(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
質量分光定量分析のための疑似内部標準の方法であって、
検査される試料のブランク基質を用いて異なる濃度の標準溶液を調製するために標準物質を計量し、
次に、検査される該試料の該ブランク基質を用いて１つから複数の濃度の内部標準溶液を調製するために同じ該標準物質を計量する段階であって、
内部標準系列が該標準溶液と同じ濃度範囲を有する、前記計量する段階と、
試料処理段階を通じて前記異なる濃度の前記標準溶液及び前記内部標準溶液を標準試料及び内部標準試料まで処理する段階と、
分析及び検出を実行するためにクロマトグラフ−質量分析システム内に前記標準試料及び前記内部標準試料を注入する段階と、
前記標準試料の注入の各完了の後に注入器を一時停止する段階と、
クロマトグラフピークが完了するのに必要とされる時間にわたって待機する段階と、
疑似内部標準の方法によって定量化された較正曲線を確立するために、前記標準試料と前記内部標準試料の間のピーク面積の比を該標準試料の前記濃度に対してプロットする段階と、
未知試料を同じ前記試料処理段階によって処理し、次に標準試料分析と同じ段階を辿り、検出される該試料及び前記内部標準試料を前記クロマトグラフ−質量分析システム内に注入して分析及び検出を実行する段階であって、次に前記内部標準試料に対する前記試料のピーク面積の比が、前記未知試料の濃度を判別するために前記較正曲線と比較される、前記実行する段階と、
を含み、
前記内部標準試料は、前記クロマトグラフ−質量分析システムのクロマトグラフカラムを通過すること、及び該標準試料と該内部標準試料は、分離されて同じ検出サイクル内で分析されることを特徴とする方法。
【請求項２】
質量分光定量分析のための疑似内部標準の方法であって、
検査される試料のブランク基質を用いて異なる濃度の標準溶液を調製するために標準物質を計量し、
次に、検査される該試料の該ブランク基質を用いて１つから複数の濃度の内部標準溶液を調製するために同じ該標準物質を計量する段階であって、
内部標準系列が該標準溶液と同じ濃度範囲を有する、前記計量する段階と、
試料処理段階を通じて前記異なる濃度の前記標準溶液及び前記内部標準溶液を標準試料及び内部標準試料まで処理する段階と、
分析及び検出を実行するためにクロマトグラフ−質量分析システム内に前記標準試料及び前記内部標準試料を注入する段階と、
疑似内部標準の方法によって定量化された較正曲線を確立するために、前記標準試料と前記内部標準試料の間のピーク面積の比を該標準試料の前記濃度に対してプロットする段階と、
未知試料を同じ前記試料処理段階によって処理し、次に標準試料分析と同じ段階を辿り、検出される該試料及び前記内部標準試料を前記クロマトグラフ−質量分析システム内に注入して分析及び検出を実行する段階であって、次に前記内部標準試料に対する前記試料のピーク面積の比が、前記未知試料の濃度を判別するために前記較正曲線と比較される、前記実行する段階と、
を含み、
前記内部標準試料は、前記標準試料の注入の各完了の後に注入され、該内部標準試料は、前記クロマトグラフ−質量分析システムのクロマトグラフカラムを迂回しながら検出を実行する流れ注入の方式で質量分析計に直接流入することを特徴とする方法。
【請求項３】
質量分光定量分析のための疑似内部標準の方法であって、
検査される試料のブランク基質を用いて異なる濃度の標準溶液を調製するために標準物質を計量し、
次に、検査される該試料の該ブランク基質を用いて１つから複数の濃度の内部標準溶液を調製するために同じ該標準物質を計量する段階であって、
内部標準系列が該標準溶液と同じ濃度範囲を有する、前記計量する段階と、
試料処理段階を通じて前記異なる濃度の前記標準溶液及び前記内部標準溶液を標準試料及び内部標準試料まで処理する段階と、
分析及び検出を実行するためにクロマトグラフ−質量分析システム内に前記標準試料及び前記内部標準試料を注入する段階と、
疑似内部標準の方法によって定量化された較正曲線を確立するために、前記標準試料と前記内部標準試料の間のピーク面積の比を該標準試料の前記濃度に対してプロットする段階と、
未知試料を同じ前記試料処理段階によって処理し、次に標準試料分析と同じ段階を辿り、検出される該試料及び前記内部標準試料を前記クロマトグラフ−質量分析システム内に注入して分析及び検出を実行する段階であって、次に前記内部標準試料に対する前記試料のピーク面積の比が、前記未知試料の濃度を判別するために前記較正曲線と比較される、前記実行する段階と、
を含み、
前記標準試料の注入の各完了の後に、該標準試料の濃度に最も近い濃度を有する内部標準試料が、該標準試料のクロマトグラフピークが検出された後に注入され、該内部標準試料は、前記クロマトグラフ−質量分析システムのクロマトグラフカラムを迂回しながら測定を実行する流れ注入の方式で質量分析計に直接流入することを特徴とする方法。
【請求項４】
前記内部標準試料が前記流れ注入を用いて注入される時に、該流れ注入の流量が、２０％だけ低減される、又は噴霧ガスの流れが、６０Ｌ／分から７０から１００Ｌ／分まで増加されることを特徴とする請求項２に記載の質量分光定量分析のための疑似内部標準の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の開示は、質量分光定量技術の分野に関し、より具体的には、質量分光定量分析のための疑似内部標準の方法、デバイス、及び使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
定量分析は、基本的に３つの段階を伴う。第１に、検体の純粋標準物を用いて異なる濃度で較正溶液を調製する。第２に、較正溶液及び未知試料を分析してそれらの信号応答を取得する。最後に、較正溶液試料から測定された信号強度（Ｙ）をそれらの濃度（Ｃ）に対してプロットして較正曲線を確立する。未知試料の濃度は、較正式から計算するか又は曲線から直接見出すことができる。理想的な較正曲線は、較正式Ｙ＝ａＣ＋ｂに適合する直線である。実際には、較正曲線の線形性は、比較的小さい範囲、例えば、濃度１と１０の間に存在するのみである。広い濃度範囲に対して、較正曲線は通常は湾曲し、式Ｙ＝ａｘ2＋ｂｘ＋ｃにより良く適合することができる真の「曲線」になる。
【０００３】
定量分析の精度を保証するために、この分野の一般的な慣習は、内部標準（ＩＳ）法を実施することである。経時的な計器感度のドリフト及び試料調製中に発生する不安定な試料体積は、定量結果に不正確性を引き起こす主な変動である。各試料の中に内部標準、すなわち、純粋物質（非検体）を正確に追加し、次に試料を調製して各分析実行中に検体と内部標準の両方を測定することにより、変動は、検体の信号強度（Ｉx）の内部標準のもの（Ｉis）に対する比を取得することによって殆ど相殺することができる。検体信号（Ｉx）が計器内の感度の変化又は試料体積内の偶発的な誤差のいずれかに起因して上下する時に、内部標準信号も相応に上下すると考えられ、信号比（Ｉx／Ｉis）はそのままであると考えられる。従って、内部標準方法を使用する定量分析に対して、較正曲線は、濃度（Ｃ）に対する信号比（Ｙ＝Ｉx／Ｉis）のプロットである。試料処理中に導入される誤差は、注意及び／又は自動化によって回避することができると考えられる人的誤差であるので、内部標準方法は、計器不安定性を補償するために最も必要なものである。
【０００４】
質量分析計は、荷電粒子の分離及び検出のためのデバイスである。その極端な感度及び無類の分解能に起因して、質量分析計は、微量分析のための一般的ツールになっている。それは、薬物動態学、薬品代謝、毒物学の毒物動態学、及び臨床試験の研究に対して特に必要不可欠である。化学分析に質量分析計を使用する時に、最初に検体をイオン化しなければならない。通常、分子のイオン化は、イオン源内の高電界又は粒子衝撃によって達成される。しかし、イオン源内の電界又は衝突粒子強度の安定性を維持するのは決して容易ではなく、イオン源がクロマトグラフ流出液の常時入力下にあることは言うまでもない。従って、質量分析法の測定感度が経時的に変化するのは不可避である。通常、イオン源の８時間変動は、３０％を超える可能性がある。すなわち、内部標準を用いない質量分析法による定量分析の精度は、約７０％に達することかできるのみである。原理的に、内部標準方法は、精度を９０％を超えるまで高めることができるはずである。しかし、イオン化効率は、物質の構造に密接に関連し、微妙な構造の相違がイオン化効率を非常に異なるものにする。検査される物質のものと一致するイオン化特性を有する内部標準物質を見出すのは非常に困難である。現在、検体の同位体類似物のみが、内部標準として使用することができる。同位体類似物は、より高い分子量を有するが構造的に同一である変異分子を取得するための水素の重水素による置換のような検体内のある一定の元素の重同位体による置換物である。測定を実行するために検体とそのような同位体類似物とが質量分析計内に同時に導入された時に、その２つの信号は、質量分析法の高分解能に起因して区別することができる。それらの信号強度の比は、内部標準方法の定量化の基礎である。要約すると、現時点で質量分析法の定量精度を改善する唯一の方法は、通常は同位体内部標準と呼ばれる同位体類似物を内部標準として使用することである。
【０００５】
質量分析定量化の現在の問題は以下の通りである：同位体内部標準は、質量分析定量化の精度を約７０％から９５％を超えるまで高めることができ、これは、他の計器を用いて達成することができる精度と同等であるが、同位体内部標準合成のコストは非常に高い。現在、新薬開発での臨床試験の分析にこの方法を使用することに加えて、製剤工程での前臨床実験を含む他の殆どの用途は、合成に関する高い費用及び時間消費のためこの方法を使用することができない。これは、質量分析法技術の幅広い応用を大いに阻み、一方で同じく生物製剤工程を遅らせて、コストを増大させる。更に、内部標準を見出すのが困難であるという問題がなければ、質量分析法技術は、臨床試験、環境分析、及び食品安全性等々の分野でより大きい役割を演じることができる。
【０００６】
従って、従来技術は、依然として改善及び開発を必要とする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以上の従来技術の欠点を踏まえて、本発明の開示の目的は、従来の質量分析定量技術に存在する同位体内部標準の低い精度及び高いコストの問題を解決することを目指す質量分光定量分析のための疑似内部標準の方法及びデバイスを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の開示の技術的ソリューションは以下の通りである。
【０００９】
質量分光定量分析のための疑似内部標準の方法は、以下の段階を含む：
【００１０】
検査される試料のブランク基質を用いて異なる濃度の標準溶液を調製するために標準物質を計量し、次に、検査される試料のブランク基質を用いて１つから複数の濃度の内部標準溶液を調製するために同じ標準物質を計量する段階であって、内部標準系列が標準溶液と同じ濃度範囲及びスパンを有する、上記計量する段階、
【００１１】
異なる濃度の標準溶液及び内部標準溶液を標準試料及び内部標準試料まで試料処理段階を通じて処理する段階、
【００１２】
分析及び測定を実行するために標準試料及び内部標準試料をクロマトグラフ−質量分析システム内に注入する段階、
【００１３】
較正曲線を取得するために濃度に対して標準試料と内部標準試料の間の測定ピーク面積の比をプロットする段階、及び
【００１４】
未知試料を同じ試料処理段階によって処理し、次に、分析及び検出を実行するために標準試料分析と同じ段階を辿り、検出される試料及び内部標準をクロマトグラフ−質量分析システムに注入し、未知試料の濃度を判別するために、内部標準に対する試料のピーク面積比が次に較正曲線と比較される段階。
【００１５】
質量分光定量分析のための疑似内部標準の方法により、標準試料の注入の各完了の後に注入器を一時停止し、標準試料の測定を終えるのに必要とされる時間の後に、内部標準試料は、クロマトグラフ−質量分析システムのクロマトグラフカラムを通過するように注入され、標準試料と内部標準試料は、同じ検出サイクルで分離されて分析される。
【００１６】
質量分光定量分析のための疑似内部標準の方法により、内部標準試料は、標準試料の注入の各完了の後に注入され、内部標準試料は、クロマトグラフ−質量分析システムのクロマトグラフカラムを迂回しながら測定を実行する流れ注入方式で質量分析計に直接流入する。
【００１７】
質量分光定量分析のための疑似内部標準の方法により、標準試料の注入の各完了の後に、標準試料の濃度に最も近い濃度を有する内部標準試料が、標準試料のクロマトグラフピークが検出された後に注入され、内部標準試料は、クロマトグラフ−質量分析システムのクロマトグラフカラムを迂回しながら測定を実行する流れ注入方式で質量分析計に直接流入する。
【００１８】
質量分光定量分析のための疑似内部標準の方法により、内部標準試料が試料分析での移動相の流量よりも２０％低い流量で流れ注入によって注入される時に、注入中の噴霧ガスの流れは、６０Ｌ／分から７０から１００Ｌ／分まで増加される。
【００１９】
質量分光定量分析のための疑似内部標準のデバイスは、以下を含む：
【００２０】
クロマトグラフ移動相及び移動相搬送デバイス、
【００２１】
移動相搬送デバイスに接続された試料注入器、
【００２２】
試料注入器に接続されたクロマトグラフカラム、
【００２３】
クロマトグラフカラムに適合する移動相切換デバイス、
【００２４】
クロマトグラフカラムに接続された質量分析計、及び
【００２５】
疑似内部標準質量分析定量工程を実施するために上述のハードウエアを制御するように構成されたソフトウエアシステムを含み、
【００２６】
試料注入器は、注入針と、注入針に接続されて注入状態と試料装填状態との間で切り換えるように構成された注入弁とを含み、注入針と注入弁は、試料ループを通して接続される。
【００２７】
質量分光定量分析のための疑似内部標準のデバイスにより、移動相切換デバイスは、クロマトグラフカラムの前部と後部の両方に接続された２つの三方切換弁である。
【００２８】
質量分光定量分析のための疑似内部標準のデバイスにより、移動相切換デバイスは、クロマトグラフカラムに接続された四方切換弁である。
【００２９】
質量分光定量分析のための疑似内部標準のデバイスにより、移動相切換デバイスは、クロマトグラフカラムに接続された六方切換弁である。
【００３０】
質量分光定量分析のための疑似内部標準のデバイスにより、六方切換弁は、内部標準試料を注入するように構成された内部標準試料注入器内の六方注入弁である。
【００３１】
質量分光定量分析のための疑似内部標準のデバイスにより、デバイスは、四方切換弁に接続された内部標準試料注入デバイスを更に含む。内部標準試料注入デバイスは、四方切換弁に接続された内部標準試料注入器と、内部標準試料注入器に接続された第２の移動相搬送デバイスと、第２の移動相搬送デバイスに接続された第２の移動相格納デバイスとを含む。
【００３２】
疑似内部標準の上述のデバイスが血液試料検出に適用される上述の疑似内部標準のデバイスの使用。
【００３３】
有益な効果：本発明の開示は、質量分光定量分析を実行するための内部標準として分析される物質の標準物質を採用する。「内部標準」は、分析試料内に追加されず、代わりに、それは、質量分析計内に個別に導入される。具体的には、試料内の検体の信号が質量分析計に出現した後に、検体の既知量の標準物質が質量分析計内に内部標準として直ちに導入される。隣接する内部標準信号に対する測定検体信号の比が、較正曲線の縦座標として取られる。質量分析法イオン化条件の変化によって引き起こされる感度変化は、非常に短い時間間隔内では非常に小さいので、本発明の開示による定量方法によって達成される効果は、従来の内部標準方法のものと同様であり、イオン化効率の変化に起因する質量分析定量化の不正確性の問題は、実質的に排除することができる。本発明の開示は、同位体内部標準の使用なしで９５％よりも高い精度を達成することができ、本発明の開示はまた、質量分光定量分析の線形応答範囲を劇的に拡張する。これに加えて、本発明の開示の方法及びデバイスは、薬物が投与された後の患者の血液試料内の薬物の濃度を正確に測定し、それによって正確な薬物使用の目的を達成するように使用薬物が特定の患者に対して有効であるか否かを判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明の開示の第１の実施形態による概略図である。
【図２】本発明の開示の第１の実施形態による別の概略図である。
【図３】本発明の開示の第１の実施形態によるクロマトグラムの図である。
【図４】本発明の開示の第１の実施形態による開始時の標準曲線の図である。
【図５】本発明の開示の第１の実施形態による２時間後の標準曲線の図である。
【図６】本発明の開示の第２の実施形態によるクロマトグラムの図である。
【図７】本発明の開示の第２の実施形態による開始時の標準曲線の図である。
【図８】本発明の開示の第２の実施形態による２時間後の標準曲線の図である。
【図９】本発明の開示の第２の実施形態による六方切換弁の状態変動図である。
【図１０】本発明の開示の第２の実施形態による内部標準試料注入デバイスの状態変動図である。
【図１１】本発明の開示の第３の実施形態による概略図である。
【図１２】本発明の開示の第３の実施形態によるクロマトグラムの図である。
【図１３】本発明の開示の第３の実施形態による別の概略図である。
【図１４】本発明の開示の第３の実施形態による開始時の標準曲線の図である。
【図１５】本発明の開示の第３の実施形態による７時間後の標準曲線の図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明の開示は、質量分光定量分析のための疑似内部標準の方法及びデバイスを提供する。本発明の上述の目的、特徴、及び利点は、添付図面を参照して本発明の実施形態を詳細に説明することによって一層明らかになるであろう。本発明を具現化する特定の方法及びデバイスは、本発明の限定ではなく例示的に示されることを理解しなければならない。
【００３６】
実施形態による質量分光定量分析のための疑似内部標準の方法は、以下の段階を含む：
【００３７】
検査される試料のブランク基質を用いて異なる濃度の標準溶液を調製するために標準物質を計量し、次に、検査される試料のブランク基質を用いて１つから複数の濃度の内部標準溶液を調製するために同じ標準物質を計量する段階であって、内部標準系列が標準溶液と同じ濃度範囲及びスパンを有する、上記計量する段階、
【００３８】
異なる濃度の標準溶液及び内部標準溶液を標準試料及び内部標準試料まで試料処理段階を通じて処理する段階、
【００３９】
分析及び測定を実行するために標準試料及び内部標準試料をクロマトグラフ−質量分析システム内に注入する段階、
【００４０】
疑似内部標準の方法によって定量化される較正曲線を取得するために濃度に対して標準試料と内部標準試料の間の測定ピーク面積の比をプロットする段階、及び
【００４１】
試料処理段階によって未知試料を処理した後に、分析及び測定を実行するために未知試料をクロマトグラフ−質量分析システム内に注入し、次に、未知試料の濃度を判別するために、検査された信号のピーク面積を較正曲線と比較する段階。
【００４２】
特定の実施工程中に、標準試料の注入の各完了の後に、注入を一時停止することができ（標準試料信号がその後の内部標準試料信号と重ならないことを保証するために標準試料の測定が完了するのに必要とされる時間、例えば、３０ｓの後に）、次に、内部標準試料が、クロマトグラフ−質量分析システムのクロマトグラフカラムを通過するように注入される。従って、標準試料と内部標準試料は分離され、同じ検出サイクル内で分析される。これに代えて、内部標準試料は、標準試料の注入の各完了の後に更に注入され、内部標準試料は、クロマトグラフカラムを迂回しながら測定を実行する流量注入方式で質量分析計に直接流入する。これに代えて、標準試料の注入の各完了の後に、標準試料の濃度に最も近い濃度を有する内部標準試料が、標準試料のクロマトグラフピークが検出された後に注入され、内部標準試料は、クロマトグラフカラムを迂回しながら検査する流れ注入方式で質量分析計に直接流入することになる。この原理は、得られる内部標準試料信号が、重なりなしで標準試料信号に可能な限り近いということである。
【００４３】
内部標準試料の注入中に、注入の流量が２０％だけ低減されるか、又は注入中の噴霧ガスの流量が６０Ｌ／分から７０から１００Ｌ／分（好ましくは、８０Ｌ／分）まで増加される。同じ濃度において、カラム前注入はカラム後注入よりも高い感度を有する。これは、主として噴霧効率の変化によって引き起こされる。この目的のために、感度差を排除する目的を達成することができるように噴霧状態を調節することによってカラム後注入の噴霧効果を高めることができる。特定の手法は、一方で、カラム後注入の流量を低減して噴霧をより効率的にすることであり、約２０％だけ流量を低減することによってそのような感度差を排除することができ、他方で、噴霧ガスの流量を６０Ｌ／分から７０から１００Ｌ／分まで増加することであり、それによってこの差を５％未満に低減することができる。
【００４４】
質量分光定量分析のための疑似内部標準のデバイスを実施形態に従って更に提供し、これは、以下を含む：
【００４５】
クロマトグラフ移動相及び移動相搬送デバイス、
【００４６】
移動相搬送デバイスに接続された試料注入器、
【００４７】
試料注入器に接続されたクロマトグラフカラム、
【００４８】
クロマトグラフカラムに適合する移動相切換デバイス、
【００４９】
クロマトグラフカラムに接続された質量分析計、及び
【００５０】
疑似内部標準質量分析定量工程を実施するために上述のハードウエアを制御するように構成されたソフトウエアシステム。
【００５１】
試料注入器は、注入針と、注入針に接続されて試料装填状態と試料注入状態の間で切り換えるように構成された注入弁とを含み、注入針と注入弁は、試料ループを通して接続される。
【００５２】
質量分光定量分析のための疑似内部標準のデバイスでは、移動相切換デバイスは、クロマトグラフカラムの前部と後部の両方に接続された２つの三方切換弁である。
【００５３】
質量分光定量分析のための疑似内部標準のデバイスでは、移動相切換デバイスは、クロマトグラフカラムに接続された四方切換弁である。
【００５４】
質量分光定量分析のための疑似内部標準のデバイスでは、移動相切換デバイスは、クロマトグラフカラムに接続された六方切換弁である。
【００５５】
質量分光定量分析のための疑似内部標準のデバイスでは、六方切換弁は、内部標準試料を注入するように構成された内部標準試料注入器内の六方注入弁である。
【００５６】
質量分光定量分析のための疑似内部標準のデバイスは、四方切換弁に接続された内部標準試料注入デバイスを更に含む。内部標準試料注入デバイスは、四方切換弁に接続された内部標準試料注入器と、内部標準試料注入器に接続された第２の移動相搬送デバイスと、第２の移動相搬送デバイスに接続された第２の移動相格納デバイスとを含む。
【００５７】
上述の疑似内部標準のデバイスの使用を実施形態に従って更に提供する。疑似内部標準のデバイスは、血液試料検出に適用される。
【００５８】
以下では、本発明の開示を特定の実施形態を通して詳細に説明する。
【００５９】
実施形態１：カラム前内部標準注入
【００６０】
標準物質をメタノールを溶媒として用いて計量し、０．２５０μｇ／ｍＬ、０．５００μｇ／ｍＬ、１．００μｇ／ｍＬ、２．００μｇ／ｍＬ、５．００μｇ／ｍＬ、８．００μｇ／ｍＬ、及び１０．０μｇ／ｍＬという７つの濃度の標準溶液を調製し、次に、標準物質を計量して２．５０μｇ／ｍＬの標準溶液を内部標準として調製した。標準試料の調製に関して、５０ｕＬの上記標準溶液（７つの濃度）を計量し、５０ｕＬのヒト血清中に追加して混合し、次に、１００ｕＬのメタノール（低温）を追加して攪拌器上で５分間攪拌した。こうして血清中の蛋白質を析出させ、遠心分離により上清を取得し、それをクロマトグラフ−質量分析システム内に注入して分析及び測定を実行した。図示の実施形態に対して用いたハードウエアは、通例のＬＣ／ＭＳ（液体クロマトグラフ質量分析法）と実質的に同じである。しかし、標準試料（異なる濃度の標準溶液）の各注入完了後に試料注入を一時停止することができ、次に、内部標準が注入されるように、試料注入を制御するための制御ソフトウエアをシステムに追加することが必要である。標準試料と内部標準試料を分離し、これらの試料は、内部標準試料を標準試料よりも後にシステム内に導入したことを除き、同じ検出サイクルで分析した。分析法の実行中に内部標準試料注入の遅延時間を判別した。クロマトグラフ分離状態が最適化された後に、検体信号の基準線幅が測定される限り、待ち時間を基準線幅よりも若干長めに設定した。重要なことは、後に注入される標準試料が発生させる信号が先に注入された試料の信号と重ならないことである。
【００６１】
図１を参照して、その作業工程は以下の通りである：１）最初に試料注入器２００内の注入針２１０をロボットハンド（図示せず）によって駆動して試料溶液（図示せず）中に挿入し、その直後に注入針２１０に直接に接続された試料注入器２００内の針ポンプ（図示せず）を起動した。標準試料を注入針２１０によって定量的に吸引し、図示の実施形態では５ｕＬの標準試料を吸引した。同時に、注入弁２３０を試料追加状態に切り換えた。次に、試料採取した注入針２１０を、注入弁２３０に接続された注入ポート２２０内にロボットハンドによって挿入した。針ポンプは、即座に針内の標準試料を試料ループ２４０内に注入ポート２２０を通して押し込み、試料ループ２４０内の元の液体を廃液中に押し込んだ。この工程を「試料装填」又は「試料追加」と呼ぶ。２）試料追加が完了した後に、注入弁を即座に試料注入状態に切り換えた（図１に点線の円に示すように）。この時点で、試料が装填された試料ループ２４０は、その一端で高圧液相ポンプ１００と連通しており、他端ではクロマトグラフカラム３００と連通している。同時に、移動相格納デバイス４００内の溶媒（移動相）を高圧液相ポンプ１００によって試料ループ２４０を通して搬送し、試料ループ２４０内の標準試料をクロマトグラフカラム３００に供給した。この工程は試料注入工程であり、試料追加と試料注入との組合せ工程を一般的に「注入」と呼ぶ。３）標準試料をこの注入工程によってクロマトグラフカラム３００に供給し、標準試料内の各化学成分が、クロマトグラフカラム３００内の充填材と相互作用して吸着を発生させた。吸着状態にある成分が連続的に溶出されて脱離が発生するように、高圧液相ポンプ１００の押圧下で移動相がクロマトグラフカラム３００を絶えず洗い流した。各試料成分は、クロマトグラフカラム３００の固定相と移動相の間で吸着−脱離を繰り返し受けたが、各試料成分は、クロマトグラフカラム３００の出口方向に向けて移動するように移動相によって常に駆動されている。移動速度は、移動相と固定相の間の物質の分配係数に関連するので、最終的に標準試料内の成分は、これらの成分の異なる分配係数に起因して順次クロマトグラフカラムから流れ出し、互いに分離された。４）分離された標準試料成分は、イオン化を実行するために質量分析計のイオン源に連続して流入し、発生したイオンを質量分析計５００によって分離し、その後に、１つずつ測定した。定量分析を実行するときに、質量分析計５００を検体及びその内部標準が発生させるイオンのみをモニタし、他のイオンは無視するように設定した。このようにして、検査信号の積分時間を増大させることができ、それによって検査感度が高まり、検体の信号に対する他の物質が発生させるイオンの干渉を排除することができる。
【００６２】
一般的に、試料がシステム内に注入された直後にデータ取得を含む試料分析サイクルが開始される。試料注入器２００は分析サイクルの開始前にしか作動せず、このサイクルを通して自己洗浄以外の役割はない。図示の実施形態では、各標準試料を注入した後の約０．５分後に２．５μｇ／ｍＬの内部標準試料を５ｕＬ更に注入した。この時点で、標準試料の分析サイクルは依然として実行中にあり、この内部標準試料注入は、試料注入器２００に、完全な注入工程のみを再度実施させ、これは新しい試料分析サイクルを開始させなかった。こうして試料のクロマトグラフデータは、図３に示すように（標準試料）試料ピークと（内部標準試料）内部標準ピークとを含む。試料ピークと内部標準ピークの間の完全な分離及び緊密近接性が、標準試料と内部標準試料の間の注入時間ギャップを判別するための基本原理である。特定の注入時間ギャップは、計器状態及び信号幅とを組合せて、この原理に従って完全に決定される。
【００６３】
図示の実施形態では、質量分析計の感度の経時的な変化を示すために、試料の分析を１０回繰り返し、約２時間の時間スパンで１０本の較正曲線を取得した。図４及び図５は、それぞれ１回目（開始時）及び１０回目（２時間後）の較正曲線のグラフである。検体は標準試料である。
【００６４】
図４及び図５では、下側の曲線（正方形マーク）が、内部標準を用いない場合に濃度に対してピーク面積をプロットした結果であり、上側の曲線（プリズム形マーク）が、内部標準を用いた後の標準試料と内部標準試料の両方のピーク面積の比をプロットした結果である。これら２つのグラフから分るように、内部標準を用いない場合の較正曲線の感度は、イオン化効率の経時変化に起因して前後で大きく変化する。２つのグラフの座標値は同じである。内部標準を用いない場合の較正曲線の最大応答値（ピーク面積）は約１４０万から１１０万以下に低下し、これは２１．４％の変化であり、一方、内部標準を追加した後の較正曲線の変化率は４．０％に過ぎない。疑似内部標準の役割は、上記２つの較正曲線によって視覚化されている。
【００６５】
実施形態２：カラム後内部標準注入
【００６６】
例示する実施形態に対して用いた溶液は、内部標準試料をクロマトグラフカラムを通さずに質量分析計内に直接注入した点を除いて、実施形態１のものと正確に同じものであった。質量分析法によって定量化した較正曲線は１０倍濃度範囲で既に湾曲し、線形範囲は小さかった。内部標準のカラム後注入は、試料信号ピークが出現した後に信号ピークのサイズに則して内部標準の注入量を一時的に調節することができ、それによって計器の非線形応答が補正される。図示の実施形態では、下記の表１に示すように３つの内部標準濃度を用いた。
【００６７】
【表１】
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【００６８】
図示の実施形態に対して用いた計器は、クロマトグラフ−質量分析システムの別のセットであり、修正が加えられていた。図示の実施形態の制御ソフトウエアは、システムのデータをリアルタイムで読み取り、リアルタイムデータに従ってシステム内の試料注入器２００及び外部弁の作動を制御するようにインストールしたものであった。ハードウエアに関しては、元のＬＣ／ＭＳシステムに流れ注入通路を追加した。具体的には、図１を参照して、２つの三方切換弁３１０だけをシステム内に追加した。２つの切換弁３１０は常に同期して作用し、両方共に上側位置に切り換えられた時に計器が典型的なＬＣ／ＭＳシステムであり、両方共に下側位置に切り換えられた時にシステムが今度は流れ注入分析（ＦＩＡ）システムになるという２つの可能な状態の一方をもたらす。切換弁３１０は、試料分析中には上側位置に設定される。この実施形態では、標準試料を試料注入器２００によって注入し、次に、分離のためクロマトグラフカラム３００内に高圧液相ポンプ１００によって給送し、この場合に、標準試料は、カラム３００の前の三方切換弁３１０、次にカラム３００、更にカラム３００の後の三方切換弁３１０を通過し、最終的に質量分析計に入った。この工程中に、制御ソフトウエアは、検体（標準試料）の質量分析信号を常にモニタし、注入完了後に注入弁２３０を試料装填位置に切り換えるように試料注入器２００を制御した。試料ピークが出現すると、制御ソフトウエアは、ピーク面積／高さを計算し、この計算に基づいて内部標準試料を選択し、その直後に、注入が計算したものとほぼ同じピーク面積／高さを有するピークを生成するように、選択された内部標準を計算された量で注入するように注入器２００に指示する。その一方、注入弁２３０を試料注入状態に切り換え、そして２つの三方切換弁３１０を下側位置に同時に切り換えて、内部標準試料がクロマトグラフカラム３００を迂回して質量分析計に直接流入するようにした。図６に示すように、得られたデータは、実施形態１と実質的に同じである。図１の２つの三方切換弁３１０は、図２に示すように接続された四方切換弁３８０で置換することができる。上記段階で２つの三方切換弁３１０を切り換える時に、四方切換弁３８０は、クロマトグラフカラム３００が短絡されるように切り換えられ、移動相は、クロマトグラフカラム３００を通過することなく質量分析計に直接流入し、得られる効果は上述の工程と同じである。
【００６９】
図示の実施形態での質量分析計の感度の経時変化を示すために、試料の分析を１０回繰り返し、約２時間の時間スパンで１０本の較正曲線を取得した。図７及び図８は、それぞれ１回目（開始時）及び１０回目（２時間後）の較正曲線のグラフである。
【００７０】
内部標準通路は、上記２つの三方切換弁３１０の代わりに図９に示すように接続された六方切換弁を使用することができる。
【００７１】
六方切換弁を使用する利点は、１つの弁しか制御する必要がなく、それによってハードウエアの故障又はソフトウエア誤作動に起因するパイプライン閉塞を回避することができる点である。２つの三方切換弁３１０が同期して切り換えられない場合に移動相はブロックされることになり、システムは過圧されることになる。六方切換弁の使用は同期切り換えを必要とせず、従って、システム過圧問題を引き起こさない。三方切換弁を使用する先の場合と同様に、図９の状態Ａは、クロマトグラフカラム３００を通して試料を分離し、次に、検出されるように質量分析計に供給する試料分析に向けて構成される。六方切換弁は、制御ソフトウエアが試料ピークの出現を見出すまでＢ状態に切り換えられず、次に、試料注入器２００が、適正内部標準試料を注入するように指示される。Ｂ状態では、注入された内部標準試料は、六方切換弁を通過することなく移動相によって質量分析計に直接供給されて検出されることになる。
【００７２】
計器市場には多くの銘柄の試料注入器が存在するので、ソフトウエア開発中に様々な試料注入器を制御するための駆動プログラムを制作するという重複する手間を避けるために、図１０に示す内部標準試料注入デバイスは、上述の実施形態に従って更に設計される。このシステムは、内部標準を用いて試料検査中に計器の変化を排除し、計器の非線形応答を補正するためにクロマトグラフカラム３００の後に内部標準を導入するように特化して構成された流れ注入システムである。この流れ注入システムは、四方切換弁９００による上記システムと協働するように組み合わされる。その作動機構は以下の通りである。１）内部標準をデバイス内の内部標準試料注入器６００によって質量分析計に至るパイプライン内に導入する。２）液相ポンプ（第２の移動相搬送デバイス７００）が、移動相を移動相格納デバイス（すなわち、第２の移動相格納デバイス８００）から内部標準試料注入器６００内に、更にパイプラインに沿って質量分析計５００内に給送する。３）質量分析計５００は内部標準を検出し、クロマトグラフピークとほぼ同じ強度を有する信号を与える。質量分析計が液体クロマトグラムに接続される場合に、移動相は、イオン化を促進することができる溶媒又は緩衝溶液を用いなければならない。
【００７３】
制御ソフトウエアは、デバイス全体の作動を制御した。試料の分離及び分析は、通例のクロマトグラフ−質量分析システムによって実行された。試料分析中に、制御ソフトウエアが、検体（試料）の質量分析信号を絶えずモニタした。検体（試料）の信号が見出された状態で、ソフトウエアは、信号強度に則して内部標準を選択し、次に、選択した内部標準を装填するように内部標準試料注入器６００に指示した。検体の信号ピークが完了した後に、ソフトウエアは、デバイス内の四方切換弁９００を図１０のＢ状態に即座に切り換え、次に、試料を注入するように内部標準試料注入器６００に指示した。同時に、内部標準を第２の移動相によって質量分析計５００に給送するように第２の移動相搬送デバイスを起動した。デバイス全体は、検体の信号が完全に出現する前にはＡ状態（使用に向けて準備が整った状態）にあった。内部標準流れ注入工程が完了した後に、四方切換弁９００は、図１０のＡ状態に即座に切り換えて戻され待機した。試料分析システムに関しては、内部標準試料注入デバイスは全く介入せず、背後で全く静かに作動する。
【００７４】
内部標準のカラム後導入の最大の利点は、内部標準試料が発生させる信号ピークのサイズが、試料が発生させる信号ピークのサイズに近いように内部標準試料の注入量を試料の信号強度に従って即座に決定することができる点である。そのような動的制御により、図示の実施形態は、イオン化効率のドリフトを補償することによって分析結果の精度を改善することだけではなく、質量分析定量化の線形応答範囲を１０倍よりも大きく又は数万倍にまでも拡張することができる。
【００７５】
実施形態３：動的内部標準試料注入
【００７６】
図示の実施形態は、ＬＣ／ＭＳシステムを制御すること及びそれ自体でデータを取得することの両方を行い、更に同時に図１０に示す内部標準試料注入デバイスを全てのハードウエアが完全な分析システムを形成するように制御することができる。図１１はシステムの概略図である。試料分析工程は以下の通りである。１）標準試料を試料注入器２００によって分析パイプライン内に導入した。２）分離のため試料をクロマトグラフカラム３００に給送するために高圧液体ポンプ１００が移動相格納デバイス４００内の移動相を絶えず搬送し、試料が質量分析計５００に供給されて検出された。３）質量分析計５００が、試料注入後に信号を常時取得した。４）検体のクロマトグラムピークが出現した直後に、内部標準注入部分を起動した。この時点で、四方切換弁９００は、試料通路が廃液につながり、内部標準通路が質量分析計５００に接続されるように切り換えられた。内部標準試料は、内部標準試料注入デバイスを通って質量分析計に流入して検出され、試料ピークの出現の後に内部標準ピークが出現した。
【００７７】
このシステムを用いて、最初に０．０１００μｇ／ｍＬ、０．０５００μｇ／ｍＬ、０．１００μｇ／ｍＬ、１．００μｇ／ｍＬ、２．００μｇ／ｍＬ、５．００μｇ／ｍＬ、１０．０μｇ／ｍＬ、２０．０μｇ／ｍＬ、５０．０μｇ／ｍＬ、及び１００μｇ／ｍＬという１００倍の濃度差を有する２系列のヒト血清試料を標準試料を用いて並行して調製した。各試料を５０ｕＬの血清試料を分注し、血清中の蛋白質を析出させるために２００ｕＬのメタノール（低温）を追加し、更に遠心分離後に上清をバイアル内に移すことによって調製した。一方の系列の調製された標準試料を試料注入器２００内に入れ、他方の系列を内部標準試料として内部標準試料注入器６００内に入れた。標準試料を上記分析工程によって１回の注入当たり５ｕＬで分析した。試料ピークの信号が出現した直後に、システム内の四方切換弁９００を内部標準注入位置に切り換えた。同時にソフトウエアが、試料ピークに対応する大体の濃度を計算した。次に、内部標準試料注入器６００が、最も近い濃度を有する５ｕＬの内部標準試料を注入した。流れ注入のパイプラインは短く、パイプラインの内径は非常に小さいので、内部標準ピークを質量分析計内に試料ピークの出現後の非常に短い時間内に導入することができる。試料ピークと内部標準ピークの間の間隔が短い程、内部標準の補正効果は高い。しかし、質量分析計のイオン化効率が瞬時に変更されることはなく、１分程度の時間範囲の変動の振幅は、一般的に無視することができる。従って、内部標準の注入時間を高精度で制御する必要はなく、数秒範囲の精度で十分である。
【００７８】
図示の実施形態は、複数の試料によって分析されるクロマトグラフデータが同じデータファイルに格納され、時間軸が連続状態に留まるように制御するのにソフトウエアを用いた。質量分析計の感度の経時変化を検査するために、これらの試料系列の検査を１０回繰り返し、更に各回の間に１５分の間隔を追加した。合計時間は、ほぼ７時間であった。得られたクロマトグラムを図１２に示している。
【００７９】
この実施工程では、内部標準の各選択において誤差は発生しなかった。言い換えれば、各回にソフトウエアが、内部標準注入のため、どの内部標準試料を使用すべきかを正確に計算した。しかし、得られた結果から分るように、内部標準試料と標準試料とは正確に同じ濃度を有し、同じ流量を用いているが、得られた内部標準ピークは試料ピークよりも約２０％低い。言い換えれば、質量分析計は、クロマトグラフカラムを通過する試料に対して直接注入によって導入されるものよりも高い信号応答を与える。同じ実験を同じ試料を用いてガスクロマトグラフ−質量分析システム上で実行したが、そのような問題は発生しなかった。これに加えて、図示の実施形態は、カラム圧が高く（約１００ＭＰａ）、クロマトグラフカラムを通過する液体のカラム前流量が液体体積の圧縮に起因して低減されるので、カラム後流量が体積の膨張に起因して増大することになることを例示している。しかし、全体的な流量は変化しない。それによって質量分析計に流入するときに流れ注入のものよりも高い線速度がもたらされる。図示の実施形態では電気噴霧イオン化源が使用されるので、噴霧効果が優れており、イオン化効率が高く、得られる質量分析信号が強い。液体が噴霧ポートから出てくるときの線速度が高い程、噴霧効果は優れている。従って、上述のカラム後流れ注入によって内部標準を導入する方法は、試料分析中にクロマトグラフ逆圧の変化によって引き起こされる信号強度の変化を補償することにはならないことを見ることができる。しかし、上述のシステムは、試料ストリームが廃棄物内に迂回されている間に内部標準が質量分析計内に導入されるので、分析ピークの背後で出現するいかなる干渉も内部標準ピークに影響を及ぼすことにはならないという優れた利点を有する。
【００８０】
図示の実施形態では、内部標準ピークが試料ピークよりも低いという上述の問題を首尾良く解決することができるように、内部標準試料を溶媒中にクロマトグラフカラム３００の背後で直接導入するために図１３に示すシステムを用いた。図示の実施形態によるシステムの作動工程は、上述のシステムと実質的に同じであった。相違点は、内部標準試料注入器６００の試料弁を分析パイプラインに直接に接続したこと、及び内部標準試料注入器６００の六方切換弁を上述の四方切換弁の切り換え時に試料注入位置に切り換えたことである。すなわち、同じ線速度を達成するように分析移動相によって内部標準試料を駆動し、内部標準試料は質量分析計内に流入し、得られた信号強度は同じであった。
【００８１】
図示の実施形態では、試料分析を１０回繰り返し、約７時間の時間スパンで１０本の較正曲線を取得した。図１４及び図１５は、それぞれ１回目（開始時）及び１０回目（７時間後）の較正曲線のグラフである。
【００８２】
これらの図から、内部標準が不在の場合に、較正曲線は、取得データを表すのに２次フィッティング曲線しか使用することができないことが明確に分る。これに加えて、適合の程度は理想的ではなく、当て嵌め係数Ｒ2は小数点の後に２つの９のみを有する。特に、開始時点で収集されたデータと７時間の時点で収集されたデータとを比較すると、当て嵌め関数の係数は有意に異なり、形状はこの差を明確に示している。図示の実施形態による動的内部標準注入法を用いた後に、内部標準試料は、標準試料信号の変動をほぼ完全に補正し、同時に計器の非線形応答の問題が完全に解決され、計器の線形応答範囲が大幅に拡張される。内部標準を用いた後の較正曲線はほぼ理想的な直線である。Ｒ値は、小数点の後に４つの９を有し、理想値は１である。更に、直線の傾きは１０００分の１よりも小さく変化する。傾きは感度を表し、感度の変化は、不正確な結果をもたらす中心的要因である。内部標準が使用されない場合に、分析感度は、時間と共に変化するだけではなく、濃度によっても変化する。内部標準を用いない場合は１０倍の濃度範囲のみを有する較正曲線（実施形態１及び２に示す）であっても湾曲する。実施形態１及び２は、質量分析計の感度が２時間で１４％だけ低下することを更に示しており、それに対して実施形態３は、７時間後に２５．４％だけ増大している。検出での感度変化は様々な不確実性によって引き起こされる可能性が高く、経時的な変化の方向を予想することができないことが見てとれる。図示の実施形態による内部標準方法の使用は、これらの変化する要因を非常に効果的に補償することができ、内部標準を探す労力は、検査される物質の標準物質を内部標準として直接使用することによって大きく軽減することができる。特に薬物分析に関して、本発明の開示は、同位体内部標準の使用を回避し、それによって多大なコストを低減して薬物の臨床試験の進歩を加速することができる。
【００８３】
本発明の開示は、特に血液試料内の薬物の濃度の分析に適し、取りわけ、薬物−時間曲線の確立に適している。薬物投与又は薬物開発においては、患者又は被験者から薬物投与後の時間経過に伴って血液試料が抜き取られる。血液試料が検査された後に、各血液試料内の薬物の濃度が時間に対してプロットされ、そのようなグラフは薬物−時間曲線と呼ばれる。本発明の開示の３つの実施形態では、全ての試料処理及び試料分析を血液試料分析の仕様に従って実行された。臨床薬物検出の分野での質量分析定量化の用途の開発も本発明の主な目的である。
【００８４】
本明細書では本発明を特定の実施形態を参照して例示して説明したが、本発明は、図示した詳細に限定されるように意図していない。むしろ、特許請求の範囲の均等物の領域及び範囲内でかつ本発明から逸脱説明ことなく様々な修正をこれらの詳細に加えることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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