(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微細流体デバイスであって、
複数の捕集デバイスを形成するように互いに結合された２つ以上の基板
を含み、各捕集デバイスは、
試料貯蔵所と、
前記試料貯蔵所と流体連通する流入チャンネルと、
前記流入チャンネルと流体連通する複数の捕集チャンネルであって、各捕集チャンネルが、長さ、幅、及び高さを有する複数の捕集チャンネルと、
前記複数の捕集チャンネルと流体連通する流出チャンネルと、を含み、
前記各捕集チャンネルの長さは、その捕集チャンネルを通る流入チャンネルから流出チャンネルへの方向に測定される長さであり、幅は、前記２つ以上の基板の少なくとも１つの表面に平行な平面内で、前記長さ方向と直交する方向に測定される幅であり、高さは、前記長さ方向及び前記幅方向に直交する方向に測定される高さであり、
前記各捕集チャンネルは、それぞれの捕集チャンネルの長さに沿って端から端まで配置された複数のセクションを含み、複数のセクションのそれぞれは、一つの高さ及び幅を有し、前記少なくとも２つの隣接するセクションの幅は、対応する捕集チャンネルの長さ方向に沿って幅が狭くなるように、互いに対して変化し、
少なくとも１つの捕集チャンネルにおいて、生物学的対象を捕集するための前記複数のセクションのうち少なくとも２つの高さは、それぞれのセクションの高さに対する幅のアスペクト比が０．２から２．０の範囲内にあるように、互いに異なり、
前記複数の捕集デバイスの少なくとも２つの流出チャンネルは、中間流出チャンネルを介して互いに流体連通する微細流体デバイス。
【請求項２】
前記複数のセクションは、第１セクション、第２セクション、及び第３セクションを含み、前記捕集チャンネルの前記第１セクションは前記流入チャンネルに近接し、前記捕集チャンネルの前記第３セクションは前記流入チャンネルから離れており、前記第２セクションは前記第１セクション及び前記第３セクションの間に位置し、前記第１セクションの高さは前記第２セクションの高さより大きく、前記第２セクションの高さは前記第３セクションの高さより大きい請求項１に記載の微細流体デバイス。
【請求項３】
少なくとも１つの捕集チャンネルの高さ及び／又は幅は、少なくとも前記チャンネルの長さの一部に沿って徐々に変化する請求項１に記載の微細流体デバイス。
【請求項４】
複数の中間流出チャンネルは最終流出チャンネルと流体連通することによって接合される請求項１に記載の微細流体デバイス。
【請求項５】
少なくとも２つの前記捕集デバイスの流出チャンネルのそれぞれは、各流出チャンネルを介した流れが類似した水理抵抗を受けるようにするサイズを有する請求項１に記載の微細流体デバイス。
【請求項６】
前記捕集デバイスは、実質的に円錐台状を有するマイクロウェルであって、生物学的対象と試薬とを前記試料貯蔵所に貯蔵するように構成されるマイクロウェルをさらに含む請求項１に記載の微細流体デバイス。
【請求項７】
前記貯蔵所に隣接する前記流入チャンネルの第１端は、１μｍと５００μｍとの間の高さ、及び、１μｍと７５０μｍとの間の幅を有し、前記流入チャンネルは、前記複数の捕集チャンネルを接続する請求項１に記載の微細流体デバイス。
【請求項８】
前記複数のチャンネルのそれぞれの長さは、２００μｍと６ｍｍとの間である請求項７に記載の微細流体デバイス。
【請求項９】
前記捕集チャンネルの構造は、単一の生物学的対象を特定の向きに配置するように構成される請求項１に記載の微細流体デバイス。
【請求項１０】
前記生物学的対象は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓワームを含む請求項９に記載の微細流体デバイス。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１４年１０月２７日付に出願された米国特許仮出願一連番号第６２／０６８、８２２号に対する優先権とその利益を主張し、その内容はすべて参照により本発明に組み込まれ、本出願の一部となる。
【０００２】
［連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載］
本発明は、米国国立衛生研究所により与えられた助成金番号第Ｒ０１ＡＧ０４１１３５号及び第Ｒ０１ＮＳ０６０１２９号に従って、米国政府の支援によってなされた。米国政府は、本発明に対する一定の権利を有する。
【０００３】
［背景技術］
薬物開発は、高効率な方式によるモデルシステムを用いて少ない量の新しい化合物をスクリーニングする方法論が必要でする。モデルシステムにおける化合物のスクリーニングは、その化合物が臨床試験または人体試験に用いられる前に新しいヒット（ｈｉｔ）を得る必要がある。モデルシステムの２つのタイプには、（正常な生物学的状況以外の細胞または生物学的な分子として行われる）生体外モデルシステムと（生物全体に対して行われる）生体内モデルシステムがある。全体有機体の生体内モデル細胞株を用いる２Ｄ／３Ｄの生体外システムよりもはるかに好まく、より多くの要因を説明し、より正確な結果を提供する。
【０００４】
従来のように、高効率の薬物検査は人から発見されるもののような薬物の吸収、循環、新陳代謝、排泄及び毒性といった生体内試験法のすべてを説明しない生体外細胞培養に基づく。薬物開発において、生体外モデルを用いたがヒット対リード比率並びに臨床への移行に不具合が生じた。一方、従来の生体内試験法モデルは低効率であるか、分解能が低いために試験過程が妨げられた。
【０００５】
通常、生体内モデルはＣ．ｅｌｅｇａｎｓ、Ｃ．ｂｒｉｇｇｓａｅ及びＰｌａｎａｒｉａのような基礎有機体に対して行われる。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓは短い生存期間、よく特徴付けられた遺伝子、単純なニューロン回路、少ない数の細胞構造及び柔軟な虫のボディを有しているために、その開発全体にわたって生体内モデルに特に適している。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのゲノムは人間の疾病遺伝子とほぼ６５％の相同関係を共有しており、疾病経路を解明するための魅力的なプラットフォームであるとされてきた。生活周期が短く、ゲノムの大きさが小さいために、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓは遺伝子操作に有用なツールとなっている。神経疾患、遺伝的障害、ガン、発達障害などにＣ．ｅｌｅｇａｎｓを用いた新しい疾病モデルが立証された。
【０００６】
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのような虫に対する典型的な試験方法は、虫をマルチウェル（多孔）プレートに配置するステップ及び麻酔溶液を使用して虫を分析するステップを含む。しかし、ウェル（孔）にある虫はこの方法では適切に配列または組織化できない。例えば、高密度流体内において虫はウェル（孔）の底面に沈み、互いに重なり合うことがある。一方で、虫は低密度流体内では良く隔離されるが、統計分析の十分なデータを作成するためには大量のイメージングデータを必要とする。現行方法の問題点を考慮すれば、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのような有機体に対して正確に、高品質で、そして高速に生体内スクリーニングを行うための高効率イメージングシステムが必要である。
【０００７】
以下の図面と詳細な説明を検討すると、他のシステム、方法、特徴及び／または利点は当業者には明らかになるであろう。すべての追加的なシステム、方法、特徴及び／または利点は本明細書内に含まれ、添付の請求範囲によって保護されることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
以下の詳細な説明は、本発明に多数実施形態のうち一つ以上を示す添付の図面を参照しつつ読むことにより、さらに良く理解されるだろう。しかし、本発明の多様な実施形態は図面に示した精密な配列と手段によって限定されないことが理解されるべきである。
【０００９】
【図１】微細流体デバイスに対する例示的な実施形態の断面図である。
【図２】複数の捕集チャンネルを有する捕集デバイスの例示的な実施形態である。
【図３】例示的な実施形態に対する圧力サイクルを示すグラフである。
【図４】アスペクト比対チャンネルの長さ及びチャンネルの高さ対チャンネルの長さを説明する例示的な実施形態に対するグラフである。
【図５】複数の捕集デバイスを有する微細流体デバイスに対する例示的な実施形態である。
【図６】例示的な実施形態において映像を分析する過程の３つのステップを示すフローチャートである。
【図７】微細流体デバイス及びコンピュータを含むイメージングシステムに対する例示的な実施形態である。
【図８Ａ】多重ｚ−スタック映像を用いてブロブパラメータを推定する自動化されたイメージ分析を示す図である。
【図８Ｂ−８Ｅ】多重ｚ−スタック映像を用いてブロブパラメータを推定する自動化されたイメージ分析を示す図である。
【図８Ｆ】多重ｚ−スタック映像を用いてブロブパラメータを推定する自動化されたイメージ分析を示す図である。
【図８Ｇ−８Ｈ】多重ｚ−スタック映像を用いてブロブパラメータを推定する自動化されたイメージ分析を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書では、高効率イメージングに適合した方式で内容物を捕集できる微細流体デバイスが説明される。微細流体デバイスは一つ以上の捕集デバイスを含み、各捕集デバイスは複数の捕集チャンネルを有することができる。捕集チャンネルは、流体連通することによって試料貯蔵所を捕集チャンネルに連結する流入チャンネルを介して内容物を収容するように構成される。捕集チャンネルは、捕集チャンネル内の内容物が最適のイメージング目的に応じて位置するようにする形を有する。捕集チャンネルは、また流体連通することによって少なくとも一つの流出チャンネルにつながる。流体及び流体内の内容物は油圧を介して制御される。
【００１１】
例示的な微細流体デバイスが図１に示されている。図１に示したデバイスは捕集チャンネル１２０が設置された基板１１０を含む。基板１１０は、捕集チャンネルを設置するための任意の適切な材質を含んでもよい。例えば、基板１１０はガラス、金属、プラスチック、または任意の他の適切な物質であってもよい。捕集チャンネル１２０は、材質１３０内の空いた空間を介して形成されることができる。材質１３０は、例えば、ポリジメチルシロキサンのような捕集チャンネル１２０を形成するための任意の適合した材質を含んでもよい。適切な形状で形成される任意の他の材質も使用されることができる。材質１３０は、また流入口１６０及び流出口１７０を含めて流体が捕集チャンネル１２０を介して流れるようにする。
【００１２】
図１は、また微細流体デバイスに使用された流体の流体力学に影響を与えるためにデバイスに内包される上部ガスケット１４０と下部ガスケット１５０を示す。例えば、上部ガスケット１４０は、捕集チャンネル１２０を他の流体経路に結合させるチャンネルを含んでもよい。上部ガスケット１４０は、またシステムの流体内に捕集された空気、または他のガスを放出する通路を含んでもよい。下部ガスケット１５０は、適当な圧力レベルを維持し、かつデバイスの下部を密封して流体の漏れを防止するのに使用される。ネジ１８０は、基板１１０、捕集チャンネル１２０、材質１３０、上部ガスケット１４０、及び／または下部ガスケット１５０を固定するために使用される。
【００１３】
図２は、多数の捕集チャンネルを有する捕集デバイスの例示的な実施形態を示す。本実施形態において、捕集デバイスは５つの捕集チャンネル２２０を含む。捕集チャンネル２２０は、流入チャンネル２６０を介して流体を収容し、順番に貯蔵所２３０を介して流体を収容する。貯蔵所２３０はウェル（図示せず）を介して、または任意に他の適切な方法によって流体で埋められる。図２の例示的な実施形態において、流体は対象物２４０を含有する。対象物２４０は、動物を含む任意の適切な試験対象であってもよい。例えば、対象物２４０は通常生体内の薬品試験に用いられる小さいワームであるＣ．ｅｌｅｇａｎｓであってもよい。捕集チャンネル２２０は、またイメージングされた対象物２４０と関連流体が流出チャンネル２７０を介して流出するように流体連通を経由して流出チャンネル２７０に連結される。用語「流体連通」は、２つの位置の間で流体の流れが可能であることを意味するように広く使用される。流体連通は持続的な流体の流れを要求せず、むしろ第１位置から他の位置に流体を移動させる能力を要求する。
【００１４】
図２は、また捕集チャンネルの長さに沿って異なる地点における捕集チャンネル２２０の断面図を含む。「フリー（ｆｒｅｅ）」に標識された断面２９０は、捕集チャンネル２２０の第１セクションにおけるチャンネルの断面図である。「捕集」に標識された断面２８０は、捕集チャンネル２２０の第２セクションにおけるチャンネルの断面図である。チャンネルの「セクション」は、チャンネルの測定可能な長さを含むか、またはチャンネルの極小部分を含むことができる。２つの断面を比較すれば、断面２８０が少なくとも１つの寸法において断面２９０より小さいことは明らかである。本実施形態において、断面２８０の断面の大きさは関心地点２５０が特別な方式で配列されるようにできる。
【００１５】
例示的な実施形態において、関心地点２５０は対象物２４０、特にＣ．ｅｌｅｇａｎｓ有機体の腹部側を表す。捕集チャンネル２２０の形状は関心地点２５０が特別な方向に向くように変わることができる。このような方式で、各捕集チャンネル２２０は、対象物２４０を捕集して類似した方向を向くようにできる。この方向はイメージが反復可能な方式で理想的な方向からキャプチャーされるときにイメージキャプチャーを容易にする。関心地点２５０は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの他の部分を表すか、または完全に他の有機体に係ることができる。ここでは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓが議論されるが、本出願における発明対象はこのような特別な有機体の形態に限定されない。
【００１６】
捕集チャンネル２２０は、図１の基板１１０のような支持表面に対して相対的に測定された高さと幅を有する。一実施形態において、捕集チャンネル２２０は、チャンネルの長さが基板の表面に平行するように配列される。従って、捕集チャンネル２２０の「高さ」は基板表面と垂直方向で測定される。捕集チャンネル２２０の「幅」は基板表面と平行するが、捕集チャンネル２２０の長さに沿って軸方向と垂直方向で測定される。
【００１７】
一実施形態において、捕集チャンネル２２０の高さはチャンネルの長さに沿って複数の位置によって変わる。例えば、捕集チャンネル２２０の少なくとも２つのセクションの高さは互いに異なる。他の例として、捕集チャンネル２２０の高さは少なくともチャンネル長さの一部に沿って連続的に変わる。一実施例において、捕集チャンネル２２０の高さが流動方向に、すなわち、捕集チャンネルの流入チャンネル側から流出チャンネル側へと、減少するように高さが変わる。
【００１８】
微細流体デバイスの特定の寸法は具現例によって変わることができる。しかし、例示的な一実施形態において、流入チャンネル２６０は、約１μｍ乃至約５００μｍの高さ、約１μｍ乃至約７５０μｍの幅を有することができる。他の例示的な実施形態において、捕集チャンネルの長さは約２００μｍ乃至約６ｍｍである。
【００１９】
微細流体デバイスを介して流体の流れを制御するために圧力調整法が用いられる。任意の適切な圧力制御方法が用いられる。図３は、用いられる例示的な圧力調整サイクルのグラフを示す。図３のグラフは、圧力が「オン（ＯＮ）」と「オフ（ＯＦＦ）」状態の間をサイクリングする方式で循環されることを示す。任意の適切な圧力レベルが用いられ、この圧力レベルは微細流体デバイス、捕集チャンネル及び試験中の対象物の大きさとマッチングされなければならない。例示的な一実施形態において、圧力は約０乃至３０ｐｓｉの間をサイクリングする。同様にサイクルに対する期間は特別なデバイスに合わせられる。例示的な一実施形態において、各圧力サイクルは０乃至６００秒の期間の間に維持される。
【００２０】
図４は、アスペクト比対チャンネルの長さ及びチャンネルの高さ対チャンネルの長さを示した例示的な実施形態に対するグラフである。グラフの左側に沿う軸はチャンネルの長さであり、ミリメートル単位で測定され、０．０乃至３．０の範囲を有する。グラフの上部に沿って、幅を高さで割って測定されるアスペクト比がある。アスペクト比は大体点線に沿う線で示されている。本実施形態において、アスペクト比は約０．４から約１．２まで変わる。一部の実施形態において、アスペクト比は約０．２から約２．０の範囲内にある。グラフの下部に沿ってマイクロメートル単位で測定されたチャンネルの高さがある。右側の線はチャンネルの高さを示し、この特定の実施形態において約５０乃至約１００μｍの範囲を有する。他の実施形態において、高さは捕集チャンネルの長さに沿って約１μｍ乃至約５００μｍの範囲を有する。
【００２１】
図５は、複数の捕集チャンネルを有する微細流体デバイスに対する例示的な一実施形態である。この例示的な実施形態において、「（Ａ）」に標識された微細流体デバイスは９６個の個別捕集デバイスを含む。しかし、他の実施形態においては如何なる個数の捕集デバイスも用いられる。捕集デバイスのサブセット５２０は「（Ｂ）」に標識される。捕集デバイスのサブセット５２０は中間流出チャンネル５３０を含む。サブセット５２０で８個の捕集デバイスそれぞれは、中間流出チャンネル５３０と流体連通する個別の流出チャンネルを有する。一実施形態において、捕集デバイスは多様な捕集デバイスの間で圧力を同等にするために互いに異なる大きさの流出チャンネルを有する。例えば、サブセット５２０でＤ１１及びＤ１２に標識された捕集デバイスは、Ａ１１及びＡ１２に標識された捕集デバイスより大きい流出チャンネルを有する。本実施形態において、Ａ１１及びＡ１２は中間流出チャンネル５３０の流出地点により近く、従ってより小さい流出チャンネルで十分である。一方、Ｄ１１及びＤ１２は中間流出チャンネル５３０の流出地点からより遠く、従ってより大きい流出チャンネルが必要である。
【００２２】
捕集デバイスの各サブセットの中間流出チャンネル５３０は、最終流出チャンネル５４０と流体連通することで接合される。図５で、（Ａ）に標識された微細流体装デバイスはデバイスの互いの反対側に２つの最終流出チャンネル５４０を有する。最終流出チャンネル５４０は微細流体デバイスを囲んだガスケットによって形成される。流出チャンネル２７０、中間流出チャンネル５３０、及び最終流出チャンネル５４０は、各捕集デバイス別の水理抵抗の経験がすべて適用可能な捕集デバイスに渡って類似するように構成される。
【００２３】
流体及び試験対象物を微細流体デバイスに供給するため、流体及び対象物は多数の捕集デバイスの貯蔵所２３０に貯蔵される。例示的な実施例において、ウェル５１０はこの対象物を貯蔵所２３０に貯蔵することを制御するのに用いられる。図５で、「（Ｃ）」に標識された捕集デバイスは、ウェル５１０が捕集デバイスの平面上に位置するためにウェル５１０を点線で示す。ウェル５１０は漏斗、注射器、ホース、チューブ、または流体及び試験対象物を供給する任意の他のデバイスであってもよい。一実施形態において、ウェル５１０は実質的に円錐台状で、形状の小さい方の端部が貯蔵所２３０に近接している。
【００２４】
上述した多様な例示的な実施形態において説明された微細流体デバイスは、高効率イメージングシステムに統合されることができる。例示的な一実施形態において、イメージングシステムは微細流体デバイス、流体連結を介して微細流体デバイスに連結された圧力デバイス、カメラ及び電動式プラットフォームを備えた顕微鏡、及びプロセッサを含む。一実施形態において、電動式プラットフォームは電動式プラットフォームの任意の位置変化も微細流体デバイスを移動させるように微細流体デバイスを支持するように構成される。他の実施形態において、電動式プラットフォームはカメラまたはカメラと一緒に使用される他のイメージングデバイスを移動させることができる。具現例とは関係なく、電動式プラットフォームは３次元に移動することができる。
【００２５】
一実施形態において、このプロセス（ｐｒｏｃｅｓｓ）は油圧を微細流体デバイスに供給し、カメラが微細流体デバイスの内容物をキャプチャーするように電動式プラットフォームを移動させ、微細流体デバイスの内容物をイメージファイルにキャプチャーし、イメージファイルを保存デバイスに保存する、コンピュータで読み取り可能な命令語を含む。
【００２６】
イメージングシステムは、またシステムで様々な欠陥を計算及び調整することができる。例えば、システムは捕集デバイス内の内容物の焦点平面でオフセットを計算することができる。このオフセットは、例えば、デバイスの製造工程における欠陥によるものであろう。同様にシステムは微細流体デバイスに用いられた基板の曲率を計算することができる。基板は捕集デバイス内に用いられた油圧によって曲がることがある。従って、システムは基板の様々な位置における圧力及び／または測定値に基づいて曲率を測定または計算することができる。これは微細流体デバイスの複数の所定位置のｘ、ｙ、及びｚの座標値を求めることを含んでもよい。その後、システムは電動式プラットフォームを移動させるか、またはカメラ設定を調整して上述した要因を補償することができる。
【００２７】
イメージ分析器は、またイメージングシステムと一緒に使用される。一実施形態において、イメージ分析器は分析のために保存されたイメージを受信する。分析器は、捕集チャンネル及び所望の捕集チャンネルの内容物を識別でき、イメージを切削して所望の内容物のない捕集チャンネル部分を取り除くことができる。分析器は、また他の焦点平面で複数の所望の内容物のイメージを比較することができる。他の焦点平面におけるイメージは、イメージスタックまたはｚ‐スタックで他のイメージとしてみなされる。分析器はスタックから最も望むイメージを選択して、そのイメージのバージョンをグラフィックユーザインターフェースにディスプレイすることができる。
【００２８】
一実施形態において、グラフィックユーザインターフェース上のイメージディスプレイの設定は、リアルタイムで調節されて表現型のスコアリングに役立つ。他の実施形態において、粒径フィルタがグラフィックユーザインターフェース上の関心領域からすべての外来粒子を取り除くのに用いられる。一部の実施形態において、イメージ分析器は自動化されて自動的に焦点平面を選択して表現型のスコアリングをすることができる。
【００２９】
図６は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ有機体のニューロン健康評価のためのイメージ分析に対する例示的な実施形態を説明するフローチャートを示したものである。各フローチャートはワームを位置させ、最上の焦点平面を特定し、ワーム内のニューロンのスコアリングをするような特別な作業を説明する。
【００３０】
ワームをチャンネル内に位置させることに対し、６１０ブロックではイメージスタックをローディングする過程を開始する。６１２ブロックでスタックの和を求める。６１４ブロックでイメージは平滑化過程に沿って平滑化される。６１６ブロックでシステムはチャンネルに渡って正規化された強度プロファイルを得る。そして、６１８ブロックでワームは強度ピークから離れて位置する。次に６２０ブロックで、個別のワームに対するイメージが切削され、２２ブロックでワームのボディは２進臨界処理を介して位置する。６２４ブロックで望まない物体は粒子フィルタリングを介して取り除かれる。６２５ブロックでワームが完全に視野内にあるかを問う。視野内になければ、６２６ブロックでワームの重心が予測される。視野内にあれば、６２７ブロックでワームの重心を位置させる。６２８ブロックで関心フィーチャーのための最上の焦点平面を位置させる。最後にワームに対するニューロンのスコアリングが行われる。６３０ブロックでは切削され、フィルタリングされたイメージがロードされる。６３２ブロックで関心ニューロンは手作業でスコアリングが行われるが、他の実施形態においてこのステップは自動的に完了される。６３４ブロックで出力図面が生成されてグラフィックユーザインターフェースにディスプレイされる。
【００３１】
図７は、微細流体デバイス及びコンピュータを含むイメージングシステムに対する例示的な実施形態である。微細流体デバイス７１０は、上部ガスケット７１２及び下部ガスケット７１４内に囲まれる。デバイス７１０及びガスケット７１２及び７１４は、プラットフォーム７１６に作動可能に連結される。プラットフォーム７１６は、コンピュータ７２６によって制御される電動式プラットフォームであってもよい。コンピュータ７２６は、またデバイス７１０に供給される油圧に影響を与えるために使用されるバルブ７１８を制御する。図７は、またミラー７２２と一緒に使用されたカメラ７２０及び対物レンズ７２４を示す。コンピュータ７２６は、またモニター７２８、または他のグラフィックユーザインターフェースを含む。インターフェースはイメージングの結果７３０をディスプレイするのに使用される。
【００３２】
［実施例‐微細流体デバイスの製造］
【００３３】
以下の説明は、微細流体デバイスの製造に係る一実施例にすぎない。微細流体デバイスは、３層のフォトリソグラフィ工程と１層のソフトリソグラフィ技術を使用して製造される。簡単に、オートキャド（ＡｕｔｏＣＡＤ）２０１３を使用してフォトマスクを設計し、５０Ｋ  ＤＰＩの解像度を有するレーザープロッター（Ｆｉｎｅｌｉｎｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ）を使用して透明体に印刷した。６インチのシリコンウェーハは、毎分２１００回転（ｒｐｍ）の回転速度でＳＵ８‐２０２５フォトレジスト（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐ．）を使用してスピンコーティングされ、約４５μｍの高さ（レイヤー‐１、赤色）を得た。レイヤーは、レイヤー‐１のためのパターンを有するフォトマスクを使用して紫外線光に露出された。レイヤーは現像されて１９００ｒｐｍで３３秒間ＳＵ８‐２０２５の第２層にコーティングされ、約６５μｍの高さを得た。第２層はレイヤー‐２のためのパターンを有するフォトマスクを使用して紫外線に露出された。レイヤーは現像されて１６５０ｒｐｍで３３秒の間にＳＵ８‐２０３５のフォトレジスト（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐ．）の第３層にコーティングされ、約８５μｍの高さを得た。第３層はレイヤー‐３のためのパターンを有するフォトマスクに露出された。計３層からなるＳＵ８モールドは、４０℃の真空チャンバーで（トリデカフルオロ‐１、１、２、２、‐テトラヒドロオクチル）‐１‐トリクロロシランの蒸気（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で処理されてソフトリソグラフィ工程のときに表面付着力を減らす。
【００３４】
ポリジメチルシロキサン（ＰＭＤＳ、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ）は１０：１の比率で混合され、ＳＵ８フィーチャーの上部に位置した９６ウェルのＰＣＲプレートを有するシラン化されたＳＵ８モールドに注がれて、すべてのウェルがすべての並列固定デザインの入口で円形パッドの上部に整列配置された。ＰＣＲプレートは、真空チャンバーでシラン蒸気で予めコーティングされてＰＤＭＳ硬化後に放出を容易にした。アクリルフォルダーがＳＵ８フィーチャーを有するシリコン基板に置かれてＰＤＭＳモールドの外郭寸法を制限し、約８ｍｍの高さのＰＤＭＳを得た。ＰＤＭＳ層は７０℃で２時間硬化されてＳＵ８モールドから剥がれ、ＰＣＲプレートから放出された。ＰＤＭＳブロックは、油圧パンチ（Ｓｙｎｅｏ）を使用してパンチングされ、１２個の出口と９６個のウェル全ての底が形成された。ＰＤＭＳブロックは、洗浄されて１００Ｗの酸素プラズマを使用して３／１６インチのホウケイ酸ガラス基板に接合された。装置は完全密閉のために最後に７０℃で６時間硬化された。
【００３５】
［実施例‐ガスケット及び圧力システム］
【００３６】
以下の説明は、本出願で議論された発明対象に係る一実施例にすぎない。ガスケットシステムは、アクリル（ガスケット‐１）及びアルミニウム（ガスケット‐２）のピースを含んでいる。１／４インチ厚のアクリルシートは、１つの緩衝液流入ポートと１つの空気排出口を有するガスケット‐１で切削加工された。４．４インチｘ３．０インチｘ１／８インチの体積がガスケット‐１の中心でミーリング加工されてＰＤＭＳブロックに埋め立てられた９６個のウェルすべての上部で十分な緩衝液の体積を維持した。２つの狭いラインは、長方形の長手外縁に沿ってミーリング加工されてＰＤＭＳブロックの各側面上の６個の出口パンチをすべて連結した。ガスケット‐１の２つの出口チャンネルがルアー（ｌｕｅｒ）コネクターを用いて外部の廃棄物貯蔵所に連結されてフレキシブルチューブを取り付けられた。ガスケット‐２のサイズは、切削加工されたフラットトップの電動式ステージと合うように機械加工された。ガスケット‐２内の大半の材料が中心領域から取り除かれて材料の重量が減少し、倒立顕微鏡からの蛍光イメージングが可能になった。ガスケット‐２の薄い階段はＰＤＭＳデバイスのガラス基板のフットプリントと一致した。上部及び下部ガスケット（ガスケット‐１及びガスケット‐２）のピースは、６個のネジで絞められて高圧ステップで緩衝液が漏れることを防止した。デバイスは、圧縮空気を用いて加圧された５００ｍＬの貯蔵所からフィルタリングされたＭ９を用いて作動された。圧力はコンピュータで制御されたソレノイドバルブを介してガスケット‐１に転送された。
【００３７】
［実施例‐自動化されたイメージの獲得］
【００３８】
以下の説明は、本出願で議論された発明対象に係る一実施例にすぎない。４メガピクセル、７．４μｍ×７．４μｍピクセルの大きさ、１秒当たり１５フレームの最大フレーム率、ＣＣＤカメラ（ＭｅｇａＰｌｕｓ  ＥＳ４０２０、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を備えたオリンパスＩＸ７３顕微鏡を使用して明視野と蛍光イメージを得た。明視野と蛍光イメージは、内部用のｌａｂＶＩＥＷプログラムをそれぞれ利用する２ｘ（０．０６ＮＡ）及び１０ｘ（０．３ＮＡ）の対物レンズを使用して得た。１１４ｍｍ×７５ｍｍ（±４４ｎｍ分解能）フラットトップＸＹの移動ステージ、及び５００±０．００２μｍの移動範囲を有するピエゾステージ（ＭＳ２０００、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｉｏｎ）を装着した電動式プラットフォームの移動をソフトウェアで制御した。スキャン領域及び移動命令は、１ウェル当たり４０個の固定チャンネルを有する全体９６個のウェルデバイスのデザインに最適化された。固定チャンネルに対するイメージングルーチン以外に、プログラムはＰＤＭＳブロックに内蔵されたアライメントマーカーを検出してデバイスイメージングを行う間に３軸すべてのオフセット値を定量化して補償した。プログラムはアレイサイズ、イメージのスタック数、各ウェル内の菌株情報、及び各ウェルに用いられた化学物質のようなユーザ定義のパラメータを自動化獲得ループで統合した。自動化獲得サブルーチンは、全ての位置でイメージスタックを獲得し、プログラムによって生成された適切なファイル名と一緒に各フレームに注釈を付けて保存した。９６個のウェルデバイスを有するフルチップは約４０ＧＢのイメージを生成して４メガピクセルのＣＣＤカメラから得た１６ビットイメージの形で生成されたイメージを保存した。
【００３９】
［実施例‐半自動イメージ分析］
【００４０】
以下の説明は、本出願で議論された発明対象に係る一実施例にすぎない。私たちは内部用グラフィックユーザインターフェース（ＧＵＩ）を開発し、これを利用して保存されたイメージスタックを特定のスクリーニング実験でデバイスの特定位置にローディングした。すべてのイメージスタックは、チップの特別な位置からローディングされて合計され、ニューロンと周辺領域間のコントラストを増加させた。合計されたイメージは、ガウシアン低域通過フィルタ（σ＝１．０）で処理されて高周波の特徴を減衰させた。フィルタリングされたイメージをデバイスの一面に投射して正規化することで均一しない照明による如何なる背景の変動も取り除いた。アルゴリズムは、臨界値５×１０４を超過するピークを特定して少なくとも１５０個のピクセル別に分離した。捕集内のワームは投射で大きいピークに該当する。ピークに中心を置いた２０４８ピクセル×２００ピクセルの領域が切削されて微細流体チャンネル内で固定された単一のワームが隔離された。切削されたワームのイメージは、１５％のピクセルが臨界値より大きくなるように臨界処理されて２進映像に変換された。サイズフィルタリングは、領域で５０００ピクセルより小さいすべての外来粒子を取り除いて視野にワームのボディのみを残した。ワームのボディの重心は、ワームバウンダリーの縁側から選択されるか、または予測された。２０１ピクセル×２０１ピクセルの小さいウィンドウがワームの重心周辺から選択されてニューロン蛍光に対して分析された。最も明るい信号が正焦点にあるニューロンから出ると仮定し、すべてのイメージスタックを介して全体の関心領域（ＲＯＩ）で最も明るい地点を探索した。同一の焦点平面に該当する全体のワームのスコアリングが行われるためにユーザにディスプレイされた。本Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのＡＤモデル研究において、ＶＣ４及びＶＣ５のニューロンは「健康な」、または「はっきりしない／損失された」または「焦点が合っていない」場合、それぞれ「正常」、または「退化」、または「スコアリングしない」でスコアリングが行われる。全体のワームは焦点を外れた場合、「はっきりしないワーム」、ＶＣ４／ＶＣ５のセルボディが奇形である場合、「ニューロン奇形」、そしてニューロン突起が生成された場合、「軸索突起の生成」のような追加的なコメントが配当された。スコアリングオプションが画面にディスプレイされて各ワームに対して選択され、スコアは統計分析のために抽出されるように多次元アレイに保存された。スコアはイメージと共に今後の参照及び検討過程のために後で公開される。
【００４１】
［実施例‐Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの系統及び維持］
【００４２】
以下の説明は、本出願で議論された発明対象に係る一実施例にすぎない。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓは、２０℃でＨＢ１０１バクテリアを有する線虫飼育培地（ＮＧＭ）寒天プレートで成長及び維持された。以下のＣ．ｅｌｅｇａｎｓの菌株をこの作業に使用している：ＬＸ９５９  ｖｓＩｓ１３（ｌｉｎ‐１１：：ｐｅｓ‐１０：：ＧＦＰ＋ｌｉｎ‐１５（＋））、ＪＰＳ６７  ｖｓＩｓ３８；ｕｎｃ‐１１９；ｖｓＩｓ１３；ｌｉｎ‐１５Ｂ、ＣＺ１２００  ｊｕＩｓ７６（ｕｎｃ‐２５ｐ：：ＧＦＰ＋ｌｉｎ‐１５（＋））、ＡＭ１３８  ｒｍＩｓ１３０（ｕｎｃ‐５４ｐ：：Ｑ２４：：ＹＦＰ）、ＡＭ１４０  ｒｍＩｓ１３２（ｕｎｃ‐５４ｐ：：Ｑ３５：：ＹＦＰ）。本作業で、ニューロンの退化研究のためにＣ．ｅｌｅｇａｎｓの系統ＬＸ９５９及びＪＰＳ６７は野生型とＡＰＰ突然変異にみなされた。２つの系統で、すべて６個のＶＣニューロンが蛍光顕微鏡で見られる緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）でマークされた。ＡＭ１３８及びＡＭ１４０の菌株は、菌株のボディ壁の筋肉細胞でＹＦＰ蛍光タンパク質に標識された２４及び３５サブユニットのポリグルタミン（ＰｏｌｙＱ）を有する。
【００４３】
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの菌株は、デバイスで高効率の研究のために大きな液体培養ワームの母集団を得るように２０℃で維持及び同時に培養された。４個の健康な幼虫期４（Ｌ４）の雌雄同体が２０℃でＨＢ１０１バクテリアローン（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｌａｗｎ）を含む１０ｃｍ直径のＮＧＭプレートに伝達された。プレートは７日間約９００乃至１０００個の妊娠したワームを生成し、その後、漂白して漂白時に約６０００個の生存可能な卵を得るだろう。漂白された卵が孵化して年齢が同一な幼虫期１（Ｌ１）を得るように卵は３６０度の回転子内で２０℃で２４時間培養されて孵化された。健康なＬ１を液体内にある孵化されていない卵、健康でない／死んだＬ１、及びワームの死体と分離する２０μｍのフィルタを介して孵化されたワームをフィルタリングすることで孵化されたＬ１が洗浄された。健康なＬ１は、ガラスチューブに収集され、２分間１０００ｒｐｍで遠心分離されて液体中で約１００ワーム／１０μＬのワーム濃度を得る。Ｓ．培地（１×１０９細胞／ｍＬ）で１ｍＬの追加のＨＢ１０１バクテリアフードで２４個のウェルプレートのうち３２個のウェル内に２０μＬの容量を配分した。ワームは２０℃で培養され、Ｌ４ステージの末期に到達するまで４８時間の間に毎分８０回転（ｒｐｍ）の回転速度で振盪された。ウェルプレートはワームがウェルの底に沈むように１０分間水平面上に放置された。新たに懸濁された１ｍＬのＨＢ１０１が各ウェルに追加された。５０μＬのＦＵｄＲ（水で８．４ｍＭ）が各ウェルに追加されてウェル容量で新しい幼いワームの生成を避けた。適当な薬物化合物が指定されたウェルに知られた濃度で追加された。プレートはワームが３日目の成虫（Ｄ３）ステージに成長するまで７２時間培養された。３２個のウェルそれぞれは、４０μｍのフィルタふるいを使用して９６個のウェルプレート上の３個のウェルに分配された。ワームはフィルタリングされ、リンスされて９６個のウェル収集プレートに伝達される。ワームは、ピペットを用いて個別のウェルから高効率スクリーニングプラットフォームを使用したイメージングに使用される主要デバイスのウェルに移される。
【００４４】
［実施例‐チャンネルの構造］
【００４５】
以下の説明は、本出願で議論された発明対象に係る一実施例にすぎない。総検査時間は重要なパラメータであり、高効率研究でボトルネックになり得る。実行別実験時間を減らすことで、科学的な／遺伝学的なスクリーンから新しい候補を特定する可能性を増加させるより多くの数の化合物／母集団をスクリーンすることができる。私たちは並列構造を設計して１ウェル当たり４０個のチャンネルを有する９６個のウェルデバイス内に最大で３８４０個のワームを固定化してＣ．ｅｌｅｇａｎｓのスクリーニングプラットフォームのための検査時間を減らした。全体デバイスは、共通のガスケットシステムの下で作動されて同一の流量を得るような設計の最適化が必要である。９６個のウェルデバイスは、共通の流出ポートに一緒に連結された８個のウェルセクションの少ない括りで分割される。ＰＤＭＳブロックの両側にある６個の流出ポート組（Ｅ１及びＥ２）は両側の上部ガスケットの共通の流出溝と整列される。ワームの入口と流出チャンネルは最大の厚み（８５μｍ）で製造され、ローディング中にデバイス内部でワームに加わる物理的なストレスを避けて全体の水理抵抗を減らす。ワームが多数の固定サイクルを有するデバイス内部及び６５μｍ（緑色）及び４５μｍ（赤色）のより小さいチャンネル幅を有するデバイス内の相対的な位置に押し込まれるにつれ、ワームの動きは減少される。チャンネル幅は長さに応じて変わり、アスペクト比（チャンネル高さ対チャンネル幅）の値が１．２‐０．４内にあるようになる。液体培養液で成長した３日目の成虫ワームは約１．０のアスペクト比を有する領域で動かない。すべてのウェルは流出チャンネルを介して主排出口に連結される。チャンネル内の正の圧力勾配はチャンネル内にワームがロードされるようにし、ｚ‐スタックイメージング時に位置を維持するようにする。
【００４６】
大きいサイズのデバイスは９６個のウェルの中及びウェルの４０個の捕集内で類似した流量、より速いローディング、及び同一のワーム固定化をなし得る特別な設計レイアウトと知能的な流出チャンネル配線が必要である。流量は微細流体チャンネルの幾何学的形状［］の関数である水理抵抗に左右される。水理抵抗の主要な寄与因子が流出チャンネルの長さであるために、流量は出口孔に対するウェルの相対的な位置によって減少する。デバイスの製造及び作動にはウェル領域外のデバイス境界上の出口孔の数を最小限にすることが必要である。デバイスの上下部に６個の流出口の２行を有する対称的な９６個のウェルデバイスを設計した。各流出口は４個の他の流出チャンネル長さを有する２×４ウェルを連結する。第１行に位置して流出口と最も近く位置したウェルＡ０１は最小限の総水理抵抗と最大流量を示す。流量は出口から最も遠くにあるウェルＤ０１で約５０％程度減少する。流量の変化はより高いウェル圧力でより著しい。流量に対するウェル位置の影響を減らすために、水理抵抗はチャンネル長さを変更されたチャンネル幅に補償して調節される必要がある。
【００４７】
［実施例‐自動化されたイメージの獲得］
【００４８】
以下の説明は、本出願で議論された発明対象に係る一実施例にすぎない。手動スクリーニングで、ワームは寒天パッドに装着され、互いに対して無作為に位置して配向される。この固定方法は十分な高い解像度ですべてのワームをスクリーンするために追加的な時間と多数の視野が必要である。手作業の表現型スクリーンは労働集約的なステップと長い分析時間によって一部の母集団に限定される。本微細流体固定デバイスを使用すれば、９６個のウェルデバイスフォーマットで約４０００ワームまで並列に固定することができる。ワームがオン／オフ圧力サイクルを使用して捕集チャンネル内部で固定される前に、ワームは９６個のウェルデバイスにロードされ、ガスケットシステムの間でクランプされる。デバイスはフラットトップ形状の電動式ＸＹステージに装着されて５００μｍピエゾを備える。３軸の動きはすべて内部用のｌａｂＶＩＥＷアルゴリズムで制御される。自動化プログラムは２つの主要なステップ：１）ワーム固定、及び２）入力パラメータを用いた適応型デバイススキャンを含む。
【００４９】
９６個のウェルはすべてＭ９緩衝液内で約６０個のＤ３成虫ワームで埋められ、ガスケットシステムの間でクランプされて固定化サイクル中の圧力漏洩を防ぐ。上部ガスケットは０．５ｐｓｉの圧力で空気排出口を開放してＭ９緩衝液で徐々に充填される。遅い充填率によって緩衝液が流れる間にこぼれてウェルの間でワームが混合されることが防止される。空気排出口と２つの流出口（Ｅ１及びＥ２）は、緩衝液が上部ガスケット内に充填された後直ぐに閉じられる。ワームはウェルの底とチャンネル入口の周辺で自由に泳ぐことができる。ワームは９６個のウェルのガスケットシステムでオン‐オフサイクルを使用して４ｐｓｉ圧力で固定される。流出口Ｅ１及びＥ２は両側で同時に開放されて９６個のウェル内のワームを同時に固定する。全体の９６ウェルの固定は５分未満で行われて約１００ｍＬの緩衝液容量を吐出する。Ｄ０１‐Ｅ１２のウェルのうち一つは低い倍率（２ｘ、０．０６ＮＡ）で見られ、サイクル数で固定程度をモニタリングする。固定サイクルが完了されれば、ステージは手作業で移動されてウェルＡ０１、Ａ１２、Ｈ０１、及びＨ１２のＸＹＺ座標を１０ｘ、０．３ＮＡ対物レンズを使用して記録してステージ軸に対してチャンネル設計のＸＹオフセット（ｅ）とＸＺチルト（σＸＺ及びσＹＺ）を補正する。値はデバイスの全ての位置で計算されてイメージングステップで各軸に対して補正される。
【００５０】
［実施例‐Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの疾病モデルの自動化されたイメージ分析］
【００５１】
そのような大規模なスクリーンで微妙な表現型変化の手作業イメージ分析は全体の検査速度を制限するまた他のボトルネックである。完全に自動化されたデータ獲得及び高解像度蛍光イメージスタックの分析を立証するためにタンパク質の凝集疾病モデル系統が使用された。モデルＡＭ１４０系統は年齢依存凝集を示す体壁筋肉内の３５ｐｌｏｙＱチェインを有する。より短いサイズのｐｌｏｙＱ切片を有する対照ワーム、ＡＭ１３８系統は似たような年齢でそのような凝集表現型を有しない。このＨＴＳシステムで収集された大規模、３Ｄスタックイメージに対してイメージ分析に必要な時間を減らしてデータ処理過程を単純化するために完全に自動化されたイメージ分析ＧＵＩが開発された（図８Ａ）。ＧＵＩは４個の視野すべてを配列し、投射された強度プロファイルでピークに対応する固定された動物があるチャンネルを識別する（図８Ｂ、８Ｃ）。アルゴリズムは、イメージプロセッシングのための最上の焦点平面で各動物を抽出し（図８Ｄ）、各動物に対して最適の焦点映像における凝集を識別する（図８Ｅ）。各動物に対する表現型点数は自動的に多次元アレイに保存される。このＧＵＩを使用して、捕集された動物の凝集統計のために全体の９６ウェルチップから収集されたイメージを大体１５分以内に分析することができる（図８Ｆ）。この自動化されたイメージ分析は手作業で行われるときに、すべて自動化されたＧＵＩステップに比べて少なくとも２桁程度の大きさほどデータ処理時間を成功的に減少させた。全体９６ウェル実験のためにＧＵＩに登録された表現型点数は点描図面で送られる（図８Ｇ）。ＢＬＯＢパラメータはこのモデルのスクリーンプラットフォームの場合、少なくとも０．８０の高いＺ’ファクターを生成する明確な区分を示す。多数のウェルを結合すれば、スクリーンの改善されたＺ’ファクターを導く分散を下げることができる（図８Ｈ）。
【００５２】
［実施例‐Ｌ４ステージ動物のための３８４‐ウェルデバイス］
【００５３】
以下の説明は、単なる本出願で議論された発明対象に係る一実施例である。Ｌ４ステージＣ．ｅｌｅｇａｎｓの超高効率固定及びイメージングのために３８４ウェルの並列固定デバイスを設計及び最適化した。９６ウェルプラットフォームと類似した形で、各ウェルが微細流体デバイスに誘導される。各デバイスは、計１１、５２０個のワームに対して３０  Ｌ４ステージのワームに向けて固定するように設計される。９６ウェルの設計と同様に、プロットフォームの半分にある各４×２デバイスセットが流出ポートに直列に連結される。抵抗を最適化してほぼ同じ流量を得るために、ジグザグ状の出口チャンネルのレイアウトが設計される。このジグザグ状の設計は４×２ウェルを連結して他の４×２ウェルと重なって大体２倍多い流出チャンネルを形成する。このレイアウトを使用して、出口アームの構造はほぼ同一のアスペクト比及び同一の流量を成すように最適化された。この３８４ウェルのプラットフォームは９６ウェルプラットフォームと同一のガスケットセットアップで運用される。表現型分析で大きい母集団のサイズが必要な大規模なイメージングの基盤研究のためにこのシステムはＬ４ステージＣ．ｅｌｅｇａｎｓに対する高効率の光学的な質疑を可能とする。デバイスインターフェースが標準型の３８４ウェルプラットフォームに合わせられているために、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓに対する商業研究所と大規模な高効率スクリーニングに相当な価値を有することができる。
【００５４】
［実施例‐例示的なデバイスの成功］
【００５５】
以下の説明は、単なる本出願で議論された発明対象に係る一実施例である。微細流体の基盤技術は単一の圧力入力を有し、３Ｄバルブ制御を有せず、３０分の試験準備、並列サンプリング処理、多数のウェルプレート処理及び非技術者に容易なプロトコルを試演している。デバイスは１２個の８ウェルプラットフォームのセグメントを有し、多数の８ウェル構成とは異なるセットで製造される。デバイスは、適切なガスケット設計で全体のチップを運用するために１つの約５ｐｓｉ圧力ラインと約１００ｍＬの緩衝液が必要である。ユーザは、チップ上で任意の四角形サイズのウェルアレイを選択して予め定義された個数のウェルをスキャンすることができる。母集団別に４０個の固定チャンネルを有する９６ウェルのすべては５分以内に最大で３８４０ワームを固定する。オン／オフの固定サイクルは、ワームをアスペクト比が変わる先細になるチャンネルの構造内に押し込み、約４０００ワームを同時に横方向に向くようにする。私たちは１０×対物レンズ（０．３ＮＡ）と大型カメラを利用して１２分以内に９６ウェルデバイスで母集団別に計４０個のチャンネルに対するイメージを獲得した。チャンネル内で固定されたワームは、自家蛍光を増加させる高いレベルのストレスを受けてスクリーン感度を減少させた（低信号対背景比）。私たちは微細流体デバイスで類似した水準の背景蛍光を発見した。そのため、固定及びイメージング時間がより短くなり、蛍光レポーターの表現水準が弱いＣ．ｅｌｅｇａｎｓスクリーンに非常に有利である。
【００５６】
一度の全体チップスキャンによって３８４０個のワームから４６０８個のイメージが生成される。チップは高い開口数の対物レンズで高解像度イメージングをすることができ、より多いｚ‐スタックを獲得することができる。より小さい視野を有する高い開口数の対物レンズは全体の長さと４０個のチャンネルすべてをカバーするより多いイメージング位置を必要とするだろう。私たちの固定サイクルは頭部‐尻部の配向偏向性が殆どないために、より高い解像度とより小さい視野で４０個のチャンネルすべてをキャプチャーしてボディの頭部、または尾部を有する約５０％の母集団から信号を獲得することができる。ＬａｂＶＩＥＷの獲得アルゴリズムは、データにすべての情報を表示してフォルダに保存する。私たちはＧＵＩを開発し、ニューロン表現型に対して半自動で蛍光信号を分析した。ＧＵＩは、ユーザが定義したウェルの母集団からすべてのイメージをロードして一度に単一のワームイメージスタックをディスプレイしてニューロン健康に対するスコアリングの前に視覚的に検査する。私たちは大体８時間計９６ウェルチップから３８４０個のチャンネルすべてに対してスコアリングを行った後、９次元のアレイに保存した。すべてのスコアは、多次元アレイから一緒に合計されて統計試験のためにディスプレイされる。高効率システムの能力を立証するための試みで、私たちは退化した体壁の筋肉を有するＣ．ｅｌｅｇａｎｓのハンティントンモデルに対する完全自動化されたイメージ分析法を開発した。ワームは、類似したイメージ獲得アルゴリズムを使用して獲得され、１５分未満で９６ウェルデバイスから退化表現型に対する分析が行われる。
【００５７】
このスクリーニングプラットフォームは、大きい母集団表現型が必要なイメージングの基盤研究を行う研究所によって容易に採用される。デバイスインターフェースが標準型の９６ウェルプラットフォームに合わせられているために、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓに対する大規模な高効率スクリーニングのための商業用基盤施設に相当な価値を有する。特定の退行性神経疾患モデルに集中した自動化されたイメージ処理アルゴリズムは３０分未満で完璧にデータを分析することができる。私たちはスクリーンでＤ３ステージＣ．ｅｌｅｇａｎｓを使用したが、他のデバイスサイズを有する他のワームステージに同一の設計原理を適用して類似した固定効率を成すことができる。幼いステージワームは、９６ウェルフォーマットをより大きいウェルフォーマットに拡張できるより小さいデバイスサイズが必要であろう。
【００５８】
上述した発明は、本開示の多数の具現例、または実施形態の全部、または一部を構成することができるコンピュータで具現されたデバイスの実現のためのコンピュータシステムを介して行うことができる。コンピュータシステムはコンピュータ、キーボード、マウス及びコンピュータが入力されるかまたは／出力を、例えば、ユーザ、オペレーター、または他のコンピュータ、またはシステム（図示せず）に提供できるディスプレイデバイス（例えば、コンピュータモニタ）を含んでもよい。一般的にディスプレイデバイス、キーボード、マウス、及びコンピュータシステムと相互作用を起こし得る他の手段、またはメカニズム（例えば、タッチスクリーンインターフェース）のような入力／出力デバイスはこの技術分野において熟知されているので、それらに対する詳細な議論は便宜上、ここでは省略されているが、制限されるものとして考慮されるべきではない。コンピュータはコンピュータを、例えば内部、または外部ネットワークに連結するようなネットワークポートを含む。コンピュータは本開示のコンピュータで具現されたデバイス及び／または方法の論理的な機能を提供するソフトウェアアプリケーションのためのプログラムの命令語を含む保存デバイスに連結される。保存デバイスはまたデータを保存するデータベースを含む。
【００５９】
当業者は、本開示の多数の実施形態の全部、または一部を具現するソフトウェアアプリケーションのためのブログラムの命令語がジャバ、またはＣ＋＋のようなプログラミング言語で記され、データベースはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＡｃｃｅｓｓＴＭのようなデータベースパッケージ、またはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＳＱＬ  ＳｅｒｖｅｒＴＭ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＳＱＬ  Ｓｅｒｖｅｒ  ＣＥＴＭ、ＩＢＭ  ＤＢ２ＴＭ、ｍｙＳＱＬ、またはｐｏｓｔｇｒｅＳＱＬのようなデータベース管理システム（ＤＢＭＳ）で具現されることを認識するだろう。
【００６０】
本開示の実施形態は、ハードウェアとソフトウェアの任意の結合で具現される。コンピュータ具現デバイスとして具現されれば、本開示は、上述したすべてのステップ及び機能を行う手段を使用して具現される。
【００６１】
本開示の実施形態は、例えば、コンピュータで使用できるか、またはコンピュータで読み取り可能な媒体を有する製造物品（例えば、多数のコンピュータプログラム製品）に含まれる。媒体はその中に、例えば、本開示の実施形態のメカニズムを供給して促すためにコンピュータで実行可能な命令語を含むコンピュータで読み取り可能なプログラムコード手段を具現する。製造物品はコンピュータシステムの一部に含まれるか、または別途販売される。
【００６２】
上述した詳細な説明で特定の実施形態が詳しく説明され、添付の図面に示されたが、当業者は本開示の全般的な思想と広い発明概念に照らして多様な変更と代替が行われることが分かるだろう。従って、本開示の範囲はここに開示された特別な実施例と具現に限定されず、添付の請求範囲とその等価物によって定義された思想と範囲内で変更を包括するように意図されることを理解すべきであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0006660950.tif 000008
【図８Ａ】
0006660950.tif 000009
【図８Ｂ−８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ−８Ｈ】
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