ分泌によって調べた。増殖させた脾細胞を標的細胞と１：１の比で２４時間共培養した。適用した標的細胞は、Ｍｅｌａｎ−Ａ−ペプチドと２時間インキュベートした、またはインキュベートしていないＫ５６２細胞（ＭＨＣ−Ｉおよび−ＩＩ陰性）、Ｋ５６２−Ａ２（ＨＬＡ−Ａ０２：０１＋）およびＭｅｌ６２４．３８（ＨＬＡ−Ａ０２：０１＋、Ｍｅｌａｎ−Ａ＋）であった。ＩＦＮ−γスポットの数をＥＬＩＳｐｏｔリーダー（Ｃ．Ｔ．Ｌ．）により検出した。グラフに示した全てのデータ点は、１匹のマウスに由来する活性化Ｔ細胞からのＦＮ−ｇスポットの数を表す。各実験において合計１６匹のマウスで３回の個別の実験を分析した（１つの例示的な実験を示す）。（Ｂ）標的細胞系Ｍｅｌ６２４．３８上でのＭＨＣ−Ｉおよび−ＩＩ発現を、モノクローナルｐａｎＭＨＣ−ＩまたはｐａｎＭＨＣ−ＩＩ抗体を使用して分析した。ミニエプスタイン・バール・ウイルス（Mini-Epstein-Barr virus）（ＥＢＶ）形質転換リンパ芽球様細胞系（ｍＬＣＬ）を陽性対照として与え、非染色細胞は陰性対照としての役割を果たした。
【図５】増殖させた脾細胞の死滅能力を示す図である。標的細胞を、細胞が溶解した場合、上清中で検出され得る放射性クロムにより標識化した。異なる腫瘍細胞系を標的細胞として使用した。増殖させた脾細胞を、異なる比（脾細胞：ＡＰＣ＝８０：１；４０：１；２０：１；１０：１）で標的細胞と４時間共培養し、その後、上清中に遊離した放射性クロムを測定した。種々の標的細胞を適用して脾細胞集団内のＮＫ細胞活性を想定した：Ｋ５６２（ＭＨＣ−Ｉ−／−ＩＩ−）を選択した。陽性対照として、Ｍｅｌａｎ−Ａ−ペプチドを負荷したＫ５６２−Ａ２（Ｍｅｌａｎ−Ａ−、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１＋）またはＭｅｌ６２４．３８（ＭｅｌａｎＡ＋、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１＋）を使用した。ＭｅｌＡ３７５（ＭｅｌａｎＡ−、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１＋）を陰性対照として与えた。グラフに示した全てのデータ点は、２つの測定値から算出した標準偏差と共に示した平均値を表す。各実験において合計１６匹のマウスで３回の個別の実験を分析した（１つの例示的な実験を示す）。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明をその好ましい実施形態のいくつかに対して詳細に記載する前に、以下の一般的定義を提供する。
【００２３】
以下に例示的に記載される本発明は、適切には、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素（複数も含む）、制限（複数も含む）の不在下で実施されてもよい。
【００２４】
本発明は、特定の実施形態に対して、および特定の図面を参照して記載されるが、本発明はそれらによって限定されず、請求項によってのみ限定される。
【００２５】
「含む」という用語が本説明および請求項に使用される場合、それは他の要素を排除しない。本発明の目的のために、「からなる」という用語は、「構成する」という用語の好ましい実施形態であるとみなされる。本明細書以下において、グループが少なくとも特定の数の実施形態を含むと定義される場合、これは、好ましくはこれらの実施形態のみからなるグループを開示することが理解され得る。
【００２６】
不定または定冠詞が単数名詞、例えば「一つの（a）」、「一つの（an）」または「その」を参照して使用される場合、これは、何か他のことが明確に述べられない限り、複数のその名詞を含む。
【００２７】
本明細書に使用される場合、「発現」という用語は、ポリペプチドが遺伝子の核酸配列に基づいて産生されるプロセスを指す。したがって、「発現された」タンパク質またはポリペプチドという用語は、限定されないが、細胞内、膜貫通および分泌タンパク質またはポリペプチドを含む。
【００２８】
専門用語はそれらの一般的な意味によって使用される。特定の意味が特定の用語に伝えられる場合、用語の定義は、以下においてその用語が使用される文脈において与えられる。
【００２９】
本発明の一態様は、抗原またはその断片を発現する樹状細胞を含む樹状細胞組成物であって、抗原またはその断片は、抗原またはその断片のＭＨＣＩＩ提示を促進するターゲティングシグナル配列と融合している、樹状細胞組成物を指す。
【００３０】
より具体的には、本発明は、
−  少なくとも１つの抗原またはその断片、
−  抗原またはその断片のＮ末端の前の小胞体（ＥＲ）移行シグナル配列、ならびに
−  抗原またはその断片のＣ末端の後のエンドソーム／リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメイン
を含む少なくとも１つの融合タンパク質を発現する樹状細胞を含む樹状細胞組成物を指す。
【００３１】
断片は、この抗原に特異的である抗原の配列であってもよく、すなわち哺乳動物、特にヒトの別のタンパク質またはペプチドに存在しない。断片は抗原の配列より短くてもよく、例えば抗原より少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％短い。断片は、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５またはそれより多いアミノ酸の長さを有してもよい。
【００３２】
ターゲティングシグナル配列と融合した抗原を発現する樹状細胞を含む樹状細胞組成物の投与により、ターゲティングシグナル配列と融合していない従来の抗原を発現する樹状細胞を含む樹状細胞組成物の投与と比較して抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加が引き起こされる。したがって、ターゲティングシグナル配列と融合した抗原を発現する樹状細胞は、ターゲティングシグナル配列と融合していない従来の抗原のみを発現する樹状細胞と比較して優れた誘発能力、刺激時のＩＦＮ−γ分泌の改善された能力および高い死滅能力を提供する。
【００３３】
特定の実施形態において、樹状細胞組成物は、少なくとも１つの抗原またはその断片を発現する樹状細胞をさらに含み、抗原は、抗原またはその断片のＭＨＣＩＩ提示を促進するターゲティングシグナル配列と融合していない。
【００３４】
そのことは、樹状細胞組成物が、（ｉ）抗原またはその断片のＭＨＣＩＩ提示を促進するターゲティングシグナル配列と融合している少なくとも１つの抗原を発現する樹状細胞および（ｉｉ）抗原またはその断片のＭＨＣＩＩ提示を促進するターゲティングシグナル配列と融合していない少なくとも１つの抗原またはその断片を発現する樹状細胞を含むことを意味する。
【００３５】
換言すれば、本発明は、
（ｉ）
−  少なくとも１つの抗原またはその断片、
−  抗原またはその断片のＮ末端の前の小胞体（ＥＲ）移行シグナル配列、ならびに
−  抗原またはその断片のＣ末端の後のエンドソーム／リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメイン
を含む少なくとも１つの融合タンパク質を発現する樹状細胞、ならびに
（ｉｉ）
−  抗原またはその断片のＮ末端の前の小胞体（ＥＲ）移行シグナル配列、ならびに
−  抗原またはその断片のＣ末端の後のエンドソーム／リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメイン
を有さない少なくとも１つの抗原またはその断片を発現する樹状細胞
を含む樹状細胞組成物を指す。
【００３６】
好ましい実施形態において、（ｉ）および（ｉｉ）の抗原は同じ抗原である。例えば、このことは、本発明の特定の実施形態が、
（ｉ）
−  ＭＥＬＡＮ−Ａ抗原またはその断片、
−  ＭＥＬＡＮ−Ａ抗原またはその断片のＮ末端の前の小胞体（ＥＲ）移行シグナル配列、ならびに
−  ＭＥＬＡＮ−Ａ抗原またはその断片のＣ末端の後のエンドソーム／リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメイン
を含む少なくとも１つの融合タンパク質を発現する樹状細胞、ならびに
（ｉｉ）
−  ＭＥＬＡＮ−Ａ抗原またはその断片のＮ末端の前の小胞体（ＥＲ）移行シグナル配列、ならびに
−  ＭＥＬＡＮ−Ａ抗原またはその断片のＣ末端の後のエンドソーム／リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメイン
を有さないＭＥＬＡＮ−Ａ抗原またはその断片を発現する樹状細胞
を含む樹状細胞組成物を指すことを意味する。
【００３７】
ターゲティングシグナル配列と融合した抗原を発現する樹状細胞およびターゲティングシグナル配列と融合していない抗原を発現する樹状細胞の混合物の投与により、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加が引き起こされる。したがって、前記混合物は、ターゲティングシグナル配列と融合していない抗原のみを発現する樹状細胞またはターゲティングシグナル配列と融合した抗原のみを発現する樹状細胞と比較して優れた誘発能力を提供する。混合物はまた、刺激時のＩＦＮ−γ分泌の高い能力および高い死滅能力を示した。
【００３８】
ＭＨＣＩＩ提示を促進するターゲティングシグナル配列と融合した、または融合していない抗原は、例えば、一過性発現または安定発現によって樹状細胞内に導入され得る。換言すれば、ＭＨＣＩＩ提示を促進するターゲティングシグナル配列と融合した、または融合していない抗原の発現は、一過性発現または安定発現であってもよい。好ましい実施形態において、発現は、例えば、少なくとも１つの融合タンパク質をコードするｉｖｔ−ＲＮＡを導入することによる一過性発現である。ｉｖｔ−ＲＮＡの発現は、品質管理されたｉｖｔ−ＲＮＡを迅速に産生することができ、免疫原性タンパク質夾雑物を保有しないという点で有益である。
【００３９】
ＥＲ移行シグナル配列はエンドソーム／リソソーム関連タンパク質に由来してもよい。
【００４０】
開示された方法に使用されるＥＲ移行シグナル配列は、エンドソーム／リソソーム局在タンパク質の選別配列であってもよい。本明細書に使用される場合、エンドソーム／リソソーム局在タンパク質とは、細胞のエンドソームおよび／またはリソソームの膜または管腔に局在するタンパク質を指す。
【００４１】
エンドソームまたはリソソーム局在タンパク質の例は、アルファ−ガラクトシダーゼＡ／ＧＬＡ、エンド−ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨ／Ｅｎｄｏ  Ｈ、アルファ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ／ＮＡＧＡ、ガラクトシルセラミダーゼ／ＧＡＬＣ、アルファ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ／ＮＡＧＬＵ、グルコシルセラミダーゼ／ＧＢＡ、アルファ−ガラクトシダーゼ／ａ−Ｇａｌ、ヘパラナーゼ／ＨＰＳＥ、アルファ−Ｌ−フコシダーゼ、ヘパリナーゼＩ、組織アルファ−Ｌ−フコシダーゼ／ＦＵＣＡ１、ヘパリナーゼＩＩ、ベータ−ガラクトシダーゼ−１／ＧＬＢ１、ヘパリナーゼＩＩＩ、ベータ−グルクロニダーゼ／ＧＵＳＢ、ヘキソサミニダーゼＡ／ＨＥＸＡ、ベータ（１−３）−ガラクトシダーゼ、ヒアルロナンリアーゼ、ベータ（１−４）−ガラクトシダーゼ、ヒアルロニダーゼ１／ＨＹＡＬ１、キチナーゼ３様１、ヒアルロニダーゼ４／ＨＹＡＬ４、キチナーゼ３様２、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ／ＩＤＵＡ、キチナーゼ３様３／ＥＣＦ−Ｌ、キトビアーゼ／ＣＴＢＳ、キトトリオシダーゼ／ＣＨＩＴ１、ラクターゼ様タンパク質／ＬＣＴＬ、コンドロイチンＢリアーゼ／コンドロイチナーゼＢ、リソソームアルファ−グルコシダーゼ、コンドロイチナーゼＡＢＣ、ＭＢＤ４、コンドロイチナーゼＡＣ、ＮＥＵ−１／シアリダーゼ−１、細胞質ベータ−グルコシダーゼ／ＧＢＡ３、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅ／ＯＧＡ、エンド−ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＦ１／Ｅｎｄｏ  Ｆ１、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ、エンド−ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＦ３／Ｅｎｄｏ  Ｆ３、ＳＰＡＭ１などのグリコシダーゼ；ＡＭＳＨ／ＳＴＡＭＢＰ、カテプシンＨ、カテプシン３、カテプシンＫ、カテプシン６、カテプシンＬ、カテプシン７／カテプシン１、カテプシンＯ、カテプシンＡ／リソソームカルボキシペプチダーゼＡ、カテプシンＳ、カテプシンＢ、カテプシンＶ、カテプシンＣ／ＤＰＰＩ、カテプシンＸ／Ｚ／Ｐ、カテプシンＤ、ガラクトシルセラミダーゼ／ＧＡＬＣ、カテプシンＦ、オエグマイン（oegumain）／アスパラギニルエンドペプチダーゼなどのリソソームプロテアーゼ；アリールスルファターゼＡ／ＡＲＳＡ、イズロン酸−２−スルファターゼ／ＩＤＳ、アリールスルファターゼＢ／ＡＲＳＢ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ／ＧＡＬＮＳｖ、アリールスルファターゼＧ／ＡＲＳＧ、スルファミダーゼ／ＳＧＳＨ、グルコサミン（Ｎ−アセチル）−６−スルファターゼ／ＧＮＳ、スルファターゼ−２／ＳＵＬＦ２などのスルファターゼ；またはＢＡＤ−ＬＡＭＰ／ＬＡＭＰ５などの他のリソソームタンパク質；ヒアルロニダーゼ１／ＨＹＡＬ１；ＣＤ６３；ＬＡＭＰ１／ＣＤ１０７ａ；ＣＤ−Ｍ６ＰＲ；ＬＡＭＰ２／ＣＤ１０７ｂ；クラスリン重鎖１／ＣＨＣ１７；Ｒａｂ２７ａ；クラスリン重鎖２／ＣＨＣ２２；ＵＮＣ１３Ｄ、ＣＤ６８、ＣＤ１ｂまたはＤＣ−ＬＡＭＰである。
【００４２】
ＥＲ移行シグナル配列はエンドソーム／リソソーム関連タンパク質に由来してもよい。エンドソーム／リソソーム関連タンパク質は、ＬＡＭＰ１、ＬＡＭＰ２、ＤＣ−ＬＡＭＰ、ＣＤ６８またはＣＤ１ｂ、好ましくはＬＡＭＰ１であってもよい。好ましくは、ＥＲ移行シグナルはヒトである。ＥＲ移行シグナル配列は、配列番号１、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２のうちの少なくとも１つの配列を含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＥＲ移行シグナル配列は、配列番号２、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３からなる群から選択される配列のうちの少なくとも１つの配列を含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＥＲ移行シグナル配列は、配列番号２、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３からなる群から選択される配列のうちの１つからなってもよい。特定の実施形態において、ＥＲ移行シグナル配列は配列番号１の配列またはその断片を含む。より特定の実施形態において、ＥＲ移行シグナル配列は配列番号２の配列からなる。
【００４３】
エンドソーム／リソソームターゲティング配列は、ＬＡＭＰ１またはＤＣ−ＬＡＭＰ、好ましくはＤＣ−ＬＡＭＰに由来してもよい。エンドソーム／リソソームターゲティング配列は典型的に膜貫通および細胞質ドメインの一部である。したがって、エンドソーム／リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインは、ＬＡＭＰ１またはＤＣ−ＬＡＭＰ、好ましくはＤＣ−ＬＡＭＰに由来してもよい。好ましくは、エンドソーム／リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインはヒトである。典型的に、エンドソーム／リソソームターゲティング配列は、モチーフＹ−ＸＸ、続いて疎水性アミノ酸（配列番号４）を含む。好ましくは、エンドソーム／リソソームターゲティングシグナル配列はＹＱＲＩ（配列番号５）である。例えば、エンドソーム／リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインは、配列番号１４の配列またはその断片を含んでもよい。
【００４４】
疎水性アミノ酸という用語は当業者に周知である。疎水性アミノ酸についての例は、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ｃｙｓである。
【００４５】
樹状細胞は抗原提示細胞の異なる集団を含んでもよく、各集団は異なる抗原融合タンパク質を発現する。
【００４６】
典型的に、樹状細胞は、以下のステップ：ｉ）単球の準備、ｉｉ）ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦとのステップｉ）の単球のインキュベーション、ｉｉｉ）成熟カクテルと組み合わせたＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦとのステップｉｉ）の単球のインキュベーション
を含む方法によって生成された成熟樹状細胞である。
【００４７】
成熟カクテルは、ＩＬ−β、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＴＬＲ７／８アゴニスト、ＰＧＥ２およびＴＬＲ３アゴニストまたはそれらの組合せからなる群から選択される化合物のうちの少なくとも１つを含んでもよい。ＴＬＲ７／８アゴニストはＲ８４８またはＣＬ０７５であってもよい。ＴＬＲ３アゴニストはポリ（Ｉ：Ｃ）であってもよい。例えば、成熟カクテルは、ＩＦＮ−γ、ＴＬＲ７／８アゴニスト、ＰＧＥ２およびＴＬＲ３アゴニストの組合せなどの、ＩＦＮ−γ、ＴＬＲ７／８アゴニスト、ＰＧＥ２の組合せを含んでもよい。特定の実施形態において、成熟カクテルは、ＩＬ−β、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＴＬＲ７／８アゴニストおよびＰＧＥ２の組合せを含んでもよい。別の特定の実施形態において、成熟カクテルは、ＩＬ−β、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＴＬＲ７／８アゴニスト、ＰＧＥ２およびＴＬＲ３アゴニストの組合せを含んでもよい。本発明はまた、本明細書に記載される成熟カクテルに関する。さらに、本発明はまた、本明細書に記載される成熟カクテルにより少なくとも１つの未成熟樹状細胞を刺激するステップを含む、少なくとも１つの未成熟樹状細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの成熟化に関する。
【００４８】
ステップｉｉ）のインキュベーションは少なくとも２日間継続してもよい。ステップｉｉｉ）のインキュベーションは、少なくとも１２時間、好ましくは２４時間継続してもよい。
【００４９】
典型的に、抗原は腫瘍抗原またはウイルス抗原である。腫瘍抗原は、ウイルス腫瘍抗原、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原および患者特異的突然変異を保有し、患者の腫瘍細胞において発現される抗原からなる群から選択されてもよい。好ましくは、患者特異的突然変異を保有し、患者の腫瘍細胞において発現される抗原は、患者の非がん性細胞において発現されない。
【００５０】
発がんウイルス抗原とも呼ばれるウイルス腫瘍抗原は、発がんＤＮＡウイルスなどの発がんウイルス、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス、ヘルペスウイルスなどのウイルス、ならびにパピローマウイルスおよび発がんＲＮＡウイルスの抗原である。腫瘍特異的抗原とは、腫瘍細胞によってのみ発現される腫瘍関連突然変異を指す。腫瘍関連抗原の群は、例えば、組織特異的がん／精巣抗原またはＭＡＲＴ−１（ＭＥＬＡＮ−Ａ）、チロシナーゼもしくはＣＤ２０などの組織分化抗原を含む。腫瘍抗原は腫瘍関連抗原であってもよく、任意選択で腫瘍関連抗原はがん／精巣抗原（Ｃ／Ｔ抗原）である。Ｃ／Ｔ抗原は、ＭＡＧＥファミリーメンバー、例えばＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、これらに限定されないが、単一点突然変異、ＮＹ−ＥＳＯ１、腫瘍／精巣抗原１Ｂ、ＧＡＧＥ−１、ＳＳＸ−４、ＸＡＧＥ−１、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＳＣＰ−１、ＳＳＸ−２、ＳＳＸ−４、ＣＴＺ９、ＣＴ１０、ＳＡＧＥおよびＣＡＧＥを含む腫瘍抗原を含む群から選択されてもよい。好ましくは、腫瘍抗原は、ＭＡＲＴ−１、チロシナーゼまたはＣＤ２０などの組織分化抗原である。
【００５１】
より好ましくは、腫瘍抗原は、ＭＥＬＡＮ−Ａとしても知られているＭＡＲＴ−１である。したがって、特定の実施形態において、本発明は、
−  少なくとも１つの抗原またはその断片、
−  抗原またはその断片のＮ末端の前の小胞体（ＥＲ）移行シグナル配列、ならびに
−  抗原またはその断片のＣ末端の後のエンドソーム／リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメイン
を含む少なくとも１つの融合タンパク質を発現する樹状細胞を含む樹状細胞組成物であって、
融合タンパク質はＭＥＬＡＮ−Ａである、樹状細胞組成物を指す。
【００５２】
本発明の特定の実施形態は、少なくとも１つの抗原またはその断片を発現する樹状細胞を含む樹状細胞組成物であって、抗原は、抗原またはその断片のＭＨＣＩＩ提示を促進するターゲティングシグナル配列と融合しておらず、前記樹状細胞は抗原またはその断片を発現せず、抗原は、抗原またはその断片のＭＨＣＩＩ提示を促進するターゲティングシグナル配列と融合しており、抗原はＭＥＬＡＮ−Ａである、樹状細胞組成物を指す。
【００５３】
特定の実施形態において、樹状細胞組成物は、（ｉ）抗原またはその断片のＭＨＣＩＩ提示を促進するターゲティングシグナル配列と融合している少なくとも１つの抗原を発現する樹状細胞ならびに（ｉｉ）抗原またはその断片のＭＨＣＩＩ提示を促進するターゲティングシグナル配列と融合していない少なくとも１つの抗原またはその断片を発現する樹状細胞および樹状細胞を含み、抗原はＭＥＬＡＮ−Ａである。
【００５４】
したがって、本発明はまた、医薬として使用するための樹状細胞組成物を指す。医薬として使用するための樹状細胞ワクチンも企図される。
【００５５】
本発明の別の態様は、がんの治療に使用するための樹状細胞組成物を指す。特定の実施形態は、黒色腫関連抗原に対する免疫応答を刺激する際に使用するための樹状細胞組成物に関する。
【００５６】
本発明のさらなる態様は、がんの治療に使用するための樹状細胞ワクチンを指す。特定の実施形態は、黒色腫関連抗原に対する免疫応答を刺激する際に使用するための樹状細胞ワクチンに関する。
【００５７】
本発明の組成物による治療の活性化プロファイルは、例えば、活性化誘発性サイトカイン遊離または本発明の樹状細胞組成物が投与される生物から単離したＴ細胞の抗原指向性（antigen-directed）死滅能力を測定することによって決定され得る。
【００５８】
活性化誘発性サイトカイン分泌を測定するために、Ｔ細胞は抗原が負荷された樹状細胞と共培養されてもよい。異なるエフェクター細胞対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比が利用されてもよい。対照抗原提示、すなわち偽トランスフェクトＡＰＣと、または刺激細胞の不在下でインキュベートしたＴ細胞が陰性対照として使用されてもよい。培養上清を標準的な酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって評価する。マーカーについての例は、限定されないが、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＦＳ）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、ＩＬ−２およびＴＮＦ−α分泌である。抗原遭遇時のＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＴＮＦ−α分泌は増強した抗腫瘍機能と相関し、したがってＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞の抗原誘発性サイトカイン分泌を測定する場合特に有用である。さらに、ＩＦＮ−γおよび顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）極性Ｔ細胞クローンを評価するための明確に定義されたサイトカインである。
【００５９】
本発明の樹状細胞集団によって活性化されたＴ細胞の細胞障害活性は、例えばクロム遊離アッセイによって測定され得る。このようなアッセイにおいて、標的細胞は放射性クロムにより標識化され、Ｔ細胞に曝露される。死滅すると、放射性クロムは上清に遊離し、共培養の開始後４時間以内に検出可能になる。特定のクロム遊離は、エフェクター細胞の不在下で標的細胞をインキュベートすることによって評価される自然遊離に正規化される。したがって、上清中の多量のクロムは優れた細胞傷害性Ｔ細胞活性と相関する。クロム遊離アッセイは好ましくは腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞をスクリーニングするために実施される。
【００６０】
ドナー由来の抗原提示細胞は、例えば、樹状細胞に成熟する、単離された単球であってもよい。成熟した樹状細胞は最適な活性化能力を示す。
【００６１】
典型的に、樹状細胞は自己細胞、すなわち、本発明の教示に従って治療される患者から得られた細胞であり、次いで同じ患者に投与される。例えば、単球は患者から単離され、樹状細胞に成熟し、所望の抗原を発現するように本明細書に記載されるように処理され、次いで同じ患者に投与される。
【００６２】
本発明はまた、本明細書に記載される樹状細胞組成物を含む樹状細胞ワクチンを指す。
【００６３】
樹状細胞組成物のような本発明の活性成分は、好ましくは、疾患が治療または少なくとも軽減され得る、許容される担体または担体材料と混合された用量において、医薬組成物中に使用される。このような組成物は、（活性成分および担体に加えて）充填材料、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤および最先端の公知である他の材料を含んでもよい。
【００６４】
「薬学的に許容される」という用語は、活性成分、すなわち本発明の樹状細胞の生物活性の有効性を妨げない非毒性材料を定義する。担体の選択は用途に応じる。
【００６５】
医薬組成物は、活性成分の活性を増強するか、または治療を補うさらなる成分を含有してもよい。このようなさらなる成分および／または要因は、相乗効果を達成するか、または有害もしくは望ましくない作用を最小化するために医薬組成物の一部であってもよい。
【００６６】
本発明の活性成分の製剤化または調製のための技術および適用／薬剤は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」, Mack Publishing Co., Easton, PA、latest editionに公開されている。適切な適用は、非経口適用、例えば皮内、筋肉内、皮下、髄内（intramedular）注射および髄腔内、直接心室内、静脈内、節内（intranodal）、腹腔内または腫瘍内注射である。静脈内注射が患者の好ましい治療である。
【００６７】
医薬組成物は、注射可能な組成物、すなわち少なくとも１種の活性成分、例えば本発明の樹状細胞組成物を含む薬学的に許容される流体組成物であってもよい。活性成分は、通常、生理的に許容される担体中に溶解または懸濁され、組成物は、乳化剤、防腐剤、およびｐＨ緩衝剤などの、少量の１つまたは複数の非毒性補助物質をさらに含んでもよい。本開示の樹状細胞との使用に有用であるこのような注射可能な組成物は慣用されており、適切な製剤は当業者に周知である。
【００６８】
間接内（関節中）、静脈内、筋肉内、真皮内、皮内、腹腔内および皮下経路（好ましくは真皮内、節内（intranodal）、皮内または皮下）などによる非経口投与に適した製剤は、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤および製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含有してもよい水性等張滅菌注射溶液ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤および防腐剤を含んでもよい水性および非水性滅菌懸濁液を含む。真皮内、皮内、皮下または節内投与は本発明の樹状細胞のための好ましい投与方法である。
【００６９】
本発明の文脈において患者に投与される樹状細胞の用量は、経時的に患者において有益な治療応答をもたらすか、またはがん細胞の成長を阻害するか、または感染を阻害するのに十分であるべきである。したがって、細胞は、ウイルスもしくは腫瘍抗原に対して効果的なＣＴＬ応答を引き起こし、ならびに／または疾患もしくは感染からの症状および／もしくは合併症を軽減、低減、治癒もしくは少なくとも部分的に停止するのに十分な量で患者に投与される。これを達成するのに適した量は「治療的に有効な用量」と定義される。用量は産生された樹状細胞の活性および患者の状態によって決定される。用量の大きさはまた、特定の患者における特定の細胞の投与に伴って起こるあらゆる有害な副作用の存在、性質および程度によって決定される。がんなどの疾患の治療または予防において投与される細胞の有効な量を決定する際に、医師は、ＣＴＬ毒性、疾患の進行および任意の導入される細胞種に対する免疫応答の誘発を評価することを必要とする。
【００７０】
投与前に、血液試料が得られ、分析のために保存される。一般に、約１０４〜１０６個、より好ましくは１０６〜１０１０個の細胞が、皮内、節内、皮下または真皮内注射による単回投与または複数回投与の形態で７０ｋｇの患者に投与される。好ましくは、ワクチン接種ごとに少なくとも２＊１０６〜１０７個の細胞数が使用される。注射は４週の期間にわたって１週間に１回投与されてもよく、その後、１カ月ごとに１回の投与／注射であってもよく、好ましくはリンパ節付近、リンパ節に直接または真皮内、皮内もしくは皮下注射によって与えられるべきである。ブースター注射がさらに実施されてもよい。上記のように、細胞再注入が好ましくは、１年の期間において合計１０〜１２回の治療にわたって毎月反復される。最初の治療の後、注入は臨床医の判断に基づいて外来で実施されてもよい。再注入が外来として与えられる場合、参加者は療法後、少なくとも４時間モニターされる。
【００７１】
樹状細胞組成物／樹状細胞ワクチンは、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回投与されてもよい。ワクチンは、多くて１５回、１８回、２０回、２５回、３０回投与されてもよい。投与の間の間隔は、少なくとも３日、少なくとも７日、少なくとも１４日または少なくとも４週である。好ましくは、ワクチンは、４週の期間にわたって１週間に１回投与され、その後、合計１０〜１２回の治療にわたって毎月１回投与される。
【００７２】
投与に関して、本発明の細胞は、患者の体重および全体的な健康に適用されるように、細胞種類のＬＤ−５０（または他の毒性の尺度）および種々の濃度における細胞種類の副作用によって決定される割合で投与されてもよい。投与は単回または分割投与により達成されてもよい。本発明の細胞は、細胞傷害性薬剤、ヌクレオチド類似体および生体応答修飾物質を含む、公知の従来の療法による状態のための他の治療を補ってもよい。同様に、生物学的応答修飾物質は樹状細胞による治療のために任意選択で加えられる。
【００７３】
本発明はまた、
ａ）
−  ヒトＥＲ移行シグナル配列、
−  エンドソーム／リソソームターゲティング配列を含むヒト膜貫通および細胞質ドメイン、ならびに
−  少なくとも１つの抗原またはその断片
を含む発現ベクター、ならびに
ｂ）少なくとも１つの抗原またはその断片を含むが、エンドソーム／リソソームターゲティング配列を含むＥＲ移行シグナル配列ならびにヒト膜貫通および細胞質ドメインを欠いている発現ベクター
を含む組成物に関する。
【００７４】
本発明はさらに、
ａ）
−  ヒトＥＲ移行シグナル配列、
−  エンドソーム／リソソームターゲティング配列を含むヒト膜貫通および細胞質ドメイン、ならびに
−  少なくとも１つの抗原またはその断片
を含む発現ベクター、ならびに
ｂ）少なくとも１つの抗原またはその断片を含むが、ＥＲ移行シグナル配列ならびにエンドソーム／リソソームターゲティング配列を含むヒト膜貫通および細胞質ドメインを欠いている発現ベクター
を含むキットに関する。
【００７５】
「ベクター」は、コードされるポリペプチドの合成が行われ得る適切な宿主細胞内に核酸配列を保有する能力を有する任意の分子または組成物である。典型的におよび好ましくは、ベクターは、所望の核酸配列（例えば、本発明の核酸）を組み込むために当該技術分野において公知である組換えＤＮＡ技術を使用して操作されている核酸である。ベクターはＤＮＡもしくはＲＮＡを含んでもよく、および／またはリポソームを含んでもよい。ベクターは、プラスミド、シャトルベクター、ファージミド、コスミド、発現ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたは遺伝子療法に使用される粒子および／もしくはベクターであってもよい。ベクターは、複製起点などの、宿主細胞内で複製することができる核酸配列を含んでもよい。ベクターはまた、１つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子および当業者に公知の他の遺伝要素を含んでもよい。ベクターは、好ましくは、前記核酸の発現を可能にする配列に作動可能に連結している本発明による核酸を含む発現ベクターである。
【実施例】
【００７６】
１．１  ＮＳＧマウスモデルにおけるＭｅｌａｎ−Ａ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化
ｉｎ  ｖｉｖｏで本発明者らのＤＣワクチン接種を研究するためのヒト化マウスモデルを開発するために、本発明者らは、ヒトＰＢＭＣを異種移植したＮＯＤ−ｓｃｉｄ／Ｉｌ２ｒγ−／−（ＮＳＧ）マウスを使用した。ＮＳＧマウスは免疫不全（ＮＫ、ＴおよびＢ細胞を欠いている）であるので（SPRANGER, S. et al. 2012. NOD/scid IL-2Rg(null) mice: a preclinical model system to evaluate human dendritic cell-based vaccine strategies in vivo. J Transl Med, 10, 30.）、免疫細胞集団における得られたニッチはヒトＰＢＭＣとの非常に有効な生着を可能にする（SHULTZ, et al. 2007. Humanized mice in translational biomedical research. Nat Rev Immunol, 7, 118-30.）。
【００７７】
１６匹のＮＳＧレシピエントマウスを４つの群に分け、１４日にわたってヒトＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  ＰＢＭＣを異種移植した。異なる群におけるマウスのワクチン接種は、注射の間、１週間間隔で２回与えた、ＣｒｏｓｓＴＡｇ−Ｍｅｌａｎ−Ａ−ｉｖｔ−ＲＮＡ、従来のＭｅｌａｎ−Ａ−ｉｖｔ−ＲＮＡまたは混合したｉｖｔ−ＲＮＡのいずれかをエレクトロポレートした新たに調製した自己成熟樹状細胞の２回の静脈内注射からなった。さらに７日後、および次のｉｎ  ｖｉｔｒｏ再刺激後、脾臓集団をＦＡＣＳによって分析してＭｅｌａｎ−Ａ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を数え上げた。４つの群全てのＭｅｌａｎ−Ａ特異的Ｔ細胞の細胞障害性およびＩＦＮ−γを分泌する能力も、クロム遊離およびＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって分析した（図１）。
【００７８】
１．２  トランスフェクト成熟樹状細胞の成熟状態およびＭｅｌａｎ−Ａ発現
健常なＨＬＡ−Ａ＊０２：０１ドナーに由来する単球を単離し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで３日以内にＳｐｒａｎｇｅｒら（2010. Generation of Th1-polarizing dendritic cells using the TLR7/8 agonist CL075. J Immunol, 185, 738-47）に記載されているように成熟化した。ｉｎ  ｖｉｖｏでのヒト化マウスへの後の投与のための樹状細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの成熟化を検証するために、本発明者らは、ＦＡＣＳ分析によって典型的に未成熟樹状細胞および成熟樹状細胞上で発現される細胞表面分子の発現を決定した（Burdek et al. 2010. Three-day dendritic cells for vaccine development: antigen uptake, processing and presentation. J Transl Med, 8, 90）。分析した樹状細胞は成熟表現型を発現した（図２Ａ）。成熟樹状細胞に、成熟３ｄ樹状細胞についてのエレクトロポレーション条件に従ってＣｒｏｓｓＴＡｇ−Ｍｅｌａｎ−Ａ−または従来のＭｅｌａｎ−Ａ−ｉｖｔ−ＲＮＡのいずれかをトランスフェクトした（Burdek et al., 2010）。トランスフェクション効率を、モノクローナル抗体によるＭｅｌａｎ−Ａタンパク質の細胞内染色によって調べた（エレクトロポレーションの６時間後）（図２Ｂ）。
【００７９】
１．３  Ｍｅｌａｎ−Ａ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の定量化
再構成したマウスに、１週間間隔で２回ワクチン接種し、その後、脾臓細胞を単離し、分析した。異なるＤＣワクチンの誘発効率を比較するために、Ｍｅｌａｎ−Ａ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数を、Ｍｅｌａｎ−Ａ−エピトープを負荷した蛍光標識化ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１多量体によって検出した（図３Ａ）。脾臓細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ分析により、従来のＤＣ群と比較してＣｒｏｓｓＴＡｇ−ＤＣ群または混合した群において、より多くの数のＭｅｌａｎ−Ａ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が既に明らかになり、これにより、対照群と比較してわずかに多くの数の特異的細胞のみが示された。さらに、本発明者らは、従来の群と比較してＣｒｏｓｓＴＡｇ群において顕著に高いパーセンテージのＣＤ８＋Ｔ細胞を検出した（図３Ｂ）。続いて、残存脾細胞を、Ｍｅｌａｎ−Ａトランスフェクト樹状細胞およびｈＩＬ−２によってｉｎ  ｖｉｔｒｏでさらに増殖させ、一方、対照群はｈＩＬ−２により処理しただけであった。増殖させた細胞の再分析により、Ｍｅｌａｎ−Ａ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の平均数に関してＣｒｏｓｓＴＡｇ−Ｍｅｌａｎ−Ａ含有樹状細胞と従来のＭｅｌａｎ−Ａ樹状細胞との間のさらにより明らかな相違が実証された。顕著に多くの数のＭｅｌａｎ−Ａ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を、従来の群と比較してＣｒｏｓｓＴＡｇ群において見ることができる（図３Ｃ）。このように、ＣｒｏｓｓＴＡｇ−Ｍｅｌａｎ−Ａ−ｉｖｔ−ＲＮＡを負荷した樹状細胞によるワクチン接種により、Ｍｅｌａｎ−Ａ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のより多くの増殖によって実証される、優れた誘発能力が生じた。さらにより強力な誘発能力は、ＣｒｏｓｓＴＡｇ−Ｍｅｌａｎ−Ａ−ｉｖｔ−ＲＮＡを負荷した樹状細胞およびＣｒｏｓｓＴＡｇと融合していないＭｅｌａｎ−Ａ−ｉｖｔ  ＲＮＡを負荷した樹状細胞の組合せによるワクチン接種に対して実証される。
【００８０】
１．４  誘発したＭｅｌａｎ−Ａ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能分析
本発明者らは、標的抗原に隣接しているＣｒｏｓｓＴＡｇ配列を含んでいるＲＮＡ構築物の明確な利点を示すＣｒｏｓｓＴＡｇトランスフェクト樹状細胞によって抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の優れた誘発効率を実証した。ＣＤ８＋Ｔ細胞記憶の樹立および首尾良い腫瘍退縮に関して、ＣＤ４＋Ｔ細胞の極めて重要な役割が以前に示されている（Mortenson, et al. 2013. Effective anti-neu-initiated antitumor responses require the complex role of CD4+ T cells. Clin Cancer Res, 19, 1476-86; Rosenberg et al. Cancer immunotherapy: moving beyond current vaccines. Nat Med, 10, 909-15）。このように、ＣｒｏｓｓＴＡｇ−Ｍｅｌａｎ−Ａ含有樹状細胞をワクチン接種したＮＳＧマウスにおいて誘発される増強した免疫応答は、ＭＨＣ−Ｉおよび−ＩＩ上でＭｅｌａｎ−Ａ提示を引き起こすＣｒｏｓｓＴＡｇ配列によって提供される使用可能なＣＤ４＋Ｔ細胞の援助によって説明することができる。
【００８１】
誘発したＴ細胞の機能性をさらに調べるために、明確にするための次の重要な問題は、誘発したＭｅｌａｎ−Ａ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞もまた、適切な免疫応答に不可欠であるＩＦＮ−γを分泌できるかどうかであった。したがって、刺激時にＩＦＮ−γを分泌するＭｅｌａｎ−Ａ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の能力を分析した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させた脾細胞を、ＩＦＮγ分泌を評価するために細胞を刺激しながら種々の腫瘍細胞系と共培養した。非刺激脾細胞は完全に非反応性であることが見出された。ＮＫ細胞はあらゆるＭＨＣ分子を欠く標的細胞によって活性化されるので、脾細胞集団内のＮＫ細胞活性を、ＨＬＡ陰性腫瘍細胞系Ｋ５６２を使用することによって決定した。ＮＫ細胞活性は検出されなかった。Ｍｅｌａｎ−Ａを発現するか、または特異的ペプチドを負荷した刺激細胞のみが脾細胞の強力な活性化を引き起こし、一方、Ｍｅｌａｎ−Ａ陰性細胞は脾細胞を刺激しなかった。平均して、より多くのＩＦＮ−γスポットを、従来の群または対照群と比較してＣｒｏｓｓＴＡｇ−または混合した群から単離したＣＤ８＋Ｔ細胞から検出することができた（図４Ａ）。
【００８２】
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて観察された反応性が、ＣＤ８＋Ｔ細胞まで遡ることができ、また、ＣＤ４＋Ｔ細胞まで遡ることができないかどうかといった問題に対処するために、刺激細胞上のＭＨＣ−ＩＩ発現を調べた。刺激細胞系はＭＨＣ−Ｉに対して陽性であったが、ＭＨＣ−ＩＩに対して陽性ではなかった（図４Ｂ）。一晩の刺激細胞のＩＦＮ−γ処理後でさえ、ＭＨＣ−ＩＩ分子の誘発性発現が引き起こされなかった（データは示さず）。したがって、ＭＨＣ−Ｉ拘束性Ｔ細胞のみを活性化することができ、観察された反応性は、ＣＤ４＋Ｔ細胞が活性化されるのにＭＨＣ−ＩＩ上での抗原提示を必要とするので、活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞に由来することが示される。
【００８３】
また、腫瘍細胞を死滅させることができるようにするためにＣＤ８＋Ｔ細胞は細胞傷害性であることも重要である。したがって、Ｍｅｌａｎ  Ａ特異的Ｔ細胞の細胞傷害能力をクロム遊離アッセイによって評価した（図５）。細胞傷害性の結果により、増殖した脾細胞は、標的抗原に対して陰性であった対照細胞系ではなく、Ｍｅｌａｎ−Ａ−ペプチド提示細胞のみを特異的に溶解することが実証された。対照群由来の細胞は死滅活性を全く示さなかった。ＮＫ細胞活性もまた、全ての群の脾細胞内で非常に低かった。とりわけ、ＣｒｏｓｓＴＡｇ−ＤＣ群および混合した群由来の細胞は従来のＤＣ群由来の脾細胞と比較してはるかに高い死滅能力を示した。
【００８４】
方法
遺伝的構築物
ｐＧＥＭ−ｅＧＦＰ−Ａ１２０ベクターを、ＣｒｏｓｓＴＡｇベクターについての開始構築物として使用した。元のｐＧＥＭベクターのこのポリＡ１２０バリアントは転写ＲＮＡをより高い安定性にし、改善されたタンパク質発現を導いた。プラスミドは、ｅＧＦＰ  ｃＤＮＡの５’末端において特有のＡｇｅＩ部位、および３’末端において特有のＥｃｏＲＩ部位をさらに含有した。ポリ−Ａ尾部の後にＳｐｅＩ部位が続き、これはｉｖｔ−ＲＮＡ産生のためのプラスミドの線状化を可能にする。
【００８５】
ｅＧＦＰを、ＣｒｏｓｓＴＡｇターゲティングシグナルをコードするｃＤＮＡと置き換えることによってｐＧＥＭ−ＣｒｏｓｓＴＡｇ−Ａ１２０プラスミドをクローニングした。ＣｒｏｓｓＴＡｇ配列は、ＤＣ−ＬＡＭＰ（受託：ＮＰ＿０５５２１３、ａａ３７６−４１６）の膜貫通および細胞質ドメインと５’で融合したヒトリソソーム関連膜タンパク質−１（ＬＡＭＰ−１、受託：ＮＰ＿００５５５２、ａａ１−２８）のＥＲ移行シグナルからなる。抗原をコードするｃＤＮＡの挿入のために、異なるＣｒｏｓｓＴＡｇ配列を、ＬＡＭＰ１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を破壊せずにＮｈｅＩ、ＫｐｎＩおよびＰｓｔＩ制限部位を含有する１８−ｂｐスペーサーによって分離する。コドン最適化Ｃｒｏｓｓ−ＴＡｇ配列を、コンピュータークローニングソフトウェアを使用して仮想的に設計し、（ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成した。続いて完全なＣｒｏｓｓＴＡｇ配列を、ＡｇｅＩ（５’末端）およびＥｃｏＲＩ（３’末端）制限部位を使用してプラスミドＤＮＡから切断し、同様に消化したｐＧＥＭ−Ａ１２０ベクターのＭＣＳ内にライゲーションした。種々のＣ／Ｔ抗原−ＣｒｏｓｓＴＡｇ構築物（ｐＧＥＭ−ＧＡＧＥ−１−ＣｒｏｓｓＴＡｇ−Ａ１２０、ｐＧＥＭ−ＭＡＧＥ−Ａ４−ＣｒｏｓｓＴＡｇ−Ａ１２０、ｐＧＥＭ−ＮＹ−ＥＳＯ−１−ＣｒｏｓｓＴＡｇ−Ａ１２０、ｐＧＥＭ−ＳＳＸ−４−ＣｒｏｓｓＴＡｇ−Ａ１２０、ｐＧＥＭ−ＸＡＧＥ−１−ＣｒｏｓｓＴＡｇ−Ａ１２０）のクローニングのために、抗原ｃＤＮＡを、フォワードおよびリバース遺伝子特異的プライマーを使用してＰＣＲ（受託：ＧＡＧＥ−１、Ｕ１９１４２；ＭＡＧＥ−Ａ４、ＮＭ＿００１０１１５５０；ＮＹ−ＥＳＯ１、ＡＪ００３１４９；ＳＳＸ−４、Ｕ９０８４１；ＸＡＧＥ−１、ＡＦ２５１２３７）によってプラスミドから増幅させ、ＮｈｅＩおよびＰｓｔＩ／ＮｏｔＩ制限部位によりライゲーションした。全ての抗原配列を、開始ＯＲＦを破壊せずにｐＧＥＭ−ＣｒｏｓｓＴＡｇ−Ａ１２０の分割したＣｒｏｓｓＴＡｇシグナルに挿入した。
【００８６】
ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの検証のために、相補的オリゴヌクレオチドを合成し（Ｍｅｔａｂｉｏｎ、Ｐｌａｎｅｇｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、アニーリングした。アニーリングにより生成した付着末端を、ＣｒｏｓｓＴＡｇベクターへのこれらの短い抗原配列の直接的なライゲーションのために使用した。
【００８７】
ｉｖｔ−ＲＮＡの産生
ＳｐｅＩ線状化後、ｐＧＥＭプラスミドを、製造業者の指示書に従って、ｍＭＥＳＳＡＧＥ  ｍＭＡＣＨＩＮＥ  Ｔ７キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）を使用して単一種のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ｉｖｔ）−ＲＮＡ産生のための鋳型として使用した。品質管理のために、ｉｖｔ−ＲＮＡ産物の長さをアガロースゲル電気泳動によって分析した。濃度および純度をＮａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ−１０００分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）によって決定した。
【００８８】
細胞培養
単球由来３ｄ成熟樹状細胞を、Ｂｕｒｄｅｋら（Journal of Translational Medicine 2010, 8:90.）に記載されているように生成し、トランスフェクトした。成熟樹状細胞：ミニエプスタイン・バール・ウイルス（Mini-Epstein-Barr virus）（ＥＢＶ）形質転換リンパ芽球様細胞系（ｍＬＣＬ）のＲＮＡトランスフェクションをエレクトロポレーションによって達成した。
【００８９】
樹状細胞の表面表現型検査
樹状細胞によって発現された表面マーカーを以下の抗体により検出した：ＰＥがコンジュゲートしたＣＣＲ７特異的抗体（３Ｄ１２）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｈｚ４５０がコンジュゲートしたＣＤ４特異的抗体（ＲＰＡ−Ｔ４）、Ｈｚ５００がコンジュゲートしたＣＤ８特異的抗体（ＲＰＡ−Ｔ８）、ＦＩＴＣがコンジュゲートしたＣＤ１４特異的抗体（Ｍ５Ｅ２）、ＰＥがコンジュゲートしたＣＤ４０特異的抗体（５Ｃ３）、ＰＥがコンジュゲートしたＣＤ４０Ｌ特異的抗体（ＴＲＡＰ１）、ＰＥがコンジュゲートしたＣＤ８０特異的抗体（Ｌ３０７．４）、ＦＩＴＣがコンジュゲートしたＣＤ８３特異的抗体（ＨＢ１５ｅ）、ＦＩＴＣがコンジュゲートしたＣＤ８６特異的抗体（２３３１）、ＡＰＣがコンジュゲートしたＣＤ１３７特異的抗体（４Ｂ４−１）、ＦＩＴＣがコンジュゲートしたＤＣ−ＳＩＧＮ特異的抗体（ＤＣＮ４６）、ＰＥがコンジュゲートしたＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体（Ｇ４６−６）（全てＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ製）。洗浄後、細胞を４℃にて３０分間染色し、ヨウ化プロピジウム（propidium iodid）（２μｇ／ｍｌ）を、死細胞を除去するために加えた。全ての表面マーカーの発現をフローサイトメトリーによって分析した（ＬＳＲＩＩ、ＢＤ）。獲得後、ＦｌｏｗＪｏ８ソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を使用してデータ分析を行った。Ｔ細胞上でのＣＤ４０Ｌ表面発現の分析を、２μｇ／ｍｌのαＣＤ４０抗体（Ｍ．Ｆｒｅｎｔｓｃｈ、Ｂｅｒｌｉｎ−Ｂｒａｎｄｅｎｂｕｒｇ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓによって提供されたクローンＧ２８．５）を使用して記載されるように実施し（Frentsch, M. et al. (2005) Direct access to CD4+ T cells specific for defined antigens according to CD154 expression. Nat Med 11(10): 1118-1124）、Ｔ細胞：ＡＰＣ共培養の開始から６時間後に評価した。
【００９０】
ＲＮＡトランスフェクト樹状細胞によるＰＢＬのデノボプライミング
健常ドナーの３ｄ成熟樹状細胞に、ＭＥＬＡＮ−ＡをコードするＣｒｏｓｓＴＡｇ−ＲＮＡをトランスフェクトした。エレクトロポレーション後、トランスフェクト成熟樹状細胞を採取し、この混合物の混合した成熟樹状細胞を、１：２の比の範囲内で末梢血リンパ球（ＰＢＬ）と共培養し、それは成熟樹状細胞生成のプロセスにおいてＰＢＭＣのプラスチック接着の間、非接着性であった。細胞を加湿雰囲気において３７℃にて培養した。インターロイキン−２（ＩＬ−２、２０Ｕ／ｍｌ；Ｃｈｉｒｏｎ  Ｂｅｈｒｉｎｇ、Ｍａｒｂｕｒｇ、ドイツ）および５ｎｇのＩＬ−７／ｍｌ（Ｐｒｏｍｏｋｉｎｅ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）を１日後に加え、次いで１日おきに加えた。
【００９１】
サイトカイン遊離アッセイ
活性化誘発性サイトカイン分泌を測定するために、５＊１０４個のＴ細胞を、加湿雰囲気において３７℃にて、丸底９６ウェルプレート内の２００μｌのＴ細胞培地中で１＊１０５個のｉｖｔ−ＲＮＡが負荷された抗原提示細胞と共培養した。偽トランスフェクトＡＰＣを有するか、または刺激細胞を有さないＴ細胞を陰性対照として使用した。１６時間の共培養後、上清を採取し、ＯｐｔＥＩＡヒトＩＦＮ−γまたはＧＭ−ＣＳＦ  Ｓｅｔ（両方ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）を使用して酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって評価した。
【図１】
0006697562.tif 000002
【図２】
0006697562.tif 000003
【図３】
0006697562.tif 000004
【図４】
0006697562.tif 000005
【図５】
0006697562.tif 000006
【配列表】
0006697562000001.app