(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウナギがニホンウナギであるか否かを判定する方法であって、
前記ウナギのミトコンドリア１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列を決定する工程と、
決定した前記塩基配列のうち、配列番号１に記載の塩基配列に対応する領域の塩基配列と、配列番号１に記載の塩基配列との配列同一性を算出する工程と、
前記配列同一性が９５％以上であった場合に前記ウナギはニホンウナギであると判定し、前記配列同一性が９５％未満であった場合に前記ウナギはニホンウナギでないと判定する工程と、
を備える方法。
【請求項２】
ウナギがニホンウナギであるか否かを判定する方法であって、
前記ウナギのミトコンドリアＤＮＡを鋳型として、
配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９３〜１１９５番目のいずれかの塩基を３’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９３〜１１９５番目のいずれかの塩基を３’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるセンスプライマーと、
配列番号２に記載の塩基配列の第１２１１〜１７０４番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列の第１２１１〜１７０４番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるアンチセンスプライマーと、
を用いた遺伝子増幅反応を行う工程と、
前記遺伝子増幅反応により遺伝子断片の増幅が認められた場合に前記ウナギはニホンウナギであると判定し、遺伝子断片の増幅が認められなかった場合に前記ウナギはニホンウナギでないと判定する工程と、
を備える方法。
【請求項３】
ウナギがニホンウナギであるか否かを判定する方法であって、
前記ウナギのミトコンドリアＤＮＡを鋳型として、
配列番号２に記載の塩基配列の第１〜１１７８番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列の第１〜１１７８番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるセンスプライマーと、
配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９２〜１１９４番目のいずれかの塩基を５’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９２〜１１９４番目のいずれかの塩基を５’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるアンチセンスプライマーと、
を用いた遺伝子増幅反応を行う工程と、
前記遺伝子増幅反応により遺伝子断片の増幅が認められた場合に前記ウナギはニホンウナギであると判定し、遺伝子断片の増幅が認められなかった場合に前記ウナギはニホンウナギでないと判定する工程と、
を備える方法。
【請求項４】
配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９３〜１１９５番目のいずれかの塩基を３’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９３〜１１９５番目のいずれかの塩基を３’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるセンスプライマーと、
配列番号２に記載の塩基配列の第１２１１〜１７０４番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列の第１２１１〜１７０４番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるアンチセンスプライマーと、
を備える、ウナギがニホンウナギであるか否かの判定用キット。
【請求項５】
配列番号２に記載の塩基配列の第１〜１１７８番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列の第１〜１１７８番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるセンスプライマーと、
配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９２〜１１９４番目のいずれかの塩基を５’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９２〜１１９４番目のいずれかの塩基を５’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるアンチセンスプライマーと、
を備える、ウナギがニホンウナギであるか否かの判定用キット。
【請求項６】
配列番号２に記載の塩基配列において、前記センスプライマーと、前記アンチセンスプライマーとに挟まれる領域内の連続する１５〜４０ヌクレオチド又は前記ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドからなり、５’末端又は３’末端の一方に蛍光物質を有し、他方に消光物質を有するプローブを更に備える、請求項４又は５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウナギがニホンウナギであるか否かを判定する方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ウナギはウナギ属に属する魚であり、東南アジアを中心に世界で１９種・亜種が知られている。ウナギの養殖は、天然のウナギの稚魚（シラスウナギ）を河口で漁獲して蓄養することにより行われる。一般的に、ニホンウナギの方が他の外国種のウナギより高価で取引されることから、ニホンウナギ以外のウナギの稚魚をニホンウナギと偽って販売する例が後を絶たない。このため、消費者の食の安心・安全の確保、生産者の商品力維持、悪質な食品関連業者への牽制等の観点から、ウナギがニホンウナギであるか否かを判定する技術が求められている。
【０００３】
また、ニホンウナギの稚魚は、１９６０年代から激減しており、現在は絶滅危惧種に指定されている。このため、ニホンウナギがワシントン条約の附属書リストに登録される可能性がある。リストに登録された場合には、税関等でウナギがニホンウナギであるか否かを判定することが必要になる。
【０００４】
例えば、特許文献１には、ウナギの稚魚を撮像する撮像手段と、該撮像手段で撮像した画像に基づいてウナギの稚魚の種を判別する判別手段と、を具備した種判別装置が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１５−１０４３７９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、ウナギ属の形態には変異が乏しく、形態で種を判定することは困難な場合がある。そこで、本発明は、ウナギがニホンウナギであるか否かを高い精度で容易に判定することができる技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下の態様を含む。
（１）ウナギがニホンウナギであるか否かを判定する方法であって、前記ウナギのミトコンドリア１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列を決定する工程と、決定した前記塩基配列のうち、配列番号１に記載の塩基配列に対応する領域の塩基配列と、配列番号１に記載の塩基配列との配列同一性を算出する工程と、前記配列同一性が９５％以上であった場合に前記ウナギはニホンウナギであると判定し、前記配列同一性が９５％未満であった場合に前記ウナギはニホンウナギでないと判定する工程と、を備える方法。
（２）ウナギがニホンウナギであるか否かを判定する方法であって、前記ウナギのミトコンドリアＤＮＡを鋳型として、配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９３〜１１９５番目のいずれかの塩基を３’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９３〜１１９５番目のいずれかの塩基を３’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるセンスプライマーと、配列番号２に記載の塩基配列の第１２１１〜１７０４番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列の第１２１１〜１７０４番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるアンチセンスプライマーと、を用いた遺伝子増幅反応を行う工程と、前記遺伝子増幅反応により遺伝子断片の増幅が認められた場合に前記ウナギはニホンウナギであると判定し、遺伝子断片の増幅が認められなかった場合に前記ウナギはニホンウナギでないと判定する工程と、を備える方法。
（３）ウナギがニホンウナギであるか否かを判定する方法であって、前記ウナギのミトコンドリアＤＮＡを鋳型として、配列番号２に記載の塩基配列の第１〜１１７８番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列の第１〜１１７８番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるセンスプライマーと、配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９２〜１１９４番目のいずれかの塩基を５’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９２〜１１９４番目のいずれかの塩基を５’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるアンチセンスプライマーと、を用いた遺伝子増幅反応を行う工程と、前記遺伝子増幅反応により遺伝子断片の増幅が認められた場合に前記ウナギはニホンウナギであると判定し、遺伝子断片の増幅が認められなかった場合に前記ウナギはニホンウナギでないと判定する工程と、を備える方法。
（４）配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９３〜１１９５番目のいずれかの塩基を３’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９３〜１１９５番目のいずれかの塩基を３’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるセンスプライマーと、配列番号２に記載の塩基配列の第１２１１〜１７０４番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列の第１２１１〜１７０４番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるアンチセンスプライマーと、を備える、ウナギがニホンウナギであるか否かの判定用キット。
（５）配列番号２に記載の塩基配列の第１〜１１７８番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列の第１〜１１７８番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるセンスプライマーと、配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９２〜１１９４番目のいずれかの塩基を５’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９２〜１１９４番目のいずれかの塩基を５’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるアンチセンスプライマーと、を備える、ウナギがニホンウナギであるか否かの判定用キット。
（６）配列番号２に記載の塩基配列において、前記センスプライマーと、前記アンチセンスプライマーとに挟まれる領域内の連続する１５〜４０ヌクレオチド又は前記ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドからなり、５’末端又は３’末端の一方に蛍光物質を有し、他方に消光物質を有するプローブを更に備える、（４）又は（５）に記載のキット。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ウナギがニホンウナギであるか否かを高い精度で容易に判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実験例１において、各種のウナギの１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列をアラインメントした結果を示す図である。
【図２】ニホンウナギの種内変異を示す図である。
【図３】ルソンウナギの種内変異を示す図である。
【図４】（ａ）及び（ｂ）は実験例２の結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
［ウナギがニホンウナギであるか否かを判定する方法］
（第１実施形態）
ウナギがニホンウナギであるか否かを判定する方法の第１実施形態は、対象のウナギがニホンウナギであるか否かを判定する方法であって、前記ウナギのミトコンドリア１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列を決定する工程と、決定した前記塩基配列のうち、配列番号１に記載の塩基配列に対応する領域の塩基配列と、配列番号１に記載の塩基配列との配列同一性を算出する工程と、前記配列同一性が９５％以上であった場合に前記ウナギはニホンウナギであると判定し、前記配列同一性が９５％未満であった場合に前記ウナギはニホンウナギでないと判定する工程と、を備える方法である。
【００１１】
発明者らは、ニホンウナギ、ルソンウナギ、オオウナギ及びバイカラウナギの多数（ｎ＝２００〜３００）の個体について、ミトコンドリア１６ＳリボソームＲＮＡ（１６Ｓ  ｒＲＮＡ）の塩基配列を同定し比較することにより、種間変異及び種内変異の存在を明らかにした。これらの塩基配列データに基づき、ニホンウナギの種内変異の存在に関わらず、ニホンウナギとそれ以外のウナギを特異的に判別することが可能な塩基配列領域を見出し、本発明を完成させた。
【００１２】
配列番号１に、ニホンウナギのミトコンドリア１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列のうち、発明者らが特定した領域の塩基配列を示す。発明者らは、ニホンウナギのミトコンドリア１６Ｓ  ｒＲＮＡの配列番号１に対応する領域には、種内変異を考慮しても最大１つの塩基変異しか存在しないことを明らかにした。
【００１３】
一方、例えばルソンウナギの場合この領域には最低でも５つの変異が存在する。また、オオウナギの場合この領域には最低でも７つの変異が存在する。また、バイカラウナギの場合この領域には最低でも４つの変異が存在する。
【００１４】
したがって、対象のウナギのミトコンドリア１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列を同定し、配列番号１に記載の塩基配列に対応する領域の塩基配列と、配列番号１に記載の塩基配列との配列同一性を算出することにより、対象のウナギがニホンウナギであるか否かを判定することができる。
【００１５】
ここで、基準塩基配列に対する、対象塩基配列の配列同一性は、例えば次のようにして求めることができる。まず、基準塩基配列及び対象塩基配列をアラインメントする。ここで、各塩基配列には、配列同一性が最大となるようにギャップを含めてもよい。続いて、基準塩基配列及び対象塩基配列において、一致した塩基の塩基数を算出し、下記式（１）にしたがって、配列同一性を求めることができる。
配列同一性（％）＝一致した塩基数／対象塩基配列の総塩基数×１００  （１）
【００１６】
上述したように、ニホンウナギのミトコンドリア１６Ｓ  ｒＲＮＡの場合、配列番号１に記載の塩基配列に対応する領域には、最大でも１つの変異しか存在しない。また、配列番号１の総塩基数は９２塩基である。このため、対象のウナギがニホンウナギである場合には、下記式（２）に示すように、少なくとも９８．９％の配列同一性がある。
９１／９２×１００＝９８．９１％  （２）
【００１７】
したがって、配列番号１に記載の塩基配列との配列同一性が９５％以上であった場合には、対象のウナギはニホンウナギであると判定し、配列同一性が９５％未満であった場合に対象のウナギはニホンウナギでないと判定することができる。
【００１８】
対象のウナギのミトコンドリア１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列を同定するためには、まず、ウナギのミトコンドリアＤＮＡを調製して試料とする。試料は、ミトコンドリアＤＮＡを含んでいればよく、ウナギのゲノムＤＮＡを試料として使用してもよい。あるいは、ウナギのミトコンドリアＤＮＡを抽出して試料として用いてもよい。あるいは、ウナギの全ＲＮＡを抽出し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡに逆転写して試料として用いてもよい。これらの試料の調製には、市販のキット等を使用することができる。
【００１９】
試料の調製は、生体のウナギの組織から行ってもよい。あるいは、加熱・調理されたウナギの組織から試料を調製することもできる。あるいは、ウナギが入っていた容器内に存在する糞や、ウナギから剥がれた組織等から試料を調製してもよい。
【００２０】
続いて、調整した試料を鋳型として、ミトコンドリア１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列を同定する。例えば、一般的な魚類のミトコンドリア１６Ｓ  ｒＲＮＡを増幅することができる、配列番号３に記載のセンスプライマー及び配列番号４に記載のアンチセンスプライマーを用いた遺伝子増幅により、ミトコンドリア１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅し、常法により塩基配列を決定してもよい。
【００２１】
（第２Ａ実施形態）
ウナギがニホンウナギであるか否かを判定する方法の第２Ａ実施形態は、対象のウナギがニホンウナギであるか否かを判定する方法であって、前記ウナギのミトコンドリアＤＮＡを鋳型として、配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９３〜１１９５番目のいずれかの塩基を３’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９３〜１１９５番目のいずれかの塩基を３’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるセンスプライマーと、配列番号２に記載の塩基配列の第１２１１〜１７０４番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列の第１２１１〜１７０４番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるアンチセンスプライマーと、を用いた遺伝子増幅反応を行う工程と、前記遺伝子増幅反応により遺伝子断片の増幅が認められた場合に前記ウナギはニホンウナギであると判定し、遺伝子断片の増幅が認められなかった場合に前記ウナギはニホンウナギでないと判定する工程と、を備える方法である。
【００２２】
上述したように、発明者らは、複数の種のウナギの多数の個体について、ミトコンドリア１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列を同定した。配列番号２に、ニホンウナギのミトコンドリア１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列を示す。なお、配列番号１に記載の塩基配列は、配列番号２に記載の塩基配列の第１１６９〜１２６０番目の塩基配列に対応する。
【００２３】
発明者らは、配列番号２に記載の塩基配列において、第１１９３〜１１９４番目の「Ｇ（グアニン）Ｔ（チミン）」の塩基配列が、ニホンウナギに特有のものであることを明らかにした。したがって、対象のウナギのミトコンドリアＤＮＡを鋳型とし、配列番号２の第１１９３〜１１９５番目のいずれかの領域を３’末端とするセンスプライマーを用いた遺伝子増幅を行うことにより、遺伝子断片の増幅が認められた場合に前記ウナギはニホンウナギであると判定し、遺伝子断片の増幅が認められなかった場合に前記ウナギはニホンウナギでないと判定することができる。なお、配列番号２の第１１９５番目の塩基を３’末端とするセンスプライマーを上記判定に用いることができるのは、遺伝子増幅においてはセンスプライマーの３’末端がアニーリングすることが特に重要であるためである。
【００２４】
第２Ａ実施形態の判定方法は、センスプライマーの３’末端が鋳型ＤＮＡにアニーリングすることができるか否かによって、対象のウナギがニホンウナギであるか否かを判定する方法である。
【００２５】
本明細書において、センスプライマー及びアンチセンスプライマーの塩基配列は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅することができれば配列番号２に記載の塩基配列と完全に一致している必要はなく、配列番号２に記載の塩基配列に対して変異を有していてもよい。ここで、変異としては置換変異が挙げられる。
【００２６】
すなわち、センスプライマーは、配列番号２に記載の塩基配列の第１１９３〜１１９５番目のいずれかの塩基を３’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列からなるものであってもよいし、配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９３〜１１９５番目のいずれかの塩基を３’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるものであってもよい。
【００２７】
同様に、アンチセンスプライマーは、配列番号２に記載の塩基配列の第１２１１〜１７０４番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列からなるものであってもよいし、配列番号２に記載の塩基配列の第１２１１〜１７０４番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるものであってもよい。
【００２８】
本明細書において、１若しくは数個とは、１〜５個であってもよく、１〜４個であってもよく、１〜３個であってもよく、１〜２個であってもよい。また、プライマーの３’末端から２塩基には塩基置換が存在しないことが好ましい。
【００２９】
プライマーの長さは、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅することができれば特に制限されないが、１５〜４０塩基であり、１５〜３５塩基であってもよく、１５〜３０塩基であってもよく、１５〜２５塩基であってもよい。
【００３０】
遺伝子増幅反応による遺伝子断片の増幅の検出は、例えば、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動等により、増幅された遺伝子断片を観察することにより行ってもよい。あるいは、ＳＹＢＲグリーン等のインターカレーター色素の存在下で遺伝子増幅反応を行い、インターカレーター色素の蛍光を検出する、リアルタイムＰＣＲ法により行ってもよい。
【００３１】
（第２Ｂ実施形態）
ウナギがニホンウナギであるか否かを判定する方法の第２Ｂ実施形態は、対象のウナギがニホンウナギであるか否かを判定する方法であって、前記ウナギのミトコンドリアＤＮＡを鋳型として、配列番号２に記載の塩基配列の第１〜１１７８番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列の第１〜１１７８番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるセンスプライマーと、配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９２〜１１９４番目のいずれかの塩基を５’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９２〜１１９４番目のいずれかの塩基を５’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるアンチセンスプライマーと、を用いた遺伝子増幅反応を行う工程と、前記遺伝子増幅反応により遺伝子断片の増幅が認められた場合に前記ウナギはニホンウナギであると判定し、遺伝子断片の増幅が認められなかった場合に前記ウナギはニホンウナギでないと判定する工程と、を備える方法である。
【００３２】
第２Ｂ実施形態の判定方法は、アンチセンスプライマーの３’末端が鋳型ＤＮＡにアニーリングすることができるか否かによって、対象のウナギがニホンウナギであるか否かを判定する方法であり、その他の点は第２Ａ実施形態の判定方法と同様である。
【００３３】
［ウナギがニホンウナギであるか否かの判定用キット］
（第１Ａ実施形態）
対象のウナギがニホンウナギであるか否かの判定用キットの第１Ａ実施形態は、配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９３〜１１９５番目のいずれかの塩基を３’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９３〜１１９５番目のいずれかの塩基を３’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるセンスプライマーと、配列番号２に記載の塩基配列の第１２１１〜１７０４番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列の第１２１１〜１７０４番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるアンチセンスプライマーと、を備えるものである。
【００３４】
第１Ａ実施形態のキットにおいて、センスプライマー及びアンチセンスプライマーは、上述した、ウナギがニホンウナギであるか否かを判定する方法の第２Ａ実施形態におけるものと同様である。本実施形態の判定用キットを用いることにより、上述した、ウナギがニホンウナギであるか否かを判定する方法の第２Ａ実施形態を実施することができる。
【００３５】
（第１Ｂ実施形態）
対象のウナギがニホンウナギであるか否かの判定用キットの第１Ｂ実施形態は、配列番号２に記載の塩基配列の第１〜１１７８番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列の第１〜１１７８番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるセンスプライマーと、配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９２〜１１９４番目のいずれかの塩基を５’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９２〜１１９４番目のいずれかの塩基を５’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるアンチセンスプライマーと、を備えるものである。
【００３６】
第１Ｂ実施形態のキットにおいて、センスプライマー及びアンチセンスプライマーは、上述した、ウナギがニホンウナギであるか否かを判定する方法の第２Ｂ実施形態におけるものと同様である。本実施形態の判定用キットを用いることにより、上述した、ウナギがニホンウナギであるか否かを判定する方法の第２Ｂ実施形態を実施することができる。
【００３７】
（第２実施形態）
対象のウナギがニホンウナギであるか否かの判定用キットの第２実施形態は、上述した第１Ａ実施形態のキット又は第２Ａ実施形態のキットが、プローブを更に備えるものである。
【００３８】
プローブとしては、上述した第１Ａ実施形態のキット又は第２Ａ実施形態のキットの、センスプライマーとアンチセンスプライマーとに挟まれる配列番号２の塩基配列上の領域内の、連続する１５〜４０ヌクレオチド又は前記ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドからなり、５’末端又は３’末端の一方に蛍光物質を有し、他方に消光物質を有するものが挙げられる。
【００３９】
プローブとしては、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いることもできる。使用可能な蛍光物質としては、ＦＡＭ、Ｙａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗ（登録商標）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＶＩＣ（登録商標）等が挙げられる。また、使用可能な消光物質としては、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）等が挙げられる。
【００４０】
上記のプローブの存在下で遺伝子増幅反応を行うと、プローブが増幅対象のＤＮＡ断片にアニーリングする。そして、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によりプローブが分解される。その結果、プローブ分子上で近接して存在していた消光物質と蛍光物質が離れ、蛍光物質が蛍光を発するようになる。この蛍光を定量することにより、遺伝子増幅反応の進行を定量的に測定することができる。
【００４１】
本実施形態のキットにおけるプローブの長さは、センスプライマー及びアンチセンスプライマーよりも先に鋳型ＤＮＡにアニーリングすることができれば（センスプライマー及びアンチセンスプライマーよりも融解温度（Ｔｍ）が高ければ）特に制限されず、例えば１５〜４０塩基であってもよく、１５〜３５塩基であってもよく、１５〜３０塩基であってもよく、１５〜２５塩基であってもよい。
【００４２】
本実施形態のキットを用いることにより、上述した、ウナギがニホンウナギであるか否かを判定する方法の第２Ａ実施形態又は第２Ｂ実施形態をリアルタイムＰＣＲ法により実施することができる。
【実施例】
【００４３】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４４】
［実験例１］
（ニホンウナギの１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列の検討）
ニホンウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、便宜的和名：ルソンウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｌｕｚｏｎｅｎｓｉｓ）、オオウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｍａｒｍｏｒａｔａ）、ヨーロッパウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ａｎｇｕｉｌｌａ）、アメリカウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｒｏｓｔｒａｔａ）、便宜的和名：インド洋型バイカラウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｂｉｃｏｌｏｒ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、便宜的和名：太平洋型バイカラウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｂｉｃｏｌｏｒ  ｐａｃｉｆｉｃａ）、便宜的和名：東方オーストラリアウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、便宜的和名：西方オーストラリアウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ  ｓｃｈｍｉｄｔｉ）、便宜的和名：東方ベンガレンシスウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｂｅｎｇａｌｅｎｓｉｓ  ｂｅｎｇａｌｅｎｓｉｓ）、便宜的和名：西方ベンガレンシスウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｂｅｎｇａｌｅｎｓｉｓ  ｌａｂｉａｔａ）、便宜的和名：セレベスウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｃｅｌｅｂｅｓｅｎｓｉｓ）、便宜的和名：ディフェンバッキウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈｉｉ）、便宜的和名：インテリオリスウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｉｎｔｅｒｉｏｒｉｓ）、便宜的和名：メガストマウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｍｅｇａｓｔｏｍａ）、便宜的和名：モザンビークウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｍｏｓｓａｍｂｉｃａ）、便宜的和名：レインハルディウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、便宜的和名：ボルネオウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｂｏｒｎｅｅｎｓｉｓ）、便宜的和名：オブスキュラウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｏｂｓｃｕｒａ）について、ミトコンドリア１６ＳリボソームＲＮＡ（１６Ｓ  ｒＲＮＡ）の塩基配列を比較した。特に、ニホンウナギ（ｎ＝４０８）、オオウナギ（ｎ＝４８７）、ルソンウナギ（ｎ＝２０７）、インド洋型バイカラウナギ（ｎ＝２１５）、太平洋型バイカラウナギ（ｎ＝４３０）、ヨーロッパウナギ（ｎ＝８７）、アメリカウナギ（ｎ＝５０）については、多数の個体の塩基配列を同定して比較した。図１は、各種のウナギの１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列をアラインメントした結果を示す図である。
【００４５】
その結果、ニホンウナギに特有の塩基配列を有する領域が明らかとなった。また、各種のウナギには種内変異が存在することが明らかとなった。
【００４６】
図２は、ニホンウナギの種内変異を示す図である。多数の個体のミトコンドリア１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列を同定した結果、図２中、ＪＡＰ−ＨＴ０１〜ＪＡＰ−ＨＴ１３と示す１３種類の種内変異を同定することができた。
【００４７】
また、図３は、ルソンウナギの種内変異を示す図である。多数の個体のミトコンドリア１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列を同定した結果、図３中、ＬＵＺ−ＨＴ０１〜ＬＵＺ−ＨＴ０５と示す５種類の種内変異を同定することができた。
【００４８】
［実験例２］
（特異的検出用プライマーを用いたニホンウナギの判定）
各種のウナギのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応を行い、ニホンウナギであるか否かの判定を行った。
【００４９】
具体的には、まず、ウナギの尾部周辺の組織（約２ｍｍ角）を摘出し、アルカリ溶液中で溶解した後に中和して、ゲノムＤＮＡを調製し試料とした。ウナギとしては、ニホンウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、ヨーロッパウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ａｎｇｕｉｌｌａ）、太平洋型バイカラウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｂｉｃｏｌｏｒ  ｐａｃｉｆｉｃａ）、ルソンウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｌｕｚｏｎｅｎｓｉｓ）及びオオウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｍａｒｍｏｒａｔａ）を用いた。ウナギは、各種について数検体ずつ用いた。
【００５０】
続いて、各試料を鋳型として、一般的な魚類のミトコンドリア１６Ｓ  ｒＲＮＡを増幅することができるセンスプライマー（配列番号３）及びアンチセンスプライマー（配列番号４）を用いたＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動により解析した。
【００５１】
図４（ａ）は、アガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。図４中、「＋」は陽性対照を表し、「Ｎ」は陰性対照を表す。陽性対照としては以前に遺伝子増幅が見られることが確認されたニホンウナギのゲノムＤＮＡを用いた。また、陰性対照としては蒸留水を用いた。その結果、全てのウナギ試料について遺伝子増幅が認められ、ミトコンドリア１６Ｓ  ｒＲＮＡの存在が確認された。
【００５２】
続いて、各試料を鋳型として、ニホンウナギの特異的検出用プライマーを用いたＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動により解析した。プライマーとしては、ニホンウナギのミトコンドリア１６Ｓ  ｒＲＮＡを特異的に増幅することができるセンスプライマー（配列番号５）及びアンチセンスプライマー（配列番号６）を用いた。
【００５３】
図４（ｂ）は、アガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。その結果、ニホンウナギ特異的に遺伝子増幅が認められた。この結果は、特異的検出用プライマーを用いた遺伝子増幅反応により、ニホンウナギを特異的に検出できることを示す。
【００５４】
［実験例３］
（ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いたニホンウナギの判定）
ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いたリアルタイムＰＣＲ反応を行い、ニホンウナギであるか否かの判定を行った。
【００５５】
まず、実験例２と同様にして、ニホンウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、ヨーロッパウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ａｎｇｕｉｌｌａ）、太平洋型バイカラウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｂｉｃｏｌｏｒ  ｐａｃｉｆｉｃａ）、ルソンウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｌｕｚｏｎｅｎｓｉｓ）及びオオウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｍａｒｍｏｒａｔａ）のゲノムＤＮＡを調製し試料とした。
【００５６】
続いて、各試料を鋳型として、センスプライマー（配列番号５）、アンチセンスプライマー（配列番号６）及びＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（配列番号７）を用いたリアルタイムＰＣＲ反応を行った。なお、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（配列番号７）は２７ｍｅｒであり、Ｔｍ値は６３．５℃であった。また、センスプライマー（配列番号５）及びアンチセンスプライマー（配列番号６）のＴｍ値は、それぞれ５４．４℃及び５６．１℃であった。
【００５７】
リアルタイムＰＣＲ反応の反応液（２０μＬ）の組成は、１０μＬのＴａｑＭａｎ（登録商標）ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（ＡＢＩ社）、９００ｎＭセンスプライマー、９００ｎＭアンチセンスプライマー、２００ｎＭ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、３μＬの鋳型ＤＮＡ（１０ｎｇ／μＬ）とした。また、リアルタイムＰＣＲ反応は、５０℃２分間、９５℃１０分間の処理後、９５℃１０秒間と６０℃６０秒間の反応を５０回繰り返すことにより行った。反応及び解析にはリアルタイムＰＣＲ装置（型式「ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７３００」、ＡＢＩ社）を用いた。
【００５８】
その結果、ニホンウナギのゲノムＤＮＡを鋳型に用いた場合には、Ｃｔ値が３０弱であったのに対し、その他の種のゲノムＤＮＡを鋳型に用いた場合には、Ｃｔ値が４０以上であったか又はシグナルが確認されなかった。
【００５９】
この結果は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いたリアルタイムＰＣＲ反応により、ニホンウナギを特異的に検出できることを示す。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明によれば、ウナギがニホンウナギであるか否かを高い精度で容易に判定することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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