(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝星細胞（ＨＳＣ）活性化関連疾患を処置するための組成物であって、前記ＨＳＣ活性化関連疾患が、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、肝臓がん又は線維性状態であり、
アンモニア降下剤を含む、組成物であって、
前記アンモニア降下剤が、フェニル酢酸塩およびフェニル酪酸塩の少なくとも１つと組み合わせたオルニチンを含む、
組成物。
【請求項２】
肝星細胞（ＨＳＣ）活性化関連疾患の発症または進行を遅延させるための組成物であって、前記ＨＳＣ活性化関連疾患が、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、肝臓がん又は線維性状態であり、アンモニア降下剤を含む、組成物であって、
前記アンモニア降下剤が、フェニル酢酸塩およびフェニル酪酸塩の少なくとも１つと組み合わせたオルニチンを含む、
組成物。
【請求項３】
前記線維性状態が肝臓線維症である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を予防するための組成物であって、アンモニア降下剤を含み、前記アンモニア降下剤が、フェニル酢酸塩およびフェニル酪酸塩の少なくとも１つと組み合わせたオルニチンを含む、
組成物。
【請求項５】
前記ＮＡＦＬＤが非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である、請求項１、２又は４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＮＡＦＬＤが脂肪症である、請求項１、２又は４に記載の組成物。
【請求項７】
前記アンモニア降下剤が、前記オルニチンならびにフェニル酢酸塩およびフェニル酪酸塩の少なくとも１つの個々の医薬として許容される塩を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
フェニル酢酸塩およびフェニル酪酸塩の少なくとも１つの医薬として許容される塩が、フェニル酢酸ナトリウムまたはフェニル酪酸ナトリウムを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記アンモニア降下剤が、オルニチンの遊離単量体アミノ酸またはその生理学的に許容される塩を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記アンモニア降下剤が、オルニチンフェニル酢酸を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
経口、静脈内、腹腔内、胃内、または血管内投与用である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
経口投与用である、請求項１１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下で２０１４年１１月２４日出願の米国仮特許出願第６２／０８３，８１４号に基づく優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
分野
本出願は、医薬化学、生化学、および医学の分野に関する。一態様は、アンモニア降下療法を用いた肝星細胞（ＨＳＣ）活性化関連疾患の処置および／または予防に関する。
【０００３】
関連技術の説明
肝星細胞（ＨＳＣ）は、肝臓の類洞周囲腔に見出される周皮細胞である。肝臓内では、星細胞は肝臓の構造的完全性を維持する上で重要な役割を果たし、線維症および肝臓がんの発症に関与している。正常な肝臓ではＨＳＣは静止状態にある。肝臓が損傷を受けるとＨＳＣが活性化状態に変わる場合がある。活性化された星細胞は、増殖性、収縮性、および走化性を特徴とする。ＨＳＣの活性化によって、様々な疾患、例えば、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、線維性状態、および肝臓がんが引き起こされ得る。
【発明の概要】
【０００４】
現在、ＨＳＣ活性化関連疾患の様々な予防、処置、および管理方法が、症状の重症度に応じて用いられている。これらの疾患を処置または予防するためのさらなる療法が必要とされている。
【０００５】
本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、肝星細胞（ＨＳＣ）活性化関連疾患を処置する方法を提供し、この方法は、それを必要とする対象に対してアンモニア降下療法を実施することを含む。また、ＨＳＣ活性化関連疾患の発症または進行を遅延させる方法も開示され、この方法は、それを必要とする対象に対してアンモニア降下療法を実施することを含む。いくつかの実施形態では、アンモニア降下療法を実施することは、対象にアンモニア降下剤を投与することを含む。
【０００６】
いくつかの実施形態では、ＨＳＣ活性化関連疾患は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である。ＮＡＦＬＤは、例えば、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）または脂肪症であり得る。
【０００７】
いくつかの実施形態では、ＨＳＣ活性化関連疾患は肝臓がんである。いくつかの実施形態では、ＨＳＣ活性化関連疾患は線維性状態である。線維性状態は、例えば、肝臓線維症であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）に罹患している。
【０００８】
いくつかの実施形態は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を予防する方法を提供し、この方法は、それを必要とする対象に対してアンモニア降下療法を実施することを含む。例えば、ＮＡＦＬＤは、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）または脂肪症であり得る。いくつかの実施形態では、アンモニア降下療法を実施することは、対象にアンモニア降下剤を投与することを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、アンモニア降下剤は、リン酸マグネシウム生成物（ＭＧＰ）、グリセロールフェニル酪酸（ＧＰＢ）、フェニル酢酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム（ＮａＰＢＡ）、グルタミン、安息香酸ナトリウム、Ｌ−アラビノース、緩下剤、抗生物質、フェニル酢酸塩（phenylacetate）およびフェニル酪酸塩（phenylbutyrate）の少なくとも１つと組み合わせたオルニチン、またはそれらの任意の組み合わせであるか、それを含む。いくつかの実施形態では、アンモニア降下剤は、フェニル酢酸塩およびフェニル酪酸塩の少なくとも１つと組み合わせたオルニチンであるか、それを含有する。
【００１０】
本明細書に開示される方法では、いくつかの実施形態において、オルニチン、ならびにフェニル酢酸塩およびフェニル酪酸塩の少なくとも１つの個々の医薬として許容される塩が対象に投与される。いくつかの実施形態では、フェニル酢酸塩およびフェニル酪酸塩の少なくとも１つは、フェニル酢酸ナトリウムまたはフェニル酪酸ナトリウムとして投与される。いくつかの実施形態では、オルニチンは、遊離単量体アミノ酸またはその生理学的に許容される塩として投与される。いくつかの実施形態では、オルニチンおよびフェニル酢酸塩は、オルニチンフェニル酢酸として投与される。
【００１１】
いくつかの実施形態では、投与は、経口、静脈内、腹腔内、胃内、または血管内投与である。いくつかの実施形態では、投与は静脈内投与である。いくつかの実施形態では、投与は経口投与である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１−１】図１Ａ〜Ｃは、アンモニアがインビトロで初代ヒト肝星細胞における細胞の増殖および代謝を用量依存的に低下させることを示す。図１Ａは、アンモニアがＤＮＡ合成（ＢｒｄＵ）および代謝活性（ＭＴＳ）を阻害することを示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および＊＊＊Ｐ＜０．００１対無血清培地（ＳＦＭ）の対応値。
【図１−２】図１Ａ〜Ｃは、アンモニアがインビトロで初代ヒト肝星細胞における細胞の増殖および代謝を用量依存的に低下させることを示す。図１Ｂは、細胞死を誘導することなくその阻害が達成されることを示す。棒グラフは３つの独立値の平均±ＳＤを示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および＊＊＊Ｐ＜０．００１対無血清培地（ＳＦＭ）の対応値。
【図１−３】図１Ａ〜Ｃは、アンモニアがインビトロで初代ヒト肝星細胞における細胞の増殖および代謝を用量依存的に低下させることを示す。図１Ｃは、光学顕微鏡検査およびニュートラルレッド細胞生存率試験（２０倍、４０倍）で観察されたとおり、アンモニアが用量依存的に強い形態変化、すなわち筋線維芽細胞様細胞から紡錘状線維芽細胞への形態変化を誘導したことを示す。棒グラフは３つの独立値の平均±ＳＤを示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および＊＊＊Ｐ＜０．００１対無血清培地（ＳＦＭ）の対応値。
【図２−１】図２Ａ〜Ｆは、アンモニアが細胞質ストレスの変化を誘導し、これが細胞の代謝／機能、収縮、およびアクチン細胞骨格構造の変化と一致することを示す。図２Ａは、アンモニアが、用量依存的に、細胞質液胞の出現を伴う劇的な形態学的変化を引き起こしたことを示す透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像である（Ｖ＝液胞；Ｎ＝核）。。
【図２−２】図２Ａ〜Ｆは、アンモニアが細胞質ストレスの変化を誘導し、これが細胞の代謝／機能、収縮、およびアクチン細胞骨格構造の変化と一致することを示す。図２Ｂは、富アンモニア培地枯渇後の細胞増殖の回復を示す。棒グラフは３つの独立値の平均±ＳＤを示す。＊Ｐ＜０．０５および＊＊＊Ｐ＜０．００１対ＳＦＭ。
【図２−３】図２Ａ〜Ｆは、アンモニアが細胞質ストレスの変化を誘導し、これが細胞の代謝／機能、収縮、およびアクチン細胞骨格構造の変化と一致することを示す。図２Ｃおよび２Ｄは、アンモニアがｈＨＳＣ収縮を誘導することを示すコラーゲンゲル収縮アッセイの結果を示す。棒グラフは、２つの独立した実験値の平均±ＳＤを示す。＊Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜０．０１対ＳＦＭの対応値。
【図２−４】図２Ａ〜Ｆは、アンモニアが細胞質ストレスの変化を誘導し、これが細胞の代謝／機能、収縮、およびアクチン細胞骨格構造の変化と一致することを示す。図２Ｅは、アンモニア誘導性ＨＳＣ収縮が形態変化と一致することを示す。
【図２−５】図２Ａ〜Ｆは、アンモニアが細胞質ストレスの変化を誘導し、これが細胞の代謝／機能、収縮、およびアクチン細胞骨格構造の変化と一致することを示す。図２Ｆは、アンモニアによる長期処置（７２時間）が用量依存的に糸状アクチンの再編成を誘導することを示す（ＴＲＩＴＣ−ファロイジン染色）。
【図３−１】図３Ａ〜Ｃは、アンモニアがＲＯＳ産生を誘導することを示す。図３Ａは、ｈＨＳＣのアンモニアによる７２時間の長期処置がｈＨＳＣにおけるＲＯＳ産生を誘導することを示す。活性酸素種（ＲＯＳ）の形成をＩｍａｇｅ−ＩＴ（商標）ＬＩＶＥ  Ｇｒｅｅｎ活性酸素種検出キットを用いて測定した。
【図３−２】図３Ａ〜Ｃは、アンモニアがＲＯＳ産生を誘導することを示す。図３Ｂにおいて、ＲＯＳシグナルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を細胞数（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）で正規化し、対照のパーセンテージとして表した。棒グラフは３つの独立値の平均±ＳＤを示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１対ＳＦＭの対応値。図３Ｃは、高アンモニア血症が、３時間および２４時間においてＲＯＳマーカーＳＯＤ２のｍＲＮＡ発現レベルを増加させることを示す。棒グラフは２つの独立値の平均±ＳＤを示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１対ＳＦＭの対応値。
【図３−３】図３Ｄは、ＮＡＣ誘導性ＲＯＳスカベンジャーが２４時間においてアンモニア誘導性ＳＯＤ２のｍＲＮＡ発現を低下させることを示す。棒グラフは２つの独立値の平均±ＳＤを示す。＊Ｐ＜０．０５＊＊Ｐ＜０．０１対ＳＦＭの対応値。
【図４−１】図４Ａ〜Ｃは、アンモニアが、いくつかの炎症誘発性マーカーおよびＨＳＣ活性化マーカーのｍＲＮＡ発現およびタンパク質レベルを変化させることを示す。図４Ａは、アンモニアが、α−ＳＭＡ、ビメンチン、ＰＤＧＦ−Ｒβ、ミオシンＩＩａおよびＩＩｂ、ならびにｐ−３８ＭＡＰＫのタンパク質発現に影響を及ぼすことを示す。
【図４−２】図４Ａ〜Ｃは、アンモニアが、いくつかの炎症誘発性マーカーおよびＨＳＣ活性化マーカーのｍＲＮＡ発現およびタンパク質レベルを変化させることを示す。図４Ｂは、アンモニアがＭＭＰ２ｍＲＮＡの上方制御を誘導し、一方、ＴＩＭＰ１ｍＲＮＡは下方制御されることを示す。
【図４−３】図４Ａ〜Ｃは、アンモニアが、いくつかの炎症誘発性マーカーおよびＨＳＣ活性化マーカーのｍＲＮＡ発現およびタンパク質レベルを変化させることを示す。図４Ｃは、インターロイキン１βおよびインターロイキンＩＬ６のｍＲＮＡ発現が上方制御されることを示す。棒グラフは３つの独立値の平均±ＳＤを示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、および＊＊＊Ｐ＜０．００１対ＳＦＭの対応値。
【図５−１】図５Ａ〜Ｂは、高アンモニア血症の処置がインビボでＢＤＬ誘導性ＨＳＣマーカーをさらに増強することを示す。図５Ａは、偽手術ラットと比較して、ＢＤＬおよびＡＡｓ給餌ＢＤＬ動物において、アンモニアの血漿レベルが有意に上方制御されることを示す（＊Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜０．０１対偽手術）。ＯＰ処置は、ＢＤＬ動物と比較してＢＤＬ−ＡＡｓ給餌動物におけるアンモニアを有意に減少させる（＊＊Ｐ＜０．０１）。図５Ｂは、ＢＤＬ誘導性線維症における高アンモニア血症の処置が、ＢＤＬ誘導性線維症と比較して、ミオシンＩＩｂ、コラーゲンＩ型、およびＰＤＧＦ−Ｒβタンパク質発現がさらに有意に増加したことを示す（＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１）。対照的に、ＯＰを用いた処置では、すべてのＨＳＣ関連活性化マーカーについて、ＡＡｓ給餌ＢＤＬの強い影響が消失した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図５−２】図５Ａ〜Ｂは、高アンモニア血症の処置がインビボでＢＤＬ誘導性ＨＳＣマーカーをさらに増強することを示す。図５Ａは、偽手術ラットと比較して、ＢＤＬおよびＡＡｓ給餌ＢＤＬ動物において、アンモニアの血漿レベルが有意に上方制御されることを示す（＊Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜０．０１対偽手術）。ＯＰ処置は、ＢＤＬ動物と比較してＢＤＬ−ＡＡｓ給餌動物におけるアンモニアを有意に減少させる（＊＊Ｐ＜０．０１）。図５Ｂは、ＢＤＬ誘導性線維症における高アンモニア血症の処置が、ＢＤＬ誘導性線維症と比較して、ミオシンＩＩｂ、コラーゲンＩ型、およびＰＤＧＦ−Ｒβタンパク質発現がさらに有意に増加したことを示す（＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１）。対照的に、ＯＰを用いた処置では、すべてのＨＳＣ関連活性化マーカーについて、ＡＡｓ給餌ＢＤＬの強い影響が消失した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図６】図６は、正常食および高脂肪高コレステロール食を１０カ月間給餌し、２カ月間回復させたラットにおけるオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）タンパク質および遺伝子の発現を示す。
【図７】図７は、メチオニン−コリン欠乏食（ＭＣＤ）を４週間給餌し、炭素で、または炭素なしで処置したマウスにおけるＯＴＣ遺伝子発現を示す。
【図８】図８は、単純脂肪症の、またはＮＡＳＨかつ線維症のＮＡＦＬＤヒト患者における肥満手術中のＯＴＣ遺伝子発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下の詳細な説明では、本明細書の一部を構成する添付の図面を参照する。詳細な説明、図面、および特許請求の範囲に記載の例示的な実施形態は、限定を意図するものではない。本明細書に提示される主題の精神または範囲から逸脱しない範囲で、他の実施形態を利用してもよく、他の変更がなされてもよい。本開示の態様は、本明細書に概説されるように、多種多様の異なる構成で配置、置換、組み合わせ、および設計することができ、これらすべてが明示的に企図され、本開示の一部を構成することは容易に理解されよう。
【００１４】
定義
本明細書で使用する場合、「対象」は、処置、観察、または実験の対象である動物を指す。「動物」としては、魚類、甲殻類、爬虫類、および特に哺乳類などの、冷血および温血の脊椎動物および無脊椎動物が挙げられる。「哺乳動物」としては、限定するものではないが、マウス；ラット；ウサギ；モルモット；イヌ；ネコ；ヒツジ；ヤギ；ウシ；ウマ；サル、チンパンジー、および類人猿、ならびに特にヒトなどの霊長類が挙げられる。
【００１５】
本明細書で使用する場合、「患者」は、特定の疾患もしくは障害を治癒もしくは少なくとも改善すること、または、そもそもその疾患もしくは障害の発症を予防することを目的として、医師（すなわち、アロパシー医学（Allopathic medicine）の医師またはオステオパシー医学（Osteopathic medicine）の医師）または獣医学の医師などの医療専門家によって処置されている対象を指す。
【００１６】
本明細書で使用する場合、「投与（administration）」または「投与する（administering）」は、脊椎動物に医薬として活性な成分を投与する方法を指す。
【００１７】
本明細書で使用する場合、「単位用量」は、患者に単回投与で投与される治療剤の量を指す。
【００１８】
本明細書で使用する場合、「１日用量」は、患者に１日に投与される治療剤の総量を指す。
【００１９】
本明細書で使用する場合、「治療有効量」または「薬学的有効量」は、治療効果を有する治療剤の量を意味する。処置に有用な医薬として活性な成分の用量が治療有効量である。したがって、本明細書で使用する場合、治療有効量は、臨床試験結果および／またはモデル動物試験によって判断される所望の治療効果を生じる治療剤の量を意味する。
【００２０】
本明細書で使用する場合、「治療効果」は、疾患または障害の１種または複数種の症状をある程度緩和する。例えば、治療効果は、対象が伝える主観的不快感の減少（例えば、自己投与患者質問票に記載された不快感の減少）によって観察することができる。
【００２１】
本明細書で使用する場合、「処置する（treat）」、「処置（treatment）」、または「処置する（treating）」は、化合物または医薬組成物を予防および／または治療目的で対象に投与することを指す。用語「予防的処置」は、疾患の症状または状態をまだ示していないが、特定の疾患または状態にかかりやすい、あるいはそのリスクがある対象を処置し、その処置により、疾患または状態を発症する可能性を減少させることを指す。用語「治療的処置」は、既に疾患または状態に罹患している対象に対して処置を行うことを指す。
【００２２】
略語
ＢＤＬ＝胆管結さつ
【００２３】
ＯＰ＝オルニチン、フェニル酢酸塩
【００２４】
ＯＴＣ＝オルニチントランスカルバミラーゼ
【００２５】
ＧＳ＝グルタミン合成酵素
【００２６】
ＨＳＣ＝肝星細胞
【００２７】
アンモニア降下療法
本明細書において、対象のアンモニアレベルを低下させるために用いることができる様々なアンモニア降下療法が開示される。例えば、対象のアンモニアレベルを低下させるために、１種または複数種のアンモニア降下剤を治療に用いることができる。本明細書で使用する場合、用語「アンモニア降下剤」は、対象のアンモニアレベルを低下させるために用いることができる物質を指す。アンモニア降下剤がアンモニアレベルを低下させる機構は様々であり得る。例えば、アンモニア降下剤は、対象におけるアンモニアの発生を減少させることによって、または、対象においてアンモニアを吸収すること、もしくは、結腸内にアンモニアを引き込み緩下剤効果によりアンモニアを除去することによって、またはこれらの任意の組み合わせによって、対象のアンモニアレベルを低下させることができる。いくつかの実施形態では、対象におけるアンモニアレベルは、対象の血液（例えば、血漿）中のアンモニアレベルであってよい。いくつかの実施形態では、アンモニア降下療法は、１種または複数種のアンモニア降下剤を対象に投与することを含む。
【００２８】
アンモニア降下剤の非限定的な例としては、リン酸マグネシウム生成物（ＭＧＰ）、グリセロールフェニル酪酸（ＧＰＢ）、フェニル酢酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム（ＮａＰＢＡ）、グルタミン、安息香酸ナトリウム、クロロフィル、Ｌ−アラビノース、緩下剤、抗生物質、フェニル酢酸塩およびフェニル酪酸塩の少なくとも１つと組み合わせたオルニチン、ならびにそれらの任意の組み合わせが挙げられ、またはこれを含む。アンモニア降下剤は、例えば、医薬組成物、栄養補給組成物、プロバイオティック組成物、またはそれらの任意の組み合わせに含まれ得る。緩下剤は、便を緩めて便通を高めることができる物質である。緩下剤は、例えば、対象の胃腸管における細菌叢を変化させ、アンモニアを生成する微生物をほとんど利用できなくすることによって、対象の胃腸管におけるアンモニアレベルを低下させるために用いることができる。緩下剤の例としては、これに限定されるものではないが、ラクツロースが挙げられる。
【００２９】
アンモニア降下剤は、１種または複数種の抗生物質であるか、それを含むことができる。例えば、抗生物質（複数可）が胃腸管で作用することができるように、アンモニア降下剤を経口経路によって投与することができる。いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、抗生物質（複数可）は、腸のアンモニア産生細菌を減少させて、対象のアンモニアレベルを低下させることができると考えられている。抗生物質の非限定的な例としては、ネオマイシン、バンコマイシン、およびリファキシミン（Ｘｉｆａｘａｎ）が挙げられる。
【００３０】
いくつかの実施形態では、対象のアンモニアレベルを低下させるために、異なるアンモニア降下剤が併用される。例えば、対象のアンモニアレベルを低下させるために、１種または複数種の緩下剤および１種または複数種の抗生物質を対象に投与することができる。
【００３１】
別の非限定的な例として、アンモニア降下療法は、対象における腸内微生物叢の組成を調節することであるか、またはそれを含むことができる。いくつかの実施形態では、対象の腸内微生物叢の組成を調節することは、糞便移植などの細菌移植を含む。いくつかの実施形態では、対象の腸内微生物叢の組成を調節することは、対象の腸内微生物叢においてウレアーゼ活性を有しないかウレアーゼ活性が低い１種または複数種の細菌種のレベルを高めることを含む。いくつかの実施形態では、対象の腸内微生物叢の組成を調節することは、対象の天然腸内微生物叢を、ウレアーゼ活性を有しないかウレアーゼ活性が低い１種または複数種の細菌種のレベルが高い組成物で置き換えることを含む。いくつかの実施形態では、対象における腸内微生物叢の組成を調節することは、ウレアーゼ活性を有しないかウレアーゼ活性が低い１種または複数種の細菌種を含有する組成物を対象に投与することを含む。ウレアーゼ活性を有しないかウレアーゼ活性が低い１種または複数種の細菌の例としては、これらに限定されるものではないが、パラバクテロイデス属（Parabacteroides）、ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）、ルミノコッカス科（Ruminococcaceae）、ユーバクテリウム属（Eubacterium）、ムシスピリラム属（Mucispirillum）、ラクトバシラス属（Lactobacillus）、およびクロストリジウム属（Clostridium）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ウレアーゼ活性を有しないかウレアーゼ活性が低い細菌は、クロストリジウム綱（Clostridia）、ムシスピリラム・シャレドレリ（Mucispirillum schaedleri）、パラバクテロイデス属（Parabacteroides）、ラクトバシラス属（Lactobacilli）、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、アンモニア降下療法は、１９７０年代にまとめられ、１９７８年に国立癌研究所によって標準化された８種のネズミ腸内共生細菌種からなるシェドラーフローラ（Schaedler flora）（ＡＳＦ）（Dewhirst et al., Appl. Environ Microbiol. 1999; 65(8):3287-3292）の対象への移植を含む。いかなる特定の理論にも制限されるものではないが、細菌ウレアーゼは宿主由来の尿素をアンモニアおよび二酸化炭素に変換して高アンモニア血症に寄与し、ウレアーゼ活性を有しないかウレアーゼ活性が低い腸内微生物叢は、対象におけるアンモニアの生成、ひいてはアンモニアレベルを低下させることができると考えられている。
【００３２】
さらに、アンモニア降下療法は、対象における高アンモニア血症に寄与する遺伝子欠損を修正するための遺伝子療法であるか、またはそれを含むことができる。例えば、高アンモニア血症は尿素サイクルに関与する酵素をコードする遺伝子の欠損によって起こる場合があり、その遺伝子としては、これらに限定されるものではないが、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）遺伝子、カルバミルリン酸合成酵素（ＣＰＳ１）遺伝子、アルギニノコハク酸合成酵素（ＡＡＳ）、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）、およびアルギナーゼ（ＡＧ）が挙げられる。また、高アンモニア血症は、シスタチオンベータ合成酵素（ＣＢＳ）遺伝子およびグルタミン合成酵素遺伝子の欠損によっても起こる場合がある。遺伝子療法は、当該分野で知られている方法によって実施することができる。例えば、欠損遺伝子（複数可）を対象に送達（例えば、肝細胞への標的化送達）して、対象のアンモニアレベルを低下させるために、組換えウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルスベクターおよびバキュロビウスベクター）を使用することができる。例えば、Torres-Vega et al. Gene Therapy (2015) 22, 58-64を参照されたい（その全内容が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、完全なＯＴＣ遺伝子を含むＡＡＶベクターをそれを必要とする対象に投与して対象のアンモニアレベルを低下させる。いくつかの実施形態では、完全なグルタミン合成酵素遺伝子を含むＡＡＶベクターをそれを必要とする対象に投与して、対象のアンモニアレベルを低下させる。
【００３３】
ＨＳＣ活性化関連疾患の処置および予防
肝星細胞（ＨＳＣ）は、肝臓生理学および線維形成、ならびに肝臓の構造的完全性の維持において重要な役割を果たす肝臓特異的間葉細胞である。ＨＳＣは一般にディッセ腔（space of Disse）に位置し、類洞内皮細胞および肝上皮細胞との密接な相互作用を維持している。ＨＳＣは、肝臓における多くの重要な機能を調整し、その機能不全は様々な病理学的状態と関連している。ＨＳＣは、肝臓の発生および再生の際、他の肝細胞種の分化、増殖および形態形成に影響を及ぼし得る。
【００３４】
正常な肝臓ではＨＳＣは静止状態にある。肝臓が損傷すると、ＨＳＣは活性化状態に変化することがある。例えば、急性または慢性の肝臓傷害の後、ＨＳＣは、「静止」（非増殖性および非収縮性）細胞から「活性化」（前癌性、線維形成促進性、および炎症誘発性筋線維芽細胞様）細胞へ形質転換する。さらに、活性化の過程で、ＨＳＣは、収縮性が高まり、多数の血管作用物質／刺激に応答して収縮または弛緩するために必要な機構を備える。活性化されたＨＳＣは、肝前駆細胞および肝細胞の増殖を直接的に促進し得る多様なサイトカインおよびケモカインを産生することができる。ＨＳＣは、例えば、線維症および肝臓がんの発症に関与する。ＨＳＣの活性化は、これらに限定されるものではないが、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、線維性状態（例えば、肝臓線維症）、肝臓がん、およびそれらの任意の組み合わせなどの様々な疾患、状態、および症状を引き起こし得る。肝臓がんの非限定的な例としては、肝細胞癌（ＨＣＣ）および肝芽細胞腫が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＨＳＣ活性化関連疾患を処置および／または予防する方法は、ＨＳＣ活性化関連疾患に罹患しているか、それを発症するリスクのある対象を同定することを含む。いくつかの実施形態では、ＨＳＣ活性化関連疾患は、ＮＡＦＬＤ、肝臓線維症、肝臓がん、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
【００３５】
ＮＡＦＬＤは、アルコールをほとんどまたは全く飲まない人の肝臓に余分な脂肪が蓄積している一群の状態を指す。ＮＦＡＬＤは先進国における一般的な肝障害である。ＮＡＦＬＤの最も一般的な形態は、脂肪肝と呼ばれる非重篤な状態である。ＮＡＦＬＤは、肝臓に脂肪が蓄積した場合（脂肪症）に発生する。肝臓に脂肪があるのは正常ではないが、おそらくそれ自体は肝臓にダメージを与えない。ＮＡＦＬＤは線維症の一般的な原因である。ＮＡＦＬＤは、定期血液検査の際、肝臓の検査において軽度の上昇が認められる過体重または肥満の人に疑いがもたれたり、腹部超音波検査やＣＴスキャンなどの放射線検査で偶発的に検出されたりする場合がある。
【００３６】
非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）は、ＮＡＦＬＤのより深刻な形態である。ＮＡＳＨでは、脂肪の蓄積は肝細胞の炎症および瘢痕化の程度の違いに関連している。ＮＡＳＨは深刻な肝臓の瘢痕化および肝硬変に至り得る潜在的に重篤な状態である。いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、ＮＡＳＨは、ヒトおよびげっ歯類におけるオルニチントランスカルバモイラーゼ（ＯＴＣ、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼとも呼ばれる）の発現および機能の低下に関連すると考えられている。例えば、実験的ＮＡＳＨでは、ミトコンドリア尿素サイクル酵素であるオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）の遺伝子およびタンパク質発現が顕著に減少し、インビボ尿素形成能の機能低下をもたらし、これにより高アンモニア血症となる。生検でＮＡＳＨと診断された患者では、血漿アンモニアレベルは、単純脂肪症の患者よりも顕著に増加する。哺乳動物では、ＯＴＣ酵素は尿素サイクルの一部をなす。ＯＴＣが欠損している哺乳類では、アンモニアレベルが上昇することとなり、これにより、高アンモニア血症およびその後の神経障害が引き起こされ得る。
【００３７】
アンモニアは、ヒトＨＳＣにおいて、および胆管結さつラットにおいてインビボで顕著な形態学的および機能的変化（例えば、酸化ストレス、サイトカインの増加、活性化マーカーの発現、マトリックスタンパク質の分泌の変化、および重度の形態の崩壊）をもたらすことが本開示において初めて開示される。いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、高アンモニア血症はインビボおよびインビトロでＨＳＣを活性化する場合があり、ＮＡＦＬＤ（例えば、ＮＡＳＨ）および線維症の進行に有利に働き得ると考えられている。本明細書に記載されるように、対象におけるアンモニアレベルの低下は、対象におけるＨＳＣの活性化を妨げることができ、例えばＨＳＣ活性化関連疾患を軽減する。
【００３８】
本明細書に記載のいくつかの実施形態は、対象に対してアンモニア降下療法を実施することによって、必要とする対象におけるＨＳＣ活性化関連疾患を処置する方法を提供する。本明細書に記載のいくつかの実施形態は、対象に対してアンモニア降下療法を実施することによって、必要とする対象におけるＨＳＣ活性化関連疾患の発症または進行を遅延させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、アンモニア降下療法を実施することは、アンモニア降下剤を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、アンモニア降下剤は、リン酸マグネシウム生成物（ＭＧＰ）、グリセロールフェニル酪酸（ＧＰＢ）、フェニル酢酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム（ＮａＰＢＡ）、グルタミン、安息香酸ナトリウム、Ｌ−アラビノース、緩下剤、抗生物質、フェニル酢酸塩およびフェニル酪酸塩の少なくとも１つと組み合わせたオルニチン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、オルニチンをフェニル酢酸塩および／またはフェニル酪酸塩と組み合わせて対象に同時投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＨＳＣ活性化関連疾患は、ＮＡＦＬＤ、例えば、ＮＡＳＨまたは脂肪症である。いくつかの実施形態では、ＨＳＣ活性化関連疾患は、肝臓がん、例えばＨＣＣまたは肝芽細胞腫である。いくつかの実施形態では、ＨＳＣ活性化関連疾患は、線維性状態、例えば肝臓線維症である。いくつかの実施形態では、肝臓がんおよび／または線維性状態に罹患している対象は、ＮＡＦＬＤにも罹患している場合がある。いくつかの実施形態では、２種以上のアンモニア降下剤が対象に同時投与される。いくつかの実施形態では、１種または複数種のアンモニア降下剤は、別の医薬として活性な成分とともに対象に同時投与される。いくつかの実施形態では、対象における腸内微生物叢の組成は、ＨＳＣ活性化関連疾患を処置するように調整される。いくつかの実施形態では、ＨＳＣ活性化関連疾患を処置するためのアンモニア降下療法として、遺伝子療法が使用される。
【００３９】
また、本明細書には、それを必要とする対象に対してアンモニア降下療法を実施することによってＮＡＦＬＤを予防する方法も開示される。いくつかの実施形態では、アンモニア降下療法を実施することは、アンモニア降下剤を対象に投与することを含む。本明細書に開示される任意のアンモニア降下剤を本方法に使用することができ、これらに限定されるものではないが、リン酸マグネシウム生成物（ＭＧＰ）、グリセロールフェニル酪酸（ＧＰＢ）、フェニル酢酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム（ＮａＰＢＡ）、グルタミン、安息香酸ナトリウム、Ｌ−アラビノース、緩下剤、抗生物質、フェニル酢酸塩およびフェニル酪酸塩の少なくとも１つと組み合わせたオルニチン、ならびにそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、本方法は、オルニチンをフェニル酢酸塩および／またはフェニル酪酸塩と組み合わせて対象に同時投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象における腸内微生物叢の組成は、ＮＡＦＬＤを予防するように調節される。いくつかの実施形態では、ＮＡＦＬＤを予防するためのアンモニア降下療法として遺伝子療法が使用される。
【００４０】
本明細書に記載のいくつかの実施形態は、それを必要とする対象に対してアンモニア降下療法を実施することによって線維性状態を処置する方法を提供する。アンモニア降下療法は、いくつかの実施形態では、フェニル酢酸塩および／またはフェニル酪酸塩と組み合わせたオルニチンなどのアンモニア降下剤を、それを必要とする対象に同時投与することを含むことができる。いくつかのそのような実施形態は、治療的処置を含む。他の実施形態は、予防的処置を含む。本明細書で使用する場合、「線維性状態」は、線維芽細胞の増殖もしくは活性の調節不全、および／または、フィブロネクチンの異常蓄積、および／または、コラーゲン組織の病理的もしくは過剰な蓄積を特徴とする状態、疾患、または障害を指す。典型的には、そのような疾患、障害、または状態は、いずれも、抗線維化活性を有する化合物の投与による処置に適している。線維性障害としては、これらに限定されるものではないが、肝臓線維症（例えば、慢性活動性肝炎に関連する肝線維症）が挙げられる。したがって、いくつかの実施形態は、オルニチンをフェニル酢酸塩および／またはフェニル酪酸塩と組み合わせてそれを必要とする対象に同時投与することによって、肝臓線維症を処置する方法を含む。いくつかの実施形態は、オルニチンをフェニル酢酸塩および／またはフェニル酪酸塩と組み合わせて投与する前に、線維性状態（例えば、肝臓線維症）であるか、またはそれを発症する危険性がある対象を同定することを含む。
【００４１】
「同時投与」とは、それらが実際に投与される時期または方法にかかわらず、患者の血流中に２種以上の薬剤が同時に含まれ得ることを意味する。いくつかの実施形態では、薬剤は同時に投与される。このような一実施形態では、併用投与は単一剤形の薬剤を組み合わせることによって達成される。いくつかの実施形態では、薬剤は逐次的に投与される。いくつかの実施形態では、薬剤は、経口などの同経路で投与される。いくつかの実施形態では、薬剤は、１つは経口投与され、もう１つは静脈内投与されるなど、異なる経路で投与される。
【００４２】
本明細書に記載されるように、ＮＡＳＨは、ヒトおよびげっ歯類における尿素サイクル酵素であるオルニチントランスカルバモイラーゼ（ＯＴＣ）レベルの発現および機能の低下と関連し、高アンモニア血症をもたらす。いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、アンモニアはＮＡＦＬＤにおいて上昇し、ＮＡＦＬＤおよび肝臓がんの進行に関与していると考えられている。さらに、アンモニア降下剤（例えば、ＯＰ）は、ＮＡＳＨ関連高アンモニア血症などの高アンモニア血症の対象における血液アンモニアレベルを低下させ、それにより、ＮＡＦＬＤの進行、ＮＡＳＨにおける線維症の進行、および肝臓がん（例えば、ＨＣＣ）の発症を予防し、制限し、または遅延させるのに有用である。いくつかの実施形態では、アンモニア降下剤は、血液アンモニアレベルを低下させるのに有用であり、それによりＮＡＳＨの発症または進行を処置し、および遅延させる。
【００４３】
いくつかの実施形態は、必要とする対象に対してアンモニア降下療法を実施することによって、線維性状態（例えば、肝臓線維症）を処置することを含む。例えば、アンモニア降下療法は、アンモニア降下剤、例えばフェニル酢酸塩および／またはフェニル酪酸塩と組み合わせたオルニチンを必要な対象に投与することを含むことができる。いくつかのそのような実施形態は、治療的処置を含む。いくつかの実施形態は、予防的処置を含む。いくつかの実施形態は、アンモニア降下剤を投与する前に、線維性状態（例えば、肝臓線維症）を有するかまたはそれを発症する危険性がある対象を同定することを含む。
【００４４】
いくつかの実施形態は、必要とする対象に対してアンモニア降下療法を実施することによって肝臓がんを処置する方法を含む。例えば、アンモニア降下療法は、アンモニア降下剤、例えばフェニル酢酸塩および／またはフェニル酪酸塩と組み合わせたオルニチンをそれを必要とする対象に同時投与することを含むことができる。いくつかのそのような実施形態は、治療的処置を含む。いくつかの実施形態は、予防的処置を含む。いくつかの実施形態は、アンモニア降下剤を投与する前に、肝臓がんを有するかまたは発症する危険性がある対象を同定することを含む。いくつかの実施形態は、フェニル酢酸塩および／またはフェニル酪酸塩と組み合わせたオルニチン、例えばオルニチンフェニル酢酸を対象に投与することによって、肝臓がんを処置することを含む。肝臓がんは、例えば、ＨＣＣまたは肝芽細胞腫であり得る。
【００４５】
対象におけるアンモニアレベルは、様々な従来の方法によって測定することができる。例えば、アンモニアを、静脈（または動脈）血液試料由来の血漿中で定期的に測定する。また、全血、赤血球、唾液、汗、および尿中で測定することもできる。アンモニア測定値は高アンモニア血症の診断に用いることができる。アンモニアは間接法または直接法によって測定することができる。例えば、アンモニアは、アンモニウム指示薬の色の変化、例えば、ブロモフェノールブルーを利用するＶｉｔｒｏｓ（登録商標）（Ｏｒｔｈｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｌｔｄ．）アンモニア測定によって測定することができる。別の例として、典型的には、抗生物質ノンアクチンとモノアクチンとの混合物に基づくＮＨ４＋選択膜もアンモニアレベルの測定に用いることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、アンモニア降下剤の投与の前および／または後に対象におけるアンモニアレベルを測定することを含む。いくつかの実施形態では、対象がアンモニア降下剤による処置を受けている期間にわたって、対象におけるアンモニアレベルを監視する。インビボでのアンモニアレベルの低下は、炎症（ＮＦκＢ）、酸化ストレス、およびαＳＭＡ発現を低下させ、一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）活性および機能を高め得る。
【００４６】
塩
いくつかの実施形態では、アンモニア降下剤（フェニル酢酸塩および／またはフェニル酪酸塩と組み合わせたオルニチンなど）は、医薬として許容される塩として投与される。用語「医薬として許容される塩」は、化合物の生物学的有効性および性質を保持しており、生物学的にもその他の点でも、医薬品における使用に有害でない塩を指す。多くの場合、本明細書に開示されるアンモニア降下剤は、アミノおよび／もしくはカルボキシル基またはそれに類似した基の存在により、酸および／または塩基塩を形成することができる。医薬として許容される酸付加塩は、無機酸および有機酸を用いて形成することができる。塩が誘導され得る無機酸としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などが挙げられる。塩が誘導され得る有機酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などが挙げられる。また、医薬として許容される塩は、無機および有機塩基を用いて形成することもできる。塩が誘導され得る無機塩基としては、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウムなどを含有する塩基が挙げられ；特に、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、カルシウム、およびマグネシウム塩が好ましい。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される化合物を無機塩基で処置すると、化合物から不安定な水素が失われ、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、およびＣａ２＋などの無機カチオンを含む塩形態が提供される。塩が誘導され得る有機塩基としては、例えば、第一級、第二級、および第三級アミン、天然に存在する置換アミンなどの置換アミン、環状アミン、塩基性イオン交換樹脂など、具体的にはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、およびエタノールアミンが挙げられる。１９８７年９月１１日公開の国際公開第８７／０５２９７号パンフレット、Ｊｏｈｎｓｔｏｎら（その全体が参照により本明細書に組み入れられる）に記載されているように、多くのそのような塩は当該分野で既知である。
【００４７】
いくつかの実施形態では、オルニチンはそのオルニチンＨＣｌ塩として投与される。いくつかの実施形態では、フェニル酢酸塩またはフェニル酪酸塩はそのナトリウム塩として投与される。いくつかの実施形態では、オルニチンおよびフェニル酢酸塩またはフェニル酪酸塩は互いの塩（例えば、オルニチンフェニル酢酸）として投与される。
【００４８】
医薬組成物および投与経路
アンモニア降下剤（フェニル酢酸塩および／またはフェニル酪酸塩と組み合わせたオルニチンなど）は、医薬として許容される担体または希釈剤とともに投与用に製剤化することができる。アンモニア降下剤は、いくつかの実施形態では、製薬業界において通常行われるように、標準的な医薬として許容される担体（複数可）および／または賦形剤（複数可）とともに医薬品として製剤化することができる。製剤の実際の性質は、望まれる投与経路などのいくつかの要因に依存することになる。例えば、アンモニア降下剤（例えば、オルニチンならびにフェニル酢酸塩および／またはフェニル酪酸塩）は、経口、静脈内、胃内、血管内、または腹腔内投与用に製剤化することができる。その全体が参照により本明細書に組み込まれるRemington's The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., Lippincott Williams & Wilkins (2005)に開示されるものなどの標準的な医薬製剤技術を用いることができる。
【００４９】
オルニチン（例えば、Ｌ−オルニチン）およびフェニル酢酸塩またはフェニル酪酸塩は、別々にまたは単一剤形で投与することができる。いくつかの実施形態では、その組み合わせは、オルニチンフェニル酢酸塩として、またはオルニチンフェニル酢酸塩の溶液として投与される。
【００５０】
フェニル酢酸塩（phenylacetate）（またはフェニル酢酸塩（phenyl acetate salts））およびフェニル酪酸塩の少なくとも１つと組み合わせたオルニチンの異なる形態の組成物が、米国特許出願公開第２００８／０１１９５５４号および第２０１０／０２８０１１９号に記載されており、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、オルニチンおよびフェニル酢酸塩は、オルニチンフェニル酢酸またはその生理学的に許容される塩として存在しおよび／または投与される。いくつかの実施形態では、オルニチンは、遊離単量体アミノ酸またはその生理学的に許容される塩として存在しおよび／または投与される。いくつかの実施形態では、フェニル酢酸塩およびフェニル酪酸塩の少なくとも１つがフェニル酢酸ナトリウムまたはフェニル酪酸ナトリウムとして存在しおよび／または投与される。いくつかの実施形態では、オルニチンの生理学的に許容される塩ならびにフェニル酢酸塩およびフェニル酪酸塩の少なくとも１つの生理学的に許容される塩が、対象に投与される。
【００５１】
本明細書に開示されるとおり、オルニチンならびにフェニル酢酸塩および／またはフェニル酪酸塩は、生理学的に許容される界面活性剤、担体、希釈剤、賦形剤、平滑剤、懸濁剤、フィルム形成物質、コーティング補助剤、またはそれらの組み合わせを含有する医薬組成物中に、投与用に製剤化することができる。いくつかの実施形態では、オルニチンならびにフェニル酢酸塩および／またはフェニル酪酸塩は、医薬として許容される担体または希釈剤とともに、投与用に製剤化される。オルニチンならびにフェニル酢酸塩および／またはフェニル酪酸塩は、製薬業界において通常行われるように、標準的な医薬として許容される担体（複数可）および／または賦形剤（複数可）とともに、医薬品として製剤化することができる。製剤の実際の性質は、望まれる投与経路などのいくつかの要因に依存することになる。典型的には、オルニチンならびにフェニル酢酸塩および／またはフェニル酪酸塩は、経口、静脈内、胃内、血管内、または腹腔内投与用に製剤化される。その全体が参照により本明細書に組み込まれるRemington's The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., Lippincott Williams & Wilkins (2005)に開示されているもののような標準的な医薬製剤技術を用いることができる。
【００５２】
用語「医薬として許容される担体」または「医薬として許容される賦形剤」としては、任意およびすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。医薬として活性な物質のためのそのような媒剤および薬剤の使用は、当該分野においてよく知られている。任意の従来の媒剤または薬剤は、有効成分と適合しない場合を除き、治療組成物におけるその使用が企図される。加えて、当該分野で一般的に使用されるもののような種々のアジュバントを含むことができる。医薬組成物中に種々の成分を含有させるための考察は、例えば、Gilman et al. (Eds.) (1990); Goodman and Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Pressに記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００５３】
医薬として許容される担体またはその成分として機能することができる物質の一例は、ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの糖；トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロースおよびその誘導体；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；ステアリン酸およびステアリン酸マグネシウムなどの固体潤滑剤；硫酸カルシウム；ピーナッツ油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、およびテオブロマ油などの植物油；プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなどのポリオール；アルギン酸；ＴＷＥＥＮＳなどの乳化剤；ラウリル硫酸ナトリウムなどの湿潤剤；着色剤；着香料；打錠剤、安定剤；抗酸化剤；保存料；発熱物を含まない（pyrogen-free）水；等張性生理食塩水；および、リン酸緩衝液である。
【００５４】
主題の化合物と組み合わせて使用するための医薬として許容される担体の選択は、基本的に、化合物が投与される方法によって決定される。
【００５５】
本明細書に記載の組成物は、好ましくは単位剤形で提供される。本明細書で使用する場合、「単位剤形」は、適切な医療行為によって、動物、好ましくは哺乳動物の対象へ単回投与で投与するのに適した量の化合物を含有する組成物である。しかしながら、単回または単位剤形の調剤薬は、その剤形が１日１回または１回の治療につき１回で投与されることを意味するものではない。このような剤形は、１日に１回、２回、３回、またはそれ以上投与することが企図され、また、ある期間（例えば、約３０分から約２〜６時間）にわたって点滴として投与するか、連続点滴投与することもでき、また、治療中に複数回投与することもできるが、単回投与が特に除外されるわけではない。当業者であれば、製剤は治療全体を具体的に考慮するものではなく、そのような決定は製剤よりも処置の分野の当業者に委ねられることを認識するであろう。
【００５６】
上記の有用な組成物は、種々の投与経路用、例えば、経口、経鼻、直腸、局所（経皮を含む）、経眼、脳内、頭蓋内、髄腔内、動脈内、静脈内、筋肉内投与、または他の非経口（parental）投与経路用の種々の適切な形態のいずれであってよい。当業者であれば、経口および経鼻組成物には、吸入投与される、利用可能な方法を用いて製造される組成物が含まれることが分かるであろう。望まれる特定の投与経路に応じて、当該分野でよく知られている種々の医薬として許容される担体を使用することができる。医薬として許容される担体としては、例えば、固体または液体充填剤、希釈剤、ヒドロトロピー剤（hydrotropy）、界面活性剤、およびカプセル化剤が挙げられる。任意の医薬として活性な物質を含めることができ、これは化合物の阻害活性を実質的に妨害しない。化合物と組み合わせて使用される担体の量は、化合物の単位用量当たりの投与に実際的な量の物質を提供するのに十分な量である。本明細書に記載の方法において有用な剤形を製造するための技術および組成物は、以下の文献に記載されており、そのすべてが参照により本明細書に組み入れられる：Modern Pharmaceutics, 4th Ed., Chapters 9 and 10 (Banker & Rhodes, editors, 2002)；Lieberman et al., Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets (1989) ；および、Ansel, Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms 8th Edition (2004)。
【００５７】
錠剤、カプセル剤、および顆粒剤などの固体形態などの様々な経口剤形を使用することができる。錠剤は、適切な結合剤、潤滑剤、希釈剤、崩壊剤、着色剤、着香料、流動誘導剤、および融解剤を含有する、圧縮錠、錠剤粉砕物、腸溶性コーティング錠、糖衣錠、フィルムコーティング錠、または多重圧縮錠とすることができる。液体経口剤形としては、好適な溶媒、保存料、乳化剤、懸濁剤、希釈剤、甘み剤、融解剤、着色剤、および着香料を含有する、水溶液、乳剤、懸濁液、非発泡性顆粒から再構成された溶液および／または懸濁液、ならびに発泡性顆粒から再構成された発泡性調剤薬が挙げられる。
【００５８】
経口投与用の単位剤形の調製に適した医薬として許容される担体は、当該分野でよく知られている。錠剤は、典型的には、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、マンニトール、ラクトース、およびセルロースなどの不活性希釈剤；デンプン、ゼラチン、およびスクロースなどの結合剤；デンプン、アルギン酸、およびクロスカルメロースなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、およびタルクなどの潤滑剤として、従来の医薬としての適合性を有するアジュバントを含む。二酸化ケイ素などの流動促進剤を使用して、粉末混合物の流動特性を改善することができる。外観のために、ＦＤ＆Ｃ染料などの着色剤を添加することができる。アスパルテーム、サッカリン、メントール、ペパーミント、およびフルーツ香料などの甘み剤および着香料は、チュアブル錠のための有用なアジュバントである。カプセル剤は、典型的には、上に開示した１種または複数種の固体希釈剤を含む。担体成分の選択は、味覚、コスト、および貯蔵安定性のような二次的な考慮事項に依存し、これらは決定的なものではなく、また、当業者が容易に選択することができる。
【００５９】
また、経口組成物としては、液体溶液、乳剤、懸濁液なども挙げられる。そのような組成物の調製に適した医薬として許容される担体は、当技術分野でよく知られている。シロップ、エリキシル剤、乳剤、および懸濁液用の担体の典型的な成分としては、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、液体スクロース、ソルビトール、および水が挙げられる。懸濁液に関して、典型的な懸濁化剤としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ＡＶＩＣＥＬ  ＲＣ−５９１、トラガカント、およびアルギン酸ナトリウムが；典型的な湿潤剤としては、レシチンおよびポリソルベート８０が；典型的な保存料としては、メチルパラベンおよび安息香酸ナトリウムが挙げられる。また、経口液体組成物は、上に開示した甘み剤、着香剤、および着色剤などの１種または複数種の成分も含有することができる。
【００６０】
主題の化合物の全身送達を達成するのに有用な他の組成物としては、舌下、頬下、および経鼻剤形が挙げられる。このような組成物は、典型的には、スクロース、ソルビトール、およびマンニトールなどの可溶性充填剤物質；ならびに、アカシア、微結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロース、およびヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの結合剤の１種または複数種を含む。また、上に開示した流動促進剤、潤滑剤、甘み剤、着色剤、抗酸化剤、および着香料も含むことができる。
【００６１】
局所使用の場合、本明細書に開示される化合物を含有するクリーム、軟膏、ゲル、溶液、または懸濁液などが用いられる。局所用製剤は、一般に、医薬担体、共溶媒、乳化剤、浸透促進剤、保存料系、および皮膚軟化剤を含むことができる。
【００６２】
静脈内投与の場合、本明細書に記載の化合物および組成物は、生理食塩水またはデキストロース溶液などの医薬として許容される希釈剤に溶解または分散させることができる。所望のｐＨを達成するために適切な賦形剤を含むことができ、賦形剤としては、これらに限定されるものではないが、ＮａＯＨ、炭酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、ＨＣｌ、およびクエン酸が挙げられる。様々な実施形態において、最終組成物のｐＨは、２〜８、好ましくは４〜７の範囲である。抗酸化賦形剤としては、重亜硫酸ナトリウム、アセトン重亜硫酸ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、チオ尿素、およびＥＤＴＡを挙げることができる。最終静脈内組成物に含まれる適切な賦形剤の他の非限定的な例としては、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウム、クエン酸、酒石酸、ゼラチン、ならびに、デキストロース、マンニトール、およびデキストランなどの炭水化物を挙げることができる。さらなる許容される賦形剤は、Powell, et al., Compendium of Excipients for Parenteral Formulations, PDA J Pharm Sci and Tech 1998, 52 238-311、およびNema et al., Excipients and Their Role in Approved Injectable Products: Current Usage and Future Directions, PDA J Pharm Sci and Tech 2011, 65 287-332に記載されており、いずれもその全体が参照により本明細書に組み込まれる。また、静菌性または静真菌性の溶液を得るために抗菌剤を含むこともでき、抗菌剤としては、これらに限定されるものではないが、フェニル水銀硝酸塩、チメロサール、塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウム、フェノール、クレゾール、およびクロロブタノールが挙げられる。
【００６３】
静脈内投与用の組成物は、投与の直前に、滅菌水、生理食塩水、またはデキストロース溶液などの適切な希釈剤で再構成される１種または複数種の固体形態で介護者に提供することができる。他の実施形態では、組成物は、そのまま非経口投与することができる溶液として提供される。さらに他の実施形態では、組成物は、投与前にさらに希釈される溶液で提供される。本明細書に記載の化合物と別の薬剤との組み合わせを投与することを含む実施形態では、その組み合わせを介護者に混合物として提供することもでき、介護者が投与前に２つの薬剤を混合することもでき、また、２つの薬剤を別々に投与することもできる。
【００６４】
非ヒト動物試験では、製品候補の適用は、高い用量レベルで開始され、望まれる効果がもはや得られなくなるか、有害な副作用が消失するまで用量を減少させる。用量は、望まれる効果および治療適応に応じて広い範囲にわたる場合がある。典型的には、用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇから４０００ｍｇ／ｋｇ体重の間、例えば約１ｍｇ／ｋｇから１６００ｍｇ／ｋｇ体重の間とすることができる。あるいは、当業者に理解されるように、用量は、患者の表面積に基づき計算することもできる。
【００６５】
処置される状態の重症度および応答性に応じて、投与は、数日間から数週間の、または、治癒が達成されるまでもしくは疾患状態が減退するまでの処置過程を伴う徐放性組成物の単回投与とすることもできる。投与される組成物の量は、当然のことながら、処置する対象、苦痛の重症度、投与方法、処方する医師の判断などの多くの要因に依存することになる。本明細書に開示される化合物または化合物の組み合わせは、１日当たり患者の体重の０．１ｍｇ／ｋｇ〜４０００ｍｇ／ｋｇの用量で、経口でまたは注射によって投与することができる。ヒト成人用の用量範囲は、一般に１ｇ〜１００ｇ／日である。個別の単位で提供される錠剤または他の提示形態は、その用量で、またはその倍数で有効である量の本明細書に開示される化合物または化合物の組み合わせを好都合に含有することができ、例えば、その単位は、１ｇ〜６０ｇ（例えば、約５ｇ〜２０ｇ、約１０ｇ〜５０ｇ、約２０ｇ〜４０ｇ、または約２５ｇ〜３５ｇ）を含有する。患者に投与される化合物の正確な量は担当医の責任となる。しかしながら、用いられる用量は、患者の年齢および性別、処置される正確な障害、およびその重症度などの多くの要因に依存することになる。また、状態およびその重症度に応じて投与経路も変わり得る。アンモニア降下剤の（例えば、オルニチンの、またはフェニル酢酸塩もしくはフェニル酪酸塩の）典型的な用量は、そのようなパラメーターに応じて、体重１ｋｇ当たり０．０２ｇ〜１．２５ｇ、例えば体重１ｋｇ当たり０．１ｇ〜０．５ｇとすることができる。いくつかの実施形態では、アンモニア降下剤の用量は、１ｇ〜１００ｇ、例えば、１０ｇ〜８０ｇ、１５ｇ〜６０ｇ、２０ｇ〜４０ｇ、または２５ｇ〜３５ｇとすることができる。いくつかの実施形態では、オルニチンおよびフェニル酢酸塩／フェニル酪酸塩は、１０：１〜１：１０、例えば、５：１〜１：５、４：１〜１：４、３：１〜１：３、２：１〜１：２、または約１：１の重量比で投与することができる。医師は、任意の特定の対象のために、アンモニア降下剤の（例えば、オルニチンの、およびフェニル酢酸塩またはフェニル酪酸塩の）必要用量を決定することができる。
【００６６】
本明細書に開示される化合物または化合物の組み合わせの医薬組成物の実際の製剤、投与経路、および用量は、患者の状態を考慮して個々の医師が選択することができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれるFingl et al. 1975の「The Pharmacological Basis of Therapeutics」、特にCh.1について参照されたい）。典型的には、患者に投与される組成物の用量範囲は、患者の体重の約０．１〜約４０００ｍｇ／ｋｇとすることができる。投与は、患者の必要に応じて、単回投与、または、１日もしくはそれ以上の間に行われる一連の２回以上の投与とすることができる。化合物のヒト用量が少なくともなんらかの状態に対して確立されている場合、本開示では、それらと同じ用量、または確立されたヒト用量の約０．１％から約５０００％の間、より好ましくは約２５％から約１０００％の間の用量を使用することになる。新たに発見された医薬化合物の場合のように、ヒト用量が確立されていない場合、適切なヒト用量は、動物における毒性試験および有効性試験で認定されるようなインビトロまたはインビボ試験から導かれるＥＤ５０もしくはＩＤ５０値、または他の適切な値から推定することができる。
【００６７】
担当医は、毒性または臓器機能不全のために投与を終了、中断、または調節する方法および時期を理解しておくべきであることに留意されたい。反対に、担当医は、臨床的反応が十分でない場合（毒性を除く）に処置をより高いレベルに調整することも理解しておくべきである。対象となる障害の管理における投与用量の大きさは、処置すべき状態の重症度および投与経路によって変わることになる。状態の重症度は、例えば、標準的な予後評価法によってある程度評価することができる。さらに、用量およびおそらく投与頻度も、個々の患者の年齢、体重および応答によっても変わることになる。上述のプログラムと同等のプログラムを動物用医薬に用いることができる。
【００６８】
実際の用量は薬物ごとに決定されることとなるが、ほとんどの場合、用量に関してはある程度一般化することができる。医薬として許容される塩を投与する場合、用量は遊離塩基として計算することができる。いくつかの実施形態では、組成物は１日当たり１〜４回投与される。あるいは、本明細書に開示される化合物または化合物の組み合わせの組成物は、連続静脈内注入によって、好ましくは各有効成分の用量として１日当たり最大１００ｇで投与することができる。当業者に理解されるように、特定の状況では、特に攻撃的な疾患または感染症を効果的かつ積極的に処置するために、本明細書に開示される化合物を、上記の好ましい用量範囲を超える量、またはそれをはるかに超える量で化合物を投与する必要がある場合がある。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される化合物または化合物の組み合わせは、例えば１週間もしくはそれ以上、または数カ月または数年間の連続治療期間にわたり投与されることとなる。
【００６９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される化合物（複数可）または化合物の組み合わせの投薬レジメンは一定期間投与するものであり、その期間は、例えば、少なくとも約１週間〜少なくとも約４週間、少なくとも約４週間〜少なくとも約８週間、少なくとも約４週間〜少なくとも約１２週間、少なくとも約４週間〜少なくとも約１６週間、またはそれ以上とすることができる。本明細書に開示される化合物（複数可）または化合物の組み合わせの投薬レジメンは、１日３回、１日２回、毎日、１日おき、週３回、１週間おき、月３回、月１回、実質的に連続的に、または連続的に投与するものとすることができる。
【実施例】
【００７０】
以下の実施例において、本出願の実施形態のいくつかの態様をさらに詳細に開示するが、これは本開示の範囲を限定することをなんら意図するものではない。
【実施例１】
【００７１】
初代ヒトＨＳＣに対するインビトロ効果
初代ヒト肝星細胞（ｈＨＳＣ）を培養した。ｈＨＳＣ増殖（ＢｒｄＵ）、代謝活性（ＭＴＳアッセイ）、生存率（ニュートラルレッド）、超微細構造変化（ＴＥ−Ｍ）、および遺伝子／タンパク質発現（ｑ−ＰＣＲ／ウェスタンブロット）に対するＮＨ４Ｃｌ負荷（NH4Cl challenge）（２４〜７２時間にわたり０．１〜１０ｍＭ）の影響を検討した。回復について試験するために、アンモニア処置細胞にグルタミンを補充し、また別の実験において、Ｌ−メチオニン−スルホキシミン（ＭＳＯ−ＧＳ阻害剤）で前処置してグルタミン合成酵素（ＧＳ）の重要性を測定した。
【００７２】
初代ｈＨＳＣにおける高アンモニア血症は、５０〜１００μｍｏｌ／Ｌにおいてさえ、細胞膨潤および筋線維芽細胞様表現型を誘導しつつ、増殖および代謝活性の時間依存的な低下を誘導した。超微細構造的には、アンモニア処置ｈＨＳＣでは、用量依存的に細胞内ＥＲが拡大し、これは培養物をＬ−グルタミンで補充することによって元に戻ることできた。ｈＨＳＣ増殖のＮＨ３阻害は、ＭＳＯおよび高アンモニア血症が細胞分離および回復防止を誘導したため、ＧＳ活性に依存しており、ｈＨＳＣの生存にグルタミンが重要であることが示唆された。
【００７３】
これらの結果は、高アンモニア血症がｈＨＳＣを改変し、腫脹した筋線維芽細胞表現型を付与し、これはアンモニアの減少により元に戻ることができることを示唆している。したがって、アンモニアを減少させる治療が、肝臓線維症を驚くほど予防および好転させ得ることが予想される。
【実施例２】
【００７４】
ＢＤＬラットにおけるインビボ効果
２８日間胆管結さつ（ＢＤＬ）したラットを生理食塩水またはオルニチンフェニル酢酸で５日間処置した。終了時に門脈圧を測定し、検討のために組織を収集した。高アンモニア血症のＢＤＬラットでは、線維形成性ｈＨＳＣ関連遺伝子（α−ＳＭＡ、ＰＤＧＦｂ−Ｒ、ミオシンＩＩＡ／ＩＩＢ、およびＣｏｌｌＩ）の肝臓での発現が増加しており、ｅＮＯＳ活性およびＤＤＡＨ−１が低く、門脈圧が高く、これらはいずれもオルニチンフェニル酢酸による処置によって改善された。
【００７５】
これらの結果は、オルニチンフェニル酢酸によるインビボでのアンモニアの低下が、線維形成性および活性化ＨＳＣ遺伝子およびタンパク質発現を低下させることを示す。このデータは、肝臓線維症および肝臓がん（星細胞の活性化が肝臓がんを引き起こす場合がある）の処置（予防を含む）におけるオルニチンフェニル酢酸の使用を支持する。
【実施例３】
【００７６】
アンモニアはヒトＨＳＣ活性化を変化させる
この実施例は、アンモニアがＨＳＣに対して有害な形態学的および機能的効果をもたらし、ＨＳＣのアンモニア誘導性機能不全はアンモニア降下剤ＯＰを用いることにより好転できることを示す。
【００７７】
方法
この実施例では、初代ヒトＨＳＣ（ｈＨＳＣ）を単離し培養した。２４〜７２時間にわたるアンモニア負荷（５０μＭ、１００μＭ、３００μＭ）の影響を同定するために、増殖（ＢｒｄＵ）、代謝活性（ＭＴＳ）、形態（ＴＥＭ、光学および免疫蛍光顕微鏡法）、ＨＳＣ活性化マーカー、収縮能、および酸化状態の変化（ＲＯＳ）を評価した。血漿アンモニアレベル、ＨＳＣ活性化マーカー、門脈圧、および肝臓ｅＮＯＳ活性の変化を、高アンモニア血症のＢＤＬ動物で、およびそのＯＰ処置後に定量した。
【００７８】
ヒトＨＳＣにおけるインビトロ試験
初代ｈＨＳＣは、ロイヤルフリーホスピタルで手術を受けた患者から得た肝臓組織のくさび形切片からインフォームドコンセント（ＥＣ０１．１４−ＲＦ）を与えた後単離した。細胞は、ヒト肝臓用にWaugh MG, editor. Lipid Signaling Protocols, 2 ed. New York: Springer Science+Business Media; 2015. p. 203-212のRombouts K, Carloni V. Determination and characterization of tetraspanin-associated phosphoinositide-4 kinases in primary and neoplastic liver cells.に記載されるように改変したMederacke et al. (Nature Protocols 2015, 10:305-315)にしたがって単離した。簡潔には、１０ｇのヒト全肝臓組織を、０．０１％コラゲナーゼ、０．０５％プロナーゼ、および０．００１％ＤＮアーゼＩで、灌流を行わずに消化した。ホモジネートを１００μｍのセルストレーナーで濾過し、フロースルーを５０×ｇで２分間４℃で遠心分離した。上清を洗浄後、１１．５％Ｏｐｔｉｐｒｅｐ勾配を用いて１４００×ｇで１７分間４℃で勾配遠心分離を行った。最後に接触面を回収し洗浄した。ｈＨＳＣＳの純度は、ＣＤ１４０ｂ（ＰＤＧＦＲベータ）、ＣＤ２９（インテグリンベータ１）、およびサイトグロビン（ＣＹＧＢ）を検出することにより確立した。
【００７９】
得られたＨＳＣを、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ＧＬＵＴＡＭＡＸ、非必須アミノ酸１×、１．０ｍＭピルビン酸ナトリウム、１×抗生物質−抗真菌剤（すべてＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＲＰＭＩ（以下、完全ＨＳＣ培地と称する）で培養した。本試験に記載の実験は、継代３と８の間の少なくとも３つの独立した細胞調製物のｈＨＳＣで実施した。
【００８０】
細胞を基本富血清条件（ＣＭ完全培地）下で２４時間播種し（密度２６×１０３／ｃｍ２）、続いて血清枯渇（ＳＦＭ）をさらに２４時間行った。アンモニアの非制御の生成を避けるために、外因性グルタミンを培地から除去した。ＮＨ４Ｃｌ処置剤を含む特定の処置剤を実験期間中毎日交換した。
【００８１】
動物モデル
すべての動物実験は、ユニヴァーシティ・カレッジ・ロンドンの動物保護に関する倫理委員会の承認を得て、英国動物科学的処置法１９８６年（UK Animals in Scientific Procedures Act 1986）の下で、内務省指針にしたがって実施した。この研究は、体重２２０〜２５０ｇの雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＵＫ、Ｍａｒｇａｔｅ、ＵＫ）で行った。
【００８２】
実験モデルの１つでは、ラットに高タンパク質／アンモニア生成食（ＡＡｓ）を５日間投与した。さらに、すべてのラットに、既述のとおり、肝硬変を誘導するためのＢＤＬまたは偽手術を行った。
【００８３】
試験設計  （ｉ）第１のプロトコルにおいて、ＨＳＣ細胞生物学に対するアンモニア誘導性効果の以前のインビトロの観察結果をインビボにおいてさらに調査した。この実験プロトコルでは、動物にＢＤＬ手術を行い、４週間で肝損傷を発症させた。第４週の間にＢＤＬ動物を３群に無作為化した：第１群は、生理食塩水の腹腔内注射（ｉｐ）に加えて富アミノ酸（ＡＡｓ）食を与えられるＢＤＬラットを含み（ｎ＝４）；第２群にはＡＡｓ食を与え、アンモニア降下剤オルニチンフェニル酢酸（ＯＰ）０．３ｇ／ｋｇを１日２回５日間ｉ．ｐ．注射して処置し（ｎ＝４）；第３群は、生理食塩水ｉ．ｐ．を与えられるＢＤＬラットからなるものとした（ｎ＝４）。ＢＤＬ動物に加えて、さらなる偽手術ラット群に生理食塩水（ｉ．ｐ．）を与えた（ｎ＝４）。動物は処置５日目に屠殺した。
【００８４】
（ｉｉ）第２のプロトコルにおいて、アンモニア誘導性門脈圧亢進症に対するアンモニア降下剤ＯＰの効果を調査した。ＢＤＬまたは偽手術の４週間後、ラットを３群に無作為化した：５日間の実験期間に生理食塩水（ｉ．ｐ．）を１日２回与えられる偽手術ラット（ｎ＝１８）；ｉ．ｐ．生理食塩水を５日間１日２回投与されたＢＤＬラット（ｎ＝２０）；ＯＰ０．３ｇ／ｋｇのｉ．ｐ．注射を５日間１日２回受けたさらなるＢＤＬラット群（ｎ＝１１）。第４週と第５週の間に、麻酔（２％イソフルラン）後、右頸動脈を分離しカニューレ挿入を行うことによって、各群のラットの平均動脈圧の評価を行った。さらに、門脈圧を主門脈の直接カニューレ挿入によって測定した。すべての測定値をＣｈａｒｔ  ｖ５．０．１ソフトウェアにリンクしたＰｏｗｅｒｌａｂ（４ＳＰ）に導入した。１分間隔で測定した３回の測定値の平均を記録した。肝臓組織を摘出し、急速冷凍して分析まで−８０℃で保存した。
【００８５】
統計分析
結果は、平均値±ＳＥＭとして表され、変数の一方向分析の後、適宜、ＤｕｎｎｅｔまたはＴｕｋｅｙの多重比較事後検定を用いて比較した。Ｐ値≦０．０５を有意とみなした。
【００８６】
インビボ実験データは、ｔ検定、および、適宜、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定によって分析し；Ｐ＜０．０５を統計的有意とみなした。結果を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて平均値±ＳＥＭとして表す。
【００８７】
結果
アンモニアは、ヒト肝星細胞（ｈＨＳＣ）における細胞増殖および代謝をインビトロで用量依存的に低下させる。異なる濃度のアンモニアで７２時間処置したｈＨＳＣは、細胞増殖（ＢｒｄＵアッセイ）および代謝活性（ＭＴＳアッセイ）における有意な阻害を示した（図１Ａ）。さらに、アンモニアによる細胞の長期処置は、細胞死検出ＥＬＩＳＡを用いて評価されるとおり、ｈＨＳＣにおいて細胞死を引き起こさなかった（図１Ｂ）。また、これらのアンモニア誘導性効果は、光学顕微鏡検査で認められる、細胞形態の用量依存的な大きな変化と一致した（図１Ｃ）。筋線維芽細胞様細胞として知られるｈＨＳＣは、完全培地および血清飢餓下で示されるように、リソソームが保持する色素であるニュートラルレッドで評価されるとおり、アンモニアで処置した場合、エンドリソソーム区画の脱調節（deregulation）の兆候とともに、形態が紡錘状線維芽細胞表現型に劇的に変化した（図１Ｃ）。ｈＨＳＣは、ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルでグルタミン合成酵素（ＧＳ）を発現することが見出された。Ｌ−メチオニンスルホキシミン（ＧＳの生化学的阻害剤であるＭＳＯ）による細胞の前処置と、それに続くアンモニアへの曝露は、ＭＳＯ処置のみの場合と比べて、増殖および代謝活性をさらに阻害することはなかった。
【００８８】
アンモニアは細胞質ストレスの変化を誘導し、これは、細胞代謝／機能およびアクチン細胞骨格構造の変化と一致する。光学顕微鏡法によって認められる形態学的変化を、超微細構造試験を行うことによってさらに特徴付けた。アンモニアは、サイトゾルにおける劇的な用量依存的変化を引き起こし、半透明の液胞の存在を際立たせた。ミトコンドリアの変化も（二重膜によって特徴付けられる）自食作用構造の存在も認められなかった（図２Ａ）。富アンモニア培地を除去し、完全培地で細胞を補充すると、細胞増殖と代謝活性の両方が回復することが分かり（図２Ｂ）、観察されたアンモニアの効果が一時的であることがそれにより裏付けられた。さらに、コラーゲンゲル上で培養したアンモニア処置ｈＨＳＣは、対照と比較して有意な収縮能を示し（図２Ｃ、２Ｄ）、これはアンモニア処置の３時間後に起こり、２４時間後まで維持され、これは既に認められている形態変化と一致した（図２Ｅ）。さらに、アンモニアによる長期処置（７２時間）により、ＴＲＩＣＴ−Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ染色を用いた場合、細胞骨格の線維状アクチンの用量依存性破壊が誘導された。Ｆ−アクチンネットワークの再構成は、用量依存的に半透明の液胞の存在と一致した（図２Ｆ）。
【００８９】
高アンモニア血症はｈＨＳＣにおけるＲＯＳ産生を誘導する。細胞のアンモニアによる７２時間までの長期処置は、細胞質カルボキシ−ＤＣＦの存在によって検出されるＲＯＳの段階的進行を示した（図３Ａ）。アンモニア誘導性ＲＯＳ生成の進行を、Mookerjee et al., (Gastroenterology, 2007, 132:2533-2541)に記載のとおりさらに定量的に測定し、アンモニア処置された初代ｈＨＳＣが顕著な活性酸素種（ＲＯＳ）を生成することを確認した（図３Ｂ）。次に、異なる時点でアンモニアで処置された細胞は、３時間後にスーパーオキシドジスムターゼ２（ＳＯＤ２）のｍＲＮＡ発現の強い増加を示し、これはアンモニア処置の２４時間まで持続した（図３Ｃ）。さらに、既知のＲＯＳスカベンジャーであるＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）による前処置は、上記で観察されたアンモニア処置３時間後のＳＯＤ２ｍＲＮＡ発現の増加に影響を与えなかった。対照的に、ＮＡＣでの前処置とそれに続く２４時間のアンモニア処置によって、アンモニア誘導性ＳＯＤ２ｍＲＮＡ発現がほぼ完全に消失した。
【００９０】
アンモニアは、ｈＨＳＣにおける線維形成促進性／炎症誘発性プロフィールを変化させる。図４Ａに示すように、アンモニアがα−ＳＭＡタンパク質発現を顕著に増加させることが示された。３００μＭのアンモニアではビメンチン（重要な中間フィラメント）合成が増加した。アンモニアの濃度上昇によって、ミオシンＩＩａ（ＨＳＣ収縮において重要な役割を果たす）およびミオシンＩＩｂ（ＨＳＣ活性化に関与する）の両方とも著しく変化した。Ｐ−３８ＭＡＰＫ発現においても、アンモニアに対する用量依存的応答が観察された。さらに、ＨＳＣ細胞増殖において重要なＰＤＧＦＲ−βは、アンモニアの影響下で顕著に上方制御され、一方コラーゲンＩ型はアンモニアによって増加する傾向を示したが、これらの効果は統計的に有意ではなかった（図４Ａ）。さらに、アンモニアはＭＭＰ２ｍＲＮＡ発現の強力かつ顕著な上方制御を誘導したが、ＴＩＭＰ１のｍＲＮＡ発現は下方制御された（図４Ｂ）。さらに、ｈＨＳＣをアンモニア３００μＭで７２時間処置すると、炎症誘発性インターロイキン−１βのｍＲＮＡ発現が顕著に誘導され（図４Ｃ）、一方、５０μＭおよび１００μＭ用量のアンモニアはインターロイキン６のｍＲＮＡ発現レベルを顕著に上方制御した。対照的に、アンモニアは、ＨＳＣにおけるインターロイキン８のｍＲＮＡ発現を変化させなかった（図４Ｃ）。これらのデータは、アンモニア誘導性ＲＯＳ形成が、ＨＳＣ関連活性化マーカーおよび炎症誘発性遺伝子の変化を引き起こすことを示す。
【００９１】
胆管結さつおよびアンモニア処置はインビボにおけるＨＳＣの細胞生物学を変化させる。肝臓組織全体におけるＨＳＣ関連シグナル伝達経路に対する高アンモニア血症の影響を調べた。ＢＤＬラットの血漿では、偽手術ラットと比較して、アンモニア濃度が有意に高い（１４９．３μｍｏｌ／Ｌ±５１．１対１０７．４μｍｏｌ／Ｌ±２３．２、Ｐ＜０．０５）。血漿アンモニア濃度は、ＢＤＬ手術と組み合わせて、動物に富アミノ酸（ＡＡｓ）食を与えた場合にさらに上昇した（１９９．１μｍｏｌ／Ｌ±４３．６対１４９．３μｍｏｌ／Ｌ±５１．１、Ｐ＜０．０５）（図５Ａ）。さらに重要なことに、ＢＤＬ−ＡＡｓ給餌動物をＯＰで処置した場合、血漿アンモニアレベルが有意に低下した（１２３．９μｍｏｌ／Ｌ±１６．１対１９９．１μｍｏｌ／ＬμＭ±４３．６、Ｐ＜０．００１）（図５Ａ）。
【００９２】
ＯＰ処置は、ＨＳＣ関連活性化マーカーのタンパク質発現の著しい低下をもたらすことが分かった（図５Ｂ）。より具体的には、高アンモニア血症（ＡＡｓ食）と組み合わせたＢＤＬは、ＢＤＬと比較して、ミオシンＩＩｂ、コラーゲンＩ型、およびＰＤＧＦ−Ｒβタンパク質発現の顕著な増加を示した。対照的に、ＯＰを用いた処置により、ＢＤＬラットの肝臓に対する高アンモニア血症の強い影響が、試験したすべてのＨＳＣ関連活性化マーカーについて消失した（図５Ｂ）。
【００９３】
この実施例は、病態生理学的アンモニア濃度が、インビトロで細胞増殖、代謝活性、およびｈＨＳＣの活性化マーカーの顕著かつ可逆的な変化を引き起こしたことを示す。アンモニアはまた、細胞質液胞形成、ＲＯＳ産生、ｈＨＳＣ収縮、ならびに、炎症誘発性遺伝子発現とともに、α−ＳＭＡ、ミオシンＩＩａ、ＩＩｂ、およびＰＤＧＦ−ＲβなどのＨＳＣ関連活性化マーカーの変化を特徴とする細胞形態の顕著な変化を誘導した。アンモニア低下剤ＯＰによる処置は血漿アンモニアを有意に減少させ（ＢＤＬ１９９．１μｍｏｌ／Ｌ±４３．６５対ＢＤＬ＋ＯＰ１４９．２７μｍｏｌ／Ｌ±５１．１、Ｐ＜０．０５）、これは、ｅＮＯＳ活性の増加およびＨＳＣ活性化マーカーの消失に関連していた。
【実施例４】
【００９４】
ＯＴＣ遺伝子発現および肝尿素窒素処理は、ＮＡＦＬＤ動物において低下し、食餌の変更および細菌転座（bacterial translocation）の減少により回復する。
この実施例は、ＮＡＳＨの動物モデルにおいて、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）の遺伝子およびタンパク質の発現が変化し、その変化が、食餌の回復、および細菌転座の減少による動物の回復により改善できることを示す。この実施例はまた、ＮＡＦＬＤ患者においてＯＴＣの遺伝子発現が変化することを示している。
【００９５】
ＮＡＳＨの２つの動物モデルを検討した：ａ）Ｗｉｓｔａｒラットを、高脂肪、高コレステロール食（ＨＦＨＣ）で１０カ月間給餌し、標準食で２カ月間回復させ、ｂ）マウスを、メチオニン−コリン欠損食（ＭＣＤ）で４週間給餌し、細菌転座を減少させることが示されているナノ多孔質炭素であるＹａｑ−００１（Ｙａｑｒｉｔ  Ｌｔｄ．）で処置した。さらに、１６人のＮＡＦＬＤヒト患者から肥満手術中に肝生検検体を取得し、これらの肝生検検体におけるＯＴＣ遺伝子発現を測定した。
【００９６】
ＮＡＳＨ動物モデルのいずれにおいても、ＯＴＣの遺伝子およびタンパク質発現は顕著に低下しており、その低下は食餌の変更または細菌翻訳の減少によって回復した。例えば、ＨＦＨＣラットでは、食餌を正常食に変更することによるＮＡＳＨの好転によりＯＴＣ遺伝子発現（０．５３（ＣＩ０．４１−０．６８）対０．３２（ＣＩ０．２８−０．３７），Ｐ＜０．０５；対照１．００（ＣＩ０．８５−１．１７））およびＯＴＣタンパク質発現（５．３３±０．２１対３．０６±０．２０，Ｐ＜０．０１；対照７．４１±０．６８）が回復した（図６）。ＭＣＤマウスでは、細菌転座の減少は、ＮＡＳＨの発症を防ぎ、ＯＴＣ遺伝子発現を回復させ（０．８９（ＣＩ０．１３−０．１６）対０．３５（ＣＩ０．０８−０．０９）、Ｐ＜０．０１；対照１．００（ＣＩ０．１２−０．１７））、ＮＡＳＨの炎症がＯＴＣ遺伝子発現に寄与していることが示唆された（図７）。
【００９７】
ＮＡＦＬＤ患者において、ＮＡＳＨおよび線維症の患者は、脂肪症単独患者よりもＯＴＣ遺伝子発現が有意に低かった（０．８２±０．３７対１．１５±０．２４、Ｐ＝０．０５）（図８）。
【００９８】
この実施例に示すように、実験的およびヒトＮＡＳＨは、尿素サイクル酵素ＯＴＣの遺伝子発現の低下をもたらし、窒素恒常性（nitrogen homeostasis）を損なう。この変化は、ＮＡＳＨの動物モデルにおいて、食事介入により、また細菌転座を減少させることによっても好転できた。本明細書に示される結果は、ＮＡＳＨ、ＯＴＣの遺伝子発現および機能の低下、ならびに細菌転座の間の関連を示す。さらに、アンモニアは形態学的変化およびＨＳＣの活性化をもたらし、ＯＴＣの低下は高アンモニア血症、ならびに肝臓損傷および線維症の進行をもたらし得る。この実施例は、ＮＡＳＨの処置法としてアンモニアおよび細菌転座を標的化することの裏付けとなる。
【実施例５】
【００９９】
高アンモニア血症は疾患の進行をもたらし、アンモニア低下剤の投与はＮＡＳＨおよび線維症の進行を軽減する
この実施例では２つの動物モデルを検討する：（ｉ）ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙラットを分割して、高脂肪および高コレステロールに富んだ食餌（ＨＦＨＣ食）、または高脂肪およびコレステロール含量を含まない標準食（標準食）のいずれかを１６週まで給餌する；および、（ｉｉ）ラットにフルクトースを補充した高脂肪食（ＨＦＤ＋Ｆ食）を１６週まで給餌する。
【０１００】
介入試験：（ｉ）予防療法−ＯＰを脂肪補充食と同時にラットに与える；
【０１０１】
（ｉｉ）介入療法は、ＮＡＳＨラットモデルで確立された治療介入を模するために、食餌誘導性ＮＡＳＨの８週後に開始する。サブグループにＯＰ（０．３ｇ／ｋｇ、１日２回、経口）またはプラセボを投与する。合計で、６実験群を調査する：１）標準食＋生理食塩水；２）標準食＋ＯＰ（１〜１６週）；３）標準食＋ＯＰ（８−１６週）；４）ＨＦＨＣ食＋生理食塩水；５）ＨＦＨＣ食＋ＯＰ（１〜１６週）−予防療法；および、６）ＨＦＨＣ食＋ＯＰ（８−１６週）−介入療法。
【０１０２】
（ｉｉｉ）過度高アンモニア血症（exaggerated hyperammonemia）：高アンモニア血症を誘導するための富アミノ酸（ＡＡｓ）食が与えられる追加の１ラット群は、陽性対照としての役割を果たす。
【０１０３】
すべての動物を屠殺し、組織を回収して、ＯＴＣ機能不全をＮＡＳＨ発症および高アンモニア血症の薬理学的調節に関連付ける機構を調べる。
【０１０４】
これらの実験の主要評価項目は、種々の試験群におけるＮＡＳＨおよび線維症の重症度を確認することである。ＮＡＳＨおよび線維症のスコアリングのために、組織学的試験を行い、動物が受けた処置の種類を知らされていない経験豊富な肝病理学者がＮＡＳＨ  ＣＲＮスコアリングシステムを用いる（ＴＶＬ；ＡＰＤ）。ヘマトキシリン−エオジン染色切片について、ＮＡＳＨの一般的な変数を分析する：１）大／小滴性脂肪変性（macro/micro vesicular steatosis）、２）小葉炎症（lobular inflammation）、３）肝細胞風船様腫大（hepatocellular ballooning）、および４）アポトーシス小体。線維症／コラーゲンの蓄積をシリウスレッド染色切片を用いて評価する。さらに、オイルレッドＯ染色を行って脂質蓄積の変化を調べ、フィリピン染色を行ってコレステロールの変化を観察する。
【０１０５】
副次的評価項目：１）血液試料：血漿生化学分析（血清ＡＬＴ、ＡＳＴ、尿素、アンモニア、アルブミン、コレステロール−ＬＤＬ、コレステロール−ＨＤＬコレステロールおよびトリグリセリド）を、Ｃｏｂａｓ  Ｉｎｔｅｇｒａ  ４００マルチアナライザと適切なキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｂｕｒｇｅｓｓ  Ｈｉｌｌ、Ｗｅｓｔ  Ｓｕｓｓｅｘ、ＵＫ）を用いて実施する。２）ＯＰＣ酵素活性の測定およびＯＴＣ（および他の尿素サイクル関連酵素）の評価を、ｑＰＣＲおよびウェスタンブロット分析を用いて行う。ＯＴＣの局在／帯状分布（zonation）の変化を免疫組織化学を用いて評価する。３）線維形成促進性、活性化関連ＨＳＣマーカーを検出する。４）炎症誘発性サイトカイン／ケモカインおよびマクロファージマーカーを検出する。５）アポトーシス関連マーカーを検出する。
【０１０６】
検出力計算および統計分析については、調査中の異なる条件間でのｐ値＜０．０５、検定力８０％での有意差を実証するために実験を行う（選択した事後群比較（post-group comparisons）を伴うＡＮＯＶＡを用いる）。以前の研究において、各群ｎ＝１２動物が有意な変化を実証するのに十分であることが示されている。
【０１０７】
（ｉ）高カロリーおよび高脂肪西洋食を模したＮＡＳＨ動物モデルは、高アンモニア血症であり、ＯＴＣ発現および機能が低下していること；および、（２）アンモニア低下剤（例えばＯＰ）による処置は、肝臓損傷の生化学的、炎症性、および組織学的指標を低下させ、ＯＴＣ機能障害および高アンモニア血症を好転させること、が期待される。
【実施例６】
【０１０８】
アンモニア低下剤で肝臓がんを処置する
この実施例では、線維症／ＨＣＣのラットモデルを用いて、アンモニア低下剤ＯＰがＨＣＣ発症のリスクを低減できるかどうかを決定する。
【０１０９】
動物を１６週まで試験し、ＨＣＣの発症について調べる。既述のとおり（Mohamed et al., Liver International 2015, 35(3):1063-1076）、動物（６〜８／群）をジエチルニトロソアミン（ＤＥＮ）／ニトロソモルホリン（ＮＭＯＲ）で処置して線維症／ＨＣＣを誘導する。試験用の６動物群を表１に列挙する。
【０１１０】
【表１】
0006797117.tif 000002
【実施例７】
【０１１１】
アンモニアレベルの低下はＮＡＦＬＤの進行を減少させる
液体高脂肪食（ＨＦＤ）（ｋｃａｌの７１％脂肪）を１６週まで雄ラットに給餌することでラットにＮＡＦＬＤを誘導する。ラットで最も一般的に使用されるＮＡＦＬＤモデルの１つである肥満Ｚｕｃｋｅｒラットを用意する。フェニル酢酸塩およびフェニル酪酸塩の少なくとも１つと組み合わせたオルニチン、例えばＯＰを、ＨＦＤラットおよび肥満Ｚｕｃｋｅｒラットに投与する。フェニル酢酸塩およびフェニル酪酸塩の少なくとも１つと組み合わせたオルニチンの投与は、ＨＦＤラットおよび肥満Ｚｕｃｋｅｒラットにおけるアンモニア濃度を低下させ、食餌誘導性ＮＡＦＬＤラットモデルおよびＮＡＦＬＤの遺伝的ラットモデルにおけるＮＡＦＬＤの進行を軽減させるのに有効であることが期待される。
【実施例８】
【０１１２】
高アンモニア血症は、ＮＡＦＬＤおよび線維症の進行を悪化させる
液体高脂肪食（ＨＦＤ）（ｋｃａｌの７１％脂肪）を３週間雄ラットに給餌することによってラットにＮＡＦＬＤを誘導する。ラットで最も一般的に使用されるＮＡＦＬＤモデルの１つである肥満Ｚｕｃｋｅｒラットを用意する。食餌誘導性ＮＡＦＬＤラットモデルおよび遺伝的ＮＡＦＬＤラットモデルの両方において、ラットのオルニチントランスカルバモイラーゼを欠損させることにより（ＯＴＣ欠損）、自然発症高アンモニア血症を操作する。ＯＴＣ欠損ラットは、ラットのＯＴＣ遺伝子を変異または欠失させることによって作製する。食餌誘発性および遺伝的ＮＡＦＬＤラットモデルの両方において、ラットに高タンパク質食を与えることにより、誘導された高アンモニア血症を操作する。自然発症高アンモニア血症および誘導性高アンモニア血症のいずれも、ＮＡＦＬＤおよび線維症の進行を悪化させることが予想される。
【実施例９】
【０１１３】
体重減少はＮＡＦＬＤの進行を軽減する
液体高脂肪食（ＨＦＤ）（ｋｃａｌの７１％脂肪）を３週間雄ラットに給餌することによってラットにＮＡＦＬＤを誘導する。ラットで最も一般的に使用されるＮＡＦＬＤモデルの１つである肥満Ｚｕｃｋｅｒラットを用意する。ＨＦＤラットおよび肥満ラットに対して体重減少手術を実施する。体重減少手術は、食餌誘導性ＮＡＦＬＤラットモデルおよびＮＡＦＬＤの遺伝的ラットモデルにおけるＮＡＦＬＤの進行を軽減することが期待される。また、体重減少により、ＮＡＦＬＤラットモデルにおける肝臓の窒素処理、ＯＴＣ遺伝子／タンパク質の発現および機能が改善されることも予想される。
【０１１４】
本開示は、実施形態および実施例を参照して説明されているが、本開示の精神から逸脱しない範囲で、多くの様々な変更がなされ得ることを理解されたい。したがって、本開示は以下の特許請求の範囲のみによって限定される。
【０１１５】
特許、特許出願、論文、教科書などの本明細書に引用されているすべての文献、および本明細書にまだ組み込まれていない程度に本明細書に引用されている文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。これらに限定されるものではないが、定義される用語、用語の使用、記載される技術などを含めて、組み込まれた文献および同様の資料の１つまたは複数が本出願と異なるかまたは矛盾する場合は、本出願に従うものとする。
【０１１６】
前述の実施形態の少なくとも一部において、ある実施形態で使用される１種または複数種の要素は、そのような置換が技術的に実現可能でない限り、別の実施形態で互換的に使用することができる。当業者であれば、特許請求された主題の範囲から逸脱しない範囲で、上記の方法および構造に対して様々な他の省略、追加および修正がなされ得ることを理解するであろう。そのような改変および変更はすべて、添付の特許請求の範囲によって規定される主題の範囲内に入ることが意図される。
【０１１７】
本明細書における実質的に任意の複数形および／または単数形の用語の使用に関して、当業者は、文脈および／または出願に適切であるように、複数形から単数形および／または単数形から複数形に変換することができる。明確化を目的として、様々な単数形／複数形の置換を本明細書に明示的に記載することができる。
【０１１８】
一般に、本明細書、特に添付の特許請求の範囲（例えば、添付の特許請求の範囲の本文）で使用されている用語は、一般的に「開放された」用語（"open" terms）として意図される（例えば、用語「含む（including）」は、「含むがこれに限定されない（including but not limited to）」と、用語「有する（having）」は、「少なくとも有する（having at least）」と、用語「含む（includes）」は、「含むがこれに限定されない（includes but is not limited to）」などと解釈されるべきである。）ことが当業者には理解されよう。さらに、導入された特許請求の範囲の記載の特定の数字が意図される場合、そのような意図は特許請求の範囲に明示的に記載されるものとし、そのような記載がない場合には、そのような意図が存在しないことは当業者には理解されよう。例えば、理解を助けるものとして、以下の添付の特許項は、特許請求の範囲の記載に導入するための「少なくとも１つ」および「１種または複数種」という前置句の使用を含み得る。しかしながら、そのような語句の使用は、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による特許請求の範囲の記載を導入することが、同じ特許請求の範囲が「１つ以上の」または「少なくとも１つの」という導入句、および、「ａ」または「ａｎ」などの不定冠詞（例えば、「ａ」および／または「ａｎ」は、「少なくとも１つ」または「１種または複数種」を意味すると解釈されるべきである）を含む場合であっても、そのような導入された特許請求の範囲の記載を含む特定の特許請求の範囲を、そのような記載を１つだけ含む実施形態に限定することを意味すると解釈されるべきではない。特許請求の範囲の記載に導入する定冠詞についても同様である。さらに、導入された特許請求の範囲の記載の特定の数が明示的に記載されていても、当業者は、そのような記載が少なくとも記載された数を意味すると解釈するべきであることを認識するであろう（例えば、他の修飾語のない「２つの記載」は、少なくとも２つの記載、または２つ以上の記載を意味する）。さらに、「Ａ、Ｂ、およびＣなどの少なくとも１つ」に類似する慣用句が使用される場合、一般に、このような構文は、当業者が当該慣用句を理解する意味を意図する（例えば、「Ａ、Ｂ、およびＣの少なくとも１つを有する系」は、これらに限定されないが、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、ＡおよびＢを一緒に、ＡおよびＣを一緒に、ＢおよびＣを一緒に、ならびに／または、Ａ、Ｂ、およびＣを一緒に有する系などを含む。）。「Ａ、Ｂ、またはＣなどの少なくとも１つ」に類似した慣用句が使用される場合、一般に、このような構文は、当業者が当該慣用句を理解する意味を意図する（例えば、「Ａ、Ｂ、またはＣの少なくとも１つを有する系」は、これらに限定されないが、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、ＡおよびＢを一緒に、ＡおよびＣを一緒に、ＢおよびＣを一緒に、ならびに／または、Ａ、Ｂ、およびＣを一緒に有する系などを含む）。当該分野において、明細書、特許請求の範囲、または図面のいずれにおいても、２つ以上の代替用語を提示する事実上任意の離接語および／または句は、用語のうちの１つ、用語のいずれか、または両方の用語を含む可能性が考慮されると理解するべきであることが、当業者であればさらに理解されよう。例えば、「ＡまたはＢ」という語句は、「Ａ」または「Ｂ」または「ＡおよびＢ」の可能性を含むものと理解されよう。
【０１１９】
さらに、本開示の特徴または態様がマーカッシュグループで記載されている場合、それにより、本開示がマーカッシュグループの任意の個別の構成要素または構成要素のサブグループでも記載されているものと当業者は認識するであろう。
【０１２０】
当業者に理解されるように、任意かつすべての目的において、例えば書面による説明の提供の観点で、本明細書に開示されるすべての範囲は、その任意かつすべての可能な部分範囲、および部分範囲の組み合わせも包含する。任意の列挙された範囲は、同範囲が、少なくとも等分、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１などに分割されることを十分に記載するもの、および、可能にするものとして容易に認識することができる。非限定的な例として、本明細書で論じられる各範囲は、下３分の１、中３分の１、上３分の１などに容易に分割することができる。これも当業者に理解されるであろうとおり、「〜まで」、「少なくとも」、「より大きい」、「より小さい」などのすべての言い方は、記載された数字を包含し、後で上述のように部分範囲に分割することができる範囲を指す。最後に、当業者に理解されるであろうとおり、範囲は個々の構成要素を含む。したがって、例えば、１〜３個の物品を有するグループは、１、２、または３個の物品を有するグループを指す。同様に、１〜５個の物品を有するグループは、１、２、３、４、または５個の物品を有するグループを指す、などである。
【０１２１】
様々な態様および実施形態が本明細書に開示されているが、他の態様および実施形態は、当業者には明らかであろう。本明細書に開示される様々な態様および実施形態は、説明を目的としたものであり、限定を意図するものではなく、本発明の真の範囲および精神が以下の特許請求の範囲によって示される。
【０１２２】
特許、特許出願、論文、教科書などの本明細書に引用されているすべての文献、および、本明細書にまだ組み込まれていない程度に本明細書に引用されている文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。これらに限定されるものではないが、定義された用語、用語の使用、記載された技術などを含めて、組み込まれた文献および同様の資料の１つまたは複数が本出願と異なるかまたは矛盾する場合は、本出願に従うものとする。
本発明は次の実施態様を含む。
［１］肝星細胞（ＨＳＣ）活性化関連疾患を処置する方法であって、それを必要とする対象に対してアンモニア降下療法を実施することを含む方法。
［２］
肝星細胞（ＨＳＣ）活性化関連疾患の発症または進行を遅延させる方法であって、それを必要とする対象に対してアンモニア降下療法を実施することを含む方法。
［３］
アンモニア降下療法を実施することが、前記対象にアンモニア降下剤を投与することを含む、上記［１］または［２］に記載の方法。
［４］
前記アンモニア降下剤が、リン酸マグネシウム生成物（ＭＧＰ）、グリセロールフェニル酪酸（ＧＰＢ）、フェニル酢酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム（ＮａＰＢＡ）、グルタミン、安息香酸ナトリウム、Ｌ−アラビノース、緩下剤、抗生物質、フェニル酢酸塩およびフェニル酪酸塩の少なくとも１つと組み合わせたオルニチン、またはそれらの任意の組み合わせを含む、上記［３］に記載の方法。
［５］
前記アンモニア降下剤が、フェニル酢酸塩およびフェニル酪酸塩の少なくとも１つと組み合わせたオルニチンを含む、上記［３］に記載の方法。
［６］
前記オルニチンならびにフェニル酢酸塩およびフェニル酪酸塩の少なくとも１つの個々の医薬として許容される塩が前記対象に投与される、上記［５］に記載の方法。
［７］
フェニル酢酸塩およびフェニル酪酸塩の少なくとも１つが、フェニル酢酸ナトリウムまたはフェニル酪酸ナトリウムとして投与される、上記［６］に記載の方法。
［８］
前記オルニチンが、遊離単量体アミノ酸またはその生理学的に許容される塩として投与される、上記［５］に記載の方法。
［９］
前記オルニチンおよびフェニル酢酸塩が、オルニチンフェニル酢酸として投与される、上記［５］に記載の方法。
［１０］
前記投与が、経口、静脈内、腹腔内、胃内、または血管内投与である、上記［３］から［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］
前記投与が静脈内投与である、上記［１０］に記載の方法。
［１２］
前記投与が経口投与である、上記［１０］に記載の方法。
［１３］
前記ＨＳＣ活性化関連疾患が、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である、上記［１］から［１２］に記載の方法。
［１４］
前記ＮＡＦＬＤが非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である、上記［１３］に記載の方法。
［１５］
前記ＮＡＦＬＤが脂肪症である、上記［１３］に記載の方法。
［１６］
前記ＨＳＣ活性化関連疾患が肝臓がんである、上記［１］から［１２］に記載の方法。
［１７］
前記ＨＳＣ活性化関連疾患が線維性状態である、上記［１］から［１２］に記載の方法。
［１８］
前記線維性状態が肝臓線維症である、上記［１７］に記載の方法。
［１９］
前記対象が非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）に罹患している、上記［１６］から［１８］のいずれかに記載の方法。
［２０］
非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を予防する方法であって、それを必要とする対象に対してアンモニア降下療法を実施することを含む方法。
［２１］
アンモニア降下療法を実施することが、前記対象にアンモニア降下剤を投与することを含む、上記［２０］に記載の方法。
［２２］
前記ＮＡＦＬＤが非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である、上記［２０］または［２１］に記載の方法。
［２３］
前記ＮＡＦＬＤが脂肪症である、上記［２０］または［２１］に記載の方法。
［２４］
前記アンモニア降下剤が、リン酸マグネシウム生成物（ＭＧＰ）、グリセロールフェニル酪酸（ＧＰＢ）、フェニル酢酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム（ＮａＰＢＡ）、グルタミン、安息香酸ナトリウム、Ｌ−アラビノース、緩下剤、抗生物質、フェニル酢酸塩およびフェニル酪酸塩の少なくとも１つと組み合わせたオルニチン、またはそれらの任意の組み合わせを含む、上記［２１］から［２３］のいずれかに記載の方法。
［２５］
前記アンモニア降下剤が、フェニル酢酸塩およびフェニル酪酸塩の少なくとも１つと組み合わせたオルニチンを含む、上記［２４］に記載の方法。
［２６］
前記オルニチンならびにフェニル酢酸塩およびフェニル酪酸塩の少なくとも１つの個々の医薬として許容される塩が前記対象に投与される、上記［２５］に記載の方法。
［２７］
フェニル酢酸塩およびフェニル酪酸塩の少なくとも１つが、フェニル酢酸ナトリウムまたはフェニル酪酸ナトリウムとして投与される、上記［２６］に記載の方法。
［２８］
前記オルニチンが、遊離単量体アミノ酸またはその生理学的に許容される塩として投与される、上記［２５］に記載の方法。
［２９］
前記オルニチンおよびフェニル酢酸塩が、オルニチンフェニル酢酸として投与される、上記［２５］に記載の方法。
［３０］
前記投与が、経口、静脈内、腹腔内、胃内、または血管内投与である、上記［２１］から［２９］のいずれかに記載の方法。
［３１］
前記投与が静脈内投与である、上記［３０］に記載の方法。
［３２］
前記投与が経口投与である、上記［３０］に記載の方法。
【図１−１】
0006797117.tif 000003
【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
0006797117.tif 000006
【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図３−１】
0006797117.tif 000011
【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
0006797117.tif 000019
【図７】
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【図８】
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