(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現を促進させた形質転換体（但し、ヒトを除く）を培養して中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシルキャリアープロテイン活性を有するタンパク質。
【請求項２】
下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現を促進させ、形質転換体（但し、ヒトを除く）の細胞内で生産される中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質の製造方法。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシルキャリアープロテイン活性を有するタンパク質。
【請求項３】
下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現を促進させて、形質転換体（但し、ヒトを除く）の細胞内で生産される中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させ、生産される全脂肪酸中又は全脂質中の脂肪酸又は脂質の組成を改変する、脂質の組成の改変方法。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシルキャリアープロテイン活性を有するタンパク質。
【請求項４】
前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を宿主（但し、ヒトを除く）に導入して前記遺伝子の発現を促進させる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）からなる遺伝子である、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
（ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなり、かつアシルキャリアープロテイン活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
前記形質転換体において、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子の発現を促進させた、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記形質転換体において、アシル基転移酵素をコードする遺伝子の発現を促進させた、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記形質転換体が微生物である、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記微生物が微細藻類である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記微細藻類がナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記脂質が中鎖脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含む、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
前記脂質がラウリン酸又はその脂肪酸エステル化合物を含む、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現を促進させた形質転換体。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシルキャリアープロテイン活性を有するタンパク質。
【請求項１４】
下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子、又は当該遺伝子を含有する組換えベクターを宿主に導入してなる形質転換体。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシルキャリアープロテイン活性を有するタンパク質。
【請求項１５】
前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）からなる遺伝子である、請求項１３又は１４記載の形質転換体。
（ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなり、かつアシルキャリアープロテイン活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１６】
アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子の発現を促進させた、請求項１３〜１５のいずれか１項記載の形質転換体。
【請求項１７】
アシル基転移酵素をコードする遺伝子の発現を促進させた、請求項１３〜１６のいずれか１項記載の形質転換体。
【請求項１８】
前記形質転換体が微生物である、請求項１３〜１７のいずれか１項記載の形質転換体。
【請求項１９】
前記微生物が微細藻類である、請求項１８記載の形質転換体。
【請求項２０】
前記微細藻類がナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類である、請求項１９記載の形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質の製造方法に関する。また、本発明は当該方法に用いる形質転換体に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪酸は脂質の主要構成成分の１つであり、生体内においてグリセリンとのエステル結合により生成するトリアシルグリセロール等の脂質（油脂）を構成する。また、多くの動植物において脂肪酸はエネルギー源として貯蔵され利用される物質でもある。動植物内に蓄えられた脂肪酸や脂質は、食用又は工業用として広く利用されている。
例えば、炭素原子数１２〜１８前後の高級脂肪酸を還元して得られる高級アルコールの誘導体は、界面活性剤として用いられている。アルキル硫酸エステル塩やアルキルベンゼンスルホン酸塩等は陰イオン性界面活性剤として利用されている。また、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルやアルキルポリグリコシド等は非イオン性界面活性剤として利用されている。そしてこれらの界面活性剤は、いずれも洗浄剤や殺菌剤等に利用されている。同じ高級アルコールの誘導体であるアルキルアミン塩やモノ又はジアルキル４級アンモニウム塩等のカチオン性界面活性剤は、繊維処理剤、毛髪リンス剤、殺菌剤等に日常的に利用されている。また、ベンザルコニウム型４級アンモニウム塩は殺菌剤や防腐剤等に日常的に利用されている。さらに、植物油脂はバイオディーゼル燃料の原料としても利用されている。
このように脂肪酸や脂質の利用は多岐にわたり、そのため植物等において生体内での脂肪酸や脂質の生産性を向上させる試みが行われている。さらに、脂肪酸の用途や有用性はその炭素原子数に依存するため、脂肪酸の炭素原子数、即ち鎖長を制御する試みも行われている。
【０００３】
一般に、植物の脂肪酸合成経路は葉緑体に局在する。葉緑体ではアセチル−アシルキャリアープロテイン（acyl  carrier  protein、以下「ACP」ともいう）を出発物質とし、炭素鎖の伸長反応が繰り返され、最終的に炭素原子数１８程度の脂肪酸が合成される。この脂肪酸の合成経路においてACPは、脂肪酸の担体としての機能を果たしている。
これまでに、脂肪酸の生合成において、脂肪酸の炭素原子数（鎖長）の制御にACPを利用する方法が提案されている。例えば、タバコの葉緑体ゲノム又は核ゲノムに導入した、オリーブ由来のACPをコードする遺伝子（以下、「ACP遺伝子」ともいう）を過剰発現させることで、炭素原子数１８の不飽和脂肪酸の生産性を向上させる方法が非特許文献１に記載されている。また、ナズナ（Arabidopsis）由来のACP遺伝子をナズナで過剰発現させることで、炭素原子数１８の不飽和脂肪酸の１種であるα−リノレン酸の生産性を向上させる方法が、非特許文献２に記載されている。
このように、ACPを利用して炭素原子数１８程度の長鎖脂肪酸の生産性を向上させる方法については知られている。しかし、ACPを利用して炭素原子数１０〜１４程度の中鎖脂肪酸の生産性を向上させることについては、未だ報告がされていない。
【０００４】
近年、持続可能な社会の実現に向けて再生可能エネルギーに関する研究が推し進められている。特に光合成微生物は、二酸化炭素の削減効果に加えて、穀物と競合しないバイオ燃料生物として期待されている。
特に近年、バイオ燃料生産に有用であるとして、藻類が注目を集めている。藻類は、バイオディーゼル燃料として利用可能な脂質を光合成によって生産でき、しかも食料と競合しないことから、次世代のバイオマス資源として注目されている。また、藻類は、植物に比べ、高い脂質生産・蓄積能力を有するとの報告もある。藻類の脂質合成メカニズムやそれを応用した生産技術について研究が始まってはいるが、未解明な部分も多い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Francesca  De  Marchis，et  al.，Transgenic  Research，2016，vol．25(1)，p．45-61
【非特許文献２】Jill  K．Branen，et  al.，Plant  Physiol.，2001，vol．127(1)，p．222-229
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質の製造方法を提供することを課題とする。
また本発明は、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させた形質転換体を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題に鑑み、鋭意検討を行った。
本発明者らはまず、中鎖脂肪酸の合成に関与する酵素として、藻類の１種であるナンノクロロプシス属の藻類のACPを新たに同定した。そして、このACPの微生物内での発現を促進させた結果、生産される中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性が有意に向上することを見出した。
本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【０００８】
本発明は、下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現を促進させた形質転換体を培養して脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法に関する。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシルキャリアープロテイン活性を有するタンパク質。
【０００９】
また本発明は、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現を促進させて、形質転換体の細胞内で生産される中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させ、生産される全脂肪酸中又は全脂質中の脂肪酸又は脂質の組成を改変する、脂質の組成の改変方法に関する。
さらに本発明は、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現を促進させた形質転換体に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の脂質の製造方法によれば、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させることができる。
また本発明の形質転換体は、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性に優れる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書における「油脂」は、中性脂質（トリアシルグリセロール等）、ろう、セラミド等の単純脂質；リン脂質、糖脂質、スルホ脂質等の複合脂質；及びこれらの脂質から誘導される、脂肪酸、アルコール類、炭化水素類等の誘導脂質を包含するものである。
また本明細書において、脂肪酸や、脂肪酸を構成するアシル基の表記において「Ｃｘ：ｙ」とあるのは、炭素原子数ｘで二重結合の数がｙであることを表す。「Ｃｘ」は炭素原子数ｘの脂肪酸やアシル基を表す。
さらに本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列の同一性は、Lipman-Pearson法（Science，1985，vol．227，p．1435-1441）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Winのホモロジー解析（Search  homology）プログラムを用いて、Unit  size  to  compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される。
また本明細書において「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular  Cloning−A  LABORATORY  MANUAL  THIRD  EDITION［Joseph  Sambrook，David  W．Russell.，Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press］記載の方法が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
さらに明細書において、遺伝子の「上流」とは、翻訳開始点からの位置ではなく、対象として捉えている遺伝子又は領域の5'側に続く領域を示す。一方、遺伝子の「下流」とは、対象として捉えている遺伝子又は領域の3'側に続く領域を示す。
【００１２】
アミノ酸配列及び塩基配列のBlast（Basic Local Alignment Search Tool）の結果から、前記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）（以下、「ACP2」、又は「NoACP2」ともいう）はACPの１種であり、脂肪酸の生合成経路において脂肪酸の担体として機能するタンパク質である。配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシス属に属する藻類であるナンノクロロプシス・オキュラータ（Nannochloropsis oculata）NIES2145株由来のACPの１種である。
ACPは脂肪酸の生合成反応（脂肪酸の伸長反応）の足場（担体）として機能する。脂肪酸のアシル基は、ACPのセリン残基に結合したホスホパンテテイン基とチオエステル結合を形成する。この状態で脂肪酸が伸長される。
【００１３】
前記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）はいずれも、アシルキャリアープロテイン活性（以下、「ACP活性」ともいう）を有する。本明細書において「ACP活性」とは、脂肪酸のアシル基とチオエステル結合を形成することで脂肪酸の伸長反応の足場として機能する活性を意味する。
前記タンパク質がACP活性を有することは、例えば、ACP遺伝子欠損株に、宿主内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡを導入し、脂肪酸合成能を相補させることで確認することができる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡを宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養し、宿主細胞内又は培養液中の脂肪酸の生産量や組成の変化を常法により分析することで確認できる。あるいは、前記タンパク質を、Dall’aglio, et al., Biochemistry, 2011, vol. 50(25), p. 5704-5717等の文献を参考にして、補酵素A（CoA）と適当なACPシンターゼ（ACP synthase）（ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（phosphopantetheinyl transferase））と反応させ、ホスホパンテテイン基が結合したholo-ACPを形成させることで確認することができる。あるいは、Rock, Garwin, The Journal of Biological Chemistry, 1979, vol. 254(15), p. 7123-7128等の文献を参考にして、前記holo-ACPを脂肪酸及び適当なアシル-ACPシンセターゼ（acyl-ACP synthetase）と反応させ、アシル基が結合したacyl-ACPを形成させることで確認することができる。
【００１４】
後述の実施例で示すように、前記タンパク質（Ａ）をコードする遺伝子の発現を促進した形質転換体では、炭素原子数が１０〜１４の中鎖脂肪酸の生産性が向上する。なお本明細書において「中鎖」とは、アシル基の炭素原子数が６以上１４以下、好ましくは炭素原子数が８以上１４以下、より好ましくは炭素原子数が１０以上１４以下、よりさらに好ましくは炭素原子数が１０、１２、又は１４、であることをいう。
【００１５】
前記タンパク質（Ｂ）において、ACP活性の点から、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列との同一性は７５％以上が好ましく、８０％以上が好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がさらに好ましく、９３％以上がより好ましく、９４％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９６％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また、前記タンパク質（Ｂ）として、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上３６個以下、好ましくは１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上２４個以下、より好ましくは１個以上１８個以下、より好ましくは１個以上１２個以下、より好ましくは１個以上９個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上７個以下、より好ましくは１個以上６個以下、より好ましくは１個以上４個以下、より好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１個以上２個以下、より好ましくは１個）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加したタンパク質が挙げられる。
アミノ酸配列に変異を導入する方法としては、例えば、アミノ酸配列をコードする塩基配列に変異を導入する方法が挙げられる。変異を導入する方法としては、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、SOE-PCRを利用した方法、ＯＤＡ法、Kunkel法等が挙げられる。また、Site-Directed  Mutagenesis  System  Mutan-SuperExpress  Kmキット（タカラバイオ社）、Transformer  TM  Site-Directed  Mutagenesisキット（Clonetech社）、KOD-Plus-Mutagenesis  Kit（東洋紡社）等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。
【００１６】
前記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）は、通常の化学的手法、遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータから単離、精製等することで天然物由来のタンパク質を取得することができる。また、配列番号１に示すアミノ酸配列情報をもとに人工的に化学合成することで、前記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）を得ることができる。あるいは、遺伝子組み換え技術により、組換えタンパク質として前記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）を作製してもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述するアシルキャリアープロテイン遺伝子を用いることができる。
なお、ナンノクロロプシス・オキュラータ等の藻類は、私的又は公的な研究所等の保存機関より入手することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145株は、国立環境研究所（NIES）から入手することができる。
【００１７】
前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子（以下、「ACP2遺伝子」ともいう）の一例として、下記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）からなる遺伝子（以下、「NoACP2遺伝子」ともいう）が挙げられる。
（ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列からなり、かつACP活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
配列番号２の塩基配列は、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列である。
【００１８】
前記ＤＮＡ（ｂ）において、ACP活性の点から、前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列との同一性は７５％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９４％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９６％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また前記ＤＮＡ（ｂ）として、前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上１０８個以下、好ましくは１個以上９０個以下、より好ましくは１個以上７２個以下、より好ましくは１個以上５４個以下、より好ましくは１個以上３６個以下、より好ましくは１個以上２９個以下、より好ましくは１個以上２５個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上１８個以下、より好ましくは１個以上１４個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上７個以下、より好ましくは１個以上３個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつACP活性を有する前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードするＤＮＡも好ましい。
さらに前記ＤＮＡ（ｂ）として、前記ＤＮＡ（ａ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつACP活性を有する前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードするＤＮＡも好ましい。
【００１９】
前記ACP2遺伝子の発現を促進させる方法としては、常法より適宜選択することができる。例えば、前記ACP2遺伝子を宿主に導入する方法、前記ACP2遺伝子をゲノム上に有する宿主において、当該遺伝子の発現調節領域（プロモーター、ターミネーター等）を改変する方法、などが挙げられる。なかでも、前記ACP2遺伝子を宿主に導入し、ACP2遺伝子の発現を促進させる方法が好ましい。
以下本明細書において、目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進させたものを「形質転換体」ともいい、目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進させていないものを「宿主」又は「野生株」ともいう。
本発明の形質転換体は、宿主自体に比べ、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性、特に、生産される全脂肪酸中又は全脂質中に占める中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の割合が有意に向上する。またその結果、当該形質転換体では、脂質中の脂肪酸組成が改変される。そのため、本発明の形質転換体は、特定の炭素原子数の脂質、特に中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、好ましくは炭素原子数６以上１４以下の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素原子数８以上１４以下の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素原子数が１０以上１４以下の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素原子数が１０、１２、若しくは１４の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素原子数が１０、１２、若しくは１４の飽和脂肪酸（カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸）又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素原子数が１２の飽和脂肪酸（ラウリン酸）又はこれを構成成分とする脂質、の生産に好適に用いることができる。
なお、宿主や形質転換体の脂肪酸及び脂質の生産性については、実施例で用いた方法により測定することができる。
【００２０】
前記ACP2遺伝子を宿主に導入して前記遺伝子の発現を促進させる方法について説明する。
前記ACP2遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列又は配列番号２に示す塩基配列に基づいて、ACP2遺伝子を人工的に合成できる。ACP2遺伝子の合成は、例えば、インビトロジェン社等のサービスを利用することができる。また、ナンノクロロプシス・オキュラータからクローニングによって取得することもできる。例えば、Molecular  Cloning−A  LABORATORY  MANUAL  THIRD  EDITION［Joseph  Sambrook，David  W．Russell，Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press（2001）］記載の方法等により行うことができる。また、実施例で用いたナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145は、国立環境研究所(NIES)より入手することができる。
【００２１】
本発明で好ましく用いることができる形質転換体は、前記ACP2遺伝子を常法により宿主に導入することで得られる。具体的には、前記ACP2遺伝子を宿主細胞中で発現させることのできる組換えベクターや遺伝子発現カセットを調製し、これを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させることにより作製できる。
【００２２】
形質転換体の宿主としては通常用いられるものより適宜選択することができる。本発明で用いることができる宿主としては、微生物（藻類や微細藻類を含む）、植物体、及び動物体が挙げられる。製造効率及び得られた脂質の利用性の点から、宿主は微生物又は植物体であることが好ましく、微生物であることがより好ましく、微細藻類であることがさらに好ましい。
前記微生物は原核生物、真核生物のいずれであってもよく、エシェリキア（Escherichia）属の微生物やバシラス（Bacillus）属の微生物、シネコシスティス（Synechocystis）属の微生物、シネココッカス（Synechococcus）属の微生物等の原核生物、又は酵母や糸状菌等の真核微生物を用いることができる。なかでも、脂質生産性の観点から、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、赤色酵母（Rhodosporidium toruloides）、又はモルチエレラ・エスピー（Mortierella  sp．）が好ましく、大腸菌がより好ましい。
前記藻類や微細藻類としては、遺伝子組換え手法が確立している観点から、クラミドモナス（Chlamydomonas）属の藻類、クロレラ（Chlorella）属の藻類、ファエオダクティラム（Phaeodactylum）属の藻類、又はナンノクロロプシス属の藻類が好ましく、ナンノクロロプシス属の藻類がより好ましい。ナンノクロロプシス属の藻類の具体例としては、ナンノクロロプシス・オキュラータ、ナンノクロロプシス・ガディタナ（Nannochloropsis gaditana）、ナンノクロロプシス・サリナ（Nannochloropsis salina）、ナンノクロロプシス・オセアニカ（Nannochloropsis oceanica）、ナンノクロロプシス・アトムス（Nannochloropsis atomus）、ナンノクロロプシス・マキュラタ（Nannochloropsis maculata）、ナンノクロロプシス・グラニュラータ（Nannochloropsis granulata）、ナンノクロロプシス・エスピー（Nannochloropsis  sp．）等が挙げられる。なかでも、脂質生産性の観点から、ナンノクロロプシス・オキュラータ、又はナンノクロロプシス・ガディタナが好ましく、ナンノクロロプシス・オキュラータがより好ましい。
前記植物体としては、種子に脂質を高含有する観点から、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、西洋アブラナ（Brassica napus）、アブラナ（Brassica rapa）、ココヤシ（Cocos nucifera）、パーム（Elaeis guineensis）、クフェア、ダイズ（Glycine max）、トウモロコシ（Zea mays）、イネ（Oryza sativa）、ヒマワリ（Helianthus annuus）、クスノキ（Cinnamomum camphora）、又はヤトロファ（Jatropha curcas）が好ましく、シロイヌナズナがより好ましい。
【００２３】
遺伝子発現用プラスミドベクター又は遺伝子発現カセットの母体となるベクター（プラスミド）としては、目的のタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入することができ、宿主細胞内で当該遺伝子を発現させることができるベクターであればよい。例えば、導入する宿主の種類に応じたプロモーターやターミネーター等の発現調節領域を有するベクターであって、複製開始点や選択マーカー等を有するベクターを用いることができる。また、プラスミド等の染色体外で自立増殖・複製するベクターであってもよいし、染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。
本発明で好ましく用いることができる発現用ベクターとしては、微生物を宿主とする場合には、例えば、pBluescript（pBS）  II  SK(-)（Stratagene社製）、pSTV系ベクター（タカラバイオ社製）、pUC系ベクター（宝酒造社製）、pET系ベクター（タカラバイオ社製）、pGEX系ベクター（GEヘルスケア社製）、pCold系ベクター（タカラバイオ社製）、pHY300PLK（タカラバイオ社製）、pUB110（Mckenzie，T．et  al.，1986，Plasmid  15（2），p．93-103）、pBR322（タカラバイオ社製）、pRS403（ストラタジーン社製）、及びpMW218/219（ニッポンジーン社製）が挙げられる。特に、宿主が大腸菌の場合は、pBluescript  II  SK(-)、又はpMW218/219が好ましく用いられる。
藻類又は微細藻類を宿主とする場合には、例えば、pUC19（タカラバイオ社製）、P66（Chlamydomonas  Center）、P-322（Chlamydomonas  Center）、pPha-T1（Yangmin  Gong，et  al.，Journal  of  Basic  Microbiology，2011，vol．51，p．666-672参照）、又はpJET1（コスモ・バイオ社製）が挙げられる。特に、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合は、pUC19、pPha-T1、又はpJET1が好ましく用いられる。また、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合には、Oliver  Kilian，et  al.，Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America，2011，vol．108(52)の記載の方法を参考にして、目的の遺伝子、プロモーター及びターミネーターからなるＤＮＡ断片（遺伝子発現カセット）を用いて宿主を形質転換することもできる。このＤＮＡ断片としては、例えば、PCR法により増幅したDNA断片や制限酵素で切断したDNA断片が挙げられる。
植物細胞を宿主とする場合には、例えば、pRI系ベクター（タカラバイオ社製）、pBI系ベクター（クロンテック社製）、及びIN3系ベクター（インプランタイノベーションズ社製）が挙げられる。特に、宿主がシロイヌナズナの場合は、pRI系ベクター又はpBI系ベクターが好ましく用いられる。
【００２４】
また、前記発現ベクターに組み込んだ目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を調整するプロモーターの種類も、使用する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができるプロモーターとしては、lacプロモーター、trpプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーター、SpoVGプロモーター、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）の添加によって誘導可能な誘導体に関するプロモーター、Rubiscoオペロン（rbc）、PSI反応中心タンパク質（psaAB）、PSIIのD1タンパク質（psbA）、カリフラワーモザイルウイルス35SRNAプロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター（例えば、チューブリンプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター等）、西洋アブラナ又はアブラナ由来Napin遺伝子プロモーター、植物由来Rubiscoプロモーター、ナンノクロロプシス属由来のビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーター（VCP1プロモーター、VCP2プロモーター）（Oliver  Kilian，et  al.，Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America，2011，vol．108(52)）、及びナンノクロロプシス属由来のオレオシン様タンパクLDSP(lipid  droplet  surface  protein)遺伝子のプロモーター（Astrid  Vieler,  et  al.,  PLOS  Genetics,  2012;8(11):e1003064.  doi:  10.1371）が挙げられる。本発明で宿主としてナンノクロロプシスを用いる場合、ビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーターや、ナンノクロロプシス属由来のオレオシン様タンパクLDSP遺伝子のプロモーターを好ましく用いることができる。
また、目的のタンパク質をコードする遺伝子が組み込まれたことを確認するための選択マーカーの種類も、使用する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができる選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、ビアラフォス耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、パロモマイシン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、及びハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。さらに、栄養要求性に関連する遺伝子の欠損等を選択マーカー遺伝子として使用することもできる。
【００２５】
目的のタンパク質をコードする遺伝子の前記ベクターへの導入は、制限酵素処理やライゲーション等の常法により行うことができる。
また、形質転換方法は、使用する宿主の種類に応じて常法より適宜選択することができる。例えば、カルシウムイオンを用いる形質転換方法、一般的なコンピテントセル形質転換方法、プロトプラスト形質転換法、エレクトロポレーション法、LP形質転換方法、アグロバクテリウムを用いた方法、パーティクルガン法等が挙げられる。宿主としてナンノクロロプシス属の藻類を用いる場合、Randor  Radakovits,  et  al.，Nature  Communications，DOI:10.1038/ncomms1688，2012等に記載のエレクトロポレーション法を用いて形質転換を行うこともできる。
【００２６】
目的遺伝子断片が導入された形質転換体の選択は、選択マーカー等を利用することで行うことができる。例えば、薬剤耐性遺伝子が、形質転換時に目的DNA断片とともに宿主細胞中に導入された結果、形質転換体が獲得する薬剤耐性を指標に行うことができる。また、ゲノムを鋳型としたPCR法等によって、目的DNA断片の導入を確認することもできる。
【００２７】
前記ACP2遺伝子をゲノム上に有する宿主において、当該遺伝子の発現調節領域を改変して、前記遺伝子の発現を促進させる方法について説明する。
「発現調節領域」とは、プロモーターやターミネーターを示し、これらの配列は一般に隣接する遺伝子の発現量（転写量、翻訳量）の調節に関与している。ゲノム上に前記ACP2遺伝子を有する宿主においては、当該遺伝子の発現調節領域を改変して前記ACP2遺伝子の発現を促進させることで、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させることができる。
【００２８】
発現調節領域の改変方法としては、例えばプロモーターの入れ替えが挙げられる。ゲノム上に前記ACP2遺伝子を有する宿主において、当該遺伝子のプロモーター（以下、「ACP2プロモーター」ともいう）を、より転写活性の高いプロモーターに入れ替えることで、前記ACP2遺伝子の発現を促進させることができる。例えば、ゲノム上に前記ACP2遺伝子を有する宿主の１つであるナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145株においては、配列番号３７に示す塩基配列からなるＤＮＡ配列の直下にNoACP2遺伝子が存在しており、配列番号３７に示す塩基配列からなるＤＮＡ配列中にプロモーター領域が存在している。この配列番号３７に示す塩基配列からなるＤＮＡ配列の一部又は全部をより転写活性の高いプロモーターに入れ替えることで、前記ACP2遺伝子の発現を促進させることができる。
【００２９】
ACP2プロモーターの入れ替えに用いるプロモーターとしては特に限定されず、ACP2プロモーターよりも転写活性が高く、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産に適したものから適宜選択することができる。
宿主としてナンノクロロプシスを用いる場合には、チューブリンプロモーター、ヒートショックプロテインプロモーター、上述のビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーター（VCP1プロモーター、VCP2プロモーター）、又はナンノクロロプシス属由来のオレオシン様タンパクLDSP遺伝子のプロモーターを好ましく用いることができる。中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性向上の観点から、ビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーター又はLDSP遺伝子のプロモーターがより好ましい。
【００３０】
前述のプロモーターの改変は、相同組換えなどの常法に従い行うことができる。具体的には、標的とするプロモーターの上流、下流領域を含み、標的プロモーターに代えて別のプロモーターを含む直鎖状のDNA断片を構築し、これを宿主細胞に取り込ませ、宿主ゲノムの標的プロモーターの上流側と下流側とで２回交差の相同組換えを起こす。その結果、ゲノム上の標的プロモーターが別のプロモーター断片と置換され、プロモーターを改変することができる。
このような相同組換えによる標的プロモーターの改変方法は、例えば、Besher  et  al.，Methods  in  molecular  biology，1995，vol．47，p．291-302等の文献を参考に行うことができる。特に、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合、Oliver  Kilian，et  al.，Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America，2011，vol．108(52)等の文献を参考にして、相同組換え法によりゲノム中の特定の領域を改変することができる。
【００３１】
本発明の形質転換体は、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子に加えて、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（以下、「TE」ともいう）をコードする遺伝子（以下、「TE遺伝子」ともいう）の発現も促進されていることが好ましい。
TEは、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ（β-Ketoacyl-acyl-carrier-protein  synthase、以下「KAS」ともいう）等の脂肪酸合成酵素によって合成されたアシル−ACPのチオエステル結合を加水分解し、遊離の脂肪酸を生成する酵素である。TEの作用によってACP上での脂肪酸合成が終了し、切り出された脂肪酸は多価不飽和脂肪酸の合成やトリアシルグリセロール等の合成に供される。
そのため、ACP2遺伝子に加えてTE遺伝子の発現を促進することで、脂質の製造に用いる形質転換体の脂質の生産性、特に脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。
本発明で好ましく用いることができるTEは、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性（以下、「TE活性」ともいう）を有するタンパク質であればよい。ここで「TE活性」とは、アシル−ＡＣＰのチオエステル結合を加水分解する活性をいう。
【００３２】
TEは、基質であるアシル−ＡＣＰを構成するアシル基（脂肪酸残基）の炭素原子数や不飽和結合数によって異なる反応性を示すことが知られている。よってTEは、生体内での脂肪酸組成を決定する重要なファクターであると考えられている。また、TEをコードする遺伝子を元来有していない宿主を用いる場合、TEをコードする遺伝子の発現を促進させることが好ましい。また、中鎖アシル−ＡＣＰに対する基質特異性を有するTE遺伝子の発現を促進させることにより、中鎖脂肪酸の生産性が向上する。このような遺伝子を導入することで、中鎖脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。
【００３３】
本発明で好ましく用いることができるTEは、通常のTEや、それらと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。
例えば、Cuphea calophylla  subsp.  mesostemon由来のTE（GenBank  ABB71581）；Cinnamomum camphora由来のTE（GenBank  AAC49151.1）；Myristica fragrans由来のTE（GenBank  AAB71729）；Myristica fragrans由来のTE（GenBank  AAB71730）；Cuphea lanceolata由来のTE（GenBank  CAA54060）；Cuphea hookeriana由来のTE（GenBank  Q39513）；Ulumus americana由来のTE(GenBank  AAB71731）；Sorghum bicolor由来のTE(GenBank  EER87824）；Sorghum bicolor由来のTE(GenBank  EER88593）；Cocos nucifera由来のTE（CnFatB1：Jing  et  al.  BMC  Biochemistry  2011,  12:44参照）；Cocos nucifera由来のTE（CnFatB2：Jing  et  al.，BMC  Biochemistry，2011，12:44参照）；Cuphea viscosissima由来のTE（CvFatB1：Jing  et  al.，BMC  Biochemistry，2011，12:44参照）；Cuphea viscosissima由来のTE（CvFatB2：Jing  et  al.，BMC  Biochemistry  2011，12:44参照）；Cuphea viscosissima由来のTE（CvFatB3：Jing  et  al.，BMC  Biochemistry，2011，12:44参照）；Elaeis guineensis由来のTE（GenBank  AAD42220）；Desulfovibrio vulgaris由来のTE（GenBank  ACL08376）；Bacteriodes fragilis由来のTE（GenBank  CAH09236）；Parabacteriodes distasonis由来のTE（GenBank  ABR43801）；Bacteroides thetaiotaomicron由来のTE（GenBank  AAO77182）；Clostridium asparagiforme由来のTE（GenBank  EEG55387）；Bryanthella formatexigens由来のTE（GenBank  EET61113）；Geobacillus  sp．由来のTE（GenBank  EDV77528）；Streptococcus dysgalactiae由来のTE（GenBank  BAH81730）；Lactobacillus brevis由来のTE（GenBank  ABJ63754）；Lactobacillus plantarum由来のTE（GenBank  CAD63310）；Anaerococcus tetradius由来のTE（GenBank  EEI82564）；Bdellovibrio bacteriovorus由来のTE（GenBank  CAE80300）；Clostridium thermocellum由来のTE（GenBank  ABN54268）；ココヤシ由来のTE（配列番号４０、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号４１）；ナンノクロロプシス・オキュラータ由来のTE（以下、「NoTE」ともいう）（配列番号３６、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号２７）；ゲッケイジュ由来のTE（GenBank  AAA34215.1、配列番号３８、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号３９）；ナンノクロロプシス・ガディタナ由来のTE（配列番号４２、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号４３）；ナンノクロロプシス・グラニュラータ由来のTE（配列番号４４、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号４５）；シンビオディニウム・ミクロアドリアチカム（Symbiodinium microadriaticum）由来のTE（配列番号４６、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号４７）、等が挙げられる。
また、これらと機能的に均等なタンパク質として、上述したいずれかのTEのアミノ酸配列との同一性が５０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）のアミノ酸配列からなり、かつTE活性を有するタンパク質も用いることができる。
【００３４】
上述したTEの中でも、中鎖アシル−ＡＣＰに対する基質特異性の観点から、ココヤシ由来のTE（配列番号４０、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号４１）、NoTE（配列番号３６、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号２７）、ゲッケイジュ由来のTE（配列番号３８、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号３９）、ナンノクロロプシス・ガディタナ由来のTE（配列番号４２、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号４３）、ナンノクロロプシス・グラニュラータ由来のTE（配列番号４４、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号４５）、シンビオディニウム・ミクロアドリアチカム由来のTE（配列番号４６、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号４７）、又はこれらのTEのアミノ酸配列との同一性が５０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）のアミノ酸配列からなり、かつ中鎖アシル−ＡＣＰに対するTE活性を有するタンパク質が好ましい。
【００３５】
タンパク質がTE活性を有することは、例えば、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にTE遺伝子を連結したDNAを脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入したTE遺伝子が発現する条件で培養して、宿主細胞又は培養液中の脂肪酸組成の変化をガスクロマトグラフィー解析等の方法を用いて分析することにより、確認することができる。
また、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にTE遺伝子を連結したDNAを宿主細胞へ導入し、導入したTE遺伝子が発現する条件で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、Yuanらの方法（Yuan  L．et  al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1995，vol．92(23)，p．10639-10643）によって調製した各種アシル−ＡＣＰを基質とした反応を行うことにより、TE活性を測定することができる。
【００３６】
さらに本発明の形質転換体は、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子に加えて、KASをコードする遺伝子の発現も促進されていることが好ましい。
KASは、アシル−ＡＣＰとマロニルＡＣＰとの縮合反応を触媒し、アシル−ACPの合成に関与するタンパク質である。そのため、ACP2遺伝子に加えてKASをコードする遺伝子（以下単に、「KAS遺伝子」ともいう）の発現を促進することで、脂質の製造に用いる形質転換体の脂質の生産性、特に脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。
本発明で好ましく用いることができるKASは、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性（以下、「KAS活性」ともいう）を有するタンパク質であればよい。ここで「KAS活性」とは、アセチル−ＡＣＰやアシル−ＡＣＰとマロニルＡＣＰとの縮合反応を触媒する活性をいう。
【００３７】
KASはその基質特異性によって、KAS  I、KAS  II、KAS  III、KAS  IVに分類される。例えば、KASの１種であるKAS  IVは主に炭素原子数６から１４の伸長反応を触媒し、中鎖アシル−ＡＣＰを合成する。そのため、ACP2遺伝子に加えKAS  IVをコードする遺伝子の発現を促進することで、中鎖脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。
また、KASの１種であるKAS IIIは炭素数２のアセチル−ＡＣＰ（又はアセチル−ＣｏＡ）を炭素数４のβ−ケトアシル−ＡＣＰに伸長する反応を触媒し、短鎖又は中鎖脂肪酸の合成を促進する。そのため、ACP2遺伝子に加えKAS IIIをコードする遺伝子の発現を促進することによっても、中鎖脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。
【００３８】
本発明で好ましく用いることができるKASは、通常のKASや、それらと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータ由来のKAS  IV（以下、「NoKASIV」ともいう）（配列番号４８、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号４９）、ナンノクロロプシス・オキュラータ由来のKAS III（以下、「NoKASIII」ともいう）（配列番号５０、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号５１）等が挙げられる。また、これらと機能的に均等なタンパク質として、前記NoKASIVのアミノ酸配列との同一性が５０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）のアミノ酸配列からなり、かつKAS活性を有するタンパク質も用いることができる。
【００３９】
さらに本発明の形質転換体は、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子に加えて、アシル基転移酵素をコードする遺伝子の発現も促進されていることが好ましい。
「アシル基転移酵素」（以下、単に「AT」ともいう）とは、グリセロール３リン酸、リゾホスファチジン酸、ジアシルグリセロールなどのグリセロール化合物のアシル化を触媒するタンパク質である。遊離脂肪酸にＣｏＡが結合した脂肪酸アシルＣｏＡ、又はアシルＡＣＰは、各種ATによってグリセロール骨格へと取り込まれ、グリセロール１分子に対して脂肪酸３分子がエステル結合してなるトリアシルグリセロール（以下、単に「TAG」ともいう）として蓄積される。
そのため、ACP2遺伝子の加えてATをコードする遺伝子（以下単に、「AT遺伝子」ともいう）の発現を促進することで、脂質の製造に用いる形質転換体の脂質の生産性、特に脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。
【００４０】
ATは、基質である脂肪酸アシルＣｏＡ又は脂肪酸アシルＡＣＰを構成するアシル基（脂肪酸残基）の炭素原子数や不飽和結合数によって異なる反応特異性を示す複数のATが存在していることが知られている。よってATは、生体内での脂肪酸組成を決定する重要なファクターであると考えられている。また、AT遺伝子を元来有していない宿主を用いる場合、AT遺伝子の発現を促進させることが好ましい。また、中鎖脂肪酸アシルＣｏＡ又は中鎖脂肪酸アシルＡＣＰに対する基質特異性を有するAT遺伝子の発現を促進することにより、中鎖脂肪酸の生産性が向上する。このような遺伝子を導入することで、中鎖脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。
本発明で用いることができるATは、アシルトランスフェラーゼ活性（以下、「AT活性」ともいう）を有するタンパク質であればよい。ここで「AT活性」とは、グリセロール３リン酸、リゾホスファチジン酸、ジアシルグリセロールなどのグリセロール化合物のアシル化を触媒する活性を意味する。
【００４１】
本発明で用いることができるATは、通常のATや、それらと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータ由来のAT（以下、「NoAT」ともいう）（配列番号５２、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号５３）等が挙げられる。また、これと機能的に均等なタンパク質として、前記NoKASIVのアミノ酸配列との同一性が５０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）のアミノ酸配列からなり、かつAT活性を有するタンパク質も用いることができる。
【００４２】
さらに本発明の形質転換体は、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子に加えて、アシル−CoAシンテターゼをコードする遺伝子の発現も促進されていることが好ましい。
「アシル−CoAシンテターゼ」（以下、単に「ACS」ともいう）とは、生合成された脂肪酸（遊離脂肪酸）にCoAを付加し、アシル−CoAの生成に関与するタンパク質である。
そのため、ACP2遺伝子の加えてACSをコードする遺伝子（以下単に、「ACS遺伝子」ともいう）の発現を促進することで、脂質の製造に用いる形質転換体の脂質の生産性、特に脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。
【００４３】
本発明で用いることができるACSは、アシルCoAシンテターゼ活性（以下、「ACS活性」ともいう）を有するタンパク質であればよい。ここで「ACS活性」とは、遊離脂肪酸とCoAを結合させてアシル−CoAを生成する活性を意味する。
本発明で用いることができるACSは、通常のACSや、それらと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータ由来のACS（配列番号５４、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号５５；配列番号５６、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号５７；配列番号５８、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号５９）等が挙げられる。また、これらと機能的に均等なタンパク質として、前記ナンノクロロプシス・オキュラータ由来のACSのアミノ酸配列との同一性が５０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）のアミノ酸配列からなり、かつACS活性を有するタンパク質も用いることができる。
【００４４】
前述のTE、KAS、AT及びACSのアミノ酸配列情報、並びにこれらをコードする遺伝子の配列情報等は、例えば、国立生物工学情報センター（National  Center  for  Biotechnology  Information,  NCBI）などから入手することができる。
また、TE遺伝子、KAS遺伝子、AT遺伝子、ACS遺伝子の発現を促進させた形質転換体は、常法により作製できる。例えば、前述のACP2遺伝子の発現を促進させる方法と同様、前記各種遺伝子を宿主に導入する方法、前記各種遺伝子をゲノム上に有する宿主において当該遺伝子の発現調節領域を改変する方法、などにより形質転換体を作製することができる。
【００４５】
本発明の形質転換体は、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性が、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現が促進されていない宿主と比較して向上している。したがって、本発明の形質転換体を適切な条件で培養し、次いで得られた培養物又は生育物から中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を回収すれば、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を効率よく製造することができる。
ここで「培養物」とは培養した後の培養液及び形質転換体をいい、「生育物」とは生育した後の形質転換体をいう。
【００４６】
本発明の形質転換体の培養条件は、宿主に応じて適宜選択することができ、その宿主に対して通常用いられる培養条件を使用できる。また脂肪酸の生産効率の点から、培地中に、例えば脂肪酸生合成系に関与する前駆物質としてグリセロール、酢酸、又はグルコース等を添加してもよい。
【００４７】
宿主として大腸菌を用いる場合、大腸菌の培養は、例えば、ＬＢ培地又はOvernight  Express  Instant  TB  Medium（Novagen社）で、３０〜３７℃、０．５〜１日間培養することができる。
また、宿主としてシロイヌナズナを用いる場合、シロイヌナズナの培養は、例えば、土壌で温度条件２０〜２５℃、白色光を連続照射又は明期１６時間・暗期８時間等の光条件下で１〜２か月間栽培することができる。
【００４８】
宿主として藻類を用いる場合、培地は天然海水又は人工海水をベースにしたものを使用してもよいし、市販の培養培地を使用してもよい。具体的な培地としては、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、ダイゴＩＭＫ培地、Ｌ１培地、ＭＮＫ培地、等を挙げることができる。なかでも、脂質の生産性向上及び栄養成分濃度の観点から、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、又はダイゴＩＭＫ培地が好ましく、ｆ／２培地、又はダイゴＩＭＫ培地がより好ましく、ｆ／２培地がさらに好ましい。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上のため、培地に、窒素源、リン源、金属塩、ビタミン類、微量金属等を適宜添加することができる。
培地に接種する形質転換体の量は適宜選択することができ、生育性の点から、培地当り１％（vol/vol）以上が好ましい。また、その上限値は５０％（vol/vol）以下が好ましく、１０％（vol/vol）以下がより好ましい。接種する藻類の量の数値範囲は、１〜５０％（vol/vol）が好ましく、１〜１０％（vol/vol）がより好ましい。培養温度は、藻類の増殖に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、通常、５〜４０℃の範囲である。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、１０℃以上が好ましく、１５℃以上がより好ましい。またその上限値は３５℃以下が好ましく、３０℃以下がより好ましい。培養温度の数値範囲は、好ましくは１０〜３５℃であり、より好ましくは１５〜３０℃である。
また藻類の培養は、光合成ができるよう光照射下で行うことが好ましい。光照射は、光合成が可能な条件であればよく、人工光でも太陽光でもよい。光照射時の照度としては、藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から、１００ルクス以上が好ましく、３００ルクス以上がより好ましく、１０００ルクス以上がさらに好ましい。またその上限値は、５００００ルクス以下が好ましく、１００００ルクス以下がより好ましく、６０００ルクス以下がさらに好ましい。光照射時の照度の数値範囲は、好ましくは１００〜５００００ルクスの範囲、より好ましくは３００〜１００００ルクスの範囲、さらに好ましくは１０００〜６０００ルクスの範囲である。また、光照射の間隔は、特に制限されないが、前記と同様の観点から、明暗周期で行うことが好ましく、２４時間のうち明期は８時間以上が好ましく、１０時間以上がより好ましい。またその上限値は、２４時間以下が好ましく、１８時間以下がより好ましい。明期の数値範囲は、好ましくは８〜２４時間、より好ましくは１０〜１８時間、さらに好ましくは１２時間である。
また藻類の培養は、光合成ができるように二酸化炭素を含む気体の存在下、又は炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩を含む培地で行うことが好ましい。気体中の二酸化炭素の濃度は特に限定されないが、生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から０．０３％（大気条件と同程度）以上が好ましく、０．０５％以上がより好ましく、０．１％以上がさらに好ましく、０．３％以上がよりさらに好ましい。またその上限値は、１０％以下が好ましく、５％以下がより好ましく、３％以下がさらに好ましく、１％以下がよりさらに好ましい。二酸化炭素の濃度の数値範囲は、０．０３〜１０％が好ましく、０．０５〜５％がより好ましく、０．１〜３％がさらに好ましく、０．３〜１％がよりさらに好ましい。炭酸塩の濃度は特に限定されないが、例えば炭酸水素ナトリウムを用いる場合、生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から０．０１質量％以上が好ましく、０．０５質量％以上がより好ましく、０．１質量％以上がさらに好ましい。またその上限値は、５質量％以下が好ましく、２質量％以下がより好ましく、１質量％以下がさらに好ましい。炭酸水素ナトリウムの濃度の数値範囲は、０．０１〜５質量％が好ましく、０．０５〜２質量％がより好ましく、０．１〜１質量％がさらに好ましい。
培養時間は特に限定されず、脂質を高濃度に蓄積する藻体が高い濃度で増殖できるように、長期間（例えば１５０日程度）行なってもよい。３日以上が好ましく、７日以上がより好ましい。またその上限値は、９０日以下が好ましく、３０日以下がより好ましい。培養期間の数値範囲は、好ましくは３〜９０日間、より好ましくは３〜３０日間、さらに好ましくは７〜３０日間である。なお、培養は、通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養のいずれでもよく、通気性の向上の観点から、通気攪拌培養が好ましい。
【００４９】
培養物又は生育物から脂質を採取する方法としては、常法から適宜選択することができる。例えば、前述の培養物又は生育物から、ろ過、遠心分離、細胞の破砕、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、クロロホルム／メタノール抽出法、ヘキサン抽出法、又はエタノール抽出法等により脂質成分を単離、回収することができる。より大規模な培養を行った場合は、培養物又は生育物より油分を圧搾又は抽出により回収後、脱ガム、脱酸、脱色、脱蝋、脱臭等の一般的な精製を行い、脂質を得ることができる。このように脂質成分を単離した後、単離した脂質を加水分解することで脂肪酸を得ることができる。脂質成分から脂肪酸を単離する方法としては、例えば、アルカリ溶液中で７０℃程度の高温で処理をする方法、リパーゼ処理をする方法、又は高圧熱水を用いて分解する方法等が挙げられる。
【００５０】
本発明の製造方法において製造される脂質は、その利用性の点から、脂肪酸又は脂肪酸化合物を含んでいることが好ましく、脂肪酸又は脂肪酸エステル化合物を含んでいることがさらに好ましい。
脂質中に含まれる脂肪酸又は脂肪酸エステル化合物は、界面活性剤等への利用性の観点から、中鎖脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物が好ましく、炭素原子数が６以上１４以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物がより好ましく、炭素原子数が８以上１４以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物がさらに好ましく、炭素原子数が１０以上１４以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物がさらに好ましく、炭素原子数が１０、１２、若しくは１４の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物がさらに好ましく、炭素原子数が１０、１２、若しくは１４の飽和脂肪酸（カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸）又はその脂肪酸エステル化合物がさらに好ましく、炭素原子数が１２の飽和脂肪酸（ラウリン酸）又はその脂肪酸エステル化合物がさらに好ましい。
脂肪酸エステル化合物は、生産性の点から、単純脂質又は複合脂質が好ましく、単純脂質がさらに好ましく、トリアシルグリセロールがさらにより好ましい。
【００５１】
本発明の製造方法により得られる脂質は、食用として用いる他、可塑剤、化粧品等の乳化剤、石鹸や洗剤等の洗浄剤、繊維処理剤、毛髪リンス剤、又は殺菌剤や防腐剤として利用することができる。
【００５２】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の脂質の製造方法、生産される脂肪酸の組成を改変する方法、形質転換体、及び形質転換体の作製方法を開示する。
【００５３】
＜１＞下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現を促進させた形質転換体を培養して脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、好ましくは９３％以上、より好ましくは９４％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつACP活性を有するタンパク質。
【００５４】
＜２＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現を促進させ、形質転換体の細胞内で生産される中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質の製造方法。
＜３＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現を促進させて、形質転換体の細胞内で生産される中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させ、生産される全脂肪酸中又は全脂質中の脂肪酸又は脂質の組成を改変する、脂質の組成の改変方法。
＜４＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を宿主に導入して前記遺伝子の発現を促進させる、前記＜１＞〜＜３＞のいずれか１項記載の方法。
【００５５】
＜５＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養して脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。
＜６＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、生産される中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質の製造方法。
＜７＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、生産される中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させ、形質転換体の細胞内で生産される全脂肪酸中又は全脂質中の脂肪酸又は脂質の組成を改変する、脂質の組成の改変方法。
【００５６】
＜８＞前記タンパク質（Ｂ）が、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上３６個以下、より好ましくは１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上２４個以下、より好ましくは１個以上１８個以下、より好ましくは１個以上１２個以下、より好ましくは１個以上９個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上７個以下、より好ましくは１個以上６個以下、より好ましくは１個以上４個以下、より好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１個以上２個以下、より好ましくは１個、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記＜１＞〜＜７＞のいずれか１項記載の方法。
＜９＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）からなる遺伝子である、前記＜１＞〜＜８＞のいずれか１項記載の方法。
（ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列と同一性が７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、好ましくは９３％以上、より好ましくは９４％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつACP活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜１０＞前記ＤＮＡ（ｂ）が、前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上１０８個以下、より好ましくは１個以上９０個以下、より好ましくは１個以上７２個以下、より好ましくは１個以上５４個以下、より好ましくは１個以上３６個以下、より好ましくは１個以上２９個以下、より好ましくは１個以上２５個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上１８個以下、より好ましくは１個以上１４個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上７個以下、より好ましくは１個以上３個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつACP活性を有する前記タンパク質（Ａ）若しくは（Ｂ）をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ａ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつACP活性を有する前記タンパク質（Ａ）若しくは（Ｂ）をコードするＤＮＡ、である、前記＜９＞項記載の方法。
＜１１＞前記形質転換体において、TEをコードする遺伝子の発現を促進させた、前記＜１＞〜＜１０＞のいずれか１項記載の方法。
＜１２＞前記TEが、中鎖アシル−ＡＣＰに対する基質特異性を有するTEである、前記＜１１＞項記載の方法。
＜１３＞前記TEが、配列番号４０、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４２、配列番号４４若しくは配列番号４６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、又は当該タンパク質のアミノ酸配列との同一性が５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、のアミノ酸配列からなり、かつ中鎖アシル−ＡＣＰに対するTE活性を有するタンパク質である、前記＜１１＞又は＜１２＞項記載の方法。
＜１４＞前記形質転換体において、ATをコードする遺伝子の発現を促進させた、前記＜１＞〜＜１３＞のいずれか１項記載の方法。
＜１５＞前記ATが、配列番号５２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、又は当該タンパク質のアミノ酸配列との同一性が５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、のアミノ酸配列からなり、かつAT活性を有するタンパク質である、前記＜１４＞項記載の方法。
＜１６＞前記形質転換体において、KAS及びACSからなる群より選ばれる少なくとも１種のタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進させた、前記＜１＞〜＜１５＞のいずれか１項記載の方法。
＜１７＞前記KASが、配列番号４８若しくは配列番号５０に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、又は当該タンパク質のアミノ酸配列との同一性が５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、のアミノ酸配列からなり、かつKAS活性を有するタンパク質である、前記＜１６＞項記載の方法。
＜１８＞前記ACSが、配列番号５４、配列番号５６若しくは配列番号５８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、又は当該タンパク質のアミノ酸配列との同一性が５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、のアミノ酸配列からなり、かつACS活性を有するタンパク質、である前記＜１６＞項記載の方法。
＜１９＞前記形質転換体が微生物又は植物である、前記＜１＞〜＜１８＞のいずれか１項記載の方法。
＜２０＞前記微生物が微細藻類である、前記＜１９＞項記載の方法。
＜２１＞前記微細藻類がナンノクロロプシス属に属する藻類、好ましくはナンノクロロプシス・オキュラータ、である、前記＜２０＞項記載の方法。
＜２２＞前記微生物が大腸菌である、前記＜１９＞項記載の方法。
＜２３＞前記植物がシロイヌナズナである、前記＜１９＞項記載の方法。
＜２４＞前記脂質が、中鎖脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、好ましくは炭素原子数が６以上１４以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が８以上１４以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が１０以上１４以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が１０、１２、若しくは１４の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が１０、１２、若しくは１４の飽和脂肪酸（カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸）又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が１２の飽和脂肪酸（ラウリン酸）又はその脂肪酸エステル化合物、を含む、前記＜１＞〜＜２３＞のいずれか１項記載の方法。
＜２５＞ｆ／２培地を用いて前記形質転換体を培養する、前記＜１＞〜＜２４＞のいずれか１項記載の方法。
【００５７】
＜２６＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子の発現を宿主の細胞内で促進させた形質転換体。
＜２７＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子、又は当該遺伝子を含有する組換えベクターを宿主に導入してなる、形質転換体。
＜２８＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子、又は当該遺伝子を含有する組換えベクターを宿主に導入する、形質転換体の作製方法。
＜２９＞前記タンパク質（Ｂ）が前記＜８＞項で規定するタンパク質である、前記＜２６＞〜＜２８＞のいずれか１項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜３０＞前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子が、前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）からなる遺伝子である、前記＜２６＞〜＜２９＞のいずれか１項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜３１＞前記ＤＮＡ（ｂ）が前記＜１０＞項で規定するＤＮＡである、前記＜３０＞項に記載の形質転換体又はその作製方法。
＜３２＞前記形質転換体において、TEをコードする遺伝子の発現を促進させた、前記＜２６＞〜＜３１＞のいずれか１項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜３３＞前記TEが、中鎖アシル−ＡＣＰに対する基質特異性を有するTEである、前記＜３２＞項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜３４＞前記TEが、配列番号４０、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４２、配列番号４４若しくは配列番号４６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、又は当該タンパク質のアミノ酸配列との同一性が５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、のアミノ酸配列からなり、かつ中鎖アシル−ＡＣＰに対するTE活性を有するタンパク質、である、前記＜３２＞又は＜３３＞項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜３５＞前記形質転換体において、ATをコードする遺伝子の発現を促進させた、前記＜２６＞〜＜３４＞のいずれか１項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜３６＞前記ATが、配列番号５２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、又は当該タンパク質のアミノ酸配列との同一性が５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、のアミノ酸配列からなり、かつAT活性を有するタンパク質である、前記＜３５＞項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜３７＞前記形質転換体において、KAS及びACSからなる群より選ばれる少なくとも１種のタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進させた、前記＜２６＞〜＜３６＞のいずれか１項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜３８＞前記KASが、配列番号４８若しくは配列番号５０に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、又は当該タンパク質のアミノ酸配列との同一性が５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、のアミノ酸配列からなり、かつKAS活性を有するタンパク質である、前記＜３７＞項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜３９＞前記ACSが、配列番号５４、配列番号５６若しくは配列番号５８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、又は当該タンパク質のアミノ酸配列との同一性が５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、のアミノ酸配列からなり、かつACS活性を有するタンパク質、である前記＜３７＞項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜４０＞前記形質転換体又は宿主が微生物又は植物である、前記＜２６＞〜＜３９＞のいずれか１項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜４１＞前記微生物が微細藻類である、前記＜４０＞項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜４２＞前記微細藻類がナンノクロロプシス属に属する藻類、好ましくはナンノクロロプシス・オキュラータ、である、前記＜４１＞項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜４３＞前記微生物が大腸菌である、前記＜４０＞項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜４４＞前記植物がシロイヌナズナである、前記＜４０＞項記載の形質転換体又はその作製方法。
【００５８】
＜４５＞脂質を製造するための、前記＜２６＞〜＜４４＞のいずれか１項記載の形質転換体、又は形質転換体の作製方法により得られた形質転換体の使用。
＜４６＞前記脂質が、中鎖脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、好ましくは炭素原子数が６以上１４以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が８以上１４以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が１０以上１４以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が１０、１２、若しくは１４の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が１０、１２、若しくは１４の飽和脂肪酸（カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸）又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が１２の飽和脂肪酸（ラウリン酸）又はその脂肪酸エステル化合物、を含む、前記＜４５＞項記載の使用。
【実施例】
【００５９】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。ここで、本実施例で用いるプライマーの塩基配列を表１〜３に示す。
【００６０】
【表１】
0006779664.tif 000002
【００６１】
【表２】
0006779664.tif 000003
【００６２】
【表３】
0006779664.tif 000004
【００６３】
実施例１  ナンノクロロプシス・オキュラータ由来ACP遺伝子をナンノクロロプシス・オキュラータへ導入した形質転換体の作製、及び形質転換体による脂質の製造
（１）ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドの構築
ゼオシン耐性遺伝子（配列番号３）、及び文献（Randor  Radakovits，et  al.，Nature  Communications，DOI:10.1038/ncomms1688，2012）に記載されている、ナンノクロロプシス・ガディタナCCMP526株由来チューブリンプロモーター配列（配列番号４）を人工合成した。
合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表１に示すプライマー番号５及びプライマー番号６のプライマー対、並びにプライマー番号７及びプライマー番号８のプライマー対をそれぞれ用いてPCRを行い、ゼオシン耐性遺伝子及びチューブリンプロモーター配列をそれぞれ増幅した。
また、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株（独立行政法人国立環境研究所(NIES)より入手）のゲノムを鋳型として、表１に示すプライマー番号９及びプライマー番号１０のプライマー対を用いてPCRを行い、ヒートショックプロテインターミネーター配列（配列番号１１）を増幅した。
さらに、プラスミドベクターpUC19（タカラバイオ社製）を鋳型として、表１に示すプライマー番号１２及びプライマー番号１３のプライマー対を用いてPCRを行い、プラスミドベクターpUC19を増幅した。
【００６４】
これら４つの増幅断片をそれぞれ制限酵素DpnI（東洋紡株式会社製）にて処理し、High  Pure  PCR  Product  Purification  Kit（Roche  Applied  Science社製)を用いて精製した。その後、得られた４つの断片をIn-Fusion  HD  Cloning  Kit（Clontech社製）を用いて融合し、ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドを構築した。
なお、本発現プラスミドは、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順に連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
【００６５】
（２）ナンノクロロプシス・オキュラータ由来ACP遺伝子の取得、及びACP遺伝子発現用プラスミドの構築
ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株の全ＲＮＡを抽出し、SuperScript（商標）III  First-Strand  Synthesis  SuperMix  for  qRT-PCR（invitrogen社製）を用いて逆転写を行ってcDNAを得た。このcDNAを鋳型として、表１に示すプライマー番号１４及びプライマー番号１５のプライマー対をそれぞれ用いてPCRを行い、配列番号２の塩基配列からなるNoACP2遺伝子断片を取得した。
また、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株のゲノムを鋳型として、表１に示すプライマー番号１６及びプライマー番号１７のプライマー対、並びにプライマー番号１８及びプライマー番号１９のプライマー対をそれぞれ用いてPCRを行い、LDSPプロモーター配列（配列番号２０）及びVCP1ターミネーター配列（配列番号２１）を取得した。
さらに、前記ゼオシン耐性遺伝子発現プラスミドを鋳型として、表１に示すプライマー番号２２及びプライマー番号１３のプライマー対を用いてPCRを行い、ゼオシン耐性遺伝子発現カセット（チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列）及びpUC19配列からなる断片を増幅した。
【００６６】
NoACP2遺伝子断片を、LDSPプロモーター断片、VCP1ターミネーター断片、ゼオシン耐性遺伝子発現カセット及びpUC19配列からなる断片と混和した。そして、これら４つの増幅断片を、前述の方法と同様の方法にて融合し、NoACP2遺伝子発現用プラスミドを構築した。
なお、本発現プラスミドはLDSPプロモーター配列、NoACP2遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
【００６７】
（３）ACP遺伝子発現用カセットのナンノクロロプシス・オキュラータへの導入
前記NoACP2遺伝子発現プラスミドを鋳型として、表１に示すプライマー番号１０及びプライマー番号１６のプライマー対を用いてPCRを行い、NoACP2遺伝子発現カセット（LDSPプロモーター配列、NoACP2遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列からなるＤＮＡ断片）を増幅した。
増幅した各DNA断片を、High  Pure  PCR  Product  Purification  Kit（Roche  Applied  Science社製）を用いて精製した。なお、精製の際の溶出には、キットに含まれる溶出バッファーではなく、滅菌水を用いた。
【００６８】
約1×109細胞のナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株を、384mMのソルビトール溶液で洗浄して塩を完全に除去し、形質転換の宿主細胞として用いた。上記で増幅したNoACP2遺伝子発現カセット約500ngを宿主細胞と混和し、50μF、500Ω、2,200v/2mmの条件でエレクトロポレーションを行った。
ｆ／２液体培地（NaNO3  75mg、NaH2PO4・2H2O  6mg、ビタミンB12  0.5μg、ビオチン  0.5μg、チアミン  100μg、Na2SiO3・9H2O  10mg、Na2EDTA・2H2O  4.4mg、FeCl3・6H2O  3.16mg、FeCl3・6H2O  12μg、ZnSO4・7H2O  21μg、MnCl2・4H2O  180μg、CuSO4・5H2O  7μg、Na2MoO4・2H2O  7μg／人工海水1L）にて２４時間回復培養を行った。その後、2μg/mLのゼオシン含有ｆ／２寒天培地に塗布し、25℃、0.3%CO２雰囲気下、12h/12h明暗条件にて２〜３週間培養した。得られたコロニーの中から、NoACP2遺伝子発現カセットを含むナンノクロロプシス・オキュラータ株をPCRにより選抜した。
【００６９】
（４）形質転換体による脂肪酸の生産
選抜した株を、ｆ／２培地の窒素濃度を15倍、リン濃度を5倍に増強した培地（以下、「Ｎ１５Ｐ５培地」という）20mLに播種し、25℃、0.3%CO２雰囲気下、12h/12h明暗条件にて３〜４週間振盪培養し、前培養液とした。それぞれ独立した２ラインの形質転換体の前培養液2mLをＮ１５Ｐ５培地18mLに植継ぎ、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて１２日間振盪培養した。なお、陰性対照として、野生株であるナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株についても同様に実験を行った。
【００７０】
（５）脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析
培養液1mLに、内部標準として1mg/mLの7-ペンタデカノン（メタノール溶液）50μLを添加後、クロロホルム0.5mL、及びメタノール1mLを培養液に添加して激しく攪拌し、10分間放置した。その後さらに、クロロホルム0.5mL及び1.5%KCl  0.5mLを添加して攪拌し、3,000rpｍにて5分間遠心分離を行い、パスツールピペットにてクロロホルム層（下層）を回収した。
得られたクロロホルム層に窒素ガスを吹き付けて乾固し、0.5NのKOHメタノール溶液を0.7mL添加し、80℃にて30分間恒温した。さらに、１４％三フッ化ホウ素溶液（SIGMA社製）1mLを添加し、80℃にて30分間恒温した。その後、ヘキサン0.5mL、及び飽和食塩水1mLを添加して激しく撹拌し、室温にて10分間放置し、上層であるヘキサン層を回収して脂肪酸メチルエステルを得た。
【００７１】
下記に示す測定条件下で、得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィー解析に供した。
＜ガスクロマトグラフィー条件＞
分析装置：7890A（Agilent technology）
キャピラリーカラム：DB-1  MS（30m×200μm×0.25μm、J＆W  Scientific社製）
移動相：高純度ヘリウム
オーブン温度：150℃保持0.5分→150〜220℃（40℃/分昇温）→220〜320℃（20℃/分昇温）→320℃保持2分（ポストラン2分）
注入口温度：300℃
注入方法：スプリット注入（スプリット比：７５：１）
注入量：1μL
洗浄バイアル：メタノール・クロロホルム
検出方法：ＦＩＤ
検出器温度：300℃
【００７２】
脂肪酸メチルエステルの同定は、同サンプルを同条件でガスクロマトグラフ質量分析解析に供することにより行った。
ガスクロマトグラフィー解析により得られた波形データのピーク面積より、各脂肪酸のメチルエステル量を定量した。各ピーク面積を、内部標準である7-ペンタデカノンのピーク面積と比較することで試料間の補正を行い、培養液1Lあたりの各脂肪酸量を算出した。さらに、各脂肪酸量の総和を総脂肪酸量とし、総脂肪酸量に占める各脂肪酸量の割合を算出した。
その結果を表４に示す。なお、以下の表において、「TFA」は総脂肪酸量を、「脂肪酸組成(%TFA)」は総脂肪酸の重量に対する各脂肪酸の重量の割合を示す。また、「n」は０〜５の整数であり、例えば「C18:n」と記載した場合には、組成がC18:0、C18:1、C18:2、C18:3、C18:4及びC18:5の脂肪酸の総和を表す。
【００７３】
【表４】
0006779664.tif 000005
【００７４】
表４に示すように、NoACP2遺伝子発現カセットを導入した形質転換体（NoACP2遺伝子導入株）は、野生株（NIES2145）と比較して、脂肪酸組成に大きな変化が確認できた。具体的には、長鎖脂肪酸、特にＣ１６：０（パルミチン酸）及びＣ１８：ｎの割合が大きく減少した。そして、中鎖脂肪酸（Ｃ１２：０（ラウリン酸）及びＣ１４：０（ミリスチン酸））の割合が顕著に増加した。
以上の結果から、NoACP2遺伝子は中鎖脂肪酸の生産性の向上に好適に用いることができるということが明らかになった。
【００７５】
実施例２  NoACP2遺伝子及びNoTE遺伝子をナンノクロロプシス・オキュラータに導入した形質転換体の作製、及び形質転換体による脂肪酸の生産
（１）NoTE発現用プラスミドの構築
実施例１で作製したナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のcDNAを鋳型として、表２に示すプライマー番号２３及びプライマー番号２４のプライマー対、並びにプライマー番号２５及びプライマー番号２６のプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号２７の２６２位〜８６４位までの塩基配列からなるアシル−ACPチオエステラーゼ遺伝子断片（以下、「NoTE遺伝子断片」ともいう）、及び配列番号２８の塩基配列からなるVCP1葉緑体移行シグナル断片を取得した。
これらの増幅断片を、実施例１と同様の方法で作製したLDSPプロモーター断片、VCP1ターミネーター断片、ゼオシン耐性遺伝子発現用カセット、及びpUC19配列からなる断片と混和し、実施例１と同様の方法にて融合し、NoTE遺伝子発現用プラスミドを構築した。なお、本発現プラスミドはLDSPプロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナル配列、NoTE遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
【００７６】
作製したNoTE遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表２に示すプライマー番号２９及びプライマー番号３０のプライマー対を用いてPCRを行い、増幅断片を実施例１と同様の方法にて精製及び融合し、NoTE改変体（以下、「NoTE（V204W）」ともいう）遺伝子発現用プラスミドを構築した。なお、本発現用プラスミドでは、配列番号３６に示すアミノ酸配列からなるNoTE（配列番号２７に示す塩基配列からなるNoTE遺伝子がコードするNoTE）のうち、２０４位のバリン（Ｖ）がトリプトファン（Ｗ）に置換されている。
【００７７】
（２）NoTE発現用プラスミドのナンノクロロプシス・オキュラータへの導入
構築したV204W遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表１に示すプライマー番号１０及びプライマー番号１６のプライマー対を用いたPCRを行い、NoTE（V204W）遺伝子発現カセット（LDSPプロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナル配列、NoTE（V204W）遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列からなるＤＮＡ断片）を増幅した。この増幅断片を、実施例１と同様の方法にて精製し、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株に形質転換した。以下、NoTE（V204W）遺伝子を導入した株を「NoTE（V204W）株」ともいう。
【００７８】
（３）NoTE（V204W）株へのNoACP2遺伝子の導入
実施例１で構築したNoACP2遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表２に示すプライマー番号３１及びプライマー番号３２のプライマー対を用いてPCRを行った。また、人工合成したパロモマイシン耐性遺伝子（配列番号３３）を鋳型として、表２に示すプライマー番号３４及びプライマー番号３５のプライマー対を用いてPCRを行った。
これら２つの増幅断片を実施例１と同様の方法にて融合し、NoACP2遺伝子発現用プラスミド（パロモマイシン耐性）を構築した。なお、本発現用プラスミドは、LDSPプロモーター配列、NoACP2遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、パロモマイシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
【００７９】
得られた前記NoACP2遺伝子発現用プラスミド（パロモマイシン耐性）を鋳型として、表１に示すプライマー番号１０及びプライマー番号１６のプライマー対を用いてPCRを行い、NoACP2遺伝子発現カセット（LDSPプロモーター配列、NoACP2遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、パロモマイシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列からなるＤＮＡ断片）を増幅した。
得られた増幅断片を実施例１と同様の方法にて精製し、前記NoTE（V204W）株に、精製した断片をエレクトロポレーションにより導入した。実施例１と同様の方法にて回復培養を行った後、2μg/mLのゼオシン及び100μg/mLのパロモマイシン含有ｆ／２寒天培地に塗布し、25℃、0.3%CO２雰囲気下、12h/12h明暗条件にて２〜３週間培養した。得られたコロニーの中から、NoACP2遺伝子発現カセットを含むナンノクロロプシス・オキュラータ株をPCRにより選抜した。
【００８０】
（４）形質転換体による脂肪酸の生産、脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析
選抜した株を、Ｎ１５Ｐ５培地20mLに播種し、25℃、0.3%CO２雰囲気下、12h/12h明暗条件にて３〜４週間振盪培養し、前培養液とした。前培養液2mLをＮ１５Ｐ５培地18mLに植継ぎ、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて１４日間振盪培養した。なお、陰性対照として、NoTE（V204W）株についても同様の実験を行った。
得られた培養液を用いて、実施例１と同様の方法にて脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析を行った。その結果を表５に示す。
【００８１】
【表５】
0006779664.tif 000006
【００８２】
表５に示すように、NoTE（V204W）株にNoACP2遺伝子を導入した形質転換体（NoTE（V204W）+NoACP2）でも、NoTE（V204W）株と比較して、脂肪酸組成に大きな変化が確認できた。具体的には、Ｃ１６：０（パルミチン酸）やＣ１６：１（パルミトレイン酸）などの長鎖脂肪酸の割合が大きく減少した。そして、中鎖脂肪酸（Ｃ１０：０（カプリン酸）及びＣ１２：０（ラウリン酸））の割合が顕著に増加した。
このことから、NoACP2遺伝子は、中鎖アシル−ＡＣＰに対する基質特異性を有するTEをコードする遺伝子と併用することで、中鎖脂肪酸の生産性をさらに向上させることができる。
【００８３】
実施例３  NoACP2遺伝子及びNoAT遺伝子をナンノクロロプシス・オキュラータに導入した形質転換体の作製、及び形質転換体による脂肪酸の生産
（１）NoAT発現用プラスミドの構築
実施例１で作製したナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のcDNAを鋳型として、表３に示すプライマー番号６０及びプライマー番号６１のプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号５３の塩基配列からなるアシルトランスフェラーゼ遺伝子断片（以下、「NoAT遺伝子断片」ともいう）を取得した。
この増幅断片を、実施例１と同様の方法で作製したLDSPプロモーター断片、VCP1ターミネーター断片、ゼオシン耐性遺伝子発現用カセット、及びpUC19配列からなる断片と混和し、実施例１と同様の方法にて融合し、NoAT遺伝子発現用プラスミドを構築した。なお、本発現プラスミドはLDSPプロモーター配列、NoAT遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
【００８４】
（２）NoAT発現用プラスミドのナンノクロロプシス・オキュラータへの導入
構築したNoAT遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表１に示すプライマー番号１０及びプライマー番号１６のプライマー対を用いたPCRを行い、NoAT遺伝子発現カセット（LDSPプロモーター配列、NoAT遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列からなるＤＮＡ断片）を増幅した。この増幅断片を、実施例１と同様の方法にて精製し、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株に形質転換した。以下、NoAT遺伝子を導入した株を「NoAT株」ともいう。
【００８５】
（３）NoAT株へのNoACP2遺伝子の導入
実施例２で構築したNoACP2遺伝子発現用プラスミド（パロモマイシン耐性）を鋳型として、表１に示すプライマー番号１０及びプライマー番号１６のプライマー対を用いてPCRを行い、NoACP2遺伝子発現カセット（LDSPプロモーター配列、NoACP2遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、パロモマイシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列からなるＤＮＡ断片）を増幅した。
得られた増幅断片を実施例１と同様の方法にて精製し、前記NoAT株に、精製した断片をエレクトロポレーションにより導入した。実施例１と同様の方法にて回復培養を行った後、2μg/mLのゼオシン及び100μg/mLのパロモマイシン含有ｆ／２寒天培地に塗布し、25℃、0.3%CO２雰囲気下、12h/12h明暗条件にて２〜３週間培養した。得られたコロニーの中から、NoACP2遺伝子発現カセットを含むナンノクロロプシス・オキュラータ株をPCRにより選抜した。
【００８６】
（４）形質転換体による脂肪酸の生産、脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析
選抜した株（それぞれ独立した３ライン）を、ｆ／２培地の窒素濃度を5倍、リン濃度を5倍に増強した培地（以下、「Ｎ５Ｐ５培地」という）に播種し、25℃、0.3%CO２雰囲気下、12h/12h明暗条件にて３週間振盪培養し、前培養液とした。前培養液1mLをＮ５Ｐ５培地19mLに植継ぎ、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて１４日間振盪培養した。なお、陰性対照として、NoAT株及びNIES2145株、並びに参考例として、実施例１で作製したNoACP2遺伝子導入株（以下、「NoACP2株」ともいう）についても、同様の実験を行った。
得られた培養液を用いて、実施例１と同様の方法にて脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析を行った。その結果を表６に示す。
【００８７】
【表６】
0006779664.tif 000007
【００８８】
表６に示すように、NoAT株にNoACP2遺伝子を導入した形質転換体（NoAT+NoACP2）でも、NoAT株と比較して、脂肪酸組成に大きな変化が確認できた。具体的には、Ｃ１６：０（パルミチン酸）などの長鎖脂肪酸の割合が大きく減少した。そして、中鎖脂肪酸（Ｃ１０：０（カプリン酸）、Ｃ１２：０（ラウリン酸）及びＣ１４：０（ミリスチン酸））の割合が顕著に増加した。
このことから、NoACP2遺伝子は、中鎖アシル基に対する基質特異性を有するATをコードする遺伝子と併用することで、中鎖脂肪酸の生産性をさらに向上させることができる。
【００８９】
以上のように、本発明で規定するACP2遺伝子の発現を促進させることで、中鎖脂肪酸の生産性を向上させた形質転換体を作製することができる。そしてこの形質転換体を培養することで、中鎖脂肪酸の生産性を向上させることができる。
【配列表】
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