(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペスチウイルスの一構成員である分離型ウイルスであって、
ａ）前記ウイルスは、豚のＧｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩ先天性振戦の原因因子であり、
ｂ）前記ウイルスは、エンベロープタンパク質Ｅｒｎｓをコードしている遺伝子、エンベロープタンパク質Ｅ２をコードしている遺伝子およびエンベロープタンパク質Ｅ１をコードしている遺伝子を含むウイルスゲノムを有し、ここで、前記Ｅｒｎｓ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号：１に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性レベルを有し、および／または前記Ｅ２遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号：３に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性レベルを有し、および／または前記Ｅ１遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号：５に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性レベルを有する、
ことを特徴とする分離型ウイルス。
【請求項２】
前記Ｅｒｎｓ遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号：１に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性レベルを有し、および前記Ｅ２遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号：３に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性レベルを有し、および前記Ｅ１遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号：５に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性レベルを有することを特徴とする、請求項１に記載の分離型ウイルス。
【請求項３】
前記Ｅｒｎｓ遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号：１に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性レベルを有し、および前記Ｅ２遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号：３に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性レベルを有し、および前記Ｅ１遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号：５に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性レベルを有し、そして前記ウイルスＲＮＡゲノムから逆転写したｃＤＮＡを、ＰＣＲ反応において配列番号：７と８に示すプライマーセットと反応させて１５６＋／−１０塩基対のＰＣＲ産物を得る、およびＰＣＲ反応において配列番号：９と１０に示すプライマーセットと反応させて３３５＋／−１０塩基対のＰＣＲ産物を得る、およびＰＣＲ反応において配列番号：１１と１２に示すプライマーセットと反応させて８９６＋／−１０塩基対のＰＣＲ産物を得る、およびＰＣＲ反応において配列番号：１３と１４に示すプライマーセットと反応させて８９６＋／−１０塩基対のＰＣＲ産物を得る、およびＰＣＲ反応において配列番号：１５と１６に示すプライマーセットと反応させて１８２＋／−１０塩基対のＰＣＲ産物を得る、およびＰＣＲ反応において配列番号：１７と１８に示すプライマーセットと反応させて１８２＋／−１０塩基対のＰＣＲ産物を得る、
ことを特徴とする、請求項１又は２に記載の分離型ウイルス。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のウイルスを含むことを特徴とする細胞培養物。
【請求項５】
Ｅｒｎｓタンパク質をコードしている遺伝子であって、そのヌクレオチド配列が、配列番号：１に示すＥｒｎｓ遺伝子のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性レベルを有することを特徴とする遺伝子。
【請求項６】
請求項５に記載の遺伝子にコードされていることを特徴とするＥｒｎｓタンパク質。
【請求項７】
Ｅ２タンパク質をコードしている遺伝子であって、そのヌクレオチド配列が、配列番号：３に示すＥ２遺伝子のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性レベルを有することを特徴とする遺伝子。
【請求項８】
請求項７に記載の遺伝子にコードされていることを特徴とするＥ２タンパク質。
【請求項９】
Ｅ１タンパク質をコードしている遺伝子であって、そのヌクレオチド配列が、配列番号：５に示すＥ１遺伝子のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性レベルを有することを特徴とする遺伝子。
【請求項１０】
請求項９に記載の遺伝子にコードされていることを特徴とするＥ１タンパク質。
【請求項１１】
Ｅｒｎｓ遺伝子が機能性異種プロモーターの制御下にあることを特徴とする、請求項５に記載のＥｒｎｓ遺伝子を含むＤＮＡ断片。
【請求項１２】
Ｅ２遺伝子が機能性異種プロモーターの制御下にあることを特徴とする、請求項７に記載のＥ２遺伝子を含むＤＮＡ断片。
【請求項１３】
Ｅ１遺伝子が機能性異種プロモーターの制御下にあることを特徴とする、請求項９に記載のＥ１遺伝子を含むＤＮＡ断片。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれかに記載のＤＮＡ断片を含む生の組換えウイルスベクター。
【請求項１５】
請求項６に記載のＥｒｎｓタンパク質、請求項８に記載のＥ２タンパク質および請求項１０に記載のＥ１タンパク質を含むことを特徴とする擬似粒子。
【請求項１６】
免疫原的有効量の請求項１〜３のいずれかに記載のウイルスおよび薬学的に許容され得る担体を含むことを特徴とする、豚のＧｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩ  ＣＴに対処するためのワクチン。
【請求項１７】
免疫原的有効量の請求項６に記載のＥｒｎｓタンパク質および／または免疫原的有効量の請求項８に記載のＥ２タンパク質および／または免疫原的有効量の請求項１０に記載のＥ１タンパク質、および、薬学的に許容され得る担体を含むことを特徴とする、豚のＧｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩ  ＣＴに対処するためのワクチン。
【請求項１８】
免疫原的有効量の請求項１５に記載の擬似粒子および薬学的に許容され得る担体を含むことを特徴とする、豚のＧｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩ  ＣＴに対処するためのワクチン。
【請求項１９】
請求項１４に記載の生の組換えウイルスベクターおよび薬学的に許容され得る担体を含むことを特徴とする、豚のＧｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩ  ＣＴに対処するためのワクチン。
【請求項２０】
請求項１１に記載のＤＮＡ断片および／または請求項１２に記載のＤＮＡ断片および／または請求項１３に記載のＤＮＡ断片、および薬学的に許容され得る担体を含むことを特徴とする、豚のＧｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩ  ＣＴに対処するためのワクチン。
【請求項２１】
豚のＧｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩ  ＣＴに対処するためのワクチンにおける使用のための、請求項１〜３のいずれかに記載のウイルスおよび／または請求項６に記載のＥｒｎｓタンパク質および／または請求項８に記載のＥ２タンパク質および／または請求項１０に記載のＥ１タンパク質および／または請求項１１に記載のＤＮＡ断片および／または請求項１２に記載のＤＮＡ断片および／または請求項１３に記載のＤＮＡ断片および／または請求項１４に記載の生の組換えウイルスベクターおよび／または請求項１５に記載の擬似粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なペスチウイルス、該ウイルスのタンパク質ならびに該ウイルスおよびそのタンパク質をベースにしたワクチンに関する。また、本発明は、該ウイルスの遺伝子を含むＤＮＡ断片および該ウイルスの遺伝子をベースにしたＤＮＡワクチンに関する。さらに、本発明は、この新規なウイルスに反応性の抗体および該ウイルスまたは該ウイルスに対する抗体の検出のための診断テストに関する。
【背景技術】
【０００２】
ここ数十年間にわたり、世界的に豚肉の消費の大きな増加がみられている。その結果、市場のニーズの高まりに応えるため、肥育舎の数とサイズの増加もみられている。家畜学一般において知られているように、大量数の動物を一緒に密な状態で生活させると、既知疾患に罹りやすくなり、および大規模な商業的肥育の時代になるまでほとんど知られていないか目撃されていないかまたはさらには未知の疾患に罹りやすくなる。
【０００３】
原因因子の同定が待たれているある疾患が、２０世紀初期以降既に存在していることが知られており、当時、ＫｉｎｓｌｅｙによりＶｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９２２；１７において「ダンス豚」と報告された。ほぼ１世紀の経過の間に、同じ症状がさまざまな名称、例えば、「豚震え病（ｓｈａｋｉｎｇ  ｐｉｇ  ｄｉｓｅａｓｅ）」、豚における振戦、先天性間代性筋痙攣（Ｍｙｏｃｌｏｎｉａ  Ｃｏｎｇｅｎｉｔａ）（１）または先天性振戦（（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｔｒｅｍｏｒ）（ＣＴ）（２）で報告されているいくつかの論文が発表されている。この疾患はさらにＣＴと称される。ＣＴの症状は新生児豚の頭と脚の振戦であり、これは、重症度はさまざまであるが寝ている間は起こらない。このような振戦は興奮および冷えによって悪化し得る。これは数週間から数ヶ月間持続するが、豚が成長するとともに低減される。震え自体が直接的に死亡を引き起こすことはないが、振戦により、子豚が乳を飲むための乳首を見つけ出すことが妨げられ得る。このため、その後、飢えによって死亡することになる場合があり得る。この疾患は広範囲に及び、世界中の養豚場で定期的に発生する。
【０００４】
ＣＴが引き起こされるいくつかの症状が知られており、現在、これらの症状は、２つのグループ；ＡとＢに分類されている。Ｇｒｏｕｐ  Ａは、組織学的病変部が視認できる症例からなるが、Ｇｒｏｕｐ  Ｂ症例では明白な病変部が示されない。Ｇｒｏｕｐ  Ａは、ＣＴの原因の違いに基づいてさらに５つの亜群に分けられる。ＣＴのＧｒｏｕｐ  Ａ−Ｉ症例は、豚コレラ（Ｃｌａｓｓｉｃａｌ  Ｓｗｉｎｅ  Ｆｅｖｅｒ）（ＣＳＦ）ウイルスによって引き起こされることが知られている。Ｇｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩＩ  ＣＴの原因は、Ｌａｎｄｒａｃｅ血統のみに存在する遺伝的（伴性）欠陥であり、一方、Ｓａｄｄｌｅｂａｃｋ血統における劣性遺伝的（常染色体関連）欠陥がＡ−ＩＶ型の原因である。Ｇｒｏｕｐ  Ａ−Ｖ症例は、多くの場合、有機リン処理飼料と関連している中毒であるトリクロルホン中毒によって引き起こされる（３，４）。
【０００５】
Ｇｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩ症例は、原因が最も難解であり、依然としてそうである。これは、未知の感染性因子によって引き起こされているのではないかと考えられている。
【０００６】
Ｇｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩ  ＣＴは、過去においてＰＣＶ感染と関連づけられていたが（５）、種々の研究により、現在では反対のものであることが示されている。例えば、ＰＣＶはＣＴの豚の神経細胞組織内には存在せず（６）、ごく少量の取るに足らない量のＰＣＶが非神経細胞組織内に見出された（４）。結局、これまでのところ、Ｇｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩ  ＣＴの原因の決定的な証拠は存在していない。しかしながら、Ｇｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩ  ＣＴは感染性因子によって引き起こされると考えるのに充分な理由がある。Ｇｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩの震えている子豚のほとんどは、最近、新しい環境に導入されたばかりの未経産豚（すなわち、受胎から最初の同腹子を産むまでの間の雌豚）の同腹子で生まれている。注目すべきことに、震えている子豚を含む最初の同腹子の後、同じ雌豚のその後の同腹子ではＣＴの徴候がほとんどみられない。これは、この雌豚において、ＣＴを引き起こす因子に対する防御を行うある種の免疫が生じていることを示すものである。およそ４０年前、Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（５０）は、臨床的罹患豚の脊髄、脳および脾臓のエマルジョンでの妊娠雌豚の実験的感染によって、なんとか子豚にＧｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩ  ＣＴを誘導しようとした。
【０００７】
しかしながら、上記のように、原因となる感染性因子は、これまでＣＴ子豚からも妊娠雌豚からも分離されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｋｉｎｓｌｅｙ  ｉｎ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９２２；１７
【非特許文献２】Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（５０）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、Ｇｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩ  ＣＴの原因因子である新しい感染性因子、ならびに該疾患に対処することを目的としたワクチンを提供することである。さらに、本発明の目的は、該疾患関連の感染性因子を検出および同定するための手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
最終的にＧｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩ  ＣＴの原因因子を検出して分離するため、Ｇｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩ  ＣＴに苦しんでいる子豚の血清および多くの場合さらなる生物材料を、２０１２年の９月から２０１４年の初めまで、オランダの８つの異なる肥育舎において採取した。これらの８つの肥育舎は子豚のＣＴ病歴を有していた（典型的には、特定の１つの肥育舎で流行のピーク中、同腹子の４匹に１匹の子豚がＣＴに苦しんでいることが発見される）。
【００１１】
オランダのある養豚場で、２０１２年初期に先天性振戦Ａ−ＩＩ型のアウトブレイクが診断された。初産動物の未経産豚から生まれた子豚が主として罹患したが、出産回数の多い雌豚もまた、たまに罹患していた。診断は、臨床観察、続いて、考えられ得る疾患原因として先天性振戦Ａ−Ｉ、Ａ−ＩＩＩ、Ａ−ＩＶおよびＡ−Ｖ型の排除に基づいて行った。臨床的罹患子豚は、活動中の過度な筋収縮による異なる等級の振戦を示した。症状は、寝ているときは減弱された。子豚の死亡は、罹患動物が自身で摂食できないこと（特に、生後、最初の１週間）によって引き起こされる副次的効果であった。組織学的に、脳と脊髄をミエリン形成不全によって特性評価した（しかしながら、罹患子豚において、常に組織学的異常がみられるわけではない。文献において、ミエリン形成不全の程度はさまざまであるとも報告されている）。以下にさらに記載するように、すべての罹患豚が生き残ったわけではなかった。生き残ったものでは、振戦は、豚が成長するにつれて減弱され、最終的に消失した。２０１２年の最初の２０週間に、未経産豚から生まれた合計２３１匹の同腹子のうち、合計４８匹の同腹子が先天性振戦の症状を伴って未経産豚から生まれた。これは、未経産豚から生まれたすべての同腹子の２１％に等しい。感染ピーク時の最初のアウトブレイク後８週目、未経産豚の同腹子の８５％が先天性振戦Ａ−ＩＩ型を有する子豚であることが示された。離乳までの子豚の死亡（「ｌｏｓｓ」）（子豚の死亡（「ｄｅａｔｈ」））のパーセンテージは罹患同腹子において２６％であったのに対して、非罹患同腹子では１１％であった。罹患同腹子では、子豚の死亡の６０％が先天性振戦によるものであった。１腹あたりの産子豚総数は影響しなかった。先天性振戦は、新生児の雄子豚および雌子豚のどちらにも罹患し、同腹子内での有病率は＜１０％〜１００％の間でさまざまであった。
【００１２】
先天性振戦のアウトブレイクに伴う問題は、この肥育舎において２０１２年以降継続しており、２０１３年と２０１４年に罹患子豚が得られた（下記参照）。しかしながら、発生率は低下した。
【００１３】
血漿試料を２０１２年３月（６例の試料，非Ａ−ＩＩが原因のＣＴの症状を有する子豚はすべて、排除され得る）と２０１２年４月（５例の試料，非Ａ−ＩＩが原因のＣＴの症状を有する子豚はすべて、排除され得る）に採取した。仮に「Ｍｉｃｈａｅｌ」（Ｍ）と称する新たなウイルスが１１／１１例の試料において検出された。
【００１４】
さらなる血漿試料を同じ肥育舎で２０１２年７月に採取した。２匹の雌豚および１匹の未経産豚から生まれた子豚由来の合計１６例の血清試料を分析した。これらの子豚はいずれも先天性振戦を示さなかった。Ｍｉｃｈａｅｌ  １は１／１６例の試料において見出された。
【００１５】
この疾患の新たなアウトブレイクが２０１３年１月に診断された。検死のため、４匹の新生児の初乳摂取前の子豚を入手し、非Ａ−ＩＩが原因のＣＴの症状を示したものはすべて排除され得る。同じ肥育舎が起源であったが、起源のアウトブレイクと新たな臨床問題の発生との間で相当な時間が経過していたため、この新たなウイルスをＭｉｃｈａｅｌ  １Ａと命名した。この新たなウイルスＭｉｃｈａｅｌ  １Ａは４／４匹の子豚で検出された。
【００１６】
再度、この疾患の新しいアウトブレイクが２０１３年３月に診断された。３匹の新生児の初乳摂取前の子豚を検死のために入手し、非Ａ−ＩＩが原因のＣＴの症状を示したものはすべて排除され得る。このウイルスをＭｉｃｈａｅｌ  １Ｂ（Ｍ  １Ｂ）と命名した。この新たなウイルスＭｉｃｈａｅｌ  １Ｂは、３／３例の試料において検出された。脳と脊髄に脱髄の徴候が示された（図２参照）。
【００１７】
この疾患の新たなアウトブレイクが２０１４年１月に診断された。４匹の新生児の初乳摂取前の子豚を入手し、非Ａ−ＩＩが原因のＣＴの症状を示すものはすべて排除され得る。このウイルスをＭｉｃｈａｅｌ  １Ｃ（Ｍ  １Ｃ）と命名した。この新たなウイルスＭｉｃｈａｅｌ  １Ｃは、４／４例の試料において検出された。さらに３匹の子豚の検死を２０１４年２月に行い、この場合も、３匹の子豚すべてがＧｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩ  ＣＴを示し、Ｍｉｃｈａｅｌは３／３例の試料において検出された。
【００１８】
２０１３年１月、２０１３年３月および２０１４年２月のアウトブレイクによる子豚の死後検査を行った。脳と脊髄に脱髄の徴候が示された。
【００１９】
先天性振戦Ａ−ＩＩ型の病歴がない肥育舎の新生児の初乳摂取前の子豚から採取された合計７例の血清を、ＰＣＲおよび死後検査の陰性対照として使用した。血漿試料はすべてＭｉｃｈａｅｌウイルスについて陰性であり、これらの子豚において病理学的異常は観察されなかった。
【００２０】
Ｇｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩ  ＣＴアウトブレイクの比較分析をオランダの他の７つの肥育舎で実施した。ＣＴ−同腹子の試料を分析し、新規なウイルスが、初乳摂取前材料（初乳または母乳の最初の摂取前に採取した材料）を採取したＣＴ−子豚の１００％において見出された。
【００２１】
本発明による新規なウイルスはまだ正式に分類されていないが、差し当たり、このウイルスは、最良には「Ｇｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩ先天性振戦関連ブタペスチウイルス（Ｇｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｔｒｅｍｏｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ）」と称される。また、以下において、このウイルスをＣＴＡＰＶとも称する。
【００２２】
このウイルスのゲノム配列を分析すると、新規な当該ウイルスは、予期せずして、フラビウイルス科とより具体的にはこの科のペスチウイルス属と、比較的低レベルだがある程度の類似性を有することが明らかになった。ペスチウイルス属の既知の構成員は、豚コレラウイルス、牛ウイルス性下痢ウイルスおよびボーダー病ウイルスである。
【００２３】
ペスチウイルスのビリオンは、直径が約５０ｎｍであり、球形であり、エンベロープを有し、およそ１２キロベース（ｋｂ）長さである一本鎖のプラスのセンスＲＮＡを含むものである。
【００２４】
この新たなウイルスの代表物の完全長ＤＮＡ配列を配列番号：１９に示す。
【００２５】
新規な当該ウイルスの遺伝的構成は、既知のペスチウイルスのものに密接に従う（図１参照）。ペスチウイルスのゲノムは、単一のポリタンパク質ＮＨ２−Ｃ−Ｅｒｎｓ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４ａ−ＮＳ４ｂ−ＮＳ５ａ−ＮＳ５ｂ−ＣＯＯＨをコードしており、これは、翻訳と同時および翻訳後に、構造タンパク質（「コア」タンパク質（Ｃ）ならびにタンパク質Ｅｒｎｓ、Ｅ１およびＥ２）と非構造（ＮＳ）タンパク質の両方にプロセッシングされる。このポリタンパク質のアミノ末端部分は宿主細胞のプロテアーゼによって切断され、その切断産物、コアならびにエンベロープ（Ｅｒｎｓ、Ｅ１およびＥ２）タンパク質がペスチウイルス粒子（ビリオン）の主要構成要素になると考えられている。
【００２６】
構造タンパク質Ｅｒｎｓは、Ｅ０またはｇｐ４４／４８としても知られており、ＲＮａｓｅ活性を有するという特有の特性を有するエンベロープタンパク質である（１２）。これは、感染細胞から比較的大量に分泌される（１３）。しかしながら、もっと大量が膜に結合したままである（１４）。Ｅｒｎｓの役割の１つは、自身のＲＮａｓｅ活性を用いてインターフェロン応答を阻害することによって宿主の免疫機構に干渉することにおけるもののようである（１５）。ビルレンスにおけるかかる役割は、Ｅｒｎｓがないウイルス株は弱毒性になるという事実によってさらに裏付けられる（１６）。Ｅ１およびＥ２は、以前は、それぞれｇｐ３３およびｇｐ５５（そして、以前はＥ１とも混同されていた）として知られており、その他の２つのエンベロープ糖タンパク質である。構造タンパク質Ｅ２はホモ二量体およびＥ１とのヘテロ二量体を形成する（１７，１８）。特に、Ｅ１タンパク質とＥ２タンパク質のヘテロ二量体は、ペスチウイルスが宿主に進入するのに重要であるが、Ｅｒｎｓはウイルス進入には必要とされないようである（１９，２０）。中和抗体は主にＥｒｎｓとＥ２を標的化し、低程度がＥ１に及ぶ（１７，２１）。
【００２７】
２１６個のアミノ酸からなるエンベロープタンパク質Ｅｒｎｓをコードしている遺伝子は、配列番号：１９の１２５８〜１８９９位にみられ、２１１個のアミノ酸からなるエンベロープタンパク質Ｅ２をコードしている遺伝子は、配列番号：１９の２４７９〜３１１１位にみられる。１９３個のアミノ酸からなるエンベロープタンパク質Ｅ１をコードしている遺伝子は、配列番号：１９の１９００〜２４７８位にみられる。
【００２８】
エンベロープタンパク質Ｅｒｎｓをコードしている遺伝子のＤＮＡ配列の一例を配列番号：１に示す。配列番号：２はＥｒｎｓタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００２９】
エンベロープタンパク質Ｅ２をコードしている遺伝子のＤＮＡ配列の一例を配列番号：３に示す。配列番号：４はＥ２タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００３０】
エンベロープタンパク質Ｅ１をコードしている遺伝子のＤＮＡ配列の一例を配列番号：５に示す。配列番号：６はＥ１タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００３１】
新規な当該ウイルスの完全配列を使用し、最尤推定法、ポアソン相関モデルおよびブートストラップ解析（５００回反復）に基づいて系統樹を作製した。
【００３２】
この系統樹は、プログラムＭＥＧＡ，バージョン５を使用し、標準設定を用いて作製した（ＭＥＧＡ５：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ，Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｄｉｓｔａｎｃｅ，ａｎｄ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｐａｒｓｉｍｏｎｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｋｏｉｃｈｉｒｏ  Ｔａｍｕｒａ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｎｉｃｈｏｌａｓ  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｇｌｅｎ  Ｓｔｅｃｈｅｒ，Ｍａｓａｔｏｓｈｉ  Ｎｅｉ  ａｎｄ  Ｓｕｄｈｉｒ  Ｋｕｍａｒ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．２８（１０）：２７３１−２７３９．２０１１  ｄｏｉ：１０．１０９３／ｍｏｌｂｅｖ／ｍｓｒ１２１  Ａｄｖａｎｃｅ  Ａｃｃｅｓｓ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ２０１１年５月４日）。
【００３３】
新規な当該ペスチウイルスの完全配列に基づいた系統樹を図３に示す。ブートストラップサポートのパーセンテージが節に明示されている。距離バーは、部位あたりのヌクレオチド置換の数を示す。
【００３４】
図３から、ペスチウイルスであるボーダー病ウイルス、トナカイのペスチウイルス、豚コレラウイルス、牛ウイルス性下痢ウイルス、キリンのペスチウイルスおよびボンゴワナウイルスは比較的近縁であるが、本発明による新規なウイルスは、これらの各ウイルスとはもっと遠縁であることが明らかである。
【００３５】
図４に、本発明によるウイルスの１０種類の異なる分離株を比較した系統樹を示す。
【００３６】
同じ肥育舎だが３年にわたって分離された分離株Ｍ１、Ｍ１Ａ、Ｍ１ＢおよびＭ１Ｃ（配列番号：１９、２０、２１、２２）は、互いに最も近縁であることがわかる。他の肥育舎での分離株は、いくぶん大きな差異を示す。Ｍ２、Ｍ４およびＭ９（配列番号：２３，２５，２９）は、Ｍ１群とよりも互いの関連性がある。同じことがＭ３、Ｍ６およびＭ８（配列番号：２４，２６，２８）同士にも言える。Ｍ７（配列番号：２７）は含まれていない。これは、分離株間に少しの遺伝的変更が存在することを示す。これは、ＲＮＡウイルスについて予測されることであり、この観察結果は、他のペスチウイルスでみられるものと整合する。
【００３７】
配列番号：１、３および５は、それぞれ、本発明によるウイルスのＥｒｎｓ、Ｅ２およびＥ１をコードしている遺伝子のヌクレオチド配列の典型的な例を示す。
【００３８】
配列番号：２、４および６は、それぞれ、本発明によるウイルスのＥｒｎｓ、Ｅ２およびＥ１タンパク質のアミノ酸配列の典型的な例を示す。
【００３９】
これらのタンパク質について、Ｇｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩ先天性振戦関連ウイルスの個々の代表物間に天然の多様性が存在し得ることは理解されよう。例えば、Ｅｒｎｓ、Ｅ２およびＥ１のアミノ酸配列の軽微な変更をもたらす遺伝的多様性は存在する。第一に、コードアミノ酸配列には現れないままであるヌクレオチドの変更が存在し得ることを説明する、いわゆる「２番目と３番目の塩基におけるゆらぎ」が存在する：例えば、トリプレットＴＴＡ、ＴＴＧ、ＴＣＡ、ＴＣＴ、ＴＣＧおよびＴＣＣ（すべて、ロイシンをコードしている）。また、本発明による新規なブタペスチウイルスの代表物間の軽微な差異はアミノ酸配列にみられる場合があり得る。このような差異は、配列全体における（１もしくは複数の）アミノ酸の違いまたは前記配列における（１もしくは複数の）アミノ酸の欠失、置換、挿入、逆位もしくは付加によって反映され得る。生物学的および免疫学的活性を本質的に改変しないアミノ酸置換は、例えば、Ｎｅｕｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌにより「Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７９）に記載されている。関連するアミノ酸間のアミノ酸置換または進化において高頻度に存在した置換には、とりわけ、Ｓｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌである（Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｄ．，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，１９７８，ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３参照）。他のアミノ酸置換としては、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／ＶａｌおよびＡｌａ／Ｇｌｕが挙げられる。この情報に基づいて、ＬｉｐｍａｎおよびＰｅａｒｓｏｎにより、相同なタンパク質間の機能的類似性を調べる迅速で高感度のタンパク質比較のための方法が開発された（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７，１４３５−１４４１，１９８５）。本発明の例示的な実施形態のかかるアミノ酸置換ならびに欠失および／または挿入を有する多様性は、本発明の範囲に含まれる。
【００４０】
これにより、なぜＥｒｎｓ、Ｅ２およびＥ１が、本発明によるブタペスチウイルスの異なる代表物から分離された場合、それらがいまだ本発明による新規なペスチウイルスのＥｒｎｓ、Ｅ２およびＥ１である一方で、１００％より有意に低い相同性レベルを有し得るということが説明される。
【００４１】
これは、例えば、高度に関連しているペスチウイルスでもなお、有意に異なる全体ゲノムヌクレオチド配列ならびに有意に異なるＮｐｒｏ遺伝子ヌクレオチド配列を有することを示すＢｅｃｈｅｒ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（４９）のペスチウイルス遺伝子Ｎｐｒｏの系統樹に明白に反映されている。
【００４２】
したがって、本発明の第１の実施形態は、ペスチウイルスの一構成員である分離型ウイルスであって、
ａ）該ウイルスは、豚のＧｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩ先天性振戦の原因因子であり、
ｂ）該ウイルスは、エンベロープタンパク質Ｅｒｎｓをコードしている遺伝子、エンベロープタンパク質Ｅ２をコードしている遺伝子およびエンベロープタンパク質Ｅ１をコードしている遺伝子を含むウイルスゲノムを有し、ここで、該Ｅｒｎｓ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号：１に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性レベルを有し、および／または該Ｅ２遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号：３に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性レベルを有し、および／または該Ｅ１遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号：５に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性レベルを有することを特徴とする分離型ウイルスに関する。
【００４３】
本発明の解釈上、同一性レベルは、例えば、配列番号：１の配列と、ペスチウイルスのＥｒｎｓをコードしている同一性レベルの測定対象の対応する領域間の同一性のパーセンテージであると理解されたい。
【００４４】
同一性レベルの測定のための好適なプログラムは、ＮＣＢＩのＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌのヌクレオチドｂｌａｓｔプログラム（ｂｌａｓｔｎ）であり、「Ａｌｉｇｎ  ｔｗｏ  ｏｒ  ｍｏｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」オプションおよび標準設定を使用する（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）。
【００４５】
本発明の解釈上、分離型（ｉｓｏｌａｔｅｄ）は：そのウイルスが自然状態で随伴している組織から離れていることを意味する。分離型ウイルスの一例は細胞培養物中に存在しているウイルスである。
【００４６】
この実施形態の好ましい一形態は、配列番号：１に示すＥｒｎｓのヌクレオチド配列と少なくとも８２％、より好ましくは、８４％、８６％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはさらには１００％（この順に好ましい）の同一性レベルを有するＥｒｎｓ遺伝子を有するというウイルスに関する。
【００４７】
この実施形態の別の好ましい形態は、配列番号：３に示すＥ２遺伝子のヌクレオチド配列と少なくとも８２％、より好ましくは、８４％、８６％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはさらには１００％（この順に好ましい）の同一性レベルを有するＥ２遺伝子を有するというウイルスに関する。
【００４８】
この実施形態のさらに別の好ましい形態は、配列番号：５に示すＥ１遺伝子のヌクレオチド配列と少なくとも８２％、より好ましくは、８４％、８６％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはさらには１００％（この順に好ましい）の同一性レベルを有するＥ１遺伝子を有するというウイルスに関する。
【００４９】
この実施形態のより好ましい一形態は、ペスチウイルスの一構成員である分離型ウイルスであって、
ａ）該ウイルスは、豚のＧｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩ先天性振戦の原因因子であり、
ｂ）該ウイルスは、エンベロープタンパク質Ｅｒｎｓをコードしている遺伝子、エンベロープタンパク質Ｅ２をコードしている遺伝子およびエンベロープタンパク質Ｅ１をコードしている遺伝子を含むウイルスゲノムを有し、ここで、該Ｅｒｎｓ遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号：１に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性レベルを有し、および該Ｅ２遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号：３に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性レベルを有し、および該Ｅ１遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号：５に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性レベルを有することを特徴とする分離型ウイルスに関する。
【００５０】
本発明によるウイルスを特性評価するための別の択一的な様式は、本発明によるウイルスのＮＳ５Ｂ遺伝子配列または５’ＵＴＲ配列に特異的なプライマーセットを使用するＰＣＲ試験に依存するものである。
【００５１】
種々のプライマーおよびこのようなプライマーを用いて作製されるＰＣＲ産物のサイズの概略を表ａおよびｂに示す。
【００５２】
４つの異なるプライマーセット（その配列を配列番号：７〜８、配列番号：９〜１０、配列番号：１１〜１２および配列番号：１３〜１４に示す）を、ウイルスのＮＳ５Ｂ領域に対する特異性のために選択した。
【００５３】
第１プライマーセット（配列番号：７〜８）、第２プライマーセット（配列番号：９〜１０）、およびウイルスのＮＳ５Ｂ遺伝子と特異的に反応するフォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせを使用するＰＣＲ試験では、それぞれ、以下の２つのプライマーのペアＦ１−Ｒ１、Ｆ２−Ｒ２、Ｆ１−Ｒ２およびＦ２−Ｒ１が使用される。
【００５４】
また、プライマーセット配列番号：１１〜１２（ＰＡＮ−ＦＷとＰＡＮ−ＲＥＶ）および配列番号：１３〜１４（ＰＡＮｄｅｇ−ＦＷとＰＡＮｄｅｇ−ＲＥＶ）も、ＮＳ５Ｂと特異的に反応する。縮重プライマー配列番号：１３〜１４を有するセットは、わずかに改変されたＲＮＡ配列を有するＣＴＡＰＶバリアントが見出される機会を高めるために設計された。
【００５５】
プライマーセット（配列番号：１５〜１６）を使用するＰＣＲ試験は、ウイルスの５’ＵＴＲと特異的に反応するものであり、２つのプライマーＦ３−Ｒ３が使用される。
【００５６】
また、プライマーセット（配列番号：１７〜１８）を使用するＰＣＲ試験も、ウイルスの５’ＵＴＲと特異的に反応するものであり、２つのプライマーＦ４−Ｒ４が使用される。
【００５７】
この試験（これは、実施例のセクションにさらに詳細に記載する）は、ｃＤＮＡにおける標準的なＰＣＲ試験である（当該ウイルスはＲＮＡゲノムを有するものであるため、ウイルスＲＮＡをまず、逆転写反応においてｃＤＮＡに転写したことは言うまでもない。ｃＤＮＡをＰＣＲ反応に使用した）。
【表１】
0006772137.tif 000002
【表２】
0006772137.tif 000003
0006772137.tif 000004
【００５８】
ウイルスを、上記のプライマーセットを用いて特性評価する場合、以下のことが言えよう：例えばＦ１−Ｒ１プライマーセットのＰＣＲ産物の解析によっておよそ１５６塩基対のＰＣＲ産物が示された場合、または例えばプライマーＦ２−Ｒ２セットのＰＣＲ産物の解析によっておよそ３３５塩基対のＰＣＲ産物が示された場合、これは、分析されたウイルスが本発明によるウイルスに属することを明白に示す。
【００５９】
単なる一例として：およそ１５６塩基対のＰＣＲ産物は１５６＋１０〜１５６−１０塩基対の長さを有するＰＣＲ産物である。およそ３３５塩基対のＰＣＲ産物は３３５＋１０〜３３５−１０塩基対の長さを有するＰＣＲ産物である。
【００６０】
したがって、本発明のこの実施形態の別の形態は、当該ペスチウイルスの一構成員である分離型ウイルスであって：
ａ）該ウイルスは、豚のＧｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩ先天性振戦の原因因子であり、
ｂ）該ウイルスＲＮＡゲノムから逆転写したｃＤＮＡを、ＰＣＲ反応において配列番号：７と８に示すプライマーセットと反応させて１５６＋／−１０塩基対のＰＣＲ産物を得る、および／またはＰＣＲ反応において配列番号：９と１０に示すプライマーセットと反応させて３３５＋／−１０塩基対のＰＣＲ産物を得る、および／またはＰＣＲ反応において配列番号：１１と１２に示すプライマーセットと反応させて８９６＋／−１０塩基対のＰＣＲ産物を得る、および／またはＰＣＲ反応において配列番号：１３と１４に示すプライマーセットと反応させて８９６＋／−１０塩基対のＰＣＲ産物を得る、および／またはＰＣＲ反応において配列番号：１５と１６に示すプライマーセットと反応させて１８２＋／−１０塩基対のＰＣＲ産物を得る、および／またはＰＣＲ反応において配列番号：１７と１８に示すプライマーセットと反応させて１８２＋／−１０塩基対のＰＣＲ産物を得ることを特徴とする分離型ウイルスに関する。
【００６１】
この実施形態の好ましい一形態は、該ウイルスＲＮＡゲノムから逆転写したｃＤＮＡを、ＰＣＲ反応において配列番号：７と８に示すプライマーセットと反応させて１５６＋／−１０塩基対のＰＣＲ産物を得る、およびＰＣＲ反応において配列番号：９と１０に示すプライマーセットと反応させて３３５＋／−１０塩基対のＰＣＲ産物を得る、およびＰＣＲ反応において配列番号：１１と１２に示すプライマーセットと反応させて８９６＋／−１０塩基対のＰＣＲ産物を得る、およびＰＣＲ反応において配列番号：１３と１４に示すプライマーセットと反応させて８９６＋／−１０塩基対のＰＣＲ産物を得る、およびＰＣＲ反応において配列番号：１５と１６に示すプライマーセットと反応させて１８２＋／−１０塩基対のＰＣＲ産物を得る、およびＰＣＲ反応において配列番号：１７と１８に示すプライマーセットと反応させて１８２＋／−１０塩基対のＰＣＲ産物を得る、本発明によるウイルスに関する。
【００６２】
この実施形態のより好ましい一形態は、Ｅｒｎｓをコードしている遺伝子、Ｅ２をコードしている遺伝子およびＥ１をコードしている遺伝子を含むウイルスゲノムを有し、ここで、該Ｅｒｎｓ遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号：１に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性レベルを有し、および該Ｅ２遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号：３に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性レベルを有し、および該Ｅ２遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号：５に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性レベルを有し、そして、該ウイルスゲノムのｃＤＮＡを、ＰＣＲ反応において配列番号：７と８に示すプライマーセットと反応させて１５６＋／−１０塩基対のＰＣＲ産物を得る、およびＰＣＲ反応において配列番号：９と１０に示すプライマーセットと反応させて３３５＋／−１０塩基対のＰＣＲ産物を得る、およびＰＣＲ反応において配列番号：１１と１２に示すプライマーセットと反応させて８９６＋／−１０塩基対のＰＣＲ産物を得る、およびＰＣＲ反応において配列番号：１３と１４に示すプライマーセットと反応させて８９６＋／−１０塩基対のＰＣＲ産物を得る、およびＰＣＲ反応において配列番号：１５と１６に示すプライマーセットと反応させて１８２＋／−１０塩基対のＰＣＲ産物を得る、およびＰＣＲ反応において配列番号：１７と１８に示すプライマーセットと反応させて１８２＋／−１０塩基対のＰＣＲ産物を得る、本発明によるウイルスに関する。
【００６３】
本発明によるウイルスは、生きている形態、生弱毒化形態または不活化形態であり得る。
【００６４】
上記のように、当該ウイルスのＥｒｎｓ、Ｅ２およびＥ１タンパク質をコードしている遺伝子のＤＮＡ配列は、ここに特性評価されている。これらの遺伝子の同定は、ここに、該遺伝子を、とりわけ（ｉ．ａ．）、これらのタンパク質を元にしたサブユニットワクチンの調製における使用のため、または診断目的のため（以下にさらに説明する）のＤＮＡワクチンのベースとして使用できるため、非常に有用である。
【００６５】
したがって、本発明の別の実施形態は、Ｅｒｎｓタンパク質をコードしている遺伝子であって、そのヌクレオチド配列が、配列番号：１に示すＥｒｎｓ遺伝子のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性レベルを有することを特徴とする遺伝子に関する。
【００６６】
この実施形態の好ましい一形態は、配列番号：１に示すＥｒｎｓ遺伝子のヌクレオチド配列と少なくとも８２％、より好ましくは、８４％、８６％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはさらには１００％（この順に好ましい）の同一性レベルを有するかかる遺伝子に関する。
【００６７】
本発明のさらに別の実施形態は、Ｅ２タンパク質をコードしている遺伝子であって、そのヌクレオチド配列が、配列番号：３に示すＥ２遺伝子のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性レベルを有することを特徴とする遺伝子に関する。
【００６８】
この実施形態の好ましい一形態は、配列番号：３に示すＥ２遺伝子のヌクレオチド配列と少なくとも８２％、より好ましくは、８４％、８６％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはさらには１００％（この順に好ましい）の同一性レベルを有する、かかる遺伝子に関する。
【００６９】
本発明のまたさらに別の実施形態は、Ｅ１タンパク質をコードしている遺伝子であって、そのヌクレオチド配列が、配列番号：５に示すＥ１遺伝子のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性レベルを有することを特徴とする遺伝子に関する。
【００７０】
この実施形態の好ましい一形態は、配列番号：５に示すＥ１遺伝子のヌクレオチド配列と少なくとも８２％、より好ましくは、８４％、８６％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはさらには１００％（この順に好ましい）の同一性レベルを有する、かかる遺伝子に関する。
【００７１】
本発明のまた別の実施形態は、本発明によるＥｒｎｓ遺伝子にコードされていることを特徴とするＥｒｎｓタンパク質に関する。
【００７２】
本発明によるウイルスのかかるＥｒｎｓタンパク質は、とりわけ、ワクチン、より具体的にはサブユニットワクチンにおける使用に適しているため、抗体を生成させるために使用することができ、そして診断テストを可能にする（以下に説明する）ため、非常に好適である。
【００７３】
この実施形態の好ましい一形態は、配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するＥｒｎｓに関する。
【００７４】
本発明のさらに別の実施形態は、本発明によるＥ２遺伝子にコードされていることを特徴とするＥ２タンパク質に関する。
【００７５】
本発明によるウイルスのかかるＥ２は、とりわけ、ワクチン、より具体的にはサブユニットワクチンにおける使用に適しているため、抗体を生成させるために使用することができ、そして診断テストを可能にする（以下に説明する）ため、非常に好適である。
【００７６】
この実施形態の好ましい一形態は、配列番号：４に示すアミノ酸配列を有するＥ２タンパク質に関する。
【００７７】
本発明のまたさらに別の実施形態は、本発明によるＥ１遺伝子にコードされていることを特徴とするＥ１タンパク質に関する。
【００７８】
本発明によるウイルスのかかるＥ１タンパク質は、とりわけ、ワクチン、より具体的には、擬似粒子およびかかる擬似粒子を含むワクチン（以下に説明する）における使用に適しているため、非常に好適である。
【００７９】
この実施形態の好ましい一形態は、配列番号：６に示すアミノ酸配列を有するＥ１タンパク質に関する。
【００８０】
本発明のメリットの１つは、ここに、初めて、ウイルス感染の過程を追跡すること、ならびに本発明による新規なウイルスに感染していることが疑われる豚の種々の器官内および体液中の当該新規なウイルスの有無を解析することが可能になったことである。
【００８１】
実施例のセクションにおいて、Ｇｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩ先天性振戦に苦しんでいる豚の多くの組織および器官が、当該新規なウイルスの有無および量について試験され得ることが記載されている。
【００８２】
Ｇｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩ先天性振戦に苦しんでいる豚から単離された血清、血漿、ＰＢＬ、心臓、小腸および大腸、脳、胸髄、腰髄、肝臓、鼡径リンパ節、肺、胆嚢、膀胱、腎臓、扁桃および脾臓に、当該新規なウイルスが含有されていることがわかった。
【００８３】
これは、該疾患の発症におけるさらなる見識を得るのに有用であった。
【００８４】
本発明の別のメリットは、ここに、健常豚を当該新規なウイルスに感染させること、およびウイルス感染経路を調べることが可能になったことである。本実施例に、これを目的として、Ｇｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩ先天性振戦動物由来の器官材料をどのようにして単離し精製するかを記載している。この材料を、続いて、離乳後の健常子豚に注射し、ウイルスの複製をインビボで、Ｐａｔｔｅｒｓｏｎによって適用された方法（１０〜２０％（ｗ／ｖ）ホモジネートを種々の投与経路、経口、経鼻、筋肉内、皮下によって注射）に従って試験した。
【００８５】
本発明のさらに別のメリットは、ここに、当該ウイルスが、未経産豚の子豚にＧｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩ先天性振戦を引き起こし得ることを示すことを目的として、妊娠中の未経産豚に当該新規なウイルスを感染させることが可能になったことである。この実験の結果は本実施例に記載している。
【００８６】
また、この材料を、後述するワクチン接種／攻撃試験において攻撃材料として使用した。
【００８７】
また、新規な当該ブタペスチウイルスがここに分離されたため、該ウイルスおよび／または該ウイルスの防御性サブユニットを、ワクチン接種目的のための出発物質として使用できることも本発明のメリットの１つである。
【００８８】
単なる一例として：とりわけ、実施例のセクションに、バキュロ発現Ｅ２タンパク質を含むワクチンの調製、全細胞ワクチンおよび精製Ｅ２−ワクチンの投与、ならびにその後の上記のビルレントな攻撃材料での攻撃を記載した。
【００８９】
したがって、本発明の別の実施形態は、豚のＧｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩ  ＣＴに対処するためのワクチンに関するものであり、ここで、かかるワクチンは、免疫原的有効量の本発明によるウイルスと薬学的に許容され得る担体とを含むものである。
【００９０】
これとの関連において、対処するとは、広い意味で解釈され：豚のＧｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩ  ＣＴに対処することは、上記に概略を示した該疾患の徴候を予防するためのワクチン接種ならびに該疾患の徴候を減弱させるためのワクチン接種を含んでいるとみなされる。
【００９１】
本発明によるワクチンにおける使用に適した薬学的に許容され得る担体の例は、滅菌水、生理食塩水、水性バッファー、例えばＰＢＳなどである。また、本発明によるワクチンに、他の添加剤、例えば、アジュバント、安定剤、酸化防止剤および後述するような他のものを含めてもよい。
【００９２】
本発明によるワクチンは、とりわけ、弱毒化生形態または不活化形態の本発明によるウイルスを含むものであり得る。
【００９３】
弱毒化生ウイルスワクチン、すなわち、生弱毒化形態の本発明によるウイルスを含むワクチンは、不活化ワクチンと比べて自然な感染様式を最もよく模倣するという利点を有する。また、その複製能により、少量のウイルスでのワクチン接種が可能となり；その数は、免疫機構の誘発レベルに達するまで自動的に増加する。その瞬間から免疫機構が誘発され、最終的にウイルスが消失する。
【００９４】
生弱毒化ウイルスは、野外から分離されたウイルスと比べて低減されたレベルの毒性（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）を有するウイルスである。低減されたレベルの毒性を有するウイルスは、野生型の本発明によるペスチウイルスによって引き起こされるＣＴの症状と比べてＧｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩ  ＣＴに対する防御を誘導するか、または少なくともＣＴの症状を減弱させるウイルスとみなされる。
【００９５】
したがって、本発明のこの実施形態の好ましい一形態は、本発明によるウイルスを含むワクチンであって、該ウイルスが生弱毒化形態であるワクチンに関する。
【００９６】
弱毒化ウイルスは、当該技術分野で知られた種々の様式で得られ得る。これは、例えば、本発明によるウイルスを変異誘発剤の存在下で培養した後、子孫レベルおよび／または複製速度の低下を示すウイルスを選択することにより得られ得る。多くのかかる変異誘発剤が当該技術分野で知られている。
【００９７】
多くの場合で使用される別の方法は、易感染性の細胞株でのインビトロでの連続継代である。ウイルスはその後、連続継代に使用した細胞株に対して適応状態となり、その結果、天然宿主にワクチンとして再度移入された場合、弱毒化型の挙動を有する。
【００９８】
弱毒化ウイルスを得るまた別の様式は、ウイルスを、その天然の生息環境の温度から外れた温度下での増殖に供することである。温度感受性変異型（Ｔｓ−変異型）の選択方法は、当該技術分野でよく知られている。かかる方法は、ウイルスを、通常、変異原の存在下で増殖させた後、準最適温度および最適温度の両方で増殖させ、細胞層上の子孫ウイルスを滴定し、最適温度において増殖が遅いプラークを目視選択することを含むものである。かかる小プラークは、増殖が遅く、したがって所望の生弱毒化ウイルスを含むものである。
【００９９】
本発明による生弱毒化ペスチウイルスを得るための択一的な様式は、ペスチウイルスのゲノムの意図的な修飾に関するものである。このアプローチは、上記の従来の弱毒化手法と比べて、弱毒化の性質が既知であるという利点を有する。ペスチウイルスでは、多くの生弱毒化ウイルス株、例えば、ペスチウイルスである牛ウイルス性下痢ウイルスおよび豚コレラウイルスが報告されており、例えばそのＥ２遺伝子、Ｅｒｎｓ遺伝子またはＮｐｒｏ遺伝子が欠失されているかまたは修飾されているかのいずれかである。
【０１００】
Ｎｐｒｏ−欠失を有する生弱毒化ペスチウイルス、より具体的には、ブタペスチウイルスの豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）の例は、とりわけ、米国特許第７５７２４５５号およびＭａｙｅｒ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ（１９）に記載されている。
【０１０１】
Ｅｒｎｓ−修飾およびＮｐｒｏ−欠失の両方を有する生弱毒化ペスチウイルス、より具体的には豚コレラウイルスの例は、とりわけ、米国特許第７５７２４５５号に記載されている。
【０１０２】
Ｅ２遺伝子に修飾を有する生弱毒化ペスチウイルス、より具体的には豚コレラウイルスの例は、とりわけ、Ｒｉｓａｔｔｉ，Ｇ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２２）およびＲｉｓａｔｔｉ、Ｇ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２３）に記載されている。
【０１０３】
ペスチウイルス感染全般は、豚、反芻動物またはヒツジを肥育している多くの国々で問題である。現在、ペスチウイルス感染全般に対処するために、ペスチウイルスが経済的ダメージを引き起こす種々の国々で異なるアプローチが適用されている。一部の国々では、ウイルスを除去するための一掃（ｓｔａｍｐｉｎｇ−ｏｕｔ）法が使用され、一方、他の国々では、ワクチン接種アプローチが好まれる。しかしながら、このような異なるアプローチが並行して使用されるという事実は問題を引き起こす。単なる一例として：例えば、ブタペスチウイルスは肥育豚間に広まるが、イノシシなどの野生動物にも広がり、したがって、これらは、ウイルスが肥育用動物に流出し得る保有宿主（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）を構成する。従来のワクチンでワクチン接種された動物は野外感染牛とは容易に区別できず、それは、どちらの場合も該ウイルスに対する抗体が存在するからである。したがって、ペスチウイルスの抗体陽性動物が、感染（この場合、動物はウイルスを保有し得る）のため抗体陽性であるのか、またはワクチン接種のため抗体陽性であるのはたいていは不明である。その結果、かかる動物は、該ペスチウイルスに対して一掃アプローチを選択している国々への輸送が許容されない。
【０１０４】
Ｇｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩ  ＣＴを引き起こす新規な当該ペスチウイルスが、ここに同定されたため、この新規なペスチウイルスについても、将来的に同じことが当てはまり得る。
【０１０５】
この問題は、いわゆるマーカーワクチンまたはＤＩＶＡワクチン（ＤＩＶＡ＝感染動物とワクチン接種動物の識別）の使用によって解決され得る。かかるワクチンは１種類以上の免疫原性ウイルスタンパク質を欠くか、または少なくとも１つの免疫原性エピトープを欠くものであり、その結果、マーカーワクチン接種動物では、すべての免疫原性ウイルスタンパク質／エピトープに対する抗体が産生されない。ワクチン接種動物と感染動物間の抗体パレットの違いは、この目的のために設計された診断テストによって示され得る。したがって、かかるテストにより、ワクチン接種動物を感染動物と区別することが可能になる。
【０１０６】
本発明による新規なペスチウイルスのＥｒｎｓ、Ｎｐｒｏ、Ｅ１およびＥ２タンパク質をコードしている遺伝子がここに既知となったため、例えば、ブタペスチウイルスＣＳＦＶについて報告された既知のマーカーワクチン手法が、ここに、この新たなウイルスに関して適用可能になる。マーカーワクチンとして同様に好適な生弱毒化ＣＳＦＶワクチンの例は、例えば、Ｖａｎ  Ｇｅｎｎｉｐ，Ｈ．Ｇ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ（７）、Ｒｅｉｍａｎｎ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ（８）、Ｂｅｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ（９）、Ｗｅｈｒｌｅ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ（１０）、Ｄｏｎｇ，Ｘ．Ｎ．ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｈ．（１１）およびｄｅ  Ｓｍｉｔ，Ａ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２４）に記載されている。ほとんどの場合、Ｅ２またはＥｒｎｓ遺伝子が異種ウイルス株または別のペスチウイルスのそれぞれの遺伝子で置き換えられたキメラウイルスが報告されている。
【０１０７】
しかしながら、生弱毒化ウイルスの使用の考えられ得る不都合点は、内在的に一定レベルの毒性が残存することであり得る。これは、ビルレンスのレベルが許容範囲である限り、すなわち、ワクチンによって少なくとも豚が死ぬことが予防される限り、実際の不都合点にはならない。もちろん、生弱毒化ワクチンの残存ビルレンスが低いほど、ワクチン接種中／後の体重増加に対してワクチン接種が有する影響は少ない。
【０１０８】
生弱毒化ウイルスの使用の代替法は、非伝染性ウイルスの使用である。かかるウイルスでは、必須遺伝子が欠失されており、該ウイルスを増殖させるために使用される細胞株内にトランスに補完される。その結果、子孫ウイルスは、宿主細胞に感染し得るが該宿主細胞内で複製できないウイルスとなる。かかる非伝染性ウイルスは、自然な感染を近似的に模倣すると同時に該ウイルスは拡散され得ない。かかる非伝染性ウイルスを含むワクチンは非常に安全であり、また、マーカーワクチンとして非常に好適である。かかるワクチンは、例えばブタペスチウイルスＣＳＦＶについて、とりわけ、Ｗｉｄｊｏｊｏａｔｍｏｄｊｏ，Ｍ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（２５）およびＶａｎ  Ｇｅｎｎｉｐ、Ｈ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２６）に記載されている。
【０１０９】
不活化ワクチンは、生弱毒化対応物とは対照的に、残存ビルレンスがないため内在的に安全である。これは、通常、生弱毒化ワクチンと比べていくぶん高用量のウイルスを含んでいるという事実にもかかわらず、これは、例えば、既に他の疾患に苦しんでいる豚におけるワクチンの好ましい形態であり得る。また、準最適の条件下、例えば、不完全な栄養または準最適の居住に維持された豚も不活化ワクチンの恩恵を被り得る。
【０１１０】
したがって、この実施形態の別の好ましい形態は、本発明によるウイルスを含むワクチンであって、該ウイルスが不活化形態であるワクチンに関する。
【０１１１】
かかる不活化された完全ウイルスワクチンは、本発明による新規なブタペスチウイルスとして作製され得る。既知のブタペスチウイルスワクチンと同様、その作製は、基本的に、新規な当該ブタペスチウイルスを易感染性のブタ細胞で増殖させる工程、該ウイルスを収集する工程、該ウイルスを不活化する工程および不活化された該ウイルスを薬学的に許容され得る担体と混合する工程を含む。
【０１１２】
不活化の標準的な様式は、ホルムアルデヒドでの従来の処理である。不活化のための当該技術分野でよく知られた他の方法は、ＵＶ線、γ−線、バイナリーエチレンイミンでの処理、チメロサールなどである。当業者には、どのようにしてこのような方法を適用するかがわかるであろう。好ましくは、ウイルスは、β−プロピオラクトン、グルタルアルデヒド、エチレンイミンまたはホルムアルデヒドを用いて不活化する。また、該ウイルスの他の不活化様式も本発明において具体化されることは言うまでもない。
【０１１３】
上記のように、本発明によるウイルスは、易感染性のブタ細胞または細胞株の細胞培養物で増殖させることができる。
【０１１４】
したがって、本発明の別の実施形態は、本発明によるペスチウイルスを含む細胞培養物に関する。かかる細胞株の一例はＳＫ６である。
【０１１５】
本発明による不活化された完全ブタペスチウイルス、および本発明による（ａｃｃｏｒｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅｎ  ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）非伝染性のブタペスチウイルスであるウイルスは不活化ワクチンのための良好なベースを提供するが、その作製は、とりわけ、使用される宿主細胞の型、使用される基材および細胞培養培地にもよるが、高価であり得る。
【０１１６】
ペスチウイルスの具体的な場合において、本発明による不活化された完全ウイルスまたは非伝染性の完全ブタペスチウイルスであるウイルスの使用の魅力的な代替法は、ブタペスチウイルスのサブユニット、特にＥｒｎｓおよびＥ２タンパク質の使用である。
【０１１７】
かかるサブユニット、特にＥｒｎｓおよびＥ２タンパク質の発現は当該技術分野で知られており、バキュロウイルス発現系および哺乳動物細胞の両方におけるブタペスチウイルスＣＳＦＶについて、Ｈｕｌｓｔ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２７）、Ｂｏｕｍａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２８）、Ｖａｎ  Ｒｉｊｎ，Ｐ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２９）、Ｍｏｏｒｍａｎ，Ｒ．Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（３０）、Ｄｏｎｏｆｒｉｏ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，（３１）、Ｌｕｔｔｉｃｋｅｎ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（３２）およびＦｌｏｅｇｅｌ−Ｎｉｅｓｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（３３）に広く記載されている。
【０１１８】
バキュロウイルス発現系におけるＥｒｎｓおよびＥ２の高収量発現は、例えば、欧州特許第１０４９７８８号に記載されている。
【０１１９】
さらに、バキュロウイルス発現系およびバキュロウイルス発現ベクターは、一般にＯ‘Ｒｅｉｌｌｙ  ａｔ  ａｌ．（３４）およびＭｕｒｈａｍｍｅｒ（３５）などの教本に広く記載されている。
【０１２０】
また、バキュロウイルスベース発現系は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（１６００  Ｆａｒａｄａｙ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ９２００８，ＵＳＡ）から市販されている。
【０１２１】
バキュロウイルスベース発現系の代替法は、酵母ベース発現系である。酵母発現系は、例えば、Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（３６）に記載されている。
【０１２２】
Ｄｏｎｏｆｒｉｏ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，（３１）には、哺乳動物細胞株におけるＢＶＤＶ  Ｅ２の発現が記載されている。
【０１２３】
既製の発現系はとりわけ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（５２１０  Ｅａｓｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｃｉｒｃｌｅ，Ｓｕｉｔｅ  ２４０，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ  ８５７１１−４４１０  ＵＳＡから市販されている。また、酵母発現系および昆虫細胞発現系は、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（４０３０  Ｆａｂｉａｎ  Ｗａｙ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ９４３０３−４６０７，ＵＳＡ）からも市販されている。
【０１２４】
Ｄｏｎｏｆｒｉｏ、Ｇ．ｅｔ  ａｌ（３１）に記載のような哺乳動物細胞ベースの発現系におけるＥｒｎｓおよびＥ２タンパク質の発現は、非常に好適であるが、バキュロウイルスベース発現系と比較した場合、たいてい、使用するのがより高価となり得る。
【０１２５】
したがって、この実施形態の別の形態は、豚のＧｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩ  ＣＴに対処するためのワクチンに関し、該ワクチンは、免疫原的有効量の本発明によるＥｒｎｓおよび／またはＥ２および／またはＥ１タンパク質と薬学的に許容され得る担体とを含むものであることを特徴とする。
【０１２６】
より好ましくは、かかるサブユニットは、いわゆるペスチウイルス擬似粒子の形態である。
【０１２７】
かかる擬似粒子は、基本的にＥｒｎｓ、Ｅ１およびＥ２タンパク質を含むウイルス様粒子である。
【０１２８】
しかしながら、これは、完全ペスチウイルスゲノムを含むものではなく、したがって、宿主内で複製できないという点で野生型ウイルスとは異なる。その結果、ペスチウイルス擬似粒子は、ワクチンに使用する前に不活化する必要がなく、したがって、固有に安全であるというさらなる利点を有する。
【０１２９】
ペスチウイルス擬似粒子は、適切な発現系でのＥｒｎｓ、Ｅ１およびＥ２タンパク質の発現によって得られ得る。ペスチウイルス擬似粒子の例およびかかる擬似粒子をどのようにして作製するかは、とりわけ、欧州特許第１４５４９８１号および欧州特許第１１７０３６７号に記載されている。
【０１３０】
したがって、さらに別の実施形態は、本発明によるＥｒｎｓタンパク質、本発明によるＥ２タンパク質および本発明によるＥ１タンパク質を含むことを特徴とする擬似粒子に関する。
【０１３１】
ワクチン中の擬似粒子の量および投与経路は、カプシドの免疫原性および類似性に関して不活化された完全ウイルス粒子と同等であるため、不活化された完全ウイルス粒子のものと同等であり得る。
【０１３２】
通常、１〜１００μｇの量の新規な当該ブタペスチウイルス擬似粒子がワクチン用量として非常に好適であり得る。コストの観点から、好ましい量は１〜５０μｇの範囲の擬似粒子であり得、１〜２５μｇの範囲がより好ましい。
【０１３３】
本発明によるワクチン、より具体的には、不活化完全ウイルス、サブユニット、例えばＥｒｎｓおよびＥ２タンパク質または擬似粒子をベースにしたワクチンには、好ましくはアジュバントを含める。当該技術分野でよく知られた慣用的なアジュバントは、例えば、フロイントの完全アジュバントおよび不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオンブロックポリマー、ムラミルジペプチド、Ｑｕｉｌｌ  Ａ（Ｒ）、鉱油、例えば、Ｂａｙｏｌ（Ｒ）またはＭａｒｋｏｌ（Ｒ）、植物油ならびにＣａｒｂｏｐｏｌ（Ｒ）（ホモポリマー）またはＤｉｌｕｖａｃ（Ｒ）Ｆｏｒｔｅである。また、ワクチンにいわゆる「ビヒクル」を含めてもよい。ビヒクルは、該ポリペプチドが共有結合することなく付着する化合物である。多くの場合で使用されるビヒクル化合物は、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたは酸化アルミニウム、シリカ、カオリンおよびベントナイトである。
【０１３４】
原則的に、本発明によるワクチンは１回投与するだけで充分であり得る。しかしながら、特に、不活化ワクチンの場合、完全ウイルスワクチンであれ、サブユニットワクチンであれ、擬似粒子ワクチンであれ、好ましくは、初回、場合によっては２回目のブースターワクチン接種もまた投与される。初回ブースターは通常、最初のワクチン接種の少なくとも２週間後に投与され得る。ブースターワクチン接種の非常に好適な時点は、最初のワクチン接種後、３〜１６週間の間である。２回目のブースター（必要であれば）は通常、初回ブースター後、４〜５０週間の間に投与され得る。
【０１３５】
不活化完全ウイルス、サブユニット、例えばＥｒｎｓ、Ｅ２およびＥ１タンパク質または擬似粒子アプローチの代替法は、宿主動物が豚である生の組換えウイルスベクターの新規な当該ブタペスチウイルスのＥｒｎｓ、Ｅ２またはＥ１遺伝子の担体としての使用である。
【０１３６】
宿主動物が豚である好適な組換えウイルスベクターの中でも、いくつかのウイルスベクター：仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、ブタアデノウイルス（ＰＡＶ）、ブタポックスウイルス（ＳＰＶ）および豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）が担体として特に好適である。また、ワクシニアウイルスも好適なウイルスベクターであることが報告されている。
【０１３７】
ワクチンにおけるかかる組換えウイルスベクターの使用は、ワクチン接種された動物が、ウイルスベクターと本発明による新規なペスチウイルスの両方に対して同時にワクチン接種状態になるというさらなる利点を有する。
【０１３８】
仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）を、ブタペスチウイルスＣＳＦＶ  Ｅ２遺伝子の生の組換えウイルスベクターとして使用することは、ｖａｎ  Ｚｉｊｌ  ｅｔ  ａｌ．（３８）に記載されており、Ｐｅｅｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（３９）には複製欠陥性ＰＲＶ組換えウイルスベクターについて記載されている。
【０１３９】
ブタペスチウイルスＣＳＦＶ  Ｅ２遺伝子のウイルスベクターとしての生組換えブタアデノウイルス（ＰＡＶ）ウイルスベクターはＨａｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（４０，４１）に記載されている。
【０１４０】
ブタペスチウイルスＣＳＦＶ  Ｅ２遺伝子のウイルスベクターとしての生組換えブタポックスウイルス（ＳＰＶ）ウイルスベクターは、Ｈａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．（４２）に記載されている。
【０１４１】
また、ワクシニアウイルスも、４種類すべての構造タンパク質の発現、とりわけ、Ｅ２を発現させるワクシニアウイルス組換えベクターでワクチン接種した豚における防御免疫の誘導が記載されたＲｕｅｍｅｎａｐｆ  ｅｔ  ａｌ．，（３７）により、好適なウイルスベクターであると報告されている。
【０１４２】
また、生弱毒化ＣＳＦＶウイルスも、生の組換えウイルスベクターとして非常に好適である。単なる一例として；Ｎｐｒｏ遺伝子を欠失させた生弱毒化ＣＳＦＶがＭａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９）に記載されている。かかる生弱毒化ウイルスにより、とりわけ、Ｎｐｒｏ遺伝子の欠失部位に、ＥｒｎｓまたはＥ２遺伝子をコードしている遺伝子を挿入することが可能になる。したがって、かかる生組換えＣＳＦＶウイルスも等しく、新規な当該ブタペスチウイルスのＥｒｎｓまたはＥ２遺伝子の非常に好適なウイルスベクターを構成する。
【０１４３】
かかる生の組換えウイルスベクターの非常に好適な量は、ウイルスの弱毒化レベルにもよるが、１０５  ＴＣＩＤ５０〜５×１０９  ＴＣＩＤ５０のウイルスベクター／ワクチン用量の範囲であり得る。
【０１４４】
新規な当該ブタペスチウイルスのＥｒｎｓ、Ｅ２またはＥ１遺伝子の発現は、哺乳動物細胞（下記参照）において機能性である任意の適切な異種プロモーターの制御下でもたらされ得る。異種プロモーターは、本発明による新規なブタペスチウイルスの野生型形態における新規な当該ブタペスチウイルスのＥｒｎｓ、Ｅ２またはＥ１遺伝子の転写を担うプロモーターでないプロモーターである。
【０１４５】
したがって、本発明の別の実施形態は、本発明による新規な当該ブタペスチウイルスのＥｒｎｓ、Ｅ２またはＥ１遺伝子をコードしている遺伝子を含むＤＮＡ断片であって、該遺伝子が機能性異種プロモーターの制御下にあることを特徴とするＤＮＡ断片に関する。
【０１４６】
哺乳動物細胞において機能性であるプロモーターは、哺乳動物細胞において該プロモーターの下流に存在する遺伝子の転写を駆動し得るプロモーターである。
【０１４７】
哺乳動物細胞において機能性である好適なプロモーターの例としては、従来のプロモーター、例えば、ＣＡＧプロモーター（Ｎｉｗａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １０８：１９３−１９９（１９９１）、（ヒト）サイトメガロウイルス極初期プロモーター（Ｓｅｅｄ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２９，８４０−８４２，１９８７；Ｆｙｎａｎ，Ｅ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９０，１１４７８−１１４８２，１９９３；Ｕｌｍｅｒ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９，１７４５−１７４８，１９９３）、ラウス肉腫ウイルス  ＬＴＲ（ＲＳＶ，Ｇｏｒｍａｎ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ７９，６７７７−６７８１，１９８２；Ｆｙｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．（上掲）；Ｕｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（上掲））、ＭＰＳＶ  ＬＴＲ（Ｓｔａｃｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５０，７２５−７３２，１９８４）、ＳＶ４０極初期プロモーター（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４５，７７３  ，１９８３）、ＳＶ−４０プロモーター（Ｂｅｒｍａｎ，Ｐ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，５２４−５２７，１９８３）、メタロチオネインプロモーター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６，３９−４２，１９８２）、熱ショックプロモーター（Ｖｏｅｌｌｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４９４９−５３，１９８５）、Ａｄ２の主要後期プロモーターおよびβ−アクチンプロモーター（Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５６，１５２−１５４，１９９２）が挙げられる。また、調節配列としては、ターミネーターおよびポリ−アデニル化配列が挙げられ得る。中でも、使用され得る配列は、よく知られた牛成長ホルモンポリ−アデニル化配列、ＳＶ４０ポリ−アデニル化配列、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）ターミネーターおよびポリ−アデニル化配列である。
【０１４８】
したがって、本発明はまた、機能性プロモーターの制御下、本発明によるＥｒｎｓおよび／またはＥ２および／またはＥ１タンパク質をコードしている遺伝子を含むＤＮＡ断片を含む、生の組換えウイルスベクターに関する。
【０１４９】
ワクチンに関する本発明の実施形態の別の形態は、豚のＧｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩ  ＣＴに対処するためのワクチンに関し、該ワクチンは、機能性プロモーターの制御下の本発明によるＥｒｎｓおよび／またはＥ２および／またはＥ１タンパク質をコードしている遺伝子を含むＤＮＡ断片を含む生の組換えウイルスベクターと、薬学的に許容され得る担体と、を含むものであることを特徴とする。
【０１５０】
該生の組換えウイルスベクターは、免疫原的有効量のＥｒｎｓおよび／またはＥ２および／またはＥ１および／またはＥを発現するはずのものであることは言うまでもない。
【０１５１】
不活化完全ウイルスワクチン、擬似粒子ワクチンまたは生の組換えウイルスベクターでのワクチン接種の代替法は、ＤＮＡワクチン接種の使用である。
【０１５２】
かかるＤＮＡワクチン接種は、適切なプロモーターの制御下のＥｒｎｓ、Ｅ２またはＥ１タンパク質をコードしている遺伝子を担持しているＤＮＡ断片を宿主動物に導入することに基づいたものである。該ＤＮＡが宿主の細胞に取り込まれたら、Ｅｒｎｓ、Ｅ２またはＥ１タンパク質をコードしている遺伝子が転写され、転写物が宿主の細胞内でＥｒｎｓ、Ｅ２またはＥ１タンパク質に翻訳される。これは、ブタペスチウイルスの自然な感染過程を近似的に模倣している。
【０１５３】
好適なプロモーターは、上記に例示したような、哺乳動物細胞において機能性のプロモーターである。
【０１５４】
適切なプロモーターの制御下のＥｒｎｓ、Ｅ２またはＥ１タンパク質をコードしている遺伝子を担持しているＤＮＡ断片は、例えば、プラスミドであり得る。このプラスミドは環状形態または線状形態であり得る。
【０１５５】
豚の成功裡のＤＮＡワクチン接種の一例は、Ｔｉａｎ，Ｄ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（４５）、Ｓｕｎ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（４６）およびＳｕｎ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（４７）に記載のような、豚コレラウイルスに対する成功裡のワクチン接種である。
【０１５６】
豚の成功裡のＤＮＡワクチン接種の他の例は、とりわけ、Ｇｅｒｄｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（４３）に記載のような、オーエスキー病に対する成功裡のワクチン接種である。これには、糖タンパク質Ｃを担持しているヒトサイトメガロウイルスの主要極初期プロモーターの制御下のＤＮＡ断片が使用されているＤＮＡワクチンが記載されている。ワクチン接種は、２週間の間隔で４回、５０μｇのＤＮＡ量で行われた。ワクチン接種された動物には、イムノブロットにおいてそれぞれの抗原を認識し、中和活性を示す血清抗体が生成された。
【０１５７】
豚の成功裡のＤＮＡワクチン接種の別の例は、Ｇｏｒｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（４４）に示されている。これには、パンデミックおよび従来のぶたＨ１Ｎ１インフルエンザの両方に対する豚の成功裡のＤＮＡワクチン接種が記載されている。機能性プロモーターの制御下のインフルエンザＨ１Ｎ１のＨＡ遺伝子を含むＤＮＡワクチンが、プライムワクチン接種と、プライミングの３週間後と６週間後に２回の等しいブーストでワクチン接種された。
【０１５８】
本発明による新規なペスチウイルスのＥ２タンパク質は最も免疫原性のタンパク質であるため、これが、ＤＮＡワクチンにおける使用に好ましいタンパク質である。それでもやはり、ＤＮＡワクチンの免疫原性を高めるために、上記の方法（（４５），（４６），（４７））を使用すること、または（９）に記載のようなさらなる手段に依存することが必要な場合があり得る。
【０１５９】
したがって、この実施形態のさらに別の形態は、豚のＧｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩ  ＣＴに対処するためのワクチンであって、該ワクチンは、機能性プロモーターの制御下の本発明によるＥｒｎｓ、Ｅ２またはＥ１タンパク質をコードしている遺伝子を含むＤＮＡ断片と薬学的に許容され得る担体とを含むものであることを特徴とする。
【０１６０】
Ｅｒｎｓ、Ｅ２またはＥ１タンパク質をコードしている遺伝子を含むＤＮＡ断片が、免疫原的有効量のＥｒｎｓ、Ｅ２またはＥ１タンパク質を発現するはずのものであることは言うまでもない。
【０１６１】
本発明による完全ブタペスチウイルス、本発明による擬似粒子、本発明による生組換えベクターまたはＤＮＡワクチンをベースにした本発明によるワクチンの「免疫原的有効量」を構成する量は、所望の効果および標的生物体に依存する。
【０１６２】
用語「免疫原的有効量」は、本明細書で用いる場合、非免疫処置豚において野生型Ｇｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩ  ＣＴペスチウイルスでの感染によって引き起こされる病理学的効果と比較した場合、野生型Ｇｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩ  ＣＴペスチウイルスでの感染によって引き起こされる病理学的効果が低減される程度に、豚に免疫応答が誘導されるのに必要な、ＣＴＡＰＶ、擬似粒子、生組換えベクターまたはＤＮＡワクチンの量に関するものである。
【０１６３】
処置が「免疫原的に有効」であるかどうかを、例えば、実験的攻撃感染源をワクチン接種対象動物に投与し、次に標的動物の疾患の臨床徴候、血清学的パラメータを調べることによって、または再分離した病原体を測定した後その所見を野外感染豚で観察されたものと比較することによって判定することは、充分に当業者の能力の範囲内である。
【０１６４】
投与されるウイルスの量は、投与経路、アジュバントの存在および投与時期に依存する。これは以下に例示し、また、他のペスチウイルスワクチンについてのワクチンに関する上記および以下に引用した文献にも、さらなる手引きが示されている。
【０１６５】
本発明によるウイルスを含む生ワクチンの好ましい量は、例えば、組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）として表示される。例えば、生ウイルスでは、ウイルスの残存ビルレンスにもよるが、１０〜１０９  ＴＣＩＤ５０／動物の用量範囲の用量が好都合に使用され得る。好ましくは、１０２〜１０６  ＴＣＩＤ５０の範囲が使用される。多くの投与様式が適用され得、すべて、当該技術分野で知られている。本発明によるワクチンは、好ましくは動物に注射（筋肉内もしくは腹腔内経路）によって、または経口で投与される。
【０１６６】
投与のためのプロトコルは、標準的なワクチン接種実務に従って最適化され得る。すべての場合において、皮内注射器（ＩＤＡＬ）による投与が好ましい投与様式である。
【０１６７】
ワクチンが本発明による不活化ウイルスまたは擬似粒子を含むものである場合、用量はまた、投与されるウイルス粒子の数として表示され得る。生ウイルス粒子は、標的動物において免疫機構によって除去される前にある程度複製されるので、この用量は通常、生ウイルス粒子の投与と比較した場合、いくぶん高いものであり得る。不活化ウイルスベースのワクチンでは、使用されるアジュバントにもよるが、約１０４〜１０９個の粒子の範囲のウイルス粒子の量が、通常好適であり得る。
【０１６８】
ワクチンが、サブユニット、例えば本発明によるＥｒｎｓ、Ｅ２またはＥ１タンパク質を含むものである場合、用量はまた、タンパク質のマイクログラムで表示され得る。サブユニットベースのワクチンでは、好適な用量は、この場合も使用されるアジュバントによるが、通常５〜５００マイクログラムの範囲のタンパク質であり得る。
【０１６９】
ワクチンが、Ｅｒｎｓ、Ｅ２またはＥ１タンパク質をコードしている遺伝子を含むＤＮＡ断片を含むものである場合、用量は、ＤＮＡのマイクログラムで表示され得る。サブユニットベースのワクチンでは、好適な用量は通常、とりわけ、使用される発現プラスミドの効率にもよるが、５〜５００マイクログラムの範囲のＤＮＡであり得る。多くの場合、２０〜５０マイクログラムの量のプラスミド／動物が有効なワクチン接種に充分であり得る。
【０１７０】
本発明によるワクチンは、豚の肥育の状況における投与に適し、所望の適用経路および所望の効果と適合する任意の形態を採用し得る。本発明によるワクチンの調製は、ペスチウイルスワクチン作製の当業者に慣用的な手段によって行われる。
【０１７１】
経口経路は、ワクチンの投与が容易であるという点で好ましい。
【０１７２】
経口投与のためには、ワクチンは好ましくは、経口投与のための適切な担体、すなわち、セルロース、食用物質もしくは代謝可能な物質、例えば、アルファセルロースまたは植物起源もしくは動物起源のさまざまな油類と混合される。
【０１７３】
実際、ぶたは、いくつかの異なる病原性のウイルスまたは微生物に対してワクチン接種される。
【０１７４】
したがって、実用上および経済上の両方の理由で、本発明による豚用ワクチンを、例えば、ウイルスもしくは豚に対して病原性の微生物の追加の免疫原もしくは該ウイルスまたは微生物の免疫原をコードしている遺伝情報と組み合わせることは非常に魅力的である。
【０１７５】
したがって、この実施形態の好ましい一形態は、ワクチンが、少なくとも１種類の他の豚病原性微生物もしくは豚病原性ウイルスおよび／または該豚病原性微生物もしくは豚病原性ウイルスの少なくとも１種類の他の免疫原性成分および／または該他の免疫原性成分をコードしている遺伝子物質を含むものである本発明によるワクチンに関する。免疫原または免疫原性成分は、動物において免疫応答を誘導する化合物である。これは、例えば、完全体のウイルスもしくは細菌、または該ウイルスもしくは細菌のタンパク質もしくは糖鎖部分であり得る。
【０１７６】
ぶたに対して病原性である最も一般的な病原性ウイルスおよび微生物は、ブラキスピラ・ヒオディセンテリア（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、アフリカ豚コレラウイルス、ニパウイルス、ブタサーコウイルス、ブタトルクテノウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタパルボウイルス、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）、口蹄疫ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ロタウイルス、大腸菌、エリジペロ・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ボルデテラ・ブロンキセプティカ、豚コレラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓ）、ヘモフィルス・パラスイス、パスツレラ・ムルトシダ、豚レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ）、マイコプラズマ・ハイオニューモニエおよびアクチノバシラス・プルロニューモニエである。
【０１７７】
したがって、本発明のより好ましい一形態は、ぶたに対して病原性のウイルスまたは微生物が、ブラキスピラ・ヒオディセンテリア（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、アフリカ豚コレラウイルス、ニパウイルス、ブタサーコウイルス、ブタトルクテノウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタパルボウイルス、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）、口蹄疫ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ロタウイルス、大腸菌、エリジペロ・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ボルデテラ・ブロンキセプティカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、豚コレラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓ）、ヘモフィルス・パラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、豚レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ）、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびアクチノバシラス・プルロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からなる群より選択される本発明によるワクチンに関する。
【０１７８】
また別の実施形態は、本発明によるワクチンの調製方法に関し、該方法は、本発明によるウイルスおよび／または本発明によるＥｒｎｓタンパク質および／または本発明によるＥ２タンパク質および／または本発明によるＥ１タンパク質および／または本発明によるＤＮＡ断片および／または本発明によるＤＮＡ断片および／または本発明によるＤＮＡ断片および／または本発明による生の組換えウイルスベクターおよび／または本発明による擬似粒子を、薬学的に許容され得る担体と混合することを含む。
【０１７９】
本発明のさらに別の実施形態は、豚のＧｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩ  ＣＴに対処するためのワクチンにおける使用のための、本発明によるウイルスおよび／または本発明によるＥｒｎｓタンパク質および／または本発明によるＥ２タンパク質および／または本発明によるＥ１タンパク質および／または本発明によるＤＮＡ断片および／または本発明によるＤＮＡ断片および／または本発明によるＤＮＡ断片および／または本発明による生の組換えウイルスベクターおよび／または本発明による擬似粒子に関する。
【０１８０】
上記のように、Ａ−ＩＩ  ＣＴは高頻度にみられ、これは、本発明による新規なペスチウイルスが、最初に臨床徴候が顕性となる前に、肥育舎にまたは特定の豚集団にも存在するかどうかがわかることが重要であることを意味する。したがって、疾患に対する効率的な防御のためには、本発明による新規なペスチウイルスの存在の迅速で正確な検出が重要である。
【０１８１】
したがって、本発明の別の目的は、本発明による新規なペスチウイルスの検出に適した診断ツールを提供することである。
【０１８２】
このようなツールは、一部において該ウイルスに対する抗体の利用可能性に依存する。かかる抗体は例えば、本発明による新規なペスチウイルスに関する診断テストに使用され得る。
【０１８３】
本発明による新規なペスチウイルスに対する抗体を含む抗体または抗血清は、例えば豚、家禽または例えばウサギに本発明によるウイルスをワクチン接種した後、約４週間後、採血し、凝固した血液を遠心分離し、血清をデカンテーションすることによって速やかに容易に得られ得る。かかる方法は、当該技術分野でよく知られている。
【０１８４】
本発明による新規なペスチウイルスに対して生成される抗体（これは、ポリクローナル、単一特異性またはモノクローナル（またはその誘導体）であり得る）の他の調製方法もまた、当該技術分野でよく知られている。ポリクローナル抗体が所望される場合、ポリクローナル血清を生成させて加工する手法が数十年間にわたって当該技術分野でよく知られており、例えば、Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｔｅｒ（３５）を参照のこと。
【０１８５】
本発明によるウイルスに対して反応性のモノクローナル抗体は、近交マウスを、同様に当該技術分野で長年知られている手法によって免疫処置することにより調製され得、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（３６）を参照のこと。
【０１８６】
したがって、本発明の別の実施形態は、本発明によるウイルスに反応性の抗体または抗血清に関する。
【０１８７】
ＣＴＡＰＶの検出に基づいた診断テストキットは、例えば、標準的なＥＬＩＳＡ試験を含むものであり得る。かかる試験の一例では、ＥＬＩＳＡプレートのウェルの壁を、該ウイルスに対して指向される抗体でコーティングする。試験対象材料とのインキュベーション後、該ウイルスに反応性の標識抗体をウェルに添加する。試験対象材料に実際に本発明による新規なペスチウイルスが含まれているとしたら、このウイルスは、ＥＬＩＳＡのウェルにコーティングされた抗体に結合し得る。続いてウェルに添加され得る該ウイルスに反応性の標識抗体が、今度は該ウイルスに結合し得、次いで、発色反応により、該ウイルスの抗原性物質の存在が明らかになり得る。
【０１８８】
したがって、本発明のまた別の実施形態は、本発明によるウイルスまたはその抗原性物質に反応性の抗体を含む、Ｇｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩ先天性振戦関連ブタペスチウイルスの検出用診断テストキットに関する。ウイルスの抗原性物質は広い意味に解釈されたい。これは、例えば、分解形態のウイルス、またはウイルス外膜タンパク質を含むウイルスエンベロープ材料であり得る。ウイルスの該材料が該ウイルスに対して生成する抗血清に反応性である限り、該材料は抗原性物質とみなされる。
【０１８９】
また、血清中のＧｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩ先天性振戦関連ブタペスチウイルスに反応性の抗体の検出に基づいた診断テストキットは、例えば、標準的なＥＬＩＳＡ試験を含むものであり得る。かかる試験では、ＥＬＩＳＡプレートのウェルの壁が、例えば、本発明によるウイルスまたはその抗原性物質でコーティングされ得る。試験対象材料、例えば、本発明による新規なペスチウイルスに感染していることが疑われる動物の血清とのインキュベーション後、本発明によるウイルスに反応性の標識抗体をウェルに添加する。試験対象血清中に本発明による新規な抗−ペスチウイルス抗体が存在しているとしたら、これらの抗体は、ＥＬＩＳＡのウェルにコーティングされたウイルスに結合する。その結果、後で添加された該ウイルスに反応性の標識抗体は結合され得ず、発色反応はみられ得ない。したがって、発色反応がないことにより、本発明によるウイルスに反応性の抗体の存在が明らかになり得る。
【０１９０】
したがって、本発明のまた別の実施形態は、本発明によるウイルスまたはその抗原性物質を含む、Ｇｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩ先天性振戦関連ブタペスチウイルスに反応性の抗体の検出用診断テストキットに関する。
【０１９１】
イムノアッセイの設計はさまざまであり得る。例えば、イムノアッセイは、競合または直接反応に基づいたものであり得る。さらに、プロトコルは、固相支持体を使用してもよく、細胞系材料を使用してもよい。抗体−抗原複合体の検出は標識抗体の使用を伴うものであり得；標識は、例えば、酵素、蛍光分子、化学発光分子、放射性分子または色素分子であり得る。
【０１９２】
試料中の本発明によるウイルスに反応性の抗体の検出のための好適な方法としては、上記のＥＬＩＳＡに加えて、免疫蛍光試験（ＩＦＴ）およびウエスタンブロット解析が挙げられる。
【０１９３】
Ｇｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩ先天性振戦関連ブタペスチウイルスの有無を診断するための代替的で速やかで容易な診断テストは、本発明による新規なペスチウイルスのゲノムと特異的に反応するＰＣＲプライマーセットを含む、上記のＰＣＲ試験である。これとの関連における特異的とは、例えば、本発明による新規なペスチウイルスのゲノムに対して一意的（ｕｎｉｑｕｅ）であり、すなわち、他のペスチウイルスのゲノムではそうでないことを意味する。
【０１９４】
上記の同定されたプライマーだけでなくさらなるプライマーを使用してもよいことは言うまでもない。本発明により初めて、本発明による新規なペスチウイルスのゲノムのユニーク配列が提供される。これにより、当業者が、なんらさらなる労力を伴わずに、他の選択的プライマーを選択することが可能になる。本発明によって提供される本発明による新規なペスチウイルスのゲノムの遺伝子の配列と他のペスチウイルスの既知のゲノムとの単純なコンピュータ解析により、当業者は、本発明による新規なペスチウイルスの検出のため、および／または本発明による新規なペスチウイルスと他のウイルス（ブタ）病原体との区別のための診断テスト用の他の特異的ＰＣＲプライマーを開発することができる。
【０１９５】
本発明による新規なペスチウイルスのゲノムと特異的に反応するＰＣＲプライマーは、本発明による新規なペスチウイルスのゲノムのみと反応し、別の（ブタ）病原性ウイルスまたは（ブタ）病原性ウイルス群のゲノムとは反応しないプライマーであると理解されたい。
【０１９６】
したがって、別の実施形態は、本発明による新規なペスチウイルスのゲノムに特異的に反応性であるＰＣＲプライマーセットを含むことを特徴とする、Ｇｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩ先天性振戦関連ブタペスチウイルスの検出用診断テストキットに関する。
【０１９７】
この実施形態の好ましい一形態は、配列番号：１５〜１６に示すプライマーセットを含む、Ｇｒｏｕｐ  Ａ−ＩＩ先天性振戦関連ブタペスチウイルスの検出用診断テストキットに関する。
【０１９８】
特別な形態の診断テストを、実施例１０により詳細に記載するｑＲＴ−ＰＣＲ試験により提供する。このテストは、種々の試料、例えば血清試料、精子試料および組織試料中に存在するウイルスの量の定量に非常に好適である。かかるテストにより、ウイルスＲＮＡの検出に加えて、かかる試料中に存在するＲＮＡコピー数の速やかで信頼性のある定量が可能になる。
【０１９９】
実施例１０に、どのようにしてＲＮＡを単離し、ＲＴ反応に供し、その後、オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＣＴＡＰＶゲノムの５’ＵＴＲゲノムを増幅したかを記載している。ウイルスゲノムのこの部分は、ＣＴＡＰＶバリアント１〜９間で保存されたヌクレオチド配列に基づいて（ヌクレオチド配列のアラインメントに基づいて）選択された。実施例１０で使用したプライマー配列は以下の通り：ＣＴＡＰＶ−ＰＡＮ２−Ｆ３−Ｂ：ＣＧＴＧＣＣＣＡＡＡＧＡＧＡＡＡＴＣＧＧ（配列番号：３５）およびＣＴＡＰＶ−ＰＡＮ２−Ｒ３−Ｂ（配列番号：３６）：ＣＣＧＧＣＡＣＴＣＴＡＴＣＡＡＧＣＡＧＴであった。
【０２００】
しかしながら、当業者であれば、ＣＴＡＰＶバリアント間で保存されたヌクレオチド配列を示すウイルスゲノムの任意の部分が好適なプライマーの選択に使用され得ることが認識され得よう。
【０２０１】
実施例１０は、本発明によるｑＲＴ−ＰＣＲ反応が、どのようにして、例えば雄豚の精子中のウイルスＲＮＡの検出に成功裡に使用されたかを示す。
【０２０２】
実施例１１に、この診断手法を使用し、ＣＴＡＰＶ感染雄豚の精子により無ＣＴＡＰＶ未経産豚がＣＴＡＰＶに感染状態になり得ることを示す。
【０２０３】
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２４）ｄｅ  Ｓｍｉｔ，Ａ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：１４６７−１４７６（２００１）．
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３２）Ｌｕｔｔｉｃｋｅｎ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．ｏｆ  ｔｈｅ  ＯＩＥ  ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｃｌａｓｓｉｃａｌ  Ｓｗｉｎｅ  Ｆｅｖｅｒ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ  ＵＫ，Ｊｕｌｙ  ９−１０，Ｓｕｍｍａｒｉｅｓ  ｐ．１７（１９９８）
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４８）Ｄｏｎｅ，Ｊ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｖｅｔ．Ｊｏｕｒｎ．１４２：１４５−１５０（１９８６）
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【図面の簡単な説明】
【０２０４】
【図１】図１は、ＣＴＡＰＶのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子（ＮＳ５Ｂ）において設計されたプライマー、およびＰＣＲ産物の概略図である。
【図２】図２は、ホルマリン固定ヘマトキシリン−エオシン染色された４００倍の倍率の脳および脊髄組織における最も明確な異常である。（Ａ）プルキンエ細胞（顆粒層と白質間の大細胞層の空砲化を示す小脳の断面。白矢印は、一部のプルキンエ細胞における空砲化の例を示す。（Ｂ）脱髄を示す白質の空砲化。脊髄における軸索の脱髄の一例を白矢印で示す。（Ｃ）大脳内の変性神経細胞（神経食現象）付近に小グリア結節を形成している小グリア細胞（濃い紫に染色）の蓄積。神経細胞を白矢印で示す。（Ｄ）胸髄における血管周囲性単核細胞浸潤。好酸性顆粒球が血管（矢印で示す）を取り囲んでいる。
【図３】図３は、ＣＴＡＰＶ  １および以前に同定された他のペスチウイルス（そのヌクレオチド配列はＧｅｎｂａｎｋに寄託されている（受託番号は図中に示している））の系統樹である。ポリタンパク質のアミノ酸配列を最近傍法に使用した。左隅のバーは、ヌクレオチド置換／部位の平均数を表す。
【図４】図４は、ＣＴＡＰＶバリアントの系統解析である。そのアミノ酸配列を最近傍法に使用している。左隅のバーは、ヌクレオチド置換／部位の平均数を表す。ゲノムの最初の５０００個のヌクレオチドに基づいた解析。ＣＴＡＰＶ  ７型は含まれていない。ＣＴＡＰＶ  ５はＣＴＡＰＶ  ８と同一である。
【図５】図５は、ＣＴＡＰＶ  １と１ＢのＥｒｎｓ−Ｅ１−Ｅ２領域のアミノ酸配列の比較である。Ｅ２タンパク質配列はイタリック体である。Ｅｒｎｓタンパク質に太線で下線を付し、Ｅ１タンパク質配列に細線で下線を付している。
【図６】図６は、ＣＴＡＰＶ  １Ｂと８のＥｒｎｓ−Ｅ１−Ｅ２領域のアミノ酸配列の比較である。Ｅ２タンパク質配列はイタリック体である。Ｅｒｎｓタンパク質に太線で下線を付し、Ｅ１タンパク質配列に細線で下線を付している。
【図７】図７：ウサギにおいて生成させた抗体が、バキュロウイルス／ＳＦ９発現系において発現させたＣＴＡＰＶ  Ｅ２タンパク質を特異的に認識する。マーカーバンドは（下から上に）５、１０、２０、２５、３７、５０、７５、１００、１５０および２５０ｋＤａに対応する。
【図８】図８は、Ｅｒｎｓタンパク質コード領域（太い下線）、Ｅ１タンパク質コード領域（細い下線）およびＥ２タンパク質コード領域（イタリック体）の位置の同定である。配列は参照ゲノムのｎｔ  １２５９から開始している。
【図９】図９は、スタンダードライン試料および陰性対照試料のＲＴ−ｑＰＣＲデータである。図９Ａは、ＲＦＵに対してプロットしたサイクルのＣｔ値の図表を示し、図９Ｂは、標準曲線；標的核酸の連続１０倍（対数）希釈液の対数変換濃度に対してプロットしたＣｔ値を示し、図９Ｃは、リアルタイムでの微分（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）融解曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【０２０５】
［実施例］
［実施例１］
オランダの養豚場での新たなウイルスＣＴＡＰＶ  １の発見
オランダに存在するある養豚場で、先天性振戦Ａ−ＩＩ型のアウトブレイクが２０１２年初期に診断された。初産動物の未経産豚から生まれた子豚が主として罹患したが、出産回数の多い雌豚もまた、たまに罹患していた。診断は、臨床観察、続いて考えられ得る疾患原因として先天性振戦Ａ−Ｉ、Ａ−ＩＩＩ、Ａ−ＩＶおよびＡ−Ｖ型の排除に基づいて行った。臨床的には罹患子豚は、活動中の過度な筋収縮による異なる等級の振戦を示した。症状は、寝ているときは減弱された。子豚の死亡は、罹患動物が自身で摂食できないこと（特に、生後、最初の１週間）によって引き起こされる副次的効果であった。組織学的に、脳と脊髄をミエリン形成不全によって特性評価した。以下にさらに記載するように、すべての罹患豚が生き残ったわけではなかった。生き残ったものでは、振戦は、豚が成長するにつれて減弱され、最終的に消失した。
【０２０６】
アウトブレイクの情報に基づき、この疾患の感染性の原因が疑われた。２０１２年の最初の２０週間に、未経産豚から生まれた合計２３１匹の同腹子のうち、合計４８匹の同腹子が、先天性振戦の症状を伴って未経産豚から生まれた。これは、未経産豚から生まれたすべての同腹子の２１％に等しい。感染ピーク時の最初のアウトブレイク後８週目、未経産豚の同腹子の８５％が先天性振戦Ａ−ＩＩ型を有する子豚であることが示された。離乳までの子豚の死亡（「ｌｏｓｓ」）（子豚の死亡（「ｄｅａｔｈ」））のパーセンテージは罹患同腹子において２６％であったのに対して、非罹患同腹子では１１％であった。罹患同腹子では、子豚の死亡の６０％が先天性振戦によるものであった。１腹あたりの産子豚総数は影響しなかった。先天性振戦はどちらの性別にも罹患し、同腹子内での有病率は＜１０％〜１００％の間でさまざまであった。
【０２０７】
２０１２年のアウトブレイク以前、２００９年１１月と２０１０年１２月に先天性振戦が数匹の同腹子に観察された。
【０２０８】
先天性振戦のアウトブレイクに伴う問題は、この肥育舎において２０１２年以降継続しており、２０１３年と２０１４年に罹患子豚が得られた（下記参照）。しかしながら、発生率は低下した。
【０２０９】
血漿試料を２０１２年３月（６例の試料，すべて、ＣＴ  Ａ−ＩＩ型の症状を有する子豚）と２０１２年４月（５例の試料，すべて、ＣＴ  Ａ−ＩＩ型の症状を有する子豚）に採取した。新たなウイルスＣＴＡＰＶ  １が１１／１１例の試料において検出された。
【０２１０】
さらなる血漿試料を同じ肥育舎で２０１２年７月に採取した。２匹の雌豚および１匹の未経産豚から生まれた子豚由来の合計１６例の血清試料を分析した。これらの子豚はいずれも先天性振戦を示さなかった。ＣＴＡＰＶは１／１６例の試料において見出された。
【０２１１】
この疾患の新たなアウトブレイクが２０１３年１月に診断された。検死のため、４匹の新生児の初乳摂取前の子豚を入手し、すべて、ＣＴ  Ａ−ＩＩ型を示した。同じ肥育舎が起源であったが、起源のアウトブレイクと新たな臨床問題の発生との間で相当な時間が経過していたため、このウイルスをＣＴＡＰＶ  １Ａと命名した。この新たなウイルスＣＴＡＰＶ  １Ａは４／４匹の子豚において検出された。
【０２１２】
この疾患の新たなアウトブレイクが２０１３年３月に診断された。３匹の新生児の初乳摂取前の子豚を検死のために入手し、すべて、ＣＴ  Ａ−ＩＩ型を示した。このウイルスをＣＴＡＰＶ  １Ｂと命名した。この新たなウイルスＣＴＡＰＶ  １は３／３例の試料において検出された。
【０２１３】
この疾患の新たなアウトブレイクが２０１４年１月に診断された。４匹の新生児の初乳摂取前の子豚を入手し（直腸スワブ）、すべて、ＣＴ  Ａ−ＩＩ型を示した。このウイルスをＣＴＡＰＶ  １Ｃと命名した。この新たなウイルスＣＴＡＰＶ  １は４／４例の試料において検出された。さらに３匹の子豚の検死を２０１４年２月に行い、この場合も、３匹すべての子豚がＣＴ  Ａ−ＩＩ型を示し、ＣＴＡＰＶが３／３例の試料において検出された。
【０２１４】
２０１３年１月、２０１３年３月および２０１４年２月のアウトブレイクによる子豚の死後検査を行った。脳と脊髄に脱髄の徴候が示された（実施例２参照）。
【０２１５】
先天性振戦Ａ−ＩＩ型の病歴がない肥育舎の７匹の子豚（出産前の妊娠期間の最後の週の６匹；新生児の１匹）をＰＣＲおよび死後検査の陰性対照として使用した。血漿試料はすべて、ＣＴＡＰＶウイルスについて陰性であり、これらの子豚において組織学的異常は観察されなかった。
【０２１６】
血清および便の試料の採取
便および血清の試料を、新生児豚にＣＴ  Ａ−ＩＩ型の問題を有するオランダの肥育舎で入手した。血液をチューブ（型番：Ｖａｃｕｏｌｅｔｔｅ  ８ｍｌ  Ｓｅｐ  Ｃｌｏｔ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｒｅｆ：４５５０７１）内に採取し、血清を３０００×ｇで４℃にて２０分間、遠心分離することによって分離した。便は、乾燥綿棒を用いて採取し、２ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）を入れた滅菌チューブ内に入れた。次いで、便の付いた綿棒を強く撹拌し、廃棄した。血清試料および便試料はどちらも、分析まで−７０℃にて保存した。
【０２１７】
ＤＮＡｓｅ処理を伴ってもよいウイルスＲＮＡの単離
ウイルスＲＮＡの単離のため、ＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）をＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）と併用した。
【０２１８】
簡単には、担体−ＲＮＡ／ＡＶＥのＡＶＬバッファー中１％の溶液を調製した。５６０μｌの担体−ＲＮＡ／ＡＶＥ（ＡＶＬ中）を１４０μｌの試料と混合し、室温で１０分間インキュベートした。次いで、５６０μｌのエタノール（＞９９％）を添加し、試料をＱＩＡａｍｐミニスピンカラムに移した。カラムを６０００×ｇで１分間、遠心分離した。カラムを、２５０μｌのＡＷ１を添加し、カラムを６０００×ｇで３０秒間スピンすることによって洗浄した。ＤＮａｓｅ−ミックスを、１０μＬのＤＮａｓｅを７０μｌのＲＤＤバッファー／試料と混合することによって調製した。８０μｌのＤＮａｓｅ−ミックスを、膜上で室温にて１５分間インキュベートした。２５０μｌのＡＷ１をカラムに入れ、６０００×ｇで３０秒間スピンすることによって洗浄を継続した後、５００μｌのＡＷ２をカラムに添加し、１３０００×ｇで３分間、遠心分離した。収集チューブを交換し、カラムをさらに１分間、遠心分離した。スピンカラムを１．５ｍｌ容エッペンドルフチューブ内に移し、ここで、６５μｌのＡＶＥバッファーを膜上に添加し、６０００×ｇで１分間、遠心分離した。このＲＮＡ試料をすぐに逆転写反応に使用した。
【０２１９】
逆転写反応
ＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲ用ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡに転写した。いくらかの軽微な修正を伴ったが。製造業者のプロトコルに従った。要約すると、１μｌのランダムヘキサマーと１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰを８μｌのＲＮＡと混合した。これをまず、６５℃で５分間インキュベートし、次いで氷上で冷却した。次いで、２μｌの１０×ＲＴバッファー、４μｌのＭｇＣＬ２、２μｌのＤＴＴ、１μｌのＲＮａｓｅＯＵＴおよび１μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ  ＲＴからなる１０μｌのｃＤＮＡ合成ミックスを試料に添加した。試料をまず、２５℃で１０分間、次いで５０℃で５０分間の後、８５℃で５分間インキュベートし、最後に氷上で冷却した。１μｌのＲＮａｓｅ  Ｈを試料に添加し、これを３７℃で２０分間インキュベートした。得られたｃＤＮＡ試料を使用まで−２０℃で保存した。
【０２２０】
ＰＣＲ
Ａ．プライマーの組み合わせＣＴＡＰＶ−ＰＡＮ２−Ｆ１Ｒ１，−Ｆ２Ｒ１，−Ｆ１Ｒ２，−Ｆ２Ｒ２，表１，２
各ＰＣＲ反応液は、２７μｌのＷＦＩ、１μｌのＳｕｐｅｒ  Ｔａｑ  Ｐｌｕｓ  ５μｌの１０×Ｓｕｐｅｒ  Ｔａｑ  ＰＣＲバッファー、５μｌのｄＮＴＰ、５μｌのフォワードプライマーおよび５μｌのリバースプライマーを含むものであった。使用したプライマーの概要を表１に示す。ＣＴＡＰＶを検出するために使用したＰＣＲプログラムは、９５℃で４分間のイニシャライズ相からなるものであった。この後、順次、９５℃で３０秒間の変性、プライマーペア（表１参照）に適切なアニーリング温度で３０秒間のアニーリングおよび７２℃で３０秒間の伸長の３５回サイクルを行った。７２℃での最後の伸長を１０分間維持した。すべてのＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル電気泳動で解析した。図１参照。
【０２２１】
Ｂ．プライマーの組み合わせＣＴＡＰＶ−ＰＡＮ−ＦＷ−ＲＶ，ＰＡＮｄｅｇ−ＦＷ−ＰＡＮｄｅｇ−ＲＥＶ，表１，２
各ＰＣＲ反応液は、２７μｌのＷＦＩ、１μｌのＳｕｐｅｒ  Ｔａｑ  Ｐｌｕｓ  ５μｌの１０×Ｓｕｐｅｒ  Ｔａｑ  ＰＣＲバッファー、５μｌのｄＮＴＰ、５μｌのフォワードプライマーおよび５μｌのリバースプライマーを含むものであった。使用したプライマーの概要を表２に示す。ＣＴＡＰＶを検出するために使用したＰＣＲプログラムは、９５℃で４分間のイニシャライズ相からなるものであった。この後、順次、９５℃で３０秒間の変性、プライマーペア（表２参照）に適切なアニーリング温度で３０秒間のアニーリングおよび７２℃で６０秒間の伸長の４０回サイクルを行った。７２℃での最後の伸長を１０分間維持した。すべてのＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル電気泳動で解析した。
【０２２２】
Ｃ．プライマーの組み合わせＣＴＡＰＶ−ＰＡＮ２−Ｆ３Ｒ３，−Ｆ４Ｒ４，表１，２
各ＰＣＲ反応液は、２７μｌのＷＦＩ、１μｌのＳｕｐｅｒ  Ｔａｑ  Ｐｌｕｓ  ５μｌの１０×Ｓｕｐｅｒ  Ｔａｑ  ＰＣＲバッファー、５μｌのｄＮＴＰ、５μｌのフォワードプライマーおよび５μｌのリバースプライマーを含むものであった。使用したプライマーの概要を表１に示す。ＣＴＡＰＶを検出するために使用したＰＣＲプログラムは、９５℃で４分間のイニシャライズ相からなるものであった。この後、順次、９５℃で３０秒間の変性、プライマーペア（表１参照）に適切なアニーリング温度で３０秒間のアニーリングおよび７２℃で３０秒間の伸長の３５回サイクルを行った。７２℃での最後の伸長を１０分間維持した。すべてのＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル電気泳動で解析した。
【表３】
0006772137.tif 000005
【表４】
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【０２２３】
Ｄ．サイバーグリーン定量的ＰＣＲ
ｑＰＣＲ結果の定量のためのスタンダードライン
ｑＰＣＲの標準を得るため、ｑＰＣＲの標的配列を含むＣＴＡＰＶ配列の１５５ｂｐのＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ４プラスミドベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内で、製造業者の使用説明書に従ってクローニングした。クローニングのための１５５ｂｐのＣＴＡＰＶ  ＰＣＲ産物は、ＣＴＡＰＶ−ＰＡＮ２−Ｆ１およびＣＴＡＰＶ−ＰＡＮ２−Ｒ１プライマー（表３参照）を用いたＰＣＲを行うことにより取得した。続いて、ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル上で電気泳動させた。１５５ｂｐのバンドを切り出し、ＤＮＡをアガロースゲルから抽出した後、ＴＯＰＯ４ベクター内でクローニングした。
【０２２４】
ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＰＣＲ産物をｐＣＲ（登録商標）４−ＴＯＰＯ４（登録商標）ベクターにライゲーションし、これでＯｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０ケミカルコンピテント大腸菌を形質転換した。簡単には、４μｌのＤＮＡを１μｌの塩類溶液および１μｌのＴＯＰＯベクターと混合した。このライゲーション物を室温で５分間インキュベートし、次いで氷上に置いた。２μｌのライゲーションミックスをＯｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０ケミカルコンピテント大腸菌に添加した。氷上で３０分間のインキュベーション後、混合物に４２℃の水浴中で３０秒間熱ショックを与え、氷上に置き戻した。次に、２５０μｌの温ＳＯＣ培地を添加し、混合物を３７℃で１時間、振盪インキュベータ内でインキュベートした後、１００μｌの混合物を寒天−ＬＢ＋１００μｇ／ｍｌアンピシリンプレート上に広げた。このプレートを３７℃のインキュベータ内で一晩インキュベートした。
【０２２５】
正しくクローニングされたコロニーを、Ｍ１３プライマー（以下の表３参照；（配列番号：３０および３１））を使用したコロニー−ＰＣＲを用いて標準的なＰＣＲアッセイにおいて同定した後、ゲル電気泳動を行った。正しいコロニーを、アンピシリンを含むＬＢＡＣＦ培地（ＭＳＤ  ＡＨ  Ｍｅｄｉａ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎロット番号３１８７８１；Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地，動物性成分無含有）中で培養し、これからプラスミドＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者のプロトコルに従って分離した。変異について確認するため、プラスミドＤＮＡを、Ｍ１３プライマーを用いてシーケンシングした。
【表５】
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【０２２６】
標的配列の標準希釈度を、ベクターのプラスミドＤＮＡ濃度を測定することにより計算した。プラスミドコピー／μｌを計算するための式を以下に示す（式１）。ＤＮＡ濃度（ｎｇ／μｌ）は分光測光法を用いて測定した。Ａ、Ｇ、ＴおよびＣは、プラスミド内の同名のヌクレオチドの計数である。６，０２＊１０２３はアボガドロ数である。２倍に乗算するとｓｓＤＮＡ濃度がｄｓＤＮＡ濃度に変換され、１０９倍に乗算するとグラムがナノグラムに変換される。ｑＰＣＲ反応のため、１０８〜１０１コピー／２μｌを含有する８つの希釈液を作製した。
【０２２７】
式１：プラスミドコピー／μｌの計算のための式
【数１】
0006772137.tif 000008
【０２２８】
ｑＰＣＲ
サイバーグリーンベースのｑＰＣＲを開発した。各反応液は、１０μｌのＫＡＰＡ  ＳＹＢＲ  Ｆａｓｔ  ｑＰＣＲマスターミックス、０．４μｌの１０μＭフォワードプライマー、０．４μｌの１０μＭリバースプライマー、７．２μｌのＷＦＩおよび２μｌの鋳型を含むものであった。プライマーＣＴＡＰＶ−ＰＡＮ−Ｆ１とＣＴＡＰＶ−ＰＡＮ−Ｒ１を使用した（表４参照）。以下のプログラム：９５℃で３分間の後、順次、９５℃で１０秒間、６０℃で１０秒間の３９回のサイクルを使用し、Ｂｉｏｒａｄ  ＣＦＸシステムでプレートの読み値を得た。結果を、Ｂｉｏｒａｄ  ＣＦＸソフトウェアを用いて解析した。結果を、上記のスタンダードライン；１５５ｂｐのＣＴＡＰＶ産物（ＴＯＰＯ４プラスミドにクローニング）の１０倍連続希釈物と比較した。６５℃→９５℃の間；０．５℃づつ０．０５秒間の融解曲線解析をｑＰＣＲプログラムに含めた。
【０２２９】
ｑＰＣＲ反応の特異性を、ＰＣＲ増幅産物のゲル電気泳動によって検証した。検量曲線の傾きとｙ切片をＣＦＸソフトウェアによって計算した。ｒ２は＞０．９９であった。傾きから計算されたＰＣＲ効率は９５〜１０５％であった。
【表６】
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【０２３０】
ヌクレオチドシーケンシング
サンガー法シーケンシングを、文献に記載の方法に従って行った。配列は、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ５．０  ａｎｄ  Ｃｌｏｎｅ  Ｍａｎａｇｅｒ  ９を用いて解析した。
【０２３１】
系統発生解析
系統発生解析を行い、ＣＴＡＰＶ  １はペスチウイルスと分類された。
【０２３２】
当該新規なウイルスの全遺伝子のアミノ酸配列を使用し、近隣結合最尤法、ポアソン相関モデルおよびブートストラップ解析（５００回反復）に基づいて系統樹を作成した。
【０２３３】
この系統樹は，プログラムＭＥＧＡ，バージョン５を使用し，標準設定を用いて作成した（ＭＥＧＡ５：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ，Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｄｉｓｔａｎｃｅ，ａｎｄ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｐａｒｓｉｍｏｎｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｋｏｉｃｈｉｒｏ  Ｔａｍｕｒａ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｎｉｃｈｏｌａｓ  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｇｌｅｎ  Ｓｔｅｃｈｅｒ，Ｍａｓａｔｏｓｈｉ  Ｎｅｉ  ａｎｄ  Ｓｕｄｈｉｒ  Ｋｕｍａｒ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．２８（１０）：２７３１−２７３９．２０１１  ｄｏｉ：１０．１０９３／ｍｏｌｂｅｖ／ｍｓｒ１２１  Ａｄｖａｎｃｅ  Ａｃｃｅｓｓ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ２０１１年５月４日）。
【０２３４】
［実施例２］
ウイルスＣＴＡＰＶは器官およびＰＢＬにみられ得る；脳および脊髄における脱髄を示す組織学的検査
先天性振戦Ａ−ＩＩ型を有する検死した初乳摂取前の生まれたばかりの子豚（ＣＴＡＰＶ  １Ａ／１Ｂ，２０１３）の以下の器官のＰＣＲ解析によりＣＴＡＰＶウイルスの存在が示された。
【０２３５】
ＣＴＡＰＶは、血液、血清、血漿およびＰＢＬ（末梢血白血球）、心臓、小腸、大腸、脳、胸髄、腰髄、肝臓、鼡径リンパ節、肺、胆嚢、膀胱、腎臓、扁桃ならびに脾臓において検出することができた。最高値の量が血清と扁桃において検出された。
【０２３６】
ＣＴ  Ａ−ＩＩ型の病歴のない肥育舎の子豚の同じ器官を、出産前（妊娠期間の最後の週）の対照試料とした。器官はすべてＰＣＲにおいて陰性であった。
【０２３７】
対照子豚およびＣＴＡＰＶ感染子豚の脳と脊髄を検死し、ホルマリン固定し、ヘマトキシリン−エオシン染色した。組織学的検査により、もっぱらＣＴＡＰＶ感染子豚において脱髄の徴候が示された（図２Ａ〜Ｄ）。
【０２３８】
異なる地理的位置の肥育舎に由来するＣＴＡＰＶバリアント
ＣＴＡＰＶバリアント２〜９を、２０１３以前にアウトブレイクしたオランダの養豚場から入手した。
【０２３９】
表５は、各肥育舎で試験した子豚の数およびＣＴＡＰＶ  ＰＣＲ陽性子豚（血清／直腸スワブ）の数を示す。
【表７】
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【０２４０】
疾患との関連は、ＣＴ  Ａ−ＩＩ型を示す子豚で１００％である。ＣＴＡＰＶウイルスは先天性振戦ＩＩ型を有するすべての子豚において検出され、ＣＴ  Ａ−ＩＩ型の病歴のない肥育舎で採取された対照試料では検出されなかった。
【０２４１】
ＣＴＡＰＶ  １が、先天性振戦を示していない１匹の子豚に見つかった。この子豚は、ＣＴ  Ａ−ＩＩ型の病歴を有する肥育舎である肥育舎１に起源を有していた。
【０２４２】
ＣＴＡＰＶ  ４が、先天性振戦を示していない子豚に見つかった。ＣＴＡＰＶ  ４は、ＣＴＡＰＶ  ３が見つかったのと同じ肥育舎（肥育舎３）で見つかった。したがって、ＣＴＡＰＶ  ４は、ＣＴ  Ａ−ＩＩ型の病歴を有する肥育舎に存在していた。
【０２４３】
８つの異なる地理的位置に由来する合計１２種類のバリアントが見つかった。
【０２４４】
・バリアントＣＴＡＰＶ  １、１Ａ、１Ｂ、１Ｃは、同じ肥育舎に由来する異なる時間点のものである。
【０２４５】
・バリアントＣＴＡＰＶ  ３と４は同じ肥育舎に由来するものである
・異なる地理的位置で見つかったが、バリアントＣＴＡＰＶ  ５と８はヌクレオチドレベルで同一である。
表６は、プライマーペアの反応性を示す。
【０２４６】
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【０２４７】
すべてのバリアントが、ＰＣＲプライマーペアＦ３Ｒ３を用いて検出され得る
すべてのバリアントが、ＰＣＲプライマーの組み合わせＦ１Ｒ１、Ｆ１Ｒ２、Ｆ２Ｒ１、Ｆ２Ｒ２のうちの１つを用いて検出され得るが、バリアントＣＴＡＰＶ  ９は試験しなかった。
【０２４８】
ゲノムシーケンシング
ＣＴＡＰＶ  １の完全ゲノム配列をサンガー法シーケンシングによって取得した。
【０２４９】
他のバリアントＣＴＡＰＶ  １Ａ、１Ｂ、１Ｃ、２、３、４、６、８および９の、Ｅｒｎｓ、Ｅ１およびＥ２のコード配列を含む最初の５０００ｂｐを取得した。
【０２５０】
Ｍ７については、１０７３ｎｔの限られたヌクレオチド配列しか入手可能でない。
【０２５１】
ゲノムシーケンシングに基づいて、ＣＴＡＰＶ  ５＝ＣＴＡＰＶ  ８と結論づけた。
【０２５２】
［実施例３］
ＣＴＡＰＶおよびＣＴＡＰＶバリアントの系統発生解析
ＣＴＡＰＶ  １および他の既知のペスチウイルスの系統樹を図３に示す。ブートストラップサポートのパーセンテージが節に明示されている。距離バーは、部位あたりのヌクレオチド置換の数を示す。
【０２５３】
本特許出願書類に記載の１０種類のＣＴＡＰＶバリアントの系統樹を図４に示す。バリアントＣＴＡＰＶ  １、１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、２、３、４、６、８および９のみをこの解析に含めた。Ｅｒｎｓ、Ｅ１およびＥ２のコード配列を含むヌクレオチド配列１〜５０００ｂｐをこの解析に含めた。
【０２５４】
ＣＴＡＰＶ  ７は、Ｍ７について１０７３ｎｔしか入手可能でないため含めなかった。
【０２５５】
ＣＴＡＰＶ  ５は、ＣＴＡＰＶ  ５＝ＣＴＡＰＶ  ８であるため含めていない。
【０２５６】
［実施例４］
推定Ｅ２タンパク質／ヌクレオチド配列の解析はＣＴＡＰＶ  １Ｂ  Ｅ２タンパク質＝ＣＴＡＰＶ  １  Ｅ２タンパク質であることを示す。ＣＴＡＰＶ  ８タンパク質はＣＴＡＰＶ  １と比べて１４個のアミノ酸置換を示す。
【０２５７】
感染実験の出発物質として使用することができる検死器官はＣＴＡＰＶ  １Ｂについて入手可能であったが、ＣＴＡＰＶ  １については入手可能でなかった。本発明者らは、ＣＴＡＰＶ  １と１ＢのＥｒｎｓ−Ｅ１−Ｅ２遺伝子／タンパク質のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を解析した。アミノ酸配列は１００％同一である（図５）。Ｅ２タンパク質配列はイタリック体である。Ｅｒｎｓタンパク質に太線で下線を付し、Ｅ１タンパク質配列に細線で下線を付している。
【０２５８】
また、感染実験の出発物質として使用することができる検死器官は、ＣＴＡＰＶ  ８についても入手可能であった。本発明者らは、ＣＴＡＰＶ  １Ｂと８のＥｒｎｓ−Ｅ１−２遺伝子／タンパク質のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を解析した（図６にアミノ酸の比較）。アミノ酸配列は９５％同一である。Ｅ２タンパク質配列はイタリック体である。Ｅｒｎｓタンパク質に太線で下線を付し、Ｅ１タンパク質配列に細線で下線を付している。ＣＴＡＰＶ  ８はＣＴＡＰＶ  １Ｂと比べて１４個のアミノ酸置換を有し（９３．３％相同性）、そのうち９個は性質が類似のアミノ酸である（類似性９７．６％）。
【０２５９】
［実施例５］
攻撃材料の調製
攻撃材料を、ＣＴＡＰＶ  １Ｂ（２０１３）およびＣＴＡＰＶ  ８（２０１４）に罹患した子豚の検死器官（野外材料）から得た。検死した器官を使用まで−７０℃で保存した。
【０２６０】
ＣＴＡＰＶ  １Ｂ
罹患同腹子の３匹の子豚の脳をプールした後、ホモジナイズした
罹患同腹子の３匹の子豚の脊髄をプールした後、ホモジナイズした
罹患同腹子の３匹の子豚の脾臓をプールした後、ホモジナイズした
罹患同腹子の３匹の子豚の扁桃をプールした後、ホモジナイズした。
【０２６１】
ＣＴＡＰＶ  ８
罹患同腹子の４匹の子豚の脳をプールした後、ホモジナイズした
罹患同腹子の４匹の子豚の脊髄をプールした後、ホモジナイズした
罹患同腹子の４匹の子豚の脾臓をプールした後、ホモジナイズした
罹患同腹子の４匹の子豚の扁桃をプールした後、ホモジナイズした。
プールした組織を解凍後、重量計測した。続いて、組織重量の９倍のＰＢＳ（ＣＴＡＰＶ  １Ｂ）または１０μＭ  ＨＥＰＥＳ含有Ｍ６Ｂ８培地（Ｓｉｇｍａ  Ｈ３３７５−２５０Ｇ，ＣＴＡＰＶ  ８）を組織材料に添加した。組織を、ブレンダーを用いてホモジナイズした後、小ガラスビーズとともに５分間振盪した。ホモジナイズ中、器官破砕物（ｐｕｌｐ）を氷上に維持した。器官破砕物を３２００×ｇで１時間、遠心分離した。上清みを、まず０．４５μｍフィルターに、続いて０．２２μｍフィルターに通した。濾過したホモジネートを使用まで−７０℃で保存した。
【０２６２】
［実施例６］
感染性材料を得るための離乳期の子豚での感染実験：
野外分離株が起源のＣＴＡＰＶ  １ＢおよびＣＴＡＰＶ  ８の器官ホモジネートでの攻撃実験を、商業的肥育後期の豚血統の４〜８週齢の離乳期のＳＰＦ／高健常子豚において実施した。
【０２６３】
試験施設に入れた時点で、ＣＰＤＡ（クエン酸塩リン酸塩デキストロースアデニン）血液試料、直腸スワブ、中咽頭スワブおよび経鼻スワブを動物から採取した。動物を２つの別々の実験室に収容した：Ａ群８匹の動物およびＢ群８匹の動物。両室間で動物の世話担当者による物理的接触または間接的接触はなかった。
【０２６４】
Ａ群では、６匹の豚にＣＴＡＰＶ  １Ｂホモジネートを、筋肉内（ＩＭ）、皮下（ＳＣ）、鼻腔内（Ｎ）および経口（ＯＲ）経路によって接種した。
【０２６５】
２匹の豚に、混合脾臓＋脊髄＋脳ホモジネート由来の接種材料を投与した
２匹の豚に、混合脾臓＋扁桃＋脳ホモジネート由来の接種材料を投与した
２匹の豚に、混合脳＋脊髄ホモジネート由来の接種材料を投与した
２匹の豚を接触歩哨動物として使用した。
【０２６６】
ＩＭ、ＳＣおよびＮ容量は１．０ｍｌ／用量（左と右）にした。ＯＲ容量は４ｍｌにした。経鼻用量は噴霧した。攻撃用量を表７に示す。
接種後、すべての豚を毎日、臨床徴候について観察したが、動物は実験過程中、無症候のままであった。
【０２６７】
ＣＰＤＡ−血液、鼻スワブ、中咽頭スワブおよび直腸スワブを接種後０日目、３日目、７日目、１０日目および１４日目に採取し、ＣＴＡＰＶ  １Ｂの感染および排出をｑＰＣＲ解析によってモニタリングした。血漿をＣＰＤＡ血液からＬｅｕｃｏｓｅｐ（登録商標）キット（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｍａｔ．番号１６３  ２８８）を用いて得た。血漿試料に関するｑＰＣＲ解析の結果を表７に示す。
【０２６８】
すべての接種動物で、１０日目の血漿において陽性のＣＴＡＰＶ  ｑＰＣＲ結果が示された。ウイルスの排出に基づいて、動物を異なる時点で致死させ、その後のインビトロおよびインビボでの試験のための新鮮感染性材料を取得した。
【０２６９】
検死のとき、脳、脊髄、脾臓、扁桃および血液を動物から採取した。
【表９】
0006772137.tif 000012
【０２７０】
Ｂ群では、６匹の豚にＣＴＡＰＶ  ８ホモジネートを、筋肉内（ＩＭ）、皮下（ＳＣ）、鼻腔内（Ｎ）および経口（ＯＲ）経路によって接種した。
【０２７１】
２匹の豚に、脾臓＋扁桃＋脳＋脊髄ホモジネート由来の接種材料を投与した
２匹の豚に、脾臓＋扁桃ホモジネート由来の接種材料を投与した
２匹の豚に、脳＋脊髄ホモジネート由来の接種材料を投与した
２匹の豚を接触歩哨動物として使用した。
【０２７２】
ＩＭ、ＳＣおよびＮ容量は２．０ｍｌ／用量（左と右）にした。ＯＲ容量は３または４ｍｌにした。経鼻（Ｎａｓｅｌ）用量は噴霧した。攻撃用量を表８に示す。
【０２７３】
接種後、すべての豚を毎日、臨床徴候について観察したが、動物は実験過程中、無症候のままであった。
【０２７４】
ＣＰＤＡ−血液、鼻スワブ、中咽頭スワブおよび直腸スワブを接種後０日目、３日目、７日目および１４日目に採取し、ＣＴＡＰＶ−８の感染および排出をｑＰＣＲ解析によってモニタリングした。血漿をＣＰＤＡ血液からＬｅｕｃｏｓｅｐ（登録商標）キット（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｍａｔ．番号１６３  ２８８）を用いて得た。血漿試料に関するｑＰＣＲ解析の結果を表８に示す。
【０２７５】
すべての接種動物で、３日目および／または７日目の血漿において陽性のＣＴＡＰＶ  ｑＰＣＲ結果が示された。ウイルスの排出に基づいて、動物を異なる時点で致死させ、その後のインビトロおよびインビボでの試験のための新鮮感染性材料を取得した。
【０２７６】
検死のとき、脳、脊髄、脾臓、扁桃および血液を動物から採取した。
【０２７７】
器官材料を、実施例８／９に記載のワクチン接種−攻撃試験における攻撃材料として使用した。
【表１０】
0006772137.tif 000013
【０２７８】
［実施例７］
ワクチン接種−攻撃実験のための攻撃材料の調製
攻撃材料を実施例６から得た。
【０２７９】
ＣＴＡＰＶ  １Ｂ
実施例６，Ａ群の検死した１匹の動物の脳、脊髄、脾臓および扁桃
ＣＴＡＰＶ  ８
実施例６，Ｂ群の検死した１匹の動物の脳、脊髄、脾臓および扁桃
プールした組織を解凍後、重量計測した。続いて、組織重量の９倍の１０μＭ  ＨＥＰＥＳ含有Ｍ６Ｂ８培地（Ｓｉｇｍａ  Ｈ３３７５−２５０Ｇ）を組織材料に添加した。組織を、ブレンダーを用いてホモジナイズした後、小ガラスビーズとともに５分間振盪した。ホモジナイズ中、器官破砕物を氷上に維持した。器官破砕物を３２００×ｇで１時間、遠心分離した。上清みを、経口投与のための材料を除いて、まず０．４５μｍフィルターに、続いて０．２２μｍフィルター通した。濾過したホモジネートを使用まで−７０℃で保存した。
【０２８０】
［実施例８］
ワクチン接種−攻撃実験
ワクチンの設計：Ｅ２タンパク質の発現：
ＣＴＡＰＶ  １ウイルスのアミノ酸配列を解析した。Ｅ２遺伝子の開始部と終止部を、ＣＴＡＰＶウイルスゲノムと豚コレラウイルス（ＣＳＦ）のＥ２タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＡＳ  ２０４１２．１）および牛ウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）のＥ２タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＧＮ０３７８７．１）とのアラインメントを用いて調べ、Ｅ２タンパク質の推定切断部位を、ＳｉｇｎａｌＰ４．１ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）を用いて調べた
ＣＴＡＰＶ  １  Ｅ２の推定アミノ酸配列（配列番号：３２）：
ＳＣＨＫＲＱＤＹＹＳＩＱＬＶＶＤＧＫＴＧＶＥＫＲＳＩＶＧＫＷＴＶＩＴＲＥＧＲＥＰＲＬＭＥＱＩＳＭＶＳＮＤＳＬＳＥＴＹＣＹ
ＮＲＬＮＴＳＳＷＧＲＱＰＡＲＱＲＧＣＧＱＴＶＰＦＷＰＧＤＮＶＬＥＥＱＹＹＳＴＧＹＷＶＮＡＴＧＧＣＱＬＲＥＧＶＷＬＳＲＫＧ
ＮＶＱＣＱＲＮＧＳＳＬＩＬＱＬＡＩＫＥＥＮＤＴＭＥＩＰＣＤＰＶＥＴＥＳＭＧＰＶＴＱＧＴＣＶＹＳＷＡＦＡＰＲＧＷＹＹＮＲＫ
ＤＧＹＷＬＱＹＶＫＫＮＤＹＱＹＷＴＫＭＰＴＡＳＳＡＴＴＭＹＲＨ
続いて、昆虫細胞におけるバキュロウイルス発現系でのＣＴＡＰＶ  Ｅ２タンパク質の発現のためのＣＴＡＰＶ  Ｅ２ヌクレオチド配列を、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  ＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅＴＭアルゴリズム（ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ）を用いて最適化した（配列番号：３３）。
0006772137.tif 000014
【０２８１】
制限部位ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩに下線を付している。開始コドンをイタリック体で示し、終止コドンをボールド体で示す。
【０２８２】
形質転換および発現：
ＣＴＡＰＶのＥ２遺伝子は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔにおいて合成され、プラスミドベクター（ｐＦａｓｔｂａｃ１）内にＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を用いて直接クローニングされた。このプラスミドで大腸菌を、標準的な形質転換手法を用いて形質転換し、続いてプラスミドＤＮＡを精製し、ＳＦ９昆虫細胞のトランスフェクションに使用した。トランスフェクションは以下のようにして行った：
５＊１０５細胞／ｍｌの２ｍｌの細胞懸濁液を６ウェルプレートの各ウェルに添加した。細胞を２７℃で１時間、プレートに付着させた。以下のトランスフェクション溶液（抗生物質なし，５μｌのミニプレップＤＮＡおよび６μｌのセルフェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の２００μｌの培地）を調製し、室温で４５分間インキュベートした。４５分後、０．８ｍｌの培地をトランスフェクション溶液に添加し、これを付着細胞に添加した。トランスフェクト細胞を２７℃で４時間インキュベートした。５時間後、さらに１ｍｌの培地（ゲンタマイシンおよびナタマイシンを補給）を細胞に添加した。細胞を２７℃で３日間培養した。上清みをＰ１ウイルスストック液として−７０℃で保存した。
【０２８３】
ＳＦ９培養物中におけるＣＴＡＰＶ  Ｅ２タンパク質の発現をＳＤＳ−ｐａｇｅゲル電気泳動によって確認した。ＳＦ９培養物から得た試料を、５％β−メルカプトエタノール含有Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｅｍｍｌｉ試料バッファーで１：１に希釈し、続いて、試料を９９℃まで１０分間加熱した。すべての試料およびＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）Ａｌｌ  Ｂｌｕｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）マーカーをＢｉｏ−Ｒａｄ  ＣｒｉｔｅｒｉｏｎＴＭＴＧＸＴＭプレキャストゲル（任意のｋＤＴＭ）にロードし、２００Ｖで４２分間、電気泳動させた。使用した電気泳動バッファーは１×Ｔｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳであった。電気泳動後、ゲルを、ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅＴＭ（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）タンパク質染色バッファー中で１時間染色した。
【０２８４】
精製：
ＳＦ９細胞での発現後、Ｅ２タンパク質を異なる２つの様式で精製した。第１の精製方法は全細胞ライセートを作製することによるものであった。ＣＴＡＰＶのＥ２を発現しているＳＦ９培養物をペレット化し、ＰＢＳ中に再懸濁させ、Ｂｒａｎｓｏｎ超音波処理装置（２回  ３０パルス，出力５，デューティサイクル５５％）を用いて超音波処理した。超音波処理後、ライセートを８，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した。過剰発現されたＥ２を含有しているペレットをＰＢＳ中に再懸濁させた。Ｅ２タンパク質の別の精製様式は、ＩＭＡＣとアニオン性洗浄剤を使用する精製方法によるものであった。この方法は、ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１２，１２：９５．（ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１２，１２：９５；Ｕｓｅ  ｏｆ  ａｎｉｏｎｉｃ  ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ  ｔｏ  ｐｕｒｉｆｙ  ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｆｔｅｒ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｓｃｈｌａｇｅｒ，Ａｎｎａ  Ｓｔｒａｅｓｓｌｅ  ａｎｄ  Ｅｒｎｓｔ  Ｈａｆｅｎ）に記載されている。アニオン性変性洗浄剤（ＳＤＳ）を含有する溶解バッファーを使用し、過剰発現Ｅ２培養物を溶解させた。過剰の洗浄剤を冷却および精製によって除去した後、アフィニティ精製した。
【０２８５】
ＳＦ９細胞において発現させ、上記のようにして精製したＥ２タンパク質をＳＤＳ−ｐａｇｅゲル上でタンパク質濃度が既知のウシ血清アルブミン標準と一緒に泳動させた。タンパク質濃度を、バンド強度の比較により、Ｇｅｎｅｔｏｏｌｓソフトウェア（Ｓｙｎｇｅｎｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０８．０７）を用いて推定した。
【０２８６】
製剤
最終ワクチンを、鉱油ベースの油中水型乳剤に製剤化した。水：油の比は重量基準で４５：５５であった。乳剤の液滴サイズは主として１μｍより小さく、粘度は約８０〜１５０ｍＰａ．ｓｅｃ．であった。
【０２８７】
ワクチン１：水相は精製Ｅ２タンパク質（推定Ｅ２濃度６０μｇ／ｍｌ）からなるものであった
ワクチン２：水相は全細胞ライセート（推定Ｅ２濃度６２μｇ／ｍｌ）からなるものであった。
ワクチン接種−ブースター
この実験のため、５週齢の４８匹の離乳期の子豚が入手可能であった。３×８匹の動物／群を小屋１に収容し、３×８匹の動物／群を小屋２に収容した。動物同士の接触は小屋間において可能でなかった。
【０２８８】
１群８匹の動物に対して、６匹の子豚にワクチン１での初回ワクチン接種を行い、その他の２匹の子豚には試験開始時にワクチン接種しなかった。
【０２８９】
ｔ＝２１日目、各群の６匹の初回ワクチン接種動物のうち５匹にワクチン２でのブースターワクチン接種を行った。
【０２９０】
血液試料を、初回ワクチン接種前、感染後ブースターワクチン接種前の２１日目および攻撃前の３９日目に採取した。
【０２９１】
各群のうち、初回ワクチン接種とブースターワクチン接種を受けた４匹の動物＋２匹の非ワクチン接種動物を、攻撃前に攻撃施設に移動させた。
【０２９２】
各群のうち、初回ワクチン接種のみを受けた１匹の動物と初回ワクチン接種とブースターワクチン接種の両方を受けた１匹の動物を、さらに２週間モニタリングした。
【０２９３】
攻撃
この実験のための３６匹の動物を、小屋３に３×６匹の動物／群，第１〜３群で収容し、小屋４には、３×６匹の動物／群，第４〜６群で収容した。小屋３の動物は小屋１が起源のものであり、小屋４の動物は小屋２が起源のものであった。
【０２９４】
動物同士の接触は小屋間において可能でなかった。小屋内での異なる群の動物間の物理的接触は可能でなかったが、空気接触は可能であった。
【０２９５】
動物に生ウイルス材料を、初回ワクチン接種後３９日目に攻撃した。
【０２９６】
小屋３では、３×６匹の子豚（第１〜３群）にＣＴＡＰＶ  １攻撃材料（上記参照）を攻撃した。
【０２９７】
第１群：１０．０ｍｌ  経口および２×２．０ｍｌ  経鼻
第２群：２×１．０ｍｌ  ＩＭ
第３群：２×１．０ｍｌ  ＩＭ。
小屋４では、３×６匹の子豚（第４〜６群）にＣＴＡＰＶ  ８攻撃材料（上記参照）を攻撃した。
【０２９８】
第１群：１０．０ｍｌ  経口および２×２．０ｍｌ  経鼻
第２群：２×１．０ｍｌ  ＩＭ
第３群：２×１．０ｍｌ  ＩＭ
血清試料ならびに経鼻、直腸および中咽頭スワブを、攻撃前ならびに攻撃後３、６、９、１３、１６、２０、２３および２７日目に採取し、ＣＴＡＰＶウイルスの感染および排出をｑＰＣＲ解析によってモニタリングした。１群あたり３匹の動物（２匹はワクチン接種、１匹は非ワクチン接種）を攻撃後１３日目に検死し、その他の３匹の動物（２匹はワクチン接種、１匹は非ワクチン接種）を攻撃後２７日目に検死した。鼡径リンパ節、腸間膜リンパ節および扁桃を検死時に試料採取した。
【０２９９】
［実施例９］
ＣＴＡＰＶ  Ｅ２タンパク質に対する抗体
大腸菌におけるＥ２タンパク質の発現：
ＣＴＡＰＶ  １ウイルスのアミノ酸配列を解析した。Ｅ２遺伝子の開始部と終止部を、ＣＴＡＰＶウイルスゲノムと豚コレラウイルス（ＣＳＦ）のＥ２タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＡＳ  ２０４１２．１）および牛ウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）のＥ２タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＧＮ０３７８７．１）とのアラインメントを用いて調べ、Ｅ２タンパク質の推定切断部位を、ＳｉｇｎａｌＰ４．１ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）を用いて調べた
ＣＴＡＰＶ  １  Ｅ２の推定アミノ酸配列（配列番号：３２）：
ＳＣＨＫＲＱＤＹＹＳＩＱＬＶＶＤＧＫＴＧＶＥＫＲＳＩＶＧＫＷＴＶＩＴＲＥＧＲＥＰＲＬＭＥＱＩＳＭＶＳＮＤＳＬＳＥＴＹＣＹ
ＮＲＬＮＴＳＳＷＧＲＱＰＡＲＱＲＧＣＧＱＴＶＰＦＷＰＧＤＮＶＬＥＥＱＹＹＳＴＧＹＷＶＮＡＴＧＧＣＱＬＲＥＧＶＷＬＳＲＫＧ
ＮＶＱＣＱＲＮＧＳＳＬＩＬＱＬＡＩＫＥＥＮＤＴＭＥＩＰＣＤＰＶＥＴＥＳＭＧＰＶＴＱＧＴＣＶＹＳＷＡＦＡＰＲＧＷＹＹＮＲＫ
ＤＧＹＷＬＱＹＶＫＫＮＤＹＱＹＷＴＫＭＰＴＡＳＳＡＴＴＭＹＲＨ
大腸菌における発現のためのタンパク質配列（ＨＩＳ−タグを含む）
ＳＣＨＫＲＱＤＹＹＳＩＱＬＶＶＤＧＫＴＧＶＥＫＲＳＩＶＧＫＷＴＶＩＴＲＥＧＲＥＰＲＬＭＥＱＩＳＭＶＳＮＤＳＬＳＥＴＹＣＹ
ＮＲＬＮＴＳＳＷＧＲＱＰＡＲＱＲＧＣＧＱＴＶＰＦＷＰＧＤＮＶＬＥＥＱＹＹＳＴＧＹＷＶＮＡＴＧＧＣＱＬＲＥＧＶＷＬＳＲＫＧ
ＮＶＱＣＱＲＮＧＳＳＬＩＬＱＬＡＩＫＥＥＮＤＴＭＥＩＰＣＤＰＶＥＴＥＳＭＧＰＶＴＱＧＴＣＶＹＳＷＡＦＡＰＲＧＷＹＹＮＲＫ
ＤＧＹＷＬＱＹＶＫＫＮＤＹＱＹＷＴＫＭＰＴＡＳＳＡＴＴＭＹＲＨＨＨＨＨＨＨ
続いて、大腸菌におけるＣＴＡＰＶ  Ｅ２タンパク質の発現のためのＣＴＡＰＶ  Ｅ２ヌクレオチド配列を、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  ＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅＴＭアルゴリズム（ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ）を用いて最適化した（配列番号：３４）。
0006772137.tif 000015
【０３００】
付加した制限部位（ボールド体）はＮｄｅＩとＸｈｏＩである。
【０３０１】
形質転換および発現：
ＣＴＡＰＶのＥ２遺伝子はＧｅｎｓｃｒｉｐｔにおいて合成され、プラスミドベクター（ｐＥＴ２２ｂ）内にＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ制限部位を用いて直接クローニングされた。このプラスミドは、標準的な形質転換手法を用いて大腸菌ＢＬ２１ｓｔａｒ＋ｐＬｙｓＳに形質転換され、発現を誘導した。
【０３０２】
発現は、発現株を自動誘導培地中で３７℃にて１８時間培養することにより行った。発現は、ＳＤＳ−ｐａｇｅゲル電気泳動での泳動によって確認した。
【０３０３】
Ｅ２は、不溶性画分中に存在することがわかった。Ｅ２タンパク質を、ＩＭＡＣとアニオン性洗浄剤を使用する精製方法を適用することによって精製した。この方法は、ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１２，１２：９５．（ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１２，１２：９５；Ｕｓｅ  ｏｆ  ａｎｉｏｎｉｃ  ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ  ｔｏ  ｐｕｒｉｆｙ  ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｆｔｅｒ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｓｃｈｌａｇｅｒ，Ａｎｎａ  Ｓｔｒａｅｓｓｌｅ  ａｎｄ  Ｅｒｎｓｔ  Ｈａｆｅｎ）に記載されている。アニオン性変性洗浄剤（ＳＤＳ）を含有する溶解バッファーを使用し、過剰発現Ｅ２培養物を溶解させた。過剰の洗浄剤を冷却および精製によって除去した後、アフィニティ精製した。
【０３０４】
精製されたタンパク質を、実施例８に記載のように、ＳＤＳ−ｐａｇｅにおいて確認した。精製されたタンパク質をＧＮＥに製剤化し、ウサギに注射して抗体を生成させるために使用した。水相中のタンパク質の推定濃度は０．５ｍｇ／ｍｌであった。
【０３０５】
図７は、ウサギにおいて生成させた抗体（ｔ＝ワクチン接種後４週目の血清）が、バキュロウイルス／ＳＦ９発現系において発現させたＣＴＡＰＶ  Ｅ２タンパク質に対応するおよそ２５ｋＤａのバンド（レーン２）を特異的に認識することを示す。レーン１はマーカーを含有しており、レーン３はバキュロウイルス／ＳＦ９発現系内の無関連発現産物を含有している。
【０３０６】
［実施例１０］
サイバーグリーン１ステップｑＲＴ−ＰＣＲ
動物試料
ぶたの血清および脾臓試料を実験的感染豚および対照豚から採取した。血液を採取し（Ｖａｃｕｏｌｅｔｔｅ  ８ｍｌ  Ｓｅｐ  Ｃｌｏｔ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｒｅｆ：４５５０７１；Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ）、血清を３，０００×ｇで４℃にて２０分間の遠心分離によって得た。精子試料を市販の繁殖業者から入手し、前処理なしで試験した。
【０３０７】
１０％組織ホモジネートをＰＢＳ中で氷上にて調製した。ホモジネーションは、Ｇｅｎｔｌｅ  Ｍａｃｓ  Ｍチューブ内でＧｅｎｔｌｅ  Ｍａｃｓ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて行った。次いで、このホモジナイズ材料を２回、最初は３，２００×ｇで３０分間、続いて１０，０００×ｇで１０分間、遠心分離した。続いてＤＮａｓｅ処理を行った：２４μｌの１０×Ｔｕｒｂｏ  ＤＮａｓｅバッファーと２０μｌのＴｕｒｂｏ  ＤＮａｓｅ（ＡＭｂｉｏｎ）を、２５０μｌの上清みに添加し、この混合物を３７℃で１０分間インキュベートした。
【０３０８】
ＲＮＡの抽出
ＲＮＡを、この試料からＭａｇｎａｐｕｒｅ  ９６装置（Ｒｏｃｈｅ）を用いて外部溶解を伴って抽出した。このシステムにより、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびウイルス核酸が、磁性ガラス粒子技術を用いて精製される。２００μｌの試料を２５０μｌのｍａｇｎａｐｕｒｅ全核酸単離キット溶解／結合バッファーと混合し、抽出を、Ｍａｇｎａｐｕｒｅ装置において外部溶解プロトコルを用いて行った。ＲＮＡ試料をさらなる使用まで−７０℃で保存した。
【０３０９】
サイバーグリーン１ステップｑＲＴ−ＰＣＲ
特異的プライマーの設計
オリゴヌクレオチドプライマーを使用してＣＴＡＰＶゲノムの５’ＵＴＲゲノムを増幅させた。ウイルスゲノムのこの部分は、ＣＴＡＰＶバリアント１〜９間で保存されたヌクレオチド配列に基づいて（ヌクレオチド配列のアラインメントに基づいて）選択した。プライマー配列は以下の通り：ＣＴＡＰＶ−ＰＡＮ２−Ｆ３−Ｂ：ＣＧＴＧＣＣＣＡＡＡＧＡＧＡＡＡＴＣＧＧ（配列番号：３５）およびＣＴＡＰＶ−ＰＡＮ２−Ｒ３−Ｂ（配列番号：３６）：ＣＣＧＧＣＡＣＴＣＴＡＴＣＡＡＧＣＡＧＴであった。
【０３１０】
ｑＲＴ−ＰＣＲプロトコル
Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｐｌａｔｉｎｕｍサイバーグリーン１ステップｑＲＴ−ＰＣＲキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用するサイバーグリーンベースの１ステップｑＲＴ−ＰＣＲを開発した。各反応液は、２５μｌの２×サイバーグリーン反応ミックス、１μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴ／Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑミックス、１μｌの１０μＭ  ＣＴＡＰＶ−ＰＡＮ２−Ｆ３−Ｂプライマー、１μｌの１０μＭ  ＣＴＡＰＶ−ＰＡＮ２−Ｒ３−Ｂプライマー、１７μｌのＲＮＡｓｅ無含有水および５μｌのＲＮＡ鋳型を含むものであった。反応はすべて、ＢｉｏＲａｄ  ＣＦＸ９６において、以下のサイクルパラメータ；５５℃で３分間のＲＴ反応、９５℃で５分間の予備変性、次いで、９５℃で１５秒、６０℃で３０秒の４０回サイクルの後、０．５℃／５秒で６０℃から９５℃までの融解曲線プログラムを用いて行った。
【０３１１】
スタンダードラインの作成
サイバーグリーン１ステップｑＲＴ−ＰＣＲにおいて検出されたＲＮＡの定量のため、標準希釈液が計算され得るｑ−ＰＣＲの標的配列を含むスタンダードラインを作成した。ＣＴＡＰＶゲノムの５’ＵＴＲ部分の１７７塩基対長の配列（１６２〜３３８）が合成され（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）、ｐＵＣ５７ベクターにライゲートし、続いて、これを大腸菌中でトランスフェクションした。プラスミドＤＮＡをミディプレップによって分離した。
【０３１２】
プラスミドコピー／μｌの計算のための式は：
プラスミドコピー／μｌ＝
ＤＮＡ濃度（ｎｇ／μｌ）／（（Ａ×３２８，４＋Ｇ×３４４，２４＋Ｔ×３０３，２２＋Ｃ×３０４，１６）／（６，０２×１０２３））×２×１０９）
である。
【０３１３】
プラスミドのＤＮＡ濃度は１００ｎｇ／μｌであった。１０８から１０１コピーまで／２μｌを含む８つの希釈液を作製した。
【０３１４】
結果
ｑＲＴ−ＰＣＲの検証
１０８から１０１コピーまで／５μｌを含む８つの希釈液および陰性対照試料でのスタンダードラインを、ｑＲＴ−ＰＣＲを検証するための実験に含めた。図１Ａは、ｑＰＣＲサイクルをリアルタイムの相対蛍光単位に対してプロットした図表を示す。各試料は二連で試験した。約１００ＲＦＵにおける直線はカットオフラインであり、０ＲＦＵにおける直線は陰性対照試料である。最高量の鋳型を有する二連の試料がサイクル１０あたりで初期の蛍光増大を示す試料である（１０８、続いてサイクル１２で１０７など）。図１Ｂは、同じ実験データから作成したが、この場合、標準曲線の開始量の対数（ｏ）を定量サイクルに対してプロットしている。スタンダードラインは１０２％の効率を有し、Ｒ２は０．９９７であり、これは、効率９５％〜１０５％の間であるべきであって、Ｒ２が０．９９０より上でなければならない特異的で定量可能なｑＰＣＲの範囲内である。図１Ｃは、パネルＡおよびＢに示す試料の融解曲線を示す。すべての陽性試料は同一の曲線および特定の融点を示し、これは、特定の断片が増幅されていること、および断片が各反応において同一であることを意味する。
【０３１５】
このデータは、開発したｑＲＴ−ＰＣＲがＣＴＡＰＶの検出および定量の要件を満たしていることを示す。続いて、ｑＲＴ−ＰＣＲをＣＴＡＰＶ陽性が疑われる試料および対照試料の試料解析に使用した。データの解釈は、ＲＦＵ／サイクル＋融解曲線の特徴に基づいた。異常な融解曲線は、アンプリコンの非特異性を示すものであり得る。
【０３１６】
血清、脾臓および精子試料中のＣＴＡＰＶ  ＲＮＡの検出および定量
実験的感染未経産豚および対照未経産豚の血清および脾臓を二連でＣＴＡＰＶ  ＲＮＡの存在について試験した。また、精子試料も試験した。（平均）結果を表９に示す。実施したアッセイにおいて、スタンダードラインは正確なｑＰＣＲの品質の範囲内であることが確認された（図９Ｂ，上記参照）。また、ＣＴＡＰＶの特定の融点が、これらのすべての試料の融解曲線において確認された。このデータに基づき、本発明者らは、ｑＲＴ−ＰＣＲは血清、脾臓および精子試料中のＣＴＡＰＶ  ＲＮＡの検出および定量に適切であると結論づけることができる。
【表１１】
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【０３１７】
ＲＮＡコピー／５μｌの欄は、２００μｌのオリジナルの試料から得た５μｌの抽出ＲＮＡ試料中のウイルスのコピー数を示す。
【０３１８】
ＲＮＡコピー／ｍＬの欄は、オリジナルの試料（血清、精子）または１０％ホモジネート（脾臓）中のウイルスのコピー数を示す。
【０３１９】
［実施例１１］
ＣＴＡＰＶ陽性精子は未経産豚および子孫を感染させる
動物
６匹の未経産豚をＳＰＦ／高健常肥育舎から入手した。ＣＴＡＰＶ陽性雄豚の精子を未経産豚の人工授精に使用した。
【０３２０】
方法
血液を未経産豚と子孫から採取し（Ｖａｃｕｏｌｅｔｔｅ  ５／８ｍｌ  Ｓｅｐ  Ｃｌｏｔ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｒｅｆ：４５５０７１；Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ）、血清を３，０００×ｇで４℃にて２０分間の遠心分離によって得た。精子試料は前処理なしで試験した。
【０３２１】
ＲＮＡ抽出およびｑＲＴ−ＰＣＲを、実施例１０の「サイバーグリーン１ステップｑＲＴ−ＰＣＲ」のセクションに記載の通りに行った。
【０３２２】
結果
試験した未経産豚は、受精前はＣＴＡＰＶについて血清学的陰性であった（ｑＲＴ−ＰＣＲ）。雄豚精子はｑＲＴ−ＰＣＲによる分析時、ＣＴＡＰＶについて陽性であった。ｔ＝受精後＋４週目、未経産豚４と５は、血清中に検出可能なレベルのＣＴＡＰＶが含有されていた。分娩の日、未経産豚１、２および６は、血清中に検出可能なレベルのＣＴＡＰＶが含有されていた。血清中に検出可能なレベルのＣＴＡＰＶを有する子豚が６匹の未経産豚のうち５匹から生まれた（結果については表１０参照）。子豚は健常であり、臨床振戦または先天性振戦ＡＩＩ型に関連する他の臨床症状（脚の外方への広がり（ｓｐｌａｙ  ｌｅｇｓ）など）の発生の増加は示さなかった。
【表１２】
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【０３２３】
［実施例１２］
「震えている子豚」から得たＣＴＡＰＶバリアント１Ｂによる妊娠中の未経産豚の感染および新生児子豚に対する影響：ＣＴＡＰＶ陽性精子
動物
６匹の未経産豚をＳＰＦ／高健常肥育舎から入手した。未経産豚を人工授精によってＣＴＡＰＶ陽性精子と受精させた。妊娠は、妊娠の２８日目に超音波を用いて確認された。すべての未経産豚が妊娠の１１５日目または１１６日目に同腹子の子豚を出産した。
【０３２４】
感染
これらの３匹の未経産豚は、受精後３２日目に、ＣＴＡＰＶ１Ｂ感染材料での感染後ｔ＝１１日目の検死豚３７１から採取した脾臓および脳の器官ホモジネートからなるＣＴＡＰＶ１Ｂ接種材料に感染させた。この実験は実施例６／表７に説明した。ホモジネートは以下の通りに調製した。１４グラムの脾臓および８グラムの脳に、１０μＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｈ３３７５−２５０Ｇ）を含む組織重量の９倍のＭ６Ｂ８培地（ＭＳＤ  ＡＨ）を添加した。組織を、ブレンダーを用いてホモジナイズした後、小ガラスビーズとともに５分間振盪した。ホモジナイズ中およびその後の加工中は、器官破砕物を氷上に維持した。器官破砕物を３２００×ｇで４℃にて１時間、遠心分離した。上清みを０．２２μｍフィルターに通した。濾過したホモジネートを使用まで−７０℃で保存した。これらの３匹の未経産豚に５ｍＬの接種材料の筋肉内注射を行った（２．５ｍＬずつ２回の注射を左と右の首に）。
【０３２５】
その他の３匹の未経産豚は、検死時に同じ豚から得た血清の接種材料で感染させた。血清は、注射前に０．２２μｍフィルターで濾過した。これらの３匹の未経産豚に５ｍＬの接種材料の筋肉内注射を行った（２．５ｍＬずつ２回の注射を左と右の首に）。
【０３２６】
接種材料中のＣＴＡＰＶの量の定量値をｑＲＴ−ＰＣＲにより、実施例１０に記載の通りに測定した。
【０３２７】
血清採取
血清を、感染前の未経産豚およびｔ＝受精後１０日目に採取した。また、血清を生後数時間以内の新生児子豚からも採取した。血液を採取し（Ｖａｃｕｏｌｅｔｔｅ  ５／８ｍｌ  Ｓｅｐ  Ｃｌｏｔ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｒｅｆ：４５５０７１；Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ）、血清を３，０００×ｇで４℃にて２０分間の遠心分離によって得た。ＲＮＡ抽出およびｑＲＴ−ＰＣＲを、「サイバーグリーン１ステップｑＲＴ−ＰＣＲ」のセクション，実施例１０に記載の通りに行った。
【０３２８】
結果
最初の３匹の未経産豚の感染に使用した脾臓と脳の混合ホモジネートには４．５Ｅ＋０２ゲノムコピー／５μｌ抽出ＲＮＡが含有されていた。これは、未経産豚の感染に使用したホモジネート中２．３Ｅ＋０４ゲノムコピー／ｍＬに等しい。
【０３２９】
その他の３匹の未経産豚の感染に使用した血清接種材料には１．２Ｅ＋０４ゲノム／５μｌ抽出ＲＮＡが含有されており、これは、未経産豚の感染に使用した６．０Ｅ＋０５ゲノムコピー／ｍＬに等しい。
【０３３０】
表１１は、ｑＲＴ−ＰＣＲ結果によって求められた感染後１０日目の量の定量値（ゲノム／ｍＬ血清）を示す。６匹の未経産豚のうち５匹が重度の先天性振戦Ａ−ＩＩ型を有する子豚を出産した。ｔ＝感染後１０日目の血清中のウイルス量が比較的低い未経産豚である１匹の未経産豚は比較的健常な同腹子を出産し、このとき、２匹の子豚だけに軽度の症状が観察された。分娩後のスコア化した同腹子の情報を表１１に示す。Ｍ．Ｗｈｉｔｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｄｉｓ．ｏｒｇ．ｕｋ／ｂｕｌｌｅｔｉｎｓ／ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ−ｔｒｅｍｏｒ．ａｓｐｘ？ａｌｔＴｅｍｐｌａｔｅ＝ＰＤＦ）に報告されているような、脚の外方への広がりの発生の増加が臨床振戦に随伴した。
【０３３１】
３匹の子豚／同腹子（臨床振戦を示さなかった未経産豚４４から生まれた子豚を除く、重度の臨床振戦を有するもの）におけるＣＴＡＰＶの存在を実施例１０に記載のｑＲＴ−ＰＣＲ試験によって試験した。ＣＴＡＰＶ陽性子豚の数を表１１に示す
【表１３】
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【０３３２】
［実施例１３］
「震えている子豚」から得たＣＴＡＰＶバリアント１Ｂによる妊娠中の未経産豚の感染および新生児子豚に対する影響：ＣＴＡＰＶ陰性精子
動物
３匹の未経産豚をＳＰＦ／高健常肥育舎から入手した。未経産豚を人工授精によってＣＴＡＰＶと受精させ、ネガティブレグナンシー（ｎｅｇａｔｉｖｅｒｅｇｎａｎｃｙ）は妊娠２８日目に超音波を用いて確認された。すべての未経産豚が同腹子の子豚を妊娠の１１４日目または１１５日目に出産した。
【０３３３】
感染
これらの３匹の未経産豚を、検死時に豚３７１から採取した血清の接種材料に感染させた。（実施例１２参照）。血清は注射前に０．２２μｍフィルターで濾過した。３匹の未経産豚に５ｍＬの接種材料の筋肉内注射を妊娠３２日目に行った（２．５ｍＬずつ２回の注射を左と右の首に）。
【０３３４】
接種材料中のＣＴＡＰＶの量の定量値をｑＲＴ−ＰＣＲにより、実施例１０と１２に記載の通りに測定した。
【０３３５】
血清採取
血清を、感染前の未経産豚およびｔ＝受精後１０日目に採取した。また、血清を生後数時間以内の新生児子豚からも採取した。血液を採取し（Ｖａｃｕｏｌｅｔｔｅ  ５／８ｍｌ  Ｓｅｐ  Ｃｌｏｔ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｒｅｆ：４５５０７１；Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ）、血清を３，０００×ｇ  ４℃で２０分間の遠心分離によって得た。ＲＮＡ抽出およびｑＲＴ−ＰＣＲを、「サイバーグリーン１ステップｑＲＴ−ＰＣＲ」のセクション，実施例１０に記載の通りに行った。
【０３３６】
結果
表１２は、ｑＲＴ−ＰＣＲ結果によって求められた感染後１０日目の量の定量値（ゲノム／ｍＬ血清）を示す。３匹の未経産豚のうち２匹が軽度の先天性振戦Ａ−ＩＩ型を有する子豚を出産した。ｔ＝感染後１０日目の血清中のウイルス量が比較的低い未経産豚である１匹の未経産豚は、健常な同腹子を出産した。分娩後のスコア化した同腹子の情報を表１１に示す。
【０３３７】
ＣＴ  Ａ−ＩＩ型を有する子豚におけるＣＴＡＰＶの存在は、実施例１０に記載のｑＲＴ−ＰＣＲ試験によって確認された。ＣＴＡＰＶ陽性子豚の数を表１２に示す。脚の外方への広がりの発生の増加が臨床振戦に随伴した。
【表１４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【配列表】
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