(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象からの尿試料中のＡＮＸＡ１レベルを検出することを含む、ＡＮＸＡ１をマーカーとする、前記対象の腎移植後合併症の存在の検出方法であって、
ＡＣＴＢおよびＧＡＰＤＨからなる群から選択される参照遺伝子を検出する工程；および
前記参照遺伝子を使用してＡＮＸＡ１レベルを正規化する工程を含み、
前記ＡＮＸＡ１が尿中エキソソームおよび微小胞中に存在し、ＡＮＸＡ１のレベル上昇の検出が前記対象の腎移植後合併症の存在を示し、
前記ＡＮＸＡ１のレベル上昇が腎移植後合併症のないドナーの尿試料中のＡＮＸＡ１のレベルと比較して２倍より高いものであり、
前記腎移植後合併症が、急性拒絶反応、慢性拒絶反応、間質性線維症および尿細管萎縮からなる群から選択される、
前記方法。
【請求項２】
腎移植後合併症と関連するＲＮＡを発現するヒト対象のスクリーニング方法であって、前記方法が、前記対象からの尿試料から単離された小胞中の前記ＲＮＡの発現を腎移植後合併症のないドナーの尿試料から単離された小胞中の前記ＲＮＡの発現と比較することを含み、腎移植後合併症と関連する前記ＲＮＡがＡＮＸＡ１であり、前記ドナーの前記ＲＮＡの前記発現と比較した前記対象の前記ＲＮＡの前記発現の増加は、前記増加が閾値を超える場合に前記対象が腎移植後合併症を有することを示し、前記尿試料から単離した前記小胞中の前記ＲＮＡの前記発現の前記比較が：
（ａ）前記対象からの前記試料を小胞捕捉フィルターを通過させることにより前記対象からの前記試料から前記小胞を捕捉することと、
（ｂ）前記小胞捕捉フィルター上に溶解バッファーをロードすることにより前記小胞を溶解して小胞関連ＲＮＡを遊離することと、
（ｃ）前記小胞関連ＲＮＡ中の腎移植後合併症と関連する前記ＲＮＡの前記発現をＰＣＲにより定量することと、
をさらに含み、
前記腎移植後合併症が、急性拒絶反応、慢性拒絶反応、間質性線維症および尿細管萎縮からなる群から選択される、
前記方法。
【請求項３】
ＰＣＲによる、前記ＲＮＡの前記発現の定量が：
前記小胞関連ＲＮＡを逆転移酵素と接触させて相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成すること；
前記ｃＤＮＡを腎移植後合併症と関連する前記ＲＮＡに対して特異的であるセンスおよびアンチセンスプライマー、ならびにＤＮＡポリメラーゼと接触させて増幅ＤＮＡを生成すること；
前記ｃＤＮＡを参照ＲＮＡに対して特異的であるセンスおよびアンチセンスプライマー、ならびに前記ＤＮＡポリメラーゼと接触させて増幅ＤＮＡを生成すること；および
解析ソフトウェアを使用して前記ＲＮＡの発現レベル、量（quantity）または量（amount）を決定すること、
を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
解析ソフトウェアを使用して腎移植後合併症と関連する前記ＲＮＡの発現レベル、量（quantity）または量（amount）を決定することが：
解析ソフトウェアを使用して腎移植後合併症と関連する前記ＲＮＡのマーカーサイクル閾値（Ｃｔ値）を決定すること；
解析ソフトウェアを使用して参照ＲＮＡの参照Ｃｔ値を決定すること：および
参照Ｃｔ値からマーカーＣｔ値を差し引いてマーカーΔＣｔ値を得ること、
を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記参照ＲＮＡが、ＡＣＴＢおよびＧＡＰＤＨからなる群から選択される、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記マーカーΔＣｔ値が６未満である場合、前記増加が前記閾値を超える、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
マーカーΔＣｔ値をコントロールΔＣｔ値と比較することをさらに含み、前記コントロールΔＣｔ値を、コントロール参照Ｃｔ値からコントロールマーカーＣｔ値を差し引くことにより決定し、前記コントロールマーカーＣｔ値が健康なドナー集団の尿中小胞中の腎移植後合併症と関連する前記ＲＮＡのＣｔ値であり、前記コントロール参照Ｃｔ値が健康なドナー集団の尿中小胞中の前記参照ＲＮＡのＣｔ値である、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記マーカーΔＣｔ値が前記コントロールΔＣｔ値より少なくとも２小さい場合、前記増加が前記閾値を超える、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先出願の参照による援用
海外または国内優先権が本願と共に提出した出願データシート中に確認されるいずれかおよび全ての出願は参照により本明細書に組み入れられ、本開示の一部とする。
【０００２】
技術分野
本明細書に開示した方法およびシステムのいくつかの実施形態は、腎移植後の病状のモニタリングに関する。いくつかの実施形態は、尿試料からのエキソソームおよび微小胞のｍＲＮＡプロファイルの特徴付けに関する。
【背景技術】
【０００３】
腎移植は、末期腎疾患患者にとって最後の手段である。１００，０００人超の患者が腎移植を待っている（平均待ち時間：３．６年）が、ドナーが限られているために２０１４年に約１７，０００件の腎移植しか行われておらず、患者とドナー間のギャップは広がっている。免疫抑制剤の開発は、近年、移植片生着率を著しく改善しているが、急性および慢性拒絶反応を含む移植後合併症は、未だに移植片機能損失及びその後の他の合併症の主要な原因である。
【０００４】
血清クレアチニン、尿クレアチニンおよび尿中タンパクなどの従来の尿バイオマーカーは、これまで移植後合併症を予測するのに充分に感受性および特異性がない。腎生検は、移植片状態を診断および治療方針を決定するための金字塔であったが、その侵襲性および患者にとって経済的負担が原因で、頻繁なモニタリングは理想的な解決策ではない。尿毒症性血小板機能低下症、脈管構造変更および他の因子のせいで抗血小板および抗凝血性薬品を受けている患者にとっては特に、腎生検を適用できないかまたはリスクが大きくなる。従って、腎移植後のモニタリングのための非侵襲性バイオマーカーが望ましい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書において、いくつかの実施形態では、このようなバイオマーカーの同定、およびこのようなバイオマーカーを使用して腎移植後の患者に対する具体的治療を方向づけるための方法およびシステムを提供する。いくつかの実施形態では、方法はコンピュータ支援のものであり、腎状態の本質的にリアルタイムな決定を可能とする。いくつかの実施形態では、方法は腎状態の決定をもたらすが、いくつかの実施形態では、特定の推奨される治療パラダイムを提供する（例えば、医療専門家がそれに従って行動する）。
【０００６】
特定の態様では、これに限定されないが、対象の腎移植後合併症の存在を検出することを含む方法において様々なＲＮＡを使用することができる。いくつかの実施形態では、方法は、マーカーレベルを検出して急性細胞拒絶反応を首尾良く診断することの他に侵襲的生検前に（例えば、生検が診断を裏付ける２０日前まで）拒絶反応を予測することも含む。使用する試料としては、血液、尿、または他の生体試料を挙げることができる。特定の変法では、方法は、患者の尿試料から単離されたエキソソームおよび微小胞中のｍＲＮＡ発現の定量を含む。いくつかの実施形態では、方法は、対象からの尿試料中のＡＮＸＡ１レベルを検出することを含み、ＡＮＸＡ１は尿エキソソームおよび微小胞中に存在し、少なくとも１つのマーカーのレベル上昇の検出は、対象の腎移植後合併症の存在を示す。いくつかの実施形態では、腎移植後合併症は、急性拒絶反応、慢性拒絶反応、境界域、間質性線維症および尿細管萎縮、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）腎症ならびにカルシニューリン阻害剤（ＣＮＩ）中毒からなる群から選択される。特定の変法では、方法は、ＡＣＴＢお
よびＧＡＰＤＨからなる群から選択される参照遺伝子を検出する工程をさらに含み、前記参照遺伝子を使用して少なくとも１つのマーカーレベルを正規化する。いくつかの実施形態では、上昇したレベルは、腎移植後合併症のないドナーの尿試料中のマーカーレベルと比較して２倍以上高いレベルである。
【０００７】
いくつかの実施形態では、腎移植後合併症と関連するＲＮＡを発現するヒト対象のスクリーニング方法が開示され、該方法は、該対象からの尿試料から単離された小胞中のＲＮＡの発現を腎移植後合併症のないドナーの尿試料から単離された小胞中のＲＮＡの発現と比較することを含み、腎移植後合併症に関連するＲＮＡがＡＮＸＡ１であり、ドナーのＲＮＡの発現と比較した該対象のＲＮＡの前記発現の増加は、該増加が閾値を超える場合に該対象が腎移植後合併症を有することを示し、尿試料から単離した小胞中のＲＮＡの発現の比較は：対象からの試料を、小胞捕捉フィルターを通過させることにより対象からの試料から小胞を捕捉し、小胞捕捉フィルター上に溶解バッファーをロードすることにより小胞を溶解して小胞関連ＲＮＡを遊離し、小胞関連ＲＮＡ中の腎移植後合併症に関連するＲＮＡの発現をＰＣＲにより定量することをさらに含む。いくつかの変法では、方法は、解析ソフトウェアを用いて腎移植後合併症に関連するＲＮＡのマーカーサイクル閾値（Ｃｔ値）を決定すること、解析ソフトウェアを用いて参照ＲＮＡの参照Ｃｔ値を決定すること、および参照Ｃｔ値からマーカーＣｔ値を減算してマーカーΔＣｔ値を得ることをさらに含む。いくつかの変法では、参照ＲＮＡは、ＡＣＴＢおよびＧＡＰＤＨからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、マーカーΔＣｔ値が６未満である場合、増加は閾値を超える。いくつかの実施形態では、方法は、マーカーΔＣｔ値をコントロールΔＣｔ値と比較することを含み、該コントロールΔＣｔ値をコントロール参照Ｃｔ値からコントロールマーカーＣｔ値を減算することにより決定し、該コントロールマーカーＣｔ値は健康なドナー集団の尿小胞中の腎移植後合併症に関連するＲＮＡのＣｔ値であり、該コントロール参照Ｃｔ値は健康なドナー集団の尿小胞中の前記参照ＲＮＡのＣｔ値である。いくつかの実施形態では、マーカーΔＣｔ値がコントロールΔＣｔ値より少なくとも２小さい場合、増加は閾値を超える。
【０００８】
上記要約し、以下にさらに詳細を記載する方法は、開業医が行う特定の措置を記載しているが、別の当事者により行われるこれらの措置の指示も含み得ると理解すべきである。従って、「疾病または病状のため対象を治療する」などの措置は、「疾病または病状のため対象の治療の管理を指示する」を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
様々な実施形態を例証目的のため付属の図に示すが、実施形態の範囲を限定するものと決して解釈すべきではない。さらに、異なる開示された実施形態の様々な特徴を組み合わせてさらなる実施形態を作ることができるが、これは本開示の一部である。
【図１−１】図１Ａは、間質性線維症（ｃｉ）に関する対象のＢａｎｆｆスコアの関数として該対象の尿中ＥＭＶ中のアネキシンＡ１（ＡＮＸＡ１）ｍＲＮＡ発現のプロットを示す。  図１Ｂは、尿細管萎縮（ｃｔ）に関する対象のＢａｎｆｆスコアの関数として該対象の尿中ＥＭＶ中のＡＮＸＡ１  ｍＲＮＡ発現のプロットを示す。  図１Ｃは、全間質性炎症（ｔｉ）に関する対象のＢａｎｆｆスコアの関数として該対象の尿中ＥＭＶ中のＡＮＸＡ１  ｍＲＮＡ発現のプロットを示す。
【図１−２】図１Ｄは、尿細管炎（ｔ）に関する対象のＢａｎｆｆスコアの関数として該対象の尿中ＥＭＶ中のＡＮＸＡ１  ｍＲＮＡ発現のプロットを示す。  図１Ｅは、間質の浸潤（ｉ）に関する対象のＢａｎｆｆスコアの関数として該対象の尿中ＥＭＶ中のＡＮＸＡ１  ｍＲＮＡ発現のプロットを示す。  図１Ｆは、内膜動脈炎（ｖ）に関する対象のＢａｎｆｆスコアの関数として該対象の尿中ＥＭＶ中のＡＮＸＡ１  ｍＲＮＡ発現のプロットを示す。
【図１−３】図１Ｇは、硝子質細動脈肥厚（ａｈ）に関する対象のＢａｎｆｆスコアの関数として該対象の尿中ＥＭＶ中のＡＮＸＡ１  ｍＲＮＡ発現のプロットを示す。  図１Ｈは、傍尿細管毛細管炎（ｐｔｃ）に関する対象のＢａｎｆｆスコアの関数として該対象の尿中ＥＭＶ中のＡＮＸＡ１  ｍＲＮＡ発現のプロットを示す。  図１Ｉは、糸球体腎炎（ｇ）に関する対象のＢａｎｆｆスコアの関数として該対象の尿中ＥＭＶ中のＡＮＸＡ１  ｍＲＮＡ発現のプロットを示す。
【図１−４】図１Ｊは、血管線維化内膜肥厚（ｃｖ）に関する対象のＢａｎｆｆスコアの関数として該対象の尿中ＥＭＶ中のＡＮＸＡ１  ｍＲＮＡ発現のプロットを示す。  図１Ｋは、硝子質細動脈肥厚（ａａｈ）の代替のスコア化に関する対象のＢａｎｆｆスコアの関数として該対象の尿中ＥＭＶ中のＡＮＸＡ１  ｍＲＮＡ発現のプロットを示す。  図１Ｌは、Ｂａｎｆｆ法により決定するとき傍尿細管毛細血管炎（ｐｔｃｂｍ）に関する該対象のＢａｎｆｆスコアの関数として対象の尿中ＥＭＶ中のＡＮＸＡ１  ｍＲＮＡ発現のプロットを示す。
【図１−５】図１Ｍは、慢性糸球体症（ｃｇ）に関する対象のＢａｎｆｆスコアの関数として該対象の尿中ＥＭＶ中のＡＮＸＡ１  ｍＲＮＡ発現のプロットを示す。  図１Ｎは、補体Ｃ４ｄ染色（ｃ４ｄ）に関する対象のＢａｎｆｆスコアの関数として該対象の尿中ＥＭＶ中のＡＮＸＡ１  ｍＲＮＡ発現のプロットを示す。  図１Ｏは、メサンギウム基質増加（ｍｍ）に関する対象のＢａｎｆｆスコアの関数として該対象の尿中ＥＭＶ中のＡＮＸＡ１  ｍＲＮＡ発現のプロットを示す。
【図２】図２Ａは、対象の尿タンパクレベルの関数として該対象の尿中ＥＭＶ中のＡＮＸＡ１  ｍＲＮＡ発現の散布図を示す。  図２Ｂは、対象の尿クレアチニンレベルの関数として該対象の尿中ＥＭＶ中のＡＮＸＡ１  ｍＲＮＡ発現の散布図を示す。  図２Ｃは、対象の血清クレアチニンレベルの関数として該対象の尿中ＥＭＶ中のＡＮＸＡ１  ｍＲＮＡ発現の散布図を示す。  図２Ｄは、対象の推定糸球体濾過量の関数として該対象の尿中ＥＭＶ中のＡＮＸＡ１  ｍＲＮＡ発現の散布図を示す。
【図３】患者および試料の分類の模式図を示す。
【図４】腎移植後の病状の様々なタイプに関する対象の状態の関数として該対象の尿中ＥＭＶ中のＡＮＸＡ１  ｍＲＮＡ発現のプロットを示す。統計的有意性をＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定により決定した：ｐ＜０．０５については１つの星印（＊）、ｐ＜０．０００１については４つの星印（＊＊＊＊）。
【図５】図５Ａは、移植拒絶反応が対象に確認された日付からの時間の関数として該対象の尿中ＥＭＶ中のＡＮＸＡ１  ｍＲＮＡ発現のプロットを示す。統計的有意性をＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定により決定した：ｐ＜０．０１については２つの星印（＊＊）、ｐ＜０．００１については３つの星印（＊＊＊）、ｐ＜０．０００１については４つの星印（＊＊＊＊）。  図５Ｂは、移植拒絶反応確認前（実線）、中（破線）および後（点線）のＡＮＸＡ１  ｍＲＮＡ発現についての受信者動作特性（ＲＯＣ）解析を示す。  図５Ｃは、間質性線維症および尿細管萎縮（ＩＦＴＡ）が対象に確認された日付からの時間の関数として該対象の尿中ＥＭＶ中のＡＮＸＡ１  ｍＲＮＡ発現のプロットを示す。統計的有意性をＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定により決定した：ｐ＜０．０１については２つの星印（＊＊）、ｐ＜０．００１については３つの星印（＊＊＊）、ｐ＜０．０００１については４つの星印（＊＊＊＊）。  図５Ｄは、ＩＦＴＡ確認前（実線）、確認中（破線）および確認後（点線）のＡＮＸＡ１  ｍＲＮＡ発現についての受信者動作特性（ＲＯＣ）解析を示す。  図５Ｅは、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）腎症およびカルシニューリン阻害剤（ＣＮＩ）中毒などの他の合併症が対象に確認された日付からの時間の関数として該対象の尿中ＥＭＶ中のＡＮＸＡ１  ｍＲＮＡ発現のプロットを示す。統計的有意性をＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定により決定した：ｐ＜０．０１については２つの星印（＊＊）、ｐ＜０．００１については３つの星印（＊＊＊）、ｐ＜０．０００１については４つの星印（＊＊＊＊）。  図５Ｆは、合併症確認前（実線）、確認中（破線）および確認後（点線）のＡＮＸＡ１  ｍＲＮＡ発現についての受信者動作特性（ＲＯＣ）解析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本開示の特定の態様は、概して、患者の腎移植後の病状をモニターする低侵襲方法を対象とする。本明細書に記載の各および全ての特徴、およびこのような特徴の２つ以上の各および全ての組合せは本開示の範囲内に含まれるが、但し、このような組合せに含まれる特徴は相互に相反しない。
【００１１】
起始細胞の細胞質分子をカプセル化することにより、エキソソームおよび微小胞（ＥＭＶ）を全ネフロン領域から尿腔に遊離する。ＥＭＶは、尿中ＥＭＶ  ｍＲＮＡプロファイルとしてバイオマーカーの有望な供給源が腎機能および腎損傷を反映するものと考えられる。尿中細胞および血液などの従来の非侵襲バイオマーカー供給源と比較して、尿中ＥＭＶは、腎損傷のより早期でより明瞭な目印を含み得る。ＣＤ３ＥおよびＣＸＣＬ１０のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）発現（例えば、１８Ｓ  ｒＲＮＡレベルと比較して）は、尿から収集された細胞内で測定されたが、尿中ＥＭＶに関しては報告されなかった。また、さらなるマーカー（例えば、ＣＦＬＡＲ、ＤＵＳＰ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＴＧＡＸ、ＭＡＰＫ９、ＮＡＭＰＴ、ＮＫＴＲ、ＰＳＥＮ１、ＲＮＦ１３０、ＲＹＢＰ、ＣＥＡＣＡＭ４、ＥＰＯＲ、ＧＺＭＫ、ＲＡＲＡ、ＲＨＥＢ、ＲＸＲＡ、ＳＬＣ２５Ａ３７等）のｍＲＮＡ発現が全血液中で測定されたが、尿中ＥＭＶでは測定されなかった。腎移植後の病状のモニタリングは、長期移植片生着の管理にとって重要である。ネフロンの重症損傷後、尿中細胞は尿中に遊離されるが、尿中ＥＭＶは損傷細胞だけでなく正常細胞からも遊離される。従って、損傷細胞が尿中に遊離される前に、損傷関連の分子目印を損傷細胞から得ることができる。従って、本開示のいくつかの実施形態は、尿からのＥＭＶを活用する。
【００１２】
尿中ＥＭＶを単離する標準的方法は、超遠心分離を用いた分画遠心分離法である。しかしながら、超遠心分離の使用は、標準的臨床検査室でのルーチン臨床アッセイに適用できない可能性がある。本開示のいくつかの実施形態は、アッセイ感度、再現性および使い勝手の良さの面から標準的方法と同様またはさらにより優れている性能を可能とするバイオマーカーおよび臨床試験のための尿中ＥＭＶ  ｍＲＮＡアッセイを使用する。いくつかの実施形態は、有利に、標準的診断技術（例えば、生検）の利用より充分な期間前に、移植片移植後のモニタリングのための腎損傷マーカーをスクリーニングするこの尿中ＥＭＶ  ｍＲＮＡアッセイを使用する。
【００１３】
以下により詳細に記載するように、尿試料を小胞捕捉フィルターに通過させて、これにより超遠心分離を使用することなく、ＥＭＶを尿から単離することを可能とすることにより、尿中エキソソームを尿から単離することができる。いくつかの実施形態では、小胞捕捉材は、捕捉する小胞の大きさと比べて大きい桁である多孔性を有する。小胞捕捉材は、ＥＭＶの大きさよりずっと大きい細孔径を有するが、ＥＭＶを小胞捕捉材に吸着することによりＥＭＶを小胞捕捉材上に捕捉する。小胞捕捉材の細孔径および構造を目的に合わせて、ＥＭＶからのｍＲＮＡを小胞捕捉材から回収できるように、ＥＭＶ捕捉とＥＭＶ回収とのバランスを取る。いくつかの実施形態では、小胞捕捉材は、異なる多孔性を有する少なくとも２層を備える多層フィルターである。１つの実施形態では、第一層は、０．６〜２．７μｍ、好ましくは１．５〜１．８μｍの粒子保持率を有し、第二層は、０．１〜１．６μｍ、好ましくは０．６〜０．８μｍの粒子保持率を有する。１つの実施形態では、第一層の粒子保持率は、第二層より大きく、それにより、高粒子担持能力およびより速い流速を得ることができる。いくつかの実施形態では、尿試料は、どちらもガラス繊維製である第一層を最初に、それから第二層を通過する。第一層は１．６μｍの細孔径を有し、第二層は０．７μｍの細孔径を有する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、腎状態をモニターするために腎移植後患者の尿試料をスクリーニングするフィルターベースＥＭＶ  ｍＲＮＡアッセイを使用する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の方法を使用して、超遠心分離により尿から単離された小胞から得られるＥＭＶ  ｍＲＮＡをスクリーニングすることができる。いくつかの実施形態では、移植拒絶反応の評価の現在の標準的実践（例えば、腎生検）により腎損傷を検出できる前に、検出できる腎損傷バイオマーカーについて尿中ＥＭＶをスクリーニングする。
【００１５】
末梢血液は、多くの疾病および臓器障害に対するバイオマーカーの豊富な供給源である。しかしながら、腎臓からの損傷関連の目印を他の臓器から末梢血液中に遊離されたＥＭＶと希釈、混合してもよい。尿中ＥＭＶ  ｍＲＮＡを示し、いくつかの環境における移植後の結果を予測した。しかしながら、ＬＣＮ２（ＮＧＡＬ）、ＩＬ１８、ＨＡＶＣＲ１（ＫＩＭ１）およびＣＳＴ３（シスタチンＣ）などの試験した特定の遺伝子は、尿中タンパクバイオマーカーまたは７日目クレアチニン低下率といつも決まった相関はなかった。本明細書に開示した方法およびシステムのいくつかの実施形態は、長期移植片生着の管理にとって重要である腎移植後の病状のモニタリングに関する。
【００１６】
本開示のいくつかの態様は、早期腎損傷バイオマーカーを、腎移植を受けた患者からスクリーニングする尿中エキソソームおよび微小胞（ＥＭＶ）  ｍＲＮＡアッセイを使用する。様々なｍＲＮＡは、これに限定されないがアネキシンＡ１（ＡＮＸＡ１）を含む腎移植後の状態に関して情報を提供する。以下に説明するように、本明細書で開示した方法のいくつかの実施形態は、ＡＮＸＡ１発現レベルが、対応した腎生検（Ｎ＝１１７）のＢａｎｆｆスコアｃｉ（間質性線維症）、ｃｔ（尿細管萎縮）およびｔｉ（全間質性炎症）と線形的に相関があることを示す。安定して回復した患者と比較して、Ｔ細胞関連型拒絶反応（ＴＣＭＲ、１０．２倍）、抗体関連型拒絶反応（ＡＢＭＲ、１４．４倍）、間質性線維症および尿細管萎縮（ＩＦＴＡ、２２．０倍）および他の合併症（８．７倍）が観察された場合、尿中ＥＭＶのアネキシンＡ１（ＡＮＸＡ１）発現は増加する。移植拒絶反応の少なくとも６．５日前、ＩＦＴＡの５６日前および他の合併症の６４日前に、ＡＮＸＡ１は増加し、合併症がなくなった後高いままであった。ＲＯＣ曲線解析は、尿中ＡＮＸＡ１が移植後合併症を正確に予測、診断することが可能である：移植拒絶反応（ＡＵＣ＝０．８５７〜０．９４６）、ＩＦＴＡ（ＡＵＣ＝０．７７７〜０．９９５）および他の合併症（ＡＵＣ＝０．６９８〜０．７９７）。従って、本明細書に開示したいくつかの実施形態に従えば、尿中ＥＭＶ  ＡＮＸＡ１  ｍＲＮＡ分析を用いた方法およびシステムは、間質性線維症および尿細管萎縮の早期予測において効果的であり、移植片移植後のモニタリングに有用である。
【００１７】
尿中ＥＭＶ  ＡＮＸＡ１  ｍＲＮＡ発現レベルを、腎移植後の患者の対応する生検スコアと比較した。図１Ａ〜Ｃに示すように、尿中ＥＭＶ  ＡＮＸＡ１発現レベルは、間質性線維症（「ｃｉ」、図１Ａ）、尿細管萎縮（「ｃｔ」、図１Ｂ）、および全間質性炎症（「ｔｉ」、図１Ｃ）のＢａｎｆｆスコアと線形的に相関関係であった。図１Ｄ〜Ｏに示すように、尿中ＥＭＶ  ＡＮＸＡ１発現レベルは、尿細管炎（「ｔ」、図Ｄ）、間質の浸潤（「ｉ」、図１Ｅ）、内膜動脈炎（「ｖ」、図１Ｆ）、硝子質細動脈肥厚（「ａｈ」、図１Ｇ）、傍尿細管毛細管炎（「ｐｔｃ」、図Ｈ）、糸球体炎（「ｇ」、図１Ｉ）、血管線維化内膜肥厚（「ｃｖ」、図１Ｊ）のＢａｎｆｆスコア、硝子質細動脈肥厚（「ａａｈ」、図１Ｋ）の代替スコア、Ｂａｎｆｆ法による傍尿細管毛細血管炎（「ｐｔｃｂｍ」、図１Ｌ）、慢性糸球体症（「ｃｇ」、図１Ｍ）、補体Ｃ４ｄ染色（「ｃ４ｄ」、図１Ｎ）、およびメサンギウム基質増加（「ｍｍ」、図１Ｏ）と相関関係はなかった。従って、ＥＭＶ中のＡＮＸＡ１  ｍＲＮＡは、間質性線維症および尿細管萎縮を示す有望なバイオマーカーであり得る。
【００１８】
図２Ａ〜Ｄは、尿中ＥＭＶ  ＡＮＸＡ１  ｍＲＮＡ発現レベルが、腎移植後合併症および／または拒絶反応の従来のマーカーと相関関係を示さないことを示す。尿中ＥＭＶ  Ａ
ＮＸＡ１  ｍＲＮＡ発現は、尿タンパク濃度（図２Ａ）、尿中クレアチニン濃度（図２Ｂ）、血清クレアチニン濃度（図２Ｃ）、および推定糸球体濾過量（図２Ｄ）と相関関係を示さなかった。
【００１９】
様々なタイプの移植後合併症を有する患者および試験期間中安定な術後回復した患者について尿中ＥＭＶ中のＡＮＸＡ１  ｍＲＮＡ発現を評価した。患者が試験期間中：安定な回復（ＳＲ）、移植拒絶反応（ＴＲ）、間質性線維症および尿細管萎縮（ＩＦＴＡ）ならびに他の合併症（ＯＴＨ）と診断された合併症による４つの群に、移植後患者を分類した（図３、表１）。ＴＲ、ＩＦＴＡおよびＯＴＨ患者群について、合併症が観察された時間：Ｃｘ前、ＣｘおよびＣｘ後、に対するサンプリング時間により尿試料を３つの群に分類した（図３、表２）。ＴＲおよびＩＦＴＡ患者が、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）腎症およびカルシニューリン阻害剤（ＣＮＩ）中毒などの他の合併症を示した場合に収集した尿試料もＣｘとして分類した。Ｃｘ前試料は、試験期間中に観察された第一合併症前に収集した試料であり、Ｃｘ後は最後の合併症後のものであった。なお、ＴＲ群中のＣｘ前の相対的サンプリング時間は、第一合併症のメディアン６．５（ＩＱＲ５〜９）日前であり、ＩＦＴＡ（メディアン５６（ＩＱＲ４３〜１６８）日前）およびＯＴＨ（メディアン６４（ＩＱＲ２７〜１７７）日前）のものと比較して歪んでいたことに注目すべきである。試料収集中に観察された合併症のタイプ：ＴＣＭＲ、境界域、ＡＢＭＲ、ＩＦＴＡおよび他の合併症により、Ｃｘ試料をさらに分類した（図３）。
【表１】
0006733968.tif 000002
【表２】
0006733968.tif 000003
【００２０】
図４は、安定な回復した患者および移植後合併症を示す患者の尿中ＥＭＶ  ＡＮＸＡ１
ｍＲＮＡ発現レベルを示す。ＳＲ群のものと比較した、移植後合併症が観察された場合に得られた試料において、尿中ＥＭＶのＡＮＸＡ１の発現レベルを分析した（図４）。ＴＣＭＲ（１０．２倍に増加、ｐ＝０．０１７）、ＡＢＭＲ（１４．４倍に増加、ｐ＝０．０１５）、ＩＦＴＡ（２２．０倍に増加、ｐ＝４．３×１０−１６）および他の合併症（８．７倍に増加、ｐ＝２．２×１０−５）において、ＡＮＸＡ１レベルの増加が観察された。一方、ＡＮＸＡ１は、境界域において少なくとも２．６倍に増加したが、統計的有意性は観察されなかった。
移植片移植後のモニタリングにおいてＡＮＸＡ１の予測値および予後値を評価するため、ＴＲ、ＩＦＴＡおよびＯＴＨ患者の尿試料をサンプリング時間により分類して解析した。ＳＲ患者と比較して、ＴＲ患者は、第一合併症の少なくともメディアン６．５（ＩＱＲ５〜９）日においてＡＮＸＡ１レベルの増加を示し、最後の合併症後メディアン２８８．５（ＩＱＲ２２２．５〜３４６．８）日間高いままであった（図４Ａ）。ＲＯＣ曲線解析は、ＡＮＸＡ１の発現レベルがＴＲ患者をＡＵＣ＝０．９４６（Ｃｘ前）、０．８５７（Ｃｘ）、および０．９４０（Ｃｘ後）を有するＳＲから区別できることを示した（図４Ｂ、表３）。
【００２１】
ＩＦＴＡおよびＯＴＨ患者も、ＴＲ患者と同様に、サンプリング時間に依存しないＡＮＸＡ１の増加を示した。しかしながら、ずっと早くまたは少なくとも、第一合併症の、それぞれ中央値で５６（ＩＱＲ４３〜１６８）日前および６４（ＩＱＲ２７〜１７７）日前に増加が観察された（図４Ｃ、４Ｅ）。ＲＯＣ曲線解析は、ＡＮＸＡ１が、ＴＲ患者：ＡＵＣ  ０．７７７（Ｃｘ前）、０．９０６（Ｃｘ）、および０．９９５（Ｃｘ後）と匹敵する感受性および特異性を有するＳＲ患者からＩＦＴＡ患者を区別できることを示した（図４Ｄ、表３）。一方、ＯＴＨ患者は、他の合併症群と比較して感受性および特異性が低いが、なお得られたＡＵＣは、０．６９８〜０．７９７であった（図３Ｅ、表３）。
【表３】
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【００２２】
本開示のいくつかの実施形態では、ＡＮＸＡ１の上方制御は、腎状態の生検再検査の必要性を示すことができる。ＡＮＸＡ１が移植後合併症間を区別しなかったが、尿中ＥＭＶ
ＡＮＸＡ１  ｍＲＮＡのレベル上昇は、現在の実践より少なくとも６．５日早く移植片拒絶反応を予測することができ、それぞれ少なくとも５６日および６４日早くＩＦＴＡおよび他の合併症を予測することができる。生検の傷害性および侵襲性を考慮すれば、本開示の方法は、生検の使用を、尿中ＥＭＶ中ＡＮＸＡ１  ｍＲＮＡ発現のレベル上昇により生検が示される場合の局面に限定することにより、腎移植後合併症の早期治療を援助することができる。
【００２３】
上記説明したように、本明細書では、特定のマーカーの発現レベルを検出および決定するために、血液または尿試料から核酸を評価するいくつかの実施形態を提供する。いくつかの実施形態では、マーカーの発現の決定は、疾病または病状、例えば、腎損傷の診断を可能とする。いくつかの実施形態では、該決定を使用して病状の重症度を測定し、適切な治療計画を立てて実行する。いくつかの実施形態では、それから、検出されたバイオマーカーを使用して適切な治療レジメンを作成する。しかしながら、いくつかの実施形態では、該治療は、さらなる行動（例えば、治療を開始しない）を取り得ない。いくつかの実施形態では、方法をコンピュータ処理する（例えば、ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ生成、または増幅の１つ以上をコンピュータにより全体または部分的に制御する）。いくつかの実施形態では、バイオマーカーの検出はリアルタイムである。
【００２４】
上記のように、方法の特定の態様は、必要に応じてコンピュータ処理する。また、いくつかの実施形態では、発現量は、その時に行うべき治療がないという決定をもたらし得る。従って、いくつかの実施形態では、本明細書に開示の方法は、不必要な医療費も減らし、その時に必要としない治療による副作用の可能性も低減する。
【００２５】
いくつかの実施形態では、生体試料を収集した後（例えば、尿試料）、膜粒子、細胞、
エキソソーム、エキソソーム様小胞、微小胞および／または対象の他の生体成分を、該試料のろ過により単離する。いくつかの実施形態では、収集した試料のろ過は、フィルター上に、膜粒子、細胞、エキソソーム、エキソソーム様小胞、および微小胞の１つ以上を捕捉するだろう。いくつかの実施形態では、小胞捕捉材は、生体試料から所望の小胞を捕捉する。従って、いくつかの実施形態では、小胞捕捉材を該材料の細孔（または他の小胞捕捉材を貫通する道）径に基づいて選択する。いくつかの実施形態では、小胞捕捉材はフィルターを含んでなる。
【００２６】
いくつかの実施形態では、フィルターは細孔を含んでなる。本明細書で使用するとき、「細孔」または「細孔（複数）」という語は、その通常の意味を与えられるべきであり、また、小胞捕捉材を貫通する直接的または回旋状通路を表す。いくつかの実施形態では、フィルターを構成する材料は、フィルターを貫通する間接的通路を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、小胞捕捉材は、繊維中の隙間を貫通する特定の物質の通過を可能とするが、それ自体は細孔を有さない複数の繊維を含んでなる。例えば、ガラス繊維フィルターは、直径約１．６ミクロン以上の大きさを有する粒子を保持するように構成されたメッシュ様構造を有し得る。本明細書において互換的に、このようなガラス繊維フィルターを１．６ミクロンの細孔径を有する、または直径約１．６ミクロン以上である成分を捕捉する材料を含んでなると呼んでもよい。しかしながら、上記説明したように、フィルターにより捕捉されるＥＭＶは、ガラスフィルターの細孔径より小さい桁の大きさである。従って、本明細書において、フィルターを、直径約１．６ミクロン以上である成分を捕捉する材料を含んでなると記載し得るが、これらの小さい成分がフィルターに吸着し得るので、かかるフィルターはより小さい直径を有する成分（例えば、ＥＭＶ）を捕捉し得る。
【００２７】
いくつかの実施形態では、フィルターは、直径約１．６ミクロン以上である成分を捕捉する材料を含んでなる。いくつかの実施形態では、複数のフィルターを使用して特に好ましい範囲の大きさ（例えば、直径）以内の小胞を捕捉する。例えば、いくつかの実施形態では、フィルターを使用して、約０．２ミクロン〜約０．４ミクロン、約０．４ミクロン〜約０．６ミクロン、約０．６ミクロン〜約０．８ミクロン、約０．８ミクロン〜約１．０ミクロン、約１．０ミクロン〜約１．２ミクロン、約１．２ミクロン〜約１．４ミクロン、約１．４ミクロン〜約１．６ミクロン（および記載したこれらの間のいずれもの大きさ）を含む直径約０．２ミクロン〜約１．６ミクロンの直径を有する小胞を捕捉する。他の実施形態では、小胞捕捉材は、約０．５ミクロン〜１．０ミクロンの大きさの範囲のエキソソームを捕捉する。
【００２８】
いくつかの実施形態では、フィルター（またはフィルター（複数））は、ガラス様材料、非ガラス様材料、またはその組合せを含んでなる。いくつかの実施形態では、小胞捕捉材がガラス様材料を含んでなる場合、小胞捕捉材は、プラスチックまたはガラスのように、原子スケールで不規則または「非晶質」である構造を有する。ガラス様材料としては、ガラスビーズもしくは繊維、シリカビーズ（または他の構造）、ニトロセルロース、ナイロン、ポリフッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）もしくは他の同様な重合体、金属もしくはナノ金属繊維、ポリスチレン、エチレン酢酸ビニルもしくは他の共重合体、天然繊維（例えば、絹）、アルギン酸繊維、またはその組合せが挙げられるが、これに限定されない。特定の実施形態では、小胞捕捉材は、必要に応じて、複数の層の小胞捕捉材を含んでなる。他の実施形態では、小胞捕捉材は、ニトロセルロースをさらに含んでなる。
【００２９】
いくつかの実施形態では、フィルター機器を使用して対象の生体成分を単離する。いくつかの実施形態では、該機器は：入口および出口、ならびに入口および出口の間の内部容積を有する第一本体；入口および出口、入口および出口の間の内部容積、第二本体の内部容積内に配置され、第一本体と流体連通するフィルター材を有する第二本体；ならびに入口、入口反対側の閉端および内部空洞を有する受け容器を備える。いくつかの実施形態で
は、第一本体および第二本体は、第二本体の入口と第一本体の出口との相互作用により可逆的に連結する。いくつかの実施形態では、受け容器の内部空洞は、第一本体および第二本体の両方を可逆的に囲い込み、第一本体の内部容積からフィルター材を貫通し、第二本体の内部空洞を通過して第二本体の出口から出て通った後に収集した試料を受けるような寸法である。いくつかの実施形態では、単離工程は、かかる機器内に収集した試料の少なくとも一部を入れて、機器に力を印加して収集した試料を、機器を通過させて受け容器に渡し対象の生体成分を捕捉させることを含む。いくつかの実施形態では、力の印加は、機器の遠心分離を含む。他の実施形態では、力の印加は、機器に対して正圧を印加することを含む。他の実施形態では、力の印加は、機器に対して真空圧を印加することを含む。かかるフィルター機器の例は、国際公開第２０１４／１８２３３０号および国際公開第２０１５／０５０８９１号に開示されており、これらは参照することにより本明細書に組み入れられるものとする。
【００３０】
いくつかの実施形態では、収集した試料を複数のフィルターを通過させて対象の生体成分を単離する。他の実施形態では、生体成分の単離は、収集した試料の希釈を含む。他の実施形態では、遠心分離を使用して対象の生体成分を単離してもよい。いくつかの実施形態では、複数の単離技術を使用してもよい（例えば、ろ過選別および／または密度勾配遠心分離の組合せ）。いくつかの実施形態では、収集した試料を単離工程後１つ以上の試料に分離する。
【００３１】
いくつかの実施形態では、測定のため、ＲＮＡを対象の生体成分から遊離する。いくつかの実施形態では、対象の生体成分からＲＮＡを遊離することは、膜粒子、エキソソーム、エキソソーム様小胞、および／または微小胞を、溶解バッファーを用いて溶解することを含む。他の実施形態では、遠心分離を使用してもよい。いくつかの実施形態では、膜粒子、エキソソーム、エキソソーム様小胞、微小胞および／または対象の他の成分をフィルターに固定化しながら、該遊離を行う。いくつかの実施形態では、膜粒子、エキソソーム、エキソソーム様小胞、微小胞および／または対象の他の成分を、収集した試料の他の成分から（および／またはもう一方の−例えばエキソソームから分離した小胞）単離さもなければ分離する。
【００３２】
様々な実施形態に従えば、ノーザンブロット解析、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、他の定量ＰＣＲ技術、ＲＮＡシークエンシング、核酸配列ベース増幅法（ＮＡＳＢＡ法）、分岐ＤＮＡ増幅法、質量分析法、ＣＨＩＰシークエンシング、ＤＮＡまたはＲＮＡマイクロアレイ解析および／または他のハイブリダイゼーションマイクロアレイを含むＲＮＡを定量するための様々な方法を使用する。これらの実施形態のいくつかまたは代替の実施形態では、増幅したＤＮＡを生成後、対象のバイオマーカーの部分に補完するプローブに暴露する。
【００３３】
いくつかの実施形態では、コンピュータ処理された方法を使用して１つ以上の工程を完了する。いくつかの実施形態では、コンピュータ処理された方法は、単離したＲＮＡおよび／または調製したｃＤＮＡ、ポリメラーゼおよび遺伝子特異的プライマーを含んでなる反応混合物を熱サイクルに暴露することを含む。いくつかの実施形態では、反応混合物を暴露する温度、およびサイクル数を制御するように構成されたコンピュータにより熱サイクルを生成する。他の実施形態では、コンピュータは時間のみを制御または反応混合物の温度のみを制御し、個人が１つ以上に追加の変数を制御する。いくつかの実施形態では、検出工程からデータを受取り、バイオマーカーに必要な熱サイクル数を検出して、対象が腎損傷を患っているかまたは腎移植拒絶反応を示しているかを識別するために所定の増幅閾値に達するように構成されたコンピュータを使用する。さらに追加の実施形態では、全試験および検出過程を自動化する。
【００３４】
例えば、いくつかの実施形態では、完全に自動化した方法、例えば、コンピュータプロセッサーおよび関連する自動機械により制御された方法により、ＲＮＡを単離する。１つの実施形態では、尿試料などの生体試料を収集し、試料処理ユニット中に配置された受け容器中に投入する。使用者は試料同定、試料量および／または特定患者の特徴などの情報をデータ入力レシーバーに入力する。いくつかの実施形態では、使用者はグラフィカルユーザーインターフェースを使用してデータを入力する。他の実施形態では、データ入力を自動化する（例えば、バーコード、ＱＲコード、または他の図形識別子による入力）。それから、使用者はＲＮＡ単離プロトコールを実行でき、このために、アルゴリズムにアクセスして小胞などの生体成分を単離するために試料を処理する関連機能を実行し、その後、小胞を処理してＲＮＡを遊離するようにコンピュータを構成する。さらなる実施形態では、プログラムを実行したコンピュータは単離したＲＮＡ量を定量および／または純度を評価することができる。このような実施形態では、量および／または純度は最低閾値を上回るべきであり、ＲＮＡを自動的にさらに処理して相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成することができる。それから、例えば、ポリＡ  ＲＮＡ鎖をオリゴｄＴ分子に結合した後ＲＮＡポリメラーゼを用いて伸長するなど、確立された方法を用いて、ｃＤＮＡを生成することができる。他の実施形態では、量および／または純度が最低閾値を超えない場合、プログラムを実行したコンピュータは、使用者が追加の生体試料（複数可）を提供するように促すことができる。
【００３５】
実施形態に依存して、ｃＤＮＡを個別の小口試料に分割することができ、いくつかは後で行う分析用に貯蔵し、いくつかは直ぐに分析する。いくつかの実施形態では、分析は、既知量のｃＤＮＡを塩ベース緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼ、および少なくとも１つの遺伝子特異的プライマーと混合して反応混合物を生成することを含む。それから、ｃＤＮＡを、コンピュータシステムを実行するように構成する所定の熱サイクルプログラムを用いて増幅することができる。同様に、この熱サイクルを必要に応じて手動で制御することもできる。増幅（例えば、リアルタイムＰＣＲ）後、コンピュータシステムは、発現の特定の閾値を上回るために対象の遺伝子（例えば、腎損傷または腎移植拒絶反応のマーカー）が必要なサイクル数を評価することができる。それから、データ解析プロセッサは、この評価を使用して元試料中に存在する対象の遺伝子数を算出することができ、異なる患者試料、既知コントロール、またはその組合せのいずれかと比較することにより、対象の遺伝子の発現レベルを算出することができる。データ出力プロセッサは、別の許容できるフォーマットで電子的に、試験施設および／または直接医療提供者のいずれかにこの情報を提供することができる。それから、この決定に基づいて、医療提供者は、腎損傷または腎移植拒絶反応の存在の決定に基づいた特定の患者を治療するか、および如何に治療するかを決定することができる。いくつかの実施形態では、リアルタイムに発現データを生成し、必要に応じて、リアルタイムに医療提供者（または他の受取人）に送られる。
【００３６】
いくつかの実施形態では、完全または部分的に自動化した方法は、手動試験方法より速い試料処理および分析を可能とする。特定の実施形態では、機械または試験機器は、医師または検査技師は通常の病院または実験室環境の外で試験を完了し得るように携帯型および／または移動可能型であってもよい。いくつかの実施形態では、移動可能型アッセイ機器は、アッセイパラメーターをアッセイ機器に入力および／またはさらに処理するためにアッセイ機器から完了した試験の生結果を受けるように使用できる携帯電話またはノートパソコンなどのコンピュータを備える携帯型機器と互換性であり得る。いくつかの実施形態では、患者または他の使用者は、検査技師または医師の支援なしでコンピュータインターフェースによりアッセイ機器を使用可能であってもよい。これらの場合、患者は、「在宅」試験を行う選択肢を有することになるだろう。一定のこれらの実施形態において、特殊化したソフトウェアまたはプログラムを備えるコンピュータは、アッセイ機器内に適切に試料を入れて、試験実施命令前にコンピュータに試料関連データおよび情報を入力するように、患者を案内してもよい。全試験を完了した後、コンピュータソフトウェアは、ア
ッセイ機器から受けた生データに基づいて自動的に試験結果を算出してもよい。結果を処理することにより、いくつかの実施形態では、インターネットまたは追加の情報を有するコンピュータを供給する他の手段からのデータまたは他の出所の保存されたライブラリーからのコントロール情報と結果を比較することにより、コンピュータは追加のデータを算出してもよい。それから、コンピュータは、これらの結果に基づいて患者（および／または医療提供者、および／または試験施設）に出力を示してもよい。
【００３７】
いくつかの実施形態では、医療専門家は、患者を診断、モニターおよび／または治療するために遺伝子試験が必要であり得る。従って、いくつかの実施形態では、医療専門家は、試験を要求し、結果を使用して患者の診断または治療計画をしてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、医療専門家は、患者から試料を集めるか、さもなければ患者に試験用試料（または試料（複数））を提供させてもよい。それから、医療専門家は、試料の処理および試験実施可能な実験室または他の第三者に試料を送ってもよい。あるいは、医療専門家が、自分自身（例えば、院内）で試料の処理および試験の一部または全部を実施してもよい。試験は、尿路上皮の疾病の存在に関連するデータを含む、試料についての定量的および／または定性的情報を提供し得る。一旦、この情報を収集すれば、いくつかの実施形態では、情報をコントロール情報（例えば、ベースラインまたは正常集団）と比較して、試験結果が患者の試料とコントロールとの間で差を示しているかどうかを決定してもよい。情報は比較、解析された後、追加の解析のために医療専門家に戻される。あるいは、医療専門家または他の病院スタッフが適用可能な比較および分析を実施できるように、試験から集められた生データを医療専門家に戻してもよい。試験および医療専門家の解析結果に基づいて、医療専門家は、患者を如何に治療または診断するか（または必要に応じて治療を止めるか）を決定してもよい。
【００３８】
いくつかの実施形態では、ろ過（単独または遠心分離と併用して）を使用して異なる大きさの小胞を捕捉する。いくつかの実施形態では、タンパク質マーカーの表面発現に基づいて小胞の識別捕捉を行う。例えば、特異的表面マーカー（例えば、抗体に結合したフィルター）または特異的タイプの小胞または異なる起源の小胞と反応性があるようにフィルターを設計してもよい。いくつかの実施形態では、フィルターと遠心分離との併用はより高収率またはより高い純度の小胞を可能とする。
【００３９】
いくつかの実施形態では、マーカーは固有の小胞タンパク質またはペプチドである。いくつかの実施形態では、特定の婦人科疾患または障害は、特定の小胞の単離を可能とするように活用できる特定の小胞修飾と関連する。修飾としては、脂質、炭水化物、およびアクリル化、ホルミル化、リポイル化、ミリストイル化、パルミトイル化、アルキル化、メチル化、イソプレニル化、プレニル化、アミド化、グリコシル化、ヒドロキシル化、ヨウ化、アデニル化、ホスホリル化、硫酸化、およびセレノイル化、ユビキチン化などの他の分子の付加を挙げられ得るが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、小胞マーカーは、脂質、炭水化物、核酸、ＲＮＡ、ＤＮＡ、他などの非タンパク質を含んでなる。
【００４０】
いくつかの実施形態では、その表面マーカーに基づいた小胞の特異的捕捉は、小胞の各異なるタイプを異なる捕捉分子（例えば、異なる特異性を有する抗体）で被覆したプローブを患者の試料中に浸漬することにより捕捉する「ディップスティック」フォーマットも可能とする。
【００４１】
遊離細胞外ＲＮＡを、強力に劣化した診断マーカーにするヌクレアーゼにより迅速に分解する。上記のように、いくつかの細胞外ＲＮＡは、尿などの様々な生体試料中に見出される粒子または小胞と関連する。ｍＲＮＡを含むこの小胞関連ＲＮＡを、分解過程から保護する。微小胞は、大部分の細胞型から流れ落とされ、細胞膜の断片からなる。微小胞は、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、およびタンパク質を含有し、それらが流れ落とさ
れた細胞の組成を映す。エキソソームは、広範な哺乳類細胞により分泌される小さな微小胞であり、正常および病的状態下で分泌される。これらの小胞は、特定のタンパク質ならびにｍＲＮＡおよびマイクロＲＮＡを含むＲＮＡを含有する。いくつかの実施形態は、とりわけ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｔＲＮＡ、および低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）などの核酸を評価する。
【００４２】
いくつかの実施形態では、患者の尿の小胞から単離されたＲＮＡを鋳型として使用し、例えば、逆転写酵素の使用により相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を製造する。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅する。他の実施形態では、核酸配列ベース増幅法（ＮＡＳＢＡ法）または核酸のプライマー依存性連続増幅、またはリガーゼ連鎖反応などのいずれもの適切な増幅技術によって、核酸およびＲＮＡの増幅を行ってもよい。例えば、ノーザンブロット解析、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ、ＲＮＡシークエンシング、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ法、分岐ＤＮＡ増幅法、ＥＬＩＳＡ、質量分析法、ＣＨＩＰシークエンシング、およびＤＮＡまたはＲＮＡマイクロアレイ解析などを含む他の方法を使用して、核酸を定量してもよい。
【００４３】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡからｃＤＮＡ合成を起こす方法およびＰＣＲを用いたｃＤＮＡの増幅により、ｍＲＮＡを定量する。１つの好ましい実施形態では、マルチウェルフィルタープレートを溶解バッファーおよび洗浄バッファーで洗浄する。それから、ｃＤＮＡ合成バッファーをマルチウェルフィルタープレートに添加する。マルチウェルフィルタープレートを遠心分離することができる。ＰＣＲプライマーをＰＣＲプレートに添加し、ｃＤＮＡをマルチウェルフィルタープレートからＰＣＲプレートに移動する。ＰＣＲプレートを遠心分離して、リアルタイムＰＣＲを開始する。
【００４４】
別の好ましい実施形態は、ｍＲＮＡハイブリダイゼーションまたはｃＤＮＡ合成中の特異的アンチセンスプライマーの適用を含んでなる。いくつかの実施形態では、過剰のアンチセンスプライマーをｃＤＮＡ合成中に取り除いて持ち越し効果を避け得るように、ｍＲＮＡハイブリダイゼーション中にプライマーを添加することが好ましい。オリゴ（ｄＴ）および特異的プライマー（ＮＮＮＮ）は、ポリＡ  ＲＮＡ上の異なる位置においてｃＤＮＡ合成を同時にプライムする。特異的プライマー（ＮＮＮＮ）およびオリゴ（ｄＴ）は、増幅中にｃＤＮＡ生成を引き起こす。各ウェルの加熱によりＧｅｎｅＰｌａｔｅから特異的プライマー由来ｃＤＮＡを取り出す場合でさえ、熱変性過程（例えば、ＴａｑＭａｎ定量ＰＣＲを用いて）から得られた特異的ｃＤＮＡ量は、非加熱ネガティブコントロールから得られた量と同様である。これは、熱変性過程を完全に省くことを可能とする。さらに、異なる標的用の複数のアンチセンスプライマーの添加により、ｃＤＮＡのアリコットから複数の遺伝子を増幅することができ、ＧｅｎｅＰｌａｔｅ中のオリゴ（ｄＴ）由来ｃＤＮＡを今後の使用のために貯蔵することができる。
【００４５】
追加の実施形態は、尿（または他の体液）からｍＲＮＡの高スループット定量化のための機器を含む。該機器は：複数試料送達ウェル、該試料送達ウェル下部のエキソソーム捕捉フィルター（または対象の別の生体成分を対象にするフィルター）、およびｍＲＮＡ捕捉ゾーンのウェル内に固定オリゴ（ｄＴ）を含有する該フィルター下のｍＲＮＡ捕捉ゾーンを含むマルチウェルフィルタープレートを備える。エキソソーム収集効率を増大するために、いくつかのろ過膜を積み重ねることができる。
【００４６】
いくつかの実施形態では、増幅は、エキソソーム由来ＲＮＡおよびコントロールＲＮＡを用いてリアルタイム定量ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ）を実行することを含む。いくつかの実施形態では、Ｔａｑｍａｎアッセイを使用する。Ｔａｑポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性をポリメラーゼ連鎖反応生成物検出システムにおいて使用して増幅と同時
に特異的検出可能なシグナルを生成する。３'末端において伸長不能、５'末端において標識化、かつ標的配列内でハイブリダイズするように設計されたオリゴヌクレオチドプローブを、ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ中に導入する。増幅の途中でポリメラーゼ連鎖反応生成物の鎖の１本にプローブをアニーリングすることにより、エキソヌクレアーゼ活性に適切な基質を生成する。増幅中、Ｔａｑポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性は、該プローブを、未分解プローブから識別できるより小さな断片に分解する。他の実施形態では、方法は：（ａ）試料を含むＰＣＲアッセイに、標的核酸の領域を相補する配列を含む少なくとも１つの標識化オリゴヌクレオチドを準備することであって、該標識化オリゴヌクレオチドが工程（ｂ）のオリゴヌクレオチドプライマーにより結合された標的核酸配列内にアニールする前記少なくとも１つの標識化オリゴヌクレオチドを準備すること；（ｂ）第一プライマーが標的核酸配列の１つの鎖中の領域を相補する配列を含み、相補ＤＮＡ鎖の合成をプライムし、第二プライマーが標的核酸配列の第二の鎖中の領域を相補する配列を含み、相補ＤＮＡ鎖の合成をプライムし；および、各オリゴヌクレオチドプライマーが同じ核酸鎖にアニールしたいずれかの標識化オリゴヌクレオチドの上流のその相補鋳型にアニールするように選択される、１組のオリゴヌクレオチドプライマーを準備すること；（ｃ）（ｉ）プライマーおよび標識化オリゴヌクレオチドを標的領域内に含まれる鋳型核酸配列にアニールすること、および（ｉｉ）前記核酸ポリメラーゼがプライマー伸長生成物を合成する一方で、核酸ポリメラーゼの５'→３'ヌクレアーゼ活性が標識化オリゴヌクレオチドを含んでなるアニールした二本鎖およびその相補鋳型核酸配列から標識化断片を同時に遊離することにより、検出可能な標識化断片を作製する、プライマーを伸長すること、のＰＣＲサイクリング工程を許容する条件下鋳型依存重合化剤として５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを使用して標的核酸配列を増幅すること；ならびに（ｄ）標識化断片の遊離を検出および／または測定して試料中の標的配列の存在または非存在を決定すること、を含む。
【００４７】
代替の実施形態では、標識の発光を修飾するように標識と相互作用するＤＮＡ結合化合物の存在下で反応を行い、発光標識で標識化した一本鎖オリゴヌクレオチドプローブの切断をもたらす反応を提供するＴａｑｍａｎアッセイを使用する。該方法は、プローブの分解から結果として起こる標識化プローブの発光変化を利用する。該方法は、概して、オリゴヌクレオチドプローブの切断をもたらす反応を利用するアッセイに、特に、ハイブリダイズしたプローブをプライマー伸長と同時に切断する均一な増幅／検出アッセイに適用することができる。増幅された標的の蓄積の同時検出および標的配列の配列特異的検出を可能とする均一な増幅／検出アッセイが提供される。
【００４８】
代替の実施形態では、リアルタイムＰＣＲフォーマットを使用してもよい。１つのフォーマットは、ＳＹＢＲグリーンなどの挿入色素を使用する。この色素は、二本鎖ＤＮＡと結合時に強力な蛍光シグナルを提供し；このシグナルは増幅ＤＮＡの定量化を可能とする。このフォーマットは増幅の配列特異的モニタリングを可能にしないが、標識化プローブなしで増幅ＤＮＡの直接的定量化を可能とする。同様に使用し得る他のこのような蛍光色素は、ＳＹＢＲゴールド、ＹＯ−ＰＲＯ色素およびＹｏ  Ｙｏ色素である。
【００４９】
使用し得る別のリアルタイムＰＣＲフォーマットは、単位複製配列にハイブリダイズして蛍光シグナルを生成するレポータープローブを使用する。ハイブリダイゼーション事象は、プローブ上のレポーターおよびクエンチャー部分を分離するかあるいはそれらをより接近させる。プローブ自体は分解せず、反応においてレポーター蛍光シグナル自体は蓄積しない。プローブが単位複製配列にハイブリダイズする場合のレポーター蛍光シグナルの増加により、ＰＣＲ中の生成物の蓄積をモニターする。この分類のフォーマットとしては、分子指標、デュアルハイブ（dual-hybe）プローブ、ＳｕｎｒｉｓｅまたはＡｍｐｌｉ
ｆｌｕｏｒ、およびＳｃｏｒｐｉｏｎリアルタイムＰＣＲアッセイが挙げられる。
【００５０】
同様に使用し得る別のリアルタイムＰＣＲフォーマットは、いわゆる、「Ｐｏｌｉｃｅｍａｎ」システムである。このシステムでは、プライマーは、ＦＡＭなどの蛍光部分、および該プライマーの３'末端において少なくとも１つのヌクレオチド塩基と共有結合した
、ＴＡＭＲＡなどの蛍光部分の蛍光をクエンチ可能なクエンチャー部分を含んでなる。３'末端において、プライマーは、少なくとも１つのミスマッチ塩基を有し、従って、その
塩基における核酸試料または塩基を相補しない。Ｐｆｕ酵素などの３'−５'エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いたＰＣＲにより、鋳型核酸配列を増幅してＰＣＲ産物を産生する。クエンチャー部分と結合したミスマッチ塩基（複数可）を、３'−５'エキソヌクレアーゼ活性により、ＰＣＲ産物の３'末端から切断する。共有結合したクエン
チャー部分を有するミスマッチ塩基がポリメラーゼにより切断され、それ故、蛍光部分に対するクエンチング効果が取り除かれた蛍光を、ＰＣＲ中少なくとも１つの時間において検出および／または定量する。バックグラウンドより上の蛍光は、合成された核酸試料の存在を示す。
【００５１】
別の代替の実施形態は、尿試料、低張緩衝液、および溶解バッファーを機器に適用するロボット；自動真空吸引装置および遠心分離、ならびに自動ＰＣＲ装置を備える、尿などの生体液中のｍＲＮＡの高スループット定量を実行するための完全自動システムを含む。
【００５２】
開示した腎移植後疾患または病状の存在の決定方法は、上記のもの以外のｍＲＮＡの他の測定方法を使用してもよい。使用し得る他の方法としては、例えば、ノーザンブロット解析、リボヌクレアーゼプロテクション、溶液ハイブリダイゼーション法、半定量ＲＴ−ＰＣＲ、およびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが挙げられる。
【００５３】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを適切に定量するために、参照値に対して、疾病または病状のマーカーをコードするｍＲＮＡ量を比較することにより、定量を算出する。いくつかの実施形態では、参照値は、健康で疾病のない患者中に見られたｍＲＮＡ量であろう。他の実施形態では、参照値は、ハウスキーピング遺伝子の発現レベルである。特定のかかる実施形態では、βアクチン、または他の適切な参照遺伝子を、参照値として使用する。当技術分野で周知である多数の他のハウスキーピング遺伝子を、参照値として使用してもよい。他の実施形態では、究極の比較が、疾病のない（コントロール）試料からの同じマーカーと比較したとき、疾病患者からのマーカーの発現レベルであるように、補正因子としてハウスキーピング遺伝子を使用する。いくつかの実施形態では、ハウスキーピング遺伝子は、上記のものなど、組織特異的遺伝子またはマーカーである。さらに他の実施形態では、マーカーの定量が絶対数により表されるように参照値は０である。いくつかの実施形態では、疾病患者からの１つ以上のマーカーと疾病のない人からの１つ以上の他のマーカーとの発現比率を比較する。いくつかの実施形態では、発現分析の早期ステージで試料について決定可能であり得るように、参照値に対する比較をリアルタイムに行う。例えば、試料を処理してリアルタイムで参照値と比較する場合、全長分析を必要とするよりむしろ、数回のみの増幅サイクル後にマーカーの発現が参照値を超えることを決定してもよい。いくつかの実施形態では、この早期比較は、迅速な診断および治療計画を必要とする場合（例えば、腎不全または移植拒絶反応前の強い損傷を受けたまたは機能不良な腎臓の治療）など、特に役立つ。
【００５４】
代替の実施形態では、既知量のスパイク標準ＲＮＡの使用による所与の試料の全効率を決定する能力は、投与非依存的および配列非依存的である実施形態に起因する。既知量のコントロールＲＮＡの使用は、ＰＣＲ測定値を元試料中の標的ｍＲＮＡの量に換算することを可能とする。
【００５５】
いくつかの実施形態では、尿などの体液試料から標的成分（例えば、ＥＭＶ）を抽出するためにキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、捕捉機器および本明細
書に開示の方法を実行するのに有用な追加の品目を備える。いくつかの実施形態では、キットは、溶解バッファー、カオトロピック試薬、洗浄バッファー、アルコール、洗剤、またはその組合せからなる群から選択される１つ以上の試薬を備える。いくつかの実施形態では、キット試薬を個別または貯蔵容器内で提供する。いくつかの実施形態では、キット試薬をすぐ使用できる状態で提供する。いくつかの実施形態では、キット試薬を、使用前に希釈する原液の形態で提供する。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に開示の方法を実行するのに有用なプラスチックパーツ（必要に応じて滅菌または滅菌可能）を備える。いくつかの実施形態では、キットは、ラック、遠心分離管、真空マニホールド、およびマルチウェルプレートからなる群から選択されるプラスチックパーツを備える。いくつかの実施形態では、使用説明書も提供する。
【００５６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の分析をヒト患者に適用可能であるが、いくつかの実施形態では、方法は動物に適用可能である（例えば、獣医診断）。
【００５７】
いくつかの実施形態では、腎移植後の病状または疾患の存在は、１つ以上のマーカーの変化した発現を含む。いくつかの実施形態では、発現の増加または減少を、前記マーカーをコードするｍＲＮＡ量により測定する（他の実施形態では、ＤＮＡまたはタンパク質を使用して発現レベルを測定する）。いくつかの実施形態では、尿を患者から収集し直接評価する。いくつかの実施形態では、例えば、ろ過または遠心分離の使用により小胞を濃縮する。それから、単離した小胞を溶解バッファーとインキュベートし、小胞からＲＮＡを遊離し、それから、ＲＮＡを定量ＰＣＲ（または他の適切な増幅もしくは定量化技術）などの方法を用いて定量するｃＤＮＡのための鋳型として使用する。いくつかの実施形態では、患者小胞からの特異的マーカーＲＮＡのレベルを、例えば、健康な患者集団からのＲＮＡレベル、または同患者からの初期時点からのＲＮＡレベルもしくは同患者からのコントロール遺伝子などの所望のコントロールと比較する。
【００５８】
実装機構
いくつかの実施形態に従えば、本明細書に記載の方法を、１つ以上の専用コンピュータ機器により実行することができる。専用コンピュータ機器は、配線で接続して技術を実行してもよく、１つ以上の特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）もしくは技術を実行するように持続的にプログラムされたフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）などのデジタル電子機器を備えてもよく、またはファームウェア、メモリー、他の記憶装置、もしくは組合せ中にプログラム指示に従って技術を実行するようにプログラムされた１つ以上の汎用ハードウェアプロセッサを備えてもよい。このような専用コンピュータ機器は、技術を実行するように、カスタムハードワイヤードロジック、ＡＳＩＣ、またはＦＰＧＡをカスタムプログラムと組み合わせてもよい。専用コンピュータ機器は、技術を実行するように、デスクトップコンピュータシステム、サーバーコンピュータシステム、ポータブルコンピュータシステム、ハンドヘルドデバイス、ネットワークデバイスもしくは他の機器またはハードワイヤードおよび／またはプログラムロジックを組み込んだ機器の組合せであってもよい。
【００５９】
概して、ｉＯＳ、Ａｎｄｒｏｉｄ、Ｃｈｒｏｍｅ  ＯＳ、Ｗｉｎｄｏｗｓ  ＸＰ、Ｗｉｎｄｏｗｓ  Ｖｉｓｔａ、Ｗｉｎｄｏｗｓ  ７、Ｗｉｎｄｏｗｓ  ８、Ｗｉｎｄｏｗｓ  Ｓｅｒｖｅｒ、Ｗｉｎｄｏｗｓ  ＣＥ、Ｕｎｉｘ、Ｌｉｎｕｘ、ＳｕｎＯＳ、Ｓｏｌａｒｉｓ、ｉＯＳ、Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ  ＯＳ、ＶｘＷｏｒｋｓ、または他の互換性のあるオペレーティングシステムなどのオペレーティングシステムソフトウェアにより、コンピュータ機器（複数可）を制御、統合する。他の実施形態では、コンピュータ機器を、独占所有権のあるオペレーティングシステムにより制御してもよい。従来のオペレーティングシステムは、とりわけ、実行用コンピュータプロセスを制御、スケジュール化し、メモリー管理を行い、ファイルシステム、ネットワーキング、Ｉ／Ｏサービスを提供し、グラフ
ィカルユーザーインターフェース（「ＧＵＩ」）などのユーザーインターフェース機能を提供する。
【００６０】
いくつかの実施形態では、コンピュータシステムは、バスまたは情報通信用の他の通信機構、および情報処理用バスと接続したハードウェアプロセッサ、またはマルチプルプロセッサを備える。ハードウェアプロセッサ（複数可）は、例えば、１つ以上の汎用マイクロプロセッサであってもよい。
【００６１】
いくつかの実施形態では、コンピュータシステムは、ランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）などのメインメモリー、キャッシュおよび／または情報記憶用バスと接続した他のダイナミックストレージデバイスおよびプロセッサにより実行される命令を備えてもよい。プロセッサにより実行される命令の実行中、一時的変数または他の中間情報を記憶するために、メインメモリーを使用してもよい。プロセッサにアクセス可能な記憶媒体に記憶された場合、このような命令は、コンピュータシステムを、命令に定められた動作を実行するようにカスタマイズされた専用機にする。
【００６２】
いくつかの実施形態では、コンピュータシステムは、読出し専用メモリー（ＲＯＭ）または静的情報およびプロセッサに対する命令の記憶用バスと接続した他の静的記憶機器をさらに備える。磁気ディスク、光ディスク、またはＵＳＢサムドライブ（フラッシュドライブ）、他などの記憶機器を準備し、情報および命令の記憶用バスと接続してもよい。
【００６３】
いくつかの実施形態では、コンピュータ使用者に情報を表示するために、コンピュータシステムを陰極線管（ＣＲＴ）またはＬＣＤディスプレイ（またはタッチスクリーン）などのディスプレイにバス経由で接続してもよい。英数字および他のキーを備える入力デバイスを、プロセッサとの情報および命令選択の通信用バスと接続する。使用者入力デバイスの別のタイプは、プロセッサとの指示情報および命令選択通信用およびディスプレイ上のカーソル移動制御用マウス、トラックボールなどのカーソル制御、またはカーソル方向キーである。この入力デバイスは、通常、機器が平面内の位置を特定することを可能とする二軸、第一軸（例えば、ｘ）および第二軸（例えば、ｙ）の二次自由度を有する。いくつかの実施形態では、同方向の情報およびカーソル制御などの命令選択を、カーソルなしでタッチスクリーン上にタッチを受けることにより実行してもよい。
【００６４】
いくつかの実施形態では、コンピュータシステムは、コンピュータ機器（複数可）により実行される実行用ソフトウェアコードとして大容量記憶装置内に記憶され得るＧＵＩを実行するためのユーザーインターフェースモジュールを備えてもよい。例として、これおよび他のモジュールは、ソフトウェアコンポーネント、オブジェクト指向ソフトウェアコンポーネント、クラスコンポーネントおよびタスクコンポーネントなどのコンポーネント、処理、機能、属性、手順、サブルーチン、プログラムコード区間、ドライバー、ファームウェア、マイクロコード、回路、データ、データベース、データ構造、テーブル、アレイ、および変数を備えてもよい。
【００６５】
概して、本明細書で使用するとき、用語「モジュール」は、ハードウェアもしくはファームウェア中に具体化したロジック、または、例えば、Ｊａｖａ、Ｌｕａ、ＣもしくはＣ＋＋などのプログラミング言語で書かれた入口および出口を場合により有するソフトウェア命令のコレクションを表す。ソフトウェアモジュールをダイナミックリンクライブラリにインストールした実行可能プログラムにコンパイルして連係してもよく、例えば、ＢＡＳＩＣ、Ｐｅｒｌ、もしくはＰｙｔｈｏｎなどの解釈されたプログラミング言語で書いてもよい。ソフトウェアモジュールは、他のモジュールまたはそれ自体から呼び出し可能であってもよく、および／または検出された事象または割り込みに応じて呼び出してもよいと考えられるだろう。コンピュータ機器上で実行するために構成されたソフトウェアモジ
ュールを、コンパクトディスク、デジタルビデオディスク、フラッシュドライブ、磁気ディスク、またはその他の有形媒体などのコンピュータ可読媒体で、またはデジタルダウンロードとして提供してもよい（実行前にインストレーション、解凍または復号を要する圧縮またはインストール可能なフォーマットで元々記憶してもよい）。このようなソフトウェアコードを、コンピュータ機器により実行するために、実行するコンピュータ機器のメモリーデバイス上に部分的または完全に記憶してもよい。ソフトウェア命令を、ＥＰＲＯＭなどのファームウェアに埋め込んでもよい。ハードウェアモジュールは、ゲートおよびフリップフロップなどの接続されたロジックユニットからなってもよく、および／またはプログラム可能なゲートアレイもしくはプロセッサなどのプログラム可能ユニットからなってもよいとさらに考えられるだろう。本明細書に記載のモジュールまたはコンピュータ機器の機能を、好ましくはソフトウェアモジュールとして実行するが、ハードウェアまたはファームウェア内で表現してもよい。概して、本明細書に記載のモジュールは、他のモジュールと組合せたまたはその物理編成もしくは記憶にかかわらずサブモジュールに分割してもよい論理モジュールを表す。
【００６６】
いくつかの実施形態では、コンピュータシステムは、コンピュータシステムとの併用において、コンピュータシステムを専用機にするまたは専用機になるようにプログラムする、カスタマイズしたハードワイヤードロジック、１つ以上のＡＳＩＣまたはＦＰＧＡ、ファームウェアおよび／またはプログラムロジックを用いて本明細書に記載の方法を実行してもよい。１つの実施形態に従えば、本明細書の方法を、メインメモリー内に含まれる１つ以上の命令の１つ以上のシーケンスを実行するハードウェアプロセッサ（複数可）に応じてコンピュータシステムにより実行する。このような命令を、記憶機器などの別の記憶媒体からメインメモリーに読み取ってもよい。メインメモリーに含まれる命令のシーケンスの実行により、プロセッサ（複数可）に本明細書に記載の工程を実施させる。代替の実施形態では、ハードワイヤード回路をソフトウェア命令の代わりにまたはソフトウェア命令と併用して使用してもよい。
【００６７】
本明細書で使用するとき、用語「一時的でない媒体」、および同様の用語は、装置を具体的に動作させるデータおよび／または命令を記憶するいずれもの媒体を表す。このような一時的でない媒体は、非揮発性媒体および／または揮発性媒体を含んでもよい。非揮発性媒体としては、例えば、光ディスクもしくは磁気ディスク、または他のタイプの記憶機器が挙げられる。揮発媒体としては、メインメモリーなどのダイナミックメモリが挙げられる。一時的でない媒体の通常の形態としては、例えば、フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、半導体ドライブ、磁気テープ、または他の磁気データ記憶媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、他の光データ記憶媒体、孔のパターンを有するいずれもの物理媒体、ＲＡＭ、ＰＲＯＭ、およびＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ−ＥＰＲＯＭ、ＮＶＲＡＭ、その他のメモリーチップもしくはカートリッジ、ならびにそのネットワーク化バージョンが挙げられる。
【００６８】
一時的でない媒体は、伝送媒体とは異なるが、併用して使用してもよい。伝送媒体は、一時的でない媒体間の情報の伝達に関与する。例えば、伝達媒体としては、バスを含んでなる線を含む同軸ケーブル、銅線および光ファイバーが挙げられる。伝送媒体は、電波および赤外データ通信中に生じるものなど、音波または光波の形態も取り得る。
【００６９】
様々な形態の媒体は、実行のための１つ以上の命令の１つ以上のシーケンスをプロセッサに伝送することに関与し得る。例えば、初めに、遠隔コンピュータの磁気ディスクまたは半導体ドライブに命令を伝送してもよい。遠隔コンピュータは命令をそのダイナミックメモリにロードし、モデムまたはＷＡＮもしくはＬＡＮインターフェースなどの他のネットワークインターフェースを用いて電話線で命令を送信することができる。コンピュータシステム固有のモデムは電話線でデータを受けて、赤外電送機を使用してデータを赤外シ
グナルに変換することができる。赤外検知器は赤外シグナルで伝送されたデータを受けることができ、適切な回路はデータをバスに置くことができる。バスはデータをメインメモリーに伝送し、そこから、プロセッサは命令を検索して実行する。メインメモリーにより受けた命令は、命令を検索し実行してもよい。必要に応じて、プロセッサによる実行前または実行後のいずれかに記憶機器にメインメモリーにより受けた命令を記憶してもよい。
【００７０】
いくつかの実施形態では、コンピュータシステムは、バスと接続した通信インターフェースも備えてもよい。通信インターフェースは、ローカルネットワークと接続されたネットワークリンクに連結している双方向データ通信を提供してもよい。例えば、通信インターフェースは、総合デジタル通信網（ＩＳＤＮ）カード、ケーブルモデム、衛星モデム、または対応するタイプの電話線とのデータ通信接続を提供するモデムであってもよい。別の例としては、通信インターフェースは、互換ＬＡＮ（またはＷＡＮと通信するＷＡＮコンポーネント）とデータ通信接続を提供するローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）カードであってもよい。無線リンクも実行してもよい。いずれものこのような実行では、通信インターフェースは、様々なタイプの情報を表現するデジタルデータストリームを伝送する電気、電磁気または光シグナルを送受信する。
【００７１】
ネットワークリンクは、通常、１つ以上のネットワークを通って他のデータ機器にデータ通信を提供してもよい。例えば、ネットワークリンクは、ローカルネットワークを通って、ホストコンピュータまたはインターネットサービスプロバイダー（ＩＳＰ）により運用されているデータ装置への接続を提供してもよい。次いで、ＩＳＰは、現在共通に「インターネット」と呼ばれているワールドワイドパケットデータ通信ネットワークを通ってデータ通信サービスを提供する。ローカルネットワークおよびインターネットは両方デジタルデータストリームを伝送する電気、電磁気または光シグナルを使用する。コンピュータシステムへおよびコンピュータシステムからのデジタルデータを伝送する様々なネットワークを通ったシグナルおよびネットワークリンク上および通信インターフェースを通ったシグナルは、伝送媒体の例証となる形態である。
【００７２】
いくつかの実施形態では、コンピュータシステムは、ネットワーク（複数可）、ネットワークリンク、および通信インターフェースを通って、メッセージを送信し、プログラムコードを含むデータを受信する。インターネットの例では、サーバーは、インターネット、ＩＳＰ、ローカルネットワーク、および通信インターフェースを通って、要求されたアプリケーションプログラム用コードを伝送し得る。
【００７３】
受信したコードを、それを受けたときに、プロセッサにより実行してもよく、および／または記憶機器、または後で実行するために他の不揮発性記憶装置に記憶してもよい。
【実施例】
【００７４】
限定的意味よりむしろ例証の意味で見るべき下記の実施例を参照して特定の実施形態を記載する。
【００７５】
患者および試料
本試験は、市立札幌病院における施設内審査委員会により審査および承認された。腎移植患者（Ｎ＝２０５）を本発明者らの施設において腎移植を受けたものから募集した。１５ｍＬ以下のスポット尿試料（Ｎ＝４３７）を、入院および手術後検査中にインフォームドコンセントを行って収集した。試料を分析するまで−８０℃で３時間まで室温において貯蔵した。Ｂａｎｆｆ診断基準２０１１を用いてｅＧＦＲ、尿タンパクおよび腎生検に基づいて移植後合併症を診断した（付随表１）。
【００７６】
尿中ＥＭＶ  ｍＲＮＡ分析
先に記載したように、ＥＭＶ  ｍＲＮＡアッセイを行った。凍結尿試料を３７℃水浴にて解凍し、１５分間、８００ｘｇで遠心分離して尿中細胞および円柱などの大きな粒子を取り除いた。ＥＭＶを含む１０ｍＬ上澄みをエキソソーム単離チューブ（Ｈｉｔａｃｈｉ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｉｎｃ．（ＨＣＤ））による処理後、オリゴ（ｄＴ）固定マイクロプレート（ＨＣＤ）を用いてＥＭＶ溶解、ｍＲＮＡ単離およびｃＤＮＡ合成した。ＶｉｉＡ７リアルタイムＰＣＲシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、６４のｍＲＮＡを定量した。これらのバイオマーカー候補を腎拒絶反応において差次的発現されたものおよび健康な対象の尿中ＥＭＶ中の対応する発現レベル（未公表ＲＮＡ配列データ）から選択した。参照遺伝子のため、ＧＡＰＤＨおよびＡＣＴＢを分析した。これらの中で、本試験においてＡＮＸＡ１を選択した。ＡＮＸＡ１、ＧＡＰＤＨおよびＡＣＴＢのプライマー配列は下記表４中で得られる。ＡＮＸＡ１の発現レベルを、カットオフ値が６であるΔＣｔ法を用いてＧＡＰＤＨの発現レベルにより正規化した。ΔＣｔ法では、試料のＡＮＸＡ１サイクル閾値（Ｃｔ値）を、その同試料のハウスキーピング遺伝子（例えば、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ）のＣｔ値から差し引く。従って、より小さなΔＣｔ値ほど、より高いＡＮＸＡ１遺伝子発現となる。図３に示すように、安定な回復患者のΔＣｔ値は５〜６であったが、ＡＢＭＲ患者のΔＣｔ値は約２であった。このことは、ＡＢＭＲ患者においてΔＣｔ値が３〜４に低下することは、上記報告したおよそ１４倍に増加することに相当することを示している。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定において１％または５％未満のｐ値により統計的有意性を決定した。Ｒ（Ｒ  ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、バージョン３．２．０）を用いてデータ解析し、「ＲＯＣＲ」パッケージによりＡＵＣを算出した。ＰＣＲ分析用に使用するセンスおよびアンチセンスプライマーを下記表４に示す。
【表４】
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【００７７】
結論
結論として、患者の腎移植後の病状のモニタリングのための安全で効果的である革新的ストラテジーを本明細書に開示する。本願の方法は、非侵襲的であり、現在の標準的技法（例えば、生検）より前に腎移植拒絶反応および他の合併症を同定する有望な診断および予後アッセイを提供することができる。該方法は、また、現在の標準的技法より標的を絞った方法で、いつ生検を実施すべきかを示す。
【００７８】
上記開示の実施形態の特異的特徴および態様の様々な組合せまたは副組合せを行ってもよいが、それでもやはり本発明の１つ以上に含まれると理解される。さらに、実施形態に関していずれもの特定の特徴、態様、方法、特性、特有性、品質、特質、要素等の本明細書中の開示を、本明細書に記載の他の全ての実施形態で使用することができる。従って、開示された実施形態の様々な特徴および態様を、本開示された発明の様々な方法を形成するために互いに組み合わせるまたは置き換えることができると理解すべきである。従って、本明細書に開示した本発明の範囲を上記特定の開示された実施形態により限定すべきでないものとする。さらに、本発明は様々な変更、および代替の形態の影響を受けやすいが、その具体例を図で示しており、本明細書に詳細に記載する。しかしながら、本発明は開
示した特定の形態または方法に限定されないが、それとは反対に、本発明は記載した様々な実施形態および添付の請求の範囲の趣旨および範囲内である全ての変更、均等物、および代替物を包含するものとすることを理解するべきである。本明細書に開示のいずれもの方法は、必ずしも、記載した順番で実施する必要はない。本明細書に開示した方法は、開業医によりなされる特定の行為を含むが；しかしながら、明示的あるいは含蓄的のいずれかでこれらの行為のいずれもの第三者の指示も包含し得る。例えば、「疾病または病状のため対象を治療する」などの措置は、「疾病または病状のため対象の治療の管理を指示する」を含む。
【００７９】
とりわけ、「できる（ｃａｎ）」、「できる（ｃｏｕｌｄ）」、「してもよい（ｍｉｇｈｔ）」、または「してもよい（ｍａｙ）」などの条件的言語は、特に別段の指定がない限り、または使用したときの文脈内で別様に理解されない限り、概して、他の実施形態は含まないが、特定の実施形態が特定の特徴、要素および／またはステップを含むことを伝えるものとする。従って、このような条件的言語は、概して、特徴、要素および／またはステップが何らか１つ以上の実施形態に必要であることを暗示していないものとする。
【００８０】
「第一（ｆｉｒｓｔ）」、「第二（ｓｅｃｏｎｄ）」、「第三（ｔｈｉｒｄ）、「第四（ｆｏｕｒｔｈ）」、「第五（ｆｉｆｔｈ）」、「第六（ｓｉｘｔｈ）」、「第七（ｓｅｖｅｎｔｈ）」、「第八（ｅｉｇｈｔｈ）」、「第九（ｎｉｎｔｈ）」、「第十（ｔｅｎｔｈ）」、または「第十一（ｅｌｅｖｅｎｔｈ）」およびそれ以上は、特に別段の指定がない限り、または使用したときの文脈内で別様に理解されない限り、概して、いずれもの順番を表し、必ずしも、対応する通常の数の単純解釈に基づいた順番を表さない。従って、通常の数を用いる用語は別の個々を単に示し得るし、必ずしも、その間の順番を意味しないかもしれない。従って、例えば、本願で使用する第一および第二バイオマーカーは、単に２組のバイオマーカーがあることを意味し得る。すなわち、いずれもの態様において、「第一」および「第二」組のデータ間の順番の意図が必ずしもないかもしれない。
【００８１】
本明細書に開示した範囲は、いずれかおよび全ての重複部分、部分範囲、およびその組合せも包含する。「まで（ｕｐ  ｔｏ）」、「少なくとも（ａｔ  ｌｅａｓｔ）」、「より大きい（ｇｒｅａｔｅｒ  ｔｈａｎ）」、「より小さい（ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ）」、「の間（ｂｅｔｗｅｅｎ）」等の言語は記載した数を含む。「約（ａｂｏｕｔ）」または「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」などの用語が前に付く数は、記載した数を含む。例えば、「約１０ナノメートル」は、「１０ナノメートル」を含む。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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