(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒトサルアデノウイルスベクターと、
トレハロース、スクロースおよびそれらの組合せから選択される非晶質糖である凍結保護剤と、
ポロキサマー界面活性剤およびポリソルベート界面活性剤から選択される界面活性剤と、
バッファーと、
ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２およびＭｇＳＯ４から選択される二価金属イオン塩と、
０〜５０ｍＭの量の塩化ナトリウムと
を含んでなる水性混合物。
【請求項２】
前記非ヒトサルアデノウイルスベクターを保存するために用いられる、請求項１に記載の水性混合物。
【請求項３】
前記塩化ナトリウムが、０〜４０ｍＭの量で存在する、請求項１または２に記載の水性混合物。
【請求項４】
前記塩化ナトリウムが、５ｍＭ＋／−１ｍＭの量で存在する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の水性混合物。
【請求項５】
前記非晶質糖が、少なくとも２．５％（ｗ／ｖ）の量で存在する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の水性混合物。
【請求項６】
前記非晶質糖が、１７．５％（ｗ／ｖ）未満の量で存在する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の水性混合物。
【請求項７】
前記非晶質糖が、８％、８．５％、９％、または９．２５％の量で存在する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の水性混合物。
【請求項８】
少なくとも５％（ｗ／ｖ）のトレハロースを含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の水性混合物。
【請求項９】
前記非ヒトサルアデノウイルスベクターが、ボノボアデノウイルスベクターおよびゴリラアデノウイルスベクターから選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の水性混合物。
【請求項１０】
前記非ヒトサルアデノウイルスベクターが、チンパンジーアデノウイルスベクターである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の水性混合物。
【請求項１１】
前記非ヒトサルアデノウイルスベクターが、ＣｈＡｄ３、ＣｈＡｄ６３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１５５およびＰａｎＡｄ３から選択されるアデノウイルスベクターである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の水性混合物。
【請求項１２】
前記非ヒトサルアデノウイルスベクターが、ＣｈＡｄ１５５である、請求項１１に記載の水性混合物。
【請求項１３】
前記界面活性剤が、ポロキサマー１８８、ポリソルベート８０およびポリソルベート２０から選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の水性混合物。
【請求項１４】
前記界面活性剤が、ポロキサマー１８８またはポリソルベート８０である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の水性混合物。
【請求項１５】
前記界面活性剤が、ポリソルベート８０である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の水性混合物。
【請求項１６】
前記界面活性剤を少なくとも０．００１％（ｗ／ｖ）かつ最大０．５％（ｗ／ｖ）の量で含んでなる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の水性混合物。
【請求項１７】
前記界面活性剤を０．０２％（ｗ／ｖ）の量で含んでなる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の水性混合物。
【請求項１８】
ｐＨが、少なくとも６である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の水性混合物。
【請求項１９】
ｐＨが、１０未満である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の水性混合物。
【請求項２０】
ｐＨが７．５〜９．５である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の水性混合物。
【請求項２１】
ｐＨが７．５（＋／−０．５）である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の水性混合物。
【請求項２２】
前記バッファーが、０．５ｍＭ〜５０ｍＭの量のトリスバッファーである、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の水性混合物。
【請求項２３】
前記二価金属イオン塩が、０．５〜１０ｍＭの量で存在する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の水性混合物。
【請求項２４】
前記二価金属イオン塩が、１ｍＭおよび２ｍＭから選択される量で存在する、請求項２３に記載の水性混合物。
【請求項２５】
前記非ヒトサルアデノウイルスベクターが、免疫原性導入遺伝子である導入遺伝子を含んでなる、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の水性混合物。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載の水性混合物からフリーズドライされた組成物。
【請求項２７】
前記非ヒトサルアデノウイルスベクターを保存するために用いられる、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
請求項２６または２７に記載の組成物であって、前記組成物を５０ｍＭ未満の量の塩化ナトリウムを含有する、または塩化ナトリウムを本質的に含有しない水性液で再構成した上で、ヒト対象に前記組成物を投与する方法で使用するための組成物。
【請求項２９】
請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の組成物であって、前記組成物を非イオン性等張性調整剤を含有する水性液で再構成した上で、対象に前記組成物を投与する方法で使用するための組成物。
【請求項３０】
前記非イオン性等張性調整剤が、スクロース、トレハロースまたはそれらの組み合わせである、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記非ヒトサルアデノウイルスベクターが、免疫原性導入遺伝子である導入遺伝子を含んでなる、請求項２６〜３０のいずれか一項の組成物。
【請求項３２】
ヒト対象において免疫原性導入遺伝子産物に対する免疫応答を誘導するための方法で使用するための、請求項２６〜３１のいずれか一項に記載の組成物または請求項１〜２５のいずれか一項の水性混合物。
【請求項３３】
ａ．アデノウイルスベクターと、トレハロース、スクロースおよびそれらの組合せから選択される非晶質糖とを含んでなる水性混合物を準備する工程、
ｂ．前記水性混合物を
ｉ．アニーリング工程を含む水性混合物の凍結、および
ｉｉ．凍結水性混合物の減圧下での乾燥
により凍結乾燥させる工程
を含んでなる、アデノウイルスベクターを含んでなる組成物の製造方法。
【請求項３４】
ａ．アデノウイルスベクターと、トレハロース、スクロースおよびそれらの組合せから選択される非晶質糖とを含んでなる水性混合物を準備する工程、
ｂ．前記水性混合物を
ｉ．以下の工程を含む水性混合物の凍結：
１．前記水性混合物を、温度を前記混合物のＴｇ’より低く降下させることにより凍結させる工程、
２．前記凍結混合物を融解させることなく温度を上昇させることにより前記凍結混合物にアニーリング工程を適用する工程、
３．温度を再びＴｇ’より低く降下させる工程、および
ｉｉ．前記凍結水性混合物の減圧下での乾燥
により凍結乾燥させる工程
を含んでなる、アデノウイルスベクターを含んでなる組成物の製造方法。
【請求項３５】
工程ａ．において水性混合物が非シリコン処理バイアル中に準備される、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
工程ａ．において水性混合物が＋２〜＋８℃の温度で準備される、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
バイアルが単一用量のアデノウイルスベクターを含んでなる、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
工程ｂ．ｉ．１．においてＴｇ’より少なくとも１０℃低い棚温度を適用することにより生成物温度を降下させる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
工程ｂ．ｉ．１．において−５０℃の棚温度を適用することにより生成物温度を降下させる、請求項３４または３８に記載の方法。
【請求項４０】
工程ｂ．ｉ．１．において温度を２〜１０℃／分の速度で降下させる、請求項３４、３８および３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
工程ｂ．ｉ．１．において温度を少なくとも１時間、Ｔｇ’より低い温度に維持する、請求項３４および３８〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
工程ｂ．ｉ．２．において温度を凍結混合物のＴｇ’より高い温度であって凍結混合物の融点より低い温度に上昇させる、請求項３４および３８〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
工程ｂ．ｉ．２．において温度を−１５℃＋／−６℃のアニーリング温度に上昇させる、請求項３４および３８〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
工程ｂ．ｉ．２．において温度を０．１〜１０℃／分の速度でアニーリング温度に上昇させる、請求項３４および３８〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
工程ｂ．ｉ．２．において凍結混合物を２〜４時間、アニーリング温度に維持する、請求項３４および３８〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
工程ｂ．ｉ．３．において温度をＴｇ’より低く降下させる、請求項３４および３８〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
工程ｂ．ｉ．３．において温度を０．１〜１０℃／分の速度で降下させる、請求項３４および３８〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
工程ｂ．ｉ．３．において凍結混合物を少なくとも１時間、Ｔｇ’より低く維持する、請求項３４および３８〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
工程ｂ．ｉｉ．が
１．崩壊温度より低い温度での一次乾燥、および
２．崩壊温度より高い温度での二次乾燥
を含む、請求項３３〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
工程ｂ．ｉｉ．１．中の圧力が４０〜９０μｂａｒである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
工程ｂ．ｉｉ．１．を少なくとも２４時間適用する、請求項４９または５０に記載の方法。
【請求項５２】
工程ｂ．ｉｉ．２．において温度を−１０℃〜２５℃の温度に、０．１〜３℃／分の速度で上昇させる、請求項４９〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
工程ｂ．ｉｉ．２．において上昇させた温度を最大６時間維持する、請求項４９〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
二次乾燥中の圧力が１５〜６０μｂａｒである、請求項４９〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
請求項１〜３２に定義される特徴のうち１以上をさらに含んでなる、請求項３３〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載の水性混合物または請求項２６〜３２のいずれか一項に記載の組成物中で、前記水性混合物又は前記組成物に含まれる前記非ヒトサルアデノウイルスベクターを保存する方法。
【請求項５７】
前記非ヒトサルアデノウイルスベクターが、少なくとも１ヶ月の間、保存される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記非ヒトサルアデノウイルスベクターが、４℃、２５℃または３７℃で保存される、請求項５６または５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記非ヒトサルアデノウイルスベクターが、保存開始時の非ヒトサルアデノウイルスベクターの感染力に比べて少なくとも５０％の感染力を保持する、請求項５６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水性混合物またはフリーズドライ組成物としてのアデノウイルスベクター製剤、その調剤ならびに乾燥組成物を得るための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アデノウイルスベクターは、治療タンパク質送達プラットフォームであり、これにより治療タンパク質をコードする核酸配列がアデノウイルスゲノムに組み込まれ、このアデノウイルスゲノムはそのアデノウイルス粒子が処置対象に投与された際に発現に導かれる。許容可能な保存温度、かなりの貯蔵寿命での保存を可能とする、アデノウイルスベクターのための安定な製剤を開発することは、当技術分野における挑戦であった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ヒトアデノウイルスベクターに関しては、R.K Evans et al. (‘Development of stable Liquid Formulations for Adenovirus-Based Vaccines’ Journal of Pharmaceutical Sciences (2004) Vol. 93, No. 10, 2458-2475)により記載されているものなど、安定な製剤が報告されている。しかしながら、当技術分野では、アデノウイルスベクターの安定性を確保する製剤の必要がなおある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは驚くことに、アデノウイルスベクターが塩化ナトリウムなどの塩の存在に特に敏感であり得ることを見出した。従って、本発明は、サルアデノウイルスベクターを調剤するための、低濃度の塩を含む、特に、５０ｍＭ以下の塩化ナトリウム濃度を含む水性混合物および前記水性混合物から凍結乾燥により得られたフリーズドライ組成物（以下、「乾燥組成物」と呼称）を提供する。本発明はまた、組成物が低塩水性液、例えば、注射水、または非イオン性等張化剤の水溶液で再構成される、フリーズドライ組成物の使用方法も提供する。
【０００５】
加えて、凍結保護剤として非晶質糖であるトレハロースを含むことがサルアデノウイルスベクター粒子の安定性にさらに有利な効果を有することも見出された。従って、本発明は、非晶質糖トレハロースまたはトレハロースと別の非晶質糖との組合せを凍結保護剤として含んでなる水性混合物および乾燥組成物を提供する。
【０００６】
第２の態様において、本発明は、凍結相でアニーリング工程を使用し、それにより凍結乾燥中のアデノウイルス粒子の安定性を実質的に増強する、アデノウイルスベクター組成物の凍結乾燥法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、実施例１で使用したフリーズドライサイクルを示す。
【図２】図２は、実施例２で使用したフリーズドライサイクルを示す。
【図３】図３は、実験４で得られた動的光散乱（ＤＬＳ）データを示す：パネルＩ−組成物（ａ）；パネルＩＩ−組成物（ｂ）；パネルＩＩＩ：組成物（ｃ）。
【図４】図４は、実験５で得られたピコグリーン（登録商標）データを示す：○−注射水（ＷＦＩ）、ｘ−ＮａＣｌ  ３０ｍＭ、□−ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、◇−スクロース９．２５％、△−トレハロース９．２５％；パネルＩ−Ｔ１ｍ４時点；パネルＩＩ−Ｔ２ｍ４時点。
【図５】図５は、実施例６で使用したフリーズドライサイクルを示す。
【図６】図６は、実験６で得られたピコグリーン（登録商標）データを示す：△−対照アデノウイルス株、▽−陰性対照変性アデノウイルス株、ｘ−フリーズドライサイクルＩにより得られたサンプルで得られたデータ、○−フリーズドライサイクルＩＩにより得られたサンプルで得られたデータ。
【図７】図７は、実施例６で得られた感染力データを示す：△−対照アデノウイルス株、▽−陰性対照変性アデノウイルス株、ｘ−フリーズドライサイクルＩにより得られたサンプルで得られたデータ、○−フリーズドライサイクルＩＩにより得られたサンプルで得られたデータ。
【図８】図８は、実験７で得られたピコグリーン（登録商標）のデータを示す：△−対照アデノウイルス株、▽−陰性対照変性アデノウイルス株、＋−アニーリング−１０℃（３時間）を伴う凍結−５２℃／一次乾燥−３０℃／二次乾燥＋１０℃（６Ｈ＋６Ｈ）の手順のフリーズドライサイクルを用いて得られたデータ、ｘ−アニーリングを伴わない凍結−５２℃／一次乾燥−３０℃／二次乾燥＋１０℃（６Ｈ＋６Ｈ）の手順のフリーズドライサイクルを用いて得られたデータ、◇−アニーリングを伴わない０．５℃／分での低速凍結／一次乾燥−３０℃／二次乾燥＋１０℃（６Ｈ＋６Ｈ）の手順のフリーズドライサイクルを用いて得られたデータ、○−アニーリング−１０℃（２時間）を伴う凍結−５２℃／一次乾燥−３０℃／二次乾燥＋１０℃（６Ｈ＋６Ｈ）のフリーズドライサイクルを用いて得られたデータ。
【図９】図９は、実験７で得られたピコグリーン（登録商標）の感染力データを示す：△−対照アデノウイルス株、▽−陰性対照変性アデノウイルス株、＋−アニーリング−１０℃（３時間）を伴う凍結−５２℃／一次乾燥−３０℃／二次乾燥＋１０℃（６Ｈ＋６Ｈ）の手順のフリーズドライサイクルを用いて得られたデータ、ｘ−アニーリングを伴わない凍結−５２℃／一次乾燥−３０℃／二次乾燥＋１０℃（６Ｈ＋６Ｈ）の手順のフリーズドライサイクルを用いて得られたデータ、◇−アニーリングを伴わない０．５℃／分での低速凍結／一次乾燥−３０℃／二次乾燥＋１０℃（６Ｈ＋６Ｈ）の手順のフリーズドライサイクルを用いて得られたデータ、○−アニーリング−１０℃（２時間）を伴う凍結−５２℃／一次乾燥−３０℃／二次乾燥＋１０℃（６Ｈ＋６Ｈ）のフリーズドライサイクルを用いて得られたデータ。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
詳細な説明
アデノウイルスベクターの製剤に関する当技術分野の報告に反して、本発明者らは、例えばヒトアデノウイルスベクターのために開発された安定な製剤は、総てのアデノウイルスベクター、例えば、サルアデノウイルスベクターには上手く適用できなかったことを見出した。本発明は、ここに、アデノウイルス粒子の構造的完全性および機能性が良好に保護または維持されるアデノウイルスベクターの組成物を記載する。
【０００９】
この新規な製剤は、液体のまたは４℃、２５℃もしくは３７℃で乾燥させた組成物の、最大１か月、３か月、６か月、１年、２年または３年の保存を可能とする。一実施形態において、乾燥組成物は、４℃で３年、２５℃で３か月または３７℃で１か月保存され得る。出発材料の感染力に比べて少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の感染力が保持されれば保存は十分であると理解される。
【００１０】
本明細書に記載の混合物、組成物および方法は、出発材料の感染力に比べて少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の感染力を保持しつつ３７℃で少なくとも１か月、または２５℃で少なくとも３か月または４℃で少なくとも３年のアデノウイルスベクターの保存を可能とする。
【００１１】
アデノウイルスベクターの安定性は、他の方法の中でも、ベクターの感染力、例えば、ウイルスベクターの操作（例えば、フリーズドライ）時または保存時の感染力の保持を測定することにより決定することができる。用語「感染力」は、感受性宿主、すなわち、細胞へ侵入し、その遺伝物質を宿主による発現に送り込むベクターの能力を意味する。感染力は、「５０％細胞培養感染量（50% cell culture infectious dose）」（ＣＣＩＤ５０）で表すことができ、これは所与の細胞培養物の細胞の５０％を感染させるのに必要とされるアデノウイルスベクターの量である。感染力は、アデノウイルス導入遺伝子が発現される細胞の割合を測定することにより評価することができる。例えば、緑色蛍光タンパク質が感染力マーカーとして使用可能であり、それによりベクターとの２４時間のインキュベーション後に緑色蛍光タンパク質を発現する細胞の数が決定される。あるいは、感染力は、ベクターとの２４時間のインキュベーション後にアデノウイルスヘキソンカプシドタンパク質を発現する細胞の数を決定することにより評価することもできる。
【００１２】
アデノウイルスは、多様な標的組織で高効率の遺伝子導入を達成できるその能力および大きな導入遺伝子収容力のために遺伝子導入適用に広く使用されてきた。本発明で使用されるアデノウイルスベクターは一定範囲の哺乳動物宿主に由来し得る。様々な哺乳動物種に感染する１００を超える異なる血清型のアデノウイルスが単離されている。これらのアデノウイルス血清型は、配列相同性およびそれらの赤血球凝集能に従って６つの亜種に類別されている（Ａ〜Ｆ；ＢはＢ１およびＢ２に細分される）(Tatsis and Ertl Molecular Therapy (2004) 10:616-629)。
【００１３】
一実施形態において、本発明のアデノウイルスベクターは、ヒトアデノウイルスに由来する。このようなヒト由来アデノウイルスは、Ａｄ１、Ａｄ２、Ａｄ４、Ａｄ５、Ａｄ６、Ａｄ１１、Ａｄ２４、Ａｄ３４、Ａｄ３５、特に、Ａｄ５、Ａｄ１１およびＡｄ３５である。Ａｄ５に基づくベクターはいくつかの遺伝子療法治験で集中的に使用されてきたが、Ａｄ５および他のヒトＣ群アデノウイルスベクターの使用には、自然感染による一般集団における既存の免疫のために限界があり得る。Ａｄ５および他のヒトＣ群メンバーは、最も血清陽性度の高い血清型にある傾向がある。加えて、治療中にベクターに曝される結果として既存のベクターに対する免疫が発達することもある。これらのタイプの、血清陽性度の高いベクターに対する既存のまたは発達した免疫は、遺伝子療法またはワクチン接種の試みの有効性を限定し得る。従って、別のアデノウイルス血清型が、宿主の免疫応答を逃れ得る遺伝子送達系の遂行において極めて重要な標的となる。
【００１４】
よって、別の実施形態において、本発明のアデノウイルスベクターは、非ヒトサルアデノウイルス（単にサルアデノウイルスとも呼称される）に由来する。チンパンジー、ボノボ、アカゲザルおよびゴリラなどの非ヒトサルから多くのアデノウイルスが単離されており、これらのアデノウイルスに由来するベクターは、これらのベクターによりコードされている導入遺伝子に対する強い免疫応答を誘導する(Colloca et al. (2012) Sci. Transl. Med. 4:1-9; Roy et al. (2004) Virol.324: 361-372; Roy et al. (2010) J. of Gene Med. 13:17-25)。非ヒトサルアデノウイルスに基づくベクターの特定の利点としては、標的集団にこれらのアデノウイルスの交差中和抗体が比較的少ないということが挙げられる。例えば、ある種のチンパンジーアデノウイルスの、既存の中和抗体応答との交差反応は、ある種の候補ヒトアデノウイルスベクターの場合での３５％に比べ、標的集団の２％に存在するに過ぎない。
【００１５】
特定の実施形態において、アデノウイルスベクターは、非ヒトアデノウイルス、例えば、サルアデノウイルス、特に、チンパンジーアデノウイルス、例えば、ＣｈＡｄ３、ＣｈＡｄ６３、ＣｈＡｄ８３、ＣｈＡｄ１５５、Ｐａｎ５、Ｐａｎ６、Ｐａｎ７（Ｃ７とも呼称される）またはＰａｎ９に由来する。このような系統の例は、ＷＯ０３／０００２８３、ＷＯ２０１０／０８６１８９およびＧＢ１５１０３５７．５に記載され、American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209および他の供給源からも入手可能である。あるいは、アデノウイルスベクターは、ボノボから単離された非ヒトサルアデノウイルス、例えば、ＰａｎＡｄ１、ＰａｎＡｄ２またはＰａｎＡｄ３に由来してもよい。本明細書に記載のこのようなベクターの例は、例えば、ＷＯ２００５／０７１０９３およびＷＯ２０１０／０８６１８９に見出すことができる。アデノウイルスベクターはまた、ＷＯ２０１３／５２７９９、ＷＯ２０１３／５２８１１およびＷＯ２０１３／５２８３２に記載されるようにゴリラから単離されたアデノウイルスに由来してもよい。
【００１６】
アデノウイルスは、３つの主要タンパク質としてヘキソン（ＩＩ）、ペントンベース（ＩＩＩ）およびノブファイバー（ＩＶ）を、いくつかの他の微量タンパク質ＶＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＩｌＩａおよびＩＶａ２とともに含んでなる正二十面体カプシドを有する特徴的な形態を持つ。ヘキソンはカプシドの構造成分の大部分を占め、カプシドは２４０の三量体ヘキソンカプソマーと１２のペントンベースからなる。ヘキソンは、３つの保存されたダブルバレルを有するとともに、その頂部に３つのタワーを有し、各タワーは、カプシドの大部分を形成する各サブユニットからのループを含む。ヘキソンのベースは、アデノウイルス血清型で保存性が高いが、表面ループは変動がある(Tatsis and Ertl Molecular Therapy (2004) 10:616-629)。ペントンは、ファイバーが付着する五量体ベースを形成するもう１つのアデノウイルスカプシドタンパク質である。三量体ファイバータンパク質は、カプシドの１２の頂点のそれぞれでペントンベースから突出し、ノブのあるロッド様構造である。ファイバータンパク質の主要な役割は、ノブ領域と細胞受容体との相互作用を介してウイルスカプシドを細胞表面につなぎ止めることであり、ファイバーのフレキシブルシャフトならびにノブ領域のバリエーションが異なる血清型に特徴的である(Nicklin et al Molecular Therapy 2005 12:384-393)。
【００１７】
アデノウイルスベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏ発現のために所望のＲＮＡまたはタンパク質配列、例えば、異種配列を送達するために使用され得る。ベクターは、裸のＤＮＡ、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソープ、プラスミド、またはウイルスを含むいずれの遺伝要素も含み得る。「発現カセット」（または「ミニ遺伝子」）とは、選択された異種遺伝子（導入遺伝子）と宿主細胞でのその遺伝子産物の翻訳、転写および／または発現を駆動するのに必要な他の調節要素との組合せを意味する。
【００１８】
一般に、アデノウイルスベクターは、選択されたアデノウイルス遺伝子の本来の領域に他のアデノウイルス配列を含む核酸分子内に発現カセットが位置するように設計される。発現カセットは、場合により、その領域の機能を破壊するために既存の遺伝子領域に挿入され得る。あるいは、発現カセットは、部分的または完全に欠失されたアデノウイルス遺伝子の部位に挿入されてもよい。例えば、発現カセットは、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３およびＥ４からなる群から選択されるゲノム領域の少なくとも１つの遺伝子を非機能的とする突然変異、挿入または欠失の部位に位置してもよい。「非機能的とする」という用語は、その遺伝子領域が機能的な遺伝子発現産物をもはや産生できないように十分な量の遺伝子領域が除去またはそうでなければ破壊されることを意味する。場合により、全遺伝子領域が除去されてもよい（好適には、発現カセットで置換される）。好適には、アデノウイルスのＥ１遺伝子が欠失され、選択プロモーター、目的遺伝子のｃＤＮＡ配列およびポリＡシグナルからなる発現カセットで置換され、複製欠陥組換えウイルスとする。
【００１９】
一実施形態において、アデノウイルスベクターによりコードされる導入遺伝子は、治療用または免疫原性タンパク質、ＲＮＡ、酵素、または触媒ＲＮＡなどの生物学および医学に有用な生成物をコードする配列である。所望のＲＮＡ分子としては、ｔＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー、およびアンチセンスＲＮＡが含まれる。有用なＲＮＡ配列の一例は、処置される動物において標的とする核酸配列の発現を無効にする配列である。
【００２０】
よって、一実施形態において、本明細書に記載の混合物または組成物は、アデノウイルスベクターによりコードされる導入遺伝子に応じて、哺乳動物またはヒト対象などの対象の予防的（従って免疫原性もしくは回避的）または治療的処置における使用のためのものである。
【００２１】
導入遺伝子（transgene）は、例えば遺伝的欠陥の治療のため、癌治療薬もしくはワクチンとして、免疫応答の誘導のため、および／または予防ワクチンの目的で使用されるポリペプチドまたはタンパク質をコードし得る。本明細書で使用する場合、免疫応答の誘導とは、「抗原」または「免疫原」としても知られるタンパク質の、そのタンパク質に対するＴ細胞および／または体液性免疫応答を誘導する能力を意味する。
【００２２】
本明細書に記載されるように調剤された、ヒトまたは非ヒト動物を他の病原体に対して免疫化するのに有用なアデノウイルスベクターにより発現される免疫原には、ヒトおよび非ヒト脊椎動物に感染する、例えば、細菌、真菌、寄生性微生物または多細胞性寄生体を含み、または癌細胞もしくは腫瘍細胞に由来する。例えば、免疫原は、様々なウイルス科から選択され得る。
【００２３】
一実施形態において、免疫原は、フィロウイルス、例えば、エボラ（ザイール、スーダン、レストン、ブンディブギョおよびコートジボワール種）またはマールブルグに由来する。このような抗原はウイルス糖タンパク質（膜貫通型および／もしくは分泌型）ならびに／またはウイルス核タンパク質に由来し得る。このようなベクターの例は、とりわけ、ＷＯ２０１１／１３０６２７に見出すことができる。
【００２４】
別の実施形態において、免疫原は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）などの呼吸器系ウイルス、ならびにヒトメタニューモウイルス、ｈＭＰＶおよびパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）などの他のパラミクソウイルスから選択され得る。ヒトまたは非ヒト動物を免疫化するための免疫原として有用なＲＳＶの好適な抗原は、融合タンパク質（Ｆ）、付着タンパク質（Ｇ）、基質タンパク質（Ｍ２）および核タンパク質（Ｎ）から選択され得る。このようなベクターは、ＷＯ２０１２／０８９８３３およびＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０６３２９７に記載されている。一実施形態において、ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０６３２９７に開示されているＣｈＡｄ１５５−ＲＳＶ構築物は、開示されている組成物および方法に関して考慮されている。
【００２５】
別の実施形態において、免疫原は、レトロウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）などのレンチウイルスに由来し得る。このような実施形態において、免疫原は、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｎｅｆ、Ｅｎｖその他など、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２配列に由来してもよい。このようなベクターは、とりわけ、ＧＢ１５１０３５７．５およびＷＯ２００８／１０７３７０に記載されている。
【００２６】
その代わりに、またはそれに加えて、導入遺伝子配列は、発現時に検出可能なシグナルを生じるリポーター配列を含んでもよい。このようなリポーター配列としては、限定されるものではないが、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリ性ホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、例えばＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８を含む膜結合タンパク質、インフルエンザ血球凝集素タンパク質、およびそれに対する高親和性抗体が存在する、または従来の手段のより生産され得る、当技術分野で周知の他のもの、およびとりわけ血球凝集素またはＭｙｃに由来する抗原タグドメインと適宜融合された膜結合タンパク質を含んでなる融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列が含まれる。これらのコード配列は、調節要素と会合した際にそれらの発現を駆動し、酵素、ラジオグラフィー、比色定量、蛍光または他の分光光度アッセイ、蛍光活性化細胞選別アッセイ、ならびに酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および免疫組織化学を含む免疫アッセイを含む、従来の手段によって検出可能なシグナルを生じる。
【００２７】
導入遺伝子に加え、発現カセットはまた、アデノウイルスベクターでトランスフェクトされた細胞においてその転写、翻訳および／または発現を可能とする様式で導入遺伝子に機能的に連結された従来の制御要素も含み得る。本明細書で使用する場合、「機能的に連結された」配列としては、目的遺伝子に隣接している発現制御配列とトランスまたは遠隔で目的遺伝子を制御する働きをする発現制御配列の両方を含む。
【００２８】
発現制御配列には、適当な転写開始配列、終止配列、プロモーター配列およびエンハンサー配列；ウサギβ−グロビンポリＡを含むスプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの有効なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質のｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を高める配列（例えば、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を高める配列；および場合により、コードされている産物の分泌を促進する配列が含まれる。他の配列としては、キメライントロンが使用可能である。
【００２９】
「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を可能とし、遺伝子の転写を指示するヌクレオチド配列である。一般に、プロモーターは、遺伝子の５’非コード領域の、その遺伝子の転写開始部位付近に配置される。転写の開始に働くプロモーター内の配列要素は、多くの場合、コンセンサスヌクレオチド配列により特徴付けられる。プロモーターの例としては、限定されるものではないが、細菌、酵母、植物、ウイルス、および哺乳動物（ヒトを含む）由来のプロモーターが含まれる。内在型、天然型、構成型、誘導型のおよび／または組織特異的なプロモーターを含む多くの発現制御配列が当技術分野で公知であり、利用可能である。
【００３０】
アデノウイルスベクターは、異種遺伝子（導入遺伝子）を発現させるため、および／または所望でないアデノウイルス配列を欠失させる、もしくは不活性化するために、野生型アデノウイルスの改変により作出される。アデノウイルスベクターはまた、複製能が変更されていてもよい。例えば、ベクターは複製欠陥型であっても、または野生型ウイルスに比べて非補完細胞では複製能の低下を示すように限定された複製能を有してもよい。例えば、複製に関与する遺伝子の欠失、例えば、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ３またはＥ４遺伝子の欠失により、ウイルスを変異させることにより行うことができる。このような改変は当業者に公知であり、当技術分野で、例えば、Roy et al., Human Gene Therapy 15:519-530, 2004；Colloca et al. (2012) Sci. Transl. Med. 4:1-9；Roy et al. (2004) Virol.324: 361-372；またはＷＯ０３／０００２８３により記載されている。
【００３１】
これらのベクターは、当業者に公知の技術を用いて作出される。このような技術には、教本に記載されているものなどの従来のｃＤＮＡクローニング技術、アデノウイルスゲノムのオーバーラッピングオリゴヌクレオチド配列の使用、ポリメラーゼ連鎖反応、および所望のヌクレオチド配列を提供する好適な方法が含まれる。特に好適な方法として、Colloca et al. (2012) Sci. Transl. Med. 4:1-9；Roy et al. (2004) Virol.324: 361-372；Roy et al. (2010) J. of Gene Med. 13:17-25；およびＷＯ２０１０／０８５９８４に提供されているものなどの標準的相同組換え法またはWarming et al. Nuc. Acids Res. (2005) 33:e36に記載されているような遺伝子組み換え工学法が含まれる。
【００３２】
アデノウイルスベクターは、ウイルスが複製できるいずれの好適な細胞株でも生産可能である。特に、ウイルスベクターから欠落していてその結果その複製障害特性をもたらしている因子（例えば、Ｅ１）を供給する補完細胞株を使用することができる。限定されるものではないが、このような細胞株は、とりわけ、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ２）、Ａ５４９（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ１８５）、ＨＥＫ２９３、ＫＢ（ＣＣＬ１７）、Ｄｅｔｒｏｉｔ（例えば、Ｄｅｔｒｏｉｔ５１０、ＣＣＬ７２）およびＷＩ−３８（ＣＣＬ７５）細胞であり得る。これらの細胞株は総てAmerican Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia  20110-2209から入手可能である。応用微生物研究センター(Centre for Applied Microbiology and Research)（ＣＡＭＲ、ＵＫ）のEuropean Collection of Animal Cell Cultures（ＥＣＡＣＣ）にＥＣＡＣＣ  ｎｏ．９６０２２９４０として寄託された細胞により代表されるようなＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞またはＨｅｒ９６細胞（Ｃｒｕｃｅｌｌ）など、他の好適な親細胞株も他の供給源から入手可能である。
【００３３】
特に好適な補完細胞株は、Ｐｒｏｃｅｌｌ９２細胞株である。Ｐｒｏｃｅｌｌ９２細胞株は、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター下のＴｅｔリプレッサー、およびＧ４１８耐性遺伝子でトランスフェクトされた、アデノウイルスＥ１遺伝子を発現するＨＥＫ２９３細胞に基づく(Vitelli et al. PLOS One (2013) 8(e55435):1-9)。Ｐｒｏｃｅｌｌ９２．Ｓは懸濁条件下の増殖に適合され、毒性タンパク質を発現するアデノウイルスベクターを生産するために有用でもある(www.okairos.com/e/inners.php?m=00084, last accessed 13 April 2015)。
【００３４】
アデノウイルス送達法および用量
本明細書に記載の混合物または組成物は、哺乳動物、好適にはヒトへの送達後にベクターにより送達された導入遺伝子産物に対する免疫応答、例えば、体液性（例えば、抗体）および／または細胞媒介性（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）応答を誘導し得る１以上の組換えベクターを含んでなり得る。組換えアデノウイルスは、（好適にはその遺伝子欠失のいずれにおいても）所望の免疫原をコードする遺伝子を含んでなり、従って、ワクチンにおいて使用され得る。組換えアデノウイルスは、免疫応答の誘導に重要で、病原体の拡散を制限できる１または複数の抗原が同定されており、かつ、そのｃＤＮＡが利用できる任意の病原体に対する予防または治療ワクチンとして使用することができる。
【００３５】
よって、一実施形態において、本明細書に記載の混合物および／または組成物は、ヒト対象などの対象の免疫誘導のためのものである。もしあれば、追加免疫の必要を決定するために、選択された遺伝子の免疫のレベルをモニタリングすることができる。血清中の抗体の力価を評価した後に、任意選択の追加免疫が望まれる場合がある。
【００３６】
場合により、本発明の混合物または組成物を、例えば、アジュバント、安定剤、ｐＨ調整剤、および保存剤などを含む他の成分を含有するように調剤してもよい。このようなアジュバントは、抗原をコードするＤＮＡワクチンでプライムする際に生じる免疫応答に比べて抗原特異的免疫応答を増強するために、抗原をコードするプライミングＤＮＡワクチンとともに投与することができる。あるいは、このようなアジュバントは、本発明のアデノウイルスベクターを含む投与計画において投与されるポリペプチド抗原で投与することができる。
【００３７】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の混合物または組成物は、筋肉注射、腟内投与、静脈注射、腹腔内注射、皮下注射、経皮投与、皮内投与、鼻腔投与または経口投与により対象に投与される。
【００３８】
治療計画が１以上のアデノウイルスベクターおよび／またはさらなる成分の併用投与を含む場合には、これらは一緒に調剤されても（すなわち、同じ混合物または組成物中）またはそれぞれ異なる組成物中に調剤されてもよい。別個に調剤される場合、それらは好都合には同じ場所に、または同じ部位に投与される。例えば、これらの成分は、（例えば、筋肉内、経皮、皮内、皮下から選択される投与経路を介して）同じ側もしくは四肢（「同側(co-lateral)」投与）または反対の側もしくは四肢（「反対側(contra-lateral)」投与）に投与することができる。
【００３９】
ウイルスベクターの用量は、主として処置される病態、患者の齢、体重および健康状態などの因子によって決まり、従って、患者間で異なり得る。例えば、本ウイルスベクターの治療上有効な成人または獣医学的用量は一般に、１×１０５〜１×１０１５個のウイルス粒子、例えば、１×１０８〜１×１０１２（例えば、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、２．５×１０１０、５×１０１０、１×１０１１、５×１０１１、１×１０１２粒子）を含有する。あるいは、ウイルスベクターは、一般に１×１０５〜１×１０１０プラーク形成単位（ＰＦＵ）、例えば、１×１０５ＰＦＵ、５×１０５ＰＦＵ、１×１０６ＰＦＵ、５×１０６ＰＦＵ、１×１０７ＰＦＵ、５×１０７ＰＦＵ、１×１０８ＰＦＵ、５×１０８ＰＦＵ、１×１０９ＰＦＵ、５×１０９ＰＦＵ、または１×１０１０ＰＦＵの用量で投与することもできる。用量は動物の大きさおよび投与経路によって異なる。例えば、筋肉注射に好適なヒトまたは獣医学的用量（約８０ｋｇの動物の場合）は、一部位に対して約１×１０９〜約５×１０１２粒子／ｍＬの範囲である。場合により、複数の投与部位を用いてもよい。別の例では、好適なヒトまたは獣医学的用量は、経口製剤の場合、約１×１０１１〜約１×１０１５粒子の範囲であり得る。
【００４０】
アデノウイルスベクターは、例えばＣＭＶプロモーター領域上に設計されたプライマーおよびプローブを用いた定量的ＰＣＲ分析（Ｑ−ＰＣＲ）により、ＨＣＭＶプロモーターを含む発現カセットとともにベクターゲノムを含有するプラスミドＤＮＡの希釈系を標準曲線として用いて定量することができる。試験サンプル中のコピー数は、平行線検定法により決定することができる。ベクター粒子の定量の別法は、分析的ＨＰＬＣまたはＡ２６０ｎｍに基づく分光光度法であり得る。
【００４１】
核酸の免疫学的に有効な量は、好適には、１ｎｇ〜１００ｍｇであり得る。例えば、好適な量は１μｇ〜１００ｍｇであり得る。特定の核酸（例えば、ベクター）の適当な量は、当業者により容易に決定することができる。核酸成分の例示的有効量は、１ｎｇ〜１００μｇ、例えば、１ｎｇ〜１μｇ（例えば、１００ｎｇ〜１μｇ）、または１μｇ〜１００μｇ、例えば、１０ｎｇ、５０ｎｇ、１００ｎｇ、１５０ｎｇ、２００ｎｇ、２５０ｎｇ、５００ｎｇ、７５０ｎｇ、または１μｇであり得る。核酸の有効量はまた、１μｇ〜５００μｇ、例えば、１μｇ〜２００μｇ、例えば、１０〜１００μｇ、例えば、１μｇ、２μｇ、５μｇ、１０μｇ、２０μｇ、５０μｇ、７５μｇ、１００μｇ、１５０μｇ、または２００μｇも含み得る。あるいは、核酸の例示的有効量は、１００μｇ〜１ｍｇ、例えば、１００μｇ〜５００μｇ、例えば、１００μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、３００μｇ、４００μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇまたは１ｍｇであり得る。
【００４２】
一般に、ヒト用量は、０．５ｍｌ〜２ｍｌの容量中に含まれる。よって、本明細書に記載の混合物および／または組成物は、単剤または合剤の免疫原性成分当たり例えば、０．５、１．０、１．５または２．０ｍｌヒト用量の容量が投与されるよう調剤することができる。
【００４３】
当業者ならば、投与経路および組換えベクターが使用される治療薬またはワクチン適用に応じてこれらの用量を調整することができる。用量投与の頻度を決定するために、導入遺伝子の発現レベル、またはアジュバントに関しては循環抗体レベルをモニタリングすることができる。
【００４４】
１回以上のプライミングおよび／または追加免疫工程が使用される場合、この工程は、時間、日、週、月、または年単位で投与されル単回用量を含み得る。一例として、哺乳動物は、担体中に約１０μｇ〜約５０μｇのプラスミドを含有する１または２用量を需要し得る。送達の量または部位は望ましくは、哺乳動物の属性および状態に基づいて選択される。
【００４５】
もしあれば、追加免疫の必要を決定するために、選択された導入遺伝子によりコードされるタンパク質の治療レベル、またはそれに対する免疫応答のレベルをモニタリングすることができる。血清においてＣＤ８＋Ｔ細胞応答、または場合により抗体力価を評価した後に、任意選択の追加免疫が望まれる場合がある。場合により、アデノウイルスベクターは、単回投与または様々な組合せ計画で、例えば、他の有効成分を含む処置計画もしくはコースと組み合わせて、またはプライム−ブースト計画で送達し得る。
【００４６】
本発明者らは、アデノウイルスベクターが、乾燥形態の場合または液体形態の場合に、塩化ナトリウムなどの塩の存在により実質的に影響を受け得ることを見出した。よって、本発明は、塩化ナトリウムなどの塩に対するアデノウイルスベクターの感受性を考慮した製剤、すなわち、液体混合物および乾燥組成物に関する。一実施形態において、サルアデノウイルスベクターは、本明細書に記載の液体混合物および組成物を用いて調剤される。
【００４７】
用語「塩」は、本明細書で使用する場合、酸および塩基の中和反応から生じる、生成物に正味電荷が存在しないように関連数の陽イオンと陰イオンから構成されるイオン性化合物、例えば、塩化ナトリウムを意味する。成分イオンは無機または有機のいずれであってもよく、一原子であってもまたは多原子であってもよい。
【００４８】
よって、一実施形態によれば、水性混合物中に存在する塩の量、特に、ＮａＣｌの量は５０ｍＭ未満、４０ｍＭ未満、３０ｍＭ未満、２０ｍＭ未満、１５ｍＭ未満、１０ｍＭ未満、または７．５ｍＭ未満であると定義される。好ましくは、組成物は、塩を完全には不含でなく、または塩化ナトリウムを完全には不含でない。よって、本発明の１つの実施形態によれば、塩、特に、塩化ナトリウムは、少なくとも０．５ｍＭ、少なくとも１ｍＭ、少なくとも２ｍＭ、少なくとも３ｍＭ、または少なくとも４ｍＭの量で存在する。あるいは、塩化ナトリウムは、１〜５０ｍＭ、２．５〜２５ｍＭ、２．５〜１５ｍＭ、２．５〜１０ｍＭ、または２．５〜７．５ｍＭの量で存在する。特定の実施形態によれば、塩化ナトリウムは約５ｍＭの量で存在する。
【００４９】
範囲を定義する目的で、用語「間」は、本明細書で使用する場合、その範囲の終点を含むと見なされる。例えば、塩化ナトリウムが２．５〜１０ｍＭの量で存在すると言われる場合、ＮａＣｌが２．５ｍＭまたは１０ｍＭの濃度で存在する製剤が含まれる。
【００５０】
さらなる実施形態によれば、乾燥組成物を再構成するための水性液の塩、例えば、塩化ナトリウム含量も定義される。一実施形態によれば、再構成用の水性液中に存在する塩、例えば、塩化ナトリウムの量は、５０ｍＭ未満、４０ｍＭ未満、３０ｍＭ未満、２０ｍＭ未満、１５ｍＭ未満、１０ｍＭ未満、または７．５ｍＭ未満である。
【００５１】
凍結乾燥組成物を再構成するための水性液は、本質的に塩不含、例えば、本質的に塩化ナトリウム不含であってもよい。本質的に不含とは、塩または塩化ナトリウムの濃度が０ｍＭまたはそれに極めて近いことを意味する。
【００５２】
さらなる実施形態において、組成物を再構成するための水性液は、塩または塩化ナトリウムを完全には不含でない。従って、塩化ナトリウムなどの塩は、乾燥組成物を再構成するための水性液中に少なくとも０．５ｍＭ、少なくとも１ｍＭ、少なくとも２ｍＭ、少なくとも３ｍＭ、または少なくとも４ｍＭの量で存在し得る。あるいは、塩化ナトリウムなどの塩は、組成物を再構成するための水性液中に１〜５０ｍＭ、２．５〜２５ｍＭ、２．５〜１５ｍＭ、２．５〜１０ｍＭまたは２．５〜７．５ｍＭの量で存在する。特定の実施形態によれば、塩化ナトリウムなどの塩は、組成物を再構成するための水性液中に５ｍＭの量で存在する。
【００５３】
よって、本発明はまた、乾燥組成物が本明細書に定義されるような、組成物を再構成するための水性液で再構成される、本明細書に記載の乾燥組成物の使用方法も提供する。
【００５４】
用語「凍結保護剤」は、凍結されるもの、この場合、アデノウイルスベクター、の凍結損傷を防ぐ種の賦形剤を意味する。
【００５５】
本発明での使用に好適な凍結保護剤は、スクロース、トレハロース、マンノース、マンニトール、ラフィノース、ラクチトール、ソルビトールおよびラクトビオン酸、グルコース、マルツロース、イソマルツロース、ラクツロース、マルトース、ラクトース、イソマルトース、マルチトール、パラチニット、スタキオース、マレジトース、デキストラン、またはそれらの組合せから選択されるものなどの非晶質糖である。一実施形態において、凍結保護剤は、スクロース、トレハロース、ラクトース、ラフィノース、デキストラン、マンニトールおよびそれらの組合せから選択される非晶質糖である。
【００５６】
特定の実施形態において、凍結保護剤または非晶質糖は、トレハロース、スクロースまたはトレハロースとスクロース、ラクトース、ラフィノース、デキストランおよびマンニトールから選択されるものなどの第２の非晶質糖との組合せである。あるいは、凍結保護剤は、トレハロース、スクロースまたはスクロースとトレハロースの組合せである。別の実施形態において、凍結保護剤は、トレハロースまたはトレハロースとスクロースとの組合せである。さらに別の実施形態において、凍結保護剤はトレハロースである。
【００５７】
本明細書の実施形態に従って選択される凍結保護剤は、定義される量で存在し得る。ある実施形態において、水性混合物は、少なくとも２．５％（ｗ／ｖ）、少なくとも３％（ｗ／ｖ）、少なくとも３．５％（ｗ／ｖ）、少なくとも４％（ｗ／ｖ）、少なくとも４．５％（ｗ／ｖ）、少なくとも５％（ｗ／ｖ）、または少なくとも６％（ｗ／ｖ）の本明細書の上記で選択される凍結保護剤を含有する。別の実施形態において、凍結保護剤は、水性混合物中に１７．５％（ｗ／ｖ）未満、例えば、１５％（ｗ／ｖ）未満、１２．５％（ｗ／ｖ）未満、１１％（ｗ／ｖ）未満、１０％（ｗ／ｖ）未満、または９．５％（ｗ／ｖ）未満の総量で存在する。言い換えれば、凍結保護剤は、水性混合物中に少なくとも４％、少なくとも４．５％または少なくとも５％（ｗ／ｖ％）１５％未満、１２．５％未満、１１％未満または１０％（ｗ／ｖ％）未満の総量で存在する。
【００５８】
水性混合物中の凍結保護剤の総濃度は好適には、５〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲である。一実施形態では、少なくとも５％、５〜１５％、または５〜１０％（ｗ／ｖ％）のトレハロースが使用される。一実施形態では、８％、８．５％、９％または９．２５％のトレハロースが使用される。特定の実施形態において、水性混合物は、少なくとも５％（ｗ／ｖ％）または５〜１０％（ｗ／ｖ％）のスクロース、トレハロースまたはそれらの組合せを含んでなる。別の特定の実施形態において、水性混合物は、少なくとも５％（ｗ／ｖ）のトレハロースを含んでなり、場合により、スクロース、ラクトース、ラフィノース、デキストランおよびマンニトールをさらに含んでなる。
【００５９】
水性混合物または乾燥組成物は、ポロキサマー界面活性剤（例えば、ポロキサマー１８８）、ポリソルベート界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０および／またはポリソルベート２０）、オクトキシナール(octoxinal)界面活性剤、ポリドカノール界面活性剤、ポリオキシルステアレート界面活性剤、ポリオキシルヒマシ油界面活性剤、Ｎ−オクチル−グルコシド界面活性剤、マクロゴール１５ヒドロキシステアレート、およびそれらの組合せから選択される界面活性剤をさらに含み得る。ある実施形態において、界面活性剤は、ポロキサマー界面活性剤（例えば、ポロキサマー１８８）、ポリソルベート界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０および／またはポリソルベート２０）、特に、ポリソルベート界面活性剤、例えば、ポリソルベート８０から選択される。
【００６０】
一実施形態において、界面活性剤は、水性混合物に関して計算した場合、少なくとも０．００１％、少なくとも０．００５％、少なくとも０．０１％（ｗ／ｖ）、および／または最大０．５％（ｗ／ｖ）の量で存在する。界面活性剤は、０．２５％未満または０．１％（ｗ／ｖ）未満の量で存在し得る。別の実施形態において、界面活性剤は、０．０２％（ｗ／ｖ）の量で存在する。
【００６１】
特定の実施形態によれば、界面活性剤は、水性混合物中に０．００５％〜０．５％（ｗ／ｖ）、例えば、約０．０２％（ｗ／ｖ）の量で存在するポリソルベート８０またはポロキサマーである。
【００６２】
さらなる実施形態では、バッファーが水性混合物または乾燥組成物に添加される。ｐＨは一般に組成物の治療成分に照らして調整される。好適には、水性混合物のｐＨは、少なくとも６、少なくとも６．５、少なくとも７または少なくとも７．５である。言い換えれば、水性混合物のｐＨは、１０未満、９．５未満、９未満または８．５未満であり得る。他の実施形態において、水性混合物のｐＨは、６〜１０、７〜９．５、７．５〜９．５、または約７．５、例えば、７．５＋／−０．５、または８．５＋／−０．５である。至適ｐＨは一つには、調剤された特定のアデノウイルスベクターおよび／またはそこに組み込まれる導入遺伝子によっても決定される。
【００６３】
適当なバッファーは、トリス、コハク酸塩（succinate）、ホウ酸塩（borate）、トリス−マレイン酸塩（Tris-maleate）、リシン、ヒスチジン、グリシン、グリシルグリシン、クエン酸塩（citrate）、炭酸塩（carbonate）またはそれらの組合せから選択され得る。一実施形態において、バッファーは、トリス、コハク酸塩またはホウ酸塩である。さらなる実施形態において、バッファーはトリスである。
【００６４】
バッファーは、水性混合物中に少なくとも０．５ｍＭ、少なくとも１ｍＭ、少なくとも２ｍＭまたは少なくとも５ｍＭの量で存在し得る。または、バッファーは、水性混合物中に５０ｍＭ未満、４０ｍＭ未満、３０ｍＭ未満または２０ｍＭ未満の量で存在し得る。例えば、バッファーは、０．５ｍＭ〜５０ｍＭ、１ｍＭ〜５０ｍＭまたは２ｍＭ〜２０ｍＭの量で存在し得る。一実施形態において、バッファーは、約１０ｍＭの量で存在する。
【００６５】
特定の実施形態によれば、バッファーは、水性混合物中に２〜２０ｍＭ、例えば、約１０ｍＭで存在するトリスである。
【００６６】
ある実施形態において、組成物はまた、最大または約２０ｍＭの量、例えば、約１０ｍＭ濃度でヒスチジンを含んでなる。
【００６７】
さらなる実施形態によれば、組成物はまた、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２またはＭｇＳＯ４などの塩の形態で、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋またはＭｇ２＋などの二価金属イオンを含んでなる。一実施形態において、二価金属イオンはＭｇ２＋である。二価金属イオンが水性混合物中に存在する典型的な量は、０．５〜１０ｍＭ、例えば、１または２ｍＭ、または特に１ｍＭである。
【００６８】
本発明の実施形態を記載する目的で、組成物中への包含が考慮される賦形剤（すなわち、塩、塩化ナトリウム、凍結保護剤、バッファー、界面活性剤および本明細書に記載の他のもの）の特定の量は、一般に（特に断りのない限り）、水性混合物の容量に対して計算されたｗ／ｖ％として表される。あるいは、水性混合物がフリーズドライおよび再構成される場合には、賦形剤の量は、再構成された組成物の容量に対して計算されたｗ／ｖ％として表してもよい。
【００６９】
一実施形態において、本明細書に記載の水性混合物および／または（フリーズドライ）組成物は、哺乳動物、例えば、ヒト対象に投与され得る。本明細書に記載の水性混合物またはフリーズドライ組成物としての調剤に関しては、特に、治療用または免疫原性タンパク質である、導入遺伝子をコードするアデノウイルスベクター（すなわち、組換えアデノウイルスベクター）を含んでなる混合物または組成物が考慮される。
【００７０】
水性混合物または乾燥組成物は、シリコン処理または非シリコン処理いずれかのガラスバイアル中に包含され得る。一実施形態において、水性混合物または乾燥組成物は、非シリコン処理バイアル中に準備される。好適な水性混合物は非シリコン処理バイアルに包含され得、そのバイアル中に包含された際にフリーズドライされ得る。
【００７１】
本発明はまた、アニーリング工程を含んでなる、アデノウイルスベクターを含有する液体、例えば、本明細書に定義される水性混合物をフリーズドライさせて乾燥組成物を得るための方法を提供する。凍結乾燥またはフリーズドライサイクルは通常、３つのプロセス相からなる。プロセスの第１相では、ほとんどの水溶液または混合物が凍結される。次に、まず、一次乾燥中の昇華により水が除去される。第３相では、二次乾燥中の拡散および脱着により非凍結水が除去される。本発明者らは、今般、凍結乾燥サイクルの凍結相の際のアニーリング工程の導入がアデノウイルスベクターの安定性に予期されないプラスの影響を持つことを見出した。
【００７２】
よって、本発明はまた、フリーズドライサイクルの凍結工程がアニーリング工程を含んでなる、アデノウイルスベクターを含有する液体、例えば、本明細書に記載の水性混合物をフリーズドライするための方法も提供する。
【００７３】
記載の方法を定義する目的で、以下の用語は当技術分野で知られている通りに使用される。用語「ガラス転移温度」または「Ｔｇ」は、非晶質固体が加熱時に軟化する、または冷却時に脆くなる温度である。用語「Ｔｇ’」は、凍結状態のガラス転移温度を意味する。用語「崩壊温度」または「Ｔｃ」は、非晶質物質がその固有の構造をもはや支持できない程度まで軟化する温度を意味する。用語「フリーズドライする」と「凍結乾燥する」、ならびに「凍結乾燥された」と「凍結乾燥された」は互換的に使用され、湿潤物質を急送凍結した後に減圧下での脱水を行う、同じプロセスを意味する。
【００７４】
用語「アニーリング工程」は、本明細書で使用する場合、凍結相中に生成物が特定の氷点下温度で所定の時間維持されるという、組成物のフリーズドライサイクルにおける方法工程を意味する。当業者に公知のように、アニーリングは氷結晶のオストワルド熟成と非晶質マトリックスの低温濃縮をもたらす。一般に、アニーリング温度はＴｇ’より（やや)高い。一実施形態において、アニーリングは、（Ｔｇ’＋０．５℃）〜（Ｔｇ’＋２０℃）の温度、例えば、−１５℃＋／−９℃もしくは−１５℃＋／−６℃の温度、または（Ｔｇ’＋０．５℃）〜（Ｔｇ’＋１０℃）の温度で行われる。いずれにせよ、アニーリング温度は、アニーリング中、Ｔｇ’〜融解温度（Ｔｍ）であるべきである。特定の実施形態において、アニーリングは、−４℃〜−２４℃、あるいは−４℃〜−２０℃、あるいは−４℃〜−１５℃、あるいはまた−８℃〜−１５℃の温度で行われる。アニーリングは、生成物の凍結中、すなわち、生成物が凍結され（固体状態）ガラス状態（Ｔｇ’未満）である限り、凍結サンプルが形成されている間に行うことができる。あるいは、アニーリングは、生成物の凍結後に行われる。
【００７５】
特定の実施形態において、より詳しくは水性混合物が約または少なくとも９％（ｗ／ｖ）トレハロースを含んでなる場合には、アニーリング温度は約−１０℃（例えば、−１０℃＋／−１℃）である。
【００７６】
ある実施形態において、生成物は、アニーリング工程の前に凍結される（すなわち、Ｔｇ’より低い生成物温度）。ある実施形態において、凍結は、サンプルまたは水性混合物を、Ｔｇ’より低い凍結温度の一定の棚温度に曝すことにより達成される。別の実施形態において、生成物は、シェルフランプフリージング(shelf-ramp freezing)を適用すること、すなわち、棚温度をＴｇ’より低い凍結温度に徐々に降下させることにより凍結することができる。実施形態によれば、凍結温度は、Ｔｇ’より５℃低い温度、Ｔｇ’ より７．５℃低い温度、またはＴｇ’より１０℃低い温度、例えば−５０℃以下である。ある実施形態によれば、フリーズドライサイクルが開始される時点の生成物温度（すなわち、フリーズドライ機内のサンプルの温度）は、＋２℃〜＋８℃である。
【００７７】
シェルフランプフリージング（shelf-ramp freezing）を適用する場合、温度は少なくとも０．１℃／分、少なくとも０．２℃／分、少なくとも０．３℃／分または少なくとも０．５℃／分の速度、および／または１０℃／分未満、７．５℃／分、５℃／分または３℃／分未満の速度で降下される。あるいは、温度は、０．１〜１０℃／分、０．１〜５℃／分、０．２〜３℃／分、または０．３〜１℃／分の速度で降下される。さらなる実施形態によれば、達成された棚温度は約または少なくとも１時間（または６０分）維持される。
【００７８】
生成物がアニーリング工程の適用前に凍結される状況に対するさらなる実施形態において、サンプルまたは生成物の初期凍結後、アニーリング工程を開始するために棚温度はＴｇ’より高い温度、例えば、Ｔｇ’より０．５℃高い、Ｔｇ’より１℃高い、Ｔｇ’より３℃高い、Ｔｇ’より５℃高い、Ｔｇ’より１０℃高いまたはＴｇ’より２０℃高い温度に上昇される。いずれにせよ、温度は、アニーリング中、Ｔｍより低く維持される。ある実施形態において、温度は、少なくとも０．１℃／分、少なくとも０．２℃／分、少なくとも０．３℃／分または少なくとも０．５℃／分の速度、および／または１０℃／分未満、７．５℃／分、５℃／分または３℃／分未満の速度で上昇される。あるいは、温度は、０．１〜１０℃／分、０．１〜５℃／分、０．２〜３℃／分、または０．３〜１℃／分の速度で上昇される。さらなる実施形態によれば、アニーリング温度は、少なくとも２時間および／または最大４時間維持される。
【００７９】
さらなる実施形態において、アニーリング工程後、棚温度は、減圧下での乾燥を開始する前に、Ｔｇ’より低い温度、例えば、Ｔｇ’より５℃低い、Ｔｇ’より７．５℃低い、またはＴｇ’より１０℃低い温度、例えば、−５０℃以下に降下される。ある実施形態において、これを達成するために、温度は、少なくとも０．１℃／分、少なくとも０．２℃／分、少なくとも０．３℃／分または少なくとも０．５℃／分の速度、および／または１０℃／分未満、７．５℃／分未満、５℃／分未満または３℃／分未満の速度で降下される。あるいは、温度は、０．１〜１０℃／分、０．１〜５℃／分、０．２〜３℃／分、または０．３〜１℃／分の速度で降下される。さらなる実施形態によれば、達成された棚温度は、約または少なくとも１時間（または６０分）維持される。
【００８０】
本明細書に記載の凍結乾燥法の工程ｂ．ｉｉ．で企図される減圧下での乾燥は一般に、２相、すなわち、一次乾燥および二次乾燥で行われる。ある実施形態において、本方法の工程ｂ．ｉｉ．は、
・生成物のＴｃより低い温度での一次乾燥のための工程ｂ．ｉｉ．１．、および
・生成物のＴｃより高く、かつ、生成物のＴｇより低い温度での二次乾燥のための工程ｂ．ｉｉ．２．
を含む。
【００８１】
さらなる実施形態において、一次乾燥は、９０μｂａｒより低いおよび／または４０μｂａｒより高い圧力で行われる。一次乾燥条件は、最大２４時間またはそれより長く適用し得る。
【００８２】
別の実施形態は、０．１℃／分、少なくとも０．２℃／分、少なくとも０．３℃／分または少なくとも０．５℃／分の速度、および／または３℃／分未満、２℃／分未満、または１℃／分未満の速度で棚温度を上昇させることにより達成される二次乾燥温度に関する。あるいは、二次乾燥温度は、０．１〜３℃／分、０．２〜２℃／分、または０．３〜１℃／分の速度で棚温度を上昇させることにより達成される。さらに別の実施形態によれば、二次乾燥温度は少なくとも−１０℃および／または２５℃より低い。二次乾燥条件は、少なくとももしくは約３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、または少なくとももしくは約６時間適用し得る。
【００８３】
以下、本発明を下記の限定されない例によりさらに説明する。
【実施例】
【００８４】
実施例１
本実験の目的は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するＣｈＡｄ３の力価に及ぼすフリーズドライサイクル中のアニーリング工程の影響を評価することであった。ＣｈＡｄ３粒子を、賦形剤トリス１０ｍＭ（ｐＨ７．４）−ヒスチジン１０ｍＭ−ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ  １ｍＭ−ツィーン８０  ０．０２％（ｍ／Ｖ）−２５ｍＭ  ＮａＣｌ−８％スクロース（ｍ／Ｖ）をさらに含んでなる水性混合物中に調剤した。ウイルス粒子の濃度は２．５．１０１０ｖｐ／ｍｌであった。調剤工程の後、３ｍｌの非シリコン処理１型ガラスバイアルに０．５ｍｌ±０．０５の水性混合物を用いて充填を行った。次に、これらのバイアルを、Ｈｅｌｖｏｅｔ  ＦＭ４６０ブロモブチルストッパーをフリーズドライポジションで挿入（フリーズドライサイクル中に水蒸気を逃がすように部分的に挿入）して部分的に封止した。サンプルの半分をフリーズドライ機のチャンバーに移し、アニーリング工程を含んでなり（図２に示される通り）、以下の工程から構成されるフリーズドライサイクルを行った。
【００８５】
１．凍結：
・棚温度を−５２℃に設定した。棚温度が−４５℃以下になった際に、充填済みのバイアルをフリーズドライ機に装填した。次に、サンプルを−５２℃で最低１時間冷却した。
【００８６】
２．アニーリング工程：
・（１）棚温度を１時間で目標アニーリング温度（−１５℃）となるように上昇させた。
・（２）アニーリング温度を２時間維持した。
・（３）棚温度を再び−１５℃から−５０℃に１時間かけて降下させた。
・（４）生成物を−５０℃で少なくとも１時間維持した。
【００８７】
３．一次乾燥：
・チャンバー圧力を８０μｂａｒに設定し、棚温度を−５２℃から−３０℃に３時間かけて上昇させた。棚温度およびチャンバー圧力を２４時間維持した。
【００８８】
４．二次乾燥：
・棚温度を−３０℃から１７℃に６時間かけて上昇させるとともに、チャンバー圧力を４０μｂａｒに降下させた。棚温度が１７℃に到達した際に、これらの条件を６時間維持した。
【００８９】
フリーズドライサイクルの終了時に、チャンバーにチャンバー圧力が８２５ｍｂａｒとなるまで乾燥窒素を充填した後、バイアルにストッパーを完全に挿入した（ストッパリング）。ストッパリングが完了したところで、取り出しのためにチャンバー圧力を大気圧と平衡化した。チャンバー温度は、バイアルが取り出されるまで＋２〜＋８℃に維持した。次に、これらのバイアルを取り出し、アルミフリップオフキャップでオーバーシールを施した。
【００９０】
アニーリング工程の影響を評価するために、フリーズドライサイクルの工程２．（３）と工程２．（４）の間に、充填バイアルの第２の半分をフリーズドライ機のチャンバーに装填した。
この実験の結果を下表に示す。
【００９１】
【表１】
0006797891.tif 000002
【００９２】
本明細書で報告される定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、ウイルス含量を決定することを可能とする。この検定は、アデノウイルス中に存在するｈＣＭＶプロモーターを標的とする。ＤＮＡサンプルは、Ｑｕｉａｇｅｎ  ＱＩＡｍｐ  ９６  ＤＮＡ血液を用いて抽出された。
【００９３】
ピコグリーン（登録商標）アッセイは、ウイルス粒子の分解を測定とする。Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ピコグリーン（登録商標）ｄｓＤＮＡ試薬は、溶液中の二本鎖ＤＮＡを定量するための超高感度蛍光核酸染剤である。
【００９４】
感染力は、発現される導入遺伝子（本実施例の場合はＧＦＰである）の量に基づいて決定される。アッセイは、２４時間の感染の後にフローサイトメトリー検出を用いてＧＦＰを発現する細胞を測定する。
【００９５】
実施例２
この実験の目的は、ｅＧＦＰを発現するＣｈＡｄ３の力価に及ぼすフリーズドライサイクル中のアニーリング工程の影響を評価することであった。ＣｈＡｄ３粒子を、賦形剤トリス１０ｍＭ（ｐＨ７．４）−ヒスチジン１０ｍＭ−ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ  １ｍＭ−ツィーン８０  ０．０２％（ｗ／ｖ）−２５ｍＭ  ＮａＣｌ−８％スクロース（ｗ／ｖ）をさらに含んでなる水性混合物中に調剤した。ウイルス粒子の濃度は２．５．１０１０ｖｐ／ｍｌであった。調剤工程の後、３ｍｌの非シリコン処理１型ガラスバイアルに０．５ｍｌ±０．０５の水性混合物を用いて充填を行った。次に、これらのバイアルを、Ｈｅｌｖｏｅｔ  ＦＭ４６０ブロモブチルストッパーをフリーズドライポジションで挿入（フリーズドライサイクル中に水蒸気を逃がすように部分的に挿入）して部分的に封止した。サンプルの半分をフリーズドライ機のチャンバーに移し、アニーリング工程を含んでなり（図２に示される通り）、以下の工程から構成されるフリーズドライサイクルを行った。
【００９６】
１．凍結：
・棚温度を−５２℃に設定した。棚温度が−４５℃以下になった際に、充填済みのバイアルをフリーズドライ機に装填した。次に、サンプルを−５２℃で最低１時間冷却した。
【００９７】
２．アニーリング工程：
・（１）棚温度を１時間で目標アニーリング温度（−１５℃）となるように上昇させた。
・（２）アニーリング温度を２時間維持した。
・（３）棚温度を再び−１５℃から−５０℃に１時間かけて降下させた。
・（４）生成物を−５０℃で少なくとも１時間維持した。
【００９８】
３．一次乾燥：
・チャンバー圧力を８０μｂａｒに設定し、棚温度を−５２℃から−３０℃に３時間かけて上昇させた。棚温度およびチャンバー圧力を２４時間維持した。
【００９９】
４．二次乾燥：
・棚温度を−３０℃から１７℃に６時間かけて上昇させるとともに、チャンバー圧力を４０μｂａｒに降下させた。棚温度が１７℃に到達した際に、これらの条件を３時間維持した。
【０１００】
フリーズドライサイクルの終了時に、チャンバーにチャンバー圧力が８２５ｍｂａｒとなるまで乾燥窒素を充填した。バイアルにストッパーを装着し、ストッパリングが完了したところで、取り出しのためにチャンバー圧力を大気圧と平衡化した。チャンバー温度は、バイアルが取り出されるまで＋２〜＋８℃に維持した。次に、これらのバイアルを取り出し、アルミフリップオフキャップでオーバーシールを施した。
【０１０１】
同じフリーズドライサイクルを用いてアニーリングされたサンプルとアニーリングされていないものを比較するために、フリーズドライサイクルの工程２．（３）と工程２．（４）の間に、充填バイアルの第２の半分をフリーズドライ機のチャンバーに装填した。
この実験の結果を下表に示す。
【０１０２】
【表２】
0006797891.tif 000003
【０１０３】
ｑＰＣＲ、感染力およびピコグリーン（登録商標）測定は、実施例１に関して記載した通りであった。
【０１０４】
実施例３
この実験の目的は、０〜５０ｍＭの範囲の異なる量のＮａＣｌの存在下で調剤した場合のアデノウイルスベクターの安定性を評価することであった。等張性はスクロースの補完的添加により維持した。ＣｈＡｄ３Ｅｂｏｚ構築物では、本実験に使用したアデノウイルスベクター、チンパンジーアデノウイルス３は、ザイール株エボラ糖タンパク質をコードするベクターとして使用する（ＷＯ２０１１／１３０６２７に記載のとおり）。よって、表１に列挙した条件を、５，０．１０９ｖｐ／ｍｌ用量のＣｈＡｄ３Ｅｂｏｚを用いて試験した。
【０１０５】
サンプルを３０℃で３日間維持し、その後、アデノウイルス粒子の安定性に及ぼす影響をｑＰＣＲ（プロモーター配列を標的とすることによりウイルス含量を測定する）および感染力（感染２４時間後にアデノウイルスヘキソンカプシドタンパク質に関して染色した細胞のフローサイトメトリー検出によりアデノウイルス粒子の感染力を測定する）を用いて評価した。試験の結果を表１に列挙する。
【０１０６】
【表３】
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【０１０７】
ｑＰＣＲ、感染力およびピコグリーン（登録商標）測定は、実施例１に関して記載した通りであった。
【０１０８】
実施例４
本実施例では、３つの組成物（組成物（ａ）、（ｂ）および（ｃ））を動的光散乱（ＤＬＳ）により評価し、それぞれフリーズドライ生成物の３つの異なる保存条件に従った。試験した保存条件は、４℃で１か月（Ｔ１ｍ４）、２５℃で１週間（Ｔ１ｗ２５）および３７℃で３日（Ｔ３ｄ３７）であった。適用したフリーズドライサイクルは実施例１と同じである（図１）。
【０１０９】
組成物（ａ）：ＣｈＡｄ３Ｅｂｏｚ  １．１０１１ｖｐ／ｍｌ、トリス１０ｍＭ  ｐＨ７．５、ヒスチジン１０ｍＭ、ＮａＣｌ  ２５ｍＭ、スクロース８％、ＭｇＣｌ２  １ｍＭ、ポリソルベート８０  ０．０２％
組成物（ｂ）：ＣｈＡｄ３Ｅｂｏｚ  １．１０１１ｖｐ／ｍｌ、トリス１０ｍＭ  ｐＨ７．５、ヒスチジン１０ｍＭ、  ＮａＣｌ  ６ｍＭ（残留）、トレハロース７％、スクロース２％（残留）、ＭｇＣｌ２  １ｍＭ、ポリソルベート８０  ０．０２％
組成物（ｃ）：ＣｈＡｄ３Ｅｂｏｚ  １．１０１１ｖｐ／ｍｌ、トリス１０ｍＭ  ｐＨ７．５、ヒスチジン１０ｍＭ、ＮａＣｌ  ６ｍＭ（残留）、トレハロース７％、スクロース２％（残留）、ＭｇＣｌ２  １ｍＭ、ポロキサマー１８８  ０．１５％
【０１１０】
６０℃で３０分の処理の前後のＣｈＡｄ３Ｅｂｏｚ出発材料の２サンプルをそれぞれ、陽性対照および陰性対照として使用した。
実験の結果を図３に示す。
【０１１１】
実施例５
ＣｈＡｄ３Ｅｂｏｚを、（Ａ）スクロース８％、ＮａＣｌ  ２５ｍＭ、トリス１０ｍＭ  ｐＨ７．４、ヒスチジン１０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １ｍＭおよびポリソルベート８０  ０．０２％、または（Ｂ）トレハロース７％、スクロース２％（残留）、ＮａＣｌ  ６ｍＭ  、トリス１０ｍＭ  ｐＨ７．４、ヒスチジン１０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １ｍＭおよびポリソルベート８０  ０．０２％のいずれかを用いて調剤した。実施例１に関して記載されたようにアニーリング工程無しのフリーズドライサイクルを適用してフリーズドライサンプルを得た。下記の再水和媒体を試験した：
・４℃で１か月（Ｔ１ｍ４）の乾燥組成物の保存後：ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、ＮａＣｌ  ３０ｍＭ、および注射水
・４℃で２か月（Ｔ２ｍ４）の乾燥組成物の保存後：ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、スクロース９．２５％、トレハロース９．２５％および注射水
【０１１２】
６０℃で３０分の処理の前後両方のバルクＣｈＡｄ３Ｅｂｏｚの２サンプルをそれぞれ、陽性対照および陰性対照として使用した。
【０１１３】
乾燥組成物の再構成時のカプシドの破壊を、ピコグリーン（登録商標）アッセイを用いて評価した。Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ピコグリーン（登録商標）は、溶液中の二本鎖ＤＮＡを定量するための超高感度蛍光核酸である。
【０１１４】
図４．Ｉ（Ｔ１ｍ４℃時点）のグラフに示されるように、外部相中の遊離ＤＮＡは再水和媒体のＮａＣｌ濃度に正比例した（ＷＦＩ＜ＮａＣｌ  ３０ｍＭ＜ＮａＣｌ  １５０ｍＭ）。加えて、トレハロースに基づく製剤（Ａ）は、低塩濃度再水和媒体（ＷＦＩおよびＮａＣｌ  ３０ｍＭ）を用いた場合、スクロースに基づく製剤（Ｂ）よりも良好なカプシド  安定性を与えた。
【０１１５】
図４．ＩＩ（Ｔ２ｍ４℃時点）のグラフに示されるように、４℃で２か月保存した低温サンプルで塩不含再水和媒体（スクロース９．２５％ｗ／ｖおよびトレハロース９．２５％ｗ／ｖ）を用いた場合に、ＷＦＩに匹敵する結果が得られた。また、この場合にも、トレハロースに基づく製剤（Ａ）は、低塩濃度再水和媒体（ＷＦＩ、トレハロース９．２５％ｗ／ｖおよびスクロース９．２５％ｗ／ｖ）を用いた場合、スクロースに基づく製剤（Ｂ）よりも良好なカプシド安定性を与えた。
【０１１６】
実施例６
この実験の目的は、以上でＣｈＡｄ３ベクターに関する前記実施例に記載されるものと同じ条件下で、ＣｈＡｄ１５５ベクターのフリーズドライの実現可能性を評価することであった。本実験に使用したＣｈＡｄ１５５ベクターは、呼吸器合胞体ウイルスタンパク質をコードし、ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０６３２９７に記載されている。
【０１１７】
評価した条件は下記の通りであった。
・実施例１で適用したフリーズドライサイクル（図１参照、以下サイクルＩと呼称）を、−１０℃でアニーリング工程および６時間かけて１０℃に上げるだけの二次乾燥を行い、この時点で止めたこと以外は図１と同じ手順を含むフリーズドライサイクル（図５参照、以下サイクルＩＩと呼称）と比較する。
・トレハロースおよびヒスチジン含量の影響を４つの組成物：
組成物（ａ）：ＣｈＡｄ１５５  １．１０１１ｐＵ／ｍｌ、トリス１０ｍＭ  ｐＨ８．５、ポリソルベート８０  ０．０２％、ＭｇＣｌ２  １ｍＭ、トレハロース９％、ＮａＣｌ  ８ｍＭ、スクロース２．５％、ヒスチジン１０ｍＭ
組成物（ｂ）：ＣｈＡｄ１５５  １．１０１１ｐＵ／ｍｌ、トリス１０ｍＭ  ｐＨ８．５、ポリソルベート８０  ０．０２％、ＭｇＣｌ２  １ｍＭ、トレハロース９％、ＮａＣｌ  ８ｍＭ、スクロース２．５％
組成物（ｃ）：ＣｈＡｄ１５５  １．１０１１ｐＵ／ｍｌ、トリス１０ｍＭ  ｐＨ８．５、ポリソルベート８０  ０．０２％、ＭｇＣｌ２  １ｍＭ、トレハロース７％、ＮａＣｌ  ６ｍＭ（残留）、スクロース２．５％、ヒスチジン１０ｍＭ
組成物（ｄ）：ＣｈＡｄ１５５  １．１０１１ｐＵ／ｍｌ、トリス１０ｍＭ  ｐＨ８．５、ポリソルベート８０  ０．０２％、ＭｇＣｌ２  １ｍＭ、トレハロース７％、ＮａＣｌ  ６ｍＭ（残留）、スクロース２．５％
を比較することにより評価した。
【０１１８】
フリーズドライ生成物を注射水で再構成する。
【０１１９】
６０℃で３０分の処理の前後両方のバルクＣｈＡｄ１５５の２サンプルをそれぞれ、陽性対照および陰性対照として使用した。
【０１２０】
乾燥組成物の再構成時のカプシドの破壊を、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ピコグリーン（登録商標）アッセイ（溶液中の二本鎖ＤＮＡを定量するための超高感度蛍光核酸）および感染力（アデノウイルスヘキソンカプシドタンパク質を染色した細胞のフローサイトメトリー検出によるアデノウイルス粒子の感染力を測定する）を用いて評価した。
この実験の結果を下表に示す（図５および６のグラスを参照）：
【０１２１】
【表４】
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【０１２２】
実施例７
この実験は、生成物の完全性に及ぼすアニーリング工程の保護的影響を確認すること、および二次乾燥中に処理される脱着速度の影響を測定することを目的とした。
【０１２３】
実施例６で選択されたフリーズドライサイクル（図５参照）を用いて、３時間のトレイのアニーリング工程および二次乾燥トレイ６時間を加えて１２時間までの脱着速度を評価した。評価は、実施例６の組成物（ａ）：ＣｈＡｄ１５５  １．１０１１ｐＵ／ｍｌ、トリス１０ｍＭ  ｐＨ８．５、ポリソルベート８０  ０．０２％、ＭｇＣｌ２  １ｍＭ、トレハロース９％、ＮａＣｌ  ８ｍＭ、スクロース２．５％、ヒスチジン１０ｍＭに基づいて行った。
【０１２４】
フリーズドライ生成物を注射水で再構成した。
【０１２５】
６０℃で３０分の処理の前後両方のバルクＣｈＡｄ１５５の２サンプルをそれぞれ、陽性対照および陰性対照として使用した。
【０１２６】
乾燥組成物の再構成時のカプシドの破壊を、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ピコグリーン（登録商標）アッセイ（溶液中の二本鎖ＤＮＡを定量するための超高感度蛍光核酸）およびＣＣＩＤ５０（感染宿主の５０％を死滅させるまたは接種した細胞培養物の５０％に細胞変性効果（ＣＰＥ）を誘導するのに必要とされるウイルスの定量）による感染力を用いて評価した。
【０１２７】
この実験の結果を下表に示し、図８および９に表す。
【０１２８】
【表５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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