(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
対象から取得された試料を分析し、参照標準と比較してバイオマーカーである抗β−グルカン抗体の濃度を計算し；そして
バイオマーカーである抗β−グルカン抗体についての所定のカットオフ値と比較した当該試料中のバイオマーカーである抗β−グルカン抗体の濃度に基づいて、当該試料をバイオマーカー陽性と同定すること、を含み、
ここで、当該所定のカットオフ値が、バイオマーカー陽性試料とバイオマーカー陰性試料とを層別化する１つ又は複数のエンドポイントと相関した特異度及び感度の組み合わせに応じて選択され、そして、
ここで、当該１つ又は複数のエンドポイントが、全生存中央値（Median Overall Survival）；全奏効率（overall response rate）；単球又は好中球へのβ−グルカン結合；補体成分Ｃ４ａ、Ｃ５ａ又はＳＣ５ｂ−９の活性化；好中球ＣＲ１、ＣＲ３、ＣＤ８８又はＣＤ６２Ｌ表面マーカー発現の調節；あるいはＩＬ−８の誘導である、方法。
【請求項２】
以下：
参照標準と比較してバイオマーカーである抗β−グルカン抗体の量について対象から取得された試料を分析し；そして
該試料が、バイオマーカー陽性試料とバイオマーカー陰性試料とを分けるバイオマーカーである抗β−グルカン抗体についての所定のカットオフ値よりも大きい抗β−グルカン抗体の量を含む場合に、当該試料をバイオマーカー陽性と同定すること、を含み、
ここで、当該所定のカットオフ値が、１つ又は複数のエンドポイントと相関した特異度及び感度の組み合わせに応じて選択され、そして、
ここで、当該１つ又は複数のエンドポイントが、全生存中央値（Median Overall Survival）；全奏効率（overall response rate）；単球又は好中球へのβ−グルカン結合；補体成分Ｃ４ａ、Ｃ５ａ又はＳＣ５ｂ−９の活性化；好中球ＣＲ１、ＣＲ３、ＣＤ８８又はＣＤ６２Ｌ表面マーカー発現の調節；あるいはＩＬ−８の誘導である、方法。
【請求項３】
前記バイオマーカーである抗β−グルカン抗体がＩｇＧを含む、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記バイオマーカーである抗β−グルカン抗体がＩｇＧを含み、かつ、前記所定のカットオフ値が、１４μｇ／ｍｌ〜８０μｇ／ｍｌの範囲内である、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記試料が、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて、バイオマーカーである抗β−グルカン抗体について分析される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載の方法においてバイオマーカー陽性と同定された試料を有する対象に投与するための、β−グルカンを含有する組成物。
【請求項７】
前記β−グルカンが酵母に由来する、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記β−グルカンがβ−１，３／１，６グルカンを含む、請求項６又は７に記載の組成物。
【請求項９】
前記β−グルカンが、β（１，６）−［ポリ−（１，３）−Ｄ−グルコピラノシル］−ポリ−β（１，３）−Ｄ−グルコピラノースを含む、請求項６から８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項１から５のいずれか一項に記載の方法においてバイオマーカー陽性と同定されなかった試料を有する対象に投与するための、抗β−グルカンＩｇＧ2を含有する組成物。
【請求項１１】
前記特異度及び感度の組み合わせが、ＲＯＣ曲線解析を用いる１つ又は複数のエンドポイントに相関している、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１３年１２月５日に出願された米国仮出願第６１／９１２，２７５号、及び２０１４年５月３０日に出願された米国仮出願第６２／００５，３３５号の優先権を主張し、そのそれぞれが参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
概要
本開示は、対象のβ−グルカンに対する免疫応答を示すバイオマーカーについて対象からの試料を分析するための方法を提供する。
【発明の概要】
【０００３】
いくつかの実施形態では、本方法は、対象から生体試料を取得すること、参照標準と比較してバイオマーカーである抗β−グルカン抗体について該試料を分析すること、該試料中の抗β−グルカン抗体について抗β−グルカン抗体濃度又は相対抗体単位（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｕｎｉｔ）（ＲＡＵ）値を計算すること、そして、該抗β−グルカン抗体濃度又はＲＡＵ値がバイオマーカーである抗β−グルカン抗体についての所定の抗β−グルカン抗体濃度又はＲＡＵ値よりも大きい場合に、当該対象をバイオマーカー陽性と同定することを一般に含む。
【０００４】
他の実施形態では、本方法は、対象から生体試料を取得すること、参照標準と比較してバイオマーカーである抗β−グルカン抗体について該試料を分析すること、そして、該試料が、バイオマーカー陽性の対象とバイオマーカー陰性の対象とを分けるバイオマーカーである抗β−グルカン抗体についての所定のカットオフ値よりも大きい抗β−グルカン抗体の量を含む場合に、当該対象をバイオマーカー陽性と同定することを一般に含む。
【０００５】
いくつかの実施形態では、該バイオマーカーである抗β−グルカン抗体はＩｇＧとすることができる。これら実施形態のいくつかでは、該所定のＲＡＵ値は２００とすることができる。
【０００６】
いくつかの実施形態では、該バイオマーカーである抗β−グルカン抗体はＩｇＭとすることができる。これら実施形態のいくつかでは、該所定のＲＡＵ値は３００とすることができる。
【０００７】
いくつかの実施形態では、本方法は、バイオマーカー陽性として同定された対象にβ−グルカンを含有する組成物を投与することをさらに含むことができる。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本方法は、バイオマーカー陽性として同定された対象に抗β−グルカンＩｇＧ2を含有する組成物を投与することをさらに含むことができる。
【０００９】
いくつかの実施形態では、該β−グルカンは、酵母、例えばβ−１，３／１，６グルカンに由来する。ある実施形態では、該β−グルカンは、β（１，６）−［ポリ−（１，３）−Ｄ−グルコピラノシル］−ポリ−β（１，３）−Ｄ−グルコピラノースを含むことができる。
【００１０】
いくつかの実施形態では、バイオマーカーである抗β−グルカン抗体について試料を分析することは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いることを含むことができる。
【００１１】
本発明の上記概要は、開示された各実施形態又は本発明の全ての実施を記載することを意図するものではない。以下の説明はより具体的に例示的な実施形態を示す。本願全体にわたっていくつかの箇所では、様々な組み合わせで使用できる例のリストを介してガイダンスが提供される。それぞれの事例において、列挙されたリストは代表群としてのみの役割を果たし、排他的なリストとして解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】任意の値の１６０を参照血清に割り当てた（すなわち１６０相対抗体単位［ＲＡＵ］／ｍＬ）。従って、検量線上の最高点、１：４００希釈は、４００ｍＲＡＵ／ｍＬの値をもたらし、検量線上の最低点で、１：５１２００希釈は、３．１２５ｍＲＡＵ／ｍＬの値をもたらす。平均ＲＡＵ／ｍＬ＝３６５。
【図１Ｂ】ＩｇＧ抗β−グルカン抗体濃度の実用標準曲線（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｃｕｒｖｅ）。
【図１Ｃ】ＩｇＭ抗β−グルカン抗体濃度の実用標準曲線。
【図２】低レベルのＩｇＧ（ＲＡＵ＜２００）及びＩｇＭ（ＲＡＵ＜１００）抗ベータグルカン抗体を有する８人の健常なボランティアからの全血を、上昇する濃度のＩＶＩＧ（０、２．５、５及び１０ｍｇ／ｍｌ）に添加した。血漿を除去し、ＲＡＵ値を各試料について決定した。
【図３】低レベルのＩｇＧ（ＲＡＵ＜２００）及びＩｇＭ（ＲＡＵ＜１００）抗ベータグルカン抗体を有する４人の健常なボランティアからの血液試料を、上昇する濃度のＩＶＩＧ（０、２．５、５及び１０ｍｇ／ｍｌ）に添加した。全血細胞を１０μｇ／ｍＬでＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧにより処理し、３０分間３７℃でインキュベートし、好中球結合について分析した。
【図４】低レベルのＩｇＧ（ＲＡＵ＜２００）及びＩｇＭ（ＲＡＵ＜１００）抗ベータグルカン抗体を有する８人の健常なボランティアからの全血細胞を、ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ（１０ｍｇ／ｍｌ）及びＩＶＩＧ（０、２．５、５及び１０ｍｇ／ｍｌ）と培養し、ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧの結合及び機能を評価した（補体解析のために３０分のインキュベーション；結合及び受容体調節のために２時間；サイトカインのために一晩培養）。
【図５】低レベルのＩｇＧ（ＲＡＵ＜２００）及びＩｇＭ（ＲＡＵ＜１００）抗ベータグルカン抗体を有する８人の健常なボランティアからの全血細胞を、ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ（１０ｍｇ／ｍｌ）及びＩＶＩＧ（０、２．５、５及び１０ｍｇ／ｍｌ）と培養し、ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ誘導性ＳＣ５ｂ−９放出を評価した。
【図６】低レベルのＩｇＧ（ＲＡＵ＜２００）及びＩｇＭ（ＲＡＵ＜１００）抗ベータグルカン抗体を有する８人の健常なボランティアからの全血細胞を、ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ（１０ｍｇ／ｍｌ）及びＩＶＩＧ（０、２．５、５、及び１０ｍｇ／ｍｌ）とインキュベートし、ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ誘導性の好中球におけるＣＤ６２Ｌ切断（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）（フローサイトメトリー）及びＩＬ−８産生（ＥＬＩＳＡ）を評価した。
【図７】結合及び機能に必要なＲＡＵは個体により異なる。したがって、バイオマーカーのカットオフの目的は、ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧに反応しないであろう個体を除外することになるＲＡＵレベルを同定し、そして反応するより高い確率を有するバイオマーカー陽性の対象を富ませることである。結合及び機能データは≧ＩＶＩＧ−５グループ（ＲＡＵ  ２３３〜６１０）で生じる最大活性を示し、それゆえ、ＩｇＧのカットオフについてのさらなる分析は２００を超えるＲＡＵ範囲に焦点を置くべきである。
【図８】ＩｇＧ  ＲＡＵレベルによりプロットされた健常なボランティアのＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧの好中球結合。
【図９】ＩｇＧ  ＲＡＵレベルによりプロットされた健常なボランティアのＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧの好中球結合。丸で囲まれたボランティアは、低いＩｇＧ  ＲＡＵを有する高い好中球バインダーであったが、高いＩｇＭ  ＲＡＵを有した、したがって、ＩｇＧ  ＲＡＵ解析から除くことができる。
【図１０】ＩｇＧ  ＲＡＵレベルによりプロットされた健常なボランティアのＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧの好中球結合。２３５のＩｇＧ  ＲＡＵのカットオフは、そのＲＡＵが結合を促進するのに十分であったボランティア（バイオマーカー陽性）対、そのＲＡＵが結合を促進するのに十分でなかったボランティア（バイオマーカー陰性）を分離した。
【図１１】ＩｇＧ  ＲＡＵレベルによりプロットされた健常なボランティアのＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧの好中球結合。丸で囲まれた個体はＩｇＧバイオマーカー陰性だが、高いＩｇＭ  ＲＡＵである。
【図１２】ＩｇＧ  ＲＡＵレベルによりプロットされた健常なボランティアのＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧの好中球結合。緑の丸で囲まれた青色でないボランティアは高いＩｇＧ  ＲＡＵに基づいて既にバイオマーカー陽性であった、したがって、ＩｇＭ  ＲＡＵ解析から除くことができる。
【図１３】ＩｇＧ  ＲＡＵレベルによりプロットされた健常なボランティアのＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧの好中球結合。３３０のＩｇＭ  ＲＡＵのカットオフは、そのＲＡＵが結合を促進するのに十分であったボランティア（バイオマーカー陽性）対、そのＲＡＵが結合を促進するのに十分でなかったボランティア（バイオマーカー陰性）を分離した。
【図１４】健常なドナーからの全血における抗ベータグルカン抗体レベルとＣ４ａ産生との相関関係。個々の健常なドナーからのＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ（１０μｇ／ｍｌ）で３０分刺激されたＷＢ培養におけるＣ４ａの量を、Ｙ軸におけるクエン酸塩の対照に対する倍率変化（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）として示す。平均倍率変化±ＳＥＭを各群についてＸ軸に示す。ＩｇＧ  ＲＡＵ≧２３５を有する８／１０個体（８０％）及びＩｇＧ  ＲＡＵ＜２３５を有する０／７個体が、ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧによる≧１．５倍のＣ４ａ産生を示し、高いＲＡＵとより大きな補体活性化との間の有意な相関関係を支持した（**ｐ＝０．００６９）。
【図１５】健常なドナーからの全血における抗ベータグルカン抗体レベルとＣ５ａ産生との相関関係。個々の健常なドナーからのＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ（１０μｇ／ｍｌ）で３０分刺激されたＷＢ培養におけるＣ５ａの量を、Ｙ軸におけるクエン酸塩の対照に対する倍率変化として示す。平均倍率変化±ＳＥＭを各群についてＸ軸に示す。ＩｇＧ  ＲＡＵ≧２３５を有する１０／１０個体及びＩｇＧ  ＲＡＵ＜２３５を有する１／７個体（１４％）は、ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧによる≧１．５倍のＣ５ａ産生を示し、高いＲＡＵとより大きな補体活性化との間の有意な相関関係を支持した（*ｐ＝０．０３８１）。
【図１６】健常なドナーからの全血における抗ベータグルカンＲＡＵレベルとＳＣ５ｂ−９産生との相関関係。ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ（１０μｇ／ｍｌ）と３０分インキュベートされた健常なドナーの全血培養におけるＳＣ５ｂ−９の量。ＳＣ５ｂ−９レベル（Ｙ軸）は、ＩｇＧ  ＲＡＵの状態（Ｘ軸）によって層別化された（ｓｔａｔｉｆｉｅｄ）クエン酸塩の対照に対する倍率変化として示した。ＩｇＧ  ＲＡＵ≧２３５を有する１１／１１（すなわち１００％）の個体、対、ＩｇＧ  ＲＡＵ＜２３５を有する０／９（すなわち０％）の個体は、≧２倍のＳＣ５ｂ−９産生を示し、高いＲＡＵとより大きな補体活性化との間の有意な相関関係を支持した（**ｐ＝０．００８２）。
【図１７】健常なドナーからの全血のＰＭＮにおけるＣＲ３の表面発現の増加と抗ベータグルカン抗体レベルとの相関関係。個々の健常なドナーからのＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ（１０μｇ／ｍｌ）で３０分刺激されたＷＢ培養におけるＣＤ１５＋好中球でのＣＲ３の表面発現を、Ｙ軸におけるクエン酸塩の対照に対するＭＦＩ変化率として示す。平均ＭＦＩ変化率±ＳＥＭを各群についてＸ軸に示す。ＩｇＧ  ＲＡＵ＜２３５を有する個体（Ｎ＝７）と比較すると、ＩｇＧ  ＲＡＵ≧２３５を有する個体（Ｎ＝１１）からの好中球は、表面ＣＲ３レベルの有意な増加を示した（*ｐ＝０．０２１１）。
【図１８】健常なドナーからの全血のＰＭＮにおけるＣＤ８８発現の減少と抗ベータグルカン抗体レベルとの相関関係。個々の健常なドナーからのＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ（１０μｇ／ｍｌ）で３０分刺激されたＷＢ培養におけるＣＤ１５＋好中球でのＣＤ８８の表面発現を、Ｙ軸におけるクエン酸塩の対照に対するＭＦＩ変化率として示す。平均ＭＦＩ変化率±ＳＥＭを各群についてＸ軸に示す。ＩｇＧ  ＲＡＵ＜２３５を有する個体（Ｎ＝８）と比較すると、ＩｇＧ  ＲＡＵ≧２３５を有する個体（Ｎ＝１３）からの好中球は、表面ＣＤ８８レベルの有意な減少を示した（*ｐ＝０．０１９７）。
【図１９】健常なドナーの全血をＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ（１０μｇ／ｍｌ）とインキュベートし、ＣＤ１５＋好中球でのＣＤ６２Ｌの表面発現を分析した。パーセントのＣＤ１５+ＣＤ６２Ｌlo細胞（個々及び平均±ＳＥＭ）を、Ｘ軸上のＲＡＵの状態によって層別化されたＹ軸上に示す。ＩｇＧ  ＲＡＵ≧２３５を有する個体からの好中球は、ＣＤ６２Ｌ発現の有意な減少を示した（**ｐ＝０．００５）。
【図２０】健常なドナーの全血をＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ（１０μｇ／ｍｌ）と一晩インキュベートし、その後血漿ＩＬ−８レベルを測定した。ＩＬ−８レベル（Ｙ軸）は、ＩｇＧ  ＲＡＵの状態（Ｘ軸）によって層別化されたクエン酸塩の対照に対する倍率変化として示した。ＩｇＧ  ＲＡＵ≧２３５を有する１２／１３（すなわち９２％）の個体、対、ＩｇＧ  ＲＡＵ＜２３５を有するわずか３／１３（すなわち２３％）の個体は、ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧによる≧２倍のＩＬ−８産生を示し、高いＲＡＵとより大きなＩＬ−８産生との間の有意な相関関係を支持した（**ｐ＝０．００２８）。
【図２１】健常なドナーからの全血における抗ベータグルカン抗体レベルとＳＣ５ｂ−９産生との相関関係。個々の健常なドナーからのＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ（１０μｇ／ｍｌ）で３０分刺激されたＷＢ培養におけるＳＣ５ｂ−９の量を、Ｙ軸におけるクエン酸塩の対照に対する倍率変化として示す。平均倍率変化±ＳＥＭを各群についてＸ軸に示す。ＩｇＭ  ＲＡＵ＜２３５を有する個体（Ｎ＝９）と比較すると、ＩｇＭ  ＲＡＵ≧３３０を有する個体（Ｎ＝３）からの好中球は、ＳＣ５ｂ−９産生の有意な増加を示した（***ｐ＝０．０００３）。
【図２２】クマシーブルーで染色した精製された「至適参照（ｇｏｌｄ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」ＩｇＧ及びＩｇＭ抗β−グルカン抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜２０％還元条件下）。キロダルトン（ｋＤａ）で表される分子量（ＭＷ）を有するタンパク質標準をレーン３に示す。
【図２３】（Ａ）健常な対象の全血におけるＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧの好中球結合と、ＩｇＧ抗β−グルカン抗体濃度との相関関係；（Ｂ）健常な対象の全血におけるＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧの好中球結合と、ＩｇＭ抗β−グルカン抗体濃度との相関関係。
【図２４】（Ａ）健常な対象の全血におけるＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧの単球結合と、ＩｇＧ抗β−グルカン抗体濃度との相関関係；（Ｂ）健常な対象の全血におけるＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧの単球結合と、ＩｇＭ抗β−グルカン抗体濃度との相関関係。
【図２５】（Ａ）高対低バインダー状態に基づくＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧの好中球結合と、ＩｇＧ抗β−グルカン抗体濃度との相関関係；（Ｂ）高対低バインダー状態に基づくＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧの好中球結合と、ＩｇＭ抗β−グルカン抗体濃度との相関関係。
【図２６】（Ａ）高対低バインダー状態に基づくＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧの単球結合と、ＩｇＧ抗β−グルカン抗体濃度との相関関係；（Ｂ）高対低バインダー状態に基づくＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧの単球結合と、ＩｇＭ抗β−グルカン抗体濃度との相関関係。
【図２７】（Ａ）好中球結合に基づくＩｇＧのＲＯＣ曲線解析；（Ｂ）好中球結合に基づくＩｇＭのＲＯＣ曲線解析。
【図２８】（Ａ）単球結合に基づくＩｇＧのＲＯＣ曲線解析；（Ｂ）単球結合に基づくＩｇＭのＲＯＣ曲線解析。
【図２９】高対低バインダー状態に基づくＩｇＧ抗β−グルカン抗体サブクラスの好中球結合。
【図３０】ＩｇＧ抗β−グルカン抗体サブクラスの好中球結合。
【図３１】低バインダー患者のＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ処置のための抗βグルカン抗体を増加させるための、静注用免疫グロブリン（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  免疫グロブリン）（ＩＶＩＧ）のイン・ビボ注入の結果。（Ａ）ＩｇＧ  ＲＡＵ；（Ｂ）ＰＭＮ結合及び単球結合；（Ｃ）Ｃ５ａ倍率増加（ｆｏｌｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅ）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
例示的な実施形態の詳細な説明
β−グルカンは、様々な微生物、並びに例えば、酵母、細菌、藻類、海藻、キノコ、オート麦、及び大麦を含む植物源に由来するグルコースのポリマーである。これらの内、酵母β−グルカンは、その免疫調節特性が広範囲に調査されている。酵母β−グルカンは、様々な形態、例えば、インタクト酵母、ザイモサン、精製全グルカン粒子、可溶化ザイモサン多糖、又は異なる分子量の高精製可溶性β−グルカンで存在し得る。構造的に、酵母β−グルカンは、β−（１，６）グリコシド結合を介して骨格に結合された過β−（１，３）グルコピラノース分枝を有する、β−（１，３）−結合グルコピラノース骨格として構成されるグルコースモノマーから成る。酵母β−グルカンの異なる形態は、互いに異なって機能し得る。酵母β−グルカンがその免疫調節効果を発揮するメカニズムは、β−グルカンの異なる形態間の構造差、例えば、その粒子性又は可溶性特性、三次元構造、主鎖の長さ、側鎖の長さ、及び側鎖の頻度によって影響される。酵母β−グルカンの免疫刺激機能は、異なる種の異なる細胞型に関与する受容体にも依存し、これは再度、β−グルカンの構造特性に依存し得る。
【００１４】
一般的に、β−グルカン免疫療法は、対象へ任意の適した形態のβ−グルカン又はβ−グルカンの２又は３以上の形態の任意の組合せを投与することを含むことができる。適したβ−グルカン及び自然源の適したβ−グルカンの調製物は、例えば、米国特許出願公開第２００８／０１０３１１２  Ａ１号明細書に記載される。場合により、β−グルカンは酵母、例えば、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来してよい。場合により、β−グルカンは、本願明細書において、可溶性酵母由来のβ−グルカンの高精製及び特徴がはっきりした形態である、ＰＧＧ（ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ、バイオセラ（Ｂｉｏｔｈｅｒａ）、イーガン、ミネソタ州）とも呼ぶ、β（１，６）−［ポリ−（１，３）−Ｄ−グルコピラノシル］−ポリ−β（１，３）−Ｄ−グルコピラノースである又はそれに由来してよい。さらに、β−グルカン−ベースの免疫療法は、例えば、修飾及び／又は誘導体化β−グルカン、例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１２／３６７９５号に記載されるものの使用を含むことができる。他の場合、β−グルカン免疫療法は、例えば、米国特許第７，９８１，４４７号明細書に記載の粒子性可溶性β−グルカン又は粒子性可溶性β−グルカン調製物を投与することを含むことができる。
【００１５】
バイオマーカー研究は、ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧに結合するそれらの好中球及び単球の能力における対象間の差異を示した。それら細胞へのＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧの結合は、対象のＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧへの免疫調節反応と相関した。また、好中球及び単球へのＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧの結合は、特定のレベルの自然の抗β−グルカン抗体の存在を含む。
【００１６】
本開示は、患者の血清試料中の抗β−グルカンＩｇＧ及びＩｇＭ抗体を定量的に測定するための単純なＥＬＩＳＡ法を提供する。ＥＬＩＳＡ法はバイオマーカーアッセイとして用いられてもよい。バイオマーカーアッセイのためのカットオフレベルは、健常なボランティアのバイオマーカー陽性及びバイオマーカー陰性サブグループを同定し、そしてそれらのカットオフポイントは結合、機能、及び臨床転帰と相関する。
【００１７】
健常なボランティアからの好中球へのＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧの結合を評価する先の研究は、異なる結合能力を有する対象を明らかにした。ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧの高い好中球結合（例えば＞２０％の好中球に結合するＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ）が、健常なボランティアの〜４０％に見られた。ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧの単球結合は健常なボランティアにおける好中球の結合能に匹敵する。イン・ビトロで、高い好中球バインダー及び高い単球バインダーは、低バインダーよりも多くのＩＬ−８を産生する。
【００１８】
より高い自然の抗β−グルカン抗体レベルはＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧの好中球結合に対応する。高バインダー血清／血漿は、低バインダーから好中球へのＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ結合を増大させることができる。高バインダー血清中の抗Β−グルカン抗体は、非許容結合条件での低バインダーにおける好中球ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ結合を増大させることができる。例えば、高い自然の抗β−グルカン抗体価を含む静注用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）は、低バインダーから好中球へのＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ結合を増大させることができる。自然の抗β−グルカンＩｇＧ及び／又はＩｇＭ抗体は好中球及び単球への結合に関与する。特定の理論に縛られることを望むものではないが、自然の抗β−グルカン抗体（例えばＩｇＧ及びＩｇＭ）はＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧに結合する。ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧは、補体活性化の古典経路を介してオプソニン化される。オプソニン化されたＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧは好中球及び単球上のＣＲ３受容体のレクチン様ドメインに結合する。ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧのオプソニン化（すなわちｉＣ３ｂ沈着）が、抗体結合後に補体活性化の古典経路の結果として起こる。いくつかの機能的なマーカーは、例えばＣ４ａ、Ｃ５ａ及びＳＣ５ｂ−９などのＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧの好中球及び／又は単球結合の過程で調節される。
【００１９】
全血試料中の好中球及び／又は単球へのＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ結合は、例えばフローサイトメトリーを使用するアッセイを用いて再現性よく測定することができる。しかしながら、そのようなアッセイのための全血の使用はある課題を提示する。例えば、血液試料は採取の２４時間以内に受け取られ、処理されることを必要とするため、それは生きている健康な細胞を必要とする。したがって、輸送条件及び環境要因は血液細胞を損傷し得る。そのようなアッセイは、既知の高バインダー及び低バインダーの対象からの対照血液試料も必要とした。最終的に、概念上は単純なアッセイであっても、フローサイトメトリー技術は多くの臨床研究室では一般的ではない。したがって、フローサイトメトリーに基づくアッセイは臨床開発には実用的なアッセイではない。
【００２０】
本開示は、ヒト血清試料中の内因性抗β−グルカン抗体レベルを測定するための単純な定量的ＥＬＩＳＡを含む方法を提供する。該方法は、実用的な臨床試験の開発のためのフローサイトメトリーに基づくアッセイにより提示された課題を克服する。血清ベースのＥＬＩＳＡアッセイは一般的な臨床アッセイであり、ほとんどの臨床研究室で行うことができる。また、血清試料は凍結することができ、より容易な貯蔵、輸送及びアッセイ性能の一貫性をもたらす。
【００２１】
いくつかの実施形態では、β−グルカンは、酵母、例えば、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来してよい。いくつかの実施形態では、β−グルカンは、β−１，３／１，６グルカン、例えば、β（１，６）−［ポリ−（１，３）−Ｄ−グルコピラノシル］−ポリ−β（１，３）−Ｄ−グルコピラノースを含むことができる。
【００２２】
いくつかの実施形態では、免疫細胞に結合されたβ−グルカンは、β−グルカンに特異的に結合するモノクローナル抗体と試料を接触させることによって検出できる。モノクローナル抗体は、特異的にβ−グルカンに結合する任意のモノクローナル抗体としてよい。本願明細書において、「特異的」及びその変形は、特定の標的に関して特異的な又は非一般的（すなわち、非特異的）結合性をある程度有することを意味する。β−グルカンを特異的に結合する代表的なモノクローナル抗体は、例えば、米国特許第６，２９４，３２１号明細書に記載の、ＢｆＤ  Ｉ、ＢｆＤ  ＩＩ、ＢｆＤ  ＩＩＩ及び／又はＢｆＤ  ＩＶ（バイオセラ、イーガン、ミネソタ州）として特定されるモノクローナル抗体を含む。
【００２３】
血清中の抗体の量を測定する従来の手法は、試料が連続的に希釈されるアッセイの文脈においてＥＬＩＳＡの使用を典型的に含む。段階希釈物はＥＬＩＳＡアッセイに供され、血清試料中の抗体の量は、陽性アッセイ反応を生じる血清試料の最大希釈に基づいて推定される。得られる力価の値は、抗体の量の正確な測定値ではなく、希釈範囲内の推定値である。段階希釈法は、血清中の抗体の量（力価レベル）を決定するために血液学において頻繁に用いられる。力価レベルを決定することは、ワクチンに対する抗体反応を評価するために頻繁に用いられる。しかしながら、段階希釈法では、産生される抗体の正確な量を直接に測定することができない。その代わりに、希釈範囲内で産生される抗体の量を推定するしかない。それゆえ力価レベルは、データ及び／又は統計的な分析技術の変更をすることなく直接的な方法での標準的な統計分析に適していない。
【００２４】
対照的に、本開示はヒト血清中のＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧに対する自然の抗β−グルカン抗体を測定するＥＬＩＳＡに基づく方法を提供する。該方法は自然の抗β−グルカン抗体の量を、統計的要件内の相対抗体単位（ＲＡＵ）又は抗β−グルカン抗体濃度のいずれかとして定量的に測定することを含む。これは、同じアッセイにおいて力価を得ること、及びＲＡＵデータ又は抗体濃度データ（いずれも検量線から決定される）のいずれかを相関させることによって達成される。したがって、本明細書に記載される方法は、自然の抗β−グルカン抗体の確立されたレベルを有する血清から内部標準曲線を作成することを含む。また該方法は、相対的又は実際の抗β−グルカン抗体を定量的に測定する、力価を測定するよりも優れた方法を提供する。
【００２５】
該方法は、抗β−グルカンＩｇＧ及び／又は抗β−グルカンＩｇＭを測定することに使用することができる。ＩｇＧ及び／又はＩｇＭについてのＲＡＵの計算結果を表７に示す。ＩｇＧ及び／又はＩｇＭについての抗体濃度の計算結果を表８及び表９にそれぞれ示す。該方法はアッセイ内精度（ｉｎｔｒａ−ａｓｓａｙ  ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）、すなわちプレート間の再現性（ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ）を与える。該方法はアッセイ間精度（ｉｎｔｅｒ−ａｓｓａｙ  ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）、すなわち、対照及び試験血清試料についてアッセイ及び／又はアッセイ日間の再現性も与える。該方法は、一人のオペレーターによって異なる試験プレート上で分析された複数の試料を評価することを可能にする。したがって該方法は、１日に複数の試料を分析する一人のオペレーターの手によってであろうと、複数日にわたって複数のオペレーターの手によってであろうとも、信頼性、再現性のある結果を与える。
【００２６】
結合及び機能に必要な抗β−グルカン抗体レベルは個体により変動し得る。図２は、ＩＶＩＧによる抗β−グルカンＩｇＧ  ＲＡＵレベルの用量依存的な増加を示す。該方法は、ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧに反応しないであろう個体を除外することになるＲＡＵレベルを同定し、そして反応するより高い確率を有するバイオマーカー陽性の対象を富ませる、バイオマーカーのカットオフを使用することを含む。結合及び機能的データは≧ＩＶＩＧ−５グループ（ＲＡＵ  ２３３〜６１０）で生じる最大活性を示し、それゆえ、ＩｇＧのカットオフについてのさらなる解析は２００を超えるＲＡＵ範囲に焦点を置くべきである（図７）。
【００２７】
３２人の健常なボランティアにおける最初の研究は、好中球又は単球におけるＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧの結合及び機能に必要な自然の抗β−グルカン抗体の特定の最小レベル（ＩｇＧ及び／又はＩｇＭのＲＡＵ）を確立するために行われた。ＩｇＧ及び／又はＩｇＭの抗β−グルカン抗体濃度として定量された最小レベルは、健常な対象のより大きなコホート（ｎ＝１４３）を用いてさらに最適化され、そして好中球及び単球へのＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧの結合、ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ誘導性の機能変化、並びに臨床転帰に関して、上昇した抗β−グルカン抗体レベルの重要性を確認した。好中球及び単球へのＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ結合をもたらす抗β−グルカン抗体レベルを有する対象は「バイオマーカー陽性」とみなされる。対象がＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧを含む治療により良く反応するために、対象が代替処置を受けるか、抗β−グルカン抗体処置を受けるかができるように、バイオアッセイは、好中球及び単球へのＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ結合にとって低すぎる抗β−グルカン抗体レベルを有する臨床設定において対象を同定することを可能にする（「バイオマーカー陰性」）。また、バイオマーカー陽性個体はバイオマーカー陰性個体よりも免疫適格であってもよく、したがって免疫療法薬により良く反応し得る。
【００２８】
ＲＡＵ法を使用する場合、少なくとも最小ＩｇＧ  ＲＡＵ所定値のＩｇＧ  ＲＡＵを有すること、及び／又は、少なくとも最小ＩｇＭ  ＲＡＵ所定値のＩｇＭ  ＲＡＵを有することによって、個体をバイオマーカー陽性とすることができる。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ  ＲＡＵ所定値は、少なくとも２００、例えば、少なくとも２０５、少なくとも２１０、少なくとも２１５、少なくとも２２０、少なくとも２２５、少なくとも２３０、少なくとも２３５、少なくとも２４０、少なくとも２４５、少なくとも２５０、少なくとも２５５、少なくとも２６０、少なくとも２６５、少なくとも２７０、又は少なくとも２７５、とすることができる。いくつかの実施形態では、ＩｇＭ  ＲＡＵ所定値は、少なくとも３００、例えば、少なくとも３０５、少なくとも３１０、少なくとも３１５、少なくとも３２０、少なくとも３２５、少なくとも３３０、少なくとも３３５、少なくとも３４０、少なくとも３４５、少なくとも３５０、少なくとも３５５、少なくとも３６０、少なくとも３６５、少なくとも３７０、又は少なくとも３７５、とすることができる。すなわち、例えば少なくとも２００のＩｇＧ  ＲＡＵ、又は、例えば少なくとも３００のＩｇＭ  ＲＡＵは、少なくとも５％の好中球結合β−グルカン、ならびにβ−グルカン「高バインダー」状態に関連する好中球及び単球の機能的調節を示す個体と理論的に相関する。
【００２９】
例えば、図８は、計算されたＩｇＧ  ＲＡＵの機能として３２人の健常なボランティアのそれぞれについてのパーセントの好中球結合のプロットを示す。５％の好中球結合における水平線は、「低バインダー」から「高バインダー」を線引きする。そのＩｇＧ  ＲＡＵが低すぎて５％超の好中球と結合できないそれらボランティアと、そのＩｇＧ  ＲＡＵが少なくとも５％のそれらの好中球結合β−グルカンを示すのに十分であったボランティアとを区別するために、本発明者らは２３５のＩｇＧ  ＲＡＵにおけるカットオフラインを確立し（図１０）、最低ＩｇＧ  ＲＡＵ値の下で最も近い値は５％よりも高い好中球結合β−グルカン（２３９）を示した。本発明者らはその後、５％よりも多い好中球結合β−グルカンを有したが、ＩｇＧバイオマーカー陰性であった３人の個体のレベルを評価した（図９、丸で囲った）。それら３人の個体はＩｇＧバイオマーカー陰性、すなわち２３５未満のＩｇＧ  ＲＡＵであったが、それにもかかわらず少なくとも５％のそれらの好中球結合β−グルカンを示した。好中球結合をＩｇＭ  ＲＡＵの機能としてプロットした場合、３３０のＩｇＭ  ＲＡＵカットオフ値を確立した（図１３）。
【００３０】
さらに最適化される抗体濃度方法を使用する場合、少なくとも最小ＩｇＧ抗β−グルカン抗体濃度所定値のＩｇＧ抗β−グルカン抗体濃度を有すること、及び／又は、少なくとも最小ＩｇＭ抗β−グルカン抗体濃度所定値のＩｇＭ抗β−グルカン抗体濃度を有することによって、個体をバイオマーカー陽性とすることができる。全血の同一ドロー由来の血清からのＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ結合及び抗β−グルカン抗体濃度測定を健常なボランティア、Ｎ＝１４３において評価した。Ｎ＝１４３の個体について決定されるＩｇＧ及びＩｇＭ抗β−グルカン抗体濃度の範囲は、それぞれ１．１３〜２０９．８μｇ／ｍｌ（７．８〜１４４７．８ＲＡＵ／ｍｌ）及び５．３〜２０３２．７μｇ／ｍｌ（１２．８〜４８７８．４ＲＡＵ／ｍｌ）であった。好中球及び単球のいずれも、それぞれ約１４μｇ／ｍｌ（１００ＲＡＵ／ｍｌ）及び４２μｇ／ｍｌ（１００ＲＡＵ／ｍｌ）のＩｇＧ及びＩｇＭ抗β−グルカン抗体レベルで、より頻繁に５％よりも高い結合を示した。
【００３１】
それゆえ、いくつかの実施形態では、ＩｇＧ抗β−グルカン抗体濃度所定値は、少なくとも１４μｇ／ｍｌ（１００ＲＡＵ）、例えば、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、又は少なくとも８０μｇ／ｍｌ（１００ＲＡＵ）、とすることができる。いくつかの実施形態では、ＩｇＭ抗β−グルカン抗体濃度所定値は、少なくとも４２μｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０、少なくとも２００、少なくとも２１０、少なくとも２２０、少なくとも２３０、少なくとも２４０、少なくとも２５０、少なくとも２６０、少なくとも２７０、少なくとも２８０、少なくとも２９０、少なくとも３００、少なくとも３１０、少なくとも３２０、少なくとも３３０、少なくとも３４０、少なくとも３５０、少なくとも３６０、少なくとも３７０、少なくとも３８０、少なくとも３９０、少なくとも４００、少なくとも４１０、少なくとも４２０、少なくとも４３０、少なくとも４４０、少なくとも４５０、少なくとも４６０、少なくとも４７０、少なくとも４８０、少なくとも４９０、少なくとも５００、少なくとも５１０、少なくとも５２０、少なくとも５３０、少なくとも５４０、又は少なくとも５５０μｇ／ｍｌ（１００ＲＡＵ）、とすることができる。すなわち、例えば少なくとも１４μｇ／ｍｌのＩｇＧ抗β−グルカン抗体濃度又は、例えば少なくとも４２μｇ／ｍｌのＩｇＭ抗β−グルカン抗体濃度は、少なくとも５％の好中球又は単球結合β−グルカン、ならびにβ−グルカン「高バインダー」状態に関連する好中球及び単球の機能的調節を示す個体と理論的に相関する。
【００３２】
図２３及び図２４は、計算された（Ａ）ＩｇＧ及び（Ｂ）ＩｇＭ抗β−グルカン抗体濃度の機能として、健常な各ボランティアについてのパーセントの好中球及び単球結合のプロットを示す。示されるように、ＩｇＧ及び／又はＩｇＭ抗β−グルカン抗体濃度が上昇するにつれて、好中球及び単球へのＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ結合が増加する。
【００３３】
図２５及び図２６に示されるように、高及び低ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧバインダーを区別する５％の結合レベルで、ＩｇＧ及びＩｇＭ抗β−グルカン抗体濃度と、好中球及び単球両方の結合との間には強い相関関係があった。抗β−グルカン抗体濃度と、年齢、性別又は総免疫グロブリンとの間には相関関係は無かった（データは示さず）。
【００３４】
次に、１４３人の健常なボランティアにおいて抗β−グルカン抗体濃度の探索的なカットオフを調査した。ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧの好中球及び単球両方の結合について５％のレベルを使用して、抗β−グルカン濃度の感度と特異度との間の相関関係を、ＲＯＣ曲線解析を用いて決定した（図２７及び図２８）。結合について９５％の最初の探索的な特異度で、抗β−グルカン抗体濃度のカットオフを決定し、健常な集団におけるバイオマーカーの保有率（ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ）と、結合状態を決定するためのその感度の両方を計算するために使用した。結果を表１に示す。
【００３５】
【表１】
0006673829.tif 000002
【００３６】
陽性のＩｇＧ抗β−グルカンバイオマーカー状態は、一連のカットオフのいずれかを使用するイン・ビトロのＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧの生物学的活性と高度に相関している。しかしながら、ＲＯＣ曲線解析によって示されるように、異なるカットオフにおける同様の感度はＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧの生物学的活性と相関する抗β−グルカン抗体濃度の範囲を示す。
【００３７】
それゆえ、種々の抗β−グルカン抗体濃度のカットオフを調査し、そして該カットオフが高バインダー及び低バインダー（バイオマーカー陽性及びバイオマーカー陰性）状態へと個体を理論的に分離するかどうかを判断するために機能的エンドポイントを用いた。ＩＬ−８産生をＩｇＧ抗β−グルカン抗体濃度のカットオフの範囲を探索するために機能的エンドポイントとして使用した。結果を表２に示す。
【００３８】
【表２】
0006673829.tif 000003
【００３９】
同様に、Ｃ４ａ／ＳＣ５ｂ９産生をＩｇＭ抗β−グルカン抗体濃度のカットオフの範囲を探索するために機能的エンドポイントとして使用した。結果を表３に示す。
【００４０】
【表３】
0006673829.tif 000004
【００４１】
データから明らかなように、特定のＩｇＧ抗β−グルカン抗体濃度又はＲＡＵのカットオフは、ＲＯＣ曲線解析を用いる臨床試験における患者の層別化又は選択に必要であると見なされる、特異度及び感度の組み合わせに応じて選択することができる。例えば、２７６ＲＡＵ／ｍｌ又は４０μｇ／ｍｌのカットオフは、健常なボランティアにおけるＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧの好中球及び単球結合のＲＯＣ曲線解析に基づく、約９８％の特異度及び６１％の感度を有するであろう。
【００４２】
ここで用いられるＣ４ａ産生のような機能解析に基づく、ＩｇＭ抗β−グルカン抗体濃度又はＲＡＵのカットオフの合理的な範囲は、２００〜３５０ＲＡＵ／ｍｌ又は８３〜１４６μｇ／ｍｌであってもよい。上記のように、特定のＩｇＭ抗β−グルカン抗体濃度又はＲＡＵのカットオフは、特定の臨床試験における患者の層別化又は選択に必要であると見なされる、特異度及び感度の組み合わせに応じて選択することができる。例えば、２５０ＲＡＵ／ｍｌ又は１０４μｇ／ｍｌのカットオフは、健常なボランティアのＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧの好中球及び単球結合のＲＯＣ曲線解析に基づく、約９４％の特異度及び３１％の感度を有するであろう。
【００４３】
さらなる支持として、表１に示されるカットオフを使用すると、バイオマーカーの状態は、補体成分Ｃ３ａ、Ｃ５ａ、ＳＣ５ｂ９の活性化、好中球ＣＲ１、ＣＲ３、ＣＤ８８及びＣＤ６２Ｌ表面マーカー発現の調節、ならびにＩＬ−８誘導を含む、ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧにより誘導される機能的変化と相関する。結果を表４に示す。
【００４４】
【表４】
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【００４５】
バイオマーカーのカットオフをその後ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧを含む肺がんの治療を研究する２つの臨床試験において患者に適用した。第１の無作為化、第２相試験では、５９人のステージＩＶのＮＳＣＬＣ患者が、最初の４から６サイクルについてそれぞれ３週の処置サイクルの１、８及び１５日目にＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ  ４ｍｇ／ｋｇを含み、又は含まず（対照）に、セツキシマブ、カルボプラチン、及びパクリタキセルの投与を受けた。セツキシマブ単独で、又はＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧとの組み合わせによる維持治療を疾患の進行まで続けた。上記の健常なボランティアのデータ及び機能的データによって確立された範囲内の種々のポイントにおけるカットオフを調べた。結果を表５に示す。
【００４６】
【表５】
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【００４７】
全生存中央値（Ｍｅｄｉａｎ  Ｏｖｅｒａｌｌ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ）（ＯＳ）は臨床試験現場で研究員によって決定された。一部の患者については、バイオマーカーの状態が処置の経過中に変化する。それゆえ、バイオマーカー陽性状態が、第１又は第２サイクルのいずれかで上記カットオフを測定する患者へと与えられた。
【００４８】
例として、５１μｇ／ｍｌのＩｇＧ抗β−グルカン抗体濃度、１１８μｇ／ｍｌのＩｇＭ抗β−グルカン抗体濃度のカットオフを使用すると、２５人の患者がバイオマーカー陽性である。バイオマーカー陽性患者は、バイオマーカー陰性患者についての２６１日と比較して、４２９日の全生存中央値を有した。したがって、２つのグループ間の生存の差は有意差である１６８日である。ここで与えられた例のうち、このカットオフは本臨床試験における最良の分離をもたらす。残りの例のカットオフは２つのグループ間でより小さい全生存中央値の差をもたらす。しかしながら、ある場合に、カットオフを引き下げることによってより多くの患者を治療することは理想的であり得る。そして上述のように、ＲＯＣ曲線解析を用いて、患者の分離をカスタマイズするために必要に応じて特異度及び感度を変更することができる。
【００４９】
第２の無作為化、第２相試験では、５８人のステージＩＶのＮＳＣＬＣ患者が、上記試験と同様の処置サイクルでＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ  ４ｍｇ／ｋｇを含み、又は含まず（対照）に、ベバシズマブ、カルボプラチン、及びパクリタキセルの投与を受けた。ベバシズマブ単独で又はＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧとの組み合わせによる維持治療を疾患の進行まで続けた。上記の健常なボランティアのデータ及び機能的データによって確立された範囲内の種々のポイントにおけるカットオフを調べた。結果を表６に示す。
【００５０】
【表６】
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【００５１】
本臨床試験について、最適なカットオフは、６０μｇ／ｍｌのＩｇＧ抗β−グルカン抗体濃度及び１００μｇ／ｍｌのＩｇＭ抗β−グルカン抗体濃度で生じる。残りの例によって示されるように、そのカットオフのいずれかの側のカットオフはすぐに機能せず、実用的な差異を与えない。
【００５２】
さらに、所望の（ＲＯＣ曲線解析により計算された）特異度及び感度に応じて、抗β−グルカン抗体の補充をすることなくＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ処置に反応する患者の層別化を達成するために適切なカットオフを選択することができる。
【００５３】
バイオマーカーの状態（高バインダー対低バインダー）に基づく患者の分離は、上述の範囲内のカットオフを使用して達成することができる。したがって、バイオマーカーの状態は、成功したβ−グルカン免疫療法の予測因子として使用することができる。
【００５４】
上述のように、一部の患者のバイオマーカー状態は治療の過程で変化し得る。それゆえ本発明者らは、治療の１サイクル後にバイオマーカー陽性状態を示した患者、対、治療の任意のサイクル後−Ｃ１／Ｃ２／Ｃ３のいずれか１つの後−にバイオマーカー陽性状態を示した患者についての、カットオフ値を評価した。
【００５５】
【表７】
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【００５６】
例として、バイオマーカー陽性患者とバイオマーカー陰性患者とを分ける、６０μｇ／ｍｌのＩｇＧ抗β−グルカン抗体濃度、１００μｇ／ｍｌのＩｇＭ抗β−グルカン抗体濃度のカットオフを使用すると、ベバシズマブ治療を受けるバイオマーカー陽性患者は同じカットオフ値を使用するバイオマーカー陰性患者よりも２００日超多い全生存中央値を有した。同様に、４５μｇ／ｍｌのＩｇＧ抗β−グルカン抗体濃度、１１０μｇ／ｍｌのＩｇＭ抗β−グルカン抗体濃度のカットオフを使用すると、セツキシマブ治療を受けるバイオマーカー陽性患者は同じカットオフ値を使用するバイオマーカー陰性患者よりも１３０日超多い全生存中央値を有した。表５及び表６に提示されるデータに関して上述のように、ＲＯＣ曲線解析を用いて患者の分離をカスタマイズするために必要に応じて、特異度及び感度の所望の組み合わせについて適切なカットオフ値を選択することができる。
【００５７】
【表８】
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【００５８】
ここでまた、バイオマーカー陽性患者の生存率を最大にするために適切なＩｇＧ及びＩｇＭ  カットオフ値を選択することができる。例えば、６０μｇ／ｍｌのＩｇＧ抗β−グルカン抗体濃度、１００μｇ／ｍｌのＩｇＭ抗β−グルカン抗体濃度のカットオフを使用すると、ベバシズマブ治療を受けるバイオマーカー陽性患者は同じカットオフ値を使用するバイオマーカー陰性患者よりも１５０日超多い全生存中央値を有した。４５μｇ／ｍｌ又は５０μｇ／ｍｌのいずれかのＩｇＧ抗β−グルカン抗体濃度、及び１１０μｇ／ｍｌ又は１２０μｇ／ｍｌのいずれかのＩｇＭ抗β−グルカン抗体濃度のカットオフを使用すると、ベバシズマブ治療を受けるバイオマーカー陽性患者は同じカットオフ値を使用するバイオマーカー陰性患者よりも１５０日超多い全生存中央値を有した。
【００５９】
しかしながらいくつかの臨床的状況では、全生存は必ずしも最も関連性のある臨床的エンドポイントでなくともよい。場合によっては、全奏効率（ｏｖｅｒａｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｒａｔｅ）（ＯＲＲ）はより関連性があり得る。本明細書で使用される、「全奏効率」とは、治療後のがんのサイズ及び／又は増殖の測定可能な減少を示す患者のパーセンテージをいう。表９のデータは、ＩｇＧ及びＩｇＭのカットオフ値が臨床的エンドポイントとしてＯＲＲを使用して決定され得ることを示している。表９は、エンドポイントとして平均全生存及び全奏効率を反映する、上述のベバシズマブ及びセツキシマブの試験からの総合データを報告する。
【００６０】
【表９】
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【００６１】
表９は、バイオマーカー陽性とバイオマーカー陰性患者とを分けるために最も効果的なＩｇＧ／ＩｇＭカットオフ値が、分離を行うための臨床的エンドポイントとして全生存かそれとも全奏効率を使用するかによって多少異なってもよいことを示す。したがって、所与のバイオマーカー陽性患者の治療に最も関連性がある臨床的エンドポイントにかかわらず、本明細書に記載される方法はバイオマーカー陽性患者を同定するためのＩｇＧ／ＩｇＭカットオフ値を提供することができる。
【００６２】
本発明者らはバイオマーカーの状態を、成功したβ−グルカン免疫療法の予測因子として使用することができたということを確立するとすぐに、本発明者らはその後ＩｇＧサブクラスが関与したかどうかを調べた。ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧは糖類であり、そして糖鎖抗原へのヒトＩｇＧの反応は主にＩｇＧ2サブクラスに限られている。ＩｇＧ2は弱い補体活性因子であり、抗原−抗体の等量、又は抗体が過剰な場合にのみ補体活性化の古典経路を活性化する。ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧは補体（Ｃ４ａ、Ｃ５ａ、ＳＣ５ｂ９）を活性化することが示されてきたが、それは細胞表面上のＭＡＣ形成による細胞溶解を引き起こさない。加えて、ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧは、ドナーの大多数においてベル型の濃度−反応曲線を示す。結合、補体活性化、及びＩＬ−８産生は、１０又は２５μｇ／ｍｌで、ただし１００μｇ／ｍｌよりも低い場合に最適である。場合によっては、これは、抗原−抗体が等量である、又は抗体が１０μｇ／ｍｌ又は２５μｇ／ｍｌで過剰であることに起因し得るが、抗原は１００μｇ／ｍｌで過剰である。
【００６３】
それらがＩｇＧ抗β−グルカン抗体に関連するＩｇＧサブクラスを理解するために、ＩｇＧ抗β−グルカン抗体の各サブクラスに特的な二次抗体を用いて好中球結合を行った。まず、高バインダー及び低バインダー血清からのＩｇＧサブクラスを好中球への結合について試験した。結果を図２９に示す。結果から明らかなように、ＩｇＧ2サブクラスはバイオマーカーの状態に最も強い相関関係を示した。この知見は図３０に作成されたプロットにおいて検証された。高バインダー血清からのＩｇＧ2抗β−グルカン抗体の好中球結合はＩｇＧ1よりもはるかに強い相関関係をもたらした。
【００６４】
それゆえ、別の実施形態では、ＩｇＧ2抗β−グルカン抗体はＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ免疫療法のための予測バイオマーカーとして使用されてもよい。加えて、低バインダーである患者にとって、ＩｇＧ2抗β−グルカンの投与はＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ免疫療法への患者の反応を向上させるために使用されてもよい。
【００６５】
最後に、静注用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）のイン・ビボ注入が抗β−グルカン抗体レベルを増加させ、ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ処置への反応を向上させるということが示された。結腸直腸腺がんのためのセツキシマブ及びＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧの毎週の注入の併用治療を受ける５４歳の患者は、処置前の血清試料で測定された低い抗β−グルカン抗体レベルを有した。患者の抗β−グルカン抗体レベルを増加させるために、ＩＶＩＧ（１ｇ／ｋｇ）を、サイクル７で開始し、サイクル１２まで続く２８日の処置サイクルの最初の日に注入した。図３１Ａに示されるように、処置後の血清試料をＥＬＩＳＡによってＲＡＵ／ｍｌでＩｇＧ抗β−グルカン抗体レベルについて分析した。ＩＶＩＧの添加は、各サイクルの１日目の試料において抗β−グルカン抗体濃度を上昇させ、その後各サイクルの残りの週の間にベースラインレベルまで低下した。図３１Ｂでは、ＰＭＮｓ及び単球へのＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ結合のイン・ビボ結合をＦＡＣＳによって分析し、投与前試料と比較したＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ投与後の全血試料におけるＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ＋  ＰＭＮｓ又は単球の増加により計算した。結合は、患者がＩＶＩＧの注入を受けた日にＰＭＮｓ及び単球の両方について最も高い結合で測定された抗β−グルカン抗体濃度のレベルにより変化した。図３１Ｃでは、補体活性化を、投与前試料と比較したＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ投与後の血清においてＥＬＩＳＡにより測定された、Ｃ５ａの倍率増加によって測定した。Ｃ５ａレベルの２倍の増加をＩＶＩＧ注入に該当する患者試料にのみ観察した。
【００６６】
本明細書中に記載の方法は、β−グルカン例えばＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧの投与を含む治療レジメンから恩恵を受ける可能性が最も高い個体を同定することができる。したがって、本アッセイは、少なくとも部分的には、β−グルカンを含む治療に反応する対象の可能性に基づいて、医療専門家が治療的処置を個体により良く合わせることを可能にする。本アッセイは、様々な対象集団をより良く定義する臨床試験に含めるための個体をスクリーニングするために使用されてもよい。
【００６７】
用語「及び／又は」は、１又は全てのリストされたエレメント又はリストされたエレメントの任意の２又は３以上の組合せを意味し；用語「含む」及びその変形は、これらの用語が明細書の記載及び請求項に現れる場合に限定的な意味を有さず；他に特定されない限り、「ａ」「ａｎ」「ｔｈｅ」及び「少なくとも１つ」は、互換的に使用され、１又は２以上を意味し；エンドポイントによる数値範囲の列挙は、斯かる範囲内に含まれる全数値を含む（例えば、１から５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５等を含む）。
【００６８】
上記記載において、特定の実施形態は、明確化のため分離して記載されてよい。特定の実施形態の特徴が他の実施形態の特徴と適合しないと他に明確に特定されない限り、特定の実施形態は、１又は２以上の実施形態に関連して本明細書に記載の適合する特徴の組合せを含むことができる。
【００６９】
別々の工程を含む本明細書に開示される任意の方法に関して、斯かる工程は任意の実行可能な順で行われて良い。また、必要に応じて、２又は３以上の工程の任意の組合せが同時に行われて良い。
【００７０】
本願発明は、以下の実施例によって説明される。特定の実施例、材料、量、及び手順は、実施例は本願で説明されるように発明の趣旨及び範囲に従って広く解釈されるべきである、と理解されるべきである。
【実施例】
【００７１】
実施例１
コスター（Ｃｏｓｔａｒ）ユニバーサル結合プレートを、精製水中１μｇ／ｍｌでのＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ（バイオセラ、イーガン、ミネソタ州）によりウェル当たり５０μＬでコーティングし、３７℃で３０分間インキュベートした。コーティングされたプレートを続いて＞１５００μＷ／ｃｍ2の高強度の紫外線に５分間室温で曝露し、５分間室温で紫外線への第二の曝露前に、乾燥するまで５０℃の強制空気オーブン（ｆｏｒｃｅｄ  ａｉｒ  ｏｖｅｎ）中に静置した。プレートをその後、洗浄緩衝剤（０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝食塩水［ＰＢＳ］）で洗浄する前に、３０分超、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の０．５％溶液でブロックした。各アッセイの実行は２つのアッセイプレートを含んだ。各プレートは参照ヒト血清を連続的に希釈することによって作成された検量線を含んだ。プレートは参照血清として同様に希釈された４つの試験血清試料も含んだ。検量線のための希釈系列及び血清試料は、１：４００希釈から開始し、連続的な１：２希釈から最低希釈の１：５１，２００で続けた。希釈物は洗浄緩衝剤で作成された。参照血清の１：５０の希釈を曲線上の最も高いアンカーポイントとして使用した。参照及び血清試料の各希釈を２つのプレートのそれぞれにおける複製（ｒｅｐｌｉｃａｔｅ）ウェルで評価した。
【００７２】
ヒトＩｇＧにプレート結合ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧへの結合を可能にするため、試料をアッセイプレート上で室温で９０分間インキュベートした。インキュベーション後に、ウェルを洗浄緩衝剤で洗浄し、酵素標識二次抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼが結合したアフィニティー精製されたヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃガンマ特異的抗体）をウェル中でインキュベートし、ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ抗原に結合したヒトＩｇＧに結合させた。二次抗体を洗浄緩衝剤で洗浄する前に９０分間インキュベートした。洗浄緩衝剤をウェルから除去した後、ペルオキシダーゼ基質をウェル中でインキュベートし、５分の発色現像において発色現像を〜１Ｍのリン酸でクエンチした。マイクロタイタープレートリーダーを使用して４５０ｎｍでの光学密度を測定し、複製ウェルからの平均を算出した。
【００７３】
結果を２つの方法で計算した：
１）力価：力価を、０．１ＯＤよりも大きい又は等しい光学密度測定値を有する試料の最大希釈係数として決定した。
２）ＲＡＵ−任意の値の１６０を参照血清に割り当てた（１６０相対抗体単位（ＲＡＵ／ｍＬ））したがって、アッセイ方法における１：４００希釈は、検量線上の最高点として４００ｍＲＡＵ／ｍＬの値をもたらす。希釈値及び対応するＲＡＵ値を表１０に記載する。
【００７４】
【表１０】
0006673829.tif 000011
【００７５】
試料及び対照についてのＲＡＵ値を、検量線として参照ヒト血清希釈系列を使用して４パラメーターフィットにより計算した。検量線の直線部分に含まれる各試料希釈についてのｍＲＡＵでの濃度を検量線からの補間によって計算し、希釈の補正に続く。その後、それらの逆算された複数希釈から各試料の平均濃度を導き出した。
結果を図１Ａに示す。
【００７６】
実施例２
ＩｇＧ及びＩｇＭ抗β−グルカン抗体の「至適参照標準（ｇｏｌｄ  ｒｅｆｅｒｅｎｓｅ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ）」を、市販の、プールされた正常ヒト血漿由来の９５％純度の総ＩｇＧ及びＩｇＭ画分（アセンズ・リサーチ・アンドテクノロジー（Ａｔｈｅｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、アテネ、ＧＡ）から精製した。ＩｇＧ及びＩｇＭ画分をＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧアフィニティーカラムを通過させ、濃縮し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて純度を特徴づけた。図２２参照。「至適参照標準」の段階希釈を、標準曲線を生成するための以下に記載の方法によって、検量線を作成するために使用した。アッセイの実用参照標準を、「至適参照標準」に対するキャリブレーションによって決定される抗β−グルカン濃度を有するプールされた正常ヒト血清から調製した。アッセイの対照を、実用標準曲線上の定義された位置に近い抗β−グルカン濃度を有する選択された個々の対象からの正常ヒト血清から調製した。
【００７７】
ＭＡＸＩＳＯＲＰ  ｆｌａｔ  ｂｏｔｔｏｍ  ９６−ウェルプレート（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック（Ｔｈｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ウォルサム、マサチューセッツ州）を、Ｄ−ＰＢＳ（コーニング・インク（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．）、トゥックズベリー、マサチューセッツ州）中、３μｇ／ｍｌでのＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧのウェル当たり１００μＬでコーティングする。プレートをカバーし、しっかり密封されたジップクロージャープラスチックバッグに入れて、最低でも１５時間そして最大で２４時間、４℃でインキュベートする。コーティングされたプレートをその後冷蔵庫から取り出し、吸引して、洗浄緩衝剤（ＰＢＳ中の０．０５％ポリソルベート２０（アルファ・エイサー（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）、ワード・ヒル、マサチューセッツ州））で３回洗浄する。最終吸引後、コーティングされた各プレートをペーパータオルで完全に包み、ペーパータオルのクッション上で３回強く叩いて、残りの液体を除去する。プレートをその後、ウェル当たり２５０μｌのＳｔａｂｉｌＣｏａｔ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ（サーモディクス・インク（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ，  Ｉｎｃ．）、エデン・プレイリー、マサチューセッツ州）で１から３時間、ベンチトップ上でブロックする。ブロッキング後、プレートを吸引して内容物を除去し、ペーパータオルに包む。上述の、残りの液体を除去するための叩く工程を繰り返す。プレートのカバーを外し、最低でも４５分間そして３時間まで、ベンチトップ上で乾燥させる。
【００７８】
各アッセイは実用参照試料を連続的に希釈することによって作成される実用標準曲線を含んだ。実用参照試料の希釈系列を表１１及び１２に示す。アッセイは１：２０、１：４００及び１：１６００に希釈された対照及び試験試料も含む。希釈物は洗浄緩衝剤で作成された。参照及び血清試料の各希釈を３連で評価した。
【００７９】
ヒトＩｇＧ及び／又はＩｇＭにプレート結合ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧへの結合を可能にするため、試料を３１０ｒｐｍに設定された２ｍｍの軌道直径を有するオービタルシェイカー上で、アッセイプレートで室温で４５分間インキュベートした。インキュベーション後に、ウェルを洗浄緩衝剤で洗浄し、酵素標識二次抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼが結合したアフィニティー精製されたヤギ抗ヒトＩｇＧ及び／又はＩｇＭ、Ｆｃガンマ特異的抗体）をウェル中でインキュベートし、ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ抗原に結合したヒトＩｇＧ及び／又はＩｇＭに結合させた。二次抗体を洗浄緩衝剤で洗浄する前に４５分間インキュベートした。洗浄緩衝剤をウェルから除去した後、ペルオキシダーゼ基質をウェル中でインキュベートし、５分の発色現像において発色現像を〜１Ｍのリン酸でクエンチした。マイクロタイタープレートリーダーを使用して４５０ｎｍでの光学密度を測定し、複製ウェルからの平均を算出した。
【００８０】
ＩｇＧ及びＩｇＭ抗β−グルカン抗体濃度（μｇ／ｍｌ）を、実用参照試料希釈物から作成された実用標準曲線に対して試料の吸光度を相関させることによって決定した。検量線のための希釈値及び対応する濃度を表１１及び１２に記載する。
【００８１】
【表１１】
0006673829.tif 000012
【００８２】
【表１２】
0006673829.tif 000013
【００８３】
表１１及び１２のデータから得られる標準曲線をそれぞれ図１Ｂ及び１Ｃに示す。一度、試験試料の抗体濃度を標準曲線によって決定すると、濃度は計算された平均濃度に希釈係数を掛け、その後１０００で割られることによってμｇ／ｍｌに変換され得る。
【００８４】
実施例３
全血（ＷＢ）を健常なボランティアからヘパリン含有チューブ（ＢＤ  バキュテイナ（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）ヘパリンナトリウムチューブ、べクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、フランクリン・レイク、ニュー・ジャージー州）に採取した。本試験に使用されるＩＶＩＧはＰｒｉｖｉｇｅｎ、１００ｍｇ／ｍＬでのヒト多価ヒト免疫グロブリンの１０％溶液（ＣＳＬベーリング（ＣＳＬ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）、キング・オブ・プルシア、ペンシルバニア州）であった。試料を、２．５ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、及び１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度までのＰＢＳ中のＩＶＩＧの希釈物、ならびにＰＢＳのみの対照に添加した。
【００８５】
ＩＶＩＧに添加された血液のアリコートをその後ＩｇＧ  ＲＡＵアッセイ、並びにＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ誘導の補体経路活性化、好中球結合（実施例４で後述）、活性化マーカー発現、及びＩＬ−８産生アッセイのために作成した。
【００８６】
ＩＶＩＧに添加されたＷＢのアリコートを１０μｇ／ｍＬでのＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ又は、対照として等量のクエン酸緩衝剤（１１ｍＭのクエン酸ナトリウム、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．３）と、３０分間３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、１００μＬのＷＢあたり５μＬのＢｆＤ  ＩＶマウス抗ベータグルカンＩｇＭ抗体を添加し、かつ室温で１５分間インキュベートする前に、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。試料をその後ＰＢＳでさらに２回洗浄し、表面マーカーのための抗体ならびにＢｆＤ  ＩＶ結合の検出のための抗マウスＩｇＭを含む抗体カクテルで染色した。細胞を、２ｍＬのＦＡＣＳ／Ｌｙｓｅ（イーバイオサイエンス（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、サンディエゴ、カリフォルニア州）を添加し、室温で１５分間インキュベートする前に、３０分室温でインキュベートした。細胞をその後、１％のパラホルムアルデヒドで固定しＬＳＲＩＩフローサイトメータで分析する前に、ＰＢＳで２回洗浄した。ＦＡＣＳデータをＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより分析した。
結果を図２〜７に示す。
【００８７】
実施例４
ＷＢ中のＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧの結合及び細胞表面のグルカン結合の検出を本質的に実施例２に上述の通り行った。
結果を図８〜１３、２３〜３０、３１Ａ及び３１Ｂに示す。
【００８８】
実施例５
全血（ＷＢ）を、実施例３に記載のとおり、健常なボランティアからヘパリン含有チューブに採取した。チューブを十分に混合し、使用する準備ができるまで氷上で保存した。ＷＢのアリコートを、１０μｇ／ｍＬ又は１００μｇ／ｍＬの最終濃度でＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧと、あるいは等量のＰＢＳ又はクエン酸緩衝剤とインキュベートした。１０μｇ／ｍＬでの全グルカン粒子（Ｗｈｏｌｅ  ｇｌｕｃａｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）（ＷＧＰ）を陽性対照として使用した。処理されたＷＢを加湿された５％ＣＯ2インキュベーターで３０分間又は１２０分間、３７℃でインキュベートした。各時点の終了時すぐに、ＷＢを２０００ｘ  ｒｐｍ（又は１１５０ｘ  ｇ）で１０分間４℃で遠心分離した。上清（血漿）を回収し、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに移して、氷上で保持した。血漿を以下のセクションで述べられる補体調節試験の同日に使用し、又は、使用する準備ができるまで−７０℃で凍結した。
【００８９】
補体Ｃ４ａ調節試験
ＭｉｃｒｏＶｕｅ  Ｃ４ａ  ＥＩＡ  ｋｉｔ（クイーデル・コーポレーション（Ｑｕｉｄｅｌ  Ｃｏｒｐ．）、サンディエゴ、カリフォルニア州）を販売元の指示に従って血漿中のＣ４ａの定量のために使用した。簡潔には、標準、対照、及び１：２０希釈試験試料（非処理又は種々の処理血漿調製物）を、特異的な抗Ｃ４ａモノクローナル抗体で事前にコーティングしたマイクロアッセイウェルに加えた。室温で６０分間のインキュベーション後、１洗浄サイクルでプレートを洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合マウス抗ヒトＣ４ａモノクローナル抗体を各試験ウェルに添加し、さらに６０分室温でインキュベートした。インキュベーション後、酵素反応を開始させるための発色酵素基質ＴＭＢの添加前に、１洗浄サイクルでプレートを洗浄した。プレートを６０分間室温でインキュベートし、続いて酵素反応を与えられた停止溶液でクエンチした。色の強度を分光光度法で４５０ｎｍにおいて測定した。試験試料に存在するＣ４ａの濃度を与えられた標準で作成した標準曲線から計算し、４パラメーター回帰分析を用いて分析した。
結果を図１４に示す。
【００９０】
補体Ｃ５ａ調節試験
ＭｉｃｒｏＶｕｅ  Ｃ５ａ  ＥＩＡ  ｋｉｔ（クイーデル・コーポレーション、サンディエゴ、カリフォルニア州）を販売元の指示に従って血漿中のＣ５ａの定量のために使用した。簡潔には、標準、対照、及び１：６０希釈試験試料（非処理又は種々の処理血漿調製物）を、特異的な抗Ｃ５ａモノクローナル抗体で事前にコーティングしたマイクロアッセイウェルに加えた。室温で６０分間のインキュベーション後、１洗浄サイクルでプレートを洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合マウス抗ヒトＣ５ａモノクローナル抗体を各試験ウェルに添加し、さらに６０分室温でインキュベートした。インキュベーション後、酵素反応を開始させるための発色酵素基質ＴＭＢの添加前に、１洗浄サイクルでプレートを洗浄した。プレートを６０分間室温でインキュベートし、続いて酵素反応を与えられた停止溶液でクエンチした。色の強度を分光光度法で４５０ｎｍにおいて測定した。試験試料に存在するＣ５ａの濃度を与えられた標準で作成した標準曲線から計算し、４パラメーター回帰分析を用いて分析した。
結果を図１５及び図３１Ｃに示す。
【００９１】
Ｓｃ５ｂ−９調節試験
ＭｉｃｒｏＶｕｅ  ＳＣ５ｂ−９  Ｐｌｕｓ  ＥＩＡ  ｋｉｔ（クイーデル・コーポレーション、サンディエゴ、カリフォルニア州）を販売元の指示に従って血漿試料に存在するＳＣ５ｂ−９複合体の量を測定するために使用した。簡潔には、標準、対照、及び１：２０希釈試験試料（非処理又は種々の処理血漿調製物）を、特異的な抗ＳＣ５ｂ−９モノクローナル抗体で事前にコーティングされたマイクロアッセイウェルに加えた。プレートを６０分間室温でインキュベートし、５回の洗浄に続いた。プレートをその後、ＳＣ５ｂ−９に特異的な西洋ワサビペルオキシダーゼ結合マウス抗ヒトＡｂを含有する、与えられたＳＣ５ｂ−９プラス複合体と、３０分間室温でインキュベートした。プレートをその後５回洗浄し、酵素反応を開始させるために発色酵素基質ＴＭＢと６０分間室温でインキュベートし、その後、停止溶液でクエンチした。ＯＤ450を測定した。結果を、線形回帰分析を用いて作成された標準曲線から計算した。
結果を図１６に示す。
【００９２】
細胞表面の補体受容体の調節
ＷＢへのＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧの結合を、１０μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬで、そして３０分及び１２０分の両方で試験した。結合後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、その後ＣＤ８８−ＡＰＣ、ＣＤ３５−ＰＥ、及びＣＤ１１ｂ−ＰＢ（バイオレジェンド（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ））と３０分間室温でインキュベートした。ＲＢＣを、２ｍＬのＦＡＣＳ／Ｌｙｓｅ（イーバイオサイエンス、サンディエゴ、カリフォルニア州）と室温で１５分間インキュベートすることによって溶解させた。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１％パラホルムアルデヒドで固定し、ＬＳＲＩＩフローサイトメータで分析した。ＦＡＣＳデータをＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより分析した。
結果を図１７及び図１８に示す。
【００９３】
実施例６
ＷＢへのＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧの結合を、１０μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬで、そして３０分及び１２０分の両方で試験した。結合後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、その後ＣＤ６２Ｌ−ＰＢ（バイオレジェンド）と３０分間室温でインキュベートした。ＲＢＣを、２ｍＬのＦＡＣＳ／Ｌｙｓｅ（イーバイオサイエンス、サンディエゴ、カリフォルニア州）と室温で１５分間インキュベートすることによって溶解させた。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１％パラホルムアルデヒドで固定し、ＬＳＲＩＩフローサイトメータで分析した。ＦＡＣＳデータをＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより分析した。
結果を図１９に示す。
【００９４】
実施例７
全血（ＷＢ）を、実施例３に記載のとおり、健常なボランティアからヘパリン含有チューブに採取した。ＷＢのアリコートを、１０μｇ／ｍＬもしくは１００μｇ／ｍＬの最終濃度でＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧとインキュベートし、あるいは、ベースライン対照としてＰＢＳもしくはクエン酸緩衝剤で、又は陽性対照として１００ｎｇ／ｍＬのＴＬＲ４アゴニストＬＰＳ（Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ）株  ０１２７：Ｂ８、シグマ（Ｓｉｇｍａ）、セントルイス、ミズーリ州）で処理した。培養物を加湿された５％ＣＯ2インキュベーターで３７℃でインキュベートした。２０〜２４時間後、ＷＢを１０分間１６００ｘ  ｒｐｍで遠心分離し、血漿上清を回収した。試料を使用の準備ができるまで、９６ウェルのマトリックス保存プレート（Ｍａｔｒｉｘ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｐｌａｔｅ）（マトリックス・テクノロジーズ（Ｍａｔｒｉｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ハドソン、ニューハンプシャー州）中に−８０℃で保存した。ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ又は対照処理されたＷＢの血漿試料中のＩＬ−８の存在を、ヒトＣＸＣＬ８／ＩＬ−８  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｃａｔａｌｏｇ＃  Ｄ８０００Ｃ、ミネアポリス、マサチューセッツ州）を製造者の指示によって行うことによって判断した。
結果を図２０に示す。
【００９５】
実施例８
Ｓｃ５ｂ−９調節試験
ＭｉｃｒｏＶｕｅ  ＳＣ５ｂ−９  Ｐｌｕｓ  ＥＩＡ  ｋｉｔ（クイーデル・コーポレーション、サンディエゴ、カリフォルニア州）を販売元の指示に従って血漿試料に存在するＳＣ５ｂ−９複合体の量を測定するために使用した。簡潔には、標準、対照、及び１：２０希釈試験試料（非処理又は種々の処理血漿調製物）を、特異的な抗ＳＣ５ｂ−９モノクローナル抗体で事前にコーティングされたマイクロアッセイウェルに加えた。プレートを６０分間室温でインキュベートし、５回の洗浄に続いた。プレートをその後、ＳＣ５ｂ−９に特異的な西洋ワサビペルオキシダーゼ結合マウス抗ヒトＡｂを含有する、与えられたＳＣ５ｂ−９プラス複合体と、３０分間室温でインキュベートした。プレートをその後５回洗浄し、酵素反応を開始させるために発色酵素基質ＴＭＢと６０分間室温でインキュベートし、その後、停止溶液でクエンチした。ＯＤ450を測定した。
結果を、線形回帰分析を用いて作成された標準曲線から計算した。結果を図２１に示す。
【００９６】
実施例９
ＲＯＣ曲線解析をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して行った。結果を図２７及び２８に示す。
【００９７】
本明細書中に記載される、全特許、特許出願、及び公表、及び電子的に利用可能な材料（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑ中のヌクレオチド配列寄託、及び例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢ中のアミノ酸配列寄託、並びにＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑ中の注釈コード領域からの翻訳を例として含む）の全開示は、参照により本明細書にその全体が組み込まれる。本願の開示と、参照により本明細書に組み込まれる任意の文献の開示との間に矛盾が存在する場合に、本願の開示が優先される。上述の詳細な説明及び実施例は、理解の明確化のためにのみ供される。不必要な制限がそこから理解されるべきではない。本願発明は、請求項によって定義される発明に含まれるであろう当業者に明らかな変形のために示され記載される正確な１つ１つに限定されない。
【００９８】
他に表示しない限り、成分量、分子量を表している全ての数値、及び明細書及び請求項で使用されるそれらは、用語「約」によって全ての例において変更されると理解されるべきである。従って、他に逆に表示しない限り、明細書及び請求項に記載の数値パラメータなどは、本願発明によって得ようとする所望の特性によって変動してもよい近似である。少なくとも、請求項の範囲への均等論の限定を試みるものではなく、各数値パラメータは、表される重要な数字の数を考慮して且つ通常の四捨五入技術の適用によって少なくとも解釈されるべきである。
【００９９】
本願発明の広範な範囲を説明する数値範囲及びパラメータは近似値であるに関わらず、具体的な実施例に記載の数値は可能な限り正確に表される。しかしながら、全数値は本質的に、各々の試験測定において見られる標準偏差から必ず得られる範囲を含む。
【０１００】
全ての見出しは、読者の利便性のためであり、特定されない限り、見出しに続く文書の意味を限定するために使用されるべきでない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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