(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ｃ）の、アミノ基及びカルボキシル基を同一分子中に有する両性高分子化合物を含む、動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤：
（ｃ）  ε−ポリ−Ｌ−リジンを、次の式ＩＩ：
【化２】
0006678931.tif 000019
（ただし、上記の式中、
Ｒ１及びＲ２は、メチル基である）
で表される化合物と反応させてカルボキシル化した両性高分子化合物。
【請求項２】
両性高分子化合物において、ε−ポリ−Ｌ−リジンの側鎖のアミノ基のうち、カルボキシル化されたアミノ基の割合が、５０％〜７５％の範囲にある、請求項１に記載の動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤。
【請求項３】
請求項１〜２のいずれかに記載された動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤を含有する生理溶液からなる、動物細胞凍結保存液。
【請求項４】
請求項１〜２のいずれかに記載された動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤を、２〜４０重量％で含有し、
エチレングリコール又はプロピレングリコールを、３〜８Ｍの濃度で含有する、生理溶液からなる、動物細胞凍結保存液。
【請求項５】
さらに、スクロースを、０．１〜１Ｍの濃度で含有する、請求項４に記載の動物細胞凍結保存液。
【請求項６】
動物細胞凍結保存液が、動物細胞ガラス化状態凍結保存液である、請求項３〜５のいずれかに記載の動物細胞凍結保存液。
【請求項７】
請求項３〜６のいずれかに記載の動物細胞凍結保存液中へ、動物細胞を浸漬する工程、
動物細胞凍結保存液中の動物細胞を、降温して凍結する工程、
を含む、動物細胞凍結保存方法。
【請求項８】
動物細胞を、降温して凍結する工程の後に、
凍結した、動物細胞凍結保存液中の動物細胞を、昇温して解凍する工程、
を含む、請求項７に記載の動物細胞凍結保存方法。
【請求項９】
動物細胞を、降温して凍結する工程が、
動物細胞を、降温してガラス化状態で凍結する工程、である、請求項７〜８のいずれかに記載の動物細胞凍結保存方法。
【請求項１０】
動物細胞を、昇温して解凍する工程が、
動物細胞を、昇温して再結晶化することなく解凍する工程、である、請求項８〜９のいずれかに記載の動物細胞凍結保存方法。
【請求項１１】
降温して凍結する工程が、
降温速度５℃／分〜５０℃／分で降温して凍結する工程、である、請求項７〜１０のいずれかに記載の動物細胞凍結保存方法。
【請求項１２】
昇温して解凍する工程が、
昇温速度５℃／分〜１００℃／分で昇温して解凍する工程、である、請求項８〜１１のいずれかに記載の動物細胞凍結保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤、及び該ガラス化状態安定化剤を含有する動物細胞凍結保存液に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、再生医療の臨床応用への期待が高まっている。このための基本技術として、細胞、細胞シート、三次元形状の細胞構造体、組織を、凍結保存する技術が必要とされている。このような技術として、凍結保護物質を添加して、対象の損傷を防ぎつつ、凍結保存する技術がある。このような凍結保護物質として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｏ＝Ｓ（ＣＨ3）2）、グリセリンなどが知られている。
【０００３】
ＤＭＳＯやグリセリンは、分散した細胞に対する凍結保存での使用には、十分な実績がある。しかし、ＤＭＳＯやグリセリンは、細胞シート、三次元形状の細胞構造体、組織などに対する凍結保存での使用では、解凍後にしばしば損傷した状態を生じて、ダメージを残してしまう。この損傷が、凍結時の氷晶形成や脱水収縮から生じるのではないかと考えて、氷の結晶化を制御して、アモルフォスの状態のままで固化させる、ガラス化法が、試みられている。
【０００４】
ガラス化法は、受精卵の凍結手法として発展してきたものであり、従来のガラス化法は、一般に、急速な凍結速度と濃い溶質濃度によって、水溶液をガラス化させることを意図している。例えば、マウスの受精卵のガラス化溶液として、ＤＡＰ２１３が知られている。ＤＡＰ２１３は、ＤＭＳＯ  ２Ｍ、アセトアミド  １Ｍ、プロピレングリコール  ３Ｍの溶液であり、濃度が高く、毒性も高くなっている。典型的な使用法は、マウスの受精卵に含有されている水を、この溶液で置換し、液体窒素に直接浸漬して、ガラス化状態を得る手法である。しかし、このようなガラス化溶液によるガラス化では、細胞毒性が高く、さらに解凍時の再結晶化によるダメージも高いとされている。
【０００５】
そこで、本発明者らは、凍結保護物質を検討して、ガラス化法を改良することを試みてきた（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第５６３０９７９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１に開示されたカルボキシル化ポリリジンを含む凍結保存液は、ガラス化能に優れた凍結保存液であるが、さらに優れたガラス化能を有する新規な凍結保存液が、求められている。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、優れたガラス化能を有する新規な動物細胞凍結保存液を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、鋭意研究の結果、以下に示す両性高分子化合物を動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤として使用した動物細胞凍結保存液によって、上記目的を達成できることを見いだして、本発明に到達した。
【００１０】
したがって、本発明は次の（１）以下を含む。
（１）
以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群から選択された、アミノ基及びカルボキシル基を同一分子中に有する両性高分子化合物を含む、動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤：
（ａ）  ε−ポリ−Ｌ−リジンをブチル無水コハク酸と反応させてカルボキシル化した両性高分子化合物；
（ｂ）  ε−ポリ−Ｌ−リジンを、ブチル無水コハク酸及び無水コハク酸と反応させてカルボキシル化した両性高分子化合物；  又は
（ｃ）  ε−ポリ−Ｌ−リジンを、次の式Ｉ：
【化１】
0006678931.tif 000002
（ただし、上記の式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、水素原子又はＣ１〜Ｃ４のアルキル基であるか、あるいはＲ１及びＲ２が一体となって形成されたＣ１〜Ｃ６のアルカン−ジイル基であり；
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子又はＣ１〜Ｃ４のアルキル基であるか、あるいはＲ３及びＲ４が一体となって形成されたＣ１〜Ｃ６のアルカン−ジイル基であり；
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子又はＣ１〜Ｃ４のアルキル基であるか、あるいはＲ５及びＲ６が一体となって形成されたＣ１〜Ｃ６のアルカン−ジイル基である）
で表される化合物と反応させてカルボキシル化した両性高分子化合物。
（２）
式Ｉで表される化合物が、次の式ＩＩ：
【化２】
0006678931.tif 000003
（ただし、上記の式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、水素原子又はＣ１〜Ｃ４のアルキル基であるか、あるいはＲ１及びＲ２が一体となって形成されたＣ１〜Ｃ６のアルカン−ジイル基である）
で表される化合物である、（１）に記載の動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤。
（３）
両性高分子化合物において、ε−ポリ−Ｌ−リジンの側鎖のアミノ基のうち、カルボキシル化されたアミノ基の割合が、５０％〜７５％の範囲にある、（１）又は（２）に記載の動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤。
（４）
ε−ポリ−Ｌ−リジンを、ブチル無水コハク酸及び無水コハク酸と反応させてカルボキシル化した両性高分子化合物が、
ε−ポリ−Ｌ−リジンの側鎖のアミノ基のうち、無水コハク酸との反応によってカルボキシル化されたアミノ基の数Ａに対する、
ε−ポリ−Ｌ−リジンの側鎖のアミノ基のうち、ブチル無水コハク酸との反応によってカルボキシル化されたアミノ基の数Ｂの比率Ｂ／Ａが、
２／３０〜４０／３０の範囲にある、（１）〜（３）のいずれかに記載の動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤。
（５）
（１）〜（４）のいずれかに記載された動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤を含有する生理溶液からなる、動物細胞凍結保存液。
（６）
（１）〜（４）のいずれかに記載された動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤を、２〜４０重量％で含有し、
エチレングリコール又はプロピレングリコールを、３〜８Ｍの濃度で含有する、生理溶液からなる、動物細胞凍結保存液。
（７）
さらに、スクロースを、０．１〜１Ｍの濃度で含有する、（６）に記載の動物細胞凍結保存液。
（８）
動物細胞凍結保存液が、動物細胞ガラス化状態凍結保存液である、（５）〜（７）のいずれかに記載の動物細胞凍結保存液。
（９）
（５）〜（８）のいずれかに記載の動物細胞凍結保存液中へ、動物細胞を浸漬する工程、
動物細胞凍結保存液中の動物細胞を、降温して凍結する工程、
を含む、動物細胞凍結保存方法。
（１０）
動物細胞を、降温して凍結する工程の後に、
凍結した、動物細胞凍結保存液中の動物細胞を、昇温して解凍する工程、
を含む、（９）に記載の動物細胞凍結保存方法。
（１１）
動物細胞を、降温して凍結する工程が、
動物細胞を、降温してガラス化状態で凍結する工程、である、（９）〜（１０）のいずれかに記載の動物細胞凍結保存方法。
（１２）
動物細胞を、昇温して解凍する工程が、
動物細胞を、昇温して再結晶化することなく解凍する工程、である、（１０）〜（１１）のいずれかに記載の動物細胞凍結保存方法。
（１３）
降温して凍結する工程が、
降温速度５℃／分〜５０℃／分で降温して凍結する工程、である、（９）〜（１２）のいずれかに記載の動物細胞凍結保存方法。
（１４）
昇温して解凍する工程が、
昇温速度５℃／分〜１００℃／分で昇温して解凍する工程、である、（１０）〜（１３）のいずれかに記載の動物細胞凍結保存方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、優れたガラス化能を有する動物細胞凍結保存液を得ることができる。この動物細胞凍結保存液を使用すれば、従来よりも遅い降温速度であっても結晶化が抑制されて、ガラス化状態を維持しつつ、凍結保存できる。また、昇温時においても、再結晶化が抑制されて、ガラス化状態が安定に維持されつつ、解凍することができる。そのために、本発明の動物細胞凍結保存液によれば、動物細胞を高い生存率で凍結解凍することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、昇温速度５０℃／ｍｉｎでの従来のガラス化液のＤＳＣの測定の結果を示すグラフである。
【図２ａ】図２ａは、ＣＯＯＨ−ＰＬＬによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。
【図２ｂ】図２ｂは、ＢＳＡ−ＰＬＬによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。
【図２ｃ】図２ｃは、ＢＳＡ（３５）−ＳＡ（３０）−ＰＬＬによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。
【図３ａ】図３ａは、ＢＳＡ−ＰＬＬ、ＥＧ５Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。
【図３ｂ】図３ｂは、ＢＳＡ−ＰＬＬ、ＥＧ４．５Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。
【図４】図４は、ＢＳＡ（３５）−ＳＡ（３０）−ＰＬＬ、ＥＧ５．５Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。
【図５ａ】図５ａは、ＣＯＯＨ−ＰＬＬによるガラス化液のＤＳＣ測定による再結晶化評価の結果を示すグラフである。
【図５ｂ】図５ｂは、ＢＳＡ−ＰＬＬによるガラス化液のＤＳＣ測定による再結晶化評価の結果を示すグラフである。
【図５ｃ】図５ｃは、ＢＳＡ（３５）−ＳＡ（３０）−ＰＬＬによるガラス化液のＤＳＣ測定による再結晶化評価の結果を示すグラフである。
【図６ａ】図６ａは、各ガラス化液による細胞生存率を示すグラフである。
【図６ｂ】図６ｂは、各ガラス化液による細胞生存率を示すグラフである。
【図７ａ】図７ａは、ＤＭＧＡ−ＰＬＬ、ＥＧ６Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。
【図７ｂ】図７ｂは、ＤＭＧＡ−ＰＬＬ、ＥＧ５Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。
【図７ｃ】図７ｃは、ＤＭＧＡ−ＰＬＬ、ＥＧ４．５Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。
【図７ｄ】図７ｄは、ＤＭＧＡ−ＰＬＬ、ＥＧ４Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。
【図８】図８は、ＥＧ６．５Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。
【図９】図９は、ＣＯＯＨ−ＰＬＬ、ＥＧ６．５Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。
【図１０ａ】図１０ａは、ＣＯＯＨ−ＰＬＬ、ＥＧ５．５Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。
【図１０ｂ】図１０ｂは、ＣＯＯＨ−ＰＬＬ、ＥＧ５Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。
【図１１ａ】図１１ａは、ＢＳＡ−ＰＬＬ、ＥＧ５Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。
【図１１ｂ】図１１ｂは、ＢＳＡ−ＰＬＬ、ＥＧ４．５Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。
【図１２ａ】図１２ａは、ＤＭＧＡ−ＰＬＬ、ＥＧ４．５Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。
【図１２ｂ】図１２ｂは、ＤＭＧＡ−ＰＬＬ、ＥＧ４Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。
【図１３ａ】図１３ａは、ＣＯＯＨ−ＰＬＬ、ＥＧ６Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。
【図１３ｂ】図１３ｂは、ＢＳＡ−ＰＬＬ、ＥＧ６Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。
【図１３ｃ】図１３ｃは、ＤＭＧＡ−ＰＬＬ、ＥＧ６Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。
【図１４ａ】図１４ａは、ＥＧ６Ｍによるガラス化液によって凍結解凍した細胞シートを二重染色した蛍光顕微鏡写真である。
【図１４ｂ】図１４ｂは、ＣＯＯＨ−ＰＬＬ、ＥＧ６Ｍによるガラス化液によって凍結解凍した細胞シートを二重染色した蛍光顕微鏡写真である。
【図１４ｃ】図１４ｃは、ＢＳＡ−ＰＬＬ、ＥＧ６Ｍによるガラス化液によって凍結解凍した細胞シートを二重染色した蛍光顕微鏡写真である。
【図１４ｄ】図１４ｄは、ＤＭＧＡ−ＰＬＬ、ＥＧ６Ｍによるガラス化液によって凍結解凍した細胞シートを二重染色した蛍光顕微鏡写真である。
【図１５】図１５は、各ガラス化液における凍結解凍後の細胞の生存率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
具体的な実施の形態をあげて、以下に本発明を詳細に説明する。本発明は、以下にあげる具体的な実施の形態に限定されるものではない。
【００１４】
［動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤］
本発明の動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤は、以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群から選択された、アミノ基及びカルボキシル基を同一分子中に有する両性高分子化合物を含む、動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤にある：
（ａ）  ε−ポリ−Ｌ−リジンをブチル無水コハク酸と反応させてカルボキシル化した両性高分子化合物；
（ｂ）  ε−ポリ−Ｌ−リジンを、ブチル無水コハク酸及び無水コハク酸と反応させてカルボキシル化した両性高分子化合物；  又は
（ｃ）  ε−ポリ−Ｌ−リジンを、次の式Ｉ：
【化３】
0006678931.tif 000004
（ただし、上記の式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、水素原子又はＣ１〜Ｃ４のアルキル基であるか、あるいはＲ１及びＲ２が一体となって形成されたＣ１〜Ｃ６のアルカン−ジイル基であり；
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子又はＣ１〜Ｃ４のアルキル基であるか、あるいはＲ３及びＲ４が一体となって形成されたＣ１〜Ｃ６のアルカン−ジイル基であり；
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子又はＣ１〜Ｃ４のアルキル基であるか、あるいはＲ５及びＲ６が一体となって形成されたＣ１〜Ｃ６のアルカン−ジイル基である）
で表される化合物と反応させてカルボキシル化した両性高分子化合物。
【００１５】
［ε−ポリ−Ｌ−リジン］
ε−ポリ−Ｌ−リジンは、公知のε−ポリ−Ｌ−リジンを使用することができる。ε−ポリ−Ｌ−リジンは、例えば分子量が１００〜１００，０００であり、好適な実施の態様において、微生物または酵素により生産される数平均分子量が例えば１０００〜２万、１０００〜１万のε−ポリ−Ｌ−リジンを使用することができる。ε−ポリ−Ｌ−リジンは、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に属する放線菌により生産されてもっぱら食品添加物として用いられており、重合度１５〜３５のものの他、重合度が２０以下のものの生産も試みられている。数平均分子量または数平均重合度の測定は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）法により、例えば、アトー（株）製の電気泳動装置及びデンシトグラフ（ＡＥ−６９２０Ｖ型）を用いて容易に測定することができる。加熱処理による高分子量化により分子量３万以上として用いることもできる。末端のみにフリーのカルボキシル基を有するポリリジンは、側鎖に１級アミノ基を有しており、このアミノ基が、後述する反応によってカルボキシル化される。
【００１６】
［ε−ポリ−Ｌ−リジンのアミノ基のカルボキシル化］
アミノ基及びカルボキシル基を同一分子中に有する両性高分子化合物は、ε−ポリ−Ｌ−リジンの側鎖のアミノ基のうち、カルボキシル化されたアミノ基の割合を、例えば５０％〜７５％、６０％〜７０％の範囲とすることができる。
【００１７】
［ＢＳＡ−ＰＬＬ］
ブチル無水コハク酸（ＢＳＡ）は、実施例に記載の化学反応式の通り、ε−ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）の側鎖のアミノ基と反応して、カルボキシル化した両性高分子化合物（ＢＳＡ−ＰＬＬ）を生成し、これはアミノ基及びカルボキシル基を同一分子中に有する両性高分子化合物であり、本発明の動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤である。
【００１８】
［ＢＳＡ−ＳＡ−ＰＬＬ］
ε−ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）の側鎖のアミノ基が、ブチル無水コハク酸（ＢＳＡ）及び無水コハク酸（ＳＡ）と反応して、カルボキシル化した両性高分子化合物（ＢＳＡ−ＳＡ−ＰＬＬ）は、アミノ基及びカルボキシル基を同一分子中に有する両性高分子化合物であり、本発明の動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤である。ε−ポリ−Ｌ−リジンとの反応は、ブチル無水コハク酸及び無水コハク酸を、同時に反応させてもよく、前後して反応させてもよく、いずれを前又は後に反応させてもよい。ε−ポリ−Ｌ−リジンの側鎖のアミノ基のうち、無水コハク酸との反応によってカルボキシル化されたアミノ基の数Ａに対する、ε−ポリ−Ｌ−リジンの側鎖のアミノ基のうち、ブチル無水コハク酸との反応によってカルボキシル化されたアミノ基の数Ｂの比率Ｂ／Ａを、例えば、２／３０〜４０／３０の範囲、１０／３０〜４０／３０の範囲、３０／４０〜４０／３０の範囲とすることができる。
【００１９】
［ＧＡ−ＰＬＬ］
次の式Ｉで表されるＧＡ誘導体（グルタル酸無水物誘導体）は、ε−ポリ−Ｌ−リジンの側鎖のアミノ基と反応して、カルボキシル化した両性高分子化合物（ＧＡ−ＰＬＬ）を生成し、これはアミノ基及びカルボキシル基を同一分子中に有する両性高分子化合物であり、本発明の動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤である。
【００２０】
【化４】
0006678931.tif 000005
【００２１】
ただし、上記の式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、水素原子又はＣ１〜Ｃ４のアルキル基とすることができ、あるいはＲ１及びＲ２が一体となって、Ｃ１〜Ｃ６のアルカン−ジイル基を形成することができる。Ｃ１〜Ｃ４のアルキル基は、例えばＣ１〜Ｃ３、Ｃ１〜Ｃ２のアルキル基とすることができる。アルカン−ジイル基としては、例えば、Ｃ１〜Ｃ３のアルカン−１，１−ジイル基、Ｃ４〜Ｃ６のアルキレン基をあげることができる。Ｒ１とＲ２の組み合わせとして、例えば、水素原子と水素原子、水素原子とメチル基、水素原子とエチル基、メチル基とメチル基、メチル基とエチル基、エチル基とエチル基をあげることができる。Ｃ１〜Ｃ３のアルカン−１，１−ジイル基として、例えば、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基をあげることができる。Ｃ４〜Ｃ６のアルキレン基として、例えば、テトラメチレン基（ブタン−１，４−ジイル基）、ペンタメチレン基（ペンタン−１，５−ジイル基）をあげることができる。
【００２２】
上記の式中、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子又はＣ１〜Ｃ４のアルキル基とすることができ、あるいはＲ３及びＲ４が一体となって、Ｃ１〜Ｃ６のアルカン−ジイル基を形成することができる。Ｃ１〜Ｃ４のアルキル基は、例えばＣ１〜Ｃ３、Ｃ１〜Ｃ２のアルキル基とすることができる。アルカン−ジイル基としては、例えば、Ｃ１〜Ｃ３のアルカン−１，１−ジイル基、Ｃ４〜Ｃ６のアルキレン基をあげることができる。Ｒ３とＲ４の組み合わせとして、例えば、水素原子と水素原子、水素原子とメチル基、水素原子とエチル基、メチル基とメチル基、メチル基とエチル基、エチル基とエチル基をあげることができる。Ｃ１〜Ｃ３のアルカン−１，１−ジイル基として、例えば、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基をあげることができる。Ｃ４〜Ｃ６のアルキレン基として、例えば、テトラメチレン基（ブタン−１，４−ジイル基）、ペンタメチレン基（ペンタン−１，５−ジイル基）をあげることができる。
【００２３】
上記の式中、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子又はＣ１〜Ｃ４のアルキル基とすることができ、あるいはＲ５及びＲ６が一体となって、Ｃ１〜Ｃ６のアルカン−ジイル基を形成することができる。Ｃ１〜Ｃ４のアルキル基は、例えばＣ１〜Ｃ３、Ｃ１〜Ｃ２のアルキル基とすることができる。アルカン−ジイル基としては、例えば、Ｃ１〜Ｃ３のアルカン−１，１−ジイル基、Ｃ４〜Ｃ６のアルキレン基をあげることができる。Ｒ５とＲ６の組み合わせとして、例えば、水素原子と水素原子、水素原子とメチル基、水素原子とエチル基、メチル基とメチル基、メチル基とエチル基、エチル基とエチル基をあげることができる。Ｃ１〜Ｃ３のアルカン−１，１−ジイル基として、例えば、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基をあげることができる。Ｃ４〜Ｃ６のアルキレン基として、例えば、テトラメチレン基（ブタン−１，４−ジイル基）、ペンタメチレン基（ペンタン−１，５−ジイル基）をあげることができる。
【００２４】
好適な実施の態様において、上記の式中、Ｒ１及びＲ２を上述の基として、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６を水素原子とすることができる。すなわち、次の式ＩＩで表されるＧＡ誘導体とすることができる。
【００２５】
【化５】
0006678931.tif 000006
【００２６】
好適な実施の態様において、上記の式中、Ｒ３及びＲ４を上述の基として、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６を水素原子とすることができる。すなわち、次の式で表されるＧＡ誘導体とすることができる。このＧＡ誘導体は、言うまでもなく、上記の式中、Ｒ５及びＲ６を上述の基として、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４を水素原子としたＧＡ誘導体と等価である。
【００２７】
【化６】
0006678931.tif 000007
【００２８】
このようなＧＡ誘導体として、具体的には、例えば、以下の構造の化合物をあげることができる：
【００２９】
３，３−ジメチルグルタル酸無水物（ＤＭＧＡ）：
【化７】
0006678931.tif 000008
【００３０】
グルタル酸無水物（ＧＡ）：
【化８】
0006678931.tif 000009
【００３１】
３−メチルグルタル酸無水物（ＭＧＡ）：
【化９】
0006678931.tif 000010
【００３２】
２，２−ジメチルグルタル酸無水物：
【化１０】
0006678931.tif 000011
【００３３】
３，３−テトラメチレングルタル酸無水物：
【化１１】
0006678931.tif 000012
【００３４】
３−オキサスピロ［５，５］ウンデカン−２，４−ジオン（３，３−ペンタメチレングルタル酸無水物）：
【化１２】
0006678931.tif 000013
【００３５】
［ＤＭＧＡ−ＰＬＬ］
好適な実施の態様において、３，３−ジメチルグルタル酸無水物（ＤＭＧＡ）が、ε−ポリ−Ｌ−リジンの側鎖のアミノ基と反応して、カルボキシル化した両性高分子化合物（ＤＭＧＡ−ＰＬＬ）を得ることができる。
【００３６】
［動物細胞凍結保存液］
本発明の動物細胞凍結保存液は、上記動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤を含有する生理溶液である。生理溶液としては、特に制限はなく、例えば、公知の組成の生理食塩水、ＰＢＳ、細胞培養培地等をあげることができる。動物細胞凍結保存液に含有される動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤は、例えば２〜４０重量％、３〜３０重量％、５〜２０重量％とすることができる。あるいは、両性高分子の分子量が２０００〜２００００の場合に、例えば１〜１００ｍＭ、５〜５０ｍＭ、１０〜３０ｍＭの濃度とすることができる。
【００３７】
［スクロース］
好適な実施の態様において、動物細胞凍結保存液には、スクロースが、含有される。スクロースの含有量は、例えば０．１〜１Ｍ、０.３〜０.６Ｍの範囲とすることができる。
【００３８】
［エチレングリコール、プロピレングリコール］
好適な実施の態様において、動物細胞凍結保存液には、エチレングリコール（ＥＧ）又はプロピレングリコール（ＰＧ）が含有され、好ましくはエチレングリコールが含有される。エチレングリコール等は、動物細胞凍結保存液において有効な成分であるが、その含有量は細胞毒性の観点から少ないほうが好ましい。本発明によれば、この含有量を低減しつつ、十分に優れたガラス化能を実現することができるために、エチレングリコール濃度を、例えば３〜８Ｍ、４〜７Ｍ、４．５〜７Ｍ、５〜７Ｍ、４Ｍ以上、４．５Ｍ以上などの範囲から選択して使用することができる。
【００３９】
［動物細胞凍結保存方法］
本発明の動物細胞凍結保存方法は、動物細胞凍結保存液中へ、動物細胞を浸漬する工程、動物細胞凍結保存液中の動物細胞を、降温して凍結する工程、を含む方法によって実施することができる。
【００４０】
好適な実施の態様において、動物細胞を、降温して凍結する工程の後に、凍結した、動物細胞凍結保存液中の動物細胞を、昇温して解凍する工程、を行うことができる。
【００４１】
［降温と結晶化］
動物細胞の損傷を防ぐためには、降温して凍結する際に、凍結保存液に結晶化が生じることなく、ガラス化状態（アモルフォス状態）を維持したままで、凍結できることが好ましい。降温速度を大きくすれば結晶化が生じにくくなるが、降温速度の増大には、細胞の取り扱いについての制約の増大が伴うために、熱容量が大きく熱伝導が不均一な三次元細胞構造体、組織、臓器等では、降温速度の増大によるひび割れ、クラックの形成などによる組織の破壊などのため、困難な選択肢となる。本発明によれば、例えば５℃／分〜５０℃／分、１０℃／分〜３０℃／分の範囲の降温速度から選択して、結晶化を生じることなく、ガラス化状態で凍結することができる。結晶化の発生の有無は、実施例に示すＤＳＣ測定によって、検出することができる。
【００４２】
［昇温と再結晶化］
動物細胞をいったんガラス化状態で凍結しても、昇温して解凍する際に、ガラス化状態が破れて、凍結保存液の再結晶化が生じてしまうことがあり、動物細胞の凍結保存による損傷を防ぐためには、この再結晶化を防いで、解凍できることが好ましい。昇温速度を大きくすれば再結晶化が生じにくくなるが、昇温速度の増大には、降温速度と同様に、細胞の取り扱いについての制約の増大が伴うために、熱容量が大きく熱伝導が不均一な三次元細胞構造体、組織、臓器等では、昇温速度の増大によるひび割れ、クラックの形成などによる組織の破壊などのため、困難な選択肢となる。本発明によれば、例えば５℃／分〜１００℃／分、５℃／分〜５０℃／分、１０℃／分〜５０℃／分の範囲の昇温速度から選択して、再結晶化を生じることなく、ガラス化状態を維持して解凍することができる。再結晶化の発生の有無は、実施例に示すＤＳＣ測定によって、検出することができる。
【００４３】
［ガラス化能］
本発明におけるガラス化能とは、ガラス状態を維持して結晶化を防ぐ能力であり、例えば、降温時に結晶化を防ぐ能力、あるいは昇温時に再結晶化を防ぐ能力のいずれであってもよく、両方であってもよい。降温時又は昇温時のいずれかにおける能力が優れていれば、優れたガラス化能を有することとなる。優れたガラス化能を備えた動物細胞凍結保存液を使用すれば、熱容量が大きく熱伝導が不均一な三次元細胞構造体、組織、臓器等に対しても、良好な凍結保存を可能とするので、本発明の動物細胞凍結保存液は、三次元細胞構造体、組織、臓器等の形態の動物細胞に対する使用に好適なものである。そのために、本発明の動物細胞凍結保存液によれば、動物細胞を高い生存率で、凍結することができ、保存することができ、解凍することができる。
【実施例】
【００４４】
以下に実施例をあげて、本発明を詳細に説明する。本発明は、以下に例示する実施例に限定されるものではない。なお、実施例中、特にことわりのない限り「％」及び「部」はそれぞれ重量％及び重量部を示す。
【００４５】
［ＣＯＯＨ−ＰＬＬの合成］
無水コハク酸（ＳＡ、東京化成）を、εポリＬリジン（２５％水溶液、ＪＮＣ、平均分子量４０００）のアミノ基に対して、１５〜５０ｍｏｌ％（あるいは１５〜６５ｍｏｌ％）となるように添加し、５０℃で１時間反応させ、カルボキシル化ポリリジン（ＣＯＯＨ−ＰＬＬ）を作成した。なお、出発材料であるεポリＬリジン（ＰＬＬ）の量に換算して１０重量％の濃度で使用した場合に、ＰＬＬの平均分子量４０００の値から２５ｍＭに相当するので、例えば、ＣＯＯＨ−ＰＬＬの濃度の表記としてＰＬＬ換算１０重量％となる場合には、以下では２５ｍＭと表記することがある。このカルボキシル化ポリリジンは、以下において、ＳＡ−ＰＬＬ、又はＣＯＯＨ−ＰＬＬと記載することがある。特に記載がない場合には、ＣＯＯＨ−ＰＬＬのカルボキシル基導入量はεポリＬリジンの側鎖のアミノ基に対して６５％であり、これをＰＬＬ（０．６５）又はＳＡ（６５）−ＰＬＬと記載することがある。このＣＯＯＨ−ＰＬＬの合成の反応式を、以下に示す。
【００４６】
【化１３】
0006678931.tif 000014
【００４７】
［ＢＳＡ−ＰＬＬの合成］
ブチル無水コハク酸（ＢＳＡ、東京化成）を、εポリＬリジン（２５％水溶液、ＪＮＣ、平均分子量４０００）のアミノ基に対して、１５〜５０ｍｏｌ％（あるいは１５〜６５ｍｏｌ％）となるように添加し、５０℃で１時間反応させ、ブチルカルボキシル化ポリリジン（ＢＳＡ−ＰＬＬ）を作成した。なお、出発材料であるεポリＬリジン（ＰＬＬ）の量に換算して１０重量％の濃度で使用した場合に、ＰＬＬの平均分子量４０００の値から２５ｍＭに相当するので、例えば、ＢＳＡ−ＰＬＬの濃度の表記としてＰＬＬ換算１０重量％となる場合には、以下では２５ｍＭと表記することがある。このＢＳＡ−ＰＬＬの合成の反応式を、以下に示す。上段が反応物、下段が生成物である。
【００４８】
【化１４】
0006678931.tif 000015
【００４９】
［ＢＳＡ−ＳＡ−ＰＬＬの合成］
εポリＬリジン（２５％水溶液、ＪＮＣ、平均分子量４０００）のアミノ基に対して、上記ブチル無水コハク酸によるブチル化に加えて、上記無水コハク酸（ＳＡ）によるカルボキシル化を行って、ブチルカルボキシル化−カルボキシル化−ポリリジン（ＢＳＡ−ＳＡ−ＰＬＬ）を作成した。後述する略号中のカッコ内の数字は、ポリリジンのアミノ基に対するそれぞれのカルボキシル基の導入率を示す。例えばＢＳＡ（３５）−ＳＡ（３０）−ＰＬＬは、ポリリジンのアミノ基のうち、３５％をＢＳＡと反応させ、３０％をＳＡと反応させた両性電解質ポリマーを示す。トータルのカルボキシル基導入量を６５％とした。他にＢＳＡ（１５）−ＳＡ（５０）−ＰＬＬ、ＢＳＡ（５０）−ＳＡ（１５）−ＰＬＬも合成した。なお、単にＢＳＡ−ＰＬＬと表記した場合には、５０％をＢＳＡ−ＰＬＬとのみ置換したＢＳＡ（５０）−ＰＬＬであり、ＳＡと反応させていないものである。なお、出発材料であるεポリＬリジン（ＰＬＬ）の量に換算して１０重量％の濃度で使用した場合に、ＰＬＬの平均分子量４０００の値から２５ｍＭに相当するので、例えば、ＢＳＡ−ＳＡ−ＰＬＬの濃度の表記としてＰＬＬ換算１０重量％となる場合には、以下では２５ｍＭと表記することがある。
【００５０】
［ＤＭＧＡ−ＰＬＬの合成］
３，３−ジメチルグルタル酸無水物（ＤＭＧＡ、シグマアルドリッチ）を、εポリＬリジン（２５％水溶液、ＪＮＣ、平均分子量４０００）のアミノ基に対して、１５−５０ｍｏｌ％（あるいは１５−６５ｍｏｌ％）となるように添加し、５０℃で１時間反応させ、ジメチルグルタルカルボキシル化ポリリジン（ＤＭＧＡ−ＰＬＬ）（３，３ジメチル無水グルタル化ポリリジン）を作成した。なお、出発材料であるεポリＬリジン（ＰＬＬ）の量に換算して１０重量％の濃度で使用した場合に、ＰＬＬの平均分子量４０００の値から２５ｍＭに相当するので、例えば、ＤＭＧＡ−ＰＬＬの濃度の表記としてＰＬＬ換算１０重量％となる場合には、以下では２５ｍＭと表記することがある。この３，３−ジメチルグルタル酸無水物（ＤＭＧＡ）の構造式を以下に示す。（このＤＭＧＡ−ＰＬＬの合成の反応式を、以下に示す。なお、ＤＭＧＡ−ＰＬＬの構造式中の２種類の繰り返し単位は、εポリＬリジンの鎖中にＤＭＧＡによる修飾反応がなされた結果として、必ずしも規則的あるいは周期的に出現するものではなく、ポリマーの鎖中に存在する割合のみを規定することが通常であることを当業者は理解している。つまり、繰り返しの値Ｘ及びＹは、分子内における各部分構造のモル分率を意味する。Ｙ／（Ｘ＋Ｙ）の比率は、ＤＭＧＡによって修飾された繰り返し単位の含有率であり、例えば０．５〜０．７０、０．５〜０．６５の範囲とすることができる。）
【００５１】
【化１５】
0006678931.tif 000016
【００５２】
0006678931.tif 000017
【００５３】
［ガラス化液の調製］
エチレングリコール（ＥＧ）とスクロースの混合溶液（リン酸緩衝液ＰＢＳ溶液）をベースとし、各カルボキシル化ポリリジンを最終１２．５ｍＭとなるように調整したガラス化液を作成した。スクロースの濃度は０．５Ｍで固定し、ＥＧの濃度を４−６．５Ｍまで変えた。
【００５４】
［ＤＳＣ測定］
示差走査熱量計（ＤＳＣ）（セイコーインスツル社製、製品名DSC6200）による各ガラス化液の評価を以下のように行った。
【００５５】
各ガラス化液を、１０μＬ、ＤＳＣ用のアルミパンに乗せ、液体窒素によって、１０℃／ｍｉｎで温度を−１２０度まで下げていき、ＤＳＣ測定のグラフのピークの有無から結晶化の有無を確認した。さらにそこから１０℃／ｍｉｎで室温まで昇温し、ＤＳＣ測定のグラフのピークの有無から再結晶化の有無を確認した。
【００５６】
［比較例１］
［ＤＳＣによる従来のガラス化液の再結晶化評価］
従来のガラス化液の特性を、液体窒素でいったん凍結した後に、上記のＤＳＣ測定の手順で、ただし５０℃／ｍｉｎの昇温速度として、評価した。従来のガラス化液としては、以下のものを使用した。これらのＤＳＣ測定結果を図１に示す。
・ＤＡＰ２１３：  ＤＭＳＯ  ２Ｍ、アセトアミド  １Ｍ、プロピレングリコール  ３Ｍ  を含む水溶液
・ＥＧ６．５Ｍ−Ｓｕｃ０．７５Ｍ：  エチレングリコール  ６．５Ｍ、スクロース０．７５Ｍ  を含む水溶液
・ＥＧ６．５Ｍ−Ｓｕｃ０．７５Ｍ−ＰＬＬ（０．６５）１０％：  エチレングリコール  ６．５Ｍ、スクロース０．７５Ｍ、ＳＡ（６５）−ＰＬＬ  １０重量％  を含む水溶液
【００５７】
図１は昇温速度５０℃／ｍｉｎでの従来のガラス化液のＤＳＣの測定の結果を示すグラフである。ＤＡＰは再結晶化が生じたことを示す発熱ピークが観察された。ＥＧ６．５Ｍ−Ｓｕｃ０．７５Ｍでも、同様に再結晶化が生じたことを示す発熱ピークが観察された。グラフにおいて確認の便宜のために、これらの発熱のピークを楕円で囲んだ。ＰＬＬ（０．６５）を添加したガラス化液、すなわちＥＧ６．５Ｍ−Ｓｕｃ０．７５Ｍ−ＰＬＬ（０．６５）１０％では、再結晶化が生じたことを示す発熱ピークが観察されなかった。
【００５８】
［実施例１］
［ＤＳＣによるガラス化液の結晶化試験］
各ガラス化液の結晶化の特性を、上記のＤＳＣ測定の手順（ただし、降温速度１０℃／ｍｉｎ、昇温速度１０℃／ｍｉｎ）によって、評価した。ガラス化液としては、以下のものを使用した。ＤＳＣ測定結果を、図２ａ（ＣＯＯＨ−ＰＬＬ）、図２ｂ（ＢＳＡ−ＰＬＬ）、図２ｃ（ＢＳＡ（３５）−ＳＡ（３０）−ＰＬＬ）にそれぞれ示す。
・ＣＯＯＨ−ＰＬＬ：  ＳＡ（６５）−ＰＬＬ  ２５ｍＭ、エチレングリコール  ６Ｍ、スクロース  ０．５Ｍ  を含む水溶液
・ＢＳＡ−ＰＬＬ：  ＢＳＡ（６５）−ＰＬＬ  ２５ｍＭ、エチレングリコール  ６Ｍ、スクロース  ０．５Ｍ  を含む水溶液
・ＢＳＡ（３５）−ＳＡ（３０）−ＰＬＬ：  ＢＳＡ（３５）−ＳＡ（３０）−ＰＬＬ  ２５ｍＭ、エチレングリコール  ６Ｍ、スクロース  ０．５Ｍ  を含む水溶液
【００５９】
図２ａは、ＣＯＯＨ−ＰＬＬによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。降温過程（グラフの上半分）において、−７０℃〜−８０℃付近で、結晶化を示すピークが観察された。すなわち、降温によって結晶化が生じた。
【００６０】
図２ｂは、ＢＳＡ−ＰＬＬによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。降温過程（グラフの上半分）において、結晶化を示すピークは観察されなかった。すなわち、降温によって結晶化が生じることなく、ガラス化状態が得られた。
【００６１】
図２ｃは、ＢＳＡ（３５）−ＳＡ（３０）−ＰＬＬによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。降温過程（グラフの上半分）において、結晶化を示すピークは観察されなかった。すなわち、降温によって結晶化が生じることなく、ガラス化状態が得られた。
【００６２】
［実施例２］
［ＤＳＣによるガラス化液の結晶化試験］
各ガラス化液の結晶化の特性を、上記のＤＳＣ測定の手順（ただし、降温速度１０℃／ｍｉｎ、昇温速度１０℃／ｍｉｎ）によって、評価した。ガラス化液としては、以下のものを使用した。これらは、実施例１のＢＳＡ−ＰＬＬにおいて、エチレングリコール濃度を、６Ｍから、それぞれ５Ｍ及び４．５Ｍへと減少させたガラス化液である。ＤＳＣ測定結果を、図３ａ（ＢＳＡ−ＰＬＬ、ＥＧ５Ｍ）、図３ｂ（ＢＳＡ−ＰＬＬ、ＥＧ４．５Ｍ）にそれぞれ示す。
・ＢＳＡ−ＰＬＬ、ＥＧ５Ｍ：  ＢＳＡ（６５）−ＰＬＬ  ２５ｍＭ、エチレングリコール  ５Ｍ、スクロース  ０．５Ｍ  を含む水溶液
・ＢＳＡ−ＰＬＬ、ＥＧ４．５Ｍ：  ＢＳＡ（６５）−ＰＬＬ  ２５ｍＭ、エチレングリコール  ４．５Ｍ、スクロース  ０．５Ｍ  を含む水溶液
【００６３】
図３ａは、ＢＳＡ−ＰＬＬ、ＥＧ５Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。降温過程（グラフの上半分）において、結晶化を示すピークは観察されなかった。すなわち、降温によって結晶化が生じることなく、ガラス化状態が得られた。
【００６４】
図３ｂは、ＢＳＡ−ＰＬＬ、ＥＧ４．５Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。降温過程（グラフの上半分）において、結晶化を示すピークが観察された。
【００６５】
［実施例３］
［ＤＳＣによるガラス化液の結晶化試験］
各ガラス化液の結晶化の特性を、上記のＤＳＣ測定の手順（ただし、降温速度１０℃／ｍｉｎ、昇温速度１０℃／ｍｉｎ）によって、評価した。ガラス化液としては、以下のものを使用した。これらは、実施例１のＢＳＡ（３５）−ＳＡ（３０）−ＰＬＬにおいて、エチレングリコール濃度を、６Ｍから、５．５Ｍへと減少させたガラス化液である。ＤＳＣ測定結果を、図４（ＢＳＡ（３５）−ＳＡ（３０）−ＰＬＬ、ＥＧ５．５Ｍ）に示す。
・ＢＳＡ（３５）−ＳＡ（３０）−ＰＬＬ：  ＢＳＡ（３５）−ＳＡ（３０）−ＰＬＬ  ２５ｍＭ、エチレングリコール  ５．５Ｍ、スクロース  ０．５Ｍ  を含む水溶液
【００６６】
図４は、ＢＳＡ（３５）−ＳＡ（３０）−ＰＬＬ、ＥＧ５．５Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。降温過程（グラフの上半分）において、結晶化を示すピークは観察されなかった。すなわち、降温によって結晶化が生じることなく、ガラス化状態が得られた。
【００６７】
［実施例４］
［ＤＳＣによるガラス化液の再結晶化試験］
各ガラス化液の結晶化の特性を、上記のＤＳＣ測定の手順（ただし、降温速度１０℃／ｍｉｎ、昇温速度４０℃／ｍｉｎ）によって、評価した。ガラス化液としては、以下のものを使用した。ＤＳＣ測定結果を、図５ａ（ＣＯＯＨ−ＰＬＬ）、図５ｂ（ＢＳＡ−ＰＬＬ）、図５ｃ（ＢＳＡ（３５）−ＳＡ（３０）−ＰＬＬ）にそれぞれ示す。
・ＣＯＯＨ−ＰＬＬ：  ＳＡ（６５）−ＰＬＬ  ２５ｍＭ、エチレングリコール  ６．５Ｍ、スクロース  ０．５Ｍ  を含む水溶液
・ＢＳＡ−ＰＬＬ：  ＢＳＡ（６５）−ＰＬＬ  ２５ｍＭ、エチレングリコール  ６Ｍ、スクロース  ０．５Ｍ  を含む水溶液
・ＢＳＡ（３５）−ＳＡ（３０）−ＰＬＬ：  ＢＳＡ（３５）−ＳＡ（３０）−ＰＬＬ  ２５ｍＭ、エチレングリコール  ６．５Ｍ、スクロース  ０．５Ｍ  を含む水溶液
【００６８】
図５ａは、ＣＯＯＨ−ＰＬＬによるガラス化液のＤＳＣ測定による再結晶化評価の結果示すグラフである。昇温過程（グラフの下半分）において、−５０℃〜−２０℃付近で、再結晶化を示すピークが観察された。すなわち、昇温によって再結晶化が生じた。
【００６９】
図５ｂは、ＢＳＡ−ＰＬＬによるガラス化液のＤＳＣ測定による再結晶化評価の結果を示すグラフである。昇温過程（グラフの下半分）において、再結晶化を示すピークは観察されなかった。すなわち、昇温によって再結晶化が生じることなく、ガラス化状態から液体状態へと移行した。
【００７０】
図５ｃは、ＢＳＡ（３５）−ＳＡ（３０）−ＰＬＬによるガラス化液のＤＳＣ測定による再結晶化評価の結果を示すグラフである。昇温過程（グラフの下半分）において、再結晶化を示すピークは観察されなかった。すなわち、昇温によって再結晶化が生じることなく、ガラス化状態から液体状態へと移行した。
【００７１】
［実施例５］
［細胞生存率試験］
各ガラス化液の細胞毒性を以下の細胞生存率試験によって評価した。
【００７２】
ＭＳＣ（間葉系幹細胞）（理研バイオリソースセンター）をシャーレで培養して、細胞シートを調製した。次に、調製した細胞シートを以下に示す各ガラス化液に０℃で２０分間浸漬した。その後、細胞シートをＴｒｉｐａｎ  Ｂｌｕｅ染色した後に、倒立位相差顕微鏡で観察して、生存率を測定した。
【００７３】
次のガラス化液について得られた結果を図６ａに示す。
・ＢＳＡ−ＰＬＬ：  ＢＳＡ（６５）−ＰＬＬ  ２５ｍＭ、エチレングリコール  ５Ｍ、スクロース  ０．５Ｍ  を含む水溶液
・ＣＯＯＨ−ＰＬＬ：  ＳＡ（６５）−ＰＬＬ  ２５ｍＭ、エチレングリコール  ６．５Ｍ、スクロース  ０．５Ｍ  を含む水溶液
・Ｃｏｎｔｒｏｌ：  エチレングリコール  ５Ｍ、スクロース  ０．５Ｍ  を含む水溶液
【００７４】
次のガラス化液について得られた結果を図６ｂに示す。
・ＢＳＡ−ＳＡ−ＰＬＬ：  ＢＳＡ（３５）−ＳＡ（３０）−ＰＬＬ  ２５ｍＭ、エチレングリコール  ５．５Ｍ、スクロース  ０．５Ｍ  を含む水溶液
・ＣＯＯＨ−ＰＬＬ：  ＳＡ（６５）−ＰＬＬ  ２５ｍＭ、エチレングリコール  ６．５Ｍ、スクロース  ０．５Ｍ  を含む水溶液
・Ｃｏｎｔｒｏｌ：  エチレングリコール  ５Ｍ、スクロース  ０．５Ｍ  を含む水溶液
【００７５】
図６ａ及び図６ｂは、各ガラス化液による細胞生存率を示すグラフである。ＢＳＡ−ＳＡ−ＰＬＬは、ＢＳＡ−ＰＬＬよりも細胞生存率が向上して、ＣＯＯＨ−ＰＬＬ及びＣｏｎｔｒｏｌを超える値となっていた。
【００７６】
［実施例１〜５及び比較例１の結果のまとめ］
無水コハク酸のみで６５％カルボキシル化したＣＯＯＨ−ＰＬＬでは、降温過程で結晶化を抑制するのに必要なＥＧの濃度は６．５Ｍ必要であったが、ＢＳＡ−ＰＬＬではＥＧを５Ｍまで下げてもガラス化が可能であった。ＢＳＡ−ＰＬＬのガラス化能の高さが確認された。
【００７７】
ＢＳＡ（３５）−ＳＡ（３０）−ＰＬＬを使用した場合、ＥＧの濃度が５．５Ｍまで下げてもガラス化を確認できた。ＢＳＡが多い方がガラス化能は高いが、細胞生存率がやや減少する（細胞毒性がやや大きくなる）傾向にあるが、ＢＳＡ（３５）−ＳＡ（３０）−ＰＬＬは十分に細胞生存率が大きかった。
【００７８】
昇温過程では、４０℃／ｍｉｎにすると、ＣＯＯＨ−ＰＬＬでは再結晶化が見られていたところ、ＢＳＡ−ＰＬＬでは再結晶化のピークも消失した。このように、ＢＳＡ−ＰＬＬでは、再結晶化も抑制されることが分かり、ガラス状態の安定性が確認された。
【００７９】
［実施例６］
［ＤＳＣによるガラス化液の結晶化試験］
各ガラス化液の結晶化の特性を、上記のＤＳＣ測定の手順（ただし、降温速度１０℃／ｍｉｎ、昇温速度１０℃／ｍｉｎ）によって、評価した。ガラス化液としては、以下のものを使用した。ＤＳＣ測定結果を、図７ａ（ＤＭＧＡ−ＰＬＬ、ＥＧ６Ｍ）、図７ｂ（ＤＭＧＡ−ＰＬＬ、ＥＧ５Ｍ）、図７ｃ（ＤＭＧＡ−ＰＬＬ、ＥＧ４．５Ｍ）、図７ｄ（ＤＭＧＡ−ＰＬＬ、ＥＧ４Ｍ）にそれぞれ示す。
・ＤＭＧＡ−ＰＬＬ、ＥＧ６Ｍ：  ＤＭＧＡ（６５）−ＰＬＬ  ２５ｍＭ、エチレングリコール  ６Ｍ、スクロース  ０．５Ｍ  を含む水溶液
・ＤＭＧＡ−ＰＬＬ、ＥＧ５Ｍ：  ＤＭＧＡ（６５）−ＰＬＬ  ２５ｍＭ、エチレングリコール  ５Ｍ、スクロース  ０．５Ｍ  を含む水溶液
・ＤＭＧＡ−ＰＬＬ、ＥＧ４．５Ｍ：  ＤＭＧＡ（６５）−ＰＬＬ  ２５ｍＭ、エチレングリコール  ４．５Ｍ、スクロース  ０．５Ｍ  を含む水溶液
・ＤＭＧＡ−ＰＬＬ、ＥＧ４Ｍ：  ＤＭＧＡ（６５）−ＰＬＬ  ２５ｍＭ、エチレングリコール  ４Ｍ、スクロース  ０．５Ｍ  を含む水溶液
【００８０】
図７ａは、ＤＭＧＡ−ＰＬＬ、ＥＧ６Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。降温過程（グラフの上半分）において、結晶化を示すピークは観察されなかった。すなわち、降温によって結晶化が生じることなく、ガラス化状態が得られた。
【００８１】
図７ｂは、ＤＭＧＡ−ＰＬＬ、ＥＧ５Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。降温過程（グラフの上半分）において、結晶化を示すピークは観察されなかった。すなわち、降温によって結晶化が生じることなく、ガラス化状態が得られた。
【００８２】
図７ｃは、ＤＭＧＡ−ＰＬＬ、ＥＧ４．５Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。降温過程（グラフの上半分）において、結晶化を示すピークは観察されなかった。すなわち、降温によって結晶化が生じることなく、ガラス化状態が得られた。
【００８３】
図７ｄは、ＤＭＧＡ−ＰＬＬ、ＥＧ４Ｍによるガラス化液のＤＳＣ測定による結晶化評価の結果を示すグラフである。降温過程（グラフの上半分）において、−５０℃〜−６０℃付近で、結晶化を示すピークが観察された。
【００８４】
［実施例７］
実施例７として、後述する実験を行った。特に記載のない限り、その他の条件は実施例１と同様にして行った。
【００８５】
［ガラス化液の調製］
エチレングリコール(EG)とスクロースの混合溶液（PBS）をベースとし、各カルボキシル化ポリリジンを最終25ｍMになるように調整したガラス化液を作成した。スクロース(Su)の濃度は0.5Mで固定し、EGの濃度を4Mから6.5Mまで変えた。使用したガラス化液の組成は、以下の通りである：
・Control : Su0.5M, EG6.5M  ：  図８
・SA-PLL（COOH-PLL）25mM, Su0.5M, EG6.5M  ：  図９
・COOH-PLL25mM, Su0.5M, EG5.5M  ：  図１０ａ
・COOH-PLL25mM, Su0.5M, EG5M  ：  図１０ｂ
・BSA-PLL25mM, Su0.5M, EG5M  ：  図１１ａ
・BSA-PLL25mM, Su0.5M, EG4.5M  ：  図１１ｂ
・DMGA-PLL 25mM, Su0.5M, EG4.5M  ：  図１２ａ
・DMGA-PLL 25mM, Su0.5M, EG4M  ：  図１２ｂ
・COOH-PLL 25mM, Su0.5M, EG6M  ：  図１３ａ
・BSA-PLL 25mM, Su0.5M, EG6M    ：  図１３ｂ
・DMGA-PLL 25mM, Su0.5M, EG6M  ：  図１３ｃ
【００８６】
［DSC測定］
各ガラス化液の評価を以下の様に行った。
各ガラス化液を10μL、DSC用のアルミパンに載せ、液体窒素によって10℃/minで温度を-170℃まで下げていき、結晶化およびガラス化の有無を確認した。さらにそこから10℃/minで室温まで昇温し、再結晶化の有無を確認した。
【００８７】
図８はガラス化液としてポリマー無しのEG6.5M、スクロース0.5Mの溶液、図９はガラス化液としてCOOH-PLL25mM、EG6.5M、スクロース0.5M溶液を10℃/minで降温、昇温した時のDSCカーブである。図８より、ポリマーが無い時は-90℃付近に結晶化のピークが、-30℃付近に融解のピークが見られた。一方、COOH-PLLを添加した際は、結晶化のピークが見られず、-130℃付近にガラス転移点が見られ、ガラス化していることが示された。また、昇温時には-60℃付近に再結晶化のピークも確認された。
【００８８】
図１０ａと図１０ｂは、COOH-PLL添加ガラス化液のEGの濃度を5.5Mおよび5.0Mに低下させた時の結果であるが、5.5Mではガラス化が確認されたが、5Mでは結晶化のピークが見られた。COOH-PLLの結晶化抑制効果はEG5.5M以上で発揮されることが確認できた。
【００８９】
一方で、図１１ａ、図１１ｂからBSA-PLLの結晶化抑制EG濃度は5Mであり、図１２ａ、図１２ｂよりDMGA-PLLの結晶化抑制EG濃度は4.5Mとなった。BSA-PLLの結晶化抑制効果はEG5M以上で発揮されることが確認できた。一方、DMGA-PLLの結晶化抑制効果はEG4.5M以上で発揮されることが確認できた。これらの結果から、合成して比較したポリマー中で、DMGA-PLLが最も高い結晶化抑制効果を持つことが確認できた。
【００９０】
図１３ａ、図１３ｂ、図１３ｃに、3種のポリマーのEG6.0M、スクロース0.5M溶液のDSC結果を示す。すべてのポリマーにおいてこの濃度のEGでは結晶化は起こらず、ガラス化していることが確認される。一方、図１３ａ、図１３ｂから、COOH-PLLとBSA-PLLでは昇温時に再結晶化が見られたのに対し、図１３ｃからはDMGA-PLLでは再結晶化も見られなかった。これらの結果より、DMGA-PLLでは結晶化抑制効果、再結晶化抑制効果ともに、他のポリマーよりも効果が高いことが確認された。
【００９１】
［実施例８］
［細胞生存率試験］
次に、これらポリマーを使用したガラス化液でヒト間葉系幹細胞(MSC)（理研バイオリソースセンター）シートをガラス化保存して、細胞の生存率を確認する実験を、後述の手順で行った。この実験の手順の概要を示す説明図を、スキーム１として示す。使用したガラス化液の組成は、以下の通りである：
・control: EG6M, Su0.5M  ：  図１４ａ
・COOH-PLL: COOH-PLL25mM, EG6M, Su0.5M  ：  図１４ｂ
・BSA-PLL: BSA-PLL25mM, EG6M, Su0.5M  ：  図１４ｃ
・DMGA-PLL: DMGA-PLL25mM, EG6M, Su0.5M  ：  図１４ｄ
・control: EG6M, Su0.5M  ：  図１５のａ
・COOH-PLL: COOH-PLL25mM, EG6M, Su0.5M  ：  図１５のｂ
・BSA-PLL: BSA-PLL25mM, EG6M, Su0.5M  ：  図１５のｃ
・DMGA-PLL: DMGA-PLL25mM, EG6M, Su0.5M  ：  図１５のｄ
【００９２】
スキーム１：
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【００９３】
MSCは10%ウシ胎児血清添加ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を使用し、37℃のインキュベータ中で培養した。3.5cm細胞培養用シャーレ(IWAKI)にコンフルエントになった後、1週間継続して培養した細胞シートを実験に用いた。
培養液を除去した後、MSCシートに20％EG/DMEM溶液を2mL添加し、室温で25分放置し、平衡化させた。その後、溶液を除去した後、氷温で各ガラス化液を500μL添加し、20分放置後、液体窒素蒸気から1cmの地点にシャーレを維持し、凍結した。このときの液体窒素蒸気からの距離で凍結スピードを制御することが可能であり、蒸気から1cmの地点では約10℃/minの凍結スピードが得られることが分かっている。その後、蒸気雰囲気下で10分放置し、十分固化した後、液体窒素の浸漬し、凍結を完了させた。続いて解凍操作にうつった。解凍は、液体窒素から取り出したMSCシート培養ディッシュに37℃に暖めた１Mスクロース/DMEMを3ml加え、1分後に除去した。次に0.5Mスクロース/DMEM溶液を3mL加え、3分後に除去した。続いてDMEMを3mL加え、5分後に除去を2回くり返し、最後はDMEMを２ｍL添加して37℃のインキュベーター中で培養にうつった。翌日、Live/Deadアッセイにより生存率を評価した。
【００９４】
この実験の結果を図１４ａ、図１４ｂ、図１４ｃ、図１４ｄに示す。図１４ａ〜１４ｄはそれぞれのガラス液を使用して上記手順で凍結解凍した細胞シートを二重染色した蛍光顕微鏡写真であり、視野の右下のバーは１００μｍを示す。Live/Deadアッセイによって、生細胞はCalseinAMで緑色に染色されており、死細胞はエチジウムホモダイマーで赤色に染色されている。図１４ａ、図１４ｂ、図１４ｃ、図１４ｄの視野中の生細胞（緑色染色細胞）と死細胞（赤色染色細胞）の数をそれぞれカウントして生存率を求めた。ポリマー無しのガラス化液（図１４ａ）では30％程度の生存率であったのに対し、COOH-PLLの系（図１４ｂ）では75％、BSA-PLL系（図１４ｃ）では55%、DMGA-PLL系（図１４ｄ）では93%であった。この値を棒グラフにして、図１５として示す。図１５の横軸のａ、ｂ、ｃ、ｄは、それぞれ図１４のａ、ｂ、ｃ、ｄに対応する。この結果から、DMGA-PLLの効果が高いことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明によれば、優れたガラス化能を有する動物細胞凍結保存液を得ることができる。本発明は産業上有用な発明である。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１４ｃ】
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【図１４ｄ】
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【図１５】
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