(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
枯草菌変異株であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域（ｙｒｋＳ−ｙｒａＫ）、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域を欠失したゲノムを有し、
ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子及びポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子が発現可能に強化又は導入され、ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築され、且つｋｉｎＡ遺伝子が欠失又は不活性化され、且つａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が欠失又は不活性化されている、枯草菌変異株であって、ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、下記の（ａ）〜（ｂ）、（ｄ）〜（ｆ）からなる群より選択される、枯草菌変異株。
（ａ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に示すヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＡｂｒＢと同様の遷移期及び定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１〜９個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつＡｂｒＢと同様の遷移期及び定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＡｂｒＢと同様の遷移期及び定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子を恒常的に発現するような遺伝子構築が、ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子の転写開始制御領域、又は転写開始制御領域及びリボソーム結合部位、或いは転写開始制御領域から翻訳開始制御領域に至るまでの領域における抑制性制御因子の結合部位を不活性化することである、請求項１記載の枯草菌変異株。
【請求項３】
ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子の転写開始制御領域、又は転写開始制御領域及びリボソーム結合部位、或いは転写開始制御領域から翻訳開始制御領域に至るまでの領域における抑制性制御因子の結合部位が、配列番号９に示される塩基配列において２０〜４９番目の塩基からなる領域又はこれに相当する領域、又は/及び７３〜８９番目の塩基からなる領域又はこれに相当する領域である請求項２載の枯草菌変異株。
【請求項４】
ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するような遺伝子構築が、配列番号９に示される塩基配列において７３〜８９番目の塩基からなる領域又はこれに相当する領域を削除するものである、請求項３記載の枯草菌変異株。
【請求項５】
ｋｉｎＡ遺伝子が、下記の（ｇ）〜（ｈ）、（ｊ）〜（ｌ）からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか１項記載の枯草菌変異株。
（ｇ）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号３に示すヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号４に示すアミノ酸配列において１〜９個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号４に示すアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
ａｌｓＳ遺伝子が、下記の（ｍ）〜（ｎ）、（ｐ）〜（ｒ）からなる群より選択される、請求項１〜５のいずれか１項記載の枯草菌変異株。
（ｍ）配列番号５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号５に示すヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｐ）配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｑ）配列番号６に示すアミノ酸配列において１〜９個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｒ）配列番号６に示すアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
ａｌｓＤ遺伝子が、下記の（ｓ）〜（ｔ）、（ｖ）〜（ｘ）からなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか１項記載の枯草菌変異株。
（ｓ）配列番号７に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｔ）配列番号７に示すヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｖ）配列番号８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｗ）配列番号８に示すアミノ酸配列において１〜９個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｘ）配列番号８に示すアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子が共に欠失又は不活性化されている、請求項１〜７いずれか１項記載の枯草菌変異株。
【請求項９】
ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素をコードする遺伝子が、枯草菌のｐｇｓＢ遺伝子、ｐｇｓＣ遺伝子、ｐｇｓＡ遺伝子及びｐｇｓＥ遺伝子、並びにそれらに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子であり、ポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子が枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子又はそれに相当する遺伝子である請求項８載の組換え枯草菌。
【請求項１０】
ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子及びポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子が、枯草菌のｐｇｓＢ遺伝子、ｐｇｓＣ遺伝子、ｐｇｓＡ遺伝子、ｐｇｓＥ遺伝子及びｐｇｄＳ遺伝子、又はこれらに相当する遺伝子である請求項９記載の組換え枯草菌。
【請求項１１】
組換え枯草菌の製造方法であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域（ｙｒｋＳ−ｙｒａＫ）、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域を欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において、ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子を恒常的に発現するように遺伝子構築する工程、ｋｉｎＡ遺伝子を欠失又は不活性化する工程、ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を欠失又は不活性化する工程、ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子及びポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子を発現可能に強化又は導入する工程を含む、方法であって、ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、下記の（ａ）〜（ｂ）、（ｄ）〜（ｆ）からなる群より選択される、方法。
（ａ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に示すヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＡｂｒＢと同様の遷移期及び定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１〜９個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつＡｂｒＢと同様の遷移期及び定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＡｂｒＢと同様の遷移期及び定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項記載の組換え枯草菌を培養し、培養物からポリ−γ−グルタミン酸を回収する工程を含む、ポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な枯草菌変異株及び利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品類をはじめとし、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等、その種類は多岐に渡っており、またその用途についても食品、医薬品、洗浄剤、化粧品等の日用品、或いは各種化成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている。
【０００３】
ポリ−γ−グルタミン酸（以下、「ＰＧＡ」とも称する）は、グルタミン酸のγ−位のカルボキシル基とα−位のアミノ基がペプチド結合によって結合した高分子化合物であり、納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｖａｒ．ｎａｔｔｏ）を始め、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｖａｒ．ｃｈｕｎｇｋｏｏｋｊａｎｇ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ等の一部のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌や、Ｎａｔｒｉａｌｂａ  ａｅｇｙｐｔｉａｃａ、Ｈｙｄｒａ等が産生する粘性物質として知られている。ＰＧＡは、保水性、親水性、増粘性、生分解性等、種々の性質から有用な高分子素材として近年注目され、その生産性の向上が重要な課題の一つとなっている。
【０００４】
近年、枯草菌については、枯草菌ゲノムに存在する約４１００種類の遺伝子の破壊株が網羅的に研究され、２７１個の遺伝子が生育に必須であることが明らかにされたことにより（非特許文献１）、生育に不必要な遺伝子を欠失させた種々の変異株が創出されている。また、ゲノムの大領域あるいは遺伝子を欠失させた変異株の網羅的解析により、各種酵素の生産性に優れた変異株が見出されている。この研究で得られた枯草菌変異株の１つであるＭＧＢ８７４株は、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｍａｒｂｕｒｇ  Ｎｏ．１６８（枯草菌１６８株）に由来し、そのゲノムの合計８７４ｋｂが削除された変異株であるが、野生株である１６８株に比較して、タンパク質の分泌生産性が有意に向上することが報告されている（特許文献１）。そして、最近では、当該ゲノムの大領域を欠失させて得られた枯草菌株を用いて、上記のＰＧＡを効率よく製造する方法が報告されている（特許文献２）。
【０００５】
一方、枯草菌ＡｂｒＢは、対数増殖期から定常期へと移行する間の遷移期及び定常期において、胞子形成やコンピテンス、或いは栄養源獲得などに関与する様々な遺伝子発現の制御に重要な役割を果たす転写因子であり（非特許文献２及び３）、例えば、ＡｂｒＢ制御下の遺伝子として死滅因子（ｋｉｌｌｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）をコードするｓｋｆ遺伝子を含むｓｋｆオペロン（ｓｋｆＡ−Ｈ）などが負に制御されることが報告されている（非特許文献４）。また、ａｂｒＢ遺伝子を欠失させた枯草菌株では、アミラーゼやプロテアーゼの生産性が向上することが報告されている（特許文献３）。
しかしながら、ＡｂｒＢを恒常的に発現させた枯草菌変異株については全く報告されていない。
【０００６】
他方、枯草菌ＫｉｎＡは細胞質内に存在し、胞子形成初期に関与する多成分制御系のヒスチジンキナーゼで、自身のリン酸化を経て、リン酸基をＳｐｏ０Ｆに転移し、Ｓｐｏ０Ｆ〜Ｐを生じるとされている。ＫｉｎＡ変異株では胞子形成能が野生型に比較して１〜３０％に減少するとされている（非特許文献５）。また、ＫｉｎＡ変異株ではアルカリセルラーゼ分泌生産性が向上することが認められている（特許文献４）。
また、枯草菌ＡｌｓＳ及びＡｌｓＤは、それぞれアセト乳酸シンターゼ及びアセト乳酸デカルボキシラーゼであり、共にアセトイン合成に関わる酵素群として知られている。
しかしながら、ＫｉｎＡやＡｌｓＳ及びＡｌｓＤが、枯草菌におけるＰＧＡの生産に如何なる影響を及ぼすかを検討した報告は全く知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−１３００１３号公報
【特許文献２】特開２０１３−２５２１１５号公報
【特許文献３】特開２００７−７４９３４号公報
【特許文献４】特開２００６−２９６２６８号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】K. Kobayashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100, 4678-4683, 2003
【非特許文献２】M. A. Strauch, et al., Mol. Microbiol., 1993, 7:337-342
【非特許文献３】Z. E. V. Phillips, et al., Cell Mol. Life Sci., 2002, 59:392-402
【非特許文献４】M. Fujita, et al., J. Bacteriol., 2005, 187:1357-1368
【非特許文献５】日本細菌学雑誌、1996,51：789-801
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ＰＧＡを高生産することができる枯草菌変異株及びこれを用いたＰＧＡの生産技術を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、ＰＧＡを効率良く生産することができる微生物株の開発を進めた。その結果、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｍａｒｂｕｒｇ  Ｎｏ．１６８（枯草菌１６８株）に由来し、１６８株のゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株において、遷移期及び定常期に特異的に発現する遺伝子群を抑制する枯草菌転写因子であるＡｂｒＢを恒常的に発現させると共と、ｋｉｎＡ遺伝子及びアセトイン合成遺伝子群の欠失又は不活化を併せて行った枯草菌変異株が優れたＰＧＡ生産能を有し、これを用いることによりＰＧＡを効率良く製造できることを見出した。
【００１１】
すなわち本発明は、以下の（１）〜（５）に係るものである。
（１）枯草菌変異株であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ、又はｙｒｋＳ-ｙｒａＫ）、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有し、
ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築され、且つｋｉｎＡ遺伝子が欠失又は不活性化され、且つａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が欠失又は不活性化されている、枯草菌変異株。
（２）（１）の枯草菌変異株において、ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子、又はポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子及びポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子が発現可能に強化又は導入された組換え枯草菌。
（３）枯草菌変異株の製造方法であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ、又はｙｒｋＳ-ｙｒａＫ）、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において、ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子を恒常的に発現するように遺伝子構築する工程、ｋｉｎＡ遺伝子を欠失又は不活性化する工程、及びａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を欠失又は不活性化する工程を含む、方法。
（４）組換え枯草菌の製造方法であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ、又はｙｒｋＳ-ｙｒａＫ）、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において、ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子を恒常的に発現するように遺伝子構築する工程、ｋｉｎＡ遺伝子を欠失又は不活性化する工程、ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を欠失又は不活性化する工程、及びポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子、又はポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子及びポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子を発現可能に強化又は導入する工程を含む、方法。
（５）（２）の組換え枯草菌を培養し、培養物からポリ−γ−グルタミン酸を回収する工程を含む、ポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、高いＰＧＡ生産能を有する枯草菌変異株が提供される。本発明の枯草菌変異株を用いることによりＰＧＡの効率的生産が実現できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】枯草菌のゲノム上から所定の領域を欠失させる方法の一例を示す模式図。
【図２】枯草菌ゲノムから外来薬剤耐性遺伝子を除去する手順を示す模式図。
【図３】ｍａｚＦ遺伝子融合カセットを使用したマーカーフリー欠失法の手順を示す模式図。
【図４】βガラクトシダーゼ活性測定の図。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書に記載の枯草菌の各遺伝子及びゲノム領域の名称は、ＪＡＦＡＮ：Ｊａｐａｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＢＳＯＲＦ  ＤＢ）でインターネット公開（[bacillus.genome.ad.jp/]、２００６年１月１８日更新）された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載されている。
【００１５】
本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列の同一性はＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｌｉｐｍａｎ，ＤＪ．，Ｐｅａｒｓｏｎ．ＷＲ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５−１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ  Ｖｅｒ．１１（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【００１６】
本明細書において、別途定義されない限り、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列におけるアミノ酸又はヌクレオチドの欠失、置換、付加又は挿入に関して使用される「１又は数個」とは、例えば、アミノ酸配列では１〜１８個、好ましくは１〜９個、より好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜２個であり、ヌクレオチド配列では１〜５６個、好ましくは１〜２８個、より好ましくは１〜１４個、さらに好ましくは１〜７個であり得る。また本明細書において、アミノ酸又はヌクレオチドの「付加」には、配列の一末端及び両末端への１又は数個のアミノ酸又はヌクレオチドの付加が含まれる。
【００１７】
本明細書において、別途定義されない限り、ハイブリダイゼーションに関する「ストリンジェントな条件」とは、配列同一性が約８０％以上、好ましくは約９０％以上のヌクレオチド配列を有する遺伝子の確認を可能にする条件である。「ストリンジェントな条件」としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ＴＨＩＲＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｄａｖｉｄ  Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）記載の条件が挙げられる。ハイブリダイゼーションの当業者は、プローブのヌクレオチド配列や濃度、長さ等に応じて、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、温度等を調節することにより、ストリンジェントな条件を適切に作り出すことができる。一例を示せば、上記「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション条件としては、５×ＳＳＣ、７０℃以上が好ましく、５×ＳＳＣ、８５℃以上がより好ましく、又は、６×ＳＳＣ、６０℃以上が好ましく、６×ＳＳＣ、６５℃以上がより好ましく、洗浄条件としては、１×ＳＳＣ、６０℃以上が好ましく、１×ＳＳＣ、７３℃以上がより好ましい。上記ＳＳＣ及び温度条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素を適宜組み合わせることにより、適切なストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００１８】
本明細書において、遺伝子又は領域の上流及び下流とは、それぞれ、対象として捉えている遺伝子又は領域の５’側及び３’側に続く領域を示す。別途定義されない限り、遺伝子の上流及び下流とは、遺伝子の翻訳開始点又は転写開始点からの上流領域及び終始コドンからの下流領域には限定されない。
【００１９】
本明細書において、遺伝子の制御領域とは、下流の遺伝子の細胞内における発現を制御する機能を有し、好ましくは、下流遺伝子を構成的に発現又は高発現させる機能を有する領域である。具体的には、当該遺伝子におけるコーディング領域の上流に存在し、ＲＮＡポリメラーゼが相互作用して当該遺伝子の転写を制御する機能を有する領域と定義され得る。好ましくは、本明細書における遺伝子の制御領域とは、当該遺伝子におけるコーディング領域の上流２００〜６００ヌクレオチド程度の領域をいう。制御領域は、遺伝子の転写開始制御領域及び／又は翻訳開始制御領域、或いは転写開始制御領域から翻訳開始制御領域に至るまでの領域を含む。転写開始制御領域はプロモーター及び転写開始点を含む領域であり、翻訳開始制御領域は開始コドンと共にリボソーム結合部位を形成するＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列に相当する部位である（Ｓｈｉｎｅ，Ｊ．，Ｄａｌｇａｒｎｏ，Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１９７４，７１：１３４２−１３４６）。
【００２０】
本明細書において、目的遺伝子と制御領域とを「作動可能に連結する」とは、制御領域による遺伝子発現を制御する機能が目的遺伝子に作用するように、ＤＮＡ上で制御領域と目的遺伝子とを配置することをいう。目的遺伝子と制御領域を作動可能に連結する方法としては、当該制御領域の下流に当該目的遺伝子を連結する方法が挙げられる。
また、本明細書において、目的遺伝子であるＰＧＡ合成に関わる遺伝子若しくはＰＧＡ分解に関わる遺伝子を導入した枯草菌変異株を組換え枯草菌といい、目的遺伝子は導入されていないが、目的遺伝子の発現能が優れた宿主として改良された枯草菌を枯草菌変異株という。
【００２１】
本明細書において、「転写因子」（「転写制御因子」）とは、ＤＮＡ上の転写開始制御領域などに結合し、ＤＮＡからＲＮＡへの転写過程を促進或いは抑制するタンパク質を意味する。
また、本明細書において、「遷移期」とは細菌の増殖において、対数増殖期又は指数増殖期から定常期又は静止期へと移行する間を意味する。
【００２２】
[１．枯草菌変異株の構築]
本発明の枯草菌変異株は、枯草菌野生株のゲノム上の大領域が欠失したゲノムを有し、ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築されており、且つｋｉｎＡ遺伝子が欠失又は不活性化され、且つａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が欠失又は不活性化されている、枯草菌変異株である。
本発明の枯草菌変異株は、該ゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株に対して、ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子を恒常的に発現させる遺伝子改変と、ｋｉｎＡ遺伝子を欠失又は不活性化させる改変と、更にａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を欠失又は不活性化させる改変を加えることによって作製することができる。
【００２３】
[１−１．ゲノム領域欠失枯草菌変異株]
本発明の枯草菌変異株の親株となる、ゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株は、枯草菌野生株（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｍａｒｂｕｒｇ  Ｎｏ．１６８；本明細書において以下、枯草菌１６８株又は単に１６８株、あるいは野生株と称する）のゲノムと比べて、そのゲノム中の大領域が欠失したゲノムを有する。すなわち、当該枯草菌変異株のゲノムにおいては、枯草菌野生株のゲノム中の、ｐｒｏｐｈａｇｅ６（ｙｏａＶ−ｙｏｂＯ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１（ｙｂｂＵ−ｙｂｄＥ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４（ｙｊｃＭ−ｙｊｄＪ）領域、ＰＢＳＸ（ｙｋｄＡ−ｘｌｙＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５（ｙｎｘＢ−ｄｕｔ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３（ｙｄｉＭ−ｙｄｊＣ）領域、ｓｐｂ（ｙｏｄＵ−ｙｐｑＰ）領域、ｐｋｓ（ｐｋｓＡ−ｙｍａＣ）領域、ｓｋｉｎ（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｓｐｏＩＩＩＣ）領域、ｐｐｓ（ｐｐｓＥ−ｐｐｓＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２（ｙｄｃＬ−ｙｄｅＪ）領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ、又はｙｒｋＳ-ｙｒａＫ）領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される領域の１以上が欠失している。
ここで示す「領域が欠失」とは、上記記載の遺伝子を両端として挟み込まれる領域を、両端の遺伝子を含めて欠失していることである。
【００２４】
好ましくは、当該枯草菌変異株は、枯草菌野生株のゲノム中の、ｐｒｏｐｈａｇｅ６（ｙｏａＶ−ｙｏｂＯ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１（ｙｂｂＵ−ｙｂｄＥ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４（ｙｊｃＭ−ｙｊｄＪ）領域、ＰＢＳＸ（ｙｋｄＡ−ｘｌｙＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５（ｙｎｘＢ−ｄｕｔ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３（ｙｄｉＭ−ｙｄｊＣ）領域、ｓｐｂ（ｙｏｄＵ−ｙｐｑＰ）領域、ｐｋｓ（ｐｋｓＡ−ｙｍａＣ）領域、ｓｋｉｎ（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｓｐｏＩＩＩＣ）領域、ｐｐｓ（ｐｐｓＥ−ｐｐｓＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２（ｙｄｃＬ−ｙｄｅＪ）領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７（ｙｒｋＳ−ｙｒａＫ）領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される領域の全てを欠失している枯草菌ＭＧＢ８７４株（特開２００７−１３００１３号公報）や、枯草菌野生株のゲノム中の、ｐｒｏｐｈａｇｅ６（ｙｏａＶ−ｙｏｂＯ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１（ｙｂｂＵ−ｙｂｄＥ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４（ｙｊｃＭ−ｙｊｄＪ）領域、ＰＢＳＸ（ｙｋｄＡ−ｘｌｙＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５（ｙｎｘＢ−ｄｕｔ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３（ｙｄｉＭ−ｙｄｊＣ）領域、ｓｐｂ（ｙｏｄＵ−ｙｐｑＰ）領域、ｐｋｓ（ｐｋｓＡ−ｙｍａＣ）領域、ｓｋｉｎ（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｓｐｏＩＩＩＣ）領域、ｐｐｓ（ｐｐｓＥ−ｐｐｓＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２（ｙｄｃＬ−ｙｄｅＪ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ）領域からなる群より選択される領域の全てを欠失しているＯＡ１０５株が挙げられる。
【００２５】
ＯＡ１０５株は、特開２００７−１３００１３号公報に記載されているｐｒｏｐｈａｇｅ６（ｙｏａＶ−ｙｏｂＯ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１（ｙｂｂＵ−ｙｂｄＥ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４（ｙｊｃＭ−ｙｊｄＪ）領域、ＰＢＳＸ（ｙｋｄＡ−ｘｌｙＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５（ｙｎｘＢ−ｄｕｔ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３（ｙｄｉＭ−ｙｄｊＣ）領域、ｓｐｂ（ｙｏｄＵ−ｙｐｑＰ）領域、ｐｋｓ（ｐｋｓＡ−ｙｍａＣ）領域、ｓｋｉｎ（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｓｐｏＩＩＩＣ）領域、ｐｐｓ（ｐｐｓＥ−ｐｐｓＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２（ｙｄｃＬ−ｙｄｅＪ）領域を欠失した株（ＭＧＢ４６９株）に対して、ｐｒｏｐｈａｇｅ７（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ）領域をさらに欠失することにより、調製される。
なお、本明細書記載のＭＧＢ８７４株の欠失領域であるｓｋｉｎ（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｓｐｏＩＩＩＣ）領域及びｐｒｏｐｈａｇｅ７（ｙｒｋＳ−ｙｒａＫ）領域は、隣接した領域であり、特開２００７−１３００１３号公報に記載されているＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｙｒａＫ）領域と同じ領域である。
ＭＧＢ４６９株及びＭＧＢ８７４株は国立遺伝学研究所ＮＢＲＰ（ナショナルバイオリソースプロジェクト）より分譲可能となっている（http://www.shigen.nig.ac.jp/bsub/kaoListAction.do）。
【００２６】
上記ゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株は、例えば、１６８株等の任意の枯草菌株から上述のゲノム領域を欠失させることによって作製することができる。欠失させるべき目的のゲノム領域は、例えば、当該任意の枯草菌株のゲノムを、公開されている枯草菌１６８株のゲノムと対比することにより決定することができる。枯草菌１６８株の全ヌクレオチド配列及びゲノムの情報は、上述のＢＳＯＲＦ  ＤＢ、又はＧｅｎＢａｎｋ：ＡＬ００９１２６．２（[www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/38680335]）から入手することができる。当業者は、これらの情報源から得た枯草菌１６８株のゲノム情報に基づいて、欠失させるべき目的のゲノム領域を決定することができる。ここで、欠失させるべきゲノム領域は、公開されている枯草菌１６８株における上述のゲノム領域のヌクレオチド配列に対して、１又は数個（例えば、１〜１００個、好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜３０個、さらに好ましくは１〜１０個、さらにより好ましくは１〜５個）のヌクレオチドにおける天然又は人工的に引き起こされた欠失、置換、挿入、付加等の変異を含むヌクレオチド配列を有するゲノム領域であり得る。あるいは、欠失させるべきゲノム領域は、公開されている枯草菌１６８株における上述のゲノム領域に対して、ヌクレオチド配列において好ましくは８０％以上同一、さらにより好ましくは９０％以上同一、なお好ましくは９５％以上同一なゲノム領域であり得る。
【００２７】
あるいは、上記欠失させるべきゲノム領域は、表１に示す一対のオリゴヌクレオチドセットにより挟み込まれる領域として表すことができる。表１に記載の領域を枯草菌ゲノム上から欠失させる方法としては、特に限定されないが、例えばＳＯＥ−ＰＣＲ法（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲ：Ｇｅｎｅ，１９８９，７７：６１−６８）等により調製された欠失用ＤＮＡ断片を用いた２重交差法が挙げられる。当該方法により枯草菌野生株から所定のゲノム領域が欠失した変異株を作製する手順は、特開２００７−１３００１３号公報に詳述されているが、以下に概要を説明する。
【００２８】
【表１】
0006660718.tif 000002
【００２９】
ＳＯＥ−ＰＣＲ法による欠失用ＤＮＡ断片の調製と当該欠失用ＤＮＡ断片を用いた２重交差法による目的領域の欠失の手順の概要を図１に示す。初めに、ＳＯＥ−ＰＣＲ法により、欠失させるべき目的領域の上流に隣接する約０．１〜３ｋｂ領域に対応する断片（上流断片と称する）と、同じく下流に隣接する約０．１〜３ｋｂ領域に対応する断片（下流断片と称する）とを連結したＤＮＡ断片を調製する。好ましくは、目的領域の欠失を確認するために、当該上流断片と下流断片の間に薬剤耐性遺伝子などのマーカー遺伝子断片をさらに連結したＤＮＡ断片を調製する。
【００３０】
まず、１回目のＰＣＲによって、欠失させるべき領域の上流断片Ａ及び下流断片Ｂ、並びに必要に応じてマーカー遺伝子断片（図１中では、クロラムフェニコール耐性遺伝子断片Ｃｍ）の３断片を調製する。上流断片及び下流断片のＰＣＲ増幅の際には、後に連結される断片の末端１０〜３０ヌクレオチドの配列を付加したプライマーを使用する。例えば、上流断片Ａ、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍ、及び下流断片Ｂをこの順で連結させる場合、上流断片Ａの下流末端に結合するプライマーの５'末端に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍの上流側１０〜３０ヌクレオチドに相当する配列を付加し（図１、プライマーＤＲ１）、また下流断片Ｂの上流末端に結合するプライマーの５'末端に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍの下流側１０〜３０ヌクレオチドに相当する配列を付加する（図１、プライマーＤＦ２）。このように設計したプライマーセットを用いて上流断片Ａ及び下流断片ＢをＰＣＲで増幅した場合、増幅された上流断片Ａ'の下流側には薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍの上流側に相当する領域が付加されることとなり、増幅された下流断片Ｂ'の上流側には薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍの下流側に相当する領域が付加されることとなる。
【００３１】
次に、１回目のＰＣＲで調製した上流断片Ａ'、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍ、及び下流断片Ｂ'を混合して鋳型とし、上流断片の上流側に結合するプライマー（図１、プライマーＤＦ１）及び下流断片の下流側に結合するプライマー（図１、プライマーＤＲ２）からなる１対のプライマーを用いて２回目のＰＣＲを行う。この２回目のＰＣＲにより、上流断片Ａ、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍ、及び下流断片Ｂをこの順で結合した欠失用ＤＮＡ断片Ｄを増幅することができる。
【００３２】
上述の方法などによって得られる欠失用ＤＮＡ断片を、通常の制限酵素とＤＮＡリガーゼを用いてプラスミドに挿入し、欠失導入用プラスミドを構築する。あるいは、上流断片及び下流断片を直接連結した欠失用ＤＮＡ断片を調製した後、当該欠失用ＤＮＡ断片を薬剤耐性マーカー遺伝子を含むプラスミドに挿入することで、上流断片及び下流断片に加えて薬剤耐性マーカー遺伝子断片を有する欠失導入用プラスミドを構築することができる。
【００３３】
上記手順で構築された欠失導入用プラスミドを、コンピテントセル形質転換法等の通常の手法により、ゲノム領域を欠失させたい枯草菌に導入する。プラスミドの導入により、当該プラスミド上の上流断片及び下流断片と、枯草菌ゲノムのそれらに相同な領域との間で２重交差の相同組換えが生じ、欠失させるべき領域が薬剤耐性マーカー遺伝子に置き換えられた形質転換体が得られる（図１）。形質転換体の選択は、欠失用ＤＮＡ断片中に存在する薬剤耐性遺伝子などのマーカー遺伝子の発現を指標に行えばよい。例えば、クロラムフェニコール耐性遺伝子断片で形質転換処理をした菌を、抗生物質（クロラムフェニコール等）を含む培地で培養し、生育したコロニーを回収することで、目的の領域が欠失しクロラムフェニコール耐性遺伝子に置き換えられた形質転換体を取得することができる。さらに、形質転換体のゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲを行うことで、目的の領域が欠失されていることを確認することができる。
【００３４】
次に、得られた形質転換体から、ゲノムＤＮＡに挿入された上記マーカー遺伝子を除去する。除去の手順としては、特に限定されないが、図２に示すような２段階相同組換え法を用いることができる（特開平２００９−２５４３５０号公報）。当該方法では、初めに第１相同組換えのためのＤＮＡ断片（供与体ＤＮＡ）を調製する。調製の方法としては、特に限定されないが、上述したＳＯＥ−ＰＣＲ法等が挙げられる。供与体ＤＮＡとしては、例えば、除去すべきマーカー遺伝子領域（すなわち、欠失された領域）の上流に隣接する領域に対応する約０．１〜３ｋｂ断片（上流断片）及び同じく下流に隣接する領域に対応する約０．１〜３ｋｂ断片（下流断片）が結合した断片と、当該除去すべきマーカー遺伝子下流領域の断片とが連結したＤＮＡ断片を用いることができる。好適には、当該下流断片と除去すべき第１のマーカー遺伝子下流領域断片との間に、相同組換えの指標となる第２のマーカー遺伝子等が挿入されたＤＮＡ断片が用いられる（図２を参照）。
【００３５】
次いで、調製された供与体ＤＮＡをコンピテントセル形質転換法等の通常の手法によって上記形質転換体に導入し、当該形質転換体ゲノム上の当該上流断片及び第１のマーカー遺伝子下流領域に相当する領域との間に相同組換えを起こさせる（第１相同組換え）。所望の相同組換えが生じた形質転換体は、供与体ＤＮＡ中に挿入した第２のマーカー遺伝子の発現を指標に選択することができる。第１相同組換えが適切に生じた形質転換体のゲノムＤＮＡでは、上流断片、下流断片、必要に応じて第２のマーカー遺伝子、第１のマーカー遺伝子下流領域、及び下流断片が順番に配置している（図２参照）。このような配置を有するゲノムＤＮＡにおいては、上記２つの下流断片同士の間で自然誘発的に相同組換えが起こり得る（ゲノム内相同組換え）。このゲノム内相同組換えによって、当該２つの下流断片の間に位置していた領域が欠失することにより、第１のマーカー遺伝子が形質転換体ゲノムから除去される。
【００３６】
ゲノム内相同組換えを起こした形質転換体を選択する手段としては、第１のマーカー遺伝子が薬剤耐性遺伝子の場合は、薬剤耐性を持たない菌を選択する方法が挙げられる。ペニシリン系抗生物質は、増殖細胞に対して殺菌的に作用するが非増殖細胞には作用しない。したがって、薬剤とペニシリン系抗生物質の存在下で菌を培養すれば、薬剤存在下で増殖しない薬剤非耐性菌を選択的に濃縮することができる（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｓ，１９７０）。別の手段としては、致死遺伝子を導入する方法が挙げられる。例えば、上記第２のマーカーとしてｃｈｐＡ（ｍａｚＦ）遺伝子等の致死遺伝子を菌に導入すれば、ゲノム内相同組換えが起こらなかった菌は当該致死遺伝子の作用で死滅するので、ゲノム内相同組換えを起こした形質転換体を選択することができる。選択された菌株からゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲを行うことで、目的の領域が欠失されていることを確認することができる（特開２００９-２５４３５０号公報を参照）。
【００３７】
以上のようにして、ゲノム上の所定の領域を欠失した枯草菌変異株を作製することができる。さらに、当該手順を繰り返すことにより、上述のゲノム領域が一部又は全て欠失した枯草菌変異株を作製することができる。
【００３８】
[１−２．ａｂｒＢ遺伝子の恒常的発現]
本発明の枯草菌変異株においては、ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築されている。
枯草菌において、ａｂｒＢ遺伝子は転写因子ＡｂｒＢをコードする遺伝子であり、対数増殖期に発現し、定常期へと移行する間の遷移期、および定常期において抑制される。本転写因子ＡｂｒＢは対数増殖期において、胞子形成やコンピテンス、或いは栄養源獲得等に関する多数の遺伝子を直接的あるいは間接的に発現抑制する。遷移期および定常期においては、ＡｂｒＢによる発現抑制が解除され、上述の多数の遺伝子が発現誘導される。
枯草菌ａｂｒＢ遺伝子は、遺伝子番号：ＢＧ１０２０４として特定され、配列番号１に示すヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質ＡｂｒＢをコードする。
【００３９】
ａｂｒＢ遺伝子に相当する遺伝子としては、枯草菌以外のバチルス属に属する微生物のａｂｒＢ遺伝子が挙げられる。枯草菌以外の微生物としては、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ等のバチルス属微生物などが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ａｂｒＢに相当する遺伝子は、上記の微生物からゲノムＤＮＡを抽出し、配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドやそのフラグメントをプローブとし、ストリンジェントな条件下にてサザンハイブリダイゼーションを行うことによって同定することができる。また例えば、公知のゲノム配列情報に基づいて上記微生物のゲノムのヌクレオチド配列と、配列番号１で示されるヌクレオチド配列とを比較することによって、上記微生物におけるａｂｒＢに相当する遺伝子を同定することができる。
【００４０】
例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＤＳＭ７株のａｂｒＢ遺伝子（配列番号１０、１１）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＡＴＣＣ１４５８０株のａｂｒＢ遺伝子（配列番号１２、１３）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  ＤＭＳ３１９株のａｂｒＢ遺伝子（配列番号１４、１５）は、枯草菌１６８株のａｂｒＢ遺伝子との配列同一性が、ヌクレオチド配列において、それぞれ９１％、８８％、８０％であり、またそれらのコードするアミノ酸配列において、それぞれ９８％、９４％、８５％である。これらは、ａｂｒＢ遺伝子に相当する遺伝子として例示される。
【００４１】
したがって、ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子としては、以下が挙げられる：
（ａ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に示すヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＡｂｒＢと同様の、遷移期及び定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＡｂｒＢと同様の、遷移期及び定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつＡｂｒＢと同様の遷移期及び定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＡｂｒＢと同様の、遷移期及び定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００４２】
本発明において、ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子を恒常的に発現するように遺伝子構築するとは、微生物が生存している間、ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が常に発現するように遺伝子構築すること、すなわち当該遺伝子が通常では発現しない対数増殖期以降の定常期においても発現するように遺伝子構築することを意味する。ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するような遺伝子構築としては、例えば、ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子の上流に位置する転写開始制御領域、又は転写開始制御領域及びリボソーム結合部位、或いは転写開始制御領域から翻訳開始制御領域に至るまでの領域における抑制性制御因子の結合部位を不活性化することが挙げられる。ここで、「抑制性制御因子」とは、遺伝子上の転写の制御に関わる特定の塩基配列に結合し、転写を抑制的に制御するタンパク質を意味する。ａｂｒＢ遺伝子の転写開始制御領域、又は転写開始制御領域及びリボソーム結合部位、或いは転写開始制御領域から翻訳開始制御領域に至るまでの領域の一例としては、配列番号９に示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該配列と相同な塩基配列からなり転写開始制御領域又は転写開始制御領域及びリボソーム結合部位、或いは転写開始制御領域から翻訳開始制御領域に至るまでの領域としての機能を有するＤＮＡが挙げられる。配列番号９に示される塩基配列と相同な塩基配列としては、例えば、配列番号９に示される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列、又は配列番号９に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡからなる塩基配列が挙げられる。
【００４３】
上記制御領域において、抑制性制御因子の結合部位としては、例えば、配列番号９に示される塩基配列において、２０〜４９番目の塩基からなる領域又はこれに相当する領域、７３〜８９番目の塩基からなる領域又はこれに相当する領域が挙げられる。
ここで、配列番号９に示される塩基配列において２０〜４９番目の塩基からなる領域又は７３〜８９番目の塩基からなる領域に相当する領域としては、上述した配列番号９に示される塩基配列からなるＤＮＡと相同な塩基配列からなり転写開始制御領域又は転写開始制御領域及びリボソーム結合部位、或いは転写開始制御領域から翻訳開始制御領域に至るまでの領域としての機能を有するＤＮＡにおいて、配列番号９に示される塩基配列と比較した場合に当該領域に相当する領域であって、抑制性制御因子の結合部位として機能するものが挙げられる。
上記部位を不活性化する手段としては、該部位のヌクレオチド配列上の１つ以上のヌクレオチドに対する突然変異導入、又は該ヌクレオチド配列に対する別のヌクレオチド配列の置換若しくは挿入、あるいは該部位の配列の一部若しくは全部の削除などが挙げられる。ここで、一部とは、１〜４０個、好ましくは５〜３０個、又は１０〜１７個の塩基からなる部分配列が挙げられる。このうち、好ましくは、配列番号９に示される塩基配列において、２０〜４９番目の塩基からなる領域又はこれに相当する領域、又は/及び７３〜８９番目の塩基からなる領域又はこれに相当する領域を全て削除することが挙げられ、より好ましくは７３〜８９番目の塩基からなる領域又はこれに相当する領域を全て削除することである。
上記突然変異導入や、ヌクレオチド配列の置換若しくは挿入のための具体的な手法としては、紫外線照射、部位特異的変異導入、及び上記[１−１．ゲノム領域欠失枯草菌変異株]にて説明したＳＯＥ−ＰＣＲ法や相同組換え法、などを挙げることができる。
【００４４】
また、ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子を恒常的に発現するような遺伝子構築の他の手段としては、ゲノム上のａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子に、定常期において該遺伝子の発現を強化できる制御領域（強発現制御領域）を作動可能に連結すること、強発現制御領域と作動可能に連結されたａｂｒＢ遺伝子又それに相当する遺伝子を細胞内のゲノム中若しくはプラスミド中に導入することが挙げられる。斯かる強発現制御領域としては、例えば、枯草菌ｒｐｌＫ遺伝子、ｆｕｓ遺伝子若しくはａｔｐＩ遺伝子又はこれらの遺伝子に相当する遺伝子の上流に位置する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位が挙げられる。
【００４５】
[１−３．ｋｉｎＡ遺伝子の欠失又は不活性化]
本発明の枯草菌変異株においては、ｋｉｎＡ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が欠失又は不活性化されている。ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するよう遺伝子構築がなされた枯草菌変異株において、ｋｉｎＡ遺伝子又はそれに相当する遺伝子の欠失又は不活性化により、培地中での溶菌現象を抑制することが見出された。
ｋｉｎＡ遺伝子は、遺伝子番号：ＢＧ１０２０４（配列番号３）として特定され、斯かる遺伝子がコードするタンパク質は、胞子形成初期に関わる多成分制御系のセンサーヒスチジンキナーゼ（ｔｗｏ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｓｅｎｓｏｒ  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ）であるとされている。
【００４６】
ｋｉｎＡ遺伝子としては、以下が挙げられる。
（ｇ）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号３に示すヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のセンサーヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号４に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００４７】
[１−４．ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子の欠失又は不活性化]
本発明の枯草菌変異株においては、ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が欠失又は不活性化されている。
ここで、ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子は、アセトイン合成に関わる枯草菌遺伝子である。ａｌｓＳ遺伝子とａｌｓＤ遺伝子は、アセトイン合成遺伝子群（ａｌｓＳＤ）として１つのオペロンを形成している。本発明においては、ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子が共に欠失又は不活性化されるのが好ましい。
【００４８】
ａｌｓＳ遺伝子とａｌｓＤ遺伝子のＢＳＯＲＦ  ＤＢにおける登録番号及びコードするタンパク質を以下の表２に示す。
【００４９】
【表２】
0006660718.tif 000003
【００５０】
ａｌｓＳ遺伝子としては、以下が挙げられる。
（ｍ）配列番号５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号５に示すヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｏ）配列番号５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｐ）配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｑ）配列番号６に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｒ）配列番号６に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００５１】
また、ａｌｓＤ遺伝子としては、以下が挙げられる。
（ｓ）配列番号７に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｔ）配列番号７に示すヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｕ）配列番号７に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｖ）配列番号８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｗ）配列番号８に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｘ）配列番号８に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００５２】
上記遺伝子を欠失又は不活性化させる手段としては、該遺伝子のヌクレオチド配列上の１つ以上のヌクレオチドに対する突然変異導入、又は該ヌクレオチド配列に対する別のヌクレオチド配列の置換若しくは挿入、あるいは該遺伝子の配列の一部若しくは全部の削除などが挙げられる。上記遺伝子の転写を阻害する変異を導入する手段としては、該遺伝子のプロモーター領域に対する突然変異導入や、別のヌクレオチド配列での置換若しくは挿入による、当該プロモーターの不活性化が挙げられる。上記突然変異導入や、ヌクレオチド配列の置換若しくは挿入のための具体的な手法としては、紫外線照射、部位特異的変異導入、及び上記[１−１．ゲノム領域欠失枯草菌変異株]にて説明したＳＯＥ−ＰＣＲ法や相同組換え法、などを挙げることができる。欠失又は不活性化させる遺伝子の枯草菌ゲノム上での位置やヌクレオチド配列は、上述したＢＳＯＲＦ  ＤＢにて確認することができる。
【００５３】
[２．組換え枯草菌の構築]
本発明の組換え枯草菌は、上述したａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築され、且つｋｉｎＡ遺伝子が欠失又は不活性化され、且つａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が欠失又は不活性化され、さらに目的とするＰＧＡ合成酵素遺伝子、又はＰＧＡ合成酵素遺伝子及びＰＧＡ分解酵素遺伝子（以下、「目的遺伝子」という）が発現可能なように強化又は導入されたものであるのが好ましい。
【００５４】
[２−１．ＰＧＡ合成酵素遺伝子]
ＰＧＡ合成酵素遺伝子としては、例えば、枯草菌遺伝子ｐｇｓＢ（配列番号１６）、ｐｇｓＣ（配列番号１８）、ｐｇｓＡ（配列番号２０）及びｐｇｓＥ（配列番号２２）、ならびにそれらに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が挙げられ、好ましくは、少なくとも枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子とを含む組み合わせであり、より好ましくは、枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子との組み合わせ、あるいは枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子と、枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はその相当遺伝子と、枯草菌ｐｇｓＥ遺伝子又はその相当遺伝子との組み合わせである。
【００５５】
枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子としては、以下が挙げられる：
（ａ）配列番号１６に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１６に示すヌクレオチド配列と少なくとも６２％、例えば、６２％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１６に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１７に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１７に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号１７に示すアミノ酸配列と少なくとも５５％、例えば、５５％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００５６】
枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はそれに相当する遺伝子としては、以下が挙げられる：
（ａ'）配列番号１８に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ'）配列番号１８に示すヌクレオチド配列と少なくとも５９％、例えば、５９％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ'）配列番号１８に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ'）配列番号１９に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ'）配列番号１９に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ'）配列番号１９に示すアミノ酸配列と少なくとも５１％、例えば、５１％以上、好ましくは５５％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００５７】
枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はそれに相当する遺伝子としては、以下が挙げられる：
（ａ''）配列番号２０に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ''）配列番号２０に示すヌクレオチド配列と少なくとも４８％、例えば、４８％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ''）配列番号２０に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ''）配列番号２１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ''）配列番号２１に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ''）配列番号２１に示すアミノ酸配列と少なくとも３０％、例えば、３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００５８】
枯草菌ｐｇｓＥ遺伝子又はそれに相当する遺伝子としては、以下が挙げられる：
（ａ'''）配列番号２２に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ'''）配列番号２２に示すヌクレオチド配列と少なくとも５１％、例えば、５１％以上、好ましくは５５％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ'''）配列番号２２に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ'''）配列番号２３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ'''）配列番号２３に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ'''）配列番号２３に示すアミノ酸配列と少なくとも３５％、例えば、３５％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００５９】
上記において、タンパク質の「アミドリガーゼ活性」は、グルタミン酸、及びＡＴＰ又はＧＴＰを基質とし、これに塩化マンガンを加えた反応溶液中におけるＰＧＡの生成を検出することにより測定することができる（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２００２，１８４：３３７−３４３）。また、上述の枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子がコードするタンパク質の「アミドリガーゼ活性」とは、当該ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子を、上記ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子とともに枯草菌又はその変異株に導入した際に、当該株におけるＰＧＡの生産と菌体外への分泌をもたらす能力であり得る。
所定の微生物におけるＰＧＡ生産能の評価は、例えば、グルタミン酸又はその塩を含有するＰＧＡ生産寒天培地に培養したときにコロニー周辺に形成される半透明の粘性物質を目視によって観察する方法；ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってＰＧＡを検出する方法（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９６，６０：２５５−２５８）；酸加水分解後にアミノ酸分析装置を用いて定量する方法（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９７，６１：１６８４−１６８７）；培養液から精製し乾燥重量を求める定量法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９９，２６３：６−１２）；ゲルろ過カラムを用いたＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）による定量／定性法（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９３，５７：１２１２−１２１３）等によって行うことができる。
【００６０】
また、枯草菌ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ、ｐｇｓＡ、及びｐｇｓＥの各遺伝子に相当する遺伝子としては、枯草菌以外のバチルス属又は他の属に属する微生物のＰＧＡ合成に関与する遺伝子が挙げられる。枯草菌以外の微生物としては、ＰＧＡ生産性微生物であってもＰＧＡ非生産性微生物であってもよく、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ等のバチルス属微生物、及びＮａｔｒｉａｌｂａ  ａｅｇｙｐｔｉａｃａ、Ｈｙｄｒａ、Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｈｅｙｅｎｓｉｓなどが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、枯草菌ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ、ｐｇｓＡ又はｐｇｓＥに相当する遺伝子は、上記の微生物からゲノムＤＮＡを抽出し、配列番号１６、１８、２０又は２２で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドやそのフラグメントをプローブとしたサザンハイブリダイゼーションを行うことによって同定することができる。また例えば、公知のゲノム配列情報に基づいて上記微生物のゲノムのヌクレオチド配列と、配列番号１６、１８、２０又は２２で示されるヌクレオチド配列とを比較することによって、上記微生物における枯草菌ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ、ｐｇｓＡ又はｐｇｓＥに相当する遺伝子を同定することができる。
【００６１】
例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＫＳＭ−３６６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２６２）のｐｇｓＢ遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＡＴＣＣ１４５８０株のｐｇｓＢ遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＦＺＢ４２株のｙｗｓＣ遺伝子、及びＯｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ  ＨＴＥ８３１株のＯＢ０２０１遺伝子は、枯草菌１６８株のｐｇｓＢ遺伝子との同一性が、ヌクレオチド配列において、それぞれ９９．９％、７８％、８１％及び６２％であり、またそれらのコードするアミノ酸配列において、それぞれ９９．７％、８９％、９３％及び５５％である。これらは、枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子に相当する遺伝子として例示され、具体的に枯草菌によるＰＧＡ生産において利用できることが示されている（特開２０１０−２１３６６４号公報）。
【００６２】
また例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＫＳＭ−３６６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２６２）のｐｇｓＣ遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＡＴＣＣ１４５８０株のｐｇｓＣ遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＦＺＢ４２株のｙｗｔＡ遺伝子、及びＯｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ  ＨＴＥ８３１株のＯＢ０２０２遺伝子は、枯草菌１６８株のｐｇｓＣ遺伝子との同一性が、ヌクレオチド配列において、それぞれ１００％、７８％、８３％及び５９％であり、またそれらのコードするアミノ酸配列において、それぞれ１００％、８９％、９３％及び５１％である。これらは、枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子に相当する遺伝子として例示され、具体的に枯草菌によるＰＧＡ生産において利用できることが示されている（特開２０１０−２１３６６４号公報）。
【００６３】
また例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＫＳＭ−３６６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２６２）のｐｇｓＡ遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＡＴＣＣ１４５８０株のｐｇｓＡ遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＦＺＢ４２株のｙｗｔＢ遺伝子、及びＯｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ  ＨＴＥ８３１株のＯＢ２９１７遺伝子は、枯草菌１６８株のｐｇｓＡ遺伝子との同一性が、ヌクレオチド配列においてそれぞれ１００％、６８％、７５％及び４８％であり、またそれらのコードするアミノ酸配列においてそれぞれ１００％、６７％、７８％及び３０％である。これらは、枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子に相当する遺伝子として例示される（特開２０１０−２１３６６４号公報）。
【００６４】
また例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＡＴＣＣ１４５８０株のｐｇｓＥ遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＦＺＢ４２株のｐｇｓＥ遺伝子、及びＢａｃｉｌｌｓｕ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ  Ｈ９４０１株のｃａｐＥ遺伝子は、枯草菌１６８株のｐｇｓＥ遺伝子との同一性が、ヌクレオチド配列においてそれぞれ６３％、７６％及び５１％であり、またそれらのコードするアミノ酸配列においてそれぞれ４７％、７２％及び３５％である。これらは、枯草菌ｐｇｓＥ遺伝子に相当する遺伝子として例示される。
【００６５】
枯草菌遺伝子ｐｇｓＢＣＡＥに相当するバチルス属又は他の属に属する微生物の遺伝子の具体的な例としては、下記表３に示す遺伝子が挙げられる。
【００６６】
【表３】
0006660718.tif 000004
【００６７】
好ましい実施形態において、本発明の枯草菌変異株において発現可能に強化又は導入されるＰＧＡ合成酵素遺伝子は、上記（ａ）〜（ｆ）、（ａ'）〜（ｆ'）、（ａ''）〜（ｆ''）及び（ａ'''）〜（ｆ'''）で表した遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つであり、好ましくは、少なくとも上記（ａ）〜（ｆ）で表した遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つと、上記（ａ'）〜（ｆ'）で表した遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つとの組み合わせを含む。また好ましくは、発現可能に強化又は導入される遺伝子は、上記（ａ）、（ａ'）、（ａ''）及び（ａ'''）で表した遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つであり、より好ましくは、少なくとも上記（ａ）で表した遺伝子と、（ａ'）で表した遺伝子との組み合わせを含む。さらに好ましくは、発現可能に強化又は導入される遺伝子は、上記（ａ）及び（ａ'）で表した遺伝子の組み合わせであるか、又は上記（ａ）、（ａ'）、（ａ''）及び（ａ'''）で表した遺伝子の組み合わせである。
【００６８】
別の好ましい実施形態において、本発明の枯草菌変異株において発現可能に強化又は導入されるＰＧＡ合成酵素遺伝子としては、例えば、配列番号１６、１８、２０、２２並びに２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８及び６０のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも１つが挙げられ、好ましくは、少なくとも配列番号１６、２６、３２、４０、４８及び５４のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも１つと、配列番号１８、２８、３４、４２、５０及び５６のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも１つとの組み合わせを含む。より好ましくは、発現可能に強化又は導入される遺伝子は、配列番号１６、２６、３２、４０、４８及び５４のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも１つと、配列番号１８、２８、３４、４２、５０及び５６のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも１つと、配列番号２０、３０、３６、４４、５２及び５８のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも１つと、配列番号２２、３８、４６及び６０のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも１つとの組み合わせである。
【００６９】
[２−２．ＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子]
ＰＧＡ合成酵素遺伝子が発現可能に強化又は導入された組換え枯草菌においては、さらにＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子が発現可能に強化又は導入されるのが好ましい。微生物がＰＧＡを高生産すると培地の粘度が高まり、その結果、微生物の生存やＰＧＡの生産性に悪影響が及ぶ場合がある。例えば、枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が発現可能に強化又は導入されることで、低分子化されたＰＧＡが生産され、培養液の粘度を抑制することにより、ＰＧＡの高生産に伴う上記課題を解決することができる。
したがって、ＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子としては、枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子（配列番号２４）又はそれに相当する遺伝子が挙げられる。
【００７０】
枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子に相当する遺伝子としては、枯草菌以外のバチルス属又は他の属に属する微生物のＰＧＡ分解に関与する遺伝子が挙げられる。枯草菌以外の微生物の枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子に相当する遺伝子は、ｐｇｓＢＣＡＥ遺伝子に関して上述したのと同様の手順で、配列番号２４で示されるヌクレオチド配列をもとに探索又は同定することができる。枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子に相当するバチルス属微生物遺伝子の具体的な例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＡＴＣＣ１４５８０株のｐｇｄＳ遺伝子（配列番号６２）及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＦＺＢ４２株のｐｇｄＳ遺伝子（配列番号６４）が挙げられる。
【００７１】
枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子又はそれに相当する遺伝子としては、以下が挙げられる：
（ｇ）配列番号２４に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号２４に示すヌクレオチド配列と少なくとも６２％、例えば、６２％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＰＧＡ分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号２４に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＰＧＡ分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号２５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号２５に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつＰＧＡ分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号２５に示すアミノ酸配列と少なくとも５７％、例えば、５７％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつＰＧＡ分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００７２】
好ましい実施形態において、本発明の組換え枯草菌において発現可能なように強化又は導入されるＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子は、上記（ｇ）〜（ｌ）で表した遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つであり、好ましくは、上記（ｇ）で表した遺伝子である。
【００７３】
別の好ましい実施形態において、枯草菌ＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子は、配列番号２４、６２及び６４のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも１つである。
【００７４】
[２−３．ＰＧＡの生産に関わる遺伝子の発現可能な強化又は導入]
【００７５】
ＰＧＡの生産に関わる遺伝子（目的遺伝子）を発現可能なように強化又は導入するとは、本発明の枯草菌変異株において、目的遺伝子が少なくとも発現可能な状態に置かれることを意味し、当該遺伝子が本発明の枯草菌変異株中に発現しているか否かは問われない。
斯かる目的遺伝子の発現可能な強化又は導入は、親株のゲノム上の目的遺伝子（例えば、ｐｇｓＢＣＡＥ遺伝子）の制御領域配列を強制御領域に置換すること、あるいは、強制御領域と作動可能に連結された目的遺伝子を含む断片を、親株のゲノム中若しくはプラスミド中に導入することによって成すことができる。またあるいは、親株中に複数の目的遺伝子を発現可能に存在させる改変により成すこともできる。
目的遺伝子を発現可能なように強化又は導入するための手順の一例を以下に記載する。
【００７６】
（１）目的遺伝子が制御領域と作動可能に連結され、さらに親株ゲノムとの相同領域と結合されたＤＮＡ断片を構築する。例えば、上流から、制御領域（例えば、ｒｒｎＯオペロン制御領域）、目的遺伝子（例えば、ｐｇｓＢＣＡＥ遺伝子）の順で配置した断片を作製し、さらにその断片に親株ゲノムの一部との相同領域を結合してＤＮＡ断片を調製する。次いで、このＤＮＡ断片を親株に導入すれば、親株ゲノム中に当該ＤＮＡ断片が挿入されて、親株を形質転換することができる。得られた形質転換体は、形質転換前の株と比べて目的遺伝子の発現量が増加する。
【００７７】
（２）制御領域と作動可能に連結された目的遺伝子を含むベクターを構築する。例えば、上流から、制御領域（例えば、ＫＳＭ−Ｓ２３７のセルラーゼ遺伝子の制御領域）、目的遺伝子（例えば、ｐｇｓＢＣ遺伝子）の順で配置したＤＮＡを含むベクターを調製する。次いで、このベクターを親株に導入すれば、親株を形質転換することができる。得られた形質転換体は、形質転換前の株と比べて目的遺伝子の発現量が増加する。
【００７８】
ここで、目的遺伝子の発現に使用され得る制御領域は、好ましくは、宿主内において下流の目的遺伝子の発現を高める機能を有し、より好ましくは、下流の目的遺伝子を構成的に発現又は高発現させる機能を有する制御領域である。また好ましくは、目的遺伝子の野生型の制御領域と比較して、目的遺伝子の発現を強化することができる制御領域（強制御領域）である。
【００７９】
ＰＧＡ合成酵素遺伝子、ＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子の発現に使用され得る制御領域の例としては、バチルス属細菌由来のα−アミラーゼ遺伝子の制御領域、プロテアーゼ遺伝子の制御領域、ｒｒｎＯオペロン制御領域、ｔｕｆＡ遺伝子制御領域、ａｐｒＥ遺伝子の制御領域、ｓｐｏＶＧ遺伝子の制御領域、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＫＳＭ−Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子の制御領域、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ由来のカナマイシン耐性遺伝子の制御領域、クロラムフェニコール耐性遺伝子の制御領域等（いずれも、特開２００９−０８９７０８号公報を参照）が挙げられる。
【００８０】
好ましくは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＫＳＭ−Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子の制御領域であるセルラーゼ遺伝子の翻訳開始点の上流０．４〜１．０ｋｂ領域（配列番号６６）、及び当該領域とヌクレオチド配列において８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有し、かつ当該領域と同等の遺伝子発現制御機能を有する塩基配列、ｒｒｎＯオペロンの１６ＳｒＲＮＡの上流０．２〜1.０ｋｂ領域（配列番号１６６）、及び当該領域とヌクレオチド配列において８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有し、かつ当該領域と同等の遺伝子発現制御機能を有する塩基配列、ｔｕｆＡ遺伝子の翻訳開始点の上流から１ｋｂの領域（配列番号１６７）、及び当該領域とヌクレオチド配列において８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有し、かつ当該領域と同等の遺伝子発現制御機能を有する塩基配列が挙げられる。
【００８１】
より好ましくは、ＰＧＡ合成酵素遺伝子（例えば、ｐｇｓＢＣ遺伝子又はその相当遺伝子）に対しては上記ＫＳＭ−Ｓ２３７セルラーゼ遺伝子の制御領域が、枯草菌ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子群全て（例えば、ｐｇｓＢＣＡＥ遺伝子又はその相当遺伝子群）に対してはｒｒｎＯオペロン制御領域が、枯草菌ポリ−γ−グルタミン酸分解酵素をコードする遺伝子又はその相当遺伝子に対してはｔｕｆＡ遺伝子制御領域が使用される。
【００８２】
目的遺伝子又は制御領域の親株への導入に使用されるベクターは、プラスミド等の形質転換に一般的に使用されるベクターであればよい。ベクターの種類は、適宜選択することができるが、親株内で自己複製可能なベクター（例えばプラスミド）であることが好ましく、多コピーのベクターであることがより好ましい。さらに、そのプラスミドのコピー数が親株のゲノム（染色体）に対し、２以上１００コピー以下であれば良く、好ましくは２以上５０コピー以下、より好ましくは２以上３０コピー以下であれば良い。好ましいプラスミドの例としては、例えば、ｐＴ１８１、ｐＣ１９４、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＳＮ２、ｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられる。
【００８３】
目的遺伝子又は制御領域のベクターへの挿入は、当該分野における通常の方法に従って行うことができる。例えば、目的遺伝子及び制御領域の断片をＰＣＲ等によって増幅し、これらの断片を制限酵素法等によってプラスミド等のベクターに挿入し、連結すればよい。あるいは、目的遺伝子及び制御領域の断片を予め連結した断片を作製し、これをプラスミド等のベクターに挿入してもよい。その際、ベクター上において、上流から制御領域断片、目的遺伝子の断片の順で連結されているようにする。
【００８４】
ＰＧＡ合成酵素遺伝子がｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子とｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子との組み合わせの場合は、親株に導入するＤＮＡ断片やベクター上において、上流から制御領域断片、ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子の断片、次いでｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子の断片の順で連結されているようにするとよい。
【００８５】
親株へのＤＮＡ断片又はベクターの導入は、例えばプロトプラスト法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９７９，１６８：１１１−１１５）やコンピテントセル法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９６３，８６：３９２−４００、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９６０，８１：７４１−７４６）などの通常の手法に従って行うことができる。
【００８６】
以上の手順で、本発明の組換え枯草菌を作製することができるが、当該組換え枯草菌は、最終的に得られた微生物において、上述したゲノムの大領域の欠失、ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するような遺伝子構築、ｋｉｎＡ遺伝子の欠失又は不活性化、及びａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の欠失又は不活性化が達成されていればよく、それぞれの遺伝子改変・導入工程の順序は特に限定されない。例えば、上述したゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株に対して、上述した手順で所定の遺伝子を改変し、次いで上述した手順で所定の遺伝子を欠失又は不活性化して製造されてもよく、あるいは、上述したゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株に対して、上述した手順で所定の遺伝子を欠失又は不活性化し、次いで上述した手順で所定の遺伝子を改変して製造されてもよい。好ましくは、ゲノムの大領域が欠失したゲノム欠失株に対して、ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築され、且つｋｉｎＡ遺伝子が欠失又は不活性化された枯草菌変異株を親株とし、これにａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を欠失又は不活性化することにより製造できる。
【００８７】
[３．ＰＧＡの製造]
斯くして得られた本発明の組換え枯草菌は、親株となるゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株に対し、ＰＧＡ合成酵素遺伝子の発現を強化した組換え枯草菌と比べて、遥かに高いＰＧＡ生産能を有している。
よって、本発明の組換え枯草菌を培養することによって、当該菌外に効率よくＰＧＡを生産することが可能になる。
本発明のＰＧＡの製造方法においては、先ず、適切な培地において上記本発明の組換え枯草菌を培養し、菌体外に生産されたＰＧＡを培地から回収する。培地としては、グリセロール、グルコース、フルクトース、マルトース、キシロース、アラビノース、各種有機酸等の炭素源、各種アミノ酸、ポリペプトン、トリプトン、硫酸アンモニウムや尿素等の窒素源、ナトリウム塩等の無機塩類及びその他必要な栄養源、微量金属塩等を含有する組成の培地を使用できる。当該培地は、合成培地であっても天然培地であってもよい。
【００８８】
ＰＧＡの製造においては、必ずしも培地にグルタミン酸を添加する必要はないが、ＰＧＡの生産性をより向上させるために、本発明の組換え枯草菌が生育に最低限必要とするグルタミン酸量よりも過剰量のグルタミン酸が添加された培地で、当該組換え枯草菌を培養することができる。グルタミン酸は、培地中へはグルタミン酸ナトリウムとして添加することが好ましいが、その濃度（グルタミン酸換算）は、例えば培地中、好ましくは０．００５〜６００ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０５〜５００ｇ／Ｌ、より好ましくは０．１〜４００ｇ／Ｌ、より好ましくは０．５〜３００ｇ／Ｌであり得る。培地中のグルタミン酸濃度は、ＰＧＡの生産性向上の点から、０．００５ｇ／Ｌ以上であることが好ましく、他方、グルタミン酸ナトリウムの飽和溶解度を超えることによる培地中のグルタミン酸ナトリウムやその他の培地成分の析出を回避する点から、グルタミン酸濃度６００ｇ／Ｌ以下であることが好ましい。
【００８９】
この場合の、培養条件として、至適温度は、好ましくは１０〜４０℃であり、より好ましくは３０〜４０℃である。至適ｐＨは、好ましくはｐＨ４〜８であり、より好ましくは５〜８である。また、培養日数は、菌接種後、好ましくは１〜１０日間であり、より好ましくは１〜５日間である。
培地中に蓄積されたＰＧＡを回収する際には、ＰＧＡを生産させた菌体と分離する必要がある。ＰＧＡを分離する手段としては、遠心分離、限外濾過膜、電気透析法、ｐＨをＰＧＡの等電点付近に維持することで沈殿として回収する方法、さらに上記手法の組み合わせ等が挙げられる。
【００９０】
本発明の例示的実施形態として、さらに以下を本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
＜１＞枯草菌変異株であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ、又はｙｒｋＳ-ｙｒａＫ）、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有し、
ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築され、且つｋｉｎＡ遺伝子が欠失又は不活性化され、且つａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が欠失又は不活性化されている、枯草菌変異株。
＜２＞ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域（ｙｒｋＳ−ｙｒａＫ）、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域を欠失したゲノムを有する、＜１＞の枯草菌変異株。
＜３＞ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子を恒常的が恒常的に発現するような遺伝子構築が、ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子の転写開始制御領域、又は転写開始制御領域及びリボソーム結合部位における抑制性制御因子の結合部位を不活性化することによりなされる、＜１＞又は＜２＞の枯草菌変異株。
＜４＞ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子の転写開始制御領域、又は転写開始制御領域及びリボソーム結合部位、或いは転写開始制御領域から翻訳開始制御領域に至るまでの領域における抑制性制御因子の結合部位が、配列番号９に示される塩基配列において２０〜４９番目の塩基からなる領域又はこれに相当する領域、又は７３〜８９番目の塩基からなる領域又はこれに相当する領域である＜３＞の枯草菌変異株。
＜５＞配列番号９に示される塩基配列において７３〜８９番目の塩基からなる領域又はこれに相当する領域を削除するものである、＜４＞の枯草菌変異株。
＜６＞枯草菌のａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、下記の（ａ）〜（ｆ）からなる群より選択される、＜１＞〜＜５＞のいずれかの枯草菌変異株。
（ａ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に示すヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＡｂｒＢと同様の遷移期及び定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＡｂｒＢと同様の遷移期及び定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつＡｂｒＢと同様の遷移期及び定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＡｂｒＢと同様の遷移期及び定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
＜７＞ｋｉｎＡ遺伝子が、下記の（ｇ）〜（ｌ）からなる群より選択される、＜１＞〜＜６＞のいずれかの枯草菌変異株。
（ｇ）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号３に示すヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のセンサーヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号４に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
＜８＞ａｌｓＳ遺伝子が、下記の（ｍ）〜（ｒ）からなる群より選択される、＜１＞〜＜７＞のいずれかの枯草菌変異株。
（ｍ）配列番号５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号５に示すヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｏ）配列番号５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｐ）配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｑ）配列番号６に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｒ）配列番号６に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
＜９＞ａｌｓＤ遺伝子が、下記の（ｓ）〜（ｘ）からなる群より選択される、＜１＞〜＜８＞のいずれかの枯草菌変異株。
（ｓ）配列番号７に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｔ）配列番号７に示すヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｕ）配列番号７に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｖ）配列番号８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｗ）配列番号８に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｘ）配列番号８に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
＜１０＞ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子が共に欠失又は不活性化されている＜１＞〜＜９＞のいずれかの枯草菌変異株。
＜１１＞＜１＞〜＜１０＞のいずれかの枯草菌変異株において、ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子、又はポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子及びポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子が発現可能に強化又は導入された組換え枯草菌。
＜１２＞ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素をコードする遺伝子が、枯草菌のｐｇｓＢ遺伝子、ｐｇｓＣ遺伝子、ｐｇｓＡ遺伝子及びｐｇｓＥ遺伝子、並びにそれらに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子であり、ポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子が枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子又はそれに相当する遺伝子である＜１１＞の組換え枯草菌。
＜１３＞ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子及びポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子が、枯草菌のｐｇｓＢ遺伝子、ｐｇｓＣ遺伝子、ｐｇｓＡ遺伝子、ｐｇｓＥ遺伝子及びｐｇｄＳ遺伝子、又はこれらに相当する遺伝子である＜１２＞の組換え枯草菌。
＜１４＞枯草菌変異株の製造方法であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ、又はｙｒｋＳ-ｙｒａＫ）、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において、ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子を恒常的に発現するように遺伝子構築する工程、ｋｉｎＡ遺伝子欠失又は不活性化する工程、及びａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を欠失又は不活性化する工程を含む、方法。
＜１５＞組換え枯草菌の製造方法であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ、又はｙｒｋＳ-ｙｒａＫ）、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において、ａｂｒＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子を恒常的に発現するように遺伝子構築する工程、ｋｉｎＡ遺伝子を欠失又は不活性化する工程、ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を欠失又は不活性化する工程、及びポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子、又はポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子及びポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子が発現可能に強化又は導入する工程を含む、方法。
＜１６＞＜１１＞〜＜１３＞のいずれかの組換え枯草菌を培養し、培養物からポリ−γ−グルタミン酸を回収する工程を含む、ポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。
【００９１】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００９２】
実施例１  菌株の構築
（１−１）トリプトファン要求性解除株の作製
枯草菌野生株ゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株（ＭＧＢ８７４株；特開２００７−１３００１３号公報）におけるトリプトファン要求性を解除した。枯草菌変異株ＭＧＢ８７４株の元株である枯草菌１６８株は、遺伝子型としてｔｒｐＣ２を所持している。つまり１６８株はトリプトファン合成に関与するインドール−３−グリセロールリン酸シンターゼをコードするｔｒｐＣ遺伝子変異のためトリプトファン合成要求性である。また、枯草菌ＡＴＣＣ６０５１Ｔ株はトリプトファン非要求性であることが知られている（Ａｌｂｅｒｔｉｎｉ，Ａ．Ｍ．＆Ｇａｌｉｚｚｉ，Ａ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９，１４５（Ｐｔ１２）：３３１９−３３２０）。枯草菌１６８株とＡＴＣＣ６０５１Ｔ株のｔｒｐＣ遺伝子を比較したところ、３２８番目から３３０番目のヌクレオチドＡＴＴが枯草菌１６８株では存在しないことがわかった。そこで、ＡＴＣＣ６０５１Ｔ株ゲノムを鋳型とし、表４記載のｔｒｐＣ＿Ｆ１及びｔｒｐＣ＿Ｒ１のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を構築した。このＰＣＲ産物を用いて枯草菌変異株ＭＧＢ８７４株をコンピテント法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９６０，８１：７４１−７４６）で形質転換し、トリプトファン非添加のＳＭＡ寒天培地（０．２％硫酸アンモニウム、１．４％リン酸水素２カリウム、０．６％リン酸２水素カリウム、０．１％クエン酸３ナトリウム-２水和物、０．５％グルコース、０．０３５％硫酸マグネシウム７水和物、１．５％寒天）に生育したコロニーを形質転換体として分離した。こうしてトリプトファン非要求性の枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株を得た。
【００９３】
【表４】
0006660718.tif 000005
【００９４】
（１−２）ａｂｒＢ遺伝子恒常発現変異が導入された枯草菌変異株（１６８＿ａｂｒＢ＊株）の構築
ａｂｒＢ遺伝子恒常発現変異の導入を行った。枯草菌野生株１６８株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表５記載のプライマーＤｓｐｏ０Ａｂｏｘ−ＦＦ及びＤｓｐｏ０Ａｂｏｘ−ＦＲを用いて、ａｂｒＢ遺伝子上流領域断片（Ａ）をＰＣＲにより増幅した。また、表５記載のプライマーＤｓｐｏ０Ａｂｏｘ−ＰＦ及びＤｓｐｏ０Ａｂｏｘ−ＰＲを用いて、ａｂｒＢ遺伝子上流領域断片（Ｂ）をＰＣＲにより増幅した。また、表５記載のプライマーＤｓｐｏ０Ａｂｏｘ−ＢＦ及びＤｓｐｏ０Ａｂｏｘ−ＢＲを用いて、ａｂｒＢ遺伝子上流域・中流領域断片（Ｃ）をＰＣＲにより増幅した。次いで、クロラムフェニコール耐性遺伝子保有のプラスミドｐＤＬＴ３（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，１４８：３５３９−３５５２）を鋳型とし、表５記載のプライマーｒＰＣＲ−ＣｍＦ２及びｒＰＣＲ−ＣｍＲ２を用いて、ＰＣＲ増幅を行い、クロラムフェニコール耐性遺伝子の断片（Ｄ）をＰＣＲ増幅した。
【００９５】
次に、得られた断片（Ａ）及び断片（Ｄ）を表５記載のプライマーＤｓｐｏ０Ａｂｏｘ−ＦＦ及びｒＰＣＲ−ＣｍＲ２を用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させ、断片（Ｂ）及び断片（Ｃ）を表５記載のプライマーＤｓｐｏ０Ａｂｏｘ−ＰＦ及びＤｓｐｏ０Ａｂｏｘ−ＢＲを用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させた。最後に、断片（Ａ＋Ｄ）及び断片（Ｂ＋Ｃ）を表５記載のプライマーＤｓｐｏ０Ａｂｏｘ−ＦＦ及びＤｓｐｏ０Ａｂｏｘ−ＢＲを用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させ、最終ＰＣＲ産物（Ａ＋Ｄ＋Ｂ＋Ｃ）を得た。得られた最終ＰＣＲ産物を用いて枯草菌野生株１６８株で形質転換し、枯草菌変異株１６８＿ａｂｒＢ＊＿Ｃｍ株を得た。
【００９６】
次に、薬剤耐性遺伝子置換用プラスミドｐＣｍ：：Ｅｍ（Ｌｅｉ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２０１３，１９５：１６９７−１７０５）を用いて枯草菌変異株１６８＿ａｂｒＢ＊＿Ｃｍ株で形質転換し、クロラムフェニコール耐性遺伝子がエリスロマイシン耐性遺伝子に置換された枯草菌変異株１６８＿ａｂｒＢ＊を構築した。
【００９７】
得られた枯草菌変異株１６８＿ａｂｒＢ＊株のゲノムを用いたＰＣＲ及びそれに続くサンガー法によるシークエンシングによって、ゲノム上の所定の位置に目的変異が導入されていることを確認した。
【００９８】
（１−３）ｋｉｎＡ遺伝子が欠失した枯草菌変異株（１６８＿ΔｋｉｎＡ株）の構築
ｋｉｎＡ遺伝子の欠失変異導入を行った。枯草菌野生株１６８株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表５記載のプライマーｋｉｎＡ−ｕＦ１及びｋｉｎＡ−ｕＲ１を用いて、ｋｉｎＡ遺伝子上流領域の断片（Ａ）をＰＣＲにより増幅した。また、表５記載のプライマーｋｉｎＡ−ｄＦ１及びｋｉｎＡ−ｄＲ１を用いて、ｋｉｎＡ遺伝子下流領域の断片（Ｂ）をＰＣＲにより増幅した。次いで、カナマイシン耐性遺伝子保有のプラスミドｐＡＰＮＣＫ（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００７，７：６９）を鋳型とし、表５記載のプライマーｒＰＣＲ−ＫｍＦ及びｒＰＣＲ−ＫｍＲを用いて、ＰＣＲ増幅を行い、カナマイシン耐性遺伝子の断片（Ｃ）をＰＣＲ増幅した。
【００９９】
次に、断片（Ａ）、断片（Ｃ）及び断片（Ｂ）をこの順になるように表５記載のプライマーｋｉｎＡ−ｕＦ１及びｋｉｎＡ−ｄＲ１を用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させ、最終ＰＣＲ産物（Ａ＋Ｃ＋Ｂ）を得た。得られた最終ＰＣＲ産物を用いて枯草菌野生株１６８株で形質転換し、枯草菌変異株１６８＿ΔｋｉｎＡ株を得た。
【０１００】
得られた枯草菌変異株１６８＿ΔｋｉｎＡ株のゲノムを用いたＰＣＲ及びそれに続くサンガー法によるシークエンシングによって、ゲノム上の所定の位置に目的遺伝子が欠失していることを確認した。
【０１０１】
（１−４）ａｂｒＢ遺伝子恒常発現変異の導入及びｋｉｎＡ遺伝子が欠失した枯草菌変異株（１６８＿ａｂｒＢ＊ΔｋｉｎＡ株）の構築
枯草菌変異株１６８＿ａｂｒＢ＊株のゲノムＤＮＡを用いてコンピテント法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９６０，８１：７４１−７４６）により枯草菌変異株１６８＿ΔｋｉｎＡ株の形質転換を行い、エリスロマイシンを含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを枯草菌変異株１６８＿ａｂｒＢ＊ΔｋｉｎＡ株として構築した。
【０１０２】
得られた枯草菌変のゲノムを用いたＰＣＲ法を用いて、ゲノム上の所定の位置に目的変異が導入されていること、及び欠失されていることを確認した。 
【０１０３】
【表５】
0006660718.tif 000006
【０１０４】
（１−５）ＰＧＡ合成酵素遺伝子群及びＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子の発現が強化された枯草菌変異株（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ株）の構築
始めに、枯草菌が本来ゲノム上に有するＰＧＡ合成酵素遺伝子群（ｐｇｓＢＣＡＥ）及びＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子の欠失変異導入を行った。本変異株の作製は、ＩＰＴＧ制御領域と遊離のｍＲＮＡ切断リボヌクレアーゼであるｍａｚＦ遺伝子を融合したカセットを使用するマーカーフリーの欠失法にて構築した（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｓｔｒａｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐｐ３４５−３５８．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）。
【０１０５】
実施例（１−１）にて構築した枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、断片（Ａ）増幅には表６記載のプライマーｐｇｓ−ＤＦ１及びｐｇｓ−ＤＲ１を、断片（Ｂ）増幅には表６記載のプライマーｐｇｓ−ＤＦ２及びｐｇｓ−ＤＲ２を、断片（Ｃ）増幅には表６記載のプライマーｐｇｓ−ＩＦ及びｐｇｓ−ＩＲを、それぞれ使用した。さらに、枯草菌変異株ＴＯＭ３１０（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｓｔｒａｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐｐ３４５−３５８．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）を鋳型とし、表６記載のプライマーｐＡＰＮＣ−Ｆ及びｃｈｐＡ−Ｒを用いて、スペクチノマイシン耐性遺伝子を含むｍａｚＦカセット断片（Ｄ）をＰＣＲにより増幅した。次に、得られた断片（Ａ）、断片（Ｂ）、断片（Ｄ）及び断片（Ｃ）をこの順となる様に表６記載のプライマーｐｇｓ−ＤＦ１及びｐｇｓ−ＩＲを用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させ、最終ＤＮＡ断片を得た。構築した最終ＰＣＲ産物を枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株で形質転換した。得られた形質転換体（枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔｐｇｓＢＣＡＥΔｐｇｄＳ株）のゲノムを用いたＰＣＲ及びそれに続くサンガー法によるシークエンシングによって、ゲノム上の変異導入を行った各遺伝子について欠失が生じていることを確認した。本実施例でのｍａｚＦ遺伝子カセットを使用するマーカーフリーの欠失法にて構築したＰＧＡ合成酵素遺伝子群（ｐｇｓＢＣＡＥ）及びＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子欠失方法を図３に示した。
【０１０６】
次いで、ＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子の導入を行った。枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表６記載のプライマーｔｕｆＡ−１ｆ及びｔｕｆＡ−１ｒを用いて、ｔｕｆＡ遺伝子下流領域の断片（Ａ）をＰＣＲにより増幅した。また、表５記載のプライマーｔｕｆＡ−２ｆ及びｔｕｆＡ−２ｒを用いて、ｔｕｆＡ遺伝子下流領域の断片（Ｂ）をＰＣＲにより増幅した。次いで、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表６記載のプライマーＢＳｐｇｄＳ−Ｆ及びＢＳｐｇｄＳ−Ｒを用いて、ｐｇｄＳ遺伝子ＯＲＦの断片（Ｃ）をＰＣＲにより増幅した。次いで、スペクチノマイシン耐性遺伝子保有のプラスミドｐＡＰＮＣ２１３（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，１４８：３５３９−３５５２）を鋳型とし、表６記載のプライマーｓｐｃ−Ｆ及びｓｐｃ−Ｒを用いて、ＰＣＲ増幅を行い、スペクチノマイシン耐性遺伝子の断片（Ｄ）をＰＣＲ増幅した。
【０１０７】
次に、得られた断片（Ａ）、断片（Ｃ）、断片（Ｄ）及び断片（Ｂ）をこの順となるように表６記載のプライマーｔｕｆＡ−１ｆ及びｔｕｆＡ−２ｒを用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させ、最終ＰＣＲ産物を得た。得られた最終ＰＣＲ産物を用いて上述した枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔｐｇｓＢＣＡＥΔｐｇｄＳ株で形質転換し、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔｐｇｓＢＣＡＥΔｐｇｄＳ＿ＰｔｕｆＡ−ｐｇｄＳ株を得た。
【０１０８】
得られた枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔｐｇｓＢＣＡＥΔｐｇｄＳ＿ＰｔｕｆＡ−ｐｇｄＳ株のゲノムを用いたＰＣＲ及びそれに続くサンガー法によるシークエンシングによって、ゲノム上の所定の位置に目的遺伝子が導入されていることを確認した。
【０１０９】
次いで、ＰＧＡ合成酵素遺伝子群の導入を行った。枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表６記載のプライマーａｍｙＥ−ＵＦ及び表６記載のプライマーａｍｙＥ−ＵＲを用いて、ａｍｙＥ上流領域の断片（Ａ）をＰＣＲにより増幅した。ｐＤＬＴ３（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，１４８：３５３９−３５５２）で枯草菌野生株１６８を形質転換した変異株を鋳型とし、表６記載のプライマーｃａｔ−Ｆ及び表６記載のプライマーａｍｙＥ−ＤＲを用いて、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むａｍｙＥ下流領域の断片（Ｂ）をＰＣＲにより増幅した。次いで、枯草菌変異株ＲＩＫ３５６株（Ｎａｔｏｒｉ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２００９，１９１：４５５５−４５６１）のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表６記載のプライマーａｍｙＥ／ＰｒｒｎＯ−Ｆ及びＰｒｒｎＯ／ｂｓ−ｐｇｓＲを用いて、ｒｒｎＯオペロンの制御領域の断片（Ｃ）をＰＣＲにより増幅した。次いで、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表６記載のプライマーｂｓ−ｐｇｓＦ及びｂｓ−ｐｇｓ／ｃａｔＲを用いて、ＰＣＲ増幅を行い、ｐｇｓＢＣＡＥ遺伝子群の断片（Ｄ）をＰＣＲ増幅した。
【０１１０】
次に、得られた断片（Ａ）、断片（Ｃ）、断片（Ｄ）及び断片（Ｂ）をこの順となる様に表６記載のプライマーａｍｙＥ−ＵＦ及びａｍｙＥ−ＤＲを用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させ、最終ＰＣＲ産物を得た。得られた最終ＰＣＲ産物を用いてＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔｐｇｓＢＣＡＥΔｐｇｄＳ＿ＰｔｕｆＡ−ｐｇｄＳ株で形質転換し、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ株を得た。
【０１１１】
得られた枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ株のゲノムを用いたＰＣＲ法を用いて、ゲノム上の所定の位置に目的遺伝子群が導入されていることを確認した。 
【０１１２】
【表６】
0006660718.tif 000007
【０１１３】
（１−６）ａｂｒＢ遺伝子恒常発現変異が導入され、ｋｉｎＡ遺伝子が欠失し、ＰＧＡ合成酵素遺伝子群及びＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子の発現が強化された枯草菌変異株（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ａｂｒＢ＊ΔｋｉｎＡ株）の構築
始めに、枯草菌変異株１６８＿ａｂｒＢ＊ΔｋｉｎＡ株のゲノムＤＮＡを用いてコンピテント法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９６０，８１：７４１−７４６）により枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ株の形質転換を行い、エリスロマイシンを含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ａｂｒＢ＊株、及びカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ΔｋｉｎＡ株としてそれぞれ構築した。
【０１１４】
次に、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ａｂｒＢ＊株のゲノムＤＮＡを用いてコンピテント法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９６０，８１：７４１−７４６）により枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ΔｋｉｎＡ株の形質転換を行い、エリスロマイシンを含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ａｂｒＢ＊ΔｋｉｎＡ株として構築した。
【０１１５】
得られた枯草菌変のゲノムを用いたＰＣＲ法を用いて、ゲノム上の所定の位置に目的遺伝子群が導入されていること、及び欠失されていることを確認した。
【０１１６】
（１−７）ａｂｒＢ遺伝子恒常発現変異が導入され、ｋｉｎＡ遺伝子が欠失し、更にａｌｓＳＤ遺伝子群が欠失し、ＰＧＡ合成酵素遺伝子群及びＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子の発現が強化された枯草菌変異株（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ａｂｒＢ＊ΔｋｉｎＡΔａｌｓＳＤ株）の構築
【０１１７】
始めに、枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔｐｇｓＢＣＡＥΔｐｇｄＳ株を宿主として、先述した（１−５）と同様の手法にて、表６及び下記表７記載のプライマーａｌｓＳＤ−ＤＦ１、ａｌｓＳＤ−ＤＲ１、ａｌｓＳＤ−ＤＦ２、ａｌｓＳＤ−ＤＲ２、ａｌｓＳＤ−ＩＦ、ａｌｓＳＤ−ＩＲ、ｐＡＰＮＣ−Ｆ及びｃｈｐＡ−Ｒを用いて、ａｌｓＳＤ遺伝子群の欠失を行った。
【０１１８】
【表７】
0006660718.tif 000008
【０１１９】
次に、（１−５）と同様の手法で、ゲノム上にＰＧＡ合成酵素遺伝子群及びＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子の発現を強化する変異を導入し、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ΔａｌｓＳＤ株を構築した。
【０１２０】
最後に、（１−６）と同様の手法で、ａｂｒＢ遺伝子恒常発現変異が導入され、ｋｉｎＡ遺伝子が欠失し、且つアセトイン合成遺伝子群が欠失し、ＰＧＡ合成酵素遺伝子群及びＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子の発現が強化された枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ａｂｒＢ＊ΔｋｉｎＡΔａｌｓＳＤ株を構築した。
【０１２１】
得られた枯草菌変のゲノムを用いたＰＣＲ法を用いて、ゲノム上の所定の位置に目的遺伝子群が導入されていること、及び欠失されていることを確認した。
【０１２２】
実施例２  ＰＧＡ生産性評価
実施例１にて得られた枯草菌変異株を２％グルコースＭＹＣプレオート培地（２％グルコース、１．８％塩化アンモニウム、０．１５％リン酸水素２カリウム、０．０３５％硫酸マグネシウム７水和物、０．００５％硫酸マンガン５水和物、５０ｍＭ ＭＯＰＳ（モノホリノプロパンスルホン酸）緩衝剤（ｐＨ７．０）、その他微量金属、０．０５％酵母エキス、０．０２％カザミノ酸、２％寒天）で３０℃にて２４時間培養を行い、得られたコロニーを３０ｍＬの５％グルコースＭ改変培地（５％グルコース、１．２％塩化アンモニウム、０．１５％リン酸水素２カリウム、０．０３５％硫酸マグネシウム７水和物、０．００５％硫酸マンガン５水和物、５０ｍＭ ＭＯＰＳ（モノホリノプロパンスルホン酸）緩衝剤（ｐＨ７．０）、その他微量金属）にＯＤ６００が０．０２〜０．１となるように接種し３０℃にて１２〜１６時間振盪培養を行い、さらに得られた培養液を、３０ｍＬの５％グルコースＭ改変培地（５％グルコース、１．２％塩化アンモニウム、０．１５％リン酸水素２カリウム、０．０３５％硫酸マグネシウム７水和物、０．００５％硫酸マンガン５水和物、５０ｍＭ ＭＯＰＳ（モノホリノプロパンスルホン酸）緩衝剤（ｐＨ７．０）、その他微量金属、４．０％炭酸カルシウム）にＯＤ６００が０．０５となるように接種し、３７℃、２００ｒｐｍで１日〜２日間、振盪培養を行った。培養終了後、下記測定例に示す分析条件にてＰＧＡ生産量を測定した。各株の到達ＰＧＡ生産量は、ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ株における到達ＰＧＡ生産量を１００％とした場合の相対値で示した。
【０１２３】
結果を表８に示す。ａｂｒＢ遺伝子を恒常発現及びｋｉｎＡ遺伝子が欠失し、更にａｌｓＳＤ遺伝子群が欠失した枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ａｂｒＢ＊ΔｋｉｎＡΔａｌｓＳＤ株は、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ａｂｒＢ＊ΔｋｉｎＡ株及び枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ΔａｌｓＳＤ株と比較して、到達ＰＧＡ生産量が最も高かった。
【０１２４】
【表８】
0006660718.tif 000009
【０１２５】
＜ＰＧＡの定量分析及び分子量分析＞
培養終了後の培養液試料を、室温にて１４，８００ｒｐｍで３０分間の遠心分離（日立工機、ｈｉｍａｃＣＦ１５ＲＸ）に供し、得られた遠心分離後の試料上清中に含まれるＰＧＡについて、ＨＰＬＣ法にて定量分析及び分子量分析を行った。使用したＨＰＬＣ装置は、送液ポンプ（島津、ＬＣ−９Ａ）、オートサンプラー（日立計測機器、ＡＳ−２０００）、カラムオーブン（島津、ＣＴＯ−６Ａ）、ＵＶ検出計（島津、ＳＰＤ−１０Ａ）、脱ガス装置（ＧＬサイエンス、ＤＧ６６０Ｂ）及びクロマトデータ解析装置（日立計測機器、Ｄ−２５００）を接続して用いた。分析カラムは、排除限界の異なる２種類の東ソー製の親水性ポリマー用ゲルろ過カラムＴＳＫｇｅｌ  Ｇ６０００ＰＷＸＬ（７．８ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３０ｃｍ、排除限界＞５×１０７）及びＴＳＫｇｅｌ  Ｇ４０００ＰＷＸＬ（７．８ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３０ｃｍ、排除限界１×１０６）を用い、これら分析カラムの直前にガードカラムＴＳＫ  ｇｕａｒｄｃｏｌｕｍｎ  ＰＷＸＬ（６．０ｍｍ Ｉ．Ｄ．×４．０ｃｍ）を接続した。溶離液には０．１Ｍ硫酸ナトリウム、流速１．０ｍＬ／分、カラム温度は５０℃、溶出ピークの検出波長は２１０ｎｍを用いた。試料注入量はサンプルループ（レオダイン）を用い、１分析あたり５０μＬとした。ＨＰＬＣ分析に供するサンプルは、不溶物を除くための前処理としてＭＵＬＴＩ  ＳＣＲＥＥＮ  ＭＮＨＶ４５（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ製、０．４５μｍデュラポア膜）にてフィルターろ過処理し調製した。濃度検定には分子量８０万のＰＧＡ（明治フードマテリアル）を用いて検量線を作成した。
【０１２６】
参考例  ａｂｒＢ遺伝子恒常発現の確認
ａｂｒＢ遺伝子恒常発現変異によりａｂｒＢ遺伝子が恒常的に発現されていることを確認するために、ｌａｃＺ遺伝子とその直前にプロモーター領域を導入した変異株を構築し、βガラクトシダーゼアッセイを行った。
（１−１）ｌａｃＺ遺伝子が導入された枯草菌変異株（ＯＣ−０１４株）の構築
まず、枯草菌ａｍｙＥ遺伝子領域にｌａｃＺ遺伝子の導入を行った。ｐＤＬ２プラスミド（Ｆｕｋｕｃｈｉ  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０００，１４６：１５７３-１５８３）を用いて枯草菌野生株１６８株を形質転換し、ａｍｙＥ遺伝子領域にｌａｃＺ遺伝子、及びクロラムフェニコール耐性遺伝子を持つ枯草菌変異株ＯＣ−０１４株を構築した。
【０１２７】
（１−２）野生型ａｂｒＢプロモーター領域又はａｂｒＢ遺伝子恒常発現変異型ａｂｒＢプロモーター領域とｌａｃＺ遺伝子が導入された枯草菌変異株（ＯＡ−０２１株及びＯＡ−０２２株）の構築
【０１２８】
枯草菌変異株ＯＣ−０１４株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表９記載のプライマーｌａｃＺ−ＦＦ及びｌａｃＺ−ＦＲを用いて、ａｍｙＥ遺伝子上流領域を含むｌａｃＺ上流領域の断片（Ａ）をＰＣＲにより増幅した。また、表９記載のプライマーｌａｃＺ−ＢＦ及びｌａｃＺ−ＢＲを用いて、ｌａｃＺ遺伝子のＳＤ配列を含むｌａｃＺ遺伝子中流領域の断片（Ｂ）をＰＣＲにより増幅した。また、枯草菌野生株１６８株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表９記載のプライマーａｂｒＢＰ−ｌａｃＺ−Ｆ及びａｂｒＢＰ−ｌａｃＺ−Ｒを用いて、野生型ａｂｒＢプロモーター領域の断片（Ｃ）をＰＣＲにより増幅した。次いで、スペクチノマイシン耐性遺伝子保有のプラスミドｐＪＬ６２（ＬｅＤｅａｕｘ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓｍａｎ，Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９５，１７７：１６６−１７５）を鋳型とし、表９記載のプライマーｒＰＣＲ−ｓｐｅｃＦ及びｒＰＣＲ−ｓｐｅｃＲを用いて、ＰＣＲ増幅を行い、スペクチノマイシン耐性遺伝子の断片（Ｄ）をＰＣＲ増幅した。
【０１２９】
次に、得られた断片（Ａ）及び断片（Ｄ）を表９記載のプライマーｌａｃＺ−ＦＦ及びｒＰＣＲ−ｓｐｅｃＦを用いてＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させ、断片（Ｃ）及び断片（Ｂ）を表９記載のプライマーａｂｒＢＰ−ｌａｃＺ−Ｆ及びｌａｃＺ−ＢＲを用いてＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させた。最後に、断片（Ａ＋Ｄ）及び断片（Ｃ＋Ｂ）を表９記載のプライマーｌａｃＺ−ＦＦ及びｌａｃＺ−ＢＲを用いてＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させ、最終ＰＣＲ産物（Ａ＋Ｄ＋Ｃ＋Ｂ）を得た。得られた最終ＰＣＲ産物を用いて枯草菌変異株ＯＣ−０１４株を形質転換し、クロラムフェニコール感受性且つスペクチノマイシン耐性の形質転換体を取得し、野生型ａｂｒＢプロモーター領域とｌａｃＺ遺伝子が導入された枯草菌変異株ＯＡ−０２１株を得た。
【０１３０】
次に、枯草菌変異株１６８＿ａｂｒＢ＊＿Ｃｍ株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表９記載のプライマーａｂｒＢＰ−ｌａｃＺ−Ｆ及びａｂｒＢＰ−ｌａｃＺ−Ｒを用いて、ａｂｒＢ遺伝子恒常発現変異型ａｂｒＢプロモーター領域の断片（Ｅ）をＰＣＲにより増幅した。上記手法と同様にして、最終ＰＣＲ産物（Ａ＋Ｄ＋Ｅ＋Ｂ）を得た。得られた最終ＰＣＲ産物を用いて枯草菌変異株ＯＣ−０１４株を形質転換し、クロラムフェニコール感受性且つスペクチノマイシン耐性の形質転換体を取得し、ａｂｒＢ遺伝子恒常発現変異型ａｂｒＢプロモーター領域とｌａｃＺ遺伝子が導入された枯草菌変異株ＯＡ−０２２株を得た。
【０１３１】
得られたそれぞれの枯草菌変異株のゲノムを用いたＰＣＲ及びそれに続くサンガー法によるシークエンシングによって、ゲノム上の所定の位置に目的変異が導入されていることを確認した。
【０１３２】
【表９】
0006660718.tif 000010
【０１３３】
（１−３）  βガラクトシダーゼアッセイ
（１−２）にて構築した枯草菌変異株ＯＡ−０２１株及び枯草菌変異株ＯＡ−０２２をスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天培地上に画線塗布し、得られたコロニーをＳ７（５０）培地（Ｊａａｃｋｓ  Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８９，１７１：４１２１−４１２９）に接種し、３７℃で振盪培養した。培養後、遠心分離によって菌体を集菌し、得られた菌体を用いてβガラクトシダーの活性を測定した。
【０１３４】
その結果、野生型ａｂｒＢプロモーター領域を有する枯草菌変異株ＯＡ−０２１株の場合、定常期に入ると転写抑制が認められるが、ａｂｒＢ遺伝子恒常発現変異型ａｂｒＢプロモーター領域を有する枯草菌変異株ＯＡ−０２２株の場合には、定常期でも高い転写活性を示した（図４）。以上のことから、ａｂｒＢ遺伝子恒常発現変異株では、ａｂｒＢ遺伝子が恒常的に発現していることが示唆された。
【０１３５】
＜βガラクトシダーゼの活性測定＞
βガラクトシダーゼ活性測定は、集菌した菌体を１ｍＬのＺバッファー（６０ｍＭＮａ２ＨＰＯ４、４０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ及び１ｍＭ  ＤＴＴ）にて懸濁し、得られたサンプル溶液１０μＬを０．６３ｍＬのＺバッファーと混合した。次いで、得られた混合溶液にＺバッファーに溶解したリゾチーム・ＤＮａｓｅＩ溶液（２．５ｍｇ／ｍＬリゾチーム及び０．０５ｍｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅＩ）０．１６ｍＬを添加し、３７℃で５分間保温した。次いで、８μＬの１０％ Ｔｒｉｔｉｏｎ−Ｘ１００を加え攪拌し、氷上に静置した。調製した最終サンプル溶液を３０℃で３分間保温し、Ｚバッファーに溶解したＯＮＰＧ溶液（４．０ｍｇ／ｍＬ ｏ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−Ｂ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（ＯＮＰＧ））０．２ｍＬを加え混合し、黄色く呈色するまで保温した。最後に０．４ｍＬのＮａ２ＣＯ３溶液を加え反応を停止させ、４２０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４２０ｎｍ）を測定し、以下の式（１）より算出される活性値を求めた。
【０１３６】
式（１）
Miller unit = (1000×OD420nm) / (T× V ×OD600 unit of cell)
【０１３７】
ＯＤ６００  ｕｎｉｔ  ｏｆ  ｃｅｌｌ：集菌時の濁度（ＯＤ６００  ｎｍ）
Ｔ：反応時間（ｍｉｎ）
Ｖ：活性測定に使用した培養液量（ｍＬ）
【図１】
0006660718.tif 000011
【図２】
0006660718.tif 000012
【図３】
0006660718.tif 000013
【図４】
0006660718.tif 000014
【配列表】
0006660718000001.app