(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
小型熱ショックタンパク質と、
前記小型熱ショックタンパク質上に配置され、蛍光共鳴エネルギー転移が可能なドナー分子及びアクセプター分子と、を備え、
前記ドナー分子及び前記アクセプター分子は、蛍光共鳴エネルギー転移を起こす距離に近接して配置された、膵液検出用蛍光プローブ。
【請求項２】
前記ドナー分子を基準とした前記アクセプター分子のモル比が０．１〜１０である、請求項１に記載の膵液検出用蛍光プローブ。
【請求項３】
前記ドナー分子は前記小型熱ショックタンパク質の内側に位置し、前記アクセプター分子は前記小型熱ショックタンパク質の外側に位置する、請求項１又は２に記載の膵液検出用蛍光プローブ。
【請求項４】
注射剤である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の膵液検出用蛍光プローブ。
【請求項５】
体液試料と、請求項１〜４のいずれか一項に記載の膵液検出用蛍光プローブとを接触させる工程と、
前記膵液検出用蛍光プローブの蛍光共鳴エネルギー転移の変化を測定する工程と、を備え、
前記膵液検出用蛍光プローブの蛍光共鳴エネルギー転移の減少が、前記体液試料中に膵液が存在することを示す、膵液検出方法。
【請求項６】
手術中の患者の体腔内に散布された、請求項１〜４のいずれか一項に記載の膵液検出用蛍光プローブの蛍光共鳴エネルギー転移の変化を測定する工程を備え、
前記膵液検出用蛍光プローブの蛍光共鳴エネルギー転移の減少が、前記患者の体腔内に膵液が存在することを示す、膵液検出方法。
【請求項７】
手術中の患者の体腔内で、患者の血液中に予め投与された、請求項１〜４のいずれか一項に記載の膵液検出用蛍光プローブの蛍光共鳴エネルギー転移の変化を測定する工程を備え、
前記膵液検出用蛍光プローブの蛍光共鳴エネルギー転移の減少が、前記患者の体腔内に膵液が存在することを示す、膵液検出方法。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の膵液検出用蛍光プローブを備える、膵液検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵液検出用蛍光プローブ、膵液検出方法及び膵液検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
膵液漏とは、膵臓から分泌される膵液が体腔内に漏れる症状のことであり、上部消化管、胆嚢、膵臓等の手術後の合併症としてしばしば発生する。例えば、膵臓実質切離後の膵液漏は一般的には１０〜５０％の頻度で発生する。
【０００３】
膵液は多量の消化酵素（あるいはその前駆体）を含んでいるために、感染症を誘発したり、周辺動脈壁の破綻や仮性動脈瘤を形成し、腹腔内出血の原因になる場合がある。したがって、膵液漏が発生すると極めて予後不良であり、絶食をともなう１ヶ月以上の入院が必要となることも多い。
【０００４】
膵液漏は、漏れ出す膵液が無色透明であるため、手術中に目視で確認することは困難である。したがって、現在、臨床での膵液漏の診断は、腹腔内ドレーンの廃液中に含まれるアミラーゼ又はリパーゼの生化学的検査によって行われている。しかしながら、この方法では、膵液漏の有無や漏出個所を手術中に正確に判断することはできない。
【０００５】
ところで、蛍光共鳴エネルギー転移を利用した多数の検出技術が知られている。例えば特許文献１には、蛍光性ポリマーのマトリックス中に蛍光色素が分散したポリマーナノ微粒子であって、該微粒子表面が界面活性剤で保護され、前記蛍光性ポリマーと前記蛍光色素間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）で蛍光を発光することを特徴とするポリマーナノ微粒子が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１０−８３８６０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、手術中に漏出した膵液の存在を、迅速かつ高感度に検出することができる技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は以下の態様を含む。
（１）タンパク質担体と、前記タンパク質担体上に配置され、蛍光共鳴エネルギー転移が可能なドナー分子及びアクセプター分子と、を備え、前記ドナー分子及び前記アクセプター分子は、蛍光共鳴エネルギー転移を起こす距離に近接して配置された、膵液検出用蛍光プローブ。
（２）前記タンパク質担体が小型熱ショックタンパク質である、請求項１に記載の膵液検出用蛍光プローブ。
（３）前記ドナー分子を基準とした前記アクセプター分子のモル比が０．１〜１０である、（１）又は（２）に記載の膵液検出用蛍光プローブ。
（４）前記ドナー分子は前記タンパク質担体の内側に位置し、前記アクセプター分子は前記タンパク質担体の外側に位置する、（１）〜（３）のいずれかに記載の膵液検出用蛍光プローブ。
（５）注射剤である、（１）〜（４）のいずれかに記載の膵液検出用蛍光プローブ。
（６）体液試料と、（１）〜（５）のいずれかに記載の膵液検出用蛍光プローブとを接触させる工程と、前記膵液検出用蛍光プローブの蛍光共鳴エネルギー転移の変化を測定する工程と、を備え、前記膵液検出用蛍光プローブの蛍光共鳴エネルギー転移の減少が、前記体液試料中に膵液が存在することを示す、膵液検出方法。
（７）手術中の患者の体腔内に散布された、（１）〜（５）のいずれかに記載の膵液検出用蛍光プローブの蛍光共鳴エネルギー転移の変化を測定する工程を備え、前記膵液検出用蛍光プローブの蛍光共鳴エネルギー転移の減少が、前記患者の体腔内に膵液が存在することを示す、膵液検出方法。
（８）手術中の患者の体腔内で、患者の血液中に予め投与された、（１）〜（５）のいずれかに記載の膵液検出用蛍光プローブの蛍光共鳴エネルギー転移の変化を測定する工程を備え、前記膵液検出用蛍光プローブの蛍光共鳴エネルギー転移の減少が、前記患者の体腔内に膵液が存在することを示す、膵液検出方法。
（９）（１）〜（５）のいずれかに記載の膵液検出用蛍光プローブを備える、膵液検出用キット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、手術中に漏出した膵液の存在を、迅速かつ高感度に検出することができる技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】１実施形態の膵液検出用蛍光プローブを説明する模式図である。
【図２】実験例１の結果を示すグラフである。
【図３】実験例２の結果を示すグラフである。
【図４】実験例３の結果を示すグラフである。
【図５】実験例４の結果を示すグラフである。
【図６】実験例５の結果を示す電子顕微鏡写真である。
【図７】実験例６の結果を示すグラフである。
【図８】（ａ）〜（ｃ）は、実験例７の結果を示すグラフである。
【図９】（ａ）及び（ｂ）は、実験例８の結果を示すグラフである。
【図１０】（ａ）〜（ｆ）は、実験例９の結果を示すグラフである。
【図１１】実験例１０の結果を示すグラフである。
【図１２】（ａ）〜（ｃ）は、実験例１１の結果を示すグラフである。
【図１３】実験例１２の結果を示すグラフである。
【図１４】実験例１３の結果を示すグラフである。
【図１５】（ａ）〜（ｆ）は、実験例１４の結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［膵液検出用蛍光プローブ］
１実施形態において、本発明は、タンパク質担体と、前記タンパク質担体上に配置され、蛍光共鳴エネルギー転移が可能なドナー分子及びアクセプター分子と、を備え、前記ドナー分子及び前記アクセプター分子は、蛍光共鳴エネルギー転移を起こす距離に近接して配置された、膵液検出用蛍光プローブを提供する。
【００１２】
本実施形態の膵液検出用蛍光プローブを構成するタンパク質担体が、膵液中に含まれる消化酵素によって分解されると、蛍光共鳴エネルギー転移（以下、「ＦＲＥＴ」という場合がある。）を起こすドナー分子及びアクセプター分子が離れ、ＦＲＥＴが減少する。この蛍光の変化を検出することにより膵液を検出することができる。
【００１３】
本実施形態の膵液検出用蛍光プローブにおいて、タンパク質担体は特に限定されず、例えば小型熱ショックタンパク質を用いることができる。小型熱ショックタンパク質は、分子シャペロンの一種であり、さまざまな生物種に普遍的に存在し、熱ストレス存在下における細胞機能維持に重要な役割を果たしている。
【００１４】
小型熱ショックタンパク質は、自己組織化による構造形成が可能であり、通常はオリゴマー構造で存在する。熱ストレス等の環境変化に応じてオリゴマー構造が解離し、分子シャペロン機能を発現する。
【００１５】
小型熱ショックタンパク質としては、例えば、古細菌であるメタノコッカス・ジャナシに由来する小型熱ショックタンパク質Ｈｓｐ１６．５が挙げられる。Ｈｓｐ１６．５は、２４量体からなるナノサイズの球状構造体であるナノカプセルを形成する。このナノカプセルは、直径１０ｎｍ、内径６ｎｍの安定な球状粒子であり、その内部に位置選択的に蛍光プローブを固定化することが可能である。このため、ＦＲＥＴの変化を検出するタンパク質担体として好適に用いることができる。
【００１６】
タンパク質担体としては、実施例において後述する、Ｈｓｐ１６．５の第４１番目のグリシン残基をシステイン残基に改変したもの（以下、「ＨｓｐＧ４１Ｃタンパク質」という場合がある。）も好適に利用できる。ＨｓｐＧ４１Ｃタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１に示す。ＨｓｐＧ４１Ｃタンパク質のシステイン残基のチオール基を利用して蛍光分子を共有結合させることにより、上記のナノカプセルの内側に特異的に蛍光分子を配置することができる。また、ＨｓｐＧ４１Ｃタンパク質のアミノ基を利用して蛍光分子を共有結合させることにより、上記のナノカプセルの外側に蛍光分子を配置することができる。
【００１７】
ドナー分子及びアクセプター分子の組み合わせとしては、ＦＲＥＴを起こす蛍光色素の組み合わせであれば特に限定されず、例えば、ＦＡＭとＴＡＭＲＡ、ＶＩＣとＴＡＭＲＡ、フルオレセインとテトラメチルローダミン、シアン色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）と黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、クマリンとフルオレセイン、５−（２−アミノエチルアミノ）−１−ナフタレンスルホン酸ナトリウム水和物（ＥＤＡＮＳ）とＤＡＢＣＹＬ等が挙げられる。膵液検出用蛍光プローブを生体に投与する観点から、ドナー分子及びアクセプター分子は生体毒性が低い化合物であることが好ましい。
【００１８】
図１は、膵液検出用蛍光プローブの１実施形態を説明する模式図である。図１では、ドナー分子として、アレクサフルオロ４８８（インビトロジェン社）を用い、アクセプター分子として、アレクサフルオロ５９４（インビトロジェン社）を使用した例を示している。
【００１９】
図１に示すように、膵液検出用蛍光プローブを作製する方法としては、例えば、ドナー分子を結合させたＨｓｐ１６．５タンパク質及びアクセプター分子を結合させたＨｓｐ１６．５タンパク質を作製する。続いて、これらのＨｓｐ１６．５タンパク質を混合し、サブユニット交換を行う。サブユニット交換は、例えば５０〜７０℃、例えば６０℃で約１時間静置することにより行うことができる。サブユニット交換を行うことにより、上記のドナー分子及びアクセプター分子が同一のナノカプセル内に導入されて近接し、ＦＲＥＴを起こすことが可能となる。
【００２０】
図１の例では、アレクサフルオロ４８８の励起波長である約４９０ｎｍの光を照射すると、ＦＲＥＴによりアレクサフルオロ５９４が励起され、アレクサフルオロ５９４の約６２０ｎｍの蛍光が生じる。
【００２１】
このナノカプセル（膵液検出用蛍光プローブ）を膵液中のプロテアーゼと接触させて、Ｈｓｐ１６．５タンパク質が消化されると、ナノカプセルが破壊され、ドナー分子及びアクセプター分子が離れる。これによりＦＲＥＴが減少し、アレクサフルオロ４８８の励起波長である約４９０ｎｍの光を照射すると、アレクサフルオロ４８８の約５２０ｎｍの蛍光が生じることとなる。
【００２２】
本実施形態の膵液検出用蛍光プローブにおいて、ＦＲＥＴの減少による蛍光の変化は定量的であり、蛍光検出器を使えば１０分程度で検出することができる。ＦＲＥＴの減少による蛍光の変化は、例えば、ドナー分子の励起波長を照射した場合にドナー分子の蛍光強度が上昇することにより検出してもよい。あるいは、ドナー分子の励起波長を照射した場合にアクセプター分子の蛍光強度が減少することにより検出してもよい。
【００２３】
また、本実施形態の膵液検出用蛍光プローブは、膵液が存在しない部分では、ＦＲＥＴにより生じる蛍光（図１の例では約６２０ｎｍの蛍光）を発するため、膵液検出用蛍光プローブが所望の位置に投与されていることを確認することが可能である。
【００２４】
実施例において後述するように、本実施形態の膵液検出用蛍光プローブにおいて、ドナー分子を基準としたアクセプター分子のモル比は０．１〜１０であることが好ましく、１〜４がより好ましく、１〜２が更に好ましい。
【００２５】
また、実施例において後述するように、ＦＲＥＴ比の高さ及びドナー蛍光強度の高さをバランスよく両立できる観点から、ドナー分子を基準としたアクセプター分子のモル比は１であることが好ましい。本明細書において、ＦＲＥＴ比とは、次式（１）により算出される値をいうものとする。
ＦＲＥＴ比＝アクセプター分子の蛍光強度／ドナー分子の蛍光強度  （１）
【００２６】
また、本実施形態の膵液検出用蛍光プローブにおいて、ドナー分子はタンパク質担体の内側に位置し、アクセプター分子はタンパク質担体の外側に位置することが好ましい。実施例において後述するように、このような配置にした場合に、最も高いＦＲＥＴ比を得ることができる。
【００２７】
本実施形態の膵液検出用蛍光プローブは、注射剤であってもよい。実施例において後述するように、本実施形態の膵液検出用蛍光プローブは、血液中で安定であり、毒性も認められないため、患者に投与することが可能である。
【００２８】
すなわち、本実施形態の膵液検出用蛍光プローブは、薬学的に許容される担体と混合して注射剤として製剤化されていてもよい。薬学的に許容される担体としては、例えば、ブドウ糖、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等の補助薬を含む等張液が挙げられる。注射剤は、エタノール等のアルコール；プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のポリアルコール；ポリソルベート８０（商標）、ＨＣＯ−５０等の非イオン性界面活性剤等を含有していてもよい。
【００２９】
膵液検出用蛍光プローブの患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等の当業者に公知の方法により行いうる。
【００３０】
本実施形態の膵液検出用蛍光プローブは、噴霧することも可能であり、腹腔鏡手術にも対応することができる。
【００３１】
［膵液検出方法］
１実施形態において、本発明は、体液試料と、上述した膵液検出用蛍光プローブとを接触させる工程と、膵液検出用蛍光プローブのＦＲＥＴの変化を測定する工程と、を備え、膵液検出用蛍光プローブのＦＲＥＴの減少が、体液試料中に膵液が存在することを示す、膵液検出方法を提供する。
【００３２】
体液試料としては、手術中に生じる腹水ドレーン等が挙げられる。例えば、腹水ドレーンと膵液検出用蛍光プローブとを反応チューブ内で混合し、膵液検出用蛍光プローブのＦＲＥＴの変化を測定する。膵液検出用蛍光プローブのＦＲＥＴの減少が検出された場合には、体液試料中に膵液が存在すると判断することができる。
【００３３】
ＦＲＥＴの減少の検出は、分光蛍光光度計を用いて行ってもよいし、実施例において後述するように、励起波長を照射し、適切な光学フィルターを通して肉眼で行うこともできる。
【００３４】
ＦＲＥＴの減少の検出は、例えば、ドナー分子の励起波長を照射した場合にドナー分子の蛍光強度が上昇することにより検出することができる。あるいは、ドナー分子の励起波長を照射した場合にアクセプター分子の蛍光強度が減少することにより検出することができる。
【００３５】
本実施形態の膵液検出方法によれば、１〜１０分程度で正確に体液試料中の膵液の存在を検出することができる。本実施形態の膵液検出方法は、腹腔鏡手術にも対応することができる。
【００３６】
１実施形態において、本発明は、手術中の患者の体腔内に散布された、膵液検出用蛍光プローブのＦＲＥＴの変化を測定する工程を備え、膵液検出用蛍光プローブのＦＲＥＴの減少が、患者の体腔内に膵液が存在することを示す、膵液検出方法を提供する。
【００３７】
患者の体腔内への膵液検出用蛍光プローブの散布は、例えば塗布により行ってもよく、例えばスプレーにより行ってもよい。
【００３８】
ＦＲＥＴの減少の検出は、例えば、ドナー分子の励起波長を照射した場合にドナー分子の蛍光強度が上昇することにより検出することができる。ドナー分子の蛍光は、適切な光学フィルターを通して肉眼で検出してもよい。本実施形態の膵液検出方法によれば、膵液が漏れている部位を特定することができる。本実施形態の膵液検出方法は、腹腔鏡手術にも対応することができる。
【００３９】
１実施形態において、本発明は、手術中の患者の体腔内で、患者の血液中に予め投与された、膵液検出用蛍光プローブのＦＲＥＴの変化を測定する工程を備え、膵液検出用蛍光プローブのＦＲＥＴの減少が、患者の体腔内に膵液が存在することを示す、膵液検出方法を提供する。
【００４０】
患者の血液中への膵液検出用蛍光プローブの投与は、注射剤である膵液検出用蛍光プローブを、手術前に患者に注射しておくことにより行うことができる。
【００４１】
ＦＲＥＴの減少の検出は、例えば、ドナー分子の励起波長を照射した場合にドナー分子の蛍光強度が上昇することにより検出することができる。ドナー分子の蛍光は、適切な光学フィルターを通して肉眼で検出してもよい。本実施形態の膵液検出方法によれば、膵液が漏れている部位を特定することができる。本実施形態の膵液検出方法は、腹腔鏡手術にも対応することができる。
【００４２】
［膵液検出用キット］
１実施形態において、本発明は上述した膵液検出用蛍光プローブを備える、膵液検出用キットを提供する。
【００４３】
本実施形態のキットにより、膵液を迅速かつ正確に検出することができる。本実施形態のキットは、例えば、肉眼でＦＲＥＴの変化を検出するための励起光照射装置、ドナー分子の蛍光を検出するための光学フィルター等を更に備えていてもよい。
【００４４】
［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、膵液検出のための蛍光プローブであって、前記蛍光プローブが、タンパク質担体と、前記タンパク質担体上に配置され、蛍光共鳴エネルギー転移が可能なドナー分子及びアクセプター分子とを備え、前記ドナー分子及び前記アクセプター分子が、蛍光共鳴エネルギー転移を起こす距離に近接して配置された、蛍光プローブを提供する。
【００４５】
１実施形態において、本発明は、膵液検出剤の製造のための蛍光プローブの使用であって、前記蛍光プローブが、タンパク質担体と、前記タンパク質担体上に配置され、蛍光共鳴エネルギー転移が可能なドナー分子及びアクセプター分子とを備え、前記ドナー分子及び前記アクセプター分子が、蛍光共鳴エネルギー転移を起こす距離に近接して配置された、蛍光プローブである使用を提供する。
【実施例】
【００４６】
次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
【００４７】
［実験例１］
（タンパク質担体におけるドナー分子及びアクセプター分子の配置の検討）
膵液検出用蛍光プローブとして、タンパク質担体上にドナー分子及びアクセプター分子を配置したナノカプセルを調製した。
【００４８】
タンパク質担体として、古細菌であるメタノコッカス・ジャナシに由来する小型熱ショックタンパク質Ｈｓｐ１６．５のアミノ酸配列において、第４１番目のグリシン残基をシステイン残基に改変したもの（以下、「ＨｓｐＧ４１Ｃタンパク質」という場合がある。）を使用した。ＨｓｐＧ４１Ｃタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１に示す。
【００４９】
上述したように、ＨｓｐＧ４１Ｃタンパク質は、２４量体からなるナノサイズの球状構造体であるナノカプセルを形成する。ＨｓｐＧ４１Ｃタンパク質の第４１番目のシステイン残基のチオール基を利用して蛍光分子を共有結合させることにより、上記のナノカプセルの内側に特異的に蛍光分子を配置することができる。また、ＨｓｐＧ４１Ｃのアミノ基を利用して蛍光分子を共有結合させることにより、上記のナノカプセルの外側に蛍光分子を配置することができる。以下、「膵液検出用蛍光プローブ」のことを「ナノカプセル」という場合がある。
【００５０】
ドナー分子及びアクセプター分子を上記のナノカプセルの内側又は外側に配置し、蛍光共鳴エネルギー転移の効率を検討した。ドナー分子としては、アレクサフルオロ４８８（インビトロジェン社）を用い、アクセプター分子としては、アレクサフルオロ５９４（インビトロジェン社）を使用した。
【００５１】
ＨｓｐＧ４１Ｃタンパク質は次のようにして調製した。まず、ＨｓｐＧ４１Ｃタンパク質をコードするＤＮＡ断片を、発現ベクターであるｐＥＴ２１ａ（＋）（ノバジェン社）に導入した。続いて、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（メルク社）に上記の発現ベクターを導入し、ＨｓｐＧ４１Ｃタンパク質を発現させた。発現したＨｓｐＧ４１Ｃタンパク質を、陰イオン交換クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。
【００５２】
ナノカプセルの内側に蛍光分子を配置する場合には、ＨｓｐＧ４１Ｃタンパク質にアレクサフルオロ色素のマレイミド誘導体を反応させた。マレイミド誘導体は、ＨｓｐＧ４１Ｃタンパク質モノマーに対して等モル量反応させた。また、ナノカプセルの外側に蛍光分子を配置する場合には、ＨｓｐＧ４１Ｃタンパク質にアレクサフルオロ色素のカルボン酸スクシンイミジルエステル誘導体を反応させた。カルボン酸スクシンイミジルエステル誘導体は、ＨｓｐＧ４１Ｃタンパク質モノマーに対して１０倍モル量反応させた。ＨｓｐＧ４１Ｃタンパク質とマレイミド誘導体又はカルボン酸スクシンイミジルエステル誘導体との反応は、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中、４℃で２４時間行った。
【００５３】
続いて、分画分子量１０万の限外濾過膜（商品名「Ａｍｉｃｏｎ（Ｒ）Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ」、メルク社）を用いて未反応のアレクサフルオロ色素を除去し、脱塩カラム（商品名「Ｚｅｂａ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎ」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）で脱塩処理した。
【００５４】
例えば、ナノカプセルの内側にドナー分子（アレクサフルオロ４８８）を配置し、ナノカプセルの外側にアクセプター分子（アレクサフルオロ５９４）を配置する場合には、次のようにしてナノカプセルを調製した。まず、ＨｓｐＧ４１Ｃタンパク質にアレクサフルオロ４８８のマレイミド誘導体を反応させた。また、これとは別に、ＨｓｐＧ４１Ｃタンパク質にアレクサフルオロ５９４のカルボン酸スクシンイミジルエステル誘導体を反応させた。続いて、これらのＨｓｐＧ４１Ｃタンパク質を混合し、６０℃で１時間静置することにより、サブユニット交換を行った。タンパク質濃度は１０μＭに調製した。その後、ナノカプセルの温度が室温以下になるまで冷却した。これにより、ナノカプセルの内側にドナー分子を配置し、ナノカプセルの外側にアクセプター分子を配置したナノカプセルが得られた。
【００５５】
同様にして、ナノカプセルの内側にドナー分子及びアクセプター分子を配置したナノカプセル、ナノカプセルの内側にアクセプター分子、外側にドナー分子を配置したナノカプセル、ナノカプセルの外側にドナー分子及びアクセプター分子を配置したナノカプセルも調製した。
【００５６】
続いて、分光蛍光光度計（型式「ＦＰ−６６００」、Ｊａｓｃｏ社製）を用いて、調製したナノカプセルに４９０ｎｍの励起光を照射し、蛍光スペクトルを測定した。図２は蛍光スペクトルを示すグラフである。その結果、ナノカプセルの内側にドナー分子（アレクサフルオロ４８８）を配置し、ナノカプセルの外側にアクセプター分子（アレクサフルオロ５９４）を配置したナノカプセルが、最も高いＦＲＥＴ比を示すことが明らかとなった。なお、ＦＲＥＴ比は次式（１）により算出することができる。
ＦＲＥＴ比＝アクセプター分子の蛍光強度／ドナー分子の蛍光強度  （１）
【００５７】
また、ナノカプセルの内側にドナー分子（アレクサフルオロ４８８）を配置し、ナノカプセルの外側にアクセプター分子（アレクサフルオロ５９４）を配置したナノカプセルにおいて、アレクサフルオロ４８８−マレイミドの導入効率は６３．８±９．６％（ｎ＝５）であり、アレクサフルオロ５９４−カルボン酸スクシンイミジルエステルの導入効率は６１．４±５．７％（ｎ＝５）であった。ここで、各アレクサフルオロ色素の導入効率は、アレクサフルオロ４８８の吸光データ（ε４９５＝７３０００ｃｍ−１Ｍ−１）及びアレクサフルオロ５９４の吸光データ（ε５９４＝９２０００ｃｍ−１Ｍ−１）に基づいて計算した。
【００５８】
［実験例２］
（ドナー分子及びアクセプター分子のモル比の検討）
ＦＲＥＴ比を最適化するため、ナノカプセルに配置するドナー分子及びアクセプター分子のモル比を検討した。
【００５９】
実験例１と同様にして、ナノカプセルの内側にドナー分子（アレクサフルオロ４８８）を配置し、ナノカプセルの外側にアクセプター分子（アレクサフルオロ５９４）を配置したナノカプセルを調製した。
【００６０】
より具体的には、ナノカプセルの内側にドナー分子を配置したＨｓｐＧ４１Ｃタンパク質と、ナノカプセルの外側にアクセプター分子を配置したＨｓｐＧ４１Ｃタンパク質とを、ドナー分子を基準としたアクセプター分子のモル比が１、２及び４となるように混合し、６０℃で１時間静置することにより、サブユニット交換を行った。タンパク質濃度は１０μＭに調製した。その後、ナノカプセルの温度が室温以下になるまで冷却した。続いて、分子排除クロマトグラフィーを行い、波長２８０ｎｍの吸光度及び励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長６２０ｎｍの蛍光を測定することにより、ナノカプセルが目的の構造を有していることを確認した。
【００６１】
続いて、調製したナノカプセルに４９０ｎｍの励起光を照射し、蛍光スペクトルを測定した。図３は蛍光スペクトルを示すグラフである。その結果、ドナー分子を基準としたアクセプター分子のモル比が４であるナノカプセルが最も高いＦＲＥＴ比を示すことが明らかとなった。ＦＲＥＴ比は、３．８２７±０．０９３（ｎ＝３）であった。なお、ＦＲＥＴ比は実験例１と同様にして求めた。
【００６２】
しかしながら、ドナー分子を基準としたアクセプター分子のモル比が４であるナノカプセルにおいて、波長４９０ｎｍで励起した場合のドナー分子の蛍光強度は低かった。これは、ドナー分子のモル数が少ないことに起因すると考えられた。
【００６３】
一方、ドナー分子を基準としたアクセプター分子のモル比が１であるナノカプセルは、ＦＲＥＴ比が２．３２５±０．２１５（ｎ＝３）であり、比較的高いＦＲＥＴ比を示し、かつ波長４９０ｎｍで励起した場合のドナー分子の蛍光強度が最も高い結果となった。
【００６４】
以上の結果から、ドナー分子を基準としたアクセプター分子のモル比が１であるナノカプセルが、ＦＲＥＴ比の高さ及びドナー蛍光強度の高さをバランスよく両立できることが明らかとなった。
【００６５】
［実験例３］
（サブユニット交換の検討）
実験例１と同様にしてナノカプセルを調製し、ナノカプセルのサブユニット交換の効果について検討した。具体的には、まず、ナノカプセルの内側にドナー分子を配置したＨｓｐＧ４１Ｃタンパク質と、ナノカプセルの外側にアクセプター分子を配置したＨｓｐＧ４１Ｃタンパク質とを、ドナー分子を基準としたアクセプター分子のモル比が１となるように混合した。タンパク質濃度は１０μＭに調製した。各タンパク質を混合した直後に、波長４９０ｎｍの励起光を照射し、蛍光スペクトルを測定した。
【００６６】
続いて、混合したＨｓｐＧ４１Ｃタンパク質を６０℃で１時間静置することにより、サブユニット交換を行った。続いて、調製したナノカプセルに波長４９０ｎｍの励起光を照射し、蛍光スペクトルを測定した。
【００６７】
図４はサブユニット交換の前及び後の蛍光スペクトルを示すグラフである。その結果、サブユニット交換の前にはＦＲＥＴが検出されず、サブユニット交換の後にＦＲＥＴが検出されることが明らかとなった。
【００６８】
以上の結果から、ＦＲＥＴを生じるためにはドナー分子を配置したＨｓｐＧ４１Ｃタンパク質及びアクセプター分子を配置したＨｓｐＧ４１Ｃタンパク質のサブユニット交換が必要であることが明らかとなった。
【００６９】
［実験例４］
（ナノカプセルの安定性の検討１）
実験例１と同様にして、ナノカプセルの内側にドナー分子を配置し、ナノカプセルの外側にアクセプター分子を配置したナノカプセルを調製した。ドナー分子を基準としたアクセプター分子のモル比は１となるように調製し、６０℃で１時間静置することにより、サブユニット交換を行った。タンパク質濃度は１０μＭに調製した。その後、ナノカプセルの温度が室温以下になるまで冷却した。
【００７０】
続いて、分子排除クロマトグラフィーを行い、ナノカプセルを波長２８０ｎｍの吸光度により検出した。また、同時に励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長６２０ｎｍの蛍光を測定した。図５は分子排除クロマトグラフィーの結果を示すグラフである。
【００７１】
その結果、分子排除クロマトグラフィーにより、単一のシャープなピークが得られた。また、蛍光強度が上記ピークと一致した。この結果は、ナノカプセルの構造が安定であることを示す。
【００７２】
［実験例５］
（ナノカプセルの安定性の検討２）
実験例３と同様にして調製したナノカプセルを、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観察した。図６は、ナノカプセルの電子顕微鏡像を示す写真である。その結果、ナノカプセルは、均一な球状構造を有することが確認された。この結果は、ナノカプセルの構造が安定であることを更に支持するものである。
【００７３】
［実験例６］
（ナノカプセルの安定性の検討３）
ナノカプセルの安定性を検討した。実験例１と同様にして、ナノカプセルの内側にドナー分子を配置し、ナノカプセルの外側にアクセプター分子を配置したナノカプセルを調製した。ドナー分子を基準としたアクセプター分子のモル比は１となるように調製し、６０℃で１時間静置することにより、サブユニット交換を行った。タンパク質濃度は１０μＭに調製した。その後、ナノカプセルの温度が室温以下になるまで冷却した。
【００７４】
続いて、調製したナノカプセルを、３７℃で２４時間又は４８時間静置した。その後、波長４９０ｎｍの励起光を照射し、蛍光スペクトルを測定した。図７は、蛍光スペクトルを示すグラフである。その結果、調整直後、２４時間後及び４８時間後において、ナノカプセルの蛍光スペクトルはほぼ一致することが明らかとなった。この結果は、ナノカプセルの構造が安定であることを更に支持するものである。
【００７５】
［実験例７］
（プロテアーゼとの反応性１）
実験例３と同様にして調製したナノカプセルを用いて、膵液中のプロテアーゼとの反応性を検討した。膵液中のプロテアーゼとしては、セリンプロテアーゼである、トリプシン、α−キモトリプシン及びエラスターゼを用いた。
【００７６】
まず、ナノカプセル（１０μＭ）に、トリプシン（２５Ｕ／ｍＬ）、α−キモトリプシン（１Ｕ／ｍＬ）及びエラスターゼ（０．０５Ｕ／ｍＬ）を添加し、３７℃で静置した。続いて、波長４９０ｎｍの励起光を照射して経時的に蛍光スペクトルを測定することにより、プロテアーゼの反応性を検討した。
【００７７】
図８（ａ）は、トリプシンを添加したナノカプセルの蛍光スペクトルの経時変化を示すグラフである。図８（ｂ）は、α−キモトリプシンを添加したナノカプセルの蛍光スペクトルの経時変化を示すグラフである。図８（ｃ）は、エラスターゼを添加したナノカプセルの蛍光スペクトルの経時変化を示すグラフである。
【００７８】
その結果、ナノカプセルは様々な膵液中のプロテアーゼと容易に反応し、１〜５分でＦＲＥＴの減少を検出できることが明らかとなった。この結果は、プロテアーゼによってナノカプセルが消化され、その構造が破壊されたことによると考えられた。
【００７９】
各プロテアーゼに対する蛍光強度の違いは、プロテアーゼの切断部位の違いによるものと考えられた。ドナー分子の蛍光強度はエラスターゼを反応させたナノカプセルで最も高くなった。エラスターゼは、イソロイシン、グリシン、アラニン、セリン、バリン、ロイシン等の疎水性アミノ酸のＣ末端側を切断する。ＨｓｐＧ４１Ｃタンパク質におけるエラスターゼの切断部位の数は、トリプシン、α−キモトリプシンの切断部位の数より多い。したがって、エラスターゼの反応性が最も高い結果となったと考えられた。
【００８０】
［実験例８］
（プロテアーゼとの反応性２）
実験例３と同様にして調製したナノカプセルを用いて、プロナーゼＥとの反応性を検討した。タンパク質をプロナーゼＥで消化するのは最も過酷な試験である。まず、ナノカプセル（１０μＭ）に、プロナーゼＥ（１Ｕ／ｍＬ）を添加し、３７℃で０．５、１、３及び６時間反応させた。続いて、波長４９０ｎｍの励起光を照射して蛍光スペクトルを測定した。
【００８１】
図９（ａ）は、プロナーゼＥを添加したナノカプセルの蛍光スペクトルの経時変化を示すグラフである。プロナーゼＥとの反応によりＦＲＥＴが減少することが明らかとなった。
【００８２】
また、プロナーゼＥを反応させた各サンプルを、分子排除クロマトグラフィーに供し、波長２８０ｎｍの吸光度により検出した。分子排除クロマトグラフィーのカラムには、東ソー社のＴＳＫ  ｇｅｌ  ＢｉｏＡｓｓｉｓｔ  Ｇ４ＳＷＸＬを用いた。また、同時に励起波長５９０ｎｍ、蛍光波長６２０ｎｍの蛍光を測定した。図９（ｂ）は分子排除クロマトグラフィーの結果を示すグラフである。その結果、プロナーゼＥとの反応により、ナノカプセルが分解したことが確認された。
【００８３】
以上の結果は、プロテアーゼによってナノカプセルが消化され、その構造が破壊されたことにより、ＦＲＥＴが減少したことを更に支持するものである。
【００８４】
［実験例９］
（プロテアーゼとの反応性はプロテアーゼ阻害剤により抑制された）
ナノカプセルに、プロテアーゼのみ、又はプロテアーゼ及びプロテアーゼインヒビターを反応させ、ドナー分子の蛍光強度及びＦＲＥＴ比を測定した。
【００８５】
プロテアーゼのみを反応させる群では、実験例３と同様にして調製したナノカプセルに、段階希釈した、トリプシン、α−キモトリプシン又はエラスターゼを添加し、３７℃で１時間反応させた。
【００８６】
また、プロテアーゼ及びプロテアーゼインヒビターを反応させる群では、実験例３と同様にして調製したナノカプセルに、トリプシン（２５Ｕ／ｍＬ）、α−キモトリプシン（０．１Ｕ／ｍＬ）又はエラスターゼ（０．０５Ｕ／ｍＬ）と、段階希釈したプロテアーゼインヒビター（アプロチニン又はエラスターゼインヒビター）とを添加し、３７℃で１時間反応させた。
【００８７】
続いて、蛍光プレートリーダーを用いて、波長４９０ｎｍの励起光を照射して、波長５２０ｎｍ（ドナー分子の蛍光）又は６２０ｎｍ（アクセプター分子の蛍光）の蛍光を測定した（ｎ＝３）。また、測定された蛍光強度に基づいてＦＲＥＴ比を算出した。ＦＲＥＴ比は実験例１と同様にして計算した。
【００８８】
図１０（ａ）は、トリプシンを添加したナノカプセルにおけるドナー分子の蛍光強度及びＦＲＥＴ比を示すグラフである。図１０（ｂ）は、α−キモトリプシンを添加したナノカプセルにおけるドナー分子の蛍光強度及びＦＲＥＴ比を示すグラフである。図１０（ｃ）は、エラスターゼを添加したナノカプセルにおけるドナー分子の蛍光強度及びＦＲＥＴ比を示すグラフである。図１０（ｄ）は、トリプシン及びアプロチニンを添加したナノカプセルにおけるドナー分子の蛍光強度及びＦＲＥＴ比を示すグラフである。図１０（ｅ）は、α−キモトリプシン及びアプロチニンを添加したナノカプセルにおけるドナー分子の蛍光強度及びＦＲＥＴ比を示すグラフである。図１０（ｆ）は、エラスターゼ及びエラスターゼインヒビターを添加したナノカプセルにおけるドナー分子の蛍光強度及びＦＲＥＴ比を示すグラフである。
【００８９】
その結果、ナノカプセルと各プロテアーゼとの反応によるＦＲＥＴの減少（ドナー分子の蛍光強度の増加）は、各プロテアーゼに特異的な活性によるものであることが確認された。
【００９０】
［実験例１０］
（血漿との反応性）
ナノカプセルと血漿との反応性を検討した。１２時間ごとの明暗サイクル下で、水及び食餌を自由摂取させて飼育した６週齢のＩＣＲマウス（オス、ＫＢＴオリエンタル社）から全血を採取した。動物実験は九州大学の動物実験委員会のガイドラインにしたがって行った。
【００９１】
採取した血液を、ヘパリンを含有するチューブに回収し、３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上清を血漿として回収した。
【００９２】
続いて、実験例３と同様にして調製したナノカプセル（１０μＭ）に、血漿（５０ｖ／ｖ％）を添加し、３７℃で静置した。続いて、波長４９０ｎｍの励起光を照射して経時的に蛍光スペクトルを測定することにより、血漿との反応性を検討した。
【００９３】
図１１は、血漿を添加したナノカプセルの蛍光スペクトルの経時変化を示すグラフである。その結果、ナノカプセルは血漿とはほとんど反応しないことが明らかとなった。
【００９４】
血漿は、カリクレインやプラスミン等のセリンプロテアーゼを含有しているが、ナノカプセルはこれらのプロテアーゼに対しては安定であることが示された。また、ナノカプセルは、膵液中のプロテアーゼに特異的に反応することが明らかとなった。
【００９５】
以上の結果は、ナノカプセルが血液中で安定であることを示す。
【００９６】
［実験例１１］
（腹水ドレーンとの反応１）
続いて、実際の手術により患者から得られた腹水ドレーンとナノカプセルとの反応性を検討した。
【００９７】
癌の治療のために胃切除術又は膵尾部切除術を受けた６名の患者から腹水ドレーンを回収した。各腹水ドレーンサンプルは５０ｍＬチューブに分注し、遠心分離し、上清を直ちに−８０℃で凍結し、使用するまで−８０℃で保存した。
【００９８】
続いて、各腹水ドレーンサンプルのｐＨ及びアミラーゼ濃度を測定した。アミラーゼ濃度の測定は臨床化学分析装置（型式「富士ドライケムＮＸ５００Ｖ」、富士フィルム社）を用いて行った。
【００９９】
アミラーゼ濃度が５０００Ｕ／ｍＬを超える腹水ドレーンサンプルを膵液陽性腹水ドレーンとし、アミラーゼ濃度が５０００Ｕ／ｍＬ以下のサンプルを膵液陰性腹水ドレーンとした。各腹水ドレーンサンプルのｐＨ及びアミラーゼ濃度を下記表１に示す。
【０１００】
【表１】
0006660633.tif 000002
【０１０１】
続いて、実験例３と同様にして調製したナノカプセル（１０μＭ）に、各腹水ドレーンサンプル（８０ｖ／ｖ％）を添加し、３７℃で静置した。続いて、波長４９０ｎｍの励起光を照射して経時的に蛍光スペクトルを測定することにより、ナノカプセルの反応性を検討した。対照として、腹水ドレーンサンプルの代わりに生理食塩水を添加したものを用いた。
【０１０２】
図１２（ａ）は対照の蛍光スペクトルの測定結果を示すグラフである。図１２（ｂ）は、膵液陽性腹水ドレーンサンプルの蛍光スペクトルの代表的な測定結果を示すグラフである。図１２（ｃ）は、膵液陰性腹水ドレーンサンプルの蛍光スペクトルの代表的な測定結果を示すグラフである。
【０１０３】
その結果、生理食塩水及び膵液陰性腹水ドレーンサンプルでは、ナノカプセルとの反応性が認められなかった。一方、膵液陽性腹水ドレーンサンプルでは、迅速にナノカプセルとの反応性が検出された。
【０１０４】
［実験例１２］
（ｐＨの検討）
通常膵液のｐＨは８．５程度である。これに対し、実験例１０で用いた腹水ドレーンサンプルのｐＨは７．５〜８．２であった。そこで、実験例３と同様にして調製したナノカプセルのｐＨを７．０及び８．５に調製し、波長４９０ｎｍの励起光を照射して経時的に蛍光スペクトルを測定することにより、ナノカプセルの反応性を検討した。
【０１０５】
図１３（ａ）は、ｐＨ７．０における蛍光スペクトルの測定結果を示すグラフである。図１３（ｂ）は、ｐＨ８．５における蛍光スペクトルの測定結果を示すグラフである。その結果、ナノカプセルの蛍光特性に対するｐＨの影響はほとんど認められなかった。
【０１０６】
［実験例１３］
（腹水ドレーンとの反応２）
実験例３と同様にして調製したナノカプセル（１０μＭ）に、実験例１０で用いた各腹水ドレーンサンプル（８０ｖ／ｖ％）を添加し、３７℃で１時間静置した。対照として、腹水ドレーンサンプルの代わりに生理食塩水を添加したものを用いた。
【０１０７】
続いて、蛍光プレートリーダーを用いて、波長４９０ｎｍの励起光を照射して、波長５２０ｎｍ（ドナー分子の蛍光）又は６２０ｎｍ（アクセプター分子の蛍光）の蛍光を測定した。続いて、測定された蛍光強度に基づいてＦＲＥＴ比を算出した。ＦＲＥＴ比は実験例１と同様にして計算した。
【０１０８】
図１４は、各腹水ドレーンサンプルのＦＲＥＴ比を示すグラフである。図中、「Ｎ．Ｓ．」は有意差がないことを示し、「＊」は危険率５％未満で有意差があることを示す。その結果、生理食塩水群（図中、「対照」と示す。）と膵液陰性腹水ドレーンサンプル群（図中、「陰性」と示す。）の結果には有意差は認められなかったが、膵液陽性腹水ドレーンサンプル群（図中、「陽性」と示す。）とその他の群の結果には危険率５％未満で有意差が認められた。
【０１０９】
以上の結果は、ナノカプセルを用いて腹水ドレーン中の膵液の存在を検出できることを示す。
【０１１０】
［実験例１４］
（肉眼での観察）
ナノカプセルの蛍光の変化を肉眼で観察できるか否かを検討した。実験例３と同様にして調製したナノカプセル（１０μＭ）に、実験例１０で用いた腹水ドレーンサンプル（８０ｖ／ｖ％）を添加した。対照として、腹水ドレーンサンプルの代わりに生理食塩水を添加したものを用いた。
【０１１１】
これらのサンプルに、ブラックライトの光（波長３６５ｎｍ）を照射し、ダイクロイックフィルター（波長５００〜５５０ｎｍの光を９０％超透過し、波長４００〜４５０ｎｍ、６００〜７００ｎｍの光を２％未満透過する。）を通してデジタルカメラで撮影した。
【０１１２】
図１５（ａ）は、各サンプルを明視野で撮影した写真である。図１５（ｂ）〜（ｆ）は、それぞれ、腹水ドレーンサンプルと混合してから１、５、１０、３０及び６０分後の各サンプルを、ダイクロイックフィルターを通して撮影した写真である。図中、「対照」は生理食塩水の結果を示し、「陽性」は膵液陽性腹水ドレーンサンプルの結果を示し、「陰性」は膵液陰性腹水ドレーンサンプルの結果を示す。
【０１１３】
その結果、ナノカプセルのＦＲＥＴの減少（ドナー分子の蛍光強度の上昇）を肉眼でも観察可能であることが明らかとなった。この結果は、ナノカプセルと腹水ドレーンサンプルとを組み合わせることにより、膵液漏を迅速かつ正確に検出することができることを示す。
【０１１４】
［実験例１５］
（ナノカプセルの毒性の検討）
ＨｓｐＧ４１Ｃタンパク質を６週齢のＩＣＲマウス（オス）に、１０ｎｍｏｌ／匹ずつ尾静脈投与した。対照として、何も投与していないマウスを用いた。２４時間後に全血を採取し、採取した血液を、ヘパリンを含有するチューブに回収し、３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上清を血漿として回収した。
【０１１５】
続いて、血漿中の、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン（ＣＲＥ）、クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の濃度を測定した。各因子の濃度の測定は臨床化学分析装置（型式「富士ドライケムＮＸ５００Ｖ」、富士フィルム社）を用いて行った。
【０１１６】
対照マウス及びＨｓｐＧ４１Ｃタンパク質を投与したマウスの血漿中の各因子の濃度を下記表２に示す。表中、「対照」は対照マウスの結果を示し、「ＨｓｐＧ４１Ｃ」は、ＨｓｐＧ４１Ｃタンパク質を投与したマウスの結果を示す。その結果、ＨｓｐＧ４１Ｃタンパク質の毒性は認められなかった。
【０１１７】
【表２】
0006660633.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【０１１８】
本発明によれば、手術中に漏出した膵液の存在を、迅速かつ高感度に検出することができる技術を提供することができる。
【図１】
0006660633.tif 000004
【図２】
0006660633.tif 000005
【図３】
0006660633.tif 000006
【図４】
0006660633.tif 000007
【図５】
0006660633.tif 000008
【図６】
0006660633.tif 000009
【図７】
0006660633.tif 000010
【図８】
0006660633.tif 000011
【図９】
0006660633.tif 000012
【図１０】
0006660633.tif 000013
【図１１】
0006660633.tif 000014
【図１２】
0006660633.tif 000015
【図１３】
0006660633.tif 000016
【図１４】
0006660633.tif 000017
【図１５】
0006660633.tif 000018
【配列表】
0006660633000001.app