(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ７０に対する抗原特異性を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、以下：
ＣＤ２７細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインの全部を欠くＣＤ２７アミノ酸配列を含む抗原結合・細胞膜貫通ドメイン；
ＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン；並びに
（ｉ）４−１ＢＢ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン及び（ｉｉ）ＣＤ２８細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインの一方又は両方
を含む、前記ＣＡＲ。
【請求項２】
４−１ＢＢ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン及びＣＤ２８細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項３】
４−１ＢＢ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項４】
前記ＣＤ２８細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインが少なくとも配列番号６と約９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載のＣＡＲ。
【請求項５】
前記ＣＤ２８細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインが、配列番号６と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のＣＡＲ。
【請求項６】
前記４−１ＢＢ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインが、配列番号５と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項７】
前記４−１ＢＢ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインが、配列番号５と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のＣＡＲ。
【請求項８】
前記ＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインが、配列番号４と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項９】
前記ＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインが、配列番号４と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のＣＡＲ。
【請求項１０】
前記ＣＤ２７抗原結合・細胞膜貫通ドメインが、配列番号３と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項１１】
前記ＣＤ２７抗原結合・細胞膜貫通ドメインが、配列番号３と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載のＣＡＲ。
【請求項１２】
少なくとも配列番号８〜１０のいずれか１つと約９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項１３】
配列番号８〜１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のＣＡＲ。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
【請求項１５】
配列番号１５〜１７のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１４に記載の核酸。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸を含む、組換え発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１６に記載の組換え発現ベクターを含む、単離された宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１７に記載の宿主細胞を少なくとも１つ含む、細胞集団。
【請求項１９】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＣＡＲ、請求項１７に記載の宿主細胞、又は請求項１８に記載の細胞集団、及び医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項２０】
哺乳動物におけるがんの存在を検出する方法であって、以下：
（ａ）哺乳動物由来の１つ以上の細胞を含む試料と、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＣＡＲ、請求項１７に記載の宿主細胞、請求項１８に記載の細胞集団、又は請求項１９に記載の医薬組成物とを接触させて複合体を形成させ；及び
（ｂ）前記複合体を検出する、
ことを含み、前記複合体の検出が哺乳動物におけるがんの存在の指標である、方法。
【請求項２１】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＣＡＲ、請求項１７に記載の宿主細胞、又は請求項１８に記載の細胞集団を含む、哺乳動物におけるがんの治療又は予防のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願のクロス・リファレンス
本願は、２０１４年１２月８日に出願した米国仮特許出願第62/088,882号について優先権を主張し、その全体が本明細書に援用される。
【０００２】
電子的に提出された資料の援用
本明細書と同時に提出され、コンピューターで読み取り可能な以下のヌクレオチド／アミノ酸配列リストは、その全体が本明細書に援用される：２０１４年１２月３日付けの「719062ST25.TXT」という名前の55,121バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル１件
【背景技術】
【０００３】
がんは健康に関して公衆が関心を寄せることである。化学療法などの治療法において進歩しているにも関わらず、腎細胞癌（ＲＣＣ）、膠芽細胞種、非ホジキン・リンパ腫（ＮＨＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫及び濾胞性リンパ腫を含む多くのがんの予後は悪い場合がある。従って、がん、特にＲＣＣ、膠芽細胞種、ＮＨＬ、ＣＬＬ、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫及び濾胞性リンパ腫についての追加的な治療法に対する満たされていない必要性が存在している。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の一実施形態は、ＣＤ７０に対する抗原特異性を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、以下：ＣＤ２７細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインの全て又は少なくとも配列番号２によって定義される２３７から２６０番目のアミノ酸残基からなる一部分を欠くＣＤ２７アミノ酸配列を含む抗原結合・細胞膜貫通ドメイン；４−１ＢＢ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン；ＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン；及び任意でＣＤ２８細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む、前記ＣＡＲを提供する。
【０００５】
本発明の別の実施形態は、配列番号１１〜１３の任意の１つと少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤ７０に対する抗原特異性を有するＣＡＲを提供する。
【０００６】
本発明の更なる実施形態は、本発明のＣＡＲに関連する核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団及び医薬組成物を提供する。
【０００７】
本発明の追加的な実施形態は、哺乳動物におけるがんの存在を検出する方法、及び哺乳動物におけるがんを治療又は予防する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１Ａ及び１Ｂは、ｍＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲ形質導入細胞（黒丸）、非形質導入細胞（白丸）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（×）又はｐｍｅｌ＋ＶＩ（四角）を投与し、放射線照射（500 Rads）後の期間（日数）中のＢ１６/ｍＣＤ７０腫瘍マウス（Ａ）又はＢ１６腫瘍マウス（Ｂ）の腫瘍サイズ（ｍｍ２）を示すグラフである。図１Ｃ及び１Ｄは、マウス当たり１×１０４（▼）、１×１０５（黒四角）、１×１０６（▲）若しくは１×１０７（黒丸）細胞の投与量のｍＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲ形質導入細胞；ＰＢＳ（白四角）；空ベクターで形質導入した細胞（白丸）；又はｐｍｅｌ＋ＶＩ（菱形）を投与後、放射線照射（500 Rads）照射あり（Ｃ）又はなし（Ｄ）の場合における、その後の期間（日数）中のＢ１６/ｍＣＤ７０腫瘍マウスの腫瘍サイズ（ｍｍ２）を示すグラフである。図１Ｅは、マウス当たり１×１０４（菱形）、１×１０５（▼）、１×１０６（▲）若しくは１×１０７（黒丸）細胞の投与量のｍＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲ形質導入細胞；ＰＢＳ（白四角）；空ベクターで形質導入した細胞（白丸）；又はｐｍｅｌ＋ＶＩ（△）を投与し、放射線照射（500 Rads）した後の期間（日数）中のＢ１６/ｍＣＤ７０腫瘍マウスの生残率を示すグラフである。図１Ｆは、ｍＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲ形質導入細胞（四角）、非形質導入細胞（△）、空ベクターで形質導入した細胞（▽）又はｐｍｅｌ＋ＶＩ（丸）を投与した後、放射線を照射し、ＩＬ−２を投与した後の期間（日数）中のＢ１６/ｍＣＤ７０腫瘍マウスの腫瘍サイズ（ｍｍ２）を示すグラフである。
【図２】図２Ａ−２Ｄは、ｍＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲ形質導入細胞（黒丸）、非形質導入細胞（白四角）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（▽）又はｐｍｅｌ＋ＶＩ（△）を投与し、放射線照射（500 Rads）あり（Ａ及びＣ）又はなし（Ｂ及びＤ）の場合における、その後の期間（日数）中のＢ１６/ｍＣＤ７０腫瘍マウス（Ａ及びＢ）又はＢ１６腫瘍マウス（Ｃ及びＤ）の平均重量（ｇ）を示すグラフである。図２Ｅ−２Ｈは、ｍＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲ形質導入細胞（斜交平行模様棒グラフ）、非形質導入細胞（陰影なし棒グラフ）又は緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）をコードするベクターで形質導入した細胞（斜線縞模様棒グラフ）を投与し、放射線照射（500 Rads）あり（Ｅ及びＧ）又はなし（Ｆ及びＨ）の場合における、その後の期間（日数）中のＢ１６/ｍＣＤ７０腫瘍マウスの白血球絶対数（Ｋ／μｌ）（Ｅ及びＦ）又は脾細胞数（脾臓あたり、×１０７）（Ｇ及びＨ）を示すグラフである。図２Ｉは、ｍＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲ形質導入細胞を投与し、放射線照射あり（黒棒グラフ）又はなし（水平縞棒グラフ）の場合、又はＧＦＰをコードするベクターで形質導入した細胞を投与し、放射線照射（500 Rads）あり（チェック模様棒グラフ）又はなし（陰影なし棒グラフ）の場合における、その後の期間（日数）中のＢ１６/ｍＣＤ７０腫瘍マウスの血清インターフェロン（ＩＦＮ）ガンマ（ｐｇ／ｍｌ）レベルを示すグラフである。
【図３】図３は、空のレトロウイルスベクター（対照）（ＭＳＧＶ１）又はｆＣＤ２７−ＣＤ３ζ（配列番号７）、ΔＣＤ２７−ＣＤ２８−ＣＤ３ζ（配列番号８）、ΔＣＤ２７−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ（配列番号９）、ΔＣＤ２７−ＣＤ２８−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ（配列番号１０）、ｆＣＤ２７−ＣＤ２８−ＣＤ３ζ（配列番号１１）、ｆＣＤ２７−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ（配列番号１２）若しくはｆＣＤ２７−ＣＤ２８−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ（配列番号１３）のうちの一つで形質導入したヒトＴ細胞を、単独（培地のみ）で培養した（縦縞模様棒グラフ）、又は対照標的細胞である６２４ｍｅｌ（チェック模様棒グラフ）、６２４／ＣＤ７０（黒棒グラフ）、９３８ｍｅｌ（ドット模様棒グラフ）若しくは９３８／ＣＤ７０（白棒グラフ）、又はＲＣＣ標的細胞ＲＣＣ２２４５Ｒ（斜線棒グラフ）、ＲＣＣ２２４６Ｒ（逆斜線棒グラフ）、ＲＣＣ２３６１Ｒ（ボックス模様棒グラフ）若しくはＲＣＣ１７６４（杉彩模様棒グラフ）と共培養したときに分泌したＩＦＮ−γ（ｐｇ／ｍｌ）を示すグラフである。
【図４】図４は、非形質導入（ＵＴ）細胞又はΔＣＤ２７−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ（配列番号９）で形質導入したレトロウイルス保有クローンＡ２、Ａ１０、Ｂ３、Ｃ１、Ｅ３若しくはＧ２を、単独（培地のみ、縦縞模様棒グラフ）で培養した、又は対照標的細胞ＳＮＵ１０７９（ドット模様棒グラフ）、ＳＮＵ１１９６（白棒グラフ）、９３８ｍｅｌ（チェック模様棒グラフ）若しくは９３８／ＣＤ７０（黒棒グラフ）、又はＲＣＣ標的細胞ＲＣＣ２２４５Ｒ（斜線棒グラフ）、ＲＣＣ２２４６Ｒ（逆斜線棒グラフ）、ＲＣＣ２３６１Ｒ（ボックス模様棒グラフ）若しくはＲＣＣ１７６４（杉彩模様棒グラフ）と共培養したときに分泌したＩＦＮ−γ（ｐｇ／ｍｌ）を示すグラフである。
【図５】図５は、非形質導入（ＵＴ）細胞又はΔＣＤ２７−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ（配列番号９）で形質導入したレトロウイルス保有クローンＡ２、Ｂ１１、Ｃ５若しくはＤ２を単独（培地のみ、縦縞模様棒グラフ）で培養した、又は対照標的細胞ＳＮＵ１０７９（ドット模様棒グラフ）、ＳＮＵ１１９６（白棒グラフ）、９３８ｍｅｌ（チェック模様棒グラフ）、若しくは９３８／ＣＤ７０（黒棒グラフ）若しくはＲＣＣ標的細胞、ＲＣＣ２２４５Ｒ（斜線棒グラフ）、ＲＣＣ２２４６Ｒ（逆斜線棒グラフ）、ＲＣＣ２３６１Ｒ（ボックス模様棒グラフ）若しくはＲＣＣ１７６４（杉彩模様棒グラフ）と共培養したときに分泌したＩＦＮ−γ（ｐｇ／ｍｌ）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明の一実施形態は、ＣＤ７０に対する抗原特異性を有し、以下：ＣＤ２７細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインの全て又は少なくとも配列番号２によって定義される２３７から２６０番目のアミノ酸残基からなる一部分を欠くＣＤ２７アミノ酸配列を含む抗原結合・細胞膜貫通ドメイン；４−１ＢＢ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン；ＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン；及び任意でＣＤ２８細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。本明細書において以後、「ＣＡＲ」は別段の定めがない限りＣＡＲの機能的部分及び機能的変異体のことも指す。
【００１０】
ＣＡＲはＴ細胞シグナル伝達ドメインに連結した受容体（例えば腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体）の抗原結合ドメインを含む、人工的に構築したハイブリッドのタンパク質又はポリペプチドである。ＣＡＲの性状は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）に制限されない様式で、受容体の抗原結合特性を活用することで、選択した標的に対するＴ細胞の特異性及び反応性を変更させる能力を含む。ＭＨＣによって制限されない抗原認識は、ＣＡＲを発現しているＴ細胞に抗原プロセッシングから独立して抗原を認識する能力を与える。そのため、腫瘍の主要なエスケープ機構を迂回する。更に、Ｔ細胞において発現した場合、ＣＡＲは有利なことに内在性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α及びβ鎖と二量体化しない。
【００１１】
本明細書で使用される「抗原特異性を有する（have antigen(ic) specificity）」及び「抗原特異的反応を引き起こす（elicit antigen-specific response）」という語句は、ＣＡＲの抗原に対する結合が免疫反応を引き起こすように、ＣＡＲが抗原に対して特異的に結合し、免疫学的に抗原を認識できることを意味する。
【００１２】
本発明のＣＡＲはＣＤ７０に対する抗原特異性を有する。ＣＤ７０はＴＮＦスーパーファミリーに属し、配列番号１のアミノ酸配列を有する。ＣＤ７０は、その受容体であるＣＤ２７と相互作用する場合に、リンパ球由来細胞の増殖（proliferation）及び生存に関与する共刺激分子である。通常、非がん状態におけるＣＤ７０の発現は、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球及び樹状細胞などのリンパ球組織に限定される。ＣＤ７０は、例えばＲＣＣ（Diegmann ら、Eur. J. Cancer, 41: 1794-801 (2005)）（例えば淡明細胞型ＲＣＣ（ｃｃＲＣＣ））、膠芽細胞種（Held-Feindt ら、Int. J. Cancer, 98: 352-56 (2002); Wischhusen ら、Cancer Res., 62: 2592-99 (2002)）、ＮＨＬ及びＣＬＬ（Lens ら、Br. J. Haematol., 106: 491-503 (1999)）、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫及び濾胞性リンパ腫などの多様なヒトのがんにおいて発現する。
【００１３】
特定の理論又は機構に縛られることはないが、ＣＤ７０に対する抗原特異的反応を引き起こすことで、本発明のＣＡＲは以下、ＣＤ７０を発現するがん細胞を標的として破壊すること、がん細胞を減らす又は除去すること、腫瘍部位（複数可）に免疫細胞の浸潤を促す及び抗がん反応を促進又は拡張することのうち任意の１以上を提供すると考えられる。通常のＣＤ７０の発現は、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球及び樹状細胞などのリンパ球組織に限られるので、本発明のＣＡＲは多くの正常な組織を標的とし破壊することを有利に実質的に回避することが期待できる。
【００１４】
本発明の一実施形態では、ＣＤ２７アミノ酸配列を含む抗原結合・細胞膜貫通ドメインを有するＣＡＲを提供する。これに関して、該ＣＡＲはＣＤ２７抗原結合ドメイン及びＣＤ２７細胞膜貫通ドメインの両方を含んでも良い。該ＣＤ２７は、ＣＤ２７アミノ酸配列の任意の適したヒト抗原結合・細胞膜貫通ドメインを含むか又はそれからなっても良い。本発明の一実施形態では、抗原結合ドメイン、細胞膜貫通ドメイン及び細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む、完全長ＣＤ２７は配列番号２のアミノ酸配列を有する。本発明の一実施形態では、ＣＤ２７の抗原結合ドメインは配列番号２の１から１８８番目のアミノ酸残基からなり、配列番号２１のアミノ酸配列を有する。ＣＤ２７の細胞膜貫通ドメインは配列番号２の１８９から２１１番目のアミノ酸残基からなり、配列番号２２のアミノ酸配列を有する。ＣＤ２７の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは配列番号２の２１２から２６０番目のアミノ酸残基からなり、配列番号２３のアミノ酸配列を有する。従って、本発明の一実施形態では、該ＣＡＲは配列番号２１及び２２のアミノ酸配列を含む、抗原結合・細胞膜貫通ドメインを含む。ＣＤ２７の抗原結合ドメインはＣＤ７０に対して特異的に結合する。
【００１５】
本発明の一実施形態は、ＣＤ２７細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインの全て又は一部を欠くＣＤ２７アミノ酸配列を含む抗原結合・細胞膜貫通ドメインを含むＣＡＲを提供し、ＣＡＲから欠落している該一部は配列番号２によって定義される、少なくとも連続するアミノ酸残基２３７から２６０番目、少なくとも連続するアミノ酸残基２３６から２６０番目、少なくとも連続するアミノ酸残基２３５から２６０番目、少なくとも連続するアミノ酸残基２３４から２６０番目、少なくとも連続するアミノ酸残基２３３から２６０番目、少なくとも連続するアミノ酸残基２３２から２６０番目、少なくとも連続するアミノ酸残基２３１から２６０番目、少なくとも連続するアミノ酸残基２３０から２６０番目、少なくとも連続するアミノ酸残基２２９から２６０番目、少なくとも連続するアミノ酸残基２２８から２６０番目、少なくとも連続するアミノ酸残基２２７から２６０番目、少なくとも連続するアミノ酸残基２２６から２６０番目、少なくとも連続するアミノ酸残基２２５から２６０番目、少なくとも連続するアミノ酸残基２２４から２６０番目、少なくとも連続するアミノ酸残基２２３から２６０番目、少なくとも連続するアミノ酸残基２２２から２６０番目、少なくとも連続するアミノ酸残基２２１から２６０番目、少なくとも連続するアミノ酸残基２２０から２６０番目、少なくとも連続するアミノ酸残基２１９から２６０番目、少なくとも連続するアミノ酸残基２１８から２６０番目、少なくとも連続するアミノ酸残基２１７から２６０番目、少なくとも連続するアミノ酸残基２１６から２６０番目、少なくとも連続するアミノ酸残基２１５から２６０番目、少なくとも連続するアミノ酸残基２１４から２６０番目、少なくとも連続するアミノ酸残基２１３から２６０番目である。本発明の一実施形態では、該抗原結合・細胞膜貫通ドメインは以下、配列番号２によって定義される２３７から２６０番目の連続するアミノ酸残基、２３６から２６０番目の連続するアミノ酸残基、２３５から２６０番目の連続するアミノ酸残基、２３４から２６０番目の連続するアミノ酸残基、２３３から２６０番目の連続するアミノ酸残基、２３２から２６０番目の連続するアミノ酸残基、２３１から２６０番目の連続するアミノ酸残基、２３０から２６０番目の連続するアミノ酸残基、２２９から２６０番目の連続するアミノ酸残基、２２８から２６０番目の連続するアミノ酸残基、２２７から２６０番目の連続するアミノ酸残基、２２６から２６０番目の連続するアミノ酸残基、２２５から２６０番目の連続するアミノ酸残基、２２４から２６０番目の連続するアミノ酸残基、２２３から２６０番目の連続するアミノ酸残基、２２２から２６０番目の連続するアミノ酸残基、２２１から２６０番目の連続するアミノ酸残基、２２０から２６０番目の連続するアミノ酸残基、２１９から２６０番目の連続するアミノ酸残基、２１８から２６０番目の連続するアミノ酸残基、２１７から２６０番目の連続するアミノ酸残基、２１６から２６０番目の連続するアミノ酸残基、２１５から２６０番目の連続するアミノ酸残基、２１４から２６０番目の連続するアミノ酸残基、２１３から２６０番目の連続するアミノ酸残基を欠くＣＤ２７アミノ酸配列を含む。ＣＤ２７細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインの全て又は一部を欠くＣＤ２７アミノ酸配列はまた本明細書において、「トランケート（truncated）ＣＤ２７アミノ酸配列」又は「トランケートＣＤ２７」としても参照する。
【００１６】
好ましい実施形態では、該抗原結合・細胞膜貫通ドメインはＣＤ２７細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインの全てを欠くＣＤ２７アミノ酸配列を含む。これに関して、該抗原結合・細胞膜貫通ドメインは、配列番号２によって定義される２１２から２６０番目の連続するアミノ酸残基を欠くＣＤ２７アミノ酸配列、又は配列番号２の２１２から２６０番目の連続するアミノ酸残基を欠くＣＤ２７アミノ酸配列を含む。本発明の一実施形態は、該抗原結合・細胞膜貫通ドメインは配列番号２３のアミノ酸配列を欠くＣＤ２７アミノ酸配列を含む。本発明の一実施形態は、該抗原結合・細胞膜貫通ドメインは、配列番号３と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなる、又は配列番号３のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなる、ＣＤ２７細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインの全てのアミノ酸配列を欠くＣＤ２７アミノ酸配列を含む。
【００１７】
該ＣＡＲは更に、４−１ＢＢ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ゼータ（ζ）細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン及び任意でＣＤ２８細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含んでも良い。本発明の一実施形態では、該ＣＡＲは４−１ＢＢ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン及びＣＤ２８細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む。本発明の別の実施形態では、該ＣＡＲは４−１ＢＢ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む。本発明の好ましい実施形態では、該ＣＡＲは４−１ＢＢ、ＣＤ３ζ及びＣＤ２８細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインはヒトである。ＣＤ２８はＴ細胞の共刺激において、Ｔ細胞マーカーとして重要である。４−１ＢＢはまた、Ｔ細胞に強力な共刺激シグナルを伝達し、Ｔリンパ球の分化を促し及び長期間の生存を促進するＣＤ１３７としても知られている。ＣＤ３ζはシグナルを生産するためにＴＣＲｓと結合し、免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭｓ）を含む。
【００１８】
該ＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは、任意の適したヒトＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列を含むか又はそれからなっても良い。本発明の一実施形態において、該ＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは、配列番号４と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。好ましくは、該ＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは配列番号４のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
【００１９】
該４−１ＢＢ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは、任意の適したヒト４−１ＢＢ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列を含むか又はそれからなっても良い。本発明の一実施形態において、該４−１ＢＢ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは、配列番号５と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一アミノ酸配列を含むか又はそれからなる。好ましくは、該４−１ＢＢ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
【００２０】
該ＣＤ２８細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは、任意の適したヒトＣＤ２８細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列を含むか又はそれからなっても良い。本発明の一実施形態において、該ＣＤ２８細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは、配列番号６と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。好ましくは、該ＣＤ２８細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは配列番号６のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
【００２１】
本発明の一実施形態において、該ＣＡＲはＣＤ２７抗原結合ドメイン、ＣＤ２７細胞膜貫通ドメイン及びＣＤ２７細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む完全長ＣＤ２７アミノ酸配列、とＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインとの組合せ（完全長（ｆ）ＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲ）を含む。これに関して、該ＣＡＲは本発明の他の態様に関して、明細書に記載の配列番号２と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一である完全長ＣＤ２７のアミノ酸配列及び任意のＣＤ３ζアミノ酸配列を含むか又はそれからなっても良い。例えば該ｆＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲは、配列番号２の完全長ＣＤ２７アミノ酸配列及び配列番号４のＣＤ３ζアミノ酸配列を含むか又はそれからなっても良い。本発明の一実施形態において、該ｆＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲは配列番号７と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなっても良い。好ましくは、該ｆＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲは配列番号７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。本発明の一実施形態において、該ｆＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲはトランケートＣＤ１９及びＤｓＲｅｄの一つ又は両方を欠く。
【００２２】
本発明の一実施形態において、該ＣＡＲはＣＤ２７抗原結合ドメイン、ＣＤ２７細胞膜貫通ドメイン及びＣＤ２７細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む完全長ＣＤ２７アミノ酸配列、とＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン及びＣＤ２８細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインとの組合せ（ｆＣＤ２７−ＣＤ２８−ＣＤ３ζ）を含む。これに関して、該ＣＡＲは本発明の他の態様に関して、明細書に記載の任意の完全長ＣＤ２７アミノ酸配列、任意のＣＤ３ζアミノ酸配列及び任意のＣＤ２８アミノ酸配列を含むか又はそれからなっても良い。例えば該ｆＣＤ２７−ＣＤ２８−ＣＤ３ζＣＡＲは、配列番号２の完全長ＣＤ２７アミノ酸配列、配列番号４のＣＤ３ζアミノ酸配列及び配列番号６のＣＤ２８アミノ酸配列を含むか又はそれからなっても良い。本発明の一実施形態において、該ｆＣＤ２７−ＣＤ２８−ＣＤ３ζＣＡＲは、配列番号１１と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなっても良い。好ましくは、該ｆＣＤ２７−ＣＤ２８−ＣＤ３ζＣＡＲは配列番号１１のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
【００２３】
本発明の一実施形態では、該ＣＡＲはＣＤ２７抗原結合ドメイン、ＣＤ２７細胞膜貫通ドメイン及びＣＤ２７細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む完全長ＣＤ２７アミノ酸配列と、ＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン及び４−１ＢＢ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインとの組合せ（ｆＣＤ２７−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ）を含む。これに関して、該ＣＡＲは本発明の他の態様に関して、明細書に記載の任意の完全長ＣＤ２７アミノ酸配列、任意のＣＤ３ζアミノ酸配列及び任意の４−１ＢＢアミノ酸配列を含むか又はそれからなっても良い。例えば該ｆＣＤ２７−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζＣＡＲは配列番号２の完全長ＣＤ２７アミノ酸配列、配列番号４のＣＤ３ζアミノ酸配列及び配列番号５の４−１ＢＢアミノ酸配列を含むか又はそれからなっても良い。本発明の一実施形態において、該ｆＣＤ２７−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζＣＡＲは配列番号１２と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなっても良い。好ましくは、該ｆＣＤ２７−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζＣＡＲは配列番号１２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
【００２４】
本発明の一実施形態では、該ＣＡＲはＣＤ２７抗原結合ドメイン、ＣＤ２７細胞膜貫通ドメイン及びＣＤ２７細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む完全長ＣＤ２７アミノ酸配列と、ＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン、４−１ＢＢ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン及びＣＤ２８細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインとの組合せ（ｆＣＤ２７−ＣＤ２８−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ）を含む。これに関して、該ＣＡＲは本発明の他の態様に関して、明細書に記載の任意の完全長ＣＤ２７アミノ酸配列、任意のＣＤ３ζアミノ酸配列、任意の４−１ＢＢアミノ酸配列及び任意のＣＤ２８アミノ酸配列を含むか又はそれからなっても良い。例えば該ｆＣＤ２７−ＣＤ２８−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζＣＡＲは配列番号２の完全長ＣＤ２７アミノ酸配列、配列番号４のＣＤ３ζアミノ酸配列、配列番号５の４−１ＢＢアミノ酸配列及び配列番号６のＣＤ２８アミノ酸配列を含むか又はそれからなっても良い。本発明の一実施形態において、該ｆＣＤ２７−ＣＤ２８−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζＣＡＲは配列番号１３と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなっても良い。好ましくは、該ｆＣＤ２７−ＣＤ２８−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζＣＡＲは配列番号１３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
【００２５】
本発明の一実施形態では、該ＣＡＲはＣＤ２７抗原結合ドメイン、ＣＤ２７細胞膜貫通ドメイン及びＣＤ２７細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む完全長マウスＣＤ２７アミノ酸配列と、マウスＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインとの組合せ（ｍＣＤ２７−ＣＤ３ζ）を含む。これに関して、該ＣＡＲは配列番号２６と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一である完全長マウスＣＤ２７アミノ酸配列と、配列番号２７と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一であるマウスＣＤ３ζアミノ酸配列との組合せを含むか又はそれからなっても良い。例えば該ｍＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲは、配列番号２６の完全長マウスＣＤ２７アミノ酸配列及び配列番号２７のマウスＣＤ３ζアミノ酸配列を含むか又はそれからなっても良い。本発明の一実施形態において、該ｍＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲは配列番号２５と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなっても良い。好ましくは、該ｍＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲは配列番号２５のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
【００２６】
本発明の一実施形態では、該ＣＡＲはＣＤ２７細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインの全てを欠くトランケートＣＤ２７のアミノ酸配列を含む抗原結合・細胞膜貫通ドメインと、ＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン及びＣＤ２８細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインとの組合せ（トランケート（Δ）ＣＤ２７−ＣＤ２８−ＣＤ３ζ）を含む。これに関して、該ＣＡＲは本発明の他の態様に関して、明細書に記載の配列番号３と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一であるトランケートＣＤ２７抗原結合・細胞膜貫通ドメインのアミノ酸配列と、任意のＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列及び任意のＣＤ２８細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列との組合せを含むか又はそれからなっても良い。例えば該ΔＣＤ２７−ＣＤ２８−ＣＤ３ζＣＡＲは配列番号３のトランケートＣＤ２７抗原結合・細胞膜貫通ドメインのアミノ酸配列、配列番号４のＣＤ３ζアミノ酸配列及び配列番号６のＣＤ２８アミノ酸配列を含むか又はそれからなっても良い。本発明の一実施形態において、該ΔＣＤ２７−ＣＤ２８−ＣＤ３ζＣＡＲは配列番号８と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなっても良い。好ましくは、該ΔＣＤ２７−ＣＤ２８−ＣＤ３ζＣＡＲは配列番号８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
【００２７】
本発明の一実施形態では、該ＣＡＲはＣＤ２７細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインの全てを欠くトランケートＣＤ２７のアミノ酸配列を含む抗原結合・細胞膜貫通ドメインと、ＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン及び４−１ＢＢ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインとの組合せ（ΔＣＤ２７−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ）を含む。これに関して、該ＣＡＲは本発明の他の態様に関して、明細書に記載の任意のトランケートＣＤ２７抗原結合・細胞膜貫通ドメインのアミノ酸配列、任意のＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列及び任意の４−１ＢＢ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列を含むか又はそれからなっても良い。例えば該ΔＣＤ２７−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζＣＡＲは配列番号３のトランケートＣＤ２７抗原結合・細胞膜貫通ドメインのアミノ酸配列、配列番号４のＣＤ３ζアミノ酸配列及び配列番号５の４−１ＢＢアミノ酸配列を含むか又はそれからなっても良い。本発明の一実施形態において、該ΔＣＤ２７−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζＣＡＲは配列番号９と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなっても良い。好ましくは、該ΔＣＤ２７−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζＣＡＲは配列番号９のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
【００２８】
本発明の一実施形態では、該ＣＡＲはＣＤ２７細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインの全てを欠くトランケートＣＤ２７のアミノ酸配列を含む抗原結合・細胞膜貫通ドメインと、ＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン及び４−１ＢＢ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインとの組合せ（ΔＣＤ２７−ＣＤ２８−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ）を含む。これに関して、該ＣＡＲは本発明の他の態様に関して、明細書に記載の任意のトランケートＣＤ２７抗原結合・細胞膜貫通ドメインのアミノ酸配列、任意のＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列、任意のＣＤ２８細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列及び任意の４−１ＢＢ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列を含むか又はそれからなっても良い。例えば該ΔＣＤ２７−ＣＤ２８−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζＣＡＲは配列番号３のトランケートＣＤ２７抗原結合・細胞膜貫通ドメインのアミノ酸配列、配列番号４のＣＤ３ζアミノ酸配列、配列番号６のＣＤ２８アミノ酸配列及び配列番号５の４−１ＢＢアミノ酸配列、を含むか又はそれからなっても良い。本発明の一実施形態において、該ΔＣＤ２７−ＣＤ２８−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζＣＡＲは配列番号１０と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなっても良い。好ましくは、該ΔＣＤ２７−ＣＤ２８−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζＣＡＲは配列番号１０のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
【００２９】
本発明の一実施形態では、該ＣＡＲは配列番号８〜１０の任意の１つのアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む。本発明の一実施形態では、該ＣＡＲは配列番号９又は１０のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む。本発明の別の実施形態では、該ＣＡＲは配列番号１１〜１３のアミノ酸配列の任意の１つと少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む。本発明の別の実施形態では、該ＣＡＲは配列番号１２又は１３のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、該ＣＡＲは表１Ａに記載された任意の１つのアミノ酸配列を含む、それからなる又は本質的にそれからなる。本発明の好ましい実施形態では、該ＣＡＲは配列番号７〜１３の任意の１つのアミノ酸配列を含む。好ましくは、該ＣＡＲは配列番号９、１０、１２及び１３の任意の１つのアミノ酸配列を含む。
【００３０】
【表１】
0006724009.tif 000002
【００３１】
本発明の範囲には、本明細書に記載された本発明のＣＡＲの機能的部分が含まれる。ＣＡＲを参照する際に用いられる「機能的部分（functional portion）」という用語は、本発明のＣＡＲの任意の部分又は断片を示し、その部分又は断片は（該親ＣＡＲの）一部分である該ＣＡＲの生物学的活性を維持している。機能的部分は、例えば該親ＣＡＲと類似する程度、同じ程度又はそれより高い程度で標的細胞を認識する、又はがんを検出、治療若しくは予防する能力を維持しているＣＡＲの部分を包含する。該親ＣＡＲを参照する場合において、該機能的部分は、例えば該親ＣＡＲの約１０％、約２５％、約３０％、約５０％、約６８％、約８０％、約９０％、約９５％又はそれ以上を含み得る。
【００３２】
該機能的部分は、該部分のアミノ末端若しくはカルボキシ末端又はその両端に、該親ＣＡＲのアミノ酸配列において見られない追加的なアミノ酸を含み得る。望ましくは、該追加的なアミノ酸は、該機能的部分の生物学的機能、例えば標的細胞を認識すること又はがんを検出、治療若しくは予防することを妨げない。より望ましくは、該追加的なアミノ酸は、該親ＣＡＲの生物学的活性と比べて、その生物学的機能を促進する。
【００３３】
本発明の範囲には、本明細書に記載された本発明のＣＡＲの機能的変異体が含まれる。ＣＡＲを参照する際に用いられる「機能的変異体（functional variant）」という用語は、親ＣＡＲと実質的又は有意に配列同一性又は類似性を有するＣＡＲ、ポリペプチド又はタンパク質を示し、その機能的変異体は変異体である該ＣＡＲの生物学的活性を維持している。機能的変異体は、例えば該親ＣＡＲと類似する程度、同じ程度又はそれより高い程度で、標的細胞を認識する能力を維持している本明細書に記載のＣＡＲの変異体を包含する。該親ＣＡＲを参照する場合において、該機能的変異体は、例えば該親ＣＡＲのアミノ酸配列と少なくとも約３０％、約５０％、約７５％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又はそれ以上同一であるものであり得る。
【００３４】
機能的変異体は、例えば該親ＣＡＲのアミノ酸配列に少なくとも一つの保存的（conservative）アミノ酸置換を有するものを含み得る。代替的に又は追加的に、該機能的変異体は該親ＣＡＲのアミノ酸配列に少なくとも一つの非保存的アミノ酸置換を有するものを含み得る。この場合において、非保存的アミノ酸置換は、該機能的変異体の生物学的活性を妨害又は阻害しないことが好ましい。該非保存的アミノ酸置換は、親ＣＡＲのものと比べて生物学的活性が増大するように、該機能的変異体の生物学的活性を促進しても良い。
【００３５】
本発明のＣＡＲのアミノ酸置換は、好ましくは保存的なアミノ酸置換である。保存的なアミノ酸置換は当技術分野において公知であり、ある物理的及び／又は化学的性質が同じ若しくは類似する化学又は物理的性質を有する、他のアミノ酸に変換されることを含む。例えば該保存的アミノ酸置換は、酸性／負電荷を帯びた極性アミノ酸が別の酸性／負電荷を帯びた極性アミノ酸（例えばＡｓｐ又はＧｌｕ）に置換され、非極性側鎖を有するアミノ酸が別の非極性側鎖を有するアミノ酸（例えばＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ｖａｌなど）に置換され、塩基性／正電荷を帯びた極性アミノ酸が他の塩基性／正電荷を帯びた極性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇなど）に置換され、極性側鎖を有する非帯電アミノ酸が別の極性側鎖を有する非帯電アミノ酸（例えばＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒなど）に置換され、β位で分枝した側鎖を有するアミノ酸が別のβ位で分枝した側鎖を有するアミノ酸（例えばＩｌｅ、Ｔｈｒ及びＶａｌ）に置換され、芳香族側鎖を有するアミノ酸が別の芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えばＨｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ及びＴｙｒ）に置換されるなどである。
【００３６】
該ＣＡＲは、他の要素、例えば他のアミノ酸が物質的に該機能的変異体の生物学的活性を変更しないように、本明細書に記載の特定のアミノ酸配列又は配列（複数可）から本質的になることができる。
【００３７】
本発明の実施形態のＣＡＲは任意の長さ、すなわち、該ＣＡＲが生物学的活性、例えば抗原に特異的に結合する、哺乳動物のがん細胞を検出する又は哺乳動物のがんを治療若しくは予防するなどの活性を維持している限り、任意のアミノ酸数を含み得る。例えば該ＣＡＲはアミノ酸配列長において約５０から約５０００アミノ酸長であり、例えば５０、７０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００又はそれ以上であり得る。
【００３８】
本発明の実施形態のＣＡＲは、１以上の天然で生じたアミノ酸の代わりに、合成アミノ酸を含み得る。そのような合成アミノ酸は当該技術分野において公知であり、例えばアミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、α−アミノ−ｎ−デカン酸、ホモセリン、Ｓ−アセチルアミノメチル−システイン、トランス−３−及びトランス−４−ヒドロキシプロリン、４−アミノフェニルアラニン、４−ニトロフェニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、４−カルボキシフェニルアラニン、β−フェニルセリン  β−ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α−ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン−２−カルボン酸、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、Ｎ’−ベンジル−Ｎ’−メチル−リジン、Ｎ’，Ｎ’−ジベンジル−リジン、６−ヒドロキシリシン、オルニチン、α−アミノシクロペンタンカルボン酸、α−アミノシクロヘキサンカルボン酸、α−アミノシクロヘプタンカルボン酸、α−（２−アミノ−２−ノルボルナン）−カルボン酸、α，γ−ジアミノ酪酸、α，β−ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン及びα−ｔｅｒｔ−ブチルグリシンが挙げられる。
【００３９】
本発明の実施形態のＣＡＲは、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、Ｎ−アシル化、環化、例えばジスルフィド架橋を介した環化、又は酸付加塩への変換及び／又は任意で二量体化若しくは重合化、又はコンジュゲート化することができる。
【００４０】
本発明の実施形態のＣＡＲは、例えばデノボ（de novo）合成などの、当分野で公知の方法によって得ることができる。また、ペプチド及びタンパク質は標準的な組換え方法により、本明細書に記載の核酸を用いて組換え的に産生することができる。例えばGreen and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manua, 4th ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY(2012)を参照されたい。代替的には、本明細書に記載の該ＣＡＲはSynpep (Dublin, CA)、Peptide Technologies Corp. (Gaithersburg, MD)及びMultiple Peptide Systems (Sandiego, CA)などの企業によって商業的に合成することができる。これに関して、本発明のＣＡＲは合成、組換え、単離及び／又は精製することができる。
【００４１】
本発明の実施形態のＣＡＲは、更に本明細書に記載の任意のＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本発明の核酸は、本明細書に記載の任意の抗原結合ドメイン、細胞膜貫通ドメイン及び／又は細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列を含んでも良い。本発明の一実施形態において、該核酸は表１Ｂに記載された任意の１つのヌクレオチド配列を含む、それからなる又は本質的にそれからなる。好ましくは、該核酸は配列番号１４〜２０の任意の１つのヌクレオチド配列を含む。好ましくは、該核酸は配列番号１６、１７、１９及び２０の任意の１つのヌクレオチド配列を含む。本発明の一実施形態において、ｆＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲをコードするヌクレオチド配列はトランケートＣＤ１９及びＤｓＲｅｄの一つ又は両方をコードしない。
【００４２】
【表２】
0006724009.tif 000003
【００４３】
本明細書で使用する「核酸（nucleic acid）」は、「ポリヌクレオチド（polynucleotide）」、「オリゴヌクレオチド（oligonucleotide）」及び「核酸分子（nucleic acid molecule）」を含み、一本鎖又は二本鎖であり、天然の材料から合成又は獲得（例えば単離及び／又は精製）することができるＤＮＡ又はＲＮＡのポリマーを一般に意味する。天然の材料には天然、非天然若しくは改変したヌクレオチドを含むことができ、及び天然の結合、非天然の結合、若しくは修飾されていないオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間にみられる、ホスホジエステルの代わりのホスホロアミデート結合又はホスホロチオエート結合などの改変したヌクレオチド間の結合を含み得る。いくつかの実施形態では、該核酸は任意の挿入、欠失、逆位及び／又は置換を含まない。しかし、本明細書で考察されるように、核酸が１以上の挿入、欠失、逆位及び／又は置換を含むいくつかの例においては適切であっても良い。いくつかの実施形態では該核酸は、ＣＡＲの機能に影響しない、及び核酸を宿主細胞が発現する際に翻訳される又はされなくても良く、追加のアミノ酸配列をコードしても良い。
【００４４】
本発明の一実施形態の核酸は組換え体であっても良い。本明細書で使用される「組換え体（recombinant）」という用語は、（ｉ）生細胞において複製される核酸分子に天然若しくは合成核酸断片を添加することにより生細胞の外側で構築される分子、又は（ｉｉ）上記（ｉ）で記載したこれらの複製の結果得られる分子を指す。本明細書の目的のために、該複製はインビトロ複製又はインビボ複製であり得る。
【００４５】
組換え核酸は、天然で生じない配列又は２つの異なる別の配列断片の人工的な組合せで作製した配列を有しても良い。この人工的組合せは化学合成によって、又はより普遍的には核酸の別の断片を人工的な操作、例えば上記のGreen and Sambrookに記載されているような遺伝子工学技術によって、しばしば達成される。当技術分野で公知の手順を用いて、化学合成及び／又は酵素的ライゲーション反応に基づいて該核酸を構築することができる。例えば上記のGreen and Sambrookを参照されたい。例えば核酸は、天然に存在するヌクレオチド、又は分子の生物学的安定性を増加させるため、若しくはハイブリダイゼーション時に形成される二本鎖の物理的安定性を高めるために設計した様々な修飾ヌクレオチド（例えばホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチド）を用いて、化学的に合成できる。核酸を合成するために使用できる修飾したヌクレオチドの例は、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−置換アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ウィブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル及び２，６−ジアミノプリンであるが、これらに限定されない。代替的には、本発明の核酸の１以上は、Macromolecular Resources (Fort Collins, CO)及びSynthegen (Houston, TX)などの企業から購入できる。
【００４６】
該核酸は、本発明の他の態様に関して、本明細書に記載の任意のＣＡＲをコードする単離又は精製したヌクレオチド配列を含み得る。代替的には、該ヌクレオチド配列は任意の配列に縮重させた又は縮重した配列の組合せであるヌクレオチド配列を含み得る。
【００４７】
本発明の一実施形態はまた、本明細書に記載の任意の核酸のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、又は本明細書に記載の任意の核酸のヌクレオチド配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む単離又は精製した核酸を提供する。
【００４８】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする該ヌクレオチド配列は、高度にストリンジェンシーな条件下でハイブリダイズしても良い。「高度にストリンジェンシーな条件（high stringency conditions）」は、該ヌクレオチド配列が非特異的なハイブリダイゼーションよりも検出可能な程度に強く、標的配列（本明細書に記載の任意の核酸のヌクレオチド配列）に特異的にハイブリダイズすることを意味する。高度にストリンジェンシーな条件には、正確に相補的な配列を有するポリヌクレオチド、又はヌクレオチド配列と一致するいくつかの小さな領域（例えば３〜１０塩基）を偶然有するランダム配列からわずかに異なった（scattered）ミスマッチを含むポリヌクレオチドを区別しうる条件が含まれる。そのような相補性の小領域は、１４〜１７塩基又はそれ以上の完全長の相補鎖よりも容易に融解し、高度にストリンジェンシーなハイブリダイゼーションによりそれらを容易に区別し得る。比較的高度にストリンジェンシーな条件には、例えば約５０〜７０℃の温度で、約０．０２〜０．１ＭのＮａＣｌ又はそれと同等な条件によって提供されるような、低塩及び／又は高温条件が含まれる。そのような高度にストリンジェンシーな条件は、ヌクレオチド配列と鋳型又は標的鎖との間のミスマッチがあれば、ほとんど許容せず、任意の本発明のＣＡＲの発現を検出するのに特に適している。ホルムアミド添加量を増加することにより、条件をより厳密にし得ることは一般的に理解されている。
【００４９】
本発明はまた、本明細書に記載の任意の核酸に対して、少なくとも約７０％又はそれ以上、例えば約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００５０】
一実施形態において本発明の核酸は組換え発現ベクターに組み込むことができる。これに関して、本発明の一実施形態は、本発明の任意の核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。本明細書の目的のために、「組換え発現ベクター（recombinant expression vector）」という用語は、コンストラクトがｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むとき、宿主細胞がｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドを発現するような遺伝子改変オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド・コンストラクトを意味し、該ベクターは細胞内でｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドを発現するのに十分な条件下で細胞と接触する。本発明のベクターは全体として自然発生的ではない。しかしながら、ベクターの部分は天然に存在し得る。本発明の組換え発現ベクターは一本鎖又は二本鎖であり、天然の材料から部分的に合成又は獲得することができ、及び天然、非天然又は改変したヌクレオチドを含み得る、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む任意の型のヌクレオチドを含み得るが、それらに限定されない。該組換え発現ベクターは、天然に存在するヌクレオチド間結合、天然に存在しないヌクレオチド間結合、又はその両方の型の結合を含み得る。好ましくは、非天然で生じた若しくは改変したヌクレオチド又はヌクレオチド間結合がベクターの転写又は複製を妨害しないものである。本発明の一実施形態において、ｆＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む該組換え発現ベクターはトランケートＣＤ１９及びＤｓＲｅｄの一つ又は両方をコードしない。
【００５１】
本発明の一実施形態において、本発明の組換え発現ベクターは、任意の適切な組換え発現ベクターであることができ、任意の適切な宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトするために用いることができる。適切なベクターは、例えばプラスミド及びウイルスのように増殖（propagation）及び増幅（expansion）のため若しくは発現のため、又はその両方のために設計したものを含む。該ベクターは、ｐＵＣシリーズ（Fermentas Life Sciences, Glen Burnie, MD）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Stratagene, LaJolla, CA）、ｐＥＴシリーズ（Novagen, Madison, WI）、ｐＧＥＸシリーズ（Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）及びｐＥＸシリーズ（Clonetech, Palo Alto, CA）からなる群より選択することができる。バクテリオファージベクター、例えばλＧＴ１０、λＧＴ１１、λＺａｐＩＩ（Stratagene）、λＥＭＢＬ４及びλＮＭ１１４９もまた使用することができる。植物発現ベクターの例には、ｐＢＩ０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩ１２１及びｐＢＩＮ１９（Clonetech）が含まれる。動物発現ベクターの例には、ｐＥＵＫ−Ｃ１、ｐＭＡＭ及びｐＭＡＭｎｅｏ（Clonetech）が含まれる。該組換え発現ベクターはウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターであっても良い。いくつかの実施形態では、該ベクターはトランスポゾンであり得る。
【００５２】
一実施形態において、本発明の組換え発現ベクターは、例えば上記のGreen and Sambrookに記載されている標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて、調製することができる。環状又は線状である発現ベクターのコンストラクトは、原核又は真核宿主細胞において機能的である複製システムを含むように調製することができる。複製システムは、例えばＣｏｌＥ１、２μプラスミド、λ、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルスなどに由来するものであり得る。
【００５３】
該組換え発現ベクターは、ベクターがＤＮＡベースであるかＲＮＡベースであるかを考慮して、適切な形でベクターを導入した宿主細胞（例えば細菌、真菌、植物又は動物）の型に特異的な転写及び翻訳の開始及び終止コドンなどの調節配列を含んでも良い。
【００５４】
該組換え発現ベクターは、形質転換又はトランスフェクトした宿主細胞の選択を可能にする１以上のマーカー遺伝子を含み得る。マーカー遺伝子は、殺生物剤耐性、例えば抗生物質、重金属などに対する耐性など、原栄養性を提供するための栄養要求性宿主細胞における相補性などを含む。本発明の発現ベクターのための適切なマーカー遺伝子は、例えばネオマイシン／Ｇ４１８耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子及びアンピシリン耐性遺伝子を含んでいる。
【００５５】
該組換え発現ベクターは、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列、又はＣＡＲをコードするヌクレオチド配列に相補的である若しくはハイブリダイズするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、天然又は非天然プロモーターを含み得る。プロモーターの選択、例えば強、弱、誘導性、組織特異性及び発生段階特異性は、当業者の通常の技術の範囲内である。同様に、ヌクレオチド配列とプロモーターの組み合わせも当業者の技術の範囲内である。該プロモーターは、非ウイルスプロモーター又はウイルスプロモーター、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター又はネズミ幹細胞ウイルスの長い末端反復に見出されるプロモーターであり得る。
【００５６】
いずれか一時期における発現若しくは安定した発現のために、又はその両方のために、本発明の組換え発現ベクターを設計することができる。また、構成的発現又は誘導発現のために組換え発現ベクターを作製することができる。
【００５７】
さらに、自殺遺伝子を含むように組換え発現ベクターを作製することができる。本明細書において「自殺遺伝子（suicide gene）」という用語は、自殺遺伝子を発現する細胞を死滅させる遺伝子を指す。該自殺遺伝子は、遺伝子を発現する細胞における作用因子、例えば薬剤に対する感受性を付与し、細胞をその作用因子と接触させ又はそれに対して曝露した場合に細胞が死滅する遺伝子であり得る。自殺遺伝子は当該分野で公知であり、例えば単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、シトシンダミナーゼ（cytosine daminase）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ及びニトロレダクターゼを含む。
【００５８】
本発明の一実施形態は、本明細書に記載の任意の組換え発現ベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。本明細書中で使用する場合、「宿主細胞（host cell）」という用語は、本発明の組換え発現ベクターを含み得る任意のタイプの細胞を指す。該宿主細胞は真核細胞、例えば植物、動物、菌類若しくは藻類又は原核細胞、例えばバクテリア又は原生動物であり得る。該宿主細胞は培養細胞又は初代細胞、すなわち生物、例えばヒトから直接単離した細胞であり得る。該宿主細胞は付着細胞又は懸濁細胞、すなわち懸濁液中で増殖する（grow）細胞であり得る。適切な宿主細胞は当該分野で公知であり、例えばＤＨ５α大腸菌細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、サルＶＥＲＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞などを含む。組換え発現ベクターを増幅又は複製する目的のために、該宿主細胞は原核細胞、例えばＤＨ５α細胞であっても良い。組換えＣＡＲを産生する目的のために、該宿主細胞は哺乳動物細胞であっても良い。該宿主細胞はヒト細胞であっても良い。宿主細胞は任意の細胞のタイプであり、任意のタイプの組織に由来し、任意の発生段階であり得る一方で、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であっても良い。該宿主細胞はＴ細胞であっても良い。
【００５９】
本明細書の目的のために、該Ｔ細胞は培養Ｔ細胞などの任意のＴ細胞、例えば初代Ｔ細胞、又は培養Ｔ細胞株、例えばＪｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴ１など由来のＴ細胞、又は哺乳動物から得たＴ細胞であり得る。哺乳動物から得たものである場合、該Ｔ細胞は、血液、骨髄、リンパ節、胸腺又は他の組織若しくは体液を含む多数の供給源から得ることができるが、これらに限定されない。Ｔ細胞を濃縮又は精製してもよい。該Ｔ細胞はヒトＴ細胞であっても良い。該Ｔ細胞はヒトから単離したＴ細胞であっても良い。該Ｔ細胞は、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、例えばＴｈ１及びＴｈ２細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば細胞傷害性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤細胞、記憶Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞などを含む任意のタイプのＴ細胞及び任意の発生段階であり得るが、これらに限定されない。該Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ４＋Ｔ細胞であっても良い。
【００６０】
また、本発明の一実施形態は、本明細書で記載の少なくとも１つの宿主細胞を含む細胞集団を提供する。該細胞集団は、記載された任意の組換え発現ベクターを含む宿主細胞を含む遺伝的に不均一な集団であり得る。加えて、少なくとも１つの他の細胞、例えば任意の組換え発現ベクターを含まない宿主細胞（例えばＴ細胞）、又はＴ細胞以外の細胞、例えばＢ細胞、マクロファージ、好中球、赤血球、肝細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋肉細胞、脳細胞などであり得る。代替的に、該細胞集団は組換え発現ベクターを含む宿主細胞を主に含む（例えば本質的にそれからなる）実質的に均質な集団であり得る。該集団は細胞のクローン集団であってもよく、集団の全ての細胞が組換え発現ベクターを含む、集団の全ての細胞が組換え発現ベクターを含む単一の宿主細胞のクローンであってもよい。本発明の一実施形態では、該細胞集団は本明細書に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞を含むクローン集団である。
【００６１】
本発明の一実施形態においては、集団の細胞数を急速に増幅（expanded）しても良い。ＣＡＲを発現する細胞数の増幅（expansion）は、例えば米国特許第8,034,334号；米国特許第8,383,099号；米国特許出願公開第2012/0244133号；Dudley ら、J. Imm nother., 26:332-42 (2003)；及びRiddell ら、J. Immunol. Methods, 128:189-201 (1990)に記載されているように、当分野において公知である方法の任意の１つによって達成することができる。一実施形態において、Ｔ細胞をＯＫＴ３抗体、ＩＬ−２及びフィーダーＰＢＭＣ（例えば放射線照射した同種異形のＰＢＭＣ）と共に培養することで細胞数の増幅（expansion）を実施する。
【００６２】
ＣＡＲ、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞（その集団を含む）の全ては、本明細書において以降「発明のＣＡＲ材料（inventive CAR materials）」として正確に参照し、単離及び／又は精製することができる。本明細書で用いられる用語「単離する（isolated）」とは、自然環境から取り出したことを意味する。用語「精製する（purified）」又は「単離する（isolated）」は、絶対的な精製又は単離を要求しない。むしろ、それらは相対的な用語として意図している。そのため、例えば精製した（単離した）宿主細胞は、体内における自然な状態での細胞よりも高い純度である宿主細胞である。そのような宿主細胞は、例えば標準的な精製技術で作製しても良い。いくつかの実施形態において、宿主細胞が総細胞の少なくとも約５０％、例えば少なくとも７０％を占めるように、宿主細胞を精製する。例えば該精製度は少なくとも約５０％であり、約６０％、約７０％又は約８０％より高く、又は約１００％であり得る。
【００６３】
本発明のＣＡＲ材料は、医薬組成物などの組成物に製剤化することができる。これに関して、本発明の一実施形態は任意のＣＡＲ、核酸、発現ベクター、宿主細胞（その集団を含む）及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。任意の本発明のＣＡＲ材料を含む本発明の医薬組成物は、１を超える発明のＣＡＲ材料、例えばＣＡＲ及び核酸又は２以上の異なるＣＡＲを含み得る。代替的に、医薬組成物はアスパラギナーゼ（asparaginase）、ブスルファン（busulfan）、カルボプラチン（carboplatin）、シスプラチン（cisplatin）、ダウノルビシン（daunorubicin）、ドキソルビシン（doxorubicin）、フルオロウラシル（fluorouracil）、ゲムシタビン（gemcitabine）、ヒドロキシ尿素（hydroxyurea）、メトトレキセート（methotrexate）、パクリタキセル（paclitaxel）、リツキシマブ（rituximab）、ビンブラスチン（vinblastine）、ビンクリスチン（vincristine）などの化学療法剤のように、他の医薬的な活性がある薬剤又は薬物と組み合わせた本発明のＣＡＲ材料を含み得る。好ましい実施形態においては、該医薬組成物は本発明の宿主細胞又はその細胞集団を含む。
【００６４】
好ましくは、該担体は医薬的に許容される担体である。医薬組成物に関して、該担体は特定の本発明のＣＡＲ材料のために慣用的に使用が考慮される任意の物であり得る。そのような医薬的に許容される担体は当業者に周知であり、一般に容易に入手可能である。医薬的に許容される担体は、使用条件下で有害な副作用又は毒性を有さないものであることが好ましい。
【００６５】
担体の選択は、本発明のＣＡＲ材料を投与するために使用される特定の方法と同様に、特定の本発明のＣＡＲ材料によって部分的に決定される。従って、本発明の医薬組成物の種々の適切な製剤が存在する。適切な製剤は、経口、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内又は腹腔内投与のための任意の製剤を含んでも良い。本発明のＣＡＲ材料を投与するために１超の経路を使用することができ、ある場合には、特定の経路は別の経路よりも迅速かつ効果的な応答を提供することができる。
【００６６】
好ましくは、本発明のＣＡＲ材料は、注射、例えば静脈内に投与される。本発明のＣＡＲ材料が、本発明のＣＡＲを発現する宿主細胞である場合、注射用細胞のための医薬的に許容される担体は、例えば通常の生理食塩水（水に溶解した約０．９０％ｗ／ｖのＮａＣｌ、約３００ｍＯｓｍ／ＬのＮａＣｌ、又は水約１Ｌ当たり約９．０ｇのＮａＣｌ）、NORMOSOL R電解質溶液（Abbott, Chicago, IL）、PLASMA-LYTE A（Baxter, Deerfield, IL）、水に溶解した５％のデキストロース又はリンゲル乳酸塩などの任意の等張な担体を含んでも良い。一実施形態では、医薬的に許容される該担体にヒト血清アルブミンを補充する。
【００６７】
本発明のＣＡＲ材料の投与量はまた、特定の本発明のＣＡＲ材料の投与に伴う任意の有害な副作用の存在、性質及び程度によって決定される。典型的には、主治医は、年齢、体重、一般的健康状態、食事、性別、投与される本発明のＣＡＲ材料、投与経路及び治療されるがんの重篤度などの様々な要因を考慮に入れて、個々の患者を治療する本発明のＣＡＲ材料の投与量を決定する。本発明のＣＡＲ材料が細胞集団である実施形態では、１回の注入当たりに投与する細胞数を、例えば約１×１０６〜約１×１０１２細胞又はそれ以上で変更しても良い。ある実施形態では１×１０６未満の細胞を投与しても良い。
【００６８】
本明細書の目的のために、投与する本発明のＣＡＲ材料の量又は投与量は、妥当な時間枠で、対象又は被験動物において治療又は予防応答を達成するのに十分であるべきである。例えば本発明のＣＡＲ材料の投与量は、投与から約２時間以上、例えば１２〜２４時間若しくはそれ以上の期間内に、抗原に結合し、又はがんを検出し、治療若しくは予防するのに十分でなければならない。ある実施形態では該期間はさらに長くなる可能性がある。該投与量は、治療される動物（例えばヒト）の体重と同様に、特定の本発明のＣＡＲ材料の有効性及び動物（例えばヒト）の状態によって決定される。
【００６９】
本発明の目的のために、標的細胞が溶解される程度、及び／又は異なる投与量のＴ細胞が与えられた哺乳動物のセット中で、そのようなＴ細胞を哺乳動物に所与の投与量で投与した際に、本発明のＣＡＲを発現するＴ細胞が分泌するＩＦＮ−γの程度を比較することを含むアッセイ法を、哺乳動物への最初の投与量を決定するために用いることができる。ある用量の投与の際に標的細胞を溶解する及び／又はＩＦＮ−γを分泌する程度は、当該分野で公知の方法によってアッセイすることができる。
【００７０】
当業者であれば、改良によって本発明のＣＡＲ材料の治療効果又は予防効果が増大するように、本発明のＣＡＲ材料を任意の数の方法で改良することができることを容易に理解するであろう。例えば本発明のＣＡＲ材料を直接的又は間接的にリンカーを介して標的成分に結合することができる。標的成分に化合物、例えば本発明のＣＡＲ材料を結合することは当該分野で公知である。
【００７１】
本発明のＣＡＲ材料を１以上の追加的な治療薬と共に投与するとき、１以上の追加的な治療薬をその哺乳動物に共投与することができる。「共投与（coadministering）」という用語は、本発明のＣＡＲ材料が１以上の追加的な治療薬の効果を増幅できるように、１以上の追加的な治療薬及び本発明のＣＡＲ材料を投与する、又は逆に１以上の追加的な治療薬が本発明のＣＡＲ材料の効果を増幅できるように、時間的に十分短い間に投与することを意味する。これに関連して、本発明のＣＡＲ材料を最初に投与し、１以上の追加的な治療薬を２番目に投与する、又は逆の順で投与することもできる。代替的に、本発明のＣＡＲ材料及び１以上の追加的な治療薬を同時に投与することもできる。ＣＡＲ材料と共投与することができる典型的な治療薬はＩＬ−２である。ＩＬ−２は本発明のＣＡＲ材料の治療効果を増大すると考えられる。
【００７２】
本発明の医薬組成物、ＣＡＲ、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞又は細胞集団を哺乳動物のがんを治療又は予防する方法において使用することができると期待される。特定の理論又は機構に拘束されるものではないが、本発明のＣＡＲが細胞で発現するとき、抗原、例えばＣＡＲに特異的であるＣＤ７０を発現する細胞に対して、免疫応答を媒介できるように、該ＣＡＲが生物学的活性、例えば抗原（例えばＣＤ７０）を認識する能力を有している。これに関して、本発明の一実施形態は、哺乳動物のがんを治療又は予防する方法を提供するものであって、哺乳動物のがんを治療又は予防するための有効量で、本発明のＣＡＲ、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団及び／又は医薬組成物を哺乳類に投与すること含んでいる。
【００７３】
本発明の一実施形態は、さらに本発明のＣＡＲ材料を投与することに先行して哺乳動物のリンパ枯渇を行うことを含む。リンパ球枯渇の例としては、骨髄非破壊的リンパ球枯渇化学療法、骨髄破壊的リンパ球枯渇化学療法、全身放射線照射などを含んでも良いが、これらに限定されない。
【００７４】
本発明の方法の目的のために、哺乳動物に対して同種異形又は自己であり得る、宿主細胞又は細胞集団を投与する。好ましくは、該細胞は哺乳動物に対して自己である。
【００７５】
本明細書で参照する哺乳動物は任意の哺乳動物であり得る。本明細書で使用される用語「哺乳動物（mammal）」は、マウス及びハムスターなどのげっ歯類の哺乳動物及びウサギなどのウサギ目の哺乳動物を含む任意の哺乳動物を意味するが、これらに限定されない。哺乳動物はネコ科（ネコ）及びイヌ科（イヌ科）を含む食肉目であっても良い。哺乳動物はウシ属（ウシ）及びイノシシ属（ブタ）を含むのウシ目、又はウマ科（ウマ）を含むウマ目であっても良い。哺乳動物は霊長目、セボイド目若しくはシモイド目（サル）又は類人猿（ヒト及び類人猿）であっても良い。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００７６】
本発明の方法に関して、該がんは以下を含む任意のがんであり得る。任意の急性リンパ球性がん、急性骨髄性白血病、肺胞横紋筋肉腫、膀胱のがん（例えば膀胱癌）、骨癌、脳癌（例えば髄芽細胞種）、乳癌、肛門・肛門管若しくは肛門直腸の癌、眼の癌、肝内胆管の癌、関節の癌、頸部・胆嚢若しくは胸膜の癌、鼻・鼻腔若しくは中耳の癌、口腔の癌、外陰部の癌、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性癌、結腸癌、食道癌、子宮頸癌、線維肉腫、胃腸カルチノイド腫瘍、頭頸部癌（例えば頭頸部扁平上皮癌）、膠芽細胞種、ホジキンリンパ腫、下喉頭癌、腎臓癌、喉頭癌、白血病、液体腫瘍、肝臓癌、肺癌（例えば非小細胞肺癌）、リンパ腫、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、悪性中皮腫、肥満細胞腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、鼻咽頭癌、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、びまん性リンパ球性白血病、毛様細胞白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、及びバーキットリンパ腫、卵巣癌、膵臓癌、腹膜、大網及び腸間膜癌、咽頭癌、前立腺癌、ＲＣＣ、ｃｃＲＣＣ、直腸癌、腎臓癌、皮膚癌、小腸癌、軟組織癌、固形腫瘍、胃癌、精巣癌、甲状腺癌及び子宮癌である。好ましくは、ＣＤ７０の発現によって特徴づけられるがんである。好ましい実施形態においては、がんは任意のＲＣＣ（例えばｃｃＲＣＣ）、膠芽細胞種、ＮＨＬ、ＣＬＬ、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫及び濾胞性リンパ腫である。
【００７７】
本明細書において使用する用語「治療（treat）」及び「予防（prevent）」ならびにそれに由来する用語は、１００％又は完全な治療又は予防を意味する必要はない。むしろ、当業者が潜在的な利益又は治療効果を有すると認識する様々な程度の治療又は予防が存在する。これに関して、本発明の方法は、哺乳動物におけるがんの治療又は予防を、任意のレベル、任意の量で提供することができる。さらに、本発明の方法が提供する治療又は予防は、治療又は予防される疾病、例えばがんの１以上の状態若しくは症状の治療又は予防を含み得る。また、本明細書の目的のために、「予防（prevention）」はその疾病の兆候又はその症状若しくは状態を遅延させることを包含することができる。
【００７８】
本発明の別の実施形態では、本発明のＣＡＲ、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団又は医薬組成物を哺乳動物のがんの治療又は予防のために使用することを提供する。
【００７９】
本発明の別の実施形態では、哺乳動物のがんの存在を検出する方法を提供し、（ａ）本発明のＣＡＲ、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞又は細胞集団と、哺乳動物由来の１以上の細胞を含む試料を接触させることで複合体を形成し、（ｂ）該複合体を検出し、該複合体の検出を哺乳動物におけるがんの存在を示す指標とする工程を含む。
【００８０】
任意の適した方法、例えばバイオプシー又はネクロプシーによって試料を得ても良い。バイオプシーは個々の動物から組織及び／又は細胞を取り出すものである。そのような取り出すことには、取り出した組織及び／又は細胞における実験を実施するために、個々の動物から組織及び／又は細胞を採取することであっても良い。この実験は、個々の動物が有するかどうか及び／又はある状態又は病気の状態から悪影響を受けているかどうかを決定する実験を含んでも良い。該状態又は病気は、例えばがんであっても良い。
【００８１】
哺乳動物におけるがんの存在を検出する本発明の方法の一実施形態に関して、哺乳動物の細胞を含む試料は、細胞全体、その溶解物、又は細胞全体の溶解物の画分、例えば核若しくは細胞質画分、全タンパク質画分又は核酸画分を含む試料であり得る。試料が細胞全体を含む場合、該細胞は哺乳動物の任意の細胞、例えば血液細胞又は上皮細胞を含む任意の器官又は組織の細胞であり得る。
【００８２】
本発明の検出方法の目的のために、哺乳動物に関してインビトロ又はインビボで接触する工程を実施することができる。好ましくは、該接触はインビトロで行う。
【００８３】
また、当該技術分野において公知の任意の数の方法によって、該複合体を検出することができる。例えば明細書に記載の本発明のＣＡＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞又は細胞集団を、例えば放射性同位体、フルオロフォア（例えばフルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ））、酵素（例えばアルカリフォスファターゼ、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ）及び元素粒子（例えば金粒子）などの検出可能なラベルで標識することができる。
【００８４】
ＣＡＲが標的細胞を認識し、抗原特異性を有する能力を試験する方法は当該分野で公知である。例えばClay ら、J. Immunol., 163: 507-513 (1999)にはサイトカイン（例えばインターフェロンγ、顆粒球／単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）又はインターロイキン２（ＩＬ−２））の放出を測定する方法が記載されている。加えてＣＡＲ機能は、Zhao ら、J. Immunol., 174: 4415-4423 (2005)で記載されているように、細胞毒性を測定することによっても評価することができる。
【００８５】
以下の実施例において、本発明をさらに説明するが、言うまでもなく、その範囲を限定する如何なるものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００８６】
実施例１
本実施例は、完全長マウスＣＤ２７及びマウスＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲ（ｍＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲ）をコードし、配列番号２５のアミノ酸配列を有するレトロウイルスベクターの形質導入効率、及びｍＣＤ７０を発現している腫瘍細胞に対するインビトロでのｍＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲの反応性を実証する。
【００８７】
完全長マウスＣＤ２７及びマウスＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲ（ｍＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲ）をコードし、配列番号２５のアミノ酸配列を有するレトロウイルスベクターを構築した。ネズミ（murine）Ｔ細胞に対して、ｍＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲレトロウイルスベクターでレトロウイルス的に形質導入した。形質導入効率は６２．６％であった。
【００８８】
脾細胞から作製したマウスＴ細胞を、形質導入せず（ＵＴ）又はＧＦＰ若しくはｍＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲをコードするベクターで形質導入し（エフェクター細胞）、単独（培地のみ）で培養した又は標的細胞としてマウスＣＤ７０を発現しないＢ１６悪性黒色腫細胞（Ｂ１６細胞）若しくはマウスＣＤ７０を発現するように形質導入したＢ１６細胞（Ｂ１６／ｍＣＤ７０）と共培養した。Ｂ１６腫瘍を認識するマウスＴ細胞であるＰｍｅｌ細胞を陽性対照のエフェクター細胞として用いた。ＩＦＮ−γ分泌を測定した。結果は表２に示す。表２に示したように、ｍＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲで形質導入した細胞はＣＤ７０発現腫瘍に対して、インビトロで高い反応性を示した。
【００８９】
【表３】
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【００９０】
実施例２
本実施例は、完全長マウスＣＤ２７及びマウスＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲ（ｍＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲ）及び配列番号２５のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列で形質導入した脾細胞から作製したマウスＴ細胞は、腫瘍の負荷を軽減し、ＣＤ７０を発現している腫瘍マウスの生存率を増加させることを実証する。
【００９１】
マウスにＣＡＲ発現細胞を移植する１１日前、Ｂ１６細胞又はＢ１６／ｍＣＤ７０細胞を注射することで腫瘍マウスを樹立した。その４日後、脾細胞をマウスから取り出し、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）及びＩＬ−７又は抗マウスＣＤ３（ｍＣＤ３）及び可溶性ＣＤ２８（ｓＣＤ２８）で刺激した。２日後、刺激した脾細胞から作製したマウスＴ細胞を、配列番号２５のアミノ酸配列を有するｍＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲをコードするＭＳＧＶ１レトロウイルスベクターで形質導入した。５日後、該ｍＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲ形質導入細胞（１×１０７）を腫瘍マウスに投与し、マウスに放射線を照射した（500 Rads）。対照腫瘍マウスに、非形質導入細胞、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、又はｐｍｅｌ細胞、ｇｐ１００ワクチン（Ｖ）及びＩＬ−２（Ｉ）の組合せ（「ｐｍｅｌ＋ＶＩ」）を投与し、放射線を照射した。治療後約３５日までの期間、腫瘍サイズを測定した。結果を図１Ａ〜１Ｂに示す。図１Ａ〜１Ｂに示したように、ｍＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲ形質導入細胞は、Ｂ１６／ｍＣＤ７０腫瘍マウスの腫瘍負荷を軽減したが、Ｂ１６腫瘍マウスの腫瘍負荷を軽減しなかった。従って、ＣＤ７０陽性腫瘍マウスは成功裏にｍＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲ形質導入細胞で治療することができ、その治療はＣＤ７０特異的であった。
【００９２】
脾細胞を抗ｍＣＤ３及びｓＣＤ２８で刺激したことを除き、Ｂ１６／ｍＣＤ７０腫瘍マウスで実験を繰り返した。放射線を照射し、形質導入細胞を投与した後のマウスにＩＬ−２を投与した。対照腫瘍マウスに、非形質導入細胞、空ベクターで形質導入した細胞、又はｐｍｅｌ＋ＶＩを投与し、放射線照射及びＩＬ−２を投与した。治療後約２４日までの期間、腫瘍サイズを測定した。結果を図１Ｆに示す。図１Ｆに示したように、ＩＬ−２を共投与した時、ｍＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲ形質導入細胞は、Ｂ１６／ｍＣＤ７０腫瘍マウスの腫瘍負荷を軽減した。
【００９３】
細胞投与から２１日後、腫瘍を治療マウスから取り出し、インビトロにおいて７日間増殖させた（grown）。腫瘍でのマウスＣＤ７０発現をＦＡＣＳで測定した。ｍＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲ形質導入細胞で治療したマウスではＣＤ７０発現は消失したが、Ｐｍｅｌ＋Ｖ又は非形質導入細胞で治療したマウスでは消失しなかった。特定の理論又は機構に縛られることはないが、腫瘍増殖（growth）の再発はＢ１６／ｍＣＤ７０腫瘍でのＣＤ７０発現の消失によると考えられる。
【００９４】
図１Ｂに相当する実験では、Ｂ１６／ｍＣＤ７０腫瘍マウスで、以下の例外を伴って繰り返し実験を行った。Ｂ１６／ｍＣＤ７０腫瘍マウスに、マウス１尾につき１×１０４、１×１０５、１×１０６又は１×１０７細胞の投与量でｍＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲ形質導入細胞を投与し、放射線を照射した（500 Rads）又は照射しなかった。対照腫瘍マウスに、ＰＢＳ、ｐｍｅｌ＋ＶＩ又は空ベクターで形質導入した細胞を投与し、放射線を照射した（500 Rads）又は照射しなかった。結果を図１Ｃに示す。図１Ｃに示したように、腫瘍を治療する最小有効投与量は、マウス１尾あたり１×１０５のｍＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲ形質導入細胞であり、放射線を照射したときであった。図１Ｃ〜１Ｄに示したように、マウス１尾あたり１×１０７の細胞投与量では、放射線照射は治療効果に影響しないようであった。
【００９５】
腫瘍マウスの生存は、治療後約４２日目までの期間、評価を行った。結果を図１Ｅに示す。図１Ｅに示したように、ｍＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲ形質導入細胞で治療し、放射線照射を行った腫瘍マウスは、特にマウス１尾あたり１×１０６又は１×１０７細胞の投与量の時に、より長い期間生存した。
【００９６】
実施例３
本実施例は、腫瘍マウスに対するｍＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲ形質導入細胞の投与が示した毒性を実証する。本実施例ではマウスが該毒性から回復できることも実証する。
【００９７】
Ｂ１６又はＢ１６／ｍＣＤ７０腫瘍マウスに、非形質導入細胞、配列番号２５のアミノ酸配列を有するｍＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲ形質導入細胞、ＰＢＳ又はｐｍｅｌ＋Ｖを投与し、放射線を照射した（500 Rads）又は照射しなかった。細胞投与後約６日目から開始して、治療後約１７日までの期間、マウスの平均重量を測定した。結果を図２Ａ〜２Ｄに示す。図２Ａ〜２Ｄに示したように、ｍＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲで治療したＢ１６／ｍＣＤ７０及びＢ１６腫瘍マウスの両方において、一時的な体重減少を観察した。ｍＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲ治療マウスで観察した体重減少は、移植した腫瘍とは無関係であった。特定の理論又は機構に縛られることはないが、体重減少はｍＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲが内在細胞を標的としたことをほのめかすと考えられる。水を含むヒドロゲル、親水コロイド、食用酸及び安息香酸ナトリウムを投与したときに、マウスは体重減少から回復した。
【００９８】
Ｂ１６又はＢ１６／ｍＣＤ７０腫瘍マウスに、非形質導入細胞、配列番号２５のアミノ酸配列を有するｍＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲ形質導入細胞、又はＧＦＰをコードするベクターで形質導入した細胞を投与し、放射線を照射した（500 Rads）又は照射しなかった。細胞投与後約６日目から開始して、治療後約１４日までの期間、マウスの白血球（ＷＢＣ）絶対数を測定した。結果を図２Ｅ〜２Ｈに示す。図２Ｅ〜２Ｈに示したように、ｍＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲ形質導入細胞で治療したマウスにおいて、一時的なＷＢＣ数の減少を観察した。図２Ｇ〜２Ｈに示したように、ｍＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲで治療したマウスにおいて、一時的な脾細胞数の減少を観察した。
【００９９】
Ｂ１６／ｍＣＤ７０腫瘍マウスに、配列番号２５のアミノ酸配列を有するｍＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲ形質導入細胞、又はＧＦＰをコードするベクターで形質導入した細胞を投与し、放射線を照射した（500 Rads）又は照射しなかった。細胞投与後約３日目から開始して、治療後約７日までの期間、血清ＩＮＦ−γレベルを測定した。結果を図２Ｉに示す。図２Ｉに示したように、ｍＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲで治療し、放射線を照射したマウスにおいて、一時的なＩＮＦ−γの分泌を観察した。
【０１００】
実施例４
本実施例は、ｍＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲの投与が非腫瘍マウスの長期間における免疫機能に測定可能な影響を及ぼさないことを実証する。
【０１０１】
配列番号２５のアミノ酸配列を有するｍＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲ形質導入細胞、又はＧＦＰをコードするベクターで形質導入した細胞（ＧＦＰ）を投与した非腫瘍マウスに、放射線を照射した（500 Rads）又は照射しなかった。形質導入細胞を投与後、該マウスをオボアルブミン（ＯＶＡ）又はヒト（ｈ）ｇｐ１００で、３２日目又は５０日目に免疫を行った。免疫後７日の該マウスの脾臓及びリンパ節（ＬＮ）からＴ細胞を取り出した。該細胞をインビトロにおいてＯＴ−１、ＯＴ−ＩＩ又はｈｇｐ１００ペプチドで刺激した。結果を表３（３２日・脾臓）、表３（３２日・ＬＮ）及び表５（５０日・脾臓）に示す。表５においては、免疫したＣ５７ＢＬ／６（免疫あり）マウス（Ｂ６／Ｉｍ）を陽性対照として用いた。ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｂ６／ナイーブ）を陰性対照として用いた。表３〜５に示したように、ｍＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲ投与は非腫瘍マウスの長期間における免疫機能に測定可能な影響を及ぼさなかった。
【０１０２】
脳、肺、肝臓、腎臓、腸、心臓、脾臓及び骨を含む様々な組織切片像を細胞投与後３〜７日に調べた。特に血液の化学的性状について、細胞投与から３〜７日の期間に、ナトリウム、カリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウム、リン、グルコース、血液尿素態窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン、尿酸、アルブミン、タンパク質、コレステロール、トリグリセリド、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＫＰ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ／ＧＰＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ／ＧＯＴ）、アミラーゼ、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）及び乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤ）について調ベた。組織切片像又は血液の化学的性状における変化は観察されなかった。
【０１０３】
【表４】
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【０１０４】
【表５】
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【０１０５】
【表６】
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【０１０６】
実施例５
本実施例は、形質導入細胞数を増幅（expansion）後、完全長ヒトＣＤ２７及びヒトＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲ（ｆＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列で形質導入したＴ細胞が、該ＣＡＲを発現することを実証する。
【０１０７】
ＯＫＴで非特異的に刺激したＰＢＬ、及びＰＢＬから作製したＴ細胞を、（ａ）形質導入しなかった（ＵＴ）、（ｂ）完全長ヒトＣＤ２７をコードするヌクレオチド配列で形質導入した（ｆＣＤ２７）又は（ｃ）配列番号７のアミノ酸配列を有するｆＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲをコードするヌクレオチド配列で形質導入した。細胞を増殖し、蛍光活性化細胞選択（ＦＡＣＳ）によってＣＡＲ発現を分析し、ＩＦＮ−γの産生に基づいて腫瘍反応性を試験した。Riddell ら、J. Immunol. Methods, 128:189-201 (1990)に記載のように、一般的な方法でＣＤ７０反応性の細胞数を急速に増幅した（rapidly expanded：ＲＥＰ）。増幅した（expanded）細胞数を増殖し（grown）、ＦＡＣＳによってＣＤ２７、ＣＤ７０、ＣＤ４５ＲＯ及びＣＤ６２Ｌの発現を分析した。表６はＦＡＣＳで測定した表示の表現型を示す細胞の割合を示す。表７は刺激後（ＲＥＰ前）及びＲＥＰ後における、細胞の増幅倍率（fold expansion）及び生残率（％）を示す。表６及び７に示すように、細胞数を増幅した（expanded）形質導入細胞はＣＡＲを発現し生残しており、エフェクター・記憶細胞としての表現型を有する。
【０１０８】
【表７】
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【０１０９】
【表８】
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【０１１０】
実施例６
本実施例は、完全長ヒトＣＤ２７及びヒトＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲ（ｆＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列で形質導入したＴ細胞を、ＣＤ７０発現細胞との共培養で増殖し（proliferate）、インビトロでＣＤ７０発現腫瘍細胞を特異的に認識することを実証する。
【０１１１】
Ｔ細胞をヒトＰＢＬから作製した。形質導入しなかった（ＵＴ）又はｆＣＤ２７若しくはｆＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲをコードするヌクレオチド配列で形質導入したＴ細胞（エフェクター細胞）を、単独で培養した又はＣＤ７０発現腫瘍細胞株６２４ｍｅｌ若しくはＣＤ７０で形質導入した６２４ｍｅｌ細胞（６２４／ＣＤ７０）（標的細胞）と共培養した。共培養開始から４日目にカルボキシルフルオレセイン・スクシニミジル・エステル（ＣＦＳＥ）を用いて、エフェクター細胞の増殖（proliferation）を測定した。ＣＤ７０発現腫瘍細胞株６２４／ＣＤ７０と共培養した時に、ｆＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲで形質導入したＴ細胞は増殖した（proliferate）。非形質導入Ｔ細胞及びｆＣＤ２７で形質導入したＴ細胞は如何なる培養においても増殖（proliferate）しなかった。
【０１１２】
形質導入しなかった又はｆＣＤ２７若しくはｆＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲ（配列番号７）をコードするヌクレオチド配列で形質導入したＴ細胞（エフェクター細胞）を、単独（培地のみ）で培養した又は以下の表８に示したヒトＲＣＣ細胞株若しくは対照細胞株６２４、６２４／ＣＤ７０、ＳＮＵ２４５、ＳＮＵ１０７９若しくはＳＮＵ１１９６（標的細胞）の１つと共培養した。全てのＳＮＵ細胞株はＣＤ７０陰性であった。ＩＦＮ−γ分泌を測定した。結果を表８に示す。表８に示すように、ｆＣＤ２７−ＣＤ３ζＣＡＲ（配列番号７）のヌクレオチド配列で形質導入したＴ細胞はＣＤ７０発現ヒトＲＣＣ細胞株に対して反応性を示した。
【０１１３】
【表９】
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【０１１４】
実施例７
本実施例は、ヒト抗ＣＤ７０ＣＡＲコンストラクトの形質導入効率を実証する。
【０１１５】
ヒトＴ細胞を空のレトロウイルスベクター（Mock）又は表９Ａ〜９Ｃに記載したコンストラクトの１つをコードするレトロウイルスベクターで形質導入した。トランケート（Δ）ＣＤ２７を含むＣＡＲは、ＣＤ２７細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインの全てを欠いており、すなわち、トランケートＣＤ２７は配列番号２の２１２〜２６０番目の連続するアミノ酸残基を欠いている。ＦＡＣＳによって、形質導入細胞のＣＤ３、ＣＤ２７、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４５ＲＯの発現を分析した。表９Ａ〜９ＣはＦＡＣＳによって測定した表示の表現型を有する細胞の割合を示す。表９Ｂに示すように、ＣＡＲで形質導入した細胞はエフェクター・記憶細胞の表現型を有する。
【０１１６】
【表１０】
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【０１１７】
【表１１】
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【０１１８】
【表１２】
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【０１１９】
実施例８
本実施例はｆＣＤ２７−ＣＤ３ζ（配列番号７）、ΔＣＤ２７−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ（配列番号９）、ΔＣＤ２７−ＣＤ２８−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ（配列番号１０）、ｆＣＤ２７−４−１ＢＢ-ＣＤ３ζ（配列番号１２）又はｆＣＤ２７−ＣＤ２８−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ（配列番号１３）で形質導入したヒトＴ細胞が、インビトロでＣＤ７０発現ＲＣＣ腫瘍細胞を認識することを実証する。
【０１２０】
空のレトロウイルスベクター（ＭＳＧＶ１）又は表９Ａに記載したコンストラクトの１つをコードするレトロウイルスベクターでヒトＴ細胞を形質導入した。形質導入したＴ細胞を、単独（培地のみ）で培養した又は対照標的細胞株６２４ｍｅｌ、６２４／ＣＤ７０、９３８ｍｅｌ若しくはＣＤ７０を発現するように形質導入した９３８ｍｅｌ細胞（９３８／ＣＤ７０）、又はＲＣＣ標的細胞ＲＣＣ２２４５Ｒ、ＲＣＣ２２４６Ｒ、ＲＣＣ２３６１Ｒ若しくはＲＣＣ１７６４と共培養した。ＩＦＮ−γ分泌を測定した。結果を図３に示した。図３に示すように、ｆＣＤ２７−ＣＤ３ζ（配列番号７）、ΔＣＤ２７−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ（配列番号９）、ΔＣＤ２７−ＣＤ２８−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ（配列番号１０）、ｆＣＤ２７−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ（配列番号１２）又はｆＣＤ２７−ＣＤ２８−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ（配列番号１３）で形質導入したヒトＴ細胞は、インビトロにおいて、ＣＤ７０を発現するＲＣＣ腫瘍細胞を認識する。
【０１２１】
実施例９
本実施例はΔＣＤ２７−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ（配列番号９）レトロウイルスベクターを産生するパッキングクローンの選択について実証する。
【０１２２】
レトロウイルス・パッキング細胞株ＰＧ１３のクローンＡ２、Ａ１０、Ｂ３、Ｃ１、Ｅ３、Ｇ２を形質導入せず、又はΔＣＤ２７−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ（配列番号９）をコードするレトロウイルスベクターで形質導入した。表１０はＦＡＣＳで測定した表示の表現型を有する細胞の割合を示す。
【０１２３】
【表１３】
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【０１２４】
形質導入したクローンを単独（培地のみ）で培養した又は標的対照細胞９３８ｍｅｌ、９３８／ＣＤ７０、ＳＮＵ１０７９、ＳＮＵ１１９６、又は標的ＲＣＣ細胞株ＲＣＣ２２４５Ｒ、ＲＣＣ２２４６Ｒ、ＲＣＣ２３６１Ｒ若しくはＲＣＣ１７６４と共培養した。ＩＦＮ−γ分泌を測定した。結果を図４に示した。図４に示すように、レトロウイルス・パッキング・クローンＥ３はＣＤ７０を発現する標的腫瘍細胞株に対する反応性を有することを実証した。
【０１２５】
レトロウイルス・パッキング細胞クローンを表１１に記載したＣＡＲで形質導入した。表１１はＦＡＣＳで測定した表示の表現型を有する細胞の割合を示す。
【０１２６】
【表１４】
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【０１２７】
形質導入したクローンを単独（培地のみ）で培養した又は標的対照細胞９３８ｍｅｌ、９３８／ＣＤ７０、ＳＮＵ１０７９、ＳＮＵ１１９６、又は標的ＲＣＣ細胞株ＲＣＣ２２４５Ｒ、ＲＣＣ２２４６Ｒ、ＲＣＣ２３６１Ｒ若しくはＲＣＣ１７６４と共培養した。ＩＦＮ−γ分泌を測定した。結果を図５に示した。図５に示すように、レトロウイルス・パッキング・クローンＥ３はＣＤ７０を発現する標的腫瘍細胞株に対する反応性を有することを実証した。
【０１２８】
形質導入効率及び腫瘍活性に基づいて、レトロウイルス・パッキング・クローンＥ３／ΔＣＤ２７−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ（配列番号９）を臨床用途として選択した。
【０１２９】
本明細書中に引用した刊行物、特許出願及び特許を含む全ての参考文献は、各参考文献を個別にかつ具体的に引用補充することが示され、その全体が本明細書に記載されているのと同程度に本明細書に援用される。
【０１３０】
本発明を記載する文脈（特に添付の特許請求の範囲の文脈）における用語「a」、「an」及び「the」並びに同様の指示対象の使用は、本明細書中で別段の指示がない限り、又は文脈によって明確に矛盾しない限り、単数及び複数形を含むものとして解釈されるべきである。「含む(comprising)」、「有する(having)」、「含む(including)」及び「含有する(containing)」という用語は、別段の記載がない限り、制限のない用語（open-ended terms）（すなわち、「含むが、これに限定されない（including, but not limited to）」を意味する）として解釈されるべきである。本明細書中の値の範囲の列挙は、本明細書中に別段の指示がない限り、範囲内の各別個の値を個別に指す簡略方法として役立つことを意図しており、本明細書において個々の値はそれぞれ個別に列挙されているかのように、個々の値は明細書に取り込まれる。本明細書中に記載された全ての方法は、本明細書中で他に指示されない限り、又は文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施し得る。本明細書で提供される任意の及び全ての例、又は例示的な言語（例えば「など（such as）」）の使用は、単に本発明をよりよく示すことを意図しており、特に断らない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中のいかなる言葉も、本発明の実施に不可欠であるとして、任意の主張されていない要素を示すものと解釈されるべきではない。
【０１３１】
本発明の好ましい実施形態は、本発明を実施するために本発明者らに知られている最良の形態を含むものとして、本明細書に記載する。これらの好ましい実施形態の変形形態は、上記の明細書を読むことによって当業者にとって明らかになるであろう。本発明者らは、当業者がこのような変形を適切に使用することを期待しており、本発明者らは本発明が本明細書に具体的に記載されたものとは別の方法で実施されることを意図する。したがって、本発明は、適用法によって許容されるように、本明細書に添付した特許請求の範囲に記載された主題の全ての改変及び均等物を含む。さらに、本明細書中で他に指示されない限り、又は文脈によって明らかに否定されない限り、それらの全ての可能な変形例における上記要素の任意の組み合わせが本発明に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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