(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
外来性ポリペプチドを産生するチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞の比生産性を増加させるためのメタチロシンの使用。
【請求項２】
CHO細胞がCHO浮遊細胞である、請求項1記載の使用。
【請求項３】
メタチロシンが、0.2mM〜0.7mMの濃度となるよう添加される、請求項1〜2のいずれか一項記載の使用。
【請求項４】
非制限濃度のフェニルアラニンを付加的に含む培養培地においてなされる、請求項1〜3のいずれか一項記載の使用。
【請求項５】
メタチロシン／フェニルアラニンのモル比が1.25以下である、請求項1〜4のいずれか一項記載の使用。
【請求項６】
ポリペプチドが免疫グロブリンまたはそのバリアントまたはその断片またはその融合物である、請求項1〜5のいずれか一項記載の使用。
【請求項７】
メタチロシンを含む培養培地において真核宿主細胞を培養する工程を含む、ポリペプチドをコードする核酸を発現する真核宿主細胞において該ポリペプチドを生産する方法。
【請求項８】
メタチロシンが、0.2mM〜0.7mMの濃度となるよう添加される、請求項7記載の方法。
【請求項９】
真核宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞である、請求項7〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
ポリペプチドが免疫グロブリンまたはそのバリアントまたはその断片またはその融合物である、請求項7〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
培養培地が非制限濃度のフェニルアラニンを付加的に含む、請求項7〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
メタチロシン／フェニルアラニンのモル比が1.25以下である、請求項7〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
温度が、方法中、一定に維持される、請求項7〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
真核宿主細胞の比生産性を増加させるのに使用するための、1.25以下のモル比でメタチロシンおよびフェニルアラニンを含む培養培地。
【請求項１５】
既知組成培養培地である、請求項14記載の培養培地。
【請求項１６】
培養培地において真核宿主細胞の比生産性を増加させる方法であって、培養培地がメタチロシンを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチド生産および細胞培養培地の領域にある。比生産性（qP）を増加させるための細胞培養培地におけるメタチロシンの使用、メタチロシンを含む細胞培養培地においてポリペプチドを生産する方法、およびメタチロシンを含む細胞培養培地が、本明細書に報告される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
細胞培養物は、物質、特に、タンパク質を生産するための発酵方法において使用される。細胞培養物が、遺伝学的に修飾されておらず、自己の代謝産物を形成する方法と、生物が、タンパク質のような自己の物質をより大量に産生するかまたは外来（異種）物質を産生するよう遺伝学的に修飾されている方法とは、区別される。物質を産生する生物には、生物の生存を保証し、所望の標的化合物の産生を可能にする栄養培地が供給される。特定の宿主の最適の培養を可能にするこれらの目的のための多数の培養培地が公知である。
【０００３】
モノクローナル抗体のようなタンパク質バイオ治療薬（biotherapeutics）は、癌、多発性硬化症、および慢性関節リウマチのような、重篤な疾病および疾患を処置するための十分に確立されている薬物と見なされる（Leaderら（Leader et al.2008）の概説を参照すること）。患者に対する安全性および機能的効力を確実にするためには、これらの高活性化合物の重大な分子的特性を厳密にモニタリングしなければならない。微生物および細胞培養物による合成から出発する生産方法全体、タンパク質の精製、製剤化、および保管において、標的タンパク質の意図されない化学的修飾が起こり得る。タンパク質医薬について最も一般的に観察される化学分解経路は、アスパラギン脱アミド、アスパラギン酸異性化（Wakankar and Borchardt,2006；Diepold et al.2012；Dengl et al.2013）、および酸化（Li et al.1995；Ji et al.2009；Hensel et al.2011）である。最近、いくつかの研究が、組換え合成されたバイオ治療薬の、付加的な、関連するが、酵素によって生成される副産物、いわゆる、タンパク質SVを報告した（Khetan et al.2010；Wen et al.2009；Feeney et al.2013）。SVは、内因性のヌクレオチド変異（Bridges,2001）または翻訳中の別のアミノ酸の誤取り込み（Zeck et al.2012）のいずれかに起因する、遺伝学的に予測される位置における意図されないアミノ酸置換である。翻訳における誤取り込みは、内在性の基質の制限の過程で、構造的に関連したアミノ酸についてのアミノアシルtRNAシンテターゼ（aaRS）の混乱によって引き起こされると考えられる（Feeney et al.2013；Jakubowski,2001）。酸化型アミノ酸についての可能性のある細胞傷害機序としての、細胞タンパク質への遊離型メタチロシンの誤取り込みは、Gurer-Urhan et.al.,(2006)に報告されている。
【発明の概要】
【０００４】
培養培地へのメタチロシンの補足が、（非内在性）ポリペプチドを産生する真核（宿主）細胞の比生産性（qP）の増加を提供することが見出された。真核細胞の培養物へのメタチロシンの添加は、細胞生存度または最終産物力価の有意な減少をもたらさないことが見出された。そのような培養物における細胞増殖は、低下する／（生細胞密度（VCD）および（CTIとして示される）全バイオマス生産の低下によって表される）負の様式で影響を受ける。本発明の方法において、培養される細胞の比生産性を増加させるため、温度、浸透圧、またはpHのシフトを実施する必要はない。バルプロ酸または酪酸ナトリウムのような薬物の添加によって、比生産性をモジュレートすることも必要ではない。メタチロシンの存在下でのmRNA翻訳中の別のアミノ酸の誤取り込みによるアミノ酸配列バリアント（SV）の発生は、非制限濃度のフェニルアラニンを付加的に供給することによって調節される。
【０００５】
本明細書に報告される一つの局面は、（非内在性／外来性）ポリペプチドを産生する／発現する／分泌する真核宿主細胞の比生産性を増加させるためのメタチロシンの使用である。
【０００６】
この局面の一つの態様において、真核宿主細胞は、哺乳動物細胞である。この局面の一つの態様において、真核宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞である。この局面の一つの態様において、CHO細胞は、浮遊液中で増殖中のCHO細胞／細胞株（＝CHO浮遊細胞／細胞株）である。この局面の一つの態様において、CHO細胞は、CHO-K1細胞である。
【０００７】
この局面の一つの態様において、メタチロシンは、0.2mM〜0.7mMの（最終）濃度となるよう添加される。この局面の一つの態様において、メタチロシンは、0.25mM〜0.6mMの（最終）濃度となるよう添加される。この局面の一つの態様において、メタチロシンは、0.3mM〜0.5mMの（最終）濃度となるよう添加される。この局面の一つの態様において、メタチロシンは、0.3mM〜0.4mMの（最終）濃度となるよう添加される。
【０００８】
この局面の一つの態様において、比生産性は、メタチロシンの補足なしの同一の生産方法と比較して、少なくとも5％増加する。この局面の一つの態様において、比生産性は、メタチロシンの補足なしの同一の生産方法と比較して、少なくとも10％増加する。この局面の一つの態様において、比生産性は、メタチロシンの補足なしの同一の生産方法と比較して、少なくとも20％増加する。この局面の一つの態様において、比生産性は、メタチロシンの補足なしの同一の生産方法と比較して、少なくとも25％増加する。
【０００９】
この局面の一つの態様において、使用は、無タンパク質培養培地においてなされる。この局面の一つの態様において、使用は、既知組成培養培地においてなされる。この局面の一つの態様において、使用は、無タンパク質既知組成培養培地においてなされる。
【００１０】
この局面の一つの態様において、使用は、非制限濃度のフェニルアラニンを付加的に含む培養培地においてなされる。この局面の一つの態様において、使用は、非制限濃度のフェニルアラニンを付加的に含む培養培地においてなされ、その際、フェニルアラニンは、連続的な供給によって、または発酵方法の最初もしくは間のPheストック溶液の1回以上の個々のボーラスショットによって添加される。
【００１１】
この局面の一つの態様において、メタチロシン／フェニルアラニンのモル比は、1.25以下である。この局面の一つの態様において、Phe→m-Tyr誤取り込みに関する最終タンパク質配列フィデリティは、95.0％以上である。この局面の一つの態様において、メタチロシン／フェニルアラニンのモル比は、1.25以下であり、かつPhe→m-Tyr誤取り込みに関する最終タンパク質配列フィデリティは、95.0％以上である。これは、5％以下のメタチロシン残基が、正確に取り込まれるフェニルアラニン残基の代わりにタンパク質配列へ誤って取り込まれることを意味する。この局面の一つの態様において、メタチロシン／フェニルアラニンのモル比は、0.25以下である。この局面の一つの態様において、Phe→m-Tyr誤取り込みに関する最終タンパク質配列フィデリティは、99.0％以上である。この局面の一つの態様において、メタチロシン／フェニルアラニンのモル比は、0.25以下であり、かつPhe→m-Tyr誤取り込みに関する最終タンパク質配列フィデリティは、99.0％以上である。この局面の一つの態様において、メタチロシン／フェニルアラニンのモル比は、0.125以下である。この局面の一つの態様において、Phe→m-Tyr誤取り込みに関する最終タンパク質配列フィデリティは、99.5％以上である。この局面の一つの態様において、メタチロシン／フェニルアラニンのモル比は、0.125以下であり、かつPhe→m-Tyr誤取り込みに関する最終タンパク質配列フィデリティは、99.5％以上である。この局面の一つの態様において、メタチロシン／フェニルアラニンのモル比は、0.025以下である。この局面の一つの態様において、Phe→m-Tyr誤取り込みに関する最終タンパク質配列フィデリティは、99.9％以上である。この局面の一つの態様において、メタチロシン／フェニルアラニンのモル比は、0.025以下であり、かつPhe→m-Tyr誤取り込みに関する最終タンパク質配列フィデリティは、99.9％以上である。
【００１２】
この局面の一つの態様において、使用は、一定温度でなされる。
【００１３】
この局面の一つの態様において、使用は、使用の過程で低下させられる温度でなされる。
【００１４】
この局面の一つの態様において、使用は、一定pHでなされる。
【００１５】
この局面の一つの態様において、ポリペプチドは、免疫グロブリンまたはそのバリアントまたはその断片またはその融合物である。この局面の一つの態様において、ポリペプチドは、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリンまたはそのバリアントまたはその断片またはその融合物である。この局面の一つの態様において、ポリペプチドは、ヒト化抗体である。この局面の一つの態様において、ポリペプチドは、ヒト化モノクローナル抗体である。
【００１６】
本明細書に報告される一つの局面は、メタチロシンを含む培養培地において真核宿主細胞を培養する工程を含む、ポリペプチドをコードする核酸を発現する真核宿主細胞においてポリペプチドを生産する方法である。
【００１７】
この局面の一つの態様において、メタチロシンは、0.2mM〜0.7mMの（最終）濃度となるよう添加される。この局面の一つの態様において、メタチロシンは、0.25mM〜0.6mMの（最終）濃度となるよう添加される。この局面の一つの態様において、メタチロシンは、0.3mM〜0.5mMの（最終）濃度となるよう添加される。この局面の一つの態様において、メタチロシンは、0.3mM〜0.4mMの（最終）濃度となるよう添加される。
【００１８】
この局面の一つの態様において、比生産性は、メタチロシンの補足なしの同一の生産方法と比較して、少なくとも5％増加する。この局面の一つの態様において、比生産性は、メタチロシンの補足なしの同一の生産方法と比較して、少なくとも10％増加する。この局面の一つの態様において、比生産性は、メタチロシンの補足なしの同一の生産方法と比較して、少なくとも20％増加する。この局面の一つの態様において、比生産性は、メタチロシンの補足なしの同一の生産方法と比較して、少なくとも25％増加する。
【００１９】
この局面の一つの態様において、真核宿主細胞は、哺乳動物細胞である。この局面の一つの態様において、真核宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞である。この局面の一つの態様において、CHO細胞は、CHO浮遊細胞／浮遊液中で増殖中のCHO細胞である。この局面の一つの態様において、CHO細胞は、CHO-K1細胞である。
【００２０】
この局面の一つの態様において、方法は、無タンパク質培養培地において実施される。この局面の一つの態様において、方法は、既知組成培養培地において実施される。この局面の一つの態様において、方法は、無タンパク質既知組成培養培地において実施される。
【００２１】
この局面の一つの態様において、方法は、非制限濃度のフェニルアラニンを付加的に含む培養培地において実施される。この局面の一つの態様において、方法は、非制限濃度のフェニルアラニンを付加的に含む培養培地において実施され、その際、フェニルアラニンは、連続的な供給によって、または発酵方法の最初もしくは間のPheストック溶液の1回以上の個々のボーラスショットによって添加される。
【００２２】
この局面の一つの態様において、メタチロシン／フェニルアラニンのモル比は、1.25以下である。この局面の一つの態様において、Phe→m-Tyr誤取り込みに関する最終タンパク質配列フィデリティは、95.0％以上である。この局面の一つの態様において、メタチロシン／フェニルアラニンのモル比は、1.25以下であり、かつPhe→m-Tyr誤取り込みに関する最終タンパク質配列フィデリティは、95.0％以上である。これは、5％以下のメタチロシン残基が、正確に取り込まれるフェニルアラニン残基の代わりにタンパク質配列へ誤って取り込まれることを意味する。
【００２３】
この局面の一つの態様において、メタチロシン／フェニルアラニンのモル比は、0.25以下である。この局面の一つの態様において、Phe→m-Tyr誤取り込みに関する最終タンパク質配列フィデリティは、99.0％以上である。この局面の一つの態様において、メタチロシン／フェニルアラニンのモル比は、0.25以下であり、かつPhe→m-Tyr誤取り込みに関する最終タンパク質配列フィデリティは、99.0％以上である。
【００２４】
この局面の一つの態様において、メタチロシン／フェニルアラニンのモル比は、0.125以下である。この局面の一つの態様において、Phe→m-Tyr誤取り込みに関する最終タンパク質配列フィデリティは、99.5％以上である。この局面の一つの態様において、メタチロシン／フェニルアラニンのモル比は、0.125以下であり、かつPhe→m-Tyr誤取り込みに関する最終タンパク質配列フィデリティは、99.5％以上である。
【００２５】
この局面の一つの態様において、メタチロシン／フェニルアラニンのモル比は、0.025以下である。この局面の一つの態様において、Phe→m-Tyr誤取り込みに関する最終タンパク質配列フィデリティは、99.9％以上である。この局面の一つの態様において、メタチロシン／フェニルアラニンのモル比は、0.025以下であり、かつPhe→m-Tyr誤取り込みに関する最終タンパク質配列フィデリティは、99.9％以上である。
【００２６】
この局面の一つの態様において、方法は、一定温度で実施される。この局面の一つの態様において、方法は、使用の過程で低下させられる温度で実施される。
【００２７】
この局面の一つの態様において、方法は、一定pHで実施される。
【００２８】
この局面の一つの態様において、ポリペプチドは、免疫グロブリンまたはそのバリアントまたはその断片またはその融合物である。この局面の一つの態様において、ポリペプチドは、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリンまたはそのバリアントまたはその断片またはその融合物である。この局面の一つの態様において、ポリペプチドは、ヒト化抗体である。この局面の一つの態様において、ポリペプチドは、ヒト化モノクローナル抗体である。
【００２９】
本明細書に報告される一つの局面は、1.25以下のモル比でメタチロシンおよびフェニルアラニンを含む培養培地である。本明細書に報告される一つの局面は、1.25以下のモル比でメタチロシンおよびフェニルアラニンを含む培養培地であり、かつPhe→m-Tyr誤取り込みに関する最終タンパク質配列フィデリティは、95.0％以上である。これは、5％以下のメタチロシン残基が、正確に取り込まれるフェニルアラニン残基の代わりにタンパク質配列へ誤って取り込まれることを意味する。
【００３０】
本明細書に報告される一つの局面は、0.25以下のモル比でメタチロシンおよびフェニルアラニンを含む培養培地である。本明細書に報告される一つの局面は、0.25以下のモル比でメタチロシンおよびフェニルアラニンを含む培養培地であり、かつPhe→m-Tyr誤取り込みに関する最終タンパク質配列フィデリティは、99.0％以上である。
【００３１】
本明細書に報告される一つの局面は、0.125以下のモル比でメタチロシンおよびフェニルアラニンを含む培養培地である。本明細書に報告される一つの局面は、0.125以下のモル比でメタチロシンおよびフェニルアラニンを含む培養培地であり、かつPhe→m-Tyr誤取り込みに関する最終タンパク質配列フィデリティは、99.5％以上である。
【００３２】
本明細書に報告される一つの局面は、0.025以下のモル比でメタチロシンおよびフェニルアラニンを含む培養培地である。本明細書に報告される一つの局面は、0.025以下のモル比でメタチロシンおよびフェニルアラニンを含む培養培地であり、かつPhe→m-Tyr誤取り込みに関する最終タンパク質配列フィデリティは、99.9％以上である。
【００３３】
この局面の一つの態様において、培養培地は、無タンパク質培養培地である。この局面の一つの態様において、培養培地は、既知組成培養培地である。この局面の一つの態様において、培養培地は、無タンパク質既知組成培養培地である。
[本発明1001]
外来性ポリペプチドを産生するチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞の比生産性を増加させるためのメタチロシンの使用。
[本発明1002]
CHO細胞がCHO浮遊細胞である、本発明1001の使用。
[本発明1003]
メタチロシンが、0.2mM〜0.7mMの濃度となるよう添加される、本発明1001〜1002のいずれかの使用。
[本発明1004]
非制限濃度のフェニルアラニンを付加的に含む培養培地においてなされる、本発明1001〜1003のいずれかの使用。
[本発明1005]
メタチロシン／フェニルアラニンのモル比が1.25以下である、本発明1001〜1004のいずれかの使用。
[本発明1006]
ポリペプチドが免疫グロブリンまたはそのバリアントまたはその断片またはその融合物である、本発明1001〜1005のいずれかの使用。
[本発明1007]
メタチロシンを含む培養培地において真核宿主細胞を培養する工程を含む、ポリペプチドをコードする核酸を発現する真核宿主細胞において該ポリペプチドを生産する方法。
[本発明1008]
メタチロシンが、0.2mM〜0.7mMの濃度となるよう添加される、本発明1007の方法。
[本発明1009]
真核宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞である、本発明1007〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
ポリペプチドが免疫グロブリンまたはそのバリアントまたはその断片またはその融合物である、本発明1007〜1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
培養培地が非制限濃度のフェニルアラニンを付加的に含む、本発明1007〜1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
メタチロシン／フェニルアラニンのモル比が1.25以下である、本発明1007〜1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
温度が、方法中、一定に維持される、本発明1007〜1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
1.25以下のモル比でメタチロシンおよびフェニルアラニンを含む培養培地。
[本発明1015]
既知組成培養培地である、本発明1014の培養培地。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】Phe制限条件下でメタTyrはCHOバイオマス生成をモジュレートする。（A）流加方法のため、2つの連続的な連続フィード、フィード1およびフィード2を使用した。方法の最初に、0mM（対照）、0.1mM、0.3mM、または0.4mMのパラTyr、オルトTyr、またはメタTyrを、CHO流加培養物に補足した。パラTyr（B）、オルトTyr（C）、およびメタTyr（D）の補足について、CHO細胞バイオマス生成の尺度としての細胞時間積分（CTI）が示される。
【図２】Phe制限条件下でのCHO細胞増殖制御におけるメタTyrおよびオルトTyrの異なる役割。パラTyr（A）、オルトTyr（B）、およびメタTyr（C）の補足について、生細胞密度が示される。パラTyr、オルトTyr、またはメタTyrの補足なしの流加培養が、対照として示される。
【図３】Phe制限条件下でCHO流加培養におけるメタTyrおよびオルトTyrの補足は産物収量を改変しない。パラTyr（A）、オルトTyr（B）、およびメタTyr（C）の補足について、産物濃度が示される。パラTyr、オルトTyr、またはメタTyrの補足なしの流加培養が、対照として示される。
【図４】Phe制限条件下でメタTyr補足は細胞当たりの比産物形成速度qPを増加させる。パラTyr（A）、オルトTyr（B）、およびメタTyr（C）の補足について、細胞当たりの比産物形成速度qPが示される。パラTyr、オルトTyr、またはメタTyrの補足なしの流加培養が、対照として示される。
【図５】Phe制限条件下でのCHO細胞生存度のためのメタTyrおよびオルトTyrの異なる役割。パラTyr（A、D）、オルトTyr（B、E）、およびメタTyr（C、F）の補足について、細胞生存度および上清LDH活性が示される。パラTyr、オルトTyr、またはメタTyrの補足なしの流加培養が、対照として示される。
【図６】Phe非制限条件下でメタTyrはCHOバイオマス生成をモジュレートする。（A）流加方法のため、2つの連続的な連続フィード、フィード1および高いPhe濃度を有するフィード2を使用した。方法の最初に、0mM（対照）、0.1mM、0.3mM、または0.4mMのパラTyr、オルトTyr、またはメタTyrを、CHO流加培養物に補足した。パラTyr（B）、オルトTyr（C）、およびメタTyr（D）の補足について、CHO細胞バイオマス生成の尺度としての細胞時間積分（CTI）が示される。
【図７】Phe非制限条件下でCHO流加培養におけるメタTyrおよびオルトTyrの補足は産物収量を改変しない。パラTyr（A）、オルトTyr（B）、およびメタTyr（C）の補足について、産物濃度が示される。パラTyr、オルトTyr、またはメタTyrの補足なしの流加培養が、対照として示される。
【図８】Phe非制限条件下でメタTyr補足は細胞当たりの比産物形成速度qPを増加させる。パラTyr（A）、オルトTyr（B）、およびメタTyr（C）の補足について、細胞当たりの比産物形成速度qPが示される。パラTyr、オルトTyr、またはメタTyrの補足なしの流加培養が、対照として示される。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
発明の詳細な説明
真核細胞の比生産性（qP）のモジュレーションは、タンパク質N-グリコシル化、電荷バリアント、タンパク質凝集物、および断片のプロファイルの微小不均一性のような産物特性の改変を解決するための強力なツールであると考えられている。例えば、中程度のqPは、標的タンパク質が、グリカン形成コンパートメントである小胞体（ER）およびゴルジ装置においてより長い滞留時間を有し得るため、翻訳後のN-グリコシル化を支持することが提唱されている（Hossler et al.2009）。
【００３６】
現在、バイオテクノロジーの実務におけるqPのモジュレーションは、ヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）阻害剤であるバルプロ酸および酪酸ナトリウム（Lee et al.2009；Murray-Beaulieu et al.2009）のような薬物、または温度シフト（Hendrick et al.2001）、pHシフト（Yoon et al.2005）、および浸透圧の増加（Han et al.2009）のような化学物理的パラメータによって実現されている。これらのアプローチは、重大な欠点を有している。一方のHDAC阻害剤は、重度に細胞生存度を減少させ、アポトーシスを誘導することによって、標的タンパク質の断片化、ならびにタンパク質精製における宿主細胞のタンパク質およびDNAの不十分な排除性能のような二次的な問題を引き起こし得る。他方、化学物理的パラメータは、GMP施設において調節するのが困難であり、容器の制限および異なる物質移動のため、異なるバイオリアクターのシフト動力学に関して変動することが極めて多い。バイオテクノロジー方法へのメタチロシンの特異的な補足は、細胞生存度に影響を与えることのない、化学物理的調整の必要のない、真核細胞、特に、CHO細胞のqPを増加させるための既存の手法に代わる有望な方法であることが、本明細書に報告される。
【００３７】
しかしながら、あるレベルのメタチロシン濃度は、付着して増殖中のCHO細胞において細胞傷害効果を誘導することが、Gurer-Orhan et al.,(2006)によって報告されている。
【００３８】
本明細書に報告される発明は、培養培地へのメタチロシンの補足が、外来性ポリペプチドを産生する真核浮遊細胞、特に、CHO浮遊細胞の比生産性（qP）の増加をもたらすという発見に、少なくとも一部分、基づく。
【００３９】
Gurer-Orhanらの発見とは反対に、メタチロシンの添加は、細胞傷害効果をもたらさない（即ち、細胞生存度および最終産物力価は有意に影響を受けない）が、細胞増殖は、生細胞密度（VCD）および（CTIとして示される）全バイオマス生産の低下によって見られるような負の様式で影響を受ける（図1〜5を参照すること）。
【００４０】
従って、本明細書に報告される一つの局面は、ポリペプチドを産生する真核宿主細胞の比生産性を増加させるためのメタチロシンの使用である。
【００４１】
本明細書に報告される一つの局面は、メタチロシンを含む培養培地において真核宿主細胞を培養する工程を含む、ポリペプチドをコードする核酸を発現する真核宿主細胞においてポリペプチドを生産する方法である。
【００４２】
全ての局面の一つの態様において、真核宿主細胞は、哺乳動物細胞である。一つの態様において、哺乳動物細胞は、CHO細胞（例えば、CHO-K1またはCHO DG44）、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK 293細胞、HEK 293 EBNA細胞、PER.C6細胞、およびCOS細胞を含む哺乳動物細胞より選択される。全ての局面の一つの態様において、哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞である。全ての局面の一つの態様において、CHO細胞は、CHO浮遊細胞である。全ての局面の一つの態様において、CHO細胞は、CHO-K1細胞である。
【００４３】
培養培地に添加されるメタチロシンのある濃度範囲において、比生産性の増加が達成され得ることが見出された。
【００４４】
全ての局面の一つの態様において、メタチロシンは、0.2mM〜0.7mMの濃度となるよう添加される。全ての局面の一つの態様において、メタチロシンは、0.25mM〜0.6mMの濃度となるよう添加される。全ての局面の一つの態様において、メタチロシンは、0.3mM〜0.5mMの濃度となるよう添加される。全ての局面の一つの態様において、メタチロシンは、0.3mM〜0.4mMの濃度となるよう添加される。
【００４５】
全ての局面の一つの態様において、比生産性は、メタチロシンの補足なしの同一の生産方法と比較して、少なくとも5％増加する。全ての局面の一つの態様において、比生産性は、メタチロシンの補足なしの同一の生産方法と比較して、少なくとも10％増加する。全ての局面の一つの態様において、比生産性は、メタチロシンの補足なしの同一の生産方法と比較して、少なくとも20％増加する。全ての局面の一つの態様において、比生産性は、メタチロシンの補足なしの同一の生産方法と比較して、少なくとも25％増加する。
【００４６】
比生産性の増加を達成するため、温度、浸透圧、またはpHのシフトを実施することは必要とされず、当技術分野において報告されているようにバルプロ酸または酪酸ナトリウムのような薬物の添加によって比生産性をモジュレートすることも必要とされないことが見出された。にも関わらず、当業者は、培養方法のこれらの修飾を、本明細書に報告される方法において付加的に行ってもよい／含めてもよいことを理解する。
【００４７】
全ての局面の一つの態様において、使用または方法は、一定温度でなされる。全ての局面の一つの態様において、使用または方法は、使用の過程で低下させられる温度でなされる。
【００４８】
全ての局面の一つの態様において、使用または方法は、一定pHでなされる。
【００４９】
メタチロシンが培養培地に添加される時に起こり得る、翻訳中の別のアミノ酸の誤取り込みによる、可能性のある配列バリアント（SV）は、非制限濃度のフェニルアラニンを付加的に供給することによって調節される。
【００５０】
表1には、トレーサーペプチドについてのPhe→xTyr（xはメタTyrおよび／またはオルトTyrを意味する）配列バリアント形成の量／頻度／画分が示される（14日目の0.1mM、0.3mM、および0.4mMのオルトTyrおよびメタTyrの補足によるPhe→xTyr誤取り込みの最大レベル）。
【００５１】
上清中のメタTyr、オルトTyr、およびL-Phe、ならびにそれぞれの補足実験のPhe→xTyr誤取り込みのデータから、（オルトTyrおよびメタTyrの誤取り込みに関する）99.9％、99.5％、99.0％、および95.0％の最終産生配列フィデリティをもたらす、メタTyr/Phe比およびオルトTyr/Phe比の閾値を計算することができる。
【００５２】
【表１】
0006697442.tif 000002
【００５３】
培養培地中の調整されたメタTyr/Pheの1.25、0.25、0.125、または0.025という最大閾値比は、産生されるポリペプチドにおける望まれないSVを調節する／回避することができ（それぞれ、95.0％、99.0％、99.5％、または99.9％の配列フィデリティ）、同時に、比生産性を増加させることが見出された。これは、付加的なPhe補足に関係なく増加したままである（図8を参照すること）。
【００５４】
全ての局面の一つの態様において、培養培地は、非制限濃度のフェニルアラニンを付加的に含む。
【００５５】
全ての局面の一つの態様において、メタチロシン／フェニルアラニンのモル比は、1.25以下である。全ての局面の一つの態様において、Phe→m-Tyr誤取り込みに関する最終タンパク質配列フィデリティは、95.0％以上である。この局面の一つの態様において、メタチロシン／フェニルアラニンのモル比は、1.25以下であり、かつPhe→m-Tyr誤取り込みに関する最終タンパク質配列フィデリティは、95.0％以上である。
【００５６】
全ての局面の一つの態様において、メタチロシン／フェニルアラニンのモル比は、0.25以下である。全ての局面の一つの態様において、Phe→m-Tyr誤取り込みに関する最終タンパク質配列フィデリティは、99.0％以上である。この局面の一つの態様において、メタチロシン／フェニルアラニンのモル比は、1.25以下であり、かつPhe→m-Tyr誤取り込みに関する最終タンパク質配列フィデリティは、99.0％以上である。
【００５７】
全ての局面の一つの態様において、メタチロシン／フェニルアラニンのモル比は、0.125以下である。全ての局面の一つの態様において、Phe→m-Tyr誤取り込みに関する最終タンパク質配列フィデリティは、99.5％以上である。この局面の一つの態様において、メタチロシン／フェニルアラニンのモル比は、1.25以下であり、かつPhe→m-Tyr誤取り込みに関する最終タンパク質配列フィデリティは、99.5％以上である。
【００５８】
全ての局面の一つの態様において、メタチロシン／フェニルアラニンのモル比は、0.025以下である。全ての局面の一つの態様において、Phe→m-Tyr誤取り込みに関する最終タンパク質配列フィデリティは、99.9％以上である。この局面の一つの態様において、メタチロシン／フェニルアラニンのモル比は、1.25以下であり、かつPhe→m-Tyr誤取り込みに関する最終タンパク質配列フィデリティは、99.9％以上である。
【００５９】
定義
「バイオマス」とは、本明細書において使用されるように、培養培地中の培養細胞の量または重量をさす。バイオマスは、生細胞密度、全細胞密度、（生細胞密度および全細胞密度についての）細胞時間積分、（生細胞密度および全細胞密度についての）細胞体積時間積分、濃縮細胞体積、乾重量、または湿重量を決定することによって、直接または間接的に測定され得る。
【００６０】
「バイオリアクター」とは、本明細書において使用されるように、哺乳動物細胞培養物の増殖のために使用される任意の容器をさす。典型的には、バイオリアクターは、少なくとも1リットルであり、10リットル、100リットル、250リットル、500リットル、1000リットル、2500リットル、5000リットル、8000リットル、10,000リットル、12,000リットル、もしくはそれ以上、またはそれらの中間の容積であり得る。pH、溶存酸素、および温度を含むが、これらに限定されない、バイオリアクターの内部条件が、典型的には、培養期間中に調節される。バイオリアクターは、ガラス、プラスチック、または金属を含む、本発明の培養条件の下で培地に浮遊した哺乳動物細胞培養物を保持するために適当な任意の材料から構成されていてよい。
【００６１】
「細胞密度」とは、本明細書において使用されるように、所定の体積の培地の中に存在する細胞の数をさす。
【００６２】
「細胞生存度」とは、特定の時点で生存している細胞の、その時点での培養物中の細胞（生および死）の総数に対する部分をさす。
【００６３】
「細胞培養物」という用語は、ローラーボトル、フラスコ、ガラス製またはステンレス鋼製の培養容器等において、浮遊液中でまたは付着して増殖中の細胞をさす。バイオリアクターのような大規模アプローチも、「細胞培養物」という用語に包含される。ポリペプチドの大規模生産および小規模生産の両方のための細胞培養手法が、本発明に包含される。流動床バイオリアクター、振とうフラスコ培養、または撹拌槽バイオリアクター系を含むが、これらに限定されない手法が、バッチモード、スプリットバッチモード、流加モード、または灌流モードで選択的に使用され操作され得る。
【００６４】
「細胞培養培地」、「培養培地」、または「培地」という用語は、本発明において交換可能に使用されるように、哺乳動物細胞を増殖させるために使用される栄養溶液を表す。そのような栄養溶液は、一般に、増殖および細胞環境の維持のために必要な様々な因子を含む。例えば、典型的な栄養溶液は、基礎培地製剤、培養の型に依る様々な補助剤を含んでいてよく、時に、選択剤を含んでいてもよい。典型的には、そのような溶液は、最小の増殖および／または生存のために細胞によって必要とされる、必須アミノ酸および非必須アミノ酸、ビタミン、エネルギー源、脂質、ならびに微量元素を提供する。そのような溶液は、ホルモンおよび／もしくはその他の増殖因子、ナトリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸のような特定のイオン、緩衝成分、ビタミン、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド、微量元素、アミノ酸、脂質、ならびに／またはグルコースもしくはその他のエネルギー源を含むが、これらに限定されない、最小速度を超えて増殖および／または生存を増強する補足成分を含有していてもよい。培地は、有利には、細胞の生存および増殖のために最適のpHおよび塩濃度に製剤化される。培地は、無タンパク質培地であり得、即ち、全長タンパク質を含有しないが、不確定のペプチド、例えば、植物加水分解産物に由来するものを含有するであろう。培地は、ヒト血清アルブミンおよびヒトトランスフェリンを含むが、動物由来のインスリンおよび脂質を含む可能性があるものであってもよいし、またはヒト血清アルブミン、ヒトトランスフェリン、ヒトインスリン、および既知組成脂質を含有しているゼノフリー培地であってもよい。あるいは、培地は、全ての物質が、明確であり、明確な濃度で存在する培地である、既知組成培地であってもよい。これらの培地は、組換えのタンパク質および／もしくはホルモンまたは無タンパク質既知組成培地のみを含有しているもの、即ち、低分子量要素のみを含有し、必要であれば、合成のペプチド／ホルモンを含有しているものであってもよい。既知組成培地は、完全に無タンパク質であってもよい。
【００６５】
「細胞」または「宿主細胞」という用語は、核酸、例えば、異種ポリペプチドをコードするものが、導入／トランスフェクトされ得るか、または導入／トランスフェクトされている細胞をさす。宿主細胞には、ベクター／プラスミドの繁殖のために使用される原核細胞および核酸の発現のために使用される真核細胞の両方が含まれる。一つの態様において、真核細胞は、哺乳動物細胞である。もう一つの態様において、哺乳動物宿主細胞は、CHO細胞（例えば、CHO-K1またはCHO DG44）、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK 293細胞、HEK 293 EBNA細胞、PER.C6細胞、およびCOS細胞を含む哺乳動物細胞より選択される。宿主細胞の発酵のため、従って、関心対象のポリペプチドの発現のため、培養培地が使用される。一般に、CHO細胞は、実験室において小規模に、または生産方法において大規模に、薬学的ポリペプチドの発現のために広く使用されている。広い流通および使用のため、CHO細胞の特徴的な特性および遺伝的背景は周知である。従って、CHO細胞は、ヒトへ適用するための治療用タンパク質の生産のため、規制当局によって承認されている。一つの態様において、哺乳動物細胞は、CHO細胞である。一つの態様において、哺乳動物細胞は、CHO浮遊細胞株／浮遊液中で増殖中のCHO細胞株である。
【００６６】
本発明による方法は、分泌型異種ポリペプチドの大規模な、即ち、産業的な生産のために適している。
【００６７】
所望のポリペプチドの大規模な生産のための細胞の培養は、一般に、最終の、即ち、大規模な培養、即ち、連続のうちの最後のもの以外の全ての培養が、培養容器中のある細胞密度に達するまで実施される、個々の培養の連続からなる。予定された細胞密度に達した場合に、先の培養の体積の100倍までのより大きい容積を有する次の培養容器に接種するため、培養物全体またはその画分が使用される。より大きい体積での少なくとも一つのさらなる培養の基礎として用いられる培養は、全て、「シードトレイン発酵」または「シードトレイン培養」と表される。「主発酵」とも表される、大規模培養、即ち、より大きい体積でのさらなる培養の基礎として用いることは意図されない培養においてのみ、培養の終点は、培養培地中の産生された分泌型異種免疫グロブリンの濃度または培養時間に依って決定される。「大規模」という用語は、本願において使用されるように、産業的な生産方法の最終培養を表す。一つの態様において、大規模培養は、少なくとも100l、もう一つの態様において、少なくとも500l、さらなる態様において、少なくとも1000l、25,000lまでの体積で実施される。一つの態様において、最終の、即ち、大規模な培養の培地は、真核生物選択剤を含有しない。
【００６８】
「分割」とは、本明細書において使用されるように、細胞の継代または継代培養としても公知である。これは、少数の細胞を新鮮な培地へ移し、それによって、分割された細胞を新たな培養の種とする工程を含む。浮遊培養においては、少数の細胞を含有している少量の培養物が、より大きい体積の新鮮な培地へ希釈される。
【００６９】
「力価」とは、本明細書において使用されるように、所定の量の培地体積の中の哺乳動物細胞培養物によって産生された組換え発現ポリペプチドの全量をさす。力価は、典型的には、培地1ミリリットル当たりのポリペプチドのミリグラム単位で表される。
【００７０】
「遺伝子」とは、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の発現を達成することができるセグメント、例えば、染色体上またはプラスミド上のセグメントである核酸を示す。コード領域、即ち、構造遺伝子の他に、遺伝子は、他の機能的要素、例えば、シグナル配列、プロモーター、イントロン、および／またはターミネーターを含む。
【００７１】
「構造遺伝子」とは、シグナル配列なしの遺伝子の領域、即ち、コード領域を表す。
【００７２】
「発現」という用語は、本明細書において使用されるように、細胞内で起こる転写および／または翻訳をさす。宿主細胞内の所望の産物の転写のレベルは、細胞内に存在する対応するmRNAの量に基づき決定され得る。例えば、PCRまたはノーザンハイブリダイゼーションによって、選択された核酸から転写されたmRNAを定量化することができる（Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)を参照すること）。選択された核酸によってコードされたタンパク質は、様々な方法によって、例えば、ELISAによって、タンパク質の生物学的活性についてアッセイすることによって、またはタンパク質を認識しそれに結合する抗体を使用することによる、ウエスタンブロッティングもしくはラジオイムノアッセイのような、そのような活性に依存しないアッセイを利用することによって、定量化され得る（Sambrook,et al.,1989（前記）を参照すること）。
【００７３】
「ポリペプチド」とは、天然に生産されたものであってもよいしまたは合成的に生産されたものであってもよい、ペプチド結合によって接合されたアミノ酸残基のポリマーである。約20アミノ酸残基未満のポリペプチドは「ペプチド」と呼ばれ得る。2本以上のアミノ酸鎖を含むかまたは100アミノ酸以上の長さのアミノ酸鎖を含むポリペプチドは、「タンパク質」と呼ばれ得る。ポリペプチドまたはタンパク質は、炭水化物基または金属イオンのような非ペプチド成分も含み得る。炭水化物およびその他の非ペプチド置換基は、タンパク質が産生される細胞によってタンパク質に付加され、細胞の型によって変動し得る。タンパク質およびポリペプチドは、アミノ酸骨格構造に関して本明細書において定義され；炭水化物基のような付加は、一般に、明示されないが、にも関わらず存在し得る。一つの態様において、ポリペプチドは、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片または免疫グロブリンコンジュゲートである。一つの態様において、ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖もしくは免疫グロブリン軽鎖、またはそれらの断片、融合物、もしくはコンジュゲートである。「外来性の」または「非内在性の」ポリペプチドとは、使用された宿主細胞に起因しないポリペプチドである。
【００７４】
「核酸」という用語は、本明細書において使用されるように、個々のヌクレオチドからなるポリマー、即ち、ポリヌクレオチドである。それは、例えば、組換えによって生産され得るポリペプチドをコードする、天然に存在する核酸、または部分的にもしくは完全に天然には存在しない核酸をさす。核酸は、単離されたまたは化学的手段によって合成されたDNA断片の構築物であり得る。核酸は、もう一つの核酸、例えば、発現プラスミドまたは宿主細胞のゲノム／染色体へ組み込まれていてもよい。プラスミドには、シャトルベクターおよび発現ベクターが含まれる。典型的には、プラスミドは、細菌におけるベクターの複製および選択のため、それぞれ、複製開始点（例えば、ColE1複製開始点）および選択可能マーカー（例えば、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性遺伝子）を含む原核生物繁殖単位も含むであろう。
【００７５】
「免疫グロブリン」という用語は、少なくとも2本のいわゆる軽鎖ポリペプチド（軽鎖）および2本のいわゆる重鎖ポリペプチド（重鎖）を含む分子を表す。重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの各々は、抗原と相互作用することができる結合領域を含む可変ドメイン（可変領域）（一般に、ポリペプチド鎖のアミノ末端部分）を含む。重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの各々は、定常領域（一般に、カルボキシ末端部分）も含む。重鎖の定常領域は、（i）食細胞のようなFcγ受容体（FcγR）を保持する細胞または（ii）ブランベル（Brambell）受容体としても公知の新生児型Fc受容体（FcRn）を保持する細胞との免疫グロブリンの結合を媒介する。それは、成分C1qのような古典的補体系の因子を含むいくつかの因子との結合も媒介する。
【００７６】
「免疫グロブリン」という用語は、最も広義に本明細書において使用され、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および免疫グロブリン断片を含むが、これらに限定されない、様々な免疫グロブリン構造を包含する。
【００７７】
重鎖の定常領域のアミノ酸配列に依って、免疫グロブリンは、異なるクラス：IgAクラス、IgDクラス、IgEクラス、IgGクラス、およびIgMクラスに分類される。これらのクラスのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）にさらに分類され、即ち、IgGは、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4に、IgAは、IgA1およびIgA2に分類される。免疫グロブリンが属するクラスに従って、重鎖定常領域は、それぞれ、α（IgA）、δ（IgD）、ε（IgE）、γ（IgG）、およびμ（IgM）と呼ばれる。一つの態様において、免疫グロブリンは、IgGクラスの免疫グロブリンである。もう一つの態様において、免疫グロブリンは、ヒト定常領域またはヒト起源に由来する定常領域を有する。さらなる態様において、免疫グロブリンは、IgG4サブクラスのもの、またはFcγ受容体（例えば、FcγRIIIa）結合および／もしくはC1q結合が検出され得ないよう修飾されているIgG1サブクラス、IgG2サブクラス、もしくはIgG3サブクラスのものである。一つの態様において、免疫グロブリンは、ヒトIgG4サブクラスまたは変異型ヒトIgG1サブクラスのものである。一つの態様において、免疫グロブリンは、変異L234AおよびL235Aを含むヒトIgG1サブクラスのものである。もう一つの態様において、免疫グロブリンは、Fcγ受容体結合に関して、IgG4サブクラスのもの、またはL234、L235、および／もしくはD265に変異を含むIgG1サブクラスもしくはIgG2サブクラスのものであり、かつ／またはPVA236変異を含有している。さらなる態様において、免疫グロブリンは、S228P、L234A、L235A、L235E、SPLE（S228PおよびL235E）、ならびに／またはPVA236（PVA236とは、IgG1のアミノ酸位置233〜236の（一文字アミノ酸コードで与えられた）アミノ酸配列ELLGもしくはIgG4のEFLGがPVAに置換されていることを意味する）より選択される変異を有する。一つの態様において、免疫グロブリンは、IgG4サブクラスのものであり、IgG4の変異S228Pを有するか、または免疫グロブリンは、IgG1サブクラスのものであり、変異L234AおよびL235Aを有する。
【００７８】
次に、免疫グロブリンの軽鎖または重鎖の可変ドメインは、異なるセグメント、即ち、4個のフレームワーク領域（FR）および3個の超可変領域（CDR）を含む。
【００７９】
「免疫グロブリン断片」とは、免疫グロブリンの重鎖の可変ドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメイン、CH4ドメイン、または免疫グロブリンの軽鎖の可変ドメインもしくはCLドメインを含むドメインの群の少なくとも1個のドメインを含むポリペプチドを表す。それらの誘導体およびバリアントも含まれる。さらに、1個以上のアミノ酸またはアミノ酸領域が欠失している可変ドメインが存在し得る。
【００８０】
「免疫グロブリンコンジュゲート」とは、ペプチド結合を介してさらなるポリペプチドにコンジュゲートされた免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の少なくとも1個のドメインを含むポリペプチドを意味する。さらなるポリペプチドは、ホルモン、増殖受容体、抗融合性（antifusogenic）ペプチド等のような非免疫グロブリンペプチドである。
【００８１】
本明細書において使用されるように、「Phe非制限的」または「Phe非制限」濃度とは、フェニルアラニンが過量に供給されること、即ち、6日目に開始して14日目まで、例えば、1日当たり0.6mM Pheが培養物に補足されることを意味する。付加的な供給がない場合、Pheは、一般に、10日目または11日目までに制限的になるであろう（「Phe制限」）。フェニルアラニン補足は、連続的な供給によって、あるいは発酵方法の最初または間のPheストック溶液の1回以上の個々のボーラスショットによって添加され得る。
【００８２】
「比生産性の増加」という用語は、本明細書に記載された条件において、それぞれの宿主細胞の比生産性が、メタチロシンの補足なしの同一の生産方法に比べて、より高いことを意味する。実施例において反映されるように、1日当たりの細胞の生産能（産生されるポリペプチド／タンパク質の量、例えば、ピコグラム単位）についての尺度として、比生産性（qP）が計算される。
【００８３】
以下の実施例および図面は、本発明についての理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲において示される。本発明の本旨を逸脱することなく、示された手法に修飾を施すことができることが理解される。
【実施例】
【００８４】
試薬および材料
DL-オルト-チロシン（2-ヒドロキシ-DL-フェニルアラニン）、DL-メタ-チロシン（3-ヒドロキシ-DL-フェニルアラニン）、L-パラ-チロシン、L-フェニルアラニン、および塩酸グアニジウムは、Sigma-Aldrich（Munich,Germany）から入手された。L-オルト-チロシン（2-ヒドロキシ-L-フェニルアラニン）およびL-メタ-チロシン（3-ヒドロキシ-L-フェニルアラニン）は、RSP Amino Acids,LLC（Shirley,MA,USA）から購入された。その他の試薬は、全て、Merck（Darmstadt,Germany）およびSigma-Aldrich（Munich,Germany）から購入された。
【００８５】
細胞および細胞培養
全ての細胞培養実験のため、ヒト化モノクローナル抗体を発現するクローン1と呼ばれる組換えCHO-K1細胞株を使用した。組換えCHO-K1細胞株は、L-メチオニンスルホキシミン感受性CHO-K1宿主細胞株（Lonza,Cologne,Germany）を使用して生成された。シードトレイン培養において、50μM L-メチオニンスルホキシミン（Sigma Aldrich,Munich,Germany）が補足された無タンパク質既知組成CD-CHO培地（Life Technologies,Darmstadt,Germany）において、細胞を培養した。加湿インキュベータ、7％CO2、および37℃の設定を使用して、振とうフラスコにおいて、シードトレイン培養を実施した。継代培養および培養物増大のため、3〜4日毎に細胞を分割した。全ての実験のため、実験の開始までの培養齢が同一（およそ21世代）の細胞を使用した。
【００８６】
メタTyrおよびオルトTyrの補足実験
全ての補足実験を、振とうフラスコ培養系、選択圧L-メチオニンスルホキシミンを含まない既知組成CD-CHO培地、ならびに2つの適切な連続的に適用された連続フィード（フィード1およびフィード2）を使用して実施した。ヒト化モノクローナル抗体を産生する組換えCHO-K1細胞を、3×105生細胞/mLで接種し、14日間培養した。接種前に、0.1mM、0.3mM、または0.4mMのオルトTyr、メタTyr、またはパラTyrを、CD-CHO基本培地に無菌的に補足した。オルトTyr、メタTyr、またはパラTyrの補足なしの対照培養を、参照として使用した。フェニルアラニン（Phe）非制限条件は、フィード2においてPheの濃度を増加させることによって実現された。
【００８７】
生細胞密度、生存度、および細胞時間積分
生細胞密度および全細胞密度の分析のため、自動Cedex HiRes系（Roche Diagnostics,Mannheim,Germany）を使用した。製造業者の仕様書に従い、トリパンブルー排除染色法を使用し、1試料当たり1日当たり10個を超える画像を分析して、生細胞密度および全細胞密度の区別を評価した。それぞれ、式1（Equ1）および式2（Equ2）に記載されるように、生細胞密度（VCD）および細胞生存度を計算した。
（Equ1）生細胞密度＝Nトリパンブルー陰性×(105生細胞/ml)
（Equ2）細胞生存度＝Nトリパンブルー陰性細胞/(Nトリパンブルー陰性細胞＋Nトリパンブルー陽性細胞)×100％
方法における全バイオマス生成の指標として、累積細胞時間積分（CTI）を以下のように計算した（Equ3）。
（Equ3）細胞時間積分＝Σ(0.5×(VCDn-1＋VCDn)×(tn−tn-1))×(105生細胞×d/ml)
無細胞上清中の乳酸脱水素酵素（LDH）活性を、Cobas Integra 400 plus系（Roche Diagnostics,Mannheim,Germany）を使用して分析した。
【００８８】
IgG力価の定量化およびqPの計算
製造業者のプロトコルに従って、Cobas Integra 400 plus系（Roche,Mannheim,Germanyによって、または以前に記載されたようなPorosA HPLC法（Zeck et al.2012）によって、産物力価を定量化した。全体的な比生産性qPを、式4に従って、細胞の生産能の分析のために計算した。
（Equ4）qP＝(力価n−力価n-1)/(CTIn−CTIn-1)×(pg/(生細胞×d))
【００８９】
ペプチド配列バリアントの決定ならびに合成ペプチドによるメタTyr配列バリアントおよびオルトTyr配列バリアントの同定
以前に記載されたように（Zeck et al.2012）、ペプチド配列バリアントの定量化を実施した。簡単に説明すると、240μLの最終体積への変性緩衝液（0.4Mトリス、8M塩酸グアニジウム、pH8）の添加によって、抗体試料（250μg）を変性させた。変性緩衝液において新鮮に調製された20μLの0.24M DTTを添加し、60分間、37℃でインキュベートすることによって、還元を達成した。その後、暗所で、室温で、15分間、20μLの0.6Mヨード酢酸を含む水の添加によって、試料をアルキル化した。過剰のアルキル化試薬を、30μLのDTT溶液の添加によって不活化した。次いで、NAP 5 Sephadex G-25 DNA等級カラム（GE Healthcare,Munich,Germany）を使用して、試料を、およそ480μLの50mMトリス/HCl、pH7.5に緩衝液交換した。37℃で、5時間、トリプシン（比1:37）によって消化を実施した。入手されたペプチド混合物を、逆相HPLC（Agilent 1100 Cap LC,Agilent Technologies,Boblingen,Germany）を使用して、前処理なしでインジェクトし分離した。Varian（Darmstadt,Germany）からのPolaris 3 C18-エーテルカラム（1×250mm；3μm粒径、180Å孔径）を、分離のために使用した。溶媒は、0.1％ギ酸を含む水（A）およびアセトニトリル（B）（Sigma Aldrich,Munich,Germany）であった。2％Bから38％Bへの直線勾配を37℃で80分で実行した。HPLC溶出液を、Triversa NanoMate（Advion,Ithaca,NY）を使用して分割し、380nL/分を陽イオンモードで作動するLTQ Orbitrap古典的タンデム質量分析計（Thermo Fisher Scientific,Dreieich,Germany）へ注入した。抽出されたイオンクロマトグラムにおけるオルトTyrおよびメタTyrのピークの確認のため、本発明者らは、mAb HC66-72の合成ペプチド、DQFTISR（未修飾）、DQpYTISR、DQmYTISR、およびDQoYTISRを使用した。合成ペプチドは、Biosyntan GmbH（Berlin,Germany）から購入された。
【００９０】
Phe→オルトTyrおよびPhe→メタTyrの配列バリアントの予測のためのペナルティ因子および代理マーカーの計算
本発明者らは、Pheの代わりのメタTyrおよび／またはオルトTyrの使用にペナルティが与えられると仮定する単純化されたモデルによって、Pheの代わりのメタTyrおよび／またはオルトTyrの取り込みを記載することができるという仮説を立てた。このペナルティ因子は、細胞へのL-Pheのよりよい輸送、ならびに／またはメタTyrおよび／もしくはオルトTyrの使用を防止しようとするタンパク質合成中の編集機序のような異なる起源に起因し得る。この仮定は以下の式をもたらす。
（Equ5）p×r×[x]＝[y]
式中、pはペナルティ因子であり、rは（所定の時間間隔における）平均のメタTyrまたはオルトTyr/Phe濃度の比であり、[x]は（その時間間隔において）産生されたタンパク質の濃度であり、[y]は配列バリアントを有する産生されたタンパク質の濃度である。このモデルは、例えば、位相シフトをもたらす、時間、処理過程、PheとメタTyrまたはオルトTyrとの濃度比への依存を含まないことに注意すること。ペナルティ因子の計算は簡単である（Equ7）。
（Equ6）p＝[y]/(r×[x])
同様に、ペナルティ因子を知ることによって、配列バリアントなしの産物の所望の百分率のための、メタTyrまたはオルトTyrの濃度とPhe濃度との比を計算することも可能である。
【００９１】
実施例1
フェニルアラニン制限条件下での比生産性（qP）のモジュレーションに対するメタチロシン補足の効果
以前に、Gurer-Orhanらは、CHO細胞のメタTyr補足が、用量依存性の細胞傷害を示すことを報告した。濃度スクリーニングにおいて、0.5mMメタTyrが補足された時、CHO細胞のMTX還元能の50％の低下が観察された（Gurer-Orhan et al.,(2006)）。細胞培養におけるオルトTyr補足についてのデータまたは濃度は、現在までに報告されていない。用量依存性の培養アプローチを使用して、CHO細胞増殖性能に対するメタTyrおよびオルトTyrの関連性および許容濃度を決定することを目指した。このため、材料および方法に記載されたCHO培養モデルに、0.1mM、0.3mM、または0.4mMのパラTyr、オルトTyr、またはメタTyrを補足した。本発明者らは、以後「対照」または「陽性対照」と呼ばれる、補足なしの標準培養方法を参照として使用した。この場合、Pheは10/11日目までに制限的になるであろう。
【００９２】
第1のアプローチにおいて、巨視的な細胞増殖マーカー、生細胞密度（VCD）、細胞生存度、および全バイオマス生産についてのマーカーとしての細胞時間積分（CTI）に対するメタTyrおよびオルトTyrの役割を分析した。9/10日目に、メタTyrを補足されたもの以外の試験された全ての培養物が、およそ180×105細胞/mlの最大VCDに達し、メタTyrによって処理されたCHOクローン1は、用量依存的に低下した最大VCDを示した（図2）。メタTyrを補足されたCHO培養物について、累積CTIの減少が観察された（図1）。
【００９３】
Gurer-Orhanらによって以前に発表されたデータとは対照的に、本発明者らの流加CHO培養モデルにおいて、細胞生存度に対するメタTyr補足の有意な影響は観察されなかった。しかしながら、オルトTyrの補足は、対照およびメタTyrと比較しても、パラTyr補足と比較しても、より低い細胞生存度（14日目に60％未満）およびより高い上清中の最終LDH活性を示した（図5）。
【００９４】
産物濃度分析によって決定された培養物の全体的な生産性は、テストケース間の差を明らかにしなかった（図3）。全ての培養物が、11/12日目以降、力価停滞を示した。さらに、メタTyrのみが、全体的により高い比生産性qPを示した（図4）。Phe制限条件下での0.1mM、0.3mM、および0.4mMのメタTyrの補足は、それぞれ、＋5％、＋26％、および＋36％、対照と比較してqPを増加させた。
【００９５】
実施例2
フェニルアラニン非制限条件下での比生産性（qP）のモジュレーションに対するメタチロシン補足の効果
第2のアプローチにおいて、Phe非制限条件下でのCHO流加培養におけるメタTyrおよびオルトTyrの補足の役割を分析した。そのため、Phe制限を防止するため、フィード2の中のPheの量を増加させた（図6）。
【００９６】
再び、メタTyrを補足されたもの以外の試験された全ての培養物が、およそ35,000〜40,000×105細胞*h/mlという類似したCTIに達したが、メタTyrによって処置されたCHOクローン1は、CTIの用量依存的な低下を示した（図6）。全ての試験された条件について、産物力価の差は観察されなかった（図7）。しかしながら、前記のPhe制限条件と比較して、十分なPheのCHO培養物への提供は、産物力価の停滞を防止する。メタTyr補足は、Phe非制限条件下でも、全体的により高い比生産性qP（図4）を示した（図8）。Phe非制限条件下での0.1mM、0.3mM、および0.4mMのメタTyrの補足は、それぞれ、＋3％、＋26％、および＋28％、対照と比較してqPを増加させた。
【００９７】
参考文献リスト
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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