(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（３）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の機能が欠損又は抑制されており、
以下の（４）〜（６）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の機能が欠損又は抑制されていることを特徴とする不稔化植物。
（１）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（２）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（３）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（４）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（５）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（６）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
【請求項２】
前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の機能が、以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質が導入されて、欠損又は抑制されており、
前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の機能が、以下の（Ｄ）〜（Ｆ）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質が導入されて、欠損又は抑制されている、請求項１に記載の不稔化植物。
（Ａ）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３に記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３に記載のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質
（Ｄ）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｅ）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４に記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質
（Ｆ）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４に記載のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質
【請求項３】
前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の機能が、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の発現を欠損又は抑制させる核酸が導入されて、欠損又は抑制されており、
前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の機能が、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の発現を欠損又は抑制させる核酸が導入されて、欠損又は抑制されている、請求項１に記載の不稔化植物。
【請求項４】
前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の発現を抑制する核酸が、以下の（ｇ）〜（ｉ）のいずれかの核酸であり、
前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の発現を抑制する核酸が、以下の（ｊ）〜（ｌ）のいずれかの核酸である、請求項３に記載の不稔化植物。
（ｇ）配列番号７１で表される塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含む核酸、
（ｈ）配列番号７１で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含み、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の発現を抑制可能な核酸、
（ｉ）配列番号７１に記載の塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含み、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の発現を抑制可能な核酸、
（ｊ）配列番号７２で表される塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含む核酸、
（ｋ）配列番号７２で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含み、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の発現を抑制可能な核酸、
（ｌ）配列番号７２に記載の塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含み、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の発現を抑制可能な核酸
【請求項５】
キク科の植物である請求項１〜４のいずれか一項に記載の不稔化植物。
【請求項６】
植物内において、
以下の（１）〜（３）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の機能を欠損又は抑制させ、
以下の（４）〜（６）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の機能を欠損又は抑制させることを含む、不稔化植物の作出方法。
（１）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（２）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（３）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（４）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（５）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（６）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
【請求項７】
植物内において、
前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の機能を、以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質を発現させることによって、欠損又は抑制し、
前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の機能を、以下の（Ｄ）〜（Ｆ）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質を発現させることによって、欠損又は抑制する、請求項６に記載の不稔化植物の作出方法。
（Ａ）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３に記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３に記載のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質
（Ｄ）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｅ）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４に記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質
（Ｆ）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４に記載のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質
【請求項８】
前記転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドが、Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａで表されるアミノ酸配列からなる、請求項７に記載の不稔化植物の作出方法。
【請求項９】
前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の機能を、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の発現を欠損又は抑制させる核酸を植物に導入することによって、欠損又は抑制し、
前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の機能を、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の発現を欠損又は抑制させる核酸を植物に導入することによって、欠損又は抑制する、請求項６に記載の不稔化植物の作出方法。
【請求項１０】
前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の発現を抑制する核酸が、以下の（ｇ）〜（ｉ）のいずれかの核酸であり、
前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の発現を抑制する核酸が、以下の（ｊ）〜（ｌ）のいずれかの核酸である、請求項９に記載の不稔化植物の作出方法。
（ｇ）配列番号７１で表される塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含む核酸、
（ｈ）配列番号７１で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含み、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の発現を抑制可能な核酸、
（ｉ）配列番号７１に記載の塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含み、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の発現を抑制可能な核酸、
（ｊ）配列番号７２で表される塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含む核酸、
（ｋ）配列番号７２で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含み、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の発現を抑制可能な核酸、
（ｌ）配列番号７２に記載の塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含み、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の発現を抑制可能な核酸
【請求項１１】
キク科の植物である請求項６〜１０のいずれか一項に記載の不稔化植物の作出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不稔化植物、融合タンパク質、融合遺伝子、ベクター、形質転換体、及び不稔化植物の作出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物の栽培や遺伝情報の拡散を制御するため、植物の不稔化が望まれている。不稔化方法の一例として、例えば、花粉を生産する雄ずいや、花粉を受粉する雌ずいの形成を制御することにより不稔化する方法が試みられている。
キクは、鑑賞用や食用として、世界中で広く栽培される有用な植物である。キクの花器官の形成制御に関して、非特許文献１には、キククラスＣ遺伝子の１つを単離し、これをターゲットにアンチセンス植物を作出したことが報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Aida, et al., “Chrysanthemum flower shape modification by suppression of chrysanthemum-AGAMOUS gene” Plant biotechnology, 2008, 25 (1): 55-59
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
非特許文献１で作出されたアンチセンス植物における、花の形態異常は軽微であり、花の形態異常が見られた個体の割合も、１０３個体中１個体と低い。このように非特許文献１に記載の植物体の不稔化は、実用上必ずしも十分ではない。
【０００５】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、花器官の形態形成が制御された不稔化植物、不稔化植物の作出に有用な融合タンパク質、融合遺伝子、ベクター、形質転換体、及び不稔化植物の作出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、キククラスC遺伝子のタンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質を、植物体内で発現させることにより、有用な不稔化植物を得られることを見出した。また、キククラスC遺伝子の発現を抑制する核酸が導入された植物体では、雄ずい及び雌ずいが花弁化され、完全不稔化された植物体が得られることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下の通りである。
【０００７】
［１］以下の（１）〜（３）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の機能が欠損又は抑制されており、
以下の（４）〜（６）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の機能が欠損又は抑制されていることを特徴とする不稔化植物。
（１）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（２）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（３）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（４）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（５）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（６）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
［２］前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の機能が、以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質が導入されて、欠損又は抑制されており、
前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の機能が、以下の（Ｄ）〜（Ｆ）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質が導入されて、欠損又は抑制されている、前記［１］に記載の不稔化植物。
（Ａ）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３に記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３に記載のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質
（Ｄ）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｅ）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４に記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質
（Ｆ）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４に記載のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質
［３］前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の機能が、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の発現を欠損又は抑制させる核酸が導入されて、欠損又は抑制されており、
前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の機能が、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の発現を欠損又は抑制させる核酸が導入されて、欠損又は抑制されている、前記［１］に記載の不稔化植物。
［４］前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の発現を抑制する核酸が、以下の（ｇ）〜（ｉ）のいずれかの核酸であり、
前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の発現を抑制する核酸が、以下の（ｊ）〜（ｌ）のいずれかの核酸である、前記［３］に記載の不稔化植物。
（ｇ）配列番号７１で表される塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含む核酸、
（ｈ）配列番号７１で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含み、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の発現を抑制可能な核酸、
（ｉ）配列番号７１に記載の塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含み、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の発現を抑制可能な核酸、
（ｊ）配列番号７２で表される塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含む核酸、
（ｋ）配列番号７２で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含み、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の発現を抑制可能な核酸、
（ｌ）配列番号７２に記載の塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含み、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の発現を抑制可能な核酸
［５］キク科の植物である前記［１］〜［４］のいずれか一つに記載の不稔化植物。
［６］植物内において、
以下の（１）〜（３）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の機能を欠損又は抑制させ、
以下の（４）〜（６）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の機能を欠損又は抑制させることを含む、不稔化植物の作出方法。
（１）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（２）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（３）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（４）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（５）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（６）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
［７］植物内において、
前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の機能を、以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質を発現させることによって、欠損又は抑制し、
前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の機能を、以下の（Ｄ）〜（Ｆ）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質を発現させることによって、欠損又は抑制する、前記［６］に記載の不稔化植物の作出方法。
（Ａ）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３に記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３に記載のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質
（Ｄ）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｅ）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４に記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質
（Ｆ）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４に記載のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質
［８］前記転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドが、Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａで表されるアミノ酸配列からなる、前記［７］に記載の不稔化植物の作出方法。
［９］前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の機能を、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の発現を欠損又は抑制させる核酸を植物に導入することによって、欠損又は抑制し、
前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の機能を、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の発現を欠損又は抑制させる核酸を植物に導入することによって、欠損又は抑制する、前記［６］に記載の不稔化植物の作出方法。
［１０］前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の発現を抑制する核酸が、以下の（ｇ）〜（ｉ）のいずれかの核酸であり、
前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の発現を抑制する核酸が、以下の（ｊ）〜（ｌ）のいずれかの核酸である、前記［９］に記載の不稔化植物の作出方法。
（ｇ）配列番号７１で表される塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含む核酸、
（ｈ）配列番号７１で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含み、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の発現を抑制可能な核酸、
（ｉ）配列番号７１に記載の塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含み、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の発現を抑制可能な核酸、
（ｊ）配列番号７２で表される塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含む核酸、
（ｋ）配列番号７２で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含み、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の発現を抑制可能な核酸、
（ｌ）配列番号７２に記載の塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含み、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の発現を抑制可能な核酸
［１１］キク科の植物である前記［６］〜［１０］のいずれか一つに記載の不稔化植物の作出方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、不稔性に優れた植物を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例において、ＣＡＧ遺伝子のアミノ酸配列、及びその他の植物種のクラスＣ遺伝子のアミノ酸配列を用いて作成された系統樹である。
【図２】実施例における、ＣＡＧ遺伝子の発現解析結果を示す写真である。
【図３】実施例における、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子の転写調節領域の発現を示す写真である。
【図４】実施例において作製された、融合遺伝子の発現カセットを模式的に示した図である。
【図５】実施例において作製された、不稔性形質転換体とコントロール植物との花の形態を比較した写真である。
【図６】実施例において、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１  ｃＤＮＡ及びＣＡＧ  ｔｙｐｅ２  ｃＤＮＡのうち、サイレンシングベクターに用いた領域を模式図的に示す図である。
【図７】実施例において作製された発現カセットを模式的に示す図である。
【図８】実施例において使用したベクターのマップ図である。
【図９】実施例において使用したベクターのマップ図である。
【図１０】実施例において作製された、不稔性形質転換体とコントロール植物との花の形態を比較した写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
≪不稔化植物≫
本発明の不稔化植物は、
以下の（１）〜（３）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の機能が欠損又は抑制されており、
以下の（４）〜（６）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の機能が欠損又は抑制されている。
【００１１】
（１）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（２）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（３）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
【００１２】
（４）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（５）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（６）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
【００１３】
＜ＣＡＧ遺伝子＞
被子植物の花の発生を説明するモデルとして、ＡＢＣモデルが知られている。ＡＢＣモデルでは、クラスＡ遺伝子、クラスＢ遺伝子、クラスＣ遺伝子の発現パターンの組合せによって、花器官の発生が制御される。クラスＡ遺伝子単独の発現領域では、萼が形成され、クラスＡ遺伝子とクラスＢ遺伝子の発現領域では、花弁が形成される。クラスＢ遺伝子とクラスＣ遺伝子の発現領域では雄ずいが形成され、クラスＣ遺伝子単独の発現領域では雌ずいが形成される。クラスＣ遺伝子としてはシロイヌナズナの  ＡＧＡＭＯＵＳ  （ＡＧ）が知られている。
しかし、上記モデルはシロイヌナズナやキンギョソウ等の一部の植物種を対象とした研究で明らかにされたものであり、他のあらゆる植物種においても上記モデルが同様に適用できるか、また、どの遺伝子が各クラスの遺伝子として機能しているかは不明である。
【００１４】
キクにおいても、これまでにクラスＣ遺伝子の一つと考えられる遺伝子が単離され、これをターゲットにアンチセンス植物を作出したことが報告されている。しかし、観察された花の形態異常は、極めて軽微なものであった。
【００１５】
発明者らは、後述の実施例に示すように、栽培ギクであるイエギク（Chrysanthemum morifolium）の“セイマリン”から、ＡＧＡＭＯＵＳの塩基配列に基づいてプライマーを設計し、計１４の遺伝子をクローニングした。これらの遺伝子は、コードされるアミノ酸配列の相同性に基づき、大きく２タイプに分類可能であり、更に４種類に分類可能であることを明らかにした。上記の２タイプは、CAG Type1とCAG Type２とし、上記の４種類とはCAG Type1 short, CAG Type1 long, CAG Type2 short, CAG Type2 longと名付けた。単離した１４遺伝子の上記分類と、各遺伝子にコードされるアミノ酸配列の配列番号を表１に示す。
【００１６】
【表１】
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【００１７】
本発明に係るCAG Type1遺伝子は、前記（１）〜（３）のいずれかの遺伝子である。
【００１８】
一般的に、何らかの生理機能を有するタンパク質は、本来の機能を損なうことなく、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加可能なことが知られている。
前記（２）のタンパク質において、配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されていてもよいアミノ酸の数は、１〜３０個が好ましく、１〜２０個がより好ましく、１〜１０個がさらに好ましく、１〜５個がさらに好ましい。
【００１９】
前記（３）のタンパク質において、配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列との同一性は、９０％以上１００％未満であり、９５％以上１００％未満であることが好ましく、９８％以上１００％未満であることがより好ましい。
アミノ酸配列同士の同一性は、公知の各種相同性検索プログラムを用いて求めることができる。本発明におけるアミノ酸配列同士の同一性は、公知の相同性検索ソフトウェアBLASTPにより得られた値を採用できる。本発明におけるアミノ酸配列同士の同一性は、後述する実施例に示すように市販の遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸにより得られた値を採用できる。
【００２０】
本発明に係るCAG Type2遺伝子は、前記（４）〜（６）のいずれかの遺伝子である。
【００２１】
前記（５）のタンパク質において、配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されていてもよいアミノ酸の数は、１〜３０個が好ましく、１〜２０個がより好ましく、１〜１０個がさらに好ましく、１〜５個がさらに好ましい。
【００２２】
前記（６）のタンパク質において、配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列との同一性は、９０％以上１００％未満であり、９５％以上１００％未満であることが好ましく、９８％以上１００％未満であることがより好ましい。
アミノ酸配列同士の同一性は、公知の各種相同性検索プログラムを用いて求めることができる。本発明におけるアミノ酸配列同士の同一性は、公知の相同性検索ソフトウェアBLASTPにより得られた値を採用できる。本発明におけるアミノ酸配列同士の同一性は、後述する実施例に示すように市販の遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸにより得られた値を採用できる。
【００２３】
前記（１）〜（６）のタンパク質は、転写制御機能を有する。転写制御機能とは、転写因子が有する機能である。タンパク質が転写制御機能を有しているかどうかは、公知の転写因子測定用試薬を用いた手法等により調べることができる。
【００２４】
前記（１）の配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、当該アミノ酸配列のみからなるタンパク質であってもよく、転写制御機能を有する範囲において、当該アミノ酸配列からなるタンパク質に任意の配列が付加されていてもよい。
前記（４）の配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、当該アミノ酸配列のみからなるタンパク質であってもよく、転写制御機能を有する範囲において、当該アミノ酸配列からなるタンパク質に任意の配列が付加されていてもよい。
前記任意の配列とは、例えば、リンカー配列、タグ配列、タンパク質安定化のための修飾配列等が挙げられる。
【００２５】
本発明に係るCAG Type1遺伝子は、本発明に係るCAG Type1タンパク質をコードするものであり、以下の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかのポリヌクレオチドである。
（Ｉ）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ＩＩ）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり転写制御機能を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ＩＩＩ）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり転写制御機能を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド
【００２６】
また、本発明に係るCAG Type2遺伝子は、本発明に係るCAG Type2タンパク質をコードするものであり、以下の（ＩＶ）〜（ＶＩ）のいずれかのポリヌクレオチドである。
（ＩＶ）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｖ）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり転写制御機能を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ＶＩ）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり転写制御機能を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド
【００２７】
前記（Ｉ）〜（ＶＩ）に示されるポリヌクレオチドにおけるタンパク質としては、前記（１）〜（６）に示される遺伝子において説明したタンパク質と同様である。
【００２８】
前記（Ｉ）における配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号１５で表される塩基配列であってもよい。
前記（Ｉ）における配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号１６で表される塩基配列であってもよい。
前記（Ｉ）における配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号１７で表される塩基配列であってもよい。
前記（Ｉ）における配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号２２で表される塩基配列であってもよい。
前記（Ｉ）における配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号２５で表される塩基配列であってもよい。
前記（Ｉ）における配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号２６で表される塩基配列であってもよい。
前記（Ｉ）における配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号２７で表される塩基配列であってもよい。
【００２９】
前記（ＩＶ）における配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号１８で表される塩基配列であってもよい。
前記（ＩＶ）における配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号１９で表される塩基配列であってもよい。
前記（ＩＶ）における配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号２０で表される塩基配列であってもよい。
前記（ＩＶ）における配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号２１で表される塩基配列であってもよい。
前記（ＩＶ）における配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号２３で表される塩基配列であってもよい。
前記（ＩＶ）における配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号２４で表される塩基配列であってもよい。
前記（ＩＶ）における配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号２８で表される塩基配列であってもよい。
【００３０】
＜融合タンパク質の導入による不稔化＞
後述の実施例に示すように、発明者らは、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドを有するＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質、及び、配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチドを有するＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質を発現させた植物体では、雄ずい及び雌ずいが花弁化され、完全不稔化された植物体が得られることを見出した。
【００３１】
本発明の不稔化植物は、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の機能が、以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質が導入されて、欠損又は抑制されていてもよい。
本発明の不稔化植物は、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の機能が、以下の（Ｄ）〜（Ｆ）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質が導入されて、欠損又は抑制されていてもよい。
【００３２】
本発明の不稔化植物は、
前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の機能が、以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質が導入されて、欠損又は抑制されており、
前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の機能が、以下の（Ｄ）〜（Ｆ）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質が導入されて、欠損又は抑制されているものであることが好ましい。
【００３３】
（Ａ）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３に記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３に記載のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質
【００３４】
（Ｄ）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｅ）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４に記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質
（Ｆ）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４に記載のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質
【００３５】
融合タンパク質におけるＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質は、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１  ｓｈｏｒｔであることが好ましい。よって、融合タンパク質におけるＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質は、以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのタンパク質であることが好ましい。
（Ａ）配列番号１、２、３、１１、又は１３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列番号１、２、３、１１、又は１３に記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号１、２、３、１１、又は１３に記載のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質
【００３６】
融合タンパク質におけるＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質は、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２  ｓｈｏｒｔであることが好ましい。よって、本発明に係るＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質は、以下の（Ｄ）〜（Ｆ）のいずれかのタンパク質であることが好ましい。
（Ｄ）配列番号５、９、又は１４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｅ）配列番号５、９、又は１４に記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質
（Ｆ）配列番号５、９、又は１４に記載のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質
【００３７】
上記の（Ａ）〜（Ｆ）のタンパク質としては、それぞれ、本明細書中の上記（１）〜（６）の遺伝子において説明したものが挙げられる。
【００３８】
融合タンパク質において、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質が前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１  ｓｈｏｒｔであり、且つ、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質が前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２  ｓｈｏｒｔであることが好ましい。
【００３９】
＜転写抑制転換ペプチド＞
近年、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチド（以下「転写抑制転換ペプチド」ということがある。）が開発され、利用されている。転写抑制転換ペプチドの例としては、ＳＲＤＸと呼ばれる転写抑制ドメインが挙げられる。例えば、ＳＲＤＸを任意の転写因子のＣ末端に付加することにより、転写因子を転写抑制因子に変換可能である（Hiratusu et al. (2003)Plant J. 34(5):733-739）。ＳＲＤＸのアミノ酸配列は、Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａで表されるアミノ酸配列［ＬＤＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡ（配列番号６８）］である。
【００４０】
転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドとは、当該ペプチドが転写因子に付加されてなる融合タンパク質と、これを付加されていない、もともとの該転写因子とを比較して、融合タンパク質の転写活性化能を有意に低下させる機能を有するペプチドを意味する。転写活性化能を低下させるとは、転写活性化能を消失させることも包含される。当該ペプチドにより転写活性化能が低下した転写因子は、本来の転写活性化の対象の遺伝子に対する、他の転写因子による転写活性化も抑制し得ることにより、対象の遺伝子の転写が効率的に抑制され得る。また、機能重複した複数の転写因子の同時抑制も可能であり得る。
【００４１】
ペプチドが、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有しているかどうかは、例えば、解析対象の遺伝子の転写を活性化する転写因子とその発現系を準備し、当該転写因子と、当該転写因子にペプチドを付加したときとで、解析対象の遺伝子の発現を比較すること等により調べることができる。解析対象の遺伝子は、転写因子が本来転写を促進する対象の遺伝子を用いてもよく、人為的に製造されたレポーター遺伝子等を用いてもよい。
【００４２】
転写抑制転換ペプチドの配列は公知であり、これら公知の転写抑制転換ペプチドを使用できる。転写抑制転換ペプチドとして知られている配列は、前記ＳＲＤＸの他にも、ＤＬＴＬＲＬ、ＤＬＳＬＲＬ、ＤＬＳＬＳＬの配列などが知られており、これらのなかではＳＲＤＸが好ましい。
【００４３】
前記（Ａ）〜（Ｆ）のタンパク質は、転写制御機能を有する。転写制御機能とは、転写因子が有する機能である。タンパク質が転写制御機能を有しているかどうかは、公知の転写因子測定用試薬を用いた手法等により調べることができる。
【００４４】
本発明に係るＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質において、（Ａ）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質は、当該アミノ酸配列のみからなるタンパク質であってもよく、本発明に係るＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質が転写制御機能を有する範囲において、当該アミノ酸配列からなるタンパク質に任意の配列が付加されていてもよい。
本発明に係るＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質において、（Ｄ）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質は、当該アミノ酸配列のみからなるタンパク質であってもよく、本発明に係るＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質が転写制御機能を有する範囲において、当該アミノ酸配列からなるタンパク質に任意の配列が付加されていてもよい。
前記任意の配列とは、例えば、リンカー配列、タグ配列、タンパク質安定化のための修飾配列等が挙げられる。
【００４５】
本発明の融合タンパク質は、公知の手法により製造可能である。例えば、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質をコードするＤＮＡと転写抑制転換ペプチドをコードするＤＮＡとが連結された配列を、発現ベクターに組み込み、これを発現させることで、融合タンパク質を合成してもよい。または、ポリペプチド合成装置によりＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質と転写抑制転換ペプチドが連結された融合タンパク質を合成してもよい。
【００４６】
後述する≪不稔化植物の作出方法≫及び実施例において示すように、例えば、CAG Type1に係る本発明の融合タンパク質をコードする融合遺伝子、及び、CAG Type2に係る本発明の融合タンパク質をコードする融合遺伝子が植物体に導入されることで、融合タンパク質が植物内で発現し、CAG Type1遺伝子及びCAG Type2遺伝子の機能を抑制可能である。
【００４７】
＜発現を抑制させる核酸の導入による不稔化＞
発明者らは、イエギクのCAG Type1遺伝子の発現を抑制する核酸、及びイエギクのCAG Type2遺伝子の発現を抑制する核酸が導入された植物体では、雄ずい及び雌ずいが花弁化され、完全不稔化された植物体が得られることを見出した。
【００４８】
本発明の不稔化植物は、前記CAG Type1遺伝子の機能の欠損又は抑制が、前記CAG Type1遺伝子の発現を欠損又は抑制させる核酸が導入されて、欠損又は抑制されていてもよい。
本発明の不稔化植物は、前記CAG Type2遺伝子の機能の欠損又は抑制が、前記CAG Type2遺伝子の発現を欠損又は抑制させる核酸が導入されて、欠損又は抑制されていてもよい。
【００４９】
本発明の不稔化植物は、
前記CAG Type1遺伝子の機能が、前記CAG Type1遺伝子の発現を欠損又は抑制させる核酸が導入されて、欠損又は抑制されており、
前記CAG Type2遺伝子の機能が、前記CAG Type2遺伝子の発現を欠損又は抑制させる核酸が導入されて、欠損又は抑制されているものであることが好ましい。
【００５０】
遺伝子の発現を抑制させる核酸としては、ＲＮＡｉ誘導性核酸、アンチセンス核酸、リボザイム等が挙げられる。ＲＮＡｉ誘導性核酸としては、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、これらの前駆体となる核酸等が挙げられる。
【００５１】
本発明において核酸とは、ＲＮＡ、ＤＮＡの他、ＬＮＡ等の核酸アナログや、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、およびそれらの混成物も包含する意味で用いている。
【００５２】
アンチセンス核酸としては、例えば、抑制対象となる遺伝子のｍＲＮＡの配列であるセンス配列と相補的な塩基配列を有する核酸が挙げられる。
配列番号６９で表される塩基配列は、本発明に係るCAG Type1遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列である。配列番号６９で表される塩基配列のうち、７４８〜９３１番目の領域は３’ＵＴＲの領域である。
本発明に係るCAG Type1遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸は、当業者であれば、例えば、配列番号６９で表される塩基配列に基づき設計可能である。
配列番号７０で表される塩基配列は、本発明に係るCAG Type2遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列である。配列番号７０で表される塩基配列のうち、７９９〜１０１４番目の領域は３’ＵＴＲの領域である。
本発明に係るCAG Type2遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸は、当業者であれば、例えば、配列番号７０で表される塩基配列に基づき設計可能である。
【００５３】
リボザイムは、触媒活性を有するＲＮＡである。リボザイムは、標的となる核酸と反応する活性部位、及び標的となる核酸と結合する基質結合部位を有する。リボザイムとしては、例えば、基質結合部位として、抑制対象となる遺伝子のｍＲＮＡの配列と相補的な配列を有するリボザイムが挙げられる。
本発明に係るCAG Type1遺伝子の発現を抑制するリボザイムは、当業者であれば、配列番号６９で表される塩基配列に基づき設計可能である。本発明に係るCAG Type2遺伝子の発現を抑制するリボザイムは、当業者であれば、配列番号７０で表される塩基配列に基づき設計可能である。
【００５４】
ＲＮＡｉ誘導性核酸としては、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、それらの前駆体等が挙げられ、例えば、抑制対象となる遺伝子のｍＲＮＡの配列と同一の塩基配列又はその部分配列を有する二本鎖構造のＲＮＡがあげられる。抑制対象となる遺伝子の発現を抑制可能な範囲において、ＲＮＡｉ誘導性核酸は、抑制対象となる遺伝子のｍＲＮＡの配列と同一の塩基配列又はその部分配列を有する二本鎖構造のＲＮＡであってもよい。
【００５５】
欠損又は抑制されるＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子は、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１  ｓｈｏｒｔであることが好ましい。欠損又は抑制されるＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子は、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１  ｌｏｎｇであることが好ましい。
【００５６】
CAG Type1 short遺伝子の発現を抑制する核酸の一態様として、以下の（ｇ）〜（ｉ）のいずれかの核酸を挙げることができる。
（ｇ）配列番号７１で表される塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含む核酸、
（ｈ）配列番号７１で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含み、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の発現を抑制可能な核酸、
（ｉ）配列番号７１に記載の塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含み、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の発現を抑制可能な核酸
【００５７】
CAG Type2 long遺伝子の発現を抑制する核酸の一態様として、以下の（ｊ）〜（ｌ）のいずれかの核酸を挙げることができる。
（ｊ）配列番号７２で表される塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含む核酸、
（ｋ）配列番号７２で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含み、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の発現を抑制可能な核酸、
（ｌ）配列番号７２に記載の塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含み、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の発現を抑制可能な核酸
【００５８】
配列番号７１で表される塩基配列に対応するアンチセンス鎖が発現するだけでもアンチセンス核酸となり、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の発現を抑制し得る。配列番号７１で表される塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含む核酸が発現することで、２本鎖ＲＮＡが形成され、ｓｉＲＮＡの形成などにより、植物体内でサイレンシングが効率よく引き起こされる。
同様に、配列番号７２で表される塩基配列に対応するアンチセンス鎖が発現するだけでもアンチセンス核酸となり、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の発現を抑制し得る。配列番号７２で表される塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含む核酸が発現することで、２本鎖ＲＮＡが形成され、ｓｉＲＮＡの形成などにより、植物体内でサイレンシングが効率よく引き起こされる。
【００５９】
一般的に、何らかの生理機能を有する核酸は、本来の機能を損なうことなく、１〜数個の塩基配列が欠失、置換又は付加可能なことが知られている。
前記（ｈ）の核酸において、配列番号７１で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されていてもよい塩基の数は、１〜３０個が好ましく、１〜２０個がより好ましく、１〜１０個がさらに好ましく、１〜５個がさらに好ましい。
【００６０】
前記（ｉ）の塩基において、配列番号７１で表される塩基配列との同一性は、９０％以上１００％未満であり、９５％以上１００％未満であることが好ましく、９８％以上１００％未満であることがより好ましい。
塩基配列同士の同一性は、公知の各種相同性検索プログラムを用いて求めることができる。本発明における塩基配列同士の同一性は、公知の相同性検索ソフトウェアBLASTにより得られた値を採用できる。本発明における塩基配列同士の同一性は、後述する実施例に示すように市販の遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸにより得られた値を採用できる。
【００６１】
前記（ｋ）の核酸において、配列番号７２で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されていてもよい塩基の数は、１〜３０個が好ましく、１〜２０個がより好ましく、１〜１０個がさらに好ましく、１〜５個がさらに好ましい。
【００６２】
前記（ｌ）の塩基において、配列番号７２で表される塩基配列との同一性は、９０％以上１００％未満であり、９５％以上１００％未満であることが好ましく、９８％以上１００％未満であることがより好ましい。
塩基配列同士の同一性は、公知の各種相同性検索プログラムを用いて求めることができる。本発明における塩基配列同士の同一性は、公知の相同性検索ソフトウェアBLASTにより得られた値を採用できる。本発明における塩基配列同士の同一性は、後述する実施例に示すように市販の遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸにより得られた値を採用できる。
【００６３】
前記（ｇ）〜（ｌ）に示される核酸において、センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖は、該センス鎖又はその一部と完全に相補する配列からなるものが好ましいが、植物内でセンス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能で、抑制対象となる遺伝子の発現を抑制可能なものであれば、該センス鎖と部分的に相補する配列からなるものであってもよい。
【００６４】
前記（ｇ）〜（ｉ）に示される核酸において、配列番号７１で表される塩基配列からなるセンス鎖の一部とは、配列番号７１で表される塩基配列中の連続する１９個以上の塩基からなるものを例示できる。
前記（ｇ）〜（ｉ）に示される核酸において、センス鎖の一部となる配列番号７１で表される塩基配列中の連続する１９個以上の塩基長としては、抑制対象となる遺伝子によって適宜定めればよく、一例として１９〜７０１塩基程度、１００〜７０１塩基程度、３００〜７０１塩基長程度、１９〜６００塩基程度、２０〜１００塩基程度、２１〜５０塩基程度とすることができる。
前記（ｇ）〜（ｉ）に示される核酸において、センス鎖の一部となる配列番号７１で表される塩基配列中の連続する１９個以上の塩基は、配列番号７１で表される塩基配列中の５２０〜７０２番目の塩基配列からなる領域の一部（連続する１９個以上の塩基）又は全部を含むものが好ましい。配列番号７１で表される塩基配列中の５２０〜７０２番目の塩基配列からなる領域は、配列番号６９で表される塩基配列のうちの３’ＵＴＲの領域に対応する。
【００６５】
前記（ｊ）〜（ｌ）に示される核酸において、配列番号７２で表される塩基配列からなるセンス鎖の一部とは、配列番号７２で表される塩基配列中の連続する１９個以上の塩基からなるものを例示できる。
前記（ｊ）〜（ｌ）に示される核酸において、センス配列の一部となる配列番号７２で表される塩基配列中の連続する１９個以上の塩基長としては、抑制対象となる遺伝子によって適宜定めればよく、一例として１９〜７３６塩基程度、１００〜７３６塩基程度、３００〜７３６塩基程度、１９〜５００塩基程度、２０〜１００塩基程度、２１〜５０塩基程度とすることができる。
前記（ｊ）〜（ｌ）に示される核酸において、センス鎖の一部となる配列番号７２で表される塩基配列中の連続する１９個以上の塩基は、配列番号７２で表される塩基配列中の５２３〜７３７番目の塩基配列からなる領域の一部（連続する１９個以上の塩基）又は全部を含むものが好ましい。配列番号７２で表される塩基配列中の５２３〜７３７番目の塩基配列からなる領域は、配列番号７０で表される塩基配列のうちの３’ＵＴＲの領域に対応する。
【００６６】
前記（ｇ）〜（ｉ）の核酸は、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の発現を抑制する活性を有する。（ｇ）〜（ｉ）の核酸が、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の発現を抑制する活性を有しているかどうかは、常法により調べることができる。例えば、後述する実施例において例示するように、（ｇ）〜(ｉ)のいずれかの核酸が導入された植物と、（ｇ）〜(ｉ)のいずれかの核酸が導入されていない植物とを比較し、（ｇ）〜(ｉ)のいずれかの核酸が導入された植物で、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の発現量が有意に減少している場合に、（ｇ）〜(ｉ)のいずれかの核酸が、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の発現を抑制する活性を有していると判断できる。
【００６７】
前記（ｊ）〜（ｌ）の核酸は、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の発現を抑制する活性を有する。（ｊ）〜（ｌ）の核酸が、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の発現を抑制する活性を有しているかどうかは、常法により調べることができる。例えば、後述する実施例において例示するように、（ｊ）〜（ｌ）のいずれかの核酸が導入された植物と、（ｊ）〜（ｌ）のいずれかの核酸が導入されていない植物とを比較し、（ｊ）〜（ｌ）のいずれかの核酸が導入された植物で、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の発現量が有意に減少している場合に、（ｊ）〜（ｌ）のいずれかの核酸が、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の発現を抑制する活性を有していると判断できる。
【００６８】
前記（ｇ）〜（ｉ）に示される核酸は、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の発現を抑制可能なものであれば、前記各センス鎖又はその一部、及び前記各アンチセンス鎖又はその一部の他に、任意の核酸が付加されていてもよい。
前記（ｊ）〜（ｌ）に示される核酸は、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の発現を抑制可能なものであれば、前記各センス鎖又はその一部、及び前記各アンチセンス鎖又はその一部の他に、任意の核酸が付加されていてもよい。
【００６９】
前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子及びＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の発現は、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子及びＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の発現を抑制可能な核酸が導入されて、欠損又は抑制されてもよい。
ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子及びＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の発現を抑制可能な核酸の一態様として、以下の（ｍ）〜（ｏ）のいずれかの核酸を挙げることができる。
（ｍ）配列番号７１で表される塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、
配列番号７２で表される塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖又はその一部と、を含む核酸、
（ｎ）配列番号７１で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、
配列番号７２で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含み、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子及び前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の発現を抑制可能な核酸、
（ｏ）配列番号７１で表される塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、
配列番号７２で表される塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含み、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子及び前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の発現を抑制可能な核酸、
が挙げられる。
【００７０】
前記（ｍ）〜（ｏ）に示される核酸において、センス鎖、該センス鎖の一部、アンチセンス鎖としては、前記（ｇ）〜（ｌ）に示される核酸において説明したものと同様である。
【００７１】
前記（ｍ）〜（ｏ）に示される核酸は、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子及びＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の発現を抑制可能なものであれば、前記各センス鎖又はその一部、及び前記各アンチセンス鎖の他に、任意の核酸が付加されていてもよい。
【００７２】
前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子及びＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の発現を抑制可能な核酸の一例として、以下の（ｐ）〜（ｒ）のいずれかの核酸を挙げることができる。
（ｐ）配列番号７３で表される塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含む核酸、
（ｑ）配列番号７３で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含み、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子及び前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の発現を抑制可能な核酸、
（ｒ）配列番号７３で表される塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含み、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子及び前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の発現を抑制可能な核酸
【００７３】
配列番号７３で表される塩基配列は、配列番号７１で表される塩基配列及び配列番号７２で表される塩基配列が連結したものであるので、前記（ｐ）〜（ｒ）に示される核酸において、センス鎖、該センス鎖の一部、アンチセンス鎖としては、前記（ｇ）〜（ｌ）に示される核酸において説明したものと同様である。
【００７４】
前記（ｐ）〜（ｒ）に示される核酸は、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子及びＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の発現を抑制可能なものであれば、前記各センス鎖又はその一部、及び前記各アンチセンス鎖の他に、任意の核酸が付加されていてもよい。
【００７５】
前記（ｐ）の核酸としては、配列番号７４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを例示できる。
なお、配列番号７４で表される塩基配列において、１〜１４３９番目の塩基からなる部分は、アンチセンス鎖の部分であり、１４４０〜２３５８番目の塩基からなる部分は、スペーサー部分であり、２３５９〜３７９７番目に塩基からなる部分はセンス鎖の部分である。
【００７６】
後述する≪不稔化植物の作出方法≫及び実施例において示すように、例えば、CAG Type1遺伝子の発現を抑制する核酸を発現可能な核酸、及び、CAG Type2遺伝子の発現を抑制する核酸を発現可能な核酸が植物体に導入されることで、当該核酸が植物内で発現し、CAG Type1遺伝子及びCAG Type2遺伝子の発現を抑制可能である。
【００７７】
本発明の不稔化植物において、「遺伝子の機能が欠損又は抑制」されているとは、人為的な操作によって、植物が本来有する内在性の該遺伝子またはその発現を制御されることにより、該遺伝子産物の活性が欠損又は抑制されている、或いは、該遺伝子の発現が欠損又は抑制されていることを指す。
不稔化植物において遺伝子の機能が欠損又は抑制していることは、人為的な操作により作出された不稔化植物と、人為的な操作を受けていないコントロールとなる野生型等の植物と比較して判断できる。
人為的な操作とは、例えば、対象とする遺伝子の発現を欠損又は抑制させる核酸やタンパク質等が人為的に導入又は発現されることが挙げられる。
本発明の不稔化植物において、本発明に係るCAG Type1遺伝子及びCAG Type2遺伝子のそれぞれについて、該遺伝子産物の活性の欠損又は抑制の程度、或いは、該遺伝子の発現の欠損又は抑制の程度は、植物体の不稔化が達成される程度であればよく、植物体の完全不稔化が達成される程度であることが好ましい。
本発明の不稔化植物において、本発明に係るCAG Type1遺伝子及びCAG Type2遺伝子のそれぞれについて、該遺伝子産物の活性の欠損又は抑制の生じる部位、或いは、該遺伝子の発現の欠損又は抑制の生じる部位は、植物体の不稔化が達成される程度であればよく、植物体の完全不稔化が達成される程度であることが好ましい。例えば、遺伝子産物の活性が花で特異的に欠損又は抑制することで、植物の不稔化又は完全不稔化が達成されてもよい。
【００７８】
本発明及び本明細書において、不稔化とは、植物個体が有する花器官のうち一部若しくは全部の雄ずい及び／又は雌ずいの稔性が失われることである。雌性不稔化とは、植物個体が有する花器官のうち一部若しくは全部の雌ずいの稔性が失われることである。雄性不稔化とは、植物個体が有する花器官のうち一部若しくは全部の雄ずいの稔性が失われることである。完全不稔化とは、植物個体が有する花器官の全ての雄ずい及び雌ずいの稔性が失われることである 。
雄ずいの不稔化としては、雄ずいが正常に形成されず花粉が生産されないことによるもの、雄ずいが他の器官に置き換わり花粉が生産されないことによるもの、花粉は生産されたが稔性を有さないことによるもの等が挙げられる。同様に、雌ずいの不稔化としては、雌ずいが正常に形成されないことによるもの、雌ずいが他の器官に置き換わることによるもの、雌ずいは形成されるが稔性を有さないことによるもの等が挙げられる。
雄ずい側の不稔は、雄ずいが花弁等の他の器官に置き換わる等を形態観察により調べてもよく、正常個体の雌ずいとの掛け合わせにより種子が形成されるかどうかによっても容易に調べることができる。雌ずい側の不稔は、雌ずいが花弁等の他の器官に置き換わる等を形態観察により調べてもよく、正常個体の雄ずいとの掛け合わせにより種子が形成されるかどうかによっても容易に調べることができる。
【００７９】
本発明において不稔化植物とは植物体のみならず、植物体を作出した場合に不稔化されているものであれば、細胞を包含する意味で用いている。細胞は、組織又は器官の状態であってもよい。本発明において不稔化植物とは、それらの後代若しくはクローンの生物又は細胞であってもよい。例えば、前記クローンの植物体としては挿し木または挿し芽等により得られた植物体が挙げられる。
【００８０】
本発明の本発明の不稔化植物は、被子植物であることが好ましく、キク科（Asteraceae）の植物体であることがより好ましい。キク科の植物としては、キク、ガーベラ、アスター、ヒマワリ等を挙げることが出来る。好ましいキクの種類としては、一般的に栽培ギク（輪菊、中ギク、小ギク、スプレーギク、ポットマム等）、イエギク等と称されるChrysanthemum morifoliumが挙げられる。
【００８１】
本発明の不稔化植物が、
前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の機能が、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の発現を欠損又は抑制させる融合タンパク質が導入されて、欠損又は抑制されており、
前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の機能が、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の発現を欠損又は抑制させる融合タンパク質が導入されて、欠損又は抑制されているものである場合、これらの融合タンパク質は少なくとも花において発現していることが好ましい。
当該融合タンパク質を花において発現させる場合、花において特異的に融合タンパク質を発現させる転写調節領域によって、融合タンパク質を発現させてもよく、花を含む植物体全体で融合タンパク質を発現させる恒常的プロモーター等の転写調節領域によって、融合タンパク質を発現させてもよい。
恒常的プロモーターとしては、CaMV35S（カリフラワーモザイクウイルス35S）プロモーターが挙げられる。
なかでも、後述の≪融合遺伝子≫の＜転写調節領域＞において詳説する、花において転写調節可能な転写調節領域の制御下で、融合タンパク質を発現させることが好ましく、そのなかでも、後述のＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子の転写調節領域の制御下で、融合タンパク質を発現させることが好ましい。
【００８２】
本発明の不稔化植物が、
前記CAG Type1遺伝子の機能が、前記CAG Type1遺伝子の発現を欠損又は抑制させる核酸が導入されて、欠損又は抑制されており、
前記CAG Type2遺伝子の機能が、前記CAG Type2遺伝子の発現を欠損又は抑制させる核酸が導入されて、欠損又は抑制されているものである場合、これらの核酸は少なくとも花において発現していることが好ましい。
当該核酸を花において発現させる場合、花において特異的に核酸を発現させる転写調節領域によって、核酸を発現させてもよく、花を含む植物体全体で核酸を発現させる恒常的プロモーター等の転写調節領域によって、核酸を発現させてもよい。
恒常的プロモーターとしては、アクチンプロモーターが挙げられ、イエギク等と称されるChrysanthemum morifolium由来のアクチンプロモーターが好ましい。
【００８３】
≪融合タンパク質≫
本発明の融合タンパク質は、以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質である。
（Ａ）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３に記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３に記載のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質
【００８４】
また、本発明に係るＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質は、以下の（Ｄ）〜（Ｆ）のいずれかのタンパク質である。
（Ｄ）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｅ）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４に記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質
（Ｆ）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４に記載のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質
【００８５】
上記の（Ａ）〜（Ｆ）のタンパク質としては、それぞれ、本明細書中の上記≪不稔化植物≫で説明したものが挙げられる。
上記の転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドとしては、それぞれ、本明細書中の上記≪不稔化植物≫で説明したものが挙げられる。
【００８６】
≪融合遺伝子≫
本発明の融合遺伝子は、本発明の融合タンパク質をコードするものである。
【００８７】
具体的には、本発明の融合遺伝子は、
ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド、
ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００８８】
本発明に係るＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質をコードする融合遺伝子は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドである。
（ａ）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と、転写抑制転換ペプチドと、が融合してなるタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３に記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり転写制御機能を有するタンパク質と、転写抑制転換ペプチドと、が融合してなるタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３に記載のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり転写制御機能を有するタンパク質と、転写抑制転換ペプチドと、が融合してなるタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド
【００８９】
また、本発明に係るＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質をコードする融合遺伝子は、以下の（ｄ）〜（ｆ）のいずれかのポリヌクレオチドである。
（ｄ）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と、転写抑制転換ペプチドと、が融合してなるタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４に記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり転写制御機能を有するタンパク質と、転写抑制転換ペプチドと、が融合してなるタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４に記載のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり転写制御機能を有するタンパク質と、転写抑制転換ペプチドと、が融合してなるタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド
【００９０】
前記（ａ）、（ｄ）における配列番号１〜１４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、上記の＜ＣＡＧ遺伝子＞において例示したように、それぞれ配列番号１５〜２８で表される塩基配列であってもよい。
【００９１】
本発明に係るポリヌクレオチドは、公知の手法により製造可能である。例えば、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質をコードするＤＮＡと転写抑制転換ペプチドをコードするＤＮＡとを、周知の遺伝子組み換え技術を用いて連結することで得られる。ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、自然界から取得したゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１５〜２８の塩基配列に基づいて設計したプライマーにより、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質をコードするＤＮＡをＰＣＲ等により増幅し、得ることができる。転写抑制転換ペプチドは、例えばオリゴＤＮＡ合成装置により合成可能である。
【００９２】
本発明に係るＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質をコードする融合遺伝子は、該融合タンパク質をコードする塩基配列のみからなるポリヌクレオチドであってもよく、本発明に係るＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質の融合タンパク質が転写抑制作用を有する範囲において、当該塩基配列のみからなるポリヌクレオチドに任意の配列が付加されていてもよい。
本発明に係るＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質をコードする融合遺伝子は、該融合タンパク質をコードする塩基配列のみからなるポリヌクレオチドであってもよく、本発明に係るＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質の融合タンパク質が転写抑制作用を有する範囲において、当該塩基配列のみからなるポリヌクレオチドに任意の配列が付加されていてもよい。
前記任意の配列とは、例えば、リンカー配列、タグ配列、タンパク質安定化のための修飾配列等が挙げられる。
【００９３】
＜転写調節領域＞
本発明の融合遺伝子は、花において転写調節可能な転写調節領域（クラスC遺伝子のMADS-boxドメインの下流に位置する第２イントロンに相当する領域であるが、プロモーター活性を有する転写調節可能な配列）が前記融合タンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドに作動可能に連結されることが好ましい。
「作動可能に連結されている」とは、前記転写調節領域が前記融合遺伝子の発現を調節可能であることを意味する。
「転写調節領域」としては、転写開始や転写効率を制御可能な配列であり、プロモーター、エンハンサー、応答配列が挙げられる。
「花において転写調節可能な転写調節領域」とは、花を構成する細胞において前記融合遺伝子の発現を調節可能であることを意味する。より詳しくは、花において転写調節可能な転写調節領域とは、前記融合遺伝子が雄ずい及び／又は雌ずいの形成に作用可能なように転写調節可能な転写調節領域であり、花において特異的に融合遺伝子の発現をもたらし得る転写調節領域が好ましく、雄ずい及び雌ずいにおいて特異的に前記融合遺伝子の発現をもたらし得る転写調節領域あるいはプロモーターがより好ましい。
【００９４】
花において転写調節可能な転写調節領域は、ＡＧＡＭＯＵＳ遺伝子の第２イントロンに相当する転写調節領域であることが好ましい。ＡＧＡＭＯＵＳ遺伝子の第２イントロンに相当する転写調節領域は、キク科植物由来のものが好ましく、Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ  ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ由来のものがより好ましい。Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ  ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ由来のＡＧＡＭＯＵＳ遺伝子の転写調節領域は、前記ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ１  ｓｈｏｒｔ、  ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ１  ｌｏｎｇ、  ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｓｈｏｒｔ、又はＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇのいずれかの遺伝子の転写調節領域が好ましく、ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｓｈｏｒｔ、又はＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇの遺伝子の転写調節領域がより好ましい。
【００９５】
後述する実施例に示すように、発明者らはＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子の転写調節領域と本発明に係る融合遺伝子を連結し、本発明に係る融合遺伝子を発現させた植物体では、雄ずい及び雌ずいが花弁化され、完全不稔化された植物体が得られることを見出した。実施例において使用したＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子の転写調節領域の塩基配列を配列番号２９に表す。
【００９６】
本発明に係るＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子の転写調節領域は、下記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。
（Ｉ）配列番号２９で表される塩基配列、
（ＩＩ）配列番号２９で表される塩基配列のうちの１〜数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなり、且つ花において転写調節可能な活性を有する塩基配列、
（ＩＩＩ）配列番号２９で表される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有し、且つ花において転写調節可能な活性を有する塩基配列。
【００９７】
配列番号２９で表される塩基配列は、配列番号６のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子（ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子）の第２イントロン部分に相当する塩基配列である。仮に、当該配列単独でプロモーター活性を有さない場合には、当該配列は、広く転写調節領域として扱われてもよい。当該配列単独でプロモーター活性を有さない場合には、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの−６０ｂｐ  ｃｏｒｅ領域をＴＡＴＡ−ｂｏｘのコア領域等のコアプロモーター領域を併用し、本発明に係る転写調節領域として利用してもよい。
【００９８】
本発明に係る遺伝子は、配列番号２９で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドの下流に、本発明に係る融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが結合されることが好ましい。
【００９９】
一般的に、何らかの生理機能を有するポリヌクレオチドは、本来の機能を損なうことなく、１〜数個の塩基を欠失、置換若しくは付加可能なことが知られている。
前記（ＩＩ）の塩基配列において、配列番号２９に記載の塩基配列に対して欠失、置換又は付加されていてもよいヌクレオチドの数は、１〜３０個が好ましく、１〜２０個がより好ましく、１〜１０個がさらに好ましく、１〜５個がさらに好ましい。
【０１００】
前記（ＩＩＩ）の塩基配列において、配列番号２９に記載の塩基配列と同一性は、８０％以上１００％未満であり、８５％以上１００％未満が好ましく、９０％以上１００％未満がより好ましく、９５％以上１００％未満がさらに好ましく、９８％以上１００％未満がさらに好ましい。
【０１０１】
塩基配列同士の同一性は、公知の各種相同性検索プログラムを用いて求めることができる。本発明における塩基配列同士の同一性は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＮにより得られた値を採用できる。本発明における塩基配列同士の同一性は、後述する実施例に示すように市販の遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸにより得られた値を採用できる。
【０１０２】
本発明に係る転写調節領域であるポリヌクレオチドにおいて、（Ｉ）配列番号２９で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、当該塩基配列のみからなるポリヌクレオチドであってもよく、本発明に係る転写調節領域であるポリヌクレオチドが花において転写調節可能な活性を有する範囲において、当該塩基配列からなるヌクレオチドに任意の配列が付加されていてもよい。
前記任意の配列とは、例えば、リンカー配列、タグ配列、タンパク質安定化のための修飾配列等が挙げられる。
【０１０３】
＜転写調節領域と遺伝子との組み合わせ＞
本発明に係る融合遺伝子において、花において転写調節可能な転写調節領域と、融合タンパク質におけるＣＡＧタンパク質の遺伝子と、の組み合わせは制限されるものではないが、以下の組み合わせが挙げられる。
ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ１  ｓｈｏｒｔ遺伝子の転写調節領域と、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１  ｓｈｏｒｔタンパク質との組み合わせ、
ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ１  ｌｏｎｇ遺伝子の転写調節領域と、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１  ｓｈｏｒｔタンパク質との組み合わせ、
ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｓｈｏｒｔ遺伝子の転写調節領域と、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１  ｓｈｏｒｔタンパク質との組み合わせ、
ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子の転写調節領域と、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１  ｓｈｏｒｔタンパク質との組み合わせ、
ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ１  ｓｈｏｒｔ遺伝子の転写調節領域と、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１  ｌｏｎｇタンパク質との組み合わせ、
ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ１  ｌｏｎｇ遺伝子の転写調節領域と、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１  ｌｏｎｇタンパク質との組み合わせ、
ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｓｈｏｒｔ遺伝子の転写調節領域と、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１  ｌｏｎｇタンパク質との組み合わせ、
ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子の転写調節領域と、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１  ｌｏｎｇタンパク質との組み合わせ、
ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ１  ｓｈｏｒｔ遺伝子の転写調節領域と、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２  ｓｈｏｒｔタンパク質との組み合わせ、
ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ１  ｌｏｎｇ遺伝子の転写調節領域と、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２  ｓｈｏｒｔタンパク質との組み合わせ、
ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｓｈｏｒｔ遺伝子の転写調節領域と、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２  ｓｈｏｒｔタンパク質との組み合わせ、
ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子の転写調節領域と、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２  ｓｈｏｒｔタンパク質との組み合わせ、
ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ１  ｓｈｏｒｔ遺伝子の転写調節領域と、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇタンパク質との組み合わせ、
ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ１  ｌｏｎｇ遺伝子の転写調節領域と、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇタンパク質との組み合わせ、
ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｓｈｏｒｔ遺伝子の転写調節領域と、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇタンパク質との組み合わせ、
ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子の転写調節領域と、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇタンパク質との組み合わせ。
【０１０４】
上記の組み合わせのなかでは、ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子の転写調節領域と、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１  ｓｈｏｒｔタンパク質の組み合わせ、又はＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子の転写調節領域と、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２  ｓｈｏｒｔタンパク質の組み合わせ好ましい。
ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子の転写調節領域、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１  ｓｈｏｒｔタンパク質、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２  ｓｈｏｒｔタンパク質としては、それぞれ、本明細書中で上記に説明したものが挙げられる。
【０１０５】
本発明に係る転写調節領域であるポリヌクレオチドは、公知の手法により製造可能である。例えば、自然界から取得したゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号２９の塩基配列に基づいて設計したプライマーにより、ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子の転写調節領域であるＤＮＡをＰＣＲ等により増幅し、得ることができる。
【０１０６】
≪ベクター≫
本発明のベクターは、本発明の融合遺伝子を含むベクターであり、宿主細胞において、本発明の融合タンパク質を発現し得る発現ベクターとなり得る。
前記発現ベクターとしては、プロモーター配列を有するＤＮＡ、本発明に係る融合タンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、ターミネーター配列を有するＤＮＡを含むベクターが挙げられ、これらが上流から順に連結されてなるＤＮＡを含むベクターが好ましい。本発明のベクターは、本発明の融合遺伝子の他に、薬剤耐性配列等の配列を有していてもよい。
【０１０７】
本発明のベクターは、本発明の融合遺伝子として、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質をコードする融合遺伝子、及びＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質をコードする融合遺伝子を含むことが好ましい。ここで、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質としては、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１  ｓｈｏｒtタンパク質が好ましく、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質としては、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２  ｓｈｏｒtタンパク質が好ましい。
【０１０８】
本発明のベクターは、周知の遺伝子組み換え技術を用いて、本発明の融合遺伝子をベクターに組み込むことで製造可能である。本発明の融合遺伝子を組み込む際には、市販の発現用ベクター作製キットを用いてもよい。
【０１０９】
≪形質転換体≫
本発明の形質転換体は、本発明の融合タンパク質を発現するものであり、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質、又はＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質を発現するものである。
本発明の形質転換体は、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質、及びＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質を発現するものが好ましい。
【０１１０】
本発明の形質転換体は、本発明の融合タンパク質が、花において転写調節可能な転写調節領域の制御下で発現するものであることが好ましい。花において転写調節可能な転写調節領域としては、上記のものが挙げられ、上記のＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子の転写調節領域が好ましい。
【０１１１】
本発明の形質転換体は、後述する≪不稔化植物の作出方法≫及び実施例において示すように、公知の遺伝子組み換え技術を用いて作出可能である。
【０１１２】
本発明において形質転換体とは生物個体のみならず細胞を包含する意味で用いている。細胞は、組織又は器官の状態であってもよい。形質転換体は、植物体、植物細胞、植物の組織又は植物の器官であることが好ましい。本発明において形質転換体とは、本発明の融合タンパク質を発現する限りにおいて、形質転換体として作製された生物又は細胞は、それらの後代若しくはクローンの生物又は細胞であってもよい。例えば、前記クローンの植物体としては挿し木により得られた植物体が挙げられる。
【０１１３】
本発明の形質転換体は、被子植物であることが好ましく、キク科（Asteraceae）の植物体であることがより好ましい。キク科の植物としては、キク、ガーベラ、アスター、ヒマワリ等を挙げることが出来る。好ましいキクの種類としては、一般的に栽培ギク（輪菊、中ギク、小ギク、スプレーギク、ポットマム等）、イエギク等と称されるChrysanthemum morifoliumが挙げられる。
【０１１４】
≪不稔化植物の作出方法≫
後述の実施例に示すように、発明者らは、本発明に係る融合タンパク質を発現させた植物体では、雄ずい及び雌ずいが花弁化され、完全不稔化された植物体が得られることを見出した。また、後述の実施例に示すように、発明者らは、本発明に係る、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子及びＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の発現を欠損又は抑制させる核酸を発現させた植物体では、雄ずい及び雌ずいが花弁化され、完全不稔化された植物体が得られることを見出した。
【０１１５】
本発明の不稔化植物の作出方法は、植物内において、以下の（１）〜（３）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の機能を欠損又は抑制させ、以下の（４）〜（６）のいずれかのＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の機能を欠損又は抑制させることを含むものである。
【０１１６】
（１）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（２）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（３）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
【０１１７】
（４）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（５）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（６）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
【０１１８】
上記の（１）〜（６）の遺伝子としては、それぞれ、本明細書中の上記≪不稔化植物≫で説明したものが挙げられる。
【０１１９】
本発明の不稔化植物の作出方法は、植物内において、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子及びＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の機能を、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質、及びＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質を発現させることによって、欠損又は抑制するものであることが好ましい。
【０１２０】
融合タンパク質としては、それぞれ、本明細書中の上記≪不稔化植物≫で説明したものが挙げられる。
【０１２１】
本発明の不稔化植物の作出方法は、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の機能を、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の発現を欠損又は抑制させる核酸を植物に導入することによって、欠損又は抑制し、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の機能を、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の発現を欠損又は抑制させる核酸を植物に導入することによって、欠損又は抑制するものであることが好ましい。
【０１２２】
遺伝子の発現を抑制させる核酸としては、それぞれ、本明細書中の上記≪不稔化植物≫で説明したものが挙げられる。
【０１２３】
前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の発現を抑制する核酸が、以下の（ｇ）〜（ｉ）のいずれかの核酸であり、
前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の発現を抑制する核酸が、以下の（ｊ）〜（ｌ）のいずれかの核酸である、請求項１７に記載の不稔化植物の作出方法。
（ｇ）配列番号７１で表される塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含む核酸、
（ｈ）配列番号７１で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含み、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の発現を抑制可能な核酸、
（ｉ）配列番号７１に記載の塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含み、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１遺伝子の発現を抑制可能な核酸、
（ｊ）配列番号７２で表される塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含む核酸、
（ｋ）配列番号７２で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含み、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の発現を抑制可能な核酸、
（ｌ）配列番号７２に記載の塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含み、前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２遺伝子の発現を抑制可能な核酸、
であることが好ましい。
【０１２４】
上記の（ｇ）〜（ｌ）の核酸としては、それぞれ、本明細書中の上記≪不稔化植物≫で説明したものが挙げられる。
【０１２５】
融合タンパク質を発現させることによって、不稔化植物を作出する場合、融合タンパク質を導入してもよく、融合タンパク質をコードする融合遺伝子を植物体に導入し、植物体内で融合タンパク質を発現させてもよい。
遺伝子の発現を抑制させる核酸を植物体に導入することによって、不稔化植物を作出する場合、当該核酸を植物体に導入してもよく、当該核酸を発現可能な遺伝子を植物体に導入し、植物体内で当該核酸を発現させてもよい。
【０１２６】
融合遺伝子は、融合タンパク質を発現可能なベクターの状態で、植物体に導入されてもよい。
より詳しくは、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質をコードする遺伝子を含むベクター、及びＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターが導入されたものであってもよい。
或いは、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質をコードする遺伝子、及びＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターが導入されたものであってもよい。
【０１２７】
融合遺伝子は、上述の≪不稔化植物≫で例示した、種々の転写調節領域と連結されて、転写調節領域の制御下で発現させることができる。
【０１２８】
遺伝子の発現を抑制させる核酸を発現可能な遺伝子は、該遺伝子を発現可能なベクターの状態で、植物体に導入されてもよい。
より詳しくは、CAG Type1遺伝子の発現を抑制する核酸を発現可能な遺伝子を含むベクター、及びCAG Type2遺伝子の発現を抑制する核酸を発現可能な遺伝子を含むベクターが導入されたものであってもよい。
或いは、CAG Type1遺伝子の発現を抑制する核酸を発現可能な遺伝子、及びCAG Type2遺伝子の発現を抑制する核酸を発現可能な遺伝子を含むベクターが導入されたものであってもよい。
【０１２９】
遺伝子の発現を抑制させる核酸を発現可能な遺伝子は、上述の≪不稔化植物≫で例示した、種々の転写調節領域と連結されて、転写調節領域の制御下で発現させることができる。
【０１３０】
発現ベクターを用いて形質転換体を作出する方法は、特に限定されず、当技術分野で通常行われている方法により行うことが可能である。当該方法としては、例えば、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法が挙げられ、アグロバクテリウム法が好ましい。
【０１３１】
導入された遺伝子の発現を抑制させる核酸は、ゲノム上に導入されていてもよく、ゲノム上に導入されていなくてもよいが、ゲノム上に導入されることが好ましい。
【０１３２】
遺伝子の発現を抑制する核酸を導入する対象の植物としては、植物体、植物細胞、植物培養細胞、カルス等が挙げられる。
【０１３３】
不稔化植物は、被子植物であることが好ましく、キク科（Asteraceae）の植物体であることがより好ましい。キク科の植物としては、キク、ガーベラ、アスター、ヒマワリ等を挙げることが出来る。好ましいキクの種類としては、一般的に栽培ギク（輪菊、中ギク、小ギク、スプレーギク、ポットマム等）、イエギク等と称されるChrysanthemum morifoliumが挙げられる。
【実施例】
【０１３４】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【０１３５】
１-１．遺伝子の単離
まず、イエギク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ  ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ）の“セイマリン”の雄蕊および雌蕊から抽出した総ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによりｃDNAを得た。
プライマー：５’‐AAAGGGAGTGATTAAGAGGGTTTGC‐３’（配列番号：３０）とプライマー：５’‐CTTAGGACACACATTGTTCACACGC‐３’（配列番号：３１）を用いて前記ｃＤＮＡから配列を増幅し、配列番号１５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドを得た。以下の各配列番号で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドの増幅に使用したプライマーの配列を表２に示す。
【０１３６】
【表２】
0006713166.tif 000003
【０１３７】
得られた配列番号１５〜２８で表される塩基配列を含む配列からオープンリーディングフレームを推定し、それらをアミノ酸配列に変換し、配列番号１〜１４で表されるアミノ酸配列を得た。
【０１３８】
それらのアミノ酸配列に基づき、GENETYX（Ver．8）を使用して、系統樹を作成した。GENETYXでの作製条件は、Neighbor-Joining Method(近隣結合法)で、bootstrap値（10000）、その他デフォルト値である。得られた系統樹を図１に示す。
配列番号１，２，３，１１，１３で表されるアミノ酸配列がひとまとまりの群を形成したため、これらをＣＡＧ  Ｔｙｐｅ  １  ｓｈｏｒｔとした。
配列番号８，１２で表されるアミノ酸配列がひとまとまりの群を形成したため、これらをＣＡＧ  Ｔｙｐｅ  １  ｌｏｎｇとした。
配列番号５，９，１４で表されるアミノ酸配列がひとまとまりの群を形成したため、これらをＣＡＧ  Ｔｙｐｅ  ２  ｓｈｏｒｔとした。
配列番号４，６，７，１０で表されるアミノ酸配列がひとまとまりの群を形成したため、これらをＣＡＧ  Ｔｙｐｅ  ２  ｌｏｎｇとした。
【０１３９】
ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ１に分類されたアミノ酸配列とＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２に分類されたアミノ酸配列との間では、各アミノ酸配列の同一性は８４〜８８％の範囲内であった。
ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ１  ｓｈｏｒｔに分類されたアミノ酸配列とＣＡＧ  Ｔｙｐｅ１  ｌｏｎｇに分類されたアミノ酸配列との間では、各アミノ酸配列の同一性は９８〜９９％の範囲内であった。
ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｓｈｏｒｔに分類されたアミノ酸配列とＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇに分類されたアミノ酸配列との間では、各アミノ酸配列の同一性は９８〜９９％の範囲内であった。
【０１４０】
１-２．発現解析
単離した１４遺伝子の、特に４種に分類した群に含まれる遺伝子同士の配列は非常に似ているため、４種に分類した群全体の遺伝子の配列をＲＴ−ＰＣＲで解析した。ＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーの配列を表３に示す。
【０１４１】
【表３】
0006713166.tif 000004
【０１４２】
イエギクの“セイマリン”の葉、がく、花床、舌状花の花弁、舌状花の雌ずい、管状花の花弁、管状花の雌ずい、管状花の雄ずいから抽出した総ＲＮＡに対し、それぞれＲＴ−ＰＣＲを行った。
図２に、ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ１  ｓｈｏｒｔ、ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｓｈｏｒｔ、ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ１  ｌｏｎｇの遺伝子の発現が、舌状花の雌ずい、管状花の雄ずい、管状花の雌ずいにおいて確認された。ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ１  ｌｏｎｇの遺伝子の発現は弱いながらも、舌状花の雌ずい、管状花の雄ずい、管状花の雌ずいにおいて確認された。
【０１４３】
２−１．転写調節領域の単離
イエギクの“セイマリン”からＤＮＡを抽出し、プライマー：５’‐ATGGCAAATTCTGATGCTTTT‐３’（配列番号：６６）とプライマー：５’‐TTACACTAACTGGAGAGGAGTTTGG‐３’（配列番号：６７）を用いて前記ｃＤＮＡから配列を増幅し、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と、エキソン、イントロンの領域を推定し、配列番号６のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子（ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子）のイントロン部分の塩基配列である、配列番号２９で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドを得た。
【０１４４】
２−２．転写調節の確認
配列番号２９で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドの下流にＧＵＳレポーター遺伝子を連結したＤＮＡ断片を、ベクター（pBI121）上の35Sプロモーター配列と置換し、バイナリーベクターを作製した。このバイナリーベクターをアグロバクテリウムに導入し、次いでこのアグロバクテリウムを用いて、アグロバクテリウム法によりイエギクの“セイマリン”に導入し形質転換体を作製した。
得られた形質転換体におけるＧＵＳレポーター遺伝子の発現を、常法により解析した。結果を図３に示す。舌状花では、舌状花弁の基部に付随した雌ずいのみがで染色が確認された。筒状花では、筒状花（上図）の花弁を除くと、花弁の内側にある雄ずいと雌ずい全体（下図）が、どちらも染色されているのが確認された。一方、葉や茎では染色が確認されなかった。以上のことから、配列番号２９で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドが、雄蕊および雌蕊において特異的な転写調節活性を有することが明らかとなった。
【０１４５】
３−１．キク形質転換体の作出
上記で得た配列番号１５で表される塩基配列からなるＤＮＡ（ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ１  ｓｈｏｒｔ遺伝子（配列番号１））とＳＲＤＸ（転写抑制転換ペプチド）とを連結し、融合遺伝子ＣＡＧ１Ｓ（ｎｏ．１）−ＳＲＤＸを作製した。ＣＡＧ１Ｓ（ｎｏ．１）−ＳＲＤＸに、さらに配列番号２９で表される塩基配列からなるＤＮＡ［配列番号６のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子（ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子）の転写調節領域］を連結した。
上記で得た配列番号１９で表される塩基配列からなるＤＮＡ（ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｓｈｏｒｔ遺伝子（配列番号５））とＳＲＤＸ（転写抑制転換ペプチド）とを連結し、融合遺伝子ＣＡＧ２ｓ（ｎｏ．５）−ＳＲＤＸを作製した。ＣＡＧ２ｓ（ｎｏ．５）−ＳＲＤＸに、さらに配列番号２９で表される塩基配列からなるＤＮＡ［配列番号６のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子（ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子）の転写調節領域］を連結した。
上記の融合遺伝子ＣＡＧ１Ｓ（ｎｏ．１）−ＳＲＤＸを含むＤＮＡ断片とＣＡＧ２  ｓ（ｎｏ．５）−ＳＲＤＸを含むＤＮＡ断片とを連結した。
図４に上記で作製された、２つの融合遺伝子が連結された発現カセットを模式的に示す。
図４中、３５Ｓｃｏｒｅは、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）  の３５Ｓプロモーターのコアプロモーター配列を示す。ＡＤＨ５’は、ＡＤＨ（Ａｌｃｏｈｏｌ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子由来の５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）配列を示す。ＨＳＰｔｒｅｒは、ＨＳＰ（Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子由来のｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを示す。
【０１４６】
この図４に示す発現カセットを、ベクター（P35SSRDXG2）上のHindIII/EcoRIサイトの位置と置換し、LR反応にてpBCKKベクターに導入したバイナリーベクターを、アグロバクテリウムに導入し、次いでこのアグロバクテリウムを用いて、アグロバクテリウム法によりイエギクの“セイマリン”に導入し形質転換体（５２２１−５系統）を作製した。
【０１４７】
３−２．キク形質転換体の形質
得られた形質転換体（５２２１−５系統）の花の形態を図５に示す。形質転換体（５２２１−５系統）の花は、コントロールのイエギクの“セイマリン”（野生型）の花と比較して、舌状花と管状花の配置は保たれており、萼と花弁の形成が繰り返される態様を伴わない、キクの花特有の形態を有する美しいものであった。
一方で、形質転換体（５２２１−５系統）では、雌しべが完全に花弁化しており、また雄ずいが完全に花弁化していた。その結果、形質転換体（５２２１−５系統）では完全不稔化されていた。
このように、本発明に係るキクは、キク特有の花の姿が持つ鑑賞性の高さと完全不稔性とを兼ね備えた非常に有用な植物体であった。
【０１４８】
形質転換体（５２２１−５系統）を切り戻し、再花させても完全不稔形質は維持されていた。形質転換体（５２２１−５系統）は完全不稔化のため種ができず、挿し木又は培養植物として植物個体を維持した。
【０１４９】
４−１．キク形質転換体の作出
上記の通り、イエギク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ  ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ）の“セイマリン”の雄蕊および雌蕊から抽出した総ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによりｃDNAを得た。
その後、プライマー：５’‐atgtctttaccggaaaatgactcgg‐３’（配列番号：７５）とプライマー：５’‐tgaggataaacaagttatttcttag‐３’（配列番号：７６）を用いて前記ｃＤＮＡから配列を増幅し、配列番号６９で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドを得た。
プライマー：５’‐atggcaagttctgatgcttttgag‐３’（配列番号：７７）とプライマー：５’‐tttagatagattgcatacataatacg‐３’（配列番号：７８）を用いて前記ｃＤＮＡから配列を増幅し、配列番号７０で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドを得た。
【０１５０】
図６に示すように、上記で得た配列番号６９（CAG Type1 shortのcDNAの配列）に基づき、MADS domainを含まないように、配列番号６９の部分配列である配列番号７１で表される702bの塩基配列を選出した。
図６に示すように、上記で得た配列番号７０（CAG Type2 longの cDNAの配列）に基づき、MADS domainを含まないように、配列番号７０の部分配列である配列番号７２で表される737bの塩基配列を選出した。
【０１５１】
プライマー：５’‐aaaAAGCTTgctccatgaaacgtataggatg‐３’（配列番号：７９、大文字部はHindIII制限酵素サイト）とプライマー：５’‐ AAAggatccCATcttatgttatctatatttac‐３’（配列番号：８０、ggatccはBamHI制限酵素サイト）を用いて、前記Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ  ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ由来のゲノミックDNAから配列を増幅し、配列番号８２で表されるアクチンプロモーター（CmACT promoter）のポリヌクレオチドを得た。
上記で得られたアクチンプロモーター（CmACT promoter）の下流に、配列番号７２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ（CAG Type2 longのアンチセンス鎖の部分配列）と、配列番号７１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ（CAG Type1 shortのアンチセンス鎖の部分配列）と、スペーサーとして配列番号８１で表される塩基配列からなるＤＮＡ（GUS遺伝子の配列）と、配列番号７１で表される塩基配列からなるＤＮＡ（CAG Type1 shortのセンス鎖の部分配列）と、配列番号７２で表される塩基配列からなるＤＮＡ（CAG Type2 longのセンス鎖の部分配列）と、ＨＳＰterとを、この順に連結し、配列番号７４で表される塩基配列からなるDNAを得た（図７）。
【０１５２】
この図７に模式的に示す発現カセットを、ベクター（P35SSRDXG-HSPter）上のHindIII/SalIサイト（図８）の位置と置換し、LR反応にてpBCKKベクター（図９）に導入したバイナリーベクターを、アグロバクテリウムに導入し、次いでこのアグロバクテリウムを用いて、アグロバクテリウム法によりキクに導入し、形質転換体（5275-12系統  組換えキク）を作製した。
【０１５３】
４−２．キク形質転換体の形質
得られた形質転換体（５２７５−１２系統）の花の形態を図１０に示す。形質転換体（５２７５−１２系統）の花は、コントロールのイエギクの“セイマリン”（野生型）の花と比較して、舌状花と管状花の配置は保たれており、萼と花弁の形成が繰り返される態様を伴わない、キクの花特有の形態を有する美しいものであった。
一方で、形質転換体（５２７５−１２系統）では、雌しべが完全に花弁化しており、また雄ずいが完全に花弁化していた。その結果、形質転換体（５２７５−１２系統）では完全不稔化されていた。
このように、本発明に係るキクは、キク特有の花の姿が持つ鑑賞性の高さと完全不稔性とを兼ね備えた非常に有用な植物体であった。
【０１５４】
形質転換体（５２７５−１２系統）を切り戻し、再花させても完全不稔形質は維持されていた。形質転換体（５２７５−１２系統）は完全不稔化のため種ができず、挿し木又は培養植物として植物個体を維持した。
【０１５５】
以上で説明した各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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