(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インタクトな抗体において、１又は複数のキャップされ、改変されたシステイン残基を選択的に還元する方法であって、前記方法が、以下のステップ：
ａ）還元剤と抗体分子とを接触させ、各抗体分子は、少なくとも１つのキャップされ、改変されたシステイン残基を有し；
ｂ）前記還元剤と前記抗体分子とを、改変されたシステイン残基を脱キャップし、そしてキャップ副産物を形成するのに十分な条件下で、反応させ；そして
ｃ）工程ｂ）の間、キャップ副産物を除去する；
ことを含み、それにより、未キャップの改変されたシステイン抗体調製物が形成され、そして重鎖−軽鎖及び重鎖−重鎖の鎖間ジスルフィド結合の実質的にすべてが、前記未キャップの改変されたシステイン抗体調製物に保持されている、方法。
【請求項２】
キャップ副産物を除去しながら、追加の還元剤を工程ｂ）に補充する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ａ）〜ｃ）が、７．０〜８．５のｐＨで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記キャップされたシステイン残基の少なくとも約７５％が、脱キャップされる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記キャップされたシステイン残基の少なくとも約８０％が、脱キャップされる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記未キャップの改変されたシステイン抗体の調製物が、以下の：
少なくとも２つの未キャップの改変されたシステイン残基を有し、そしてキャップされ、改変されたシステイン残基を有さない抗体分子；
少なくとも２つのキャップされ、改変されたシステイン残基を有し、そして未キャップの改変されたシステイン残基を有さない抗体分子；及び
少なくとも１つのキャップされ、改変されたシステイン残基、及び少なくとも１つの未キャップの改変されたシステイン残基を有する抗体分子
から成る群から選択される複数のメンバーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
工程ｂ）の前、前記抗体分子に存在する重鎖−軽鎖及び重鎖−重鎖の鎖間ジスルフィド結合の少なくとも８０％（好ましくは、少なくとも８５％、又は少なくとも９０％）が、前記未キャップの改変されたシステイン抗体調製物に保持される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体調製物に存在する遊離チオールの少なくとも９０％が、改変されたシステイン残基に由来する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
工程ｂ）が、透析又はダイアフィルトレーションを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
工程ｂ）の前の各抗体分子が、少なくとも１の鎖間ジスルフィド結合を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
工程ｂ）の前の各抗体分子が、少なくとも３つの重鎖-軽鎖及び重鎖-重鎖鎖間ジスルフィド結合を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
工程ｂ）のの前の各抗体分子が、少なくとも４個の重鎖−軽鎖及び重鎖−重鎖の鎖間ジスルフィド結合を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記還元剤及び還元条件が、前記抗体分子に存在する重鎖−軽鎖及び重鎖−重鎖の鎖間ジスルフィド結合の約２０％以下が、工程ｂ）の間、一対の遊離チオールに変換されるように選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記還元剤及び還元条件が、前記抗体分子に存在する重鎖−軽鎖及び重鎖−重鎖の鎖間ジスルフィド結合の約１５％以下が、工程ｂ）の間、一対の遊離チオールに変換されるように選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記還元剤及び還元条件が、前記抗体分子に存在する重鎖−軽鎖及び重鎖−重鎖の鎖間ジスルフィド結合の約１０％以下が、工程ｂ）の間、一対の遊離チオールに変換されるように選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記還元剤及び還元条件が、前記抗体分子に存在する重鎖−軽鎖及び重鎖−重鎖の鎖間ジスルフィド結合の約５％以下が、工程ｂ）の間、一対の遊離チオールに変換されるように選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
各抗体分子が、少なくとも２つの改変されたシステイン残基を有する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
各抗体分子が、４つの改変されたシステイン残基を有する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記改変されたシステイン残基が、重鎖定常領域、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域、及びそれらの組み合わせからなる群から選ばれる抗体分子の領域に存在する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記改変されたシステイン残基が、前記抗体分子の重鎖定常領域に存在する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記改変されたシステイン残基が、前記抗体分子の重鎖又は軽鎖可変領域に存在する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記還元剤が、システイン、システアミン、βメルカプトエタノール、２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム塩、及びそれらの混合物から成る群から選択される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
工程ｂ）の間、タンパク質の濃度よりも約５倍〜約１５倍高い濃度で還元剤を維持することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
工程ｂ）の間、タンパク質の濃度よりも約５倍〜約１０倍高い濃度で還元剤を維持することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記還元剤がシステインである、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記システインの濃度が、工程ｂ）の間、０．５ｍＭ〜約１．５ｍＭの濃度で維持される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記キャップ副産物の濃度が、再キャッピングが改変されたシステイン残基のさらなる活性化を妨げる濃度以下で維持される、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記未キャップの改変されたシステイン抗体調製物が、モノクローナル抗体調製物である、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記未キャップの改変されたシステイン抗体調製物から残留還元剤を除去する工程をさらに含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記未キャップの改変されたシステイン抗体調製物を精製する工程をさらに含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
抗体−薬剤複合体を形成するのに十分な条件下で、未キャップ抗体と薬物−リンカー化合物とを組合せることをさらに含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗体−薬剤複合体の平均薬物負荷が、抗体当たり約４の薬物部分である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗体−薬剤複合体の平均薬物負荷が、抗体当たり約３．６〜４．２の薬物部分である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗体−薬剤複合体の平均薬物負荷が、抗体当たり約２の薬物部分である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗体−薬剤複合体の平均薬物負荷が、抗体当たり約１．５〜２．２の薬物部分である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記抗体−薬物複合体が、溶液中に存在する、請求項３１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
改変されたシステイン抗体のキャップされた改変されたシステイン残基の選択的活性化方法であって、前記方法が、以下のステップ：
（ａ）改変されたシステイン抗体と緩衝液との混合物をダイアフィルトレートし；
（ｂ）前記混合物に還元剤を、（ｂ）の前、前記改変されたシステイン抗体に存在する実質的にすべての重鎖−軽鎖及び重鎖−重鎖の鎖間ジスルフィド結合を保持しながら、利用可能なキャップされた改変されたシステイン残基の一部を活性化する濃度及び速度で添加し；
（ｃ）工程（ｂ）の間、前記混合物のダイアフィルトレーションを維持し；
そして
（ｄ）（ｂ）の間キャップ副産物を除去して、キャップされた改変されたシステイン残基を選択的に活性化することを含む、方法。
【請求項３８】
工程a)〜ｄ）がｐH７．０〜８．５で行われる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記改変されたシステイン残基が、重鎖定常領域、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域、及びそれらの組み合わせからなる群から選ばれる、改変されたシステイン抗体の領域に存在する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記キャップされた改変されたシステイン残基の少なくとも７５％が活性化される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記重鎖−軽鎖及び重鎖−重鎖の鎖間ジスルフィド結合の約２０％未満（好ましくは、１５％未満、又は１０％未満）が、一対の遊離チオールに変換される、請求項３７〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記キャップされた改変されたシステイン残基の少なくとも７５％が活性化され、そして前記重鎖−軽鎖及び重鎖−重鎖の鎖間ジスルフィド結合の２０％未満（好ましくは、１５％未満、又は１０％未満）が一対の遊離チオールに変換される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
前記還元剤がシステインである、請求項３７〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記還元剤がシステインであり、前記キャップされた改変されたシステイン残基の少なくとも７５％が活性化され、そして前記重鎖−軽鎖及び重鎖−重鎖の鎖間ジスルフィド結合の２０％未満（好ましくは、１５％未満、又は１０％未満）が一対の遊離チオールに変換される、請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に関する相互参照
本出願は、２０１４年２月１１日に提出された米国特許出願第６１／９３８，３７８号に関する優先権を主張し、この内容は、参照により全体が本明細書に組込まれる。
【背景技術】
【０００２】
選択されたアミノ酸がシステインに突然変異されているモノクローナル抗体（すなわち、改変されたシステインｍＡｂ又はｅｃｍＡｂ）は、それらに由来する複合体（conjugate）が、好ましい性質、例えば、均質性、良好な薬物動態、安定性、及び溶解性を有することができるので、複合体（例えば、抗体薬物複合体（ＡＤＣ））での使用のために、特に適している。システイン突然変異は、鎖間ジスルフィド結合を一般的に形成しない抗体のアミノ酸配列の位置に配置され、そして、変異体ｍＡｂを生成する細胞内の発現機構が不対システインとしてシステイン残基を処理する。従って、改変されたシステインは、一般的に、非コードシステイン分子と共に混合されたジスルフィドの形で発現される（すなわち、改変されたシステインは、キャッピング剤、例えば、システイン、システイニルグリシン、又はグルタチオンにより「キャップされる（capped）」）。
【０００３】
従って、ｅｃｍＡｂから複合体（例えば、ＡＤＣ）を調製するためには、混合されたジスルフィドから遊離チオールに、改変されたシステインを変換する還元条件下に、ｅｃｍＡｂを供することが一般的に必要であり、そして典型的には、この脱キャッピング（uncapping）又は「活性化（activation）」が、ｅｃｍＡｂ鎖間ジスルフィドの還元を伴う。鎖間ジスルフィドは、穏やかな酸化により再形成され得るが、そのような再酸化工程は、ＡＤＣ調製の複雑性及び費用を伴う。選択的還元方法は、鎖間ジスルフィドを同時に還元しないで、改変されたシステインを還元することが困難であることが判明しているので、理解しにくかった。従って、改変されたシステイン残基の脱キャッピングのための選択的還元方法が、必要とされる。本発明は、この必要性及び他の必要性に対処する。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、とりわけ、改変されたシステイン抗体を選択的に還元するための方法を提供する。この方法は、還元剤と改変されたシステイン抗体分子とを接触し、ここで各抗体分子は、少なくとも１つのキャップされ、改変されたシステイン残基、及び少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を有し；そして、前記還元剤と前記抗体質分子とを、改変されたシステイン残基のキャップを取り、そしてキャップ副産物を形成するのに十分な条件下で、反応せしめることを包含する。キャップ副産物は、還元反応の間、除去される。この方法は、未キャップ（uncapped）の改変されたシステイン抗体調製物の形成をもたらす。未キャップの改変されたシステイン抗体調製物は、キャップされた及び未キャップの両改変されたシステイン抗体を含むことができる。還元反応の前、抗体分子に存在する鎖間ジスルフィド結合の実質的にすべては、未キャップの改変されたシステイン抗体調製物に保持される。前記方法はさらに、キャップ副産物を除去しながら、追加の還元剤を還元反応に補充する工程も包含することができる。還元反応の間、反応混合物からのキャップ副産物の除去は、例えば、透析又はダイアフィルトレーションにおいて、行い得る。好ましい実施態様によれば、キャップ副産物の濃度は、再キャッピングが、改変されたシステイン残基のさらなる活性化を妨げる濃度以下に、還元反応混合物において維持される。
【０００５】
いくつかの態様によれば、前記方法は、未キャップの改変されたシステイン抗体調製物を提供する。典型的には、抗体調製物に存在する改変されたシステイン残基の少なくとも約６０％は、未キャップの改変されたシステイン残基である。いくつかの態様によれば、抗体調製物に存在する改変されたシステイン残基の少なくとも約７０％、少なくとも約７５％又は少なくとも約８０％は、未キャップの改変されたシステイン残基である。いくつかの態様によれば、本発明の方法を用いれば、還元反応の前、抗体分子に存在する鎖間ジスルフィド結合の少なくとも８５％が、未キャップの改変されたシステイン抗体調製物に保持される。いくつかの態様によれば、前記還元剤及び還元条件は、前記抗体分子に存在する鎖間ジスルフィド結合の約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満又は約５％未満が、還元反応の間、一対の遊離チオールに変換されるように選択される。
【０００６】
関連する態様によれば、本発明は、抗体薬物複合体を包含する抗体複合体、及び未キャップの抗体を用いての抗体複合体の調製方法を提供する。残留する還元剤は、抗体薬物複合体の調製の前、抗体調製物から除去され得る。
【０００７】
本発明はまた、不対システイン残基を有する非抗体タンパク質を選択的に還元するための方法も提供する。前記方法は、還元剤とタンパク質分子とを接触させ、ここで各タンパク質分子は、少なくとも１つのキャップされたシステイン残基、及び少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を有し；そして、前記還元剤と前記タンパク質分子とを、システイン残基のキャップを取り、そしてキャップ副産物を形成するのに十分な条件下で、反応せしめることを包含する。キャップ副産物は、還元反応の間、除去される。前記方法は、未キャップシステインタンパク質調製物の形成をもたらす。未キャップのシステインタンパク質調製物は、キャップされた及び未キャップの両システインタンパク質分子を含むことができる。還元反応の前、タンパク質分子に存在する鎖間ジスルフィド結合の実質的にすべては、未キャップのシステインタンパク質調製物に保持される。前記方法はさらに、キャップ副産物を除去しながら、追加の還元剤を還元反応に補充する工程も包含することができる。還元反応の間、反応混合物からのキャップ副産物の除去は、例えば、透析又はダイアフィルトレーションにおいて、行い得る。好ましい実施態様によれば、キャップ副産物の濃度は、再キャッピングが改変されたシステイン残基のさらなる活性化を妨げる濃度以下に、還元反応混合物において維持される。前記方法は、未キャップのシステインタンパク質調製物を提供する。典型的には、キャップされたシステイン残基の少なくとも約６０％が、前記方法を用いて、脱キャッピングされる（又は、言い換えれば、活性化される）。キャップされたシステイン残基の少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、又は少なくとも約８０％が、前記方法を用いて、脱キャッピングされる。いくつかの態様によれば、前記方法を用いれば、還元反応の前、タンパク質分子に存在する鎖間ジスルフィド結合の少なくとも８５％が、未キャップの改変されたシステイン抗体調製物に保持される。いくつかの態様によれば、前記還元剤及び還元条件は、前記タンパク質分子に存在する鎖間ジスルフィド結合の約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満又は約５％未満が、還元反応の間、一対の遊離チオールに変換されるように選択される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、低濃度（２ｍＭ）で、同一の条件下で、３種の異なったモノチオール還元剤（システイン、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）及びシステアミン）により、ｅｃｍＡｂ（溶液中、９９μＭ）を処理することにより生成されるサンプルのｒＰＬＲＰカラム分析の結果を示す。Ｙ軸は、使用可能な全改変されたシステインの％活性化を表す。還元剤のいずれも、使用可能な改変されたシステイン残基の１００％活性化に接近することはできない。それらの実験で、鎖間ジスルフィド結合の還元の証拠は存在しなかった。
【図２】図２は、Ｓ２３９Ｃ ｅｃｍＡｂ ｍｃＭＭＡＦ ＡＤＣからの、Ｈ鎖のｒＰＬＲＰカラム分析の結果を示す。Ｓ２３９Ｃ ｅｃｍＡｂは、本発明の方法により選択的に還元され、そしてｍｃＭＭＡＦ薬物−リンカーにコンジュゲートされる。還元剤は、０．８ｍＭの濃度でのシステインであった。改変されたシステイン残基の活性化は、完了するまで実質的に進行した。％Ｈ０で示されるバーは、コンジュゲートされる薬物−リンカーを有さないＨ鎖を示す。％Ｈ１で示されるバーは、１つのコンジュゲートされる薬物−リンカーを有するＨ鎖を示し、そして％Ｈ２で示されるバーは、２つのコンジュゲートされる薬物−リンカーを有するＨ鎖を示す。
【図３】図３は、Ｓ２３９Ｃ ｅｃｍＡｂ ｍｃＭＭＡＦ ＡＤＣからの、Ｈ鎖のｒＰＬＲＰカラム分析の結果を示す。Ｓ２３９Ｃ ｅｃｍＡｂは、本発明の方法により選択的に還元され、そしてｍｃＭＭＡＦ薬物−リンカーにコンジュゲートされる。還元剤は、０．５５ｍＭの濃度でのシステインであった。改変されたシステイン残基のわずかな割合が、キャップされたままであるが（％Ｈ０）、しかしながら、未キャップの改変されたシステイン残基の割合は、１００％に接近し（％Ｈ１）、そして非特異的還元の量（％Ｈ２）は、低いままであった。
【図４】図４は、改変されたシステインの活性化が、Ｈ及びＬ鎖可変領域の同一性にもかかわらず、Ｓ２３９Ｃ ｅｃｍＡｂにより選択的に達成されたことを示す。ｍＡｂ１はヒト化２Ｈ１２ ｅｃＭＡｂであり、そしてｍＡｂ２はヒト化ｈ１Ｆ６ ｅｃＭＡｂである（活性化：％Ｈ０；選択性：％Ｈ２）。脱キャッピングの割合は、２つのｍＡｂについて類似した。改変されたシステインの選択的活性化が、３種の異なった部位Ｓ２３９、Ｋ３２６及びＡ３２７で、ｍＡｂ１について示されている。結果は、改変されたシステイン活性化が、種々の部位で選択的に達成され得ることを示唆する。それらの実験は約０．９ｍＭのシステインにより実施された。
【図５】図５は、ｍＡｂ１のＳ２３９Ｃ変異体についての改変されたシステインの活性化を示す。反応混合物中のｍＡｂ濃度は、図４における反応についてとほぼ同じであるが、しかしながらシステイン濃度は、時間経過を通して低く、約０．５ｍＭであった。この実験は、最大選択性が低システイン濃度で得られ、そして十分な時間が与えられると、完全な活性化が、非常に良好な選択性を伴って達成され得ることを示した。この実験における最終時点から調製された複合体の平均薬物負荷は、１．９３であり、これは、２．０の公称値に近く、そして非選択的還元、続く再酸化の従来の方法により得られる値の範囲内である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
Ｉ．一般
本発明は、とりわけ、抗体、例えば、モノクローナル抗体における改変されたシステイン残基から、スルフィドキャップを選択的に除去するための方法を提供する。ある選択的除去は、低濃度での小分子チオールへの抗体の長期暴露の後に観察されるが、完全なキャップ除去は、静的反応混合物においては発生しない。好都合には、改変されたシステインのほぼ完全な活性化が、還元副産物を除去しながら、還元剤濃度が維持されている本発明の方法を用いることにより達成され得る。改変されたシステインの実質的にすべてを活性化することが所望されない実施態様によれば、本発明の方法は、活性化のレベルを調節するために使用され得る。驚くべきことには、未キャップの抗体が、抗体構造を保持し、そして薬物、又は他の機能性薬剤との抗体のコンジュゲートの前、再酸化工程の必要性を除去する、無傷（intact）の鎖間ジスルフィド結合により得られる。とりわけ、本発明の方法は、抗体複合体、例えば、抗体薬物複合体の調製のための現在の製造基準の有意な簡略化を提供する。
【００１０】
ＩＩ．定義
本明細書において使用される場合、用語「抗体（antibody）」とは、完全な（intact）モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体（すなわち、二重特異性抗体）、及び所望する生物学的活性（すなわち、標的抗原に対する特異的結合）を示し、そして少なくとも１つの生来の鎖間ジスルフィド結合を有する抗体フラグメントを広範囲には意味する。完全な抗体は、典型的には、４個のポリペプチド鎖（２つのＨ鎖及び２つのＬ鎖）から構成され、各ポリペプチドは、主に２つの領域、すなわち、可変領域、及び定常領域を有する。可変領域は、標的抗原に対して特異的に結合し、そしてそれと相互作用する。可変領域は、特定の抗原上の特異的結合部位を認識し、そしてそれに結合する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。定常領域は、免疫系により認識され、そして、それと相互作用することができる（例えば、Janeway et al., 2001, Immuno. Biology, 5th Ed., Garland Publishing, New Yorkを参照のこと）。４個のポリペプチド鎖は、鎖間ジスルフィド結合を通して、お互いに共有結合される。抗体は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＡ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１ 及び ＩｇＡ２）又はサブクラスのものであり得る。抗体は、任意の適切な種に由来することができる。いくつかの実施態様によれば、抗体は、ヒト、又はネズミ起源のものである。モノクローナル抗体は、例えば、ヒト、ヒト化、又はキメラ性であり得る。属性に依存して、用語「抗体」とは、単一の抗体分子、又は抗体分子の集合体、例えば、抗体溶液を意味する。
【００１１】
本明細書において使用される場合、用語「鎖間ジスルフィド結合（inter-chain disulfide bond）」とは、抗体における隣接するポリペプチド鎖上の２つのシステイン残基間の共有結合を意味する。ジスルフィド結合は、式Ｒ1―Ｓ―Ｓ−Ｒ2を有し、ここで、硫黄原子は、システイン側鎖に存在し、そして、Ｒ1及びＲ2は、システイン残基、及びそれらが存在するポリペプチド鎖の残りの部分を表す。鎖間ジスルフィド結合は、一般的に、抗体におけるＨ鎖とＬ鎖との間に、又は２つのＨ鎖間に存在する。
【００１２】
本明細書において使用される場合、用語「改変されたシステイン残基（engineered cysteine residue）」とは、タンパク質（例えば、抗体）のペプチド配列中に導入されるシステイン残基を意味する。改変されたシステイン残基を有するモノクローナル抗体は、「ｅｃｍＡｂ」として言及され得る。改変されたシステイン残基は、一般的に、タンパク質の生来（すなわち、天然に存在する）のペプチド配列には存在しない。改変されたシステイン残基は、ペプチド配列における所定の位置で、天然において存在するアミノ酸の位置を採ることができ、そして、組換え技法、例えば、部位特異的突然変異を通して、ペプチド配列中に導入され得る。改変されたシステイン残基は、キャップされても又は脱キャッピングされても良い。
【００１３】
本明細書において使用される場合、用語「未キャップのシステイン残基（uncapped cysteine residue）」とは、α側鎖が、式Ｒ1−ＳＨを有する遊離チオール部分を含む、システイン残基を意味する。Ｒ1は、システイン残基の非チオール部分を表す。未キャップのシステイン残基は、未キャップの改変されたシステイン残基であり得る。
【００１４】
本明細書において使用される場合、用語「キャップされたシステイン残基（capped cysteine residue）」とは、α側鎖が、式Ｒ1−Ｓ−Ｓ−Ｒ3を有するジスルフィド部分を含む、システイン残基を意味する。Ｒ1は、システイン残基の非チオール部分を表し、そしてＲ3は、約５００Ｄａ未満、又はそれに等しい分子量を有するキャッピング部分の非チオール部分を表す。例えば、キャップは、システイン、システイニルグリシン、又はグルタチオン（それぞれ、遊離システインの非チオール部分、又はグルタチオンの非チオール部分を表すＲ3を有する）、又は他の利用可能モノチオールであり得る。キャップされたシステイン残基は、キャップされ、改変されたシステイン残基であり得る。
【００１５】
本明細書において使用される場合、用語「還元反応（reduction reaction）」とは、式Ｒ1−Ｓ−Ｓ−Ｒ3を有するキャップされたシステイン残基（例えば、キャップされ、改変されたシステイン残基）が還元され、そして、構造Ｒ1−ＳＨを有するチオール部分を形成する反応を意味する。Ｒ1及びＲ3は、上部に記載の通りに定義される。
【００１６】
本明細書において使用される場合、用語「還元剤（reducing agent）」とは、ジスルフィド結合を還元できる化合物を意味する。還元剤は、チオール、例えば、システイン、シスタミン、及びβ−メルカプトエタノールを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【００１７】
本明細書において使用される場合、用語「酸化剤（oxidizing agent）」とは、一対の遊離チオールのジスルフィド結合への変換を引起す化合物を意味する。酸化剤の例は、５、５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、デヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡＡ）、及び硫酸銅（ＣｕＳＯ4）を包含するが、但しそれらだけには制限されない。「再−酸化工程（re-oxidation step）」は、一対の遊離チオールのジスルフィド結合への変換を引起すために取られる積極的工程である。積極的工程は、外因性酸化剤の導入及び／又は自動酸化を可能にするための意図的保持期間を包含する。
【００１８】
本明細書において使用される場合、抗体、及び物質を含む混合物から物質、例えば、キャップ副産物を「除去する（removing）」とは、物質の全体を包含する、物質の任意の部分を、混合物から除去することを意味する。物質の除去はまた、物質を含む第１混合物、及び物質を含まない第２混合物からの、抗体の移送を包含する。混合物からの物質の除去は、透析、ダイアフィルトレーション、クロマトグラフィー、及び同様の手段のような工程を含むことができる。
【００１９】
本明細書において使用される場合、用語「抗体−薬物複合体（antibody-drug conjugate）」、及び「ＡＤＣ」とは、任意には、リンカーを通して治療剤（すなわち、薬物）にコンジュゲートされる抗体を意味する。
【００２０】
本明細書において使用される場合、用語「薬物−リンカー化合物（drug-linker compound）」、又は「薬物−リンカー（drug-linker）」とは、薬物部分、及びそれに結合されるリンカーを有する分子を意味し、ここで、リンカーは、抗体におけるアミノ酸残基（例えば、システイン残基）への結合のために適切な反応性部分を含む。
【００２１】
ＩＩＩ．実施態様の説明
とりわけ、本発明は、改変されたシステイン抗体を選択的に還元し、それにより、未キャップの抗体調製物を形成する方法を提供する。前記方法は、還元剤と改変されたシステイン抗体分子とを接触させ、各抗体分子は、少なくとも１つのキャップされ、改変されたシステイン残基、及び少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を有し；そして、前記還元剤と前記抗体分子とを、改変されたシステイン残基のキャップを取り、そして、キャップ副産物を形成するのに十分な条件下で、反応せしめることを包含する。還元反応の間、キャップ副産物は除去され、それにより、新たに形成されたチオールの再キャッピングを妨げる。キャップ副産物と共に排除される還元剤は、還元反応を先に進めるために配置される。還元剤及び条件は、改変されたシステイン残基が、選択的に還元される（すなわち、選択的に活性化される）ように選択される。結果として、別個の再酸化工程は、還元工程に続いて、鎖間ジスルフィド結合を再形成するために必要とされない。キャップされ、改変されたシステイン残基を有する抗体分子に存在する、鎖間ジスルフィド結合の実質的にすべてが、未キャップの抗体調製物に保持される。用語「保持する（retain）」の使用により、鎖間ジスルフィド結合は、還元反応の間、必ず無傷のままであることを意味するものではない。結合は、還元の間、破壊され得るが、しかしそれらは、一対の遊離チオールへの変換の前、再形成する。結合再形成は、個別の再酸化工程に依存しないが、しかしながら、スキーム２に示されるように、還元反応の間、発生する。
【００２２】
スキーム１は、典型的なタンパク質としてモノクローナル抗体を用いて、本発明の方法に従って脱キャッピングするシステイン残基の略図を示す。反応（ｉ）に示されるように、キャップされ、改変されたシステイン残基を有する抗体（２）と還元剤（１）との反応は、未キャップの改変されたシステイン残基を有する抗体（３）、及びキャップ副産物（４）をもたらす。反応（ｉ）は、両方向に進行することができ、未キャップの改変されたシステイン残基とキャップ副産物との反応は、改変されたシステイン残基の再キャッピングをもたらすことができる。逆反応の結果は、組成物中の抗体のいくらかのみが、未キャップの改変されたシステイン残基を有する組成物である。本発明の方法によれば、反応混合物は、反応（ii）に示されるように、追加の還元剤を補充され、そしてキャップ副産物が反応混合物から除去される。還元剤補充及びキャップ副産物除去は、反応を先に進め、そして、逆反応を妨げ、未キャップの改変されたシステイン残基を有する所望する抗体（３）の形成を促進する。
【００２３】
スキーム１
【化１】
0006713931.tif 000002
【００２４】
通常（すなわち、「静的溶液」）条件下で、再キャッピング反応は、改変されたシステインの活性化の程度を制限する。図１におけるグラフは、同一の条件下で、３種の異なったモノチオールによる、ｅｃｍＡｂの処理の結果を示す。Ｙ軸は、利用可能な改変された全システインの％活性化を表す。このグラフは、何れの還元剤も、利用可能な改変されたシステイン残基の１００％活性化に接近することはできず、そしてこの制限は、ジスルフィド副産物（４、スキーム１）が、上記のように、生成されたチオールを再キャップするためであることを示す。
【００２５】
還元剤
任意の適切な還元剤が、本発明の方法に使用され得る。還元剤の例は、モノチオール還元剤、例えば、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、システアミン、β−メルカプトエタノール、２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム塩、及び同様のものを包含するが、但しそれらだけには制限されない。軽度の還元剤、例えば、システイン、及び同様のものが、鎖間ジスルフィド結合を還元しないで、キャップされたシステイン残基（例えば、キャップされ、改変されたシステイン残基）から、キャップを除くために特に適している。より強い還元剤、例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、及びビス（２−メルカプトエチルスルホン）は、多くの場合、早すぎる鎖間ジスルフィド結合の還元をもたらす。スキーム２の中間体６の混合されたジスルフィドが形成しないか、又は単に一時的に形成する還元剤、例えば、ＴＣＥＰ及びＤＴＴは、キャップされたシステインを選択的に脱キャップする可能性は低い。いくつかの実施態様によれば、還元剤は、システイン、システアミン、β−メルカプトエタノール、２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム塩、及びそれらの混合物から選択される。
【００２６】
反応条件
多くのモノチオールが、選択的活性化のために使用されるが、図１におけるグラフは、異なったチオールが改変されたシステインを異なった速度で、及び異なった最大レベルに活性化することを示す。従って、改変されたシステイン残基の活性化のための適切な条件の特定は、適切な還元剤の特定、及び還元剤の適切な濃度の特定を包含する。
【００２７】
反応条件は、改変されたシステイン残基の位置、キャップの正体、又は特定抗体における残基により、部分的に決定されるであろう。例えば、溶媒に暴露され、改変されたシステイン残基は、埋め込まれ、又は部分的に埋め込まれ、改変されたシステイン残基よりも容易に脱キャップされ得る。
【００２８】
タンパク質における不対システイン残基の選択的活性化を好む条件は、スキーム２における反応に基づいて、理解され得る。還元剤が、反応（ａ）におけるように、改変されたシステイン残基と反応し、すなわち反応（ｂ）におけるように鎖間ジスルフィド結合よりも非常に早く反応する場合、選択的活性化は、比較的単純であり得る。この条件は、たとえあったとしても、改変されたシステインが、抗体表面上で溶媒に高く暴露される場合でのみ生じる。しかしながら、頻繁には、あまり暴露されていない位置が、抗体複合体、例えば、ＡＣＤに使用されるｅｃｍＡｂにおける改変されたシステイン残基のために好ましい。還元剤は、それらのあまり暴露されていない改変されたシステイン残基と、及び同等の速度でジスルフィド結合と反応することができる。このようにして、反応（ａ）及び（ｂ）が、同等の速度で生じる場合、選択的活性化条件を見出すことが、しばしば必要である。
【００２９】
反応（ａ）及び（ｂ）が同等の速度で生じるか、又は反応（ｂ）が反応（ａ）よりも早い場合、改変されたシステインの選択的活性化は、鎖間ジスルフィドが還元剤により攻撃される場合、ジスルフィドを再形成するための反応（ｃ）が、鎖間ジスルフィドの所望しない切断をもたらす、第２の還元工程（ｄ）よりも早いことを確保する必要がある。一般的に、反応（ｃ）は単分子反応であるので、反応（ｃ）の速度に影響を及ぼすことは不可能である。６に示されるチオール、及び混合されたジスルフィドは、同じ抗体の一部である。しかしながら、反応（ｄ）の速度は、還元剤の濃度に依存し、結果的に、反応（ｄ）は、十分に低い濃度の還元剤を用いることにより、反応（ｃ）よりも遅くなるようにされ得る。もちろん、反応（ａ）及び（ｂ）は、また、還元剤の濃度に依存し、結果的に、それらの条件下で、活性化は、また遅い。従って、改変されたシステインの選択的活性化は、一般的に、長時間にわたって、非常に穏やかな還元条件（低濃度の還元剤、及び比較的軽度の還元剤）の維持により好まれる。
【００３０】
スキーム２
【化２】
0006713931.tif 000003
【００３１】
還元反応混合物は、任意の適切な量のタンパク質を含むことができる。典型的には、還元反応混合物中のタンパク質（抗体又は非抗体タンパク質）の濃度は、約０．０１ｍｇ／ｍ〜約１５０ｍｇ／ｍｌ、より典型的には、約１ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｌ／ｍｌの範囲である。還元反応混合物は、例えば還元反応混合物１ｍｌの当たり、約０．０１、０．０５、０．１、０．２５、０．５、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１２．５、１５、１７．５、２０、２２．５、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、又は１５０ｍｇのタンパク質（抗体又は非抗体タンパク質）を含むことができる。タンパク質（抗体又は非抗体タンパク質）の濃度は、使用される特定の反応条件に依存して、より高くても又は低くても良い。当業者は、質量に基づく濃度（例えば、ｍｇ／ｍｌ）を、モル濃度（すなわち、モルｌ／ｌ）に変換することができるであろう。
【００３２】
任意の適切な量の還元剤が本発明の方法に使用され得る。一般的に、還元反応混合物中の還元剤の濃度は、反応が進行するのに十分に高いが、しかしながら、十分に低いので、鎖間ジスルフィド還元は、無視できるほど遅い。還元反応混合物は、典型的には、初期濃度で、初期量の還元剤を用いて形成される。この初期濃度は、還元反応の期間を通して追加の量の還元剤を、還元反応混合物に、連続的に、又は段階的に補充することにより、実質的に維持される。一定の実施態様によれば、還元反応混合物は、還元反応を通して、追加の量の還元剤を、連続的態様で補充される。実施例に記載される条件を用いて、システインの最適濃度は、約０．５ｍＭ〜約１．５ｍＭであることが決定された。還元剤の強度及びｅｃｍＡｂの濃度に依存して、その濃度は高められても又は低められても良い。いくつかの実施態様によれば、還元剤の濃度は、全抗体の濃度よりも高い濃度で維持されるであろう。還元剤：全抗体の最適な濃度比はまた、還元剤の強度に依存するであろう。いくつかの態様によれば、還元反応混合物中の還元剤の濃度は、還元反応混合物中の全抗体の濃度よりも約５〜約２５倍、５〜約２０倍、５〜約１５倍、又は５〜約１０倍、高いであろう。例えば、いくつかの実施態様によれば、還元反応混合物中の還元剤：全抗体の濃度比は、約５：１、 ６：１、 ７：１、 ８：１、 ９：１、 １０：１、 １１：１、 １２：１、 １３：１、 １４：１、 １５：１、 １６：１、 １７：１、 １８：１、 １９：１又は２０：１である。いくつかの実施態様、例えば、還元剤がシステインである場合のいくつかの実施態様によれば、還元反応混合物中の還元剤：全抗体の濃度比は、約５：１〜約１２：１、約７：１〜約１０：１、好ましくは約８：１であろう。いくつかのそのような態様によれば、改変されたシステイン残基は、Ｈ鎖の位置２３９に存在するであろう（ＥＵ指標に従って番号付け）。他の濃度比が、要因、例えば、使用される特定の還元剤又は抗体における改変されたシステイン残基の位置に依存して、本発明の方法に使用され得る。
【００３３】
システイン残基（改変された又は生来のシステイン残基）を脱キャッピングする還元反応は、それが、鎖間ジスルフィド結合の還元、及び遊離チオールの続く生成を最少にするように実施される。キャップされたシステイン残基を有するタンパク質に存在する鎖間ジスルフィド結合の実質的にすべてが、本発明の方法を用いて形成された、未キャップのタンパク質調製物に保持される。一般的に、鎖間ジスルフィド結合の少なくとも約８０％が、未キャップのタンパク質調製物に保持される。一定の実施態様によれば、鎖間ジスルフィド結合の少なくとも約８５％が、未キャップのタンパク質調製物に保持される。一定の実施態様によれば、鎖間ジスルフィド結合の少なくとも約９０％、又は約９５％が、未キャップのタンパク質調製物に保持される。一定の実施態様によれば、鎖間ジスルフィド結合のすべてが、未キャップのタンパク質調製物に保持される。又は、言い換えれば、典型的な実施態様によれば、鎖間ジスルフィド結合の約２０％未満、約１５％未満、約１０未満、又は約５％未満が、還元反応の間、一対の遊離チオールに変換される。抗体に適用される場合、キャップされ、改変されたシステイン残基を有する抗体分子（例えば、還元反応の前の抗体分子）に存在する鎖間ジスルフィド結合の実質的にすべてが、本発明の方法を用いて形成される未キャップの抗体調製物に保持される。一般的に、鎖間ジスルフィド結合の少なくとも約８０％が、未キャップの抗体調製物に保持される。一定の実施態様によれば、鎖間ジスルフィド結合の少なくとも約８５％が、未キャップの抗体調製物に保持される。一定の実施態様によれば、鎖間ジスルフィド結合の少なくとも約９０％、又は約９５％が、未キャップの抗体調製物に保持される。一定の実施態様によれば、鎖間ジスルフィド結合のすべてが、未キャップの抗体調製物に保持される。又は、言い換えれば、典型的な実施態様によれば、鎖間ジスルフィド結合の約２０％未満、約１５％未満、約１０未満、又は約５％未満が、還元反応の間、一対の遊離チオールに変換される。
【００３４】
還元剤の濃度は、還元反応混合物において維持されるが、還元副産物は、還元反応混合物から除去される。還元剤添加、及び副産物除去は、連続的に又は段階的に行われ得る。一定の実施態様によれば、還元剤添加及び副産物除去は、連続的態様で行われる。還元剤が添加され、そして副産物が、技法、例えば、接線流濾過（例えば、ダイアフィルトレーション）、サイズ排除クロマトグラフィー、固相固定化及び透析（但し、それらだけには限定されない）により除去され得る。ダイアフィルトレーション工程によれば、還元剤水溶液が、典型的には、所定の流速で還元反応混合物に、その混合物の一部をほぼ同じ流速で除去しながら、添加される。半透膜が、還元反応混合物夕のタンパク質（例えば、抗体）を保持するために使用され得る。他方では、タンパク質（例えば、抗体）は、固体支持体（例えば、プロテインＡアガロースビーズ）上に固定され得、そして、還元剤水溶液が、固定されたタンパク質（例えば、抗体）を通過し得る。キャップ副産物と反応する反応性樹脂もまた、使用され得る。例えば、キャップ副産物は、タンパク質（例えば、抗体）を排除するのに十分に小さな孔の内部上に、反応性部分、例えば、ジスルフィドを有する樹脂を用いて隔離され得る。
【００３５】
従って、本発明のいくつかの実施態様は、上記のような方法を提供し、ここで、還元反応混合物からのキャップ副産物の除去は、還元反応の間、還元反応混合物を透析するか、又はダイアフィルトレートすることを包含する。いくつかの実施態様によれば、還元反応混合物からのキャップ副産物の除去は、還元反応の間、還元反応混合物をダイアフィルトレートすることを包含する。
【００３６】
しばしば、本発明の方法は、システイン残基の脱キャッピングを最大にするために実施される。しかしながら、いずれか１つのタンパク質分子は、キャップされたシステイン残基、及び未キャップの残基を有することができる。しばしば、未キャップの抗体調製物は、複数の次の抗体分子を含むであろう：少なくとも２つの未キャップの改変されたシステイン残基を有し、そして、キャップされ、改変されたシステイン残基を有さない抗体分子；少なくとも２つのキャップされ、改変されたシステイン残基を有し、そして、未キャップの改変されたシステイン残基を有さない抗体分子；及び少なくとも１つのキャップされ、改変されたシステイン残基及び少なくとも１つの未キャップの改変されたシステイン残基を有する抗体分子。好都合には、本発明の方法は、高レベルの選択的に未キャップの改変されたシステイン残基を提供する。例えば、前記方法は、改変されたシステイン残基の少なくとも４０％が、脱キャップされるよう実施され得る。いくつかの態様によれば、前記方法は、改変されたシステイン残基の少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％又は少なくとも約９０％が脱キャップされるよう実施され得る。一定の実施態様によれば、改変されたシステイン残基の少なくとも６０％が、脱キャップされる。より高いか、又は低いレベルの脱キャッピングが、特定の抗体、及び抗体内の改変されたシステイン残基の位置に一部、依存して、また生じ得る。本発明の方法は、一般的に、システイン残基の脱キャッピングを最大にするために行われるが、システイン残基の脱キャッピングの最大化が所望されない場合が存在する。例えば、２つの改変されたシステイン残基を有する抗体に関しては、システイン残基の１つを、機能剤に単にコンジュゲートすることが所望される場合である。いくつかのそのような実施態様によれば、本発明の方法は、改変されたシステイン残基の活性化を、しっかりと調節するために使用され得る。本発明の方法の好都合な態様は、中間レベルの脱キャッピングが、所望するレベルで活性化を停止し、そして、コンジュゲートすることにより、単純に容易に達成可能であることである。そのような中間複合体は、完全な還元、続く再酸化の方法を用いる場合、得ることは困難である。
【００３７】
反応混合物は、追加の試薬、又は成分を含むことができる。非制限的例として、反応混合物は、緩衝液（例えば、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸(ＭＥＳ)、 ２−［４−（２−ヒドロキシエチル) ピペラジン−１−イル] エタンスルホン酸(ＨＥＰＥＳ)、 ３−モルホリノプロパン−１−スルホン酸(ＭＯＰＳ)、 ２−アミノ−２−ヒドロキシメチル − プロパン−１、３−ジオ−ル (ＴＲＩＳ)、 リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸緩衝生理食塩水、 クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム及びホウ酸ナトリウム）、共溶媒（例えば、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、エタノ−ル、メタノ−ル、イソプロパノ−ル、グリセロ−ル、テトラヒドロフラン、アセトン、アセトニトリル及び酢酸）、塩（例えば、ＮａＣｌ、 ＫＣｌ、 ＣａＣｌ2、 及びＭｎ2+及び Ｍｇ2+の塩）、変性剤（例えば、尿素及び塩酸グアニジン）、界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム及びTriton-X100）、及びキレート剤（例えば、エチレングリコ−ル − ビス(２−アミノエチルエ−テル)−N、N、N'、N'−四酢酸(ＥＧＴＡ)、 ２−(｛２−[ビス（カルボキシメチル）アミノ]エチル｝ (カルボキシメチル)アミノ)酢酸 (ＥＤＴＡ)、 及び １、２−ビス（o−アミノフェノキシ）エタン−N、N、N'、N'−四酢酸(ＢＡＰＴＡ)）を含むことができる。緩衝液、共溶媒、塩、変性剤、界面活性剤、及びキレート剤は、当業者により容易に決定され得る任意の適切な濃度で使用され得る。一般的に、緩衝液、共溶媒、塩、変性剤、界面活性剤及びキレート剤は、存在する場合、約１μＭ〜約１Ｍの範囲の濃度で、反応混合物に含まれる。例えば、緩衝液、共溶媒、塩、変性剤、界面活性剤及びキレート剤は、約１μＭ、又は約１０μＭ、又は約１００μＭ、又は約１ｍＭ、又は約１０ｍＭ、又は約２５ｍＭ、又は約５０ｍＭ、又は約１００ｍＭ、又は約２５０ｍＭ、又は約５００ｍＭ、又は約１Ｍの濃度で反応混合物に含まれ得る。特に、共溶媒は、例えば約１％v/v〜約７５％v/v、又はそれよりも高い範囲の量で反応混合物に含まれ得る。共溶媒は、約５、１０、２０、３０、４０、又は５０％v/vの量で、反応混合物に含まれ得る。
【００３８】
反応は、未キャップのシステイン残基を形成するのに十分な条件下で行われる。反応はいずれか適切な温度で行われ得る。一般的に、反応は、約４℃〜約４０℃の温度で行われる。反応は、例えば、約２５℃又は約３７℃で行われ得る。反応は、いずれか適切なｐＨで行われ得る。一般的に、反応は、約６．５〜約１０のｐＨで行われる。ある場合、ｐＨは、約７．０〜約８．５である。反応は、いずれか適切な時間、行われ得る。選択される時間の長さは、還元剤の強度に依存するであろう。穏やかな還元条件（低濃度の還元剤、及び比較的穏やかな還元剤）が、本発明の方法に使用されるので、還元反応は、典型的には、鎖間ジスルフィド結合の還元のために予測されるよりも長く延長されるであろう。いくつかの好ましい態様によれば、還元反応は、キャップされ、改変されたシステイン残基の少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約８５％が脱キャップされるまで、進行するであろう。いくつかの態様によれば、還元反応は、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、又は少なくとも６時間、適切な条件下でインキュベートされるであろう。反応は、不活性雰囲気、例えば、窒素雰囲気又はアルゴン雰囲気下で行われ得る。他の反応条件は、特定の抗体、又は還元剤の正体に依存して、本発明の方法に使用され得る。
【００３９】
いくつかの実施態様によれば、反応混合物のｐＨは、約６．５〜約８．５の範囲である。いくつかの実施態様によれば、本発明の方法は、約４℃〜約３７℃の範囲の温度で、反応混合物を維持することを包含する。いくつかの実施態様によれば、反応混合物は、約１〜約８時間の範囲の時間、所望する温度で維持される。
【００４０】
多くの既知精製技法が、本発明の方法の間、種々の点で使用され得る。そのような技法は、過剰還元剤を除去し、反応混合物から緩衝液又は他の成分を交換し、そして必要の場合、抗体組成物を濃縮するか又は希釈するために使用され得る。本発明の方法において有用な精製技法は、接線流濾過（ＴＦＦ）、ゲル濾過、免疫沈澱、親和性クロマトグラフィー及び同様のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない。好ましくは、精製時間は、未キャップの改変されたシステインの所望しない酸化、又は再キャッピングを妨げるために、最小化される。
【００４１】
抗体複合体
抗体上の未キャップの改変されたシステイン残基は、種々の機能剤、例えばイメージング剤（例えば、発色団及び蛍光団）、診断剤（例えば、ＭＲＩ造影試薬及び放射性同位体）、安定剤（例えば、ポリエチレングリコールポリマー）及び治療剤のインストールのための有用な手段として役に立つ。未キャップのシステイン残基を有する抗体は、抗体−機能剤−複合体を形成するために、機能剤にコンジュゲートされ得る。機能剤（例えば、薬物、検出剤、安定剤）は、改変されたシステイン残基の部位で、抗体にコンジュゲートされる（共有結合される）。機能剤は、リンカーを通して間接的に、又は機能剤上のチオール反応性基を通して直接的に、結合され得る。
【００４２】
未キャップのシステイン残基を有する抗体は、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成するために、薬物にコンジュゲートされ得る。典型的には、ＡＤＣは、薬物と抗体との間にリンカーを含む。リンカーは切断できるか、又は非切断性リンカーであり得る。切断できるリンカーは、典型的には、リンカーの切断が標的部位で抗体から薬物を放出するよう細胞内条件下で切断を受けやすい。適切な切断可能リンカーは例えば、細胞内プロテアーゼ、例えば、リソソームプロテアーゼ、又はエンドソームプロテアーゼにより切断できるリンカーを含むペプチジルを含む酵素切断可能リンカー、又は糖リンカー、例えば、グルクロニダーゼにより切断できるグルクロニド含有リンカーを包含する。ペプチジルリンカーは、例えば、ジペプチド、例えば、バリン−シトルリン（Ｖａｌ−ｃｉｔ）、フェニルアラニン−リシン（ｐｈｅ−ｌｙｓ）又はバリン−アラニン（ｖａｌ−ａｌａ）を包含する。他の適切な断片可能リンカーは、例えば、ｐＨ−感受性リンカー（例えば５．５未満のｐＨで加水分解できるリンカー、例えば、ヒドラゾンリンカー）、及び還元条件下で切断できるリンカー（例えば、ジスルフィドリンカー）を包含する。非切断性リンカーは典型的には、抗体のタンパク質分解により薬物を開放する。
【００４３】
抗体へのコンジュゲートの前、リンカーは未キャップの改変されたシステイン残基と反応性の基を有し、そして結合は、その反応性基を通してであろう。チオール特異的反応性基が好ましく、そして、例えば、マレイミド；ハロアセトアミド（例えば、ヨード、ブロモ又はクロロ）；ハロエステル（例えば、ヨード、ブロモ又はクロロ）；ハロメチルケトン（例えば、ヨード、プロモ、又はクロロ）；ベンジルハロゲン化物（例えば、ヨウ化物、臭化物又は塩化物）；ビニルスルホン；（ピリジル）ジスルフィド；二酸化ジスルフィド誘導体；水銀誘導体、例えば酢酸塩、塩化物又は硝酸塩の対イオンを有する３，６−ビス（マーキュリーメチル）ジオキサン；及びポリメチレンビスメタンチオルホネートを包含する。リンカーは例えば、チオ−スクシンイミド連結を介して抗体に結合するマレイミドを包含することができる。
【００４４】
薬物は、任意の細胞毒性、細胞増殖抑制、又は免疫抑制薬物であり得る。リンカーが、抗体、及び薬物を連結する実施態様によれば、薬物は、リンカーと結合を形成できる官能基を有する。例えば、薬物は、リンカーと結合を形成できる、アミン、カルボン酸、チオール、ヒドロキシル基、又はケトンを有することができる。薬物が、リンカーに直接結合される態様によれば、薬物は、抗体への結合の前、未キャップの改変されたシステインと反応性の基を有するであろう。
【００４５】
有用な種類の薬物は、例えば、抗チューブリン剤、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化剤、抗生物質、抗葉酸剤、代謝拮抗剤、化学療法増感剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイド、又は同様のものを包含する。特に、有用な種類の細胞毒性剤の例は、例えば、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡアルキル化剤、及びチューブリン阻害剤を包含する。典型的な細胞毒性剤は、例えば、アウリスタチン、カンプトテシン、デュオカルマイシン、エトポシド、メイタンシン、及びメイタンシノイド（例えば、DM1及びDM4）、タキサン、ベンゾジアゼピン、又はベンゾジアゼピン含有薬物（例えば、ピロロ［１，４］−ベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、インドリノベンゾジアゼピン、及びオキサゾリジノベンゾジアゼピン）、及びビンカアルカノイドを包含する。ベンゾジアゼピン含有薬物は、国際公開第２０１０／０９１１５０号、国際公開第２０１２／１１２７９８号、国際公開第２００７／０８５９３０号、及び国際公開第２０１１／０２３８８３号に記載されている。
【００４６】
いくつかの典型的な実施態様によれば、適切な細胞毒性剤は、例えば、ＤＮＡ副溝結合剤（例えば、エンジイン及びレキシトロプシン、ＣＢＩ化合物；また米国特許第６，１３０，２３７号を参照のこと）、デュオカルマイシン（米国公開番号第２００６００２４３１７号を参照のこと）、タキサン（例えば、パクリタキセル及びドセタキセル）、ピューロマイシン、ビンカアルカロイド、ＣＣ−１０６５、ＳＮ−３８、トポテカン、モルホリノ - ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ - ドキソルビシン、エキノマイシン、コンブレタスタチン、ネトロプシン、エポチロンＡ及びＢ、エストラムスチン、クリプト、セマドチン、メイタンシノイド、ジスコデルモリド、エレウテロビン、及びミトキサントロンを包含する。
【００４７】
薬物は、抗チューブリン剤であり得る。抗チューブリン剤の例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには制限されない：タキサン（例えば、タキソール（登録商標）（パクリタキセル）、タキソテール（登録商標）（ドセタキセル））Ｔ６７（Tularik）、及びビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、及びビノレルビン）。他の抗チューブリン剤は、例えば、バッカチン誘導体、タキサン類似体（例えば、エポチロンＡ及びＢ）、コダゾール、コルヒチン及びコルセミド、エストラムスチン、クリプト、セマドチン、メイタンシノイド、コンブレタスタチン、ジスコデルモリド、アウリスタチン、及びエレウテロビンを包含する。
【００４８】
薬物は、メイタンシン又はメイタンシノイド、別のグループの抗チューブリン剤であり得る（また、Chari et al., 1992, Cancer Res. 52:127-131及び米国特許第８，１６３，８８８号を参照のこと）。
【００４９】
薬物は、アクリスタチンであり得る。アウリスタチンは、ＡＥ、ＡＦＰ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ、ＭＭＡＦ、及びＭＭＡＥを包含するが、但しそれらだけには制限されない。アウリスタチンの合成及び構造は、米国特許出願公開番号第２００３−００８３２６３号及び第２００９−０１１１７５６号；国際特許公開番号第０４/０１０９５７号；国際特許公開番号第０２/０８８１７２号；米国特許第６，８８４，８６９号；米国特許第７，６５９，２４１号；米国特許第７，４９８，２９８号；米国特許第８，３４３，９２８号；及び米国特許第８，６０９，１０５号（それらの個々は、参照により全体が本明細書に組込まれる）に記載される。
【００５０】
いくつかの実施態様によれば、薬物部分は、抗チューブリン剤、ＤＮＡ結合剤及びＤＮＡアルキル化剤から成る群から選択される。いくつかの実施態様によれば、薬物は、アウリスタチン、ピロロベンゾジアゼピン、デュオカルマイシン、メイタンシノイド、タキサン、カリケアマイシン、及びアントラサイクリンから成る群から選択される。
【００５１】
薬物−リンカーは、単一工程でＡＤＣを形成するために使用され得る。他の実施態様によれば、二官能性リンカー化合物は、二工程又は多工程方法で、ＡＤＣを形成するために使用され得る。１つの例によれば、未キャップの改変されたシステイン残基は、第１工程でリンカーの反応性部分と反応され、そして、リンカー上の官能基が、続く工程でＡＤＣ形成するために、薬物と反応せしめられる。
【００５２】
一般的に、リンカー上の官能基は、薬物部分における適切な反応基との特異的反応のために選択される。非制限的例として、アジドベースの部分が、薬物部分における反応性アルキン基との特異的反応のために使用され得る。薬物は、アジド及びアルキンの１，３−双極子付加還化を通して、リンカーに共有結合される。他の有用な官能基は、例えば、ケトン及びアルデヒド（ヒドラジド及びアルコキシアミンとの反応に適する）；ホスフィン（アジドとの反応に適する）；イソシアネート及びイソチオシアネート（アミン及びアルコールとの反応に適する）；及び活性化されたエステル、例えば、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル（アミン及びアルコールとの反応に適する）を包含する。例えば、Bioconjugate Techniques, 2nd Ed. (Elsevier)に記載されるように、それらの及び他の連結手段は、当業者に良く知られている。当業者は、反応性官能基の相補対が、リンカーへの薬物部分の選択的反応のために選択される場合、前記対の各メンバーが、リンカー又は薬物のいずれか上に使用され得ることを理解するであろう。
【００５３】
従って、本発明のいくつかの実施態様は、未キャップの抗体（例えば、未キャップの抗体調製物を包含する）と、薬物−リンカー化合物とを、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を形成するのに十分な条件下で組合すことを、さらに包含する、上記未キャップの抗体調製物の調製方法を提供する。
【００５４】
いくつかの実施態様によれば、前記方法は、未キャップの抗体と、二官能性リンカー化合物とを、抗体−リンカー複合体を形成するのに十分な条件下で、組合すことを包含する。そのような実施態様によれば、本発明の方法はさらに、抗体−リンカー複合体と、薬物部分とを、リンカーを通して抗体に薬物部分を共有結合するのに十分な条件下で、組合すことを包含することができる。
【００５５】
いくつかの実施態様によれば、ＡＤＣは、下記式：
【００５６】
【化３】
0006713931.tif 000004
［式中、Ａｂは抗体であり、ＬＵはリンカーであり、Ｄは薬物であり、そして下付文字ｐは１〜８である］で表される。
【００５７】
上記式において、リンカーＬＵは、未キャップの改変されたシステインを通して抗体にコンジュゲートされる。下付文字ｐの値は、コンジュゲートのために利用できる未キャップの改変されたシステインの数に依存する。例えば、２つの末キャップの改変されたシステインを有する抗体（各Ｈ鎖上の１つの部位、又は各Ｌ鎖上の１つの部位）に関しては、ｐの値は２であり得る。同様に、４個の未キャップの改変されたシステインを有する抗体（例えば、各Ｈ鎖上の２つの部位、又は各Ｌ鎖上の２つの部位、又は各Ｈ鎖上の１つの部位、及び各Ｌ鎖上の１つの部位）に関しては、ｐの値は４であり得る。いくつかの好ましい実施態様によれば、ｐは１〜４の値である。
【００５８】
薬物負荷
抗体当たりの薬物−リンカー分子の平均数（又は平均薬物負荷）は、標的細胞に送達され得る薬物の量の主要決定因子であるので、ＡＤＣ組成物の重要な特性である。平均薬物負荷は、改変されたシステイン残基にコンジュゲートされる薬物、及び意図される改変されたシステイン残基以外の部位にコンジュゲートされる薬物、及び組成物における未コンジュゲートの抗体の量を包含する。抗体当たり約２つの薬物の平均薬物負荷が標的化される場合、２つの改変されたシステイン残基を有する抗体（例えば、各Ｈ鎖上の１つの部位又は各Ｌ鎖上の１つの部位）が、ＡＤＣ組成物を調製するために使用され得る。抗体当たり約４個の薬物の平均薬物負荷が、標的化される場合、４個の改変されたシステイン残基を有する抗体（例えば、各Ｈ鎖上の２つの部位、又はＬ鎖上の２つの部位、又はＨ鎖上の１つの部位及びＬ鎖上の１つの部位）が、ＡＤＣ組成物を調製するために使用され得る。当業者は、他のレベルの薬物負荷（例えば、２以下の薬物負荷レベル及び４以上の薬物負荷レベルを包含する）が、特定の抗体又は特定の薬物に依存して、治療的に有用であることを理解しているである。薬物複合体のために部位は、Ｈ鎖における複数の部位又は２以上の部位で、改変されたシステインを配置することにより、又はＬ鎖における上記部位で、改変されたシステインを配置することにより、又は両者により、抗体に導入され得る。重要なことは、上記の改変されたシステイン残基の脱キャッピングのレベルは、有用な薬物負荷を有するＡＤＣ組成物の調製を可能にする。
【００５９】
典型的には、２つの改変されたシステイン残基を有する抗体により調製されたＡＤＣ組成物は、抗体当たり約１．５〜２．５の薬物の平均薬物負荷を有する。抗体当たりの薬物部分の平均数は例えば、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、又は２．５であり得る。いくつかの実施態様によれば、２つの改変されたシステイン残基を有する抗体により調製されたＡＤＣ組成物についての平均薬物負荷は、抗体当たり約１．５〜約２．２又は約１．８〜約２の薬物部分である。典型的には、４個の改変されたシステイン残基を有する抗体により調製されたＡＤＣ組成物は、抗体当たり約３．４〜４．５の薬物部分の平均薬物負荷を有する。抗体当たりの薬物部分の平均数は、約３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、又は４．０であり得る。４個の改変されたシステイン残基を有する抗体により調製されたＡＤＣ組成物についての平均薬物負荷は、抗体当たり約３．６〜約４．２、又は約３．８〜約４の薬物部分である。
【００６０】
本発明の方法は、典型的には、未キャップの改変されたシステイン残基を、選択的に修飾するために行われるが、しかしながら、種々の程度の非改変された（すなわち、生来の）システイン残基修飾が通常、観察される。反応条件は、必要な場合、非改変されたシステイン残基の修飾を制限するよう調節され得る。特定の場合、前記方法は、非改変されたシステイン残基の修飾を排除するか、又は最小にするために実施され得る。例えば、前記方法は、ＡＤＣ組成物中の抗体分子の約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満又は約５％未満が非改変されたシステイン残基に共有結合される薬物部分を有するよう、実施され得る。前記方法はまた、ＡＤＣ組成物を調製するためにも使用され、ここで修飾された非操作システイン残基を有する抗体分子の数は、全抗体分子の約５％、１０％、２０％、２５％又は３０％未満に及ぶ。
【００６１】
種々の分析方法が、収率、及び複合体の異性体混合物を決定するために使用され得る。抗体への薬物のコンジュゲートに続いて、コンジュゲートされた薬物−抗体種が分離され得る。いくつかの実施態様によれば、コンジュゲートされた抗体種は、抗体、薬物及び／又は複合体の特徴に基づいて分離され得る。ＡＤＣ組成物の分析のために有用な他の技法は、逆相クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動及び質量分析法を包含するが、但しそれらだけには制限されない。例えば、ＡＤＣ組成物は、ＡＤＣ中の薬物部分の位置を決定するために、タンパク質分解消化をカップリングされたＬＣ／ＭＳにより分析され得る。
【００６２】
抗体
多くの適切な抗体が、本発明の方法に使用され得る。本発明の方法に使用される抗体は、特徴的抗原に関連する疾患及び病状についてのインビトロ又はインビボ診断、インビボイメージング、及び治療を包含する多くの用途のために有用である。５種のヒト抗体クラス（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥ）、及びそれらのクラス内の種々のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）は、構造的差異、例えば、単一の抗体分子における免疫グロブリン単位の数、個々の単位のジスルフィド架橋構造、及び鎖長及び配列における差異に基づいて認識される。抗体のクラス及びサブクラスは、抗体アイソタイプと呼ばれる。
【００６３】
抗体は、完全な抗体又は抗原結合抗体フラグメントであり得るが、但しその抗体フラグメントは、少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合を含む。
【００６４】
典型的には、抗体は、ヒト、齧歯類（例えば、マウス及びラット）、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、又はニワトリである。抗体は、例えば、当業者に良く知られている技法により生成される、ネズミ、キメラ、ヒト化、又は完全ヒト抗体であり得る。標準の組換えＤＮＡ技法を用いて製造され得る、ヒト及び非ヒト部分の両者を含む組換え抗体、例えば、キメラ、及びヒト化モノクローナル抗体は、有用な抗体である。キメラ抗体は、異なった部分が、異なった動物種に由来する分子、例えば、ネズミモノクローナル由来の可変領域、及びヒト免疫グロブリン定常領域を有するそれらの分子である（例えば、Cabilly et al., 米国特許第４，８１６，５６７号; 及び Boss et al., 米国特許第４，８１６，３９７号を参照のこと；それらは、それらの全体が参照により本明細書に組込まれる）。ヒト化抗体は、非ヒト種からの１又は２以上の相補性決定領域、及びヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を有する、非ヒト種からの抗体分子である（例えば、Queen、米国特許第５，５８５，０８９号を参照のこと；それは、それらの全体が参照により本明細書に組込まれる）。そのようなキメラ及びヒト化モノクローナル抗体は、当業界において知られている組換えＤＮＡ技法により生成され得る。本明細書において使用され得る場合、「ヒト（human）」抗体は、例えば、米国特許第５，９３９，５９８号及び第６，１１１，１６６号に記載されるように、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を包含し、そしてヒト免疫グロブリン、ヒトＢ細胞、又は１又は２以上のヒト免疫グロブリンのためのトランスジェニック動物から単離された抗体を包含する。
【００６５】
抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性、又はより大きな多重特異性のものであり得る。
【００６６】
特定の場合、定常ドメインは、エフェクター機能を有する。用語、抗体エフェクター機能とは、本明細書において使用される場合、ＩｇのＦｃドメインにより寄与される機能を意味する。そのような機能は、例えば、食細胞、又は溶解活性を有する免疫細胞上のＦｃ受容体へのＦｃエフェクタードメインの結合により、又は補体系の成分へのＦｃエフェクタードメインの結合によりもたらされ得る。エフェクター機能は、例えば、「抗体依存性細胞毒性（antibody-dependent cellular cytotoxicity）」又はＡＤＣＣ、「抗体依存性細胞食作用（antibody-dependent cellular phagocytosis）」又はＡＤＣＰ、「補体依存性細胞毒性（complement-dependent cytotoxicity）」又はＣＤＣであり得る。特定の場合、定常ドメインは、１又は２以上のエフェクター機能を欠いている。エフェクター機能結合ドメインに位置する改変されたシステイン残基への薬物リンカー化合物のコンジュゲートが、エフェクター機能を調節することができる。
【００６７】
抗体は、医療及び／又は治療的関心のいずれかの抗原に対して指向され得る。例えば、抗原は、病原体（例えば、ウィルス、細菌、菌類及び原生動物（但し、それらだけには限定されない））、寄生虫、腫瘍細胞、又は特定の医学的状態に関連するものであり得る。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の場合、癌は、免疫系、肺、結腸、直腸、乳房、卵巣、前立腺、頭、首、骨、又は他の任意の解剖学的位置のものであり得る。目的の抗原は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：ＣＤ３０、ＣＤ４０、ルイスＹ、ＣＤ７０、ＣＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＣＥＡ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＲ１０、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、Ｌ６、ルイスＸ、αフェトプロテイン、ＣＡ２４２、胎盤アルカリホスファターゼ、前立腺特異抗原、前立腺酸性ホスファターゼ、上皮成長因子、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、抗トランスフェリン受容体、Ｐ９７、ＭＵＣ１−ＫＬＨ、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ１、ＩＬ−２受容体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ムチン、Ｐ２１、ＭＰＧ、及びＮｅｕ癌遺伝子産物。
【００６８】
いくつかの特定の有用な抗体は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：ＣＤ３３抗原に対する抗体（例えば、国際出願番号ＷＯ ２０１３／１７３４９６号に記載されるようなヒト化２Ｈ１２抗体）、ＣＤ７０抗原に対する抗体（例えば、国際出願番号ＷＯ ２００６／１１３９０９号に記載されるようなヒト化１Ｆ６抗体）、ＣＤ３０抗原に対する抗体（例えば、国際出願番号ＷＯ ２００８／０２５０２０号に記載されるようなヒト化ＡＣ１０抗体）、ＣＤ１９抗原胃対する抗体（例えば、国際出願番号ＷＯ ２００９／０５２４３１号に記載されるようなヒト化ＢＵ１２抗体）、ｌＩＶ−１、ＮＴＢＡ又はαＶ β６に対する抗体。腫瘍特異的抗原に結合する多くの他の内在化する抗体が、使用され得、そして概説されてきた（例えば、Franke et al. (2000), Cancer Biother Radiopharm. 15:459-76; Murray (2000), Semin Oncol. 27:64-70; Breitling et al., Recombinant Antibodies, John Wiley, and Sons, New York, 1998を参照のこと）。それらの引例及び国際出願の開示は、参照により、本明細書に組込まれる。
【００６９】
いくつかの実施態様によれば、本明細書は、上記のような未キャップの改変されたシステイン残基を有する抗体の調製方法を提供し、ここで前記抗体は、少なくとも３個の鎖間ジスルフィド結合を含む。いくつかの実施態様によれば、抗体は、少なくとも４個の鎖ジスルフィド結合を含む。いくつかの実施態様によれば、抗体は、１、２、３、４又は５個の鎖間ジスルフィドを含む。いくつかの実施態様によれば、改変されたシステイン残基は、抗体のＨ鎖定常領域又はＬ鎖定常領域に存在する。
【００７０】
改変されたシステイン残基
改変されたシステインの部位は、ＡＤＣの性質に対する影響を有することができる。例えば、タンパク質の構造に完全に埋め込まれた、改変されたシステインは、溶媒への不良な接近のために、コンジュゲートするのに困難であるが、ところが抗体の外表面上の改変されたシステインは、血漿における物質への長期の暴露のために、安定性を損なっているＡＤＣをもたらすことができる。また、高く表面暴露された、改変されたシステインを有するｅｃｏｍＡｂから調製されたＡＤＣは、薬物の疎水性に対して敏感であるが、ところが、より保護された位置での改変されたシステインは、溶液中の他の材料への接近が制限されるので、薬物の性質に対してあまり敏感でない。改変されたシステイン残基の位置はまた、特定のＡＣＤについての所望のようなエフェクター機能を調節するためにも使用され得る。例えば、エフェクター機能結合ドメインにおける改変されたシステイン残基への薬物−リンカーのコンジュゲートは、エフェクター機能介在受容体への結合を阻止するために使用され得る。
【００７１】
いくつかの実施態様によれば、改変されたシステインは、Ｈ鎖定常領域、Ｈ鎖可変領域、Ｌ鎖可変領域、Ｌ鎖定常領域、又はそれらの組合せに位置する。好ましい改変されたシステイン残基は、コンジュゲートでき、そして安定した連鎖をもたらす部分に位置する残基である。コンジュゲートできるとは、改変されたシステイン残基が、最初に、抗体を変性しないで、機能剤（例えば、イメージング剤、診断剤、安定剤又は治療剤）に結合できることを意味する。続いて、機能剤にコンジュゲートされ得るシステイン残基を導入するための部位の選択方法は、当業界において知られている（例えば、Junutula et al., 2008, Nature Biotechnology, 26(8), 925-932を参照のこと）。
【００７２】
いくつかの態様によれば、改変されたシステイン残基は、１０％又はそれ以上、２０％又はそれ以上、３０％又はそれ以上、４０％又はそれ以上、又は５０％又はそれ以上の分別溶媒接近性を有するシステイン残基である。いくつかの態様によれば、システイン残基は、約１０％〜約９５％、約１０％〜約８５％、約１０％〜約７５％、約１０％〜約６０％、約２０％〜約９５％、約２０％〜約８５％、約２０％〜約７５％、約２０％〜約６０％、約４０％〜約９５％、約４０％〜約８５％、約４０％〜約７５％、約４０％〜約６０％の分別溶液接近性を有するシステイン残基である。特定部位での残基の分別溶媒接近性を決定するための方法は、当業界に知られており、そして例えば、Fraczkiewicz and Braun, 1998, J. Comp. Chem., 19, 319-333 (http://curie.utmb.edu/getarea.htmlを参照のこと)に記載される方法を用いるオンラインサーバー getareaを用いて、決定され得る。典型的な残基は、Ｌ鎖上の部位１５、１１４、１２１、１２７、１６８、２０５（Ｋａｂａｔに従って番号付け）、又はＨ鎖上の部位１１２、１１４又は１１６（Ｋａｂａｔに従って番号付け）でのそれらの残基を包含する。典型的な残基は、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域におけるそれらの残基、例えば、Ｆｃ領域における部位２３９、３２６又は２６９でのそれらの残基を包含する（ＥＵ指標に従って番号付け）。部位２３９、３２６及び３２７での残基の分別溶媒接近性は、それぞれ、約５０％、約９４％及び約２３％である。
【００７３】
当業者は、改変されたシステインの選択的活性化のために必要とされる条件は、抗体中の改変されたシステインの部位に依存するであろうことを理解しているであろう。スキーム２における化学式は、改変されたシステインが、タンパク質配列内のどこで発生しても、それらのシステインの選択的活性化を可能にする還元条件を選択するための骨格を提供する。いくつかの実施態様によれば、抗体は、１〜８、又は２〜８、又は２〜４個の改変されたシステイン残基を有する。
【００７４】
非抗体タンパク質
本明細書に記載される工程は、抗体に関して例示されているが、それは、発現又は製造の間、チオールによりキャップされる、改変された、又は生来の不対システイン（タンパク質内で、一般的に鎖間又は鎖内結合を形成しないシステイン）を有する任意のタンパク質のために、都合よく使用され得ることは、当業者により理解されるであろう。この工程が特に有用であるタンパク質は、不対システインを含む他に、鎖間ジスルフィド結合、特に、タンパク質のアンフォールディングをすぐにはもたらさないで切断され得る結合を形成する、生来のシステインを含むタンパク質である。非抗体タンパク質を意味する場合、用語、鎖間ジスルフィド結合とは、隣接するポリペプチド鎖上の２つのシステイン残基間の共有結合を意味する。候補体非抗体タンパク質は、生来の折畳まれたコンフォメーションでの安定性が、キャップされたチオールのコンフォメーションに匹敵する、溶媒暴露されたジスルフィド結合を含むそれらのタンパク質を包含する。改変されたシステインタンパク質とは、本明細書において使用される場合、タンパク質における選択されたアミノ酸が、システインに変異されるタンパク質である。典型的なタンパク質は、また、Ｆｃ−融合タンパク質、例えば、所望する標的に対する特異性を提供するタンパク質に共有結合される抗体のＦｃ領域を含むタンパク質を包含する。
【実施例】
【００７５】
ＩＶ．実施例
実施例１：選択的還元を実施するための典型的な方法
反応容器を、接線流濾過（ＴＦＦ）装置に連結し、そして限外濾過膜を設置する（例えば、８８ｃｍ2、Millipore Pelicon ３、再生セルロース）。（適切なサイズを有する多くの異なった膜型が、この抗体に使用され得る。還元剤についての添加速度の計算のために必要とされる流出速度及び篩分け係数は、透過流束で、及びこの工程に使用されるであろう膜型、及び表面積で決定されるべきである）。膜を、製造業者の指示に従って、フラッシュし、そして平衡化する。ダイアフィルトレーション緩衝液リザーバーを、緩衝液（例えば、５０mＭのトリス／５mＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を含むよう設定する。それを、反応容器に、管を介して連結し、そしてその管を通しての流れを、蠕動ポンプ（例えば、ダイアフィルトレーション緩衝ポンプ）により制御する。キャップされ、改変されたシステインを含むｍＡｂを、反応容器に配置する。反応を室温で行い、反応混合物を、約２０ｐｓｉの膜貫通圧力を維持するためにくびれた保持液ラインにより、限外濾過膜を通してポンプで連続的に送る。
【００７６】
還元剤の溶液を含むリザーバーを、ダイアフィルトレーション緩衝液ライン、又は流路又は反応容器内の他の位置に、管を介して連結する。還元剤を含むストック溶液が、反応混合物における還元剤の初期（所望の）濃度を維持するために、反応混合物に添加されるべき点で、流速を計算する。（反応混合物中の還元剤の最適濃度は、本明細書に記載される技法を用いて、実験的に決定され、そして図１に記載されるように、それらの異なった還元強度のために、異なったチオールごとに異なる）。還元剤の濃度は、全反応時間にわたって、大部分、一定のままであるべきである。ダイアフィルトレーション緩衝液は、また、全反応体積が、一定のままである（一定−体積−ダイアフィルトレーションにおけるように）ように調節される速度で、反応容器中にポンプで送られ、すなわち、反応器中への還元剤、及びダイアフィルトレーション緩衝液の導入速度は、透過を介しての体積損失速度と一致する。
【００７７】
実施例２：キャップ副産物の除去なしで、還元剤としてシステイン、Ｎ−アセチルシステイン、及びシステアミンを用いての改変されたシステイン残基の脱キャッピング
Ｓ２３９Ｃ改変されたシステイン抗体（部位２３９で改変されたシステイン残基を有するＩｇＧ１抗体；ＥＵ指標に従って番号付け）２０ｍｇ（１５ｍｇ/ｍｌで１３５ｎモル）を、ｐＨ８．０及び室温で８時間、３３μｌの１００ｍＭ（３．３μモル）のシステイン、Ｎ−アセチルシステイン、又はシステアミンにより処理した。サンプルを、１時間の間隔で除去し、精製し、過剰のＳＧＤ−１２６９とコンジュゲートし、そして凍結貯蔵した。精製及びコンジュゲートが、還元反応を停止し、還元工程により生成されたチオールを保存した。コンジュゲートされたサンプルを、変性条件（［ｒＰＬＲＰ］）下で、逆相ＨＰＬＣにより分析し、これから、改変されたシステイン脱キャッピングの程度を推定した（Ｈ０のＨ１への変換）。鎖間ジスルフィド切断の程度を、コンジュゲートされた１以上のｍｃＭＭＡＦを有するＨ鎖の量から決定した（ｍｃＭＭＡＦは、薬物モノメチルアウリスタチンＦに結合されたマレイミドカプロン酸リンカーである）。コンジュゲートされた２以上のｍｃＭＭＡＦ分子を有するＨ鎖は、観察されなかった。静的溶液還元実験からの結果を、図１に示す。結果は、３個のチオールの個々が、改変されたシステインを脱キャップするために、ｅｃｍＡｂと反応することができるが、しかしながら、それらの３個のチオールは、非常に異なった挙動性を有することを示す。ＮＡＣは、スキーム１における第１反応により、最も直接的に記載される態様で挙動する：反応は、十分な濃度のジスルフィド４が蓄積するまで、進行し、次に、順方向及び逆方向の反応が、同じ速度で発生するので、停止する。システインは、ＮＡＣよりもより強力な還元剤として挙動するが、しかしながら、部分的に活性化されたｅｃｍＡｂでの停止の代わりに、反応は逆転し、ｅｃｍＡｂを再生する。この逆転は、システインにより、追加の反応、すなわち、還元剤の自動酸化が関与することを示唆する。
【００７８】
【化４】
0006713931.tif 000005
【００７９】
従って、システインの自動酸化により生成されるシステインはまた、活性化され、改変されたシステインを再キャップし、初期還元を逆転する。図１の試験は、この同じ現象、すなわち初期還元、続く再キャッピングがまた、システアミンによっても生じるが、しかしながら、システアミンは弱い還元剤であり、結果的に、還元の初期程度はシステイン又はＮ−アセチルシステインほど高くなかったことを示す。
【００８０】
実施例３：ｅｃｍＡｂにおける改変されたシステイン残基の選択的活性化
反応容器を、接線流濾過（ＴＦＦ）装置に連結し、そして限外濾過膜を設置した（例えば、８８ｃｍ2、Millipore Pelicon ３、再生セルロース）。膜を、製造業者の指示に従って、フラッシュし、そして平衡化した。ダイアフィルトレーション緩衝液リザーバーを、５０mＭのトリス／５mＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を含むように設定した。それを、反応容器に、管を介して連結し、そしてその管を通しての流れを、蠕動ポンプ（例えば、ダイアフィルトレーション緩衝ポンプ）により制御した。キャップされた、改変されたシステインを含む、改変されたシステインｍＡｂ（ｈ２Ｈ１２ Ｓ２３９Ｃ ｅｃＭａｂ、ｈ１Ｆ６ ２３９ ｅｃＭａｂ、ｈ２Ｈ１２ Ｋ３２６Ｃ ｅｃＭａｂ又はｈ２Ｈ１２ Ａ３２７Ｃ ｅｃＭａｂ；ＥＵ指標に従って番号付け）を、約１５ｍｇ／ｍｌの濃度で反応容器に配置し、そして、ｐＨを８．０に調節した。反応を室温で行い、反応混合物を、約２０ｐｓｉの膜貫通圧力を維持するためにくびれた保持液ラインにより、限外濾過膜を通して、ポンプで連続的に送った。
【００８１】
システイン溶液を含むリザーバーを、ダイアフィルトレーション緩衝液ラインに、管を介して連結した。システインストック溶液が、反応混合物におけるシステインの初期（所望の）濃度を維持するために、反応混合物に添加されるべき点で、流速を計算した。反応混合物中に供給されるシステインストックの濃度、及び添加速度を、下記のようにして計算し、結果的に、システインの濃度は、全反応時間にわたって大部分、一定のままであった。図２〜５に示される例においては、システインの反応濃度は、０．５〜０．９ｍＭの範囲であり（図の説明に記載されるように）；システインのストック濃度は、１００ｍＭ、１０ｍＭ、又は５ｍＭのいずれかであり、そして反応器中に注入されるシステインの流速を、下記式に従って、実験システイン濃度を維持するために調節した。システインについての篩分け計数を、０．８〜０．９で測定した。反応混合物中のシステイン濃度を、ＤＴＮＢアッセイを用いて、実験を通して定期的に決定し、システインレベルが、所望する濃度（示されていない）で維持していることを確認した。
【００８２】
ダイアフィルトレーション緩衝液をまた、全反応体積が一定のままである（一定−体積−ダイアフィルトレーションにおけるように）ように調節される速度で、反応容器中にポンプで送り、すなわち、反応器中へのシステイン及びダイアフィルトレーション緩衝液の導入速度は、透過を介しての体積損失速度と一致する。
【００８３】
サンプルを、図に示される間隔で除去し、ＰＤ−１０カラムを通しての溶出により精製し、そしてＳＧＤ−１２６９とコンジュゲートした。次に、コンジュゲートされたサンプルを、ｒＰＬＲＰにより分析した。ｒＰＬＲＰクロマトグラムの分析は、キャップされたままであったＨ鎖の割合（％Ｈ０）、改変されたシステインで選択的に還元された割合（％Ｈ１）、又は改変されたシステインで、及びさらに、鎖間ジスルフィド部位で還元された割合（％Ｈ２；非選択的還元）を提供した。
【００８４】
システイン添加速度の計算
システインを、反応混合物に、システインが、透過ラインを通して損なわれる同じ速度で添加した。透過ラインを通して分析物の損失の初期速度を、式２から計算し、この式は一定体積ダイアフィルトレーションによるクリアランスのための理論式、すなわち式１から誘導され得る。システインストック溶液が、初期システイン濃度を維持するために、反応混合物中にポンプ輸送される速度が、式３により与えられる。
【００８５】
式１：Ｃ/Ｃ0 ＝ ｅ（−ＮＳ）。Ｃは、任意の時間ｔでの濃度であり；Ｃ0は、初期濃度であり；Ｎは、時間ｔでのダイア容量（diavolume）の数であり；そしてＳは、分析物についての篩分け計数である（経験的に決定された）。ダイア容量の数Ｎは、ｒ＊ｔ/Ｖｄであり、ここでｒは、透過流速であり、そしてＶｄは、バッチ体積である。この置換の実施、誘導体の入手、及びｔ＝０での誘導体の評価が、式２を与える。
【００８６】
式２：ｄＣ/ｄｔ ＝ −Ｃ0 * （ｒ/Ｖｄ） * Ｓ、ここでｄＣ／ｄｔは、ｔ0でのシステインの損失速度である。システイン溶液が、反応混合物において所定の濃度に達するように添加されるべき速度が、式３により与えられる。
【００８７】
式３：Ｒ ＝ −ｄＣ/ｄｔ * Ｖｄ/［Ｃｙｓ］、ここで［Ｃｙｓ］は、システインストック溶液の濃度である。
【００８８】
従って、式２におけるｄＣ／ｄｔについての表現の置換が、添加速度についての式４を与える。
式４：Ｒ ＝ Ｃ0- * ｒ * Ｓ/［Ｃｙｓ］ ＝ （０．８ ｍＭ） * （７２０ ｍＬ/ｈｒ） * （０．８）/（１００ ｍＭ） ＝ ４．６１ ｍＬ/ｈｒ。
【００８９】
結果
ｅｃｍＡｂ中の改変されたシステインの選択的活性化は、工程を通してダイアフィルトレーション緩衝液中にシステインを補充しながら、反応の間、ｅｃｍＡｂを連続してダイアフィルトレートすることにより達成された。ダイアフィルトレーションは、反応副産物を連続して枯渇させた。システイン添加速度は、反応混合物中のシステインの一定濃度を提供するために、ダイアフィルトレーションによるシステインのクリアランスの理論的速度に基づいて計算された。図２は、鎖間ジスルフィド結合の無視できる切断（％Ｈ２により示される）を伴って、４．５時間後の利用可能な改変されたシステインの約８０％の活性化（％Ｈ１）を示す。この実験が、長期間、０．６ｍＭのシステインを用いて反復され、類似する結果が得られた（図３）。より高い濃度で、反応は早く且つ、やや低い特異性であった。反応混合物は、システイン供給ポンプを介して反応混合物に入り、そしてＴＦＦ膜（浸透する）を介して反応混合物を出るシステイン溶液と共に、工程を通してフラックスの状態で存在し、結果的に、その濃度は反応の間、多少変動することができるが、しかし、それにもかかわらず、活性化条件は一般的に公称濃度近くに保持され得ることは、理解されているであろう。１．５〜２ｍＭ、及びそれよりも高いシステイン濃度は、高められた鎖間ジスルフィド切断をもたらした。図４は、改変されたシステイン活性化は、抗体の同一性にもかかわらず、種々の部位で選択的に達成され得ることを示す。活性化時間の経過と共に、Ｋ３２６変異体は、活性化がＳ２３９又はＡ３２７部位でよりもこの部位で、より早いことを示唆する。これは、たぶん、Ｋ３２６部位がより溶媒接近性であるが、しかしながら、それにもかかわらず、その方法が所望する選択的活性化を達成する事実のためである。図５は、反応が、長時間にわたって低濃度の還元剤を用いることにより、非常に良好な選択性を伴って、改変されたシステインの１００％に非常に近い活性化まで進み得ることを示す。
【００９０】
上記は、明確性及び理解のために、例示的及び例的に、いくらか詳細に記載されてきたが、当業者は、一定の変更及び修飾が、添付の特許請求の範囲内で実施され得ることを理解しているであろう。さらに、本明細書に提供される各引例は、各引例が参照により個々に組込まれる同程度に、その全体が参照により本明細書に組込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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