(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ヒト間葉系前駆細胞またはヒト間葉系幹細胞を含む、得られたヒト細胞集団を培養すること、
（ｉｉ）前記細胞によって培地中に放出されたＴＧＦβ１の量を測定すること、および
（ｉｉｉ）ヒト間葉系前駆細胞またはヒト間葉系幹細胞が、少なくとも２８００ｐｇ／１０６細胞のＴＧＦβ１量を培地中に放出する場合かつその場合に限り、変性椎間板疾患に罹患した対象の治療において使用するために、前記得られた細胞集団を選択すること
を含む、変性椎間板疾患に罹患した対象の治療において使用するためにヒト間葉系前駆細胞またはヒト間葉系幹細胞を選択するための、インビトロ方法。
【請求項２】
前記得られた集団は、ヒト間葉系前駆細胞またはヒト間葉系幹細胞に富んでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培養ステップは、培養容器に、５０，０００生存細胞／ｃｍ２の密度で前記細胞を播種することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記培養ステップは、０．５％ウシ血清アルブミンを添加した軟骨形成基本培地で前記細胞を培養することを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞は、少なくとも６８〜７６時間培養される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記測定ステップは、前記細胞を培養した前記培地の試料を採取することを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記測定ステップは先に前記培地中の潜在ＴＧＦβ１を活性化させてから、前記培地中のＴＧＦβ１量を測定することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
潜在ＴＧＦβ１の活性化は、前記培地試料に酸を加えて前記培地のｐＨを下げることを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記方法は、先に前記培地試料を濃縮してからｐＨを下げることを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記酸の添加後、前記培地をｐＨ７．２〜７．６に中和させる、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって前記培地中のＴＧＦβ１の量を測定することを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記選択が、変性椎間板疾患の治療において使用するための選択である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヒト間葉系前駆細胞またはヒト間葉系幹細胞は、前記細胞集団の少なくとも５％を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項1〜１３のいずれか一項に記載の方法によって選択されたヒト間葉系前駆細胞またはヒト間葉系幹細胞を含む単離された細胞集団を含む、変性椎間板疾患に罹患した対象の治療において使用するための組成物。
【請求項１５】
凍害保護剤をさらに含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
ヒアルロナンをさらに含む、請求項１４または１５に記載の組成物。
【請求項１７】
変性椎間板疾患に罹患した対象の治療のための医薬の製造における、ヒト間葉系前駆細胞またはヒト間葉系幹細胞を含む単離された細胞集団の使用であって、ヒト間葉系前駆細胞またはヒト間葉系幹細胞が、培養条件下で少なくとも２８００ｐｇ／１０６細胞の量のＴＧＦβ１を放出定する場合かつその場合に限り、前記集団が前記使用のために選択されている、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、細胞治療製品のための効力検定に関する。間葉系の前駆細胞または幹細胞を含む細胞集団の効力検定を提供する。
【背景技術】
【０００２】
再生治療または免疫治療用のいくつかの細胞治療製品は、臨床的評価及び販売承認の段階まで前進を見せている。しかし、これらの細胞治療製品の上市にはその複雑さ及び不均一性が壁となっており、そのため関連する生物学的活性の同定、ひいては細胞治療製品の一定の品質を定義することが困難になっている。
【０００３】
物理化学的パラメータ（例えば、大きさの特性解析、形態、光散乱特性、引張り強度、細胞数、コンフルエント状態、表現型マーカーの同定、分泌物質、遺伝子型、遺伝子発現プロファイル）は、活性物質、中間体、不純物及び汚染物質の同定及び定量に日常的に使用されている。しかし、物理化学的パラメータでは、製品が生物学的に活性となり効力があるか（すなわち、所望の効果を誘導するか）を確認することはできない。対照的に、生物学的特性解析では、インビトロモデルでも、または動物及び最終的には臨床でのインビボモデルでも生物学系に対する製品の効果が考慮される。
【０００４】
米国及びヨーロッパの薬事規則では、分子構造を完全に定義できない活性物質は、上市前にその効力を評価することを要求している。許可を受けた細胞治療製品の各バッチの効力評価は法的要件である。
【０００５】
効力試験では、製品の関連する１つまたは複数の生物学的活性が実証されなければならない。効力試験は製品の生物学的機能すべてを反映させることは要件としてはいないが、１つ以上の関連する生物学的機能を示さなければならない。効力試験で使用する分析方法のための精度、感度、特異性及び再現性が確立されること、及びそれらが好適に頑健であることが望まれる。
【０００６】
細胞治療製品の有効性に欠かせないパラメータを同定し、それらを管理して（例えば、効力試験を介して）一定品質の製品を製造できるようにすることが求められている。
【発明の概要】
【０００７】
本願発明者らは、間葉系の前駆細胞または間葉系幹細胞（以後「間葉系前駆細胞または幹細胞」という）を含む細胞治療製品の生物学的活性または治療有効性を測定する効力検定を開発した。
【０００８】
したがって、本開示は、
（ｉ）間葉系前駆細胞または幹細胞を含む母集団を得、
（ｉｉ）該細胞を培地で培養し、かつ
（ｉｉｉ）該培地中に前記細胞によって放出されたＴＧＦβ１の量を測定し、ここで、少なくとも約２８００ｐｇ／１０６細胞のＴＧＦβ１量は、生物学的活性または治療有効性を示すことを含む、間葉系前駆細胞または幹細胞の効力を測定する方法を提供する。例えば、少なくとも約２８１０ｐｇ／１０６細胞のＴＧＦβ１、少なくとも約２８２０ｐｇ／１０６細胞ＴＧＦβ１、少なくとも約２８３０ｐｇ／１０６細胞ＴＧＦβ１、少なくとも約２８４０ｐｇ／１０６細胞ＴＧＦβ１、少なくとも約２８５０ｐｇ／１０６細胞ＴＧＦβ１、少なくとも約２８６０ｐｇ／１０６細胞ＴＧＦβ１、少なくとも約２８７０ｐｇ／１０６細胞ＴＧＦβ１、少なくとも約２８８０ｐｇ／１０６細胞ＴＧＦβ１、少なくとも約２８９０ｐｇ／１０６細胞ＴＧＦβ１、少なくとも約２９００ｐｇ／１０６細胞ＴＧＦβ１、少なくとも約２９１０ｐｇ／１０６細胞ＴＧＦβ１、少なくとも約２９２０ｐｇ／１０６細胞ＴＧＦβ１、少なくとも約２９３０ｐｇ／１０６細胞ＴＧＦβ１、少なくとも約２９４０ｐｇ／１０６細胞ＴＧＦβ１、少なくとも約２９５０ｐｇ／１０６細胞ＴＧＦβ１、少なくとも約２９６０ｐｇ／１０６細胞ＴＧＦβ１、少なくとも約２９７０ｐｇ／１０６細胞ＴＧＦβ１、少なくとも約２９８０ｐｇ／１０６細胞ＴＧＦβ１、少なくとも約２９９０ｐｇ／１０６細胞ＴＧＦβ１、または少なくとも約３０００ｐｇ／１０６細胞の量のＴＧＦβ１は、生物学的活性または治療有効性を示す。
【０００９】
本開示は、
（ｉ）間葉系前駆細胞または幹細胞を含む母集団を得、
（ｉｉ）該細胞を培地で培養し、かつ
（ｉｉｉ）該培地中に前記細胞によって放出されたＴＧＦβ１の量を測定し、ここで、少なくとも培地１ｍｌあたり約４００ｐｇのＴＧＦβ１量は、生物学的活性または治療有効性を示すことを含む、間葉系前駆細胞または幹細胞の効力を測定する方法も提供する。例えば、少なくとも培地１ｍｌあたり約４０５ｐｇのＴＧＦβ１、少なくとも培地１ｍｌあたり約４１０ｐｇのＴＧＦβ１、少なくとも培地１ｍｌあたり約４１５ｐｇのＴＧＦβ１、少なくとも培地１ｍｌあたり約４２０ｐｇのＴＧＦβ１、少なくとも培地１ｍｌあたり約４２５ｐｇのＴＧＦβ１、少なくとも培地１ｍｌあたり約４３０ｐｇのＴＧＦβ１、少なくとも培地１ｍｌあたり約４３５ｐｇのＴＧＦβ１、少なくとも培地１ｍｌあたり約４４０ｐｇのＴＧＦβ１、少なくとも培地１ｍｌあたり約４４５ｐｇのＴＧＦβ１、少なくとも培地１ｍｌあたり約４５０ｐｇのＴＧＦβ１、少なくとも培地１ｍｌあたり約４５５ｐｇのＴＧＦβ１、少なくとも培地１ｍｌあたり約４６０ｐｇのＴＧＦβ１、少なくとも培地１ｍｌあたり約４６５ｐｇのＴＧＦβ１、少なくとも培地１ｍｌあたり約４７０ｐｇのＴＧＦβ１、少なくとも培地１ｍｌあたり約４７５ｐｇのＴＧＦβ１、少なくとも培地１ｍｌあたり約４８０ｐｇのＴＧＦβ１、少なくとも培地１ｍｌあたり約４８５ｐｇのＴＧＦβ１、少なくとも培地１ｍｌあたり約４９０ｐｇのＴＧＦβ１、少なくとも培地１ｍｌあたり約４９５ｐｇの、または少なくとも培地１ｍｌあたり約５００ｐｇのＴＧＦβ１量は、生物学的活性または治療有効性を示す。
【００１０】
一実施形態では、細胞の生物学的活性は、インビトロにおいてヒト線維輪細胞でのコラーゲン産生を刺激する能力を含む。
【００１１】
一実施形態では、治療有効性は、変性椎間板疾患の治療における治療有効性を含む。
【００１２】
一実施形態では、方法は、あらかじめ培養で増殖させておいた間葉系前駆細胞または幹細胞の効力測定に使用される。代替実施形態では、方法は、新鮮単離された間葉系前駆細胞または幹細胞の効力測定に使用される。
【００１３】
一実施形態では、母集団は間葉系前駆細胞または幹細胞に富んでいる。
【００１４】
一実施形態では、方法はさらに、富化母集団を得るために間葉系前駆細胞または幹細胞を富化することを含む。例えば、間葉系前駆細胞または幹細胞は、ＳＴＲＯ−１＋細胞及び／または組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＡＰ）＋細胞の選択により富化される。
【００１５】
一実施形態では、間葉系前駆細胞または幹細胞は、ヒト間葉系前駆細胞または幹細胞である。
【００１６】
一実施形態では、方法は、培養容器に約５０，０００生存細胞／ｃｍ２で細胞を播種することを含む。
【００１７】
一実施形態では、方法は、０．５％ウシ血清アルブミンを添加した軟骨形成基本培地で細胞を培養することを含む。
【００１８】
一実施形態では、方法は、接着細胞を少なくとも６８〜７６時間培養することを含む。一実施形態では、接着細胞は、まず細胞母集団を、例えば０．５％ウシ血清アルブミンを添加した軟骨形成基本培地で一晩培養し、それらを培養容器に接着させることにより得られる。
【００１９】
一実施形態では、方法は、細胞を培養した培地の試料を採取することを含む。一実施形態では、採取した試料は、細胞を培養した培地のすべてを含む。
【００２０】
一実施形態では、方法は、先に培地中の潜在ＴＧＦβ１を活性化させてから、培地中のＴＧＦβ１量を測定することを含む。
【００２１】
一実施形態では、潜在ＴＧＦβ１の活性化は、培地のｐＨを下げるため、酸、例えば１Ｎ  ＨＣｌを培地に加えることを含む。一実施形態では、方法は、ｐＨを下げる前に培地試料を濃縮させることを含む。一実施形態では、方法は、酸を加えた後、例えば、１．２Ｎ  ＮａＯＨ／０．５Ｍ  ＨＥＰＥＳまたは１Ｎ  ＮａＯＨを加えることによって培地のｐＨを７．２〜７．６まで中和させることを含む。
【００２２】
一実施形態では、方法は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって培地中のＴＧＦβ１の量を測定することを含む。
【００２３】
一例では、ＥＬＩＳＡは、
（ｉ）培地をサンプル希釈液で１：５に希釈すること、
（ｉｉ）ＴＧＦβ１に対して特異的なモノクローナル抗体でプレコートしたマイクロプレートのウェルに希釈した培地を加えること、
（ｉｉｉ）マイクロプレートの各ウェルにサンプル希釈液を加えること、
（ｉｖ）マイクロプレートを室温で２時間インキュベートすること、
（ｖ）マイクロプレートを洗浄すること、
（ｖｉ）ウェルにＴＧＦβ１複合体を加えること、
（ｖｉｉ）マイクロプレートを室温で２時間インキュベートすること、
（ｖｉｉｉ）マイクロプレートを洗浄すること、
（ｉｘ）ウェルに基質溶液を加えること、
（ｘ）マイクロプレートを室温で３０分間インキュベートすること、
（ｘｉ）ウェルに停止液を加えること、
（ｘｉｉ）波長補正を５７０ｎｍにし、４５０ｎｍに設定したマイクロプレートリーダーで光学濃度を読み取ること、
（ｘｉｉｉ）希釈について補正したＴＧＦβ１の濃度を測定することを含む。
【００２４】
一実施形態では、サンプル希釈液は、０．５％ウシ血清アルブミンを添加した軟骨形成基本培地である。
【００２５】
一実施形態では、方法はさらに、
最終濃度が３１．２〜２０００ｐｇ／ｍｌの範囲のＴＧＦβ１標準液の段階希釈をサンプル希釈液で調製すること、
ステップ（ｉｉｉ）の前にマイクロプレートに標準液を加えること、
４パラメータロジスティック曲線フィッティングを使用して標準曲線を作成すること、及び
標準曲線を基準にして培地中のＴＧＦβ１の濃度を測定することを含む。
【００２６】
本開示は、間葉系前駆細胞の効力を測定する方法も提供し、
（ｉ）間葉系前駆細胞の母集団を得ること、
（ｉｉ）培養容器に、５０，０００生存細胞／ｃｍ２で細胞を播種すること、
（ｉｉｉ）０．５％ウシ血清アルブミンを添加した軟骨形成基本培地で細胞を培養すること、
（ｉｖ）培地を採取すること、
（ｖ）１Ｎ  ＨＣｌを加えて培地のｐＨを下げることによって、前記細胞が培地中に放出した潜在ＴＧＦβ１を活性化させること、
（ｖｉ）１．２Ｎ  ＮａＯＨ／０．５Ｍ  ＨＥＰＥＳまたは１Ｎ  ＮａＯＨを加えることによって、培地のｐＨを７．２〜７．６まで中和させること、
（ｖｉｉ）培地を、０．５％ウシ血清アルブミンを添加した軟骨形成基本培地で１：５に希釈すること、
（ｖｉｉｉ）ＴＧＦβ１に対して特異的なモノクローナル抗体でプレコートしたマイクロプレートのウェルに希釈した培地を加えること、
（ｉｘ）マイクロプレートの各ウェルにサンプル希釈液を加えること、
（ｘ）マイクロプレートを室温で２時間インキュベートすること、
（ｘｉ）マイクロプレートを洗浄すること、
（ｘｉｉ）ウェルにＴＧＦβ１複合体を加えること、
（ｘｉｉｉ）マイクロプレートを室温で２時間インキュベートすること、
（ｘｉｖ）マイクロプレートを洗浄すること、
（ｘｖ）ウェルに基質溶液を加えること、
（ｘｖｉ）マイクロプレートを室温で３０分間インキュベートすること、
（ｘｖｉｉ）ウェルに停止液を加えること、
（ｘｖｉｉｉ）波長補正を５７０ｎｍにし、４５０ｎｍに設定したマイクロプレートリーダーで光学濃度を読み取ること、
（ｘｉｘ）希釈について補正したＴＧＦβ１の濃度を測定することを含む。
【００２７】
一実施形態では、方法はさらに、
最終濃度が３１．２〜２０００ｐｇ／ｍｌの範囲のＴＧＦβ１標準液の段階希釈を、０．５％ウシ血清アルブミンを添加した軟骨形成基本培地で調製すること、
ステップ（ｉｘ）の前にマイクロプレートに標準液を加えること、
４パラメータロジスティック曲線フィッティングを使用して標準曲線を作成すること、及び
標準曲線を基準にして培地中のＴＧＦβ１の濃度を測定することを含む。
【００２８】
本開示は、治療で使用するために選択された間葉系前駆細胞または幹細胞を含む細胞の母集団も提供し、ここで、かかる細胞母集団は、開示の方法で評価した場合に２８００ｐｇ／１０６細胞のＴＧＦβ１を放出する。
【００２９】
本開示は、治療で使用するために選択された間葉系前駆細胞または幹細胞を含む単離された細胞母集団も提供し、ここで、かかる細胞母集団は、開示の方法で評価した場合に培地１ｍｌあたり４００ｐｇのＴＧＦβ１を放出する。
【００３０】
本開示は、間葉系前駆細胞または幹細胞を含む単離された細胞母集団も提供し、ここで、かかる細胞母集団は、培養条件下でのＴＧＦβ１放出を測定することによって治療で使用するために選択されている。
【００３１】
一実施形態では、単離された細胞母集団は、培養で増殖させた間葉系前駆細胞または幹細胞を含む。代替実施形態では、単離された細胞母集団は、新鮮単離された間葉系前駆細胞または幹細胞を含む。一実施形態では、単離された細胞母集団は、アッセイを行って培養条件下でのＴＧＦβ１放出が測定されている間葉系前駆細胞または幹細胞を含む。別の実施形態では、単離された細胞母集団は、サンプリングを行って培養条件下でのＴＧＦβ１放出が測定されている母集団に由来する間葉系前駆細胞または幹細胞（すなわち、単離された母集団の細胞自体には、培養条件下でのＴＧＦβ１放出を測定するためのアッセイは行われていない）を含む。
【００３２】
一実施形態では、間葉系前駆細胞または幹細胞は単離された細胞集団の少なくとも５％を構成する。
【００３３】
一実施形態では、上述の単離された細胞集団の１つ及び凍害保護剤を含む組成物も提供される。一実施形態では、組成物中の凍害保護剤はＤＭＳＯまたはＰｒｏｆｒｅｅｚｅ（商標）である。一実施形態では、組成物は、４２．５％（ｖ／ｖ）Ｐｒｏｆｒｅｅｚｅ（商標）／５０％αＭＥＭ（ｖ／ｖ）／７．５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ中に溶解させた単離された細胞集団を含む。
【００３４】
一実施形態では、本明細書は、上述の単離された細胞集団の１つ及びヒアルロナン、例えば、少なくとも約０．５％のＨＡまたはＨＡ塩、少なくとも約０．６％のＨＡまたはＨＡ塩、少なくとも約０．７％のＨＡまたはＨＡ塩、少なくとも約０．８％のＨＡまたはＨＡ塩、少なくとも約０．９％のＨＡまたはＨＡ塩、少なくとも約１％のＨＡまたはＨＡ塩、少なくとも約１．５％のＨＡまたはＨＡ塩、少なくとも約２％のＨＡまたはＨＡ塩、少なくとも約２．５％のＨＡまたはＨＡ塩、少なくとも約３％のＨＡまたはＨＡ塩、少なくとも約３．５％のＨＡまたはＨＡ塩、少なくとも約４％のＨＡまたはＨＡ塩、少なくとも約４．５％のＨＡまたはＨＡ塩、少なくとも約５％のＨＡまたはＨＡ塩、少なくとも約６％のＨＡまたはＨＡ塩、少なくとも約７％のＨＡまたはＨＡ塩、少なくとも約８％のＨＡまたはＨＡ塩、少なくとも約９％のＨＡまたはＨＡ塩、または少なくとも約１０％のＨＡまたはＨＡ塩のを含む組成物を提供する。
【００３５】
本開示は、変性椎間板疾患に罹患した対象を治療する方法も提供し、かかる方法は、対象に開示の組成物を投与することを含む。
【００３６】
一実施形態では、凍結保存されている開示組成物を解凍してヒアルロナン（ＨＡ）またはＨＡ塩、例えば、ＨＡナトリウムなどと混合してから投与する。
【００３７】
本開示は、変性椎間板疾患に罹患した対象を治療する方法も提供し、かかる方法は、少なくとも培地１ｍｌあたり約４００ｐｇのＴＧＦβ１を含む培地を対象に投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１Ａ】ＩＶＤの位置と構造を示す。２椎体間の椎間板（ＩＶＤ）の位置を示す代表図である。
【図１Ｂ】ＩＶＤの位置と構造を示す。周囲を線維輪（ＡＦ）に囲まれた中心部の髄核（ＮＰ）、及び椎体終板を示す健常な椎間板（図の出典（Ｒａｊ、２００８））である。
【図２Ａ】微小塊培養におけるヒトＮＰＣの増殖とマトリックス組成に対するＭＰＣ  ＣＭの効果を示す。間葉前駆細胞（ＭＰＣ）により条件付けされた培地（ＣＭ）に応答した髄核細胞（ＮＰＣ）増殖時のＥｄＵの取り込みを示すデータである。データは、ＥｄＵ取り込みの陽性の割合（％）の平均±ＳＤとして表されている。ｎ＝３連／条件。
【図２Ｂ】微小塊培養におけるヒトＮＰＣの増殖とマトリックス組成に対するＭＰＣ  ＣＭの効果を示す。ヒトＮＰＣ微小塊培養で硫酸化ＧＡＧプロテオグリカンについて行ったアルシアンブルー染色の代表的画像である。
【図２Ｃ】微小塊培養におけるヒトＮＰＣの増殖とマトリックス組成に対するＭＰＣ  ＣＭの効果を示す。ＮＰ微小塊培養から抽出したプロテオグリカンの半定量である。データは、平均±ＳＤとして表されている。ｎ＝３連／条件。有意水準（ｐ≦０．０５）と対照基本培地との比較。
【図３Ａ】微小塊培養におけるヒトＡＦＣの増殖とマトリックス産生に対するＭＰＣ  ＣＭのインビトロでの効果。ＭＰＣ  ＣＭに応答した線維輪細胞（ＡＦＣ）の増殖を示すデータである。データは、ＥＤＵ取り込みの陽性の割合（％）の平均±ＳＤとして表されている。ｎ＝３連／条件。
【図３Ｂ】微小塊培養におけるヒトＡＦＣの増殖とマトリックス産生に対するＭＰＣ  ＣＭのインビトロでの効果。ＭＰＣ  ＣＭに応答してＡＦ微小塊培養で産生された総コラーゲンの定量を示す。平均±ＳＤとして表されている１つのドナーから得た代表的データである。ｎ＝３連／条件。有意水準（ｐ≦０．０５）と対照基本培地との比較。
【図４】ＭＰＣ  ＣＭで検出されたＴＧＦβ１のレベル。ＥＬＩＳＡにより測定したＭＰＣ  ＣＭ中のＴＧＦβ１の検出である。データは、２連試料の平均として表されている。異なる５つのドナーに由来するＭＰＣのロット、ｎ＝１５。
【図５Ａ】ヒトＡＦＣの微小塊培養におけるヒドロキシプロリン含有量に対するＴＧＦβ１及びＭＰＣ  ＣＭの効果。３つのＡＦＣドナーから得たＡＦ微小塊培養における組換え型ヒトＴＧＦβ１（ｒｈＴＧＦβ１）誘導性コラーゲン産生に対する用量反応である。データは、抗ＴＧＦβ１中和抗体に応答した有意なｒｈＴＧＦ１阻害を示す。
【図５Ｂ】ヒトＡＦＣの微小塊培養におけるヒドロキシプロリン含有量に対するＴＧＦβ１及びＭＰＣ  ＣＭの効果。抗ＴＧＦβ１による中和またはＩｇＧ対照を受けた後の、ＭＰＣ  ＣＭに応答してＡＦ微小塊培養により産生された総コラーゲンの定量を示す。    ３つのＡＦＣドナー及び４〜７ロットのＭＰＣ  ＣＭにより作成されたデータである。データは、平均±ＳＤとして表されている。ｎ＝３連／条件。有意水準（ｐ≦０．０５）と、＊対照基本培地；‡ＩｇＧ対照との比較。
【図６】胎児ヒトＡＦＣと成人ヒトＡＦＣの各微小塊培養で比較した、ヒドロキシプロリン含有量に対するｒｈＴＧＦβ１の効果。胎児及び成人の各ＡＦＣ微小塊培養によるｒｈＴＧＦβ１に応答したコラーゲン産生を示す。各データポイントは、３つの胎児または成人のＡＦＣドナーを表す。データは、平均±ＳＤとして表されている。ｎ＝６〜９連／条件。
【図７Ａ】成人ヒトＡＦＣ微小塊培養におけるヒドロキシプロリン含有量に対するＴＧＦβ及びＭＰＣ  ＣＭの効果。３つのＡＦＣドナーから得た成人ＡＦＣ微小塊培養による、ｒｈＴＧＦβ１またはＭＰＣ  ＣＭに応答したコラーゲン産生。データは、平均±ＳＤとして表されている。ｎ＝３〜８連／条件。
【図７Ｂ】成人ヒトＡＦＣ微小塊培養におけるヒドロキシプロリン含有量に対するＴＧＦβ及びＭＰＣ  ＣＭの効果。３つのＡＦＣドナーから得た成人ＡＦＣ微小塊培養による、ｒｈＴＧＦβ１またはＭＰＣ  ＣＭに応答したコラーゲン産生。データは、平均±ＳＤとして表されている。ｎ＝３〜８連／条件。
【図７Ｃ】成人ヒトＡＦＣ微小塊培養におけるヒドロキシプロリン含有量に対するＴＧＦβ及びＭＰＣ  ＣＭの効果。３つのＡＦＣドナーから得た成人ＡＦＣ微小塊培養による、ｒｈＴＧＦβ１またはＭＰＣ  ＣＭに応答したコラーゲン産生。データは、平均±ＳＤとして表されている。ｎ＝３〜８連／条件。
【図７Ｄ】成人ヒトＡＦＣ微小塊培養におけるヒドロキシプロリン含有量に対するＴＧＦβ及びＭＰＣ  ＣＭの効果。成人ＡＦＣ３ロットの平均ヒドロキシプロリン含有量である。有意水準（ｐ≦０．０５）（対照基本培地（０ｎｇ／ｍｌのｒｈＴＧＦβ１）に対して）。
【図８】異なる基本培地で増殖させたＭＰＣからのＣＭ中ＴＧＦβ１レベル。ＣＭ作製に最適な培地組成と、最適下限の培地組成で比較した、ＥＬＩＳＡ測定による増殖後のＭＰＣ  ＣＭ中のＴＧＦβ１の検出。濃色バー＝軟骨形成基本培地＋０．５％ウシ血清アルブミン（ＣＢＭ＋０．５％ＢＳＡ）。明色バー＝ＥＢＭ−２  ＋０．５％ＢＳＡ）。データは、２連試料の平均として表されている。ＭＰＣロットはすべて単一ドナー由来である。
【図９】ＭＰＣ  ＣＭで検出されたＴＧＦβ１のレベル。ＴＧＦβ１の検出には、試料の酸処理を要したため、測定値はＣＭ中の総ＴＧＦβ１を反映している。データは、平均±ＳＤとして表されている。４つの異なるドナーに由来するＭＰＣのロット、ｎ＝１８。
【図１０Ａ】微小塊培養における、胎児ヒトＡＦＣ（ロット４７２９）のマトリックス組成に対するＴＧＦβ１及びＭＰＣ  ＣＭの効果。４ロットから得たＭＰＣ製品を、ＴＧＦβ１を標的にするｓｉＲＮＡまたはスクランブル陰性対照を用いてトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞から生成されたＣＭ中ＴＧＦβ１レベルを示す。データは、ＴＧＦβ１  ｓｉＲＮＡを含むＣＭの生物活性が有意に阻害されていることを示す。データは、平均±ＳＤとして表されている。ｎ＝１８の正常ＣＭ（３〜８複製試料／ＣＭ）、及び４つのスクランブルＭＰＣまたはＴＧＦβ１  ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされたＭＰＣ（３連／条件）。未刺激基本対照（＊）またはスクランブル対照（＋）に対し有意水準はｐ≦０．０５。
【図１０Ｂ】微小塊培養における、胎児ヒトＡＦＣ（ロット４７２９）のマトリックス組成に対するＴＧＦβ１及びＭＰＣ  ＣＭの効果．未処理ＭＰＣまたはｓｉＲＮＡをトランスフェクションされたＭＰＣに由来するＣＭに応答した胎児ＡＦＣ（ロット４７２９）による平均コラーゲン産生である。データは、ＴＧＦβ１  ｓｉＲＮＡを含むＣＭの生物活性が有意に阻害されていることを示す。データは、平均±ＳＤとして表されている。ｎ＝１８の正常ＣＭ（３〜８複製試料／ＣＭ）、及び４つのスクランブルＭＰＣまたはＴＧＦβ１  ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされたＭＰＣ（３連／条件）。未刺激基本対照（＊）またはスクランブル対照（＋）に対し有意水準はｐ≦０．０５。
【図１１】ＭＰＣ  ＣＭとＡＦＣで比較した、コラーゲン産生におけるＴＧＦβ１レベルの回帰分析。
【図１２Ａ】初期細胞播種密度、時間及び操作者を相関する要素とした、２つのＭＰＣロットによるＴＧＦ−β１分泌。２５，０００細胞／ｃｍ２で播種した細胞の経時的解析。
【図１２Ｂ】初期細胞播種密度、時間及び操作者を相関する要素とした、２つのＭＰＣロットによるＴＧＦ−β１分泌。５０，０００細胞／ｃｍ２で播種した細胞の経時的解析。
【図１３Ａ】ＥＬＩＳＡキットの３ロットから得た標準曲線を使用したＴＧＦβ１標準曲線の直線性。キャリブレーター希釈液で作成した標準曲線。
【図１３Ｂ】ＥＬＩＳＡキットの３ロットから得た標準曲線を使用したＴＧＦβ１標準曲線の直線性。ＣＢＭ＋０．５％ＢＳＡで作成した標準曲線。
【図１４】キャリブレーター希釈液と軟骨形成基本培地（ＣＢＭ）＋０．５％ＢＳＡで比較する、ＴＧＦβ１  ＥＬＩＳＡ法の標準曲線。キャリブレーター希釈液及びＣＢＭ＋０．５％ＢＳＡで作成したそれぞれの標準曲線を比較してマトリックス効果を評価した（同一プレート上で並行して分析を行った）。各標準曲線は２連で表され、独立した２つの実験を実施した。キャリブレーター希釈液で作成した標準曲線よりもＣＢＭで作成した標準曲線の方がＯＤがわずかに高く、マトリックス効果があったことが示された。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
一般技術及び定義
本明細書全体を通して、特に具体的な断りがある、または文脈において特に指定がある場合を除いては、単一のステップ、組成物、ステップ群または組成物群は、かかるステップ、組成物、ステップ群または組成物群を１つ及び複数（すなわち１つ以上）包含すると解釈されるべきである。
【００４０】
本明細書に記載する開示は、具体的に記載されているもの以外に変更及び修正を受けやすいことは、当業者には理解されるであろう。本開示には、そのような変更及び修正すべてが含まれることを理解されるべきである。また、本開示には、本明細書において個別または集合的に言及または指示されるステップ、特徴、組成物及び化合物のすべて、ならびに前記ステップもしくは特徴の任意の２つ以上のあらゆる組み合わせも含まれる。
【００４１】
本開示は、あくまで例示することが意図されている、本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲を限定されるものではない。機能的に同等な生成物、組成物及び方法は、本開示の範囲内であることは明確である。
【００４２】
本明細書のいかなる例も、特に具体的に断らない限り、他のいかなる例にも準用すると解釈されるべきである。
【００４３】
特に明記しない限り、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、当該技術分野（例えば、細胞培養、分子遺伝学、幹細胞分化、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、及び生化学の分野）の当業者に共通して理解される意味と同一の意味を持つと解釈されるべきである。
【００４４】
特に明記しない限り、本開示で利用する幹細胞、細胞培養、及び外科手法は、当業者に周知の標準的手技である。このような技術は、（Ｐｅｒｂａｌ、１９８４）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｇｒｅｅｎ、２０１２）（Ｂｒｏｗｎ、１９９１）（Ｇｌｏｖｅｒ＆Ｈａｍｅｓ、１９９５、１９９６）（Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．、１９８７、現在までの更新すべてを含む）（Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ、１９８８）及び（Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｓｈｅｖａｃｈ、＆Ｓｔｒｏｂｅｒ、１９９１、及び現在までの更新すべてを含む）などの原文献に十分な記載及び説明がある。
【００４５】
用語「及び／または」、例えば、「Ｘ及び／またはＹ」は、「Ｘ及びＹ」または「ＸまたはＹ」のいずれも意味すると理解されるべきであり、かつ両方の意味またはいずれか一方の意味について明確に支持すると理解されるべきである。
【００４６】
本明細書で使用する場合、約、という用語は、特に断らない限り、指定値の＋／−１０％、より好ましくは＋／−５％を指す。
【００４７】
本明細書全体を通して、語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」、または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」もしくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」のような変形は、記述されている要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群を含むが、他の任意の要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群を除外するものではないことを意味すると理解されるであろう。
【００４８】
間葉系前駆細胞
本明細書で使用する場合、用語「間葉系前駆細胞または幹細胞」は、多能性を維持しつつ自己再生する能力、ならびに間葉に由来する細胞型、例えば、破骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、間質細胞、線維芽細胞及び腱、または中胚葉組織に由来しない細胞型、例えば、肝細胞、神経細胞及び上皮細胞といった多数の細胞型に分化する能力を有する未分化の多能性細胞を指す。
【００４９】
用語「間葉系前駆細胞または幹細胞」には、親細胞及びその未分化の後代の両方が含まれる。この用語には、間葉系前駆細胞、多能性間質細胞、間葉系幹細胞、血管周囲の間葉系前駆細胞、及びその未分化の後代も含まれる。
【００５０】
間葉系前駆細胞または幹細胞は、自己由来、異種、同系または同質であり得る。自己由来細胞は、再び細胞を移植する同一個体から単離される。同種細胞は、同一種ドナーから単離される。異種細胞は、別の種のドナーから単離される。同系細胞または同質細胞は、遺伝学的に同一な生物、例えば双子、クローン、または高近交系研究用動物モデルから単離される。
【００５１】
間葉系前駆細胞または幹細胞は、主に、骨髄に存在するが、さまざまな宿主組織、例えば、臍帯血及び臍帯、成人末梢血、脂肪組織、海綿骨及び歯髄にも存在することがわかっている。
【００５２】
間葉系前駆細胞または幹細胞は、宿主組織から単離され得、ＳＴＲＯ−１＋細胞を選択することにより富化され得る。例えば、対象から得た骨髄穿刺液をＳＴＲＯ−１またはＴＮＡＰに対する抗体でさらに処理して、間葉系前駆細胞または幹細胞の選択を可能にしてよい。一例では、間葉系前駆細胞または幹細胞は、（Ｓｉｍｍｏｎｓ＆Ｔｏｒｏｋ−Ｓｔｏｒｂ、１９９１）に記載のＳＴＲＯ−１抗体を使用して富化され得る。
【００５３】
ＳＴＲＯ−１＋細胞は、骨髄、血液、歯髄細胞、脂肪組織、皮膚、脾臓、膵臓、脳、腎臓、肝臓、心臓、網膜、脳、毛包、腸、肺、リンパ節、胸腺、骨、靭帯、腱、骨格筋、真皮、及び骨膜に見られる細胞であり、これらは、中胚葉及び／または内胚葉及び／または外胚葉などの生殖細胞に分化することができる。したがって、ＳＴＲＯ−１＋細胞は、脂肪組織、骨組織、軟骨組織、弾性組織、筋組織、及び繊維性結合組織を含むがこれらに限定されない多数の細胞型に分化することができる。特定の分化系列決定及びこれらの細胞が入る分化経路は、機械的影響ならびに／または内因性生物活性因子、例えば増殖因子、サイトカイン、及び／または宿主組織により確立された局所微小環境条件から受ける多様な影響に左右される。本明細書で使用する「富化された」という用語は、特定の１つの細胞型の割合または特定の多数の細胞型の割合が、未処理の細胞母集団（例えば、その天然の環境）と比べて増強されている細胞母集団を表す。一例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞を富化した母集団は、少なくとも約０．１％または０．５％または１％または２％または５％または１０％または１５％または２０％または２５％または３０％または５０％または７５％のＳＴＲＯ−１＋細胞を含む。これに関し、「ＳＴＲＯ−１＋細胞を富化した細胞母集団」という用語は、Ｘ％が本明細書で引用するパーセンテージである「Ｘ％のＳＴＲＯ−１＋細胞を含む細胞母集団」という用語を明確に支持すると解釈されることになる。いくつかの例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞はクローン原性コロニーを形成することができ、例えば、ＣＦＵ−Ｆ（線維芽細胞）またはそのサブセット（例えば、５０％または６０％または７０％または７０％または９０％または９５％）は、この活性を有しうる。
【００５４】
一例では、細胞母集団は、ＳＴＲＯ−１＋細胞を選択可能な形態で含む細胞調製物により富化される。これに関し、「選択可能な形態」という用語は、ＳＴＲＯ−１＋細胞の選択を可能にするマーカー（例えば、細胞表面マーカー）を細胞が発現するという意味であると理解されるであろう。マーカーはＳＴＲＯ−１であり得るが、必須ではない。例えば、本明細書に記載され、かつ／または例示されているように、ＳＴＲＯ−２及び／またはＳＴＲＯ−３（ＴＮＡＰ）及び／またはＳＴＲＯ−４及び／またはＶＣＡＭ−１及び／またはＣＤ１４６及び／または３Ｇ５を発現している細胞（例えば、ＭＰＣ）は、ＳＴＲＯ−１（また、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔであり得る）をも発現する。したがって、細胞がＳＴＲＯ−１＋であると示されても、その細胞がＳＴＲＯ−１発現によって選択されたという意味にはならない。一例では、細胞は少なくともＳＴＲＯ−３発現に基づいて選択され、例えば、それらの細胞はＳＴＲＯ−３＋（ＴＮＡＰ＋）である。
【００５５】
細胞またはその母集団の選択基準は、必ずしも特定組織供給源からの選択を要求してはいない。本明細書に記載するＳＴＲＯ−１＋細胞は、多種多様な供給源からの選択または単離または富化が可能である。しかしながら、いくつかの例では、これらの用語は、ＳＴＲＯ−１＋細胞を含む任意の組織、または血管新生組織、または周皮細胞（例えば、ＳＴＲＯ−１＋周皮細胞）、または本明細書で引用した組織のうち任意の１つ以上を含む組織から選択されることを支持するものである。
【００５６】
一例では、開示の間葉系前駆細胞または幹細胞は、ＴＮＡＰ＋、ＶＣＡＭ−１＋、ＴＨＹ−１＋、ＳＴＲＯ−２＋、ＳＴＲＯ−４＋（ＨＳＰ−９０β）、ＣＤ４５＋、ＣＤ１４６＋、３Ｇ５＋からなる群から個々別々または集合的に選択される１つ以上のマーカーを発現する。
【００５７】
「個々別々に」という語により、開示は、記載されているマーカーまたはマーカー群を別々にを包含すること、及び、本明細書に個々のマーカーまたはマーカー群が別々に列記されていなくても、添付の請求項により、そのようなマーカーまたはマーカー群は互いに別々かつ可分に定義され得ることを意味する。
【００５８】
「集合的に」という語により、開示は、記載されているマーカーまたはペプチド群の任意の数または組み合わせを包含すること、及び、マーカーまたはマーカー群のそのような数または組み合わせが本明細書に具体的に列記されていなくても、添付の請求項により、そのような組み合わせまたは部分的組み合わせは、マーカーまたはマーカー群の他の任意の組み合わせとは別々かつ可分に定義され得ることを意味する。
【００５９】
一例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞はＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ（ｓｙｎ．ＳＴＲＯ−１ｂｒｉ）である。一例では、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉ細胞は、ＳＴＲＯ−１ｄｉｍまたはＳＴＲＯ−１ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ細胞に関して選択的に富化される。
【００６０】
一例では、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞はさらに、ＴＮＡＰ＋、ＶＣＡＭ−１＋、ＴＨＹ−１＋、ＳＴＲＯ−２＋、ＳＴＲＯ−４＋（ＨＳＰ−９０β）及び／またはＣＤ１４６＋のうち１つ以上である。例えば、細胞は、上述のマーカーのうち１つ以上について選択され、かつ／または上述のマーカーのうち１つ以上の発現を示す。これに関し、あるマーカーの発現を示す細胞は必ずしも詳細に試験されなくてもよく、むしろ、あらかじめ富化または単離された細胞を試験した後で使用することができ、単離または富化された細胞は、当然同じマーカーを発現するともみなされ得る。
【００６１】
一例では、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞は、ＷＯ２００４／８５６３０で定義されているように血管周囲間葉系前駆細胞であり、血管周囲のマーカーである３Ｇ５の存在を特徴とする。
【００６２】
所与のマーカーについて「陽性」とされる細胞は、マーカーが細胞表面にどの程度存在しているかによって、そのマーカーを低（ｌｏまたはｄｉｍ）レベルでも高（ｂｒｉｇｈｔ、ｂｒｉ）レベルでも発現し得、各用語は、蛍光強度または細胞の選別工程で使用した他のマーカーに関連している。ｌｏ（またはｄｉｍまたはｄｕｌｌ）とｂｒｉの違いは、選別される特定の細胞集団に使用したマーカーとの関連で理解されるであろう。所与のマーカーについて「陰性」とされる細胞は、必ずしもその細胞に完全に欠如しているわけではない。この用語は、その細胞が相対的に非常に低いレベルで当該マーカーを発現していること、及び標識可能に標識した場合に該マーカーが非常に低いシグナルを発するか、または背景レベル、例えば、アイソタイプ・コントロール抗体を使用して検出されるレベルより上で検出不可能であることを意味する。
【００６３】
本明細書で使用する「ｂｒｉｇｈｔ」またはｂｒｉという用語は、標識可能に標識した場合に比較的高いシグナルを発する細胞表面上マーカーを指す。理論により制限を受けることは望まないが、「ｂｒｉｇｈｔ」細胞は、試料中の他の細胞よりも多くの標的マーカータンパク質（例えば、ＳＴＲＯ−１抗体によって認識される抗原）を発現すると提案されている。例えば、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉ細胞は、ＦＩＴＣを結合させたＳＴＲＯ−１抗体で標識すると、蛍光活性化細胞選別（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ：ＦＡＣＳ）分析により測定した場合にｂｒｉｇｈｔではない細胞（ＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌ／ｄｉｍ）よりも強い蛍光シグナルを産生する。一例では、間葉系前駆細胞または幹細胞は骨髄から単離され、ＳＴＲＯ−１＋細胞の選択によって富化される。この例では、「ｂｒｉｇｈｔ」細胞は、開始試料に含まれている最も強く（ｂｒｉｇｈｔｌｙ）標識された骨髄単核球細胞の少なくとも約０．１％を構成する。他の例では、「ｂｒｉｇｈｔ」細胞は、開始試料に含まれている最も強く（ｂｒｉｇｈｔｌｙ）標識された骨髄単核球細胞の少なくとも約０．１％、少なくとも約０．５％、少なくとも約１％、少なくとも約１．５％、または少なくとも約２％を構成する。一例では、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞は、ＳＴＲＯ−１表面発現が「背景」、すなわちＳＴＲＯ−１−である細胞に対して２ｌｏｇ高い。これに対し、ＳＴＲＯ−１ｄｉｍ及び／またはＳＴＲＯ−１ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ細胞は、ＳＴＲＯ−１表面発現は「背景」を２ｌｏｇ未満、典型的に約１ｌｏｇ以下で上回る。
【００６４】
本明細書で使用する用語「ＴＮＡＰ」は、組織非特異的アルカリホスファターゼのすべてのアイソフォームを包含することを意図する。例えば、この用語は、肝臓のアイソフォーム（ＬＡＰ）、骨のアイソフォーム（ＢＡＰ）及び腎臓のアイソフォーム（ＫＡＰ）を包含する。一例では、ＴＮＡＰはＢＡＰである。一例では、ＴＮＡＰとは、ブダペスト条約の規定に基づき２００５年１２月１９日にＡＴＣＣに寄託された、寄託の受託番号ＰＴＡ−７２８２のハイブリドーマ細胞株によって産生されるＳＴＲＯ−３抗体と結合することができる分子を指す。
【００６５】
さらに、一例では、ＳＴＲＯ−１＋細胞は、クローン原性ＣＦＵ−Ｆを発生させることができる。
【００６６】
一例では、かなりの割合のＳＴＲＯ−１＋細胞が、少なくとも２種の異なる生殖細胞に分化することができる。細胞の分化が決定され得る系列の非限定的な例には、骨前駆細胞；胆管上皮細胞及び肝細胞の多能性細胞である肝細胞前駆細胞；オリゴデンドロサイト及びアストロサイトへと発達するグリア細胞前駆細胞を発生させることができる神経拘束性細胞；ニューロンに発達する神経前駆細胞；心筋及び心筋細胞の前駆細胞、グルコース反応性インスリン分泌膵ベータ細胞株が挙げられる。他の系列には、象牙芽細胞、象牙質産生細胞及び軟骨細胞、ならびに以下の前駆細胞、すなわち、網膜色素上皮細胞、線維芽細胞、ケラチノサイトのような皮膚細胞、樹状細胞、毛包細胞、腎管（ｒｅｎａｌ  ｄｕｃｔ）上皮細胞、平滑筋細胞と骨格筋細胞、精巣の前駆細胞、血管内皮細胞、腱、靭帯、軟骨、脂肪細胞、線維芽細胞、骨髄間質細胞（ｍａｒｒｏｗ  ｓｔｒｏｍａ）、心筋、平滑筋、骨格筋、周皮細胞、血管、上皮、グリア、ニューロン、アストロサイト及びオリゴデンドロサイトの各細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６７】
一例では、間葉系前駆細胞または幹細胞はＭＳＣである。ＭＳＣは、均質の組成物であってもよいし、またはＭＳＣを富化した混合細胞集団であってもよい。均質なＭＳＣ組成物は、接着性の骨髄細胞または骨膜細胞の培養により得てよく、また特異なモノクローナル抗体で同定される特定の細胞表面マーカーによってＭＳＣを同定してよい。ＭＳＣを富化した細胞集団を得る方法は、例えば、米国特許第５４８６３５９号に記載されている。ＭＳＣの代替的供給源には、血液、皮膚、臍帯血、筋肉、脂肪、骨、及び軟骨膜が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６８】
単離または富化された間葉系前駆細胞もしくは幹細胞は、培養によるインビトロでの増殖が可能である。当業者に理解されるように、単離または富化された間葉系前駆細胞または幹細胞は、凍結保存、解凍の後、培養によるインビトロでの増殖が可能である。
【００６９】
一例では、単離または富化または培養された間葉系前駆細胞もしくは幹細胞を、血清添加培地、例えば、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及びグルタミンを添加したアルファ最小必須培地（αＭＥＭ）に５０，０００生存細胞／ｃｍ２で播種し、培養容器に３７℃、２０％Ｏ２で一晩接着させる。その後、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加した軟骨形成基本培地（ＣＢＭ；Ｌｏｎｚａ、ウォーカーズビル、メリーランド州）で培地を交換し、細胞をさらに３７℃、５％Ｏ２で６８〜７２時間培養してから、細胞によって培地中に放出されたＴＧＦβ１の量を測定する。
【００７０】
培養した間葉系前駆細胞または幹細胞は、インビボでの細胞とは表現型が異なっている。例えば、一実施形態では、これらの細胞はＣＤ４４、ＮＧ２、ＤＣ１４６及びＣＤ１４０ｂのうち１つ以上のマーカーを発現する。
【００７１】
培養した間葉系前駆細胞または幹細胞は、インビボでの細胞とは生物学的に異なっており、インビボでほとんど非周期（静止期）の細胞と比較して増殖速度が速い。
【００７２】
間葉系前駆細胞または幹細胞は、対象への投与前に凍結保存してよい。
【００７３】
ＴＧＦβ１レベルの測定
本開示はあらゆる形態のアッセイを意図し、これには、ウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光結合免疫吸着法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ：ＦＬＩＳＡ）、競合アッセイ、ラジオイムノアッセイ、ラテラルフローイムノアッセイ、フロースルー免疫測定法、電気化学発光法、ネフェロメトリーによる測定法、比濁法による測定法、間葉系細胞または前駆細胞の培養に使用した培地中のＴＧＦβ１を検出するための蛍光活性化細胞選別（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）による測定法、及び表面プラズモン共鳴法（ＢｉａｃｏｒｅのＳＰＲ）が含まれる。
【００７４】
好適なアッセイの一形態は、例えば、ＥＬＩＳＡまたはＦＬＩＳＡである。
【００７５】
一形態では、このようなアッセイは、例えば、ポリスチレンもしくはポリカーボネートのマイクロウェルもしくはディップスティック、膜、またはガラス製支持体（例えば、スライドガラス）などの固体マトリックス上へのＴＧＦβ１結合タンパク質の固定を行う。その後、ＴＧＦβ１結合タンパク質に被験試料を直接接触させると、試料中のＴＧＦβ１が結合する、すなわち捕捉される。洗浄して、試料中の結合していないタンパク質をすべて除去した後、異なるエピトープでＴＧＦβ１に結合するタンパク質を、捕捉したＴＧＦβ１と直接接触させる。この検出用タンパク質は一般に、検出可能なレポーター分子、例えば、ＥＬＩＳＡの場合は酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）またはβ−ガラクトシダーゼ）、またＦＬＩＳＡの場合はフルオロフォアなどで標識される。別法として、検出用タンパク質に結合する、第２の標識済タンパク質を使用することができる。洗浄して、結合していないタンパク質をすべて除去した後、ＥＬＩＳＡの場合は、例えば、過酸化水素、ＴＭＢ、またはトルイジン、または５−ブロモ−４−クロロ−３−インドール−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｘ−ｇａｌ）などの基質を加えることによって検出可能なレポーター分子を検出する。もちろん固定化した（捕捉）タンパク質及び検出用タンパク質を逆にして使用してよい。
【００７６】
その後、既知量のマーカーを使用して作成した標準曲線を使用するか、または対照試料と比較することにより試料中の抗原レベルを測定する。
【００７７】
上記の各種アッセイを簡単に変更して、化学発光または電気化学発光を検出の基盤として使用するようにする。
【００７８】
当業者には明らかなように、免疫吸着法に基づく他の検出方法も本開示の実施の際に有用である。例えば、検出用放射性標識、もしくは検出用金標識（例えば、金コロイド）、もしくは、例えば検出用ＮＡＤ＋の封入といったリポソームを使用する、上記に基づく免疫吸着方法、またはアクリジニウム結合免疫吸着法がある。
【００７９】
開示のいくつかの例では、ＴＧＦβ１レベルは、表面プラズモン共鳴検出器（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）、フロースルー型デバイス（例えば、米国特許第７２０５１５９号に記載）、マイクロ免疫測定装置もしくはナノ免疫測定装置（例えば、米国特許第７２７１００７号に記載）、ラテラルフロー装置（例えば、米国公開第２００４０２２８７６１号または米国公開第２００４０２６５９２６号に記載）、蛍光偏光免疫測定法（ＦＰＩＡ、例えば、米国特許第４５９３０８９号または米国特許第４７５１１９０号に記載）、またはａｎ免疫比濁法（例えば、米国特許第５５７１７２８号または米国特許第６２４８５９７号に記載）を使用して測定する。
【００８０】
組成物及び投与
間葉系前駆細胞または幹細胞を含む組成物は、薬理学的に許容される担体に調製してよい。本明細書で使用する「薬理学的に許容される担体」という用語は、間葉系前駆細胞または幹細胞の、保存、投与、かつ／または生物学的活性の維持を容易にする組成物を指す。
【００８１】
一例では、担体は、局所または全身の有意な有害作用をレシピエントに引き起すことがない。薬理学的に許容される担体は、固体であっても液体であってもよい。薬理学的に許容される担体の有用な例には、間葉系前駆細胞または幹細胞の生存性及び活性に影響を与えない、希釈液、溶媒、界面活性剤、添加物、懸濁剤、緩衝剤、滑沢剤、アジュバント、ビヒクル、乳化剤、吸収剤、分散媒、コーティング剤、安定化剤、保護コロイド、接着剤、粘稠剤、チキソトロープ剤、浸透剤、封鎖剤、足場、等張吸収遅延剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好適な担体の選択は当業者の技能の範囲内である。
【００８２】
好適な医薬担体には、ヒアルロナン、化学修飾ヒアルロナン、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩液、硫酸コンドロイチン、グルコサミン、マンノサミン、プロテオグリカン、プロテオグリカン断片、キチン、キトサン、または他の多糖類もしくはポリマー物質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８３】
間葉系前駆細胞または幹細胞は足場内への組込みまたは包埋がなされ得る。好適な足場には、生物学的な分解性の足場が挙げられるが、これに限定されるものではない。天然の生分解性足場には、コラーゲン、フィブロネクチン、及びラミニンの各足場が挙げられるが、これらに限定されるものではない。生分解性の合成足場には、ポリグリコール酸の足場（例えば、（Ｖａｃａｎｔｉ、Ｍｏｒｓｅ、＆Ｓａｌｔｚｍａｎ、１９８８）（Ｃｉｍａ、Ｉｎｇｂｅｒ、Ｖａｃａｎｔｉ、＆Ｌａｎｇｅｒ、１９９１）（Ｖａｃａｎｔｉ、Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｈｌｏｏ、＆Ｖａｃａｎｔｉ、１９９１）にて記載）、合成ポリマー、例えば、ポリ無水物、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸、ならびに、例えば、Ｇｅｌｆｏｒｍ（商標）（Ｐｆｉｚｅｒ）のような再吸収性ゼラチンスポンジなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８４】
開示の組成物は、単位剤形にして好都合に提示されてよく、当技術分野において周知の任意の方法で調製してよい。本明細書で使用する「投与単位形態」という用語は、治療すべき対象への単位用量として好適な物理的個別単位を指し、所望の治療的または予防的効果を得るために計算された所定量の活性化合物が医薬担体と共に含有されるものを指す。間葉系前駆細胞または幹細胞の用量は、治療すべき対象の疾患の状態、年齢、性別、及び体重などの因子によって異なり得る。
【００８５】
例示的用量として、少なくとも約１×１０６細胞が挙げられる。例えば、用量は、約１．０×１０６〜約１ｘ１０１０細胞、例えば、約１．１×１０６〜約１ｘ１０９細胞、例えば、約１．２×１０６〜約１×１０８細胞、例えば、約１．３×１０６〜約１×１０７細胞、例えば、約１．４×１０６〜約９×１０６細胞、例えば、約１．５×１０６〜約８×１０６細胞、例えば、約１．６×１０６〜約７×１０６細胞、例えば、約１．７×１０６〜約６×１０６細胞、例えば、約１．８×１０６〜約５×１０６細胞、例えば、約１．９×１０６〜約４×１０６細胞、例えば、約２×１０６〜約３×１０６細胞を含み得る。
【００８６】
一例では、用量は、約５×１０５〜２ｘ１０７細胞、例えば、約６×１０６細胞〜約１．８×１０７細胞を含む。用量は、例えば、約６×１０６細胞または約１．８×１０７細胞であってよい。
【００８７】
間葉系前駆細胞または幹細胞は、組成物の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％の細胞集団を構成する。
【００８８】
開示の組成物は、凍結保存してよい。間葉系前駆細胞または幹細胞の凍結保存は、当技術分野で公知の低速冷却法または「急速」冷凍プロトコルを使用して行うことができる。好ましくは、凍結保存方法では、凍結保存細胞の表現型、細胞表面マーカー及び増殖率は、冷凍しない細胞と比較して同様に維持される。
【００８９】
凍結保存した組成物は凍結保存液を含んでよい。凍結保存液のｐＨは典型的に６．５〜８、好ましくは７．４である。
【００９０】
凍結保存液は、パイロジェン不含滅菌等張液、例えば、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａ（商標）などを含んでよい。１００ｍＬのＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａ（商標）は、５２６ｍｇの塩化ナトリウム、ＵＳＰ（ＮａＣｌ）；５０２ｍｇのグルコン酸ナトリウム（Ｃ６Ｈ１１ＮａＯ７）；３６８ｍｇの酢酸ナトリウム三水和物、ＵＳＰ（Ｃ２Ｈ３ＮａＯ２・３Ｈ２Ｏ）；３７ｍｇの塩化カリウム、ＵＳＰ（ＫＣｌ）；及び３０ｍｇの塩化マグネシウム、ＵＳＰ（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）を含有する。抗菌剤は一切含有されていない。水酸化ナトリウムでｐＨを調整する。ｐＨは７．４（６．５〜８．０）である。
【００９１】
凍結保存液はＰｒｏｆｒｅｅｚｅ（商標）を含んでよい。凍結保存液は、追加または代替として培地、例えばαＭＥＭを含んでよい。
【００９２】
凍結を促進させるため、凍結保存液に凍結保護剤、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などが通常は添加される。理想的には、凍結保護剤は、細胞及び患者に対する毒性がないこと、非抗原性であること、化学的に不活性であること、高い解凍後生存率を提供すること、及び洗浄しなくても移植が可能であることが必要である。しかし、最も一般的に使用されている凍結保護剤のＤＭＳＯはある程度の細胞毒性を示す。凍結保存液の細胞毒性を低下させるために、ヒドロキシエチルスターチ（Ｈｙｄｒｏｘｙｌｅｔｈｙｌ  ｓｔａｒｃｈ）（ＨＥＳ）を代用物として使用するか、またはＤＭＳＯと併用してよい。
【００９３】
凍結保存液は、ＤＭＳＯ、ヒドロキシエチルスターチ、ヒト血清成分及び他のタンパク質増量剤のうち１つ以上を含んでよい。一例では、凍結保存溶液は、約５％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及び約１０％のＤＭＳＯを含む。凍結保存液はさらに、メチセルロース（ｍｅｔｈｙｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）及びトレハロースのうち１つ以上を含んでよい。
【００９４】
一実施形態では、細胞を、４２．５％Ｐｒｏｆｒｅｅｚｅ（商標）／５０％αＭＥＭ／７．５％ＤＭＳＯに懸濁させ、速度制御（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｒａｔｅ）フリーザーで冷却する。
【００９５】
凍結保存した組成物は、解凍して、対象に直接投与しても、または別の溶液、例えばＨＡを含む溶液に加えてもよい。別法として、凍結保存した組成物は、解凍して、間葉系前駆細胞または幹細胞を代替担体に再懸濁させてから投与してよい。
【００９６】
開示の組成物は、治療すべき特定の疾患に好適な経路で投与することができる。例えば、開示の組成物は、全身投与、すなわち、非経口、静脈内または注射によって投与することができる。開示の組成物を、特定の組織または臓器を標的として向かわせることができる。
【００９７】
投与レジメンを調整して最適な治療応答を得てよい。例えば、単回ボーラス投与をしてもよいし、いくつかの分割量を経時的に投与してもよいし、または治療状況で必要とされる指標にしたがって用量をバランスよく増減してもよい。投与の簡便さ及び用量の均一性のためには、非経口組成物を単位剤形に製剤化することが都合がよい場合がある。
【００９８】
いくつかの実施形態では、細胞組成物を用いた治療の開始前に患者の免疫抑制を行うことが必要とされないかまたは望ましくない場合がある。事実、ヒツジでの同種ＳＴＲＯ−１＋細胞の移植では、免疫抑制なしで忍容性が高かった。しかし、他の場合には、細胞治療開始に先立ち患者に薬理学的免疫抑制を行うことが望ましいかまたは適切であり得る。薬理学的免疫抑制は、全身または局所的免疫抑制剤の使用により達成してもよいし、または封入デバイスに入れが細胞送達によって達成してもよい。細胞は、細胞及び治療因子が必要とする栄養及び酸素を通すカプセル内に封入してよいが、細胞は免疫液性因子及び細胞を通さない。好ましくは、封入剤は、低アレルギー性であり、標的組織に容易かつ安定に位置し、埋め込まれている構造体にさらなる保護を提供する。移植細胞対する免疫応答を低下または消失させる上記及び他の手段は当技術分野で公知である。別法として、細胞の遺伝子組換えを行ってその免疫原性を低下させてよい。
【００９９】
間葉系前駆細胞または幹細胞を、他の有益な薬物または生物学的分子（増殖因子、栄養因子）と共に投与してよいことは認識されよう。他の薬剤と共に投与する場合は、単一医薬組成物にして一緒に投与しても、または別々の医薬組成物にして他の薬剤と同時に、もしくは順次（他剤投与の前または後）投与してもよい。同時投与してよい生物活性因子には、抗アポトーシス物質（例えば、ＥＰＯ、ＥＰＯミメティボディ、ＴＰＯ、ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ、ＨＧＦ、カスパーゼ阻害剤）；抗炎症剤（例えば、ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤、ＴＧＦ−ベータ阻害剤、スタチン、ＩＬ−６阻害剤とＩＬ−１阻害剤、ＰＥＭＩＲＯＬＡＳＴ（商標）、ＴＲＡＮＩＬＡＳＴ（商標）、ＲＥＭＩＣＡＤＥ（商標）、ＳＩＲＯＬＩＭＵＳ（商標）、及び非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、例えばＴＥＰＯＸＡＬＩＮ（商標）、ＴＯＬＭＥＴＩＮ（商標）、ＳＵＰＲＯＦＥＮ（商標））；免疫抑制剤／免疫調節剤（例えば、シクロスポリン、タクロリムスなどのカルシニューリン阻害剤）；ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ＳＩＲＯＬＩＭＵＳ（商標）、ＥＶＥＲＯＬＩＭＵＳ（商標））；抗増殖剤（例えば、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）；コルチコステロイド（例えば、プレドニゾロン、ヒドロコルチゾン）；抗体、例えば抗ＩＬ−２Ｒアルファ受容体モノクローナル抗体（例えば、バシリキシマブ、ダクリズマブ）、抗Ｔ細胞ポリクローナル抗体（例えば、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）、抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）、抗Ｔ細胞モノクローナル抗体ＯＫＴ３））など；抗血栓性薬剤（例えば、ヘパリン、ヘパリン誘導体、ウロキナーゼ、ＰＰａｃｋ（デキストロフェニルアラニン−プロリン−アルギニン−クロロメチルケトン）、抗トロンビン化合物、血小板受容体アンタゴニスト、抗トロンビン抗体、抗血小板受容体抗体、アスピリン、ジピリダモール、プロタミン、ヒルジン、プロスタグランジン阻害剤、及び血小板阻害剤）；及び抗酸化剤（例えば、プロブコール、ビタミンＡ、アスコルビン酸、トコフェロール、補酵素Ｑ−１０、グルタチオン、Ｌ−システイン、Ｎ−アセチルシステイン）ならびに局所麻酔薬が挙げられる。
【０１００】
変性椎間板疾患の治療
椎間板（ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ：ＩＶＤ）は、脊椎の椎体を接続する機能単位であり、脊椎単位の衝撃吸収及び可動性を担っている（Ｒａｊ、２００８）。椎間板は、中心部の髄核（ＮＰ）及び周囲の線維輪（ＡＦ）で構成され、２つの軟骨終板（ＥＰ）によって椎体から分離している（図１）。ＮＰは、ＩＶＤのゲル状内核を形成している。これは、不規則な網目状のＩＩ型コラーゲン線維と大量のアグリカンというプロテオグリカンとを含み、その中の陰イオン性グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の含有量が多いこと、及び水と結合することにより、組織に粘弾性、硬度及び耐圧縮性を提供している（Ｗａｔａｎａｂｅ、Ｙａｍａｄａ、＆Ｋｉｍａｔａ、１９９８）。ＡＦは外側部と内側部にさらに細分され、ＡＦ外層は、別個の層板によって形成され、それを構成するＩ型コラーゲン線維は層板同士が斜め方向を向くようになっており（Ｍａｒｃｈａｎｄ＆Ａｈｍｅｄ、１９９０）、ＡＦ内層は、線維に乏しく組織性に劣り、ＩＩ型コラーゲンへ移行していること、及びプロテオグリカン含有量が多くなっていることを特徴とする（Ｈｕｍｚａｈ＆Ｓｏａｍｅｓ、１９８８）。この構造によって、ＡＦは、圧迫された時にＮＰ内部に静水圧が発生するのを制限し、脊髄分節間の可動性を促進することができる（Ｇｕｅｒｉｎ＆Ｅｌｌｉｏｔｔ、２００７）（Ｓｃｈｍｉｄｔ、Ｋｅｔｔｌｅｒ、Ｈｅｕｅｒ、Ｓｉｍｏｎ、Ｃｌａｅｓ、＆Ｗｉｌｋｅ、２００７）。ＡＦの最外層を除いては、ＩＶＤには神経組織がなく（ａｎｅｕｒａｌ）（Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｅｉｓｅｎｓｔｅｉｎ、Ｍｅｎａｇｅ、Ｅｖａｎｓ、＆Ａｓｈｔｏｎ、１９９５）、事実上、血管を欠いており（Ｃｒｏｃｋ＆Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒ、１９８４）、そのため栄養及び酸素の供給はＥＰを介した拡散に依存している（Ｕｒｂａｎ、Ｓｍｉｔｈ、＆Ｆａｉｒｂａｎｋ、２００４）。単位としてのＩＶＤの恒常性には、３つの構造体すべてが最適に機能することが必要であり、これらの構造体のうち１つ以上に障害が生じるとＩＶＤの変性をもたらし得る。
【０１０１】
ＩＶＤの完全性は、サイトカイン、増殖因子、酵素、及び酵素阻害物質の活性の精巧なバランスによって維持されており、傍分泌かつ／または自己分泌の作用様式で、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の合成／付加（ａｐｐｏｓｉｔｉｏｎ）と分解とのバランスを集合的に調節している。
【０１０２】
ＩＶＤ変性では、複数の病因因子（加齢、感染、喫煙、遺伝的素因、異常な生物力学的負荷またはＩＶＤの栄養状態など）によってこの微妙なバランスが乱される（Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｅｖａｎｓ、Ｔｒｉｖｅｄｉ、＆Ｍｅｎａｇｅ、２００６）（Ｃｈｅｕｎｇ、ｅｔ  ａｌ．、２００９）。組織病理学的変化は必ずしも欠陥の原発部位で観察されるわけではないが、最初に観察されるのはＮＰにおいてであり、それには、ＥＣＭ破壊の増加、マトリックス合成の変化（大部分がＩＩ型コラーゲンからＩ型コラーゲンへの産生の切替わり、及びアグリカン合成の減少）ならびにアポトーシス、及び生存細胞がｉｎ  ｓｉｔｕで複製しクラスターを形成することによる細胞の消失というエビデンスを伴う（Ａｄａｍｓ＆Ｒｏｕｇｈｌｅｙ、２００６）（Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｒｏｂｅｒｔｓ、２００７）（Ｌｅ  Ｍａｉｔｒｅ、Ｐｏｃｋｅｒｔ、Ｂｕｔｔｌｅ、Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、＆Ｈｏｙｌａｎｄ、２００７）。それに伴いＮＰ内の膨圧がなくなることにより、ＮＰとＡＦ間の力の正常なバランスが失われて変性プロセスがＡＦまで拡大される結果、微小外傷（「断裂」）を起こし、それにより血管及び神経にＩＶＤへの道筋が与えられて（Ｈｉｌｔｏｎ＆Ｂａｌｌ、１９８４）、変性椎間板疾患に関連した痛みを発生させることになる。
【０１０３】
特定の初期イベントに関係なく、ＩＶＤ変性は、内在性のＮＰ細胞（ＮＰＣ）とＡＦ細胞（ＡＦＣ）の双方、かつマクロファージ及びＴ細胞のような免疫系に定住していない細胞によって炎症誘発性分子が異常に合成され分泌されることで誘発されると考えられている（（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、２００９）（Ｒｉｓｂｕｄ＆Ｓｈａｐｉｒｏ、２０１４）によるレビュー）。椎間板変性で分泌される炎症誘発性メディエーターには、さまざまなケモカインに加え、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン（ＩＬ）−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１７及びＩＬ−１７が含まれ（Ｒｉｓｂｕｄ＆Ｓｈａｐｉｒｏ、２０１４）（Ｓｅｇｕｉｎ、Ｐｉｌｌｉａｒ、Ｒｏｕｇｈｌｅｙ、＆Ｋａｎｄｅｌ、２００５）（Ｌｅ  Ｍａｉｔｒｅ、Ｈｏｙｌａｎｄ、＆Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、２００７）（Ｓｈａｍｊｉ、ｅｔ  ａｌ．、２０１０）（Ｐｕｒｍｅｓｓｕｒ、Ｗａｌｔｅｒ、Ｒｏｕｇｈｌｅｙ、Ｌａｕｄｉｅｒ、Ｈｅｃｈｔ、＆Ｉａｔｒｉｄｉｓ、２０１３）、その中でも、ＴＮＦα及びＩＬ−１βの役割は最も幅広く研究されている。両サイトカインはいずれもＥＣＭ分解に関与する遺伝子の上方制御を誘導する（Ｌｅ  Ｍａｉｔｒｅ、Ｈｏｙｌａｎｄ、＆Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、２００７）（Ｌｅ  Ｍａｉｔｒｅ、Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、＆Ｈｏｙｌａｎｄ、２００５）（Ｌｅ  Ｍａｉｔｒｅ、Ｈｏｙｌａｎｄ、＆Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、２００７）。ＩＬ−１β及びその受容体はともに、変性したＩＶＤ組織において上方制御され（Ｌｅ  Ｍａｉｔｒｅ、Ｈｏｙｌａｎｄ、＆Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、２００７）（Ｌｅ  Ｍａｉｔｒｅ、Ｈｏｙｌａｎｄ、＆Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、２００７）、また、ＴＮＦαの発現は神経突起の内方への伸長及び炎症にも関与している（Ｍｕｒａｔａ、Ｏｎｄａ、Ｒｙｄｅｖｉｋ、Ｔａｋａｈａｓｈｉ、＆Ｏｌｍａｒｋｅｒ、２００６）（Ｗａｎｇ、Ｍａｒｋｏｖａ、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｚｈｅｎｇ、Ｓｈａｐｉｒｏ、＆Ｒｉｓｂｕｄ、２０１１）。
【０１０４】
一実施形態では、間葉系前駆細胞または幹細胞をＮＰ内へ注入して、損傷した椎間板に正常な機械的及び／または生理的な特性を回復させる。
【０１０５】
ＮＰ内への間葉系前駆細胞または幹細胞との同時注入には、生物由来及び合成の多数の物質が意図される。例えば、１つ以上の天然または合成のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）もしくはムコ多糖類、例えば、ヒアルロナン（ヒアルロン酸；ＨＡ）、コンドロイタン硫酸（ｃｏｎｄｒｏｉｔａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ガラクトサミノグリクロングリカン硫酸（ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃｕｒｏｎｇｌｙｃａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）（ＧＧＧＳ）、及びその生理的塩などを直接ＮＰに注入してよい。ＨＡは、滑膜細胞による内因性のＨＡ合成及び軟骨細胞によるプロテオグリカン合成を刺激する役割を果たし、軟骨分解性酵素（ｃｈｏｎｄｒｏｄｅｇｒａｄａｔｉｖｅ  ｅｎｚｙｍｅｓ）の放出を抑制し、軟骨の劣化に関与することが知られている酸素フリーラジカルを消去する物質として作用する。硫酸コンドロイチン及びグルコサミンの注入物質は、関節軟骨変性の進行を同様に遮断することが示されていることが示唆されている。恐らく間違いなく、他のＧＡＧは、それらをＤＤＤ発症椎間板への理想的な注入候補にする治療的値を有する、同様の保護的または修復的特性を提供し得る。ＧＡＧの別の有益な特性は、その強力な親水性と保水能力であろう。したがって、ＮＰを吸引してできた空間に注入するか、または代替的に既存ＮＰに補充として加えられ得る粘性ゲルを形成させるために、ＧＡＧと水または他の水溶性物質とを混合することが適切であり得る。これにより、空間を三次元的に充填し、圧潰しにくい充填剤のように作用することができ、かつ椎間板が運動に伴う衝撃を適切に吸収することができるようにする天然の「ヒドロゲル」が形成され得る。
【０１０６】
合成ヒアルロン酸ゲル、例えば、Ｅｕｆｌｅｘｘａ（登録商標）、（Ｆｅｒｒｉｎｇ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）またはＲｅｓｔｙｌａｎｅ（商標）（Ｑ−Ｍｅｄ  Ａｋｔｉｅｂｏｌａｇ  Ｃｏ．、スウェーデン）なども使用に好適である。
【０１０７】
同時投与に使用してよい注入可能な合成物質の他の例には、医療グレードのシリコーン、Ｂｉｏｐｌａｓｔｉｑｕｅ（商標）（ポリビニルピロリドン担体に懸濁させた固体シリコーン粒子；Ｕｒｏｐｌａｓｔｙ  ＢＶ、オランダ）、Ａｒｔｅｐｌａｓｔ（商標）（ゼラチン担体に懸濁させたポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）ミクロ粒子；Ａｒｔｃｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ、米国）、Ａｒｔｅｃｏｌｌ（商標）（ウシ軟骨の担体に懸濁させた滑らかなＰＭＭＡ球体；Ａｒｔｅｐｈａｒｍａ  Ｐｈａｒｍａｚｅｕ  Ｔｉｓｃｈｅ、ＧＭＢＨ  Ｃｏ．、ドイツ）が挙げられる。さらに、合成ヒドロゲル組成物を充填材として使用して椎間板に正常な形状を回復させ、これにより正常な生物力学的機能を回復させてよい。
【０１０８】
既知の軟骨保護能を有する抗酸化剤も、ＮＰ注入の候補となる。これらの例には、トコフェレオール（ｔｏｃｏｐｈｅｒｅｏｌ）（ビタミンＥ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、アスコルビン酸塩（ビタミンＣ）、カタラーゼなどが挙げられる。さらに、アルギン酸ナトリウムの両親媒性誘導体等も本明細書で注入用に意図される。さらに、組換え型骨形成タンパク質−１（ＯＰ−１）は、ＮＰＣ及びＡＦＣによるプロテオグリカン豊富なマトリックス形成を促進する能力があることから、注入用の良好な候補となる。
【０１０９】
合成注入物質の使用も意図される。これらは、その主たる目的が、椎間板に生物力学的機能を回復させることにある状況に特に適用され得る。
【０１１０】
ＨＡを単独で、または他のＧＡＧと組み合わせて、間葉系前駆細胞または幹細胞を送達する担体として使用してよい。ＨＡ／ＧＡＧ組成物の濃度及び粘度は、日常的に決定され得る。一実施形態では、組成物は少なくとも約０．５％のＨＡまたはＨＡ塩を含む。例えば、間葉系前駆細胞または幹細胞を含む細胞の母集団をＥｕｆｌｅｘｘａ（商標）（１％ヒアルロン酸ナトリウム）に１：１の比で懸濁させることができた。
【０１１１】
別の例では、間葉系前駆細胞または幹細胞をフィブリン糊との混合物にして送達してよい。本明細書で使用する「フィブリン糊」という用語は、カルシウムイオン存在下でのフィブリンポリマーの架橋によって形成される不溶性マトリックスを指す。フィブリン糊は、フィブリンマトリックスを形成する生物学的組織もしくは流体に由来する、フィブリノゲン、またはその誘導体もしくは代謝物、フィブリン（可溶性の単量体またはポリマー）及び／またはその複合体から形成されてよい。別法として、フィブリン糊は、組換えＤＮＡ技術により作製された、フィブリノゲン、またはその誘導体もしくは代謝物、またはフィブリンから形成されてよい。
【０１１２】
フィブリン糊は、フィブリノゲンとフィブリン糊形成触媒と（トロンビン及び／または第ＸＩＩＩ因子など）の相互作用によって形成されてもよい。当業者に理解されるように、フィブリノゲンは、触媒（トロンビンなど）の存在下でタンパク分解性に切断され、フィブリン単量体に変換される。その後、フィブリン単量体は、架橋してフィブリン糊マトリックスを形成し得るポリマーを形成することができる。フィブリンポリマーの架橋は、第ＸＩＩＩ因子などの触媒の存在によって増強され得る。フィブリン糊形成の触媒は、血漿、クリオプレシピテートまたはフィブリノゲンもしくはトロンビンを含有する他の血漿画分に由来してよい。別法として、触媒は、組換えＤＮＡ技術によって作製されてよい。
【０１１３】
フィブリノゲンとトロンビンを組み合わせると凝血塊が形成される。凝血塊形成速度は、フィブリノゲンと混合されるトロンビンの濃度に依存する。酵素依存性反応であるため、温度が高いほど（最高３７℃）凝血塊形成速度は速い。凝血塊の引張り強度は、使用するフィブリノゲンの濃度に依存する。
【０１１４】
ＨＡ存在下でフィブリン塊が生じると、相互作用して架橋したマトリックスと互いに噛み合う。このマトリックスは、組織再生に主要な役割を果たし、組織修復において細胞調節機能を果たすことが知られている（Ｗｅｉｇｅｌ、Ｆｕｌｌｅｒ、＆Ｌｅ  Ｂｏｅｕｆ、１９８６）。ＨＡ−フィブリンマトリックスではＨＡの溶解速度も持続し、このＧＡＧの治療効果を延長させる上で有益であると考えられる（Ｗａｄｓｔｒｏｍ＆Ｔｅｎｇｂｌａｄ、１９９３）。
【０１１５】
いくつかの刊行物に、治療剤を送達するためのフィブリン糊の使用が記載されている。例えば、米国特許第４９８３３９３号には、アガロース、寒天、生理食塩水グリコサミノグリカン、コラーゲン、フィブリン及び酵素を含む、腟内挿入物として使用するための組成物が開示されている。さらに、米国特許第３０８９８１５号には、フィブリノゲン及びトロンビンで構成される注入可能な医薬製剤が開示されており、また米国特許第６４６８５２７号には、体内の特定の部位への各種の生物学的及び非生物学的薬剤の送達を促進するフィブリン糊が開示されている。
【０１１６】
開示の組成物は、椎間板空間に「外科的に加える」ことが可能である。すなわち、組成物を医療従事者の介入によって加えることができ、体の自然の成長または再生過程によって「加えられる」こととは区別される。好ましくは、外科的手技として皮下注射針を介した注入が含まれるが、椎間板に組成物を導入する他の外科的方法も使用してよい。例えば、組成物は、拡張環状開口部を介した押出し成形、カテーテルを介した輸注、外傷もしくは外科的切開で形成した開口部を介した挿入、または椎間板空間内に組成物を沈着させる他の侵襲性もしくは低侵襲性の手段によって椎間板に導入してよい。
【０１１７】
遺伝子組換え細胞
一実施形態では、間葉系前駆細胞または幹細胞は、遺伝子を組換えられて、例えば、対象タンパク質、例えば、治療及び／または予防上の利益を提供するタンパク質、例えば、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、エラスターゼ、カルボキシペプチダーゼ、膵リパーゼもしくはアミラーゼ、または血管新生増強に関連するかもしくは原因となるポリペプチドまたは膵細胞もしくは血管細胞への細胞分化に関連するポリペプチドを発現及び／または分泌する。
【０１１８】
細胞の遺伝子組換えを行う方法は当業者に明らかであろう。例えば、細胞での発現を誘導するために細胞で発現させるべき核酸をプロモーターに機能的に結合させる。例えば、対象のさまざまな細胞で機能的なプロモーター、例えば、ウイルスプロモーター、例えば、ＣＭＶプロモーター（例えば、ＣＭＶ−ＩＥプロモーター）またはＳＶ−４０プロモーターなどに核酸を結合させる。さらなる好適なプロモーターは当技術分野で公知である。
【０１１９】
好ましくは、核酸は、発現構成体の形態で提供される。本明細書で使用する「発現構成体」という用語は、細胞において、１つの機能的に接続されている核酸（例えば、レポーター遺伝子及び／または逆選択性レポーター遺伝子）での発現を与える能力を有する別の核酸を指す。本開示と関連して、発現構成体は、プラスミド、バクテリオファージ、ファージミド、コスミド、ウイルスのサブゲノムもしくはゲノムの断片、または非相同なＤＮＡを発現可能なフォーマットで維持及び／もしくは複製できる他の核酸であるか、またはそれを含むことを理解されるべきである。
【０１２０】
本発明を実施するための好適な発現構成体の構築方法は、当業者には明らかとなることであり、例えば、（Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．、１９８７及び現在までの更新をすべて含む）または（Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｇｒｅｅｎ、２０１２）に記載されている。例えば、発現構成体の構成要素各々を、例えばＰＣＲを使用して好適な鋳型核酸から増幅させ、その後、例えば、プラスミドまたはファージミドなどの好適な発現構成体にクローニングする。
【０１２１】
そのような発現構成体に好適なベクターは、当技術分野で公知であり、かつ／または本明細書に記載される。例えば、哺乳類細胞において本発明の方法に好適な発現ベクターは、例えば、ｐｃＤＮＡベクターパッケージのベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＩベクターパッケージのベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＣＭＶベクターパッケージのベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＭベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＳＩベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＶＰ１６ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、またはｐｃＤＮＡベクターパッケージのベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
【０１２２】
当業者は、さらなるベクター及びそのようなベクターの供給源、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＣｌｏｎｔｅｃｈまたはＰｒｏｍｅｇａなどについて理解するであろう。
【０１２３】
単離された核酸分子またはそれを含む遺伝子構成体を発現用に細胞に導入する手段は当業者に公知である。所与の生物に使用する技術は、成功したことが既知である技術に依存する。組換えＤＮＡを細胞に導入する手段には、中でも、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ−デキストランにより誘導されるトランスフェクション、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ、米国、メリーランド州）及び／またはｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（Ｇｉｂｃｏ、米国、メリーランド州）を使用するようなリポソームで誘導されるトランスフェクション、ＰＥＧ誘導性のＤＮＡ取込み、電気穿孔法ならびにＤＮＡでコーティングしたタングステンまたは金粒子（Ａｇｒａｃｅｔｕｓ  Ｉｎｃ．、米国、ウィスコンシン州）を使用するような微粒子の撃込みが挙げられる。
【０１２４】
別法として、本発明の発現構成体はウイルスベクターである。好適なウイルスベクターは当技術分野で公知であり市販されている。核酸を送達し、その核酸を宿主細胞ゲノムへ組み込むためのウイルスを用いる従来の系には、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはアデノ関連ウイルスベクターが含まれる。別法として、アデノウイルスベクターは、エピソームのままを維持する核酸を宿主細胞に導入するのに有用である。ウイルスベクターは、標的細胞及び組織に遺伝子を導入する効率的かつ多様性のある方法である。その上、高い形質導入効率が多くの異なる細胞型及び標的組織において観察されている。
【０１２５】
例えば、レトロウイルスベクターは一般に、シス作用性の長い末端反復配列を含み、最高６〜１０ｋｂの外来配列パッケージング能力を有する。最小シス作用性ＬＴＲは、ベクターの複製及びパッケージングに十分であり、その後、これらを使用して、標的細胞に発現構成体を組み込み、長期的発現を得る。広く使用されるレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳｒＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、及びその組み合わせに基づいたものが含まれる（例えば、国際公開ＷＯ１９９４／０２６８７７、（Ｂｕｃｈｓｃｈａｃｈｅｒ＆Ｐａｎｇａｎｉｂａｎ、１９９２）（Ｊｏｈａｎｎ、Ｇｉｂｂｏｎｓ、＆Ｏ’Ｈａｒａ、１９９２）（Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ＆Ｗｅｉｓｓ、１９９０）（Ｗｉｌｓｏｎ、Ｒｅｉｔｚ、Ｏｋａｙａｍａ、＆Ｅｉｄｅｎ、１９８９）（Ｍｉｌｌｅｒ、Ｇａｒｃｉａ、ｖｏｎ  Ｓｕｈｒ、Ｌｙｎｃｈ、Ｗｉｌｓｏｎ、＆Ｅｉｄｅｎ、１９９１）（Ｍｉｌｌｅｒ＆Ｒｏｓｍａｎ、１９８９）（Ｍｉｌｌｅｒ、１９９０）（Ｓｃａｒｐａ、Ｃｏｕｒｎｏｙｅｒ、Ｍｕｎｚｙ、Ｍｏｏｒｅ、Ｂｅｌｍｏｎｔ、＆Ｃａｓｋｅｙ、１９９１）（Ｂｕｒｎｓ、Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ、Ｄｒｉｅｖｅｒ、Ｂｕｒｒａｓｃａｎｏ、＆Ｙｅｅ、１９９３）ｊを参照のこと）。
【０１２６】
さまざまなアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター系も核酸送達用に開発されている。ＡＡＶベクターは、当技術分野で公知の技術を使用して容易に構築することができる。（例えば、米国特許第５１７３４１４号及び５１３９９４１、国際公開公報ＷＯ９２／０１０７０及びＷＯ９３／０３７６９、（Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ、ＭｃＮａｌｌｙ、Ｏｋａｒｍａ、＆Ｌｅｒｃｈ、１９８８）（Ｖｉｎｃｅｎｔ、Ｍｏｏｒｅ、＆Ｈａｉｇｗｏｏｄ、１９９０）（Ｃａｒｔｅｒ、１９９２）（Ｍｕｚｙｃｚｋａ、１９９２）；（Ｋｏｔｉｎ、１９９４）（Ｓｈｅｌｌｉｎｇ＆Ｓｍｉｔｈ、１９９４）（Ｚｈｏｕ、ｅｔ  ａｌ．、１９９４）を参照のこと）。
【０１２７】
本発明の発現構成体の送達に有用なさらなるウイルスベクターには、例えば、ワクシニアウイルス及び鳥類ポックスウイルスなどのポックスウイルス科由来のベクター、またはアルファウイルスまたは結合型ウイルスベクター（例えば、（Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈ、ｅｔ  ａｌ．、１９８９）に記載のもの）が含まれる。
【実施例】
【０１２８】
実施例１  材料及び方法
ＳＴＲＯ−３＋細胞の選択によるＭＰＣの免疫選択
正常な健常成人ボランティア（２０〜３５歳）から骨髄（ＢＭ）を採取する。簡単に言えば、腸骨稜後縁から４０ｍｌのＢＭをリチウム−ヘパリン抗凝固薬を含有する管に吸引する。
【０１２９】
前述のように（Ｚａｎｎｅｔｔｉｎｏ、Ｂｕｈｒｉｎｇ、Ｎｉｕｔｔａ、Ｗａｔｔ、Ｂｅｎｔｏｎ、＆Ｓｉｍｍｏｎｓ、１９９８）、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａ、ノルウェー、オスロ）を使用して、密度勾配分離によってＢＭ単核球細胞（ＢＭＭＮＣ）を調製する。
４００×ｇ、４℃にて３０分の遠心分離を行った後、軟層（ｂｕｆｆｙ  ｌａｙｅｒ）をトランスファーピペットで除去し、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、ＣＳＬ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、オーストラリア、ビクトリア州）を含有するハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ゲイザースバーグ、メリーランド州）で構成される「ＨＨＦ」で３回洗浄する。
【０１３０】
続いて、前述のように（Ｇｒｏｎｔｈｏｓ＆Ｓｉｍｍｏｎｓ、１９９５）（Ｇｒｏｎｔｈｏｓ、２００３）、磁性活性化細胞分離（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）によってＳＴＲＯ−３＋（またはＴＮＡＰ＋）細胞を単離した。簡単に言えば、約１〜３×１０８のＢＭＭＮＣを、１０％（ｖ／ｖ）正常ウサギ血清含有ＨＨＦからなるブロッキング緩衝液中で２０分間氷上でインキュベートする、。細胞を、ブロッキング緩衝液に溶解させたＳＴＲＯ−３  ｍＡｂの１０μｇ／ｍｌ溶液２００μｌを用いて１時間氷上でインキュベートする。その後、４００×ｇの遠心分離によってＨＨＦ中で細胞を２回洗浄する。ＨＨＦ緩衝液中にヤギ抗マウスγ−ビオチン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、英国、バーミンガム）を１／５０で希釈したものを加え、細胞を１時間氷上でインキュベートする。上記のように、ＭＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．０１％アジ化ナトリウムを添加した、Ｃａ２＋とＭｇ２＋を含まないＰＢＳ）中で細胞を２回洗浄し、最終容量０．９ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させる。
【０１３１】
１００μｌのストレプトアビジンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ；ドイツ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ）を細胞懸濁液に加え、氷上で１５分インキュベートする。細胞懸濁液を２回洗浄し、０．５ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた後、ｍｉｎｉ  ＭＡＣＳカラム（ＭＳ  Ｃｏｌｕｍｎｓ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に担持させ、０．５ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液で３回洗浄してＳＴＲＯ−３  ｍＡｂ（２００５年１２月１９日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に受託番号ＰＴＡ−７２８２にて寄託．国際公開公報ＷＯ２００６／１０８２２９号を参照のこと）に結合しなかった細胞を回収する。さらに１ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液を加えた後、磁石からカラムを除去し、陽圧でＴＮＡＰ＋細胞を単離する。各分画から得た細胞の分注を、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣで染色し、その純度をフローサイトメトリーで評価することができる。
【０１３２】
この方法で単離された間葉系前駆細胞（ＭＰＣ）はＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ  ＭＰＣである。
【０１３３】
ＭＰＣ  ＣＭの作製
入手可能なＭＰＣ製品ロット（２６３８７３、２２−１２−００１ＵＳ、２２−１２−０２ＵＳ、３４５９３８，２０１１ＣＣ０５３，２０１１ＣＣ０１１，２０１２ＣＣ０１０，３２２５０９，３７６２３２，３７６２３３，３８０５０５，３８０５０７，３８５４７０，３８５４７１，１８５７４６９）であり、それぞれにドナーならびに臨床開発及び製品開発の製造工程が異なる代表ロットから条件培地（ＣＭ）を作製した。凍結保存されたＭＰＣ製品を解凍し、血清添加増殖培地に細胞を５０，０００細胞／ｃｍ２で播種し、３７℃、２０％Ｏ２で一晩接着させた。椎間板細胞を用いる機能解析と適合性のあるＣＭを作製するため、ＭＰＣ増殖培地を、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のみを添加した軟骨形成基本培地（ＣＢＭ；Ｌｏｎｚａ、ウォーカーズビル、メリーランド州）と２０９μｌ培地／ｃｍ２の容量で交換し、細胞を３７℃、５％Ｏ２で３日間培養した。この培養期間終了時、培地を採取し、遠心分離にかけて浮遊状態の細胞を除去し、得られる上清を採取し、使用するまで−８０℃で保存した。
【０１３４】
ＮＰＣ増殖のバイオアッセイ
ＭＰＣ  ＣＭに応答した髄核細胞（ＮＰＣ）の増殖は、分裂が活発な細胞における５−エチニル−２’−デオキシウリジン（ＥｄＵ）のＤＮＡへの取り込みを定量して評価した。ポリ−Ｌ−リシンをコートした培養皿に入れた血清含有増殖培地にヒトＮＰＣを２，５００細胞／ｃｍ２で播種した。細胞を３７℃、５％Ｏ２でインキュベートして一晩接着させた後、４８時間の血清飢餓状態に置いた。血清を欠乏させた後、細胞をＭＰＣ  ＣＭで４８時間刺激した。培養終了までの１８時間、製造者の指示書（Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ（商標）Ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）にしたがって細胞にＥｄＵを加えた。続いて、細胞をトリプシンで脱離させ、生存性を調べるために染色した。その後、細胞を固定し、ＥｄＵの取り込みを調べるために染色し、フローサイトメトリーで解析した。ＥｄＵで染色されていない対照細胞に対する、生存母集団内のＥｄＵ＋細胞を同定した。
【０１３５】
ＮＰＣプロテオグリカン合成のバイオアッセイ
インビトロでのＮＰＣマトリックス産生に対するＭＰＣ  ＣＭの効果を、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）内に沈着したプロテオグリカンの染色後に微小塊培養から抽出したアルシアンブルー染料を半定量的に測定することによって調べた。ヒトＮＰ微小塊培養を確立するため、ＮＰＣを、ヒトフィブロネクチンを用いて５μｇ／ｃｍ２でコートした４８ウェルプレートの各ウェルに、１００，０００細胞を含有した増殖培地を１０μｌずつ滴下して、高密度２次元（２Ｄ）培養で播種した。細胞を２時間接着させた後、完全増殖培地を加えてウェルをいっぱいに満たし、細胞を一晩インキュベーションした。翌日、細胞を温ＰＢＳで１回洗浄し、血清飢餓状態に４８時間置いてから、ＭＰＣ  ＣＭを用いて７日間刺激した。培養期間終了時、１０％亜鉛ホルマリンに細胞をｉｎ  ｓｉｔｕで固定し、アルシアンブルーで染色しプロテオグリカンを検出した。代表的ウェルのデジタル画像を取り込み、プレートを１〜２時間空気乾燥させた。アルシアンブルー染色を、０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む６ＮグアニジンＨＣｌで各ウェルから抽出し、マイクロプレートリーダーを使用して各試料について６００ｎｍで光学濃度（ＯＤ）を測定した（Ｂｊｏｒｎｓｓｏｎ、１９９３）。
【０１３６】
ＡＦＣ増殖のバイオアッセイ
ＮＰＣ増殖の測定に使用した方法と同様に、ＭＰＣ  ＣＭに応答した線維輪細胞（ＡＦＣ）の増殖を、ＥｄＵの取り込みによって測定したが、培養期間はＡＦＣに適切であると判明した期間に変更した。簡単に言えば、血清添加ＡＦＣ増殖培地にＡＦＣを２，５００細胞／ｃｍ２で播種した。一晩付着させた後、細胞を４８時間の血清飢餓状態に置いてから、３日間のＭＰＣ  ＣＭ処理を行った。培養終了前の１８時間、細胞にＥｄＵをパルスした。その後、細胞を回収して染色し、フローサイトメトリーで解析した。
【０１３７】
ＡＦＣコラーゲン合成のバイオアッセイ
線維輪（ＡＦ）の微小塊培養を確立するため、ヒトフィブロネクチンで５μｇ／ｃｍ２でコートした４８ウェルプレートの各ウェルに、１００，０００細胞を含有した増殖培地を１０μｌずつ滴下して、線維輪細胞（ＡＦＣ）を高密度２次元（２Ｄ）培養で播種した。細胞を２時間接着させた後、完全増殖培地を加えてウェルをいっぱいに満たし、細胞を一晩インキュベーションした。翌日、細胞を温ＰＢＳで１回洗浄し、血清飢餓状態に４８時間置いてから、ＭＰＣ  ＣＭを用いて７日間刺激した。この培養期間の終了時、ＭＰＣ  ＣＭで刺激されたコラーゲン産生を、市販のキット（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）を使用してヒドロキシプロリンアッセイによって測定した。培地を吸引し、細胞を水で洗浄した。沈着したコラーゲンを塩酸中で加水分解させ、得られる上清を採取して蒸発させた。各試料をクロラミンＴの存在下で短時間インキュベートし、ヒドロキシプロリンを酸化させた。最後に、各試料に４−（ジメチルアミノ）ベンズアルデヒドを加え、比色分析生成物とし５６０ｎｍでの値を読み取った。各実験において、既知量のヒドロキシプロリン（０．２〜１μｇ）を使用して標準曲線を作成し、ＭＰＣ  ＣＭ処理に応答したコラーゲン合成の定量測定をできるようにした。
【０１３８】
成人ヒトＡＦＣの単離及び培養
成人死体椎間板組織を、以下の除外基準についてスクリーニングしたドナーから得た。
【表１】
0006797833.tif 000002
【０１３９】
抗生物質（例えば、ペニシリン（２００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（２００ｍｇ／ｍＬ）及びファンギゾン（１．２５ｍｇ／ｍＬ）またはゲンタマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ））を添加したＤＭＥＭ−ハムＦ１２（１：１）−１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）からなる保存培地に組織を浸漬し、実験室への輸送用に最終濃度を０．１％（ｖ／ｖ）とし、消化させた。消化用組織を調製するため、ＮＰ組織からＡＦ組織を慎重に切除し、それを消化及び単離に別々に供した。各椎間板を切除し、別々に培養した。先に記載があるように、消化はすべて、４５ｍｌの滅菌ＤＭＥＭ−ハムＦ１２−１０％ＦＢＳ中で実施した（Ｍｅｌｒｏｓｅ、Ｇｈｏｓｈ、Ｔａｙｌｏｒ、Ｌａｔｈａｍ、＆Ｍｏｏｒｅ、１９９７）（Ｍｅｌｒｏｓｅ、Ｓｍｉｔｈ、Ｇｈｏｓｈ、＆Ｔａｙｌｏｒ、２００１）（Ｓｈｅｎ、Ｍｅｌｒｏｓｅ、Ｇｈｏｓｈ、＆Ｔａｙｌｏｒ、２００３）。簡単に言えば、無菌条件下、組織をメスで細かくさいの目状に切断した。約２．５ｇの切断組織を、０．２ｗ／ｖ％プロナーゼと０．０１ｗ／ｖ％ＤＮＡａｓｅとの酵素溶液の入った５０ｍｌ円錐管に移した。組織を３７℃で９０分消化させた。残存組織を１０ｍｌ  ＰＢＳで洗浄し、上清を廃棄した。その後、抗生物質含有ＤＭＥＭ−ハムＦ１２−１０％ＦＢＳ中で、０．０５ｗ／ｖ％のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ由来細菌コラゲナーゼ１Ａ型、０．０１ｗ／ｖ％ＤＮａｓｅ（４５ｍｌ／管）を用いて、組織が完全に脱凝集化するまで残留組織を数時間消化させた。細胞を遠心分離（８００ｇｘ１０分）によって採取し、ＤＭＥＭ−ハムＦ１２−１０％ＦＢＳで１回洗浄した。得られる細胞懸濁液を、７０μｍストレーナーに通し、再度懸濁させて細胞数及び生存率を測定した。ＮＰＣ及びＡＦＣの双方を、組織培養処理したフラスコに入れたＤＭＥＭ−ハムＦ１２−５％ＦＢＳ及び２ｍＭＬ−グルタミンに播種した。初代のＮＰＣ及びＡＦＣを、８０〜９０％コンフルエントな状態になるまで培養し、ヒューストンのＭｅｓｏｂｌａｓｔ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓに発送した。０．０５％トリプシン／０．１％ＥＤＴＡで初代培養を回収し、凍結保存した。成人ＡＦＣの初代細胞を解凍し、継代１代目として１０，０００細胞／ｃｍ２で播種し、その後、採取してバイオアッセイを準備した。
【０１４０】
胎児ＡＦＣを商用供給業者（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ、カリフォルニア州カールスバッド）から入手した。
【０１４１】
ＥＬＩＳＡによるＭＰＣ  ＣＭ中ＴＧＦβ１レベルの測定
ＭＰＣ  ＣＭ中ＴＧＦβ１レベルを、ＥＬＩＳＡで製造者の指示書（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）にしたがって測定した。
【０１４２】
使用前に、製造者の操作手順にしたがい、総ＴＧＦβ１レベルの測定に必要な酸活性化ステップを促進するため、ＭＰＣ  ＣＭを約４０倍濃縮した。酸処理後、バイオアッセイで使用するために、試料をＣＢＭ中に本来の容量で再構成した。
【０１４３】
標準液及び試料希釈の再構成及び調製に使用した希釈液を変更して、製造者の操作手順にしたがいＥＬＩＳＡを実施する。キットで提供されたＴＧＦβ１標準を、０．５％ＢＳＡを添加したＣＢＭ（ＣＢＭ＋０．５％ＢＳＡ）中で再構成する。ＣＢＭ＋０．５％ＢＳＡに段階希釈を調製し、最終濃度を３１．２〜２０００ｐｇ／ｍｌの範囲にする。試料を酸で活性化し、ＣＢＭ＋０．５％ＢＳＡに１：５で希釈する。ＴＧＦβ１に対して特異的なモノクローナル抗体で予めコートしたマイクロプレートに標準液、試料及び対照群を加える。室温で（ＲＴ）２時間インキュベーションした後、プレートを洗浄する。ＴＧＦβ１複合体を各ウェルに加え、プレートを室温で２時間インキュベートする。その後、プレートを再び洗浄し、各ウェルに基質溶液を加え、室温で３０分インキュベートする。停止液を各ウェルに加え、波長補正を５７０ｎｍにし、４５０ｎｍに設定したマイクロプレートリーダーで各試料の光学濃度（ＯＤ）を読み取る。４パラメータロジスティック曲線フィッティングを使用して標準曲線を作成する。各試料中のＴＧＦβ１濃度を標準曲線から導き、希釈について補正し最終結果を得る。
【０１４４】
ＴＧＦβ１ノックダウンＭＰＣの作製
ＴＧＦβ１  ｓｉＲＮＡまたは対照としてのスクランブルオリゴヌクレオチドを用いて新鮮解凍ＭＰＣ製品（ｎ＝４）をトランスフェクションした。細胞を無血清αＭＥＭに懸濁させ、ＴＧＦβ１  ｓｉＲＮＡまたはスクランブルｓｉＲＮＡ（５００ｐｍｏｌ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールスバッド）及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有しているトランスフェクション混合物と合わせた。その後、フィブロネクチンをコートしたプレート上に細胞を高密度で播種し、一晩付着させた。翌日、細胞を洗浄し、培地をＣＢＭ＋０．５％ＢＳＡと交換した。細胞をインキュベーターに戻し、３７℃、５％Ｏ２／９５％ＣＯ２で７２時間静置した。この培養期間の終了時、培養上清を採取し、懸濁細胞または残渣を遠心分離にかけてペレットにした後、分注して、アッセイまで−８０℃で保存した。
【０１４５】
実施例２  概念実証実験
椎間板修復におけるＭＰＣの適切な効力検定を確立するという観点で、変性椎間板疾患（ＤＤＤ）においてＭＰＣが治療利益を誘導し得る可能性のあるメカニズムをモデル化し、かつ評価するため、一連のインビトロ試験を行った。
【０１４６】
実験室条件下では、ＭＰＣは複数系列への分化能を有しており、これには、適切な誘導性合図に応答したインビトロでの軟骨細胞分化の能力が含まれる。古典的なインビトロでの軟骨形成試験では、ＴＧＦβ１存在下の３週間にわたる高密度ペレットの細胞培養が行われる（Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ，Ｈｅｒｉｎｇ，Ｃａｐｌａｎ，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，＆Ｙｏｏ，１９９８）。その後、ペレットを固定して薄片にし、染色して、軟骨細胞活性の特徴であるプロテオグリカンの存在を検出する。本アッセイ及び非定量的評価方法の実施に要する時間を考えると、本アッセイは、放出アッセイとしての適格性評価及びバリデーションに適用できないとみなされた。したがって、インビトロでの軟骨形成放出アッセイの開発はそれ以上実行されなかった。その代わり、椎間板（ＩＶＤ）細胞に対するＭＰＣの傍分泌型の作用機序を効力検定開発の基盤として同定することに焦点を当てて取組みがなされた。
【０１４７】
ＭＰＣは、広範にわたる生物活性液性因子を分泌し、これには炎症の緩和、細胞増殖の促進及びマトリックス産生の刺激が知られている因子が含まれる（ｅｔ  ａｌ．、２０１１を参照のこと）。ＭＰＣ製品の複数のロットのサイトカイン特性を調べ、広範にわたる生物活性分子の分泌が確認された。これらのデータに基づき、ＭＰＣは、ＩＶＤに導入された後、椎間板定住細胞に作用する可溶性分子の放出を介した傍分泌型機序によって、内因性の修復プロセスを刺激し得るという仮説を立てた。本願発明者らは、ＮＰＣ及び／またはＡＦＣの生存、増殖及び分化に寄与し、椎間板機能の持続的な増強をもたらし得る分泌因子の同定に焦点を絞った。関連文献の幅広い選別を実施して、椎間板細胞同化作用を有する分泌因子を同定した。その後、この調査によって同定された因子を、免疫解析を手段とし、かつこれらのデータをもとに、ＭＰＣ  ＣＭの場合についてスクリーニングし、ＴＧＦβ１を主要候補として同定した。
【０１４８】
ＴＧＦβ１を介した作用機序が、ＭＰＣ製品を評価する効力検定の開発の基盤を提供し得るか否かを決定するため、以下を目的としてインビトロ概念実証実験を実施した。
１．ＭＰＣ  ＣＭは、ＮＰＣ増殖及びマトリックス産生を刺激するか否かを決定すること、及び
２．ＭＰＣ  ＣＭは、ＡＦＣ増殖及びマトリックス産生を刺激するか否かを決定すること、及び
３．ＭＰＣ  ＣＭ中のＴＧＦβ１は、椎間板細胞に対するＭＰＣ  ＣＭの生物活性をインビトロで誘導するか否かを決定すること。
【０１４９】
ＭＰＣ由来液性因子はＮＰＣ増殖及びプロテオグリカン産生を刺激する
ＮＰは、主に、プロテオグリカン、アグリカン、ＩＶＤ内に膨圧を提供する基質である水結合分子で構成される。ＮＰＣは、ＩＶＤの主要プロテオグリカン供給源であり、これにより組織の構造及び機能の維持に重要な役割を果たしている。さらに、インビトロ試験では、完全プロテオグリカンマトリックスが神経突起の内方への伸長を押し返すことが示されていることから（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｃａｔｅｒｓｏｎ，Ｅｉｓｅｎｓｔｅｉｎ，Ｈｙｎｄｓ，Ｓｈｏｗ，＆Ｒｏｂｅｒｔｓ，２００２）、ＮＰＣによるプロテオグリカンの沈着は、健常な無痛の椎間板の無神経組織環境を保持する上で重要であり得る。逆に、ＤＤＤは、ＮＰＣ死、マトリックス破壊と消失、及び神経突起の内方への伸長に関連している（Ｌｏｒｅｔｏ，Ｍｕｓｕｍｅｃｉ，Ｃａｓｔｏｒｉｎａ，Ｌｏｒｅｔｏ，＆Ｍａｒｔｉｎｅｚ，２０１１）（Ｍｅｌｒｏｓｅ，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｍｅｎａｇｅ，＆Ｇｈｏｓｈ，２００２）。したがって、損傷したＮＰ組織の修復には、定住ＮＰＣ母集団の維持とマトリックス合成の刺激の両方を必要とし得る。一方、ＮＰＣの支持により、椎間板の構造と機能が改善されて疼痛感覚が減弱され得る。ＭＰＣ  ＣＭがＮＰＣ機能に対して影響を与えるか否かを調べるため、インビトロでのヒトＮＰＣの増殖とプロテオグリカン産生に対するＭＰＣ  ＣＭの効果を測定するためのバイオアッセイを確立した。
【０１５０】
ＭＰＣのさまざまなロットから得たＣＭ試料を、ＥｄＵの取り込みにより決定するＮＰＣ増殖アッセイで活性について試験した。図２Ａでは、被験１０ロット中９ロットが、未刺激対照細胞と比べ（１２．９％）、培養中での分裂が活発なＮＰＣの割合の有意な増加を刺激した（平均％ＥｄＵ＋細胞＝４４．９±１５．７％、範囲＝３８．９〜６６．９％、ｎ＝４ドナー由来１０ロット）。残りのロットは、対照基本培地と比較して、ＮＰＣ増殖に対する有意な効果を示さなかった。
【０１５１】
２Ｄ高密度培養では、ＮＰＣは、恒常的に低レベルのプロテオグリカンを産生し、アルシアンブルー染色で確認された（図２Ｂ）。ＭＰＣの異なる３ロットから得たＣＭは、未刺激対照細胞よりもさらに強いアルシアンブルー染色で示され、これらのベースラインレベルを越えてプロテオグリカン合成を有意に増強させた。プロテオグリカン合成を定量化するため、吸光度測定用にアルシアンブルー染色を抽出した。ＭＰＣ  ＣＭによるＮＰＣの処理により、プロテオグリカン含有量は、基本培地で増殖させた対照細胞より約２倍増加した（平均ＯＤ＝０．４０±０．０２、範囲＝０．３８〜０．４２、ｎ＝１ドナー由来３ロット）（図２Ｃ）。
【０１５２】
併せて、これらのデータは、ＭＰＣ  ＣＭには、プロテオグリカンの増殖と合成に対する効果で測定された、ＮＰＣ同化作用を有する因子（複数可）が含まれるという証拠を提供している。したがって、ＭＰＣ処理は、ＮＰＣに対する傍分泌型作用を介して損傷した椎間板の修復的機序を刺激し得る。
【０１５３】
ＭＰＣ由来の液性因子はＡＦＣの増殖とコラーゲン合成を刺激する
ＩＶＤのＡＦは主に、線維性のＩ型コラーゲン及びＩＩ型コラーゲンで構成され、ＮＰを取り囲む複数の層板を形成する。Ｉ型コラーゲンのレベルは外層で高く、ＮＰとの界面に近くなるほど減少し、一方、ＩＩ型コラーゲン含有量は外層から離れると多くなり、組織中心部へ向かうにつれ非常に豊富になる。これらのコラーゲンの勾配が、引張り強度と弾性の両方を椎間板に提供しており、これによりＩＶＤの構造及び機能が支持されている。完全なＡＦは、神経及び血管が椎間板組織の内方へ伸長するのを防ぐ障壁を作る重要な役割を果たしている。対照的に、ＤＤＤで生じるようなＡＦの破損は、ＩＶＤの構造及び機能の障害をもたらし、血管及び神経の侵入に関連した痛みをもたらす。ＡＦのコラーゲンマトリックスは定住ＡＦＣによって維持されている。変性椎間板から得たＡＦＣでは、表現型異常を示すことがわかっており、これは、ＥＣＭ成分及び細胞増殖に関連する遺伝子の下方制御を特徴とする（Ｇｒｕｂｅｒ，Ｈｏｅｌｓｃｈｅｒ，＆Ｈａｎｌｅｙ，２０１０）。ＤＤＤ組織のＡＦ母集団では、老化細胞が高い割合で含まれ、同時に増殖細胞の割合が低くなっていることがわかっている（Ｇｒｕｂｅｒ，Ｉｎｇｒａｍ，Ｄａｖｉｓ，＆Ｈａｎｌｅｙ，２００９）。ＡＦＣのプールと活性の維持を助ける治療的戦略は、ＡＦの構造と機能を回復させることによって長期的な利益をもたらし得る。ＭＰＣ由来の因子がＡＦＣ機能に対して影響を与えるか否かを決定するため、ヒトＡＦＣのインビトロでの増殖及びコラーゲン合成に対するＭＰＣ  ＣＭの効果を測定するためのバイオアッセイを確立した。
【０１５４】
図３Ａは、ＥｄＵの取り込みにより測定した場合、別々のロットのＭＰＣから作製したＣＭ試料において、基本培地のみで増殖させた細胞で観察されたレベルを超えてＡＦＣ増殖が増加したことを示す。この実験では、被験７ロットすべてから得たＣＭは、対照培地と比べて（３．６％）、培養中の分裂が活発な細胞の割合の有意な増加を刺激した（平均％ＥｄＵ＋細胞＝２７．１±１５．１％、範囲＝７．８〜５３．２％、ｎ＝３ドナー由来１０ロット）。
【０１５５】
ＭＰＣ  ＣＭは、ＡＦＣ増殖を刺激したほか、ＡＦＣのコラーゲン合成を増加させた。ＭＰＣ  ＣＭで処理したＡＦＣには、基本培地のみで増殖させた細胞と比較して（０．０１μｇ／ｍｌ）有意に高いレベルのヒドロキシプロリンが含有されていた（平均ヒドロキシプロリン含有量＝０．３±０．１μｇ／ｍｌ、範囲＝０．２〜０．５μｇ／ｍｌ、ｎ＝３ドナー由来ＭＰＣ６ロット）、（図３Ｂ）。これらの種類のバイオアッセイに固有のばらつきが観察されたにもかかわらず、総合すると、これらのデータから、ＭＰＣ  ＣＭはＡＦＣ活性を刺激する液性因子を含有していることが明確に実証された。
【０１５６】
ＡＦＣのコラーゲン合成におけるＴＧＦβ１の役割
ＴＧＦβ１の寄与の可能性を調べるため、異なる５つのドナーを包含する複数のＭＰＣ製品ロットに由来するＣＭ中のＴＧＦβ１レベルを調査した。その後、抗ＴＧＦβ１中和抗体の存在下及び非存在下における、ＡＦＣのインビトロでのコラーゲン合成に対するＴＧＦβ１の推定上の原因的役割を調べた。
【０１５７】
製造者の指示書にしたがい、ＥＬＩＳＡによってＭＰＣ  ＣＭ中ＴＧＦβ１レベルを測定した（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）。ＭＰＣ  ＣＭ中のＴＧＦβ１のレベルは、１０８３．１〜４２０２．８ｐｇ／ｍｌの範囲であった（平均＝２９８１．６±１０５４．３ｐｇ／ｍｌ、ｎ＝１５ロット、異なる５ドナーから作製）（図４）。
【０１５８】
データから、ＭＰＣは確かなレベルのＴＧＦβ１をそのＣＭ中に分泌し、再現性のあることが確認された。図５Ａに示すように、ＡＦＣの異なる３ロットは、明らかなＴＧＦβ１用量依存的コラーゲン合成を示し、ＴＧＦβ１が１〜３ｎｇ／ｍｌでプラトーに達した。抗ＴＧＦβ１中和抗体の存在下では、１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１に応答したＡＦＣによるコラーゲン合成は、ＴＧＦβ１非存在下で得られたレベルをわずかに上回るレベルに低下した。これらのデータは、標的ＡＦＣ母集団のＴＧＦβ１に対する直線的な用量−反応性、及び抗ＴＧＦβ１中和抗体の効力を検証するものである。
【０１５９】
ＭＰＣ由来のＴＧＦβ１がＡＦＣコラーゲン産生において原因的作用を果たすか否かを調べるため、ＭＰＣ  ＣＭ試料をＴＧＦβ１に対する中和抗体で予め処理してからＡＦ培養に加えた。図５Ｂ（左パネル）では、ＭＰＣ７ロットそれぞれから得たＣＭは、対照基本培地と比べ、ＡＦＣ中ヒドロキシプロリン含有量の統計的に有意な増加を刺激した。ＴＧＦβ１活性の中和により、７ロット中５ロットでヒドロキシプロリン含有量の有意な低下がもたらされた。残りの２ロットでコラーゲン合成の減少傾向が見られたが、これらにも本アッセイ中最低レベルの活性が含まれていた。異なるドナーから得たＡＦＣの異なるロット間でＣＭ試料を試験したところ（図５Ｂ、中央パネルと右パネル）、どの実験でも同様のパターンの結果が観察された。抗ＴＧＦβ１中和抗体の存在下でコラーゲン合成が完全に阻害される（同等レベルの対照抗体と比較した場合）ことがＣＭのいくつかのロットで実証され、これにより、これらの特定の場合ではＴＧＦβ１がコラーゲンの合成促進における唯一の原因因子であることが実証された。
【０１６０】
概念実証実験による結論
データは、ＭＰＣ  ＣＭは、ＮＰＣ及びＡＦＣの増殖とマトリックス産生を刺激する液性因子を含有することを実証している。複数のＭＰＣロットから得たＣＭにおいて、椎間板細胞同化作用があることがわかっているＴＧＦβ１を検出した。さらに、ＴＧＦβ１は、ＭＰＣ  ＣＭで処理した細胞におけるコラーゲン合成の主要エフェクターであることが示された。データは、ＭＰＣ由来のＴＧＦβ１はＡＦＣコラーゲン合成を刺激すること、またそれにより、ＤＤＤに関連するＡＦの修復及び長期の治療的利益に寄与し得ることを示唆している。したがって、ＭＰＣ  ＣＭ中のＴＧＦβ１レベルの検出は、椎間板修復に対するＭＰＣの効力の強力な代替的尺度を表す。
【０１６１】
また、データは、ＴＧＦβ１により誘導された生物活性を測定する定量的アッセイ、すなわち、ＮＰＣ及びＡＦＣの増殖のの尺度としてのＥｄＵ取り込みアッセイ、及びＡＦＣコラーゲン合成の尺度としてのヒドロキシプロリンアッセイの確立を実証している。ＡＦＣの異なるロットを使用してヒドロキシプロリンアッセイを実施したところ、知見により、標的細胞ドナーを問わず、ＡＦＣに対するＭＰＣ  ＣＭのコラーゲン合成促進作用の再現性、及びこの作用に対するＴＧＦβ１の寄与が支持される。ＮＰ及びＡＦＣの異なるロットの性能を比較する同様の取り組みがＥｄＵ取り込みアッセイの評価において行われた。ＭＰＣ製品ロット間である程度のＴＧＦβ１レベルのばらつきが観察された（スクリーニングをしたロットの範囲＝１０８３．１〜４２０２．８ｐｇ／ｍｌ）。重要なことには、この範囲のＴＧＦβ１レベルは、測定可能な活性があることが示され、組換え型ヒトＴＧＦβ１（ｒｈＴＧＦβ１）を使用したＡＦＣコラーゲン合成アッセイにおいてベースライン対照を統計的に有意に上回っていた。総合すると、これらのデータは、ＭＰＣ  ＣＭにおけるＴＧＦβ１の生物活性を測定するための本バイオアッセイの使用を支持している。
【０１６２】
実施例３  胎児ＡＦＣと成人ＡＦＣの比較可能性
ＡＦＣコラーゲン合成に対するＭＰＣ  ＣＭの効果を測定するバイオアッセイを先に開発した。アッセイは、胎児ＡＦＣを使用して開発したが、これは、それらが市販されていることによるものである。この因子は、効力検定の開発に取り組む際に、供給の重要な利点を表す。対照的に、成人ＡＦＣは現在のところ市販されていない。本願発明者らは、コラーゲン合成バイオアッセイにおいて胎児ＡＦＣが成人ＡＦＣの好適な代替となるかという検証を試みた。したがって、本願発明者らは、胎児ＡＦＣ及び成人ＡＦＣの微小塊培養に対するｒｈＴＧＦβ１及びＭＰＣ  ＣＭの効果を比較した。
【０１６３】
胎児細胞と同様に、成人ＡＦＣは、ｒｈＴＧＦβ１に対する用量依存的反応を示した（０．１〜３ｎｇ／ｍｌ）（図６及び表２）。胎児細胞と比較すると、成人ＡＦＣの培養ではコラーゲンのベースラインレベルは高く、低レベルのＴＧＦβ１に対する応答の程度（１００ｐｇ／ｍｌ）も大きかった（図６及び表２）。
５００ｐｇ／ｍｌに応答した産生は胎児ＡＦＣと成人ＡＦＣとでは同様であった。用量反応曲線のＴＧＦβ１  １〜３ｐｇ／ｍｌにおいて、成人ＡＦＣ培養ではプラトーが始まったが、胎児ＡＦＣでは直線のままであった。
【０１６４】
成人ＡＦＣをＭＰＣ  ＣＭでの処理することにより、成人ＡＦＣにおいて確実かつ有意なコラーゲン産生増加が刺激された（図７及び表３）。
【表２】
0006797833.tif 000003
【表３】
0006797833.tif 000004
【０１６５】
総合すると、これらのデータは、胎児及び成人のＡＦＣの微小塊培養をＴＧＦβ１で刺激することにより、コラーゲン産生が用量依存的に増加することを実証している。成人ＡＦＣをＭＰＣ  ＣＭの処理することにより、先に胎児ＡＦＣで観察された効果と同様、ヒドロキシプロリン含有量の確固たる増加がもたらされた。総合すると、これらのデータは、この細胞型におけるコラーゲン産生に対するＭＰＣ  ＣＭの効果を評価する場合に、胎児ＡＦＣが成人ＡＦＣの好適な代替となることを示している。
【０１６６】
実施例４  ＤＤＤのためのＭＰＣ製品用のＴＧＦβ１効力検定の開発
インビトロモデルを使用して、ＤＤＤにおいてＭＰＣが有益に作用し得る、可能性のある多数の傍分泌型機序を調べた（実施例２）。これらのうち、ＡＦＣによるコラーゲン産生の刺激は、長期の治療的利益へ向けた重要なステップとなり得る。ＡＦＣのコラーゲン産生が増大すれば、椎間板の構造上の完全性が回復されるとともに、血管及び神経の内方への伸長が阻害され得、それにより椎間板の生物力学的機能が改善されて痛みが軽減され得る。
【０１６７】
ＡＦＣコラーゲン産生に対するＭＰＣ由来の液性因子の効果を調べるため、本願発明者らは、ＡＦＣの微小塊培養におけるヒドロキシプロリン（コラーゲンの主成分）のレベルを測定する定量的アッセイを開発した（実施例２）。胎児ＡＦＣの異なる３ロット及びｒｈＴＧＦβ１を使用してアッセイを確立した。本願発明者らは、ｒｈＴＧＦβ１（１００〜３０００ｐｇ／ｍｌの濃度範囲を通じて）が、ＡＦＣで用量依存的にコラーゲン産生を刺激することを示した、（図５Ａ）。また、本願発明者らは、本バイオアッセイにおいてＭＰＣ  ＣＭがコラーゲン産生を刺激することを実証した。ＭＰＣ  ＣＭのコラーゲン刺激作用は、少なくとも一部は、ＴＧＦβ１活性に起因していたが、これは、抗ＴＧＦβ１中和抗体がこれらの効果を抑制したためである（図５Ｂ）。重要なことには、ｒｈＴＧＦβ１及びＭＰＣ  ＣＭ双方のコラーゲン刺激作用は、異なるドナーを代表するＡＦＣの複数のロット間で再現性があり、このことは、これらの作用がＡＦＣドナーとは無関係であることを示している。また、本願発明者らは、本バイオアッセイでは市販されている胎児ＡＦＣが成人ＡＦＣの好適な代替となることを確認した（実施例３）。総合すると、これらのデータは、効力検定開発の重要要素を２つ提供している。すなわち第一は、データは、ＭＰＣは、傍分泌型機序を介してＡＦＣによるコラーゲン産生を刺激し得、ＴＧＦβ１はこの設定において重要な役割を果たしているという概念実証を提供することである。第２は、データは、ＭＰＣ  ＣＭ生物活性を測定するＡＦＣコラーゲン合成アッセイの有用性を支持していることである。したがって、ＭＰＣ  ＣＭにおいて見られたＴＧＦβ１の確かなレベル、及びＡＦＣコラーゲン産生に対するＭＰＣ  ＣＭの効果でＴＧＦβ１が果たす原因的役割を考えると、データから、ＴＧＦβ１は、ＤＤＤに関連するＭＰＣの生物活性に関する代替的マーカーとして妥当な候補であることも示唆される。
【０１６８】
ＤＤＤ用ＭＰＣの効力検定として、ＭＰＣ  ＣＭ中のＴＧＦβ１を検出するため、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を用いる方法を採用した。
【０１６９】
市販のＥＬＩＳＡを使用して、異なる２つの基本培地で増殖させたＭＰＣから得たＣＭでＴＧＦβ１レベルを測定した。データは、培地組成を相関要素としたＣＭ中のＴＧＦβ１レベルにおける顕著な差を示す（図８）。これらの試料を実験中に作製して、ＭＰＣのＴＧＦβ１産生とインビトロでの生物活性の評価用ＣＭの作製に最適な基本培地を決定した。０．５％ＢＳＡ（図８、濃色バー）のみを添加したＣＢＭをこれらの実験で使用するために選択したが、これはＩＶＤを用いた機能バイオアッセイにおいて、ＭＰＣ機能の支持と、川下用途との適合性とのバランスの取れた培地を反映している。拡大して解釈すれば、これらのデータは、ＭＰＣによるＴＧＦβ１合成に悪影響を与える製造工程における変化を検出するためにＴＧＦβ１  ＥＬＩＳＡを使用してよいことを実証している。
【０１７０】
ＭＰＣ  ＣＭはヒトＡＦＣによるコラーゲン産生を刺激し確かなレベルのＴＧＦβ１を含有する
図７及び表４は、胎児ＡＦＣの独立した３ロットにおけるコラーゲン産生に対するＭＰＣ  ＣＭの効果を示す。データは、各ＡＦＣロットが用量依存的にｒｈＴＧＦβ１（１００〜３０００ｐｇ／ｍｌ）に反応したことを示し、これはシステムの適性を確認するために実験に含めた。ＧＭＰロット１〜１８から得たＣＭ各々をＡＦＣロット４７２９で評価した（図７Ａ）。分注が利用可能な場合は、ＡＦＣロット５９４５及び４７５５でもＣＭ試料を評価した（図７Ｂ及び図７Ｃ）。各ＭＰＣロットは、ＡＦＣロット４７２９の未刺激対照群に対し、コラーゲン産生の統計的に有意な増加を刺激した（図７Ａ）。この効果をＡＦＣロット５９４５及び４７５５に再現させた（図７Ｂ及び図７Ｃ）。図７Ｄは、各ＭＰＣ  ＣＭ試料に対する全ＡＦＣロットの平均反応を示す。
【０１７１】
ＭＰＣ  ＣＭコラーゲン刺激活性は、各試料中に確かなレベルのＴＧＦβ１が存在することに関連していた（図９及び表４）。標準化培養条件下、ＭＰＣ上清中の総ＴＧＦβ１レベルは１９７９．１２〜４２０２．８２ｐｇ／ｍｌの範囲であり、平均３３０３．１６±５６９．５６ｐｇ／ｍｌであった。
【０１７２】
ＡＦＣコラーゲン合成バイオアッセイにおけるＭＰＣ  ＣＭの最小閾値効果の設定
ＴＧＦβ１の分泌を基にしたＭＰＣのリリース暫定仕様書を確立するため、本願発明者らはまず、ＡＦＣコラーゲン合成バイオアッセイにおけるＭＰＣ  ＣＭの最小閾値効果を同定しようと試みた。本願発明者らは、この閾値は、試料型（ＣＭ）の特徴にもバイオアッセイ自体にもともに関連するであろうと推測した。図７及び図９に示すように、被験ロットから得たＭＰＣ  ＣＭ試料には、ある範囲のレベルのＴＧＦβ１（１９７９．１２〜４２０２．８２ｐｇ／ｍｌ）が含有されているが、それらのいずれでも、コラーゲン合成はベースラインの未刺激対照を上回って有意に増加していた。さらに、本願発明者らは、ＭＰＣ  ＣＭ中のＴＧＦβ１試料の平均レベルは３３０３．１６±５６９．５６ｐｇ／ｍｌであったが、コラーゲン産生に対するＭＰＣ  ＣＭの効果は３０００ｐｇ／ｍｌのｒｈＴＧＦβ１単独で示されたものより低く、これは、ＭＰＣ  ＣＭにＴＧＦβ１の作用を阻害する因子が含有されているであろうという本アッセイの仮説と一致したことに注目した。したがって、本バイオアッセイの通常より弱い活性を反映するであろう、ＭＰＣ  ＣＭにおける生物活性レベルを確立するため、本願発明者らは、ｓｉＲＮＡ技術を使用してＴＧＦβ１を低下させたＣＭをＭＰＣロットから作製した。
【０１７３】
ＴＧＦβ１ノックダウンＭＰＣから得たＣＭの特性解析
本願発明者らは、ＥＬＩＳＡでＭＰＣ  ＣＭ中のＴＧＦβ１レベルを測定することによってＴＧＦβ１のノックダウンについて検証した。図１０Ａ及び表５は、対照スクランブルオリゴヌクレオチドまたはＴＧＦβ１  ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした各ＭＰＣロットから得たＣＭ中のＴＧＦβ１レベルを示す。
５００ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡでＭＰＣをトランスフェクションしたところ、ＴＧＦβ１レベルがスクランブル対照群より約９０％低下し、生存率に対する直接的な影響はなかった（データ示さず）。
【０１７４】
ＴＧＦβ１のノックダウンが確認されたので、ＡＦＣヒドロキシプロリンアッセイでＭＰＣ  ＣＭ試料を試験した。図１０Ｂ及び表５は、スクランブルｓｉＲＮＡでトランスフェクションしたＭＰＣから得たＣＭは、ＡＦＣにおいて、すべての被験ＭＰＣロットによって刺激されたレベルの平均と同レベルのコラーゲン産生を刺激することを示す。対照的に、ＴＧＦβ１ノックダウンＭＰＣ  ＣＭに応答したＡＦＣコラーゲン合成は、スクランブルｓｉＲＮＡ対照群から得たＭＰＣ  ＣＭで刺激したＡＦＣより有意に低下していた。しかし、ＴＧＦβ１ノックダウンＭＰＣから得たＣＭの効果は、ベースライン対照群を有意に上回ったことに変わりはなく、このことから、残留ＴＧＦβ１活性及び／または他の寄与因子の存在が示唆される。
【０１７５】
以上をまとめると、データから、ノックダウンＭＰＣは、平均２０４．８１±５２．０７ｐｇ／ｍｌのＴＧＦβ１を分泌し、それにより０．１７±０．０６μｇのヒドロキシプロリンがＡＦＣで産生されたことが示される（図１０及び表５）。ヒドロキシプロリンのこのレベルは、ＡＦＣバイオアッセイで観察されたＭＰＣ  ＣＭの最小効果を表す。本願発明者らは、この最小効果レベルは、現在利用可能なデータセットに基づいて効力が通常より弱い細胞と効力が強い細胞の間の閾値を定義するものとみなす。効力の強い細胞についての厳密さを高くするため、最小効果レベルを閾値レベル０．１７μｇより１ＳＤ高い０．２３μｇのヒドロキシプロリンに設定した。
【表４】
0006797833.tif 000005
【表５】
0006797833.tif 000006
【０１７６】
ＴＧＦβ１の分泌を基にしたＭＰＣのリリース暫定仕様書の確立
未処理ＭＰＣ及びＴＧＦβ１ノックダウンＭＰＣを用いた我々の実験から得られたデータを使用して、本願では、統計解析を実施し、インビトロでのＴＧＦβ１レベルとＡＦＣコラーゲン産生との関係を調べ、また、ＤＤＤのための臨床用ＭＰＣ製品のリリースに必要とされるＴＧＦβ１の閾値レベルを同定した。
【０１７７】
ＡＦＣコラーゲン合成バイオアッセイにおけるＭＰＣ  ＣＭのＴＧＦβ１レベルと活性の間の関係
最初に、ＭＰＣ  ＣＭに存在するＴＧＦβ１のレベルと、インビトロでのＡＦＣによるコラーゲン産生に対するＭＰＣ  ＣＭの効果との間の関係の有無を決定した。未処理ＭＰＣ及びノックダウンＭＰＣから得たデータを合わせて計２６試料とした。このデータセットでは、ＴＧＦβ１レベルの範囲は１４３．８〜４２０２．８ｐｇ／ｍｌ、またコラーゲンレベルの範囲は０．１０〜０．５３μｇであった（表４及び表５）。Ｐｅａｒｓｏｎの相関によると、ＴＧＦβ１レベルとコラーゲン産生との間に統計的に有意な関係があった（ｒ＝０．６５、ｐ＜０．００１）。回帰分析を実施して、ＴＧＦβ１レベルとコラーゲン産生との間で最もよく適合している直線を決定した（ｐ＜０．００１、図１１を参照のこと）。
【０１７８】
上記で確立されたＡＦＣコラーゲン合成バイオアッセイにおけるＭＰＣ  ＣＭの最小効果レベルを使用すると、この線形回帰モデルから、ＡＦＣバイオアッセイにおいて０．２３μｇのコラーゲン産生を刺激させるためには４０５ｐｇ／ｍｌのＴＧＦβ１が必要であると予測される。
【０１７９】
モデルの感度及び特異性の評価
モデルの感度及び特異性を調べた。閾値を４０５ｐｇ／ｍｌに設定し、偶発性分析を実施した。感度は１００％である、すなわち、陽性（ＡＦＣバイオアッセイで０．２３μｇ超のヒドロキシプロリンを刺激）であると予測された試料２２中２２は実際に真に陽性であることがわかった。本願発明者らは、特異性が１００％である、すなわち、閾値未満（０．２３μｇ未満のヒドロキシプロリンを刺激）であると予測された試料４中４は実際に真に陰性であることを見出した。偽陽性試料はなく、また偽陰性試料もなかった。
【０１８０】
ここに掲載したデータは、インビトロにおけるＡＦＣによるコラーゲン産生を刺激するＭＰＣの効力についての代替的マーカーとしてＴＧＦβ１を使用することを支持するものである。ＡＦＣコラーゲン合成バイオアッセイを使用することにより、ＥＬＩＳＡによって測定した場合に、ＭＰＣ製品１８ロットから作製したＣＭ試料は、インビトロでのＡＦＣによるコラーゲン産生を刺激し、確かなレベルのＴＧＦβ１を含有することが示された。この効果は、ＴＧＦβ１ノックダウンＭＰＣから得たＣＭでは減弱しており、これは、この設定におけるＴＧＦβ１の原因的役割を実証するもので、中和抗体試験から得られた先の提供データと一致する。未処理ＭＰＣ及びＴＧＦβ１ノックダウンＭＰＣから得たデータを合わせ、ＡＦＣコラーゲン合成バイオアッセイにおける生物活性に必要とされる、ＭＰＣ  ＣＭ中のＴＧＦβ１の閾値レベルを定義した。実験データの統計解析により、インビトロにおけるＡＦＣによるコラーゲン産生の有意な増加を刺激するために必要とされる最小ＴＧＦβ１レベルは、４０５ｐｇ／ｍｌであると確認された。したがって、ＴＧＦβ１  ４０５ｐｇ／ｍｌは、ＤＤＤのＭＰＣのリリース暫定仕様を表す。総合すると、これらのデータは、ＭＰＣ  ＣＭ中ＴＧＦβ１のＥＬＩＳＡを用いた検出は、ＭＰＣがヒト椎間板の内因性修復プロセスを刺激する可能性についての妥当な尺度を提供することを示している。
【０１８１】
実施例５  ＴＧＦβ１効力検定の最適化
ＴＧＦβ１効力検定では、培養し回収したＭＰＣ製品により放出されるＴＧＦβ１レベルを測定する。アッセイは２部あり、（１）培養し回収したＭＰＣ製品から得たＭＰＣ  ＣＭの作製、及び（２）市販の酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｈｕｍａｎ  ＴＧＦβ１  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ）を使用した、ＣＭ中ＴＧＦβ１レベルの検出である。
細胞播種密度、培養時間及び操作者間のばらつきによるＭＰＣ  ＣＭ中ＴＧＦβ１レベルに対する影響の評価。
【０１８２】
この試験ではＭＰＣロット３４５９３８及び２０１１ｃｃ０６３を使用した。ＭＰＣ製品を解凍、洗浄して計数し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したαＭＥＭに入れて６ウェルプレートに２５，０００または５０，０００生存細胞／ｃｍ２で播種した。翌日、細胞をＰＢＳで洗浄した後、培地をＣＢＭ＋０．５％ＢＳＡで交換した。ＣＢＭ培地交換後２４時間、４８時間、６８時間、７０時間、７２時間、７４時間、７６時間及び１２０時間目にＣＭを採取した。各測定時点につき３連を採取し、ＥＬＩＳＡによってＴＧＦβ１含有量について各ＣＭ試料を２連で分析した。操作者間のばらつきを測定するため、細胞の各ロットの単一バイアルを解凍し、２つの分注に分け、細胞数計数からＣＭ採取までの実験を２人の操作者が並行して実施した。
【０１８３】
図１２は、初期細胞播種密度、時間及び操作者を相関する要素とした、２つのＭＰＣロットによるＴＧＦβ１分泌を示す。図１２Ａは、２５，０００生存細胞／ｃｍ２で播種した細胞から得たデータを示す。３４５９３８及び２０１１ｃｃ０６３のどちらのロットにおいても、ＴＧＦβ１レベルは経時的に増加した（２４〜１２０時間）が、６８時間〜７６時間の間はレベルが一定であった。ロット３４５９３８から得たＣＭ試料において被験測定時点それぞれで測定したＴＧＦβ１レベルには、分析者間で有意なばらつきがあった。ロット２０１１ｃｃ０６３では、分析者間の結果のばらつきはさほど顕著ではなかった。５０，０００生存細胞／ｃｍ２で播種した細胞から得たデータを、図１２Ｂに示す。５０，０００生存細胞／ｃｍ２で播種した細胞から得られたＴＧＦβ１レベルは、細胞を２５，０００細胞／ｃｍ２で播種した場合に観察されたレベルよりも高かった。しかし、低密度で播種した細胞から得たＣＭ試料と同様、５０，０００生存細胞／ｃｍ２で播種した細胞から得たＣＭ中のＴＧＦβ１レベルは経時的に増加し、６８〜７６時間の時間枠内では一定であった。各ロットの各分析者から得た結果は、細胞を５０，０００生存細胞／ｃｍ２で播種した場合に比較可能であった。
【０１８４】
これらのデータは、２５，０００生存細胞／ｃｍ２での細胞播種と比較すると、５０，０００生存細胞／ｃｍ２での細胞播種の方が、分析者間でより一貫したデータが得られることを示唆している。また、データから、ＴＧＦβ１レベルは６８時間〜７６時間の間は一定であり、これは、この時間枠（ＣＢＭ培地交換後７２±４時間）が、ＴＧＦβ１効力検定用にＣＭを採取するための許容される時間枠を表すことを示すということも示される。
【０１８５】
１Ｎ  ＮａＯＨと１．２Ｎ  ＮａＯＨ／０．５Ｍ  ＨＥＰＥＳとで比較した、酸で活性化された試料の中和
アッセイに先立ち、潜在ＴＧＦ−β１を活性化させて、ＴＧＦβ１  ＥＬＩＳＡで検出可能な免疫反応性タンパク質にするために、ＣＭ試料を酸で処理する必要がある。これは、試料に１Ｎ  ＨＣｌを加え、その後、ｐＨ７．２〜７．６に中和することによって達成される。中和ステップは、１．２Ｎ  ＮａＯＨ／０．５Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ＴＧＦβ１  ＥＬＩＳＡ製造者の操作手順にしたがう）または１Ｎ  ＮａＯＨを使用して行うことができる。ＴＧＦβ１  ＥＬＩＳＡ用の酸性化試料の中和について、非緩衝ＮａＯＨと緩衝ＮａＯＨの同等性を測定した。
３つのＭＰＣロット（３４５９３８，２０１１ｃｃ０６３，２０１１ｃｃ０４８）から得たＣＭ試料を酸で処理した。その後、１Ｎ  ＮａＯＨまたは１．２Ｎ  ＮａＯＨ／０．５Ｍ  ＨＥＰＥＳを使用して複製試料をｐＨ７．２〜７．４まで中和した。その後、ＥＬＩＳＡによって２連試料のＴＧＦ−β１レベルを測定した。
【０１８６】
データを表６に示す。ＴＧＦβ１レベルは、ＮａＯＨ及びＨＥＰＥＳ緩衝ＮａＯＨで中和した酸活性化ＣＭの複製試料において同様であった（ｐ＞０．０５、スチューデントｔ検定）。したがって、ＴＧＦβ１効力検定用のＣＭ試料調製においては、ＨＥＰＥＳ緩衝ＮａＯＨを非緩衝ＮａＯＨに置き換えることができる。
【表６】
0006797833.tif 000007
【０１８７】
結論
２人の別々の操作者が、２つの異なる初期細胞密度（２５，０００生存細胞／ｃｍ２及び５０，０００生存細胞／ｃｍ２）で経時的なＴＧＦβ１の分泌について試験を行った。結果から、細胞を５０，０００生存細胞／ｃｍ２で播種した場合、２人の操作者から得られた値は、細胞を低密度で播種した場合よりも一貫していたことが示される。重要なことには、６８時間〜７６時間の間に採取した試料間のＴＧＦβ１レベルには、ばらつきはほとんどない。これらのデータに基づき、ＭＰＣ  ＣＭは、細胞を５０，０００生存細胞／ｃｍ２で播種して調製すること、及びＴＧＦβ１効力検定用のＭＰＣ  ＣＭの採取は、ＣＢＭ＋０．５％ＢＳＡ添加後７２±４時間に実施することが推奨される。
【０１８８】
データは、１Ｎ  ＮａＯＨで中和した酸活性化ＣＭ試料のＴＧＦβ１レベルは、１．２Ｎ  ＮａＯＨ／０．５Ｍ  ＨＥＰＥＳで中和された試料と同等であることを示す。したがって、１Ｎ  ＮａＯＨは、ＴＧＦβ１  ＥＬＩＳＡ用に試料を中和するための１．２Ｎ  ＮａＯＨ／０．５Ｍ  ＨＥＰＥＳの代替として許容される。
【０１８９】
実施例６：ＴＧＦβ１効力検定の性能
以下のパラメータの評価によってＴＧＦβ１  ＥＬＩＳＡの性能を評価した。
１．アッセイの直線性：標準曲線は、キャリブレーター希釈液またはＣＢＭ＋０．５％ＢＳＡで作成した；
２．マトリックス干渉：ｒｈＴＧＦβ１を、キャリブレーター希釈液またはＣＢＭ＋０．５％ＢＳＡで希釈した；
３アッセイの真度及び試料の直線性：実験を行って添加回収を調べ、ＴＧＦβ１はＣＭ試料に段階希釈した。
【０１９０】
アッセイの直線性
標準曲線の適合度を評価した。３つの別々のキットのＴＧＦβ１標準液を再構成し、ＥＬＩＳＡキットで提供されたキャリブレーター希釈液またはＣＢＭ＋０．５％ＢＳＡに希釈した。２０００ｐｇ／ｍｌから段階希釈を調製した。キット製造者により作成された標準曲線は、７つの測定時点及びゼロ時点で構成される。したがって、確立された標準曲線の範囲は３１．２〜２，０００ｐｇ／ｍｌであった。各標準濃度を２連で分析した。４パラメータロジスティック非線形回帰曲線フィッティングを使用して相関係数（Ｒ２）を測定した。典型的に、許容される標準曲線Ｒ２は≧０．９５である。キャリブレーター希釈液を使用して作製した３本の標準曲線の相関係数は０．９９１〜１．０００の範囲であり、またＣＢＭ＋０．５％ＢＳＡで作成した３本の標準曲線ではいずれもＲ２＝１．０００であった。標準曲線を図１３に示す。標準曲線の精度を保証するため、ＴＧＦβ１濃度を逆算し、％回収を決定した。全体的に、％回収は、８０％〜１２０％以内であることがわかった（表７）。
【表７】
0006797833.tif 000008
【０１９１】
マトリックス干渉
マトリックス干渉を調べるため、キャリブレーター希釈液またはＣＢＭ＋０．５％ＢＳＡにｒｈＴＧＦ−β１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を０ｐｇ／ｍｌ、５０ｐｇ／ｍｌ、２５０ｐｇ／ｍｌ及び１，５００ｐｇ／ｍｌで調製した。各濃度を２連で調製した。各試料中のＴＧＦβ１濃度をＥＬＩＳＡで測定した。各試料の平均濃度及び％回収を表８に提示する。キャリブレーター希釈液では、％回収は７０．４〜７４．７％の範囲であり、ＣＢＭ＋０．５％ＢＳＡでは回収は９４．５〜１０６．１％の範囲であった。
【表８】
0006797833.tif 000009
【０１９２】
さらに、キャリブレーター希釈液で作成した標準曲線とＣＢＭ＋０．５％ＢＳＡで作成した標準曲線との比較（同一プレート上での並行分析）によってマトリックス効果を評価した。各標準曲線は２連で表され、独立した２つの実験を実施した。図１４は、キャリブレーター希釈液で作成した標準曲線よりもＣＢＭで作成した標準曲線の方が平均ＯＤがわずかに高く、マトリックス効果があったことを示している。
【０１９３】
アッセイの真度
添加回収実験を実施して、アッセイの真度を評価した。異なる３濃度（５０ｐｇ／ｍｌ、２５０ｐｇ／ｍｌ及び５００ｐｇ／ｍｌ）のｒｈＴＧＦβ１を、３つのＭＰＣロット（３４５９３８，２０１１ｃｃ０６３，２０１１ｃｃ０４８）に由来するＣＭに添加した。各条件を２連で評価した。各濃度でのＴＧＦβ１パーセント回収を以下の式を用いて算出した。
［平均測定濃度／予測濃度］×１００
【０１９４】
平均測定濃度は、標準曲線から決定した、添加を受けた試料中のＴＧＦβ１濃度に対応する。３セットのデータから得た結果を表９に示す。許容される添加回収は典型的に８０〜１２０％の範囲である。すべての試料のパーセント回収値は９６．１７％〜１２６．８７％の範囲であった。各被験濃度での平均ＴＧＦβ１回収率は、５０ｐｇ／ｍｌでは１１２．１％、２５０ｐｇ／ｍｌでは１０３．８％、５００ｐｇ／ｍｌでは９７．８％と算出された。
【表９】
0006797833.tif 000010
【０１９５】
試料の直線性
試料の直線性を、３つの異なるＭＰＣロット（２２−１２−００２ＵＳ、１８５７４６９、３４５９３８）に由来するＣＭ試料を、未希釈ならびに２倍希釈、５倍希釈及び１０倍希釈で試験し、評価した。各試料を２連で評価した。所与の試料の各希釈度における精度（％ドリフト）を以下のように算出した。
％ドリフト＝（結果−全希釈結果の平均）／全希釈結果の平均×１００
【０１９６】
結果を表１０にまとめた。％ドリフトは、−１７．８〜１０．５％の範囲であった。許容される％ドリフトは典型的に±２０％である。
【表１０】
0006797833.tif 000011
結論
データは、ＭＰＣ培養で採取されたＣＭ中のＴＧＦβ１の測定としてＴＧＦβ１  ＥＬＩＳＡの適性を支持するものである。標準曲線のＲ２値は０．９９１〜１．０００の範囲であり、各標準濃度におけるＴＧＦβ１回収率は８０〜１２０％内であることがわかった。マトリックス効果を調べるために実施した実験では、キャリブレーター希釈液と比較して、ＣＢＭ＋０．５％ＢＳＡの方がＴＧＦβ１回収率が高く、ＣＢＭ＋０．５％ＢＳＡで作成した標準曲線は、キャリブレーター希釈液と比較してわずかに上方及び右方向へシフトしていることが示された。したがって、標準曲線は、ＣＢＭ＋０．５％ＢＳＡで作成することが推奨される。
【０１９７】
[参考文献]
Ａｄａｍｓ，Ｍ．Ａ．，＆Ｒｏｕｇｈｌｅｙ，Ｐ．Ｊ．（２００６）．Ｓｐｉｎｅ，３１，２１５１−２１６１．
Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（Ｅｄ．）．（１９８７  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ａｌｌ  ｕｐｄａｔｅｓ  ｕｎｔｉｌｌ  ｐｒｅｓｅｎｔ）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆Ｓｏｎｓ．
Ｂａｅ，Ｗ．Ｃ．，＆Ｍａｓｕｄａ，Ｋ．（２０１１）．Ｔｈｅ  Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ  Ｃｌｉｎｉｃｓ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ，２０１１，５８５−６０１，ｉｘ．
Ｂｊｏｒｎｓｓｏｎ，Ｓ．（１９９３）．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２１０，２８２−２９１．
Ｂｒｏｗｎ，Ｔ．Ａ．（Ｅｄ．）．（１９９１）．Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （Ｖｏｌ．１  ａｎｄ  ２）．Ｏｘｆｏｒｄ：  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ．
Ｂｕｃｈｓｃｈａｃｈｅｒ，Ｇ．Ｌ．，＆Ｐａｎｇａｎｉｂａｎ，Ａ．Ｔ．（１９９２）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２７３１−２７３９．
Ｂｕｒｎｓ，Ｊ．Ｃ．，Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，Ｔ．，Ｄｒｉｅｖｅｒ，Ｗ．，Ｂｕｒｒａｓｃａｎｏ，Ｍ．，＆Ｙｅｅ，Ｊ．Ｋ．（１９９３）．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，８０３３−８０３７．
Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．（１９９２）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５３３−５３９．
Ｃｈｅｕｎｇ，Ｋ．Ｍ．，Ｋａｒｐｐｉｎｅｎ，Ｊ．，Ｃｈａｎ，Ｄ．，Ｈｏ，Ｄ．Ｗ．，Ｓｏｎｇ，Ｙ．Ｑ．，Ｓｈａｍ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｓｐｉｎｅ，３４，９３４−９４０．
Ｃｉｍａ，Ｌ．Ｇ．，Ｉｎｇｂｅｒ，Ｄ．Ｅ．，Ｖａｃａｎｔｉ，Ｊ．Ｐ．，＆Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．（１９９１）．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３８，１４５−１５８．
Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．，Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ａ．Ｍ．，Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｄ．Ｈ．，Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｅ．Ｍ．，＆Ｓｔｒｏｂｅｒ，Ｗ．（Ｅｄｓ．）．（１９９１  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ａｌｌ  ｕｐｄａｔｅｓ  ｕｎｔｉｌ  ｐｒｅｓｅｎｔ）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆Ｓｏｎｓ．
Ｃｒｏｃｋ，Ｈ．Ｖ．，＆Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒ，Ｍ．（１９８４）．Ｓｐｉｎｅ，９，７０２−７０６．
Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈ，Ｓ．Ｐ．，ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｊ．Ｂ．，Ａｕｐｅｒｉｎ，Ｄ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｂ．Ｇ．，Ｃａｓｔｏｒ，Ｍ．，Ｐｅｒｅｚ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，５６，３１７−３２１．
Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，Ａ．Ｊ．（２００９）．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，４８，５−１０．
Ｇｌｏｖｅｒ，Ｍ．，＆Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．（Ｅｄｓ．）．（１９９５  ａｎｄ  １９９６）．ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （Ｖｏｌｓ．１−４）．
Ｇｒｏｎｔｈｏｓ，Ｓ．（２００３）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１１６（Ｐｔ  ９），１８２７−１８３５．
Ｇｒｏｎｔｈｏｓ，Ｓ．，＆Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｐ．Ｊ．（１９９５）．Ｂｌｏｏｄ，８５（４），９２９−９４０．
Ｇｒｕｂｅｒ  ，Ｈ．Ｅ．，Ｉｎｇｒａｍ，Ｊ．Ａ．，Ｄａｖｉｓ，Ｄ．Ｅ．，＆Ｈａｎｌｅｙ，Ｅ．Ｎ．（２００９）．Ｔｈｅ  Ｓｐｉｎｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ：  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｐｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，９，２１０−２１５．
Ｇｒｕｂｅｒ，Ｈ．Ｅ．，Ｈｏｅｌｓｃｈｅｒ，Ｇ．Ｌ．，＆Ｈａｎｌｅｙ，Ｅ．Ｎ．（２０１０）．Ｔｈｅ  Ｓｐｉｎｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ：  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｐｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，１０，７２１−７２７．
Ｇｕｅｒｉｎ，Ｈ．Ｌ．，＆Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｄ．Ｍ．（２００７）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  −  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，２５，５０８−５１６．
Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．，＆Ｌａｎｅ，Ｄ．（１９８８）．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．
Ｈｉｌｔｏｎ，Ｒ．Ｃ．，＆Ｂａｌｌ，Ｊ．（１９８４）．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，４３，３０２−３０７．
Ｈｕｍｚａｈ，Ｍ．Ｄ．，＆Ｓｏａｍｅｓ，Ｒ．Ｗ．（１９８８）．Ｔｈｅ  Ａｎａｔｏｍｉｃａｌ  Ｒｅｃｏｒｄ，２２０，３３７−３５６．
Ｊｏｈａｎｎ，Ｓ．Ｖ．，Ｇｉｂｂｏｎｓ，Ｊ．Ｊ．，＆Ｏ’Ｈａｒａ，Ｂ．（１９９２）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６５，１６３５−１６４０．
Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｗ．Ｅ．，＆Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｓ．（２００７）．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，３５，６８０−６８２．
Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｗ．Ｅ．，Ｃａｔｅｒｓｏｎ，Ｂ．，Ｅｉｓｅｎｓｔｅｉｎ，Ｓ．Ｍ．，Ｈｙｎｄｓ，Ｄ．Ｌ．，Ｓｈｏｗ，Ｄ．Ｍ．，＆Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｓ．（２００２）．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，４６，２６５８−２６６４．
Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ，Ｂ．，Ｈｅｒｉｎｇ，Ｔ．Ｍ．，Ｃａｐｌａｎ，Ａ．Ｉ．，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｖ．Ｍ．，＆Ｙｏｏ，Ｊ．Ｕ．（１９９８）．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３８，２６５−２７２．
Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）．Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，７９３−８０１．
Ｌｅ  Ｍａｉｔｒｅ，Ｃ．Ｌ．，Ｆｒｅｅｍｏｎｔ  ，Ａ．Ｊ．，＆Ｈｏｙｌａｎｄ，Ｊ．Ａ．（２００５）．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，７，Ｒ７３２−７４５．
Ｌｅ  Ｍａｉｔｒｅ，Ｃ．Ｌ．，Ｈｏｙｌａｎｄ，Ｊ．Ａ．，＆Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，Ａ．Ｊ．（２００７）．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，９，Ｒ７７．
Ｌｅ  Ｍａｉｔｒｅ，Ｃ．Ｌ．，Ｈｏｙｌａｎｄ，Ｊ．Ａ．，＆Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，Ａ．Ｊ．（２００７）．Ａｒｔｈｒｉｓｔｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，９，Ｒ８３．
Ｌｅ  Ｍａｉｔｒｅ，Ｃ．Ｌ．，Ｐｏｃｋｅｒｔ，Ａ．，Ｂｕｔｔｌｅ，Ｄ．Ｊ．，Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，Ａ．Ｊ．，＆Ｈｏｙｌａｎｄ，Ｊ．Ａ．（２００７）．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，２００７，６５２−６５５．
Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｓ．，ＭｃＮａｌｌｙ，Ｍ．Ｍ．，Ｏｋａｒｍａ，Ｔ．Ｂ．，＆Ｌｅｒｃｈ，Ｌ．Ｂ．（１９８８）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３９８８−３９９６．
Ｌｏｒｅｔｏ，Ｃ．，Ｍｕｓｕｍｅｃｉ，Ｇ．，Ｃａｓｔｏｒｉｎａ，Ａ．，Ｌｏｒｅｔｏ，Ｃ．，＆Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｇ．（２０１１）．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ａｎａｔｏｍｙ  ＝  Ａｎａｔｏｍｉｓｃｈｅｒ  Ａｎｚｅｉｇｅｒ  ：  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｏｒｇａｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｎａｔｏｍｉｓｃｈｅ  Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，１９３，１５６−１６２．
Ｍａｒｃｈａｎｄ，Ｆ．，＆Ａｈｍｅｄ，Ａ．Ｍ．（１９９０）．Ｓｐｉｎｅ，１５，４０２−４１０．
Ｍａｓｕｄａ，Ｋ．（２００８）．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｐｉｎｅｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ：  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｐｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｐｉｎａｌ  Ｄｅｆｏｒｍｉｔｙ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｒｖｉｃａｌ  Ｓｐｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，１７  Ｓｕｐｐｌ  ４，４４１−４５１．
Ｍｅｌｒｏｓｅ，Ｊ．，Ｇｈｏｓｈ，Ｐ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｔ．，Ｌａｔｈａｍ，Ｊ．，＆Ｍｏｏｒｅ，Ｒ．（１９９７）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｐｉｎａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，１０（１），５６−６７．
Ｍｅｌｒｏｓｅ，Ｊ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｓ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｓ．，Ｍｅｎａｇｅ，Ｊ．，＆Ｇｈｏｓｈ，Ｐ．（２００２）．Ｓｐｉｎｅ，２７，１２７８−１２８５．
Ｍｅｌｒｏｓｅ，Ｊ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｓ．，Ｇｈｏｓｈ，Ｐ．，＆Ｔａｙｌｏｒ，Ｔ．（２００１）．Ｃｅｌｌｓ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  Ｏｒｇａｎｓ，１６８，１３７−１４６．
Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）．Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，７，５−１４．
Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．，＆Ｒｏｓｍａｎ，Ｇ．Ｊ．（１９８９）．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，７，９８０−９９０．
Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．，Ｇａｒｃｉａ，Ｊ．Ｖ．，ｖｏｎ  Ｓｕｈｒ，Ｎ．，Ｌｙｎｃｈ，Ｃ．Ｍ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃ．，＆Ｅｉｄｅｎ，Ｍ．Ｖ．（１９９１）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６５，２２２０−２２２４．
Ｍｕｒａｔａ，Ｙ．，Ｏｎｄａ，Ａ．，Ｒｙｄｅｖｉｋ，Ｂ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｉ．，＆Ｏｌｍａｒｋｅｒ，Ｋ．（２００６）．Ｓｐｉｎｅ，３１，５３０−５３５．
Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８，９７−１２９．
Ｏ’Ｈａｌｌｏｒａｎ，Ｄ．Ｍ．，＆Ｐａｎｄｉｔ，Ａ．Ｓ．（２００７）．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１３，１９２７−１９５４．
Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．Ｖ．（１９８４）．Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｗｉｌｅｙ．
Ｐｕｒｍｅｓｓｕｒ，Ｄ．，Ｗａｌｔｅｒ，Ｂ．Ａ．，Ｒｏｕｇｈｌｅｙ，Ｐ．Ｊ．，Ｌａｕｄｉｅｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｈｅｃｈｔ，Ａ．Ｃ．，＆Ｉａｔｒｉｄｉｓ，Ｊ．Ａ．（２０１３）．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，４３３，１５１−１５６．
Ｒａｊ，Ｐ．Ｐ．（２００８）．Ｐａｉｎ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，８，１８−４４．
Ｒｉｓｂｕｄ，Ｍ．Ｖ．，＆Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｉ．Ｍ．（２０１４）．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，１０，４４−５６．
Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｓ．，Ｅｉｓｅｎｓｔｅｉｎ，Ｓ．Ｍ．，Ｍｅｎａｇｅ，Ｊ．，Ｅｖａｎｓ，Ｅ．Ｈ．，＆Ａｓｈｔｏｎ，Ｉ．Ｋ．（１９９５）．Ｓｐｉｎｅ，２０，２６４５−２６５１．
Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｓ．，Ｅｖａｎｓ，Ｈ．，Ｔｒｉｖｅｄｉ，Ｊ．，＆Ｍｅｎａｇｅ，Ｊ．（２００６）．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇｅｒｙ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｖｏｌｕｍｅ，８８  Ｓｕｐｐｌ  ２，１０−１４．
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，＆Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．Ｒ．（２０１２）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．
Ｓｃａｒｐａ，Ｍ．，Ｃｏｕｒｎｏｙｅｒ，Ｄ．，Ｍｕｎｚｙ，Ｄ．Ｍ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｋ．Ａ．，Ｂｅｌｍｏｎｔ，Ｊ．Ｗ．，＆Ｃａｓｋｅｙ，Ｃ．Ｔ．（１９９１）．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７５，８４９−８５２．
Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｈ．，Ｋｅｔｔｌｅｒ，Ａ．，Ｈｅｕｅｒ，Ｆ．，Ｓｉｍｏｎ，Ｕ．，Ｃｌａｅｓ，Ｌ．，＆Ｗｉｌｋｅ，Ｈ．Ｊ．（２００７）．Ｓｐｉｎｅ，３２，７４８−７５５．
Ｓｅｅ，Ｆ．，Ｓｅｋｉ，Ｔ．，Ｐｓａｌｔｉｓ，Ｐ．Ｊ．，Ｓｏｎｄｅｒｍｅｉｊｅｒ，Ｈ．Ｐ．，Ｇｒｏｎｔｈｏｓ，Ｓ．，Ｚａｎｎｅｔｔｉｎｏ，Ａ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１５，２１１７−２１２９．
Ｓｅｇｕｉｎ，Ｃ．Ａ．，Ｐｉｌｌｉａｒ，Ｒ．Ｍ．，Ｒｏｕｇｈｌｅｙ，Ｐ．Ｊ．，＆Ｋａｎｄｅｌ，Ｒ．Ａ．（２００５）．Ｓｐｉｎｅ，３０，１９４０−１９４８．
Ｓｈａｍｊｉ，Ｍ．Ｆ．，Ｓｅｔｔｏｎ，Ｌ．Ａ．，Ｊａｒｖｉｓ，Ｗ．，Ｓｏ，Ｓ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｊｉｎｇ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，６２，１９７４−１９８２．
Ｓｈｅｌｌｉｎｇ，Ａ．Ｎ．，＆Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｇ．（１９９４）．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，７，１６５−１６９．
Ｓｈｅｎ，Ｂ．，Ｍｅｌｒｏｓｅ，Ｊ．，Ｇｈｏｓｈ，Ｐ．，＆Ｔａｙｌｏｒ，Ｔ．（２００３）．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｐｉｎｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１２，６６−７５．
Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ，Ｍ．Ａ．，＆Ｗｅｉｓｓ，Ｒ．Ａ．（１９９０）．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７６，５８−５９．
Ｕｒｂａｎ，Ｊ．Ｐ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｓ．，＆Ｆａｉｒｂａｎｋ，Ｊ．Ｃ．（２００４）．Ｓｐｉｎｅ，２９，２７００−２７０９．
Ｖａｃａｎｔｉ，Ｃ．Ａ．，Ｌａｎｇｅｒ  ，Ｒ．，Ｓｃｈｌｏｏ，Ｂ．，＆Ｖａｃａｎｔｉ，Ｊ．Ｐ．（１９９１）．Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，８８，７５３−７４９．
Ｖａｃａｎｔｉ，Ｊ．Ｐ．，Ｍｏｒｓｅ，Ｍ．Ａ．，＆Ｓａｌｔｚｍａｎ，Ｗ．Ｍ．（１９８８）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，２３，３−９．
Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｋ．Ａ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｇ．Ｋ．，＆Ｈａｉｇｗｏｏｄ，Ｎ．Ｌ．（１９９０）．Ｖａｃｃｉｎｅ，３５３−３５９．
Ｗａｄｓｔｒｏｍ，Ｊ．，＆Ｔｅｎｇｂｌａｄ，Ａ．（１９９３）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，９８，１５９−１６７．
Ｗａｎｇ，Ｊ．，Ｍａｒｋｏｖａ，Ｄ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｚ．，Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｉ．Ｍ．，＆Ｒｉｓｂｕｄ，Ｍ．Ｖ．（２０１１）．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｏｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８６，３９７３８−３９７４９．
Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｈ．，Ｙａｍａｄａ，Ｙ．，＆Ｋｉｍａｔａ，Ｋ．（１９９８）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１２４，６８７−６９３．
Ｗｅｉｇｅｌ，Ｐ．Ｈ．，Ｆｕｌｌｅｒ，Ｇ．Ｍ．，＆Ｌｅ  Ｂｏｅｕｆ，Ｒ．Ｄ．（１９８６）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１１９，２１９−２３４．
Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃ．，Ｒｅｉｔｚ，Ｍ．Ｓ．，Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．，＆Ｅｉｄｅｎ，Ｍ．Ｖ．（１９８９）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６３，２３７４−２３７８．
Ｚａｎｎｅｔｔｉｎｏ，Ａ．Ｃ．，Ｂｕｈｒｉｎｇ，Ｈ．Ｊ．，Ｎｉｕｔｔａ，Ｓ．，Ｗａｔｔ，Ｓ．Ｍ．，Ｂｅｎｔｏｎ，Ｍ．Ａ．，＆Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｐ．Ｊ．（１９９８）．Ｂｌｏｏｄ，９２（８），２６１３−２６２８．
Ｚｈｏｕ，Ｓ．Ｚ．，Ｃｏｏｐｅｒ，Ｓ．，Ｋａｎｇ，Ｌ．Ｙ．，Ｒｕｇｇｉｅｒｉ，Ｌ．，Ｈｅｉｍｆｅｌｄ，Ｓ．，Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１７９，１８６７−１８７５．
【図１】
0006797833.tif 000012
【図２】
0006797833.tif 000013
【図３】
0006797833.tif 000014
【図４】
0006797833.tif 000015
【図５】
0006797833.tif 000016
【図６】
0006797833.tif 000017
【図７】
0006797833.tif 000018
【図８】
0006797833.tif 000019
【図９】
0006797833.tif 000020
【図１０】
0006797833.tif 000021
【図１１】
0006797833.tif 000022
【図１２】
0006797833.tif 000023
【図１３Ａ】
0006797833.tif 000024
【図１３Ｂ】
0006797833.tif 000025
【図１４】
0006797833.tif 000026