(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型ＥＧＦＲのエクソン３において始まり、そしてエクソン７において終わるインフレーム欠失を含んで成り、アミノ酸９０〜２２１が欠失しており、当該ＥＧＦＲタンパク質が、配列番号：５のアミノ酸配列、又は配列番号：５のアミノ酸配列と９０％を超えて同一であるアミノ酸配列を含んで成る、単離上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）タンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のＥＧＦＲをコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号３または４のヌクレオチド配列を含んで成る、ＥＧＦＲタンパク質をコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１に記載されたＥＧＦＲタンパク質と結合し、野生型ＥＧＦＲタンパク質、及びアミノ酸９０〜２２１が欠失していないＥＧＦＲ変異体と結合しない抗体。
【請求項５】
がんの存在、またはがんの発達への対象のより高い素因を判定するために、ＥＧＦＲタンパク質またはポリヌクレオチドの存在を検出するインビトロの方法であって、請求項１〜３のいずれか１項に記載されたＥＧＦＲタンパク質またはポリヌクレオチドの存在について生体試料を分析する工程を含み、当該ＥＧＦＲタンパク質またはポリヌクレオチドの存在が、がんの存在、またはがんの発達への対象のより高い素因を示す、方法。
【請求項６】
前記がんが、神経系のがん、または上皮がんである、請求項５に記載された方法。
【請求項７】
前記神経系のがんが、膠芽腫または多形性膠芽腫である、請求項６に記載された方法。
【請求項８】
前記上皮がんが、結腸がん、肺がん、前立腺がん、乳がんまたは他の固形腫瘍がんである、請求項６に記載された方法。
【請求項９】
治療計画への対象の応答性を評価するために、ＥＧＦＲタンパク質またはポリヌクレオチドの存在、不存在、または発現のレベルを決定するインビトロの方法であって、対象に由来する生体試料を提供する工程、及び請求項１〜３のいずれか１項に記載されたＥＧＦＲタンパク質またはポリヌクレオチドの存在、不存在、または発現のレベルを決定する工程を含み、当該ＥＧＦＲタンパク質またはポリヌクレオチドの存在、不存在、または発現のレベルが、当該治療計画への対象の応答性を示す、当該方法。
【請求項１０】
前記治療計画が、ＥＧＦＲ阻害剤を含んで成る、請求項９に記載された方法。
【請求項１１】
請求項１に記載されたＥＧＦＲタンパク質に特異的に結合し、野生型ＥＧＦＲタンパク質、及びアミノ酸９０〜２２１が欠失していないＥＧＦＲ変異体と結合しない抗体を含有する、請求項１に記載されたＥＧＦＲタンパク質を発現するがん細胞を標的にするための組成物。
【請求項１２】
前記抗体が、治療剤に共有結合している、請求項１１に記載された組成物。
【請求項１３】
前記治療剤が、化学療法剤、抗がん剤、毒素、ラジオアイソトープ、またはナノ粒子である、請求項１２に記載された組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１３年２月１５日に出願された米国特許仮出願第６１／７６５，５３７号に対し、優先権の利益を主張し、その内容は、参照によりその全内容において本明細書に組み込まれている。
【０００２】
本発明は、一般に新規のＥＧＦＲ変異体、新規のＥＧＦＲ変異体を検出するための方法、及びがんを診断及び治療するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
成長因子及びそれらの受容体は、細胞分裂、増殖及び分化の調節において、重要な役割を果たす。結果として多くの成長因子受容体は、がんにおいて突然変異し、または異常に発現し、成長因子経路の脱調整を引き起こし、そしてがんの特徴である非制御の増殖をもたらす。
【０００４】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、とりわけがんにおいて頻繁に突然変異し、異常に発現し、または誤った調整をする成長因子受容体である。多形性膠芽腫（ＧＢＭ）等の特定のがんでは、５０％までの患者は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ等の腫瘍特異的なＥＧＦＲ変異体を示す。さらにＥＧＦＲの突然変異及び増幅は、近年、がん遺伝子、並びにヒトの固形腫瘍及び上皮腫瘍の進行に関係があるとされ、またより短い生存時間／生存率に相関するとされてきた。したがってＥＧＦＲは、がんの診断及び予後診断のための有益なバイオマーカーをとして現れた。
【０００５】
重要なことに、ＥＧＦＲは、治療の開発に伴い、ＥＧＦＲシグナル変換を取り除くことに向けた抗がん治療の標的にもされてきた。現在、リガンドに仲介されるＥＧＦＲ活性化を妨げる抗体、及びＥＧＦＲキナーゼ活性を阻害する小分子の二つの治療分類が存在する。しかしながら臨床データは、全ての患者がかかる治療に応答するわけでなないことを明らかにし、それは、多様なＥＧＦＲ変異体の腫瘍特異的発現の結果であり得る。ＥＧＦＲｖＩＩＩ変異体は、Ｎ−末端のリガンド結合ドメインの一部を欠く。結果として、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する腫瘍を伴うＧＢＭ患者は、Ｎ−末端リガンド結合ドメインを特異的に標的にする治療に対し、非応答性であることが見出されている。特定のＥＧＦＲ変異体の検出は、特定のＥＧＦＲ標的化治療に対する患者の応答性を予測するための実用性を示した。
【０００６】
したがって多様ながんに関連するＥＧＦＲ変異体の同定は、がんの改良された診断、予後診断、階層化及び／または治療指針を提供するのに有用である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
発明の概要
本発明は、膠芽腫患者において同定された新規のＥＧＦＲ変異体の発見に基づく。本発明は、がんのより正確な診断及びがんの素因についてのがんバイオマーカー、並びにがんを治療するための治療計画を導くバイオマーカーの必要性に向けられる。一般に本発明は、本明細書においてＥＧＦＲｖＶＩと称される新規のＥＧＦＲ変異体を特徴とする。さらに本発明は、がんの診断、予後診断、及び／または治療指針のためのＥＧＦＲ変異体の検出に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、野生型ＥＧＦＲのエクソン３において始まり、そしてエクソン７において終わるインフレーム欠失を含んで成る単離された上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）タンパク質を提供する。一つの観点では、アミノ酸９０〜２２１は、欠失していた。一つの観点では、ＥＧＦＲタンパク質は、配列番号５のアミノ酸配列を含んで成る。
【０００９】
さらに本発明は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供し、ここでアミノ酸９０〜２２１をコードするヌクレオチドは、欠失している。一つの観点では、ポリヌクレオチドは、配列番号３または４のヌクレオチドを含んで成る。
【００１０】
さらに本発明は、本発明のＥＧＦＲタンパク質に結合する抗体を提供する。好適には抗体は、野生型ＥＧＦＲよりも本発明のＥＧＦＲ変異体に対して大きな親和性を有する。より好適には、抗体は、本発明のＥＧＦＲ変異体に結合し、且つ野生型ＥＧＦＲに結合しない。  
【００１１】
さらに本発明は、本発明のＥＧＦＲタンパク質またはポリヌクレオチドの存在について生体試料を分析することを含んで成る、対象におけるがんを診断するための方法を提供し、ここでＥＧＦＲタンパク質またはポリヌクレオチドの存在は、がんの存在、またはがんを発達させる対象のより高い素因を示す。がんは、神経系のがん、または上皮がんである。いくつかの好適な態様では、神経系のがんは、膠芽腫または多形性膠芽腫である。上皮がんは、結腸がん、肺がん、前立腺がん、乳がんまたは他の固形腫瘍がんである。
【００１２】
さらに本発明は、対象由来の生体試料を提供し、そして本発明のＥＧＦＲタンパク質またはポリヌクレオチドの存在、不存在、または発現のレベルを決定することを含んで成る治療計画に対する対象の応答性を評価するための方法を提供し、ここでＥＧＦＲタンパク質またはポリヌクレオチドの存在、不存在、または発現のレベルは、治療計画に対する対象の応答性を示し、ここで治療計画は、ＥＧＦＲ阻害剤を含んで成る。
【００１３】
さらに本発明は、対象由来の生体試料を提供し、本発明のＥＧＦＲタンパク質またはポリヌクレオチドの存在を決定することを含んで成る治療計画を推奨するための方法を提供し、ここでＥＧＦＲタンパク質またはポリヌクレオチドの存在は、ＥＧＦＲ阻害剤を含んで成る治療計画を排除する。
【００１４】
本明細書において発表される任意の方法では、ＥＧＦＲ阻害剤は、小分子、抗体、ヌクレオチド、ＲＮＡ干渉剤であり得る。ＥＧＦＲ阻害剤は、ＥＧＦＲ活性またはｍＲＮＡまたはタンパク質発現を阻害し、または減少させる。ＥＧＦＲ阻害剤の例は、これらに限定されないが、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ商標）、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ商標）、セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ商標）、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ商標）、パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ商標）、バンデタニブ（ＣＡＰＲＥＬＳＡ商標）を含める。ＥＧＦＲ阻害剤の他の例は、リンドペピムト（Ｒｉｎｄｏｐｅｐｉｍｕｔ）（ＣＤＸ−１１０、Ｃｅｌｌｄｅｘ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）等のＥＧＦＲ欠失を標的とするがんワクチンを含める。本発明により使用され得る他の阻害剤は、ＰＡＲＰ１阻害剤である。
【００１５】
ＥＧＦＲ変異体の存在を決定するために本明細書において発表される方法では、ＥＧＦＲ変異体のＲＮＡ、ＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列は、例えば核酸増幅または定量的なリアルタイムＰＣＲにより検出される。ＥＧＦＲ変異体の増幅産物またはレベルは、ＥＧＦＲｖＶＩを発現しない、または野生型ＥＧＦＲを発現する対象から由来する参照試料と比較され得る。参照試料は、癌を有しない対象から由来し得る。他の態様では、参照試料は、早い時点、例えば治療計画の開始前、または癌の診断前での同一の対象から由来し得る。特定の対象に関するＥＧＦＲｖＶＩのレベルにおける変化または存在は、治療の選定または治療効果の評価を支援し得る。
【００１６】
さらに本発明は、ＥＧＦＲｖＶＩ変異体と結合し、またはＥＧＦＲｖＶＩ変異体を認識する化学物質を、それを必要とする対象に投与することを含んで成る、がんを標的にするための方法を提供する。好適には化学物質は、ＥＧＦＲｖＶＩ変異体と結合し、またはＥＧＦＲｖＶＩ変異体を認識するが、野生型ＥＧＦＲには結合せず、または野生型ＥＧＦＲを認識しない。したがって化学物質は、がん細胞を特異的に認識する。いくつかの観点では、化学物質は、治療剤と共有結合的に連結し得る。例えば治療用の化学物質は、化学療法剤、毒素、ラジオアイソトープ、またはナノ粒子であり得る。
【００１７】
本発明は、ＥＧＦＲｖＶＩ変異体の阻害剤を、それを必要とする対象に投与することを含んで成る、がんまたはがんの兆候を治療するための方法をさらに提供する。ＥＧＦＲｖＶＩ阻害剤は、例えば小分子、抗体、またはＲＮＡ干渉剤である。好適にはＥＧＦＲｖＶＩ阻害剤は、ＥＧＦＲ活性またはｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を阻害し、または減少させる。
【００１８】
本発明の多様な観点及び態様は、ここに詳細に説明されるだろう。詳細な修飾は、本発明の範囲から逸脱せずに成され得ることが理解されるだろう。さらに文脈により他に要求されない限り、単数形の用語は複数を含め、且つ複数形の用語は単数を含めるものとする。
【００１９】
特定された全ての特許、特許出願、及び刊行物は、例えば、本発明との関連で使用され得るかかる刊行物において発表される方法論を説明及び開示する目的のために、参照により、本明細書中に明確に組み込まれている。本願の出願日より前のこれらの刊行物は、それらの開示のためだけに提供される。これに関連して、かかる開示が先行するために、先行発明の長所、または任意の他の理由により、本発明者等に権利が付与されない承認として解釈されるべきことは何もない。これらの文書の内容についての日付または説明に関わる全ての陳述は、本出願人に入手可能な情報に基づき、且つこれらの文書の日付または内容の正確性について任意の承認を構成しない。  
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、一人の患者（患者００１）から由来する４ｍＬの脳脊髄液（ＣＳＦ）試料から抽出したＲＮＡ試料の電気泳動図を示す。１８Ｓ及び２８Ｓ  ｒＲＮＡのピークは、ＲＮＡインテグリティナンバー（ＲＩＮ）を作り出すために標識化され、そして使用される。
【図２】図２は、ＱＰＣＲアッセイにおいてテンプレートが使用されることがなかった場合の、ＥＧＦＲアッセイにおける典型的なコントロール試料の電気泳動図を示す。検出される産物はない。
【図３】図３は、ＥＧＦＲＱＰＣＲアッセイにおける、患者００１から由来するＣＳＦ試料から抽出したＲＮＡの電気泳動図を示す。増幅産物は、３９７ｂｐで検出される。
【図４】図４は、配列化されたＥＧＦＲヌクレオチド配列（部分的な配列が示されている）のエクソン３〜７での欠失の概略図を示す。（Ａ）灰色の四角は、欠失を導くエクソン３及び７中で切断点を構成する相同領域を指定する。（Ｂ）本概略図は、ＥＧＦＲ中の選定エクソン：エクソン１（イタリック体）；エクソン２（太字体）；エクソン３の一部（下線部）；エクソン７の一部（太い下線部）；及びエクソン８（太いイタリック体）を表す。
【図５】図５は、全長ＥＧＦＲアミノ酸配列の文脈において、ＥＧＦＲ変異体であるＥＧＦＲｖＩＩＩ及びＥＧＦＲｖＶＩの概略図を示す。灰色の四角は、患者００１において検出、且つ同定されたＥＧＦＲｖＶＩ中で欠失する領域を指定する。下線部の配列は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ中で欠失する領域を指定する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の新規の変異体の発見に基づく。ＥＧＦＲの突然変異及び過剰発現は、肺がん、いくつかの上皮がん、及び多形性膠芽腫を含める多くのがんに関連していることが公知である。一般にがんにおいて見出されるＥＧＦＲｖＩＩＩ変異体等のＥＧＦＲ突然変異は、ＥＧＦＲの構造的な活性化を引き起こし、がんの顕著な特徴である非制御の細胞分裂を引き起こし得る下流のシグナル伝達をもたらす。結果として、ＥＧＦＲの突然変異型の存在は、がんの存在、またはがんのより高い素因を示し得る。さらに近年の治療法は、ＥＧＦＲを標的にするように、特にＥＧＦＲ活性を阻害するように設計されてきた。特定のＥＧＦＲ突然変異を伴うがん患者は、しばしば突然変異したドメインまたは領域の結合または阻害を介して作用するそれらの治療法に非応答性である。したがってＥＧＦＲ突然変異体は、対象ががん、またはがんの高い素因を有するか否かを診断するために、並びにがん患者の特定の治療計画への応答性を決定するために、または治療計画の有効性を決定するために有用である。
【００２２】
ＥＧＦＲ及びがん
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、細胞表面上に存在するＥｒｂＢ（ＨＥＲ及びヒト上皮成長因子受容体としても公知である）シグナル伝達経路における四つの受容体のうちの一つである。さらにＥＧＦＲは、ＥｒｂＢ−１及びＨＥＲ１としても公知である。ＨＥＲファミリーの他のメンバーは、ＥｒｂＢ−２（ＨＥＲ２／ｃ−ｎｅｕ）、ＥｒｂＢ−３（ＨＥＲ３）、及びＥｒｂＢ−４（ＨＥＲ４）を含める。
【００２３】
ＥＧＦＲは、ｃ−ｅｒｂＢ１プロト−がん遺伝子によりコードされ、且つ１７０ｋＤＡの分子量を有する。野生型（ＷＴ）ＥＧＦＲ核酸は、以下のヒトｍＲＮＡ配列：
ＧＴＣＣＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＧＣＧＣＡＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＣＣＣＣＣＧＣＡＣＧＧＴＧＴＧＡＧＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＧＡＧＴＣＣＣＧＡＧＣＴＡＧＣＣＣＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＣＡＧＡＣＣＧＧＡＣＧＡＣＡＧＧＣＣＡＣＣＴＣＧＴＣＧＧＣＧＴＣＣＧＣＣＣＧＡＧＴＣＣＣＣＧＣＣＴＣＧＣＣＧＣＣＡＡＣＧＣＣＡＣＡＡＣＣＡＣＣＧＣＧＣＡＣＧＧＣＣＣＣＣＴＧＡＣＴＣＣＧＴＣＣＡＧＴＡＴＴＧＡＴＣＧＧＧＡＧＡＧＣＣＧＧＡＧＣＧＡＧＣＴＣＴＴＣＧＧＧＧＡＧＣＡＧＣＧＡＴＧＣＧＡＣＣＣＴＣＣＧＧＧＡＣＧＧＣＣＧＧＧＧＣＡＧＣＧＣＴＣＣＴＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＴＧＣＣＣＧＧＣＧＡＧＴＣＧＧＧＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡＧＡＡＡＧＴＴＴＧＣＣＡＡＧＧＣＡＣＧＡＧＴＡＡＣＡＡＧＣＴＣＡＣＧＣＡＧＴＴＧＧＧＣＡＣＴＴＴＴＧＡＡＧＡＴＣＡＴＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＧＡＧＧＡＴＧＴＴＣＡＡＴＡＡＣＴＧＴＧＡＧＧＴＧＧＴＣＣＴＴＧＧＧＡＡＴＴＴＧＧＡＡＡＴＴＡＣＣＴＡＴＧＴＧＣＡＧＡＧＧＡＡＴＴＡＴＧＡＴＣＴＴＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＡＣＣＡＴＣＣＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＧＧＴＴＡＴＧＴＣＣＴＣＡＴＴＧＣＣＣＴＣＡＡＣＡＣＡＧＴＧＧＡＧＣＧＡＡＴＴＣＣＴＴＴＧＧＡＡＡＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＣＡＴＣＡＧＡＧＧＡＡＡＴＡＴＧＴＡＣＴＡＣＧＡＡＡＡＴＴＣＣＴＡＴＧＣＣＴＴＡＧＣＡＧＴＣＴＴＡＴＣＴＡＡＣＴＡＴＧＡＴＧＣＡＡＡＴＡＡＡＡＣＣＧＧＡＣＴＧＡＡＧＧＡＧＣＴＧＣＣＣＡＴＧＡＧＡＡＡＴＴＴＡＣＡＧＧＧＡＣＡＡＡＡＧＴＧＴＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＧＴＣＣＣＡＡＴＧＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＴＧＣＡＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＡＣＴＧＣＣＡＧＡＡＡＣＴＧＡＣＣＡＡＡＡＴＣＡＴＣＴＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＴＧＣＴＣＣＧＧＧＣＧＣＴＧＣＣＧＴＧＧＣＡＡＧＴＣＣＣＣＣＡＧＴＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＡＣＡＡＣＣＡＧＴＧＴＧＣＴＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＣＡＧＧＣＣＣＣＣＧＧＧＡＧＡＧＣＧＡＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＴＧＣＣＧＣＡＡＡＴＴＣＣＧＡＧＡＣＧＡＡＧＣＣＡＣＧＴＧＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＡＣＴＣＡＴＧＣＴＣＴＡＣＡＡＣＣＣＣＡＣＣＡＣＧＴＡＣＣＡＧＡＴＧＧＡＴＧＴＧＡＡＣＣＣＣＧＡＧＧＧＣＡＡＡＴＡＣＡＧＣＴＴＴＧＧＴＧＣＣＡＣＣＴＧＣＧＴＧＡＡＧＡＡＧＴＧＴＣＣＣＣＧＴＡＡＴＴＡＴＧＴＧＧＴＧＡＣＡＧＡＴＣＡＣＧＧＣＴＣＧＴＧＣＧＴＣＣＧＡＧＣＣＴＧＴＧＧＧＧＣＣＧＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＧＡＴＧＧＡＧＧＡＡＧＡＣＧＧＣＧＴＣＣＧＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＡＡＧＴＧＣＧＡＡＧＧＧＣＣＴＴＧＣＣＧＣＡＡＡＧＴＧＴＧＴＡＡＣＧＧＡＡＴＡＧＧＴＡＴＴＧＧＴＧＡＡＴＴＴＡＡＡＧＡＣＴＣＡＣＴＣＴＣＣＡＴＡＡＡＴＧＣＴＡＣＧＡＡＴＡＴＴＡＡＡＣＡＣＴＴＣＡＡＡＡＡＣＴＧＣＡＣＣＴＣＣＡＴＣＡＧＴＧＧＣＧＡＴＣＴＣＣＡＣＡＴＣＣＴＧＣＣＧＧＴＧＧＣＡＴＴＴＡＧＧＧＧＴＧＡＣＴＣＣＴＴＣＡＣＡＣＡＴＡＣＴＣＣＴＣＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＡＣＴＧＧＡＴＡＴＴＣＴＧＡＡＡＡＣＣＧＴＡＡＡＧＧＡＡＡＴＣＡＣＡＧＧＧＴＴＴＴＴＧＣＴＧＡＴＴＣＡＧＧＣＴＴＧＧＣＣＴＧＡＡＡＡＣＡＧＧＡＣＧＧＡＣＣＴＣＣＡＴＧＣＣＴＴＴＧＡＧＡＡＣＣＴＡＧＡＡＡＴＣＡＴＡＣＧＣＧＧＣＡＧＧＡＣＣＡＡＧＣＡＡＣＡＴＧＧＴＣＡＧＴＴＴＴＣＴＣＴＴＧＣＡＧＴＣＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＡＣＡＴＡＡＣＡＴＣＣＴＴＧＧＧＡＴＴＡＣＧＣＴＣＣＣＴＣＡＡＧＧＡＧＡＴＡＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＡＴＧＴＧＡＴＡＡＴＴＴＣＡＧＧＡＡＡＣＡＡＡＡＡＴＴＴＧＴＧＣＴＡＴＧＣＡＡＡＴＡＣＡＡＴＡＡＡＣＴＧＧＡＡＡＡＡＡＣＴＧＴＴＴＧＧＧＡＣＣＴＣＣＧＧＴＣＡＧＡＡＡＡＣＣＡＡＡＡＴＴＡＴＡＡＧＣＡＡＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＡＣＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＡＧＧＴＣＴＧＣＣＡＴＧＣＣＴＴＧＴＧＣＴＣＣＣＣＣＧＡＧＧＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＣＣＣＧＧＡＧＣＣＣＡＧＧＧＡＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＴＧＣＣＧＧＡＡＴＧＴＣＡＧＣＣＧＡＧＧＣＡＧＧＧＡＡＴＧＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＣＣＴＴＣＴＧＧＡＧＧＧＴＧＡＧＣＣＡＡＧＧＧＡＧＴＴＴＧＴＧＧＡＧＡＡＣＴＣＴＧＡＧＴＧＣＡＴＡＣＡＧＴＧＣＣＡＣＣＣＡＧＡＧＴＧＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＧＣＣＡＴＧＡＡＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＣＡＧＧＡＣＧＧＧＧＡＣＣＡＧＡＣＡＡＣＴＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＴＧＣＣＣＡＣＴＡＣＡＴＴＧＡＣＧＧＣＣＣＣＣＡＣＴＧＣＧＴＣＡＡＧＡＣＣＴＧＣＣＣＧＧＣＡＧＧＡＧＴＣＡＴＧＧＧＡＧＡＡＡＡＣＡＡＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＴＧＧＡＡＧＴＡＣＧＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＴＧＴＧＣＣＡＣＣＴＧＴＧＣＣＡＴＣＣＡＡＡＣＴＧＣＡＣＣＴＡＣＧＧＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＣＣＡＧＧＴＣＴＴＧＡＡＧＧＣＴＧＴＣＣＡＡＣＧＡＡＴＧＧＧＣＣＴＡＡＧＡＴＣＣＣＧＴＣＣＡＴＣＧＣＣＡＣＴＧＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＧＧＣＣＣＴＣＣＴＣＴＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＣＴＧＧＧＧＡＴＣＧＧＣＣＴＣＴＴＣＡＴＧＣＧＡＡＧＧＣＧＣＣＡＣＡＴＣＧＴＴＣＧＧＡＡＧＣＧＣＡＣＧＣＴＧＣＧＧＡＧＧＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＣＴＴＧＴＧＧＡＧＣＣＴＣＴＴＡＣＡＣＣＣＡＧＴＧＧＡＧＡＡＧＣＴＣＣＣＡＡＣＣＡＡＧＣＴＣＴＣＴＴＧＡＧＧＡＴＣＴＴＧＡＡＧＧＡＡＡＣＴＧＡＡＴＴＣＡＡＡＡＡＧＡＴＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＣＧＴＴＣＧＧＣＡＣＧＧＴＧＴＡＴＡＡＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＡＧＡＡＧＧＴＧＡＧＡＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＴＣＣＣＧＴＣＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＡＡＴＴＡＡＧＡＧＡＡＧＣＡＡＣＡＴＣＴＣＣＧＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＧＧＡＡＡＴＣＣＴＣＧＡＴＧＡＡＧＣＣＴＡＣＧＴＧＡＴＧＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＡＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＧＴＧＴＧＣＣＧＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＣＡＣＧＣＡＧＣＴＣＡＴＧＣＣＣＴＴＣＧＧＣＴＧＣＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴＡＴＧＴＣＣＧＧＧＡＡＣＡＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＡＴＴＧＧＣＴＣＣＣＡＧＴＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＧＣＡＧＡＴＣＧＣＡＡＡＧＧＧＣＡＴＧＡＡＣＴＡＣＴＴＧＧＡＧＧＡＣＣＧＴＣＧＣＴＴＧＧＴＧＣＡＣＣＧＣＧＡＣＣＴＧＧＣＡＧＣＣＡＧＧＡＡＣＧＴＡＣＴＧＧＴＧＡＡＡＡＣＡＣＣＧＣＡＧＣＡＴＧＴＣＡＡＧＡＴＣＡＣＡＧＡＴＴＴＴＧＧＧＣＴＧＧＣＣＡＡＡＣＴＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＡＡＡＧＴＧＣＣＴＡＴＣＡＡＧＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＡＡＴＴＴＴＡＣＡＣＡＧＡＡＴＣＴＡＴＡＣＣＣＡＣＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＡＣＧＧＧＧＴＧＡＣＣＧＴＴＴＧＧＧＡＧＴＴＧＡＴＧＡＣＣＴＴＴＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＣＡＴＡＴＧＡＣＧＧＡＡＴＣＣＣＴＧＣＣＡＧＣＧＡＧＡＴＣＴＣＣＴＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＡＡＡＧＧＡＧＡＡＣＧＣＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＣＡＣＣＣＡＴＡＴＧＴＡＣＣＡＴＣＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＡＧＴＧＣＴＧＧＡＴＧＡＴＡＧＡＣＧＣＡＧＡＴＡＧＴＣＧＣＣＣＡＡＡＧＴＴＣＣＧＴＧＡＧＴＴＧＡＴＣＡＴＣＧＡＡＴＴＣＴＣＣＡＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＡＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＣＡＴＴＣＡＧＧＧＧＧＡＴＧＡＡＡＧＡＡＴＧＣＡＴＴＴＧＣＣＡＡＧＴＣＣＴＡＣＡＧＡＣＴＣＣＡＡＣＴＴＣＴＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＧＡＴＧＧＡＴＧＡＡＧＡＡＧＡＣＡＴＧＧＡＣＧＡＣＧＴＧＧＴＧＧＡＴＧＣＣＧＡＣＧＡＧＴＡＣＣＴＣＡＴＣＣＣＡＣＡＧＣＡＧＧＧＣＴＴＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＣＣＣＴＣＣＡＣＧＴＣＡＣＧＧＡＣＴＣＣＣＣＴＣＣＴＧＡＧＣＴＣＴＣＴＧＡＧＴＧＣＡＡＣＣＡＧＣＡＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＣＧＴＧＧＣＴＴＧＣＡＴＴＧＡＴＡＧＡＡＡＴＧＧＧＣＴＧＣＡＡＡＧＣＴＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＣＡＧＣＴＴＣＴＴＧＣＡＧＣＧＡＴＡＣＡＧＣＴＣＡＧＡＣＣＣＣＡＣＡＧＧＣＧＣＣＴＴＧＡＣＴＧＡＧＧＡＣＡＧＣＡＴＡＧＡＣＧＡＣＡＣＣＴＴＣＣＴＣＣＣＡＧＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＧＴＧＧＣＴＴＧＴＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＣＡＡＣＣＴＣＣＴＣＧＡＣＣＣＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＴＧＴＣＣＡＡＧＣＣＡＧＧＴＧＣＴＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＧＧＧＧＡＡＡＣＡＧＴＧＧＣＡＧＡＴＴＴＧＣＡＧＡＣＡＣＡＧＴＧＡＡＧＧＧＣＧＴＡＡＧＧＡＧＣＡＧＡＴＡＡＡＣＡＣＡＴＧＡＣＣＧＡＧＣＣＴＧＣＡＣＡＡＧＣＴＣＴＴＴＧＴＴＧＴＧＴＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＧＣＴＧＴＡＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＡＡＧＡＡＴＧＡＡＴＣＴＧＣＡＡＡＡＴＴＴＣＴＡＧＣＴＴＡＴＧＡＡＧＣＡＡＡＴＣＡＣＧＧＡＣＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴＧＴＡＴＧＴＧＴＧＡＧＴＧＴＴＣＡＴＧＡＴＧＴＧＴＧＴＡＣＡＴＣＴＧＴＧＴＡＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＡＴＧＴＧＴＧＴＧＴＴＴＧＴＧＡＣＡＧＡＴＴＴＧＡＴＣＣＣＴＧＴＴＣＴＣＴＣＴＧＣＴＧＧＣＴＣＴＡＴＣＴＴＧＡＣＣＴＧＴＧＡＡＡＣＧＴＡＴＡＴＴＴＡＡＣＴＡＡＴＴＡＡＡＴＡＴＴＡＧＴＴＡＡＴＡＴＴＡＡＴＡＡＡＴＴＴＴＡＡＧＣＴＴＴＡＴＣＣＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
によりコードされ得る（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＢＣ０９４７６１．１）（配列番号：１）。
【００２４】
野生型ＥＧＦＲタンパク質は、以下のヒトアミノ酸配列：
ＭＲＰＳＧＴＡＧＡＡＬＬＡＬＬＡＡＬＣＰＡＳＲＡＬＥＥＫＫＶＣＱＧＴＳＮＫＬＴＱＬＧＴＦＥＤＨＦＬＳＬＱＲＭＦＮＮＣＥＶＶＬＧＮＬＥＩＴＹＶＱＲＮＹＤＬＳＦＬＫＴＩＱＥＶＡＧＹＶＬＩＡＬＮＴＶＥＲＩＰＬＥＮＬＱＩＩＲＧＮＭＹＹＥＮＳＹＡＬＡＶＬＳＮＹＤＡＮＫＴＧＬＫＥＬＰＭＲＮＬＱＧＱＫＣＤＰＳＣＰＮＧＳＣＷＧＡＧＥＥＮＣＱＫＬＴＫＩＩＣＡＱＱＣＳＧＲＣＲＧＫＳＰＳＤＣＣＨＮＱＣＡＡＧＣＴＧＰＲＥＳＤＣＬＶＣＲＫＦＲＤＥＡＴＣＫＤＴＣＰＰＬＭＬＹＮＰＴＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧＫＹＳＦＧＡＴＣＶＫＫＣＰＲＮＹＶＶＴＤＨＧＳＣＶＲＡＣＧＡＤＳＹＥＭＥＥＤＧＶＲＫＣＫＫＣＥＧＰＣＲＫＶＣＮＧＩＧＩＧＥＦＫＤＳＬＳＩＮＡＴＮＩＫＨＦＫＮＣＴＳＩＳＧＤＬＨＩＬＰＶＡＦＲＧＤＳＦＴＨＴＰＰＬＤＰＱＥＬＤＩＬＫＴＶＫＥＩＴＧＦＬＬＩＱＡＷＰＥＮＲＴＤＬＨＡＦＥＮＬＥＩＩＲＧＲＴＫＱＨＧＱＦＳＬＡＶＶＳＬＮＩＴＳＬＧＬＲＳＬＫＥＩＳＤＧＤＶＩＩＳＧＮＫＮＬＣＹＡＮＴＩＮＷＫＫＬＦＧＴＳＧＱＫＴＫＩＩＳＮＲＧＥＮＳＣＫＡＴＧＱＶＣＨＡＬＣＳＰＥＧＣＷＧＰＥＰＲＤＣＶＳＣＲＮＶＳＲＧＲＥＣＶＤＫＣＮＬＬＥＧＥＰＲＥＦＶＥＮＳＥＣＩＱＣＨＰＥＣＬＰＱＡＭＮＩＴＣＴＧＲＧＰＤＮＣＩＱＣＡＨＹＩＤＧＰＨＣＶＫＴＣＰＡＧＶＭＧＥＮＮＴＬＶＷＫＹＡＤＡＧＨＶＣＨＬＣＨＰＮＣＴＹＧＣＴＧＰＧＬＥＧＣＰＴＮＧＰＫＩＰＳＩＡＴＧＭＶＧＡＬＬＬＬＬＶＶＡＬＧＩＧＬＦＭＲＲＲＨＩＶＲＫＲＴＬＲＲＬＬＱＥＲＥＬＶＥＰＬＴＰＳＧＥＡＰＮＱＡＬＬＲＩＬＫＥＴＥＦＫＫＩＫＶＬＧＳＧＡＦＧＴＶＹＫＧＬＷＩＰＥＧＥＫＶＫＩＰＶＡＩＫＥＬＲＥＡＴＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＳＶＤＮＰＨＶＣＲＬＬＧＩＣＬＴＳＴＶＱＬＩＴＱＬＭＰＦＧＣＬＬＤＹＶＲＥＨＫＤＮＩＧＳＱＹＬＬＮＷＣＶＱＩＡＫＧＭＮＹＬＥＤＲＲＬＶＨＲＤＬＡＡＲＮＶＬＶＫＴＰＱＨＶＫＩＴＤＦＧＬＡＫＬＬＧＡＥＥＫＥＹＨＡＥＧＧＫＶＰＩＫＷＭＡＬＥＳＩＬＨＲＩＹＴＨＱＳＤＶＷＳＹＧＶＴＶＷＥＬＭＴＦＧＳＫＰＹＤＧＩＰＡＳＥＩＳＳＩＬＥＫＧＥＲＬＰＱＰＰＩＣＴＩＤＶＹＭＩＭＶＫＣＷＭＩＤＡＤＳＲＰＫＦＲＥＬＩＩＥＦＳＫＭＡＲＤＰＱＲＹＬＶＩＱＧＤＥＲＭＨＬＰＳＰＴＤＳＮＦＹＲＡＬＭＤＥＥＤＭＤＤＶＶＤＡＤＥＹＬＩＰＱＱＧＦＦＳＳＰＳＴＳＲＴＰＬＬＳＳＬＳＡＴＳＮＮＳＴＶＡＣＩＤＲＮＧＬＱＳＣＰＩＫＥＤＳＦＬＱＲＹＳＳＤＰＴＧＡＬＴＥＤＳＩＤＤＴＦＬＰＶＰＧＥＷＬＶＷＫＱＳＣＳＳＴＳＳＴＨＳＡＡＡＳＬＱＣＰＳＱＶＬＰＰＡＳＰＥＧＥＴＶＡＤＬＱＴＱ
によりコードされ得る（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＡＡＨ９４７６１．１）（配列番号：２）。
【００２５】
多様なＥＧＦＲ変異体をコードする多数の前駆体アイソフォーム及び選択的にスプライスされた転写変異体は、同定されている。ＥＧＦＲの多数の前駆体アイソフォームの核酸及びポリペプチド配列は、例えばアイソフォームＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  受け入れ番号  ＮＭ＿００５２２８．３及びＮＰ＿００５２１９．２）、アイソフォームＢ（ＮＭ＿２０１２８２．１及びＮＰ＿９５８４３９．１）、アイソフォームＣ（ＮＭ＿２０１２８３．１及びＮＰ＿９５８４４０．１）及びアイソフォームＤ（ＮＭ＿２０１２８４．１及びＮＰ＿９５８４４１．１）等のように、当業界において公知である。本発明は、エクソン３内部に始まり、エクソン７内部までに欠失を有することにより、エクソン３の一部、エクソン４〜６の全て、及びエクソン７の一部を欠失するＥＧＦＲ変異体を特徴とする。欠失は、好適には野生型ＥＧＦＲのアミノ酸９０〜２２１の欠失である。
【００２６】
ＥＧＦＲ及び他のＨＥＲ受容体は、受容体チロシンキナーゼであり、且つその特異的なリガンドの結合を介して活性化される。ＥＧＦＲリガンドは、当業界において公知であり、且つＥＧＦ（上皮成長因子）、ＴＧＦ−α（形質転換成長因子α）、ＨＢ−ＥＧＦ（ヘパリン−結合ＥＧＦ−様成長因子）、アンフィレグリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）（ＡＲ）、ベタセルリン（ｂｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎ）（ＢＴＣ）、エピジェン（ｅｐｉｇｅｎ）及びエピレグリン（ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ）（ＥＰＲ）等の成長因子を含める。そのリガンドの一つの結合において、ＥＧＦＲは活性化され、他のＥＧＦＲ単量体とのホモ二量体を形成する。いくつかの例では、さらにＥＧＦＲは、ＥｒｂＢ受容体ファミリーの他のメンバーと対になり、活性ヘテロ二量体を形成し得る。ＥＧＦＲ二量化は、その内因性の細胞内タンパク質チロシンキナーゼ活性を刺激し、ＥＧＦＲのＣ−末端ドメイン中のいくつかのチロシン（Ｙ）残基の自己リン酸化をもたらす。リン酸化され得るチロシンは、Ｙ９９２、Ｙ１０４５、Ｙ１０６９、Ｙ１１４８及びＹ１１７３を含める。チロシン自己リン酸化は、蛍光体−チロシン−結合ＳＨ２ドメインを介する、ＥＧＦＲのリン酸化チロシンと関連するいくつかの他のタンパク質により、下流のシグナル伝達を活性化する。かかる下流のシグナル伝達は、いくつかのシグナル伝達カスケード、主にＭＡＰＫ、Ａｋｔ及びＪＮＫ経路を活性化し得る。これらのシグナル伝達カスケードは、ＤＮＡ合成、細胞増殖及び細胞成長、並びに細胞移動及び接着等の細胞表現型の調節において、本質的な役割を果たすことが公知である。
【００２７】
ＥＧＦＲ及びＨＥＲシグナル伝達経路の他の構成要素は、複合体中で、且つしっかりと調整された方法で相互作用し、細胞成長を調整する。ＨＥＲファミリーメンバー、例えばＥＧＦＲの量または活性の変更は、がん細胞の増殖、移動、及び生き残りを導く不適切な細胞成長の原因となり、またはかかる不適切な細胞成長を支持し得る。シグナル伝達経路が、それぞれのステップで成長シグナルを増幅させるカスケードとして働くせいで、ＥＧＦＲの量または活性における小さな変化は、細胞成長及び転移、（例えば細胞移動）を促進することにより、並びにアポトーシス（プログラム細胞死）を阻害することにより、がんの発達、または進行を有意に推進し得る。
【００２８】
ＥＧＦＲの突然変異及び過剰発現は、悪性腫瘍の増殖における重要な因子として暗示され、また特定のがんについての乏しい予後診断のマーカーとして利用されてきた。ＥＧＦＲは、多形性膠芽腫（ＧＢＭ）において、増幅及び再配列され、そして腫瘍形成的に働き、成長を刺激し、そしてがん細胞を広げることを同定された最初の細胞表面糖タンパク質であった。さらにＥＧＦＲは、がん遺伝子、並びに膠芽腫、星状細胞腫、髄膜腫、頭頸部扁平上皮がん、黒色腫、子宮頸がん、腎細胞がん、肺がん、前立腺がん、膀胱がん、大腸がん、膵がん及び乳がん等の他のがんの進行において、重要な役割を果たすことが示されている。
【００２９】
新規のＥＧＦＲ変異体の同定
さらに本明細書においてＥＧＦＲの突然変異体と呼ばれる多くの多様な変異体が同定され、また多くのこれらのＥＧＦＲ変異体は、特定のがんの開始または進行に関与してきた。ＥＧＦＲの突然変異は、一般にＮまたはＣ末端における小さな欠失である。ｍＲＮＡ中のエクソン２〜７に対応するインフレーム欠失であるＥＧＦＲｖＩＩＩは、現在、最も一般的なＥＧＦＲ変異体として公知であり、また多形性膠芽腫（ＧＢＭ）において最初に同定された。
【００３０】
当業界において公知であるＥＧＦＲ変異体は、ＥＧＦＲｖＩ（Ｎ−末端切断）、ＥＧＦＲｖＩＩ（エクソン１４〜１５の欠失）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（エクソン２〜７の欠失）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ／Δ１２〜１３（エクソン２〜７及びエクソン１２〜１３の欠失）、ＥＧＦＲｖＩＶ（エクソン２５〜２７の欠失）、ＥＧＦＲｖＶ（Ｃ−末端切断）、ＥＧＦＲ．ＴＤＭ／２〜７（エクソン２〜７の縦列重複）、ＥＧＦＲ．ＴＤＭ／１８−２５（エクソン１８〜２５の縦列重複）及びＥＧＦＲ．ＴＤＭ／１８−２６（エクソン１８〜２６の縦列重複）を含める。
【００３１】
本発明は、本明細書においてＥＧＦＲｖＶＩと呼ばれる新規のＥＧＦＲ変異体を特徴とする。新規のＥＧＦＲ変異体は、実施例１において発表されるように同定された。ＥＧＦＲｖＶＩは、エクソン７の一部を通るエクソン３の一部に対応するインフレーム欠失を含む。特に欠失は、エクソン３の内部で始まり、且つエクソン７の内部で終わる。好適には欠失は、エクソン３中の３分の１で始まり、且つエクソン７中の途中で終わる。欠失を引き起こすエクソン３及びエクソン７の内部で切断点を構成する相同領域は、図４に描かれている。好適には欠失は、野生型ＥＧＦＲ（例えば配列番号：２）のアミノ酸９０〜２２１から由来し、且つ図５に示すような９５９アミノ酸長（例えば配列番号：５）であるＥＧＦＲ変異体をもたらす。好適には欠失は、１０７３０塩基対（ｂｐ）長である。いくつかの観点では、変異体は、野生型ＥＧＦＲの９０位でのアミノ酸のＮ−末端配列、または２２１位でのアミノ酸のＣ−末端配列から欠失した１、２、３、４、５、１０、１５または２０個の追加のアミノ酸を有し得る。反対に、追加のアミノ酸が、野生型ＥＧＦＲの対応位置でのアミノ酸と全く一致している変異体は、９０位でのアミノ酸のＣ−末端、または２２１位でのアミノ酸のＮ−末端に、１、２、３、４、５、１０、１５または２０個の追加のアミノ酸を有し得る。本明細書において発表される欠失は、任意のＥＧＦＲのスプライス変異体またはアイソフォームにおいて存在し得る。
【００３２】
一つの観点では、ＥＧＦＲ変異体は、ＥＧＦＲ変異体のヌクレオチド配列、例えば配列番号：１と６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超えて同一性であるヌクレオチド配列を含んで成る。他の観点では、ＥＧＦＲ変異体は、ＥＧＦＲ変異体のアミノ酸配列、例えば配列番号：５と６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超えて同一性であるアミノ酸配列を含んで成る。
【００３３】
二つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸配列の文脈における用語“％同一性”とは、最大の一致について以下の配列比較アルゴリズムの一つを使用して、または目視検査により測定されるように比較し、そして位置合わせした場合に同一である、或いは同一である特定のパーセンテージのアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する、二つ以上の配列またはサブ配列に言及する。例えば、％同一性は、比較される配列のコード領域の全長に関連する。
【００３４】
配列比較に関し、典型的に一つの配列は、比較される試験配列に対する参照配列としての役割を果たす。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列は、コンピューター中に入力され、必要に応じてサブ配列座標が指定され、そして配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。その後に配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づき、参照配列に対する試験配列（単数・複数）のパーセント配列同一性を計算する。パーセント同一性は、ＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ等のサーチアルゴリズムを使用して決定され得る（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等、１９９０、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：３、４０３〜４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ等、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２５：１７、３３８９〜４０２）。
【００３５】
本発明は、以下に示すヌクレオチド配列を含んで成る、新規のＥＧＦＲ変異体であるＥＧＦＲｖＶＩを特徴とする。下線を引いた配列は、エクソン３及び７の内部の切断点を構成する相同領域を示す。
ＧＴＣＣＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＧＣＧＣＡＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＣＣＣＣＣＧＣＡＣＧＧＴＧＴＧＡＧＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＧＡＧＴＣＣＣＧＡＧＣＴＡＧＣＣＣＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＣＡＧＡＣＣＧＧＡＣＧＡＣＡＧＧＣＣＡＣＣＴＣＧＴＣＧＧＣＧＴＣＣＧＣＣＣＧＡＧＴＣＣＣＣＧＣＣＴＣＧＣＣＧＣＣＡＡＣＧＣＣＡＣＡＡＣＣＡＣＣＧＣＧＣＡＣＧＧＣＣＣＣＣＴＧＡＣＴＣＣＧＴＣＣＡＧＴＡＴＴＧＡＴＣＧＧＧＡＧＡＧＣＣＧＧＡＧＣＧＡＧＣＴＣＴＴＣＧＧＧＧＡＧＣＡＧＣＧＡＴＧＣＧＡＣＣＣＴＣＣＧＧＧＡＣＧＧＣＣＧＧＧＧＣＡＧＣＧＣＴＣＣＴＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＴＧＣＣＣＧＧＣＧＡＧＴＣＧＧＧＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡＧＡＡＡＧＴＴＴＧＣＣＡＡＧＧＣＡＣＧＡＧＴＡＡＣＡＡＧＣＴＣＡＣＧＣＡＧＴＴＧＧＧＣＡＣＴＴＴＴＧＡＡＧＡＴＣＡＴＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＧＡＧＧＡＴＧＴＴＣＡＡＴＡＡＣＴＧＴＧＡＧＧＴＧＧＴＣＣＴＴＧＧＧＡＡＴＴＴＧＧＡＡＡＴＴＡＣＣＴＡＴＧＴＧＣＡＧＡＧＧＡＡＴＴＡＴＧＡＴＣＴＴＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＡＣＣＡＴＣＣＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＧＧＴＴＡＴＧＴＣＣＴＣＡＴＧＣＴＣＴＡＣＡＡＣＣＣＣＡＣＣＡＣＧＴＡＣＣＡＧＡＴＧＧＡＴＧＴＧＡＡＣＣＣＣＧＡＧＧＧＣＡＡＡＴＡＣＡＣＣＴＴＴＧＧＴＧＣＣＡＣＣＴＧＣＧＴＧＡＡＧＡＡＧＴＧＴＣＣＣＣＧＴＡＡＴＴＡＴＧＴＧＧＴＧＡＣＡＧＡＴＣＡＣＧＧＣＴＣＧＴＧＣＧＴＣＣＧＡＧＣＣＴＧＴＧＧＧＧＣＣＧＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＧＡＴＧＧＡＧＧＡＡＧＡＣＧＧＣＧＴＣＣＧＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＡＡＧＴＧＣＧＡＡＧＧＧＣＣＴＴＧＣＣＧＣＡＡＡＧＴＧＴＧＴＡＡＣＧＧＡＡＴＡＧＧＴＡＴＴＧＧＴＧＡＡＴＴＴＡＡＡＧＡＣＴＣＡＣＴＣＴＣＣＡＴＡＡＡＴＧＣＴＡＣＧＡＡＴＡＴＴＡＡＡＣＡＣＴＴＣＡＡＡＡＡＣＴＧＣＡＣＣＴＣＣＡＴＣＡＧＴＧＧＣＧＡＴＣＴＣＣＡＣＡＴＣＣＴＧＣＣＧＧＴＧＧＣＡＴＴＴＡＧＧＧＧＴＧＡＣＴＣＣＴＴＣＡＣＡＣＡＴＡＣＴＣＣＴＣＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＡＣＴＧＧＡＴＡＴＴＣＴＧＡＡＡＡＣＣＧＴＡＡＡＧＧＡＡＡＴＣＡＣＡＧＧＧＴＴＴＴＴＧＣＴＧＡＴＴＣＡＧＧＣＴＴＧＧＣＣＴＧＡＡＡＡＣＡＧＧＡＣＧＧＡＣＣＴＣＣＡＴＧＣＣＴＴＴＧＡＧＡＡＣＣＴＡＧＡＡＡＴＣＡＴＡＣＧＣＧＧＣＡＧＧＡＣＣＡＡＧＣＡＡＣＡＴＧＧＴＣＡＧＴＴＴＴＣＴＣＴＴＧＣＡＧＴＣＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＡＣＡＴＡＡＣＡＴＣＣＴＴＧＧＧＡＴＴＡＣＧＣＴＣＣＣＴＣＡＡＧＧＡＧＡＴＡＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＡＴＧＴＧＡＴＡＡＴＴＴＣＡＧＧＡＡＡＣＡＡＡＡＡＴＴＴＧＴＧＣＴＡＴＧＣＡＡＡＴＡＣＡＡＴＡＡＡＣＴＧＧＡＡＡＡＡＡＣＴＧＴＴＴＧＧＧＡＣＣＴＣＣＧＧＴＣＡＧＡＡＡＡＣＣＡＡＡＡＴＴＡＴＡＡＧＣＡＡＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＡＣＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＡＧＧＴＣＴＧＣＣＡＴＧＣＣＴＴＧＴＧＣＴＣＣＣＣＣＧＡＧＧＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＣＣＣＧＧＡＧＣＣＣＡＧＧＧＡＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＴＧＣＣＧＧＡＡＴＧＴＣＡＧＣＣＧＡＧＧＣＡＧＧＧＡＡＴＧＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＣＣＴＴＣＴＧＧＡＧＧＧＴＧＡＧＣＣＡＡＧＧＧＡＧＴＴＴＧＴＧＧＡＧＡＡＣＴＣＴＧＡＧＴＧＣＡＴＡＣＡＧＴＧＣＣＡＣＣＣＡＧＡＧＴＧＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＧＣＣＡＴＧＡＡＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＣＡＧＧＡＣＧＧＧＧＡＣＣＡＧＡＣＡＡＣＴＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＴＧＣＣＣＡＣＴＡＣＡＴＴＧＡＣＧＧＣＣＣＣＣＡＣＴＧＣＧＴＣＡＡＧＡＣＣＴＧＣＣＣＧＧＣＡＧＧＡＧＴＣＡＴＧＧＧＡＧＡＡＡＡＣＡＡＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＴＧＧＡＡＧＴＡＣＧＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＴＧＴＧＣＣＡＣＣＴＧＴＧＣＣＡＴＣＣＡＡＡＣＴＧＣＡＣＣＴＡＣＧＧＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＣＣＡＧＧＴＣＴＴＧＡＡＧＧＣＴＧＴＣＣＡＡＣＧＡＡＴＧＧＧＣＣＴＡＡＧＡＴＣＣＣＧＴＣＣＡＴＣＧＣＣＡＣＴＧＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＧＧＣＣＣＴＣＣＴＣＴＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＣＴＧＧＧＧＡＴＣＧＧＣＣＴＣＴＴＣＡＴＧＣＧＡＡＧＧＣＧＣＣＡＣＡＴＣＧＴＴＣＧＧＡＡＧＣＧＣＡＣＧＣＴＧＣＧＧＡＧＧＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＣＴＴＧＴＧＧＡＧＣＣＴＣＴＴＡＣＡＣＣＣＡＧＴＧＧＡＧＡＡＧＣＴＣＣＣＡＡＣＣＡＡＧＣＴＣＴＣＴＴＧＡＧＧＡＴＣＴＴＧＡＡＧＧＡＡＡＣＴＧＡＡＴＴＣＡＡＡＡＡＧＡＴＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＣＧＴＴＣＧＧＣＡＣＧＧＴＧＴＡＴＡＡＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＡＧＡＡＧＧＴＧＡＧＡＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＴＣＣＣＧＴＣＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＡＡＴＴＡＡＧＡＧＡＡＧＣＡＡＣＡＴＣＴＣＣＧＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＧＧＡＡＡＴＣＣＴＣＧＡＴＧＡＡＧＣＣＴＡＣＧＴＧＡＴＧＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＡＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＧＴＧＴＧＣＣＧＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＣＡＣＧＣＡＧＣＴＣＡＴＧＣＣＣＴＴＣＧＧＣＴＧＣＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴＡＴＧＴＣＣＧＧＧＡＡＣＡＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＡＴＴＧＧＣＴＣＣＣＡＧＴＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＧＣＡＧＡＴＣＧＣＡＡＡＧＧＧＣＡＴＧＡＡＣＴＡＣＴＴＧＧＡＧＧＡＣＣＧＴＣＧＣＴＴＧＧＴＧＣＡＣＣＧＣＧＡＣＣＴＧＧＣＡＧＣＣＡＧＧＡＡＣＧＴＡＣＴＧＧＴＧＡＡＡＡＣＡＣＣＧＣＡＧＣＡＴＧＴＣＡＡＧＡＴＣＡＣＡＧＡＴＴＴＴＧＧＧＣＴＧＧＣＣＡＡＡＣＴＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＡＡＡＧＴＧＣＣＴＡＴＣＡＡＧＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＡＡＴＴＴＴＡＣＡＣＡＧＡＡＴＣＴＡＴＡＣＣＣＡＣＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＡＣＧＧＧＧＴＧＡＣＣＧＴＴＴＧＧＧＡＧＴＴＧＡＴＧＡＣＣＴＴＴＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＣＡＴＡＴＧＡＣＧＧＡＡＴＣＣＣＴＧＣＣＡＧＣＧＡＧＡＴＣＴＣＣＴＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＡＡＡＧＧＡＧＡＡＣＧＣＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＣＡＣＣＣＡＴＡＴＧＴＡＣＣＡＴＣＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＡＧＴＧＣＴＧＧＡＴＧＡＴＡＧＡＣＧＣＡＧＡＴＡＧＴＣＧＣＣＣＡＡＡＧＴＴＣＣＧＴＧＡＧＴＴＧＡＴＣＡＴＣＧＡＡＴＴＣＴＣＣＡＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＡＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＣＡＴＴＣＡＧＧＧＧＧＡＴＧＡＡＡＧＡＡＴＧＣＡＴＴＴＧＣＣＡＡＧＴＣＣＴＡＣＡＧＡＣＴＣＣＡＡＣＴＴＣＴＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＧＡＴＧＧＡＴＧＡＡＧＡＡＧＡＣＡＴＧＧＡＣＧＡＣＧＴＧＧＴＧＧＡＴＧＣＣＧＡＣＧＡＧＴＡＣＣＴＣＡＴＣＣＣＡＣＡＧＣＡＧＧＧＣＴＴＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＣＣＣＴＣＣＡＣＧＴＣＡＣＧＧＡＣＴＣＣＣＣＴＣＣＴＧＡＧＣＴＣＴＣＴＧＡＧＴＧＣＡＡＣＣＡＧＣＡＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＣＧＴＧＧＣＴＴＧＣＡＴＴＧＡＴＡＧＡＡＡＴＧＧＧＣＴＧＣＡＡＡＧＣＴＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＣＡＧＣＴＴＣＴＴＧＣＡＧＣＧＡＴＡＣＡＧＣＴＣＡＧＡＣＣＣＣＡＣＡＧＧＣＧＣＣＴＴＧＡＣＴＧＡＧＧＡＣＡＧＣＡＴＡＧＡＣＧＡＣＡＣＣＴＴＣＣＴＣＣＣＡＧＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＧＴＧＧＣＴＴＧＴＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＣＡＡＣＣＴＣＣＴＣＧＡＣＣＣＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＴＧＴＣＣＡＡＧＣＣＡＧＧＴＧＣＴＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＧＧＧＧＡＡＡＣＡＧＴＧＧＣＡＧＡＴＴＴＧＣＡＧＡＣＡＣＡＧＴＧＡＡＧＧＧＣＧＴＡＡＧＧＡＧＣＡＧＡＴＡＡＡＣＡＣＡＴＧＡＣＣＧＡＧＣＣＴＧＣＡＣＡＡＧＣＴＣＴＴＴＧＴＴＧＴＧＴＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＧＣＴＧＴＡＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＡＡＧＡＡＴＧＡＡＴＣＴＧＣＡＡＡＡＴＴＴＣＴＡＧＣＴＴＡＴＧＡＡＧＣＡＡＡＴＣＡＣＧＧＡＣＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴＧＴＡＴＧＴＧＴＧＡＧＴＧＴＴＣＡＴＧＡＴＧＴＧＴＧＴＡＣＡＴＣＴＧＴＧＴＡＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＡＴＧＴＧＴＧＴＧＴＴＴＧＴＧＡＣＡＧＡＴＴＴＧＡＴＣＣＣＴＧＴＴＣＴＣＴＣＴＧＣＴＧＧＣＴＣＴＡＴＣＴＴＧＡＣＣＴＧＴＧＡＡＡＣＧＴＡＴＡＴＴＴＡＡＣＴＡＡＴＴＡＡＡＴＡＴＴＡＧＴＴＡＡＴＡＴＴＡＡＴＡＡＡＴＴＴＴＡＡＧＣＴＴＴＡＴＣＣＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号：３）。
【００３６】
本発明は、以下のようにＥＧＦＲｖＶＩの一部分、特にエクソン１、２、３、７及び８を含むヌクレオチド配列を含んで成る、新規のＥＧＦＲ変異体であるＥＧＦＲｖＶＩを特徴とし、ここで下線を引いた配列は、エクソン３〜７の内部で切断点を構成する相同領域を示す：
ＧＣＴＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＴＧＣＣＣＧＧＣＧＡＧＴＣＧＧＧＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡＧＡＡＡＧＴＴＴＧＣＣＡＡＧＧＣＡＣＧＡＧＴＡＡＣＡＡＧＣＴＣＡＣＧＣＡＧＴＴＧＧＧＣＡＣＴＴＴＴＧＡＡＧＡＴＣＡＴＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＧＡＧＧＡＴＧＴＴＣＡＡＴＡＡＣＴＧＴＧＡＧＧＴＧＧＴＣＣＴＴＧＧＧＡＡＴＴＴＧＧＡＡＡＴＴＡＣＣＴＡＴＧＴＧＣＡＧＡＧＧＡＡＴＴＡＴＧＡＴＣＴＴＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＡＣＣＡＴＣＣＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＧＧＴＴＡＴＧＴＣＣＴＣＡＴＧＣＴＣＴＡＣＡＡＣＣＣＣＡＣＣＡＣＧＴＡＣＣＡＧＡＴＧＧＡＴＧＴＧＡＡＣＣＣＣＧＡＧＧＧＣＡＡＡＴＡＣＡＣＣＴＴＴＧＧＴＧＣＣＡＣＣＴＧＣＧＴＧＡＡＧＡＡＧＴＧＴＣＣＣＣＧＴＡＡＴＴＡＴＧＴＧＧＴＧＡＣＡＧＡＴＣＡＣＧＧＣＴＣＧＴＧＣＧＴＣＣＧＡＧＣＣＴＧＴＧＧＧＧＣＣＧＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＧＡＴＧＧＡＧＧＡＡ（配列番号：４）。
【００３７】
本発明は、以下のアミノ酸配列を伴う、新規のＥＧＦＲ変異体であるＥＧＦＲｖＶＩを特徴とする：
ＭＲＰＳＧＴＡＧＡＡＬＬＡＬＬＡＡＬＣＰＡＳＲＡＬＥＥＫＫＶＣＱＧＴＳＮＫＬＴＱＬＧＴＦＥＤＨＦＬＳＬＱＲＭＦＮＮＣＥＶＶＬＧＮＬＥＩＴＹＶＱＲＮＹＤＬＳＦＬＫＴＩＱＥＶＡＧＹＶＬＭＬＹＮＰＴＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧＫＹＳＦＧＡＴＣＶＫＫＣＰＲＮＹＶＶＴＤＨＧＳＣＶＲＡＣＧＡＤＳＹＥＭＥＥＤＧＶＲＫＣＫＫＣＥＧＰＣＲＫＶＣＮＧＩＧＩＧＥＦＫＤＳＬＳＩＮＡＴＮＩＫＨＦＫＮＣＴＳＩＳＧＤＬＨＩＬＰＶＡＦＲＧＤＳＦＴＨＴＰＰＬＤＰＱＥＬＤＩＬＫＴＶＫＥＩＴＧＦＬＬＩＱＡＷＰＥＮＲＴＤＬＨＡＦＥＮＬＥＩＩＲＧＲＴＫＱＨＧＱＦＳＬＡＶＶＳＬＮＩＴＳＬＧＬＲＳＬＫＥＩＳＤＧＤＶＩＩＳＧＮＫＮＬＣＹＡＮＴＩＮＷＫＫＬＦＧＴＳＧＱＫＴＫＩＩＳＮＲＧＥＮＳＣＫＡＴＧＱＶＣＨＡＬＣＳＰＥＧＣＷＧＰＥＰＲＤＣＶＳＣＲＮＶＳＲＧＲＥＣＶＤＫＣＮＬＬＥＧＥＰＲＥＦＶＥＮＳＥＣＩＱＣＨＰＥＣＬＰＱＡＭＮＩＴＣＴＧＲＧＰＤＮＣＩＱＣＡＨＹＩＤＧＰＨＣＶＫＴＣＰＡＧＶＭＧＥＮＮＴＬＶＷＫＹＡＤＡＧＨＶＣＨＬＣＨＰＮＣＴＹＧＣＴＧＰＧＬＥＧＣＰＴＮＧＰＫＩＰＳＩＡＴＧＭＶＧＡＬＬＬＬＬＶＶＡＬＧＩＧＬＦＭＲＲＲＨＩＶＲＫＲＴＬＲＲＬＬＱＥＲＥＬＶＥＰＬＴＰＳＧＥＡＰＮＱＡＬＬＲＩＬＫＥＴＥＦＫＫＩＫＶＬＧＳＧＡＦＧＴＶＹＫＧＬＷＩＰＥＧＥＫＶＫＩＰＶＡＩＫＥＬＲＥＡＴＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＳＶＤＮＰＨＶＣＲＬＬＧＩＣＬＴＳＴＶＱＬＩＴＱＬＭＰＦＧＣＬＬＤＹＶＲＥＨＫＤＮＩＧＳＱＹＬＬＮＷＣＶＱＩＡＫＧＭＮＹＬＥＤＲＲＬＶＨＲＤＬＡＡＲＮＶＬＶＫＴＰＱＨＶＫＩＴＤＦＧＬＡＫＬＬＧＡＥＥＫＥＹＨＡＥＧＧＫＶＰＩＫＷＭＡＬＥＳＩＬＨＲＩＹＴＨＱＳＤＶＷＳＹＧＶＴＶＷＥＬＭＴＦＧＳＫＰＹＤＧＩＰＡＳＥＩＳＳＩＬＥＫＧＥＲＬＰＱＰＰＩＣＴＩＤＶＹＭＩＭＶＫＣＷＭＩＤＡＤＳＲＰＫＦＲＥＬＩＩＥＦＳＫＭＡＲＤＰＱＲＹＬＶＩＱＧＤＥＲＭＨＬＰＳＰＴＤＳＮＦＹＲＡＬＭＤＥＥＤＭＤＤＶＶＤＡＤＥＹＬＩＰＱＱＧＦＦＳＳＰＳＴＳＲＴＰＬＬＳＳＬＳＡＴＳＮＮＳＴＶＡＣＩＤＲＮＧＬＱＳＣＰＩＫＥＤＳＦＬＱＲＹＳＳＤＰＴＧＡＬＴＥＤＳＩＤＤＴＦＬＰＶＰＧＥＷＬＶＷＫＱＳＣＳＳＴＳＳＴＨＳＡＡＡＳＬＱＣＰＳＱＶＬＰＰＡＳＰＥＧＥＴＶＡＤＬＱＴＱ（配列番号：５）。
【００３８】
いくつかの態様では、ＥＧＦＲｖＶＩは、優先的に腫瘍細胞中で発現する。例示的な腫瘍細胞は、膠芽腫細胞を含める。他の腫瘍細胞は、上皮腫瘍細胞を含め得る。腫瘍細胞は、これらに限定されないが、以下のがんの腫瘍細胞：膠芽腫、星状細胞腫、髄膜腫、頭頸部扁平上皮がん、黒色腫、子宮頸がん、腎細胞がん、肺がん、前立腺がん、膀胱がん、大腸がん、膵がん及び乳がんを含め得る。
【００３９】
患者におけるＥＧＦＲｖＶＩの同定は、患者ががんを有するか否か、がんを発達させるリスクがあるか否か、またはがんを発達させるより高い素因を有するか否かを決定するために使用され得る。これは、一つには、ＥＧＦＲ変異体が、がんを有しない健常対象において発現しないという事実のせいである。いくつかの態様では、特定のＥＧＦＲ変異体は、特定のがんにおいてより高頻度に見られ得る。例えばＥＧＦＲｖＩＩＩは、非小細胞肺がん細胞（ＮＳＣＬＣ）及びＧＢＭにおいて見出される、最も頻度の高いＥＧＦＲ突然変異である。いくつかの態様では、ＥＧＦＲｖＶＩは、神経系のがん、例えばＧＢＭまたは星状細胞腫を有する患者において見出される。
【００４０】
本明細書において使用されるがんは、過剰増殖性の病状または障害に言及する。用語は、悪性及び非悪性細胞集団を包含する。かかる障害は、細胞の一つ以上のサブセットの増加した細胞増殖、または過度の細胞増殖により特徴付けられ、それはしばしば形態学的且つ遺伝子型的に、取り囲む組織とは異なると思われる。患者由来の組織試料における増加した細胞増殖、または過剰な細胞増殖は、参照試料の組織試料との細胞増殖の比較により決定され得る。参照試料は、一般集団もしくは健常対象集団、またはがんと診断されていない対象から由来する試料の集団から決定されたスコアであり得る。さらに参照試料は、同一の患者から異なる時点で得られた試料であり得る。細胞増殖は、Ｋｉ−６７、ＢｒＤＵ、または有糸分裂マーカー等の増殖マーカーに関する生体試料の免疫組織化学的染色等の当業界において公知の任意の方法により測定され得る。過剰増殖性の細胞障害は、多様なタイプの動物、及びヒトにおいて生じ、そして影響を受けた細胞に応じて、多様な物理的兆候を生み出し得る。
【００４１】
がんは、神経系のがん、上皮がん及び固形腫瘍がんを含める。かかるがんは、膠芽腫、星状細胞腫、髄膜腫、頭頸部扁平上皮がん、黒色腫、子宮頸がん、腎細胞がん、肺がん、前立腺がん、膀胱がん、大腸がん、膵がん及び乳がんを含める。
【００４２】
特に注目のがんは、脳腫瘍を含める神経系のがんである。神経系の腫瘍は、例えば星状膠細胞のような、腫瘍が生じたと思われる細胞の種類に従い分類される。びまん性、線維性星状細胞腫は、成人の原発性脳腫瘍の最も一般的なタイプである。これらの腫瘍は、病理組織学的に三つの悪性グレード：世界保健機関（ＷＨＯ）グレードII星状細胞腫、ＷＨＯグレードIII未分化星状細胞腫及びＷＨＯグレードIV多形性膠芽腫（ＧＢＭ）に分けられる。ＷＨＯグレードII星状細胞腫は、最も進行が遅いびまん性の星状細胞腫スペクトルである。星状細胞腫は、周囲の脳に浸透し、局所制御での治療試みを悪化させる顕著な傾向を示す。これらの侵襲的な能力は、しばしば低いグレード及び高いグレードの腫瘍において明らかである。
【００４３】
多形性膠芽腫は、殆どの患者が２年未満の生存時間である、星状細胞腫の最も悪性のステージである。組織学的にこれらの腫瘍は、高い増殖インデックス、内皮増殖及び限局性壊死により特徴付けられる。これらの病変のより高い増殖性質は、多数のマイトジェン効果に起因するようだ。ＧＢＭの一つの顕著な特徴は、内皮の増殖である。成長因子の宿主及びそれらの受容体は、ＧＢＭ中で増幅及び／または突然変異して見出される。
【００４４】
抗体
フラグメント、誘導体及びその類似物を含める本発明のＥＧＦＲ変異体は、後に発表する診断、研究、及び治療方法における用途を有する抗体を産するための免疫原として使用され得る。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル、キメラ、ヒト化、単鎖（ｓｖＦｃ）またはＦａｂフラグメントであり得る。通常の当業者に公知である多様な手順は、かかる抗体及びフラグメントの生産及び標識化のために使用され得る。例えばＢｕｒｎｓ、編、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第３補改訂編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２００５）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）；Ｋｏｚｂｏｒ等、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２（１９８３）；Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）を参照する。
【００４５】
ＥＧＦＲｖＶＩ及び全長野生型ＥＧＦＲまたは他のＥＧＦＲ変異体の間の差異を利用する抗体またはフラグメントは、特に好適である。特に注目すべきは、ＥＧＦＲｖＶＩを特異的に認識する抗体、またはその機能的なフラグメントである。“特異的に認識する”が何を意味しているかは、抗体、またはその機能的なフラグメントが、野生型ＥＧＦＲ及び／または他のＥＧＦＲ変異体、例えばＥＧＦＲｖＩＩＩと比べて、ＥＧＦＲｖＶＩと優先的に結合することである。例えば抗体は、エクソン３及び７が融合されるＥＧＦＲｖＶＩの領域に結合し得る。或いは３次元構造、または天然構造の天然のＥＧＦＲｖＶＩタンパク質は、本明細書において開示されるＥＧＦＲｖＶＩ−特異的抗体により認識され得る野生型ＥＧＦＲまたは他のＥＧＦＲ変異体において存在し得ない、または入手し得ない新規のエピトープを提示し得る。
【００４６】
ＥＧＦＲｖＶＩ抗体の例示的な用途は、本明細書において開示されている。かかる用途は、診断方法及び予後診断方法を含める。
【００４７】
診断的適用
本発明は、ＥＧＦＲｖＶＩを直接的または間接的に検出するような診断方法に基づくＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質を提供する。さらに本発明は、診断目的のための組成物及びキットを提供する。
【００４８】
本発明は、患者から生体試料を得ること、核酸またはタンパク質を抽出すること、そして生体試料中のＥＧＦＲｖＶＩの存在、不存在、またはそのレベルを決定することを含んで成る診断方法を特徴とする。生体試料中のＥＧＦＲｖＶＩの存在、不存在、またはそのレベルを決定するための方法は、本明細書においてさらに検討される。
【００４９】
本発明の診断方法は、定性的または定量的であり得る。定量的な診断方法は、例えば予め定められたカットオフ、または閾値を介して、遅発性と進行性のがんの間を見分けるために使用され得る。適切な場合には、さらに定性的または定量的な診断方法は、標的、シグナルまたは中間物（例えばユニバーサルプライマー）の増幅を含め得る。
【００５０】
ＥＧＦＲｖＶＩは、マルチプレックスまたはパネルフォーマットにおいて、他のマーカーと共に検出され得る。マーカーは、単独、またはＥＧＦＲ変異体との組み合わせにあるそれらの予測値のために選定される。さらにかかるマーカーは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ等の一つ以上の他のＥＧＦＲ変異体を含め得る。さらに当業界において公知である他のがん、疾患、感染症、及び代謝性の病状についてのマーカーは、  マルチプレックスのパネルフォーマット中に含められることを熟慮される。
【００５１】
さらに本発明の診断方法は、ＥＧＦＲｖＶＩ等の特定のＥＧＦＲ変異体を、疾患のステージ、悪性度もしくは進行、または転移の存在もしくはリスクと相関させるデータについての考察を含め得る。最終的に本発明の方法により提供される情報は、特定の患者への治療の最善策を選定する上で、医師を支援するだろう。
【００５２】
試料
本明細書において使用される用語“生体試料”とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質等の生体材料を含む試料に言及する。いくつかの態様では、生体試料は、組織試料、細胞培養試料、または生検試料であり得る。いくつかの態様では、生体試料は、対象から由来する体液を適切に含んで成り得る。体液は、これらに限定されないが、例えば血液、血漿、血清、尿、唾液、髄液、脳脊髄液、胸膜液、乳頭吸引液、リンパ液、気道液、腸液、尿生殖路の液体、涙液、唾液、母乳、リンパ系から由来する液体、精液、脳脊髄液、臓器内系統の液体、腹水、腫瘍嚢胞液、羊水及びその組み合わせを含める対象の体のいずれの場所からでも単離される、好適には末梢の位置から単離される液体であり得る。いくつかの態様では、生体試料として使用するために好適な体液は、尿である。他の態様では、好適な体液は、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血清または血漿である。適切には、約０．１ｍＬ〜約３０ｍＬの液体の試料容積が使用され得る。液体の容積は、いくつかの要因、例えば使用される液体のタイプに左右され得る。例えば血清試料の容積は、約０．１ｍＬ〜約２０ｍＬ、好適には約４ｍＬであり得る。尿試料の容積は、約１０ｍＬ〜約３０ｍＬ、好適には約２０ｍＬであり得る。
【００５３】
他の態様では、試料は、ｉｎ  ｖｉｖｏにあってよく、ここでＥＧＦＲｖＶＩを発現する循環腫瘍細胞または微小胞（例えばエキソソーム）は、静脈カテーテルの挿入を介して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて生体液から検出され得る。具体的には静脈カテーテルは、ＥＧＦＲｖＶＩ、例えばＥＧＦＲｖＶＩ−特異的抗体に結合し得る検出薬を含んで成る。その後にカテーテルは、ＥＧＦＲｖＶＩ−発現循環腫瘍細胞または微小胞を検出または収集する。静脈カテーテルは、少なくとも５分間、対象に挿入されたままで、少なくとも２．５リットルの血液が調査され得る。したがって本方法は、まれな腫瘍事象の検出を可能にする。
【００５４】
用語“対象”とは、ＥＧＦＲ及びその変異体を発現することが示されている、またはＥＧＦＲ及びその変異体を発現することが予測される全ての動物を含めることが意図される。特定の態様では、対象は、哺乳動物、ヒトまたは非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、他の家畜、または齧歯動物（例えばマウス、ラット、モルモット等）である。ヒト対象は、観察可能な異常、例えば疾患を伴わない正常のヒトであり得る。ヒト対象は、観察可能な異常、例えば疾患を伴うヒトであり得る。観察可能な異常は、そのヒト自身により、または医療専門家により観察され得る。用語“対象”、“患者”及び“個体”とは、本明細書において区別せずに使用される。
【００５５】
生体試料は、ＥＧＦＲｖＶＩ、または他の注目のマーカーの試料を単離または富ませるように設計される予備処理を要求し得る。いくつかの観点では、ＥＧＦＲｖＶＩまたは他の注目のマーカーを含む細胞、または他の核酸含有粒子が単離される。これらに限定されないが、遠心分離；免疫捕獲；細胞融解；及び核酸標的捕獲（例えば参照によりその全体が本明細書に組み込まれているＥＰ特許第１４０９７２７号を参照）を含める通常の当業者に公知である多様な技術は、本目的のために使用され得る。
【００５６】
いくつかの態様では、微小胞フラクションを単離、精製し、または富ませるように生体試料を前処理することは、好都合であり得る。本明細書において使用される用語“微小胞”とは、細胞から剥がれ落ちる０．８ミクロン未満の全ての膜小胞について集合的に言及する。生体試料からの微小胞の単離は、遠心分離、ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー及び親和性クロマトグラフィー、または任意のその組み合わせを通して達成され得る（例えばＰＣＴ出願ＷＯ２０１１／００９１０４、ＷＯ２０１２／０５１６２２、及びＷＯ２０１２／０６４９９３を参照）。核酸またはタンパク質の抽出に先立ち、微小胞フラクションの単離は、ＥＧＦＲｖＶＩ及び他の注目のマーカーのより正確な、または特異的な検出に関し、より高い品質抽出をもたらす。
【００５７】
核酸検出
ＥＧＦＲｖＶＩは、これらに限定されないが、核酸シークエンシング；核酸ハイブリダイゼーション；及び核酸増幅を含める通常の当業者に公知である多様な核酸技術を使用して、ゲノムＤＮＡまたはキメラｍＲＮＡの染色体再配置として検出され得る。
【００５８】
核酸シークエンシング技術の例は、これらに限定されないが、連鎖停止（サンガー）シークエンシング及びダイターミネーターシークエンシングを含める。それらの通常の当業者は、ＲＮＡが細胞中でより安定ではなく、且つよりヌクレアーゼ攻撃への傾向にあるので、通常シークエンシング前に、ＲＮＡがＤＮＡに逆転写されることを認識するだろう。ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写させるための方法及び試薬は、当業界において公知である。連鎖停止シークエンシングは、修飾ヌクレオチド基質、放射性または他の標識化オリゴヌクレオチドプライマー、及び連鎖停止ヌクレオチドを使用するＤＮＡ合成反応の配列特異的末端を使用する。ダイターミネーターシークエンシングは、ターミネーターを標識し、そして完全なシークエンシングは、それぞれのジ−ジオキヌクレオチド連鎖停止剤を、別個の蛍光染料で標識することにより、単一の反応において行われ得る。
【００５９】
核酸ハイブリダイゼーション技術の例は、これらに限定されないが、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション  ＦＩＳＨ等のＩＳＨ）、マイクロアレイ、及びサザンまたはノーザンブロットを含める。ＩＳＨは、標識化された相補的なＤＮＡまたはＲＮＡプローブを使用し、組織の一部または部分において特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列の場所を見つけ出し、または特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列とハイブリダイズする（ｉｎ  ｓｉｔｕ）。マイクロアレイの例は、ＤＮＡマイクロアレイ（例えばｃＤＮＡマイクロアレイ及びオリゴヌクレオチドマイクロアレイ）、タンパク質マイクロアレイ；組織マイクロアレイ、トランスフェクションまたは細胞マイクロアレイ、化合物マイクロアレイ、及び抗体マイクロアレイを含める。さらにＤＮＡマイクロアレイは、一般に遺伝子チップ、ＤＮＡチップ、またはバイオチップとしても公知である。マイクロアレイは、何千もの遺伝子またはタンパク質の発現プロファイルを同時にモニタリングする目的のために、アレイを形成する固体表面（例えばガラス、プラスチックまたはシリコンチップ）に付着したプローブ（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、化合物または抗体）を集めることである。サザンブロット法は、特異的なフィルターに結合したＤＮＡ配列を、注目の配列に相補的な標識化プローブとのハイブリダイゼーションにより検出するために利用される。ノーザンブロット法は、特異的なフィルターに結合したＲＮＡ配列を、注目の配列に相補的な標識化プローブとのハイブリダイゼーションにより検出するために利用される。
【００６０】
ＥＧＦＲｖＶＩは、検出に先立ち、または検出と同時に行われる増幅により同定され得る。核酸増幅技術の例は、これらに限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、転写仲介増幅（ＴＭＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、及び核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）を含める。特定の増幅技術（例えばＰＣＲ）は、増幅に先立ちＲＮＡをＤＮＡに逆転写することを要求するが（例えばＲＴ−ＰＣＲ）、他の増幅技術は、直接ＲＮＡを増幅する（例えばＴＭＡ及びＮＡＳＢＡ）ということを、それらの通常の当業者は認識するだろう。
【００６１】
一般にＰＣＲと呼ばれるポリメラーゼ連鎖反応（それぞれが、その全体において参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第４，６８３，１９５号、４，６８３，２０２号、４，８００，１５９号及び４，９６５，１８８号）は、多数のサイクルの変性、逆鎖へのプライマー対のアニーリング、及びプライマー伸長を使用して、標的の核酸配列のコピー数を指数関数的に増加させる。ＲＴ−ＰＣＲと呼ばれる変形では、逆転写酵素（ＲＴ）は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をｍＲＮＡから作るために使用され、そしてその後にｃＤＮＡは、ＰＣＲにより増幅され、ＤＮＡの多数のコピーを産する。他の多様なＰＣＲの変形については、例えばその全体において参照により本明細書に組み込まれている米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号及び第４，８００，１５９号；Ｍｕｌｌｉｓ等、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５５：３３５（１９８７）；及びＭｕｒａｋａｗａ等、ＤＮＡ  ７：２８７（１９８８）を参照する。一般にＴＭＡと呼ばれる転写仲介増幅は、実質的に一定の温度、イオン強度、及びｐＨの条件下で、標的核酸配列の多数のコピーを自己触媒的に合成し、ここで標的配列の多数のＲＮＡのコピーは、自己触媒的にさらなるコピーを作り出す。一般にＬＣＲと呼ばれるリガーゼ連鎖反応は、標的核酸の隣接した領域にハイブリダイズする、２セットの相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、繰り返される熱変性、ハイブリダイゼーション及びライゲーションのサイクルにおいて、ＤＮＡリガーゼにより共有結合され、検出可能な二本鎖及び結合したオリゴヌクレオチド産物を産する。一般にＳＤＡと呼ばれる鎖置換増幅は、標的配列の逆鎖へのプライマー配列対のアニーリング、ｄＮＴＰαＳの存在中でのプライマー伸長のサイクルを使用し、二本鎖ヘミホスホロチオエート化プライマー伸長産物を産する。このプライマー伸長産物は、半修飾された制限エンドヌクレアーゼ認識部位でエンドヌクレアーゼに仲介されるニッキングを受け、そしてニックの３’末端からのポリメラーゼに仲介されるプライマー伸長は、既存の鎖を置き換え、そして次回のプライマーアニーリング、ニッキング及び鎖置換のための鎖を生み出すことにより、幾何学的な産物の増幅をもたらす。
【００６２】
非増幅、または増幅されたＥＧＦＲ変異体核酸は、任意の従来型の手段により検出され得る。例えばＥＧＦＲｖＶＩは、検出可能な標識化プローブとのハイブリダイゼーション、及び得られるハイブリッドの測定により検出され得る。実例となる検出方法の非限定的な例は、以下に発表する。
【００６３】
増幅工程の定量的評価は、リアルタイムで行われ得る。“リアルタイム”での増幅工程の評価は、連続的または定期的に、増幅反応の間、反応混合物中のアンプリコンの量を決定すること、及び決定された値を用いて、試料中に最初に存在する標的配列の量を計算することを伴う。リアルタイム増幅に基づき、試料中に存在する最初の標的配列の量を決定するための多様な方法は、当業界において周知である。これらは、それぞれその全体において、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，３０３，３０５号及び第６，５４１，２０５号において開示されている方法を含める。リアルタイム増幅に基づかないが、試料中に最初に存在する標的配列の量を決定するための他の方法は、その全体において、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，７１０，０２９号において開示されている。
【００６４】
さらに本発明は、試料中のＥＧＦＲｖＶＩ核酸の存在の特異的検出のための、ＥＧＦＲｖＶＩ核酸と結合する核酸を提供する。ＥＧＦＲｖＶＩを検出するための核酸は、ＥＧＦＲｖＶＩをコードするＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＥＧＦＲ遺伝子とハイブリダイズする、１０〜１０００個のヌクレオチド（好適には、１０〜５００、１０〜１００、１０〜５０、１０〜３５、２０〜１０００、２０〜５００、２０〜１００、２０〜５０、または２０〜３５個のヌクレオチド）から成る単離核酸を含んで成る。好適な態様では、核酸は、野生型ＥＧＦＲｖＶＩ、または他のＥＧＦＲ変異体のＲＮＡまたはＤＮＡではなく、ＥＧＦＲｖＶＩをコードするＲＮＡまたはＤＮＡと選択的にハイブリダイズする。特に単離核酸は、配列番号：５におけるアミノ酸配列を含んで成るＥＧＦＲｖＶＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；配列番号：３または配列番号４における核酸配列を含んで成るヌクレオチド配列；ＥＧＦＲｖＶＩ（配列番号：３）または野生型ＥＧＦＲ、例えば配列番号：１のエクソン１〜３、またはエクソン７〜２８の任意の一つのヌクレオチド配列から成る群から選定される配列と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子から由来する、少なくとも１０個の連続的なヌクレオチド（好適には、１５、１８、２０、２５、または３０個）から成るヌクレオチド配列であり、または該配列と相補的であり、ここでヌクレオチド配列は、隣接したエクソン：または上記の任意のヌクレオチド配列と相補的である配列にも及び得る。好適にはヌクレオチド配列は、野生型ＥＧＦＲ、例えば配列番号：１のエクソン４、エクソン５、またはエクソン６と相補的な配列の配列を含まない。さらに相補的な配列は、それらがコード鎖と相補的である配列を含んで成る場合、アンチセンス核酸としても公知である。好適には核酸は、野生型ＥＧＦＲの９０〜２２１位でアミノ酸をコードするヌクレオチドとは特異的にハイブリダイズしない。さらに検出に有用な核酸は、本明細書においてプライマーまたはプローブとも呼ばれ、また本明細書において発表される多くの検出方法において利用され得る。
【００６５】
一つの観点では、ＥＧＦＲｖＶＩを検出するための単離核酸分子は、ＥＧＦＲｖＶＩ  ＲＮＡ、ＤＮＡまたはｃＤＮＡと特異的にハイブリダイズする１０〜５０個のヌクレオチドを含んで成る。核酸分子は、エクソン１〜３及び７〜２８の隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含める、ＥＧＦＲｖＶＩ（配列番号：３）または野生型ＥＧＦＲ（配列番号：１）のＥＧＦＲｖＶＩエクソン１〜３またはエクソン７〜２８から由来する、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、または少なくとも２０個の連続的なヌクレオチドから成るヌクレオチド配列であり、または該配列と相補的である。具体的には核酸分子は、野生型ＥＧＦＲのアミノ酸９０〜２２１をコードするヌクレオチド配列にはハイブリダイズしない。
【００６６】
本発明において使用され得る特異的な核酸プライマー及びプローブの例は：
ＥＧＦＲ  Ｆｏｒｗ  １−  ＣＴＧＣＴＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＴＧ（配列番号：６）
ＥＧＦＲｖ３  ｒｅｖ４  -  ＣＧＴＧＡＴＣＴＧＴＣＡＣＣＡＣＡＴＡＡＴＴＡＣＣ（配列番号：７）
ＥＧＦＲ  プローブ６  -  ＴＴＣＣＴＣＣＡＧＡＧＣＣＣＧＡＣＴ（配列番号：８）
ＥＧＦＲ  Ｆｏｒｗ  １−  ＣＴＧＣＴＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＴＧ（配列番号：６）
ＥＧＦＲ  Ｒｅｖ  １−  ＴＴＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＣＧ（配列番号：９）
ＥＧＦＲ  プローブ６：  ＴＴＣＣＴＣＣＡＧＡＧＣＣＣＧＡＣＴ（配列番号：８）
ＥＧＦＲ  ｑＰＣＲ  エクソン３〜７  ｄｅｌ  ｆｏｒｗ  １：  ＴＧＧＴＣＣＴＴＧＧＧＡＡＴＴＴＧＧＡＡ（配列番号：１０）
ＥＧＦＲ  ｑＰＣＲ  エクソン３〜７  ｄｅｌ  ｒｅｖ：  ＧＴＧＧＧＧＴＴＧＴＡＧＡＧＣＡＴＧＡＧＧＡ（配列番号：１１）
ＥＧＦＲ  ｑＰＣＲ  エクソン３〜７  ｄｅｌ  プローブ：  ＴＡＣＣＴＡＴＧＴＧＣＡＧＡＧＧＡＡ（配列番号：１２）を含める。
【００６７】
通常の当業者により理解されるように、多数の追加のプローブまたはプライマーは、配列番号：３から設計され得る。
【００６８】
核酸プローブは、通常のハイブリダイゼーション方法により適切な染色体またはｃＤＮＡライブラリーを精査し、本発明の他の核酸分子を得るために使用され得る。染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーは、当業界において認識される方法に従い、適切な細胞から調製され得る（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第二編、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ、＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８９を参照）。
【００６９】
別の方法では、化学合成は、ＰＣＡ３アミノ酸配列のＮ−末端及びＣ−末端部分に対応するヌクレオチド配列を有する核酸プローブを得るために行われる。したがって合成された核酸プローブは、本発明のフラグメントを得るために適切な染色体、ｃＤＮＡまたは細胞株ライブラリーを利用する認識されているＰＣＲ技術に従い、本質的にはＰＣＲプロトコール、Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｍｉｃｈａｅｌ等編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９０に従い行われる、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるプライマーとして使用され得る。
【００７０】
当業者は、本明細書において開示される配列に基づき、当業界において公知のコンピューターアライメント及び配列分析の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第二編、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ、＆Ｍａｎｉａｔｉｓ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８９を参照）を用いて、かかるプローブを容易に設計し得る。
【００７１】
本発明のハイブリダイゼーションプローブは、放射性標識、酵素標識、蛍光標識、ビオチン−アビジン標識、化学発光等による標準の標識化技術により標識化され得る。例えばプローブは、ＦＡＭ染料により標識化される。ハイブリダイゼーション後にプローブは、公知の方法を用いて可視化され得る。
【００７２】
本発明の核酸プライマー及びプローブは、当業界において公知の技術を用いて作り出されたプローブ等のＲＮＡ及びＤＮＡプローブを含める。
【００７３】
上記の方法の一つの態様では、核酸プローブは、固体の支持体上で固定される。かかる固体の支持体の例は、これらに限定されないが、ポリカーボネート等のプラスチック、アガロース及びセファロース等の複合糖質、並びにポリアクリルアミド及びラテックスビーズ等のアクリル樹脂を含める。核酸プローブをかかる固体支持体にカップリングさせるための技術は、当業界において周知である。
【００７４】
タンパク質検出
本発明のＥＧＦＲｖＶＩは、これらに限定されないが、タンパク質シークエンシング及び免疫測定法を含める通常の当業者に公知である多様なタンパク質技術を用いて、先を切断されたＥＧＦＲタンパク質、キメラタンパク質または欠失を伴うタンパク質として検出され得る。タンパク質シークエンシング技術の例は、これらに限定されないが、質量分析法及びエドマン分解を含める。免疫測定法の例は、これらに限定されないが、免疫沈降、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、免疫細胞化学、フローサイトメトリー、及び免疫−ＰＣＲを含める。通常の当業者に公知である多様な技術（例えば熱量測定、蛍光、化学発光または放射性標識）を用いて、検出可能な部分により標識化されたポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、免疫測定における使用に適している。
【００７５】
いくつかの態様では、コンピューターに基づく分析プログラムは、検出アッセイにより作り出される生データ（例えば所定のマーカー、または例えばＥＧＦＲｖＶＩのようなマーカーの存在、不存在、または量）を、臨床医のための予測値のデータに翻訳するために使用される。臨床医は、任意の適切な手段を用いて、予測データを利用し得る。したがって、いくつかの好適な態様では、本発明は、恐らく遺伝子または分子生物学の教育を受けていない臨床医が、生データを理解する必要がないという、さらなる利益を提供する。データは、その最も有用な形態で臨床医に直接提示される。その後に臨床医は、対象への配慮を最適化するために、情報を即座に利用することができる。本発明は、アッセイを行う研究室から情報を受け、処理し、そして研究室から研究室に伝えることができる任意の方法を検討し、情報は、医療従事者及び対象に提供される。
【００７６】
さらにＥＧＦＲｖＶＩは、これらに限定されないが、放射性核種画像化；ポジトロン放出型断層撮影（ＰＥＴ）；コンピューター断層撮影、Ｘ線または磁気共鳴画像化、蛍光検出、及び化学発光検出を含めるｉｎ  ｖｉｖｏ画像化技術を用いて検出され得る。いくつかの態様では、ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化技術は、動物（例えばヒト、または非ヒト哺乳動物）におけるがんマーカーの発現の存在、または発現を可視化するために使用される。例えば、いくつかの態様では、がんマーカーｍＲＮＡまたはタンパク質は、がんマーカーに特異的な標識化抗体を用いて標識化される。特異的に結合され、且つ標識化された抗体は、これらに限定されないが、放射性核種画像化、ポジトロン放出型断層撮影、コンピューター断層撮影、Ｘ線または磁気共鳴画像化、蛍光検出、及び化学発光検出を含めるｉｎ  ｖｉｖｏ画像化法を用いて、個体において検出され得る。本発明のｉｎ  ｖｉｖｏ画像化法は、本発明のがんマーカーを発現するがんの診断に有用である（例えば膠芽腫）。ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化は、がんを示すマーカー、例えばＥＧＦＲｖＶＩの存在を可視化するために使用される。かかる技術は、不快な生検の使用を伴わない診断を可能にする。さらに本発明のｉｎ  ｖｉｖｏ画像化法は、がん患者への予後診断を提供するのに有用である。例えば、転移の恐れのあるがんを示すマーカーの存在は、検出され得る。本発明のｉｎ  ｖｉｖｏ画像化法は、さらに身体の他の部分における転移性のがんを検出するために使用され得る。
【００７７】
組成物及びキット
本発明の診断方法において使用するための組成物は、これらに限定されないがプローブ、増幅オリゴヌクレオチド、及び抗体を含める。特に好適な組成物は、任意の他のＥＧＦＲ変異体ではなく、ＥＧＦＲｖＶＩを検出する。これらの組成物は、ＥＧＦＲのエクソンからの５’部分が、エクソン７からの３’部分に結合するジャンクションとハイブリダイズする配列を含んで成る単一の標識化プローブまたはオリゴヌクレオチドプライマー；エクソン３及びエクソン７が、ＥＧＦＲｖＶＩ中でつながるところで、一つの増幅オリゴヌクレオチドが、相同の切断点にハイブリダイズする配列を含んで成る、一対の増幅オリゴヌクレオチド；またはＥＧＦＲｖＶＩを特異的に認識する抗体を含める。
【００７８】
単独、または本発明の他の組成物との組み合わせにある、任意のこれらの組成物は、キットの形態において提供され得る。例えば、単一の標識化プローブ、及び増幅オリゴヌクレオチド対は、本発明のＥＧＦＲ変異体の増幅及び検出のためのキットにおいて提供され得る。キットは、適切なコントロール及び／または検出試薬をさらに含んで成り得る。
【００７９】
さらに本発明のプローブ及び抗体組成物は、アレイの形態において提供され得る。
【００８０】
予後診断適用
ＥＧＦＲｖＶＩ及びがんを伴う患者の予後診断の間で、相関性は存在し得る。いくつかの態様では、ＥＧＦＲｖＶＩの存在、不存在またはそのレベルは、その活性、悪性度、侵襲性、または転移能に基づき、腫瘍を、階層化または分類するための用途であり得る。したがって、いくつかの態様では、ＥＧＦＲｖＶＩを検出するためのアッセイは、予後診断を提供し、そして医師が適切な治療戦略を決定するのを助けるために使用される。例えば、いくつかの態様では、ＥＧＦＲｖＶＩを有する腫瘍を伴う患者は、野生型ＥＧＦＲを有するものとは別に治療される。例えば、ＥＧＦＲｖＶＩを有する患者の予後診断は、ＥＧＦＲｖＶＩを欠く患者よりも悪くなり得るので、より積極的な治療計画を要求し得る。いくつかの態様では、ＥＧＦＲｖＶＩの存在は、生存率／時間、腫瘍の侵襲性、及び転移と相関する。
【００８１】
本発明は、膠芽腫がん患者の予後診断を得ることとの関連において、最適に使用されるだろうが、さらに他の上皮または固形細胞腫瘍も調査されてよく、そして本明細書において発表されるアッセイ及びプローブは、特に悪性になる恐れがある、すなわち侵襲性及び転移性である恐れがあるこれらの腫瘍から由来するがん細胞が、ＥＧＦＲｖＶＩを発現するか否かの決定において使用され得る。本手段を用いて特徴化され得る腫瘍の例は、乳房、肺、結腸、卵巣、子宮、食道、胃、肝臓、腎臓、脳、皮膚及び筋肉の腫瘍を含める。さらに本発明のアッセイは、細胞株及び動物モデルにおいて、これらのがんを研究する研究者達にとって、価値のあるものになるだろう。
【００８２】
薬物スクリーニング及び治療適用
いくつかの態様では、本発明は、薬物スクリーニングアッセイ（例えば抗がん剤をスクリーニングする）を提供する。本発明のスクリーニング方法は、ＥＧＦＲｖＶＩの生物学的機能を調節し得る化合物または化学物質（例えば小分子、薬物、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、ペプトイド）の同定を提供する。例えば化合物または化学物質は、ＥＧＦＲｖＶＩがリガンド結合ドメインの一部を欠いているような、リガンド非依存性の方法において、ＥＧＦＲｖＶＩを阻害し得る。ＥＧＦＲｖＶＩの生物学的機能の阻害は、ＥＧＦＲキナーゼ活性を阻害すること、ＥＧＦＲｖＶＩの上流もしくは下流であるシグナル経路を調節すること、またはＥＧＦＲｖＶＩのプロテアソーム分解を増加させることを含め得る。ＥＧＦＲｖＶＩの活性を阻害する化合物は、増殖性疾患、例えばがんの治療において有用であり得る。
【００８３】
いくつかの態様では、がん等の増殖性疾患の治療のために、ＥＧＦＲｖＶＩを調節または阻害するのは、好都合であり得る。本発明は、ＥＧＦＲｖＶＩを直接的または間接的に標的にする治療を包含する。ＥＧＦＲｖＶＩの機能を阻害するのに有用な治療の例は、ｓｉＲＮＡｓ等のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）化合物、及びＥＧＦＲｖＶＩをコードする標的核酸と特異的にハイブリダイズする他のアンチセンス化合物を含める。有用であり得る他の治療は、特異的にＥＧＦＲｖＶＩを結合し、及び／またはＥＧＦＲｖＶＩの活性を阻害する抗体を含める。いくつかの態様では、抗体は、細胞毒性物質（例えば毒素、薬物または放射性部分）  と結合され得る。
【００８４】
いくつかの態様では、本発明は、ＥＧＦＲｖＶＩの存在または不存在を分析することを含んで成る、ＥＧＦＲｖＶＩを検出し、特定の治療計画に対する対象の応答性を決定または評価するための方法を特徴とし、ここでの存在または不存在は、対象の治療計画への応答性に相関する。検出方法は、本明細書に開示されるようなＥＧＦＲｖＶＩ  ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質を検出するために使用され得る。好適には、検出の方法は、核酸増幅、例えば定量的リアルタイムＰＣＲによる。
【００８５】
ＥＧＦＲは、がんまたは増殖性疾患のための分子治療の代表的な標的であった。ＥＧＦＲに特異的な治療は、一般にＥＧＦＲキナーゼ活性の阻害剤、及びＥＧＦＲのリガンド仲介活性化の阻害剤を含める。ＥＧＦＲを標的にする治療の例は、細胞外のＮ末端リガンド結合ドメインを遮断する抗体阻害剤を含める。リガンド結合ドメインの遮断は、ＥＧＦＲの不十分な活性化及び下流のシグナル伝達を阻む。ＥＧＦＲのリガンド結合ドメインを遮断する化学物質の例は、セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ  商標）、パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ  商標）、ザルツムマブ、ニモツズマブ（ＢｉｏＭａｂ  ＥＧＦＲ）、及びマツズマブ（ＥＭＤ７２００）を含める、他のＥＧＦＲ特異的阻害剤は、ＡＴＰ結合ポケットを可逆的または不可逆的に結合させることにより、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性を阻害する小分子を含める。これらの小分子は、細胞質タンパク質及びタンパク質のＣ末端上にあるキナーゼドメインを標的にする。かかる阻害剤は、例えばゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ商標）、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ商標）及びラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ商標）を含める。他のＥＧＦＲ阻害剤は、リンドペピムト（Ｒｉｎｄｏｐｅｐｉｍｕｔ）（ＣＤＸ−１１０，  Ｃｅｌｌｄｅｘ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）等のＥＧＦＲ欠失を標的にする、がんワクチンを含める。ＥＧＦＲ及び下流のシグナル伝達を間接的に阻害する、特に有用であり得る他の阻害剤は、ＰＡＲＰ１阻害剤、例えば、５−ＡＩＱ塩酸塩、ＡＢＴ−８８８、ミノサイクリン、ＰＡＲＰ阻害剤ＩＸ（ＥＢ−４７）、ＰＡＲＰ阻害剤ＸＩ（ＤＲ２３１３）、ＴＩＱ−Ａ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手可能）である。
【００８６】
しかしながら、特定の治療剤により標的にされるＥＧＦＲの部分の欠失を示す腫瘍特異的なＥＧＦＲ変異体に部分的に寄与し得る、これらのＥＧＦＲ阻害剤による治療に、全ての患者が反応するわけではない。例えば、ＥＧＦＲｖＶＩは、Ｎ末端リガンド結合ドメインの重要な部分を欠く。ＥＧＦＲｖＶＩの存在は、リガンド結合ドメインを標的にする分子を含んで成る治療計画が、がんの治療には効果がないであろうことを示し得る。ＥＧＦＲｖＶＩの存在は、対象が、リガンド結合ドメインを標的にする分子を含んで成る治療計画には応答性ではないだろうということを示し得る。したがって、ＥＧＦＲｖＶＩの存在の検出は、ＥＧＦＲ阻害剤を含んで成る治療計画を排除することを当業者に指示し得る。
【実施例】
【００８７】
実施例１：新規のＥＧＦＲ変異体の同定
本実施例では、患者（患者ＩＤ  ＵＣＳ−０００１）からグリオーマ脳脊髄液（ＣＳＦ）試料を得た。生検では、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性であった。微小胞は、４ｍＬのＣＳＦ試料から抽出した。核酸、例えばＲＮＡは、当業界において公知の方法により抽出した。
【００８８】
ＥＧＦＲ  ＰＣＲに基づく検出アッセイを行った。ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的アッセイにおいて、以下のプライマー及びプローブ：
ＥＧＦＲ  Ｆｏｒｗ  １−  ＣＴＧＣＴＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＴＧ（配列番号：６）
ＥＧＦＲｖ３  ｒｅｖ４  -  ＣＧＴＧＡＴＣＴＧＴＣＡＣＣＡＣＡＴＡＡＴＴＡＣＣ（配列番号：７）
ＥＧＦＲプローブ６  -  ＴＴＣＣＴＣＣＡＧＡＧＣＣＣＧＡＣＴ（ＦＡＭ−染料で標識されたＭｉｎｏｒ  Ｇｒｏｖｅ  Ｂｉｎｄｅｒ  （ＭＧＢ）プローブ）（配列番号：８）を使用した。
【００８９】
２番目のＥＧＦＲ  ＰＣＲに基づく検出アッセイでは、以下のプライマー及びプローブ：
ＥＧＦＲ  Ｆｏｒｗ  １−  ＣＴＧＣＴＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＴＧ（配列番号：６）
ＥＧＦＲ  Ｒｅｖ  １−  ＴＴＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＣＧ（配列番号：９）
ＥＧＦＲプローブ６−  ＴＴＣＣＴＣＣＡＧＡＧＣＣＣＧＡＣＴ  （ＦＡＭ−染料で標識されたＭｉｎｏｒ  Ｇｒｏｖｅ  Ｂｉｎｄｅｒ  （ＭＧＢ）プローブ）（配列番号：８）を使用した。
【００９０】
ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的アッセイ（ＥＧＦＲ  Ｆｏｒｗ  １、ＥＧＦＲｖ３ｒｅｖ４、ＥＧＦＲプローブ６）は、ＣＳＦ試料から増幅産物を生み出さなかった。しかしながら２番目のＥＧＦＲアッセイ（ＥＧＦＲ  Ｆｏｒｗ  １、ＥＧＦＲ  Ｒｅｖ  １及びＥＧＦＲ  プローブ６）は、増幅産物を生み出した。
【００９１】
２番目のＥＧＦＲアッセイからの本増幅産物を、定性的ＰＣＲ増幅によりさらに調査した。以下のＰＣＲ設定：
ＥＧＦＲ  Ｆｏｒｗ  １  （１８μＭ）                         １μＬ
ＥＧＦＲ  Ｒｅｖ  １  （１８μＭ）                    １μＬ
ｄＮＴＰｓ  （１０ｍＭ）                                     １μＬ
ＨＦ酵素緩衝剤  （５×）                      １０μＬ
Ｐｈｕｓｉｏｎ  ホットスタート  ＩＩ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ  ０．５μＬ
ＤＭＳＯ                                      １．５μＬ
Ｈ２Ｏ                                        ３０μＬ
ｃＤＮＡ                                      ５μＬ
を使用した。
【００９２】
ＰＣＲサイクル条件は、以下の通りであった。
１．９８℃、３０秒
２．９８℃、１０秒
３．６２℃、１５秒
４．７２℃、１５秒
５．７２℃、５分
ステップ２〜４を、３６サイクルで繰り返す。
【００９３】
ＥＧＦＲアッセイから増幅されたＰＣＲ産物を分析したら、ＥＧＦＲｖＩＩＩよりも大きなバンドを示した。生物分析器の結果は、図３に示されるような電気泳動図中に作り出された。増幅されたＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯベクター中にクローン化し、そして配列化させた。エクソン１、２、エクソン３の一部、エクソン７の一部及びエクソン８のヌクレオチド配列を図４に示す。
【００９４】
増幅されたＰＣＲ産物のシークエンシングでは、エクソン７中の中間につながるエクソン３中の３分の１の途切れを同定した。ＥＧＦＲｖＩＩＩは欠失であり、ここでエクソン２〜７の全体は欠失し、ここでＤＮＡの途切れは、イントロン領域中のいずれにおいてもあり得る。対照的に新しく同定されたＥＧＦＲ変異体は、エクソン内部に生じるＤＮＡの途切れにより特徴付けられるので、ＤＮＡへの定義された連結を有する。ＥＧＦＲｖＶＩは、１０７３０ｂｐ長の欠失を含み、且つコード及び非コード領域を含める。ＥＧＦＲｖＶＩヌクレオチド配列は、図５において示すように、ＷＴ  ＥＧＦＲのアミノ酸９０〜２２１を欠くポリペプチドをコードする。
【００９５】
ＥＧＦＲ  Ｆｏｒｗ１（配列番号：６）及びＥＧＦＲ  Ｒｅｖ１（配列番号：９）に加えて、ＥＧＦＲｖＶＩの増幅のために使用され得るプライマーの更なる例は、以下のようなもの：
ＥＧＦＲ  ｑＰＣＲ  エクソン３〜７  ｄｅｌ  ｆｏｒｗ  １：  ＴＧＧＴＣＣＴＴＧＧＧＡＡＴＴＴＧＧＡＡ（配列番号：１０）
ＥＧＦＲ  ｑＰＣＲ  エクソン３〜７  ｄｅｌ  ｒｅｖ：  ＧＴＧＧＧＧＴＴＧＴＡＧＡＧＣＡＴＧＡＧＧＡ（配列番号：１１）
ＥＧＦＲ  ｑＰＣＲ  エクソン３〜７  ｄｅｌ  プローブ（ＦＡＭＭＧＢ）：  ＴＡＣＣＴＡＴＧＴＧＣＡＧＡＧＧＡＡ（配列番号：１２）である。
【００９６】
本発明は、特定の態様に関連して開示されているが、添付の明細書及び特許請求の範囲に発表されるような本発明の全範囲から逸脱せずに、発表される態様に多くの修飾、修正、及び変更を施すことは、可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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