(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
鮭由来のプロテオグリカンを、プロトン型強酸性陽イオン交換樹脂に接触させ、次に、該接触プロテオグリカンをピリジンで中和させ、次に、中和したプロテオグリカンに三酸化硫黄ピリジン錯体を加え、ジメチルスルホキシド中で２０〜４０℃で１〜５時間反応させ得られる硫酸基が２２重量％以上３６重量％以下の範囲で付加されたプロテオグリカンを有効成分とする上皮細胞増殖剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、効果の高い多硫酸化プロテオグリカンの上皮細胞増殖剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
肌などの上皮細胞増殖剤の細胞のターンオーバーの速さは、火傷における回復やシミ、皺などの減少にも関わるので、医薬品や化粧料では重要な事項である。ターンオーバーの速さは細胞の増殖能と同義的であり、細胞増殖因子様作用を有する物質としてタンパク質やペプチドを中心に見出されている。
【０００３】
化粧料の分野では、皮膚の健康や美容を保つため、保水性と細胞増殖因子様作用を有する物質が求められている。近年、プロテオグリカンは保水性を有するばかりでなく、細胞増殖因子様作用も有することが明らかにされてきた（特許文献１、特許文献２、非特許文献１）。しかし、プロテオグリカンの細胞増殖因子様作用は弱いという欠点があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−２４７８０３号  公報
【特許文献２】特開２０１１−１０８３３９号  公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｆｏｏｄ  Ｓｔｙｌｅ  ２１、第１３巻Ｎｏ．１、７０−７２頁、２００９年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、従来のプロテオグリカンの上皮細胞増殖因子様作用を改善することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を達成するために、本発明の上皮細胞増殖剤は、プロテオグリカンについて、硫酸基を２２重量％以上含む多硫酸化プロテオグリカンを有効成分とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の硫酸基を２２重量％以上含む多硫酸化プロテオグリカンは、安全で、上皮細胞増殖効果の高いものである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、実施の形態をより具体的に説明する。
【００１０】
本発明の原料となるプロテオグリカンは、動物や魚類に存在するグリコサミノグリカンとタンパク質の共有結合物からなる分子量数十万から数百万の天然高分子化合物である。起源となる生物や抽出・製造条件により、分子量や含まれる糖（ウロン酸、アミノ糖、中性糖など）やアミノ酸の種類や量、比率も異なっているが、本発明の原料となるプロテオグリカンは、起源となる生物や抽出・製造条件を問わない。プロテオグリカンは、糖タンパク質の一種であるが、グリコサミノグリカンの重量構成比が７０％以上であり、ウロン酸とアミノ糖がほぼ当量で含まれている。そのため、プロテオグリカンの簡易な定性法、定量法として、ウロン酸に特異的な呈色反応法であるカルバゾール硫酸法が、一般的に用いられている。
【００１１】
本発明でいう多硫酸化プロテオグリカンとは、プロテオグリカンのヒドロキシ基に硫酸基がエステル結合したものであって、プロテオグリカン全体の重量のうち、硫酸基を２２重量％以上含有するプロテオグリカンをいう。本発明は天然のプロテオグリカンに硫酸基を付加させた多硫酸化プロテオグリカンが、上皮細胞増殖剤として有効であることを見出したものである。
【００１２】
硫酸基含量の測定法は、元素分析あるいはロジゾン酸法などの比色法など、硫酸基が定量できる方法であればいずれでもよい。元素分析の場合は、分析の結果から得られた硫黄含量を基に硫酸基含量を算出する。プロテオグリカンにおいて、硫黄原子は糖鎖中の硫酸基とタンパク質中のアミノ酸に含まれる。プロテオグリカンのタンパク質中のアミノ酸の硫黄量は、プロテオグリカンの糖鎖中の硫酸基の硫黄量に比べて極めて少ない。よって、本明細書においては、元素分析で測定された硫黄含量を、糖鎖の硫酸基由来の硫黄含量として表し、硫黄含量から硫酸基含量を計算で求める。硫黄含量を測定する元素分析については、硫黄含量を測定できる手法であればいずれでもよい。
【００１３】
硫酸基を２２重量％以上含む多硫酸化プロテオグリカンは、原料となるプロテオグリカンを有機溶媒に可溶な状態にし、有機溶媒中にて、硫酸や三酸化硫黄ピリジン錯体、三酸化硫黄トリエチルアミン錯体、三酸化硫黄ジメチルホルムアミド錯体など各種硫酸化試薬を反応させることにより得られる。有機溶媒は可能な限り予備乾燥され、水分や不純物が少ないものが、反応効率の点で好ましい。反応温度は概ね２０〜６０℃程度、反応時間は概ね１時間以上必要である。硫酸化試薬は、そのまま反応液に添加する方法でもよいし、はじめに有機溶媒に溶解させ、その溶解液を反応液に滴下する方法でもよい。
【００１４】
硫酸化反応後、少量の水を添加することで反応を止め、塩基による中和工程や、エタノール沈殿や透析などによる精製工程を経て、本発明の実施の形態に係る多硫酸化プロテオグリカンが得られる。
【００１５】
本発明の上皮細胞増殖剤は使用製品形態により異なるが、多硫酸化プロテオグリカンをおおよそ０．０１重量％以上含んだ状態で使用するのが好ましい。
【００１６】
本発明の上皮細胞増殖剤の有効成分である多硫酸化プロテオグリカンは水溶性であることから、そのまま固体での使用以外にも、水溶液に溶解し使用可能であり、ハンドリングに優れている。化粧料として使用する場合は、化粧水、乳液、クリームなどに容易に添加することができる。医薬用的な利用として、皮膚へ塗布するクリームや貼付剤の原料の一部として添加してもよい。また、他の原材料と一緒にカプセルの中に封じ込めたり、錠剤化してもよい。
【００１７】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、これは単に例示の目的で述べるものであり、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００１８】
（多硫酸化プロテオグリカンの製造１−１：プロテオグリカンピリジニウム塩の調製）
原料となるプロテオグリカンは、市販の鮭由来プロテオグリカン（角弘プロテオグリカン研究所）を購入し、用いた（以降、「原料ＰＧ」と表記する）。強酸性陽イオン交換樹脂（商品名：ダイヤイオンＳＫ１Ｂ（三菱化学））をガラス製カラムに充填し（内径４．５ｃｍ、高さ５ｃｍ）、１Ｍ塩酸６０ｍＬと脱イオン水２００ｍＬを順次流下して樹脂をプロトン型に活性化した後、原料ＰＧ０．５０ｇを脱イオン水１０ｍＬに溶解した溶液を、室温でカラム上方から添加・流下した。その後、樹脂に脱イオン水を約５０ｍＬ流下し、溶出液約６０ｍＬを得た。溶出液のｐＨを卓上ｐＨメータ（Ｆ−５５、堀場製作所製）で測定したところ、２．１であった。ｐＨを測定しながら、ピリジン（試薬特級、関東化学）を滴下し、溶出液のｐＨを６．６とした。中和後の溶液を回収し、凍結乾燥し、０．５４ｇの白色綿状固体であるプロテオグリカンピリジニウム塩を得た。以降の実施例で用いるプロテオグリカンピリジニウム塩は、すべて本実施例と同じ方法で得たものである。
【００１９】
（多硫酸化プロテオグリカンの製造１−２：硫酸化反応）
本実施例に係るプロテオグリカンピリジニウム塩１５ｍｇとジメチルスルホキシド（特級、関東化学）０．９ｍＬをふた付バイアル瓶に入れ、続いて三酸化硫黄ピリジン錯体（純度９０％以上、和光純薬工業）４７ｍｇを添加し、プロテオグリカンピリジニウム塩と三酸化硫黄ピリジン錯体をジメチルスルホキシドに溶解させた。バイアル瓶のふたを閉め、溶液が入ったバイアル瓶を２０℃の恒温水層に入れた。１時間後にバイアル瓶を恒温水層から取り出し、溶液のｐＨを卓上ｐＨメータ（Ｆ−５５、堀場製作所製）により測定したところ、弱酸性を呈した。溶液を水酸化ナトリウム水溶液で中和し、全量をプラスチック製遠沈管に移し、エタノール３０ｍＬを加え、卓上遠心機（ｈｉｍａｃ  ＣＴ  ６Ｄ、日立工機製）を用い、２，０００ｒｐｍで１０分間、室温で遠心分離を行った。遠心分離処理後、上澄みを除去し、得られた沈殿に脱イオン水約１０ｍＬを加え、溶解させた。溶解液にエタノール３０ｍＬを加え、再度遠心分離を行った。遠心分離処理後、上澄みを除去し、得られた沈殿に脱イオン水約１５ｍＬを加え、溶解させた。溶解液全量を透析用セルロースチューブ（エーディア）に入れ、チューブの両端をクリップ留めし、脱イオン水を外液にして透析した。外液は１日に３回交換した。３日後、透析用セルロースチューブ内液を回収し、エバポレーターで溶液が約５ｍＬになるまで濃縮した。濃縮後の溶液を凍結乾燥し、１５ｍｇの白色綿状固体である多硫酸化プロテオグリカンを得た。
【００２０】
（多硫酸化プロテオグリカンの分析１）
実施例１に係る多硫酸化プロテオグリカンのウロン酸含量をカルバゾール硫酸法で求めた。実施例１に係る多硫酸化プロテオグリカンの２００μｇ／ｍＬ水溶液０．２５ｍＬに、カルバゾール溶液５０μＬと濃硫酸１．５ｍＬを添加してよく撹拌し、２０分間１００℃で加熱した。放冷後、分光光度計（Ｕ−３４１０、日立製作所製）で５３５ｎｍの吸光度を測定した。グルクロン酸（シグマ）を標準物質として作成した検量線より、実施例１に係る多硫酸化プロテオグリカンのウロン酸含量は３２．７重量％と算出された。
【００２１】
原料ＰＧのウロン酸含量を、同様の方法で測定したところ、３４．６重量％であった。
【００２２】
実施例１に係る多硫酸化プロテオグリカンの硫酸基含量を、燃焼型元素分析装置ｖａｒｉｏ  ＥＬ  ｃｕｂｅ（エレメンタール社製）を用い、炭素・水素・窒素・硫黄の４元素測定モードで測定した結果より算出した。実施例１に係る多硫酸化プロテオグリカンの硫黄含量は７．５重量％であり、硫酸基含量は２２．５重量％と算出された。同様の測定法で原料ＰＧを測定したところ、硫黄含量は４．５重量％であり、硫酸基含量は１３．５重量％と算出された。
【００２３】
実施例１に係る多硫酸化プロテオグリカンの炭素含量を、燃焼型元素分析装置ｖａｒｉｏ  ＥＬ  ｃｕｂｅ（エレメンタール社製）を用い、炭素・水素・窒素・硫黄の４元素測定モードで測定した。実施例１に係る多硫酸化プロテオグリカンの炭素含量は２９．９５重量％であり、炭素含量に対する硫黄含量の重量比は０．２５であった。同様の測定法で原料ＰＧの炭素含量を測定したところ、炭素含量は３０．８５重量％であり、炭素含量に対する硫黄含量の重量比は０．１５であった。硫酸化反応の前後で、プロテオグリカンの基本骨格を成す炭素原子の量は不変であるため、炭素含量に対する硫黄含量の重量比を比較することで、硫酸基の導入度合を算出することができる。炭素含量に対する硫黄含量の重量比の相対比より、実施例１に係る多硫酸化プロテオグリカンは、原料ＰＧの約１．７倍に硫酸基が増えたことが分かった。
【００２４】
（上皮細胞数の測定方法の検討）
上皮細胞として、正常ヒト皮膚線維芽細胞（クラボウ）を用いた。９６ウェルプレートに、５％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で、細胞数を変えて播種した。細胞数の測定にあたって、生細胞に特異的に反応し、生成する水溶性ホルマザンの濃度を指標として、細胞数を算出した。具体的には、セルカウンティングキット−８ (同仁化学)を用い、最終濃度１０％（ｖ／ｖ）となるように各ウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で１時間反応させ、マイクロプレートリーダー（ＴｒｉＳｔａｒ  ＬＢ９４１、ベルトールドジャパン社製）を用いて、４５０ｎｍの吸光度を測定した。予備試験の結果、細胞数０〜４×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェルの範囲で、４５０ｎｍの吸光度と正の一次相関が得られた。以下、明細書では細胞数を吸光度で測定することとする。
【００２５】
（上皮細胞増殖促進効果の検討１）
正常ヒト皮膚線維芽細胞（クラボウ）を９６ウェルプレートに４×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェルの密度で播種し、５％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下２４時間前培養を行った。その後、試験物質として原料ＰＧまたは実施例１に係る多硫酸化プロテオグリカン（添加濃度１００、２００、４００mｇ／ｍＬ）を添加した０．２５％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地に交換して、さらに７２時間培養した。試験物質を添加していない区分を無添加対照群とした。また５％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養したものを陽性対照群とした（各群のサンプル数８）。培養終了後、セルカウンティングキット−８ (同仁化学)を用い、上記と同様に４５０ｎｍの吸光度を測定した。実験データは平均値±標準誤差で表し、無添加対照群の細胞増殖率を１００％として、テューキー法の検定により各群の細胞増殖率を比較した。
【００２６】
その結果、原料ＰＧ群の細胞増殖率は、添加濃度１００、２００、４００mｇ／ｍＬで、それぞれ１０６．４±１．４、１０９．０±１．２、１１０．４±１．３％であった。実施例１に係る多硫酸化プロテオグリカン群の細胞増殖率は、添加濃度１００、２００、４００mｇ／ｍＬで、それぞれ１１７．４±２．１、１２２．０±１．９、１２６．６±２．５％であった。なお、陽性対照群の細胞増殖率は１６９．１±２．６であった。テューキー法の検定により各群の細胞増殖率を比較したところ、原料ＰＧ群の１００mｇ／ｍＬの添加に対して、実施例１に係る多硫酸化プロテオグリカンの１００mｇ／ｍＬ添加は有意差（ｐ＜０．０１）があり、原料ＰＧ群の４００mｇ／ｍＬの添加に対して、２００と４００mｇ／ｍＬ添加は有意差（ｐ＜０．０１）があった。実施例１に係る多硫酸化プロテオグリカンは、原料ＰＧ群に対して有意な細胞増殖能の向上が認められた。なお、実施例１に係る多硫酸化プロテオグリカン群は全ての添加濃度において、無添加対照群に対して有意差（ｐ＜０．０１）があり、細胞増殖能の向上が認められた。原料ＰＧ及び実施例１に係る多硫酸化プロテオグリカンを添加しても、細胞の形態などには異常が観察されず、細胞毒性などはないものと判断された。
【実施例２】
【００２７】
（多硫酸化プロテオグリカンの製造２）
実施例１に係るプロテオグリカンピリジニウム塩１５ｍｇとジメチルスルホキシド（特級、関東化学）０．９ｍＬをふた付バイアル瓶に入れ、続いて三酸化硫黄ピリジン錯体（純度９０％以上、和光純薬工業）７９ｍｇを添加し、プロテオグリカンピリジニウム塩と三酸化硫黄ピリジン錯体をジメチルスルホキシドに溶解させた。バイアル瓶のふたを閉め、溶液が入ったバイアル瓶を２０℃の恒温水層に入れた。１時間後にバイアル瓶を恒温水層から取り出し、溶液のｐＨを卓上ｐＨメータ（Ｆ−５５、堀場製作所製）により測定したところ、弱酸性を呈した。溶液を水酸化ナトリウム水溶液で中和し、全量をプラスチック製遠沈管に移し、エタノール３０ｍＬを加え、卓上遠心機（ｈｉｍａｃ  ＣＴ  ６Ｄ、日立工機製）を用い、２，０００ｒｐｍで１０分間、室温で遠心分離を行った。遠心分離処理後、上澄みを除去し、得られた沈殿に脱イオン水約１０ｍＬを加え、溶解させた。溶解液にエタノール３０ｍＬを加え、再度遠心分離を行った。遠心分離処理後、上澄みを除去し、得られた沈殿に脱イオン水約１５ｍＬを加え、溶解させた。溶解液全量を透析用セルロースチューブ（エーディア）に入れ、チューブの両端をクリップ留めし、脱イオン水を外液にして透析した。外液は１日に３回交換した。３日後、透析用セルロースチューブ内液を回収し、エバポレーターで溶液が約５ｍＬになるまで濃縮した。濃縮後の溶液を凍結乾燥し、１５ｍｇの白色綿状固体である多硫酸化プロテオグリカンを得た。
【００２８】
（多硫酸化プロテオグリカンの分析２）
実施例２に係る多硫酸化プロテオグリカンのウロン酸含量を、実施例１と同様の方法で測定したところ、２９．９重量％であった。
【００２９】
実施例２に係る多硫酸化プロテオグリカンの硫酸基含量を、実施例１と同様の方法で算出したところ、硫黄含量は８．５重量％であり、硫酸基含量は２５．０重量％であった。
【００３０】
実施例２に係る多硫酸化プロテオグリカンの炭素含量を、実施例１と同様の方法で測定した。その結果、炭素含量は２８．２９重量％であり、炭素含量に対する硫黄含量の重量比は０．３０であった。実施例１より、原料ＰＧの炭素含量に対する硫黄含量の重量比は０．１５であった。炭素含量に対する硫黄含量の重量比の相対比より、実施例２に係る多硫酸化プロテオグリカンは、原料ＰＧの約２．０倍に硫酸基が増えたことが分かった。
【００３１】
（上皮細胞増殖促進効果の検討２）
試験物質として原料ＰＧと実施例２に係る多硫酸化プロテオグリカンを用いて、実施例１と同様の方法で試験を行った。その結果、原料ＰＧ群の細胞増殖率は、添加濃度１００、２００、４００mｇ／ｍＬで、それぞれ１０６．４±１．４、１０９．０±１．２、１１０．４±１．３％であった。実施例２に係る多硫酸化プロテオグリカン群の細胞増殖率は、添加濃度１００、２００、４００mｇ／ｍＬで、それぞれ１１３．５±１．９、１２３．３±２．８、１２３．９±２．９％であった。なお、陽性対照群の細胞増殖率は１６９．１±２．６であった。テューキー法の検定により各群の細胞増殖率を比較したところ、原料ＰＧ群の１００mｇ／ｍＬの添加に対して、実施例２に係る多硫酸化プロテオグリカンの１００mｇ／ｍＬ添加は有意差（ｐ＜０．０５）があり、原料ＰＧ群の４００mｇ／ｍＬの添加に対して、実施例２に係る多硫酸化プロテオグリカンの２００と４００mｇ／ｍＬ添加は有意差（ｐ＜０．０１）があった。実施例２に係る多硫酸化プロテオグリカンは、原料ＰＧ群に対して細胞増殖能の向上が認められた。なお、実施例２に係る多硫酸化プロテオグリカン群は全ての添加濃度において、無添加対照群に対して有意差（ｐ＜０．０１）が有り、細胞増殖能の向上が認められた。実施例２に係る多硫酸化プロテオグリカンを添加しても、細胞の形態などには異常が観察されず、細胞毒性などはないものと判断された。
【実施例３】
【００３２】
（多硫酸化プロテオグリカンの製造３）
実施例１に係るプロテオグリカンピリジニウム塩３０ｍｇとジメチルスルホキシド（特級、関東化学）１．８ｍＬをふた付バイアル瓶に入れ、続いて三酸化硫黄ピリジン錯体（純度９０％以上、和光純薬工業）９４ｍｇを添加し、プロテオグリカンピリジニウム塩と三酸化硫黄ピリジン錯体をジメチルスルホキシドに溶解させた。バイアル瓶のふたを閉め、溶液が入ったバイアル瓶を４０℃の恒温水層に入れた。１時間後にバイアル瓶を恒温水層から取り出し、溶液のｐＨを卓上ｐＨメータ（Ｆ−５５、堀場製作所製）により測定したところ、弱酸性を呈した。溶液を水酸化ナトリウム水溶液で中和し、全量をプラスチック製遠沈管に移し、エタノール３０ｍＬを加え、卓上遠心機（ｈｉｍａｃ  ＣＴ  ６Ｄ、日立工機製）を用い、２，０００ｒｐｍで１０分間、室温で遠心分離を行った。遠心分離処理後、上澄みを除去し、得られた沈殿に脱イオン水約１０ｍＬを加え、溶解させた。溶解液にエタノール３０ｍＬを加え、再度遠心分離を行った。遠心分離処理後、上澄みを除去し、得られた沈殿に脱イオン水約１５ｍＬを加え、溶解させた。溶解液全量を透析用セルロースチューブ（エーディア）に入れ、チューブの両端をクリップ留めし、脱イオン水を外液にして透析した。外液は１日に３回交換した。３日後、透析用セルロースチューブ内液を回収し、エバポレーターで溶液が約５ｍＬになるまで濃縮した。濃縮後の溶液を凍結乾燥し、３５ｍｇの白色綿状固体である多硫酸化プロテオグリカンを得た。
【００３３】
（多硫酸化プロテオグリカンの分析３）
実施例３に係る多硫酸化プロテオグリカンのウロン酸含量を、実施例１と同様の方法で測定したところ、２８．５重量％であった。
【００３４】
実施例３に係る多硫酸化プロテオグリカンの硫酸基含量を、実施例１と同様の方法で算出したところ、硫黄含量は１１．０重量％であり、硫酸基含量は３３．０重量％であった。
【００３５】
実施例３に係る多硫酸化プロテオグリカンの炭素含量を、実施例１と同様の方法で測定した。その結果、炭素含量は２６．２４重量％であり、炭素含量に対する硫黄含量の重量比は０．４２であった。実施例１より、原料ＰＧの炭素含量に対する硫黄含量の重量比は０．１５であった。炭素含量に対する硫黄含量の重量比の相対比より、実施例３に係る多硫酸化プロテオグリカンは、原料ＰＧの約２．８倍に硫酸基が増えたことが分かった。
【００３６】
（上皮細胞増殖促進効果の検討３）
試験物質として原料ＰＧと実施例３に係る多硫酸化プロテオグリカンを用いて、実施例１と同様の方法で試験を行った。その結果、原料ＰＧ群の細胞増殖率は、添加濃度１００、２００、４００mｇ／ｍＬで、それぞれ１０６．４±１．４、１０９．０±１．２、１１０．４±１．３％であった。実施例３に係る多硫酸化プロテオグリカン群の細胞増殖率は、添加濃度１００、２００、４００mｇ／ｍＬで、それぞれ１１５．７±１．８、１１８．５±２．４、１２２．５±３．０％であった。なお、陽性対照群の細胞増殖率は１６９．１±２．６であった。テューキー法の検定により各群の細胞増殖率を比較したところ、原料ＰＧ群の１００mｇ／ｍＬの添加に対して、実施例３に係る多硫酸化プロテオグリカンの１００mｇ／ｍＬ添加は有意差（ｐ＜０．０１）があり、原料ＰＧ群の２００mｇ／ｍＬの添加に対して、実施例３に係る多硫酸化プロテオグリカンの２００mｇ／ｍＬ添加は有意差（ｐ＜０．０５）があり、原料ＰＧ群の４００mｇ／ｍＬの添加に対して、実施例３に係る多硫酸化プロテオグリカンの４００mｇ／ｍＬ添加は有意差（ｐ＜０．０１）があった。実施例３に係る多硫酸化プロテオグリカンは、原料ＰＧ群に対して細胞増殖能の向上が認められた。なお、実施例３に係る多硫酸化プロテオグリカン群は全ての添加濃度において、無添加対照群に対して有意差（ｐ＜０．０１）があり、細胞増殖能の向上が認められた。実施例３に係る多硫酸化プロテオグリカンを添加しても、細胞の形態などには異常が観察されず、細胞毒性などはないものと判断された。
【実施例４】
【００３７】
（多硫酸化プロテオグリカンの製造４）
実施例１に係るプロテオグリカンピリジニウム塩３０ｍｇとジメチルスルホキシド（特級、関東化学）１．８ｍＬをふた付バイアル瓶に入れ、続いて三酸化硫黄ピリジン錯体（純度９０％以上、和光純薬工業）１５７ｍｇを添加し、プロテオグリカンピリジニウム塩と三酸化硫黄ピリジン錯体をジメチルスルホキシドに溶解させた。バイアル瓶のふたを閉め、溶液が入ったバイアル瓶を４０℃の恒温水層に入れた。１時間後にバイアル瓶を恒温水層から取り出し、溶液のｐＨを卓上ｐＨメータ（Ｆ−５５、堀場製作所製）により測定したところ、弱酸性を呈した。溶液を水酸化ナトリウム水溶液で中和し、全量をプラスチック製遠沈管に移し、エタノール３０ｍＬを加え、卓上遠心機（ｈｉｍａｃ  ＣＴ  ６Ｄ、日立工機製）を用い、２，０００ｒｐｍで１０分間、室温で遠心分離を行った。遠心分離処理後、上澄みを除去し、得られた沈殿に脱イオン水約１０ｍＬを加え、溶解させた。溶解液にエタノール３０ｍＬを加え、再度遠心分離を行った。遠心分離処理後、上澄みを除去し、得られた沈殿に脱イオン水約１５ｍＬを加え、溶解させた。溶解液全量を透析用セルロースチューブ（エーディア）に入れ、チューブの両端をクリップ留めし、脱イオン水を外液にして透析した。外液は１日に３回交換した。３日後、透析用セルロースチューブ内液を回収し、エバポレーターで溶液が約５ｍＬになるまで濃縮した。濃縮後の溶液を凍結乾燥し、３８ｍｇの白色綿状固体である多硫酸化プロテオグリカンを得た。
【００３８】
（多硫酸化プロテオグリカンの分析４）
実施例４に係る多硫酸化プロテオグリカンのウロン酸含量を、実施例１と同様の方法で測定したところ、２７．５重量％であった。
【００３９】
実施例４に係る多硫酸化プロテオグリカンの硫酸基含量を、実施例１と同様の方法で算出したところ、硫黄含量は１２．０重量％であり、硫酸基含量は３６．０重量％であった。
【００４０】
実施例４に係る多硫酸化プロテオグリカンの炭素含量を、実施例１と同様の方法で測定した。その結果、炭素含量は２５．３０重量％であり、炭素含量に対する硫黄含量の重量比は０．４７であった。実施例１より、原料ＰＧの炭素含量に対する硫黄含量の重量比は０．１５であった。炭素含量に対する硫黄含量の重量比の相対比より、実施例４に係る多硫酸化プロテオグリカンは、原料ＰＧの約３．１倍に硫酸基が増えたことが分かった。
【００４１】
（上皮細胞増殖促進効果の検討４）
試験物質として原料ＰＧと実施例４に係る多硫酸化プロテオグリカンを用いて、実施例１と同様の方法で試験を行った。その結果、原料ＰＧ群の細胞増殖率は、添加濃度１００、２００、４００mｇ／ｍＬで、それぞれ１０６．４±１．４、１０９．０±１．２、１１０．４±１．３％であった。実施例４に係る多硫酸化プロテオグリカン群の細胞増殖率は、添加濃度１００、２００、４００mｇ／ｍＬで、それぞれ１２０．２±２．６、１２８．５±２．４、１３１．６±２．８％であった。なお、陽性対照群の細胞増殖率は１６９．１±２．６であった。テューキー法の検定により各群の細胞増殖率を比較したところ、原料ＰＧ群の４００mｇ／ｍＬの添加に対して、実施例４に係る多硫酸化プロテオグリカンの１００mｇ／ｍＬ添加は有意差（ｐ＜０．０５）があり、実施例４に係る多硫酸化プロテオグリカンの２００、４００mｇ／ｍＬ添加は有意差（ｐ＜０．０１）があった。実施例４に係る多硫酸化プロテオグリカンは、原料ＰＧ群に対して細胞増殖能の向上が認められた。なお、実施例４に係る多硫酸化プロテオグリカン群は全ての添加濃度において、無添加対照群に対して有意差（ｐ＜０．０１）があり、細胞増殖能の向上が認められた。実施例４に係る多硫酸化プロテオグリカンを添加しても、細胞の形態などには異常が観察されず、細胞毒性などはないものと判断された。
【実施例５】
【００４２】
（多硫酸化プロテオグリカンの製造５）
実施例１に係るプロテオグリカンピリジニウム塩３０ｍｇとジメチルスルホキシド（特級、関東化学）１．８ｍＬをふた付バイアル瓶に入れ、続いて三酸化硫黄ピリジン錯体（純度９０％以上、和光純薬工業）１５７ｍｇを添加し、プロテオグリカンピリジニウム塩と三酸化硫黄ピリジン錯体をジメチルスルホキシドに溶解させた。バイアル瓶のふたを閉め、溶液が入ったバイアル瓶を４０℃の恒温水層に入れた。５時間後にバイアル瓶を恒温水層から取り出し、全量をプラスチック製遠沈管に移し、エタノール６ｍＬを加え、卓上遠心機（ｈｉｍａｃ  ＣＴ  ６Ｄ、日立工機製）を用い、２，０００ｒｐｍで１０分間、室温で遠心分離を行った。遠心分離処理後、上澄みを除去し、得られた沈殿に脱イオン水約３ｍＬを加え、溶解させた。溶液のｐＨを卓上ｐＨメータ（Ｆ−５５、堀場製作所製）により測定したところ、弱酸性を呈した。溶液を水酸化ナトリウム水溶液で中和し、溶液全量を透析用セルロースチューブ（エーディア）に入れ、チューブの両端をクリップ留めし、脱イオン水を外液にして透析した。外液は１日に３回交換した。３日後、透析用セルロースチューブ内液を凍結乾燥し、３９ｍｇの白色綿状固体である多硫酸化プロテオグリカンを得た。
【００４３】
（多硫酸化プロテオグリカンの分析５）
実施例５に係る多硫酸化プロテオグリカンのウロン酸含量を、実施例１と同様の方法で測定したところ、２２．３重量％であった。
【００４４】
実施例５に係る多硫酸化プロテオグリカンの硫酸基含量を、実施例１と同様の方法で算出したところ、硫黄含量は１１．８重量％であり、硫酸基含量は３５．４重量％であった。
【００４５】
実施例５に係る多硫酸化プロテオグリカンの炭素含量を、実施例１と同様の方法で測定した。その結果、炭素含量は２４．４５重量％であり、炭素含量に対する硫黄含量の重量比は０．４８であった。実施例１より、原料ＰＧの炭素含量に対する硫黄含量の重量比は０．１５であった。炭素含量に対する硫黄含量の重量比の相対比より、実施例５に係る多硫酸化プロテオグリカンは、原料ＰＧの約３．２倍に硫酸基が増えたことが分かった。
【００４６】
（上皮細胞増殖促進効果の検討５）
試験物質として原料ＰＧと実施例５に係る多硫酸化プロテオグリカンを用いて、実施例１と同様の方法で試験を行った。その結果、原料ＰＧ群の細胞増殖率は、添加濃度１００、２００、４００mｇ／ｍＬで、それぞれ１０６．４±１．４、１０９．０±１．２、１１０．４±１．３％であった。実施例５に係る多硫酸化プロテオグリカン群の細胞増殖率は、添加濃度１００、２００、４００mｇ／ｍＬで、それぞれ１２４．４±１．７、１３１．７±２．２、１３９．９±３．９％であった。なお、陽性対照群の細胞増殖率は１６９．１±２．６であった。テューキー法の検定により各群の細胞増殖率を比較したところ、原料ＰＧ群の４００mｇ／ｍＬの添加に対して、実施例５に係る多硫酸化プロテオグリカンの１００、２００、４００mｇ／ｍＬ添加は有意差（ｐ＜０．０１）があった。実施例５に係る多硫酸化プロテオグリカンは、原料ＰＧ群に対して細胞増殖能の向上が認められた。なお、実施例５に係る多硫酸化プロテオグリカン群は全ての添加濃度において、無添加対照群に対して有意差（ｐ＜０．０１）があり、細胞増殖能の向上が認められた。実施例５に係る多硫酸化プロテオグリカンを添加しても、細胞の形態などには異常が観察されず、細胞毒性などはないものと判断された。
【実施例６】
【００４７】
（多硫酸化プロテオグリカンの製造６）
実施例１に係るプロテオグリカンピリジニウム塩３０ｍｇとジメチルスルホキシド（特級、関東化学）１．８ｍＬをふた付バイアル瓶に入れ、続いて三酸化硫黄ピリジン錯体（純度９０％以上、和光純薬工業）１５７ｍｇを添加し、プロテオグリカンピリジニウム塩と三酸化硫黄ピリジン錯体をジメチルスルホキシドに溶解させた。バイアル瓶のふたを閉め、溶液が入ったバイアル瓶を４０℃の恒温水層に入れた。５時間後にバイアル瓶を恒温水層から取り出し、溶液のｐＨを卓上ｐＨメータ（Ｆ−５５、堀場製作所製）により測定したところ、弱酸性を呈した。溶液を水酸化ナトリウム水溶液で中和し、全量をプラスチック製遠沈管に移し、エタノール６０ｍＬを加え、卓上遠心機（ｈｉｍａｃ  ＣＴ  ６Ｄ、日立工機製）を用い、３，０００ｒｐｍで１５分間、室温で遠心分離を行った。遠心分離処理後、上澄みを除去し、得られた沈殿に脱イオン水約１０ｍＬを加え、溶解させた。溶解液にエタノール６０ｍＬを加え、再度遠心分離を行った。遠心分離処理後、上澄みを除去し、得られた沈殿に脱イオン水約１５ｍＬを加え、溶解させた。溶解液全量を透析用セルロースチューブ（エーディア）に入れ、チューブの両端をクリップ留めし、脱イオン水を外液にして透析した。外液は１日に３回交換した。３日後、透析用セルロースチューブ内液を回収し、エバポレーターで溶液が約５ｍＬになるまで濃縮した。濃縮後の溶液を凍結乾燥し、３８ｍｇの白色綿状固体である多硫酸化プロテオグリカンを得た。
【００４８】
（多硫酸化プロテオグリカンの分析６）
実施例６に係る多硫酸化プロテオグリカンのウロン酸含量を、実施例１と同様の方法で測定したところ、２２．４重量％であった。
【００４９】
実施例６に係る多硫酸化プロテオグリカンの硫酸基含量を、実施例１と同様の方法で算出したところ、硫黄含量は１１．６重量％であり、硫酸基含量は３４．８重量％であった。
【００５０】
実施例６に係る多硫酸化プロテオグリカンの炭素含量を、実施例１と同様の方法で測定した。その結果、炭素含量は２２．７１重量％であり、炭素含量に対する硫黄含量の重量比は０．５１であった。実施例１より、原料ＰＧの炭素含量に対する硫黄含量の重量比は０．１５であった。炭素含量に対する硫黄含量の重量比の相対比より、実施例６に係る多硫酸化プロテオグリカンは、原料ＰＧの約３．４倍に硫酸基が増えたことが分かった。
【００５１】
（上皮細胞増殖促進効果の検討６）
試験物質として原料ＰＧと実施例６に係る多硫酸化プロテオグリカンを用いて、実施例１と同様の方法で試験を行った。その結果、原料ＰＧ群の細胞増殖率は、添加濃度１００、と４００mｇ／ｍＬで、それぞれ１０５．０±２．２、１０８．１±２．７％であった。実施例６に係る多硫酸化プロテオグリカン群の細胞増殖率は、添加濃度１００と４００mｇ／ｍＬで、それぞれ１１３．２±１．５、１２２．０±２．５％であった。なお、陽性対照群の細胞増殖率は１６２．２±４．０であった。テューキー法の検定により各群の細胞増殖率を比較したところ、原料ＰＧ群の１００mｇ／ｍＬの添加に対して、実施例６に係る多硫酸化プロテオグリカンの１００mｇ／ｍＬ添加は有意差（ｐ＜０．０５）があり、原料ＰＧ群の４００mｇ／ｍＬの添加に対して、実施例６に係る多硫酸化プロテオグリカンの４００mｇ／ｍＬ添加は有意差（ｐ＜０．０１）があった。なお、実施例６に係る多硫酸化プロテオグリカン群は全ての添加濃度において、無添加対照群に対して有意差（ｐ＜０．０１）があり、細胞増殖能の向上が認められた。実施例６に係る多硫酸化プロテオグリカンを添加しても、細胞の形態などには異常が観察されず、細胞毒性などはないものと判断された。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明により、従来のプロテオグリカンの上皮細胞増殖能を改善することができた。本発明は、化粧品、医薬品の分野で広く利用されることが可能である。