(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニトリルヒドラターゼ産生微生物を培養するための組成物であって、糖類（ｉ）および有機酸（ｉｉ）を含み、前記糖類（ｉ）がグルコース、フルクトース、リボースおよびマンノースからなる群から選択され、前記有機酸（ｉｉ）が乳酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸およびコハク酸からなる群から選択され、前記糖類（ｉ）と前記有機酸（ｉｉ）との比が、重量で３：７〜７：３であり、前記微生物が、ロドコッカス・ロドクラウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）またはロドコッカス・ピリジノボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｉｄｉｎｏｖｏｒａｎｓ）の種に属する、前記組成物。
【請求項２】
前記微生物が、炭素供給源として前記糖類（ｉ）のみであるか、あるいは前記有機酸（ｉｉ）のみを含む組成物中で培養された同種微生物よりも増加したニトリルヒドラターゼ活性を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ニトリルヒドラターゼが、配列番号１および／または配列番号３に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ニトリルヒドラターゼが、配列番号２および／または配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１から３までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
ニトリルヒドラターゼ産生微生物を培養するための方法であって、以下：
（ａ）前記微生物と、請求項１から４までのいずれか１項に記載の組成物とを接触させるステップ；
（ｂ）前記微生物を（ａ）の前記組成物中で培養するステップ
を含み、前記微生物がロドコッカス・ロドクラウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）またはロドコッカス・ピリジノボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｉｄｉｎｏｖｏｒａｎｓ）の種に属する、前記方法。
【請求項６】
前記微生物が、炭素供給源として前記糖類（ｉ）のみであるか、あるいは前記有機酸（ｉｉ）のみを含む組成物中で培養された同種微生物よりも増加したニトリルヒドラターゼ活性を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
（ｃ）培養後に得られた前記微生物を乾燥させるステップ
を更に含む、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
ニトリルヒドラターゼ産生微生物を培養するための、請求項１から４までのいずれか１項に記載の組成物の使用であって、前記微生物がロドコッカス・ロドクラウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）またはロドコッカス・ピリジノボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｉｄｉｎｏｖｏｒａｎｓ）の種に属する、前記使用。
【請求項９】
前記微生物が、炭素供給源として前記糖類（ｉ）のみであるか、あるいは前記有機酸（ｉｉ）のみを含む組成物中で培養された同種微生物よりも増加したニトリルヒドラターゼ活性を有する、請求項８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニトリルヒドラターゼ産生微生物を培養するための方法、ニトリルヒドラターゼ産生微生物を培養するための組成物およびニトリルヒドラターゼ産生微生物を培養するための糖類と有機酸とを含む組成物の使用に関する。本発明に関連して提供されかつ使用されることができる組成物は、対応する微生物の成長およびニトリルヒドラターゼ産生の双方の誘発に特に適している。
【０００２】
ポリアクリルアミドは、凝集剤として、製紙工業における増粘剤として、三次採油における添加剤としておよび他の多くの分野で広く用いられている。ポリアクリルアミドの原材料は、典型的にはそのモノマー、アクリルアミドである。原則として、工業的規模でのアクリルアミドの製造には、２つの異なる方法、すなわち化学合成および生物学的合成があるが、反応条件がより穏和であり、固有のプロセス安全性が存在することから、生物学的合成が増えてきている。反応条件がより穏和であり、銅触媒が存在せずかつニトリルが定量的に転化されることから、生物学的合成においては、高コストの下流処理ステップ、例えば蒸留またはイオン交換を回避することができ、それによって、プラントフットプリントが大幅に減少し、プラントがより低コストとなる。
【０００３】
どちらの合成方法でも、出発物質としてはアクリロニトリルが使用される。化学合成法では銅触媒（例えば米国特許第４０４８２２６号明細書（ＵＳ  ４０４８２２６）、米国特許第３５９７４８１号明細書（ＵＳ  ３５９７４８１））が使用され、一方で生物学的合成法では、アクリロニトリルを水和する生体触媒を使用することでアクリルアミドを得ている。一般にこのような生体触媒は、酵素ニトリルヒドラターゼ（ＩＵＢＭＢ命名法、２０１４年９月３０日時点：ＥＣ  ４．２．１．８４；ＣＡＳ番号２３９１−３７−５；例えばＮＨアーゼとも呼ばれる）を産生しうる微生物である。ニトリルヒドラターゼ産生微生物は環境中に広く分布しており、該微生物にはとりわけ以下の代表例が含まれる：ロドコッカス・ロドクラウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）、ロドコッカス・ピリジノボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｉｄｉｎｏｖｏｒａｎｓ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）、ロドコッカス・ルベル（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｕｂｅｒ）、ロドコッカス・オパクス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アシドボラックス・アヴェナエ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ａｖｅｎａｅ）、アシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・パリダス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｌｌｉｄｕｓ）、バチルス・スミシー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ）、バチルス属ＢＲ４４９種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ  ＢＲ４４９）、ブラジリゾビウム・オリゴトロフィカム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、ブラジリゾビウム・ジアゾエフィシエンス（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｄｉａｚｏｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、ブラジリゾビウム・ジャポニカム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、バークホルデリア・セノセパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）、バークホルデリア・グラジオリ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌａｄｉｏｌｉ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）、クレブシエラ・ニューモニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、クレブシエラ・バリコラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ）、メソリゾビウム・シセリ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｃｉｃｅｒｉ）、メソリゾビウム・オポーチュニスタム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｕｍ）、メソリゾビウム属Ｆ２８種（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ  Ｆ２８）、モラクセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、パントエア・エンドフィティカ（Ｐａｎｔｏｅａ  ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃａ）、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、シュードモナス・クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、セラチア・リクファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、アミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ブレビバクテリウム属ＣＨ１種（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ  ＣＨ１）、ブレビバクテリウム属ＣＨ２種（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ  ＣＨ２）、ブレビバクテリウム属Ｒ３１２種（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ  Ｒ３１２）、ブレビバクテリウム・インペリアレ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｍｐｅｒｉａｌｅ）、コリネバクテリウム・ニトリロフィルス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｉｔｒｉｌｏｐｈｉｌｕｓ）、コリネバクテリウム・シュードジフテリティカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｄｉｐｈｔｅｒｉｔｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・ホフマニー（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｏｆｆｍａｎｉｉ）、ミクロバクテリウム・インペリアレ（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｍｐｅｒｉａｌｅ）、ミクロバクテリウム・スメグマチス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）、ノカルジア・グロベルラ（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｇｌｏｂｅｒｕｌａ）、ノカルジア・ロドクラウス（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）、シュードノカルジア・サーモフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、マイロテシウム・ベルカリア（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ  ｖｅｒｒｕｃａｒｉａ）、オーレオバシジウム・プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、カンジダ・ファマータ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｆａｍａｔａ）、カンジダ・ギリエルモンジィ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、クリプトコッカス・フラバス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）、クリプトコッカス属ＵＦＭＧ−Ｙ２８種（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ  ＵＦＭＧ−Ｙ２８）、デバリオマイセス・ハンセイ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｉｉ）、ゲオトリカム・カンジダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍ）、ゲオトリカム属ＪＲ１種（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｓｐ  ＪＲ１）、ハンセニアスポラ（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ）、クルイベロマイセス・サーモトレランス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピキア・クルイベリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、ロドトルラ・グルティニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、コモモナス・テストステロニ（Ｃｏｍｏｍｏｎａｓ  ｔｅｓ��ｏｓｔｅｒｏｎｉ）、パイロコッカス・アビッシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）およびパイロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）。（例えばＰｒａｓａｄ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  （２０１０），  ２８（６）：  ７２５−７４１；仏国特許第２８３５５３１号明細書（ＦＲ  ２８３５５３１）参照）。酵素ニトリルヒドラターゼは、鉄またはコバルトのいずれかに依存し（すなわち、酵素ニトリルヒドラターゼは、その活性中心に配位した鉄またはコバルトの原子のいずれかを有し）、特に、アクリロニトリルの水和によるアクリロニトリル転化を触媒してアクリルアミドを得るその能力により特徴付けられる（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （１９９８），１６：  ７３３−７３６）。
【０００４】
アクリロニトリルをアクリルアミドへ転化させるための生体触媒として作用する微生物の能力は基本的に、２つのパラメータ、すなわち該微生物の十分な成長およびそのニトリルヒドラターゼ産生速度に依存する。ニトリルヒドラターゼ産生微生物を培養するための公知の発酵方法は、いくつかの様々な問題に直面しており、例えば成長に適した高濃度の炭素または窒素供給源が酵素の産生を阻害しうること、いわゆる「カタボライト抑制（ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）」（Ｌｅｏｎｏｖａ，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  （２０００），  ８８：  ２３１−２４１）または金属イオン補因子の阻害効果（欧州特許第１２８３２５６号明細書（ＥＰ−Ｂ１  １２８３２５６）；  Ｐｅｉ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｌｅｔｔｅｒｓ  （２０１３），  ３５：  １４１９−１４２４）といった問題に直面している。こうした問題の結果として、酵素産生速度が低いこと（すなわち、微生物は概ね成長するが、依然として低い酵素産生速度を示すこと）に起因して、または微生物の成長速度が低いこと（すなわち、微生物は高い産生速度を示すが、存在する微生物が依然として少なすぎること）に起因して、所与の期間内でのニトリルヒドラターゼ活性率が低くなる。
【０００５】
したがって、短時間で高収率のニトリルヒドラターゼ活性を得ることができるニトリルヒドラターゼ産生微生物の培養方法が求められている。
【０００６】
対象となるこの技術上の課題は、特許請求の範囲に定められかつ本明細書中で以下に記載および例示される本発明によって解決された。
【０００７】
本発明の要旨は、糖類と有機酸との組み合わせによって、成長と、ニトリルヒドラターゼ活性レベルによるニトリルヒドラターゼ産生速度とが増加するという驚くべき知見にある。理論に拘泥するものではないが、細胞への糖類の取り込みが有機酸によって改善されるものと考えられる。
【０００８】
したがって本発明は、ニトリルヒドラターゼ（ＮＨアーゼ）産生微生物を培養するための方法であって、以下：
（ａ）前記微生物と、糖類（ｉ）および有機酸（ｉｉ）を含む水性組成物とを接触させるステップ；
（ｂ）（ａ）の前記水性組成物中で前記微生物を培養するステップ
を含む前記方法に関する。
【０００９】
本発明はさらに、本明細書中に記載および提供される培養方法から得られるまたは該方法によって得ることができる微生物に関する。
【００１０】
本発明はさらに、ニトリルヒドラターゼ産生微生物を培養するための組成物であって、糖類（ｉ）と有機酸（ｉｉ）とを含む前記組成物に関する。
【００１１】
本発明はさらに、ニトリルヒドラターゼ産生微生物を培養するための、糖類（ｉ）と有機酸（ｉｉ）とを含む組成物の使用に関する。
【００１２】
以下で、本発明により記載および提供される方法、組成物およびかかる組成物の使用の単一の特徴（例えばニトリルヒドラターゼ、微生物、組成、糖類、有機酸など）をさらに定義および規定するに当たり、このような定義および規定は、本明細書中に記載および提供される本発明の方法、本発明の組成物およびかかる組成物の本発明の使用のいずれにも適用されるものとする。
【００１３】
本発明の知見により判明した通り、ある糖類は、有機酸と組み合わせた場合に、他のものよりもニトリルヒドラターゼ活性を増加させる能力が高い（例えば微生物の高度の成長と高度の酵素産生とを可能にする）ものと考えられる。したがって一実施形態において、本発明に関連して提供されかつ使用されることができる組成物に含まれる糖類（ｉ）は、単糖類である。さらに本発明に関連して、糖類（ｉ）は、炭素原子数が少なくとも５、好ましくは少なくとも６の糖類であることができる。一実施形態において、糖類（ｉ）中の炭素原子数は、６である。本明細書中で提供されかつ本発明に関連して使用されることができる組成物に含まれる糖類の具体例としては、グルコース、フルクトース、リボースおよびマンノースが挙げられ、好ましくはグルコース、フルクトースまたはマンノースが挙げられる。一実施形態において、糖類（ｉ）は、グルコースである。
【００１４】
本明細書中で提供されかつ本発明に関連して使用されることができる組成物に含まれる有機酸（ｉｉ）は、例えば３個以下のカルボキシル基、好ましくは２個以下のカルボキシル基、最も好ましくは１個以下のカルボキシル基を含む有機酸であることができる。このような有機酸は、本発明によれば、本明細書中および実施例においてさらに記載および例示されるように、ニトリルヒドラターゼ活性を増加させる能力が特に高いことが判明した。有機酸（ｉｉ）は、サイズにおいては総じて限定されないが、有機酸（ｉｉ）は、例えば６個以下の炭素原子、好ましくは４個以下の炭素原子、最も好ましくは３個以下の炭素原子を含むことができる。本発明に関連する有機酸の特定の例としては、乳酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸およびコハク酸が挙げられる。本発明の一実施形態において、有機酸（ｉｉ）は、乳酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸およびコハク酸からなる群から選択され、好ましくは、乳酸、酒石酸、リンゴ酸およびコハク酸からなる群から選択され、より好ましくは、乳酸、酒石酸およびリンゴ酸からなる群から選択され、最も好ましくは、有機酸（ｉｉ）は、乳酸である。
【００１５】
本発明の特定の一実施形態において、本明細書中で提供されかつ本発明に関連して使用されることができる組成物に含まれる糖類（ｉ）は、グルコースであり、有機酸（ｉｉ）は、乳酸である。
【００１６】
本明細書中で提供および記載されるニトリル産生微生物の培養方法に関連して、まず、微生物と、糖類（ｉ）を含む（有機酸（ｉｉ）はまだ含まない）組成物とを、ステップ（ａ）により接触させ、次いで、ステップ（ｂ）により該微生物の培養を開始し、その後でようやく該微生物の培養中に該組成物に有機酸（ｉｉ）を添加することが可能である。またその逆に、本明細書中で提供および記載されるニトリル産生微生物の培養方法に関連して、まず、微生物と、有機酸（ｉｉ）を含む（糖類（ｉ）はまだ含まない）組成物とを、ステップ（ａ）により接触させ、次いで、ステップ（ｂ）により該微生物の培養を開始し、その後でようやく該微生物の培養中に該組成物に糖類（ｉ）を添加することも可能である。換言すれば、ちょうど培養開始時から、微生物と接触させる組成物中に糖類（ｉ）および有機酸（ｉｉ）の双方の成分が存在する必要はない。そうではなく、最終的に微生物が双方の成分を含む組成物中で培養され、それによりニトリルヒドラターゼ活性を増加させるという所望の効果が達成されるのであれば、ニトリルヒドラターゼ産生微生物の培養が開始された後に成分（ｉ）および（ｉｉ）の一方または双方を組成物に添加することも可能である。
【００１７】
本明細書中で提供されかつ本発明に関連して使用されることができる組成物に含まれる糖類（ｉ）と有機酸（ｉｉ）との比は、総じて限定されない。本明細書中で提供されかつ本発明に関連して使用されることができる組成物に含まれる糖類（ｉ）と有機酸（ｉｉ）との比（本明細書中では、常に重量／重量比として示される）の可能な例は、１：９〜９：１；２：８〜８：２；２．５：７．５〜７．５：２．５；３：７〜７：３；３．５：６．５〜６．５：３．５；４：６〜６：４；４．５：５．５〜５．５：４．５；または１：１である。一実施形態において、組成物中の糖類（ｉ）と有機酸（ｉｉ）との比は、２：８〜９：１であり、好ましくは３：７〜９：１であり、より好ましくは３：７〜８：２であり、より好ましくは３：７〜７．５：２．５であり、最も好ましくは３：７〜７：３または１：１〜７：３である。本発明に関連して、これらの比は、ニトリルヒドラターゼ産生微生物を培養するために本発明に関連して本明細書中で提供されかつ使用されることができる組成物に添加される糖類（ｉ）および有機酸（ｉｉ）のそれぞれの重量に関する。例えば、ニトリルヒドラターゼ産生微生物の培養中に組成物中の比は変化し得るが、それは、双方の成分が独立して比較的迅速にまたは比較的遅く消費または転化される場合もあれば、一方または双方の成分が培養の全過程を通して付加的な量で添加される場合もあるためである。
【００１８】
本発明の特定の一実施形態において、本明細書中で提供されかつ本発明に関連して使用されることができる組成物に含まれる糖類（ｉ）は、グルコースであり、有機酸（ｉｉ）は、乳酸であり、かつ該組成物中での糖類（ｉ）と有機酸（ｉｉ）との比は、３：７〜７：３である。
【００１９】
本発明により記載および提供されかつ使用されることができる糖類（ｉ）と有機酸（ｉｉ）とを含む組成物は、当技術分野において知られている、微生物を培養するための組成物に有用なさらなる成分をさらに含むことができる。最も好ましくは、本発明に関連して、前述の組成物は、水性組成物である。さらなる成分としては、例えば窒素供給源（例えばアンモニウム塩または硝酸塩、有機酸、例えばグルタミン酸、酵母抽出物またはタンパク質加水分解物）、リン供給源（例えば、リン酸塩。これは緩衝能をも提供しうる）、硫黄供給源（例えば硫酸塩）、コバルトおよび／または鉄の供給源（ＮＨアーゼの補因子として）、ニトリルヒドラターゼ発現のための誘導物質、例えば尿素、他の栄養素の供給源、例えばマグネシウム、カルシウム、亜鉛、マンガン、銅およびビタミンが挙げられる。
【００２０】
本明細書中に記載の、本明細書中で提供される方法の特にステップ（ｂ）に関連するニトリルヒドラターゼ産生微生物の培養は、当業者に知られている通常の方法で行われることができる。すなわち、本明細書中で提供されかつこれに関連して使用されることができる組成物は、本明細書中に記載の糖類（ｉ）および有機酸（ｉｉ）の他に、培養すべき微生物の成長および維持を可能にするために必要なさらなる成分を含むべきである。さらに、本発明に関連して培養すべき微生物の成長および維持が可能となるように、他のパラメータ、例えば温度、ｐＨ、溶存酸素濃度、圧力、通気および撹拌が設定されるべきである。これに関連して、本明細書中に記載および例示される微生物を培養するための典型的な温度は、３０℃〜４０℃、好ましくは３５℃〜３８℃、最も好ましくは３６．５℃〜３７．５℃であることができ、特に３７℃であることができる。しかし、本発明に関連して培養すべき微生物に応じて他の温度を設定することもできる。ｐＨは、発酵培地への緩衝液の供給によって、または強酸および／または塩基のフィードバック制御添加によって、６〜８、好ましくは６．５〜７．５に保たれるべきである。典型的な溶存酸素濃度値は、飽和濃度の５％〜７５％、好ましくは２０％〜４０％であることができる。
【００２１】
本発明に関連して、本明細書中に記載および提供される培養方法によりニトリルヒドラターゼ産生微生物を培養した後、培養組成物から該微生物を収集して乾燥させるかまたは他の方法で蓄積させることができる。場合によって、細胞懸濁液を、乾燥前に、例えば遠心分離または（精密濾過モードまたは限外濾過モードでの）クロスフロー濾過により濃縮することができる。発酵ブロスから残留物質を除去するために、乾燥前に細胞を水または緩衝液で洗浄することもできる。例えば、その後、微生物を、培養後に噴霧乾燥、流動層乾燥、噴霧造粒または凍結乾燥によって乾燥することができ、好ましくは噴霧乾燥または凍結乾燥によって乾燥することができる。例えば、細胞を、穏和な条件下で、例えば８０〜１５０℃、好ましくは９０〜１２０℃の入口温度と、例えば３５〜６５℃、好ましくは４０〜５０℃の出口温度とで噴霧乾燥して、残留水分を１〜１０重量％、好ましくは４〜８重量％とすることができる。
【００２２】
本発明に関連して、糖類（ｉ）と有機酸（ｉｉ）とを含む組成物を用いて培養すべきニトリルヒドラターゼ産生微生物は、本明細書中に記載の酵素ニトリルヒドラターゼを産生しうるいずれの微生物であってもよい。酵素ニトリルヒドラターゼは、鉄またはコバルトのいずれかに依存し（すなわち、酵素ニトリルヒドラターゼは、その活性中心に配位した鉄またはコバルトの原子のいずれかを有し）、特に、アクリロニトリルの水和によるアクリロニトリル転化を触媒してアクリルアミドを得るその能力により特徴付けられる（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （１９９８），１６：  ７３３−７３６）。本発明に関連して使用されることができるこのような微生物は、ニトリルヒドラターゼを天然に産生しうる微生物、すなわちニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子を天然に含む微生物であることができる。このような微生物は、ニトリルヒドラターゼを天然に産生しうる微生物であってもよいし、例えばニトリルヒドラターゼの産生が増加するように、またはニトリルヒドラターゼの安定性および／もしくは搬出が増加するように、さらに遺伝子操作された微生物であってもよい。このような微生物は、ニトリルヒドラターゼを天然には産生しえない微生物であってもよいし、ニトリルヒドラターゼが安定的に発現および産生されるようにさらに遺伝子操作された微生物であってもよい。これに関連して、ニトリルヒドラターゼを天然に産生しうる微生物は、当技術分野において知られており、該微生物にはとりわけ以下の代表例が含まれる：ロドコッカス・ロドクラウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）、ロドコッカス・ピリジノボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｉｄｉｎｏｖｏｒａｎｓ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）、ロドコッカス・ルベル（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｕｂｅｒ）、ロドコッカス・オパクス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アシドボラックス・アヴェナエ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ａｖｅｎａｅ）、アシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・パリダス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｌｌｉｄｕｓ）、バチルス・スミシー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ）、バチルス属ＢＲ４４９種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ  ＢＲ４４９）、ブラジリゾビウム・オリゴトロフィカム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、ブラジリゾビウム・ジアゾエフィシエンス（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｄｉａｚｏｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、ブラジリゾビウム・ジャポニカム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、バークホルデリア・セノセパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）、バークホルデリア・グラジオリ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌａｄｉｏｌｉ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）、クレブシエラ・ニューモニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、クレブシエラ・バリコラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｖａｒｉｉｃｏｌａ）、メソリゾビウム・シセリ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｃｉｃｅｒｉ）、メソリゾビウム・オポーチュニスタム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｕｍ）、メソリゾビウム属Ｆ２８種（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ  Ｆ２８）、モラクセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、パントエア・エンドフィティカ（Ｐａｎｔｏｅａ  ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃａ）、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、シュードモナス・クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、セラチア・リクファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、アミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ブレビバクテリウム属ＣＨ１種（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ  ＣＨ１）、ゲオバチルス属ＲＡＰｃ８種（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ  ＲＡＰｃ８）、ブレビバクテリウム属ＣＨ２種（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ  ＣＨ２）、ブレビバクテリウム属Ｒ３１２種（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ  Ｒ３１２）、ブレビバクテリウム・インペリアレ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｍｐｅｒｉａｌｅ）、コリネバクテリウム・ニトリロフィルス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｉｔｒｉｌｏｐｈｉｌｕｓ）、コリネバクテリウム・シュードジフテリティカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｄｉｐｈｔｅｒｉｔｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・ホフマニー（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｏｆｆｍａｎｉｉ）、ミクロバクテリウム・インペリアレ（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｍｐｅｒｉａｌｅ）、ミクロバクテリウム・スメグマチス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）、ノカルジア・グロベルラ（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｇｌｏｂｅｒｕｌａ）、ノカルジア・ロドクラウス（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）、シュードノカルジア・サーモフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、マイロテシウム・ベルカリア（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ  ｖｅｒｒｕｃａｒｉａ）、オーレオバシジウム・プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、カンジダ・ファマータ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｆａｍａｔａ）、カンジダ・ギリエルモンジィ（Ｃａｎｄｉｄａ  ��ｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、クリプトコッカス・フラバス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）、クリプトコッカス属ＵＦＭＧ−Ｙ２８種（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ  ＵＦＭＧ−Ｙ２８）、デバリオマイセス・ハンセイ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｉｉ）、ゲオトリカム・カンジダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍ）、ゲオトリカム属ＪＲ１種（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｓｐ  ＪＲ１）、ハンセニアスポラ（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ）、クルイベロマイセス・サーモトレランス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピキア・クルイベリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、ロドトルラ・グルティニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、コモモナス・テストステロニ（Ｃｏｍｏｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）、パイロコッカス・アビッシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）およびパイロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）。天然にはニトリルヒドラターゼを発現しない微生物、例えばエシェリキア属（例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ））は、例えばニトリルヒドラターゼを安定的に発現および産生するように遺伝子操作を行ってから、使用されてもよい。本発明の一実施形態において、ニトリルヒドラターゼ産生微生物としては、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属が代表的であり、その種、例えばロドコッカス・ロドクラウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）またはロドコッカス・ピリジノボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｉｄｉｎｏｖｏｒａｎｓ）が代表的である。これに関連して、ロドコッカス・ロドクラウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）種の代表例としては、以下の番号で寄託される株が含まれうる：ＮＣＩＭＢ  ４１１６４、ＦＥＲＭ−ＢＰ  １４７８（Ｊ１）、Ｍ３３またはＭ８。さらに本発明に関連して、ニトリルヒドラターゼ産生微生物は、ニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子を天然には含まないが、例えばニトリルヒドラターゼをコードするポリヌクレオチドを含むように操作（例えば形質転換、形質導入、トランスフェクション、コンジュゲーション、またはポリヌクレオチドを細胞に移入もしくは挿入するのに適した当技術分野において知られている他の方法による；  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ  ２００１，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  ＵＳＡ参照）され、それによって微生物がニトリルヒドラターゼ酵素を産生しうるようにされた遺伝子操作微生物であることができる。この目的のために、ニトリルヒドラターゼの遺伝子またはｍＲＮＡのそれぞれ転写および翻訳を可能にするために必要となりうるさらなるポリヌクレオチドを挿入することがさらに必要となる場合がある。そのようなさらなるポリヌクレオチドには、とりわけ、プロモーター配列、ポリＴテール、ポリＵテールもしくは複製起点、または他のプラスミド制御配列が含まれうる。これに関連して、ニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子を天然には含まないが、例えばニトリルヒドラターゼをコードするポリヌクレオチドを含むように操作されたこのような遺伝子操作微生物は、原核微生物であっても真核微生物であってもよい。そのような原核微生物の例としては、例えば大腸菌なる種が代表的である。そのような真核微生物の例としては、例えば酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））が挙げられる。
【００２３】
本発明の特定の一実施形態において、本明細書中で提供されかつ本発明に関連して使用されることができる組成物に含まれる糖類（ｉ）は、グルコースであり、有機酸（ｉｉ）は、乳酸であり、かつニトリルヒドラターゼ産生微生物は、ロドコッカス・ロドクラウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）、例えばＮＣＩＭＢ  ４１１６４またはＦＥＲＭ−ＢＰ  １４７８である。
【００２４】
本発明の他の特定の一実施形態において、ニトリルヒドラターゼ産生微生物は、ロドコッカス・ロドクラウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）であり、かつ組成物中での糖（ｉ）と有機酸（ｉｉ）との比は、３：７〜７：３である。
【００２５】
本発明のさらなる特定の一実施形態において、本明細書中で提供されかつ本発明に関連して使用されることができる組成物に含まれる糖類（ｉ）は、グルコースであり、有機酸（ｉｉ）は、乳酸であり、ニトリルヒドラターゼ産生微生物は、ロドコッカス・ロドクラウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）であり、かつ組成物中での糖（ｉ）と有機酸（ｉｉ）との比は、３：７〜７：３である。
【００２６】
本発明に関連して、「ニトリルヒドラターゼ」との用語は、アクリロニトリルからアクリルアミドへの水和を触媒することができる、すなわちニトリルヒドラターゼ活性を有する、酵素ニトリルヒドラターゼ（本明細書中では「ＮＨアーゼ」とも呼ぶ）を意味する。本発明に関連して、本発明の趣意におけるニトリルヒドラターゼの活性は、以下のようにして決定されることができる：まず、推定上のニトリルヒドラターゼを含む、細胞懸濁液、細胞溶解物、溶解酵素粉末または他のいずれかの調製物１００μｌと、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液８７５μｌと、アクリロニトリル２５μｌとを、２５℃で、エッペンドルフチューブシェーカー上で１，０００ｒｐｍで１０分間反応させる。１０分間の反応時間の後、試料を抜取り、同一容積の１．４％塩酸を添加することによって直ちにクエンチさせる。試料を混合した後、１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離することにより細胞を除去し、そして、澄明な上清みをＨＰＬＣで分析することにより、形成されたアクリルアミドの量を測定する。アクリルアミドの濃度は、０．２５〜１．２５ｍｍｏｌ／ｌでなければならず、必要であれば、それに応じて試料を希釈し、そして転化を繰り返さなければならない。ＨＰＬＣ分析から得られたアクリルアミド濃度を反応時間（これは１０分間であった）で除し、この値にＨＰＬＣ試料と元の試料との希釈係数を乗じることによって、アクリルアミドの濃度から酵素活性が推測される。活性が１０Ｕ／ｍｌを上回る、好ましくは１００Ｕ／ｍｌを上回る、より好ましくは１，０００Ｕ／ｍｌを上回る場合には、これは、機能的に発現されるニトリルヒドラターゼの存在を示し、かつニトリルヒドラターゼ活性ありと考えられ、したがって本発明に関連するニトリル水和酵素と考えられる。例えば本明細書中で使用されるニトリルヒドラターゼには、ＩＵＢＭＢ命名法（２０１４年９月３０日時点）でＥＣ  ４．２．１．８４として分類されるまたはＣＡＳ番号２３９１−３７−５として分類される酵素と、ニトリル化合物（例えばアクリロニトリル）からアミド化合物（例えばアクリルアミド）への転化（すなわち水和）を触媒することができる限り、例えばニトリル化合物（例えばアクリロニトリル）をより迅速にアミド化合物（例えばアクリルアミド）へと転化させうる、より高い収率／時間比で産生されうる、または、より安定である、修飾もしくは増強された酵素も含まれる。本発明に関連して、ニトリルヒドラターゼは、配列番号１のヌクレオチド配列（Ｒ．ロドクラウス（Ｒ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）のニトリルヒドラターゼのαサブユニット：
【００２７】
【化１】
0006714584.tif 000002
）および／または配列番号３のヌクレオチド配列（Ｒ．ロドクラウス（Ｒ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）のニトリルヒドラターゼのβ−サブユニット：
【００２８】
【化２】
0006714584.tif 000003
）と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも９９．５％、最も好ましくは１００％同一であるヌクレオチド配列を含むかまたは該ヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであることができるが、但し、前述のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、本明細書中に記載および例示されるように、アクリロニトリルからアクリルアミドへの水和を触媒することができる（すなわちニトリルヒドラターゼ活性を有する）ものである。また本発明に関連して、ニトリルヒドラターゼは、配列番号２のアミノ酸配列（Ｒ．ロドクラウス（Ｒ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）のニトリルヒドラターゼのαサブユニット：
【００２９】
【化３】
0006714584.tif 000004
）および／または配列番号４のアミノ酸配列（Ｒ．ロドクラウス（Ｒ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）のニトリルヒドラターゼのβ−サブユニット：
【００３０】
【化４】
0006714584.tif 000005
）と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも９９．５％、最も好ましくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたは該アミノ酸配列からなるポリペプチドであることができるが、但し、前述のポリペプチドは、本明細書中に記載および例示されるように、アクリロニトリルからアクリルアミドへの水和を触媒することができるものである。
【００３１】
２つ以上の配列（例えば核酸配列またはアミノ酸配列）間の同一性のレベルは、当技術分野において知られている方法、例えばＢＬＡＳＴ解析によって容易に決定することができる。総じて本発明に関連して、例えば配列比較によって比較すべき２つの配列（例えばポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列）の同一性が異なる場合には、「同一性」なる用語は、より短い配列と当該より短い配列に一致するより長い配列の一部とに関するものであることができる。したがって、比較される配列が同一の長さを有しない場合には、同一性の程度とは、好ましくは、より長い配列中のヌクレオチド残基と同一であるより短い配列中のヌクレオチド残基のパーセンテージか、またはより短い配列中のヌクレオチド配列と同一のより長い配列中のヌクレオチドのパーセンテージのいずれかを意味しうる。これに関連して、当業者は、より短い配列に一致するより長い配列の部分を容易に決定することができる。さらに、本明細書中で使用される場合に、核酸配列またはアミノ酸配列の同一性レベルは、それぞれの配列の全長に関するものであることができ、好ましくはペアごとに評価され、その際、各ギャップは１つのミスマッチとしてカウントされることができる。配列比較に関するこれらの定義（例えば「同一性」値についての規定）は、本明細書中に記載および開示されるいずれの配列にも適用されることができる。
【００３２】
さらに、本明細書中で使用される場合の「同一性」なる用語は、対応する配列間に機能的および／または構造的な等価性が存在することを意味する。本明細書中に記載の特定の核酸／アミノ酸配列に対して所与の同一性レベルを有する核酸／アミノ酸配列は、好ましくは同一の生物学的機能を有するこれらの配列の誘導体／変異体を表すことができる。これらは、天然に存在する変形、例えば他の変種、種などからの配列であってもよいし、突然変異体であってもよく、該突然変異体は、天然に形成されたものでもよいし、意図的な突然変異誘発によって生成されたものでもよい。さらに該変形は、合成により生成された配列であってもよい。該変異体は、天然に存在する変異体であってもよいし、合成により生成された変異体であってもよいし、組換えＤＮＡ技術によって生成された変異体であってもよい。上記の核酸配列からの逸脱は、例えば欠失、置換、付加、挿入および／または組換えによって生じたものであることができる。「付加」との用語が、所与の配列の末端に少なくとも１つの核酸残基／アミノ酸を付加することを意味するのに対して、「挿入」とは、所与の配列内に少なくとも１つの核酸残基／アミノ酸を挿入することを意味する。「欠失」なる用語は、所与の配列中の少なくとも１つの核酸残基またはアミノ酸残基の欠失または除去を意味する。「置換」なる用語は、所与の配列中の少なくとも１つの核酸残基／アミノ酸残基の置き換えを意味する。ここでも、本明細書中で使用される場合のこれらの定義は、本明細書中に提供および記載されるいずれの配列に対しても適用される。
【００３３】
総じて、本明細書中で使用される場合に、「ポリヌクレオチド」および「核酸」または「核酸分子」なる用語は、同義語として解釈されるべきである。総じて、核酸分子にはとりわけ、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、オリゴヌクレオチドチオホスフェート、置換リボオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡ分子が含まれうる。さらに、「核酸分子」なる用語には、当技術分野において知られているＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらのハイブリッド、またはそれらのいずれかの改変体を意味しうる（改変体の例については、例えば米国特許第５５２５７１１号明細書（ＵＳ  ５５２５７１１）、米国特許第４７１１９５５号明細書（ＵＳ  ４７１１９５５）、米国特許第５７９２６０８号明細書（ＵＳ  ５７９２６０８）または欧州特許第３０２１７５号明細書（ＥＰ  ３０２１７５）参照）。ポリヌクレオチド配列は、一本鎖であっても二本鎖であっても、線状であっても環状であっても、天然のものであっても合成のものであってもよく、またサイズの制限はない。例えばポリヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、またはそのようなＲＮＡをコードするＤＮＡもしくはキメロプラスト（ｃｈｉｍｅｒｏｐｌａｓｔ）であることができる（Ｇａｍｐｅｒ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２０００，  ２８，  ４３３２−４３３９）。前述のポリヌクレオチド配列は、ベクターの形態であっても、プラスミドの形態であっても、ウイルスＤＮＡの形態であっても、ウイルスＲＮＡの形態であってもよい。また本明細書中では、上記の核酸分子に相補的な核酸分子および本明細書中に記載の核酸分子にハイブリダイズしうる核酸分子も記載する。本明細書中に記載の核酸分子は、本発明に関連して、核酸分子の断片であってもよい。特にそのような断片は、機能的断片である。そのような機能的断片の例は、プライマーとして機能しうる核酸分子である。
【００３４】
総じて本発明は、本明細書中に記載のすべての実施形態ならびにそれらのすべての順列および組合せに関する。本明細書中に記載のいずれの特定の態様も実施形態も、本発明の範囲をそのような態様または実施形態に限定するものと解釈されてはならない。
【００３５】
以下の実施例により本発明を説明する。しかし、本発明は以下の実施例により限定されるものと解釈されてはならない。
【００３６】
実施例
実施例１
ロドコッカス亜種（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｓｐ．）の培養
マイクロ発酵システム内で、異なるロドコッカス株（Ｒ．ロドクラウス（Ｒ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）「ＣＩＢＡ」（ＮＣＩＭＢ  ４１１６４）およびＲ．ロドクラウス（Ｒ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）「Ｊ１」（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４７８））について、様々な糖／有機酸の比を評価した。
【００３７】
基本培養培地は、水において、酵母抽出物（バイオスプリンガー（Ｂｉｏｓｐｒｉｎｇｅｒ））（１．２５ｇ／ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（１０ｇ／ｌ）、Ｋ２ＨＰＯ４（１０ｇ／ｌ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（１ｇ／ｌ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．３７５ｇ／ｌ）、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（２５ｍｇ／ｌ）、微量元素溶液（２．５ｇ／ｌ）（以下参照）、Ｃｏ（ＮＯ３）２（３１．２ｍｇ／ｌ）、消泡剤Ｐ２０００（ＢＡＳＦ）（６２．５ｍｇ／ｌ）、尿素（７ｇ／ｌ）およびグルタミン酸アンモニウム（２．５ｇ／ｌ）を含んでいた。
【００３８】
微量元素溶液：水において、クエン酸一水和物（４０ｇ／ｌ）、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（１１ｇ／ｌ）、（ＮＨ４）２Ｆｅ（ＳＯ４）２・６Ｈ２Ｏ（８．５ｇ／ｌ）、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ（３ｇ／ｌ）およびＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（０．８ｇ／ｌ）。
【００３９】
次いで、この培地に、１０ｇ／ｌの炭素供給源（以下の表に示す通り、糖類、有機酸または双方の混合物）を補充した。Ｈ３ＰＯ４またはＮａＯＨを用いて、ｐＨを６．６に調整した。この培地を、凍結ストックから直接播種して、（６００ｎｍで測定した場合に）ＯＤ  ０．０５とした。培養を、作業容積１．５ｍｌの４８ウェルフラワープレートを用いて、バイオレクター（ＢｉｏＬｅｃｔｏｒ）マイクロ発酵システム（Ｍ２Ｐ  Ｌａｂｓ、ドイツ・ベスヴァイラー在）内で、１，１００ｒｐｍで３７℃で６４時間行った。培養後、試料を抜取り、塩酸でクエンチし、そして実施例２に記載したようにニトリルヒドラターゼ活性を決定した。
【００４０】
以下の表に、異なる株および糖／酸比についての相対的ニトリルヒドラターゼ活性を示す。糖類を唯一の炭素供給源として用いて達成されたニトリルヒドラターゼ活性を、１００％とした。
【００４１】
【表１】
0006714584.tif 000006
【００４２】
【表２】
0006714584.tif 000007
【００４３】
【表３】
0006714584.tif 000008
【００４４】
実施例２
ニトリルヒドラターゼ活性の測定
実施例１の培養培地から試料を採取し、５０ｍｍｏｌ／ｌのＫＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．０）で１：１０（ｖ／ｖ）で希釈した。得られた溶液をさらに、５０ｍｍｏｌ／ｌのＫＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．０）で１：２０（ｖ／ｖ）で希釈し、培養培地に対して１：２００の最終希釈率に達する。
【００４５】
反応：
ＫＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．０）８７５μｌを、ピペットで２ｍｌエッペンドルフチューブに移した。希釈した培養培地１００μｌを添加し、この混合物を、サーモミキサー中で２５℃で５００ｒｐｍで５分間プレインキュベートした。プレインキュベーション後、アクリロニトリル２５μｌの添加によって反応を開始した。この反応を、２５℃、１，０００ｒｐｍで１０分間行った。
【００４６】
試料の調製：
反応時間が１０分間経過した後、この反応溶液３００μｌを、１．４％（ｍ／ｖ）塩酸３００μｌの入った１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移すことによって、この反応をクエンチした。この混合物を短時間ボルテックス処理し、卓上遠心分離機で１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離して、細胞を分離させた。澄明な上澄み１００μｌと水９００μｌとを混合した。次いで、この混合物をＨＰＬＣで分析した。
【００４７】
ＨＰＬＣ分析：
・カラム：アクア（Ａｑｕａ）５μ  Ｃ１８  １２５Ａ、２５０×４．６０ｍｍ（フェノメネックス（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ））
・オーブン温度：４５℃
・注入量：１μｌ
・検出：ＵＶ  ２１０ｎｍ
・流量：１．０ｍｌ／分
・溶媒Ａ：２５ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４  ｐＨ２．５
・溶媒Ｂ：アセトニトリル
・分離：１０％Ｂ（イソクラティック）
・保持：アクリルアミド：約３．６分間
・ＨＰＬＣ値は、０．２５〜１．２５ｍｍｏｌ／ｌであるべきである。
【００４８】
ＨＰＬＣにより測定されるアクリルアミドの濃度は、０．２５〜１．２５ｍｍｏｌ／ｌであるべきである。このことが直接達成されない場合には、反応に使用する細胞濃度をそれに応じて調整する必要がある。
【００４９】
ニトリルヒドラターゼ活性の決定：
・ｃ：生成物の物質量［ｍＭ］（ＨＰＬＣ値）
・ｔ：インキュベーション時間［分］、本試験では１０分間
・ｋ：希釈係数  −出発試料からＨＰＬＣ試料への合計希釈
活性（ｋＵ／ｌ）の計算
・活性（ｋＵ／ｌ）＝ｃ／ｔ×ｋ
１活性単位［Ｕ］とは、反応時間１分間中にアクリルアミドが１μｍｏｌ生成されることと定義される。
【配列表】
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