(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体吸収性ヒドロゲルでコーティングされた多孔質線維チューブを含む神経再生のための生体適合性神経導管であって、
該線維は、内在性タンパク質の優先的吸着によって神経再生を支持するポリマーを含み、
ここで、該線維は、ねじれ耐性の編組パターンを使用して、５マイクロメートルから２００マイクロメートルまでの範囲の細孔で編組され、該ヒドロゲルコーティング材料及び厚さは、栄養素及び酸素が前記ヒドロゲルコーティングを通って拡散することができるが、コーティングを通る線維組織の浸潤が防止されるように、全体的な多孔性を制御するように選択され、
前記ポリマーは、構造：
【化１】
0006733890.tif 000005
の繰り返し単位を有し、
式中、ａ及びｂは独立に０又は１以上６以下の整数であり；
ｃ及びｄは、独立に０又は１以上６以下の整数であり；
各Ｒ1は１８個までの炭素原子を含む直鎖及び分岐アルキル基からなる群から独立に選択され；
各Ｒ2は独立に６個までの炭素原子を含むアルキレン基であり；
ｋは約２０から約２００までであり；及び
ｘは約０．００２から約０．２０までの範囲であり；ｚは約０．００５から約０．０１までの範囲であり；及びｘ＋ｙ＋ｚ＝１．００である、神経再生のための生体適合性神経導管。
【請求項２】
ａ及びｂはそれぞれ２及び１である、請求項１に記載の生体適合性神経導管。
【請求項３】
ｃ及びｄはそれぞれ２及び１であり、Ｒ1はエチルである、請求項１に記載の生体適合性神経導管。
【請求項４】
前記ポリマーのＲ2はエチレンであり、ｋは約２０から約１００までである、請求項１に記載の生体適合性神経導管。
【請求項５】
前記多孔質線維チューブは、螺旋状に巻かれた二軸の編組を含む、請求項１に記載の生体適合性神経導管。
【請求項６】
前記生体吸収性ヒドロゲルは架橋ヒアルロン酸（ＨＡ）を含む、請求項１に記載の生体適合性神経導管。
【請求項７】
前記ヒアルロン酸ゲル（ＨＡ）はＰＥＧＤＡで架橋される、請求項６に記載の生体適合性神経導管。
【請求項８】
生体適合性神経導管は、生体適合性神経導管の内腔を充填するための第２生体吸収性ヒドロゲルをさらに含む、請求項１に記載の生体適合性神経導管。
【請求項９】
前記第２生体吸収性ヒドロゲルは、ヒトナチュラルキラー１（ｍ−ＨＮＫ−１）グリカンの共有結合した神経突起促進ペプチド模倣体を有するコラーゲンを含む、請求項８に記載の生体適合性神経導管。
【請求項１０】
損傷した神経の近位及び遠位の切開部は、損傷又は瘢痕組織が残らないように、きれいにかつ垂直に切開するステップと、
約１ｍｍの各切開部が生体適合性神経導管の近位端及び遠位端にそれぞれ組み込まれるように、前記生体適合性神経導管をその場に置くステップと、
従来の微小神経外科技術を使用して前記生体適合性神経導管に前記切開部を固定するステップとを含む、
末梢神経損傷の治療又は修復のための方法に用いられる、請求項１に記載の生体適合性神経導管。
【請求項１１】
前記生体適合性神経導管が、縫合糸で周辺軟組織に、又は修復部位をフィブリン様接着剤で満たすことによって、又は両方で安定化される、請求項１０に記載の生体適合性神経導管。
【請求項１２】
前記生体適合性神経導管の内腔に神経又は神経組織又は神経細胞成分を挿入することにより使用される、請求項１に記載の生体適合性神経導管。
【請求項１３】
前記神経細胞成分が、前記内腔を充填するためにヒドロゲル内に注入されるか、又は前記内腔のヒドロゲル型充填剤に注入されることにより使用される、請求項１２に記載の生体適合性神経導管。
【請求項１４】
前記神経組織成分が、前記内腔に置かれて使用される、請求項１２に記載の生体適合性神経導管。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この特許文献は、神経再生のためのインプラントの分野に関し、より具体的には、生物学的性能が、線維組織の浸潤を制御するためのコーティングでさらに強化された末梢神経損傷の治療又は修復のための生体適合性及び生体吸収性（ｂｉｏｒｅｓｏｒｂａｂｌｅ）の神経導管（ｎｅｒｖｅ  ｃｏｎｄｕｉｔｓ）及び神経ラップ（ｎｅｒｖｅ  ｗｒａｐｓ）に関する。
【０００２】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１５年４月１５日に出願された米国仮出願６２／１４８，０８７号に対する優先権の利益を主張し、その出願は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０００３】
連邦政府による資金援助を受けた研究の記載
この研究は、米軍再生医療研究所の受賞番号Ｗ８１ＸＷＨ−０８−２−００３４によって全体的又は部分的に資金援助された。また、この研究は、軍バイオマテリアル研究センター（ＣｅＭＢＲ）の受賞番号Ｗ８１ＸＷＨ−０４−２−００３１、ラトガース大学のニュージャージー州バイオマテリアルセンター、及び国立衛生研究所の受賞番号Ｒ０１ＮＳ０７８３８５によって資金援助された。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
外傷又は外科手術によって引き起こされる末梢神経損傷は、感覚及び運動の喪失につながり得る。回復の速度と程度は遅く、通常は不完全であり、不定である。生じる機能の喪失は、患者を非常に苦しめ、適切な治療オプションがないために恒久的な身体障害につながり得る。
【０００５】
神経導管は、切断された神経の末端を連結し、２つの末端間のギャップを橋渡しするために、末梢神経系の病変のために使用される。神経導管は、さらなる外傷から脆弱な新たに成長した神経線維を成長し、保護するための神経線維（軸索）空間を提供し、軸索成長を阻害する傾向がある瘢痕形成、結合組織細胞（線維芽細胞）によって、浸透に対する保護をも理想的に提供する。神経ラップは、力学的支持を提供し、損傷した神経へのさらなる外傷を最小限にし、損傷した神経の機能回復を増大するために、損傷した神経の周囲に巻かれるシートである。神経導管及び神経ラップは、神経導管又は神経ラップと具体的に言及することが必要でない限り、本特許文献では神経支援デバイス（ＮＡＤ）として総称される。
【０００６】
治癒中及び神経線維が回復した後に、ＮＡＤが分解し、再吸収されるため、外来構造物が除去を必要とせず、治癒期後に再生された神経を損傷したり、炎症を起こすリスクがないように、分解可能で、再吸収可能なＮＡＤが神経再生のために好ましい。ＮＡＤは、合成ポリマー（例えば、ポリ（乳酸））、生物起源由来のポリマー（例えば、コラーゲン、架橋ゼラチン）、及び静脈移植片及び神経移植片などのヒト又は動物の死体由来材料から開発されている。しかしながら、これらの導管の多くは、管腔体積の膨張及び縮小、縫合糸の引き抜き、崩壊、ねじれ、圧縮及び継ぎ手を動かす牽引に耐える機械的強度の欠如に起因する治療不良に関係する。
【０００７】
所望の物理的及び力学的特性、特にねじれ耐性及び縫合可能性を提供するだけでなく、神経線維の成長を促進し、非神経組織の浸潤に対する保護を提供する神経導管及び神経ラップの形態の生体適合性及び生体吸収性ＮＡＤについての必要性が残っている。また、かかるＮＡＤは、それらの強度及び物理的完全性の喪失のタイミングが、損傷又は切断された神経の機能回復に必要とされる時間と一致するように、適切な生分解及び生体吸収プロファイルを有さなければならない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
さまざまな実施態様は、末梢神経損傷の治療又は修復に適したＮＡＤを提供し、いくつかの態様において従来の導管を超える顕著な改善を示す。第１に、神経導管を構築するために使用されるポリマーは生体適合性で生体吸収性であるだけでなく、内在性タンパク質の吸着による軸索成長を支持することが見出されている。第２に、ＮＡＤの分解及び生体吸収の最適速度が、架橋する必要がある神経ギャップの長さを横切るために成長する軸索によって必要とされる時間と一致するように調節できるように、ポリマーのライブラリーが同定されている。生分解及び生体再吸収の速度のこの調節は、ポリマーの力学的及び生物学的特性に対する最小限の影響のみで行うことができる。第３に、編組（ｂｒａｉｄｉｎｇ）がよく知られているが、編組はＮＡＤを構築する際に重要な利点（改善された圧縮強度、ねじれ及び伸縮に対する改善された耐性）を提供することが現在認識されている。第４に、ＮＡＤ壁の多孔性の役割は、科学文献で熱く議論された問題である。ＮＡＤ壁は、装置の全長にわたって栄養素交換を可能にするために多孔質でなければならないが、多孔性は、ＮＡＤの内腔内への線維性組織の望ましくない浸潤を防止するようにしっかりと制御されなければならないことが現在認識されている。したがって、本発明の第４の態様は、ＮＡＤの壁を通る酸素及び栄養素の拡散を改善しつつ、線維性組織の浸潤を制御するヒドロゲル様コーティングの開発である。ＮＡＤの総合的性能が患者のより良い機能的な神経再生をもたらすように、全４つの態様の組み合わせが、ＮＡＤのための新規で改良された設計をもたらす。
【０００９】
本発明のある態様では、神経再生のための多孔質編組チューブを含む神経導管が提供される。前記多孔質編組チューブは生体吸収性ヒドロゲルでコーティングされ、その表面での内在性タンパク質の吸着に起因する軸索成長を支持する再吸収可能な生体適合性ポリマーから製造される。線維は、ねじれ耐性の編組パターンを使用して５マイクロメートルから２００マイクロメートルまでの範囲の細孔で編組され、ヒドロゲルコーティングの材料及び厚さは、栄養素及び酸素が前記ヒドロゲルコーティングを通って拡散することができるが、コーティングを通じての線維組織の浸潤が妨げられるように、総合的な多孔性を制御するのに選択される。一つの実施形態では、吸収性生体適合性ポリマーは、式Ｉ：
【化１】
0006733890.tif 000002
の構造の繰り返し単位を有し、
式中、ａ及びｂは独立に０又は１以上６以下の整数であり；ｃ及びｄは、独立に０又は１以上６以下の整数であり；各Ｒ１は１８個までの炭素原子を含む直鎖及び分岐アルキル基からなる群から独立に選択され；各Ｒ２は独立に６個までの炭素原子を含むアルキレン基であり；ｋは約２０から約２００までであり；及びｘは約０．００２から約０．２０までの範囲であり；ｚは約０．００５から０．１までの範囲であり；及びｘ＋ｙ＋ｚ＝１．００である。
【００１０】
式Ｉのいくつかの実施態様では、ａ及びｂはそれぞれ２及び１である。
【００１１】
式Ｉのいくつかの実施態様では、ｃ及びｄはそれぞれ２及び１であり、Ｒ１はエチルである。
【００１２】
式Ｉのいくつかの実施態様では、Ｒ２はエチレンであり、ｋは約２５から約５０までである。
【００１３】
いくつかの実施態様では、ＮＡＤは編組によって製造される。好ましい実施態様では、ＮＡＤは、上記の式Ｉの繰り返し単位を有するポリマーでできている線維を編組することによって作製される。
【００１４】
いくつかの実施態様では、ＮＡＤは、螺旋状に巻かれた二軸の編組パターンを使用して製造される。
【００１５】
いくつかの実施態様では、多孔質ＮＡＤは、架橋ヒアルロン酸（ＨＡ）である生体吸収性ヒドロゲルでコーティングされる。
【００１６】
いくつかの実施態様では、生体吸収性ＨＡヒドロゲルは、ポリ（エチレングリコールジアクリレート）（ＰＥＧＤＡ）で架橋される。
【００１７】
いくつかの実施態様では、生体適合性神経導管は、生体適合性神経導管の内腔を充填するための第２生体吸収性ヒドロゲルをさらに含む。
【００１８】
いくつかの実施態様では、生体適合性神経導管の内腔を充填するための第２生体吸収性ヒドロゲルは、ヒトナチュラルキラー１グリカンの神経突起促進ペプチド模倣体（ｍ−ＨＮＫ−１と称される）などの、共有結合した神経栄養因子で増大されたコラーゲンを利用したゲルである。
【００１９】
本発明の別の態様では、神経導管の形態又は神経ラップの形態のいずれかで上記ＮＡＤの移植を用いる末梢神経損傷の治療又は修復のための方法が提供される。損傷した神経の近位及び遠位の切開部は、生存不能な組織が残らないように、きれいにかつ垂直に切開される。その後、導管は、約１ｍｍの各切開部が導管の近位端及び遠位端にそれぞれ組み込まれるように、その場に置かれ、その後、神経切開部は、従来の微小神経外科技術を使用して導管に固定される。導管は、縫合糸で周辺軟組織に、又はフィブリン様接着剤で修復部位を満たすことによって、又は両方でさらに安定化されてもよい。神経ラップの場合、損傷した神経は注意深くラップ内に置かれ、その後、閉じられた神経ラップを縫合することによって、損傷した神経の周囲で閉じられる。
【００２０】
本発明のさらに別の態様では、生体適合性神経導管の内腔に挿入される神経又は神経組織又は神経細胞成分を有する上記導管が提供される。細胞成分は、管腔を充填するためにヒドロゲル内に注入されてもよく、又は管腔内のヒドロゲル型充填剤に注入されてもよい。導管がアクセスできるように縦に開口部を作られた後に、組織成分が管腔に置かれてもよい。代替的に、神経ラップは損傷した神経及び上記の充填剤のいずれかを包むために用いられ、続いて導管又はラップを閉じるか、又は縫合する。本発明のこの態様の一部として、カールアップされた形状を保持するために固有の性質を有する導管及びラップを作製することが可能であり、損傷した神経及び充填材料がデバイスの内腔内にうまく置かれた後に縫合することによってデバイスの閉鎖を容易にする。
【００２１】
いくつかの実施態様では、生体適合性ＮＡＤの内腔を充填するための第２生体吸収性ヒドロゲルは、共有結合したポリ（シアル酸）の軸索促進ペプチド模倣物（ｍＰＳＡと称される）で増強されたコラーゲン由来のヒドロゲルである。
【００２２】
いくつかの実施態様では、生体適合性神経導管の内腔は、ｍ−ＨＮＫ−１、ｍ−ＰＳＡ又はその他のもの等の既知の軸索成長を増強する生物学的因子のいずれかを治療量で含有し、放出することができるヒドロゲルである。
【００２３】
本発明のさらに別の態様では、シートが神経導管よりもむしろ神経ラップとして使用される得るように、同一の生物活性物質（ｍ−ＨＮＫ−１、ｍ−ＰＳＡ又は既知の神経線維成長を増強する生物学的因子のその他の小分子模倣体）を任意に含む同一のヒドロゲルで任意にコーティングされ得る編組シートに、同一のポリマーが製造される。
【００２４】
本発明のさらに別の実施態様では、ＢＩＭＵ−８、シサプリド、ＣＪ−０３３，４６６、モサプリド、プルカロプリド、レンザプリド、ＲＳ−６７３３３、ＳＬ６５．０１５５、ザコプリド及びテガセロドを含むがこれらに限定されない５−ＨＴ４アゴニストの追加が、ＮＡＤの管腔内の軸索の成長をさらに支持することが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、１０ｍｏｌ％デスアミノチロシルチロシン（ＤＴ）と０．５０ｍｏｌ％ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）（ＭＷ１０００）とを共重合したデスアミノチロシルチロシンエチルエステル（ＤＴＥ）からなるポリマー単位を示す。
【図２】図２は、異なる多孔性を有する導管の断面図を示す。
【図３】図３は、対照基質、組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）及びガラスとの比較における、図１のポリマー及びポリエチレン（ＰＥ）の二次元（２Ｄ）フィルムでの神経突起伸長及びシュワン細胞増殖及び伸長のｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価を示す。
【図４】図４は、対照基質との比較における、図１のポリマー及びＰＥの２Ｄフィルムでの神経支持細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質（ラミニン、フィブロネクチン及びＩ型コラーゲン）の相対吸収を示す。
【図５】図５は、図１のポリマー及び非多孔質ポリエチレン（ＮＰ−ＰＥ）導管で再生された大腿神経の組織形態計測分析を示す。
【図６】図６は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの導管の移植、及び、図１のポリマー及び非多孔質ポリエチレン導管によって促進した機能的回復の計量後にマウスで行われた機能測定のビデオフレームを示す。
【図７】図７は、代表的な神経切片及び線維直径分析を示す。
【図８】図８は、導管材料間の神経修復における初期の違いを示す。
【００２６】
図１
デスアミノチロシルチロシンエチルエステル（ＤＴＥ）、デスアミノチロシルチロシン（ＤＴ）及びポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）からなるＥ１０−０．５（１ｋ）の化学構造。
図２
導管の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像。（Ａ、Ｄ）非多孔質ポリエチレン（ＮＰ−ＰＥ）導管、（Ｂ、Ｅ）多孔質Ｅ１０−０．５（１Ｋ）［Ｐ−Ｅ１０−０．５（１ｋ）］導管、及び（Ｃ、Ｆ）非多孔質Ｅ１０−０．５（１ｋ）［ＮＰＥ１０−０．５（１ｋ）］導管それぞれの横断面。各列のスケールバー：１００μｍ
図３
対照基質、組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）及びガラスとの比較における、Ｅ１０−０．５（１ｋ）及びポリエチレン（ＰＥ）の二次元（２Ｄ）フィルムでの神経突起伸長及びシュワン細胞増殖及び伸長のｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価
図４
対照基質ＴＣＰＳとの比較における、Ｅ１０−０．５（１ｋ）及びポリエチレン（ＰＥ）の二次元（２Ｄ）フィルムでの神経支持細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質（ラミニン、フィブロネクチン及びＩ型コラーゲン）の相対吸着。（＊ｐ＜０．０５、テューキーの事後検定による一元配置分散分析）
図５
導管の移植、及び、Ｅ１０−０．５（１ｋ）及びＮＰ−ＰＥ導管によって促進した機能的回復の計量後にマウスで行われた機能測定を示すビデオフレーム。フレームＡ及びＣは損傷前の測定を表し、フレームＢ及びＤは損傷後（ｉｎｊ）の測定を表す。ビデオフレームに描かれた白線は、足底角（ＦＢＡ）（Ａ、Ｂ）、及び伸展四肢比（ＰＬＲ）（Ｃ、Ｄ）の計算に使用された四肢の長さを示す。（Ａ）損傷前のＦＢＡは平均５０−７０°である。（Ｂ）損傷後１週間のマウスのＦＢＡは平均９０−１１０°である。機能回復は、この配向角度の減少によって示される。（Ｃ）鉛筆グリップ試験は、両足が同様に伸長され、マウスの損傷前のＰＬＲを測定し、１の比を与える。（Ｄ）損傷後１週間のマウスのＰＬＲは、傷害による四肢の進展における差を示し、ＰＬＲ＞１をもたらす。（Ｆ）１５週目のＦＢＡの回復指数。各ドットは１匹の動物を表す。（Ｇ）全条件についてのＰＬＲ。（Ｈ）１５週目のＰＬＲの回復指数。（＊ｐ＜０．００１、テューキーの事後検定による一元配置分散分析）
図６
Ｅ１０−０．５（１Ｋ）及びＮＰ−ＰＥ導管で再生された大腿神経の組織形態計測分析。（Ａ−Ｃ）（Ａ）非多孔質ＰＥ導管（ＮＰ−ＰＥ）、（Ｂ）多孔質Ｅ１０−０．５（１Ｋ）導管［Ｐ−Ｅ１０−０．５（１Ｋ）］又は（Ｃ）非多孔質Ｅ１０−０．５（１Ｋ）導管［ＮＰ−Ｅ１０−０．５（１Ｋ）］のいずれかでの包管術後の再生大腿神経の中点由来のトルイジンブルーで染色された神経切片の代表的な断面画像（４０倍、スケールバー：５０μｍ）。（Ｄ）各導管型の中間導管神経切片における再生ケーブル中の有髄軸索の軸索数。（Ｅ）原組織面積。（Ｆ）再生された神経線維の断面積。（Ｇ）再生神経ケーブル中の有髄神経線維率（％）。＊ＮＰ−ＰＥからの群平均値間の有意差（＊ｐ＜０．０５、テューキーの事後検定による一元配置分散分析）
図７
代表的な神経切片及び線維直径分析。（Ａ）非多孔質ＰＥ導管（ＮＰ−ＰＥ）、（Ｂ）多孔質Ｅ１０−０．５（１Ｋ）導管［Ｐ−Ｅ１０−０．５（１Ｋ）］又は（Ｃ）非多孔質Ｅ１０−０．５（１Ｋ）導管［ＮＰ−Ｅ１０−０．５（１Ｋ）］のいずれかでの包管術後の再生大腿神経の中点由来のトルイジンブルーで染色された神経切片の代表的な断面画像（１００倍、スケールバー：２０μｍ）及び神経線維直径の相対分布のヒストグラム。線維直径のヒストグラムは、ＮＰ−ＰＥ導管で処置された動物と比較して、Ｅ１０−０．５（１Ｋ）導管で処置された動物で、小さな軸索の数の減少及びより大きな軸索の数の増加を示す。ＮＰ−ＰＥと比較して、Ｐ−Ｅ１０−０．５（１Ｋ）及びＮＰ−Ｅ１０−０．５（１Ｋ）導管において、４、５、６、７及び８ｍｍの線維直径測定の統計的に高い相対分布（％）があった（＊ｐ＜０．０５、テューキーの事後検定による一元配置分散分析）。
図８
導管材料間の神経修復における初期の違い。（Ａ）及び（Ｂ）は、移植２週間後の導管内の無細胞フィブリンマトリックスの縦断面の代表的な画像を示す。（Ａ）Ｅ１０−０．５（１Ｋ）導管に見出される天然マトリックス。（Ｂ）ＮＰ−ＰＥ導管中に存在するマトリックス。Ｅ１０−０．５（１Ｋ）中の天然のフィブリンマトリックスを含むポリマーは、優勢な縦配向（黒色矢印Ａ）を有する一方、フィブリン鎖はＮＰＰＥ導管で観察されなかった。白い矢印は、各導管タイプ内の内腔の端を示す。スケールバー：０．５ｍｍ。（Ｃ）移植１週間で非多孔質Ｅ１０−０．５（１Ｋ）及びＮＰ−ＰＥ導管滲出液から採取されたＳ１００ｂ及びグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の代表的なウェスタンブロット解析。バンドの右側の値は、バンドの相対光学密度を示す（ＮＰ−Ｅ１０−０．５（１Ｋ）／ＮＰＰＥ）。
【００２７】
[発明の詳細な説明]
さまざまな実施態様は、神経再生のための神経導管を提供する。適切な形態で本発明のポリマーで製造された導管は、生分解及び再吸収速度の適切な範囲、所望の力学的特性及び周囲組織との適合性を含む潜在的利益を提供する。かかる導管の多孔質線維チューブのコーティングは軸索成長をさらに促進し、非神経組織に対する障壁として役割を果たす。ヒドロゲル管腔充填剤はまた、線維性組織の浸潤と比較してより速い軸索再生を促進する。本発明の導管はまた、神経再生のためのシード、プロモーター又はブリッジとして移植前の神経又は神経組織を含んでもかまわない。したがって、本発明のデバイスは、ヒト又は動物の体内での神経又は神経（ｎｅｒｖｅｓ）に対する外傷又は損傷の治療に有用である。
【００２８】
この特許文献全体を通して、さまざまな刊行物が参照される。これらの刊行物の全体の開示は、開示された事項が関係する最新技術をより完全に説明するために、本明細書中に参照として取り込まれる。以下の文章は、特定のポリマー、線維チューブ又は神経導管を参照又は例示する場合があるが、本発明の範囲をかかる特定の参考文献又は実施例に限定することを意図するものではない。実用的及び経済的な観点から、さまざまな変更が当業者によって行われる場合がある。特許請求の範囲の主題をより明確かつ簡潔に説明するために、以下の定義は、本明細書で使用される用語の意味に関するガイダンスを提供することを意図している。
【００２９】
定義
本明細書で用いられるところの冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、他に示されない限り、「１つ以上」又は「少なくとも１つ」を指す。すなわち、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による本発明のいずれかの要素への言及は、１つよりも多い要素が存在する可能性を排除するものではない。
【００３０】
本明細書で用いられるところの「約（Ａｂｏｕｔ）」は、その参照数字表示のプラス又はマイナス１０％の参照数字表示をいう。
【００３１】
用語「アルキル」、「アルキレン」及び類似の用語は、当業者に知られた通常の意味を有し、したがって、直鎖又は分枝炭化水素鎖の完全飽和（二重又は三重結合のない）炭化水素基をいうために使用される場合がある。例えば、一般式−ＣｎＨ２ｎ＋１の末端アルキル基は、本明細書では「アルキル」基と称される場合がある一方、一般式−（ＣＨ２）ｎ−の連結アルキル基は、本明細書では「アルキレン」基と称される場合がある。アルキル基は、１個から１８個までの炭素原子を有していてもよい（本定義はまた、数値範囲が指定されていない「アルキル」という用語の出現をも包含するけれども、本明細書で現れるときはいつでも、「１から１８まで」などの数値範囲は所定の範囲内の各整数を指し、すなわち、「１個から１８個の炭素原子」は、アルキル基が１個の炭素原子、２個の炭素原子、３個の炭素原子などから１８個までで、１８個を含む炭素原子からなる場合があることを意味する。）アルキル基は、１個から６個までの炭素原子を有する中型のアルキルであってもよい。アルキル基は、１個から５個までの炭素原子を有する低級アルキルであってもよい。化合物のアルキル基は、「Ｃ１−Ｃ４アルキル」又は類似の名称で表されてもよい。ほんの一例として、「Ｃ１−Ｃ４アルキル」は、アルキル鎖中に１個から４個までの炭素原子が存在することを示し、すなわち、該アルキル鎖は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル及びｔ−ブチルからなる群から選択される。典型的なアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシルなどを含むが、これらに限定されない。
【００３２】
本明細書で用いられるところの「分解」又は「生分解」という用語は、ポリマー主鎖の化学的開裂をもたらすプロセスをいい、ポリマー分子量及び機械的強度の低下をもたらす。生理学的条件下でのポリマー分解速度は、個々のポリマー繰り返し単位を一緒に連結するために使用される結合の種類によって主に決定される。従って、ポリ酸無水物、例えば高度に不安定な無水物結合を含むポリマーは、ポリエステルよりも速く分解する傾向がある。対照的に、用語「再吸収」又は「生体吸収」は、移植されたデバイスの質量の減少をもたらすプロセスとして定義される。再吸収の速度は、主に、ポリマー自体又はその分解産物の溶解度によって支配される。移植物の全質量が移植部位から除去されると、移植物の再吸収が完了する。
【００３３】
「生体適合性」という用語は、科学文献において多くの異なる意味を有する。本特許文献の内容において、生体適合性移植物は、容認できない組織応答が、合理的かつ確立された臨床業務下で、人体からの移植物の除去を必要とする移植部位で臨床的に容認できない組織応答を引き起こすことなく、人体内で機能すると理解される。
【００３４】
ある態様では、生体吸収可能なヒドロゲルでコーティングされた多孔質線維チューブを含む、神経再生のための生体適合性神経導管が提供される。本発明の神経導管は、生分解及び生体吸収プロファイル、力学的特性、タンパク質吸着、フィブリンマトリックス形成及びシュワン細胞浸潤に関して従来の導管を超える利益を提供する線維から製造される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ研究からの結果（図１−８）は、上記の４つの設計戦略を組み込んだ神経導管が、それらの設計戦略を組み入れていない従来の導管よりも著しく良好に役割を果たすことを示す。具体的には、本発明の導管はポリエチレン（ＰＥ）で構築された従来の導管と比較された。上記の４つの設計戦略は、（１）軸索成長を支持するポリマー組成物、（２）ＮＡＤの分解及び生体吸収速度が、神経ギャップの長さを横切るために成長する軸索によって必要とされる時間に調節され得るようなポリマーのライブラリーの使用、（３）編組構造、（４）線維組織の浸潤を許容することなく、最適な栄養輸送のために多孔性を制御するコーティングである。設計戦略のこの組み合わせが、末梢神経再生を必要とする患者にとってより良好な臨床成果をもたらすことができる有意な性能優位性をもたらすことが現在見出されている。
【００３５】
いくつかの実施態様では、ポリマー線維材料は、デスアミノチロシルチロシンアルキルエステル（ＤＴＥ）、デスアミノチロシルチロシンペンダントフリーカルボン酸（ＤＴ）及びポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）からなる。本明細書に記載のポリマー中の遊離カルボン酸単位及びＰＥＧ単位のモル分率は、かかるポリマーから製造されたＮＡＤの力学的特性及び分解速度を改変するように調節することができる。例えば、遊離カルボン酸の量がより少ないポリマーは、体内でより長い寿命を有する傾向がある。さらに別の方法で、ポリマー中の遊離カルボン酸の量を好ましいモル分率の範囲にわたって調整することによって、得られるポリマーは、異なるデバイス寿命を必要とするさまざまな用途での使用に適合させることができる。一般に、遊離カルボン酸単位のモル分率が高いほど、体内のデバイスの寿命が短くなり、より好適なかかるデバイスは、より短い寿命が望ましい又は必要とされる用途のためである。
【００３６】
一つの実施形態では、線維材料は、構造（式Ｉ）：
【化２】
0006733890.tif 000003
の繰り返し単位を有する生体適合性ポリマーであり、
式中、ａ及びｂは独立に０又は１以上６以下の整数であり；ｃ及びｄは、独立に０又は１以上６以下の整数であり；
各Ｒ１は１８個までの炭素原子を含む直鎖及び分岐アルキル基からなる群から独立に選択され；各Ｒ２は独立に６個までの炭素原子を含むアルキレン基であり；ｋは約２０から約２００までであり；及びｘは約０．０２から約０．２０までの範囲であり；ｚは約０．００５から０．１までの範囲であり；及びｘ＋ｙ＋ｚ＝１．００である。
【００３７】
いくつかの実施態様では、ａ及びｂはそれぞれ２及び１である。
【００３８】
いくつかの実施態様では、ｃ及びｄはそれぞれ２及び１であり、Ｒ１はエチルである。
【００３９】
いくつかの実施態様では、かかるポリマーのＲ２はエチレンであり、ｋは約２５から約５０までである。
【００４０】
さまざまなポリカーボネートポリマーの合成は、当業者に一般的に知られており、例えば、米国特許第６，１２０，４９１号公報及び第６，４７５，４７７号公報に開示されている方法を含み、これらの開示物は参照により本明細書に取り込まれる。ペンダントフリーカルボン酸基を有するポリマーは、遊離カルボン酸基とコモノマーとの交差反応を回避するために、対応するベンジル及びｔｅｒｔ−ブチルエステルポリマーから調製することが好ましい。ベンジルエステルポリマーは、米国特許第６，１２０，４９１号公報に開示されたパラジウム触媒水素化分解法によって対応する遊離カルボン酸ポリマーに変換される場合がある。ｔｅｒｔ−ブチルエステルポリマーは、米国特許公開第２００６００３４７６９号公報に開示された酸化水分解法によるｔｅｒｔ−ブチル基の選択的除去を通じて、対応する遊離カルボン酸ポリマーに変換される場合があり、該公報も参照により本明細書に取り込まれる。
【００４１】
いくつかの実施態様では、所定の時間内に分解又は再吸収するポリマーが選択される。この理由のために、本発明に応じる実施態様は、約２ｍｏｌ％から約２０ｍｏｌ％まで、好ましくは約５ｍｏｌ％から約２０ｍｏｌ％までの、ＤＴ等のペンダントフリーカルボン酸基を有するモノマーの繰り返し単位のモル分率を有するポリマーを含む。
【００４２】
ＰＥＧ等のポリ（アルキレングリコール）セグメントは、ポリマーの表面接着を減少させる。本発明により提供されるブロックコポリマー中のポリ（アルキレングリコール）セグメントのモル分率を変えることによって、ポリマーの親水性／疎水性比は、細胞の挙動を改変するためのポリマーコーティングの能力を調節するために変えられ得る。ポリ（アルキレングリコール）のレベルの増加は、細胞接着、遊走及び増殖を阻害する。第２に、ＰＥＧは水の摂取を増加させ、したがってポリマーの分解速度を増加させる。したがって、ある実施態様では、ポリ（アルキレングリコール）の量が０．５ｍｏｌ％から約１０ｍｏｌ％まで、好ましくは約０．５ｍｏｌ％から約５ｍｏｌ％まで、より好ましくは約０．５ｍｏｌ％から約１ｍｏｌ％までに限定されるポリマーが選択される。ポリ（アルキレングリコール）は、１ｋから２ｋまでの分子量を有する場合がある。
【００４３】
いくつかの実施態様では、弾性、剛性、強度及び分解挙動を含む適切な力学的特性を有する神経導管における使用に適した固有の物理的特性を有するポリマーが選択される。かかるポリマーは、ポリマーがアモルファスである場合、生理学的条件下で完全に水和された際に３７℃より高いガラス転移温度を有するポリマーと、ポリマーが結晶性である場合、生理学的条件下で完全に水和された際に３７℃より高い結晶融解温度を有するポリマーとを含む。
【００４４】
その他の生体適合性分解性ポリマーは、生じる神経導管の特定の望ましい特性を提供するか、又は補強する線維を形成するために使用され得ると理解されるべきである。使用される場合があるその他のポリマーの例は、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸コグリコール酸）、ポリカプロラクトン、さまざまなポリ（アミノ酸）及びポリ酸無水物を含むが、これらに限定されない。その他の天然又は非天然線維材料、例えば、コラーゲン、セルロース、キトサン及びそれらの誘導体が、生じる神経導管の特定の望ましい特性を提供又は強化するために代替的又は追加的に利用される場合がある（例えば、米国特許第８，２１６，６０２号公報を参照せよ）。
【００４５】
いくつかの実施態様では、生体適合性ポリマー組成物は生分解性及び生体吸収性である。本発明のＮＡＤは、好ましくは生分解性で生体吸収性であり、回復される必要のある神経ギャップの長さに応じて調整される場合がある特定の分解プロファイルを有する。神経線維は、一日あたり約１ｍｍ、又は一月あたり約１インチ成長する。従って、２インチの神経ギャップを上手く再生するためには、治癒プロセスは少なくとも２ヶ月必要であり、ＮＡＤは少なくとも２ヶ月間その機械的強度の大部分を保持すべきである。４インチの神経ギャップの再生のために、ＮＡＤが機械的に弱すぎて損傷した神経線維の再増殖を支持することができなくなる前に、ＮＡＤは、完全な回復を確実にするために、少なくとも４ヶ月間、機械的強度の大部分を保持すべきである。いくつかの実施態様では、分解プロファイルは、異なる分解プロファイルをそれぞれ有する多数のポリマー線維からＮＡＤを形成することによって制御される場合がある。
【００４６】
いくつかの実施態様では、ポリマー組成物は放射線不透過性である一方、その他の実施態様では放射線不透過性ではない。いくつかの実施態様では、ポリマーは、ポリマー単位の１つ又は２つ以上の芳香環でヨウ素化される（例えば、米国特許第６，４７５４，７７号公報を参照せよ）。かかる改変は、医用画像技術を用いてＮＡＤの検出及び追跡を可能にする。
【００４７】
いくつかの実施態様では、ＮＡＤは形状記憶を有する場合がある。
【００４８】
図１は、８９．５ｍｏｌ％デスアミノチロシルチロシンエチルエステル（ＤＴＥ）、１０ｍｏｌ％デスアミノチロシルチロシン（ＤＴ）及び０．５ｍｏｌ％ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ、分子量［Ｍｗ］＝１ｋＤａ）からなるポリマー線維材料［Ｅ１０−０．５（１Ｋ）と表される］を示す。ＰＥ及び対照基質ピークの右側へのピークシフトによって示されるように、より長い軸索が、ＰＥと比較した際にこのポリマーで観察された（図２）。異なる基質でシュワン細胞の接着及び伸長のプロセスの評価は、このポリマーが同様にＰＥと比較してこれらの態様を促進したことを明らかにした（図２Ｂ、Ｃ）。異なる材料への、神経再生に必須なタンパク質の吸着もまた有意に異なっていた（図３）。このポリマーに吸着する３つのＥＣＭタンパク質の量は、図４に示すようにＰＥフィルムと比較して有意に大きかった。
【００４９】
運動機能回復研究では、８９．５ｍｏｌ％ＤＴＥ、１０ｍｏｌ％ＤＴ、０．５ｍｏｌ％ＰＥＧ１Ｋのポリマー導管を移植された動物は、ＮＰ−ＰＥ導管を移植されたマウスと比較して足底角（Ｆｏｏｔ  Ｂａｓｅ  Ａｎｇｌｅ（ＦＢＡ））の顕著な改善を示した。外壁の細孔の存在にもかかわらず、原線維組織面積がより小さいこのポリマーの導管内に形成された再生神経ケーブル内に、かなり多くの軸索が存在した（図５）。有髄神経線維の断面積は、ＮＰ−ＰＥ導管と比較して全ての導管において有意に大きく、この面積のより大きな割合が有髄神経線維によって占められていた。本発明の導管は、多数の軸索、束状構造、広範囲の神経線維直径及び小さい線維組織を有する神経ケーブルを生成したが、ＮＰ−ＰＥ導管は、たとえあったとしても、明らかな軸索をほとんど含まなかった（図７）。内腔は、密度の高い線維組織であると思われるもので完全に満たされていた。縦断面は、フィブリンマトリックスがＮＰ−ＰＥ内よりも早く本発明の導管内に発生することを示す（図８）。
【００５０】
本発明の多孔質ＮＡＤは、編組プロセスを用いて製造することができる。編組プロセスの多数の変形例が当業者に知られている。編組パターンを変更することによって、生じるＮＡＤの全体的な力学的特性を、異なる医療ニーズに対応するように調整することができる。ねじれ耐性神経導管を作製するために有用であることが見出された一般的な編組パターンは、らせん状に巻かれた二軸の編組と称される。さらに、多数の異なる種類の線維を、異なるポリマーからなる編組デバイスを作製するために組み合わせて使用することができる。式Ｉの繰り返し単位を有するこれらのポリマーのみを用いて、個々の線維がそれらの分解速度において異なるマルチフィラメントデバイスを構築することができる。このアプローチを、デバイスの分解及び吸収プロファイルを微調整するために使用することができる。別の実施態様では、適切な薬剤を個々のポリマー線維に取り込むことができる。各々が異なる薬剤を充填した線維の組み合わせを使用することにより、「個別医療」アプローチで神経再生を助けるためにカスタマイズされた異なる薬剤の混合物をそれぞれ放出する幅広い薬学的に増強したＮＡＤを想定することができる。ＮＡＤを編組するために異なる線維を使用するという概念は、デバイスの全体的な性能特性を最適化するための強力な手段であり、デバイス設計においてこれまで認識されていない程度の柔軟性を提供する。編組ＮＡＤを作製するために多数の異なる線維を使用するさらなる潜在的な用途は、生体高分子（コラーゲン、ゼラチン、架橋アルギン酸及びその他のもの）由来の線維を、上述のチロシン由来ポリカーボネート等の合成ポリマーからの線維と組み合わせることである。編組プロセスでは、個々の線維を互いに重ね合わし、それにより、個々の線維の選択、編組構造体内でのそれらの相対的比率、及び使用される編組パターンによって特性を微調整することができる独自のハイブリッド構造を作製する。当業者によく知られた編組を用いてチューブを構築するための手順（例えば、米国特許第８，１０６，０１４号公報を参照せよ）。
【００５１】
多孔質ＮＡＤは、編組によって構築される。この特許文献の図及び実施例に示されるように、編組導管は、物理的及び力学的特性に関して利益を提供するが、全体的な性能の有意な向上は、編組が上記の他の重要な設計戦略（神経突起の成長を増大するポリマー組成物、分解プロファイルを調整するためのポリマーのライブラリーの使用、及び多孔性制御コーティング）と組み合わされた場合にのみ得られる。これらの設計戦略は、以前は認識されておらず、観察された増強した神経再生をもたらす相乗効果を有する。
【００５２】
編組導管は、特に高移動性の領域における大きな神経ギャップのための導管設計の重要な基準である柔軟性及びねじれ耐性及び引張り強さを含む望ましい力学的特性を提供することができる。脆弱な再生中の神経を傷つけるか、又は再切断することを回避するために、導管は管腔閉塞を経験することなく曲げられることができなければならない。本発明の編組導管は、導管がワイヤでねじれ（内腔の内径の縮小）が生じるまで曲げられるねじれ試験において、かかる能力を実証する。（Ｅ００００と略記されるポリ（ＤＴＥカーボネート）から製造された）編組導管の研究は、臨床的に使用される（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｍａｔｅｒ  １９９２；９（３−４）：１９５−２００．、Ｉ型コラーゲンから作製された）ＮｅｕｒａＧｅｎ（登録商標）導管及び（ポリ（ＤＴＥカーボネート）から製造された）非多孔質浸漬導管と比較すると、（ポリ（ＤＴＥカーボネート）から製造された）編組導管は１２５°を超える角度で曲げた際に、ねじれに耐え、一定の内腔径を維持したことを示す。また編組導管は、装薬の放出後も元の形状に回復した一方、浸漬コーティングした導管及びＮｅｕｒａＧｅｎ（登録商標）導管は、曲げられ、それらの元の形状に回復しなかった際に、部分的又は完全に内腔を閉塞した。さらに、ポリ（ＤＴＥカーボネート）編組導管は、四肢運動及び筋肉収縮によって生じる張力、圧縮力及びせん断力に耐えることができる。
【００５３】
また研究は、本発明のＮＡＤが十分に耐性を有し、強い炎症性宿主応答を生じさせないことを示す。本発明の移植されたＮＡＤの周囲の線維状カプセルの形成は許容範囲内であり、最小限の炎症性宿主応答を示す。
【００５４】
本発明のＮＡＤは、しっかりと制御された多孔性レベルを有する。編組材料内の細孔のサイズは、瘢痕組織の浸潤に対する障壁として作用する際に、デバイスの全長にわたって有効栄養素及び酸素交換を促進するのに適した範囲内でなければならない。ＮＡＤの細孔サイズを、異なる編組プロセスを使用することによって及び／又は線維直径を制御することによって操作することができる。その後、全体的な多孔性をヒドロゲルコーティングプロセスによってさらに操作することができる。例示的な実施形態では、編組導管は、糸を形成するために個々に使用するか、又は一緒にねじられて使用され、編組機に装填される小径線維を最初に作製することによって製造される。前記編組機は、導管を作製するためにマンドレルの周囲に線維又は糸を巻き付ける。線維又は糸を、さまざまな編組パターンでマンドレルの周囲に編組することができる。マンドレルの直径が管腔の直径を決定し、線維又は糸の直径が導管壁の厚さを決定する。いったん適切な線維が利用可能になると、編組導管を、寸法制限なしに迅速かつ再現可能に製造することができる。
【００５５】
ＮＡＤの全体的な多孔性をさらに微調整するためにヒドロゲルコーティングを用いることができる。コーティングプロセスから生じる細孔サイズの非限定的な例は、約３μｍから４０μｍまでである。ヒドロゲルコーティングなしでは、これらの編組誘導細孔は大きすぎであり、ＮＡＤの管腔への線維組織の望ましくない浸潤を可能にする。以前に知られていた編組神経導管による細孔サイズに対する制御欠陥が、臨床的に有用な神経再生に至らなかった理由の１つである。本発明のヒドロゲルコーティングプロセスは、編組プロセスのこの固有の欠点に対処している。浸漬コーティングを含むさまざまな既知の技術を本発明のＮＡＤのコーティングに適用することができる。
【００５６】
例えば、ポリペプチドベース系ヒドロゲル、多糖類系ヒドロゲル及び石油化学系ヒドロゲルを含む天然資源又は合成起源のさまざまなヒドロゲルを、編組ＮＡＤをコーティングするために、個々に又は互いに組み合わせて使用することができる。コーティング材料の非限定的な例は、アルギン酸、ヒアルロン酸及びポリ（アクリル酸）ヒドロゲルを含む。
【００５７】
いくつかの実施態様では、線維性チューブをコーティングするためのヒドロゲルは、架橋剤によってさらに機能化される。これは、非架橋ヒドロゲルが水溶性であるか、又は機械的に安定なコーティングを提供するには弱すぎる場合はいつでも重要である。架橋剤の非限定的な例は、ポリ（エチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）、ポリ（エチレングリコールジグリシジルエーテル）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド及びジビニルスルホンを含む。有効なコーティングを生成するのに必要なヒドロゲルの量及び架橋の程度は、編組ＮＡＤの初期細孔サイズ、チューブの直径及び長さ、多孔性のサイズ及びレベルを含むさまざまな因子、場合によっては再生される特定の神経によって決まる。ヒドロゲルを架橋する方法は、文献において容易に利用可能であり、過度な実験をすることなく実施することができる（例えば、Ｎｉｌｉｍａｎｋａ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ２０１３，  ５（４），  ５５−５８；  Ｈｅｎｎｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．  ２００２  Ｊａｎ  １７；５４（１）：１３−３６を参照せよ）。いくつかの実施態様では、ＮＡＤをコーティングするための生体吸収性ヒドロゲルは、架橋ヒアルロン酸（ＨＡ）である。いくつかの実施態様では、架橋剤はＰＥＧＤＡである。
【００５８】
多孔質チューブのヒドロゲルコーティングは、コーティングされていない多孔質チューブと比較して、有意に改善された神経再生をもたらすことができる。Ｅ１００１（１ｋ）（８９．５ｍｏｌ％デスアミノチロシルチロシンエチルエステル（ＤＴＥ）、１０ｍｏｌ％デスアミノチロシルチロシン（ＤＴ）及び１ｍｏｌ％ポリ（エチレングリコール）からなるコポリマー）から製造された導管に関する研究は、神経再生におけるヒドロゲルコーティングの効果を示す。４種類の導管（コーティングされていない、架橋ヒアルロン酸（ＨＡ）コーティング、電界紡糸８９ｍｏｌ％ＤＴＥ、１０ｍｏｌ％ＤＴ、１ｍｏｌ％ＰＥＧ  １Ｋのポリマー線維コーティング、及び電界紡糸８９ｍｏｌ％ＤＴＥ、１０ｍｏｌ％ＤＴ、１ｍｏｌ％ＰＥＧ  １Ｋのポリマー線維コーティング後のＨＡでのコーティングの組み合わせ）のうち、ＨＡでコーティングされた導管すべてが、神経再生において有意に良好な結果を示した。コーティングされていない編組導管は、緩やかに組織された束の中に多くの再生軸索と、かなりの量の非神経組織とを示した。また、電界紡糸でコーティングされた編組導管は、軸索成長と非神経組織との不一致を示し、編組導管を囲む電界紡糸マットが線維組織の浸潤を促進する場合があることを示唆した。
【００５９】
対照的に、ＨＡでコーティングされた導管すべては、しっかりと充填された束及び軸索を有する丸くて高密度に充填された神経ケーブルを示した。これらの特徴は、再生神経軸索及び束内に挿入した広範な線維組織が観察された、電界紡糸線維及びＨＡの両方でコーティングした編組導管内で再生された神経では再現されなかった。さらに、ＨＡでコーティングされた編組導管の前脛骨筋（ＴＡ）の筋重量回復は、コーティングされていない導管よりも有意に高かった。さらに、欠陥及び再建された筋肉群による神経伝導の電気生理学的測定が、複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）を評価するのに用いられた。導管群の中で、ＨＡでコーティングされた編組導管は最も高いＣＭＡＰ振幅を有し、１６週間のエンドポイントで約１４％のＣＭＡＰ信号が回復した。
【００６０】
いくつかの実施態様では、神経導管は、その内腔内に生体吸収性ヒドロゲルを充填される。生体吸収性ヒドロゲルは神経ギャップを横切る物理的架橋として機能するフィブリンマトリックスの形成を促進し、細胞が遊走するための構造を提供する。充填剤としてのヒドロゲルの非限定的な例は、ラミニン、アルギン酸塩、コラーゲン、ヒアルロン酸及びこれらの組み合わせから生じるヒドロゲルを含む（例えば、Ｖｅｒｄu，  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ＆  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２，  ２０：  １６９；  Ｃｅｂａｌｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  １９９９，  １５８：  ２９０−３００を参照せよ）。長い神経ギャップの場合には、導管の長さにわたって栄養素、酸素及び廃棄物交換を可能し、血管の浸潤をも可能にするため、多孔質チューブがしばしば必要とされる。しかしながら、導管の多孔性はまた、非ニューロン線維組織の浸潤を可能にする。したがって、ヒドロゲル充填剤は、ニューロン組織と非ニューロン線維組織とを区別し、線維組織の浸潤と比較してより速い軸索再生を促進することが望ましい。
【００６１】
したがって、いくつかの実施態様では、チューブの内腔を充填するためのヒドロゲルは、軸索成長及び適切な運動ニューロン標的化に有利な細胞シグナル伝達又は神経突起促進成分によって増強される。かかる神経突起促進成分の非限定的な例は、ヒトナチュラルキラー１グリカン（ｍ−ＨＮＫ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）及びグリア成長因子（ＧＧＦ）のペプチド模倣薬を含む。いくつかの実施態様では、神経突起促進成分は、ヒトナチュラルキラー１グリカン（ｍ−ＨＮＫ）のペプチド模倣薬である。神経突起促進成分をヒドロゲルに結合するための手順は、当業者に周知であり、過度な実験をすることなく実施することができる。例えば、ｍ−ＨＮＫで増強されたコラーゲンは、以前に記載されたようにＥＤＣ化学を用いて、コラーゲンにヒトナチュラルキラー１（ｍ−ＨＮＫ）グリカンのペプチド模倣薬を接合することによって調製され得る（例えば、Ｍａｓａｎｄ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，  ２０１２，  ３３：  ８３５３−６２を参照せよ）。
【００６２】
別の態様では、本発明の神経導管の移植を含む末梢神経損傷の治療又は修復のための方法が提供される。神経導管を移植するためのプロトコールは容易に入手可能であり、過度の実験をすることなく実施することができる（例えば、Ｒｕｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｃｔａ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ  ２０１２；８（２）：５１１−５１８；  ｄｅ  Ｒｕｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２００８；２１１（２）：３３９−５０を参照せよ）。例示的な実施態様では、神経導管の２つの末端は、それらの間に存在するギャップを橋渡しするために、病変部に形成された２つの神経端と連結される。神経端の間に残っている神経誘導管腔は、再生軸索の方向を特定し、誤って誘導される成長を回避して、標的とされた再生を促進する（例えば、米国特許第８，２１６，６０２号公報を参照せよ）。
【００６３】
別の態様では、組織工学によって作製された（例えば、実験室で増殖された）軸索で予め充填された神経導管が提供される。予め充填された軸索は、組織増殖のための生物活性支持体を提供するシードとして機能することによって、神経の再生を促進する。患者の体内に移植する前に導管を予め充填するために、生物学的成分及び／又は生体工学によって作製された神経組織を使用するという概念は、大きな可能性を有し、前例のない長さの神経ギャップの治癒を促進する場合がある。組織工学によって作製された神経移植片（ＴＥＮＧ）の使用は、ペンシルベニア大学及びアクソニアメディカル（ミシガン州カラマズー）によって開発されている。完全な臨床上の可能性に到達するためのこの画期的なアプローチのために、注意深く最適化されたＮＡＤの中にＴＥＮＧを封入する必要がある。長期間の生体吸収を最適化しながら、大きなギャップにわたって栄養素交換、力学的特性及びねじれ耐性を維持することは、現在利用可能な合成神経導管のいずれによっても十分に対処されていない難しい課題である。ペンシルバニア大学及びアクソニアの研究者は、本発明のＮＡＤがシュワン細胞の進入及びＴＥＮＧに沿った宿主軸索の伸長を支持し、自家移植と比較して改善された神経再生速度をもたらすことを示した。生きている（生体工学によって作製された）神経組織を予め充填された本発明のＮＡＤの使用は、本発明のさらなる実施態様を表す。
【実施例】
【００６４】
実施例１
導管製造
８９．５ｍｏｌ％デスアミノチロシルチロシンエチルエステル（ＤＴＥ）、１０ｍｏｌ％デスアミノチロシルチロシン（ＤＴ）及び１ｋＤａのＭｗの０．５ｍｏｌ％ポリ（エチレングリコール）からなるＥ１０−０．５（１Ｋ）（図１）は、以前に公開された手順を利用して合成された（Ｍａｇｎｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｍａｔｅｒ  Ｃｈｅｍ  ２０，  ８８８５，  ２０１０）。テフロンでコーティングされたマンドレルが一定速度（４０ｍｍ／分）でポリマー溶液に浸漬された浸漬コーティング（ＫＳＶディップコーター；  ＫＳＶ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ．）技術を用いて、内径５８０ｍｍの中空導管が製造された。非多孔質導管については、３ｍＬの塩化メチレンに９００ｍｇのポリマーを含む溶液が用いられた。多孔質導管については、２５ｍｍから４５ｍｍまでにふるい分けしたショ糖結晶４５０ｍｇと、塩化メチレン３ｍＬ中に溶解したポリマー４５０ｍｇとの溶液が使用された。浸漬コーティング後、マンドレルを真空中で一晩乾燥させ、ｉｎ  ｖｉｖｏ評価のために導管が引き抜かれ、５ｍｍの長さに切断された。多孔質導管については、ショ糖が多孔質構造を作製するために水中で浸出された。また、市販のＰＥチューブが神経導管として使用された（長さ５ｍｍ、内径０．５８ｍｍ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）。
【００６５】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価
脊髄ニューロン及びシュワン細胞を用いた導管材料のｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価が実施された。神経突起伸長及びシュワン細胞の接着及び伸長における８９．５ｍｏｌ％ＤＴＥ、１０ｍｏｌ％ＤＴ、０．５ｍｏｌ％ＰＥＧ  １Ｋのポリマー及びポリエチレン（ＰＥ）の効果が、８９．５ｍｏｌ％ＤＴＥ、１０ｍｏｌ％ＤＴ、０．５ｍｏｌ％ＰＥＧ  １Ｋのポリマー（２．５％ｗ／ｖのテトラヒドロフラン溶液）をスピンコーティングされたか、又はＰＥ（ＶＷＲ）の薄い自己接着性フィルムでコーティングされたカバーガラスを用いて決定された。細胞の生存及び増殖を促進するために、カバーガラスが２００μｇ／ｍＬのポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ；Ｓｉｇｍａ）に続いて２０μｇ／ｍＬのラミニン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でコーティングされた。胚性脊髄ニューロンは、運動量の多い集団について単離され、精製された。シュワン細胞は、公開されたプロトコール（Ｈｏｎｋａｎｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２６，  ９５３，  ２００７）に従って、Ｐ２新生児の坐骨神経から単離及び精製され、Ｓ１００βに対して陽性に染色された細胞が９５％よりも多い培養物を得た。細胞はカバーガラスに播種され（１．５×１０４個の細胞／カバーガラス）、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間維持された。ニューロン及びシュワン細胞の神経突起及び突起伸長がそれぞれβチューブリン抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ；１：５００）及びＳ１００β（Ａｂｃａｍ；１：５００）を用いて評価され、両方の細胞タイプは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて可視化された。核染色はＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８染色（ＡｎａＳｐｅｃ，  Ｉｎｃ．）を用いて実施された。細胞あたりの全神経突起／突起の長さがＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を用いて測定された。各カバーガラスについては、無作為に選択した代表画像１０枚が二重盲検法で分析され、神経突起がその長さに基づいてビニングされた。
【００６６】
タンパク質吸着アッセイ
８９．５ｍｏｌ％ＤＴＥ、１０ｍｏｌ％ＤＴ、０．５ｍｏｌ％ＰＥＧ  １Ｋのポリマー及びＰＥフィルムにおける３種類の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分子（ラミニン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、フィブロネクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＩ型コラーゲン（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｍａｔｒｉｘ））のタンパク質吸着の相対量が評価された。圧縮成形によって調製された８９．５ｍｏｌ％ＤＴＥ、１０ｍｏｌ％ＤＴ、０．５ｍｏｌ％ＰＥＧ  １Ｋのポリマーフィルム及びＰＥフィルム（ＶＷＲ）を、９６ウェルプレートに適合された。各タンパク質の７０ｍＬ溶液（ｄｄＨ２Ｏ中に２０ｍｇ／ｍＬ）を、各ウェルに添加し、３７℃で４８時間フィルムに接着された。上清が除去された後、各ウェルが徹底的にすすがれ、ウシ胎仔血清を含む培地でブロッキングされた。すすぎ後、各タンパク質に対する一次抗体が室温で１時間添加された（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；１：１００）。すすぎプロセス全体が繰り返えされ、二次ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；１：２００希釈）が室温で１時間添加された。すすぎプロセスがもう一度繰り返えされ、ルミノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が各ウェルに添加された。５分後、各ウェルからの発光が、Ｔｅｃａｎプレートリーダーを用いて１０００ｍｓの積分時間及び５００ｍｓの整定時間で読み取られた。タンパク質量は組織培養ポリスチレンの対照表面に対して正規化された。
【００６７】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ評価
外科的方法及び動物群。すべての実験は、動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）に従って実施された。メスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（３ヵ月齢）は、ケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１２ｍｇ／ｍｇ）混合物の腹腔内注射によって麻酔された。左大腿神経が外科的に露出させられ、神経切断が神経の分岐部の近位から約３ｍｍの距離で行われた。神経の切断端が生理食塩水で満たされた神経管に挿入され、近位端及び遠位端の間に５ｍｍのギャップが存在するように、１０−０のナイロン縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ）を用いて各端部に固定された。切開した皮膚が創傷クリップで閉じられ、外科手術２週間後に除去した。Ｐ−Ｅ１０−０．５（１Ｋ）、ＮＰ−Ｅ１０−０．５（１Ｋ）及びＮＰ−ＰＥを含む、３つの導管を移植された３つの動物群（各動物８匹）が１５週間の期間にわたって比較された。
【００６８】
運動機能回復
機能回復は、単一フレーム運動解析アプローチ（ＳＦＭＡ）を用いて評価された。４０匹の動物が、導管の移植前にビーム歩行試験を行うために訓練された。外科手術後、この試験が実験のエンドポイントまで毎週行われた。高速度カメラ（Ａ６０２ｆｃ；  Ｂａｓｌｅｒ）を用いて、歩行しているマウスの背面を撮影したビデオ（Ｒｅａｒ  ｖｉｅｗ  ｖｉｄｅｏｓ）が収集された。正常歩行周期中の後肢の動きが、Ｓｉｍｉ−Ｍｏｔｉｏｎ（ＳＩＭＩ  Ｒｅａｌｉｔｙ  Ｍｏｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて個々のビデオフレームから分析された。足底角（ＦＢＡ）４０が大腿四頭筋の機能を評価するために測定された。さらに、マウスが鉛筆グリップ試験中に随意運動を行った際に、伸展四肢比（ｐｒｏｔｒａｃｔｉｏｎ  ｌｉｍｂ  ｒａｔｉｏ）（ＰＬＲ）４０が測定された。
【００６９】
回復指数（ＲＩ）が、機能回復の相対測定値を提供するために、ＦＢＡ及びＰＬＲの両方について、各動物について計算された。ＲＩは、以下の式：
0006733890.tif 000004
を用いて百分率として計算され、
式中、Ｘｗｅｅｋ  ０、Ｘｗｅｅｋ  １及びＸｗｅｅｋ  ｙは、（ＦＢＡ又はＰＬＲのいずれかの）０週で未変化の値であり、値はそれぞれ損傷後１週目又は週ｙ（ここで、ｙは研究のエンドポイントであり、１５週目）で測定した（Ｉｒｉｎｔｃｈｅｖ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２２，  ８０２，  ２００５）。ＲＩ値１００は、大腿神経の完全な回復を示す。
【００７０】
外植神経の組織形態計測分析
１６週目の４％パラホルムアルデヒドでのかん流後、大腿神経が動物から切り取られ、形態計測分析が標準プロトコールに従って行われた。
【００７１】
神経断面あたりの有髄軸索の総数、原組織面積、再生ケーブルの断面積及び神経再生率がＩｍａｇｅＪで測定された。（ミエリン鞘の内側の）軸索及び（ミエリン鞘を含む）神経線維の直径が、各切片からの無作為標本で測定された。
【００７２】
ｉｎ  ｖｉｖｏで１週目の神経滲出液のウェスタンブロット解析。
神経導管内のシュワン細胞の存在を評価するために、シュワン細胞マーカーのウェスタンブロット解析が神経滲出液で行われた（Ｋａｅｗｋｈａｗ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｌｉａ  ５９，  ７３４，  ２０１１）。導管（ｎ＝３）がマウス大腿神経に１週間移植され、その後動物が屠殺され、導管内の神経滲出液が除去され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で流され、ＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏｒａｄ）に移された。膜はブロッキングされ、Ｓ１００β（１：１０００）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ、１：５０，０００）、ＧＡＰＤＨ（１：１０００）及びβ−アクチン（１：５０００）（Ａｂｃａｍ）に対する抗体で調べられ、二次抗体のＨＰＲ発光によって同定された。デンシトメトリー分析が、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を用いてウェスタンブロットのＧＦＡＰ、Ｓ１００β及びアクチンのバンド密度を定量するために行われた。量は、アクチン充填対照に基づいて正規化された。
【００７３】
フィブリンマトリックス形成の形態学的分析
フィブリン鎖の存在を視覚化するために、動物（条件あたりｎ＝３）が移植後２週目で屠殺された。神経外植片が、標準プロトコールに従って四酸化オスミウムで後固定され、樹脂に包埋された。神経の縦方向の１ｍｍ厚の切片が切断され、１％トルイジンブルー／１％ホウ砂の蒸留水で染色された。従来の光学顕微鏡法が、フィブリンマトリックスの存在及び配向性を視覚化するために用いられた。
【００７４】
統計分析
研究は、神経再生での２Ｄ及び導管様式の両方において、８９．５ｍｏｌ％ＤＴＥ、１０ｍｏｌ％ＤＴ、０．５ｍｏｌ％ＰＥＧ  １Ｋのポリマー及びＰＥのポリマーの効果の比較を可能にするように設計された。一元配置分散分析を用いる分散分析が使用され、その後、テューキーの検定で事後の事前比較（ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｐｌａｎｎｅｄ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ）が行われた。差はｐ＜０．０５で有意とみなされた。
【００７５】
結果
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの特性評価
ＰＥ及び８９．５ｍｏｌ％ＤＴＥ、１０ｍｏｌ％ＤＴ、０．５ｍｏｌ％ＰＥＧ  １Ｋのポリマーの両方の非多孔質導管は、ＳＥＭ顕微鏡写真に基づいた類似の外観を有した（図２Ａ、Ｄ、Ｃ、Ｆ）。多孔質の８９．５ｍｏｌ％ＤＴＥ、１０ｍｏｌ％ＤＴ、０．５ｍｏｌ％ＰＥＧ  １Ｋのポリマーの導管は相互接続した細孔構造を有し、導管の多孔度及び平均細孔サイズはそれぞれ５５．２％〜１．２％及び３５．７ｍｍ〜９．０ｍｍであった（図２Ｂ、Ｅ）。Ｅ１０−０．５（１Ｋ）から製造された導管は、（５ｍｍの長さで）不透明で非伸縮性であり、５８０ｍｍの内径及び６８０ｍｍの外径を有する。全ての導管は、試験中、無傷のままであった。材料及び細胞の研究は、導管タイプ間で異なる特性を明らかにした。異なる材料に対する運動ニューロンの応答は、ＰＬＬ及びラミニンでコーティングされた８９．５ｍｏｌ％ＤＴＥ、１０ｍｏｌ％ＤＴ、０．５ｍｏｌ％ＰＥＧ１Ｋのポリマー及びＰＬ２Ｄフィルムで評価された。ＰＥ及び対照基質ピークの右側への８９．５ｍｏｌ％ＤＴＥ、１０ｍｏｌ％ＤＴ、０．５ｍｏｌ％ＰＥＧ  １Ｋのポリマーのピークシフトによって示されるように、ＰＥと比較したとき、より長い軸索が、８９．５ｍｏｌ％ＤＴＥ、１０ｍｏｌ％ＤＴ、０．５ｍｏｌ％ＰＥＧ  １Ｋのポリマーで観察された（図３）。異なる基質に対するシュワン細胞の接着及び突起の伸長の評価は、８９．５ｍｏｌ％ＤＴＥ、１０ｍｏｌ％ＤＴ、０．５ｍｏｌ％ＰＥＧ  １ＫのポリマーがＰＥと比較してこれらの局面を同様に促進したことを明らかにした（図３Ｂ、Ｃ）。異なる材料に対する神経再生に必要不可欠なタンパク質の吸着もまた有意に異なった（図４）。８９．５ｍｏｌ％ＤＴＥ、１０ｍｏｌ％ＤＴ、０．５ｍｏｌ％ＰＥＧ  １Ｋのポリマーに吸着する３種類のＥＣＭタンパク質の量は、ＰＥフィルムと比べて有意に多かった。
【００７６】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ評価
運動機能回復。機能回復は、十分に確立された方法（Ｉｒｉｎｔｃｈｅｖ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２２，  ８０２，  ２００５）を用いて、ＦＢＡ及びＰＬＲのＳＦＭＡによって定量化された（図５Ａ−Ｄ）。８週目までに、８９．５ｍｏｌ％ＤＴＥ、１０ｍｏｌ％ＤＴ、０．５ｍｏｌ％ＰＥＧ  １Ｋのポリマー導管を移植された動物は、ＮＰ−ＰＥ導管を移植されたマウスと比較して、ＦＢＡにおける著しい改善を示した（図５Ｅ）。また、多孔質又は非多孔質の導管が使用されたかどうかにかかわらず、早ければ２週目ほどで、８９．５ｍｏｌ％ＤＴＥ、１０ｍｏｌ％ＤＴ、０．５ｍｏｌ％ＰＥＧ  １Ｋのポリマーで処置された動物における運動機能の改善がＰＬＲによって実証された（図５Ｇ）。１５週目までに収集された結果は、８９．５ｍｏｌ％ＤＴＥ、１０ｍｏｌ％ＤＴ、０．５ｍｏｌ％ＰＥＧ  １Ｋのポリマー導管を有する動物のＰＬＲ値は、ＮＰ−ＰＥで処置された動物よりも早い速度で術前値に近づいたことを実証した。
【００７７】
ＲＩの計算は、８９．５ｍｏｌ％ＤＴＥ、１０ｍｏｌ％ＤＴ、０．５ｍｏｌ％ＰＥＧ  １Ｋのポリマーによって促進された回復が、ＰＥ導管で促進された回復よりも向上したことをさらに支持した。８９．５ｍｏｌ％ＤＴＥ、１０ｍｏｌ％ＤＴ、０．５ｍｏｌ％ＰＥＧ  １Ｋのポリマー導管を移植された動物は、ＦＢＡでは５０％（図５Ｆ）、ＰＬＲでは１００％（図５Ｈ）に近いＲＩ値を達成した。ＮＰ−ＰＥ導管を移植された動物は、ＦＢＡについての平均ＲＩ値が２６％であり、ＰＬＲについての平均ＲＩ値が２３％であることを実証した。各８９．５ｍｏｌ％ＤＴＥ、１０ｍｏｌ％ＤＴ、０．５ｍｏｌ％ＰＥＧ  １Ｋのポリマー群内の動物の厳格なグループ分けは、ＮＰ−ＰＥ導管を移植された動物から計算したＲＩ値の変化とは対照的に、一貫した性能を示す。概して、機能的結果は、８９．５ｍｏｌ％ＤＴＥ、１０ｍｏｌ％ＤＴ、０．５ｍｏｌ％ＰＥＧ  １Ｋのポリマー導管の多孔性に関わらず、８９．５ｍｏｌ％ＤＴＥ、１０ｍｏｌ％ＤＴ、０．５ｍｏｌ％ＰＥＧ  １Ｋのポリマー導管の使用が機能的運動の有意な回復をもたらすことを示す。
【００７８】
組織形態計測分析
研究のエンドポイントで、神経は組織形態計測の特徴について分析された（図６）。外壁の細孔の存在にかかわらず、著しく多くの軸索は、原線維組織面積がより小さい８９．５ｍｏｌ％ＤＴＥ、１０ｍｏｌ％ＤＴ、０．５ｍｏｌ％ＰＥＧ  １Ｋのポリマー導管内に形成された再生神経ケーブル内に存在した。有髄神経線維の断面積は、ＮＰ−ＰＥ導管と比較して８９．５ｍｏｌ％ＤＴＥ、１０ｍｏｌ％ＤＴ、０．５ｍｏｌ％ＰＥＧ  １Ｋのポリマー導管において有意に大きく、この面積のより大きな割合が有髄神経線維よって占められた。オスミウム四酸化物中に後固定された１ｍｍ厚の断面の代表的な１００倍の画像ならびに各条件の線維直径分布がそれぞれ図７に示される。８９．５ｍｏｌ％ＤＴＥ、１０ｍｏｌ％ＤＴ、０．５ｍｏｌ％ＰＥＧ  １Ｋのポリマー導管は、多数の軸索、束状構造、広範囲な神経線維直径及び小さな線維組織を有する神経ケーブルを生成した一方、ＮＰ−ＰＥ導管はたとえあったとしても、明らかな軸索はほとんど含まなかった。内腔は、密度の高い線維組織であると思われるもので完全に満たされた。
【００７９】
導管材料間での神経修復における初期の違い  フィブリンケーブルの初期形成は、軸索成長及びシュワン細胞浸潤を支持するのに役立ち、再生神経ケーブルの最終結果を早期に決定するために重要である。本発明者らは、縦方向のフィブリン鎖が、（図８Ａの黒色矢印によって示されるように）８９．５ｍｏｌ％ＤＴＥ、１０ｍｏｌ％ＤＴ、０．５ｍｏｌ％ＰＥＧ  １Ｋのポリマー導管において、移植後２週目で観察され得るが、ＮＰ−ＰＥ導管では観察されないことを見出し（図８Ａ、Ｂ）、これは、神経ギャップを横切るフィブリンケーブル形成の開始を示唆する（Ｚｈａｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｓｔｏｒ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ５，  １９７，  １９９３．）。さらに、移植後１週目の神経滲出液中のシュワン細胞マーカーのウェスタンブロット解析は、ＮＰ−ＰＥ導管内から取り出された滲出液と比較して、８９．５ｍｏｌ％ＤＴＥ、１０ｍｏｌ％ＤＴ、０．５ｍｏｌ％ＰＥＧ  １Ｋのポリマー導管から取り出された滲出液において、より多くのＳ１００β及びＧＦＡＰ免疫反応を示した（図８Ｃ、Ｄ）。
【００８０】
実施例２
材料及び方法
ポリマー合成及び特性評価
溶融押出によって線維を生成するためにチロシン誘導ポリカーボネートを用いて研究が行われた。ポリ（ＤＴＥカーボネート）と呼ばれ、「Ｅ００００」と省略されるポリ（デスアミノチロシルチロシンエチルエステルカーボネート）の単一のポリマー組成物が研究のために選択された。ポリ（ＤＴＥカーボネート）はｉｎ  ｖｉｖｏで非常にゆっくりと分解し、分子量の顕著な変化が明らかになるまでに１年を超える期間を要する。従って、ポリ（ＤＴＥカーボネート）からなる導管は、本発明者らの研究の期間内にごくわずかしか分解せず、導管性能の変数として分解を効果的に除外する。
【００８１】
以前に公開された手順（Ｅｒｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  １９９４；２８（８）：９１９−３０）を利用して、ポリ（ＤＴＥカーボネート）は合成され、精製された。分子量（数平均、Ｍｎ、重量平均、Ｍｗ）及び多分散指数（ＰＤＩ）は、移動相として０．１％トリフルオロ酢酸を含有するジメチルホルムアミドにおけるポリスチレン標準に換算して、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチューセッツ州ミルフォード）を用いて決定された。ポリマーのガラス転移温度（Ｔｇ）は、以前に記載されたように決定された（Ｅｎｇｅｌｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １９９１；１２（３）：２９２−３０４）。編組導管及び浸漬導管を製造するために使用されたポリ（ＤＴＥカーボネート）は１６７，７００ＤａのＭｎを有し、ＰＤＩは１．４７であり、Ｔｇは９６．５℃であった。８９ｍｏｌ％デスアミノチロシルチロシンエチルエステル（ＤＴＥ）、１０ｍｏｌ％デスアミノチロシルチロシン（ＤＴ）及び１ｍｏｌ％１ｋＤａポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）からなるコポリマーのＥ１００１（１ｋ）を用いて電界紡糸コーティングが製造された。Ｅ１００１（１ｋ）は、以前に公開された手順（Ｍａｇｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，    Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１０；２０（４０）：８８８５−８８９３）を用いて合成され、２３９，０００ＤａのＭｎを有し、ＰＤＩは１．６であり、Ｔｇは９７．０℃であった。
【００８２】
編組導管製造
異なる編組設計が、導管の細孔サイズ及び力学的特性における編組パターン及び線維密度の効果を決定するために６０μｍ厚の工業用ポリプロピレン（ＰＰ）の試作品の糸（ＡＴＥＸ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ、Ｐｉｎｅｂｌｕｆｆ、ＮＣ）を用いて最初に実施された。以下の方法論が導管を製造するために利用された：Ａ）単線維編組：２４つのキャリア、１回ねじられたＰＰ線維／キャリア、２／２編組；Ｂ）３軸編組：２４つのキャリア、３回ねじられたＰＰファイバ／キャリア＋４本の縦３軸線維；Ｃ）３つの編組：２４つのキャリア、３回ねじられたＰＰ線維／キャリア、２／２編組；Ｄ）３つの線維編組：２４つのキャリア、３回ねじられたＥ００００線維／キャリア、２／２編組。
【００８３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ試験に使用された編組導管は、ポリ（ＤＴＥカーボネート）線維のチューブ状編組によって製造された。ポリ（ＤＴＥカーボネート）は３／８インチの単軸スクリュー押出機（ｍｉｃｒｏｅｘｔｒｕｄｅｒ  ｆｒｏｍ  Ｒａｎｄｃａｓｔｌｅ、ニュージャージー州シーダーグローブ）を用いて約６０ミクロンの目標直径の線維を生産するために溶融押出され、レーザーマイクロメーター（Ｚ−Ｍｉｋｅ  １２００シリーズ、Ｇｒｏs−Ｕｍｓｔａｄｔ、ドイツ）を用いてモニターされた。最終押出線維直径は８０μｍから１１０μｍまでの範囲であり、製造後のＭｎは１３８，５５０Ｄａであり、ＰＤＩは２．０５であった。その後、マルチフィラメント糸を形成するために３本のポリマー線維を一緒に撚り合わせ、編組紡錘に巻きつけられた。２４つのキャリアを備えたＨｅｒｚｏｇ  ＮＧ  １  ／  ２４−１２０チューブ状編組機（Ｈｅｒｚｏｇ  Ｍａｓｃｈｉｎｅｎｆａｂｒｉｋ、Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ、ドイツ）が、外径１．５ｍｍのテフロンマンドレルに導管を編組するために用いられた（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｌａｓｔｉｃｓ  Ｃｏ．、Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ノーウッド）。編組後、導管は所望の長さに切断され、末端がサーモカッター（ＺＴＳ  ２０、ＡＺ  Ｚａｎｇｌ、ドイツ）を用いて整えられ、密封された。導管は、超音波処理しながらシクロヘキサン（１ｘ）、脱イオン水（１ｘ）中に０．５容量％のＴｗｅｅｎ２０、及びＤＩ水（５ｘ）中で順次洗浄することによって洗浄された。
【００８４】
浸漬導管製造
導管は、以前に公開された手順（Ｅｚｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ａ  ２０１３）を使用して、塩化メチレン中に２０％（ｗ／ｖ）ポリ（ＤＴＥカーボネート）溶液の浸漬コーティングによって製造され、１．５ｍｍのＯＤテフロンでコーティングされたマンドレルに沈着された。
【００８５】
電界紡糸
二次電界紡糸層は、高電圧電源（Ｇａｍｍａ  Ｈｉｇｈ  Ｖｏｌｔａｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．，フロリダ州オマハビーチ）と、２０ゲージ×３インチのテフロンチューブを介して平滑な先端の２３Ｇステンレス鋼針（両方ともＨａｍｉｌｔｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ製、ネバダ州リノ）に接続した注射器ポンプ（ＫＤ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ホリストン）とを使用する電界紡糸装置において回転マンドレル上の編組導管上に形成された。８９ｍｏｌ％ＤＴＥ、１０ｍｏｌ％ＤＴ、１．０ｍｏｌ％ＰＥＧ  １Ｋのポリマーの１０％（ｗ／ｖ）のポリマー溶液は、電界紡糸線維からビーディング（ｂｅａｄｉｎｇ）を排除するために、１：２５の比のトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン（ｔＨｙｐ）：８９ｍｏｌ％ＤＴＥ、１０ｍｏｌ％ＤＴ、１．０ｍｏｌ％ＰＥＧ  １Ｋポリマーを用いて氷酢酸（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ペンシルベニア州ピッツバーグ）中で調製された。厚さ３００μｍのコーティングが編組導管の周囲に形成されるまで、電界紡糸が続けられた。導管は、残留溶剤を除去するためにドラフトチャンバー内で完全に乾燥された。
【００８６】
ヒアルロン酸（ＨＡ）ヒドロゲルコーティング
滅菌編組導管が、１％（ｗ／ｖ）滅菌チオール修飾ヒアルロン酸溶液（ＨｙＳｔｅｍ）に浸漬コーティングされ、続いて超音波処理した水浴中で滅菌１％（ｗ／ｖ）ポリ（エチレングリコールジアクリレート）（ＰＥＧＤＡ）溶液（両方ともＧｌｙｃｏｓａｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ−ＢｉｏＴｉｍｅ、Ｉｎｃ．、カリフォルニア州アラメダ）に浸漬コーティングすることによって即座に架橋される。導管は各浸漬コーティング工程後に５分間乾燥され、このプロセスが合計５回繰り返された。また、デュアル電界紡糸及びＨＡコーティングを有する導管は、上記したように編組導管上に電界紡糸層を最初に沈着し、続いてヒアルロン酸及びＰＥＧＤＡ溶液に浸漬コーティングすることによって製造された。ＨＡでコーティングされた導管は、クリーンベンチ内で一晩乾燥され、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験のために乾燥状態で移植された。
【００８７】
滅菌
汚染微生物数を減少させるために、全ての導管がｉｎ  ｖｉｖｏでの使用に先立って、ＵＶ照射に４０分間曝露された。
【００８８】
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）
スパッターコーティングした（ＳＣＤ  ００４スパッターコーター、Ａｕ／Ｐｄで１２０秒間３０ミリアンペア）標本の細孔サイズ及びトポグラフィーがＳＥＭ（Ａｍｒａｙ  １８３０Ｉ、２０ｋＶ）を使用して評価された。導管の細孔サイズ、編組角度及び壁厚、及び電界紡糸マットの線維直径が、ＩｍａｇｅＪ（国立衛生研究所の公開ドメインソフトウェア）を用いてＳＥＭ画像上で測定された。編組角度が、編組の縦軸に垂直な線と、チューブ軸に近接して整列された線維群に平行な線との間で測定された。
【００８９】
力学的試験
編組導管の力学的特性は、Ｓｙｎｔｅｃ  ５／Ｄ力学的試験機を用いる圧縮及び３点曲げ試験と、ＭＴＳ  Ｔｙｔｒｏｎ（商標）２５０微小力試験システム（両方ともＭＴＳ、ミネソタ州エデンプレイリー）を用いる引張試験とによって特徴付けられた。試料は３７℃で一晩ＰＢＳ中でインキュベーションすることによって予め適当な状態にされ、インキュベーターから取り出した直後に試験された。圧縮試験は、１ｃｍの長さの導管で、６ｍｍ／分の横断クロスヘッド速度で、初期導管直径の６０％に相当するエンドポイント変位まで行われた。圧縮剛性は、力対変位曲線における線形領域の傾きから算出された。
【００９０】
３点曲げ試験は、曲げ装置の下部ホルダービーム上に配置された長さ１．５ｃｍの導管で実施され、１ｃｍ離して設置された。第３点は、１０ｍｍ／分のクロスヘッド速度で導管の中点の上から下げられた。引張試験のために、長さ３ｃｍの導管が、つかみ部の間隔２ｃｍでつかみ部に固定され、破損するまで２０ｍｍ／分の速度で伸張された。ねじれ試験は、ねじれが生じるまで、可撓性の０．６ｍｍの直径のワイヤ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｌａｓｔｉｃｓ  Ｃｏ．，  Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ノーウッド）で長さ３ｃｍの導管を曲げることによって実施され、ねじれは屈曲点での導管外径の視覚的に検出可能な減少として定義された。編組及び浸漬コーティングならびに市販のＮｅｕｒａＧｅｎ（登録商標）導管（Ｉｎｔｅｇｒａ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ニュージャージー州プレインズボロ）によって製造されたポリ（ＤＴＥカーボネート）導管は曲げられ、屈曲点でのねじれ形成が観察された。導管の曲がったアームと水平軸との間の角度が測定され、曲げ角度として報告された。さらに編組導管について、ねじれ試験が、ねじれが発生するまで円形構造で導管を曲げることによって行われた。この試験のために、編組導管がより小さな円形構造に徐々にねじられ、各増分で撮影された。その後、導管によって形成された内側の円形構造の周長がＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて測定され、環状円形構造と仮定して、対応する内部円形構造の直径が周長から計算された。
【００９１】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ評価
すべての実験は、ラトガース動物管理施設委員会及び動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）の承認されたプロトコールのもとで行われた。
【００９２】
編組導管の皮下移植
体重２５０ｇから３００ｇまでのオスのスプラグ・ドーリーラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ、マサチューセッツ州ウィルミントン）はケタミン／キシラジン（それぞれ７５／１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射により麻酔され、編組導管が動物の背中の４つの皮下ポケットに移植された。動物は移植後３週間で屠殺され、導管は周囲の結合組織で外植された。外植直後、導管が１０％緩衝ホルマリン中で固定され、続いて組織学的染色のために組織処理され、パラフィン包埋された。標準的な方法を用いて６μｍの切片が調製され、ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色された。
【００９３】
１ｃｍのラット坐骨神経モデルにおける導管のＩｎ  ｓｉｔｕ移植：  体重２００ｇから２５０ｇまでのメスのルイスラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ、マサチューセッツ州ウィルミントン）がケタミン／キシラジン（それぞれ７５／１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射により麻酔され、公開されたプロトコールを用いて導管を移植された。導管群について、坐骨神経の５ｍｍ切片が取り出され、神経端は１０ｍｍのギャップを形成するために収縮可能にされた。その後、滅菌導管（長さ１．２ｃｍ及び直径１．５ｍｍ）が、神経端の間に１０ｍｍのギャップを維持しながら、各末端に２つの９−０の縫合糸縫合を用いて、神経端に縫合された。自家移植の場合、１ｃｍの神経セグメントが取り出され、反転され、各末端に３〜４つの９−０縫合糸を使用してギャップにおいて背中を縫合された。
【００９４】
電気生理学：
神経損傷後の電気生理学的機能の回復は、坐骨神経の腓骨及び脛骨の分枝の最も遠位の標的である背側の筋及び足底筋における複合筋活動電位（ＣＭＡＰｓ）を測定することにより、全身麻酔下で評価された。ＣＭＡＰは、ＶｉｋｉｎｇＱｕｅｓｔ  ＥＭＧシステム（Ｎａｔｕｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンカルロス）を用いて、手術直前（無傷な動物）及び手術後４週ごとに記録された。皮下ＥＥＧ針が、記録電極、参照電極及び接地電極として使用した。参照電極及び接地電極が、ラットの手術した側の、第５中足骨及び踵骨の側面にそれぞれ配置された。記録電極は、腓骨ＣＭＡＰの第３中足骨にわたる背側足筋と、脛骨ＣＭＡＰの足底筋との皮下に挿入された。坐骨神経は、脛骨のすぐに後ろの足首の高さで双極刺激電極を使用して経皮的に刺激された。電極が最大のＣＭＡＰ振幅を生じさせるために局所的に調整され、刺激が超極大応答を生じさせるために漸進的に増加された。ＣＭＡＰ信号の開始からピークの頂部まで測定された３つの連続的なＣＭＡＰ振幅の平均、及び３つの連続的な潜時が各動物について計算され、プロットするために同一処置群の動物について平均された。
【００９５】
外植神経の組織形態計測分析
術後１６週間で、ラットはケタミン／キシラジン麻酔を用いて深く麻酔され、手術した側の坐骨神経が露出され、神経のｉｎ−ｓｉｔｕ固定がトランプの固定剤に神経を３０分間浸漬することによって行われた。その後、前述のように神経が採取され、処理された。各１μｍ厚の神経の切片について無作為な１００倍画像において最小５００個の有髄軸索を計測し、神経切片を３回反復して平均化することにより、神経の断面あたりの有髄軸索の総数がＩｍａｇｅＪ  １．４３ｕソフトウェアを用いて計測された。原組織面積、有髄神経ケーブルの断面積及び神経再生率が１０倍画像で測定され、ＩｍａｇｅＪ  １．４３ｕソフトウェアで分析された。（ミエリン鞘の内側の）軸索及び（ミエリン鞘を含む）神経線維の直径が、Ｇ比を計算するために各切片の３つの無作為な１００倍試料で測定された。
【００９６】
筋肉採取
神経採取時に、動物がＣＯ２窒息により安楽死させられた。両後肢の前脛骨筋及び腓腹筋が、膝からくるぶしまで縦走した皮膚切開部を介して筋肉組織を曝すことによって直ちに採取された。筋肉が起始から挿入部まで採取され、電子天秤で秤量された。
【００９７】
統計的方法
この研究のデータは、特に明記しない限り、平均±ＳＥとして表される。Ｄｕｎｎｅｔｔの事後検定による一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）検定が、有意差を評価するために、この研究で使用された。統計的有意性はｐ＜０．０５として定義された。
【００９８】
結果
導管の製造及び物理的特性評価
市販の非分解性ポリプロピレンの試作品を製造する線維を用いて、糸のフィラメント数及びひねり数を変えることにより、３つの導管の試作品が構築された。得られる導管は、実際に、細孔サイズ及び編組角などの物理的特性において実質的な違いを示した。３本の線維糸から構成された２／２編組が最も良好な力学的特徴を有し、優れたねじれ耐性及び弾性変形を示した。三軸編組は最小細孔サイズを有し、より硬く、変形時に望ましくない形状記憶を有していた。細孔サイズと力学的特性との組み合わせのため、ポリ（ＤＴＥカーボネート）線維を用いてより詳細に調査するために従来の２／２編組法が選択された。ポリ（ＤＴＥカーボネート）編組導管は、直径が８０μｍから１１０μｍまでの線維で製造された。得られる導管は、６５±１９μｍの平均細孔サイズ及び１．５ｍｍの内腔直径を有した。
【００９９】
編組導管の力学的比較
移動性の高い領域で大きな神経ギャップを修復するために、柔軟性及びねじれの防止は、重要な導管設計基準である。本発明者らは、厚さ１８３±１５μｍの壁を有する編組ポリ（ＤＴＥカーボネート）導管、非多孔質浸漬ポリ（ＤＴＥカーボネート）導管、及び、Ｉ型コラーゲンからなる臨床的に使用されるＮｅｕｒａＧｅｎ（登録商標）導管（Ｉｎｔｅｇｒａ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州サウスプレインフィールド）の力学的特性を比較した。十分な量のＮｅｕｒａＧｅｎ（登録商標）導管を確保することができないため、全ての実験を再現することができず、これらの導管を使用するＹａｏらの以前の所見が、比較を完成するために時々引用される。
【０１００】
開放管腔を維持しながら屈曲に耐えるための能力を評価するために、ねじれ試験が、いずれかの管腔閉塞が起こる前にポリ（ＤＴＥカーボネート）導管が曲げられ得る角度を評価するために行われた。導管は、管腔の内径が減少するねじれが生じるまでワイヤで曲げられた。浸漬コーティングされた導管及びＮｅｕｒａＧｅｎ（登録商標）について、導管が水平軸からそれぞれ２９．３度及び５５．０度に曲げられたとき、管腔の直径における目に見える崩壊が生じた。編組導管はねじれに耐え、１２５°を超える角度で曲げても一定の管腔の直径を維持した。編組導管はまた、装薬の放出後も元の形状に回復した一方、浸漬コーティングした導管及びＮｅｕｒａＧｅｎ（登録商標）導管は、曲げられた際に、部分的又は完全に管腔を閉塞し、それらの元の形状に回復しなかった。
【０１０１】
本発明者らの編組導管は管腔閉塞に対して耐性が高く、屈曲性が高い領域に適用されたときに、開放管腔を維持する可能性がより高いことをこれらの結果は示す。編組導管によって許容される大きな曲げ角度は生理的に関連し、肘及び指の関節は９０度を越える高い角度で日常的に曲げられる。ラットの坐骨神経損傷モデルで使用された長さ２２ｍｍのコラーゲンチューブについて、チューブ状構造物の柔軟性が不十分であるために、膝関節付近の損傷による不具合が報告されている。
【０１０２】
末梢神経はまた、四肢の運動及び筋肉の収縮によって生じる引張力、圧縮力及びせん断力を受ける。末梢神経はｉｎ  ｓｉｔｕで引張荷重下にあり、静止位置で〜１１％のひずみを受ける。１１．７ＭＰａの最大引張応力に耐える。したがって、末梢神経ギャップを橋渡しするように作用するいずれかの神経導管は、１１．７ＭＰａまでの荷重下で可逆的に伸長可能であるべきである。本発明者らは、この荷重が、ポリ（ＤＴＥカーボネート）編組導管の応力ひずみ曲線の直線部分内にあり、四肢運動のストレスに耐えるのに十分なこの荷重下で１７−２２％の可逆的なひずみを示すことを見出した。
【０１０３】
横方向の圧縮において、浸漬された導管は、加えられた荷重に対して最も大きな耐性を示したが、内径の６０％に圧縮されたときに塑性変形した一方、編組導管は、圧縮荷重を取り除いた直後に元の形状に回復した。ＮｅｕｒａＧｅｎ（登録商標）導管の報告データは、圧縮下で、これらの導管が編組導管よりも１０倍以上変形することを示す。同様の傾向が、浸漬コーティングされた導管及び編組導管の３点屈曲実験について指摘され、浸漬コーティングされた導管は屈曲に対してより大きい耐性を示す。屈曲データはＮｅｕｒａＧｅｎ（登録商標）導管について全く報告されていない。編組導管が管腔を閉塞することなく自由に曲がることができるというこの知見は、硬すぎで曲がることができず、したがって、新しく形成された神経ケーブルを破壊する組織損傷を引き起こすか、又は屈曲点でねじれを生じさせる場合がある他の導管に優る重大な利点である。引張剛性に関して、編組導管及びＮｅｕｒａＧｅｎ（登録商標）導管は、浸漬コーティングされた導管よりも張力をより容易に生じやすく、編組導管は生理的負荷条件下で弾性的に変形し、運動及び引張応力を受ける神経に有益である。一方、編組導管の最大抗張力はＮｅｕｒａＧｅｎ（登録商標）より５倍高く、臨床属性（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｒｅｄｉｃａｔｅ）に対する編組構造の強度を実証した。
【０１０４】
宿主応答
導管材料が、その後の神経再生研究で得られた結果に影響を与え得る強い炎症応答を引き出さないということを確かめるために、小規模な対照研究が行われた。総組織応答を評価するために、ポリ（ＤＴＥカーボネート）編組導管が成体ラットの背中の皮下ポケットに移植された。３週間後、導管が取り出され、Ｈ＆Ｅ組織学が実施された。切片は、導管の周囲に線維性カプセルの期待される形成を示した。カプセル組織は拡散的に組織化され、高濃度の炎症細胞を欠いており、ポリ（ＤＴＥカーボネート）編組導管に対する宿主応答は最小限であり、チロシン誘導ポリカーボネートファミリー内のポリマーに対する宿主応答に関する以前の所見と一致することを示す。
【０１０５】
二次コーティング
Ｈ＆Ｅ染色はまた、導管材料に接着し、細孔を通して浸透し、ポリ（ＤＴＥカーボネート）導管内腔に入り込んだ周囲組織を明らかにした。神経再生の成果における導管の細孔サイズの影響が調査され、この重要な態様の結果及び解釈が幅広く変化する一方、導管の最適細孔サイズは、栄養及び廃棄物の拡散を可能にし、線維性及び炎症性細胞の浸潤を最小限にするために、５μｍから３０μｍまでの範囲となると報告された。ポリ（ＤＴＥカーボネート）編組導管は、２０μｍから１４０μｍの細孔を有する。編組導管への細胞の浸潤を示すＨ＆Ｅ染色切片のために、発明者らは、栄養交換を可能にするが、非神経細胞の導管への浸潤及び再生を妨げる能力を低下させる一時的なマイクロ又はナノ多孔質バリアコーティングを開発した。
【０１０６】
３つの導管コーティングが調査された。すなわち、適用後に脱水された架橋ヒアルロン酸（ＨＡ）からなるヒドロゲルコーティング、導管の表面に適用された８９ｍｏｌ％ＤＴＥ、１０ｍｏｌ％ＤＴ、１．０ｍｏｌ％ＰＥＧ  １Ｋのポリマーの電界紡糸層、及びその後ＨＡでコーティングされた電界紡糸層の組み合わせ。本発明者らは、線維芽細胞の接着を妨げることがわかったＨＡの高分子量で、ＰＥＧＤＡ架橋結合型のものを使用した。ＰＥＧＤＡ架橋ＨＡヒドロゲルは、ｉｎ  ｖｉｖｏで４〜８週間安定であると報告されているが、発明者らの知見は、このやり方で神経導管コーティングとして使用されていない。
【０１０７】
コーティングされていない編組導管の大孔の平均サイズは６５±１９μｍであり、二次コーティング方法はこれらの孔のさまざまな程度の被覆率を提供した。薄いＨＡコーティングは脱水状態で非多孔質であり、編組線維ならびに細孔にコーティングされた。電界紡糸層は、線維直径０．２６±０．０６μｍ及び細孔サイズ２．０２μｍで、平均厚さ２９２±３９μｍであり、細孔比が０．８５であると仮定して、Ｓａｍｐｓｏｎらによって導かれた等方性近平面ネットワークにおける平均細孔半径の式で計算した。電界紡糸及びＨＡコーティングされた導管について、導管を超音波処理しながら浸漬コーティングをすることは、ハイドロゲルが電界紡糸線維マットを介して拡散し、該マットの線維及び下層の導管の周囲を完全にコーティングして、外見上非多孔質バリアを形成することを可能にした。電界紡糸層は、ＨＡヒドロゲルでコーティングする際に最終の厚さ５４±９μｍに収縮した。圧縮、曲げ及び引張の試験は、これらのコーティングが編組導管の力学的利点を損なわなかったことを示した。
【０１０８】
ラット坐骨神経の再生の評価
神経再生を支持するための基本的な能力を評価するために、ポリ（ＤＴＥカーボネート）編組導管が、十分に記載されたギャップ１ｃｍのラット坐骨神経損傷モデルで試験された。処置群は、コーティングされていない編組導管（ｎ＝７動物／群）、ＨＡでコーティングされた編組導管（ｎ＝７）、８９ｍｏｌ％ＤＴＥ、１０ｍｏｌ％ＤＴ、１．０ｍｏｌ％ＰＥＧ  １Ｋのポリマーの電界紡糸でコーティングされた編組導管（ｎ＝４）、８９ｍｏｌ％ＤＴＥ、１０ｍｏｌ％ＤＴ、１．０ｍｏｌ％ＰＥＧ  １Ｋのポリマーの電界紡糸で、その後ＨＡで連続的にコーティングされた編組導管（ｎ＝４）を含む。損傷部位内で反転された自家移植片（ｎ＝７）の対照群が使用され、すべての群の再生神経は１６週間後に採取された。
【０１０９】
外植神経の組織形態計測分析
すべての条件が軸索の再生を支持したが、顕著な変化が観察されたことを、導管の中心の再生神経セグメントの切片は示した。コーティングされていない編組導管内の再生組織は、緩やかに組織された束の中に多くの再生軸索を示した。線維状の外観を有するかなりの量の非神経組織が、再生神経の外側の導管内と、再生神経の周辺に位置する束の間に挿入された導管内との両方で観察された。同様の特徴が、電界紡糸線維コーティングを有する編組導管内で再生された神経に認められた。電界紡糸でコーティングされた編組導管における神経ケーブルは、サイズが小さく、軸索領域と周辺組織との境界の存在下で可変であり、いくつかの試料は緩い神経の束を持っていたが、他のサンプルでは、束はよりいっそう詰め込まれ、神経ケーブルは、緩く配置された非神経組織の層によって取り囲まれていた。この結果は驚くべきことであり、編組導管を囲む電界紡糸マットが線維組織の浸潤を促進した可能性があることを示唆する。
【０１１０】
対照的に、ＨＡでコーティングされた導管すべては、しっかりと詰め込まれた束及び軸索を有する丸くて密集した神経ケーブルを示した。ＨＡでコーティングされたすべての導管内の再生神経は、導管内の再生神経と線維性組織との間で明確な境界を形成する神経周膜層を形成したように見える。これらの特徴は、再生神経軸索及び束に挿入した広範な線維組織が観察された、電界紡糸線維及びＨＡの両方でコーティングされた編組導管内で再生した神経において再現されなかった。自己移植片内の再生神経は、期待されたように、成熟した神経周膜を伴って高度に組織された。
【０１１１】
組織形態学的特性評価は、有髄領域又は神経軸索によって占められた領域がコーティングされていない編組導管において最大であり、自家移植片に匹敵したことを示した。次に大きい有髄領域を示したＨＡでコーティングされた導管は、電界紡糸線維及びＨＡでコーティングされた導管であり、最後に電界紡糸線維のみでコーティングされた導管である。対照的に、軸索密度は、ＨＡでコーティングされた導管で最も高く、コーティングされていない編組導管で最も低く、ＨＡでコーティングされた導管は高密度に再生された神経ケーブルを含む一方、コーティングされていない編組導管は大きいが、緩やかに詰め込まれた神経ケーブルを有することが確認された。Ｇ比を測定することによる軸索髄鞘形成の評価は、最小のＧ比が自家移植グループに存在し、他の全てのグループは、自家移植よりも有意に大きいが、お互いに同等であることを示した。自家移植片と比較して、ＨＡでコーティング導管は、予想されたように、これらの軸索は成熟度がより低い（Ｇ比がより大きく、ミエリン鞘がより薄い）にもかかわらず、単位面積あたり、より多くの数の詰め込まれた軸索を有していた。再生期間中に、ＨＡでコーティングされた導管群の軸索は、より速い神経伝導及び改善された再生成果を達成するために、さらに成熟するようである。
【０１１２】
筋重量
坐骨神経二等分後に、前脛骨筋（ＴＡ）及び腓腹筋の萎縮及び筋重量の回復は、回復を示す。これらの筋肉は、１６週間の回復期間の終わりに両方の後肢から採取され、重量が測定された。筋重量の回復は、自家移植片群で最大であり、続いてＨＡでコーティングされた編組導管であった。ＨＡでコーティングされた編組導管のＴＡ筋重量回復は、コーティングされていない導管よりも有意に高かった。ＴＡ及び腓腹筋の重量回復は、他の導管群において同等であった。ＨＡでコーティングされた編組導管でのＴＡ筋重量の回復の改善は、強化された再生が線維組織の浸潤の程度と、これらの導管での神経周膜層を形成する能力とを制限することと一致するという点で神経組織学の所見を支持する。
【０１１３】
電気生理学
機能的な神経再生を評価するために、欠陥及び再建された筋肉群による神経伝導の電気生理学的測定が、腓骨神経及び脛骨神経の複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）の最大振幅及び潜時を記録することにより、評価された。脛骨及び腓骨の両方のＣＭＡＰについて、最も初期の術後ＣＭＡＰシグナルは、自家移植については８週間、導管群については１２週間で同定された。ＣＭＡＰシグナルの３７％が、１６週のエンドポイントで自家移植群において回復され、処置の中で最大の振幅を示した。導管群の中で、ＨＡでコーティングされた編組導管は最も高いＣＭＡＰ振幅を有し、１６週のエンドポイントで約１４％のＣＭＡＰ信号が回復した。
【０１１４】
機能的再生の改善は、ＣＭＡＰ潜時と振幅との間の逆相関で明らかである。したがって、自家移植群は、１６週間で最も低い腓骨及び脛骨潜時の値を有し、より速い信号伝導を示した。観察された潜時値は、ＥＳでコーティングされた導管を除いて、編組導管群で同等であり、この群の組織学において観察されたより少ない軸索及びより大きなＧ比と一致して、より長い潜時を示した。
【０１１５】
電気生理学は組織学を支持し、損傷後の神経回復の妨げにおける、多孔性及び細胞浸潤の主要な役割を示す。おそらく最も驚くべきことは、ＨＡの有無にかかわらずＥＳ層は非神経組織の浸潤を有していたという悪影響であった。導管へのコーティングとして適用されたときに、これらの導管は、マット全体に線維状組織が豊富になることを本研究は見出した。マットによって提供される広範囲の細胞に好ましい表面が、ＨＡの細胞忌避特性を圧倒したようである。さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏ環境への継続的な曝露によるマットの緩みは、組織浸潤を促進する場合もある。また、ポリ（ＤＴＥカーボネート）及び８９ｍｏｌ％ＤＴＥ、１０ｍｏｌ％ＤＴ、１．０ｍｏｌ％ＰＥＧ  １Ｋのポリマーの導管材料は、細胞接着及びタンパク質吸着に好ましいことが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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