(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚バリア機能を改善するため、ならびに／または皮膚の老化を予防および／もしくは軽減するため、ならびに／または前記皮膚を保湿するための候補化合物をスクリーニングするｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、
ａ．少なくとも１つの試験化合物を角化細胞の試料と接触させるステップ、
ｂ．前記角化細胞においてｕｃ．２９１の発現または活性を測定するステップ、
ｃ．未処理角化細胞と比較して、ａで処理した前記角化細胞において、ｕｃ．２９１の発現の少なくとも２０％の活性化、またはｕｃ．２９１の活性の少なくとも２０％の活性化が測定される化合物を選択するステップ、
を含む、方法。
【請求項２】
ステップｂが、ステップａの前および後に実行されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ａ’．角化細胞の少なくとも２つの試料を調製するステップ、
ａ．前記試料の１つを少なくとも１つの試験化合物と接触させるステップ、次いで
ｂ．前記試料においてｕｃ．２９１の前記発現または前記活性を測定するステップ、および
ｃ．前記未処理角化細胞の試料と比較して、ａで処理した前記角化細胞において、ｕｃ．２９１の前記発現の少なくとも２０％の活性化、またはｕｃ．２９１の前記活性の少なくとも２０％の活性化が測定される前記化合物を選択するステップ、
を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記試験化合物が、植物抽出物から選択されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ステップｃで測定されるｕｃ．２９１の発現または活性の前記活性化が、少なくとも５０％であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚バリア機能を改善するため、ならびに／または老化を予防および／もしくは軽減するため、ならびに／または皮膚を保湿するためのｕｃ．２９１の発現または活性を活性化する化合物の同定および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ、２００ヌクレオチドを超える転写産物）は、重要な生物学的機能を果たし、組織特異的様式で発現され、皮膚を含む多くの器官における生理的および病理学的状態に関わる。ｎｃＲＮＡは、構造（例えば、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、または核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ））、調節（例えば、ｍｉＲＮＡ、またはｐｉｗｉ−相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ））、およびセンス／アンチセンス転写産物からなる幅広いクラスの転写産物であり、それらの機能はほとんど未同定のままである。そのカテゴリーに収まる多数の転写産物がしばらくの間研究されてきた一方で（例えば、Ｘｉｓｔ）、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）が非常に多くのＲＮＡサブクラスを表すという認識は、比較的最近であり、ゲノムワイドなトランスクリプトーム研究に由来する（Ｗａｎｇら、２０１１）。
【０００３】
ｌｎｃＲＮＡは、少なくともｍＲＮＡと同程度ほどあると推定され、ｍＲＮＡのように、それらの発現レベルおよびパターンは多くの場合組織特異的である。配列、構造およびサイズにおける異種性は、ｌｎｃＲＮＡの広範に異なる細胞内局在性と共に、多数の細胞プロセスにおけるそれらの関与を示す（Ｃｌａｒｋら、２０１１）。核において、いくつかのｌｎｃＲＮＡは転写を阻害または活性化することが示され、このことは、他のｎｃＲＮＡと対照的に、転写の基本的特徴を表すと考えられる。反対に、クロマチン構造は、ｌｎｃＲＮＡと共に遺伝子発現を調整する役割を果たすと考えられる（Ｗａｎｇら、２０１１）。表皮発達および角化細胞分化においても、クロマチン再形成および転写機構は、遺伝子活性化およびサイレンシングの組織特異的なパターンを確立するために、高度に組織化された様式で発現されるという事実を支持するいくつかの証拠がある（Ｆｅｓｓｉｎｇら、２０１１）。
【０００４】
紫外線などの外部からの攻撃に対してバリアを構成する皮膚組織を考慮すると、このバリアを効果的に維持するため、例えば遺伝子活性化およびサイレンシングの組織特異的なパターンを維持するための活性剤を提案する必要性が常に存在する。皮膚は、主に３層、すなわち最上層から順に、表皮、真皮および皮下組織からなる。表皮は、特に、角化細胞（大部分）、メラニン細胞（皮膚の色素沈着に関わる）およびランゲルハンス細胞からなる。その機能は、体を外部環境から保護し、その完全性を保証すること、特に微生物または化学物質の侵入および皮膚に含有される水分の蒸発を防ぐことである。
【０００５】
これを行うために、角化細胞は、増殖の過程を経た後、連続的な方向性を持った成熟の過程を経て、その過程の間に表皮の基底層に存在する角化細胞は分化の最終ステージで角質細胞を形成する。この角質細胞は、表皮セラミドのようなタンパク質および脂質からなる角質鞘の形で全体的に角質化した死細胞である。この分化過程の間、角質細胞間（intercorneocytic）表皮脂質も形成され、次いで角質層（stratum corneum）中の二重層（ラメラ）の形態で組織化され、上記の角質鞘と共に表皮のバリア機能に関与する。
【０００６】
しかし、表皮のバリア機能は、ある種の気候条件（例えば低温および／または風の影響下）またはストレスもしくは疲労の影響下でかき乱される場合があり、これにより特にアレルゲン、刺激物または微生物の侵入が促進される。これらの外的要因は、皮膚の乾燥（皮膚が浸透性を失い、脱水状態になり、その経表皮の水分損失が増加する）および熱感または赤色感の原因となる場合もあり、顔色の輝きおよび皮膚の柔軟性を損なう原因となる場合もある。皮膚バリアの損傷は、微小なあかぎれ（microchapping）または微小亀裂の出現を促す場合もある。さらに、増殖および分化過程の機能不全に起因してバリア形成が不完全になると、皮膚は、ＵＶ照射またはあらゆる他のタイプの外部からの攻撃から保護されなくなる。次いで、皮膚に浸透する紫外線は、様々な標的に有害作用を及ぼし得るフリーラジカルを生成する場合があり、例えば、それぞれコラーゲンおよびエラスチンの分解に関与するコラゲナーゼおよびエラスターゼを活性化させ、これにより皮膚の弾力性および硬さを低下させ、しわを形成する。
【０００７】
この現象を防止または補正するために、皮膚に存在する水分を吸収してその蒸発を妨げるように意図された糖またはポリオールのような吸湿剤を含有する皮膚化粧用組成物を皮膚に塗布することが行われることが公知である。従来、水の蒸発を妨げるのに寄与する密封フィルムが皮膚上に形成されることを可能にする脂肪性物質が使用されてきた。さらに、これらの組成物は、皮膚代謝回転過程、特に角化細胞分化、表皮脂質合成および角質細胞凝集、または皮膚の天然保湿因子（ＮＭＦ）成分の内因性合成、特にプロテオグリカンの合成のいずれかに関与する、１つまたは複数の様々な生物学的標的に作用する活性剤を取り入れる場合が非常に多い。
【０００８】
しかし、皮膚の不快感、刺痛感、硬直感、そう痒、熱感もしくは赤色感、および／または微小なあかぎれもしくは微小亀裂の出現、および／または顔色の輝きの損失もしくはくすんだ顔色、および／または皮膚の柔軟性の損失を予防および／または低減するため、および／またはＵＶに対する表皮の保護を改善するための皮膚のバリア機能を強化する新規な化粧品活性剤を提案する必要性が常に存在する。
【発明の概要】
【０００９】
本発明者らは、驚いたことに、角化細胞分化の間に特異的に上方制御されるｌｎｃＲＮＡを同定した。このｌｎｃＲＮＡは、ヒト、ラットおよびマウスゲノムのオーソログ領域の間で極めて高い保存を示す領域から転写され（Ｂｅｊｅｒａｎｏら、２００４ａ；Ｂｅｊｅｒａｎｏら、２００４ｂ）、「転写超保存領域」（Ｔ−ｕｃ）または超保存遺伝子と呼ばれるファミリーに属し、これらの転写産物は１００〜２００ヌクレオチドの範囲である（Ｃａｌｉｎら、２００７）。それらの顕著な進化上の保持は、広範な生理学的反応において深遠な生物学的役割を示唆している。
【００１０】
このｌｎｃＲＮＡはｕｃ．２９１であり、プロ分化ｌｎｃＲＮＡである。ｕｃ．２９１を欠いている角化細胞は、角化細胞分化の遅延および増殖の増加を示す。実施例に示すように、ｕｃ．２９１は角化細胞の核に非常に存在し、サーファクタントタンパク質Ｄ（ＳＦＴＰＤ）、ジンクフィンガーＭＩＺタイプ（ＺＭＩＺ１）および８含有ジンクフィンガーＳＷＩＭタイプ（ＺＳＷＩＭ８）の転写エンハンサーとして働く。
【００１１】
このｌｎｃＲＮＡｕｃ．２９１は、皮膚バリア機能の状態のマーカーとして使用される場合がある。
【００１２】
したがって本発明は、前記ｕｃ．２９１を使用して、皮膚バリア機能を改善するため、ならびに／または皮膚の老化を予防および／もしくは軽減するため、ならびに／または皮膚を保湿するために有用な薬剤を同定する方法を提供する。
【００１３】
したがって本発明は、皮膚バリア機能を改善するため、ならびに／または皮膚の老化を予防および／もしくは軽減するため、ならびに／または皮膚を保湿するための候補化合物をスクリーニングするｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、
ａ．少なくとも１つの試験化合物を角化細胞の試料と接触させるステップ、
ｂ．前記角化細胞においてｕｃ．２９１の発現または活性を測定するステップ、
ｃ．未処理角化細胞と比較して、ａで処理した角化細胞において、ｕｃ．２９１の発現の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％の活性化、またはｕｃ．２９１の活性の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％の活性化が測定される化合物を選択するステップ
を含む、方法に関する。
【００１４】
第１の実施形態によれば、ステップｂはステップａの前および後に実行される。この場合、ステップａの前に角化細胞で測定されたｕｃ．２９１の発現または活性は、対照値に相当する（すなわち、未処理角化細胞）。したがって、ステップｃは、ステップａの前の同一の角化細胞と比較して、ａで処理した角化細胞において、ｕｃ．２９１の発現の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％の活性化、またはｕｃ．２９１の活性の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％の活性化が測定される化合物の選択を含む。
【００１５】
別の実施形態によれば、方法は角化細胞の試料を調製する第１のステップａ’を含む。したがって、好ましくは、本発明は、皮膚バリア機能を改善するため、ならびに／または皮膚の老化を予防および／もしくは軽減するため、ならびに／または皮膚を保湿するための候補化合物をスクリーニングするｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、
ａ’．好ましくは老化前の角化細胞の少なくとも２つの試料を調製するステップ、
ａ．試料の１つを少なくとも１つの試験化合物と接触させるステップ、次いで
ｂ．前記試料においてｕｃ．２９１の発現または活性を測定するステップ、および
ｃ．未処理角化細胞の試料と比較して、ａで処理した角化細胞において、ｕｃ．２９１の発現の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％の活性化、またはｕｃ．２９１の活性の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％の活性化が測定される化合物を選択するステップ
を含む、方法に関する。
【００１６】
この第２の実施形態において、ステップａを受けていない角化細胞の試料で測定されたｕｃ．２９１の発現または活性は、対照値に相当する（すなわち、未処理角化細胞）。
上記の方法において、前記試験化合物は植物抽出物から選択されることを特徴としてもよい。
上記の方法において、ステップｃで測定されるｕｃ．２９１の発現または活性の前記活性化は、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％であることを特徴としてもよい。
また、上記の方法に従って得ることができる、皮膚バリア機能を改善するため、ならびに／または前記皮膚の老化を予防および／もしくは軽減するため、ならびに／または前記皮膚を保湿するための、ｕｃ．２９１の活性化因子の化粧品としての使用が提供される。
さらに、上記の方法に従って得ることができる、皮膚バリア機能の改善するため、ならびに／または前記皮膚の老化の予防および／もしくは軽減するため、ならびに／または前記皮膚を保湿するのに使用するためのｕｃ．２９１の活性化因子が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、ｕｃ．２９１がカルシウム誘導分化中に角化細胞で発現される図である。
【図２】図２は、ｕｃ．２９１の枯渇が分化を遅延する図である。
【図３】図３は、ｕｃ．２９１の枯渇は増殖を増加させる図である。
【図４】図４は、ｕｃ．２９１は核内で発現され、エンハンサーとして機能する図である。
【図５】図５は、ＳＦＴＰ、ＺＭＩＺ１およびＺＳＷＩＭ８遺伝子はｕｃ．２９１の近傍に局在し、それらの発現は分化中に誘導される図である。
【図６】図６は、ｕｃ．２９１の発現がＳＦＴＰＤの発現を増強する図である。
【図７】図７は、ＳＦＴＰＤ、ＺＭＩＺ１およびＺＳＷＩＭ８のサイレンシングがｓｉ−ｕｃ．２９１効果を再現する図である。
【図８】図８は、ｕｃ．２９１配列の図である。
【図９】図９は、化合物の実験的設定の図である。
【図１０】図１０は、異なる化合物がｕｃ．２９１発現を調節することができる図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
「皮膚の老化」という表現は、例えば、しわおよび細い線、しなびた皮膚、たるんだ皮膚、薄くなった皮膚、ならびに弾力性および／または張り(tonus)を欠いている皮膚のような、時間生物学的であれ光誘起性であれ、老化による皮膚の任意の外観変化、ならびに、例えば紫外線放射に曝露後の特にコラーゲンの皮膚の任意の内部的分解のような、外観の変化には組織上では反映されない皮膚の任意の内部変化を意図する。
【００１９】
「皮膚を保湿する」とは、皮膚の自然の湿度を維持すること、およびその乾燥を予防することを意味する。
【００２０】
「ｕｃ．２９１」または「ｌｎｃＲＮＡ  ｕｃ．２９１」は、コード名ＺＮＦ５０３＿Ｓｉｄｄｈａｒｔｈａ（ｈｔｔｐ：／／ｃｃｇ．ｖｉｔａｌ−ｉｔ．ｃｈ／ＵＣＮＥｂａｓｅ／ｌｉｓｔ．ｐｈｐ？ｄａｔａ＝ｕｃｎｅ＆ｏｒｇ＝ｈｇ１９＆ｖｉｅｗ＝ｕｃｅＩＤ＆ｖａｌｕｅ＝ｕｃ．２９１）の超保存非コードエレメント（データベースＵＣＮＥ：ｈｔｔｐ：／／ｃｃｇ．ｖｉｔａｌ−ｉｔ．ｃｈ／ＵＣＮＥｂａｓｅ／）である。ｕｃ．２９１の配列は、以下の配列番号１である。
【００２１】
【化１】
0006678231.tif 000002
【００２２】
試験される試験化合物は、任意のタイプであってよい。それら化合物は、天然起源のものであっても、化学的合成によって生成されたものであってもよい。この化合物は、既知構造の化学化合物、未同定の化合物もしくは物質、または化合物の混合物のライブラリーを含む場合がある。
天然の化合物は、植物のような植物性起源の化合物を含む。好ましくは、試験化合物は、植物性であり、好ましくは植物抽出物から選択される。
【００２３】
ステップａによれば、試験化合物を、角化細胞の試料と接触させる。
【００２４】
ステップｂによれば、ｕｃ．２９１の発現および／または活性は、前記角化細胞において測定される。
【００２５】
「ｕｃ．２９１の発現」という用語は、生産されたｕｃ．２９１の量を意味するものとする。
【００２６】
「ｕｃ．２９１の活性」という用語は、それがハイブリダイズする配列部分の転写レベルを増強するｕｃ．２９１の能力を意味するものとする。
【００２７】
当業者は、ｕｃ．２９１がハイブリダイズする配列を定量的または半定量的に検出し、これにより前記ｕｃ．２９１活性を判定する技術に精通している。特異的なヌクレオチドプローブを用いた、配列のハイブリダイゼーションに基づく技術が最も一般的であり、ノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）などがある。
【００２８】
当業者は、ｕｃ．２９１、またはｕｃ．２９１がハイブリダイズする配列を定量的または半定量的に判定する技術にも精通している。特に、ｕｃ．２９１の発現は、リアルタイムＰＣＲによって測定することができる。ｕｃ．２９１活性は、配列標的上のリアルタイムＰＣＲによって、またはウェスタンブロットによる標的のタンパク質レベルを評価することによって測定することができる。
【００２９】
好ましくは、ｕｃ．２９１の発現は、リアルタイムＰＣＲによって測定される。
【００３０】
試験化合物で処理後のｕｃ．２９１の発現または活性を、次いで対照値、すなわち処理前の同一角化細胞で得られた値、または未処理の別の試料の角化細胞で得られた値、と比較する。
【００３１】
ステップｃによれば、有用な化合物は、未処理の角化細胞と比較して、処理した角化細胞において、ｕｃ．２９１の発現の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％の活性化、またはｕｃ．２９１の活性の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％の活性化が測定される化合物である。好ましくは、ｕｃ．２９１の発現または活性の活性化は、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％である。
【００３２】
本明細書に定義されたスクリーニング方法によって選択される化合物は、続いて、他のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏモデル（動物またはヒトにおいて）で、皮膚バリア機能および／または皮膚の老化および／または皮膚水和へのそれらの影響を試験することができる。本発明に記載の有用な化合物は、ｕｃ．２９１を標的にする活性化因子である。
【００３３】
本発明の課題は、ｕｃ．２９１の活性化因子の化粧品としての使用でもあり、前記活性化因子は、皮膚バリア機能を改善、ならびに／または皮膚の老化を予防および／もしくは軽減、ならびに／または皮膚を保湿するために上記の方法に従って同定される。
【００３４】
別の態様によれば、本発明の目的は、少なくとも１つのｕｃ．２９１活性化因子の使用であり、前記活性化因子は、皮膚バリア機能を改善するため、ならびに／または皮膚の老化を予防および／もしくは軽減するため、ならびに／または皮膚を保湿するための治療組成物を作製するために上記の方法に従って同定される。したがって本発明は、ｕｃ．２９１活性化因子の使用にも関し、前記活性化因子は、皮膚バリア機能を改善するため、ならびに／または皮膚の老化を予防および／もしくは軽減するため、ならびに／または皮膚を保湿するために、上記の方法に従って同定される。
【００３５】
活性化因子は、ｕｃ．２９１の発現または活性を実質的に増加する化合物を表す。「実質的に」という用語は、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、およびより好ましくは少なくとも６０％の増加を意味する。
【００３６】
ｕｃ．２９１活性化因子は、組成物の０．００１から１０％重量の割合で、好ましくは０．０１から５％重量の割合で使用することができる。
【００３７】
上記に記載されたスクリーニング方法の結果同定されたｕｃ．２９１活性化因子は、生理学的に許容される担体、好ましくは化粧品的に許容される媒体、すなわち、毒性、不適合、不安定性またはアレルギー応答の任意の危険性がなく、および特にユーザに受け入れられない任意の不快感（赤色感、硬直感、刺痛感、その他）を引き起こさない、ヒト皮膚と接触させて使用するのに適した媒体と組み合わせた組成内で製剤化することができる。これらの組成物は、例えば、経口で、または局所に投与される場合がある。好ましくは、組成物は局所に適用される。経口投与については、組成物は、錠剤、ゲルカプセル剤、糖衣錠、シロップ剤、懸濁剤、液剤、散剤、顆粒、エマルション剤、放出制御のための微小球またはナノ粒子または脂質もしくはポリマー小胞の懸濁剤の形態である場合がある。局所投与については、組成物は、より詳細には皮膚および粘膜の治療に使用するものであり、膏薬、クリーム剤、ミルク剤、軟膏剤、散剤、含浸パッド、液剤、ゲル剤、スプレー剤、ローション剤または懸濁剤の形態である場合がある。放出制御のための微小球またはナノ粒子または脂質もしくはポリマー小胞またはポリマーパッチまたはハイドロゲルの懸濁剤の形態である場合もある。この局所適用のための組成は、無水型、水溶性型またはエマルション剤の形態である場合がある。局所適用のための組成物は、水中油型、油中水型または多重エマルション剤（Ｗ／Ｏ／ＷまたはＯ／Ｗ／Ｏ）の形態である場合があり、場合により、マイクロエマルション剤もしくはナノエマルション剤、または水溶性分散体剤、液剤、水溶性ゲル剤もしくは散剤の形態である場合がある。好ましい変化形においては、組成物は、ゲル剤、クリーム剤またはローション剤の形態である。
【００３８】
組成物の生理学的に許容される担体は、一般に水および場合によりエタノールのような他の溶媒を含む。
【００３９】
この組成物は、好ましくは、顔および／または体の皮膚のケアおよび／またはクレンジング製品として使用され、特に、例えば、ポンプディスペンサーボトル、エアロゾルもしくはチューブ内に調製された液体剤、ゲル剤またはムース剤の形態であるか、または例えば広口瓶内に調製されたクリーム剤の形態である場合がある。変化形として、化粧品の形態で、特に、ファンデーション、またはルースもしくはコンパクトパウダーの形態である場合がある。
【００４０】
−  油、特にポリジメチルシロキサン（ジメチコン）、ポリアルキルシクロシロキサン（シクロメチコン）およびポリアルキルフェニルシロキサン（フェニルジメチコン）のような直鎖状または環状、揮発性または非揮発性シリコーンオイル；フルオロオイルのような合成油、安息香酸アルキルおよびポリイソブチレンのような分岐炭化水素；植物油および特に大豆油またはホホバ油；および液体ワセリンのような鉱油、から選択される場合がある、
−  オゾケライト、ポリエチレンワックス、蜜ろうまたはカルナバワックスのようなワックス、
−  少なくとも１つの反応基（特に水素またはビニル）を含有し、末端および／または側鎖の位置に少なくとも１つのアルキル基（特にメチル）またはフェニルを有するポリシロキサンを、触媒の存在下で、オルガノハイドロジェンポリシロキサン（organohydrogeno-polysiloxane）のようなオルガノシリコーンと反応させることによって特に得られるシリコーンエラストマー、
−  非イオン性、陰イオン性、陽イオン性または両性であるかどうかにかかわらず、界面活性剤、好ましくは乳化界面活性剤、特にグリセロールの脂肪酸エステル、ソルビタンの脂肪酸エステル、ポリエチレングリコールの脂肪酸エステルおよびスクロースの脂肪酸エステルのようなポリオールの脂肪酸エステル；ポリエチレングリコールの脂肪アルキルエーテル；アルキルポリグルコシド；ポリシロキサン修飾ポリエーテル；ベタインおよびそれらの誘導体；ポリクオタニウム；エトキシ化脂肪アルキル硫酸塩；スルホサクシネート；サルコシネート；リン酸アルキルおよびリン酸ジアルキルならびにそれらの塩；および脂肪酸せっけん、
−  直鎖脂肪アルコール、特に、セチルアルコールおよびステアリルアルコールのような補助界面活性剤、
−  増粘剤および／またはゲル化剤、ならびに特に、アクリロイルメチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）および／またはアクリルアミドおよび／またはアクリル酸および／またはアクリル酸の塩もしくはエステルの、架橋または非架橋の、親水性または両親媒性のホモポリマーおよびコポリマー；キサンタンガムまたはグアーゴム；セルロース誘導体；およびシリコーンゴム（ジメチコノール）、
−  有機スクリーニング剤、例えば、ジベンゾイルメタン誘導体（ブチルメトキシジベンゾイルメタンを含む）、桂皮酸誘導体（メトキシ桂皮酸エチルヘキシルを含む）、サリチル酸、パラ−アミノ安息香酸、β，β’−ジフェニルアクリレート、ベンゾフェノン、ベンジリデンカンファ誘導体、フェニルベンズイミダゾール、トリアジン、フェニルベンゾトリアゾールおよびアントラニル誘導体、
−  コーティングされたまたはコーティングされていない顔料またはナノ顔料の形態の鉱物酸化物に基づく、特に、二酸化チタンまたは酸化亜鉛に基づく、無機スクリーニング剤、
−  色素、
−  保存剤、
−  ＥＤＴＡ塩のような隔離剤、
−  香料、
−  およびこのリストに限定されないそれらの混合物、
から選択される少なくとも１つの化合物のような様々なアジュバントを含む場合がある。
【００４１】
そのようなアジュバントの例は、本発明による組成物中の追加の成分としての使用に適している、スキンケア産業において通常使用される化粧品および医薬品成分を広範に、制限なく記載するＣＴＦＡ辞典（International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook published by The Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association, 第11版, 2006年）に特に挙げられている。
【００４２】
本組成物はまた、充填剤、顔料、真珠層、張力調整剤および艶消しポリマー（matting polymers）、およびそれらの混合物などの視覚的効果を有する少なくとも１つの化合物を含む場合がある。
【００４３】
「充填剤」という用語は、組成物の本体または剛性および／もしくは柔軟性、艶消し効果ならびに適用時の迅速な均一性を付与するのに適した、無色または白色、鉱物または合成、ラメラまたは非ラメラ粒子を意味すると理解すべきである。特に名前を挙げてよい充填剤としては、タルク、雲母、シリカ、カオリン、Ｎｙｌｏｎ−１２（Ａｔｏｃｈｅｍ社によって販売されるＯｒｇａｓｏｌ（登録商標））のようなナイロン（登録商標）粉末、ポリエチレン粉末、ポリウレタン粉末、ポリスチレン粉末、ポリエステル粉末、場合により修飾されるデンプン、東芝社によってＴｏｓｐｅａｒｌ（登録商標）の名称で販売されているもののようなシリコーン樹脂マイクロビーズ、ヒドロキシアパタイト、および中空シリカ微小球（Ｍａｐｒｅｃｏｓ社のＳｉｌｉｃａＢｅａｄｓ（登録商標））が挙げられる。
【００４４】
「顔料」という用語は、組成物を着色および／または不透明にすることを意図とした、媒体に不溶性の白色または有色の、鉱物または有機粒子を意味すると理解されるべきである。それらは、標準またはナノメータサイズのものである場合がある。名前を挙げることができる鉱物顔料の中には、二酸化チタン、二酸化ジルコニウムおよび二酸化セリウム、ならびに酸化亜鉛、酸化鉄および酸化クロムがある。
【００４５】
「真珠層」という用語は、光を反射する玉虫色の粒子を意味すると理解されるべきである。想定される真珠層の中で、天然の真珠、酸化チタン、酸化鉄、天然顔料またはオキシ塩化ビスマス、および着色された雲母チタンで被覆された雲母が挙げられる。
【００４６】
これらの充填剤および／または顔料および／または真珠層の水相中の質量濃度は、組成物の総重量に対して一般に０．１〜２０％重量、好ましくは０．２〜７％重量である。
【００４７】
「張力調整剤」という用語は、皮膚を張りのある状態にし、この張力効果によって皮膚を滑らかにし、そこからしわおよび細い線を低減させ、または直ちに排除するのに適した化合物を意味すると理解されるべきである。名前を挙げることができる張力調整剤としては、天然起源のポリマーが挙げられる。「天然起源のポリマー」という用語は、植物起源のポリマー、外皮由来のポリマー、卵タンパク質および天然起源のラテックスを意味する。これらのポリマーは、好ましくは親水性である。特に名前を挙げることができる植物起源のポリマーとしては、タンパク質およびタンパク質加水分解物、より詳細には、穀物類、マメ科植物および油生成植物の抽出物、例えばトウモロコシ、ライムギ、コムギ、ソバ、ゴマ、スペルト、エンドウ、マメ、レンズマメ、ダイズおよびルピナスの抽出物が挙げられる。合成ポリマーは、一般に、ラテックスまたはシュードラテックスの形態であり、重縮合タイプである場合があり、またはフリーラジカル重合によって得られる場合がある。特にポリエステル／ポリウレタンおよびポリエーテル／ポリウレタン分散体が挙げられる。好ましくは、張力調整剤は、ＰＶＰ／ジメチコニルアクリレートの、および親水性ポリウレタン（Ｈｙｄｒｏｍｅｒ社のＡｑｕａｍｅｒｅＳ−２００１（登録商標））のコポリマーである。
【００４８】
「艶消しポリマー」という用語は、本明細書では、皮膚の光沢を低減し、および顔色を統一する、溶液中、分散体中または粒子形態の任意のポリマーを意味する。名前を挙げることができる例としては、シリコーンエラストマー、樹脂粒子、およびそれらの混合物が挙げられる。名前を挙げることができるシリコーンエラストマーの例としては、信越化学工業株式会社によるＫＳＧ（登録商標）、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ社によるＴｒｅｆｉｌ（登録商標）、ＢＹ２９（登録商標）もしくはＥＰＳＸ（登録商標）、またはＧｒａｎｔ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社によるＧｒａｎｓｉｌ（登録商標）の名称で販売されている製品が挙げられる。
【００４９】
本発明に従って使用される組成物には、ｕｃ．２９１活性化因子以外の活性剤、および特に、増殖因子の生成を刺激する薬剤；抗糖化または脱グリカン化薬剤；コラーゲン合成を増加させるか、またはその分解を防止する薬剤（抗コラゲナーゼ剤、特にマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤）；エラスチン合成を増加させるか、またはその分解を防止する薬剤（抗エラスターゼ剤）；インテグリンまたはテンシンのような接着斑成分の合成を促進する薬剤；グリコサミノグリカンもしくはプロテオグリカンの合成を増加させるか、またはそれらの分解を防止する薬剤（抗プロテオグリカナーゼ剤）；線維芽細胞増殖を増加させる薬剤；脱色素剤または抗色素剤；抗酸化剤またはフリーラジカルスカベンジャーまたは汚染防止剤；およびこれらの混合物から選択されるが、これらに限定されない、少なくとも１つの活性剤を含む場合もある。
【００５０】
そのような薬剤の例は、特に、植物抽出物および特に、コンドラス・クリスプス（Chondrus crispus）の、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）の、エンドウ（Pisum sativum）（Ｐｒｏｔｅａｓｙｌ（登録商標）ＴＰ  ＬＳ）の、ツボクサ（Centella asiatica）の、イカダモ（Scenedesmus）の、モリンガ・プテリゴスペルマ（Moringa pterygosperma）の、マンサクの、ヨーロッパグリ（Castanea sativa）の、ローゼル（Hibiscus sabdriffa）の、チューベローズ（Polianthes tuberosa）の、アルガンノキ（Argania spinosa）の、アロエベラ（Aloe vera）の、スイセン（Narcissus tarzetta）の、または甘草の抽出物；ダイダイ（Citrus aurantium）（ネロリ）の精油；グリコール酸、乳酸およびクエン酸、ならびにそれらのエステルなどのα−ヒドロキシ酸；サリチル酸およびその誘導体などのβ−ヒドロキシ酸；植物タンパク質加水分解物（特にダイズまたはヘーゼルナッツのもの）；アシル化オリゴペプチド（特にＳｅｄｅｒｍａ社によって、Ｍａｘｉｌｉｐ（登録商標）、Ｍａｔｒｉｘｙｌ（登録商標）３０００、Ｂｉｏｐｅｐｔｉｄｅ（登録商標）ＣＬまたはＢｉｏｐｅｐｔｉｄｅ（登録商標）ＥＬという商品名で販売されるもの）；酵母抽出物および特にサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の酵母抽出物；藻類抽出物および特に、ラミナリア属（laminairia）の藻類抽出物；ビタミンおよびそれらの誘導体、例えばレチニルパルミテート、アスコルビン酸、アスコルビルグルコシド、アスコルビルリン酸マグネシウムまたはアスコルビルリン酸ナトリウム、アスコルビルパルミテート、アスコルビルテトライソパルミテート、アスコルビルソルベート、トコフェロール、トコフェリルアセテートおよびトコフェリルソルベート；アルブチン；コウジ酸；エラグ酸、およびそれらの混合物である。
【００５１】
変化形または追加として、本発明に従って使用される組成物は、特にフランスのＬａｂｏｒａｔｏｉｒｅｓ  Ｓｅｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｑｕｅｓ／Ｃｏｇｎｉｓ社によってＰｒｏｔｅａｓｙｌ  ＴＰ  ＬＳ（登録商標）という商品名で販売されるエンドウ（Pisum sativum）種子の抽出物のような少なくとも１つのエラスターゼ阻害剤（抗エラスターゼ）を含む場合がある。
【００５２】
組成物は、湿潤剤、安定剤、水分調節剤、ｐＨ調節剤、浸透圧調節剤、またはＵＶ−ＡおよびＵＶ−Ｂスクリーンのような不活性な添加物またはこれらの添加物の組合せを含有する場合もある。
【００５３】
以下の実施例は本発明を説明するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。これらの例は、以下に列挙した図に基づいている。
【００５４】
図１は、ｕｃ．２９１がカルシウム誘導性の分化の間に角化細胞内で発現される図である。
初代ヒト角化細胞は、カルシウム添加（１．２ｍＭ）によって３、６または９日間分化誘導された。
Ａ）ＲＴ−ＰＣＲによる分化中のｕｃ．２９１の評価、陽性対照（Ｂ）として、インボルクリンおよびＫ１０（分化マーカー）を使用する。
図２は、ｕｃ．２９１の枯渇が分化を遅延する図である。
ｕｃ．２９１の枯渇、ならびに分化マーカーＫ１０およびインボルクリンｍＲＮＡの発現のＲＴ−ＰＣＲによる評価。対照と比較して、両マーカーは、ｕｃ．２９１が枯渇した細胞において強く低減された。
図３は、ｕｃ．２９１の枯渇は増殖を増加させる図である。
（Ａ）トランスフェクション３日後のサイレンシングのＲＴ−ＰＣＲによる評価。
（Ｂ）トランスフェクション３日後のスクランブルトランスフェクトした細胞（Ｃｔｒｌ）およびｓｉ−ｕｃ．２９１トランスフェクトした細胞の細胞周期分析。
（Ｃ）ｕｃ．２９１枯渇時のカルシウム誘導性分化（１、２、３日間）中の増殖マーカー（ｐ６３）および分化マーカー（Ｋ１０）のウェスタンブロットによる評価。
図４は、ｕｃ．２９１は核内で発現され、エンハンサーとして機能する図である。
Ａ）角化細胞の核および細胞質の生化学的分画。Ｕｃ．２９１は主に核で検出される。
Ｂ）ｕｃ．２９１の保存配列を、プロモーターの上流に、ルシフェラーゼアッセイ用のベクターにクローニングし、本発明者らはＳａｏｓ−２細胞中にこのベクター（ｕｃ．２９１）および対照ベクター（Ｃｔｒ）をトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性が対照に対して２倍増加するため、ルシフェラーゼアッセイは、ｕｃ．２９１がエンハンサーとして作用することを示唆する。
図５は、ＳＦＴＰ、ＺＭＩＺ１およびＺＳＷＩＭ８遺伝子はｕｃ．２９１の近傍に局在し、それらの発現は分化中に誘導される図である。
（Ａ）ｕｃ．２９１が位置する第１０の染色体のスキームおよび４百万塩基以内に位置する遺伝子。
（Ｂ）ＳＦＴＰＤ、ＺＭＩＺ１およびＺＳＷＩＭ８遺伝子が、カルシウムによって誘導される分化の間、ｕｃ．２９１発現と並行して発現することを示すＲＴ−ＰＣＲ。
図６は、ｕｃ．２９１の発現がＳＦＴＰＤの発現を増強する図である。ＳＦＴＰＤのサイレンシングは、ｓｉ−ｕｃ．２９１効果を再現する。
（Ａ）角化細胞を、ｕｃ．２９１（ｓｉ−ｕｃ．２９１）に特異的なｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、１．２ｍＭのカルシウムで処理した。示された時点で細胞を分析した。
（Ｂ）３日目に、本発明者らは、ＳＦＴＰＤ、ＺＳＷＩＭ８およびＺＭＩＺ１の発現レベルをＲＴ−ＰＣＲによって評価した。本発明者らは、ｕｃ．２９１の非存在下で、ＳＦＴＰＤ、ＺＳＷＩＭ８およびＺＭＩＺ１のｍＲＮＡが４０％低減することを見出した。
図７は、ＳＦＴＰＤ、ＺＭＩＺ１およびＺＳＷＩＭ８のサイレンシングがｓｉ−ｕｃ．２９１効果を再現する図である。
角化細胞を、ｕｃ．２９１（ｓｉ−ｕｃ．２９１）に特異的なｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、１．２ｍＭのカルシウムで３日間処理した。本発明者らは、分化マーカーのインボルクリンの発現レベルを評価した。本発明者らは、ｓｉ−ｕｃ．２９１と同様にｓｉ−ＳＦＴＰＤ、ｓｉ−ＺＳＷＩＭ８およびｓｉ−ＺＭＩＺ１において、インボルクリン発現ｍＲＮＡが４０％低減することを見出した。
図８は、ｕｃ．２９１配列の図である。
コードネームＺＮＦ５０３＿Ｓｉｄｄｈａｒｔｈａを有するヒトｕｃ．２９１配列のお５’から３’方向（データベースＵＣＮＥ：ｈｔｔｐ：／／ｃｃｇ．ｖｉｔａｌ−ｉｔ．ｃｈ／ＵＣＮＥｂａｓｅ／）。
図９は、化合物の実験的設定の図である。
図１０は、異なる化合物が、ｕｃ．２９１発現を調節することができる図である。
ｕｃ．２９１の発現を、化合物での処理時にリアルタイムＰＣＲによって評価した。本発明者らは、すべての化合物がｕｃ．２９１発現の増強においてカルシウムと相乗効果を有することを認めることができる。
【実施例１】
【００５５】
材料および方法
細胞培養およびトランスフェクション
ヒト表皮角化細胞、新生児（ＨＥＫｎ）（Ｃａｓｃａｄｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、ＨＫＧＳ増殖補助剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＥｐｉｌｉｆｅ培地で培養し、５％ＣＯ２の加湿チャンバー内で、３７℃で培養した。培養培地に１．２ｍＭＣａＣｌ２を添加することによって細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化誘導させ、次いで細胞を完全なコンフルエンスで９日間まで増殖させた。ｕｃ．２９１サイレンシングのために、ＨＥＫｎをｓｉ−２９１−１  ＨＰ  Ｃｕｓｔｏｍ  ｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）でトランスフェクトし、トランスフェクションを、製造業社のプロトコールに従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉｍａｘトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行った。トランスフェクションの４８時間後、培地を除去し、培養培地に１．２ｍＭＣａＣｌ２を添加することによってカルシウム誘導分化を開始した。Ｓａｏｓ−２細胞を、１０％ＦＢＳ、１００ペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤ−ＭＥＭ  Ｆ１２中で培養し、製造業社のプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００でトランスフェクトした。
【００５６】
細胞培養および化合物
本発明者らは、以下の化合物、
Ｎ１：ツバキ属（Camellia）葉抽出物：最終濃度０．０５％
Ｎ２：ツバキ属（Camellia）の幹細胞：最終濃度１％
を使用した。
【００５７】
ツバキ属（Camellia）葉抽出物を、以下のように調製する。：ツバキ属（Camellia）葉の抽出物は、ヤブツバキ（Camellia japonica）の新鮮ですりつぶした葉をエタノール（または任意のアルコール溶媒）で抽出し、活性炭で脱色させ、ろ過し、ジプロピレングリコール（または他の適切な化粧用溶媒）で希釈することによって得られ、液状の最終抽出物を得る。
【００５８】
ツバキ属（Camellia）の幹細胞は、国際公開第２００３／０７７８８１号パンフレットに開示された技術を用いて、ヤブツバキ（Camellia japonica alba plena）の分裂組織から得られた幹細胞である。
【００５９】
化合物を増殖および分化条件で試験した。細胞（ＨＥＫｎ、３００．０００／６０ｍｍ培養皿）を増殖条件培地に播種し、示された濃度の化合物で２４時間処理した。細胞を１日後に回収し、以下に示すリアルタイムＰＣＲによってｕｃ．２９１発現を分析した。あるいは、指示された化合物を含む細胞に分化培地（１．２ｍＭカルシウムを含む）を添加し、３日後に収集して、ｕｃ．２９１発現レベルを評価した。
【００６０】
ＲＮＡ抽出およびリアルタイムＰＣＲ分析
ｍｉｒＶａｎａ  ｍｉＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を製造業者のプロトコールに従って使用して、分化した（３、６および９日）および増殖するヒト角化細胞から全ＲＮＡを単離した。１マイクログラムの全ＲＮＡをＧｏＳｃｒｉｐｔ（商標）  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて製造業者のプロトコールに従って逆転写した。リアルタイムＰＣＲを、次いでＰｌａｔｉｎｕｍ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して行った。各遺伝子およびｕｃ．２９１の発現は、閾値サイクル（Ｃｔ）から定義され、相対発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子の発現に関して正規化した後、２−ΔΔＣｔ法を使用して算出した。ｕｃ．２９１保存配列を図８に示す。
【００６１】
細胞増殖および細胞周期分析
ＤＮＡ合成中のブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込みを、製造業社のプロトコールに従って、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ（商標）  ＥｄＵフローサイトメトリーアッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、ＵＳＡ）を用いて評価した。細胞周期を、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサートメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して分析した。Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ（ＢＤ）ソフトウェアを使用して１５，０００事象を評価した。
【００６２】
ウェスタンブロット法
全細胞抽出物をＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離し、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｐ  ＰＶＤＦ膜（Ｇ＆Ｅ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＫ）ヘブロットした。膜をＰＢＳＴ５％脱脂粉乳で遮断し、室温で２時間一次抗体と共にインキュベートし、洗浄し、適切な西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（ウサギおよびマウス、ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を使用して室温で１時間ハイブリダイズさせた。検出は、ＥＣＬ化学発光キット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）を用いて行った。以下の抗体、抗−ｐ６３（Ａｂ４、Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ；希釈１：５００）、抗−Ｋ１０（Ｃｏｖａｎｃｅ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎｊ、ＵＳＡ；希釈１：１０００）、抗−βアクチン（Ｓｉｇｍａ、ＳｔＬｏｕｉｓ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ、ＵＳＡ；希釈１：５０００）を使用した。
【００６３】
細胞分画およびＲＮＡ抽出
細胞をトリプシン処理により採取し、氷上の１５ｍｌコニカルチューブに回収し、冷ＰＢＳで３回洗浄し、微量遠心管に移し、冷却遠心分離機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５４１５Ｒ）で、４０００回転、３分間ペレット化した。細胞ペレットを１ｍｌのＲＳＢ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に再懸濁し、氷上で３分間インキュベートし、続いて４℃で遠心分離した。膨張した細胞ペレットの体積を推定し、その体積の４倍の溶解緩衝液ＲＳＢＧ４０［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０％グリセロール、０．５％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、０．５ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、および１００Ｕ／ｍｌ  ｒＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ）］を用いて緩やかなピペッティングによって再懸濁させた。核を７０００回転で３分間の遠心分離によってペレット化し、上清を回収し、細胞質画分として保存した。核ペレットをＲＳＢＧ４０中に再懸濁させ、１０分の１の体積の界面活性剤［３．３％（重量／重量）デオキシコール酸ナトリウムおよび６．６％（体積／体積）Ｔｗｅｅｎ４０］をゆっくりとボルテックスしながら加え、続いて氷上で５分間インキュベートした。核を再度ペレット化し、上清を以前の細胞質画分とプールした。核ペレットをＲＳＢＧ４０中でもう一度洗浄し、１０，０００回転、５分間で回収し、得られたペレットを核ＲＮＡ抽出に使用した。トリパンブルー染色後、細胞溶解および核の完全性を光学顕微鏡でモニターした。製造業社の取扱説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）に従って、ＴＲＩＺＯＬ法を使用してＲＮＡを抽出した。
【００６４】
コンストラクトおよびＬｕｃアッセイ
ｕｃ．２９１ゲノム配列（２３１ｂｐ）を、以下のプライマー、ｕｃ．２９１ｐＧＬＦ  ５’−ｇｇｃｃｇｃｔａｇｃｇｇｇａａｃｔｔａｔｔｔｇｔａｔｇｃａｇｃ−３’（配列番号２）、ｕｃ．２９１ｐＧＬＲ  ５’−ｇｇｃｃｃｔｃｇａｇｃａａｃｔｇｃａｇｔｇｃｃｔｇｃａｔｇｔｔｔｔｃ−３’（配列番号３）を使用してヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ制限後の２３１ｂｐ断片を、ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ線状化ｐＧＬ３プロモーターベクターにライゲーションした（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）。トランスフェクションの２４時間前に、合計１×１０５個のＳａｏｓ−２細胞を１２ウェル培養皿に播種した。６００ｎｇのｐＧＬ３ベクター、１３ピコモルのｕｃ．２９１  ｓｉＲＮＡおよび１０ｎｇのＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼｐＲＬ−ＣＭＶベクターを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して共トランスフェクトした。細胞抽出物のルシフェラーゼ活性を、トランスフェクションの２４時間後に、Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定し、ＯＰＴＯＣＯＭＰ  Ｉルミノメーターを使用して発光を測定した。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性を使用して、トランスフェクションの効率を正規化した。
【００６５】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
ｕｃ．２９１プローブの配列は以下のようである。
／５ＤｉｇＮ／ＡＣＡＡＣＣＡＣＡＴＧＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＡ／３Ｄｉｇ（配列番号４）、Ｕ６プローブはＥｘｉｑｏｎより、カタログ番号は９９００２−１５である。ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片をキシレン中で脱ワックスし、エタノール希釈シリーズを通して再水和させた。組織切片を１５μｇ／ｍＬプロテイナーゼＫで、１０分間室温で消化し、次いでｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析のためにＶｅｎｔａｎａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｕｌｔｒａにロードした。組織スライドをＤｉｇ標識水銀プローブ（Ｅｘｉｑｏｎ）と共に５０℃で２時間インキュベートした。次いで、基質としてＮＢＴ−ＢＣＩＰを使用して、ポリクローナル抗ＤＩＧ抗体およびアルカリホスファターゼ結合二次抗体（Ｖｅｎｔａｎａ）でジゴキシゲニンを検出することができる。二重ｄｉｇ標識対照Ｕ６  ｓｎＲＮＡプローブもまたＥｘｉｑｏｎ製である。
【００６６】
結果
ｕｃ．２９１はカルシウム誘導分化中に角化細胞で発現される
初代ヒト角化細胞は、カルシウム添加によって３、６または９日間分化誘導され。ｕｃ．２９１発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって評価した。ｕｃ−２９１発現は時間依存性であり、本発明者らは、陽性対照として、２つの分化マーカー、インボルクリンおよびＫ１０を使用した（図１Ａおよび１Ｂ）。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（データは示さず）は、ｕｃ．２９１が表皮において特異的に発現することを確認した。
【００６７】
ｕｃ．２９１の枯渇は分化を遅延する
角化細胞分化の間にｕｃ．２９１が重要であることを確認するために、本発明者らは、初代ヒト角化細胞においてｓｉＲＮＡによってｕｃ．２９１をサイレンシングし、カルシウム添加によって分化を誘導した。１日、２日、３日のカルシウム添加で、スクランブルトランスフェクト細胞（Ｃｔｒｌ）およびｓｉ−ｕｃ．２９１トランスフェクト細胞における細胞形態の評価は、ｓｉ−ｕｃ．２９１細胞が増殖する細胞に典型的な丸い形状をより長く維持し、一方、Ｃｔｒｌ（スクランブルトランスフェクションした細胞）は、カルシウム処理１日後に既に平坦で伸長しているように見えることを示す（図２）。これをより定量化するために、本発明者らは、スクランブルトランスフェクト細胞（Ｃｔｒｌ）およびｓｉ−ｕｃ．２９１トランスフェクト細胞における分化中の分化マーカー（Ｋ１０およびインボルクリン）の発現を評価した。得られたデータは、分化がｕｃ．２９１の欠如により非常に遅延することを示している。
【００６８】
ｕｃ．２９１の枯渇は増殖を増加させる
増殖中のｕｃ．２９１の効果を評価するために、本発明者らは、初代ヒト角化細胞においてｓｉＲＮＡによってｕｃ．２９１をサイレンシングした。サイレンシングは、クローン原性アッセイによって評価される長期増殖（図３）および３日間のカルシウム（１．２ｍＭ）処理後のＦＡＣＳ分析によって評価される短期分化の両者に影響を及ぼす。これらの結果は、ｕｃ．２９１枯渇時のカルシウム誘導分化（１、２、３日間）中の増殖マーカー（ｐ６３）および分化マーカー（Ｋ１０）をウェスタンブロットによって評価するタンパク質レベルにおいても確認された（図３Ｃ）。
【００６９】
ｕｃ．２９１は核内で発現され、転写エンハンサーとして機能する
ｕｃ．２９１が角化細胞の増殖および分化に影響を及ぼす分子機構を探索するために、本発明者らは角化細胞の細胞抽出物の生化学的分画を行い、核を細胞質から分離した。図４Ａに示すように、ｕｃ．２９１は主に核内で検出される。さらに、転写エンハンサーとして機能するかどうかを理解するために、本発明者らは、ｕｃ．２９１の保存配列を、プロモーターの上流に、ルシフェラーゼアッセイ用のベクターにクローニングし、内生ｕｃ．２９１を発現するＳａｏｓ−２細胞において、このベクター（ｕｃ．２９１）および対照ベクター（Ｃｔｒ）をトランスフェクトした。本発明者らは、ルシフェラーゼ発光が対照に対して２倍増加することを観察することができ（図４Ｂ）、これはｕｃ．２９１が転写エンハンサーとして作用することを示している。
【００７０】
ＳＦＴＰＤ、ＺＭＩＺ１、ＺＳＷＩＭ８遺伝子はｕｃ．２９１遺伝子座の近傍に位置し、それらの発現はｕｃ．２９１発現と並行する
角化細胞の増殖および分化を制御するｕｃ．２９１の効果に関与する可能性のある機構を同定するために、本発明者らは、ｕｃ．２９１の近傍に位置し、その発現が分化の間のｕｃ．２９１発現と並行する遺伝子の役割について研究する。本発明者らは、これらの遺伝子の中で、ＳＦＴＰＤ、ＺＭＩＺ１ａおよびＺＳＷＩＭ８遺伝子は、角化細胞の分化の間に高度に発現され（図５Ａおよび５Ｂ）、それらのｍＲＮＡはカルシウム添加後にｕｃ．２９１と同様に増加することを見出した。
【００７１】
角化細胞において、ｕｃ．２９１の発現はＳＦＴＰＤ、ＺＭＩＺ１、ＺＳＷＩＭ８の発現を高め、ＳＦＴＰＤ、ＺＭＩＺ１、ＺＳＷＩＭ８のサイレンシングは、ｓｉ−ｕｃ．２９１効果を再現する
ｕｃ．２９１発現がＳＦＴＰＤ、ＺＭＩＺ１およびＺＳＷＩＭ８の転写エンハンサーとして作用することを実証するために、本発明者らはｕｃ．２９１をサイレンシングし、カルシウムを３日間添加した。本発明者らは、ｓｉ−ｕｃ．２９１でＳＦＴＰＤ、ＺＭＩＺ１およびＺＳＷＩＭ８発現が５０％低減することを見出した（図６Ａおよび６Ｂ）。興味深いことに、ｓｉ−ＳＦＴＰＤ、ｓｉ−ＺＭＩＺ１およびｓｉ−ＺＳＷＩＭ８は、細胞形態（図示せず）およびインボルクリン発現に関してｕｃ．２９１サイレンシングを表現型模写する。実際、カルシウムで３日間処理したｓｉ−ｕｃ．２９１およびｓｉ−ＳＦＴＰＤ細胞は、３日間のカルシウムと比較して、細胞が分化しているように見える、類似の形態（丸形、図示せず）を有する。また、インボルクリンの発現はｓｉ−ＳＦＴＰＤ、ｓｉ−ＺＭＩＺ１およびｓｉ−ＺＳＷＩＭ８で遅延する（図７）。
【００７２】
異なる化合物は、ｕｃ．２９１発現を調節することができる
本発明者らは、ｕｃ．２９１発現レベルの調節における化合物（Ｎ１、０．０５％；Ｎ２、１％）の影響を評価した（図９および１０）。本発明者らは、試験された化合物がｕｃ．２９１発現の増強においてカルシウムと相乗効果を有することを観察した。
【００７３】
要約
提示されたデータによれば、
−  ｕｃ．２９１は、カルシウム駆動角化細胞分化中に誘導される。プロ分化ｌｎｃＲＮＡである。
−  ｕｃ．２９１はヒト表皮の上層で発現する。
−  ｓｉＲＮＡによるｕｃ．２９１ノックダウンは、角化細胞の分化を減少させる（分化マーカー：Ｋ１０およびインボルクリンを伴う）。
−  ｕｃ．２９１ノックダウンは増殖を増加させる（短期増殖および長期増殖）。
−  ｕｃ．２９１は主に角化細胞の核で発現する
ことが示される。
−  ｕｃ．２９１は、ＳＦＴＰＤ、ＺＭＩＺ１およびＺＳＷＩＭ８遺伝子に対するｃｉｓ−エンハンサー活性を有する転写調節因子である。これまでのところ、ＺＭＩＺ１およびＺＳＷＩＭ８の役割は表皮では知られていないが、ＳＦＴＰＤ遺伝子によってコードされるサーファクタントタンパク質Ｄは表皮で発現され、強力な免疫調節および抗炎症特性を示す。
【００７４】
結論
これらのデータは、ｕｃ．２９１が皮膚バリア機能形成において二重の機能を有することを示唆している。適切な分化および角質化を可能にし、病原体感染を防止し、抗炎症特性を有することにより皮膚の恒常性を維持する。
【実施例２】
【００７５】
化粧用組成物
以下の組成物は、当業者に慣用の様式で調製することができる。以下に示す量は、重量パーセントで表される。
【００７６】
【表１】
0006678231.tif 000003
【００７７】
【表２】
0006678231.tif 000004
【００７８】
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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