(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のカリシウイルス科ウイルスの検査方法であって、試料からウイルスＲＮＡの精製処理を行うことなく、または試料の事前の熱処理を行うことなく、逆転写酵素および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液中に試料を加えることを特徴とし、該１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液が、アミノ酸におけるアミノ基に３個のメチル基を付加した構造を有する第４級アンモニウム塩（以下、「ベタイン様４級アンモニウム」という）、１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミン、グリセロール、グリコールおよびゼラチンよりなる群から選択された少なくとも１つを含み、ここで該１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液は１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミンを必ず含む、カリシウイルス科ウイルスの存在の有無を検査するための方法。
【請求項２】
試料が糞便である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試料が水、生理食塩水または緩衝液に懸濁された懸濁液である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
試料が請求項３に記載の懸濁液の遠心上清である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
試料が環境中の拭き取り検査試料を水、生理食塩水または緩衝液に懸濁し、かつ、懸濁液を濃縮した試料であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
カリシウイルスがノロウイルスである請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ノロウイルスがＧ１型であるかＧ２型であるかの判別を行うことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液が、少なくともベタイン様４級アンモニウム塩、１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミンおよび１％以上のゼラチンを含むことを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液が、少なくともグリセロールまたはグリコール、１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミンおよび１％以上のゼラチンを含むことを特徴とする請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液が、少なくともグリセロールまたはグリコール、並びにベタイン様４級アンモニウム塩、１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミンおよび１％以上のゼラチンを含むことを特徴とする請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ベタイン様４級アンモニウム塩が、ベタインまたはＬ−カルニチンである請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、ＴａｑまたはＴｔｈから選択されることを特徴とする請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
逆転写酵素の由来が、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＲＶ）またはトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）から選択されることを特徴とする請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
逆転写反応温度が３０℃以上、５０℃未満である請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ベタイン様４級アンモニウム塩、１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミン、グリセロール、グリコールおよびゼラチンよりなる群から選択された少なくとも１つを含み、ここで１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミンは必ず含む、１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液からなることを特徴とするカリシウイルス科ウイルスの検査キット。
【請求項１６】
１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液が、少なくともベタイン様４級アンモニウム、１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミンおよび１％以上のゼラチンを含むことを特徴とする請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液が、少なくともグリセロールまたはグリコール、１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミンおよび１％以上のゼラチンを含むことを特徴とする請求項１５又は１６に記載のキット。
【請求項１８】
１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液が、少なくともグリセロールまたはグリコール、並びにベタイン様４級アンモニウム塩、１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミンおよび１％以上のゼラチンを含むことを特徴とする請求項１５から１７のいずれかに記載のキット。
【請求項１９】
ベタイン様４級アンモニウムが、ベタインまたはＬ−カルニチンである請求項１５から１８のいずれかに記載のキット。
【請求項２０】
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、ＴａｑまたはＴｔｈである請求項１５から１９のいずれかに記載のキット。
【請求項２１】
逆転写酵素の由来が、ＭＭＲＶまたはＡＭＶである請求項１５から２０のいずれかに記載のキット。
【請求項２２】
検出対象のＲＮＡウイルスの検出領域に対応するプライマー対をさらに含むことを特徴とする請求項１５から２１のいずれかに記載のキット。
【請求項２３】
検出対象のＲＮＡウイルスの検出領域に対応する蛍光プローブをさらに含むことを特徴とする請求項１５から２２のいずれかに記載のキット。
【請求項２４】
カリシウイルスがノロウイルスである請求項１５から２３のいずれかに記載のキット。
【請求項２５】
ノロウイルスがＧ１型であるか、Ｇ２型であるかの判別を行うことを特徴とする請求項１５から２４のいずれかに記載のキット。
【請求項２６】
糞便または環境中の拭き取り検査試料を試料として用いることを特徴とする請求項１５から２５のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅によるウイルスの検出法に関する。より具体的には、試料から核酸の単離や加熱処理することなく、試料をリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）の反応液に加え、糞便試料または環境拭き取り試料中のカリシウイルス科ウイルスの検出に関する。本発明は、生命科学研究、臨床診断や食品衛生検査、環境検査等にも利用できる。
【背景技術】
【０００２】
核酸増幅法は数コピーの標的核酸を可視化可能なレベル、すなわち数億コピー以上に増幅する技術であり、生命科学研究分野のみならず、遺伝子診断、臨床検査といった医療分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等においても、広く用いられている。
代表的な核酸増幅法は、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）である。ＰＣＲは、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。アニーリングと伸長を同温度で、２ステップで行う場合もある。
ＲＮＡを分析する場合、このＰＣＲの前段として、鋳型ＲＮＡをｃＤＮＡに変換する逆転写（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）を実施する。これをＲＴ−ＰＣＲという。このＲＴ−ＰＣＲは、（１）ＲＴ、ＰＣＲを非連続に実施する２ステップＲＴ−ＰＣＲ、（２）ＲＴ、ＰＣＲを、単一酵素を利用して連続して実施する一酵素系１ステップＲＴ−ＰＣＲ、（３）逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼを利用して、ＲＴ、ＰＣＲを連続的に実施する二酵素系１ステップＲＴ−ＰＣＲの３つに大別される。
【０００３】
ＲＴ−ＰＣＲのうち、遺伝子検査では、処理能力の高さや、反応途中での反応容器の開閉によるコンタミネーションを回避するため、１ステップＲＴ−ＰＣＲが好まれる。一酵素系１ステップＲＴ−ＰＣＲでは、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼやＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼなどの逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼが利用される。一方、二酵素１ステップＲＴ−ＰＣＲでは、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼの少なくとも２種類の酵素が使用される。
【０００４】
逆転写酵素としては、レトロウイルスあるいは細菌由来の逆転写酵素（例えば、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ；モロニーマウス白血病ウイルス）−ＲＴ  （Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）、ＡＭＶ（Ａｖｉａｎ  Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ；トリ骨髄芽球症ウイルス）−ＲＴ、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ）−ＲＴ、ＲＡＶ（Ｒｏｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）２−ＲＴ、ＥＩＡＶ（Ｅｑｕｉｎｅ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ａｎｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）−ＲＴ、カルボキシドサーマス・ハイドロゲノフォルマン（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｍ）ＤＮＡポリメラーゼなど）やこれらの変異体が利用される。また、ＤＮＡポリメラーゼとしては。Ｔａｑ、Ｔｔｈ，Ｂｓｔ，ＫＯＤ，Ｐｆｕ，Ｐｗｏ、Ｔｂｒ，Ｔｆｉ，Ｔｆｌ，Ｔｍａ，Ｔｎｅ、Ｖｅｎｔ，ＤＥＥＰＶＥＮＴやこれらの変異体などが利用される。
【０００５】
一酵素系１ステップＲＴ−ＰＣＲ法は、２ステップＲＴ−ＰＣＲよりも感度が低いことが知られる（非特許文献１）。これに対し、二酵素系１ステップＲＴ−ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼの逆転写酵素活性と比べ、レトロウイルス由来の逆転写酵素の逆転写効率が高いことから、単一酵素共役ＲＴ−ＰＣＲよりも感度が高いとされる（非特許文献２）。しかし、二酵素系１ステップＲＴ−ＰＣＲは、２ステップＲＴ−ＰＣＲよりも感度が高いが、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼが干渉し、反応効率を低下させることが報告されている（非特許文献３）。この干渉を抑えるため、鋳型ＲＮＡの増加、非ホモログｔＲＮＡ、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、あるいは逆転写酵素に対するＤＮＡポリメラーゼ比率の増加などの使用が行われてきた。
【０００６】
病原性ＲＮＡウイルスの一つであるノロウイルスは、急性胃腸炎の原因となる１本鎖ＲＮＡウイルスである。感染力が強く、集団食中毒や集団感染を引き起こすことから、公衆衛生上関心の高いウイルスである。ノロウイルスはＧｅｎｏｇｒｏｕｐＩ（Ｇ１）及びＧｅｎｏｇｒｏｕｐＩＩ（Ｇ２）の２つの遺伝子群に分類される。ノロウイルスの病原体検査では、組織培養法が確立できておらず、電子顕微鏡法、ＥＬＩＳＡによる免疫学的抗原検出法、または核酸増幅技術を利用したウイルス遺伝子の検出法が開発されてきた。このうち、厚生労働省医薬食品局安全部監視安全課の通知（食安監１１０５００１号）に基づくＲＴ−ＰＣＲ法が公定法として普及している。
【０００７】
ノロウイルスの感染の原因として主にノロウイルスに汚染された食品を飲食することによるが、ヒトの手を介した感染が多いため、調理施設、医療現場、老人介護施設及び保育園などでは定期的な検便検査が求められている。大量調理施設衛生管理マニュアルには、調理従事者等の検便検査に、必要に応じてノロウイルスの流行期である１０月から３月についてノロウイルスの検査を含めることが追加されている。これはウイルスに感染していても症状がでない人（健康保因者）が少なからず存在し、これらの人たちが知らず知らずのうちに感染を広げる可能性があるためである。さらに、下痢や嘔吐などの症状がある調理従事者は医療機関を受診し、ノロウイルスに感染していることが判明した場合はリアルタイムＰＣＲ等の高感度検査を実施し、ノロウイルスを保有していないことが確認されるまでは食品に直接触れる調理作業を控えるなどの適切な処置をとることが望まれている。
【０００８】
ノロウイルスは、約３０ｎｍのキャプシドタンパク質からなる正二十面体構造を持ったウイルスである。その中にウイルスＲＮＡゲノムが封入される。そこで、従来、糞便試料からのノロウイルスの検出は、例えば糞便の１０％乳剤を作製し、遠心上清から市販のウイルスＲＮＡ抽出キットを用いてＲＮＡを抽出・精製し、このＲＮＡ抽出液を用いてノロウイルスの検出が行われてきた。しかし、短時間で多数の検体を検査するには、このＲＮＡ抽出作業は煩雑である。そこで、近年、糞便試料から熱処理でキャプシドを破壊し、ウイルスＲＮＡを露出させた処理液をＲＴ−ＰＣＲに供することでウイルスの有無を検出する手法がとられるようになった（非特許文献４）。この際、ＲＮＡの抽出を省略することで、糞便試料中には含まれる、多糖類などのＰＣＲ反応阻害物質が持ち込まれる。そこで、これらの影響を低減するような工夫が前処理剤やＰＣＲ反応液になされている（特許文献１）。便によるＰＣＲ阻害は、ベタイン、ＢＳＡ、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、タンパク質分解酵素阻害剤の添加により改善されることが報告されているが、便試料にスパイクされたＤＮＡを検出したものでＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによる検出を改善できるか不明であった（非特許文献５）。
【０００９】
さらに、前記糞便試料の熱処理は、逆転写酵素を失活させてしまうことから、熱処理後にＲＴ−ＰＣＲ反応液を添加する必要がある。ここで反応容器の開閉や試薬の添加が非常に手間と労力を要する。さらに、サンプル間のコンタミネーションのリスクもある。Ｋ．Ｋａｎｇらは、高病原性北米産豚生殖器呼吸器症候群ウイルスＲＮＡを豚血清サンプルから直接ＲＴ−ＰＣＲにより検出できることを報告している（非特許文献６）。しかしながら、糞便試料からのウイルスＲＮＡの直接検出について報告された例はない。血清よりも糞便の方がタンパク質量やＰＣＲ阻害物質を多量に含み、検出が困難であったためである。このため、糞便試料や拭き取り検査の濃縮試料から事前にＲＮＡの単離や熱処理をせずに、ＲＴ−ＰＣＲ反応液に直接加え、ウイルスＲＮＡの有無を検出する方法が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０１５―１１９６５６号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第１７巻，１９９４年、第１０３４−１０３６頁
【非特許文献２】ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第２５巻，１９９８年、第２３０−２３４頁
【非特許文献３】Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，第２０巻，１９９２年、第１４８７−１４９０頁
【非特許文献４】Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，第１６３巻，２０１０年、第２８２−２８６頁
【非特許文献５】Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，第３８巻、２０００年、第４４６３−４４７０頁
【非特許文献６】Ｊ．Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第５巻、２０１４年、第４５頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、試料からカリシウイルス科ウイルスＲＮＡの単離や試料の事前の加熱処理を行うことなく、反応液に加え、１ステップＲＴ−ＰＣＲによりカリシウイルス科ウイルスＲＮＡの有無の検出を可能とすることである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究を行った結果、ウイルスＲＮＡの精製や事前の熱処理を行っていない試料を１ステップＲＴ−ＰＣＲに供することで、カリシウイルス科ウイルスＲＮＡの検出が可能であることを見出した。
さらに本発明者らは、１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミン、アミノ酸におけるアミノ基に３個のメチル基を付加した構造を有する第４級アンモニウム塩、グリセリン、グリコール、１％以上のゼラチンの少なくとも１つを１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液に添加することで、より効率よく検出可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
代表的な本願発明は、以下の通りである。
項１．試料中のカリシウイルス科ウイルスの検査方法であって、試料からウイルスＲＮＡの精製処理を行うことなく、または試料の熱処理を行うことなく、逆転写酵素および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液中に試料を加えることを特徴とするカリシウイルス科ウイルスの存在の有無を検査するための方法。
項２．試料が糞便である項１に記載の方法。
項３．試料が水、生理食塩水または緩衝液に懸濁された懸濁液である項１に記載の方法。
項４．試料が項３に記載の懸濁液の遠心上清である項１に記載の方法。
項５．試料が環境中の拭き取り検査試料を水、生理食塩水または緩衝液に懸濁し、かつ、懸濁液を濃縮した試料であることを特徴とする項１に記載の方法。
項６．カリシウイルスがノロウイルスである項１から５のいずれかに記載の方法。
項７．ノロウイルスがＧ１型であるかＧ２型であるかの判別を行うことを特徴とする項６に記載の方法。
項８．１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液が、アミノ酸におけるアミノ基に３個のメチル基を付加した構造を有する第４級アンモニウム塩（以下、「ベタイン様４級アンモニウム」という）、１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミン、グリセロール、グリコールおよびゼラチンよりなる群から選択された少なくとも１つを含むことを特徴とする項１から７のいずれかに記載の方法。
項９．１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液が、少なくともベタイン様４級アンモニウム塩、１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミンおよび１％以上のゼラチンを含むことを特徴とする項８に記載の方法。
項１０．１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液が、少なくともグリセロールまたはグリコール、１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミンおよび１％以上のゼラチンを含むことを特徴とする項８に記載の方法。
項１１．１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液が、少なくともグリセロールまたはグリコール、並びにベタイン様４級アンモニウム塩、１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミンおよび１％以上のゼラチンを含むことを特徴とする項８に記載の方法。
項１２．ベタイン様４級アンモニウム塩が、ベタインまたはＬ−カルニチンである項８に記載の方法。
項１３．耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ、Ｔｔｈまたはそれらの変異体から選択されることを特徴とする項１から１２のいずれかに記載の方法。
項１４．逆転写酵素の由来が、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＲＶ）、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）またはこれらの変異体から選択されることを特徴とする項１から１１のいずれかに記載の方法。
項１５．逆転写反応温度が３０℃以上、５０℃未満である項１から１４のいずれかに記載の方法。
項１６．ベタイン様４級アンモニウム塩、１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミン、グリセロール、グリコールおよびゼラチンよりなる群から選択された少なくとも１つを含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液からなることを特徴とするカリシウイルス科ウイルスの検査キット。
項１７．１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液が、少なくともベタイン様４級アンモニウム、１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミンおよび１％以上のゼラチンを含むことを特徴とする項１６に記載のキット。
項１８．１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液が、少なくともグリセロールまたはグリコール、１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミンおよび１％以上のゼラチンを含むことを特徴とする項１６に記載のキット。
項１９．１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液が、少なくともグリセロールまたはグリコール、並びにベタイン様４級アンモニウム塩、１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミンおよび１％以上のゼラチンを含むことを特徴とする項１６に記載のキット。
項２０．ベタイン様４級アンモニウムが、ベタインまたはＬ−カルニチンである項１６に記載のキット。
項２１．耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ、Ｔｔｈまたはそれらの変異体である項１６から２０のいずれかに記載のキット。
項２２．逆転写酵素の由来が、ＭＭＲＶ、ＡＭＶまたはそれらの変異体である項１６から２１のいずれかに記載のキット。
項２３．検出対象のＲＮＡウイルスの検出領域に対応するプライマー対をさらに含むことを特徴とする項１６〜２２のいずれかに記載のキット。
項２４．検出対象のＲＮＡウイルスの検出領域に対応する蛍光プローブをさらに含むことを特徴とする項２３に記載のキット。
項２５．カリシウイルスがノロウイルスである項１６から２４のいずれかに記載のキット。
項２６．ノロウイルスがＧ１型であるか、Ｇ２型であるかの判別を行うことを特徴とする項２５に記載のキット。
項２７．糞便または環境中の拭き取り検査試料を試料として用いることを特徴とする項１６から２６のいずれかに記載のキット。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によって、試料からウイルスＲＮＡの単離や事前の試料の熱処理を必要とせず、試料を１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液に添加するだけで、試料中のカリシウイルス科ウイルスの有無を検出することが可能になる。この結果、検査業務がさらに効率化することから、ウイルス感染しても症状のない被験者の検査量を増やすことができ、感染症予防にも寄与する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】Ｔａｑ又はＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、１，３−プロパンジオール、Ｌ−カルニチンの組合せによるノロウイルスの直接検出を示した図である。
【図２】ＢＳＡとゼラチンの組合せによるノロウイルスの直接検出における判定不可の解消を示す図である。
【図３】ＢＳＡとゼラチンの組合せによるノロウイルスの直接検出における判定不可の解消を示す図である。
【図４】ゼラチンの濃度による、ノロウイルスの直接検出の判定不可の解消効果を示す図である。
【図５】ゼラチンの濃度による、ノロウイルスの直接検出の判定不可の解消効果を示す図である。
【図６】異なる由来のゼラチンの効果の再現性を確認した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説する。
【００１８】
本発明の一態様は、試料中のカリシウイルス（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）科ＲＮＡウイルスの検査方法であって、試料からウイルスＲＮＡの精製や試料の事前の熱処理を行うことなく、１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミン、アミノ酸におけるアミノ基に３個のメチル基を付加した構造を有する第４級アンモニウム塩（以下「ベタイン様４級アンモニウム塩」という）、グリセリン、グリコール、１％以上のゼラチンの少なくともいずれか１つを、逆転写酵素、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液に試験試料を加え、ウイルスの存在の有無を検査するための方法である。
【００１９】
検査対象となるＲＮＡウイルスは、ゲノムとしてＲＮＡを持つカリシウイルス科ウイルスである。ＲＮＡウイルスの例としては特に限定されるものではないが、ノロウイルス属ノーウォークウイルス、サポウイルス属サッポロウイルス、ラゴウイルス属兎出血病ウイルス、ヨーロッパ褐色野兎症候群ウイルス、ベシウイルス属猫カリシウイルス、豚水疱疹ウイルス、ネボウイルス属ニューバリー１ウイルス、レコウイルス属Ｔｕｌａｎｅウイルスなどが挙げられる。
【００２０】
本発明の試料として、糞便（排泄便、直腸便）、嘔吐物、唾液などが挙げられるが、特に限定されるものではない。本発明におけるこれら試料は、市販のＲＮＡ精製キットでＲＮＡを単離したり、あるいは熱処理でＲＮＡをウイルス構造から露出させるような処理を行う必要が一切ないことを特徴とするものである。前記試料は直接反応液に加えてもよいし、夾雑物の反応への影響を低減し、より安定した検査結果を得るために、水、生理食塩水または緩衝液に前記試料を懸濁した試料であってもよい。さらに、糞便など夾雑物の多い試料では、遠心分離し、その上清を使用してもよい。あるいは、フィルターろ過を実施してもよい。前記緩衝液としては、特に限定されるものではないが、ハンクス緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、トリシン緩衝液などが挙げられる。
【００２１】
本発明における別の態様の試料としては、拭き取り検査試料である。汚染経路の解明や施設環境等の汚染状況の把握には、ふき取り検査が有用である。本発明において、拭き取り検査とは、特に限定されるものでないが、例えば綿棒等で該当区画や設備等を拭き取り、水や緩衝液に溶出し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈澱などで濃縮した試料である。具体的な拭き取り検査の要領としては、「ふきとり検体のノロウイルス検査法の改良」（ｈｔｔｐ：／／ｉｄｓｃ．ｎｉｈ．ｇｏ．ｊｐ／ｉａｓｒ／３２／３８２／ｄｊ３８２４．ｈｔｍｌ）
）などが例示されるが、特に限定はされるものはなく、これに準ずる方法が広く含まれる。拭き取り箇所の例としては、まな板や包丁、ふきん、食器などの調理器具類、冷蔵庫の取手やトイレ、浴室のドアノブ、洗面所、厨房、トイレ、浴室などの蛇口、調理者の手や指、浴室、トイレ、洗面、手すり、居室などの施設などが挙げられる。また、拭き取り検査ではないが、環境検査として、下水試料の濃縮試料にも適用できる。
【００２２】
前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液に含まれるベタイン様４級アンモニウム塩としては、ベタイン（トリメチルグリシン）、Ｌ−カルニチンなどが挙げられるが、アミノ酸におけるアミノ基に３個のメチル基を付加した構造を有する第４級アンモニウム塩であれば、特に限定されるものではない。ベタイン様４級アンモニウム塩が有する構造は分子内に安定な正、負の両電荷を持つ化合物で、界面活性剤のような性質を示し、ウイルス構造の不安定化を引き起こすものと考えられる。さらに、ＤＮＡポリメラーゼの核酸増幅を促進することが知られる。好ましい前記ベタイン様４級アンモニウム塩濃度は０．１Ｍ〜２Ｍであり、より好ましくは０．２Ｍ〜１．２Ｍである。
【００２３】
前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液に含まれるウシ血清アルブミンとしては、好ましくは少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ以上、より好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｍｌ以上である。夾雑物の多い試料では、ウシ血清アルブミンの濃度が好ましくは２ｍｇ／ｍｌ以上、さらに好ましくは３ｍｇ／ｍｇ以上で、良好な検出が可能となる。
【００２４】
前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液に含まれるゼラチンは、ウシや豚などの動物の皮膚や骨、腱、あるいは魚の鱗や皮に由来し、ＰＣＲ酵素の安定化に寄与すると考えられている。使用濃度としては、ＰＣＲ増幅を安定化する一方で、蛍光検出を妨げない程度が好ましい。好ましくは１〜５％、さらに好ましくは１〜２％である。特にゼラチンの由来については限定されるものではないが、ウシや豚由来よりも魚由来のものの方が、ゼリー強度が低く、反応液のハンドリングがよい点で好ましい。
【００２５】
前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液に含まれるグリセリン濃度としては１〜２０％、より好ましくは５〜１５％である。
【００２６】
前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液に含まれるグリコール（ジオール化合物）とは、鎖式または環式脂肪族炭化水素の２つの炭素原子が、１つずつヒドロキシ基が置換された化合物である。グリコールの例としては、エチレングリコール、１、２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール等が挙げられるが、これらに限られるものではない。グリコールの好ましい反応液中の濃度としては１〜２０％、より好ましくは３〜１０％である。
【００２７】
前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液に含まれる逆転写酵素の由来としては、ＲＮＡをＤＮＡに変換できれば特に限定されないが、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）−ＲＴ、ＡＭＶ−ＲＴ（Ａｖｉａｎ  Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）、ＨＩＶ−ＲＴ、ＲＡＶ２−ＲＴ、ＥＩＡＶ−ＲＴ、カルボキシドサーマス・ハイドロゲノフォルマン（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｍ）ＤＮＡポリメラーゼ）やその変異体が例示される。特に好ましい例としては、ＭＭＬＶ−ＲＴ、ＡＭＶ−ＲＴ、またはそれらの変異体が挙げられる。
【００２８】
本発明における逆転写反応温度は、３０℃以上、５０℃未満であり、好ましくは３５℃から４５℃、より好ましくは３７℃から４２℃である。逆転写反応時間は、３分から３０分程度で行うことが好ましい。
【００２９】
前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液に含まれる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑ、Ｔｔｈ，Ｂｓｔ，ＫＯＤ，Ｐｆｕ，Ｐｗｏ、Ｔｂｒ，Ｔｆｉ，Ｔｆｌ，Ｔｍａ，Ｔｎｅ、Ｖｅｎｔ，ＤＥＥＰＶＥＮＴやこれらの変異体が挙げられるが、特に限定されない。より好ましくは、Ｔａｑ、Ｔｔｈ又はこれらの変異体の使用である。特に好ましくはＴｔｈ又はその変異体の使用である。さらに、非特異的反応抑制の効果を高めるため、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体との併用、あるいは化学修飾により熱不安定ブロック基のＤＮＡポリメラーゼへ導入することで、逆転写反応の間、ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を抑制され、ホットスタートＰＣＲへの適用ができることが好ましい。
【００３０】
本発明に用いられる１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液には、緩衝剤、適当な塩、マグネシウム塩又はマンガン塩、デオキシヌクレオチド三リン酸、検出対象のウイルスＲＮＡの検出対象領域に対応するプライマー対、さらに必要に応じて添加剤を含んでいてもよい。
【００３１】
本発明に用いられるプライマー対としては、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である２種一対のプライマーが挙げられる。また、別の態様として、上記プライマーが２対以上含まれる、いわゆるマルチプレックスＰＣＲも挙げられる。さらに、ターゲットとする核酸が亜型からなる場合、縮重プライマーを含んでもよい。ノロウイルス検出用のプライマーとしては、厚生労働省医薬食品局安全部監視安全課の通知（食安監１１０５００１号）に記載のプライマーが挙げられるが、これに限るものではない。
【００３２】
本発明で使用される緩衝剤としては、特に限定されないが、トリス（Ｔｒｉｓ），トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ），ビスートリシン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅ），ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）などが挙げられる。硫酸、塩酸、酢酸、リン酸などでｐＨを６〜９、より好ましくはｐＨ７〜８に調整されたものである。また、添加する緩衝剤の濃度としては、１０〜２００ｍＭ，より好ましくは２０〜１５０ｍＭで使用される。この際、反応に適当なイオン条件とするために、塩溶液が加えられる。塩溶液としては、塩化カリウム、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウムなどが加えられる。
【００３３】
この反応液には、さらにｄＮＴＰ、マグネシウム塩またはマンガン塩、プライマーなどが含まれる。ｄＮＴＰとしてはｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰがそれぞれ０．１〜０．５ｍＭ、最も一般的には０．２ｍＭ程度加えられる。ｄＴＴＰの代わり及び／又は一部としてｄＵＴＰを使用することによって、クロスコンタミネーションの予防処置をとってもよい。マグネシウム塩としては、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、マンガン塩としては、塩化マンガン、硫酸マンガン、酢酸マンガンなどが例示され、１〜１０ｍＭ程度加えられることが好ましい。
【００３４】
さらには、当該分野で知られるＲＴ−ＰＣＲを促進するような物質と組み合わせて使用することもできる。本発明において有用な促進物質とは、例えば、プロテアーゼインヒビター、シングルストランド結合タンパク質（ＳＳＢ）、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ｔＲＮＡ、硫黄または酢酸含有化合物類、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチレングリコール、ホルムアミド、アセトアミド、ベタイン、エクトイン、トレハロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ），塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、水酸化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＨ）、酢酸テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＡ）、ポリエチレングリコール、トリトンＸ−１００（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、トリトンＸ−１１４（ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４）、ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０），ノニデットＰ４０、Ｂｒｉｊｉ５８などが挙げられるが、これに限定されない。さらに反応阻害を低減するように、エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）のようなキレート剤を含んでもよい。
【００３５】
本発明は、別の態様としては、さらに、少なくとも１種類の標識されたハイブリダイゼーションプローブまたは２本鎖ＤＮＡ結合蛍光化合物を含む検出方法である。これによって、増幅産物の分析を通常の電気泳動ではなく、蛍光シグナルのモニタリングで監視することができ、解析労力が低減される。さらには、反応容器を開放する必要がなく、コンタミネーションのリスク低減が可能である。ウイルスのサブタイプに対応する、それぞれのハイブリダイゼーションプローブを異なる蛍光色素で標識することによって、ウイルスのサブタイプを識別することも可能である。
【００３６】
ハイブリダイゼーションプローブとしては、例えば、ＴａｑＭａｎ加水分解プローブ（米国特許第５，２１０，０１５号公報、米国特許第５，５３８，８４８号公報、米国特許第５，４８７，９７２号公報、米国特許第５，８０４，３７５号公報）、モレキュラービーコン（米国特許第５，１１８，８０１号公報）、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ（国際公開第９７／４６７０７号パンフレット，国際公開第９７／４６７１２号パンフレット，国際公開第９７／４６７１４号パンフレット）などが挙げられる。ノロウイルス検出用のプローブの塩基配列としては、厚生労働省医薬食品局安全部監視安全課の通知（食安監１１０５００１号）に記載の配列が挙げられるが、これに限るものではない。さらに、ターゲットとする核酸が亜型からなる場合、縮重配列を含んでもよい。
【００３７】
２本鎖ＤＮＡ結合蛍光化合物としては、例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ，ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｏｌｄ、ＳＹＴＯ−９、ＳＹＴＰ−１３、ＳＹＴＯ−８２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），ＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標；Ｂｉｏｔｉｕｍ）、ＬＣＧｒｅｅｎ（Ｉｄａｈｏ），ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）  ４８０  ＲｅｓｏＬｉｇｈｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）などが挙げられる。
【００３８】
本発明の別の一態様は、試料中のウイルスＲＮＡの検査キットであって、試料からウイルスＲＮＡの精製や試料の事前の熱処理を行うことなく、ベタイン様４級アンモニウム塩、１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミン、グリセロール、グリコール、およびゼラチンよりなる群から選択された少なくとも１つと、逆転写酵素および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液に試料を加え、ウイルスの存在の有無を検査するためのキットである。
【００３９】
本発明の別の一態様は、試料中のウイルスＲＮＡの検査キットであって、試料からウイルスＲＮＡの精製や試料の事前の熱処理を行うことなく、少なくともベタイン様４級アンモニウム塩、１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミン、および１％以上のゼラチンと、さらに逆転写酵素および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液に試料を加え、ウイルスの存在の有無を検査するためのキットである。
【００４０】
本発明の別の一態様は、試料中のウイルスＲＮＡの検査キットであって、試料からウイルスＲＮＡの精製や試料の事前の熱処理を行うことなく、少なくともグリセロールまたはグリコール、１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミン、および１％以上のゼラチンと、さらに逆転写酵素、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミンを含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液に試料を加え、ウイルスの存在の有無を検査するためのキットである。
【００４１】
本発明の別の一態様は、試料中のウイルスＲＮＡの検査キットであって、試料からウイルスＲＮＡの精製や試料の事前の熱処理を行うことなく、ベタイン様４級アンモニウム塩、１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミン、グリセロールまたはグリコール、および１％以上のゼラチン、逆転写酵素、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液に試料を加え、ウイルスの存在の有無を検査するためのキットである。
【００４２】
本発明の別の一態様は、試料中のウイルスＲＮＡの検査キットであって、試料からウイルスＲＮＡの精製や試料の事前の熱処理を行うことなく、前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液に試験試料を加え、ウイルスの存在の有無を検査するためのキットであって、検出対象のウイルスＲＮＡの検出領域に対応するプライマー対を含むキットである。
【００４３】
本発明の別の一態様は、試料中のウイルスＲＮＡの検査キットであって、試料からウイルスＲＮＡの精製や試料の事前の熱処理を行うことなく、前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液に試料を加え、ウイルスの存在の有無を検査するためのキットであって、検出対象のウイルスＲＮＡの検出領域に対応するプライマー対および検出対象のＲＮＡウイルスの検出領域に対応する蛍光プローブを含むキットである。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例をもって本発明を具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００４５】
実施例１．糞便試料からのノロウイルスの直接検出（１）
・  糞便懸濁処理液の調製
ノロウイルスＧ２陽性のヒト糞便３検体滅菌水０．５ｍｌに１０％（重量％）となるように懸濁した。この懸濁液を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清をＲＴ−ＰＣＲ反応液に加えた。
（２）１ステップＲＴ−ＰＣＲ
（２−１）反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、（２−２）に示す添加剤の検出への影響を評価した。
１ｘＢｕｆｆｅｒ  （Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ（Ｒ）添付バッファー（東洋紡））
１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ
各０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ
プライマー液  （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）添付品）
プローブ液  （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）添付品）
０．０５ｕｎｉｔ／μｌ  ｒＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
またはｒＴｔｈ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０１μｇ／μｌ  抗Ｔａｑ抗体（ａｎｔｉ  Ｔａｑ  ｈｉｇｈ（東洋紡）
または抗Ｔｔｈ抗体
０．０５ｕｎｉｔ／μｌ  ＲｅｖｅｒｔｒａＡｃｅ（東洋紡）
（２−２）添加剤、ＤＮＡポリメラーゼ
条件１  ４％  １，３−プロパンジオール、Ｔａｑ
条件２  ４％  １，３−プロパンジオール、０．３Ｍ  Ｌ−カルニチン、Ｔａｑ
条件３  ４％  １，３−プロパンジオール、Ｔｔｈ
条件４  ４％  １，３−プロパンジオール、０．３Ｍ  Ｌ−カルニチン、Ｔｔｈ
（３）反応
前記反応液４９μｌに（１）で調製した各試料１μｌを添加した。これを以下の温度サイクルで反応した。５６℃の伸長ステップで蛍光値の読取を行った。
５０℃  １５分（逆転写反応）、
９５℃  １分、
９５℃  １０秒−５６℃  ６０秒  ４５サイクル（ＰＣＲ）
（４）結果
プローブ液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）添付品）ではＦＡＭチャネルで内部コントロール遺伝子、Ｃｙ５チャネルでノロウイルスＧ１、ＲＯＸチャネルでノロウイルスＧ２を検出する。ここでは、Ｇ２  ＲＮＡの検出を示すＲＯＸチャネルの増幅曲線、Ｃｑ値を図１に示す。この結果、いずれの条件でも試料からウイルスＲＮＡを単離したり、あるいは１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応前に事前に試料を加熱処理したりすることなく、ウイルスの検出が可能であった。
【００４６】
実施例２．糞便試料からのノロウイルスの直接検出（２）
（１）糞便懸濁処理液の調製
ノロウイルスＧ１、Ｇ２陽性のヒト糞便各２検体滅菌水０．５ｍｌに１０％（重量％）となるように懸濁した。この懸濁液を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清をＲＴ−ＰＣＲ反応液に加えた。
（２）１ステップＲＴ−ＰＣＲ
（２−１）反応液基本組成
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、（２−２）に示す添加剤の検出への影響を評価した。
１ｘＢｕｆｆｅｒ  （Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ（登録商標）添付バッファー（東洋紡））
１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ
各０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ
プライマー液  （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）添付品）
プローブ液  （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）添付品）
０．０５ｕｎｉｔ／μｌ  ｒＴｔｈ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０１μｇ／μｌ  抗Ｔｔｈ抗体
０．０５ｕｎｉｔ／μｌ  ＲｅｖｅｒｔｒａＡｃｅ（東洋紡）
（２−２）添加剤
条件１  ０．７５Ｍ  ベタイン、３％  １，３−プロパンジオール（ＴＭＧ）
条件２  ０．７５Ｍ  ベタイン、６％  グリセリン
条件３  ０．７５Ｍ  ベタイン、８％  グリセリン
条件４  ０．７５Ｍ  ベタイン、１０％  グリセリン
条件５  １Ｍ  ベタイン、３％  １，３−プロパンジオール（ＴＭＧ）
条件６  １Ｍ  ベタイン、６％  グリセリン
条件７  １Ｍ  ベタイン、８％  グリセリン
条件８  １Ｍ  ベタイン、１０％  グリセリン
条件９  １．２５Ｍ  ベタイン、３％  １，３−プロパンジオール（ＴＭＧ）
条件１０  １．２５Ｍ  ベタイン、６％  グリセリン
条件１１  １．２５Ｍ  ベタイン、８％  グリセリン
条件１２  １．２５Ｍ  ベタイン、１０％  グリセリン
（３）反応
前記反応液４９μｌに（１）で調製した各試料１μｌを添加した。これを以下の温度サイクルで反応した。５６℃の伸長ステップで蛍光値の読取を行った。
５０℃  １５分（逆転写反応）、
９５℃  １分、
９５℃  １０秒−５６℃  ６０秒  ４５サイクル（ＰＣＲ）
（４）結果
Ｇ１、Ｇ２ウイルス、内部コントロールについて増幅曲線の立ち上がりを示すＣｑ値を表１に示す。この結果、ベタインと１，３−プロパンジオール（表中TMG）、グリセリンのいずれの組合せ条件でも試料からウイルスＲＮＡを単離したり、あるいは１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応前に事前に試料を加熱処理したりすることなく、ウイルスの検出が可能であった。
【００４７】
【表１】
0006642045.tif 000002
【００４８】
実施例３．糞便試料からのノロウイルス検査の改善検討（１）
（１）糞便懸濁処理液の調製
ノロウイルスＧ１、Ｇ２陽性のヒト糞便１０検体、及び陰性糞便試料６検体を滅菌水０．５ｍｌに１０％（重量％）となるように懸濁した。この懸濁液を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清をＲＴ−ＰＣＲ反応液に加えた。
（２）１ステップＲＴ−ＰＣＲ
（２−１）反応液基本組成
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、（２−２）に示す添加剤の検出への影響を評価した。
１ｘＢｕｆｆｅｒ  （Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ（登録商標）添付バッファー（東洋紡））
各０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ
０．３Ｍ  Ｌ−カルニチン
３％  １，３−プロパンジオール
プライマー液  （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）添付品）
プローブ液  （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）添付品）
０．０５ｕｎｉｔ／μｌ  ｒＴｔｈ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０１μｇ／μｌ  抗Ｔｔｈ抗体
０．０５ｕｎｉｔ／μｌ  ＲｅｖｅｒｔｒａＡｃｅ（東洋紡）
（２−２）添加剤
条件１  １ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１％魚ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）
条件２  １ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、３％魚ゼラチン
条件３  １ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、５％魚ゼラチン
条件４  ２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１％魚ゼラチン
条件５  ２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、３％魚ゼラチン
条件６  ３ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１％魚ゼラチン
（３）反応
前記反応液４９μｌに、（１）で調製した各試料１μｌを添加した。これを以下の温度サイクルで反応した。５６℃の伸長ステップで蛍光値の読取を行った。
５０℃  １５分（逆転写反応）、
９５℃  １分、
９５℃  １０秒−５６℃  ６０秒  ４５サイクル（ＰＣＲ）
（４）結果
Ｇ１、Ｇ２ウイルス、内部コントロールの増幅曲線を図２及び図３に、Ｃｑ値を表２に示す。この結果、１〜２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡでは３％魚ゼラチンと、３ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡでは１％の魚ゼラチンを組み合わせることで内部コントロール遺伝子が検出できない（増幅曲線に立ち上がりが認められない）、判定不可の検体の解消が可能であった。
【００４９】
【表２】
0006642045.tif 000003
【００５０】
実施例４．糞便試料からのノロウイルス検査の改善検討（２）
（１）糞便懸濁処理液の調製
ノロウイルスＧ１、Ｇ２陽性のヒト糞便１０検体、及び陰性糞便試料６検体を滅菌水０．５ｍｌに１０％（重量％）となるように懸濁した。この懸濁液を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清をＲＴ−ＰＣＲ反応液に加えた。
（２）１ステップＲＴ−ＰＣＲ
（２−１）反応液基本組成
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、（２−２）に示す添加剤の検出への影響を評価した。
１ｘＢｕｆｆｅｒ  （Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ（登録商標）添付バッファー（東洋紡））
０．３Ｍ  Ｌ−カルニチン
３％  １，３−プロパンジオール
各０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ
プライマー液  （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）添付品）
プローブ液  （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）添付品）
０．０５ｕｎｉｔ／μｌ  ｒＴｔｈ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０１μｇ／μｌ  抗Ｔｔｈ抗体
０．０５ｕｎｉｔ／μｌ  ＲｅｖｅｒｔｒａＡｃｅ（東洋紡）
（２−２）添加剤
条件１  ３ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０％魚ゼラチン
条件２  ３ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．５％魚ゼラチン
条件３  ３ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１％魚ゼラチン
条件４  ３ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、２％魚ゼラチン
条件５  ２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、３％魚ゼラチン
条件６  ３ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、５％魚ゼラチン
（３）反応
前記反応液４９μｌに（１）で調製した各試料１μｌを添加した。これを以下の温度サイクルで反応した。５６℃の伸長ステップで蛍光値の読取を行った。
５０℃  １５分（逆転写反応）、
９５℃  １分、
９５℃  １０秒−５６℃  ６０秒  ４５サイクル（ＰＣＲ）
（４）結果
Ｇ１、Ｇ２ウイルス、内部コントロールの増幅曲線を図４及び図５、Ｃｑ値を表３に示す。この結果、少なくとも０．５％以上、より好ましくは１％以上の魚ゼラチンを組み合わせることで内部コントロール遺伝子を検出できない、判定不可の検体の解消が可能であった。
【００５１】
【表３】
0006642045.tif 000004
【００５２】
実施例５．糞便試料からのノロウイルス検査の改善検討（３）
（１）糞便懸濁処理液の調製
ノロウイルスＧ１、Ｇ２陽性のヒト糞便１０検体、及び陰性糞便試料６検体を滅菌水０．５ｍｌに１０％（重量％）となるように懸濁した。この懸濁液を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清をＲＴ−ＰＣＲ反応液に加えた。
（２）１ステップＲＴ−ＰＣＲ
（２−１）反応液基本組成
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、（２−２）に示す添加剤の検出への影響を評価した。
１ｘＢｕｆｆｅｒ  （Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ（登録商標）添付バッファー（東洋紡））
０．３Ｍ  Ｌ−カルニチン
３％  １，３−プロパンジオール
各０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ
プライマー液  （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）添付品）
プローブ液  （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）添付品）
０．０５ｕｎｉｔ／μｌ  ｒＴｔｈ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０１μｇ／μｌ  抗Ｔｔｈ抗体
０．０５ｕｎｉｔ／μｌ  ＲｅｖｅｒｔｒａＡｃｅ（東洋紡）
（２−２）添加剤
条件１  ３ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、
条件２  ３ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１％魚ゼラチン
条件３  ３ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１％豚ゼラチン
（３）反応
前記反応液４９μｌに（１）で調製した各試料１μｌを添加した。これを以下の温度サイクルで反応した。５６℃の伸長ステップで蛍光値の読取を行った。
５０℃  １５分（逆転写反応）、
９５℃  １分、
９５℃  １０秒−５６℃  ６０秒  ４５サイクル（ＰＣＲ）
（４）結果
Ｇ１、Ｇ２ウイルス、内部コントロールの増幅曲線、Ｃｑ値を図６に示す。この結果、ゼラチンを添加しない条件１では、内部コントロール遺伝子が検出されないものが１サンプル、Ｇ２陽性サンプルで検出されないものが１サンプル生じた。一方、ゼラチンを添加した条件２、３では、豚、魚などの由来に関係なく、内部コントロール遺伝子がすべて検出され、陽性サンプルもすべて検出された。
【００５３】
実施例６．糞便試料からのノロウイルス直接検出と従来法の相関性チェック
（１）糞便懸濁処理液の調製
直接検出では、ヒト糞便８８検体を滅菌水０．５ｍｌに１０％（重量％）となるように懸濁した。この懸濁液を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、ＲＴ−ＰＣＲ反応液に加えた。従来法では、ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）を用い、添付のプロトコールに従って、キット添付の懸濁液に糞便を懸濁し、室温で１５分間インキュベートした。
（２）１ステップＲＴ−ＰＣＲ
（２−１）反応液基本組成
以下に示される組成の反応液を調製した。
１ｘＢｕｆｆｅｒ  （Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ（登録商標）添付バッファー（東洋紡））
０．３Ｍ  Ｌ−カルニチン
３％  １，３−プロパンジオール
３ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ
１％  ゼラチン
各０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ
プライマー液  （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）添付品）
プローブ液  （ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２−プローブ検出―（東洋紡）添付品）
０．０５ｕｎｉｔ／μｌ  ｒＴｔｈ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０１μｇ／μｌ  抗Ｔｔｈ抗体
０．０５ｕｎｉｔ／μｌ  ＲｅｖｅｒｔｒａＡｃｅ（東洋紡）
（３）反応
直接検出では、前記反応液４９μｌに、（１）で調製した各試料１μｌを添加した。これを以下の温度サイクルで反応した。５６℃の伸長ステップで蛍光値の読取を行った。一方、従来法では、添付のプロトコールに従い、前記懸濁液１μｌを前処理液４μｌと混合後、８５℃、１分間の熱処理を行い、キット添付の反応液、酵素液、プライマー液、プローブ液の混合液を４５μｌ加え、反応を実施した。
５０℃  １５分（逆転写反応）、
９５℃  １分、
９５℃  １０秒−５６℃  ６０秒  ４５サイクル（ＰＣＲ）
（４）結果
各方法で実施した結果の比較を表４に示す。この結果、直接検出と従来法では一致率９７％と高い相関を示し、直接検出が有効であることを確認できた。
【００５４】
【表４】
0006642045.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明は、分子生物学研究、さらに臨床検査や食品衛生管理などを目的とした検査において、好適に用いられる。
【図１】
0006642045.tif 000006
【図２】
0006642045.tif 000007
【図３】
0006642045.tif 000008
【図４】
0006642045.tif 000009
【図５】
0006642045.tif 000010
【図６】
0006642045.tif 000011