(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのＩＬ−６結合ポリペプチド及び少なくとも１つの抗体又はその抗原結合フラグメントを含む複合体であり、前記ＩＬ−６結合ポリペプチドがＩＬ−６結合モチーフＢＭを含み、前記モチーフが：
ｉ）ＥＥＸ3Ｘ4ＡＷＸ7ＥＩＨＸ11ＬＰＮＬＸ16Ｘ17Ｘ18ＱＸ20Ｘ21ＡＦＩＸ25Ｘ26ＬＸ28Ｘ29
（式中、互いに独立して、
Ｘ3が、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｗ及びＹから選択され；
Ｘ4が、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ及びＹから選択され；
Ｘ7が、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ及びＹから選択され；
Ｘ11が、Ａ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔ及びＶから選択され；
Ｘ16が、Ｎ及びＴから選択され；
Ｘ17が、Ａ、Ｉ、Ｔ及びＶから選択され；
Ｘ18が、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ及びＴから選択され；
Ｘ20が、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｔ及びＶから選択され；
Ｘ21が、Ａ、Ｓ、Ｔ及びＶから選択され；
Ｘ25が、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ及びＷから選択され；
Ｘ26が、Ｋ及びＳから選択され；
Ｘ28が、Ｆ、Ｌ、Ｍ及びＹから選択され；並びに、
Ｘ29が、Ｄ及びＲから選択される）
及び、
ｉｉ）ｉ）で定義された配列と少なくとも９３％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列からなる、複合体。
【請求項２】
前記配列ｉ）が、配列番号１〜１５５１からなる群から選択される配列の８位から３６位の配列に相当する、例えば、配列番号１〜１４及び配列番号１５１２からなる群から選択される、例えば配列番号１５１２の８位から３６位の配列に相当する、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記ＩＬ−６結合モチーフが、３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインの一部を形成する、請求項１又は２に記載の複合体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の複合体であり、前記ＩＬ−６結合ポリペプチドが、結合モジュールＢＭｏｄを含み、前記結合モジュールＢＭｏｄのアミノ酸配列が：
ｉｉｉ）Ｋ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＸaＸbＬＬＸcＥＡＫＫＬＸdＸeＸfＱ
（式中、
［ＢＭ］は、請求項１又は２に定義されるＩＬ−６結合モチーフであり、但し、Ｘ29は、Ｄであり；
Ｘaは、Ａ及びＳから選択され；
Ｘbは、Ｎ及びＥから選択され；
Ｘcは、Ａ、Ｓ及びＣから選択され；
Ｘdは、Ｅ、Ｎ及びＳから選択され；
Ｘeは、Ｄ、Ｅ及びＳから選択され；
Ｘfは、Ａ及びＳから選択される）；及び、
ｉｖ）ｉｉｉ）によって定義される配列と少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択される、複合体。
【請求項５】
ｘｉ）ＶＤＡＫＹＡＫ-［ＢＭ］-ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
（式中、［ＢＭ］は、請求項１〜４のいずれか１項に定義されたＩＬ−６結合モチーフである）、及び、
ｘｉｉ）ｘｉ）で定義された配列と少なくとも８９％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項６】
前記配列ｘｉ）が、配列番号１〜１５５１からなる群から選択される、例えば、配列番号１〜１４及び配列番号１５１２からなる群から選択される、例えば配列番号１５１２である、請求項５に記載の複合体。
【請求項７】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、付加的な抗原、例えば免疫系の疾患若しくは障害に関連する抗原又は癌に関連する抗原、例えば、アンジオゲニン２（Ａｎｇ−２）、血管内皮増殖因子、腫瘍壊死因子、ＴＮＦＳＦ１１、ＴＮＦＳＦ１３、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４、ＴＮＦＳＦ１５、インスリン様増殖因子、インターロイキン１α、インターロイキン１β、インターロイキン１０、インターロイキン１７Ａ、インターロイキン１２、インターロイキン２３、インターロイキン３３、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、高移動度群タンパク質Ｂ１（ｈｉｇｈ−ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ１）、リポポリサッカライド、トール様受容体４、神経成長因子、ケモカインＣ−Ｃモチーフリガンド１９、ケモカインＣ−Ｃモチーフリガンド２１、ケモカインＣ−Ｘ−Ｃモチーフリガンド４及びインターフェロンαからなる群から選択される抗原、例えば特に腫瘍壊死因子、に対して親和性を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項８】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、アダリムマブ、インフリキシマブ、ゴリムマブ及びセルトリズマブペゴール並びにその抗原結合フラグメントからなる群から選択され、例えば、アダリムマブ、インフリキシマブ、ゴリムマブ、及びセルトリズマブペゴールからなる群から選択される全長抗体である、請求項７に記載の複合体。
【請求項９】
シス−シグナル伝達経路及び／又はトランス−シグナル伝達経路を介してＩＬ−６依存性シグナル伝達を阻害することができる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１０】
ＩＬ−６シグナル伝達を阻害する半最大阻害濃度が最大で１×１０-6Ｍ、例えば最大で１×１０-7、例えば最大で１×１０-8Ｍ、例えば最大で１×１０-9Ｍ、例えば最大で１×１０-10Ｍである、請求項９に記載の複合体。
【請求項１１】
相互作用のＥＣ５０値が最大で１×１０-7、例えば最大で１×１０-8Ｍ、例えば最大で１×１０-9Ｍ、例えば最大で１×１０-10Ｍであるように、又は、相互作用のＫD値が最大で１×１０-8Ｍ、例えば最大で１×１０-9Ｍ、例えば最大で１×１０-10Ｍ、例えば最大で１×１０-11Ｍ、であるようにＩＬ−６に結合することができる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１２】
ＴＮＦ依存性シグナル伝達を阻害することができる、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１３】
前記ＴＮＦ依存性シグナル伝達を阻害する半最大阻害濃度が、最大で１×１０-7Ｍ、例えば最大で１×１０-8Ｍ、例えば最大で１×１０-9Ｍ、例えば最大で１×１０-10Ｍ、例えば最大で１×１０-11Ｍである、請求項１２に記載の複合体。
【請求項１４】
相互作用のＫD値が、最大で１×１０-7Ｍ、例えば最大で１×１０-8Ｍ、例えば最大で１×１０-9Ｍ、例えば最大で１×１０-10Ｍ、例えば最大で１×１０-11Ｍ、例えば最大で１×１０-12ＭであるようにＴＮＦに結合することができる、請求項７〜１３のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１５】
融合タンパク質である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１６】
少なくとも１つのリンカー、例えば、可撓性アミノ酸リンカー、剛性アミノ酸リンカー及び切断可能アミノ酸リンカーからなる群から選択されるリンカーをさらに含み、例えば、前記ＩＬ−６結合ポリペプチドと、前記抗体又はその抗原結合フラグメントとの間に配置される、請求項１５に記載の複合体。
【請求項１７】
前記リンカーが、
（ＧnＳm）p及び（ＳmＧn）p、
（式中、独立して、
ｎ＝１〜７、
ｍ＝０〜７、
ｎ＋ｍ＜８  及び
ｐ＝１〜７である）
から選択される一般式を有する、請求項１６に記載の複合体。
【請求項１８】
請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードするポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の複合体と、少なくとも１つの医薬的に許容される賦形剤又は担体とを含む、組成物。
【請求項２０】
薬剤として使用するための請求項１〜１７のいずれか１項に記載の複合体又は請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記複合体又は組成物が、ＩＬ−６機能及び追加の抗原、例えばインビボでの免疫系の疾患又は障害に関連する抗原、又は癌に関連する抗原の機能を調節する、請求項２０に記載の使用のための複合体又は組成物。
【請求項２２】
ＩＬ−６関連障害、例えばＩＬ−６及びＴＮＦに関連する障害、例えば自己免疫疾患、炎症性疾患、癌及び腫瘍性疾患からなる群から選択される、例えば慢性炎症性疾患及び炎症誘発性癌から選択されるＩＬ−６関連障害である、請求項２０又は２１に記載の使用のための複合体又は組成物。
【請求項２３】
前記障害が、慢性関節リウマチ；若年性関節リウマチ；若年性特発性関節炎；全身性若年性特発性関節炎；血管炎；乾癬性関節炎；乾癬；強直性脊椎炎；慢性炎症性腸疾患、例えばクローン病及び潰瘍性大腸炎；グレーブス病；ベーチェット病；ブドウ膜炎；巨細胞性動脈炎；多発性硬化症；全身性硬化症；全身性エリテマトーデス；多発性筋炎；リウマチ性多発性筋痛症；喘息；慢性閉塞性肺疾患；再発性多発軟骨症；膵炎；腹膜炎；腎炎；川崎病、シェーグレン症候群及び成人スティル病、からなる群から選択される、請求項２２に記載の使用のための複合体又は組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本願は、インターロイキン−６（以下、ＩＬ−６と称する）に対する親和性を有する改変ポリペプチド及び抗体又はその抗原結合フラグメントを含む複合体に関し、ここで、前記ＩＬ−６に対する親和性を有する改変ポリペプチドは、配列  ＥＥＸ3Ｘ4ＡＷＸ7ＥＩＨＸ11ＬＰＮＬＸ16Ｘ17Ｘ18ＱＸ20Ｘ21ＡＦＩＸ25Ｘ26ＬＸ28Ｘ29を含む改変されたポリペプチドのクラスに属する。
【０００２】
本願はまた、前記複合体を治療剤として使用することに関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
炎症は、例えば病原体及び損傷細胞を破壊する自然免疫系によるサイトカイン駆動応答である。関節リウマチ（ＲＡ）及びクローン病などのいくつかの疾患状態では、炎症系の調節が損なわれ、組織損傷を引き起こす。最も研究されている炎症誘発剤の中には、サイトカインであるインターロイキン−６（ＩＬ−６）及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）がある。抗ＴＮＦモノクローナル抗体アダリムマブ（ヒュミラ（登録商標））及びインフリキシマブ（レミケード（登録商標））並びにＴＮＦ受容体２−Ｆｃ融合エタネルセプト（エンブレル（登録商標））のような、ＴＮＦの様々な阻害剤が臨床使用に利用可能である。サイトカイン自体ではなくＩＬ−６受容体α（ＩＬ−６Ｒα）に結合するトシリズマブ抗体（アクテムラ（登録商標））は、ＩＬ−６関連障害の臨床使用に承認されている。ＲＡの治療のために、ＩＬ−６又はＴＮＦブロッキング抗炎症治療戦略の選択は自明ではない。従来は、抗ＴＮＦ戦略が標準として考慮されているが（Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｆｅｌｄｍａｎｎ、２００９、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ５：５７８−５８２）、ＲＡ患者の近年の協力した（ｓｈｏｕｌｄｅｒ−ｔｏ−ｓｈｏｕｌｄｅｒ）単剤フェーズＩＶ試験（ＡＤＡＣＴＡ）では、トシリズマブは、ＲＡ関連症状の軽減においてアダリムマブよりも効果的であることを示した（Ｇａｂａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｌａｎｃｅｔ  ３８１：１５４１−１５５０）。
【０００４】
ヒトＩＬ−６は、２１ｋＤａの分子量を有する１８４個のアミノ酸の単一のポリペプチド鎖からなるが、変わりやすいグリコシル化パターンは、２１〜２６ｋＤａの間で変化するサイズを説明している。ＩＬ−６は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、線維芽細胞、肝細胞、内皮細胞及びケラチノサイトを含む多種多様な細胞型によって分泌される。下流のシグナル伝達は、急性炎症から後天性免疫又は慢性炎症性疾患への移行を誘導する。ＩＬ−６シグナル伝達及びその調節は複雑であり、いくつかの因子及びメカニズムが関与する。ＩＬ−６は、シスシグナル伝達経路としても知られる、古典的なＩＬ−６シグナル伝達経路を介して又はトランスシグナル伝達経路を介してシグナル伝達する。古典的なＩＬ−６シグナル伝達経路では、循環するＩＬ−６が、膜結合ＩＬ−６受容体α（ＩＬ−６Ｒα）に結合し、続いて、膜結合アンカー型ｇｐ１３０コレセプターに結合し、三元複合体が形成される。この複合体は、続いて、ｇｐ１３０部分を介したシグナル伝達をもたらす第２の隣接する三元複合体と二量体化する（Ｂｏｕｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００（５６２８）：２１０１−２１０４）。循環系において、ＩＬ−６は、ＩＬ−６Ｒαの可溶性外部ドメインに結合して存在することもできる。そのような複合体は、共受容体ｇｐ１３０を発現するがＩＬ−６Ｒαを欠く、任意の細胞のＩＬ−６依存性活性化を含む、トランスシグナル伝達機構の要因である（Ｃｈａｌａｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９０（６−７）：４８４−４９４；Ａｓｓｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｊｏｉｎｔ  Ｂｏｎｅ  Ｓｐｉｎｅ７７（６）：５３２−６）。トランス−シグナリング又は前炎症性経路は、疾患状態に最も関連する経路であることが示唆されており、従って、前記経路を阻害することは高い関心事である。対照的に、古典的経路は、重要な抗炎症及び再生プロセスに関与すると考えられている（Ｓｃｈｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １８１３（５）：８７８−８８８）。
【０００５】
異なるＩＬ−６誘発経路に対処するために、トシリズマブに加えて他の薬物候補も開発されている。これには、ＩＬ−６サイトカインそれ自体に両方とも結合する、抗体ＣＮＴＯ１３６（シルクマブ）（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｂｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ７２（２）：２７０−２８１；Ｚｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ  ５１（３）：１８７−１９９）及びＭＥＤＩ５１１７（Ｆｉｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４１１（４）：７９１−８０７）並びにトランス−シグナル伝達を選択的にブロックすることを目的とするｇｐ１３０−Ｆｃ融合ＣＲ５／１８（Ｋｏｐｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ９（９）：７０３−７１８；Ｃｈａｌａｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｄｉｇ  Ｄｉｓ  ３０（５）：４９２−４９９）を含む。
【０００６】
近年、最近、２つ以上の抗原に結合する能力を有する抗体の開発においてかなりの進歩がなされており、例えば、単一の抗体結合部位中の２つの抗原に対処するための相補性決定領域（ＣＤＲ）の設計（Ｂｏｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２３（５９２１）：１６１０−１６１４；Ｓｃｈａｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２０（４）：４７２−４８６）、設計されたＦｃ単位を使用するヘテロ二量体抗体の構築（Ｃａｒｔｅｒ，２００１，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８（１−２）：７−１５；Ｓｃｈａｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０８（２７）：１１１８７−１１１９２）及び、全長軽鎖又は軽鎖のＮ末端又はＣ末端に対する補助認識単位の遺伝子融合を介するものである（Ｋａｎａｋａｒａｊ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ＭＡｂｓ  ４（５）：６００−６１３；  ＬａＦｌｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，ＭＡｂｓ  ５（２）：２０８−２１８）。
【０００７】
従って、炎症性及び自己免疫疾患に関連する１つ以上の因子を阻害することにより、炎症性及び自己免疫疾患、例えば様々な形態の慢性関節リウマチ及び乾癬の治療の新しい様式の開発を保証する、未だ対処されていない医療ニーズが存在する。ＩＬ−６に対して高い親和性を有し、薬剤及び炎症性及び自己免疫疾患に関連する１以上のさらなる因子のような、二重又は多種の親和性を有する薬剤の提供は非常に重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本願の目的は、新規な多重特異性薬剤、例えば、治療用途に使用され得る、二重特異性薬剤を提供することである。
【０００９】
本願の目的は、新規の多重特異性薬剤、例えば、ＩＬ−６及び少なくとも１つのさらなる抗原に対する親和性を有する、二重特異性薬剤を提供することである。
【００１０】
本願の目的は、現行の治療法の上記及び他の欠点を緩和しながら、様々な形態の炎症性及び自己免疫疾患を標的とする効率的な治療を可能にする分子を提供することである。
【００１１】
本願から当業者に明らかなこれらの目的及び他の目的は、添付の特許請求の範囲において請求される本発明の様々な態様によって、及び本明細書において一般に開示されるものによって満たされる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
従って、本願の第１の態様は、少なくとも１つのＩＬ−６結合ポリペプチドと、少なくとも１つの抗体又はその抗原結合フラグメントとを含む複合体が提供されるものであり、ここで、前記ＩＬ−６結合ポリペプチドは、ＩＬ−６結合モチーフＢＭを含み、該モチーフは、
ｉ）ＥＥＸ3Ｘ4ＡＷＸ7ＥＩＨＸ11ＬＰＮＬＸ16Ｘ17Ｘ18ＱＸ20Ｘ21ＡＦＩＸ25Ｘ26ＬＸ28Ｘ29
［式中、互いに独立して、
Ｘ3が、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｗ及びＹから選択され；
Ｘ4が、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ及びＹから選択され；
Ｘ7が、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ及びＹから選択され；
Ｘ11が、Ａ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔ及びＶから選択され；
Ｘ16が、Ｎ及びＴから選択され；
Ｘ17が、Ａ、Ｉ、Ｔ及びＶ；
Ｘ18が、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ及びＴから選択され；
Ｘ20が、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｔ及びＶから選択され；
Ｘ21が、Ａ、Ｓ、Ｔ及びＶから選択され；
Ｘ25が、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ及びＷから選択され；
Ｘ26が、Ｋ及びＳから選択され；
Ｘ28が、Ｆ、Ｌ、Ｍ及びＹから選択され；並びに、
Ｘ29が、Ｄ及びＲから選択される］
及び、
ｉｉ）ｉ）で定義された配列と少なくとも９３％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列からなる、複合体が提供される。
【００１３】
本明細書において本願の第１の態様を示すために使用される場合、「複合体」という用語は、２つ以上の関連ポリペプチド鎖を指すことを意図し、一方は上記で定義されるそのＩＬ−６結合モチーフによりＩＬ−６に対する親和性を有し、他方は抗体又はその抗原結合フラグメントである。これらのポリペプチド鎖は、それぞれ異なるタンパク質ドメインを含むことができ、得られた多タンパク質複合体は複数の機能を有することができる。「複合体」は、共有結合によって連結された本明細書で定義される２つ以上のポリペプチド、例えば組換え融合タンパク質としてのその発現により、共有結合によって連結される２つ以上のポリペプチド鎖、又は化学的結合によって結合されることを意味する。
【００１４】
配列に関連したＩＬ−６結合ポリペプチドの上記の定義は、いくつかの異なる選択実験においてＩＬ−６とのそれらの相互作用で選択された親骨格の多数のランダムポリペプチド変異体の統計分析に基づく。同定されたＩＬ−６結合モチーフ、すなわち「ＢＭ」は、親の骨格の標的結合領域に対応し、この領域は３ヘリックスバンドルタンパク質ドメイン内に２つのαヘリックスを構成する。親骨格では、２つのＢＭヘリックスの様々なアミノ酸残基が、抗体の定常Ｆｃ部分と相互作用するための結合表面を構成する。本願において、結合表面残基のランダム変異及びその後の変異体の選択は、Ｆｃ相互作用能力を、ＩＬ−６との相互作用能力と置き換えた。
【００１５】
当業者が理解するように、本願のポリペプチドのＩＬ−６結合能力などの任意のポリペプチドの機能は、ポリペプチドの三次構造に依存する。それゆえ、ポリペプチド中のアミノ酸の配列に、その機能に影響を与えることなく、わずかな変更を加えることが可能である。従って、本願は、ＩＬ−６結合特性が保持されるようなＩＬ−６結合ポリペプチドの改変された改変体を包含する。
【００１６】
このように、本願に包含されるのは、ＩＬ−６結合ポリペプチドを含む本明細書で定義される複合体であり、このポリペプチドは、ｉ）において定義されるポリペプチドに対して９３％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ｉ）で定義したポリペプチドと少なくとも９６％同一である配列を含み得る。例えば、アミノ酸残基の特定の官能基（例えば、疎水性、親水性、極性など）に属するアミノ酸残基を、同じ官能基からの別のアミノ酸残基に交換することができる可能性がある。
【００１７】
いくつかの実施形態では、そのような変換は、本明細書に開示されるＩＬ−６結合ポリペプチドの配列の任意の位置でなされ得る。他の実施形態において、そのような変換は、非可変位置においてのみなされ得、骨格アミノ酸残基とも示される。そのような場合、変換は、可変位置、すなわち、配列ｉ）の「Ｘ」で示される位置での変換は許容されない。
【００１８】
本明細書全体を通して使用される用語「％同一性」は、例えば、以下のように計算され得る。クエリー配列は、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアルゴリズム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４６７３−４６８０（１９９４））を用いて標的配列に対して整列される。整列された配列のうち最も短いものに対応するウインドウで比較が行われる。整列した配列の最短は、場合によっては標的配列であってもよい。他の例では、クエリー配列は、整列した配列の最短を構成してもよい。各位置のアミノ酸残基を比較し、標的配列中の同一の対応するクエリー配列中の位置のパーセンテージを％同一性として報告する。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、「Ｘn」及び「Ｘm」は、上で定義した配列ｉ）のｎ及びｍ位のアミノ酸を示すために使用され、ｎおよびｍは、前記配列のＮ末端から数えて前記配列内のアミノ酸の位置を示す整数である。例えば、Ｘ3及びＸ7は、配列ｉ）のＮ末端から３位及び７位のアミノ酸をそれぞれ示す。
【００２０】
第１の態様の実施形態では、配列ｉ）のＸnが、表１の可能性のある残基の群から独立して選択される複合体が提供される。当業者であれば、Ｘnが、可能性がある前記の列挙した任意の１つから選択され、この選択は、ｎ≠ｍであるＸmにおけるアミノ酸の選択とは独立していることを理解するであろう。従って、表１の位置Ｘnに列挙された可能性のある残基のいずれかは、表１の任意の他の可変位置に列挙された可能性のある残基のいずれかと独立して組み合わせることができる。
【００２１】
当業者は、表１を以下のように読むべきであることを理解するであろう：
第１の態様による一実施形態では、少なくとも１つのＩＬ−６結合ポリペプチドを含む本明細書で定義される複合体が提供され、ここで、配列ｉ）の「Ｘn」は、「可能性のある残基」から選択される。従って、表１は、本願の第１の態様のいくつかの特定の個別化された実施形態を開示する。例えば、第１の態様による一実施形態では、配列ｉ）のＸ3がＡ、Ｈ、Ｋ、Ｑ、Ｒ及びＹから選択され、第１の態様による別の実施形態では、配列ｉ）のＸ3がＡ、Ｋ、Ｑ、Ｒ及びＹから選択される複合体が提供される。疑わしいことを避けるために、列挙された実施形態は、さらに他の実施形態において自由に組み合わせることができる。例えば、そのような組合せ実施形態の１つは、Ｘ3がＡ、Ｋ、Ｒ及びＹから選択され、Ｘ4がＨ及びＫから選択され、Ｘ11がＡ、Ｉ、Ｌ及びＴから選択される複合体である。
【００２２】
【表１−１】
0006678661.tif 000002
【表１−２】
0006678661.tif 000003
【表１−３】
0006678661.tif 000004
【表１−４】
0006678661.tif 000005
【表１−５】
0006678661.tif 000006
【００２３】
第１の態様の１つの特定の実施形態では、少なくとも１つのＩＬ−６結合ポリペプチドを含む本明細書で定義される複合体が提供されるものであり、配列ｉ）において、
Ｘ3が、Ａ、Ｈ、Ｋ、Ｑ、Ｒ及びＹから選択され；
Ｘ4が、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ及びＹから選択され；
Ｘ7が、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ及びＹから選択され；
が、Ａ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、Ｔ及びＶから選択され；
Ｘ16が、Ｔであり；
Ｘ17が、Ａ、Ｉ、Ｔ及びＶから選択され；
Ｘ18が、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ及びＴから選択され；
Ｘ20が、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｒ及びＶから選択され；
Ｘ21が、Ａ、Ｓ及びＶから選択され；
Ｘ25が、Ｉ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ及びＷから選択され；
Ｘ26が、Ｋであり；
Ｘ28が、Ｆ、Ｌ、Ｍ及びＹから選択され；並びに、
Ｘ29が、Ｄである。
【００２４】
少なくとも１つのＩＬ−６結合ポリペプチドを含む複合体のサブクラスを規定する、より具体的な実施形態では、配列ｉ）は、１１の条件Ｉ〜ＸＩ：
Ｉ．Ｘ3が、Ｋ及びＲから選択される；
ＩＩ．Ｘ11が、Ａ及びＬから選択される；
ＩＩＩ．Ｘ16が、Ｔである；
ＩＶ．Ｘ17が、Ｉ及びＶから選択される；
Ｖ．Ｘ18が、Ｄ及びＥから選択される；
ＶＩ．Ｘ20が、Ｍである；
ＶＩＩ．Ｘ21が、Ａである；
ＶＩＩＩ．Ｘ25が、Ｓ及びＴから選択される；
ＩＸ．Ｘ26が、Ｋである；
Ｘ．Ｘ28が、Ｆ；並びに
ＸＩ．Ｘ29が、Ｄである、
の少なくとも６つを満たす。
【００２５】
第１の態様による前記複合体のいくつかの例において、配列ｉ）は、１１の条件Ｉ〜ＸＩの少なくとも７つを満たす。より具体的には、配列ｉ）は、１１の条件Ｉ〜ＸＩの少なくとも８つ、例えば１１の条件Ｉ〜ＸＩの少なくとも９つ、例えば１１の条件Ｉ〜ＸＩのうちの少なくとも１０、例えば、１１の条件Ｉ〜ＸＩの全てを満たしてもよい。
【００２６】
第１の態様による複合体のいくつかの実施形態では、前記複合体は少なくとも１つのＩＬ−６結合ポリペプチドを含み、ここで、配列ｉ）のＸ17Ｘ20Ｘ21はＶＭＡ及びＩＭＡから選択される。いくつかの実施形態では、配列ｉ）のＸ20Ｘ21Ｘ28はＭＡＦである。いくつかの実施形態では、配列ｉ）のＸ17Ｘ20Ｘ28は、ＶＭＦ及びＩＭＦから選択される。いくつかの実施形態において、配列ｉ）のＸ17Ｘ21Ｘ28は、ＶＡＦ及びＩＡＦから選択される。
【００２７】
以下の実験セクションで詳細に記載されるように、ＩＬ−６結合ポリペプチド変異体の選択は、配列ｉ）の異なる実施形態を構成するいくつかの個々のＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）配列の同定をもたらした。配列ｉ）の異なる実施形態を含む複合体は、第１の態様による複合体の個々の実施形態を構成する。個々のＩＬ−６結合モチーフの配列は、図１に提示された配列番号１〜１５５１のアミノ酸８位〜３６に対応する。従って、この態様による複合体の一実施形態では、配列ｉ）は、配列番号１〜１５５１からなる群より選択される配列中の８位〜３６位に対応する。一実施形態では、配列ｉ）は、配列番号１〜１５０２からなる群より選択される配列における８位〜３６位の配列に対応する。一実施形態では、配列ｉ）は、配列番号７、配列番号１５〜８９及び配列番号１５１〜８７１からなる群から選択される配列における８位〜３６位の配列に対応する。一実施形態では、配列ｉ）は、配列番号１〜６、配列番号８〜１４、配列番号９０〜１５０及び配列番号８７２〜１５０２からなる群から選択される配列における８位から３６位の配列に対応する。一実施形態では、配列ｉ）は、配列番号１〜１５２及び配列番号１５０３〜１５１５からなる群から選択される配列における８位〜３６位の配列に対応する。一実施形態では、配列ｉ）は、配列番号１〜１５０及び配列番号１５０３〜１５１５からなる群から選択される配列における８位〜３６位の配列に対応する。一実施形態では、配列ｉ）は、配列番号１〜１５２からなる群より選択される配列における８位〜３６位の配列に対応する。別の実施形態では、配列ｉ）は、配列番号１〜１５０からなる群から選択される配列における８位〜３６位の配列に対応する。さらに別の実施形態では、配列ｉ）は、配列番号７、配列番号１５〜８９及び配列番号１５１〜１５２からなる群から選択される配列における８位〜３６位の配列に対応する。一実施形態では、配列ｉ）は、配列番号１〜６、配列番号８〜１４及び配列番号９０〜１５０からなる群から選択される配列における８位から３６位の配列に対応する。一実施形態では、配列ｉ）は、配列番号１〜１４及び配列番号１５０３〜１５１５からなる群から選択される配列における８位〜３６位の配列に対応する。一実施形態では、配列ｉ）は、配列番号１〜１４及び配列番号１５１２からなる群より選択される配列における８位〜３６位の配列に対応する。一実施形態では、配列ｉ）は、配列番号１〜１４からなる群より選択される配列における８位〜３６位の配列に対応する。一実施形態では、配列ｉ）は、配列番号１〜５からなる群から選択される配列における８位〜３６位の配列に対応する。一実施形態では、配列ｉ）は、配列番号１５１２の８位〜３６位の配列に対応する。特定の個々の実施形態では、配列ｉ）は、それぞれに配列番号１〜１４のいずれか１つの８位〜３６位の配列に対応する。
【００２８】
本願のいくつかの実施形態では、上記で定義したＢＭは、３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインの「一部を形成する」。これは、元の３ヘリックスバンドルドメインの配列にＢＭの配列が「挿入」されているか又は「グラフトされている」ことを意味し、ＢＭが元のドメインの類似の構造モチーフに置き換わることを意味する。例えば、理論に縛られることを望むものではないが、ＢＭは３ヘリックスバンドルの３つのヘリックスのうちの２つを構成すると考えられ、従って、３ヘリックスバンドル内のそのような２ヘリックスモチーフを置き換えることができる。当業者が理解するように、２つのＢＭヘリックスによる３ヘリックスバンドルドメインの２つのヘリックスの置換は、ポリペプチドの基本構造に影響を与えないように行わなければならない。すなわち、本発明のこの実施形態によるポリペプチドのＣα骨格の全体的な折り畳みは、それが部分を形成する、例えば、同じオーダーなどの二次構造の同一の要素を有する、３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインのそれと実質的に同じである。従って、本発明によるＢＭは、本態様のこの実施形態によるポリペプチドが元のドメインと同じ折り畳みを有する場合、３ヘリックスバンドルドメインの「一部分を形成」し、基本的な構造的性質が共有されていることを意味しており、これらの特性は、例えば、同様のＣＤスペクトルが得られる。当業者は、関連する他のパラメータを認識している。
【００２９】
特定の実施形態では、本明細書で定義される複合体は、３へリックスバンドルタンパク質ドメインの一部を形成する少なくとも１つのＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）を含む。例えば、ＢＭは、本質的に、前記３ヘリックスバンドルタンパク質内に、タンパク質ドメイン内に相互接続ループを有する２つのαヘリックスを構成することができる。特定の実施形態では、前記３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインは、細菌受容体タンパク質のドメインから選択される。そのようなドメインの非限定的な例は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来のプロテインＡの５つの異なる３ヘリックスドメイン、例えばドメインＢ、及びその誘導体である。いくつかの実施形態では、３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインは、ブドウ球菌の（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）プロテインＡのドメインＢに由来するタンパク質Ｚの変異体である。
【００３０】
本明細書に記載の複合体のいくつかの実施形態では、前記ＩＬ−６結合ポリペプチドが３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインの一部を形成し、該複合体は少なくとも１つのＩＬ−６結合ポリペプチドを含み、これは、同様に結合モジュール（ＢＭｏｄ）を含み、前記結合モジュールのアミノ酸配列が：
ｉｉｉ）Ｋ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＸaＸbＬＬＸcＥＡＫＫＬＸdＸeＸfＱ
（式中、
［ＢＭ］は、本明細書で定義されたＩＬ−６結合モチーフであり、但し、Ｘ29は、Ｄであり；
Ｘaは、Ａ及びＳから選択され；
Ｘbは、Ｎ及びＥから選択され；
Ｘcは、Ａ、Ｓ及びＣから選択され；
Ｘdは、Ｅ、Ｎ及びＳから選択され；
Ｘeは、Ｄ、Ｅ及びＳから選択され；
Ｘfは、Ａ及びＳから選択される）；及び、
ｉｖ）ｉｉｉ）によって定義される配列と少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択される。
【００３１】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−６結合ポリペプチドのような複合体全体又は少なくともその一部は、生産及び貯蔵の間、並びにインビボにおいて、化学的修飾に対し、物理的条件の変化に対し、及びタンパク質分解に対して、高い構造安定性、例えば異性化に対する耐性を示すことが有益であり得る。従って、本明細書に開示されるＩＬ−６結合ポリペプチドが３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインの一部を形成する他の実施形態では、複合体は、少なくとも１つのＩＬ−６結合ポリペプチドを含み、これは結合モジュール（ＢＭｏｄ）を含み、そのアミノ酸配列は：
ｖ）Ｋ−［ＢＭ］−ＱＰＥＱＳＸaＸbＬＬＸcＥＡＫＫＬＸdＸeＸfＱ
（式中、
［ＢＭ］は、本明細書で定義されたＩＬ−６結合モチーフであり、但し、Ｘ29は、Ｒであり；
Ｘaは、Ａ及びＳから選択され；
Ｘbは、Ｎ及びＥから選択され；
Ｘcは、Ａ、Ｓ及びＣから選択され；
Ｘdは、Ｅ、Ｎ及びＳから選択され；
Ｘeは、Ｄ、Ｅ及びＳから選択され；
Ｘfは、Ａ及びＳから選択される）；及び、
ｖｉ）ｖ）によって定義される配列と少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択される。
【００３２】
上述のように、ポリペプチドの三次構造及び機能にほとんど影響を与えない、上記のアミノ酸と比較してわずかな置換を含むＩＬ−６結合ポリペプチドも本願の範囲内である。従って、いくつかの実施形態では、本明細書で定義される複合体は、少なくとも１つのＩＬ−６結合ポリペプチドを含み、それは、ｉｉｉ）及びｖ）にそれぞれ定義される配列と、少なくとも９３％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９７％の同一性を有する配列ｉｖ）又はｖｉ）を含む。
【００３３】
一実施形態において、配列ｉｉｉ）又はｖ）のＸaは、Ａである。
一実施形態において、配列ｉｉｉ）又はｖ）のＸaは、Ｓである。
一実施形態において、配列ｉｉｉ）又はｖ）のＸbは、Ｎである。
一実施形態において、配列ｉｉｉ）又はｖ）のＸbは、Ｅである。
一実施形態において、配列ｉｉｉ）又はｖ）のＸcは、Ａである。
一実施形態において、配列ｉｉｉ）又はｖ）のＸcは、Ｓである。
一実施形態において、配列ｉｉｉ）又はｖ）のＸcは、Ｃである。
一実施形態において、配列ｉｉｉ）又はｖ）のＸdは、Ｅである。
一実施形態において、配列ｉｉｉ）又はｖ）のＸdは、Ｎである。
一実施形態において、配列ｉｉｉ）又はｖ）のＸdは、Ｓである。
一実施形態において、配列ｉｉｉ）又はｖ）のＸeは、Ｄである。
一実施形態において、配列ｉｉｉ）又はｖ）のＸeは、Ｅである。
一実施形態において、配列ｉｉｉ）又はｖ）のＸeは、Ｓである。
【００３４】
一実施形態において、配列ｉｉｉ）又はｖ）のＸdＸeは、ＥＥ、ＥＳ、ＳＥ、ＳＤ及びＳＳから選択される。
【００３５】
一実施形態において、配列ｉｉｉ）又はｖ）のＸdＸeは、ＥＳである。
一実施形態において、配列ｉｉｉ）又はｖ）のＸdＸeは、ＳＥである。
一実施形態において、配列ｉｉｉ）又はｖ）のＸdＸeは、ＳＤである。
一実施形態において、配列ｉｉｉ）又はｖ）のＸfは、Ａである。
一実施形態において、配列ｉｉｉ）又はｖ）のＸfは、Ｓである。
【００３６】
一実施形態において、配列ｉｉｉ）又はｖ）のＸaはＡ；ＸbはＮ；ＸcはＡ及びＸfはＡである。
一実施形態において、配列ｉｉｉ）又はｖ）のＸaはＡ；ＸbはＮ；ＸcはＣ及びＸfはＡである。
一実施形態において、配列ｉｉｉ）又はｖ）のＸaはＳ；ＸbはＥ；ＸcはＳ及びＸfはＳである。
一実施形態において、配列ｉｉｉ）又はｖ）のＸaはＳ；ＸbはＥ；ＸcはＣ及びＸfはＳである。
一実施形態において、配列ｉｉｉ）又はｖ）のＸaはＡ；ＸbはＮ；ＸcはＡ；ＸdＸeはＮＤ及びＸfはＡである。
一実施形態において、配列ｉｉｉ）又はｖ）のＸaはＡ；ＸbはＮ；ＸcはＣ；ＸdＸeはＮＤ及びＸfはＡである。
一実施形態において、配列ｉｉｉ）又はｖ）のＸaはＳ；ＸbはＥ；ＸcはＳ；ＸdＸeはＮＤ及びＸfはＳである。
一実施形態において、配列ｉｉｉ）又はｖ）のＸaはＳ；ＸbはＥ；ＸcはＣ；ＸdＸeはＮＤ及びＸfはＳである。
一実施形態において、配列ｉｉｉ）又はｖ）のＸaはＡ；ＸbはＮ；ＸcはＡ；ＸdＸeはＳＥ及びＸfはＡである。
一実施形態において、配列ｉｉｉ）又はｖ）のＸaはＡ；ＸbはＮ；ＸcはＣ；ＸdＸeはＳＥ及びＸfはＡである。
一実施形態において、配列ｉｉｉ）又はｖ）のＸaはＳ；ＸbはＥ；ＸcはＳ；ＸdＸeはＳＥ及びＸfはＳである。
一実施形態において、配列ｉｉｉ）又はｖ）のＸaはＳ；ＸbはＥ；ＸcはＣ；ＸdＸeはＳＥ及びＸfはＳである。
一実施形態において、配列ｉｉｉ）又はｖ）のＸaはＡ；ＸbはＮ；ＸcはＡ；ＸdＸeはＳＤ及びＸfはＡである。
一実施形態において、配列ｉｉｉ）又はｖ）のＸaはＡ；ＸbはＮ；ＸcはＣ；ＸdＸeはＳＤ及びＸfはＡである。
一実施形態において、配列ｉｉｉ）又はｖ）のＸaはＳ；ＸbはＥ；ＸcはＳ；ＸdＸeはＳＤ及びＸfはＳである。
一実施形態において、配列ｉｉｉ）又はｖ）のＸaはＳ；ＸbはＥ；ＸcはＣ；ＸdＸeはＳＤ及びＸfはＳである。
一実施形態において、配列ｉｉｉ）又はｖ）のＸaはＡ；ＸbはＮ；ＸcはＡ；ＸdＸeはＥＳ及びＸfはＡである。
一実施形態において、配列ｉｉｉ）又はｖ）のＸaはＡ；ＸbはＮ；ＸcはＣ；ＸdＸeはＥＳ及びＸfはＡである。
一実施形態において、配列ｉｉｉ）又はｖ）のＸaはＳ；ＸbはＥ；ＸcはＳ；ＸdＸeはＥＳ及びＸfはＳである。
一実施形態において、配列ｉｉｉ）又はｖ）のＸaはＳ；ＸbはＥ；ＸcはＣ；ＸdＸeはＥＳ及びＸfはＳである。
【００３７】
前記複合体のさらに別の実施形態において、配列ｉｉｉ）は、図１に提示される配列番号１〜１５５１からなる群から選択される配列の７位〜５５位の配列に対応する。他の実施形態において、配列ｉｉｉ）は、配列番号１〜１５０２からなる群から選択される配列中の７位〜５５位の配列に対応する。一実施形態では、配列ｉｉｉ）は、配列番号７、配列番号１５〜８９及び配列番号１５１〜８７１からなる群から選択される配列中の７位〜５５位の配列に対応する。一実施形態では、配列ｉｉｉ）は、配列番号１〜６、配列番号８〜１４、配列番号９０〜１５０及び配列番号８７２〜１５０２からなる群から選択される配列における７位〜５５位の配列に対応する。一実施形態では、配列ｉｉｉ）は、配列番号１〜１５２及び配列番号１５０３〜１５１５からなる群から選択される配列における７位〜５５位の配列に対応する。一実施形態では、配列ｉｉｉ）は、配列番号１〜１５０及び配列番号１５０３〜１５１５からなる群から選択される配列における７位〜５５位の配列に対応する。一実施形態では、配列ｉｉｉ）は、配列番号１〜１５２からなる群から選択される配列における７位〜５５位の配列に対応する。別の実施形態において、配列ｉｉｉ）は、配列番号１〜１５０からなる群より選択される配列における７位〜５５位の配列に対応する。さらに別の実施形態では、配列ｉｉｉ）は、配列番号７、配列番号１５〜８９及び配列番号１５１〜１５２からなる群から選択される配列における７位〜５５位の配列に対応する。一実施形態では、配列ｉｉｉ）は、配列番号１〜６、配列番号８〜１４及び配列番号９０〜１５０からなる群から選択される配列における７位〜５５位の配列に対応する。一実施形態では、配列ｉｉｉ）は、配列番号１〜１４及び配列番号１５０３〜１５１５からなる群から選択される配列における７位〜５５位の配列に対応する。一実施形態では、配列ｉｉｉ）は、配列番号１〜１４及び配列番号１５１２からなる群から選択される配列における７位〜５５位の配列に対応する。一実施形態では、配列ｉｉｉ）は、配列番号１〜１４からなる群から選択される配列における７位〜５５位の配列に対応する。一実施形態では、配列ｉｉｉ）は、配列番号１〜５からなる群より選択される配列における７位〜５５位の配列に対応する。一実施形態では、配列ｉｉｉ）は、配列番号１５１２の７位〜５５位の配列に対応する。特定の個々の実施形態では、配列ｉｉｉ）は、それぞれに配列番号１〜１４のいずれか１つの７位〜５５位の配列に対応する。
【００３８】
また、さらなる実施形態では、少なくとも１つのＩＬ−６結合ポリペプチドを含む本明細書で定義される複合体が提供され、前記ＩＬ−６結合ポリペプチドは、
ｖｉｉ）ＹＡ−［ＢＭｏｄ］−ＡＰ；
（式中、［ＢＭｏｄ］は、上記定義のＩＬ−６結合モジュールである）；及び、
ｖｉｉｉ）ｖｉｉ）で定義される配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００３９】
あるいは、少なくとも１つのＩＬ−６結合ポリペプチドを含む本明細書で定義される複合体が提供され、前記ＩＬ−６結合ポリペプチドは、
ｉｘ）ＦＮ−［ＢＭｏｄ］−ＡＰ；
（式中、［ＢＭｏｄ］は、上記定義のＩＬ−６結合モジュールである）；及び、
ｘ）ｉｘ）で定義される配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４０】
上述のように、ポリペプチドの三次構造及び機能にほとんど影響を与えない上記アミノ酸配列と比較して、小さな置換を含むＩＬ−６結合ポリペプチドも本願の範囲内に含まれる。従って、いくつかの実施形態では、配列ｖｉｉｉ）及びｘ）は、例えばｖｉｉ）及びｖｉｉ）それぞれによって定義される配列と少なくとも９２％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９６％同一である。
【００４１】
いくつかの実施形態において、本明細書で定義される複合体は、ＩＬ−６結合モチーフを含み、これは、以下から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの一部を形成する：
ＡＤＮＮＦＮＫ-［ＢＭ］-ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＳＥＡＫＫＬＮＥＳＱＡＰＫ；
ＡＤＮＫＦＮＫ-［ＢＭ］-ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＤＮＫＦＮＫ-［ＢＭ］-ＤＰＳＶＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＤＡＱＱＮＮＦＮＫ-［ＢＭ］-ＤＰＳＱＳＴＮＶＬＧＥＡＫＫＬＮＥＳＱＡＰＫ；
ＡＱＨＤＥ-［ＢＭ］-ＤＰＳＱＳＡＮＶＬＧＥＡＱＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＶＤＮＫＦＮＫ-［ＢＭ］-ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ-［ＢＭ］-ＤＰＳＥＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＫＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ-［ＢＭ］-ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ-［ＢＭ］-ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ-［ＢＭ］-ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ-［ＢＭ］-ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ-［ＢＭ］-ＱＰＥＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ-［ＢＭ］-ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＥＳＳＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ-［ＢＭ］-ＱＰＥＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＥＳＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ-［ＢＭ］-ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ-［ＢＭ］-ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ-［ＢＭ］-ＱＰＥＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ-［ＢＭ］-ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＥＳＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ-［ＢＭ］-ＱＰＥＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＥＳＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ-［ＢＭ］-ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＫＡＱＡＰＫ；及び
ＡＥＡＫＹＡＫ-［ＢＭ］-ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＫＡＱＡＰＫ；
（式中、［ＢＭ］は、上記で定義されるＩＬ−６結合モチーフである）
【００４２】
一実施形態では、本明細書で定義される複合体は、ＩＬ−６結合モチーフを含み、それは、
ｘｉ）ＶＤＡＫＹＡＫ-［ＢＭ］-ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
（式中、［ＢＭ］は、上で定義したＩＬ−６結合モチーフである）、及び、
ｘｉｉ）ｘｉ）で定義した配列と少なくとも８９％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４３】
別の実施形態では、本明細書で定義される複合体は、ＩＬ−６結合モチーフを含み、それは、
ｘｉｉｉ）ＡＥＡＫＹＡＫ-［ＢＭ］-ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
（式中、［ＢＭ］は、上で定義したＩＬ−６結合モチーフである）、及び、
ｘｉｖ）ｘｉｉｉ）で定義した配列と少なくとも８９％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４４】
また、上記アミノ酸配列と比較してわずかな置換（ポリペプチドの三次構造及び機能に大きな影響を与えない）を含むポリペプチドもまた、本願の範囲内に含まれる。従って、いくつかの実施形態において、配列ｘｉｉ）及びｘｉｖ）は、ｘｉ）及びｘｉｉｉ）によってそれぞれ定義される配列と、例えば、少なくとも９１％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９８％同一であり得る。
【００４５】
そのようなポリペプチドにおける配列ｘｉ）は、配列番号１〜１５５１からなる群から選択され得る。別の実施形態では、配列ｘｉ）は、配列番号１〜１５０２からなる群から選択される。一実施形態では、配列ｘｉ）は、配列番号７、配列番号１５〜８９及び配列番号１５１〜８７１からなる群から選択される。一実施形態では、配列ｘｉ）は、配列番号１〜６、配列番号８〜１４、配列番号９０〜１５０及び配列番号８７２〜１５０２からなる群から選択される。一実施形態では、配列ｘｉ）は、配列番号１〜１５２及び配列番号１５０３〜１５１５からなる群から選択される。一実施形態では、配列ｘｉ）は、配列番号１〜１５０及び配列番号１５０３〜１５１５からなる群から選択される。一実施形態では、配列ｘｉ）は、配列番号１〜１５２からなる群から選択される。別の実施形態では、配列ｘｉ）は、配列番号１〜１５０からなる群から選択される。さらに別の実施形態では、配列ｘｉ）は、配列番号７、配列番号１５〜８９及び配列番号１５１〜１５２からなる群から選択される。一実施形態では、配列ｘｉ）は、配列番号１〜６、配列番号８〜１４及び配列番号９０〜１５０からなる群から選択される。一実施形態では、配列ｘｉ）は、配列番号１〜１４及び配列番号１５０３〜１５１５からなる群から選択される。一実施形態では、配列ｘｉ）は、配列番号１〜１４及び配列番号１５１２からなる群から選択される。一実施形態では、配列ｘｉ）は、配列番号１〜１４からなる群から選択される。一実施形態では、配列ｘｉ）は、配列番号１〜５からなる群から選択される。一実施形態では、配列ｘｉ）は配列番号１５１２である。特定の個々の実施形態において、配列ｘｉ）は、それぞれ配列番号１〜１４のいずれか１つである。
【００４６】
当業者は、本明細書で定義されるＩＬ−６結合ポリペプチド、その抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は本明細書に定義されるような全体としての複合体に対して、本願の範囲から逸脱することなく、特定の適用に対してと該複合体を適合させるために、様々な改変及び／又は付加を行うことができることを理解するであろう。
【００４７】
従って、一実施形態では、前記ＩＬ−６結合ポリペプチド及び／又は前記抗体若しくはその抗原結合フラグメント又は全体としての前記複合体が、少なくとも１つのＣ末端及び／又はＮ末端に、付加的なアミノ酸を含む、本明細書に定義される複合体が提供される。このような複合体は、ＩＬ−６結合ポリペプチド及び／又はその抗体若しくは抗原結合フラグメントのポリペプチド鎖のＮ末端及び／又はＣ末端位置に、１つ以上の付加アミノ酸残基を有する複合体として理解されるべきである。あるいは、複合体が融合タンパク質として発現される場合、前記複合体は、複合体全体のＮ末端及び／又はＣ末端位置に１つ以上の付加的なアミノ酸残基を有するものとして理解されるべきである。従って、前記複合体は、任意の適切な数の付加的なアミノ酸残基、例えば、少なくとも１つの付加的なアミノ酸残基を含み得る。各付加的なアミノ酸残基は、例えば、産生、精製、インビボ又はインビトロでの安定化、複合体の結合又は検出を改善するために、個々に又は集合的に追加され得る。このような付加的なアミノ酸残基は、化学的カップリングのために添加される１つ以上のアミノ酸残基を含み得る。この一例は、システイン残基の付加である。付加的なアミノ酸残基はまた、ポリペプチドの精製又は検出のための「タグ」、例えば、タグに特異的な抗体との相互作用のための、あるいは、Ｈｉｓ6タグの場合の固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）のための、Ｈｉｓ6タグ、（ＨｉｓＧｌｕ）3タグ（「ＨＥＨＥＨＥ」タグ）又は「ｍｙｃ」（ｃ−ｍｙｃ）タグ又は「ＦＬＡＧ」タグ、を提供し得る。
【００４８】
上記のさらなるアミノ酸は、本明細書中で定義されるＩＬ−６結合ポリペプチド、その抗体若しくは抗原結合フラグメント、又は前記複合体全体に対し、化学的コンジュゲート（公知の有機化学方法を使用する）の方法によって、又は他の方法によって、例えば、ＩＬ−６結合ポリペプチド、その抗体若しくは抗原結合フラグメント又は融合タンパク質としての複合体の発現を介して、あるいは、任意の他の方法で、直接又はリンカーを介して、例えばアミノ酸リンカーを介して、結合してもよい。
【００４９】
一実施形態では、前記ＩＬ−６結合ポリペプチドが多量体形態である、本明細書で定義される複合体が提供される。前記多量体は、単量体単位として本明細書に開示される少なくとも２つのＩＬ−６結合ポリペプチドを含むと理解され、そのアミノ酸配列は同一でも異なっていてもよい。ポリペプチドの多量体形態は、それぞれがＩＬ−６結合モチーフを有し、それぞれが多量体内に単量体を形成する、適切な数のドメインを含み得る。これらのドメインは、同一のアミノ酸配列を有していてもよいが、異なるアミノ酸配列を有していてもよい。換言すれば、本願の複合体は、ホモ又はヘテロ多量体、例えばホモ又はヘテロ二量体の形態のＩＬ−６結合ポリペプチドを含み得る。一実施形態では、ＩＬ−６結合ポリペプチド単量体単位が共に共有結合している、本明細書で定義される複合体が提供される。別の実施形態では、前記ＩＬ−６結合ポリペプチド単量体単位は、融合タンパク質として発現される。一実施形態では、二量体形態のＩＬ−６結合ポリペプチドが提供される。
【００５０】
本態様は、抗体又はその抗原結合フラグメントを含む複合体を提供する。周知のように、抗体は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的（抗原）に特異的に結合することができる免疫グロブリン分子である。本明細書中で使用される場合、用語「抗体又はその抗原結合フラグメント」は、完全長又は無傷のポリクローナル又はモノクローナル抗体だけでなく、その抗原結合フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ3、Ｆｖ及びその変異体、１以上の抗体部分、ヒト化抗体、キメラ抗体、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、直鎖抗体、一本鎖抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）及び抗体のグリコシル化改変体、抗体のアミノ酸配列改変体及び共有結合的に改変された抗体を含む、必要とされる特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子を含む他の修飾された形態（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）を含む融合タンパク質を包含する。修飾抗体及びその抗原結合フラグメントのさらなる例には、ナノボディ、ＡｌｂｕｄＡｂｓ、ＤＡＲＴ（二重親和性再ターゲティング）、ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）、ＴａｎｄＡｂｓ（タンデムダイアボディ）、ＤＡＦ（二重作用Ｆａｂ）、２イン１抗体、ＳＭＩＰ（小型モジュラー免疫医薬品）、ＦｙｎｏｍＡｂｓ（抗体に融合したフィノマー）、ＤＶＤ−Ｉｇ（二重可変ドメイン免疫グロブリン）、ＣｏｖＸ−体（ペプチド修飾抗体）、二重ボディ及び三重抗体を含む。抗体及びその抗原結合フラグメントの改変体のこの列挙は限定的であると見なされるべきではなく、当業者は他の適切な改変体を認識している。
【００５１】
完全長抗体は、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶH）並びに第１、第２及び第３定常領域（ＣＨ1、ＣＨ2及びＣＨ3）を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶL）及び軽鎖定常領域（ＣL）を含む。その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、抗体は異なるクラスに割り当てられる。６つの主なクラスの抗体：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ及びＩｇＹ、があり、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に分けられる。本明細書で使用する用語「全長抗体」は、任意のクラスの抗体、例えば、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ又はＩｇＹ（又はその任意のサブクラス）を指す。異なるクラスの抗体のサブユニット構造及び三次元立体配置は周知である。
【００５２】
「抗原結合フラグメント」は、対応する全長抗体の抗原結合の全て又は有意な部分を保持する、抗体分子又はその誘導体の一部又は領域である。抗原結合フラグメントは、重鎖可変領域（ＶH）、軽鎖可変領域（ＶL）、又はその両方を含み得る。ＶH及びＶLの各々は、典型的には、３つの相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。ＶH又はＶLの３つのＣＤＲはフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）に隣接している。上に簡単に列挙したように、抗原結合フラグメントの例には、これに限定されないが、（１）ＶL−ＣL鎖及びＶH−ＣH１鎖を有する一価のフラグメントであるＦａｂフラグメント；（２）重鎖ヒンジ領域を有するＦａｂフラグメントであるＦａｂ’フラグメント；（３）重鎖ヒンジ領域によって連結された、例えば、ヒンジ領域のジスルフィド架橋によって連結されたＦａｂ’フラグメントの二量体であるＦ（ａｂ’）2フラグメント；（４）Ｆｃフラグメント；（５）抗体のシングルアームのＶL及びＶHドメインを有する最小抗体フラグメントであるＦｖフラグメント；（６）ｓｃＦｖのＶH及びＶLドメインがペプチドリンカーによって連結された単一ポリペプチド鎖である一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント；（７）ジスルフィド架橋を介して２つのＶHドメインに関連する２つのＶHドメイン及び２つのＶLドメインを含む（ｓｃＦｖ）2、及び（８）抗原に特異的に結合する抗体単一可変ドメイン（ＶH又はＶL）ポリペプチドであり得るドメイン抗体、を含む。
【００５３】
抗原結合フラグメントは、常法により調製することができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントは、全長抗体分子のペプシン消化によって産生され得、Ｆａｂフラグメントは、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成され得る。あるいは、適切な宿主細胞（例えば、大腸菌、酵母、哺乳動物、植物又は昆虫細胞）中で重鎖及び軽鎖フラグメントを発現させ、それらをインビボ又はインビトロで組み立てて所望の抗原結合フラグメントを形成させることによる、組換え技術によって調製することができる。一本鎖抗体は、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列と軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列とを連結することにより、組換え技術によって調製することができる。例えば、２つの可変領域の間に柔軟なリンカーを組み込むことができる。当業者は、完全長抗体及びその抗原結合フラグメントの両方の調製方法を認識している。
【００５４】
従って、一実施形態では、本願のこの態様は、前記少なくとも１つの抗体又はその抗原結合フラグメントが、全長抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆｃフラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖Ｆｖフラグメント、（ｓｃＦｖ）2及びドメイン抗体からなる群から選択される、本明細書に定義される複合体を提供する。一実施形態では、前記少なくとも１つの抗体又はその抗原結合フラグメントは、全長抗体、Ｆａｂフラグメント及びｓｃＦｖフラグメントから選択される。１つの特定の実施形態では、前記少なくとも１つの抗体又はその抗原結合フラグメントは全長抗体である。
【００５５】
本明細書で定義される前記複合体の一実施形態において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体及びその抗原結合フラグメントからなる群より選択される。
【００５６】
本明細書で使用する「モノクローナル抗体」という用語は、モノクローナル抗体のサンプル中の各抗体分子が抗原上の同じエピトープに結合することを意味する一価の親和性を有する抗体を指し、一方で、本明細書で使用する用語「ポリクローナル抗体」は、特定の抗原に対して反応する抗体のコレクションであるが、コレクション中に異なる抗体分子は、例えば抗原上の異なるエピトープを同定することができる。ポリクローナル抗体は、典型的には適切な哺乳動物の接種によって産生され、哺乳動物の血清から精製される。モノクローナル抗体は、固有の親細胞のクローンである同一の免疫細胞（例えば、ハイブリドーマ細胞株）によって作製される。本明細書で使用される用語「ヒト抗体」は、ヒト被験体から得られた抗体に実質的に対応する、又はそれに由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を指す。本明細書で使用される用語「キメラ抗体」は、組換え又は遺伝子操作抗体、例えば、抗体の免疫原性を低下させるために導入された、異なる種、例えばヒトに由来するポリペプチド又はドメインを含む、マウスモノクローナル抗体などを指す。「ヒト化抗体」という用語は、免疫原性を低下させるために、ヒトで天然に産生された抗体変異体と類似性を増大させるようにタンパク質配列が改変された、非ヒト種由来の抗体を指す。
【００５７】
ＩＬ−６に結合することに加えて、少なくとも１つのさらなる抗原を標的とする本明細書で定義される複合体は有益であり得る。一実施形態では、前記追加の抗原は、免疫系の疾患又は障害と関連する。別の実施形態では、前記追加の抗原は、癌に関連する。従って、一実施形態では、前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、例えば免疫系の疾患又は障害に関連するか、又は癌に関連するさらなる抗原に対する親和性を有する、本明細書で定義される複合体が提供される。非限定的な例には、免疫系のＩＬ−６関連障害に関連する抗原、並びに任意の他のＩＬ−６関連障害に関連する抗原が含まれる。一実施形態では、抗原は、アンギオゲニン２（Ａｎｇ−２）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１１（ＴＮＦＳＦ１１）、ＴＮＦＳＦ１３、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４、ＴＮＦＳＦ１５、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インターロイキン１α（ＩＬ−１α）、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン１７Ａ（ＩＬ−１７）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン２３（ＩＬ−２３）、インターロイキン３３（ＩＬ−３３）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、高移動度群タンパク質Ｂ１（ＨＭＧＢ１）、リポ多糖類（ＬＰＳ）、トール様受容体４（ＴＬＲ４）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ケモカインＣ−Ｃモチーフリガンド１９（ＣＣＬ１９）、ケモカインＣ−Ｃモチーフリガンド２１（ＣＣＬ２１）、ケモカインＣ−Ｘ−Ｃモチーフリガンド４（ＣＸＣＬ４）及びインターフェロンα、からなる群から選択される。
【００５８】
１つの特定の実施形態において、前記抗原は、ＩＬ−１β、ＴＮＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１７、ＨＭＧＢ１、ＬＰＳ及びＴＬＲ４からなる群より選択される。一実施形態では、前記抗原はサイトカインであり、例えばＩＬ−１β、ＴＮＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３及びＩＬ−１７からなる群から選択される。１つの特定の実施形態では、前記抗原はＴＮＦである。
【００５９】
一実施形態では、前記抗体又はそのフラグメントは、アダリムマブ、インフリキシマブ、ゴリムマブ、セルトリムマブペゴール（ｃｅｒｔｏｌｉｍｕｍａｂ  ｐｅｇｏｌ）及びその抗原結合フラグメントからなる群から選択される。別の実施形態では、前記抗体又はそのフラグメントは、アダリムマブ、インフリキシマブ、ゴリムマブ及びセルトリムマブペゴールからなる群から選択される全長抗体である。１つの特定の実施形態では、前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、アダリムマブ又はその抗原結合フラグメント、例えば全長アダリムマブである。
【００６０】
本明細書で定義される複合体によって、結合のための追加の標的の他の非限定的な例は、半減期を延長する標的である。複合体がそのような標的に結合すると、複合体のインビボ半減期が延長される。１つの特定の実施形態では、さらなる標的はアルブミンである。一実施形態では、前記アルブミン結合活性は、連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）タンパク質Ｇ又はその誘導体のアルブミン結合ドメインを本明細書で定義される複合体に含めることによって提供される。
【００６１】
本明細書で定義されるような複合体のＩＬ−６への結合は、インビボ又はインビトロでＩＬ−６を介する標準的なシス及び／又はトランス−シグナル伝達を妨害し得る。従って、一実施形態では、シス−シグナル伝達経路を介してＩＬ−６依存性シグナル伝達を阻害することができる、本明細書で定義される複合体が提供される。別の実施形態では、本明細書で定義される複合体は、トランス−シグナル伝達経路を介してＩＬ−６依存性シグナル伝達を阻害することができる。別の実施形態では、本明細書で定義される複合体は、シス−シグナル伝達経路及びトランス−シグナル伝達経路の両方を介してＩＬ−６依存性シグナル伝達を阻害することができる。
【００６２】
半最大阻害濃度（ＩＣ５０）は、特定の生物学的又は生化学的機能を阻害する物質の有効性の尺度である。この定量的尺度は、所与の生物学的プロセスを半減させるために特定の物質がどれくらい必要であるかを示し、当技術分野で一般的に使用されている。１つの特定の実施形態では、阻害の半最大阻害濃度（ＩＣ５０）が最大で１×１０-6Ｍ、例えば最大で１×１０-7Ｍ、例えば最大で１×１０-8Ｍ、例えば最大で１×１０-9Ｍ、例えば最大で１×１０-10Ｍであるように、ＩＬ−６シグナル伝達を阻害することができる本明細書に定義される複合体が提供される。この阻害はシス又はトランスシグナル伝達経路のいずれかであり得る。一実施形態では、前記複合体は、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒαとｇｐ１３０との相互作用を阻害することができる。
【００６３】
以下のセクションにおいて、ＴＮＦは、上記のような追加の抗原の例示的な例として使用され、従って、限定として見なされるべきではない。従って、親和性を測定する方法は、任意の他の適切な追加の抗原に対して、本明細書に記載される複合体の親和性を測定するために等しく良好に適合される。
【００６４】
本明細書で使用される「ＩＬ−６結合」、「ＩＬ−６に対する結合親和性」、「ＴＮＦ結合」及び「ＴＮＦに対する結合親和性」という用語は、例えば、ＥＬＩＳＡ又は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術の使用によって試験され得る本明細書で定義されるポリペプチド又は複合体の特性を指す。例えば、以下の実施例に記載されるように、結合親和性は、ポリペプチドのサンプルが抗体被覆ＥＬＩＳＡプレート上に捕捉され、ビオチン化ＩＬ−６（又はビオチン化ＴＮＦ）が添加され、続いてストレプトアビジン結合ＨＲＰが添加される実験において試験され得る。ＴＭＢ基質を添加し、Ｖｉｃｔｏｒ3（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）のようなマルチウェルプレートリーダーを用いて４５０ｎｍで吸光度を測定する。当業者は、このような実験によって得られた結果を解釈して、少なくともＩＬ−６（又はＴＮＦ）に対する複合体の結合親和性の定性的尺度を確立することができる。定量的測定が望まれる場合、例えば、相互作用のＥＣ５０値（半最大有効濃度）を決定するために、ＥＬＩＳＡもまた使用され得る。ビオチン化ＩＬ−６（又はビオチン化ＴＮＦ）の連続希釈に対するポリペプチドの応答を、上記のようなＥＬＩＳＡを用いて測定される。当業者は、このような実験によって得られた結果を解釈し、ＥＣ５０値を、例えばＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５及び非線形回帰を用いて、結果から計算することができる。
【００６５】
ＴＮＦのような追加の抗原に対するＩＬ−６結合親和性又は親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験において試験することもできる。ＩＬ−６（又はＴＮＦ）、又はそのフラグメントは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）装置のセンサーチップ上に固定化され、試験される複合体を含むサンプルはチップ上を通過する。あるいは、試験される複合体を機器のセンサーチップ上に固定し、ＩＬ−６（又はＴＮＦ）又はそのフラグメントを含むサンプルをチップ上に通す。当業者は、このような実験によって得られた結果を解釈して、少なくともＩＬ−６（又はＴＮＦ）に対する複合体の結合親和性の定性的尺度を確立することができる。定量的尺度が望ましい場合、例えば、相互作用のＫD値を決定するために、表面プラズモン共鳴法を使用することもできる。結合値は、例えばＢｉａｃｏｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）又はＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）機器で定義することができる。ＩＬ−６（又はＴＮＦ）は、装置のセンサーチップ上に適切に固定化され、親和性が決定されるべき複合体のサンプルは、連続希釈によって調製され、ランダムな順序で注入される。ＫD値は、例えば、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１ソフトウェアの１：１  Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデル、又は機器製造者によって提供される他の適切なソフトウェアを使用して、結果から計算することができる。
【００６６】
本明細書で定義される複合体に関して、一実施形態では、相互作用のＥＣ５０値が最大で１×１０-7Ｍ、例えば最大で１×１０-8Ｍ、例えば最大で１×１０-9Ｍ、例えば最大で１×１０-10Ｍであるように、ＩＬ−６に結合することができる。
【００６７】
一実施形態では、複合体は、相互作用のＫＤ値が、最大で１×１０-8Ｍ、例えば最大で１×１０-9Ｍ、例えば最大で１×１０-10Ｍ、例えば最大で１×１０-11ＭであるようにＩＬ−６に結合することができる。
【００６８】
本明細書で定義される複合体のさらなる抗原への結合は、インビボ又はインビトロにおいて、前記抗原が関与するシグナル伝達経路を妨害し得る。例えば、前記追加の抗原がＴＮＦである場合、前記複合体のＴＮＦへの結合は、インビボ又はインビトロにおいてＴＮＦシグナル伝達を妨害し得る。従って、一実施形態では、ＴＮＦ依存性シグナル伝達を阻害することができる本明細書で定義される複合体が提供される。１つの特定の実施形態では、阻害の半最大阻害濃度（ＩＣ５０）が最大で１×１０-7Ｍ、例えば最大で１×１０-8Ｍ、例えば最大で１×１０-9Ｍ、例えば最大で１×１０-10Ｍ、例えば最大で１×１０-11ＭであるようにＴＮＦシグナル伝達を阻害することができる本明細書に定義する複合体が提供される。
【００６９】
一実施形態では、複合体は、相互作用のＫD値が最大で１×１０-7Ｍ、例えば最大で１×１０-8Ｍ、例えば最大で１×１０-9Ｍ、例えば最大で１×１０-10Ｍ、例えば１×１０-11Ｍ、例えば最大で１×１０-12Ｍであるように、ＴＮＦへ結合することができる。
【００７０】
本明細書に記載の複合体は、例えば融合タンパク質又はコンジュゲートの形態で存在してもよい。従って、前記少なくとも１つのＩＬ−６結合ポリペプチド及び前記少なくとも１つの抗体又はその抗原結合フラグメントは、化学的コンジュゲート（公知の有機化学方法を使用）又は他の任意の手段、例えば融合タンパク質として複合体を発現するか、又は直接的に又はリンカーを介して、例えばアミノ酸リンカーを介して、他の任意の様式で連結されてもよい。
【００７１】
従って、一実施形態では、前記複合体が融合タンパク質又はコンジュゲートである、本明細書で定義される複合体が提供される。一実施形態では、前記複合体は融合タンパク質である。別の実施形態において、前記複合体はコンジュゲートである。前記複合体の一実施形態において、前記ＩＬ−６結合ポリペプチドは、前記抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖のＮ末端又はＣ末端に結合される。別の実施形態では、前記ＩＬ−６結合ポリペプチドは、前記抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖のＮ末端又はＣ末端に結合される。一実施形態では、前記ＩＬ−６結合ポリペプチドは、前記抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖及び重鎖のＮ末端及び／又はＣ末端に結合される。例えば、ＩＬ−６結合ポリペプチドは、重鎖（単数又は複数）のＮ末端のみに、軽鎖（単数又は複数）のＮ末端のみに、前記抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖（単数又は複数）のＣ末端のみに、軽鎖（単数又は複数）のＣ末端のみ、重鎖（単数又は複数）のＮ末端及びＣ末端の両方に、軽鎖（単数又は複数）のＮ末端及びＣ末端の両方に、軽鎖（単数又は複数）のＣ末端及び重鎖（単数又は複数）のＮ末端のみに、重鎖（単数又は複数）のＣ末端及び軽鎖（単数又は複数）のＮ末端のみに、結合されてもよい。
【００７２】
当業者は、融合タンパク質の構築には、融合される機能的部分の間にリンカーを使用することがしばしばあり、異なる特性を有する異なる種類のリンカー、例えば、可撓性アミノ酸リンカー、剛性アミノ酸リンカー及び切断可能なリンカーが存在することを認識している。リンカーは、融合タンパク質の発現を増大させ、生物活性を向上させ、標的化を可能にし、薬物動態を変化させるために、例えば、融合タンパク質の安定性を増加させるか、又は折り畳みを改善するために使用されている。従って、一実施形態では、前記複合体は、さらに少なくとも１つのリンカー、例えば、可撓性アミノ酸リンカー、剛性アミノ酸リンカー及び切断可能アミノ酸リンカーから選択される少なくとも１つのリンカーを含む。１つの実施形態において、前記リンカーは、前記ＩＬ−６結合ポリペプチドと前記抗体又はその抗原結合フラグメントとの間に配置される。
【００７３】
可撓性リンカーは、接合されたドメインがある程度の運動又は相互作用を必要とする場合、しばしば当該分野で使用され、複合体のいくつかの実施形態において特に有用であり得る。そのようなリンカーは、一般に、小さい、非極性（例えばＧ）又は極性（例えばＳ又はＴ）アミノ酸からなる。いくつかの可撓性リンカーは、主にＧ及びＳ残基のストレッチからなり、例えば、（ＧＧＧＧＳ）ｐである。コピー数「ｐ」を調製することにより、機能的部分の間の適切な分離を達成するために、又は必要な部分間の相互作用を維持するために、リンカーを最適化することが可能になる。Ｇ及びＳリンカーとは別に、他の可撓性リンカーが当該分野で公知であり、例えば、可撓性を維持するためのＴ及びＡ、並びに、溶解性を改善するための極性アミノ酸残基などのさらなるアミノ酸残基を含むＧ及びＳリンカーである。本明細書に記載される複合体の使用が意図される可撓性リンカーの例には、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＫＳＴ及びＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦも含まれる。
【００７４】
従って、一実施形態では、前記リンカーは、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）及び／又はスレオニン（Ｔ）残基を含む可撓性リンカーである。一実施形態では、前記リンカーは、（ＧnＳm）p及び（ＳmＧn）pから選択される一般式（式中、独立して、ｎ＝１〜７、ｍ＝０〜７、ｎ＋ｍ≦８及びｐ＝１〜７である）を有する。一実施形態では、ｎ＝１〜５である。一実施形態では、ｍ＝０〜５である。一実施形態では、ｐ＝１〜５である。より特定の実施形態では、ｎ＝４、ｍ＝１及びｐ＝１〜４である。さらにより具体的な実施形態では、前記リンカーは（ＧＧＧＧＳ）3である。別の特定の実施形態では、前記リンカーはＧＧＧＧＳである。別の特定の実施形態では、前記リンカーはＶＤＧＳである。別の特定の実施形態では、前記リンカーはＡＳＧＳである。
【００７５】
本願のさらなる態様において、本明細書に記載の複合体をコードするポリヌクレオチド；該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター；及び前記発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。
【００７６】
また、本願に包含されるのは、上記の複合体の製造方法であり、その発現ベクターから前記ポリペプチドの発現を許容する条件下で前記宿主細胞を培養すること、及び前記ポリペプチドを単離することを含む、方法である。
【００７７】
本願の複合体、又はそのサブコンポーネント、ポリペプチド部分、例えば、ＩＬ−６結合ポリペプチド又は抗体の抗原結合フラグメントの任意の１つ以上は、代わりに、保護された反応性側鎖を有するアミノ酸及び／又はアミノ酸誘導体を使用する非生物学的ペプチド合成によって製造することができ、非生物学的ペプチド合成が、
−保護された反応性側鎖を有する第１の態様のポリペプチドを形成するためのアミノ酸及び／又はアミノ酸誘導体の段階的カップリング、
−ポリペプチドの反応性側鎖からの保護基の除去、及び
−水溶液中でのポリペプチドの折り畳み、
を含んでいる。
【００７８】
前記複合体はまた、少なくとも１つのＩＬ−６結合ポリペプチドを、本明細書に記載の少なくとも１つの抗体又はその抗原結合フラグメントへのコンジュゲーションによって産生され得る。当業者は、例えば荷電したサクシニミジルエステル又はカルボジイミドを使用する従来の化学的コンジュゲーション法のような、当該分野で公知のコンジュゲーション法を認識している。
【００７９】
本願に従って開示される複合体は、少なくともＩＬ−６シグナル伝達を阻害するための治療剤として有用であり得ることが理解されるべきである。前記複合体は、さらに、前記追加のシグナル伝達経路の成分である追加の抗原に対する前記抗体又はその抗原結合フラグメントの親和性を介して、さらなる経路のシグナル伝達を阻害するために有用であり得る。例えば、前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＴＮＦに対する親和性を有し得る。
【００８０】
別の態様では、本明細書に記載の複合体及び少なくとも１つの医薬的に許容される賦形剤又は担体を含む組成物が提供される。
【００８１】
一実施形態では、前記組成物は、少なくとも１つの追加の活性剤、例えば少なくとも２つの追加の活性剤、例えば少なくとも３つの追加の活性剤をさらに含む。そのような組成物において有用であり得る追加の活性物質の非限定的な例は、免疫応答修飾剤（ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）及び抗癌剤である。
【００８２】
この態様による組成物の実施形態において追加の活性剤として使用することができる免疫応答修飾剤の非限定的な例には、免疫抑制剤及び免疫調節剤及び他の抗炎症剤が含まれる。例えば、本明細書に記載の複合体は、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）（例えば、金塩（ｇｏｌｄ  ｓａｌｔ）、アザチオプリン、メトトレキセート及びレフルノミド）；カルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリンＡ又はＦＫ５０６）；リンパ球再循環モジュレータ；ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）；免疫抑制特性を有するアスコマイシン；グルココルチコイド；コルチコステロイド；シクロホスファミド；免疫抑制性モノクローナル抗体；接着分子阻害剤（例えば、ＬＦＡ−１アンタゴニスト、ＩＣＡＭ−１若しくは−３アンタゴニスト、ＶＣＡＭ−４アンタゴニスト又はＶＬＡ−４アンタゴニスト）；抗ＴＮＦ剤（例えば、エタネルセプト又はＴＮＦに対するモノクローナル抗体、例えばインフリキシマブ、アダリムマブ、ゴリムマブ及びセルトリズマブペゴール）；炎症誘発性サイトカイン阻害剤；ＩＬ−１阻害剤（例えば、アナキンラ又はＩＬ−１トラップ）；ＩＬ−１７阻害剤；ケモカイン阻害剤；非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）（例えば、アスピリン）；及び抗感染剤及び他の免疫応答調節剤、並びにそれらの組み合わせ、からなる群より選択される薬剤と組み合わせて使用してもよい。
【００８３】
この態様による組成物の実施形態において追加の活性剤として使用することができる抗癌剤の非限定的な例には、オーリスタチン、アントラサイクリン、カリケアマイシン、コンブレタスタチン、ドキソルビシン、デュオカルマイシン、ＣＣ−１０６５抗腫瘍抗生物質、エクテインサスシジン（ｅｃｔｅｉｎｓａｓｃｉｄｉｎ）、ゲルダナマイシン、マイタンシノイド、メトトレキセート、マイコトキシン、タキソール、リシン、ブーゲニン（ｂｏｕｇａｎｉｎ）、ゲロニン、シュードモナスエキソトキシン３８（ＰＥ３８）、ジフテリアトキシン（ＤＴ）、及びそれらの類似体、及びそれらの誘導体並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される薬剤を含む。当業者は、細胞傷害性薬剤の非限定的な例には、前記薬剤の全ての可能な変異体が含まれ、例えば、薬剤オーリスタチンは、例えばオーリスタチンＥ、オーリスタチンＦ、オーリスタチンＰＥ、及びその誘導体が含まれることが理解されよう。
【００８４】
当業者は、本明細書に記載の複合体又は前記複合体を含む医薬組成物は、例えば、経口、局所、静脈内、腹腔内、皮下、肺、経皮、筋肉内、鼻腔内、頬側、舌下又は坐剤投与が含まれる通常の投与技術を用いて被験体へ投与されてもよいことを理解するであろう。従って、一実施形態では、経口、局所、静脈内、腹腔内、皮下、肺、経皮、筋肉内、鼻腔内、頬側、舌下又は坐剤投与のための本明細書に記載の複合体又は医薬組成物が提供される。
【００８５】
従って、本願の別の態様では、医薬として使用するための本明細書に記載の複合体又は組成物が提供される。一実施形態において、前記複合体又は組成物は、ＩＬ−６機能及びさらなる抗原の機能を調節する。前記さらなる抗原は、インビボでの免疫系の疾患又は障害と関連し得るか、又は癌に関連し得る。一実施形態では、インビボでＩＬ−６機能を調節するための薬剤として使用するための、本明細書に記載の複合体が提供される。一実施形態において、前記複合体又は組成物は、ＩＬ−６機能及びさらなる抗原、例えばインビボでの免疫系の疾患又は障害と関連する、又は癌と関連するさらなる抗原の機能を調節するための薬剤としての使用のために提供される。１つの特定の実施形態において、前記複合体又は組成物は、インビボでＩＬ−６機能及びＴＮＦ機能を調節するための薬剤としての使用のために提供される。
【００８６】
本明細書中で使用される場合、用語「調節する」は、活性を変化させる、例えば、ＩＬ−６機能又は追加の抗原ハイポモルフ（ｈｙｐｏｍｏｒｐｈ）の機能にすること、ＩＬ−６機能又は追加の抗原の機能を部分的に阻害すること又は完全に阻害することをいう。
【００８７】
本明細書中で使用される場合、用語「ＩＬ−６関連障害」は、ＩＬ−６がシグナル伝達経路において調節的役割を果たす任意の障害、疾患又は状態をいう。本明細書で使用する「ＴＮＦ関連障害」という用語は、ＴＮＦが疾患又は障害に関与するシグナル伝達経路において調節的役割を果たす任意の障害、疾患又は状態を指す。
【００８８】
一実施形態では、ＩＬ−６関連障害、例えばＩＬ−６及びＴＮＦに関連する障害の治療に使用するための本明細書に記載の複合体又は組成物が提供される。
【００８９】
本明細書に記載の複合体又は組成物が有用であり得る治療のためのＩＬ−６関連障害の非限定的なリストには、炎症性疾患、自己免疫疾患、感染性疾患、癌、腫瘍性疾患、糖尿病、神経疾患うつ病、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、若年性ＲＡ、若年性突発性関節炎（ｊｕｖｅｎｉｌｅ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、全身性若年性突発性関節炎、血管炎（ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ）、乾癬性関節炎、乾癬、強直性脊椎炎、クローン病又は潰瘍性大腸炎などの慢性炎症性腸疾患、グレーブス病、ベーチェット病、ブドウ膜炎、巨細胞性動脈炎、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性硬化症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性筋炎、リウマチ性多発筋痛症（ｐｏｌｙｍｙａｌｇｉａ  ｒｈｅｕｍａｔｉｃ）、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、再発性多発軟骨症、膵炎、腹膜炎、腎炎、川崎病、シェーグレン症候群、成人スティル病（ａｄｕｌｔ  Ｓｔｉｌｌ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、大腸炎関連癌（ｃｏｌｉｔｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃａｎｃｅｒ）、腎癌（ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ  ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、キャッスルマン病、乳癌、肺癌、アルツハイマー病、ＨＩＶ、糖尿病、敗血症、悪液質、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、肝硬変、移植片対宿主病、心筋梗塞、子宮内膜症及び骨粗鬆症を含む。
【００９０】
抗ＴＮＦ剤による治療が、他の強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、プラーク乾癬、クローン病及び潰瘍性大腸炎の治療に有用であることは、当技術分野で公知である。さらに、抗ＴＮＦ薬の非標識使用によるデータは、ＴＮＦ阻害が、ベーチェット病、非感染性眼炎症、化膿性汗腺炎及び壊疽性膿皮症などの特定の症例において炎症過程の迅速な制御をもたらし得ることを示す。さらに、治療抵抗性の主要なうつ病、アルツハイマー病、尋常性天疱瘡、サルコイドーシスの皮膚症状、毒性表皮壊死、扁平苔癬、封入体筋炎及び川崎病の治療における抗ＴＮＦ剤の使用に関する進行中の臨床試験がある（Ｋａｒａｍｐｅｔｓｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌｕｍｅ  １０３，Ｎｏ  １２．９１７−９２８）。従って、本明細書に記載の複合体又は組成物が、追加抗原がＴＮＦである実施形態において有用であり得るＴＮＦ関連障害の非限定的なリストには、炎症性疾患、自己免疫疾患、感染症、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、慢性関節リウマチ、若年性突発性関節炎、プラーク乾癬、クローン病又は潰瘍性大腸炎などの慢性炎症性腸疾患、ベーチェット病、非感染性眼炎症、化膿性汗腺炎、壊疽性膿皮症、鬱病、アルツハイマー病、尋常性天疱瘡、サルコイドーシスの皮膚症状、中毒性表皮壊死症、扁平苔癬、封入体筋炎及び川崎病を含む。
【００９１】
一実施形態において、前記障害は、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、慢性関節リウマチ、若年性特発性関節炎及びプラーク乾癬からなる群、例えば、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、慢性関節リウマチ及びプラーク乾癬からなる群、例えば、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、クローン病、慢性関節リウマチ、若年性特発性関節炎及びプラーク乾癬からなる群、例えば、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、クローン病及び慢性関節リウマチからなる群、例えば、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎及び慢性関節リウマチからなる群から選択される。
【００９２】
１つの特定の実施形態において、前記障害は、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、若年性ＲＡ、若年性特発性関節炎又は全身性若年性特発性関節炎からなる群から選択される。特定の実施形態では、前記障害は慢性関節リウマチ（ＲＡ）である。
【００９３】
別の特定の実施形態では、前記障害は、慢性炎症性腸疾患、例えばクローン病又は潰瘍性大腸炎である。
【００９４】
別の実施形態では、前記障害は、癌又は腫瘍疾患、例えば、大腸炎関連癌、腎癌、腎臓癌、前立腺癌、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、キャッスルマン病、乳癌及び肺癌からなる群から選択される癌又は腫瘍疾患である。
【００９５】
別の実施形態において、前記障害は、アルツハイマー病、ＨＩＶ、糖尿病、敗血症、悪液質、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、肝硬変、移植片対宿主病、心筋梗塞、子宮内膜症及び骨粗鬆症からなる群から選択される。
【００９６】
関連する態様では、ＩＬ−６関連障害の治療方法であって、本明細書に記載の有効量の複合体又は組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む方法が提供される。前記方法のより具体的な実施形態において、本明細書に記載の複合体又は組成物は、インビボでＩＬ−６機能を調節する。一実施形態では、前記複合体又は組成物は、ＩＬ−６機能及びさらなる抗原、例えばインビボでの免疫系の疾患又は障害に関連する抗原、又は癌に関連する抗原の機能を調節する。前記追加抗原がＴＮＦである１つの特定の実施形態において、前記複合体又は組成物は、インビボでＩＬ−６機能及びＴＮＦ機能を調節する。
【００９７】
特定の障害に関連し、治療に使用するための本明細書に記載の複合体又は組成物に関する態様の文脈で開示される実施形態は、治療方法の本願の態様に対して等しく関連する。簡潔さのために、障害のリストはここでは繰り返さない。
【００９８】
本明細書に記載される治療上有効な量の複合体又は組成物、及び上述の免疫応答調節剤又は抗癌剤などの少なくとも１つの第２の薬物物質を投与することは有益であり得る。
【００９９】
本明細書で使用される場合、用語「共投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」は、同時投与及び逐次投与の両方を包含する。従って、一実施形態では、上記のような免疫応答調節剤の共投与をさらに含む、上記で定義した方法が提供される。別の実施形態では、上記のような抗癌剤の共投与をさらに含む、上で定義した方法が提供される。
【０１００】
本発明は、様々な例示的な態様及び実施形態を参照して説明されているが、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な変更が行われ得、均等物がその要素の代わりに用いられ得ることは、当業者に理解される。さらに、本発明の本質的な範囲から逸脱することなく、特定の状況又は分子を本発明の教示に適合させるために、多くの改変を行うことができる。従って、本発明は、企図される特定の実施形態に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲に含まれる全ての実施形態を含む。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１−１】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−２】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−３】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−４】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−５】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−６】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−７】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−８】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−９】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−１０】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−１１】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−１２】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−１３】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−１４】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−１５】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−１６】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−１７】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−１８】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−１９】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−２０】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−２１】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−２２】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−２３】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−２４】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−２５】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−２６】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−２７】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−２８】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−２９】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−３０】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−３１】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−３２】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−３３】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−３４】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−３５】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−３６】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−３７】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−３８】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−３９】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−４０】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−４１】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−４２】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−４３】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−４４】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−４５】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−４６】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−４７】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図１−４８】図１は、ＩＬ−６結合Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１〜１５５１）、対照Ｚ変異体ポリペプチド（配列番号１５５２〜１５５３）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）、選択、スクリーニング及び／又は特徴付けに使用されるヒトＩＬ−６（配列番号１５５５）及びマウスＩＬ−６（配列番号１５５６）、ＴＮＦ結合モノクローナル抗体Ａｄａ及びＡｄａ２の２つの異なる重鎖配列（ＨＣAda及びＨＣ２Ada；配列番号１５５７及び１５５９）及び１つの軽鎖配列（ＬＣAda；配列番号１５５８）の例のアミノ酸配列のリストである。ＩＬ−６結合ポリペプチドにおいて、推定されるＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列中の８位から３６位まで伸長する。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸長する。
【図２】図２は、実施例２に記載したようにアッセイした、ｈＩＬ−６とｈＩＬ−６Ｒαとの間の相互作用の阻害の結果を示す。比較のために含めたｈＩＬ−６Ｒα結合抗体トシリズマブ（黒）と対照的に、試験したＩＬ−６結合Ｚ変異体（灰色）は、ｈＩＬ−６のその受容体ｈＩＬ−６Ｒαへの結合を阻害しなかった。
【図３】図３は、実施例２に記載したようにアッセイしたｈｇｐ１３０に対する予め混合したｈＩＬ−６／ｈＩＬ−６Ｒαの結合の阻害の結果を示す。濃度依存的阻害は、全ての試験した主要なＩＬ−６結合Ｚ変異体（灰色）、並びに比較のために含まれていたトシリズマブ（黒）でも見られた。各変異体の計算されたＩＣ５０値を表３に示す。
【図４】図４は、実施例２に記載したようにアッセイした、ｇｐ１３０発現ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に基づく系におけるＩＬ−６媒介性トランス−シグナル伝達の濃度依存的阻害を示す。ＡＢＤ変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）のＣ末端に融合したにＩＬ−６結合Ｚ変異体はトランス−シグナル伝達を阻害したが、ＰＰ０１３と融合した対照Ｚ変異体Ｚ０３６３８（配列番号１５５２）はトランス−シグナル伝達を阻害しなかった。比較のためにトシリズマブを含めた。
【図５】図５は、実施例７に記載したようにアッセイした、ｈｇｐ１３０に対する予め混合したｈＩＬ−６／ｈＩＬ−６Ｒαの結合の阻害の結果を示す。濃度依存的阻害は、試験した全ての成熟ＩＬ−６結合Ｚ変異体（灰色）並びに両方とも比較のために含めたトライリツマブ（黒色）及び主要なバインダーＺ０６８１４（配列番号１５１２；破線）で見られた。全て成熟したＩＬ−６結合Ｚ変異体は、実施例２でアッセイした主要バインダーよりも効率的な阻害を示した（図３との比較）。
【図６】図６は、実施例７に記載のＴＦ−１細胞中和アッセイの結果を示す。ＩＬ−６誘導ＴＦ−１細胞増殖の濃度依存的阻害は、試験した全てのＩＬ−６結合Ｚ変異体（黒で示された成熟したＺ変異体；灰色三角で示された主要なバインダーＺ０６８１４（配列番号１５１２）及びトシリズマブ（灰色四角形）について見られたが、陰性対照抗体ｈＩｇＧ（灰色丸形）では認められなかった。
【図７】図７は、実施例８に記載したような抗関節炎マウスモデルにおいて、ＩＬ−６で誘発された血清アミロイド−Ａ（ＳＡＡ）タンパク質放出をアッセイでスコア付けされた、ＡＢ変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）と融合したＺ変異体Ｚ０６８１４（配列番号１５１２）のインビボでの有効性を示す。４群のマウスに、ＩＬ−６結合Ｚ０６８１４−ＡＢＤ融合タンパク質を０ｍｇ／ｋｇ体重（黒正方形）、０．０２５ｍｇ／ｋｇ体重（白丸）、２．５ｍｇ／ｋｇ体重（白三角）又は２５ｍｇ／ｋｇ体重（白三角）与えた。対照として、マウスにＡＢＤ（白四角）と融合した対照Ｚ変異体（Ｚ０４７２６；配列番号１５５３）（Ｚcontrol−ＡＢＤと称する）２５ｍｇ／ｋｇを与えた。マウスにｈＩＬ−６を注射し、続いてＳＡＡタンパク質のレベルを測定した。ＰＢＳ（黒丸）及び２５ｍｇ／ｋｇ  Ｚ０６８１４−ＡＢＤ（十字）をそれぞれ与えたマウスの２つのさらなる対照群は、その後ＩＬ−６注射されなかった。
【図８】図８は、実施例９に記載されるように製造された本願の４つの複合体のデザインの略図を示す。「Ｚ」は、１５残基（ＧＧＧＧＳ）3−リンカーを介して抗ＴＮＦモノクローナル抗体Ａｄａに全ての構築物において、遺伝的に融合された、ＩＬ−６標的Ｚ変異体Ｚ０６８１４（配列番号１５１２）を示す。Ａ）Ｚ０６８１４−ＨＣAda：Ａｄａの重鎖のＮ末端に融合したＺ０６８１４；  Ｂ）Ｚ０６８１４−ＬＣAda：Ａｄａの軽鎖のＮ末端に融合したＺ０６８１４；  Ｃ）ＬＣAda−Ｚ０６８１４：Ａｄａの軽鎖のＣ末端に融合したＺ０６８１４；  Ｄ）ＨＣAda−Ｚ０６８１４：Ａｄａの重鎖のＣ末端に融合したＺ０６８１４。
【図９】図９は、ＣＨＯ細胞で産生され、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製された、図７に示される複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。レーン１：Ｎｏｖｅｘ  Ｓｈａｒｐ分子量標準（２１６，１６０，１１０，８０，６０，５０，４０，３０，２０，１５，１０，３．５ｋＤａ）。レーン２：Ａｄａ（非還元）；レーン３：Ｚ０６８１４−ＨＣAda（非還元）；レーン４：Ｚ０６８１４−ＬＣAda（非還元）；レーン５：ＨＣAda−Ｚ０６８１４（非還元）；レーン６：ＬＣAda−Ｚ０６８１４（非還元）；レーン７：レーン１の分子量標準；レーン８：Ａｄａ（還元）；レーン９：Ｚ０６８１４−ＨＣAda（還元）；レーン１０：Ｚ０６８１４−ＬＣAda（還元）；レーン１１：ＨＣAda−Ｚ０６８１４（還元）及びレーン１２：ＬＣAda−Ｚ０６８１４（還元）。
【図１０Ａ】図１０は、実施例１１に記載したようにアッセイし、指示の構築物及び比較物を用いてアッセイしたＴＦ−１細胞増殖の阻害を示す。Ａ）ＩＬ−６で刺激されたＴＦ−１細胞
【図１０Ｂ】Ｂ）ＴＮＦで刺激されたＴＦ−１細胞、
【図１０Ｃ】Ｃ）ＩＬ−６及びＴＮＦの両方で刺激されたＴＦ−１細胞
【図１１】図１１は、実施例１２に記載のＩＬ−６誘発血清アミロイド−Ａ（ＳＡＡ）タンパク質放出をアッセイする抗関節炎マウスモデルにおけるＡｄａ（黒丸）と比較したＺ０６８１４−ＨＣAda（四角）のインビボ有効性を示す。Ｚ０６８１４−ＨＣAda及びＡｄａを０．７、７及び７０ｍｇ／ｋｇの用量で注射した。
【図１２】図１２は、実施例１３に記載の精製複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。Ａ）非還元条件。  Ｂ）還元条件。レーンＭ：分子量標準；レーン１：トラスツズマブ（対照ＩｇＧ）；レーン２：アダリムマブ（対照ＩｇＧ）；レーン３：ＬＣAda−ＧＧＧＧＳ−Ｚ１４９７６；レーン４：Ｚ１４９７６−（ＧＧＧＧＳ）−ＬＣAda；レーン５：Ｚ１４９７６−（ＧＧＧＧＳ）3−ＬＣAda。  Ｂ）の矢印は、Ｚ１４９７６に融合した軽鎖を示す。
【図１３】図１３は、実施例１３に記載のように、ＥＬＩＳＡによって分析された、Ａ）ＴＮＦ及びＢ）ＩＬ−６に対する示された複合体の結合を示す。ＴＮＦ−結合抗体アダリムマブ及び非関連ＩｇＧを両アッセイに対照として含めた。
【実施例】
【０１０２】
概要
炎症性リウマチ疾患では、ＩＬ−６誘発効果の競合的阻害が非常に有効であることが示されている。同様に、高親和性抗ヒトＴＮＦモノクローナル抗体アダリムマブは、慢性関節リウマチを含むＴＮＦ誘発性炎症適応症の治療に臨床的に使用される。これらの２つの抗炎症効果が１つの分子に組み合わされ得るかどうかを調べるために、ＩＬ−６標的Ｚ変異体及びＴＮＦ標的抗体アダリムマブと同じ結合特異性を有する抗体「Ａｄａ」に基づく異なる融合分子を設計し、以下の実施例に記載するように、インビトロ及びインビボで産生及び特性を決定した。
【０１０３】
実施例１〜８は、インターロイキン６（ＩＬ−６）を標的とする新規なＺ変異体分子の開発を開示する。後述のＩＬ−６結合Ｚ変異体の第１成熟ライブラリー及びＩＬ−６結合Ｚ変異体の第２成熟ライブラリーである、Ｚ変異体のファージライブラリーを用いたファージディスプレイ技術を用いて、Ｚ変異体を得た。本明細書に記載されるＩＬ−６結合ポリペプチドをコードする遺伝子を配列決定し、対応するアミノ酸配列を図１に列挙し、識別子配列番号１〜１５５１で示す。前記ＩＬ−６結合ポリペプチドは、インビトロ及びインビボで産生され、特徴付けられた。
【０１０４】
実施例９〜１３は、同じ分子内にＩＬ−６結合ポリペプチド及び前記抗体を含む複合体の炎症阻害効果を研究するために、選択されたＩＬ−６結合Ｚ変異体の抗ＴＮＦモノクローナル抗体への融合を開示する。ＩＬ−６標的Ｚ変異体及びＴＮＦ標的モノクローナル抗体に基づく融合体をインビトロ及びインビボで設計、作製及び特徴付けした。
【０１０５】
実施例１
ＩＬ−６結合Ｚ変異体の選択及びＥＬＩＳＡスクリーニング
【０１０６】
この実施例では、ヒト（ｈＩＬ−６）及びマウスＩＬ−６（ｍＩＬ−６）を、Ｚ変異体のファージライブラリーを用いるファージディスプレイ選択において、標的タンパク質として使用した。選択されたクローンのＤＮＡを配列決定し、クローンを大腸菌ペリプラズム画分で産生させ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）でＩＬ−６に対してアッセイした。
【０１０７】
材料及び方法
標的タンパク質、ヒト及びマウスＩＬ−６のビオチン化：Ｎｏ−Ｗｅｉｇｈ  ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号２１３２７）を用いて、製造業者の推奨に従って１２×モル過剰で添加して、ｈＩＬ−６及びｍＩＬ−６（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、各カタログ番号２００−０６及び２１６−１６）をビオチン化した。反応は室温（ＲＴ）で３０分間行った。次に、Ｓｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒ透析カセット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号６６３３３，３，５００  ＭＷＣＯ）を用いて、製造元の指示に従って、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、１０ｍＭリン酸、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）に緩衝液を交換する。
【０１０８】
ＩＬ−６結合Ｚ変異体のファージディスプレイ選択：Ｇｒｏｎｗａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１２８：１６２−１８３に本質的に記載されたファージミドｐＡＹ０２５９２で構築された、バクテリオファージ上に提示されるタンパク質Ｚのランダム変異体のライブラリーを用いてＩＬ−６結合Ｚ変異体を選択した。このライブラリーでは、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤと略記され、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）Ｇ１４８株由来のプロテインＧのＧＡ３に対応する）をＺ変異体に対する融合パートナーとして使用した。ライブラリーはＺｌｉｂ００６Ｎａｉｖｅ．ＩＩと表示され、１．５×１０10ライブラリメンバ（Ｚ変異体）のサイズを有する。ファージミドライブラリーＺｌｉｂ００６Ｎａｉｖｅ．ＩＩを含有するグリセロールストックからの大腸菌ＲＲＩΔＭ１５細胞（Ｒｕｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １０：５７６５−５７７２）を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補充した２０Ｌの規定されたプロリンフリー培地［７ｇ／Ｌのリン酸水素二カリウム、１ｇ／Ｌのクエン酸三ナトリウム二水和物、０．０２ｇ／Ｌのウラシル、６．７ｇ／ＬのＹＮＢ（Ｄｉｆｃｏ（商標）Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、５．５ｇ／Ｌのグルコース一水和物、０．３ｇ／ＬのＬ−アラニン、０．２４ｇ／ＬのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．１１ｇ／ＬのＬ−アスパラギン一水和物、０．１ｇ／ＬのＬ−システイン、０．３ｇ／ＬのＬ−グルタミン酸、０．１ｇ／ＬのＬ−グルタミン、０．２ｇ／Ｌのグリシン、０．０５ｇ／ＬのＬ−ヒスチジン、０．１ｇ／ＬのＬ−イソロイシン、０．１ｇ／ＬのＬ−ロイシン、０．２５ｇ／ＬのＬ−リジン一塩酸塩、０．１ｇ／ＬのＬ−メチオニン、０．２ｇ／ＬのＬ−フェニルアラニン、０．３ｇ／ＬのＬ−セリン、０．２ｇ／ＬのＬ−スレオニン、０．１ｇ／ＬのＬ−トリプトファン、０．０５ｇ／ＬのＬ−チロシン、０．１ｇ／ＬのＬ−バリン］に播種した。培養物を発酵槽（Ｂｅｌａｃｈ  Ｂｉｏｔｅｋｎｉｋ、ＢＲ２０）中で３７℃にて培養した。細胞が、０．７５の６００ｎｍ（ＯＤ600）の光学密度に達したとき、培養物約２．６Ｌを１０倍モル過剰のＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｎ０３１５Ｓ）を用いて感染させた。細胞を３０分間インキュベートした後、発現の誘導のための１００μＭのイソプロピル−β−Ｄ−ガラクトシド、２５μｇ／ｍＬカナマイシン及び１２．５μｇ／ｍＬカルベニシリンを補充したＴＳＢ−ＹＥ（トリプシンソイブロス−酵母エキス；３０ｇ／ＬのＴＳＢ、５ｇ／Ｌの酵母エキス）を発酵槽に２０Ｌまで充填した。細胞を３０℃で２２時間増殖させ、培養中の細胞を１５，９００ｇでの遠心分離によってペレット化した。ファージ粒子を上清からＰＥＧ／ＮａＣｌ（ポリエチレングリコール／塩化ナトリウム）中で２回沈殿させ、ろ過し、Ｇｒｏｎｗａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（上記）に記載のようにＰＢＳ及びグリセロールに溶解した。ファージストックは、使用前まで−８０℃で保存した。
【０１０９】
選択手順及びファージストック調製は、本質的に国際公開第２００９／０７７１７５号の別のビオチン化標的に対する選択について記載したように実施された。バックグラウンド結合剤（ｂｉｎｄｅｒ）の量を減少させるために、ファージストックをＳＡビーズと共に室温で３０分間インキュベートすることにより予備選択を行った。選択に使用される全てのチューブ及びビーズを、５％ＢＳＡを補充したＰＢＳで予備ブロッキングを行った。選択は、室温で２時間、３％ＢＳＡ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を補充したＰＢＳ中で行い、続いて、１．６μｇビオチン化ｈＩＬ−６又はｍＩＬ−６あたり１ｍｇビーズを使用して、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０ストレプトアビジン（ＳＡビーズ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１２０６Ｄ）上の標的結合ファージの捕捉を行った。ファージ増幅には大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号２００２６８）を用いた。
【０１１０】
ビオチン化ｈＩＬ−６及びｍＩＬ−６に対する選択は、４つの異なる最終トラックに分割された４つのサイクルで行われた：サイクル１のトラック（１）は、第２サイクル又は第４サイクルのいずれかに分けられ、サイクル２では３つのトラック（１−１から１−３）、サイクル３では３つのトラック（１−１−１から１−３−１）、そしてサイクル４では４つのトラック（１−１−１−１から１−３−１−２）が完全に得られた。洗浄後、結合したファージを５００μｌの０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．２を用いて選択トラックから溶出し、続いて５０μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０及び４５０μｌのＰＢＳで直ちに中和した。使用した選択ストラテジー及びパラメータの概要は、低下した標的濃度及び洗浄回数の増加に関する選択トラックの差異を表２に示す。
【０１１１】
【表２】
0006678661.tif 000007
【０１１２】
配列決定：標準的ＰＣＲプログラム及びプライマーＡＦＦＩ−２１（５’−ｔｇｃｔｔｃｃｇｇｃｔｃｇｔａｔｇｔｔｇｔｇｔｇ；配列番号１５６０）及びＡＦＦＩ−２２（５’−ｃｇｇａａｃｃａｇａｇｃｃａｃｃａｃｃａｃｃｇｇ；配列番号１５６１）を使用して、単一のコロニーからＰＣＲフラグメントを増幅した。ビオチン化オリゴヌクレオチドＡＦＦＩ−７２（５’−ｂｉｏｔｉｎ−ｃｇｇａａｃｃａｇａｇｃｃａｃｃａｃｃａｃｃｇｇ；配列番号１５６２）及びＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、製造業者の推奨に従って使用して、増幅フラグメントの配列決定を行った。Ｍａｇｎａｔｒｉｘ  ８０００（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎ）機器を用いて磁気ストレプトアビジン被覆ビーズ（Ｄｅｔａｃｈ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｂｅａｄｓ、Ｎｏｒｄｉａｇ、カタログ番号２０１２−０１）に結合させてシークエンス反応物を精製し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１３０ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で解析した。
【０１１３】
ＥＬＩＳＡのためのＺ変異体の作製：配列決定したＺ変異体を、深ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、カタログ番号２７８７５２）中で、１００μｇ／ｍｌアンピシリン及び０．１ｍＭ  ＩＰＴＧを補充した１ｍｌ  ＴＳＢ−ＹＥ培地中の選択物から単一コロニーを接種することによって産生した。プレートを３７℃で２４時間インキュベートした。細胞を遠心分離によりペレット化し、ＰＢＳＴ０．０５％（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を補充したＰＢＳ）２００μｌに再懸濁し、−８０℃で凍結し、ウォーターバス中で解凍して、細胞のペリプラズム画分を放出させた。凍結融解手順を５回繰り返した。サンプルをＰＢＳＴ０．０５％で合計８００μｌに希釈し、細胞を遠心分離によってペレット化した。ペリプラズム抽出物の上清は、ＡＱＨＤＥＡＬＥ−［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＶＤＹＶ−［ＡＢＤ］−ＹＶＰＧ（Ｇｒｏｎｗａｌｌら、上記）として発現した、ＡＢＤに対する融合物としてＺ変異体を含有した。Ｚ＃＃＃＃＃は個々の５８個のアミノ酸残基Ｚ変異体を意味する。
【０１１４】
Ｚ変異体のＥＬＩＳＡ分析：ＩＬ−６へのＺ変異体の結合をＥＬＩＳＡアッセイで分析した。コーティングバッファー（５０ｍＭの炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６；Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｃ３０４１）で希釈した２μｇ／ｍｌの抗ＡＢＤヤギ抗体（社内で製造）を４℃で一晩、ハーフエリアの９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３６９０）をコートした。抗体溶液を注ぎ出し、ウェルを１００μｌのＰＢＳＣ（０．５％カゼインを補充したＰＢＳ；Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｃ８６５４）で室温にて１．５時間ブロッキングした。ブロッキング溶液を捨て、５０μｌのペリプラズム溶液をウェルに添加し、ゆっくり振盪しながら室温で１．５時間インキュベートした。上清を注ぎ出し、ウェルをＰＢＳＴ０．０５％で４回洗浄した。次に、ＰＢＳＣ中の７．７ｎＭの濃度の５０μｌのビオチン化ｈＩＬ−６を各ウェルに添加した。プレートを室温で１．５時間インキュベートし、続いて上記のように洗浄した。ストレプトアビジンコンジュゲートＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｎ１００）をＰＢＳＣで１：３００００に希釈してウェル添加し、続いて４５分間インキュベートした。上記のように洗浄した後、５０μｌのＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  ＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号３４０２１）をウェルに添加し、プレートを製造業者の推奨に従って処理した。特定の無関係のタンパク質に結合するＺ変異体を、その特異的で無関係なタンパク質に対してアッセイすることによって陽性対照として使用し、ｈＩＬ−６に対してアッセイすることによって陰性対照として使用した。ブランク対照として、ペリプラズムサンプルの代わりにＰＢＳＴ０．０５％を添加した。マルチウェルプレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ3、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【０１１５】
結果
ＩＬ−６結合Ｚ変異体のファージディスプレイ選択：個々のクローンを、ビオチン化ｈＩＬ−６及びｍＩＬ−６に対する４サイクルのファージディスプレイ選択の後に調製した。
【０１１６】
配列決定：選択ラウンド４から無作為に選んだクローンについて配列決定を行った。各Ｚ変異体には一意の識別番号＃＃＃＃＃が与え、個々の変異体はＺ＃＃＃＃＃という。５８残基の長さのＺ変異体のアミノ酸配列を図１及び配列表の配列番号１５０３〜１５５１に列挙する。推定のＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列において８位から３６位まで伸びる。これらの各Ｚ変異体（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸びる。
【０１１７】
Ｚ変異体のＥＬＩＳＡ分析：４サイクルの選択後に得られたクローンを９６ウェルプレートで生成し、ＥＬＩＳＡでｈＩＬ−６結合活性についてスクリーニングした。少なくとも３×ネガティブコントロールに対応するシグナルで反応する全てのクローンを陽性ＩＬ−６結合剤とみなした。無関係のタンパク質に特異的な対照分子は、特異的タンパク質に対して陽性シグナルを与えたが、ｈＩＬ−６に対してはシグナルが得られなかった。
【０１１８】
実施例２
ＩＬ−６結合Ｚ変異体の産生及びインビトロ特性決定
【０１１９】
この実施例では、Ｚ変異体のサブセットをサブクローニングし、産生させ、競合ＥＬＩＳＡ及び細胞アッセイにおいて機能的に評価した。ＩＬ−６結合Ｚ変異体が、ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒαの間、又はＩＬ−６とｇｐ１３０受容体との間の特異的相互作用をそれぞれ阻害できるかどうかを調べるために、２つの異なるＥＬＩＳＡアッセイを適用した。古典的なシス−シグナル伝達経路及びトランス−シグナル伝達経路をそれぞれ模倣する２つの異なる細胞アッセイを用いて、Ｚ変異体ポリペプチドの効力を評価した。最後に、それらの二次構造を調べ、それらの融解温度Ｔｍを決定するために、Ｚ変異体のサブセットについて円偏光二色性（ＣＤ）分光法を実施した。
【０１２０】
材料及び方法
Ｚ変異体のサブクローニング：１３のＩＬ−６結合Ｚ変異体のＤＮＡ、Ｚ０６７７７（配列番号１５０３）、Ｚ０６７７９（配列番号１５０４）、Ｚ０６７８９（配列番号１５０５）、Ｚ０６７９１（配列番号１５０６）、Ｚ０６７９２（配列番号１５０７）、Ｚ０６７９９（配列番号１５０８）、Ｚ０６８０２（配列番号１５０９）、Ｚ０６８０５（配列番号１５１０）、Ｚ０６８０９（配列番号１５１１）、Ｚ０６８１４（配列番号１５１２）、Ｚ０６８２９（配列番号１５１３）、Ｚ０６８３４（配列番号１５１４）、Ｚ０６８４４（配列番号１５１５）を、ライブラリーベクターｐＡＹ０２５９２から増幅した。標準的な分子生物学技術（別の標的に結合するＺ変異体について、国際公開第２００９／０７７１７５号に本質的に記載されているように）を用いて、Ｎ末端Ｈｉｓ6タグを有する単量体Ｚ変異体分子の構築のサブクローニング戦略を適用した。Ｚ遺伝子フラグメントを発現ベクターｐＡＹ０１４４８にサブクローニングして、コードされた配列ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＬＱ−［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＶＤを得た。
【０１２１】
５つのＩＬ−６結合Ｚ変異体、Ｚ０６７８９、Ｚ０６７９９、Ｚ０６８０９、Ｚ０６８１４及びＺ０６８２９、及び無関係の標的であるに結合する２つの対照Ｚ変異体Ｚ０３６３８（配列番号１５５２）及びＺ０４７２６（配列番号１５５３）のサブセットは、ＡＢＤ変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）と融合してサブクローニングした。発現ベクターにコードされる構築物はＭＧＳＳＬＱ−［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＶＤＧＳ−ＰＰ０１３であった。
【０１２２】
培養及び精製：各ＩＬ−６結合Ｚ変異体の遺伝子フラグメントを含むプラスミドで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）を形質転換し、３７℃で５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補充した８００又は１０００ｍｌのＴＳＢ−ＹＥ培地で培養した。タンパク質発現を誘導するために、ＯＤ600＝２でＩＰＴＧを０．２ｍＭの最終濃度まで添加し、培養物を３７℃でさらに５時間インキュベートした。遠心分離により細胞を回収した。
【０１２３】
Ｈｉｓ6−タグを有するＩＬ−６結合Ｚ変異体の精製：タンパク質精製は、非変性又は変性条件下で行った。
【０１２４】
非変性条件下での精製は以下のように行った：約２〜５ｇの各細胞ペレットを１０ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。超音波処理による細胞破壊の後、遠心分離により細胞破片を除去し、各上清を、２０ｍｌの洗浄緩衝液（４６．６ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、３．４ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、及び３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で平衡化した２ｍｌのＴａｌｏｎ  ｃｏｂｏｌｔカラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号６３５５０４）に適用した。コンタミネーションを洗浄緩衝液で洗浄することによって除去し、続いて溶出緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、３０ｍＭ  ＨＡｃ及び７０ｍＭ  ＮａＡｃ、ｐＨ５．０）でＩＬ−６結合Ｚ変異体を溶出した。
【０１２５】
変性条件下での精製は以下のように行った：約２〜５ｇの各細胞ペレットを１０ｍｌの溶解緩衝液（７Ｍ塩酸グアニジニウム、４７ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、２．６５ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０４ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に再懸濁し、続いて３７℃、１５０ｒｐｍで２時間インキュベートした。洗浄及び溶出工程は、非変性精製のように、しかし、異なる緩衝液（洗浄緩衝液：６Ｍ塩酸グアニジニウム、４７ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、３．４ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０；溶出緩衝液：６Ｍ尿素、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、２９．６ｍＭのＨＡｃ、７０．４ｍＭのＮａＡｃ及び５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ５．０）を用いて実施した。精製したＺ変異体を、製造者のプロトコールに従って、ＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＰＢＳに緩衝液交換した。
【０１２６】
タンパク質濃度は、各タンパク質の吸光係数を用いて２８０ｎｍでの吸光度を測定することによって決定した。ＩＬ−６結合Ｚ変異体の純度を、クーマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０１２７】
ＡＢＤとの融合したＩＬ−６結合Ｚ変異体の精製：約２．５ｇの各細胞ペレットを、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ）を補充した２０ｍｌのＴＳＴ緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．０）に再懸濁した。超音波処理による細胞破壊及び遠心分離による清澄化後、各上清を１ｍｌの抗ＡＢＤアガロース（国際公開第２０１４／０６４２３７号）を有する重力流カラムに適用した。ＴＳＴ緩衝液及び５ｍＭ  ＮＨ4Ａｃ  ｐＨ５．５緩衝液で洗浄した後、ＡＢＤ融合Ｚ変異体を０．１Ｍ  ＨＡｃで溶出した。ＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ＰＢＳ（２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１．４７ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、８．１ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．４）への緩衝液交換を行った。次に、低エンドトキシン含量を確実にするために、ＡＢＤ融合Ｚ変異体を１ｍｌのＤｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ除去カラム（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号２０３４４）で精製した。タンパク質濃度は、それぞれのタンパク質の吸光係数を用いて２８０ｎｍでの吸光度を測定することによって決定した。純度を、クーマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、各精製Ｚ−ＡＢＤ変異体の同一性をＬＣ／ＭＳ分析を用いて確認した。
【０１２８】
結合部位の分析：第１のアッセイを用いて、ｈＩＬ−６とヒトＩＬ−６Ｒα（ｈＩＬ−６Ｒα）との間の相互作用のＩＬ−６結合Ｚ変異体の干渉を評価した。この実験では、半分の領域の９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを２μｇ／ｍｌの濃度で抗ＩＬ−６Ｒ捕捉抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）でコーティングした。プレートを４℃で一晩インキュベートし、次いで水道水で２回洗浄した。次に、プレートをＰＢＳＣ中で１時間ブロッキングし、ｈＩＬ−６Ｒα（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を２５０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した。プレートを室温で１．５時間インキュベートし、次いで２００μｌの０．０５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで４回洗浄した。別々のプレートにおいて、１３個のＨｉｓ6タグ付きＺ変異体ポリペプチドの連続希釈液（濃度範囲５００〜０．５ｎＭ）を、２．５ｎＭのビオチン化ｈＩＬ−６で滴定した。ＩＬ−６Ｒα抗体トシリズマブ（Ｒｏｃｈｅ）を同じ方法で調製し、比較のために含めた。次に、Ｚ変異体とビオチン化ｈＩＬ−６との各予備混合物を、ｈＩＬ６Ｒαを含むウェルに移した。プレートをさらに１．５時間インキュベートし、次いで４回洗浄した。ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の１：８０００希釈液を加え、プレートを１時間インキュベートした。プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで最後の４回洗浄し、ＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、１５分後、反応を２Ｍ  Ｈ2ＳＯ4で停止させた。吸光度は、マイクロプレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ3、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて４５０ｎｍで測定した。
【０１２９】
第２のアッセイを用いて、ヒトｇｐ１３０（ｈｇｐ１３０）と予め混合したｈＩＬ−６／ｈＩＬ−６Ｒαとの間の相互作用に対するＩＬ−６結合Ｚ変異体の干渉を評価した。この実験では、半分領域の９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、４μｇ／ｍｌの濃度にてＦｃ融合ｈｇｐ１３０（ｈｇｐ１３０−Ｆｃ）でコーティングした。プレートを４℃で一晩インキュベートし、次いで水道水で２回洗浄した。次に、プレートをＰＢＳＣ中で１時間ブロッキングした。プレートを室温で１．５時間インキュベートし、次いで２００μｌの０．０５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで４回洗浄した。別々のプレートにおいて、１３のＨｉｓ６タグ化Ｚ変異体ポリペプチドの連続希釈物（濃度範囲５００〜０．５ｎＭ）をｈＩＬ−６／ｈＩＬ−６Ｒαの固定濃度（それぞれ０．５ｎＭ及び５ｎＭ）で滴定した。
【０１３０】
ＩＬ−６Ｒα結合抗体トシリズマブ（Ｒｏｃｈｅ）を同様に調製し、比較のために含めた。次いで、各Ｚ変異体ポリペプチドとｈＩＬ−６／ｈＩＬ−６Ｒαとを予め混合して会合させたものを、ｈｇｐ１３０を含有するウェルに移した。プレートを１．５時間インキュベートし、次いで４回洗浄した。ビオチン化抗ＩＬ−６Ｒα抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加し、プレートをさらに１．５時間インキュベートし、続いて洗浄した。ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の１：８０００希釈液を加え、プレートを１時間インキュベートした。次に、プレートを４回洗浄し、ＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１５分間添加してから、反応を２Ｍ  Ｈ2ＳＯ4で停止させた。吸光度は、マイクロプレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ3、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて４５０ｎｍで測定した。
【０１３１】
インビトロ中和アッセイ：古典的なシグナル伝達経路を評価する第１のアッセイは、ヒトＩＬ−６、ＴＮＦ及びＧＭ−ＣＳＦに応答して増殖するＴＦ−１細胞株を使用した。ＴＦ−１細胞を、１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（Ｌｏｎｚａ）及び２ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加したＬ−ｇｌｕｔ（Ｌｏｎｚａ）を含むＲＰＭＩ１６４０中で培養した。使用前に、細胞をｒｈＧＭ−ＣＳＦの非存在下にて、ＲＰＭＩ１６４０中で２回洗浄した。次いで細胞を計数し、１ウェルあたり４×１０4細胞の密度で９６ウェル平底プレートに分注した。別々のプレートにおいて、阻害化合物（ＩＬ−６結合Ｚ変異体、Ｈｉｓ6タグ（濃度範囲１０００〜０．１ｎＭ）又はＡＢＤ変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４；濃度範囲２００〜０．００７ｎＭ））及びＩＬ−６Ｒα結合抗体トシリズマブ（Ｒｏｃｈｅ；濃度範囲２００〜０．００７ｎＭ）を、０．０９９ｎＭ  ｒｈＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＫ）の存在下でインキュベートした。さらに、ＡＢＤ融合変異体を９μＭのｒｈＨＳＡ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）と共に又は伴わずにインキュベートした。その後、Ｚ変異体ポリペプチドとｈＩＬ−６とのプレ混合物を、ＴＦ−１細胞を含むウェルに移し、３７℃にて加湿５％ＣＯ2雰囲気下で７２時間インキュベートした。インキュベーションの最後の４時間の間に、１０μｌのＣＣＫ−８（Ｆｌｕｋａ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を増殖細胞の数を決定するためにウェルごとに添加した。吸光度は、マイクロプレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ3、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて４５０ｎｍ（Ａｂｓ４５０）で測定した。細胞増殖のデータを、４パラメータの用量反応曲線への非線形回帰によって評価し、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍプログラムを用いて半最大阻害濃度（ＩＣ５０）を決定した。阻害分子によるＴＦ−１細胞のＩＬ−６依存性増殖の阻害は、Ａｂｓ４５０から、細胞を含むがｈＩＬ−６を含まないコントロールウェルを差し引いたものであった。
【０１３２】
トランスシグナル伝達経路に対処するために、第２のアッセイを使用した。ここでは、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）をｈＩＬ−６及び可溶性ｈＩＬ−６Ｒαで刺激し、読み出しは単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）の産生であった。ＨＵＶＥＣ（Ｌｏｎｚａ）は、ＥＧＭ−２  ｂｕｌｌｅｔキット培地（Ｌｏｎｚａ）で増殖させ、８回以下で培養継代した。使用前に細胞を７５％コンフルエントになるまで増殖させた。トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｌｏｎｚａ）を用いて細胞を剥離し、再懸濁し、新鮮な培地で１回洗浄した。次に、細胞を計数し、１ウェルあたり２×１０4細胞の密度で９６ウェル平底プレートに分注した。細胞を、加湿した５％ＣＯ2雰囲気中、３７℃で一晩培養した。別々のプレートにおいて、ＡＢＤ変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）と融合させたＩＬ−６結合Ｚ変異体Ｚ０６７８９、Ｚ０６７９９、Ｚ０６８０９、Ｚ０６８１４及びＺ０６８２９、異なる標的に結合するＰＰ０１３融合陰性対照Ｚ０３６３８（配列番号１５５４）の連続希釈液（１００〜０．００１５ｎＭ）、及び、トキシリズマブ（Ｒｏｃｈｅ）の連続希釈液（２００〜０．００３ｎＭ）を、組換えｈＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ；０．５ｎＭ）及び固定濃度２００ｎｇ／ｍｌ（５．６ｎＭ）の可溶性ｈＩＬ−６Ｒαの存在下で、９μＭｒｈＨＳＡ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）を含む又は含まない状態でインキュベートした。次に、試験分子及びｈＩＬ−６／ｈＩＬ−６Ｒαとのプレ混合溶液を、ＨＵＶＥＣを含むウェルに移し、これを加湿５％ＣＯ2雰囲気中、３７℃で２４時間インキュベートした。培養期間後に無細胞上清を収集し、ヒトＭＣＰ−１レベルを、ＭＣＰ−１  Ｄｕｏｓｅｔ  ＥＬＩＳＡ開発システム（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法によって決定した。
【０１３３】
ＭＣＰ−１  ＥＬＩＳＡ：半分領域の９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、１μｇ／ｍｌの濃度にて抗ＭＣＰ−１捕捉抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）でコーティングした。プレートを４℃で一晩インキュベートし、水道水で２回洗浄し、ＰＢＳＣ中で１時間ブロッキングした。次いで、プレートを４×２００μｌの０．０５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで４回洗浄した後、標準及びサンプルを添加した。プレートを室温で２時間インキュベートし、０．１μｇ／ｍｌのビオチン化抗ＭＣＰ−１抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加する前に洗浄した。次いで、プレートをさらに１．５時間インキュベートし、次に４回洗浄した。次に、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の１：８０００希釈液を加え、プレートを１時間インキュベートした。プレートを最後に４回洗浄し、ＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を２０分間添加してから、反応を２Ｍ  Ｈ2ＳＯ4で停止させた。吸光度は、マイクロプレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ3、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて４５０ｎｍで測定した。
【０１３４】
ＣＤ分析：精製されたＨｉｓ6標識Ｚ変異体のサブセットをＰＢＳで０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した。各希釈Ｚ変異体について、２５０〜１９５ｎｍのＣＤスペクトルを２０℃で得た。さらに、融解温度（Ｔｍ）を決定するために可変温度測定（ＶＴＭ）を行った。ＶＴＭでは、吸光度を２２１ｎｍで測定し、温度を２０℃から９０℃に上昇させ、５℃／分の温度勾配で測定した。ＣＤ測定は、光路長１ｍｍのセルを使用してＪａｓｃｏ  Ｊ−８１０分光偏光計（Ｊａｓｃｏ  Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａ  ＡＢ）で行った。
【０１３５】
結果
培養及び精製：Ｎ末端Ｈｉｓ6タグを用いて構築された１３のＩＬ−６結合Ｚ変異体（配列番号１５０３〜１５１５）を大腸菌で産生させた。２８０ｎｍでの吸光度を測定することによって分光光度的に決定した、約２〜５ｇの細菌ペレット由来のＩＭＡＣ精製タンパク質の量は、異なるＩＬ−６結合Ｚ変異体について約１０ｍｇ〜２０ｍｇの範囲であった。ＡＢＤ変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）に融合された５つのＺ変異体、約２．５ｇの細菌ペレットから２ｍｇ〜１２ｍｇが得られた。各最終タンパク質調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、これらが主にＩＬ−６結合Ｚ変異体を含有することを示した。各ＩＬ−６結合Ｚ変異体の正確な同一性及び分子量を、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析によって確認した。
【０１３６】
結合部位の分析：（ｉ）ｈＩＬ−６とｈＩＬ−６Ｒα又は（ｉｉ）ｈｇｐ１３０と予め形成したｈＩＬ−６／ｈＩＬ−６Ｒαとの間の相互作用を阻害する、試験した１３のＩＬ−６結合Ｈｉｓ6タグ付きＺ変異体の能力を、２つの別の競合ＥＬＩＳＡ実験で調査した。ｈＩＬ−６／ｈＩＬ−６Ｒαの相互作用の阻害について試験した場合、１３種のＺ変異体のいずれも有意な効果を示さなかった（図２）。しかしながら、全てのＺ変異体は、予め形成したｈＩＬ−６／ｈＩＬ−６Ｒαとｈｇｐ１３０との間の相互作用の明確な濃度依存的阻害、すなわち、トランスシグナル伝達類似の相互作用の阻害を示した（図３）。各Ｚ変異体の計算されたＩＣ５０値を表３に示す。比較のために含まれる抗体トシリズマブは、両方の実験において阻害効果を示した。
【０１３７】
【表３】
0006678661.tif 000008
【０１３８】
インビトロ中和アッセイ：古典的シグナル伝達経路及びトランスシグナル伝達経路におけるＩＬ−６依存性シグナル伝達を阻害するＩＬ−６結合Ｚ変異体の能力を調べるために、２つの異なる細胞アッセイを使用した。古典的なシグナル伝達経路を評価する第一のアッセイは、ヒトＩＬ−６、ＴＮＦ及びＧＭ−ＣＳＦに応答して増殖するＴＦ−１細胞株を使用した。ｇｐ１３０と呼ばれるシグナル伝達受容体サブユニットと併せたＩＬ−６の細胞表面ＩＬ−６受容体への直接のシグナル伝達は、シスシグナル伝達と呼ばれる。このアッセイは、１３の変異体全てがＴＦ−１細胞のＩＬ−６依存性増殖を阻止することができることを示した。Ｈｉｓ6タグ付きＺ変異体及びＡＢＤ変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）に組換え融合したＺ変異体、並びに比較のために含んだトラスツズマブのｈＩＬ−６Ｒα結合抗体の計算されたＩＣ５０値を表４に示す。
【０１３９】
【表４】
0006678661.tif 000009
【０１４０】
トランス−シグナル伝達経路も細胞ベースのシステムで阻害できるかどうかを調べるために、ｇｐ１３０発現ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いた第２のアッセイを行った。予め形成したｈＩＬ−６／ｈＩＬ−６ＲαとＨＵＶＥＣのインキュベーションは、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）のＩＬ−６トランス伝達依存性分泌を生じ、ＩＬ−６結合Ｚ変異体の任意のトランスシグナル伝達阻害能力の分析を可能にする。このアッセイでは、ＡＢＤ変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）に組換え融合された５つのＺ変異体をＨＳＡの存在下で分析した。比較のために、ｈＩＬ−６Ｒα結合抗体トシリズマブを含めた。研究された５つの変異体の全てがトランスシグナル伝達を阻害することが示された（図４）。１つの変異体、Ｚ０６８１４−ＡＢＤは、トシリズマブよりも強力であることが示され、５ｎＭのトシリズマブと比較して、約１ｎＭのＩＣ５０値を示した。
【０１４１】
ＣＤ分析：７つのＺ変異体について決定されたＣＤスペクトルは、各々が２０℃でα−ヘリックス構造を有することを示した。可変温度測定で決定された融解温度（Ｔｍ）を表５に示す。
【０１４２】
【表５】
0006678661.tif 000010
【０１４３】
実施例３
ＩＬ−６結合Ｚ変異体の第一の成熟したライブラリーの設計及び構築
【０１４４】
この実施例では、成熟ライブラリーを構築した。このライブラリーを新しいＩＬ−６結合Ｚ変異体の選択に使用した。成熟ライブラリーからの選択は、通常、増加した親和性を有する結合剤をもたらすと予想される（Ｏｒｌｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６（８）：４３３９−４８）。この研究では、スプリットプール合成（ｓｐｌｉｔ−ｐｏｏｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を用いて、ランダム化された一本鎖リンカーを生成し、合成において、所望の位置に規定のコドンの取り込みを可能にした。
【０１４５】
材料及び方法
ライブラリー設計：ライブラリーは、実施例１及び２に記載のＩＬ−６結合Ｚ変異体の配列の選択に基づいた。新しいライブラリーでは、Ｚ分子骨格中の１２の可変位置は、特定のアミノ酸残基にバイアスを有し、１つの位置は、配列番号１５０３〜１５５１に定義されたＺ変異体配列に基づく戦略に従って、一定に保たれた。スプリットプール合成を使用して、１４７ｂｐのＤＮＡリンカーを生成し、Ｚ変異体アミノ酸配列の部分的に無作為化されたヘリックス１及び２をコードした。従って、制限部位ＸｈｏＩ及びＳａｃＩに隣接する５’−ＡＡ  ＡＴＡ  ＡＡＴ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＧＴＡ  ＧＡＴ  ＧＣＣ  ＡＡＡ  ＴＡＣ  ＧＣＣ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＧＣＧ  ＴＧＧ  ＮＮＮ  ＧＡＧ  ＡＴＣ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＣＴＧ  ＣＣＴ  ＡＡＣ  ＣＴＣ  ＡＣＣ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＣＡＡ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＧＣＣ  ＴＴＣ  ＡＴＣ  ＮＮＮ  ＡＡＡ  ＴＴＡ  ＮＮＮ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＣＣＡ  ＡＧＣ  ＣＡＧ  ＡＧＣ  ＴＣＡ  ＴＴＡ  ＴＴＴ  Ａ−３’（配列番号１５６３；ＮＮＮと表示したランダム化コドン）は、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ、ＵＳＡ）に注文した。Ｚ分子骨格における１２の可変Ｚ位置（９，１０，１１，１４，１７，１８，２４，２５，２７，２８，３２及び３５）を含む新しいライブラリー中のアミノ酸残基の理論的分布を表６に示す。結果として得られる理論上のライブラリーサイズは、３．６×１０9変異体である。
【０１４６】
【表６】
0006678661.tif 000011
【０１４７】
ライブラリー構築：１２サイクルのＰＣＲ中にＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３１１８１６）を用いてライブラリーを増幅し、供給元の推奨に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号２８１０６）を使用して精製した。無作為ライブラリーフラグメントの精製したプールを制限酵素ＸｈｏＩ及びＳａｃＩ−ＨＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｒ０１４６Ｌ及びカタログ番号Ｒ３１５６Ｍ）で消化し、ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号２８１０６）を使用して濃縮した。続いて、産物を調製用２．５％アガロースゲル（Ｎｕｉｓｉｅｖｅ  ＧＴＣアガロース、Ｃａｍｂｒｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に流し、供給元の推奨に従って、ＱＩＡＧＥＮゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号２８７０６）を使用して、精製した。
【０１４８】
ファージミドベクターｐＡＹ０２５９２（本質的には上記のＧｒｏｎｗａｌｌらに記載のｐＡｆｆｉ１と同じ）を同じ酵素で制限し、フェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿を用いて精製した。制限フラグメント及びベクターをと５：１のモル比で、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、カタログ番号ＥＬ００１１）を用いて室温で２時間連結し、続いて４℃で一晩インキュベートした。連結したＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿により回収し、続いて１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）に溶解した。従って、ベクターｐＡＹ０２５９２中に得られたライブラリーは、連鎖球菌プロテインＧに由来するアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）にそれぞれ融合したＺ変異体をコードした。
【０１４９】
連結反応（約１６０ｎｇのＤＮＡ／形質転換）をエレクトロコンピテント大腸菌ＥＲ２７３８細胞（５０μｌ、Ｌｕｃｉｇｅｎ、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの直後に、約１ｍｌの回収培地（ＥＲ２７３８細胞とともに供給）を添加した。形質転換した細胞を３７℃で６０分間インキュベートした。滴定及び形質転換体の数を決定するためにサンプルを採取した。次に、細胞をプールし、２％グルコース、１０μｇ／ｍｌテトラサイクリン及び１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補充した１リットルのＴＳＢ−ＹＥ培地中で、３７℃にて一晩培養した。細胞を４，０００ｇで７分間ペレット化し、ＰＢＳ／グリセロール溶液（約４０％グリセロール）に再懸濁し、等分し、−８０℃で保存した。内容を確認するためにＺ変異体のライブラリー由来のクローンを配列決定し、ライブラリー設計と比較して、構築ライブラリーの結果を評価した。配列決定を実施例１に記載のように行い、アミノ酸分布を確認した。
【０１５０】
ファージストックの調製：ファージミドライブラリーを含むファージストックを２０リットルの発酵槽（Ｂｅｌａｃｈ  Ｂｉｏｔｅｋｎｉｋ）中で調製した。ファージミドライブラリーを含むグリセロールストックからの細胞を、１ｇ／ｌのグルコース、１００ｍｇ／ｌのアンピシリン及び１０ｍｇ／ｌテトラサイクリンを補充したＴＳＢ−ＹＥ（トリプシンソイブロス−酵母エキス；３０ｇ／ｌ  ＴＳＢ、５ｇ／ｌ酵母エキス）１０Ｌ中に播種した。細胞が６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ600）が０．６４に達したとき、５倍モル過剰のＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを用いて約１．１Ｌの培養物を感染させた。細胞を３０分間インキュベートした後、発酵槽に複合発酵培地［２．５ｇ／Ｌ（ＮＨ4）2ＳＯ4；酵母エキス５．０ｇ／Ｌ；  ３０ｇ／Ｌ  トリプトン、２ｇ／Ｌ  Ｋ2ＨＰＯ4；  ３ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4、１．２５ｇ／Ｌ；  Ｎａ3Ｃ6Ｈ5Ｏ7・２Ｈ2Ｏ；  Ｂｒｅｏｘ  ＦＭＴ３０消泡剤０．１ｍｌ／Ｌ］で１０Ｌまで充填した。以下の成分を添加した：１０ｍｌのカルベニシリン２５ｍｇ／ｍＬ；  ５ｍｌのカナマイシン５０ｍｇ／ｍＬ；  １ｍＬの１Ｍイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）；  １７．５ｍｌ／Ｌの３００ｇ／ＬのＭｇＳＯ4及び５ｍｌの微量元素溶液［１．２Ｍ  ＨＣｌに溶解した、３５ｇ／ｌのＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ；  １０．５６ｇ／ＬのＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；  ２．６４ｇ／ＬのＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ；  １３．２ｇ／ＬのＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ；  １３．８４ｇ／ＬのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ）。グルコース制限流加培養を、６００ｇ／Ｌグルコース溶液を反応器に供給して開始した（開始時３．５ｇ／ｈ、２０時間後から培養終了時まで３７．５ｇ／ｈ）。ｐＨは、２５％ＮＨ4ＯＨの自動添加によりｐＨ７に制御した。空気を補充し（５Ｌ／分）、撹拌機を５００ｒｐｍに設定した。流加培養の２４時間後、ＯＤ600は２２であった。培養中の細胞を１５，９００ｇの遠心分離によってペレット化した。ファージ粒子をＰＥＧ／ＮａＣｌ中の上清から２回沈殿させ、濾過し、実施例１に記載したようにＰＢＳ及びグリセロールに溶解した。選択時に使用するまでファージストックを−８０℃で保存した。
【０１５１】
結果
ライブラリー構築：新しいライブラリーは、結合特性が確認されたＩＬ−６結合Ｚ変異体のセット（実施例１及び２）に基づいて設計された。設計されたライブラリーの理論上のサイズは、３．６×１０9個のＺ変異体であった。大腸菌ＥＲ２７３８細胞への形質転換後の滴定によって決定されたライブラリーの実際のサイズは、３．５×１０9個の形質転換体であった。
【０１５２】
ライブラリーの品質は、１９２の形質転換体の配列決定及びそれらの実際の配列を理論的デザインと比較することによって試験した。設計されたライブラリーと比較した実際のライブラリーの内容は満足のいくものであることが示された。従って、ＩＬ−６に対する潜在的な結合剤の成熟したライブラリーが良好に構築された。
【０１５３】
実施例４
第一の成熟したライブラリーからのＺ変異体の選択、スクリーニング及び特徴付け
【０１５４】
材料及び方法
成熟ＩＬ−６結合Ｚ変異体のファージディスプレイ選択：標的タンパク質ｈＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２０６−ＩＬ／ＣＦ）及びｍＩＬ−６（Ａｂｎｏｖａ、カタログ番号Ｐ４３４６１１６）は、実施例１に記載のようにビオチン化した。実施例３に記載のＺ変異体分子の新規ライブラリーを用いたファージディスプレイ選択は、以下の例外を除いて、本質的には実施例１に記載されるように、ｈＩＬ−６及びｍＩＬ−６に対して４サイクルで実施した。選択時に、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０１０８−１６５）及びヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、Ａｌｂｕｃｕｌｔ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、カタログ番号２３０−００５）を選択緩衝液に最終濃度１０％及び１．５μＭになるように添加した。選択に用いた全ての試験管及びビーズを、３％ＢＳＡを補充した０．１％のＰＢＳＴで予備ブロッキングした。サイクル１Ａでは、ＳＡ−ビーズとファージストックのインキュベーションによって予備選択工程を実施した。全てのトラックに対し、サイクル１で選択容量は２ｍｌであった。標的結合ファージ捕捉のために、４μｇのビオチン化ｈＩＬ−６又はｍＩＬ−６あたり１ｍｇのビーズを使用した。
【０１５５】
サイクル１の６つのトラック（１から６）は、サイクル２又はサイクル３のいずれかに分割し、サイクル２では合計７つのトラック（１−１から６−２）、サイクル３では１２トラック（１−１−１から６−２−１）、及び、サイクル４では１２トラック（１−１−１−１から６−２−１−１）が得られた。
【０１５６】
結合したファージ粒子は、２つの異なる手順を用いて溶出した；１）５００μｌの０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．２、続いて５０μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０及び４５０μｌのＰＢＳでの即時中和、又は２）５００μｌの１００ｍＭリン酸ナトリウム及び１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．５及び５００μｌのＰＢＳで中和した。
【０１５７】
低い標的濃度及び洗浄回数の増加を用いて得られるその後のサイクルにおけるストリンジェンシーの増大を説明する、選択戦略の概要を表７に示す。
【０１５８】
【表７】
0006678661.tif 000012
【０１５９】
ファージ粒子の増幅：選択サイクル１と２との間のファージ粒子の増幅は、以下の例外を除いて、本質的に実施例１に記載の通りに行った。大腸菌ＥＲ２７３８をファージ増幅に使用し、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを５倍過剰で使用した。選択サイクル２と４との間のファージ粒子の増幅は、以下のように溶液中の細菌の感染によって実施された。対数期大腸菌ＥＲ２７３８のファージ粒子の感染後、２％グルコース、１０μｇ／ｍｌテトラサイクリン及び１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補充したＴＳＢを添加し、続いて３７℃で３０分間回転しながらインキュベートした。その後、細菌にＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを感染させた。感染した細菌を遠心分離によってペレット化し、１００μＭのＩＰＴＧ、２５μｇ／ｍｌのカナマイシン及び１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補充したＴＳＢ−ＹＥ培地に再懸濁し、３０℃で一晩増殖させた。一晩培養した物を遠心分離し、上清中のファージ粒子をＰＥＧ／ＮａＣｌ緩衝液で２回沈殿させた。最後に、ファージ粒子を次の選択サイクルに入る前に選択バッファーに再懸濁した。最後の選択サイクルでは、対数期の細菌を溶出液で感染させた、ＥＬＩＳＡスクリーニングに使用するための単一コロニーを形成するために０．２ｇ／ｌのアンピシリンを補充したＴＢＡＢプレート（３０ｇ／ｌトリプトース血液寒天基質、Ｏｘｏｉｄ、カタログ番号ＣＭＯ２３３Ｂ）に広げる前に希釈した。
【０１６０】
潜在的な結合剤の配列決定：異なる選択トラックからの個々のクローンを配列決定のために選択した。ＥＬＩＳＡスクリーニングで実行された全てのクローンを配列決定した。遺伝子フラグメントの増幅及び遺伝子フラグメントの配列分析は、基本的に実施例１に記載したように行った。
【０１６１】
Ｚ変異体のＥＬＩＳＡスクリーニング：Ｚ変異体を含有する単一コロニー（Ｚ変異体ＡＢＤ融合タンパク質として発現される）を、ＩＬ−６成熟ライブラリーの選択されたクローンから無作為に選択し、実施例１に記載のように培養した。ペリプラズム上清の調製は、６回の凍結融解サイクルを有すること以外は、実施例１のように実施した。ＥＬＩＳＡスクリーニングは、０．５８ｎＭの濃度のビオチン化ｈＩＬ−６を用いて、実施例１に記載したように本質的に行った。主要なＩＬ−６結合剤Ｚ０６８１４のペリプラズム画分を陽性対照として用いた。陰性対照は、ＡＢＤのみを含むペリプラズムを用いて作製した。
【０１６２】
ヒトＩＬ−６結合剤のＥＬＩＳＡ  ＥＣ５０分析：選択されたＩＬ−６結合剤を、上記のようなＥＬＩＳＡを用いたビオチン化ｈＩＬ−６の希釈シリーズに対する応答の分析に供した。ビオチン化タンパク質を２５ｎＭの濃度で添加し、段階的に１：３希釈して１１ｐＭまで希釈した。全てのＺ変異体もバックグラウンド対照として標的タンパク質を添加せずにアッセイした。主要なＩＬ−６結合剤Ｚ０６８１４（配列番号１５１２）を含有するペリプラズムサンプルが含まれ、陽性対照として分析した。陰性対照として、ＡＢＤのみを含むペリプラズムを、ビオチン化ｈＩＬ−６に対してアッセイした。ｍＩＬ−６に対する選択に由来する２つの結合剤、Ｚ１１６１２（配列番号１５１）及びＺ１１６１６（配列番号１５２）を、上記のようにＥＬＩＳＡを用いてビオチン化ｍＩＬ−６の希釈シリーズに対する応答に供した。ビオチン化タンパク質を２２７ｎＭの濃度で添加し、段階的に１：３希釈して１０４ｐＭまで希釈した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５及び非線形回帰を用いて得られた値を分析した。
【０１６３】
結果
成熟したＩＬ−６結合Ｚ変異体のファージディスプレイ選択：各４サイクルを含む完全に並列の１２トラックで選択した。異なる選択トラックは、標的濃度、標的型（ｈＩＬ−６又はｍＩＬ−６）、選択時間、洗浄条件及び溶出緩衝液のｐＨを変えた。
【０１６４】
シークエンシング：ランダムに選択したクローンを配列決定した。それぞれの個々のＺ変異体には、実施例１に記載のように、識別番号Ｚ＃＃＃＃＃が与えられた。合計８０９個の新たなユニークなＺ変異体分子が同定された。
【０１６５】
５８残基の長さのＺ変異体のアミノ酸配列を図１及び配列表の配列番号７、配列番号１５〜８９及び配列番号１５１〜８７１として列挙する。推定ＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列において８位から３６位まで伸びている。これらのＺ変異体の各々（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は７位から５５位まで伸びる。
【０１６６】
Ｚ変異体のＥＬＩＳＡスクリーニング：４回の選択サイクル後に得られたクローンを９６ウェルプレートで産生し、ＥＬＩＳＡを用いてｈＩＬ−６結合活性についてスクリーニングした。全ての無作為に選択されたクローンを分析した。８０９個のユニークなＺ変異体のうち７９６個が、０．５８ｎＭの濃度でｈＩＬ−６に対して陰性対照の３倍以上の応答（０．３〜２．１ＡＵ）を与えることが見出された。ｈＩＬ−６を選択標的として使用した全ての選択トラックからのクローンは、陽性シグナルを示した。陰性対照は、０．０７８〜０．１０２ＡＵの吸光度を有していた。代表的なプレートセットのブランク対照の平均応答は０．０８７ＡＵであった。
【０１６７】
ＩＬ−６結合剤のＥＬＩＳＡ  ＥＣ５０分析：Ｚ変異体のサブセットを、上記のＥＬＩＳＡ実験の結果（各プレート上の陽性対照に対してそれぞれ正規化した最高のＥＬＩＳＡ値）に基づいて選択し、ＥＬＩＳＡフォーマットにて、標的滴定に供した。ペリプラズムサンプルを、ビオチン化ｈＩＬ−６又はｍＩＬ−６の連続希釈物とともにインキュベートした。主要な結合剤Ｚ０６８１４（配列番号１５１２）を有するペリプラズムサンプルもまた、陽性対照としてｈＩＬ−６に対してアッセイした。得られた値を分析し、それぞれのＥＣ５０値を計算した（表８及び９）。
【０１６８】
【表８】
0006678661.tif 000013
【０１６９】
【表９】
0006678661.tif 000014
【０１７０】
実施例５
ＩＬ−６結合Ｚ変異体の第２成熟ライブラリーの設計及び構築
【０１７１】
この実施例では、本質的に実施例４に記載したように、第２成熟ライブラリーを構築した。このライブラリーをＩＬ−６結合Ｚ変異体の選択に使用した。
【０１７２】
材料及び方法
ライブラリー設計：ライブラリーは、実施例４に記載のヒトＩＬ−６結合Ｚ変異体の配列の選択に主に基づいた。新しいライブラリーでは、Ｚ分子骨格中の１３の可変位置は、主に第１の成熟からのＺ変異体、すなわち、配列番号７、配列番号１５〜８９及び配列番号１５１〜８７１で定義された配列に基づく戦略に従って、特定のアミノ酸残基にバイアスを有した。無作為の二本鎖リンカーは、後に構築される二本鎖ＤＮＡの連結及び制限を用いて、トリヌクレオチド構築阻害の無作為セットの組み込みを可能にするＣｏｌｉｂｒａ（商標）技術によって生成された。二本鎖ＤＮＡのライブラリーであり、制限部位ＸｈｏＩ及びＳａｃＩに隣接するＺ変異体アミノ酸配列の部分的にランダム化されたヘリックス１及び２をコードする、５’−ＡＡ  ＡＴＡ  ＡＡＴ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＧＴＡ  ＧＡＴ  ＧＣＣ  ＡＡＡ  ＴＡＣ  ＧＣＣ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＧＣＴ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＧＡＧ  ＡＴＣ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＣＴＧ  ＣＣＧ  ＡＡＣ  ＣＴＧ  ＡＣＣ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＣＡＧ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＧＣＣ  ＴＴＣ  ＡＴＣ  ＮＮＮ  ＡＡＡ  ＴＴＡ  ＮＮＮ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＣＣＡ  ＡＧＣ  ＣＡＧ  ＡＧＣ  ＴＣＡ  ＴＴＡ  ＴＴＴ  Ａ−３’（配列番号１５６４；ランダム化コドンをＮＮＮと表示する）をＩｓｏｇｅｎｉｃａ（Ｅｓｓｅｘ、ＵＫ）から注文された。Ｚ分子骨格中に８つの可変アミノ酸位置（１０，１１，１４，１８，２４，２５，２７及び３２）及び５つの定常アミノ酸位置（９，１３，１７，２８及び３５）を含む、新規ライブラリー中のアミノ酸残基の理論的分布は、表１０に示す。得られた理論上のライブラリーサイズは、２．６×１０7変異体であった。
【０１７３】
ライブラリー構築及びファージストック調製：ライブラリーは、実施例３に記載したように基本的には構築された。ライブラリーのファージストックを実施例３に記載のように調製した。
【０１７４】
【表１０】
0006678661.tif 000015
【０１７５】
結果
ライブラリー構築及びファージストック調製：新規ライブラリーは、結合特性が確認されたＩＬ−６結合Ｚ変異体のセット（実施例４）に基づいて設計された。設計されたライブラリーの理論上のサイズは、２．６×１０7個の変異体であった。大腸菌ＥＲ２７３８細胞への形質転換後の滴定によって決定されたライブラリーの実際のサイズは、１．８×１０9個の形質転換体であった。
【０１７６】
ライブラリーの品質は、１９２の形質転換体の配列決定し、それらの実際の配列を理論的設計と比較することによって試験した。理論上のライブラリーと比較した実際のライブラリーの内容は満足するものであることが示された。従って、ＩＬ−６に対する潜在的な結合剤の成熟したライブラリーがうまく構築された。
【０１７７】
実施例６
第２の成熟ライブラリーからのＺ変異体の選択、スクリーニング及び特徴付け
【０１７８】
材料及び方法
成熟したＩＬ−６結合Ｚ変異体の第２のファージディスプレイ選択：実施例４に記載のように、標的タンパク質ｈＩＬ−６をビオチン化した。実施例５に記載のＺ変異体分子の第２の成熟化ライブラリーを用いた、ファージディスプレイ選択は、以下の例外を除いて、本質的に実施例４に記載の通り、ｈＩＬ−６に対して実施した。全てのトラックに対し、サイクル１で選択容量は４ｍｌであった。サイクル２では、選択トラック１−２及び１−３を１本の共通のチューブで取り扱い、最後の１分間の洗浄後まで分離せず、その後それらを別々に処理した。サイクル４でも、選択トラック１−１−１−１から１−１−１−３、１−１−１−４から１−１−１−６、１−１−２−１から１−１−２−３及び１−１−２−４から１−１−２−６それぞれを共通のチューブに入れ、最後の１分間の洗浄後に３本の別々のチューブに分割した後、表１１に要約した異なる洗浄戦略を用いて別々に処理した。実施例１に記載のように、グリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．２を用いて結合したファージ粒子を溶出させた。選択サイクル間のファージ粒子の増幅は、基本的に実施例１に記載したように行った。
【０１７９】
低くした標的濃度及び洗浄回数の増加の点における、選択トラックの差異を記述する、選択された戦略及び使用したパラメータの概要を、表１１に示す。
【０１８０】
【表１１】
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【０１８１】
潜在的な結合剤の配列決定：異なる選択トラックから個々のクローンを配列決定するために選択した。ＥＬＩＳＡスクリーニングに供した全てのクローンの配列決定を行った。遺伝子フラグメントの増幅及び遺伝子フラグメントの配列分析は、基本的に実施例１に記載したように行った。
【０１８２】
Ｚ変異体のＥＬＩＳＡスクリーニング：Ｚ変異体（実施例１に記載のＺ変異体ＡＢＤ融合タンパク質として発現される）を含有する単一のコロニーを、ＩＬ−６第２成熟ライブラリーの選択クローンから無作為に選別して、実施例１に記載のように培養した。ペリプラズム上清の調製及びＥＬＩＳＡスクリーニングを本質的に実施例１に記載したように行い、凍結融解を１５０μｌの０．０５％ＰＢＳＴ中で行い、８回繰り返した。ビオチン化ｈＩＬ−６を０．２５ｎＭの濃度で使用した。ＩＬ−６結合剤Ｚ０６８１４のペリプラズム画分（配列番号１５１２）を、各ＥＬＩＳＡプレート上の陽性対照としてデュプリケートで使用した。陰性対照として、ＡＢＤのみを含むペリプラズムを、ビオチン化ｈＩＬ−６に対してアッセイした。
【０１８３】
ＩＬ−６結合剤のＥＬＩＳＡ  ＥＣ５０分析：選択されたＩＬ−６結合剤を、実施例２に記載のＥＬＩＳＡを用いて、ビオチン化ｈＩＬ−６の連続希釈に対する応答に供した。ビオチン化タンパク質を５ｎＭの濃度で添加し、段階的に１：３で希釈し、８３ｆＭまで希釈した。バックグラウンド対照として、全てのＺ変異体もまた、標的タンパク質を添加せずにアッセイした。主要なＩＬ−６結合剤Ｚ０６８１４（配列番号１５１２）並びに成熟結合剤Ｚ１１６３２（配列番号７）を含有するペリプラズムサンプルを陽性対照として含めた。陰性対照として、ＡＢＤのみを含むペリプラズムを、ビオチン化ｈＩＬ−６に対してアッセイした。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５及び非線形回帰を用いて得られた値を分析した。
【０１８４】
結果
成熟したＩＬ−６結合Ｚ変異体の第２のファージディスプレイ選択：各トラックは４つのサイクルを含み、合計１７の並行トラックで選択を実施した。選択トラックは、表１１に概説されているように、標的濃度、選択時間及び洗浄条件が異なっていた。
【０１８５】
潜在的な結合剤の配列決定：ランダムに選択されたクローンの配列決定を行った。それぞれ個々のＺ変異体には、実施例１に記載のように、識別番号Ｚ＃＃＃＃＃が与えられた。合計７０７個の新規ユニークなＺ変異体分子が同定された。５８残基長のＺ変異体のアミノ酸配列を図１及び配列番号１〜６、配列番号８〜１４、配列番号９０〜１５０及び配列番号８７２〜１５０２として配列表に列挙されている。推定ＩＬ−６結合モチーフ（ＢＭ）は、各配列の８位から３６位に伸びる。これらのＺ変異体の各々（ＢＭｏｄ）内の完全な３ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列は、７位から５５位まで伸びる。
【０１８６】
Ｚ変異体のＥＬＩＳＡスクリーニング：４つの選択サイクル後に得られたクローンを９６ウェルプレートで産生し、ＥＬＩＳＡを用いてヒトＩＬ−６結合活性についてスクリーニングした。全ての無作為に選択されたクローンを分析した。７０７個のユニークなＺ変異体のうち７０５個は、陰性対照の３倍又は０．２５ｎＭの濃度のｈＩＬ−６に対する応答（０．３〜２．３ＡＵ）を与えることが見出された。全ての選択トラックに由来するクローンについて陽性シグナルが示された。プレート上の陰性対照の平均応答は０．０８５ＡＵであった。
【０１８７】
ＩＬ−６結合剤のＥＬＩＳＡ  ＥＣ５０分析：Ｚ変異体のサブセットを、上記のＥＬＩＳＡ実験の結果に基づいて選択した。各プレート上のデュプリケート陽性対照Ｚ０６８１４（配列番号１５１２）の平均応答に対する応答を標準化した後、１．６ＡＵを超える吸光度又は１．７を超える応答を示すＺ変異体の全てを、実施例４に記載のようにＥＬＩＳＡフォーマットで標的滴定に供した。成熟した結合剤Ｚ１１６３２（配列番号７）並びに主要な結合剤Ｚ０６８１４（配列番号１５１２）を有するペリプラズムサンプルも陽性対照としてアッセイした。得られた値を分析し、それぞれのＥＣ５０値を計算した（表１２）。
【０１８８】
【表１２】
0006678661.tif 000017
【０１８９】
実施例７
ＩＬ−６結合Ｚ変異体のサブセットのサブクローニング、生産及び特性決定
【０１９０】
この実施例では、親和性成熟ＩＬ−６結合Ｚ変異体のサブセットを作製し、ＳＰＲ、ＥＬＩＳＡ、細胞ベースのアッセイ及びＣＤによって機能的に評価した。ＳＰＲは、ＩＬ−６と相互作用するＺ変異体の動態パラメータを測定するために使用した。競合ＥＬＩＳＡを、ヒトＩＬ−６タンパク質に対するＺ変異体の結合様式を調べるために適用した。ＴＦ−１細胞に基づくアッセイを適用して、ＩＬ−６依存性シグナル伝達を阻害するＺ変異体の能力を評価した。ＣＤを使用して、Ｚ変異体の二次構造を調べ、それらの融解温度を決定した。
【０１９１】
材料及び方法
Ｚ変異体の発現ベクターへのサブクローニング：１４のＩＬ−６結合Ｚ変異体、Ｚ１１６３２（配列番号７）、Ｚ１４６３０（配列番号６）、Ｚ１４７００（配列番号８）、Ｚ１４７１２（配列番号９）、Ｚ１４８６１（配列番号４）、Ｚ１４８６２（配列番号１０）、Ｚ１４９７６（配列番号１）、Ｚ１４９８４（配列番号５）、Ｚ１５０１５（配列番号２）、Ｚ１５０３６（配列番号１１）、Ｚ１５１１０（配列番号１２）、Ｚ１５１２２（配列番号３）、Ｚ１５１２６（配列番号１３）及びＺ１５１４２（配列番号１４）のＤＮＡは、ベクターｐＡＹ０２５９２から増幅した。サブクローニングを実施例２に記載のように実施した。Ｚ遺伝子フラグメントを発現ベクターｐＡＹ０１４４８にサブクローニングし、コードされた配列ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＬＱ−［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＶＤを得た。
【０１９２】
変性条件下でのタンパク質の発現及び精製：各ＩＬ−６結合Ｚ変異体の遺伝子フラグメントを含むプラスミドを用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒｏｓｅｔｔａ細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）を形質転換し、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを補充した１００ｍｌのＴＳＢ−ＹＥ培地中で３７℃にて培養した。ＯＤ600＝０．８で最終濃度１ｍＭにてＩＰＴＧを添加することにより発現を誘導し、培養物を２５℃でさらに１６〜２０時間インキュベートした。遠心分離により細胞を回収した。
【０１９３】
タンパク質精製は、本質的に実施例２に記載したような変性条件下で行った。タンパク質濃度は、それぞれのタンパク質の吸光係数を用いて２８０ｎｍでの吸光度を測定することによって決定した。ＩＬ−６結合Ｚ変異体の純度を、クーマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０１９４】
天然の条件下でのタンパク質発現及び精製：主要なＺ変異体Ｚ０６８１４（配列番号１５１２）並びに対照Ｚ変異体Ｚ０４７２６（配列番号１５５３）の成熟変異体Ｚ１１６３２（配列番号７）、Ｚ１４６３０（配列番号６）、Ｚ１４７００（配列番号８）、Ｚ１４７１２（配列番号９）、Ｚ１４８６１（配列番号４）、Ｚ１４８６２（配列番号１０）、Ｚ１４９７６（配列番号１）、Ｚ１４９８４（配列番号５）、Ｚ１５０１５（配列番号２）、Ｚ１５０３６（配列番号１１）、Ｚ１５１１０（配列番号１２）、Ｚ１５１２２（配列番号３）、Ｚ１５１４２（配列番号１４）の遺伝子フラグメントを含むプラスミドで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（ＮＥＢ、カタログ番号Ｃ２５２７Ｉ）に形質転換した。形質転換された細菌細胞を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補充した１０００ｍｌのＬＢ培地中、３７℃で培養した。タンパク質発現を誘導するために、ＯＤ600＝０．８でＩＰＴＧを０．１ｍＭの最終濃度まで加え、培養物を２５℃で１７時間インキュベートした。４℃及び８０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することにより細胞を回収した。上清を捨て、細胞ペレットを１０ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。超音波処理による細胞破壊の後、遠心分離によって細胞破片を除去し、各上清を、２０ｍｌの洗浄緩衝液（２０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール，ｐＨ６．０）で平衡化した２ｍｌのＮｉ−ＮＴＡカラム（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号３０４１０）イミダゾール、ｐＨ６．０）に適用した。汚染物を洗浄緩衝液で洗浄することにより除去し、Ｚ変異体を溶出緩衝液（２０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ６．０）で溶出した。溶出液をイオン交換カラム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号４４８１３１７）で精製し、Ｚ変異体を塩濃度の増加によって溶出させた。次いで、ＶＩＶＡＳＰＩＮ６カラム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、カタログ番号ＶＳ０６９１）を用いて、溶出液の緩衝液溶液をＰＢＳ（１０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、１．８ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ）に交換した。Ｚ変異体の純度を、クーマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０１９５】
ＰｒｏｔｅＯｎ動態分析：ヒトＩＬ−６の動態定数（ｋon及びｋoff）及び親和性（ＫD）を、変性条件下で精製した６つのＨｉｓ6タグ付きＺ変異体について決定した。ＩＬ−６結合変異体Ｚ０６８１４（配列番号１５１２）、Ｚ１４８６１（配列番号４）、Ｚ０１４９７６（配列番号１）、Ｚ１４９８４（配列番号５）、Ｚ１５０１５（配列番号２）、及びＺ１５１２２（配列番号３）を、１０ｍＭ  ＮａＡｃ緩衝液，ｐＨ４．５中で５μｇ／ｍｌに希釈し、ＧＬＣチップ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カタログ番号１７６−５０１１）に別々に固定した。製造元の推奨に従ってアミンカップリング化学を用いて固定し、ランニング緩衝液として０．０５％ＰＢＳＴを使用した。６０μｌ／分である流速を使用する動態実験において、ランニング緩衝液としてＰＢＳＴ０．０５％も使用した。分析物ｈＩＬ−６を、最終濃度５０ｎＭ、１２．５ｎＭ、３．１ｎＭ、０．７８ｎＭ、０．１９ｎＭ及び０ｎＭになるように０．０５％ＰＢＳＴランニング緩衝液で希釈し、３分間にトリプリケートで注入し、続いてランニング緩衝液で９０分間、解離させた。解離後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を補充したＨＣｌで表面を再生した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｍａｎａｇｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の１：１モデルを用いてセンサーグラムから動態定数を計算した。
【０１９６】
結合部位の分析：ヒトｇｐ１３０（ｈｇｐ１３０）とｈＩＬ−６／ｈＩＬ−６Ｒαの間の相互作用を有する１４の成熟ＩＬ−６結合Ｚ変異体（変性条件下で精製）の干渉を、実施例２に記載のように評価した。Ｚ０６８１４及びｈＩＬ−６Ｒα結合抗体トシリズマブを比較のために含めた。
【０１９７】
ＴＦ−１細胞ベースアッセイ：ＴＦ−１細胞を、１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３０９１９．０３）、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（ＨｙＣｌｏｎｅ、カタログ番号１５１４０−１６３）、及び２ｎｇ／ｍｌのｒｈＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２１５−ＧＭ−０１０）を添加した、Ｌ−グルタミン（ＨｙＣｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３００２７）を有するＲＰＭＩ１６４０中で培養した。使用前に、ｒｈＧＭ−ＣＳＦの非存在下でＲＰＭＩ−１６４０中で細胞を２回洗浄した。次いで、細胞を計数し、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５９６）中に４×１０4細胞／ウェルの密度で分注した。別個のプレートにおいて、Ｚ変異体（非変性条件下で精製された）、トシリズマブ（Ｒｏｃｈｅ）及び対照ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号Ｊａｃ−００９−０００−００３）の連続希釈物（濃度範囲１０〜０．０００６１ｎＭ）を、０．０９９ｎＭのｒｈＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２０６−ＩＬ／ＣＦ）の存在下で培養した。次に、これらのプレ混合物を、ＴＦ−１細胞を含むウェルに移し、３７℃、加湿５％ＣＯ2雰囲気下で７２時間インキュベートした。インキュベーションの最後の４時間の間に、ウェル当たり１０μｌのＷＳＴ（ＤｏＧｅｎ、カタログ番号ＥＺ３０００）をウェルに含めた。Ｖｉｃｔｏｒ  Ｘ３プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて４５０ｎＭで吸光度を測定した。各ウェルの吸光度を各プレート中のＩＬ−６処理ウェルの平均吸光度で割ることにより、相対的な細胞生存率を計算した。データは、４パラメータ用量反応曲線に対して非線形回帰によって評価し、最大半阻害濃度（ＩＣ５０）はＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて測定した。
【０１９８】
ＣＤ分析：ＣＤ分析は、非変性条件下で精製されたＺ変異体を用いて実施例２に記載のように実施した。
【０１９９】
結果
ＰｒｏｔｅＯｎ動態分析：６つのＨｉｓ6タグ化ＩＬ−６結合Ｚ変異体とヒトＩＬ−６との相互作用を、異なる固定化Ｚ変異体を含む表面上で様々な濃度のｈＩＬ−６を注入することによりＰｒｏｔｅＯｎ装置で分析した。表面のリガンド固定化レベルは、それぞれ１００〜２２０ＲＵであった。１：１相互作用モデルを用いたｈＩＬ−６のＺ変異体への結合に関する速度論的パラメータ（ＫD、ｋa（ｋon）及びｋd（ｋoff））の概要を表１３に示す。
【０２００】
【表１３】
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【０２０１】
結合部位の分析：全ての成熟ＩＬ−６結合Ｚ変異体は、予め形成したｈＩＬ−６／ｈＩＬ−６Ｒαとｈｇｐ１３０との間のトランスシグナル伝達に似た相互作用の明確な濃度依存的阻害を示した（図５）。各成熟Ｚ変異体は、主要な結合剤Ｚ０６８１４及びトシリズマブよりも高い阻害能を示した。すなわち、それは、１．６ｎＭ未満のＩＣ５０値に相当する。
【０２０２】
ＴＦ−１細胞に基づくアッセイ：ＴＦ−１細胞に基づくアッセイを実施して、古典的なシグナル伝達経路におけるＩＬ−６結合Ｚ変異体の有効性及び効力を評価した。このアッセイは、全ての親和性成熟ＩＬ−６結合Ｚ変異体がＴＦ−１細胞のＩＬ−６依存性増殖を阻止できることを示した（図６）。Ｚ変異体及びｈＩＬ−６Ｒα結合抗体トシリズマブについての計算されたＩＣ５０値を表１４に示す。
【０２０３】
【表１４】
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【０２０４】
ＣＤ分析：１０個の成熟Ｚ変異体について決定されたＣＤスペクトルは、それぞれが２０℃でα−ヘリックス構造を有することを示した。可変温度測定によって決定された融解温度（Ｔｍ）を表１５に示す。
【０２０５】
【表１５】
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【０２０６】
実施例８
ＡＢＤとの融合におけるＩＬ−６結合Ｚ変異体のインビボ活性
【０２０７】
ＡＢＤとの融合におけるＩＬ−６結合Ｚ変異体のインビボでの阻害効果を探索するために、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）マウスモデルを使用した。急性期タンパク質ＳＡＡは、肝細胞から分泌され、炎症誘発性サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−６及びＴＮＦによって誘導され得る。ヒト及びマウスサイトカインの配列相同性のために、ヒト変異体は、対応するマウス受容体に作用し、マウスＳＡＡ応答を誘導することができる。ヒトＴＮＦタンパク質はマウスＴＮＦＲＩＩ（マウスＴＮＦＲＩではない）とのみ相互作用することができることに留意されたい。
【０２０８】
材料及び方法
ＩＬ−６標的Ｚ変異体Ｚ０６８１４（配列番号１５１２）及び無関係の標的に結合する対照Ｚ変異体Ｚ０４７２６（配列番号１５３５）をクローニングし、実施例２に記載のように、ＡＢＤ変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）と融合させた。Ｂａｌｂ／ｃマウスの４つの群（ｎ＝８）に、５μｇ／ｋｇのｈＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の腹腔内（ｉｐ）投与９時間後に、Ｚ０６８１４−ＡＢＤを様々な用量（０，０．０２５，２．５又は２５ｍｇ／ｋｇ体重）を皮下（ｓｃ）に注射した。第５群のマウス（ｎ＝８）は、２５ｍｇ／ｋｇのＺ０４７２６−ＡＢＤを受けた。マウスの２つのさらなる対照群は、それぞれＰＢＳ（ｎ＝４）及び２５ｍｇ／ｋｇのＺ０６８１４−ＡＢＤ（ｎ＝８）を受けたが、その後ＩＬ−６注射はしなかった。２０時間後、血液を心穿刺により採取し、血清を採取した。
【０２０９】
ＥＬＩＳＡ（Ｔｒｉｄｅｌｔａ）によるマウスＳＡＡの含有量について、製造元の指示に従って血清を評価した。簡単に説明すると、希釈した血清サンプルを抗ＳＡＡ−ＨＲＰとともにＳＡＡ−プレコートプレートに添加した。プレートを１時間インキュベートし、次いで４回洗浄した。ＴＭＢ基質を２０分間添加し、停止溶液で反応を停止させた。吸光度は、マイクロプレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ3、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて４５０ｎｍで測定した。
【０２１０】
結果
Ｚ変異体Ｚ０６８１４（配列番号１５１２）の抗関節炎効果を、ＩＬ−６誘発血清アミロイド−Ａ（ＳＡＡ）タンパク質放出をマウスモデルを用いて、インビボで評価した。４群のマウスに、５μｇ／ｋｇ体重のｈＩＬ−６を注射する９時間前に、０、０．０２５、２．５又は２５ｍｇ／ｋｇ体重のＩＬ−６結合Ｚ０６８１４−ＡＢＤ融合タンパク質又は２５ｍｇ／ｋｇの対照Ｚ０４７２６−ＡＢＤ融合タンパク質を与えた。さらに２２時間後、ＳＡＡタンパク質のレベルを測定し、異なる群間で比較した。Ｚ０６８１４−ＡＢＤ無し又は２５ｍｇ／ｋｇの対照Ｚ０４７２６−ＡＢＤ融合物を投与していない動物では、血清中のＳＡＡタンパク質レベルは約５００〜６００μｇ／ｍｌのレベルまで増加した。ＰＢＳのみ（及びｈＩＬ−６なし）を与えた対照動物は、１６〜６４μｇ／ｍｌの範囲のレベルを示した。Ｚ０６８１４−ＡＢＤを与えられた動物では、有意に低いＳＡＡタンパク質レベルが用量依存的に測定された（図７）。最も高い用量のＺ０６８１４−ＡＢＤ（２５ｍｇ／ｋｇ体重）を与えられた群では、ＳＡＡタンパク質レベルは、ｈＩＬ−６注射されていない動物ほど低かった。
【０２１１】
実施例９
複合体及び対照ポリペプチドの産生
【０２１２】
材料及び方法
抗体及び複合体の生成：ＩＬ−６及びＴＮＦを標的とする４つの異なる複合体、並びにＴＮＦに対する親和性を有する抗体を構築した。市販のモノクローナル抗体アダリムマブと同じＣＤＲ配列及び特異性を有する「Ａｄａ」と称する抗体を、重鎖（ＨC）及び軽鎖（ＬC）配列ＨＣAda（配列番号１５５７）及びＬＣAda（配列番号１５５８）を用いて構築した。ＶＤの代わりにアミノ酸残基ＡＥで始まり、追加のＣ末端アミノ酸残基ＶＤを有する、ＩＬ−６標的Ｚ変異体Ｚ０６８１４（配列番号１５１２）部分は、柔軟な１５残基（ＧＧＧＧＳ）3を介し、ＨＣAda又はＬＣAdaのＮ末端に遺伝的に融合し、それぞれＺ０６８１４−ＨＣAda及びＺ０６８１４−ＬＣAdaと表される複合体、又は同じ鎖のＣ末端に融合し、複合体ＨＣAda−Ｚ０６８１４及びＬＣAda−Ｚ０６８１４が得られる。遺伝子合成、クローニング、ＣＨＯ細胞における一過性遺伝子発現による産生及びプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いる精製は、Ｅｖｉｔｒｉａ  ＡＧ（スイス）によって実施した。複合体及びＡｄａの純度は、非還元条件下及び還元条件下の両方でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。１５μｇの各変異体を１２ウェル４−１２％ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にロードした。
【０２１３】
対照ポリペプチドの産生：Ｎ末端Ｈｉｓ6を有する、ＩＬ−６結合Ｚ変異体Ｚ０６８１４（配列番号１５１２）及び無関係の標的に結合するＺ変異体であるＺ０４７２６（配列番号１５５３）を構築するためのサブクローニング戦略は、標準的な分子生物学技術（本質的に、別の標的に結合するＺ変異体に関する国際公開第２００９／０７７１７５号に詳細に記載されているように）を用いて適用した。Ｚ遺伝子フラグメントを発現ベクターｐＡＹ０１４４８にサブクローニングし、コードされた配列ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＬＱ−［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＶＤを得た。
【０２１４】
Ｚ０６８１４はまた、アルブミン結合ドメイン変異体ＰＰ０１３（配列番号１５５４）との融合においてサブクローニングされた。発現ベクターによってコードされた構築物は、ＭＧＳＳＬＱ−［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＶＤＧＳ−ＰＰ０１３であった。
【０２１５】
各Ｚ変異体の遺伝子フラグメントを含むプラスミドを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）を形質転換し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補充したＴＳＢ−ＹＥ培地中で３７℃にて培養した。ＩＰＴＧを用いてタンパク質発現を誘導した。ペレット化した細胞を超音波処理により破壊し、遠心分離により細胞破片を除去した。Ｈｉｓ6タグ付きタンパク質又はＡＢＤ融合タンパク質を含む各上清を、ＧｒａｖｉＴｒａｐ  ＩＭＡＣカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１１−００３３−９９）又は抗ＡＢＤアガロース（国際公開第２０１４／０６４２３７号）をそれぞれ用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。ＡＢＤ融合Ｚ変異体はまた、１ｍｌのＤｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ除去カラム（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号２０３４４）で精製した。次に、精製されたＺ変異体について、緩衝液をＰＢＳ（１０ｍＭリン酸、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）に交換した。各サンプルの純度を、クーマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、ＬＣ／ＭＳ分析を用いて、それぞれ精製した対照Ｚ変異体の同一性を確認した。
【０２１６】
結果
複合体構築物の作製：４つの異なる産生複合体の各設計の模式図を図８に示す。作製された構築物を含むサンプルの非還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析は、それらが高純度であることを示した。還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、Ｚ変異体の抗体鎖への融合部位と一致する個々のサブユニットの予想されるサイズを確認した（図９）。
【０２１７】
対照ポリペプチドの産生：Ｎ末端のＨｉｓ6タグ又はＣ末端のＡＢＤ変異体ＰＰ０１３と共に構築された対照ポリペプチドを大腸菌で産生させた。各最終タンパク質調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析が高純度を示し、各対照Ｚ変異体の正確な同一性及び分子量がＨＰＬＣ−ＭＳ分析によって確認された。
【０２１８】
実施例１０
ＩＬ−６及びＴＮＦに結合する複合体の親和性の決定
【０２１９】
材料及び方法
複合体Ｚ０６８１４−ＨＣAda及びＬＣAda−Ｚ０６８１４、並びにＡｄａ及びＨｉｓ6−Ｚ０６８１４の各１０μｇ／ｍｌ溶液、すなわち各融合パートナーのみを１０ｍＭ  ＮａＡｃ  ｐＨ４．５緩衝液中で調製し、アミンカップリング化学反応を介して、Ｐｒｏｔｅｏｎ  ＧＬＣチップ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上に該タンパク質を固定するために使用した。得られた固定化レベルは、２つの複合体及びＡｄａについては〜１４００〜２０００ＲＵであり、Ｈｉｓ6−Ｚ０６８１４については１００〜２００ＲＵであった。一連の５０ｎＭ、１０ｎＭ、２ｎＭ、０．４ｎＭ及び０．０８ｎＭ濃度のｒｈＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を注入し、応答を記録した。この実験を３回繰り返した。
【０２２０】
別のトリプリケート実験では、ＴＮＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を同じ濃度系列で注入した。全ての場合において、注入の持続時間は、流速６０μｌ／分で３分であり、解離時間は３０分であった。活性化／非活性化スポット又はスポット領域の間で得られた緩衝液応答レベルを、製造業者の指示に従って差し引いた。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｍａｎａｇｅｒソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を用いてデータを分析した。
【０２２１】
結果
２つの標的タンパク質ＩＬ−６及びＴＮＦに対する親和性は、複合体Ｚ０６８１４−ＨＣAda及びＬＣAda−Ｚ０６８１４並びに個々のサブユニットＡｄａ及びＺ０６８１４単独について測定した。ＩＬ−６及びＴＮＦとの相互作用の動態パラメータ（（ＫD、ｋa（ｋon）及びｋd（ｋoff））をそれぞれ表１６及び１７に要約する。
【０２２２】
【表１６】
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【０２２３】
【表１７】
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【０２２４】
ＴＮＦと産生したＡｄａ構築物との相互作用に関する解離定数ＫDは、２２０ｐＭであると決定された。Ｚ０６８１４−ＨＣAda及びＬＣAda−Ｚ０６８１４複合体について、ＴＮＦに対する観察されたＫD値は、それぞれ１７０ｐＭ及び１３０ｐＭであった。これは、Ｚ変異体の抗体Ａｄａへの融合は、ＴＮＦに対する抗体の親和性にネガティブに影響しないことを示す；むしろ、幾分高い親和性が観察された。ＩＬ−６への結合について分析した場合、複合体Ｚ０６８１４−ＨＣAda及びＬＣAda−Ｚ０６８１４の親和性は、Ｈｉｓ6−Ｚ０６８１４単独の親和性とわずかに異なっていた。
【０２２５】
実施例１１
インビトロでの生物学的活性の分析
【０２２６】
実施例９に記載のように構築され、産生された４つの異なる複合体の変異体の効力を、ＴＦ−１細胞アッセイを使用して決定し、古典的なシグナル伝達経路を評価した。ＴＦ−１細胞株は、ヒトＩＬ−６、ＴＮＦ及びＧＭ−ＣＳＦに応答して増殖する。ｇｐ１３０と呼ばれるシグナル伝達受容体サブユニットと併せて、細胞表面ＩＬ−６受容体に対するＩＬ−６のこの直接的なシグナル伝達は、シスシグナリングと呼ばれる。ＴＦ−１細胞を、ＩＬ−６又はＴＮＦ単独のいずれか又は両方を組み合わせて刺激した。
【０２２７】
材料及び方法
ＴＦ−１細胞を、１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（Ｌｏｎｚａ）及び２ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加したＬ−ｇｌｕｔ（Ｌｏｎｚａ）を含むＲＰＭＩ１６４０中で培養した。使用前に、細胞をｒｈＧＭ−ＣＳＦの非存在下でＲＰＭＩ１６４０中にて２回洗浄した。次いで細胞を計数し、１ウェルあたり４×１０4細胞の密度で９６ウェル平底プレートに分注した。別々のプレートにおいて、複合体Ｚ０６８１４−ＨＣAda、Ｚ０６８１４−ＬＣAda、ＨＣAda−Ｚ０６８１４及びＬＣAda−Ｚ０６８１４の連続希釈物（４００〜０．００４ｎＭ又は１０〜０．００００１ｎＭのいずれかの範囲）；Ｎ末端Ｈｉｓ6タグを有する陰性対照ポリペプチドＺ０４７２６（配列番号１５５３）；陽性対照ポリペプチドＺ０６８１４−ＡＢＤ及びＡｄａ、及びＡｄａとＺ０６８１４−ＡＢＤとの混合物を調製した。サンプルを、０．０９９ｎＭ  ｒｈＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２０６−ＩＬ／ＣＦ）、０．０２３ｎＭ  ｒｈＴＮＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２１０−ＴＡ）又は両方のサイトカインの組み合わせのいずれかの存在下でインキュベートした。プレ混合物を、ＴＦ−１細胞を含むウェルに移し、３７℃、加湿５％ＣＯ2雰囲気下で７２時間インキュベートした。インキュベーションの最後の４時間の間に、１０μｌのＣＣＫ−８（Ｆｌｕｋａ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）をウェルごとに添加して、増殖細胞の数を決定した。吸光度は、マイクロプレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ3、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて４５０ｎｍ（Ａｂｓ４５０）で測定した。細胞増殖に関するデータを、４パラメータの用量反応曲線に対する非線形回帰によって評価し、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍプログラムを用いて半最大阻害濃度（ＩＣ５０）を決定した。阻害分子によるＴＦ−１細胞のＩＬ−６／ＴＮＦ依存増殖の阻害は、Ａｂｓ４５０から、細胞を含むがＩＬ−６を含んでいない対照ウェルを除算したものであった。
【０２２８】
結果
第１セットの実験では、ＴＦ−１細胞のｈＩＬ−６又はＴＮＦ依存性増殖のいずれかを阻害する４つの異なる複合体Ｚ０６８１４−ＨＣAda、Ｚ０６８１４−ＬＣAda、ＨＣAda−Ｚ０６８１４及びＬＣAda−Ｚ０６８１４の能力を試験した。対照として、Ａｄａ及びＺ０６８１４−ＡＢＤのみを含んだ。ＩＬ−６阻害試験では、４つの複合体並びにＺ０６８１４−ＡＢＤ構築物の全てが、０．１〜１ｎＭの範囲で推定されるＩＣ５０値を有する増殖阻害能力を示した。予想通り、このアッセイでは、ＴＮＦ標的Ａｄａは効果を示さなかった（図１０Ａ）。
【０２２９】
細胞を刺激するためにＴＮＦを使用した実験では、４つ全てのＡｄａベース複合体及びＡｄａそれ自体が、増殖刺激性ＴＮＦシグナルの有効な阻害を示し、全て約１０ｐＭのＩＣ５０値を示した（図１０Ｂ）。予想通り、ＩＬ−６を標的とするがＴＮＦを標的としないＺ０６８１４−ＡＢＤは、このアッセイにおいていかなる効果も示さなかった。
【０２３０】
第２の組の実験では、ＴＦ−１細胞をＩＬ−６及びＴＮＦの両方で同時に刺激した。４つの異なる複合体のそれぞれの阻害効果を調べて、Ａｄａ、Ｚ０６８１４−ＡＢＤ、並びに、Ａｄａ及びＺ０６８１４−ＡＢＤの１：２の混合物（すなわち、結合部分の数に関して等モル濃度）と比較した。結果は、４つの複合体全てが、Ａｄａ又はＺ０６８１４−ＡＢＤ単独よりもＴＦ１細胞増殖をより良好に阻害することを示した（図１０Ｃ）。個々に添加した場合、Ａｄａ及びＺ０６８１４−ＡＢＤの両方が、最も高い濃度で５０％生存率に達する増殖阻害効果を示し、ＩＬ−６及びＴＮＦとほぼ等しい細胞増殖刺激効果が得られたことを示唆した。Ａｄａ及びＺ０６８１４−ＡＢＤの１：２の混合物を添加すると、細胞増殖の完全な阻害が観察され、協同的阻害効果が示唆された。Ｚ０６８１４−ＨＣAda複合体についても同様の効果が観察され、その成分は両方とも機能的であり、ＴＦ−１細胞増殖を独立して阻害することができることが示された。無関係の標的に結合する陰性対照Ｚ変異体、Ｈｉｓ6−Ｚ０４７２６では効果が見られなかった（図１０Ｃ）。
【０２３１】
実施例１２
インビボにおける生物学的活性の解析
【０２３２】
血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）マウスモデルをインビボでＺ０６８１４−ＨＣAdaの炎症阻害効果を研究するために使用した。急性期タンパク質ＳＡＡは、肝細胞から分泌され、プロ炎症誘発性サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−６及びＴＮＦによって誘導され得る。ヒトサイトカインとマウスサイトカインとの間の配列相同性が高いため、ヒト変異体は、対応するマウスレセプターに作用し、マウスＳＡＡ応答を誘導することができる。しかし、ヒトＴＮＦタンパク質はマウスＴＮＦ受容体ＩＩ（ＴＮＦＲＩＩ）とのみ相互作用することができ、マウスＴＮＦ受容体Ｉ（ＴＮＦＲＩ）とは相互作用しない。
【０２３３】
材料及び方法
７群のＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝６）に、７０、７、０．７又は０（ビヒクル）ｍｇ／ｋｇのＺ０６８１４−ＨＣAda又はＡｄａを腹腔内（ｉ．ｐ．）に注射した。注射は、ｒｈＩＬ−６及びｒｈＴＮＦの混合物（それぞれ２．５μｇ／ｋｇ）で腹腔内注射の９時間前に投与した。１６時間後、眼窩穿刺により採血し、血清を採取した。採取した血清を製造者の指示に従ってＥＬＩＳＡ（Ｔｒｉｄｅｌｔａ、カタログ番号ＫＭＡ００２１）によりマウスＳＡＡ含量を評価した。簡潔述べると、希釈した血清サンプルを抗ＳＡＡ−ＨＲＰとともにＳＡＡでプレコートしたプレートに添加した。プレートを１時間インキュベートし、次いで４回洗浄した。ＴＭＢ基質を加え、２０分後に停止溶液で反応を停止させた。吸光度は、マイクロプレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ3、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて４５０ｎｍで測定した。
【０２３４】
結果
ＩＬ−６誘発血清アミロイド−Ａ（ＳＡＡ）タンパク質放出のマウスモデルを用いて、Ｚ０６８１４−ＨＣAdaの抗関節炎効果をインビボで評価した。この結果は、高用量（７０ｍｇ／ｋｇ）のＴＮＦ阻害抗体Ａｄａ単独では観察された血清ＳＡＡレベルが５０％低下したが、同じ用量のＺ０６８１４−ＨＣAdaは、使用した試験キットの定量限界（ＬＯＱ）よりも低い濃度まで血清ＳＡＡレベルを減少したことを示す（図１１）。このことは、１分子中のＩＬ−６シグナル伝達阻害ポリペプチドＺ０６８１４とＴＮＦ阻害Ａｄａ抗体との組み合わせが、二重作用が可能な複合体をもたらし、従ってＩＬ−６及びＴＮＦ曝露の両方に対して治療軽減をもたらすことを示唆する。
【０２３５】
実施例１３
ＩＬ−６及びＴＮＦを標的とする成熟複合体の産生及び結合活性
【０２３６】
材料及び方法
ＩＬ−６及びＴＮＦ標的複合体の産生：ＩＬ−６及びＴＮＦを標的とする３つの異なる複合体を構築した。市販のモノクローナル抗体アダリムマブと同じＣＤＲ配列及び特異性を有する「Ａｄａ２」と称される抗体を、重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）配列ＨＣ２Ada（配列番号１５５９）及びＬＣAda（配列番号１５５９）を用いて構築した。ＶＤの代わりにアミノ酸残基ＡＥで始まるＩＬ−６標的Ｚ変異体Ｚ１４９７６（配列番号１）部分は、柔軟な５残基（ＧＧＧＧＳ）又は１５残基（ＧＧＧＧＳ）3リンカーをＬＣAdaのＮ末端へ介して遺伝的に融合して、それぞれＺ１４９７６−（ＧＧＧＧＳ）−ＬＣAda及びＺ１４９７６−（ＧＧＧＧＳ）3−ＬＣAdaと表示される複合体が得られる、又は、ＬＣAdaのＣ末端に対して柔軟な５残基（ＧＧＧＧＳ）リンカーを介して遺伝的に融合して、ＬＣAda−（ＧＧＧＧＳ）−Ｚ１４９７６と表示される複合体が得られる。重鎖及びＺ変異体融合軽鎖構築物をそれぞれｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はｐＯｐｔｉＶＥＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。ＣＨＯ−Ｓシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＩＬ−６及びＴＮＦ標的化複合体を生成し、プロテインＡクロマトグラフィー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１７−１２７９−０１）を用いて精製した。複合体の純度を非還元（６％アクリルアミドゲル）及び還元条件（１２％アクリルアミドゲル）の両方でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０２３７】
ＥＬＩＳＡ結合活性：ＴＮＦ及びＩＬ−６標的複合体の結合をＥＬＩＳＡアッセイで分析した。ハーフエリアの９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ緩衝液中の０．５μｇ／ｍｌのＴＮＦ又はＩＬ−６で一晩４℃にて直接コーティングし、３％スキムミルク／ＰＢＳ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、１．８ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4）を用いて１時間室温でブロッキングした。次に、３％スキムミルク／ＰＢＳ中にて、１μｇ／ｍｌの出発濃度から連続的に希釈した複合体及び対照抗体３０μｌを各ウェルに添加した。プレートを室温で２時間インキュベートし、続いてＰＢＳＴ  ０．０５％で４回洗浄した。ＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ二次抗体（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号３１４２３）を３％スキムミルク／ＰＢＳで１：５０００に希釈し、ウェルに加え、続いて１時間インキュベートした。上記のように洗浄した後、３０μｌのＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  ＴＭＢ基質（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号３４０１４）をウェルに添加し、プレートを製造業者の推奨に従って処理した。アダリムマブ（Ａｂｂｖｉｅ、ＬＯＴ４４３５ＸＨ０４）をＴＮＦ結合活性の陽性対照として、及び、ＩＬ−６結合活性の陰性対照として用いた。さらに、無関係のＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号Ｊａｃ−００９−０００−００３）を両方のアッセイにおいてネガティブコントロールとして含めた。
【０２３８】
結果
ＩＬ−６及びＴＮＦを標的とする複合体の産生：非還元及び還元条件下で精製した複合体のＳＤＳページ分析を図１２に示す。還元条件下で行った分析（図１２Ｂ）は、個々のサブユニットの予想されるサイズを確認した。
【０２３９】
ＥＬＩＳＡ結合活性：ＥＬＩＳＡ結合分析の結果は、全て試験した複合体、すなわち、Ｚ１４９７６−（ＧＧＧＧＳ）−ＬＣAda、Ｚ１４９７６−（ＧＧＧＧＳ）3−ＬＣAda及びＬＣAda−（ＧＧＧＧＳ）−Ｚ１４９７６に対し、ＴＮＦへの結合が維持されていることを確認した（図１３Ａ）。ＩＬ−６結合は、複合体Ｚ１４９７６−（ＧＧＧＧＳ）−ＬＣAda及びＺ１４９７６−（ＧＧＧＧＳ）3−ＬＣAdaについては維持されたが、ＬＣAda−（ＧＧＧＧＳ）−Ｚ１４９７６については保持されなかった（図１３Ｂ）。それぞれの相互作用の計算したおおよそのＥＣ５０値を表１８に示す。
【０２４０】
【表１８】
0006678661.tif 000023
【０２４１】
発明の実施の形態
【０２４２】
１．少なくとも１つのＩＬ−６結合ポリペプチド及び少なくとも１つの抗体又はその抗原結合フラグメントを含む複合体であり、前記ＩＬ−６結合ポリペプチドがＩＬ−６結合モチーフＢＭを含み、前記モチーフが：
ｉ）ＥＥＸ3Ｘ4ＡＷＸ7ＥＩＨＸ11ＬＰＮＬＸ16Ｘ17Ｘ18ＱＸ20Ｘ21ＡＦＩＸ25Ｘ26ＬＸ28Ｘ29
（式中、互いに独立して、
Ｘ3が、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｗ及びＹから選択され；
Ｘ4が、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ及びＹから選択され；
Ｘ7が、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ及びＹから選択され；
Ｘ11が、Ａ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔ及びＶから選択され；
Ｘ16が、Ｎ及びＴから選択され；
Ｘ17が、Ａ、Ｉ、Ｔ及びＶ；
Ｘ18が、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ及びＴから選択され；
Ｘ20が、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｔ及びＶから選択され；
Ｘ21が、Ａ、Ｓ、Ｔ及びＶから選択され；
Ｘ25が、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ及びＷから選択され；
Ｘ26が、Ｋ及びＳから選択され；
Ｘ28が、Ｆ、Ｌ、Ｍ及びＹから選択され；並びに、
Ｘ29が、Ｄ及びＲから選択される）
及び、
ｉｉ）ｉ）で定義された配列と少なくとも９３％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列からなる、複合体。
【０２４３】
２．項目１の複合体であり、前記配列ｉ）において：
Ｘ3が、Ａ、Ｈ、Ｋ、Ｑ、Ｒ及びＹから選択され；
Ｘ4が、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ及びＹから選択され；
Ｘ7が、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ及びＹから選択され；
Ｘ11が、Ａ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、Ｔ及びＶから選択され；
Ｘ16が、Ｔであり；
Ｘ17が、Ａ、Ｉ、Ｔ及びＶ；
Ｘ18が、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ及びＴから選択され；
Ｘ20が、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｒ及びＶから選択され；
Ｘ21が、Ａ、Ｓ及びＶから選択され；
Ｘ25が、Ｉ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ及びＷから選択され；
Ｘ26が、Ｋであり；
Ｘ28が、Ｆ、Ｌ、Ｍ及びＹから選択され；並びに、
Ｘ29が、Ｄである、
複合体。
【０２４４】
３．項目１又は２に記載の複合体であり、前記配列が、１１の条件Ｉ〜ＸＩ：
Ｉ．Ｘ3が、Ｋ及びＲから選択される；
ＩＩ．Ｘ11が、Ａ及びＬから選択される；
ＩＩＩ．Ｘ16が、Ｔである；
ＩＶ．Ｘ17が、Ｉ及びＶから選択される；
Ｖ．Ｘ18が、Ｄ及びＥから選択される；
ＶＩ．Ｘ20が、Ｍである；
ＶＩＩ．Ｘ21が、Ａである；
ＶＩＩＩ．Ｘ25が、Ｓ及びＴから選択される；
ＩＸ．Ｘ26が、Ｋである；
Ｘ．Ｘ28が、Ｆ；並びに
ＸＩ．Ｘ29が、Ｄである、
の少なくとも６つを満たす、複合体。
【０２４５】
４．前記配列ｉ）が、１１の条件Ｉ〜ＸＩの少なくとも７つを満たす、項目３に記載の複合体。
【０２４６】
５．前記配列ｉ）が、１１の条件Ｉ〜ＸＩの少なくとも８つを満たす、項目４に記載の複合体。
【０２４７】
６．前記配列ｉ）が、１１の条件Ｉ〜ＸＩの少なくとも９つを満たす、項目５に記載の複合体。
【０２４８】
７．前記配列ｉ）が、１１の条件Ｉ〜ＸＩの少なくとも１０を満たす、項目６に記載の複合体。
【０２４９】
８．前記配列ｉ）が、１１の条件Ｉ〜ＸＩの全てを満たす、項目７に記載の複合体。
【０２５０】
９．Ｘ17Ｘ20Ｘ21が、ＶＭＡ及びＩＭＡから選択される、項目１〜８のいずれか１項に記載の複合体。
【０２５１】
１０．Ｘ20Ｘ21Ｘ28が、ＭＡＦである、項目１〜８のいずれか１項に記載の複合体。
【０２５２】
１１．Ｘ17Ｘ20Ｘ28が、ＶＭＦ及びＩＭＦから選択される、項目１〜８のいずれか１項に記載の複合体。
【０２５３】
１２．Ｘ17Ｘ21Ｘ28が、ＶＡＦ及びＩＡＦから選択される、項目１〜８のいずれか１項に記載の複合体。
【０２５４】
１３．前記配列ｉ）が、配列番号１〜１５５１からなる群から選択される配列の８位から３６位の配列に相当する、項目１〜１２のいずれか１項に記載の複合体。
【０２５５】
１４．前記配列ｉ）が、配列番号１〜１５０２からなる群から選択される配列の８位から３６位の配列に相当する、項目１３に記載の複合体。
【０２５６】
１５．前記配列ｉ）が、配列番号７、配列番号１５〜８９及び配列番号１５１〜８７１からなる群から選択される配列の８位から３６位の配列に相当する、項目１４に記載の複合体。
【０２５７】
１６．前記配列ｉ）が、配列番号１〜６、配列番号８〜１４、配列番号９０〜１５０及び配列番号８７２〜１５０２からなる群から選択される配列の８位から３６位の配列に相当する、項目１４に記載の複合体。
【０２５８】
１７．前記配列ｉ）が、配列番号１〜１５２及び配列番号１５０３〜１５１５からなる群から選択される配列の８位から３６位の配列に相当する、項目１３に記載の複合体。
【０２５９】
１８．前記配列ｉ）が、配列番号１〜１５０及び配列番号１５０３〜１５１５からなる群から選択される配列の８位から３６位の配列に相当する、項目１７に記載の複合体。
【０２６０】
１９．前記配列ｉ）が、配列番号１〜１５２からなる群から選択される配列の８位から３６位の配列に相当する、項目１７に記載の複合体。
【０２６１】
２０．前記配列ｉ）が、配列番号１〜１５０からなる群から選択される配列の８位から３６位の配列に相当する、項目１８又は１９に記載の複合体。
【０２６２】
２１．前記配列ｉ）が、配列番号７、配列番号１５〜８９及び配列番号１５１〜１５２からなる群から選択される配列の８位から３６位の配列に相当する、項目１９に記載の複合体。
【０２６３】
２２．前記配列ｉ）が、配列番号１〜６、配列番号８〜１４及び配列番号９０〜１５０からなる群から選択される配列の８位から３６位の配列に相当する、項目２０に記載の複合体。
【０２６４】
２３．前記配列ｉ）が、配列番号１〜１４及び配列番号１５０３〜１５１５からなる群から選択される配列の８位から３６位の配列に相当する、項目１８に記載の複合体。
【０２６５】
２４．前記配列ｉ）が、配列番号１〜１４及び配列番号１５１２からなる群から選択される配列の８位から３６位の配列に相当する、項目２３に記載の複合体。
【０２６６】
２５．前記配列ｉ）が、配列番号１〜１４からなる群から選択される配列の８位から３６位の配列に相当する、項目２４に記載の複合体。
【０２６７】
２６．前記配列ｉ）が、配列番号１〜５からなる群から選択される配列の８位から３６位の配列に相当する、項目１６、２２及び２５のいずれか１項に記載の複合体。
【０２６８】
２７．前記配列ｉ）が、配列番号１５１２の８位から３６位の配列に相当する、項目２４に記載の複合体。
【０２６９】
２８．前記ＩＬ−６結合モチーフが、３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインの一部を形成する、項目１〜２７のいずれか１項に記載の複合体。
【０２７０】
２９．前記ＩＬ−６結合モチーフが、本質的に相互連結ループを有する２つのヘリックスの一部を形成し、前記３ヘリックスバンドルタンパク質ドメイン内に存在する、項目２８に記載の複合体。
【０２７１】
３０．前記３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインが、細菌受容体ドメインから選択される、項目２９に記載の複合体。
【０２７２】
３１．前記３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインが、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来のプロテインＡのドメイン又はその誘導体から選択される、項目３０に記載の複合体。
【０２７３】
３２．項目１〜３１のいずれか１項に記載の複合体であり、前記ＩＬ−６結合ポリペプチドが、結合モジュールＢＭｏｄを含み、前記結合モジュールＢＭｏｄのアミノ酸配列が：
ｉｉｉ）Ｋ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＸaＸbＬＬＸcＥＡＫＫＬＸdＸeＸfＱ
（式中、
［ＢＭ］は、項目１〜２７のいずれか１項に定義されるＩＬ−６結合モチーフであり、但し、Ｘ29は、Ｄであり；
Ｘaは、Ａ及びＳから選択され；
Ｘbは、Ｎ及びＥから選択され；
Ｘcは、Ａ、Ｓ及びＣから選択され；
Ｘdは、Ｅ、Ｎ及びＳから選択され；
Ｘeは、Ｄ、Ｅ及びＳから選択され；
Ｘfは、Ａ及びＳから選択される）；及び、
ｉｖ）ｉｉｉ）によって定義される配列と少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択される、複合体。
【０２７４】
３３．項目１〜３１のいずれか１項に記載の複合体であり、前記ＩＬ−６結合ポリペプチドが、結合モジュールＢＭｏｄを含み、前記結合モジュールＢＭｏｄのアミノ酸配列が：
ｖ）Ｋ−［ＢＭ］−ＱＰＥＱＳＸaＸbＬＬＸcＥＡＫＫＬＸdＸeＸfＱ
（式中、
［ＢＭ］は、項目１〜２７のいずれか１項に定義されるＩＬ−６結合モチーフであり、但し、Ｘ29は、Ｒであり；
Ｘaは、Ａ及びＳから選択され；
Ｘbは、Ｎ及びＥから選択され；
Ｘcは、Ａ、Ｓ及びＣから選択され；
Ｘdは、Ｅ、Ｎ及びＳから選択され；
Ｘeは、Ｄ、Ｅ及びＳから選択され；
Ｘfは、Ａ及びＳから選択される）；及び、
ｖｉ）ｖ）によって定義される配列と少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択される、複合体。
【０２７５】
３４．前記配列ｉｉｉ）が、配列番号１〜１５５１からなる群から選択される配列の７位から５５位の配列に相当する、項目１〜３２のいずれか１項に記載の複合体。
【０２７６】
３５．前記配列ｉｉｉ）が、配列番号１〜１５０２からなる群から選択される配列の７位から５５位の配列に相当する、項目３４に記載の複合体。
【０２７７】
３６．前記配列ｉｉｉ）が、配列番号７、配列番号１５〜８９及び配列番号１５１〜８７１からなる群から選択される配列の７位から５５位の配列に相当する、項目３５に記載の複合体。
【０２７８】
３７．前記配列ｉｉｉ）が、配列番号１〜６、配列番号８〜１４、配列番号９０〜１５０及び配列番号８７２〜１５０２からなる群から選択される配列の７位から５５位の配列に相当する、項目３５に記載の複合体。
【０２７９】
３８．前記配列ｉｉｉ）が、配列番号１〜１５２及び配列番号１５０３〜１５１５からなる群から選択される配列の７位から５５位の配列に相当する、項目３４に記載の複合体。
【０２８０】
３９．前記配列ｉｉｉ）が、配列番号１〜１５０及び配列番号１５０３〜１５１５からなる群から選択される配列の７位から５５位の配列に相当する、項目３８に記載の複合体。
【０２８１】
４０．前記配列ｉｉｉ）が、配列番号１〜１５２からなる群から選択される配列の７位から５５位の配列に相当する、項目３５又は３８に記載の複合体。
【０２８２】
４１．前記配列ｉｉｉ）が、配列番号１〜１５０からなる群から選択される配列の７位から５５位の配列に相当する、項目３９又は４０に記載の複合体。
【０２８３】
４２．前記配列ｉｉｉ）が、配列番号７、配列番号１５〜８９及び配列番号１５１〜１５２からなる群から選択される配列の７位から５５位の配列に相当する、項目４０に記載の複合体。
【０２８４】
４３．前記配列ｉｉｉ）が、配列番号１〜６、配列番号８〜１４及び配列番号９０〜１５０からなる群から選択される配列の７位から５５位の配列に相当する、項目４１に記載の複合体。
【０２８５】
４４．前記配列ｉｉｉ）が、配列番号１〜１４及び配列番号１５０３〜１５１５からなる群から選択される配列の７位から５５位の配列に相当する、項目３９に記載の複合体。
【０２８６】
４５．前記配列ｉｉｉ）が、配列番号１〜１４及び配列番号１５１２からなる群から選択される配列の７位から５５位の配列に相当する、項目４４に記載の複合体。
【０２８７】
４６．前記配列ｉｉｉ）が、配列番号１〜１４からなる群から選択される配列の７位から５５位の配列に相当する、項目４５に記載の複合体。
【０２８８】
４７．前記配列ｉｉｉ）が、配列番号１〜５からなる群から選択される配列の７位から５５位の配列に相当する、項目３６、４２及び４６のいずれか１項に記載の複合体。
【０２８９】
４８．前記配列ｉｉｉ）が、配列番号１５１２の配列の７位から５５位の配列に相当する、項目３９に記載の複合体。
【０２９０】
４９．前記ＩＬ−６結合ポリペプチドが、以下：
ｖｉｉ）ＹＡ−［ＢＭｏｄ］−ＡＰ
（式中、［ＢＭｏｄ］は、項目３２〜４８のいずれか１項に定義されるＩＬ−６結合モジュールである）；及び、
ｖｉｉｉ）ｖｉｉ）で定義される配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１〜４８のいずれか１項に記載の複合体。
【０２９１】
５０．前記ＩＬ−６結合ポリペプチドが、以下：
ｉｘ）ＦＮ−［ＢＭｏｄ］−ＡＰ
（式中、［ＢＭｏｄ］は、項目３２〜４８のいずれか１項に定義されるＩＬ−６結合モジュールである）；及び、
ｘ）ｉｘ）で定義される配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１〜４８のいずれか１項に記載の複合体。
【０２９２】
５１．ＡＤＮＮＦＮＫ-［ＢＭ］-ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＳＥＡＫＫＬＮＥＳＱＡＰＫ；
ＡＤＮＫＦＮＫ-［ＢＭ］-ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＤＮＫＦＮＫ-［ＢＭ］-ＤＰＳＶＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＤＡＱＱＮＮＦＮＫ-［ＢＭ］-ＤＰＳＱＳＴＮＶＬＧＥＡＫＫＬＮＥＳＱＡＰＫ；
ＡＱＨＤＥ-［ＢＭ］-ＤＰＳＱＳＡＮＶＬＧＥＡＱＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＶＤＮＫＦＮＫ-［ＢＭ］-ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ-［ＢＭ］-ＤＰＳＥＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＫＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ-［ＢＭ］-ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ-［ＢＭ］-ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ-［ＢＭ］-ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ-［ＢＭ］-ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ-［ＢＭ］-ＱＰＥＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ-［ＢＭ］-ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＥＳＳＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ-［ＢＭ］-ＱＰＥＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＥＳＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ-［ＢＭ］-ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ-［ＢＭ］-ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ-［ＢＭ］-ＱＰＥＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＳＥＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ-［ＢＭ］-ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＥＳＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ-［ＢＭ］-ＱＰＥＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＥＳＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ-［ＢＭ］-ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＫＡＱＡＰＫ；及び
ＡＥＡＫＹＡＫ-［ＢＭ］-ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＫＡＱＡＰＫ；
（式中、［ＢＭ］は、項目１〜２７のいずれか１項に定義されるＩＬ−６結合モチーフである）
から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１〜５０のいずれか１項に記載の複合体。
【０２９３】
５２．ｘｉ）ＶＤＡＫＹＡＫ-［ＢＭ］-ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
（式中、［ＢＭ］は、項目１〜２７のいずれか１項に定義されたＩＬ−６結合モチーフである）、及び、
ｘｉｉ）ｘｉ）で定義された配列と少なくとも８９％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１〜４９のいずれか１項に記載の複合体。
【０２９４】
５３．項目１〜４９のいずれか１項に記載の複合体であり、
ｘｉｉｉ）ＡＥＡＫＹＡＫ-［ＢＭ］-ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
（式中、［ＢＭ］は、項目１〜２７のいずれか１項に定義されたＩＬ−６結合モチーフである）、及び、
ｘｉｖ）ｘｉｉｉ）で定義した配列と少なくとも８９％の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を含む、複合体。
【０２９５】
５４．前記配列ｘｉ）が、配列番号１〜１５５１からなる群から選択される、項目５２に記載の複合体。
【０２９６】
５５．前記配列ｘｉ）が、配列番号１〜１５０２からなる群から選択される、項目５４に記載の複合体。
【０２９７】
５６．前記配列ｘｉ）が、配列番号７、配列番号１５〜８９及び配列番号１５１〜８７１からなる群から選択される、項目５５に記載の複合体。
【０２９８】
５７．前記配列ｘｉ）が、配列番号１〜６、配列番号８〜１４、配列番号９０〜１５０及び配列番号８７２〜１５０２からなる群から選択される、項目５５に記載の複合体。
【０２９９】
５８．前記配列ｘｉ）が、配列番号１〜１５２及び配列番号１５０３〜１５１５からなる群から選択される、項目５４に記載の複合体。
【０３００】
５９．前記配列ｘｉ）が、配列番号１〜１５０及び配列番号１５０３〜１５１５からなる群から選択される、項目５８に記載の複合体。
【０３０１】
６０．前記配列ｘｉ）が、配列番号１〜１５２からなる群から選択される、項目５５又は５８に記載の複合体。
【０３０２】
６１．前記配列ｘｉ）が、配列番号１〜１５０からなる群から選択される、項目５９又は６０に記載の複合体。
【０３０３】
６２．前記配列ｘｉ）が、配列番号７、配列番号１５〜８９及び配列番号１５１〜１５２からなる群から選択される、項目６０に記載の複合体。
【０３０４】
６３．前記配列ｘｉ）が、配列番号１〜６、配列番号８〜１４及び配列番号９０〜１５０からなる群から選択される、項目６１に記載の複合体。
【０３０５】
６４．前記配列ｘｉ）が、配列番号１〜１４及び配列番号１５０３〜１５１５からなる群から選択される、項目５９に記載の複合体。
【０３０６】
６５．前記配列ｘｉ）が、配列番号１〜１４及び配列番号１５１２からなる群から選択される、項目６４に記載の複合体。
【０３０７】
６６．前記配列ｘｉ）が、配列番号１〜１４からなる群から選択される、項目６５に記載の複合体。
【０３０８】
６７．前記配列ｘｉ）が、配列番号１〜５からなる群から選択される、項目５７、６３及び６６に記載の複合体。
【０３０９】
６８．前記配列ｘｉ）が、配列番号１５１２である、項目６５に記載の複合体。
【０３１０】
６９．少なくとも１つのＣ末端及び／又はＮ末端に、付加的なアミノ酸を含む、項目１〜６８のいずれか１項に記載の複合体。
【０３１１】
７０．前記付加的なアミノ酸（単数又は複数）が、前記複合体の産生、精製、インビボ若しくはインビトロでの安定化、カップリング又は検出を改善する、項目６９に記載の複合体。
【０３１２】
７１．多量体形態で前記ＩＬ−６結合ポリペプチドを含み、例えば、少なくとも２つのＩＬ−６結合ポリペプチド単量体単位を含み、そのアミノ酸配列が同じであってもよく、又は異なってもよい、項目１〜７０のいずれか１項に記載の複合体。
【０３１３】
７２．前記ＩＬ−６結合ポリペプチド単量体単位が、共に共有結合している、項目７１に記載の複合体。
【０３１４】
７３．前記ＩＬ−６結合ポリペプチド単量体単位が、融合タンパク質の形態である、項目７２に記載の複合体。
【０３１５】
７４．前記ＩＬ−６結合ポリペプチド単量体単位が、二量体の形態である、項目７３に記載の複合体。
【０３１６】
７５．前記少なくとも１つの抗体又はその抗原結合フラグメントが、全長抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆｃフラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖Ｆｖフラグメント、（ｓｃＦｖ）2及びドメイン抗体からなる群から選択される、項目１〜７４のいずれか１項に記載の複合体。
【０３１７】
７６．前記少なくとも１つの抗体又はその抗原結合フラグメントが、全長抗体、Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦｖフラグメントからなる群から選択される、項目７５に記載の複合体。
【０３１８】
７７．前記少なくとも１つの抗体又はその抗原結合フラグメントが、全長抗体である、項目７６に記載の複合体。
【０３１９】
７８．前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントである、項目７５〜７７のいずれか１項に記載の複合体。
【０３２０】
７９．前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、ヒト抗体、ヒト化抗体及びキメラ抗体、並びにその抗原結合フラグメントからなる群から選択される、項目７５〜７８のいずれか１項に記載の複合体。
【０３２１】
８０．前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、ヒト若しくはヒト化抗体、又はその抗原結合フラグメントである、項目７９に記載の複合体。
【０３２２】
８１．前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、抗原、例えば免疫系の疾患又は障害に関連する抗原又は癌に関連する抗原に対して親和性を有する、項目１〜８０のいずれか１項に記載の複合体。
【０３２３】
８２．前記抗原が、アンジオゲニン２（Ａｎｇ−２）、血管内皮増殖因子、腫瘍壊死因子、ＴＮＦＳＦ１１、ＴＮＦＳＦ１３、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４、ＴＮＦＳＦ１５、インスリン様増殖因子、インターロイキン１α、インターロイキン１β、インターロイキン１０、インターロイキン１７Ａ、インターロイキン１２、インターロイキン２３、インターロイキン３３、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、高移動度群タンパク質Ｂ１（ｈｉｇｈ−ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ１）、リポポリサッカライド、トール様受容体４、神経成長因子、ケモカインＣ−Ｃモチーフリガンド１９、ケモカインＣ−Ｃモチーフリガンド２１、ケモカインＣ−Ｘ−Ｃモチーフリガンド４及びインターフェロンαからなる群から選択される、項目８１に記載の複合体。
【０３２４】
８３．前記抗原が、インターロイキン１β、腫瘍壊死因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、インターロイキン１２、インターロイキン１７、インターロイキン２３、高移動度群タンパク質Ｂ１、リポポリサッカライド、トール様受容体４からなる群から選択される、項目８２に記載の複合体。
【０３２５】
８４．前記抗原が、例えばインターロイキン１β、腫瘍壊死因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、インターロイキン１２、インターロイキン１７及びインターロイキン２３からなる群から選択されるサイトカインである、項目８２〜８３のいずれか１項に記載の複合体。
【０３２６】
８５．前記抗原が、腫瘍壊死因子である、項目８４に記載の複合体。
【０３２７】
８６．前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、アダリムマブ、インフリキシマブ、ゴリムマブ及びセルトリズマブペゴール並びにその抗原結合フラグメント、例えば、アダリムマブ、インフリキシマブ、ゴリムマブ、及びセルトリズマブペゴールからなる群から選択される全長抗体である、項目８５に記載の複合体。
【０３２８】
８７．前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、アダリムマブ又はその抗原結合フラグメント、例えば全長アダリムマブである、項目８６に記載の複合体。
【０３２９】
８８．シス−シグナル伝達経路及び／又はトランス−シグナル伝達経路を介してＩＬ−６依存性シグナル伝達を阻害することができる、項目１〜８７のいずれか１項に記載の複合体。
【０３３０】
８９．ＩＬ−６シグナル伝達を阻害する半最大阻害濃度が最大で１×１０-6Ｍ、例えば最大で１×１０-7、例えば最大で１×１０-8Ｍ、例えば最大で１×１０-9Ｍ、例えば最大で１×１０-10Ｍである、項目８８に記載の複合体。
【０３３１】
９０．ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒαとｇｐ１３０との相互作用を阻害することができる項目８８〜８９のいずれか１項に記載の複合体。
【０３３２】
９１．相互作用のＥＣ５０値が最大で１×１０-7、例えば最大で１×１０-8Ｍ、例えば最大で１×１０-9Ｍ、例えば最大で１×１０-10ＭであるようにＩＬ−６に結合することができる、項目１〜９０のいずれか１項に記載の複合体。
【０３３３】
９２．相互作用のＫD値が最大で１×１０-8Ｍ、例えば最大で１×１０-9Ｍ、例えば最大で１×１０-10Ｍ、例えば最大で１×１０-11Ｍ、であるようにＩＬ−６に結合することができる、項目１〜９１のいずれか１項に記載の複合体。
【０３３４】
９３．ＴＮＦ依存性シグナル伝達を阻害することができる、項目１〜９２のいずれか１項に記載の複合体。
【０３３５】
９４．ＴＮＦ依存性シグナル伝達を阻害する半最大阻害濃度（ＩＣ５０）が、最大で１×１０-7Ｍ、例えば最大で１×１０-8Ｍ、例えば最大で１×１０-9Ｍ、例えば最大で１×１０-10Ｍ、例えば最大で１×１０-11Ｍである、項目９３に記載の複合体。
【０３３６】
９５．相互作用のＫD値が最大で１×１０-7Ｍ、例えば最大で１×１０-8Ｍ、例えば最大で１×１０-9Ｍ、例えば最大で１×１０-10Ｍ、例えば最大で１×１０-11Ｍ、例えば最大で１×１０-12ＭであるようにＴＮＦに結合することができる、項目１〜９４のいずれか１項に記載の複合体。
【０３３７】
９６．融合タンパク質又はコンジュゲートである、項目１〜９５のいずれか１項に記載の複合体。
【０３３８】
９７．前記ＩＬ−６結合ポリペプチドが、前記抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖のＮ末端又はＣ末端に結合している、項目１〜９６のいずれか１項に記載の複合体。
【０３３９】
９８．前記ＩＬ−６結合ポリペプチドが、前記抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖のＮ末端又はＣ末端に結合している、項目１〜９６のいずれか１項に記載の複合体。
【０３４０】
９９．前記ＩＬ−６結合ポリペプチドが、前記抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖及び重鎖のＮ末端及び／又はＣ末端に結合している、項目９７に記載の複合体。
【０３４１】
１００．融合タンパク質である、項目９６〜９９のいずれか１項に記載の複合体。
【０３４２】
１０１．少なくとも１つのリンカー、例えば、可撓性アミノ酸リンカー、剛性アミノ酸リンカー及び切断可能アミノ酸リンカーからなる群から選択されるリンカーをさらに含む、項目１００に記載の複合体。
【０３４３】
１０２．前記リンカーが、前記ＩＬ−６結合ポリペプチドと、前記抗体又はその抗原結合フラグメントとの間に配置される、項目１０１に記載の複合体。
【０３４４】
１０３．前記リンカーが、グリシン、セリン及びスレオニンからなる群から選択されるアミノ酸残基を含む可撓性リンカーである、項目１０２に記載の複合体。
【０３４５】
１０４．前記リンカーが、
（ＧnＳm）p及び（ＳmＧn）p、
［式中、独立して、
ｎ＝１〜７，
ｍ＝０〜７、
ｎ＋ｍ＜８  及び
ｐ＝１〜７である］
から選択される一般式を有する、項目１０３に記載の複合体。
【０３４６】
１０５．ｎ＝１〜５である、項目１０４に記載の複合体。
【０３４７】
１０６．ｍ＝０〜５である、項目１０４又は１０５に記載の複合体。
【０３４８】
１０７．ｐ＝１〜５である、項目１０４〜１０６のいずれか１項に記載の複合体。
【０３４９】
１０８．ｎ＝４、ｍ＝１及びｐ＝１〜４である、項目１０５〜１０７のいずれか１項に記載の複合体。
【０３５０】
１０９．前記可撓性リンカーが、（ＧＧＧＧＳ）3又はＧＧＧＧＳである、項目１０８に記載の複合体。
【０３５１】
１１０．項目１〜１０９のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードするポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【０３５２】
１１１．項目１１０に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【０３５３】
１１２．項目１１１に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【０３５４】
１１３．項目１〜１０９のいずれか１項に記載の複合体を調製する方法であり、
−前記発現ベクター由来の前記融合タンパク質の発現を許容する条件下で、項目１１２に記載の宿主細胞を培養すること、及び
−前記ポリペプチドを単離すること、
を含む、方法。
【０３５５】
１１４．項目１〜１０９のいずれか１項に記載の複合体と、少なくとも１つの医薬的に許容される賦形剤又は担体とを含む、組成物。
【０３５６】
１１５．少なくとも１つの追加の活性剤、例えば、免疫応答調節剤及び抗癌剤から選択される薬剤をさらに含む、項目１１４に記載の組成物。
【０３５７】
１１６．経口、局所、静脈内、腹腔内、皮下、肺、経皮、筋肉内、鼻腔内、頬側（ｂｕｃｃａｌ）、舌下又は坐薬投与のための項目１〜１０９のいずれか１項に記載の複合体又は項目１１４〜１１５のいずれか１項に記載の組成物。
【０３５８】
１１７．薬剤として使用するための項目１〜１０９のいずれか１項に記載の複合体又は項目１１４〜１１５のいずれか１項に記載の組成物。
【０３５９】
１１８．前記複合体又は組成物が、ＩＬ−６機能及び追加の抗原、例えばインビボでの免疫系の疾患又は障害に関連する抗原、又は癌に関連する抗原の機能を調節する、項目１１７に記載の使用のための複合体又は組成物。
【０３６０】
１１９．前記複合体又は組成物が、インビボでＩＬ−６機能及びＴＮＦ機能を調節する、項目１１８に記載の使用のための複合体又は組成物。
【０３６１】
１２０．ＩＬ−６関連障害、例えばＩＬ−６及びＴＮＦに関連する障害の治療における、項目１１７〜１１９のいずれか１項に記載の使用のための複合体又は組成物。
【０３６２】
１２１．前記ＩＬ−６関連障害が、自己免疫疾患、炎症性疾患、癌及び腫瘍性疾患からなる群から選択される、例えば慢性炎症性疾患及び炎症誘発性癌から選択されるＩＬ−６関連障害である、項目１２０に記載の使用のための複合体又は組成物。
【０３６３】
１２２．前記障害が、慢性関節リウマチ；若年性関節リウマチ；若年性特発性関節炎；全身性若年性特発性関節炎；血管炎；乾癬性関節炎；乾癬；強直性脊椎炎；慢性炎症性腸疾患、例えばクローン病及び潰瘍性大腸炎；グレーブス病；ベーチェット病；ブドウ膜炎；巨細胞性動脈炎；多発性硬化症；全身性硬化症；全身性エリテマトーデス；多発性筋炎；リウマチ性多発性筋痛症；喘息；慢性閉塞性肺疾患；再発性多発軟骨症；膵炎；腹膜炎；腎炎；川崎病、シェーグレン症候群及び成人スティル病、からなる群から選択される、項目１２１に記載の使用のための複合体又は組成物。
【０３６４】
１２３．前記障害が、癌又は腫瘍性疾患、例えば大腸炎関連癌、腎癌（ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ  ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、キャッスルマン病、乳癌及び肺癌からなる群から選択される、項目１２１に記載の使用のための複合体又は組成物。
【０３６５】
１２４．前記障害が、アルツハイマー病、ＨＩＶ、糖尿病、敗血症、悪液質、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、肝硬変、移植片対宿主病、心筋梗塞、子宮内膜症及び骨粗鬆症から選択される、項目１２１に記載の使用のための複合体又は組成物。
【０３６６】
１２５．項目１〜１０９のいずれか１項に記載の複合体又は項目１１４〜１１５のいずれか１項に記載の組成物の有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含む、ＩＬ−６関連障害の治療方法。
【０３６７】
１２６．前記障害が、ＩＬ−６及びＴＮＦに関連する疾患である、項目１２５に記載の方法。
【０３６８】
１２７．前記障害が、自己免疫疾患、炎症性疾患、癌及び腫瘍性疾患、例えば慢性炎症性疾患及び炎症誘発性癌から選択されるＩＬ−６関連疾患から選択される、項目１２５又は１２６に記載の方法。
【０３６９】
１２８．前記障害が、慢性関節リウマチ；若年性関節リウマチ；若年性特発性関節炎；全身性若年性特発性関節炎；血管炎；乾癬性関節炎；乾癬；強直性脊椎炎；慢性炎症性腸疾患、例えばクローン病及び潰瘍性大腸炎；グレーブス病；ベーチェット病；ブドウ膜炎；巨細胞性動脈炎；多発性硬化症；全身性硬化症；全身性エリテマトーデス；多発性筋炎；リウマチ性多発性筋痛症；喘息；慢性閉塞性肺疾患；再発性多発軟骨症；膵炎；腹膜炎；腎炎；川崎病、シェーグレン症候群及び成人スティル病、からなる群から選択される、項目１２７に記載の方法。
【０３７０】
１２９．前記障害が、癌又は腫瘍性疾患、例えば大腸炎関連癌、腎癌（ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ  ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、キャッスルマン病、乳癌及び肺癌からなる群から選択される、項目１２７に記載の方法。
【０３７１】
１３０．前記障害が、アルツハイマー病、ＨＩＶ、糖尿病、敗血症、悪液質、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、肝硬変、移植片対宿主病、心筋梗塞、子宮内膜症及び骨粗鬆症から選択される、項目１２７に記載の方法。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図１−１０】
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【図１−１１】
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【図１−１２】
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【図１−１３】
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【図１−１４】
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【図１−１５】
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【図１−１６】
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【図１−１７】
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【図１−１８】
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【図１−１９】
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【図１−２０】
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【図１−２１】
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【図１−２２】
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【図１−２３】
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【図１−２４】
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【図１−２５】
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【図１−２６】
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【図１−２７】
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【図１−２８】
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【図１−２９】
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【図１−３０】
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【図１−３１】
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【図１−３２】
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【図１−３３】
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【図１−３４】
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【図１−３５】
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【図１−３６】
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【図１−３７】
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【図１−３８】
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【図１−３９】
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【図１−４０】
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【図１−４１】
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【図１−４２】
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【図１−４３】
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【図１−４４】
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【図１−４５】
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【図１−４６】
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【図１−４７】
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【図１−４８】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【配列表】
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