(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
関心対象の組換えペプチド（ＰｅＯＩ）またはタンパク質（ＰｒＯＩ）を生成するための方法であり、
（ａ）少なくとも１つのＰｅＯＩまたはＰｒＯＩと、タイプ１分泌系（Ｔ１ＳＳ）の少なくとも１つのアロクライトまたはその断片と、を含む融合タンパク質を符号化する核酸分子を宿主細胞に導入する段階であって、当該段階において、前記宿主細胞は、外来性のＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーター、外来性の膜融合タンパク質（ＭＦＰ）、および／または外来性の外膜タンパク質（ＯＭＰ）を発現しない段階と、
（ｂ）前記融合タンパク質の発現を可能とする条件下で前記宿主細胞を培養する段階であって、当該段階において、前記融合タンパク質は、封入体（ＩＢ）の形態で発現する段階と、
（ｃ）前記組換え融合タンパク質を前記宿主細胞から単離する段階と、
（ｄ）前記ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩが機能的立体配座に折り畳まれることを可能とする条件に前記組換え融合タンパク質を晒す段階と
を備え、
前記Ｔ１ＳＳのアロクライトは、ＨｌｙＡ及びＬｉｐＡから成る群から選択され、封入体の機能的立体配座への効率的な復元を可能にし、
前記核酸分子の前記Ｔ１ＳＳのアロクライトまたはその断片を符号化する部分は、少なくとも１つの共通配列ＧＧｘＧｘＤｘＵｘからなるＧＧ反復配列を符号化する核酸配列を有し、ｘは任意のアミノ酸であり得、Ｕは、疎水性の、大きなアミノ酸であり、
前記核酸分子の前記Ｔ１ＳＳのアロクライトまたはその断片を符号化する部分は、配列番号４のアミノ酸配列で表される野生型のＨｌｙＡ１または配列番号３８の２−２４２残渣で表される野生型のＬｉｐＡ１に対応する部分に対し、少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを符号化する核酸配列を有する、方法。
【請求項２】
前記核酸分子の前記Ｔ１ＳＳのアロクライトまたはその断片を符号化する部分は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に明記されているアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列から成るＨｌｙＡを符号化する核酸配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸分子の前記Ｔ１ＳＳのアロクライトまたはその断片を符号化する部分は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に明記されているアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列から成る、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
発現培地は、２０．０ｍＭまたはそれより少量のＣａ２＋を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記宿主細胞の内在性ＡＢＣトランスポーター遺伝子、内在性ＭＦＰ遺伝子、および／または内在性ＯＭＰ遺伝子の発現、または前記宿主細胞における対応する遺伝子産物の活性は阻害され、または輸送が非効率的である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記宿主細胞は、内在性ＡＢＣトランスポーター、内在性ＭＦＰ、および／または内在性ＯＭＰを発現しない、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｄ）において、前記組換えペプチドまたはタンパク質は再折り畳み緩衝液に曝され、前記再折り畳み緩衝液は、少なくとも０．０１ｍＭのＣａ２＋を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
（Ｉ）前記宿主細胞は原核細胞であり、および／または、
（ＩＩ）前記発現は、最小培地で行われ、および／または、
（ＩＩＩ）前記組換え融合ペプチドまたはタンパク質は、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびこれらの複数の組み合わせから選択される方法を用いて精製され、および／または、
（ＩＶ）前記方法は、前記組換え融合タンパク質を、前記融合タンパク質の開裂に適したプロテアーゼと接触させて、別個の複数の分子として前記アロクライトおよび前記ペプチドまたはＰｒＯＩを生成する追加のステップ（ｅ）を備え、および／または、
（Ｖ）前記方法は、化学的処理により前記組換え融合タンパク質を開裂して、別個の複数の分子として前記アロクライトおよび前記ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩを生成する追加のステップ（ｅ）を備え、および／または、
（ＶＩ）前記方法は、（ＩＶ）または（Ｖ）に定義されている、前記ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩの精製がその後に続くことになるステップ（ｅ）を備える、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つのＰｅＯＩまたはＰｒＯＩは、ナイシン、ＨＣＲＦ、ＩＦＡＢＰ、ＩＦＮＡ２、ＭＢＰ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に明記されているアミノ酸配列から成るペプチド１０１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に明記されているアミノ酸配列から成るペプチド１０２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に明記されているアミノ酸配列から成るペプチド１０３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３に明記されているアミノ酸配列から成るＭＡＢ−４０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４に明記されているアミノ酸配列から成るＭａｂ−４２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１に明記されているアミノ酸配列から成るペプチド、サケカルシトニン、ヒトカルシトニン、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２に明記されているアミノ酸配列から成る阻害物質ペプチド１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３に明記されているアミノ酸配列から成るペプチド２３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４に明記されているアミノ酸配列から成るペプチド２３９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５に明記されているアミノ酸配列から成るペプチド２４０またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６に明記されているアミノ酸配列から成るペプチド２４１から成る群から選択される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記融合タンパク質を符号化する前記核酸分子は、前記融合タンパク質の発現を変調させる調節ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は分子生物学、組換えペプチドおよびタンパク質の発現の分野に属し、関心対象の組換えペプチドおよびタンパク質の効率的な生成のための、タイプ１分泌系の基質／アロクライト（ａｌｌｏｃｒｉｔｅ）またはその断片の核酸配列を含む方法に関する。アロクライトまたはその断片は、封入体（ＩＢ）としての関心対象のペプチドおよびタンパク質の発現を向上させ、ＩＢ−タグとして機能する。
【背景技術】
【０００２】
近年、工業プロセスに用いられる組換えタンパク質／酵素生成は、ますます重要になってきており、近いうちに、多くの工業プロセスが組換え技術を伴うであろうと予想される。現在、生理活性のペプチドおよびタンパク質が、例をいくつか挙げるとすれば、糖尿病（インスリン）、ウイルス感染症および白血病（インターフェロン）、免疫系の病気（インターロイキン）、および赤血球の欠乏（エリスロポエチン）などの様々な病気における治療剤として用いられている。加えて、多量のタンパク質およびペプチドが、例えば、パルプおよび紙産業、繊維、食品産業、介護および化粧品産業、精糖、廃水処理、アルコール飲料の生産を含む様々な工業的用途のために、および新たな医薬品の生成のための触媒として必要とされている。
【０００３】
しかし、天然の折り畳みを有する所望されるペプチドおよびタンパク質を大量に、かつ高い純度で得るためには多大な努力が必要とされるので、組換えペプチドおよびタンパク質の発現はまだ限定されている。
【０００４】
概して、産物の精製はコストが高く、同様の特性をもつタンパク質は互いから分離するのが困難であるので、特に純度１００％への最終的なステップは、コストを指数関数的に増加させる傾向にある（Ｈａｃｋｉｎｇ，Ａ．Ｊ．（１９８６）Ｅｃｏｎｏｍｉｃ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）。
【０００５】
多くの場合、特に、関心対象のペプチド（ＰｅＯＩ）または関心対象のタンパク質（ＰｒＯＩ）がかなり短く、通常は可溶性であり、および／または宿主細胞内でタンパク質分解してしまうときに、不溶性の形態でタンパク質またはペプチドを発現させるのが有用である。不溶性の形態でのペプチドの生成は、単純な回収の容易化と、所望されないタンパク質分解からのペプチドの保護との両方を達成する。不溶性の形態でペプチドを生成するための１つの手段は、ＩＢの形成を誘発する少なくとも１つの可溶性タグ（すなわち、封入体（ＩＢタグ）を融合ペプチドに含めることにより、不溶性融合ペプチド／タンパク質の一部としてペプチドを組み換えで生成することである。典型的には、融合タンパク質は、ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩがその後に融合タンパク質から回収され得るよう、少なくとも１つの開裂可能なペプチドリンカーを含むよう設計される。融合タンパク質は、複数のＩＢ−タグ、開裂可能なペプチドリンカー、およびＰｅＯＩまたはＰｒＯＩを符号化する領域を含むよう設計され得る。
【０００６】
不溶性タンパク質の発現を促進するペプチドタグを含む融合タンパク質は、当技術分野で周知である。典型的には、キメラタンパク質または融合タンパク質のタグ部分は大きく、融合タンパク質が不溶性となる可能性が高くなる。典型的に用いられる大きいペプチドの複数の例は、限定されないが以下を含む。クロラムフェニコールアセチル基転移酵素（Ｄｙｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７４：４１１）、βガラクトシダーゼ（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．，４１：３２６、Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２８１：４６２７、およびＫｅｍｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｇｅｎｅ，３９：２３９）、グルタチオン−Ｓ−転移酵素（Ｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１：６４、およびＨａｎｃｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（ＷＯ９４／０４６８８））、ＬリブロキナーゼのＮ末端（米国特許第５，２０６，１５４号およびＬａｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  ＆  Ｃｈｅｍｏ．），３７：１６１４、バクテリオファージＴ４  ｇｐ５５タンパク質（Ｇｒａｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：１０１７）、バクテリアケトステロイドイソメラーゼタンパク質（Ｋｕｌｉｏｐｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｊ  Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：４５９９、および米国特許第５，６４８，２４４）、ユビキチン（Ｐｉｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，１３：３７４−７９）、ウシプロキモシン（Ｈａｕｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ．５７：５５−６１）、殺菌／透過性増加タンパク質（"ＢＰＩ"；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．Ｄ．およびＧａｖｉｔ，Ｐ  Ｄ．、米国特許第６，２４２，２１９号）。当技術分野は、この技術の具体的な例で満ちている。例えば、特定のプロテアーゼから、発現したキメラタンパク質を保護するタグについて教示している米国特許第６，０３７，１４５号、所望されるタンパク質の容易な精製のためのタグおよび開裂可能なリンカーを有する融合タンパク質の合成について教示している米国特許第５，６４８，２４４号、並びに、特にキメラタンパク質またはペプチドの非溶解性を高めるよう設計されたアミノ酸組成を含む融合タグについて説明している米国特許第５，２１５，８９６号、第５，３０２，５２６号、第５，３３０，９０２号、および米国特許出願公開第２００５／２２１４４４号を参照されたい。
【０００７】
しかし、当技術分野で公知の方法は、ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩを再び折り畳む解決法を何ら提供していない。したがって、当技術分野にはまだ、組換えＰｅＯＩおよびＰｒＯＩの向上した生成を可能とする方法の必要性がある。
【０００８】
本発明者らは、溶血毒Ａ（ＨｌｙＡ）またはリパーゼＡ（ＬｉｐＡ）遺伝子断片を含む核酸配列を備える方法が、当技術分野における上記の必要性を克服することを見出した。両方の遺伝子は、ほとんどの場合にグラム陰性菌において生じ、周辺基質の中間物を形成することなくそれらの同族の基質を単一のステップで細胞基質から細胞外培地に排出するタイプ１分泌系（Ｔ１ＳＳ）の一部である。Ｔ１ＳＳファミリーのうち、輸送基質としてＨｌｙＡを伴う、Ｂａｋｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．によって説明されているＨｌｙ  Ｔ１ＳＳは、共通配列ＧＧｘＧｘＤｘＵｘ（ｘ：任意のアミノ酸残基、Ｕ：大きい疎水性アミノ酸残基）のいわゆるＧＧ反復配列を有しているので特に関心が高い（Ｏｓｔｏｌａｚａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２２８，３９−４４）。これらＧＧ反復配列はＣａ２＋イオンを高い親和性で結合する。この結合イベントは、Ｃａ２＋濃度が細胞内部（高いｎＭ）のＣａ２＋濃度と比較し高い（最大ｍＭの範囲）外部へのＴ１ＳＳアロクライトの分泌の後に起こる。ＧＧ反復配列に結合しているＣａ２＋は、アロクライトの天然型の活性形態への折り畳みに触媒作用を及ぼし、Ｃａ２＋イオンは、折り畳みヘルパー／シャペロンとしての役割を担う（Ｊｕｍｐｅｒｔｚ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５６，２４９５−２５０５，ｄｏｉ：ｍｉｃ．０．０３８５６２−０［ｐｉｉ］）。大腸菌のＨｌｙＡ  Ｔ１ＳＳの更なる成分は、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーターである内膜タンパク質ＨｌｙＢ、外膜タンパク質（ＯＭＰ）ＴｏｌＣ、および内膜における膜融合タンパク質（ＭＦＰ）ＨｌｙＤである。
【発明の概要】
【０００９】
第１態様において、本願発明は、組換えＰｅＯＩまたはＰｒＯＩを生成するための方法に関し、方法は、（ａ）少なくとも１つのＰｅＯＩまたはＰｒＯＩを含む融合タンパク質を符号化する核酸分子と、Ｔ１ＳＳの少なくとも１つのアロクライトまたはその断片とを、宿主細胞に導入する段階であり、宿主細胞は、Ｔ１ＳＳの異種のＡＢＣトランスポーター、異種のＭＦＰ、および／または異種のＯＭＰを発現しない段階と、（ｂ）融合タンパク質の発現を可能とする条件下で宿主細胞を培養する段階であり、融合タンパク質は、ＩＢの形態で発現する段階と、（ｃ）組換え融合タンパク質を宿主細胞から単離する段階と、（ｄ）ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩが機能的立体配座へと折り畳まれることを可能とする条件に組換え融合タンパク質を晒す段階とを備える。
【００１０】
様々な実施形態において、Ｔ１ＳＳのアロクライトは、ＨｌｙＡ、ＣｙａＡ、ＥｈｘＡ、ＬｋｔＡ、ＰｌＬｋｔＡ、ＰａｓＡ、ＰｖｘＡ、ＭｍｘＡ、ＬｔｘＡ、ＡｐｘＩＡ、ＡｐｘＩＩＡ、ＡｐｘＩＩＩＡ、ＡｐｘＩＶＡ、ＡｐｘＩ、ＡｐｘＩＩ、ＡｑｘＡ、ＶｃＲｔｘＡ、ＶｖＲｔｘＡ、ＭｂｘＡ、ＲＴＸ細胞毒素、ＲｔｘＬ１、ＲｔｘＬ２、ＦｒｈＡ、ＬｉｐＡ、ＴｌｉＡ、ＰｒｔＡ、ＰｒｔＳＭ、ＰｒｔＧ、ＰｒｔＢ、ＰｒｔＣ、ＡｐｒＡ、ＡｐｒＸ、ＺａｐＡ、ＺａｐＥ、Ｓａｐ、ＨａｓＡ、コリシンＶ、ＬａｐＡ、ＯＲＦ、ＲｚｃＡ、ＲｔｘＡ、ＸＦ２４０７、ＸＦ２７５９、ＲｚｃＡ、ＲｓａＡ、Ｃｒｓ、ＣｓｘＡ、ＣｓｘＢ、ＳｌａＡ、ＳｗｍＡ、Ｓｌｌ１９５１、ＮｏｄＯ、ＰｌｙＡ、ＰｌｙＢ、ＦｒｐＡ、ＦｒｐＣ、およびその断片から成る群から選択される。
【００１１】
好ましい複数の実施形態において、Ｔ１ＳＳのアロクライトは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に明記されているアミノ酸配列、その断片、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド、またはその断片を含む、またはこれらから成るＨｌｙＡであり得る。
【００１２】
より好ましい複数の実施形態において、ＨｌｙＡの断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に明記されているアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドから成る。
【００１３】
様々な実施形態において、発現培地は、２０．０ｍＭまたはそれより少量のＣａ２＋を含む。
【００１４】
更なる複数の実施形態において、本願発明は、Ｔ１ＳＳの内在性ＡＢＣトランスポーター遺伝子、内在性ＭＦＰ遺伝子、および／または内在性ＯＭＰ遺伝子の発現、または宿主細胞における対応する遺伝子産物の活性は阻害され、または輸送が非効率的である方法に関する。
【００１５】
他の様々な実施形態において、宿主細胞は、Ｔ１ＳＳの内在性ＡＢＣトランスポーター、内在性ＭＦＰ、および／または内在性ＯＭＰを発現しない。
【００１６】
また更なる複数の実施形態において、組換えペプチドまたはタンパク質は再折り畳み緩衝液に曝され得、再折り畳み緩衝液は、少なくとも０．０１ｍＭのＣａ２＋を含む。
【００１７】
本願発明の方法の様々な実施形態において、（Ｉ）宿主細胞は原核細胞であり、および／または、（ＩＩ）発現は、最小培地で行われ、および／または、（ＩＩＩ）組換え融合ペプチドまたはタンパク質は、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびこれらの複数の組み合わせから選択される方法を用いて精製され、および／または、（ＩＶ）方法は、組換え融合タンパク質を、融合タンパク質の開裂に適したプロテアーゼと接触させて、別個の複数の分子としてアロクライトおよびＰｅＯＩまたはＰｒＯＩを生成する追加のステップ（ｅ）を備え、および／または、（Ｖ）方法は、（ＩＶ）に定義されている、ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩの精製がその後に続くことになるステップ（ｅ）を備える。
【００１８】
更なる他の複数の実施形態において、本願発明は、少なくとも１つのＰｅＯＩまたはＰｒＯＩが、ナイシン、ＨＣＲＦ、ＩＦＡＢＰ、ＩＦＮＡ２、ＭＢＰ、ペプチド１０１、ペプチド１０２、ペプチド１０３、ＭＡＢ−４０、Ｍａｂ−４２、Ｆｕｚｅｏｎ（登録商標）、サケカルシトニン、ヒトカルシトニン、ペプチド１、２３８、２３９、２４０または２４１から成る群から選択される方法に関する。
【００１９】
さらに、更なる複数の実施形態において、融合タンパク質を符号化する核酸分子は、融合タンパク質の発現を変調させる調節ヌクレオチド配列をさらに含む。
【００２０】
上記にて開示された複数の実施形態の全ての組み合わせも本願発明の範囲内に含まれることが意図されていることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】用いられるプラスミドコンストラクトのいくつかの模式図を示す。
【図２】ＨｌｙＡ１／ＨｌｙＡｃのＮ末端に融合させられたＩＦＡＢＰおよびＭＢＰ（およびそれらの示されている突然変異）の細胞可溶化物の不溶性および可溶性分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１５％）を示す（図２のＡ）。試料はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に載せられ、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染色された。図２のＢは、ＨｌｙＡ１および示されているＰｒＯＩまたはＰｅＯＩの融合タンパク質を発現する大腸菌の細胞可溶化物試料を示しており、ＰｒＯＩまたはＰｅＯＩは、ＨｌｙＡ１にＣ末端で融合させられ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析され、ＣＢＢ染色により可視化されている。図２のＣは、（プラスミドｐＱＥ−ＩＦＡＢＰ  ｗｔにより符号化された）ＩＦＡＢＰ  ｗｔ、または（ｐＩＡＲ＿２０７により符号化された）ＨｌｙＡ１−ＩＦＡＢＰ  ｗｔを生成している細胞の細胞破壊の後の可溶性および不溶性分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％）を描写している。ＨｌｙＡ１−ＩＦＡＢＰ  ｗｔの可溶性分解産物が示されている。図２のＤは、ＨｌｙＡ１に融合させられたペプチド２３８、２３９、２４０および２４１の発現を示し、ペプチド２４０および２４１の発現は、融合タンパク質ＨｌｙＡ１なしで失敗することを示している。
【図３】ＨｌｙＡ１がＥＤＴＡまたはＣａ２＋存在下で再び折り畳まれ、ＩＭＡＣおよびＳＥＣに適用された実験を示す。Ａ：Ｃａ２＋存在下で、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグをもつＨｌｙＡ１がＩＭＡＣに充填され（左列）、結合したタンパク質がイミダゾールの勾配により溶出させられた。Ｂ：ＩＭＡＣから溶出させられたＨｌｙＡ１のＳＥＣ解析（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００カラム。ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。ＣおよびＤ：ＥＤＴＡ存在下でＩＭＡＣおよびＳＥＣによりＨｌｙＡ１が解析された。
【図４】ＨｌｙＡ１−ナイシンがＣａ２＋またはＥＤＴＡ存在下で再び折り畳まれ、濃縮されＳＥＣに適用された実験を示す。Ａ：Ｃａ２＋存在下での再折り畳みの後のＨｌｙＡ１−ナイシンの不溶性（「ペレット」）および可溶性（「上清」）分画、およびＳＥＣ解析の溶出分画。Ｂ：ＥＤＴＡ存在下での再折り畳みの後のＨｌｙＡ１−ナイシンの不溶性（「ペレット」）および可溶性（「上清」）分画、およびＳＥＣ解析の溶出分画。Ｃ：ＡおよびＢのＳＥＣクロマトグラム。Ｄ：ＨｌｙＡ１−ナイシンが第Ｘａ因子（ＮＥＢ）により培養され、混合物の試料が様々な時点（左から右に０、２０、４０、６０、９０、１２０分）において取り出され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に載せられ、ＣＢＢにより染色された。Ｅ：基準であるナイシン（上の線）および本願発明に係る技術により生成されたナイシン（下の線）のＨＰＬＣクロマトグラム。Ｆ：ＨＰＬＣ溶出分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。左列：９０分後の第Ｘａ因子反応。他の列：ＨＰＬＣの溶出分画。矢印は、ナイシンおよびＨｌｙＡ１の位置を示す。
【図５】Ｃａ２＋およびＥＤＴＡ存在下でのＬｉｐＡ１−ナイシンの再折り畳み実験を示す。ＬｉｐＡ１−ナイシンが大腸菌におけるＩＢとして生成され、単離されたＩＢが、Ｃａ２＋またはＥＤＴＡ存在下で再び折り畳まれた。Ｃａ２＋存在下で、純粋かつ可溶性のＬｉｐＡ１−ナイシンが均質な状態で生成された。対照的に、ＬｉｐＡ１−ナイシンはＥＤＴＡ存在下で凝集した。ＡおよびＢ：ＳＥＣ溶出分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析、および、Ｃａ２＋により再び折り畳まれたＬｉｐＡ１−ナイシンの対応するＳＥＣクロマトグラム。ＣおよびＤ：ＥＤＴＡ存在下でＬｉｐＡ１−ナイシンが再び折り畳まれ、ＡおよびＢに説明されているように解析された。
【図６】ｐＩＡＲ＿２１５、ｐＩＡＲ＿２２０、ｐＩＡＲ＿２２１、ｐＩＡＲ＿２２２およびｐＩＡＲ＿２２３により符号化されたペプチドの発現解析、および、Ｃａ２＋およびＥＤＴＡ存在下で発現した（ｐＩＡＲ＿２２０、ｐＩＡＲ＿２２２およびｐＩＡＲ＿２２３により符号化された）ペプチドの再折り畳み実験を示す。示されているタンパク質は、大腸菌においてＩＢとして生成され、単離されたＩＢはＣａ２＋またはＥＤＴＡ存在下で再び折り畳まれた。Ａ：示されている試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。Ｂ〜Ｇ：再び折り畳まれた示されているタンパク質のＳＥＣ解析。
【図７】ＨＣＲＦの生成を示す。Ａ：プラスミドｐＩＡＲ＿２０２により符号化されたＨｌｙＡ１−ＨＣＲＦのＩＢが、Ｃａ２＋またはＥＤＴＡ存在下で再び折り畳まれた。Ｂ：Ｃａ２＋存在下で再び折り畳まれたＨｌｙＡ１−ＨＣＲＦが、１０分、４０分、および１２０分の間、第Ｘａ因子により培養された。矢印は、それぞれＨｌｙＡ１−ＨＣＲＦ、ＨｌｙＡ１およびＨＣＲＦの位置を示す。Ｃａ２＋またはＥＤＴＡを含む緩衝液内で再び折り畳まれたＨｌｙＡ１−ＨＣＲＦがＳＥＣ解析に適用され、溶出分画がＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析された。Ｃ：上記で言及されたＳＥＣ解析の溶出クロマトグラム。Ｄ：Ｃａ２＋存在下で再び折り畳まれたＨｌｙＡ１−ＨＣＲＦのＳＥＣ解析の後のＣＢＢ染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。Ｅ：ＥＤＴＡ存在下で再び折り畳まれたＨｌｙＡ１−ＨＣＲＦのＳＥＣ解析の後のＣＢＢ染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。矢印は、ＨｌｙＡ１−ＨＣＲＦの位置を示す。ＨｌｙＡ１−ＨＣＲＦは、Ｃａ２＋存在下で再び折り畳まれ、２時間の間、第Ｘａ因子により培養され、温浸混合物がＨＰＬＣにより精製された。Ｆ：ＨＰＬＣクロマトグラム。Ｇ：ＨＰＬＣ溶出分画のＣＢＢ染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。矢印は、ＨＣＲＦの位置を示す。
【図８】ＨｌｙＡ１−ＩＦＡＢＰの生成および機能性の研究を示す。再び折り畳まれたＨｌｙＡ１−ＩＦＡＢＰのＳＥＣ解析ＡおよびＣ：Ｃａ２＋により再び折り畳まれたＨｌｙＡ１−ＩＦＡＢＰのＳＥＣ解析からの溶出分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、およびＳＥＣの溶出クロマトグラムＢおよびＤ：ＥＤＴＡにより再び折り畳まれたＨｌｙＡ１−ＩＦＡＢＰのＳＥＣ解析からの溶出分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、およびＳＥＣの溶出クロマトグラムＥ：Ｃａ２＋またはＥＤＴＡ存在下で精製されたＨｌｙＡ１−ＩＦＡＢＰが、第Ｘａ因子により培養され、示されている時点で、タンパク質試料がＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析された。矢印は、ＩＦＡＢＰの位置を示す。ＦおよびＧ：ＤＡＵＤＡによる滴定実験を用いたＨｌｙＡ１−ＩＦＡＢＰの機能性の研究Ｆ：ＨｌｙＡ１−ＩＦＡＢＰが、Ｃａ２＋存在下で再び折り畳まれ、ＳＥＣにより精製された。ＤＡＵＤＡがＨｌｙＡ１−ＩＦＡＢＰに滴定され、５００ｎｍでの蛍光信号が記録され、ＤＡＵＤＡ濃度に対してプロットされている。黒色の列は、理論的合致度の曲線を表す。Ｇ：Ｆと同じ実験が、ＥＤＴＡ存在下で精製されたＨｌｙＡ１−ＩＦＡＢＰに関して繰り返された。
【図９】ＨｌｙＡ１−ＩＦＮＡ２の生成を示す。Ａ：０．５Ｍアルギニン存在下で再び折り畳まれたＨｌｙＡ１−ＩＦＮＡ２のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析分泌させられたＩＦＮＡ２−ＨｌｙＡ１が、ジスルフィド結合を含む酸化タンパク質に関する基準としての役割を担った（左列）。ＤＴＴの不在状態で、ＨｌｙＡ１−ＩＦＮＡ２は、基準と同じランニング高さ（ｒｕｎｎｉｎｇ  ｈｅｉｇｈｔ）で移動する。対照的に、ＤＴＴ存在下でＨｌｙＡ１−ＩＦＮＡ２はより遅く移動する。これらの結果は、再び折り畳まれたＨｌｙＡ１−ＩＦＮＡ２内でのジスルフィド結合の形成を示す。ＢおよびＣ：それぞれＣａ２＋およびＥＤＴＡ存在下で再び折り畳まれた後のＨｌｙＡ１−ＩＦＮＡ２のＳＥＣ解析Ｂ：Ｃａ２＋存在下での再折り畳みＣ：ＥＤＴＡ存在下での再折り畳み
【図１０】再び折り畳まれたＨｌｙＡ１−ＭＢＰおよびアミロース樹脂の結合実験を示す。ＨｌｙＡ１−ＭＢＰは大腸菌において発現させられ（列「細胞可溶化物」）およびＨｌｙＡ１−ＭＢＰのＩＢを調製し（列「変性ＨｌｙＡ１−ＭＢＰ」）、Ｃａ２＋存在下で変性させられ再び折り畳まれた。再折り畳み（列「沈殿」）の間にいくつかのＨｌｙＡ１−ＭＢＰが沈殿し、および可溶性ＨｌｙＡ１−ＭＢＰ（列「再折り畳み」）がアミロース樹脂に充填された。ＨｌｙＡ１−ＭＢＰはアミロースに結合し、「通過分画」内にはタンパク質が残らなかった。洗浄の後、ＨｌｙＡ１−ＭＢＰはマルトースにより溶出させられた（列「溶出」）。
【図１１】ペプチド１０１、１０２および１０３の生成を示す。Ａ：ペプチド１０１、１０２および１０３に融合させられたＨｌｙＡ１の発現。Ｂ〜Ｄ：ペプチド１０１、１０２および１０３に融合させられたＨｌｙＡ１の精製方式。対応する融合タンパク質を発現する細胞は破壊され、細胞可溶化物（列「細胞可溶化物」）が遠心分離させられた。可溶性分画には見える融合タンパク質はなく（列「可溶性分画」）、融合タンパク質がＩＢとして凝集した。ＩＢは変性させられ（列「変性ＩＢ」）、Ｃａ２＋存在下で再び折り畳まれた。融合タンパク質はＣａ２＋により効率的に再び折り畳まれ（「再び折り畳まれたペプチド１０Ｘ」）、およびタンパク質は沈殿しなかった（「ペレット」）。復元された融合タンパク質は第Ｘａ因子により培養され、ペプチド１０１、１０２、および１０３がＨｌｙＡ１から分離された（列「第Ｘａ因子」）。非特異的な開裂産物が全ての場合において生じた（列「＋第Ｘａ因子」を参照）。
【図１２】（プラスミドｐＩＡＲ＿１１２により符号化された）ＨｌｙＡ１−Ｒ２１０Ｄに融合させられたペプチド１０３による第Ｘａ因子消化実験を示す。再び折り畳まれたＩＢ（列「−」）が第Ｘａ因子により培養され（「＋」）、試料がＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析された。非特異的な開裂産物は生じなかった（図１１に示される結果と比較）。
【図１３】Ｆｕｚｅｏｎ（登録商標）の生成を示すＨｌｙＡ１−Ｆｕｚｅｏｎ（登録商標）がＣａ２＋（ａ）またはＥＤＴＡ（ｂ）存在下で再び折り畳まれ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １６／６０カラムに載せられた。矢印は、ＨｌｙＡ１−Ｆｕｚｅｏｎ（登録商標）の位置を示す。Ｃ：ＨｌｙＡ１−Ｆｕｚｅｏｎ（登録商標）がＣａ２＋存在下で再び折り畳まれ、１０分、４０分、および１２０分の間、第Ｘａ因子により培養された。矢印は、開裂産物ＨｌｙＡ１およびＦｕｚｅｏｎ（登録商標）の位置を示す。
【図１４】示されている期間の間、ＣＮＢｒにより変性させられ培養されたＨｌｙＡ１  Ｍ８８Ａ−Ｍｅｔ−ペプチド１０３のＩＢの実験を示す。試料はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析された。開裂産物ＨｌｙＡ１  Ｍ８８Ａ−Ｍｅｔがゲル上に見える。非特異的な開裂産物は得られなかった。ペプチド１０３は（おそらくその比較的小さい分子量に起因して）ＣＢＢにより染色されなかったので、それは、ＨＰＬＣにより精製され、質量分析により改めて配列決定された。そのような方法を用いて、ペプチド１０３が識別された。
【図１５】バッチ培養および発酵におけるＨｌｙＡ１  Ｍ８８Ａ−Ｍｅｔ−ペプチド３の発現解析を示す。プラスミドｐＩＡＲ＿１１５を含む大腸菌細胞がバッチ培養（左列）において、またはグルコース（中央の列）またはグリセロール（右列）を餌として用いた発酵によって培養された。グルコースおよびグリセリンを餌として用いた発酵により高い細胞密度（＞５０）が得られた。しかし、グルコースは用いられた条件下で融合タンパク質の発現を抑制するようである。グリセロール存在下で、対照的に、高い細胞密度および高い発現レベルが達成された。
【図１６】ＨｌｙＡ１に融合させられた異なるペプチドの分泌解析を示す。Ａ：ＨｌｙＡ１に融合させられたペプチド１０１、１０２および１０３の分泌解析。ＰｅＯＩは、ＨｌｙＡ１にＣ末端で融合させられ（プラスミドｐＩＡＲ＿１０１、ｐＩＡＲ＿１０２、およびｐＩＡＲ＿１０３）、ＨｌｙＢおよびＨｌｙＤ（ｐＫ１８４−ＨｌｙＢＤ）と同時発現した。細胞可溶化物および上清試料が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析された。Ｂ：ＨｌｙＡ１−Ｍａｂ４０の分泌解析。細胞はＨｌｙＡ１−Ｍａｂ４０を、およびａ＋で示されている場合には、ＨｌｙＢおよびＨｌｙＤを（プラスミドｐＫ１８４−ＨｌｙＢＤから）発現した。さらに、ＩＰＴＧおよび整流装置（異なる通気）の発現および分泌に対する影響を調査した。細胞増殖の後に、細胞可溶化物および上清試料がＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析された。ＨｌｙＡ１にＣ末端で融合させられた解析されたペプチドは、専用のＴ１ＳＳにより効率的に分泌された。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本明細書に用いられている用語は、その逆のことがはっきりと述べられていない限り、以下の意味をもつ。
【００２３】
本明細書で用いられる「少なくとも１つ」とは、１つまたは複数、特に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多くに関する。
【００２４】
分子に関して本明細書で入れ替え可能に用いられている「単離された」または「単離する」とは、その分子が、その分子と自然な状態で関連している他の分子から少なくとも部分的に分離されていることを意味する。「単離された」とは、分子が精製されて、それが、他のタンパク質および核酸、並びに宿主細胞から生じる細胞残屑など他の分子および成分から分離させられていることを意味し得る。
【００２５】
本明細書で用いられる「核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡなど全ての天然型の核酸を含む。好ましくは、核酸分子はＤＮＡである。本明細書で用いられる「核酸配列同一性」とは、任意の位置における残基が、基準である核酸の対応する位置におけるものと同一であることを意味する。本願発明の好ましい核酸配列同一性は８０％であり、より好ましくは９０％であり、または、さらにより好ましくは９５％である。
【００２６】
核酸分子に関連して本明細書で用いられる「断片」という用語は、１つまたは複数の３'または５'末端ヌクレオチドだけ短縮されたその基準である核酸配列と比較される核酸配列に関する。短縮は、基準である配列の連続するヌクレオチド鎖が残るよう３'末端、５'末端、またはそれら両方で起こる。断片は好ましくは、少なくとも２０、より好ましくは少なくとも５０個のヌクレオチドの長さを有する。
【００２７】
「ペプチド」という用語は、本明細書を通して、ペプチド結合により互いに結合されたアミノ酸残基のポリマーを指すのに用いられる。本願発明に係るペプチドは、２〜１００のアミノ酸残基を有する。
【００２８】
「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書を通じて入れ替え可能に、ペプチド結合により互いに結合されたアミノ酸残基のポリマーを指すのに用いられる。本願発明に係るタンパク質またはポリペプチドは、好ましくは、１００またはそれより多くのアミノ酸残基を有する。
【００２９】
本明細書で用いられる「関心対象のタンパク質」、「ＰｒＯＩ」、または「関心対象のペプチド」、「ＰｅＯＩ」という用語は、組換え発現を介して発現する任意の遺伝子産物に関する。本明細書に開示されている「関心対象のペプチドまたはタンパク質」という用語は、任意の天然型または非天然型のペプチドまたはタンパク質を網羅する。いくつかの実施形態において、ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩは、非天然型／合成ペプチドまたはタンパク質である。これに関連する合成とは、ペプチドまたはタンパク質の配列が人工的に設計されていることを意味する。したがって、ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩに関する配列符号化は、１、２またはそれより多く天然型ペプチドまたはタンパク質に関する核酸配列符号化を含み得る。これらの天然型ペプチドまたはタンパク質はさらに、例えば、符号化配列の突然変異誘発により修飾されていてもよい。
【００３０】
「Ｎ末端断片」という用語は、ペプチドまたはタンパク質のＮ末端から始まる連続するするアミノ酸ポリマーが残るよう、基準であるペプチドまたはタンパク質配列と比較してＣ末端で切断されたペプチドまたはタンパク質配列に関する。いくつかの実施形態において、そのような断片は、少なくとも１０個のアミノ酸の長さを有し得る。
【００３１】
「Ｃ末端断片」という用語は、ペプチドまたはタンパク質のＣ末端から始まる連続するアミノ酸ポリマーが残るよう、基準であるペプチドまたはタンパク質配列と比較してＮ末端で切断されたペプチドまたはタンパク質配列に関する。いくつかの実施形態において、そのような断片は、少なくとも１０個のアミノ酸の長さを有し得る。
【００３２】
本明細書で用いられる「融合タンパク質」という用語は、ＮまたはＣ末端で互いに結合されたペプチドおよびタンパク質に関する。そのような融合タンパク質は、操作可能に互いに融合させられた核酸配列により符号化され得る。特定の複数の実施形態において、融合タンパク質とは、本願発明に従って、ポリペプチド鎖、例えば、ＨｌｙＡまたはその断片またはその相同体を含むポリペプチド鎖にＣ末端で融合させられた少なくとも１つのＰｅＯＩまたはＰｒＯＩを指す。
【００３３】
概して、当業者は、本願発明を実施するために、本明細書に説明されている任意のヌクレオチド配列が、追加の開始および／または終止コドンを備え得る、または備えなければならないことを、または、本明細書に説明されている配列のいずれかの開始および／または終止コドンが、用いられる核酸コンストラクトに応じて削除され得る、または削除されなければならないことを理解する。当業者は、この決定を、例えば、本願発明の核酸分子に含まれる核酸配列が翻訳されることになるのか、および／または融合タンパク質として翻訳されることになるのかに基づいて行うであろう。
【００３４】
核酸分子に関して本明細書で用いられる「導入」という用語は、宿主細胞への外来ＤＮＡの取り込みおよび組み込みを指す。核酸分子のそのような取り込みは、宿主細胞の自然な形質転換受容性に、または当技術分野で周知の電気穿孔または塩化カルシウム変換などの遺伝子導入法に依存し得る。
【００３５】
本明細書で用いられる「宿主細胞」という用語は、核酸分子を内部に持つ生物、または組換えＰｅＯＩまたはＰｒＯＩを符号化するベクターに関する。好ましい複数の実施形態において、宿主細胞は原核細胞である。より好ましい複数の実施形態において、宿主細胞は、ＢＬ２１、ＤＨ１、ＤＨ５α、ＤＭ１、ＨＢ１０１、ＪＭ１０１−１１０、Ｋ１２、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＳＵＲＥ、ＴＯＰ１０、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、およびＸＬ１０−Ｂｌｕｅ系を含み得るがこれらに限定されない大腸菌である。
【００３６】
本明細書で入れ替え可能に用いられている「発現」または「発現した」という用語は、遺伝子からの情報が遺伝子産物の合成のために用いられるプロセスに関する。細胞ベースの発現系において、発現は、転写および翻訳ステップを含む。
【００３７】
本明細書で用いられる「組換え発現」という用語は、宿主生物における外来遺伝子の転写および翻訳に関する。外来ＤＮＡとは、当該生物の外部から生じる任意のデオキシリボ核酸を指す。タンパク質に関して本明細書で用いられる「異種」という用語は、外来ＤＮＡから発現するタンパク質を指す。これは、内在性核酸配列と同一である核酸配列から発現する、および人工的に複製されたタンパク質も含む。
【００３８】
組換えペプチドまたはタンパク質に関して本明細書で用いられる「生成」という用語は、組換えペプチドまたはタンパク質が宿主細胞において発現し、続いて、宿主細胞の他の分子から単離されることを指す。
【００３９】
本明細書で用いられる「培養する（ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ）」、「培養する」または「培養」は、管理された条件下で特別に用意された培地における宿主細胞の増殖に関する。「組換え発現に適した条件」または「発現を可能とする条件」という用語は、当技術分野で公知の方法を用いて宿主細胞におけるＰｒＯＩの生成を可能とする条件に関連し、ここで細胞は、規定の培地および温度条件下で培養される。培地は、栄養、最小、選択、分別、または強化培地であり得る。好ましくは、培地は最小培地である。宿主細胞の増殖および発現温度は、４℃から４５℃の範囲であり得る。好ましくは、増殖および発現温度は、３０℃から３９℃の範囲である。本明細書で用いられる「発現培地」という用語は、それらがタンパク質の発現の間に宿主細胞の培養のために用いられるときの上記培地のいずれかに関する。
【００４０】
本明細書で用いられる「晒す」という用語は、様々な成分、例えば、タンパク質および緩衝液が接触させられることを意味する。
【００４１】
本明細書で入れ替え可能に用いられている「封入体」または「ＩＢ」という用語は、物質、例えば、タンパク質の核または細胞質内集蔟体に関する。ＩＢは、未溶解であり、非単位（ｎｏｎ−ｕｎｉｔ）脂質膜を有する。本願発明の方法において、ＩＢは主に、少なくとも１つのＰｅＯＩまたはＰｒＯＩと、Ｔ１ＳＳの少なくとも１つのアロクライトまたはその断片とを含む融合タンパク質から成る。
【００４２】
本明細書で入れ替え可能に用いられている「基質」または「アロクライト」という用語は、Ｔ１ＳＳのカーゴであり得る溶質に関する。基質またはアロクライトは、ＧＧ反復配列および分泌信号などＴ１ＳＳを介した輸送を可能とする特定のペプチド配列輸送性を有するタンパク質である。
【００４３】
本明細書で入れ替え可能に用いられている「タイプ１分泌系」または「Ｔ１ＳＳ」という用語は、３つのタンパク質サブユニット、ＡＢＣトランスポータータンパク質、ＭＦＰ、およびＯＭＰから成るタンパク質複合体に関する。ＡＢＣトランスポーターは、複数の膜に亘る様々な基質の転座を含む特定の生物学的プロセスを実行するのにアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）加水分解のエネルギーを利用する膜貫通タンパク質である。ＭＦＰファミリーのタンパク質は、グラム陰性菌の細胞膜における主要なポーターを、外膜においてポリンまたはチャネル機能を果たす外膜因子タンパク質と繋ぐ補助タンパク質または「アダプター」として機能する。したがって、三連のタンパク質複合体は、イオン、薬剤およびタンパク質などの様々な分子がグラム陰性菌の内膜および外膜を通過する輸送を可能とする。Ｔ１ＳＳ基質のサブグループは、ＲＴＸ（毒素における反復配列）毒素である。
【００４４】
タンパク質に関して本明細書で用いられる「機能的立体配座」という用語は、当該タンパク質が、その天然立体配座において同じタンパク質の活性の少なくとも５％、１０％、２０％、４０％または５０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは１００％である他のタンパク質との基質触媒作用、タンパク質特定の局在化または相互作用など特定の活性を有することを可能とする当該タンパク質の構造を指す。機能的立体配座は通常、タンパク質が可溶性であることを要する。タンパク質の天然立体配座は、有効であり機能性であるその適切に折り畳まれた、および／または組み立てられた形態である。生体分子の天然状態は、二次から四次構造が共有結合したバックボーンに沿った弱い相互作用から形成された、４つの全てのレベルの生体分子構造を有し得る。これは、これらの弱い相互作用が妨害され、これらの形態の構造の喪失に繋がり、生体分子の一次構造のみを保持している変性状態と対照的である。
【００４５】
本明細書で用いられる「阻害」という用語は、エフェクター分子により引き起こされるタンパク質活性または遺伝子発現活性の検出可能である著しい低下に関する。タンパク質活性または遺伝子発現を検出する方法は当技術分野で公知である。
【００４６】
本願発明は、関心対象の組換えペプチドおよびタンパク質の効率的な生成のための、タイプ１分泌系の基質／アロクライトまたはその断片の核酸配列を備える方法に関する。アロクライトまたはその断片は、封入体（ＩＢ）として関心対象のペプチドおよびタンパク質の発現を向上させ、ＩＢ−タグとして機能する。重要なことに、アロクライトおよびその断片は、封入体の、機能的立体配座への効率的な復元を可能とする。したがって、アロクライトおよびその断片は、対応する不利益なしで、複数のＩＢ−タグおよび可溶性タグの利点を兼ね備える。
【００４７】
Ｈｌｙ分泌系は、大抵はグラム陰性菌において起こるタンパク質分泌系である。この分泌系は、周辺質において中間的に留まることなく細胞基質から細胞外空間へ単一のステップでＡＴＰ駆動されたやり方でそれらの基質を輸送するＴ１ＳＳファミリーに属する。Ｈｌｙ分泌系は、ＡＢＣトランスポーターを表すＨｌｙＢと、ＭＦＰ  ＨｌｙＤと、一般的なＯＭＰ  ＴｏｌＣとを含む。〜１１０ｋＤａ溶血性毒素ＨｌｙＡは、Ｈｌｙ分泌系の輸送基質である。遺伝子レベルでは、ＨｌｙＡ特定の分泌に必要な成分は、オペロン構造で組織化されている。ＨｌｙＣのための核酸配列符号化は、このオペロンの一部を形成するが、Ｈｌｙ分泌系を通じたＨｌｙＡ分泌には必要ではない。ＨｌｙＣは、ＨｌｙＡを溶血性にするＨｌｙＡのアシル化に触媒作用を及ぼす。ＨｌｙＡは、１０２４個のアミノ酸残基から成るタンパク質であり、Ｈｌｙ分泌系を介したその排出のために、分泌信号と呼ばれる約４０〜６０個のアミノ酸を含むそのＣ末端を必要とする。さらに、ＨｌｙＡは、いくつかのグリシンが豊富な（ＧＧ）反復配列（ＧＧＸＧＸＤＸＵＸ。ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり得、Ｕは、分泌信号のＮ末端に位置する疎水性の大きなアミノ酸である。）を含む領域により特徴づけられる。ＧＧ反復配列は、毒素（ＲＴＸ）ファミリーにおける反復配列の特性である。ＧＧ反復配列は、それらの折り畳みを誘発するＣａ２＋を結合する。したがって、Ｃａ２＋の不在状態で、ＧＧ反復配列を含む領域は構造化されない。１つのＨｌｙＡタンパク質のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に明記されているヌクレオチド配列により符号化されるものとして明記されている。野生型ＨｌｙＡと比較し高められたレベルで発現させられ、ＨｌｙＡ（図１）のＮ末端部分を欠くＨｌｙＡの断片は、ＨｌｙＡ１と名前が付けられた。ＨｌｙＡ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に明記されており、他方、符号化するヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に明記されている。
【００４８】
本願発明は、Ｔ１ＳＳの少なくとも１つのアロクライトまたはその断片に融合させられたＰｅＯＩまたはＰｒＯＩが、非抱合型ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩ単体が可溶性の形態で発現した場合であってもＩＢの形態の融合タンパク質の発現に繋がるという本発明者らの驚くべき発見に基づいている。さらに、Ｃａ２＋が、アロクライトおよびＰｅＯＩまたはＰｒＯＩから成る融合タンパク質の変性ＩＢの、可溶性および機能的立体配座への折り畳みを誘発することが本発明者らによって発見された。したがって、アロクライトまたはその断片は、対応する不利益（封入体タグ：凝集した非活性の産物。可溶性タグ：かなり低い収率、低い純度、タンパク質分解し易い）なしで、ＩＢ−タグ（高い収率、高い初期純度、タンパク質分解に対する免疫性）および可溶性タグ（可溶性かつ生理活性の産物）の利点を兼ね備える二機能性のタグである。
【００４９】
したがって、第１態様において、本願発明は組換えＰｅＯＩまたはＰｒＯＩを生成するための方法に関し、方法は、（ａ）少なくとも１つのＰｅＯＩまたはＰｒＯＩを含む融合タンパク質を符号化する核酸分子と、Ｔ１ＳＳの少なくとも１つのアロクライトまたはその断片とを宿主細胞に導入する段階と、（ｂ）融合タンパク質の発現を可能とする条件下で宿主細胞を培養する段階であり、融合タンパク質は、ＩＢの形態で発現する段階と、（ｃ）組換え融合タンパク質を宿主細胞から単離する段階とを備える。更なる複数の実施形態は、（ｄ）ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩが機能的立体配座へと折り畳まれることを可能とする条件に組換え融合タンパク質を晒すステップを備え得る。第１態様の様々な他の実施形態において、宿主細胞は、Ｔ１ＳＳの異種ＡＢＣトランスポーター、異種ＭＦＰ、および／または異種ＯＭＰを発現しない。
【００５０】
様々な実施形態において、本願発明の本態様は、Ｌｉｎｈａｒｔｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｌｉｎｈａｒｔｏｖａ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ３４，１０７６−１１１２，ＦＭＲ２３１［ｐｉｉ］１０．１１１１／ｊ．１５７４−６９７６．２０１０．００２３１．ｘ）に説明されているようなＨｌｙＡ、ＣｙａＡ、ＥｈｘＡ、ＬｋｔＡ、ＰｌＬｋｔＡ、ＰａｓＡ、ＰｖｘＡ、ＭｍｘＡ、ＬｔｘＡ、ＡｐｘＩＡ、ＡｐｘＩＩＡ、ＡｐｘＩＩＩＡ、ＡｐｘＩＶＡ、ＡｐｘＩ、ＡｐｘＩＩ、ＡｑｘＡ、ＶｃＲｔｘＡ、ＶｖＲｔｘＡ、ＭｂｘＡ、ＲＴＸ細胞毒素、ＲｔｘＬ１、ＲｔｘＬ２、ＦｒｈＡ、ＬｉｐＡ、ＴｌｉＡ、ＰｒｔＡ、ＰｒｔＳＭ、ＰｒｔＧ、ＰｒｔＢ、ＰｒｔＣ、ＡｐｒＡ、ＡｐｒＸ、ＺａｐＡ、ＺａｐＥ、Ｓａｐ、ＨａｓＡ、コリシンＶ、ＬａｐＡ、ＯＲＦ、ＲｚｃＡ、ＲｔｘＡ、ＸＦ２４０７、ＸＦ２７５９、ＲｚｃＡ、ＲｓａＡ、Ｃｒｓ、ＣｓｘＡ、ＣｓｘＢ、ＳｌａＡ、ＳｗｍＡ、Ｓｌｌ１９５１、ＮｏｄＯ、ＰｌｙＡ、ＰｌｙＢ、ＦｒｐＡ、ＦｒｐＣ、ＦｒｐＣ様または他のＴ１ＳＳアロクライトから成る群から選択されるＴ１ＳＳのアロクライト、およびその断片も含む。様々な好ましい実施形態において、アロクライトは、共通配列ＧＧｘＧｘＤｘＵｘ（ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり得、Ｕは、疎水性の、大きなアミノ酸である。）の少なくとも１つのＧＧ反復配列の存在により特徴づけられる。より好ましい複数の実施形態において、Ｔ１ＳＳのアロクライトは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に明記されているアミノ酸配列、その断片、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド、またはその断片を含む、またはこれらから成るＨｌｙＡである。他の様々な実施形態において、ＨｌｙＡの断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に明記されているアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドから成る。
【００５１】
様々な実施形態において、本願発明の本態様は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１〜４の上記された配列の相同体も含む。本明細書で用いられる「相同性」または「相同体」という用語は、他のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列またはその一部とかなり同様の配列、または高い配列同一性（例えば、７０％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、またはそれより高い）を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を指す。したがって、上記の核酸分子に関して、相同体という用語は、上記で定義されている第１の核酸配列のヌクレオチド配列と少なくとも７０、好ましくは８０、より好ましくは９０、さらにより好ましくは９５、９７．５、または９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。配列同一性は、ヌクレオチドの連続した区間に亘り起こり得、または非連続的であり得る。
【００５２】
本願発明の第１態様の様々な実施形態において、Ｔ１ＳＳのアロクライトは、ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩのＣ末端に融合させられ得る。第１態様の他の様々な実施形態において、アロクライトは、ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩのＮ末端に融合させられ得る。
【００５３】
一実施形態において、発現培地は２０．０ｍＭまたはそれより少量のＣａ２＋を含む。より好ましい実施形態において、発現培地におけるＣａ２＋濃度は、０．１ｍＭまたはそれより低い。
【００５４】
様々な実施形態において、Ｔ１ＳＳの内在性ＡＢＣトランスポーター遺伝子、内在性ＭＦＰ遺伝子、および／または内在性ＯＭＰ遺伝子の発現、または宿主細胞における対応する遺伝子産物の活性は阻害される。様々な実施形態において、宿主細胞は、Ｔ１ＳＳの内在性ＡＢＣトランスポーター、内在性ＭＦＰ、および／または内在性ＯＭＰを発現しない。遺伝子の発現を阻害する、それらの削除、またはプロモータ配列または遺伝子自体の完全性を破壊するヌクレオチド配列の挿入などの方法が当技術分野で公知である。削除または破壊の後の好ましい遺伝子発現活性は、未処理の細胞において測定される活性の３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％より低くてもよい。本願発明の他の様々な実施形態において、タイプ１分泌系の内在性ＡＢＣトランスポーター、内在性ＭＦＰ、および／または内在性ＯＭＰは、抗体または小分子阻害物質により阻害される。本願発明の好ましい複数の実施形態において、ＡＢＣトランスポーター活性は、オルトバナジウム酸または８−アジド−ＡＴＰなどのＡＴＰ相同性阻害物質により阻害される。そのようなＡＴＰミメティックは当技術分野で公知である。阻害物質処理の後の好ましいタンパク質活性は、未処理の細胞で測定される活性の３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％より低くてもよい。本願発明の他の複数の実施形態において、輸送は、アロクライト自体、例えば、アロクライトを過剰発現させることにより、または融合ペプチドおよびタンパク質の付着により阻害またはブロックされる。
【００５５】
他の複数の実施形態において、組換えペプチドまたはタンパク質は、再折り畳み緩衝液に曝され、ここで再折り畳み緩衝液は、少なくとも０．０１、より好ましくは０．０１〜４０ｍＭのＣａ２＋を含む。
【００５６】
本願発明の方法の様々な実施形態において、（Ｉ）宿主細胞は原核細胞であり、および／または、（ＩＩ）発現は、最小培地で行われ、および／または、（ＩＩＩ）組換え融合ペプチドまたはタンパク質は、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびこれらの複数の組み合わせから選択される方法を用いて精製され、および／または、（ＩＶ）方法は、組換え融合タンパク質を、融合タンパク質の開裂に適したプロテアーゼと接触させて、別個の複数の分子としてアロクライトおよびＰｅＯＩまたはＰｒＯＩを生成する追加のステップ（ｅ）を備え、および／または、（Ｖ）方法は、（ＩＶ）に定義されている、ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩの精製がその後に続くことになるステップ（ｅ）を備える。
【００５７】
さらに他の実施形態において、本願発明は、少なくとも１つのＰｅＯＩまたはＰｒＯＩが、ナイシン、ＨＣＲＦ、ＩＦＡＢＰ、ＩＦＮＡ２、ＭＢＰ、ペプチド１０１、ペプチド１０２、ペプチド１０３、ＭＡＢ−４０、Ｍａｂ−４２、Ｆｕｚｅｏｎ（登録商標）、サケカルシトニン、ヒトカルシトニン、阻害物質ペプチド１、２３８、２３９、２４０または２４１から成る群から選択される方法にも関し得る。
【００５８】
様々な実施形態において、融合タンパク質を符号化する核酸分子は、融合タンパク質の発現を変調させる調節ヌクレオチド配列をさらに含む。好ましい調節核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９に明記されている。本明細書で用いられる「調節ヌクレオチド配列」という用語は、遺伝子の５'に位置し、当該遺伝子の発現活性を高める核酸配列に関する。
【００５９】
本明細書で用いられる「親和性タグ」という用語は、ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩに結合され、親和性タグリセプタを用いてタグ付けされたＰｅＯＩまたはＰｒＯＩの濃縮を可能とする実体に関する。本明細書で用いられる「親和性クロマトグラフィー」という用語は、タグ付けされたペプチドまたはタンパク質およびリセプタの複合体形成に関する。特定の複数の実施形態において、親和性タグは、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）またはＳｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）ＩＩ、ｍｙｃ−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、Ｈｉｓ−タグ、低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）タグ、共有結合性であるが分離可能なＮｏｒｐＤペプチド（ＣＹＤ）タグ、タンパク質Ｃ重鎖（ＨＰＣ）タグ、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）タグ、またはＨＡタグ、若しくは、ストレプトアビジン結合タンパク質（ＳＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、およびグルタチオン−Ｓ−転移酵素などのタンパク質から成る群から選択され得る。
【００６０】
「プロテアーゼ開裂部位」という用語は、選択されたプロテアーゼに開裂され得、したがって、プロテアーゼ開裂部位により相互結合されたペプチドまたはタンパク質配列の分離を可能とするペプチド配列を指す。特定の複数の実施形態において、プロテアーゼ開裂部位は、第Ｘａ因子、タバコエッジウイルス（ｔｏｂａｃｃｏ  ｅｄｇｅ  ｖｉｒｕｓ。ＴＥＶ）プロテアーゼ、エンテロキナーゼ、ＳＵＭＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓプロテアーゼ、ＩｇＡ−プロテアーゼ、Ａｒｇ−Ｃプロテイナーゼ、Ａｓｐ−Ｎエンドペプチダーゼ、Ａｓｐ−Ｎエンドペプチダーゼ＋Ｎ末端グル、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、キモトリプシン高特異性、キモトリプシン低特異性、クロストリパイン（クロストリジオペプチダーゼＢ）、グルタミルエンドペプチダーゼ、グランザイムＢ、ペプシン、プロリンエンドペプチダーゼ、プロテイナーゼＫ、ブドウ球菌ペプチダーゼＩ、トロンビン、トリプシン、およびサーモリシン開裂部位から成る群から選択される。
【００６１】
化学的開裂という用語は、化合物により引き起こされる、ペプチド結合の開裂を指す。そのような化合物は、メチオニン残基へのＣ末端を開裂する臭化シアン（ＣＮＢｒ）、トリプトファン残基へのＣ末端を開裂するＢＮＰＳスカトール、ＮＣＳまたはＴＦＡ、および、テトラペプチドＳ／ＴＸＨＺ（ＸおよびＺは、任意のアミノ酸残基であり得るが、Ｘ＝プロリンであることを除く）へのＣ末端を開裂するＮｉ２＋イオンを含み得るが、これらに限定されない（Ｋｏｐｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２），Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ  ７（５））。
【００６２】
本願発明の文脈で用いられる「融合させられ」とは、結果として得られるペプチドまたはタンパク質が直接的に、１つまたは複数のアミノ酸、ペプチド、またはタンパク質、例えば、１つまたは複数のプロテアーゼ開裂部位および／または親和性タグにより互いに結合され、または互いに連結されていることを意味する。
【００６３】
ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩが２またはそれより多くの天然型ペプチドまたはタンパク質を含む場合、それら２つまたはそれより多くのペプチドまたはタンパク質は、プロテアーゼ開裂部位により分離され得る。
【００６４】
概して、任意のペプチドまたはタンパク質が、ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩとして選択され得る。特定の複数の実施形態において、ＰｒＯＩは、ホモ二量体またはホモ多量体を形成しないタンパク質である。より大きなタンパク質複合体の形成は効率的なタンパク質の排出を阻み得るので、自己相互作用するペプチドまたはタンパク質を避けることは、組換えペプチドまたはタンパク質が細胞培養上清内へと分泌される場合に有利であり得る。しかし、ＰｒＯＩは、より大きなペプチドまたはタンパク質複合体のサブユニットであるペプチドまたはタンパク質であってもよい。そのようなペプチドまたはタンパク質は、発現、およびオプションで分泌の後に単離され得、マルチペプチドまたはタンパク質複合体のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの再構築に適し得る。特定の複数の実施形態において、ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩは、１００個より少ないアミノ酸残基を有するペプチドである。これらのペプチドがそれらの天然状態において、翻訳の後にプレおよび／またはプロ配列を含む場合、ＰｅＯＩのための核酸配列符号化は、成熟ペプチドを符号化する配列に限定されるように操作され得る。１つの例示的なペプチドはインスリン、例えば、ヒトインスリンである。過剰発現したペプチドおよびタンパク質の分泌は、ペプチドまたはタンパク質が宿主細胞にとって有害であるときに特に有利である。このことが理由となり、本願発明は、宿主細胞にとって毒性があると知られているリパーゼおよびプロテアーゼの発現に関して特に有利であり、したがって、本願発明に係るシステムおよび方法によるこれらのタンパク質の発現は、本願発明の特定の実施形態を表す。
【００６５】
様々な実施形態において、ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩは酵素である。
【００６６】
Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙは、酵素に関する学名、ＥＣ番号を開発した。各酵素は、「ＥＣ」が頭に付けられた４つの番号の配列により説明される。最初の番号は、そのメカニズムに基づいて酵素を広く分類する。
【００６７】
学名の全体は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｑｍｕｌ．ａｃ．ｕｋ／ｉｕｂｍｂ／ｅｎｚｙｍｅ／で閲覧することが出来る。
【００６８】
したがって、本願発明に係るＰｅＯＩまたはＰｒＯＩは、クラスＥＣ１（酸化還元酵素）、ＥＣ２（転移酵素）、ＥＣ３（加水分解酵素）、ＥＣ４（リアーゼ）、ＥＣ５（イソメラーゼ）、およびＥＣ６（連結酵素）、並びにこれらのサブクラスのいずれかから選択され得る。
【００６９】
特定の複数の実施形態において、ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩは、補助因子依存であり得、補欠分子族を内部に持つ。そのようなペプチドまたはタンパク質の発現のために、いくつかの実施形態において、対応する補助因子、または補欠分子族が、発現の間に培地に加えられ得る。
【００７０】
特定の場合において、ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩは脱水素酵素または酸化酵素である。
【００７１】
ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩが脱水素酵素である場合、いくつかの実施形態において、ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩは、アルコール脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、セロビオース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、およびアルデヒド脱水素酵素から成る群から選択される。
【００７２】
ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩが酸化酵素である場合、いくつかの実施形態において、ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩは、シトクロムＰ４５０酸化還元酵素、特にＰ４５０  ＢＭ３およびその変種、過酸化酵素、モノキシゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ、モノアミン酸化酵素、アルデヒド酸化酵素、キサンチン酸化酵素、アミノ酸酸化酵素およびＮＡＤＨ酸化酵素から成る群から選択される。
【００７３】
更なる複数の実施形態において、ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩは、アミノ基転移酵素またはキナーゼである。
【００７４】
ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩがアミノ基転移酵素である場合、いくつかの実施形態において、ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩは、アラニンアミノ基転移酵素、アスパラギン酸アミノ基転移酵素、グルタミン酸オキサロ酢酸アミノ基転移酵素、ヒスチジノール−リン酸アミノ基転移酵素、およびヒスチジノールピルビン酸アミノ基転移酵素から成る群から選択である。
【００７５】
様々な実施形態において、ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩがキナーゼである場合、ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩは、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、ヌクレオシド一リン酸キナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、およびグルコキナーゼから成る群から選択である。
【００７６】
いくつかの実施形態において、ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩが加水分解酵素である場合、ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩは、リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ニトリル加水分解酵素、ハロゲナーゼ、ホスホリパーゼ、およびエステラーゼから成る群から選択される。
【００７７】
特定の複数の実施形態において、ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩがリアーゼである場合、ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩは、アルドラーゼ、例えば、ヒドロキシニトリルリアーゼ、チアミン依存酵素、例えば、ベンズアルデヒドリアーゼ、およびピルビン酸デカルボキシラーゼから成る群から選択される。
【００７８】
様々な実施形態において、ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩがイソメラーゼである場合、ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩは、イソメラーゼおよびムターゼから成る群から選択される。
【００７９】
いくつかの実施形態において、ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩが連結酵素である場合、ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩはＤＮＡ連結酵素であり得る。
【００８０】
特定の複数の実施形態において、ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩは抗体であり得る。これは、完全な免疫グロブリンまたはその断片を含み得、それら免疫グロブリンは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇＧ３、ＩｇＭなどの様々なクラスおよびアイソタイプを含む。その断片は、Ｆａｂ、Ｆｖ、およびＦ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'などを含み得る。
【００８１】
また、本明細書においては治療的に活性なＰｅＯＩおよびＰｒＯＩ、例えば、サイトカインも考慮されている。
【００８２】
したがって、特定の複数の実施形態において、ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩは、サイトカイン、特に、ヒトまたはマウスインターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、壊死因子、例えば、腫瘍壊死因子、および増殖因子から成る群から選択される。
【００８３】
いくつかの実施形態において、ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩがインターフェロンである場合、ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩは、インターフェロンアルファ、例えば、アルファ−１、アルファ−２、アルファ−２ａ、およびアルファ−２ｂ、アルファ−２、アルファ−８、アルファ−１６、アルファ−２１、ベータ、例えば、ベータ−１、ベータ−１ａ、およびベータ−１ｂ、又はガンマから成る群から選択され得る。
【００８４】
更なる複数の実施形態において、ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩは、抗菌性ペプチド、特に、バクテリオシンおよびランチビオティクス、例えば、ナイシン、カテリシジン、デフェンシン、およびサポシンから成る群から選択されるペプチドである。
【００８５】
更なる複数の実施形態において、ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩは、例えば、鋼、アルミニウムおよびその他の金属に対して明確な表面特異性、炭素、セラミック、鉱物、プラスチック、木材や他の材料または細胞のような他の生物材料などの他の表面に対して特異性を有する接着性ペプチド、または、水環境において、および嫌気性菌条件下で機能する接着性ペプチドである。
【００８６】
更なる複数の実施形態において、ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩは、２〜１００個の範囲のアミノ酸の長さを有し、当該アミノ酸は、２０のタンパク質構成アミノ酸から成る群から選択される。より好ましくは、当該ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩは、ＤＹＫＤＤＤＤＫＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧＨＨＨＨＨＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）、ＭＧＳＳＡＡＡＡＡＡＡＡＳＧＰＧＧＹＧＰＥＮＱＧＰＳＧＰＧＧＹＧＰＧＧＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、ＥＮＲＥＶＰＰＧＦＴＡＬＩＫＴＬＲＫＣＫＩＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）、ＮＬＶＳＧＬＩＥＡＲＫＹＬＥＷＬＨＲＫＬＫＮＣＫＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）、ＨＨＨＨＨＨＩＥＧＲＡＭＳＩＬＫＳＰＩＤＥＲＳＩＬＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）、ＨＨＨＨＨＨＩＥＧＲＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）、ＨＨＨＨＨＨＩＥＧＲＧＡＰＧＡＰＧＳＱＧＡＰＧＬＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）、ＧＧＧＲＧＤＭＧＳＳＡＡＡＡＡＡＡＡＳＧＰＧＧＹＧＰＥＮＱＧＰＳＧＰＧＧＹＧＰＧＧＰＲＧＤＧＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２）から成るペプチドまたはタンパク質の群から選択される。
【００８７】
また、本明細書に開示されているのは、治療的に活性なペプチドまたはタンパク質であるＰｅＯＩまたはＰｒＯＩである。特定の複数の実施形態において、ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩは治療的に活性なペプチドである。いくつかの実施形態において、治療的に活性なペプチドは、Ｆｕｚｅｏｎ／Ｔ２０、ヒトカルシトニン、サケカルシトニン、ヒトの副腎皮質刺激ホルモン放出因子、Ｍａｂ４０、Ｍａｂ４２、アルツハイマー病に関連するペプチド、エクセナチド、グラチラマー／コパクソン、テリパラチド／ｆｏｒｓｔｅｏ、ロミプロスチム／ｎｐｌａｔｅ、ｐｒａｍｌｉｎｔｉｔｄｅ／シムリン、チマルファシン／ザダキシン、エンフビルチド、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド、ネシリチド／ナトレコル、コルチコリベリン、セルモレリン、ソマトレリン、セクレチン（ヒトおよびブタ）、テルリプレシン、シナプルチド、テデュグルチド、ｖｘ−００１、血管作用性腸ペプチド、アビプダジル、リナクロチドおよびテデュグルチドから成る群から選択され得る。
【００８８】
特定の複数の実施形態において、ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩはタイプＩ分泌基質である。１０００より多くのタンパク質が、文献においてタイプＩ分泌基質として注釈をつけられ、または説明されている。それらの多く、特にプロテアーゼおよびリパーゼのような加水分解酵素は、生物工学的な使用に関して興味深い特性を有している。適したプロテアーゼおよびリパーゼは、Ｂａｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ  １２，３３５７−３３６４およびＭｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．：２８２（４３），ｐｐ．３１４７７−３１４８３により説明されている。これらの文書のそれぞれの内容は、その全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【００８９】
当然、少なくとも１つのＰｅＯＩまたはＰｒＯＩに関する核酸配列符号化は突然変異誘発を受け得、したがって、タンパク質レベルで変異したＰｅＯＩまたはＰｒＯＩへと繋がり得る。
【００９０】
本明細書で用いられる「突然変異」という用語は、任意のヌクレオチド配列またはタンパク質のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列における変化に関連し、置換、削除、短縮化、および挿入を含む。１つの具体的な例において、突然変異は、点変異、すなわち、任意の配列における、１つまたは複数のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸の置換である。タンパク質配列に関して「突然変異」という用語が用いられた場合、タンパク質を符号化するヌクレオチド配列が、例えば、アミノ酸配列を変化させることなく発現の効率性を高める（コドン最適化）目的に資する沈黙突然変異を含む複数の突然変異または修飾を含み得ることが理解される。本願発明において、突然変異は好ましくは、他のアミノ酸による１または２つのアミノ酸の置換である。代替的に、または加えて、核酸分子は、符号化されたタンパク質配列を変化させないヌクレオチド交換、いわゆる沈黙突然変異を含み得る。いくつかの実施形態において、突然変異、例えば、沈黙突然変異は、核酸分子により符号化されたペプチドまたはタンパク質の発現および／または分泌の効率性を高める。重要なことに、突然変異は、本願発明の核酸分子全体で誘発され得る。したがって、突然変異は、ペプチドまたはタンパク質に関する配列符号化に限定されないかもしれない。したがって、また、非符号化配列の区間は突然変異誘発を受け得る。このタイプの突然変異も、沈黙突然変異という用語の範囲に含まれる。非符号化配列の突然変異誘発は、例えば、核酸分子内の異なる配列区間により符号化されたペプチドまたはタンパク質の向上した発現および／または分泌の達成のために有利であり得る。
【００９１】
本明細書で用いられる「突然変異誘発」という用語は、タンパク質配列の任意の配列位置における天然型のアミノ酸が、それぞれの天然のポリペプチド配列においてこの特定の位置に存在しない少なくとも１つのアミノ酸により置換されるよう実験条件が選択されることを意味する。「突然変異誘発」という用語は、１つまたは複数のアミノ酸の削除または挿入による、配列セグメントの長さの（追加の）修正も含む。したがって、例えば、選択された配列位置における１つのアミノ酸が３つのランダムな突然変異の区間により置き換えられ、野生型のタンパク質のそれぞれのセグメントの長さと比較して２つのアミノ酸残基の挿入に繋がることも本願発明の範囲に含まれる。本願発明において、そのような挿入または削除は、突然変異誘発を受け得るペプチドセグメントのいずれかにおいて互いに独立してもたらされ得る。
【００９２】
「ランダム突然変異誘発」という用語は、予め定められた単一のアミノ酸（突然変異）が特定の配列位置に存在していないが、少なくとも２つの異なるアミノ酸の１つが、突然変異誘発の間に規定の配列位置において特定の確率で組み込まれ得ることを意味する。
【００９３】
「コドン最適化された」とは、１つのアミノ酸残基を符号化するコドンが、同じアミノ酸を符号化するが、この特定のアミノ酸に関して任意の宿主生物によってより頻繁に用いられている異なるコドンにより置き換えられることを意味する。相同性のポリペプチドを符号化するそのようなヌクレオチド配列は、高い配列可変性を有し得、したがって、同じ、または相同性のポリペプチドを符号化する核酸分子間の配列同一性が低いかもしれないことが理解される。
【００９４】
タンパク質配列の自然の符号化配列、すなわち、酵素のそれぞれの遺伝子セグメントは、本願発明において選択されるアミノ酸位置の突然変異誘発のための開始点として用いられ得る。列挙されているアミノ酸位置の突然変異誘発に関して、当業者は、部位特異的な突然変異誘発のための様々な確立された標準的な方法を自由に選ぶことが出来る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）。一般的に用いられている技術は、所望される配列位置において縮重塩基組成を有する合成オリゴヌクレオチドの混合物を用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により突然変異をもたらすことである。例えば、コドンＮＮＫまたはＮＮＳ（ここで、Ｎ＝アデニン、グアニン、シトシン、またはチミン、Ｋ＝グアニンまたはチミン、Ｓ＝アデニンまたはシトシン）を用いることにより、突然変異誘発の間に２０の全てのアミノ酸、およびそれに加えてアンバー終止コドンを組み込むことが可能となり、他方、コドンＶＶＳは、アミノ酸Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ（Ｖ＝アデニン、グアニン、またはシトシン）がポリペプチド配列の選択された位置に組み込まれることを阻害するので、組み込まれる可能性のあるアミノ酸の数を１２に制限する。コドンＮＭＳ（Ｍ＝アデニンまたはシトシン）を用いることにより、アミノ酸Ａｒｇ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｖａｌが選択された配列位置において組み込まれることを阻害するので、例えば、選択された配列位置における可能性のあるアミノ酸の数を１１に制限する。他の可能性としては、コドンＮＤＴまたはＮＤＣ（Ｄ＝アデニン、グアニン、またはチミン）を用いることがある。これはコドンおよび符号化されたアミノ酸の数の間の割合を１：１とし、したがって、スクリーニングの手間を減らし、１２の極性、非極性、芳香族、非芳香族、親水性および疎水性アミノ酸残基（Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ（Ｒｅｅｔｚ  ＭＴ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，２１；９（１１）：１７９７−８０４））のバランスのとれたセットへと繋がる。
【００９５】
特定の複数の実施形態において、ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩは、野生型ペプチドまたはタンパク質配列に対する、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、またはそれより多くのＮおよび／またはＣ末端アミノ酸の削除を含む。
【００９６】
様々な実施形態において、ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩは、ＭＢＰ、リパーゼＣａｌＢ、プロテアーゼＳｐｒＰ、加水分解酵素ＰｌａＢ、加水分解酵素ＰｌａＫ、加水分解酵素ＰｌｂＦ、リパーゼＴｅｓＡ、Ｖｉｆ、ヒトインターフェロンアルファ−１、アルファ−２、アルファ−８、アルファ−１６、アルファ−２１、ヒトインターフェロンベータ、ヒトインターフェロンガンマ、マウスインターフェロンアルファ、マウスインターフェロンガンマ、ＩＦＡＢＰ、Ｃａｓ２、アフィボディタンパク質ＺＡ３、ナイシン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、アミロイドベータペプチド、エクセナチド、Ｆｕｚｅｏｎ）／Ｔ２０、サケカルシトニン、Ｍａｂ４０、Ｍａｂ４２、リパーゼＬｉｐＡ、ＳｐｒＰ、ＨＩＶ−１タンパク質Ｖｉｆ、およびヒトカルシトニンから成る群から選択される。
【００９７】
ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩはベクターへとクローン化され得る。特定の複数の実施形態において、ベクターは、ｐＳＵベクター、ｐＥＴベクター、ｐＢＡＤベクター、ｐＫ１８４ベクター、ｐＭＯＮＯベクター、ｐＳＥＬＥＣＴベクター、ｐＳＥＬＥＣＴ−Ｔａｇベクター、ｐＶＩＴＲＯベクター、ｐＶＩＶＯベクター、ｐＯＲＦベクター、ｐＢＬＡＳＴベクター、ｐＵＮＯベクター、ｐＤＵＯベクター、ｐＺＥＲＯベクター、ｐＤｅＮｙベクター、ｐＤＲＩＶＥベクター、ｐＤＲＩＶＥ−ＳＥＡＰベクター、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）Ｆｕｓｉｏｎベクター、ｐＴＡＲＧＥＴ（商標）ベクター、Ｆｌｅｘｉ（登録商標）ベクター、ｐＤＥＳＴベクター、ｐＨＩＬベクター、ｐＰＩＣベクター、ｐＭＥＴベクター、ｐＰｉｎｋベクター、ｐＬＰベクター、ｐＴＯＰＯベクター、ｐＢｕｄベクター、ｐＣＥＰベクター、ｐＣＭＶベクター、ｐＤｉｓｐｌａｙベクター、ｐＥＦベクター、ｐＦＬベクター、ｐＦＲＴベクター、ｐＦａｓｔＢａｃベクター、ｐＧＡＰＺベクター、ｐＩＺ／Ｖ５ベクター、ｐＬｅｎｔｉ６ベクター、ｐＭＩＢベクター、ｐＯＧベクター、ｐＯｐｔｉベクター、ｐＲＥＰ４ベクター、ｐＲＳＥＴベクター、ｐＳＣＲＥＥＮベクター、ｐＳｅｃＴａｇベクター、ｐＴＥＦ１ベクター、ｐＴｒａｃｅｒベクター、ｐＴｒｃベクター、ｐＵＢ６ベクター、ｐＶＡＸ１ベクター、ｐＹＣ２ベクター、ｐＹＥＳ２−ｖｅｃｔｏｒ、ｐＺｅｏベクター、ｐｃＤＮＡベクター、ｐＦＬＡＧベクター、ｐＴＡＣベクター、ｐＴ７ベクター、ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ベクター、ｐＱＥベクター、ｐＬＥＸＹベクター、ｐＲＮＡベクター、ｐＰＫベクター、ｐＵＭＶＣベクター、ｐＬＩＶＥベクター、ｐＣＲＵＺベクター、Ｄｕｅｔベクター、および他のベクター、またはそれらの誘導体から成る群から選択される。好ましい複数の実施形態において、ベクターはｐＳＵベクターである。
【００９８】
本願発明のベクターは、高、中、低コピーベクターから成る群から選択され得る。
【００９９】
上記で説明されているベクターは、上記で説明されている核酸分子により符号化され、ベクターＤＮＡに含まれるペプチドまたはタンパク質の発現を達成するために、宿主細胞の変換または遺伝子導入のために用いられ得る。
【０１００】
宿主細胞は具体的に、遺伝子を発現可能な宿主細胞として選択され得る。加えて、またはそうでなければ、ペプチドまたはタンパク質、ペプチドまたはタンパク質の断片、または他のポリペプチドとのペプチドまたはタンパク質の融合タンパク質を生成するために、ペプチドまたはタンパク質に関する核酸符号化は、適した系における発現のために遺伝子改変され得る。変換は、標準的な技術を用いて行われ得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）既出）。
【０１０１】
本明細書に説明されているＰｅＯＩまたはＰｒＯＩの組換え発現に関するそのようなベクターを含む原核または真核の宿主生物も、本願発明の一部を形成する。適した宿主細胞は原核細胞であり得る。特定の複数の実施形態において、宿主細胞は、グラム陽性およびグラム陰性細菌から成る群から選択される。いくつかの実施形態において、宿主細胞は大腸菌などのグラム陰性細菌である。特定の複数の実施形態において、宿主細胞は大腸菌、特に大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）または他の大腸菌Ｋ１２または大腸菌Ｂ８３４または大腸菌ＤＨ５αまたはＸＬ−１誘導体である。更なる複数の実施形態において、宿主細胞は、大腸菌（大腸菌）、シュードモナス、セラチアマルセセンス、サルモネラ菌、赤痢菌（および他の腸内細菌）、ナイセリア、ヘモフィルス、クレブシエラ、プロテウス、エンテロバクター、ヘリコバクター、アシネトバクター、モラクセラ、ヘリコバクター、ステノトロホモナス、デロビブリオ、レジオネラ菌、酢酸菌、バチルス、桿菌、Ｃａｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、クロストリジウム、リステリア菌、連鎖球菌、ブドウ球菌、および古細菌細胞から成る群から選択される。適した真核生物の宿主細胞には、ＣＨＯ細胞、昆虫細胞、真菌、酵母細胞、例えば、サッカロミセス・セレビシエ、分裂酵母、ピキア・パストリスが含まれる。
【０１０２】
変換された宿主細胞は本願発明のペプチドまたはタンパク質を符号化するヌクレオチド配列の発現に適した条件下で培養される。特定の複数の実施形態において、細胞は、ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩを符号化するヌクレオチド配列の発現に適した条件下で培養される。
【０１０３】
組換えＰｅＯＩまたはＰｒＯＩを生成するために、組換えＤＮＡ技術によりベクターが、適した原核または真核の宿主生物に導入される。この目的のために、宿主細胞は最初に、確立された標準的な方法を用いて本願発明に係る核酸分子を含むベクターにより変換される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）既出）。その後、宿主細胞は、異種ＤＮＡの発現、したがって、対応するポリペプチドの合成を可能とする条件下で培養される。続いて、ポリペプチドが細胞から回収される。
【０１０４】
本願発明のペプチドおよびタンパク質の発現のために、いくつかの適した実施要綱が当業者に公知である。
【０１０５】
概して、選択された宿主の増殖に適した任意の公知である培地が本方法に採用され得る。様々な実施形態において、培地は富栄養培地または最小培地である。また、本明細書において考慮されているのは、細胞を増殖させるステップとペプチドまたはタンパク質を発現させるステップとが異なる培地の使用を含む方法である。例えば、増殖ステップは、富栄養培地を用いて行われ、発現ステップにおいて最小培地により置き換えられる。特定の場合において、培地は、ＬＢ培地、ＴＢ培地、２ＹＴ培地、合成培地、およ最小培地から成る群から選択される。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、培地は、ＩＰＴＧ、アラビノース、トリプトファンおよび／またはマルトースが加えられてもよく、並びに／若しくは、培養温度が変更されてもよく、並びに／若しくは培養はＵＶ光に曝されてもよい。様々な実施形態において、組換えペプチドまたはタンパク質の分泌を可能とする条件は、ペプチドまたはタンパク質の発現のために用いられるものと同じである。
【０１０７】
特定の複数の実施形態において、宿主細胞は、大腸菌、特に大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）および大腸菌ＤＨ５αなどの原核細胞である。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、例えば、増殖および発現の間に宿主細胞の培養全体が最小培地で実行される。最小培地は、この培地においてタンパク質、脂質、炭化水素、色素、および不純物含有量が低下し、したがって、広範な精製ステップの必要性を回避または低減するので、組換えペプチドまたはタンパク質の発現に有利である。
【０１０９】
さらに、本発明者らは、再折り畳み緩衝液にアルカリ土類金属塩を加えることが、組換えＰｅＯＩまたはＰｒＯＩを機能的立体配座へと折り畳むのに有利であることを見出した。いくつかの実施形態において、再折り畳み緩衝液の最終的な濃度は少なくとも０．０１ｍＭである。特定の複数の実施形態において、再折り畳み緩衝液は、マグネシウム塩、カルシウム塩、ストロンチウム塩、バリウム塩から成る群から選択される少なくとも１つのアルカリ土類金属塩が補充され得る。いくつかの実施形態において、再折り畳み緩衝液は、少なくとも０．０１ｍＭのカルシウム塩を含む。アルカリ土類金属塩の少なくとも０．０１ｍＭの全体濃度は、異なるアルカリ土類金属および／または同じアルカリ土類金属からのいくつかの塩を組み合わせることにより達成され得る。アルカリ土類金属が、マグネシウム塩、カルシウム塩、ストロンチウム塩、またはバリウム塩から選択された場合、合成物は、少なくとも０．０１ｍＭの単一のカルシウム、ストロンチウムまたはバリウム塩、若しくはいくつかのマグネシウム、カルシウム、ストロンチウムまたはバリウム塩の組み合わせを含み得、少なくとも０．０１ｍＭの全体濃度に繋がり得る。特に、少なくとも０．０１ｍＭであるカルシウム塩濃度は、いくつかのカルシウム塩を組み合わせることにより達成され得、少なくとも０．０１ｍＭの全体濃度に繋がり得る。特定の複数の実施形態において、カルシウム塩は、ＣａＣｌ２、ＣａＣＯ３、Ｃａ（ＯＨ）２、ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ、Ｃａ３（ＰＯ４）２、Ｃａ（ＣＨ３ＣＯＯ）２・Ｈ２Ｏ、およびＣａ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２から成る群から選択される。特定の複数の実施形態において、緩衝液は、少なくとも０．０１ｍＭのＣａ２＋イオンを含む。様々な実施形態において、再折り畳み緩衝液におけるＣａ２＋の濃度は、２０〜１００ｍＭの範囲内である。好ましい実施形態において、Ｃａ２＋濃度は２０ｍＭである。
【０１１０】
様々な実施形態において、方法は、組換えペプチドまたはタンパク質の精製も網羅し、組換えペプチドまたはタンパク質は、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびこれらの複数の組み合わせから選択される方法を用いて精製される。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、方法は、組換えペプチドまたはタンパク質内のプロテアーゼ開裂部位の開裂に適したプロテアーゼにより組換えペプチドまたはタンパク質を処理することを備え得る。いくつかの実施形態において、組換えペプチドまたはタンパク質は、上記に開示されている１つまたは複数の方法を用いてタンパク質分解開裂の前に精製される。また、組換えペプチドまたはタンパク質の開裂の後に、方法は、上記に定義されているようにさらに精製ステップを備え得る。したがって、いくつかの実施形態において、組換えペプチドまたはタンパク質は精製され、タンパク質分解開裂を受け、ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩはさらに精製される。
【０１１２】
ＨｌｙＡまたはＨｌｙＡの断片とＰｅＯＩ（例えばプロテアーゼ第Ｘａ因子）との間の部位特異的なプロテアーゼ開裂部位の導入により、または化学的開裂により、アロクライトおよびＰｅＯＩまたはＰｒＯＩは、分離され得、および結果として得られるＰｒＯＩまたはＰｅＯＩが、追加の／人工的なアミノ酸なしで生成される。化学的開裂は、臭化シアン、Ｂ−ブロモスクシンイミド、Ｎ−クロロスクシンイミド、ＢＮＰＳスカトール（３−ブロモ−３−メチル−２−（ｏ−ニトロフェニルスルフェニル）インドレニン）、またはＮｉ２＋イオンにより処理され得る。そのような方法は当技術分野で周知である。
【０１１３】
本願発明のペプチドまたはタンパク質の、特にＰｅＯＩまたはＰｒＯＩの精製および／または分泌の後に、ペプチドまたはタンパク質は、ペプチドまたはタンパク質の血清半減期を延長させる成分に融合させられ得る。そのような成分は当技術分野で周知であり、当業者は、通常のやり方に頼って、適した成分を特定し得る。例示的な成分は、免疫グロブリンのＦｃ部分、免疫グロブリンのＣＨ３ドメイン、免疫グロブリンのＣＨ４ドメイン、アルブミンまたはアルブミン断片、アルブミン結合ペプチド、アルブミン結合タンパク質、トランスフェリン、ポリアルキレングリコール分子、ヒドロキシエチルデンプン、パルミチン酸、および他の脂肪酸分子を含むがこれらに限定されない。融合はＮまたはＣ末端への融合であり得、しかしまた、システイン、リシン、セリン、スレオニン、グルタミン酸およびアスパラギン酸の側鎖を含む、そのように修飾されることが出来るアミノ酸側鎖への融合であり得る。
【０１１４】
様々な他の実施形態において、本願発明のペプチドまたはタンパク質、例えば、ＰｅＯＩまたはＰｒＯＩのポリペプチド配列におけるシステイン残基は、他のアミノ酸へ変異させられ、または例えば、ジスルフィド架橋形成を防ぐよう削除させられ得る。他の複数の実施形態において、本願発明のペプチドまたはタンパク質は、修飾、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ビオチン、ペプチドまたはタンパク質などの他の化合物との共役のために、または非天然型ジスルフィド結合の形成のための共役部位を生成するために、システイン残基に変異させられる１つまたは複数のアミノ酸を含み得る。したがって、上記で説明されている方法は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ビオチン、ペプチドまたはタンパク質などの化合物の結合、または非天然型ジスルフィド結合の形成も含み得る。
【０１１５】
実施例
【０１１６】
材料および方法
【０１１７】
タンパク質を、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｎｏｖａｇｅｎ）で発現させた。全てのオリゴヌクレオチドはＥｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧから購入した。全ての酵素は、ＮＥＢ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、またはＦｅｒｍｅｎｔａｓから購入した。
【０１１８】
１．Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤクローン化
【０１１９】
１．  １  ベクターの直線化
【０１２０】
ベクターは、所望される位置でアニーリングするオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲにより直線化した。例えば、プラスミドｐＳＵ−ＨｌｙＡ１を、（５'−ＴＡＡＴＡＴＡＴＴＡＡＴＴＴＡＡＡＴＧＡＴＡＧＣＡＡＴＣＴＴＡＣＴ−３'）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）およびｐＳＵｒｅｖ＿Ｘ＿ｒｅｖ（５'−ＴＧＣＴＧＡＴＧＴＧＧＴＣＡＧＧ−３）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）のためにオリゴヌクレオチドｐＳＵｒｅｖ＿ｌｉｎ＿ｆｏｒにより増幅させた。所望される場合、オリゴヌクレオチドは、プロテアーゼ開裂部位を符号化し、すなわち、オリゴヌクレオチドｐＳＵｒｅｖ＿ｌｉｎ＿Ｘａ＿ｒｅｖ（５'−ＡＣＧＧＣＣＡＴＣＡＡＴＴＧＣＴＧＡＴＧＴＧＧＴＣＡＧＧ−３'）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）が第Ｘａ因子開裂部位（一次配列：ＩＤＧＲ）を符号化した。ＰＣＲ産物をＤｐｎＩで処置して、ＰＣＲテンプレートを破壊した。所望される場合、ＰＣＲ産物をＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）により、またはＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）により精製した。
【０１２１】
１．  ２．挿入断片の増幅  関心対象の遺伝子を、関心対象の遺伝子にアニーリングする、直線化されたベクターと相補的な５'オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドによるＰＣＲにより増幅させた。例えば、順方向オリゴヌクレオチドのオーバーハング（（５'−ＧＣＡＡＴＴＧＡＴＧＧＣＣＧＴ−３'）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）は、オリゴヌクレオチドｐＳＵｒｅｖ＿ｌｉｎ＿Ｘａ＿ｒｅｖと相補的であり、逆方向オリゴヌクレオチドのオーバーハング（５'−ＴＡＡＡＴＴＡＡＴＡＴＡＴＴＡ−３）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）は、オリゴヌクレオチドｐＳＵｒｅｖ＿ｌｉｎ＿ｆｏｒと相補的であった。所望される場合、ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）により、またはＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）により精製した。
【０１２２】
１．  ３．Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ反応
【０１２３】
この反応は、マニュアル（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）に従って行った。
【０１２４】
１．  ４．変換
【０１２５】
適した大腸菌細胞をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ産物により変換させ、所望される選択マーカを含む寒天平板上で一晩増殖させ、単一のコロニーをプラスミドの調製のために選び取った。全てのプラスミドの配列を、配列決定により検証した。
【０１２６】
２．ＰＣＲおよびそれに続く連結によるヌクレオチドの挿入または削除
【０１２７】
２．  １．リン酸化
【０１２８】
オリゴヌクレオチドは、マニュアルに従って５'リン酸塩と共にオーダーし、または５'においてＴ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ（ＮＥＢ）によりリン酸化させた。
【０１２９】
２．  ２．プラスミドの増幅
【０１３０】
ヌクレオチドの削除のために、プラスミドを、リン酸化されたオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲにより、所望されるヌクレオチドにおいて増幅させた。挿入のために、プラスミドを、それらの５'に挿入されることになるヌクレオチドを有する５'リン酸化オリゴヌクレオチドを用い、ＰＣＲにより、所望されるヌクレオチドにおいて増幅させた。ＰＣＲ反応を３７℃でＤｐｎＩによって恒温放置してテンプレートＤＮＡを破壊し、ゲル抽出された５０ｎｇ直線化プラスミドを、Ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）および推奨される反応緩衝液を用いて一晩かけて４℃で連結させた。連結試料を大腸菌の変換のために用い、プラスミドを単離し、配列を配列決定により検証した。
【０１３１】
３．部位特異的な突然変異誘発
【０１３２】
突然変異誘発を、Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｏｆ（Ａｇｉｌｅｎｔ）に従って行った。
【０１３３】
４．関心対象の遺伝子の過剰発現
【０１３４】
大腸菌を、所望されるプラスミドを用いて変換させ、３７℃で振盪しながら２ＹＴ培地で増殖させた。発現を、１ｍＭのＩＰＴＧにより誘発させ、細胞を４時間の間、増殖させた。典型的には、培養のＯＤ６００は５から８の範囲であった。細胞を遠心分離により回収し、−２０℃で保存した。
【０１３５】
５．ＩＢの調製
【０１３６】
細胞を、再懸濁緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１２０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．３）に再懸濁させ、細胞粉砕器（２．５  ｋｂａｒ。Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の３回の通過により破壊した。細胞可溶化物を２０分の間、１３．５００ｘｇ、４℃で遠心分離し、ペレットを、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００および１ｍＭのＤＴＴが加えられた再懸濁緩衝液を用いて洗浄した。２０分間の１３．５００ｘｇ、４℃での遠心分離の後、ペレットを、再懸濁緩衝液を用いて洗浄した。遠心分離の後、ＩＢを含むペレットを、４℃／室温で変性緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１２０ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＥＴＤＡ、１０％グリセロール、６Ｍのグアニジウム−塩酸塩／８Ｍの尿素ｐＨ７．３）において可溶化させ／変性させた。変性ＩＢは−２０℃で保存した。
【０１３７】
６．臭化シアン（ＣＮＢｒ）による化学的開裂
【０１３８】
変性ＩＢに、０．１Ｎ  ＨＣｌおよび１００倍のモル過剰量のＣＮＢｒ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。反応は、室温で恒温放置した。
【０１３９】
７．３−ブロモ−３−メチル−２−（２−ニトロフェニルチオ）−３Ｈ−インドール（ＢＮＰＳスカトール）による化学的開裂
【０１４０】
ＩＢを５０％  Ｈ２Ｏおよび５０％酢酸で可溶化させ、（酢酸に溶解された）ＢＮＰＳスカトールを用いて室温または他の温度で培養した。更なる詳細は、Ｖｅｓｔｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）ＲＣＭ  ８，７８６−７９０、およびＲａｈａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８，１−１２に説明されている。
【０１４１】
８．Ｎ−クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）による化学的開裂
【０１４２】
ＩＢを、８Ｍの尿素、ｐＨ７．３で溶解し、（酢酸に溶解された）ＮＣＳと混ぜ合わせた。更なる詳細は、Ｓｈｅｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １５，５０７１−５０７５、およびＬｉｓｃｈｗｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５２，４９７６−４９８０に説明されている。
【０１４３】
９．トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）による化学的開裂
【０１４４】
ＩＢを、ＴＦＡに溶解した。ＤＭＳＯおよびＨＣｌ（３７％）を加えて、開裂反応を開始させた。反応混合物は、異なる複数の温度で恒温放置した。更なる詳細はＤｉｍａｒｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｏｎｄ  ｃｌｅａｖａｇｅ，ＥＰ０２８８２７２Ａ３に説明されている。
【０１４５】
１０．ＩＢの再折り畳み
【０１４６】
変性ＩＢを、変性緩衝液において０．２ｍｇ／ｍＬまで希釈し、２０ｍＭのＣａＣｌ２または０．２ｍＭのＥＤＴＡが加えられた再折り畳み緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１２０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．３）に対して透析しつつ、または変性ＩＢを（２０ｍＭのＣａＣｌ２または０．２ｍＭのＥＤＴＡが加えられた）再懸濁緩衝液において０．２ｍｇ／ｍＬまで迅速に希釈することにより再び折り畳んだ。再折り畳み緩衝液の成分は変更され得、他の緩衝液（Ｈｅｐｅｓ、ＣＡＰＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｃｉｔｒａｔｅなど）、０〜１４の範囲のｐＨ値、塩濃度、および追加の補足物が用いられ得る。再折り畳みのためのタンパク質濃度も、例えば、０．０１〜２０ｍｇ／ｍＬの範囲で変更され得る。再び折り畳まれたＩＢは２０分の間、５０．０００ｘｇ、４℃で遠心分離し、上清を更なる実験のために用いた。
【０１４７】
１１．タンパク質試料の濃度
【０１４８】
タンパク質を、所望される分画分子量（ＭＷＣＯ）による限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ  Ｆｉｌｔｅｒデバイス。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により濃縮させた。
【０１４９】
１２．固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）
【０１５０】
ＩＭＡＣを、ＦＰＬＣシステム（Ａｋｔａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ。ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。Ｈｉｓタグを含む再び折り畳まれたタンパク質をＩＭＡＣカラムに充填し、０．１ｍＭのＥＤＴＡまたは２０ｍＭのＣａＣｌ２が加えられたＩＭＡＣ緩衝液Ａ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭのＫＣｌ、１０％グリセロール、１０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．３）において平衡化させた。タンパク質を、１０〜５００ｍＭの直線勾配のイミダゾールから溶出させた。
【０１５１】
１３．第Ｘａ因子消化
【０１５２】
５０μｇのタンパク質を、４℃、２０℃、または２５℃で１μｇ第Ｘａ因子（ＮＥＢ）を用いて培養し、試料を様々な時点において取り出した。
【０１５３】
１４．サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
【０１５４】
対応する緩衝液において平衡化させられたＳＥＣカラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １６／６０、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １６／６０、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００。ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）へ、タンパク質を載せた。
【０１５５】
１５．ＨＰＬＣ
【０１５６】
分析ＲＰ−ＨＰＬＣを、室温で、ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＷＰ  ３００  ＲＰ−１８の末端にキャップがつけられたカラム（Ｍｅｒｃｋ）を用いて行った。再び折り畳まれた／変性ＩＢを注入し、水性緩衝液Ａ（０％アセトニトリル、０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸）を有機溶剤緩衝液Ｂ）１００％アセトニトリル、０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸）と混合することにより溶出させた。タンパク質またはペプチドを、０〜１００％の勾配の緩衝液を用いて溶出させた。クロマトグラムは、２２０ｎｍでの吸光度を示す。溶出剤を分画し、回収し、溶剤を蒸発させた。
【０１５７】
１６．ＤＡＵＤＡによる蛍光分光法
【０１５８】
１１−（ダンシルアミノ）ウンデカノン酸（ＤＡＵＤＡ。Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を、５０％イソプロパノルおよび５０％緩衝液（２０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．２５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．３）の１ｍＭの保存液として調製し、さらに、緩衝液を用いて適切な濃度まで希釈した。１００ｎＭのタンパク質を、緩衝液および１ｍＬの石英ガラスキュベットにおいて用いた。Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ（登録商標）−３（Ｈｏｒｉｂａ）（Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｆｒｉｅｄｅｎ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ，７，１８２１−１８２８）を用いた３５０ｎｍでの励起の後、蛍光信号を５００ｎｍの波長で記録した。励起および発光の両方に関してスリット幅は４．３ｎｍに調整し、０．５秒の間、信号を積算した。タンパク質の不在状態での緩衝液におけるＤＡＵＤＡの蛍光信号は、バックグラウンドとして減算した。補正し、正規化した蛍光信号を、ＤＡＵＤＡ濃度に対してプロットした。データは、プログラムＰｒｉｓｍ  ５を用いて調整した。
【０１５９】
１７．アミロース樹脂への結合検定
【０１６０】
再び折り畳まれたＨｌｙＡ１−ＭＢＰを、自然流下によりアミロース樹脂上に載せ、広範な洗浄の後に、タンパク質を、１０ｍＭのマルトースを含む再折り畳み緩衝液により溶出させた。
【０１６１】
１８．分泌検定
【０１６２】
大腸菌細胞を、（ＡＢＣトランスポーターＨｌｙＢおよび膜融合タンパク質ＨｌｙＤを符号化する）プラスミドｐＫ１８４−ＨｌｙＢＤにより変換させ、Ｈａｅｍｏｌｙｓｉｎ  Ａ  Ｔ１ＳＳとプラスミド符号化融合タンパク質との会合を可能とした。ｐＫ１８４  ＨｌｙＢ，Ｄは、Ｂａｋｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）ＪＢＣ；２８５（５２）：４０５７３−８０により以前に説明されている。（３０μｇ／ｍＬ）およびアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）および５ｍＭのＣａＣｌ２が加えられたた２ｘＹＴ培地で、細胞を一晩かけて増殖させた。５０ｍＬの増殖培地に、開始０．１のＯＤ６００の細胞を播種した。細胞を３７℃で攪拌して増殖させ、発現を０．４〜０．６のＯＤ６００で１ｍＭのＩＰＴＧにより誘発させた。２〜６時間後、培養物を遠心分離し（２０分、５０．０００ｘｇ、４℃）、上清試料（１６μＬ）および細胞（ＯＤｅｑ＝０．０８）がＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色により解析した。
【０１６３】
１９．用いられたベクター、および用いられたベクターにより符号化されたタンパク質配列
【０１６４】
以下のＤＮＡを、ｐＳＵプラスミドのバックボーンへとクローン化させた。
【表１】
0006714902.tif 000002
【表２】
0006714902.tif 000003
【０１６５】
実施例１：ＨｌｙＡまたはその断片にＮ末端またはＣ末端で融合させられたＰｅＯＩまたはＰｒＯＩのＩＢの形成
【０１６６】
全ての示されている、ＨｌｙＡまたはＨｌｙＡの断片（例えば、ＨｌｙＡ１。いくつかのコンストラクトの模式図に関しては図１を参照）にＮ末端で融合させられたＰｒＯＩおよびＰｅＯＩがＩＢとして細胞において凝集する（図２）。注目すべきことに、非抱合型のＩＦＡＢＰは通常、細胞内で可溶性であった（図２のＣを参照）。これら結果は、ＨｌｙＡおよびＨｌｙＡの断片がＩＢの形成を誘発し、この特性を、融合させられたペプチドおよびタンパク質へと伝えていることを示している。
【０１６７】
ＨｌｙＡまたはＨｌｙＡの断片（例えば、ＨｌｙＡ１。コンストラクトの模式図に関しては図１を参照）にＣ末端で融合させられたＰｒＯＩまたはＰｅＯＩを、大腸菌において発現させ（図２のＢ）、それらは細胞内で不溶性である（例示的なＨｌｙＡ１−ＩＦＡＢＰ、図２のＣを参照）。したがって、ＨｌｙＡおよびＨｌｙＡの断片は、そのＮおよびＣ末端に融合させられたＰｒＯＩおよびＰｅＯＩのＩＢとしての凝集を強いる。
【０１６８】
ＨｌｙＡまたはその断片の融合タンパク質、および１つのペプチドまたは異なる複数のペプチドの２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、またはそれより多くの単量体から成るペプチド多量体も、細胞内の不溶性凝集体として発現する。図２のＤは、ＨｌｙＡ１に融合させられた、単量体としてのペプチド２３８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）、三量体（ペプチド２４０ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５）、および五量体（ペプチド２４１［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６］）の発現を示す。ＨｌｙＡ１への融合なしで、三量体および五量体のペプチドは細胞により生成されなかった（ｐＥＴ１６ｂ＿２４０およびｐＥＴ１６ｂ＿２４１を参照）。多量体のペプチドは細胞内で発現せず、またたタンパク分解的に分解されなかった（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ  ｄｅｇｒａｄｅｄ）。
【０１６９】
同様の発現データを、ＨｌｙＡ１に融合させられた以下のペプチドに関して得た。Ｍａｂ４０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３）、Ｍａｂ４２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）、サケカルシトニン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５）、ヒトカルシトニン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０）、阻害物質ペプチド１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）、およびその他。
【０１７０】
実施例２：ＨｌｙＡおよびＨｌｙＡ１の精製および再折り畳み
【０１７１】
ＨｌｙＡおよびＨｌｙＡ１を、ＩＢとして大腸菌において生成した。ＩＢを、それぞれＥＤＴＡまたはＣａＣｌ２存在下で再び折り畳んだ。再折り畳み効率性は、ＥＤＴＡにより約３５％であり、不均質かつ不安定なＨｌｙＡまたはＨｌｙＡ１を得た。図３のＡおよびＢは、ＨｌｙＡ断片ＨｌｙＡ１に関する結果を示す。対照的に、Ｃａ２＋存在下で９０％を超えるＨｌｙＡまたはＨｌｙＡ１が再び折り畳まれ、タンパク質は安定しており均質であった（図３のＣおよびＤ）。
【０１７２】
実施例３：ＨｌｙＡ１−ナイシンの精製および再折り畳み
【０１７３】
（プラスミドｐＩＡＲ＿２１４により符号化された）ＨｌｙＡ１−ナイシンを発現している５ｇの細胞から、ＨｌｙＡ１−ナイシンの約１４０ｍｇの未精製ＩＢを調製し、変性させ、再び折り畳んだ。ＥＤＴＡ存在下で、殆どのタンパク質は不溶性であり、凝集し、少量の不均質なＨｌｙＡ１−ナイシンのみが生成された（図４のＡおよびＣ）。対照的に、Ｃａ２＋による再折り畳みは、高い純度の均質なタンパク質種を高い収率で生成した（図４のＢおよびＣ）。再折り畳みの効率性は、Ｃａ２＋存在下で９５％より高く、ＥＤＴＡ存在下で２５％より低かった。
【０１７４】
再折り畳みに続き、第Ｘａ因子による部位特異的なタンパク質分解によりナイシンをＨｌｙＡ１から分離させた（図４のＤ）。９０分後、１００μＬの反応混合物を、ＨＰＬＣにより精製した（図４のＥ）。溶出分画を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析（図４のＦ）、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ、および質量分析（データは示されていない）により解析し、完全なナイシン分子を識別した。
【０１７５】
実施例４：ＬｉｐＡ１−ナイシンの精製および再折り畳み
【０１７６】
リパーゼＡ（ＬｉｐＡ）は、専用のＴ１ＳＳにより分泌させられた他のＲＴＸタンパク質である。ＨｌｙＡ１−ナイシンと同等の、ナイシンがＬｉｐＡのＣ末端断片に融合させられたコンストラクトをクローン化させた。この断片は、ＲＴＸ領域、および（プラスミドｐＩＡＲ＿３０２上で符号化された）ＬｉｐＡの分泌信号をカバーしていた。続いてＬｉｐＡ１−ナイシンを大腸菌において生成し、ＩＢの形成を検査した。図５のＡに示されているように、ＬｉｐＡ１−ナイシンはＩＢを形成する。さらに、変性させられたＬｉｐＡ１−ナイシンの再折り畳みを、Ｃａ２＋およびＥＤＴＡそれぞれの存在下で解析した。再び折り畳まれたＬｉｐＡ１−ナイシンのＳＥＣ解析は、融合タンパク質がＨｌｙＡ１−ナイシンと同様の挙動を示し、Ｃａ２＋が、ＬｉｐＡ１−ナイシンの、安定した均質なタンパク質への再折り畳みを誘発することを示した（図５のＢ）。対照的に、ＥＤＴＡ存在下で、ＬｉｐＡ１−ナイシンはより低い効率性で再び折り畳まれ、ＬｉｐＡ１−ナイシンの大部分は凝集を形成する（図５のＣおよびＤ）。したがって、ＨｌｙＡ、ＬｉｐＡ、およびおそらくＲＴＸタンパク質スーパーファミリーの他の要素が、ＩＢとしてＰｒＯＩおよびＰｅＯＩを生成し、Ｃａ２＋、他の金属イオン、または特定の再折り畳み条件を加えることにより融合タンパク質を再び折り畳むのに用いられ得るかもしれない。
【０１７７】
実施例５：異なるＨｌｙＡ断片およびそれらの再折り畳みを誘発する統合性の解析
【０１７８】
各ＧＧ反復配列の、ＩＢの形成および再折り畳みに関する影響を調べるためにＨｌｙＡ１−ナイシンを、ＧＧ反復配列毎にＮ末端から段階的に切断した（図１）。プラスミドｐＩＡＲ＿２１５、ｐＩＡＲ＿２２０、ｐＩＡＲ＿２２１、ｐＩＡＲ＿２２２から発現させられたタンパク質を調べた。ＨｌｙＡ１のＣ末端部分の影響を検討するためにｐＩＡＲ＿２２３を設計した。ｐＩＡＲ＿２２３は、ＨｌｙＡ１のＣ末端を欠いている（分泌信号を含む）ＨｌｙＡ１の４つのＧＧ反復配列全てにＣ末端で融合させられたナイシンに対応する。
【０１７９】
プラスミドｐＩＡＲ＿２２２からの発現させられたタンパク質のみを、細胞可溶化物試料において見える量で大腸菌において発現させた（図６のＡ）。それにも関わらず、ｐＩＡＲ＿２１５、ｐＩＡＲ＿２２０〜２２３により符号化されたタンパク質を発現する細胞のＩＢを調製し、変性させ、Ｃａ２＋またはＥＤＴＡを用いて再び折り畳むことが出来た。再び折り畳まれたタンパク質を濃縮させ、ＳＥＣにより解析した。濃縮されたタンパク質の、第Ｘａ因子による開裂を解析した。プラスミドｐＩＡＲ＿２２０、ｐＩＡＲ＿２２２、およびｐＩＡＲ＿２２３のみが、相当量の組換えタンパク質を生成した。したがって、これらのタンパク質は、以下の解釈により検討された。
【０１８０】
プラスミドｐＩＡＲ＿２２０（２つのＧＧ反復配列）、ｐＩＡＲ＿２２２（ＧＧ反復配列なし）、およびｐＩＡＲ＿２２３（４つのＧＧ反復配列のみ、ＨｌｙＡ１のＣ末端部分なし）から符号化されたタンパク質のＩＢを生成した。したがって、ＧＧ反復配列および分泌信号から成るＨｌｙＡ１のＣ末端部分がＩＢの形成を誘発する可能性がある。
【０１８１】
ｐＩＡＲ＿２２０（２つのＧＧ反復配列）により符号化されたタンパク質は、ＥＤＴＡと比較してＣａ２＋存在下でより効率的に再び折り畳まれ濃縮された（図６のＢおよびＣ）。他方、Ｃａ２＋およびＥＤＴＡの両方の場合において、ｐＩＡＲ＿２２２（ＧＧ反復配列なし）により符号化されたタンパク質の再折り畳みおよび濃縮の効率性は同程度であった。したがって、２つのＧＧ反復配列は、Ｃａ２＋依存的に再折り畳みの効率性の向上を可能とする。ｐＩＡＲ＿２２０およびｐＩＡＲ＿２２２により符号化されたタンパク質のＳＥＣ解析はこれらの結果を支持している。ｐＩＡＲ＿２２０により符号化されたタンパク質は、Ｃａ２＋存在下でのみ、ＳＥＣ解析により明確かつ対称的な信号を示し（図６のＣ）、他方、ｐＩＡＲ＿２２２により符号化されたタンパク質によるＳＥＣ解析のクロマトグラムは、ＥＤＴＡおよびＣａ２＋存在下で同等であり（図６のＤおよびＥ）、したがって、ｐＩＡＲ＿２２２により符号化されたタンパク質は、可溶性の均質な状態へと折り畳まれなかった。このことは、ＧＧ反復配列が効率的な復元のために必須であることを示している。
【０１８２】
Ｃａ２＋存在下でのみＳＥＣから対称的な信号として、ｐＩＡＲ＿２２３（４つのＧＧ反復配列あり、ＨｌｙＡ１のＣ末端部分なし）により符号化されたタンパク質は溶出する。対照的に、ＥＤＴＡ存在下で、ｐＩＡＲ＿２２３から発現させられた組換えタンパク質は不均質である（図６のＦおよびＧ）。
【０１８３】
実施例６：ＨｌｙＡ１−ＨＣＲＦの精製および再折り畳み
【０１８４】
約５ｇの細胞から、（プラスミドｐＩＡＲ＿２０２により符号化された）ＨｌｙＡ１−ＨＣＲＦに関して約２００ｍｇの未精製ＩＢを精製し、グアニジウム−塩酸塩において変性させ、続いて再び折り畳んだ（図７のＡ）。ＥＤＴＡ存在下での４０ｍｇのＨｌｙＡ１−ＨＣＲＦの再折り畳みは、約８．４ｍｇの可溶性タンパク質を生成したが、タンパク質試料は不安定かつ不均質であった（図７のＣおよびＥ）。対照的に、Ｃａ２＋存在下での再折り畳みは、（約８５％の再折り畳み率に対応する）３４ｍｇの可溶性かつ均質なタンパク質を生成した（図７のＣおよびＤ）。
【０１８５】
再び折り畳まれたＨｌｙＡ１−ＨＣＲＦは第Ｘａ因子を用いて温浸し（図７のＧ）、反応混合物をＨＰＬＣにより精製した（図７のＦ）。この方策により、ＨＣＲＦをＨｌｙＡ１から開裂し、分離させた。
【０１８６】
実施例７：ＩＦＡＢＰの生成
【０１８７】
（プラスミドｐＩＡＲ＿２０７上で符号化された）ＨｌｙＡ１−ＩＦＡＢＰを発現させ、約６ｇの細胞から２０５ｍｇの変性ＩＢを調製した。ＨｌｙＡ１−ＩＦＡＢＰを、Ｃａ２＋およびＥＤＴＡ存在下で、安定した均質な状態へと再び折り畳んだ（＞６５％）（図８のＡ〜Ｄ）。ＩＦＡＢＰのＩＢへの凝集を強いたにも関わらず、ＨｌｙＡ１は、変性させられたＩＦＡＢＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの再折り畳みを阻害しない。この方策により、ＨｌｙＡ１−ＩＦＡＢＰは高い収率、高い純度、および可溶性の形態で生成された。ＳＥＣ解析に基づくと、Ｃａ２＋のプラスの影響はＨｌｙＡ１−ＩＦＡＢＰの復元に関して無視できる程度であったが、しかし、ＨｌｙＡ１−ＩＦＡＢＰの生物活性はＣａ２＋存在下でより高い（図８のＦおよびＧ）。したがって、いくつかの実施形態において、Ｔ１ＳＳのアロクライトまたはその断片は、ＩＢ−タグとして機能し、融合させられたＰｅＯＩまたはＰｒＯＩの効率的な復元を妨げない。Ｃａ２＋イオンの存在は融合パートナーの生物活性を、例えば、アロクライトまたはその断片の安定性および／または可溶性を高めることによりその安定性および可溶性を高めることにより高める。
【０１８８】
ＩＦＡＢＰを、第Ｘａ因子によりＨｌｙＡ１から開裂した。１μｇの第Ｘａ因子が３時間および２０℃で５０μｇのＨｌｙＡ１−ＩＦＡＢＰの＞９５％を消化した（図８のＥ）。ＨｌｙＡ１−ＩＦＡＢＰの生物活性を、１１−（（（５−（ジメチルアミノ）−１−ナフタレニル）スルホニル）アミノ）−ウンデカノン酸（ＤＡＵＤＡ）、蛍光性脂肪酸類似体により検査した（図８のＦおよびＧ）。Ｃａ２＋およびＥＤＴＡにおいて再び折り畳まれたＨｌｙＡ１−ＩＦＡＢＰのＫＤは、それぞれ１４０．８ｎＭ±１３．１ｎＭおよび２６４．３ｎＭ±１３．２ｎＭであると判断した。ＨｌｙＡ１−ＩＦＡＢＰは、生物活性であり、開発された技術が、活性であり可溶性であるタンパク質の生成を可能とすることを示した。活性は、ＩＦＡＢＰに関する文献における値と同等であった（ＫＤ＝２０．９ｎＭ±０．６ｎＭ）。
【０１８９】
実施例８：ＩＦＮＡ２の生成
【０１９０】
（プラスミドｐＩＡＲ＿２１０により符号化された）ＨｌｙＡ１−ＩＦＮＡ２を、大腸菌において高いレベルで発現させた。約５ｇの細胞から３１０ｍｇの変性ＩＢを精製した。ＨｌｙＡ１−ＩＦＮＡ２の再折り畳みを、Ｃａ２＋またはＥＤＴＡ存在下で行った。±３〜４％のＨｌｙＡ１−ＩＦＮＡ２を、両方の試薬存在下で再び折り畳んだ。還元剤（ＤＴＴ）ありでの、またはなしでのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析は、再折り畳み後のＨｌｙＡ１−ＩＦＮＡ２の酸化状態、およびしたがって、ジスルフィド結合の形成を示唆している（データは示されていない）。再折り畳みの効率性は、０．５Ｍアルギニンを加えることによりほぼ１００％まで高められた。ここでも、ＨｌｙＡ１はＩＦＮＡ２の再折り畳みを妨げず、ＩＦＮＡ２が、本願発明を用いることにより高い収率で生成された。再び折り畳まれたＨｌｙＡ１−ＩＦＮＡ２はＤＴＴ存在下で、またはそれが存在していない状態でＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により示されるように酸化され（図９のＡ）、生物活性であった（データは示されていない）。
【０１９１】
アルギニンおよびＣａ２＋存在下で再び折り畳まれたＨｌｙＡ１−ＩＦＮＡ２は可溶性であり均質であった（図９のＢ）。対照的に、アルギニンおよびＥＤＴＡにより再び折り畳まれたＨｌｙＡ１−ＩＦＮＡ２に関して２つの溶出信号が観察された（図９のＣ）。したがって、Ｃａ２＋存在下での再折り畳みは、ＥＤＴＡ存在下での再折り畳みと比較してＨｌｙＡ１−ＩＦＮＡ２の均質性を高めた。
【０１９２】
実施例９：ＭＢＰの生成
【０１９３】
ＭＢＰは、大腸菌内での融合させられたＰｒＯＩの可溶性の発現のための可溶性タグとして周知である（Ｎａｌｌａｍｓｅｔｔｙ，Ｓ．＆  Ｗａｕｇｈ，Ｄ．Ｓ．Ａ．（２００７）Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ，２，３８３−３９１）。それにも関わらず、ＩＢおよび（プラスミドｐＩＡＲ＿２１３により符号化された）ＨｌｙＡ１−ＭＢＰ  ＩＢが調製され、ＨｌｙＡ１はＭＢＰの凝集を強いる（図１０）。ＨｌｙＡ１−ＭＢＰをＣａ２＋存在下で再び折り畳み、濃縮させた。ＳＥＣ解析は、可溶性ＨｌｙＡ１−ＭＢＰの生成を示した（データは示されていない）。再び折り畳まれたＨｌｙＡ１−ＭＢＰは固定化アミロースに結合し、再び折り畳まれたＭＢＰの生物学的機能性を示した（図１０）。
【０１９４】
実施例１０：ｐＩＡＲ＿１０１〜１０３再折り畳みおよび第Ｘａ因子消化
【０１９５】
ＨｌｙＡ１および（プラスミドｐＩＡＲ＿１０１、ｐＩＡＲ＿１０２、ｐＩＡＲ＿１０３により符号化された）ペプチド１０１、１０２および１０３の融合タンパク質を、ＩＢとして大腸菌において発現させた（図１１のＡ）。約４．５ｇの細胞から７２ｍｇ、９２ｍｇ、および１０８ｍｇの未精製ＩＢを調製した。
【０１９６】
ＩＢを、Ｃａ２＋によりほぼ１００％まで再び折り畳み、タンパク質を濃縮させた（列「ペレット」および「再び折り畳まれたペプチド１０Ｘ」を比較。図１１のＢ〜Ｄ）。融合タンパク質を第Ｘａ因子により培養し、ＰｅＯＩをＨｌｙＡ１から分離させることが出来た。ペプチドをＨＰＬＣにより精製した。ペプチド１０３を質量分析により識別した（データは示されていない）。
【０１９７】
実施例１１：ＨｌｙＡ１−Ｆｕｚｅｏｎ（登録商標）の精製および再折り畳み
【０１９８】
約４ｇの細胞から、（プラスミドｐＩＡＲ＿２０１により符号化された）ＨｌｙＡ１−Ｆｕｚｅｏｎ（登録商標）の１３０ｍｇの未精製ＩＢを精製し、これらをグアニジウム−塩酸塩で変性させ、続いて再び折り畳んだ。再折り畳みの効率性はＣａ２＋を用いた場合に±３０％であり、ＥＤＴＡを用いた場合に±１１％であった。ＳＥＣ解析は、ＨｌｙＡ１−Ｆｕｚｅｏｎ（登録商標）は、Ｃａ２＋存在下でのみ可溶性状態で生成され得ることを示した（図１２のＡおよびＢ）。図１２のＣは、第Ｘａ因子による、ＨｌｙＡ１−Ｆｕｚｅｏｎ（登録商標）からのＦｕｚｅｏｎ（登録商標）のタンパク分解性分離の結果を示す。
【０１９９】
実施例１２：ＨｌｙＡ１における第Ｘａ因子に関する非特異的な開裂部位の変性
【０２００】
質量分析は、ＨｌｙＡ１における第Ｘａ因子に関する非特異的な開裂部位を識別した（一次配列ＳＹＧＲ、ａａ  ２０７−２１０）。野生型ＨｌｙＡ１の、プラスミドｐＩＡＲ＿１１２におけるＨｌｙＡ１−Ｒ２１０Ｄへの突然変異は、この開裂部位を破壊すること、およびＨｌｙＡ１とＰｅＯＩまたはＰｒＯＩとの間の意図されている開裂部位上での第Ｘａ因子の開裂の効率性を高めることを目的として構築された。ペプチド１０３に融合させられたＨｌｙＡ１−Ｒ２１０Ｄの第Ｘａ因子消化は、ＨｌｙＡ１−Ｒ２１０Ｄの部位産物が形成されなかったことを示した（図１３）。
【０２０１】
実施例１３：融合タンパク質の化学的開裂
【０２０２】
ペプチド結合の化学的開裂は文献において周知である。そのようなアプローチの、ＰｒＯＩまたはＰｅＯＩの二機能性タグからの分離への適用可能性を調べた。臭化シアン（ＣＮＢｒ）、メチオニン残基にＣ末端で結合するペプチドを開裂する化学試薬、およびＢＮＰＳスカトール、ＮＣＳ、およびＴＦＡ、トリプトファン残基のＣ末端でのペプチド結合を開裂する化学試薬を選択した。ＨｌｙＡ１内の単一のメチオニンおよびトリプトファン残基はアラニン（Ｍ８８Ａ、Ｗ１０９Ａ）に変異し、メチオニンまたはトリプトファンはＮ末端でＰｅＯＩまたはＰｒＯＩに置かれた。例えば、メチオニンを、Ｎ末端でペプチド１０３（タンパク質ＨｌｙＡ１  Ｍ８８Ａ−Ｍｅｔ−ペプチド３。プラスミドｐＩＡＲ＿１１５上で符号化された）に追加した。図１４におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により示されるように、ペプチドは成功裏にＨｌｙＡ１から開裂された。Ａ：ペプチド１０３を、ＣＮＢｒによりＨｌｙＡ１  Ｍ８８Ａ−Ｍｅｔから分離させた。ペプチド１０３のアイデンティティは、質量分析により確認された（データは示されていない）。Ｂ：ｐＩＡＲ＿２０２ｗ、ｐＩＡＲ＿２３８、ｐＩＡＲ＿２３９、ｐＩＡＲ＿２４０およびｐＩＡＲ＿２４１により符号化されたペプチドの約５０％を、３ｈでＮＣＳによりＨｌｙＡ１から開裂した。ｐＩＡＲ＿２４０およびｐＩＡＲ＿２４１はクーマシー染色されたゲル上で明確に見え（矢印により示されている）、他方、他のペプチドは染色するには小さ過ぎた。０ｈの試料において５０ｋＤａ超で見える種は、ペプチドのシステイン架橋二量体に対応する。
【０２０３】
実施例１４：発酵を介して発現させられたＨｌｙＡ１融合タンパク質
【０２０４】
プラスミドｐＩＡＲ＿１１５を含む大腸菌を発酵のために用いた。発酵の間に餌としてグルコースが用いられたとき、発現が抑制された。この抑制は、グルコースによるプラスミドｐＩＡＲ＿１１５の発現を規制するラクトースプロモータの抑制から生じるのかもしれない。したがって、グリセロールを、発酵の間に餌としてテストした。この方策により、２．５ｋｇより多くの湿細胞が１０Ｌの発酵ブロスから生成された。ＨｌｙＡ１  Ｍ８８Ａ−Ｍｅｔ−ペプチド３の発現レベルは、バッチ培養と同等であり、またはさらには、それよりも高められた（図１５）。４４０ｇの細胞（湿細胞質量）から６５ｇのＩＢを調製した。したがって、本願発明に係る技術は規模の拡張が可能であり、ＩＢの滴定量は、細胞質量を増やす、および／または発現レベルを高めることにより増やされる。
【０２０５】
本明細書に引用されている全ての文書は、それらの全体が参照によりここに組み込まれる。
【０２０６】
本明細書において例示的に説明されてきた複数の本願発明は、本明細書に具体的に開示されていない要素または複数の要素、限定または複数の限定がなくても適切に実施され得る。したがって、例えば、「備える」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」等の用語は、拡大的に、限定することなく読まれるべきである。加えて、本明細書に採用されている用語および表現は、限定ではなく説明の用語として用いられており、そのような用語および表現の使用において、示されている、および説明されている特徴、またその一部の任意の同等物を排除する意図はなく、様々な修正が特許請求されている発明の範囲内で可能であることが認識される。したがって、本願発明が、好ましい複数の実施形態、およびオプション的な複数の特徴によって具体的に開示されてきたが、それらにおいて実施される、本明細書において開示されている本願発明の修正および変形が、当業者により用いられるかもしれなく、そのような修正および変形は本願発明の範囲内にあるものとして見なされることが理解されるべきである。本願発明は、本明細書において幅広く、および一般的に説明されてきた。包括的な開示内に含まれるより狭い範囲の種および部分的なグルーピングのそれぞれも本願発明の一部を形成する。これには、削除された部材が本明細書に具体的に列挙されているかいないかに関わらず、任意の主題をその種類から取り除く但し書きまたは否定的な限定を用いた本願発明の包括的な説明が含まれる。加えて、本願発明の複数の特徴または態様が、マーカッシュグループに関して説明されているとき、これによって本願発明は、マーカッシュグループの任意の個々の要素、または複数の要素のサブグループに関しても説明されていることを当業者は認識されよう。本願発明の更なる複数の実施形態は、以下の請求項より明らかになるであろう。
【配列表フリーテキスト】
【０２０７】
<223>  Inventor:  SCHMITT, Lutz; SCHWARZ, Christian; SMITS, Sander Hendrikus Joannes
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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