(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
0006779494.tif 000017
［式中、
Ｒ１は、水素原子、又はメチル基であり；
Ｒ２は、水素原子、又はメチル基であり；
但し、Ｒ１及びＲ２は異なる置換基である］
で示されるトリテルペン、その塩若しくはエステル、又はそれらの配糖体であって、
上記エステルは、１７位のカルボキシ基のメチルエステル又はエチルエステルであるか、又は
３位の水酸基、１９位の水酸基及び２０位の−ＣＨ２ＯＨから選択される少なくとも１つと、酢酸、プロピオン酸、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、デセン酸、オレイン酸、エルシン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、安息香酸、オルト、メタ及び／若しくはパラ位にアミノ基若しくは水酸基を有する安息香酸、及びナフトエ酸から選択されるカルボン酸とのエステルであり、
上記配糖体は、３位の水酸基、１９位の水酸基、２０位の−ＣＨ２ＯＨ及び１７位のカルボキシ基から選択される少なくとも１つに、グルコース、マンノース、ガラクトース、グルコサミン、マンノサミン、ガラクトサミン、アラビノース、キシロース、リボース、マルトース、ラクトース、トレハロース、セロビオース、イソマルトース、ゲンチオビオース、メリビオース、ラミナリビオース、キトビオース、キシロビオース、マンノビオース、ソホロース、マルトトリオース、イソマルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マンノトリオース、マンニノトリオース、並びにでんぷん、セルロース、キチン若しくはキトサンの加水分解物から選択される糖残基が結合した配糖体である、上記トリテルペン、その塩若しくはエステル、又はそれらの配糖体（ただし、下記：
【化２】
0006779494.tif 000018
の３位の水酸基及び１７位のカルボキシ基に糖残基が結合した配糖体を除く）。
【請求項２】
上記エステルが、１７位のカルボキシ基のメチルエステル又はエチルエステルであるか、又は
３位の水酸基、１９位の水酸基及び２０位の−ＣＨ２ＯＨから選択される少なくとも１つと、酢酸、プロピオン酸、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、デセン酸、安息香酸、オルト、メタ及び／若しくはパラ位にアミノ基若しくは水酸基を有する安息香酸、及びナフトエ酸から選択されるカルボン酸とのエステルであり、
上記配糖体が、３位の水酸基、１９位の水酸基、２０位の−ＣＨ２ＯＨ及び１７位のカルボキシ基から選択される少なくとも１つに、グルコース、マンノース、ガラクトース、グルコサミン、マンノサミン、ガラクトサミン、アラビノース、キシロース、及びリボースから選択される糖残基が結合した配糖体である、請求項１に記載のトリテルペン、その塩若しくはエステル、又はそれらの配糖体。
【請求項３】
式（Ｉ）が、下記式：
【化３】
0006779494.tif 000019
である、請求項１又は２に記載のトリテルペン、その塩若しくはエステル、又はそれらの配糖体。
【請求項４】
３位水酸基に糖残基が結合した配糖体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のトリテルペン、その塩若しくはエステル、又はそれらの配糖体。
【請求項５】
以下：
【化４】
0006779494.tif 000020
からなる群から選択される化合物。
【請求項６】
アマミナナフシ代謝残渣より抽出・精製することを特徴とする、請求項５に記載の化合物の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のトリテルペン、その塩若しくはエステル、又はそれらの配糖体から選択される少なくとも１種、或いは請求項５に記載の化合物から選択される少なくとも１種を有効成分として含有する、アミロイドβ凝集阻害剤。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のトリテルペン、その塩若しくはエステル、又はそれらの配糖体から選択される少なくとも１種、或いは請求項５に記載の化合物から選択される少なくとも１種を有効成分として含有する、抗認知症剤。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のトリテルペン、その塩若しくはエステル、又はそれらの配糖体から選択される少なくとも１種、或いは請求項５に記載の化合物から選択される少なくとも１種を有効成分として含有する、抗腫瘍剤。
【請求項１０】
医薬品又は食品である、請求項７に記載のアミロイドβ凝集阻害剤。
【請求項１１】
医薬品又は食品である、請求項８に記載の抗認知症剤。
【請求項１２】
医薬品又は食品である、請求項９に記載の抗腫瘍剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規トリテルペン、その製造方法及びそれを含有する組成物に関する。また本発明は、新規トリテルペンを有効成分として含有する、アミロイドβ凝集阻害剤、抗認知症剤及び抗腫瘍剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＡＤ）は初老期に発症して進行性痴呆を呈し、有効な治療法もなく数年で死に至る難病である。高齢化社会を迎え患者数は年々増加しており、早期診断・治療・予防法の確立が急務である。病理学的にＡＤ脳では老人斑として知られるアミロイドベータ蛋白質（以下、Ａβ、アミロイドβともいう）の沈着や、異常にリン酸化したタウ蛋白質の蓄積により神経原線維の変化を伴って脳の広汎な神経細胞死が引き起こされる（非特許文献１）。現在ＡＤ治療薬として、Ａβの産生に関与するβ−セクレターゼ阻害やＡβ凝集阻害を標的とした化合物の探索が広く行われている。
【０００３】
ハイスループットにＡβ凝集阻害活性の有無の評価を行う方法として、チオフラビンＴ（ＴＨＴ）法が汎用された１次スクリーニング法の一つとして用いられており、天然物由来成分についても報告がある。例えば、ツバキ科のチャノキ（茶の木）Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ  ｖａｒ．  ａｓｓａｍｉｃａ花部から単離された新規サポニンであるトリテルペン配糖体のｆｌｏｒａａｓｓａｍｓａｐｏｎｉｎ  ＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩにはＡβ凝集阻害活性を有することが報告されている（非特許文献２）。また、中国薬用植物として知られるＳａｌｖｉａ  ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａの主成分であるｃｒｙｐｔｏｔａｎｓｈｉｎｏｎｅはＳＴＡＴ３のリン酸化阻害（非特許文献３）の他にＡβ凝集阻害活性があることが報告されている（非特許文献４）。さらには、天然物化合物のフラボノイドとして広く知られるミリセチンはＡβの産生に関与するβ−セクレターゼ阻害活性（非特許文献５）に加えＡβ凝集阻害活性（非特許文献６）も報告されている。
【０００４】
これまでに天然物由来の生理活性物質の探索では、植物及び菌類を主な出発材料として用いていたが、単離可能な有用物質は探索され尽くされており、新たな出発材料として適切な素材が見つからない点が問題となっていた。上述したように、植物由来天然物材料からＡβ凝集阻害活性物質の探索が行われているが、昆虫を出発材料としたＡβ凝集阻害活性物質の探索は行われていなかった。
【０００５】
昆虫は世界中に１１０万種類以上存在することが知られており、ヒトが利用できないアルカロイド類等を含む植物でさえも利用することができる（非特許文献７）。アルカロイド類は多くの薬理作用があり、中には抗ガン作用を持つ化合物も知られている（非特許文献８）。この他にもヒトにとっては毒である成分も昆虫種によってはそれらを生体システムの維持に組み込み、巧みに利用している。また昆虫はその体内において植物や動物体から吸収した成分を濃縮し、ヒトが吸収しやすい形にも変えることができる（非特許文献９）。このように昆虫はヒトにとって有用な物質をその体内に持つ種類が存在する。これまでにも昆虫からは多くの有用物質が発見されているが、医薬品候補化合物として化合物の単離・構造決定はほとんどなされていない。
【０００６】
一方で、昆虫体内で強力な抗ガン作用を持つものとしてモンシロチョウからピエリシンが国立がんセンターの若林らにより偶然発見されている（非特許文献１０）が、ピエリシンは高分子であるタンパク質であるために、医薬品としての製剤化が困難であるという問題点があり、現在も強力な広範囲の癌に作用する抗癌活性を有するものの医薬品としての開発はされていない。また、昆虫資源類からＡβ凝集阻害を有する化合物はこれまでに単離・同定されていない。
以上より、新たな素材から単離可能な有用物質が求められていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｅｎｎｖｉｋ，  Ｋ．ｅｔ  ａｌ，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｌｅｔｔ．２７８，１６９−１７２，２０００
【非特許文献２】Ｏｈｔａ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，７１，８４６−８５１，２０１５
【非特許文献３】Ｌｉａｎｇ  Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３８１，２７３−２８２，２０１３
【非特許文献４】Ｚｈｅｎｇｒｏｎｇ  Ｍｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．，３７，６２２−６２８，２０１２
【非特許文献５】Ｓｈｉｍｍｙｏ  Ｙｏｓｈｉａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１７８０，８１９−８２５，２００８
【非特許文献６】Ｏｎｏ  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．，２８７，１４６３１−１４６４３，２０１２
【非特許文献７】Ｂｅｚｚｅｒｉｄｅｓ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，１０１，９０２９−９０３２（２００４）
【非特許文献８】Ｊｉａｎｇ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．１４，１８５２−１８５９（２００９）
【非特許文献９】Ｂｏｐｐｒｅ  Ｍ．  Ｊ  Ｃｈｅｍ  Ｅｃｏｌ；１６，１６５−１８５（１９８９）
【非特許文献１０】Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．９６，１０６０８−１０６１３（１９９９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、新規トリテルペン、その製造方法及びそれを含有する組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、アマミナナフシの代謝残渣から有用物質の探索を行い、アマミナナフシの代謝残渣由来の化合物及び組成物が高いアミロイドβ凝集阻害活性を有することを見出した。当該化合物は、背景技術の説明において上に挙げた化合物類と異なる構造を有する。
【００１０】
本発明は以下の発明を包含する。
（１）式（Ｉ）：
【化１】
0006779494.tif 000002
［式中、
Ｒ１は、水素原子、又はメチル基であり；
Ｒ２は、水素原子、又はメチル基であり；
但し、Ｒ１及びＲ２は異なる置換基である］
で示されるトリテルペン、その塩若しくはエステル、又はそれらの配糖体。
（２）式（Ｉ）が、下記式：
【化２】
0006779494.tif 000003
である、上記（１）に記載のトリテルペン、その塩若しくはエステル、又はそれらの配糖体。
（３）３位水酸基に糖残基が結合した配糖体である、上記（１）又は（２）に記載のトリテルペン、その塩若しくはエステル、又はそれらの配糖体。
（４）以下：
【化３】
0006779494.tif 000004
からなる群から選択される化合物。
（５）アマミナナフシ代謝残渣より抽出・精製することを特徴とする、上記（４）に記載の化合物の製造方法。
（６）上記（４）に記載の化合物から選択される少なくとも１種を含有するアマミナナフシ代謝残渣由来の組成物。
（７）前記組成物がアマミナナフシ代謝残渣の抽出物又はその処理物である、上記（６）に記載のアマミナナフシ代謝残渣由来の組成物。
（８）上記（１）〜（３）のいずれかに記載のトリテルペン、その塩若しくはエステル、又はそれらの配糖体から選択される少なくとも１種、上記（４）に記載の化合物から選択される少なくとも１種、或いは上記（６）又は（７）に記載の組成物を有効成分として含有する、アミロイドβ凝集阻害剤。
（９）上記（１）〜（３）のいずれかに記載のトリテルペン、その塩若しくはエステル、又はそれらの配糖体から選択される少なくとも１種、上記（４）に記載の化合物から選択される少なくとも１種、或いは上記（６）又は（７）に記載の組成物を有効成分として含有する、抗認知症剤。
（１０）上記（１）〜（３）のいずれかに記載のトリテルペン、その塩若しくはエステル、又はそれらの配糖体から選択される少なくとも１種、上記（４）に記載の化合物から選択される少なくとも１種、或いは上記（６）又は（７）に記載の組成物を有効成分として含有する、抗腫瘍剤。
（１１）医薬品又は食品である、上記（８）に記載のアミロイドβ凝集阻害剤。
（１２）医薬品又は食品である、上記（９）に記載の抗認知症剤。
（１３）医薬品又は食品である、上記（１０）に記載の抗腫瘍剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のトリテルペン、その塩若しくはエステル、又はそれらの配糖体、及びこれを含有する組成物は、高いアミロイドβ凝集阻害活性を有し、高いアミロイドβ凝集阻害剤として用いることができる。本発明のトリテルペン、その塩若しくはエステル、又はそれらの配糖体、及びこれを含有する組成物は、抗認知症剤又は抗腫瘍剤として用いることができる。本発明の製造方法によれば、上記のような活性を有するトリテルペン又はそれらの配糖体を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、アマミナナフシ（Ｅｎｔｏｒｉａ  ｏｋｉｎａｗａｅｎｓｉｓ）の糞のクロロホルム抽出物からの本発明の化合物：式（Ｉ−１）の化合物（ＥＯ−３）、式（Ｉ−２）の化合物（ＥＯ−４）、式（Ｉ−３）の化合物（ＥＯ−５）、及び式（Ｉ−４）の化合物（ＥＯ−６）の抽出・単離スキームを示す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明の化合物：式（Ｉ−１）の化合物（ＥＯ−３）の構造と、ＨＭＢＣ相関及びＮＯＥＳＹ相関と物性値を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明の化合物：式（Ｉ−２）の化合物（ＥＯ−４）の構造と、ＨＭＢＣ相関及びＮＯＥＳＹ相関と物性値を示す図である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、本発明の化合物：式（Ｉ−３）の化合物（ＥＯ−５）の構造と、ＨＭＢＣ相関及びＮＯＥＳＹ相関と物性値を示す図である。
【図２Ｄ】図２Ｄは、本発明の化合物：式（Ｉ−４）の化合物（ＥＯ−６）の構造と、ＨＭＢＣ相関及びＮＯＥＳＹ相関と物性値を示す図である。
【図３】図３は、アマミナナフシの糞のクロロホルム抽出物から得られた分画とシラカシの葉のクロロホルム抽出物をＨＰＬＣにより分析した結果を示す図である。
【図４】図４は、式（Ｉ−３）の化合物（ＥＯ−５）及び式（Ｉ−４）の化合物（ＥＯ−６）、アマミナナフシの糞のクロロホルム抽出物、及び、シラカシの葉のクロロホルム抽出物をＬＣ−ＭＳにより分析した結果を示す図である。
【図５】図５は、ＭＴＴ−アッセイの概略図である。
【図６】図６は、チオフラビン−Ｔ法の概略図である。
【図７】図７（ａ）は、本発明の化合物：式（Ｉ−１）の化合物（ＥＯ−３）及び式（Ｉ−２）の化合物（ＥＯ−４）に対して、チオフラビン−Ｔ法によりアミロイドβ凝集阻害活性を評価した結果を示す図である。図７（ｂ）は、式（Ｉ−３）の化合物（ＥＯ−５）及び式（Ｉ−４）の化合物（ＥＯ−６）に対して、チオフラビン−Ｔ法によりアミロイドβ凝集阻害活性を評価した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、式（Ｉ）：
【化４】
0006779494.tif 000005
［式中、
Ｒ１は、水素原子、又はメチル基であり；
Ｒ２は、水素原子、又はメチル基であり；
但し、Ｒ１及びＲ２は異なる置換基である］
で示されるトリテルペン、その塩若しくはエステル、又はそれらの配糖体（以下、式（Ｉ）の化合物ともいう）に関する。本発明の式（Ｉ）の化合物は、高いアミロイドβ凝集阻害活性を示し、また、本発明の式（Ｉ）の化合物は、癌細胞に対して高い細胞毒性を示す。
【００１４】
本発明の式（Ｉ）で示される化合物は、１９位及び２０位における絶対配置はＲ体及びＳ体のいずれであってもよく、またラセミ体であってもよい。また、式（Ｉ）において、Ｒ１とＲ２が相互にシス配置であることが好ましい。具体的には、式（Ｉ）は、以下：
【化５】
0006779494.tif 000006
であることが好ましい。
【００１５】
式（Ｉ）で示されるトリテルペンの塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、トリエチルアミン塩等の有機塩基塩等が挙げられ、式（Ｉ）で示されるトリテルペンは、式（Ｉ）中の水酸基の内１〜４個の位置、好ましくは１７位のカルボキシ基で塩を形成しうる。
【００１６】
式（Ｉ）で示されるトリテルペンのエステルとしては、特に制限はなく、例えばメチルエステル、エチルエステル等のアルキルエステルが挙げられる。これらのエステルは、常法に従い、例えば、酸性触媒下、メタノール等の対応するアルコール化合物と式（Ｉ）で示されるトリテルペンとを反応させることで得ることができる。また式（Ｉ）で示されるトリテルペンのエステルとしては、酢酸等の脂肪酸、安息香酸等の芳香族カルボン酸とのエステル等を含む。脂肪酸とは飽和脂肪酸及び不飽和脂肪酸を含み、鎖長については短鎖、中鎖及び長鎖を含み、具体的には酢酸、プロピオン酸、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、ラウリル酸、ミリスチル酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、デセン酸、オレイン酸、エルシン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸等が挙げられるが、これらに限定されない。また芳香族脂肪酸とは、安息香酸、安息香酸のオルト、メタ及び／またはパラ位にアミノ基、水酸基等の置換基を有するものも含まれ、ナフトエ酸等の多環芳香族のカルボン酸も含む。式（Ｉ）で示されるトリテルペンは、式（Ｉ）中の水酸基の内１〜４個の位置でエステルを形成しうる。これらのエステルは、常法に従い、例えば、酸性触媒下、対応するカルボン酸と式（Ｉ）で示されるトリテルペンとを反応させることで得ることができる。
【００１７】
式（Ｉ）で示されるトリテルペンの配糖体を形成する糖残基としては、糖単位１〜１０、好ましくは１〜５の単糖又はオリゴ糖、特に好ましくは単糖が挙げられる。糖残基としては、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、グルコサミン、マンノサミン、ガラクトサミン等の六炭糖類、アラビノース、キシロース、リボース等の五炭糖類、マルトース、ラクトース、トレハロース、セロビオース、イソマルトース、ゲンチオビオース、メリビオース、ラミナリビオース、キトビオース、キシロビオース、マンノビオース、ソホロース等の二糖類、マルトトリオース、イソマルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マンノトリオース、マンニノトリオース等や、でんぷん、セルロース、キチン、キトサン等の加水分解物（例えば、局方デキストリン、アクロデキストリン、ブリテッシュガム、セロデキストリン等）等を挙げることができ、これらの中で、アラビノース、キシロース、リボース等の五炭糖類が好ましい。式（Ｉ）で示されるトリテルペンは、式（Ｉ）中の水酸基の内１〜４個の位置、好ましくは３位の水酸基で配糖体を形成しうる。これらの配糖体は、常法に従い、例えば、酸性触媒下、対応する糖と式（Ｉ）で示されるトリテルペンとを反応させることで得ることができる。
【００１８】
上記式（Ｉ）で示されるトリテルペンの配糖体としては以下：
【化６】
0006779494.tif 000007
が好ましい。
【００１９】
本発明は、式（Ｉ−１）〜（Ｉ−４）で示される化合物の製造方法にも関する（以下、本発明の化合物の製造方法ともいう）。本発明の化合物の製造方法は、アマミナナフシ代謝残渣より抽出・精製することを特徴とする。アマミナナフシ代謝残渣からの式（Ｉ−１）〜（Ｉ−４）で示される化合物の抽出・精製工程については、式（Ｉ−１）〜（Ｉ−４）で示される化合物から選択される少なくとも１種を含有する組成物に関する下記の記載を引用するものとする。
【００２０】
本発明は、式（Ｉ−１）〜（Ｉ−４）で示される化合物から選択される少なくとも１種を含有するアマミナナフシ代謝残渣由来の組成物にも関する（以下、本発明の組成物ともいう）。本発明の組成物は、高いアミロイドβ凝集阻害活性を示し、また本発明の組成物は、癌細胞に対して高い細胞毒性を示す。
【００２１】
本発明の組成物は、アマミナナフシ代謝残渣に由来する。アマミナナフシ代謝残渣としては、最終代謝残渣が好ましく、糞が挙げられる。本発明者らは、これまで利用されたことがなかった植食性昆虫の最終代謝残渣である糞に着目した。昆虫はごく一部のモデル昆虫類（ショウジョウバエ・ハマダラカ・カイコ・コクヌストモドキ・タバコスズメガ）を除いて生体内における代謝機構が未だ明らかにされていない。また昆虫の形態は多様であり、種の数だけ代謝系のバリエーションが存在することが予測される。
【００２２】
上記アマミナナフシとしては、所望の代謝系を活性化する観点から、例えば温度及び明暗周期等の条件が調整された環境で生育されたものを用いることが好ましい。具体的には、温度としては約２５〜２８℃であることが好ましく、明暗周期としては明期約１６時間、暗期約８時間の周期であることが好ましい。また上記アマミナナフシとしては、餌として例えば、ブナ科コナラ属カシ類、バラ科及びカエデ科を含む植物を摂取させたものを用いることが好ましい。このような植物としては、シラカシ（Ｑｕｅｒｃｕｓ  ｍｙｒｓｉｎｉｆｏｌｉａ）、ウラジロガシ（Ｑｕｅｒｃｕｓ  ｓｔｅｎｏｐｈｙｌｌａ）、マテバシイ（Ｌｉｔｈｏｃａｒｐｕｓ  ｅｄｕｌｉｓ）、バラ（Ｒｏｓａ）、イロハモミジ（Ａｃｅｒ  ｐｌｍａｔｕｍ）及びヤマザクラ（Ｃｅｒａｓｕｓ  ｊａｍａｓａｋｕｒａ）等が挙げられる。用いる植物の部分は、特に限定されず、全ての植物体を使用できるが、茎つきの葉を用いることが好ましい。
【００２３】
本発明の組成物は、アマミナナフシ代謝残渣の抽出物（以下、抽出物という）又はその処理物（以下、処理物という）であることが好ましい。処理物とは、抽出物に分離、精製、単離等の各種処理の少なくとも１つを施したものである。
【００２４】
抽出溶媒としては、水；脂肪族炭化水素類、例えばヘキサン、クロロホルム；アルコール類、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール；エステル類、例えば酢酸エチル等の酢酸エステル；エーテル類、例えばエチルエーテル、ジオキサン；ケトン類、例えばアセトン等が挙げられる。抽出物を一旦溶媒除去して乾燥物として用いる場合には、前述した任意の溶媒を単独で又は混合して用いることができる。一方、抽出物を溶媒に溶解した状態で用いる場合には、人体に対して有害な作用を示さない溶媒を用いる必要があり、この場合には、水、エタノール又はこれらの混合物を用いることが好ましい。抽出に際して、アマミナナフシ代謝残渣は、そのまま用いることができ、また乾燥後に破砕又は粉砕して溶媒との接触を高めることもできる。
【００２５】
一実施形態において、本発明の抽出物は、アマミナナフシ代謝残渣１ｋｇ当たり、好ましくは３〜４Ｌの抽出溶媒で、好ましくは３〜５回抽出することができる。抽出温度は、好ましくは室温ないし加圧下での沸点の範囲内であり、抽出時間は、抽出温度等により異なるが、好ましくは２０〜４８時間であり、さらに好ましくは２０〜２４時間である。
【００２６】
このようにして得られた抽出液は、必要に応じて、布、ステンレスフィルター、濾紙、濾過滅菌用フィルター等で濾過して不溶物、不純物等を除去してもよい。また、濾過後の抽出液に、スプレードライ処理、フリーズドライ処理、超臨界処理等、エバポレート処理を施してもよい。
【００２７】
好ましい一実施形態において、本発明の抽出物は、アマミナナフシ代謝残渣１ｋｇ当たり、好ましくは３〜４Ｌの抽出溶媒で、好ましくは３〜５回抽出することができる。抽出温度は、好ましくは室温であり、抽出時間は、好ましくは２０〜２４時間又は２４〜４８時間である。
【００２８】
このようにして得られた抽出液は、濾紙で濾過して不溶物、不純物等を除去してもよい。また、濾過後の抽出液に、エバポレート処理を施してもよい。
【００２９】
このようにして得られた抽出物又はその処理物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、吸着・逆相分配クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等の各種精製手段により処理し、さらに活性を高めた処理物としてもよい。
【００３０】
本発明の抽出物としては、例えば、アマミナナフシ代謝残渣、好ましくは糞のクロロホルム抽出物等が挙げられる。具体的にはアマミナナフシ代謝残渣をノルマルヘキサンで抽出後、アマミナナフシ代謝残渣をクロロホルムで抽出して得られたクロロホルムエキスが挙げられる。
【００３１】
本発明の処理物としては、例えば、上記抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（例えば移動相としてクロロホルム／メタノールを用い、好ましくはメタノール濃度を次第に高くする濃度勾配で用いる）を用いて分取した溶出画分、好ましくは５：１〜０：１クロロホルム：メタノール溶出画分（図１中の分離１により得られるＦｒ．３）が挙げられる。
【００３２】
本発明の処理物としては、上記溶出画分（図１中の分離１により得られるＦｒ．３）をさらに、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（例えば移動相としてクロロホルム／メタノールを用い、好ましくはメタノール濃度を次第に高くする濃度勾配で用いる）を用いて分取した溶出画分、好ましくは５：１クロロホルム：メタノール溶出画分（図１中の分離２により得られるＦｒ．３−５）が挙げられる。
【００３３】
本発明の処理物としては、上記溶出画分（図１中の分離２により得られるＦｒ．３−５）由来の画分を、例えば逆相ＨＰＬＣ（例えばＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ（商標）Ｃ１８，５μｍ，カラム内径１ｃｍｘ長さ２５ｃｍ、例えば移動相としてメタノール：水＝８０：２０を用いる）を用いて分取した溶出画分が挙げられる（図１中の分離１０により得られるＰｅａｋ  Ａ及びＢ）。図１中のＰｅａｋ  Ａからは式（Ｉ−３）で示される化合物（化合物ＥＯ−５）が得られ、Ｐｅａｋ  Ｂからは式（Ｉ−４）で示される化合物（化合物ＥＯ−６）が得られる。
【００３４】
また、本発明の処理物としては、例えば、上記抽出物（図１中の分離１により得られるＦｒ．３）を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（例えば移動相としてクロロホルム／メタノールを用い、好ましくはメタノール濃度を次第に高くする濃度勾配で用いる）を用いて分取した溶出画分、好ましくは２０：１クロロホルム：メタノール溶出画分（図１中の分離２により得られるＦｒ．３−２）が挙げられる。
【００３５】
本発明の処理物としては、例えば、上記抽出物（図１中の分離２により得られるＦｒ．３−２）由来の画分を、ＯＤＳカラムクロマトグラフィー（例えば移動相としてメタノールを用いる）を用いて分取した溶出画分（図１中の分離３により得られるＦｒ．３−２−１）を、さらに、ＯＤＳカラムクロマトグラフィー（例えば移動相としてメタノール／水を用い、好ましくはメタノール濃度を次第に高くする濃度勾配で用いる）を用いて分取した溶出画分、好ましくは８０：２０メタノール：水溶出画分（図１中の分離４により得られるＦｒ．３−２−１−２）が挙げられる。
【００３６】
本発明の処理物としては、上記溶出画分（図１中の分離４により得られるＦｒ．３−２−１−２）由来の画分を、例えば逆相ＨＰＬＣ（例えばＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ（商標）Ｃ１８，５μｍ，カラム内径１ｃｍｘ長さ２５ｃｍ、例えば移動相としてメタノール：水＝８０：２０を用いる）を用いて分取した溶出画分が挙げられる（図１中の分離６により得られるＰｅａｋ  １及び２）。図１中のＰｅａｋ  １からは式（Ｉ−１）で示される化合物（化合物ＥＯ−３）が得られ、Ｐｅａｋ  ２からは式（Ｉ−２）で示される化合物（化合物ＥＯ−４）が得られる。
【００３７】
本発明の組成物は、式（Ｉ−１）〜（Ｉ−４）で示される化合物から選択される少なくとも１種を、組成物全量を１００質量部として、好ましくは０．２〜０．３質量部、又は好ましくは０．３質量部以上含有する。
【００３８】
本発明は、式（Ｉ）の化合物から選択される少なくとも１種、式（Ｉ−１）〜（Ｉ−４）で示される化合物から選択される少なくとも１種、或いは本発明の組成物を有効成分として含有する、アミロイドβ凝集阻害剤（以下、本発明のアミロイドβ凝集阻害剤ともいう）にも関する。本発明の組成物は、そのまま本発明のアミロイドβ凝集阻害剤の有効成分として使用することができる。本発明のアミロイドβ凝集阻害剤は医薬品であってもよく、食品であってもよい。本発明において、「アミロイドβ凝集阻害剤」が適用することができる症状としては、アルツハイマー型認知症が挙げられる。
【００３９】
本発明は、式（Ｉ）の化合物から選択される少なくとも１種、式（Ｉ−１）〜（Ｉ−４）で示される化合物から選択される少なくとも１種、或いは本発明の組成物を有効成分として含有する、抗認知症剤（以下、本発明の抗認知症剤ともいう）にも関する。本発明の組成物は、そのまま本発明の抗認知症剤の有効成分として使用することができる。本発明の抗認知症剤は医薬品であってもよく、食品であってもよい。本発明において、「認知症」としては、アルツハイマー型認知症が挙げられる。
【００４０】
本発明は、式（Ｉ）の化合物から選択される少なくとも１種、式（Ｉ−１）〜（Ｉ−４）で示される化合物から選択される少なくとも１種、或いは本発明の組成物を有効成分として含有する、抗腫瘍剤（以下、本発明の抗腫瘍剤ともいう）にも関する。本発明の組成物は、そのまま本発明の抗腫瘍剤の有効成分として使用することができる。本発明の抗腫瘍剤は医薬品であってもよく、食品であってもよい。
【００４１】
本発明において、「腫瘍」には固形腫瘍及び造血器腫瘍が含まれる。ここで、固形腫瘍は、例えば、脳腫瘍、頭頸部癌、食道癌、甲状腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、乳癌、胃癌、胆のう・胆管癌、肝癌、膵癌、結腸癌、直腸癌、卵巣癌、絨毛上皮癌、子宮体癌、子宮頸癌、腎盂・尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、睾丸癌、胎児性癌、ウイルス腫瘍、皮膚癌、皮膚線維腫、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、ユーイング腫、軟部肉腫等であり、好ましくは子宮頸癌及び肝癌である。一方、造血器腫瘍は、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）等の白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（例えばＢ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫等）等のリンパ腫、多発性骨髄腫等である。
【００４２】
本発明のアミロイドβ凝集阻害剤、抗認知症剤又は抗腫瘍剤に含まれる式（Ｉ）の化合物、及び式（Ｉ−１）〜（Ｉ−４）で示される化合物は、合成により製造されたものであってもよい。
【００４３】
本発明のアミロイドβ凝集阻害剤、抗認知症剤又は抗腫瘍剤は、公知の食品用担体又は医薬用担体と組合せて製剤化することができる。投与形態としては、特に制限はなく、必要に応じ適宜選択されるが、一般には錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤、エリキシル剤等の経口剤として使用される。また、本発明のアミロイドβ凝集阻害剤、抗認知症剤又は抗腫瘍剤は、注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、貼付剤、軟膏剤等の非経口剤として使用してもよい。また、本発明のアミロイドβ凝集阻害剤、抗認知症剤又は抗腫瘍剤は、食品、チューインガム、飲料等に添加して、いわゆる特定保健用食品（例えば、癌予防食品）等とすることもできる。
【００４４】
経口剤は、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等の賦形剤を用いて常法に従って製造される。
【００４５】
この種の製剤には、適宜前記賦形剤の他に、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を使用することができる。
【００４６】
結合剤の具体例としては、結晶セルロース、結晶セルロース・カルメロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、カルメロースナトリウム、エチルセルロース、カルボキシメチルエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、コムギデンプン、コメデンプン、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、デキストリン、アルファー化デンプン、部分アルファー化デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、プルラン、ポリビニルピロリドン、アミノアルキルメタクリレートコポリマーＥ、アミノアルキルメタクリレートコポリマーＲＳ、メタクリル酸コポリマーＬ、メタクリル酸コポリマー、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルアルコール、アラビアゴム、アラビアゴム末、寒天、ゼラチン、白色セラック、トラガント、精製白糖、マクロゴールが挙げられる。
【００４７】
崩壊剤の具体例としては、結晶セルロース、メチルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロース、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、コムギデンプン、コメデンプン、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、部分アルファー化デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、トラガントが挙げられる。
【００４８】
界面活性剤の具体例としては、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸ポリオキシル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、セスキオレイン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、ポリソルベート、モノステアリン酸グリセリン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウロマクロゴールが挙げられる。
【００４９】
滑沢剤の具体例としては、コムギデンプン、コメデンプン、トウモロコシデンプン、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、含水二酸化ケイ素、軽質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、乾燥水酸化アルミニウムゲル、タルク、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、リン酸水素カルシウム、無水リン酸水素カルシウム、ショ糖脂肪酸エステル、ロウ類、水素添加植物油、ポリエチレングリコールが挙げられる。
【００５０】
流動性促進剤の具体例としては、含水二酸化ケイ素、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウムが挙げられる。
【００５１】
また、本発明のアミロイドβ凝集阻害剤、抗認知症剤又は抗腫瘍剤は、液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤、エリキシル剤として投与する場合には、矯味矯臭剤、着色剤を含有してもよい。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５３】
（実施例１）
１．アマミナナフシの糞の抽出物、その処理物の調製、及び式（Ｉ−１）の化合物（ＥＯ−３）、式（Ｉ−２）の化合物（ＥＯ−４）、式（Ｉ−３）の化合物（ＥＯ−５）、及び式（Ｉ−４）の化合物（ＥＯ−６）の単離
上記抽出・単離スキームを図１に示す。
［１］アマミナナフシの糞の抽出：アマミナナフシ（Ｅｎｔｏｒｉａ  ｏｋｉｎａｗａｅｎｓｉｓ）の糞を４００ｍＬのノルマルヘキサンで一昼夜、室温（２０〜２５℃）、３回抽出後、４００ｍＬのクロロホルムで一昼夜、室温（２０〜２５℃）、３回抽出し、引き続き４００ｍＬのメタノールで一昼夜、室温（２０〜２５℃）、３回抽出して、それぞれのエキスを作成した（ノルマルヘキサン抽出エキス：１．３ｇ、クロロホルム抽出エキス：１．４ｇ、メタノール抽出エキス：３．１ｇ）。
【００５４】
［２］クロロホルム抽出エキス及びメタノール抽出エキスは、１ｍｇ／ｍＬとなるようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で溶解し、ヒト肝癌細胞（ＨｅｐＧ２）に最終濃度１μｇ／ｍＬで添加し、７２時間まで細胞の形態変化を観察した。強い癌細胞死が誘導されたクロロホルム抽出エキスについてその後の分離操作を行った。またＭＴＴ−アッセイ（下記「４．ＭＴＴ−アッセイによる細胞毒性試験」参照）によりクロロホルム抽出エキスのＨｅＬａ細胞に対する細胞毒性は４８．４μｇ／ｍｌであった。
【００５５】
［３］クロロホルム抽出エキスについて以下に示した分離１の分離条件により分離、精製した。
＜分離１＞
（ｉ）シリカゲルカラムクロマトグラフィー：シリカゲル６５ｇ［ＫＡＮＴＯ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０Ｎ（中性）６３−２１０μｍ］、内径３ｃｍｘ高さ１７．５ｃｍ
（ｉｉ）溶出溶媒：クロロホルム：メタノール＝５０：１（１５０ｍＬ）→３０：１（１８６ｍＬ）→１５：１（１６０ｍＬ）→１０：１（１３２ｍＬ）→５：１（１２０ｍＬ）→０：１（２５０ｍＬ）の混合溶液を溶出溶媒とし、順次カラムに流した。
（ｉｉｉ）分取物：３つのフラクション（Ｆｒ．１、２、３）に分画した。各フラクションについてＴＬＣ（ＭＥＲＣＫ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０Ｆ２５４）を行った。展開溶媒としてクロロホルム：メタノール＝５：１を用いて展開後、５０％硫酸メタノール溶液を噴霧し、１１０℃で加熱して検出した。
【００５６】
［４］Ｆｒ．３（３５９．９ｍｇ）について、以下の分離２の条件により分離、精製した。
＜分離２＞
（ｉ）シリカゲルカラムクロマトグラフィー：シリカゲル６５ｇ［ＫＡＮＴＯ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０Ｎ（中性）６３−２１０μｍ］、内径３ｃｍｘ高さ１７．５ｃｍ
（ｉｉ）溶出溶媒：クロロホルム：メタノール＝２０：１（２１０ｍＬ）→１０：１（２２０ｍＬ）→５：１（２４０ｍＬ）→０：１（２００ｍＬ）の混合溶液を溶出溶媒とし、順次カラムに流した。
（ｉｉｉ）分取物：７つのフラクション（Ｆｒ．３−１、３−２、３−３、３−４、３−５、３−６、３−７）に分画した。各フラクションについてＴＬＣ（ＭＥＲＣＫ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０Ｆ２５４）を行った。展開溶媒としてクロロホルム：メタノール＝５：１を用いて展開後、５０％硫酸メタノール溶液を噴霧し、１１０℃で加熱して検出した。
【００５７】
［５］Ｆｒ．３−２（１４４．１ｍｇ）について、以下の分離３の条件により分離した。（ＥＯ−３、ＥＯ−４分離、精製−１）
＜分離３＞
（ｉ）ＯＤＳカラムクロマトグラフィー：ＯＤＳ２８ｇ［センシュー科学  ＰＥＧＡＳＩＬ  ＰＲＥＰ  ＯＤＳ−７５１５−１２−Ａ］、内径２．３ｃｍｘ高さ１５ｃｍ
（ｉｉ）溶出溶媒：メタノールを溶出溶媒とし、順次カラムに流した。
（ｉｉｉ）分取物：３つのフラクション（Ｆｒ．３−２−１、３−２−２、３−２−３）に分画した。各フラクションについてＴＬＣ（ＭＥＲＣＫ  ＲＰ−１８  Ｆ２５４）を行った。展開溶媒としてメタノールを用いて展開後、５０％硫酸メタノール溶液を噴霧し、１１０℃で加熱して検出した。
【００５８】
［６］Ｆｒ．３−２−１（８２．１ｍｇ）について、以下の分離４の条件により分離した。（ＥＯ−３、ＥＯ−４分離、精製−２）
＜分離４＞
（ｉ）ＯＤＳカラムクロマトグラフィー：ＯＤＳ２８ｇ［センシュー科学  ＰＥＧＡＳＩＬ  ＰＲＥＰ  ＯＤＳ−７５１５−１２−Ａ］、内径２．３ｃｍｘ高さ１５ｃｍ
（ｉｉ）溶出溶媒：メタノール：水＝８０：２０（１００ｍＬ）→９０：１０（５０ｍＬ）→１００：０（１００ｍＬ）を溶出溶媒とし、順次カラムに流した。
（ｉｉｉ）分取物：４つのフラクション（Ｆｒ．３−２−１−１、３−２−１−２、３−２−１−３、３−２−１−４）に分画した。各フラクションについてＴＬＣ（ＭＥＲＣＫ  ＲＰ−１８  Ｆ２５４）を行った。展開溶媒としてメタノールを用いて展開後、５０％硫酸メタノール溶液を噴霧し、１１０℃で加熱して検出した。
【００５９】
［７］Ｆｒ．３−２−１−２（３７．１ｍｇ）について、以下の分離５の条件により分離した。（ＥＯ−３、ＥＯ−４分離、精製−３）
＜分離５＞
（ｉ）セファデックスＬＨ−２０カラムクロマトグラフィー：ＬＨ−２０［セファデックスＬＨ−２０］、内径１．０ｃｍｘ高さ３５ｃｍ
（ｉｉ）溶出溶媒：メタノール（１００ｍＬ）を順次カラムに流し、１０ｍＬずつ分取した。
（ｉｉｉ）分取物：４つのフラクション（Ｆｒ．３−２−１−２−１、３−２−１−２−２、３−２−１−２−３、３−２−１−２−４）に分画した。各フラクションについてＴＬＣ（ＭＥＲＣＫ  ＲＰ−１８  Ｆ２５４）を行った。展開溶媒としてメタノールを用いて展開後、５０％硫酸メタノール溶液を噴霧し、１１０℃で加熱して検出した。
【００６０】
［８］Ｆｒ．３−２−１−２−３（１３．７ｍｇ）について、以下の分離６の条件により分離、精製した。（ＥＯ−３、ＥＯ−４分離、精製−４）
＜分離６＞
（ｉ）逆相ＨＰＬＣ：［カラム：ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ（商標）Ｃ１８、５μｍ、カラム内径１ｃｍｘ長さ２５ｃｍ］
ポンプ：ＪＡＳＣＯ  ＰＵ９８０、ＵＶ検出器：ＪＡＳＣＯ  ＵＶ９７０
（ｉｉ）溶出溶媒：メタノール：水＝８０：２０を溶出溶媒とし、流速２．０ｍＬ／ｍｉｎ、ＵＶ検出２２２ｎｍ、サンプル濃度０．４８ｍｇ／１ｍＬ、８０％ＭｅＯＨの条件で分離した。
（ｉｉｉ）分取物：主に２つのピーク（リテンションタイム１６．２ｍｉｎ、１８．０ｍｉｎ）が検出され、それぞれｐｅａｋ−１、ｐｅａｋ−２とした。各ピークについてＴＬＣ（ＭＥＲＣＫ  ＲＰ−１８  Ｆ２５４又はＭＥＲＣＫ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０Ｆ２５４、展開溶媒としてメタノールまたはクロロホルム：メタノール＝５：１を用いて展開後、５０％硫酸メタノール溶液を噴霧し、１１０℃で加熱して検出した。）その結果、ｐｅａｋ−１とｐｅａｋ−２はそれぞれＴＬＣで単一スポットとして検出され、これらの画分の溶媒を留去すると白色粉末が得られた。得られたｐｅａｋ−１、ｐｅａｋ−２をそれぞれＥＯ−３、ＥＯ−４とした。
【００６１】
［９］Ｆｒ．３−５（１５．１ｍｇ）について、以下の分離７の条件により分離、精製した。（ＥＯ−５、ＥＯ−６分離、精製−１）
＜分離７＞
（ｉ）セファデックスＬＨ−２０カラムクロマトグラフィー：ＬＨ−２０［セファデックスＬＨ−２０］、内径１．０ｃｍｘ高さ４０ｃｍ
（ｉｉ）溶出溶媒：メタノール（６０ｍＬ）を順次カラムに流し、１０ｍＬずつ分取した。
（ｉｉｉ）分取物：３つのフラクション（Ｆｒ．３−５−１、３−５−２、３−５−３）に分画した。各フラクションについてＴＬＣ（ＭＥＲＣＫ  ＲＰ−１８  Ｆ２５４）を行った。展開溶媒としてメタノールを用いて展開後、５０％硫酸メタノール溶液を噴霧し、１１０℃で加熱して検出した。
【００６２】
［１０］Ｆｒ．３−５−２（１２．７ｍｇ）について、以下の分離８の条件により分離した。（ＥＯ−５、ＥＯ−６分離、精製−２）
＜分離８＞
（ｉ）ＯＤＳカラムクロマトグラフィー：ＯＤＳ１３ｇ［センシュー科学  ＰＥＧＡＳＩＬ  ＰＲＥＰ  ＯＤＳ−７５１５−１２−Ａ］、内径１．０ｃｍｘ高さ２０ｃｍ
（ｉｉ）溶出溶媒：メタノール：水＝５０：５０（５０ｍＬ）→８０：２０（５０ｍＬ）→１００：０（５０ｍＬ）を溶出溶媒とし、順次カラムに流し１０ｍＬずつ分取した。
（ｉｉｉ）分取物：３つのフラクション（Ｆｒ．３−５−２−１、３−５−２−２、３−５−２−３）に分画した。各フラクションについてＴＬＣ（ＭＥＲＣＫ  ＲＰ−１８  Ｆ２５４）を行った。展開溶媒としてメタノールを用いて展開後、５０％硫酸メタノール溶液を噴霧し、１１０℃で加熱して検出した。
【００６３】
［１１］Ｆｒ．３−５−２−２（８．５ｍｇ）について、以下の分離９の条件により分離した。（ＥＯ−５、ＥＯ−６分離、精製−３）
＜分離９＞
（ｉ）ＯＤＳカラムクロマトグラフィー：ＯＤＳ１０ｇ［センシュー科学  ＰＥＧＡＳＩＬ  ＰＲＥＰ  ＯＤＳ−７５１５−１２−Ａ］、内径１．０ｃｍｘ高さ１０ｃｍ
（ｉｉ）溶出溶媒：メタノール（１００ｍＬ）溶出溶媒とし、カラムに流した。
（ｉｉｉ）分取物：２つのフラクション（Ｆｒ．３−５−２−２−１、３−５−２−２−２）に分画した。各フラクションについてＴＬＣ（ＭＥＲＣＫ  ＲＰ−１８  Ｆ２５４）を行った。展開溶媒としてメタノールを用いて展開後、５０％硫酸メタノール溶液を噴霧し、１１０℃で加熱して検出した。
【００６４】
［１２］Ｆｒ．３−５−２−２−２（６．９ｍｇ）について、以下の分離１０の条件により分離、精製した。（ＥＯ−５、ＥＯ−６分離、精製−４）
＜分離１０＞
（ｉ）逆相ＨＰＬＣ：［カラム：ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ（商標）Ｃ１８、５μｍ、カラム内径１ｃｍｘ長さ２５ｃｍ］
ポンプ：ＪＡＳＣＯ  ＰＵ９８０、ＵＶ検出器：ＪＡＳＣＯ  ＵＶ９７０
（ｉｉ）溶出溶媒：メタノール：水＝８０：２０を溶出溶媒とし、流速１．５  ｍＬ／ｍｉｎ、ＵＶ検出２２２ｎｍ、サンプル濃度１．０ｍｇ／１ｍＬ、８０％ＭｅＯＨの条件で分離した。
（ｉｉｉ）分取物：主に２つのピーク（リテンションタイム１５．２ｍｉｎ、１６．４ｍｉｎ）が検出され、それぞれｐｅａｋ−Ａ、ｐｅａｋ−Ｂとした。各ピークについてＴＬＣ（ＭＥＲＣＫ  ＲＰ−１８  Ｆ２５４又はＭＥＲＣＫ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０Ｆ２５４、展開溶媒としてメタノールまたはクロロホルム：メタノール＝５：１を用いて展開後、５０％硫酸メタノール溶液を噴霧し、１１０℃で加熱して検出した。）その結果、ｐｅａｋ−１とｐｅａｋ−２はそれぞれＴＬＣで単一スポットとして検出され、これらの画分の溶媒を留去すると白色粉末が得られた。得られたｐｅａｋ−Ａ、ｐｅａｋ−ＢをそれぞれＥＯ−５、ＥＯ−６とした。
【００６５】
２．構造決定
前記白色粉末ＥＯ−３、ＥＯ−４、ＥＯ−５、ＥＯ−６の４種の化合物についてのスペクトルデータを下記表１−４に示す。
【００６６】
【表１】
0006779494.tif 000008
0006779494.tif 000009
【００６７】
【表２】
0006779494.tif 000010
0006779494.tif 000011
【００６８】
【表３】
0006779494.tif 000012
0006779494.tif 000013
【００６９】
【表４】
0006779494.tif 000014
0006779494.tif 000015
【００７０】
ＥＯ−３とＥＯ−４は１３Ｃ−ＮＭＲから炭素数３０であり、１Ｈ−ＮＭＲと１３Ｃ−ＮＭＲのシグナルパターンより、トリテルペンであることが推測された。また、ＥＯ−５とＥＯ−６は１Ｈ−ＮＭＲと１３Ｃ−ＮＭＲより、それぞれＥＯ−３とＥＯ−４の３位に五炭糖のアラビノースが結合した構造であることが推測された。さらに、二次元ＮＭＲを詳細に解析することにより、各炭素と水素の結合様式を明らかにすることができ、最終的に下記式に示される新規な構造を有するトリテルペン及びその配糖体であると決定した。ＥＯ−３、ＥＯ−４、ＥＯ−５、ＥＯ−６は、現在までに単離された報告はなく、今回初めて単離された化合物であった。
【００７１】
３．ＨＰＬＣ及びＬＣ−ＭＳによる分析
得られたＥＯ−３、ＥＯ−４、ＥＯ−５、ＥＯ−６についてＨＰＬＣによる分析を行ったところ、餌であるシラカシ（Ｑｕｅｒｃｕｓ  ｍｙｒｓｉｎｉｆｏｌｉａ）の葉のクロロホルム抽出物にはＥＯ−３及びＥＯ−４のピークは認められなかった（図３）。ＥＯ−５及びＥＯ−６についてＬＣ−ＭＳによる分析を行ったところ、シラカシの葉のクロロホルム抽出物には、保持時間：２４ｍｉｎ付近に認められたＥＯ−５及びＥＯ−６由来の［Ｍ−Ｈ］−：６１９のピークは認められなかった（図４）。従ってＥＯ−３〜６の化合物はアマミナナフシの糞にのみ含まれる化合物であることが明らかとなった。
【００７２】
４．ＭＴＴ−アッセイによる細胞毒性試験
ＭＴＴ−アッセイは下記の方法により行った（図５）。
【００７３】
抽出エキスまたは単離した化合物をＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド）に溶解後、９６ウェル細胞プレートに２ｘ１０３／ウェルにて播種したＨｅｌａ細胞に化合物の濃度を段階的に変えて添加した。各薬剤濃度においてＤＭＳＯの最終濃度は０．１％となるように調整した。７２時間後に細胞にＭＴＴ試薬を添加し、４時間３７度にて培養したのち、反応停止薬（イソプロパノール／塩酸溶液）にて反応を停止するとともに細胞を溶解し、５７０ｎｍの吸収を測定した。細胞生存率は、０．１％ＤＭＳＯを添加した細胞を１００とし算出した。
【００７４】
Ｈｅｌａ細胞を用いた細胞毒性試験の結果、ＥＯ−３、ＥＯ−４、ＥＯ−５及びＥＯ−６、特にＥＯ−５はＨｅＬａ細胞に対して毒性を示すことが分かった。
【００７５】
【表５】
0006779494.tif 000016
【００７６】
５．アミロイドβタンパク質（Ａβ）凝集阻害活性の評価
本発明により単離・同定した４種類の化合物におけるＡβ凝集阻害活性は内木らによって報告された方法（Ｈｉｒｏｎｏｂｕ  Ｎａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７７，２４４−２４９，１９８９参照）を参考にしたＴＨＴ法により評価した（図６）。ミリセチンをポジティブコントロール化合物として用いた。その結果、本研究において単離・同定したＥＯ−３、ＥＯ−４、ＥＯ−５、ＥＯ−６は、コントロールと比較して４種ともに高いＡβ凝集阻害活性が認められた（図７）。また、ＥＯ−３以外の化合物において濃度依存的にＡβ凝集阻害活性を示した（図７）。これにより、これまでに報告されているトリテルペン配糖体（サポニン）の約半分の濃度でＡβ凝集阻害活性を示し、強い活性物質であることがわかった。
【００７７】
ＥＯ−３、ＥＯ−４、ＥＯ−５、ＥＯ−６は、脳内のアミロイドβタンパク質の蓄積・凝集を抑制し、神経細胞死を回避することで、アルツハイマー病の進行抑制治療を目指した医薬品開発に役立つことが期待できる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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