(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ポリヌクレオチドによってコードされる遺伝子産物の発現を阻害するインビトロの方法であって、前記標的ポリヌクレオチドを、（ｉ）コアシェルナノ粒子であって、前記コアが、単一タンパク質を含み、前記シェルが、ポリヌクレオチドの高密度なシェルを含み、前記ポリヌクレオチドが、前記タンパク質表面に共有結合を介して結合しており、ここで、少なくとも１つのポリヌクレオチドが、前記標的ポリヌクレオチドに対して、前記遺伝子産物の発現を阻害するのに十分な条件下でハイブリッド形成するのに十分に相補的であり、前記タンパク質表面上のポリヌクレオチドの密度が、約１０ｐｍｏｌ／ｃｍ２〜約１００ｐｍｏｌ／ｃｍ２である、コアシェルナノ粒子；または（ｉｉ）複数の（ｉ）のコアシェルナノ粒子を含む組成物と接触させることを含み、ここで、好ましくは、前記遺伝子産物の発現が少なくとも約５％阻害される、インビトロの方法。
【請求項２】
遺伝子産物の発現の阻害における治療的使用のための、コアシェルナノ粒子または複数のコアシェルナノ粒子を含む組成物であって、前記コアが、単一タンパク質を含み、前記シェルが、ポリヌクレオチドの高密度なシェルを含み、前記ポリヌクレオチドが、前記タンパク質表面に共有結合を介して結合しており、ここで、少なくとも１つのポリヌクレオチドが、前記標的ポリヌクレオチドに対して、前記遺伝子産物の発現を阻害するのに十分な条件下でハイブリッド形成するのに十分に相補的であり、前記タンパク質表面上のポリヌクレオチドの密度が、約１０ｐｍｏｌ／ｃｍ２〜約１００ｐｍｏｌ／ｃｍ２である、組成物。
【請求項３】
前記タンパク質が、触媒活性、シグナル伝達活性、治療活性、または輸送活性を呈する；ならびに／あるいは
前記複数のポリヌクレオチドの各々が同じであるか；または前記複数のポリヌクレオチドのうちの少なくとも２つが異なっている；ならびに／あるいは
前記タンパク質表面上のポリヌクレオチドの密度が、約１００ｐｍｏｌ／ｃｍ２である、請求項１に記載のインビトロの方法。
【請求項４】
前記コアシェルナノ粒子または前記組成物は、前記複数のポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つに共有結合または非共有結合している追加の薬剤を更に含み、好ましくは、前記追加の薬剤は、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、リン脂質、オリゴ糖、金属複合体、小分子、治療薬、造影剤、またはこれらの組み合わせであり、そして、好ましくは、
前記追加の薬剤が、前記複数のポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つにハイブリッド形成によって非共有結合しているか、または前記複数のポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つと共有結合している、請求項１または３に記載のインビトロの方法。
【請求項５】
前記シェルの少なくとも１つのポリヌクレオチドが、前記タンパク質表面に前記タンパク質の表面アミノ基を介して結合しており、好ましくは、前記表面アミノ基が、Ｌｙｓ残基に由来し、好ましくは、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが、（ａ）前記表面アミノ基に結合しているアジド部分と、（ｂ）前記少なくとも１つのポリヌクレオチド上のアルキン官能基との反応から形成されるトリアゾール結合を介して結合しており、最も好ましくは、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが、式（Ｉ）、（ＩＩ）、またはその両方：
【化９】
0006797108.tif 000017
、及び
【化１０】
0006797108.tif 000018
（Ｌ及びＬ２が、各々独立して、Ｃ１−１０アルキレン、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−１０アルキレン−Ｙ−、及び−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−１０アルキレン−Ｙ−Ｃ１−１０アルキレン−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−Ｙ−から選択され、
各Ｙが、独立して、結合、Ｃ（Ｏ）、Ｏ、ＮＨ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、及びＮＨＣ（Ｏ）から成る群から選択され、
ｍが、０、１、２、３、４、または５であり、
ＰＮが、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドである）
に示される結合を介して前記タンパク質表面に結合している、請求項１および３〜４のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
【請求項６】
前記シェルの少なくとも１つのポリヌクレオチドが、前記タンパク質表面に前記タンパク質の表面カルボキシル基を介して結合している；および／または、前記シェルの少なくとも１つのポリヌクレオチドが、前記タンパク質表面に前記タンパク質の表面チオール基を介して結合している、請求項１および３〜５のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
【請求項７】
前記複数のコアシェルナノ粒子が、結晶構造を形成する；ならびに／あるいは
各コアシェルナノ粒子が、同じタンパク質を含む；または少なくとも２つのコアシェルナノ粒子が、異なるタンパク質を含む；ならびに／あるいは
前記組成物が金属ナノ粒子を更に含み、好ましくは、前記金属ナノ粒子が、金、銀、白金、アルミニウム、パラジウム、銅、コバルト、インジウム、ニッケル、またはこれらの混合物を含むか；ならびに／あるいは
第１のコアシェルナノ粒子の複数のポリヌクレオチドが、第２のコアシェルナノ粒子の複数のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列に対して、ハイブリッド形成して超格子構造を形成するのに十分に相補的であるポリヌクレオチド配列を有する、請求項１および３〜６のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
【請求項８】
前記コアシェルナノ粒子が、前記複数のポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つに共有結合または非共有結合している追加の薬剤を更に含む、請求項１および３〜７のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
【請求項９】
前記追加の薬剤が、標的ポリヌクレオチドに対して、前記標的ポリヌクレオチドとハイブリッド形成し、前記標的ポリヌクレオチドの発現を阻害するのに十分に相補的であるポリヌクレオチドである、請求項８に記載のインビトロの方法。
【請求項１０】
前記タンパク質表面上のポリヌクレオチドの密度が、約１０ｐｍｏｌ／ｃｍ２である、請求項１および４〜９のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
【請求項１１】
前記タンパク質表面上のポリヌクレオチドの密度が、約５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２である、請求項１および４〜９のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
【請求項１２】
前記タンパク質表面上のポリヌクレオチドの密度が、約３０〜５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２である、請求項１および４〜９のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
【請求項１３】
前記遺伝子産物の発現が少なくとも約５％阻害されることを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記タンパク質が、触媒活性、シグナル伝達活性、治療活性、または輸送活性を呈する；ならびに／あるいは
前記複数のポリヌクレオチドの各々が同じであるか；または前記複数のポリヌクレオチドのうちの少なくとも２つが異なっている；ならびに／あるいは
前記タンパク質表面上のポリヌクレオチドの密度が、約１００ｐｍｏｌ／ｃｍ２である、請求項２または１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物は、前記複数のポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つに共有結合または非共有結合している追加の薬剤を更に含み、好ましくは、前記追加の薬剤は、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、リン脂質、オリゴ糖、金属複合体、小分子、治療薬、造影剤、またはこれらの組み合わせであり、そして、好ましくは、
前記追加の薬剤が、前記複数のポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つにハイブリッド形成によって非共有結合しているか、または前記複数のポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つと共有結合している、請求項２および１３〜１４のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
前記シェルの少なくとも１つのポリヌクレオチドが、前記タンパク質表面に前記タンパク質の表面アミノ基を介して結合しており、好ましくは、前記表面アミノ基が、Ｌｙｓ残基に由来し、好ましくは、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが、（ａ）前記表面アミノ基に結合しているアジド部分と、（ｂ）前記少なくとも１つのポリヌクレオチド上のアルキン官能基との反応から形成されるトリアゾール結合を介して結合しており、最も好ましくは、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが、式（Ｉ）、（ＩＩ）、またはその両方：
【化９】
0006797108.tif 000019
、及び
【化１０】
0006797108.tif 000020
（Ｌ及びＬ２が、各々独立して、Ｃ１−１０アルキレン、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−１０アルキレン−Ｙ−、及び−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−１０アルキレン−Ｙ−Ｃ１−１０アルキレン−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−Ｙ−から選択され、
各Ｙが、独立して、結合、Ｃ（Ｏ）、Ｏ、ＮＨ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、及びＮＨＣ（Ｏ）から成る群から選択され、
ｍが、０、１、２、３、４、または５であり、
ＰＮが、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドである）
に示される結合を介して前記タンパク質表面に結合している、請求項２および１３〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記シェルの少なくとも１つのポリヌクレオチドが、前記タンパク質表面に前記タンパク質の表面カルボキシル基を介して結合している；および／または、前記シェルの少なくとも１つのポリヌクレオチドが、前記タンパク質表面に前記タンパク質の表面チオール基を介して結合している、請求項２および１３〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記複数のコアシェルナノ粒子が、結晶構造を形成する；ならびに／あるいは
各コアシェルナノ粒子が、同じタンパク質を含む；または少なくとも２つのコアシェルナノ粒子が、異なるタンパク質を含む；ならびに／あるいは
前記組成物が金属ナノ粒子を更に含み、好ましくは、前記金属ナノ粒子が、金、銀、白金、アルミニウム、パラジウム、銅、コバルト、インジウム、ニッケル、またはこれらの混合物を含むか；ならびに／あるいは
第１のコアシェルナノ粒子の複数のポリヌクレオチドが、第２のコアシェルナノ粒子の複数のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列に対して、ハイブリッド形成して超格子構造を形成するのに十分に相補的であるポリヌクレオチド配列を有する、請求項２および１３〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記コアシェルナノ粒子が、前記複数のポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つに共有結合または非共有結合している追加の薬剤を更に含む、請求項２および１３〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記追加の薬剤が、標的ポリヌクレオチドに対して、前記標的ポリヌクレオチドとハイブリッド形成し、前記標的ポリヌクレオチドの発現を阻害するのに十分に相補的であるポリヌクレオチドである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記タンパク質表面上のポリヌクレオチドの密度が、約１０ｐｍｏｌ／ｃｍ２である、請求項２および１３〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記タンパク質表面上のポリヌクレオチドの密度が、約５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２である、請求項２および１３〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記タンパク質表面上のポリヌクレオチドの密度が、約３０〜５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２である、請求項２および１３〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年８月１９日に出願された米国仮出願第６２／０３９，３４０号、２０１４年８月２０日に出願された米国仮出願第６２／０３９，６０８号、及び２０１５年３月２３日に出願された米国仮出願第６２／１３７，１８３号の、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）のもとの優先権を主張し、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府支援に関する記述
本発明は、空軍科学研究所より与えられた助成金番号ＦＡ９５５０−１２−１−０２８０及びＦＡ９５５０−１１−１−０２７５及び国防総省国防高等研究事業局より与えられた助成金番号ＨＲ００１１−１３−２−００１８のもと、政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明においてある特定の権利を有する。
電子提出資料の参照による組み込み
【０００３】
本出願は、本開示の別の部分としてコンピュータ可読形態の配列リストを含み、その全体は参照により本明細書に組み込まれ、ファイル名：２０１４−１０４Ｒ＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、３、３０８バイト、作成日２０１５年８月１９日として識別される。
【背景技術】
【０００４】
タンパク質は、急成長している治療薬のクラスの代表であり、薬物送達、薬物標的化、癌治療、及び酵素補充療法における用途の可能性を持っている。しかしながら、不良な細胞取り込み、先天的な免疫応答の活性化、不良な生体利用性、細胞プロテアーゼによる分解、または保管が長期に及ぶ際の凝集及び不活性化などの問題により、タンパク質の治療的可能性は現在制限されている。
【０００５】
剛性の構成単位を活用し、「原子価」が明確に定義された実体を創出するように配向オリゴヌクレオチドで機能化した、ＤＮＡ媒介性組織化戦略［Ｍｉｒｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８２（６５９２）：６０７−６０９（１９９６）、Ｓｅｅｍａｎ，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３７（３）：２４６−２５７（２００７）］が、結晶質形成のプログラミングのための強力な新しい方法として出現した［Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４５１（７１７８）：５５３−５５６（２００８）、Ｎｙｋｙｐａｎｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４５１（７１７８）：５４９−５５２（２００８）］。かかる方法を用いると、明確に定義された格子パラメータ［Ｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ  ８（８）：２３４１−２３４４（２００８）、Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ４９（２７）：４５８９−４５９２（２０１０）、Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３４（６０５３）：２０４−２０８（２０１１）、Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｓ  Ｒｅｖ  Ｌｅｔｔ  １０２（１）：０１５５０４（２００９）、Ａｕｙｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ  ７（１）：２４−２８（２０１２）、Ａｕｙｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ５０５（７４８１）：７３−７７（２０１４）、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍａｔｅｒ  １２（８）：７４１−７４６（２０１３）］、対称性［Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４５１（７１７８）：５５３−５５６（２００８）、Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３４（６０５３）：２０４−２０８（２０１１）、Ａｕｙｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ  ７（１）：２４−２８（２０１２）、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍａｔｅｒ  １２（８）：７４１−７４６（２０１３）］、及び組成物［Ａｕｙｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ  ７（１）：２４−２８（２０１２）、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍａｔｅｒ  １２（８）：７４１−７４６（２０１３）、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ  ８（１１）：８６５−８７２（２０１３）］を持つ構造を作製することができるが、これらは、これまで主に硬質の無機ナノ粒子または高度に分枝した純粋な核酸物質の使用［Ｓｅｅｍａｎ，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３７（３）：２４６−２５７（２００７）、Ｗｉｎｆｒｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９４（６６９３）：５３９−５４４（１９９８）、Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４６１（７２６０）：７４−７７（２００９）］に限定されてきた。対照的に、自然の最も強力かつ多用途であるナノ構造構成単位は、タンパク質であり、生物系におけるプロセスの大部分を可能にするために使用される［Ｍａｎｎ，  Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ４７（２９）：５３０６−５３２０（２００８）］。ほとんどの無機ナノ粒子系とは異なり、タンパク質は、純粋かつ完全に単分散の形態で作製することができるため、これらは超分子組織化に対して理想的なシントンとなる。しかしながら、複数のタンパク��、またはタンパク質及び無機ナノ物質で構成される格子を操作する能力は限定的であり、タンパク質構成単位の選択は、構造的制約によって制限される場合が多く、このことは、これらの構造に組み込まれ得る触媒機能性を限定する。現在のところ、タンパク質格子を作製するための主な方法は、天然のタンパク質間相互作用［Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ５：  ４４４５（２０１４）］、無機ナノ粒子（ＮＰ）の表面におけるタンパク質とリガンドとの間の相互作用［Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ５：４４４５（２０１４）、Ｋｏｓｔｉａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ  ８（１）：５２−５６（２０１３）］、金属配位化学［Ｂｒｏｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  ４（５）：３７５−３８２（２０１２）］、小分子リガンド−タンパク質間相互作用［Ｄｏｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ３８（１６）：２３６３−２３６６（１９９９）、Ｒｉｎｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０２（５６４２）：１０６−１０９（２００３）、Ｓａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ５：４６３４（２０１４）、Ｏｏｈｏｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍｕｎ  ４８（９６）：１１７１４−１１７２６（２０１２）］、特定の対称性で遺伝子的に融合しているタンパク質複合体［Ｐａｄｉｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８（５）：２２１７−２２２１（２００１）、Ｓｉｎｃｌａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６（９）：５５８−５６２（２０１１）］、またはウイルスのＤＮＡ媒介性組織化［Ｓｔｒａｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ  ４（８）：１３８５−１３８９（２００４）、Ｃｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍａｔｅｒ  ９（１１）：９１８−９２２（２０１０）］の使用に依存している。
【０００６】
ＤＮＡ指向性の組織化は、結晶質形態ナノスケール前駆体の構築のための強力な方法であることが分かっている。しかしながら、このアプローチの可用性を示す度重なる実証にも関わらず、研究されたこのシステムは、金属ナノ粒子に大きく限定されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｍｉｒｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８２（６５９２）：６０７−６０９（１９９６）
【非特許文献２】Ｓｅｅｍａｎ，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３７（３）：２４６−２５７（２００７）
【非特許文献３】Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４５１（７１７８）：５５３−５５６（２００８）
【非特許文献４】Ｎｙｋｙｐａｎｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４５１（７１７８）：５４９−５５２（２００８）
【非特許文献５】Ｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ  ８（８）：２３４１−２３４４（２００８）
【非特許文献６】Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ４９（２７）：４５８９−４５９２（２０１０）
【非特許文献７】Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３４（６０５３）：２０４−２０８（２０１１）
【非特許文献８】Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｓ  Ｒｅｖ  Ｌｅｔｔ  １０２（１）：０１５５０４（２００９）
【非特許文献９】Ａｕｙｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ  ７（１）：２４−２８（２０１２）
【非特許文献１０】Ａｕｙｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ５０５（７４８１）：７３−７７（２０１４）
【非特許文献１１】Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍａｔｅｒ  １２（８）：７４１−７４６（２０１３）
【非特許文献１２】Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ  ８（１１）：８６５−８７２（２０１３）
【非特許文献１３】Ｓｅｅｍａｎ，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３７（３）：２４６−２５７（２００７）
【非特許文献１４】Ｗｉｎｆｒｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９４（６６９３）：５３９−５４４（１９９８）
【非特許文献１５】Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４６１（７２６０）：７４−７７（２００９）
【非特許文献１６】Ｍａｎｎ，  Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ４７（２９）：５３０６−５３２０（２００８）
【非特許文献１７】Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ５：  ４４４５（２０１４）
【非特許文献１８】Ｋｏｓｔｉａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ  ８（１）：５２−５６（２０１３）
【非特許文献１９】Ｂｒｏｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  ４（５）：３７５−３８２（２０１２）
【非特許文献２０】Ｄｏｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ３８（１６）：２３６３−２３６６（１９９９）
【非特許文献２１】Ｒｉｎｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０２（５６４２）：１０６−１０９（２００３）
【非特許文献２２】Ｓａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ５：４６３４（２０１４）
【非特許文献２３】Ｏｏｈｏｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍｕｎ  ４８（９６）：１１７１４−１１７２６（２０１２）
【非特許文献２４】Ｐａｄｉｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８（５）：２２１７−２２２１（２００１）
【非特許文献２５】Ｓｉｎｃｌａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６（９）：５５８−５６２（２０１１）
【非特許文献２６】Ｓｔｒａｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ  ４（８）：１３８５−１３８９（２００４）
【非特許文献２７】Ｃｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍａｔｅｒ  ９（１１）：９１８−９２２（２０１０）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前述の問題を克服するために、本開示は、タンパク質の表面がオリゴヌクレオチドの高密度なシェルを化学的に機能化し、タンパク質／ＤＮＡコアシェルナノ粒子（ＮＰ）を生成するための、産出物及び方法を開示する。タンパク質／ＤＮＡコアシェルナノ粒子は、タンパク質コア及びオリゴヌクレオチドの高密度なシェルから成る。これらのハイブリッド高分子を使用して、触媒活性タンパク質から結晶質を構築することができる。加えて、ＤＮＡ鋳型タンパク質結晶化の戦略を使用して、Ｘ線結晶学によるタンパク質構造決定に好適な結晶を組織化することができる。オリゴヌクレオチドシェルがタンパク質に付与する高密度かつ高度にアニオン性の表面は、機能化されたタンパク質の凝集及びアンフォールドを防止し、細胞プロテアーゼによる分解を制限するバリアも提供することになることが企図される。核酸の高密度なシェルで修飾された他のナノ物質と同様に、本開示が提供する修飾されたタンパク質は、細胞に効率的に進入し、励起する免疫応答が最小限となる。更に、タンパク質−オリゴヌクレオチド抱合体は、酵素の自然の化学機能性及びオリゴヌクレオチドシェルの遺伝子調節能力が各々はっきり異なる治療応答を励起する、二機能性治療薬として働く。
【０００９】
複数のナノスケールの構成単位、特に、化学特性及び物理特性が全く異なるもの、例えば、生体分子及び無機ナノ粒子の共同組織化を予測可能に制御する能力は、触媒作用、センシング、及びフォトニクスにおいて広範囲に及ぶ可能性を有するが、これらの粒子間の特定の接触を操作するための汎化可能な戦略は、解決されていない困難である。これは、可能性のある粒子間相互作用の種類が多数であり、多様であり、かつ複雑であるタンパク質の場合に特に当てはまる。本明細書では、界面化学がはっきり異なる２つの核酸機能化タンパク質を組織化して、触媒活性タンパク質、またはタンパク質及びＤＮＡで修飾された金ナノ粒子の組み合わせで構成される６つの固有の格子にするために、タンパク質間相互作用をＤＮＡ間相互作用と交換する構想が提供される。この戦略において用いられるＤＮＡ間相互作用のプログラム可能な性質により、結果として得られる結晶の格子対称性及び単位セル定数ならびに組成及び晶癖の制御が可能となる。本開示は、機能性結晶質を組織化するためにタンパク質の多様な形態、界面化学、及び機能性を活用する、固有のクラスの物質を構築するための汎化可能な戦略を提供する。
【００１０】
したがって、種々の態様において、本開示は、タンパク質間相互作用を相補的なオリゴヌクレオチド間相互作用と交換することによってタンパク質結晶化をもたらすための方法を提供する。適切なオリゴヌクレオチドで機能化された異なるタンパク質を、無機系のために導入される設計ルール［Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ４９（２７）：４５８９−４５９２（２０１０）、Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３４（６０５３）：２０４−２０８（２０１１）、Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ５２（２２）：５６８８−５６９８（２０１３）］と共に使用することにより、本開示は、ＤＮＡ機能化酵素ならびに酵素及び無機ナノ粒子の異なる組み合わせを意図的に組織化して、あらかじめ考えられた格子、及び一部の場合には明確に定義された晶癖にすることを示す。重要なことに、酵素は、その表面をＤＮＡで大規模に修飾し、組織化して結晶性超格子にした後に、その自然の構造及び触媒機能性を保持する。本開示は、とりわけ、ＤＮＡが、多くの容易にアクセス可能な機能性タンパク質を、その原子組成に関わらず組織化して規則物質にするために使用され得ることを示す。
【００１１】
タンパク質コア及び高密度なオリゴヌクレオチドシェルで構成される、あるクラスのタンパク質ベースの材料の合成を本明細書に開示する。オリゴヌクレオチドシェルは、酵素コアに安定性を付与するだけでなく、更なるオリゴヌクレオチドが共にハイブリッド形成することができる汎用骨格としても働き、最終的に、タンパク質の結晶質へのＤＮＡ指向性の組織化を提供する。タンパク質の超分子構造への組織化をプログラミングするための他のアプローチと比較して、本開示が提供するＤＮＡ鋳型戦略は、例えば、限定的ではなく、いずれのタンパク質にも汎化可能であり、タンパク質コアの遺伝子操作を必要とせず、複数の構成要素（例えば、複数のタンパク質、またはタンパク質及び無機ナノ構造の組み合わせ）を持つ格子を組織化して、規定の化学量及び相対配向を持つ物質にすることを可能にする。このアプローチを広範なタンパク質に用いることは、触媒作用及びセンシングにおける用途に繋がり、構造決定に好適なタンパク質の結晶を組織化する戦略として働くことが予期される。
【００１２】
よって、一部の態様において、本開示は、コアシェルナノ粒子を提供し、コアは、単一タンパク質を含み、シェルは、複数のポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドは、タンパク質表面に共有結合を介して結合している。種々の実施形態において、タンパク質は、触媒活性、シグナル伝達活性、治療活性、または輸送活性を呈する。一部の実施形態において、複数のポリヌクレオチドの各々は同じである。更なる実施形態において、複数のポリヌクレオチドのうちの少なくとも２つは異なる。
【００１３】
一部の実施形態において、タンパク質表面上のポリヌクレオチドの密度は、約２ｐｍｏｌ／ｃｍ２〜約２００ｐｍｏｌ／ｃｍ２である。更なる実施形態において、タンパク質表面上のポリヌクレオチドの密度は、約１０ｐｍｏｌ／ｃｍ２である。また更なる実施形態において、タンパク質表面上のポリヌクレオチドの密度は、約１００ｐｍｏｌ／ｃｍ２である。
【００１４】
一部の実施形態において、本開示のコアシェルナノ粒子は、複数のポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つに共有結合または非共有結合している追加の薬剤を更に含む。種々の実施形態において、この追加の薬剤は、ポリヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、リン脂質、オリゴ糖、金属複合体、小分子、治療薬、造影剤、またはこれらの組み合わせである。一部の実施形態において、追加の薬剤は、複数のポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つにハイブリッド形成によって非共有結合している。更なる実施形態において、追加の薬剤は、複数のポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つに共有結合している。
【００１５】
本開示はまた、シェルの少なくとも１つのポリヌクレオチドが、タンパク質表面にタンパク質の表面アミノ基を介して結合している実施形態を提供する。一部の実施形態において、表面アミノ基はＬｙｓ残基に由来する。
【００１６】
一部の実施形態において、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、（ａ）表面アミノ基に結合しているアジド部分と、（ｂ）少なくとも１つのポリヌクレオチド上のアルキン官能基との反応から形成されるトリアゾール結合を介して結合している。
【００１７】
追加の実施形態において、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、タンパク質表面に結合し、式（Ｉ）、（ＩＩ）、またはその両方に示される結合を介してであり、
【化１】
0006797108.tif 000002
、及び
【化２】
0006797108.tif 000003
、Ｌ及びＬ２が、各々独立して、Ｃ１−１０アルキレン、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−１０アルキレン−Ｙ−、及び−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−１０アルキレン−Ｙ−Ｃ１−１０アルキレン−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−Ｙ−から選択され、
各Ｙが、独立して、結合、Ｃ（Ｏ）、Ｏ、ＮＨ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、及びＮＨＣ（Ｏ）から成る群から選択され、
ｍが、０、１、２、３、４、または５であり、
ＰＮが、少なくとも１つのポリヌクレオチドである。
【００１８】
また更なる実施形態において、シェルの少なくとも１つのポリヌクレオチドは、タンパク質表面にタンパク質の表面カルボキシル基を介して結合している。一部の実施形態において、シェルの少なくとも１つのポリヌクレオチドは、タンパク質表面にタンパク質の表面チオール基を介して結合している。追加の実施形態において、シェルの少なくとも１つのポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドに対して、標的ポリヌクレオチドとハイブリッド形成しその発現を阻害するのに十分に相補的である。
【００１９】
追加の薬剤は、一部の実施形態において、標的ポリヌクレオチドに対して、標的ポリヌクレオチドとハイブリッド形成しその発現を阻害するのに十分に相補的である、ポリヌクレオチドである。
【００２０】
一部の態様において、本開示は、前述の請求項のいずれか一項に記載のコアシェルナノ粒子を複数含む組成物を提供する。一部の実施形態において、複数のコアシェルナノ粒子は結晶構造を形成する。
【００２１】
一部の実施形態において、各コアシェルナノ粒子は、同じタンパク質を含む。更なる実施形態において、少なくとも２つのコアシェルナノ粒子は、異なるタンパク質を含む。
【００２２】
追加の実施形態において、本組成物は、金属ナノ粒子を更に含む。種々の実施形態において、金属ナノ粒子は、金、銀、白金、アルミニウム、パラジウム、銅、コバルト、インジウム、ニッケル、またはこれらの混合物を含む。
【００２３】
更なる実施形態において、第１のコアシェルナノ粒子の複数のポリヌクレオチドは、第２のコアシェルナノ粒子の複数のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列に対して、ハイブリッド形成して超格子構造を形成するのに十分に相補的である。
【００２４】
本開示の更なる態様においては、反応を触媒する方法が提供され、本方法は、反応用の試薬を本開示の組成物と接触させることを含み、試薬と本組成物との間の接触が反応の触媒に繋がる。
【００２５】
追加の態様において、本開示は、標的分子を検出する方法を提供し、本方法は、標的分子をコアシェルナノ粒子または本開示の組成物と接触させることを含み、標的分子とコアシェルナノ粒子または本組成物との間の接触が検出可能な変化をもたらす。一部の実施形態において、検出はインビトロである。一部の実施形態において、検出はインビボである。
【００２６】
一部の態様において、標的ポリヌクレオチドによってコードされる遺伝子産物の発現を阻止する方法が提供され、本方法は、標的ポリヌクレオチドを、コアシェルナノ粒子または本開示の組成物と、遺伝子産物の発現を阻害するのに十分な条件下で接触させることを含む。一部の実施形態において、遺伝子産物の発現はインビボで阻害される。一部の実施形態において、遺伝子産物の発現はインビトロで阻害される。一部の実施形態において、遺伝子産物の発現は、少なくとも約５％阻害される。
【００２７】
本開示の更なる態様において、治療用タンパク質を細胞に送達する方法が提供され、本方法は、コアシェルナノ粒子または本開示の組成物を細胞に投与することを含み、このコアシェルナノ粒子のタンパク質は、治療用タンパク質である。一部の実施形態において、送達はインビトロ送達である。一部の実施形態において、送達はインビボ送達である。
【００２８】
種々の実施形態において、細胞は対象中にある。更なる実施形態において、対象は治療用タンパク質を必要としている。
【００２９】
本開示の一部の実施形態において、本方法は、治療用タンパク質のみの投与と比較して、対象において減少した免疫原性応答を提供する。更なる実施形態において、本方法は、治療用タンパク質のみの投与と比較して、増加した治療用タンパク質の細胞取り込みを提供する。
【００３０】
一部の態様において、本開示は、コアシェルナノ粒子を調製する方法を提供し、本方法は、タンパク質を、複数のポリヌクレオチドと、複数のポリヌクレオチドをタンパク質の表面に共有結合させるのに十分な条件下で接触させることを含む。
【００３１】
一部の実施形態において、本タンパク質は、以下の構造を有し
タンパク質−Ｘ−Ｌ−Ｎ３、
Ｘが、タンパク質上の表面アミノ基、カルボン酸基、またはチオール基に由来し、
Ｌが、Ｃ１−１０アルキレン、−Ｙ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−１０アルキレン−Ｙ−、及び−Ｙ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−１０アルキレン−Ｙ−Ｃ１−１０アルキレン−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−Ｙ−から選択され、
各Ｙが、独立して、結合、Ｃ（Ｏ）、Ｏ、ＮＨ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、及びＮＨＣ（Ｏ）から成る群から選択され、
ｍが、０、１、２、３、４、または５である。
【００３２】
更なる実施形態において、少なくとも１つの  ポリヌクレオチドは、以下の構造を有し
ポリヌクレオチド−Ｌ２−Ｘ−≡−Ｒ、
Ｌ２が、Ｃ１−１０アルキレン、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−１０アルキレン−Ｙ−、及び−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−１０アルキレン−Ｙ−Ｃ１−１０アルキレン−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−Ｙ−から選択され、
各Ｙが、独立して、結合、Ｃ（Ｏ）、Ｏ、ＮＨ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、及びＮＨＣ（Ｏ）から成る群から選択され、
ｍが、０、１、２、３、４、または５であり、
Ｘが、結合であり、Ｒが、ＨまたはＣ１−１０アルキルであり、
あるいは、Ｘ及びＲが、それらが結合する炭素と一緒になって、８〜１０員の炭素環式基または８〜１０員の複素環式基を形成する。
【００３３】
また更なる実施形態において、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、以下の構造を有する。
【化３】
0006797108.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１Ａ】オリゴヌクレオチドのタンパク質の表面への共有結合のための戦略を描写する。（１ａ）は、ウシカタラーゼの図案表現である。一級アミンを含有するリジンアミノ酸が青色の棒として強調されている。（１ｂ）は、オリゴヌクレオチドの高密度なシェルによるタンパク質表面の修飾のための反応スキームである。明確化のため、１つのみの表面アミンが示される。外側の円は、抱合アジド（中央の構造）またはＤＮＡ（下部の構造）のシェルを表す。
【図１Ｂ】オリゴヌクレオチドのタンパク質の表面への共有結合のための戦略を描写する。（１ａ）は、ウシカタラーゼの図案表現である。一級アミンを含有するリジンアミノ酸が青色の棒として強調されている。（１ｂ）は、オリゴヌクレオチドの高密度なシェルによるタンパク質表面の修飾のための反応スキームである。明確化のため、１つのみの表面アミンが示される。外側の円は、抱合アジド（中央の構造）またはＤＮＡ（下部の構造）のシェルを表す。
【図２】（１）（パネルａ）及び（２）（パネルｂ）を用いたカタラーゼの表面修飾の程度の決定を示す。（２ａ）は、天然（左のスペクトル）及びアジド標識（右のスペクトル）カタラーゼのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルである。４１９０Ｄａの分子量における差異は、当量約６０の（１）による標識に対応する。（２ｂ）は、天然の黒色及びＤＮＡ標識（最大３００ｎｍのピークを示すスペクトル）カタラーゼのＵＶ可視スペクトルである。２６０ｎｍでの吸光度における差異は、約６４個のオリゴヌクレオチドの共有結合に対応する。４０５ｎｍでの吸光度（挿入図）を使用して、タンパク質濃度を決定し、活性部位を取り囲むタンパク質構造の保持を確認した。
【図３Ａ】タンパク質／ＤＮＡコアシェルナノ粒子の特性評価を示す。（３ａ）は、天然のアジド標識及びＤＮＡ標識カタラーゼの円偏光二色性スペクトルである。２０８ｎｍ及び２２２ｎｍでの最小値は、タンパク質のらせん構造に対応する。ＤＮＡの共有結合後のスペクトルにおけるわずかな差異は、付加されるＤＮＡ鎖の特徴的なＣＤ特質に起因する。（３ｂ）は、Ｈ２Ｏ２のＨ２Ｏ及びＯ２への分解を測定するカタラーゼの酵素アッセイである。（３ｃ）は、天然のアジド標識及びＤＮＡ標識カタラーゼの動的光散乱スペクトルである。
【図３Ｂ】タンパク質／ＤＮＡコアシェルナノ粒子の特性評価を示す。（３ａ）は、天然のアジド標識及びＤＮＡ標識カタラーゼの円偏光二色性スペクトルである。２０８ｎｍ及び２２２ｎｍでの最小値は、タンパク質のらせん構造に対応する。ＤＮＡの共有結合後のスペクトルにおけるわずかな差異は、付加されるＤＮＡ鎖の特徴的なＣＤ特質に起因する。（３ｂ）は、Ｈ２Ｏ２のＨ２Ｏ及びＯ２への分解を測定するカタラーゼの酵素アッセイである。（３ｃ）は、天然のアジド標識及びＤＮＡ標識カタラーゼの動的光散乱スペクトルである。
【図３Ｃ】タンパク質／ＤＮＡコアシェルナノ粒子の特性評価を示す。（３ａ）は、天然のアジド標識及びＤＮＡ標識カタラーゼの円偏光二色性スペクトルである。２０８ｎｍ及び２２２ｎｍでの最小値は、タンパク質のらせん構造に対応する。ＤＮＡの共有結合後のスペクトルにおけるわずかな差異は、付加されるＤＮＡ鎖の特徴的なＣＤ特質に起因する。（３ｂ）は、Ｈ２Ｏ２のＨ２Ｏ及びＯ２への分解を測定するカタラーゼの酵素アッセイである。（３ｃ）は、天然のアジド標識及びＤＮＡ標識カタラーゼの動的光散乱スペクトルである。
【図４】約１．５のＦＩＴＣ分子及び約５０個のＣｙ５含有オリゴヌクレオチドで標識したカタラーゼの取り込みを示す、Ｃ８Ｓ細胞の警告顕微鏡写真を描出する。
【図５Ａ】オリゴヌクレオチドのタンパク質の表面への共有結合のための戦略を描写する。（５ａ）は、ウシカタラーゼの図案表現である。一級アミンを含有するリジンアミノ酸が強調されている。（５ｂ）は、コリネバクテリウムグルタミクム（「Ｃｇ」）カタラーゼの図案表現である。（５ｃ）は、オリゴヌクレオチドの高密度なシェルによるタンパク質表面の修飾のための反応スキームである。明確化のため、１つのみの表面アミンが示される。外側の円は、抱合アジド（中央の構造）またはＤＮＡ（下部の構造）のシェルを表す。
【図５Ｂ】オリゴヌクレオチドのタンパク質の表面への共有結合のための戦略を描写する。（５ａ）は、ウシカタラーゼの図案表現である。一級アミンを含有するリジンアミノ酸が強調されている。（５ｂ）は、コリネバクテリウムグルタミクム（「Ｃｇ」）カタラーゼの図案表現である。（５ｃ）は、オリゴヌクレオチドの高密度なシェルによるタンパク質表面の修飾のための反応スキームである。明確化のため、１つのみの表面アミンが示される。外側の円は、抱合アジド（中央の構造）またはＤＮＡ（下部の構造）のシェルを表す。
【図５Ｃ】オリゴヌクレオチドのタンパク質の表面への共有結合のための戦略を描写する。（５ａ）は、ウシカタラーゼの図案表現である。一級アミンを含有するリジンアミノ酸が強調されている。（５ｂ）は、コリネバクテリウムグルタミクム（「Ｃｇ」）カタラーゼの図案表現である。（５ｃ）は、オリゴヌクレオチドの高密度なシェルによるタンパク質表面の修飾のための反応スキームである。明確化のため、１つのみの表面アミンが示される。外側の円は、抱合アジド（中央の構造）またはＤＮＡ（下部の構造）のシェルを表す。
【図６】単一成分タンパク質超格子の組織化を描出する。（６ａ）は、自己相補性リンカーを使用するタンパク質の組織化のためのスキームである。図６ｂ）は、自己相補性リンカーを添加した後のＤＮＡ標識ウシカタラーゼの写真である。凝縮していない試料（右）は、非自己相補的リンカーの添加が凝集をもたらさないことを示す。図６ｃ）は、熱的に誘導されるタンパク質凝集体の分解及びその後のＵＶ分光法である。
【図７】２成分系タンパク質超格子の組織化を示す。（７ａ）非自己相補的リンカーを使用するタンパク質の組織化のためのスキームである。図７ｂ）は、自己相補的リンカーの添加時に形成される、ウシカタラーゼ及びＣｇカタラーゼ両方を含有するＤＮＡ鋳型凝集体の写真である。図７ｃ）は、熱的に誘導される２成分系タンパク質凝集体の分解及びその後のＵＶ分光法である。図７ｄ）は、別の粒子型上のリンカーに相補的であるリンカーの添加時に形成される、ウシカタラーゼ及びＡｕＮＰを含有するＤＮＡ鋳型凝集体の写真である。図７ｅ）は、熱的に誘導される２成分系タンパク質ＡｕＮＰ凝集体の分解及びその後のＵＶ分光法である。
【図８】ＳＡＸＳによるタンパク質格子の特性評価を示す。図８ａ）は、全てがタンパク質構成単位で構成される体心立方（ＢＣＣ）単位セルの描出である。図８ｂ）は、実験的（赤色）及び理論的（黒色）なＢＣＣ超格子の１−Ｄ  ＳＡＸＳ散乱プロファイルである。図８ｃ）は、タンパク質及びＡｕ  ＰＡＥの組み合わせから形成されるＢＣＣ単位セルの描出である。図８ｄ）は、２成分系Ａｕ−タンパク質超格子の１−Ｄ  ＳＡＸＳ散乱プロファイルである。
【図９】Ｃｇカタラーゼで構成される結晶のＳＴＥＭ顕微鏡写真を示す。低倍率画像（９ａ）をＳＥモードで、高倍率画像（９ｂ）をＺコントラストモードで収集した。
【図１０】２成分系タンパク質−ＡｕＮＰ結晶で構成される結晶のＳＴＥＭ顕微鏡写真を示す。低倍率画像（１０ａ）をＳＥモードで、高倍率画像（１０ｂ）をＺコントラストモードで収集した。
【図１１】天然、ＡＦ６４７機能化、及びＤＮＡ機能化β−ｇａｌのＵＶ可視分光法を描出する。約６５０ｎｍでの吸光度ピークは共有結合したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ色素に由来し、これを、タンパク質をＤＮＡで標識した後でタンパク質の濃度を測定するために使用した（最上の線）。ＤＮＡの濃度を２６０ｎｍでの吸光度に基づいて決定した。
【図１２】共焦点蛍光顕微鏡法によって決定した天然（左）及びＤＮＡ機能化（右）β−ｇａｌの細胞取り込みを描出する。細胞核をＤＡＰＩで染色して青色にした。タンパク質の表面に共有結合したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ色素からの蛍光シグナルは赤色である。
【図１３】トランスフェクトした細胞内の天然（左）及びＤＮＡ機能化（右）β−ｇａｌの触媒活性を示す。
【図１４】タンパク質−ＤＮＡ抱合体の追加の合成及び特性評価を描写する。図１４ａ）は、ウシカタラーゼ及びＣｇカタラーゼの図案描写であり、これらは、その分子トポロジー及び表面接触可能なアミンの場所を示す。図１４ｂ）は、ＤＮＡ機能化カタラーゼの合成及び組織化のためのスキームである。表面接触可能なアミンを、ＮＨＳ及びＮ３部分を反対側の末端にて含有するアジドで修飾し（ｉ）、その後、共有結合したアジドを、銅を含まない「クリック化学」反応によって２つのはっきり異なる５’−ＤＢＣＯ修飾ＤＮＡ鎖に抱合させた（ｉｉ）。ＤＮＡ機能化タンパク質とのリンカー鎖のハイブリッド形成（ｉｉｉ）、及びその後のタンパク質と相補的リンカーとの混合（ｉｖ）により、タンパク質のＢＣＣまたはＣｓＣｌ型単位セルへの組織化がもたらされた。図１４ｃ）〜ｅ）は、ＤＬＳによって決定した、天然（図１４ｃ）、Ｎ３機能化（図１４ｄ）、及びＤＮＡ機能化（図１４ｅ）Ｃｇカタラーゼの流体力学直径の比較である。（図１４ｆ）は、天然（黒色の丸）、ＤＮＡ機能化（赤色（鎖１）及び青色（鎖２）の四角）、及び結晶  （シアン色の三角）Ｃｇカタラーゼによる基質濃度の関数としてのＨ２Ｏ２の不均化の酵素触媒速度の比較である。図１４ｇ）は、Ｃｇカタラーゼで構成されるＤＮＡ鋳型凝集体の熱的融解転移である。
【図１５】カタラーゼの直径に及ぼす表面修飾の影響を示す。図１５ａ）は、抱合体の流体力学直径に対するＤＮＡ、タンパク質、及びリンカーの相対的寄与を示す、ＤＮＡ機能化Ｃｇカタラーゼの図案描写である。リンカー領域（シアン色）は、アジドリンカーからのテトラエチレングリコールスペーサー、及びＤＢＣＯとＤＢＣＯ  ｄＴ合成ホスホラミダイトのチミジン部分との間のスペーサーで構成される（挿入図）。２つのスペーサー１８ホスホラミダイトもＤＮＡ設計に含まれたが、明確化のため、図案には描出しない。図１５ｂ）〜ｄ）は、天然（ｂ）、アジド機能化（ｃ）、及びＤＮＡ機能化（ｄ）ウシカタラーゼの動的光散乱（ＤＬＳ）スペクトルである。図１５ｅ）は、ウシカタラーゼ及びＣｇカタラーゼ、及びそのアジド機能化及びＤＮＡ機能化変異型の流体力学直径の要約である。図１５ａにおける距離は、ＰｒｏＤｒｕｇ  Ｓｅｒｖｅｒによって計算した、結晶状態にある塩基対あたりの距離ならびに理想結合距離及び角度を採用するリンカーに基づく推定であることに留意されたい［Ｓｃｈｕｔｔｅｌｋｏｐｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  ６０：１３５５−１３６３（２００４）］。
【図１６】ＭＡＬＤＩ−ＭＳによるアジドを用いたタンパク質の標識の程度の決定を示す。アジドを用いた天然（左の線）及びＮ３標識（右の線）ウシカタラーゼ（図１６ａ）及びＣｇ（図１６ｂ）カタラーゼの機能化の程度を、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによって決定した。タンパク質と反応する各アジドリンカーは、２７４Ｄａをその分子量に加える。三量体酵素は試料調製及び分析中にモノマーに解離するため、ここで観察された値は、単一のサブユニットに対するものである。ＤＮＡを持つウシカタラーゼ（図１６ｃ）及びＣｇ（図１６ｄ）カタラーゼのＤＮＡ：タンパク質比率を、オリゴヌクレオチド１（白い四角）及び２（塗りつぶした四角）で機能化し、念入りに洗浄して未反応ＤＮＡを除去した後で、ＵＶ可視分光法によって決定した。２６０ｎｍでの差吸光度は、ＤＮＡによるタンパク質の修飾に起因する。図１６ｅ）は、アジド及び各オリゴヌクレオチドによるタンパク質機能化の程度の要約である。表面接触可能なリジンの数は、Ｐｙｍｏｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ［Ｔｈｅ  ＰｙＭＯＬ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．５．０．４  Ｓｃｈｒoｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ．］において生成した各タンパク質の表面表現から計算した。各アミンの実際の溶媒接触可能性は多様であり、このことが、観察された収率が理論的に可能な収率を下回った理由である可能性が高い。それでも、機能化アミンの数は、幾つかの標識反応にわたって高度に再現可能であった（ウシカタラーゼについて１５〜１６、Ｃｇカタラーゼについて１１〜１２）。ウシカタラーゼのオリゴ２についてのＤＮＡ鎖の見掛けの過剰さは、タンパク質濃度の推定における誤差、及び／またはタンパク質の表面上の込み合った環境におけるＤＮＡの消滅のわずかな変化、若しくは計算されたＤＮＡの消滅における不確実性に起因する可能性が高い。
【図１７】天然及びＤＮＡ機能化ウシカタラーゼ（図１７ａ〜ｃ）及びＣｇ（図１７ｄ〜ｆ）カタラーゼの構造的特性評価である。オリゴヌクレオチド１及び２による機能化前（白い丸）及び後（塗りつぶした丸）のウシカタラーゼ（図１７ａ）及びＣｇ（図１７ｄ）  カタラーゼのＵＶ可視吸光度スペクトル。ＤＮＡ機能化タンパク質の可視吸光度スペクトルにおける変化は本質的には観察されず、活性部位を取り囲むタンパク質環境が、各ＤＮＡ鎖によるいずれのタンパク質の機能化の後でも完全であることを示す。オリゴヌクレオチド１（図１７ｂ及びｅ）またはオリゴヌクレオチド２（図１７ｃ及びｆ）による機能化の前（白い丸）及び後（塗りつぶした丸）のウシ（図１７ｂ〜ｃ）及びＣｇ（図１７ｅ〜ｆ）カタラーゼの円偏光二色性スペクトル。遊離オリゴヌクレオチド１及び２のスペクトルは、白い四角として表され、単一のＤＮＡ分子のΔεに予測されるＤＮＡ：タンパク質比率を乗じた積である。塗りつぶした四角は、天然カタラーゼ及び各遊離オリゴヌクレオチドのＣＤスペクトルの合計を表す。計算したスペクトルと観察されたスペクトルとの間の合致は、吸光度スペクトルから計算したＤＮＡ：タンパク質比率が、実際の機能化の程度の適正な推定であることを示唆する。
【図１８】アジドリンカーによる機能化の前（白い丸）及び後（塗りつぶした丸）のウシカタラーゼ（図１８ａ及びｂ）及び「Ｃｇ」（図１８ｃ及びｄ）カタラーゼの構造の分光学的特性評価を示す。図１８ａ）及びｃ）は、天然及びＮ３機能化ウシカタラーゼ（図１８ａ）及びＣｇ（図１８ｃ）カタラーゼのＵＶ可視吸光度スペクトルである。天然酵素と比較したＮ３機能化タンパク質変異型のほぼ同一の可視吸光度スペクトルにより、タンパク質の活性部位が機能化後にほとんど完全であることが確認される。４０５：２８０比率の保持により、ヘムの損失が、機能化手順中に発生しないことが確認される。図１８ｂ）及びｄ）は、ウシカタラーゼ（図１８ｂ）及びＣｇ（図１８ｄ）カタラーゼのＣＤスペクトルである。特徴的な吸光度特性及び強度の保持により、酵素が、アジドによる機能化の後でその二次構造を保持することが確認される。
【図１９Ａ】天然カタラーゼ、ＤＮＡ機能化カタラーゼ、及びＣｇカタラーゼ結晶によるＨ２Ｏ２の触媒分解を示す。天然（図１９ａ及びｄ）またはＤＮＡ機能化（図１９ｂ〜ｃ及びｅ〜ｆ）Ｃｇ（図１９ａ〜ｃ）、及びウシ（図１９ｄ〜ｆ）カタラーゼの添加後の２４０ｎｍでの吸光度の変化を、Ｈ２Ｏ２のモル吸光係数（４３Ｍ−１ｃｍ−１）で割ることによって分解したＨ２Ｏ２の濃度に変換し、時間関数としてプロットした。各Ｈ２Ｏ２濃度に対する初期反応速度を計算し、図１４ｆ（Ｃｇ  カタラーゼ）及び１９ｇ（ウシカタラーゼ）にプロットした。図１９ｈ）は、各酵素変異型によるＨ２Ｏ２の分解に対する速度定数の要約である。図１９ｉ）は、種々の基質濃度でのＣｇカタラーゼ結晶によるＨ２Ｏ２の分解である。図１９ｊ）は、酵素結晶のリサイクルである。下部の点及び上部の点は、それぞれ、上清及びペレットに対応する。図１９ｋ）５周回の触媒、遠心分離、及び再懸濁前（最下部）及び後（最上部）のタンパク質結晶の構造である。
【図１９Ｂ】天然カタラーゼ、ＤＮＡ機能化カタラーゼ、及びＣｇカタラーゼ結晶によるＨ２Ｏ２の触媒分解を示す。天然（図１９ａ及びｄ）またはＤＮＡ機能化（図１９ｂ〜ｃ及びｅ〜ｆ）Ｃｇ（図１９ａ〜ｃ）、及びウシ（図１９ｄ〜ｆ）カタラーゼの添加後の２４０ｎｍでの吸光度の変化を、Ｈ２Ｏ２のモル吸光係数（４３Ｍ−１ｃｍ−１）で割ることによって分解したＨ２Ｏ２の濃度に変換し、時間関数としてプロットした。各Ｈ２Ｏ２濃度に対する初期反応速度を計算し、図１４ｆ（Ｃｇ  カタラーゼ）及び１９ｇ（ウシカタラーゼ）にプロットした。図１９ｈ）は、各酵素変異型によるＨ２Ｏ２の分解に対する速度定数の要約である。図１９ｉ）は、種々の基質濃度でのＣｇカタラーゼ結晶によるＨ２Ｏ２の分解である。図１９ｊ）は、酵素結晶のリサイクルである。下部の点及び上部の点は、それぞれ、上清及びペレットに対応する。図１９ｋ）５周回の触媒、遠心分離、及び再懸濁前（最下部）及び後（最上部）のタンパク質結晶の構造である。
【図１９Ｃ】天然カタラーゼ、ＤＮＡ機能化カタラーゼ、及びＣｇカタラーゼ結晶によるＨ２Ｏ２の触媒分解を示す。天然（図１９ａ及びｄ）またはＤＮＡ機能化（図１９ｂ〜ｃ及びｅ〜ｆ）Ｃｇ（図１９ａ〜ｃ）、及びウシ（図１９ｄ〜ｆ）カタラーゼの添加後の２４０ｎｍでの吸光度の変化を、Ｈ２Ｏ２のモル吸光係数（４３Ｍ−１ｃｍ−１）で割ることによって分解したＨ２Ｏ２の濃度に変換し、時間関数としてプロットした。各Ｈ２Ｏ２濃度に対する初期反応速度を計算し、図１４ｆ（Ｃｇ  カタラーゼ）及び１９ｇ（ウシカタラーゼ）にプロットした。図１９ｈ）は、各酵素変異型によるＨ２Ｏ２の分解に対する速度定数の要約である。図１９ｉ）は、種々の基質濃度でのＣｇカタラーゼ結晶によるＨ２Ｏ２の分解である。図１９ｊ）は、酵素結晶のリサイクルである。下部の点及び上部の点は、それぞれ、上清及びペレットに対応する。図１９ｋ）５周回の触媒、遠心分離、及び再懸濁前（最下部）及び後（最上部）のタンパク質結晶の構造である。
【図１９Ｄ】天然カタラーゼ、ＤＮＡ機能化カタラーゼ、及びＣｇカタラーゼ結晶によるＨ２Ｏ２の触媒分解を示す。天然（図１９ａ及びｄ）またはＤＮＡ機能化（図１９ｂ〜ｃ及びｅ〜ｆ）Ｃｇ（図１９ａ〜ｃ）、及びウシ（図１９ｄ〜ｆ）カタラーゼの添加後の２４０ｎｍでの吸光度の変化を、Ｈ２Ｏ２のモル吸光係数（４３Ｍ−１ｃｍ−１）で割ることによって分解したＨ２Ｏ２の濃度に変換し、時間関数としてプロットした。各Ｈ２Ｏ２濃度に対する初期反応速度を計算し、図１４ｆ（Ｃｇ  カタラーゼ）及び１９ｇ（ウシカタラーゼ）にプロットした。図１９ｈ）は、各酵素変異型によるＨ２Ｏ２の分解に対する速度定数の要約である。図１９ｉ）は、種々の基質濃度でのＣｇカタラーゼ結晶によるＨ２Ｏ２の分解である。図１９ｊ）は、酵素結晶のリサイクルである。下部の点及び上部の点は、それぞれ、上清及びペレットに対応する。図１９ｋ）５周回の触媒、遠心分離、及び再懸濁前（最下部）及び後（最上部）のタンパク質結晶の構造である。
【図１９Ｅ】天然カタラーゼ、ＤＮＡ機能化カタラーゼ、及びＣｇカタラーゼ結晶によるＨ２Ｏ２の触媒分解を示す。天然（図１９ａ及びｄ）またはＤＮＡ機能化（図１９ｂ〜ｃ及びｅ〜ｆ）Ｃｇ（図１９ａ〜ｃ）、及びウシ（図１９ｄ〜ｆ）カタラーゼの添加後の２４０ｎｍでの吸光度の変化を、Ｈ２Ｏ２のモル吸光係数（４３Ｍ−１ｃｍ−１）で割ることによって分解したＨ２Ｏ２の濃度に変換し、時間関数としてプロットした。各Ｈ２Ｏ２濃度に対する初期反応速度を計算し、図１４ｆ（Ｃｇ  カタラーゼ）及び１９ｇ（ウシカタラーゼ）にプロットした。図１９ｈ）は、各酵素変異型によるＨ２Ｏ２の分解に対する速度定数の要約である。図１９ｉ）は、種々の基質濃度でのＣｇカタラーゼ結晶によるＨ２Ｏ２の分解である。図１９ｊ）は、酵素結晶のリサイクルである。下部の点及び上部の点は、それぞれ、上清及びペレットに対応する。図１９ｋ）５周回の触媒、遠心分離、及び再懸濁前（最下部）及び後（最上部）のタンパク質結晶の構造である。
【図１９Ｆ】天然カタラーゼ、ＤＮＡ機能化カタラーゼ、及びＣｇカタラーゼ結晶によるＨ２Ｏ２の触媒分解を示す。天然（図１９ａ及びｄ）またはＤＮＡ機能化（図１９ｂ〜ｃ及びｅ〜ｆ）Ｃｇ（図１９ａ〜ｃ）、及びウシ（図１９ｄ〜ｆ）カタラーゼの添加後の２４０ｎｍでの吸光度の変化を、Ｈ２Ｏ２のモル吸光係数（４３Ｍ−１ｃｍ−１）で割ることによって分解したＨ２Ｏ２の濃度に変換し、時間関数としてプロットした。各Ｈ２Ｏ２濃度に対する初期反応速度を計算し、図１４ｆ（Ｃｇ  カタラーゼ）及び１９ｇ（ウシカタラーゼ）にプロットした。図１９ｈ）は、各酵素変異型によるＨ２Ｏ２の分解に対する速度定数の要約である。図１９ｉ）は、種々の基質濃度でのＣｇカタラーゼ結晶によるＨ２Ｏ２の分解である。図１９ｊ）は、酵素結晶のリサイクルである。下部の点及び上部の点は、それぞれ、上清及びペレットに対応する。図１９ｋ）５周回の触媒、遠心分離、及び再懸濁前（最下部）及び後（最上部）のタンパク質結晶の構造である。
【図１９Ｇ】天然カタラーゼ、ＤＮＡ機能化カタラーゼ、及びＣｇカタラーゼ結晶によるＨ２Ｏ２の触媒分解を示す。天然（図１９ａ及びｄ）またはＤＮＡ機能化（図１９ｂ〜ｃ及びｅ〜ｆ）Ｃｇ（図１９ａ〜ｃ）、及びウシ（図１９ｄ〜ｆ）カタラーゼの添加後の２４０ｎｍでの吸光度の変化を、Ｈ２Ｏ２のモル吸光係数（４３Ｍ−１ｃｍ−１）で割ることによって分解したＨ２Ｏ２の濃度に変換し、時間関数としてプロットした。各Ｈ２Ｏ２濃度に対する初期反応速度を計算し、図１４ｆ（Ｃｇ  カタラーゼ）及び１９ｇ（ウシカタラーゼ）にプロットした。図１９ｈ）は、各酵素変異型によるＨ２Ｏ２の分解に対する速度定数の要約である。図１９ｉ）は、種々の基質濃度でのＣｇカタラーゼ結晶によるＨ２Ｏ２の分解である。図１９ｊ）は、酵素結晶のリサイクルである。下部の点及び上部の点は、それぞれ、上清及びペレットに対応する。図１９ｋ）５周回の触媒、遠心分離、及び再懸濁前（最下部）及び後（最上部）のタンパク質結晶の構造である。
【図１９Ｈ】天然カタラーゼ、ＤＮＡ機能化カタラーゼ、及びＣｇカタラーゼ結晶によるＨ２Ｏ２の触媒分解を示す。天然（図１９ａ及びｄ）またはＤＮＡ機能化（図１９ｂ〜ｃ及びｅ〜ｆ）Ｃｇ（図１９ａ〜ｃ）、及びウシ（図１９ｄ〜ｆ）カタラーゼの添加後の２４０ｎｍでの吸光度の変化を、Ｈ２Ｏ２のモル吸光係数（４３Ｍ−１ｃｍ−１）で割ることによって分解したＨ２Ｏ２の濃度に変換し、時間関数としてプロットした。各Ｈ２Ｏ２濃度に対する初期反応速度を計算し、図１４ｆ（Ｃｇ  カタラーゼ）及び１９ｇ（ウシカタラーゼ）にプロットした。図１９ｈ）は、各酵素変異型によるＨ２Ｏ２の分解に対する速度定数の要約である。図１９ｉ）は、種々の基質濃度でのＣｇカタラーゼ結晶によるＨ２Ｏ２の分解である。図１９ｊ）は、酵素結晶のリサイクルである。下部の点及び上部の点は、それぞれ、上清及びペレットに対応する。図１９ｋ）５周回の触媒、遠心分離、及び再懸濁前（最下部）及び後（最上部）のタンパク質結晶の構造である。
【図１９Ｉ】天然カタラーゼ、ＤＮＡ機能化カタラーゼ、及びＣｇカタラーゼ結晶によるＨ２Ｏ２の触媒分解を示す。天然（図１９ａ及びｄ）またはＤＮＡ機能化（図１９ｂ〜ｃ及びｅ〜ｆ）Ｃｇ（図１９ａ〜ｃ）、及びウシ（図１９ｄ〜ｆ）カタラーゼの添加後の２４０ｎｍでの吸光度の変化を、Ｈ２Ｏ２のモル吸光係数（４３Ｍ−１ｃｍ−１）で割ることによって分解したＨ２Ｏ２の濃度に変換し、時間関数としてプロットした。各Ｈ２Ｏ２濃度に対する初期反応速度を計算し、図１４ｆ（Ｃｇ  カタラーゼ）及び１９ｇ（ウシカタラーゼ）にプロットした。図１９ｈ）は、各酵素変異型によるＨ２Ｏ２の分解に対する速度定数の要約である。図１９ｉ）は、種々の基質濃度でのＣｇカタラーゼ結晶によるＨ２Ｏ２の分解である。図１９ｊ）は、酵素結晶のリサイクルである。下部の点及び上部の点は、それぞれ、上清及びペレットに対応する。図１９ｋ）５周回の触媒、遠心分離、及び再懸濁前（最下部）及び後（最上部）のタンパク質結晶の構造である。
【図１９Ｊ】天然カタラーゼ、ＤＮＡ機能化カタラーゼ、及びＣｇカタラーゼ結晶によるＨ２Ｏ２の触媒分解を示す。天然（図１９ａ及びｄ）またはＤＮＡ機能化（図１９ｂ〜ｃ及びｅ〜ｆ）Ｃｇ（図１９ａ〜ｃ）、及びウシ（図１９ｄ〜ｆ）カタラーゼの添加後の２４０ｎｍでの吸光度の変化を、Ｈ２Ｏ２のモル吸光係数（４３Ｍ−１ｃｍ−１）で割ることによって分解したＨ２Ｏ２の濃度に変換し、時間関数としてプロットした。各Ｈ２Ｏ２濃度に対する初期反応速度を計算し、図１４ｆ（Ｃｇ  カタラーゼ）及び１９ｇ（ウシカタラーゼ）にプロットした。図１９ｈ）は、各酵素変異型によるＨ２Ｏ２の分解に対する速度定数の要約である。図１９ｉ）は、種々の基質濃度でのＣｇカタラーゼ結晶によるＨ２Ｏ２の分解である。図１９ｊ）は、酵素結晶のリサイクルである。下部の点及び上部の点は、それぞれ、上清及びペレットに対応する。図１９ｋ）５周回の触媒、遠心分離、及び再懸濁前（最下部）及び後（最上部）のタンパク質結晶の構造である。
【図１９Ｋ】天然カタラーゼ、ＤＮＡ機能化カタラーゼ、及びＣｇカタラーゼ結晶によるＨ２Ｏ２の触媒分解を示す。天然（図１９ａ及びｄ）またはＤＮＡ機能化（図１９ｂ〜ｃ及びｅ〜ｆ）Ｃｇ（図１９ａ〜ｃ）、及びウシ（図１９ｄ〜ｆ）カタラーゼの添加後の２４０ｎｍでの吸光度の変化を、Ｈ２Ｏ２のモル吸光係数（４３Ｍ−１ｃｍ−１）で割ることによって分解したＨ２Ｏ２の濃度に変換し、時間関数としてプロットした。各Ｈ２Ｏ２濃度に対する初期反応速度を計算し、図１４ｆ（Ｃｇ  カタラーゼ）及び１９ｇ（ウシカタラーゼ）にプロットした。図１９ｈ）は、各酵素変異型によるＨ２Ｏ２の分解に対する速度定数の要約である。図１９ｉ）は、種々の基質濃度でのＣｇカタラーゼ結晶によるＨ２Ｏ２の分解である。図１９ｊ）は、酵素結晶のリサイクルである。下部の点及び上部の点は、それぞれ、上清及びペレットに対応する。図１９ｋ）５周回の触媒、遠心分離、及び再懸濁前（最下部）及び後（最上部）のタンパク質結晶の構造である。
【図２０】ＤＮＡ鋳型タンパク質凝集体の熱的融解転移の分析を示す。凝集体を、相補的付着末端またはタンパク質を保有するリンカーとハイブリッド形成した２つのタンパク質の可能な組み合わせの各々（図２０ａ〜ｄ）、及び１０ｎｍコアＳＮＡ−ＡｕＮＰ抱合体（図２０ｅ−ｆ）から組織化した。融解曲線を、温度を室温から４５℃にゆっくりと（０．１℃／分）上昇させながら、凝集体を含有する溶液の２６０ｎｍでの消滅における変化を追うことによって得た。全ての粒子の組み合わせは、オリゴヌクレオチドによる構成ナノ粒子の表面の高密度な被覆と一致する急激な融解転移を示した凝集体をもたらした。図２０ｇ）は、融解温度、及び各融解曲線の第１の導関数の半値全幅の要約である。
【図２１】タンパク質−タンパク質（図２１ａ〜ｄ）及びタンパク質−ＡｕＮＰ（図２１ｅ〜ｆ）超格子についてのＳＡＸＳデータを示す。各パネルは、タンパク質を含有する超格子についての、実験で観察された１次元的ＳＡＸＳパターン（上部のトレース）と理論的予測（下部のトレース）との間の比較を示す。各超格子型の構成要素及び単位セルの概略が各パネルの最上部に示され、ここでは、Ｃｇカタラーゼ、ウシカタラーゼ、及びＡｕＮＰは、それぞれ、赤色の図案、シアン色の図案、または金色の球形として描出される。超格子は、図２１ａ）ＢＣＣ（青色の理論的トレース）とＣｓＣｌ（黒色の理論的トレース）との混合物、（図２１ｂ〜ｄ）ＣｓＣｌ、及び（図２１ｅ〜ｆ）単純な立方と等構造である。
【図２２】ＴＥＭによる単結晶超格子の特性評価を示す。Ｃｇカタラーゼ−ＡｕＮＰハイブリッド超格子の低倍率（図２２ａ）及び高倍率（図２２ｂ）のＴＥＭ顕微鏡写真は、予測された菱形十二面体晶癖の均一な形成を示す。菱形十二面体の種々の配向の図案描写を、実験で観察された一致する配向を持つ超格子と並べて示す。（図２２ｂ）中の挿入図は、単結晶内のＡｕＮＰ間の高度な短距離秩序を描出する。図ｃ）〜ｄ）は、Ｃｇカタラーゼで構成される超格子の低倍率及び高倍率ＴＥＭ画像である。図２２ｄ）は、格子面が明確に可視であるＣｇカタラーゼ単結晶の高倍率ＴＥＭ画像であり、その単結晶性質を示している。スケールバーは、（図２２ａ）及び（図２２ｃ）については５μｍ、（図２２ｂ）については５００ｎｍ、及び（図２２ｄ）については２００ｎｍである。
【図２３】ＤＮＡ機能化Ｃｇカタラーゼ及びＳＮＡ−ＡｕＮＰ抱合体から組織化した単結晶超格子の代表的な低倍率顕微鏡写真を示す。スケールバーは１０μｍである。
【図２４】相補的オリゴヌクレオチドによって機能化した粒子間のＤＮＡ媒介性相互作用を例示するスキームである。各粒子（タンパク質は赤紫色の図案、及びＡｕＮＰは金色の球形）は、粒子結合のための化学反応性部分（ＡｕＮＰ及びタンパク質に対して、それぞれ、チオール部分及びＤＢＣＯ部分）を含有する領域（ｉ）と、ＰＥＧスペーサー（Ｓｐ）から成る短い柔軟性領域とから成るオリゴヌクレオチドによって機能化される。リンカー鎖の認識部分と付着末端部分との間にも含まれるこれらのスペーサーを含めることで、ＤＮＡ相互接続の柔軟性を増大させ、高品質な結晶の形成を促進する。柔軟性領域は、両側に相補的リンカー鎖とハイブリッド形成する認識配列（ｉｉ）を有する（青色または黄色）。各リンカーの末端は、別の粒子型上の付着末端に相補的である短い付着末端（ｉｉｉ）から成る。明確化のため、１つのみのタンパク質−ＤＮＡまたはＡｕＮＰ−ＤＮＡ結合を示すが、タンパク質の表面は、多数の機能化できる可能性を持つリジン残基を含有する（青色の棒）。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
タンパク質は、その固有かつ多様な触媒機能性に起因して、機能性超分子物質のための前駆体のほぼ無限のセットを示す。しかしながら、単一タンパク質の規則超格子への組織化であっても、それをプログラミングすることは困難な作業であり、界面化学がはっきり異なる複数のタンパク質、またはタンパク質と無機ナノ粒子とを共同組織化するための汎化可能な戦略は、現在のところ存在しない。本明細書では、ＤＮＡ間「結合」の高忠実度の相互作用特性を用いて、種々の実施形態において、２つのタンパク質の、単一タンパク質、複数のタンパク質、またはタンパク質及び金ナノ粒子のいずれかで構成される６つの固有の超格子への組織化を行う。重要なことに、ＤＮＡ機能化タンパク質は、溶液中と結晶状態との両方において、その自然の触媒機能性を保持する。
【００３６】
ＤＮＡ媒介性ナノ粒子（ＮＰ）の組織化及び結晶化［Ｍｉｒｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８２（６５９２）：６０７−６０９（１９９６）、Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４５１（７１７８）：５５３−５５６（２００８）、Ｎｙｋｙｐａｎｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４５１（７１７８）：５４９−５５２（２００８）］は、成分構成単位の表面を放射状配向オリゴヌクレオチドの高密度な単分子層で修飾することを必要とする。プログラム可能な原子等価物［Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ５２（２２）：５６８８−５６９８（２０１３）］または球形核酸（ＳＮＡ）−ＮＰ抱合体とも称されるこの構造により、短い相補的付着末端を保有するリンカー鎖とハイブリッド形成する粒子間の多価相互作用の形成ができるようになる（図１及び２４）。相補的付着末端を保有するナノ粒子が組み合わされ、これらの多価相互作用を分断するのに十分な温度に加熱された後、ゆっくりと室温に冷却されるとき、個々としては弱い多くの粒子間相互作用の可逆的形成は、集合して、動態的に捕らわれた非晶質凝集体にわたる熱力学的に安定した単結晶超格子の形成に助力する［Ａｕｙｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ５０５（７４８１）：７３−７７（２０１４）］。機能性タンパク質をＤＮＡ媒介性超格子に含めることは、その表面が、その機能性を維持するのに不可欠であるその自然の構造を完全に残したまま、オリゴヌクレオチドで十分に機能化され得ることを条件とすれば可能である。オリゴヌクレオチドを緩和な条件下でタンパク質表面に付加するための２段階反応スキームを開発し、ＤＮＡ機能化タンパク質を特性評価して、それらがその自然の構造及び機能を維持することを確実にし、その単結晶超格子へのＤＮＡ媒介性組織化を観察した。
【００３７】
本開示は種々の用途を対象とし、これらの用途としては、
タンパク質の表面をオリゴヌクレオチドの高密度なシェルで化学的に修飾するための方法、
細胞プロテアーゼによる分解または長期に及ぶ保管の際の分解に対する可能性のあるタンパク質ベースの治療薬の安定化、
欠損酵素の代置のため（例えば例えば、リポソーム保管障害のため）または毒性の代謝の酵素的変換のため（例えば、外傷性脳損傷または脳卒中後にＨ２Ｏ２を分解するためのカタラーゼ）のタンパク質−オリゴヌクレオチド抱合体の適用、
細胞進入のためのオリゴヌクレオチド及び標的化のための他の化学部分（例えば、リソソームを標的化するためのマンノース６−リン酸）とのタンパク質の組み合わせた機能化、
タンパク質−オリゴヌクレオチド抱合体の多機能治療薬としての適用、が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
本開示によって提供される利点としては、
コーティングとしてのオリゴヌクレオチドの使用により、共同治療戦略が可能となること；
酵素コアの使用により、オリゴヌクレオチドの送達のための他の方法と比較して、追加の機能性が得られること；
オリゴヌクレオチドシェルの配列を、特定の速度で分解し、タンパク質表面を露出させるように調整して、細胞プロセスの制御を可能にする  （例えば、シグナル伝達カスケードに結合する受容体）ことが挙げられるが、これらに限定されない。
タンパク質の表面は、直交化学修飾的化学を持つ複数の官能基を提示する。このことにより、例えば、オリゴヌクレオチドシェルに加えて、複数のオリゴヌクレオチドまたは標的部分の抱合体によるタンパク質表面の修飾が可能となるはずである。
【００３９】
本開示は、タンパク質治療薬の使用に関連する多くの困難（不良な細胞取り込み、先天的な免疫応答の活性化、不良な生体利用性、細胞プロテアーゼによる分解、または保管が長期に及ぶ際の凝集及び不活性化）の解決を提供する。
【００４０】
開示の粒子は、多くの異なるタンパク質ベースの産出物までに拡大され得るコア技術である。あらゆる酵素の薬物動態特性を安定させ改善する可能性を有するため、数々の疾患の治療に適用され得る。加えて、ＤＮＡ送達のための伝統的な骨格は支持としてしか機能しないのに対し、タンパク質ベースの骨格はそれ自体が治療薬として使用され得る。
【００４１】
タンパク質−オリゴヌクレオチドのコアシェルＮＰは、オリゴヌクレオチドの高密度なシェルで化学的に修飾されたタンパク質コアから成る。タンパク質コアは、例えば、非限定的に、治療機能、触媒機能、シグナル伝達機能、または輸送機能を持つ広範なタンパク質から選択され得る。同様に、オリゴヌクレオチドシェルは、タンパク質コアが生理学的環境において機能的となるように、その治療的価値に対して、または調節可能な分解速度を有するように、選択され得る。
【００４２】
本発明により、機能性タンパク質の超分子物質への予測可能な組織化ができるようになる。これにより、２つ以上の構成要素（例えば、複数のタンパク質または、タンパク質及び無機ナノ構造）の規定の比率での物質の合成が可能となる。
【００４３】
本技術の用途は、タンパク質／ＤＮＡコアシェルナノ粒子の合成のための一般的方法；室温での長期にわたる保管の際のタンパク質の安定化；酵素的に活性な結晶の組織化；直列型触媒作用における用途を有する１つ超のタンパク質を含有する結晶の組織化；タンパク質分子及び無機ナノ粒子で構成される多成分結晶の組織化；ならびに構造決定における使用のためのタンパク質の結晶化が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
本技術の幾つかの利点としては、ＤＮＡ二重鎖形成の高忠実度により、他の戦略の使用によってでは不可能な程度までオリゴヌクレオチド機能化タンパク質の組織化挙動を予測できること；タンパク質が、それ自体を機能的物質の組織化にとって理想的な構成単位にする多くの固有の特徴、例えば、均一な原子組成及び他のナノスケール物質と比較して高度な構造的均一性、直交型化学及び広範な触媒機能性を持つ複数の化学的に修飾可能な官能基を含有する表面の存在を有すること、が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
本明細書に使用される、「複数」は、１つ超を意味する。ポリヌクレオチドとの関連において、複数とは、「シェル」を形成するのに十分な被覆を提供するタンパク質コア表面に結合しているポリヌクレオチドの数である。一部の場合、この複数は、ポリヌクレオチド密度によって測定される。
【００４６】
本明細書に使用される、「生体分子」は、ポリヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、リン脂質、オリゴ糖、小分子、治療薬、造影剤、及びこれらの組み合わせを含むように理解される。
【００４７】
本明細書及び付属の特許請求の範囲に使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、特に明確に記載のない限り、複数形の参照を含むことを、ここに記載しておく。
【００４８】
また、本明細書に使用される「約」という用語は、およそを意味するように理解されることを記載しておく。
【００４９】
コアシェルナノ粒子
本開示のコアシェルナノ粒子の基本的構成要素は、複数のポリヌクレオチド及び単一タンパク質である。コアシェルナノ粒子の種々の態様において、ポリヌクレオチドの全ては同じであり、あるいは代替的な態様においては、少なくとも２つのポリヌクレオチドは異なる。
【００５０】
タンパク質
本明細書に使用される、タンパク質は、「ポリペプチド」と互換的に使用され、アミノ酸残基で構成されるポリマーを指す。本明細書に使用される「単一タンパク質」は、アミノ酸残基の連続的なポリマーを指す。本明細書に開示のタンパク質は、概して、コアシェルナノ粒子の「コア」として機能する。
【００５１】
タンパク質は、当該技術分野で理解されており、抗体、酵素、構造タンパク質、及びホルモンを含むが、これらに限定されない。よって、本開示が企図するタンパク質は、触媒活性、シグナル伝達活性、治療活性、または輸送活性を有するものを含むが、これらに限定されない。種々の実施形態において、触媒機能性は、生物医学的に関連した機能、例えば、リソソーム蓄積障害において欠乏している酵素（中でも、α−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−セレブロシダーゼ、アグルコシダーゼ−α、α−マンノシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼＡ、酸性リパーゼ、及びこれらの酵素の変異型）、胃腸障害において欠乏している酵素（ラクターゼ、リパーゼ、アミラーゼ、またはプロテアーゼ）、または免役欠乏に関与している酵素（アデノシンデアミナーゼ）の代置を含み、あるいは技術的用途に適した酵素（ヒドロゲナーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、オキシゲナーゼ、またはラッカーゼ）を含み、これらは、種々の実施形態において、細胞内または細胞外で使用される。シグナル伝達タンパク質は、ＴＮＦ−αまたはカスパーゼなどの増殖因子を含む。ヒト血清アルブミンは、輸送タンパク質としての使用が企図され、ここでは、小分子治療薬または造影剤がコアにおいて結合し、ＤＮＡシェルが細胞取り込みシグナルとして働き得る。
【００５２】
本開示のタンパク質は、天然または非天然のいずれかであり得る。タンパク質は、任意に、本明細書に記載のスペーサーを含む。
【００５３】
天然タンパク質
天然タンパク質としては、天然に存在するか、または例えば化学合成若しくは組み換え発現技法によって、天然に見られる形態で産出することができる生物学的に活性なタンパク質（抗体を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。また、天然タンパク質としては、例えばグリコシル化タンパク質などであるがこれに限定されない、リポタンパク質及び翻訳後修飾タンパク質が挙げられる。
【００５４】
本開示の方法及び組成物における使用が企図される抗体としては、インビボまたはインビトロのいずれかで標的分子を認識しそれと結合する抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
本開示が企図する構造タンパク質としては、アクチン、チューブリン、コラーゲン、エラスチン、ミオシン、キネシン、及びダイニンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
非天然タンパク質
本開示が企図する非天然タンパク質としては、合成タンパク質、ならびに本明細書に定義される天然または非天然タンパク質の断片、類似体、及び変異型が挙げられるが、これらに限定されない。また、非天然タンパク質としては、Ｄ型アミノ酸、Ｄ若しくはＬ構成にある修飾、誘導体化、若しくは非天然アミノ酸、及び／またはその構造の一部としてのペプチド模倣体単位を有する、タンパク質またはタンパク性物質が挙げられる。「ペプチド」という用語は、典型的には、短いポリペプチド／タンパク質を指す。
【００５７】
非天然タンパク質は、例えば、自動タンパク質合成器を使用するか、または代替的に、所望のタンパク質をコードする修飾ポリヌクレオチドを使用する組み換え発現技法を使用して、調製される。
【００５８】
本明細書に使用される、タンパク質の「断片」は、完全長タンパク質またはタンパク質発現産物より小さい、タンパク質の任意の部分を指すことが意味される。
【００５９】
本明細書に使用される、「類似体」は、構造が実質的に同様であり同じ生物学的活性を有するが、分子全体またはその断片のいずれかに対して種々の活性度を有し得る、２つ以上のタンパク質の任意のものを指す。類似体は、置換、欠失、挿入、及び／または１つ以上のアミノ酸の他のアミノ酸への添加に関与する１つ以上の変異に基づいて、そのアミノ酸配列の組成が異なる。置換は、代置されるアミノ酸及びそれを代置するアミノ酸の物理化学的または機能的関連性に基づいて、保存的または非保存的であり得る。
【００６０】
本明細書に使用される、「変異型」は、通常は分子の一部ではない追加の化学部分を含むように修飾されるタンパク質またはその類似体を指す。かかる部分は、例えば、非限定的に、分子の可溶性、吸収、及び／または生物学的半減期を調節してもよい。かかる効果を媒介することができる部分は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８０）に開示されている。かかる部分を分子にカップリングするための手順は、当該技術分野で周知である。種々の態様において、タンパク質は、グリコシル化、ペグ化、及び／またはポリシアル化によって修飾される。
【００６１】
融合タンパク質も企図され、これは、１つの融合構成要素が断片また模倣体である融合タンパク質を含む。本明細書に使用される、「模倣体」は、それが模倣するタンパク質と同等の生物学的活性を有するペプチドまたはタンパク質を意味する。例として、内皮細胞増殖因子模倣体が、自然の内皮細胞成長因子と同等の生物学的活性を有するペプチドまたはタンパク質である。この用語は、関心のタンパク質の天然リガンドの効果を増強することなどによって関心のタンパク質の活性を間接的に模倣する、ペプチドまたはタンパク質を更に含む。
【００６２】
タンパク質は、抗体をそれらの断片及び誘導体と共に含み、これらとしては、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片、Ｆｖ断片、Ｆｃ断片、１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、個々の重鎖、個々の軽鎖、二量体重鎖及び軽鎖（無傷抗体において見られるヘテロ四量体重鎖及び軽鎖に対立するものとして）、単鎖抗体（ｓｃＡｂ）、ヒト化抗体（ならびにヒト化抗体の様式で修飾されたが、生じる抗体が非ヒト種における抗体によりよく似ている抗体）、キレート化組換え抗体（ＣＲＡＢ）、二重特異性抗体及び多特異性抗体、ならびに当技術分野で知られている他の抗体誘導体または断片が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
密度
タンパク質の被覆率、及び調製混合物中の出発構成要素、即ち、ポリヌクレオチドの量に応じて、提供されるコアシェルナノ粒子は、異なる密度を有するように企図される。よって、タンパク質は、一態様においては、ポリヌクレオチドで完全に被覆され、あるいは代替的な態様においては、ポリヌクレオチドで有意に被覆されるか、またはポリヌクレオチドで疎らに被覆される。タンパク質の被覆の密度は、一態様においては、表面全体にわたって均一であり、あるいは代替の態様においては、密度は、表面にわたって不均一である。
【００６４】
一部の態様において、コアシェルナノ粒子のシェルを成すポリヌクレオチドの密度は、分解に対する耐性を増加させる。一態様において、細胞によるコアシェルナノ粒子の取り込みは、ナノ粒子と結合するポリヌクレオチドの密度により影響を受ける。全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２００８／６５３６６に記載されるように、ポリヌクレオチド機能化ナノ粒子の表面上の高密度なポリヌクレオチドは、細胞によるナノ粒子の取り込みの増加と関連する。この態様は、同様にコアシェルナノ粒子の特性であると企図され、これにおいては、コアシェルナノ粒子のシェルを構成する高密度なポリヌクレオチドは、細胞によるコアシェルナノ粒子の取り込みの増加と関連する。
【００６５】
概して、少なくとも２ｐｍｏｌ／ｃｍ２のポリヌクレオチドの面密度が、安定したコアシェルナノ粒子を提供するのに十分となる。一部の態様において、面密度は、少なくとも１５ｐｍｏｌ／ｃｍ２である。ポリヌクレオチドが、少なくとも２ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも３ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも４ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも６ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも７ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも８ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも９ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも１０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約２０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約３０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約３５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約４０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約４５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約５５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約６０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約６５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約７０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約７５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約８０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約８５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約９０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約９５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１７５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約２００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約２５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約３００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約３５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約４００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約４５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約５００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約５５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約６００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約６５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約７００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約７５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約８００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約８５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約９００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約９５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１０００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、またはそれ以上の面密度でコアシェルナノ粒子中に存在する、組成物及び方法も提供される。
【００６６】
ポリヌクレオチド
「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書において互換的に使用される。ポリヌクレオチドは、コアシェル粒子のシェルの一部としてであっても、または追加の薬剤としてであっても、本明細書に定義される、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾形態、及びこれらの組み合わせを含むことが、本開示により企図される。したがって、一部の態様において、コアシェルナノ粒子はＤＮＡを含む。一部の実施形態においては、ＤＮＡは二本鎖であり、更なる実施形態においては、ＤＮＡは一本鎖である。更なる態様において、コアシェルナノ粒子はＲＮＡを含み、また更なる態様においては、コアシェルナノ粒子は二本鎖ＲＮＡを含み、特定の実施形態においては、二本鎖ＲＮＡ薬剤は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。「ＲＮＡ」という用語は、２つの別個の鎖の二本鎖、及び一本鎖構造を含む。一本鎖ＲＮＡはまた、二次構造を持つＲＮＡを含む。一態様において、ヘアピンループを有するＲＮＡが企図される。
【００６７】
本コアシェルナノ粒子は、種々の実施形態において、コアシェルナノ粒子の一部であるポリヌクレオチド及び標的ポリヌクレオチドのハイブリッド形成が生じるように、標的ポリヌクレオチドの標的配列に十分に相補的である配列から成る複数のポリヌクレオチドを含む。二本鎖分子が、標的ポリヌクレオチドの一本鎖配列とハイブリッド形成する一本鎖配列を含む限り、種々の態様におけるポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖である。一部の態様において、コアシェルナノ粒子の一部であるポリヌクレオチドのハイブリッド形成により、二本鎖標的ポリヌクレオチドと三重鎖構造を形成することができる。別の態様において、三重鎖構造は、コアシェルナノ粒子の一部である二本鎖ポリヌクレオチドの一本鎖標的ポリヌクレオチドとのハイブリッド形成により形成することができる。三重鎖ポリヌクレオチド複合体の更なる説明は、全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２００６／４０１２４において見い出される。
【００６８】
一部の態様において、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のスペーサーを含有する。
【００６９】
「ポリヌクレオチド」は、個別に重合されたヌクレオチドサブユニットを含むと当該技術分野では理解されている。本明細書に使用される、「ヌクレオチド」という用語、またはその複数形は、本明細書に記載されるように、修飾形態と互換性であり、当該技術分野において公知である。ある特定の場合において、当該技術は、天然のヌクレオチドを包含する「核酸塩基」という用語、及び修飾ヌクレオチドを含む非天然ヌクレオチドを使用する。よって、ヌクレオチドまたは核酸塩基は、天然の核酸塩基である、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、及びウラシル（Ｕ）を意味する。非天然の核酸塩基としては、例えば、限定的ではなく、キサンチン、ジアミノプリン、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン、７−デアザキサンチン、７−デアザグアニン、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、Ｎ’，Ｎ’−エタノ−２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン（ｍＣ）、５−（Ｃ３−Ｃ６）−アルキニル−シトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、プソイドイソシトシン、２−ヒドロキシ−５−メチル−４−トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシン、及び「非天然」の核酸塩基が挙げられ、これについては、Ｂｅｎｎｅｒらの米国特許第５，４３２，２７２号、及びＳｕｓａｎ  Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ  Ａｌｔｍａｎｎ，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．２５：ｐｐ４４２９−４４４３に記載されている。「核酸塩基」という用語はまた、既知のプリン及びピリミジン複素環だけでなく、複素環式類似体及びその互変異性体も含む。更なる天然及び非天然の核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号（Ｍｅｒｉｇａｎら）、Ｃｈａｐｔｅｒ  １５  ｂｙ  Ｓａｎｇｈｖｉ，ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ  ａｎｄ  Ｂ．Ｌｅｂｌｅｕ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，３０：６１３−７２２（特に６２２〜６２３ページ、及びＣｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｊ．Ｉ．Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ  Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０，ｐａｇｅｓ  ８５８−８５９、Ｃｏｏｋ，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  １９９１，６，５８５−６０７を参照し、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているものが挙げられる。種々の態様において、ポリヌクレオチドは、核酸塩基のように機能できる複素環式化合物等の化合物を含む、非天然ヌクレオチドの分類である、１つ以上の「ヌクレオシド塩基」または「塩基部」も含み、最も伝統的な意味でヌクレオシド塩基ではないが、ヌクレオシド塩基として機能する、ある特定の「普遍的塩基」を含む。普遍的塩基は、３−ニトロピロール、任意に、置換インドール（例えば、５−ニトロインドール）、及び任意に、置換ヒポキサンチンを含む。他の望ましい普遍的塩基としては、当該技術��野で公知の普遍的塩基を含む、ピロール、ジアゾール、またはトリアゾール誘導体が挙げられる。
【００７０】
修飾ヌクレオチドは、ＥＰ１  ０７２  ６７９号及び国際公開第９７／１２８９６号に記載されており、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。修飾核酸塩基としては、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル及び他のアデニンとグアニンとのアルキル誘導体、２−プロピル及び他のアデニンとグアニンとのアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニルウラシル及びシトシンならびに他のピリミジン塩基のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルならびに他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルならびに他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンが挙げられるが、これらに限定されない。更なる修飾塩基としては、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）等の三環ピリミジン、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）等のＧ−クランプ、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）が挙げられる。修飾された塩基は、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン、及び２−ピリドンと置換されるものも含んでもよい。追加の核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ  ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されているもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，３０：６１３によって開示されているもの、及びＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ  ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．  ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３によって開示されているものが挙げられる。これらの塩基の一部は、結合親和性を増加させるのに有用であり、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６、��びＯ−６置換プリンを含み、これは、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、及び５−プロピニルシトシンを含む。５−メチルシトシン置換は、０．６〜１．２℃で核酸二重鎖安定性を増加させることを示しており、ある特定の態様において、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされる。米国特許第３，６８７，８０８号、米国特許第４，８４５，２０５号、同第５，１３０，３０２号、同第５，１３４，０６６号、同第５，１７５，２７３号、同第５，３６７，０６６号、同第５，４３２，２７２号、同第５，４５７，１８７号、同第５，４５９，２５５号、同第５，４８４，９０８号、同第５，５０２，１７７号、同第５，５２５，７１１号、同第５，５５２，５４０号、同第５，５８７，４６９号、同第５，５９４，１２１号、同第５，５９６，０９１号、同第５，６１４，６１７号、同第５，６４５，９８５号、同第５，８３０，６５３号、同第５，７６３，５８８号、同第６，００５，０９６号、同第５，７５０，６９２号、及び同第５，６８１，９４１号を参照されたい。これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７１】
所定の配列のポリヌクレオチドを作製する方法は周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．１９８９）、及びＦ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（ｅｄ．）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，１ｓｔ  Ｅｄ．（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１）を参照されたい。固相合成は、ポリリボヌクレオチド及びポリデオキシリボヌクレオチドの両方に好ましい（周知のＤＮＡ合成方法も、ＲＮＡ合成に有用である）。ポリリボヌクレオチドは、酵素的に調製することもできる。非天然核酸塩基は、ポリヌクレオチドの中に組み込むこともできる。例えば、米国特許第７，２２３，８３３号、Ｋａｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７４：２２３８（１９５１）、Ｙａｍａｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８３：２５９９（１９６１）、Ｋｏｓｔｕｒｋｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：３９４９（１９７４）、Ｔｈｏｍａｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７６：６０３２（１９５４）、Ｚｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２７：７４−７５（２００５）、及びＺｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２４：１３６８４−１３６８５（２００２）を参照されたい。
【００７２】
本開示のポリヌクレオチドまたはその修飾形態は、概して、長さが約５ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドである。一般に、より長いポリヌクレオチドは、コアシェルナノ粒子のより遅い分解に繋がる。より具体的には、コアシェルナノ粒子は、長さが約５〜約９０ヌクレオチド、長さが約５〜約８０ヌクレオチド、長さが約５〜約７０ヌクレオチド、長さが約５〜約６０ヌクレオチド、長さが約５〜約５０ヌクレオチド、長さが約５〜約４５ヌクレオチド、長さが約５〜約４０ヌクレオチド、長さが約５〜約３５ヌクレオチド、長さが約５〜約３０ヌクレオチド、長さが約５〜約２５ヌクレオチド、長さが約５〜約２０ヌクレオチド、長さが約５〜約１５ヌクレオチド、長さが約５〜約１０ヌクレオチドであるポリヌクレオチド、及びポリヌクレオチドが所望の結果を達成することができる範囲内で具体的に開示される大きさの長さの中間である全てのポリヌクレオチドを含む。したがって、長さが５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、またはそれ以上のヌクレオチドのポリヌクレオチドが企図される。１５〜１００ヌクレオチド、または１５〜６０ヌクレオチド、または１８〜３０ヌクレオチドを有するポリヌクレオチドが、具体的に本明細書で企図される。
【００７３】
本明細書に定義されるポリヌクレオチドはまた、アプタマーを含む。アプタマーの産出及び使用は、当業者には既知である。一般に、アプタマーは、標的リガンドに強く結合し、それを厳密に区別することができる核酸またはペプチド結合種である［Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ  Ｂｉｏｌ．６（３）３１６−３２０（２００９）、この全体は参照により本明細書に組み込まれる］。  アプタマーは、一部の実施形態において、指数関数的増加によるリガンドの系統的展開（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）（ＳＥＬＥＸ）プロセスと呼ばれる技法によって得てもよい［Ｔｕｅｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：５０５−１０（１９９０）、米国特許第５，２７０，１６３号、及び米国特許第５，６３７，４５９号、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる］。核酸アプタマーの概論は、例えば、限定的ではなく、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ａｐｔａｍｅｒｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍａｙｅｒ編集、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、２００９）、及びＣｒａｗｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２（１）：７２−７９（２００３）において見い出される。アプタマーの更なる考察は、ＲＮＡアプタマーの選択、ＤＮＡアプタマーの選択、標的タンパク質に共有結合することができるアプタマーの選択、修飾アプタマーライブラリの使用、ならびに診断用薬剤及び治療薬としてのアプタマーの使用を非限定的に含めて、Ｍｏｌｅｋｕｌｙａｒｎａｙａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｙａ，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．６，２０００，ｐｐ．１０９７−１１１３の翻訳であるＫｏｐｙｌｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３４（６）：９４０−９５４（２０００）中で提供されており、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。種々の態様において、アプタマーは、長さが１０〜１００ヌクレオチドである。
【００７４】
スペーサー
ある特定の態様において、コアシェルナノ粒子がポリヌクレオチドを含み、このポリヌクレオチドがスペーサーを更に含む、コアシェルナノ粒子が企図される。
【００７５】
本明細書に記載される「スペーサー」は、ポリヌクレオチドとポリヌクレオチドが結合するコアとの間の距離を増加させる働きをする部分を意味する。コアシェルナノ粒子が生物学的活性のために使用される本開示の一部の態様において、スペーサーは、それが結合するポリヌクレオチドの活性に直接的に関与しないことが企図される。代替的な態様において、スペーサーは、全てにおいてまたは一部において標的ポリヌクレオチドに相補的であり得る。
【００７６】
スペーサーは、種々の態様において、ポリヌクレオチドが同じ配列を有するか、または異なる配列を有するかに関わらず、直列型で個別のポリヌクレオチド間に位置するように更に企図される。一態様において、スペーサーは、存在する場合、有機部分である。別の態様において、スペーサーは、重合体であり、水溶性重合体、核酸、タンパク質、オリゴ糖、炭水化物、脂質、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【００７７】
スペーサーの長さは、種々の実施形態において、少なくとも約５ヌクレオチド、少なくとも約１０ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチド、１０〜４０ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチド、１０〜６０ヌクレオチド、または更には６０ヌクレオチド超である。スペーサーは、相互に相補的な配列、またはポリヌクレオチドの配列に相補的な配列を有するべきではない。特定の態様において、ポリヌクレオチドスペーサーの塩基は、全てアデニン、全てチミン、全てシチジン、全てグアニン、全てウラシル、または全て他の何らかの修飾塩基である。一部の実施形態において、スペーサーはヌクレオチドを含有せず、かかる実施形態においては、スペーサーの長さは、少なくとも約５ヌクレオチド、少なくとも約１０ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチド、１０〜４０ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチド、１０〜６０ヌクレオチド、または更には６０ヌクレオチド超に相当する。
【００７８】
修飾ポリヌクレオチド
上で考察したように、コアシェルナノ粒子の産出における使用のための修飾ポリヌクレオチドが企図される。種々の態様において、本開示のポリヌクレオチドは、完全に修飾されるか、または部分的に修飾される。よって、種々の態様において、１つ以上若しくは全ての糖類及び／またはポリヌクレオチドにおけるヌクレオチド部の１つ以上若しくは全てのヌクレオチド間結合は、「非天然」群と置換される。
【００７９】
一態様において、本開示は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）の使用を企図する。ＰＮＡ化合物において、ポリヌクレオチドの糖骨格は、アミドを含有する骨格と置換される。例えば、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７１４，３３１号、及び同第５，７１９，２６２号、ならびにＮｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００を参照されたい。これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８０】
開示されるポリヌクレオチドについて企図されるヌクレオチドと非天然ヌクレオチドとの間の他の結合は、米国特許第４，９８１，９５７号、同第５，１１８，８００号、同第５，３１９，０８０号、同第５，３５９，０４４号、同第５，３９３，８７８号、同第５，４４６，１３７号、同第５，４６６，７８６号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５１９，１３４号、同第５，５６７，８１１号、同第５，５７６，４２７号、同第５，５９１，７２２号、同第５，５９７，９０９号、同第５，６１０，３００号、同第５，６２７，０５３号、同第５，６３９，８７３号、同第５，６４６，２６５号、同第５，６５８，８７３号、同第５，６７０，６３３号、同第５，７９２，７４７号、及び同第５，７００，９２０号、米国特許公開第２００４０２１９５６５号、国際特許公開第９８／３９３５２号及び第９９／１４２２６号、Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ  ｅｔ．ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５：３４３−３５５（１９９５）、ならびにＳｕｓａｎ  Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ  Ａｌｔｍａｎｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５：４４２９−４４４３（１９９７）に記載されているものを含み、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８１】
ポリヌクレオチドの特定の例としては、修飾された骨格または非天然ヌクレオシド間結合を含有するものが挙げられる。修飾された骨格を有するポリヌクレオチドは、骨格にリン原子を保持するもの、及び骨格にリン原子を持たないものを含む。ヌクレオシド間骨格にリン原子を持たない修飾されたポリヌクレオチドは、「ポリヌクレオチド」の意味内であるとみなされる。
【００８２】
リン原子を含有する修飾されたポリヌクレオチド骨格は、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及び３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネート、及びキラルホスホネートを含む他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、正常３’−５’結合を有するセレノホスフェート及びボラノホスフェート、それらの２’−５’結合類似体、ならびに１つ以上のヌクレオチド間結合が３’−３’、５’−５’または２’−２’結合である反転極性を有するものを含む。３’末端ヌクレオチド間結合で単一３’−３’結合を含む反転極性を有するポリヌクレオチド、即ち、非塩基であってもよい（ヌクレオチドが欠損しているか、またはその位置にヒドロキシル基を有する）単一の反転ヌクレオシド残基も企図される。塩類、混合塩、及び遊離酸形態も企図される。
【００８３】
上記のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許としては、米国特許第３，６８７，８０８号、同第４，４６９，８６３号、同第４，４７６，３０１号、同第５，０２３，２４３号、同第５，１７７，１９６号、同第５，１８８，８９７号、同第５，２６４，４２３号、同第５，２７６，０１９号、同第５，２７８，３０２号、同第５，２８６，７１７号、同第５，３２１，１３１号、同第５，３９９，６７６号、同第５，４０５，９３９号、同第５，４５３，４９６号、同第５，４５５，２３３号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７６，９２５号、同第５，５１９，１２６号、同第５，５３６，８２１号、同第５，５４１，３０６号、同第５，５５０，１１１号、同第５，５６３，２５３号、同第５，５７１，７９９号、同第５，５８７，３６１号、同第５，１９４，５９９号、同第５，５６５，５５５号、同第５，５２７，８９９号、同第５，７２１，２１８号、同第５，６７２，６９７号、及び同第５，６２５，０５０号が挙げられ、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８４】
リン原子を含まない修飾されたポリヌクレオチド骨格は、短鎖アルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子若しくは複素環式ヌクレオシド間結合により形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ結合、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格、ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格、スルホネート及びスルホンアミド骨格、アミド骨格、及び混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２構成要素を有する他のものを有するものを含む。また他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を用いて提供され、オリゴヌクレオシドはヘテロ原子を用いて提供され、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、及び−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−を含み、これらは、米国特許第５，４８９，６７７号及び同第５，６０２，２４０号に記載されている。例えば、米国特許第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，１８５，４４４号、同第５，２１４，１３４号、同第５，２１６，１４１号、同第５，２３５，０３３号、同第５，２６４，５６２号、同第５，２６４，５６４号、同第５，４０５，９３８号、同第５，４３４，２５７号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７０，９６７号、同第５，４８９，６７７号、同第５，５４１，３０７号、同第５，５６１，２２５号、同第５，５９６，０８６号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６０８，０４６号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６１８，７０４号、同第５，６２３，０７０号、同第５，６６３，３１２号、同第５，６３３，３６０号、同第５，６７７，４３７号、同第５，７９２，６０８号、同第５，６４６，２６９号、及び同第５，６７７，４３９号を参照されたい。これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００８５】
種々の形態において、ポリヌクレオチドにおける２つの連続したモノマー間の結合は、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲＨ−、＞Ｃ＝Ｏ、＞Ｃ＝ＮＲＨ、＞Ｃ＝Ｓ、−Ｓｉ（Ｒ”）２−、−ＳＯ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｐ（Ｏ）２−、−ＰＯ（ＢＨ３）−、−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−、−Ｐ（Ｓ）２−、−ＰＯ（Ｒ”）−、−ＰＯ（ＯＣＨ３）−、及び−ＰＯ（ＮＨＲＨ）−から選択される、２〜４、望ましくは３基／原子から成り、ＲＨは、水素及びＣ１−４−アルキルから選択され、Ｒ”は、Ｃ１−６−アルキル及びフェニルから選択される。かかる結合の事例は、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＯ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝（後続モノマーへの結合として使用される場合、Ｒ５を含む）、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−ＣＨ２−−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＳ−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−Ｃ（＝ＮＲＨ）−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ＝（後続モノマーへの結合として使用される場合、Ｒ５を含む）、−ＣＨ２−Ｏ−ＮＲＨ−、−ＣＯ−ＮＲＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−ＣＯ−、−Ｏ−ＮＲＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＮＲＨ、−Ｏ−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ＝（後続モノマーへの結合として使用される場合、Ｒ５を含む）、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−−Ｏ−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＳＯ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＳＯ２−ＣＨ２−、−Ｏ−ＳＯ−Ｏ−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ２−；−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）２−Ｓ−、−Ｏ−ＰＯ（Ｒ”）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（Ｏ  ＣＨ２ＣＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（Ｏ  ＣＨ２ＣＨ２Ｓ−Ｒ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＢＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲＮ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−ＮＲＨ  Ｈ−、−ＮＲＨ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，ＮＲＨ）−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−ＣＨ２−、及び−Ｏ−Ｓｉ（Ｒ”）２−Ｏ−であり；その中でも、−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−、−Ｓ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−Ｏ−Ｐ（−  Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−ＮＲＨ  Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，ＮＲＨ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（Ｒ”）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＣＨ３）−Ｏ−、及び−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲＮ）−Ｏ−が企図され、ＲＨは、水素及びＣ１−４−アルキルから選択され、Ｒ”は、Ｃ１−６−アルキル及びフェニルから選択される。更なる事例は、Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ  ｅｔ．ａｌ．，１９９５，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５：３４３−３５５、及びＳｕｓａｎ  Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ  Ａｌｔｍａｎｎ，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ  ２５：ｐｐ４４２９−４４４３に提供されている。
【００８６】
ポリヌクレオチドのまた他の修飾された形態は、米国特許公開第２００４０２１９５６５号に詳細に記載されており、この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００８７】
修飾されたポリヌクレオチドは、１つ以上の置換糖部分も含有し得る。ある特定の態様において、ポリヌクレオチドは、２’位置で、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルのうちの１つを含み、アルキル、アルケニル、及びアルキニルは、置換または非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであってもよい。他の実施形態は、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２を含み、式中、ｎ及びｍは１〜約１０である。他のポリヌクレオチドは、２’位置で、以下のうちの１つを含む：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、介入物、ポリヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、またはポリヌクレオチドの薬物動力特性を改善するための基、及び類似する特性を有する他の置換基。一態様において、修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、これは２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られる）（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｈｅｌｖ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ，７８：４８６−５０４）、即ち、アルコキシアルコキシ基を含む。他の修飾は、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、即ち、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られるＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、及び２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野では２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、即ち、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２を含む。
【００８８】
また他の修飾は、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’−アリル（２’−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。２’−修飾は、アラビノ（上）位置またはリボ（下）位置であってもよい。一態様において、２’−アラビノ修飾は２’−Ｆである。同様の修飾は、ポリヌクレオチド上の他の位置、例えば、３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位置、または２’−５’結合ポリヌクレオチド及び５’末端ヌクレオチドの５’位置でも行われ得る。ポリヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分等の糖模擬体も有してもよい。例えば、米国特許第４，９８１，９５７号、同第５，１１８，８００号、同第５，３１９，０８０号、同第５，３５９，０４４号、同第５，３９３，８７８号、同第５，４４６，１３７号、同第５，４６６，７８６号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５１９，１３４号、同第５，５６７，８１１号、同第５，５７６，４２７号、同第５，５９１，７２２号、同第５，５９７，９０９号、同第５，６１０，３００号、同第５，６２７，０５３号、同第５，６３９，８７３号、同第５，６４６，２６５号、同第５，６５８，８７３号、同第５，６７０，６３３号、同第５，７９２，７４７号、及び同第５，７００，９２０号を参照されたい。これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００８９】
一態様において、糖修飾は、２’−ヒドロキシル基が糖環の３’または４’炭素原子に結合され、これによって二環式糖部分を形成する、ロックされた核酸（ＬＮＡ）を含む。特定の態様において、結合は、２’酸素原子と４’炭素原子を架橋するメチレン（−ＣＨ２−）ｎ基であり、ｎは、１または２である。ＬＮＡ及びその調製物は、国際公開第９８／３９３５２号及び第９９／１４２２６号に記載されており、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９０】
ポリヌクレオチドの特徴
提供される各コアシェルナノ粒子は、複数のポリヌクレオチドを含む。その結果、各コアシェルナノ粒子は、十分に相補的な配列を有する複数の標的ポリヌクレオチドに結合する能力を有する。例えば、特異的ポリヌクレオチドを標的化する場合、単一のコアシェルナノ粒子は、同じ分子の複数のコピーに結合する能力を有する。一態様において、コアシェルナノ粒子が同一のポリヌクレオチドを含む、即ち、各ポリヌクレオチドが同じ長さ及び同じ配列を有する方法が提供される。他の態様において、コアシェルナノ粒子は、同一でない２つ以上のポリヌクレオチドを含む、即ち、コアシェルナノ粒子のポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、異なる長さ及び／または異なる配列を有するという点において、コアシェルナノ粒子の少なくとも１つの他のポリヌクレオチドとは異なる。コアシェルナノ粒子が異なるポリヌクレオチドを含む態様において、これらの異なるポリヌクレオチドは、同じ単一の標的ポリヌクレオチドに異なる場所で結合するか、または異なる遺伝子産物をコードする異なる標的ポリヌクレオチドに結合する。したがって、種々の態様において、単一のコアシェルナノ粒子は、１つ超の遺伝子産物の発現を阻害するための方法において使用され得る。よって、ポリヌクレオチドを使用して、遺伝子発現の所望のレベルの阻害をもたらすために必要に応じて、標的ポリヌクレオチドにおける１つ以上の特異的領域にて、または標的ポリヌクレオチドの全長にわたって、特異的ポリヌクレオチドを標的にする。
【００９１】
したがって、一態様においては、ポリヌクレオチドは、標的配列を知った上で設計される。代替的に、コアシェルナノ粒子中のポリヌクレオチドは、本明細書に記載の所望の効果を達成するために、標的ポリヌクレオチドとハイブリッド形成する必要がない。いずれにせよ、所定の配列のポリヌクレオチドを作製する方法は周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．  １９８９）、及びＦ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（ｅｄ．）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，１ｓｔ  Ｅｄ．（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１）を参照されたい。固相合成は、オリゴリボヌクレオチド及びオリゴデオキシリボヌクレオチドの両方について企図される（周知のＤＮＡ合成方法も、ＲＮＡ合成に有用である）。オリゴリボヌクレオチド及びオリゴデオキシリボヌクレオチドは、酵素的に調製することもできる。
【００９２】
代替的に、ポリヌクレオチドは、ライブラリから選択される。この種のライブラリの調製は、当該技術分野で周知である。例えば、２００５年９月２９日公開の米国特許出願第２００５０２１４７８２号、オリゴヌクレオチドライブラリを参照されたい。
【００９３】
コアシェルナノ粒子の産出について企図されるポリヌクレオチドは、種々の態様において、標的ポリヌクレオチドから発現される遺伝子産物の発現を調節するものを含む。したがって、標的ポリヌクレオチドとハイブリッド形成し、翻訳を阻害するアンチセンスポリヌクレオチド、標的ポリヌクレオチドにハイブリッド形成し、ＲＮＡｓｅ活性（例えば、ＲＮＡｓｅ  Ｈ）を始動するｓｉＲＮＡポリヌクレオチド、二本鎖ポリヌクレオチドとハイブリッド形成し、転写を阻害する三重らせん形成ポリヌクレオチド、及び標的ポリヌクレオチドとハイブリッド形成し、翻訳を阻害するリボザイムが企図される。
【００９４】
一部の態様において、コアシェルナノ粒子は、コアシェルナノ粒子の取り込みを可能にする。種々の態様において、ポリヌクレオチドは、コアシェルナノ粒子の取り込み効率を増加させるヌクレオチド配列を含む。本明細書に使用される、「効率」とは、細胞における／細胞によるコアシェルナノ粒子の取り込みの数または割合を指す。コアシェルナノ粒子の細胞への進入及びそこからの退出のプロセスは、動的なものであるため、効率は、多くのコアシェルナノ粒子を取り込むことにより、または細胞に進入するそれらのコアシェルナノ粒子を長期間保持することにより増加することができる。同様に、効率は、少ないコアシェルナノ粒子を取り込むことにより、または細胞に進入するそれらのコアシェルナノ粒子を短期間保持することにより低下させることができる。
【００９５】
よって、ヌクレオチド配列は、所望される任意のヌクレオチド配列であってもよく、種々の態様において、コアシェルナノ粒子の細胞取り込み若しくは遺伝子制御の増加または減少のために選択することができる。ヌクレオチド配列は、一部の態様において、コアシェルナノ粒子が細胞によって取り込まれる効率に影響するホモポリマー配列を含む。したがって、ホモポリマー配列は、効率を増加または低下させる。また、種々の態様において、ヌクレオチド配列は、それが決してホモポリマー配列でないように核酸塩基の組み合わせであることも企図される。例えば、非限定的に、種々の態様において、ヌクレオチド配列は、交互になったチミジン及びウリジン残基、２つのチミジンの後に２つのウリジン、または増加した取り込みに影響する任意の組み合わせを含み、本開示によって企図される。一部の態様において、取り込み効率に影響するヌクレオチド配列は、追加の配列を含むポリヌクレオチド中にドメインとして含まれる。この「ドメイン」は、追加のヌクレオチド配列が、例えば、非限定的に、遺伝子発現を制御するのに役立つことになる一方、取り込み効率に影響する特徴として機能するのに役立つことになる。種々の態様において、ポリヌクレオチド中のドメインは、コアに対して、近位、遠位、または中心位置のいずれかであり得る。ポリヌクレオチドが、１つ超のドメインを含むことがまた企図される。
【００９６】
ホモポリマー配列は、一部の実施形態において、細胞によるコアシェルナノ粒子の取り込みの効率を増加させる。一部の態様において、ホモポリマー配列は、チミジン残基（ポリＴ）またはウリジン残基（ポリＵ）の配列を含む。更なる態様において、ポリＴまたはポリＵ配列は、２つのチミジンまたはウリジンを含む。種々の態様において、ポリＴまたはポリＵ配列は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、またはそれ以上のチミジン若しくはウリジン残基を含む。
【００９７】
一部の実施形態において、ホモポリマー配列を含むポリヌクレオチドを含むコアシェルナノ粒子が、同じポリヌクレオチドを含むがホモポリマー配列を欠損するコアシェルナノ粒子よりも高い効率で、細胞によって取り込まれることが企図される。種々の態様において、ホモポリマー配列を含むポリヌクレオチドを含むコアシェルナノ粒子は、同じポリヌクレオチドを含むがホモポリマー配列を欠損するコアシェルナノ粒子よりも約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍、約１００倍以上、より効率的に細胞によって取り込まれる。
【００９８】
他の態様において、ドメインは、リン酸塩ポリマー（Ｃ３残基）である。一部の態様において、ドメインは、２つのリン酸から成るリン酸重合体（Ｃ３残基）を含む。種々の態様において、Ｃ３残基は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００以上のリン酸塩を含む。
【００９９】
一部の実施形態において、ドメインを含むポリヌクレオチドを含むコアシェルナノ粒子が、同じポリヌクレオチドを含むがドメインを欠損するコアシェルナノ粒子よりも低い効率で、細胞によって取り込まれることが企図される。種々の態様において、ドメインを含むポリヌクレオチドを含むコアシェルナノ粒子は、同じポリヌクレオチドを含むがドメインを欠損するコアシェルナノ粒子よりも約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍、約１００倍以上、効率が悪く細胞によって取り込まれる。
【０１００】
本明細書に使用される、「抱合部位」は、造影剤がそこに付着されるポリヌクレオチド上の部位を意味すると理解される。ある特定の態様において、本開示はまた、コアシェルナノ粒子の一部である１つ以上のポリヌクレオチドが抱合部位を含む一方、抱合部位を含まない同じコアシェルナノ粒子の一部である１つ以上のポリヌクレオチドを提供する。抱合部位を通る造影剤のコアシェルナノ粒子への抱合は、概して、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２０１０／４４８４４号に記載される。本開示は、一態様において、ポリヌクレオチドを含むコアシェルナノ粒子を提供し、ポリヌクレオチドは、１〜約１０の抱合部位を含む。別の態様において、ポリヌクレオチドは、５つの抱合部位を含む。一般的に、ヌクレオチドのその骨格（リン酸基）及び核酸塩基の両方が修飾され得る。したがって、本開示は、２ｎ抱合部位が存在すると企図し、ここでは、ｎ＝ポリヌクレオチド鋳型の長さである。一部の態様において、コアシェルナノ粒子の複数のポリヌクレオチドは、造影剤が１つ以上の抱合部位を通してそこに結合される少なくとも１つのポリヌクレオチド、ならびに本明細書に記載される遺伝子調節活性を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。
【０１０１】
ポリヌクレオチドコピー−同じ／異なる配列
単一のポリヌクレオチドにおける単一の配列または単一のポリヌクレオチドにおける単一の配列の複数のコピーがコアシェルナノ粒子の一部であるものを含むコアシェルナノ粒子が提供される。よって、種々の態様において、直列している、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の直列反復の単一の配列の複数のコピーを持つポリヌクレオチドが企図される。
【０１０２】
代替的に、コアシェルナノ粒子は、異なる配列を有する少なくとも２つのポリヌクレオチドを含む。上記のように、異なるポリヌクレオチド配列は、種々の態様において、直列で（即ち、単一のポリヌクレオチド上に）及び／または複数のコピーで（即ち、少なくとも２つのポリヌクレオチド上に）配列される。異なる配列を有するポリヌクレオチドがコアシェルナノ粒子の一部である方法において、本開示の態様は、異なるポリヌクレオチド配列が同じポリヌクレオチド上の異なる領域とハイブリッド形成するものを含む。代替的に、異なるポリヌクレオチド配列は、異なるポリヌクレオチドとハイブリッド形成する。
【０１０３】
追加の薬剤
本開示が提供するコアシェルナノ粒子は、任意に追加の薬剤を含む。追加の薬剤は、種々の実施形態において、単純に、コアシェルナノ粒子のシェルを構成している複数のポリヌクレオチドのうちの１つ以上と結合し、かつ／またはコアシェルナノ粒子のタンパク質コアと結合する。この追加の薬剤は、一態様において、複数のポリヌクレオチドのうちの１つ以上と共有結合するか、または代替的な態様においては、複数のポリヌクレオチドのうちの１つ以上と非共有結合することが企図される。しかしながら、本開示は、１つ以上の追加の薬剤が複数のポリヌクレオチドのうちの１つ以上と共有的及び非共有的の両方で結合している、コアナノシェル粒子を提供することが理解される。非共有結合は、ハイブリッド形成（即ち、ポリヌクレオチド間）、タンパク質結合（即ち、結合することができるタンパク質間、またはタンパク質とアプタマーとの間）及び／または疎水性相互作用（即ち、脂質と十分に疎水性であるドメインを含む他の薬剤との間）を含むことも理解されることになる。
【０１０４】
本開示が企図する追加の薬剤としては、ポリヌクレオチド、ペプチド、検出可能なマーカー、リン脂質、オリゴ糖、金属複合体、小分子、造影剤、タンパク質（例えば、治療薬）、抗生物質、標的部分、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。これらの追加の薬剤を本明細書で考察する。
【０１０５】
治療薬
本明細書に使用される、「治療薬」、「薬物」、または「活性剤」は、治療目的または診断目的に有用な任意の化合物を意味する。本明細書に使用される用語は、状態の治療のために患者に投与される任意の化合物を意味するように理解される。以下で企図される治療薬のいずれもタンパク質である限り、これらのタンパク質はまた、コアシェルナノ粒子の「単一タンパク質」としての使用が企図される。
【０１０６】
本開示は、送達が所望されるいずれの治療薬にも適用可能である。かかる活性剤及び疎水性薬物の非限定的な例は、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，６１１，７２８号に見い出される。使用のために企図されている追加の治療薬は、全体が参照により本明細書に組み込まれる第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／５５０１８号に見い出される。
【０１０７】
コアシェルナノ粒子が多数の治療薬を含む本明細書に開示のコアシェルナノ粒子及び方法が、種々の実施形態において提供される。一態様において、多数の治療薬がシェル内の１つ以上のポリヌクレオチドとの結合を介して１つのコアシェルナノ粒子に特異的に結合する、組成物及び方法が提供される。別の態様において、これらの多数の治療薬は、１つ超のコアシェルナノ粒子に特異的に結合する。
【０１０８】
治療薬としては、親水性化合物及び疎水性化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０９】
タンパク質治療薬としては、異常な発現が１つ以上の障害をもたらす、ペプチド、酵素、構造タンパク質、受容体、及び他の細胞内または血中タンパク質、ならびにその断片及び誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。また治療薬としては、１つの特定の実施形態として、化学療法剤が挙げられる。また治療薬としては、種々の実施形態において、放射性物質が挙げられる。
【０１１０】
種々の態様において、タンパク質治療薬としては、サイトカインまたは造血因子が挙げられ、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン−アルファ（ＩＦＮ−アルファ）、コンセンサスインターフェロン、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、アンジオポイエチン、例えば、Ａｎｇ−１、Ａｎｇ−２、Ａｎｇ−４、Ａｎｇ−Ｙ、ヒトアンジオポイエチン様ポリペプチド、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンギオジェニン、骨形態形成タンパク質−１、骨形態形成タンパク質−２、骨形態形成タンパク質−３、骨形態形成タンパク質−４、骨形態形成タンパク質−５、骨形態形成タンパク質−６、骨形態形成タンパク質−７、骨形態形成タンパク質−８、骨形態形成タンパク質−９、骨形態形成タンパク質−１０、骨形態形成タンパク質−１１、骨形態形成タンパク質−１２、骨形態形成タンパク質−１３、骨形態形成タンパク質−１４、骨形態形成タンパク質−１５、骨形態形成タンパク質受容体ＩＡ、骨形態形成タンパク質  受容体ＩＢ、脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、毛様体神経栄養因子受容体、サイトカイン誘導性好中球走化因子１、サイトカイン誘導性好中球、化学走化性因子２α、サイトカイン誘導性好中球走化性因子２β、β内皮細胞成長因子、エンドセリン１、上皮性増殖因子、上皮由来好中球誘引物質、線維芽細胞増殖因子４、線維芽細胞増殖因子５、線維芽細胞増殖因子６、線維芽細胞増殖因子７、線維芽細胞増殖因子８、線維芽細胞増殖因子８ｂ、線維芽細胞増殖因子８ｃ、線維芽細胞増殖因子９、線維芽細胞増殖因子１０、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、グリア細胞株由来神経栄養因子受容体α１、グリア細胞株由来神経栄養因子受容体α２、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質α、増殖関連タンパク質β、増殖関連タンパク質γ、ヘパリン結合上皮性増殖因子、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、インスリン様増殖因子Ｉ、インスリン様増殖因子受容体、インスリン様増殖因子ＩＩ、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ケラチン生成増殖因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体α、神経増殖因子、神経増殖因子受容体、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、胎盤増殖因子、胎盤増殖因子２、血小板由来内皮細胞成長因子、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子Ａ鎖、血小板由来増殖因子ＡＡ、血小板由来増殖因子ＡＢ、血小板由来増殖因子Ｂ鎖、血小板由来増殖因子ＢＢ、血小板由来増殖因子受容体α、血小板由来増殖因子受容体β、プレＢ細胞沿増殖刺激因子、幹細胞因子受容体、ＴＮＦ０、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２を含むＴＮＦ、形質転換増殖因子α、形質転換増殖因子β、形質転換増殖因子β１、形質転換増殖因子β１．２、形質転換増殖因子β２、形質転換増殖因子β３、形質転換増殖因子β５、潜在性形質転換増殖因子β１、形��転換増殖因子β結合タンパク質Ｉ、形質転換増殖因子β結合タンパク質ＩＩ、形質転換増殖因子β結合タンパク質ＩＩＩ、腫瘍壊死因子受容体Ｉ型、腫瘍壊死因子受容体ＩＩ型、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体、血管内皮増殖因子、及びキメラタンパク質、ならびにこれらの生物学的または免疫学的に活性な断片を含むが、これらに限定されない。生物剤の例としては、サイトカインなどの免役調節タンパク質、腫瘍抗原に対するモノクローナル抗体、腫瘍抑制遺伝子、及び癌ワクチンが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の組成物及び方法と併用され得るインターロイキンの例としては、インターロイキン２（ＩＬ−２）、及びインターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）が挙げられるが、これらに限定されない。サイトカイン以外の他の免疫調節剤としては、カルメットゲラン桿菌、レバミゾール、及びオクトレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１１】
本開示に記載されるように、一部の態様において、治療薬は小分子を含む。「小分子」という用語は、本明細書に使用される場合、化合物、例えば、任意に誘導体化され得るペプチド模倣薬、または天然若しくは合成のいずれかである任意の他の低分子量有機化合物を指す。かかる小分子は、治療的に送達可能な物質であってもよく、または送達を促進するように更に誘導体化されてもよい。
【０１１２】
「低分子量」によって、１０００ダルトン未満、典型的に、３００〜７００ダルトンの分子量を有する化合物が意味される。低分子量化合物は、種々の態様において、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約６５０、約７００、約７５０、約８００、約８５０、約９００、または約１０００ダルトンである。
【０１１３】
「薬物らしい分子」という用語は、当該技術分野で周知であり、医学的使用、例えば、非限定的に、医薬品中の活性剤として好適とする特徴を有する化合物の意味を含む。よって、例えば、非限定的に、薬物らしい分子は、有機化学の技法によってまたは分子生物学若しくは生化学の技法によって合成される分子であり、一部の態様においては、本明細書に定義される小分子である。薬物らしい分子は、種々の態様において、特定のタンパク質（単数または複数）と選択的に相互作用する特徴を更に呈し、生体可用性であり、かつ／あるいは、単独でまたは本開示の組成物または方法と組み合わせて、細胞膜を貫通することができる。
【０１１４】
種々の実施形態において、米国特許第７，６６７，００４号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている治療薬が、本明細書に開示の組成物及び方法における使用に対して企図され、アルキル化剤、抗生物質剤、代謝拮抗剤、ホルモン剤、植物性薬剤、及び生物剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１５】
アルキル化剤の例としては、ビスクロロエチルアミン（ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、メクロレタミン、メルファラン、ウラシルマスタード）、アジリジン（例えば、チオテパ）、アルキルアルコンスルホネート（例えば、ブスルファン）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン）、非古典型アルキル化剤（アルトレタミン、ダカルバジン、及びプロカルバジン）、白金化合物（例えば、カルボプラスチン（ｃａｒｂｏｐｌａｓｔｉｎ）、シスプラチン及び白金（ＩＶ）（Ｐｔ（ＩＶ）））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１６】
抗生物質剤の例としては、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、及びアントラセンジオン）、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ピリカトマイシン（ｐｌｉｃａｔｏｍｙｃｉｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。追加の抗生物質剤を以下で詳細に考察する。
【０１１７】
代謝拮抗剤の例としては、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロクスウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキサート、ロイコボリン、ヒドロキシウレア、チオグアニン（６−ＴＧ）、メルカプトプリン（６−ＭＰ）、シタラビン、ペントスタチン、リン酸フルダラビン、クラドリビン（２−ＣＤＡ）、アスパラギナーゼ、メシル酸イマチニブ（またはＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標））、及びゲムシタビンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１８】
ホルモン剤の例としては、合成エストロゲン（例えば、ジエチルスチベストロール（ｄｉｅｔｈｙｌｓｔｉｂｅｓｔｒｏｌ））、抗エストロゲン剤（例えば、タモキシフェン、トレミフェン、フルオキシメステロール（ｆｌｕｏｘｙｍｅｓｔｅｒｏｌ）、及びラロキシフェン）、抗アンドロゲン剤（ビカルタミド、ニルタミド、フルタミド）、アロマターゼ阻害剤（例えば、アミノグルテチミド、アナストロゾール、及びテトラゾール）、ケトコナゾール、酢酸ゴセレリン、ロイプロリド、酢酸メゲストロール、及びミフェプリストンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１９】
植物性薬剤の例としては、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビンゾリジン、及びビノレルビン）、ポドフィロトキシン（例えば、エトポシド（ＶＰ−１６）及びテニポシド（ＶＭ−２６））、カンプトテシン化合物（例えば、２０（Ｓ）カンプトテシン、トポテカン、ルビテカン、及びイリノテカン）、タキサン（例えば、パクリタキセル及びドセタキセル）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２０】
使用が企図されている化学療法剤としては、非限定的にアルキル化剤が挙げられ、ナイトロジェンマスタード、例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、及びクロラムブシル；  ニトロソウレア、例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、及びセムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）；エチレンイミン／メチルメラミン、  例えば、トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、トリエチレン、チオホスホルアミド（チオテパ）、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ、アルトレタミン）；スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン；トリアジン、例えば、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）；葉酸類似体、例えば、メトトレキサート及びトリメトレキサート、ピリミジン類似体、例えば、５−フルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ、シトラビン）、５−アザシチジン、２，２´−ジフルオロデオキシシチジン、プリン類似体、例えば、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アザチオプリン、２’−デオキシコホルマイシン（ペントスタチン）、エリスロヒドロキシノニルアデニン（ＥＨＮＡ）、リン酸フルダラビン、及び２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン、２−ＣｄＡ）を含む代謝拮抗物質薬；細胞分裂抑制薬、例えば、パクリタキセル、ビンブラスチン（ＶＬＢ）、ビンクリスチン、及びビノレルビンを含むビンカアルカロイド、タキソテール、エストラムスチン、ならびにリン酸エストラムスチンを含む天然産物；エピポドフィロトキシン、例えば、エトポシド及びテニポシド；抗生物質、例えば、アクチモマイシン（ａｃｔｉｍｏｍｙｃｉｎ）Ｄ、ダウノマイシン（ルビモマイシン）、ドキソルビシン、ミトキサントロン、イダルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、マイトマイシＣ、及びアクチノマイシン；酵素、例えば、Ｌ−アスパラギナーゼ；生体応答修飾物質、例えば、インターフェロン−アルファ、ＩＬ−２、Ｇ−ＣＳＦ、及びＧＭ−ＣＳＦ；白金配位複合体、例えば、シスプラチン、Ｐｔ（ＩＶ）、及びカルボプラチン、アントラセンジオン、例えば、ミトキサントロン、置換尿素、例えば、ヒドロキシウレア、Ｎ−メチルヒドラジン（ＭＩＨ）及びプロカルバジンを含むメチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、例えば、ミトタン（ｏ，ｐ´−ＤＤＤ）及びアミノグルテチミドを含む、様々な薬剤；副腎皮質ステロイド拮抗薬、例えば、プレドニゾン及び等価物、デキサメタゾン、ならびにアミノグルテチミドを含む、ホルモン及び拮抗薬；プロゲスチン、例えば、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、及び酢酸メゲストロール；エストロゲン、例えば、ジエチルスチルベストロール及びエチニルエストラジオール等価物；抗エストロゲン、例えば、タモキシフェン；プロピオン酸テストステロン及びフルオキシメステロン／等価物を含むアンドロゲン；抗アンドロゲン、例えば、フルタミド、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体及びロイプロリド；ならびに非ステロイド系抗アンドロゲン、例えば、フルタミドを含む。
【０１２１】
マーカー／標識
本明細書に記載される、タンパク質、ポリヌクレオチド、または追加の薬剤は、種々の態様において、任意に検出可能な標識を含む。したがって、本開示は、複合体形成が検出可能な変化によって検出される組成物及び方法を提供する。一態様において、複合体形成は、肉眼で、または分光学的に観察される色の変化を生じさせる。
【０１２２】
生体分子複合体形成から生じる検出可能な変化を可視化するための方法はまた、非限定的に、蛍光顕微鏡法、マイクロタイタープレートリーダー、または蛍光励起細胞分取器（ＦＡＣＳ）を含む、任意の蛍光検出法を含む。
【０１２３】
本開示によって企図される標識は、本明細書に記載されるフルオロフォアのいずれか、ならびに当技術分野で知られている他の検出可能な標識を含むことが理解されるであろう。例えば、標識にはまた、レドックスアクティブプローブ（ｒｅｄｏｘ  ａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｂｅ）、化学発光分子、放射性標識、色素、蛍光分子、リン光分子、以下に記載されるイメージング剤及び／または造影剤、量子ドット、ならびに分光学的手法を使用して検出され得る任意のマーカー、即ち、顕微鏡法及び細胞数測定を使用して検出可能なそれらのマーカーが挙げられるが、これらに限定されない。検出可能な標識が検出される本開示の態様において、本開示は、任意の発光、蛍光、若しくはリン光分子または粒子が、貴金属表面によって効率的に反応停止されることを提供する。したがって、分子の各型は、開示される組成物及び方法での使用が企図される。
【０１２４】
蛍光分子で生体分子を標識化し、蛍光を測定する方法は、当該技術分野で周知である。
【０１２５】
好適な蛍光分子もまた当技術分野でよく知られており、限定することなく、１，８−ＡＮＳ（１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸）、１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸（１，８−ＡＮＳ）、５−（及び−６）−カルボキシ−２’、７’−ジクロロフルオレセインｐＨ９．０、５−ＦＡＭｐＨ９．０、５−ＲＯＸ（５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、トリエチルアンモニウム塩）、５−ＲＯＸｐＨ７．０、５−ＴＡＭＲＡ、５−ＴＡＭＲＡｐＨ７．０、５−ＴＡＭＲＡ−ＭｅＯＨ、６ＪＯＥ、６，８−ジフルオロ−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリンｐＨ９．０、６−カルボキシローダミン６ＧｐＨ７．０、６−カルボキシローダミン６Ｇ、塩酸塩、６−ＨＥＸ、ＳＥｐＨ９．０、６−ＴＥＴ、ＳＥｐＨ９．０、７−アミノ−４−メチルクマリンｐＨ７．０、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリンｐＨ９．０、Ａｌｅｘａ３５０、Ａｌｅｘａ４０５、Ａｌｅｘａ４３０、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５３２、Ａｌｅｘａ５４６、Ａｌｅｘａ５５５、Ａｌｅｘａ５６８、Ａｌｅｘａ５９４、Ａｌｅｘａ６４７、Ａｌｅｘａ６６０、Ａｌｅｘａ６８０、Ａｌｅｘａ７００、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４３０抗体抱合体ｐＨ７．２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８抗体抱合体ｐＨ８．０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８ヒドラジド−水、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５３２抗体抱合体ｐＨ７．２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５抗体抱合体ｐＨ７．２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５６８抗体抱合体ｐＨ７．２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６１０Ｒ−フィコエリトリンストレプトアビジンｐＨ７．２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７抗体抱合体ｐＨ７．２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７Ｒ−フィコエリトリンストレプトアビジンｐＨ７．２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６６０抗体抱合体ｐＨ７．２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０抗体抱合体ｐＨ７．２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００抗体抱合体ｐＨ７．２、アロフィコシアニンｐＨ７．５、ＡＭＣＡ抱合体、アミノクマリン、ＡＰＣ（アロフィコシアニン）、Ａｔｔｏ６４７、ＢＣＥＣＦｐＨ５．５、ＢＣＥＣＦｐＨ９．０、ＢＦＰ（青蛍光タンパク質）、ＢＯ−ＰＲＯ−１−ＤＮＡ、ＢＯ−ＰＲＯ−３−ＤＮＡ、ＢＯＢＯ−１−ＤＮＡ、ＢＯＢＯ−３−ＤＮＡ、ボディパイ６５０／６６５−Ｘ、ＭｅＯＨ、ボディパイＦＬ抱合体、ボディパイＦＬ、ＭｅＯＨ、ボディパイＲ６ＧＳＥ、ボディパイＲ６Ｇ、ＭｅＯＨ、ボディパイＴＭＲ−Ｘ抗体抱合体ｐＨ７．２、ボディパイＴＭＲ−Ｘ抱合体、ボディパイＴＭＲ−Ｘ、ＭｅＯＨ、ボディパイＴＭＲ−Ｘ、ＳＥ、ボディパイＴＲ−ＸファラシジンｐＨ７．０、ボディパイＴＲ−Ｘ、ＭｅＯＨ、ボディパイＴＲ−Ｘ、ＳＥ、ＢＯＰＲＯ−１、ＢＯＰＲＯ−３、カルセイン、カルセインｐＨ９．０、カルシウムクリムゾン、カルシウムクリムゾンＣａ２＋、カルシウムグリーン、カルシウムグリーン−１Ｃａ２＋、カルシウムオレンジ、カルシウムオレンジＣａ２＋、カルボキシナフトフルオレセインｐＨ１０．０、カスケードブルー、カスケードブルーＢＳＡｐＨ７．０、カスケードイエロー、カスケードイエロー抗体抱合体ｐＨ８．０、ＣＦＤＡ、ＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）、ＣＩ−ＮＥＲＦｐＨ２．５、ＣＩ−ＮＥＲＦｐＨ６．０、シトリン、クマリン、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＣｙＱＵＡＮＴＧＲ−ＤＮＡ、ダンシルカダベリン、ダンシルカダベリン、ＭｅＯＨ、ＤＡＰＩ、ＤＡＰＩ−ＤＮＡ、ダポキシル（Ｄａｐｏｘｙｌ）（２−アミノエチル）スルホンアミド、ＤＤＡＯｐＨ９．０、Ｄｉ−８ＡＮＥＰＰＳ、Ｄｉ−８−ＡＮＥＰＰＳ−脂質、ＤｉＩ、ＤｉＯ、ＤＭ−ＮＥＲＦｐＨ４．０、ＤＭ−ＮＥＲＦｐＨ７．０、Ｄｓレッド、ＤＴＡＦ、ｄＴｏｍａｔｏ、ｅＣＦＰ（高感度シアン蛍光タンパク質）、ｅＧＦＰ（高感度緑蛍光タンパク質）、エオシン、エオシン抗体抱合体ｐＨ８．０、エリスロシン−５−イソチオシアン酸塩ｐＨ９．０、エチジウム臭化物、エチジウムホモ二量体、エチジウムホモ二量体−１−ＤＮＡ、ｅＹＦＰ（高感度黄色蛍光タンパク質）、ＦＤＡ、ＦＩＴＣ、ＦＩＴＣ抗体抱合体ｐＨ８．０、ＦｌＡｓＨ、Ｆｌｕｏ−３、Ｆｌｕｏ−３Ｃａ２＋、Ｆｌｕｏ−４、フルオロ（Ｆｌｕｏｒ）−ルビー、フルオレセイン、フルオレセイン０．１Ｍ  ＮａＯＨ、フルオレセイン抗体抱合体ｐＨ８．０、フルオレセインデキストランｐＨ８．０、フルオレセインｐＨ９．０、フルオロ−エメラルド、ＦＭ１−４３、ＦＭ１−４３脂質、ＦＭ４−６４、ＦＭ４−６４、２％ＣＨＡＰＳ、ＦｕｒａレッドＣａ２＋、Ｆｕｒａレッド、高Ｃａ、Ｆｕｒａレッド、低Ｃａ、Ｆｕｒａ−２Ｃａ２＋、Ｆｕｒａ−２、高Ｃａ、Ｆｕｒａ−２、Ｃａなし、ＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）、Ｈｃレッド、ヘキスト３３２５８、ヘキスト３３２５８−ＤＮＡ、ヘキスト３３３４２、Ｉｎｄｏ−１Ｃａ２＋、Ｉｎｄｏ−１、Ｃａを含まない、Ｉｎｄｏ−１、Ｃａ飽和、ＪＣ−１、ＪＣ−１ｐＨ８．２、リサミンローダミン、ＬＯＬＯ−１−ＤＮＡ、ルシファーイエロー、ＣＨ、ライソセンサー（ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ）ブルー、ライソセンサーブルーｐＨ５．０、ライソセンサーグリーン、ライソセンサーグリーンｐＨ５．０、ライソセンサーイエローｐＨ３．０、ライソセンサーイエローｐＨ９．０、ライソトラッカー（ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ）ブルー、ライソトラッカーグリーン、ライソトラッカーレッド、マグネシウムグリーン、マグネシウムグリーンＭｇ２＋、マグネシウムオレンジ、マリーナブルー、ｍＢａｎａｎａ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＨｏｎｅｙｄｅｗ、ミトトラッカー（ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ）グリーン、ミトトラッカーグリーンＦＭ、ＭｅＯＨ、ミトトラッカーオレンジ、ミトトラッカーオレンジ、ＭｅＯＨ、ミトトラッカーレッド、ミトトラッカーレッド、ＭｅＯＨ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＰｌｕｍ、ｍＲＦＰ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ＮＢＤ−Ｘ、ＮＢＤ−Ｘ、ＭｅＯＨ、ＮｅｕｒｏＴｒａｃｅ５００／５２５、緑蛍光ニッスル染色−ＲＮＡ、ナイルブルー、ＥｔＯＨ、ナイルレッド、ナイルレッド−脂質、ニッスル、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン４８８抗体抱合体ｐＨ８．０、オレゴングリーン５１４、オレゴングリーン５１４抗体抱合体ｐＨ８．０、パシフィックブルー、パシフィックブルー抗体抱合体ｐＨ８．０、フィコエリトリン、ピコグリーンｄｓＤＮＡ定量化試薬、ＰＯ−ＰＲＯ−１、ＰＯ−ＰＲＯ−１−ＤＮＡ、ＰＯ−ＰＲＯ−３、ＰＯ−ＰＲ���−３−ＤＮＡ、ＰＯＰＯ−１、ＰＯＰＯ−１−ＤＮＡ、ＰＯＰＯ−３、ヨウ化プロピジウム、ヨウ化プロピジウム−ＤＮＡ、Ｒ−フィコエリトリンｐＨ７．５、ＲｅＡｓＨ、レゾルフィン、レゾルフィンｐＨ９．０、Ｒｈｏｄ−２、Ｒｈｏｄ−２Ｃａ２＋、ローダミン、ローダミン１１０、ローダミン１１０ｐＨ７．０、ローダミン１２３、ＭｅＯＨ、ローダミングリーン、ローダミンファロイジンｐＨ７．０、ローダミンレッド−Ｘ抗体抱合体ｐＨ８．０、ローダミネン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅｎ）グリーンｐＨ７．０、Ｒｈｏｄｏｌグリーン抗体抱合体ｐＨ８．０、サファイア、ＳＢＦＩ−Ｎａ＋、ナトリウムグリーンＮａ＋、スルホローダミン１０１、ＥｔＯＨ、ＳＹＢＲグリーンＩ、ＳＹＰＲＯルビー、ＳＹＴＯ１３−ＤＮＡ、ＳＹＴＯ４５−ＤＮＡ、ＳＹＴＯＸブルー−ＤＮＡ、テトラメチルローダミン抗体抱合体ｐＨ８．０、テトラメチルローダミンデキストランｐＨ７．０、テキサスレッド−Ｘ抗体抱合体ｐＨ７．２、ＴＯ−ＰＲＯ−１−ＤＮＡ、ＴＯ−ＰＲＯ−３−ＤＮＡ、ＴＯＴＯ−１−ＤＮＡ、ＴＯＴＯ−３−ＤＮＡ、ＴＲＩＴＣ、Ｘ−Ｒｈｏｄ−１Ｃａ２＋、ＹＯ−ＰＲＯ−１−ＤＮＡ、ＹＯ−ＰＲＯ−３−ＤＮＡ、ＹＯＹＯ−１−ＤＮＡ、ならびにＹＯＹＯ−３−ＤＮＡを含む。
【０１２６】
一部の態様において蛍光タンパク質が使用されることも本開示によって企図される。当該技術分野で既知のいずれのタンパク質も本開示の方法において有用であり、一部の態様において、これは蛍光タンパク質であり、ＥＧＦＰ、ＥＣＦＰ、及びＥＹＦＰを含むが、これらに限定されない。
【０１２７】
造影剤
種々の態様において、コアシェルナノ粒子を含む方法及び組成物が本明細書で開示され、ここでポリヌクレオチドは、抱合部位を介して造影剤に抱合される。更なる態様において、、造影剤は、本明細書に記載のタンパク質または追加の薬剤に抱合される。本明細書で使用される、「造影剤」は、様々な器官及び組織の見かけ密度の差を生成させ、描かれた隣接する体組織及び器官の観察をより容易にするために、細胞に導入される化合物または他の物質である。
【０１２８】
一部の実施形態において、造影剤は、ガドリニウム、キセノン、酸化鉄、マンガンキレート（Ｍｎ−ＤＰＤＰ）、及び銅から成る群から選択される。よって、一部の実施形態において、造影剤は常磁性化合物であり、一部の態様において、常磁性化合物はガドリニウムである。
【０１２９】
ある特定の実施形態において、造影剤は、１１Ｃ、１３Ｎ、１８Ｆ、６４Ｃｕ、６８Ｇｅ、９９ｍＴｃ、及び８２Ｒｕから成る群から選択される標識を含む陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）造影剤を含む。特定の実施形態において、造影剤は、［１１Ｃ］コリン、［１１Ｃ］フルオロデオキシグルコース（ＦＤＧ）、［１１Ｃ］メチオニン、［１１Ｃ］コリン、［１１Ｃ］アセテート、［１８Ｆ］フルオロコリン、６４Ｃｕキレート、９９ｍＴｃキレート、及び［１８Ｆ］ポリエチレングリコールスチルベンから成る群から選択されるＰＥＴ造影剤である。
【０１３０】
本開示はまた、ＰＥＴ造影剤がポリヌクレオチド合成プロセス中にポリヌクレオチド内に導入されるか、あるいはポリヌクレオチド合成後にヌクレオチドに抱合される方法を提供する。例えば、限定することなく、リン原子のうちの１つが３２Ｐまたは３３Ｐと置換される、リン酸基中の酸素原子のうちの１つが３５Ｓと置換される、または水素原子のうちの１つ以上が３Ｈと置換されるヌクレオチドが合成され得る。放射性核種を含有する官能基はまた、抱合部位を介してヌクレオチドに抱合され得る。
【０１３１】
ＭＲＩ造影剤には、ポジティブ造影剤及び／またはネガティブ造影剤が挙げられるが、これらに限定されない。ポジティブ造影剤は、Ｔ１緩和時間の減少（Ｔ１加重画像に対するシグナル強度の増加）を引き起こす。それら（ＭＲＩ上で明るく見えるもの）は、典型的に、活性元素としてガドリニウム、マンガン、または鉄を含有する小分子量化合物である。特殊な群のネガティブ造影剤（ＭＲＩ上で暗く見えるもの）には、パーフルオロカーボン（パーフルオロ化学薬品）が挙げられ、これは、その存在がＭＲイメージングにおいてシグナルに関与する水素原子を排除するためである。
【０１３２】
本開示の組成物は、種々の態様において、約５０〜約２．５×１０６の造影剤を含むコアシェルナノ粒子を含むように企図される。一部の実施形態において、コアシェルナノ粒子は約５００〜約１×１０６の造影剤を含む。
【０１３３】
標的化部分
「標的化部分」という用語は、本明細書で使用される場合、特定の標的、標的領域への結合、あるいはそこへの限局化、標的細胞（複数可）への進入、または標的受容体への結合において、化合物または他の分子を支援する任意の分子構造を指す。例えば、非限定的に、標的化部分はタンパク質を含んでもよく、所望の標的部位に生体内または生体外で結合することができる抗体及びタンパク質断片、ペプチド、小分子、抗癌剤、ポリヌクレオチド結合剤、炭水化物、細胞表面受容体のためのリガンド、アプタマー、脂質（カチオン性、中性、及びステロイド性脂質、ビロソーム、及びリポソームを含む）、抗体、レクチン、リガンド、糖、ステロイド、ホルモン、及び栄養素が挙げられ、標的化部分として機能し得る。標的化部分は、コアシェルナノ粒子の特異細胞型及び／または器官、ならびに細胞内位置への送達に有用である。
【０１３４】
一部の実施形態において、標的化部分はタンパク質である。本開示の組成物のタンパク質部分は、一部の態様において、コアシェルナノ粒子を標的細胞に標的化することができるタンパク質である。本開示の標的化タンパク質は、受容体、基質、抗原決定基、または標的細胞上の他の結合部位若しくは他の標的部位に結合することができる。
【０１３５】
標的化タンパク質として有用な抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。特異型の細胞に結合する多くのモノクローナル抗体（ＭＡｂ）が開発されている。遺伝子工学またはタンパク質工学によって派生した抗体も、同様に使用され得る。
【０１３６】
本開示において標的化薬剤として使用される抗体は、無傷分子、その断片、またはその機能等価物であり得る。本開示の組成物において有用な抗体断片の例は、これらは従来の方法によって、または遺伝子若しくはタンパク質工学によって生成され得るＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’Ｆａｂ、及びＦｖ断片である。
【０１３７】
一部の実施形態において、コアシェルナノ粒子のポリヌクレオチド部分は、追加のまたは補助的な標的化部分として機能し得る。ポリヌクレオチド部分は、細胞外標的化を支援するように、または細胞内の標的化部分として機能するように選択または設計され得る。つまり、ポリヌクレオチド部分は、標的細胞を探し求めるＤＮＡプローブとして機能し得る。一部の実施形態において、この追加の標的化能力は、組成物の標的細胞への送達における特異性を改善するのに役立つであろう。ポリヌクレオチドは、更にまたは代替的に、標的細胞内の組成物を標的とするように選択または設計され得るが、一方、標的化タンパク質は、抱合体を細胞外で標的とする。
【０１３８】
標的化部分は、種々の実施形態において、コアシェルナノ粒子と結合され得ることが企図される。したがって、一部の態様において、標的化部分は、コアシェル粒子のタンパク質、コアシェルナノ粒子のポリヌクレオチド、またはその両方のいずれかに結合されることが企図される。
【０１３９】
リン脂質
本開示は、リン脂質を含むコアシェルナノ粒子も企図する。リン脂質生体分子は、ある特定の態様において、任意のスペーサー構成要素を含む。
【０１４０】
本開示は、脂質及びリン脂質由来のホルモンを企図し、これらの化合物は、リノール酸及びアラキドン酸などの脂質ならびにリン脂質に由来する。主なクラスは、コレステロール及びエイコサノイドに由来するステロイドホルモンである。
【０１４１】
金属複合体
本明細書に使用される、「金属複合体」は、金属を指し、本明細書に記載の白金化合物、ゲルマニウム（ＩＶ）、チタニウム（ＩＶ）、スズ（ＩＶ）、ルテニウム（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、及び銅（ＩＩ）が挙げられるが、これらに限定されない。金属複合体は、任意に、本明細書に記載のスペーサーを含む。
【０１４２】
オリゴ糖
オリゴ糖は、約２〜約１０個の単糖、またはそれ以上のアルファ若しくはベータグリコシド結合のいずれかによって接続している単糖を含むいずれかの炭水化物も含む。オリゴ糖は、遊離形態及び結合形態の両方で自然に広く見られる。オリゴ糖は、任意に、本明細書で上に記載したスペーサーを含む。
【０１４３】
無機ナノ粒子
本開示は、金属ナノ粒子を含む組成物を企図する。よって、米国特許出願第２００３０１４７９６６号に記載されているように、金属、半導体物質、またはセラミックが挙げられるがこれらに限定されない、種々の無機物質を含む、ナノ粒子が企図される。例えば、金属ベースのナノ粒子としては、本明細書に記載のナノ粒子が挙げられる。セラミックナノ粒子物質としては、ブラッシュ石、リン酸三カルシウム、アルミナ、シリカ、及びジルコニアが挙げられるが、これらに限定されない。ナノ粒子が産出される有機物質としては、炭素が挙げられる。ナノ粒子重合体としては、ポリスチレン、シリコーンゴム、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリエーテル、及びポリエチレンが挙げられる。ナノ粒子の産出に使用するための生分解性の生重合体（例えば、ＢＳＡなどポリペプチド、多糖等）、他の生体物質（例えば、炭水化物）、及び／または重合化合物も企図される。
【０１４４】
一部の実施形態において、ナノ粒子は金属性であり、種々の態様において、ナノ粒子はコロイド性金属である。よって、種々の実施形態において、本方法の実施において有用なナノ粒子は、金属（例えば、金、銀、白金、アルミニウム、パラジウム、銅、コバルト、鉄、インジウム、ニッケル、またはナノ粒子形成に適した任意の他の金属が挙げられるが、これらに限定されない）、半導体（例えば、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、及びＣｄＳまたはＺｎＳでコーティングされるＣｄＳｅが挙げられる、これらに限定されない）、及び磁性（例えば、強磁性）コロイド性物質が挙げられる。本発明の実施において有用な他のナノ粒子としては、ＺｎＳ、ＺｎＯ、Ｔｉ、ＴｉＯ２、Ｓｎ、ＳｎＯ２、Ｓｉ、ＳｉＯ２、Ｆｅ、Ｆｅ＋４、Ｆｅ３Ｏ４、Ｆｅ２Ｏ３、Ａｇ、Ｃｕ、Ｎｉ、Ａｌ、鋼、コバルト−クロム合金、Ｃｄ、チタン合金、ＡｇＩ、ＡｇＢｒ、ＨｇＩ２、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ、Ｉｎ２Ｓ３、Ｉｎ２Ｓｅ３、Ｃｄ３Ｐ２、Ｃｄ３Ａｓ２、ＩｎＡｓ、及びＧａＡｓが挙げられるが、同様にこれに限定されない。ＺｎＳ、ＺｎＯ、ＴｉＯ２、ＡｇＩ、ＡｇＢｒ、ＨｇＩ２、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ、Ｉｎ２Ｓ３、Ｉｎ２Ｓｅ３、Ｃｄ３Ｐ２、Ｃｄ３Ａｓ２、ＩｎＡｓ、及びＧａＡｓナノ粒子を作製する方法は、当該技術分野でも既知である。例えば、Ｗｅｌｌｅｒ，Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．，３２，４１（１９９３）、Ｈｅｎｇｌｅｉｎ，Ｔｏｐ．  Ｃｕｒｒ．  Ｃｈｅｍ．，１４３，１１３（１９８８）、Ｈｅｎｇｌｅｉｎ，Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．，８９，１８６１（１９８９）、Ｂｒｕｓ，Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓ．  Ａ．，５３，４６５（１９９１）、Ｂａｈｎｃｍａｎｎ，ｉｎ  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔｏｒａｇｅ  ｏｆ  Ｓｏｌａｒ  Ｅｎｅｒｇｙ（ｅｄｓ．  Ｐｅｌｉｚｅｔｔｉ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉａｖｅｌｌｏ  １９９１），ｐａｇｅ  ２５１、Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｈｅｒｒｏｎ，Ｊ．Ｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．，９５，５２５（１９９１）、Ｏｌｓｈａｖｓｋｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１２，９４３８（１９９０）、Ｕｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．，９５，５３８２（１９９２）を参照されたい。
【０１４５】
金属、半導体、及び磁性ナノ粒子を作製する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｓｃｈｍｉｄ，Ｇ．（ｅｄ．）Ｃｌｕｓｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｏｉｄｓ（ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，１９９４）、Ｈａｙａｔ，Ｍ．Ａ．（ｅｄ．）Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｇｏｌｄ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９１）、Ｍａｓｓａｒｔ，Ｒ．，ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  Ｏｎ  Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ，１７，１２４７（１９８１）、Ａｈｍａｄｉ，Ｔ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２，１９２４（１９９６）、Ｈｅｎｇｌｅｉｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．，９９，１４１２９（１９９５）、Ｃｕｒｔｉｓ，Ａ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．，２７，１５３０（１９８８）を参照されたい。調製されるポリアルキルシアノアクリレートナノ粒子の調製は、Ｆａｔｔａｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ（１９９８）５３：１３７−１４３、及び米国特許第４，４８９，０５５号に記載されている。ポリ（Ｄ−グルカルアミドアミン（ｇｌｕｃａｒａｍｉｄｏａｍｉｎｅ））を含むナノ粒子を作製するための方法は、Ｌｉｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００４）１２６：７４２２−７４２３に記載されている。重合メチルメタクリレート（ＭＭＡ）を含むナノ粒子の調製は、Ｔｏｎｄｅｌｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  （１９９８）２６：５４２５−５４３１に記載され、デンドリマーナノ粒子の調製は、例えば、Ｋｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ（１９９６）９３：４８９７−４９０２（星形ポリアミドアミンデンドリマー）に記載されている。
【０１４６】
米国特許出願第２００３０１４７９６６号に記載されているように、本明細書に記載の物質を含むナノ粒子は、例えば、Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ，Ｉｎｃ．  （金）、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（金）、及びＮａｎｏｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．  （金）から市販されており、あるいは本ナノ粒子は、溶液中の進行性核形成から（例えば、コロイド反応により）、またはスパッタ蒸着法等の種々の物理及び化学蒸着プロセスにより、産出され得る。例えば、ＨａＶａｓｈｉ，（１９８７）Ｖａｃ．  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｊｕｌｙ／Ａｕｇｕｓｔ  １９８７，Ａ５（４）：１３７５−８４、Ｈａｙａｓｈｉ，（１９８７）Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｔｏｄａｙ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １９８７，ｐｐ．  ４４−６０、ＭＲＳ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，Ｊａｎｕａｒｙ  １９９０，ｐｇｓ．  １６−４７を参照されたい。
【０１４７】
米国特許出願第２００３０１４７９６６号に更に記載されているように、企図されるナノ粒子は、当該技術分野で既知の方法を使用して、ＨＡｕＣｌ４及びクエン酸還元剤を使用して産出される。例えば、Ｍａｒｉｎａｋｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ａｄｖ．  Ｍａｔｅｒ．  １１：３４−３７、Ｍａｒｉｎａｋｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｃｈｅｍ．  Ｍａｔｅｒ．  １０：１２１４−１９、Ｅｎｕｓｔｕｎ＆Ｔｕｒｋｅｖｉｃｈ，（１９６３）Ｊ．Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：３３１７を参照されたい。分散凝集粒径が約１４０ｎｍの酸化錫ナノ粒子は、日本の千葉県のＶａｃｕｕｍ  Ｍｅｔａｌｌｕｒｇｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から市販されている。種々の組成及びサイズ展開の他の市販のナノ粒子は、例えば、カリフォルニア州バーリンゲームのＶｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能である。
【０１４８】
種々の態様において、提供される組成物及び方法は、大きさが、平均直径約１ｎｍ〜約２５０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約２４０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約２３０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約２２０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約２１０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約２００ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約１９０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約１８０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約１７０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約１６０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約１５０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約１４０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約１３０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約１２０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約１１０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約９０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約８０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約７０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約６０ｎｍ、約１ｎｍ〜約５０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約４０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約３０ｎｍ、または平均直径約１ｎｍ〜約２０ｎｍ、平均直径約１ｎｍ〜約１０ｎｍの範囲であるナノ粒子を利用するものを含む。他の態様において、ナノ粒子の大きさは、約５ｎｍ〜約１５０ｎｍ（平均直径）、約５〜約５０ｎｍ、約１０〜約３０ｎｍである。ナノ粒子の大きさは、約５ｎｍ〜約１５０ｎｍ（平均直径）、約３０〜約１００ｎｍ、約４０〜約８０ｎｍである。本方法に使用されるナノ粒子の大きさは、それらの特定の使用または用途に応じて変動する。大きさの変動は、ナノ粒子のある特定の物理的特徴、例えば、本明細書に記載されるように誘導体化することができる、光学特性または表面積の量を最適化するように有利に使用される。
【０１４９】
コアシェルナノ粒子合成
ポリヌクレオチドは、アルキン部分、例えば、タンパク質表面のアジドとの反応のためのＤＢＣＯ型部分によって末端にて修飾され得、
【化４】
0006797108.tif 000005
式中、Ｌは、ポリヌクレオチドの末端へのリンカーである。Ｌ２は、Ｃ１−１０アルキレン、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−１０アルキレン−Ｙ−、及び−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−１０アルキレン−Ｙ−Ｃ１−１０アルキレン−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−Ｙ−であることができ、式中、Ｙは、独立して、結合、Ｃ（Ｏ）、Ｏ、ＮＨ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、及びＮＨＣ（Ｏ）から成る群から選択され、ｍは、０、１、２、３、４、または５である。例えば、ＤＢＣＯ官能基は、構造
【化５】
0006797108.tif 000006
を有するリンカーを介して結合し、末端「Ｏ」は、ポリヌクレオチド上の末端ヌクレオチドに由来する。このＤＢＣＯ型部分の使用により、表面アミンが修飾される場合、ポリヌクレオチド及びタンパク質間の構造
【化６】
0006797108.tif 000007
及び
【化７】
0006797108.tif 000008
がもたらされ、式中、Ｌ及びＬ２は、各々独立して、Ｃ１−１０アルキレン、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−１０アルキレン−Ｙ−、及び−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−１０アルキレン−Ｙ−Ｃ１−１０アルキレン−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−Ｙ−から選択され、各Ｙは、独立して、結合、Ｃ（Ｏ）、Ｏ、ＮＨ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、及びＮＨＣ（Ｏ）から成る群から選択され、ｍは、０、１、２、３、４、または５であり、ＰＮは、ポリヌクレオチドである。タンパク質の表面チオールまたは表面カルボキシレートが修飾される同様の構造を同様の様式で作製して、同等の結合構造をもたらすことができる。
【０１５０】
タンパク質は、表面官能基（例えば、表面アミン、表面カルボキシレート、表面チオール）にて、アジド  官能基で終結するリンカーを用いて修飾することができる：タンパク質−Ｘ−Ｌ−Ｎ３、Ｘは、タンパク質上の表面アミノ基（例えば、−ＮＨ−）、カルボン酸基（例えば、−Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）Ｏ−）、またはチオール基（例えば、−Ｓ−）に由来し；Ｌは、Ｃ１−１０アルキレン、−Ｙ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−１０アルキレン−Ｙ−、及び−Ｙ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−１０アルキレン−Ｙ−Ｃ１−１０アルキレン−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−Ｙ−から選択され；各Ｙは、独立して、結合、Ｃ（Ｏ）、Ｏ、ＮＨ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、及びＮＨＣ（Ｏ）から成る群から選択され；ｍは、０、１、２、３、４、または５である。「Ｌ−Ｎ３」官能基のタンパク質の表面部分への導入は、周知の技法を使用して達成することができる。例えば、タンパク質の表面アミンを、末端Ｎ３を有するリンカーの活性エステルと反応させて、タンパク質のアミンとリンカー試薬の活性エステルのカルボキシレートとの間のアミド結合を形成することができる。
【０１５１】
ポリヌクレオチドの末端にてアルキン官能基を含むようにポリヌクレオチドを修飾することができる：ポリヌクレオチド−Ｌ２−Ｘ−≡−Ｒ；Ｌ２は、Ｃ１−１０アルキレン、
−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−１０アルキレン−Ｙ−、及び−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−１０アルキレン−Ｙ−Ｃ１−１０アルキレン−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−Ｙ−から選択され；各Ｙは、独立して、結合、Ｃ（Ｏ）、Ｏ、ＮＨ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、及びＮＨＣ（Ｏ）から成る群から選択され；ｍは、０、１、２、３、４、または５であり；Ｘは、結合であり、Ｒは、ＨまたはＣ１−１０アルキルであり；あるいはＸ及びＲは、それらが結合する炭素と一緒になって、８〜１０員の炭素環式基または８〜１０員の複素環式基を形成する。一部の場合には、ポリヌクレオチドは、構造
【化８】
0006797108.tif 000009
を有する。
【０１５２】
表面修飾アジドを持つタンパク質、及び末端がアルキンを含むように修飾されたポリヌクレオチドを、銅（ＩＩ）塩、及び銅（Ｉ）塩をインサイツで生成するための還元剤の存在下で共に反応させて、トリアゾール環を形成することができる。一部の場合には、銅（Ｉ）塩は、直接添加される。企図される還元剤としては、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩、水素化ホウ素ナトリウム、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ヒドラジン、水素化アルミニウムリチウム、水素化ジイソブチルアルミニウム、シュウ酸、リンドラー触媒、亜硫酸塩化合物、第一スズ化合物、第一鉄化合物、ナトリウムアマルガム、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、ヒドロキノン、及びこれらの混合物が挙げられる。
【０１５３】
タンパク質の表面官能基は、他の結合化学を使用してポリヌクレオチドに結合させることができる。例えば、表面アミンをポリヌクレオチドの末端にてカルボキシレートまたは活性エステルに抱合させて、アミド結合を形成させることができる。表面カルボキシレートをポリヌクレオチドの末端上でアミンに抱合させて、アミド結合を形成することができる。代替的に、表面カルボキシレートを、ジアミンと反応させて、表面カルボキシレートにてアミド結合を、他の末端にてアミンを形成し得る。その後、この末端アミンを、タンパク質の表面アミンのための様式と同様の様式で修飾することができる。表面チオールをポリヌクレオチド上のチオール部分と抱合させて、ジスルフィド結合を形成することができる。代替的に、チオールをポリヌクレオチドの末端上の活性エステルと抱合させて、チオカルボキシレートを形成し得る。
【０１５４】
薬学的組成物
本明細書に記載の組成物のいずれも、所望の治療効果を達成するために治療上有効量で哺乳動物に投与し得ることが理解される。
【０１５５】
本明細書に使用される、「治療上有効量」という用語は、識別された疾病または病状を治療する、軽減する、若しくは防止する、または認識できる治療効果、予防効果、若しくは阻害作用を示すのに十分な組成物の量を指す。効果は、例えば、臨床状態の改善、症状の低減、または本明細書に記載されるアッセイにより認めることができる。対象に対する正確な有効量は、対象の体重、体の大きさ、及び一般の健康状態、病状の性質及び程度、ならびに投与に選択される組成物または組成物の組み合わせに依存することになる。所与の状態の治療上有効量は、臨床医の技能及び判断の内である日常の実験により決定することができる。本明細書に記載される組成物は、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とともに、薬学的組成物に製剤化されてもよい。化合物または組成物は、疾患、障害、または感染の治療を可能にする任意の経路により投与することができる。好ましい投与経路は経口投与である。
【０１５６】
複数のコアシェル粒子の組成物
更に、複数のコアシェル粒子を含む組成物を本明細書に開示する。一部の場合には、１つのコアシェル粒子の少なくとも１つのポリヌクレオチド及び第２のコアシェル粒子の少なくとも１つのポリヌクレオチドは、ハイブリッド形成して超格子構造を形成するのに十分に相補的である。種々の場合には、１つのコアシェル粒子のコアのタンパク質は、第２のコアシェル粒子のコアのタンパク質とは異なる。他の場合には、複数のコアシェル粒子全てのコアのタンパク質は同じである。
【０１５７】
種々の場合には、本組成物のコアシェル粒子は、非共有的に相互作用して（例えば、シェルの相補的ポリヌクレオチドのハイブリッド形成によって）、または共有的に相互作用して（例えば、ポリヌクレオチドの相溶性である反応性の機能性部分間の直接結合の形成によって）、超格子構造を形成することができる。他の場合には、複数のコアシェルナノ粒子は、共有的にも非共有的にも相互作用しないが、単に同じ組成物内である。
【０１５８】
種々の場合において、１つのコアシェル粒子は、化学反応のための酵素を含むことができ、第２のコアシェル粒子は、第２の化学反応のための第２の酵素を含むことができる。更なる場合には、１つ以上の追加のコアシェル粒子は、第１及び／または第２のコアシェル粒子中に存在する酵素と同じかまたは異なる更なる酵素（複数可）を含む。
【０１５９】
使用方法
標的ポリヌクレオチドを検出する方法
本開示は、標的分子（例えば、標的ポリヌクレオチド）を検出する方法を提供し、本方法は、標的分子を本明細書に記載のコアシェルナノ粒子と接触させることを含む。この接触により、種々の態様において、本開示が提供する遺伝子発現の調節ができるようになる。別の態様において、この接触により検出可能な変化がもたらされ、ここでは、この検出可能な変化は標的分子の検出を示す。検出可能な標識の検出は、本明細書に記載の方法のいずれかによって行われ、この検出可能な標識は、コアシェルナノ粒子の一部である分子上であるか、または標的分子上にあることができる。
【０１６０】
種々の態様において、本方法は、標的ポリヌクレオチドに１００％相補的、即ち、完全一致であるポリヌクレオチドの使用を含むが、他の態様においては、ポリヌクレオチドは、標的遺伝子産物の所望の阻害を達成することができる程度に、ポリヌクレオチドの長さにわたって少なくとも（つまり、それ以上）約９５％ポリヌクレオチドに相補的であり、ポリヌクレオチドの長さにわたって少なくとも約９０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７５％、少なくとも約７０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６０％、少なくとも約５５％、少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、少なくとも約２０％ポリヌクレオチドに相補的である。
【０１６１】
一部の実施形態において、本開示のコアシェルナノ粒子は、ナノフレア技術において有用である。ナノフレアは、生細胞内部の標的分子レベルの蛍光検出のためのポリヌクレオチド機能化ナノ粒子との関連において既に説明されている［全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００８／０９８２４８号に記載されている］。本系において、「フレア」は、検出可能に標識され、入ってくる標的ポリヌクレオチドによってコアシェルナノ粒子から移動または放出される。よって、ナノフレア技術は、本明細書に記載のコアシェルナノ粒子との関連において有用であることが企図される。
【０１６２】
標的分子
本開示は、本明細書に記載の組成物のいずれかを使用して標的分子を検出し得ることを企図する。種々の態様において、標的分子は、ポリヌクレオチドであり、このポリヌクレオチドは、真核性、原核性、またはウイルス性のいずれかである。標的分子は、同様に当該技術分野で既知であるように、細胞、組織試料、または体液中にあり得る。
【０１６３】
ポリヌクレオチドが少量で存在する場合、ポリヌクレオチドを、当該技術分野で既知の方法によって増幅してもよい。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．１９８９）、及びＢ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  １（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９５）を参照されたい。概して、非限定的に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を行うことで、標的核酸の濃度を、その検出をより容易にし得る程度まで増加させることができる。
【０１６４】
種々の実施形態において、提供される方法は、標的ポリヌクレオチドが遺伝子産物をコードしているｍＲＮＡであり、遺伝子産物の翻訳が阻害されるか、あるいは標的ポリヌクレオチドが遺伝子産物をコードしている遺伝子中のＤＮＡであり、遺伝子産物の転写が阻害される方法を含む。標的ポリヌクレオチドがＤＮＡである方法において、ポリヌクレオチドは、ある特定の態様では、阻害される遺伝子産物をコードするＤＮＡである。他の方法において、ＤＮＡは、遺伝子産物に対するコード領域に相補的である。また他の態様において、ＤＮＡは、遺伝子産物の発現に必要な調製要素をコードする。「調節要素」としては、エンハンサー、プロモーター、サイレンサー、ポリアデニル化シグナル、調節タンパク質結合要素、調節イントロン、及び／またはリボソーム進入部位が挙げられるが、これらに限定されない。また別の態様において、標的ポリヌクレオチドは、内因性の複製に求められる配列である。更なる実施形態において、標的分子はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。
【０１６５】
遺伝子発現を阻害する方法
本開示によって提供される更なる方法は、標的ポリヌクレオチドから発現される遺伝子産物の発現を阻害する方法を含み、遺伝子産物の発現を阻害するために十分である、標的ポリヌクレオチドを本明細書に記載されるコアシェルナノ粒子または組成物に接触することを含む。遺伝子産物の阻害は、本開示のコアシェルナノ粒子または組成物と標的ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって生じる。
【０１６６】
コアシェルナノ粒子の一部であるポリヌクレオチドの配列は、標的ポリヌクレオチドと特異的にハイブリッド形成するために、その標的ポリヌクレオチドのものに１００％相補的である必要がないことが当技術分野において理解される。その上、コアシェルナノ粒子の一部であるポリヌクレオチドは、１つ以上のセグメントにわたって標的ポリヌクレオチドとハイブリッド形成することができ、介在性のまたは隣接するセグメントはハイブリダイゼーション事象（例えば、限定することなく、ループ構造またはヘアピン構造）に関与しない。パーセント相補性は、コアシェルナノ粒子の一部であるポリヌクレオチドの長さにわたって判定される。例えば、ポリヌクレオチドの２０ヌクレオチドの１８個が、全長１００ヌクレオチドの標的ポリヌクレオチド中の２０ヌクレオチド領域に相補的であるポリヌクレオチドを含むコアシェルナノ粒子を所与として、コアシェルナノ粒子の一部であるポリヌクレオチドは、９０パーセント相補的であることになる。この例において、残りの非相補的なヌクレオチドは、相補的なヌクレオチドと密集しているか、あるいは相補的なヌクレオチドが散在していてもよく、互いにまたは相補的なヌクレオチドに近接する必要はない。標的ポリヌクレオチドの領域を有するコアシェルナノ粒子の一部であるポリヌクレオチドのパーセント相補性は、ＢＬＡＳＴプログラム（基本局所配列検索ツール（ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ））、及び当技術分野で知られているＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３−４１０、Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，１９９７，７，６４９−６５６）を使用して、日常的に判定され得る。
【０１６７】
提供される遺伝子産物発現を阻害する方法には、標的遺伝子産物の発現が、コアシェルナノ粒子の不在下における遺伝子産物発現と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％阻害されるものが挙げられる。言い換えると、提供される方法は、基本的に標的遺伝子産物の発現のいかなる程度の阻害を生じるものを包含する。
【０１６８】
阻害の程度は、体液試料から、若しくは生検試料からインビボで、または当該技術分野で周知の画像処理技術によって判定される。代替的に、阻害の程度は、概して、本明細書に記載される組成物の使用により生体内で生じると予期され得る阻害の程度の予測可能な測定として、細胞培養アッセイ中の生体外で判定される。標的ポリヌクレオチドの阻害は、所与の細胞上での阻害の効果を評価するために使用されることが、本開示によって企図される。非限定的な例として、遺伝子産物の阻害の効果を研究することができ、ここでは、遺伝子産物はシグナル伝達経路の一部である。代替的に、遺伝子産物の阻害を研究することができ、ここでは、遺伝子産物はアポトーシス経路に関与すると仮定される。
【０１６９】
本明細書に記載される方法のいずれかが、所望の結果を達成するために組み合わせて使用されてもよいことが理解されるであろう。例えば、非限定的に、本明細書に記載される方法は、標的ポリヌクレオチドの検出ならびにその発現の制御の両方ができるように組み合わせられ得る。一部の実施形態において、この組み合わせは、インビトロまたはインビボのいずれかで経時的に標的ポリヌクレオチド発現の阻害を定量化するように使用され得る。経時的な定量化は、一態様において、特定の時点で細胞を培養物から除去し、かつ各時点で標的ポリヌクレオチドの発現の相対レベルを評価することによって達成される。一態様において、検出可能な標識の可視化を介して評価される標的ポリヌクレオチド量の減少は、標的ポリヌクレオチドの阻害の速度を経時的に示す。
【０１７０】
よって、標的ポリヌクレオチドとハイブリッド形成し、かつその発現を阻害する所与のポリヌクレオチドの有効性を判定すること、ならびに細胞上の所与のポリヌクレオチドの阻害の効果を判定することは、企図される態様である。
【０１７１】
反応を触媒する方法
開示のコアシェル粒子またはその複合体を化学反応の触媒として使用して１つ以上の試薬を産出物へと転換する方法が本明細書に提供される。本方法は、反応の１つ以上の試薬を本明細書に開示される複数のコアシェル粒子の組成物と接触させることを含み、その結果、試薬（単数または複数）の組成物との接触によって反応が触媒されて反応産出物が形成され、ここで、コアシェル粒子のタンパク質は化学反応のための酵素である。
【実施例】
【０１７２】
実施例１
タンパク質／オリゴヌクレオチドコアシェルナノ粒子の合成
材料及び機器：ウシカタラーゼをＳｉｇｍａから購入し、提供時のまま使用した。ＮＨＳ−ＰＥＧ４−アジドをＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから、修飾ホスホラミダイトをＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから購入した。Ｃ８Ｓ星状膠細胞をＡＴＣＣから入手した。オリゴヌクレオチドをＭｅｒＭａｄｅ  ４８（ＭＭ４８）自動オリゴヌクレオチド合成器（ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ）上で合成した。オリゴヌクレオチドを、水性ＮａＯＨ中（ＤＢＣＯ含有オリゴヌクレオチド）またはメタノール中の０．０５Ｍの炭酸カリウム中（Ｃｙ５含有オリゴヌクレオチド）で１２時間室温にてインキュベートすることによって脱保護した。脱保護したオリゴヌクレオチドをＶａｒｉａｎ  Ｐｒｏｓｔａｒクロマトグラフィーステーション上で逆相ＨＰＬＣによって精製した後、その配列をマトリックス支援飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）によって確認し、その濃度をＵＶ分光法によって決定した。円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルをＪａｓｃｏ  Ｊ−１８分光光度計上で測定した。Ｃｙ５で標識したオリゴヌクレオチドの細胞取り込みを、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０倒立レーザ走査共焦点顕微鏡上での蛍光共焦点顕微鏡法によって監視した。
【０１７３】
タンパク質／オリゴヌクレオチドコアシェルナノ粒子の合成：ウシカタラーゼ（図１ａ）を、図１ｂに示すように、オリゴヌクレオチドの高密度なシェルで修飾した。表面が露出したアミンを、５０μＭのカタラーゼを５０ｍＭの（１）（図１）と２時間室温で反応させることによってアジドに変換させた。典型的な反応は、ＭＡＬＤＩ質量分析によって決定して６０＋／−１のアミンのアジドへの変換をもたらした（図２ａ）。アジド修飾タンパク質を以下のＤＮＡ配列で共有的に修飾した。
１）  ５’ＤＢＣＯ  Ｓｐ１８２  ＡＡＧ  ＡＡＴ  ＴＴＡ  ＴＡＡ  ＧＣＡ  ＧＡＡ（ε２６０ｎｍ＝１９９，９００  Ｍ−１ｃｍ−１）（配列番号１）
２）  ５’ＤＢＣＯ  Ｓｐ１８２  ＡＡＣ  ＡＡＴ  ＴＡＴ  ＡＣＴ  ＣＡＧ  ＣＡＡ（ε２６０ｎｍ＝１８７，７００  Ｍ−１ｃｍ−１）（配列番号２）
３）  ５’ＤＢＣＯ  Ｔ１０−Ｃｙ５−Ｔ１０（ε２６０ｎｍ＝１７２，６００  Ｍ−１ｃｍ−１）（配列番号３）
【０１７４】
１μＭのアジドで標識したカタラーゼ及び１ｍＭの５’−ＤＢＣＯで修飾したＤＮＡを含有する溶液を３日間室温でインキュベートした。その後、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して過剰なＤＮＡを溶液から除去した後、ＤＮＡによる標識の程度を以下のように決定した。まず、酵素濃度を、ベールの法則、及び４０５ｎｍで３２４，０００Ｍ−１ｃｍ−１のモル吸光係数に従って決定した。その後、ＤＮＡによる標識の程度を、２６０ｎｍでの吸光の変化を測定することによって決定した（図２ｂ）。典型的な反応により、約６０〜７０個のオリゴヌクレオチド／タンパク質を得た。アジドの数と比較してわずかに過剰なオリゴヌクレオチドは、少数の非共有結合オリゴヌクレオチドの保持、または用いたオリゴヌクレオチド配列について計算したモル吸光度の概算のわずかな誤差に起因する可能性が高い。
【０１７５】
タンパク質／オリゴヌクレオチドコアシェルナノ粒子の特性評価。Ｎ３−ＰＥＧ−アジド及びＤＮＡの共有結合時のウシカタラーゼの二次構造の保持をＣＤ分光法によって監視した。全てのスペクトルを、１μＭのカタラーゼを含有する溶液を使用して測定した（図３ａ）。天然及びＤＮＡで標識したカタラーゼの酵素活性を、Ｈ２Ｏ２の分解を追うことによって監視した（図３ｂ）。オリゴヌクレオチドのカタラーゼの表面への共有結合を確認した後、酵素の大きさの変化をＤＬＳによって測定した（図３ｃ）。約１１ｎｍから約２５ｎｍへの推移は、オリゴヌクレオチドの単層の酵素表面への共有結合と一致した。
【０１７６】
タンパク質／ＤＮＡコアシェルナノ粒子の細胞取り込み。ＤＮＡによる修飾の前に、カタラーゼを約１．５のＦＩＴＣ分子で標識した。その後、この抱合体を、上記のように、５’ＤＢＣＯ及び内部Ｃｙ５ホスホラミダイトを含有するＴ２０オリゴヌクレオチドで標識した（配列番号３）。二重標識戦略により、細胞取り込みの際のタンパク質コア及びオリゴヌクレオチドシェル両方の細胞内運命を追跡することができた。タンパク質トランスフェクション実験を、１０％の加熱不活性化したウシ胎仔血清と共にＡＴＣＣ細胞培養ガイドラインに従って培養し、５％のＣＯ２中３７℃で維持したＣ８Ｓ細胞（ＡＴＣＣ，ＶＡ，ＵＳＡ）を使用して行った。カタラーゼの添加の前に、細胞を無血清培地に移し、１ｎＭのタンパク質／ＤＮＡコアシェルナノ粒子と共に４時間インキュベートした後、コアシェルナノ粒子の取り込みを蛍光共焦点顕微鏡法によって測定した（図４）。
【０１７７】
実施例２
追加のタンパク質／オリゴヌクレオチドコアシェルナノ粒子の合成
材料及び機器。全ての酵素をＳｉｇｍａから購入し、提供時のまま使用した。ＮＨＳ−ＰＥＧ４−アジドをＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから、修飾ホスホラミダイトをＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから購入した。オリゴヌクレオチドをＭｅｒＭａｄｅ  ４８（ＭＭ４８）自動オリゴヌクレオチド合成器（ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ）上で合成した。オリゴヌクレオチドを、水性ＮａＯＨ中でインキュベートすることによって脱保護した。その後、脱保護したオリゴヌクレオチドをＶａｒｉａｎ  Ｐｒｏｓｔａｒクロマトグラフィーステーション上で逆相ＨＰＬＣによって精製した後、その配列をマトリックス支援飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）によって確認し、その濃度をＵＶ分光法によって決定した。円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルをＪａｓｃｏ  Ｊ−１８分光光度計上で測定した。小角Ｘ線散乱実験を、ＤｕＰｏｎｔ  −  Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  Ｄｏｗｎ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｔｅａｍ  ｂｅａｍｌｉｎｅを使用して、Ａｒｇｏｎｎｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｓにて行った。走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）をＨｉｔａｃｈｉ  Ｓ４８００−ＩＩ  ｃＦＥＧ  ＳＥＭ上で行い、走査型透過電子顕微鏡法（ＳＴＥＭ）の顕微鏡写真を、Ｈｉｔａｃｈｉ  ＨＤ−２３００  ＳＴＥＭを使用して収集した。
【０１７８】
タンパク質／オリゴヌクレオチドコアシェルナノ粒子の合成：ウシカタラーゼ及びＣｇカタラーゼ（図５ａ及び５ｂ）を、図５ｃに示すように、オリゴヌクレオチドの高密度なシェルで修飾した。表面が露出したアミンを、５０μＭのカタラーゼを５０ｍＭの（１）と２時間室温で反応させることによってアジドに変換させた。典型的な反応は、ＭＡＬＤＩ質量分析によって決定して、それぞれウシカタラーゼ及びＣｇカタラーゼについて、６０または４８のアミンのアジドへの変換をもたらした（図２ａ）。アジド修飾タンパク質を以下のＤＮＡ配列で共有的に修飾した。
１）５’ＤＢＣＯ  Ｓｐ１８２  ＡＡＧ  ＡＡＴ  ＴＴＡ  ＴＡＡ  ＧＣＡ  ＧＡＡ  （２６０ｎｍ＝１９９，９００  Ｍ−１  ｃｍ−１）（配列番号１）
２）５’ＤＢＣＯ  Ｓｐ１８２  ＡＡＣ  ＡＡＴ  ＴＡＴ  ＡＣＴ  ＣＡＧ  ＣＡＡ  （２６０ｎｍ＝１８７，７００  Ｍ−１  ｃｍ−１）（配列番号２）
【０１７９】
１μＭのアジドで標識したカタラーゼ及び１ｍＭの５’−ＤＢＣＯで修飾したＤＮＡを含有するＤＮＡ標識反応を３日間室温でインキュベートした。その後、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して過剰なＤＮＡを溶液から除去した後、ＤＮＡによる標識の程度を以下のように決定した。まず、酵素濃度を、ベールの法則、及び４０５ｎｍで３２４，０００Ｍ−１ｃｍ−１のモル吸光係数に従って決定した。その後、タンパク質１つあたりのＤＮＡ分子の数を、２６０ｎｍでの吸光の変化を測定することによって決定した（図２ｂ）。典型的な反応により、約６０〜７０個及び４０〜５０個のＤＮＡ鎖それぞれウシカタラーゼまたはＣｇカタラーゼを得た。アジドの数と比較してわずかに過剰なＤＮＡ鎖は、少数の非共有結合ＤＮＡ鎖の保持、またはＤＮＡ鎖について計算したモル吸光度のわずかな誤差に起因する可能性が高い。
【０１８０】
ＤＮＡ抱合タンパク質の組織化。２つの異なる種類のＤＮＡ鎖を使用して、タンパク質を組織化してより高次の構造とした。まず、自己相補的リンカーを使用して、単一タンパク質を図６に示すように組織化した。ＤＮＡ媒介性凝集体を分解した後、ＤＮＡ二本鎖と比較した一本鎖ＤＮＡの過色素性質に起因して生じる、２６０ｎｍでの吸光度の増加を測定した。急激な融解転移は、ＤＮＡで高密度に修飾したナノ粒子間で達成される多価相互作用の特徴である。
【０１８１】
互いに相補的であるがそれ自体ではないリンカーを使用することで、２つの異なる酵素、または酵素及びＡｕＮＰのいずれかを含有している２成分系格子の組織化が可能となる（図７）。
【０１８２】
タンパク質結晶の形成及び小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）によるタンパク質超格子の特性評価。タンパク質結晶を、タンパク質ＤＮＡ抱合体またはＡｕＮＰあたり当量１００のリンカーＤＮＡを添加することによって組織化した。リンカーＤＮＡを添加した後、凝集体をその融解温度を上回る温度に加熱し、試料をサーマルサイクラー中で１℃／１０分の速度で冷却することによって、結晶を形成させた（図８）。
【０１８３】
ＳＥＭ及びＳＴＥＭによるタンパク質格子の特性評価。タンパク質のみを含有する結晶を、結晶を含有する溶液の５μＬのアリコートを炭素コーティングしたグリッドにドロップキャスティングし、酢酸ウラニルの２％溶液で染色することによる撮像のために調製した（図９ａ〜ｂ）。２成分系タンパク質−ＡｕＮＰ結晶をシリカ中に包埋させた後、結晶を含有する溶液の５μＬのアリコートを炭素コーティングしたグリッドにドロップキャスティングした。画像を図１０ａ〜ｂに示す。
【０１８４】
実施例３
ベータ−ガラクトシダーゼタンパク質／オリゴヌクレオチドコアシェルナノ粒子の合成
ベータガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）をＳｉｇｍａから購入し、使用前にサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。ベータガラクトシダーゼの表面を、以下の修飾を用いて、本質的には前述したように（図１ｂ）、ポリヌクレオチドで修飾した。アジドによる修飾の前に、β−ｇａｌを発色団ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で機能化して、細胞輸送を撮像し、タンパク質濃度を決定するための手段を提供した。９．７５μＭのタンパク質及び２８μＭのフルオロフォアを含有する反応により、タンパク質１個あたりのフルオロフォアが約２．６個である抱合体を得た（図１１）。その後、β−ｇａｌをアジドで修飾し、続いてポリヌクレオチドと反応させて、タンパク質１個あたりのＤＮＡ鎖が約３８個である抱合体を得た（図１１）。
【０１８５】
ＵＶ可視吸光度分光法によって決定するβ−ガラクトシダーゼ表面のＤＮＡによる機能化。β−ガラクトシダーゼをまず発色団ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７と抱合させた後、２つの異なるＤＮＡ配列で機能化した。機能化収率を、６４７ｎｍ（抱合フルオロフォアから）での吸光度及び２６０ｎｍ（ＤＮＡから）での吸光度の比率に基づいて決定した。両方のＤＮＡ鎖を約３５：１の比率で酵素の表面に抱合させた。
【０１８６】
ＤＮＡ修飾β−ｇａｌの細胞取り込みを共焦点蛍光顕微鏡法によって測定した。Ｃ８Ｓ細胞を１００ｎＭの天然またはＤＮＡ修飾β−ｇａｌと共に１２時間インキュベートし、１倍ＰＢＳで洗浄し、共焦点顕微鏡によって撮像した（図１２）。蛍光シグナルは、タンパク質の表面に共有結合したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ色素から生じ、ＤＮＡ修飾β−ｇａｌの細胞取り込みを裏付ける。
【０１８７】
天然及びＤＮＡ機能化β−ガラクトシダーゼの細胞取り込みも、Ｃ１６６、ＨａＣａｔ、及びＳＫＯＶ３細胞におけるフローサイトメトリーによって決定した。これらのデータは、ＤＮＡ機能化酵素の取り込みが天然タンパク質と比較して増強され、取り込みが複数の細胞株にわたって持続することを示した。
【０１８８】
ベータ−ガラクトシダーゼがＤＮＡによる機能化の後で折り畳まれたままであることの円偏光二色性分光法による検証。天然β−ガラクトシダーゼとＤＮＡ機能化β−ガラクトシダーゼとの抱合体のスペクトルを決定した。全てのスペクトルを濃度について補正した。２２０ｎｍでの信号の減少は、ＤＮＡからの寄与に起因するものであり、タンパク質のアンフォールドに起因するものではなかった。天然β−ガラクトシダーゼとＤＮＡ機能化β−ガラクトシダーゼ抱合体による、発蛍光性ベータ−ガラクトシダーゼ基質であるカルボキシウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシドの酵素加水分解も示された。
【０１８９】
トランスフェクトしたβ−ｇａｌの触媒活性を、モデル基質である５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）の加水分解を測定するβ−ｇａｌ染色キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して決定した。加水分解の際、この化合物は、光学顕微鏡法によって視覚化することができる青色の沈殿物を形成した。これらの実験のために、細胞を１００ｎＭの天然またはＤＮＡ修飾β−ｇａｌと１２時間インキュベートし、１倍ＰＢＳで洗浄し、凝固させた後、製造業者の推奨に従ってアッセイを行った。Ｘ−ｇａｌと共にインキュベートした後、細胞を洗浄し、光学顕微鏡上で撮像すると（図１３）、天然β−ｇａｌと比較してＤＮＡ機能化β−ｇａｌの増強した活性が示された。
【０１９０】
実施例４
タンパク質のＤＮＡ媒介性組織化。
材料及び方法。全てのオリゴヌクレオチドを、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手した試薬を使用してＭｅｒｍａｄｅ  ４８（ＭＭ４８）オリゴヌクレオチド合成器において固体支持体上で合成し、逆相拘束液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって精製した。クエン酸塩で覆った公称径１０ｎｍの金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）をＴｅｄ  Ｐｅｌｌａから入手し、既に説明されているように［Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４５１（７１７８）：５５３−５５６（２００８）、Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３４（６０５３）：２０４−２０８（２０１１）］ＤＮＡで機能化した。端的には、ＡｕＮＰ１ｍＬあたり約５ｎｍｏｌの適切な５’−チオール化オリゴヌクレオチドを添加した後、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を最終濃度が０．０１％になるまで添加し、結果として得られた溶液を室温で４時間インキュベートした。５ＭのＮａＣｌのアリコートを３時間かけて０．１Ｍのステップで溶液に添加し、０．５ＭのＮａＣｌの最終濃度に到達させた。その後、この溶液を室温で一晩インキュベートさせて、ＡｕＮＰの表面上のＤＮＡローディングを最大化した。ＤＮＡ機能化粒子を３周回の１６０００ｒｐｍでの遠心分離によって精製した後、結果として得られたペレットを１ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁させた。粒子濃度を、９．５５×１０７Ｍ−１ｃｍ−１のモル吸光係数（ε５２０）（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ提供）を使用するＵＶ可視吸光度スペクトル（Ｖａｒｉａｎ  Ｃａｒｙ  ５０００）に基づいて決定した。
【０１９１】
ウシ及びコリネバクテリウムグルタミクム（「Ｃｇ」）カタラーゼ（Ｓｉｇｍａ）を限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ、１００ｋＤａ）によってＰＢＳ中に交換し、その純度を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって確認した。両タンパク質は、予期された分子量（約６０ｋＤａ／モノマー）の単一分子種として動作したため、受け取ったままで使用した。化学的機能化の前に、各タンパク質を濃縮し、限外濾過によって１００ｍＭの重炭酸ナトリウムを含む緩衝液（ｐＨ９、０．５ＭのＮａＣｌ）中に交換した。タンパク質濃度を、３２４，０００Ｍ−１ｃｍ−１のモル吸光係数（ε４０５）を使用するＵＶ可視吸光度分光法によって決定した［Ｓａｍｅｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２３８（１０）：３２５６−６１（１９６３）］。
【０１９２】
１００ｍＭの重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９、０．５ＭのＮａＣｌ）中の５０μＭのタンパク質を含有する１００μＬの溶液に約６ｍｇのリンカーＮＨＳ−ＰＥＧ４−Ｎ３（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、図１５、挿入図）を添加した。表面アミンとＮＨＳ−ＰＥＧ４−Ｎ３とを１０００ｒｐｍで振盪しながら２５℃で２時間反応させた。アジド機能化タンパク質を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で平衡化したＮＡＰ１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。結合したリンカーの数を、２７４Ｄａ／リンカーの付加質量に基づくＢｒｕｋｅｒ  Ａｕｔｏｆｌｅｘ  ＩＩＩ質量分析計（図１６）上でのマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）によって決定した。
【０１９３】
各アジド修飾タンパク質を、５’末端ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）部分を含有する２つのはっきり異なるオリゴヌクレオチドで別々に機能化した。典型的な反応物は、ＰＢＳ（０．５ＭのＮａＣｌ）中、３ｎｍｏｌのタンパク質及び１μｍｏｌの示されるオリゴヌクレオチドを含有した。反応物を１０００ｒｐｍで振盪しながら２５℃で３日間インキュベートした後、未反応のＤＮＡを１０周回の限外濾過（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔｓ）によって反応溶液から除去した。各ＤＮＡ機能化タンパク質のオリゴヌクレオチド：タンパク質比率を、ＵＶ可視吸光度分光法によって決定した（図１６）。
【０１９４】
動的光散乱（ＤＬＳ）実験をＭａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ上で行った。各試料は、１μＭの天然のアジド機能化またはＤＮＡ機能化カタラーゼを含有した。報告するスペクトル及び流体力学直径（図１ｃ〜ｅ及び１５）は、強度分布に基づき、３回の測定の平均である。
【０１９５】
ＵＶ可視吸光度及びＣＤ分光法を用いて、天然のＮ３機能化及びＤＮＡ機能化カタラーゼ変異型の構造をプローブした（図１７及び１８）。ＵＶ可視吸光度スペクトルを、ＰＢＳ（０．５ＭのＮａＣｌ）中の約１μＭのタンパク質の溶液を含有する経路長１ｃｍのキュベットにおいて記録した。ＣＤスペクトルを、経路長１ｍｍのキュベットにおいてＪａｓｃｏ  Ｊ−８１８分光光度計上で記録した。全てのタンパク質含有試料を、ＰＢＳ（０．５ＭのＮａＣｌ）中で３００ｎＭの濃度で調製した。原楕円率値（ｍｄｅｇ）をΔε（ｍＭ−１ｃｍ−１）に変換し、結果として得られたスペクトルを、Ｉｇｏｒ  Ｐｒｏ（Ｗａｖｅｍｅｔｒｉｃｓ）においてＳａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙアルゴリズムを使用して平滑化した。アジド機能化タンパク質のスペクトルをその天然の対応物と直接比較した（図１８）。図３ａ及び図１８ｂからの円偏光二色性シグナルの差異は、アジド標識タンパク質のスペクトルが比較的不安定であることに起因する。図１８ｂについて、スペクトルは標識化実験を完了したその日のうちに収集し、修飾タンパク質は４℃で保管した。図３ａについては、アジド抱合タンパク質は、抱合反応を完了した後で長期間室温で放置し、部分的にアンフォールドした。
【０１９６】
非抱合５’ＤＢＣＯ含有オリゴヌクレオチドのＣＤスペクトルを、約１５μＭの濃度にて調製した試料から収集した。その後、各ＤＮＡ鎖のΔε値に、各タンパク質変異体について計算したＤＮＡ：タンパク質比率を乗じた（表１）。各ＤＮＡ機能化タンパク質の理論的スペクトルを、天然タンパク質のスペクトル及びＤＮＡのスペクトルの合計に予測されるＤＮＡ：タンパク質比率を乗じることによって計算した（図１７）。
【０１９７】
分光光度法によるＨ２Ｏ２のＨ２Ｏ及びＯ２に対する不均化を、本質的には［Ｂｅｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９５（１）：１３３−１４０（１９５２）］に既に記載されているように続けた。端的には、天然またはＤＮＡ機能化カタラーゼの１０μＬのアリコートを、原液（１００ｎＭ）から、１０００μＬのＰＢＳ（０．５ＭのＮａＣｌ）中の示す濃度のＨ２Ｏ２を含む撹拌したキュベットに添加した。カタラーゼの添加後、２４０ｎｍでの吸光度を１分間連続的に監視した。その後、反応速度を、４３Ｍ−１ｃｍ−１のＨ２Ｏ２ε２４０値を使用して、これらのトレースの初期直線部分の勾配から計算した。各データ点は、３つの試験の平均を表す（図１９）。標準速度定数（ｋａｐｐ）を各Ｈ２Ｏ２濃度について計算し、平均を図１９ｈに報告する。観察された触媒活性が、遊離ポルフィリン、またはアンフォールドされたタンパク質及びＤＮＡのマトリックス中に包埋されたポルフィリンではなく、完全な折り畳まれたカタラーゼの存在に起因するものであったのかどうかを試験するために、１０分間６０℃でのインキュベーションによってアンフォールドしたＤＮＡ機能化タンパク質を使用して酵素アッセイを行った（図１９）。
【０１９８】
タンパク質結晶（以下に記載のように組織化したもの）を、４周回の５，０００ｒｐｍでの遠心分離によって単離した。精製した結晶中に含有されるタンパク質の総濃度を、その４０℃でのＵＶ可視吸光度スペクトルを記録することによって決定した。その後、結晶を１００ｎＭの最終タンパク質濃度に希釈し、その触媒活性を試験した（図１４ｆ及び１９）。酵素結晶のリサイクル可能率を試験するために、結晶を、１０分間１５ｍＭのＨ２Ｏ２と共にインキュベートし、遠心分離させて残りの不溶性物質を収集した。この処理の後、上清と不溶性物質との両方を触媒活性について試験した（図１９ｊ）。このプロセスを５回繰り返した後、ＳＡＸＳスペクトルを収集して、結晶格子が完全なままであることを確実にした（図１９ｋ）。
【０１９９】
当量１００の適切なリンカーを、ＰＢＳ（０．５ＭのＮａＣｌ）中３００ｎＭの示すタンパク質を含有する溶液に添加することによって、ＤＮＡ機能化タンパク質及びＡｕＮＰ−ＳＮＡ抱合体を相補的リンカー鎖とハイブッド形成した。２つの異なるリンカー、各々が一方に相補的であるリンカーとハイブリッド形成した２つの異なるＤＮＡ機能化タンパク質、または相補的リンカーと別々にハイブリッド形成したＤＮＡ機能化タンパク質及びＳＮＡ−ＡｕＮＰ抱合体と別々にハイブリッド形成した単一ＤＮＡ機能化タンパク質を混合することによって、タンパク質含有凝集体を組織化した。結果として得られる凝集体を、１５ｎＭの最終粒子濃度になるまで１０００μＬのＰＢＳ（０．５ＭのＮａＣｌ）に添加し、その融解温度をＵＶ可視吸光分光法によって決定した（図１４ｇ及び２０）。各融解曲線の第１の導関数を計算して、Ｔｍ、及び各試料の半値全幅（ＦＷＨＭ）を決定した。
【０２００】
リンカーとハイブリッド形成したＤＮＡ機能化タンパク質、またはリンカーとハイブリッド形成したタンパク質とＳＮＡ−ＡｕＮＰとの抱合体のいずれかで構成されるＤＮＡ鋳型凝集体を、その融解温度（４３℃）を上回る温度で加熱して、それらを０．０１℃／分の速度で室温までゆっくりと冷却することによって、結晶を組織化した。この手順は、多結晶超格子よりも単結晶の形成を好むことが最近示された［Ａｕｙｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ５０５（７４８１）：７３−７７（２０１４）］。
【０２０１】
ＳＡＸＳ実験を、Ａｒｇｏｎｎｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙにあるＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ（ＡＰＳ）のＤｕＰｏｎｔ−Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ−Ｄｏｗ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｔｅａｍ（ＤＮＤ−ＣＡＴ）ｂｅａｍｌｉｎｅにて行った。実験は、ベヘン酸銀標準に対して較正した１０ｋｅＶ（波長１．２４Å）の平行Ｘ線を用いて行った。試料を１．５ｍｍの石英キャピラリー（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｓｕｐｐｅｒ）に移し、その２Ｄ散乱パターンをＣＣＤ面積検出器上でインサイツで記録した。使用した露出時間は、Ａｕ−タンパク質ハイブリッド及びタンパク質のみの格子について、それぞれ０．５秒及び５秒であった。図２１に提示する１次元散乱データを２次元データの径方向平均化によって得て、散乱ベクトルの関数ｑとしての散乱強度のプロットを得た。
【数１】
0006797108.tif 000010
【０２０２】
式中、θは散乱角の半分であり、λは使用したＸ線の波長である。
【０２０３】
全ての理論的Ｘ線回折パターンは、Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅｓｔｉｎｇよりインターネット上で無料で利用可能なＰｏｗｄｅｒＣｅｌｌソフトウェアパッケージを使用して計算した。このソフトウェアは、当初、格子についての構造係数を原子構成要素に基づいて計算するために開発されたが、実験データと十分に一致するナノ粒子超格子についての理論的散乱パターンを生成することも示されている。結果として得られる散乱パターンがＡｕＮＰによって占められ、かつ単純な立方格子を特徴とする、タンパク質及びＡｕＮＰから組織化した２成分系超格子については、原子選択は任意である。単一タンパク質で構成されるＢＣＣ型格子にも同じことが言える。単一タンパク質または２つのタンパク質で構成されるＣｓＣｌ型格子の模擬回折パターンを生成するために、同様の電子密度の原子を選択した。模擬散乱パターンにおける回折ピークの位置は、実験で観察されたものと十分に一致した。
【０２０４】
各格子型についての最近隣距離ｄを、以下の方程式
【数２】
0006797108.tif 000011
【０２０５】
を使用して第１の散乱ピークｑ０の位置に基づいて計算し、式中、ｄは、２つの粒子間の距離（単位ｎｍ）であり、ｑ０は、１／Åにおける初期散乱ピークの位置であり、Ｃは、最近隣の２つのナノ粒子間の距離と、第１の散乱ピークと関連する［ｈｋｌ］平面間の距離とを相関させる定数である。Ｃ、ｑ０、ｄ、及び格子パラメータの値を表２で要約する。
【０２０６】
ＴＥＭ撮像を、ＳＥまたはＺコントラストモードで２００ｋｅＶにて操作するＨｉｔａｃｈｉ  ＨＤ２３００走査型透過電子顕微鏡上で行った。ＳＮＡ−ＡｕＮＰ抱合体及びＤＮＡ機能化タンパク質で構成される２成分系超格子を、既に説明されているように［Ａｕｙｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ５０５（７４８１）：７３−７７（２０１４）、Ａｕｙｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ  Ｍａｔｅｒ  ２４（３８）：５１８１−５１８６（２０１２）］、非晶質シリカ中に包埋させた。この手順は、ＤＮＡ媒介性格子が試料調製及び真空下での撮像中に崩壊することを防止するのに必要である。これらのシリカに包埋させた超格子の５μＬのアリコートを、炭素コーティングした銅線メッシュグリッド上にドロップキャスティングし、過剰な液体をＷｈａｔｍａｎ濾紙で吸い取ることによって除去した。ＤＮＡ機能化タンパク質のみで構成される超格子を酢酸ウラニルの２％溶液で染色して、撮像に十分なコントラストを得た。
【０２０７】
結果。四量体のヘム含有酵素であるカタラーゼ（ウシカタラーゼ及びＣｇカタラーゼ）の２つの変異型を、タンパク質のＤＮＡ媒介性組織化を研究するためのモデル系として用いた（図１４）。各カタラーゼ変異型は、同様の分子トポロジーを共有するが、化学反応性の表面接触可能なアミン官能基のはっきり異なるパターンを特徴とする。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルとアジド部分とを反対側の末端に含有する（図１４ｂのｉ及び１５の挿入図）大幅に過剰な（タンパク質濃度と比べて約３０００倍）テトラエチレングリコールリンカーを添加することによって、これらの表面接触可能なアミンは、質量分析によって決定して、高い収率（Ｃｇ及びウシカタラーゼについての四量体タンパク質複合体あたり、それぞれ、全ての溶媒接触可能な一級アミンの７５％及び８３％）でアジドに変換された（図１６）。タンパク質のアジドによる機能化は、３つの異なるバッチのタンパク質を使用する５回の独立した反応にわたって極めて再現性が高かった（ウシカタラーゼ及びＣｇカタラーゼについて、それぞれ、１５．３±０．３及び１２．２±０．６の標識）。その後、アジド修飾タンパク質を、合成オリゴヌクレオチドの５’末端における表面結合アジド部分とジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）部分との間の歪みで促進される付加環化反応（Ｃｕを含まない「クリック化学」）を介して、２つの異なるオリゴヌクレオチド（以下の表１）で別々に機能化した（図１４ｂのｉｉ）。この戦略により、各タンパク質−ＤＮＡ抱合体のＵＶ吸光度スペクトルにおける変化によって決定して、３０〜５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２のＤＮＡ機能化密度を得た（図１６）。これらの値は、ＤＮＡ媒介性結晶化スキームにおいて既に用いられている同様にサイズ決定された無機ナノ物質［Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍａｔｅｒ  １２（８）：７４１−７４６（２０１３）、Ｈｕｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ７８（２４）：８３１３−８３１８（２００６）］によって達成される値と同等である。動的光散乱（ＤＬＳ）による各タンパク質抱合体の更なる特性評価により、その流体力学直径が、ＤＮＡ機能化後に、ウシカタラーゼ及びＣｇカタラーゼについて、それぞれ、１１．７ｎｍまたは１２ｎｍから２４．３ｎｍ及び２５ｎｍへと増大したことが明らかとなり、これは、タンパク質コアから径方向に配向されるオリゴヌクレオチドのシェルの形成と一貫する（図１４ｃ〜ｅ及び図１５）。理論に束縛されるものではないが、リンカーがある程度タンパク質と相互作用する可能性が高く、このことは、流体力学直径が予期されたほど増大しない理由を説明する。同様に、ＤＮＡは、ＣＤ分光法から明らかなように、超格子におけるＤＮＡと配座的に同一ではない可能性が高く、周辺の鎖を持つ追加の二次構造を採用する（図１７）。
【表１】
0006797108.tif 000012
１．ＤＢＣＯ  ｄＴは、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ製造のジベンゾシクロオクチン修飾ホスホラミダイトを指す
２．Ｓｐは、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ製造のヘキサエチレングリコール修飾ホスホラミダイト、スペーサー１８を指す
表１．本開示で使用するオリゴヌクレオチドの配列
【０２０８】
アジド修飾タンパク質及びＤＮＡ修飾タンパク質を幅広く特性評価して、それらが折り畳まれ機能的なままであることを確実にした。各タンパク質の構造をＵＶ可視分光法及び円偏光二色性（ＣＤ）分光法によってプローブすることにより、それぞれタンパク質のヘム活性部位及びグローバル二次構造を取り囲む環境に関する構造情報が提供された（図１７及び１８）。両技法は、天然タンパク質構造が、アジドまたはＤＮＡによる機能化時に主に完全なままであることを示唆する。ＤＮＡ機能化タンパク質の触媒機能性の保持を、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２、ε２４０＝４３Ｍ−１ｃｍ−１）のそのＨ２Ｏ及びＯ２へのカタラーゼ触媒性不均化時のＵＶ吸光度（２４０ｎｍにて）における減少を監視することによって、分光光度的に決定した（図１４ｆ及び１９）［Ｂｅｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９５（１）：１３３−１４０（１９５２）］。この反応の初期速度は、基質のｍＭ濃度及び酵素の比較的低い（ｎＭ）濃度を用いるときに、Ｈ２Ｏ２濃度に関して一次的である。標準的な速度定数は、ＤＮＡ機能化酵素及びその天然の対応物について同様であり、既刊のレポート［Ｂｅｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９５（１）：１３３−１４０（１９５２）］と十分に合致し、このことは、各カタラーゼ変異型の表面に付加されるＤＮＡの高密度なシェルが、活性部位への基質のアクセスに大きな影響を及ぼさず、あるいはその構造に決定的な変化を引き起こさないことを示す。対照的に、ＤＮＡ機能化タンパク質がアッセイの前にそのアンフォールド温度を上回って加熱されるときには、Ｈ２Ｏ２分解は観察されなかった（図１９）。この発見は、ＤＮＡ機能化タンパク質の存在下で観察された速度増強が、遊離ヘム、またはアンフォールドしたタンパク質及びＤＮＡのマトリックス中に包埋したヘムに起因するペルオキシダーゼ活性ではなく、完全な活性部位に由来することを示す。
【０２０９】
実施例５
次に、タンパク質−ＤＮＡ抱合体がＳＮＡ−無機ＮＰ抱合体に特徴的なＤＮＡ依存性特性を採用したかどうかを決定した。これらの抱合体は、相補的オリゴヌクレオチドを保有する粒子と多価相互作用を形成し、これらの相互作用は、温度の漸進的な上昇時の組織化状態と分解状態との間の高度に協力的な転移によって特徴付けられる。各タンパク質−ＤＮＡ抱合体は、一本鎖の付着末端配列（５’−ＡＡＧＧＡＡ−３’または５’−ＴＴＣＣＴＴ−３’、図１４ｂのｉｉｉ及び表１）を保有する相補的オリゴヌクレオチドと独立してハイブリッド形成した。相補的付着末端を持つタンパク質を担持するリンカーを組み合わせたとき、またはいずれかのタンパク質が相補的付着末端を持つＳＮＡ−金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）（直径１０ｎｍ）抱合体と組み合わせたとき、溶液の濁度の急激な増加及び凝集体の漸進的な蓄積が観察された。重要なことに、この凝集事象は、非相補的付着末端を持つ粒子を組み合わせたときには発生しなかったため、タンパク質間、タンパク質及びＡｕＮＰ表面間、またはタンパク質及びＤＮＡ間の非特異的相互作用の可能性を排除する。これらのＤＮＡ鋳型凝集体を含有する溶液をゆっくりと加熱すると、２６０ｎｍでのその消滅における急激な増大がもたらされた（図１４ｇ及び２０）。ＤＮＡ機能化タンパク質のみを含有する凝集体については、この転移は、凝集体の解離の際の二本鎖ＤＮＡの過色素性一本鎖ＤＮＡへのハイブリッド形成に由来し、一方で、ＤＮＡ機能化タンパク質とＳＮＡ−ＡｕＮＰ抱合体との混合物を含有する凝集体については、消滅の増大は、ＡｕＮＰの光学特性の変化に主に起因する。これらの転移の融解温度及び半値全幅値は、無機コアを持つＳＮＡ−ＮＰ抱合体について観察されたもの［Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍａｔｅｒ  １２（８）：７４１−７４６（２０１３）、Ｈｕｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ７８（２４）：８３１３−８３１８（２００６）］と同様であった。
【０２１０】
次に、ＳＮＡ−無機ＮＰ抱合体に対して開発された設計ルール［Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３４（６０５３）：２０４−２０８（２０１１）、Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ５２（２２）：５６８８−５６９８（２０１３）］がＤＮＡ機能化タンパク質の組織化にも適用されるかどうかを決定した。大きさが同一である球形ＳＮＡ−ＡｕＮＰ抱合体が、非自己相補的付着末端を保有するリンカーで別々に機能化される場合、熱力学的に好ましい格子は体心立方であることが既に示されている。これらの格子は、それらがはっきり異なるＤＮＡ配列で機能化されるにもかかわらずコアナノ粒子が同一であるため、ＣｓＣｌではなくＢＣＣ型として定義される。ＤＮＡ機能化タンパク質が同様の格子を形成するかどうかを試験するために、等モル比の２つのタンパク質を含有する凝集体、またはタンパク質及びＳＮＡ−ＡｕＮＰ抱合体から成る２成分系を、その融点を上回る温度であるがタンパク質のアンフォールドが開始する温度を下回る温度に加熱し、０．０１℃／分の速度でゆっくりと２０℃に冷却して、熱力学的に安定した産出物の形成を促進した。その融解温度をわずかに下回る温度でアニールされる代替的な手順と比較して、解離状態からナノ粒子を含有する溶液をゆっくりと冷却することは、多結晶凝集体よりも単結晶の形成に有利に働くことが示されている［Ａｕｙｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ５０５（７４８１）：７３−７７（２０１４）］。０．０１℃／分の速度は、より早い冷却速度がよく定義されていない単結晶または多結晶凝集体をもたらしたことを観察した後で、実験に基づいて決定した。この手順を使用して、Ｃｇカタラーゼを組織化して、径方向平均化１Ｄ小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）パターンから決定した体心立法（ＢＣＣ）対称性及び２５．６ｎｍの粒子間隔を持つ超格子にした（図２１ａ）。この粒子間隔は、ＤＮＡ修飾Ｃｇカタラーゼの測定された流体力学直径と一致した（図１４ｅ及び１５）。０．０２２  Å−１での追加の回折ピーク及び０．０３  Å−１でのショルダーも観察され、これは、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）と等構造である別個の格子の存在を示唆する。３つの追加のタンパク質−タンパク質の組み合わせから形成した結晶もＣｓＣｌ型格子に特徴的な散乱パターンを産出したが、同様の粒子間隔を持つＢＣＣ格子の存在を排除することはできない（図２１ｂ〜ｄ、表２）。ほぼ同一のタンパク質変異型からのＢＣＣ対称性ではなくＣｓＣｌ型対称性を持つ格子の形成は、各々固有の格子位置に存在するタンパク質が、予測したように８個の最近隣のものとの接続を形成しているが、それらは、はっきり異なる配向も採用することを示唆する。この観察は、タンパク質の構成単位の独特な形状の異方性及び非均一界面化学が、伝統的なＳＮＡ−ＮＰ抱合体を使用してでは観察されていなかったＤＮＡ媒介性超格子組織化に影響し、新規の対称性を持つ格子を形成するための設計努力に活用されるであろうことを示す。
【表２】
0006797108.tif 000013
【０２１１】
ＡｕＮＰに対するタンパク質の散乱断面積はごくわずかであるため、タンパク質−ＡｕＮＰ２成分系格子は、格子内のＡｕＮＰの配列にのみ依存する散乱パターンを産出することが予期される。実際に、ＤＮＡ機能化タンパク質を、相補的付着末端を持つリンカーを保有するＳＮＡ−ＡｕＮＰ抱合体と１：１の比率で組み合わせたとき、結果として得られたＣｓＣｌ型格子は、単純な立方散乱パターンを産出した（図２１ｅ〜ｆ）。これらの格子において、タンパク質は、さもなければＡｕＮＰによって占有され得る格子位置を効果的に欠失させる３次元スペーサーとして働く。柔らかいタンパク質ベースの構成単位の小型の３Ｄ構造を大きく改変することなく、かかる物理特性及び化学特性が全く異なる２つの型のナノ物質を組み合わせることができる能力は、ＤＮＡ媒介性組織化の幅広い一般化可能性を強調し、多機能性物質の組織化に有用である。
【０２１２】
タンパク質結晶の微小規模形態を、シリカに包埋させた（２成分系タンパク質−Ａｕ系について）または負染色した（ＤＮＡ機能化タンパク質のみで構成される格子について）標本の走査型透過電子顕微鏡法（ＳＴＥＭ）によって調査した（図２２及び２３）。両試料の顕微鏡写真は、各寸法が１〜７μｍの単結晶の均一な形成を示す。２成分系タンパク質−ＡｕＮＰ結晶は、明確なファセットならびに六角形及び四角形のドメインを示し、これらは、菱形十二面体へと組織化するＳＮＡ−ＡｕＮＰ抱合体について既に観察されているものと同様である［Ａｕｙｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ５０５（７４８１）：７３−７７（２０１４）］。これは、Ａｕ−タンパク質２成分系結晶に関して、タンパク質スペーサーの包含によりＡｕＮＰの単純な立方配列がもたらされるにもかかわらず、発生する。２成分系タンパク質−ＡｕＮＰ複合体を持つ単結晶の高倍率画像（図２２ｂ）により、個々のナノ粒子のスタックが明確に認識できる卓越した秩序度が明らかとなった（図２２ｂの挿入図）。同様に、格子平面は、Ｃｇカタラーゼ結晶から調製した負染色標本において可視化することができた（図２２ｄ）。
【０２１３】
Ｃｇカタラーゼで構成される結晶を、上記のようにＨ２Ｏ２分解アッセイにおいて用いて、酵素が結晶化プロセス後に活性なままであったかどうかを決定した。溶液中で遊離している天然またはＤＮＡ機能化酵素について、結晶によるＨ２Ｏ２分解の速度は、基質濃度に対する一時従属を示した（図１９ｉ）が、見掛けの速度定数は約２０の因数によって減少した。触媒効率の同様の減少は、結晶への拡散が制限因子である結晶酵素調製、特に高効率の酵素に関する研究において既に観察されている［Ｍｏｚｚａｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈ  Ｂｉｏｍ  ２５：３４３−３６５（１９９６）］。重要なことに、これらの酵素は、遠心分離による触媒作用の後で容易にリサイクルすることができ、少なくとも５周回の触媒にわたって完全な触媒活性を保持した（図１９ｊ）。最終回の触媒後のＳＡＸＳによる不溶性物質の分析により、結晶格子が完全なままであることを確認した（図１９ｋ）。
【０２１４】
結論。最近の成果［Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３６（６０８５）：１１７１−１１７４（２０１２）、Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ５１０（７５０３）：１０３−１０８（２０１４）］にもかかわらず、特に二量体複合体を超える  超分子構造を形成するためのタンパク質−タンパク質相互作用の新たな設計は、普遍的相互作用モチーフの欠如に起因して困難なままである［Ｓｔｒａｎｇｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ２２（１）：７４−８２（２０１３）］。対照的に、オリゴヌクレオチド塩基対合相互作用は、十分に理解されており、高忠実度で形成され、タンパク質またはタンパク質ベースのウイルスカプシドを含む外部分子の組織化を体系化するための骨格として作用し得る多様な超分子形状を組織化するための手段として広く用いられている［Ｗｉｌｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ  ４（４）：２４９−２５４（２００９）、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ５１（１４）：３３８２−３３８５（２０１２）、Ｒｕｓｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ５３（１５）：３９７９−３９８２（２０１４）、Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１（５６４１）：１８８２−１８８４（２００３）、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｎａｎｏ  ８（８）：  ７８９６−７９０４（２０１４）、Ｃｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １３５（１３）：５０１２−５０１６（２０１３）］。タンパク質間相互作用の形成をオリゴヌクレオチドハイブリッド形成で代置することによって、本開示は、結晶超格子が、単一タンパク質、複数のタンパク質、またはタンパク質とＡｕＮＰとの組み合わせから組織化され得ることを示した。この戦略は、とりわけ、複雑な生体物質（例えば、酵素カスケードまたはハイブリッド無機−有機格子）の機能タンパク質からの組織化を、そのアミノ酸組成または分子トポロジーにかかわらずプログラムするための手段を提供する。
本発明の実施形態の例として、以下の項目が挙げられる。
（項目１）
コアシェルナノ粒子であって、前記コアが、単一タンパク質を含み、前記シェルが、複数のポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドが、前記タンパク質表面に共有結合を介して結合している、コアシェルナノ粒子。
（項目２）
前記タンパク質が、触媒活性、シグナル伝達活性、治療活性、または輸送活性を呈する、項目１に記載のコアシェルナノ粒子。
（項目３）
前記複数のポリヌクレオチドの各々が同じである、項目１または項目２に記載のコアシェルナノ粒子。
（項目４）
前記複数のポリヌクレオチドのうちの少なくとも２つが異なっている、項目１または項目２に記載のコアシェルナノ粒子。
（項目５）
前記タンパク質表面上のポリヌクレオチドの密度が、約２ｐｍｏｌ／ｃｍ２〜約２００ｐｍｏｌ／ｃｍ２である、項目１〜４のいずれか一項に記載のコアシェルナノ粒子。
（項目６）
前記タンパク質表面上のポリヌクレオチドの密度が、約１０ｐｍｏｌ／ｃｍ２〜約１００ｐｍｏｌ／ｃｍ２である、項目５に記載のコアシェルナノ粒子。
（項目７）
前記タンパク質表面上のポリヌクレオチドの密度が、約１００ｐｍｏｌ／ｃｍ２である、項目１〜４のいずれか一項に記載のコアシェルナノ粒子。
（項目８）
前記複数のポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つに共有結合または非共有結合している追加の薬剤を更に含む、項目１〜７のいずれか一項に記載のコアシェルナノ粒子。
（項目９）
前記追加の薬剤が、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、リン脂質、オリゴ糖、金属複合体、小分子、治療薬、造影剤、またはこれらの組み合わせである、項目８に記載のコアシェルナノ粒子。
（項目１０）
前記追加の薬剤が、前記複数のポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つにハイブリッド形成によって非共有結合している、項目８または９に記載のコアシェルナノ粒子。
（項目１１）
前記追加の薬剤が、前記複数のポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つと共有結合している、項目８または９に記載のコアシェルナノ粒子。
（項目１２）
前記シェルの少なくとも１つのポリヌクレオチドが、前記タンパク質表面に前記タンパク質の表面アミノ基を介して結合している、項目１〜１１のいずれか一項に記載のコアシェルナノ粒子。
（項目１３）
前記表面アミノ基が、Ｌｙｓ残基に由来する、項目１２に記載のコアシェルナノ粒子。
（項目１４）
前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが、（ａ）前記表面アミノ基に結合しているアジド部分と、（ｂ）前記少なくとも１つのポリヌクレオチド上のアルキン官能基との反応から形成されるトリアゾール結合を介して結合している、項目１２または１３に記載のコアシェルナノ粒子。
（項目１５）
前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが、前記タンパク質表面に結合し、式（Ｉ）、
（ＩＩ）、またはその両方に示される結合を介してであり、
【化９】
0006797108.tif 000014
、及び
【化１０】
0006797108.tif 000015
、Ｌ及びＬ２が、各々独立して、Ｃ１−１０アルキレン、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−１０アルキレン−Ｙ−、及び−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−１０アルキレン−Ｙ−Ｃ１−１０アルキレン−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−Ｙ−から選択され、
各Ｙが、独立して、結合、Ｃ（Ｏ）、Ｏ、ＮＨ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、及びＮＨＣ（Ｏ）から成る群から選択され、
ｍが、０、１、２、３、４、または５であり、
ＰＮが、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドである、項目１４に記載のコアシェルナノ粒子。
（項目１６）
前記シェルの少なくとも１つのポリヌクレオチドが、前記タンパク質表面に前記タンパク質の表面カルボキシル基を介して結合している、項目１〜１５のいずれか一項に記載のコアシェルナノ粒子。
（項目１７）
前記シェルの少なくとも１つのポリヌクレオチドが、前記タンパク質表面に前記タンパク質の表面チオール基を介して結合している、項目１〜１６のいずれか一項に記載のコアシェルナノ粒子。
（項目１８）
前記シェルの少なくとも１つのポリヌクレオチドが、標的ポリヌクレオチドに対して、前記標的ポリヌクレオチドとハイブリッド形成しその発現を阻害するのに十分に相補的である、項目１〜１７のいずれか一項に記載のコアシェルナノ粒子。
（項目１９）
前記追加の薬剤が、標的ポリヌクレオチドに対して、前記標的ポリヌクレオチドとハイブリッド形成しその発現を阻害するのに十分に相補的であるポリヌクレオチドである、項目８〜１７のいずれか一項に記載のコアシェルナノ粒子。
（項目２０）
項目１〜１９のいずれか一項に記載のコアシェルナノ粒子を複数含む、組成物。
（項目２１）
前記複数のコアシェルナノ粒子が、結晶構造を形成する、項目２０に記載の組成物。
（項目２２）
各コアシェルナノ粒子が、同じタンパク質を含む、項目２０または項目２１に記載の組成物。
（項目２３）
少なくとも２つのコアシェルナノ粒子が、異なるタンパク質を含む、項目２０または項目２１に記載の組成物。
（項目２４）
金属ナノ粒子を更に含む、項目２０〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２５）
前記金属ナノ粒子が、金、銀、白金、アルミニウム、パラジウム、銅、コバルト、インジウム、ニッケル、またはこれらの混合物を含む、項目２４に記載の組成物。
（項目２６）
第１のコアシェルナノ粒子の複数のポリヌクレオチドが、第２のコアシェルナノ粒子の複数のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列に対して、ハイブリッド形成して超格子構造を形成するのに十分に相補的である、ポリヌクレオチド配列を有する、項目２０〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２７）
反応を触媒する方法であって、反応用の１つ以上の試薬を項目２０〜２６のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを含み、前記試薬と前記組成物との間の接触が、触媒されて前記反応の産物を形成する前記反応に繋がる、方法。
（項目２８）
標的分子を検出する方法であって、前記標的分子を、項目１〜１９のいずれか一項に記載のコアシェルナノ粒子または項目２０〜２６のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを含み、前記標的分子と前記コアシェルナノ粒子または前記組成物との間の接触が、検出可能な変化に繋がる、方法。
（項目２９）
前記検出がインビトロである、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記検出がインビボである、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
標的ポリヌクレオチドによってコードされる遺伝子産物の発現を阻害する方法であって、前記標的ポリヌクレオチドを、項目１〜１９のいずれか一項に記載のコアシェルナノ粒子または項目２０〜２６のいずれか一項に記載の組成物と、前記遺伝子産物の発現を阻害するのに十分な条件下で接触させることを含む、方法。
（項目３２）
前記遺伝子産物の発現がインビボで阻害される、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記遺伝子産物の発現がインビトロで阻害される、項目３１に記載の方法。
（項目３４）
前記遺伝子産物の発現が少なくとも約５％阻害される、項目３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
治療用タンパク質を細胞に送達する方法であって、項目１〜１９のいずれか一項に記載のコアシェルナノ粒子または項目２０〜２６のいずれか一項に記載の組成物を前記細胞に投与することを含み、
前記コアシェルナノ粒子の前記タンパク質が、前記治療用タンパク質である、方法。
（項目３６）
インビトロである、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
インビボである、項目３５に記載の方法。
（項目３８）
前記細胞が対象中にある、項目３５または項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記対象が、前記治療用タンパク質を必要としている、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記方法が、前記治療用タンパク質のみの投与と比較して、前記対象において減少した免疫原性応答を提供する、項目３８または項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記方法が、前記治療用タンパク質のみの投与と比較して、増加した前記治療用タンパク質の細胞取り込みを提供する、項目３５〜４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
項目１〜１９のいずれか一項に記載のコアシェルナノ粒子を調製する方法であって、前記タンパク質を、複数のポリヌクレオチドと、前記複数のポリヌクレオチドを前記タンパク質の前記表面に共有結合させるのに十分な条件下で接触させることを含む、方法。
（項目４３）
前記タンパク質が、以下の構造を有し
タンパク質−Ｘ−Ｌ−Ｎ３、
Ｘが、前記タンパク質上の表面アミノ基、カルボン酸基、またはチオール基に由来し、
Ｌが、Ｃ１−１０アルキレン、−Ｙ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−１０アルキレン−Ｙ−、及び−Ｙ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−１０アルキレン−Ｙ−Ｃ１−１０アルキレン−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−Ｙ−から選択され、
各Ｙが、独立して、結合、Ｃ（Ｏ）、Ｏ、ＮＨ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、及びＮＨＣ（Ｏ）から成る群から選択され、
ｍが、０、１、２、３、４、または５である、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
少なくとも１つのポリヌクレオチドが、以下の構造を有し、
ポリヌクレオチド−Ｌ２−Ｘ−≡−Ｒ、
Ｌ２が、Ｃ１−１０アルキレン、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−１０アルキレン−Ｙ−、及び−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−１０アルキレン−Ｙ−Ｃ１−１０アルキレン−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−Ｙ−から選択され、
各Ｙが、独立して、結合、Ｃ（Ｏ）、Ｏ、ＮＨ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、及びＮＨＣ（Ｏ）から成る群から選択され、
ｍが、０、１、２、３、４、または５であり、
Ｘが、結合であり、Ｒが、ＨまたはＣ１−１０アルキルであり、
あるいは、Ｘ及びＲが、それらが結合する炭素と一緒になって、８〜１０員の炭素環式基または８〜１０員の複素環式基を形成する、項目４２または４３に記載の方法。
（項目４５）
前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが、以下の構造を有する、項目４４に記載の方法。
【化１１】
0006797108.tif 000016
【図１Ａ】
0006797108.tif 000021
【図１Ｂ】
0006797108.tif 000022
【図２】
0006797108.tif 000023
【図３Ａ】
0006797108.tif 000024
【図３Ｂ】
0006797108.tif 000025
【図３Ｃ】
0006797108.tif 000026
【図４】
0006797108.tif 000027
【図５Ａ】
0006797108.tif 000028
【図５Ｂ】
0006797108.tif 000029
【図５Ｃ】
0006797108.tif 000030
【図６】
0006797108.tif 000031
【図７】
0006797108.tif 000032
【図８】
0006797108.tif 000033
【図９】
0006797108.tif 000034
【図１０】
0006797108.tif 000035
【図１１】
0006797108.tif 000036
【図１２】
0006797108.tif 000037
【図１３】
0006797108.tif 000038
【図１４】
0006797108.tif 000039
【図１５】
0006797108.tif 000040
【図１６】
0006797108.tif 000041
【図１７】
0006797108.tif 000042
【図１８】
0006797108.tif 000043
【図１９Ａ】
0006797108.tif 000044
【図１９Ｂ】
0006797108.tif 000045
【図１９Ｃ】
0006797108.tif 000046
【図１９Ｄ】
0006797108.tif 000047
【図１９Ｅ】
0006797108.tif 000048
【図１９Ｆ】
0006797108.tif 000049
【図１９Ｇ】
0006797108.tif 000050
【図１９Ｈ】
0006797108.tif 000051
【図１９Ｉ】
0006797108.tif 000052
【図１９Ｊ】
0006797108.tif 000053
【図１９Ｋ】
0006797108.tif 000054
【図２０】
0006797108.tif 000055
【図２１】
0006797108.tif 000056
【図２２】
0006797108.tif 000057
【図２３】
0006797108.tif 000058
【図２４】
0006797108.tif 000059
【配列表】
0006797108000001.app