(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
妊娠女性由来の尿試料が異常折り畳みタンパク質(misfolded protein)を含むかまたは含まないことを決定する方法であって、
(a)  妊娠女性由来の尿試料と、異常折り畳みタンパク質およびセルロースにインターカレーションにより結合する色素を合わせて、それにより尿および色素の溶液を生成する工程；
(b)  該溶液を、セルロースを含む表面に適用し、それにより該表面上にスポットを生成する工程；
(c)  異常折り畳みタンパク質および色素を含む尿の溶液の拡散が起こるように、該表面上のスポットを維持する工程；ならびに
(d)  色素が該表面上のスポットから目に見える程度に放射状に拡散する場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むと決定するか、または色素が該表面上のスポットから目に見える程度に放射状に拡散しない場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含まないと決定する工程
を含み、該異常折り畳みタンパク質が、SERPINA1、アルブミン、κFLC、セルロプラスミン、インターフェロン誘導性タンパク質6-16(IFI6)およびアミロイド前駆体タンパク質(APP)からなる群より選択されるものを含む、方法。
【請求項２】
該色素がコンゴーレッドである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該溶液中の色素の濃度が0.05%〜0.2%である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
セルロースを含む該表面が紙表面である、請求項１〜３いずれか記載の方法。
【請求項５】
該尿および色素の溶液が、該表面上のスポットから放射状に拡散する程度と陽性対照を比較する工程、ならびに該尿および色素の溶液が該表面上のスポットから放射状に拡散する程度が、陽性対照と同等である場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むと決定する工程をさらに含む、請求項１〜４いずれか記載の方法。
【請求項６】
該尿および色素の溶液が、該表面上のスポットから放射状に拡散する程度と陰性対照を比較する工程、ならびに該尿および色素の溶液が該表面上のスポットから放射状に拡散する程度が、陰性対照と同等である場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含まないと決定する工程をさらに含む、請求項１〜５いずれか記載の方法。
【請求項７】
該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含む場合、妊娠女性が子癇前症を有するかまたは子癇前症を発症する可能性がある、請求項１〜６いずれか記載の方法。
【請求項８】
妊娠女性由来の尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むかまたは含まないことを決定するためのキットであって、
(a)  異常折り畳みタンパク質およびセルロースにインターカレーションにより結合する色素；
(b)  セルロースを含む表面；ならびに
(c)  塗布器
を含み、該異常折り畳みタンパク質が、SERPINA1、アルブミン、κFLC、セルロプラスミン、インターフェロン誘導性タンパク質6-16(IFI6)およびアミロイド前駆体タンパク質(APP)からなる群より選択されるものを含む、キット。
【請求項９】
該色素がコンゴーレッドである、請求項８記載のキット。
【請求項１０】
セルロースを含む該表面が紙表面である、請求項８または９記載のキット。
【請求項１１】
該色素が水溶液中にある、請求項８〜１０いずれか記載のキット。
【請求項１２】
該水溶液中の色素の濃度が0.2%〜1.0%である、請求項１１記載のキット。
【請求項１３】
該水溶液の体積が1μl〜10μlである、請求項１２記載のキット。
【請求項１４】
該塗布器に色素が予め充填される、請求項８〜１３いずれか記載のキット。
【請求項１５】
該塗布器がピペットである、請求項８〜１４いずれか記載のキット。
【請求項１６】
陽性対照をさらに含む、請求項８〜１５いずれか記載のキット。
【請求項１７】
陰性試料をさらに含む、請求項８〜１６いずれか記載のキット。
【請求項１８】
妊娠女性由来の尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むかまたは含まないことを決定する方法であって、
(a)  妊娠女性由来の尿試料と、異常折り畳みタンパク質およびセルロースにインターカレーションにより結合する第1の色素、ならびに第1の色素とは色が異なりかつ異常折り畳みタンパク質およびセルロースに結合しない第2の色素を合わせて、それにより、尿および2つの色素の溶液を生成する工程；
(b)  該溶液を、セルロースを含む表面に適用して、それにより、表面上のスポットを生成する工程；
(c)  異常折り畳みタンパク質および色素を含む尿の溶液の拡散が起こるように、該表面上のスポットを維持する工程；ならびに
(d)  第1の色素および第2の色素が該表面上のスポットから目に見える程度に放射状に拡散する場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むと決定するか、または第1の色素ではなく第2の色素が該表面上のスポットから目に見える程度に放射状に拡散する場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含まないと決定する工程
を含み、該異常折り畳みタンパク質が、SERPINA1、アルブミン、κFLC、セルロプラスミン、インターフェロン誘導性タンパク質6-16(IFI6)およびアミロイド前駆体タンパク質(APP)からなる群より選択されるものを含む、方法。
【請求項１９】
尿および2つの色素の溶液が該表面上のスポットから放射状に拡散する程度と陽性対照を比較する工程、ならびに尿および2つの色素の溶液が該表面上のスポットから放射状に拡散する程度が陽性対照と同等である場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むと決定する工程をさらに含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
尿および2つの色素の溶液が該表面上のスポットから放射状に拡散する程度と陰性対照を比較する工程、ならびに尿および2つの色素の溶液が該表面上のスポットから放射状に拡散する程度が陰性対照と同等である場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含まないと決定する工程をさらに含む、請求項１８または１９記載の方法。
【請求項２１】
該表面上のスポットの画像を取得する工程をさらに含む、請求項１８〜２０いずれか記載の方法。
【請求項２２】
該画像が、携帯電話を使用して取得される、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
該表面上のスポットから第1の色素が放射状に拡散する程度と該表面上のスポットから第2の色素が放射状に拡散する程度の間の差を定量する工程をさらに含む、請求項１８〜２２いずれか記載の方法。
【請求項２４】
該表面上のスポットから第1の色素が放射状に拡散する程度と該表面上のスポットから第2の色素が放射状に拡散する程度の間の相関係数を計算する工程をさらに含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
アルゴリズムを使用して該相関係数を計算する、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
第1の色素がコンゴーレッドである、請求項１８〜２５いずれか記載の方法。
【請求項２７】
第2の色素がエリオグラウシンである、請求項１８〜２６いずれか記載の方法。
【請求項２８】
該溶液中の第1の色素の濃度が0.05%〜0.2%である、請求項１８〜２７いずれか記載の方法。
【請求項２９】
該溶液中の第2の色素の濃度が0.05%〜0.2%である、請求項１８〜２８いずれか記載の方法。
【請求項３０】
セルロースを含む該表面が紙表面である、請求項１８〜２９いずれか記載の方法。
【請求項３１】
該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含む場合、妊娠女性が子癇前症を有するか、または子癇前症を発症する可能性がある、請求項１８〜３０いずれか記載の方法。
【請求項３２】
妊娠女性由来の尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むかまたは含まないことを決定するためのキットであって、
(a)  異常折り畳みタンパク質およびセルロースにインターカレーションにより結合する第1の色素；
(b)  第1の色素とは色が異なりかつ異常折り畳みタンパク質およびセルロースに結合しない第2の色素；
(c)  セルロースを含む表面；ならびに
(d)  塗布器
を含み、該異常折り畳みタンパク質が、SERPINA1、アルブミン、κFLC、セルロプラスミン、インターフェロン誘導性タンパク質6-16(IFI6)およびアミロイド前駆体タンパク質(APP)からなる群より選択されるものを含む、キット。
【請求項３３】
第1の色素がコンゴーレッドである、請求項３２記載のキット。
【請求項３４】
第2の色素がエリオグラウシンである、請求項３２記載のキット。
【請求項３５】
セルロースを含む該表面が紙表面である、請求項３２〜３４いずれか記載のキット。
【請求項３６】
第1の色素および第2の色素を水溶液中で合わせて、それにより、2つの色素の水溶液を生成する、請求項３２〜３５いずれか記載のキット。
【請求項３７】
該水溶液中の2つの色素の濃度が2%〜10%である、請求項３６記載のキット。
【請求項３８】
該水溶液の体積が1μl〜10μlである、請求項３６または３７記載のキット。
【請求項３９】
該塗布器に、2つの色素の水溶液が予め充填される、請求項３６〜３８いずれか記載のキット。
【請求項４０】
該塗布器がピペットである、請求項３２〜３９いずれか記載のキット。
【請求項４１】
陽性対照をさらに含む、請求項３２〜４０いずれか記載のキット。
【請求項４２】
陰性対照をさらに含む、請求項３２〜４１いずれか記載のキット。
【請求項４３】
妊娠女性由来の尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むかまたは含まないことを決定する方法であって、
(a)  妊娠女性由来の尿試料と、異常折り畳みタンパク質およびセルロースにインターカレーションにより結合する色素を合わせて、それにより、尿および色素の溶液を生成する工程；
(b)  該溶液を、セルロースを含む表面に適用して、それにより、表面上のスポットを生成する工程；
(c)  異常折り畳みタンパク質および色素を含む尿の溶液の拡散が起こるように、該表面上のスポットを維持する工程；ならびに
(d)  該表面を通過する溶液が着色されている場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むと決定するか、または該表面を通過する溶液が無色である場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含まないと決定する工程
を含み、該異常折り畳みタンパク質が、SERPINA1、アルブミン、κFLC、セルロプラスミン、インターフェロン誘導性タンパク質6-16(IFI6)およびアミロイド前駆体タンパク質(APP)からなる群より選択されるものを含む、方法。
【請求項４４】
妊娠女性由来の尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むかまたは含まないことを決定するためのキットであって、
(a)  異常折り畳みタンパク質およびセルロースにインターカレーションにより結合する色素；ならびに
(b)  セルロースを含む表面
を含み、該異常折り畳みタンパク質が、SERPINA1、アルブミン、κFLC、セルロプラスミン、インターフェロン誘導性タンパク質6-16(IFI6)およびアミロイド前駆体タンパク質(APP)からなる群より選択されるものを含む、キット。
【請求項４５】
請求項８〜１７、３２〜４２および４４のいずれか一項に記載のキットならびに妊娠女性由来の尿試料を含む装置。
【請求項４６】
妊娠女性について子癇前症またはそのリスクを検出する方法であって、
(a)  妊娠女性由来の尿試料とコンゴーレッドを合わせて、それにより、尿およびコンゴーレッドの溶液を生成する工程；
(b)  該溶液を、セルロースを含む表面に適用して、それにより、表面上のスポットを生成する工程；ならびに
(c)  コンゴーレッドを含む尿の溶液の拡散が起こるように、該表面上のスポットを維持する工程
を含み、コンゴーレッドが該表面上のスポットから目に見える程度に拡散する場合、該妊娠女性が子癇前症を有するかまたは子癇前症のリスクを有する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、その全体において本明細中で参照により援用される2014年4月10日に出願された米国仮特許出願番号61/978,158の35U.S.C. §119(e)の利益を主張する。
【０００２】
分野
本開示の局面は、診断および予後の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
子癇前症(PE)は、妊娠特異的過敏性障害であり、世界的に、母性および周産期の罹病率ならびに死亡についての第1の原因である。世界保健機関(WHO)は、世界的な母性死亡率の16%(1年間に約63,000の母体死亡)がPE単独によると推定している。米国において、全妊婦の5〜8%、すなわち270,000人の女性が子癇前症に罹患し、子癇前症は毎年の母体死亡の18%を占め、発現は増加している。幼児もまたリスクが高く、米国では毎年10,500人の赤ん坊が子癇前症のために死亡している。子癇前症は、観察された症状に基づいて診断される。子癇前症のための正確な診断製品はない。
【０００４】
母体死亡のリスクは、資源が限られた設定においてかなり高い。主要な母性および胎児性の罹病率の原因となる最も頻繁に認識される要因は、時間様式での子癇前症の認識の失敗である。認識の失敗により、マグネシウム、ステロイド治療により、および/または子癇、母性過敏発作(maternal hypertensive stroke)または剥離による胎児死亡の前の緊急搬送により子癇前症を有する女性を管理し得るより高度な健康管理施設への該女性の移送が可能ではなくなるので、これは大きな障害である。子癇前症は発展していく状態である。そのため、子癇前症について臨床的に無症状であるかまたは症状に疑問のある女性における子癇前症の検出の向上は、臨床的に非常に重要である。この戦略は、第二次子癇前症予防(secondary preeclampsia prevention)として知られており、子癇、ならびに痙攣、発作、肺水腫、肝臓および/または腎臓機能不全による末端臓器系への損傷、ならびに母体死亡を防ぐことにより妊娠関連死および疾患を低減する可能性を有する。
【０００５】
重度の子癇前症(sPE)が診断されると、硫酸マグネシウム、抗高血圧薬および医学的に適応された分娩(medically indicated delivery)が、既に明らかにされた人命救助である効果的な戦略(第三次子癇前症予防(tertiary preeclampsia prevention)として知られる戦略)となる。出産予定日前の妊婦について、保存的な管理(例えばステロイド)を可能にするための医学的に支持された出産の適正な時期も、新生児転帰(neonatal outcome)を改善することが知られている。子癇前症合併症の予防のための治療的戦略の使用は、この症状の正確な診断により条件づけられる。
【発明の概要】
【０００６】
概要
子癇前症は、ヒトの妊婦に特有の高血圧性蛋白尿症候群である。子癇前症の診断に伴う1つの問題は、高血圧も蛋白尿もいずれも、特に典型的でない胎位を有する女性において感受性または特異的ではないということである。子癇前症の女性の尿は異常折り畳みタンパク質(misfolded protein)に非常に富んでいる。異常折り畳みタンパク質が豊富であるために、異常折り畳みタンパク質に親和性を有する色素を使用した単純な色素試験を、子癇前症の診断的ツールおよび臨床的予後ツールとして使用し得る。かかる色素試験の一例は、異常折り畳みタンパク質に親和性を有する(例えば結合能力を有する)アゾ色素、コンゴーレッドの使用を含むコンゴーレッドドット試験である。
【０００７】
いくつかの態様において、蛋白尿の評価のための典型的な尿計量棒(urine dipstick)の制限に取り組むための科学技術的なアプローチが本明細書において提供される。いくつかの態様において、本開示は、短期間(例えば2分)で半定量的な結果を可能にする紙ベースの方法(いくつかの態様においてコンゴーレッドドットシンプルキットと称される)を提供する。いくつかの態様において、本開示はまた、例えば供給源が制限された健康管理施設などの健康管理施設において24時間の蛋白尿評価を完了できないことに取り組む能力を有する、短期間(例えば7分)で尿中の異常折り畳みタンパク質の定量的でかつ偏りのない評価を可能にする、画像解析のためのスマートフォンベースの方法(いくつかの態様において、コンゴーレッドドット定量キットと称される)を提供する。
【０００８】
コンゴーレッドは、本開示に従って使用され得る色素の非限定的な一例であることが理解されるべきである。簡易化のために、本明細書に記載される試験およびキットは、特にコンゴーレッド(例えばコンゴーレッドドット簡易キット(Congo Red Dot Simple Kit))に関して言及されるが、いくつかの態様において、異常折り畳みタンパク質および以下に例示されるように、セルロースに親和性を有するコンゴーレッド以外の色素が使用され得る。同様に、コンゴーレッドに結合する異常折り畳みタンパク質を有する尿のことをいう「尿コンゴーレッド好性(urine congophilia)」についての参照がなされる。この用語は限定されることを意図しないことが理解されるべきである。コンゴーレッド好性のタンパク質はまた、コンゴーレッドの代替物として使用され得る他の色素に親和性を有し得る。
【０００９】
本開示のいくつかの局面は、被験体(例えば妊娠女性)から得られた試料(例えば尿試料)が異常折り畳みタンパク質を含むかまたは含まないことを決定する方法を提供する。いくつかの態様において、該方法は、(a)被験体(例えば妊娠女性)から得られた試料(例えば尿試料)と、異常折り畳みタンパク質および遊離ヒドロキシル基を含む物質(例えばセルロース)に結合する色素を合わせて、(例えば尿および色素の)溶液を生成する工程；(b)該溶液を、該色素が異常折り畳みタンパク質および遊離ヒドロキシル基を含む物質(例えばセルロース)に結合する条件下で、遊離ヒドロキシル基を含む物質(例えばセルロース)を含む表面に適用して、表面上のスポット(例えば色素を含むスポット)を生成する工程；(c)(例えば異常折り畳みタンパク質を含む尿および色素の)溶液の拡散が起こる条件下で、該表面上のスポットを維持する工程；ならびに(d)色素が表面上のスポットから目に見える程度に拡散(例えば放射状に拡散)する場合、試料(例えば尿試料)が異常折り畳みタンパク質を含むことを決定するか、または色素が表面上のスポットから目に見える程度に拡散(例えば放射状に拡散)しない場合、試料(例えば尿試料)が異常折り畳みタンパク質を含まないことを決定する工程を含む。いくつかの態様において、色素が異常折り畳みタンパク質および遊離ヒドロキシル基を含む物質に結合する条件は、室温(例えば約25℃)で30分〜3時間以上(例えば30分、1時間、2時間または3時間)の条件を含む。
【００１０】
本開示のいくつかの局面は、被験体(例えば妊娠女性)から得られた試料(例えば尿試料)中の異常折り畳みタンパク質を検出する方法を提供する。いくつかの態様において、該方法は、(a)被験体(例えば妊娠女性)から得られた試料(例えば尿試料)と、異常折り畳みタンパク質および遊離ヒドロキシル基を含む物質(例えばセルロース)を含む表面に結合する色素を合わせて、試料(例えば尿)および色素の溶液を生成する工程；(b)該溶液を、色素が異常折り畳みタンパク質に結合するか、遊離ヒドロキシル基を含む物質を含む表面に結合するか、または異常折り畳みタンパク質および遊離ヒドロキシル基を含む物質を含む表面に結合する条件下で、セルロースを含む表面などの遊離ヒドロキシル基を含む物質を含む表面に適用して、表面上のスポットを生成する工程；(c)(例えば異常折り畳みタンパク質を含む尿および色素の)溶液の拡散が起こる条件下で、該表面上のスポットを維持する工程；ならびに(d)色素が表面上のスポットから目に見える程度に拡散(例えば放射状に拡散)する場合、試料(例えば尿試料)中の異常折り畳みタンパク質を検出するか、または色素が表面上のスポットから目に見える程度に拡散しない(例えば放射状に拡散しない)場合、試料(例えば尿試料)中の異常折り畳みタンパク質を検出しない工程を含む。
【００１１】
本開示のいくつかの局面は、被験体(例えば妊娠女性)から得られた試料(例えば尿試料)中の異常折り畳みタンパク質を検出する方法を提供する。いくつかの態様において、該方法は、(a)被験体(例えば妊娠女性)から得られた試料(例えば尿試料)と、異常折り畳みタンパク質および遊離ヒドロキシル基を含む物質(例えばセルロース)を含む表面に結合する色素を合わせて、試料(例えば尿)および色素の溶液を生成する工程；(b)該溶液を、該色素が異常折り畳みタンパク質に結合するか、遊離ヒドロキシル基を含む物質を含む表面に結合するか、または異常折り畳みタンパク質および遊離ヒドロキシル基を含む物質を含む表面に結合する条件下で、セルロースを含む表面などの遊離ヒドロキシル基を含む物質を含む表面に適用して、表面上のスポットを生成する工程；(c)(例えば異常折り畳みタンパク質を含む尿および色素の)溶液の拡散が起こる条件下で、該表面上のスポットを維持する工程；ならびに(d)色素が表面上のスポットから目に見える程度に拡散する場合であって、色素が目に見える程度に拡散する場合に試料(例えば尿試料)中の異常折り畳みタンパク質が検出され、色素が目に見える程度に拡散しない場合に異常折り畳みタンパク質が尿試料中で検出されないことを決定する工程を含む。
【００１２】
本開示のいくつかの局面は、妊娠女性から得られた試料(例えば尿試料)が異常折り畳みタンパク質を含むかまたは含まないことを決定する方法を提供し、該方法は、(a)妊娠女性から得られた試料(例えば尿試料)と、異常折り畳みタンパク質および遊離ヒドロキシル基を含む物質(例えばセルロース)を含む物質を含む表面に結合する色素を合わせて、試料(例えば尿)および色素の溶液を生成する工程；(b)該溶液を、色素が異常折り畳みタンパク質に結合するか、遊離ヒドロキシル基を含む物質を含む表面に結合するか、または異常折り畳みタンパク質および遊離ヒドロキシル基を含む物質を含む表面に結合する条件下で、遊離ヒドロキシル基を含む物質(例えばセルロース)を含む表面に適用して、該表面上のスポットを生成する工程；(c)(例えば異常折り畳みタンパク質を含む尿および色素の)溶液の拡散が起こる条件下で、該表面上のスポットを維持する工程；ならびに(d)該表面を通過する溶液が着色される場合、該試料(例えば尿試料)が異常折り畳みタンパク質を含むことを決定するか、または該表面を通過する溶液が無色である場合、該試料(例えば尿試料)が異常折り畳みタンパク質を含まないことを決定する工程を含む。
【００１３】
いくつかの態様において、該方法はさらに、(例えば尿および色素の)溶液が表面上のスポットから拡散(例えば放射状に拡散)する程度と、陽性対照が拡散する程度を比較する工程、および(例えば尿および色素の)溶液が表面上のスポットから拡散(例えば放射状に拡散)する程度が陽性対照中で拡散が起こる程度と同等である場合、試料(例えば尿試料)が異常折り畳みタンパク質を含むことを決定する工程を含む。
【００１４】
いくつかの態様において、該方法はさらに、(例えば尿および色素の)溶液が表面上のスポットから拡散(例えば放射状に拡散)する程度と陰性対照が拡散する程度を比較する工程、および(例えば尿および色素の)溶液が表面上のスポットから拡散(例えば放射状に拡散)する程度が陰性対照中で拡散が起こる程度と同等である場合、該試料(例えば尿試料)が異常折り畳みタンパク質を含まないことを決定する工程を含む。
【００１５】
いくつかの態様において、該方法はさらに、(e)妊娠女性由来のさらなる試料(例えば尿試料)を希釈して、希釈試料(例えば希釈尿試料)を生成する工程；(f)該希釈試料(例えば尿試料)と、異常折り畳みタンパク質および遊離ヒドロキシル基を含む物質(例えばセルロース)を含む表面に結合する色素を合わせて、(例えば尿および色素の)溶液を生成する工程；(g)(f)の溶液を、色素が異常折り畳みタンパク質に結合するか、遊離ヒドロキシル基を含む物質を含む表面に結合するか、または異常折り畳みタンパク質および遊離ヒドロキシル基を含む物質を含む表面に結合する条件下で、セルロースを含む表面に適用して、表面上のスポットを生成する工程；(h)(例えば異常折り畳みタンパク質を含む尿および色素の)溶液の拡散が起こる条件下で、該表面上のスポットを維持する工程；ならびに(i)色素が工程(h)の表面上のスポットから拡散(例えば放射状に拡散)する場合、該希釈試料(例えば希釈尿試料)が異常折り畳みタンパク質を含むことを決定するか、または色素が工程(h)で維持された表面上のスポットから拡散(例えば放射状に拡散)しない場合、該試料(例えば尿試料)が異常折り畳みタンパク質を含まないことを決定する工程を含む。
【００１６】
いくつかの態様において、該さらなる試料(例えば尿試料)は、該方法が実施される条件下に必要な程度、例えば5倍〜15倍(例えば、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍または15倍)まで希釈される。
【００１７】
いくつかの態様において、該被験体は妊娠女性である。いくつかの態様において、該被験体は、子癇前症を有することが疑われる妊娠女性である。いくつかの態様において、該被験体は、子癇前症を発症するリスクを有する(例えば遺伝的に素因を有するかまたは以前から有する)妊娠女性である。いくつかの態様において、該方法はさらに、該試料(例えば尿試料)が異常折り畳みタンパク質を含む場合または異常折り畳みタンパク質が検出される場合、妊娠女性が子癇前症を有するかまたは子癇前症を発症する可能性があると診断する工程を含む。
【００１８】
いくつかの態様において、該色素はコンゴーレッドである。
【００１９】
いくつかの態様において、該溶液中の色素の濃度は、0.05%〜0.2%である。例えば、該溶液中の色素の濃度は0.1%であり得る。
【００２０】
いくつかの態様において、遊離ヒドロキシル基を含む物質はセルロースである。いくつかの態様において、該表面は紙であるかまたは紙を含む。
【００２１】
いくつかの態様において、該表面はさらに粘着性の裏張りを含む。
【００２２】
本開示のいくつかの局面は、被験体(例えば妊娠女性)から得られた試料(例えば尿試料)が異常折り畳みタンパク質を含むかまたは含まないことを決定する方法を提供する。いくつかの態様において、該方法は、(a)被験体(妊娠女性)から得られた試料(例えば尿試料)と、異常折り畳みタンパク質および遊離ヒドロキシル基を含む物質(例えばセルロース)に結合する第1の色素ならびに第1の色素とは色が異なりかつ異常折り畳みタンパク質および遊離ヒドロキシル基を含む物質(例えばセルロース)に結合しない第2の色素を合わせて、(例えば尿および2つの色素の)溶液を生成する工程；(b)該溶液を、第1の色素が異常折り畳みタンパク質に結合するか、遊離ヒドロキシル基を含む物質(例えばセルロース)を含む表面に結合するか、または異常折り畳みタンパク質および遊離ヒドロキシル基を含む物質を含む表面に結合する条件下で、遊離ヒドロキシル基を含む物質(例えばセルロース)を含む表面に適用して、表面上のスポットを生成する工程；(c)(例えば異常折り畳みタンパク質を含む尿および色素の)溶液の拡散が起こる条件下で、該表面上のスポットを維持する工程；ならびに(d)第1の色素および第2の色素が該表面上のスポットから目に見える程度に(例えば放射状に)拡散する場合、該試料(例えば尿試料)が異常折り畳みタンパク質を含むことを決定するか、または第1の色素ではなく第2の色素が該表面上のスポットから目に見える程度に(放射状に)拡散する場合、該試料(例えば尿試料)が異常折り畳みタンパク質を含まないことを決定する工程を含む。
【００２３】
本開示のいくつかの局面は、被験体(例えば妊娠女性)中の異常折り畳みタンパク質を検出する方法を提供する。いくつかの態様において、該方法は、(a)被験体(妊娠女性)から得られた試料(例えば尿試料)と、異常折り畳みタンパク質および遊離ヒドロキシル基を含む物質(例えばセルロース)に結合する第1の色素ならびに(ii)第1の色素とは色が異なり、かつ異常折り畳みタンパク質および遊離ヒドロキシル基を含む物質(例えばセルロース)に結合しない第2の色素を合わせて、(例えば尿および2つの色素の)溶液を生成する工程；(b)該溶液を、第1の色素が異常折り畳みタンパク質およびセルロースに結合する条件下で、セルロースを含む表面に提供して、表面上のスポットを生成する工程；(c)(例えば異常折り畳みタンパク質を含む尿および色素の)溶液の拡散が起こる条件下で、該表面上のスポットを維持する工程；ならびに(d)第1の色素および第2の色素が表面上のスポットから目に見える程度に拡散(例えば放射状に拡散)する場合、試料(例えば尿試料)中の異常折り畳みタンパク質を検出するか、または第1の色素ではなく第2の色素が表面上のスポットから目に見える程度に(例えば放射状に)拡散する場合、試料(例えば尿試料)中の異常折り畳みタンパク質を検出しない工程を含む。
【００２４】
いくつかの態様において、該方法はさらに、(例えば尿および2つの色素の)溶液が該表面上のスポットから拡散(例えば放射状に拡散)する程度と、陽性対照中で拡散が起こる程度を比較する工程、および(例えば尿および2つの色素の)該溶液が該表面上のスポットから放射状に拡散する程度が陽性対照中で拡散が起こる程度と同等である場合、該試料(例えば尿試料)が異常折り畳みタンパク質を含むことを決定する工程を含む。
【００２５】
いくつかの態様において、該方法はさらに、(例えば尿および2つの色素の)溶液が該表面上のスポットから拡散(例えば放射状に拡散)する程度と、陰性対照中で拡散が起こる程度を比較する工程、および(尿および2つの色素の)溶液が該表面上のスポットから放射状に拡散する程度が、陰性対照中で拡散が起こる程度と同等である場合、該試料(例えば尿試料)が異常折り畳みタンパク質を含むことを決定する工程を含む。
【００２６】
いくつかの態様において、該方法はさらに、該表面上のスポットの画像を取得する工程を含む。例えば携帯電話を使用して画像は取得され得る。
【００２７】
いくつかの態様において、該方法はさらに、第1の色素が該表面上のスポットから放射状に拡散する程度と、第2の色素が該表面上のスポットから放射状に拡散する程度の間の差を定量する工程を含む。本明細書に提供されるように、較正手順には2つの異なる色素が使用され得る。
【００２８】
いくつかの態様において、該方法はさらに、第1の色素が該表面上のスポットから放射状に拡散する程度と、第2の色素が該表面上のスポットから放射状に拡散する程度の間の較正係数を計算する工程を含む。例えば、較正係数は、アルゴリズム(例えばスマートフォンで撮影された写真の異なる色チャネル中のシグナル間の較正係数(ρ)を評価するアルゴリズム)を使用して計算され得る。
【００２９】
いくつかの態様において、第1の色素はコンゴーレッドである。
【００３０】
いくつかの態様において、第2の色素はエリオグラウシンである。
【００３１】
いくつかの態様において、該溶液中の第1の色素の濃度は、0.05%〜0.2%である。例えば該溶液中の第1の色素の濃度は0.1%であり得る。
【００３２】
いくつかの態様において、該溶液中の第2の色素の濃度は0.05%〜0.2%である。例えば、該溶液中の第2の色素の濃度は0.1%であり得る。
【００３３】
いくつかの態様において、該方法はさらに、(e)妊娠女性由来のさらなる試料(例えば尿試料)を希釈して、希釈試料(例えば尿試料)を生成する工程、(f)該試料(例えば尿試料)と、異常折り畳みタンパク質および遊離ヒドロキシル基を含む物質(例えばセルロース)に結合する第1の色素ならびに第1の色素とは異なりかつ異常折り畳みタンパク質および遊離ヒドロキシル基を含む物質(例えばセルロース)とは結合しない第2の色素を合わせて、(尿および2つの色素の)溶液を生成する工程；(g)(f)の溶液を、第1の色素が異常折り畳みタンパク質および遊離ヒドロキシル基を含む物質(例えばセルロース)に結合する条件下で、遊離ヒドロキシル基を含む物質(例えばセルロース)を含む表面に適用して、該表面上のスポットを生成する工程；(h)(例えば異常折り畳みタンパク質を含む尿および色素の)溶液の拡散が起こる条件下で工程(g)の表面上のスポットを維持する工程；ならびに(i)第1の色素および第2の色素が(h)の表面上のスポットから拡散(例えば放射状に拡散)する場合、希釈試料(例えば尿試料)が異常折り畳みタンパク質を含むことを決定するか、または第1の色素ではなく第2の色素が(h)の表面上のスポットから拡散(例えば放射状に拡散)する場合、該試料(例えば尿試料)が異常折り畳みタンパク質を含まないことを決定する工程を含む。
【００３４】
いくつかの態様において、さらなる試料(例えば尿試料)は、5倍〜15倍に希釈される。
【００３５】
また、被験体(例えば妊娠女性)から得られた試料(例えば尿試料)が異常折り畳みタンパク質を含むかまたは含まないことを決定するためのキットが本明細書に記載される。いくつかの態様は、被験体(例えば妊娠女性)から得られた試料(例えば尿試料)中の異常折り畳みタンパク質を検出するキットである。いくつかの態様において、該キットは、(a)異常折り畳みタンパク質に結合する色素およびセルロース、(b)遊離ヒドロキシル基を含む物質(例えばセルロース)を含む表面、ならびに任意に塗布器を含む。
【００３６】
いくつかの態様において、遊離ヒドロキシル基を含む物質(例えばセルロース)を含む表面は、さらなる表面に固定される。
【００３７】
いくつかの態様において、該色素は、(塗布器中に予め充填される)水溶液である。水溶液は、例えば、水または他のバッファ(例えばリン酸緩衝化食塩水)を含み得る。いくつかの態様において、水溶液は、アルコール(例えばエタノール、メタノール、イソプロパノール)を含まない。
【００３８】
いくつかの態様において、該水溶液中の色素の濃度は、0.2%〜1.0%である。例えば、該水溶液中の色素の濃度は0.5%であり得る。
【００３９】
いくつかの態様において、該水溶液の体積は、1μl〜10μlである。例えば、該水溶液の体積は、5μlであり得る。
【００４０】
いくつかの態様において、該キットはさらに、塗布器(例えばピペット、例えば使い捨てピペット)を含む。いくつかの態様において、塗布器には該色素が予め充填される。
【００４１】
いくつかの態様において、該キットはさらに、陽性対照、陰性対照または陽性対照と陰性対照の両方を含む。
【００４２】
いくつかの態様において、該キットはさらに、異常折り畳みタンパク質の存在について試料が陽性であるかまたは陰性であるかを決定するための試験結果についての比較のための陽性結果および陰性結果の画像を含む。
【００４３】
被験体(例えば妊娠女性)から得られた試料(例えば尿試料)が異常折り畳みタンパク質を含むかまたは含まないことを決定するためのキットも本明細書に記載される。いくつかの態様は、被験体(妊娠女性)から得られた試料(例えば尿試料)中の異常折り畳みタンパク質を検出するキットである。いくつかの態様において、該キットは、(a)異常折り畳みタンパク質および遊離ヒドロキシル基を含む物質(例えばセルロース)に結合する第1の色素、(b)第1の色素とは色が異なりかつ異常折り畳みタンパク質および遊離ヒドロキシル基を含む物質(例えばセルロース)に結合しない第2の色素、(c)遊離ヒドロキシル基を含む物質(例えばセルロース)を含む表面、ならびに(d)任意に塗布器を含む。
【００４４】
いくつかの態様において、第1の色素はコンゴーレッドである。いくつかの態様において、第2の色素はエリオグラウシンである。
【００４５】
いくつかの態様において、該表面は紙である。
【００４６】
いくつかの態様において、第1の色素および第2の色素を水溶液中で合わせて、2つの色素の水溶液を生成する。
【００４７】
いくつかの態様において、該水溶液中の2つの色素の濃度は、0.2%〜1.0%である。例えば該水溶液中の2つの色素の濃度は、0.5%であり得る。
【００４８】
いくつかの態様において、該水溶液の体積は、1μl〜10μlである。例えば、該水溶液の体積は、7.5μlであり得る。
【００４９】
いくつかの態様において、塗布器には2つの色素の水溶液が予め充填される。
【００５０】
いくつかの態様において、塗布器はピペット(例えば使い捨てピペット)である。
【００５１】
いくつかの態様において、該キットはさらに、陽性対照、陰性態様、または陽性対照と陰性対照の両方を含む。
【００５２】
また、(例えば妊娠女性から得られた)尿、異常折り畳みタンパク質およびセルロースに結合する色素ならびにセルロースを含む表面を含む組成物が本明細書に記載される。
【００５３】
本明細書に記載されるキットのいずれかおよび妊娠女性から得られた尿試料を含む装置がさらに本明細書に記載される。
【００５４】
いくつかの態様において、該方法はさらに、子癇前症について被験体を治療する工程(例えば、血圧を下げるための医薬を投与する工程、コルチコステロイドを投与する工程、抗痙攣薬を投与する工程)を含む。
【００５５】
いくつかの局面は、妊娠女性が子癇前症を有するかまたは子癇前症のリスクを有するかどうかを決定する方法に関し、該方法は、(a)妊娠女性由来の尿試料と、コンゴーレッドを合わせて、尿およびコンゴーレッドの溶液を生成する工程；(b)該溶液を、セルロースを含む表面に適用して、表面上のスポットを生成する工程；(c)色素を含む尿の溶液の拡散が起こる条件下で該表面上のスポットを維持する工程；ならびに(d)コンゴーレッドが該表面上のスポットから目に見える程度に拡散する場合、該妊娠女性が子癇前症を有するかまたは子癇前症のリスクを有することを決定する工程を含む。
【００５６】
いくつかの局面は、妊娠女性から得られた尿試料中の異常折り畳みタンパク質を検出する方法を提供し、該方法は、(a)コンゴーレッドが吸着した表面に、妊娠女性から得られた尿試料を適用して、尿およびコンゴーレッドを含む表面を生成する工程、ならびに(b)尿およびコンゴーレッドを含む表面を等電点電気泳動に供する工程、ならびに(c)コンゴーレッドの移動の程度または速度を決定する工程を含む。いくつかの態様において、該方法はさらに、コンゴーレッドの移動の程度または速度と、適切な陽性または陰性対照を比較する工程を含み、ここで適切な対照と比べたコンゴーレッドの移動の程度または速度の差は、尿試料中の異常折り畳みタンパク質を示す。「等電点電気泳動」は、等電点(pI)の差により異なる分子を分離するための技術をいう。等電点電気泳動は、典型的にゲル(または他の多孔性基質)中タンパク質に対して行われるある種のゾーン電気泳動であり、目的の分子の全体的な電荷がその周囲のpHの関数となるという利点を有する。
【００５７】
いくつかの態様において、該表面は、タンパク質および色素の移動(movement)(例えば正または負電極への例えば移動(migration))を可能にする多孔質表面である。例えば、該表面は、アガロースゲルまたはアガロースビーズであり得る。本明細書において他の多孔質表面が企図される。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図1は、3名の異なる被験体：重度の子癇前症を有する妊娠女性(症例1)、子癇前症を有する妊娠女性(症例2)、および子癇前症を有さない妊娠女性から得られた尿試料による「通常の(plain)」紙を使用した、本開示の方法の例の比較を示す。「ブランク」は、水と混合したコンゴーレッド色素を示し、「試料」(互いに隣接する2つ)は、指定された尿試料と混合されたコンゴーレッド色素を示す。
【図２】図2は、「良好」な試験紙、「許容可能」な試験紙および「不良」な試験紙の例の比較を示す。示される例は、スマートフォンで撮影した写真の異なる色チャネル、この場合は特に赤色と青色のチャネルにおけるシグナル間の相関係数(ρ)を評価するアルゴリズムについての基準となる。ρNorm計算は、子癇前症を有さない妊娠女性由来の試料に基づき、ρPE計算は、子癇前症を有する妊娠女性由来の試料に基づく。
【図３】図3A〜3Cは、本開示の3種類の異なる診断キットの例の写真を示す。図3Aは、コンゴーレッド簡易キット(Congo Red Simple Kit)を示し、図3Bは、コンゴーレッド定量キット(Congo Red Quant Kit)を示し、図3Cは、コンゴーレッド定量アレイ(Congo Red Quant Array)を示す。
【図４】図4は、コンゴーレッド定量アレイ分析の例の各工程の写真を示す。
【図５】図5は、試験設計および実施例2のコンゴーレッドドット試験のための尿試料を提供した女性のフローチャートを示す。
【図６】図6A〜6Iは、重度の子癇前症(sPE)を有する女性の尿におけるスペクトル特徴タンパク質凝集およびコンゴーレッド好性の例を示す。
【図７】図7A〜7Fは、尿コンゴーレッド好性の診断および予後の特徴の例を示す。
【図８】図8A〜8Dは、尿オリゴマー免疫反応性の例および子癇前症の重症度との関係を示す。
【図９】図9A〜9Kは、重度の子癇前症(sPE)を有する女性の尿から単離したコンゴーレッド好性凝集物の顕微鏡的および免疫反応性の特徴の例を示す。
【図１０】図10A〜10Fは、重度の子癇前症を有する女性の尿中のアミロイド前駆体タンパク質(APP)プロテオフォーム(proteoform)の例を示す。
【図１１−１】図11A〜11Cは、ヒト胎盤におけるアミロイド前駆体タンパク質および原型アミロイド前駆体タンパク質プロセッシング酵素のmRNA発現の例を示す。
【図１１−２】図11Dは、統計学的に変化しないことが見られる転写産物の相対量を示す。
【図１２】図12A〜12Pは、ヒト胎盤におけるアミロイド前駆体タンパク質および原型アミロイド前駆体タンパク質プロセッシング酵素の免疫局在化の例を示す。
【図１３】図13は、尿コンゴーレッド好性と、24時間尿蛋白尿の量的関係の例を示す。
【図１４】図14は、子癇前症異常折り畳み体(misfoldome)に関連するタンパク質同一性のウエスタンブロット検証の例を示す。
【図１５】図15A〜15Fは、インターフェロン誘導性タンパク質6-16(G1P3)アイソフォームの比較凝集予測の例を示す。アイソフォームA(配列番号：1)；アイソフォームB(配列番号：2)；およびアイソフォームC(配列番号：3)。
【図１６】図16A〜16Dは、子癇前症を有する妊娠女性由来の尿中のアミロイド前駆体タンパク質免疫反応性のパターンの例を示す：アルブミン枯渇の効果(図16A、16B)およびAPP免疫反応性のパターン(図16C、16D)。
【図１７】図17A〜17Dは、子癇前症胎盤における石灰化したアルツハイマー病様プラークにおけるALZ90およびG1P3エピトープの免疫局在化の例を示す。
【図１８】図18A〜18Jは、子癇前症を有する女性由来の胎盤におけるβ-セクレターゼBACE1およびBACE2についての免疫反応性のパターンの例を示す。
【図１９】図19A〜19Cは、SERPINA1配列(配列番号：4)に対するバイオマーカー成分マッピングを用いた子癇前症(PE)の尿プロテオミクスプロフィールの例を示す。図19C：SERPINA1(プロテオフォーム)のC末端断片-配列番号：5(上部)および配列番号：6(底部)。
【図２０】図20A〜20Fは、実施例3に記載される試験の段階1の際の自動化コンゴーレッド保持計算アルゴリズムの例の比較を示す。
【図２１】図21は、コンゴーレッドドット試験および画像処理ルーチンの例のワークフロー図を示す。
【図２２】図22A〜22Cは、実施例3に記載される試験の段階2におけるスマートフォン補助コンゴーレッド保持計算の例の評価および等価試験を示す。
【図２３】図23は、コンゴーレッドドット試験アレイスマートフォンアプリケーションの例のスクリーン-バイ-スクリーンワークフローを示す。
【図２４】図24は、アレイ分析のための試料位置決定鋳型の例を示す。
【図２５】図25A〜25Bは、本開示のコンゴーレッド簡易キットの例を示す。図25Aは、三つ折り構成キットの前面を示す。図25Bは、三つ折り構成キットの背面を示す。
【図２６】図26A〜26Bは、本開示のコンゴーレッドドット定量キットの例を示す。図26Aは、三つ折り構成キットの前面を示す。図26Bは、三つ折り構成キットの背面を示す。
【図２７】図27Aは、左から右へコンゴーレッド/食物色素割合が増加する対照尿液滴の拡散の例を示す。図27Bは、左から右へコンゴーレッド/食物色素割合が増加する子癇前症尿液滴の拡散の例を示す。
【図２８】図28は、コンゴーレッドを含む(例えばゲルの表面上に吸着させた)アガロースゲルに適用した非子癇前症尿(レーン1および3)および子癇前症尿(レーン4および5)の試料を含む画像を示す。ゲルを等電点電気泳動に供した際に、尿中のタンパク質はゲルを通って押出され、タンパク質が吸着されたコンゴーレッド色素に到達した際に、タンパク質に色素がインターカレートされる。(子癇前症尿中の)コンゴーレッド好性タンパク質と結合したコンゴーレッドは、コンゴーレッド好性タンパク質と結合しなかったコンゴーレッドとは異なった速度(または程度)でゲルを通って移動する。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
詳細な説明
子癇前症(PE)診断、高血圧および蛋白尿の基礎は、子癇前症を示すが特異的ではない血圧(BP)および尿タンパク質の定量的な測定に依拠するということは、大きな問題である。さらに、これらの測定は低供給源設定では達成することが困難である。また、子癇前症の診断は、子癇前症が慢性高血圧(crHTN)(例えばspPEとして公知の事例)または慢性腎疾患と共に存在する場合、高い供給源設定であっても、母子医学の専門家に難題を与え続ける。しばしば高血圧または蛋白尿の最小量または非存在を示す単発的な神経学的症状、右上四円分の痛み、肝臓酵素の上昇および尿量減少などの「典型的でない」臨床症状発現によって他の課題が提起される。高供給源設定において、これらの女性は、第三次レベルの病院に入院して、連続的な血圧および胎児のモニタリングに沿って4〜6時間ごとに多くの血液および尿の実験室精密検査を受ける。多くの低供給源設定および発展途上国において、これは実際に達成可能ではない。
【００６０】
国連児童基金(UNICEF)によると、発展途上国において、80%の女性が、少なくとも妊娠の際に、熟練した健康提供者からの出生前ケア(antenatal care)(ANC)を受けている。しかしながら、ANC通院の質および回数は、子癇前症の効果的な検出のためには最適なものに及んでいない。出生前ケアの実施単独では子癇の予防に効果的でないことが示されているので、各出生前ケアの通院における血圧および蛋白尿の測定の失敗は、機会の消失を示す。実際に、出生前ケアの通院の際に、多くの女性は、タンパク質について尿をスクリーニングされるよりも、血圧を測定されているように思われる。明らかに、蛋白尿を評価することなく、crHTNおよび妊娠性高血圧(gestHT)などの良性妊娠関連高血圧症状から、子癇前症の適切なスクリーニングまたは特異な診断は達成できない。低供給源設定における子癇前症の検出のための蛋白尿の評価を改善することは、隔たりを埋める可能性を有する。
【００６１】
臨床設定において子癇前症を規定(ruling-in)または除外(ruling-out)するために意義のあるものとなるために、蛋白尿を定量的に評価し得る。水分補給(hydration)、姿勢および妊娠自体に伴う生理学的な変化は、尿中に存在するタンパク質の量を変化させる。これらの理由のために、妊娠における蛋白尿評価のための「黄金」標準は、定期的な(24時間)尿の採取である。米国およびカナダにおいて、子癇前症であると疑われるほとんどの女性は、採取の際に入院するが、他の女性は、外来患者として管理され得、自宅で24時間の尿試料を採取するように指示されることがある。完全試料を採取する負担、および各排尿(void)の間の冷却のための必要性は、不従順および試験の不正確さをもたらす。24時間の採取の完了を試験するカナダにおける試験により、子癇前症について評価された女性の検体の60%までが体積的に不適当であることが見出された。全ての上記の理由のために、尿計量棒は、24時間蛋白尿よりも正確さが低いことが知られているが、子癇前症スクリーニングのための一般的な方法となっている。
【００６２】
いくつかの試験により、尿計量棒は、実質的な偽陽性および偽陰性を伴い、このために尿計量棒は妊娠女性において蛋白尿の検出または除外が信頼できないものとなることが示された。900名を超える女性の予想試験により、低リスク集団に割り当てられた場合、高血圧がない際の計量棒は、子癇前症の発症について不十分な予測物である(例えば高い偽陽性割合)ことが示された。該試験において約40%の女性は、妊娠の際に少なくとも1つの+1以上の結果を有した。しかしながら、4%が子癇前症を発症しただけであった。泌尿器感染、膣分泌物、血液または精液による尿の汚染が高い偽陽性示数の最も頻繁に起こる原因である。計量棒示数の患者自身の評価はさらに、看護師の読み取りと比較した場合、陽性度を過大評価することが見出された。計量棒はまた、訓練を受けた職員の間であってもエラーの重要な原因として挙げられる、適切な保管、取り扱いおよび主観的な視覚的読み取りを必要とする。また、計量棒に使用される比色定量試薬(例えばテトラブロモフェノールブルー)は、子癇前症の尿中に排出されるタンパク質のわずかな画分のみを検出することが良く知られている。例えば、ベンスジョーンズタンパク質に類似するIgGの2種類のタンパク質軽鎖および断片化されたアルブミンは、子癇前症と病理学的に関連し、0の計量棒反応を生じる。これは、計量棒が全体量を過小評価することがあり、スクリーニングの際に尿中に存在するタンパク質の種類に関連する重要な定量的データを欠如するということを示唆する。
【００６３】
いくつかの態様において、(1)第1のレベルの出生前ケア診療所に従順で、(2)計量棒と少なくとも同等に使用が簡易であるが子癇前症の蛋白尿についてより特異的であり、(3)定量スケールにおいてより再現性が高く、(4)結果を予測する能力を有する方法および組成物(例えばキット)が本明細書において提供される。
【００６４】
いくつかの態様において、本開示の方法および組成物は、理想的な診断についてASSURED基準(感染のリスクのあるものに対して手ごろであり、感受性がありかつ特異的であり、使用者に使いやすいものであり、迅速かつ丈夫であり、装備品がなく、必要な場所に送達される(Affordable for those at risk for infection, Sensitive and Specific, User-Friendly, Rapid and robust, Equipment-free, and Delivered to those in need))に一致する。驚くべきことに、子癇前症を有する女性は、尿中に高レベルの異常折り畳みタンパク質を排泄する。これは重症度を増加させ、臨床的な症状発現の開始前の10週目まで進行する。原則的に、この現象は、子癇前症を、アルツハイマー病およびプリオン病と同様のタンパク質立体構造障害として分類する。さらに、異常折り畳みタンパク質の存在は、特定の色素(例えばアゾ色素コンゴーレッド)を使用して、子癇前症を有する女性から得られた尿中、およびいくつかの例において血液中に検出され得る。例えば、コンゴーレッドは、自己集合(self-assembling)特性を有し、大きな不溶性オリゴマーの形成を開始し得、次いで多くのβシート構造を有するアミロイドタンパク質に結合する。コンゴーレッドは、試料(例えば尿試料)中のタンパク質内に存在する場合、βシート構造内にインターカレートされ得る。コンゴーレッドドット試験と称される子癇前症のための単純な比色定量尿診断試験が本明細書中に記載される。尿中の異常折り畳みタンパク質の検出は、無作為的な単一排泄(void)である試料中で評価される場合であっても、子癇前症についての診断的および予後的な値を有する。この理由は、現在使用される方法(例えば24時間尿採取における計量棒および比濁分析)とは対照的に、本明細書に示されるように、異常折り畳みタンパク質の存在は、非特異的蛋白尿の存在よりも密接に、子癇前症病態生理学に関連することである。そのため、いくつかの例において、子癇前症の診断が考えられる場合、尿中の異常折り畳みタンパク質についての陽性の結果は、臨床的に重要な蛋白尿の原因となるタンパク質も異常に折りたたまれていることを示唆する。異常折り畳みタンパク質の存在のこの量的な所見は、妊娠時に起こる他の高血圧症状を伴わない子癇前症に特有の特徴である。
【００６５】
部分的にこの評価に基づいて、例えば尿中の異常折り畳みタンパク質に基づいた高い程度の確実性を有する子癇前症の診断を確立するための方法および組成物(例えばキット)が本明細書において提供される。該方法および組成物は、十分に信頼性のある迅速な診断スクリーニングを可能にして、適切な介入を使用し得るので、健康管理提供者に重大で臨床的な利点を提供する。
【００６６】
本開示のいくつかの局面は、被験体(例えば妊娠女性)から得られた尿試料が、異常折り畳みタンパク質を含むかまたは含まないことを決定する方法に関する。本開示の他の局面は、被験体(例えば妊娠女性)から得られた試料(例えば尿試料)中の異常折り畳みタンパク質を検出する方法に関する。タンパク質折り畳みは、タンパク質がその最少エネルギー形態をとるプロセスである。それぞれのタンパク質は、mRNAの配列からアミノ酸の直鎖に翻訳される際に、折りたたまれていないポリペプチドまたはランダムコイルとして存在する。タンパク質折り畳みの際に、ポリペプチドは、ランダムコイルからその特徴的および機能的な三次元構造に折りたたまれる。異常折り畳みタンパク質は、タンパク質が誤った折り畳み経路またはエネルギー最少集中(funnel)に従った際に生じ得、異常折り畳みは自然発生的に起こり得る。異常折り畳みタンパク質は、異常な分解、クリアランス機構またはタンパク質集合(crowding)によっても生じ得る。異常折り畳みタンパク質は、常にではないが典型的に、不溶性であり、長い直鎖またはアミロイド堆積物と称される線維状の凝集物を形成する傾向がある(本明細書において参照により援用されるDobson C. M. Nature 426, 884-890, 2003)。個々にまたはヘテロ共凝集物として検出され得る異常折り畳みタンパク質の例としては、限定されることなく、Serpina-1、アルブミン、IgGκ遊離軽鎖(κFLC)、セルロプラスミン、インターフェロン誘導性タンパク質6-16(IFI6、G1P3としても公知)、アミロイド前駆体タンパク質(APP)が挙げられる。いくつかの態様において、異常折り畳みタンパク質は、コンゴーレッド好性タンパク質またはコンゴーレッド好性タンパク質凝集物である。いくつかの態様において、異常折り畳みタンパク質は、アミロイドタンパク質またはβシート凝集物であり得る。いくつかの態様において、異常折り畳みタンパク質は、Serpina-1およびアルブミンの非無作為的切断断片の凝集物である。いくつかの態様において、異常折り畳みタンパク質は、アミロイド性タンパク質であり、例えば前線維状オリゴマーおよび環状のプロト原線維(protofibril)などのエピトープを提示し得る。
【００６７】
尿試料は、例えば限定されないが、ふた付きカップ(例えば滅菌カップ)を使用するクリーンキャッチ法を使用するなどの任意の標準的な手段により回収され得る。いくつかの態様において、尿試料は、尿が被験体の膀胱中に1〜5時間(例えば1、2、3、4または5時間)ある場合に回収される。いくつかの態様において、尿試料は、尿が被験体の膀胱中に1時間未満または5時間より長くある場合に回収される。被験体から回収された全尿試料を必ずしも本開示の方法で使用する必要はないことが理解されるべきである。いくつかの態様において、本開示の方法における使用のための「尿試料」(例えば、色素と合わされる試料)は、10μl〜1ml以上である。いくつかの態様において、尿試料は50μl〜500μlである。いくつかの態様において、尿試料は10μl、20μl、30μl、40μl、50μl、60μl、70μl、80μl、90μl、100μl、110μl、120μl、130μl、140μl、150μl、160μl、170μl、180μl、190μlまたは200μlである。いくつかの態様において、尿試料は100μl、200μl、300μl、400μlまたは500μlである。
【００６８】
被験体は、尿中に異常折り畳みタンパク質を有することが疑われる任意の被験体であり得る。いくつかの態様において、被験体は女性、例えば妊娠女性である。いくつかの態様において、被験体は、子癇前症を有することが疑われるおよび/または子癇前症を発症するリスクを有する妊娠女性である。本開示の尿試料は、妊娠の1〜20週目、20〜40週目もしくは1〜40週目またはそれ以降の女性から得られ得る。いくつかの態様において、尿試料は、妊娠の1〜5、1〜10、1〜15、5〜10、5〜15、5〜20、10〜15、10〜20または15〜20週目の妊娠女性から得られる。いくつかの態様において、尿試料は、妊娠の15〜20、15〜25、15〜30、15〜35、15〜40、20〜30、20〜35、20〜40、25〜25または25〜40週目の妊娠女性から得られる。いくつかの態様において、尿試料は、妊娠の1週間未満(例えば妊娠の1、2、3、4、5または6日目)の妊娠女性由来であり得る。いくつかの態様において、尿試料は、妊娠の第1のトリメスター、第2のトリメスター、または第3のトリメスターにある女性から得られる。いくつかの態様において、尿試料は、(例えばコンゴーレッド好性のベースラインレベルを評価するために)妊娠していない女性および妊娠していると思われる女性から得られる。いくつかの態様において、尿試料は、分娩後の女性から得られる。
【００６９】
いくつかの態様において、尿試料は、健康管理提供者による任意のまたは全ての出生前および分娩後健康診断の時点で妊娠女性から得られる。例えば、尿試料は、第1の出生前通院時、妊娠の28週目まで4週間毎、妊娠の36週目まで2〜3週間毎、妊娠の最終月の間に少なくとも毎週、出産後、健康管理施設からの退院の時点および/または任意の出生後健康診断の時点で得られ得る。尿は、既存の医学的問題を有する女性、妊娠の際に合併症を発症する女性または妊娠している十代について、より高い頻度で得られ得る。
【００７０】
種々の神経変性および非神経学的疾患は、異常折り畳みタンパク質の存在により起こるかまたは該存在を特徴とする。例えば、異常折り畳みタンパク質の蓄積により起こる最も一般的な神経変性疾患は、アルツハイマー病である。パーキンソン病およびハンチントン病は同様のアミロイド起源を有する。さらに別の例は筋萎縮性側索硬化症である。したがって、いくつかの態様において、被験体は妊娠女性ではない。いくつかの態様において、被験体は、神経学的(例えば神経変性)障害を有すると疑われる、および/または該障害を発症するリスクを有するヒトである。いくつかの態様において、被験体は、非神経学的障害を有することが疑われる、および/または該障害を発症するリスクを有するヒトである。
【００７１】
本開示のいくつかの局面は、被験体(例えば妊娠女性)由来の尿試料と、異常折り畳みタンパク質に結合し(例えば優先的に結合する)、またセルロースまたは遊離ヒドロキシル基を含む任意の物質に結合する色素を合わせて、尿および色素の溶液を生成する工程を含む。尿試料および色素(または1つより多くの色素)は、同じ容器中に存在する場合(例えば尿試料が、色素を含む容器に添加される場合、または色素が、尿試料を含む容器に添加される場合、または尿試料および色素が同時に合される場合)に「合わされる」とみなされる。したがって、「尿および色素の溶液」は、色素を含む尿のことをいう。該溶液は、例えば水またはバッファなどのさらなる成分を含んでも含まなくてもよいことが理解されるべきである。いくつかの態様において、被験体由来の尿試料は、色素と合わされる前に(例えば水またはバッファで)希釈される。いくつかの態様において、尿試料は希釈されないままである。
【００７２】
異常折り畳みタンパク質に結合する色素は、異常折り畳みタンパク質に親和性を有する(例えばインターカレートされる)ものである。異常折り畳みタンパク質に結合する色素の非限定的な例は、コンゴーレッドである。コンゴーレッドは、3,3'-([1,1'-ジフェニル]-4,4'-ジイル)ビス(4-アミノナフタレン-1-スルホン酸ンのナトリウム塩である。これは水溶性の二次ジアゾ色素であり赤色コロイド溶液を生じる。異常折り畳みタンパク質に結合する他の色素が本開示に従って使用され得、限定されることなく、例えば最初は綿を染色するために植物から抽出されたかまたは開発され、その後アミロイドを染色することが見出されたものなどの他の直接色素(典型的に媒染剤を必要とせずに水素結合を介して作用するために直接色素としても知られる)が挙げられることが理解されるべきである。本明細書において提供されるような使用のためのかかる直接色素の例としては、限定されることなく、シリウスレッドF3B(CI 35780)、ベンゾスカーレット4BNS(CI 29200)、シリウススカーレットGG(CI 40270)、オレンジGおよびクリスタルバイオレットが挙げられる。本明細書において提供されるような使用のための色素のさらなる例としては、限定されることなく、チオフラビンTおよびチオフラビンSなどの蛍光色素が挙げられる。いくつかの態様において、本明細書において提供されるような使用のための色素は、エヴァンスブルー、トリパンブルー、アミノ-8-ナフタレンスルホネート(ANS)またはビス-アゾANSである。
【００７３】
セルロースに結合する色素は、セルロース線維に親和性を有する(例えばインターカレートされる)ものである。本開示に従って使用され得るセルロース線維に結合する色素の例としては、限定されることなく、コンゴーレッド、シリウスレッドF3B(CI 35780)、ベンゾスカーレット4BNS(CI 29200)、シリウススカーレットGG(CI 40270)、オレンジG、クリスタルバイオレット、チオフラビンS、チオフラビンT、エヴァンスブルー、トリパンブルー、ANSおよびアゾ-ビスANSが挙げられる。
【００７４】
本開示のいくつかの局面は、尿および色素の溶液を、セルロースを含む表面に適用して、表面上のスポットを生成する工程を含む。セルロースは、式(C6H10O5)nを有する有機化合物、多糖類であり、数百〜10000を超えるβ(1→4)結合Dグルコース単位の直鎖を含む。用語「セルロース」は、ニトロセルロースを除外する。したがって、セルロースを含む表面は、ニトロセルロースを含まない。すなわち、セルロースを含む表面は、ニトロセルロースを有さない(含まない(is free of))。しかしながら、いくつかの態様において、セルロースを含む表面は、使用する表面および色素の種類に応じてニトロセルロースをさらに含んでもよい。
【００７５】
例えばコンゴーレッドなどの色素は、セルロースに対し非共有結合的親和性を有すると思われ、そのためセルロースに結合する。セルロースに関して、コンゴーレッドは、多糖類鎖のヒドロキシル基と、色素のアミノ基の間の水素結合により吸着されると考えられる。セルロースを含む表面の例としては、紙表面(例えば通常の紙、粘着性の裏張りを有する紙の標識)が挙げられるが、本明細書における使用のためのセルロースを含む表面はそのようには限定されない。セルロースを含む他の表面としては、綿、リネン、またはエラスチンを含む表面が挙げられる。例えばコンゴーレッドが結合するセルロースを含む表面は、色素適合性表面またはコンゴーレッド適合性表面と称され得る。本明細書において使用される表面は、異常折り畳みタンパク質の非存在下で色素が表面に結合し得る場合、使用される特定の色素に「適合性である」とみなされる。驚くべきことに、本開示は、セルロースを含む表面(セルロース性表面(cellulosic surface)と称される)の全てが本明細書において提供される方法および組成物における使用に適するわけではないことを示す。セルロース性表面の個々の種類内であっても、適切さは変わる。例えば、試験された50種類の紙において、結果は、数種類の紙のみが適切であったことを示した。セルロース性表面(例えば紙)の適切さは、例えば表面の接触角、表面の多孔性、表面の蛍光(添加剤の反射である)、および環境(本開示の方法が実施される環境の温度および湿度)などのいくつかの要因に基づく。したがって、色素が異常折り畳みタンパク質およびセルロースに結合し、続いてセルロースを含む表面に沿って拡散する(または色素が拡散しない)条件は、前述の要因のいずれか1つ以上に依存する。該表面に適合される場合に、(1)異常折り畳みタンパク質および色素を含む尿の溶液が、溶液を適用した点からセルロース性表面へと拡散(例えば放射状に拡散)し(例えば図1、症例1、「試料」に示される)、および(2)(異常折り畳みタンパク質ではなく)色素を含む尿の溶液において色素が溶液の適用点からセルロース性表面へと放射状に拡散しないか(例えば図1、症例1、「ブランク」)、または(異常折り畳みタンパク質ではなく)色素を含む尿の溶液において、色素が、異常折り畳みタンパク質および色素を含む溶液と比べて低い程度に拡散(例えば放射状に拡散)するならば、セルロース性表面は、本明細書において提供される使用に適するとみなされる。
【００７６】
いくつかの態様において、相関係数ρは、適切な紙と適切でない紙を区別するために使用される。適切な紙と適切でない紙の間の相関係数ρの正確なカットオフは、異なる種類の「通常の」紙のρと、接触角θとの関係を決定することにより規定される。いくつかの態様において、0.5以下(例えば0.1〜0.5)の相関係数ρは、適切な紙を示す。例えば0.1、0.2、0.3、0.4または0.5のρは、適切な紙を示す。
【００７７】
「表面上のスポット」は、溶液、例えば(尿中に異常折り畳みタンパク質を有するかまたは有さない)尿および色素の溶液の適用後に、表面上に形成される検出可能(例えば観察可能、可視)なスポットをいう。理論に拘束されることなく、表面中のセルロース線維および尿中の異常折り畳みタンパク質は、色素との結合について「競合する」。尿試料が異常折り畳みタンパク質を含む場合、色素(例えばコンゴーレッド)は異常折り畳みタンパク質に結合し、結合しなかった色素(例えば異常折り畳みタンパク質に結合しない色素)の量は、比例して減少する。異常折り畳みタンパク質および色素を含む尿の溶液を、適切なセルロース性表面(例えば通常の紙)に適用する場合、異常折り畳みタンパク質および色素を含む尿の溶液は、可視の適用スポット(表面上のスポットと称する)から拡散(例えば放射状に拡散)し、色素の拡散は検出可能である。例えば、異常折り畳みタンパク質および色素を含む100μlの試料(例えば尿)の溶液を適切なセルロース性表面に適用する場合、異常折り畳みタンパク質および色素を含む試料の溶液は、例えば適用スポットから5〜7mmの距離まで放射状に拡散し、色素の拡散は検出可能である。この色素の拡散の程度は、「目に見える程度まで拡散すること」または「目に見える程度まで放射状に拡散すること」の一例である。したがって、放射状に拡散し、特徴がより大きくなる場合、(例えば図1、症例1、「試料」に示されるように)異常折り畳みタンパク質および色素を含む尿を有する溶液の拡散により形成される均一な円は、尿試料中の異常折り畳みタンパク質の存在を示す。すなわち、該尿試料は異常折り畳みタンパク質を含む。
【００７８】
対照的に、試料(例えば尿試料)が異常折り畳みタンパク質を含まない場合、溶液中の色素(例えばコンゴーレッド)はセルロース性表面のセルロース線維に結合しない。例えば尿および色素を含むが異常折り畳みタンパク質を含まない溶液を適切なセルロース性表面(例えば通常の紙)に適用した場合、色素は適用スポット内またはその近くの表面のセルロース線維に結合し、溶液中の尿は、適用スポットから(例えば放射状に)拡散し、色素は適用スポットから拡散しないか、または色素は、異常折り畳みタンパク質を含む尿を有する溶液中の色素と比較してより低い程度に拡散する。例えば、(異常折り畳みタンパク質を含まず)色素を含む尿を有する100μlの溶液を適切なセルロース性表面に適用する場合、試料は、適用スポットから5〜7mmの距離まで(例えば放射状に)拡散し得、色素は、適用スポットからわずか1〜3mmの距離まで(例えば放射状に)拡散し得る。この色素の拡散の程度は、「目に見える程度まで拡散しないこと」または「目に見える程度まで放射状に拡散しないこと」の一例である。したがって、特徴がより小さくなると、色素の目に見える拡散の欠如により形成される(例えば図1、症例1、「ブランク」に示されるような)不均一な円は、試料中の異常折り畳みタンパク質の非存在を示す。すなわち、該試料(例えば尿試料)は、異常折り畳みタンパク質を含まない。
【００７９】
本開示の異常折り畳みタンパク質を検出する方法は、部分的に、クロマトグラフィーの原理に基づき、いくつかの態様においてはクロマトグラフィーの結果の視覚的評価に基づくことが理解されるべきである。当業者は、特に本明細書に記載されるタンパク質および色素の化学的性質を考慮すると、「目に見える程度」の拡散が意味するものを理解する。色素が中心点から離れて(例えば放射状に)広がることを決定し得る場合、色素は、表面の中心点から目に見える程度に拡散すると考えられる。色素が異常折り畳みタンパク質に結合して表面には結合し得ないためにこの広がりが生じる。比較により、色素が(中心点から1〜3mmなどの限定された程度まで拡散し得るが)中心点から(例えば放射状に)広がらなかったことが決定され得る場合、色素は、眼に見える程度まで拡散しないとみなされる。表面に適用した場合に色素が異常折り畳みタンパク質に結合せず、表面に結合し得、放射状に拡散するために、この限定された広がりが生じる。
【００８０】
いくつかの態様において、試料(例えば尿)は、異常折り畳みタンパク質に対して「強く陽性」であり得る(例えば溶液中の色素の全てまたはほとんどに結合するのに十分な異常折り畳みタンパク質を含む)。かかる態様において、特徴的な均一の円は、例えば図1、症例1、「試料」に示されるように本開示の方法により生じ得る。他の態様において、試料は、異常折り畳みタンパク質について「弱い陽性」であり得る(例えば、異常折り畳みタンパク質を含むが、溶液中の色素の全てまたはほとんどに結合するには十分ではない)。かかる態様において、均一な「円光」を有する特徴的な中心スポットは、例えば図1、症例2、「試料」に示されるように、本開示の方法により生じ得る。円光は典型的に、異常折り畳みタンパク質に結合して中心スポット領域のセルロースには結合しない色素の一部の拡散により生じる。
【００８１】
本開示のいくつかの局面は、例えばセルロースを含む表面上のスポットを、異常折り畳みタンパク質および色素を含む尿(または他の試料)の溶液の拡散が起こる条件下で維持する工程を含む。いくつかの態様において、本開示の方法の1つの利点は、結果を得るために必要な時間が短いことである。いくつかの態様において、溶液またはスポットは、表面上で1〜5分またはそれ以上維持される。例えば、スポットは、1〜3分間または1〜2分間維持され得る。いくつかの態様において、スポットは2分間維持される。いくつかの態様において、スポットは表面上で1分未満の間維持される。いくつかの態様において、維持はまた、溶液の拡散を支持する特定の試料の評価の時間(例えば1〜5分)、環境(例えば温度および湿度)を維持することをいうことが理解されるべきである。本開示の診断試験を完了するための時間は、環境および表面の種類(例えばセルロース性表面)に応じて変化し得ることも理解されるべきである。
【００８２】
本開示のいくつかの局面は、表面を通過する溶液が着色される場合、尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むことを決定する工程、または表面を通過する溶液が無色である場合、尿試料が異常折り畳みタンパク質を含まないことを決定する工程を含む。例えば、色素がコンゴーレッドである場合、表面を通過する溶液は、尿試料中に異常折り畳みタンパク質が存在する場合、(該溶液がコンゴーレッドを含むため)赤色、ピンク色または紫色に見える。理論に拘束されることなく、これは、異常折り畳みタンパク質に結合して表面に結合し得ない(例えば異常折り畳みタンパク質の結合による飽和の結果として)コンゴーレッドが、表面を通過するためである。反対に、尿試料中に異常折り畳みタンパク質が存在しない場合は、表面を通過する溶液は(該溶液がコンゴーレッドを含まないために)無色に見える。理論に拘束されることなく、これは、遊離コンゴーレッドが表面に結合して、表面がフィルターとして機能し、異常折り畳みタンパク質を含まずに、コンゴーレッドを含まない溶液のみを通過させるためである。
【００８３】
いくつかの態様において、セルロースを含む表面は、通常の紙の表面である。通常の紙としては、コーティングを有さない紙が挙げられる。コーティングされた紙は、つや消し、半つや消しまたはシルクおよび光沢(例えば片面または両面を炭酸カルシウムまたは陶土の薄い層で被覆される)に分けられ得る。よって、つや消し、半つや消しもしくはシルクまたは光沢のコーティングを有さない紙が「通常の紙」の定義に入る。コーティングされていないプリンター紙は、通常の紙の非限定的な一例である。添加剤(例えばチョークまたは陶土)を有さない紙も「通常の紙」の定義に含まれる。いくつかの態様において、紙は、重量で特徴付けられ得る。紙に割り当てられた重量は、一連の紙(例えば500枚で1枚が17インチx22インチ)の重量である。いくつかの態様において、通常の紙は、20lb、24lbまたは32lbの重量を有する。いくつかの態様において、紙は、密度で特徴付けられ得る。いくつかの態様において、通常の紙は800kg/m3(50lb/ft3)密度を有する。
【００８４】
いくつかの態様において、セルロースを含む表面は、粘着性の裏張りをさらに含む。いくつかの態様において、粘着性の裏張りを有するセルロースを含む表面は、ラベル(例えば市販の自己粘着性ラベル)である。本明細書に提供される結果は、いくつかの態様において、粘着性裏張りは、紙の表面がしわになることを防ぎ、より正確な結果を提供することを示す。しかしながら、セルロースを含む表面は、粘着性の裏張りを必要としない。
【００８５】
いくつかの態様において、溶液(例えば尿および色素を含む溶液)中の色素の濃度(または2つ以上の色素の組合せの濃度)は、0.01%〜1.0%以上である。例えば、溶液中の色素の濃度(または2つ以上の色素の組合せの濃度)は、0.01%〜0.1%、0.01%〜0.2%、0.01%〜0.3%、0.01%〜0.4%、0.05%〜0.1%、0.05%〜0.2%、0.05%〜0.3%、0.05%〜0.4%、0.05%〜0.5%、0.05%〜0.6%、0.05%〜0.7%、0.05%〜0.8%または0.05%〜0.9%であり得る。いくつかの態様において、溶液中の色素の濃度(または2つ以上の色素の組合せの濃度)は、0.01%、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%、0.4%、0.45%、0.5%、0.55%、0.6%、0.65%、0.7%、0.75%、0.8%、0.85%、0.9%、0.95%または1.0%である。いくつかの態様において、溶液中の色素の濃度(または2つ以上の色素の組合せの濃度)は、0.1%である。
【００８６】
いくつかの態様において、水溶液(例えば色素を含む水または水性バッファ)中の色素の濃度(または2つ以上の色素の組合せの濃度)は、0.2%〜1.0%以上である。例えば、溶液中の色素の濃度(または2つ以上の色素の組合せの濃度)は、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%または1.0%であり得る。
【００８７】
いくつかの態様において、水溶液(例えば色素を含む水または水性バッファ)の体積は、1μl〜10μl以上である。例えば、水溶液の体積は、1μl、1.5μl、2μl、2.5μl、3μl、3.5μl、4μl、4.5μl、5μl、5.5μl、6μl、6.5μl、7μl、7.5μl、8μl、8.5μl、9μl、9.5μlまたは10μlであり得る。
【００８８】
本発明の陽性対照は、異常折り畳みタンパク質を含むことが分かっている試料(例えば尿試料)から生成される。同様に、本開示の陰性対照は、異常折り畳みタンパク質を含まないことが分かっている試料(例えば尿試料)、または異常折り畳みタンパク質を含まない水、食塩水、リン酸緩衝食塩水(PBS)もしくは他の塩溶液から得られる。陽性対照および/または陰性対照が生成される条件は、陽性対照または陰性対照と比較して、本開示方法が、特定の尿試料について実施される条件と同様である。例えば、妊娠女性由来の試験尿試料を、妊娠女性由来の異常折り畳みタンパク質を含む尿試料(陽性対照)および/または妊娠女性由来の異常折り畳みタンパク質を含まない尿試料(陰性対照)と比較する。試験試料により得られた結果が陽性試料により得られた結果と同等である場合、試験試料は異常折り畳みタンパク質を含むと決定される。試験試料により得られた結果が陰性試料により得られた結果と同等である場合、試験試料は異常折り畳みタンパク質を含まないと決定される。さらに、陽性対照および/または陰性対照を生成する方法に使用されるセルロースを含む表面(例えば通常の紙)の種類は、試験尿試料を評価する方法に使用されるセルロースを含む表面の種類と同じである。陽性対照および/または陰性対照を生成する方法に使用される溶液の体積ならびに色素(1つまたは複数)の種類(例えばコンゴーレッド)および濃度は、試験尿試料を評価する方法に使用される溶液の体積ならびに色素(1つまたは複数)の種類および濃度と同じであることも理解されるべきである。
【００８９】
いくつかの態様において、試験試料結果についての比較のための陽性および陰性の結果は、試験キット中で画像として提供される。
【００９０】
本開示のいくつかの方法は、被験体(例えば妊娠女性)由来の試料(例えば尿試料)が異常折り畳みタンパク質を含むかどうかを確認するためのさらなる工程を含む。例えば、被験体由来の尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むと同定された後、さらなる希釈された尿試料が同時に評価され得る。これは、少なくとも2つの方法で実施され得る。一例において、第1の尿試料は、(例えばクリーンキャッチを使用して)被験体から得られ、第1の尿試料の第1の部分は、異常折り畳みタンパク質の存在について評価される。次いで、第1の試料の第2の部分は、異常折り畳みタンパク質の存在について同様に評価される。第2の部分は希釈され得、次いで異常折り畳みタンパク質の存在について同時に評価される。第1の尿試料由来の尿の第1および第2の部分(希釈されるかまたは希釈されない)の両方が異常折り畳みタンパク質を有することの決定は、被験体が異常折り畳みタンパク質を有する尿を有することの確認となり得る。代替的に、第1の尿試料は(例えばクリーンキャッチを使用して)得られ、第1の尿試料の一部は、異常折り畳みタンパク質の存在について評価される。次いで、一定時間(例えば数時間)の後、同じ被験体から第2の尿試料を回収して、第2の尿試料の一部を、異常折り畳みタンパク質の存在について同様に評価する。第2の部分を希釈して、次いで異常折り畳みタンパク質の存在について同様に評価し得る。同じ被験体由来の尿の第1および第2の試料(希釈されるかまたは希釈されない)の両方が異常折り畳みタンパク質を有するという決定は、被験体が異常折り畳みタンパク質を有する尿を有することの確認となり得る。
【００９１】
本開示のいくつかの局面は、妊娠女性由来の試料(例えば尿試料)と、異常折り畳みタンパク質および例えばセルロースに結合する第1の色素、ならびに第1の色素とは色が異なりかつ異常折り畳みタンパク質およびセルロースに結合しない第2の色素を合わせて、尿および2つの色素の溶液を生成する工程を含む。典型的に、1つの色素の色は、もう一方の色素の色とは視覚的に異なる。例えば、第1の色素は赤色であり得、第2の試料は青色であり得る。いくつかの態様において、第1の色素はコンゴーレッドである。いくつかの態様において、第2の色素はエリオグラウシン(FD & C Blue No. 1とも称される、食物着色剤)などの水溶性色素である。他の水溶性色素(例えば他のFD & C着色剤)を、異常折り畳みタンパク質およびセルロースに結合しない第2の色素として使用してもよく、限定されることなく、FD & C Red No. 40、FD & C Yellow No. 5、FD & C Yellow No. 6、FD & C Blue No. 2、FD & C Red No. 3またはFD & C Green No. 3が挙げられる。
【００９２】
いくつかの態様において、相関係数ρは、非子癇前症試料(例えば尿試料)と子癇前症試料(例えば尿試料)を区別するために使用される。非子癇前症尿試料と子癇前症尿試料を最良に識別する相関係数ρの正確なカットオフは、子癇前症を有さない妊娠女性、子癇前症を有する妊娠女性および他の妊娠症状を有する妊娠女性由来の尿試料の大きなセットを試験することにより規定される。いくつかの態様において、0.5以上(例えば0.5〜1.0)の相関係数ρは子癇前症を示す。例えば0.5、0.6、0.7、0.8、0.9または1.0のρは、適切な紙を示す。
【００９３】
いくつかの態様において、相関係数はアルゴリズムを使用して計算される。いくつかの態様において、該アルゴリズムは、携帯電話またはタブレットのアプリケーションとしてプログラムされる。いくつかの態様において、該アルゴリズムは、照明を補償し、白色バックグラウンドを差し引き、次いで拡散したスポットのカラー画像の異なる色のチャネル(例えば赤色および青色のチャネル)の間の相関係数を計算する。チャネルの間の相関係数は、非子癇前症試料(例えば尿試料)と子癇前症試料(例えば尿試料)の間で大きく異なる。この情報は、例えば以下のように、計算およびスクリーニングのアプリケーション(例えばソフトウェアアプリケーション)中で使用し得る。
【００９４】
較正：較正アプリケーションの目的は、正常試料と子癇前症試料(例えば尿試料)の間のエラー強さのある識別のために、使用者が、セルロース性表面(例えば紙)などの表面を選択すること、および色素(例えばコンゴーレッドおよび青色食物色素)の濃度を選択することを補助することである。2つの基準：(1)カメラノイズが相関計算に影響を及ぼさないような両方の色チャネルにおける十分なシグナル；および(2)第2の色素(例えば青色食物色素)が均一に拡散することを可能にし、異常折り畳みタンパク質に結合しない場合に第1の色素(例えばコンゴーレッド色素)を結合させる表面(例えば紙)の線維構造を使用し得る。したがって、適切な表面(例えば紙)および色素濃度の選択は、両方の色チャネル(例えば赤色および青色チャネル)において均衡のとれたシグナル、ならびに非子癇前症試料と子癇前症試料(例えば尿試料)の間の相関係数において大きな差を与えるはずである。
【００９５】
いくつかの態様において、較正手法は、非子癇前症試料および子癇前症試料(例えば尿試料)において異なる濃度の第1の色素(例えばコンゴーレッド)および第2の色素(例えば青色食物色素)を注意深く導入し、混合物の液滴を異なる表面(例えば紙)上に適用し、試料を拡散させ、拡散した試料の写真を撮ることにより機能する(図27Aおよび27B参照)。較正ソフトウェアは、2つのチャネル(例えば赤色および青色チャネル)のシグナルの差のパーセンテージ、および2つのチャネルの間の相関係数を測定する。相関係数およびシグナルの差のパーセンテージのプロットにより、どの濃度および表面(例えば紙)が使用に適切であるかが明らかになる。図27Aおよび27Bにおいて、例えば異なる割合のコンゴーレッド/青色色素を使用して、非子癇前症尿(a)および子癇前症尿(b)を試験し、赤色チャネルと青色チャネルの間のシグナルの差が、例えば試料8および9におけるシグナルの差よりも小さく、赤色チャネル-青色チャネルの相関係数が、非子癇前症尿および子癇前症尿について充分に異なるので、試料2〜試料7由来のコンゴーレッド/青色色素の結果のいずれかが許容可能である。
【００９６】
スクリーニング：表面(例えば紙)および色素濃度が較正されると、異常折り畳みタンパク質のスクリーニングのためにソフトウェアアプリケーション(「app」)を任意に含むキットを使用し得る。尿を第1および第2の色素と混合して、例えば混合物の液滴をセルロース性表面上に拡散させ、拡散した試料(例えば液滴)の写真を、例えばスマートフォンまたはタブレットのカメラで撮影する。次いでソフトウェアアプリケーションにより白色バックグラウンドを使用して、照明色を予測および補償する。次に、画像から背景を除き、試料に対応するピクセルのみを残す。次いで2つの色チャネル(例えば赤色および青色チャネル)の間の相関係数を計算して閾値について比較し、異常折り畳みタンパク質の存在を示す。いくつかの態様において、0.5〜1.0(例えば0.85)の相関係数の閾値は、図27Aおよび27Bで例示されるように、正常尿と子癇前症尿を区別する。
【００９７】
本開示のいくつかの局面は、試料(例えば尿試料)中の異常折り畳みタンパク質を検出するための組成物およびキットを提供する。いくつかの態様において、かかる組成物およびキットを使用して子癇前症を診断し得る。本開示のキットの非限定的な例を図25Aおよび25B、ならびに図26Aおよび26Bに示す。
【００９８】
図25Aおよび25Aは、3回折り畳み形態のコンゴーレッドドット簡易キットおよびコンゴーレッドドット定量キットのそれぞれの例の内部を示し、上パネル、中パネルおよび下パネルは例えばカードストック(cardstock)で作製する。「折り畳み」形態において、上パネルおよび下パネルで覆われる中パネルにより袋が形成される。下パネルの湾曲したスリット(湾曲した点線で示される)は、袋を閉じる折り畳まれたフラップを受けるような位置および大きさである。
【００９９】
図25Aの上パネルは、キット中に提供され得る使い捨てピペットを示す。該ピペットは、色素(例えば5μl、0.5%のコンゴーレッドの溶液、または5μl、5%のコンゴーレッドの溶液+2.5μl、0.1%のエリオグラウシンの溶液)を予め充填され、密封され得る。次いでピペットを、予め形成されたスリット(2本の直線の点線で示される)により中パネルに固定し得る。色素(または2つの色素)を予め充填されたピペットの先端が袋の内側にあり、遮光されるようにスリットを配置する。いくつかの例において、キットにはピペットの密封された端を留めるためのデバイス(例えばネイルクリップまたは一対の小さなハサミ)が備えられる。
【０１００】
ピペットの下は、試料試験のためにセルロースを含む表面が備えられる領域である。表面は三つ折りのキットに固定される(例えば自己粘着性紙ラベル)。いくつかの態様において、表面にキットが備えられる。他の態様において、該表面は別々に提供される。それぞれの臨床現場について、表面は、例えば湿度および温度などの環境条件の違いによる適切さについての検証を分離する必要があり得る。
【０１０１】
下パネルは、強い陽性の試料、弱い陽性の試料および陰性の試料についての対照の一連の画像を含む。試験試料を、いずれか1つ以上の対照と比較して、試料の結果を決定し得る。
【０１０２】
図26Aに示されるキットはさらに、色較正スケールを含む(写真を方向づけて任意の光勾配を補正するように設計された、試験表面の左右に並んだ等級がついたバーで示される)。過剰な緑色(試験表面の上下に並んだバーで示される)は、カメラの任意の傾向を補正し、色を調整する。
【０１０３】
アレイキットの例を図3Cおよび図4(1)に示す。いくつかの態様において、コンゴーレッドドット定量アレイキットは、1つの表面(例えばセルロース性表面)上で複数の試験試料の評価が提供される以外、キットは基本的に同じである、コンゴーレッドドット定量キットの拡張である。
【０１０４】
したがって、本開示の種々の局面および態様は、尿(または他の試料)中の異常折り畳みタンパク質の効率的かつ正確な検出のために使用され得る診断方法およびキットを提供し、いくつかの場合、該検出は、特定の障害(例えば試験試料が妊娠女性から得られた尿である場合は子癇前症)を示す。
【実施例】
【０１０５】
実施例1
この実施例に示される実験は、例えば尿中の異常折り畳みタンパク質の迅速かつ正確な同定のための簡易な診断方法および組成物(例えばキット)の開発に関するものであった。妊娠女性において、尿中の異常折り畳みタンパク質の存在は、子癇前症の指標として使用し得る。既存のコンゴーレッドドット試験は、子癇前症のための診断および予後ツールとして使用し得る有効な試験である。しかしながら、ニトロセルロースおよびアルコール洗浄などの比較的高価な試薬を典型的に使用するコンゴーレッドドット試験は、完了するのに約5時間かかる。この試験の目的の1つは、例えばケアの点で、例えば健康管理提供者による妊娠健康診断において実行され得、また低供給源設定に適する、簡易化され、低コストでかつ効果的な診断方法および組成物を生成することであった。この目的に対して、いくつかの態様において、低コストで半定量的な結果を例えば2分以内、定量的な結果を例えば7分以内に提供する簡易化された紙ベースの方法および組成物が本明細書において提供される。
【０１０６】
子癇前症を診断するための簡易化された紙の方法の開発についての最初の工程として、50を超える異なる種類の紙の「適切さ」を分析した。驚くべきことに、例えばコンゴーレッドに結合した異常折り畳みタンパク質を検出するための表面としての使用について全ての紙が適するわけではない。本明細書における分析により、例えば通常の紙などのセルロース性表面がコンゴーレッドドット試験の化学的性質に積極的に関与することが示された。この紙のクロマトグラフィーにある化学的性質は複雑である。コンゴーレッドは、セルロース性遊離ヒドロキシル基との水素結合を介してセルロース線維に結合する。その平面分子構造のために、コンゴーレッドは、セルロース線維の間にインターカレートされる。βシートに富むために、セルロース線維と同様の空間的配置を有する異常折り畳みタンパク質にも同じ原理が適用される。対照的に、ニトロセルロースは、硝酸との反応によりエステル化されたヒドロキシル基を有する。ヒドロキシル基はすでに占有されているのでこれ以上コンゴーレッドに結合せず、そのためニトロセルロースはコンゴーレッドに結合せず、大きく不活性である。理論に拘束されることなく、セルロース性表面(例えば通常の紙)は、尿試料の異常折り畳みタンパク質と、コンゴーレッド結合について競合する。異常折り畳みタンパク質を含まない尿試料中では、コンゴーレッドは溶液中で遊離している。多孔質のセルロース性表面に滴下されると、この遊離したコンゴーレッドは、セルロースと水素結合を形成し、そのため表面を通過する溶液の流れは遅くなる(本明細書において「コンゴーレッド遅延(Congo Red retardation)」と称する)。
【０１０７】
紙の適切さは、少なくとも部分的に紙の接触角、添加剤の反射である紙の蛍光、および紙の多孔性、環境(例えば環境/領域の温度および湿度)に基づく。多孔質表面(例えば紙)上の液体の流れは、物理的法則(例えばフィックの法則およびストークス-アインシュタインの関係)に支配された複雑なプロセスであるので、適切な紙と適切でない紙の間の相関係数(ρ)に基づいたコンゴーレッドドット試験について紙の「適切さ」を決定するソフトウェアルーチンを設計した。適切な紙と適切でない紙の間の相関係数ρの正確なカットオフは、異なる種類の「通常の」紙のρと、接触角θの関係を決定することにより規定される。電解質およびタンパク質の濃度はインビトロにおいて変化する。接触角θは、ρの重要な決定因子である可能性があり、電解質およびタンパク質の濃度に影響を受けにくい。いくつかの態様において、0.5以下(例えば0.1〜0.5)のρは、適切な紙を示す。例えば0.1、0.2、0.3、0.4または0.5のρは適切な紙を示す。
【０１０８】
コンゴーレッドドット簡易法およびキット
50種類の異なる紙を分析した後、部分的に、粘着性の裏張りを有する特定の紙を使用して得られた結果は、試験した他の種類の紙と比べて、湿った際にしわになることがないためにより矛盾がなかったので、粘着性の裏張りを有する特定の種類を選択した。重度の子癇前症(sPE)を有する妊娠女性由来(図1、「試料」、症例1)、子癇前症を有する妊娠女性由来(図1、「試料」、症例2)、および子癇前症を有さない妊娠女性由来(図1、「試料」、症例3、対照)の尿試料を、最初にコンゴーレッドと混合して通常の紙に適用した。対照としてコンゴーレッドと混合した水を使用した(図1、「ブランク」、症例1〜3)。水の試料(図1、「ブランク」、症例3)および非子癇前症対照試料(図1、「試料」、症例3)において、コンゴーレッドは適用点の周囲で密に中心に集まったままであったが、透明な液体がゆっくり外側に広がった。子癇前症を有する女性由来の試料(図1、「試料」、症例2)において、コンゴーレッドは透明な液体に沿って広がり、中心の可視的な適用点を取り囲むピンク色の拡大した円光を生じた(図1、「試料」、症例2)。重度の子癇前症を有する女性由来の試料(例えば「高度に陽性」の試料)(図1、「試料、症例1)において、コンゴーレッドおよび試料は最初の試料適用スポットを超えて広がる均一な強度のピンク色の拡大されたスポットを形成した。実験(n=78)において、コンゴーレッドと3レベル視覚的スコア(P<0.001)の間に重大な相関が示された。この例の結果は、通常の紙との相互作用に関して、コンゴーレッド処理子癇前症尿と、コンゴーレッド処理非子癇前症尿の間の化学的性質において著しい差を示した。
【０１０９】
全ての結合が飽和性であるので、形成された円の大きさは、例えば紙の湿潤度(例えば接触角θにより測定される)およびコンゴーレッドの濃度などの多くの要因に依存する。理論に拘束されることなく、紙が低い接触角を有する(例えばペーパータオル)場合、水素結合のための十分な時間がなく、試料は非常に早く広がり、コンゴーレッド遅延は見られない(データは示さず)。対照的に、紙が高い接触角を有する(例えば光沢コーティング紙)場合、試料は広がらずにスポット中で乾燥する(データは示さず)。試料が異常折り畳みタンパク質(例えば異常折り畳みタンパク質)を含む場合、コンゴーレッドは異常折り畳みタンパク質の濃度に比例してインターカレートされる。かかる試料をセルロース性表面に適用した場合、コンゴーレッドは、ほとんどが溶液中の異常折り畳みタンパク質に結合しているので、セルロース結合についてほとんどまたは全く利用可能ではない。結果は、異常折り畳みタンパク質の拡散によりもたらされる特徴的な広いピンク色の円である(図1、「試料」、症例1)。全てのコンゴーレッドが異常折り畳みタンパク質に結合する場合、均一なピンク色の円が見られ(図1、「試料」、症例1)、セルロースへの結合に遊離のコンゴーレッドが利用可能な場合、均一なピンク色の円光中に密な中心円が見られる(図1、「試料」、症例2)。
【０１１０】
本明細書において提供される結果に基づいて、子癇前症のための2つの簡易な診断キットを設計した。コンゴーレッドドット簡易キット(迅速さのため(例えば1〜3分))と称される第1のキットは、尿コンゴーレッド好性の主観的な評価に使用され得る。コンゴーレッドドット定量キットと称される第2のキットは、結果の客観的な定量化に使用され得、「スポット均一性」を測定するソフトウェアアルゴリズムにより利用される。コンゴーレッドドット定量法およびキットの開発を以下に記載する。
【０１１１】
コンゴーレッドドット定量法およびキット
子癇前症を有さない妊娠女性由来の尿試料のほとんどは、通常の紙などのセルロース性表面に適用した場合、乾燥して透明(またはほとんど透明)になるので、かかる表面上で試料がどのくらい遠くまで広がったかは測定されない。この問題に取り組むために、赤色および青色色素を使用する二重色素混合物を有するコンゴーレッドドット定量キットを設計した。RGB(赤緑青)カラー空間において、コンゴーレッドの色と相補的なものとして青色を選択した。RGBカラーモデルは、ヒトの目および脳の生理学に関連し、比色的に規定された色には関連しない。これは、携帯電話(例えばスマートフォン)のカメラの典型的な出力でもある。試験したいくつかの青色色素の中で、エリオグラウシン(FD&C blue 1、非毒性色素、McCormick & Co.)を、画像解析によるコンゴーレッドの広がり/遅延の定量化のために選択し、子癇前症の症例と非子癇前症の症例を区別した。青色色素は、最大広がり領域を示す水相と共に移動する(例えば図2、「正常」、上列参照)。二重色素の最適組成は、5%コンゴーレッド:10%エリオグラウシンの2:1混合であることを決定し、100μl体積の尿当たり3μlの二重色素混合物を添加した。
【０１１２】
次いで、携帯電話取得画像またはタブレット取得画像の赤色および青色のチャネルにおけるシグナルの間の相関係数(ロー、ρ)を抽出する画像解析アルゴリズムを作製した(例えばMATLAB中)(図2)。光源および紙の色を補正するための前処理の後に、相関係数を計算する。非子癇前症尿試料と子癇前症尿試料を最良に区別する相関係数ρの正確なカットオフは、子癇前症を有さない妊娠女性、子癇前症を有する妊娠女性および他の妊娠症状を有する妊娠女性由来の多くの尿試料を試験することにより規定される。この目的に、良く特徴付けられた診断および妊娠結果を有する女性から回収した保存尿試料を使用する(例えば662名の女性由来の824の尿試料が-80℃で保存されて利用可能である)。P/C比(全ての試料についての結果が利用可能であった)およびSiemens Clinitek Statusリーダーを使用して視覚的かつ客観的に読まれる計量棒試験に対して比較正確性分析を行う。また、機械学習アルゴリズム(machine-learning algorithms)(例えばサポートベクターマシン)などのアルゴリズム、変動分析および/またはノンパラメトリックベイズ技術を使用して、他の画像解析パラメーター(例えば広がりの空間における赤色および青色のピクセルの相関係数とは別に)が患者の分類をさらに向上し得るかどうかを決定する。さらに、携帯電話またはタブレットの代わりに遠隔サーバー上で画像処理を行い、結果がユーザーに報告され得る。
【０１１３】
実施例2
重度の子癇前症(sPE)を有する女性はアミロイド様凝集体のスペクトル特徴を有する尿コンゴーレッド好性を示す
実行性および変動性の相を含んだ厳密な試験設計を使用した(図5)。原理の最初のプルーフ(実行性)として、正確な臨床的分類および公知の結果を有する妊娠女性(n=80)由来の尿試料を試験した：40名の重度の子癇前症(sPE)女性は、医学的に適応された子癇前症のための分娩(MIDPE)を必要とし、40名の合併症を伴わない妊娠を有する健常妊娠対照(P-CRL)女性は出産予定日に分娩した。それらの臨床的な特徴を表1に含める。
【表１】
0006697394.tif 000002
【０１１４】
コンゴーレッド(CR)と混合された尿を、支持されないニトロセルロース膜上にスポットし、次いで増加濃度のメタノールで洗浄した(図6A)。この実験の原理は、CRの自己集合特性および大きな不溶性オリゴマーの形成を開始し次いで多くのβシート構造を有するアミロイドタンパク質に結合するその能力に基づいた。示されるように、P-CRL女性ではなくsPE女性のスポットは、メタノール洗浄後も赤色のままであり、PEを有する女性が尿コンゴーレッド好性を示すことを示した。CRをそのままにしてタンパク尿および水和状態の差による変動性を最小にするそれぞれの尿試料の性質の客観的な定量化を可能にするために、標準化されたプロトコルをさらに設計した(コンゴーレッドドット[CRD]試験)。画像解析により2つの指標：CR保持(CRR、コンゴーレッド好性の測定)およびCR組込み(CRI、内部参照)を得た。P-CRLと比較して、sPE尿においてCRRは有意に増加した(P<0.001、図6B)。2つの群の間でCRIに差がないことが示された(図6C)。受信者動作特性曲線(ROC)分析において、15%のCRRカットオフ値は100% [95%CI: 92-100]感度および100% [95%CI: 92-100]特異性を有し、sPE症例とP-CRLを区別した。実行性コホートにおいて、全てのsPE患者は、15%より高いCRR値を有した。この結果に基づいて、CRR≧15%は、「非再補償(non-reassuring)」(NR-CRR)とみなされた。
【０１１５】
CR結合アミロイドは、UV光を照射した場合、約490から540nmへの吸光度のシフトに従って明るい赤色の蛍光を発する。ニトロセルロース膜に短波長ではなく長波長のUVを照射した場合、アミロイド結合CRの特徴的な赤色の蛍光が観察された(図6D)。CRストック溶液の添加の直後に30%(12/40)のsPE尿試料(P-CRLではない)は、色が視覚的に橙赤色からマゼンタに変わり(図6E)、インビトロにおけるβアミロイドオリゴマー化(凝集)について記載される深色団スペクトルシフトに一致した。403nm(等吸収点)および541nm(最大シフトの点)での吸光度の分光測光的な測定により、sPE尿中のアミロイド様凝集物の存在を確認した(図6F)。sPE女性のうち、スペクトルシフトの程度は、CRRインデックスに相関した(r=0.664、P<0.001)。群として、sPE女性はより高い濃度のアミロイド様凝集物を有したが、20%(8/40)のsPE尿は、CRD試験においてNR-CRRであるにもかかわらず検出可能(視覚的および/または分光測光的)なスペクトルシフトを示さなかった(図6G)。CRR>50%を有する試料のみについて分光測光的に検出可能なシフトが起こり、CRD試験(CRRカットオフ15%)と比較して、直接分光測光法がPEの同定においてより低い感度を有する(80% [95%CI:64-91])(P=0.007、実行性コホート)ことが示唆された。また、sPE女性は増加した尿チオフラビンT誘導性(ThT)蛍光を示した(図6H)、P<0.001)。しかしながらこれはPEを有する女性の尿に存在するアミロイド様構造の別の指標である。直接分光測光法と同様に、sPE検体の下位集団(42%)のみが、ThT結合時に485nmでの蛍光の有意な増加を示した(図6I)。CRD試験と比較して、尿ThT結合は、PEの同定においてより低い感度(82% [95%CI:65-92])を有した(P<0.001、実行性コホート)。
【０１１６】
尿コンゴーレッド好性は高血圧性妊娠障害間で異なりPE重症度に伴って増加する
妊娠の際の尿コンゴーレッド好性の臨床的な有意さをさらに理解するために、さらに582名の女性由来の尿試料を試験したが、この時間は登録カテゴリーに関して選択されたものではなかった(図5、変動性相)。横断面的(cross-sectional)(n=526)および長さ的(longitudinal)(n=56)コホートを設計した。横断面的コホート中の女性は、単一の尿試料に関係した。結果は、試料回収および妊娠結果(MIDPEまたはその他)における臨床的分類に基づいてグループ分けして分析した。横断面コホートに含まれる女性の臨床的特徴を表2に示す。長さ的コホートの女性は、試験開始の時点ではPEについて無症候性であり、妊娠を通して長さ方向に続いた。
【表２】
0006697394.tif 000003
【０１１７】
横断面的コホートに含まれる症例が試料回収時の臨床診断によりグループ分けされる場合、sPEおよび混合型PE(spPE)の女性は両方、全ての他の群と比較してより高いCRRレベルを有した(図7A、P<0.001)。次いで、本発明者らは、尿NR-CRR値を示す女性の割合を分析した。本発明者らは、中程度PE(mPE)、sPEおよびspPEのそれぞれの診断により認められた女性の75%(40/53)、89%(120/135)および91%(52/57)がNR-CRR値を有することを見出した(図7B)。これらの割合は、全ての他の群よりも有意に高かった(P<0.05)。臨床および実験室的基準に基づいて登録時にspPEから除外された慢性高血圧(crHTN)女性のうち、35%(22/63)は、NR-CRRレベルを示した。これは、P-CRL(6%、1/18、P=0.017)またはPEに関連しない病理学を有する女性(1型：13%、16/125、P<0.001)と比較して有意に高かった。PEの進行性の性質と一致して、登録時にcrHTNと分類された女性の27%(17/63)は、spPEに診断が改訂され、最終的にMIDPEが必要になった(図7C)。これらのうち、53%(9/17)は、最初の評価時に尿コンゴーレッド好性を有し、これは、CRD試験は、現在の臨床基準のみに基づいてはspPEの症状を診断できない場合に、spPEを迅速に予測するために有用であり得ることを示唆した。出産時のGAに基づく長さ的コホートにおけるCRR指標とMIDPEの関係を図7Dに示す。MIDPEを必要とした女性は、全てのGA期間において有意に高いCRRを有した(MIDPE：P<0.001、GA：P=0.008)。出産予定日前のPEにおけるCRRレベルは、GAとMIDPEの間の有意な相互作用を伴う出産予定日のPEと比較して有意に高かった(二元配置ANOVA、P<0.018)。この観察は、ケアの標準からみて、遅延することなくMIDPEにより管理される出産予定日のmPEを示す女性のより高い割合により説明され得る。さらに、高いCRR値(CRR≧60%)を有する症例は、出産予定日のMIDPEを有する女性では、34週未満でMIDPEを必要とする女性と比較して、より低く示される(29% 対 58%、P=0.003)。
【０１１８】
長さ的コホートにおいて(図7E)、PEを発症してMIDPEを必要とする女性(n=9、高リスク登録群の全て)は、疾患の臨床的症状発現前に有意に高いCRRレベルを有した(MIDPEおよび間隔をあけて分娩(interval-to-delivery)の両方についてP<0.001)。興味深いことに、これらの女性の78%(7/9)は、臨床的に明らかなPEの10週以上前の試験エントリー時にNR-CRR値を有した。これは、尿コンゴーレッド好性の基底の機構が、無症候性の相において早期に生じる可能性があり、進行的に悪化することを示唆する。全体的に、4名の高リスクの女性は、20週未満のGAで尿コンゴーレッド好性を示し、全員がMIDPEを有した。全ての低リスク女性(n=28)は、PEによる合併症を伴わない妊娠経過、出産予定日の分娩を有し、1人以外全員が、妊娠を通じて非コンゴーレッド好性のままであった。この1人の症例は、第3トリメスターにおいてコンゴーレッド好性になり、出産予定日に妊娠性高血圧(gestHT)のための適応された分娩を行った。
【０１１９】
PEを発症していない低リスクおよび高リスクの女性の中で、試験エントリー時にCRRレベルにおいて統計的な差はなかった(低リスク：3.2±0.6% 対 高リスク：7.0±2.8%、P=0.397)。
【０１２０】
コンゴーレッドドット(CRD)試験はsPEを診断し、MIDPEを予測するための簡単な様相である
妊娠結果を知っている検証コホート(追跡を消失していない横断面的コホート被験体：n=508 + 追跡を消失していない長さ的コホート被験体：n=55)に含まれる妊娠女性由来の登録尿試料(n=563)のROC分析により、CRR単独(≧15%のカットオフ)は、MIDPEを必要とするPEの予測において、85.9%の感度[95%CI: 81.1-89.9]、85.0%の特異性[95%CI: 80.4-88.8]、5.7の陽性尤度比(LR)[95%CI: 4.4-7.5]および0.17の陰性LR[95%CI: 0.1-0.2]を有することが決定された(表3)。
【表３】
0006697394.tif 000004
【０１２１】
これは、PEの診断について現在認識される臨床スクリーニング基準と比較して有意に良好であった(CRR 対 血圧 P<0.001；CRR 対 タンパク質計量棒P<0.001)。CRRは、心収縮期および心拡張期の血圧の両方に付加的な値を有した(P<0.001)。CRR単独は、ACOG(P=0.004)(3)およびWHO(P<0.001)(23)の両方の血圧および蛋白尿に基づく推奨カットオフの組合せよりも有意に良好であった。CRRとMIDPEの関連は、マルチロジスティック回帰においてGAおよび母体人口統計的特徴を調節した後に有意なままであった(NRCRRオッズ比[95%CI]：30.6[18.9-49.6]；GAオッズ比：3.3[2.0-5.4])。P>0.1に基づくモデルから母体の年齢、人種および出産経験は除外した。
【０１２２】
次いで、24時間のタンパク質回収(現在のPEの蛋白尿について黄金標準(gold standard)とみなされる、n=250)を完了した女性の群を分析した。CRRと24時間蛋白尿の間に有意な相関があった(r=0.788、P<0.001)。MIDPEを必要とした≧300mg/24時間の24時間蛋白尿を有する女性のうち、94%(148/158)はCRR≧15%を有し、82%(129/158)はCRR≧30%を有した(図13)。蛋白尿または高血圧のいずれかの非存在に基づいて「非典型的」と推定されたいくつかのPE症例は尿コンゴーレッド好性を示した。非蛋白尿性「非典型的」症例のうち、58%(23/40)は、第1の評価の時点でコンゴーレッド好性であり、かかる臨床状況におけるCRD試験の潜在的な臨床有用性が示唆された。「非典型的なPE」を有する全ての23名のコンゴーレッド好性の女性は、医学的に適応された分娩を有した。21症例において、出産適応症は、非典型的な提示を有するsPEであった。残りの2症例において、出産についての適応症は、異常な胎児の心臓速度の痕跡であった。
【０１２３】
CRRは、尿可溶性fms様チロシンキナーゼ-1(sFlt-1)/胎盤成長因子(PlGF)比[uFP、z統計=4.5、P<0.001]、クレアチニン-正常化尿sFlt-1濃度(z統計=6.8、P<0.001)、クレアチニン-正常化尿PlGF濃度(z統計=9.2、P<0.001)およびタンパク質-対-クレアチニン(P:C)比(z統計=13.9、P<0.001)よりも有意に良好であった(図7F)。CRRは、本発明者らが以前に記載した尿プロテオミクススコア(UPS、z統計=0.4、P=0.695)により、MIDPEの予測において同様の性能を有した。UPSは、GAまたは総蛋白尿またはアルブミン尿とは独立して、MIDPEを必要とする女性の中で最も強力な尿コンゴーレッド好性の予測因子であった(P<0.001)。この所見は、UPSスコアのいくつかのペプチド断片バイオマーカーが異常折り畳みの高い可能性を有するという以前の観察と一致した。
【０１２４】
尿コンゴーレッド好性は原型異常折り畳みタンパク質のオリゴマー性エピトープに対する免疫反応性と関連する
以前に検証された3つの4要素からなる構造である抗体を、公知のアミロイド原性(amyloidgenic)タンパク質の相互に排他的なエピトープを同定するために使用した。A11ポリクローナル抗体は、βバレルおよびβシリンドリン(cylindrin)を含む逆行性βシート構造であると思われる細胞傷害性前線維状オリゴマー(PFO)上の一般的な配列独立型立体構造エピトープを検出する。αAPFポリクローナル抗体は、βバレルであるように思われかつより成熟しており一般的なPFOよりも細胞傷害性が低い管状プロト原線維(APF)立体構造上の一般的な配列独立型エピトープを認識する。OC抗体は、成熟原線維および可溶性線維状オリゴマーの平行性登録(in-register)原線維立体構造を検出する。P-CRL(n=57)、crHTN(n=16)、mPE(n=33)およびsPE(n=128)の女性由来の234連続尿検体の部分集合に対してタンパク質標準化ドットブロットを行った。P-CRLおよびcrHTN女性と比較して、sPEにおいてより高いA11免疫反応性が見られた(P<0.001、図8A)。P-CRLおよびcrHTNと比較して、sPEおよびmPEの女性の両方は、登録時にαAPFについて有意に上昇した尿免疫反応性を有した(図8B)。図8Cに示すように、A11およびαAPF免疫反応性において有意な不均一性が見られ、いくつかの検体は両方の抗体に対して同等に反応し(S3)、他のものは一方に優先的に反応した(S2)。これらの結果は、APF形成の前駆体としてのPFOの役割を示唆する、最近の結果に照らして説明され得る。OC抗体では有意な反応性は見られなかった。集合的に、これらの結果は、PEを有する女性の尿において、線維状オリゴマーまたは成熟原線維ではなくPFOおよびAPFの存在を示した。しかしながら、尿コンゴーレッド好性を有する全てのsPE女性が検出可能なAPFまたはPFO免疫反応性を示したわけではなかった。図8Dは、本発明者らの分析に含まれるそれぞれの尿検体についてのコンゴーレッド好性レベルに沿ったA11およびαAPF免疫反応性の3Dプロットを示す。ほとんどの非MIDPE試料(n=73、緑色の円)は一緒に集中してグラフの原点に近づいたが、MIDPE検体(n=161、赤色の正方形)は3つの軸に沿って実質的に散らばり、尿PFO、APFおよびコンゴーレッド好性の間の大きな不均一性を示した。MIDPE群において、CRRは、APF免疫反応性(r=0.128、P=0.106)ではなく、PFOと有意に相関した(r=0.268、P<0.001)。顕著なことに、尿PFO免疫反応性を有さない女性と比較すると、陽性であると試験された患者は、有意に高い心収縮期(P=0.002)および心拡張期(P=0.020)の血圧、ならびに高血圧症候群のより重度な臨床的症状発現(P<0.001)を有した。全ての分析は、GAおよび総蛋白尿についての補正後、有意なままであった(尿P/C比)。
【０１２５】
PE尿から単離されたコンゴーレッド好性物質はアミロイド様顕微鏡的特徴を有する丸い線維状のナノスケール構造を含む
尿試料のCR補助沈殿のためのプロトコルを開発して、PEのコンゴーレッド好性をさらに特徴付けた。局所顕微鏡法によりsPE沈殿物を視覚化した際に(図9A)、緑色の複屈折性の丸いかまたは細長い粒子(挿入図を参照)が観察された。透過電子顕微鏡(TEM、図9B、9C)では、まるい構造の大きさは30〜300nmで変化し、線維状の立体構造は、より大きく電気的に緻密な(electrodense)新規の構造中で、より長く、樹枝状でかつ一緒になってもつれていた。これらの構造は、並行して処理および画像化したP-CRL検体中には存在しなかった(図9D)。陰性染色TEM(図9E、9F)により、直径約50〜60nmの滑らかな丸い末端を有する細長いフィラメントとして単一原線維が示された(アステリスク)。より厚い直径以外は、sPE尿由来のコンゴーレッド好性沈殿物のこの全体的な顕微鏡的な外観は、CRにより染色されたアミロイド積載組織から抽出された原線維について従来から報告されるものに似ていた。
【０１２６】
PE異常折り畳み体(misfoldome)の採取(mining)：PE尿中のコンゴーレッド好性物質の免疫原性およびプロテオミック(proteomic)分析により不均一なタンパク質成分が明らかになる
用語「異常折り畳み体(misfoldome)」は、異常折り畳みタンパク質の任意の回収物を記載する。UPSスコアの識別バイオマーカーは、SERPINA1およびアルブミンの非ランダム切断断片を示す。SERPINA1の凝集する性質およびPEにおけるタンパク質の異常折り畳みに基づいて、次の工程は、尿コンゴーレッド好性物質中のSERPINA1およびアルブミンの痕跡(footprint)を調べることであった。図9G(左パネル)は、2つのsPE尿試料の代表的なSERPINA1ウエスタンブロット(レーンU1〜U2)およびそれらの対応するCR沈殿物(レーンP1〜P2)を示す。示されるように、CRペレットは、完全な前駆体(約57kDa、黒色矢印)上のSERPINA1断片の占有を示すはしご状パターンを有するSERPINA1免疫反応性において顕著に富化されていた。同じ試料の非特異的クーマシー染色(図9G、右パネル)は、CR補助沈殿のプロセスにより、バンド形成パターンが変化することを示し、sPE尿中のいくつかのペプチドのみがCR親和性を有し、SERPINA1断片がこのファミリーの一部であることが示唆される。図9H(左パネル)は、CR補助沈殿の前(U1)および後(P1)のsPE尿試料を示すアルブミンについての代表的なウエスタンブロットである。示されるように、完全なアルブミン前駆体(約66kDa、黒色の矢印)および高分子量凝集物は、アルブミン断片に対して優勢であるように思われた。還元後にゲル中を自由に移動するCR色素の位置を赤い矢印で記す。これらの実験により、sPE尿由来のCR沈殿物は、不均一であるがランダムではないように思われるタンパク質成分を含むことが確認された。該タンパク質成分を、抗アルブミン(図9I)および抗SERPINA1(図9J)抗体を用いたTEM免疫標識でさらに検証した。二重免疫TEMで観察されたパターンは、CR沈殿物中SERPINA1がアルブミンと共に存在することを示し、不均一な共凝集の考えを支持するものであった。
【０１２７】
他のいかなるタンパク質がCR沈殿中に示されるかを決定するために、良く特徴付けられたsPE症例由来の検体に対してプロテオミクス技術を適用した。タンデム質量分析により確認されたSERPINA1およびアルブミンに加えて、他の示された同定物は、IgGκ遊離軽鎖(κFLC)、セルロプラスミンおよびインターフェロン誘導性タンパク質6-16(IFI6、G1P3としても公知)であった。興味深いことに、sPEの尿バイオマーカーとして、以前の本発明者らがSERPINA1のMet365-酸化C末端断片を発見したことに一致する結果であるように、質量分析により同定されたペプチドの多くは、酸化メチオニン残基を含むことが見出された。上述の同定物を、60個の異なる尿試料から単離されたCR沈殿物のウエスタンブロッティングにより検証した。出産予定日前sPEを有する4名の女性由来の尿CR沈殿物中のκFLC(約25〜30kDa)、セルロプラスミン(約150kDa)、G1P3(約30kDa)、SERPINA1(約57kDa)およびアルブミン(約66kDa)の例示的なウエスタンブロットを図14に示す。集合的に、これらの結果は、sPE女性のコンゴーレッド好性物質が複数のタンパク質の断片および/または凝集物由来のプロテオフォーム(proteoform)を含むことを示唆する。さらに、sPE患者は、コンゴーレッド好性凝集物中で、少なくとも5種類の異なるタンパク質由来の免疫反応性プロテオフォームの非ランダムパターンを共有する。κFLC、セルロプラスミンおよびG1P3は、完全なタンパク質の予想される分子サイズで最も優勢な免疫反応性バンドを有するので、このことは、断片化されていない状態であっても、固有の凝集性質を支持する。
【０１２８】
いくつかのヒト立体構造障害に関する病理学的凝集を起こすことが以前に報告されているκFLCおよびセルロプラスミンとは異なり、G1P3は、アミロイド構造中に関与することについて以前に調べられていなかった。本発明者らは、オルタナティブスプライシングの結果生じる3つのG1P3アイソフォームについてアミロイド原性能力の分析をインシリコで行った。G1P3配列中、本発明者らは、通常は見られない多くの数の凝集傾向のある区分(「ホットスポット」)に注目した。AGGRESCANアルゴリズムにより、少なくともアミロイド原性が最も高い最短のアイソフォーム(G1P3a)を有するAβ42が過剰ではない場合、G1P3が凝集性質を有するはずであるということが予測された(Na4vSS：G1P3a：13.6 対 Aβ42：6.4、図15および表4)。
【０１２９】
PE尿は凝集したAPPプロテオフォームを含む
線維状アミロイドタンパク質は、トリプシンによるタンパク質分解に抵抗性である。このことは、本発明者らに、トリプシン切断ペプチドのフィンガープリントに頼るプロテオミクスアプローチでは、尿コンゴーレッド好性物質中の重要なタンパク質同定物が消失し得るという可能性を考えさせた。1つの候補はAPPであった。APPの細胞性プロセッシングは、アルツハイマー病に関連するよく知られた病態生理学的現象である。
【表４】
0006697394.tif 000005
【０１３０】
APPは、APP遺伝子のオルタナティブスプライシングにより生成される3つの主要なアイソフォーム(APP770、APP751、APP695)を有する、偏在的に発現されるタンパク質である。正常な代謝経路では、APPはβセクレターゼよりもαセクレターゼにより、最初に切断され、可溶性N末端断片(sAPPα)を放出する。sAPPαは、非デンプン形成性であり、細胞の生存、増殖および移動を促進する成長因子として機能する。しかしながら、βセクレターゼ次いでλセクレターゼによるAPPの切断(図10A)により、コンゴーレッド好性老人斑の主要な構成因子である短いアミロイドβペプチド(Aβ)が放出される。オリゴマー化および自己集合のための高い性質のために、Aβは、アルツハイマー病に関連する酸化ストレスおよび神経変性を誘導する直接的な病理学的役割を有する。
【０１３１】
上述の知識に基づいて、APP断片の存在を、sPEを有する女性から回収された尿試料のCR沈殿物中で分析した。APPに特異的なドメインの残基511〜608を認識するALZ90モノクローナル抗体を使用して、これらの試料中で、ウエスタンブロッティングによりAPP断片の存在を示した(図10B、レーンP1〜P3)。最も目立つバンドは60〜90kDaの間で移動し、sPE症例の間で矛盾しないバンドパターンであった。このパターンは、spPE症例(P4〜P7)中では見られないか変更され、この観察は、妊娠に関連するこれら2つの臨床的に重複する症候群の間の病理学的な差を支持するものであった。図10Bに示される全ての試料はNR-CRRレベルを有したので、尿コンゴーレッド好性は、APP断片も含む異常折り畳みタンパク質の回収物を合計している可能性が高い。
【０１３２】
次いで、健常なP-CRL(n=8)およびsPE(n=16)女性の粗製尿検体中のAPP断片の存在を、APP配列上のエピトープのアレイに対して生成された良く特徴付けられたモノクローナル抗体：ALZ90、DE2B4(Aβ領域の残基1〜17中のエピトープと反応性)、22C11(APP、sAPPおよび構造的に関連のあるタンパク質APLP-2のN末端エピトープと反応性)(47)およびMAB5354抗体(クニッツ(Kunitz)プロテアーゼインヒビター[KPI]ドメイン中のエピトープと反応性)(47)を使用して、ウエスタンブロットにより調査した。図10Cは、CR沈殿物と同様に、粗製sPE尿検体(U3〜U8)が、強いALZ90免疫反応性を示したことを示す。DE2B4は、低い強度ではあるが、ALZ90と同様の免疫反応性パターンを検出した。ヒトアルブミンと2つの抗APPモノクローナル抗体の非特異的な交差反応性は除外されたので(図10D、DE2B4について示される)、sPE尿中でALZ90およびDE2B4により明らかにされたバンド形成パターンについての有力な説明は、APP断片化および/またはAPP断片と他のタンパク質の共凝集のみであった。後半の可能性は、sPE尿をシバクロンブルー(Cibacron blue)で処理した際の顕著な64kDaのバンドの強度の低下により実証された、図16A、16B)。22C11抗体は、P-CRL(U1〜U2)とsPE(U3〜U8)の両方において、成熟sAPPの予想分子量(約130kDa)で免疫反応性尿タンパク質を検出した(図10E)。しかし、sPE尿は、未熟sAPP(レーンU4〜U6)を表す可能性のあるさらなるバンド(約110kDa)を含んだ。顕著なことに、強いALZ90およびDE2B4免疫反応性を有するいくらかのsPE女性(レーンU3、U7、U8)は、あまり顕著でない22C11 sAPPバンドを有した。一緒に解釈されると、陽性のALZ90およびDE2B4免疫反応性を有する22C11についての有意な染色の欠如は、sPE女性は、N切断およびαセクレターゼ切断の両方の多くの量のAPP断片を排出することを示唆する。全sAPP(sAPPαおよびsAPPβ)を検出するELISAを使用して、sPE女性(n=66)は、P-CRL(n=44)と比較して、sAPPのより高い断片的排出を有することを決定した(sPE：0.27% [0.05-0.90] 対 P-CRL：0.09% [0.01-0.42]、P=0.032)。
【０１３３】
KPIドメインを含むsAPPアイソフォーム(例えばAPP770およびAPP 751)は、抗プロテアーゼとして機能し、一般的にプロテアーゼネキシン-IIと称される(APP-KPI/PN2)。SERPINA1と同様に、APP-KPI/PN2は、トリプシンなどのセリンプロテアーゼおよび自殺基質として作用する凝固因子を強く阻害する。KPIドメインを含むAPP-KPI/PN2の断片は、高度にアミロイド原性であることが知られている(50、51)。図10Fは、sPE女性の尿検体は、MAB5354(KPIドメイン)抗体により特異的に検出されるAPP断片(約47kDa)を含むことを示す。しかしながら、DE2B4と比較して、MAB5354免疫反応性およびそのためのAPP751アイソフォームの寄与は、小さいと思われた(図16C、16D)。要約すると、成熟sAPPプロテオフォームは、健常妊娠者における正常な尿成分である。比較的低い血清sAPP、sAPPの高い断片的排出および特にsPE尿中の高いレベルのAPPプロテオフォームの断片化は、sPEにおけるAPPタンパク質分解性プロセッシング経路における乱れの可能性を指摘する。
【０１３４】
ヒト胎盤はAPP、ならびにPEにおいてADAM10およびBACE2を増加させる原型α、βおよびγ-セクレターゼのmRNAを発現する
胎盤はPEの病態生理学の中心である。APPの細胞性プロセッシングは酵素切断の良く特徴付けられた配列であるので、本発明者らは、総APPおよび原型APPプロセッシング酵素：α-セクレターゼ(ADAM10、ADAM17)、β-セクレターゼ(BACE1、BACE2)およびγ-セクレターゼ(PSEN1、PSEN2)の胎盤mRNA発現を調べた。定量的リアルタイムRT-PCRにより、本発明者らは、ヒト胎盤が、APP、ならびにα、βおよびγ-セクレターゼのmRNAを発現し、APP、ADAM10、ADAM17、BACE2、PSEN1およびPSEN2について、出産予定日に対して出産予定日前(preterm)に、より高い発現を有することを測定した(図11A、11B)。α-セクレターゼADAM10の相対的な豊富さは、出産予定日前(P=0.001)および出産予定日(P=0.009)の両方でADAM17の豊富さよりも有意に高かった。β-セクレターゼBACE1についての増幅シグナルのみが、出産予定日前および出産予定日の両方の胎盤において弱く検出された。これは、特に出産予定日前の胎盤で有意に高いレベルで発現されたBACE2とは対照的であった(出産予定日に対してP<0.00)。α-およびβ-セクレターゼと比較して、γ-セクレターゼは、全体的に低いmRNAレベルを有した。PSEN1のmRNAは、出産予定日前のPSEN2と比較して有意に高かったが(P<0.001)、両方のγ-セクレターゼが低いレベルで発現される出産予定日の胎盤(P=0.209)では高くなかった。ADAM10(P<0.001)およびBACE2(P<0.001)の絨毛栄養膜mRNAレベルは、特発性の早産(iPTB)を有する女性のGA-適合胎盤組織と比較して、sPEにおいて有意に高かった(図11C)。同じ群の間の比較により、sPEにおけるBACE1 mRNAレベルの低下が示された(P=0.021、図11C)。ADAM17、PSEN1、PSEN2またはAPPについてはmRNA発現の有意な変化は見られなかった(全てについてP>0.05)。
【０１３５】
重度の子癇前症はアミロイド斑に類似した胎盤における細胞外ALZ90陽性凝集物の体積に関連する
iPTB胎盤の基底板および絨毛膜絨毛において強い22C11(N末端)APP免疫反応性が確認された(図12A)。脱落膜細胞は、外絨毛(extravillous)栄養膜よりも強く染色され、胎盤絨毛においては内皮細胞および細胞栄養膜が、ストロマの周囲と比較して、より顕著に染色された(図12A、挿入図)。sPEおよびiPTBの胎盤の間で、22C11染色パターンの顕著な違いが見られた。sPEにおいて、脱落膜細胞は、iPTBと比較してほぼ同じ強度で陽性に染色されたが、22C11脱落細胞膜の分布は、より散らばっており、ゆがんだ形態を有した(図12B)。母性絨毛間空間において無細胞線維状凝集物の強い染色が観察され、sPE切片上の数が有意に増加した、図12B挿入図、矢じり)。
【０１３６】
ALZ90抗体染色のパターン(Aβアミロイド斑に特異的)は、22C11で観察されたものと異なった。ALZ90陽性領域は出産予定日前iPTB組織では少なく、存在する場合は、組織学的免疫反応性が事実上非存在である胎盤絨毛よりも脱落膜(図12C)においてより多く局在した(図12C、挿入図)。逆に、sPE胎盤において、ALZ90染色は、全体的な胎盤のばらばらな外観を示す基底板(図12D)および絨毛領域(図12E)の両方においてより顕著であった。顕著なことに、ALZ90は、表面が小さな斑点で覆われた物質(図12E、挿入図)または斑に凝集する薄片上の無細胞物質(図12F)に強く局在した。ALZ90陽性の斑は、フィブリノイド様変性により影響を受けた領域で高頻度に観察された。しかし、全てのフィブリノイド様物質がALZ90陽性なわけではなかった。H&E染色では、ALZ90陽性物質は、エオシン好性フィブリノイドの周辺とは異なり、特徴的な紫色の蛋白様の外観を有した(図12G)。マウスIgGとのインキュベーションにより染色の特異性を確認した(図12H)。ALZ90陽性血管内物質は、G13Pについて免疫反応性であり、本発明者がアリザリンS染色により確認した胎盤カルシウム沈着として以前から形態学的に記載される領域に高頻度で見られた(図17A〜17D)。
【０１３７】
ヒト胎盤はADAM10、BACE1、BACE2およびPSEN1が細胞特異的な様式でPE胎盤中に増加する原型α、βおよびγ-セクレターゼについて免疫反応性を発現する
iPTB胎盤と比較して、sPE胎盤は、より多くのADAM10(P=0.017、図12I、12J)およびBACE2(P=0.007、図12K、12L)を発現した。sPEにおいて、絨毛ADAM10免疫反応性は、主に栄養膜細胞層(図8J)に局在し、β-セクレターゼBACE2は、絨毛栄養膜細胞層、合胞体層および絨毛ストロマ細胞を含む胎盤細胞集団の間でより偏在的に発現された(図8L)。ヒト胎盤は、BACE1について陽性の免疫染色を示すことが見出された。iPTB胎盤脱落膜細胞および栄養膜細胞層は、ほとんどが陽性染色を示した(図8M)。絨毛の縁の周りにあるような合胞体層における顕著なBACE1の存在を有するsPE絨毛において、BACE1発現パターンの変化が観察された(図8N)。注目すべきことに、sPE胎盤は、BACE1染色強度の領域的な違いを示した(図18A〜18J)。胎盤梗塞の近位の領域は、最も著しい合胞体層染色を有することが観察された。γ-セクレターゼPSEN1に関して、iPTB胎盤は、絨毛栄養膜または合胞体層において事実上染色がなかった(図12O、挿入図)。逆に、sPE合胞体層は、顕著なPSEN1染色を示し(P=0.038、図12P、挿入図)、これはBACE1と一緒になってアミロイド原性経路を介したAPPプロセッシングに関与する2つの重要な酵素を示す。
【０１３８】
試験設計
妊娠女性は、2004年3月から2010年12月まで、Yale-New Haven Hospital (New Haven, CT)で登録した。妊娠していない蛋白尿の女性は、Fletcher Allen Health Care Hospital (Burlington, VT)で登録した。研究プロトコルは、Yale UniversityおよびUniversity of Vermont Human Research Protection Programの両方に承認された。
【０１３９】
委員会. 全ての女性に書面のインフォームドコンセントを提供した。662名の女性由来の824の尿試料(図5)を調べた。尿コンゴーレッド好性の調査について、実行性段階を、sPEおよびMIDPEを有する40名の患者、ならびに合併症を何ら有さず出産予定日に分娩した40名の健常妊娠無症候性女性から回収した80の尿試料において行った。実行性段階患者の臨床的な特徴を補足資料(表1)に示す。該試験の第2段階において、尿コンゴーレッド好性を、登録時の診断に基づいて以下の群に分類した526名の連続患者からなる予測コホート試験においてさらに検証した：(a)妊娠無症候性対照(P-CRL、n=18)；(b)妊娠性高血圧(gHTN、n=28)；(c)慢性高血圧(crHTN、n=63)；(d)中程度PE(mPE、n=53)；(e)sPE(n=135)；(f)混合型PE(spPE、n=57)；(g)PEについて実験室精密検査を必要としなかった妊娠関連医学状態(他の型-1、n=125)；(h)頻繁にPEに関与し、実験室精密検査を行ってPEを確認または排除した妊娠関連医学状態または共病的状態(co-morbidities)(他の型-2、n=37)；ならびに(i)妊娠していない蛋白尿の女性(n=10)。検証段階患者の臨床的特徴を補足資料(表2)に示す。
【０１４０】
長さ的コホートは、試験エントリー時に無症候性で妊娠期間を通じて複数の試料を提供した女性からなった(n=56)。研究者の有用性に基づいて、これらの患者を連続的に補充し、PEのリスクが高い(n=28)または低い(n=28)のいずれかで評価した。
【０１４１】
臨床および代理(surrogate)終点
PEは、異なる病因および種々のリスク因子を有する不均一な臨床的症状発現により特徴付けられる症候群である。妊娠中のPEおよび高血圧障害の定義はしばしば自由裁量である。種々の定義の妥当性を支持するデータがない場合、PEの診断は人が考え得るほどに容易ではない。特にPEまたはPEの種々の模倣を有する女性において、不都合な妊娠結果のリスクを有する患者の同定には大きな困難がある。結果的に、疾患の経過および医師の両方により異なり得る臨床的な診断カテゴリーに加えて、真の疾患の良好な反映として、介入に基づいた目標に近いが不十分な(near-miss)事象、MIDPEが選択された。このアプローチは、本発明者らの以前の尿プロテオミクス発見試験の間に成功裡に適用された。簡潔に、これは、MIDPEについての適応は臨床チームに属するものであり、全ての他の治療戦略が失敗した場合にその結果が最終となる最後の管理手段であり、取り消すことができないために被験体を偏らせることが少ないためであった。PEを有する患者(妊娠している人 対 出産した人)の臨床管理は診断時の在胎齢(GA)に基づいて変化し得るので、結果は出産時のGAに従って分析された。34週未満、34〜366/7週および37週より長いGAカットオフを使用した。MIDPEまたは上記のGA分布に基づいた他の原因について出産した患者の数を、横断面的(cross-sectional)コホートおよび長さ的(longitudinal)コホートの両方について図5ならびに表1および2に示す。
【０１４２】
生物学的試料
尿試料を回収した。簡潔に、「ストレートキャッチ」または「クリーンキャッチ」滅菌技術を使用して滅菌容器の標準的な使用によりランダムな尿試料(5〜10mL)を回収した。sPE女性は、尿出力の正確なモニタリングを可能にするために設置されたフォーリーカテーテルを有した。出産予定日前のPE女性の70%は、発作予防剤(硫酸マグネシウム)およびステロイドの前に登録された。長さ的コホートに登録された女性は、時間連続的な様式で連続の試料を提供した。尿回収の際に、横断面的コホート由来の女性(n=141)の部分集団において、静脈穿刺により血液試料を採取した。血液を凝固させた。血清および尿試料を4℃で20分間、3,000gで遠心して、分析したかまたはアリコート中-80℃で保管した。sPEを有する女性(n=8、GA：31±1週；成長パーセンテージ(growth percentile)：24±7%)から、出産の直後に胎盤組織を回収した。GA適合自発性特発性早産(n=8、羊水穿刺による羊膜内感染がないことに基づく診断、組織学的絨毛羊膜炎なし、GA：31±1週；成長パーセンテージ：31%±7%)および分娩なしで出産予定日に予定された帝王切開により出産した健常な女性(n=5、GA：39±1週、成長パーセンテージ：36±10%)を対照として使用した。組織は液体窒素中で凍結したかまたはホルマリン中で固定した。
【０１４３】
ニトロセルロース膜アレイおよびコンゴーレッドドット(CRD)試験の原理での尿コンゴーレッド好性の評価
尿コンゴーレッド好性についての評価は、クロイツフェルト-ヤーコプ(プリオン)病にかかった患者の尿におけるこの性質を調べたHalimiらによるプロトコルに基づいてなされた。このプロトコルを、最終的な結果がCRD試験である膜アレイ形式におけるPE尿のために最適化した。技術的な詳細を以下に示す。簡潔に100μlの尿上清を、2μlの5mg/mL CRの溶液と混合した。1時間後、5μlの上清を、ニトロセルロース膜上に二重にスポットして、風乾させた。膜を連続的に水、次いで増加濃度のメタノールで洗浄した。洗浄後、遊離CR(MW約700g/mol)を除去しながら、CR染色凝集物を膜中に保持した。PE女性の尿試料はタンパク質濃度において広範な変動性を有するので、試験の最初部分で総タンパク質/CR比の標準化を行った。試験アウトプットは、%CR保持(Retention)[(CRR)、添加した色素の量に対する洗浄後に残った色素を測定]および%CR取り込み(Incorporation)[(CRI)、それぞれに試料に添加した色素を測定し、内部対照とした]と表示した。
【０１４４】
直接分光測光法による尿コンゴーレッド好性の評価
アミロイドへのCRの結合により、可視光における色素吸光度スペクトルの変化が生じ(橙色-赤色からバラ色-マゼンタ)、この深色団シフトは、インビトロにおけるβアミロイドオリゴマー化(凝集)のレベルを評価するために以前に使用されている(22、100)。実行性段階で使用される全てのsPEおよびP-CRL尿試料を、CDR試験と同様に処理した。尿-CR混合物を10倍に希釈し、CR誘導性スペクトルシフトについて分光測光法により調べた(下記参照)。それぞれの尿試料中のアミロイド様タンパク質の理論的濃度は、Klunkの式を使用して、403、504および541nmの吸光度の値から導いた。固有の吸光度および光散乱の標準化は、CRなしの試料中で得られた値を差し引いて行った。スペクトルシフトにより決定されたアミロイド様タンパク質の濃度を、被験体のCRR試験結果と相関させた。
【０１４５】
尿中のThT誘導蛍光の評価
元は血清について記載されたプロトコルの後に、ThT蛍光を測定した。簡潔に、スピンした尿試料(30μl)を、100mMリン酸緩衝化食塩水(PBS)pH7.4中の80μM ThTと混合した。それぞれ、444/485nmの励起/放射波長設定を有する分光蛍光計(Clariostar, BMG Labtech, Cary NC)において蛍光測定値を得た。ThTの非存在下の値を差し引いて固有の尿蛍光についての標準化を行った。
【０１４６】
オリゴマー状態免疫反応性のための試験
可溶性アミロイドオリゴマーは、細胞傷害性であり、細胞死の有力な誘導体である。いくつかの免疫学的に明確な構造変形物：前線維状オリゴマー(PFO)、線維状オリゴマー(FO)および管状プロト原線維(protofibrils)(APF)が記載される。それぞれPFO、FOおよびAPFを認識する以下の一次抗体、A11、OCおよび抗APFを用いたドットブロット技術を使用した、4群の女性(P-CRL、n=57；crHTN、n=16；mPE、n=33；sPE、n=128)の尿中の可溶性アミロイドオリゴマーの存在(14〜16)。技術的な詳細は補足方法に示す。
【０１４７】
CR補助沈殿
異なる臨床カテゴリー(P-CRL、n=13；crHTN、n=5；mPE、n=5；sPE、n=51；spPE、n=9；非PE蛋白尿症状、n=8)中の91名の妊娠女性由来の尿試料を、補足方法に記載されるようにCR補助沈殿のために処理した。CR沈殿は、P-CRL、crHTNまたは非PE蛋白尿被験体(CR沈殿陰性)のいずれかではなく、PE試料の90%において微小遠心チューブ(microfuge)の底で、可視的に同定した。
【０１４８】
極性顕微鏡法および透過電子顕微鏡法(TEM)
下記のように、sPE尿(n=5)由来のCR沈殿を、水に再懸濁し、顕微鏡スライド上で乾燥させ、特徴的な緑色CR複屈折のための偏光顕微鏡法により可視化した。代替的に、懸濁は、2%酢酸ウラニルでの陽性または陰性染色後、200メッシュのホルムバール(formvar)/炭素被覆ニッケルグリッド上に配置した。CR沈殿P-CRL女性(n=4)の調製を試みたチューブ由来の検体も試験した。
【０１４９】
尿コンゴーレッド好性物質中のタンパク質の同定、検証および凝集モデリング
CR沈殿を、sPEを有する女性(n=4、GA：28±2週)から単離し、還元Laemelliバッファ(BioRad)に再懸濁し、10分間煮沸した。試料を10% SDS-PAGEゲルに充填し、これをクーマシーブルーで染色した。目に見えるバンドを切り出し、トリプシン消化およびタンデム質量分析のために処理した(下記参照)。53より高いMOWSEスコア(matrixscience.com)に基づいて、タンパク質同一性を確立した。SERPINA1、アルブミン、κFLC、セルロプラスミンおよびインターフェロン誘導性タンパク質6-16(G1P3)は、60名の他の症例から単離されたCR沈殿物においてウエスタンブロッティングによる検証のために示され、選択されることが見出された。G1P3の凝集性質は、http://bioinf.uab.es/aggrescan/のウェブサーバー上で走らせたAGGRESCANアルゴリズムを使用して決定した(以下に詳細)。
【０１５０】
尿、尿コンゴーレッド好性物質および/または母性血清中のAPPおよびADAM-10免疫反応性の決定
sPE症例の例示的なコンゴーレッド好性物質(n=38)および尿(n=16)に対してウエスタンブロッティングを使用した。GA適合症例のP-CRL尿(n=8)は参照のために使用した。血清および尿中の可溶性APP(sAPP)の免疫反応性およびADAM-10免疫反応性を、ELISA(下記のプロトコル)により調べた。
【０１５１】
定量的リアルタイムPCRおよび免疫組織化学によるα、βおよびγ-セクレターゼの調査
APPならびに以下のAPP切断酵素：α-セクレターゼ(ADAM10、ADAM17)、β-セクレターゼ(BACE1、BACE2)およびγ-セクレターゼ[プレセニリン-1(PSEN1)、プレセニリン-2(PSEN2)]についてTaqMan化学(Applied Biosystems)および有効なプライマー/プローブを使用して、胎盤および羊膜絨毛膜mRNAに対してリアルタイムPCRを行った。胎盤絨毛中の染色強度は、0(非存在)〜+5(強い)のスケールで半定量的に評価した。栄養膜およびマクロファージそれぞれの細胞性マーカーとしてサイトケラチン-7およびCD163に対する抗体を使用した。技術的な詳細を以下に示す。
【０１５２】
免疫組織化学による胎盤内のアミロイド斑の局在
アミロイドの異常な堆積が、原型タンパク質異常折り畳み障害であるアルツハイマーの特徴である。病理学的証拠により、ペプチドAβの原線維がアミロイドの基本的な成分であることが示された。アルツハイマー病を有する患者の脳内の斑に存在することが知られるAβエピトープの検出のためにパラフィン包埋スライドを処理した。2つの良く特徴付けられたモノクローナル(抗ALZ90およびDE2B4)を使用した。アリザリンS染色により、共に堆積するカルシウムを同定した。技術的な詳細を以下に示す。
【０１５３】
他の生化学的、免疫学的および分子的推定に対する方法の詳細
タンパク質-対-クレアチニン(P:C比)、可溶性fms様チロシンキナーゼ-1(sFlt-1) 対 胎盤成長因子(PlGF)の比(uFP)および尿プロテオミクススコア(UPSbおよびUPSr)などの(使用または提唱される)PE代理マーカーについて全ての尿試料を分析した。技術的な詳細を以下に示す。
【０１５４】
統計分析
(正規分布したデータについて)標準誤差(SEM)を有する平均または(非正規分布したデータについて)四分位数間領域を有する平均としてデータを報告した。データセットは、適切なように、スチューデントt検定、マン-ホイットニー検定、一元配置、二元配置またはクラスカル-ウォリスANOVAを用いて比較した。ピアソンまたはスピアマンの順位相関関数を使用して相関分析を行った。フィッシャーの正確検定またはχ二乗検定により割合を比較した。一緒に、長さ的コホートの最初の試料と共に実行性および横断面的コホートに登録された妊娠女性の尿試料は、登録に関して不偏の女性の連続コホートについて代表的であるので、受信者動作特性曲線(ROC)に適した。MedCalc(Broekstraat, Belgium)統計学的ソフトウェアを使用して、受信者動作特性ROCプロットに対して試験正確性(正確に分類された症例/症例の総数)、感度、特異性、陽性および陰性予測値、および尤度比(LR)を測定した。ブートストラップ法を使用して信頼区間(CI)を計算した。依存型ROC曲線下面積(同じ症例由来)の間の差の統計的な有意さをを決定するためにノンパラメトリック法を使用するDe Long法を使用してROC曲線の比較を行った。
【０１５５】
臨床的な定義
・在胎齢(GA)は、全ての例において、最後の月経期間の日に相関する良く確立された超音波検査基準を用いて確立された。
【０１５６】
・重度の子癇前症(sPE)は、6時間おきの少なくとも2回の測定(occasions)で＞160mmHgの心収縮期の血圧または＞110mmHgの心拡張期の血圧、＞5グラムのタンパク質排出/24時間尿回収、および/または計量棒試験で持続性の+3蛋白尿として定義された。子宮内胎児発育遅延(Intra-uterine fetal growth restriction)(IUGR)＜10%(10th percentile)、持続性の神経学的症状(頭痛、視覚障害)、上胃部の疼痛、尿量過少(500mL/24時間未満)、＞1.0mg/dLの血清クレアチニンまたは任意のHELLP症候群の要素：溶血、肝臓酵素の上昇(正常の2倍より高い)、低い血小板数(＜100,000細胞/μL)が、米国婦人科学会(American College of Obstetricians and Gynecologists)(ACOG)によりsPEの定義の一部として使用された。
【０１５７】
・中程度PE(mPE)は、sPEまたはspPEのいずれかの診断と一致する徴候または症状の非存在下で、それぞれ4〜6時間おきに2回の測定で少なくとも140/90mmHgの心拡張期血圧および少なくとも300mg/24時間尿回収の尿タンパク質排出(または計量棒試験で少なくとも1+以上)として、ACOGにより定義された。
【０１５８】
・世界保健機関(WHO)のPEの定義、≧90mmHgの心拡張期および計量棒蛋白尿2+以上)が、特定の選択統計学的分析に使用された。
【０１５９】
・妊娠性高血圧は、蛋白尿またはsPEのマーカーなしで20週間後に新たに示される、4時間〜1週間おきの2回の測定でPEと一致する血圧の上昇として定義された。
【０１６０】
・「典型的でないPE」は：
蛋白尿非存在の妊娠性高血圧、および以下の事項：子癇前症の症状(上胃部の疼痛、重度の頭痛、尿量過少、肺水腫)、溶血、血小板減少(＜100,000/mm3)、肝臓酵素の上昇(アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼまたはアラニンアミノトランスフェラーゼについて通常の値の上限の2倍)の1つ以上
妊娠性高血圧非存在の妊娠性蛋白尿、および以下の事項：子癇前症の症状、溶血、血小板減少、肝臓酵素の上昇の1つ以上
の設定において診断された。
【０１６１】
・混合型子癇前症(spPE)は、妊娠の20週前に慢性の高血圧を有する女性において「新たに始まった蛋白尿」、既に妊娠初期に存在する場合は突然の蛋白尿の増加、高血圧の突然の増加、またはHELLP症候群の発症として定義された。
【０１６２】
・慢性高血圧(crHTN)は、妊娠前または20週在胎齢前の血圧の持続的な上昇として定義された。
【０１６３】
・慢性腎症は、患者が、20週GA前に検出された既知の妊娠前腎臓疾患または持続性蛋白尿(少なくとも2回の測定で＞0.5グラム/24時間)を有する場合に、診察後に腎臓病学者により診断された。
【０１６４】
・非妊娠女性における蛋白尿は、150mg/24時間尿回収のカットオフに基づいて判断された。
【０１６５】
・他の型-1(PEの精密検査を必要としなかった、頻繁にはPEに関連しない症状). 本発明者らはさらに、臨床的表示に基づいてPE精密検査を必要としなかった妊娠患者の群(n=125)において尿コンゴーレッド好性を試験した。該患者らの登録時の臨床的診断は：出産予定日前の未熟な膜の破裂(PPROM、n=25)、短い子宮頸および/または完全な膜を有する出産予定日前の分娩(n=76)、成育可能以前の胎盤(placenta previa)(n=6)、正常血圧、非蛋白尿女性の未知の病因の子宮内胎児死亡(IUFD)(n=5)、正常血圧、非蛋白尿女性における剥離(n=2)、血栓形成傾向(n=3)および腎盂腎炎(n=8)であった。
【０１６６】
・他の型-2(PEを確認はまた排除するための実験室精密検査を必要とした、高リスクPEに頻繁に関連した症状). 臨床的関連性のため、ならびに尿コンゴーレッド好性の頑健性について試験してPEを有する患者と有さない患者を区別するため、PEを有する異なる診断のための実験室精密検査を必要とした患者の臨床的に不均一な群(n=37)が、分析に含まれた。この群は、IUGRを示した症例(n=20)、既存の腎症を有する症例(n=9)、未知の病因の肝臓および/または腎臓の不全を有する症例(n=4)、ならびに抗リン脂質症候群を有する症例(n=4)からなった。
【０１６７】
コンゴーレッドドット(CRD)試験および研究設定におけるCRRの計算のためのプロトコル
・試料調製：尿を4℃で15分、15,000gで遠心した。標準としてアルブミンを用いるPierce BCAキット(Thermo Scientific, Rockford, IL)を使用して総タンパク質/濃度を測定した。全ての尿試料を蒸留水で標準化して、BCAアッセイにおいて6.6mg/mL総タンパク質/濃度を測定した。CRおよびタンパク質/濃度の関数としてBCAアッセイの直線性を調べた以前の実験に基づいてこの値を選択した。実施の関連性のために、BCAアッセイにおいて＞6.6mg/mLと測定された試料を水で希釈し、＜6.6mg/mLと測定された試料をSpeedVac(Thermo Scientific)中乾燥まで濃縮し、上記の濃度まで水で再懸濁した。
【０１６８】
・CRDニトロセルロース膜アレイの調製：100μlの標準化された尿を、2μlのコンゴーレッドのストック水溶液(5 mg/mL、Sigma Cat#C6277、St Louis MO)と混合した。2μlのCRストック溶液を100μlのリン酸緩衝化食塩水(PBS)に添加して、ブランク試料(BLK)を調製した。室温のボルテックス混合の1時間後、5μlの混合物を支持されないニトロセルロース膜(0.22μm, BioRad, LaJolla CA)に二重にスポットし、風乾させた(約15分)。次いで、膜を水で3分間すすぎ、その後デジタルカメラ(CoolPix 4500, Nikon, Tokyo, Japan)を使用して写真を撮り、第1の写真を取得した(PIX1：洗浄前)。次いで、膜を増加濃度のメタノール[50%メタノール：3分、70%メタノール：1分、90%メタノールで、BLK試料中の赤色が完全に消えるまで(約10分)で洗浄した。この間に、非PE試料の赤色は、遊離CR色素が洗い流されて、消えた。尿が異常折り畳みタンパク質を含んだ場合、CRは固定された異常折り畳みタンパク質により保持され、スポットは視覚的に赤色に維持された。その後第2の写真を撮った(PIX2：洗浄後)。
【０１６９】
・画像処理：PIX1およびPIX2をAdobe Photoshop (Adobe, San Jose, CA)で処理した。具体的に、それぞれの画像を手動でグレースケールに変換し、切り取り、レーン内で離し、PIX1の同じスポットがPIX2と平行に並ぶように調整した。それぞれのスポットの光学密度(OD)はImageJソフトウェア(http://imagej.nih.gov/ij/)を使用して決定した。ベースラインを手動で差し引き、プロフィール曲線下面積を抽出した。OD結果をExcelに出力し、それぞれのスポットについて比PIX2/PIX1x100を計算し、患者当たり二重のスポットの間で平均した。この試験結果(CR保持：CRR)を尿コンゴーレッド好性の定量的基準として現在の試験に使用し、PEの診断および予後に関する臨床的変数に対して分析した。第2の変数、CR取り込み(CRI)は、平均試料OD/平均BLK OD x100の比としてPIX1のみから計算し、内部対照とした。
【０１７０】
直接分光測光法による尿コンゴーレッド好性の評価
溶液中のCR誘導スペクトルシフトのための分光測光法分析を、Aβ結合について以前に記載されたように実行した。CRD試験について記載されるように尿試料を標準化してCRと混合した。200μlの10倍希釈CR尿混合物を、CRなしの尿の同じ希釈物と共に、96ウェルプレート上に二重で適用した。ブランク試料はCRありおよびなしのPBSであった。SOFTmax Pro 4.0ソフトウェアを備えたSpectramaxプレートリーダー(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)中でプレートを読んだ。測定値は、最初に波長走査モード(300〜700nm)、次いで403nm(等吸収(isobestic)点)、504nm(遊離CRの最大吸光の点)および541nm(遊離およびアミロイド結合CRの間の最大の差の点)での終点読み込みにより取得した。CRなしの同じ尿試料からOD読み込みを引いて、固有の光散乱の補正を行った。それぞれの尿試料中のアミロイド様タンパク質の理論濃度は、Klunkの式および被験体のCRD試験結果と相関した結果を使用して吸光値から導いた。
【０１７１】
他の生化学的、免疫学的および分子的な推定
・尿タンパク質/濃度は、アルブミン標準に対して、ビシンコニン酸/硫酸銅試薬(BCAキット、Pierce、Rockford、IL)を用いて測定した。ほとんどの尿試料に対して12倍希釈力価を使用した。標準曲線より下または上のそれぞれで測定した試料に対して未希釈または50倍希釈試料の反復測定を行った。
【０１７２】
・尿クレアチニンは、既知の濃度由来の標準曲線に対して比色定量的に測定した(Stanbio Laboratory, Boerne, TX)。
【０１７３】
・可溶性fms様チロシンキナーゼ(sFlt-1)および胎盤成長因子(PlGF)に結合しない尿は、以前に記載されたように、製造業者の指示書(R&D Systems, Minneapolis, MN)に従って、ELISAにより測定した(24)。遊離のsFlt-1およびPlGFに対する捕捉抗体で予め被覆した96ウェルプレート中、尿試料は2回アッセイした。インキュベーションおよび洗浄プロトコルを行った後、450nmで読み込んだ。sFlt-1およびPlGFについてのアッセイにおける最少検出可能濃度は、それぞれ5および7pg/mLであった。データは、SoftmaxソフトウェアPro 3.1.1 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)を使用して報告し、プロットした。変数のアッセイ内およびアッセイ間係数は、3〜10%変化した。sFlt-1 PlGFおよびタンパク質の尿レベルを、尿クレアチニン濃度に対して標準化した。以前に報告されたように、いずれかの分析物単独よりも良好なPEの指標としてuFP(log [sFlt/PlGF x 100])を計算した。
【０１７４】
・尿プロテオミクススコア(UPS)は、以前に公表された表面増強レーザー脱着イオン化飛行時間(surface-enhanced laser desorption ionization time-of-flight)(SELDI-TOF)トレーシングに由来した。本発明者らは、逆相疎水性表面H4およびH50チップ(BioRad, La Jolla, CA)を使用してそれぞれの尿試料を個々にアッセイした。2.3〜17.5kDa質量領域中の13個のバイオマーカーピーク(P1〜P13)は、PEについての尿プロテオミクスプロフィール特徴を構成する。バイオマーカーとして設計されたそれぞれのピークについて、実験質量(同一性の指標)およびその信号-対-雑音比(相対的豊富さの指標)を計算した。2つの目的の尿プロテオミクススコアを計算した：UPSb(Booleanスコア)は、それぞれのバイオマーカーに割り当てられたBoolean指標(1：存在、0：非存在)の合計を示し、UPSr(ランク付けされたスコア)は、UPSr = Σx(S/N)/10+1(式中、「x」は1のBoolean指標を有するバイオマーカーを含む)で計算された際の存在するバイオマーカーの半定量的情報と重ねた。
【０１７５】
オリゴマー化状態免疫反応性のための試験
可溶性オリゴマーの免疫検出に使用される一次抗体を、本発明のメンバーまたは本発明のチームのメンバーによる以前の公開公報において、開発して特徴付けた。以下の一次ポリクローナル抗体：アミロイド原性タンパク質により形成される特異的な四次構造エピトープを認識するA11、OCおよび抗APFを使用した。
A11は前線維状オリゴマー(PFO)を認識する
OCは成熟原線維を検出する
抗APFは管状プロト原線維(αAPF)と反応する。
【０１７６】
ドットブロット技術を使用して最適化し、凝集物のFLC成分に対する二次抗体の非特異的結合を最小化した。40μgタンパク質/スポットを含むように標準化された二重の尿試料をニトロセルロース膜に供して、室温で乾燥させ、次いで室温で2時間、Tris緩衝化食塩水(TBS)中10%脱脂乳でブロッキングした。一次抗体を、1:1,000(A11)または1:5,000(OCおよびαAPF)希釈のいずれかで5%ミルク中に希釈した。4℃で一晩のインキュベーション後、膜をTBS-Tで4回洗浄し、次いで5%ミルク/TBS-T中1:5,000に希釈したビオチニル化ヤギ抗ウサギIgG(H+L)(Fab'2)(Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)と室温で1時間インキュベートした。膜を再度洗浄し、次いでミルクなしTBS-T中ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)(1:8,000、GE Healthcare, Kings Park, NY)とインキュベートした。最後に、膜をTBS-Tで3回洗浄し、ECL化学発光(GE Healthcare)で発色させた。
【０１７７】
CR補助沈殿のためのプロトコル
準安定ポリペプチド結合についての自己集合特性および親和性を考慮して、CRは、水溶液中のアミロイドオリゴマー成長および凝集を誘導することが知られる。CR結合凝集物が成長するにつれて、該凝集物は溶液外で沈殿し、遠心分離により単離し得る。それらの原理に基づいて、発明者らは、尿試料のCR補助沈殿のためのプロトコルを開発し、PEのコンゴーレッド好性および異常折り畳み体をさらに特徴付けた。10mL体積の尿を最初に15,000gで4℃、15分間遠心した。上清を200μl CRストック溶液と混合し、CRD試験について1時間ボルテックスにかけ、再度遠心分離し、次いでコンゴーレッド好性凝集タンパク質をペレット化した。ペレットを水に再懸濁して、遠心分離により3回再回収して、未結合CRを除去した。最後のCR沈殿を50μlの水に再懸濁し、すぐに画像化したか、またはその後の分析のために-80℃で凍結保存した。ペレットが見られない場合、検体をCR沈殿陰性とみなしたが、CR沈殿陽性試料と同様に微小遠心分離を処理した。
【０１７８】
偏光顕微鏡法、透過電気顕微鏡法(TEM)および凍結TEM
CR沈殿物を水に再懸濁し、顕微鏡スライド上で乾燥させ、Olympus OLY-200デジタルカメラを備えたOlympus U-STP顕微鏡(Olympus, Melville, NY)を使用して、偏光下で画像化した。代替的に、懸濁物を、2%酢酸ウラニルで陽性または陰性染色した後200メッシュホルムバール/炭素被覆ニッケルグリッド上に置いた。CR沈殿P-CRL女性の調製を試みたチューブ由来の検体も試験した。凍結TEMについて、CR沈殿を、0.9%塩化ナトリウムを有する10mM HEPES(pH7.4)中4%パラホルムアルデヒド/0.1%グルタルアルデヒド中で30分間固定してすすぎ、遠心して10%ゼラチンに再懸濁した。次いで試料を、以前記載された微細胞孔と同様に処理した。超薄凍結切片を、ウサギ抗SERPINA1(1:500, LabVision, Freemont, CA)またはヤギ抗ヒトアルブミン(1:500, Bethyl Laboratories, Montgomery, TX)のいずれかで単一標識し、ウサギ抗ヤギ抗体(1:200, Jackson Immunoresearch)および10nmの金に連結されたプロテインA(Cell Microscopy Center, Utrecht, Netherlands)を使用して架橋した。二重標識グリッドは、一次ヤギ抗アルブミン1:500および5nmのプロテインA-金、次いでウサギ抗SERPINA1および10nmプロテインA-金を使用した。全ての試料は、MoradaデジタルカメラおよびOlympus画像化ソフトウェアを備えたTecnai 12 BioTWIN電子顕微鏡(FEI/Phillips, Hillsboro, Oregon)中で観察した。FEI Tencai Biotwin TEMは80Kvであった。Morada CCDおよびiTEM(Olympus)ソフトウェアを使用して画像を得た。
【０１７９】
ウエスタンブロットによるタンパク質同定および検証のための技術
CR沈殿物を還元Laemelliバッファ(BioRad)に再懸濁し、10分間煮沸した。試料を10% SDS-PAGEに充填し、クーマシーブルーで染色した。可視のバンドを切り出し、Ettan TA Digester (GE Healthcare)でトリプシン消化について処理した。自動化MALDI-MS/MSスペクトルを4800 TOF/TOFプロテオミクス分析器(Applied Biosystems, Foster City, CA)上で取得した。得られたペプチド配列を、ウェブで利用可能なYale Protein Expression Database (YPED http://medicine.yale.edu/keck/proteomics/yped/index.aspx)にアップロードした。＞53の確率Mowseスコアは過度の相同性を示すと思われた。以下のタンパク質：SERPINA1、アルブミン、セルロプラスミン、IgG κFLCおよびインターフェロン誘導性タンパク質6-16(IFI6-16、G1P3としても公知)が示されることが見出された。これらの同一性を、他の60の症例の尿から単離した沈殿物中でウエスタンブロットにより検証した。沈殿物をLaemelliバッファで還元し、4〜20% SDS-PAGEゲルで電気泳動し、PVDF膜に転写した。以下の一次抗体：ウサギ抗SERPINA1(1:1,000, LabVision,)、ヤギ抗アルブミン(1:1,000, Bethyl Laboratories)、マウス抗セルロプラスミン(クローン3B11、1:1,000 Thermo Scientific, Rockford, IL)、マウス抗κFLC(クローンMEN09、1:1,000 Novus Biologicals, Littleton, CO)、ウサギ抗G1P3(1:300, Proteintech, Chicago, IL)を使用した。適切なビオチニル化二次抗体(1:5,000、Jackson Immunoresearch)、次いでストレプトアビジン-HRP(1:8,000、GE Healthcare)およびECL化学発光(GE Healthcare)を使用してブロットを検出した。
【０１８０】
G1P3の凝集性質についての分析
凝集性質の計算および可視化のためにAGGRESCAN、ウェブベースアルゴリズムを使用して配列を分析した。このアルゴリズムは、いくつかの立体障害に含まれるタンパク質断片の凝集を予測することが示されている。これは種々のクラスのタンパク質をそれらの凝集および可溶化性質による識別することも示されている。天然に折り畳まれたタンパク質は、最も低い凝集性質を有することが予測された。AGGRESCAN出力において、最も高い予測凝集性質を有する配列強度は、プロフィールプロット中ピークとして現れる。1アミノ酸当たりホットスポット閾値(HST)よりも高い平均凝集性質値(a4v)を有する5以上の連続残基がある場合、ポリペプチド配列は「ホットスポット」であるとみなされる。AGGRESCAN パラメーターを表4に列挙する。
【０１８１】
APPおよびAβエピトープについてのウエスタンブロッティング
尿またはCR沈殿試料をLaemelliバッファで還元して、4〜20% SDS-PAGEゲルで電気泳動し、PVDF膜に転写した。以下：マウスモノクローナル抗APP(1:1,000、MAB348、クローン22C11；APPのN末端エピトープアミノ酸66〜81に対する、Millipore)、マウスモノクローナル抗APP(1:259、MAB5354、APPのKPIドメインに対して生成、Millipore)、マウスモノクローナル抗Alz90(1:250、MAB349、APPのアミノ酸511〜608に対応する合成ペプチドに対して生成、Millipore, Billerica, MA)およびマウスモノクローナルDE2B4(1;1,000、ヒトAβの残基1〜17に対して生成、Littleton, CO)の一次抗体を使用した。異なるブロットをそれぞれの抗体に曝露した(ブロットははがれず(stripped)、再プローブ化しなかった)。ヒトアルブミン(血漿から精製)または稲中で発現したリコンビナント(Sigma)を使用して、抗APP抗体の可能性のある非特異的交差反応性を除外した。アルツハイマーの脳組織溶解物(Novus, Littleton, CO)を陽性対照として使用した。ビオチニル化ヤギ抗マウス二次抗体(1:5,000, Jackson Immunoresearch)、次いでストレプトアビジン-HRP(1:8,000, GE Healthcare)およびECL化学発光(GE Healthcare)を用いてブロットを検出した。
【０１８２】
総可溶性APP(sAPP)およびADAM10についての免疫アッセイ
sAPPを、ELISAにより尿中で測定し、血清試料と対にした(sAPP：IBL International, Hamburg, Germany)。適切に希釈した試料(尿2倍、血清50倍)をsAPP(αセクレターゼの分解産物)およびsAPPβ(βセクレターゼの分解産物)の両方に共通のエピトープに対する捕捉抗体で予め被覆した96ウェルプレートに入れた。ADAM10 ELISA(CosmoBio USA, Carlsbad, CA)について、母性の血清を3倍希釈した。製造業者に示されるとおりにインキュベーションおよび洗浄プロトコルを行い、次いで波長を補正して450nmで読み取った。SoftmaxソフトウェアPro 3.1.1(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)を使用してデータを報告しプロットした。
【０１８３】
定量的リアルタイムRT-PCR
RNAを抽出し、標準的な手順を使用して、ランダムヘキサマープライマーを用いてcDNAに逆転写した。10μLマスターミックス(TaqMan(登録商標) Fast Universal PCR 2x Master Mix)、8μLの水、1μLの標準化したcDNA鋳型および1μL PCRプローブセット(TaqMan(登録商標)Gene Expression Assays on Demand)で構成される20μLの反応中TaqMan(Applied Biosystems, Carlsbad, CA)化学を使用してRT-PCRを行った。分析に使用したプローブ(Applied Biosystems)は、以下：アミロイド前駆体タンパク質/プロテアーゼネキシン-II(APP、Hs01552282_m1)、A-ディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ-10(ADAM10、Hs00153853_m1)、ADAM17(Hs01041915_m1)、BACE-1(Hs00201573_m1)、BACE-2(Hs00273238_m1)、プレセニリン-1(PSEN1、Hs00240518_m1)およびプレセニリン-2(PSEN2、Hs00240982_m1)であった。β2ミクログロブリン(B2M；Hs99999907_m1)およびリボソームタンパク質L30(RPL30、Hs00265497_m1)を内在性対照として使用した。これら2つの内在性対照mRNA(B2MおよびRPL30)の組合せを、TaqMan(登録商標) Human Endogenous Control Plate (Applied Biosystems)中で増幅したPEまたはCRL組織(胎盤または羊膜)いずれか由来のcDNAのプールを使用して予備実験において検証した。2つの参照遺伝子の選択は、6個のｃDNAプール中で異ならない低サイクル閾値(Ct)に基づいた。それぞれの標的について、増幅は、2段階サイクル(変性、95℃、15秒；アニーリング/伸長、62℃、60秒)を40サイクルで、二重の反応で行った。StepOneソフトウェア(v2.1)を使用して処理後の計算を行った。得られた値を、dCt(ΔCt：標的のCt-内在性対照のCt平均)の計算を使用して内在性対照RNAの幾何学平均に対して標準化した。0のdCtは、標的とハウスキーピング遺伝子の間の1の比を示し、異なる標的間および異なる組織間の相対的な豊富さの指標として使用し得る。ddCt(個々の試料のdCt-参照試料中の同じ標的のdCt)の計算は、標的標準化内でさらなる考察を追加し、異なる生物学的グループの間の相対的mRNA豊富さの良好な推定である。ddCt計算について、本発明者らは全ての試料由来のRNAプールを使用した。
【０１８４】
免疫組織化学
胎盤絨毛組織の5μmのパラフィン切片をキシレン中で脱パラフィン化して、段階的エタノール〜カリウムリン酸緩衝化食塩水溶液、pH7.2で再水和した。クエン酸バッファによる抗原回復後、切片を1%過酸化水素で15分前処理し、次いでブロッキングして、以下の一次抗体：マウスモノクローナル抗Alz90(1:250)、マウスモノクローナルDE2B4(1:1,000)、ヤギ抗ADAM10(1:200、R&D Systems, Minneapolis, MN)、ヤギ抗ADAM17(1:50 R&D Systems)、マウスモノクローナル抗BACE1(1:150、MO2、クローン2C13、Abnova, Taipei, Taiwan)、ウサギ抗BACE2(1:200、Novus, Littleton, CO)およびウサギモノクローナル抗PSEN1(1:100、Abcam, Cambridge, MA)およびウサギモノクローナル抗PSEN2(1:100、Abcam)と一晩(4℃)インキュベートした。栄養膜上皮細胞および胎盤マクロファージは、マウスモノクローナル抗サイトケラチン7(1:100、Zymed/Invitrogen, Carlsbad, CA)またはマウスモノクローナル抗CD163 Neomarkers, Fremont CA)抗体のそれぞれ(110, 111)を使用して、以前記載されたように選択切片上で同定した。適切なビオチニル化二次抗体(1:600, Jackson Immunochemicals)を用いて室温で1時間のインキュベーション後、色素原としてVector NovaRed(Vector Laboratories)および対比染色としてヘマトキシリンを用いて、アビジン-ビオチン染色(Vectastain Elite ABC, Vector Laboratories, Burlingame, CA)を使用して検出を行った。組織切片は、段階エタノール中で脱水して、透明化し、封入した。適切に、陰性対照スライドを、ウサギまたはマウスアイソタイプIgGとインキュベーションした。
【０１８５】
参照(それぞれは本明細書において参照により援用される)
【表５】
0006697394.tif 000006
【表６】
0006697394.tif 000007
【表７】
0006697394.tif 000008
【表８】
0006697394.tif 000009
【表９】
0006697394.tif 000010
【表１０】
0006697394.tif 000011
【０１８６】
実施例3
試験設計および検体
CDR試験について2つのパートがある。「湿潤パート(wet part)」は、尿-コンゴーレッド混合物の調製、ニトロセルロースシート上のドットとしての混合物のスポット(CRDシートアレイ)、次いでスマートフォンによる2枚の写真の撮影および保存(Pix1：シートを洗浄する前に撮影およびPix2：疎水性洗浄後に撮影)を含む。「乾燥パート(dry part)」は、2つの画像の処理、次いでそれぞれのドットについて個々に、およびブランク試料(BLK、ヒト尿の代わりにリン酸緩衝食塩水[PBS])からコンゴーレッド保持(CRR)結果を引いた後のアレイ上の二重のドットの平均としてそれぞれの被験体についてのCRD試験結果[%コンゴーレッド保持(CRR)]の計算を含む。この試験は3段階で行い、それぞれでCRD試験の「湿潤パート」および「乾燥パート」の両方を相乗的に簡易化、高速化および向上することに努めた。
【０１８７】
・段階1において、ImageJソフトウェア(http://imagej.nih.gov/ij/)を使用した手動の分析のための調製において、Adobe Photoshop(Adobe, San Jose, CA)において以前に処理された保存された画像について、画像処理ソフトウェアツールの仮のバージョンを評価した。段階1の結果により、試験および「乾燥パート」の最適化の携帯電話利用可能画像処理ツールパートの「湿潤パート」の際の、試料のドットの矛盾しない位置決定のための標準化された鋳型の開発がもたらされた。
【０１８８】
・段階2において、これらの向上を、新たに調製され、標準化されたCRDアレイに対してリアルタイムで試験し、手動プロトコルに対する一致および疾患関連予後的標準(医学的に適応された子癇前症のための出産：MIDPE)に対する試験正確性について結果を分析した。
【０１８９】
・段階3において、試験結果は、エラー強さを調べるためならびに該システムのエラー取り扱いおよびフィードバックを向上するための本発明者らのシステムのなんらかの指示または以前の知識を有さない訓練を受けていない職員を含む4名のオペレーターにより分析された。また、プロトコルの「湿潤パート」は、いくつかの工程を体系的に改変および/または排除して、技術的な性能を損なうことなく最大限の簡易化を達成するようにさらに簡易化された。
【０１９０】
この試験に含まれる尿検体は、CRD原則の分子的基準に対して報告された試験の一部として回収された(実施例2)。評価の際に、一人の専門家(IAB)により手動で計算されたCRRは、技術的黄金標準として機能した。MIDPE(子癇前症に関連する目標に近いが不十分な成果の事象)は、比較正確性分析において目的の結果として選択された。統計学的な方法を以下に要約する。
【０１９１】
ドット定量化のためのアルゴリズムの評価
段階1のデータセットは、以前に取得された画像(洗浄の前および後、Nikon Coolpix 4500)に由来し、最初の試験の一部として手動で定量化された。このデータセットは、合計218名の被験体由来の18のアレイからなった。それぞれのアレイは、12〜15名の被験体由来の二重のスポットを維持した(図20A)。バックグラウンドシートに対する赤色ドットの顕著さにおける目的に基づいて、色素の色を理論的に増強し、赤色チャネルピクセル値を緑色チャネルで割り(比R/G、RおよびGは0〜255の範囲である)、バックグラウンドの色を低減することにより赤色の情報を増強する2つの可能性のあるアルゴリズムを試験した。同じ理由で、第2の計算は、緑色チャネルを引いた赤色チャネルの情報(R-Gの差)を使用した。緑色に対するヒトの視覚系の強調された感度に適合させるために、青色よりも緑色に対して高感度なデジタルカメラセンサーを作製するBayerパターンのために、青色チャネルに対して緑色チャネルを選択した。最後に、輝度変換等式を使用して、色情報自体を排除しながら色の強度を維持した(図20B)。輝度(L)アルゴリズムは、手動の処理ルーチンにより使用されたものと似ていた。本発明者らの出願のコマンドラインインターフェイス(Linux Ubuntuオペレーティングシステムを有するThinkPad T500上で走らせる処理ライブラリのコマンドラインバージョン)により実行された擬似計算により、R/G(図20C)およびL(図20D)の計算が、R-Gと比較して手動で誘導されたCRR(両方の比較についてz試験 P＜0.001)と有意に良好に相関したCRR値に戻ったことが決定された(図20E)。比較正確性分析において(図20F)、手動で導かれたCRR[AUC=0.966; 95%CI [0.932-0.985])と、L返還を使用して自動で計算されたCRR(0.962 [0.927-0.983], P=0.579)との受信者動作曲線下面積(AUG)の間に差はなかった。しかしながら、手動の統合と比較して、CRRをR/Gとして計算した場合(0.962 [0.927-0.983], P=0.042)、AUCにおいて統計的に有意に異なる小さな低下が見られた。本発明者らは、この差は、L変換よりも有意にR/G比に影響を及ぼす選択された尿検体により発揮された(赤から紫への)微細な深色団シフトのためであると考えた。グレースケール画像に必要な一般的なより短い処理時間に加えて、このことは、その後の方法開発のために、本発明者らにLベースのアルゴリズムを選択させた。
【０１９２】
CRDアレイサイズおよびレイアウトの標準化
完全に自動化されたルーチンについて、シートの自動検出および取得された画像上のドットの一致する位置は、段階1の際の必要性と同様に現れた。また、シートの寸法および方向が既知である必要があった。これを達成するために、CRDアレイのレイアウトを標準化して再訪した(revisited)。Pix1およびPix2を取得した様式も、以下のように標準化して再訪した：i)ニトロセルロースシートを、iPhoneの画面のサイズに比例する幅4.5インチ x 長さ6インチの標準的な大きさに切断する；ii)正方形のシートの四隅のうちの3箇所に、手で握るクラフト紙パンチを使用して穴を開ける；iii)鋳型に位置する試料(図21)を通常の紙のシート上にプリントし、次いでこれをプラスチック製シート保護器の中でニトロセルロースシートの下に置いた。鋳型を一定の大きさにするための現実(true)は、図24に示されるようにプリントアウトに含まれた。41名の被験体まで試料の位置を鋳型に記す(それぞれの検体は、2つのカラムの隣接細胞中で二重にスポットされる)。それぞれの細胞中の黒い中心点は、透明なものを通して可視であり、シート上の予測されるドットの位置決定を確実にするために試料の配置のためのガイドとして機能する。ブランク(BLKまたはPBS)に対応する試料のドットは、第1の左側の隅に配置される；iv)Pix1およびPix2画像の両方の取得は、黒い表面上に配置されたアレイシートにより行い、これにより、洗浄中にしみ出し得るインクまたはシートのコストを上げ得る他のマーカーを使用する必要なく、パンチで開けられた穴が、位置マーカーとして機能する。CRD試験アレイのこの標準化された形式は、QUICK RESPONSE(登録商標)(QR)コードの要素を取り入れ、つまりシートは既知の縦横比を有し、4つの隅のうちの3つが強調される。左上の隅の3つのマーカーの検出により、Pix2中のそれ自体と対応するPix1中のそれぞれ個々のドット(または色素が洗い流された位置)の回転、補正(de-skewing)および完全な重ね合わせが可能になる。この最後の特徴は、Pix1およびPix2を取得するために使用される同じスマートフォン(この場合iPhone 4)上のアプリケーションとして機能するようにカスタマイズされた画像処理シークエンスにより達成される。
【０１９３】
CRDアレイ画像処理シークエンス
該シークエンスは、7つの画像処理工程を、以下のようにつなげる：i)CRD試験の湿潤パートの画像部分の取得；ii)シート検出；iii)シート抽出；iv)細胞抽出；v)ドット検出；vi)ドット抽出およびvii)CRR計算。該処理ワークフローを図21に模式的に示す。
【０１９４】
画像取得. スマートフォンに組み込まれたカメラを用いて画像を取得する。iPhone 4カメラの解像度は、直径当たり約40ピクセルの最大数を有する試料ドットを捕捉するのに十分である。これは、1試料ドット当たり約1,200ピクセルを生じる。処理速度およびエラー強さのために、それぞれの画像を、以下の全ての工程のために輝度グレースケールに変換する。
【０１９５】
シート検出. 写真撮影の角度のばらつきのためにシートの正確な位置および歪みはわからないので、遠近感突出の補正(de-skewing)が最初に必要となる。これを達成するために、4つの隅を検出し、次いで4つの隅の間に簡単な挿入(interpolation)を適用して、シートを長方形の画像に補正した。隅を発見するために、シート自体次いでその端を探し当てる必要がある。シートの2つの向かい合う面は同じ長さであるべきであり、隅は90°の角度を有し、隣の面の比は標準化された鋳型の比(0.75)と等しくある。自動検出のために、Otsu法を使用して、グレースケール入力画像を二進法にする。画像のバックグラウンドは黒色であり(パンチで開けられた穴を通して、黒色の写真背景が見られるため)シートは白色であるので、シートのOtsu閾値を計算して、前景(シート)と背景を分離する。得られる二進法画像をさらに滑らかにするために、前景部の全ての穴に数学的形態学を適用する。次いで、勾配フィルターを適用して画像上のシートの境界を曝露させる。境界を過剰に表現した(over-expressed)この勾配画像上で、ハフライン変換(画像中の線を発見する方法)を使用して隅を検出する。最初に粗いハフライン変換を計算して4つの最も顕著な縁(シートの境界)を緩やかに発見する。次に、これらの線の4つの交差を抽出する。これらの位置は隅と完全には一致しないので、先に発見した隅の周囲の目的の領域に対して第2のより正確なハフライン変換を別々に実行する。この第2の試行において、隅に近い二本の主要な線のみが抽出され交差し、メモリの使用率を最小に維持しながら隅の点の位置推定が向上される。
【０１９６】
シート抽出. 4つの隅の点から、より長い縁およびより短い縁の位置が推定され、二本線の挿入を使用してシートが遠近法的に長方形の形態に変換される。幾何学的な補正によってもドット当たりのピクセルの数が約700ピクセルまで低減される(ダウンスケール化(downscaling))。可能な風景 対 肖像取得を説明するために、それぞれの隅の平均強度を計算して参照点として最も強度の高い隅(穴を開けたマーカーを有さない隅に相当)を選択することにより、シートの隅の3つの位置マーカーを検出する。シートを置き換えるかまたは回転させて、全てのマーカーを左上の隅に再配置させる。ここで標準化された画像は4つの画像の隅に広がるシートを含む。この過程をPix1およびPix2に対して個々に行う。
【０１９７】
細胞抽出. アレイの幾何学は標準化された試料適用鋳型に基づいて良好に規定されるので、それぞれの患者の細胞の位置を、さらなる画像処置を行うことなく標準化された画像から抽出する。しかしながら、それぞれの細胞は未知の場所に2つのドットを含む。この過程をPix1およびPix2に対して個々に行う。
【０１９８】
ドット検出. 全ての可能性のある試料ドットはPix1に存在するが、いくつかは洗浄の間に消失し得る(陰性試験試料)。したがって、完全なドット検出はPix1上のみで行われ得る。ドットの位置を決定するために、Pix1上のそれぞれの抽出された細胞に勾配フィルターを適用してドットの縁を検出する。それぞれのドットの半径を推定する。続いてハフ円変換を行い、それぞれのセル中の最も顕著な円の形状を選択する。ドットの相対的な位置は洗浄の間に変わらないので、Pix2の処理についてPix1と同じ位置情報を使用する。
【０１９９】
ドット抽出. ドットの位置が既知である場合、対応するピクセルの強度を抽出し、合計する。ホワイトバランスおよび緩やかな照度の変化を説明するために、ドット内の平均輝度からドットの外側のセルの平均輝度を引いてバックグラウンドサブトラクションを行う、表5。
【表１１】
0006697394.tif 000012
【０２００】
CRR計算. 手引きの式と類似して、Pix1上のドットの平均強度 対 Pix2のドットの平均強度の比と同様に、試験結果(CRR)を計算する。シート状の全ての他の計算したCRR値からブランク試料の値(左上のセル位置のドット)を引く。
【０２０１】
検証および同等性/非劣性(non-inferiority)試験
段階2において、iPhone 4および上述のシークエンスを走らせるアプリケーションで画像を取得して処理した。反復性について、取得のためにiPhoneカメラを使用したが、画像をコンピュータに移し、iPhoneシミュレーター中で処理を実施した。328の異なる尿検体を含む8個のCRDアレイを、段階2の一部として分析した。これらのアレイは、この試験に特異的に、-80℃で維持されたアリコートから調製した。検体は273名の異なる女性に由来した(妊娠後期に55個の検体を続けて回収)。全ての検体は、検体回収および保存に関して連続する。検体において、分析した段階1の一部のものと重複はなかった。段階2のデータセットにおける目的の結果の有病率(MIDPE)は、検体間(118/328)および被験体間(108/273)で40%であった。
【０２０２】
段階1と同様に、手動と自動のCRR測定の間で有意なレベルの一致が見られた。0.968のLinの一致係数(ρc)、95%CI[0.961-0.974])は、ピアソンの正確性係数ρ=0.973および偏り補正係数Cb=0.995に「実質的に」基づくように定性化された(図22A)。2つの一面検定(two one-sided test)(TOST)法により、スマートフォンで利用可能なCRR計算は、手動の統合と同等であることが決定された(図22B)。これは、分析される群が結果により合わされたかまたは別々であったかに関係なく、手動 対 自動化法により計算されたCRRの90%信頼区間の重複により容易に見出し得る。TOST分析に特有なことに、90%信頼区間はP=0.05有意さレベルに相当する。同等性の誤差(margin)は、MIDPE群について10%であり、MIDPEなしの群およびデータセット全体について5%であった。それぞれの被験体由来の第1の検体を使用したROC分析により、CRRの手動定量(0.911 [0.882-0.935])およびスマートフォン利用可能な計算(0.923 [0.986-0.945], P=0.329)の間のAUCに統計的に有意な差はないことが決定された(図22C)。
【０２０３】
処理時間
処理時間を図示するiPhone appのスクリーンワークフローによるスクリーンが図23に含まれる(示される例において写真Pix1およびPix2は以前に取得され、スマートフォンの写真ライブラリに保存されていた)。本発明者らの画像処理ツールを利用することで、CRD試験アレイの「湿潤パート」の結論から結果までの時間は、スマートフォンを用いて約2分の処理時間に低減された。
【０２０４】
性能および工学技術許容性分析
本発明者らのアルゴリズムを実証し、本発明者らの試験の段階3における画像化プロトコルのエラー強さをさらに向上させるために、6個の標準化されたCRDアレイのさらなるデータセットを取得した。訓練を受けておらず、画像を取得するためまたは不均一な照度およびシェーディングを回避するためにスマートフォンをどのように設置するか(カメラの角度)についての指示も受けていない職員により実験を行った。このデータセットは、オペレーターにより誘導されるエラーの可能性のある原因を評価することを補助した。これらの取り扱いの問題を、一続きの画像処理およびアップデートされたバージョンで実施される補正における結果と共に表5に要約する。もっともしばしば観察される取扱いエラーは、Pix1およびPix2を取得した過剰な遠近法であった。問題の大部分は、問題を回避するためにどのように画像を再度取得するかの指示をユーザーにフィードバックすることで修正された。本発明者らの一連の画像化のエラー強さは、Pix1およびPix2上で許容される不均一な照度のレベルに限界を設定することによりさらに向上された。ユーザーは、シェーディングが変数の許容レベルを超えた場合(変数の係数＞15%)、インターフェースを介して写真を撮り直すおよび光源から遠ざけることを思いついた。
【０２０５】
CRD試験の湿潤部分のさらなる最適化
以前に検証された2つの省略バージョンを有するCRD試験の「湿潤パート」を比較して、段階3の一部として、94尿試料の連続セットに対してさらなるアレイを実施した：一方は尿タンパク質標準化を省略し、他方はタンパク質標準化およびコンゴーレッドとの1時間の撹拌の両方を省略した。尿標準化および撹拌(コンゴーレッドと混合された試料はすぐにシート上に配置された)の両方を省略することにより、本来のプロトコルで許容可能な一致(Linのρ=0.914 [0.873-0.942])が生じた。多変量線形回帰において、偏りの程度は、CRRレベルのみで決定され、シート上の位置、オペレーターの熟練度または尿タンパク質濃度によっては決定されなかった。精度(accuracy)(Cb=0.997)は正確性(precision)(ピアソンのρ=0.916)を超え、数はわずかに変化し得るが、標準化を省略することで疾患分類に大きく影響を及ぼすことはないということが示唆された。メタノール洗浄を手順および廃棄がより簡単な代替法で置き換えるための他の実験を行った。試行錯誤により、本発明者らは、医薬等級イソプロパノール(90%)がメタノールよりも効果的であり、洗浄時間(ブランクの脱色の完了までを測定)が7分まで短縮されることを決定した。医薬等級エタノール(70%)は、メタノールの代用としては適さなかった。変性剤(すなわちアセトン、米国において添加、飲料不可)は、ニトロセルロースシートの孔径に影響を及ぼし、陽性試料に対して許容できないシグナルの消失を生じた。
【０２０６】
統計学的手法
他に特定されなければ、MedCalcソフトウェア(v 12.5 Ostend, Belgium)を統計学的補助として使用した。ピアソンの生成物モーメント相関関数を使用して相関を試験して、一方でLinの一致係数および合意のMcBride図形描写スケーリングを使用して同意を決定した。TOST/XLSTAT add-ins手順を使用して、Microsoft Excelにおいて同等性/非劣性試験を行った。多変数段階的線形回帰を使用して、偏りの程度(手動方法を使用して得られた結果と湿潤プロトコルにおける工程の系統的排除の後の結果の差)に対する複数の変数の影響を決定した。該モデルにおいて、P＜0.05の場合に変数を入力し、P＞0.1の場合に変数を除去した。全ての手順について、統計的な有意さを示すためにP＜0.05を使用した。
【０２０７】
等式
【数１】
0006697394.tif 000013
式中、L(x,y)は輝度であり、R(x,y)、G(x,y)およびB(x,y)は、位置x,yにおけるピクセルの赤色、緑色および青色の値のそれぞれを決定する。
【数２】
0006697394.tif 000014
式中、r(di)は、ドットdi、ci、ドットdiを含むセルの標準化された輝度(「赤色(redness)」とみなされる)であり、Nは、ciまたはdiにおけるピクセル数である。
【０２０８】
参照(それぞれは本明細書において参照により援用される)
【表１２】
0006697394.tif 000015
【表１３】
0006697394.tif 000016
【表１４】
0006697394.tif 000017
【０２０９】
本明細書において定義および使用される場合、全ての定義は、辞書の定義、参照により援用される文書の定義、および/または定義された用語の通常の意味を支配するものと理解されるべきである。
【０２１０】
本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、不定冠詞「a」および「an」は、反対のことを明確に示さなければ、「少なくとも1つ」を意味すると理解されるべきである。
【０２１１】
本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、句「および/または」は、そのように接続された要素、すなわちある場合において接続的に存在し、他の場合において離接的に存在する要素の「いずれかまたは両方」を意味すると理解されるべきである。「および/または」と共に列挙される複数の要素は、同じ様式、すなわちそのように接続された「1つ以上」の要素と解釈されるべきである。「および/または」節で具体的に特定された要素以外の他の要素は、具体的に特定されたこれらの要素と関連するか関連しないかのいずれにせよ、任意に存在し得る。したがって、非限定的な例として、「Aおよび/またはB」についての参照は、「含む(comprising)」などの開放型の用語法を伴って使用される場合、一態様においてAのみ(任意にB以外の要素を含む)、別の態様においてBのみ(任意にA以外の要素を含む)、さらに別の態様においてAとBの両方(任意に他の要素を含む)などのことをいい得る。同様に、「A、Bおよび/またはC」についての参照は、「含む(comprising)」などの開放型の用語法を伴って使用される場合、いくつかの態様においてAのみ(任意にBおよびC以外の要素を含む)、別の態様においてBのみ(任意にAおよびC以外の要素を含む)、さらに別の態様においてCのみ(任意にCおよびC以外の要素を含む)、さらに別の態様においてAおよびB(任意に他の要素を含む)、AおよびC(任意に他の要素を含む)、BおよびC(任意に他の要素を含む)、またはA、BおよびC(任意に他の要素を含む)をいい得る。
【０２１２】
本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、1つ以上の要素のリストに関して、句「少なくとも1つ」は、要素のリスト中のいずれか1つ以上の要素から選択されるが、要素のリスト内に具体的に列挙されるそれぞれの要素の少なくとも1つおよび全ての要素を必ずしも含むわけではなく、該要素のリストにおける要素の任意の組合せを排除しない少なくとも1つの要素を意味すると理解されるべきである。この定義はまた、具体的に特定されるこれらの要素に関係があるか関係がないかのいずれにしても、句「少なくとも1つ」が指す要素のリスト内に具体的に特定される要素以外の要素が任意に存在し得ることを可能にする。したがって、非限定的な例として、「AおよびBの少なくとも1つ」(または同等に、「AまたはBの少なくとも1つ」、または同等に「Aおよび/またはBの少なくとも1つ)は、いくつかの態様において、Bが存在せずに1つより多くのAを任意に含む少なくとも1つのA(およびB以外の要素を任意に含む)、別の態様において、Aが存在せずに1つより多くのBを任意に含む少なくとも1つのB(およびA以外の要素を任意に含む)、さらに別の態様において、1つより多くのAを任意に含む少なくとも1つのAと、1つより多くのBを任意に含む少なくとも1つのB(および他の要素を任意に含む)などをいい得る。
【０２１３】
反対のことが明確に示されなければ、本願において特許請求される、１つより多くの工程または動作を含む任意の方法において、該方法の工程または動作の順序は、該方法の工程または動作が記載される順序に必ずしも限定されるわけではないことも理解されるべきである。
【０２１４】
本明細書に開示される全ての参考文献、特許および特許出願は、それぞれが引用され、いくつかの場合には文書全体を包含し得る主題に関して、参照により本明細書に援用される。
【０２１５】
特許請求の範囲および上述の明細書において、例えば、「含む(comprising)」、「含む(including)」、「保有する(carrying)」、「有する(having)」、「含む(containing)」、「含む(involving)」、「保持する(holding)」、「で構成される(composed of)」などの全ての一過的な句は、開放型である、すなわち含む(including)を意味するが、これに限定されないと理解されよう。一過的な句「からなる(consisting of)」および「本質的にからなる(consisting essentially of)」のみは、米国特許事務局、特許審査手続の便覧、項2111.03に記載されるように、それぞれ閉鎖型または半閉鎖型の一過的な句であるものとする。
本発明の態様として、以下のものが挙げられる。
［１］妊娠女性由来の尿試料が異常折り畳みタンパク質(misfolded protein)を含むかまたは含まないことを決定する方法であって、
(a)  妊娠女性由来の尿試料と、異常折り畳みタンパク質およびセルロースに結合する色素を合わせて、それにより尿および色素の溶液を生成する工程；
(b)  色素が異常折り畳みタンパク質およびセルロースに結合する条件下で、該溶液を、セルロースを含む表面に適用し、それにより該表面上にスポットを生成する工程；
(c)  異常折り畳みタンパク質および色素を含む尿の溶液の拡散が起こる条件下で、該表面上のスポットを維持する工程；ならびに
(d)  色素が該表面上のスポットから目に見える程度に放射状に拡散する場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むことを決定するか、または色素が該表面上のスポットから目に見える程度に放射状に拡散しない場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含まないことを決定する工程
を含む、方法。
［２］該色素がコンゴーレッドである、［１］記載の方法。
［３］該溶液中の色素の濃度が0.05%〜0.2%である、［１］または［２］記載の方法。
［４］該溶液中の色素の濃度が0.1%である、［３］記載の方法。
［５］セルロースを含む該表面が紙表面である、［１］〜［４］いずれか記載の方法。
［６］セルロースを含む該表面が、粘着性の裏張りをさらに含む、［１］〜［５］いずれか記載の方法。
［７］該尿および色素の溶液が、該表面上のスポットから放射状に拡散する程度と陽性対照を比較する工程、ならびに該尿および色素の溶液が該表面上のスポットから放射状に拡散する程度が、陽性対照と同等である場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むことを決定する工程をさらに含む、［１］〜［６］いずれか記載の方法。
［８］該尿および色素の溶液が、該表面上のスポットから放射状に拡散する程度と陰性対照を比較する工程、ならびに該尿および色素の溶液が該表面上のスポットから放射状に拡散する程度が、陰性対照と同等である場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含まないことを決定する工程をさらに含む、［１］〜［７］いずれか記載の方法。
［９］(e)  妊娠女性由来のさらなる尿試料を希釈して、希釈尿試料を生成する工程；
(f)  該希釈尿試料と、異常折り畳みタンパク質およびセルロースに結合する色素を合わせて、尿および色素の溶液を生成する工程；
(g)  工程(f)の溶液を、該色素が異常折り畳みタンパク質およびセルロースに結合する条件下で、セルロースを含む表面に適用して、表面上のスポットを生成する工程；
(h)  異常折り畳みタンパク質および色素を含む尿の溶液の拡散が起こる条件下で、工程(g)の表面上のスポットを維持する工程；ならびに
(i)  該色素が工程(h)の表面上のスポットから放射状に拡散する場合、該希釈尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むことを決定するか、または該色素が工程(h)の表面上のスポットから放射状に拡散しない場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含まないことを決定する工程
をさらに含む、［１］〜［８］いずれか記載の方法。
［１０］該さらなる尿試料が5倍〜15倍に希釈される、［９］記載の方法。
［１１］該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含む場合に妊娠女性が子癇前症を有するかまたは子癇前症を発症する可能性があると診断する工程をさらに含む、［１］〜［１０］いずれか記載の方法。
［１２］妊娠女性由来の尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むかまたは含まないことを決定するためのキットであって、
(a)  異常折り畳みタンパク質およびセルロースに結合する色素；
(b)  セルロースを含む表面；ならびに
(c)  塗布器
を含む、キット。
［１３］該色素がコンゴーレッドである、［１２］記載のキット。
［１４］セルロースを含む該表面が紙表面である、［１２］または［１３］記載のキット。
［１５］セルロースを含む該表面が、粘着性の裏張りをさらに含む、［１２］〜［１４］いずれか記載のキット。
［１６］セルロースを含む該表面が、さらなる表面に固定される、［１５］記載のキット。
［１７］該色素が水溶液である、［１２］〜［１６］いずれか記載のキット。
［１８］該水溶液中の色素の濃度が0.2%〜1.0%である、［１７］記載のキット。
［１９］該水溶液中の色素の濃度が0.5%である、［１８］記載のキット。
［２０］該水溶液の体積が1μl〜10μlである、［１８］または［１９］記載のキット。
［２１］該水溶液の体積が5μlである、［１９］記載のキット。
［２２］該塗布器に色素が予め充填される、［１２］〜［２１］いずれか記載のキット。
［２３］該塗布器がピペットである、［１２］〜［２２］いずれか記載のキット。
［２４］該ピペットが使い捨てピペットである、［２３］記載のキット。
［２５］陽性対照をさらに含む、［１２］〜［２４］いずれか記載のキット。
［２６］陰性試料をさらに含む、［１２］〜［２５］いずれか記載のキット。
［２７］妊娠女性由来の尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むかまたは含まないことを決定する方法であって、
(a)  妊娠女性由来の尿試料と、異常折り畳みタンパク質およびセルロースに結合する第1の色素、ならびに第1の色素とは色が異なりかつ異常折り畳みタンパク質およびセルロースに結合しない第2の色素を合わせて、尿および2つの色素の溶液を生成する工程；
(b)  該溶液を、第1の色素が異常折り畳みタンパク質およびセルロースに結合する条件下で、セルロースを含む表面に適用して、表面上のスポットを生成する工程；
(c)  異常折り畳みタンパク質および色素を含む尿の溶液の拡散が起こる条件下で、該表面上のスポットを維持する工程；ならびに
(d)  第1の色素および第2の色素が該表面上のスポットから目に見える程度に放射状に拡散する場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むことを決定するか、または第1の色素ではなく第2の色素が該表面上のスポットから目に見える程度に放射状に拡散する場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含まないことを決定する工程
を含む、方法。
［２８］尿および2つの色素の溶液が該表面上のスポットから放射状に拡散する程度と陽性対照を比較する工程、ならびに尿および2つの色素の溶液が該表面上のスポットから放射状に拡散する程度が陽性対照と同等である場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むことを決定する工程をさらに含む、［２７］記載の方法。
［２９］尿および2つの色素の溶液が該表面上のスポットから放射状に拡散する程度と陰性対照を比較する工程、ならびに尿および2つの色素の溶液が該表面上のスポットから放射状に拡散する程度が陰性対照と同等である場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含まないことを決定する工程をさらに含む、［２７］または［２８］記載の方法。
［３０］該表面上のスポットの画像を取得する工程をさらに含む、［２７］〜［２９］いずれか記載の方法。
［３１］該画像が、携帯電話を使用して取得される、［３０］記載の方法。
［３２］該表面上のスポットから第1の色素が放射状に拡散する程度と該表面上のスポットから第2の色素が放射状に拡散する程度の間の差を定量する工程をさらに含む、［２７］〜［３１］いずれか記載の方法。
［３３］該表面上のスポットから第1の色素が放射状に拡散する程度と該表面上のスポットから第2の色素が放射状に拡散する程度の間の相関係数を計算する工程をさらに含む、［３２］記載の方法。
［３４］アルゴリズムを使用して該相関係数を計算する、［３３］記載の方法。
［３５］第1の色素がコンゴーレッドである、［２７］〜［３４］いずれか記載の方法。
［３６］第2の色素がエリオグラウシンである、［２７］〜［３５］いずれか記載の方法。
［３７］該溶液中の第1の色素の濃度が0.05%〜0.2%である、［２７］〜［３６］いずれか記載の方法。
［３８］該溶液中の第1の色素の濃度が0.1%である、［３７］記載の方法。
［３９］該溶液中の第2の色素の濃度が0.05%〜0.2%である、［２７］〜［３８］いずれか記載の方法。
［４０］該溶液中の第2の色素の濃度が0.1%である、［３９］記載の方法。
［４１］セルロースを含む該表面が紙表面である、［２７］〜［４０］いずれか記載の方法。
［４２］セルロースを含む該表面が、粘着性の裏張りをさらに含む、［２７］〜［４１］いずれか記載の方法。
［４３］(e)  妊娠女性由来のさらなる尿試料を希釈して、希釈尿試料を生成する工程；
(f)  該尿試料と、異常折り畳みタンパク質およびセルロースに結合する第1の色素ならびに第1の色素とは異なりかつ異常折り畳みタンパク質およびセルロースに結合しない第2の色素を合わせて、尿および2つの色素の溶液を生成する工程；
(g)  工程(f)の溶液を、第1の色素が異常折り畳みタンパク質およびセルロースに結合する条件下でセルロースを含む表面に適用して、表面上のスポットを生成する工程；
(h)  異常折り畳みタンパク質および色素を含む尿の溶液の拡散が起こる条件下で、工程(g)の表面上のスポットを維持する工程；ならびに
(i)  工程(h)の表面上のスポットから第1の色素および第2の色素が放射状に拡散する場合、該希釈尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むことを決定するか、または第1の色素ではなく第2の色素が工程(h)の表面上のスポットから放射状に拡散する場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含まないことを決定する工程
をさらに含む、［２７］〜［４２］いずれか記載の方法。
［４４］さらなる尿試料が5倍〜15倍に希釈される、［４３］記載の方法。
［４５］該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含む場合、妊娠女性が子癇前症を有するか、または子癇前症を発症する可能性があると診断する工程をさらに含む、［２７］〜［４４］いずれか記載の方法。
［４６］妊娠女性由来の尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むかまたは含まないことを決定するためのキットであって、
(a)  異常折り畳みタンパク質およびセルロースに結合する第1の色素；
(b)  第1の色素とは色が異なりかつ異常折り畳みタンパク質およびセルロースに結合しない第2の色素；
(c)  セルロースを含む表面；ならびに
(d)  塗布器
を含む、キット。
［４７］第1の色素がコンゴーレッドである、［４６］記載のキット。
［４８］第2の色素がエリオグラウシンである、［４６］記載のキット。
［４９］セルロースを含む該表面が紙表面である、［４６］〜［４８］いずれか記載のキット。
［５０］セルロースを含む該表面が、粘着性の裏張りをさらに含む、［４６］〜［４９］いずれか記載のキット。
［５１］セルロースを含む該表面が、さらなる表面に固定される、［５０］記載のキット。
［５２］第1の色素および第2の色素を水溶液中で合わせて、2つの色素の水溶液を生成する、［４６］〜［５１］記載のキット。
［５３］該水溶液中の2つの色素の濃度が2%〜10%である、［５２］記載のキット。
［５４］該水溶液中の2つの色素の濃度が5%である、［５３］記載のキット。
［５５］該水溶液の体積が1μl〜10μlである、［５２］〜［５４］いずれか記載のキット。
［５６］該水溶液の体積が7.5μlである、［５５］記載のキット。
［５７］該塗布器に、2つの色素の水溶液が予め充填される、［５２］〜［５６］いずれか記載のキット。
［５８］該塗布器がピペットである、［４６］〜［５７］いずれか記載のキット。
［５９］該ピペットが使い捨てピペットである、［５８］記載のキット。
［６０］陽性対照をさらに含む、［４６］〜［５９］いずれか記載のキット。
［６１］陰性対照をさらに含む、［４６］〜［６０］いずれか記載のキット。
［６２］妊娠女性由来の尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むかまたは含まないことを決定する方法であって、
(a)  妊娠女性由来の尿試料と、異常折り畳みタンパク質およびセルロースに結合する色素を合わせて、尿および色素の溶液を生成する工程；
(b)  該色素が異常折り畳みタンパク質およびセルロースに結合する条件下で、該溶液を、セルロースを含む表面に適用して、表面上のスポットを生成する工程；
(c)  異常折り畳みタンパク質および色素を含む尿の溶液の拡散が起こる条件下で、該表面上のスポットを維持する工程；ならびに
(d)  該表面を通過する溶液が着色される場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含むことを決定するか、または該表面を通過する溶液が無色である場合、該尿試料が異常折り畳みタンパク質を含まないことを決定する工程
を含む、方法。
［６３］妊娠女性から得られた尿、異常折り畳みタンパク質およびセルロースに結合する色素、ならびにセルロースを含む表面を含む組成物。
［６４］［１２］〜［２６］および［４６］〜［６１］いずれか一項に記載のキットならびに妊娠女性由来の尿試料を含む装置。
［６５］妊娠女性が子癇前症を有するかまたは子癇前症のリスクを有するかどうかを決定する方法であって、
(a)  妊娠女性由来の尿試料とコンゴーレッドを合わせて、尿およびコンゴーレッドの溶液を生成する工程；
(b)  該溶液を、セルロースを含む表面に適用して、表面上のスポットを生成する工程；
(c)  該表面上のスポットを、色素を含む尿の溶液の拡散が起こる条件下で維持する工程；ならびに
(d)  コンゴーレッドが該表面上のスポットから目に見える程度に拡散する場合、該妊娠女性が子癇前症を有するかまたは子癇前症のリスクを有することを決定する工程
を含む、方法。
【図１】
0006697394.tif 000018
【図２】
0006697394.tif 000019
【図３】
0006697394.tif 000020
【図４】
0006697394.tif 000021
【図５】
0006697394.tif 000022
【図６】
0006697394.tif 000023
【図７】
0006697394.tif 000024
【図８】
0006697394.tif 000025
【図９】
0006697394.tif 000026
【図１０】
0006697394.tif 000027
【図１１−１】
0006697394.tif 000028
【図１１−２】
0006697394.tif 000029
【図１２】
0006697394.tif 000030
【図１３】
0006697394.tif 000031
【図１４】
0006697394.tif 000032
【図１５】
0006697394.tif 000033
【図１６】
0006697394.tif 000034
【図１７】
0006697394.tif 000035
【図１８】
0006697394.tif 000036
【図１９】
0006697394.tif 000037
【図２０】
0006697394.tif 000038
【図２１】
0006697394.tif 000039
【図２２】
0006697394.tif 000040
【図２３】
0006697394.tif 000041
【図２４】
0006697394.tif 000042
【図２５】
0006697394.tif 000043
【図２６】
0006697394.tif 000044
【図２７】
0006697394.tif 000045
【図２８】
0006697394.tif 000046
【配列表】
0006697394000001.app