(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
気管支肺異形成症（ＢＰＤ）の治療のための組成物であって、
前記組成物は、抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片を含み、
前記組成物は、治療を必要とする個体に投与されることを特徴とし、
前記抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片が、表面プラズモン共鳴結合アッセイにおいて、ヒトＦｌｔ−１に対して０．５×１０−１１Ｍを超える結合親和性を有する、組成物。
【請求項２】
前記個体が、ＢＰＤに罹患しているか、またはＢＰＤに罹患しやすい乳児である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記個体が、ＢＰＤに罹患しているか、またはＢＰＤに罹患しやすい胎児を孕む妊婦である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片が、表面プラズモン共鳴結合アッセイにおいて、１０−１２Ｍを超えるヒトＦｌｔ−１への結合親和性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片が、ヒトＦｌｔ−１との競合アッセイにおいて１００ｐＭより低いＩＣ５０で特徴付けられる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片が、ヒトＦｌｔ−１との競合アッセイにおいて１０ｐＭより低いＩＣ５０で特徴付けられる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片が、ヒトＦｌｔ−１との競合アッセイにおいて１ｐＭより低いＩＣ５０で特徴付けられる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記競合アッセイが、ＶＥＧＦのヒトＦｌｔ−１への結合の阻害である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記競合アッセイが、ＰＬＧＦのヒトＦｌｔ−１への結合の阻害である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片が、ＶＥＧＦＲ２及び／またはＶＥＧＦＲ３に結合しない、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片が、マウスまたはサルＦｌｔ−１に結合しない、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片が、マウス及び／またはサルＦｌｔ−１に結合する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片が、ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ＳｃＦｖｓ、ダイアボディ、トリアボディ及びテトラボディからなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片が、ＩｇＧである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片が、ＩｇＧ１である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片が、モノクローナル抗体である、請求項１４または１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記モノクローナル抗体が、ヒト化モノクローナル抗体である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ヒト化モノクローナル抗体が、ヒトＦｃ領域を含有する、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記Ｆｃ領域が、前記抗体のインビボ半減期が延長されるように、前記Ｆｃ領域と前記ＦｃＲｎ領域との間の前記結合親和性を向上させる１つ以上の突然変異を含有する、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記Ｆｃ領域が、ヒトＩｇＧ１のＴｈｒ  ２５０、Ｍｅｔ  ２５２、Ｓｅｒ  ２５４、Ｔｈｒ  ２５６、Ｔｈｒ  ３０７、Ｇｌｕ  ３８０、Ｍｅｔ  ４２８、Ｈｉｓ  ４３３、及び／またはＡｓｎ  ４３４に相当する１つ以上の位置において１つ以上の突然変異を含有する、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記組成物が、非経口投与されることを特徴とする、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記非経口投与が、静脈内、皮内、髄腔内、吸入、経皮（局所）、眼内、筋肉内、皮下、肺送達、及び／または経粘膜投与から選択される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記非経口投与が、静脈内投与である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記組成物が、経口投与されることを特徴とする、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記組成物が、隔月、毎月、３週間毎、隔週、毎週、毎日、または変動時間間隔で投与されることを特徴とする、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片が、肺及び心臓から選択される１つ以上の標的組織に送達される、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片が、肺に送達される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片が、心臓に送達される、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
前記組成物の前記投与が、健常な肺組織の成長、肺炎症の減少、肺胞形成の増加、血管新生の増加、肺血管床の改善された構造、肺の瘢痕化の低減、改善された肺成長、呼吸不全の低減、改善された運動不耐性、有害神経学的転帰の低減、及び／または対照と比べての改善された肺機能をもたらす、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
前記組成物が、界面活性剤、酸素療法、人工呼吸器療法、ステロイド、ビタミンＡ、一酸化窒素吸入、高カロリー栄養処方物、利尿剤、及び／または気管支拡張剤から選択される少なくとも１つの追加薬剤または療法と同時投与されることを特徴とする、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年４月７日に出願された米国仮出願第６２／１４４，２４１号の優先権を主張するものであり、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
気管支肺異形成症（ＢＰＤ）は、主に未熟児に影響を及ぼす重度の慢性肺疾患である。未熟児は、酸素補充及び機械的呼吸補助装置の使用によりそれらの肺が損傷した後にＢＰＤを発症する可能性がある。ＢＰＤを患う乳児は、肺に炎症及び瘢痕を有し、重度の症例では、人工呼吸器または酸素補充の長期的の必要性、肺高血圧症、再発性呼吸器感染症、肺機能異常、運動不耐性、遅発性神経発達状態、及びさらには死亡する高いリスクにある。
【０００３】
しかしながら、ＢＰＤを患う多くの乳児は時間と共に回復かつ改善するが、これらの子供は、喘息及びウイルス性肺炎を含むさらなる合併症を発症するリスクが高い。そして、大半の乳児は生存するが、非常に重度のＢＰＤの乳児は、数か月のケア後にもこの疾患によって死亡するであろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、とりわけ、抗Ｆｌｔ−１抗体療法に基づく、慢性肺障害、特に気管支肺異形成症（ＢＰＤ）を治療するための改善された方法及び組成物を提供する。以下の実施例に記載するように、本発明は、一部には、抗Ｆｌｔ−１抗体、またはその抗原結合断片は、ＶＥＧＦ及び他のリガンドがＦｌｔ−１受容体に結合することを阻害でき、これにより、ＶＥＧＦ及び／またはＶＥＧＦ受容体に結合するために利用可能な他のリガンドの量を増加させるという発見に基づいている。この増加した結合は、毛細血管密度を増加させ、線維症ならびに炎症の軽減、及びＢＰＤに関連する症状ならびに特徴の軽減を促進する血管新生促進効果を誘起することができる。実際、実施例に示すように、本発明者らは、抗Ｆｌｔ−１抗体の投与が、ＢＰＤ動物モデルにおける肺病理学の尺度を改善することを実証した。したがって、本発明は、ＢＰＤの治療のための安全かつ有効な抗体ベースの療法を提供する。
【０００５】
一態様では、本発明は、抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合性断片の有効量を、治療を必要とする個体に投与することを含む、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）の治療方法を提供する。
【０００６】
いくつかの実施形態において、個体は、ＢＰＤに罹患しているか、または、ＢＰＤに罹患しやすい乳児である。いくつかの実施形態において、個体は、ＢＰＤに罹患しているか、または、ＢＰＤに罹患しやすい胎児を孕む妊婦である。
【０００７】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合性断片は、表面プラズモン共鳴結合アッセイにおいて、１０−９Ｍを超える、１０−１０Ｍを超える、または１０−１２Ｍを超える親和性で、ヒトＦｌｔ−１に結合する能力によって特徴付けられる。
【０００８】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＦｌｔ−１との競合アッセイにおいて、１００ｐＭより低い、１０ｐＭより低い、または１ｐＭより低いＩＣ５０によって特徴付けられる。
【０００９】
いくつかの実施形態において、競合アッセイは、ＶＥＧＦのヒトＦｌｔ−１への結合の阻害である。いくつかの実施形態において、競合アッセイは、ＰＬＧＦのヒトＦｌｔ−１への結合の阻害である。
【００１０】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片は、ＶＥＧＦＲ２及び／またはＶＥＧＦＲ３に結合しない。
【００１１】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片は、マウスまたはサルＦｌｔ−１に結合しない。
【００１２】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片は、マウス及び／またはサルＦｌｔ−１に結合する。
【００１３】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片は、ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ＳｃＦｖｓ、ダイアボディ、トリアボディ及びテトラボディからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片は、ＩｇＧである。いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片は、ＩｇＧ１である。
【００１４】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、ヒト化モノクローナル抗体はヒトＦｃ領域を含有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、抗体のインビボ半減期を延長させるように、Ｆｃ領域とＦｃＲｎ受容体との間の結合親和性を高める１つ以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１のＴｈｒ  ２５０、Ｍｅｔ  ２５２、Ｓｅｒ  ２５４、Ｔｈｒ  ２５６、Ｔｈｒ  ３０７、Ｇｌｕ  ３８０、Ｍｅｔ  ４２８、Ｈｉｓ  ４３３、及び／またはＡｓｎ  ４３４に相当する１つ以上の位置において１つ以上の突然変異を含有する。
【００１５】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片は、非経口投与される。いくつかの実施形態において、非経口投与は、静脈内、皮内、髄腔内、吸入、経皮（局所）、眼内、筋肉内、皮下、肺送達、及び／または経粘膜投与から選択される。いくつかの実施形態において、非経口投与は、静脈内投与である。
【００１６】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片は、経口投与される。
【００１７】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片は、隔月、毎月、三週間毎、隔週、毎週、毎日、または変動時間間隔で投与される。
【００１８】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片は、肺及び心臓から選択される１つ以上の標的組織に送達される。いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片は、肺に送達される。いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片は、心臓に送達される。
【００１９】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片の投与は、対照と比較して、健常な肺組織の成長、肺炎症の減少、肺胞形成の増加、血管新生の増加、肺血管床の改善された構造、肺の瘢痕化の低減、改善された肺成長、呼吸不全の低減、改善された運動不耐性、有害神経学的転帰の低減、及び／または改善された肺機能をもたらす。
【００２０】
いくつかの実施形態において、本発明は、界面活性剤、酸素療法、人工呼吸器療法、ステロイド、ビタミンＡ、一酸化窒素吸入、高カロリー栄養処方物、利尿剤、及び／または気管支拡張剤から選択される少なくとも１つの追加薬剤または療法を同時投与することをさらに含む方法を提供する。
【００２１】
本出願で使用される場合、「約」及び「およそ」という用語は、等価物として使用される。本出願において約／およその有無を問わず使用される任意の数字は、関連技術分野の当業者によって認識される任意の通常の変動を網羅することを意味する。
【００２２】
本発明の他の特徴、目的、及び利点は、以下の詳細な説明から明らかである。しかしながら、詳細な説明は、本発明の実施形態を示しているが、例示として供与されているものにすぎず、限定されるものではないことを理解されたい。本発明の範囲内の様々な変更及び修正は、詳細な説明から当業者には明らかになるであろう。
特定の実施形態において、例えば、以下が提供される：
（項目１）
気管支肺異形成症（ＢＰＤ）の治療法であって、
抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片の有効量を、治療を必要とする個体に投与することを含む、方法。
（項目２）
前記個体が、ＢＰＤに罹患しているか、またはＢＰＤに罹患しやすい乳児である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記個体が、ＢＰＤに罹患しているか、またはＢＰＤに罹患しやすい胎児を孕む妊婦である、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片が、表面プラズモン共鳴結合アッセイにおいて、１０−９Ｍを超える親和性でヒトＦｌｔ−１に結合する能力で特徴付けられる、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片が、表面プラズモン共鳴結合アッセイにおいて、１０−１０Ｍを超えるヒトＦｌｔ−１への結合親和性を有する、項目１または４に記載の方法。
（項目６）
前記抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片が、表面プラズモン共鳴結合アッセイにおいて、１０−１２Ｍを超えるヒトＦｌｔ−１への結合親和性を有する、項目１〜５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片が、ヒトＦｌｔ−１との競合アッセイにおいて１００ｐＭより低いＩＣ５０で特徴付けられる、項目１〜６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片が、ヒトＦｌｔ−１との競合アッセイにおいて１０ｐＭより低いＩＣ５０で特徴付けられる、項目１〜７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片が、ヒトＦｌｔ−１との競合アッセイにおいて１ｐＭより低いＩＣ５０で特徴付けられる、項目１〜８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記競合アッセイが、ＶＥＧＦのヒトＦｌｔ−１への結合の阻害である、項目７〜９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記競合アッセイが、ＰＬＧＦのヒトＦｌｔ−１への結合の阻害である、項目７〜９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片が、ＶＥＧＦＲ２及び／またはＶＥＧＦＲ３に結合しない、項目１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片が、マウスまたはサルＦｌｔ−１に結合しない、項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片が、マウス及び／またはサルＦｌｔ−１に結合する、項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片が、ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ＳｃＦｖｓ、ダイアボディ、トリアボディ及びテトラボディからなる群から選択される、項目１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片が、ＩｇＧである、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片が、ＩｇＧ１である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片が、モノクローナル抗体である、項目１６または１７に記載の方法。
（項目１９）
前記モノクローナル抗体が、ヒト化モノクローナル抗体である、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記ヒト化モノクローナル抗体が、ヒトＦｃ領域を含有する、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記Ｆｃ領域が、前記抗体のインビボ半減期が延長されるように、前記Ｆｃ領域と前記ＦｃＲｎ領域との間の前記結合親和性を向上させる１つ以上の突然変異を含有する、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記Ｆｃ領域が、ヒトＩｇＧ１のＴｈｒ  ２５０、Ｍｅｔ  ２５２、Ｓｅｒ  ２５４、Ｔｈｒ  ２５６、Ｔｈｒ  ３０７、Ｇｌｕ  ３８０、Ｍｅｔ  ４２８、Ｈｉｓ  ４３３、及び／またはＡｓｎ  ４３４に相当する１つ以上の位置において１つ以上の突然変異を含有する、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片が、非経口投与される、項目１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記非経口投与が、静脈内、皮内、髄腔内、吸入、経皮（局所）、眼内、筋肉内、皮下、肺送達、及び／または経粘膜投与から選択される、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記非経口投与が、静脈内投与である、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片が、経口投与される、項目１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片が、隔月、毎月、３週間毎、隔週、毎週、毎日、または変動時間間隔で投与される、項目１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片が、肺及び心臓から選択される１つ以上の標的組織に送達される、項目１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片が、肺に送達される、項目１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片が、心臓に送達される、項目１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片の前記投与が、健常な肺組織の成長、肺炎症の減少、肺胞形成の増加、血管新生の増加、肺血管床の改善された構造、肺の瘢痕化の低減、改善された肺成長、呼吸不全の低減、改善された運動不耐性、有害神経学的転帰の低減、及び／または対照と比べての改善された肺機能をもたらす、項目１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
界面活性剤、酸素療法、人工呼吸器療法、ステロイド、ビタミンＡ、一酸化窒素吸入、高カロリー栄養処方物、利尿剤、及び／または気管支拡張剤から選択される少なくとも１つの追加薬剤または療法を同時投与することをさらに含む、項目１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】可溶性ヒトＦｌｔ−１抗原で免疫化されたマウスの抗可溶性ヒトＦｌｔ−１抗血清力価を示す例示的な結果を示す。
【図２】ＥＬＩＳＡにおけるモノクローナル抗体のヒト可溶性Ｆｌｔ−１との競合的結合を示す例示的な結果を示す。
【図３】可溶性ヒトＦｌｔ−１に結合する例示的なモノクローナル抗体を示す。
【図４】表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥ）アッセイを介した、モノクローナル抗体の可溶性ヒトＦｌｔ−１への結合を示す例示的な結果を示す。
【図５】カニクイザル（ｃｙｎｏ）（サル）Ｆｌｔ−１と結合するモノクローナル抗体の交差反応性を示す例示的な結果を示す。
【図６】ＥＬＩＳＡにおけるモノクローナル抗体のヒト可溶性Ｆｌｔ−１との競合結合を示す例示的な結果を示す。市販ベンチマークに対するモノクローナル抗体０１Ａ０４（サブクローン０２Ｂ１０−０２Ｇ０７）のＶＥＧＦ：ｓＦｌｔ−１  ＩＣ５０の決定を示す。
【図７】細胞ベースのアッセイにおける、ＶＥＧＦのｓＦｌｔ−１への結合の抗Ｆｌｔ−１モノクローナル抗体阻害を示す例示的な結果を示す。
【図８】治療から３日後の肺動脈内皮細胞（ＰＡＥＣ）の増殖を示す例示的な結果を示す。
【図９】治療から３日後のＰＡＥＣの増殖を示す例示的な結果を示す。
【図１０】治療から２４時間後のチューブ形成を示す例示的な結果を示す。
【図１１】治療から２４時間後のチューブ形成を示す例示的な結果を示す。
【図１２】ビタミンＤの子宮内投与の、ラットのＢＰＤのエンドトキシン（ＥＴＸ）誘発性モデルにおける効果を示す例示的な結果を示す。
【図１３】ラットのＢＰＤのエンドトキシン（ＥＴＸ）誘導モデルにおける抗Ｆｌｔ−１モノクローナル抗体の子宮内投与の効果を示す例示的な結果を示す。
【図１４】ＢＰＤの可溶性Ｆｌｔ１（ｓＦＬＴ）誘導モデルにおける抗Ｆｌｔ−１モノクローナル抗体の子宮内投与の、ラットの肺血管密度に及ぼす効果を示す例示的な結果を示す。
【図１５】ＢＰＤの可溶性Ｆｌｔ１（ｓＦＬＴ）誘導モデルにおける抗Ｆｌｔ−１モノクローナル抗体の子宮内投与のラットの、ラットの肺血管密度に及ぼす効果を示す例示的な結果を示す。
【図１６】ラットのＢＰＤの可溶性Ｆｌｔ１（ｓＦＬＴ）誘導モデルにおける抗Ｆｌｔ−１モノクローナル抗体（ａ−ｓＦＬＴ）の低用量投与及び高用量投与の効果を示す例示的な結果を示す。
【図１７】ラットのＢＰＤの可溶性Ｆｌｔ１（ｓＦＬＴ）誘導モデルにおける抗Ｆｌｔ−１モノクローナル抗体（ａ−ｓＦＬＴ）の低用量投与及び高用量投与の効果を示す例示的な結果を示す。
【図１８】ラットのＢＰＤの可溶性Ｆｌｔ１（ｓＦＬＴ）誘導モデルにおける抗Ｆｌｔ−１モノクローナル抗体（ａ−ｓＦＬＴ）の低用量投与及び高用量投与の効果を示す例示的な結果を示す。
【図１９】抗Ｆｌｔ−１モノクローナル抗体（抗ｓＦＬＴ）の１ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの出生後投与の、ラットのＢＰＤのエンドトキシン（ＥＴＸ）誘導モデルにおける体重に及ぼす効果を示す例示的な結果を示す。
【図２０】抗Ｆｌｔ−１モノクローナル抗体（Ｍａｂ）の１ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの出生後投与の、ラットのＢＰＤのエンドトキシン（ＥＴＸ）誘導モデルにおける肺胞分岐数（ｒａｄｉａｌ  ａｌｖｅｏｌａｒ  ｃｏｕｎｔ）（ＲＡＣ）に及ぼす効果を示す例示的結果を示す。
【図２１】抗Ｆｌｔ−１モノクローナル抗体（抗ｓＦＬＴ）の１ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの出生後投与の、ラットのＢＰＤのエンドトキシン（ＥＴＸ）誘導モデルにおける右心室肥大（ＲＶＨ）に及ぼす効果を示す例示的な結果を示す。
【図２２】抗Ｆｌｔ−１モノクローナル抗体（抗ｓＦＬＴ）の１ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの出生後投与の、ラットのＢＰＤのエンドトキシン（ＥＴＸ）誘導モデルにおける肺構造に及ぼす効果を示す例示的な結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
定義
本発明をより容易に理解するために、特定の用語を最初に以下に定義する。以下の用語及びその他の用語の追加的な定義は、本明細書の全体を通して記載される。
【００２５】
動物：本明細書で使用される場合、「動物」という用語は、動物界の任意の一員を指す。いくつかの実施形態において、「動物」とは、任意の発達段階におけるヒトを指す。いくつかの実施形態において、「動物」とは、任意の発達段階における非ヒト動物を指す。特定の実施形態において、非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、齧歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、及び／またはブタ）である。いくつかの実施形態において、動物には、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫、及び／または蠕虫が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、動物は、遺伝子導入動物、遺伝子操作した動物、及び／またはクローンであってもよい。
【００２６】
抗体：本明細書で使用される場合、「抗体」というは用語、天然であろうが、または完全もしくは部分的に合成により産生されようが、任意の免疫グロブリンを指す。特異的な結合能力を維持するそれらの全ての誘導体も、この用語に含まれる。この用語はまた、免疫グロブリン結合ドメインと相同であるか、またはほとんど相同である結合ドメインを有する任意のタンパク質を網羅する。そのようなタンパク質は、天然源に由来してもよく、または部分的もしくは全体的に合成により産生されてもよい。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってもよい。抗体は、ヒトクラス：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥのいずれかを含む、任意の免疫グロブリンクラスの一員であってもよい。特定の実施形態において、抗体は、ＩｇＧ免疫グロブリンクラスの一員であり得る。本明細書で使用される場合、「抗体断片」または「抗体の特徴部」という用語は、互換的に使用され、完全長未満である抗体の任意の誘導体を指す。一般に、抗体断片は、完全長抗体の特異的結合能力の、少なくとも重要な部分を保持する。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖダイアボディ、及びＦｄ断片が挙げられるが、これらに限定されない。抗体断片は、任意の手段によって産生することができる。例えば、抗体断片は、完全な抗体の断片化によって酵素的もしくは化学的に産生されてもよく、及び／または部分的な抗体配列をコードする遺伝子から組換え的に産生されてもよい。代替的または追加的に、抗体断片は、全体的もしくは部分的に合成により産生することができる。抗体断片は、任意に、一本鎖抗体断片を含むことがある。代替的または追加的に、抗体断片は、例えば、ジスルフィド結合によって一緒に結合される複数の鎖を含んでもよい。抗体断片は、任意に、多分子複合体を含んでもよい。機能的抗体断片は、典型的には、少なくとも約５０個のアミノ酸を含み、より典型的には、少なくとも約２００個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、抗体はヒト抗体であってもよい。いくつかの実施形態において、抗体はヒト化抗体であってもよい。
【００２７】
抗原結合断片：本明細書で使用される場合、「抗原結合断片」という用語は、抗原（すなわち、Ｆｌｔ−１）と接触かつ結合する免疫グロブリン分子の一部分を指す。
【００２８】
およそまたは約：本明細書で使用される場合、対象の１つ以上の値に適用される「約」または「およそ」という用語は、記載された基準値と同様である値を指す。特別の実施形態において、「約」または「およそ」という用語は、別段の記載がない限り、または文脈から明らかでない限り、記載された基準値のいずれかの方向（より大きいかまたは小さい）に、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満に入る値の範囲を指す（そのような数が可能な値の１００％を超える場合を除く）。
【００２９】
生物学的に活性：本明細書で使用される場合、「生物学的に活性」という表現は、生物学的系において、特に生物において活性を有する任意の作用物質の特性を指す。例えば、生物に投与されるときに、その生物に対して生物学的効果を有する作用物質は、生物学的に活性であるとみなされる。特定の実施形態において、ペプチドが生物学的に活性である場合、ペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を共有するそのペプチドの一部は、典型的には「生物学的に活性」部分と呼ばれる。特定の実施形態において、ペプチドは固有の生物活性を有さないが、１つ以上のＶＥＧＦリガンドの結合を阻害することから、生物学的に活性であるとみなされる。
【００３０】
担体または希釈剤：本明細書で使用される場合、「担体」及び「希釈剤」という用語は、医薬製剤の調製に有用な、医薬上許容される（例えば、ヒトへの投与に対して安全かつ非毒性の）担体または希釈物質を指す。希釈剤の例には、滅菌水、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンガー溶液またはデキストロース溶液が挙げられる。
【００３１】
投与形態：本明細書で使用される場合、「投与形態」及び「単位投与形態」という用語は、治療される患者のための治療用タンパク質（例えば、抗体）の物理的に別個の単位を指す。各単位は、所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性物質を含有する。しかしながら、組成物の総投与量は、主治医によって、健全な医学的判断の範囲内で決定されることが理解されるであろう。
【００３２】
機能的等価物または誘導体：本明細書で使用される場合、「機能的等価物」または「機能的誘導体」という用語は、アミノ酸配列の機能的誘導体という観点で、元の配列のものと実質的に同様である生物学的活性（機能または構造のいずれか）を保持する分子を示す。機能的誘導体または等価物は、天然誘導体であってもよく、または合成により調製される。例示的な機能的誘導体には、タンパク質の生物学的活性が保存されているという条件で、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または付加を有するアミノ酸配列が含まれる。置換アミノ酸は、望ましくは、置換アミノ酸のものと類似する化学−物理的性質を有する。望ましい類似する化学−物理的性質には、電荷、嵩高さ、疎水性、親水性、その他同種類のものが含まれる。
【００３３】
融合タンパク質：本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」または「キメラタンパク質」という用語は、２つ以上の元々は別々のタンパク質、またはその一部の結合を通じて生成されるタンパク質を指す。いくつかの実施形態において、各タンパク質間にリンカーまたはスペーサーが存在するであろう。
【００３４】
半減期：本明細書で使用される場合、「半減期」という用語は、タンパク質濃度または活性など量が、ある期間の開始時に測定されるその値の半分に低下するのに必要な時間である。
【００３５】
肥大：本明細書で使用される場合、「肥大」という用語は、その構成細胞の拡大に起因する器官または組織の体積の増加を指す。
【００３６】
改善する、増加させる、または低減させる：本明細書で使用される場合、「改善する」、「増加させる」または「低減させる」という用語、もしくは文法的に等価な用語は、本明細書に記載される治療の開始前に同じ個体での測定、または本明細書に記載される治療の不在下での（または複数の対照被験体）における測定などの、ベースライン測定値に関連する値を示す。「対照被験体」とは、治療される被験体とほぼ同じ年齢である、治療される被験体と同じ型の疾患に罹患した被験体である。
【００３７】
インビトロ：本明細書で使用される場合、「インビトロ」という用語は、例えば、多細胞生物内よりはむしろ、試験管または反応容器、細胞培養などの人工的な環境において発生する事象を指す。
【００３８】
インビボ：本明細書で使用される場合、「インビボ」という用語は、ヒト及び非ヒト動物などの多細胞生物内で発生する事象を指す。細胞ベースシステムの観点において、この用語は、（例えば、インビトロ系とは対照的に）生きている細胞内で発生する事象を指すために使用することができる。
【００３９】
リンカー：本明細書で使用される場合、「リンカー」という用語は、融合タンパク質において、天然タンパク質の特定の位置に出現するもの以外のアミノ酸配列を指し、一般に、柔軟性のあるように、または２つのタンパク質部分間のα−ヘリックスなどの構造を挿入するように設計されている。リンカーはスペーサーとも呼ばれる。リンカーまたはスペーサーは、典型的には、それ自体で生物学的機能を有さない。
【００４０】
製薬上許容される：本明細書で使用される場合、「製薬上許容される」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なしに、人間及び動物の組織との接触で使用するのに適し、妥当な利益／リスク比に見合った物質を指す。
【００４１】
ポリペプチド：本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合を介して一緒に結合されたアミノ酸の連続鎖を指す。この用語は、任意の長さのアミノ酸鎖を指すために使用されるが、当業者は、この用語が長い鎖に限定されるものではなく、ペプチド結合を介して一緒に連結された２つのアミノ酸を含む最小の鎖を指すことができることを理解するであろう。当業者に既知であるように、ポリペプチドは処理及び／または修飾されてもよい。
【００４２】
予防：本明細書で使用される場合、「予防する」または「予防」という用語は、疾患、障害、及び／または病態の発生に関連して使用されるとき、疾患、障害及び／または病態を発症するリスクを低減することを指す。「リスク」の定義を参照されたい。
【００４３】
タンパク質：本明細書で使用される場合、「タンパク質」という用語は、別個の単位として機能する１つ以上のポリペプチドを指す。単一のポリペプチドが別個の機能単位であり、別個の機能単位を形成するために他のポリペプチドとの永続的または一時的な物理的会合を必要としない場合、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、互換的に使用されてもよい。別個の機能単位が、互いに物理的に会合する複数のポリペプチドから構成される場合、「タンパク質」という用語は、物理的に結合され、別個の単位として一緒に機能する複数のポリペプチドを指す。
【００４４】
リスク：文脈から理解されるように、疾患、障害、及び／または病態の「リスク」は、特定の個体が疾患、障害及び／または病態（例えば、ＢＰＤ）を発症する可能性を含む。いくつかの実施形態において、リスクはパーセンテージとして表される。いくつかの実施形態において、リスクは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０から最大１００％までである。いくつかの実施形態において、リスクは、基準試料または基準試料の群に関連するリスクに対するリスクとして表される。いくつかの実施形態において、基準試料または基準試料の群は、疾患、障害、病態及び／または事象（例えば、ＢＰＤ）の既知のリスクを有する。いくつかの実施形態において、基準試料または基準試料の群は、特定の個体に匹敵する個体からのものである。いくつかの実施形態において、相対リスクは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上である。
【００４５】
被験体：本明細書で使用される場合、「被験体」という用語は、ヒトまたは任意の非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、または霊長類など）を指す。ヒトには、出生前及び出生後の形態が含まれる。多くの実施形態において、被験体はヒトである。被験体は患者であってもよく、患者は疾患の診断または治療のために医療提供者に提示するヒトを指す。「被験体」という用語は、本明細書では「個体」または「患者」と互換的に使用される。被験体は、疾患または障害に罹患しているか、または罹患しやすい可能性があるが、疾患または障害の症状を示していなくてもよい。
【００４６】
実質的に：本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、対象の特徴または特性の、全体またはほぼ全体の程度または度合いを示す質的条件を指す。生物学的技術分野における当業者であれば、生物学的及び化学的現象が完了する、及び／または完全に進む、または、絶対的な結果を達成するかまたは回避することはあるにしても極めて稀であることを理解するであろう。したがって、「実質的に」という用語は、本明細書では、多くの生物学的及び化学的現象に固有の完全性の潜在的な欠如を捕らえるために使用される。
【００４７】
実質的に相同：本明細書で使用される「実質的に相同」という表現は、アミノ酸または核酸配列間の比較を指す。当業者であれば理解されるように、２つの配列は、それらが対応する位置に相同残基を含有する場合、一般的に「実質的に相同」であるとみなされる。相同残基は同一残基であってもよい。あるいは、相同残基は、適切な類似の構造的及び／または機能的特徴を備える非同一の残基であってもよい。例えば、当業者に周知のように、特定のアミノ酸は、典型的には、「疎水性」または「親水性」アミノ酸として分類され、及び／または「極性」または「非極性」側鎖を有するものとして分類される。同じ型の別のものに対する１つのアミノ酸の置換は、しばしば「相同」置換とみなされる場合がある。
【００４８】
当該技術分野で周知のように、アミノ酸配列または核酸配列は、ヌクレオチド配列用のＢＬＡＳＴＮ、及びアミノ酸配列用のＢＬＡＳＴＰ、ギャップドＢＬＡＳＴ、ならびにＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなどの市販のコンピュータプログラムで利用可能なものを含む、様々なアルゴリズムのいずれかを用いて比較することができる。例示的なそのようなプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３−４１０，１９９０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８；及びＭｉｓｅｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。相同配列を同定することに加えて、上述のプログラムは、典型的には、相同性の度合いの指標をもたらす。いくつかの実施形態において、それらの対応する残基の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上が、残基の関連するストレッチにわたって相同である場合、２つの配列は、実質的に相同であるとみなされる。いくつかの実施形態において、関連するストレッチは、完全な配列である。いくつかの実施態様では、関連するストレッチは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００個、またはそれ以上の残基を含む。
【００４９】
実質的に同一：本明細書で使用される場合、「実質的に同一」という表現は、アミノ酸または核酸配列間の比較を指すために使用される。当業者であれば理解されるように、２つの配列は、それらが対応する位置に同一の残基を含む場合、一般に「実質的に同一」であるとみなされる。当該技術分野で周知のように、ヌクレオチド配列用のＢＬＡＳＴＮ、及びアミノ酸配列用のＢＬＡＳＴＰ、ギャップドＢＬＡＳＴ、ならびにＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなどの市販のコンピュータプログラムで利用可能なものを含む、様々なアルゴリズムのいずれかを用いて比較することができる。例示的なそのようなプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３−４１０，１９９０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８；及びＭｉｓｅｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。同一配列を同定することに加えて、上述のプログラムは、典型的には、同一性の度合いの指標をもたらす。いくつかの実施形態において、その対応する残基の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上が、残基の関連するストレッチにわたって同一である場合、２つの配列は実質的に同一であるとみなされる。いくつかの実施形態において、関連するストレッチは完全な配列である。いくつかの実施形態において、関連するストレッチは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００個、またはそれ以上の残基である。
【００５０】
罹患している：疾患、障害、及び／または病態に「罹患している」個体は、その疾患、障害、及び／または病態の１つ以上の症状を有するかまたは示すと診断されている。
【００５１】
罹患しやすい；疾患、障害、及び／または病態に「罹患しやすい」個体は、疾患、障害、及び／または病態を有すると診断されていない。いくつかの実施形態において、疾患、障害、及び／または病態に罹患しやすい個体は、疾患、障害、及び／または病態の症状を示さない場合がある。いくつかの実施形態において、疾患、障害、病態、または事象（例えば、ＢＰＤ）に罹患しやすい個体は、以下の１つ以上の項目によって特徴付けることができる：（１）疾患、障害、及び／または病態の発症に関連する遺伝子変異、（２）疾患、障害、及び／または病態の発症に関連する遺伝子多型、（３）疾患、障害、及び／または病態に関連するタンパク質の発現及び／または活性の増加ならびに／もしくは減少、（４）疾患、障害、病態、及び／または事象の発症に関連する習慣ならびに／もしくはライフスタイル、及び／または（５）移植を、受けているか、受けると計画しているか、または必要としているかである。いくつかの実施形態において、疾患、障害、及び／または病態に罹患しやすい個体は、疾患、障害、及び／または病態を発症するであろう。いくつかの実施形態において、疾患、障害、及び／または病態に罹患しやすい個体は、疾患、障害及び／または病態を発症しないであろう。
【００５２】
標的組織：本明細書で使用される場合、「標的組織」という用語は、ＢＰＤなどの治療される疾患によって影響を受ける任意の組織を指す。いくつかの実施形態において、標的組織には、疾患関連病理、症状、または特徴を示す組織が含まれ、これらには、肺の炎症、肺瘢痕化、肺の成長障害、早期肺傷害、長期の呼吸不全、肺感染症、運動不耐性、及び有害な神経学的転帰が挙げられる、これらに限定されない。
【００５３】
治療有効量：本明細書で使用される場合、治療剤の「治療有効量」という用語は、疾患、障害、及び／または病態に罹患している、または罹患しやすい被験体に投与したときに、疾患、障害、及び／または病態の症状（複数可）の発症を治療、診断、予防、及び／または遅延させるのに十分である量を意味する。当業者であれば、治療有効量が、典型的には、少なくとも１つの単位用量を含む投与計画を介して投与されることを理解されるであろう。
【００５４】
治療：本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療」、または「治療すること」という用語は、特定の疾患、障害、及び／または病態の、１つ以上の症状または特徴の部分的もしくは完全な軽減、改善、緩和、阻害、予防、発症の遅延、重症度の軽減、及び／または発生率の低下に使用される任意の方法を指す。治療は、疾患の兆候を示さない及び／または疾患の早期兆候のみを示す被験体に、疾患に関連する病理を発症するリスクを低下させる目的で施すことができる。
【００５５】
特定の実施形態の詳細な説明
本発明は、とりわけ、抗Ｆｌｔ−１抗体、またはその抗原結合断片の使用に基づく、慢性肺疾患、特に気管支肺異形成（ＢＰＤ）を治療するための方法及び組成物を、ＢＰＤを治療するための治療剤として提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、ＢＰＤに罹患しているか、またはＢＰＤに罹患しやすい個体に対して、ＢＰＤの少なくとも１つの症状または特徴を、強度、重症度、または頻度において低減させるか、または発症を遅延させるように、Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片の有効量を投与することを含むＢＰＤの治療方法を提供する。
【００５６】
本発明の様々な態様は、以下のセクションで詳細に説明される。セクションの用途は、本発明を限定することを意味するものではない。各セクションは、本発明の任意の態様に適用可能である。本出願において、「または」の使用は、他に記載がない限り、「及び／または」を意味する。
【００５７】
気管支肺異形成症（ＢＰＤ）
界面活性剤療法、母体ステロイド、新しい人工呼吸器戦略、動脈管開存症の積極的な管理、改善された栄養、及び他の治療の導入により、ＲＤＳを有する未熟児の臨床経過及び転帰は、過去３０年間にわたって劇的に変化している。ＢＰＤを発症する乳児の約３分の２が、出生時に軽度の呼吸困難のみを呈することが最近立証されている。これは、肺損傷の発症時期がＢＰＤの病因において重要な因子であることを示唆している。
【００５８】
この疫学的及び臨床的変化パターンと平行して、ＢＰＤにおける肺組織学の重要な特徴も変化した。早産後の持続性肺疾患を有する乳児は、この前界面活性剤期間中にＢＰＤで死亡した乳児で従来観察されたものとは異なる臨床経過、及び病理を有するという認識が現在高まっている。ＢＰＤを最初に特性評価した古典的な進行期は、臨床管理の変更によりしばしば不在であり、また、ＢＰＤは、主に急性肺傷害の重篤度によって定義されるものから、主に遠位肺の成長の崩壊によって定義されるその現在の特性評価まで明確に変化している。したがって、界面活性剤形成後期間のいわゆる新規ＢＰＤは、肺構造、成長、及び、遠位の気腔ならびに脈管構造の機能の変更を伴う肺発生の阻害を表す。生理学的には、これは、肺胞−毛細血管表面積の著しい減少を示唆し、運動不耐性、肺高血圧症、及び急性呼吸器感染症の耐性悪化のリスク増加による、ガス交換障害に潜在的に寄与する。
【００５９】
ＢＰＤの病因
ＢＰＤは、肺の成長の重要な期間、すなわち、気腔中隔形成及び血管発生が劇的に増加する期間である管状期（ヒトでは１７〜２６週）の間の損傷に対する肺の応答を表している。いくつかの実施形態において、早産新生児のＢＰＤの発症への罹患しやすさを増加させる因子には、界面活性剤欠乏症、抗酸化防御の低下、上皮イオンならびに水の送達機能障害、及び肺構造の未成熟が挙げられる。いくつかの実施形態において、早産後の肺損傷及びその後の肺成長の停止は、防御が不十分な発達中の肺の炎症、高酸素症、機械的換気、及び感染症を含む、複数の有害な刺激間の複雑な相互作用から生じる。いくつかの実施形態において、母体絨毛羊膜炎によるＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−８などの炎症誘発性サイトカインへの出生前の曝露は、子宮内の肺成熟を向上させるが、ＢＰＤのリスクを増加させる。
【００６０】
高酸素症、及びオキシダントストレスは、ＢＰＤの発症に重要な因子である。いくつかの実施形態において、早産新生児の、正常な胎児の低酸素圧環境から子宮外生活の相対的な高酸素状態への移行は、肺胞形成の減少及び異型脈管構造を伴う、ＢＰＤのリスクを増加させる。いくつかの実施形態において、酸素環境の早過ぎる変化は、正常な上皮−間葉相互作用を妨げ、毛細血管系における内皮細胞の生存、分化、及び組織化の変化につながる。いくつかの実施形態において、未熟児は、早産後に適切な抗酸化物質の欠如のために、活性酸素種（ＲＯＳ）誘発損傷に特に罹患しやすい。いくつかの実施形態において、酸化防止酵素［例えば、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ、及びグルタチオンペルオキシダーゼ］は、妊娠後期に著しく増加する。いくつかのさらなる実施形態において、高酸素に応答する抗酸化酵素の合成を増加させる能力は、早産の動物において減少し、そのため、早産は、早期の出生後生活中にも持続する抗酸化物質の、正常な上方制御よりも先に起こる可能性がある。いくつかの実施形態において、内皮細胞及び肺胞ＩＩ型細胞は、高酸素症及びＲＯＳ誘発性損傷に極めて罹患しやすく、浮腫の増加、細胞機能障害、及び細胞生存ならびに増殖の障害につながる。
【００６１】
いくつかの実施形態において、重力または容量損傷の明白な兆候がない場合でも、未熟児の機械的換気による治療は、炎症及び浸透性浮腫を伴う肺損傷を起こしかつ促進し、またＢＰＤに寄与する。いくつかの実施形態において、人工呼吸器関連肺損傷（ＶＡＬＩ）は遠位気道上皮及び毛細血管内皮を引き伸ばすことに起因し、これにより、浸透性浮腫を増加させ、界面活性剤の機能を阻害し、及び複雑な炎症性カスケードを引き起こす。いくつかの実施形態において、分娩室における蘇生中などの短時間の正圧換気でさえ、進行性の炎症及び損傷のきっかけをもたらす、肺における細気管支上皮及び内皮の損傷を引き起こし得る。
【００６２】
肺炎症は、出生前に誘起されようが（絨毛羊膜炎から）、出生後の早期（高酸素症またはＶＡＬＩによるもの）に誘起されようが、ＢＰＤの発症において大きな役割を果たす。いくつかの実施形態において、ＢＰＤのリスクは、気管液好中球数、活性化マクロファージ、高濃度の脂質生成物、オキシダント不活性化α−１−アンチトリプシン活性、及び、ＩＬ−６及びＩＬ−８を含む炎症誘発性サイトカインの持続的増加、ならびにＩＬ−１０レベルの低下に関連する。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、及びＴＧＦ−βなどの初期応答サイトカインのマクロファージによる放出、及び可溶性接着分子（すなわち、セレクチン）の存在は、他の細胞に影響を及ぼして、好中球を動員し、炎症反応を増幅する化学誘引物質を放出する可能性がある。いくつかの実施形態において、抗炎症性生成物（すなわち、ＩＬ−１０）の減少に伴う炎症誘発性サイトカインの濃度上昇は、生後数時間以内の胎児の気管吸引液に現れ、その後ＢＰＤを発症する。いくつかの実施形態において、活性化された好中球からのエラスターゼ及びコラゲナーゼ放出の増加は、肺のエラスチン及びコラーゲン骨格を直接破壊し、コラーゲン及びエラスチン分解のマーカーを、ＢＰＤに罹患している乳児の尿中で回収することができる。いくつかの実施形態において、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）による気道コロニー形成などの比較的低い病毒性生物からの感染は、炎症反応を増大させ、さらにＢＰＤのリスクを増加させる可能性がある。いくつかの実施形態において、栄養失調など他の因子、及びビタミンＡならびにＥの欠乏症または界面活性剤タンパク質の一塩基多型変異体などの遺伝因子は、それぞれ、一部の早産新生児のＢＰＤのリスクを増加させる可能性が高い。
【００６３】
ＢＰＤにおける肺循環
気道及び遠位気腔への有害な影響に加えて、急性肺傷害はまた、早産後の発達途上の肺循環の成長、構造、及び機能を害する。いくつかの実施形態において、内皮細胞は、特に高酸素症または炎症を通してオキシダント障害に罹患しやすい。いくつかの実施形態において、小さな肺動脈の媒体は、平滑筋細胞の増殖、未成熟間葉系細胞の成熟平滑筋細胞への早熟、及び血管壁への線維芽細胞／筋線維芽細胞の組込みを含む著しい変化を受ける。いくつかの実施形態において、肺血管系の構造変化は、血管直径の狭小化及び血管コンプライアンスの低下を通して高い肺血管抵抗（ＰＶＲ）に寄与する。いくつかの実施形態において、これらの構造変化に加えて、肺循環は、ＰＶＲも増加させる異常な血管反応性によってさらに特徴付けられる。いくつかの実施形態において、血管形成の低下は、血管表面積を制限する可能性があり、特に運動またはストレスによる高い心拍出量に応答して、ＰＶＲのさらなる上昇を引き起こす。
【００６４】
全体的に、肺循環の早期傷害は、肺高血圧症の急速な発症につながり、重度のＢＰＤの罹患率及び死亡率に著しく寄与する。いくつかの実施形態において、高い死亡率は、長期的な人工呼吸器による補助を必要とするＢＰＤ及び肺高血圧症の乳児で生じる。いくつかの実施形態において、肺高血圧症はより進行したＢＰＤのマーカーであり、ＰＶＲの上昇もまた、右心室機能不良、心拍出量の障害、酸素供給の制限、肺浮腫の増加、及び、恐らくは、突然死のより高いリスクも引き起こす。いくつかの実施形態において、急性低酸素症に対する顕著な血管収縮反応によって証明されるように、ＢＰＤにおける肺循環の生理学的異常には、ＰＶＲの上昇及び異常な血管反応性が含まれる。いくつかの実施形態において、軽度の低酸素症でさえ、中程度の肺高血圧症の基礎レベルを有する乳児において、肺動脈圧の著しい上昇を引き起こす。いくつかの実施形態において、９２〜９４％を超える酸素飽和度の治療レベルは、効果的に肺動脈圧を低下させる。いくつかの実施形態において、肺動脈圧を低下させるか、または肺血管系への損傷を制限するための戦略は、ＢＰＤにおけるその後の肺高血圧症の発症を制限し得る。
【００６５】
最終的に、肺高血圧症及び右心機能は、ＢＰＤを罹患している乳児において主要な臨床的問題として残っている。いくつかの実施形態において、ＢＰＤにおける肺血管疾患はまた、ガス交換障害の生理学的異常、ならびにＢＰＤの実際の病因に寄与する、成長障害による肺動脈密度の低下も含む。いくつかの実施形態において、血管形成障害は、肺胞化を妨げ、内皮細胞の生存、増殖及び機能を保存及び高める戦略は、ＢＰＤの予防のための治療的アプローチを提供する。
【００６６】
ＢＰＤにおける血管形成因子の変更されたシグナル伝達
複数の増殖因子及びシグナル伝達系は、正常な肺血管増殖において重要な役割を果たす。いくつかの実施形態において、早産、及び酸素分圧、炎症性サイトカイン、ならびに他のシグナルの変化は、正常な増殖因子の発現ならびにシグナル伝達、及びしたがって肺／肺血管の発達を変更させる。いくつかの実施形態において、増殖因子はＶＥＧＦである。ＶＥＧＦシグナル伝達の障害は、臨床現場におけるＢＰＤの病因と関連付けられている。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦは、ＢＰＤをその後発症する早期新生児の気管液試料において、慢性肺疾患を発症していないものよりも低いことが見出されている（１８５）。いくつかの実施形態において、高酸素症は、肺のＶＥＧＦ発現を下方制御し、ＶＥＧＦシグナル伝達の薬理学的阻害は、肺血管成長を害して、肺胞形成を阻害する。血管成長の減少及び肺胞形成障害につながるＶＥＧＦシグナル伝達の障害に関する生物学的根拠は、十分に確立されている。
【００６７】
血管成長及び肺胞形成
上記のように、気道と血管との間の緊密な連携は、正常な肺の発達にとって不可欠である。いくつかの実施形態において、肺成長の重要な期間（発達の嚢状または肺胞期）における肺血管成長の不全は、中隔形成を減少させ、最終的にＢＰＤを特徴付ける肺形成不全に寄与する。いくつかの実施形態において、血管形成は肺の発達中の肺胞形成に関与し、肺血管の成長を損ないかつ阻害する機序は、早産後の肺胞の成長を妨げる可能性がある。いくつかの実施形態において、出生後肺成長の重要期間中の肺血管成長の阻害は、肺胞形成を害する。
【００６８】
Ｆｌｔ−１受容体
血管内皮増殖因子受容体１としても知られるＦｌｔ−１受容体は、ＦＬＴ１遺伝子によってコードされる受容体である。シグナル糖タンパク質の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ファミリーは、胚形成及び出生後成長中の血管形成の強力なプロモーターとして作用する。具体的には、ＶＥＧＦ−ＡリガンドのＶＥＧＦ受容体との結合は、血管浸透性を改善し、内皮細胞の移動、増殖、及び生存を誘発することが示されており、新たに形成された内皮細胞は、新しい脈管構造の基本構造をもたらす。血管形成のための主要なＶＥＧＦシグナル分子であるＶＥＧＦ−Ａは、ＶＥＧＦ受容体−１（ＶＥＧＦＲ−１、Ｆｌｔ−１としても知られる）及びＶＥＧＦ受容体−２（ＶＥＧＦＲ−２、Ｆｌｋ−１としても知られている）を介してそのシグナルを媒介する。Ｆｌｔ−１（ｓＦｌｔ−１）の可溶性形態も存在するが、細胞内シグナル伝達ドメインを欠くため、それに結合するＶＥＧＦ−Ａまたは他のリガンドを隔離することによる調節能力でのみ役立つと考えられる。ｓＦｌｔ−１及び細胞内のシグナル伝達経路に結合していないＦｌｔ−１結合部位を含有する他の分子は、「デコイ受容体」と呼ばれる。Ｆｌｔ−１受容体及びＦｌｋ−１受容体は、細胞外ＶＥＧＦ−Ａ結合ドメイン及び細胞内チロシンキナーゼドメインを含み、両方とも、血管芽細胞及び内皮細胞系統における、発達段階及び組織再生中の発現を示す。Ｆｌｔ−１は、Ｆｌｋ−１と比較して、ＶＥＧＦ−Ａ（Ｋｄが約２〜１０ｐＭ）に対して約１０倍高い結合親和性を有するが、より弱いチロシンキナーゼドメインは、ＶＥＧＦ−ＡのＦｌｔ−１への結合後の血管形成シグナル伝達が、Ｆｌｋ−１シグナルよりも比較的弱いことを示す。このように、ホモ接合型Ｆｌｔ−１遺伝子ノックアウトマウスは、内皮細胞の過剰産生及び血管の破壊により胎形成期に死亡する。逆に、ホモ接合型Ｆｌｋ−１遺伝子ノックアウトのマウスは、胚形成中の卵黄嚢血島形成の欠如のために、組織化された血管の発達の欠陥によって死亡する。Ｆｌｔ−１及びＦｌｋ−１受容体の両方は、正常な発達に必要であるが、ＶＥＧＦ−Ａ濃度の選択的増大は、Ｆｌｋ−１受容体へのより大きな結合を可能にし、また毛細血管密度を増加させ、線維症ならびに炎症の軽減、及びＢＰＤに関連する症状ならびに特徴の緩和を促進する血管新生促進効果を誘起させることができる。
【００６９】
本明細書中で使用される場合、「Ｆｌｔ−１受容体」という用語は、可溶性及び膜結合性の両方のＦｌｔ−１受容体、またはその機能的断片を指す。
【００７０】
抗Ｆｌｔ−１抗体
本明細書で使用される場合、「抗Ｆｌｔ−１抗体」という用語は、Ｆｌｔ−１受容体（例えば、可溶性または膜結合Ｆｌｔ−１受容体）に結合する任意の抗体、またはその抗原結合抗体を指す。いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ−１抗体はＦｌｔ−１受容体との高い親和力での結合により生産される。理論により拘束されることを望むものではないが、Ｆｌｔ−１受容体に結合する抗Ｆｌｔ−１抗体は、１つ以上の内因性リガンドが、Ｆｌｔ−１に結合することを阻害し、これによって大量の利用可能なリガンドがＦｌｋ−１受容体などの他のＶＥＧＦ受容体と結合することを可能にすると考えられている。Ｆｌｋ−１受容体の活性化の増加は、毛細血管密度を増大させて、線維症ならびに炎症の低減、及びＢＰＤに関連する症状ならびに特徴の軽減を促進する。いくつかの実施形態において、Ｆｌｔ−１受容体に結合する抗体は、他のＶＥＧＦ受容体に結合するために利用可能なＶＥＧＦの量を増加させる。いくつかの実施形態において、Ｆｌｔ−１受容体に結合する抗体は、他のＶＥＧＦ受容体に結合するために利用可能な胎盤増殖因子（ＰＬＧＦ）の量を増加させる。
【００７１】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ−１抗体、またはその抗原結合断片は、約１０−９Ｍを超える、約１０−１０Ｍを超える、約０．５×１０−１０Ｍを超える、約１０−１１Ｍを超える、約５×１０−１１Ｍを超える、約１０−１２Ｍを超える、または０．５×１０−１２Ｍを超える親和性でヒトＦｌｔ−１に結合する。Ｆｌｔ−１抗体の親和性は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥアッセイなどの表面プラズモン共鳴アッセイで測定されてもよい。
【００７２】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ−１抗体、またはその抗原結合断片は、ヒトＦｌｔ−１との競合アッセイにおいて、１００ｐＭより低い、１０ｐＭより低い、または１ｐＭより低いＩＣ５０によって特徴付けられる。
【００７３】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ−１抗体、またはその抗原結合断片は、Ｆｌｔ−１受容体におけるＶＥＧＦの結合及び／または活性を阻害する。いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ−１抗体、またはその抗原結合断片は、競合アッセイにおけるヒトＦｌｔ−１へのＶＥＧＦの結合の阻害について、１００ｐＭより低い、１０ｐＭより低い、または１ｐＭより低いＩＣ５０によって特徴付けられる。
【００７４】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ−１抗体、またはその抗原結合断片は、Ｆｌｔ−１受容体におけるＰＬＧＦの結合及び／または活性を阻害する。いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ−１抗体、またはその抗原結合断片は、競合アッセイにおけるヒトＦｌｔ−１へのＰＬＧＦの結合の阻害について、１００ｐＭより低い、１０ｐＭより低い、または１ｐＭより低いＩＣ５０によって特徴付けられる。
【００７５】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ−１抗体、またはその抗原結合断片は、Ｆｌｔ−１に選択的に結合し、他のＶＥＧＦ受容体への最小の、またはわずかな結合を有する。いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ−１抗体、またはその抗原結合断片は、Ｆｌｔ−１に選択的に結合し、ＶＥＧＦＲ２（Ｆｌｋ−１）及び／またはＶＥＧＦＲ３（Ｆｌｔ−４）受容体への最小の、またはわずかな結合を有する。
【００７６】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ−１抗体、またはその抗原結合断片は、Ｆｌｔ−１に選択的に結合し、他の哺乳動物Ｆｌｔ−１受容体への最小の、またはわずかな結合を有する（例えば、１０−７Ｍまたは１０−６Ｍ未満の結合親和性で）。いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ−１抗体、またはその抗原結合断片は、ヒトＦｌｔ−１に選択的に結合し、サルＦｌｔ−１には結合しない。いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ−１抗体、またはその抗原結合断片は、ヒトＦｌｔ−１に選択的に結合し、マウスＦｌｔ−１には結合しない。
【００７７】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ−１抗体、またはその抗原結合断片は、ヒトＦｌｔ−１ならびにサルＦｌｔ−１に結合する。いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ−１抗体、またはその抗原結合断片は、ヒトＦｌｔ−１ならびにマウスＦｌｔ−１に結合する。
【００７８】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ−１抗体、またはその抗原結合断片は、ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ＳｃＦｖｓ、ダイアボディ、トリアボディ及びテトラボディからなる群から選択される。
【００７９】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ−１抗体、またはその抗原結合断片は、ＩｇＧである。いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ−１抗体、またはその抗原結合断片は、ＩｇＧ１である。
【００８０】
いくつかの実施形態において、適切な抗Ｆｌｔ−１抗体は、ＦｃＲｎ受容体に結合するＦｃドメインまたはその一部を含む。非限定的な例として、適切なＦｃドメインは、ＩｇＧなどの免疫グロブリンのサブクラスから誘導することができる。いくつかの実施形態において、適切なＦｃドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４から誘導される。特に適切なＦｃドメインには、ヒトまたはヒト化抗体由来のものが含まれる。
【００８１】
ＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体との間の結合の改善は、血清半減期の延長をもたらすと考えられる。したがって、いくつかの実施形態において、適切なＦｃドメインは、ＦｃＲｎへの結合の改善につながる、１つ以上のアミノ酸突然変異を含む。ＦｃＲｎへの結合の改善に影響するＦｃドメイン内の種々の突然変異は、当該技術分野において既知であり、本発明を実施するために適合可能であり得る。いくつかの実施形態において、適切なＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ１のＴｈｒ  ２５０、Ｍｅｔ  ２５２、Ｓｅｒ  ２５４、Ｔｈｒ  ２５６、Ｔｈｒ  ３０７、Ｇｌｕ  ３８０、Ｍｅｔ  ４２８、Ｈｉｓ  ４３３、及び／またはＡｓｎ  ４３４に相当する１つ以上の位置に、１つ以上の突然変異を含む。
【００８２】
いくつかの実施形態において、抗ＦＬＴ−１抗体または抗原結合断片は、スペーサーを含有し、及び／または別の実体に結合される。いくつかの実施形態において、リンカーまたはスペーサーは、ＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰ（配列番号１）（ＧＡＧリンカー）と少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、リンカーまたはスペーサーは、ＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰ（配列番号２）（ＧＡＧ２リンカー）と少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、リンカーまたはスペーサーは、ＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰ（配列番号３）（ＧＡＧ３リンカー）と少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一である配列を含む。
【００８３】
抗Ｆｌｔ−１抗体及び抗原結合断片の産生
本発明に適した組換え抗Ｆｌｔ−１抗体または抗原結合断片は、任意の利用可能な手段によって産生することができる。例えば、組換え抗Ｆｌｔ−１抗体または抗原結合断片は、組換え抗Ｆｌｔ−１抗体または抗原結合断片をコードする核酸を発現するように操作された宿主細胞系を利用することによって、組換え的に産生することができる。
【００８４】
抗体が組換え的に産生される場合、任意の発現系を使用することができる。本の数例を挙げれば、既知の発現系には、例えば、卵、バキュロウイルス、植物、酵母、または哺乳動物細胞が挙げられる。
【００８５】
いくつかの実施形態において、本発明に適した組換え抗Ｆｌｔ−１抗体または抗原結合断片は、哺乳動物細胞において産生される。本発明により使用することができる哺乳動物細胞の非限定的な例には、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫株（ＮＳＯ／ｌ、ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ：８５１１０５０３）、ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６、ＣｒｕＣｅｌｌ、Ｌｅｉｄｅｎ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、及びＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株が挙げられる。
【００８６】
いくつかの実施形態において、本発明は、ヒト細胞から産生された組換え抗Ｆｌｔ−１抗体または抗原結合断片を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、ＣＨＯから産生された抗Ｆｌｔ−１抗体または抗原結合断片を提供する。
【００８７】
医薬組成物及び投与
本発明は、本明細書に記載される抗Ｆｌｔ−１抗体または抗原結合断片、及び生理学的に許容される担体または賦形剤を含有する医薬組成物を提供する。
【００８８】
適切な医薬上許容される担体には、水、塩溶液（例えば、ＮａＣｌ）、生理食塩水、緩衝生理食塩水、アルコール、グリセロール、エタノール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトースなどの炭水化物、アミロースもしくはデンプン、マンニトール、スクロースなどの糖類、デキストロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなど、ならびにこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。医薬製剤は、必要に応じて、活性化合物と有害に反応しないか、または活性を妨害しない補助剤（例えば、滑沢剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝剤、着色剤、香味剤及び／または芳香物質など）と混合することができる。好ましい実施形態において、静脈内投与に適した水溶性担体が使用される。
【００８９】
適切な医薬組成物または医薬品は、必要に応じて、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有することもできる。組成物は、液体溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤、または粉末とすることができる。組成物はまた、トリグリセリドなどの従来の結合剤及び担体を用いて坐剤として製剤化することもできる。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含むことができる。
【００９０】
医薬組成物または医薬品は、人間への投与に適合した医薬組成物として、常法に従って製剤化することができる。例えば、いくつかの実施形態において、静脈内投与用の組成物は、通常、無菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要ならば、この組成物はまた、可溶化剤及び注射部位での痛みを和らげるための局所麻酔剤を含んでもよい。一般に、成分は、別々に、または単位投与形態中に一緒に混合されるかのいずれかで、例えば、活性剤の量を表示するアンプルまたは小袋（ｓａｃｈｅｔｔｅ）などの密閉型容器中の凍結乾燥粉末または無水濃縮物として供給される。組成物が輸注により投与される場合、これは、滅菌医薬品グレードの水、生理食塩水またはデキストロース／水を含有する輸液ボトルで分配され得る。組成物が注射によって投与される場合、成分を投与前に混合することができるように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
【００９１】
投与の経路
本明細書に記載される抗Ｆｌｔ−１抗体または抗原結合断片（あるいは、本明細書に記載される抗Ｆｌｔ−１抗体または抗原結合断片を含有する組成物もしくは医薬品）は、適切な経路で投与される。いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ−１抗体または抗原結合断片タンパク質もしくはそれらを含有する医薬組成物は、非経口投与される。非経口投与は、静脈内、皮内、髄腔内、吸入、経皮（局所）、眼内、筋肉内、皮下、筋肉内、及び／または経粘膜投与であってもよい。いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ−１抗体または抗原結合断片もしくはそれらを含有する医薬組成物は、皮下投与される。本明細書で使用される場合、「皮下組織」は、皮膚の直下の疎な不規則な結合組織として定義される。例えば、皮下投与は、大腿部、腹部、臀部、または肩甲部が挙げられるが、これらに限定されない領域に組成物を注射することによって実行することができる。いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片もしくはそれらを含有する医薬組成物は、静脈内投与される。いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片もしくはそれらを含有する医薬組成物は、髄腔内投与される。いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ−１抗体または抗原結合断片もしくはそれらを含有する医薬組成物は、経口投与される。必要に応じて、複数の経路を同時に使用することができる。
【００９２】
いくつかの実施形態において、投与は、個体において局所的効果だけをもたらすが、一方他の実施形態においては、投与は、個体の複数の部分の全体にわたる効果、例えば、全身的効果をもたらす。典型的には、投与は、抗Ｆｌｔ−１抗体または抗原結合断片の、肺及び心臓が挙げられるが、これらに限定されない、１つ以上の標的組織への送達をもたらす。
【００９３】
投与形態及び投与計画
いくつかの実施形態において、組成物は、治療有効量で、及び／または特定の所望の転帰（例えば、気管支肺異形成症などの慢性肺障害を治療すること、またはそのリスクを低減することによる）に相関している投与計画に従って投与される。
【００９４】
本発明に従って投与される特定の用量または量は、例えば、所望の転帰の性質及び／または程度に、投与の経路及び／またはタイミングの詳細に、ならびに／もしくは１つ以上の特性（例えば、体重、年齢、既往歴、遺伝的特性、生活様式パラメータ、心臓の欠陥の重症度及び／または心臓の血管のレベルなど、もしくはこれらの組み合わせ）に応じて変化してもよい。このような用量または量は、当業者によって決定することができる。いくつかの実施形態において、適切な用量または量は、標準的な臨床技術に従って決定される。代替的または追加的に、いくつかの実施形態において、適切な用量または量は、１つ以上のインビトロまたはインビボアッセイの使用を通して決定され、投与される所望のまたは最適な投与範囲もしくは量を特定する助けとなる。
【００９５】
様々な実施形態において、抗Ｆｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片は、治療有効量で投与される。一般に、治療有効量は、対象にとって有意義な利益を達成する（例えば、基礎疾患または病態を治療し、調節し、治癒し、予防及び／または改善する）のに十分なものである。いくつかの特定の実施形態において、投与されるのに適切な用量または量は、インビトロまたは動物モデル試験システムから導出される用量反応曲線から推定することができる。
【００９６】
いくつかの実施形態において、提供される組成物は、医薬製剤としてもたらされる。いくつかの実施形態において、医薬製剤は、気管支肺異形成症などの慢性肺障害の罹病率またはリスクの低減の達成に相関している投与計画に従って、投与のための単位用量または量であるか、またはそれを含む。
【００９７】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗Ｆｌｔ−１抗体または抗原結合断片を含む製剤は、単回投与として投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗Ｆｌｔ−１抗体または抗原結合断片を含む製剤は、規則的な間隔で投与される。本明細書で使用される場合の「間隔」での投与は、治療有効量が周期的に（単回投与とは区別して）投与されることを示す。この間隔は、標準的な臨床技術によって決定することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗Ｆｌｔ−１抗体または抗原結合断片を含む製剤は、隔月、毎月、月に２回、３週間毎、隔週、毎週、週に２回、週に３回、毎日、１日２回、またはさらには６時間毎に投与される。単一の個体に対する投与間隔は、固定間隔である必要はなく、個体のニーズに応じて、時とともに変化することができる。
【００９８】
本明細書で使用される場合、「隔月」という用語は、２ヶ月に１回（すなわち、２ヶ月毎に１回）を意味し、「毎月」という用語は、１ヶ月に１回の投与を意味し、「３週間毎」という用語は、３週間に１回（すなわち、３週間毎に１回）の投与を意味し、「隔週」という用語は、２週間に１回（すなわち、２週間毎に１回）の投与を意味し、「毎週」という用語は、１週間に１回を意味し、及び「毎日」という用語は、１日１回の投与を意味する。
【００９９】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗Ｆｌｔ−１抗体または抗原結合断片を含む製剤は、規則的な間隔で無期限に投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗Ｆｌｔ−１抗体または抗原結合断片を含む製剤は、規則的な間隔で定められた期間の間に投与される。
【０１００】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗Ｆｌｔ−１抗体または抗原結合断片を含む製剤は、出生前に投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗Ｆｌｔ−１抗体または抗原結合断片を含む製剤は、出生後に投与される。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗Ｆｌｔ−１抗体または抗原結合断片を含む製剤は、約０．５ｍｇ／ｋｇ体重、約１．０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ／ｋｇ体重、または約２０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗Ｆｌｔ−１抗体または抗原結合断片を含む製剤は、約０．５ｍｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、約１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で投与される。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗Ｆｌｔ−１抗体または抗原結合断片を含む製剤は、約３５ｍｇ、約７０ｍｇ、約７００ｍｇ、または約１４００ｍｇの単位用量で成体に投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗Ｆｌｔ−１抗体または抗原結合断片を含む製剤は、約３５ｍｇ〜約１４００ｍｇ、例えば、約７０ｍｇ〜約７００ｍｇの範囲の用量で投与される。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗Ｆｌｔ−１抗体または抗原結合断片を含む製剤は、約２ｍｇ、約４ｍｇ、約４０ｍｇ、または約８０ｍｇの単位用量で乳児に投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗Ｆｌｔ−１抗体または抗原結合断片を含む製剤は、約２ｍｇ〜約８０ｍｇ、例えば、約４ｍｇ〜約４０ｍｇの範囲の用量で投与される。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ−１抗体、またはその抗原結合断片の投与は、少なくとも１つのＢＰＤの兆候または症状の強度、重症度、または頻度を低減し、もしくはその発症を遅延させる。いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ−１抗体、またはその抗原結合断片の投与は、肺炎症、肺瘢痕化、肺成長の障害、早期肺損傷、長期の呼吸不全、肺感染症、運動不耐性、及び有害な神経学的転帰からなる群から選択される少なくとも１つのＢＰＤの兆候または症状の強度、重症度、または頻度を低減し、もしくはその発症を遅延させる。
【０１０６】
併用療法
いくつかの実施形態において、抗Ｆｌｔ−１抗体または抗原結合断片は、１つ以上の既知の治療薬（例えば、コルチコステロイド）と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、既知の治療薬（複数可）は、その標準的なもしくは承認された投与計画及び／またはスケジュールに従って投与される。いくつかの実施形態において、既知の治療薬（複数可）は、その標準的なもしくは承認された投与計画及び／またはスケジュールと比べて変更されている計画に従って投与される。いくつかの実施形態において、このような変更された計画は、１つ以上の単位用量が、量で変更されている（例えば、低減または増加されている）という点で、及び／または投与が頻度で変更されているという点で（例えば、単位用量間の１つ以上の間隔が、より低い頻度をもたらすように広げられているか、またはより高い頻度をもたらすように狭められているという点で）標準的なもしくは承認された投与計画及び／またはスケジュールとは異なる。
【実施例】
【０１０７】
実施例１．高親和性抗Ｆｌｔ−１抗体の生成及び特性評価
抗体０１Ａ０４
抗体を、従来のマウスモノクローナル抗体方法論を用いて、可溶性Ｆｌｔ−１に対して生成した。簡単に言うと、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、組換えヒト可溶性Ｆｌｔ−１（ＡＢＣＡＭから購入）で免疫化した。免疫化から２０日後に、動物を、ＥＬＩＳＡにより抗ｓＦｌｔ−１について力価測定した（図１）。１匹のマウスは、高力価レスポンダーであることが判明し、この動物を、その後、抗原で追加免疫し、５日後に殺処分した。この動物からの脾臓及びリンパ節細胞を、マウス黒色腫パートナーに融合させて、ハイブリドーマを生成した。ハイブリドーマの上清を、ｓＦｌｔ−１抗原に対してスクリーニングし、陽性レスポンダーをスケールアップして、ヒト及びマウスｓＦｌｔ−１の両方への結合、ならびにＶＥＧＦ結合に対してｓＦｌｔ−１と競合する能力について再アッセイした。ヒト及びマウスｓＦｌｔ−１の両方に結合することができる交差反応性ハイブリドーマは存在しなかった。しかしながら、ヒトｓＦｌｔ−１反応性ハイブリドーマの中で、数個のｓＦｌｔ−１：ＶＥＧＦアンタゴニストを、競合ＥＬＩＳＡによって特定した（代表的な実験については、図２を参照されたい）。これらの最も強力な融合パートナー０１Ａ０４を、３ラウンドの単一細胞クローニングにかけ、モノクローナル抗体０１Ａ０４を得た。この抗体を、ｓＦｌｔ−１抗原に対する結合親和性（ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡＣＯＲＥ及びＦＡＣｓ）、ｓＦｌｔ−１：ＶＥＧＦ競合ＥＬＩＳＡにおけるＩＣ５０、及び細胞ベースのアッセイにおける性能についてさらに特性評価した。
【０１０８】
抗体０１Ａ０４の特性評価−結合
融合パートナーの親のクローニング及びサブクローニング後に、０１Ａ０４の親の複数のサブクローンが、固定化可溶性Ｆｌｔ−１への結合を立証した（図３）。これらのサブクローンのうちの１つのモノクローナル０１Ａ０４−０２Ｂ１０−０２Ｇ０７を、抗原への結合、クローンの形態及び生存能力に基づいて、スケールアップ及び細胞バンキング用に選択した。０１Ａ０４−０２Ｂ１０−０２Ｇ０７のｓＦｌｔ−１抗原に対する結合定数を、表面プラズモン共鳴方法論（ＢＩＡＣＯＲＥ、図４を参照）を介して決定した。モノクローナル抗体０１Ａ０４−０２Ｂ１０−０２Ｇ０７は、ヒトｓＦｌｔ−１へのサブナノモルバインダーである。
【０１０９】
抗体０１Ａ０４の特性評価−交差反応性
モノクローナル抗体０１Ａ０４の細胞上で発現したＦｌｔ−１受容体への結合を、ＦＡＣＳで試験した。全ての３つの細胞株への結合を、これら細胞を抗体と１時間インキュベートすることによって試験した。次いで、抗体の細胞への結合を、抗マウスＩｇＧ  ＰＥ抗体で明らかにした。結果を図５に示す。ＥＬＩＳＡ及びＢＩＡＣＯＲＥデータと一致して、モノクローナル抗体０１Ａ０４は、マウスＦｌｔ−１に結合しない。しかしながら、この抗体は、細胞上で発現したヒト及びカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）Ｆｌｔ−１には結合する。
【０１１０】
抗体０１Ａ０４の特性評価−競合
抗体の有効性を推定するために、ラマのＦａｂ及びＩｇＧのスクリーニング用の設定である競合ＥＬＩＳＡ（ヒトｓＦｌｔ−１及びＶＥＧＦを使用する）を使用した。１０〜０．０１μｇ／ｍｌの濃度範囲のＩｇＧを試験した。モノクローナル抗体０１Ａ０４を、陰性対照（精製ポリクローナルマウスＩｇＧ）及び陽性対照（市販の抗ｓＦｌｔ−１モノクローナル抗体Ａｂｃａｍ５６３００）分子の両方に対してアッセイした。半数阻害濃度（ＩＣ５０）値を算出した。結果を図６に示す。
【０１１１】
抗体０１Ａ０４の特性評価−細胞ベースのアッセイ
ヒト初代臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、可溶性Ｆｌｔ−１及びモノクローナル抗体０１Ａ０４の存在または不在下においてＶＥＧＦで刺激した。ＶＥＧＦに誘導された細胞の活性化を、ＶＥＧＦ  Ｒ２受容体のリン酸化状態を決定することによって、アッセイした。可溶性Ｆｌｔ−１の存在下では、ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦに誘導されたＨＵＶＥＣ活性は減衰される。モノクローナル抗体０１Ａ０４の添加は、可溶性Ｆｌｔ−１を拮抗することによって、細胞活性化を救済する（図７）。
【０１１２】
実施例２．抗Ｆｌｔ−１抗体のインビトロ有効性
乳児肺動脈内皮細胞の単離
肺動脈内皮細胞（ＰＡＥＣ）を、１３５日目の妊娠後期（懐胎期間１４７日）の対照ヒツジ胎児の近位肺動脈から採取した。標準内皮マーカーを用いた免疫組織化学法は、細胞の表現型を確認した。次いで、低継代のＰＡＥＣ（ｐ４〜５）を、ＥＴＸ、ＶＥＧＦ、ｓＦｌｔ１または抗Ｆｌｔ１の単独に、または組み合わせに曝した。
【０１１３】
ＥＴＸ、ＶＥＧＦ，ｓＦｌｔ１及び抗Ｆｌｔ１に曝されている間のＰＡＥＣの増殖
胎児ＰＡＥＣを、１０％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で５０，０００細胞／ウェルにて１２ウェルプレートに三通りでプレートし、２１％の酸素中で一晩接着させた。翌日に（０日目）、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。ＶＥＧＦ、ＥＴＸ、ｓＦｌｔ１、または抗Ｆｌｔ１（単独または組み合わせて）を含む２．５％のＦＢＳで補充したＤＭＥＭを添加し、細胞を２１％の酸素中でインキュベートした。外因性因子の最終濃度は、次のとおりである：ＶＥＧＦ  ５０ｎｇ／ｍＬ、ＥＴＸ  １ｎｇ／ｍＬ、ｓＦｌｔ１  １１４ｎｇ／ｍＬ、及び抗Ｆｌｔ１  １８００ｎｇ／ｍＬ。実験培地を毎日交換し、細胞を、０．２５％のトリプシンを用いて取り外してから３日後に計数し、細胞カウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ；Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）で計数した。処置による増殖試験を、２．５％のＦＢＳで補充したＤＭＥＭ中で行い、これは、この濃度が、胎児ＰＡＥＣ生存をいくらかの増殖を伴いながら支援する最低血清濃度であることを決定した以前の研究に基づくものであった。
【０１１４】
ＰＡＥＣチューブ形成アッセイ
インビトロ血管形成をアッセイするために、我々は、０．２％のフラビンモノヌクレオチド及びＵＶ  Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ  １８００（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、ラットの尾部のコラーゲンを架橋させた。５０，０００細胞／ウェルを、ＥＴＸ、ＶＥＧＦ、ｓＦｌｔ１及び抗Ｆｌｔ１（単独または組み合わせて）で補充した無血清ＤＭＥＭ培地に添加し、各条件をそれぞれの動物について三通りで試験した。次いで、ＰＡＥＣを、チューブ形成が２１％の酸素と比べて３％でより堅牢であることを決定した以前の研究に基づいて３％の酸素条件下で、１２〜１８時間インキュベートした。分岐点計数を、ウェル当たり３〜４の視野を有する３つのウェルのそれぞれからの１０倍の倍率下で、盲検様式で行った。ウェルを、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７１蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて画像化した。
【０１１５】
統計的分析
統計的分析を、Ｐｒｉｓｍソフトウェアパッケージ（ｖ．５．０ａ、ＧｒａｐｈＰａｄ）で行った。ボンフェローニ事後検定（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｐｏｓｔ−ｔｅｓｔ）分析による反復測定による一元配置分散分析法（ＡＮＯＶＡ）を行った。０．０５未満のＰ値を有意とみなした。
【０１１６】
抗Ｆｌｔ−１抗体のｓＦＬＴに曝されたＰＡＥＣへの投与
細胞を、組換えヒトＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）、組換えヒト可溶性Ｆｌｔ−１（ｓＦＬＴ、１１４ｎｇ／ｍＬ）またはヒト可溶性Ｆｌｔ−１に対する抗体（ａ−ｓＦＬＴ、１８００ｎｇ／ｍＬ）の単独または組み合わせで処置した。ＰＡＥＣの増殖を処置から３日後に測定し、チューブ分岐点の数を処置から２４時間後に計測した。
【０１１７】
結果
図８に示すように、ｓＦＬＴ及びＶＥＧＦによる処置は、ＶＥＧＦ処置のみによって処置された細胞と比べてＰＡＥＣの数を減少させ、ｓＦＬＴは、ＶＥＧＦが細胞増殖を促進することを防止することを示唆している。ｓＦＬＴ及びａ−ｓＦＬＴの両方がＶＥＧＦと組み合わされたとき、ＰＡＥＣの数は、細胞がＶＥＧＦのみで処置された場合にみられるレベルまで引き上げられ、ａ−ｓＦＬＴが、細胞増殖におけるｓＦＬＴに誘導される減少を阻害することを裏付けている。
【０１１８】
図１０に示すように、ＶＥＧＦ単独による処置は、ＶＥＧＦ及びａ−ｓＦＬＴによる処置と同じように、チューブ分岐点の数を増加させた。これとは対照的に、ＶＥＧＦ及びｓＦＬＴによる処置は、ＶＥＧＦのみによって処置された細胞と比べて、分岐点の数を減少させた。ｓＦＬＴ及びａ−ｓＦＬＴの両方がＶＥＧＦと組み合わされたとき、分岐点の数は、ＶＥＧＦのみの群で見られた数と匹敵し、ａ−ｓＦｌｔは、分岐点の数のｓＦＬＴに誘導される減少を阻害することを裏付けている。
【０１１９】
抗Ｆｌｔ−１抗体のＥＴＸに曝されたＰＡＥＣへの投与
細胞を、ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）、エンドトキシン（ＥＴＸ、１ｎｇ／ｍＬ）、ＶＥＧＦ＋ＥＴＸ、ＥＸＴ＋ａ−ｓＦＬＴ（１８００ｎｇ／ｍＬ）またはＥＸＴ＋ＶＥＧＦ＋ａ−ｓＦＬＴのいずれかで処置した。ＰＡＥＣの増殖を、処置から３日後に測定し、チューブ分岐点の数を処置から２４時間後に計測した。
【０１２０】
結果
図９に示すように、ＰＡＥＣの増殖は、対照（ＣＴＬ）と比べてＶＥＧＦの処置後に増加し、ＥＴＸでの未処置されたＰＡＥＣは、対照と比べて増殖の減少を示した。ＶＥＧＦまたはａ−ｓＦＬＴのいずれかとＥＴＸとの組み合わせは、ＥＴＸ、ＶＥＧＦ及びａ−ｓＦＬＴによる処置と同じように、細胞数を対照群で見られるレベルまで引き上げ、ＶＥＧＦまたはａ−ｓＦＬＴのいずれかによる処置が、ＥＴＸのＰＡＥＣの増殖に及ぼす有害な効果を逆転させることができることを裏付けている。
【０１２１】
図１１に示すように、分岐点の数は、ＶＥＧＦのみによる処置後に増加し、ＥＴＸでのみ処置された細胞は、対照及びＶＥＧＦ処置群の両方と比べて、分岐点の数の減少を示した。ＶＥＧＦまたはａ−ｓＦＬＴのいずれかとＥＴＸとの組み合わせは、ＥＴＸ、ＶＥＧＦ及びａ−ｓＦＬＴによる処置と同じように、分岐点の数を対照群で見られたレベルまで引き上げ、ＶＥＧＦまたはａ−ｓＦＬＴのいずれかによる処置が、ＥＴＸのチューブの分岐点の数に及ぼす有害な効果を逆転させることができることを裏付けている。
【０１２２】
実施例３．ＢＰＤのＥＴＸモデルにおける抗Ｆｌｔ−１抗体のインビボ有効性
動物
全ての手順及びプロトコルは、コロラド大学健康科学センター（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｌｏｒａｄｏ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｅｎｔｅｒ）の動物実験委員会（Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認されたものであった。妊娠中のスプラーグ・ドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から購入し、出産前の少なくとも１週間、デンバーの高度で室内気で維持した（１，６００ｍ、大気圧６３０ｍｍＨｇ、吸入気酸素分圧１２２ｍｍＨｇ）。動物に不断給餌し、１２時間毎に交互に代わる昼夜サイクルに曝した。ラットを、ペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射（０．３ｍｇ／ｇ体重；Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅ，ＩＡ）で殺処分した。
【０１２３】
動物モデル及び試験デザイン
羊膜内ＥＴＸ、ビタミンＤ及び抗ｓＦＬＴの投与
絨毛羊膜炎の動物モデルを利用した。妊娠２０日目に（懐胎期間２２日）に、妊娠ラットを、羊膜内（ＩＡ）注射を受けるように準備した。ラットにおける肺発生の後期管状期中の注射のタイミングを、ＢＰＤの最高のリスクにある２４〜２６週の早期新生児におけるヒトの肺発生の同様な段階に匹敵するように選択した。ブプレノルフィンによる前投薬（０．０１〜０．０５ｍｇ／ｋｇ、皮下注射）の後に、フェースマスク（麻酔器：ＭｉｄｍａｒｋによるＭａｔｒｘ、モデルＶＩＰ３０００）を介しての１〜２％のイソフルラン吸入を用いた全身麻酔下で開腹術を行い、低体温症を防止するために、妊娠ラットを加熱パッド上に保持した。妊娠ラットを、１つの試験において、生理食塩水対照（ＣＴＲ）、エンドトキシン（ＥＴＸ）、またはＥＴＸ＋ビタミンＤ（ｖｉｔ  Ｄ）群に、もしくは他の試験において、生理食塩水対照（ＣＴＲ）、エンドトキシン（ＥＴＸ）またはＥＴＸ＋抗ｓＦＬＴに無作為に割り付けした。ＣＴＲ群は、羊膜嚢当たり通常１３６生理食塩水５０μｌを受容し、ＥＴＸ群は、羊膜嚢当たり、通常生理食塩水で５０μｌに希釈した大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）０５５：Ｂ５５  ＥＴＸ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の１０μｇを受容し、ＥＴＸ＋ｖｉｔ  Ｄ群は、１０μｇの大腸菌０５５：Ｂ５５  ＥＴＸ及び通常生理食塩水で５０μｌに希釈された５０ｐｇを受容し、ＥＴＸ＋抗ｓＦＬＴ群は、１０μｇの大腸菌０５５：Ｂ５５  ＥＴＸ及び低用量（１×モル当量）もしくは高用量（１０×モル当量）の抗ｓＦｌｔ１抗体を受容した。無菌準備下で、３〜４ｃｍの長さの正中線腹部切開を行って羊膜嚢をＩＡ注射用に露出させた。右卵巣に最も近い羊膜嚢を最初に特定して注射し、その後、反時計回りの順序で各羊膜嚢を特定して、母体当たり最大１０個の羊膜嚢に注射した。注射は、ＩＡ  ＥＴＸの蓄積用量による全身毒性に起因する母体死亡を防止するために、１０個の羊膜嚢までに制限された。ＥＴＸの用量を、ＥＴＸが低用量（１〜５μｇ／嚢）では、１４日齢で異常な肺構造を誘導することに失敗するとの以前の研究から確立した。ｖｉｔ  Ｄの用量は、これも、ｖｉｔ  Ｄが高用量（５００ｎｇ／ｇｍ）で、子ラットにおいて皮下カルシウム沈着を生じることを立証する以前の研究から確立した。腹部切開をナイロン縫合糸で閉じた。術後疼痛の制御のために、ブピバカイン（１〜２ｍｇ／ｋｇ、筋肉内注射）を切創上に適用した。術後１０分以内の覚醒を確実にするために、妊娠ラットを注意深く監視し、ラットをケージに戻し、活動及び出血または感染の兆候を監視した。
【０１２４】
帝王切開
ＩＡ注射から２日後に、上述したようなイソフルラン吸入による全身麻酔下で、妊娠ラットで帝王切開を行った。右卵巣に最も近い羊膜嚢内の胎児を娩出させ、その後、反時計回りの順序で残りの胎児を娩出させて、ＩＡ注射に曝された胎児を特定した。帝王切開は、羊膜嚢の順序及びそれらの卵巣に関連する解剖学的位置に基づいて、特異的ＩＡ注射に曝された胎児を特定するために、経膣分娩の代わりに行った。注射された羊膜嚢内の子ラットの全てを、麻酔の開始から５分以内に娩出させた。次いで、母親ラットをペントバルビタールナトリウムで安楽死させた。新生児ラットを、素早く乾燥させて、加熱パッド上に置き、低体温症を回避させた。子ラットは、出生時には、酸素補充または人工呼吸器を受けさせなかった。出生から３０分以内に、子ラットを秤量し、組織学検査用に殺処分にするか、または養母ラットのそばに置き、１４日間生育させた。組織学的評価のために、ラットの肺を出生時及び１４日齢に採取した。出生から試験期間を通して、乳児ラットの生存を毎日監視し、記録した。生存率を、各所定の同腹子における羊膜内注射を受けた羊膜嚢の数で割られた生存した子ラットの数として算出した。
【０１２５】
試験の測定
組織学的分析用の組織
動物を腹腔内ペントバルビタールナトリウムで殺処分した。カテーテルを気管内に置き、肺を４％のパラホルムアルデヒドで膨張させて、２０ｃｍのＨ２Ｏ圧で６０分間維持した。結紮を気管の周りで締め付けて圧力を維持し、カニューレを取り外した。肺を、固定化のために、４％のパラホルムアルデヒド中で、室温にて一晩浸漬させた。２ｍｍの厚さの横断面を、それぞれ、動物ごとに固定した肺の右下葉及び左下葉の中央平面から採取した。各動物からの２つの部分を処置し、試験用にパラフィンワックス中に包埋した。
【０１２６】
気管支肺胞洗浄
気管支肺胞洗浄を、標準的技術に従って出生日に（０日目に）行い、肺のｓＦＬＴレベルを測定した。
肺胞分岐数（ＲＡＣ）
【０１２７】
肺胞形成を、Ｅｍｅｒｙ及びＭｉｔｈａｌのＲＡＣ法によって、記載されるように評価した（Ｃｏｏｎｅｙ  ＴＰ，Ｔｈｕｒｌｂｅｃｋ  ＷＭ．Ｔｈｅ  ｒａｄｉａｌ  ａｌｖｅｏｌａｒ  ｃｏｕｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｅｍｅｒｙ  ａｎｄ  Ｍｉｔｈａｌ：ａ  ｒｅａｐｐｒａｉｓａｌ  １−ｐｏｓｔｎａｔａｌ  ｌｕｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ．Ｔｈｏｒａｘ  ３７：５７２−５７９，１９８２；Ｃｏｏｎｅｙ  ＴＰ，Ｔｈｕｒｌｂｅｃｋ  ＷＭ．Ｔｈｅ  ｒａｄｉａｌ  ａｌｖｅｏｌａｒ  ｃｏｕｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｅｍｅｒｙ  ａｎｄ  Ｍｉｔｈａｌ：ａ  ｒｅａｐｐｒａｉｓａｌ  ２−ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ  ａｎｄ  ｅａｒｌｙ  ｐｏｓｔｎａｔａｌ  ｌｕｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ．Ｔｈｏｒａｘ  ３７：５８０−５８３，１９８２）。呼吸細気管支を、壁の一部において上皮によって覆われた細気管支として特定した。呼吸細気管支の中心から垂直線を細葉結合組織または中隔もしくは胸膜の縁部まで下ろし、この線で交差された中隔の数を計測した。
【０１２８】
統計的分析
統計的分析を、Ｐｒｉｓｍソフトウェアパッケージ（ｖ．５．０ａ、ＧｒａｐｈＰａｄ）で行った。ボンフェローニ事後検定分析による反復測定による一元配置分散分析法（ＡＮＯＶＡ）を行った。０．０５未満のＰ値を有意とみなした。
【０１２９】
結果
図１２に示すように、ｓＦＬＴレベルは、対照群と比べて子宮内でＥＴＸに曝されたラットで有意に（＊ｐ＜０．０５）増加し、ビタミンＤによる処置は、対照群で見られるレベルまでｓＦＬＴのレベルを減少させた。これは、ビタミンＤによる処置が、肺におけるｓＦＬＴのレベルに及ぼすビタミンＤの作用を介してＢＰＤを治療するための治療薬として使用することができることを裏付けている。
【０１３０】
図１３に示すように、形態計測的分析によって、ＲＡＣは、対照群と比べて子宮内でＥＴＸに曝されたラットで減少し、ＥＴＸに曝されたラットにおける抗ｓＦＬＴによる子宮内投与は、ＥＴＸにのみ曝された群と比べて、ＲＡＣを有意に（＊ｐ＜０．０５）増加させた。これは、抗ｓＦＬＴによる治療が、ＢＰＤのための治療薬として使用することができることを裏付けている。
【０１３１】
実施例４．ＢＰＤのｓＦＬＴモデルにおける抗Ｆｌｔ−１抗体のインビボ有効性
動物
全ての手順及びプロトコルは、コロラド大学健康科学センターの動物実験委員会によって承認されたものであった。妊娠中のスプラーグ・ドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から購入し、出産前の少なくとも１週間、デンバーの高度で室内気で維持した（１，６００ｍ、大気圧６３０ｍｍＨｇ、吸入気酸素分圧１２２ｍｍＨｇ）。動物に不断給餌し、１２時間毎に交互に代わる昼夜サイクルに曝した。ラットを、ペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射（０．３ｍｇ／ｇ体重；Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅ，ＩＡ）で殺処分した。
【０１３２】
試験デザイン
羊膜内ｓＦｌｔ−１の投与
妊娠２０日目に（懐胎期間２２日）に、妊娠ラットを、羊膜内（ＩＡ）注射を受けるように準備した。ラットにおける肺発生の後期管状期中の注射のタイミングを、ＢＰＤの最高のリスクにある２４〜２６週の早期新生児におけるヒトの肺発生の同様な段階に匹敵するように選択した。ブプレノルフィンによる前投薬（０．０１〜０．０５ｍｇ／ｋｇ、筋肉内注射）の後に、フェースマスク（麻酔器：ＭｉｄｍａｒｋによるＭａｔｒｘ、モデルＶＩＰ３０００）を介しての１〜２％のイソフルラン吸入を用いた全身麻酔下で開腹術を行った。麻酔及び開腹術中に、低体温症を防止するために、妊娠ラットを加熱パッド上に保持した。妊娠ラットを、生理食塩水対照またはｓＦｌｔ−１群に無作為に割り付けし、生理食塩水群は、羊膜嚢当たり通常生理食塩水５０μｌを受容し、ｓＦｌｔ−１群は、羊膜嚢当たり通常生理食塩水で５０μＬに希釈された組換えヒトｓＦｌｔ−１−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）の５０μｇを受容した。一方のｓＦＬＴ群は、抗ｓＦＬＴの低用量（１×モル当量）の抗ｓＦＬＴを受容し、他方は、高用量（１０×モル当量）の抗ｓＦｌｔ１を受容した。無菌準備下で、３〜４ｃｍの長さの正中線腹部切開を行って羊膜嚢を羊膜内注射用に露出させた。右卵巣に最も近い羊膜嚢を最初に特定して注射し、その後、反時計回りの順序で各羊膜嚢を特定して、母体当たり最大１０個の羊膜嚢に注射した。羊膜内物質の胎児及び母体循環への移動を媒介するために、胎盤の胎児面上の胎児脈管構造の微視的ネットワークによって特徴付けられる、羊膜内ｓＦｌｔ−１が膜内経路を通して母体循環に吸収されることを考慮して、対照として機能する羊膜内生理食塩水を個々の母親ラットでｓＦｌｔ−１の一貫した総用量を達成するために、ｓＦｌｔ−１注射を妊娠ラット当たり１０個の羊膜脳に制限した。同様に、膜内経路を通しての羊膜腔と母体及び胎児循環との間の連通を考慮して、羊膜内生理食塩水を対照として機能するように別々の同腹子で提供した。開腹術中に、各母親ラットの羊膜嚢の総数を検査し、記録した。腹部切開をナイロン縫合糸で閉じた。術後疼痛の制御のために、ブピバカイン（１〜２ｍｇ／ｋｇ、皮下注射）を切創上に適用した。術後１０分以内の覚醒を確実にするために、妊娠ラットを注意深く監視し、ラットをケージに戻し、活動、飲食の能力、及び出血または感染の兆候を監視した。
【０１３３】
帝王切開
羊膜内注射から２日後に、上述したようなイソフルラン吸入による全身麻酔下で、妊娠ラットで帝王切開を行った。右卵巣に最も近い羊膜嚢内の胎児を娩出させ、その後、反時計回りの順序で残りの胎児を娩出させて、羊膜内注射に曝された胎児を特定した。各母親ラットの羊膜嚢の総数を、分娩時にさらに確認した。経膣分娩させる代わりに帝王切開を行う主な理由は、羊膜嚢の順序及びそれらの卵巣に関連する解剖学的位置に基づいて、羊膜内注射に曝された胎児を特定することである。注射された羊膜嚢内の子ラットの全てを、麻酔の開始から５分以内に娩出させた。次いで、母親ラットをペントバルビタールナトリウムで安楽死させた。新生児ラットを、加熱パッド上に置き、低体温症を回避させ、ガーゼスポンジで手により乾燥させた。子ラットは、出生時には、酸素補充または人工呼吸器を受けさせなかった。出生から３０分以内に、子ラットを秤量し、通常のケージ内で養母ラットのそばに置いた。出生から最初の２４時間に、新生児を脂肪または呼吸困難兆候について注意深く監視した。
【０１３４】
ラットの肺を、ウェスタンブロット分析用に出生時に、及び組織学的評価用に１４日齢に採取した。心臓を切開し、出生時ならびに７日及び１４日齢に秤量した。３〜９匹のラットを、各時間点での各測定について、各群で試験を行った。出生から試験期間を通して、乳児ラットの生存を毎日監視し、記録した。生存率を、各所定の同腹子における羊膜内注射を受けた羊膜嚢の数で割られた生存した子ラットの数として算出した。体重を出生時に、及び試験測定のために殺処分される時に測定した。
【０１３５】
試験の測定
組織学的分析用の組織
動物を腹腔内ペントバルビタールナトリウムで殺処分した。カテーテルを気管内に置き、肺を４％のパラホルムアルデヒドで膨張させて、２０ｃｍのＨ２Ｏ圧で６０分間維持した。結紮を気管の周りで締め付けて圧力を維持し、その後、カニューレを取り外した。肺を、固定化のために、４％のパラホルムアルデヒド中で、室温にて２４時間浸漬させた。２ｍｍの厚さの横断面を、それぞれ、動物ごとに固定した肺の右下葉及び左下葉の中央平面から採取し、処置して、パラフィンワックス中に包埋した。
【０１３６】
免疫組織化学
５μｍのパラフィン部分を備えるスライドを、肺胞構造を評価するためにヘマトキシリン及びエオシンで、また血管密度を定量化するために、内皮細胞特異的マーカーであるウィルブランド（Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）（ｖＷＦ）因子で染色した。
【０１３７】
肺血管密度
肺血管密度を、高倍率視野を通して、５０μｍ以下の外径を有するｖＷＦ染色された血管を計数することによって決定した。＞５０μｍの外径を有する大きな気道または血管を含有する視野は避けた。
【０１３８】
肺胞分岐数（ＲＡＣ）
肺胞形成を、Ｅｍｅｒｙ及びＭｉｔｈａｌのＲＡＣ法によって、記載されるように評価した（Ｃｏｏｎｅｙ  ＴＰ，Ｔｈｕｒｌｂｅｃｋ  ＷＭ．Ｔｈｅ  ｒａｄｉａｌ  ａｌｖｅｏｌａｒ  ｃｏｕｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｅｍｅｒｙ  ａｎｄ  Ｍｉｔｈａｌ：ａ  ｒｅａｐｐｒａｉｓａｌ  １−ｐｏｓｔｎａｔａｌ  ｌｕｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ．Ｔｈｏｒａｘ  ３７：５７２−５７９，１９８２；Ｃｏｏｎｅｙ  ＴＰ，Ｔｈｕｒｌｂｅｃｋ  ＷＭ．Ｔｈｅ  ｒａｄｉａｌ  ａｌｖｅｏｌａｒ  ｃｏｕｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｅｍｅｒｙ  ａｎｄ  Ｍｉｔｈａｌ：ａ  ｒｅａｐｐｒａｉｓａｌ  ２−ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ  ａｎｄ  ｅａｒｌｙ  ｐｏｓｔｎａｔａｌ  ｌｕｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ．Ｔｈｏｒａｘ  ３７：５８０−５８３，１９８２）。呼吸細気管支を、壁の一部において上皮によって覆われた細気管支として特定した。呼吸細気管支の中心から垂直線を細葉結合組織または中隔もしくは胸膜の縁部まで下ろし、この線で交差された中隔の数を計測した。
【０１３９】
右心室肥大の指標
右心室（ＲＶ）及び左心室に加えて中隔（ＬＶ＋Ｓ）を切開し、秤量した。ＲＶのＬＶ＋Ｓ重量の比（ＲＶ／ＬＶ＋Ｓ％）及びＲＶ／体重（ＲＶ／ＢＷ％）を決定し、右心室肥大（ＲＶＨ）を評価した。
【０１４０】
統計的分析
統計的分析を、ＩｎＳｔａｔ  ３．０ソフトウェアパッケージ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で行った。統計的比較を、有意性についてのニューマン・コイルス（Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ）事後分析によるｔ検定またはＡＮＯＶＡを用いて群間で行った。ｐ＜０．０５を有意とみなした。
【０１４１】
結果
図１４及び１５に示すように、肺血管密度は、ｓＦＬＴデノミ処置された動物のものと比べて、ｓＦＬＴ＋抗ｓＦＬＴで処置された動物で増加した。
【０１４２】
肺胞形成を、肺胞分岐数（ＲＡＣ）法により評価した。図１６に示すように、形態計測分析によって分析するとき、ｓＦＬＴラットは、対照群（ＣＴＬ）と比べて、ＲＡＣを有意に（Ｐ＜０．００１）減少させた。低用量のａ−ｓＦＬＴによる処置は、ｓＦＬＴ群と比べて、ＲＡＣを有意に（Ｐ＜０．０１）増加させた。これは、ａ−ｓＦＬＴによる処置が、ｓＦＬＴによって引き起こされる肺胞形成における減少を逆転させることができることを示している。
【０１４３】
右心室肥大を、右心室（ＲＶ）及び左心室に加えて中隔（ＬＶ＋Ｓ）を秤量し、その比を算出することによって評価した。図１７に示すように、ｓＦＬＴに曝された動物は、対照群と比べて、ＲＶ／（ＬＶ＋Ｓ）比を有意に（Ｐ＜０．０５）増加させた。低用量のａ−ｓＦＬＴによる処置は、ｓＦＬＴ群と比べて、ＲＶ／（ＬＶ＋Ｓ）比を有意に（Ｐ＜０．０５）減少させた。これは、ａ−ｓＦＬＴによる処置が、ｓＦＬＴによって引き起こされる右心室肥大を逆転させることができることを示している。
【０１４４】
右心室（ＲＶ）の体重に対する比を決定して、右心室肥大を評価した。図１８に示すように、ｓＦＬＴに曝された動物は、対照群と比べて、ＲＶ／体重比を有意に（Ｐ＜０．０５）増加させた。低用量のａ−ｓＦＬＴによる処置は、ｓＦＬＴ群と比べて、ＲＶ／体重比を有意に減少させた（Ｐ＜０．０５）。これは、ａ−ｓＦＬＴによる処置が、ｓＦＬＴにより引き起こされる右心室肥大を逆転させることができることを示している。
【０１４５】
実施例５．ＢＰＤのエンドトキシン（ＥＴＸ）モデルにおける抗Ｆｌｔ−１抗体のインビボ有効性
試験デザイン
羊膜内ｓＦｌｔ−１及びＥＴＸ投与
妊娠２０日目に（懐胎期間２２日）に、妊娠ラットを、羊膜内注射を受けるように準備した。妊娠ラットを、生理食塩水対照またはＥＴＸ（エンドトキシン）群に無作為に割り付けし、生理食塩水群は、羊膜嚢への通常生理食塩水の注射を受容し、ＥＴＸ群は、羊膜嚢当たり１０μｇのエンドトキシンを受容した。羊膜内投与後に、腹部切開を閉じて、術後の覚醒を確実にするために、ラットを注意深く監視した。
【０１４６】
帝王切開及び処置
羊膜内注射から２日後に、上述したように、妊娠ラットで、全身麻酔下で帝王切開を行った。子ラットを１ｍｇ／ｋｇの抗ｓＦＬＴモノクローナル、１０ｍｇ／ｋｇの抗ｓＦＬＴモノクローナルまたは１０ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ対照（マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照）で、１週間に２回、２週間にわたって処置した。
【０１４７】
試験測定
１４日目に、形態計測分析用及び組織学的評価用に、ラットの肺を採取した。動物の体重を、出生時及び殺処分時に計測した。肺を、４％のパラホルムアルデヒドの２０ｃｍ  Ｈ２Ｏによる膨張後に固定化した。遠位気腔構造を、肺胞分岐数（ＲＡＣ）によって評価した。心臓を採集し、右心室肥大（ＲＶ／ＬＳ＋Ｓ重量）を決定した。
【０１４８】
体重
動物の体重を計測し、出生前ＥＴＸ処置後の出生後抗Ｆｌｔ−１モノクローナル抗体処置が、体重を改善するかどうかを決定した。ＥＴＸを子宮内で投与し、続いてＩｇＧ（対照）または抗Ｆｌｔ−１  ｍＡｂ（１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ）で出生後処置した動物を秤量した。ＥＴＸのみ、またはＥＴＸ＋ＩｇＧを受容した動物は、対照動物よりも有意に少ない重量であった（図１９）。ＥＴＸ＋抗Ｆｌｔ−１  ｍＡｂのいずれかの用量を受容した動物の体重は、対照動物の体重とは有意差がなかった。これらのデータは、出生後に抗Ｆｌｔ−１  ｍＡｂを供与された動物が、ＢＰＤのエンドトキシン誘導モデルにおいて成長の利点を有することを示している。
【０１４９】
肺胞分岐数（ＲＡＣ）
出生前ＥＴＸ処置後の出生後抗Ｆｌｔ−１モノクローナル抗体処置が、肺胞の増殖を改善するかどうかを決定するために、肺胞分岐数を測定した。ＥＴＸを子宮内で投与し、続いてＩｇＧ（対照処置）または抗Ｆｌｔ−１  ｍＡｂ（１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ）で出生後処置した動物の肺について試験した。ＥＴＸのみ、またはＥＴＸ＋ＩｇＧを受容した動物は、対照動物と比べて、肺胞増殖を有意に低減することを立証した（図２０）。ＥＴＸ＋１０ｍｇ／ｋｇの抗Ｆｌｔ−１モノクローナル抗体を受容した動物の肺胞増殖は、単独のＥＴＸを受容した動物の肺胞増殖よりも有意に良好であった。これらのデータは、出生後に抗Ｆｌｔ−１モノクローナル抗体を供与された動物が、ＢＰＤのエンドトキシン誘導モデルにおいて改善された肺構造を有することを示している。
【０１５０】
右心室肥大の指標
出生前ＥＴＸ処置後の出生後抗Ｆｌｔ−１モノクローナル抗体処置が、右心室心臓肥大（ＲＶＨ）を予防するかどうかを決定するために、右心室を測定した。ＥＴＸを子宮内で投与し、続いてＩｇＧ（対照処置）または抗Ｆｌｔ−１  ｍＡｂ（１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ）で出生後処置した動物の心臓について試験した。ＥＴＸのみ、またはＥＴＸ＋ＩｇＧを受容した動物は、対照動物と比べて、右心室比を有意に増加させることを立証した（図２１）。ＥＴＸ＋抗Ｆｌｔ−１モノクローナル抗体のいずれかの用量を受容した動物の右心室比は、対照動物の右心室比とは有意差がなかった。ＥＴＸ＋抗Ｆｌｔ−１モノクローナル抗体のいずれかの用量を受容した動物の右心室比は、単独のＥＴＸを受容した動物の右心室比とは有意差があった。これらのデータは、出生後に抗Ｆｌｔ−１モノクローナル抗体を供与された動物が、ＢＰＤのエンドトキシン誘導モデルにおいて減少した肺高血圧症を有することを示している。
【０１５１】
肺構造
出生前ＥＴＸ処置後の出生後抗Ｆｌｔ−１モノクローナル抗体処置が、肺構造を修復するかどうかを決定するために、肺構造及び肺血管密度を評価した。ＥＴＸを子宮内で投与し、続いてＩｇＧ（対照処置）または抗Ｆｌｔ−１モノクローナル抗体（１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ）で出生後処置した動物の心臓について試験した（図２２）。これらのデータは、出生後の抗ｓＦｌｔ−１モノクローナル抗体が、実験的な絨毛羊膜炎において肺構造を修復することを示している。
【０１５２】
等価物及び範囲
当業者であれば、単なる通常の実験を用いて、本明細書に記載される特定の実施形態の多くの等価物を認識し、または解明することができるであろう。本発明の範囲は、上記説明に限定されることを意図するものではなく、むしろ、以下の特許請求の範囲に記載されるとおりである。
【図１】
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【図２】
0006797826.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
0006797826.tif 000017
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
0006797826.tif 000021
【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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