(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも
ナノ粒子である固体担体、
タンパク質
及び
タンパク質型化合物
から選択される
機能性成分であって、タンパク質及びタンパク質型化合物から選択される機能性成分が  酵素又は酵素型化合物である機能性成分
並びに
機能性成分を少なくとも部分的に埋め込むことにより、
機能性成分を保護するための保護層
並びに
酵素又は酵素型化合物を固体担体の表面に結合させるための少なくとも１つの二官能性  架橋剤
を含む
組成物を製造する方法であって、
最初に
少なくとも１つの機能性成分を固体担体の表面上に固定化し、
次いで、
機能性成分を
少なくとも部分的に
埋め込むこと
により
機能性成分を保護するための
保護層を、
その少なくとも一部が
相互に
及び
固定化機能性成分
と相互作用すること
ができるモノマーである
構築ブロックを用いて
構築する
工程を含み、構築ブロックが、水性条件下でのシリカ前駆体の重縮合による保護層を構築し、シリカ前駆体がトリアルコキシシラン及びテトラアルコキシシランであり、該方法が、所望の厚さを有する好ましい保護層を得るために、構築ブロックを用いて保護層を構築するための保護物質の自己集合反応を、特定の反応時間間隔の後に停止する工程をさらに含み、
保護層の厚さが１ｎｍ−２５ｎｍの範囲にあり、少なくとも１つの機能性成分の長軸の  長さの５０％−１５０％である
方法。
【請求項２】
用いるモノマーが固体担体の表面とさらに相互作用することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
機能性成分を
固体担体の表面上に
固定化する前に、
固体担体を修飾して
表面上の
機能性成分の固定化を改善する、
請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
機能性成分の固定化を改善するために表面領域の一部のみが修飾されるが、他の部分が修飾されていないままであり、モノマーが担体表面の修飾されていない部分と結合相互作用することができる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
機能性成分が担体表面上にランダム配向で固定化される、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
組成物が
アダプター分子、
アンカー分子、
足場分子
及び／又は
受容体分子
の群から選択される少なくとも１種の機能性分子をさらに含む、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
機能性成分を保護するための保護層が少なくとも１種の機能性分子をも埋め込んでいるように
アダプター分子、
アンカー分子、
足場分子
及び／又は
受容体分子
の群から選択される少なくとも１種の機能性分子とさらに相互作用することができるようなモノマー構築ブロックが選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
層が多孔性層として構築される、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
有機シランモノマーを、機能性成分を少なくとも部分的に埋め込む保護層を構築するための構築ブロックとして用いる、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
アルコール、
アミン、
カルボキシレート
芳香族官能基、
チオール、
チオエーテル、
グアニジニウム、
イミダゾール、
脂肪族鎖、
アミド
及び／又はフェノール
から選択される
固定化機能性成分と相互作用する
少なくとも１つの官能基、
特に
弱い力の相互作用により
タンパク質又はタンパク質型化合物の
表面に存在するアミノ酸の
１つ又は複数のアミノ酸側鎖と
相互作用する
官能基
を有する
有機シランモノマー、
特に
テトラオルトシリケート、
からなる群から選択され、
そして特に
ベンジルトリエトキシシラン、
プロピルトリエトキシシラン、
イソブチルトリエトキシシラン、
ｎ−オクチルトリエトキシシラン、
ヒドロキシメチルトリエトキシシラン、
ビス（２−ヒドロキシエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、
アミノプロピルトリエトキシシラン、
ウレイドプロピルトリエトキシシラン、
（Ｎ−アセチルグリシル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン
から選択され、
及び／又は
ベンジルトリメトキシシラン、
プロピルトリメトキシシラン、
イソブチルトリメトキシシラン、
ｎ−オクチルトリメトキシシラン、
ヒドロキシメチルトリメトキシシラン、
ビス（２−ヒドロキシエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、
アミノプロピルトリメトキシシラン、
ウレイドプロピルトリメトキシシラン
（Ｎ−アセチルグリシル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン
から選択され、
及び／又は
ベンジルトリヒドロキシエトキシシラン、
プロピルトリヒドロキシエトキシシラン、
イソブチルトリヒドロキシエトキシシラン、
ｎ−オクチルトリヒドロキシエトキシシラン、
ヒドロキシメチルトリヒドロキシエトキシシラン、
ビス（２−ヒドロキシエチル）−３−アミノプロピルトリヒドロキシエトキシシラン、
アミノプロピルトリヒドロキシエトキシシラン、
ウレイドプロピルトリヒドロキシエトキシシラン
（Ｎ−アセチルグリシル）−３−アミノプロピルトリヒドロキシメトキシシラン
から選択される
有機シランモノマーが用いられる、
請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
複数の異なる有機シランモノマーが用いられる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つの機能性成分について、
Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、
Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ
からなる群から選択される
少なくとも数種の
表面アミノ酸
のそれぞれの量が
決定され、
決定に従って
複数の異なる有機シランモノマーが用いられる、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ナノ粒子である固体担体、
タンパク質
及び
タンパク質型化合物
から選択される
機能性成分であって、タンパク質及びタンパク質型化合物から選択される機能性成分    が酵素又は酵素型化合物である少なくとも１つの機能性成分、
酵素又は酵素型化合物を固体担体の表面に結合させるための少なくとも１つの二官能性  架橋剤、を含み、
酵素又は酵素型化合物が固体担体の表面に固定化され、
並びに
機能性成分を少なくとも部分的に埋め込むことにより
機能性成分を保護するための保護層
を含む組成物であって、
機能性成分を保護するための保護層が
構築ブロック
により構築された
層であり、
そのモノマーが
相互に
及び
固定化機能性成分
と相互作用することができ、構築ブロックが、水性条件下でのシリカ前駆体の重縮合による保護層を構築し、シリカ前駆体がトリアルコキシシラン及びテトラアルコキシシランであり、
保護層の厚さが１ｎｍ−２５ｎｍの範囲にあり、少なくとも１つの機能性成分の長軸の  長さの５０％−１５０％である
組成物。
【請求項１４】
固体担体がナノ粒子、
特に、
有機ナノ粒子、
無機ナノ粒子、
有機−無機複合ナノ粒子、
自己集合有機ナノ粒子、
メソ多孔性シリカナノ粒子（ＳＮＰ）、
金ナノ粒子、
チタンナノ粒子
の群から選択されるナノ粒子である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
担体が
特に、最大１００μｍ、好ましくは
２０−１０００ｎｍ、
特に２００−５００ｎｍ、
特に３００−４００ｎｍの範囲の
粒径を有する粒子状担体である、請求項１３又は１４に記載の組成物。
【請求項１６】
保護層の厚さが
１−１００ｎｍ、
１ｎｍ−５０ｎｍ、
１ｎｍ−３０ｎｍ、
１ｎｍ−２５ｎｍ、
１ｎｍ−２０ｎｍ、
１ｎｍ−１５ｎｍ、
好ましくは５ｎｍ−１５ｎｍの
範囲にある、請求項１３から１５の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
保護層の厚さが
長軸の長さの少なくとも３０％であり、層が多孔性である、
請求項１３から１６の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
細孔径が
１ｎｍ−１０ｎｍ、
特に２ｎｍ−９ｎｍ、
特に３ｎｍ−８ｎｍ、
特に４ｎｍ−７ｎｍ、
特に４ｎｍ−６ｎｍ、
特に４ｎｍ−５ｎｍである、
請求項１３から１７の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
組成物の使用中にそれとの相互作用のために機能性成分への分子の拡散を可能にするように細孔径が寸法化されている、
請求項１３から１８の何れか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
固体担体の表面への
少なくとも１つの機能性成分の
固定化結合
が共有結合である、
請求項１３から１９の何れか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
少なくとも１つの機能性成分を結合させるための
少なくとも１つの
二官能性架橋剤が、
アミンをスルフヒドリル（チオール）官能基に架橋結合させるための架橋剤
及び／又は
スルフヒドリルをスルフヒドリル（チオール）官能基に架橋結合させるための架橋剤、
及び／又は
グルタルアルデヒド、
酒石酸ジスクシンイミジル、
スベリン酸ビス［スルホスクシンイミジル］、
エチレングリコールビス（コハク酸スルホスクシンイミジル）、
アジプイミド酸ジメチル、
ピメルイミド酸ジメチル、
アミノ安息香酸スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）、
１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、
活性化スルフヒドリル（スルフヒドリル反応性２−ピリジルジチオ）、
ＢＳＯＣＯＥＳ（ビス［２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン）、
ＤＳＰ（ジチオビス［プロピオン酸スクシンイミジル］）、
ＤＴＳＳＰ（３，３’−ジチオビス［プロピオン酸スルホスクシンイミジル］）、
ＤＴＢＰ（ジメチル３，３’−ジチオビスプロピオンイミデート・２ＨＣｌ）、
ＤＳＴ（酒石酸ジスクシンイミジル）、
スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ（４−スルホスクシンイミジル−６−メチル−ａ−（２−ピリジルジチオ）トルアミド）ヘキサノエート））、
ＳＰＤＰ（３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル）、
ＬＣ−ＳＰＤＰ（スクシンイミジル６−（３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド）ヘキサノエート）、
ＳＭＰＴ（４−スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル−ａ−［２−ピリジルジチオ］トルエン）、
ＤＰＤＰＢ（１，４−ジ−［３’−（２’−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ブタン）、
ＤＴＭＥ（ジチオ−ビスマレイミドエタン）、
ＢＭＤＢ（１，４ビスマレイミジル−２，３−ジヒドロオキシブタン）
からなる群から選択される二官能性架橋剤である、
請求項１３から２０の何れか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
保護層のモノマー構築ブロック
と
固定化機能性成分と
の間の相互作用が
特に、弱い力の相互作用に基づいて
タンパク質又はタンパク質型化合物のアミノ酸側鎖間で生じる、
請求項１３から２１の何れか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
異なる構築ブロックが異なる機能性部分及び／又は異なるアミノ酸側鎖と相互作用するように複数の異なる構築ブロックが供給される、
請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
固定化された少なくとも１つのタンパク質又はタンパク質型化合物と相互作用する
保護物質の官能基が
アルコール、
アミン、
カルボキシレート、
芳香族官能基、
チオール、
チオエーテル、
グアニジニウム、
イミダゾール、
脂肪族鎖、
アミド
及び／又はフェノール
のうちの１つである、
請求項１３から２３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
有機シランモノマーが機能性成分を少なくとも部分的に埋め込む保護層を構築するための構築ブロックとして用いられる、請求項１３から２４の何れか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
タンパク質
及び
タンパク質型化合物
から選択される
前記機能性成分
が
オキシドレダクターゼ、
トランスフェラーゼ、
ヒドロラーゼ、
リアーゼ、
イソメラーゼ
及び／又はリガーゼ
からなる群から選択される
酵素又は酵素型化合物である、
請求項１３から２５の何れか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
触媒工程における請求項１３から２６の何れか一項に記載の組成物の使用。
【請求項２８】
工程中、組成物が
特にｐＨ値が機能性成分に最適なｐＨと少なくとも＋／−０．５ｐＨ単位及び／又は最大＋／−５ｐＨ単位異なるような機能性成分の最適ｐＨと異なる少なくとも１つのｐＨに、
並びに／あるいは
化学的ストレスに、及び／又は
生物学的ストレスに、及び／又は
溶媒に、及び／又は
物理的ストレスに、及び／又は
機能性成分の
最適温度を
少なくとも５℃、及び／又は最大６０℃、
特に５０℃、
特に４０℃より高い、
特に３０℃、
特に２０℃、
特に１０℃
超える
高温に、及び／又は
機能性成分の
最適温度から
少なくとも５℃、及び／又は最大６０℃
逸脱している
低温に、
さらされる、
触媒工程における請求項１３から２６の何れか一項に記載の組成物の使用。
【請求項２９】
治療、特に
スフィンゴミエリナーゼ欠乏（ＡＳＭＤ）症候群、
ニーマン−ピック病（ＮＰＤ）、
リソソーム蓄積症、
ゴーシェ病、
ファブリー病、
ＭＰＳＩ、
ＭＰＳＩＩ、
ＭＰＳＶＩ
糖原病ＩＩ型、
癌、
アレルギー性疾患、
代謝疾患、
心血管疾患、
自己免疫疾患、
神経系疾患、
リンパ系疾患
及びウイルス性疾患
の１つの治療に用いるための、請求項１３から２６の何れか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質及びタンパク質型化合物の保護に関する。さらに特に、本発明は、例えば、悪条件下で、タンパク質及びタンパク質型化合物を保護することを可能にする方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素のようなタンパク質及びタンパク質型化合物は、例えば、産業への応用、治療上の使用に関する診断などにしばしば必要である。
【０００３】
これらの応用において、例えば、酵素が用いられる条件が酵素の活性が最大となる条件であることを保証することができない。むしろ、実際の条件は、例えば、温度、汚染物質の存在、溶媒などに関して最適条件から著しく逸脱していることが予想される。したがって、しばしば、タンパク質及びタンパク質型化合物は、使用中又は使用前、例えば、貯蔵中に実質的なストレスにさらされる。これにより、それらの活性又は用途に悪影響が及ぼされる可能性があり、特にタンパク質又はタンパク質型化合物として、しばしば高価であるため、活性物質又は活性の喪失はコストの著しい増加をもたらす恐れがある。担体の表面に酵素を固定化すること、及び様々な種類のストレスに対する高い耐性を有する生体触媒組成物を得るために保護物質の層でそれらを保護することが以前に提案された。
【０００４】
これに関して、産業応用に固定化酵素を使用することにより、それらが除去されることが保証され、その結果として、反応器の設計及び反応の制御が簡便化されることが記載された（C. Mateo等）。多数の酵素固定化及び保護方法が開発されてきた（D. Brady及びJ. Jordaan）。それらの方法には、固定化酵素の可能な再使用可能性、機械的（泡）、化学的（ｐＨ変化、カオトロピック剤）及び生物学的（プロテアーゼ）ストレスからの酵素の保護のような利点があるが、支持体からの酵素の漏れ、タンパク質の３次構造／活性構造の喪失、基質の拡散の制限（R. C. Rodrigues等）及び多孔質材料（例えば、セファビーズ）の場合の担体の目詰まりのような欠点もある。さらに、支持体への酵素の固定を可能にするために、酵素が遺伝子改変されることもある（H. R. Luckarift等）。
【０００５】
Ｈａｎｅｆｅｌｄ等は、酵素固定化の理解に関するレビューを公表した。この仕事は、ほんの数例を挙げれば、酵素（例えば、サイズ、安定性、添加物の必要性）及び担体（化学的及び機械的安定性、多孔性）の特性並びに拡散制限及び酵素阻害などの反応因子の重要性に焦点を合わせている（U. Hanefeldら）。
【０００６】
Ｈａｒｔｍａｎｎ及びＪｕｎｇは、メソ多孔性支持体への酵素の固定化によって、どれほどそれらの操作の安定性が向上し、連続工程におけるそれらの再使用が可能になるかを報告した。Ｈｉｌｔｅｒｈａｕｓ等は、Ｓｅｐａｂｅａｄｓ支持体への数種の酵素（エンドグルカナーゼ、デカルボキシラーゼ及びリパーゼ）の固定化と気泡塔反応器並びに撹拌槽型反応器における反復使用の利益について報告した。
【０００７】
２００５年に、Ｎａｉｋ等は、生物珪化による酵素の固定化の方法に関する特許願書を提出した。その著者らは、酵素、シリカ前駆体及びシラフィンペプチドを混合することにより固定化が起こり、得られた物質が経時的な安定性の改善により酵素活性を維持したことを記載した。
【０００８】
最近、Ｗｅｒｃｈａｎｔは、固定化酵素の調製を記述する方法に関する特許を出願した。システムは、酵素、ポリマー及び架橋剤から構成されるネットワークからなっている。共有結合により固定化された酵素システムは、乾燥し、環境条件で貯蔵した場合、安定な活性を保持していた（S. A. Werchant）。
【０００９】
米国特許出願第２０１２０１４９０８２Ａ１号は、特に、ラッカーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、オキシニトリラーゼ、ニトリラーゼ、アミノアシラーゼ、ペニシリンアシラーゼ、リアーゼ、オキシダーゼ及びレダクターゼの固定化用の架橋酵素−シリカ凝集体の合成を開示している。該複合体は、酵素を溶媒に溶解し、酵素を沈殿させ、アルコキシシラン及びグルタルアルデヒドなどの架橋剤を加えることにより調製する。
【００１０】
Ｏｓｔａｓｚｅｗｓｋｉは、シアヌル酸塩化物により活性化されたアミノプロピルシラン処理シリカゲルへのレボスタチンエステラーゼ酵素の固定化に関する方法に関する特許を出願した。
【００１１】
米国特許第７６４２０７７Ｂ２号は、有機鋳型分子、すなわちポリアミン又はポリペプチドの作用によるシリカ及び／又は有機シリケート溶液との共沈による酵素又は細胞固定化の他の方法を開示している。
【００１２】
Ｃｈｕｎｇ等は、それぞれ標的抗原及び抗原特異的二次抗体の固定化のための磁気ミクロ粒子及びトシル官能基化磁気シリカナノ粒子を用いるカスケード酵素結合免疫吸着検定法に関する特許を出願した（S. J. Chung等）。
【００１３】
メソ多孔性シリカ結合ヒスチジンタグ付きタンパク質の使用が米国特許出願第２０１０／０２６４１８８Ａ１号で出願された。メソ多孔性シリカに最初にＦｅ吸着により磁性を与え、次いで、Ｎｉで被覆して、ヒスチジンで標識された特定のタンパク質／酵素の結合を可能にする。
【００１４】
Ａｕｇｅｒ等は、標的分子とのイオン及び／又は水素非共有結合をもたらす基により官能基化された多孔性シリカナノ粒子（３０−４０ｎｍ）の内部への生体巨大分子（少なくとも１つのタンパク質又は核酸）の取り込みの方法を開示した（J. H. Chung等、A. Auger等）。
【００１５】
国際公開第２０１１０６０１２９Ａ１号は、熱応答性ポリマーシェル内に酵素を共有結合により固定化し、保護する方法を開示している。酵素の共有結合グラフティング（例えば、ビニル基結合）により、ポリマーへのタンパク質の共有結合が可能となる。ポリマーシェルは、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（イソプロピル−Ｎ−ビニルピロリドン）及び／又はＮ−イソプロピルアクリルアミド及び／又はポリスチレンポリマーなどの少なくとも１つの熱応答性ポリマーを含む。封入酵素は、３０℃より高い温度で安定であり、化学的治療、薬物送達、創傷治癒及びタンパク質療法に用いることができる（A. Auger等）。
【００１６】
最近、Ｌａｎｔは、脂質エステラーゼを含む保護粒子を含む水溶液により繊維製品を処理する方法に関する特許を出願した。より詳細には、保護粒子のコアが酵素及び基質を含み、コアが基質も含み得る遅延放出コーティング層（ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール又はヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む）により取り囲まれている（N. J.Lant等）。
【００１７】
酵素保護に加えて、機能性タンパク質のマイクロアレイ及びバイオセンサーの製造を含む支持体上にタンパク質を固定する多くの重要な応用が大きな重要性を帯びている（L. S. Wong等）。
【００１８】
国際公開第２０１２／１４２６２５Ａ２号は、生体標的組織中、好ましくは腫瘍組織中に物質を送達するのに用いることができる「ナノ粒子デバイス」の製造の方法を開示している。ナノ粒子デバイスは、内及び外層により作られているシェル構造を含む。内層は、送達可能な物質を含み、穴を有し、多孔性物質製である外層は、穴をシールしている。制御された条件において、外層が分解し、ナノ粒子デバイスに含まれている物質の送達が可能になる（L. S. Wong等）。
【００１９】
β−ガラクトシダーゼは、β−ガラクトシドの単糖への加水分解反応を触媒する酵素（ヒドロラーゼ）である。例えば、β−ガラクトシダーゼは、ラクトースのグルコース及びガラクトースへの加水分解を可能にする。
【００２０】
酪農業におけるその多大な重要性のため、β−ガラクトシダーゼの固定化が幅広く検討され、種々の戦略が策定された（S. C. Esener等）。
【００２１】
既に１９８１年に固体支持体へのラクターゼの固定化に関する特許が住友化学株式会社により出願された（ＥＰ００２６６７２Ａ２）。この文書は、マクロ多孔性両性フェノール−ホルムアルデヒド型イオン交換樹脂に活性ラクターゼを固定化する方法を開示している（Q. Husain）。
【００２２】
１９９８年に、Ｇｉａｃｏｍｉｎｉ等は、２種の多孔性支持体：無機担体シラン被覆（ＣＰＣ−シリカ）及びアガロースへのクルイベロミセス・ラクチス（Ｋ．  ｌａｃｔｉｓ）からのβ−ガラクトシダーゼの共有結合性固定化を報告した（C. Giacomini等）。ＣＰＣ−シリカは、グルタルアルデヒドにより活性化されたが、アガロースは、シアニル化剤により活性化された。他の支持体と比較して高い量のβ−ガラクトシダーゼが活性化ＣＰＣ−シリカ上に固定化されたが、酵素活性の３４％のみが発現した。著者等は、この結果を固定化時に酵素の不活性化が起こったこととして説明している。
【００２３】
後に、Ｔａｎｒｉｓｅｖｅｎ及びＤｏｇａｎは、グルタルアルデヒドにより硬化された、アルギネート及びゼラチン繊維上に固定化されたアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）からのβ−ガラクトシダーゼがその最初の活性の５６％を維持したことを示した。
【００２４】
Ｍａｍｍａｒｅｌｌａ及びＲｕｂｉｏｌｏは、アルギネート−カラゲナンゲルビーズ中のクルイベロミセス・フラギリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）からのβ−ガラクトシダーゼの封入について報告した。ゲルが、酵素の活性を増大させるＫ＋イオン内に形成されるため、カラゲナンの存在は、酵素触媒反応に対する好ましい影響を有していた。それにもかかわらず、支持体からのかなりの問題とされる酵素の漏れが連続反応中に認められた。
【００２５】
セルロース、アガロース、キトサン、デキストラン、アルギネート、ゼラチン及びコラーゲンなどの親水性担体が、かなりの活性保持を有する固定化酵素支持体として使用された（E. J. Mammarella及びA. C. Rubiolo、S. Rejikumar及びS. Devi）。しかし、これらの材料は、操作条件下で、あるいは微生物が存在する場合に膨潤及び／又は分解し得るので、固定化酵素への応用に必ずしも適するとは限らない。
【００２６】
グルタルアルデヒドにより架橋結合した繊維状ポリマー材料も酵素の固定化に用いられたが、それらを用いた場合、固定化効率が低く、酵素活性が小さいことが特徴である。ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を製造するために、アスペルギルス・オリザエからのβ−ガラクトシダーゼを、塩化トシルで修飾した綿布に共有結合により固定化した（N. Albayrak及びS. T. Yang）。著者等は、固定化酵素が５０℃で５０日、４０℃で１年超の半減期を有することを報告した。綿繊維を調製する手順は、単調で退屈であり、有機化学物質の使用を必要とする。それらの不利な点を克服するために、ポリエチレンイミンによる綿の修飾の新たな戦略が策定された（N. Albayrak及びS. T. Yang）。この技術の主な欠点は、大規模生産が依然として困難なままである。
【００２７】
Ｍａｔｅｏ等は、エポキシ−ボロン酸樹脂（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ）、グリオキシル−アガロース、グルタルアルデヒド−アガロース及びグルタルアルデヒド−Ｅｕｐｅｒｇｉｔなどの種々の支持体上に固定化されたクルイベロミセス・ラクチスからのβ−ガラクトシダーゼの活性を測定した。一般的に、固定化酵素の活性は、遊離酵素より１０％高かった。それにもかかわらず、エポキシド活性化支持体は、酵素が支持体上に吸着されることを可能にする吸着基による表面の修飾を必要とするという主な制約をもたらす。これらの相互作用は、触媒の構造を変化させ、酵素の特徴及び能力の変化をもたらし得る。
【００２８】
２０００年にＬａｄｅｒｏ等は、ＡＰＴＥＳによりシラン処理され、グルタルアルデヒドで修飾された市販のシリカアルミナ支持体上に共有結合により固定化されたクルイベロミセス・フラギリスからのβ−ガラクトシダーゼによるラクトースの加水分解を記載した。固定化酵素は、遊離酵素の活性より５０％劣る触媒活性を示した。さらに、活性は、乳処理に適さない可能性がある５℃から４０℃までの温度の範囲に限定されていた。
【００２９】
Ｂｅｔａｎｃｏｒ等は、２００７年にケイ素支持体に結合した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からの封入β−ガラクトシダーゼを含むシリカナノスフェアの３次元ネットワークを作り出す新たな戦略を報告した。固定化β−ガラクトシダーゼは、安定であり、２４℃で１０日後にその最初の活性の８０％超の活性を保持していた。たとえ成功であるとしても、このアプローチは、単調で退屈な調製手順及び大規模生産が困難であるという主な不利な点を生ずる。シリケート材料への酵素の固定化の主な不利な点の１つは、シリカゲルの低い多孔度又はメソ細孔チャンネル内の分子／酵素充填であり、それにより、遊離酵素より低い触媒活性がもたらされる（Y. Kuwahara等）。
【００３０】
アスペルギルス・オリザエからのβ−ガラクトシダーゼを、ラクトースの加水分解のためにレンズ状ＰＶＡ（ポリビニルアルコール）ヒドロゲルカプセル（直径３−４ｍｍ、厚さ２００−４００μｍ）に封入した。酵素は、その元々の活性の３２％を維持したにすぎなかった。さらに、酵素の固定化の後にその基質に対するβ−ガラクトシダーゼの親和性の一般的な低下が認められた。著者等は、それをマトリックスとの相互作用の後の酵素の構造の変化の可能性及びヒドロゲルを通しての基質の拡散の起こり得る制限により説明した（Z. Grosova等）。
【００３１】
Ｎｅｒｉ等は、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）及びポリシロキサン（ＰＯＳ）のグルタルアルデヒド活性化磁気ビーズ中へのクルイベロミセス・ラクチスからのβ−ガラクトシダーゼの封入について報告した。固定化酵素は、２０回再使用された後にその最初の活性の約半分を保持していた。しかし、固定化酵素の触媒効率は、天然酵素で認められた値と比較して１２％にすぎなかった。この触媒活性の低下は、支持体によって誘導された酵素の立体構造の変化、又は基質の拡散の立体的困難若しくは制限に起因し得る。
【００３２】
それらの方法は、かなり興味深く、有望なものであるが、それらの主な限界は、酵素のアンカー部位が欠如していることとひいては支持体からの触媒の漏れの可能性があること又はその微小環境における酵素の３次元配置が矯正されていないことにある。さらに、それらの方法の大部分は、費用のかかるものであり、したがって、工業的な大規模生産に不適切であるという不都合がある。
【００３３】
米国特許出願第２０１０１９６９８５Ａ１号は、疎水性官能基化ポリマー支持体、すなわち、食品包装材料（例えば、ポリ（エチレン）、ポリ（エチレン酢酸ビニル）、ポリスチレン／アクリル酸コポリマー）にラクターゼを共有結合させる方法を開示している。この発明は、触媒の漏れ、担体の安定性及びコストのような酵素固定化技術の一般的な欠点を克服することはできるが、酵素の再使用可能性の主な制限を有する。
【００３４】
さらに、国際公開第２００５／０５６８０８Ａ２号から、鋳型指向性ケイ酸塩沈殿による生体触媒の固定化が公知である。該文書は、１つ又は複数の生体触媒及びシリカ又は有機シリケートが共沈しているバイオ複合材料を提案している。
【００３５】
ＥＰ２４３１７４２Ａ１から、分子認識エレメントの調製が公知である。鋳型を担体物質の表面に結合させ、次いで、認識物質の重合を開始し、重合を停止し、重合認識物質から鋳型を放出することが提案されている。好ましい重合は、水性条件下でのトリアルコキシシラン及びテトラアルコキシシランなどのシリカ前駆体の重縮合に基づいて得られることが記載されている。
【００３６】
国際公開第９３／０７２６３号から、ビニルポリマー若しくはコポリマーで被覆された水溶性若しくは分散性物質を有するコア、１つ若しくは複数の酵素及びビニルポリマー若しくはコポリマーを含む酵素層並びにビニルポリマー若しくはコポリマーを含む外側コーティングを含む、酵素含有顆粒が公知である。
【００３７】
米国特許第６２６８３２９Ｂ１２号から、酵素含有顆粒が公知であり、実質的な量の水溶性コーティングを含むコーティングを含む酵素含有コアが備えられている。この顆粒を洗剤組成物に使用することが提案されている。
【００３８】
Ｓ．ＢＨＡＴＴＡＣＨＡＲＹＹＡ等から、「巨大分子の制御放出用のポリマー被覆メソ多孔性シリカナノ粒子」が公知である。ＢＨＡＴＴＡＣＨＡＲＹＹＡは、「モデルタンパク質」として用いたトリプシン阻害剤の固定化のために調製されたメソ多孔性シリカナノスフェアを用い、次いでトリプシン阻害剤負荷担体の表面にＰＥＧ−アミンの薄層を共有結合させることを提案しており、そのＰＥＧは、３ｋＤａの分子量を有し、したがって、約６８エチレングリコール単位から構成されている。
【００３９】
Ｙｏｎｇ−Ｑｉｎｇ  Ｘｉａ等「媒介基質としてのキトサンを用いたシリカ粒子上のタンパク質認識」から、ヘモグロビンに対する特異的認識部位を有する２回被覆シリカ粒子を調製するための分子インプリンティング法が公知である。キトサンが相反転法によりシリカ粒子上に被覆される媒介物として用いられ、多くの曝露アミン基がアルデヒド基を導入するための活性部位であった。アルデヒド基によるイミン結合の形成によりヘモグロビンが共有結合により固定化された後、アクリルアミドがキトサン被覆シリカ粒子上で重合されて、認識部位を形成する。
【００４０】
Ｐ．Ｇａｌｌｉｋｅｒ等「ラッカーゼ修飾シリカナノ粒子はフェノール化合物の変換を効率よく触媒する」によれば、ラッカーゼ修飾シリカナノ粒子に基づくシステムが主要な内分泌撹乱化学物質４，４’−イソプロピリデンジフェノール（ビスフェノールＡ）を分解するその能力について試験された。このために、ナノ粒子がＳｔｏｅｂｅｒ法を用いて製造され、走査型電子顕微鏡法、動的光散乱及び□−電位測定を用いて特性評価がなされた。これらの粒子の表面における第１級アミノ基の導入が有機シラン（アミノプロピルトリエトキシシラン）を用いて行われた。二官能性カップリング剤としてのグルタルアルデヒドの使用により、カップリングされたタンパク質の量及び製造されたナノ粒子の□−電位を測定することによりモニターされた、ナノ粒子の表面におけるコリオロプシス・ポリゾナ（Ｃｏｒｉｏｌｏｐｓｉｓ  ｐｏｌｙｚｏｎａ）からのラッカーゼのコンジュゲーションが可能であった。そのように生成したバイオコンジュゲートの酸化活性が、放射性標識ビスフェノールＡを用いて試験された。たとえ固定化酵素の特異的触媒活性の低下が測定されるとしても、バイオコンジュゲートの活性は、フェノール性汚染物質の変換へのこれらのシステムの適用に依然として適合することが示された。
【００４１】
Ａ．−Ｍ．Ｃｈｉｏｒｃｅａ−Ｐａｑｕｉｍ等「ｉｎ  ｓｉｔｕ電解重合中性レドックスメディエーターオキシシランゾル−ゲル封入グルコースオキシダーゼ電気化学バイオセンサーのＡＦＭナノメートル表面形態試験」によれば、高度配向熱分解黒鉛（ＨＯＰＧ）上に集合させたメチルトリメトキシシラン（ＭＴＭＯＳ）、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＯＳ）及び３−グリシドオキシプロピル−トリメトキシシラン（ＧＯＰＭＯＳ）の４種のシリカゾル−ゲルフィルムが、グルコースバイオセンサーの開発にそれらが使用されるために、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）を用いて特性評価がなされた。オキシシラン前駆体の化学構造及びゾル−ゲル混合物の組成が、酵素の封入に関連する、ゾル−ゲルフィルムの粗さ、細孔のサイズ及び分布に影響を及ぼすと述べられた。ＧＯＰＭＯＳゾル−ゲルフィルムは、申し立てによると表面における小さな、直径が５０ｎｍの細孔のみの非常に密で、均一な分布を有する平滑なトポグラフィーのため、酵素の十分な封入に必要なすべての形態学的特性を満たしていると述べられている。ＡＰＴＯＳ及びＭＴＭＯＳゾル−ゲルフィルムは、小さな細孔並びに酵素の漏れを可能にする３００−４００ｎｍの大きな細孔を発生すると述べられているが、ＴＥＯＳフィルムは、酵素の固定化にさほど適していない、電極上に粗く、不完全なネットワークを形成すると報告されている。ＡＦＭの結果は、レドックスメディエーターを有する各種オキシシランゾル−ゲル封入グルコースオキシダーゼバイオセンサーを用いて得られた経時的な安定性、感度及び検出限界の変化を説明することが述べられている。
【発明の概要】
【００４２】
したがって、タンパク質又は酵素を不活性化又は変性させ得る好ましくない影響から、タンパク質又はタンパク質型化合物、特に酵素を保護するための経済的で、使用しやすいシステムを提供することに対する、満たされていない要求がある。さらに、商業的な大規模応用におけるタンパク質又は酵素の使用及びタンパク質又は酵素の再利用を可能にする、保護システムの特別な要求がある。
【００４３】
この要求は、独立クレームの特徴により規定される組成物及び方法の提供により本発明の範囲内で満たされる。好ましい実施態様は、本明細書に開示され、且つ／又は従属クレームの主題である。
【００４４】
したがって、提案されるものは、とりわけ、少なくとも固体担体、タンパク質及びタンパク質型化合物から選択される機能性成分、並びに機能性成分を少なくとも部分的に埋め込むことにより、機能性成分を保護するための保護層を含む、組成物を製造する方法であり、該方法は、最初に少なくとも１つの機能性成分を固体担体の表面上に固定化し、次いで、機能性成分を少なくとも部分的に埋め込むことにより機能性成分を保護するための保護層を、その少なくとも一部が相互及び固定化機能性成分の両方と相互作用することができるモノマーである構築ブロックを用いて構築する工程を含む。
【００４５】
この方法は、機能性成分の非常に有効な保護を可能にする。本発明により得られる良好な結果は、以下の理由によると考えられる。保護層を形成するモノマーは、相互及び機能性成分の両方と相互作用することができ、モノマー相互の相互作用は、自己集合とそれによるポリマー構築反応をもたらし、したがって、ポリマーが機能性成分の周囲に形成され、それに加えてさらなる相互作用によりモノマーが機能性成分の周囲に密に配置される。モノマー相互の相互作用がモノマーと機能性成分との相互作用と同種である必要もなく、そのような相互作用が同時に始まる又は顕著になる必要もないことが認められるであろう。通常、保護層を形成するモノマーは、相互の相互作用の前に機能性成分と相互作用する。相互の相互作用は、通常、機能性成分の周囲のポリマーの形成につながるモノマー相互の反応であるが、同時に、すなわち、ポリマーを形成している間に、それに加えてさらなる相互作用によりモノマーが機能性成分の周囲に密に配置されている（又はそのままである）。保護される機能性成分の周囲の構築ブロックのそのような密な配置は、長いポリマーが用いられる場合には起こらない。その理由は、これらについて、例えば、非共有結合性結合を介して機能性成分との相互作用の能力のある各官能基は、正しい位置にあると予想することができない。したがって、本発明による封入は、緊密なものである。封入が緊密なものであるならば、例えば、機能性成分の立体構造がより十分に維持されるため、機能性成分は、より十分に保護されることとなる。
【００４６】
埋め込みは、機能性成分（その少なくとも大多数又は大部分）が使用時まで、好ましくは使用の終了まで埋め込まれたままであるようなものであり、意図した使用中に洗い落とされることを意図するものでもなく、洗い落としも起こるものでもない。したがって、機能性成分の除去は、意図するものでなく、実際に避けるべきである。本発明によれば、使用前にインプリントされた物質を放出する認識層としての役割を単に果たす層から洗い落とされた機能性成分の単なるインプリントを維持することは、意図するものでも十分なものでもない。公知の放出認識層と対照的に、本発明の保護層は、使用中に前記機能性成分を保持する、機能性成分保持保護層と考えることができる。
【００４７】
緊密な封入は、保持に役立つ。これに関連して、「緊密な」という用語は、本明細書で用いているように密な空間関係を指すために用いることができるだけでなく、機能性成分の活性、特に特定の条件下での長期使用の後の機能性成分の活性を緊密さの尺度として用いることができることに注目すべきである。
【００４８】
さらに、固定化の後、したがって機能性成分が既に表面上に存在した後に埋め込み層が構築されるので、機能性成分の下に保護物質が存在する必要はない。これは、実質的な量の保護物質が機能性成分の下に、したがって、機能性成分と担体との間に存在する共沈とあからさまな対比をなしている。したがって、保護層の構築は、より正確に制御することができ、特定の特性を有する層がより容易に得られる。
【００４９】
好ましい実施態様において、本発明は、本発明による組成物を製造するための本明細書で開示する方法であって、特定の時点に保護物質の自己集合反応を停止することにより多孔性ナノ環境の厚さを制御して、所望の厚さを有する保護層を得る方法に関する。
【００５０】
層の厚さは、より正確に制御される特定の特性の１つであり得るので、標的分子が到達できないほど層内に過度に深く大量の機能性成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ（ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ））を埋めることは、避けることができ、したがって、組成物の製造に用いられる機能性成分のより有効な使用が行われる。したがって、厚さに対する制御は、より大きい酵素軸のおおよそのサイズを有する最終的な保護層を得る可能性をもたらす。そのような層は、保護層内に存在するすべての酵素が同様に活性である均一な層である。
【００５１】
したがって、本発明による方法は、好ましくは保護層の標的サイズを事前に定めることに関する。この標的サイズを事前に定めることは、重合保護物質が事前に定めた標的厚さに本質的に等しい厚さに達したときに担体物質の表面上の保護物質の重合が停止されるように、標的厚さを事前に定めることを含む。重合保護物質の厚さを制御することにより、固体担体の表面上に固定化されたタンパク質又はタンパク質型化合物を埋め込む保護層のサイズを意図する用途について好都合に調節し、最適化することができる。
【００５２】
特に、重合保護物質の厚さを制御することにより、保護層の成長を制御し、１−１００ｎｍ、１ｎｍ−５０ｎｍ、１ｎｍ−３０ｎｍ、１ｎｍ−２５ｎｍ、１ｎｍ−２０ｎｍ、１ｎｍ−１５ｎｍ、好ましくは５ｎｍ−１５ｎｍの範囲に調節することができる。これらの範囲内で、重合保護物質の成長の精度レベルは、１−１０ｎｍ、１ｎｍ−５ｎｍ、１ｎｍ−４ｎｍ、１ｎｍ−３ｎｍ、１ｎｍ−２ｎｍ、好ましくは１ｎｍの範囲にあり得る。厚さは、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）、走査型プローブ顕微鏡法（ＳＰＭ）などの顕微鏡又は光散乱法を用いて検査することができる。例えば、当技術分野で公知であるように、ＳＥＭは、電子の高エネルギービームによりラスター走査パターンで試料の表面を走査することによって試料の表面を撮像する電子顕微鏡の一種である。電子は、試料を構成している原子と相互作用して、表面のトポグラフィー（例えば、重合保護物質のトポグラフィー）、組成及び電気伝導度などの他の特性に関する情報を含むシグナルを発生する。分析の目的のためのそのような種類の顕微鏡検査を行う方法は、当業者に周知である。
【００５３】
重合保護物質の厚さが事前に定めた標的厚さと本質的に等しいときに、担体物質の表面上の保護物質の重合を停止することにより、保護層のサイズの正確な制御が可能となる。これに関連して、所定の条件における時間依存的に重合する保護物質の厚さに関する保護層の成長について成長速度論を予備的に測定することもできる。この測定の結果は、次に重合保護物質が事前に定めた層の厚さに達した時点で重合反応を停止するのに用いることができる。
【００５４】
一態様において、重合保護物質の標的厚さを事前に定めることは、所定の反応条件下での重合反応の標的継続時間を事前に定めることを含む。次いで、担体物質の表面上の保護物質の重合をこれらの条件下で実施し、担体物質の表面上の保護物質の重合が事前に定めた標的厚さに本質的に等しいと判断された事前に定めた時点に停止する。この状況における「条件」という用語は、保護物質の成長を決定するパラメーターに関する。特に、それは、保護物質に用いられるモノマー構築ブロックの（初期）濃度及び組成、重合温度、圧力並びに／又は湿度に関するものであり得る。「モノマーの相互との相互作用」に言及する場合、及びそのような相互作用が重合反応である場合、モノマーの相互作用がモノマーと重合中に得られた中間生成物との相互作用も含むことは、理解されよう。
【００５５】
上述の手順により、重合保護物質の厚さ、及びひいては保護層の厚さ、特に保護物質に埋め込まれた固定化タンパク質又はタンパク質型化合物の周囲の保護層の厚さを正確に制御することができる。例えば、自己集合保護物質の厚さを制御することにより、前記保護物質に埋め込まれた固定化酵素の活性を選択的に調節することができる。この状況において、所定の条件において重合させる保護物質の重合継続時間及び酵素の活性が自己集合保護物質の厚さに依存することを考慮に入れる、重合保護物質の成長速度論を予備的に測定することができる。この測定の結果として、層の厚さに依存する、好ましい酵素活性に達した時点に、重合反応を停止することができる。例えば、酵素活性とストレスに対する酵素の抵抗との間のバランスが最適である時点で、重合を停止することができる。
【００５６】
本発明の方法について１００％純粋で、ダイマー及びオリゴマーを含まないモノマー組成物又は混合物を用いることは必要でないが、構築ブロックとして用いるモノマーの百分率は、良好な結果を得るために、原則として非常に高いものであるべきであることに注目されたい。より多くの構築ブロックがモノマーの形である場合、すなわち、構築ブロックのより高い百分率の部分がモノマーにより構成されている場合、酵素又は他の固定化機能性成分の周囲のモノマーの細かく、正確な自己選別及び組織化が改善され、埋め込み層の結果として生じる保護能力が特に有効である、より高い可能性がもたらされる。ダイマー又はオリゴマーを用いる場合、最終保護層が酵素にさほど密に巻き付けられず、したがって、さほど有効な保護能力は予想されないはずである。
【００５７】
しかし、市販のモノマーは、通常、本発明の要求を満たすであろう。これらについて構築ブロックの８０％超はモノマーの形であり、一般的に構築ブロックの９５％超はモノマーの形であると予想することができる。
【００５８】
用いるモノマーが固体担体の表面とさらに相互作用することができる場合、これは、保護層が担体にも結合することを保証するので、保護層が十分に密でないことを防ぐことが有利である。
【００５９】
しばしば、固体担体の表面上の機能性成分を固定化する前に、表面上の機能性成分の固定化を改善するために固体担体を修飾する。
【００６０】
したがって、さらなる実施態様において、本発明は、本発明による組成物を製造するための本明細書で開示する方法であって、本明細書で開示する前記固体担体の表面を修飾して、少なくとも１つの分子をアンカーポイントとして導入する方法に関する。アンカーポイントとして用いる前記少なくとも１つの分子は、アンカーポイントとしての該少なくとも１つの分子と二官能性架橋剤との化学反応を誘導することによりさらに修飾することができる。特に、前記アンカーポイントは、アミン部分、さらに特にアミノシラン、さらに特に３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）である。本明細書で開示する対象の少なくとも１つのタンパク質又はタンパク質型化合物と、任意選択的に、本明細書で開示する少なくとも１つの任意選択の分子とを二官能性架橋剤の自由活性官能基を介して修飾担体の表面において結合させる。特に、前記二官能性架橋剤は、グルタルアルデヒドである。二官能性架橋剤の他の例は、酒石酸ジスクシンイミジル、スベリン酸ビス［スルホスクシンイミジル］、エチレングリコールビス（コハク酸スルホスクシンイミジル）、アジプイミド酸ジメチル、ピメルイミド酸ジメチル、アミノ安息香酸スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、活性化スルフヒドリル（例えば、スルフヒドリル反応性２−ピリジルジチオ）である。
【００６１】
特定の実施態様において、本発明は、本発明による組成物を製造するための本明細書で開示する方法であって、二官能性架橋剤の自由活性官能基は、アルデヒド、カルボン酸、イミドエステル及び／又はハロゲン化アリールである方法に関する。
【００６２】
他の特定の実施態様において、本発明は、本発明による組成物を製造するための本明細書で開示する方法であって、本明細書で開示するタンパク質又はタンパク質型化合物、特に酵素又は酵素型化合物は、固体担体の表面において共有結合させる方法に関する。
【００６３】
本発明による、及び本明細書で述べる方法はしたがって、タンパク質又はタンパク質型化合物を担体物質の表面に結合させる前に担体物質の表面を活性化するさらなる工程を含んでいてもよく、特定の態様において、これは、担体物質の表面上に結合手段を均一に分布させることによって達成することができる。
【００６４】
この状況において、結合手段の均一な分布は、結合手段が担体物質の表面上にそれらの間に等しい又は少なくとも同等な間隔をあけることによって結合していることに関連する。これは、特に、担体表面上に固定化されている機能性成分が互いを遮らない又は他の状態で妨害しない場合、好ましくは担体表面にモノマーを結合させるのに十分な場所も残されている場合に達成される。結合手段によってもたらされる結合部位の均一性は、担体物質の表面の均一性に依存し得る。
【００６５】
好ましくは、結合手段は、担体物質のパターン化表面の提供により担体物質の表面上に均一に分布する。
【００６６】
パターン化表面は、各粒子が事前に定められた直径を有する、粒子、すなわち、ナノ粒子から構成されている表面を調製することによるなどの様々な方法で得ることができる。さらに、パターン化表面は、担体物質の表面上に均一に分布している誘引物質及び非誘引物質部分により表面を構造化することによって得ることができる。誘引物質部分は、例えば、結合手段に対する親和性を有する。対照的に、非誘引物質部分は、結合手段に対する低い親和性を有し又はまったく親和性を有さず、したがって、結合手段が担体物質の表面に結合することができない。そのような構造化表面は、周知の技術、例えば、フォトリソグラフィ法又はミクロ接触プリンティングにより得ることができる。
【００６７】
したがって、機能性成分の固定化を改善するために表面領域の一部のみが修飾されているが、他の部分は、修飾されていないままであり、そのような場合に、モノマーが好ましくは担体表面の修飾されていない部分と結合相互作用の能力が（も）あるということが可能であることが指摘される。このようにして、保護層が機能性成分と担体表面の両方に結合しているので、保護層は、際だった密な状態となる。したがって、とりわけ安定な組成物を得ることができる。
【００６８】
これに関して、アミノ修飾、またより正確には修飾アミノ基の密度のような、担体に適用される化学の種類が固定化段階におけるタンパク質の安定性及び活性に影響を及ぼし得ることも当業者により理解されるであろう。固定化に用いられる架橋剤（例えば、グルタルアルデヒド）は、一般的にタンパク質を支持体物質に共有結合させるので、高密度の表面アミノ基、したがって、高密度のアンカーポイントが酵素を固定し、引き伸ばし、平らにし、最後に広げ、ひいてはタンパク質構造に影響をもたらす可能性が最も高く、したがって、これが機能を失うこととなる。この状況において、一般的に、最初に粒子を架橋剤で修飾し、次いでタンパク質を加えるというような架橋剤の使用は、タンパク質構造に影響をもたらさないか、又は最初に粒子上のタンパク質の吸着を実施し、次いで架橋剤を加えるという異なるアプローチよりも低い程度にタンパク質構造に少なくとも影響を及ぼすということが指摘され、異なるアプローチでは、過剰の架橋剤がタンパク質を「固定する」又は「引き伸ばす」ことがあり得るので、タンパク質構造の変化がもたらされる可能性がより高い。
【００６９】
したがって、安定な固定化を得るために、粒子表面上でアンカーアミノ基の適切な密度が達せられるべきである。過度に少ないアンカーアミノ基は、弱く結合したタンパク質の漏れをもたらす。反対に、過度に高いアンカーアミノ基密度は、固定化タンパク質のアンフォールディングをもたらし得る。
【００７０】
本明細書で用いているように、「結合手段」という用語は、例えば、架橋試薬又は架橋剤の一端が担体物質の表面に結合し、他端がタンパク質又はタンパク質型化合物に結合するように特定の官能基（例えば、第一級アミン、スルフヒドリル等）に結合することができる、反応性末端を含む架橋試薬又は架橋剤に関するものである。架橋剤は、核酸、タンパク質、ポリマー及び固体表面又は固体鋳型を修飾するために用いることができる。例えば、架橋剤を担体物質としてのシリカ表面上に固定化することができ、次いでタンパク質又はタンパク質型化合物を架橋剤の非占有結合部位に結合させることができる。あるいは、架橋剤が最初にタンパク質又はタンパク質型化合物に結合し、次いでタンパク質又はタンパク質型化合物に結合した架橋剤がその非占有結合部位によりシリカ表面に結合し得る。本発明による方法の範囲内で用いられる架橋剤は、ケイ素酸化物又はチタン酸化物のような無機酸化物、有機、無機、ポリマー又は無機−有機複合材料及び自己集合有機物質などの用いられる担体物質の種類に依存し得る。好ましくは、架橋剤は、切断可能な架橋剤、すなわち、温度、ｐＨ、電気、光などの外部刺激により切断されるその結合を有することができる架橋剤であり得る。特に、例えば、還元剤としてのＤＴＴ（ジチオトレイトール）を用いることにより切断することができる、ＤＴＳＳＰ（３，３’−ジチオビス［プロピオン酸スルホスクシンイミジル］）などの架橋剤を用いることができる。
【００７１】
非限定的な例として、アミノ修飾シリカ表面は、担体物質の表面におけるアミン基とともにシッフ塩基を形成するホモ二官能性架橋剤（例えば、グルタルアルデヒド）で修飾された担体物質として用いることができる。次いで、残存自由アルデヒド基は、タンパク質又はタンパク質型化合物とともに他のシッフ塩基を形成することができ、それにより、タンパク質又はタンパク質型化合物を担体物質の表面に結合させることができる。タンパク質又はタンパク質型化合物は、酸性条件で遊離し得るので、注意を払うべきである。
【００７２】
金又はチタン表面を担体物質として用いる場合、それぞれの表面に鋳型を結合させるための適切な架橋剤は、それぞれの表面に結合することを可能にするチオール末端基及びさらに切断可能な分子内ジスルフィド結合を有し得る。
【００７３】
機能性成分、すなわち、タンパク質又はタンパク質型化合物を共有結合により担体物質の表面に結合させるならば、それが好ましい。これは、担体の表面が共有結合することができることを意味するので、モノマーは、そのような結合によっても修飾表面と相互作用するように適合させることができる。一般的に、モノマーがこの表面に直接結合するならば、それが好ましく、固定化を改善するように表面を調製することが可能である。
【００７４】
したがって、組成物は、タンパク質又はタンパク質型化合物から選択される少なくとも１つの機能性成分を固体担体の表面に結合させるための少なくとも１つの二官能性架橋剤、特に、アミンをスルフヒドリル（チオール）官能基に架橋結合させるための架橋剤及び／又はスルフヒドリルをスルフヒドリル（チオール）官能基に架橋結合させるための架橋剤、及び／又はグルタルアルデヒド、酒石酸ジスクシンイミジル、スベリン酸ビス［スルホスクシンイミジル］、エチレングリコールビス（コハク酸スルホスクシンイミジル）、アジプイミド酸ジメチル、ピメルイミド酸ジメチル、アミノ安息香酸スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、活性化スルフヒドリル（スルフヒドリル反応性２−ピリジルジチオ）、ＢＳＯＣＯＥＳ（ビス［２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン、ＤＳＰ（ジチオビス［プロピオン酸スクシンイミジル］）、ＤＴＳＳＰ（３，３’−ジチオビス［プロピオン酸スルホスクシンイミジル］）、ＤＴＢＰ（ジメチル３，３’−ジチオビスプロピオンイミデート・２ＨＣｌ）、ＤＳＴ（酒石酸ジスクシンイミジル）、スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ（４−スルホスクシンイミジル−６−メチル−ａ−（２−ピリジルジチオ）トルアミド）ヘキサノエート））、ＳＰＤＰ（３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル）、ＬＣ−ＳＰＤＰ（スクシンイミジル６−（３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド）ヘキサノエート）、ＳＭＰＴ（４−スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル−ａ−［２−ピリジルジチオ］トルエン）、ＤＰＤＰＢ（１，４−ジ−［３’−（２’−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ブタン）、ＤＴＭＥ（ジチオ−ビスマレイミドエタン）、ＢＭＤＢ（１，４ビスマレイミジル−２，３−ジヒドロオキシブタン）の群から選択される二官能性架橋剤をさらに含み得る。
【００７５】
機能性成分が担体表面上に特定の配向で固定化されることは、必要でない。むしろ、担体表面上に固定化された機能性成分の分子の配向がランダムである場合、本発明により十分な保護効果を得ることさえもできる。これは、ほとんどの機能性成分についてモノマーとの複数の相互作用部位があらゆる配向で存在するという事実により得るものであり、そのため所定の分子の特定の配向と無関係に、保護層の密な結合が生じる。
【００７６】
また、基質が保護層に浸透し、且つ／又は酵素若しくは他の機能性成分の活性部位に到達することができる限りは、担体の表面上の固定化酵素の配向は、考慮すべき必須のものではない。現在、保護層をかなり薄く設計することができ、したがって、固定化され、保護された機能性成分と相互作用する標的分子によって容易に浸透できるように設計することができるので、保護層は、機能性成分の酵素の配向にかかわらず、活性に悪影響を及ぼすことはほとんどない。それにもかかわらず、ほとんどの場合、保護層は、形態固定（form locking）の形で機能性成分を保持するのに十分に厚く、それにより、モノマーから構築された重合、例えば、重縮合物質が、放出が減少又は妨げられるように機能性成分分子の少なくとも一部の上に備えられる。円形の分子断面を有する機能性成分については、これは、明らかに保護層が断面の直径の５０％より厚い場合である。そのような場合、形態固定が起こる場合、分子は、構築ブロックとの弱い相互作用によって維持されるだけでなく、機能性成分分子の上の構築ブロックが他の構築ブロックと架橋結合してポリマーを形成し、機能性成分分子を除去するには、そのような架橋結合力に打ち勝つ必要があるという理由によっても維持される。これは、例えば、ウイルスインプリンティング技術におけるウイルス粒子を放出するために形成された認識層と際だった対照をなす。平均的な技術者は、保護層内に細孔を備えることは、そのような層を通しての機能性成分と相互作用する標的物質分子の拡散が他の場合には遅い又は不可能であるとしても、機能性成分の関連断面直径の１００％に達する又は超える層を用いることを可能にするのに特に有効であることを認識するであろう。したがって、細孔を備えることは、機能性成分をより良好に保持するのに役立つ。したがって、多孔性機能性成分保持層は、保護層として特に好ましい。
【００７７】
したがって、機能性成分の分子を特定の配向で固定化することは必要でないので、本発明による方法を実施することは、より容易である。
【００７８】
しかし、配向が好ましい場合、そのような配向は、例えば、特定の基質の存在下若しくは溶媒の存在下で酵素を固定化する酵素特異的溶液を適用することによって、又は当技術分野で本質的に公知の特定の固定化戦略を用いることによって得ることができる。
【００７９】
また、機能性成分のみを組成物に加えることは、必要でない。それどころか、組成物は、アダプター分子、アンカー分子、足場分子及び／又は受容体分子の群から選択される少なくとも１種の機能性（補助）分子をさらに含むことが可能である。したがって、本発明はさらに、特定の実施態様において、本明細書で開示する本発明の組成物であって、前記組成物は、アダプター分子、アンカー分子、足場分子及び／又は受容体分子の群から選択される少なくとも１つの分子を任意選択的にさらに含む組成物に関する。これらの分子の任意を、基質（標的）分子を結合させ、安定化し、捕獲し、捕捉し又は捕らえるために用いることができる。これにより、基質又は相互作用パートナーを機能性成分、すなわち、タンパク質又はタンパク質型化合物、特に酵素又は酵素型化合物のより近くに至らせ、それにより、タンパク質又はタンパク質型化合物とその基質又は相互作用パートナーとの相互作用を促進することができる。
【００８０】
したがって、そのような機能性（補助）分子を用いることは、機能性成分を固定化するのに、且つ／又は固定化されたならば若しくは保護層の構築の前に機能性成分を安定化するのに有用であり得る。そのような機能性（補助）分子を用いる場合、機能性成分を保護するための保護層が少なくとも１種の機能性分子も埋め込んでいるようにアダプター分子、アンカー分子、足場分子及び／又は受容体分子の群から選択される少なくとも１種の機能性分子とさらに相互作用することができるようにモノマー構築ブロックが選択されるならば、それは有利であろう。
【００８１】
特定の好ましい実施態様において、本発明により構築される保護層は、多孔性層である。
【００８２】
この状況において、機能性成分を利用するためには、その特定の部分が本発明の組成物が共に用いられる特定の分子又は分子の群によりアクセスされなければならないことは、当業者に明らかであろう。今や、そのような「標的」分子は、機能性成分が部分的にのみ埋め込まれ、それぞれの特定の部分が覆われていない場合には機能性成分の特定の部位に直接アクセスし得るか、又はさもなければ、アクセスは、保護層を経て達成されなければならない。その場合、固定化され、保護された機能性成分の特定の部位への「標的」分子のアクセスをもたらす細孔が具備されている必要がある。
【００８３】
上述のことから、本発明が、そのような場合及び特定の非限定的実施態様について、固体担体を得る工程と、対象の少なくとも１つのタンパク質又はタンパク質型化合物、特に少なくとも１つの酵素又は酵素型化合物、（及び、本開示から明らかであるように）任意選択的に、少なくとも１つの任意選択の分子を担体の表面に固定化する工程と、次いで、固体担体の表面に結合した少なくとも１つのタンパク質又はタンパク質型化合物及び、妥当な場合、任意選択の分子を自己集合性構築ブロックとともにインキュベートして、固体担体の自由表面の周囲の多孔性ナノ環境並びに固体担体の表面に結合した少なくとも１つのタンパク質又はタンパク質型化合物及び任意選択の分子を得る工程を含む組成物を製造する方法に関するように表されてもよいことは明らかである。
【００８４】
上文で述べたように、保護層の構築を正確に制御することができ、特定の特性を有する層が容易に得られる。特に、層の厚さを正確に制御することができることは、上文で述べた。
【００８５】
ほとんどの場合、層が悪影響に対する十分な保護を保証するのに十分に厚い場合には、保護は、より十分であるが、過度に厚い層は、活性を低下させることを予想することができる。そのような減損は、不十分な細孔が過度に厚い層に具備されている場合、固定化され、保護された機能性成分への標的分子のアクセスが妨げられているためにもたらされるが、特に大きく、且つ／又は多数の細孔が具備されている場合、層が機能性成分を十分に封入しないので、保護が損なわれることとなる。したがって、保護層の最適な厚さが存在することを予想することができる。
【００８６】
保護層の厚さが少なくとも１つの機能性成分のより長い軸の長さの少なくとも５％、好ましくは少なくとも１つの機能性成分のより長い軸の長さの５０％−１５０％であるならば、それは、好都合である。一般的な場合、保護層の厚さは、１−１００ｎｍ、より一般的に１ｎｍ−５０ｎｍ、より一般的に１ｎｍ−３０ｎｍ、より一般的に１ｎｍ−２５ｎｍ、より一般的に１ｎｍ−２０ｎｍ、より一般的に１ｎｍ−１５ｎｍ、好ましくは５ｎｍ−１５ｎｍの範囲にある。層の最適な厚さは、考慮される特定の機能性成分、特定標的分子及び組成物が使用される可能性がある工程パラメーターによってさえ異なることがあり得ることは、理解されよう。そのような最適厚さは、他の点では同じ条件下で異なる厚さの保護層を用いて得られた活性を比較する簡単な一連の測定によって決定することができることも理解されよう。したがって、特定の工程条件に適応することが可能である。再び、厚さの好ましい値は、実験的に決定することができると述べることができる。したがって、特定の場合、本発明の組成物により具備され、本明細書で開示する保護物質は、特定の要求に適応させることができ、２ｎｍ−５０ｎｍ、特に５ｎｍ−４０ｎｍ、特に５ｎｍ−２５ｎｍ、特に１０ｎｍ−２５ｎｍ、特に５ｎｍ−２０ｎｍ、特に１０ｎｍ−２０ｎｍ、特に１５ｎｍ−２５ｎｍ、特に１５ｎｍ−２０ｎｍ、特に２０ｎｍ−２５ｎｍ又は２５ｎｍ超の厚さを有しうることは、理解されよう。
【００８７】
保護層の厚さと特定の細孔径の両方を決定する必要がある場合、これは、例えば、最初の一連の実験において最初に標的分子のサイズに少なくとも対応する細孔径により最適層厚を決定し、次いで先に見いだされた層厚により最適活性に対する細孔径を再調整し、必要な場合、改善された細孔径により最適活性に対する層厚を再調整することによって、反復して行うことができることも注意すべきである。良好な活性が少数の反復段階の範囲内で得られることが見いだされるであろう。
【００８８】
上記のことを考慮すると、保護層が機能性成分分子のより長い軸の長さの少なくとも５０％であるならば、保護層における細孔が特に有利であることは、明らかであろう。この状況において、機能性成分の固定化がランダム配向で達成されることを推測することができる。例えば、より長い軸が担体表面と一般的に平行である状態で機能性成分分子が配向した状態で固定化され、機能性成分分子の長及び短軸のアスペクト比が高い場合、厚さがより長い軸の３０％より低いとしても細孔が具備されていることは有利であり得る。同じことは、機能性成分分子が大きな側枝などを有する場合にも当てはまる。また、薄い層の場合でさえ、標的分子がかなり大きいか、又はかさばり、したがって、機能性成分への標的分子のアクセスが損なわれる場合には細孔があることが有利であり得る。
【００８９】
したがって、時として、本発明の組成物により具備され、本明細書で開示する保護物質のサイズを特定の要求に適応させ、機能性成分、すなわち、固定化タンパク質又はタンパク質型化合物、特に固定化酵素又は酵素型化合物の約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％又は１００％が保護物質により覆われるように具体化することが有利であり得ることは、理解されよう。さらに、細孔を備えることは、機能性成分分子のより長い軸と層厚との比により測定される約５％から、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％又は１００％の層厚について有利であり得ることは、理解されよう。一般的に、層が厚い場合、細孔は、ますます有利になる。
【００９０】
細孔が具備されている場合、細孔径が１ｎｍ−１０ｎｍ、特に２ｎｍ−９ｎｍ、特に３ｎｍ−８ｎｍ、特に４ｎｍ−７ｎｍ、特に４ｎｍ−６ｎｍ、特に４ｎｍ−５ｎｍであるならば、それが有利である。上記のことから、実際の細孔径は、機能性成分に到達しなければならない特定の標的分子（一又は複数）に依存することは、明らかである。組成物の使用中にそれとの相互作用のために機能性成分への分子の拡散を可能にするように細孔径を必要な大きさとするならば、それが有利である。したがって、細孔は、標的分子のサイズに少なくとも対応するサイズを有するものとする。好ましいことが示される異なる細孔径が、異なる特定の標的分子及び／又は異なる厚さの層に関連し、より厚い層については、より大きい細孔が、機能性成分の機能性部位（一又は複数）への標的分子のより容易且つ／又はより大きい程度の浸透を可能にすることを考慮すると、より大きい細孔径が有利であり得ることは、当業者により理解されよう。
【００９１】
これに関して、細孔径に影響を与え、調節することができることは、注目すべきである。したがって、本発明の組成物により具備され、本明細書で開示する保護物質中に存在する細孔のサイズは、特定の要求に適応させることができ、前記細孔径は、前記機能性成分を形成するタンパク質又はタンパク質型化合物と相互作用することとなる、分子の拡散をそれが可能とするように選択される。細孔径は、所望の官能基を有する特定の構築ブロックを選択することによって調節することができる。一般的に、より大きい官能基を用いることによって、より小さい官能基を用いる場合と比較して多孔度の増加がもたらされる。例えば、その少なくとも一部が共有結合を形成する３つの化学基及び機能性成分と非共有結合的に相互作用する第４の基を有する、保護層の構築ブロックとしてのモノマーを用いることができる。また、界面活性剤は、保護層の形成の間に臨界ミセル濃度で導入し得る。次に、大きく、かさばる基を有するモノマーを加えることができる。例として、有機シランが構築ブロックモノマーである場合、オクタデシルシラン及びトリフェニルシラン（triphenylysilane）、例えば、オクタデシルトリメトキシシラン及びトリフェニル−トリエトキシシランを用いることができる。
【００９２】
当業者は、保護層の表面から担体表面に至るまで細孔径を変化させることも可能であることを理解するであろう。例えば、後半の段階のみにおいて特定の成分を加えることによって異なる細孔径が得られるように保護層の積層が積層過程中に工程条件を変化させるのに十分に遅いため、そのような変化は実現できる。
【００９３】
特に好ましい実施態様において、保護層の表面における勾配を作るために、例えば、酵素の基質のようなタンパク質又はタンパク質型化合物と相互作用することとなる分子に対する生成する保護層の親和性を特に改善することによって、追加の機能性を導入するために、保護物質をその外表面においてさらに化学的に修飾することができる。
【００９４】
互いに相互作用することができるモノマー及び固定化機能性成分が水溶液として用意されるならば、それは有利である。モノマーの水溶液を用いることは、機能性成分の立体構造による損傷を防ぎ、ひいてはその活性を維持する助けとなる。
【００９５】
構築ブロックが自己集合反応で保護層を構築するならば、それは有利である。重合は、例えば、表面結合又は可溶性イニシエーター、水溶性不飽和モノマー又は水溶性架橋剤を用いるラジカル重合であり得るが、本発明の目的のために、重合反応は、しばしば、一般的に水性条件下でのトリアルコキシシラン及びテトラアルコキシシランなどのシリカ前駆体の重縮合である。したがって、重縮合反応を用いることは、好ましい自己集合反応である。
【００９６】
ほとんどの場合に、まだ保護されていないタンパク質又はタンパク質型化合物の活性を損ない得る開始剤などのような、さもなければ重合に用いられる特定の化学物質を加えないことが好ましい。重縮合は、水溶液中で実施することができ、この方法において、機能性成分の立体構造が保護される、又はもしあったとしてもその活性がわずかな程度に損なわれるにすぎないように少なくともわずかな程度に悪影響を受けるように、これが一般的に生体にやさしい反応環境を保証するので、そうすることが特に好ましいことが指摘される。また、重縮合は、容易に制御することができ、酵素の保護及び基質の拡散に適合する保護層の厚さ（機能性成分が酵素である場合に酵素のより長い軸、又は５０％超）が達成されることを可能にし、活性保護酵素が結果として得られる。有機シランモノマーがこの状況において有利に用いることができることが指摘される。
【００９７】
先のクレームの１つにより組成物を製造する方法が、所望の厚さを有する好ましい保護層をそのように得るために保護層の構築及び／又は保護物質の自己集合反応を停止する工程をさらに含むならば、それは有利である。担体物質の表面上の保護物質（及び／又はそのような層が既に積層された限り保護埋込み層）の重合を停止することは、重合反応を能動的に停止することによって又は重合反応の自己停止によって実施することができる。
【００９８】
保護層のモノマー構築ブロックと固定化機能性成分との間の相互作用が特に弱い力の相互作用に基づいて機能性成分のタンパク質又はタンパク質型化合物のアミノ酸側鎖間で生じるならば、それは有利である。
【００９９】
そのようなアミノ酸側鎖は、本発明により埋め込まれる機能性成分の分子の表面に存在する。異なる酸側鎖が異なる弱い力の相互作用により相互作用するので、異なる構築ブロックが異なる機能性部分及び／又は異なるアミノ酸側鎖と相互作用するように複数の異なる構築ブロックが供給されるならば、それも有利である。この状況において、弱い力の相互作用は、非共有結合性結合及び／又はｐ−ｐ（芳香族）相互作用、ファンデルワールス相互作用、Ｈ結合相互作用、イオン相互作用に関するものである。モノマー相互の相互作用が好ましくは重合反応であり得るが、モノマーと機能性成分との相互作用が好ましくは弱い相互作用であるという事実から、モノマー−モノマー相互作用は、モノマーと機能性成分との相互作用と同じ相互作用である必要はないということを推論することができる。その代わりに、一般的に相互作用は、異なるものである。さらに、固体担体の表面に対するモノマーの結合相互作用は、共有結合であり得る。
【０１００】
固定化機能性成分との相互作用のための少なくとも１つの官能基を有するモノマーを用いる場合、官能基がタンパク質又はタンパク質型化合物の表面に存在するアミノ酸の１つ又は複数のアミノ酸側鎖と弱い力の相互作用により相互作用し得るように、これらがアルコール、アミン、カルボキシレート、芳香族官能基、チオール、チオエーテル、グアニジニウム、イミダゾール、脂肪族鎖、アミド及び／又はフェノールから選択されるならば、それが好ましい。
【０１０１】
そのような官能基を有する複数の異なるモノマーが利用できるが、有機シランの使用が通常特に好ましいことに注意すべきである。
【０１０２】
特定の実施態様において、したがって、本発明は、保護物質が有機シリカである、本明細書で開示する組成物に関する。
【０１０３】
したがって、特に好ましい実施態様において、機能性成分を少なくとも部分的に埋め込む保護層を構築するための構築ブロックとして有機シランモノマーを用いる。その場合、アルコール、アミン、カルボキシレート、芳香族官能基、チオール、チオエーテル、グアニジニウム、イミダゾール、脂肪族鎖、アミド及び／又はフェノール、特にタンパク質又はタンパク質型化合物の表面に存在するアミノ酸の１つ又は複数のアミノ酸側鎖と弱い力の相互作用により相互作用する官能基から選択される固定化機能性成分と相互作用する少なくとも１つの官能基を有する有機シランモノマーが用いられるならば、それは有利である。この状況において、弱い力の相互作用は、非共有結合性結合及び／又はｐ−ｐ（芳香族）相互作用、ファンデルワールス相互作用、Ｈ結合相互作用、イオン（静電）相互作用に関連している。
【０１０４】
有機シランモノマーは、好ましくはテトラオルトシリケート、カルボキシエチルシラントリオール及び／又はベンジルシラン、プロピルシラン、イソブチルシラン、ｎ−オクチルシラン、ヒドロキシシラン、ビス（２−ヒドロキシエチル）−３−アミノプロピルシラン、アミノプロピルシラン、ウレイドプロピルシラン（Ｎ−アセチルグリシル）−３−アミノプロピルシランからなる群から選択され、特にベンジルトリエトキシシラン、プロピルトリエトキシシラン、イソブチルトリエトキシシラン、ｎ−オクチルトリエトキシシラン、ヒドロキシメチルトリエトキシシラン、ビス（２−ヒドロキシエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシラン、ウレイドプロピルトリエトキシシラン、（Ｎ−アセチルグリシル）−３−アミノプロピルトリエトキシシランから選択され、及び／又はベンジルトリメトキシシラン、プロピルトリメトキシシラン、イソブチルトリメトキシシラン、ｎ−オクチルトリメトキシシラン、ヒドロキシメチルトリメトキシシラン、ビス（２−ヒドロキシエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、アミノプロピルトリメトキシシラン、ウレイドプロピルトリメトキシシラン（Ｎ−アセチルグリシル）−３−アミノプロピルトリメトキシシランから選択され、及び／又はベンジルトリヒドロキシエトキシシラン、プロピルトリヒドロキシエトキシシラン、イソブチルトリヒドロキシエトキシシラン、ｎ−オクチルトリヒドロキシエトキシシラン、ヒドロキシメチルトリヒドロキシエトキシシラン、ビス（２−ヒドロキシエチル）−３−アミノプロピルトリヒドロキシエトキシシラン、アミノプロピルトリヒドロキシエトキシシラン、ウレイドプロピルトリヒドロキシエトキシシラン（Ｎ−アセチルグリシル）−３−アミノプロピルトリヒドロキシメトキシシランから選択される。これらのシランは、市販されているので好ましいことに注意すべきである。したがって、現在又は将来入手可能な他の有機シランも用いることができること、またしたがって、好ましいモノマーを示しているが、該リストは、本開示から他のモノマーを除外するものでないことは、本開示を考慮して当業者に明らかであろう。
【０１０５】
異なる表面アミノ酸側鎖が機能性成分の表面に一般的に存在するので、特に好ましい実施態様において、異なる有機シランモノマーを１種の単一モノマーの代わりに用いる。平均的技術者は、異なる表面アミノ酸が異なる相互作用（結合）メカニズムにより相互作用することを認識する。これは、異なる官能基を有するモノマーについても当てはまり、異なる表面アミノ酸の量に関して最適化されたモノマーの混合物を用いることが好ましい。
【０１０６】
好ましくは、本発明による方法は、したがって、構築ブロックを用意する前にタンパク質又はタンパク質型化合物の表面構造を解析又は決定し、表面構造に対応する構築ブロックを選択する工程を含む。この工程は、特に、タンパク質又はタンパク質型化合物が上述のような公知の構造を有する場合に、保護物質に対するタンパク質又はタンパク質型化合物の特異的結合を可能とするのに有用であり得る。
【０１０７】
タンパク質又はタンパク質型化合物が公知の構造を有する場合、タンパク質又はタンパク質型化合物の表面上の化学的機能を特定することができる。したがって、保護物質を調製するために用いる構築ブロックの選択は、保護物質の親和性を適応させるためにタンパク質又はタンパク質型化合物の公知の構造に依存し得る。保護物質を調製するために用いることができる、構築ブロックの選択は、保護物質の親和性をその各要求に適応させるためにタンパク質又はタンパク質型化合物の公知の構造に依存し得る。保護物質の組成は、構造構築ブロック（例えば、テトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ））及び／又は保護構築ブロック（例えば、テトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）、ｎ−プロピルトリエトキシシラン（ＰＴＥＳ）、イソブチルトリエトキシシラン（ＩＢＴＥＳ）、ヒドロキシメチルトリエトキシシラン（ＨＴＭＥＯＳ）、ベンジルトリエトキシシラン（ＢＴＥＳ）、ウレイドプロピルトリエトキシシラン（ＵＰＴＥＳ）、カルボキシエチルトリエトキシシラン（ＣＥＴＥＳ））などの反応混合物中に存在する化合物並びに水素結合、静電相互作用、疎水性相互作用又はファンデルワールス相互作用、π−πスタッキング「（ｐｉ−ｐｉ）スタッキング」などの弱い力の相互作用によるタンパク質又はタンパク質型化合物の周囲のこれらの構築ブロックの自己前組織化に依存する。
【０１０８】
したがって、少なくとも１つの機能性成分について、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓからなる群から選択される少なくとも数種の表面アミノ酸のそれぞれの量を決定し、決定に従って異なるモノマーを用いるならば、それは有利である。
【０１０９】
したがって、少なくとも１つの機能性成分の表面アミノ酸としてのＰｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐの少なくとも１つの量を決定するならば、それは有利である。そのような決定は、前記表面アミノ酸の１つのみの量又は前記表面アミノ酸のいくつかの量、好ましくはそれらのすべての和に関するものであり得る。次に、ｐ−ｐ（芳香族）相互作用により機能性成分の表面アミノ酸Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐと相互作用する官能基を有するモノマー（一又は複数）の量、特にベンジルシラン、特にベンジルトリエトキシシラン、ベンジルトリメトキシシラン又はベンジルトリヒドロキシエトキシシランの１つ又は複数の量をこの決定に従って選択する。決定は、前記表面アミノ酸の１つのみの量に、又は前記表面アミノ酸のいくつかの量、好ましくはそれらのすべて（の和）に関するものであることが指摘される。次に、機能性成分の述べた表面アミノ酸と相互作用する官能基を有するモノマー（一又は複数）の量をこの決定に従って定める場合、それぞれの相互作用を有する１つ又は複数のモノマーを保護層を構築するために選択することができる。
【０１１０】
さらに及び／又は代替手段として、少なくとも１つの機能性成分の表面アミノ酸としてのＧｌｙ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｐｒｏの少なくとも１つの量を決定し、ファンデルワールス相互作用により機能性成分の表面アミノ酸Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｐｒｏと相互作用する官能基を有するモノマーの量を決定に従って、特にプロピルシラン、イソブチルシラン、ｎ−オクチルシランの少なくとも１つ、特にプロピルトリメトキシシラン、イソブチルトリエトキシシラン、若しくはｎ−オクチルトリエトキシシランの１つ及び／又はプロピルトリエトキシシラン、イソブチルトリエトキシシラン、ｎ−オクチルトリエトキシシランの１つ、及び／又はプロピルトリヒドロキシエトキシシラン、イソブチルトリヒドロキシエトキシシラン、ｎ−オクチルトリヒドロキシエトキシシランの量を選択する。再び、決定は、前記表面アミノ酸の１つのみの量又は前記表面アミノ酸のいくつかの量、好ましくはそれらのすべての和に関するものであり得る。次に、機能性成分の述べた表面アミノ酸と相互作用する官能基を有するモノマー（一又は複数）の量をこの決定に従って定める場合、それぞれの相互作用を有する１つ又は複数のモノマーを保護層を構築するために選択することができる。
【０１１１】
さらに及び／又は代替手段として、少なくとも１つの機能性成分の表面アミノ酸としてのＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒの少なくとも１つの量を決定し、Ｈ結合相互作用により機能性成分の表面アミノ酸Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒと相互作用する官能基を有するモノマーの量を決定に従って、特にヒドロキシシラン、ビス（２−ヒドロキシエチル）−３−アミノプロピルシランの少なくとも１つの、特にヒドロキシメチルトリエトキシシラン、ビス（２−ヒドロキシエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシランの１つ、及び／又はヒドロキシメチルトリメトキシシラン、ビス（２−ヒドロキシエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシランの１つ、及び／又はヒドロキシメチルトリヒドロキシエトキシシラン、ビス（２−ヒドロキシエチル）−３−アミノプロピルトリヒドロキシエトキシシランの１つの量を選択する。再び、機能性成分の述べた表面アミノ酸と相互作用する官能基を有するモノマー（一又は複数）の量をこの決定に従って定める場合、それぞれの相互作用を有する１つ又は複数のモノマーを保護層を構築するために選択することができる。
【０１１２】
さらに及び／又は代替手段として、少なくとも１つの機能性成分の表面アミノ酸としてのＡｓｐ、Ｇｌｕの少なくとも１つの量を決定し、イオン相互作用により機能性成分の表面アミノ酸Ａｓｐ、Ｇｌｕと相互作用する官能基を有するモノマーの量を決定に従って、特にアミノプロピルシランの、特にアミノプロピルトリメトキシシラン、アミノプロピルトリヒドロキシエトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシランの少なくとも１つの量を選択する。再び、機能性成分の述べた表面アミノ酸と相互作用する官能基を有するモノマー（一又は複数）の量をこの決定に従って定める場合、それぞれの相互作用を有する１つ又は複数のモノマーを保護層を構築するために選択することができる。
【０１１３】
いくつかの表面アミノ酸側鎖が異なるメカニズムにより相互作用し得ることが指摘される。モノマー混合物を特定の表面アミノ酸側鎖の量に従って適応させる場合、これを考慮に入れることができる。
【０１１４】
上記から導かれることは、例えば、標的酵素のアミノ酸表面分析に基づいて、機能性成分を規定する酵素の表面に存在する大部分のアミノ酸が負に荷電している場合、正に荷電した官能基を有するより多くの有機シランを構築ブロック混合物に加えるべきであるということである。このようにして、混合物の有機シランは、用いるために埋め込むことによって保護される酵素とより十分に相互作用する（非共有結合の形で）。
【０１１５】
担体は、任意の固体担体、例えば、チップ又は同様のものであり得るが、ほとんどの用途において固体担体が特に２０−１０００ｎｍ、特に２００−５００ｎｍ、特に３００−４００ｎｍの範囲の粒径を有する粒子状担体であるならば、それは有利である。
【０１１６】
この状況において、所定の粒子に結合することができる又は結合するタンパク質又はタンパク質型化合物分子の数、すなわち、個々の機能性成分分子の数は、担体粒子のサイズと前記タンパク質又はタンパク質型化合物分子のサイズの比に依存することを注意すべきである。より大きい粒子については、明らかに前記数の統計的な変動があり得る。タンパク質又はタンパク質型化合物がナノ粒子と同様のサイズを有する場合、粒子１個当たり１個のタンパク質又はタンパク質型化合物分子が結合し得る。この例における同様のサイズは、０．５％−１０％の範囲にあるサイズの差を意味する。
【０１１７】
一実施態様において、粒子とタンパク質又はタンパク質型化合物のサイズの比は、それがナノ粒子１個当たり１０−２００個、特に５０−２５０個、特に２０−１５０個のタンパク質又はタンパク質型化合物の結合を可能にするようなものである。特定の実施態様において、ナノ粒子は、ナノ粒子１個当たり２００個のタンパク質又はタンパク質型化合物の結合を可能にするサイズを有する。そのような比は、そのような比で、少量の組成物をプロセス容器、生物体又は同様のものの中に加えることは、かなり大量の活性機能性成分の添加と同等であるため好ましい。
【０１１８】
しかし、かなり大きな粒子状担体を用いることにより、使用後にろ過することにより組成物を流体から分離することができることを注意すべきである。いくつかの場合に、例えば、生きた生物体内の組成物の輸送を可能にするために、小さな粒子担体を用いることは、より好ましいことがあり得るが、より大きなサイズの粒子、特に少なくとも１０００ｎｍ、最大で１００μｍのサイズを有する粒子を本発明の範囲内で用いる場合もあり得る。
【０１１９】
したがって、担体は、ナノ粒子、特に、有機ナノ粒子、無機ナノ粒子、有機−無機複合ナノ粒子、自己集合有機ナノ粒子、メソ多孔性シリカナノ粒子（ＳＮＰ）、金ナノ粒子、チタンナノ粒子の群から選択されるナノ粒子であり得る。
【０１２０】
担体のサイズにかかわりなく、担体物質は、有機シランをモノマーとして用いる場合に特に好ましいケイ素酸化物表面を有し得る。
【０１２１】
タンパク質及びタンパク質型化合物から選択される前記機能性成分が酵素又は酵素型化合物、特にオキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ及び／又はリガーゼからなる群から選択される酵素又は酵素型化合物であるならば、それは、可能であり、有利である。
【０１２２】
保護は、固体担体、タンパク質及びタンパク質型化合物から選択され、固体担体の表面上に固定化された少なくとも１つの機能性成分、並びに機能性成分を少なくとも部分的に埋め込むことにより機能性成分を保護するための保護層を含む組成物についても求められ、機能性成分を保護するための保護層は、相互に、及び固定化機能性成分と相互作用することができる構築ブロックモノマーにより構築された層である。
【０１２３】
再び、埋め込みは、機能性成分（その少なくとも大多数又は大部分）が使用時まで、好ましくは使用の終了まで埋め込まれたままであるようなものであり、意図した使用中に洗い落とされることを意図するものでもなく、洗い落としも起こるものでもない。
【０１２４】
平均的な技術を有する読者は、タンパク質が極めて異質なクラスの生体巨大分子を含むことを認識している。多くは、それらの天然環境にない場合には不安定である。特定の緩衝条件が維持されなければ、抽出されたタンパク質は、適切に機能しないか、又は可溶性のままであり得る。タンパク質は、最適に及ばない温度、タンパク質溶解、凝集及び最適に及ばない緩衝条件の結果として構造の完全性及び活性を失い得る。
【０１２５】
本発明によれば、本明細書で開示する組成物の保護物質は、タンパク質又はタンパク質型化合物、特に酵素又は酵素型化合物に天然条件から逸脱している環境条件からの保護をもたらす。
【０１２６】
特に、タンパク質又はタンパク質型化合物、特に酵素又は酵素型化合物は、以下から保護される。
ａ）最適に及ばないｐＨ、及び／又は
ｂ）化学的ストレス、及び／又は
ｃ）生物学的ストレス、及び／又は
ｄ）溶媒、及び／又は
ｅ）物理的ストレス。
【０１２７】
「最適に及ばないｐＨ」は、少なくとも１種のタンパク質又はタンパク質型化合物に対する最適ｐＨと例えば、＋／−５、＋／−４、＋／−３、＋／−２、＋／−１、＋／−０．５ｐＨ単位異なるｐＨを意味する。本発明の組成物がより極端な条件にさらされる場合、保護層は、そのような条件に適応し得ることは、平均的技術者により理解されよう。
【０１２８】
本明細書で用いている「化学的ストレス」という用語は、溶媒による希釈、望ましくない反応物、例えば、農薬、殺虫剤、汚染空気及び／又は水、水銀又は鉛などの重金属、アスベスト又は放射性廃棄物、化学療法に用いられる化合物、又は毒素による汚染によってもたらされる状態を含むが、これらに限定されない。特に、酵素は、それらの最適緩衝液系と異なる溶媒中で不安定である。
【０１２９】
本明細書で用いている「生物学的ストレス」という用語は、プロテアーゼ活性、酸化ストレス、カスパーゼ活性、天然酵素阻害剤、低基質濃度、高輝度光曝露、ＵＶ光曝露、低ＡＴＰレベル、望ましくないタンパク質による汚染、ホスファターゼ活性及び薬物代謝によってもたらされる状態を含むが、これらに限定されない。
【０１３０】
本明細書で用いている「物理的ストレス」という用語は、せん断力、乾燥、圧力及び真空誘発ストレスを含むが、これらに限定されない。
【０１３１】
一実施態様において、本発明は、保護物質がタンパク質又はタンパク質型化合物に、保護されていないタンパク質の不活性化及び／又は変性につながり得る、最適に及ばない温度からの保護をもたらす、本明細書に開示する組成物に関する。
【０１３２】
タンパク質が酵素である場合、本明細書に開示する固定化され、保護された酵素は、最適反応温度より高く、対象の酵素が低い活性を有し得る、最適に及ばない温度下でその活性及び構造の完全性を保持することができる。特に、本発明は、保護物質が、タンパク質又はタンパク質型化合物に、保護されていないタンパク質又はタンパク質型化合物の最適温度を６０℃、特に５０℃、特に４０℃より高い、特に３０℃、特に２０℃、特に１０℃、特に５℃超える、高温からの保護をもたらす、本明細書に開示する組成物を提供する。特定の実施態様において、タンパク質又はタンパク質型化合物は、酵素又は酵素型化合物である。本発明により達成された緊密な封入は、したがって、極度の悪条件下でさえ機能性成分を保護するものである。
【０１３３】
したがって、組成物を触媒工程及び／又は他の工業工程に用いるならば、それは、可能であり、有利であり、組成物は、様々な触媒工程に用いることができる。
【０１３４】
特に、本発明の組成物を触媒工程に用いることが可能であり、該工程中、組成物は、特にｐＨ値が機能性成分に最適なｐＨと少なくとも＋／−０．５ｐＨ単位及び／又は最大＋／−５ｐＨ単位異なるような機能性成分の最適ｐＨと異なる少なくとも１つのｐＨに、並びに／あるいは化学的ストレスに、及び／又は生物学的ストレスに、及び／又は溶媒に、及び／又は物理的ストレスに、並びに／あるいは機能性成分の最適温度を少なくとも５℃、及び／又は最大６０℃、特に５０℃、特に４０℃より高い、特に３０℃、特に２０℃、特に１０℃超える、高温に、及び／又は機能性成分の最適温度から少なくとも５℃、及び／又は最大６０℃逸脱している、低温にさらされる。
【０１３５】
一実施態様において、本発明は保護物質がタンパク質又はタンパク質型化合物に、最適温度より低く、保護されていないタンパク質の不活性化及び／又は変性につながり得る、低温からの保護をもたらす、本明細書に開示する組成物に関する。
【０１３６】
タンパク質が酵素である場合、本明細書に開示する固定化され、保護された酵素は、最適反応温度より低く、対象の酵素が低い活性を有し得る、最適に及ばない温度下でその活性及び構造の完全性を保持することができる。特に、本発明は、保護物質が、タンパク質又はタンパク質型化合物に、保護されていないタンパク質又はタンパク質型化合物の最適温度から６０℃、特に５０℃、特に４０℃、特に３０℃、特に２０℃、特に１０℃、特に５℃逸脱している、低温からの保護をもたらす、本明細書に開示する組成物を提供する。特定の実施態様において、タンパク質又はタンパク質型化合物は、酵素又は酵素型化合物である。
【０１３７】
本発明の他の実施態様において、本明細書に開示する組成物は、生体触媒システムである。特に、対象の少なくとも１つのタンパク質又はタンパク質型化合物は、酵素又は酵素型化合物である。
【０１３８】
特に、酵素又は酵素型化合物は、例えば、ラッカーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、オキシゲナーゼ、レダクターゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ及び／又はエステラーゼなどのオキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ及び／又はリガーゼの群から選択される。
【０１３９】
したがって、特に、本発明による、本明細書で開示する組成物は、食品加工又は醸造に用いることができる。したがって、本発明による、本明細書で開示する組成物は、食品加工、特に酪農製品の加工、醸造、果汁の加工、特に果汁浄化、砂糖製造、軟化肉生産、ワイン製造等・・・に用いることができる。さらに、本発明による、本明細書で開示する組成物は、除染工程、解毒工程、デンプン産業、製糸業、バイオ燃料産業、ゴム産業、写真産業、又は洗剤製造に用いることができる。特に、本発明による開示組成物は、追加の反応サイクルにおいて再使用するためにリサイクルすることができる。ここで、触媒工程に本発明による組成物を使用することは、非常に有利である。
【０１４０】
さらに、本発明の組成物は、除染工程、特に酵素依存性除染工程にも用いることができる。例えば、組成物は、炭化水素、芳香族炭化水素、殺虫剤、毒素、溶媒、農薬及び／又は重金属などの望ましくない化合物を除去又は分解するために用いることができる。本発明の組成物は、したがって汚染された土壌又は水を浄化するために用いることができる。例えば、本発明による組成物は、汚染物質を除去又は分解することにより廃水を精製するために用いることができる。
【０１４１】
本発明による組成物は、浸透法により水を処理するための充填層反応器システムの調製に直接用いることができる。さらなる可能な技術は、廃水を処理するためのろ過膜におけるタンパク質又はタンパク質型化合物の固定化／埋込みである。この応用は、発展途上国に適切であり得る、家庭用水の浄化用のフィルターの形で見ることができる。
【０１４２】
原理上は、本発明による組成物は、あらゆる触媒工程、すなわち、少なくとも１つの特定のタンパク質、特に酵素の使用に基づくあらゆる工程に用いることができる。
【０１４３】
天然タンパク質又は酵素の代わりに本発明による組成物を用いることは、タンパク質又は酵素をリサイクルし、それにより、他の反応サイクルに再度用いることができるという利点がある。これにより、対象のタンパク質、特に、対象の酵素を製造又は単離するためのコスト及び努力が削減される。組成物を保護されていない対象のタンパク質の代わりに用いる場合、複数の生体触媒反応を達成できるので、対象のタンパク質の必要な総量は、より少ない。さらに、本発明による組成物は、大規模に製造することができ、これにより、基質の高生産性がしばしば要求される、工業製造工程での使用に特に適するものとなる。単離又は組換えタンパク質、特に酵素は、様々な産業部門で数種の応用がなされている。例えば、酵素は、食品産業、化学産業及びタンパク質技術に用いられている。特に、それらは、鏡像異性的に純粋なアミノ酸、フルクトースなどの希少糖、ペニシリン及びその誘導体、洗浄剤並びに他の化合物の製造に用いることができる。本発明による固定化及び保護酵素は、その生体触媒活性を高めるために遺伝的に最適化することもできる。
【０１４４】
本発明の組成物が機能性成分の特に十分な保護をもたらし、ひいては極度の悪条件下での組成物の使用を可能にするという事実。これは、完全に新たな応用への又は活性の急速な低下とそれによる結果として生じる（保護されていない）機能性成分の量を増加させる必要性のためさもなければ高価すぎて使用できない物質の使用への道をしばしば開くものであるので、好都合である。
【０１４５】
本発明はさらに、本明細書で開示する、非毒性である組成物に関する。さらに、本発明による組成物は、大規模生産に適している。
【０１４６】
したがって、該組成物をヒト又は動物の治療、特に哺乳動物の治療に用いるならば、それは、可能であり、有利である。したがって、本明細書で述べる本発明の組成物は、ヒト又は動物の治療に用いることができるように、薬学的組成物として製剤化することができる。
【０１４７】
特に、該組成物は、スフィンゴミエリナーゼ欠乏（ＡＳＭＤ）症候群、ニーマン−ピック病（ＮＰＤ）、リソソーム蓄積症、ゴーシェ病、ファブリー病、ＭＰＳＩ、ＭＰＳＩＩ、ＭＰＳＶＩ糖原病ＩＩ型、癌、アレルギー性疾患、代謝疾患、心血管疾患、自己免疫疾患、神経系疾患、リンパ系疾患及びウイルス性疾患の１つの治療に用いることができる。
【０１４８】
本明細書で述べる本発明による組成物は、特定の酵素の欠乏又は非存在によって引き起こされる疾患に罹患している患者における酵素補充療法（ＥＲＴ）に用いることができる。本発明の固定化され、保護された形で欠乏又は欠失酵素を含む組成物は、単独で又は前記疾患の治療に用いられる他の薬剤と併用して動物、特に哺乳動物、さらに特にヒトに投与することができる。
【０１４９】
特に、癌の治療において、本発明による、本明細書で述べる組成物は、保護層により保護された酵素を具備することができ、その触媒活性は、生存のために癌細胞により必要とされる１つ又は複数の代謝物の枯渇をもたらす。
【０１５０】
例えば、特定の癌においては、癌細胞は、酵素、例えば、これらの細胞をアルギニンに対する栄養要求性にする、アルギニノコハク酸シンテターゼを欠いている。例えば、保護層により保護されたアルギナーゼのようなアルギニン分解酵素を含む本発明による、本明細書で述べる組成物を供給することによってアルギニンのレベルを枯渇させることは、癌細胞にとって致命的となるが、正常細胞は、影響を受けないままであるか、又は少なくとも致命的な影響を受けない。
【０１５１】
他の態様において、本発明による、本明細書で開示する組成物は、疾患、障害若しくは状態又は前記疾患の症状を治療するための薬学的組成物の調製に用いることができる。
【０１５２】
薬学的組成物は、本発明の、本明細書で述べる組成物に加えて、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を含み得る。本発明の組成物は、治療上及び／又は予防上有効量で供給することができる。
【０１５３】
例えば、本発明の、本明細書で開示する組成物は、クリーム剤、錠剤、丸剤、生体接着性貼付剤、スポンジ剤、フィルム剤、ロゼンジ剤、硬質キャンディ、カシェ剤、スフェア、ロリポップ、ディスク状構造又は噴霧剤として製剤化することができる。
【０１５４】
組成物は、それを必要とする対象に全身、鼻腔内、頬側、経口、経粘膜、気管内、静脈内、皮下、尿路内、膣内、舌下、気管支内、肺内、経皮又は筋肉内投与により投与することができる。
【０１５５】
本発明による組成物は、体内への投与後のタンパク質又はタンパク質型化合物の分解、特にタンパク質又はタンパク質型化合物のプロテアソーム分解を防ぐためにさらに用いることができる。タンパク質は、小タンパク質、いわゆるユビキチンによりプロテアソーム分解のために連結される。本発明による組成物を用いることにより、対象のタンパク質又はタンパク質型化合物のユビキチン連結が防止され、ひいてはプロテアソームによるタンパク質又はタンパク質型化合物の分解も防止され得る。その結果、投与されたタンパク質又はタンパク質型化合物のレベルを患者の血液及び組織中でより長期間にわたって安定に維持することができる。
【０１５６】
上述のことから、本発明の一部は、とりわけ、担体、特に固体担体の表面に固定化された少なくとも１つのタンパク質又はタンパク質型化合物を含み、前記タンパク質又はタンパク質型化合物が自己集合構築ブロックを含む保護物質に完全又は部分的に埋め込まれている、組成物を提供すると考えることができることが理解されよう。保護物質のこれらの構築ブロックは、担体表面上及び担体表面上に固定化されたタンパク質又はタンパク質型化合物の周囲における自己集合反応を受けて、固定化タンパク質又はタンパク質型化合物の周囲の多孔性ナノ環境を構築することができる。前記多孔性ナノ環境の構築は、保護物質により具備されており、タンパク質又はタンパク質型化合物の天然立体構造が安定化し、その機能が保存されるようにタンパク質又はタンパク質型化合物の化学基と相互作用する、選択される官能基の存在によって達成され得る。
【０１５７】
より詳細で、具体的な実施態様によれば、本発明は、とりわけ、担体、特に固体担体の表面に固定化された少なくとも１つのタンパク質又はタンパク質型化合物を含み、前記タンパク質又はタンパク質型化合物が自己集合構築ブロックを含む保護物質に完全又は部分的に埋め込まれている、組成物を提供すると理解することができる。
【０１５８】
本明細書で用いているように、保護物質は、重合反応の能力があり、担体物質の表面に供給することができる、物質に関するものと解釈することができる。好ましくは、保護物質は、モノマー物質であるか、又はそのようなモノマー物質を大きな割合で含み、液相で供給される。重合時に、保護物質は、担体表面上及び固体担体の表面に固定化された少なくとも１つのタンパク質又はタンパク質型化合物の周囲に自己集合することができる。このようにして、少なくとも１つのタンパク質又はタンパク質型化合物は、担体物質の表面から少なくとも１つのタンパク質又はタンパク質型化合物の方向に又は少なくとも１つのタンパク質又はタンパク質型化合物から担体物質の表面方向に又は両方に成長した保護層に埋め込まれた状態になる。重合した後、保護物質は、通常固相で存在する。
【０１５９】
本発明による好ましい方法を適用することにより、重合保護物質は、保護物質により完全又は部分的に埋め込まれている、タンパク質又はタンパク質型化合物の周囲の多孔性ナノ環境をもたらす。好ましい実施態様において、保護物質は、有機シランモノマー（一又は複数）であるものとする。
【０１６０】
好ましい実施態様において、組成物は、シリカのＡＰＴＥＳ修飾及びグルタルアルデヒド架橋結合化学によってシリカ上の酵素の固定化が達成され、次いで、鋳型としての酵素の周囲の有機シランモノマーの自己集合が達成され、重縮合反応中の添加物の使用の必要性により水中での有機シランモノマーの制御重縮合が達成されることによって得られる。
【０１６１】
「完全に埋め込まれたタンパク質又はタンパク質型化合物」という表現が本明細書で用いられている場合、それは、本発明による対象のタンパク質又はタンパク質型化合物が本発明の様々な実施態様で定義されている自己集合保護物質により１００％覆われていることを意味するものとする。
【０１６２】
「部分的に埋め込まれたタンパク質又はタンパク質型化合物」という表現及び本明細書で用いている同様の表現は、本発明によるタンパク質又はタンパク質型化合物が本発明の様々な実施態様で定義されている自己集合保護物質により十分には覆われておらず、したがって、タンパク質又はタンパク質型化合物が保護物質に完全には埋め込まれていないことを意味するものとする。本発明の様々な実施態様において、対象のタンパク質又はタンパク質型化合物の５％以上が保護物質により覆われている可能性があるが、一般的にはより多く少なくとも１０％が覆われ、それにより、機能性成分の保護が改善される。そのような最小限の埋込みは、時として十分であるが、一般的に、機能性成分のより十分な保護と保持のためにはより高い程度の埋込みが好ましく、したがって、一般的にとりわけ少なくとも５０％の埋込みがもたらされる。特に好ましい実施態様において、埋込みは、対象のタンパク質又はタンパク質型化合物の少なくとも８０％、特に少なくとも９０％、特に少なくとも９９％が自己集合保護物質により覆われているものとする。したがって、機能性成分が一般的に洗い落とされないような程度の埋込みを選択することが極めて好ましいことは、明らかである。機能性成分の分子の形状を円形又は円筒形と仮定すると、少なくとも５０％の埋込みが用いられ、単に幾何学的考慮から一般的に少なくとも７０％の埋込みが好ましいが、側鎖などの存在によって、より低い程度、例えば、３０％が洗い落としを防ぐのに既に十分であり得ることは明らかである。再び、洗い落としの尺度を容易に決定することができ、したがって、保護層の十分な厚さ又は埋込みの程度を決定することができることを注意すべきである。
【０１６３】
他方で、保護を改善するために機能性成分保持保護層の厚さが過度になることは、必要でない。機能性成分分子がほぼ覆われ又は完全に覆われ（すなわち１００％まで）、保護層の厚さをさらに増加させる必要がない場合、機能性成分分子をぴったりとオーバーラップする架橋結合物質による機能性分子の保持及び化学物質による攻撃からの保護の両方は、十分なものである。より厚い層によって拡散が減少するならば、化学的攻撃からのある程度の付加的な保護が得られることがあり得るが、約２００％より厚い層を有する必要はほとんどない。一般的に層は、機能性成分のより長い軸の長さの１５０％より小さく、最もしばしば層は、約１２０％より小さく、好ましい場合、１１０％さえ超えない。小さい機能性成分分子についてさえ、層の上の架橋結合物質による保持力は、ほとんどの場合及び摩耗条件などにおいてさえ十分であり、そのような層の耐久性は、ほとんどの工程について十分である。
【０１６４】
本発明の特定の実施態様において、タンパク質又はタンパク質型化合物が共有結合により担体物質の表面に結合することも上文で既に開示した。共有結合タンパク質又はタンパク質型化合物は、保護物質の重合のための安定な条件をもたらし得るタンパク質又はタンパク質型化合物を支える担体物質の安定な表面に寄与する。
【０１６５】
特定の実施態様において、本発明の組成物に具備され、本明細書で開示する保護物質が、担体の自由表面上及び担体の表面に固定化された固定化タンパク質又はタンパク質型化合物の周囲に自己集合する、モノマー構築ブロックから構成され得ることも平均的技術者によって理解されよう。次に保護物質のモノマー構築ブロックは、担体の自由表面上で自己集合し、担体表面に固定され（かなり強い結合力により）、固定化されたタンパク質又はタンパク質型化合物の周囲の多孔性ナノ環境をもたらす、保護層が生成されるように、担体表面上に具備された反応性基との、自己集合構築ブロックによる結合、特に共有結合を形成する。多孔性ナノ環境は、固体担体の表面上に固定化された少なくとも１つのタンパク質又はタンパク質型化合物を本明細書で定義した環境ストレス、ｐＨストレス、生物学的ストレス、機械的ストレス及び／又は物理的ストレスを含む様々なストレスから保護する。多孔性ナノ環境はさらに、小分子が細孔を経て移動し、対象の固定化されたタンパク質又はタンパク質型化合物と相互作用することを可能にする。保護層に細孔を具備することにより架橋結合物質によりもたらされる保持力が低下し得るが、そのような力は、十分過ぎるものであることは、平均的技術者により理解されよう。
【０１６６】
特に好ましい実施態様において、保護層の表面における勾配を作るために、例えば、酵素の基質のようなタンパク質又はタンパク質型化合物と相互作用する分子に対する生成した保護層の親和性を特に改善することにより、さらなる機能性を導入するために、保護物質をその外表面上でさらに化学的に修飾することができる。
【０１６７】
本明細書で開示する本発明によれば、機能性成分として用いる、埋め込まれ、保持された酵素又は酵素型化合物の触媒部位を保護し、その機能性を保護し、保存することは、可能である。したがって、本発明の組成物に備えられ、本明細書で開示する前記固定化され、保護された酵素又は酵素型化合物は、例えば、
ａ）遊離の保護されていない酵素と比較したときストレス条件下で活性の増加、及び／又は
ｂ）遊離の保護されていない酵素と比較したとき連続操作で使用するための回収可能性の増加
を有する。
【０１６８】
本明細書で用いている「活性の増加」は、同じ試験方法において、同じ条件下で試験した場合に、結合させず、保護されない形で用意した場合の同じ酵素又は酵素型化合物の活性より高い、固定化され、保護された酵素又は酵素型化合物の活性を意味すると理解される。特に、前記増加は、約５％、特に約１０％、特に約１５％、特に約２０％、特に約２５％、特に約３０％、特に約３５％、特に約４０％、特に約４５％、特に約５０％、特に約５５％、約６０％、特に約７０％、特に約８０％、特に約９０％、特に約１００％、特に約１１０％、特に約１２０％、特に約１３０％、特に約１４０％、特に約１５０％、特に約１６０％、特に約１６５％である。活性の増加の正確な量は、機能性成分、必要な細孔径、層厚などのパラメーター及び工程パラメーターによって異なるが、一般的に、少なくとも１０％の増加を予想することができることが理解されよう。
【０１６９】
次に、「回収可能性の増加」は、本発明の目的のために産業上又は実験室での使用において、すなわち、組成物が治療目的のために投与されない場合に、数回再使用される本発明による組成物の能力を意味すると理解される。特に、本発明の、本明細書で述べる組成物は、２−３０回、特に５−３０回、特に１０−３０回、特に１５−３０回、特に２０−３０回、特に２５−３０回、特に少なくとも３０回再使用することができる。ここで、「回収可能性の増加」は、組成物の機械的回収及び実際の工程後の組成物の損傷の防止の両方に依存するが、一般的に、工業工程への十分な適応が認められる場合には著しい損失を伴わずに少なくとも２回であると予想することができる。
【０１７０】
本発明はさらに、特定の実施態様において、アダプター分子、アンカー分子、足場分子及び／又は受容体分子の群から選択される少なくとも１つの分子を任意選択的にさらに含む、本明細書で開示する本発明の組成物に関する。これらの分子の何れかは、基質（標的）分子を結合させ、安定化し、捕獲し、捕捉し又は捕らえるために用いることができる。これにより、基質又は相互作用パートナーを機能性成分、すなわち、タンパク質又はタンパク質型化合物、特に酵素又は酵素型化合物のより近くに至らせ、それにより、タンパク質又はタンパク質型化合物とその基質又は相互作用パートナーとの相互作用を促進することができる。
【０１７１】
一実施態様において、本発明は、タンパク質若しくはタンパク質型化合物及び／又は少なくとも１つの任意選択の分子が固体担体の表面に共有結合している、本明細書で開示する組成物に関する。タンパク質若しくはタンパク質型化合物及び／又は少なくとも１つの任意選択の分子は、例えば、二官能性架橋剤、特にグルタルアルデヒドのような担体の表面上に具備された、反応性基により固体担体の表面に結合させることができる。
【０１７２】
本発明による組成物は、検査される対象の試料に疾患又は障害の診断のために用いることができ、担体の表面上に固定化されたタンパク質又はタンパク質型化合物が、特定の相互作用パートナーに結合する、捕獲分子であり、前記特定の相互作用パートナーの存在又は非存在が、前記対象が疾患に罹患しているかどうかを示す。適切な捕獲分子の例は、特異的抗体又はその機能的に同等の部分である。
【０１７３】
さらに、本発明による組成物は、検査される対象の試料に疾患又は障害の診断のために用いることができ、担体の表面上に固定化されたタンパク質又はタンパク質型化合物が酵素であり、酵素が、起こる場合には前記試料中の特定の分子の存在を示す、反応を触媒し、特に、酵素が、分子の少なくとも１つが前記試料に由来する、少なくとも２つの分子の間の反応を触媒する。例えば、陽性反応は、溶液の色の変化又は分子の沈殿、したがって、溶液中の固体の形成であり得る。
【０１７４】
検査を受ける対象における疾患又は障害又は特定の病状の診断の方法は、
ａ）前記対象から試料を得る工程と、
ｂ）陰性コントロール基準として健常対象から試料を得る工程と、
ｃ）陽性コントロール基準としてこの疾患に罹患している対象から試料を得る工程と、
ｄ）工程ａ）−ｃ）で得られた試料のそれぞれに存在する特定の分子の量を測定する工程と、
ｅ）工程ｄ）で得られた試料のそれぞれに存在する前記分子の量を比較する工程と
を含み得る。
【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１Ａ】固体担体物質上の保護酵素の製造の工程の概略図である；  ａ）酵素を固体担体物質に結合させる；  ｂ）保護層が固定化触媒の周囲に成長する；  ｃ）時間とともに保護層が酵素を完全に取り囲むことができる。
【図１Ｂ】酵素保護戦略の略図である；  ａ：固体シリカ支持体（黒）への酵素（円形）の固定化；  ｂ：酵素の周囲の保護層構築ブロックの自己集合；  ｃ及びｄ：保護層の成長（灰色）。
【図２Ａ】担体物質として用いたシリカナノ粒子（ＳＮＰ）のＳＥＭ顕微鏡写真である。
【図２Ｂ】４（左）、  ６（中央）  及び２０時間の  保護層の成長後の酵素固定化ＳＮＰのＳＥＭ顕微鏡写真である。
【図３】４、６及び２０時間の反応の後に測定した保護層の厚さを示すグラフである。
【図４】漸増時間にわたり４２℃で熱ストレスをかけた  遊離（黒四角）  及び  保護（白四角）  酵素の相対活性を示すグラフである（活性値は、熱ストレスをかけずに測定した初期活性値で標準化されている）。
【図５】漸増反応温度において測定した  遊離（黒四角）  及び  保護（白四角）  酵素の相対活性を示すグラフである。
【図６】異なるｐＨ値でインキュベートし、ｐＨ６．５で測定した  遊離（白色バー）  及び  保護（黒色バー）  酵素の相対活性を示すグラフである（活性値は、初期活性値で標準化されている）。
【図７】異なるｐＨ値で測定した  遊離（白四角）  及び  保護（黒四角）  酵素の相対活性を示すグラフである（活性値は、ｐＨ６．５で観測された最大活性で標準化されている）。
【図８】シラン層の成長中の  相対酵素活性を示すグラフである（活性値は、保護層の非存在下での固定化触媒の活性で標準化されている）。
【図９】漸増熱ストレス持続時間（６５℃）における  保護（黒四角）  及び  参照遊離酵素（白四角）  の相対酵素活性を示すグラフである（活性値は、温度ストレス前の固定化触媒の活性で標準化されている）。
【図１０】本発明による他の例の漸増反応時間において測定した保護層の厚さを示すグラフである。
【図１１】５０℃で１時間熱ストレスをかけた  遊離ラクターゼ  及び  ＡＰＴＥＳ−ＴＥＯＳ混合物で構成された層で  又は  シラン混合物で構成された層で  保護されたラクターゼ  の相対活性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０１７６】
固体担体物質上の保護酵素の製造の工程の概略図を示す図１Ａ）によれば、酵素を最初に固体担体物質に結合させる、ｃｍｐ．ａ）。次に、保護層が固定化触媒の周囲に成長する、ｃｍｐ．ｂ）。その後、時間とともに保護層が酵素を完全に取り囲むことができる、ｃｍｐ．ｃ。
【０１７７】
次に、図１：Ｂ）に酵素保護戦略の略図を示す。最初に、固体シリカ支持体黒）への酵素（円形）の固定化、ｃｍｐ．ａ）。次に、酵素の周囲の保護層構築ブロックの自己集合が起こる。次に、ｃｍｐ．ｃ＆ｄ、保護層が成長する（灰色）。酵素の周囲の環境（すなわち、酵素外表面と有機シリカ層に形成された空洞との相互作用）は、大きな立体構造安定化効果をもたらす。この例では、担体物質は、シリカ（ナノ粒子）であり、保護層は、シリカ前駆体（テトラオルトシリケート及び有機シラン）の重縮合反応により生成した有機シリカ（ポリシルセスキオキサン）である。
【０１７８】
適切に折りたたまれた酵素のみが活性であり得るので、活性の測定からストレスに対する三次タンパク質構造の安定化の増大が達成されたと結論付けられることが指摘される。
【０１７９】
図２Ａ）に担体物質として用いたシリカナノ粒子（ＳＮＰ）のＳＥＭ顕微鏡写真を示し、４（左）、６（中央）及び２０時間の保護層の成長後の酵素固定化ＳＮＰのＳＥＭ顕微鏡写真を図２Ｂに示す。
【実施例】
【０１８０】
実施例１：  固体担体物質へのラクターゼの固定化及び有機シリカ（すなわち、シルセスキオキサン）層による保護
シリカナノ粒子（ＳＮＰ）などの固体担体物質へのラクターゼ／β−ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２３）の固定化及び保護には、以下の通りである４つの主要な工程を必要とする。
ｉ．  酵素とのさらなる化学結合のためのアンカーポイント（すなわち、アミン）を導入するためのＳＮＰの表面修飾
ｉｉ．  導入されたアミン部分と二官能性架橋剤（例えば、グルタルアルデヒド）との化学反応
ｉｉｉ．  二官能性架橋剤の自由活性官能基を介するＳＮＰの表面における酵素の結合
ｉｖ．  保護層を得るための固定化酵素及びＳＮＰの自由表面の両方の周囲のシラン構築ブロックの重縮合
【０１８１】
この合成手順は、酵素を取り囲み、それにより保護するＳＮＰの表面における保護層を生成することを可能にする。生成する保護層の厚さは、対象用途に依存する設計により調節することができる。
【０１８２】
ｉ）ＳＮＰは、Ｉｍｈｏｆ等の報告（J. Phys. Chem. B 1999, 103, 1408）を改変した従来のＳｔｏｂｅｒの方法を用いて次のように製造した。エタノール（３４５．４ｍｌ）、アンモニア２５％（３９．３ｍｌ）及びＴＥＯＳ（テトラエチルオルトシリケート、１５．３ｍｌ）を丸底フラスコ中で混合し、この混合物を６００ｒｐｍで２０℃の一定温度で２０時間撹拌した。得られた沈殿をエタノールで２回、水で２回洗浄し、凍結乾燥して、走査型電子顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、ＳＵＰＲＡ４０ＶＰ）を用いて特性評価した裸のＳＮＰを得た。取得した顕微鏡写真は、ａｎａｌｙｓｉｓ（登録商標）（Ｏｌｙｍｐｕｓ）ソフトウエアパッケージを用いた粒子径測定のために用いた（１００回の測定について統計解析を行った）。図２Ａに製造されたＳＮＰの代表的な顕微鏡写真を示す。
ｉｉ）保護されるべき酵素のさらなる固定を可能にするアミン官能基をＳＮＰの表面に導入するために、それらをアミノシランと反応させた。保護層のさらなる結合のためのシラノール基を残すように、この修飾は部分的にのみであるべきであることに注意することが重要である。
より詳細には、水中に懸濁したＳＮＰ（１８ｍＬ；３．２ｍｇ／ｍｌ）をＡＰＴＥＳ（３−アミノプロピルトリエトキシシラン、１１ｍｇ）とともに２０℃で９０分間インキュベートした。水での２回の洗浄工程の後、得られたアミノ修飾ＳＮＰを１ｇ／Ｌの最終濃度の二官能性架橋剤（酵素のさらなる固定化を可能にするための）グルタルアルデヒドと３０分間反応させた。
ｉｉｉ）水での２回の洗浄工程の後、得られたＳＮＰをＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ６．２、１ｍＭ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に再懸濁し、４００ｒｐｍでの磁気撹拌下でラクターゼ酵素（１００μｇ／ｍｌ）とともに２０℃で１時間インキュベートした。
ｉｖ）ＳＮＰ上に固定化された酵素の保護は、製造された酵素固定化ＳＮＰを酵素の周囲に自己集合したシラン構築ブロックの混合物とともにインキュベートし、酵素の周囲の保護層を形成した重縮合反応を行わせることによって行った。対象のタンパク質又はタンパク質型化合物及び表面上のそのアミノ酸残基に無関係に適切な構築ブロックを選択しなければならない。自己集合構築ブロックの好ましい選択の例を表１に示す。表に想定される保護層構築ブロックのリスト及び保護タンパク質のタンパク質表面のアミノ酸残基と自己集合構築ブロックとの間の相互作用の主な力を示す。ＳＮＰの表面におけるこの層の結合を可能にするＳＮＰの裸の表面における重縮合反応も起こった。そのために、酵素固定化ＳＮＰ（１８ｍＬ；３．２ｍｇ／ｍＬ）を最初に４００ｒｐｍでの撹拌下で３６μｌのＴＥＯＳと２０℃で反応させた。２時間の反応の後に、１８μｌのＡＰＴＥＳを加え、４℃で保護層を徐々に成長させた。ＳＮＰの試料を２時間ごとに採取し、２０時間後にＭＥＳ緩衝液での２回の洗浄工程により反応を停止させた。種々の時点における保護シラン層の厚さを上述のように測定し、図２Ｂ及び図３に報告する。これらの結果から、有機シラン層は、それぞれ４、６及び２０時間の反応の後に厚さが２、１０及び２５ｎｍであることがわかった。これらの結果から、酵素固定化ＳＮＰの表面における有機シリカ層の成長を制御することが可能であることが確認された。
【０１８３】
そのように製造された粒子の酵素活性を人工基質としてのオルトニトロフェニル−β−ガラクトシド（ＯＮＰＧ）を用い、分光光度法により追跡してアッセイし、４２０ｎｍにおけるオルトニトロフェノール（ＯＮＰ）生成物の出現がアルカリ条件で示された。より詳細には、ＳＮＰを、シラン重縮合の持続時間を延長しつつ採取し、ＭＥＳ緩衝液で２回洗浄した。ラクターゼ活性を測定するために、ＳＮＰをｐＨ６．５でＯＮＰＧ（４０ｍＭ）とともに４０℃で５分間インキュベートし、等量のＮａ２ＣＯ３（１Ｍ）の水溶液の添加により反応を停止させた。結果から、２５ｎｍの保護層を有する粒子に初期酵素活性の４５％が存在していたことが示され、酵素が有機シリカ保護層に埋め込まれている場合でさえ、それがその活性を部分的に維持していることが確認された。
【０１８４】
図３に関して、時間ともに得られた層厚は、重縮合反応の速度論に依存し、それに対応して（ｉ）時間、（ｉｉ）温度及び（ｉｉｉ）用いた有機シランの混合物に依存することが指摘される。（ｉ）については、反応をより長く持続させるほど、保護層がより厚くなることは、明らかである。温度については、温度が高いほど、反応速度が速くなり、したがって、保護層がより厚くなる（逆の場合も同じ）ことは、理解されよう。モノマーの混合物に関しては、基本的特性を有する有機シラン（ＡＰＴＥＳ又はＵＰＴＥＳ）の存在が保護層の成長を促進することが指摘される。
【０１８５】
図３において、より疎水性のモノマーの初期前加水分解及び可溶化に現在のところ帰せられる初期の遅延を観察することができる。この初期反応が行われると、保護層の厚さが測定可能になる（例えば、走査型電子顕微鏡写真及びソフトウエアによる粒子径の統計解析により）。保護層が必要な厚さに達し、反応及び、したがって保護層がさらに厚くなることを停止させる場合、保護層構築重縮合反応の場合、粒子を洗浄し、未反応モノマーを除去することによって、これを行うことができる。
【０１８６】
表１：保護層構築ブロック及びこれらの構築ブロックと保護層に埋め込まれる、対象のタンパク質又はタンパク質型化合物の表面上のアミノ酸残基との間の相互作用の主な力のリスト。適切な構築ブロックの選択は、存在するタンパク質表面アミノ酸残基に適応させるべきである。
0006678103.tif 000002
【０１８７】
表１に関して、次のことが指摘される。第１に、特定の機能性成分の埋込みに関連して表１を示すが、表１に開示する情報、及びそれに関連する情報は、他の機能性成分にも関連することが理解されよう。次に、表１のリストは網羅的なものでなく、本発明による方法に用いることができる他の有機シランモノマーが存在することは、平均的技術者により理解されよう。
【０１８８】
これに関連して、例えば、非商用シランも製造し、使用することができるので、網羅的なものを確立することが困難であると思われることから、該リストが網羅的なものでないことがさらに指摘される。さらに、特定の場合に、例えば、十分に大きな細孔を得るために、大きく、かさばる基を有する有機シラン、例えば、オクタデシルトリメトキシシラン及びトリフェニルトリエトキシシランを用いることが有利であり得る。
【０１８９】
さらに、表における並びに本開示の他の部分を通してしばしばトリエトキシ誘導体として示すシランについて、例えば、トリメトキシ又はトリヒドロキシエトキシ誘導体などのすべての可能な誘導体ではなく単一誘導体に言及することは、読むことを簡便化し、同時に読者を容易に入手可能な有機シランに導くために行ったのであって、本開示の範囲を制限するためでないことが認められよう。平均的技術者は、一般的に「シラン」に言及することができる（reference could be had to）（例えば、表におけるアミノプロピルトリエトキシシランに言及する代わりにアミノプロピルシラン）ことを理解するであろう。さらに、リストは、特定の主相互作用に特に関連するシランに関して完全でもない。例として、ウレイドプロピルトリエトキシシラン及び（Ｎ−アセチルグリシル）−３−アミノプロピルトリメトキシシランは、さらなる強いＨ結合ドナーアクセプターモノマーとして含めることができると思われる。
【０１９０】
次に、ＣＹＳ及びＭＥＴが表１に挙げられていないことが指摘される。しかし、これらが機能性成分の表面に存在する場合、これらのアミノ酸と相互作用する適切な有機シランを選択することができる。例えば、これらのアミノ酸が（３−メルカプトプロピル）トリメトキシシラン又はより一般的に（３−メルカプトプロピル）シランなどのＳＨ基を有する適切な有機シランに対する共有結合性ジスルフィド架橋（−Ｓ−Ｓ−）を形成し得るという事実を利用することができる。したがって、例えば、官能性−ＳＨ基を有する有機シランもリストに加えることができると思われる。
【０１９１】
最後に、表１は、ラクターゼ固定化のカプセル化について示しているだけでなく、他の機能性成分を埋め込むことを意図している平均的技術者によって有益であることも見いだされることが明らかである。
【０１９２】
実施例２：  熱ストレスからの保護
本明細書で述べた方法により保護された酵素の耐熱性を、実施例１で述べたように製造した２０ｎｍの保護層を有するラクターゼ修飾粒子を用いて試験した。触媒活性は、実施例１においても述べたＯＮＰＧ比色法を用いて測定した。
【０１９３】
最初に保護及び遊離酵素に４２℃で漸増期間にわたり熱ストレスをかけ、活性を測定した。図４を参照のこと。
【０１９４】
遊離酵素の活性は、５分後に７０％に、３０分後に４５％に、６０分後に８％に低下したが、保護酵素は、すべての試験した条件で９０％より高い活性値に留まっていたことがわかった。興味深いことに、活性は、２０分及び３０分間の熱ストレスで１１２％に増加さえした。この一組の結果から、本明細書で述べた酵素保護戦略の利点が明らかに実証された。
【０１９５】
さらに、酵素活性を漸増温度値で測定し、結果を図５に報告する。
【０１９６】
図５に報告した結果から、遊離酵素の活性が５０℃で５２％の値に低下し、５０、５５及び６０℃では活性を測定することができなかったことがわかった。保護酵素については、興味深いことに、４５℃、５０℃及び５５℃の反応温度で活性が１０６％、１１３％及び１１１％に増加した。６０℃で測定した反応で１１％のわずかな低下が認められる。
【０１９７】
実施例３：  保護ラクターゼのｐＨ抵抗性及びｐＨ範囲拡大
本明細書で述べた方法により保護した酵素の抵抗性及びそれらのｐＨ活性範囲の拡大を、実施例１で述べたように製造した２０ｎｍの保護層を有するラクターゼ修飾粒子を用いて試験した。触媒活性は、実施例１においても述べたＯＮＰＧ比色法を用いて測定した。
【０１９８】
最初に、遊離及び固定化酵素を種々のｐＨ値（４．８、６．５、７．６、８．８）で１５分間インキュベートし、次いでｐＨ値を最適触媒ｐＨ（６．５）に調整し、各種システムの活性を測定した。結果を図６に報告する。ｐＨ６．５での処理は、固定化酵素にもその遊離のカウンターパートにも影響を及ぼさなかったが、ｐＨ４．８での処理は、遊離酵素の活性の２５％への劇的な低下をもたらしたが、保護酵素は、影響を受けないままであったことがわかった。７．６及び８．８のｐＨ値では、遊離酵素は、それぞれ１５％及び２８％の活性を失ったが、保護酵素は、ｐＨ７．６で影響を受けず、ｐＨ８．８で１０％の活性を失ったにすぎなかった。
【０１９９】
さらに、遊離及び固定化ラクターゼの触媒活性を、種々のｐＨ値（５．５、６．０、６．５、７．５及び８．０）で実施例１においても述べたＯＮＰＧ比色法を用いて測定した。測定された相対活性値を図７に報告する。
【０２００】
両酵素システムは、６．５の最適ｐＨ値を有していた。ｐＨを７．５及び８．０に上昇させると、遊離酵素は、それぞれ２０％及び４０％の活性の低下を示したが、保護酵素は、同じ条件で５％及び１８％を失ったにすぎなかった。酸性ｐＨ値については、遊離酵素は、それぞれ６．０及び５．５のｐＨ値で４０％及び８０％の活性を失ったが、保護酵素は、２％及び１５％を失ったにすぎなかった。それらの結果から、酵素の保護がその活性範囲の拡大をもたらすことが確認された。
【０２０１】
実施例４：  プロテアーゼの攻撃からの保護
本明細書で述べた方法により保護した酵素のプロテアーゼに対する抵抗性を、実施例１で述べたように製造した２０ｎｍの保護層を有するラクターゼ修飾粒子を用いて試験した。遊離及び保護酵素を０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中でプロテイナーゼＫ及びトリプシン（１ｍｇ／ｍＬ）とともに３７℃で６０分間インキュベートした。遊離酵素の活性はゼロに低下したが、保護酵素の活性は変化しないままであった。
【０２０２】
実施例５：  ＳＮＰへの酸性ホスファターゼの固定化及び有機シリカ（すなわち、シルセスキオキサン）層による保護並びに温度ストレス試験
ＳＮＰへの酸性ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．２）の固定化及び有機シランの層を成長させることによる保護を実施例１で述べたように実施した。保護層の厚さを増加させながら、保護触媒を製造し、人工基質としてのリン酸パラニトロフェニル（ｐＮＰＰ）を用いてアッセイした。４０５ｎｍでの生成物ｐ−ニトロフェニル（ｐＮＰ）の出現を分光光度法で追跡したところ、アルカリ条件で示された。
【０２０３】
手短に述べると、酸性ホスファターゼ活性を測定するために、保護生体触媒をｐＨ４．８でｐＮＰＰ（１５ｍＭ）とともに３７℃で５分間インキュベートし、等量のＮａＯＨの水溶液（１００ｍＭ）の添加により反応を停止した。結果を図８に示す。酵素活性が保護層の存在により増大することが示されている。
【０２０４】
製造粒子（及び可溶性参照酵素）を６５℃で漸増時間にわたりインキュベートすることにより、温度に対する抵抗性をアッセイした。活性の結果を図９に報告する。遊離参照酵素は、１０分後に９０％超の活性を、３０分後に９５％超を失ったが、保護酵素は、１０分の処理後に８０％と同程度、６０分後に７５％超維持することが実証されている。
【０２０５】
実施例６：  ＳＮＰへのラクターゼの固定化及びシラン混合物で構成された層による保護
ＳＮＰへのラクターゼ／β−ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２３）の固定化は、実施例１で述べたように実施した。ＳＮＰに固定化された酵素の保護は、製造した酵素固定化ＳＮＰを酵素の周囲に自己集合したシラン構築ブロックの混合物とともにインキュベートし、酵素の周囲に保護層を形成した重縮合反応にかけることによって行った。用いたシランは、ＡＰＴＥＳ、ＴＥＯＳ、ベンジルトリエトキシシラン（ＢＴＥＳ）、プロピルトリエトキシシラン（ＰＴＥＳ）及びヒドロキシメチルトリエトキシシラン（ＨＭＴＥＳ）である。より詳細には、酵素固定化ＳＮＰ（１８ｍＬ；３．２ｍｇ／ｍｌ）を最初に４００ｒｐｍでの撹拌下で３６μｌのＴＥＯＳと２０℃で反応させた。１時間の反応後に、１８μｌのＡＰＴＥＳ、１８μｌのＢＴＥＳ、１８μｌのＰＴＥＳ及び３６μｌのＨＭＴＥＳを加え、保護層を２０℃で成長させた。ＳＮＰの試料を漸増反応時間で採取し、２０時間後にＭＥＳ緩衝液での２回の洗浄工程により反応を停止させた。種々の時点における、保護シラン層の厚さを前述のように測定した。図１０に示すように、有機シラン層は、４、６、１０、１７及び２０時間の反応後にそれぞれ２、８、１２及び１６ｎｍの厚さであった。
【０２０６】
そのように製造された保護ラクターゼの耐熱性を、５０℃で６０分間インキュベートすることにより試験し、図５に示したＡＰＴＥＳ−ＴＥＯＳの混合物を用いて保護した触媒と比較した。結果から、遊離ラクターゼの活性は、５０℃で１時間の処理後に５％より低かったが、ＡＰＴＥＳ−ＴＥＯＳで構成された又はシラン混合物で構成された層により保護されたラクターゼの活性は、それぞれ１１０％及び１５０％より高かったことが示された（図１１）。
【０２０７】
本発明がＥＰ１３１７８５０．４の優先権を主張することが指摘される。優先権付与文書は、開示の目的のために本明細書で十分に包含されている。
【０２０８】
したがって、上述したものは、とりわけ、少なくとも１つのタンパク質又はタンパク質型化合物を含み、固体担体の表面に固定化された、アダプター分子、アンカー分子、足場分子及び／又は受容体分子の群から選択される少なくとも１つの分子を任意選択的にさらに含む組成物であり、前記タンパク質又はタンパク質型化合物及び少なくとも１つの任意選択の分子は、自己集合構築ブロックを含む保護物質に完全又は部分的に埋め込まれ、構築ブロックは、多孔性ナノ環境が担体表面上並びに固定化タンパク質又はタンパク質型化合物及び少なくとも１つの任意選択の分子の周囲に構築されるようにタンパク質又はタンパク質型化合物及び少なくとも１つの任意選択の分子の化学基と相互作用し、タンパク質又はタンパク質型化合物及び少なくとも１つの任意選択の分子の天然立体構造を安定化し、その機能を保存する、官能基を含む。
【０２０９】
さらに、そのような組成物において、固体担体は、ナノ粒子、特にシリカナノ粒子（ＳＮＰ）、特に金ナノ粒子、特にチタンナノ粒子であることを提案した。
【０２１０】
さらに、そのような組成物において、固体担体の表面へのタンパク質又はタンパク質型化合物の結合は、共有結合であることを提案した。
【０２１１】
さらに、そのような組成物において、ナノ粒子のサイズは、２０−１０００ｎｍ、特に２００−５００ｎｍ、特に３００−４００ｎｍの範囲にあることを提案した。
【０２１２】
さらに、そのような組成物において、保護物質の厚さは、１−１００ｎｍ、１ｎｍ−５０ｎｍ、１ｎｍ−３０ｎｍ、１ｎｍ−２５ｎｍ、１ｎｍ−２０ｎｍ、１ｎｍ−１５ｎｍ、好ましくは５ｎｍ−１５ｎｍの範囲にあることを提案した。
【０２１３】
さらに、そのような組成物において、自己集合保護物質は、基質の拡散を可能にする細孔径、特に１ｎｍ−１０ｎｍ、特に２ｎｍ−９ｎｍ、特に３ｎｍ−８ｎｍ、特に４ｎｍ−７ｎｍ、特に４ｎｍ−６ｎｍ、特に４ｎｍ−５ｎｍの細孔径を有することを提案した。
【０２１４】
さらに、そのような組成物において、自己集合保護物質の官能基は、特に弱い力の相互作用に基づいて、タンパク質又はタンパク質型化合物のアミノ酸側鎖と相互作用する基であることを提案した。
【０２１５】
さらに、そのような組成物において、前記保護物質は、有機シリカであることを提案した。
【０２１６】
さらに、前記タンパク質又はタンパク質型化合物は、酵素又は酵素型化合物、特に、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ（isomerises）及び／又はリガーゼからなる群から選択される酵素又は酵素型化合物であることを提案した。
【０２１７】
さらに、そのような組成物において、前記タンパク質又はタンパク質型化合物及び／又は少なくとも１つの任意選択の分子は、二官能性架橋剤、特に、グルタルアルデヒド、酒石酸ジスクシンイミジル、スベリン酸ビス［スルホスクシンイミジル］、エチレングリコールビス（コハク酸スルホスクシンイミジル）、アジプイミド酸ジメチル、ピメルイミド酸ジメチル、アミノ安息香酸スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、活性化スルフヒドリル（例えば、スルフヒドリル反応性２−ピリジルジチオ）の群から選択される二官能性架橋剤により固体担体の表面に結合していることを提案した。
【０２１８】
さらに、そのような組成物において、保護物質は、以下に対する保護をもたらすことを提案した。
ａ）少なくとも１つのタンパク質又はタンパク質型化合物の最適ｐＨと異なり、該ｐＨ値が最適ｐＨと＋／−５、＋／−４、＋／−３、＋／−２、＋／−１、＋／−０．５ｐＨ単位異なる、ｐＨ、及び／又は
ｂ）化学的ストレス、及び／又は
ｃ）生物学的ストレス、及び／又は
ｄ）溶媒、及び／又は
ｅ）物理的ストレス、及び／又は
ｆ）保護されていないタンパク質又はタンパク質型化合物の最適温度を６０℃、特に５０℃、特に４０℃より高い、特に３０℃、特に２０℃、特に１０℃、特に５℃超える、高温、及び／又は
ｇ）保護されていないタンパク質又はタンパク質型化合物の最適温度から６０℃、特に５０℃、特に４０℃より高い、特に３０℃、特に２０℃、特に１０℃、特に５℃逸脱する、低温。
【０２１９】
さらに、そのような組成物において、前記固定化され、保護された酵素は、以下を有することを提案した。
ａ）遊離の保護されていない酵素と比較したときストレス条件下で活性の増加、及び／又は
ｂ）遊離の保護されていない酵素と比較して連続操作で使用するための回収可能性の増加。
【０２２０】
次に、以下の工程を含むそのような一致する組成物を製造する方法を提案する。
ａ）固体担体を得る工程と、
ｂ）対象の少なくとも１つのタンパク質又はタンパク質型化合物、特に少なくとも１つの酵素又は酵素型化合物を、及び任意選択的に、少なくとも１つの任意選択の分子を担体の表面に固定化する工程と、
ｃ）固体担体の表面に結合した少なくとも１つのタンパク質又はタンパク質型化合物及び任意選択の分子を自己集合構築ブロックとともにインキュベートして、固体担体の自由表面並びに固体担体の表面に結合した少なくとも１つのタンパク質又はタンパク質型化合物及び任意選択の分子の周囲の多孔性ナノ環境を生じさせる工程と、
ｄ）特定の時点に保護物質の自己集合反応を停止させて、所望の厚さを有する好ましい保護層を得る工程。
【０２２１】
さらに、そのような組成物を触媒工程に用いることを提案した。
【０２２２】
さらに、そのような組成物を、例えば、スフィンゴミエリナーゼ欠乏（ＡＳＭＤ）症候群、ニーマン−ピック病（ＮＰＤ）、リソソーム蓄積症、ゴーシェ病、ファブリー病、ＭＰＳＩ、ＭＰＳＩＩ、ＭＰＳＶＩ、糖原病ＩＩ型、癌、アレルギー性疾患、代謝疾患、心血管疾患、自己免疫疾患、神経系疾患、リンパ系疾患及びウイルス性疾患などの治療に用いることを提案した。
【０２２３】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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