(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
外植片における細菌コロニー形成およびバイオフィルム形成を視覚化および定量化するための方法であって、
１）前記外植片を、ＰＢＳブロッキング緩衝液および１％ウサギ血清（ＲＳ）の第１の溶液で続けて少なくとも１回洗浄するステップと、
２）第１の期間、グラム陽性およびグラム陰性の両方のコンジュゲート抗体を適用するステップと、
３）前記外植片を、ＰＢＳブロッキング緩衝液および１％ＲＳで続けて少なくとも１回洗浄するステップと、
４）第２の期間、グラム陽性およびグラム陰性の両方の二次抗体を導入するステップと、
５）ＰＢＳブロッキング緩衝液および１％ＲＳですすぐステップと、
６）前記外植片をグラム陽性およびグラム陰性の付着に関して、共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）で確認するステップと、を含む、方法。
【請求項２】
ステップ１）および３）の前記少なくとも１回の洗浄が、それぞれ３回であり、
前記第１および第２の期間が、それぞれおよそ１５分である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（１）〜（５）の間、光誘起損傷および光退色を予防するために、前記外植片の周囲にスズ箔を巻き付けるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
細菌プレートにおいて、グラム陽性およびグラム陰性の一次および二次の抗体型の間で確実に蛍光のバランスを取ってぼやけを最小限に抑えるために、複数回、抗体希釈試験を反復するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記外植片を、３０ｒｐｍでの緩徐な洗浄効果のためにロッキング装置に載置するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＣＬＳＭからの図を前記外植片の表面の三次元レンダリングに配置するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
外植片における細菌コロニー形成およびバイオフィルム形成を視覚化および定量化するための方法であって、
前記外植片を、ＰＢＳブロッキング緩衝液および１％ウサギ血清（ＲＳ）の第１の溶液で続けて少なくとも１回洗浄するステップと、
第１の期間、５０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および５０％ＲＳの第２の溶液でブロッキングするステップと、
第２の期間、グラム陽性およびグラム陰性の両方の一次抗体を導入するステップと、
前記外植片を、ＰＢＳブロッキング緩衝液および１％ＲＳで続けて少なくとも１回洗浄するステップと、
第３の期間、グラム陽性およびグラム陰性の両方の二次抗体を導入するステップと、
ＰＢＳブロッキング緩衝液および１％ＲＳですすぐステップと、
グラム陽性およびグラム陰性の付着に関して、前記外植片を、共焦点レーザー走査顕微鏡で確認するステップと、を含む、方法。
【請求項８】
ステップ１）および３）の前記少なくとも１回の洗浄が、それぞれ３回であり、
前記第１、第２、および第３の期間が、それぞれおよそ１５分間である、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、除去時の埋込片における微生物コロニー形成およびバイオフィルム形成の高速な定量化および特徴付けのためのシステムおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
整形外科的外傷用埋込片における微生物感染およびバイオフィルム形成は、整形外科手術において最も深刻な問題の１つである。バイオフィルムの形成は、抗生物質処置に対する耐性を増加させ、また典型的には、感染した整形外科デバイスは除去しなければならない。多くの場合、埋込片の複雑な表面を包囲する組織の不均一さにより、微生物のコロニー形成または感染の兆候が複雑になる可能性がある。外植片における細菌のコロニー形成、付着、および種を判定するための後続の分析は、数日または数週間かかることがあり、可能性のある治療計画の有効性および効率性に悪い影響を及ぼす。多くの事例において、現在の検出方法は、偽陰性の結果をもたらすことがあり、これが、問題をさらに悪化させる。
【０００３】
２００４年からの予測に基づくと、米国で１年間に埋め込まれる２百万個の骨折固定用デバイスのうち、感染埋込片の数は、１００，０００件、すなわち全体の５％を上回っていた。整形外科的外傷の分野は、有意に高い感染率に見舞われている。開放骨折（骨が皮膚および軟組織を傷つける骨折）では、感染の発症は、３０％を上回る場合がある。外傷患者の全体的な感染率は極めて高く、具体的な発生は、骨折の種類に依存する。
【０００４】
さらに、この感染率は、戦闘中に受ける外傷性の四肢傷害および発展途上国においては、劇的に増加する。予防的抗生物質投与、外科的創面切除および灌注、ならびに外科手術後の抗生物質レジメンを含む感染治療における多くの戦略にもかかわらず、感染した整形外科用デバイスは、典型的に、除去、すなわち「外植」しなければならない。
【０００５】
これらの１ステップまたは２ステップの再置換術は、治癒時間の長期化、医療費の増加、および良好な術後予後の減少を意味する。整形外科的外傷の分野における最も大きな進行中の課題の１つとして、細菌感染の率および結果として生じる病的影響を低下させることが残っている。
【０００６】
有効な感染治療に立ちはだかる主な要因の１つは、感染組織および／または整形外科用埋込片に付着する細菌膜のコーティングである細菌バイオフィルムの形成である。バイオフィルム形成は、４ステップのプロセスとして進行する：１）細菌壁がまず付着し、２）複数の細胞層に細胞が凝集および蓄積し、３）バイオフィルムが成熟し、４）細胞がバイオフィルムから離れてプランクトン様（浮遊）状態になり、別の場所で新しいバイオフィルム形成が開始される。続いて、緊密に結合した細菌集団の複合体ができ、この複合体は、細胞間のシグナル伝達を示し、強力な細胞外ポリマーマトリックス内に存在している。
【０００７】
バイオフィルムは、細菌を、抗生物質処置に対してより耐性にし、細菌に感染再発を起こさせる。バイオフィルムは根絶が難しく、これは、ほとんどの抗生物質は、バイオフィルム表面を貫通することができず、主要な攻撃ラインが弱まるためである。さらに、バイオフィルムは、封入されている細菌を、宿主の免疫系の多くの作用に対して耐性にする。バイオフィルムを中心とした埋込片の感染に対抗するために、抗感染性または感染抵抗性の埋込片材料を含む、新しい治療戦略が開発されている。抗付着特性をもたせるように生物材料表面を修飾すること、材料に抗微生物物質をドープすること、抗付着効果と抗微生物効果を組み合わせること、またはバイオフィルム形成に対抗し、骨の修復を補助する材料を設計することを通じて、バイオフィルム形成を、著しく低下させることができる。
【０００８】
感染治療における進歩にかかわらず、骨折の管理および治療における最も包括的問題の１つは、微生物汚染または感染の高速かつ正確な特定および定量化の必要性である。感染の診断には、標準的な細菌単離および培養、ならびに分子処理技法を含め、複数の利用可能な臨床的選択肢が存在する。標準的な単離および培養方法では、罹患領域から複数の部位からのスワブ試料を採取し、研究室においてプレートで培養し、単離する。しかしながら、スワブした試料またはバイオフィルム付着細菌の量が限定されていると、検出の可能性が低下し、偽陰性の結果をもたらす可能性がある。
【０００９】
細菌スワブは、研究室において成長および培養されるため、処理中の複数の原因（例えば、外科医、技師、他の試料、研究室環境）による汚染が起こり得る。重要なことに、外植片における細菌のコロニー形成の存在、付着、および種を判定するための分析は、細菌種が成長する期間次第では数日かかる場合がある。誤っている可能性のある結果に加えて、処置から診断までのこの時間差は、現在の治療計画の有効性に悪い影響を及ぼす。
【００１０】
あまり一般的に用いられない別の診断試験は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ分子試験であり、これは、細菌１６Ｓ分子マーカーの分析および配列決定に基づいて病原体を特定する。この技法は、高いレベルの特定正確性および特異性を有することがわかったが、これらの試験は、広く利用できるものではなく、種の特定は、細菌の配列決定および種に特異的なプライマーを必要とする。さらに、分子プローブは、対象とされる抗体療法のインビボでの成功または失敗を予測する、感受性試験を提供しない。リアルタイムＰＣＲなどのゲノムプローブは、単離に依存し、汚染しやすく、数時間から数日間の期間の応答時間を有する。さらに、これらの試験は、従来的な細菌培養および単離技法よりも高価であることがわかっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
任意の埋込片が任意の再置換術のプロセス中に除去される場合、感染が存在するかどうかを認識することが重要である。整形外科用外植片における微生物コロニー形成およびバイオフィルム形成の検出および定量化のための臨床的に関連する高速なアッセイ（視覚的または化学的またはそれ以外）の開発は、外科手術の時点で治療介入を決定するために重要である。現在のところ、細菌の存在のリアルタイムの検出を可能にする、信頼できる高速な診断ツールは存在しない。
【００１２】
例えば、高倍率視野１つ当たりの細胞数を計数することは、信頼できないことがよく知られており、ポリメラーゼ連鎖反応研究（ＰＣＲ）は、依然として、完了までに何時間もかかる。研究室培養は、結果を得るまでに数日または数週間かかることがあり、汚染が存在するかどうかは正確でない可能性がある。
【００１３】
したがって、感染した可能性のある外植片、組織表面、骨セメントなどにおける細菌のリアルタイム検出を可能にする高速な診断ツールに対する必要性が残っている。好ましいことに、本システムおよび方法は、既に病院環境に典型的に存在しているか、またはそこで利用可能である、既存の機器および材料を利用する。本システムおよび方法はまた、感染した可能性のある外植片および組織表面における細菌のバイオフィルム形成の検出および特徴付けを行うことができ、また正確に行う。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本主題の技術は、既知の感染を有する整形外科的外傷患者から外植したハードウェアの表面上に形成される細菌バイオフィルムの視覚化、特徴付け、および定量化を展開する。蛍光コンジュゲート細菌抗体（ＦＣＢＡ）および共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）の技法を用いることにより、本主題の技法は、除去の時点で、整形外科用ハードウェアの表面上の細菌の存在を特定するためのより迅速な視覚的手段を提供する。
【００１５】
蛍光コンジュゲート細菌抗体は、多様な種類の細胞を特定するのを免疫系の生理学的教示に頼っている。宿主の免疫系から採取および精製された抗体（特定の病原体に特異的である）は、所与の試料に導入されると、宿主の体内と同じように、病原体に付着する。これらの一次抗体を、蛍光色素にコンジュゲートされた「二次抗体」で標識する。一次抗体への二次「蛍光色素」の結合が、免疫蛍光染色の基礎を形成する。二次抗体（特定の一次抗体に特異的である）が、特定の病原体に付着した一次抗体に付着した後に、その試料を、ＣＬＳＭで撮像し、分析することができる。
【００１６】
共焦点レーザー走査顕微鏡は、暗視野集光装置および紫外線光源と一致して、標準的な顕微鏡からなる。連続的なＵＶレーザーにより、使用される様々な二次蛍光色素抗体の吸収波長と一致した、異なる波長の光を試料ステージに提供する。この特異性により、（異なる波長の二次蛍光およびその後の特定によって、単一の試料に対する複数種類の種を差別的特定が可能となる。ＣＬＳＭの別の利点は、典型的な顕微鏡の従来的な２Ｄ画像の捕捉とは対照的に、試料を三次元的に撮像する能力である。共焦点顕微鏡は、試料の奥行方向における「ｚ」切片画像を撮ることができる。これにより、外植片全体または試料全体の合成三次元レンダリングが可能となり、これにより、存在する細菌性の位置、複雑性、対象範囲、および組成に関する重要な情報を提供する。
【００１７】
本主題の技術は、ＦＣＢＡおよびＣＬＳＭの能力を用いて、細菌種を効果的かつ正確に標識し、特定する。グラム染色試験は、細菌種間を区別するための基礎的な方法であり、ＦＣＢＡアッセイにおいて差別的細菌特定の基礎を形成している。この概念を証明するために、黄色ブドウ球菌をグラム陽性細菌として使用し、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）をグラム陰性細菌として研究した。これらの細菌を、それぞれ、ガラス底のウェルプレートに標準濃度で播種し、本主題の技術に従ったプロトコルによって培養し、固定する。細菌を、次いで、それぞれにグラム陽性またはグラム陰性のＦＣＢＡで標識し、ＣＬＳＭで分析する。
【００１８】
グラム陽性菌およびグラム陰性菌の共培養も、同じウェルプレートで行うことができる。本主題の技術は、グラム陽性抗体およびグラム陰性抗体を用いて、グラム陰性ＦＣＢＡがグラム陰性種のみを標識し、グラム陽性ＦＣＢＡがグラム陽性種のみを標識したことを確実にする。本主題の技術による方法およびシステムは、同じ試料中のグラム陽性種とグラム陰性種との区別を同時に行うことができ、この試料は、広範な種類の外植片であり得る。本主題の技術は、外植片および組織における細菌バイオフィルムを定量化し、それによって、外科手術の最中および後の両方において、医師の介入および治療レジメンを決定するのを補助することができる。
【００１９】
一実施形態は、外植片における細菌コロニー形成およびバイオフィルム形成を視覚化および定量化するための方法を対象とし、この方法は、外植片をＰＢＳブロッキング緩衝液および１％ウサギ血清（ＲＳ）の第１の溶液で続けて少なくとも１回洗浄するステップと、第１の期間、グラム陽性およびグラム陰性の両方のコンジュゲート抗体適用するステップと、外植片をＰＢＳおよび１％ＲＳで続けて少なくとも１回洗浄するステップと、第２の期間、グラム陽性およびグラム陰性の両方の二次抗体を導入するステップと、ＰＢＳブロッキング緩衝液および１％ＲＳですすぐステップと、外植片をグラム陽性およびグラム陰性の付着に関して共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）で確認するステップと、を含む。本方法は、ステップ１）および３）の少なくとも１回の洗浄が、それぞれ３回であり、第１および第２の期間が、それぞれおよそ１５分間であるようなものであってもよい。
【００２０】
外植片は、光誘起損傷および光退色を予防するために、これらのステップの１つ以上の間スズ箔を巻き付けてもよい。細菌プレートにおいて複数回抗体希釈試験を反復することは、グラム陽性およびグラム陰性の一次および二次の抗体型の間で確実に蛍光のバランスを取って、ぼやけを最小限に抑えるために行われ得る。３０ｒｐｍなどの緩徐な洗浄効果のために、ロッキング装置で、外植片をキット内に保持してもよい。また、ＣＬＳＭからの画像を、外植片の表面の三次元レンダリングに配置することもできる。
【００２１】
本主題の技術の別の実施形態は、外植片における細菌コロニー形成およびバイオフィルム形成を視覚化および定量化するための方法を対象とする。本方法は、外植片を、ＰＢＳブロッキング緩衝液および１％ウサギ血清（ＲＳ）の第１の溶液で続けて少なくとも１回洗浄すること、ならびに第１の期間、５０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および５０％ＲＳの第２の溶液でブロッキングすることを含む。グラム陽性およびグラム陰性の両方の一次抗体を、第２の期間導入する。次いで、外植片をＰＢＳブロッキング緩衝液および１％ＲＳで続けて少なくとも１回洗浄する。グラム陽性およびグラム陰性の両方の二次抗体を、第３の期間導入した後、ＰＢＳブロッキング緩衝液および１％ＲＳですすぐ。このように調製した後、この外植片を、グラム陽性およびグラム陰性の付着に関して、共焦点レーザー走査顕微鏡で確認することができる。本方法は、ステップにおける少なくとも１回の洗浄が、それぞれ３回であり、第２および第３の期間が、それぞれおよそ１５分間であるようなものであってもよい。
【００２２】
本主題の技術は、限定することなく、プロセス、装置、システム、デバイス、現在知られている用途およびこれから開発される用途のための方法、またはコンピュータ可読媒体を含む、様々な手段で実装および利用され得ることを理解されたい。本明細書に開示されるこれらおよび他の固有な特徴は、以下の説明および添付の図面から、より容易に明らかとなろう。
【００２３】
以下の図面への参照がなされてもよく、それにより、本開示のシステムが属する技術分野の当業者であればそれを作製および使用する方法を容易に理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ】ネジ外植片の画像である。
【図１Ｂ】ネジ頭外植片の画像である。
【図１Ｃ】骨セメント外植片の画像である。
【図２Ａ】本主題の開示による図１Ａの外植片の共焦点顕微鏡画像である。
【図２Ｂ】本主題の開示による図２Ｂの外植片の共焦点顕微鏡画像である。
【図２Ｃ】本主題の開示による図２Ｃの外植片の共焦点顕微鏡画像である。
【図３Ａ】本主題の開示による、グラム陽性菌およびグラム陰性菌の概略図である。
【図３Ｂ】本主題の開示による、グラム陽性菌およびグラム陰性菌の概略図である。
【図４Ａ】本主題の開示による、直接的ＩＦ染色および間接的ＩＲ染色の標識プロセスを示す図である。
【図４Ｂ】本主題の開示による、直接的ＩＦ染色および間接的ＩＲ染色の標識プロセスを示す図である。
【図５】共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）のシステムである。
【図６】本主題の開示による、緑色（励起４９２ｎｍ−放出５１８ｎｍ）を示す例示的なグラム陽性フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）であり、グラム陰性のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒは、赤色（励起５７８ｎｍ−放出６０３ｎｍ）を示す。
【図７Ａ】本主題の開示による、観察された真核生物染色の飽和決定閾値である。
【図７Ｂ】本主題の開示による、図７Ａの可視球菌の緑色チャネルのグレースケールである。
【図８Ａ】本主題の開示による、培養、固定、ＣＬＳＭ調製、および撮像が成功した細菌プレートの画像である。
【図８Ｂ】本主題の開示による、培養、固定、ＣＬＳＭ調製、および撮像が成功した細菌プレートの画像である。
【図９】本主題の開示による、バイオフィルム成長の可能性に関して分析することができる、ネジにおける様々な位置でのネジの画像である。
【図１０Ａ】本主題の開示による、存在している細菌量を示すＣＬＳＭ画像である。
【図１０Ｂ】本主題の開示による、存在している細菌量を示すＣＬＳＭ画像である。
【図１０Ｃ】本主題の開示による、標本の表面の完全な三次元レンダリングに配置された複数のＣＬＳＭ画像である。
【図１１Ａ】ＣＬＳＭ自己蛍光現象を呈するチタンおよびステンレス鋼のネジ頭からのＣＬＳＭ画像である。
【図１１Ｂ】ＣＬＳＭ自己蛍光現象を呈するチタンおよびステンレス鋼のネジ頭からのＣＬＳＭ画像である。
【図１２Ａ】本主題の技術による、ネジ頭から得られた画像の特徴付けである。
【図１２Ｂ】本主題の技術による、黄色ブドウ球菌サイズの球菌の全体的な範囲によって示されるＣＬＳＭ画像におけるグラム陽性感染の証拠である。
【図１２Ｃ】本主題の技術による、全ＦＣＢＡアッセイの実行時のぼやけおよび自己蛍光の課題を示すＣＬＳＭ画像である。
【図１３Ａ】本主題の技術による、緑色チャネル、赤色チャネル、および両方のチャネルに青色染色（ＤＡＰＩ）を加えた複合物での試料のＣＬＳＭ画像である。
【図１３Ｂ】本主題の技術による、緑色チャネル、赤色チャネル、および両方のチャネルに青色染色（ＤＡＰＩ）を加えた複合物での試料のＣＬＳＭ画像である。
【図１３Ｃ】本主題の技術による、緑色チャネル、赤色チャネル、および両方のチャネルに青色染色（ＤＡＰＩ）を加えた複合物での試料のＣＬＳＭ画像である。
【図１３Ｄ】本主題の技術による、緑色チャネル、赤色チャネル、および両方のチャネルに青色染色（ＤＡＰＩ）を加えた複合物での試料のＣＬＳＭ画像である。
【図１３Ｅ】本主題の技術による、緑色チャネル、赤色チャネル、および両方のチャネルに青色染色（ＤＡＰＩ）を加えた複合物での試料のＣＬＳＭ画像である。
【図１３Ｆ】本主題の技術による、緑色チャネル、赤色チャネル、および両方のチャネルに青色染色（ＤＡＰＩ）を加えた複合物での試料のＣＬＳＭ画像である。
【図１３Ｇ】本主題の技術による、緑色チャネル、赤色チャネル、および両方のチャネルに青色染色（ＤＡＰＩ）を加えた複合物での試料のＣＬＳＭ画像である。
【図１３Ｈ】本主題の技術による、緑色チャネル、赤色チャネル、および両方のチャネルに青色染色（ＤＡＰＩ）を加えた複合物での試料のＣＬＳＭ画像である。
【図１３Ｉ】本主題の技術による、緑色チャネル、赤色チャネル、および両方のチャネルに青色染色（ＤＡＰＩ）を加えた複合物での試料のＣＬＳＭ画像である。
【図１４Ａ】本主題の技術による、不適切に強力なグラム陰性抗体の適用によるＭＳＳＡの蛍光画像である。
【図１４Ｂ】本主題の技術による、不適切に強力なグラム陰性抗体の適用によるＭＳＳＡの蛍光画像である。
【図１５Ａ】本主題の技術による、細菌共培養物におけるグラム陰性抗体アッセイ操作のＣＬＳＭ画像である。
【図１５Ｂ】本主題の技術による、細菌共培養物におけるグラム陰性抗体アッセイ操作のＣＬＳＭ画像である。
【図１６Ａ】本主題の技術による、グラム陰性希釈係数のさらなる調整を除いて図１５Ａおよび１５Ｂの試料画像と同じアッセイプロトコルを用いて調整した共培養物研究画像である。
【図１６Ｂ】本主題の技術による、グラム陰性希釈係数のさらなる調整を除いて図１５Ａおよび１５Ｂの試料画像と同じアッセイプロトコルを用いて調整した共培養物研究画像である。
【図１７】本主題の技術による、２０％ウサギ血清を添加した、成功した共培養物アッセイの画像である。
【図１８】本主題の技術による、２０％ウサギ血清を添加した、成功した共培養物アッセイの画像である。
【図１９】本主題の技術による、真核生物および二種細菌種モデル画像の画像である。
【図２０】本主題の技術による、５０％ウサギ血清を用いた、真核生物および二種細菌種アッセイ作業の画像である。
【図２１】本主題の技術による、様々なＣＬＳＭ画像である。
【図２２】本主題の技術による、様々なＣＬＳＭ画像である。
【図２３】本主題の技術による、様々なＣＬＳＭ画像である。
【図２４】本主題の技術による、様々なＣＬＳＭ画像である。
【図２５】本主題の技術による、様々なＣＬＳＭ画像である。
【図２６】本主題の技術による、様々なＣＬＳＭ画像である。
【図２７】本主題の技術による、自動分注のための事前にパッケージ化された試薬を有する標準的なマイクロプレート２００の概略上面図が示されている。マイクロプレート２００には、本明細書に企図される任意の方法のための試薬が含まれ得る。
【図２８】本主題の技術による、外植片アッセイの一部としての特注プレートの概略上面図である。
【図２９】本主題の技術による、外植片を配置した外植片アッセイキットの一部としての特注プレートの概略上面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本主題の技術により、外植片における微生物コロニー形成およびバイオフィルム形成の定量化および特徴付けと関連する先行技術の問題の多くが克服される。本明細書に開示されるシステムの利点および他の特徴は、本発明のそれぞれの実施形態について記載している図面と併せて、以下のある特定の好ましい実施形態の詳細な説明から、当業者にはより容易に明らかとなろうが、ここで、同様の参照番号は、同様の構造的要素を特定する。上、下、上方、下方、左、および右など、図面への参照は、図面に対するものであり、限定する意味ではないことが理解される。
【００２６】
ここで、図１Ａ〜Ｃを参照すると、典型的な外植片が示されている。図１Ａは、ネジ１００の上部である。図１Ｂは、ネジ頭１０２である。図１Ｃは、ポリメチルメタクリレート骨セメントの断片１０４である。ここで図２Ａ〜Ｃを参照すると、それぞれ、本明細書の方法を適用した後に図Ａ〜Ｃの外植片それぞれについて取得した共焦点レーザー走査顕微鏡写真である。図２Ａ〜Ｃは、真核生物細胞標識に関してはＤＡＰＩ（青色）、ＦＩＴＣコンジュゲートグラム陽性抗体（緑色）、およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒコンジュゲートグラム陰性抗体で標識されており、重度の細菌コロニー形成を示している。
【００２７】
共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）用に外植片を調製するための複数の方法を、以下に記載する。１つの方法は、蛍光コンジュゲート抗体（ＦＣＢＡ）を使用する。外植片を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｏｆ  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬから入手可能）およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｏｆ  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ  ＮＹから入手可能）にコンジュゲートしたグラム陽性抗体およびグラム陰性抗体で標識する。４’，６’ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を使用して、真核生物組織を特定した（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｏｆ  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬから入手可能）。グラム陰性菌種（例えば、多剤耐性アシネトバクター・バウマンニ）およびグラム陽性種（例えば、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌）を、抗体希釈物およびロット品質を確立するための陽性対照として、ガラス底のウェルプレートで培養し、固定し、共焦点分析のために標識した。反復試験を通じて、時間効率ならびにそれぞれ個別の試料の種類（例えば、ネジ、プレート、およびポリメチルメタクリレート断片）の明瞭な視覚化および特徴付けに関して、さらに最適化した。細菌の定量化は、ＣＬＳＭ結果の考察に基づいて決定した。
【００２８】
確認できるように、細菌コロニー形成およびバイオフィルム形成の視覚化および定量化をおよそ１時間以内に行うことができる臨床関連の高速検出アッセイが、市販の蛍光コンジュゲート抗体および共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して、開発された。この方法は、外植片のＣＬＳＭ用調製および撮像により、高速かつ正確なものをもたらし得、外植片感染の判定は、従来の培養／ポリメラーゼ連鎖反応に基づく技術のわずか一部の時間で行われる。
【００２９】
本主題の技術を使用することにより、細菌バイオフィルムが、ネジ頭の溝および隣接するネック部内、ならびに骨セメントの不規則な表面内の組織など、主にどこに位置しているかを判定することができる。整形外科用ハードウェアの複雑な微細構造内での細菌コロニー形成の視覚化および定量化は、高速かつ正確である。本主題の技術は、外科医にフィードバックを提供するために外科手術中に実行され得ることが想定される。そのため、外科医は、全身レベルの処置により良い結果を祈るのではなく、存在する感染の特定の領域および種類を標的とするように、感染と戦う治療法を調整することができる。
【００３０】
有利なことに、整形外科用埋込片に存在する微生物の検出のための本主題の方法は、培養物中に現れるのに数日かかり得るプロピオニバクテリウム・アクネスのような成長の遅い細菌では偽陰性の結果をもたらしやすい埋込片の周囲の組織からの細菌培養の成功を必要とするものではない。本主題の技術は、高速検出方法の開発の基盤を提供し、この方法は、患者がまだ手術台にいる間に外科医が一連の措置を決定することができるように、短い試料取得時間で視覚データを提供するであろう。まとめると、本明細書に教示される整形外科外植片における微生物コロニー形成およびバイオフィルム形成の視覚化および定量化のための臨床関連の高速検出アッセイの開発は、整形外科の治療介入を改善し、感染の診断を促進し、患者の予後を大いに向上させるであろう処置を改良することにおいて極めて重要であることが判明するであろう。
【００３１】
細菌の分類：グラム染色
【００３２】
グラム試験は、細菌分類の２つの主な群である、グラム陽性種とグラム陰性種とを区別する能力のため、微生物学において用いられる染色である。グラム試験により、臨床医が、２つの主な細菌クラスを区別し、初期診断を展開し、細菌における本質的な違いに基づいて治療を開始することが可能となる。これらの２つの種の間の構造上の違い（および続いて細菌の分類に基づいてなされる臨床判断）が、本主題のＦＣＢＡ法およびＣＬＳＭ法の分子的根拠を形成する。
【００３３】
グラム試験には、標本の固定が含まれる。標本を（熱またはアルコールによって）スライドに固定した後、試料をクリスタルバイオレット染料に曝露し、ヨウ素を添加して、一次染料との複合体を形成させる。続いてアルコールで脱色する間に、このクリスタルバイオレット複合体は、グラム陽性菌には保持されるが、グラム陰性菌では失われる。この脱色のため、サフラニン染料でグラム陰性菌を対比染色すると、細菌は赤色になる。染色におけるこの違いは、これら２種類の細菌の細胞壁構造、構成要素、および機能の違いに起因する。グラム陽性菌については、最初のクリスタルバイオレット染料は、ペプチドグリカン層と呼ばれる厚く架橋したメッシュ様の構造に閉じ込められる。グラム陰性菌は、染料を保持することができない薄いペプチドグリカン層を有し、そのため細胞は、サフラニン染料を導入すると、赤色に対比染色される。
【００３４】
グラム陽性種とグラム陰性種との間の構造上の違いに関する背景、ならびに調査に使用した２つの特定の細菌生物の詳細について、探求する。グラム陽性菌とグラム陰性菌との違いは、蛍光コンジュゲート抗体により異なって標識および特定する能力についての情報を与えるたけでなく、整形外科感染におけるこれらの異なる種の疫学的視点および臨床処置に関する見識も提供する。
【００３５】
ここで図３Ａおよび３Ｂを参照すると、グラム陽性菌およびグラム陰性菌の概略図が、それぞれ、違いを図示して示されている。図３Ａにおいて、グラム陽性菌は、厚い架橋したペプチドグリカン層からなり、タイコ酸およびリポタイコ酸が散在している。リポタイコ酸、すなわちＬＴＡは、グラム陽性ＦＣＢＡ抗体が結合するものである。図３Ｂにおいて、グラム陰性菌は、薄いペプチドグリカン層と、リポ多糖、リン脂質、およびタンパク質を含有する外側膜とからなる、より複雑な細胞壁を有する。グラム陰性一次ＦＣＢＡは、グラム陰性細胞壁に含有されているリポ多糖（ＬＰＳ）に結合する。
【００３６】
グラム陽性菌種：背景
【００３７】
グラム陽性菌は、メッシュ様の外骨格として原形質膜を包囲する厚いペプチドグリカン層を有する。ペプチドグリカンは、ペプチド架橋によって架橋したＮ−アセチルグルコサミンおよびＭ−アセチルムラミン酸グリカン鎖からなる。この堅強な構成は、細胞の構造、ならびに環境からの保護を提供する。ペプチドグリカン層はまた、テコン酸（ｔｅｃｈｏｉｃ  ａｃｉｄ）およびリポテコン酸（ｌｉｐｏｔｅｃｈｏｉｃ  ａｃｉｄ）も含む。テコン酸は、ポリリビトールリン酸（ｐｏｌｙｒｉｂｉｔｏｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）およびグリセロールリン酸からなり、これらは、細胞生存に非常に重要な水溶性ポリマーである。リポテイン酸（Ｌｉｐｏｔｅｉｃ  ａｃｉｄ）は、脂質が結合したタイコ酸であり（例えば、リポテイン酸は脂肪酸成分を含有する）、原形質膜に固定される。これらの化合物のいずれも、ペプチドグリカン層に結合し、細胞壁の強度、カルシウム隔離、および本質的な宿主保護活性化を担う。さらに、これらの化合物は、細菌種を区別する一般的な表面抗原であり、哺乳動物細胞表面への結合（付着）を促進する。グラム陽性細胞の構造および機能の肝要な態様であることの他にも、リポテイン酸は、グラム陽性菌特定のためのアッセイの一次抗体（グラム陽性菌ＬＴＡ抗体）がグラム陽性生物のペプチドグリカン細胞壁内のリポテイン酸を標的とするため、さらなる重要性を持つ。
【００３８】
実験的グラム陽性種：黄色ブドウ球菌
【００３９】
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）が、本主題の技術のインビトロ対照および検証研究に用いたグラム陽性菌種である。選択されたグラム陰性種とともに、黄色ブドウ球菌の培養物を使用して、グラム陽性菌を正確に標識するためのＦＣＢＡおよびＣＬＳＭの実行可能性を調査し、希釈物および抗体標識手順に対するプロトコルの修正形を試験した。黄色ブドウ球菌は、生体材料関連の感染の主要な原因であり、術後の予後が芳しくないことおよび再置換術の主な要因でもある。骨髄炎における様々な細菌株の蔓延を調査するいくつかの研究において、ブドウ球菌種（特に、黄色ブドウ球菌）が、最も一般的に単離された生物であった。
【００４０】
黄色ブドウ球菌の高い感染率は、多因子の問題である。黄色ブドウ球菌は、開放骨折の場合、傷害時に創傷部位が外部環境に曝露されることにより、その部位にコロニーを形成し、付着し、結果としてそこに感染し得る。さらに、これらの生物は、厚いペプチドグリカン層のためおよび外側膜の欠如のために、乾燥した表面上で長期間生存することができる。したがって、ブドウ球菌は、皮膚およびヒト粘膜表面に通常に見出される外部環境において一般的であり、手術中に外科医、埋込片、または手術具を介して骨折部位に導入される可能性がある。「健常な成人のおよそ１５％が、黄色ブドウ球菌を鼻咽頭に持続的に保持しており、入院患者、医療従事者、湿疹性皮膚疾患を有する者、および不法的または医療上の理由で定期的に針を使用する者では、より高い発生が報告されている。
【００４１】
広汎性に加えて、黄色ブドウ球菌は、菌を組織および外来体、例えば埋込片に効果的に結合する単糖、タンパク質、および小分子ペプチドのバイオフィルムを生成することができる。整形外科的外傷患者は、特に高い感染の危険性にある。黄色ブドウ球菌は、整形外科感染において極めて広汎性の高い種である。したがって、黄色ブドウ球菌は、本主題の技術であるグラム陽性菌抗体標識技術の正確性および有効性を調査するためのグラム陽性種として優れた候補である。
【００４２】
目的のインビボグラム陽性菌種：プロピオニバクテリウム・アクネス
【００４３】
整形外科感染における別の一般的に遭遇する菌は、プロピオニバクテリウム・アクネスであり、これは、肩の手術において特に高い感染率を有する。プロピオニバクテリウム・アクネスはまた、検出が困難でもある。プロピオニバクテリウム・アクネスは、真皮層の毛包における常在菌叢として生存している、嫌気性で成長が遅いグラム陽性桿菌である。プロピオニバクテリウム・アクネスは、頭部および肩の領域に広く見出され、肩の皮膚の周囲で濃度が高いため肩関節形成術および切開型肩処置における術後感染の原因となる主な病原体として関連付けられている。プロピオニバクテリウム・アクネスは、肩手術における術後感染のうちの５０〜８６％の原因となっている可能性がある。
【００４４】
プロピオニバクテリウム・アクネスは、皮膚層深くに嫌気的に生存しているため、術後の滅菌方法では、内在する細菌を殺滅させることができず、外科手術の開始時に創傷部位への細菌導入をもたらし得る。プロピオバクテリウム感染においては、２つの出現型が一般的であり、これらはいずれも臨床上の問題がある。１つの出現型は、急性および化膿性（滲出液産生性）であり、もう１つの出現型は、ゆっくりとした埋込片の緩み、および手術失敗をもたらす遅延型（例えば、外科手術の数年後）である。高い感染率という課題をもたらすため、プロピオバクテリウム・アクネスの治療後の予後もまた、極めて芳しくない。一調査では、肩回旋筋腱板修復後のプロピオバクテリウム・アクネスの外科手術および抗生物質処置の後、患者の３８％が、平均８年で不満足の結果を報告した。
【００４５】
可能性のあるプロピオバクテリウム・アクネス治療における問題は、予防的および直接的に、単純に手術部位を侵し、感染を引き起こすプロピオバクテリウム・アクネスの能力を越えて発展している。プロピオバクテリウム・アクネスは、おそらく、従来的な「培養および単離」の感染試験方法を用いて正確に単離および特定するのは、さらにより困難である。プロピオバクテリウム・アクネスは、低い病毒性を有し、特定に必要な非従来的微生物試験は、この生物の共同コロニー形成の過小報告をもたらしている。グラム染色では、臨床培養物におけるプロピオバクテリウム・アクネスの特定が信頼できず、偽陰性結果をもたらすことがわかっており、これが術後予後に重大な影響を及ぼす。菌が、研究室において適切に培養され、単離され、成長したとしても、成長が現れるまでに数日かかり、コロニーが発達するまでには数週間かかり得る。さらに、試料の汚染がよく生じる。皮膚で通常見られる生物による標本の汚染を回避するように注意しなければならない。外科手術、術後処置、および感染検出においてプロピオバクテリウム・アクネスが問題を引き起こすため、本主題の技術は、創傷部位および／または整形外科用ハードウェアにおけるプロピオバクテリウム・アクネスの細菌コロニー形成を高速かつ正確に特定する方法における重要な改善点である。
【００４６】
肩の外科手術は、関節鏡検査であるか切開術であるかにかかわらず、グラム陽性菌および／またはグラム陰性菌のコロニー形成検出のための高速検出アッセイの開発にとって、固有の問題および原理証明の機会を提供する。単純に培養物を研究室に提出し、結果を数日待つのではなく、周囲組織または外植片を研究室に提出して約３０分以内に、患者の周囲組織、ハードウェア、または創傷の感染状況を正確に伝えることができる本主題の技術による試験から、外科医は大いに利益を得るであろう。この非常に有益な情報により、外科医は、患者がまだ手術台にいる間に、１段階もしくは２段階の再置換として進めるかどうか、灌注および創面切除をどれくらい行うか、ならびに／またはどの抗生物質レジメンを処方するかなど、情報に基づいた処置決断を行うことが可能となる。
【００４７】
グラム陰性菌種：背景
【００４８】
グラム陰性菌の細胞壁は、グラム陽性細胞のものよりも複雑である。厚い細胞外ペプチドグリカン層とは対照的に、グラム陰性細胞壁は、原形質膜の外側に２つの層を含有する。原形質膜に直近して、薄いペプチドグリカン層が包囲しており、これは、重量基準で細胞壁の５〜１０％のみを含む。ペプチドグリカン層の外側には、外側膜があり、これは、周縁質空間と呼ばれるペプチドグリカン層と膜層との間の空間に外層膜を提供する。周縁質空間は、イオンおよび代謝産物、ならびに代謝酵素の混合物のための輸送システムの構成要素を含有する。グラム陰性菌に固有な外側膜は、細菌構造を維持し、より大きな分子に対する透過性障壁として機能する。この外側層は、主に、リポ多糖、すなわちＬＰＳから構成され、このＬＰＳは、抗体標識システムにとって極めて重要である。ＬＰＳ（およびそれが構成する外側膜）は、グラム陰性菌に固有であるため、これは、グラム陰性種の標識を担う一次細菌抗体の理想的な標識分子として機能する。一実施形態において、グラム陰性菌は、グラム陰性細胞の外側膜内のＬＰＳを効果的に標的とし、それに結合する。さらに、グラム陰性ペプチドグリカン層も外側膜も、タイコ酸またはリポタイコ酸を含有しない。グラム陰性細胞およびグラム陽性細胞のこれらの個別化された特徴のため、特異的な抗体標識を、グラム分類間で標識が重複または「混在」することなく、それぞれの種に対して達成することができる。
【００４９】
実験的グラム陰性種：アシネトバクター・バウマンニ
【００５０】
一実施形態において、黄色ブドウ球菌と実験上のグラム陰性同等物であるアシネトバクター・バウマンニを、ＦＣＢＡ希釈試験、ならびにプロトコル検証、問題の解決、および改良に用いるグラム陰性対照種として選択した。抗体標識実験を可能にするために、ガラス底のウェルプレートに、標準濃度の菌を播種し、培養し、固定した。アシネトバクター・バウマンニは、その広汎性および抗生物質耐性に起因して、急速に、院内の整形外科感染における目立った懸念となっている。アシネトバクターは、ヒトの皮膚など、湿潤および乾燥のいずれの表面でも生存することができ、これはグラム陰性桿状菌には珍しい特徴である。これらの細菌はまた、一部の健常な人物の中咽頭の常在菌叢の一部であり、入院時には大量に増殖し得る。
【００５１】
アシネトバクターは、呼吸器、泌尿器、および創傷部において感染を引き起こす日和見病原体であり、これらの感染により、敗血症が生じる場合がある。多くのアシネトバクター・バウマンニ感染は、ほとんどの抗生物質に対して耐性な株によって引き起こされるため、これらの院内での創傷感染は、特に問題である。多くのグラム陰性感染の最後の手段である薬物での治療に耐性の全耐性株が報告されている。
【００５２】
一般人の整形外科的外傷だけでなく、アシネトバクターは、軍事行動においてさらに大きな脅威である。戦闘時には、四肢が傷害の最も一般的な部位であることが続いており、高い割合で感染性合併症を伴う。四肢傷害を有する多くの患者は、骨髄炎を発症し、それらの感染の多くは、逆行または再発する。それらの創傷部に感染する細菌には、アシネトバクター・バウマンニなどの多剤耐性菌が含まれていた。整形外科感染においてグラム陰性病原体が関与することが顕著になるにつれ、アシネトバクター・バウマンニが、臨床的に関連のあるグラム陰性生物としての役割に効果的に一致した。このため、アシネトバクター・バウマンニを、本主題の技術の試験および改良に使用した。
【００５３】
蛍光コンジュゲート細菌抗体
【００５４】
本主題の技術による方法、標的細胞を標識し、細菌付着構築物を正確に特定するための手段としての蛍光コンジュゲート細菌抗体（ＦＣＢＡ）。本方法は、外植した整形外科用ハードウェアを、ＦＣＢＡおよび共焦点レーザー走査顕微鏡法、すなわちＣＬＳＭを用いて、細菌付着またはバイオフィルム形成の存在に関して正確かつ高速に試験することができる。これらの技術を利用して、本方法は、整形外科的外傷の外植片においてグラム陽性菌種とグラム陰性菌種とを効果的に区別することができる。
【００５５】
ＦＣＢＡ実験の基本原理として、これらの抗体がどのように動作するかに関する知識がある。蛍光を発することができる分子は、蛍光染料また蛍光色素と称される。蛍光色素が巨大分子とコンジュゲートすると、タグ化された巨大分子は、フルオロフォアを含有し、蛍光を発することができると考えられる。ＦＣＢＡ技術では、注意深く選択した蛍光色素が、細胞型の特異的標的要素に結合する細菌抗体にコンジュゲートされる。フルオロフォアと抗体とのこのコンジュゲーションは、化学反応または単純な吸収のいずれかによって達成される。蛍光色素と抗体との結合が、標識された抗体での染色の基礎を形成している。
【００５６】
ここで図４Ａおよび４Ｂを参照すると、直接的ＩＦ染色および間接的ＩＲ染色の標識プロセスを示す図が示されている。「直接的免疫蛍光染色」と称される図４Ａの第１の方法は、予め組み合わせた蛍光色素と抗体との混合物を、抗原標的を含有する試料に適用することからなる。この「コンジュゲート」ＦＣＢＡが導入され、その標的に付着すると、試料は、ＣＬＳＭでの撮像の準備が整う。「間接的染色」と称される図４Ｂの第２の方法は、まず、標識していない特異的抗血清、すなわち「一次抗体」で抗原標的を含む試料を処置することからなる。得られた抗原−抗体を、特異的抗体グロブリンに対する蛍光標識抗体である「二次抗体」の蛍光標識抗体で処置することにより、レンダリングして視覚化する。二次抗体が一次抗体に結合すると、試料は撮像準備が整う。
【００５７】
蛍光および関連する撮像現象
【００５８】
試料は、（直接法または間接法のいずれかによって）付着した抗体が蛍光を有した状態となると、撮像準備が整う。蛍光は、原子または分子による光子の放出であり、この原子または分子の電子が、外部源からの放射エネルギーによってより高い励起状態に一過的に刺激されるものである。蛍光分子が適切な波長の光子を吸収すると、電子は、より高いエネルギー状態に励起され、すぐに、その初期基底状態へと崩壊する。エネルギー崩壊のプロセスにおいて、分子は、吸収したエネルギーを蛍光光子として放出し得る。
【００５９】
蛍光は、共焦点顕微鏡の光源によって生じ、これを、続いて、捕捉し、分析する。ＦＣＢＡは、異なる波長範囲で蛍光を発するため、複数のフルオロフォアを、同じ試料において検出することができる。ＦＣＢＡの背景にある驚くべき技術にもかかわらず、いくつかの課題を克服しなければならない。本主題の技術によって克服される１つの課題としては、反応停止、光退色、ぼやけ、および自己蛍光の現象を挙げることができる。
【００６０】
反応停止および光退色のいずれも、試料における蛍光の量を低減させ、これにより、明瞭な視覚化および特徴付けが妨げられ得る。反応停止は、近接する芳香族アミノ酸との電荷移動相互作用のために生じ、一方で光退色は、光子に誘導される化学的損傷および共有結合修飾に起因する色素による蛍光の恒久的喪失を指す。反応停止を予防するためには、それぞれ個々の抗体と試料中の示される標的分子との適正な付着および結合を可能にするように注意しなければならない。光退色を予防するためには、共焦点法のための調製プロトコルの間中、試料にスズ箔を巻き付けて、抗体のいずれに対しても光誘起損傷を予防してもよい。
【００６１】
自己蛍光は、ＦＣＢＡの別の課題である。すべての細胞は、共焦点顕微鏡の光源で照射されると蛍光を発する内在性代謝物質を含有している。一部の一般的な自己蛍光源は、ビタミンＢ類、フラビン、還元型ピリジンヌクレオチド、脂肪酸、ポルフィリン、および未結合シトクロムである。これらの細胞要素（およびその他のもの）の蛍光は、顕微鏡において、バックグラウンドシグナルに追加される。一部の事例では、これらのシグナルは、蛍光タグ化分子のシグナルと間違うのに十分なほど強力である。顕微鏡下で、残留細胞要素または外科手術アーチファクトに加え、金属表面もまた、ある程度「バックグラウンド」に寄与する。可能な限り明瞭な画像を得るために、所望される標的以外の要素の蛍光を減らすためのいくつかの「ブロッキング」ステップを追加してもよい。
【００６２】
ＦＣＢＡ撮像の別の課題は、ぼやけの問題である。ぼやけは、１つの蛍光シグナル（例えば、フルオロフォア（ｆｌｏｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）からのもの）が、異なるフルオロフォアの蛍光シグナルと交差し、それに干渉する場合に生じ、試料において所望される色の間で干渉および「混在」を引き起こす。ぼやけは、細菌プレートにおいて抗体希釈試験を複数回反復して、抗体型（例えば、グラム陽性およびグラム陰性、一次および二次）の間で確実に蛍光のバランスを取ることにより最小限に抑えることができる。一次抗体および二次抗体の正しい希釈は、所望される標的における抗体特異的なタグ化および蛍光、ならびに試料中の他のＦＣＢＡのものとの混在の減少を促進する。異なる励起および放出波長、または蛍光範囲を有するそれぞれの二次抗体（蛍光コンジュゲート抗体）を選択して、試料におけるぼやけを最小限に抑えることができる。
【００６３】
共焦点レーザー走査顕微鏡
【００６４】
ここで図５を参照すると、共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）のシステムが示されている。典型的なＣＬＳＭには、蛍光顕微鏡、複数のレーザー光源、光学および電子機器を備える共焦点走査ヘッド、表示用のコンピュータモニタ、ならびに画像の取得、処理、および分析のためのソフトウェアが含まれる。ＣＬＳＭがどのように機能するかを理解することは、高速な感染検出のための有望なツールとしてのＣＬＳＭおよびＦＣＢＡの適正な理解を助ける。ＣＬＳＭの背後にある技術は複雑であるが、試料の撮像が達成可能である。
【００６５】
励起フィルタは、標本中の特定のフルオロフォアを励起するための短い波長を選択的に透過する。二色ミラーが、対物レンズおよび標本に向かって短い光を反射するが、長い波長は透過して蛍光光を検出器に戻す。このミラーはまた、標本によって反射された任意の励起波長を、フィルタおよび照射器に戻す。最後に、バリアフィルタが、すべての残りの波長を遮断する。これらのフィルタを通った蛍光波長は、次いで、眼またはカメラで結像する。
【００６６】
可能性のある細菌付着またはバイオフィルム形成に関して外植されたハードウェアを視覚化および分析するためのツールとしてＣＬＳＭを使用することには、多くの利点がある。「ｚ軸に沿って小刻みに顕微鏡の焦点を変えるモーターを使用することにより、共焦点顕微鏡では、異なる焦点面でたくさんの画像またはｚシリーズを取得し、コンピュータ・ソフトウェアを用いて標本の三次元図を生成することが可能となる。
【００６７】
外植片または組織表面の三次元レンダリング能力により、細菌付着および／またはバイオフィルムが存在するかどうか、およびどこにあるかに関する明瞭な視覚化が可能となる。ＣＬＳＭはまた、複数の蛍光波長について同時に走査することができる。さらに、ＣＬＳＭは、どのような顕微鏡画像または表面の不完全さにも関係なく、外植片表面の迅速な走査を可能にする。ＣＬＳＭソフトウェアは、所与の画像または試料における細菌量／範囲の定量化を可能にし、感染状態に関して臨床医とのより具体的な考察を可能にする可能性がある。
【００６８】
細菌細胞培養物
【００６９】
メチシリン感受性の黄色ブドウ球菌および多剤耐性アセニトバクター・バウマンニ（Ａｃｅｎｉｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）の単一のコロニーを、それぞれ、Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ培地（Ｂｅｃｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ｏｆ  Ｓｐａｒｋｓ  ＭＤから入手可能に懸濁させた。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ｏｆ  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ  ＣＡから入手可能）を使用して、細菌ストックの光学密度を取得した。無菌操作を用いて、３５ｍｍのガラス底ウェルプレート（ＭａｔＴｅｋ  ｏｆ  Ａｓｈｌａｎｄ  ＭＡから入手可能）に、１ｍＬ当たり２×１０７コロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍＬ）の標準細菌濃度で、２ｍＬ播種した。プレートを、４時間で新しいＴＳＢ培地を添加して、３７℃で２４時間インキュベートした。
【００７０】
真核生物および二種細菌の共培養
【００７１】
ヒト頭蓋冠（ｃａｌａｖａｒｉａｌ）骨芽細胞（ＨＣＯ）（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  ｏｆ  Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから入手可能）を、１０％ウシ胎児血清を補充した骨芽細胞基礎培地（ＯｂＭ−ｂ）（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  ｏｆ  Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから入手可能）で培養し、３７℃、５％ＣＯ２、加湿雰囲気において、６５％コンフルエントまでインキュベートした。ＨＣＯ細胞を、ガラス底の３５ｍｍ皿（ＭａｔＴｅｋ  ｏｆ  Ａｓｈｌａｎｄ，ＭＡから入手可能）において、５０，０００細胞／ｍＬで培養した。細菌を、２×１０７ＣＦＵ／ｍＬで添加し、２．５時間の間、付着させた。共培養物を、次いで、固定し、以下に詳述されるようにＣＬＳＭ用に調製した。
【００７２】
細菌の固定および共焦点レーザー走査顕微鏡用の調製
【００７３】
２４時間のインキュベーションノアと、細菌の３５ｍｍガラス底ウェルプレートをインキュベータから取り出し、１００％アセトン中に３０分間固定した。次いで、プレートを、１×リン酸緩衝食塩水＋１％ウサギ血清（１０×ＰＢＳ、Ｈｏｅｆｅｒ  Ｉｎｃ．ｏｆ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ＣＡから入手可能）で３回洗浄した。次いで、所望されない抗体結合／標識作用を、ブロッキングステップにより阻害した。５０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡから入手可能）＋５０％ウサギ血清の溶液を、３０分間プレートに導入し、プレートを、３０ｒｐｍでの緩徐な洗浄効果のためにロッキング装置に置いた。ブロッキングが達成された後、プレートを、以下の節に詳述されるＦＣＢＡプロトコルに従ってＣＬＳＭ用に調製した。
【００７４】
共焦点レーザー走査顕微鏡用の外植片調製アッセイ
【００７５】
試験のために、様々な組成の外植片を採取し、即座に１０％中性緩衝ホルマリン溶液中で標識するまで保管した。調製の初めに、これらの外植片をＰＢＳ＋１％ウサギ血清で３回洗浄して、ホルマリンを除去した。まず、グラム陽性ＬＴＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｏｆ  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  ＩＬから入手可能）を、グラム陽性一次抗体として、１：１００希釈で６０分間導入した。試料を、次いで、ＰＢＳ＋１％ウサギ血清で２回洗浄した。［ウサギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ断片特異的なフルオレセインコンジュゲート二次抗体］を、二次グラム陽性抗体として用い（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｏｆ  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  ＩＬから入手可能）、１：５０で６０分間導入した。試料を、次いで、ＰＢＳ＋１％ウサギ血清で２回洗浄した。［ＬＰＳグラム陰性］（Ａｃｒｉｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｏｆ  Ｈｅｒｆｏｒｄ  Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能）を、グラム陰性一次抗体として、１：１０００で６０分間用いた。ＰＢＳ＋１％ウサギ血清で２回洗浄した後、グラム陰性二次［Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５８６）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ  ＮＹ）を、１：２００で６０分間導入した。試料を、新しいＰＢＳに入れた後、ＣＬＳＭ撮像の準備が整った。図６において確認できるように、例示的なグラム陽性フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）は、緑色（励起４９２ｎｍ−放出５１８ｎｍ）およびを示し、グラム陰性Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒは、赤色（励起５７８ｎｍ−放出６０３ｎｍ）を示す。
【００７６】
共焦点レーザー走査顕微鏡用の外植片調製：高速アッセイ
【００７７】
本主題の技術は、上記に詳述されたものと同じ製品および希釈物を使用した高速検出を含む。外植片を、ＰＢＳ＋１％ウサギ血清で３回洗浄し、５０％ウサギ血清＋５０％ＢＳＡの溶液で１５分間ブロッキングする。グラム陽性およびグラム陰性の一次抗体を、溶液を均質にするために一緒にボルテックスした後、１５分間、標本に導入する。ＰＢＳ＋１％ウサギ血清で２回洗浄した後、グラム陽性およびグラム陰性の二次抗体を、溶液を均質にするために一緒にボルテックスし、１５分間、標本に導入する。抗体を導入した後、試料を新しいＰＢＳ中で洗浄し、その後でＣＬＳＭ撮像の準備が整った。
【００７８】
グラム陽性＋グラム陰性ＣＬＳＭアッセイ：４時間４５分
以下のステップを行った。
１）３×ＰＢＳ＋１％ＲＳで洗浄し、
２）ＢＳＡ＋ＲＳで３０分間ブロッキングし、
３）グラム陽性一次［グラム陽性ＬＴＡ］を１：１００で６０分間導入し、
４）２×ＰＢＳで洗浄＋１％ＲＳで洗浄し、
５）グラム陽性二次［ウサギ抗ＩｇＧ  Ｆｃ  ＦＩＴＣ］を１：５０で６０分間導入し、
６）２×ＰＢＳ＋１％ＲＳで洗浄し、
７）グラム陰性一次［ＬＰＳグラム陰性抗ヤギ］を１：１０００で６０分間導入し、
８）２×ＰＢＳ＋１％ＲＳで洗浄し、
９）グラム陰性二次［Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８］を１：２００で６０分間導入し、
１０）２×ＰＢＳ＋１％ＲＳで洗浄し、
１１）新しいＰＢＳと置き換え、共焦点法の準備が整う。
【００７９】
共焦点レーザー走査顕微鏡での視覚化および分析
【００８０】
ＣＬＳＭの準備が整うと、試料をガラススライドに置き、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ＋ＤＡＰＩ培地（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．ｏｆ  Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ  ＣＡから入手可能）を１滴乗せた。Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄは、光退色を予防し、真核生物標識のための４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を迅速に提供する。ＣＬＳＭでの視覚化および分析は、好ましくは、４０２、４８８、および５６１の波長の３つのダイオードレーザーを備えるＮｉｋｏｎ  Ｃ１ｓｉ共焦点レーザー顕微鏡を用いて行う。デコンボリューション（バックグラウンドを排除し、標本のより実物に近い画像を提供するアルゴリズム）を、Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎｉｋｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｌｖｉｌｌｅ  ＮＹから入手可能）によって行う。
【００８１】
定量化
【００８２】
ＣＬＳＭ画像を取得した後、定量化が、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ  ｏｆ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤから入手可能）を用いて達成される。画像を、緑色、赤色、および青色のチャネルに分け、これらのチャネルは、それぞれ、図７Ａおよび７Ｂに示されるように、グラム陽性、グラム陰性、および真核生物細胞の存在を示し、これらは、ＣＬＳＭ画像の蛍光シグナルによる分離である。観察された真核生物染色の飽和決定閾値が、図７Ａに示されており、可視球菌を有する緑色チャネルのグレースケールが、図７Ｂに示されている。完全に標識されている特定可能な物体を単離し、バックグラウンドおよび自己蛍光を抑えるために、各チャネル内で、飽和閾値を、各色の飽和を調節することによって決定する。閾値が選択されると、各色チャネルの範囲の相対面積が、標準偏差とともに決定される。全細胞範囲もまた、計算した。
【００８３】
結果
【００８４】
本主題の技術は、外植された整形外科用ハードウェアに存在する細菌バイオフィルムを特定し、特徴付ける視覚的手段を提供する。多くのＦＣＢＡタグ付けアプローチを利用することができる。以下の結果は、段階に分割された様々なステップを詳述し、各段階には、それぞれのステップからの特に注目すべき外植片研究が含まれる。
【００８５】
個別に培養し、固定したメチシリン感受性黄色ブドウ球菌および多剤耐性アシネトバクター・バウマンニのプレートを、試験に用いた。これらの細菌プレートは、テンプレートを提供するものであり、本主題の方法を最適化するために細菌濃度、抗体希釈強度、および標識時間に対する修正を研究し、評価することができる。次いで、外植片を、確立されたＣＬＳＭ調製プロトコルに供したが、結果は、ＦＣＢＡの混在および自己蛍光に起因してさらなるプロトコルの改良の必要性を示した。ＭＳＳＡ（グラム陽性）およびアシネトバクター・バウマンニ（グラム陰性）を、ガラス底ウェルプレートで一緒に培養し固定した、細菌共培養モデルを通じて、問題の解決を達成した。
【００８６】
ＣＬＳＭ調製の準備が整った後、両方のグラム種が重複することなく同時にはっきりと視覚化するよう最適化するために、これらの共培養プレートを、ＦＣＢＡアッセイの多数の操作に供した。これを達成した後に、外植片の調製および分析を再開した。関連する真核生物細胞／細菌細胞の培養ならびにＣＬＳＭ調製プロジェクトと関連して、ＣＬＳＭプロトコルを、時間を最適化するようにさらに改良した。
【００８７】
段階１：単一種プレートにおける原理の証明およびＣＬＳＭ／ＦＣＢＡプロトコルの改良
【００８８】
最初のプレートは、当初から蛍光タグ化に伴ういくつかの課題を呈していた。２つの別個のアシネトバクター・バウマンニグラム陰性ＦＣＢＡ対照研究ロットから、画像を取得した。不適当な播種、固定、ブロッキング、ならびに／またはＦＣＢＡ希釈および曝露時間を含め、信頼できる結果が得られなかったこれらの画像結果には、いくつかの要因が寄与していた可能性がある。実験的修正（およびこれら同様に結果の構成的分析）の反復を通じて、本主題の技術を、結果が向上するように改良した。
【００８９】
定量化は、以下のように行った。
アシネトバクター・バウマンニ対照１２０×（７Ａ）、
全細菌範囲：．１４５±１０．８８％、赤色閾値：．２６％、
アシネトバクター・バウマンニ対照１２０×（７Ｂ）、
全細菌範囲：．３６７±．０５６７％、赤色閾値：．５２％。
【００９０】
図８Ａおよび８Ｂを参照すると、培養、固定、ＣＬＳＭ調製、および撮像が成功した細菌プレートが示されている。図８Ａは、黄色ブドウ球菌（グラム陽性、ＦＩＴＣ緑色）であり、図８Ｂは、多剤耐性アシネトバクター・バウマンニ（グラム陰性、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、赤色）である。各種の球菌（球状）の形状および相対サイズに注目されたい。これらの確立された対照は、プロトコルの改良およびＣＬＳＭ画像分析を確実にするための本質的な参照物として機能した。
【００９１】
定量化は、以下の通りである。
ＭＳＳＡ対照１２０×（８Ａ）
全細菌範囲：２０．８８±．５８２％
緑色閾値：２１．３２％
アシネトバクター・バウマンニ対照１２０×（８Ｂ）
全細菌範囲：３９．２６８±．４６２％  赤色閾値：３９．１７％
黄色ブドウ球菌特異的ＣＬＳＭ調製アッセイ：２時間
１．  ３×５分間ＰＢＳで洗浄し、
２．  ＢＳＡで３０分間ブロッキングし、
３．  ［黄色ブドウ球菌／ＦＩＴＣコンジュゲート抗体］を１：２００希釈で６０分間導入し、
４．  ３×５分間のＰＢＳ、共焦点法の準備が整う
【００９２】
グラム陰性ＣＬＳＭ調製アッセイ：３時間３０分
【００９３】
３時間３０分のグラム陰性ＣＬＳＭ調製アッセイは、以下の通りである。
１．  ＢＳＡで３０分間ブロッキングし、
２．  グラム陰性一次抗体［ＬＰＳグラム陰性抗ヤギ］を１：６００希釈で６０分間導入し、
３．  ３×５分間ＰＢＳで洗浄し、
５．  グラム陰性二次抗体［Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８］を１：２００希釈で６０分間導入し、
６．  ３×５分間ＰＢＳで洗浄し、共焦点法の準備が整う。
【００９４】
段階２：グラム陽性外植片の調製および厳密な分析
【００９５】
個別に試料を調製し、細菌付着を特定する能力を確立した後、外植片の調製および撮像は改善された。（ネジ、プレート、およびポリメチルメタクリレート骨セメントを含め）様々な外植片を撮像したが、最も一般的に受容され、撮像されたハードウェアは、外植されたネジであった。図９は、バイオフィルム成長の可能性について分析した、４つのネジ位置を有するネジの画像である。
【００９６】
組織および細菌細胞がネジ継手位置で検出されたいくつかの事例を除き、真核生物細胞および細菌細胞の存在は、ほぼ例外なくネジ頭で検出された。いずれの特定の理論にも限定されるものではなく、これは、直感的に、ネジ本体および先端部は元々の骨に固定され、元々の軟組織および可能性のある細菌コロニー形成部位には曝露されないという事実に起因する。ＣＬＳＭに関してより断定的にデータを収集するために、特定の細菌種に感染していることがわかっている外植片を、まず調製し、分析した。これにより、インビトロ対照研究を外植片の撮像の成功に置き換えられるかどうかに関する分析が可能となった。
【００９７】
図１Ｂに示されるものなどのネジ頭は、黄色ブドウ球菌に感染していることが既知であった。可能性のある未知の感染状態であった外植片を調製し、分析するという状況をより近似してシミュレーションするために、インビトロ対照プレートで用いた特異的な黄色ブドウ球菌抗体を用いるのではなく、グラム陽性一次抗体およびそのコンジュゲート二次フルオロフォアを代わりに用いた。ＣＬＳＭで試験すると、大量の真核生物組織が認められた。存在していた細菌量は（細菌プレート対照研究と比較して）大幅に少なかったが、グラム陽性球菌（緑色）が元々の組織に散在していることが観察され、グラム陽性菌のコロニー形成の存在が確認された。図１０Ａおよび１０Ｂは、この存在を示す画像である。いくつかの他のネジ頭およびポリ（メチル）メタクリレート骨セメント標本を含め、様々なグラム陽性菌種に感染していることが既知であったいくつかの他の外植片で、同様の結果が達成された。
【００９８】
図１０Ａおよび１０ｂの印象的な画像は、ＣＬＳＭの三次元レンダリング特徴を用いる機会を提供した。ＣＬＳＭソフトウェアは、試料のｚ方向のスタックを、標本の表面の、この事例ではネジ頭の完全な三次元レンダリングに配置することができる。以下の図１０Ｃわかるように、三次元レンダリングにより、視覚化および特徴付けの別の捉え方が可能となる。
【００９９】
グラム陽性ＣＬＳＭ調製アッセイ：４時間
【０１００】
およそ４時間のグラム陽性ＣＬＳＭ調製アッセイの内容を以下に示す。
１）３×５分間ＰＢＳで洗浄し、
２）ＢＳＡで１時間３０分ブロッキングし、
３）グラム陽性一次抗体［グラム陽性ＬＴＡ］を１：１００で６０分間導入し、
４）２×１０分間ＰＢＳで洗浄し、
６）グラム陽性二次［ウサギ抗ＩｇＧ  Ｆｃ  ＦＩＴＣ］を１：５０で６０分間導入し、
７）ＤＡＰＩを５分間添加し、
８）新しいＰＢＳと置き換え、共焦点法の準備が整う。
【０１０１】
このようなプロトコルを用いた試験において、行った定量化および結果を、以下の表１に示す。
【表１】
0006660392.tif 000002
【０１０２】
以下の追加の外植片を、グラム陽性種を特異的に標識する４時間１０分のプロトコルである上述の「グラム陽性ＣＬＳＭ調製アッセイ」に詳述されるように調製した。断定的な真核生物細胞が、グラム陽性バイオフィルム要素および細菌とともに、存在していた。図１１Ａおよび１１ｂは、チタンおよびステンレス鋼のネジ頭からの画像であり、それぞれ、ＣＬＳＭ自己蛍光現象を示し、標本表面上の標準的な細胞要素、残留物、およびアーチファクトが、共焦点レーザー下において蛍光を発している。図１１Ａの画像は、可能性のあるグラム陽性種（何らかの認識可能な球菌形態を有する）を含むが、図１１Ｂの画像は、より多くのバックグラウンドおよび自己蛍光を低いシグナル強度（輝度が低く、形態があまりはっきりしない）で含む。
【０１０３】
このようなプロトコルを用いた試験において、行った定量化および結果を、以下の表２に示す。
【表２】
0006660392.tif 000003
【０１０４】
段階３：全グラム陽性およびグラム陰性アッセイおよび厳密な分析
【０１０５】
いくつかの外植片を調製し、望ましくはグラム陽性アッセイで分析した後、連続的なグラム陽性およびグラム陰性のＦＣＢＡ標識のさらなる調査を行った。ネジを、全グラム陽性およびグラム陰性ＣＬＳＭアッセイに供した。図１２Ａ〜Ｃは、結果のＣＬＳＭ画像である。図１２Ａにおいて、ネジ頭から得られた画像の特徴付けは、はっきりとしない形状のため困難となった。しかしながら、図１２Ｂでは、グラム陽性感染の証拠が、黄色ブドウ球菌サイズの球菌の全体的な範囲によって示されている。
【０１０６】
図１２Ｃの画像は、全ＦＣＢＡアッセイの実行時のぼやけおよび自己蛍光の課題を示す。図１２Ｃの画像は、認識できる赤色（グラム陰性）および緑色（グラム陽性）の球菌を示す。標本アーチファクト可能性のある自己蛍光、ならびにぼやけ（蛍光色素の重複による妙な色）およびバックグラウンドシグナル（蛍光を発する不確定の形態）が示される。
【０１０７】
グラム陽性×グラム陰性ＣＬＳＭアッセイは、およそ７時間かかり、手順は以下の通りである。
１）３×５分間ＰＢＳで洗浄し、
２）ＢＳＡで９０分間ブロッキングし、
３）グラム陰性一次［グラム陰性内毒素］を１：１００で９０分間、
４）２×１０分間ＰＢＳで洗浄し、
５）グラム陰性二次［Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４］を１：１００で６０分間、
６）グラム陽性一次［グラム陽性ＬＴＡ］を１：１００で６０分間、１：１００、
７）２×１０分間ＰＢＳ洗浄し、
８）グラム陽性二次［ウサギ抗ＩｇＧ  Ｆｃ  ＦＩＴＣ］を１：５０で６０分間、
９）ＤＡＰＩを５分間添加し、
１０）新しいＰＢＳと置き換え、共焦点法の準備が整う。
【０１０８】
このようなプロトコルを用いた試験において、定量化を行ったが、結果は以下に示される。
ネジ側１２０×（図１２Ａ）
全グラム陽性範囲：．３７８±３．８８９％
緑色閾値：．４７％
全グラム陰性範囲：．０４８±２７．０６７％
赤色閾値：．０８％
全真核生物範囲：．０６５±５．５８５％
青色閾値：．０９％
ネジ側部１２０×（図１２Ｂ）
全グラム陽性範囲：．３９９±４．２３５％
緑色閾値：．４７％
全グラム陰性範囲：．０９４±１６．５３２％
赤色閾値：．０９４％
全真核生物範囲：０％
【０１０９】
図１３Ａ〜Ｉに示されるように、このネジ頭に対して、グラム陽性およびグラム陰性の組み合わせアッセイのさらなる実験を続けた。図１３Ａ、１３Ｄ、および１３Ｇの画像は、緑色チャネルでのネジの画像であり、図１３Ｂ、１３Ｅ、および１３Ｈは、赤色チャネルでの同じそれぞれの画像であり、図１３Ｃ、１３Ｆ、および１３Ｉは、両方のチャネルに青色染色（ＤＡＰＩ）を加えた複合物である。赤色チャネルと緑色チャネルとの重複、ならびに複合画像において可能性のある球菌の退色は、ぼやけを示す。
【０１１０】
段階４：新しいグラム陰性アッセイ：対照および改良
【０１１１】
アッセイでのぼやけを克服するために、新しいグラム陰性一次抗体および蛍光コンジュゲート二次抗体を取得した。ここでも、多剤耐性アシネトバクター・バウマンニを改良およびアッセイ開発に使用したが、一方でメチシリン感受性黄色ブドウ球菌培養物は、グラム陽性種を標識するグラム陰性ＦＣＢＡの所望されない交差標識が確実に生じないようにするために使用した。まず、ＭＳＳＡは、それぞれ図１４Ａおよび１４Ｂの画像に詳細が示されるように、１：２００および１：４００希釈でグラム陰性の一次および二次の適用で蛍光を発した。
【０１１２】
ＭＳＳＡを新しいグラム陰性ＦＣＢＡで標識する手順は、およそ２時間５５分かかり、以下のように行った。
１）３×５分間ＰＢＳで洗浄し、
２）ＢＳＡで３０分間ブロッキングし、
３）グラム陰性一次［ＬＰＳグラム陰性抗ヤギ］を８＝１：２００、９＝１：４００で６０分間導入し、
４）２×５分間ＰＢＳで洗浄し、
５）グラム陰性二次［Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８］を１：２００で６０分間導入し、
６）新しいＰＢＳと置き換え、共焦点法の準備が整う。
【０１１３】
このようなプロトコルを用いた試験において、定量化を行ったが、結果は以下に示される。
１：２００でグラム陰性ＦＣＢＡでタグ化したＭＳＳＡ、１２０×（１４Ａ）
全細菌範囲：５．４±１．０４０％
赤色閾値：５．５９％
１：４００でグラム陰性ＦＣＢＡでタグ化したＭＳＳＡ、１２０×（１４Ｂ）
全細菌範囲：１８．４３±．５３８％
赤色閾値：１９．０６％
【０１１４】
ＭＳＳＡの所望されない標識に加えて、共培養物中のグラム陰性種の初期希釈により、既に確立されたグラム陽性ＦＣＢＡの標識および蛍光を遮断した。図１５Ａおよび１５Ｂの画像は、全グラム陽性およびグラム陰性ＦＣＢＡプロトコルを用いてＣＬＳＭ用に調製したアシネトバクター・バウマンニおよび黄色ブドウ球菌の２つの異なる共培養プレートを詳しく説明する。図１５Ａと１５Ｂとの単一の違いは、グラム陰性一次抗体の希釈であり、その希釈強度が、望ましくない標識作用に寄与するという理論を立てた。図１５Ａの画像のグラム陰性一次抗体希釈は、１：２００であり、図１５Ｂの画像は１：４００である。
【０１１５】
グラム陽性＋新しいグラム陰性ＣＬＳＭアッセイ（共培養物上）手順は、およそ５時間１５分かかり、以下のように行った。
１）３×５分間ＰＢＳで洗浄し、
２）ＢＳＡで３０分間ブロッキングし、
３）グラム陰性一次［ＬＰＳグラム陰性抗ヤギ］を１０＝１：２００、１１＝１：４００で６０分間導入し、
４）２×５分間ＰＢＳで洗浄し、
５）グラム陰性二次［Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８］を１：２００で６０分間導入し、
６）２×５分間ＰＢＳで洗浄し、
７）グラム陽性一次［グラム陽性ＬＴＡ］を１：１００で６０分間導入し、
８）２×５分間ＰＢＳで洗浄し、
９）グラム陽性二次［ウサギ抗ＩｇＧ  Ｆｃ  ＦＩＴＣ］を１：５０で６０分間導入し、
１０）新しいＰＢＳと置き換え、共焦点法の準備が整う。
【０１１６】
このようなプロトコルを用いた試験において、定量化を行ったが、結果は以下の通りである。
ＭＳＳＡ＋アシネトバクター・バウマンニ共培養物、１２０×（１５Ａ）
全グラム陽性範囲：．９０４±１．６６８％
緑色閾値：．９０％
全グラム陰性範囲：１．６５±２．８７％
赤色閾値：１．８２％
ＭＳＳＡ＋アシネトバクター・バウマンニ共培養物、１２０×（１５Ｂ）
全グラム陽性範囲：．０６２１±１３．８％
緑色閾値：．０８％
全グラム陰性範囲：．０２８９±２．４７１％
赤色閾値：２．４５％。
【０１１７】
ここで図１６Ａおよび１６Ｂを参照すると、グラム陰性の希釈係数のさらなる調整を除いて図１５Ａおよび１５Ｂの試料画像と同じアッセイプロトコルを用いて調製した追加の共培養物研究画像が示されている。図１６Ａの画像は、１：６００のグラム陰性一次抗体希釈係数を有する。図１５Ｂの画像は、１：１０００のグラム陰性一次抗体を有する。ぼやけおよび重複した蛍光シグナルにおける進歩的な向上が、グラム陰性抗体希釈の減弱化を伴って観察された。
【０１１８】
このようなプロトコルを用いた試験において、定量化を行ったが、結果は以下に示される。
ＭＳＳＡ＋アシネトバクター・バウマンニ共培養物、１２０×（１６Ａ）
全グラム陽性範囲：１．６５±．９８０％
緑色閾値：１．８４％
全グラム陰性範囲：８．０５±．８８３％
赤色閾値：８．３７％
全体的な細菌範囲：１０．８４±１．２０１％
全体的な範囲の閾値：１１．１２％
ＭＳＳＡ＋アシネトバクター・バウマンニ共培養物１２０×、（１６Ｂ）
全グラム陽性範囲：１．７２５±．３３６％
緑色閾値：３．８４％
全グラム陰性範囲：５．５７±．３４５％
赤色閾値：７．３３％
全体的な細菌範囲：２８．７６±．４３６％
全体的な範囲の閾値：２８．８７％
【０１１９】
共培養物実験モデルを用いて調査を行った。グラム陰性一次抗体の希釈強度が、バランスの取れたシグナルのものに近似していたため、別の修正を実行し、グラム陰性一次希釈係数は１：１０００に保った。加えて、ウサギ血清を、ブロッキングステップ、ＰＢＳ洗浄ステップ、および抗体導入ステップに添加した。ウサギ血清の添加は、理論上のグラム陽性細胞壁が交差標識の観察を引き起こす際に関与する要素であるプロテインＡの発現を遮断するために実行した。２つのプレートを、上記に詳述された全アッセイに従って調製したが、いくつかの修正を加え、最も注目すべきは、図１７および１８において、それぞれ、２０％または４０％ウサギ血清をＢＳＡブロッキングへの添加したことであった。加えて、１％ウサギ血清ＰＢＳを、すべての洗浄および抗体希釈に用いた。ウサギ血清を添加して、プロテインＡの蛍光を遮断したため、いずれの画像でも混在は観察されず、緑色および赤色の両チャネルからの蛍光はバランスが取れている。
【０１２０】
図１７は、２０％ウサギ血清を添加した、成功した共培養アッセイである。定量化の結果を以下に示す。
ＭＳＳＡ＋アシネトバクター・バウマンニ共培養物＋２０％ＲＳ、１２０×（１７Ａ）
全グラム陽性範囲：９．６７±．７７６％
緑色閾値：９．８９％
全グラム陰性範囲：６．６６％±１．６２％
赤色閾値：９．４６％
全体的な細菌範囲：１４．７３±１．１２％
全体的な範囲の閾値：１６．６４
【０１２１】
図１８は、４０％ウサギ血清を添加した、成功した共培養アッセイである。定量化の結果を以下に示す。
ＭＳＳＡ＋アシネトバクター・バウマンニ共培養物＋４０％ＲＳ、１２０×（１８Ａ）
全グラム陽性範囲：６．９３４±１．５７％
緑色閾値：７．２３％
全グラム陰性範囲：５．５６±１．７４％
赤色閾値：８．０４％
全体的な細菌範囲：１０．４６±１．７９％
全体的な範囲の閾値：１４．０１％
【０１２２】
段階５：真核生物培養モデルを用いたアッセイの強化
【０１２３】
適切なグラム陰性希釈およびウサギ血清ブロッキングにおける進歩はまた、研究室において、真核生物および細菌の共培養物を用いたＦＣＢＡ染色およびＣＬＳＭ分析に対するさらなる実験を可能にした。Ｃａｒｙｎ  Ｃｏｂｂ  ａｎｄ  Ｄｒ．Ｇａｒｃｉａにより導出されたこの平行した真核生物／細菌培養物モデルの実験では、ここで確立した共培養プロトコルを時間および画像品質に関して最適化するためのインビトロのテンプレートが得られた。真核生物細胞には、グラム陽性バイオフィルムの拡がりがはっきりと観察される。グラム陰性の存在も認められる。最も注目すべきことには、この真核生物／二種細菌の共培養物は、１時間でＣＬＳＭ用に調製された。
【０１２４】
図１９は、真核生物および二種細菌種モデルの画像である。より詳細に、アッセイの項目を以下に示す。グラム陽性＋グラム陰性ＣＬＳＭアッセイ：４５分間
１）３×ＰＢＳ＋１％ウサギ血清（ＲＳ）で続けて洗浄し、
２）５０％ＢＳＡ＋５０％ＲＳで１５分間ブロッキングし、
３）グラム陽性およびグラム陰性の一次抗体を１５分間導入し、
−［グラム陽性ＬＴＡ］１：１００
−［ＬＰＳグラム陰性抗ヤギ］１：１０００
４）３×ＰＢＳ＋１％ＲＳで洗浄し、
５）グラム陽性およびグラム陰性の両方の二次抗体［ウサギ抗ＩｇＧ  Ｆｃ  ＦＩＴＣ］を１：５０で、［Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８］を１：２００で１５分間導入し、
６）ＰＢＳ＋１％ＲＳですすぎ、共焦点法の準備が整う。
【０１２５】
図１９の定量化の結果を以下に示す。
ＭＳＳＡ＋アシネトバクター・バウマンニ＋Ｅｕｋ（２０％ＲＳ）１２０×：１時間のプロトコル（１９Ａ）
グラム陽性菌：１２．５４±．７５７％
緑色閾値：１２．５２％
グラム陰性菌：０．９９２±３．１６６％
赤色閾値：１．４３％
真核生物細胞：９．６２９±．７７３％
青色閾値：９．７５％
範囲面積パーセント：１８．０１３±．６４３％
全体の閾値：１８．２１％
【０１２６】
真核生物／二種細菌の共培養物モデルを用いて、ウサギ血清ブロッキングならびに明確な視覚化および特徴付けの再現に対するさらなる実験を行ったが、その結果を図２０Ａに示す。図２０Ａの画像は、５０％ウサギ血清／５０％ＢＳＡのブロッキングステップの結果を示す。ここでも、明瞭な真核生物組織が、細菌の存在とともに認められ、ＦＣＢＡ／ＣＬＳＭ調製アッセイ時間は１時間であった。
【０１２７】
図２０は、５０％ウサギ血清を用いた真核生物および二重細菌種アッセイの作業である。より詳細に、アッセイの項目を以下に示す。
ＭＳＳＡ＋アシネトバクター・バウマンニ＋Ｅｕｋ（５０％ＲＳ）１２０×：１時間のプロトコル（２０Ａ）
グラム陽性菌：１１．５２±．６４７％
緑色閾値：１１．５１％
グラム陰性菌：０．３５６±４．７１６％
赤色閾値：０．６８％
真核生物細胞：９．５３±１．１６９％
青色閾値：９．５７％
範囲面積パーセント：１６．２３±．９７５％
全体の閾値：１６．３１％
【０１２８】
段階６：外植片の継続的な調製
【０１２９】
抗体間の混在を打ち消し、希釈を改良し、望ましくないバックグラウンドの自己蛍光および混在を遮断するために、さらなる作業を行った。結果として、外植した整形外科用ハードウェアの急速なＦＣＢＡ標識、ならびに続いての可能性のある細菌付着またはバイオフィルム形成の視覚化および特徴付けが達成された。
【０１３０】
図２１Ａ、２１Ｂ、および２２を参照すると、図２１Ａおよび２１Ｂの画像は、グラム陽性菌の存在を詳しく示し、詳細な真核生物組織が２１Ｂに認められる。図２２の画像は、元々の組織に散在して付着した、断定的なグラム陰性菌の存在を詳しく示す。図２１Ａ、２１Ｂ、および２２の画像を作成するために使用した外植片は、長時間の全グラム陽性＋グラム陰性ＦＣＢＡアッセイに従って調製した。（共培養物から移行した）外植片における調製プロトコルを検証するために長時間の外植片アッセイを用いた後、時間の最適化について調査した。
【０１３１】
図２１Ａの外植片の全体的な改良したアッセイプロトコルを以下に示す。グラム陽性＋グラム陰性ＣＬＳＭアッセイは、およそ４時間４５分である。
１）３×ＰＢＳ＋１％ＲＳで洗浄し、
２）ＢＳＡ＋ＲＳで３０分間ブロッキングし、
３）グラム陽性一次［グラム陽性ＬＴＡ］を１：１００で６０分間導入し、
４）２×ＰＢＳで洗浄し、１％ＲＳで洗浄し、
５）グラム陽性二次［ウサギ抗ＩｇＧ  Ｆｃ  ＦＩＴＣ］を１：５０で６０分間導入し、
６）２×ＰＢＳ＋１％ＲＳで洗浄し、
７）グラム陰性一次［ＬＰＳグラム陰性抗ヤギ］を１：１０００で６０分間導入し、
８）２×ＰＢＳ＋１％ＲＳで洗浄し、
９）グラム陰性二次［Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８］を１：２００で６０分間導入し、
１０）２×ＰＢＳ＋１％ＲＳで洗浄し、ＣＬＭの準備が整う
【０１３２】
定量化の結果を以下に示す。
ネジ頭１２０×（２１Ｂ）
グラム陽性菌：４．９５±．９８９％
緑色閾値：５．１９％
真核生物細胞：．５８１±１０２３％
青色閾値：．６５％
範囲面積パーセント：６．２１±１．１７％
全体の閾値：６．４９％
ネジ頭、全アッセイ１２０×（２１Ｃ）
グラム陽性菌：１．９８±１．２２％
緑色閾値：２．４０％
真核生物細胞：．８９５±．３６４％
青色閾値：１．０９％
範囲面積パーセント：３．７９±．７２２％
全体の閾値：４．３０％
【０１３３】
ここで図２２を参照すると、図２２は、グラム陰性種での全アッセイで調製したネジ頭からの共焦点画像を示す。このネジ頭の定量化の結果は以下の通りである。
ネジ頭、全アッセイ１２０×（２２Ｂ）
グラム陰性菌：２．７４±１．１９％
赤色閾値：３．４８％
真核生物細胞：９．６３±．９７７％
青色閾値：１０．０９％
範囲面積パーセント：６．２７±．７７％
全体の閾値：６．８６％
【０１３４】
ここで図２３を参照すると、ポリメチルメタクリレート骨セメントの断片を、グラム陽性外植片調製プロトコルに従って調製して、図に示される画像を生成した。図２３の画像において、結果として得られたグラム陽性球菌およびバイオフィルム形成の明瞭なＣＬＳＭ画像は、外植されたハードウェア上の細菌バイオフィルム付着の明瞭な視覚化および特徴付けの基準として機能した。グラム陽性コロニー間に拡がった明瞭な真核生物組織の存在が認められる。
【０１３５】
段階７：高速調製アッセイの実行および改良
定量化：
ネジ頭１２０×（２３Ｂ）：
グラム陽性菌：６．４９±１．６７％
緑色閾値：７．１０％
真核生物細胞：１．２５±１．１５％
青色閾値：１２．６２％
範囲：２０．０５±１．１１％
全体の閾値：２０．３８％
【０１３６】
長時間のアッセイによりいくつかの外植片に明瞭な視覚化が達成され、実験を、４５分間のＣＬＳＭ調製プロトコルの実行で開始した。図２４の以下の代表的な画像は、外植片に対する４５分間の高速アッセイの実行から得られた結果を詳しく示す。図２４の画像は、４５分間のアッセイにより調製したポリ（メチル）メタクリレート（Ａ）片から生成した。図２４の画像は、定義できる細菌コロニー形成が存在しない元々の真核生物組織を示す。
【０１３７】
図２４の４５分間プロトコル下における外植片ＣＬＳＭの定量化は、以下の通りである。
ＰＭＭＡ骨セメント高速アッセイ１２０ｘ（２４Ｂ）：
グラム陽性菌：０．２８５±．５０８％
緑色閾値：０．４６％
グラム陰性菌：０．３８１±．６２６％
赤色閾値：０．５７％
真核生物細胞：１．２４８±３．６３％
青色閾値：１．３３％
範囲面積パーセント：３．３６±．８６７％
全体の閾値：３．７２％
【０１３８】
また、４５分間のグラム陽性＋グラム陰性ＣＬＳＭアッセイは、以下の通りである。
１）３×ＰＢＳ＋１％ウサギ血清（ＲＳ）で続けて洗浄し、
２）５０％ＢＳＡ＋５０％ＲＳで１５分間ブロッキングし、
３）グラム陽性およびグラム陰性の両方の一次抗体、グラム陽性：［グラム陽性ＬＴＡ］を１：１００で、グラム陰性：［ＬＰＳグラム陰性抗ヤギ］を１：１０００で１５分間導入し、
４）３×ＰＢＳ＋１％ＲＳで続けて洗浄し、
５）グラム陽性およびグラム陰性の両方の二次抗体、グラム陽性：［ウサギ抗ＩｇＧ  Ｆｃ  ＦＩＴＣ］を１：５０で、グラム陰性：［Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８］を１：２００で１５分間導入し、
６）ＰＢＳ＋１％ＲＳですすぎ、共焦点法の準備が整う。
７）
【０１３９】
ここで図２５を参照すると、高速４５分間全アッセイで調製したネジ頭から生成した画像は、断定的なグラム陰性コロニー形成を示す。図２５の画像の下半分には赤色の大きな筋がありネジ頭の表面の自己蛍光およびバックグラウンドが示されるが、左上の４分の１は、グラム陰性球菌の形態と一致する赤色シグナルを詳しく示している。
【０１４０】
図２５の４５分間のプロトコルを用いた外植片ＣＬＳＭの定量化は、以下の通りである。
ネジ頭高速アッセイ１２０ｘ（２５Ｂ）：
グラム陽性菌：０．０２８±．６４２４％
緑色閾値：０．１８％
グラム陰性菌：３．１８５±．５７５％
赤色閾値：５．４４％
真核生物細胞：３．１９６±１．０２３％
青色閾値：３．２１％
範囲面積パーセント：４．５８±．５２２％
全体の閾値：６．３７％
【０１４１】
図２６を参照すると、４５分間のプロトコルを用いて別のネジ頭を調製し、その結果得られたＣＦＳＬ画像が示されている。図２６の画像の中心には、真核生物組織が詳しく示され、極めて限定された範囲のグラム陽性およびグラム陰性球菌も存在している。
【０１４２】
外植片ＣＬＳＭの４５分間のプロトコルを用いたこのネジ頭の定量化は、以下の通りである。
ネジ頭高速アッセイ１２０ｘ（２６Ｂ）：
グラム陽性菌：０．４５１±１．３６４％
緑色閾値：０．５９％
グラム陰性菌：１．１６７±１．１００３％
赤色閾値：１．６３％
真核生物細胞：１．４６５±２．３０９％
青色閾値：１．５１％
範囲面積パーセント：２．８４３±．８９％
全体の閾値：３．０３％
【０１４３】
上記を考察することに基づいて、当業者には理解することができるように、ＦＣＢＡおよびＣＬＳＭの技術を用いることにより、細菌対照プレートおよび外植片の両方を、細菌バイオフィルム成長に関して効果的に視覚化し、分析することができることが、確立された。この新規なアッセイ方法の開発は、定量化および全アッセイ時間の両方の論題を通じた細菌プレート実験および外植片調製の結果から追跡することができる。注目すべき結果の定量化により、効果的な標識が生じたレベルが示され、新規なアッセイの有効性の評価に関する全体的な見識が可能となる。
【０１４４】
定量化および厳密な分析
【０１４５】
結果の節において見られるように、注目すべき画像をＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて定量化した。画像を、緑色、赤色、および青色のチャネルに分け、これらのチャネルは、それぞれ、グラム陽性、グラム陰性、および真核生物細胞の存在を示す。完全に標識されている特定可能な物体を単離し、バックグラウンドおよび自己蛍光を抑えるために、各チャネル内で、飽和閾値を、各色の飽和を調節することによって決定する。閾値が選択されると、各色チャネルの範囲の相対面積が、標準偏差とともに決定される。アッセイ開発期間にわたり、注目すべき画像の定量化により、ＦＣＢＡ標識方法における改善が示される。図８Ａおよび８Ｂの画像において、ＭＳＳＡ対照は、２０．８８±．５８２％の細菌範囲を有するが、アシネトバクター・バウマンニ対照は、３９．２６８±．４６２％の範囲を呈する。直感的には、これらの細菌対照に、すべての画像の中で最も大きな細菌範囲が観察されたことを表す。さらに、これらの小さな標準偏差は、標識した物体全体で一貫したシグナル強度を示しており、効果的な標識を示すものである。
【０１４６】
外植片処理を開始すると、定量化により、細菌範囲計算および染色効率の厳密な分析が可能となる。ＭＳＳＡに感染していることがわかっている試料（図９）は、豊富な真核生物範囲、およびグラム陽性コロニー形成と一致する小さな緑色の球菌を示した。細菌範囲が２．３２±１．１３２％である図１０Ｂの画像および範囲が２．１３４±１．３１２％である図１０Ｃの画像は、いずれも、細菌が確かに存在していることを示すが、緑色標識した対象の飽和閾値の判定は、緑色シグナルの範囲に起因して困難であった。同様の見解が、図１１Ａおよび１１Ｂでも見られ、ここで、緑色の強度の蛍光シグナルの範囲、ならびに多様なアーチファクトサイズは、特徴付けにおける何らかの不明瞭さと解釈される。これらの外植片はグラム陽性種に感染している事がわかっているが、それらの細菌範囲（および標準偏差）の定量化により、プロトコルの修正による改善の可能性が示された。図１２Ａおよび１２Ｂの画像もまたこの見解を示しており、ここで、全グラム陽性範囲は．３７８±３．８８９％（Ｂ）および．３９９±４．２３５％（Ｃ）であることがわかり、グラム陰性範囲は、．０４８±２７．０６７％（Ｂ）および．０９４±１６．５３２％（Ｃ）であることがわかった。
【０１４７】
定量化の結果、ならびにプロトコルの修正および改良の原因となっている細菌特徴付けにおける不明瞭さのため、細菌プレートの実験に焦点を戻した。これらの段階における問題の解決は、大部分が定量化により可能であった。図１５Ａおよび１５Ｂの図（ＭＳＳＡおよびアシネトバクター・バウマンニの共培養物のもの）は、グラム陽性抗体とグラム陰性抗体との間でのぼやけの現象の問題を解決する初期段階を詳しく示す。図１５Ａおよび１５Ｂに示されるグラム陽性菌範囲（それぞれ、．９０４±１．６６８％および．０６２１±１３．８％）は、著しいぼやけが生じており、バランスの取れた均一で一貫したグラム陽性株を妨げられていることを示している。視覚的分析は、グラム陰性菌範囲が、赤色および緑色のバランスの取れた同時の特徴付けを妨げていることをはっきりと示している。
【０１４８】
アッセイ標識の相当な程度の改善が、図１６Ａおよび１６Ｂに示されている。視覚的検査は、重複が依然として生じているものの（オレンジ色および黄色の対象物として蛍光を発すると見られる球菌によって示される）、個々の赤色および緑色の細菌種は、区別することができる。同様に、これらの画像の定量化により、アッセイの調整（グラム陰性一次抗体の強度を減少させること）により得られた改善を検証する。図１６Ａの画像におけるグラム陽性およびグラム陰性の範囲は、それぞれ、１．６５±．９８０％および８．０５±．８８３％であることがわかった。これらの比較的小さい標準偏差は、バランスの取れたシグナル強度のより一貫した検出が達成されたこと、各種の全体的な存在度パーセントのバランスが良く取れていることを示している。図１６Ｂにはさらなる改善が示されており、ここで、グラム陽性範囲は１．７２５±．３３６％であること観察され、グラム陰性範囲は５．５７±．３４５％であることが観察された。蛍光シグナルにおいて高い重複度が認められるが、両方の種の標準偏差は、より一貫したシグナル検出閾値を示している。さらに、２つの種の相対的な存在度は、全体的な抗体染色のバランスが向上するにつれ、互いに近づいていく。最後に、全体的な細菌範囲（２８．７６±．４３６％）は、初期の個々の細菌プレート（図８）で以前に観察された範囲に近づいている。
【０１４９】
グラム陽性およびグラム陰性の培養および標識の成功が、図１７および１８で達成された。前述した画像１６の蛍光シグナルは、適切なバランスに近づいてきたため、グラム陰性一次抗体希釈を、１：１０００に維持した。ウサギ血清を、ブロッキングステップ、ＰＢＳ洗浄ステップ、および抗体導入ステップに添加した。これは、理論上のグラム陽性細胞壁が交差標識および蛍光のぼやけの観察がもたらされる際に関与する要素であるプロテインＡの発現を遮断するために実行した。
【０１５０】
図１７では、グラム陽性範囲は９．６７±．７７６であり、グラム陰性は６．６６％±１．６２％であると定量化された。これは、より有効かつバランスのとれた調製プロトコルを示す。同様に、図１８は、それぞれ６．９３４±１．５７％および５．５６±１．７４％のグラム陽性範囲およびグラム陰性範囲を示している。ここでも、これらの定量化により、両方の種間で、バランスの取れた全存在度および蛍光シグナル、ならびに各グラム標識スキーム内で一貫した蛍光閾値が示されている。懸念すべき重複は観察されず、実行したアッセイ改良の強度を強めている。
【０１５１】
細菌培養研究からの改良により、外植片ＣＬＳＭ調製を、全グラム陽性グラム陰性検出アッセイで再び開始した。図２１Ｂの画像に示されるように、ネジ頭の全アッセイ調製からの結果として、明瞭なグラム陽性成長が示されている。ここでも、グラム陽性菌範囲は４．９５±．９８９％と定量化され、グラム陰性標識の添加に関係なく一貫して標識されたグラム陽性対象物を示している。逆の結果が図２２Ｂの画像に認められ、グラム陰性菌の表面範囲（真核生物細胞の周囲）は、２．７４±１．１９％であると定量化され、グラム陽性蛍光の妨げはない。
【０１５２】
全アッセイにより共焦点のために調製したものではなかったが、図２３の画像を生成するのに使用した外植片（例えば、骨セメント断片）は、驚くほど明瞭な視覚化、特徴付け、および定量化の例示的な画像としての機能を果たす画像を提供した。ＰＭＭＡ骨セメントの表面を詳しく示すこの画像は、元々の組織（２０．０５±１．１１％．）を包囲するグラム陽性表面量が６．４９±１．６７％であることを示す。これらの比較的低い標準偏差は、一貫した蛍光シグナルの閾値および有効な標識を示す。明瞭なグラム陽性球菌形態のこの画像が、ＣＬＳＭアッセイを行うことを通じて外植片の明瞭な視覚化および特徴付けを進める標準物である。
【０１５３】
いくつかの全アッセイ外植片を調製および分析し、４５分間ＣＬＳＭ調製アッセイの実行に関して実験を行った。図２４Ｂの画像は、４５分間のプロトコルに従ってＣＬＳＭのために調製したポリメチルメタクリレート骨セメント断片の結果の画像を詳しく示す。グラム陽性菌範囲は示されておらず、表面半には０．２８５±．５０８％である。同様に、グラム陰性の存在（表面範囲０．３８１±．６２６％）もまた、示されていない。少量のバックグラウンドが認められるが、４５分間のプロトコル（およびその後の定量化）は、外植片に存在する細菌種がないことを示している。
【０１５４】
対照的に、図２５Ｂの画像は、表面積３．１８５±．５７５％で断定的なグラム陰性の存在を詳しく示す。小さな標準偏差は、所望されるように、赤色飽和閾値の一貫性およびバランスが達成されることを示す。加えて、定量化により、画像を横切る赤色の筋により示されるように、バックグラウンドおよび自己蛍光の軽減が可能となる。赤色飽和閾値は自己蛍光の筋の強度を上回るため、これは、細菌表面積の計算には含まれない。図２６は、４５分間のアッセイに従って調製した別のネジから生成した画像である。明瞭な真核生物の存在が、断定的なグラム陰性蛍光とともに認められ、グラム陰性領域は、計算により１．１６７±１．１００３％であった。図２４、２５、および２６（４５分間のアッセイからの撮像結果を象徴している）は、ある範囲の定量化の所見を示し、これらの図は、外植片が、短い時間間隔でグラム陽性およびグラム陰性に関して効果的に撮像することができることを示す。
【０１５５】
全アッセイ調製時間および厳密な分析
【０１５６】
定量化の結果の主題に加えて、全アッセイ調製時間は、その開発および改良を通じて、増加するアッセイの臨床関連性で肝要な兆候を提供する。図１９および２０は、２つの画像を詳しく示し、ここで、ＭＳＳＡおよびアシネトバクター・バウマンニは、真核生物細胞とともに培養し、ＣＬＳＭ用に調製した。図１９および２０のいずれの画像も、一時間で調製された。これらの調査は、特に、ＣＬＳＭでの撮像および分析のために外植片を調製するのに必要な時間の量を減少させる能力に役立った。図２４、２５、および２６の画像を生成するための外植片は、すべて、４５分以内に調製され、共焦点分析の準備ができた。
【０１５７】
本主題の技術により、除去から近い時間内に、外植片におけるグラム陽性および／またはグラム陰性のバイオフィルム形成の正確かつ高速な視覚化、特徴付け、および定量化を行うことが可能となる。蛍光コンジュゲート抗体および共焦点レーザー走査顕微鏡の使用を通じて、本主題の技術は、１時間未満で細菌コロニー形成およびバイオフィルム形成の視覚化および定量化が可能である、臨床的に関連する高速検出アッセイを開発した。
【０１５８】
感染の検出、診断、および治療の臨床上の展望において、本主題の技術は、さらなる改善を提供する。整形外科用埋込片における微生物の存在を検出するための既存の臨床で用いられている方法は、依然として、埋込片の周囲の組織からの細菌の培養が成功することに依存している。これらの方法は、培養物中に現れるのにさらに数日かかり得るプロピオニバクテリウム・アクネスのような成長の遅い細菌では、偽陰性の結果をもたらす傾向にある。感染検出を再考する別の利点は、現在の微生物感染試験技法の費用に表れる。細菌の培養および単離、ＰＣＲ、ならびに他の分子試験の費用は、比較的高価であり、調査に応じて広範であり＄１００〜＄３００に及ぶ。上述の材料および方法に基づいて、外植片標本セットを、本発明者らのＦＣＢＡおよびＣＬＳＭ方法を用いて＄２０未満、またはそれよりも低く、調製し、分析することができる。
【０１５９】
高速検出アッセイの臨床での実行が現実となるには、さらなる調査が必要である。ＣＬＳＭ調製アッセイにおける多様なグラム陽性およびグラム陰性種の追加の細菌対照試験により、特定の細菌コロニー形成パターンおよび形態に関するより広範な見識の基礎が得られる。本主題の技術には、実質的なデータベースを構築するための外植片の処理および特徴付けが含まれ、このデータベースを用いて、さらなるアッセイの改良および臨床予後の比較を引き出すこと、ならびにアッセイを特定の手順、外植片もしくは試料型、および特定の状況での既知の傾向に適用することが可能である。さらに、事前にコンジュゲートした抗体により、アッセイ時間をさらに短縮し、特定の細菌種の抗体標識特異性を増加させることができる。
【０１６０】
本主題の技術は、患者がまだ手術台にいる間に一連の措置を決定するための極めて重要なツールを外科医に提供するための、正確かつ高速な検出アッセイを提供する。本主題の技術は、整形外科の治療介入を改善し、感染の診断を促進し、患者の予後を多いに向上させるであろう処置を改良することにおいて極めて重要であり得る。
【０１６１】
一実施形態において、本主題の技術は、マイクロプレートの一片内に置かれた外植片、組織試料、埋込片などの部分を取得し、マイクロプレートリーダーの分注機能を用いて本方法に記載されるＥＬＩＳＡ剤を継続的に試料上に流すが、追加の手作業によるすすぎステップを伴う場合もそうでない場合もある。ロッキング装置を用いて、洗浄または他のステップの容易さおよび有効性を高めてもよい。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｉｎｃ．のＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ  ３  Ｍｕｌｔｉ−Ｍｏｄｅ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒが、標識剤用の複数ウェルのプレート１つと標識すべき埋込片または組織試料を保持するための別のプレートを収容することができる、プレートリーダーの例である。
【０１６２】
このような場合には、アッセイは、事前にパッケージ化された、従来的なマイクロプレート配置で一般的な病原性微生物群を標識するための試薬を含むキットから構成されるであろう。外植片または組織試料を保持するたように特別に設計された別個のトレイも使用され得る。試薬は、評価のために、フルオロフォアまたは発色団または発光性分子で外植片または試料を標識するために使用されるであろう。記載される方法の自動化のためのマイクロプレート構造を用いる利点は、複数モードのプレート読み取り機器が、容易に利用でき、細菌の分析に適していることである。記載されるアッセイ方法を自動化し、外科手術中に病原体感染の存在を確認するための、標準的なプレートリーダーのソフトウェアのルーチンは、容易に記述することができる。これにより、医師が、標的化された抗生物質処置を行い、取り出した埋込片を新しい埋込片と即座に置き換えることが適切であるかどうか、または新しい装置を埋め込む前に感染が一掃されるまでさらなる時間を与えるべきかどうかに関して、決断を下すことが可能となる。
【０１６３】
ここで図２７を参照すると、本主題の技術による自動分注のための事前にパッケージ化された試薬を有する、標準的なマイクロプレート２００の概略上面図が示されている。マイクロプレート２００には、本明細書に企図される任意の方法のための試薬が含まれ得る。図２８および２９は、試料（例えば、ネジ、骨セメント、組織断片など）を保持するための中央のウェル２０４を有する特注のプレート２０２の概略上面図である。中央のウェル２０４は、４つの円形ウェル２０６ａ〜ｄと流体連通にある。中央のウェル２０４は、排液チャネル２０８ａ〜ｄを介して４つの周囲ウェル２０６ａ〜ｄに試薬を排出することを可能にするために隆起および傾斜がついている。図２９は、特注のプレート２０２におけるネジ試料２１０の例示的な配置を示す。
【０１６４】
ここで図３０を参照すると、高速視覚化アッセイのためのキット３００が示されている。キット３００は、小さな固形材料、ならびに核染色ＤＡＰＩ形態での真核生物細胞、ＦＩＴＣによるグラム陽性細胞、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５６８形態でのグラム陰性細胞の標識のために設計されている。複数の発達段階でのバイオフィルムの直接的視覚化のためのキットもまた、本明細書により企図される。真菌性病原体もまた、視覚化することができる。標識は、利用するプローブの数に適合するように任意の色数に調整することができる。好ましくは、キット３００は、すぐに使用できるか、作業溶液と単純に混合するように構成されている。
【０１６５】
キット３００には、作業溶液を保持するための少なくとも１つの黒一色または黒／透明の底のウェルプレート３０２を含む。一実施形態において、ウェルプレート３０２は、６つのウェル３０４ａ〜ｆを有する。キット３００は、室温で行われる、単純な段階ごとの浸水／およびインキュベーション手順を提供する。例えば、ウェル３０４Ａは、任意の固定剤または血液を除去するすすぎ緩衝液を含んでいる。ウェル３０４ｂは、バックグラウンドおよび非特異的な抗体結合を最小限に抑えるよう設計されたブロッキング緩衝液のカクテルを含んでいる。ウェル３０４ｃは、緩衝液中または凍結乾燥したコンジュゲート抗体を含んでいる。ウェル３０４ｄは、ＤＡＰＩでの緩衝すすぎ液を含んでいる。ウェル３０４ｅおよび３０４ｆは、追加の緩衝液を含んでいる。キットは、ガラススライドおよび／またはバイオフィルムの追加のマーカーを提供することにより、液体試料用に調節することができる。
【０１６６】
図３１および３２を参照すると、抗体染色を示す画像が示されている。蛍光コンジュゲート抗体での抗体染色により、細菌の存在を特定することを助ける。図３１において、一次抗体が抗原結合部位に結合し、この部位は、細菌上に位置している（すなわち、ＬＴＡまたはＬＰＳ）。フルオロフォアにコンジュゲートしたコンジュゲート二次抗体は、一次抗体上の可変領域に結合する。抗体は、バイオフィルムを突き抜けることができるが、これは、バイオフィルム中の細菌が蛍光を発し、ＣＬＳＭ下において整形外科用外植片上で確認できるという事実により裏付けられる。
【０１６７】
抗体コンジュゲーションのプロセスは、直接的または間接的アッセイを通じて達成することができる。直接的アッセイにおいては、図３２に示されるように、グラム陽性菌上の抗原、ＬＴＡ部位に結合した単一の抗体に、フルオロフォアをコンジュゲートする。間接的アッセイにおいては、複数の二次抗体を用いる間接的アッセイである図３１に示されるように、細菌上の抗原認識部位に一次抗体を結合させた後、それに結合する二次抗体にフルオロフォアをコンジュゲートする。間接的アッセイは、１つを上回る二次抗体が一次抗体に結合しているため、増幅したシグナルを有し得る。しかしながら、この現象は、強化された増幅により生じ得る過剰なバックグラウンドを回避するために、二次溶液を希釈することにより克服することができる。
【０１６８】
アッセイが、一次抗体を省略して行われてもよいことも想起される。一次抗体の省略は、一次抗体が、二次抗体の非特異的な結合が存在しないことを確実にするために省略される場合である。結果として、視覚化問題の決定が補助される。さらに、試料を抗体に暴露する時間が短縮されて、アッセイをさらに高速にすることができる。アッセイを特定の用途のために調整するか、またはインビボでの感染およびコロニー形成の検出に異なる試料型（例えば、組織または滑液）を使用するために、さらに改善を行ってもよい。滑液および埋込片周囲の組織は、整形外科用埋込片関連の感染症の微生物診断が推奨される。なおもさらに、埋込片を取り出す必要なしに感染がある場所を視覚化するために、ナノ粒子コンジュゲート抗体を、Ｘ線などの装置を用いることにより撮像してもよい。
【０１６９】
別の実施形態では、以下のプロトコルにより、ＣＬＳＭで撮像するための試料（例えば、外植片）を準備するためのおよそ３０分間の手順が得られる。第１のステップは、２５％ウサギ血清を含有するリン酸緩衝食塩水溶液で、外植片を緩徐に３回すすぐことである。すすぎステップに続いて、事前に作製した１：１の比のウシ血清アルブミンおよびウサギ血清の溶液で試料をブロッキングする。試料は、好ましくは、室温で１分当たり５０回転でロッキング装置において、およそ１５〜２０分間溶液中に留めるべきである。揺り動かした後、試料を、ブロッキング溶液から取り出し、コンジュゲートしたグラム陽性抗体およびグラム陰性抗体のカクテルを添加する。一実施形態では、グラム陽性抗体比は、１：２００であり、グラム陰性抗体の量は、１：７５０である。抗体溶液は、摂氏３７度であることが好ましい。抗体溶液は、使用前に温水槽で温めてもよい。外植片を、およそ１５分間暗所でインキュベートする。インキュベーションした後、外植片は、長時間（例えば、１週間）摂氏４度でリン酸緩衝液中に保管してもよく、即座に撮像してもよい。
【０１７０】
本技術の趣旨から逸脱することなく、例示した実施形態に、様々な変更および修正がなされてもよいことが、当業者には理解されるであろう。すべてのそのような修正および変更は、本技術の範囲内に含まれることが意図される。
本発明に関連して、以下の内容を更に開示する。
［１］
外植片における細菌コロニー形成およびバイオフィルム形成を視覚化および定量化するための方法であって、
１）前記外植片を、ＰＢＳブロッキング緩衝液および１％ウサギ血清（ＲＳ）の第１の溶液で続けて少なくとも１回洗浄するステップと、
２）第１の期間、グラム陽性およびグラム陰性の両方のコンジュゲート抗体を適用するステップと、
３）前記外植片を、ＰＢＳブロッキング緩衝液および１％ＲＳで続けて少なくとも１回洗浄するステップと、
４）第２の期間、グラム陽性およびグラム陰性の両方の二次抗体を導入するステップと、
５）ＰＢＳブロッキング緩衝液および１％ＲＳですすぐステップと、
６）前記外植片をグラム陽性およびグラム陰性の付着に関して、共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）で確認するステップと、を含む、方法。
［２］
ステップ１）および３）の前記少なくとも１回の洗浄が、それぞれ３回であり、
前記第１および第２の期間が、それぞれおよそ１５分である、［１］に記載の方法。
［３］
ステップ（１）〜（５）の間、光誘起損傷および光退色を予防するために、前記外植片の周囲にスズ箔を巻き付けるステップをさらに含む、［１］に記載の方法。
［４］
細菌プレートにおいて、グラム陽性およびグラム陰性の一次および二次の抗体型の間で確実に蛍光のバランスを取ってぼやけを最小限に抑えるために、複数回、抗体希釈試験を反復するステップをさらに含む、［１］に記載の方法。
［５］
前記外植片を、３０ｒｐｍでの緩徐な洗浄効果のためにロッキング装置に載置するステップをさらに含む、［１］に記載の方法。
［６］
前記ＣＬＳＭからの図を前記外植片の表面の三次元レンダリングに配置するステップをさらに含む、［１］に記載の方法。
［７］
外植片における細菌コロニー形成およびバイオフィルム形成を視覚化および定量化するための方法であって、
前記外植片を、ＰＢＳブロッキング緩衝液および１％ウサギ血清（ＲＳ）の第１の溶液で続けて少なくとも１回洗浄するステップと、
第１の期間、５０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および５０％ＲＳの第２の溶液でブロッキングするステップと、
第２の期間、グラム陽性およびグラム陰性の両方の一次抗体を導入するステップと、
前記外植片を、ＰＢＳブロッキング緩衝液および１％ＲＳで続けて少なくとも１回洗浄するステップと、
第３の期間、グラム陽性およびグラム陰性の両方の二次抗体を導入するステップと、
ＰＢＳブロッキング緩衝液および１％ＲＳですすぐステップと、
グラム陽性およびグラム陰性の付着に関して、前記外植片を、共焦点レーザー走査顕微鏡で確認するステップと、を含む、方法。
［８］
ステップ１）および３）の前記少なくとも１回の洗浄が、それぞれ３回であり、
前記第１、第２、および第３の期間が、それぞれおよそ１５分間である、［７］に記載の方法。
［９］
共焦点レーザー走査顕微鏡において撮像するための試料を調製するための方法であって、
ａ）前記試料を、第１のウサギ血清溶液で３回すすぐステップと、
ｂ）前記試料を、第１の期間、第２のウサギ血清溶液でブロッキングするステップと、
ｃ）前記第２のウサギ血清から前記試料を取り出すステップと、
ｄ）抗体溶液を添加して第２の期間インキュベートするステップと、を含む、方法。
［１０］
ブロッキング中に室温で前記試料をかき混ぜるステップをさらに含む、［９］に記載の方法。
［１１］
前記第１のウサギ血清溶液が、２５％のウサギ血清を含有するリン酸緩衝食塩水の溶液であり、
前記第１の期間が、およそ１５分間であり、
前記第２のウサギ血清溶液が、５０％のウサギ血清および５０％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）であり、
前記抗体溶液が、コンジュゲートしたグラム陽性抗体およびグラム陰性抗体のカクテルである、［９］に記載の方法。
［１２］
前記抗体溶液が、グラム陽性抗体比が１：２００であり、グラム陰性抗体量が１：７５０であることを有する、［１１］に記載の方法。
［１３］
前記抗体溶液が、１％ウサギ血清を有する、［１１］に記載の方法。
［１４］
前記抗体溶液が、摂氏およそ３７度であり、前記試料が、暗所でインキュベートされ、前記第２の期間が、およそ１５分間である、［１５］に記載の方法。
［１５］
インキュベートした後に、前記試料が、摂氏およそ４度でリン酸緩衝食塩水中に保管される、［９］に記載の方法。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ−７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ−１３Ｉ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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