(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２０１５年９月９日に番号Ｉ−５０１１としてＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ  −  ＣＮＣＭ）  −  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、２５ｒｕｅ  ｄｕ  ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ  Ｆ７５７２４  Ｐａｒｉｓに寄託した酵母株である株Ｓ１と、２０１５年９月９日に番号Ｉ−５０１２としてＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ  −  ＣＮＣＭ）  −  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、２５ｒｕｅ  ｄｕ  ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ  Ｆ７５７２４  Ｐａｒｉｓに寄託した酵母株である株Ｓ２をハイブリダイズすることによって得られる酵母株であって、前記酵母株は、試験Ａに従って、以下の特徴：
−  ２４℃の温度にて１５〜２２日の発酵速度、および
−  １５％ｖ／ｖ以上のアルコール度数に対する耐性、および
−  ２００ｐｐｍ以下の窒素要求
を示し、試験Ａは、２４℃の一定温度にて発酵することによって２００ｐｐｍの開始窒素濃度で２５０ｇ／ｌの発酵性糖に調節したＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｉｎｅ  ａｎｄ  Ｗｉｎｅによって標準化された合成ムスト上に２．１０６ＣＦＵ／ｍｌの量で播種した前記酵母株の発酵活性の分析に対応する、酵母株。
【請求項２】
前記株は、ブダペスト条約に従って２０１５年５月５日に番号Ｉ−４９７５としてＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ  −  ＣＮＣＭ）  −  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、２５ｒｕｅ  ｄｕ  ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ  Ｆ７５７２４  Ｐａｒｉｓに寄託した株である、請求項１に記載の酵母株。
【請求項３】
前記株は、ブダペスト条約に従って２０１５年５月５日に番号Ｉ−４９７７としてＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ  −  ＣＮＣＭ）  −  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、２５ｒｕｅ  ｄｕ  ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ  Ｆ７５７２４  Ｐａｒｉｓに寄託した株である、請求項１に記載の酵母株。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵母株から単離された酵母細胞。
【請求項５】
ワイン醸造用酵母株を得る方法であって、以下の工程：
ａ）２０１５年９月９日に番号Ｉ−５０１１としてＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ  −  ＣＮＣＭ）  −  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、２５ｒｕｅ  ｄｕ  ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ  Ｆ７５７２４  Ｐａｒｉｓに寄託した酵母株である酵母株Ｓ１と、２０１５年９月９日に番号Ｉ−５０１２としてＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ  −  ＣＮＣＭ）  −  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、２５ｒｕｅ  ｄｕ  ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ  Ｆ７５７２４  Ｐａｒｉｓに寄託した酵母株である酵母株Ｓ２をハイブリダイズする工程と、
ｂ）工程ａ）において得られた株を単離する工程と、
ｃ）工程ｂ）において単離された株を、２００ｐｐｍの開始窒素濃度で２５０ｇ／ｌの発酵性糖に調節したＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｉｎｅ  ａｎｄ  Ｗｉｎｅ［Ｏｒｇａｎｉｓｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  ｌａ  Ｖｉｇｎｅ  ｅｔ  ｄｕ  Ｖｉｎ  −  ＯＩＶ］によって標準化された合成ムスト上に、２．１０６ＣＦＵ／ｍｌの量で播種する工程と、
ｄ）前記株の発酵速度を調べる工程と、
ｅ）以下の３つの特徴：
ｉ）２４℃の温度にて１５〜２２日の発酵速度、および
ｉｉ）１５％ｖ／ｖ以上のアルコール度数に対する耐性、および
ｉｉｉ）２００ｐｐｍ以下の窒素要求
を示す株を選択する工程と
を含む、方法。
【請求項６】
合成ＯＩＶムスト上で、親株Ｓ１より少なくとも１５％、好ましくは少なくとも３０％、より優先的には少なくとも４０％高く、親株Ｓ２より少なくとも１５％、好ましくは少なくとも３０％、より優先的には少なくとも４０％低い発酵速度を示す株を選択する工程をさらに含む、請求項５に記載のワイン醸造用酵母株を得る方法。
【請求項７】
ワインを生産するための請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵母株または請求項４に記載の酵母の使用。
【請求項８】
前記ワインが赤ワインである、請求項７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵飲料のための酵母株および前記株を選択する方法に関する。本出願はまた、ワインを生産するためのそれらの株由来の酵母の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発酵はワイン生産における必須工程の１つであり、その間に、ブドウムストに存在する糖は酵母などの微生物の作用によりアルコールに変換される。
【０００３】
異なる酵母株が生産されるワインの種類に応じて使用される。出願人からのサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）Ｓ１酵母株は、規則的に発酵する能力を有するが、非常にゆっくりであり、したがってこの株は、高度に着色され、非常にタンニン性の黒ブドウ種における高レベルのポリフェノール（アントシアニン、タンニン）からの恩恵を受けるように長いマセラシオン／抽出プロセスに起因する高品質の赤ワインに特に適している。
【０００４】
残念なことに、この株は、ムストにおいて利用可能な通常のまたはさらに多量の窒素の存在下で１４％ｖ／ｖより多いアルコールポテンシャルでムストを発酵することが難しい。これらの条件は、ワインを貯蔵することを意図する赤ワインに一般的であり、そのワインは、それらの性質によって、高いアルコールポテンシャルを有し、利用可能な窒素が不足しているムストを生じる熟れ過ぎたブドウから得られる。したがって、これらの条件下で、発酵を時期尚早に停止する高いリスクが存在し、ワイン生産に有害となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、特に、酒醸造において、より関心をもたらすように、酵母株Ｓ１の発酵能力を改良することを可能にする手段を開発することが有益である。
【０００６】
酵母は、従来の遺伝学的技術を使用することによって、または分子遺伝学的技術を使用することによって改良され得る。しかしながら、酒醸造市場は遺伝子組換え微生物（ＧＭＯ）を使用することに対して非常に抵抗している。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって、本発明は、少量の窒素の存在下および低温で、株Ｓ１を、大量の糖を迅速に発酵できる酵母株とハイブリダイズすることによって高いタンニンレベルを有する黒ブドウの酒醸造において特に目的のある株を得ることを可能にすることを決定した：サッカロミセス・バヤナス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）種のＳ２酵母株は出願人の所有物である。
【０００８】
このハイブリダイゼーションプロセスのおかげで、本発明者らは、非常に良好な発酵速度および１５％ｖ／ｖより多いアルコール度数に対する耐性ならびに少量の利用可能な窒素の存在下で発酵能力を示すいくつかの株を産生し、選択した。これらの株は、Ｂｏｒｄｅａｕｘのグレートビンテージなどの「貯蔵」ワインとして知られているワインの場合である、長期の発酵を必要とする利用可能な窒素が少ないムストの酒醸造において特に興味深いことが見出された。
【０００９】
したがって、第１の態様によれば、本発明は株Ｓ１と株Ｓ２をハイブリダイズすることによって得られる酵母株に関し、前記酵母株は、以下に定義される試験Ａに従って、以下の特徴：
−  ２４℃の温度にて１５〜２２日の発酵速度、および
−  １５％ｖ／ｖ以上のアルコール度数に対する耐性、および
−  ２００ｐｐｍ以下の窒素要求
を有する。
【００１０】
本発明者らはまた、株Ｓ１と株Ｓ２のハイブリダイゼーションからワイン酵母株を得、選択することを可能にする方法を開発した。
【００１１】
したがって、別の態様によれば、本発明は、ワイン酵母株を得る方法であって、以下の工程：
ａ）酵母株Ｓ１と酵母株Ｓ２をハイブリダイズする工程と、
ｂ）工程ａ）において得られた株を単離する工程と、
ｃ）工程ｂ）において単離された株をムスト上に播種する工程と、
ｄ）前記株の発酵速度を調べる工程と、
ｅ）工程ｃ）のムストと同じムスト上で、親株Ｓ１より少なくとも１５％、好ましくは少なくとも３０％、より優先的には少なくとも４０％高く、親株Ｓ２より少なくとも１５％、好ましくは少なくとも３０％、より優先的には少なくとも４０％低い発酵速度を示す株を選択する工程と
を含む、方法に関する。
【００１２】
本発明はまた、発酵飲料、より具体的にはワインを生産するための上記の酵母株の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】時間の関数として重量／開始重量比を測定することによって表される株５１−０６２（Ｈ）、５１−１３５（Ｆ）、Ｓ１（Ｄ）およびＳ２（Ｅ）の発酵速度を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
酵母株Ｓ１のワインでの成長能力、特にその発酵能力を改良するために、本発明者らは、特にワイン成長用途に適応される新規株を開発した。
【００１５】
本明細書において、「改良された発酵特性」は、平均揮発性酸度生成および低ＳＯ２生成などの分析的な欠陥がなく、向上したポリフェノール抽出およびフルーティーな香りの促進などの関心のある官能特性を有するが、場合により、適度な量の利用可能な窒素の存在下で、長期的に（ムストのアルコール度数が１５％ｖ／ｖを超える場合でも）迅速に発酵もできる株Ｓ１によって提供される利点、特に適度および通常の速度でムストを発酵する能力を有する酵母株を意味すると理解される。
【００１６】
したがって、本明細書において保持される選択基準は以下の通りである：
−  親株Ｓ１より高い発酵速度であるが、通常後者と等しい、
−  適度な量の利用可能な窒素の存在下で発酵する能力、および
−  高いアルコール度数（すなわち１５％以上）に対する耐性。
【００１７】
したがって、本発明の第１の態様は、株Ｓ１と株Ｓ２をハイブリダイズすることによって得られる可能性が高い酵母株に関し、前記酵母株は、試験Ａに従って、以下の特徴：
ｉ）２４℃の温度にて１５〜２２日の発酵速度、および
ｉｉ）１５％ｖ／ｖ以上のアルコール度数に対する耐性、および
ｉｉｉ）２００ｐｐｍ以下の窒素要求
を示す。
【００１８】
本発明による「試験Ａ」は、２４℃の一定温度にて発酵することによって２００ｐｐｍの開始窒素濃度で２５０ｇ／ｌの発酵性糖（１５％ｖ／ｖのアルコールポテンシャルを得るため）に調節したＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｉｎｅ  ａｎｄ  Ｗｉｎｅ［Ｏｒｇａｎｉｓｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  ｌａ  Ｖｉｇｎｅ  ｅｔ  ｄｕ  Ｖｉｎ  −  ＯＩＶ］（ＯＩＶ−ＯＥＮＯ  ＲＥＳＯＬＵＴＩＯＮ  ３７０−２０１２）によって標準化された合成ムスト上に２．１０６ＣＦＵ／ｍｌの量で播種される酵母株の発酵活性に従った試験である。
【００１９】
「酵母株」という表現は、酵母細胞の比較的均一な集団を意味する。酵母株は、クローンから得られ、クローンは単一酵母細胞から得られる細胞の集団である。
【００２０】
「ワイン酵母株」は、ワインを発酵するために使用される株を指すと理解される。
【００２１】
酵母株Ｓ１または株Ｓ１とは、２０１５年９月９日に参照番号Ｉ−５０１１としてＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ  −  ＣＮＣＭ）  −  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、２５ｒｕｅ  ｄｕ  ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ  Ｆ７５７２４  Ｐａｒｉｓに寄託した出願人の酵母株を指す。
【００２２】
酵母株Ｓ２またはＳ２とは、出願人の名で２０１５年９月９日に参照番号Ｉ−５０１２としてＣＮＣＭに寄託した酵母株を指す。
【００２３】
「Ｘ％ｖ／ｖ以上のアルコール度数に対する耐性」とは、酵母株が、培地の体積に対してアルコール度数がＸ％ｖ／ｖ以上である場合に生存し、発酵し続けることができることを意味する。
【００２４】
酵母株の「窒素要求」は、前記株が所与のムスト上で発酵（少なくとも２ｇ／ｌの残留発酵性糖の存在）を完了できるようにムストに存在しなければならない最小量の利用可能な窒素と定義される。
【００２５】
発酵速度は当業者に公知の種々の技術によって容易に測定することができる。例えば、発酵速度は、経時的に計量することによって発酵を追跡することによって測定することができる。
【００２６】
本発明は特に、上記の２つの新規酵母株：それぞれ番号Ｉ−４９７５およびＩ−４９７７としてブダペスト条約に従って２０１５年５月５日にＣＮＣＭに提出された株５１−０６２および５１−１３５に関する。
【００２７】
本発明はまた、上記の酵母株から単離された酵母に関する。
【００２８】
本発明者らはまた、株Ｓ１と、低温にて少量の窒素の存在下で迅速に大量の糖を発酵する能力を有する株である、サッカロミセス・バヤナスＳ２株をハイブリダイズする方法を開発した。次いで、本発明者らは、このハイブリダイゼーションから得られた種々の株の中で、改良され、従って酒醸造に関心のある発酵特性を示す株を同定することを可能にする選択方法を開発した。
【００２９】
したがって、別の態様において、本発明はワイン酵母株を得る方法であって、以下の工程：
ａ）酵母株Ｓ１と酵母株Ｓ２をハイブリダイズする工程と、
ｂ）工程ａ）において得られた株を単離する工程と、
ｃ）工程ｂ）において単離された株をムスト上に播種する工程と、
ｄ）前記株の発酵速度を調べる工程と、
ｅ）工程ｃ）と同じムスト上で、親株Ｓ１より少なくとも１５％、好ましくは少なくとも３０％、より優先的には少なくとも４０％高く、親株Ｓ２より少なくとも１５％、好ましくは少なくとも３０％、より優先的には少なくとも４０％低い発酵速度を示す株を選択する工程と
を含む、方法に関する。
【００３０】
当業者は酵母株をハイブリダイズするいくつかの方法を知っており、酵母株Ｓ１を酵母株Ｓ２とハイブリダイズするための適切な方法を使用することができる。この場合、本発明者らは、株Ｓ１が生殖型胞子の分化したａ型またはα型を産生できないことを発見した。したがってこの株は同株性である。したがって、株Ｓ１と株Ｓ２をハイブリダイズする手段は、各々の株からの四分子の解離後、これらの２つの株由来の胞子のハイブリダイゼーションからなる。このように新たなハイブリッドは、Ｓ１由来の胞子とＳ２由来の胞子との交配の結果またはむしろ胞子Ｓ１と、生殖型が複製の間に変化しているＳ１由来の胞子との交配の結果であり得る。Ｓ１由来の胞子とＳ２由来の胞子との交配から得られたハイブリッドは、新たなハイブリッドの遺伝子プロファイルを解析し（例えばＰＣＴ  Ｔｙによって）、それらのプロファイルを親株の遺伝子プロファイルと比較することによって後で選択される。
【００３１】
本明細書において、「ムスト」は、ブドウムスト、すなわち、ブドウを圧搾した後に得られる混合物または合成ムスト、すなわち、天然ブドウムストの組成を最適に模倣するように合成的に再構成されたムストを指すと理解される。
【００３２】
いくつかのムストが本発明の目的のために使用され得る。例として、酵母を予め選択するために合成「Ｌｅｓａｆｆｒｅワイン」ムストを引用することができ、その合成ムストは、酵母をそれらの選択を改良することを意図するための環境に置くために高温で予め発酵されたマセラシオンから得られているか、または得られてない、いずれかの、ポリフェノールが濃縮された黒ブドウ種からのブドウムストまたは酵母を選択するようにＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｉｎｅ  ａｎｄ  Ｗｉｎｅ［Ｏｒｇａｎｉｓｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  ｌａ  Ｖｉｇｎｅ  ｅｔ  ｄｕ  Ｖｉｎ  −  ＯＩＶ］（ＯＩＶ−ＯＥＮＯ  ＲＥＳＯＬＵＴＩＯＮ  ３７０−２０１２）によって標準化されている。
【００３３】
一実施形態において、発酵試験は合成ＯＩＶムストで実施される。
【００３４】
「合成ＯＩＶムスト」は、２００ｐｐｍの開始窒素濃度で２５０ｇ／ｌの発酵性糖（１５％ｖ／ｖのアルコールポテンシャルを得るため）に調節したＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｉｎｅ  ａｎｄ  Ｗｉｎｅ［Ｏｒｇａｎｉｓｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  ｌａ  Ｖｉｇｎｅ  ｅｔ  ｄｕ  Ｖｉｎ  −  ＯＩＶ］（ＯＩＶ−ＯＥＮＯ  ＲＥＳＯＬＵＴＩＯＮ  ３７０−２０１２）によって標準化された合成ムストである。
【００３５】
したがって、別の実施形態によれば、本出願は、ワイン酵母株を得る方法であって、以下の工程：
ａ）酵母株Ｓ１と酵母株Ｓ２をハイブリダイズする工程と、
ｂ）工程ａ）において得られた株を単離する工程と、
ｃ）工程ｂ）において単離された株を合成ＯＩＶムスト上に播種する工程と、
ｄ）前記株の発酵速度を調べる工程と、
ｅ）以下の３つの特徴：
ｉ）２４℃の温度にて１５〜２２日の発酵速度、および
ｉｉ）１５％ｖ／ｖ以上のアルコール度数に対する耐性、および
ｉｉｉ）２００ｐｐｍ以下の窒素要求
を示す株を選択する工程と
を含む、方法に関する。
【００３６】
このように選択された酵母は、高いアルコール度数でさえも、少量の窒素を使用することによって大量の糖を発酵することができる。
【００３７】
さらに、別の態様によれば、本発明は、ワイン、特に赤ワイン、さらにより好ましくは非常にタンニン性の黒ブドウ種からのワインを生産するための上記の酵母株または酵母の使用に関する。別の実施形態において、本発明に従って得られた／選択された酵母株および酵母は、「貯蔵」ワインとして知られている赤ワインを発酵するために使用される。
【００３８】
「貯蔵ワイン」は、セラーで数年間貯蔵することができ、年数と共に改質するワインである。これはＢｏｒｄｅａｕｘのグレートビンテージを有する場合である。貯蔵ワインはセラーにおいて少なくとも５年貯蔵することができる。
【実施例】
【００３９】
実施例１：株Ｓ１とＳ２由来の株のハイブリダイゼーション。
−  ２つの親株の胞子形成および株Ｓ１を胞子形成するための操作条件の開発。
胞子形成条件をＳ２およびＳ１株の両方に適用した。胞子形成速度を算出し、表１に提示する。
【００４０】
【表１】
0006713531.tif 000002
【００４１】
−  顕微操作による胞子の単離ならびに株Ｓ２およびＳ１から単離された胞子の自己複相化（ｓｅｌｆ−ｄｉｐｌｏｉｄｉｚａｔｉｏｎ）の研究
胞子形成条件を２つのワイン株においてラージスケールで適用した。子嚢を処理し、顕微鏡によって四分子を可視化した後、解離は四分子を分離することからなり、胞子を除去し、次いでそれらを寒天の正確な位置に堆積させることを実施した。堆積した胞子および発芽した胞子の一覧を以下の表２に提示する。
【００４２】
【表２】
0006713531.tif 000003
【００４３】
株Ｓ１およびＳ２をハイブリダイズできるように、生殖型胞子の明確に分化したａ型またはα型を各株について得なければならない。以前に得られた各胞子の生殖特徴をＰＣＲ「接合型」によって調べた（表３）。
【００４４】
【表３】
0006713531.tif 000004
【００４５】
表３は、生殖型胞子の分化したａ型またはα型を株Ｓ１について得ることができなかったことを示す。したがって株Ｓ１は同株性であるように見える。これらの条件下で、株Ｓ２とＳ１との間で従来のハイブリダイゼーションプログラムを企図することは可能ではない。
【００４６】
−  Ｓ１×Ｓ２交配に特異的なハイブリダイゼーション操作条件の開発、新規株の単離およびＳ１とＳ２との交配から得られたハイブリッドを選択するためのそれらの遺伝子プロファイルの調査。
本発明者らは、利用可能な株Ｓ１についての生殖型ａまたはα胞子を得られなかったので、マイクロマニピュレータによる各株からの四分子の解離後のＳ１およびＳ２由来の胞子をハイブリダイズした。したがって新規ハイブリッドは、Ｓ１由来の胞子とＳ２由来の胞子との交配の結果であり得るか、またはむしろＳ１由来の胞子と、生殖型が複製の間に変化しているＳ１由来の胞子との交配の結果であり得る。Ｓ１由来の胞子とＳ２由来の胞子との交配から得られたハイブリッドを選択するために、新たなハイブリッドの遺伝子プロファイルをＰＣＴ  Ｔｙによって分析し、次いでこれらのプロファイルを親株のものと比較した。最後に、親株プロファイルに対して異なる強度で混合プロファイルを示す６８個のハイブリッドを保持した。次いでこれらの６８個の株のワイン醸造の質を評価した。株５１−０６２および５１−１３５を以下のように選択した。
【００４７】
実施例２：ハイブリッド選択技術の開発
いくつかの選択技術を使用した：
ａ）合成Ｌｅｓａｆｆｒｅワインムスト（２５０ｇ／Ｌの糖および２５０ｐｐｍの利用可能な窒素）＝試験Ａおよび合成ＯＩＶムスト上でのハイブリッドおよび親株における発酵性糖脱水、発酵速度および目的の発酵化合物の生成を調べることによる合成条件の選択。
【００４８】
速度基準で行った第１の選択により、フルクトース脱水に関してＳ１より良好な特性を示す１１個のハイブリッドの選択が可能となった。
【００４９】
これらのハイブリッドの中で、株５１−０６２および５１−１３５を選択した。なぜならそれらは、Ｓ１とＳ２との間の平均速度を示し、発酵の終わりにこれらの株は、２つの親株と異なる中間発酵化合物を産生するからである。
【００５０】
ｂ）ハイブリッドおよび親株の天然ムスト上での発酵速度およびエステル産生を調べることによる実際の条件の選択：
選択基準は、天然Ｃａｂｅｒｎｅｔ  Ｓａｕｖｉｇｎｏｎムスト上での微量醸造の間の発酵速度の分析、ワイン醸造パラメーターの制御および主要なエステル分析であった。このムストは、非常に熟したｃａｂｅｒｎｅｔ  ｓａｕｖｉｇｎｏｎブドウの高温予備発酵マセラシオンによって得られる。この年の収穫からのムストをフリーザー内で−６０℃にて貯蔵した。
【００５１】
発酵前に、ムストを以下のように処理した：１）室温にて解凍し、２）遠心分離によって清浄化し、３）５つの均質なバッチにムストを分離した。
【００５２】
発酵前に、フーリエ変換赤外分光分析＋比色分析ＳＯ２測定によってムストを分析した。得られた結果を以下の表４にまとめる：
【００５３】
【表４】
0006713531.tif 000005
【００５４】
ムスト分析後、発酵前にアルコールおよび酢酸の不在も観察した。２４６ｇのグルコース＋フルクトースは１４．６％ｖｏｌ（１６．８３の収率）の推定強度に対応する。
【００５５】
−  寒天管上での酵母の調製：株５１−１３５（Ｆ）および５１−０６２（Ｈ）
０日目のインキュベートされる培地の調製：酵母エキス２０ｇ、スクロース１００ｇ、ミネラル溶液（１００ｇＭｇＳＯ４＋１００ｇＫＨ２ＰＯ４＋脱塩水ＱＳ１Ｌ）１０ｍＬ、水道水ＱＳ  １Ｌ。
【００５６】
３日目  −  試験管「Ａ」の接種（試験した各株について）：単糖を寒天から除去し、２６℃にて２４時間インキュベートする１０ｍｌの培地に堆積させる。
【００５７】
４日目  −  ２６℃にて２４時間インキュベートする９ｍｌの培地中の管Ａからの試験管「Ｂ」１ｍｌの調製。
【００５８】
５日目：各々の管「Ｂ」を、十分に撹拌して２６℃にて１６時間＋／−２時間インキュベートする９０ｍｌの培地に注ぐ。
【００５９】
６日目：Ｔｈｏｍａ細胞を有する集団の測定。
播種ジャー（表５）：
【００６０】
【表５】
0006713531.tif 000006
【００６１】
ジャーにおける集団の制御（表６）：
【００６２】
【表６】
0006713531.tif 000007
【００６３】
−  乾燥酵母の調製：株Ｄ（株Ｓ１）およびＥ（株Ｓ２）：
６日目：滅菌水中の酵母の水和：１０ｍＬ中に１ｇ、次いで１０分間超音波撹拌、３０℃にて２０分間インキュベーション、１５分間超音波撹拌、周囲温度にて２０分静止。
【００６４】
ジャーを１Ｌのムスト中で２ｍｌの調製物にて播種した。集団は、Ｔｈｏｍａ細胞：１０１０細胞／Ｌを有すると実証した（表７）：
【００６５】
【表７】
0006713531.tif 000008
【００６６】
−  発酵分析
発酵を１８℃の温度で気候を制御した部屋で実施する。発酵速度を、＋／−０．１ｇスケール、約２回／１日でジャーの重量を量ることによって分析する。発酵は７日目に開始し、１９日目に停止した。
【００６７】
結果を図１に示す。
【００６８】
発酵の終了時：約６０ｍｇ／Ｌを搾取し、硫黄処理し、瓶詰めし、８℃にて貯蔵する。
【００６９】
−  得られたワインの分析
Ｄ２０でのフーリエ変換赤外分光分析および比色分析ＳＯ２測定による分析：
【００７０】
【表８】
0006713531.tif 000009
【００７１】
酵母株に応じて以下を観察する：
−  体積による総アルコール度数に対する０．５％体積変化。
−  １９日後、残留糖が全ての株について存在する。
−  総酸度が４．６９から５．１２ｇ  ｅｑＨ２ＳＯ４／Ｌ変化する。
−  揮発性酸度が０．４８から０．７１ｇ  ｅｑＨ２ＳＯ４／Ｌ変化する。
−  マロラクティック発酵は始まらなかった。
【００７２】
ポリフェノール色分析（表９）
【００７３】
【表９】
0006713531.tif 000010
【００７４】
【表１０】
0006713531.tif 000011
【００７５】
−  結論：
概して、本発明者らは、乾燥酵母Ｄによって得られた結果と寒天管酵母によって得られた結果との間に有意な差を観察しない。
【００７６】
【表１１】
0006713531.tif 000012
【００７７】
ハイブリッドは、２群が形成されるが、Ｓ１より速い速度を確認する：
−  ５１−１３５は、Ｓ２およびＳ１と比較して中間の発酵速度、糖および総ＳＯ２の残留物含有量（高い、したがって陰性）ならびにＳ２に近い色への影響および親株に近いがわずかに高いエステル産生を示す。
【００７８】
−  ５１−０６２は、同等の勾配を有するがＳ２より速い速度、Ｓ２より低い残留糖含有量、揮発性酸度およびＳＯ２ならびに親株より高いエステル産生を示す。この酵母は速度基準に対応しないように見えるが、さらなる研究に供されるべき非常に興味深い特徴を示す。
【図１】
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