(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
V30M  TTR発現を選択的に阻害するためのUNAオリゴマーであって、該オリゴマーは第1鎖および第2鎖を含み、各鎖は19〜29モノマー長であり、該モノマーはUNAモノマーおよび核酸モノマーを含み、オリゴマーは14〜29モノマー長の二重鎖構造を有し、該第1鎖は5’から3’方向において
【表１】
0006771387.tif 000010
から選択される配列を含み、該第2鎖は5’から3’方向において
【表２】
0006771387.tif 000011
から選択される配列を含み、G"はUNA-Gであり、U"はUNA-Uであり、A"はUNA-Aであり、C"はUNA-Cであり、mUは2’−O−メチルウリジンである、UNAオリゴマー。
【請求項２】
前記オリゴマーは、V30M  TTR発現を減少させるためのIC50が20pM未満である、請求項1に記載のUNAオリゴマー。
【請求項３】
前記オリゴマーは、選択比が少なくとも10であり、該選択比が、野生型TTR発現を減少させるためのIC50対V30M  TTR発現を減少させるためのIC50の比である、請求項1に記載のUNAオリゴマー。
【請求項４】
前記オリゴマーは、選択比が少なくとも20である、請求項3に記載のUNAオリゴマー。
【請求項５】
前記オリゴマーは、インビトロでの選択比が少なくとも50である、請求項3に記載のUNAオリゴマー。
【請求項６】
前記オリゴマーが、インビボまたはエクスビボでのV30M  TTR発現を選択的に阻害する、請求項1に記載のUNAオリゴマー。
【請求項７】
塩基修飾、糖修飾または結合修飾された少なくとも1つの核酸モノマーをさらに含む、請求項1に記載のUNAオリゴマー。
【請求項８】
前記オリゴマーが、平滑末端を有するか、または1つ以上のオーバーハングを有する、請求項1に記載のUNAオリゴマー。
【請求項９】
前記第1鎖および前記第2鎖が接合されて、一末端でループによる二重鎖領域を形成する、請求項1に記載のUNAオリゴマー。
【請求項１０】
請求項1〜9のいずれか1項に記載のUNAオリゴマーおよび医薬的に許容され得る担体を含む、医薬組成物。
【請求項１１】
脂質配合物を含む、請求項10に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
カチオン性脂質、アニオン性脂質、ステロール、ペグ化脂質およびこれらの任意の組み合わせから選択される1つ以上の脂質を含む、請求項10に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記組成物が実質的にリポソームを含まない、請求項10に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記組成物がリポソームを含有する、請求項10に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
TTR関連アミロイドーシスの治療または予防のための、請求項10〜14のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記TTR関連アミロイドーシスがATTRである、請求項15に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
対象においてV30M  TTRを選択的に減少させる、請求項15に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
静脈内、皮下、肺、筋肉内、腹腔内、経皮または経口的に投与される、請求項15に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
対照よりも少なくとも10%超で対象におけるV30M  TTRを選択的に減少させる、請求項15に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
TTR  mRNA発現を少なくとも5日間減少させる、請求項15に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対立遺伝子選択的遺伝子サイレンシングに基づくバイオ医薬品およびバイオ治療薬の分野に関する。より詳細には、本発明は、トランスサイレチンの対立遺伝子選択的ノックダウンが可能なUNAオリゴマーを用いたトランスサイレチン関連アミロイドーシスの治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ある特定の疾患の存在は、変異対立遺伝子の発現と相関すると思われる。例えば、アミロイドーシスは、ある特定のトランスサイレチン(TTR)変異と相関し得る。そのような場合、野生型バリアントの発現を維持しつつ、変異対立遺伝子の発現を選択的にサイレンシングするのが望ましい。
【０００３】
トランスサイレチンに関連するアミロイドーシス(ATTR)は、末梢神経系、自律神経系および中枢神経系を含む様々な器官および組織におけるアミロイドフィブリルタンパク質の沈着と関係する。トランスサイレチン(TTR)は、レチノール結合タンパク質、ならびに血漿および脳脊髄液における血清チロキシンと結合して輸送する分泌型甲状腺ホルモン結合タンパク質である。
【０００４】
ATTRの病理には多くのTTR変異を含み得る。多くの場合、ATTRの症状には、ニューロパシーおよび／または心筋症が含まれる。末梢神経ニューロパシーは、感覚神経ニューロパシーや運動神経ニューロパシーを伴って、下肢にて始まり、上肢に進行し得る。自律神経ニューロパシーには、胃腸症状や起立性低血圧が発症し得る。
【０００５】
最も一般的な変異であるTTR遺伝子のVal−30−Metを有する患者は、通常の心エコー図を有する。しかし、そのような患者は刺激伝導系の異常を有し、ペースメーカーを必要とする可能性がある。ATTR  V30Mバリアントは、下肢脱力、疼痛や感覚不全、ならびに自律神経機能不全を引き起こし得る。硝子体アミロイド沈着および不透明アミロイド沈着は、ATTRの特徴であり得る。
【０００６】
ATTRの発症に対する生存は、5〜15年あり得る。ATTRアミロイドーシスに対する主な治療は肝臓移植であり、これはバリアントTTR産生の主要源を除去して通常のTTRに置き換える。肝臓移植は疾患進行を遅らせ、自律神経ニューロパシーおよび末梢神経ニューロパシーにおいていくらか改善され得る。
【０００７】
現在、TTRアミロイドの形成を止めることができる薬理学的治療は存在しない。
【０００８】
ATTRおよび他のアミロイド関連疾患の治療薬が、継続的に必要とされている。
【０００９】
疾患関連対立遺伝子を選択的にダウンレギュレートすることができる遺伝子サイレンシング剤が長年必要とされている。
【００１０】
TTRの効率的で特異的なノックダウンをもたらし得る活性物質もまた必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
（簡単な要旨）
本発明は、V30M  TTR発現を選択的に阻害するためのUNAオリゴマーであって、アミロイドーシスの治療に使用することができるUNAオリゴマーを提供する。UNAオリゴマーは第1鎖および第2鎖を有し得、各鎖は19〜29モノマー長であり、該モノマーはUNAモノマーおよび核酸モノマーである。実施形態には、UNAオリゴマーを対象に投与することによってTTR関連アミロイドーシスを治療または予防するための医薬組成物および方法が含まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の実施形態には、以下が含まれる。
【００１３】
V30M  TTR発現を選択的に阻害するためのUNAオリゴマーであって、該オリゴマーは第1鎖および第2鎖を含み、各鎖は19〜29モノマー長であり、該モノマーはUNAモノマーおよび核酸モノマーを含み、オリゴマーは14〜29モノマー長の二重鎖構造を有する、UNAオリゴマー。
【００１４】
第2鎖が二重鎖領域において少なくとも1つのUNAモノマーを有する、上記のUNAオリゴマー。第2鎖における少なくとも1つのUNAモノマーが、5’端から2〜8番目の位置のいずれか1つである、上記のUNAオリゴマー。第2鎖における少なくとも1つのUNAモノマーが、5’端から9〜18番目の位置のいずれか1つである、上記のUNAオリゴマー。第2鎖における少なくとも1つのUNAモノマーが、5’端から6、7、15、16または17番目の位置である、上記のUNAオリゴマー。
【００１５】
オリゴマーは、V30M  TTR発現を減少させるためのIC50が20pM未満である、上記のUNAオリゴマー。
【００１６】
オリゴマーは、選択比が少なくとも10であり、該選択比が、野生型TTR発現を減少させるためのIC50対V30M  TTR発現を減少させるためのIC50の比である、上記のUNAオリゴマー。オリゴマーは、選択比が少なくとも20である、上記のUNAオリゴマー。オリゴマーは、インビトロでの選択比が少なくとも50である、上記のUNAオリゴマー。
【００１７】
オリゴマーが、インビボでのV30M  TTR発現を選択的に阻害する、上記のUNAオリゴマー。オリゴマーが、エクスビボでのV30M  TTR発現を選択的に阻害する、上記のUNAオリゴマー。
【００１８】
塩基修飾、糖修飾または結合修飾された少なくとも1つの核酸モノマーを含む、上記のUNAオリゴマー。
【００１９】
上記のUNAオリゴマーおよび医薬的に許容され得る担体を含む、医薬組成物。脂質配合物を含む、上記の医薬組成物。カチオン性脂質、アニオン性脂質、ステロール、ペグ化脂質およびこれらの任意の組み合わせから選択される1つ以上の脂質を含む、上記の医薬組成物。組成物が実質的にリポソームを含まない、上記の医薬組成物。組成物がリポソームを含有する、上記の医薬組成物。
【００２０】
TTR関連アミロイドーシスの治療または予防方法であって、必要とする対象に有効量の上記のUNAオリゴマーを投与する工程を含む、方法。TTR関連アミロイドーシスがATTRである、上記の方法。対象がヒトである、上記の方法。対象がV30M遺伝子を含む、上記の方法。方法が、対象においてV30M  TTRを選択的に減少させる、上記の方法。投与が、局所的または全身的である、上記の方法。投与が静脈内、皮下、肺、筋肉内、腹腔内、経皮または経口である、上記の方法。方法が、コントロールよりも少なくとも10%超で対象におけるV30M  TTRを選択的に減少させる、上記の方法。有効量が、0.001〜50.0mg/kgの用量である、上記の方法。
【００２１】
TTR  mRNA発現を少なくとも5日間減少させる、上記の方法。方法が、対象における末梢神経ニューロパシーまたは自律神経ニューロパシーを軽減させる、上記の方法。投与が炎症性反応をもたらさない、上記の方法。
【００２２】
細胞におけるTTR遺伝子発現の阻害方法であって、該細胞を上記のUNAオリゴマーで処理する工程を含む、方法。
【００２３】
哺乳動物におけるTTR遺伝子発現の阻害方法であって、該哺乳動物に上記のUNAオリゴマーを投与する工程を含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
図１：図1は、野生型(WT)TTR  mRNAと比較して、V30M変異mRNAにおける284番目の位置に存在する単一ヌクレオチド多形(SNP)を示す。WT  mRNAに相補的な従来のsiRNAを、284番目の位置の周囲にタイリングすることができる。
【００２５】
図２：図2は、HepG2細胞におけるTTRノックダウンで測定されるように、WT  mRNAに相補的な従来のsiRNAが、WT  TTR遺伝子のサイレンシングにおいて制限された活性を有することを示す。矢印によって示される5、9、14および15番目の位置は、他の位置よりもサイレンシングに対しより利用可能であるように思われる。
【００２６】
図３：図3は、V30M  mRNAに相補的な従来のsiRNAを284番目の位置の周囲にタイリングすることができることを示す。4種の従来のsiRNAのバリエーション、すなわちV30M−P5、V30M−P9、V30M−P14およびV30M−P15を調製した。また図3に示すように、2つのレポーターバリアントのV30VおよびV30Mを調製し、ルシフェラーゼ遺伝子の3’−UTR領域のPSICHECKレポーター系に使用した。ここでV30VおよびV30Mは、各々ヒトTTRの塩基配列264〜304を有し、V30Vは284番目の位置に点突然変異を有さず、V30Mは284番目の位置に点突然変異を有する。
【００２７】
図４：図4は、V30V遺伝子レポーターバリアントおよびV30M遺伝子レポーターバリアントに対してPSICHECKレポーターアッセイで測定した4種の従来のsiRNAのバリエーションであるV30M−P5、V30M−P9、V30M−P14およびV30M−P15の活性を示す。従来のsiRNAのバリエーションであるV30M−P5、V30M−P9およびV30M−P15は、V30VよりV30Mに対してより効果的であった。従来のsiRNAのバリエーションであるV30M−P14は、V30VよりV30Mに対してより効果的でなかった。
【００２８】
図５：図5は、V30V遺伝子レポーターバリアントおよびV30M遺伝子レポーターバリアントに対してPSICHECKレポーターアッセイで測定した4種の従来のsiRNAのバリエーションであるV30M−P5、V30M−P9、V30M−P14およびV30M−P15についてのIC50分析を示す。従来のV30M−P15バリアントは、V30VよりV30Mに対して5.6倍さらに効果的であった。したがって、V30VよりもV30Mに対する従来のsiRNAの選択率は、5.6以下であった。
【００２９】
図６：図6は、PSICHECKレポーターアッセイで測定されるように、V30M  TTRのサイレンシングに効果的であったUNAオリゴマーの構造を示す。UNAオリゴマーの各実施形態のP15U6、P15U7、P15U14、P15U15およびP15U16は、4種のUNAモノマーを含有した。各UNAオリゴマーにおいて、第1UNAモノマーは第1鎖の5’端に位置し、パッセンジャー鎖とも呼ばれた。各UNAオリゴマーにおいて、ガイド鎖とも呼ばれる第2鎖は、第1鎖とともに19モノマー長の二重鎖領域を形成した。各UNAオリゴマーは、19個のモノマーの二重鎖領域と、各末端に2個のモノマーのオーバーハングを有した。各UNAオリゴマーにおいて、第2UNAモノマーは、オーバーハング部分中の第1鎖の3’端、20番目に位置した。各UNAオリゴマーにおいて、第3UNAモノマーは、オーバーハング部分中の第2鎖の3’端、20番目に位置した。UNAオリゴマーの実施形態のP15U6、P15U7、P15U14、P15U15およびP15U16において、第4UNAモノマーは、第2鎖の5’端から数えて、第2鎖の6、7、14、15および16番目にそれぞれ位置した。
【００３０】
図７：図7は、従来のsiRNA  V30M−P15と比較して、V30V遺伝子レポーターバリアントおよびV30M遺伝子レポーターバリアントに対するPSICHECKレポーターアッセイで測定したUNAオリゴマーであるP15U6、P15U7、P15U15およびP15U16の活性を示す。UNAオリゴマーの各実施形態であるP15U6、P15U7、P15U15およびP15U16について、UNAオリゴマーは、V30VよりV30Mに対してより効果的であった。驚くべきことに、UNAオリゴマーであるP15U6の活性は、従来のsiRNA  V30M−P15の活性よりも実質的かつ有利に優れていた（各々は、V30Mを標的とする）。また図7は、UNAオリゴマーであるP15U6、P15U7、P15U15およびP15U16のV30VよりもV30Mに対する選択率が、従来のsiRNA  V30M−P15についてよりも実質的に大きかったという驚くべきかつ予期しない結果を示す。特に、V30VよりもV30Mに対するUNAオリゴマーであるP15U6の選択率は24であり、これは、V30M(37.6  pM)に対するUNAオリゴマーであるP15U6のIC50が、V30V(919.9  pM)に対するUNAオリゴマーであるP15U6のIC50より24倍低いことを意味する。この選択率は、有利なことに、従来のsiRNAについての上記図5に示した5.6の選択率より４倍優れていた。
【００３１】
図８：図8は、PSICHECKレポーターアッセイで測定されるように、V30M  TTRのサイレンシングに効果的であったUNAオリゴマーの構造を示す。UNAオリゴマーの各実施形態のP16U6、P16U7、P16U15、P16U16およびP16U17は、4種のUNAモノマーを含有した。各UNAオリゴマーにおいて、第1UNAモノマーは第1鎖の5’端に位置し、パッセンジャー鎖とも呼ばれた。各UNAオリゴマーにおいて、ガイド鎖とも呼ばれる第2鎖は、第1鎖とともに19モノマー長の二重鎖領域を形成した。各UNAオリゴマーは、19個のモノマーの二重鎖領域と、各末端に2個のモノマーのオーバーハングを有した。各UNAオリゴマーにおいて、第2UNAモノマーは、オーバーハング部分中の第1鎖の3’端、20番目に位置した。各UNAオリゴマーにおいて、第3UNAモノマーは、オーバーハング部分中の第2鎖の3’端、20番目に位置した。UNAオリゴマーの実施形態のP16U6、P16U7、P16U15、P16U16およびP16U17において、第4UNAモノマーは、第2鎖の5’端から数えて、第2鎖の6、7、15、16および17番目にそれぞれ位置した。
【００３２】
図9：図9は、従来のsiRNA  V30M−P16と比較して、V30V遺伝子レポーターバリアントおよびV30M遺伝子レポーターバリアントに対するPSICHECKレポーターアッセイで測定したUNAオリゴマーであるP16U6、P16U7、P16U15およびP16U16の活性を示す。UNAオリゴマーの各実施形態であるP16U6、P16U7、P16U15およびP16U16について、UNAオリゴマーは、V30VよりV30Mに対してより効果的であった。驚くべきことに、UNAオリゴマーであるP16U6、P16U7、P16U15およびP16U16のそれぞれの活性は、従来のsiRNA  V30M−P16の活性よりも実質的かつ有利に優れていた（各々は、V30Mを標的とする）。また図9は、UNAオリゴマーであるP16U6、P16U7、P16U15およびP16U16のV30VよりもV30Mに対する選択率が、従来のsiRNA  V30M−P16についてよりも実質的に大きかったという驚くべきかつ予期しない結果を示す。特に、V30VよりもV30Mに対するUNAオリゴマーであるP16U6の選択率は23であり、これは、V30M(92.4  pM)に対するUNAオリゴマーであるP16U6のIC50が、V30V(2119  pM)に対するUNAオリゴマーであるP16U6のIC50より23倍低いことを意味する。この選択率は、有利なことに、従来のsiRNAについての上記図5に示した5.6の選択率より４倍優れていた。
【００３３】
図１０：図10（左）は、V30VよりもV30Mに対するUNAオリゴマーであるP15U6の選択率を示す。V30M(37.6  pM)に対するUNAオリゴマーであるP15U6のIC50が、V30V(919.9  pM)に対するUNAオリゴマーであるP15U6のIC50より24倍低かった。この選択率は、有利なことに、従来のsiRNAについての上記図5に示した5.6の選択率より４倍優れていた。図10（右）は、V30M(92.4  pM)に対するUNAオリゴマーであるP16U6のIC50が、V30V(2119  pM)に対するUNAオリゴマーであるP16U6のIC50より23倍低かったという驚くべきかつ予期しない結果を示す。この選択率は、有利なことに、従来のsiRNAについての上記図5に示した5.6の選択率より４倍優れていた。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明は、V30M  TTR発現を選択的に阻害するためのUNAオリゴマーを提供する。本発明のUNAオリゴマーは、アミロイドーシスを治療するための治療薬として使用することができる。特に本発明は、トランスサイレチン関連アミロイドーシスを治療するためのUNAオリゴマー、組成物および方法を提供する。
【００３５】
UNAオリゴマーは第1鎖および第2鎖を有し得、各鎖は19〜29モノマー長であり、該モノマーはUNAモノマーおよび核酸モノマーである。本発明の実施形態には、対象にUNAオリゴマーを投与することにより、TTR関連アミロイドーシスを治療または予防するための医薬組成物および方法が含まれる。
【００３６】
本発明のUNAオリゴマーは、トランスサイレチンの対立遺伝子特異的ノックダウンが可能である。
【００３７】
いくつかの実施形態において、UNAオリゴマーは、トランスサイレチンに関するアミロイドーシス(ATTR)を治療するために提供される。本発明のUNAオリゴマーは、末梢神経系、自律神経系および中枢神経系を含む様々な器官および組織におけるアミロイドフィブリルタンパク質の沈着を減少させることができる。
【００３８】
ある特定の態様において、本発明は、ATTR関連疾患およびアミロイド関連疾患に対する治療薬を提供する。
【００３９】
本発明の態様には、神経ニューロパシーおよび／または心筋症を含むATTRアミロイドーシスの臨床的特徴を治療するために使用することができるUNAオリゴマーを含む。
【００４０】
いくつかの実施形態において、本発明のUNAオリゴマーは、1つの変異であるVal−30−Met  TTRを標的とする。
【００４１】
本発明は、TTRアミロイドの形成を止めることができる薬理学的療法を提供することができる。
【００４２】
UNAオリゴマー
【００４３】
本発明のUNAオリゴマーは、V30M  TTR発現を阻害するために使用することができる。
【００４４】
本発明のUNAオリゴマーであるオリゴマーは、第1鎖および第2鎖を有し得、各鎖の長さは19〜29モノマー長である。
【００４５】
UNAオリゴマーのモノマーには、UNAモノマーおよび核酸モノマーを含むことができる。
【００４６】
UNAオリゴマーは、14〜29モノマー長の二重鎖構造とすることができる。
【００４７】
いくつかの実施形態において、UNAオリゴマーの第2鎖は、二重鎖領域中に少なくとも1つのUNAモノマーを有することができる。ある特定の実施形態において、UNAオリゴマーは二重鎖領域の5’端から6、7、15、16または17番目の位置のいずれかで第2鎖の少なくとも1つのUNAモノマーを有することができる。
【００４８】
本発明のUNAオリゴマーは、その全長内で任意の数のUNAモノマーを有してよい。
【００４９】
UNAオリゴマーは、塩基修飾、糖修飾、または結合修飾された核酸モノマーを含むことができる。
【００５０】
本発明の実施形態では、さらに、V30M  TTR発現を選択的に阻害するUNAオリゴマーを提供する。
【００５１】
ある特定の実施形態において、UNAオリゴマーは、インビトロでのV30M  TTR発現を減少させるためのIC50が20pM未満である。
【００５２】
さらなる実施形態において、UNAオリゴマーは、インビトロでの選択比が少なくとも5とすることができる。選択比は、V30M  TTR発現を減少させるためのIC50対野生型TTR発現を減少させるためのIC50の比である。本発明のUNAオリゴマーの選択比は、2〜1000の範囲とすることができる。ある特定の実施形態において、UNAオリゴマーの選択比は、少なくとも2、または少なくとも5、または少なくとも10、または少なくとも30、または少なくとも30、または少なくとも50、または少なくとも100である。
【００５３】
いくつかの態様において、本発明のUNAオリゴマーは、インビボでのV30M  TTR発現を選択的に阻害することができる。
【００５４】
ある特定の態様において、本発明のUNAオリゴマーは、エクスビボでのV30M  TTR発現を選択的に阻害することができる。
【００５５】
UNAオリゴマーは、モノマーからなる鎖である活性な医薬分子であり、オリゴマーとも呼ばれる。オリゴマーのモノマーには、UNAモノマーおよび他の核酸モノマーを含むことができる。
【００５６】
UNAモノマーは、鎖中に結合してオリゴマーを形成することができる新規な合成分子である。
【００５７】
核酸モノマーは、天然に存在するヌクレオチド、修飾された天然に存在するヌクレオチド、またはある特定の非天然に存在するヌクレオチドとすることができる。
【００５８】
本発明のUNAオリゴマーは、合成された薬理学的に活性な分子であり、状態または疾患の治療に使用することができる。
【００５９】
本開示のUNAオリゴマーは、二本鎖オリゴマーとすることができる。二本鎖オリゴマーの各鎖は、全長が19〜29個のモノマーの多数の核酸モノマーに加え、UNAモノマーから構成することができる。
【００６０】
本発明のUNAオリゴマーは、任意の鎖において1つ以上のUNAモノマーを含有することができる。UNAモノマーは、一本鎖、または二本鎖UNAオリゴマーのいずれかの鎖、または二本鎖UNAオリゴマーの両方の鎖であることができる。
【００６１】
UNAモノマー
【００６２】
UNAモノマーは、以下に示すプロパン−1,2,3−トリ−イル−トリスオキシ構造に基づく小有機分子である。
【化１】
0006771387.tif 000002
（式中、R1およびR2はHであり、R1およびR2はホスホジエステル結合であり得、Baseは核酸塩基であり得、R3は以下に説明する官能基である。）
【００６３】
別の見方において、UNAモノマーの主要な原子は、IUPAC命名法で以下のように記載することができる。
【化２】
0006771387.tif 000003
ここで、オリゴマー鎖の進行方向は、プロパン残基の1−端から3−端である。
【００６４】
核酸塩基の例としては、ウラシル、チミン、シトシン、5−メチルシトシン、アデニン、グアニン、イノシン、天然型の核酸塩基アナログおよび非天然型の核酸塩基アナログが挙げられる。
【００６５】
一般に、UNAモノマーはヌクレオチドではないので、UNAモノマーはオリゴマーの少なくとも4つの形態を示すことができる。第一に、UNAモノマーは、オリゴマーの内部モノマーであり得、UNAモノマーは、両側にて他のモノマーに隣接される。この形態において、オリゴマーが例えば二重鎖の場合、UNAモノマーは塩基対形成に関与し得、二重鎖の核酸塩基を有する他のモノマーが存在する。
【００６６】
R3が−OHである、プロパン−1−イル位およびプロパン−3−イル位の両方で隣接された内部モノマーとしてのUNAモノマーの例を以下に示す。
【化３】
0006771387.tif 000004
【００６７】
第二に、UNAモノマーはオリゴマー二重鎖のオーバーハングのモノマーであり得、UNAモノマーは、両側の他のモノマーに隣接される。この形態では、UNAモノマーは塩基対形成に関与しない。UNAモノマーが柔軟性の有機構造体であるため、ヌクレオチドと異なり、UNAモノマーを含有するオーバーハングは、オリゴマーに対して柔軟性のターミネーター(flexible  terminator)であろう。
【００６８】
UNAモノマーは、オリゴマーのオーバーハングの末端モノマーであり得、UNAモノマーはプロパン−1−イル位またはプロパン−3−イル位のいずれかにて1つのモノマーのみに結合する。この形態では、UNAモノマーは塩基対形成に関与しない。UNAモノマーが柔軟性の有機構造体であるため、ヌクレオチドと異なり、UNAモノマーを含有するオーバーハングは、オリゴマーに対して柔軟性のターミネーターであり得る。
【００６９】
プロパン−3−イル位に結合した末端モノマーとしてのUNAモノマーの例を以下に示す。
【化４】
0006771387.tif 000005
【００７０】
UNAモノマーは、柔軟性を有する分子とすることができるので、末端モノマーとしてのUNAモノマーは、異なるコンフォメーションを広くとると推測することができる。プロパン−3−イル位に結合した末端モノマーとしてのエネルギー最小化UNAモノマーコンフォメーションの一例を以下に示す。
【化５】
0006771387.tif 000006
UNA  A末端形態：破線の結合は、プロパン−3−イル結合を示す。
したがって、末端UNAモノマーを有するUNAオリゴマーは、従来の核酸作用物質、例えばsiRNAと構造が大きく異なる。例えばsiRNAは、二重鎖における末端モノマーまたはオーバーハングを安定させることが必要となり得る。対照的に、末端UNAモノマーのなじみ性により、異なる特性を備えたUNAオリゴマーを提供することができる。
【００７１】
とりわけ、UNAモノマーの構造は、天然に存在するヌクレオチドへの結合を可能にする。UNAオリゴマーは、UNAモノマー、ならびに天然に存在するヌクレオシドに基づき得る種々のヌクレオチドからなる鎖とすることができる。
【００７２】
いくつかの実施形態において、UNAモノマーの官能基R3は、−OR4、−SR4、−NR42、−NH(C=O)R4、モルホリノ、モルホリン−1−イル、ピペラジン−1−イル、または4−アルカノイル−ピペラジン−1−イルであり得、ここでR4は各存在において同じか異なり、Ｈ、アルキル、コレステロール、脂質分子、ポリアミン、アミノ酸またはポリペプチドであり得る。
【００７３】
UNAモノマーは有機分子である。UNAモノマーは、核酸モノマーでもヌクレオチドでもなく、天然に存在するヌクレオシドでもなく修飾された天然に存在するヌクレオシドでもない。
【００７４】
本発明のUNAオリゴマーは、合成鎖分子である。本発明のUNAオリゴマーは、核酸でもオリゴヌクレオチドでもない。
【００７５】
いくつかの実施形態において、上記したように、UNAモノマーはUNA  A(A"と称号)、UNA  U(U"と称号)、UNA  C(C"と称号)およびUNA  G(G"と称号)とすることができる。
【００７６】
本明細書にて使用することができる称号には、mA、mG、mCおよびmUが含まれ、これらは2’−O−メチル修飾リボヌクレオチドを参照されたい。
【００７７】
本明細書にて使用することができる称号には、下ケースｃおよびｕが含まれ、これらは2’−O−メチル修飾リボヌクレオチドを参照されたい。
【００７８】
本明細書にて使用することができる称号には、dTが含まれ、これは2’−デオキシTヌクレオチドを参照されたい。
【００７９】
UNAオリゴマーに対するモノマー
【００８０】
本明細書で使用される場合、オリゴマー配列に関連して、符号XはUNAモノマーを表す。
【００８１】
本明細書で使用される場合、オリゴマー配列に関連して、符号Nは、任意の天然ヌクレオチドモノマー、または修飾されたヌクレオチドモノマーを表す。
【００８２】
本明細書で使用される場合、オリゴマー配列に関連して、符号Qは、非天然型ヌクレオチドモノマー、修飾ヌクレオチドモノマー、または化学的修飾ヌクレオチドモノマーを表す。
【００８３】
非天然型ヌクレオチドモノマー、修飾ヌクレオチドモノマー、および化学的修飾ヌクレオチドモノマーの例としては、2’−O−メチルリボヌクレオチド、2’−O−メチルプリンヌクレオチド、2’−デオキシ−2’−フルオロリボヌクレオチド、2’−デオキシ−2’−フルオロピリミジンヌクレオチド、2’−デオキシリボヌクレオチド、2’−デオキシプリンヌクレオチド、ユニバーサル塩基ヌクレオチド、5−C−メチル−ヌクレオチド、および反転デオキシ塩基モノマー残基が挙げられる。
【００８４】
非天然型ヌクレオチドモノマー、修飾ヌクレオチドモノマー、および化学的修飾ヌクレオチドモノマーの例としては、3’端安定化ヌクレオチド、3’−グリセリルヌクレオチド、3’−反転非塩基性ヌクレオチド、3’−反転チミジンが挙げられる。
【００８５】
非天然型ヌクレオチドモノマー、修飾ヌクレオチドモノマー、および化学的修飾ヌクレオチドモノマーの例としては、ロック型核酸ヌクレオチド、2’−O,4’−C−メチレン−(D−リボフラノシル)ヌクレオチド、2’−メトキシエトキシ(MOE)ヌクレオチド、2’−メチル−チオ−エチル、2’−デオキシ−2’−フルオロヌクレオチド、および2’−O−メチルヌクレオチドが挙げられる。
【００８６】
非天然型ヌクレオチドモノマー、修飾ヌクレオチドモノマー、および化学的修飾ヌクレオチドモノマーの例としては、2’−アミノヌクレオチド、2’−O−アミノヌクレオチド、2’−C−アリルヌクレオチド、および2’−O−アリルヌクレオチドが挙げられる。
【００８７】
非天然型ヌクレオチドモノマー、修飾ヌクレオチドモノマー、および化学的修飾ヌクレオチドモノマーの例としては、N6−メチルアデノシンヌクレオチドが挙げられる。
【００８８】
非天然型ヌクレオチドモノマー、修飾ヌクレオチドモノマー、および化学的修飾ヌクレオチドモノマーの例としては、修飾塩基の5−(3−アミノ)プロピルウリジン、5−(2−メルカプト)エチルウリジン、5−ブロモウリジン；8−ブロモグアノシン、または７−デアザアデノシンを有するヌクレオチドモノマーが挙げられる。
【００８９】
非天然型ヌクレオチドモノマー、修飾ヌクレオチドモノマー、および化学的修飾ヌクレオチドモノマーの例としては、2’−O−アミノプロピル置換ヌクレオチドが挙げられる。
【００９０】
非天然型ヌクレオチドモノマー、修飾ヌクレオチドモノマー、および化学的修飾ヌクレオチドモノマーの例としては、ヌクレオチドの2’−OH基を2’−R、2’−OR、2’−ハロゲン、2’−SR、または2’−アミノ（ここで、RはH、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり得る）で置換したものが挙げられる。
【００９１】
修飾ヌクレオチドのいくつかの例は、Saenger, Principles of Nucleic Acid Structure, Springer−Verlag, 1984に記載されている。
【００９２】
UNAオリゴマー構造の詳細
【００９３】
本発明のUNAオリゴマーは、鎖状分子である。UNAオリゴマーを二重鎖対とすることができる。したがって、UNAオリゴマーは、二重鎖の第1鎖と、該第1鎖に相補的であるが3個までのミスマッチが起こり得る二重鎖の第2鎖とを有することができる。UNAオリゴマー二重鎖は、オーバーハングを有することができる。
【００９４】
いくつかのUNAオリゴマーは、米国特許第8,314,227号、ならびに米国特許出願公開第20110313020A1号で検討されている。
【００９５】
UNAオリゴマーの標的は、標的核酸とすることができる。いくつかの実施形態において、標的は、対象の任意のTTR  mRNAとすることができる。UNAオリゴマーは、RNA干渉における遺伝子サイレンシングに対して活性であり得る。
【００９６】
UNAオリゴマーは、一緒になって二重鎖をもたらす二本の鎖を含んでよい。二重鎖は、パッセンジャー鎖またはセンス鎖とも呼ばれ得る第１鎖、およびガイド鎖またはアンチセンス鎖とも呼ばれ得る第２鎖により構成され得る。
【００９７】
いくつかの態様において、本発明のUNAオリゴマーは、二重鎖構造の任意の鎖または両方の鎖の任意の位置に、任意の数のホスホロチオエートモノマー間結合を有することができる。
【００９８】
ある特定の実施形態において、本発明のUNAオリゴマーは、任意の鎖のいずれかの末端にて、最後の1つまたは2つのモノマー間にホスホロチオエートモノマー間結合を有することができる。
【００９９】
本発明のUNAオリゴマーの例としては、一般的に相補的である二重鎖対が挙げられる。したがって、例えば配列番号：1は、二重鎖の第1鎖を表すことができ、配列番号：2は、第1鎖に相補的な二重鎖の第2鎖を表すことができる。
【０１００】
例えば、第1鎖の符号「N」は、第2鎖において対応する位置のモノマーに相補的な任意のヌクレオチドを表すことができる。本開示のUNAオリゴマーの例は、2モノマー長のオーバーハングで示されるが、1〜8個またはそれよりも長いモノマーのオーバーハングを使用することができる。
【０１０１】
鎖またはオリゴマーの符号「X」は、UNAモノマーを表す。
【０１０２】
さらに、オリゴマーがUNAモノマーで終結する場合、端末位置は、上記位置ナンバリングによれば、ヌクレオチドの場合の5’−端の代わりに1−端を有するか、または端末位置は、上記位置ナンバリングによれば、ヌクレオチドの場合の3’−端の代わりに3−端を有する。例えば、UNAオリゴマーは、
【０１０３】
【化６】
0006771387.tif 000007
第1鎖上にUNAモノマーの1−端、第1鎖上にUNAモノマーの3−端、第2鎖上にUNAモノマーの3−端、および第2鎖上にヌクレオチド5’−端を有する。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、本発明のUNAオリゴマーは、第1鎖の1−端に1つ以上のUNAモノマー、および第1鎖の3−端に1つ以上のUNAモノマーを有することができる。
【０１０５】
さらなる実施形態において、本発明のUNAオリゴマーは、第2鎖の3−端に1つ以上のUNAモノマーを有することができる。
【０１０６】
ある特定の実施形態において、本発明の二重鎖UNAオリゴマーは、第1鎖の1−端に1つ以上のUNAモノマー、第1鎖の3−端に1つ以上のUNAモノマー、および第2鎖の3−端に1つ以上のUNAモノマーを有することができる。
【０１０７】
本発明のUNAオリゴマーであるオリゴマーは、第1鎖および第2鎖を有し得、各鎖は、独立して19〜23モノマー長である。
【０１０８】
ある特定の実施形態において、本発明のUNAオリゴマーは、19〜23モノマー長である第1鎖を有してよい。
【０１０９】
ある特定の実施形態において、本発明のUNAオリゴマーは、19〜21モノマー長である二重鎖領域を有してよい。
【０１１０】
さらなる実施形態において、本発明のUNAオリゴマーは、19〜23モノマー長である第2鎖を有してよい。
【０１１１】
ある特定の実施形態において、本発明のUNAオリゴマーは、19モノマー長である第1鎖および21モノマー長である第2鎖を有してよい。
【０１１２】
ある特定の実施形態において、本発明のUNAオリゴマーは、20モノマー長である第1鎖および21モノマー長である第2鎖を有してよい。
【０１１３】
ある特定の実施形態において、本発明のUNAオリゴマーは、21モノマー長である第1鎖および21モノマー長である第2鎖を有してよい。
【０１１４】
ある特定の実施形態において、本発明のUNAオリゴマーは、22モノマー長である第1鎖および21モノマー長である第2鎖を有してよい
【０１１５】
別の態様において、UNAオリゴマーは、平滑末端を有してよく、または1つ以上のオーバーハングを有してよい。いくつかの実施形態において、第1鎖および第2鎖は、鎖間で結合オリゴマーと結合して、一末端で結合ループによる二重鎖領域を形成してよい。
【０１１６】
ある特定の実施形態において、オーバーハングは、1〜2モノマー長とすることができる。
【０１１７】
UNAオリゴマーは、細胞中の標的核酸の切断を仲介することができる。いくつかのプロセスにおいて、UNAオリゴマーの第2鎖は、少なくとも一部が標的核酸に相補的であることができるが、標的核酸にハイブリダイズすることができるガイド鎖として作用することができる。
【０１１８】
第2鎖は、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)に組み込むことができる。
【０１１９】
本開示のUNAオリゴマーには、天然に存在する核酸ヌクレオチド、および遺伝子サイレンシング活性と適合性があるその修飾物を含み得る。
【０１２０】
いくつかの態様において、UNAオリゴマーは、遺伝子発現を阻害することができる二本鎖構築物分子である。
【０１２１】
本明細書で使用される場合、用語「鎖」は、モノマーの単一連続鎖であって、任意の数の内部モノマーおよび2つの末端モノマーを有する、鎖のことをいい、ここで各末端モノマーは、一方側の1つの内部モノマーに結合し、他方側のモノマーに結合しないので、各鎖モノマーは鎖を終結する。
【０１２２】
UNAオリゴマーのモノマーは、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ギャップ化結合、および他の変形結合を介して結合し得る。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、UNAオリゴマーは、第1鎖および第2鎖間の相補性におけるミスマッチを含み得る。他の実施形態において、UNAオリゴマーは、1、または2、または3つのミスマッチを有し得る。ミスマッチは、二重鎖領域の任意の位置で起こり得る。
【０１２４】
UNAオリゴマーの標的は、標的遺伝子の標的核酸であり得る。
【０１２５】
UNAオリゴマーは、二重領域外に1つまたは2つのオーバーハングを有してよい。オーバーハングは、第1鎖または第2鎖の末端で不対部分となり得る。第1鎖のオーバーハング部分の長さおよび第2鎖のオーバーハング部分の長さは、同じでも異なってもよい。
【０１２６】
UNAオリゴマーは、少なくとも１つの平滑末端を有してよい。平滑末端は、オーバーハング部分を有さず、平滑末端での二重鎖領域は、第1鎖および第2鎖の両方について、同じ位置で終結する。
【０１２７】
UNAオリゴマーはRISCの長さであり得、これはUNAオリゴマーが25塩基対未満の二重鎖の長さを有することを意味する。
【０１２８】
ある特定の実施形態において、UNAオリゴマーは一本鎖であり得、これはそれ自体の上に折り畳まれてそれ自体にハイブリダイズし、結合ループを有する二本鎖領域を形成する。
【０１２９】
本発明のUNAオリゴマー構造の例を表1に示す。
【０１３０】
【表１】
0006771387.tif 000008
【０１３１】
本発明のUNAオリゴマー構造の例を表２に示す。
【０１３２】
【表２】
0006771387.tif 000009
【０１３３】
ある特定の実施形態において、UNAオリゴマーは二重鎖領域を有してよく、該二重鎖領域内の第2鎖にUNAモノマーを有してよく、ここで第2鎖のUNAモノマーは、第2鎖の5’端から数えて1〜19番目の位置のいずれかに存在する。
【０１３４】
ある特定の実施形態において、UNAオリゴマーは二重鎖領域を有してよく、該二重鎖領域内の第2鎖にUNAモノマーを有してよく、ここで第2鎖のUNAモノマーは、第2鎖の5’端から数えて6、7、14、15および16番目の位置のいずれかに存在する。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、UNAオリゴマーは、第1鎖の3’端に2モノマー長またはそれより長いオーバーハング部分を含んでよく、ここで二重鎖部分に直接隣接するオーバーハングモノマーはUNAモノマーである。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、UNAオリゴマーは、第2鎖の3’端に2モノマー長またはそれより長いオーバーハング部分を含んでよく、ここで二重鎖部分に直接隣接するオーバーハングモノマーはUNAモノマーである。
【０１３７】
アミロイドーシスの治療方法
【０１３８】
本発明の方法には、ヒト対象および哺乳動物の対象におけるTTR関連アミロイドーシスの治療および予防が含まれる。
【０１３９】
本発明の方法において、治療または予防を必要とする対象に有効量のUNAオリゴマーを投与することができる。1、2、もしくは7日まで、または1、2、3、もしくは4週間まで、またはそれ以上投与することができる。
【０１４０】
対象は、ATTRとしても知られるTTR関連アミロイドーシスを有し得る。
【０１４１】
特に、対象はV30M遺伝子を有し得る。本発明の方法は、該対象におけるV30M  TTRを選択的に減少させることができる。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、対照と比較して、対象におけるV30M  TTRを選択的に少なくとも10％減少させることができる。ある特定の実施形態においては、対照と比較して、対象におけるV30M  TTRを少なくとも20%、または30%、または50%減少させることができる。
【０１４３】
本発明のUNAオリゴマーの有効量は、0.001mg/kg〜50.0mg/kgの範囲の用量であることができる。
【０１４４】
本発明の方法において、TTR  mRNA発現を、対象において少なくとも５日間減少させることができる。ある特定の実施形態において、TTR  mRNA発現を、対象において少なくとも10日、または15日間減少させることができる。
【０１４５】
本発明の方法において、対象における末梢神経ニューロパシーまたは自律神経ニューロパシーを軽減させることができる。
【０１４６】
本発明の方法において、対象における末梢神経ニューロパシーまたは自律神経ニューロパシーを軽減させることができる。いくつかの実施形態において、対象は、下肢脱力の軽減、疼痛の軽減、または感覚の向上を経験し得る。本発明の方法により、対象における硝子体混濁の発生を減少させることができる。
【０１４７】
本開示の方法において、UNAオリゴマーの投与により、炎症性応答を生じないことがある。
【０１４８】
さらなる実施形態において、本発明は、細胞をUNAオリゴマーで処理することによる、該細胞におけるTTR遺伝子の発現を阻害する方法を含む。
【０１４９】
追加の実施形態において、本発明は、哺乳動物にUNAオリゴマーを含有する組成物を投与することによる、該哺乳動物おけるTTR遺伝子の発現を阻害する方法を含む。
【０１５０】
医薬組成物
【０１５１】
いくつかの態様において、本発明は、UNAオリゴマーおよび医薬的に許容され得る担体を含有する医薬組成物を提供する。
【０１５２】
医薬組成物は、局所または全身投与することができる。いくつかの態様において、医薬組成物は、あらゆる投与様式とすることができる。ある特定の態様において、投与は、静脈内、皮下、肺、筋肉内、腹腔内、皮膚、経口、または経鼻投与とすることができる。
【０１５３】
本発明の実施形態には、脂質製剤中にUNAオリゴマーを含有する医薬組成物を含む。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、カチオン性脂質、アニオン性脂質、ステロール、ペグ化脂質およびこれらの任意の組み合わせから選択される1つ以上の脂質を含んでよい。
【０１５５】
ある特定の実施形態において、医薬組成物は、実質的にリポソームを含まないとすることができる。
【０１５６】
さらなる態様において、医薬組成物は、リポソームを含むことができる。
【０１５７】
追加の実施形態において、医薬組成物は、ウイルスまたは細菌ベクター内のUNAオリゴマーを含有することができる。
【０１５８】
本開示の医薬組成物は、当技術分野で公知の担体、希釈剤または賦形剤を含んでよい。医薬組成物の例は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.(A. R. Gennaro ed. 1985)に記載される。
【０１５９】
医薬組成物用の賦形剤の例としては、酸化防止剤、懸濁剤、分散剤、防腐剤、緩衝剤、等張化剤、および界面活性剤が挙げられる。
【実施例】
【０１６０】
実施例
【０１６１】
実施例1：図1は、野生型(WT)TTR  mRNAと比較して、ヒトTTR  mRNAのV30M変異における284番目の位置に存在する単一ヌクレオチド多形(SNP)を示す。WT  mRNAに相補的な従来のsiRNAを、284番目の位置の周囲にタイリングした。図2は、HepG2細胞におけるTTRノックダウンで測定されるように、WT  mRNAに相補的な従来のsiRNAが、WT  TTR遺伝子のサイレンシングにおいて制限された活性を有することを示す。5、9、14および15番目の位置は、他の位置よりもサイレンシングに対しより利用可能であるように思われる。図3は、V30M  mRNAに相補的だった従来のsiRNAを、284番目の位置の周囲にタイリングしたことを示す。4種の従来のsiRNAのバリエーション、すなわちV30M−P5、V30M−P9、V30M−P14およびV30M−P15を調製した。また図3に示すように、2つの遺伝子レポーターバリアントのV30VおよびV30Mを調製し、ルシフェラーゼ遺伝子の3’−UTR領域のPSICHECKレポーター系に使用した。ここでV30VおよびV30Mは、各々ヒトTTRの塩基配列264〜304を有し、V30Vは284番目の位置に点突然変異を有さず、V30Mは284番目の位置に点突然変異を有する。
【０１６２】
実施例2：図4は、V30V遺伝子レポーターバリアントおよびV30M遺伝子レポーターバリアントに対してPSICHECKレポーターアッセイで測定されるように、4種の従来のsiRNAのバリエーションであるV30M−P5、V30M−P9、V30M−P14およびV30M−P15の活性を示す。従来のsiRNAのバリエーションであるV30M−P5、V30M−P9およびV30M−P15は、V30VよりV30Mに対してより効果的であった。従来のsiRNAのバリエーションであるV30M−P14は、V30VよりV30Mに対してより効果的でなかった。図5は、V30V遺伝子レポーターバリアントおよびV30M遺伝子レポーターバリアントに対してPSICHECKレポーターアッセイで測定した4種の従来のsiRNAのバリエーションであるV30M−P5、V30M−P9、V30M−P14およびV30M−P15についてのIC50分析を示す。従来のV30M−P15バリアントは、V30VよりV30Mに対して5.6倍さらに効果的であった。したがって、V30VよりもV30Mに対する従来のsiRNAの選択率は、5.6以下であった。
【０１６３】
実施例3：図6は、PSICHECKレポーターアッセイで測定されるように、V30M  TTRのサイレンシングに効果的であったUNAオリゴマーの構造を示す。UNAオリゴマーの各実施形態のP15U6、P15U7、P15U14、P15U15およびP15U16は、4種のUNAモノマーを含有した。各UNAオリゴマーにおいて、第1UNAモノマーは第1鎖の5’端に位置し、パッセンジャー鎖とも呼ばれた。各UNAオリゴマーにおいて、ガイド鎖とも呼ばれる第2鎖は、第1鎖とともに19モノマー長の二重鎖領域を形成した。各UNAオリゴマーは、19個のモノマーの二重鎖領域と、各末端に2個のモノマーのオーバーハングを有した。各UNAオリゴマーにおいて、第2UNAモノマーは、オーバーハング部分中の第1鎖の3’端、20番目に位置した。各UNAオリゴマーにおいて、第3UNAモノマーは、オーバーハング部分中の第2鎖の3’端、20番目に位置した。UNAオリゴマーの実施形態のP15U6、P15U7、P15U14、P15U15およびP15U16において、第4UNAモノマーは、第2鎖の5’端から数えて、第2鎖の6、7、14、15および16番目にそれぞれ位置した。
【０１６４】
実施例4：図7は、従来のsiRNA  V30M−P15と比較して、V30V遺伝子レポーターバリアントおよびV30M遺伝子レポーターバリアントに対するPSICHECKレポーターアッセイで測定したUNAオリゴマーであるP15U6、P15U7、P15U15およびP15U16の活性を示す。UNAオリゴマーの各実施形態であるP15U6、P15U7、P15U15およびP15U16について、UNAオリゴマーは、V30VよりV30Mに対してより効果的であった。驚くべきことに、UNAオリゴマーであるP15U6の活性は、従来のsiRNA  V30M−P15の活性よりも実質的かつ有利に優れていた（各々は、V30Mを標的とする）。また図7は、UNAオリゴマーであるP15U6、P15U7、P15U15およびP15U16のV30VよりもV30Mに対する選択率が、従来のsiRNA  V30M−P15に対してよりも実質的に大きかったという驚くべきかつ予期しない結果を示す。特に、V30VよりもV30Mに対するUNAオリゴマーであるP15U6の選択率は24であり、これは、V30M(37.6  pM)に対するUNAオリゴマーであるP15U6のIC50が、V30V(919.9  pM)に対するUNAオリゴマーであるP15U6のIC50より24倍低かったことを意味する。この選択率は、有利なことに、従来のsiRNAによって示される5.6の選択率より４倍優れていた。
【０１６５】
実施例5：図8は、PSICHECKレポーターアッセイで測定されるように、V30M  TTRのサイレンシングに効果的であったUNAオリゴマーの構造を示す。UNAオリゴマーの各実施形態のP16U6、P16U7、P16U15、P16U16およびP16U17は、4種のUNAモノマーを含有した。各UNAオリゴマーにおいて、第1UNAモノマーは第1鎖の5’端に位置し、パッセンジャー鎖とも呼ばれた。各UNAオリゴマーにおいて、ガイド鎖とも呼ばれる第2鎖は、第1鎖とともに19モノマー長の二重鎖領域を形成した。各UNAオリゴマーは、19個のモノマーの二重鎖領域と、各末端に2個のモノマーのオーバーハングを有した。各UNAオリゴマーにおいて、第2UNAモノマーは、オーバーハング部分中の第1鎖の3’端、20番目に位置した。各UNAオリゴマーにおいて、第3UNAモノマーは、オーバーハング部分中の第2鎖の3’端、20番目に位置した。UNAオリゴマーの実施形態のP16U6、P16U7、P16U15、P16U16およびP16U17において、第4UNAモノマーは、第2鎖の5’端から数えて、第2鎖の6、7、15、16および17番目にそれぞれ位置した。
【０１６６】
実施例6：図9は、従来のsiRNA  V30M−P16と比較して、V30V遺伝子レポーターバリアントおよびV30M遺伝子レポーターバリアントに対するPSICHECKレポーターアッセイで測定したUNAオリゴマーであるP16U6、P16U7、P16U15およびP16U16の活性を示す。UNAオリゴマーの各実施形態であるP16U6、P16U7、P16U15およびP16U16について、UNAオリゴマーは、V30VよりV30Mに対してより効果的であった。驚くべきことに、UNAオリゴマーであるP16U6、P16U7、P16U15およびP16U16のそれぞれの活性は、従来のsiRNA  V30M−P16の活性よりも実質的かつ有利に優れていた（各々は、V30Mを標的とする）。また図9は、UNAオリゴマーであるP16U6、P16U7、P16U15およびP16U16のV30VよりもV30Mに対する選択率が、従来のsiRNA  V30M−P16に対してよりも実質的に大きかったという驚くべきかつ予期しない結果を示す。特に、V30VよりもV30Mに対するUNAオリゴマーであるP16U6の選択率は23であり、これは、V30M(92.4  pM)に対するUNAオリゴマーであるP16U6のIC50が、V30V(2119  pM)に対するUNAオリゴマーであるP16U6のIC50より23倍低かったことを意味する。この選択率は、有利なことに、従来のsiRNAによって示される5.6の選択率より４倍優れていた。
【０１６７】
図10（左）は、V30VよりもV30Mに対するUNAオリゴマーP15U6の選択率を示す。V30M(37.6  pM)に対するUNAオリゴマーであるP15U6のIC50が、V30V(919.9  pM)に対するUNAオリゴマーであるP15U6のIC50より24倍低かった。この選択率は、有利なことに、従来のsiRNAによって示される5.6の選択率より４倍優れていた。図10（右）は、V30M(92.4  pM)に対するUNAオリゴマーであるP16U6のIC50が、V30V(2119  pM)に対するUNAオリゴマーであるP16U6のIC50より23倍低かったという驚くべきかつ予期しない結果を示す。この選択率は、有利なことに、従来のsiRNAによって示される5.6の選択率より４倍優れていた。
【０１６８】
実施例7：UNAオリゴマーは、インビボでのV30M  TTR沈着を減少させる。
ヒトTTR  V30Mを過剰発現させたトランスジェニックマウスを、6ヶ月齢で使用する。TTR野生型マウスおよびTTRノックアウトマウスを、対照として使用する。動物を制御された環境に収容し、ケタミンおよびメデトミジンで安楽死させる。
【０１６９】
TTR遺伝子サイレンシングについて、TTR  UNAオリゴマー、ならびに対照をリポソーム製剤に送達する。マウスに、TTR  UNAオリゴマー(n=6)を1mg/kgの濃度で尾静脈注射する。未処置の同齢対照を、ブランク製剤で処置する。1週間につき1回の注射を4週間にわたって行い、動物を、最後の注射後48時間に屠殺する。肝臓および結腸を除去し、10%ホルマリンに回収して凍結する。
【０１７０】
肝臓および結腸mRNAを、フェノール抽出(Invitrogen社)を用いて単離する。V30Mマウス由来の坐骨神経を他の組織から切り離し、mRNAをRNeasy Mini column(Qiagen)で抽出する。cDNAを、SuperScript double−stranded cDNA Kit(Invitrogen)で合成する。抽出したRNAをExperion RNA StdSens Analysis Kit(Bio−Rad)で検証する。プライマーおよびiQ Syber Green Super Mix(Bio−Rad)を用いてqPCRを行う。坐骨神経、背根神経節、および上記のように除去して処理したV30M動物由来の結腸を用いて、二重免疫蛍光分析を行う。スチューデントt−検定または一元配置分散分析を用いて比較する。データを、平均値±標準誤差(SEM)として表す。0.05未満のp値は、有意であると考えられる。
【０１７１】
1つ以上のUNAオリゴマーを含有する組成物をV30Mマウスに注射することにより、対照よりも少なくとも90%坐骨神経、背根神経節、および結腸でのV30M  TTR沈着が減少する。
【０１７２】
UNAオリゴマーP15U6、P15U7、P15U15、P15U16のいずれか1つ、またはこれらUNAオリゴマーの任意の組み合わせを含有する組成物をV30Mマウスに注射することにより、対照よりも少なくとも90%坐骨神経、背根神経節、および結腸でのV30M  TTR沈着が減少する。
【０１７３】
本明細書で具体的に言及するすべての刊行物、特許および文献は、あらゆる目的のために参照として援用される。
【０１７４】
本発明は記載される特定の方法論、プロトコル、材料、または試薬に限定されず、変更され得ると理解される。また、本明細書で用いる専門用語は、特定の実施形態を説明する目的のためのもので、本発明の範囲を限定しようとするものではなく、添付の特許請求の範囲に含まれると理解される。
【０１７５】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる単数形「1つ(a)」、「1つ(an)」、および「その(the)」は、他に明確な指示がない限り、複数の対象も含まれることに留意しなければならない。さらに、用語「1つ(a)」（または「1つ(an)」）、「1つ以上(one or more)」、および「少なくとも1つ(at least one)」は、本明細書において互換的に用いられ得る。用語「含む(comprise)」、「含む(comprising)」、「含有する(containing)」、「含む(including)」、および「有する(having)」が互換的に用いられ得ることもまた留意されなければならない。
【０１７６】
さらに詳述されなくとも、当業者は、上記説明に基づいて、本発明を十分利用できると考えられる。したがって、下記特定の実施形態は、単に説明するためのものであり、いずれの残りの開示を制限するものではないと、解されるべきである。
【０１７７】
本明細書に開示される全ての特徴は、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書に開示される個々の特徴は、同様の、等価な、または類似の目的を果たす代替の特徴に置き換えることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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