(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４のアミノ酸３２〜４５３、組換え技術によって作成されたそれらの変異体またはそれらの活性断片からなるポリペプチドを含むバチルス・アガラドヘレンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）由来の単離組換え発現イヌロスクラーゼ（ＩＮＵＯ）であって、前記変異体はβ−（２→１）結合を含有するイヌリンオリゴ糖の重合を触媒することができ、前記変異体は配列番号４のアミノ酸配列のアミノ酸３２〜４５３との少なくとも９０％の配列同一性を有し、前記活性断片はβ−（２→１）結合を含有するイヌリンオリゴ糖の重合を触媒することができる活性を有する、イヌロスクラーゼ。
【請求項２】
配列番号４のアミノ酸３２〜４５３からなる前記ポリペプチドを含む前記ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸３２〜４５３からなる前記ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に融合した、バチルス・アガラドヘレンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）菌株ＷＤＧ１８５（配列番号４）由来の天然型ＩＮＵＯと関連していないアミノ酸配列を含有する、請求項１に記載のイヌロスクラーゼ。
【請求項３】
前記組換え技術によって作成された変異体は、配列番号４の前記アミノ酸配列のアミノ酸３２〜４５３との少なくとも９５％もしくは少なくとも９８％の配列同一性を有する、請求項１に記載のイヌロスクラーゼ。
【請求項４】
前記組換え技術によって作成された変異体は、配列番号４の前記アミノ酸配列のアミノ酸３２〜４５３との少なくとも９９％または少なくとも９９．５％の配列同一性を有する、請求項３に記載のイヌロスクラーゼ。
【請求項５】
配列番号４のアミノ酸３２〜４５３と同一ではない前記組換え技術によって作成された変異体の前記アミノ酸残基は、Ｃ末端もしくはＮ末端のいずれかからの保存的アミノ酸置換もしくは欠失から選択される、請求項１に記載のイヌロスクラーゼ。
【請求項６】
前記組換え技術によって作成された変異体の前記アミノ酸配列は、配列番号４のアミノ酸７９〜３９３と同一の配列を含む、請求項１に記載のイヌロスクラーゼ。
【請求項７】
請求項１に記載の前記イヌロスクラーゼを含む組成物。
【請求項８】
前記イヌロスクラーゼは、凍結乾燥粉末形、カプセル封入形、コーティング形、顆粒形または液剤である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
希釈剤をさらに含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の前記イヌロスクラーゼをコードする合成核酸。
【請求項１１】
請求項１０に記載の前記合成核酸を含むベクター。
【請求項１２】
発現ベクターである、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
請求項１０に記載の前記合成核酸または請求項１１に記載の前記ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１４】
配列番号３のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載の前記ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１６】
配列番号３のヌクレオチド配列を含む、バチルス・アガラドヘレンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）ではない宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１３に記載の前記宿主細胞と食品用、飼料用、工業用もしくは医薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む組成物。
【請求項１８】
イヌロサッカライド（ＩＯＳ）生成物を製造する方法であって、請求項１に記載の前記イヌロスクラーゼをフルクトース源と接触させる工程と、前記ＩＯＳ生成物を製造するためにｐＨ５〜１０および４０℃〜６０℃で前記イヌロスクラーゼを前記フルクトース源と反応させる工程とを含む方法。
【請求項１９】
前記フルクトース源は、スクロース、スタキオース、ラフィノース、イヌリンまたはフルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＩＯＳ生成物は、ＧＦ３〜ＧＦ１００、ＧＦ３〜ＧＦ３０またはＧＦ１０〜ＧＦ２５のＧＦ範囲を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記イヌロスクラーゼは、組換えＩＮＵＯをコードする核酸を含む宿主細胞を含む組成物中で提供される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＩＯＳ生成物の化学修飾をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
調製されたオリゴフルクトシド生成物を製造する方法であって、請求項１に記載の前記イヌロスクラーゼを他の糖類によって置換されたスクロースのグルコースキャップを有するスクロースアナログと接触させる工程と、前記調製されたオリゴフルクトシド生成物を製造するために前記イヌロスクラーゼをスクロースアナログとｐＨ５〜１０および４０℃〜６０℃で反応させる工程とを含む方法。
【請求項２４】
前記スクロースアナログは、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロースまたはアロースによって置換されたスクロースの前記グルコースキャップを有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記イヌロスクラーゼは、組換えＩＮＵＯをコードする核酸を含む宿主細胞を含む組成物中で提供される、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体とし本明細書に組み込まれる、２０１４年１２月５日に出願された米国仮特許出願第６２／０８８，３２０号明細書からの優先権の利益を主張するものである。
【０００２】
バチルス・アガラドヘレンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）由来の単離および／または精製イヌロスクラーゼ、組換え技術によって作成されたそれらの変異体、それらの活性断片、イヌロスクラーゼをコードする合成核酸およびそれらの変異体、合成核酸を含む宿主細胞ならびにイヌロスクラーゼを含む組成物が提供される。それらの組成物を使用する方法には、イヌロオリゴ糖の製造が含まれる。
【０００３】
配列表
配列番号１〜１９を含む配列表は、添付されており、その全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
イヌリン型のフルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）であるイヌロオリゴ糖（ＩＯＳ）は、それらが有する有益な健康効果のために、ますます多くの注目を集めつつある。イヌリン型の短鎖ＦＯＳおよびイヌリン型フルクタンは、それらが実証された顕著なｉｎ  ｖｉｔｒｏプレバイオティクス効果を有するために、すなわち有益な細菌のための食物源として関心対象である。イヌリンはさらに、食品工業において脂肪代替物として、および例えばデザート、パン・菓子類および発酵乳製品ならびに乳児用調製粉乳などの数種の製品において質感および安定性を提供するためにも使用されている。
【０００５】
ＩＯＳは、フルクトース単位間にβ−（２→１）結合を備えるフルクトシル単位の鎖によって伸長したスクロース分子を含む。ＩＯＳポリマーは、包括的構造ＧＦｎ（式中、「Ｇ」はグルコース分子を意味し、「Ｆｎ」はフルクトース単位の数を意味する）を備える繰り返し単位を含有する。例には、１−ケストース（ＧＦ２）、１−ニストース（ＧＦ３）および１Ｆ−フルクトフラノシルニストース（ＧＦ４）が含まれる。植物由来のＩＯＳポリマーは、例えば、一般に３０〜５０フルクトシル単位を含有している。
【０００６】
植物、真菌および細菌によって生成されたフルクトシルトランスフェラーゼ（ＦＴａｓｅ）は、ＦＯＳの合成を触媒する。ＦＴａｓｅは、グリコシドヒドロラーゼ３２（ＧＨ３２）およびグリコシドヒドロラーゼ６８（ＧＨ６８）ファミリーを含有するクランＧＨ−Ｊ酵素に属する。ＧＨ３２およびＧＨ６８ファミリー内では現在、約９１のＦＴａｓｅタンパク質アミノ酸配列が知られている。ＧＨ３２およびＧＨ６８ファミリーは、各々が４本の逆平行β鎖からなり、一緒に中心負荷電腔を形成する、５枚羽根のβ−プロペラフォールドを共有する。これらの配列は、５つの植物クレード、１つの真菌クレードおよび１つの細菌クレードに分類される。Ａｌｍｅｃｉｇａ−Ｄｉａｚ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）“Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｒｕｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ，ｆｕｎｇｉ  ａｎｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ．”Ｇｅｎｅ  ４８４：２６−３４を参照されたい。ＧＨ６８ファミリーのＦＴａｓｅは、それらの基質であるスクロースのフルクトース部分をフルクタンに重合させる。ＦＴａｓｅには、イヌロスクラーゼおよびレバンスクラーゼの両方が含まれる。一般に、イヌロスクラーゼは、β−（２→１）結合を通しての重合を触媒し、レバンスクラーゼはβ−（２→６）結合による重合を触媒する。イヌロスクラーゼは、β−（２→１）結合を通してのさらなる重合およびグルコースの生成の両方を生じさせる化学反応：
【数１】
0006730281.tif 000002
を触媒する。
【０００７】
相当に少数の公知のＦＴａｓｅ酵素がイヌロスクラーゼ（ＥＣ２．４．１．９）として同定されてきた。これまでに同定されたイヌロスクラーゼ酵素およびコーディング遺伝子は、主として乳酸菌：ラクトバチラス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）菌株、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）ＣＷ２８、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＮＣＣ５３３、Ｌ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）１２１およびＬ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）ＴＭＷ１．１０６中に存在する。ＧＨ６８ファミリー由来の特徴付けられたイヌロスクラーゼ酵素および遺伝子は、大きなイヌリンポリマーを合成する。例えば、Ｌ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）１２１ＩＮＵイヌロスクラーゼは、サイズが１×１０７Ｄａを超えるイヌリンポリマーを合成する；Ｌ．ジョンソニイ（Ｌ．ｊｏｎｓｏｎｉｉ）ＩＮＵＪイヌロスクラーゼは、サイズが約４×１０７Ｄａのイヌリンポリマーを合成する；およびＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＧＳ−５イヌロスクラーゼは、サイズが約７×１０７Ｄａのイヌリンポリマーを合成する。これらの酵素によって合成されたイヌリンポリマーは大きいが、イヌリンオリゴ糖はＧＦ２〜ＧＦ６の相当に小さなＧＦ範囲を有する。バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）２１７Ｃ−１１由来のフルクタンスクラーゼ酵素は、生化学的に特徴付けられている。バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属酵素は、ＧＦ１０〜ＧＦ２５のＧＦ範囲およびＧＦ１６〜ＧＦ１７でピークを有するＩＯＳだけを合成する。Ｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）“Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｅｎｚｙｍｅ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．２１７Ｃ−１１  ｔｈａｔ  ｐｒｏｄｕｃｅｓ  ｉｎｕｌｉｎ  ｆｒｏｍ  ｓｕｃｒｏｓｅ．”Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：１３２７−１３３４を参照されたい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
バチルス・アガラドヘレンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）菌株ＷＤＧ１８５は、ＧＦ３〜ＧＦ３０のＧＦ範囲を備える広範囲のＩＯＳを効率的に合成するイヌロスクラーゼを発現する。単離および／または精製イヌロスクラーゼ、組換え技術によって作成されたそれらの変異体、それらの活性断片、イヌロスクラーゼをコードする合成核酸、それらの変異体、もしくはそれらの活性断片、合成核酸を含む宿主細胞ならびにイヌロスクラーゼを含む組成物が提供される。それらの組成物を使用する方法には、イヌロオリゴ糖の製造が含まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、配列番号４のアミノ酸３２〜４５３、組換え技術によって作成されたそれらの変異体またはそれらの活性断片からなるポリペプチドを含むバチルス・アガラドヘレンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）由来の単離組換え発現イヌロスクラーゼ（ＩＮＵＯ）であって、変異体はβ−（２→１）結合を含有するイヌリンオリゴ糖の重合を触媒することができ、変異体は配列番号４のアミノ酸配列のアミノ酸３２〜４５３と少なくとも６０％の配列同一性を有するＩＮＵＯが提供される。配列番号４のアミノ酸３２〜４５３からなるポリペプチドを含むイヌロスクラーゼは、バチルス・アガラドヘレンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）菌株ＷＤＧ１８５（配列番号４）由来の天然型ＩＮＵＯと通常は関連していない少なくとも１つのアミノ酸を含む可能性がある。組換え技術によって作成された変異体は、配列番号４のアミノ酸配列のアミノ酸３２〜４５３との少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９８％の配列同一性を有する可能性がある。または、組換え技術によって作成された変異体は、配列番号４のアミノ酸配列のアミノ酸３２〜４５３との少なくとも９９％もしくは少なくとも９９．５％の配列同一性を有する可能性がある。配列番号４のアミノ酸３２〜４５３と同一ではない組換え技術によって作成された変異体のアミノ酸残基は、Ｃ末端もしくはＮ末端のいずれかからの保存的アミノ酸置換もしくは欠失から選択することができる。組換え技術によって作成された変異体のアミノ酸配列は、配列番号４のアミノ酸７９〜３９３と同一の配列を含む場合がある。
【００１０】
イヌロスクラーゼを含む組成物もまた提供される。イヌロスクラーゼは、凍結乾燥粉末形、カプセル封入形、コーティング形、顆粒形または液剤であってよい。本組成物は、さらに希釈剤を含む場合がある。
【００１１】
さらに、（１）イヌロスクラーゼをコードする合成核酸；（２）その合成核酸を含むベクター；および（３）その合成核酸もしくはベクターを含む宿主細胞が提供される。ベクターは、発現ベクターであってよい。ベクターは、配列番号３のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含んでいてよい。１つの実施形態では、宿主細胞は、配列番号３のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含んでいてよい。また別の実施形態では、バチルス・アガラドヘレンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）ではない宿主細胞は、配列番号３のヌクレオチド配列を含んでいてよい。さらに、宿主細胞と食品用、飼料用、工業用もしくは医薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む組成物が提供される。本組成物を使用する方法は、本組成物を個体に投与する工程を含むことができるが、このとき本組成物は個体におけるプレバイオティクスとして作用することができる。
【００１２】
さらに、イヌロサッカライド（ＩＯＳ）生成物を製造する方法であって、イヌロスクラーゼをフルクトース源と接触させる工程と、ＩＯＳ生成物を製造するためにｐＨ５〜１０および４０℃〜６０℃でイヌロスクラーゼをフルクトース源と反応させる工程とを含む方法が提供される。フルクトース源は、スクロース、スタキオース、ラフィノース、イヌリンまたはフルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）であってよい。ＩＯＳ生成物は、ＧＦ３〜ＧＦ１００、ＧＦ３〜ＧＦ３０もしくはＧＦ１０〜ＧＦ２５のＧＦ範囲を有していてよい。イヌロスクラーゼは、組換えＩＮＵＯをコードする核酸を含む宿主細胞を含む組成物中で提供されてよい。イヌロサッカライド（ＩＯＳ）を製造する方法は、さらにＩＯＳ生成物の化学修飾を含む場合がある。
【００１３】
さらに、調製されたオリゴフルクトシド生成物を製造する方法であって、イヌロスクラーゼを他の糖類によって置換されたスクロースのグルコースキャップを有するスクロースアナログと接触させる工程と、調製されたオリゴフルクトシド生成物を製造するためにイヌロスクラーゼをスクロースアナログとｐＨ５〜１０および４０℃〜６０℃で反応させる工程とを含む方法が提供される。スクロースアナログは、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロースもしくはアロースによって置換されたスクロースのグルコースキャップを有していてよい。イヌロスクラーゼは、組換えＩＮＵＯをコードする核酸を含む宿主細胞を含む組成物中で提供される。
【００１４】
用語解説
ＢＬＡＳＴ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ
ＣＡＺｙ  炭水化物活性酵素データベース
ＥＤＴＡ  エチレンジアミン四酢酸
ＦＯＳ  フルクトオリゴ糖
Ｆｔａｓｅ、ＦＴＦまたはＦＳ  フルクトシルトランスフェラーゼ
ＧＦｎ  ＩＯＳポリマー内の繰り返し構造（式中、Ｇはグルコース分子を意味し、Ｆｎはフルクトース単位の数、例えば、ＧＦ４を意味する）
ＧＨ３２  グリコシドヒドロラーゼのファミリー３２
ＧＨ６８  グリコシドヒドロラーゼのファミリー６８
ＧＬＣ  ＥＩ／ＭＳ  電子衝撃質量分析法（ＥＩ／ＭＳ）と結合された気液クロマトグラフィー（ＧＬＣ）
ＧＰＣ  ゲル透過クロマトグラフィー
ＨＯＤ信号  １つの陽子が１つの重水素と置換される水からのＮＭＲ信号
ＨＰＡＥＣ  高性能アニオン交換クロマトグラフィー
ＨＰＬＣ  高性能液体クロマトグラフィー
ＨＰＳＥＣ  高性能サイズ排除クロマトグラフィー
ＨＳＱＣ  異核単一量子コヒーレンス
ＩＮＵＯ  バチルス・アガラドヘレンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）由来のイヌロスクラーゼ
ＩＯＳ  イヌロオリゴ糖
ＭＡＬＬＳ  マルチアングルレーザー光散乱法
ＮＭＲ  核磁気共鳴法
ＲＩ  屈折指数
ＳＥＣ  サイズ排除クロマトグラフィー
ＴＬＣ  薄層クロマトグラフィー
汎用バッファー  特定ｐＨを生じさせるように設計されたＮａ２ＨＰＯ４とクエン酸との混合液
ＰＤＩ  多分散性指数
Ｍｗ  重量平均分子量
Ｍｎ  平均分子量
Ｍｐ  ピーク分子量
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】乳酸菌由来のＦＴａｓｅ（イヌロスクラーゼおよびレバンスクラーゼ）の系統樹を示す図である。系統発生のブートストラップ試験は、５００回の複製を使用する近隣結合法によって実施した。ブートストラップ値（％）は、分岐点に示されている。スケールバーは、１つの位置当たり０．１置換の遺伝的距離に対応する。入手できる三次元構造情報を備えるＦＴａｓｅには下線が付けられている。イヌロスクラーゼは灰色フォント、レバンスクラーゼは黒色フォントで記載されている；本明細書に開示したバチルス・アガラドヘレンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）菌株ＷＤＧ１８５由来のＩＮＵＯ酵素はボールド体で記載されている。
【図２】Ｂ．アガラドヘレンス（Ｂ．ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）菌株ＷＤＧ１８５由来のＩＮＵＯ酵素のアミノ酸配列（配列番号４）を示す図である。他のフルクタンスクラーゼ酵素の触媒ドメイン内で同定された保存領域（Ｉ〜ＸＩ）に対応する領域にはボールド体で下線が付けられている。「∇」は触媒残基を表す；および「↓」は、Ｃａ２＋結合残基を表す。「〜」は、推定３１−ａａシグナルペプチド配列を示す。
【図３】組換えＩＮＵＯ（配列番号４のアミノ酸配列のアミノ酸３２〜４５３）によるＩＯＳ形成を示す図である。反応条件は、８００ｍＭのスクロース、２Ｌの８００ｍＭのスクロース中の２００ｍＬ（１．７９ｍｇ／ｍＬ）のＩＮＵＯ、７５ｍＭの汎用バッファー（ｐＨ７．０）である。様々な時間間隔（０〜４時間）で、サンプルが採取された。図３Ａは、スクロース（◆）、グルコース（■）およびフルクトース（●）のレベルの相対量を示している高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析を示している。図３Ｂは、反応開始のＴ＝０、１、２、３および４時間後に測定された経時的なＩＯＳ形成を示している高性能アニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）分析を示している。
【図４】０．３５μｇ／ｍＬの精製ＩＮＵＯ酵素と８００ｍＭのスクロースおよびチコリーイヌリン（実線）とのインキュベーション後に形成されたＩＮＵＯ反応生成物（点線）のＨＰＡＥＣ分析を示す図である（ＧＦ２＝１−ケトース；ＧＦ３＝１−ニストース；およびＧＦ４＝１Ｆ−フルクトフラノシルニストース）。
【図５】（１）精製ＩＮＵＯの沈降および凍結乾燥させた反応生成物、（２）イヌリナーゼによって分解されたＩＮＵＯの反応生成物、（３）１−ケトース（ＧＦ２）および（４）１−ニストース（ＧＦ３）のＴＬＣ分析を示す図である。
【図６】精製組換えＩＮＵＯによって作成されたエタノール沈降ＦＯＳの６００ＭＨｚ  ２Ｄ  １Ｈ−１３Ｃ感受性強化多重度編集異核単一量子コヒーレンス（ＨＳＱＣ）分光法を示す図である。化学シフトは、ｐｐｍ単位で示されている。１Ｈシグナルは、外部アセトン（１Ｈ、δ＝２．２２５）に比して与えられる。
【図７】ＩＮＵＯ（黒色線）およびΣチコリーイヌリン（灰色線）によって合成されたイヌリンのＬｉＮＯ３高性能サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）−マルチアングルレーザー光散乱法（ＭＡＬＬＳ）−屈折指数（ＲＩ）スペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
バチルス・アガラドヘレンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）由来のイヌロスクラーゼ（ＩＮＵＯ）、組換え技術によって作成されたそれらの変異体およびそれらの活性断片が開示される。イヌロスクラーゼの全長配列は、配列番号４に規定したアミノ酸配列からなる。ＩＮＵＯは、成熟酵素として発現させられると、配列番号４のアミノ酸配列のアミノ酸３２〜４５３からなる可能性がある。組換えＩＮＵＯ酵素は、イヌロスクラーゼ活性を有し、β−（２→１）結合を含有するイヌリンオリゴ糖の重合を触媒することができる。ＩＮＵＯは、配列番号４のアミノ酸３２〜４５３からなるポリペプチドを含むことができるが、このとき追加のアミノ酸配列は、配列番号４のアミノ酸３２〜４５３からなるポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に融合させられてよい。いずれかの末端に融合したアミノ酸配列は、通常は天然型ＩＮＵＯと関連していないアミノ酸配列を含有することができる。例えば、そのようなアミノ酸配列は、タンパク質を標識または精製するために有用な可能性がある。そのようなアミノ酸配列は、さらに発現したＩＮＵＯに新規な機能を付与するポリペプチドを含む。例えば、非相同炭水化物結合ドメインは、組換えＩＮＵＯのカルボキシル末端に融合させられてよい。
【００１７】
ＩＮＵＯは、「単離」されていてよく、これはＩＮＵＯが自然にそれが関連している生物学的材料の少なくとも一部から分離されていて、その後に精製されて自然には見いだされない形態、例えば凍結乾燥粉末形、カプセル封入形、コーティング形、顆粒形または液剤に濃縮されていることを意味する。ＩＮＵＯは、「組換え発現」されてよいが、これは、ＩＮＵＯがＤＮＡもしくは類似の合成核酸由来の組換え宿主細胞内で発現させられることを意味する。単一ペプチドは、宿主細胞内の発現ベクターからの組換え発現したタンパク質の分泌を促進するためにＮ末端に機能的に連結している可能性がある。シグナルペプチドは、例えば、配列番号４のアミノ酸１〜３１の配列を有していてよい。または、ＩＮＵＯは、様々なシグナル配列、例えば、また別の細菌種、例えば別のバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）由来のシグナル配列と連結していてよい。シグナルペプチドは、イヌロスクラーゼの成熟形を産生するために組換え発現中にタンパク質分解的に切断されてよい。
【００１８】
「組換えＩＮＵＯ」には、配列番号４のアミノ酸３２〜４５３からなる組換え発現ＩＮＵＯならびに組換え技術によって作成されたそれらの変異体もしくはそれらの活性断片が含まれる。「組換え技術によって作成された変異体」は、配列番号４のアミノ酸３２〜４５３と比較して、Ｎ末端もしくはＣ末端からの少なくとも１つのアミノ酸置換もしくは欠失を含有する。組換え技術によって作成された変異体のアミノ酸配列は、配列番号４の天然型イヌロスクラーゼのアミノ酸配列とは少なくとも１つのアミノ酸が相違する。組換え技術によって作成された変異体は、配列番号４のアミノ酸配列のアミノ酸３２〜４５３との少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは少なくとも９９．５％の配列同一性を示す可能性がある。ＩＮＵＯの変異体は、配列番号４のアミノ酸配列のアミノ酸３２〜４５３からなり、非同一アミノ酸は、Ｃ末端もしくはＮ末端のいずれかからのアミノ酸置換もしくは欠失であってよい。例えば、配列番号４の残基４４９〜４５３の欠失を備える変異体は、配列番号４のアミノ酸配列のアミノ酸３２〜４５３との少なくとも９８％配列同一性を有するであろう。組換えＩＮＵＯには、１、２、３もしくは４つの無作為に選択されたアミノ酸修飾を備えるポリペプチドが含まれるがそれらに限定されない。アミノ酸置換は、さらに、表１に示した保存的アミノ酸置換から選択することができる。
【００１９】
【表１】
0006730281.tif 000003
【００２０】
アミノ酸置換、欠失および／または挿入は、例えば固相ペプチド合成法などの当技術分野において周知のペプチド合成技術を使用して、または組換えＤＮＡ操作によって容易に作成することができる。タンパク質の置換、挿入もしくは欠失変異体を生成するためのＤＮＡ配列を操作するための方法は当技術分野において周知であり、例えば、指定部位変異導入法が含まれる。
【００２１】
組換え発現ＩＮＵＯの活性断片もまた提供される。ＩＮＵＯの活性断片は、測定可能なイヌロスクラーゼ活性を保持するＩＮＵＯの一部分であり、β（２→１）結合を含有するイヌリンオリゴ糖の重合を触媒することができる。
【００２２】
本明細書で使用する「配列同一性率（％）」は、変異体がデフォルトパラメーターを備えるＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアルゴリズムを使用して整列させた場合に、野生型酵素と少なくとも所定の百分率は同一のアミノ酸残基を有することを意味する。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０を参照されたい。ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアルゴリズムのためのデフォルトパラメーターは、次の通りである：
Ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｅｎａｌｔｙ：１０．０
Ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ：０．０５
Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭシリーズ
ＤＮＡ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘ：ＩＵＢ
Ｄｅｌａｙ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ％：４０
Ｇａｐ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｄｉｓｔａｎｃｅ：８
ＤＮＡ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ  ｗｅｉｇｈｔ：０．５０
Ｌｉｓｔ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ：ＧＰＳＮＤＱＥＫＲ
Ｕｓｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｍａｔｒｉｘ：ＯＦＦ
Ｔｏｇｇｌｅ  Ｒｅｓｉｄｕｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ：ＯＮ
Ｔｏｇｇｌｅ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ：ＯＮ
Ｔｏｇｇｌｅ  ｅｎｄ  ｇａｐ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ  ＯＦＦ
【００２３】
欠失は、参照配列と比較して、非同一残基と計数される。いずれかの末端で発生している欠失が含まれる。例えば、配列番号４の残基４４９〜４５３の欠失を備える変異体は、配列番号４のアミノ酸配列のアミノ酸３２〜４５３と比較して、少なくとも９８％配列同一性を有するであろうが、少なくとも９９％の配列同一性は有していないであろう（４１７／４２２個の同一残基×１００は、９８．８％の配列同一性を生じさせる）。
【００２４】
ＩＮＵＯ変異体内のアミノ酸修飾は、他のＧＨ６８酵素と比較して保存されている配列モチーフ内の残基を含む可能性がある。例えば、図２に図示されているＩＮＵＯのモチーフＩ〜ＸＩは、他のＧＨ６８酵素において保存された配列モチーフである（表２）。表２は、様々なフルクタンスクラーゼ酵素の触媒ドメイン内の保存領域（Ｉ〜ＸＩ）のアミノ酸配列アラインメントを示している（各酵素についての各モチーフの開始位置および終了位置が提供されている）：「ＩＮＵ」はイヌロスクラーゼを表す；「ＬＥＶ」はレバンスクラーゼを表す；「∇」は触媒残基を表す；「↓」はＣａ２＋結合残基を表す；「＊」は同一残基を表す；「：」は保存的置換を表す；および「．」は半保存的置換を表す。
【００２５】
【表２】
0006730281.tif 000004
【００２６】
モチーフＩ、ＶおよびＶＩＩＩは、ＦＴａｓｅ内の３つの触媒的アミノ酸残基を含有する領域であると同定されている。ＩＮＵＯの変異体は、配列番号４のアミノ酸配列のアミノ酸３２〜４５３からなる可能性がある。または、ＩＮＵＯの変異体は、配列番号４のアミノ酸配列と同一であるモチーフＩ〜ＩＶ（配列番号４の残基７９〜１６８）またはモチーフＩ〜ＸＩ（配列番号４の残基７９〜３９３）を含む可能性がある。
【００２７】
ＩＮＵＯは、組成物の１つの成分であってよい。本組成物は、Ｂ．アガラドヘレンス（Ｂ．ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）の培養から得られた精製ＩＮＵＯを含む場合がある、または組換えＩＮＵＯをコードする核酸を含む組換え技術によって作成された修飾宿主細胞内で発現させることができる精製組換えＩＮＵＯを含む場合がある。例えば、本組成物は、組換えＩＮＵＯをコードする核酸を発現する宿主細胞を含む場合がある。ＩＮＵＯは、本組成物中で少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％の純度を有していてよい。例えば、ＩＮＵＯは、相同性まで精製されてよい。本組成物は、他の成分を含むことができる。例えば、ＩＮＵＯ組成物は、凍結乾燥粉末としてのＩＮＵＯおよび任意選択的に１つ以上の担体、例えばイヌロスクラーゼ活性を有していない他のタンパク質などを含むことができる。本組成物はさらに、例えば蒸留水、蒸留／脱イオン水または緩衝生理食塩液などの希釈剤中にＩＮＵＯを含む場合がある。
【００２８】
組換えＩＮＵＯをコードする合成核酸、例えばＤＮＡ、核酸を含むベクターおよびベクターもしくは核酸を含む宿主細胞が提供される。「合成」核酸は、配列番号３に描出した天然型配列内では見いだされない少なくとも１つのヌクレオチド残基を含有する。組換えＩＮＵＯをコードする核酸配列は、相同性もしくは非相同性発現のために使用できる発現調節領域（例えば、プロモーター、エンハンサーおよびターミネーター）を含む場合がある。そのような発現調節配列は、ポリペプチドコーディング核酸配列に機能的に連結している。当業者であれば明確に理解できるように、遺伝コードは縮重しており、これは一部の場合には複数のコドンが同一アミノ酸をコードできることを意味する。組換えＩＮＵＯをコードする合成核酸には、全ての可能性のあるコドン縮重が含まれる。組換えＩＮＵＯをコードする核酸は、Ｂ．アガラドヘレンス（Ｂ．ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）のｆｔｆ遺伝子である、配列番号３のポリヌクレオチドを含む場合がある。
【００２９】
ベクターは、組換えＩＮＵＯをコードする合成核酸を含む場合がある。ベクターは、例えば、組換えＩＮＵＯを発現できる発現ベクターの場合がある。ベクターは、１つ以上の選択可能なマーカー、例えば、抗生物質耐性遺伝子を含む場合がある。ＩＮＵＯコーディング核酸を含むベクターは、配列番号３のｆｔｆポリヌクレオチドを含むベクターを含むことができる。他のベクターは、配列番号３のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含んでいてよい。核酸構築物の１つ以上のコピーを含有する組換え宿主細胞、例えば植物、動物、真菌もしくは細菌細胞が提供される。宿主細胞は、組換えＩＮＵＯを発現および分泌することができる細菌細胞、例えば、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）であってよい。他の宿主細菌細胞は、バチルス・アガラドヘレンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）でなくてもよい。宿主細胞は、配列番号３のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むベクターを含んでいてよい。組換えＩＮＵＯをコードする核酸、ベクター、核酸を含む発現構築物および宿主細胞を製造および使用する好適な技術は、当技術分野において周知である。
【００３０】
ＩＯＳ生成物を製造するためのＩＮＵＯ、例えば、組換えＩＮＵＯを使用する方法もまた提供される。本方法は、ＩＮＵＯを好適なフルクトース源、例えば、スクロース、スタキオース、ラフィノースまたはＦＯＳと接触させる工程を含むことができる。好適なスクロース源には、例えばサトウキビ、ビートジュースおよび糖蜜のような原料物質が含まれるがそれらに限定されない。イヌリン形スクロースを製造する場合は、イヌリン（例えば、ＧＦｎ）の最終平均重合度は、培養培地のスクロース濃度、イヌリンシンターゼがスクロースと接触させられる場合の温度および／または反応中のスクロース基質添加の時機を制御することによって影響を受ける可能性がある。米国特許第７，５０７，５５８号明細書を参照されたい。イヌリンの最終平均重合度（すなわち、ＧＦｎ）は、ＧＦ３〜ＧＦ１００または典型的にはＧＦ３〜ＧＦ３０もしくはＧＦ１０〜ＧＦ２５の範囲内にあってよい。例えば、スクロースは、２０〜１，０００ｍＭのレベルの濃度で添加されてよい。反応を開始させるために８００ｍＭのスクロースが一度に加えられると、例えば、ＩＯＳ生成物はＧＦ１０〜ＧＦ２５のＧＦ範囲を有し、ピークはＧＦ１６〜ＧＦ１７にある。本方法は、広いｐＨ範囲にわたり、例えば、約ｐＨ５〜１０、約ｐＨ５．５〜９．５、約ｐＨ６〜８または約ｐＨ７で実施することができる。温度は、約４０℃〜６０℃、例えば、約４５℃〜５５℃または約５０℃に保持することができる。
【００３１】
上述のように、ＩＮＵＯによるＩＯＳの製造は、同時にスクロース基質からグルコースを生成する。ＩＮＵＯ触媒反応中に生成されたグルコースは、さらに、ＩＮＵＯを好適なフルクトース源と接触させる工程と同時に、または引き続いてさらに利用することができる。例えば、ＩＮＵＯを使用する方法は、フルクトースを生成するために遊離したグルコースを異性体化する工程をさらに含むことができる。この異性体化する工程は、例えば、高フルクトースシロップの製造における１つの工程であってよい。または、グルコースは、共発酵の工程における微生物、例えば、酵母のための基質として利用することができる。例えば、ＩＮＵＯを発現する微生物は、発酵微生物とともに共培養することができる。この場合には、ＩＮＵＯ触媒反応のために使用されるｐＨおよび温度の状況は、発酵微生物とＩＮＵＯを発現する微生物とを共培養するために最適化されてよい。
【００３２】
ＩＮＵＯと接触させられる好適なフルクトース源は、例えば、スクロースを含有する食品であってよい。食品をＩＮＵＯと接触させる工程は、食品中のＦＯＳの量を増加させながら、食品のスクロース含量を低下させる。ＦＯＳは、有益には低カロリー値を備える食物繊維として機能する。この状況における好適なフルクトース源には、果汁やヨーグルトが含まれるがそれらに限定されない。
【００３３】
ＩＮＵＯは、精製ＩＮＵＯまたは組換えＩＮＵＯを含む組成物中で提供されてよい。ＩＮＵＯは、ＩＮＵＯを発現する細胞、例えば組換えＩＮＵＯをコードする核酸を含む宿主細胞を含む組成物の形態で提供されてよい。この場合には、細胞は、非増殖状態にあってよい。これは、細胞の増殖を支持するための栄養素および他の材料を供給する必要を伴わずにフルクタンの製造が進行することを許容する。製造は、スクロースもしくは他のフルクトース源、例えばラフィノースを細胞と接触させ、培地由来の多糖類を取り出す工程によって実施することができる。ＩＮＵＯを発現する細胞は、担体、例えば固体粒子、フィルターおよび反応装置の壁の上に固定化させることができる。細胞は、ＩＮＵＯに加えて少なくとも１つの酵素、例えばグルカンスクラーゼ酵素を共発現できる可能性がある。例えば、ＩＮＵＯと共発現できる可能性がある酵素、例えば、イソメラーゼは、ＩＮＵＯ触媒反応中に生成したグルコースを基質として利用することができよう。
【００３４】
ＩＯＳ生成物は、ＩＯＳ生成物の所望の適用に依存して、製造工程後に化学的に修飾することができる。イヌリンの一部の化学修飾および修飾オリゴ糖の様々な工業用途は、Ｓｔｅｖｅｎｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）“Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｕｌｉｎ，ａ  ｖａｌｕａｂｌｅ  ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  ｒｅｓｏｕｒｃｅ，ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．”ＢｉｏＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２：１−１６に要約されている。例えば、カルバミル化イヌリンは、それが界面張力を減少させる能力を前提に、生分解性界面活性剤として機能することができる。さらに、炭水化物中へのカルボン酸／カルボン酸塩機能の導入は、洗剤成分または食品成分として使用できる化合物および材料を生じさせる。イヌリンは、例えば、Ｖｅｒｒａｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．２７１：１０１−１１２および国際公開第９５／１５９８４号パンフレットに記載されたような、当技術分野において公知の方法にしたがってカルボキシメチル化することができる。カルボキシメチル化イヌリンは、例えば、スケール調整剤として使用できる。または、ＩＯＳの酸化は、例えば、欧州特許第４２７３４９号明細書、国際公開第９５／１２６１９号パンフレットおよび同第９５／０７３０３号パンフレットに開示されたものを含む、当技術分野において周知である手段によって実施することができる。イヌリンのエステル化は、食品用非イオン性界面活性剤として使用できる界面活性分子を生成することができる。イヌリンのアルコキシル化は、水発泡ポリウレタンフォームを調製する際に有用であることが証明されている。例えば、Ｒｏｇｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）“Ａｐｐｌｉｃａｎｔ  ｏｆ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｄ  ｉｎｕｌｉｎ  ｉｎ  ｗａｔｅｒ−ｂｌｏｗｎ  ｐｏｌｙｕｒｅｔｈａｎｅ  ｆｏａｍｓ．”ＢｉｏＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ６：１９９２−１９９７を参照されたい。酸化フルクタンは、改良された水溶性、変化した粘度および遅延発酵性を有し、それらの金属錯化剤、洗剤添加物、補強剤、生体活性炭水化物、乳化剤および水結合剤としてのそれらの使用を促進する。例えばタンパク質もしくは脂肪酸などの化合物に結合した酸化フルクタンは、乳化剤および安定剤として使用できる。
【００３５】
ＩＯＳ生成物の分解によって生成されたＦＯＳは、個体に投与できるプレバイオティクス組成物中で使用できる。ＦＯＳ生成物を含むプレバイオティクス組成物は、例えば、便秘、下痢および／または高コレステロールレベルを持つ個体に投与することができる。ＦＯＳは、大腸内の微生物叢の基質として機能することができ、消化管全体の健康状態を増加させる。ＦＯＳおよびＩＯＳは、さらに動物およびヒト両方の腸内でカルシウム吸収を促進することができる。ＦＯＳは、低カロリー値を備える食物繊維として有用な可能性がある。例えば、ヒトには１日当たり２０ｇのプレバイオティクス組成物を投与することができる。
【００３６】
組換えＩＮＵＯを発現できる組換え宿主細胞は、プレバイオティクスとして作用できる組成物中に使用できる。組換え宿主細胞は、消化後に腸内でＩＯＳを生成することができ、それによりイヌリンを代謝できるビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属のような菌株の増殖を促進する。本組成物は、さらに食品用、飼料用、工業用もしくは医薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤を含むことができる。この状況では、「医薬上許容される」は、この成分が動物および／またはヒトが消化するために安全であることを意味する。本組成物は、動物またはヒトに投与することができる。プレバイオティクス組成物は、食品と結び付けて直接的に消化される可能性がある。
【００３７】
さらに、調製されたオリゴフルクトシド生成物（ＩＯＳ以外）を生成するためにＩＮＵＯ、例えば、組換えＩＮＵＯを使用する方法であって、ＩＯＳのグルコースキャップが例えば、ガラクトース、マノース（ｍａｎｏｓｅ）、フコースもしくはキシロースなどの他の糖類で置換される方法もまた提供される。例えば、Ｈｏｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）“Ｃｈｅｍｏ−ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｓｙｓｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔａｉｌｏｒ−ｍａｄｅ  ｏｌｉｇｏｆｒｕｃｔｏｓｉｄｅｓ．”ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：９０；Ｋｒａｌｊ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）“Ｆｒｕｃｔａｎｓｕｃｒａｓｅ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  ｓｕｃｒｏｓｅ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  ｎｅｗ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｕｎｉｑｕｅ  ｆｒｕｃｔｏ−ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．”Ｂｉｏｃａｔ．Ｂｉｏｔｒａｎｓｆ．２６：３２−４１を参照されたい。本方法は、ＩＮＵＯを好適なスクロースアナログと接触させる工程であって、スクロースのグルコースキャップがまた別の糖類、例えばガラクトース、マンノース、フコース、キシロースもしくはアロースで置換される工程を含むことができる。スクロースからＩＯＳを製造する方法に類似して、調整されたオリゴフルクトシドの最終平均重合度は、培養培地のスクロースアナログ濃度、イヌリンシンターゼがスクロースアナログと接触させられる場合の温度および／または反応中のスクロースアナログ添加の時機を制御することによって影響を受ける可能性がある。本方法は、広いｐＨ範囲にわたり、例えば、約ｐＨ５〜１０、約ｐＨ５．５〜９．５、約ｐＨ６〜８または約ｐＨ７で実施することができる。温度は、約４０℃〜６０℃、例えば、約４５℃〜５５℃にわたって、または約５０℃に保持することができる。
【００３８】
用語「約」は、一般に参照値の±１５％を意味する。温度を定義する場合、「約」は、工程中の平均温度に関する。当業者であれば、工程の温度が、例えば設定温度から±１℃までのように、設定温度の周囲で若干変動することを予想するであろう。「約４０℃」の温度は、４０±１℃の温度を含むであろうし、さらに工程中に発生する可能性がある温度における一過性の急上昇もまた含む。例えば、工程の温度は、数分間にわたり４０℃を数度超える可能性がある。これらの一過性の急上昇は、「約４０℃」に含まれる。
【実施例】
【００３９】
細菌株、プラスミドおよび培養条件
バチルス・アガラドヘレンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）菌株ＷＤＧ１８５（Ｄｕｐｏｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）の全ゲノム（３．７ＭＢ）は、Ｉｌｕｍｉｎａ次世代シーケンシング（ＮＧＳ）（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用してシーケンシングし、組み立てた（ＢａｓｅＣｌｅａｒ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。その分類学的位置は、１６ｓＲＮＡ分析（同一性：バチルス・アガラドヘレンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）菌株ＤＳＭ８７２１を用いて１４３６／１４３８＝９９％）によって同定した。連続配列ランは、ＢｉｏＸｐｒ（Ｎａｍｕｒ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用して注釈が付けられた。Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）検索を使用して、２つの推定フルクタンスクラーゼ遺伝子を、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（配列番号７）のＳＡＣＢおよびＬ．ジョンソニイ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＮＣＣ５３３（配列番号１２）のＩＮＵＪをコードする遺伝子との配列相同性によってバチルス・アガラドヘレンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）ＷＤＧ１８５ゲノム内で同定した。
【００４０】
クローニングのための細胞宿主としては、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＳＣ６．１（ＢＧ３５９４ｃｏｍＫ；ΔａｐｒＥ、ΔｎｐｒＥ、ｄｅｇＵＨｙ３２、ｏｐｐＡ、ΔｓｐｏＩＩＥ３５０１、ａｍｙＥ：：ｘｙｌＲＰｘｙｌＡｃｏｍＫ−ｐｈｌｅｏとも呼ばれる）を使用した。そのコンピテント遺伝子（ｃｏｍＫ）は、ＤＮＡ結合および取込みのためのコンピテンシーを誘導するために使用したキシロース誘導性プロモーターの下に配置した。Ｈａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）“Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｉｎｐｕｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ＣｏｍＫ，ｔｈｅ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ．”Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２１：７６３−７７５を参照されたい。枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＳＣ６．１宿主細胞内でｉｎｕＯ遺伝子を発現させるためには、プラスミドのｐＨＰＬＴを使用した。Ｖａｎ  Ｓｏｌｉｎｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ  ５：３３３−３４１を参照されたい。組換えプラスミドを含有する宿主細胞は、トリプトンダイズブロス（Ｏｘｏｉｄ  Ｌｔｄ．，ＵＫ）およびグラントの第ＩＩ培地中で培養した。米国特許第８，５０７，２４４Ｂ２号明細書を参照されたい。形質転換体を選択するためには、ハートインフュージョン寒天プレート（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＭＩ）を使用した。プラスミド完全性は、１０μｇ／ｍＬのネオマイシンの添加によって維持した。
【００４１】
ＩＮＵＯ由来のイヌロスクラーゼのアミノ酸配列アラインメントおよび系統樹の構築
ＩＮＵＯならびにイヌロスクラーゼおよびレバンスクラーゼ両方を含む以前に特徴付けたＦＴａｓｅｓのアミノ酸配列は、それぞれ１０および０．２のｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｅｎａｌｔｙおよびｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙを備えるＣｌｕｓｔａｌＷインターフェースのＭＥＧＡバージョン４（インターネット上のｍｅｇａｓｏｆｔｗａｒｅ．ｎｅｔで）を用いてアラインメントした。アミノ酸配列は、ＣＡＺｙ（炭水化物活性酵素）データベース（インターネット上のｃａｚｙ．ｏｒｇで）から取得した。系統樹もまた、ＭＥＧＡプログラムを使用して作成した。系統発生のブートストラップ試験は、５００回の複製を使用する近隣結合法によって実施した。
【００４２】
分子技術
遺伝子クローニング、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡ形質転換、ＤＮＡ操作およびアガロースゲル電気泳動法のための一般的方法は、記載された通りであった。Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，４ｔｈ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いた制限エンドヌクレアーゼ消化およびライゲーションは、酵素の供給業者（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）によって勧告されたように実施した。プライマーは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤから得た。シーケンシングは、ＢａｓｅＣｌｅａｒ（Ｌｅｉｄｅｎ，ＮＬ）を使用して実施した。枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のプラスミドＤＮＡは、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）プラスミドキット（Ｍａｃｈｅｒｙ−Ｎａｇｅｌ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．ＫＧ，Ｄｕｅｒｅｎ，ＦＲＧ）を使用して単離した。
【００４３】
ｉｎｕＯ遺伝子のクローニング
バチルス・アガラドヘレンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）由来の全ゲノムＤＮＡは、最初にこの菌株を３７℃で２４時間にわたりハートインフュージョン寒天プレート（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＭＩ）上で増殖させることにより入手した。細胞物質をこのプレートから擦り取り、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）（製品番号Ｄ６００５）からのＺＦ真菌／細菌ＤＮＡミニプレップキットを用いてゲノムＤＮＡを調製するために使用した。ＤＮＡは、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を使用するＤＮＡサーマルサイクラーＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ（登録商標）ｅｐ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｓ上で増幅させた。Ｂ．アガラドヘレンス（Ｂ．ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）ｉｎｕＯ遺伝子は、Ｂ．アガラドヘレンス（Ｂ．ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）のゲノムＤＮＡからのポリメラーゼ連鎖反応によってプライマー：
ＰｓｔＩ部位（ボールド体）およびＮｄｅＩ部位（イタリック体）を含有するＢｓｐＫ０２３１３−ＦＷ  ５’−ＣＴＣＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＡＧＣＧＣＡＡＣＣＴＣＡＧＡＣＴＧＧＧＡＴＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＡＴ−３’（配列番号１）、および
ＨｐａＩ部位（ボールド体）を含有するＢｓｐＫ０２３１３−ＲＶ  ５’−ＣＧＣＡＧＡＴＡＴＣＧＴＴＡＡＣＴＣＡＡＣＧＡＴＡＧＧＣＡＣＣＧＡＡＴＧＧＴＣＴＧＡＴ−３’（配列番号２）を使用して増幅させた。ＰｓｔＩおよびＨｐａＩ制限部位を使用して、ｉｎｕＯアンプリコンは、発現ベクターｐＨＰＬＴ内にクローン化した。生じたベクター（ｐＨＰＬＴ−ＩｎｕＯ）は、発現試験のために枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＳＣ６．１内に形質転換させた。プラスミドの正確な構築は、ヌクレオチド配列分析（ＢａｓｅＣｌｅａｒ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって確証した。
【００４４】
ＩＮＵＯの推定アミノ酸配列分析およびデンドログラム
Ｂ．アガラドヘレンス（Ｂ．ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）ＷＤＧ１８５のｆｔｆ遺伝子は、上記に開示したクローニングおよび発現方法によって同定した。ｆｔｆ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号３に開示した。ｆｔｆ遺伝子は、３１アミノ酸の推定シグナル配列を備える４５３アミノ酸のタンパク質をコードする。コードされたタンパク質の全長アミノ酸配列は、配列番号４に示した。シグナルペプチダーゼについての推定切断部位は、インターネット上のｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰで提供されたソフトウエアを使用して決定した。ｆｔｆ遺伝子によってコードされた成熟タンパク質の推定分子量は、４７．３ｋＤａである。４１６アミノ酸のコア領域（配列番号４の残基３２〜４４７）は、グリコシドヒドロラーゼファミリー６８（ＧＨ６８）のメンバーとして配列相同性（インターネット上のｐｆａｍ．ｊａｎｅｌｉａ．ｏｒｇでのソフトウエア）によって同定した。
【００４５】
ＩＮＵＯのＢＬＡＳＴ検索は、パエニバチルス・エルギイ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｅｌｇｉ）由来の推定ＦＴａｓｅとの最高類似性を解明した。これら２つのタンパク質は、全タンパク質配列にわたって６７％の配列同一性および４４３アミノ酸内で８１％の配列同一性を共有する。配列番号４のＩＮＵＯの残基３５〜６４は、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）の部分的に特徴付けられたイヌロスクラーゼ２１７Ｃ−１１由来の３０アミノ酸Ｎ末端配列との５０％の配列同一性を共有した。Ｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）を参照されたい。
【００４６】
ＩＮＵＯは系統樹内でレバンスクラーゼと最も緊密にクラスター化していたが（図１）、他の公知のイヌロスクラーゼ酵素とは緊密にクラスター化していなかった。ＧＨ６８酵素における触媒作用に含まれると報告された保存モチーフおよびアミノ酸は、表２に描出したように、全部がＩＮＵＯ配列内に存在した。Ｖａｎ  Ｈｉｊｕｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．  ７０：１５７−１７６；Ｖｅｌａｚｑｕｅｚ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０６：１７６３−１７７８を参照されたい。
【００４７】
ＧＨ６８酵素の触媒活性のために重要である３つのアミノ酸残基もまたＩＮＵＯ内に存在する。例えば、触媒性求核剤（ｎｕｃｌｅｐｏｈｉｌｅ）Ｄ８１は、ＩＮＵＯ（配列番号４）の残基７９〜８３に位置する保存（Ｖ／Ｌ）ＷＤ（Ｔ／Ｓ）（Ｗ／Ｍ）モチーフ（配列番号５）内に存在する。第二に、遷移状態安定剤残基Ｄ２４２は、ＩＮＵＯの残基２４１〜２４３に位置する保存ＲＤ２４２Ｐモチーフ内に存在する。第三に、酸／塩基触媒残基Ｅ３２６は、ＩＮＵＯの残基３２３〜３２７で保存Ｄ（Ｅ／Ｑ）（Ｉ／Ｔ）ＥＲモチーフ（配列番号６）内に存在する。Ｖｅｌａｚｑｕｅｚ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）；Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：９３５−９４１；Ｏｚｉｍｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５６０：１３１−１３３を参照されたい。
【００４８】
保存モチーフおよび触媒性アミノ酸を取り囲んでいるアミノ酸残基は、表２に描出した配列アラインメントに示したように、他のＧＨ６８酵素との差を示した。例えば、遷移状態安定剤を抱いている保存配列モチーフＲＤＰには、大多数のイヌロスクラーゼ酵素内の配列モチーフＩＡＭが先行するが、他方ＩＮＵＯ内には配列モチーフＳＡＦが存在する。保存Ｄ（Ｅ／Ｑ）（Ｉ／Ｔ）ＥＲモチーフ（配列番号６）内では、また別の差が見られる。酸／塩基触媒残基Ｅ３２６はＩＮＵＯ内に存在するが、モチーフ由来の保存アスパラギン酸塩（Ｄ）は、ＩＮＵＯ内ではその代りにヒスチジン（Ｈ）である。Ｄ（Ｅ／Ｑ）（Ｉ／Ｔ）ＥＲモチーフ（配列番号６）内のアスパラギン酸塩残基は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＳＡＣＢおよびＬ．ジョンソニイ（Ｌ．ｊｏｎｓｏｎｉｉ）ＮＣＣ５３３  ＩＮＵＪ酵素のカルシウム結合部位内のＣａ２＋と協調する。Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）；Ｐｉｊｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１２：８０−９３を参照されたい。ＳＡＣＢ内のカルシウム結合部位を構成するまた別の残基であるＤ２４１は、ＩＮＵＯ内ではその代りにイソロイシン（Ｉ２３６）である（表２を参照されたい）。これは、ＩＮＵＯがＣａ２＋に結合しないことを示唆しており、これは上記のＩＮＵＯ活性に及ぼすＥＤＴＡ効果の非存在と一致しているであろう。さらに、触媒性酸塩基触媒残基Ｅ３２６に先行するアミノ酸はロイシン（Ｌ）であるが、通例は、他のＧＨ６８酵素内の保存イソロイシンもしくはトレオニンである。（例えば、表２を参照されたい。）
【００４９】
３１アミノ酸シグナル配列および上記で考察したＩＮＵＯの様々なモチーフおよびアミノ酸残基は、図２ではボールド体で記載し、強調表示した。フォワードスラッシュは、モチーフＩＩＩとＩＶとの間を区切っている。
【００５０】
ＩｎｕＯ遺伝子発現およびＩＮＵＯの精製
発現は、ＴＳＢ中で６時間にわたり３７℃で好気的（２５０ｒｐｍ）に増殖させたｐＨＰＬＴ−ＩｎｕＯを抱いている枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＳＣ６．１の単一コロニーから開始させた。前培養（１ｍＬ）は、３滴の消泡剤（Ｍａｚｕ  ＤＦ  ６０００Ｋ、Ｍａｚｅｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｕｒｎｅｅ，ＩＬ）を含有する２ＬのＢｅｌｌｃｏバッフル式振とうフラスコ内の２００ｍＬのグラントの第ＩＩ培地に接種するために使用した。３７℃での６６時間にわたる（２２０ｒｐｍでの）インキュベーション後、上清は、遠心分離（１７，０００×ｇ）によって収集し、０．２２μｍのＤｕｒａｐｏｒｅ（登録商標）ＰＶＤＦ膜（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過した。
【００５１】
ＩｎｕＯの高発現レベルが宿主として上記の枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＳＣ６．１を使用して達成されると、１Ｌの培養から約１００ｍｇの高精製タンパク質が産生した。ＩＮＵＯの予測Ｍｒは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって得られた結果と一致していた。
【００５２】
上清中に存在するＩＮＵＯ酵素は、１ｍＬのＲｅｓｏｕｒｃｅＱカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および２０ｍＭのＴｒｉｓバッファー（ｐＨ７．５）中の１ＭのＮａＣｌを用いる３０ｍＬの線形勾配を備えたＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して１ｍＬ／分の流量でアニオン交換クロマトグラフィーによって均質になるまで精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって判定される溶出ピークに存在するタンパク質は、汎用バッファー（ｐＨ７）（すなわち、Ｎａ２ＨＰＯ４とｐＨ７を有するクエン酸の混合物）を使用して脱塩した（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット１０ｋＤａのＭＷＣＯ，Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）。タンパク質濃度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ試薬および標準物質としてのウシ血清アルブミン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用するＢｒａｄｆｏｒｄ法によって決定した。
【００５３】
ｐＨおよび温度の最適値
ｐＨ最適値（２５ｍＭの汎用バッファー（ｐＨ２〜１２）および温度最適値（４０〜８８℃）は、１５分間（ＨＰＬＣ）もしくは２４時間のインキュベーション（ＴＬＣ）後の８００ｍＭのスクロースからの０．５３ｍｇ／ｍＬの精製ＩＮＵＯによって合成された糖類の量を測定することによって決定した（データは示していない）。糖類の量は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって定性的に、および／または高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって定量的に決定した。
【００５４】
ＩＮＵＯは、それぞれｐＨ５．５〜９．５（＞６０％の活性）および４５℃〜５５℃（＞６０％の活性）の広範囲のｐＨおよび温度最適値を示した。温度およびバッファーの様々な組み合わせを用いたアッセイは、５０℃およびｐＨ７．０で精製ＩＮＵＯの活性が最適であることを証明した。ＩＮＵＯは、Ｃａ２＋キレート剤であるエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の添加によって阻害されなかった。ＩＮＵＯの温度およびｐＨプロファイル／最適値ならびに酵素活性にＥＤＴＡが及ぼす効果は、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）２１７Ｃ−１１のイヌロスクラーゼについて報告されたものに最も類似していた。
【００５５】
糖濃度決定のためのＨＰＬＣアッセイ
ＩＮＵＯとスクロースとの酵素反応からのスクロース、グルコースおよびフルクトース濃度は、５０ｍｍおよび１００ｍｍのインライン接続ＲＮＭ  Ｃａ２＋炭水化物カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を装備したＡｇｉｌｅｎｔ  １２００（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）ＨＰＬＣを使用して監視した。カラムは、８０℃の温度および１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）の溶離液中の０．８ｍＬ／分の流量で操作した。検出は、３５℃の温度で作動する屈折指数（ＲＩ）検出器を用いて実施した。注入量は５μＬで、正確な糖濃度を決定するために適切な較正設定を使用した。
【００５６】
ＦＯＳ産生と特性解析
（ｉ）ＦＯＳの産生：
０．３５μｇ／ｍＬへ精製した組換えＩＮＵＯは、ＦＯＳを生成するために５０ｍＭの汎用バッファー（ｐＨ７．０）中の５０℃で８００ｍＭのスクロースとともにインキュベートした。スクロースの枯渇ならびにグルコースおよびフルクトースの形成は、ＨＰＬＣを使用して監視した（上記を参照されたい）。生成されたＦＯＳは、ＴＬＣ（データは示していない）およびＨＰＬＣによって分析した。図３は、ＨＰＬＣおよび高性能アニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）によって測定された組換えＩＮＵＯによるＩＯＳ形成の結果を示している。
【００５７】
ＦＯＳは、２体積の９６％低温エタノールを使用してインキュベーション混合物から沈降させた。４℃での一晩のインキュベーション後、ＦＯＳは、６０分間にわたる９００×ｇでの遠心分離により分離した。ＦＯＳは、それらをＭｉｌｌｉＱ水中に溶解させた後に沈降させた。この工程を２回以上繰り返し、ＦＯＳは最終的に凍結乾燥させた。
【００５８】
より大きなバッチのＦＯＳは、総量２Ｌで、２００ｍＬのＩＮＵＯを８００ｍＭのスクロース、７５ｍＭの汎用バッファー（ｐＨ７．０）中で１．７９μｇ／ｍＬでインキュベートすることによって生成した。この混合物を緩徐に振とうしながら（３０ｒｐｍ）５０℃でインキュベートした。スクロースの枯渇は、ＨＰＬＣによって監視し、生成物の形成は経時的にＨＰＡＥＣによって測定した。
【００５９】
（ｉｉ）薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）：
ＦＯＳ生成物を特性解析するために、１μＬの２×希釈インキュベーションサンプルもしくは１μＬの精製凍結乾燥ＦＯＳサンプル（１ｍｇ／２０μＬ）を移動相としての１−ブタノール：エタノール：水（５：５：３）を使用してＴＬＣ（シリカゲル６０  Ｆ２５４；Ｍｅｒｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に一晩適用した。プレートを風乾させ、４５：４５：１０のＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ：Ｈ２ＳＯ４展開溶液を用いてスプレーし、およそ１５分間にわたり１１０℃で展開させた。
【００６０】
凍結乾燥ＦＯＳ生成物のエキソイヌリナーゼによる分解は、下記のように実施した：１０μＬのサンプルおよび２μＬのアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）イヌリナーゼ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（１ｍＬの０．１Ｍの酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．５）中に溶解させた２２Ｕ／ｍｇでの酵素１０ｍｇのストック溶液から）は、室温で１５分間インキュベートし、上述したようにＴＬＣプレート上でランした。
【００６１】
（ｉｉｉ）高性能アニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）分析：
ＩＮＵＯとスクロースおよび精製フルクトオリゴ糖（０．１ｍｇ／ｍＬ）との酵素インキュベーション反応は、適切に希釈した後、パルス式電流測定検出（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ−Ｄｉｏｎｅｘ  ＩＣＳ−５０００）と結合した高性能アニオン交換クロマトグラフィーによって分析した。グルコース、フルクトース、スクロース、ケストース、ニストース、フルクトシルニストースおよびチコリーイヌリン（Ｓｉｇｍａ，Ｍｅｇａｚｙｍｅ）を標準物質として使用した。糖は、溶媒としての０．５０ｍＬ／分の流量での超純水（溶離液Ａ）、１ＭのＮａＯＨ（溶離液Ｂ）および０．５ＭのＮａＡｃ（溶離液Ｃ）、５〜１０μＬの注入量、３０℃のカラム温度および２５℃の検出器温度を使用するＣａｒｂｏｐａｃＰＡ２００カラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて分離した。下記の溶離液Ａ、ＢおよびＣの勾配を使用した：
溶離液Ａ（０分間、８９％）；（５５分間、３５％）；（６０．９分間、２５％）；（６１分間、１５％）；
溶離液Ｂ（０分間、１０％）；（５５分間、１０％）；（６０．９分間、１０％）；（６１分間、２０％）；および
溶離液Ｃ（０分間、１％）；（５５分間、５５％）；（６０．９分間、６５％）；（６１分間、６５％）；
【００６２】
検出は、Ａｕ作用電極およびＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極を備える電気化学的検出器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて実施した。波長：Ｇｏｌｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＰＡＤ（標準クワッド電位）：＋０．１ボルト（０〜０．４０秒）；−２．０ボルト（０．４１〜０．４２秒）；０．６ボルト（０．４３秒）；−０．１ボルト（０．４４〜０．５０秒）。データは、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎソフトウエア（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して統合された。
【００６３】
（ｉｖ）核磁気共鳴法（ＮＭＲ）：
ＮＭＲ分光法のためには、およそ１（重量／体積）％のサンプルを９９．９原子％のＤ２Ｏ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中に溶解させ、５０℃で２０分間にわたり撹拌し、その後にＮＭＲチューブに移した。チコリーイヌリンおよびザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）由来のレバン（Ｓｉｇｍａ）をコントロールとして使用した。一次元１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、３００Ｋの二重共鳴広帯域プローブで６００ＭＨｚのＡｖａｎｃｅ  ＩＩＩ  ＮＭＲ分光計（Ｂｒｕｋｅｒ）上に記録された。化学シフトは、外部アセトンのメチル基に比較してｐｐｍで表示される（δ＝２．２２５）。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、３２ｋの複合データポイントにおいて１０，０００Ｈｚのスペクトル幅を用いて記録された。ＨＯＤシグナル（すなわち、その中から１つの陽子が重水素と置換されている水からの）は、励起彫刻（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｓｃｕｌｐｔｉｎｇ）によって抑制された。フーリエ変換に先行して、時間領域データは、１Ｈｚの線幅拡大に対応する指数関数を伴ってアポダイズされた。
【００６４】
標準パラメーターを使用する二次元１Ｈ−１３Ｃ感度増強多重度編集異核単一光子コヒーレンス（ＨＳＱＣ）分光法は、６００．１３ＭＨｚの１Ｈ周波数および１５０．９ＭＨｚの１３Ｃ周波数で実施された。スペクトルは、Ｆ２については７２１１ＨｚおよびＦ１については２５ｋＨｚのスペクトル幅を用いて記録された。スペクトルは、２秒のｄ１および１４１ｍｓの獲得時間を使用して、１６のトランジエントおよび２５６の間接増分を用いて獲得された。
【００６５】
（ｖ）ＦＯＳサンプルのメチル化：
ＦＯＳサンプルは、ＣＨ３Ｉおよびジメチルスルホキシド中の固体ＮａＯＨを使用してパーメチル化した。Ｐｅｔｔｏｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．７：１５９０−１６０７を参照されたい。２Ｍのトリフルオロ酢酸を用いた加水分解（２時間、１２０℃）後、部分メチル化単糖類は、ＮａＢＤ４を用いて還元させた（一晩、室温）。酢酸を用いた中和およびメタノールを用いた共蒸発によるホウ酸の除去、その後の酢酸無水物−トリフルオロ酢酸を用いたアセチル化（２５：２３（ｖ／ｖ）、２０分間、５０℃）は、部分メチル化アルジトール酢酸塩の混合物を産生した。これらの生成物は、電子衝撃質量分析法（ＥＩ／ＭＳ）と結び付けた気液クロマトグラフィー（ＧＬＣ）によって分析した。ＧＬＣ  ＥＩ／ＭＳは、ＲＴｘ−２３３０カラム（３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２μｍの膜厚）（Ｒｅｓｔｅｋ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，ＰＡ）を装備したＧＣ  ７８９０／ＭＳＤ  ５９７３システム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｆａｌｌｓ，ＤＥ）上で、３０℃／分で８０℃（２分間）〜１７０℃（０分間）、その後に４℃／分で２４０℃（２０分間）までの温度勾配を使用して実施した。
【００６６】
（ｖｉ）ＦＯＳ分子質量の決定：
（ａ）ＬｉＮＯ３溶離液：ＦＯＳの分子質量は、４０℃で作動するマルチアングルレーザー光散乱法（ＭＡＬＬＳ）および示差的屈折指数（ＲＩ）検出（Ｏｐｔｉｌａｂ  ｒＥＸ，Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）とオンラインで結合した高性能サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）によって決定した。１〜２ｍｇのサンプルは、５０ｍＭのＬｉＮＯ３中に溶解させ、０．４５μｍのフィルター（Ｍｉｎｉ  Ｓｐｉｋｅ，ＢＢｒａｕｎ  Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ  ＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に通して濾過した。１００μＬのサンプルは、４０℃で作動するＰＳＳ  ＳＵＰＲＥＭＡ−ＬＵＸ  １０００ÅおよびＰＳＳ  ＳＵＰＲＥＭＡ−ＬＵＸ  ３０００Åゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）カラムを装備したＨＰＬＣ（Ｇｙｎｋｏｔｅｋ  ＨＰＬＣポンプＰ５８０Ａ，Ｇｅｍｉｎｉ  ＢＶ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＬ）上に注入した。溶離液として、２００ｐｐｍのＮａＮ３とともに５０ｍＭのＬｉＮＯ３を０．６ｍＬ／分の流量で使用した。Ｋ５フローセルおよび１２．８°〜１６４．７°の範囲の角度で１８の検出器を装備したＤＡＷＮ−ＥＯＳレーザー光度計Ｈｅ−Ｎｅ（λ＝６９０ｎｍ）（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）をＭＡＬＬＳ検出器として使用した。
【００６７】
（ｂ）水性溶離液：ＦＯＳの分子質量は、示差屈折計および示差毛管粘度計を装備した、および追加してＭＡＬＬＳ光度計ＤＡＷＮ−ＨＥＬＥＯＳ−ＩＩ（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）と結合した、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＰＬ−ＧＰＣ２２０統合サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）システムを使用するマルチ検出器サイズ排除クロマトグラフィー法によって決定した。サンプルは、５ｍｇ／ｍＬの濃度でＴｒｉｓバッファー（０．０５Ｍのヒドロキシメチルアミノメタンおよび０．１５Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ７．６））中に溶解させ、１００μＬの注入量を備えるＳＥＣシステム内に注入した。この溶液を注入前に０．４５μｍの親水性ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）ＬＣＲ）に通して濾過した。分離のためには、３０℃で作動する２つのＴＫＳｇｅｌ  ＧＭＰＷ−ＸＬ（孔径は１００〜１，０００Å）ＧＰＣカラムならびにガードカラムを使用した。２００ｐｐｍのＮａＮ３を含むＴｒｉｓバッファーを溶離液として０．５ｍＬ／分の流量で使用した。これらのデータは、カラム較正を使用せずにＡＳＴＲＡ  ｖ．６．２ソフトウエア（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を使用して処理された。
【００６８】
ＩＮＵＯによって合成されたＦＯＳの製造および特性解析
組換えＩＮＵＯは、８００ｍＭの出発濃度でスクロースとの数時間のインキュベーション後に２００ｍＬの枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の培養から約１００ｇのＦＯＳを合成した。例えば、図３を参照されたい。試験した条件下で、ＩＮＵＯ酵素は極めて低い加水分解活性を有し、フルクトースの大部分がＦＯＳ内に組み込まれた。単離生成物のＴＬＣ分析は、精製組換えＩＮＵＯが使用したＴＬＣ条件下では分離しないより大きな＞１０のＦＯＳに加えてある範囲のＦＯＳを合成することを証明した。
【００６９】
ＩＮＵＯ酵素は、ＧＦ１０〜ＧＦ２５のＧＦ範囲およびＧＦ１６〜ＧＦ１７でピークを有するＩＯＳだけを合成する。チコリーイヌリンと比較したＩＮＵＯとスクロースとのインキュベーション反応のＨＰＡＥＣ分析（図４）は、ＦＯＳピークの大多数が類似の位置で溶出することを証明した。チコリーイヌリンは、ＧＦｎピークの隣の中間ピークおよびまたＩＮＵＯより高範囲の分布を示した。ＩＮＵＯによって生成された単離ＦＯＳは、ＴＬＣ（図５）およびＨＰＡＥＣ（データは示していない）によって分析されたように、エキソ−イヌリナーゼが添加されると分解された。これらの観察は、合成されたＦＯＳ材料がイヌリン型（すなわち、β−（２→１）結合フルクトース単位）であることを示している。
【００７０】
チコリー由来のイヌリン、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）由来のレバンおよびＩＮＵＯによって合成されたＦＯＳの２Ｄ  ＮＭＲ  １Ｈ−１３Ｃ  ＨＳＱＣスペクトルの比較は、ＩＮＵＯによって合成されたＦＯＳのスペクトルがイヌリンにおいて見いだされる構造について典型的なβ−（２→１）結合フルクトース単位と一致することを証明した（図６）。さらに、ＧＣ−ＭＳ分析は、＞９５％のβ−（２→１）結合フルクトース単位の存在を確証した。
【００７１】
ＬｉＮＯ３  ＨＰＳＥＣによって決定されたＩＮＵＯによって合成されたＦＯＳ材料のサイズは、約３ｋＤａであった。このサイズは、ＨＰＡＥＣによって得られた結果を裏付けしているより広範な分布（図７）を示したチコリーイヌリンに類似していた（図４）。
【００７２】
下記の質量は、ＩＮＵＯによって生成されたＦＯＳおよびチコリーイヌリンについての水性ＨＰＳＥＣを使用してそれぞれ決定された：Ｍｎ  ３．２／３．９ｋＤａ；Ｍｗ  ３．３／４．６；ＰＤＩ  Ｍｗ／Ｍｎ  １．００２／１．１９４およびＭｐ  ３．３／４．０。ＩＮＵＯ生成物の多分散性は、顕著に小さく、チコリーイヌリンの多分散性よりいっそう狭かった。
【００７３】
配列表
配列番号１−プライマー配列
５’−ｃｔｃａｔｔｃｔｇｃａｇｃｔａｇｃｇｃａＡＣＣＴＣＡＧＡＣＴＧＧＧＡＴＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＡＴ−３’
配列番号２−プライマー配列
５’−ＣＧＣＡＧＡＴＡＴＣＧＴＴＡＡＣＴＣＡＡＣＧＡＴＡＧＧＣＡＣＣＧＡＡＴＧＧＴＣＴＧＡＴ−３’
配列番号３−ＩｎｕＯをコードするＢ．アグラドヘランス（Ｂ．ａｇｒａｄｈａｅｒａｎｓ）ＷＤＧ１８５  ｆｔｆ遺伝子のヌクレオチド配列：
【化１】
0006730281.tif 000005
配列番号４−Ｂ．アグラドヘランス（Ｂ．ａｇｒａｄｈａｅｒａｎｓ）ＩｎｕＯのアミノ酸配列
【化２】
0006730281.tif 000006
配列番号５−ＧＨ６８酵素の保存触媒モチーフ
（Ｖ／Ｌ）ＷＤ（Ｔ／Ｓ）（Ｗ／Ｍ）
配列番号６−ＧＨ６８酵素の保存触媒モチーフ
Ｄ（Ｅ／Ｑ）（Ｉ／Ｔ）ＥＲ
配列番号７−枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＳＡＣＢのアミノ酸配列
【化３】
0006730281.tif 000007
配列番号８−Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＤＳＭ３１９  ＳＡＣＢのアミノ酸配列
【化４】
0006730281.tif 000008
配列番号９−Ｌｎ．メゼンテロイデス（Ｌｎ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５１２  ＬＥＶＳのアミノ酸配列
【化５】
0006730281.tif 000009
配列番号１０−Ｌ．ガセリ（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ）２０２４３  ＩＮＵＧＡのアミノ酸配列
【化６】
0006730281.tif 000010
配列番号１１−Ｌ．ガセリ（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ）２０６０４  ＩＮＵＧＢのアミノ酸配列
【化７】
0006730281.tif 000011
配列番号１２−Ｌ．ジョンソニイ（Ｌ．ｊｏｎｓｏｎｉｉ）ＮＣＣ５３３  ＩＮＵＪのアミノ酸配列
【化８】
0006730281.tif 000012
配列番号１３−Ｌ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）ＴＭＷ１．１０６  ＩＮＵのアミノ酸配列
【化９】
0006730281.tif 000013
配列番号１４−Ｌ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）１２１  ＩＮＵのアミノ酸配列
【化１０】
0006730281.tif 000014
配列番号１５−Ｌ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）１２１  ＬＥＶのアミノ酸配列
【化１１】
0006730281.tif 000015
配列番号１６−Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＧＳ−５  ＩＮＵのアミノ酸配列
【化１２】
0006730281.tif 000016
配列番号１７−Ｌｎ．メゼンテロイデス（Ｌｎ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＣＷ２８  ＩＳＬＡのアミノ酸配列
【化１３】
0006730281.tif 000017
配列番号１８−Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ  １０９８８  ＬＥＶＵのアミノ酸配列
【化１４】
0006730281.tif 000018
配列番号１９−Ｇ．ジアゾトロフィカス（Ｇ．ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）ＳＲＴ４  ＬＤＳＡのアミノ酸配列
【化１５】
0006730281.tif 000019
【図１】
0006730281.tif 000020
【図２】
0006730281.tif 000021
【図３】
0006730281.tif 000022
【図４】
0006730281.tif 000023
【図５】
0006730281.tif 000024
【図６】
0006730281.tif 000025
【図７】
0006730281.tif 000026
【配列表】
0006730281000001.app