(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１０〜４５％の二酸化炭素を含有するガスを供給しつつ、配列番号１又は２記載の塩基配列と９８％以上の同一性を有する塩基配列を含有する１８ＳｒＤＮＡを有し、
（ａ）配列番号３〜１３のいずれか記載の塩基配列を含有する１６ＳｒＤＮＡを有する細菌、又は
（ｂ）配列番号３〜１３のいずれか記載の塩基配列と９８％以上の同一性を有する塩基配列を含有する１６ＳｒＤＮＡを有する細菌と共生しているピコクロラム属微細藻類を培養する工程を有する二酸化炭素の固定化方法。
【請求項２】
ピコクロラム属微細藻類がＡｚｉｓｕ−１株又はＡｚｉｓｕ−２株であることを特徴とする請求項１記載の二酸化炭素の固定化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、４０％濃度の二酸化炭素の雰囲気下で生育可能なピコクロラム（Picochlorum）属微細藻類や、かかる微細藻類を用いた二酸化炭素の固定化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微細藻類は光合成を行うことにより微細藻類自身の生命活動に必要な各種有機物を生合成できるという特徴を有している。この微細藻類の特徴を生かして、二酸化炭素（ＣＯ２）を固定化することや、微細藻類で有機物を生合成する研究が行われている。
【０００３】
工業由来の排気ガス（以下、産業ガス）はＣＯ２を含んでおり、中でも火力発電所や製鉄所のガスは１５〜４０％のＣＯ２を含んでいる。定期的に開催される気候変動枠組条約締結国会議ＣＯＰでは、締結国がＣＯ２排出量の削減を目指すこと、削減目標を到達できなかった国は排出権取引により実質的なペナルティを課せられることが検討されている。従って、産業ガスに含まれるＣＯ２の削減は官民挙げての努力目標であり、ＣＯ２の低減あるいは資源化技術の開発が求められている。
【０００４】
他方、温暖化が進む今日であってもＣＯ２は大気中の０．０３％程度であるが、原始地球では大気の主成分であり、３０％程度を占めていたと考えられている。ＣＯ２は有機物の乏しい環境で微細藻類が光合成により増殖するための炭素源となる。この低濃度のＣＯ２に順応した現在の微細藻類種はＣＯ２濃度を２〜３％にするだけで増殖が促進されるが、それ以上の高濃度になると培養液のｐＨ低下等により生育が抑制されはじめる。従って、微細藻類の培養で産業ガスを利用する場合、ＣＯ２が２〜３％程度になるように空気等で希釈したものを通気する必要があり、ＣＯ２の利用という点からは非効率である。
【０００５】
また、屋外で商業スケールの培養を行う場合、厳密な雑菌防除は困難であり、ある程度の野生藻類の混入を覚悟しなければならない。２〜３％のＣＯ２は目的藻類のみならず野生藻類にとっても好適な濃度であることから、野生増殖の増殖をも刺激するリスクを備えている。従って、目的藻類が高濃度ＣＯ２でも生育が抑制されずに増殖できるのであれば、混入した野生藻類が繁殖するリスクも低減でき、屋外培養が成功する可能性が高くなる。
【０００６】
高濃度ＣＯ２でも生育が可能な微細藻類として、例えば５〜６０％の濃度のＣＯ２に耐性を有する微細藻類クロロコックム  ドルシベントラレ  クラノ  エト  チハラ  エスピー  ノブ（Chlorococcum  dorsiventrale  Kurano  et  Chihara  sp.  nov.）株（特許文献１参照）や、Synechocystis属に属する新規微細藻類（特許文献２参照）や、生育至適ＣＯ２濃度が２０〜４０％である微細藻クロレラ  ソロキニアナＨＡＫ−２株（特許文献３参照）が開示されている。特許文献１記載の株は５％、２０％の二酸化炭素分圧下では増殖能力が高いが、４０％の二酸化炭素分圧下では、２０％の二酸化炭素分圧下と比較して１／３程度まで増殖能力が低下するという問題があった。また、特許文献２記載の株はＣＯ２の至適濃度が約１０％であり、ＣＯ２を１０〜２０％程度含有している排ガスを用いる場合には空気と混合させてＣＯ２の濃度が１〜５％程度になるように調整することが必要とされており、二酸化炭素の固定としては非効率的であるという問題があった。さらに、特許文献３記載の株は４０℃という高温環境下で選択された株であり、培養温度が４０℃より低いと増殖そのものが低下するという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平７−５１０５１号公報
【特許文献２】特開平８−５６６４８号公報
【特許文献３】特開平１０−２４８５５３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、４０％の二酸化炭素を含有するガスの雰囲気下で生育可能な微細藻類や、かかる微細藻類を用いた二酸化炭素の固定化方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者ら当初、地球成立の早期の時期から現在まで生存し続けてきた微細藻類種を探索することを研究の目的としてきた。前述のとおり、原始地球の大気ではＣＯ２が主成分であったことから、高濃度のＣＯ２に耐える性質を備えた藻類種は原始大気下で生存していた先祖藻類の痕跡を残しているのではないか、という仮説に基づいて藻類探索を行ってきた。その結果、４０％ＣＯ２ガスを封入した容器内で増殖能力が高い微細藻類を得ることができ、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の［１］〜［１０］に示すとおりのものである。
［１］４０％の二酸化炭素を含有するガスの雰囲気下で増殖可能なピコクロラム（Picochlorum）属微細藻類。
［２］配列番号１又は２記載の塩基配列と９８％以上の同一性を有する塩基配列を含有する１８ＳｒＤＮＡを有することを特徴とする上記［１］記載のピコクロラム属微細藻類。
［３］乾燥菌体あたりのγ−アミノ酪酸含量が３．５ｍｏｌ％以上であることを特徴とする上記［１］又は［２］記載のピコクロラム属微細藻類。
［４］以下の（ａ）又は（ｂ）記載の細菌と共生していることを特徴としている上記［１］〜［３］のいずれか記載のピコクロラム属微細藻類。
（ａ）配列番号３〜１３のいずれか記載の塩基配列を含有する１６ＳｒＤＮＡを有する細菌；
（ｂ）配列番号３〜１３のいずれか記載の塩基配列と９８％以上の同一性を有する塩基配列を含有する１６ＳｒＤＮＡを有する細菌；
［５］Ａｚｉｓｕ−１株又はＡｚｉｓｕ−２株であることを特徴とする上記［１］〜［４］のいずれか記載のピコクロラム属微細藻類。
［６］上記［１］〜［５］のいずれか記載のピコクロラム属微細藻類を含有する飼料。
［７］上記［１］〜［５］のいずれか記載のピコクロラム属微細藻類を含有する食品。
［８］上記［１］〜［５］のいずれか記載のピコクロラム属微細藻類を含有する化粧品。
［９］上記［１］〜［５］のいずれか記載のピコクロラム属微細藻類を培養する工程を有する二酸化炭素の固定化方法。
［１０］０．０２〜６０％の二酸化炭素を含有するガスを供給しつつ培養することを特徴とする上記［９］記載の二酸化炭素の固定化方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のピコクロラム属微細藻類は４０％の二酸化炭素を含有するガスの雰囲気下で増殖可能であり、産業ガス等に含まれるＣＯ2の資源化が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】１８ＳｒＤＮＡ解析によるＡｚｉｓｕ−１株及びＡｚｉｓｕ−２株の系統樹を示す図である。
【図２】Ａｚｉｓｕ−１株（ａ）及びＡｚｉｓｕ−２株（ｂ）の顕微鏡写真を示す図である。
【図３】Ａｚｉｓｕ−１株及びＡｚｉｓｕ−２株の共生細菌の１６ＳｒＤＮＡのＤＧＧＥ解析の結果を示す図である。
【図４】Ａｚｉｓｕ−１株（ａ）及びＡｚｉｓｕ−２株（ｂ）を３週間培養した場合の細胞密度を調べた結果を示す図である。
【図５】Ａｚｉｓｕ−１株、Ａｚｉｓｕ−２株、及び他の微細藻類の菌体に含まれるアミノ酸含量（ｍｏｌ％）を調べた結果を示す図である。
【図６】Ａｚｉｓｕ−１株、Ａｚｉｓｕ−２株、及び他の微細藻類の菌体に含まれるビタミンやカロチノイド含量（ｍｇ／ｋｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌｓ）を調べた結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の微細藻類は、４０％の二酸化炭素を含有するガスの雰囲気下で生育可能なピコクロラム（Picochlorum）属微細藻類であれば特に制限されず、ここで、「４０％の二酸化炭素を含有するガスの雰囲気下で増殖可能」とは、微細藻類を培養する培地上に４０％の二酸化炭素を含有するガスを供給して微細藻類を２週間培養した場合に、培養前と比較して培地中の微細藻類の細胞密度（cells/mL）が向上していることを意味する。培養する培地としては特に制限されないが、土壌の熱水抽出物を最終濃度で１％含む無機培地であることが好ましく、ナトリウムをさらに含有する上記無機培地であることがより好ましく、以下の表１に示す、人工海水（マリンアートＳＦ−１：富田製薬社製）に窒素、リン、ビタミンを補充したＡＳ無機培地がさらに好ましい。また、培養する際のｐＨ、温度、照度としては、ｐＨ８、温度２５℃、培地表面の照度８，０００ｌｕｘを挙げることができる。
【００１４】
【表１】
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【００１５】
本発明の微細藻類としては、配列番号１又は２記載の塩基配列と９８以上、好ましくは９８．５％以上、より好ましくは９９％、さらに好ましくは９９．５％、最も好ましくは９９．８％以上の同一性を有する塩基配列を含有する１８ＳｒＤＮＡを有する微細藻類を挙げることができ、Ａｚｉｓｕ−１株又はＡｚｉｓｕ−２株であることが好ましい。なお、Ａｚｉｓｕ−１株又はＡｚｉｓｕ−２株は生物確認試験の結果、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２丁目５番８号）において技術的理由等によって寄託ができない微生物（通知番号２０１５−０９０５、２０１５−０９０６：通知年月日  ２０１５年１２月２１日）に該当したため、国立大学法人山口大学農学部生物機能科学科（山口県山口市吉田１６７７番地１）に保管されており、一定条件下で分譲可能である。
【００１６】
１８ＳｒＤＮＡ（１８ＳｒＲＮＡ遺伝子をコードするＤＮＡ）の塩基配列は公知の遺伝子工学的手法によって求めることができ、例えば、１８ＳｒＤＮＡを増幅するプライマーセットを用いて、検査対象の株から得られたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応で増幅し、ＤＮＡシーケンサーで塩基配列を決定することによって求めることができる。
【００１７】
本発明の微細藻類としては、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）や、プロリン等の非必須アミノ酸や、バリン（Ｖａｌ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、又はリシン（Ｌｙｓ）等の必須アミノ酸を含有することが好ましい。
【００１８】
本発明の微細藻類がγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を含有する場合、乾燥菌体あたりのγ−アミノ酪酸含量が３．５ｍｏｌ％以上、好ましくは３．８ｍｏｌ％以上、より好ましくは４．０ｍｏｌ％以上の微細藻類を挙げることができる。
【００１９】
本発明の微細藻類がプロリン（Ｐｒｏ）を含有する場合、乾燥菌体あたりのプロリン（Ｐｒｏ）含量が２０ｍｏｌ％以上、好ましくは２３ｍｏｌ％以上の微細藻類を挙げることができる。
【００２０】
上記γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）は抗不安作用等が、プロリン（Ｐｒｏ）はコラーゲンの合成や修復作用等があるといわれていることから栄養価として極めて重要であり、これらを含有する微細藻類は飼料、食品、化粧品等での利用価値が高まる。
【００２１】
本発明の微細藻類がバリン（Ｖａｌ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、又はリシン（Ｌｙｓ）等のヒトの必須アミノ酸を含有する場合、乾燥菌体あたりのバリン（Ｖａｌ）含量が２．０ｍｏｌ％以上、好ましくは２．４ｍｏｌ％以上の微細藻類や、乾燥菌体あたりのメチオニン（Ｍｅｔ）含量が０．５ｍｏｌ％以上、好ましくは０．７ｍｏｌ％以上の微細藻類や、乾燥菌体あたりのイソロイシン（Ｉｌｅ）含量が１．２ｍｏｌ％以上、好ましくは１．５ｍｏｌ％以上の微細藻類や、乾燥菌体あたりのロイシン（Ｌｅｕ）含量が２．２ｍｏｌ％以上、好ましくは２．５ｍｏｌ％以上の微細藻類や、乾燥菌体あたりのフェニルアラニン（Ｐｈｅ）含量が０．８ｍｏｌ％以上、好ましくは１．０ｍｏｌ％以上の微細藻類や、乾燥菌体あたりのヒスチジン（Ｈｉｓ）含量が０．３ｍｏｌ％以上、好ましくは０．４ｍｏｌ％以上の微細藻類や、乾燥菌体あたりのリシン（Ｌｙｓ）含量が２．０ｍｏｌ％以上、好ましくは２．１ｍｏｌ％以上の微細藻類を挙げることができる。さらに好ましくは、乾燥菌体あたりのバリン（ＶＡＬ）含量が２．０ｍｏｌ％以上、メチオニン（Ｍｅｔ）含量が０．５ｍｏｌ％以上、イソロイシン（Ｉｌｅ）含量が１．２ｍｏｌ％以上、ロイシン（Ｌｅｕ）含量が２．２ｍｏｌ％以上、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）含量が０．８ｍｏｌ％以上、ヒスチジン（Ｈｉｓ）含量が０．３ｍｏｌ％以上、かつ、リシン（Ｌｙｓ）含量が２．０ｍｏｌ％以上の微細藻類を挙げることができる。
【００２２】
本発明において、乾燥菌体とは、本件微細藻類を、土壌の熱抽出物を１％含有する無機塩培地で培養後、６，０００ｒｐｍ、１０分で遠心分離し、上澄みを除去したものを−５０℃で凍結乾燥して得られた菌体をいう。
【００２３】
上記乾燥菌体あたりのγ−アミノ酪酸含量、非必須アミノ酸含量、及び必須アミノ酸含量は、例えば、まず、凍結乾燥菌体をＭｉｌｌｉＱ水等で懸濁し、ガラスビーズ、ジルコニアビーズ等を加えて細胞破砕処理し、微量遠心機にかけて上清液を回収し、凍結乾燥する。次に、凍結乾燥した乾個物を塩酸に溶解し、乾固物中のタンパク質をアミノ酸まで加水分解し、市販のアミノ酸分析器で解析することで算出することができる。
【００２４】
このほか、本発明の微細藻類としては、ビタミン類を含有することが好ましく、乾燥菌体あたりのビタミンＢ１含量が８０ｍｇ／ｋｇ以上、好ましくは１００ｍｇ／ｋｇ以上の微細藻類や、乾燥菌体あたりのビタミンＢ３含量が６０ｍｇ／ｋｇ以上、好ましくは７５ｍｇ／ｋｇ以上の微細藻類や、乾燥菌体あたりのビタミンＢ６含量が３０ｍｇ／ｋｇ以上、好ましくは３５ｍｇ／ｋｇ以上の微細藻類や、乾燥菌体あたりのビタミンＢ１２含量が１．５ｍｇ／ｋｇ以上、好ましくは２ｍｇ／ｋｇ以上の微細藻類や、乾燥菌体あたりのビタミンＣ含量が１，０００ｍｇ／ｋｇ以上、好ましくは１，０５０ｍｇ／ｋｇ以上の微細藻類や、乾燥菌体あたりのビタミンＢ１含量が８０ｍｇ／ｋｇ以上、ビタミンＢ３含量が６０ｍｇ／ｋｇ以上、ビタミンＢ６含量が３０ｍｇ／ｋｇ以上、ビタミンＢ１２含量が１．５ｍｇ／ｋｇ以上、かつ、ビタミンＣ含量が１，０００ｍｇ／ｋｇ以上の微細藻類を挙げることができる。
【００２５】
なお、乾燥菌体あたりのビタミン類含量は、例えば、まず、凍結乾燥菌体をＭｉｌｌｉＱ水等で懸濁し、ガラスビーズ、ジルコニアビーズ等を加えて細胞破砕処理し、微量遠心機にかけて上清液を回収し、凍結乾燥する。次に、凍結乾燥した乾個物をリン酸二水素カリウムに溶解し、市販の高速液体クロマトグラフィーで解析することで算出することができる。
【００２６】
加えて、本発明の微細藻類としては、アスタキサンチンを含有することが好ましく、乾燥菌体あたりのアスタキサンチン含量が８０ｍｇ／ｋｇ以上、好ましくは１００ｍｇ／ｋｇ以上の微細藻類を挙げることができる。
【００２７】
なお、乾燥菌体あたりのアスタキサンチン含量は、例えば、まず、凍結乾燥菌体をアセトン／ヘキサン＝３５／６５）等の有機溶剤で懸濁し、ガラスビーズ、ジルコニアビーズ等を加えて細胞破砕処理し、微量遠心機にかけて上清液を回収し、凍結乾燥する。次に、凍結乾燥した乾個物をリン酸二水素カリウムに溶解し、市販の高速液体クロマトグラフィーで解析することで算出することができる。
【００２８】
本発明の微細藻類としては、細菌と共生している微細藻類でもよく、かかる細菌としては、（ａ）配列番号３〜１３のいずれかに示す塩基配列を含有する１６ＳｒＤＮＡを有する細菌や、（ｂ）配列番号３〜１３のいずれかに示す塩基配列と９８以上、好ましくは９８．５％以上、より好ましくは９９％、さらに好ましくは９９．５％、最も好ましくは９９．８％以上の同一性を有する塩基配列を含有する１６ＳｒＤＮＡを有する細菌を挙げることができ、α−プロテオバクテリア（alpha-proteobacteria）、γ−プロテオバクテリア（gamma-proteobacteria）等のプロテオバクテリア、ラブレンジア属（Labrenzia  sp.）、又はディエラ属（Dyella  sp.）細菌を好適に挙げることができる。
【００２９】
本発明の微細藻類に共生している細菌の種類としては、１種以上でも、２種以上でも、３種以上でも、４種以上でも、９種以上でもよい。具体的には、配列番号３に示す塩基配列、又は配列番号３に示す塩基配列と９８％以上の同一性を有する塩基配列を含有する１６ＳｒＤＮＡを有する細菌、配列番号４に示す塩基配列、又は配列番号４に示す塩基配列と９８％以上の同一性を有する塩基配列を含有する１６ＳｒＤＮＡを有する細菌、配列番号５に示す塩基配列、又は配列番号５に示す塩基配列と９８％以上の同一性を有する塩基配列を含有する１６ＳｒＤＮＡを有する細菌、配列番号６に示す塩基配列、又は配列番号６に示す塩基配列と９８％以上の同一性を有する塩基配列を含有する１６ＳｒＤＮＡを有する細菌、配列番号７に示す塩基配列、又は配列番号７に示す塩基配列と９８％以上の同一性を有する塩基配列を含有する１６ＳｒＤＮＡを有する細菌、配列番号８に示す塩基配列、又は配列番号８に示す塩基配列と９８％以上の同一性を有する塩基配列を含有する１６ＳｒＤＮＡを有する細菌、配列番号９に示す塩基配列、又は配列番号９に示す塩基配列と９８％以上の同一性を有する塩基配列を含有する１６ＳｒＤＮＡを有する細菌、配列番号１０に示す塩基配列、又は配列番号１０に示す塩基配列と９８％以上の同一性を有する塩基配列を含有する１６ＳｒＤＮＡを有する細菌、及び、配列番号１３に示す塩基配列、又は配列番号１３に示す塩基配列と９８％以上の同一性を有する塩基配列を含有する１６ＳｒＤＮＡを有する細菌の９種や、配列番号１０に示す塩基配列、又は配列番号１０に示す塩基配列と９８％以上の同一性を有する塩基配列を含有する１６ＳｒＤＮＡを有する細菌、配列番号１１に示す塩基配列、又は配列番号１１に示す塩基配列と９８％以上の同一性を有する塩基配列を含有する１６ＳｒＤＮＡを有する細菌、配列番号１２に示す塩基配列、又は配列番号１２に示す塩基配列と９８％以上の同一性を有する塩基配列を含有する１６ＳｒＤＮＡを有する細菌、及び、配列番号１３に示す塩基配列、又は配列番号１３に示す塩基配列と９８％以上の同一性を有する塩基配列を含有する１６ＳｒＤＮＡを有する細菌の４種を挙げることができる。
【００３０】
これら細菌と共生することで、より高い二酸化炭素濃度を含有するガスの雰囲気下で高い増殖能力を備えることが可能となる。なお、本発明において、「共生」とは微細藻類と細菌が相互関係を持ちながら同所的に生育する状態をいう。
【００３１】
本発明のＣＯ2の固定化方法としては、上記本発明の微細藻類を培養する工程を有するＣＯ2の固定化方法であれば特に制限されず、ＣＯ2を含有するガスを供給しつつ上記本発明の微細藻類を培養する方法や、ＣＯ2が溶存した培地で上記本発明の微細藻類を培養する方法を挙げることができるが、ＣＯ2を含有するガスを供給しつつ上記本発明の微細藻類を培養する方法を好適に挙げることができる。供給するＣＯ2の濃度としては、好ましくは０．０１〜６０％、より好ましくは０．０３〜５５％、さらに好ましくは１〜５０％、最も好ましくは１０〜４５％を挙げることができる。また、上記ガスにおけるＣＯ2以外の成分としては特に制限されず、窒素、酸素、アルゴン、ネオン、ヘリウム、メタン、クリプトン等の空気中に含まれる成分や、一酸化炭素、窒化酸化物、硫黄酸化物、塩化水素、アンモニア等の産業排気ガスに含まれる成分を挙げることができる。なお、上記ＣＯ2を含有するガスとしては、火力発電所、焼却場、鉄工所、自動車等において炭素含有物質を燃焼させて生じたＣＯ2含有ガスや、汚泥処理場等において発酵により生じたＣＯ2含有ガスをそのまま用いてもよく、空気等の他のガスと混合して用いてもよい。
【００３２】
ＣＯ2を含有するガスを供給しつつ培養する方法としては、培地の表面にＣＯ2を含有するガスを供給しつつ培養する方法や、培地中にＣＯ2を含有するガスをバブリングにより通気しつつ培養する方法を挙げることができる。
【００３３】
本発明のＣＯ2の固定化方法において用いる培地としては特に制限されないが、本発明の微細藻類以外の藻類又は細菌の増殖を塩濃度で抑える観点から、海水、好ましくは窒素源とリン源を補充した海水を挙げることができ、さらに、本発明の微細藻類以外の藻類又は細菌の増殖を酸性ｐＨでも抑える観点から、上記海水にＣＯ2を供給して培養液ｐＨを酸性（ｐＨ５−６）にしたものを挙げることができる。
【００３４】
また、本発明のＣＯ2の固定化方法において培養する際の培地のｐＨ条件としては、４．５〜９．０、好ましくは５．０〜８．５、温度条件としては、２２〜２８℃、好ましくは２４〜２６℃、光照射条件としては、培地表面の照度として１，５００〜１２，０００ｌｕｘ、好ましくは４，０００〜９，０００ｌｕｘ、培養時間としては７日〜６０日、好ましくは１０日〜２０日を好適に例示することができ、ＣＯ2を含有するガスを供給している限り、振とう培養、静置培養、撹拌培養、通気培養、又はこれらの組み合わせでもよい。
【００３５】
また、本発明の微細藻類はγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、プロリン、必須アミノ酸、ビタミン類及び／又はアスタキサンチンを含有することから、本発明の微細藻類を培養してγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、プロリン、必須アミノ酸、ビタミン類及び／又はアスタキサンチンを生産することが可能となり、必要に応じて遠心分離法や濾過分離法等により本発明の微細藻類を培地から回収した後、ビーズ法等により細胞を破砕して公知の方法によってγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、プロリン、必須アミノ酸、ビタミン類及び／又はアスタキサンチンを抽出、精製してもよい。
【００３６】
培養した本発明の微細藻類は飼料に含有させることができ、例えば本発明の微細藻類と共に、一般的な飼料に使用されている粗蛋白質、粗灰分、カルシウム、リン等を、給餌する家畜や養殖魚介類の生育状態等に応じて配合して用いることができる。かかる飼料に含有させる本発明の微細藻類は、必要に応じて細胞壁を物理的又は化学的に破壊することができる。
【００３７】
培養した本発明の微細藻類は食品に含有させることができ、該食品としては、栄養補助食品、サプリメント等を挙げることができる。かかる食品に含有させる本発明の微細藻類は、必要に応じて細胞壁を物理的又は化学的に破壊することができる。
【００３８】
培養した本発明の微細藻類は化粧品に含有させることができ、該化粧品としては、クリーム状でも、乳液状でもよく、また入浴剤でもよい。かかる化粧品に含有させる本発明の微細藻類は、必要に応じて細胞壁を物理的又は化学的に破壊することができる。
【実施例１】
【００３９】
（微細藻類の探索）
山口県内の瀬戸内海及び日本海沿岸（合計６箇所）より波打ち際の海水を採集した。採水した海水１Ｌを０．２μｍミリポアフィルターでろ過し、フィルター膜上に溜まった藻体細胞をスパーテルでかきとり、１ｍＬの上記ＡＳ培養液に懸濁した。ポリスチレン製ボトル（２００ｍＬ容）にこの懸濁液１ｍＬと上記ＡＳ培養液５０ｍＬを加え、ボトル内の気相を１００％ＣＯ２で充填して密封した。これを蛍光灯照射下８，０００ｌｕｘ、２５℃で振とう培養し、藻類の増殖有無を観察した。培養期間は４週間であった。なお、ポリスチレンはガス透過性を持つ素材により、無菌条件下でも徐々にＣＯ2が透過し、培養開始時に１００％であったＣＯ2濃度は１週間後に６０％、２週間後に４０％、３週間後に３０％、４週間後に２０％まで低減していた。今回の藻類は４週間目で増殖が視認できたことからボトル内のＣＯ2濃度が２０−３０％程度になった時に生育を開始したと推定される。
【００４０】
１ヶ月後に藻類の増殖が確認された培養ボトルの細胞懸濁液の一部を採集し、段階希釈をして９６孔マイクロプレートに分注し、蛍光灯照射下８，０００ｌｕｘ、２５℃で静置培養した。なお、マイクロプレートは１００％ＣＯ２を充填したポリスチレン製透明コンテナに入れ、水で湿らせたティッシュをプレート脇に置くことでサンプルの蒸発を防ぎつつ１ヶ月培養した。藻類の生育が見られたマイクロウェルから細胞懸濁液を回収した。このようにして得られた懸濁液を顕微鏡で観察したところ、形態学的には１種類に分離されているように見えた。また、懸濁液からＤＮＡを抽出し、１８ＳｒＤＮＡを分析したところ、１種類の藻類に由来する遺伝子配列シグナルが確認できた。他方、後述するＰＣＲ−ＤＧＧＥ法より数種類の細菌に由来する１６ＳｒＤＮＡ部分配列が確認された。このことから、分離された２サンプル（Ａｚｉｓｕ−１株及びＡｚｉｓｕ−２株）は、単藻化はできているが、複数種の細菌種と共生していることがわかった。
【実施例２】
【００４１】
（１８ＳｒＤＮＡ解析）
微細藻類の同定に際して常用される１８ＳｒＤＮＡの解析を以下の方法で行った。上述のＡｚｉｓｕ−１藻液及びＡｚｉｓｕ−２藻液を新鮮な上記ＡＳ培養液（ｐＨ８．０）に接種し、蛍光灯照射下８，０００ｌｕｘ、２５℃で静置培養した。増殖液から各１ｍＬを分取、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃）して藻体沈殿を得た。これを１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）０．２ｍＬで再懸濁し、沸騰水で１０分間煮沸した。煮沸後の試料を氷水で急冷した後、クロロホルム／イソアミルアルコール混合液（２４／１）０．２ｍＬを加えて懸濁し、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃）を行った。遠心分離で生じた水相を分取し、これをＤＮＡ抽出液とした。
【００４２】
ＰＣＲ反応によりＡｚｉｓｕ−１藻液及びＡｚｉｓｕ−２藻液の１８ＳｒＤＮＡの増幅を行った。鋳型として上述のＤＮＡ抽出液、ＤＮＡポリメラーゼにはＫＯＤ  Ｆｘ  Ｎｅｏ（東洋紡社製）を用いた。プライマーは以下のものを用いた。
１８ＳｒＤＮＡ前半：ＮＳ−１（配列番号１４）／ＮＳ−４（配列番号１５）
１８ＳｒＤＮＡ後半：ＮＳ−３（配列番号１６）／Ｐｉｃｏ１７５０ＲＶ（配列番号１７）
【００４３】
ＰＣＲの温度サイクルは９８℃で１０秒、６１℃で３０秒、６８℃で６０秒を４５サイクルで行った。増幅したＰＣＲ産物はBigDye  Direct  Cycle  Sequencing  Kit（Thermofisher社製）を用いてシーケンスサイクル反応を行い、ＤＮＡシーケンサーで配列決定を行った。Ａｚｉｓｕ−１の１８ＳｒＤＮＡの塩基配列を配列番号１に、Ａｚｉｓｕ−２の１８ＳｒＤＮＡの塩基配列を配列番号２に示す。また、得られたＤＮＡ配列はＢＬＡＳＴ解析を行うことで既知藻類種の遺伝子と相同性比較を行うことで、属名を決定した。ClustalWプログラム（ＤＤＢＪ：バージョン２．１）で既知種との系統遺伝学的位置関係を解析し、系統樹を構築した。得られた系統樹を図１に示す。
【００４４】
また、Ａｚｉｓｕ−１株及びＡｚｉｓｕ−２株の顕微鏡観察（×４００）の結果、以下の性質を持つことがわかった。それぞれの顕微鏡写真を図２に示す。
細胞形態：球形、又は、球形に近い楕円形（完全な球形ではない）
細胞サイズ：直径２〜５μｍ程度
運動性：認められない
【００４５】
これらの結果から、Ａｚｉｓｕ−１株及びＡｚｉｓｕ−２株はピコクロラム（Picochlorum）属微細藻類であることが明らかとなった。
【実施例３】
【００４６】
（１６ＳｒＤＮＡのＤＧＧＥ解析）
微細藻類の多くは細菌が共生していることが知られている。そこで、本発明の微細藻類に細菌が共生しているか否かを確認するために、上述のＡｚｉｓｕ−１藻液又はＡｚｉｓｕ−２藻液から得られたＤＮＡ抽出液を鋳型として用いて以下の方法によりＤＧＧＥ解析を行った。
【００４７】
まず、２種類のプライマー（Ｆ９８４ＧＣ：配列番号１８、Ｒ１３７８：配列番号１９）を用いて細菌１６ＳｒＤＮＡのＶ６−８領域を増幅した。The  KOD  Fx  Neo  polymerase  （Toyobo社製）を酵素に用い、９４℃で２分を１サイクル、その後９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び６８℃で３０秒を３４サイクルでＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物をa  Bio-Rad  Dcode  mutation  detection  system（Hercules社製）で電気泳動し、菌種ごとに１６ＳｒＤＮＡ増幅断片を分離した。ゲルは６％  polyacrylamide  gelsを用い、変性剤の濃度勾配は５０−７０％  ５０Ｖ定電圧及び５８℃定温で１８時間泳動した。ゲルはSYBR  Green（Life  Technologies社製）で１６ＳｒＤＮＡ増幅断片を染色し、断片を含むゲル片を個別に切り取って回収した。回収したゲル片を４日間ＴＥバッファに浸して断片を浸出させ、これを鋳型に再度ＰＣＲを行った。この時は次の２種類のプライマー（Ｆ９８４：配列番号２０、Ｒ１３７８：配列番号１９）を用いた。得られた増幅断片はGeneJET  PCR  Purification  Kit  （Thermo  Fisher  Scientific社製）で精製した後、ＤＮＡシーケンサーで分析した。ＤＮＡシークエンスはGenBank、EMBL、及びDDBJ  databases  とthe  BLAST  algorithmで系統解析した。ＰＣＲ産物の電気泳動後の写真を図３に示す。
【００４８】
図３の結果より、Ａｚｉｓｕ−１株には９種類、Ａｚｉｓｕ−２株には４種の細菌が共生していることが明らかとなった。また、その後のＤＮＡシークエンス解析により、Ａｚｉｓｕ−１株に共生する９種の細菌は、１６ＳｒＤＮＡにそれぞれ配列番号３〜１０、１３に示す塩基配列（図３中、バンド１〜８、１１）を含み、Ａｚｉｓｕ−２株に共生する４種の細菌は、１６ＳｒＤＮＡにそれぞれ配列番号１０〜１３に示す塩基配列（図３中、バンド８〜１１）を含むことが明らかとなった。さらに、ＢＬＡＳＴ解析により、配列番号３、８、９に示す塩基配列はproteobacteria（図３中、バンド１、６、７）、配列番号４に示す塩基配列はLabrenzia  sp.（図３中、バンド２）、配列番号５に示す塩基配列はalpha-proteobacteria（図３中、バンド３）、配列番号１０、１２に示す塩基配列はgamma-proteobacteria（図３中、バンド８、１０）、配列番号１３に示す塩基配列はDyella  sp.  （図３中、バンド１１）の１６ＳｒＤＮＡの部分配列であることが明らかとなった。
【実施例４】
【００４９】
（細胞増殖解析）
上記ＡＳ培養液（ｐＨ８）をガラス製ボトル（ＣＯ2非透過）に加えて、Ａｚｉｓｕ−１株又はＡｚｉｓｕ−２株を細胞密度（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）が１×１０６となるように加えて、０．０３％（空気）、２％、２０％、４０％、又は７０％のＣＯ2を含有するガスの雰囲気下で蛍光灯照射下８，０００ｌｕｘ、２５℃で３週間ほど静置培養した。培養開始から１、２、３週間後の細胞密度（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を調べた結果を図４に示す。
【００５０】
図４に示すように、Ａｚｉｓｕ−１株又はＡｚｉｓｕ−２株は２％、２０％、又は４０％のＣＯ2を含有するガスの雰囲気下では、０．０３％のＣＯ2を含有するガスの雰囲気下で培養した場合と比較して細胞密度が飛躍的に増加していた。具体的には、Ａｚｉｓｕ−１株においては、１週間後では、０．０３％の場合に１．７倍であるのに対し、２％の場合に２６倍、２０％の場合に１１５倍、４０％の場合に４５倍、２週間後では、０．０３％の場合に１．８倍であるのに対し、２％の場合に６０倍、２０％の場合に１７５倍、４０％の場合に８７８倍、３週間後では、０．０３％の場合に１．３倍であるのに対し、２％の場合に２０倍、２０％の場合に６８倍、４０％の場合に４８３倍であった。Ａｚｉｓｕ−２株においては、１週間後では、０．０３％の場合に７倍であるのに対し、２％の場合に６０倍、２０％の場合に１７８倍、４０％の場合に２９倍、２週間後では、０．０３％の場合に７倍であるのに対し、２％の場合に８９倍、２０％の場合に２２０倍、４０％の場合に６１５倍、３週間後では、０．０３％の場合に１．９倍であるのに対し、２％の場合に９．５倍、２０％の場合に４９倍、４０％の場合に４７８倍であった。
【００５１】
上記結果から、本発明の微細藻類は高濃度のＣＯ2を含有するガスの雰囲気下で極めて増殖能力が高いことが明らかとなった。換言すれば、本発明の微細藻類は、培養する培地上に４０％の二酸化炭素を含有するガスを供給して１週間、２週間、又は３週間培養した場合に、培養前と比較して培地中の細胞密度が顕著に向上することが明らかとなった。微細藻類は５％程度以上のＣＯ2を含有するガスの雰囲気下では、ｐＨの低下等により増殖が抑制されることが知られており、そのため高濃度のＣＯ2を供給する際には空気等で５％以下に希釈するなどの非効率な作業が必要とされていたが、本発明の微細藻類は上記のように高濃度のＣＯ2を含有するガスの雰囲気下で極めて増殖能力が高いことから、高濃度のＣＯ2を含有するガスをそのまま供給することが可能となる。
【００５２】
なお、従来の高濃度ＣＯ2での生育できる微細藻類というのは、単に２〜５％のＣＯ2環境下でも生育できる微細藻類を意味することが多かったが、本発明の微細藻類は、２０％や４０％、特に２〜３週間培養した場合の４０％のＣＯ2を含有するガスの雰囲気下では、２％のＣＯ2を含有するガスの雰囲気下で培養した場合と比較して増殖能力が同等どころか、むしろ飛躍的に高まっており、単に高濃度ＣＯ2に耐性のある微細藻類というより、高濃度ＣＯ2、特に２０〜４０％のＣＯ2を含有するガスの雰囲気下をより好む藻類ということができる。
【００５３】
また、通常、特定の微細藻類を培養する際に、野生微細藻類等の他の微細藻類や菌類等の雑菌の増殖抑制が必要となる。しかしながら、本発明の微細藻類は、他の上記雑菌の増殖が極めて困難な５％以上のＣＯ2を含有するガスの雰囲気下でも生育可能であることから、５％以上のＣＯ2を含有するガスの雰囲気下では、厳密な雑菌防除が不要となり、雑菌防除に必要な設備や薬剤が不要となるだけでなく、屋外での培養も可能となる。
【実施例５】
【００５４】
（乾燥菌体の成分解析）
本発明の微細藻類は単にＣＯ2だけでなく、培養した微細藻類又はその微細藻類から抽出した成分を飼料、食品、化粧品等への応用が期待される。そこで、本発明の微細藻類のアミノ酸、ビタミン、アスタキサンチン含有量を以下の方法で調べた。
【００５５】
＜アミノ酸解析＞
上記ＡＳ培養液（ｐＨ８）中、１０％のＣＯ2を含有するガスの雰囲気下でＡｚｉｓｕ−１株又はＡｚｉｓｕ−２株を蛍光灯照射下８，０００ｌｕｘ、２５℃で２週間静置培養した後、６，０００ｒｐｍ、１０分で遠心分離し、上澄みを除去したものを−５０℃で凍結乾燥してそれぞれの凍結乾燥菌体を得た。得られた凍結乾燥藻体３０ｍｇを５００μｌのＭｉｌｌｉＱ水に懸濁し、これに０．５ｍｍガラスビースと０．１ｍｍジルコニアビースを５０ｍｇずつ加え、Mini  Bead  Beater-8細胞破砕装置（Biospec社製）で３０秒間細胞破砕処理をした。生じた細胞破砕液を微量遠心機（14,500  rpm,  4℃,  for  5  min）にかけて上清液を回収し、これを凍結乾燥した。乾固物２０ｍｇを２ｍＬの６Ｎ  ＨＣｌに溶解して１４５℃で４時間、窒素雰囲気下で加熱し、乾固物中のタンパク質をアミノ酸まで加水分解した。加水分解物はJLC-500V  アミノ酸分析器  （日本電子社製）で解析し、アミノ酸含量を算出した。結果を図５に示す。図５中、Ａｚｉｓｕ−１株又はＡｚｉｓｕ−２株については上記方法で解析したアミノ酸含量を示す。また、図５中、他の微細藻類のアミノ酸含量の参考として、Chlorella  vulgaris株は次の文献（I.  Maruyama  et  al.,  Hydrobiologia  358  (1997)  133―138）、Scenedesmus  obliquus株は次の文献（E.W.  Becker,  Biotechnol  Adv  25  (2007)  207―210）、Spirulina  platensis株は上記E.W.  Beckerの文献及び次の文献（N.S.  Parmi  et  al.,  Front  Energy  Res  3  (2015)  1-9）、Tetraselmis  suecica、Isochrysis  galbana、Dunaliella  tertiolecta、Nannochloropsis  oculata、及びPavlova  luteri  s株は次の文献（M.R.  Brown,  J  Exp  Marine  Biol  Ecol  145  (1991)  79―99）に記載された、菌体に含まれるアミノ酸含量を記載した。
【００５６】
＜ビタミン解析＞
上記アミノ酸解析と同様にＡｚｉｓｕ−１株又はＡｚｉｓｕ−２株を培養し、凍結乾燥体を得て、ガラスビースとジルコニアビースを用いて細胞破砕処理をし、細胞破砕液を微量遠心機にかけて上清液を回収し、これを凍結乾燥した。乾固物を１ｍＬの５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４に溶解し、Luna  5  μm  C18  column  （Phenomenex社製）を備えたＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ（Shimadzu社製）で濃度測定をし、ビタミン含量を算出した。
【００５７】
＜カロチノイド解析＞
上記アミノ酸解析と同様にＡｚｉｓｕ−１株又はＡｚｉｓｕ−２株を培養し、凍結乾燥体を得た。次に、凍結乾燥藻体３０ｍｇを５００μＬ溶剤（acetone/hexane,  35/65  vol%）に懸濁し、これに０．５ｍｍガラスビースと０．１ｍｍジルコニアビースを５０ｍｇずつ加え、Mini  Bead  Beater-8細胞破砕装置（Biospec社製）で３０秒間細胞破砕処理をした。生じた細胞破砕液を微量遠心機（14,500  rpm,  4℃,  for  5  min）にかけて上清液を回収し、これを凍結乾燥した。乾固物を１ｍＬの５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４に溶解し、Inertsil  ODS-3V（GL  Sciences社製）を備えたＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ（Shimadzu社製）で濃度測定をしてカロチノイド（βカロチン、アスタキサンチン）含量を算出した。上述のビタミン解析結果及びカロチノイド解析の結果を図６に示す。図６中、Ａｚｉｓｕ−１株又はＡｚｉｓｕ−２株については上記方法で解析したビタミン、βカロチン、又はアスタキサンチン含量を示す。また、図６中、他の微細藻類のビタミン、βカロチン、又はアスタキサンチン含量の参考として、Chlorella  vulgaris株は次の文献（L.  Gouveia  et  al.,  Bioresource  Technol  57  (1996)  157―163,  Y.  Panahi  et  al.,  Nutr  Diet  69  (2012)  13―19）、Scenedesmus  obliquus株は次の文献（J.  Burczyk  et  al.,  Planta  151  (1981)  247―250,  E.W.  Becker  et  al.,  Microalgae:  biotechnology  and  microbiology,  pp.  177―195.,  Cambridge  University  Press,  New  York  (1984),  R.  Patnaik  et  al.,  Algal  Res  12  (2015)  328―336）、Spirulina  platensis株は次の文献（上記E.W.  Beckerらの文献、M.  Olaizola  et  al.,  J  Appl  Phycol  2  (1990)  97―104）、Tetraselmis  suecica株は次の文献（S.  Aaronson  et  al.,  Arch  Microbiol  112  (1977)  57―59,  J.  Fabregas  et  al.,  J  Ind  Microbiol  5  (1990)  259―264）、Isochrysis  galbana株は次の文献（上記J.  Fabregasらの文献、R.  Berger  et  al.,  Biochem  Syst  Ecol  5  (1977)  71―75）、Dunaliella  tertiolecta株は次の文献（上記J.  Fabregasらの文献、上記I.  Maruyamaらの文献）、Nannochloropsis  oculata株は次の文献（上記I.  Maruyamaらの文献、L.P.Jr.  Goh  et  al.,  Malays  J  Nutr  15  (2009)  77―86）、Pavlova  pinguis株は次の文献（M.R.  Brown  et  al.,  J  Appl  Phycol  11  (1999)  247―255）、Haematococcus  pluvialisは次の文献（M.  Kobayashi  et  al.,  J  Ferment  Bioeng  71  (1991)  335―339,  R.T.  Lorenz  et  al.,  Naturose  Technical  Bull  060  (1999)）に記載された、菌体に含まれるビタミン、βカロチノイド、又はアスタキサンチン含量を記載した。
【００５８】
図５、６の結果より、本発明の微細藻類は、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、プロリン、及びやヒトを含む動物の必須アミノ酸であるバリン（Ｖａｌ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、リシン（Ｌｙｓ）や、ビタミンＢ１、Ｂ３、Ｂ６、Ｂ１２、Ｃ等のビタミンやアスタキサンチンを多く含有することが明らかとなった。したがって、本発明の微細藻類は健康食品の主成分、天然由来の食品添加物、化粧品成分、家畜・養殖魚の飼料として有用であることが明らかとなった。
【実施例６】
【００５９】
（ＣＯ2固定化量）
培地１ＬあたりのＣＯ2固定化量は、乾燥物の中での炭素の割合を５０％、これにＣＯ2の分子量４４を考慮すると、以下の式で算出することが可能である。
ＣＯ2固定化量（ｍｇ／Ｌ）＝乾燥物（ｍｇ／Ｌ）／２×４４／１２
【００６０】
本発明のＡｚｉｓｕ−１株又はＡｚｉｓｕ−２株を上記ＡＳ培養液１０Ｌ（ｐＨ８）中、１０％のＣＯ2を含有するガスの雰囲気下で、蛍光灯照射下８，０００ｌｕｘ、２５℃で２週間静置培養した後、６，０００ｒｐｍ、１０分で遠心分離し、上澄みを除去したものを−５０℃で乾燥した。その結果、Ａｚｉｓｕ−１株、Ａｚｉｓｕ−２株についてそれぞれ３３ｍｇ／Ｌの乾燥菌体を得た。得られた乾燥藻体を上記ＣＯ2固定化量の算出方法に基づいて計算すると、Ａｚｉｓｕ−１株、Ａｚｉｓｕ−２株についてそれぞれ６０．５ｍｇ／ＬのＣＯ2が固定化されたこととなる。したがって、本発明の微細藻類は火力発電所や製鉄所のような高濃度ＣＯ2を含有するガスのＣＯ2を固定化してＣＯ2排出量の低減や資源化に応用できることが明らかとなった。
【実施例７】
【００６１】
（共生細菌の死滅によるＡｚｉｓｕ−１株又はＡｚｉｓｕ−２株の生育への影響）
共生細菌の影響を調べるため、抗生物質によって処理した場合の生育への影響を調べた。寒天シャーレに１００μg／ｍＬでアンピシリンあるいはクロラムフェニコールを添加してＡｚｉｓｕ−１株又はＡｚｉｓｕ−２株の単離を試みた。その結果、細菌コロニーは生えなかったが、Ａｚｉｓｕ−１株又はＡｚｉｓｕ−２株も生えなくなった。したがって、本発明のＡｚｉｓｕ−１株又はＡｚｉｓｕ−２株の生育において、細菌が共生していることが好ましいことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明の微細藻類は、産業ガスに含まれるＣＯ２の固定化分野、及び産業ガスに含まれるＣＯ２を炭素源としたアミノ酸やビタミン類の生産分野で利用可能である。生産されたアミノ酸やビタミンは健康食品、化粧品、家畜・養殖魚の飼料などに応用が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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