(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
保持部へ細胞を導入する工程と、接着物質を含む試薬を前記保持部に添加して前記接着物質を修飾させた保持部により前記細胞を接着させる工程と、細胞固定試薬を含む細胞膜透過試薬を前記保持部に添加して前記細胞を標本化する工程と、回収手段により前記標本化した細胞を回収する工程とを含む、標本作製方法であって、
接着物質を含む試薬が０．０１（ｗ／ｖ）％以下のポリ−Ｌ−リジンを含む試薬であり、細胞膜透過試薬が３０から６５（ｖ／ｖ）％のエタノールを含む試薬である、前記方法。
【請求項２】
細胞固定試薬が０．１から５％のホルムアルデヒドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
保持部へ細胞を導入する工程が、誘電泳動力を利用して保持部へ細胞を導入する工程である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞回収方法において、細胞を、保持部との接着力を弱める酵素を含む溶液で処理する工程を含む、請求項１〜３の何れかに記載の細胞回収方法。
【請求項５】
回収手段により標本化した細胞を回収する工程が、回収手段により、当該細胞を標本化した保持部の中心から水平方向に一定距離ずらした位置で、垂直方向に吸引することで細胞を回収する工程である、請求項１〜４の何れかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、保持部に導入された細胞を前記保持部に接着させることで細胞標本を作製する方法に関する。特に本発明は、細胞回収手段により前記細胞を回収可能な細胞標本を作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
溶液中に同じ種類の細胞が含まれていたとしても、当該細胞の性質が個々に異なることが知られている（非特許文献１）。一方で、溶液中に含まれる細胞から通常得られる情報は、個々の細胞の情報が平均化された情報となるため、個々の細胞の情報を得ることは難しい。そのため、溶液中に含まれる細胞を個別に解析し、個々の細胞の情報を得ることへの関心が高まっている。
【０００３】
溶液中に含まれる細胞を個別に解析する例として、血中循環癌細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌｓ、以下ＣＴＣ）の解析があげられる。ＣＴＣは癌の転移や再発に重要な役割を果たすと考えられており、ＣＴＣの解析が可能になると、癌患者の術後診断や投薬方針を決定することができるため、治療の最適化や効率化につながると考えられる。しかしながら、ＣＴＣは未解明な点が多く、またＣＴＣが有する遺伝子の変異やコピー数変化が個々の細胞で異なるという報告もあるため、個別に細胞を解析する必要がある（非特許文献２）。
【０００４】
ＣＴＣは血液中に存在する数が血球細胞と比較して非常に少ない。具体的には、血液１ｍＬあたり、赤血球細胞は５０億個、白血球細胞は３００万から１０００万個含まれているのに対し、ＣＴＣは１０個程度しか含まれない。そのためＣＴＣを解析する際は、多数の血球細胞と少数のＣＴＣとが混合された状態から、ＣＴＣを極力ロスすることなく血球細胞から分離した上で解析する必要がある。
【０００５】
溶液中に含まれる細胞を個々に解析する方法として、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ）、光ピンセット、誘電泳動、マイクロマニピュレーションを用いた方法が知られている（非特許文献３から５、特許文献１）。しかしながらＦＡＣＳは、特定の細胞を確実に選別することが困難であり、またソーティングにより細胞が損傷する可能性がある。光ピンセット、誘電泳動、マイクロマニピュレーションを利用した解析では、細胞と同程度の大きさのウェルに細胞を導入し、当該導入した細胞について形状や光学的情報の解析を行なう。光学的情報の解析は、細胞膜表面または内部に存在するタンパク質または遺伝子へ蛍光物質を結合させ、当該蛍光物質を蛍光顕微鏡で観察する方法が一般的である。しかしながら、結合していない蛍光物質の除去／洗浄をするため、細胞が導入されたウェル（保持部）に対し液交換を行なう際、ウェル内に導入された細胞がウェル外へと脱離し、細胞をロスするおそれがあった。特にＣＴＣのように、溶液中に含まれる細胞の数が少ない場合は、当該ロスによる影響が大きい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許５００６１１７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｇｒｏｒｉａ，Ｈ．Ｈ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４４，２２５９−２２６５（１９８４）
【非特許文献２】Ｍａｒｔｉｎａ，Ａｕｅｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，４，８１２−８１３（２０１３）
【非特許文献３】Ｆｕ，ＡＹ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，１１０９−１１１１（１９９９）
【非特許文献４】Ｈｅｌｌｍｉｃｈ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２６，３６８９−３６９６（２００５）
【非特許文献５】Ｖｏｌｄｍａｎ，Ｊ．，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８，４２５−４５４（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、保持部に導入した細胞の標本化方法であって、液交換等を行なっても前記細胞が保持部外へ脱離せず、かつその後の回収操作により前記細胞を回収できるよう、前記細胞を標本化する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、本発明に到達した。
【００１０】
すなわち本発明の第一の態様は、
保持部へ細胞を導入する工程と、接着物質を含む試薬を前記保持部に添加して前記接着物質を修飾させた保持部により前記細胞を接着させる工程と、細胞固定試薬を含む細胞膜透過試薬を前記保持部に添加して前記細胞を標本化する工程とを含む、標本作製方法であって、
接着物質を含む試薬が０．０１（ｗ／ｖ）％以下のポリ−Ｌ−リジンを含む試薬であり、
細胞膜透過試薬が３０から６５（ｖ／ｖ）％のエタノールを含む試薬である、前記方法である。
【００１１】
また本発明の第二の態様は、細胞固定試薬が０．１から５％のホルムアルデヒドである、前記第一の態様に記載の方法である。
【００１２】
また本発明の第三の態様は、保持部へ細胞を導入する工程が、誘電泳動力を利用して保持部へ細胞を導入する工程である、前記第一または第二の態様に記載の方法である。
【００１３】
さらに本発明の第四の態様は、前記第一から第三の態様のいずれかに記載の方法で保持部に細胞を標本化する工程と、回収手段により前記標本化した細胞を回収する工程とを含む、細胞回収方法である。
【００１４】
また本発明の第五の態様は、回収手段により標本化した細胞を回収する工程が、回収手段により、当該細胞を標本化した保持部の中心から水平方向に一定距離ずらした位置で、垂直方向に吸引することで細胞を回収する工程である、前記第四の態様に記載の方法である。
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１６】
本発明は、保持部へ細胞を導入する工程と、接着物質を含む試薬を前記保持部に添加して前記接着物質を修飾させた保持部により前記細胞を接着させる工程と、細胞固定試薬を含む細胞膜透過試薬を前記保持部に添加し前記細胞を標本化する工程とを含む、標本作製方法において、接着物質を含む試薬が０．０１（ｗ／ｖ）％以下のポリ−Ｌ−リジンを含む試薬であり、細胞膜透過試薬が３０から６５（ｖ／ｖ）％のエタノールを含むことを特徴としている。
【００１７】
接着物質を含む試薬による前記接着物質の保持部への修飾は、保持部へ細胞を導入する工程の前に行なってもよいし、保持部へ細胞を導入する工程の後に行なってもよい。保持部へ細胞を導入する工程の後に行なう場合は、細胞へのダメージを少なくするために、修飾処理を短時間で完了させた方がよい。具体的には処理時間が５分以内だと好ましく、３分以内だとより好ましい。
【００１８】
保持部に修飾された接着物質により接着された細胞は、細胞固定試薬を含む細胞膜透過試薬を前記保持部に添加することで標本化される。本発明では、細胞膜透過試薬として３０から６５（ｖ／ｖ）％のエタノールを含む試薬を用いればよいが、４０から６５（ｖ／ｖ）％のエタノールを含む試薬を用いると、接着した細胞が十分な透過性を有するため好ましい。また４０から５０（ｖ／ｖ）％のエタノールを含む試薬を用いると、接着した細胞が十分な透過性を有し、かつその後の細胞回収工程を容易に行なえる点でさらに好ましい。なお本発明では、細胞膜透過試薬として３０から６５（ｖ／ｖ）％のエタノールを含む試薬を用いるが、細胞膜透過試薬としてはこの他にも、界面活性剤であるサポニン、Ｔｗｅｅｎ  ２０（商品名）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商品名）、ジギトニンなどを含む試薬が使用でき、これら界面活性剤を本発明で用いる細胞膜透過試薬にさらに含んでもよい。一方、細胞膜透過試薬に含まれる細胞固定試薬は、当業者が細胞固定に通常用いる試薬の中から適宜選択することができ、具体的には、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、パラホルムアルデヒドといったアルデヒド類や、金属塩、有機溶媒系固定液が例示できる。細胞固定試薬としてホルムアルデヒドを用いる場合は０．１から５％含むと好ましく、０．１から１％含むと細胞膜内外タンパク質の架橋反応による抗原のマスキングが防止できる点でより好ましい。
【００１９】
本発明のうち、保持部へ細胞を導入する方法に特に限定はなく、単に保持部に細胞を含む液体を導入するだけでもよいし、細胞を含む液体を導入した後、遠心力を利用して保持部へ強制的に細胞を導入させてもよい。中でも細胞を含む液体を導入した後、誘電泳動力を利用して保持部へ細胞を導入させると、細胞を保持部へ効率的に保持させることができる点で好ましい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明は、保持部へ細胞を導入する工程と、接着物質を含む試薬を前記保持部に添加して前記接着物質を修飾させた保持部により前記細胞を接着させる工程と、細胞固定試薬を含む細胞膜透過試薬を前記保持部に添加して前記細胞を標本化する工程とを含む、標本作製方法において、接着物質を含む試薬として０．０１（ｗ／ｖ）％以下のポリ−Ｌ−リジンを含む試薬を、細胞膜透過試薬として３０から６５（ｖ／ｖ）％のエタノールを含む試薬を、それぞれ用いることを特徴としている。
【００２１】
本発明の方法により、０．０１（ｗ／ｖ）％以下のポリ−Ｌ−リジンを含む試薬のみで細胞を接着させる場合と比較して、保持部に導入した細胞を当該保持部により強く接着させることができる。そのため、保持部内の液置換等による細胞のロスを極力少なくでき、保持部へ細胞を導入する工程を再度行なう必要がなくなるため、その後の細胞解析を短時間かつ効率的に解析することができる。
【００２２】
一方、本発明の方法により標本化した細胞は、回収手段により容易に回収できる。そのため、前記標本化した細胞の中から光学的情報等により選別した細胞の更なる解析（遺伝子解析等）が容易となる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の標本作製方法を利用可能な装置の一例を示した図（分解図）。
【図２】図１に示す装置の正面図。
【図３】図１に示す装置を用いた、本発明の標本作製方法および細胞回収方法の一例を示した図。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、図面を用いて本発明をさらに詳細に説明する。
【００２５】
本発明の標本作製方法を利用可能な装置の一例（分解図）を図１に示す。また図１に示した装置の正面図を図２に示す。
【００２６】
図１に示す装置１００は、貫通孔１１ａを有した平板状の遮光部材１１と、貫通孔１２ａを有した平板状の絶縁体１２と、導入口１３ａ、排出口１３ｂおよび貫通部１３ｃを有した平板状のスペーサ１３とからなる細胞導入保持手段１０と、細胞導入保持手段１０を上下方向に密着して挟むよう設けた電極基板２１・２２と、電極基板２１・２２同士を接続する導線３０と、電極基板２１・２２に信号を印加する信号発生器４０と、を備えている。遮光部材１１が有する貫通孔１１ａと絶縁体１２が有する貫通孔１２ａとは互いに同一の寸法および形状であり、かつそれぞれの貫通孔の位置が一致するよう遮光部材１１および絶縁体１２を設けている。貫通孔１１ａ、貫通孔１２ａおよび遮光部材１１の下部に密着して設けた電極基板２１により保持部５０が構成され、導入口１３ａから細胞を含む液体を導入すると、貫通部１３ｃを通じて保持部５０へ細胞が導入される。電極基板２２はスペーサ１３上部に密着して設けており、導入口１３ａから導入した、細胞を含む液体の飛散や蒸発を防止している。なお保持部５０に保持した細胞の回収を容易にするため、電極基板２２はスペーサ１３から取り外し可能な構造となっている。
【００２７】
次に図１に示す装置を用いた、本発明の標本作製方法および細胞回収方法の一例を図３を用いて説明する。
【００２８】
（１）保持部へ細胞を導入する工程
導入口１３ａから細胞６０を含む液体を導入し、細胞６０を保持部５０へ導入させる。図１に示す装置では細胞６０を保持部５０へ導入させる際、誘電泳動力７０を利用して導入する。具体的には、信号発生器４０から電極基板２１・２２へ交流電圧を印加することで誘電泳動力７０を発生させ、保持部５０へ細胞６０を導入する。図１に示す装置に導入する細胞を含む液体は、誘電泳動力で細胞が移動できるよう懸濁された液であればよく、例えば、マンニトール、グルコース、スクロース等の糖類を含んだ水溶液や、当該水溶液に塩化カルシウム、塩化マグネシウム等の電解質、および／またはＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）等のタンパク質をさらに含んだ水溶液に、細胞を含んだ試料を懸濁させた液体があげられる。特に細胞を含む液体として、マンニトールを含む水溶液に細胞を含んだ試料を懸濁させた液体を用いると、細胞へのダメージが少なくなる点で好ましい。添加するマンニトールの濃度は等張液となる濃度とすればよく、具体的には２５０ｍＭから３５０ｍＭの間とするとよい。信号発生器４０から電極基板２１・２２へ印加する交流電圧は、保持部５０に保持された細胞６０の充放電が周期的に繰り返される波形を有した交流電圧とすると好ましく、周波数を１００ｋＨｚから３ＭＨｚまでの間とし、電界強度を１×１０５から５×１０５Ｖ／ｍまでの間とすると特に好ましい（ＷＯ２０１１／１４９０３２号および特開２０１２−０１３５４９号公報参照）。
【００２９】
（２）接着物質８０を含む試薬を添加する工程
導入口１３ａから接着物質８０を含む試薬を導入することで、保持部５０を接着物質８０で修飾し、接着物質８０を介して保持部５０と保持部５０に導入した細胞６０とを接着させる。なお接着物質８０による保持部５０の修飾は前記（１）の工程の前に実施してもよい。
【００３０】
本発明の方法では、接着物質として、細胞表面と静電気的に結合することで、比較的短時間に細胞と保持部との接着が可能なポリ−Ｌ−リジンを用い、その濃度は０．０１（ｗ／ｖ）％以下とする。なお本工程は、細胞へのダメージを少なくするために、短時間で完了させるとよい。本工程の具体例として、ポリ−Ｌ−リジンを０．０１（ｗ／ｖ）％含む溶液を導入口１３ａから３分間導入して、保持部５０を置換する工程があげられる。
【００３１】
本工程を前記（１）の工程の後に実施する場合、信号発生器４０から電極基板２１・２２へ交流電圧を印加した状態（つまり細胞への誘電泳動力が存在する状態）で実施すると好ましい。前記好ましい態様で本工程を実施する場合、接着物質８０を含む試薬に、前記（１）で導入した、細胞６０を含む液体と同じ濃度の糖類（例えば、２５０ｍＭから３５０ｍＭのマンニトール）を含むとよい。
【００３２】
（３）細胞膜透過試薬を添加する工程
排出口１３ｂから接着物質８０を含む試薬を排出した後、導入口１３ａから細胞固定試薬を含む細胞膜透過試薬を導入することで、保持部５０に導入した細胞６０を標本化する。細胞膜透過試薬は３０から６５（ｖ／ｖ）％のエタノールを含んでいればよい。細胞膜透過試薬に含まれる細胞固定試薬は、当業者が細胞固定に通常用いる試薬の中から適宜選択することができ、例えば０．１から１％のホルムアルデヒドがあげられる。細胞固定試薬を含む細胞膜透過試薬の導入時間（保持部への試薬置換時間）は５から１５分が好ましく、１０分前後がより好ましい。
【００３３】
（４）ブロッキング試薬を添加する工程
後述の標識工程における非特異標識の発生を防止するため、導入口１３ａから洗浄液を導入して、残存した細胞膜透過試薬を除去した後、導入口１３ａから非特異標識を防止するためのブロッキング試薬を導入する。洗浄液は、細胞膜透過試薬に含まれる有機溶媒成分（エタノール、ホルムアルデヒド等）を除去可能な水系溶媒であればよく、例えば、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）があげられる。また洗浄液に界面活性剤を添加すると、液置換による洗浄が容易に行なえるため好ましく、前記好ましい洗浄液の一例として、Ｔｗｅｅｎ  ２０（商品名）を０．０５（ｖ／ｖ）％添加したＰＢＳがあげられる。
【００３４】
ブロッキング試薬としては、タンパク質や界面活性剤を含んだ水溶液が例示できる。具体的にはタンパク質としてはＢＳＡ、ゼラチン、カゼインなどが、界面活性剤としてはサポニン、Ｔｗｅｅｎ  ２０（商品名）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商品名）、ジギトニンなどが、それぞれ例示できる。ブロッキング試薬を導入する時間（保持部への試薬置換時間）は含まれる成分およびその濃度によって異なるが、ＢＳＡを１（ｗ／ｖ）％含んだＰＢＳをブロッキング試薬として用いる場合、５から１５分導入すればよく、１０分前後の導入時間とすると好ましい。
【００３５】
（５）標識試薬を添加する工程
排出口１３ｂからブロッキング試薬を排出した後、導入口１３ａから標識試薬を導入して、標本化した細胞を標識させる（標識化細胞６１）。標識試薬は、目的細胞の検出に適した標識物質の中から適宜選択すればよい。例えば目的細胞が血中循環癌細胞（ＣＴＣ）の場合、蛍光標識された抗サイトケラチン抗体もしくは抗ＥｐＣＡＭ抗体を含む溶液や、白血球染色試薬である抗ＣＤ４５抗体と細胞核染色試薬である４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２等との混合溶液が使用できる。なお抗原抗体反応を利用して目的細胞を標識する場合であって、当該細胞における抗原発現量が少ないときは、当該抗原に対する抗体を含む標識試薬を添加後、添加した抗体に対する抗体を順次添加していくことで蛍光シグナルを増幅させる方法を採用してもよい。
【００３６】
（６）目的細胞を選別する工程
標識試薬に由来するバックグラウンドの上昇を防止するため、導入口１３ａから洗浄液を導入して、残存した標識試薬を除去した後、光学検出器２００で標本化された細胞の光情報（可視光または蛍光）および位置情報を取得し、目的細胞６１の位置を検出する。洗浄液としては、標識試薬を除去できる水系の溶媒であればよく、一例として前記（４）の工程で洗浄液として用いた、ＰＢＳやＴｗｅｅｎ２０を０．０５（ｖ／ｖ）％添加したＰＢＳがあげられる。目的細胞がＣＴＣの場合、光学検出器２００により、抗サイトケラチン抗体または抗ＥｐＣＡＭ抗体由来の蛍光が確認され、ＤＡＰＩ等の細胞核染色試薬由来の蛍光が確認され、かつ抗ＣＤ４５抗体由来の蛍光が確認されない細胞を選別すればよい。
【００３７】
（７）目的細胞を回収する工程
光学検出器２００で検出した目的細胞６１を回収するために、電極基板２２をスペーサ１３から取り外した後、回収装置３００で吸引することで目的細胞６１を回収する。電極基板２２を取り外す際は、スペーサ１３を剥がさないよう取り外す必要がある。もしスペーサ１３が絶縁体１２から剥がれると、装置内に保持されている溶液が系外に流れてしまい、目的細胞６１が破壊されるからである。
【００３８】
回収装置３００による目的細胞６１の吸引は、前記（６）の工程で検出した目的細胞６１が標本化されている保持部５０に回収装置３００を移動させ、回収装置３００により液を吸引することで目的細胞６１を回収する。なお回収装置３００による目的細胞６１の吸引位置を、目的細胞６１を標本化した保持部５０の中心から水平方向に一定距離ずらした位置とすると、目的細胞６１の吸引を容易に行なえるため好ましい。具体的には目的細胞６１の吸引位置を、保持部５０の中心から水平方向に保持部５０の直径の０．１倍から２倍の長さ分（ただし隣接する保持部５０間の距離の２分の１以下）ずらし、かつ保持部５０の高さから垂直方向に保持部５０の高さの０．０１倍から２倍の高さ分高い位置とすると好ましい。また回収装置３００による目的細胞６１の吸引操作の前に、目的細胞６１と保持部５０との接着性を弱める酵素を含む溶液を添加する操作を行なってもよい。
【００３９】
回収装置３００による目的細胞６１を吸引する方法として、ポンプを用いた陰圧による吸引や、電気浸透流による吸引が例示できる。目的細胞６１は保持部５０に比較的強く接着されていることから、回収装置３００としてシリンジポンプを用いる場合は高流速で吸引する必要があり、具体的には０．０１μＬ／ｓ以上の流量が必要である。しかしながら流量を大きくしすぎると、流路内に気泡が発生し、著しく流量が低下してしまうため、流量は０．０１から５．０μＬ／ｓの間が好ましい。
【００４０】
回収装置３００による目的細胞６１の吸引で用いる細管の材質としては、ガラス、金属、樹脂等があげられるが、耐衝撃性および光透過性が高いガラスが好ましい。また細管の内径は、吸引後の細管内での詰まりを防ぐため、吸引する細胞の直径よりも大きくするとよい。例えば、直径３０μｍの保持部（保持部間の距離は５０μｍ）に導入された細胞を吸引する場合は、細管の内径を２５μｍから３５μｍの間とするとよい。
【００４１】
（８）回収した目的細胞を回収チューブへ吐出する工程
回収装置３００による吸引で回収した目的細胞６１を回収チューブ４００へ吐出し、回収チューブ４００へ目的細胞６１が吐出されたかどうかを光学検出器２００で検出する。回収チューブ４００に回収された目的細胞６１はその後遺伝子解析等さらなる解析に供される。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例および参考例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら例の内容に限定されるものではない。
【００４３】
実施例１  細胞膜透過試薬のエタノール濃度検討
（１）ヒト非小細胞肺がん由来のＨ１９７５細胞を、１０（ｖ／ｖ）％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて、５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養した。
（２）細胞がサブコンフルエントに達した後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて個々の細胞がばらばらになるよう細胞を剥がした。
（３）処理した細胞を遠心し（２００×ｇ、２５℃、５分間）、上清を捨てた後、１０５個／ｍＬの細胞密度になるよう、３００ｍＭマンニトール水溶液に懸濁させた。
（４）（３）で調製した懸濁液を図１に示す装置１００に導入し、誘電泳動力を利用して保持部へ細胞を導入した。なお各保持部５０の大きさは直径３０μｍ、深さ４０μｍであり、各保持部５０間の距離は５０μｍである。信号発生器４０から電極基板２１・２２に印加する交流電圧は、電圧２０Ｖｐｐ、周波数３ＭＨｚの矩形波である。交流電圧を印加してから１分程度で、保持部５０へ細胞を１つずつ導入することができた。
（５）（４）に記載の条件で交流電圧を印加しながら、０．０１（ｗ／ｖ）％のポリ−Ｌ−リジンを含む３００ｍＭマンニトール水溶液を導入し、２分間静置後、前記交流電圧の印加を停止し、前記水溶液を吸引除去した。
（６）エタノールと１％ホルムアルデヒドを含む水溶液（以下、細胞膜透過試薬）を導入し、１０分間静置することで、細胞膜を透過させ、保持部に導入した細胞を標本化した。
なおエタノール濃度は４０（ｖ／ｖ）％、４５（ｖ／ｖ）％、５０（ｖ／ｖ）％、５５（ｖ／ｖ）％、６０（ｖ／ｖ）％、６５（ｖ／ｖ）％、７０（ｖ／ｖ）％、７５（ｖ／ｖ）％、８０（ｖ／ｖ）％、８６（ｖ／ｖ）％、９０（ｖ／ｖ）％、９５（ｖ／ｖ）％のいずれかとした。
（７）細胞膜透過試薬を吸引除去し、ＰＢＳを導入することで、残留した細胞膜透過試薬を洗浄した。
（８）細胞膜内外のタンパク質と特異的に結合可能な蛍光標識された抗体と、細胞核を標識する蛍光試薬を含む水溶液（以下、標識試薬）を導入し、１０分間静置した。
（９）標識試薬を吸引除去し、ＰＢＳを導入することで、残留した標識試薬を除去した。
（１０）電極基板２２をスペーサ１３から取り外した後、蛍光顕微鏡のステージ上に載置した。
（１１）蛍光顕微鏡による蛍光観察で、細胞が保持部で標本化されていることを確認した後、円筒状の細管（回収装置３００）を用いて任意の保持部から細胞を吸引できるか検証した。
【００４４】
結果を表１に示す。細胞透過試薬におけるエタノール濃度を７０（ｖ／ｖ）％以上とすると細胞回収率（吸引成功率）が大きく低下することがわかる。一方、６５（ｖ／ｖ）％以下の濃度では保持部からの細胞回収率（吸引成功率）が７０％以上と、高い確率で細胞を吸引することができた。
【００４５】
【表１】
0006686361.tif 000002
【００４６】
比較例１
（１）ヒト非小細胞肺がん由来のＨ１９７５細胞を、１０（ｖ／ｖ）％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて、５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養した。
（２）細胞がサブコンフルエントに達した後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて個々の細胞がばらばらになるよう細胞を剥がした。
（３）処理した細胞を遠心し（２００×ｇ、２５℃、５分間）、上清を捨てた後、１０５個／ｍＬの細胞密度になるよう、３００ｍＭマンニトール水溶液に懸濁させた。
（４）（３）で調製した懸濁液を図１に示す装置１００に導入し、誘電泳動力を利用して保持部へ細胞を導入した。なお各保持部５０の大きさは直径３０μｍ、深さ４０μｍであり、各保持部５０間の距離は５０μｍである。信号発生器４０から電極基板２１・２２に印加する交流電圧は、電圧２０Ｖｐｐ、周波数３ＭＨｚの矩形波である。交流電圧を印加してから１分程度で、保持部５０へ細胞を１つずつ導入することができた。
（５）（４）に記載の条件で交流電圧を印加しながら、０．０１（ｗ／ｖ）％のポリ−Ｌ−リジンを含む３００ｍＭマンニトール水溶液を導入し、２分間静置後、前記交流電圧の印加を停止し、前記水溶液を吸引除去した。
（６）電極基板２２をスペーサ１３から取り外した後、蛍光顕微鏡のステージ上に載置した。
（７）蛍光顕微鏡による蛍光観察で、細胞が保持部で標本化されていることを確認した後、円筒状の細管（回収装置３００）を用いて任意の保持部から細胞を吸引できるか検証した。
【００４７】
その結果、保持部からの細胞回収率（吸引成功率）は１００％であり、高い確率で細胞を吸引することができた。
【００４８】
実施例１と比較例１の結果から、接着物質を含む試薬として０．０１（ｗ／ｖ）％以下のポリ−Ｌ−リジンを含む試薬を、細胞膜透過試薬として３０から６５（ｖ／ｖ）％のエタノールを含む試薬を、それぞれ用いることで、０．０１（ｗ／ｖ）％以下のポリ−Ｌ−リジンを含む試薬のみで細胞を接着させる場合と比較して、保持部に導入した細胞を当該保持部により強く接着させることができることがわかる。
【００４９】
実施例２
実施例２のうち、細胞膜透過試薬として、８６（ｖ／ｖ）％エタノールと１％ホルムアルデヒドを含む溶液を用いて細胞の標本化を行なった後、細胞と保持部の接着性を弱める目的でトリプシンを添加し、保持部から細胞を吸引できるか検討した。
（１）ヒト非小細胞肺がん由来のＨ１９７５細胞を、１０（ｖ／ｖ）％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて、５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養した。
（２）細胞がサブコンフルエントに達した後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて個々の細胞がばらばらになるよう細胞を剥がした。
（３）処理した細胞を遠心し（２００×ｇ、２５℃、５分間）、上清を捨てた後、１０５個／ｍＬの細胞密度になるよう、３００ｍＭマンニトール水溶液に懸濁させた。
（４）（３）で調製した懸濁液を図１に示す装置１００に導入し、誘電泳動力を利用して保持部へ細胞を導入した。なお各保持部５０の大きさは直径３０μｍ、深さ４０μｍであり、各保持部５０間の距離は５０μｍである。信号発生器４０から電極基板２１・２２に印加する交流電圧は、電圧２０Ｖｐｐ、周波数３ＭＨｚの矩形波である。交流電圧を印加してから１分程度で、保持部５０へ細胞を１つずつ導入することができた。
（５）（４）に記載の条件で交流電圧を印加しながら、０．０１（ｗ／ｖ）％のポリ−Ｌ−リジンを含む３００ｍＭマンニトール水溶液を導入し、２分間静置後、前記交流電圧の印加を停止し、前記水溶液を吸引除去した。
（６）８６（ｖ／ｖ）％エタノールと１％ホルムアルデヒドを含む水溶液（以下、細胞膜透過試薬）を導入し、１０分間静置することで、細胞膜を透過させ、保持部に導入した細胞を標本化した。
（７）細胞膜透過試薬を吸引除去し、ＰＢＳを導入することで、残留した細胞膜透過試薬を洗浄した。
（８）細胞膜内外のタンパク質と特異的に結合可能な蛍光標識された抗体と、細胞核を標識する蛍光試薬を含む水溶液（以下、標識試薬）を導入し、１０分間静置した。
（９）標識試薬を吸引除去し、ＰＢＳを導入することで、残留した標識試薬を除去した。
（１０）蛍光顕微鏡による蛍光観察で、細胞が保持部で標本化されていることを確認した。
（１１）０．２５ｗ／ｖ％トリプシン−１ｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ・４Ｎａ溶液（和光純薬工業製）をＰＢＳで１／２０に希釈したもの（以下、トリプシン溶液）を導入し、室温で２０分間静置した。
（１２）トリプシン溶液を吸引除去し、ＰＢＳを導入することで残留したトリプシン溶液を除去した。
（１３）電極基板２２をスペーサ１３から取り外した後、蛍光顕微鏡のステージ上に載置した。
（１４）蛍光顕微鏡による蛍光観察で、細胞が保持部で標本化されていることを確認した後、円筒状の細管（回収装置３００）を用いて任意の保持部から細胞を吸引できるか検証した。
【００５０】
その結果、保持部からの細胞回収率（吸引成功率）は、トリプシン溶液を導入後２０分間静置した場合は１００％であった。以上の結果から、標本化した細胞をトリプシン溶液で処理することで、高い確率で細胞を吸引できることが分かった。
【００５１】
比較例２
実施例１のうち、細胞膜透過試薬として、８６（ｖ／ｖ）％エタノールと１％ホルムアルデヒドを含む溶液を用いて細胞の標本化を行なった後、以下の（ｉ）から（ｖ）に示す、ポリ−Ｌ−リジンによる静電相互作用を阻害する処理を行なうことで、保持部から細胞を吸引ができるか検討した。
（ｉ）ｐＨ変化
スペーサ１３から電極基板２２を取り外した後、細胞を標本化した保持部へ、ＨＣｌまたはＮａＯＨを添加することでｐＨを変動させた。
（ｉｉ）塩強度変化
１０×Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）、５×Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）または１Ｍ  ＮａＣｌ溶液を導入し、３０分間静置した。
（ｉｉｉ）シアル酸分解酵素処理
０．１から５．０Ｕ／ｍＬのノイラミニダーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製）と４０ｍＭのＣａＣｌ２とを添加した酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を導入し、１時間静置した。
（ｉｖ）ポリ−Ｌ−リジン分解酵素処理（その１）
５０から５００μｇ／ｍＬのパパイン（和光純薬工業製）と１０ｍＭのＥＤＴＡと６０ｍＭの２−メルカプトエタノールと５０ｍＭのシステイン塩酸塩とを含むＰＢＳを導入し、３７℃で３０分間静置した。
（ｖ）ポリ−Ｌ−リジン分解酵素処理（その２）
０．０５から１．０ｍｇ／ｍＬのα―キモトリプシン（和光純薬工業製）と８０ｍＭのＴｒｉｓと８ｍＭのＥＤＴＡと２００ｍＭのＣａＣｌ２とを含む水溶液を導入し、３７℃で３０分間静置した。
【００５２】
結果、前記（ｉ）から（ｖ）に示す処理を行なっても、標本化された細胞を吸引することはできなかった。
【符号の説明】
【００５３】
１００：細胞導入装置
２００：光学検出器
３００：回収装置
４００：回収チューブ
１０：細胞導入保持手段
１１：遮光部材
１２：絶縁体
１１ａ、１２ａ：貫通孔
１３：スペーサ
１３ａ：導入口
１３ｂ：排出口
１３ｃ：貫通部
２１・２２：電極基板
３０：導線
４０：信号発生器
５０：保持部
６０：細胞
６１：標識化細胞（目的細胞）
７０：誘電泳動力
８０：接着物質
【図１】
0006686361.tif 000003
【図２】
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【図３】
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