(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸相互作用複合体のアゴニストのコロナを含むナノスケール構築物であって、ここで、核酸相互作用複合体のアゴニストが、配列番号３０を含む免疫刺激性オリゴヌクレオチドであり、ここで、核酸相互作用複合体のアゴニストの表面密度が少なくとも０．３ｐｍｏｌ／ｃｍ２であり、ここで、ナノスケール構築物の直径が１ｎｍ〜４０ｎｍであり、および、ここで、アゴニストが、スペーサーを含み、スペーサーは、オリゴエチレンを含み、スペーサーは、オリゴヌクレオチドを含まない、前記ナノスケール構築物。 
【請求項２】
オリゴエチレンが、ヘキサエチレングリコールである、請求項１に記載のナノスケール構築物。 
【請求項３】
コロナに組み込まれた抗原を含み、抗原の表面密度が少なくとも０．３ｐｍｏｌ／ｃｍ２である、請求項１または２に記載のナノスケール構築物。 
【請求項４】
コロナの中心に金属であるナノ粒子コアを含み、ここで、金属コアが、金、銀、白金、アルミニウム、パラジウム、銅、コバルト、インジウム、ニッケルおよびそれらの混合物からなる群から任意に選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のナノスケール構築物。 
【請求項５】
コロナの中心に金属ではないナノ粒子コアを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のナノスケール構築物。 
【請求項６】
ナノスケール構築物が分解性である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のナノスケール構築物。 
【請求項７】
ナノスケール構築物の直径が、１ｎｍ〜３０ｎｍ、または１ｎｍ〜２０ｎｍである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のナノスケール構築物。 
【請求項８】
コロナが球状コロナである、請求項１〜７のいずれか一項に記載のナノスケール構築物。 
【請求項９】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、３’末端でリンカーにコンジュゲートしている、請求項１〜８のいずれか一項に記載のナノスケール構築物。 
【請求項１０】
コロナが、幾何学的な位置に配置されてナノ粒子コアの周りに球状の形状を形成している核酸分子から構成される外側シェルである、請求項１〜９のいずれか一項に記載のナノスケール構築物。 
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のナノスケール構築物および担体を含む、ワクチン。
【請求項１２】
治療剤を細胞に送達することにおける使用のための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のナノスケール構築物。 
【請求項１３】
感染症、がん、自己免疫疾患、アレルギー、またはアレルギー性疾患を処置することにおける使用のための、免疫応答を刺激する有効量で対象に投与される、請求項１〜１０および１２のいずれか一項に記載のナノスケール構築物を含む、組成物。 
【請求項１４】
対象において免疫応答を誘導することにおける使用のための、請求項１〜１０および１２のいずれか一項に記載のナノスケール構築物を含む組成物、または、請求項１１に記載のワクチンであって、ここで、当該組成物またはワクチンが、免疫応答を刺激する有効量で対象に投与される、前記組成物またはワクチン。
【請求項１５】
がんが、胆道がん、脳のがん、乳がん、子宮頸がん、絨毛癌、結腸がん、子宮体がん、食道がん、胃がん、上皮内新生物、リンパ腫、肝臓がん、肺がん、皮膚がん、口腔がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、直腸がん、精巣がん、甲状腺がん、または腎臓がんである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
がんが、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、メラノーマ、ヘアリー細胞白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚Ｔ細胞白血病、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、扁平上皮癌、または膀胱細胞癌である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１７】
がんが、神経芽細胞腫、肉腫、または上皮内新生物である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１８】
ナノスケール構築物が、経口、非経口、筋肉内、静脈内、皮下、粘膜、鼻腔内、舌下、気管内、吸入、眼、膣、経皮、直腸、および直接注入から選択される経路により対象へ投与される、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
ナノスケール構築物が、１以上のがん細胞への直接注入によって対象へ投与される、請求項１３および１５〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
ナノスケール構築物が、治療用または診断用抗体と組み合わせて対象へ投与される、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、35 U.S.C. § 119(e)の下で、２０１３年７月２５日に出願された米国仮出願第61/858,558号、名称「SPHERICAL NUCLEIC ACID-BASED CONSTRUCTS AS IMMUNOSTIMULATORY AGENTS FOR PROPHYLACTIC AND THERAPEUTIC USE（予防的および治療的使用のための免疫刺激剤としての球状の核酸ベース構築物）」の優先権を主張し、この仮出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ＴＬＲのアゴニストなどの核酸相互作用複合体のアゴニストのナノスケール構築物、ならびにそれらの方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
免疫系は、病原体および老化または悪性の宿主細胞を含む、異物、有害物および不要物質を取り除くための、高度に進化した極めて精密な内因性のメカニズムである。治療的または予防的目的のための免疫系の調節は、特定の免疫細胞の活性を調節する化合物の導入により可能であることが知られている。主な例はワクチンであり、これは病原体およびがん細胞に対する防御を誘導する能力を示す。最初の近代的なワクチン製剤は、生きている／弱毒化または不活化病原体を含有したが、これらは多くの場合、毒性が強すぎるとみなされるか、または防御免疫を提供しなかった。精製したタンパク質誘導体および他の抗原性サブユニットワクチン戦略が追求されたが、これらは一般に、軽度に予防的または非効率的な応答をもたらす。現在有効な免疫はほとんどの場合において、免疫刺激性化合物の使用が必要であることが知られていることが理解されており、該免疫刺激性化合物は特に、細胞媒介性免疫および免疫学的記憶を含む、より堅牢で特異的で長く続く応答を誘導するために必要な信号を提供する。これらの応答の性質は、導入される免疫刺激性化合物（複数可）の種類によって調節することができる。実際、適切な抗原刺激の存在下で一緒に投与される免疫刺激性化合物を使用して、感染症およびがんを含む様々な病気を処置または予防する潜在能力により、多様な免疫応答の誘発が可能であると考えられている。これらはまた、子供や老人などの免疫不全の集団のワクチン接種にも、使用できる可能性がある１。
【０００４】
既存のワクチンは、ＡＩＤＳ、マラリア、クラミジア、様々な悪性腫瘍、およびアレルギーまたは喘息等のアレルギー性疾患などの、重要で世界的影響力を持つ様々な疾患において、効果的な免疫応答を誘導することができない。開発されている免疫刺激性化合物の中で、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）のアゴニストは、優れた可能性を実証した。モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）などのＴＬＲ４のアゴニストは、様々な国でいくつかの例において、臨床試験の後期段階および承認に達している２。これらの有望な結果にもかかわらず、細胞内の病原体およびがんを取り除くことができる応答を、安全かつ効果的に誘導可能な化合物、例えば細胞媒介性免疫の誘導因子などに対する、明確かつ著しい需要が依然として存在する。ＴＬＲ３、ＴＬＲ７／８およびＴＬＲ９のアゴニストは、Ｔｈ１細胞媒介性免疫応答を誘導するその強力な能力のため、優れた可能性を有する。合成ＴＬＲ７／８アゴニスト、イミキモドは、表在癌および性器いぼを含む様々な皮膚疾患の処置のために承認されており、様々な他の適応症に対して開発されつつある。同様に、ＴＬＲ９のアゴニストは、多くの満たされない医療ニーズを有する様々な疾患の処置のために、臨床開発の様々な段階にある。しかし、有効性の欠如に起因する問題、的外れのホスホロチオエート効果、および毒性が、ＴＬＲ７／８およびＴＬＲ９アゴニストの効果的な臨床的トランスレーションを遅延させてきた。
【発明の概要】
【０００５】
本明細書に記載されるのは、ナノスケール構築物を使用した、免疫応答を増強し、ＴＬＲなどの核酸相互作用複合体を活性化するための、新規な方法および組成物である。本発明の側面は、核酸相互作用複合体のアゴニストのコロナを含み、ここで核酸相互作用複合体の前記アゴニストの表面密度が少なくとも０．３ｐｍｏｌ／ｃｍ２である、ナノスケール構築物に関する。
他の側面において、本発明は、核酸相互作用複合体のアゴニストのコロナ、および該コロナに組み込まれた抗原を含む、ナノスケール構築物である。いくつかの態様において、抗原の表面密度は、少なくとも０．３ｐｍｏｌ／ｃｍ２である。他の態様において、抗原は、少なくとも２つの異なる種類の抗原を含む。
さらに他の側面において、本発明は、核酸相互作用複合体の少なくとも２種のアゴニストが組み込まれたコロナを含み、ここで前記アゴニストが、ＴＬＲ３、７／８、および／または９アゴニストからなる群から選択される、ナノスケール構築物である。
いくつかの態様において、核酸相互作用複合体のアゴニストは、スペーサーを含む。
【０００６】
他の態様において、核酸相互作用複合体のアゴニストは、ＲＮＡまたはＤＮＡである。核酸相互作用複合体のアゴニストは、例えば、ポリ（Ｉ：Ｃ）などの二本鎖ＲＮＡであってよい。代替的に、核酸相互作用複合体のアゴニストは、ＵＵＧモチーフを含むＲＮＡなどの、一本鎖ＲＮＡであってもよい。いくつかの態様において、核酸相互作用複合体のアゴニストは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドなどの、非メチル化デオキシリボ核酸である。
ナノスケール構築物は、いくつかの態様において、任意に金属である、コロナの中心におけるナノ粒子コアを含む。金属コアは、金、銀、白金、アルミニウム、パラジウム、銅、コバルト、インジウム、ニッケル、およびそれらの混合物からなる群から選択することができる。いくつかの態様において、ナノ粒子コアは、金を含む。他の態様において、ナノスケール構築物は分解性である。
【０００７】
特定の態様において、ナノスケールの構築物の直径は、平均直径で１ｎｍ〜約２５０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約２４０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約２３０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約２２０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約２１０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約２００ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約１９０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約１８０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約１７０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約１６０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約１５０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約１４０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約１３０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約１２０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約１１０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約９０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約８０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約７０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約６０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約５０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約４０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約３０ｎｍ、または平均直径で約１ｎｍ〜約２０ｎｍ、または平均直径で約１ｎｍ〜約１０ｎｍである。
【０００８】
他の側面において、本発明は、核酸相互作用複合体のアゴニストのコロナのナノスケール構築物であり、ここで前記アゴニストは、少なくとも１つのホスホジエステルヌクレオチド間結合を有する核酸である。いくつかの態様において、アゴニストは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドである。他の態様において、核酸のそれぞれのヌクレオチド間結合は、ホスホジエステル結合である。
本発明の態様において、コロナは球状コロナである。
本明細書に記載のナノスケール構築物および担体から構成されるワクチンが、本発明の他の側面により提供される。
本発明のナノスケール構築物を細胞に送達することによる、治療剤を細胞に送達する方法が、他の側面において提供される。
標的分子の発現を調節するための方法が、本発明の他の側面において提供される。方法は、本発明のナノスケール構築物を細胞に送達することを含む。いくつかの態様において、標的分子は、ＴＬＲ３、７、８、および９からなる群から選択されるＴＬＲである。
【０００９】
本明細書に記載のナノスケール構築物を細胞に送達することにより、ＴＬＲを活性化するための方法が、本発明の他の側面において提供される。
他の側面によれば、本発明は、対象を処置する方法であって、該対象に対して、本明細書に記載のナノスケール構築物を、免疫応答を刺激する有効量で投与することを含む、前記方法である。いくつかの態様において、対象は、感染症、がん、自己免疫疾患、アレルギー、または喘息などのアレルギー性疾患を有する。
さらに他の態様において、本発明は、対象に対して、核酸相互作用複合体のアゴニストのコロナのナノスケール構築物を投与することにより、対象に免疫応答を誘導する方法であって、ここで前記アゴニストは、少なくとも１つのホスホジエステルヌクレオチド間結合を免疫応答を刺激する有効量で有する核酸である、前記方法である。
特定の態様において、方法は、治療または検出モダリティを細胞に送達することを含む。
【００１０】
本発明のさらなる側面は、以下を含むキットに関する：任意にナノ粒子コアを含み；核酸相互作用複合体のアゴニストを有する、ナノスケール構築物、および核酸相互作用複合体コロナのアゴニストの組み立てのための指示書。特定の態様において、キットはさらに使用のための指示書を含む。
本発明の限定の各々は、本発明の種々の態様を包含することができる。したがって、任意の１つの要素または要素の組み合わせを含む本発明の限定の各々は、本発明の各側面に含まれ得ることが予想される。本発明はその用途において、以下の説明に記載されまたは図面に示された要素の構成および配置の詳細に限定されない。本発明は、他の態様で、および様々な方法で、実践または実施可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
添付の図面は、縮尺通りに描かれることを意図していない。図面において、様々な図に示される同一またはほぼ同一のそれぞれの要素は、同様の数字によって表される。明確化のため、すべての要素がすべての図面においてラベル付けされるわけではない。図面において：
【図１】図１Ａ−１Ｂは、本発明のナノスケール構築物の概略の非限定的な例を示す図である。Ａ．コアおよび、これに結合した、１または２以上の、ＴＬＲアゴニストなどの核酸相互作用複合体のアゴニストを有する、アジュバントナノスケール構築物の一般的構造を示す図である。Ｂ．コアおよび、これに結合した、１または２以上のＴＬＲアゴニストおよび１または２以上の抗原を有する、アジュバントナノスケール構築物の一般的構造を示す図である。
【図２】図２は、溶液中の核酸相互作用複合体のアゴニスト（ＣｐＧオリゴヌクレオチド）に対する、本発明のナノスケール構築物の、マクロファージにおける著しく強化された効力を示す一組のグラフである。
【００１２】
【図３】図３は、一晩のインキュベーション後の、溶液中の核酸相互作用複合体のアゴニスト（ＣｐＧオリゴヌクレオチド）に対する、本発明のナノスケール構築物の、マクロファージにおける著しく強化された効力を示す一組のグラフである。
【図４】図４は、溶液中の核酸相互作用複合体のアゴニスト（ＣｐＧオリゴヌクレオチド）に対する、本発明のナノスケール構築物による、サイトカイン分泌の強化されたレベルを示す一組のグラフである。サイトカイン誘導に及ぼす効果は、ナノスケール構築物およびＴＲＬアゴニスト群の両方において、ホスホジエステルおよびホスホロチオエート結合を有する両方のオリゴヌクレオチドについて試験した。
【図５】図５は、溶液中のホスホジエステルＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびホスホロチオエートＣｐＧオリゴヌクレオチドと比較した、ホスホジエステルＣｐＧオリゴヌクレオチドを有する本発明のナノスケール構築物での刺激に応答した、ＴＬＲ９活性化を示す折れ線グラフおよび棒グラフの図である。
【００１３】
【図６】図６は、いくつかの異なるＣｐＧオリゴヌクレオチド配列に対する、本発明のナノスケール構築物の効力の複数倍の増加を示す一組のグラフである。ＣｐＧ１８２６は配列番号１であり、その下のｒｐｌＶは配列番号２である。ＣｐＧ１６６８は配列番号３であり、その下のｒｐｌＶは配列番号４である。
【図７】図７は、ナノスケール構築物のコアサイズの調節の、アゴニスト活性の増強に対する効果を示す一組のグラフである。
【図８】図８は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドよりも迅速かつ持続的な活性化を示すグラフである。
【図９】図９は、ホスホロチオエート修飾の、配列依存的にアゴニスト活性を調節する能力を示す一組のグラフである。ＣｐＧ１６６８について：ＰＯは配列番号５、Ｃ＊Ｇは配列番号６、５ＰＳ２／Ｃ＊Ｇは配列番号７、およびＰＳは配列番号８である。ＣｐＧ１８２６について：ＰＯは配列番号９、Ｃ＊Ｇは配列番号１０、５ＰＳ２／Ｃ＊Ｇは配列番号１１、およびＰＳは配列番号１２である。
【００１４】
【図１０】図１０は、オリゴヌクレオチド負荷密度の、アゴニスト活性に影響を及ぼす能力を示す一組のグラフである。
【図１１】図１１は、ＣｐＧ ＰＯ／ＰＯナノスケール構築物の活性化の時間経過を示すグラフである。試験された構築物は、インキュベーションの＞４ｈｒまで活性化されない。
【図１２】図１２は、５’Ｃｈｏｌ ＣｐＧ ＰＯナノスケール構築物が低ｎＭ範囲で活性化を示し、５’Ｃ１８が活性を阻害したことを示すグラフである。
【図１３】図１３は、前プレーティングされたマクロファージが、その後の活性化に対してより準備していることを実証する、一組のグラフである。
【図１４】図１４は、マクロファージによる、低レベルのＩＦＮ−γ分泌を実証する一組のグラフである。
【図１５】図１５は、免疫治療用ＳＮＡ（ＡＳＴ−００８）を示す図である。図６は、ＳＮＡが、単一のナノ粒子上に治療ワクチン抗原とアジュバントを共に存在させることができ、かつ同時に複数の免疫刺激性受容体（例えば、ＴＬＲ３、４、７／８、９）を標的とし得ることを示す。
【００１５】
【図１６】図１６は、ＡＳＴ−００８が如何にして、誘発されたエンドサイトーシスを介してエンドソームに入ることができ、そこで汎用性の免疫系刺激のために使用することができるかを示す、概略図である。エンドソーム内でＡＳＴ−００８は、ＳＮＡ療法のための分子標的であるＴＬＲ９受容体を介して免疫系シグナル伝達を刺激し、先天性および適応免疫応答の両方をもたらす。ＡＳＴ−００８はまた、ＴＬＲ３、４、７／８も標的として、先天性および適応免疫応答をもたらすことができる。
【図１７】図１７Ａおよび１７Ｂは、ＡＳＴ−００８が、in vitroで、対応するＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（オリゴ）よりも、高い炎症誘発応答を誘導することを示す一組のグラフである。図１７Ａは、ＣＴＬオリゴ、ＣＴＬ ＳＮＡ、ＣｐＧ １８２６およびＡＳＴ−００８により誘導されるＴＮＦ、ＩＬ−１２、およびＩＬ−６の発現レベルを示す。図１７Ｂは、示された薬剤に起因するＮＦ−ＫＢ活性化を示す。
【００１６】
【図１８】図１８は、ＡＳＴ−００８が、単回皮下用量の投与後に、流入領域リンパ節を標的とすることを示す図である。ＡＳＴ−００８は金コアの光散乱を増強するために銀染色され、その後エオシンで対比染色された。４×の明視野倍率を使用した。
【図１９】図１９は、ＡＳＴ−００８のin vivo活性を示すグラフである。マウスは、５．１ｎｍｏｌ溶液（ＡＳＴ−００８−ｐｏ、ＡＳＴ−００８−ｐｓ、ＣｐＧ １８２６−ｐｏ、ＣｐＧ １８２６−ｐｓ、ＧｐＣ−ｐｏ ＳＮＡ、ＧｐＣ−ｐｓ ＳＮＡ、ＧｐＣ−ｐｏ、またはＧｐＣ−ｐｓ）の５０μＬのボーラス尾静脈（静脈内）注射を受け、次いで注射の１、３および６時間後にＩＬ−１２発現について分析した（１群あたり２４匹のマウス、各時点について３匹）。ＩＬ−１２レベルは、ＰＢＳに対する倍数として表示される。ＡＳＴ−００８構築物（architecture）は、ＩＬ−１２の誘導を、遊離のオリゴデオキシヌクレオチドに対して約２０倍強化し、その効果は、最初の投与後６時間以上持続した。
【００１７】
【図２０】図２０Ａ−２０Ｃは、ＡＳＴ−００８が、バランスのとれたＴｈ１／Ｔｈ２応答（図２０Ａ）および、ミョウバン（alum）またはＣｐＧオリゴヌクレオチドよりも高いＩｇＧ２ａ抗体（図２０Ｂ）応答の両方を誘導することを実証する、一対のグラフおよびチャートから構成される。結果を図２０Ｃにまとめる。＊＊Ｐ＜０．０１。
【図２１】図２１Ａ−２１Ｂは、ＡＳＴ−００８が、ミョウバンまたはＣｐＧオリゴヌクレオチドよりも効果的に細胞応答を誘導することを示す図である。図２１Ａは、プロトコルの概略図を示す：脾細胞は２８日間増殖させ、０日目と２１日目にチャレンジし、その後SIINFEKLで再刺激し、２８日目に、ELISPOTでＩＮＦ−γについてプローブした。図２１Ｂは、結果を表すグラフである。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【００１８】
【図２２】図２２Ａ−２２Ｂは、ＡＳＴ−００８が、in vivoのリンパ腫モデルにおいて、腫瘍を取り除く強い免疫応答を誘導することを実証する図である。図２２Ａはプロトコルを示す：C57BL/6マウスの右脇腹に１×１０６のＥ．Ｇ７−ＯＶＡリンパ腫を注射した（１群あたり１１匹）。次いで、マウスを１００μｇのＯＶＡｓ．ｃ．、１．８μｇのＯＶＡ２５７−２６４ｓ．ｃ．、およびＡＳＴ−００８中０．９２ｎｍｏｌのオリゴで３回チャレンジし、２０００ｍｍ３で屠殺した。図２２Ｂは、結果のグラフである。２要因ＡＮＯＶＡを使用し、＊Ｐ＜０．０５。
【図２３】図２３Ａ−２３Ｂは、ＡＳＴ−００８が、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドより優れた抗腫瘍活性およびより長い生存期間を示すことを表す図である。グラフは、C57BL/6マウスの右脇腹に１×１０６のＥ．Ｇ７−ＯＶＡリンパ腫を注射し（１群あたり１１匹）、次いで、ＰＢＳ、ＰＢＳとＯＶＡ、ＣｐＧ１８２６とＯＶＡ、またはＡＳＴ−００８とＯＶＡで３回チャレンジした後の、腫瘍体積（図２３Ａ）および生存率％（図２３Ｂ）を示す。＊Ｐ＜０．０５。
【００１９】
詳細な説明
本発明は、その用途において、以下の説明に記載または図面に示された、要素の構成および配置の詳細に限定されない。本発明は他の態様が可能であり、様々な方法で実践または実施可能である。また、本明細書で使用される表現および用語は説明のためであり、限定とみなされるべきではない。本明細書における「含む（including）」、「含む（comprising）」、または「有する」、「含有する」、「関与する」、およびそれらの変形の使用は、その後に列挙される項目およびその均等物ならびに追加の項目を包含することを意味する。
【００２０】
本発明は、いくつかの側面において、特に様々なアジュバントおよび抗原を含有する構造の、より速い活性化を実現する、多価構造を作製する、細胞内分布を変化させる、および簡単かつ拡大縮小可能な合成を促進することによって、従来のＴＬＲ３、ＴＬＲ７／８、およびＴＬＲ９アゴニストが遭遇するいくつかの主要なハードルを克服する。本発明の構築物は、多種多様な疾患／感染症の処置における予防的または治療的使用のための、より効果的なワクチンをもたらし、ここで前記疾患／感染症の例としては、特に以下が挙げられる：ＡＩＤＳ、マラリア、クラミジア、カンピロバクター、サイトメガロウイルス、デング熱、エプスタイン・バール単核球症、口蹄疫、狂犬病、ヘリコバクター・ピロリ菌胃潰瘍、Ａ、Ｂ、Ｃ型肝炎、単純ヘルペス、インフルエンザ、リーシュマニア症、コレラ、ジフテリア、ヘモフィルス・インフルエンザ、髄膜炎菌性髄膜炎、ペスト、肺炎球菌性肺炎、破傷風、腸チフス、呼吸器合胞体（ＲＳ）ウイルス、ライノウイルス、住血吸虫症、赤痢菌、連鎖球菌群ＡおよびＢ、結核、コレラ菌、サルモネラ菌、アスペルギルス、ブラストミセス、ヒストプラズマ、カンジダ、クリプトコッカス、ニューモシスチス、および尿路感染症；様々な食物アレルギー、例えば落花生、果物、ニンニク、オート麦、肉、乳、魚、貝、大豆、木のナッツ、小麦、グルテン、卵、亜硫酸塩；様々な薬物アレルギー、例えばテトラサイクリン、ジランチン、カルバマゼピン、ペニシリン、セファロスポリン、スルホンアミド、ＮＳＡＩＤ、静脈造影剤、局所麻酔薬に対するもの；自己免疫疾患、例えば多発性硬化症、狼瘡、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、喘息、およびＣＯＰＤ；およびがん、例えばメラノーマ、乳がん、前立腺がん、膀胱がん、ＮＳＣＬＣ、多形膠芽細胞腫など。
【００２１】
本発明の例示的な一組のナノスケール構築物を、図１の概略図に示す。本明細書に記載のプラットフォームは、核酸相互作用複合体の１または複数のアゴニスト（Ａ）、または核酸相互作用複合体の１または複数のアゴニストおよび抗原（Ｂ）、を負荷するのに有用である。以下の最適化：（１）標的化される、ＴＬＲなど（ＴＬＲ３、７／８、および／または９）の核酸相互作用複合体、（２）核酸相互作用複合体のアゴニストの密度、（３）抗原密度、（４）複数の抗原提示、（５）コアの組成、サイズ、および電荷、および（６）コアリンカーの化学的性質「Ｌ」、および（７）アゴニスト化学構造、は、ワクチン開発において新規なパラダイムをもたらすことが期待される。特に、核酸相互作用複合体のアゴニストは、二本鎖ＲＮＡ（例えば、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ＴＬＲ３）、一本鎖ＲＮＡ（例えば、ＵＧＧモチーフを含む鎖、ＴＬＲ７／８）、および非メチル化デオキシリボ核酸および誘導体（例えば、ＣｐＧモチーフを含有する鎖）を含む。
【００２２】
本発明の側面は、ナノスケール構築物に関する。ナノスケール構築物とは、幾何学的な位置に保持された１または２以上の核酸を有する、ナノメートルサイズの構築物を意味する。ナノスケール構築物は、典型的には、一組の核酸のコロナとして言及される。コロナは、本明細書において、核酸分子からなる外側シェルを指す。コロナは、核酸または金属等の他の材料から構成される、ナノ粒子コアを有していてもよい。代替的に、コロナは単純に、中空コアを有する幾何学的形状に配置された一組の核酸、すなわち、核酸の３次元形状の層であってもよい。典型的には、常にではないが、コロナは球状の形状を有する。
コロナがナノ粒子コアを含む場合の例では、核酸は、コアに直接連結することができる。核酸の一部またはすべては、共有結合または非共有結合を介して直接または間接的に、他の核酸に連結することができる。１つの核酸の別の核酸に対する結合は、その核酸のコアへの連結に加えて、またはその代替としてであってよい。１または２以上の核酸はまた、抗原などの他の分子に連結していてもよい。
【００２３】
コロナがナノ粒子コアを含まない場合、核酸は、共有結合または非共有結合を介して直接または間接的に互いに連結されていてもよい。いくつかの態様において、ナノ粒子コアを含まないコロナは、格子または他の溶解構造に核酸を積層した後、格子または他の構造を溶解して空の中心を生成することにより、形成することができる。
本明細書において、ナノスケール構築物は、ナノメーターのオーダー（すなわち約１ｎｍ〜約１μｍの間）の平均直径を有する構築物である。例えば、ナノ粒子の直径は、平均直径で約１ｎｍ〜約２５０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約２４０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約２３０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約２２０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約２１０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約２００ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約１９０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約１８０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約１７０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約１６０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約１５０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約１４０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約１３０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約１２０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約１１０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約９０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約８０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約７０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約６０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約５０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約４０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約３０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約２０ｎｍ、平均直径で約１ｎｍ〜約１０ｎｍ、平均直径で約５ｎｍ〜約１５０ｎｍ、平均直径で約５〜約５０ｎｍ、平均直径で約１０〜約３０ｎｍ、平均直径で約１０〜約１５０ｎｍ、平均直径で約１０〜約１００ｎｍ、平均直径で約１０〜約５０ｎｍ、平均直径で約３０〜約１００ｎｍ、または平均直径で約４０〜約８０ｎｍである。
【００２４】
いくつかの例において、コロナは、１または２以上の、核酸相互作用複合体のアゴニストおよび／または抗原に付着したナノ粒子コアを含む。本明細書で使用される場合、ナノ粒子コアは、付着したモダリティなしの、ナノ粒子構築物のナノ粒子成分を意味する。いくつかの例において、ナノ粒子コアは、金属である。ナノ粒子コアは、任意の金属を含み得ることが理解されるべきである。金属のいくつかの非限定的な例としては、金、銀、白金、アルミニウム、パラジウム、銅、コバルト、インジウム、ニッケル、およびそれらの混合物が挙げられる。いくつかの態様において、ナノ粒子コアは金を含む。例えば、ナノ粒子コアは、分解できる金を含む格子構造とすることができる。ナノ粒子はまた、半導体および磁性材料を含むこともできる。
【００２５】
本発明の側面に適合するナノ粒子の非限定的な例は、以下に記載されており、また以下から参照により組み込まれる：米国特許第7,238,472号、米国特許公開第2003/0147966号、米国特許公開第2008/0306016号、米国特許公開第2009/0209629号、米国特許公開第2010/0136682号、米国特許公開第2010/0184844号、米国特許公開第2010/0294952号、米国特許公開第2010/0129808号、米国特許公開第2010/0233270号、米国特許公開第2011/0111974号、ＰＣＴ公開第WO 2002/096262号、ＰＣＴ公開第WO 2003/08539号、ＰＣＴ公開第WO 2006/138145号、ＰＣＴ公開第WO 2008/127789号、ＰＣＴ公開第WO 2008/098248号、ＰＣＴ公開第WO 2011/079290号、ＰＣＴ公開第WO 2011/053940号、ＰＣＴ公開第WO 2011/017690号およびＰＣＴ公開第WO 2011/017456号。本発明に関連するナノ粒子は、当該技術分野で知られている任意の手段に従って合成することができ、または商業的に入手することができる。例えば、ナノ粒子の商業的供給業者のいくつかの非限定的な例としては、Ted Pella, Inc., Redding, CA、Nanoprobes, Inc., Yaphank, NY、Vacuum Metallurgical Co,. Ltd., Chiba, JapanおよびVector Laboratories, Inc., Burlington, CAが挙げられる。
【００２６】
核酸相互作用複合体のアゴニスト
本明細書中で使用される核酸相互作用複合体は、核酸分子と相互作用し、その相互作用に応答して免疫応答を生成するように刺激される、分子または分子複合体を指す。分子または分子複合体は、例えば、受容体であってもよい。いくつかの態様において、核酸相互作用複合体は、パターン認識受容体（ＰＲＲ）複合体である。ＰＲＲは、先天性免疫系の細胞によって発現されて病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を識別するタンパク質からなる、免疫系の原始的な部分であり、これは、微生物病原体または細胞ストレス、並びに、細胞損傷の間に放出される細胞成分に関連する、ダメージ関連分子パターン（ＤＡＭＰ）に関連付けられている。ＰＲＲとしては、限定はされないが、膜結合ＰＲＲ、例えば受容体キナーゼ、トール様受容体（ＴＬＲ）、およびＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）（マンノース受容体およびアシアロ糖タンパク質受容体）など；細胞質ＰＲＲ、例えばＲＩＧ−Ｉ様受容体（ＲＬＲ）、ＲＮＡヘリカーゼ、植物ＰＲＲ、およびＮｏｎＲＤキナーゼ；および分泌ＰＲＲを含む。
【００２７】
核酸相互作用複合体としては、限定はされないが、ＴＬＲ、ＲＩＧ−Ｉ、転写因子、細胞翻訳機構、細胞転写機構、核酸作用酵素、および核酸関連自己抗原を含む。核酸相互作用複合体のアゴニストである核酸分子としては、限定はされないが、ＴＬＲアゴニスト、および、ＲＩＧ−Ｉ、転写因子、細胞翻訳機構、細胞転写機構、核酸作用酵素、および核酸関連自己抗原のアゴニストを含む。
いくつかの態様において、核酸相互作用複合体のアゴニストはＴＬＲアゴニストである。本明細書において、ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲと相互作用してその活性を刺激する、核酸分子である。
【００２８】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、哺乳動物の先天性免疫において重要な役割を果たす、高度に保存されたポリペプチドのファミリーである。少なくとも１０のファミリーメンバーが、ＴＬＲ１〜ＴＬＲ１０と指定されて同定されている。種々のＴＬＲの細胞質ドメインは、Ｔｏｌｌ−インターロイキン１（ＩＬ−１）受容体（ＴＩＲ）ドメインによって特徴付けられる。Medzhitov R et al.  (1998) Mol Cell 2:253-8。ＴＬＲによる微生物侵入の認識は、ショウジョウバエと哺乳類で進化的に保存されているシグナル伝達カスケードの活性化を引き起こす。ＴＩＲドメイン含有アダプタータンパク質ＭｙＤ８８は、ＴＬＲと関連して、ＩＬ−１受容体関連キナーゼ（ＩＲＡＫ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）を、ＴＬＲへ動員することが報告されている。ＭｙＤ８８依存性シグナル伝達経路は、ＮＦ−κＢ転写因子およびｃ−Ｊｕｎ ＮＨ２末端キナーゼ（Ｊｎｋ）、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化、すなわち免疫活性化および炎症性サイトカインの産生における重要なステップの活性化を導くと考えられている。総説については、Aderem A et al. (2000) Nature 406:782-87を参照。
【００２９】
ＴＬＲは、種々の組織および様々な種類の免疫細胞において特異的に発現されると考えられている。例えば、ヒトＴＬＲ７は、胎盤、肺、脾臓、リンパ節、扁桃腺、および形質細胞様前駆樹状細胞（ｐＤＣ）で発現されることが報告されている。Chuang T-H et al. (2000) Eur Cytokine Netw 11:372-8)；Kadowaki N et al. (2001) J Exp Med 194:863-9。ヒトＴＬＲ８は、肺、末梢血白血球（ＰＢＬ）、胎盤、脾臓、リンパ節、および単球で発現することが報告されている。Kadowaki N et al. (2001) J Exp Med 194:863-9；Chuang T-H et al. (2000) Eur Cytokine Netw 11:372-8。ヒトＴＬＲ９は、脾臓、リンパ節、骨髄、ＰＢＬ、およびｐＤＣおよびＢ細胞上で発現されると報告されている。Kadowaki N et al. (2001) J Exp Med 194:863-9；Bauer S et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:9237-42；Chuang T-H et al. (2000) Eur Cytokine Netw 11:372-8。
ヒトおよびマウスのＴＬＲ７のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は知られている。例えば、GenBank受託番号AF240467、AF245702、NM_016562、AF334942、NM_133211；およびAAF60188、AAF78035、NP_057646、AAL73191およびAAL73192を参照、これらの全内容は参照により本明細書に組み込まれる。ヒトＴＬＲ７は１０４９アミノ酸長であると報告されている。マウスＴＬＲ７は１０５０アミノ酸長であると報告されている。ＴＬＲ７ポリペプチドは、ロイシンリッチリピート領域、膜貫通ドメイン、およびＴＩＲドメインを含む細胞内ドメインを有する、細胞外ドメインを含む。
【００３０】
ヒトおよびマウスのＴＬＲ８のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は知られている。例えば、GenBank受託番号AF246971、AF245703、NM_016610、XM_045706、AY035890、NM_133212；およびAAF64061、AAF78036、NP_057694、XP_045706、AAK62677およびNP_573475を参照、これらの全内容は参照により本明細書に組み込まれる。ヒトＴＬＲ８は、少なくとも２つのアイソフォームで存在することが報告されており、１つは１０４１アミノ酸長であり、他は１０５９アミノ酸長である。マウスＴＬＲ８は１０３２アミノ酸長である。ＴＬＲ８ポリペプチドは、ロイシンリッチリピート領域、膜貫通ドメイン、およびＴＩＲドメインを含む細胞内ドメインを有する、細胞外ドメインを含む。
ヒトおよびマウスのＴＬＲ９のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は知られている。例えば、GenBank受託番号NM_017442、AF259262、AB045180、AF245704、AB045181、AF348140、AF314224、NM_031178；およびNP_059138、AAF72189、BAB19259、AAF78037、BAB19260、AAK29625、AAK28488、およびNP_112455を参照、これらの全内容は参照により本明細書に組み込まれる。ヒトＴＬＲ９は、少なくとも２つのアイソフォームで存在することが報告されており、１つは１０３２アミノ酸長であり、他は１０５５アミノ酸長である。マウスＴＬＲ９は１０３２アミノ酸長である。ＴＬＲ９ポリペプチドは、ロイシンリッチリピート領域、膜貫通ドメイン、およびＴＩＲドメインを含む細胞内ドメインを有する、細胞外ドメインを含む。
【００３１】
本明細書で使用する用語「ＴＬＲシグナル伝達」は、ＴＬＲを介したシグナル伝達に関連する、細胞内シグナル伝達の任意の側面を指す。本明細書で使用する用語「ＴＬＲ媒介性免疫応答」は、ＴＬＲシグナル伝達に関連する免疫応答を指す。
ＴＬＲ７媒介性免疫応答は、ＴＬＲ７シグナル伝達に関連する応答である。ＴＬＲ７媒介性免疫応答は、一般に、ＩＦＮ−αおよび、ＩＰ−１０およびＩ−ＴＡＣなどのＩＦＮ誘導性サイトカインの誘導によって特徴付けられる。ＴＬＲ７媒介性免疫応答において誘導されるサイトカインＩＬ−１α／β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＩＰ−１α／βおよびＭＩＰ−３α／βのレベルは、ＴＬＲ８媒介性免疫応答において誘導されるものよりも低い。
ＴＬＲ８媒介性免疫応答は、ＴＬＲ８シグナル伝達に関連する応答である。この応答はさらに、例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２ｐ４０／７０、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１α／β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＩＰ−１α／βおよびＭＩＰ−３α／βなどの炎症誘発性サイトカインの誘導により、さらに特徴付けられる。
【００３２】
ＴＬＲ９媒介性免疫応答は、ＴＬＲ９シグナル伝達に関連する応答である。この応答はさらに、少なくともＩＦＮ−γとＩＬ−１２の産生／分泌によって特徴付けられるが、ただし、ＴＬＲ８媒介性免疫応答を介して達成されるよりも低いレベルである。
本明細書で使用される場合、「ＴＬＲ７／８アゴニスト」は全体として、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８シグナル伝達を増加させることができる、任意の核酸を意味する（すなわち、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８のアゴニスト）。いくつかのＴＬＲ７／８リガンドは、ＴＬＲ７シグナル伝達のみを誘導し（例えば、ＴＬＲ７特異的アゴニスト）、いくつかはＴＬＲ８シグナル伝達のみを誘導し（例えば、ＴＬＲ８特異的アゴニスト）、他は、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８シグナル伝達の両方を誘導する。
ＴＬＲ７またはＴＬＲ８シグナル伝達のレベルは、シグナル伝達の既存のレベルに対して強化することができるか、またはシグナル伝達のバックグラウンドレベルを超えて誘導することができる。ＴＬＲ７リガンドとしては、限定されないが、Ｃ８置換グアノシンなどのグアノシン類似体、本質的にＧおよびＵからなるリボヌクレオシドの混合物、グアノシンリボヌクレオチドおよびＲＮＡまたはＲＮＡ様分子（PCT/US03/10406）、およびアデノシンベースの化合物（例えば６−アミノ−９−ベンジル−２−（３−ヒドロキシ−プロポキシ）−９Ｈ−プリン−８−オール、およびSumitomoにより作製された類似化合物（例えば、CL-029））が挙げられる。
【００３３】
本明細書で使用する用語「グアノシン類似体」は、グアニン塩基、グアノシンヌクレオシド糖、またはグアニン塩基とグアノシンヌクレオシド糖の両方を含む化学的修飾を有する、グアノシン様ヌクレオチド（グアノシンを除く）を指す。グアノシン類似体は、具体的には、限定することなく、７−デアザ−グアノシンを含む。
グアノシン類似体はさらに以下を含む：Ｃ８置換グアノシン、例えば７−チア−８−オキソグアノシン（イムノシン）、８−メルカプトグアノシン、８−ブロモグアノシン、８−メチルグアノシン、８−オキソ−７，８−ジヒドログアノシン、Ｃ８−アリールアミノ−２’−デオキシグアノシン、Ｃ８−プロピニル−グアノシン；Ｃ８−およびＮ７−置換グアニンリボヌクレオシド、例えば７−アリル−８−オキソグアノシン（ロキソリビン）および７−メチル−８−オキソグアノシン、８−アミノグアノシン、８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン、８−ヒドロキシグアノシン、および７−デアザ８−置換グアノシン。
【００３４】
ＴＬＲ８リガンドは、ＧおよびＵから本質的になるリボヌクレオシド、グアノシンリボヌクレオチドおよびＲＮＡまたはＲＮＡ様分子の混合物を含む（PCT/US03/10406）。追加のＴＬＲ８リガンドは、Gorden et al. J. Immunol. 2005, 174:1259-1268にも開示されている。
本明細書で使用する用語「ＴＬＲ９アゴニスト」は、ＴＬＲ９シグナル伝達を増加させることができる任意の薬剤を意味する（すなわち、ＴＬＲ９のアゴニスト）。ＴＬＲ９アゴニストには、具体的には、限定することなく、免疫刺激性核酸、および特にＣｐＧ免疫刺激性核酸が含まれる。
【００３５】
本明細書で使用する用語「免疫刺激性ＣｐＧ核酸」または「免疫刺激性ＣｐＧオリゴヌクレオチド」は、免疫細胞を活性化することができる任意のＣｐＧ含有核酸を指す。ＣｐＧジヌクレオチドの少なくともＣは、典型的には非メチル化されているが、しかし必ずしもそうではない。免疫刺激性ＣｐＧ核酸は、多くの発行特許および公開特許出願に記載されており、例えば米国特許第6,194,388号；第6,207,646号；第6,218,371号；第6,239,116号；第6,339,068号；第6,406,705号；および第6,429,199号である。
いくつかの態様において、核酸相互作用複合体のアゴニストは、免疫刺激性オリゴヌクレオチドである。本明細書で使用する「免疫刺激性オリゴヌクレオチド」とは、免疫応答を誘導することができる免疫刺激性モチーフまたは骨格を含有する任意の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）である。免疫応答の誘導とは、免疫細胞の数または活性の任意の増加、またはサイトカインなどの免疫因子の発現または絶対レベルの増加を意味する。免疫細胞としては、限定はされないが、ＮＫ細胞、ＣＤ４＋Ｔリンパ球、ＣＤ８＋Ｔリンパ球、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージおよび他の抗原提示細胞を含む。サイトカインとしては、限定はされないが、インターロイキン、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α、βおよびγ、Ｆｌｔリガンド、および共刺激分子を含む。免疫刺激性モチーフとしては、限定はされないが、ＣｐＧモチーフおよびＴリッチモチーフを含む。
【００３６】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドの非限定的な組としては、以下を含む：
【数１】
0006697384.tif 000002
【００３７】
【数２】
0006697384.tif 000003
免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、コアに、またはお互いに、または抗原などの他の分子に、連結することができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、５’末端または３’末端を介してリンカーにコンジュゲートすることができる。例えば、[配列、５’−３’]−リンカーまたはリンカー−[配列、５’−３’]。
【００３８】
用語「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は互換的に使用され、複数のヌクレオチド（すなわち、リン酸基に連結され、置換ピリミジン（例えば、シトシン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ））もしくは置換プリン（例えば、アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ））のいずれかである交換可能な有機塩基に連結された糖（リボースまたはデオキシリボース）を含む分子を意味する。したがって、この用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡオリゴヌクレオチドの両方を包含する。用語はまた、ポリヌクレオシド（すなわち、ポリヌクレオチドからリン酸塩を引いたもの）および任意の他の有機塩基含有ポリマーを含む。オリゴヌクレオチドは、既存の核酸源（例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡ）から得ることができるが、好ましくは合成である（例えば、核酸合成によって産生される）。ナノスケール構築物のポリヌクレオチドであって、任意にナノ粒子コアに付着するものは、一本鎖または二本鎖であることができる。二本鎖ポリヌクレオチドはまた、本明細書において二重鎖とも呼ぶ。本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、２つの別々の相補的な核酸鎖を含むことができる。
【００３９】
本明細書で使用される「二重鎖」は、相補配列が互いに水素結合した、二本鎖核酸分子を含む。相補配列は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むことができる。アンチセンスヌクレオチド配列は、効果的な標的遺伝子の阻害を媒介するために、標的遺伝子に対して同一であるか、または充分に同一であることができる（例えば、少なくとも約９８％同一、９６％同一、９４％、９０％同一、８５％同一、または８０％同一）。
二本鎖ポリヌクレオチドは、その全長にわたって二本鎖であることができ、それがオーバーハングする一本鎖配列を有さず、したがって平滑末端であることを意味する。他の態様において、二本鎖ポリヌクレオチドの二本の鎖は、１または２以上の一本鎖オーバーハングを生成する、異なる長さを有することができる。本発明の二本鎖ポリヌクレオチドは、ミスマッチおよび／またはループまたは膨隆（bulge）を含むことができる。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が、二本鎖である。いくつかの態様において、本発明の二本鎖ポリヌクレオチドは、少なくとも、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５個までの、ミスマッチを含有する。
【００４０】
本発明に関連するポリヌクレオチドは、例えば糖部分、ホスホジエステル結合、および／または塩基などにおいて、修飾することができる。本明細書で使用される「糖部分」は、ペントース、リボースおよびデオキシリボースを含む天然で未修飾の糖、修飾糖および糖類似体を含む。糖部分の修飾は、ヒドロキシル基の、ハロゲン、ヘテロ原子、または脂肪族基による置換を含むことができ、例えば、エーテル、アミンまたはチオールなどの、ヒドロキシル基の官能化を含むことができる。
糖部分の修飾は、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含むことができ、これは「メチル化」と呼ばれる。いくつかの例において、本発明に関連するポリヌクレオチドは、修飾または非修飾の糖部分のみを含んでもよく、一方他の例において、ポリヌクレオチドは、修飾されたいくつかの糖部分および修飾されていないいくつかの糖部分を含む。
【００４１】
いくつかの例において、修飾ヌクレオモノマーは、糖−または骨格−修飾リボヌクレオチドを含む。修飾リボヌクレオチドは、非天然塩基を含むことができ、例えば以下である：５’位で修飾されたウリジンまたはシチジン、例えば５’−（２−アミノ）プロピルウリジンおよび５’−ブロモウリジン；８位で修飾されたアデノシンおよびグアノシン、例えば、８−ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド、例えば、７−デアザ−アデノシン；およびＮ−アルキル化ヌクレオチド、例えば、Ｎ６−メチルアデノシン。また、糖修飾リボヌクレオチドは、２’−ＯＨ基を、Ｈ、アルコキシ（またはＯＲ）、Ｒまたはアルキル、ハロゲン、ＳＨ、ＳＲ、アミノ（例えば、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２）、またはＣＮ基で置き換えて有していてもよく、式中Ｒは、低級アルキル、アルケニル、またはアルキニルである。いくつかの態様において、修飾リボヌクレオチドは、修飾基で置換された隣接するリボヌクレオチドに結合するホスホジエステル基、例えばホスホロチオエート基などを、有していてもよい。
いくつかの側面において、２’−Ｏ−メチル修飾は、二本鎖核酸に対するインターフェロン応答などの、望ましくない細胞ストレス応答を減少させるために有益であり得る。修飾された糖としては、Ｄ−リボース、２’−Ｏ−アルキル（２’−Ｏ−メチルおよび２’−Ｏ−エチルを含む）、すなわち、２’−アルコキシ、２’−アミノ、２’−Ｓ−アルキル、２’−ハロ（２’−フルオロを含む）、２’−メトキシエトキシ、２’−アリルオキシ（−ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−プロパルギル、２’−プロピル、エチニル、エテニル、プロペニル、およびシアノ基等が挙げられる。糖部分はまた、ヘキソースであることができる。
【００４２】
用語「アルキル」は飽和脂肪族基を含み、これは以下を含む：直鎖アルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなど）、分枝鎖アルキル基（イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチルなど）、シクロアルキル（脂環式）基（シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル）、アルキル置換シクロアルキル基、およびシクロアルキル置換アルキル基。いくつかの態様において、直鎖または分枝鎖アルキルは、その骨格に６個以下の（例えば、直鎖についてＣ１〜Ｃ６、分枝鎖についてＣ３〜Ｃ６）、およびより好ましくは４個以下の、炭素原子を有する。同様に、好ましいシクロアルキルは、その環構造に３〜８個の炭素原子を有し、より好ましくは環構造に５または６個の炭素を有する。用語Ｃ１〜Ｃ６は、１〜６個の炭素原子を含むアルキル基を含む。
【００４３】
特に断りのない限り、用語アルキルは、「非置換アルキル」および「置換アルキル」の両方を含み、この後者は、炭化水素骨格の１または２個以上の炭素上の水素を置き換える、独立して選択される置換基を有するアルキル部分を指す。かかる置換基としては、例えば、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分を挙げることができる。シクロアルキルはさらに、例えば上述の置換基で、置換されることができる。「アルキルアリール」または「アリールアルキル」部分は、アリールで置換されたアルキルである（例えば、フェニルメチル（ベンジル））。用語「アルキル」はまた、天然および非天然アミノ酸の側鎖を含む。用語「ｎ−アルキル」は、直鎖（すなわち、非分枝）の非置換アルキル基を意味する。
【００４４】
用語「アルケニル」は、上記のアルキルと長さおよび可能な置換において類似するが、少なくとも１つの二重結合を含む、不飽和脂肪族基を含む。例えば、用語「アルケニル」は、以下を含む：直鎖アルケニル基（例えば、エチレニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニル等）、分枝鎖アルケニル基、シクロアルケニル（脂環式）基（シクロプロペニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、シクロオクテニル）、アルキルまたはアルケニル置換シクロアルケニル基、およびシクロアルキルまたはシクロアルケニル置換アルケニル基。いくつかの態様において、直鎖または分枝鎖アルケニル基は、その骨格中に６個以下の炭素原子を有する（例えば、直鎖についてＣ２〜Ｃ６、分枝鎖についてＣ３〜Ｃ６）。同様に、シクロアルケニル基はその環構造に３〜８個の炭素原子を有することができ、より好ましくは環構造に５または６個の炭素を有する。用語Ｃ２〜Ｃ６は、２〜６個の炭素原子を含むアルケニル基を含む。
【００４５】
特に断りのない限り、用語アルケニルは、「非置換アルケニル」および「置換アルケニル」の両方を含み、後者は炭化水素骨格の１または２個以上の炭素上の水素を置き換える、独立して選択される置換基を有するアルケニル部分を指す。かかる置換基としては、例えば、アルキル基、アルキニル基、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分が挙げられる。
用語「疎水性修飾」とは、塩基の修飾であって、全体の疎水性が増加し、塩基がそれでも通常のワトソン−クリック相互作用に近いものを形成することができる、前記修飾を意味する。塩基修飾の非限定的な例としては、５位のウリジンおよびシチジンの修飾を含み、例えばフェニル、４−ピリジル、２−ピリジル、インドリル、およびイソブチル、フェニル（Ｃ６Ｈ５ＯＨ）；トリプトファニル（Ｃ８Ｈ６Ｎ）ＣＨ２ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯ）、イソブチル、ブチル、アミノベンジル；フェニル；ナフチル、などである。
【００４６】
用語「ヘテロ原子」は、炭素または水素以外の任意の元素の原子を含む。いくつかの態様において、好適なヘテロ原子は、窒素、酸素、硫黄、およびリンである。用語「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」は、−ＯＨまたは−Ｏ−（適切な対イオン付き）を有する基を含む。用語「ハロゲン」は、フッ素、臭素、塩素、ヨウ素などを含む。用語「過ハロゲン化」は、一般に、全ての水素がハロゲン原子によって置換されている部分を意味する。
用語「置換」は、部分上に配置することができ、分子がその意図した機能を実行することを可能にする、独立して選択される置換基を含む。置換基の例としては、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、（ＣＲ’Ｒ”）０−３ＮＲ’Ｒ”、（ＣＲ’Ｒ”）０−３ＣＮ、ＮＯ２、ハロゲン、（ＣＲ’Ｒ”）０−３Ｃ（ハロゲン）３、（ＣＲ’Ｒ”）０−３ＣＨ（ハロゲン）２、（ＣＲ’Ｒ”）０−３ＣＨ２（ハロゲン）、（ＣＲ’Ｒ”）０−３ＣＯＮＲ’Ｒ”、（ＣＲ’Ｒ”）０−３Ｓ（Ｏ）１−２ＮＲ’Ｒ”、（ＣＲ’Ｒ”）０−３ＣＨＯ、（ＣＲ’Ｒ”）０−３Ｏ（ＣＲ’Ｒ”）０−３Ｈ、（ＣＲ’Ｒ”）０−３Ｓ（Ｏ）０−２Ｒ’、（ＣＲ’Ｒ”）０−３Ｏ（ＣＲ’Ｒ”）０−３Ｈ、（ＣＲ’Ｒ”）０−３ＣＯＲ’、（ＣＲ’Ｒ”）０−３ＣＯ２Ｒ’、または（ＣＲ’Ｒ”）０−３ＯＲ’基を含み；式中、それぞれのＲ’およびＲ”は、各々独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ２〜Ｃ５アルケニル、Ｃ２〜Ｃ５アルキニル、またはアリール基であるか、またはＲ’およびＲ”は一緒になってベンジリデン基または-（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）２−基である。
【００４７】
用語「アミン」または「アミノ」は、窒素原子が少なくとも１つの炭素またはヘテロ原子に共有結合している化合物または部分を含む。用語「アルキルアミノ」は、窒素が少なくとも１個の追加のアルキル基に結合している基および化合物を含む。用語「ジアルキルアミノ」は、窒素原子が少なくとも２つの追加のアルキル基に結合している基を含む。
用語「エーテル」は、２つの異なる炭素原子またはヘテロ原子に結合した酸素を含む、化合物または部分を含む。例えば、この用語は「アルコキシアルキル」を含み、これは、別のアルキル基に共有結合している酸素原子に共有結合したアルキル、アルケニル、またはアルキニル基を含む。
【００４８】
用語「塩基」は、周知のプリンおよびピリミジン複素環式塩基、デアザプリン、および類似体（ヘテロ環置換類似体、例えば、アミノエチオキシ（aminoethyosy）フェノキサジンを含む）、誘導体（例えば、１−アルキル−、１−アルケニル−、ヘテロ芳香族−および１−アルキニル誘導体）およびその互変異性体を含む。プリンの例には、アデニン、グアニン、イノシン、ジアミノプリン、およびキサンチンおよび類似体（例えば、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニンまたは７−ジアザキサンチン）およびその誘導体が挙げられる。ピリミジンは、例えば、チミン、ウラシル、およびシトシン、ならびにそれらの類似体（例えば、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、５−（１−プロピニル）ウラシル、５−（１−プロピニル）シトシンおよび４，４−エタノシトシン）を含む。適切な塩基の他の例は、２−アミノピリジンおよびトリアジンなどの非プリニルおよび非ピリミジニル塩基を含む。
【００４９】
いくつかの側面において、本発明のポリヌクレオチドのヌクレオモノマーは、修飾ＲＮＡヌクレオチドを含むＲＮＡヌクレオチドである。
用語「ヌクレオシド」は、糖部分に、好ましくはリボースまたはデオキシリボースに共有的に付着された、塩基を含む。好適なヌクレオシドの例としては、リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドを含む。ヌクレオシドはまた、遊離カルボキシル基、遊離アミノ基、または保護基を含んでいてもよいアミノ酸またはアミノ酸類似体に連結された塩基を含む。適切な保護基は、当技術分野で知られている（P. G. M. Wuts and T. W. Greene, “Protective Groups in Organic Synthesis”, 2nd Ed., Wiley-Interscience, New York, 1999を参照）。
用語「ヌクレオチド」は、さらにリン酸基またはリン酸類似体を含むヌクレオシドを含む。
【００５０】
本明細書で使用する用語「結合」は、隣接するヌクレオモノマーに共有結合する、天然の非修飾ホスホジエステル部分（−Ｏ−（ＰＯ２−）−Ｏ−）を含む。本明細書で使用する用語「代替結合」は、隣接するヌクレオモノマーに共有結合する、天然のホスホジエステル基の任意の類似体もしくは誘導体を含む。代替結合としては、ホスホジエステル類似体、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、およびＰ−エチオキシ（ethyoxy）ホスホジエステル、Ｐ−エトキシホスホジエステル、Ｐ−アルキルオキシホスホトリエステル、メチルホスホネート、および結合を含む非リン、例えば、アセタールおよびアミドが含まれる。かかる代替結合は、当技術分野で知られている（例えば、Bjergarde et al. 1991. Nucleic Acids Res. 19:5843；Caruthers et al. 1991. Nucleosides Nucleotides. 10:47）。特定の態様において、ホスホロチオエート結合などの非加水分解性結合が好ましい。
【００５１】
いくつかの側面において、本発明のポリヌクレオチドは、３’および５’末端を含む（円形のオリゴヌクレオチドを除く）。ポリヌクレオチドの３’および５’末端は、例えば３’または５’結合を修飾することによって、実質的にヌクレアーゼから保護することができる（例えば、米国特許第5,849,902号およびWO 98/13526）。オリゴヌクレオチドは、「ブロック基」を含めることによって耐性にすることができる。本明細書で用いられる「ブロック基」という用語は、保護基としてまたは合成のための結合基のいずれかとして、オリゴヌクレオチドまたはヌクレオモノマーに付着することができる置換基（例えば、ＯＨ基以外）を意味する（例えば、ＦＩＴＣ、プロピル（ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ３）、グリコール（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ホスフェート（ＰＯ３２−）、水素ホスホネート、またはホスホロアミダイト）。「ブロック基」はまた、「末端ブロック基」または「エキソヌクレアーゼブロック基」を含み、これらは、修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドエキソヌクレアーゼ耐性構造を含む、オリゴヌクレオチドの５’および３’末端を保護する。
【００５２】
典型的な末端ブロック基の例としては、キャップ構造（例えば、７−メチルグアノシンキャップ）、反転ヌクレオモノマー、例えば３’−３’または５’−５’末端の反転を含むもの（例えば、Ortiagao et al. 1992. Antisense Res. Dev. 2:129を参照）、メチルホスホネート、ホスホロアミダイト、非ヌクレオチド基（例えば、非ヌクレオチドリンカー、アミノ酸リンカー、コンジュゲート）等が挙げられる。３’末端ヌクレオモノマーは、修飾糖部分を含むことができる。３’末端ヌクレオモノマーは、オリゴヌクレオチドの３’−エキソヌクレアーゼ分解を防ぐブロック基で任意に置換することができる、３’−Ｏを含む。例えば、３’−ヒドロキシルは、３’→３’ヌクレオチド間結合を介してヌクレオチドにエステル化することができる。例えば、アルキルオキシラジカルは、メトキシ、エトキシ、またはイソプロポキシ、好ましくはエトキシであることができる。任意に、３’末端において３’→３’連結ヌクレオチドを、代替結合により連結することができる。ヌクレアーゼ分解を低減するために、最も５’の３’→５’結合を、修飾結合、例えば、ホスホロチオエートまたはＰ−アルキルオキシホスホトリエステル結合とすることができる。好ましくは、２つの最も５’の３’→５’結合は、修飾結合である。任意に、５’末端ヒドロキシ部分を、リン含有部分、例えば、ホスフェート、ホスホロチオエート、またはＰ−エトキシホスフェートで、エステル化することができる。
いくつかの態様において、ポリヌクレオチドはＤＮＡとＲＮＡの両方を含むことができる。
【００５３】
いくつかの側面において、連続したポリヌクレオチドの少なくとも一部は、代替結合、例えば、ホスホロチオエート結合によって連結される。代替結合の存在は、血清タンパク質に対するそれらの高い親和性により、薬物動態を改善することができる。
ＣｐＧ配列は、ヒトＤＮＡにおいては比較的稀であるが、細菌などの感染性生物のＤＮＡでは通常に見出される。ヒト免疫系は明らかに、ＣｐＧ配列を感染の早期警告サインとして認識し、他の免疫刺激剤で頻繁に見られる副作用を引き起こすことなく、侵入する病原体に対する即時かつ強力な免疫応答を開始するように、進化してきた。したがって、ＣｐＧ含有核酸は、この先天性免疫防御機構に依存して、免疫療法のためのユニークで天然の経路を利用することができる。免疫調節に対するＣｐＧ核酸の効果は、以下の文献に広範囲に記載されている：米国特許第6,194,388号、および公開された特許出願、例えばPCT US95/01570、PCT/US97/19791、PCT/US98/03678；PCT/US98/10408；PCT/US98/04703；PCT/US99/07335；およびPCT/US99/09863。
【００５４】
「ＣｐＧオリゴヌクレオチド」は、少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む核酸である。いくつかの態様において、核酸は、３または４以上の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む。少なくとも１つの「非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド」を含む核酸は、非メチル化シトシンをシトシン−グアニンジヌクレオチド配列（すなわち「ＣｐＧ ＤＮＡ」または、５’シトシンと続いて３’グアノシンを含み、リン酸結合で連結されたＤＮＡ）に含み、免疫系を活性化する核酸分子である。
ナノスケール構築物の免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、好ましくは長さが６から１００塩基の範囲である。しかしながら、６ヌクレオチドより大きい任意のサイズ（複数ｋｂ長であってもよい）の核酸は、充分な免疫刺激モチーフが存在する場合、本発明による免疫応答を誘導することができる。好ましくは、免疫刺激性核酸は、ヌクレオチドのサイズが８〜１００の範囲、いくつかの態様においては８〜５０または８〜３０である。
いくつかの態様において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート（ＰＳ）骨格などの修飾された骨格を有する。他の態様において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル（ＰＯ）骨格を有する。さらに他の態様において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、混合されたＰＯおよびＰＳ骨格を有する。
【００５５】
ナノ粒子コアへのモダリティの付着
核酸相互作用複合体および抗原のアゴニストを含む、本発明に関連するモダリティは、当技術分野で知られている任意の手段によってナノ粒子コアに付着することができる。オリゴヌクレオチドをナノ粒子に付着させるための方法は、米国特許出願公開第2010/0129808号に詳細に記載され、これは参照により組み込まれている。
ナノ粒子は、ポリヌクレオチドを付着するために官能化することができる。代替的にまたは付加的に、ポリヌクレオチドを官能化することができる。官能化のための１つのメカニズムはアルカンチオール法であり、これにより、オリゴヌクレオチドは、それらの３’または５’末端でアルカンチオールにより官能化され、その後、金ナノ粒子または他の金属、半導体、もしくは磁気材料を含むナノ粒子に付着される。かかる方法は、例えば、Whitesides, Proceedings of the Robert A. Welch Foundation 39th Conference On Chemical Research Nanophase Chemistry, Houston, Tex., pages 109-121 (1995)、およびMucic et al. Chem. Commun. 555-557 (1996)に記載されている。オリゴヌクレオチドはまた、例えば、米国特許第5,472,881号に記載され参照により組み込まれているように、ホスホロチオエート基などの他の官能基を用いて、または、Burwell, Chemical Technology, 4, 370-377 (1974)およびMatteucci and Caruthers, J. Am. Chem. Soc., 103, 3185-3191 (1981)に記載され参照により組み込まれているように、置換アルキルシロキサンを用いて、ナノ粒子に付着することができる。いくつかの例において、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドを５’または３’チオヌクレオシドで終端させることにより、ナノ粒子に付着することができる。他の例において、熟成プロセスを使用して、ポリヌクレオチドをナノ粒子に付着することができ、これは以下に記載されており、参照により組み込まれる：米国特許第6,361,944号、第6,506, 569号、第6,767,702号および第6,750,016号、およびＰＣＴ公開第WO 1998/004740号、第WO 2001/000876号、第WO 2001/051665号および第WO 2001/073123号。
【００５６】
いくつかの例において、核酸および／または抗原は、金−チオール結合などを介して、ナノ粒子コアに共有的に付着される。スペーサー配列を、付着部位および取り込み制御部分および／または結合部分の間に含めることができる。いくつかの態様において、スペーサー配列は、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリマーまたはオリゴエチレンを含むか、これらから成る。
ナノスケール構築物は、複数の化学物質を用いて設計することができる。例えば、ＤＴＰＡ（ジチオールホスホロアミダイト）結合を使用することができる。ＤＴＰＡは、チオールによるフレアの細胞内放出に抵抗し、信号対雑音比を高めるのに役立ち得る。
本明細書に記載の方法によって生産されたコンジュゲートは、他の方法によって生産されたものよりもかなり安定である。この増大した安定性は、ナノ粒子コアの表面上の、またはコロナの表面を形成する、オリゴヌクレオチドの高密度化に起因する。界面活性剤の存在下で、例えば約０．０１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Tween、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の存在下で、塩の添加を行うことにより、塩熟成処理は約１時間で行うことができる。
【００５７】
表面密度は、ナノ粒子のサイズと種類、およびオリゴヌクレオチドの長さ、配列と濃度に依存し得る。ナノ粒子を安定させるのに適切な表面密度、および、ナノ粒子とオリゴヌクレオチドの所望の組み合わせに対してこれを得るために必要な条件は、経験的に決定することができる。一般に、少なくとも１０ｐｍｏｌ／ｃｍの表面密度は、安定なナノ粒子−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを提供するのに充分であろう。好ましくは、表面密度は、少なくとも１５ｐｍｏｌ／ｃｍである。表面密度が大きすぎる場合、コンジュゲートのオリゴヌクレオチドの、標的とハイブリダイズする能力が低下し得るため、表面密度は任意に、約３５〜４０ｐｍｏｌ／ｃｍ２以下である。オリゴヌクレオチドをナノ粒子に、表面密度が少なくとも１０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも１５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも２０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも３０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも３５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも４０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも４５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、または５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２以上にて、結合する方法もまた提供される。
【００５８】
治療
本発明の側面は、ナノスケール構築物の、治療および／または診断的使用のための対象への送達に関する。粒子は、in vivoでの投与のために、それのみで投与してもよく、または任意の適切な医薬担体中、例えば生理食塩水などの液体、もしくは粉末中で投与してもよい。それらはまた、より大きな担体粒子と共に、または投与デバイス内で送達することもできる。粒子を処方してもよい。本発明の製剤は、薬学的に許容し得る溶液中で投与することができ、該溶液は、薬学的に許容し得る濃度の、塩、緩衝剤、保存剤、適合性担体、アジュバント、および任意に他の治療成分を日常的に含有することができる。いくつかの態様において、本発明に関連するナノスケール構築物は、ローションなどの物質（例えば、アクアホル（aquaphor））と混合し、対象の皮膚に投与されて、これにより、ナノスケール構築物が対象の皮膚を介して送達される。当該技術分野で知られているナノ粒子送達の任意の方法は、本発明の側面と適合性であり得ることが理解されるべきである。
【００５９】
治療に使用するため、粒子の有効量を、対象に対して、粒子を所望の細胞へ送達する任意の様式によって投与することができる。医薬組成物の投与は、当業者に知られている任意の手段によって達成することができる。投与経路としては、限定はされないが、経口、非経口、筋肉内、静脈内、皮下、粘膜、鼻腔内、舌下、気管内、吸入、眼、膣、経皮、直腸、および直接注入を含む。
したがって、一側面において本発明には、核酸相互作用複合体のアゴニストが、免疫刺激効果を媒介するのに非常に有効であるという発見が関与する。核酸相互作用複合体のこれらのアゴニストは、治療的および予防的に免疫系を刺激して、がん、感染症、アレルギー、喘息、自己免疫疾患、および他の障害を処置し、がん化学療法後の日和見感染から保護するために有用である。例えば、ＴＬＲアゴニスト刺激から生じる、強力だがバランスのとれた細胞性および体液性免疫応答は、侵入する病原体およびがん細胞に対する身体自身の自然防御システムを反映する。
【００６０】
したがって、核酸相互作用複合体のアゴニストは、本発明のいくつかの側面において、アレルギーまたは喘息、感染性生物による感染症、または特定のがん抗原が同定されたがんを、発症するリスクを有するか、またはこれらを有している対象を処置するための、ワクチンとして有用である。核酸相互作用複合体のアゴニストはまた、感染、アレルギーまたはがんに対する保護のための抗原またはアレルゲンなしに、与えることができ、この場合、反復投与がより長期の保護を可能にすることができる。本明細書中で使用される、リスクを有する対象とは、感染症を引き起こす病原体もしくはがんもしくはアレルゲンへの暴露の任意のリスク、またはがんを発症するリスクを有する対象である。例えば、リスクを有する対象は、特定種類の病原菌が発見された地域への旅行を計画している対象であってよく、またはライフスタイルや医療処置を介して、感染性生物を含有し得る体液に暴露されるか、生物に直接暴露される対象であってよく、または、感染性生物またはアレルゲンが同定されている地域に住む任意の対象であってもよい。感染症を発症するリスクのある対象はまた、医療機関が特定の感染性生物抗原によるワクチン接種を推奨する、一般的な集団を含む。抗原がアレルゲンであり、対象がその特定の抗原に対するアレルギー反応を発症し、対象が抗原にさらされる可能性がある場合、すなわち花粉の季節の間、その対象は、抗原への暴露のリスクがある。
【００６１】
感染症を有する対象とは、感染性病原体に既に暴露されており、体内において、病原体の急性または慢性の検出可能なレベルを有する対象である。ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドを病原体有りまたは無しで用いて、感染性病原体のレベルを低下させるか、これを根絶することが可能な、抗原特異的な全身または粘膜の免疫応答を、開始することができる。感染性疾患は、本明細書で使用する場合、体内における外来微生物の存在から生じる疾患である。効果的なワクチン戦略と処置法を開発して、病原体侵入の主な部位である身体の粘膜表面を保護することが、特に重要である。
アレルギーを有する対象とは、アレルゲンに応答してアレルギー反応を有するか、これを発症するリスクのある対象である。アレルギーは、物質（アレルゲン）に対する後天性の過敏性を指す。アレルギー状態としては、限定はされないが、湿疹、アレルギー性鼻炎または鼻感冒、枯草熱、結膜炎、気管支喘息、蕁麻疹（じんましん）、および食物アレルギー、ならびに他のアトピー状態が挙げられる。
【００６２】
がんを有する対象は、検出可能ながん性細胞を有する対象である。がんは、悪性または非悪性のがんであってよい。がんまたは腫瘍としては、限定はされないが、胆道がん；脳のがん；乳がん；子宮頸がん；絨毛癌；結腸がん；子宮体がん；食道がん；胃がん；上皮内新生物；リンパ腫；肝臓がん；肺がん（例えば、小細胞および非小細胞）；メラノーマ；神経芽細胞腫；口腔がん；卵巣がん；膵臓がん；前立腺がん；直腸がん；肉腫；皮膚がん；精巣がん；甲状腺がん；および腎臓がん、ならびに他の癌および肉腫を含む。一態様において、がんは、ヘアリー細胞白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚Ｔ細胞白血病、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、悪性黒色腫、扁平上皮癌、腎細胞癌、前立腺癌、膀胱細胞癌、または結腸癌である。
対象は、ヒトまたは脊椎動物を意味し、限定はされないが、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、シチメンチョウ、ニワトリ、霊長類、例えばサル、および魚（水産養殖種）、例えばサケを含む。したがって本発明はまた、非ヒト対象におけるがんおよび腫瘍、感染症、およびアレルギー／喘息を処置するために使用することができる。
【００６３】
本明細書において、感染症、がん、アレルギー、または喘息などの疾患に関連して使用される場合、用語：処置、処置された、また処置するとは、対象の、疾患（例えば、病原体による感染症）の発症に対する抵抗性を増大させる、または言い換えれば、対象が疾患を発症する（例えば、病原体に感染する）可能性を低減する、予防的処置、ならびに、対象が疾患を発症した後に、疾患と闘う（例えば感染を低減または除去する）ため、または疾患が悪化することを防ぐための処置を指す。
本明細書で使用される抗原は、免疫応答を誘発することができる分子である。抗原としては、限定はされないが、細胞、細胞抽出物、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖類、多糖複合体、多糖類および他の分子のペプチドおよび非ペプチド模倣物、小分子、脂質、糖脂質、炭水化物、ウイルスおよびウイルス抽出物ならびに、寄生虫およびアレルゲンなどの多細胞生物が挙げられる。抗原という用語は、広義に、宿主免疫系によって外来性であるとして認識される任意の種類の分子を含む。抗原としては、限定はされないが、がん抗原、微生物抗原、およびアレルゲンを含む。
【００６４】
本明細書で使用する場合、用語「がん抗原」および「腫瘍抗原」は互換的に使用されて、がん細胞によって差別的に発現され、これによりがん細胞を標的化するために利用することができる抗原を指す。がん抗原は、明らかな腫瘍特異的免疫応答を潜在的に刺激し得る抗原である。これらの抗原のいくつかは正常細胞によってコードされるが、必ずしも発現はされない。これらの抗原は、正常細胞において通常はサイレントであるが（すなわち、発現されない）、分化の特定の段階でのみ発現されるもの、および胚性および胎児性抗原のように、一時的に発現されるものとして、特徴付けることができる。他のがん抗原は、変異細胞遺伝子によってコードされる；すなわち例えば、癌遺伝子（例えば、活性化ｒａｓ癌遺伝子）、抑制遺伝子（例えば、変異ｐ５３）、内部欠失または染色体転座に起因する融合タンパク質などによりコードされる。さらに他のがん抗原は、ＲＮＡおよびＤＮＡ腫瘍ウイルス上に担持されたものなどの、ウイルス遺伝子によってコードされ得る。がん抗原は、腫瘍またはがん細胞表面と関連するペプチドまたはタンパク質などの化合物であり、ＭＨＣ分子の文脈において、抗原提示細胞の表面に発現された場合に免疫応答を誘発することが可能である。がん抗原は、例えば、Cohen, et al., 1994, Cancer Research, 54:1055に記載のようにがん細胞の粗抽出物の調製により、抗原の部分的精製により、組み換え技術により、または既知の抗原のde novo合成により、がん細胞から調製することができる。
【００６５】
本明細書で用いられる微生物抗原は、微生物の抗原であり、限定はされないが、ウイルス、細菌、寄生虫、および真菌を含む。かかる抗原は、無傷の微生物ならびに天然の単離物および断片、またはそれらの誘導体、およびまた、天然の微生物抗原に同一または類似しており、その微生物に特異的な免疫応答を誘導する合成化合物が挙げられる。化合物は、天然の微生物抗原に対して免疫応答（体液性および／または細胞性）を誘導する場合、天然の微生物抗原に類似している。かかる抗原は、当技術分野において日常的に使用され、当業者に知られている。
【００６６】
ヒトにおいて見出されているウイルスの例としては、これらに限定されないが、以下が挙げられる：Retroviridae（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、例えばＨＩＶ−１（ＨＤＴＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶＥまたはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、またはＨＩＶ−ＩＩＩとも呼ばれる；および他の分離株、例えばＨＩＶ−ＬＰ；Picornaviridae（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；Calciviridae（例えば、胃腸炎を引き起こす株）；Togaviridae（例えばウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；Flaviridae（例えばデング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；Coronoviridae（例えばコロナウイルス）；Rhabdoviradae（例えば水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；Filoviridae（例えばエボラウイルス）；Paramyxoviridae（例えば、パラインフルエンザウイルス、おたふくかぜウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；Orthomyxoviridae（例えばインフルエンザウイルス）；Bungaviridae（例えばハンターンウイルス、ブンガウイルス、フレボウイルスおよびナイロウイルス）；Arenaviridae（出血熱ウイルス）；Reoviridae（例えば、レオウイルス、オルビウイルスおよびロタウイルス）；Birnaviridae；Hepadnaviridae（Ｂ型肝炎ウイルス）；Parvoviridae（パルボウイルス）；Papovaviridae（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；Adenoviridae（ほとんどのアデノウイルス）；Herpesviridae（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１および２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）；ヘルペスウイルス；Poxviridae（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；およびIridoviridae（例えば、アフリカ豚コレラウイルス）；および未分類ウイルス（例えば、デルタ肝炎の薬剤（Ｂ型肝炎ウイルスの不良付随体であると考えられる）、非Ａ非Ｂ型肝炎の薬剤（クラス１＝内部的に送達；クラス２＝非経口的に送達（すなわち、Ｃ型肝炎）；ノーウォークおよび関連ウイルス、およびアストロウイルス）。
【００６７】
グラム陰性菌およびグラム陽性菌は両方とも、脊椎動物における抗原としての役割を果たす。かかるグラム陽性細菌としては、限定はされないが、パスツレラ種、ブドウ球菌種、および連鎖球菌種が挙げられる。グラム陰性細菌としては、限定はされないが、大腸菌、シュードモナス種、およびサルモネラ種が挙げられる。感染性細菌の具体例としては、これらに限定されないが、以下が挙げられる：Helicobacter pyloris、Borelia burgdorferi、Legionella pneumophilia、Mycobacteria sps（例えばM. tuberculosis、M. avium, M. intracellulare、M. kansaii、M. gordonae）、Staphylococcus aureus、Neisseria gonorrhoeae、Neisseria meningitidis、Listeria monocytogenes、Streptococcus pyogenes（Ａ群連鎖球菌）、Streptococcus agalactiae（Ｂ群連鎖球菌）、Streptococcus（ビリダンス群）、Streptococcus faecalis、Streptococcus bovis、Streptococcus（嫌気性種）、Streptococcus pneumoniae、病原性Campylobacter sp.、Enterococcus sp.、Haemophilus influenzae、Bacillus antracis、corynebacterium diphtheriae、corynebacterium sp.、Erysipelothrix rhusiopathiae、Clostridium perfringers、Clostridium tetani、Enterobacter aerogenes、Klebsiella pneumoniae、Pasturella multocida、Bacteroides sp.、Fusobacterium nucleatum、Streptobacillus moniliformis、Treponema pallidium、Treponema pertenue、Leptospira、Rickettsia、およびActinomyces israelli。
真菌の例としては、Cryptococcus neoformans、Histoplasma capsulatum、Coccidioides immitis、Blastomyces dermatitidis、Chlamydia trachomatis、Candida albicansを含む。
【００６８】
他の感染性生物（すなわち、原生生物）としては、マラリア原虫属を含み、例えばPlasmodium falciparum、Plasmodium malariae、Plasmodium ovale、およびPlasmodium vivaxおよびToxoplasma gondiiである。血液由来および／または組織寄生虫には、Plasmodium種、Babesia microti、Babesia divergens、Leishmania tropica、Leishmania種、Leishmania braziliensis、Leishmania donovani、Trypanosoma gambienseおよびTrypanosoma rhodesiense（アフリカ睡眠病）、Trypanosoma cruzi（シャーガス病）、およびToxoplasma gondiiを含む。
他の医学的に関連する微生物は文献に広く記載されており、例えば、C.G.A Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Great Britain 1983を参照されたい；この内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６９】
アレルゲンは、感受性のある対象においてアレルギー反応または喘息反応を誘導し得える物質（抗原）を指す。アレルゲンのリストは膨大であり、花粉、昆虫毒、動物の鱗屑粉、真菌胞子および薬物（例えばペニシリン）を含み得る。天然の動物および植物アレルゲンの例としては、限定はされないが、以下の属に特異的なタンパク質が挙げられる：Canine（イヌ）（Canis familiaris）；Dermatophagoides（ヒョウヒダニ）（例えば、Dermatophagoides farinae）；Felis（ネコ属）（Felis domesticus）；Ambrosia（Ambrosia artemiisfolia；Lolium（例えばLolium perenneまたはLolium multiflorum）；Cryptomeria（Cryptomeria japonica）；Alternaria（Alternaria alternata）；Alder；Alnus（Alnus gultinoasa）；Betula（Betula verrucosa）；Quercus（Quercus alba）；Olea（Olea europa）；Artemisia（Artemisia vulgaris）；Plantago（例えばPlantago lanceolata）；Parietaria（例えばParietaria officinalisまたはParietaria judaica）；Blattella（例えばBlattella germanica）；Apis（例えばApis multiflorum）；Cupressus（例えばCupressus sempervirens、Cupressus arizonicaおよびCupressus macrocarpa）；Juniperus（例えばJuniperus sabinoides、Juniperus virginiana、Juniperus communisおよびJuniperus ashei）；Thuya（例えばThuya orientalis）；Chamaecyparis（例えばChamaecyparis obtusa）；Periplaneta（例えばPeriplaneta americana）；Agropyron（例えばAgropyron repens）；Secale（例えばSecale cereale）；Triticum（例えばTriticum aestivum）；Dactylis（例えばDactylis glomerata）；Festuca（例えばFestuca elatior）；Poa（例えばPoa pratensisまたはPoa compressa）；Avena（例えばAvena sativa）；Holcus（例えばHolcus lanatus）；Anthoxanthum（例えばAnthoxanthum odoratum）；Arrhenatherum（例えばArrhenatherum elatius) ；Agrostis（例えばAgrostis alba）；Phleum（例えばPhleum pratense）；Phalaris（例えばPhalaris arundinacea）；Paspalum（例えばPaspalum notatum）；Sorghum（例えばSorghum halepensis）；およびBromus（例えばBromus inermis）。
【００７０】
本発明のナノスケール構築物はまた、抗菌剤で被覆されるか、または抗菌剤と組み合わせて投与することができる。本明細書において抗菌剤は、感染性微生物を死滅または阻害することができる、天然または合成の化合物を指す。本発明による有用な抗菌剤の種類は、対象が感染されているか、または感染するリスクのある微生物の種類に依存する。抗菌剤としては、限定はされないが、抗細菌剤（antibacterial agent）、抗ウイルス剤、抗真菌剤および抗寄生虫剤が挙げられる。「抗感染剤」、「抗細菌剤」、「抗ウイルス剤」、「抗真菌剤」、「抗寄生虫剤」および「殺寄生虫薬」などの句は、当業者に対して充分に確立された意味を有し、標準的な医学教科書に定義されている。簡潔に述べると、抗細菌剤は、細菌を殺傷または阻害し、抗生物質ならびに同様の機能を有する他の合成または天然の化合物を含む。抗生物質は、微生物などの細胞によって二次代謝産物として産生される低分子量分子である。一般に抗生物質は、微生物に特異的で宿主細胞には存在しない１または２以上の細菌の機能または構造を、妨害する。抗ウイルス剤は、天然源から単離するかまたは合成することができ、ウイルスを殺傷または阻害するために有用である。抗真菌剤は、表在性真菌感染ならびに日和見性および原発性の全身性真菌感染症を処置するために使用される。抗寄生虫剤は、寄生虫を殺傷または阻害する。
【００７１】
抗細菌剤は、細菌の増殖または機能を殺傷または阻害する。抗細菌剤の大きなクラスは、抗生物質である。広範囲の細菌を殺傷または阻害するのに有効な抗生物質は、広域抗生物質と呼ばれる。抗生物質の他の種類は、主として、グラム陽性またはグラム陰性のクラスの細菌に対して有効である。これらの種類の抗生物質は、狭域抗生物質と呼ばれる。単一の生物または疾患に対して有効であり、他の種類の細菌に対しては有効ではない他の抗生物質は、限定スペクトル抗生物質と呼ばれる。抗細菌剤は、それらの作用の主要な様式に基づいて分類される場合もある。一般に、抗細菌剤は、細胞壁合成阻害剤、細胞膜阻害剤、タンパク質合成阻害剤、核酸合成または機能阻害剤、および競合的阻害剤である。
抗ウイルス剤は、ウイルスによる細胞の感染または細胞内でのウイルスの複製を防止する化合物である。抗ウイルス薬の種類は抗細菌薬よりも大幅に少なく、その理由は、ウイルス複製のプロセスが宿主細胞内のＤＮＡ複製に非常に密接に関連しており、非特異的な抗ウイルス剤は多くの場合、宿主に対して毒性であるからである。抗ウイルス剤によって遮断または阻害することができる、ウイルス感染のプロセス内のいくつかの段階がある。これらの段階は、ウイルスの宿主細胞への付着（免疫グロブリンまたは結合ペプチド）、ウイルスの脱殻（例えば、アマンタジン）、ウイルスｍＲＮＡの合成または翻訳（例えばインターフェロン）、ウイルスＲＮＡまたはＤＮＡの複製（例えば、ヌクレオチド類似体）、新しいウイルスタンパク質の成熟（例えば、プロテアーゼ阻害剤）、およびウイルスの出芽および放出を含む。
【００７２】
本発明の構築物はまた、治療用または診断用抗体と組み合わせて投与してもよい。一態様において、抗体は、以下からなる群から選択することができる：リブタキシン（Ributaxin）、ハーセプチン、クアドラメット、パノレックス、IDEC-Y2B8、BEC2、C225、オンコリム（Oncolym）、SMART M195、ATRAGEN、オバレックス（Ovarex）、ベキサール、LDP-03、ior t6、MDX-210、MDX-11、MDX-22、OV103、3622W94、抗VEGF、ゼナパックス（Zenapax）、MDX-220、MDX-447、MELIMMUNE-2、MELIMMUNE-1、CEACIDE、プレターゲット（Pretarget）、NovoMAb-G2、TNT、Gliomab-H、GNI-250、EMD-72000、LymphoCide、CMA 676、Monopharm-C、4B5、ior egf.r3、ior C5、BABS、抗FLK-2、MDX-260、ANA Ab、SMART 1D10 Ab、SMART ABL 364 Ab、リツキサン、ベバシズマブ、およびImmuRAIT-CEA。
【００７３】
核酸相互作用複合体のアゴニストはまた、自己免疫疾患の処置および予防にも有用である。自己免疫疾患は、対象自身の抗体が宿主組織と反応するか、またはその免疫エフェクターＴ細胞が内因性自己ペプチドに対して自己反応性であり、組織の破壊を引き起こす、疾患のクラスである。こうして免疫応答が、自己抗原と呼ばれる対象自身の抗原に対して開始される。自己免疫疾患としては、限定はされないが、以下が挙げられる：関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、自己免疫性脳脊髄炎、重症筋無力症（ＭＧ）、橋本甲状腺炎、グッドパスチャー症候群、天疱瘡（例えば、尋常性天疱瘡）、グレーブス病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、抗コラーゲン抗体を有する強皮症、混合性結合組織病、多発性筋炎、悪性貧血、特発性アジソン病、自己免疫に関連する不妊症、糸球体腎炎（例えば、半月糸球体腎炎、増殖性糸球体腎炎）、水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、インスリン抵抗性、および自己免疫性糖尿病。
本明細書で使用する「自己抗原」は、正常な宿主組織の抗原を指す。正常な宿主組織は、がん細胞を含まない。したがって、自己抗原に対して開始された免疫応答は、自己免疫疾患の文脈において望ましくない免疫応答であり、正常組織の破壊および損傷に寄与し、一方がん抗原に対して開始される免疫応答は、望ましい免疫応答であり、腫瘍またはがんの破壊に寄与する。したがって、自己免疫疾患の処置を目的とした本発明のいくつかの側面において、ＣｐＧ免疫刺激性核酸を自己抗原、特に、自己免疫疾患の標的である自己抗原と共に投与することは推奨されない。
【００７４】
他の例において、ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、低用量の自己抗原とともに送達されてもよい。多くの動物試験により、低用量の抗原の粘膜投与が、免疫低応答性または「寛容」の状態をもたらし得ることが実証された。活性なメカニズムは、Ｔｈ１から離れて主にＴｈ２およびＴｈ３応答に向かう（すなわち、ＴＧＦ−βが支配する）、サイトカイン媒介性の免疫偏向であると思われる。低用量の抗原送達による活性抑制はまた、無関係な免疫応答を抑制することができ（バイスタンダー抑制）、これは例えば、関節リウマチおよびＳＬＥなどの自己免疫疾患の治療においてかなりの関心の的となっている。バイスタンダー抑制は、炎症誘発性サイトカインおよびＴｈ１サイトカインが抗原特異的または抗原非特異的な様式のいずれかで放出される局所環境における、Ｔｈ１カウンター調節性のサプレッサーサイトカインの分泌を伴う。本明細書で用いられる「寛容」は、この現象を指すために使用される。実際、経口寛容は、以下を含む、動物における多数の自己免疫疾患の処置に有効であった：実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、実験的自己免疫性重症筋無力症、コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）、およびインスリン依存性糖尿病。これらのモデルにおいて、自己免疫疾患の予防および抑制は、抗原特異的な体液性および細胞性応答の、Ｔｈ１からＴｈ２／Ｔｈ３応答へのシフトと関連する。
【００７５】
別の側面において、本発明は、先に説明した１または２以上の組成物を含むキットに向けられる。本明細書で用いられる「キット」は、典型的には、本発明の１または２以上の組成物、および／または、例えば前に記載されたような本発明に関連する他の組成物を含む、パッケージまたはアセンブリを定義する。存在する場合、キットの各組成物は、液体形態（例えば、溶液中で）、または固体形態（例えば、乾燥粉末）で提供されてもよい。特定の場合において、組成物のいくつかは、例えば、キットと共に提供されていてもいなくてもよい適切な溶媒または他の種の添加によって、構成可能であるか、あるいは処理可能（例えば活性形態へと）であってもよい。本発明と関連し得る他の組成物の例としては、限定はされないが、以下が挙げられる：溶媒、界面活性剤、希釈剤、塩、緩衝液、乳化剤、キレート化剤、充填剤、酸化防止剤、結合剤、増量剤、保存剤、乾燥剤、抗菌剤、針、シリンジ、包装材料、チューブ、ボトル、フラスコ、ビーカー、皿、フリット、フィルタ、リング、クランプ、ラップ、パッチ、容器、テープ、接着剤などであって、例えば、組成物の成分を、例えば試料および／または対象に対する特定の使用のために、用いる、投与する、修飾する、組み立てる、保管する、包装する、調製する、混合する、希釈する、および／または保存するためのもの。
【００７６】
いくつかの態様において、本発明に関連するキットは、金を含むナノ粒子コアなどの、１または２以上のナノ粒子コアを含む。キットはまた、核酸相互作用複合体の１または２以上のアゴニストを含むことができる。キットはまた、１または２以上の抗原を含むことができる。
本発明のキットは、いくつかの場合において、本発明の組成物に関連して提供される任意の形態の指示書であって、当業者が、指示書が本発明の組成物と関連することを認識するような様式の、前記指示書を含むことができる。例えば、指示書は、キットに関連する組成物および／または他の組成物の、使用、修飾、混合、希釈、保存、投与、組立、格納、包装、および／または調製のための指示を含むことができる。いくつかのケースにおいて、指示書は、例えば、試料に対する等の特定の使用のための、組成物の使用についての指示書を含むことができる。指示書は、当業者によってかかる指示書を含む適切な媒体として認識できる任意の形態で提供されてよく、例えば、記載されたまたは公開された、口頭、可聴（例えば、電話）、デジタル、光学的、視覚的（例えば、ビデオテープ、ＤＶＤなど）、または電子通信（インターネットまたはウェブベースの通信を含む）であって、任意の様式で提供されるものである。
【００７７】
いくつかの態様において、本発明は、本明細書で説明したように、本発明の１または２以上の態様を促進する方法に向けられている。本明細書において、「促進する」とは、事業を行うすべての方法を含み、これには限定することなく、以下を含む：本明細書で説明するような本発明のシステム、デバイス、装置、物品、方法、組成物、キットなどに関連する、販売、広告、割り当て、ライセンス、契約、指示、教育、研究、輸入、輸出、交渉、資金調達、貸与、売買、販売、再販、分配、修理、交換、保証、訴訟、特許取得などの方法。促進方法は、任意の当事者によって行われ、限定することなく、個人当事者、企業（パブリックまたはプライベート）、パートナーシップ、法人、信託、契約またはサブ契約機関、カレッジや大学、研究機関などの教育機関、病院や他の医療機関、政府機関等を含む。促進活動は、本発明に明確に関連する任意の形態の通信を含んでよい（例えば、書面、口頭、および／または電子通信、例えば限定することなく、電子メール、電話、インターネット、Ｗｅｂベース等）。
【００７８】
一組の態様において、促進方法は、１または２以上の指示書を含むことができる。本明細書において、「指示書」は、指示ユーティリティ（例えば、指示、ガイド、警告、ラベル、ノート、ＦＡＱまたは「よくある質問」等）の構成要素を定義し、典型的には、本発明および／または本発明の包装の上に、またはこれに関連して、記載された指示書を含む。指示書はまた、ユーザーが明確に、例えば本明細書で記載のように、指示書が本発明に関連していることを認識するであろう任意の様式で提供された、任意の形式の指示の通信を含むことができる（例えば、口頭、電子、可聴、デジタル、光学的、視覚的）。
本発明は、以下の例によりさらに説明されるが、さらに限定するものと解釈されるべきでは決してない。本出願を通して引用されている全ての参考文献の内容全体（参考文献、発行済み特許、公開特許出願、および同時係属中の特許出願を含む）は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【００７９】
例
例１：
材料および方法
免疫刺激性ＳＮＡの合成
免疫刺激性ＳＮＡ（ｉｓＳＮＡ）の合成を、以下の本質的な変更を加え、他の場所で説明したようにして７−１２実施する。簡潔に述べると、２０ｍＬの１３ｎｍの金コロイドを、１０％Tween 20およびスルフヒドリル修飾核酸（ＴＬＲ３、７／８、９）のＴＬＲアゴニスト配列と、５μＭなどの適切な濃度で混合し、一晩反応させる。抗原の添加は、他の場所で説明したようにして実施することができる１０。ＳＮＡの精製は、繰り返しの超遠心分離を７５，０００ｘｇで３０ｍｉｎ行って実施することができる。
【００８０】
細胞株
RAW 264.7細胞株はＡＴＣＣから入手した。RAW-BlueマクロファージはInVivoGenから入手した。Ramos-BlueおよびTHP1-XBlue細胞は、InVivoGenから入手した。これらはすべて、販売業者の推奨に従って培養した。
結果と考察
本発明のナノスケール構築物は、溶液中の核酸相互作用複合体の未処方アゴニスト（ＣｐＧオリゴヌクレオチド）と比べて、マクロファージにおいて効力を大幅に増強することが見出された（図２）。RAW-Blueマクロファージは、ウェル当たり６５ｋの細胞でプレーティングし、一晩接着させた。実験の日に、細胞をＡＳＴ−００８−ｐｓまたはＣｐＧ １８２６−ｐｓでオリゴの指示された濃度で、３０ｍｉｎ（上パネル）、４ｈ（中央パネル）、または一晩（下パネル）処置した。３０ｍｉｎおよび４ｈの時点については、全上清を吸引し、細胞を洗浄し、試験薬剤なしの完全増殖培地を投与した。一晩の時点で、細胞の活性化状態を、QuantiBlueアッセイキットを用いて決定した。結果は、特に短い時点において、ＡＳＴ−００８−ｐｓが、ＣｐＧ １８２６−ｐｓの１７８００ｎＭよりも有意に低い、１８８ｎＭのＥＣ５０を実証していることを示す（９〜１０００倍の減少、平均から１標準偏差）。４ｈの時点で、ＡＳＴ−００８−ｐｓは、ＣｐＧ １８２６−ｐｓよりも低いＥＣ５０（３２ｎＭ対５７ｎｍ）およびより強い活性化状態を実証する。この違いは、一晩のインキュベーションの後に小さくなり、この時点でＥＣ５０は互いに統計的に差がなかった。これは、標的細胞と薬剤の滞留時間が制限された条件下、特に３０分以下で、ＡＳＴ−００８−ｐｓ製剤が、より迅速かつ強い免疫活性化をもたらすことを示唆する。
【００８１】
また、本発明のナノスケール構築物は、一晩インキュベートした後の溶液中の核酸相互作用複合体の未処方のアゴニスト（ＣｐＧオリゴヌクレオチド）に比べて、マクロファージにおいて効力を大幅に増強することが実証された（図３）。RAW-Blueマクロファージを、ウェル当たり６５ｋの細胞でプレーティングし、一晩接着させた。実験の日に、ＡＳＴ−００７−ｐｏ、ＡＳＴ−００７−ｐｓ、ＡＳＴ−００８−ｐｏ、ＡＳＴ−００８−ｐｓ、ＣｐＧ １８２６−ｐｏ、ＣｐＧ １８２６−ｐｓを、細胞と一晩インキュベートした。活性化の程度を、次に、QuantiBlueアッセイキットを用いて決定した。結果は、ホスホジエステル（−ｐｏ）結合のみを含有する化合物については（上パネル）、ＡＳＴ−００７−ｐｏおよびＡＳＴ−００８−ｐｏは、それらのＥＣ５０値により決定されるように、ＣｐＧ １８２６−ｐｏよりも約５０〜１５０倍強力であった(１６０３２ｎＭに比べて、それぞれ１９１ｎＭおよび１９４ｎＭ)。ホスホロチオエート修飾化合物（−ｐｓ、下パネル）については、ＡＳＴ−００７−ｐｓおよびＡＳＴ−００８−ｐｓはＣｐＧ １８２６−ｐｓとほぼ同等であり、ＥＣ５０はそれぞれ２９ｎＭ、２７ｎＭ、および２０ｎＭである。
【００８２】
溶液中の核酸相互作用複合体の未処方アゴニスト（ＣｐＧオリゴヌクレオチド）に対する、本発明のナノスケール構造物に対する暴露後のサイトカイン分泌のレベルを試験した。サイトカイン誘導に及ぼす影響を、ナノ粒子およびＴＲＬアゴニスト群において、ホスホジエステルおよびホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する両方のオリゴヌクレオチドについて試験した（図４）。RAW-Blueマクロファージを、ウェル当たり６５ｋの細胞でプレーティングし、一晩接着させた。実験の日に、示された化合物を細胞と共に一晩インキュベートした。サイトカイン分泌の程度は、上清を回収し、示されたサイトカインの濃度をＥＬＩＳＡで測定することにより決定した（ＴＮＦ−α−：上パネル、ＩＬ−１２−：右下パネル、ＩＬ−６：左下パネル）。結果は、ＡＳＴ−００８−ｐｓおよびＡＳＴ−００８−ｐｏを使用して、ＣｐＧ １８２６−ｐｓ、ＣｐＧ １８２６−ｐｏ、および示された対照よりも、低い容量で顕著に高いサイトカイン分泌が可能であることを示した。例えば、２０００ｐｇ／ｍｌより高いＴＮＦ−αを達成するためには、１００ｎＭ未満のＡＳＴ−００８−ｐｓおよび１０００ｎＭ未満のＡＳＴ−００７−ｐｓが必要なのに対して、１０００ｎＭより高いＣｐＧ １８２６−ｐｓが必要であった。
【００８３】
次に、溶液中のホスホジエステルおよびホスホロチオエートＣｐＧオリゴヌクレオチドと比較して、ホスホジエステルＣｐＧオリゴヌクレオチドを有する本発明のナノスケールでの刺激に応答した、ＴＬＲ９の活性化を試験した（図５）。Ramos-BlueまたはTHP1-XBlue細胞を播種し、製造業者の推奨プロトコルに従って、示された化合物および対照を使用して活性化した。驚くべきことに、ＡＳＴ−００７−ｐｏ、ＡＳＴ−００８−ｐｏ、およびＡＳＴ−００９−ｐｏは、周知の最適化されたＴＬＲ９アゴニストＣｐＧ ７９０９−ｐｓに対して、同様の用量で同等の活性化を実証する。さらに、ＴＬＲ９アゴニストに感受性のないTHP1-XBlue細胞はいかなる活性化も示さなかったことから、活性化はＴＬＲ９アゴニストに依存するように見えた。
なお、本発明のナノスケール構築物は、いくつかの異なるＣｐＧオリゴ配列に対して、複数倍の効力の増加があったことが判明した（図６）。Ramos-Blue細胞を播種し、製造業者の推奨プロトコルに従って、示された化合物および対照を使用して活性化した。オリゴ１８２６（上パネル）および１６６８（下パネル）を試験した。特に、ＳＮＡ化合物は、対照と比較して化学的性質とは無関係に、遊離オリゴよりも有意に低いＥＣ５０値を示す。これは、これらの配列に対して、オリゴのＳＮＡ製剤が数倍強力であることを示唆している。
【００８４】
ナノ粒子コアサイズを調節する効果を試験した（図７）。Raw Blue細胞をプレーティングし、３．５ｎｍ〜１３ｎｍの範囲の異なる金コアサイズを有する示したアゴニストで、示したオリゴを使用して処置した。結果は、より小さな金コアサイズが、in vitroでのアゴニスト活性を増強する可能性を示すように見える。
本発明のナノスケール構築物は、ＣｐＧオリゴよりも迅速かつ持続的な活性を有することが観察された（図８）。細胞を記載のようにプレーティングし、活性化をQuantiBlueを用いて測定した。結果は、６ｎＭのオリゴにおいて、ＰＳ ＳＮＡが、遊離の１６６８ ＰＳオリゴよりも著しい活性化を実証することを示す。
ホスホロチオエート修飾の、配列依存的な様式でアゴニスト活性を調節する能力を試験した（図９）。Raw Blue細胞をプレーティングし、示したアゴニストで処置した。オリゴ１８２６（上パネル）および１６６８（下パネル）を試験した。その結果、内部ホスホロチオエート修飾（Ｃ＊Ｇ）および２つの５’ホスホロチオエート結合（５’ＰＳ２）が、配列依存的に見える様式で、免疫刺激性ＳＮＡＳの活性に効果を及ぼすことを示す。
【００８５】
オリゴヌクレオチド負荷密度の、アゴニスト活性に影響を与える能力を評価した（図１０）。Ｖ２は、構築物が、オリゴを金コアに加える前に、完全に金でコーティングされたことを示す。ホスホジエステルオリゴヌクレオチド（上パネル）およびホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（下パネル）を試験した。データは、金の表面上のオリゴヌクレオチドの濃度が、免疫刺激性構築物の活性を調節することを示す。
ＣｐＧ ＰＯ／ＰＯのナノスケール構築物の活性化の時間経過を試験した（図１１）。試験された構築物は、インキュベーションの＞４ｈまで活性化されない。Raw Blue細胞をプレーティングし、示したアゴニストで処置した。結果は、ＰＯおよびＰＯ ＳＮＡが、インキュベーションが４時間を超えるまで、接着したRaw Blue細胞を強力に活性化しないことを示す。
５’ＣｈｏｌのＣｐＧ ＰＯナノスケール構築物は、低いｎＭ範囲内で活性化を示し、一方５’Ｃ１８は、活性を抑止した（図１２）。５’コレステロール修飾（５’Ｃｈｏｌ）は、特に低濃度で、オリゴ用量依存的にアゴニストの効力を増大することができる。Ｃ１８分子による５’末端の修飾（５’Ｃ１８）は、全ての活性を排除するように見える。
【００８６】
前プレーティングしたマクロファージは、その後の活性化のためにより準備されている（図１３）。アゴニスト化合物を添加する前に一晩プレーティングしたRaw Blueマクロファージは（上）、一般的に、細胞をアゴニスト化合物の添加と同時にプレーティングするよりも（下）、高い活性を示す。
マクロファージによる、低レベルのＩＦＮ−γ分泌が実証された（図１４）。Raw Blueマクロファージを、ウェル当たり６５ｋの細胞でプレーティングし、一晩接着させた。実験の日に、示された化合物を、細胞で一晩インキュベートした。サイトカイン分泌の程度（処置後、２４時間−左パネル、または４８時間−右パネル）を、上清を回収し、示されたサイトカインの濃度をＥＬＩＳＡで測定することにより、決定した。結果は、ＩＦＮ−γが、これらの化合物で刺激されたRaw Blueマクロファージによって、感知できる程度に産生されないことを示す。
【００８７】
例２  免疫腫瘍学および免疫療法
免疫治療用ＳＮＡ（すなわち、ＡＳＴ−００８）は、新規で汎用的な技術プラットフォームを提供する。これらによる多価の免疫調節剤の送達は応答を最適化し、リンパ腫モデルにおける大幅な腫瘍の減少が観察されている。さらにこれらは、遊離オリゴヌクレオチドまたはミョウバンよりも高い、in vivoでの強力かつバランスのとれたＴ細胞応答を誘発する。ＳＮＡは、単一のナノ粒子上で治療ワクチン抗原およびアジュバントと共存でき、遊離の免疫刺激性ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドよりも、増強された活性および速い動態を有することができる。さらに、ＳＮＡは、複数の免疫刺激性受容体（例えば、ＴＬＲ３、４、７／８、９）を同時に標的とする可能性を有する。それらは、例えば、がん免疫療法およびワクチンにおいて使用可能である（予防的または治療的）。
免疫治療用ＳＮＡ（ＡＳＴ−００８）の模式図を図１５に示す。ＳＮＡは、単一のナノ粒子上に治療ワクチン抗原およびアジュバントと共存でき、複数の免疫刺激性受容体（例えば、ＴＬＲ３、４、７／８、９）を同時に標的とし得る。
【００８８】
ＡＳＴ−００８が如何にして、誘発されたエンドサイトーシスを介してエンドソームに入ることができるかを実証する模式図を、図１６に示す。一旦エンドソーム入ったＡＳＴ−００８は、汎用的な免疫系刺激のために使用することができる。エンドソーム内において、ＡＳＴ−００８は、ＳＮＡ療法の分子標的であるＴＬＲ９受容体を介して、免疫系のシグナル伝達を刺激し、先天性免疫応答および適応免疫応答の両方を生じさせる。ＡＳＴ−００８はまた、ＴＬＲ３、４、７／８も標的とすることができ、先天性および適応免疫応答をもたらす。
ＡＳＴ−００８は、in vitroで、対応するＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（オリゴ）よりも高い炎症誘発応答を誘導する。この知見を実証するアッセイを行った。データは、図１７Ａおよび１７Ｂに一組のグラフとして示されている。図１７Ａは、ＣＴＬオリゴ、ＣＴＬ ＳＮＡ、ＣｐＧ １８２６およびＡＳＴ−００８によって誘導されるＴＮＦ、ＩＬ−１２、およびＩＬ−６の発現レベルを示す。図１７Ｂは、示された薬剤に起因するＮＦ−ＫＢの活性化を示す。
ＡＳＴ−００８はまた、単回皮下用量の投与後に流入領域リンパ節を標的とする。ＡＳＴ−００８は、金コアの光散乱を増強するために銀染色され、その後エオシンで対比染色された。４×の明視野倍率を使用した。データを図１８に示す。
【００８９】
本発明の構造体は、in vivoで強い免疫応答を刺激するのに有用である。例えば、図１９は、ＡＳＴ−００８のin vivo活性を示すグラフである。マウスに対し、５．１ｎｍｏｌ溶液（ＡＳＴ−００８−ｐｏ、ＡＳＴ−００８−ｐｓ、ＣｐＧ １８２６−ｐｏ、ＣｐＧ １８２６−ｐｓ、ＧｐＣ−ｐｏ ＳＮＡ、ＧｐＣ−ｐｓ ＳＮＡ、ＧｐＣ−ｐｏ、またはＧｐＣ−ｐｓ）の５０μＬボーラス尾静脈（静脈内）注射を与え、次いで注射の１、３および６時間後にＩＬ−１２発現について分析した（１群あたり２４匹のマウス、各時点当たり３匹）。ＩＬ−１２レベルは、ＰＢＳに対する倍数として表される。ＡＳＴ−００８構築物（architecture）は、ＩＬ−１２の誘導を、遊離オリゴデオキシヌクレオチドに対して約２０倍強化し、その効果は、最初の投与後６時間以上持続した。図２０Ａ−２０Ｃは、ＡＳＴ−００８が、ミョウバンまたはＣｐＧオリゴヌクレオチドよりも、バランスのとれたＴｈ１／Ｔｈ２応答（図２０Ａ）および高いＩｇＧ２ａ抗体応答（図２０Ｂ）の両方を誘導することを実証する、一対のグラフおよびチャートで構成される。結果を図２０Ｃにまとめる。＊＊Ｐ＜０．０１。図２１Ａ−２１Ｂは、ＡＳＴ−００８が、ミョウバンまたはＣｐＧオリゴヌクレオチドよりも効果的に、細胞応答を誘導することを示す。図２１Ａは、プロトコルを概略的に表す：脾細胞は２８日間増殖させ、０日目と２１日目にチャレンジし、その後２８日目にSIINFEKLで再刺激してＩＮＦ−γについてELISPOTでプローブした。図２１Ｂは、結果を示すグラフである。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【００９０】
構造物は、in vivoでも劇的な抗腫瘍応答を生成することが示された。図２２Ａ−２２Ｂは、ＡＳＴ−００８が、in vivoのリンパ腫モデルにおいて大きく腫瘍を取り除く免疫応答を誘導することを実証する。図２２Ａは、プロトコルを示す：C57BL/6マウスの右脇腹に、１×１０６のE.G7-OVAリンパ腫を注射した（１群あたり１１匹）。次いでマウスを、１００μｇのＯＶＡｓ．ｃ．、１．８μｇのＯＶＡ２５７−２６４ｓ．ｃ．、およびＡＳＴ−００８中０．９２ｎｍｏｌのオリゴで３回、チャレンジし、２０００ｍｍ３にて屠殺した。図１３Ｂは、結果のグラフである。２要因ＡＮＯＶＡを使用し、＊Ｐ＜０．０５。図２３Ａ−２３Ｂは、ＡＳＴ−００８が、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドより優れた抗腫瘍活性およびより長い生存期間を示すことを表す。グラフは、C57BL/6マウスの右脇腹に、１×１０６のE.G7-OVAリンパ腫を注射し（１群あたり１１匹）、次にＰＢＳ、ＰＢＳとＯＶＡ、ＣｐＧ１８２６とＯＶＡ、またはＡＳＴ−００８とＯＶＡで３回チャレンジした後の、腫瘍体積（図２３Ａ）および生存率％（図２３Ｂ）を示す。＊Ｐ＜０．０５。
【００９１】
【表１−１】
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【００９２】
【表１−２】
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【００９３】
参考文献
【表２】
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【００９４】
均等物
当業者は、日常的な実験のみを用いて、本明細書に記載の本発明の特定の態様に対する多くの均等物を認識し、または確認することができるであろう。かかる均等物は、以下の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
明細書に開示された特許文献を含む全ての参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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