(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療有効量の小分子を含む、対象において鉄トランスポーターの欠損又は欠陥により特徴づけられる疾患又は状態を治療するための組成物であって、前記小分子はヒノキチオールである、組成物。
【請求項２】
前記鉄トランスポーターの欠損又は欠陥により特徴づけられる疾患又は状態が、低色素性小球性貧血である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
対象において経上皮鉄輸送を増進させるために使用される、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
対象において生理機能を増進させるために使用される、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項５】
対象においてヘモグロビン合成を増進させるために使用される、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項６】
対象において鉄放出を増進させるために使用される、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項７】
前記小分子が全身投与される、請求項１−６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記小分子が経口投与される、請求項１−６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記小分子が静脈内投与される、請求項１−６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記対象は哺乳動物である、請求項１−９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記対象はヒトである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記対象は、二価金属トランスポーター１（ＤＭＴ１）が欠損している、請求項１−１１のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１５年１月９日出願の米国仮特許出願第６２／１０１，７０６号、及び２０１５年１１月６日出願の米国仮特許出願第６２／２５１，９６４号に基づく優先権の利益を主張する。
【政府の支援】
【０００２】
本発明は、アメリカ国立衛生研究所によって承認された許可番号第ＧＭ０８０４３６号の下、米国政府の支援により成された。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
鉄は全ての生物において多くのプロセスで重要であるが、高濃度では毒性を有する。２５より多くのヒト疾患が、主要な鉄トランスポーター及び調節タンパク質の欠損に起因する。そのような疾患の例として、二価金属トランスポーター１（ＤＭＴ１）の欠損により生じる低色素性小球性貧血、ミトフェリンの欠損によって生じる低色素性貧血、及びフェロポルチンレベルの低下によって生じうるヘモクロマトーシスが挙げられる。これら欠損の共通の結果は、脂質膜を隔てた鉄勾配の蓄積(buildup)と考えられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
例えばヒノキチオール等の小分子（small molecules）は、鉄輸送複合体（iron transporting complex）であるＦｅｔ３Ｆｔｒ１を欠く酵母の増殖の回復によって測定される生理機能を回復させると共に、ＤＭＴ１を欠くヒトＣａｃｏ−２上皮の単層を横断する鉄の輸送を回復させる。これら研究は、ヒノキチオールのような小分子で、鉄欠乏症を治療する潜在的な可能性を裏付ける。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１−１】小分子を用いた鉄欠乏生物の生理機能の回復を示す。１Ａは、鉄の不適切な流入に関連する鉄疾患の単純化した概略図である；１Ｂは、鉄の不適切な細胞内移動に関連する鉄疾患の単純化した概略図である；１Ｃは、鉄の不適切な流出に関連する鉄疾患の単純化した概略図である；１Ｄは、形成された鉄勾配を解放し、生理機能を回復させると仮定される小分子イオントランスポーターを示す。
【図１−２】図１−１の続き。１Ｅは、小分子天然物ヒノキチオール及びＣ２ｄｅＯＨｉｎｏの構造を示す；１Ｆは、ヒノキチオールが固体培地（１Ｇ）で、野生型酵母と同様の酵母の増殖を回復させることを示す。
【図１−３】図１−２の続き。１Ｈは、ヒノキチオールが液体培地で、野生型酵母と同様の酵母の増殖を回復させることを示す；１Ｉは、増殖の用量依存的回復を示す；１Ｊは、５５Ｆｅの細胞内への流入の回復を示す；１Ｋ及び１Ｌはそれぞれ、ヒノキチオール（Ｈｉｎｏ）救済酵母が、エブセレンでのＰｍａ  １の化学的阻害、及びバフィロマイシンでのＶ−ＡＴＰａｓｅの化学的阻害に対して、非常に感受性であることを示す。
【図２−１】ヒノキチオールがインビトロでＤＭＴ１欠損における生理機能を回復させることを示す。２Ａは、ヒノキチオール（Ｈｉｎｏ）が細胞への鉄の取込みを回復させることを示す；２Ｂは、ヒノキチオール（Ｈｉｎｏ）がＤＭＴ１欠損Ｃａｃｏ−２上皮単層における経上皮輸送を、時間依存的態様（２Ｃ）及び用量依存的態様（２Ｄ）で回復させることを示す。２Ｅは、ヒノキチオール（Ｈｉｎｏ）が、ヘモグロビンの存在により同定される、ＤＭＴ１欠損ＭＥＬ細胞における分化を回復させることを示す。１Ｆは、ヒノキチオールが、ヘモグロビン合成（hemoglobinization）を回復させることを表わすヘムのジアニシジン染色を示す。
【図２−２】図２−１の続き。２Ｇは、２Ｆの結果をＩｍａｇｅ  Ｊ解析により定量化したもの。２Ｈは、時間依存性のヒノキチオール媒介回復を示す。２Ｉは、ヒノキチオールが用量依存的態様で分化を回復させることを示す。グラフは平均±標準誤差（ＳＥＭ）を表わす。
【図３】ヒノキチオールが、インビボでＤＭＴ１欠損における生理機能を回復させることを示す。３Ａは、重篤な貧血を示すＢｅｌｇｒａｄｅ（ｂ／ｂ）ラットを表わす；３Ｂは、Ｆ３４４ラットでのＩＰ投与後のヒノキチオールの半減期の決定を示す；３Ｃは、ラット食餌中のヒノキチオールが、〜１００ｍｇ／ｋｇでの１ヶ月の処置の後、ｂ／ｂラットにおいて、ヘマトクリット値を非貧血の値に回復させることを示す。
【図４−１】ヒノキチオールが鉄トランスポーター欠損酵母の増殖を回復させることを示す。４Ａは、ヒノキチオールによる増殖回復が、酵母におけるシデロホアトランスポーターとは無関係であることを示す；４Ｂは、増殖回復が好気的条件下で生じることを示し、鉄が活発な条件下（iron-strenuous conditions）での鉄利用を表わす。
【図４−２】図４−１の続き。４Ｃは、ヒノキチオールが、鉄欠乏酵母の増殖を回復させ、野生型と類似の倍加時間を有することを示す。
【図４−３】図４−２の続き。４Ｄは、増殖の回復がホルミシス効果によるものではないことを示す；４Ｅは、増殖の回復が、ヒノキチオールに対する継続した依存を以って持続的であることを示す。
【図４−４】図４−３の続き。４Ｆは、ヒノキチオール媒介の増殖回復の程度が、鉄が正常レベルに達するまで媒体に添加される鉄の量に依存性であることを示す；４Ｇは、鉄の量を増やすと、ヒノキチオールが酵母の増殖を回復させる用量の範囲を広げることを示す。
【図４−５】図４−４の続き。４Ｈは、ヒノキチオールで処理した鉄欠乏酵母が、細胞壁生合成のオフパスウェイ（off-pathway）経路阻害剤（カスポファンギン）の阻害に対して等感受性（equi-sensitive）であることを示す；
【図４−６】図４−４の続き。４Ｉは、親油性鉄担体は増殖を回復させるのに対して、親水性鉄担体は増殖を回復させないことを示す。他のイオンのトランスポーターも同様に増殖を回復させない。
【図５−１】ヒノキチオールの生物物理学的特性を示す。５Ａは、鉄の添加後のヒノキチオールのＵＶトレースが、それが鉄に結合することを裏付けることを示すが、５Ｂに示すように、Ｃ２ｄｅＯＨｉｎｏはそうではない；５Ｃは、ヒノキチオールがＰＯＰＣリポソームからの鉄の放出を促進するが、Ｃ２ｄｅＯＨｉｎｏ及びＤＭＳＯビヒクルはそうしないことを示す。
【図５−２】図５−１の続き。５Ｄは、ヒノキチオールのＸ線結晶構造が、親水性の内部を包み込む疎水性の外部を示唆することを示す；５Ｅは、（酵母増殖を回復させない）水溶性キレート剤とは異なり、ヒノキチオール鉄錯体がオクタノール中に優勢的に分配することを示す；
【図５−３】図５−２の続き。５Ｆは、ヒノキチオール鉄錯体がヘキサンに溶解性であるのに対して、デフェリプロンのような水溶性キレート剤は主に水中に分配することを示す；５Ｇは、Ｃ２ｄｅＯＨｉｎｏのマルチグラムスケールでの合成を示す。
【図６−１】ヒノキチオールがＤＭＴ１−欠損Ｃａｃｏ−２上皮の生理機能を回復させることを示す。６Ａは、ｓｈＲＮＡトランスフェクションによりＤＭＴ１ノックダウンＣａｃｏ−２細胞株を確立したことを示す。
【図６−２】図６−１の続き。６Ｂは、ヒノキチオールがＤＭＴ１の発現を誘導しないことを示す；６Ｃは、ヒノキチオールが十二指腸全体に亘りみられるｐＨ値の範囲で経上皮輸送を促進することを示す。
【図６−３】図６−２の続き。６Ｄは、水溶性鉄キレート剤が、鉄輸送を促進しないことを示す；６Ｅは、ヒノキチオールが、鉄の頂端側の輸送と同様には側底側の輸送を促進できないことを示す。
【図６−４】図６−３の続き。６Ｆは、フェリチンのヒノキチオール処理及び免疫沈降の後、フェリチンへの高い鉄の組込み(incorporation)が観察されたことを示す；６Ｇは、ケルセチンによるフェロポルチン１（ＦＰＮ１）のダウンレギュレーションが、ヒノキチオールが輸送を回復させる能力を失わせたことを示す；及び６Ｈは、それが取込みに影響を及ぼすことなくなされることを示す；６Ｉは、細胞への鉄の取込みはヒノキチオールの増加と共に増えることを示すが、６Ｊは、高濃度のヒノキチオールでは鉄の経上皮輸送が減少することを示す。
【図７】ヒノキチオールがＤＭＴ１欠損赤血球前駆細胞の生理機能を回復させることを示す。７Ａは、ヒノキチオールが、エクスビボ（ex vivo）で、ｂ／ｂラットから単離したＤＭＴ１欠損網状赤血球においてヘムへの鉄の組込みを増加することを示す；７Ｂは、ｓｈＲＮＡトランスフェクションによるＤＭＴ１欠損ＭＥＬ細胞の発生を示す；７Ｃは、ヒノキチオールが、ｏ−ジアニシジンでの茶色の染色によって示されるように、対照細胞にほぼ同程度に、ＤＭＴ１欠損ＭＥＬ細胞のヘモグロビン合成を回復させることを示す。
【図８】ヒノキチオールが、インビトロでＤＭＴ１欠損ＭＥＬ細胞において生理機能を回復させることを表わす一連の棒グラフ。８Ａは鉄染色を表わす；８Ｂは、５５Ｆｅ取込みを表わす；８Ｃは、５５Ｆｅ−ヘム組込みを表わす。
【図９】ヒノキチオールがＤＭＴ１欠損Ｂｅｌｇｒａｄｅ（ｂ／ｂ）ラットにおいて生理機能を回復させることを示す一対の棒グラフ。９Ａは、ｂ／ｂラットから単離した網状赤血球におけるヘモグロビン合成を表わし；及び９Ｂは、ヒノキチオール又はＣ２ｄｅＯＨｉｎｏへのｂ／ｂラットの慢性的曝露によるヘマトクリット値に対するインビボ効果を表わす。
【図１０】ヒノキチオールが、エンドソームからサイトゾル内への鉄の放出、及び続くミトコンドリアの取込みを促進することを示す。１０Ａは、鉄特異的色素であるｏｘｙｂｕｒｓｔ  ｇｒｅｅｎ、ｃａｌｃｅｉｎ  ｇｒｅｅｎ及びＲＰＡを用いた生細胞の蛍光画像を表わす。１０Ｂは、エンドソームを示す、ｏｘｙｂｕｒｓｔ  ｇｒｅｅｎの定量化した結果を表わす；１０Ｃは、サイトゾルを示す、ｃａｌｃｅｉｎ  ｇｒｅｅｎの定量化した結果を表わす；１０Ｄは、ミトコンドリアを示す、ＲＰＡの定量化した結果を表わす。
【図１１】過剰なタンパク質機能に対する小分子阻害剤の効果を示す。
【図１２】タンパク質機能の欠損における分子補綴（molecular prosthetics）の予想を示す。
【図１３】低色素性小球性貧血につながるＤＭＴ１の欠損を示す。
【図１４】ロバスト性仮説（robustness hypothesis）を示す。
【図１５】小分子の機能相補(functional complementation)を示す。
【図１６】ヒノキチオールが自律的に鉄を輸送することを示す。
【図１７】ヒノキチオールが酵母において生理機能を回復させることを示す。
【図１８】増殖が鉄輸送に依存することを示す。
【図１９】多くの小分子に関する機能相補を示す。
【図２０】下流の生理機能の回復を示す。
【図２１】腸上皮組織において機能を元に戻すことを示す。
【図２２】ヒト腸細胞の単層における機能相補を示す。
【図２３】ヒノキチオールがＣａｃｏ−２細胞を透過性にすることを示す
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本発明は、例えばヒノキチオール等の小分子が、鉄輸送複合体であるＦｅｔ３Ｆｔｒ１を欠く酵母の増殖の回復によって測定されるような生理機能を回復させると共に、ＤＭＴ１を欠損するヒトＣａｃｏ−２上皮の単層を横断する鉄の輸送を回復させることの発見に基づく。したがって、本発明は、ヒノキチオールのような小分子で、鉄欠乏症を治療する潜在的な可能性に関する。
【０００７】
本明細書で用いられる場合、用語「治療する（treat）」又は「治療（treatment）」とは、障害（disorder）、その障害の１つ又は複数の症状（symptom）、あるいはその障害の素因（predisposition）を治す、治癒させる、軽減する、緩和する、変化させる、矯正する、向上させる、改善する、又は影響を及ぼすため（例えば、障害の１つ又は複数の症状を防ぐため、或いは障害の１つ又は複数の症状の発現を遅らせるため）に、化合物を単独で、又は第２の化合物と組み合わせて、例えば患者等の対象への適用又は投与、或いは、障害（例えば本明細書に記載されているような障害）、障害の症状、あるいは障害の素因を有する患者等の対象由来の単離組織又は細胞（例えば細胞株）に化合物を適用又は投与することとして定義される。傷病治癒の場合、治療有効量は、創傷の治癒を促進する量である。
【０００８】
本明細書で用いられる場合、障害を治療するのに有効な化合物の量、すなわち「治療有効量」は、障害の１つ又は複数の症状を治す、軽減する、矯正する、又は改善する際に、対象又は細胞への単回又は複数回投与で有効である化合物の量を称する。傷病治癒の場合、治療有効量は、創傷の治癒を促進する量である。
【０００９】
１つ又は複数のさらなる治療剤と組み合わせて投与することは、同時（併存）及び任意の順序での逐次投与を含む。
【００１０】
「薬学的に許容される」の語は、過度の毒性、過敏、アレルギー反応、或いは他の問題又は合併症なしに、健全な医療判断の範囲内で、ヒト及び動物の組織と接触して使用するのに適し、合理的なベネフィット／リスク比に相応する、化合物、物質、組成物、及び／又は剤形を称するのに用いられる。
【００１１】
発明が属する技術分野の通常の知識を有する医師又は獣医は、必要な医薬組成物の治療有効量を容易に決定及び処方することができる。例えば、医師又は獣医は、所望の治療効果を達成するのに必要なレベルより低いレベルで医薬組成物又は化合物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまでその用量を次第に増加させることができる。「治療有効量」は、所望の治療効果を導き出すのに十分な化合物の濃度を意味する。化合物の有効量は、対象の体重、性別、年齢及び病歴によって異なることが一般的に理解されている。有効量に影響する他の因子として、限定はされないが、患者の状態の重篤性、治療すべき障害、化合物の安定性、投与方法、特定化合物のバイオアベイラビリティ、並びに、必要に応じて本発明の化合物と一緒に投与される別の種類の治療剤などが挙げられる。薬剤の複数回投与によってより多くの総量を送達できる。有効性及び投与量を決定する方法は当業者に公知である（Isselbacher et al. (1996) Harrison’s Principles of Internal Medicine 13 ed., 1814-1882, 参照によって本明細書に組み込まれる）。
【００１２】
「変調（modulating）」又は「変調させる（modulate）」は、機能、状態又は障害の治療、予防、抑制、増強又は誘導を称する。
【００１３】
「治療する（treating）」の語は、予防的及び／又は治療的処置を含む。「予防的又は治療的」処置の語は、当業界で承認されており、対象組成物の１つ又は複数のホストへの投与を含む。望ましくない状態（例えば、ホスト動物の疾患又は他の望ましくない状況）の臨床発現の前に投与されれば、その処置は予防的であり、一方、望ましくない状態の発現後に投与されれば、その処置は治療的である（すなわち、存在する望ましくない状態又はその副作用を、縮小する、向上させる、又は安定化させることが意図されている）、
【００１４】
本明細書及び請求項で用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、その文脈が明確にそうでないことを述べていない限り、複数形を含む。
【００１５】
「及び／又は」の語は、本明細書において「Ａ及び／又はＢ」のようなフレーズで用いられている場合、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ」、及び「Ｂ」を含むことが意図されている。同様に、「及び／又は」の語は、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」のようなフレーズで用いられている場合、以下の具体例：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；並びにＣ（単独）：のそれぞれを包含することが意図されている。
【００１６】
「含む」の語を用いて本明細書に記載されているどんな実施形態も、「からなる」及び／又は「から実質的になる」に置き換えた同様の実施形態も提供されていると理解される。
【００１７】
本明細書で用いられる場合、「対象」の語は、本明細書に記載されている１つ又は複数の疾患及び障害に罹患する可能性を有する、温血動物、例えば哺乳動物、例えばヒト、又はヒトの子供を称する。
【００１８】
例えば、本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩を、必要とする患者に投与することを含む、哺乳動物（ヒト及び非ヒトを含む）において、鉄トランスポーターの欠損又は欠陥によって特徴づけられる様々な疾患又は状態を治療する方法を提供する。そのような鉄トランスポーターの欠損又は欠陥によって特徴づけられる様々な疾患又は状態として、遺伝性ヘモクロマトーシス（肝硬変、心筋症、糖尿病、多発性関節障害、性腺機能低下症も付随しうる）、鉄欠乏性貧血、低色素性小球性貧血、慢性疾患の貧血症（例えば、正色素性貧血、正球性貧血、慢性感染症、持続的炎症状態（例えば、炎症性腸疾患、血管炎）、自己免疫疾患、及び新生物形成（ｎｅｏｐｌａｓｉａ）から生じる）；鉄過剰（例えば、鉄中毒、慢性鉄過剰、無効造血）；疲労、無気力；眩暈；頭痛；息切れ；耳鳴り；味覚障害；下肢静止不能症候群；蒼白；扁平化爪（ｆｌａｔｔｅｎｅｄ）；脆弱爪（匙状爪）；口角糜爛症（口角に亀裂）；舌炎；青色強膜（白目）；結膜蒼白；異食症（氷食症）；最大有酸素能力の低下；運動能力の低下；持久力の低下；体温調節障害；免疫機能低下；感染率の上昇；認知機能障害及び記憶障害；成育の障害（compromised growth and development）；及び鉛及びカルシウム吸収の増加が挙げられる。
【００１９】
本明細書で用いられる場合、「ヒノキチオール」は、下記構造式：
【化１】
0006725515.tif 000002
により表され、「β−ツヤプリシン」、「２−ヒドロキシ−６−プロパン−２−イルシクロヘプタ−２，４，６−トリエン−１−オン」及び「４−イソプロピルトロポロン」とも称される。
【００２０】
本発明の１つの態様は、鉄トランスポーターの欠損又は欠陥によって特徴づけられる様々な疾患又は状態を治療する方法に関し、治療有効量の小分子を、必要とする対象に投与して、鉄トランスポーターの欠損又は欠陥によって特徴づけられる様々な疾患又は状態を治療することを含む。
【００２１】
ある実施形態では、小分子は、アムホテリシンＢ（ＡｍＢ）、カルシマイシン、ノナクチン、デフェリプロン、プルプロガリン、及びマルトール、並びにそれらの任意の組合せからなる群より選択される。
【００２２】
ある実施形態では、小分子は、カルシマイシン、デフェリプロン、プルプロガリン、及びマルトール、並びにそれらの任意の組合せからなる群より選択される。
【００２３】
ある実施形態では、小分子はヒノキチオールである。
【００２４】
ある実施形態では、小分子は医薬組成物として投与される。
【００２５】
本発明の医薬組成物は、局所又は全身治療のいずれかのためのあらゆるやり方で投与してよい。投与は、局所投与（膣及び直腸送達を含む粘膜への投与のような）、例えば、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点滴薬、坐薬、スプレー、液体及び粉末等；肺投与（例えば、噴霧器によるものを含む、粉末又はエアロゾルの吸入又は通気（insufflation）、気管内、経鼻、表皮及び経皮による）；経口投与；非経口投与、例えば、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内又は筋肉内への注射又は注入等；或いは、頭蓋内（例えば、髄腔内又は脳室内）投与であってよい。
【００２６】
ある実施形態において、小分子は全身投与される。ある実施形態では、小分子は経口投与される。ある実施形態では、小分子は静脈投与される。
【００２７】
本発明の化合物は、他の治療剤と組み合わせてもよい。本発明の化合物及び他の治療剤は、同時投与しても、又は逐次投与してもよい。他の治療剤を同時投与する場合、それらは、同じ又は別個の製剤において投与することができるが、それらは実質的に同時に投与される。他の治療剤及び本発明の化合物の投与が時間的に離れる場合、他の治療剤は互いに及び本発明の化合物と逐次投与される。これら化合物の投与間の時間の分離は、ほんの数分であるか、あるいはそれより長くてもよい。
【００２８】
本発明の化合物と共に投与しうる他の治療剤の例示として、ステロイド、膜安定化剤、５ＬＯ阻害剤、ロイコトリエン合成及び受容体阻害剤、ＩｇＥアイソタイプスイッチ（isotype switching）又はＩｇＥ合成の阻害剤、ＩｇＧアイソタイプスイッチ又はＩｇＧ合成の阻害剤、β−作動薬、トリプターゼ阻害剤、アスピリン、ＣＯＸ阻害剤、メトトレキサート、抗ＴＮＦ薬、リツキサン、ＰＤ４阻害剤、ｐ３８阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、及び抗ヒスタミン剤が挙げられる。さらに、鉄サプリメントも本発明の化合物と共投与（co-administration）してもよい。ある実施形態では、本発明は、本発明の化合物と、デフェリプロン又は別の鉄キレート療法との共投与に関する。
【００２９】
したがって、本発明の別の態様は、治療有効量の本発明の化合物と、ステロイド、膜安定化剤、５ＬＯ阻害剤、ロイコトリエン合成及び受容体阻害剤、ＩｇＥアイソタイプスイッチ又はＩｇＥ合成の阻害剤、ＩｇＧアイソタイプスイッチ又はＩｇＧ合成の阻害剤、β−作動薬、トリプターゼ阻害剤、アセチルサリチル酸、ＣＯＸ阻害剤、メトトレキサート、抗ＴＮＦ薬、リツキサン及び他のＢ−細胞標的薬、ＴＮＦ−標的薬、ＰＤ４阻害剤、ｐ３８阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、及び抗ヒスタミン剤からなる群より選択される第２の治療剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００３０】
上記で述べられた「有効量」は、所望の生物学的効果を達成するのに十分な任意の量を称する。本明細書で提供される教示と相まって、様々な活性化合物の中から選択し、さらに、例えば効力、相対的バイオアベイラビリティ、患者の体重、有害な副作用の重篤性、及び好ましい投与方法等の因子を熟慮して、実質的な望ましくない毒性を生じずかつ特定の対象を治療するのに有効である、有効な予防的又は治療的な処置計画をたてることができる。任意の特定の適用のための有効量は、治療される疾患又は状態、投与される本発明の特定の化合物、対象のサイズ、又は疾患又は状態の重篤性等の因子によって変化しうる。当業者は、本発明の特定化合物及び／又は他の治療剤の有効量を、過度の実験を必要としないで経験によって決定できる。一般的に、最大用量を用いることが好ましく、すなわち、それはいくつかの医学的判断に従う最大安全用量である。１日当たり複数回投与は、化合物の適切な全身レベルを達成するのに熟慮されうる。適切な全身レベルは、例えば、患者の薬物のピーク又は持続血漿レベルの測定によって決定できる。「用量」と「投与量」は本明細書において交換可能に用いられる。
【００３１】
一般的に、活性化合物の１日の経口用量は、ヒト対象に関して、１日当たり約０．０００１ｍｇ／ｋｇから、１日当たり０．００１ｍｇ／ｋｇから、又は１日当たり０．０１ｍｇ／ｋｇから、１日当たり約１００ｍｇ／ｋｇまで又は１日当たり１０００ｍｇ／ｋｇまでである。１日当たり１又は数回の投与で、０．５〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲での経口用量が所望の結果をもたらすことが予測される。投与量は、局所又は全身、投与方法に依存して、所望の治療効果を達成又は維持するのに十分な所望の薬物レベルを達成するように適切に調整されうる。例えば、静脈内投与は、１桁から数桁低い１日当たりの用量であろう。そのような用量で対象における応答が不十分であるような場合には、より高い用量（又は異なるより局所化された送達経路によって有効なより高い用量）を、患者の耐性が許す限りにおいて、用いることができる。１日当たり複数回投与が、化合物の適切な全身レベルを達成するために熟慮される。中でも、投与方法、治療される特定の徴候、及び処方医師の判断等に依存して、化合物は、１週間に１回、１週間に数回（例えば、隔日）、１日に１回又は１日に複数回投与してもよい。１つの実施形態において、本発明の化合物は、典型的には、０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜１２５ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与されうる。例えば、本発明の化合物は、約２５ｍｇ／ｋｇ／日、５０ｍｇ／ｋｇ／日、７５ｍｇ／ｋｇ／日、又は１００ｍｇ／ｋｇ／日で投与されうる。
【００３２】
特定の使用及び投与方法のための化合物の有効投与量の決定は、当業者の能力の範囲内である。有効投与量は、最初、インビトロ活性及び代謝アッセイから見積もることができる。例えば、動物で使用するための化合物の初回投与量は、インビトロアッセイで測定した特定化合物のＩＣ５０又はＩＣ５０超である代謝産物活性化合物の循環血又は血清濃度を達成するように処方される。所望の投与経路を介した特定化合物のバイオアベイラビリティを考慮して、そのような循環血又は血清濃度を達成する投与量を計算することは、当業者の能力の範囲内である。化合物の初回投与量は、動物モデルのようなインビボデータからも見積もることができる。本明細書に記載されている任意の化合物に関して、治療有効量を最初に動物モデルから決定してもよい。治療有効用量は、ヒトにおいて試験された本発明の化合物に関して、及び他の関連活性薬剤のような類似の薬理学的活性を示すことが知られている化合物に関して、ヒトデータからも決定することができる。非経口投与にはより高い用量が必要となりうる。投与される化合物の相対的バイオアベイラビリティ及び効力に基づき、適用される用量を調整できる。上記の方法及び当業界で周知の他の方法に基づき最大効果を達成するために用量を調整することは、当業者の能力の範囲内である。
【００３３】
本発明の製剤は、薬学的に許容される濃度の塩、緩衝剤、保存剤、適合性の担体、アジュバント、及び必要に応じて他の治療成分を通常含みうる、薬学的に許容される溶液中において投与してもよい。
【００３４】
本発明の化合物を含む医薬組成物は、従来の混合、溶解、造粒、糖剤製造（dragee making）、微粒子化（levigating）、乳化、カプセル化、封入（entrapping）又は凍結乾燥プロセスにより製造することができる。組成物は、薬学的に使用できる製剤への化合物の加工を容易にする１つ又は複数の生理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤又は助剤を用いて、従来のやり方で製剤化することができる。
【００３５】
治療での使用のために、有効量の本発明の化合物を、本発明の化合物を所望の表面に送達する任意の方法で対象に投与することができる。本発明の医薬組成物の投与は、当業者に公知の任意の手段により達成することができる。投与経路として、限定はされないが、経口、口腔内、鼻、直腸、膣、眼、局所、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮、髄腔内、直接注入（例えば、膿瘍内に）、粘膜、吸入、及び通気が挙げられる。
【００３６】
経口投与のために、活性化合物を、当業界で周知の薬学的に許容される担体と組み合わせることにより、化合物（すなわち、本発明の化合物、及び他の治療剤）を容易に製剤化することができる。そのような担体は、治療される患者による経口摂取のために、錠剤、丸剤、糖剤、トローチ（lozenges）、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして、本発明の化合物を製剤化することを可能にする。経口使用のための医薬製剤は、固体賦形剤として得ることができ、必要に応じて、得られた混合物を粉砕し、さらに望ましい場合には、適当な助剤を加えた後で顆粒の混合物を加工して、錠剤又は糖剤コアを得る。適当な賦形剤は、特に、結合剤、充填剤、潤滑剤、崩壊剤、及び湿潤剤である。適切な充填剤として、ラクトース、スクロース、マンニトール、又はソルビトールを含む糖；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び／又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）が挙げられる。望ましい場合、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、又はアルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウムのようなその塩などの崩壊剤を加えることができる。必要に応じて、経口製剤はまた、生理食塩水又は、例えば、体内の酸性状態を中和するためのＥＤＴＡなどの緩衝剤中に製剤化してもよく、或いは、いずれの担体も使用せずに投与してもよい。
【００３７】
また、上記の成分の経口剤形を具体的に検討する。誘導体の経口送達が有効になるように、１種以上の成分を化学修飾してもよい。一般に、検討される化学的修飾は、成分分子自体への少なくとも１つの部分の付加であり、その部分は、（ａ）酸加水分解の抑制；及び、（ｂ）胃又は腸から血流への取込みを可能にする。１種類以上の成分の全体的な安定性の向上、及び体内における循環時間の増加もまた所望される。このような部分の例としては、次のものが挙げられる：ポリエチレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン及びポリプロリン。Abuchowski and Davis, “Soluble Polymer-Enzyme Adducts”, In: Enzymes as Drugs, Hocenberg and Roberts, eds., Wiley-Interscience, New York, N.Y., pp. 367-383(1981);Newmark et al., J Appl Biochem 4:185-9(1982)。使用可能な他のポリマーは、ポリ−１，３−ジオキソラン及びポリ−１，３，６−チオキソカンである。医薬用途にとって好ましいものは、前述の通り、ポリエチレングリコール部分である。
【００３８】
成分（又は誘導体）の放出場所は、胃、小腸（十二指腸、空腸、又は回腸）、又は大腸となりうる。当業者は、胃内では溶解せず、十二指腸又は腸の他の場所において物質を放出する、利用可能な製剤を有する。好ましくは、放出は、本発明の化合物（又は誘導体）の保護によって、或いは、例えば腸など胃内環境を過ぎてからの生物活性物質の放出によって、胃内環境の有害な影響を回避する。
【００３９】
十分な胃耐性を確実にするために、少なくともｐＨ５．０に対して非浸透性のコーティングが必須である。腸溶性コーティングとして用いられるより一般的な不活性成分の例は、トリメリト酸酢酸セルロース（ＣＡＴ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、ＨＰＭＣＰ  ５０、ＨＰＭＣＰ  ５５、ポリビニルアセテートフタレート（ＰＶＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ３０Ｄ、Ａｑｕａｔｅｒｉｃ、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｓ、及びシェラックである。これらのコーティングは、混合膜として使用してもよい。
【００４０】
コーティング又はコーティング混合物は、胃に対する保護が意図されていない錠剤においても使用することができる。このコーティングは、糖衣、あるいは、錠剤をより飲み込み易くするコーティングを含んでいてよい。カプセルは、乾燥治療薬（例えば粉末）の送達用の硬質シェル（ゼラチンなど）で構成することができる；液体形態については、軟質ゼラチンシェルを使用してよい。カシェ剤のシェル材料は、濃デンプン又は他の食用紙であってよい。丸薬、トローチ剤、成形錠剤又は湿製錠剤については、湿式塊化法（moist massing techniques）を使用することができる。
【００４１】
治療薬は、粒径約１ｍｍの顆粒又はペレットの形態の細かい多微粒子として、製剤中に含めることができる。カプセル投与用材料の製剤は、粉末、軽度に圧縮されたプラグ（lightly compressed plugs）、又は錠剤であってもよい。治療薬は、圧縮によって調製することができる。
【００４２】
着色剤及び香味剤は全て含めてよい。例えば、本発明の化合物（又は誘導体）を、（リポソーム又はマイクロスフィアのカプセル化などにより）製剤化し、その後さらに、着色剤及び香味剤を含む冷蔵された飲料などの可食性製品内に含めてもよい。
【００４３】
不活性物質を用いて、治療薬を希釈し又はその容積を増加させてもよい。これらの希釈剤としては、特に、マンニトール、α−ラクトース、無水乳糖、セルロース、スクロース、改質デキストラン及びデンプンなどの炭水化物を挙げることができる。ある特定の無機塩を、充填剤として使用してもよく、例えば三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウム及び塩化ナトリウムが挙げられる。幾つかの市販の希釈剤としては、ファスト−フロ（Fast-Fro）、エムデックス（Emdex）、ＳＴＡ−Ｒｘ  １５００、エンコンプレス（Emcompress）及びアビセル（Avicell）が挙げられる。
【００４４】
治療薬を固体剤形に製剤化する際に崩壊剤を含めてもよい。崩壊剤として使用される物質として、限定はされないがデンプンが挙げられ、デンプンをベースとした市販の崩壊剤であるエキスプロタブを含む。デンプングリコール酸ナトリウム、アンバーライト、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラミロペクチン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジピール、酸型カルボキシメチルセルロース、天然のスポンジ及びベントナイトは、すべて使用できる。崩壊剤の別の形態は、不溶性の陽イオン交換樹脂である。粉末状ガムは、崩壊剤及び結合剤として使用でき、寒天、カラヤ又はトラガカントなどの粉末状ガムを含みうる。アルギン酸及びそのナトリウム塩も崩壊剤として有用である。
【００４５】
堅い錠剤を形成するために治療剤を結合させるのに結合剤を使用してもよく、例えば、アカシア、トラガカント、デンプン及びゼラチンなどの天然物由来の物質を含む。他のものとしては、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）及びカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）が挙げられる。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）及びヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）は両方とも、治療薬を粒状にするためにアルコール溶液において使用することができる。
【００４６】
製剤化プロセスの間の接着を防止するために、抗摩擦剤（anti-frictional agent）を治療薬の製剤に含めてもよい。潤滑剤を治療薬とダイ壁との間の層として使用してもよく、ステアリン酸並びにそのマグネシウム及びカルシウム塩、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、液体パラフィン、植物油及びワックスを含みうるが、これらに限定されない。ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、さまざまな分子量のポリエチレングリコール、Ｃａｒｂｏｗａｘ  ４０００及び６０００などの可溶性の潤滑剤も使用することができる。
【００４７】
製剤化の際の薬物の流動特性を改善し、圧縮の際の再配列を補助しうる滑剤を添加してもよい。滑剤としては、例えば、デンプン、タルク、焼成シリカ及び水和ケイ酸アルミニウム（hydrated silicoaluminate）が挙げられる。
【００４８】
水性環境内への治療薬の溶解を補助するために、サーファクタントを湿潤剤として添加してもよい。サーファクタントとしては、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム及びスルホン酸ジオクチルナトリウムなどの陰イオン性界面活性剤が挙げられうる。使用可能な陽イオン性性界面活性剤としては、塩化ベンザルコニウム及び塩化ベンゼトニウムが挙げられうる。製剤にサーファクタントとして含まれる可能性のある非イオン性界面活性剤としては、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０及び６０、モノステアリン酸グリセリル、ポリソルベート４０、６０、６５及び８０、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース、並びにカルボキシメチルセルロースが挙げられる。これらのサーファクタントは、本発明の化合物又は誘導体の製剤中に、単独で、又はさまざまな比率の混合物として、存在していてよい。
【００４９】
経口的に用いることができる医薬製剤として、ゼラチンで作られた押し込み式（push-fit）カプセル、並びに、ゼラチン及び可塑剤（例えば、グリセロール又はソルビトールなど）で作られた軟質の密封カプセル等が挙げられる。押し込み式カプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、及び／又は、タルク又はステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、並びに必要に応じて安定剤と混合して、活性成分を含みうる。軟質カプセルでは、活性化合物は、脂肪油、液体パラフィン又は液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体に溶解又は懸濁させることができる。さらに、安定剤を添加してもよい。経口投与用に製剤化されたマイクロスフィアも使用することができる。このようなマイクロスフィアは、当技術分野で十分に定義されている。経口投与用のすべての製剤は、このような投与に適した用量である。
【００５０】
経口投与用の液体製剤は、例えば、エリキシル剤、溶液、シロップ剤又は懸濁液の形態をとる、或いは、水又は他の適切なビヒクルで使用前に構成するための乾燥製品として提供してもよい。そのような液体製剤は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用脂）；乳化剤（例えば、レシチン又はアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンドオイル、油性のエステル、エチルアルコール、又は植物油分画（fractionated vegetable oil））；及び保存剤（例えば、メチル−若しくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート、又はソルビン酸）のような、薬学的に許容される添加剤を用いて、従来の手段により調製することができる。製剤は、緩衝塩、保存剤、香味料、着色料及び甘味料も適宜含んでいてよい。
【００５１】
医薬組成物は、望ましい場合は、化合物を含む１又は複数の単位剤形を含有するパック又はディスペンサー装置中に提供してもよい。パックは、例えば、ブリスターパックのような金属又はプラスチックオイルを含んでいてよい。パック又はディスペンサー装置には、投与の指示を添付してよい。
【００５２】
上述の製剤に加えて、持続性送達のために、本発明の化合物はまた、例えば埋め込み又は筋肉内注入等による投与のためのデポー製剤として製剤化してもよい。このような長時間作用型の製剤は、適切なポリマー性又は疎水性の材料（例えば許容される油中のエマルションとして）又はイオン交換樹脂を用いて、或は、例えば難溶性塩などの難溶性誘導体として、製剤化することができる。或いは、経皮吸収のために化合物を徐々に放出する接着ディスク又はパッチとして製造された経皮輸送システムも使用できる。この目的のため、透過促進剤を用いて化合物の経皮浸透を促進させてもよい。
【００５３】
医薬組成物はまた、適切な固体又はゲル相担体又は賦形剤も含んでいてよい。このような担体又は賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、さまざまな糖類、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、及び、ポリエチレングリコールなどのポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
適切な液体又は固体の医薬製剤の形態は、例えば、吸入用の水溶液又は生理食塩水、マイクロカプセル化、渦巻形に内包化（encochleated）、微細な金粒子上のコーティング、リポソームに内包、噴霧化、エアロゾル、皮膚への埋め込みペレット、又は、皮膚を引っ掻くための鋭器上の乾燥形態などである。医薬組成物として、顆粒、粉末、錠剤、コーティング錠、（マイクロ）カプセル、坐剤、シロップ剤、エマルション、懸濁液、クリーム、点滴剤、又は、活性化合物が持続放出される製剤も挙げられ、該製剤において、賦形剤及び添加剤、及び／又は、例えば、崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨潤剤、潤滑剤、香味剤、甘味剤又は可溶化剤などの助剤が、上述のように慣用的に用いられる。医薬組成物は、さまざまな薬物送達システムにおける使用に適している。薬物送達のための方法の簡単な見直しについては、参照によって本明細書に組み込まれるLanger R, Science 249:1527-33(1990)を参照されたい。
【００５５】
本発明の化合物及び必要に応じて他の治療薬は、そのまま（ストレート）で、又は薬学的に許容される塩の形態で投与することができる。医薬に用いられる場合、塩は薬学的に許容されるべきであるが、薬学的に許容されない塩は、それらの薬学的に許容される塩の調製に便利に用いることができる。このような塩としては、限定はされないが、以下の酸から調製されるものが挙げられる：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸、及びベンゼンスルホン酸。そのような塩は、カルボン酸基のナトリウム、カリウム又はカルシウム塩など、アルカリ金属又はアルカリ土類塩としても調製することができる。通常、そのような塩は、対応の遊離酸又は塩基よりも水溶液への溶解性が高いが、対応の遊離酸又は塩基よりも溶解性が低い塩も形成されうる。
【００５６】
化合物は、それ自体、或いはその水和物、溶媒和、又はＮ−オキシドの形で、医薬組成物中に配合することができる。
【００５７】
適切な緩衝剤としては、以下のものが挙げられる：酢酸及び塩（１〜２％ｗ／ｖ）；クエン酸及び塩（１〜３％ｗ／ｖ）；ホウ酸及び塩（０．５〜２．５％ｗ／ｖ）；並びに、リン酸及び塩（０．８〜２％ｗ／ｖ）。適切な保存料としては、塩化ベンザルコニウム（０．００３〜０．０３％ｗ／ｖ）；クロロブタノール（０．３〜０．９％ｗ／ｖ）；パラベン（０．０１〜０．２５％ｗ／ｖ）及びチメロサール（０．００４〜０．０２％ｗ／ｖ）が挙げられる。
【００５８】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体中に含まれる、有効量の本発明の化合物、及び、必要に応じて他の１種類以上の治療剤を含む。用語「薬学的に許容される担体」は、ヒト又は他の脊椎動物への投与に適した１種類以上の相容性の固体又は液体の充填剤、希釈剤又は内包用物質を意味する。用語「担体」は、適用を容易にするために活性成分と組み合わせる、天然又は合成の有機又は無機の成分を意味する。医薬組成物の成分はまた、実質的に所望の薬剤効率を損なうような相互作用が存在しない態様で、本発明の化合物と、及び互いに、混合可能である。
【００５９】
本発明の化合物を含むがそれに限定されない治療剤を、粒子内に提供してもよい。本明細書で用いられる粒子は、ナノ粒子又はマイクロ粒子（又は、場合によっては、より大きい粒子）を意味し、該粒子は、その全て又は一部が、本明細書に記載される本発明の化合物又は他の治療剤で構成されていてよい。粒子は、腸溶性コーティングを含むがそれに限定されないコーティングによって取り囲まれたコア内に、治療剤を含むことができる。治療剤はまた、粒子全体に分散されてもよい。治療剤はまた、粒子内に吸着されていてもよい。粒子は、ゼロ次放出、一次放出、二次放出、遅延放出、徐放、即時放出、及びそれらのいずれかの組合せ等を含む、任意の次数の放出速度論を示すことができる。粒子は、治療剤に加えて、薬学及び医学の分野で日常的に使用される物質を含んでいてよく、それら物質は、崩壊性（erodible）、非崩壊性、生分解性、又は非生分解性の物質又はそれらの組合せを含むが、それらに限定されない。粒子は、溶液中又は半固体状態内に本発明の化合物を含むマイクロカプセルであってもよい。粒子は、事実上、どのような形状であってもよい。
【００６０】
非生分解性及び生分解性の両方のポリマー材料を、治療剤の送達のための粒子の製造に使用することができる。このようなポリマーは、天然のポリマーであっても合成のポリマーであってもよい。ポリマーは、放出が望まれる期間に基づいて選択される。特に注目される生体接着性のポリマーとしては、その教示が本明細書に援用される、Sawhney H S et al. (1993) Macromolecules 26:581-7に記載される生体内分解性のハイドロゲルが挙げられる。これらには、ポリヒアルロン酸、カゼイン、ゼラチン、グルチン、ポリ無水物、ポリアクリル酸、アルギン酸塩、キトサン、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（メタクリル酸エチル）、ポリ（メタクリル酸ブチル）、ポリ（メタクリル酸イソブチル）、ポリ（メタクリル酸ヘキシル）、ポリ（メタクリル酸イソデシル）、ポリ（メタクリル酸ラウリル）、ポリ（メタクリル酸フェニル）、ポリ（アクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸イソプロピル）、ポリ（アクリル酸イソブチル）、及びポリ（アクリル酸オクタデシル）が含まれる。
【００６１】
治療剤は、制御放出システム内に含めてもよい。用語「制御放出」は、製剤からの薬物放出の態様及びプロファイルが制御された、任意の薬物含有製剤を指すことが意図されている。これは、即時放出性製剤、並びに非即時放出性製剤を指し、非即時放出性製剤には、徐放性及び遅延放出性の製剤が含まれるがこれらに限定されない。用語「徐放性」（「持続放出」とも称される）は、長期間にわたって薬物の徐放（gradual release）をもたらし、かつ、好ましくは、必ずというわけではないが、長期間にわたり薬物の実質的に一定の血中濃度をもたらす、薬物製剤を称する、通常の意味で用いられる。用語「遅延放出性」は、製剤の投与と、製剤からの薬物の放出との間に時間の遅延が存在する薬物製剤のことを称する、通常の意味で用いられる。「遅延放出性」は、長期間にわたる薬物の徐放を含んでも含まなくてもよく、したがって、「徐放性」であってもなくてもよい。
【００６２】
長期徐放性インプラントの使用は、慢性状態の治療に特に適するであろう。「長期」放出は、本明細書で用いられる場合、インプラントが、少なくとも７日間、好ましくは３０〜６０日間、治療レベルの活性成分を送達するように構成及び配置されることを意味する。長期徐放性インプラントは、当業者に広く知られており、上述の放出システムの幾つかを含む。
【００６３】
当業者は、当業者に公知である情報を鑑みて、本明細書に記載されている組成物及び方法への他の適切な修飾及び適応が、本明細書に含まれる発明の記載から明白であり、本発明又は任意のその実施態様の範囲から逸脱することなくなされうることを理解するであろう。
【００６４】
方法及び使用
本明細書に示されているように、必要とする患者に投与される小分子は、鉄トランスポーターを欠く対象において、生理機能を回復させるのに有用であり、ならびに単層を横断するイオンの輸送を回復させる。
【００６５】
したがって、本発明は、治療有効量の少なくとも１つの小分子又はその医薬組成物を、必要とする対象に投与することを含む、鉄トランスポーターの欠損又は欠陥に関連する疾患、障害、又は状態を治療又は予防する方法を提供する。
【００６６】
ある実施形態では、鉄トランスポーターの欠損又は欠陥に関連する疾患、障害、又は状態として、遺伝性ヘモクロマトーシス、鉄欠乏性貧血、低色素性小球性貧血、慢性疾患の貧血、鉄過剰が挙げられる。ある実施形態では、鉄トランスポーターの欠損又は欠陥に関連する疾患、障害、又は状態として、疲労、無気力；眩暈；頭痛；息切れ；耳鳴り；味覚障害；下肢静止不能症候群；蒼白；扁平化爪(flattened)；脆弱爪；口角糜爛症；舌炎；青色強膜；結膜蒼白；異食症；最大有酸素能力の低下；運動能力の低下；持久力の低下；体温調節障害；及び認知機能障害及び記憶障害が挙げられる。
【００６７】
ある態様では、本発明は、治療有効量の小分子又はその医薬組成物を対象に投与することを含む、必要とする対象において、経上皮鉄輸送を増進させる方法を提供する。
【００６８】
ある態様では、本発明は、治療有効量の小分子又はその医薬組成物を対象に投与することを含む、必要とする対象において、成長を増進させる方法を提供する。
【００６９】
ある態様では、本発明は、治療有効量の小分子又はその医薬組成物を対象に投与することを含む、必要とする対象において、生理機能を増進させる方法を提供する。
【００７０】
ある態様では、本発明は、治療有効量の小分子又はその医薬組成物を対象に投与することを含む、必要とする対象において、ヘモグロビン合成を増進させる方法を提供する。
【００７１】
ある態様では、本発明は、治療有効量の小分子を対象に投与することを含む、必要とする患者において、鉄放出を増進させる方法を提供する。
【００７２】
ある態様では、本発明は、細胞において、経上皮鉄輸送、生理機能又はヘモグロビン合成の１つ又は複数をインビトロで増進させる方法を提供する。
【００７３】
ある態様では、本発明は、細胞又は臓器において、経上皮鉄輸送、生理機能又はヘモグロビン合成の１つ又は複数をエキソビボで増進させる方法を提供する。
【００７４】
本発明の別の態様は、必要とする対象において鉄トランスポーターの欠損又は欠陥に関連する疾患又は状態を治療することができる化合物をスクリーニングする方法に関し、以下の工程を含む：
ａ）鉄結合及び輸送の増進を決定する；
ｂ）増殖の回復の増進を決定する；及び
ｃ）ヒト疾患に関連する系（human disease-relevant systems）における生理機能の増進を決定する。
【００７５】
ある実施形態では、そのような方法により同定される小分子は、鉄トランスポーターの欠損又は欠陥に関連する疾患又は状態を治療するのに有効である。
【００７６】
或いは、鉄トランスポーターの欠損又は欠陥に関連する疾患又は状態を治療する小分子の有効性は、鉄結合輸送を測定する、増殖の回復を測定する、及びヒト疾患に関連する系での生理機能を測定することにより、決定することができる。そのような実施形態において、結合輸送、増殖の回復、及びヒト疾患に関連する系における生理機能は、小分子の投与の前及び後に測定することができる。結合輸送、増殖の回復、及びヒト疾患に関連する系における生理機能が、小分子の投与後に増加する場合、そのような薬剤は鉄トランスポーターの欠損又は欠陥に関連する疾患又は状態を治療するのに有効である。
【００７７】
ある実施形態では、治療を受ける対象は哺乳動物である。例えば、本明細書に記載される方法及び使用は、ヒトにおける医学用途に適している。或いは、その方法及び使用は、獣医的文脈でも適しており、対象として、限定はされないが、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ及びヤギ等が挙げられる。
【００７８】
ある実施形態では、対象は、鉄トランスポーターが欠損している。ある実施形態では、対象は、トランスフェリン受容体１（ＴＦＲ１）又はトランスフェリン受容体２（ＴＦＲ２）が欠損している。ある実施形態では、対象は、二価カチオンインポーター（divalent cation importers）が欠損している。ある実施形態では、対象は、ＤＭＴ１又はＺＩＰ１４（Ｚｒｔ−Ｉｒｔ様タンパク質１４）が欠損している。ある実施形態では、対象は、ＦＰＮ１が欠損している。ある実施形態では、対象は、ミトフェリン、ＴＭＰＲＳＳ６、フラタキシン、セルロプラスミン、Ｄｃｙｔｂ、ＦＴＨ１、又はＨＣＰ１が欠損している。
【実施例】
【００７９】
実施例１．脂質二重層を横断して鉄を自律的に輸送する能力を有する小分子の同定
そのような輸送を実施する小分子を同定するために、改良された機能相補実験を実施した。鉄輸送複合体Ｆｅｔ３Ｆｔｒ１を欠く増殖欠損サッカロミセス・セレビシエ（S.cerevisia）（ｆｅｔ３Δｆｔｒ１Δ）を用いて、鉄に結合すると思われる小分子をスクリーニングした後、天然物であるヒノキチオール（図１Ｅ）が、酵母における公知のシデロフォアトランスポーターと無関係に（図４Ａ）、細胞増殖を回復させた（図１Ｆ、１Ｇ）。増殖の回復は、好気条件下で生じ（図４Ｂ）、細胞内イオンの利用を示唆する。ヒノキチオール処理ｆｅｔ３Δｆｔｒ１Δ酵母は、類似の倍加時間で（図４Ｃ）野生型のレベルまで増殖する（図１Ｈ）。増殖回復は、一般的なホルミシス効果によるものではなく（図４Ｄ）、ヒノキチオールに対する継続した依存を以って、＞４０日持続しうる（図４Ｅ）。
【００８０】
実施例２．鉄の結合及び輸送の決定
ヒノキチオールが促進するｆｅｔ３Δｆｔｒ１Δ増殖の回復の背後にある基礎をより理解するために、鉄の結合及び輸送を確認した（図５Ａ、５Ｃ）。トリス（ヒナコラト）鉄（ＩＩＩ）錯体（tris(hinacolato) iron (III) complex）の結晶構造（図５Ｄ）は、親水性の鉄結合中心コアを包み込む疎水性の外側シェルを明らかにする。このアッセイで増殖を回復させることができない水溶性イオンキレート剤（図４Ｉ、及び図４Ｅ、４Ｆ）とは反対に、トリス（ヒナコラト）鉄（ＩＩＩ）は、オクタノールに優勢的に分配する（図４Ｅ、４Ｆ）。Ｃ２−デオキシヒノキチオール（Ｃ２ｄｅＯＨｉｎｏ、図１Ｅ）を作成するＣ−２酸素の合成削除（図５Ｇ）は、鉄の結合及び輸送をなくし、これを、ヒノキチオールの生物活性における鉄輸送の役割に関する有力なプローブとする。
【００８１】
実施例３．ヒト疾患に関連する系における生理機能の回復
ヒト疾患に関連する系において生理機能を回復させるヒノキチオールの能力を評価した。血中への放出及びトランスフェリン媒介の循環の前に、ＤＭＴ１−依存性非ヘム鉄吸収が十二指腸細胞の微絨毛において生じる。トランスフェリン結合鉄はその後、発達中のエリトロン（developing erythrons）における、サイトゾルへのＤＭＴ１媒介エンドソーム鉄放出、及び続くミトコンドリア内への鉄輸送の後、末梢で利用される。ＤＭＴ１欠損は、鉄吸収の減少及び赤血球前駆細胞におけるヘモグロビン合成の減少を生じさせ、総合して、低色素性小球性貧血を引き起こす。栄養吸収及び赤血球の成熟のＤＭＴ１欠損モデルにおいて、ヒノキチオールが、鉄吸収及び細胞内鉄輸送の両方を回復させることができ、結果として、正常な生理機能を回復させることができたと仮説をたてた。
【００８２】
ヒノキチオール促進経上皮鉄輸送
分化Ｃａｃｏ−２腸上皮単層におけるヒノキチオール促進経上皮鉄輸送を最初に評価した。安定なｓｈＲＮＡトランスフェクションによってＤＭＴ１欠損細胞を確立した（図６Ａ）。十二指腸イオン吸収に見合った条件を用いて、ｓｈＤＭＴ１単層と比較して、対照の単層の頂端側への５５Ｆｅの添加は、細胞内への高い５５Ｆｅの取込み（図２Ａ）及び高い経上皮輸送（図２Ｂ）を示した。ヒノキチオール（５００ｎＭ）を頂端側へ添加すると、単層の一体性を破壊することなく（図２Ｄ）、取込み及び輸送の両方が、対照におけるそれらの値（図２Ｃ）に類似する割合に回復した（図２Ａ、２Ｂ）。ヒノキチオール媒介の取込み及び輸送は、ＤＭＴ１発現に非依存的であり（図６Ｂ）、及び十二指腸全体に亘りみられるｐＨ値の範囲で維持された（図６Ｃ）。Ｃ２ｄｅＯＨｉｎｏは、取込みも輸送も促進させることはできず（図２Ａ、２Ｂ）、水溶性鉄キレート剤であるデフェリプロン及びピリドキサールイソニコチノイルヒドラゾン（ＰＩＨ）でも促進できなかった（図６Ｄ）。
【００８３】
更なる研究は、経上皮鉄輸送の観察された回復を達成するための鉄輸送タンパク質の内因性ネットワークとの協働を示した。側底側への５５Ｆｅ及びヒノキチオールの添加は、小分子のみが経上皮鉄輸送を媒介するのとは矛盾して、側底から頂端側への鉄の輸送を促進することはできなかった（図６Ｅ）。正常の上皮において、頂端膜のＤＭＴ１トランスポーターにより細胞内に取り込まれた鉄は、サイトゾルのフェリチンクラスター中に貯蔵され、ＦＰＮ１により側底膜を通って一方向的に輸出される。このタンパク質のネットワークを介した経上皮鉄の流れは、細胞内鉄濃度に感受性である鉄応答エレメント（iron response element）によって調節される。対照の単層では、頂端側への５５Ｆｅの添加の後のフェリチンの免疫沈降は、高い鉄の組込みを示し、ＤＭＴ１欠損単層では実質的に減少したフェリチンの鉄の組込みが観察され、さらにヒノキチオール処理は、フェリチンへの５５Ｆｅの高い組込みを回復した（図６Ｆ）。ケルセチンを用いた対照単層におけるＦＰＮ１発現のダウンレギュレーションにより、取込みに影響を及ぼすことなく（図６Ｈ）、経上皮輸送が減少した（図６Ｇ）。ヒノキチオールは、この系で経上皮輸送を回復させることができず（図６Ｇ）、ヒノキチオール媒介の輸送の回復におけるＦＰＮ１の役割を裏付ける。最後に、ＤＭＴ１欠損単層への５５Ｆｅの取込みは、ヒノキチオール投与量に比例した（図６Ｉ）が、経上皮５５Ｆｅ輸送は、高い細胞内鉄濃度に達したとき、減少した（図６Ｊ）。総合して、このデータは、ヒノキチオール媒介経上皮鉄輸送が、内因性の鉄応答エレメント制御経路によって調節されうることを示唆する。
【００８４】
実施例４．ＤＭＴ１欠損赤血球前駆細胞におけるヘモグロビン合成の回復
ヒノキチオールがＤＭＴ１欠損赤血球前駆細胞（erythroid progenitors）においてヘモグロビン合成を回復させる能力を評価した。エキソビボで、ＤＭＴ１欠損Ｂｅｌｇｒａｄｅ（ｂ／ｂ）及び健康な（＋／ｂ）ラットから単離した網状赤血球を、５９Ｆｅ−トランスフェリンを添加した血漿中においてインキュベートして、ヒノキチオールが鉄利用を促進する能力を評価した。ヒノキチオールは、溶血を生じない濃度において用量依存的態様で、ヘムへの５９Ｆｅの組込みを増加させた（図７Ａ）が、Ｃ２ｄｅＯＨｉｎｏは明らかな効果を有さなかった。
【００８５】
この現象の更なる基本的理解を得るために、ＤＳ１９マウス赤白血病（ＭＥＬ）細胞を用いた。これら細胞は、鉄の取込み及びグロブリン発現の増加につながる２％ＤＭＳＯでの誘導後に、最終的に赤血球を発生する方向に分化する。ｓｈＲＮＡノックダウンによりＤＭＴ１欠損細胞株を開発した（図７Ｂ）。これら細胞は、ＤＭＴ１ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの低減、及び分化率の低下を示した。ｓｈＤＭＴ１細胞と比較した、ヘモグロビンを発現した細胞の著しい染色によって示されるように、対照細胞は正常に分化した（図２Ｅ−２Ｇ、及び図７Ｃ）。ヒノキチオールの添加後、７２時間インキュベートすると、時間依存的（図２Ｈ）及び用量依存的（図２Ｉ）態様で、毒性をもたらすことなく、ｏ−ジアニシジンでのヘモグロビン発現細胞の陽性染色によって特定されるように、これら細胞の分化を回復させた（図２Ｅ−２Ｇ；図７Ｃ；及び図８Ａ）。分化の回復は、これら細胞への５５Ｆｅの取込み（図８Ｂ）及びヘムへの５５Ｆｅの組込み（図８Ｃ）の定量化によってさらに実証された。重要なこととして、ヒノキチオールは、ＤＭＳＯ誘導無しでは分化を促進することができなかった。Ｃ２ｄｅＯＨｉｎｏは、いずれの場合も生理機能を回復させることはできなかった（図２Ｇ）。
【００８６】
さらに、ヒノキチオールは、エキソビボでＤＭＴ１欠損Ｂｅｌｇｒａｄｅ（ｂ／ｂ）ラットから単離された網状赤血球中のヘムへの５９Ｆｅの組込みを回復させた（図９Ａ）。これらＭＥＬ細胞の使用は、ヒノキチオールが、前から存在する濃度勾配の下方へ自律的に鉄を輸送するという仮説を試験することを可能にする。これを行うために、鉄特異的色素を用いた生細胞蛍光画像を用いて、細胞内の鉄分布を可視化した。特に、ｏｘｙｂｕｒｓｔ  ｇｒｅｅｎの使用（図１０Ａ、１０Ｂ）は、高い蛍光強度によって示されるように、ＤＭＴ１欠損細胞のエンドソーム中の高い鉄レベルを示し、エンドソームからサイトゾルへと鉄を放出するＤＭＴ１の役割と合致する。さらに、それぞれ、ｃａｌｃｅｉｎ  ｇｒｅｅｎ及びＲＰＡの最小のクエンチングによって示されるように、比較的低いレベルのサイトゾルの鉄（図１０Ａ、１０Ｃ）、及びミトコンドリアの鉄（図１０Ａ、１０Ｄ）を観察した。ヒノキチオールの添加は、著しく、エンドソームの鉄レベルを減少させ、及びサイトゾル及びミトコンドリアの鉄レベルを増加させ、それらは、正常にＤＭＴ１を持つ脂質膜を横断して鉄を放出することに一致する（図１０Ａ〜１０Ｄ）。
【００８７】
実施例５．ＤＭＴ１欠損動物における生理機能の回復
ヒノキチオールが、インビトロで鉄の吸収及びヘモグロビン合成を回復させる能力を観察した後、ＤＭＴ１欠損動物における生理機能の回復に関してヒノキチオールを評価した。Ｂｅｌｇｒａｄｅ（ｂ／ｂ）ラット（図３Ａ）は、疾患の優れたモデルであり、数あるマーカーの中で、ヘマトクリット値の低下のような、重篤な血液異常を示す。ヒノキチオールは、妥当な薬物動態半減期を有し、健康なラットにおいて比較的毒性がなく（図３Ｂ）、及び透過性アッセイは、インビボで良好な経口バイオアベイラビリティを示唆した。ラットの食餌中の（食餌の０．２％）、ヒノキチオール並びに鉄に結合もまたその輸送もしない誘導体であるＣ２ｄｅＯＨｉｎｏへの、ｂ／ｂラットの慢性曝露を実施した。このヒノキチオールの投与量は、１３週間の経口での処置の後、非致死性であることが既に示されており（Y.M. Cho et al., A 13-week subchronic toxicity study of hinokitiol administered in the diet to F344 rats. Food Chem Toxocol 49, 1782-1786 (2011)）、毎日合計〜１２５ｍｇ／ｋｇの処置になった。処置の４週間後、ヘマトクリット値に有意な増加が観察され、非貧血状態を示す値を超えた（図３Ｃ）。際立って、１ヶ月の処置の後、０．２％ヒノキチオール（〜１００ｍｇ／ｋｇ／日）は、ｂ／ｂラットのヘマトクリット値を、最早貧血とはみなされないレベルまで回復させた（図９Ｂ）が、Ｃ２ｄｅＯＨｉｎｏは、未処置のｂ／ｂラットに普通に観察される低いヘマトクリット値をもたらした。これは、＞２ヶ月持続した。
【００８８】
実施例６．疾患モデルで生理機能を回復させる
他の鉄トランスポーター欠損の疾患モデルにおける生理機能の回復についてヒノキチオールを評価した。多くのミトコンドリア病は、貧血をもたらす鉄利用障害を生じさせる。例えば、ミトコンドリア内膜にみられるミトフェリンの欠損は、ミトコンドリアマトリックスへの鉄の取込みを減少させる。これは、ヘモグロビンレベルを低下させ、低色素性貧血を生じさせる。したがって、貧血のこの別の原因を治療するためにヒノキチオールを試験した。
【００８９】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性ノックアウトによってミトフェリン欠損ＭＥＬ細胞株が確立され、ヘモグロビン合成の減少を示した（図４Ａ）。ＤＭＴ１欠損細胞のヘモグロビン合成を回復させるために使用したのと同一の条件下で、ヒノキチオールはヘモグロビン合成を回復させた（図４Ａ）。このことは、ヘムへの５５Ｆｅの取込み及び組込みの増加によってさらに裏付けられた（図４Ｂ、４Ｃ）。Ｃ２ｄｅＯＨｉｎｏは、これらの効果を生じさせなかった（図４Ａ〜４Ｃ）。正常なヘモグロビン合成の回復における、ヒノキチオールの鉄輸送促進の役割の更なる証拠として、ヘム生合成に関連する酵素の遺伝子欠損（ＴＭＥＭ１４ＣΔ）を用いた。ヒノキチオール処置は、ヘモグロビン合成を回復させなかった（図４Ａ〜４Ｃ）。
【００９０】
実施例７．ＦＰＮ１欠損系からの鉄放出の促進
ヘモクロマトーシスは、米国における重要な遺伝子疾患であり、ＦＰＮ１の欠損によって生じうる。ＦＰＮ１は、腸細胞から血中への鉄の主要なエクスポーターであり、さらに、老化赤血球細胞の赤血球貪食の後に、肝臓の細網内皮系のマクロファージから鉄を放出する役割を果たす。ヒノキチオールが促進する鉄吸収及び細胞内再分布の著しい一般性を観察するために、ＦＰＮ１欠損系からの鉄の放出を促進することについてヒノキチオールをさらに評価した。
【００９１】
ヒノキチオールがＦＰＮ１欠損において鉄放出を回復させる能力を試験するために、Ｊ７７４マクロファージを用いた。５５Ｆｅ−トランスフェリンを有するＪ７７４細胞を、ヘプセチンの存在下又は不在下においてインキュベートした。ヘプシジンは、主要な鉄調節因子であり、分解を促進することによりＦＰＢ１をダウンレギュレートする。したがって、ＦＰＮ１はヘプシジンでダウンレギュレートされ、鉄放出の減少をもたらす（図３Ｄ）。ヒノキチオールの添加は、用量依存的態様で、観察可能な毒性をもたらすことなく（図３Ｅ）、この細胞内の鉄を正常レベルに戻すまで放出した（図３Ｄ）。
【００９２】
総合して、結果は、自律的にタンパク質様機能を果たす小分子は、インビトロで、ならびに顕著に複雑な多細胞生物においてインビボで、生理機能を広く回復させることができる。
他の実施形態
１．鉄トランスポーターの欠損又は欠陥により特徴づけられる疾患又は状態を治療する方法であって、必要とする対象に、治療有効量の小分子を投与することを含み、それにより、前記疾患又は状態を治療する、方法。
２．前記鉄トランスポーターの欠損又は欠陥により特徴づけられる疾患又は状態が、低色素性小球性貧血である、実施形態１記載の方法。
３．必要とする対象において経上皮鉄輸送を増進させる方法であって、有効量の小分子を前記対象に投与することを含む、方法。
４．必要とする対象において生理機能を増進させる方法であって、有効量の小分子を前記対象に投与することを含む、方法。
５．必要とする対象においてヘモグロビン合成を増進させる方法であって、有効量の小分子を前記対象に投与することを含む、方法。
６．必要とする対象において鉄放出を増進させる方法であって、有効量の小分子を前記対象に投与することを含む、方法。
７．前記小分子は、アムホテリシンＢ（ＡｍＢ）、カルシマイシン、ノナクチン、デフェリプロン、プルプロガリン、及びマルトール、並びにそれらの任意の組合せからなる群より選択される、実施形態１−６いずれかに記載の方法。
８．前記小分子は、カルシマイシン、デフェリプロン、プルプロガリン、及びマルトール、並びにそれらの任意の組合せからなる群より選択される、実施形態７記載の方法。
９．前記小分子はヒノキチオールである、実施形態１−６いずれかに記載の方法。
１０．前記小分子が全身投与される、実施形態１−９いずれかに記載の方法。
１１．前記小分子が経口投与される、実施形態１−９いずれかに記載の方法。
１２．前記小分子が静脈内投与される、実施形態１−９いずれかに記載の方法。
１３．前記対象は哺乳動物である、実施形態１−１２いずれかに記載の方法。
１４．前記対象はヒトである、実施形態１３記載の方法。
１５．前記対象は、二価金属トランスポーター１（ＤＭＴ１）が欠損している、実施形態１−１４いずれかに記載の方法。
１６．インビトロで細胞における経上皮鉄輸送、生理機能、又はヘモグロビン合成を増進させる方法であって、前記細胞に有効量の小分子を接触させることを含む、方法。
１７．エキソビボで臓器における経上皮鉄輸送、生理機能、又はヘモグロビン合成を増進させる方法であって、前記臓器に有効量の小分子を接触させることを含む、方法。
１８．前記小分子は、アムホテリシンＢ（ＡｍＢ）、カルシマイシン、ノナクチン、デフェリプロン、プルプロガリン、及びマルトール、並びにそれらの任意の組合せからなる群より選択される、実施形態１６又は１７記載の方法。
１９．前記小分子は、カルシマイシン、デフェリプロン、プルプロガリン、及びマルトール、並びにそれらの任意の組合せからなる群より選択される、実施形態１８記載の方法。
２０．前記小分子はヒノキチオールである、実施形態１６又は１７記載の方法。
２１．対象において鉄トランスポーターの欠損又は欠陥により特徴づけられる疾患又は状態を治療することができる化合物を同定する方法であって、
ａ）細胞に小分子を接触させる；及び
ｂ）前記細胞における鉄の結合及び輸送の増加を決定する；
各工程を含み、前記細胞は哺乳動物の疾患又は状態を表わす、方法。
２２．細胞増殖の増進又は回復を決定することをさらに含む、実施形態２１記載の方法。
２３．前記細胞における生理機能の改善又は増進を決定することをさらに含み、前記細胞はヒトの疾患又は状態を表わす、実施形態２１又は２２記載の方法。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図４−６】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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