(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）反応容器中で被験物質をＲＯＲ１タンパク質及びＲＯＲ２タンパク質と混合し、（ｉｉ）標準対照と比較して前記ＲＯＲ１タンパク質の前記ＲＯＲ２タンパク質に対する結合の低下を検出し、これによりＲＯＲ１−ＲＯＲ２結合のインヒビターを同定することを含むＲＯＲ１−ＲＯＲ２結合のインヒビターの同定方法。
【請求項２】
前記検出は前記被験物質の存在下で前記ＲＯＲ２タンパク質に結合したＲＯＲ１タンパク質のレベルを検出することを含み、標準対照と比較して前記ＲＯＲ２タンパク質に結合したＲＯＲ１タンパク質の低いレベルは、該被験物質がＲＯＲ１−ＲＯＲ２結合のインヒビターであることを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記検出は前記被験物質の存在下で非結合ＲＯＲ１タンパク質または非結合ＲＯＲ２タンパク質のレベルを検出することを含み、標準対照と比較して非結合ＲＯＲ１タンパク質の高いレベルまたは非結合ＲＯＲ２タンパク質の高いレベルは、該被験物質がＲＯＲ１−ＲＯＲ２結合のインヒビターであることを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＲＯＲ１タンパク質及び前記ＲＯＲ２タンパク質は検出可能部分を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記検出は前記被験物質の存在下でグアニン交換因子（ＧＥＦ）タンパク質活性またはグアノシントリホスファターゼ（ＧＴＰアーゼ）タンパク質活性のレベルを検出することを含み、標準対照と比較して前記ＧＥＦタンパク質活性または前記ＧＴＰアーゼタンパク質活性の低いレベルは該被験物質がＲＯＲ１−ＲＯＲ２結合のインヒビターであることを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＧＥＦタンパク質はＡＲＨＧＥＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２、またはＡＲＨＧＥＦ６である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＧＴＰアーゼタンパク質はＲｈｏＡまたはＲａｃ１である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ＧＥＦタンパク質または前記ＧＴＰアーゼタンパク質は検出可能部分を含む、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記混合はＷｎｔ５ａタンパク質の存在下で行われる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記反応容器は固体支持体を含むカラムである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記反応容器は細胞を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＲＯＲ１タンパク質及び前記ＲＯＲ２タンパク質は前記細胞の表面上で発現する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞はがん細胞である、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記がん細胞は慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＣＬＬ細胞はＭＥＣ１細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞はインビトロ細胞培養物の一部を形成する、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記被験物質は抗体、小分子、ペプチド、タンパク質、または核酸である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記被験物質は抗体である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体は抗ＲＯＲ１抗体である、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体は抗ＲＯＲ２抗体である、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体はＲＯＲ１タンパク質またはＲＯＲ２タンパク質に結合する、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体はＫＮＧドメインに結合する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗体はヒト化抗体である、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗体はキメラ抗体である、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗体はｓｃＦｖである、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
受容体−チロシンキナーゼ様オーファン受容体のＲＯＲ１及びＲＯＲ２は進化的に保存されたタイプＩタンパク質である［１−８］。これらタンパク質のカエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）及びハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）における発生的発現パターンに関する研究は顕著な保存を示している［９］。ＲＯＲ１及びＲＯＲ２は胚発生の初期段階に最高レベルで発現し、３つすべての胚葉由来の組織中の主要系の殆どにおいて、最も顕著には神経堤において提示されるのに対して、ＲＯＲ１の発現は神経間葉により限定されているとみられる［１０，１１］。しかしながら、ＲＯＲ１またはＲＯＲ２のいずれかをノックアウトすると、心臓、肺、尿生殖路及び他の臓器をも含む広汎性発達障害が生じ、各々は潜在的に器官形成に広く寄与していると示唆される［１２，１３］。
【０００２】
低レベルのＲＯＲ２は幾つかの成体組織で見られ得るが、血球小芽細胞と称されるＢ細胞前駆体の小集団を除いてＲＯＲ１の出生後の発現は明白でない［１４］。しかしながら、ＲＯＲ１は慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）患者の白血病細胞で見られ得［１５−１７］、ＲＯＲ１またはＲＯＲ２は各種の異なるがんの新生細胞により発現する［１８，１９］。ＲＯＲ１またはＲＯＲ２のがん細胞発現は、高いがん細胞遊走、上皮間葉転換（ＥＭＴ）、再発した疾患及び転移に対する高い関連リスク、及び予後不良に関係している［２０，２１］。もっと最近では、ＲＯＲ１は、インビトロでの遊走／スフェロイド形成及びインビボでの移植／転移に対して高い能力を有する卵巣がん幹細胞で同定された［２２］。
【０００３】
ＲＯＲ１及びＲＯＲ２は各々Ｗｎｔ５ａに対する受容体として機能し得［１５，２３］、これは非古典的Ｗｎｔシグナル伝達を誘導し得、潜在的に高い腫瘍細胞増殖、定方向遊走、及び／または器官形成中の組織−細胞極性をもたらし得る［１８，２４−２６］。一方、ＲＯＲ２はＷｎｔ標的遺伝子の転写を抑制し、古典的Ｗｎｔリガンドの隔離によりＷｎｔシグナル伝達をモジュレートすることもでき、これにより異なる細胞環境において腫瘍サプレッサーとして役立つ［２７］。ＲＯＲ１またはＲＯＲ２の活性は関連タンパク質により影響されると考えられるが［２８，２９］、ＲＯＲ１及びＲＯＲ２は相互に独立して機能すると考えられる。
【０００４】
当該分野では、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２及び／またはＷｎｔ５ａに関連する分子経路の有効なモジュレーターの要望がある。当該分野では、抗がん治療薬に対する要望がある。本発明では当該分野のこれらの要望及び他の要望に対する解決法が提供される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２６１８１−２６１９０（１９９２）
【非特許文献２】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０，７１０９−７１１３（１９９３）
【非特許文献３】Ｎａｔｕｒｅ，４００，８８１−８８５（１９９９）
【非特許文献４】Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２６，５３８７−５３９８（１９９９）
【非特許文献５】Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１７，８２１−８４１（２００１）
【非特許文献６】Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２９，５２２７−５２３９（２００２）
【非特許文献７】Ａｎａｔ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．（Ｂｅｒｌ．），２０７，４９５−５０２（２００４）
【非特許文献８】Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．，１４，１３８１−１３８４（２００５）
【非特許文献９】Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，２３９，１−１５（２０１０）
【非特許文献１０】Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ，４，４１−５６（１９９９）
【非特許文献１１】Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅｓ  Ｅｖｏｌ．，２１１，１６１−１７１（２００１）
【非特許文献１２】Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２１，８３２９−８３３５（２００１）
【非特許文献１３】Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，２３９，２２６６−２２７７（２０１０）
【非特許文献１４】Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．，３５，１３９０−１３９４（２０１１）
【非特許文献１５】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０５，３０４７−３０５２（２００８）
【非特許文献１６】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１２３，１１９０−１１９５（２００８）
【非特許文献１７】Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１４，３９６−４０４（２００８）
【非特許文献１８】Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１８１，１９０３−１９１０（２０１２）
【非特許文献１９】Ｄｅｂｅｂｅ，Ｚ．＆  Ｒａｔｈｍｅｌｌ，Ｗ．Ｋ．Ｒｏｒ２  ａｓ  ａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｔａｒｇｅｔ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２０１５）
【非特許文献２０】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，７３，３６４９−３６６０（２０１３）
【非特許文献２１】Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ，１８，６０８−６１９（２０１３）
【非特許文献２２】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１１１，１７２６６−１７２７１（２０１４）
【非特許文献２３】Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ，８，６４５−６５４（２００３）
【非特許文献２４】Ｃｅｌｌ，１３４，６４６−６５６（２００８）
【非特許文献２５】Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３５，３８７１−３８７９（２００８）
【非特許文献２６】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０９，４０４４−４０５１（２０１２）
【非特許文献２７】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１３３，７７９−７８７（２０１３）
【非特許文献２８】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，７１，３１３２−３１４１（２０１１）
【非特許文献２９】Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，２１，３４８−３６１（２０１２）
【発明の概要】
【０００６】
１つの態様において、ＲＯＲ１−ＲＯＲ２結合のインヒビターを同定する方法を提供する。その方法は、（ｉ）反応容器において被験物質をＲＯＲ１タンパク質及びＲＯＲ２タンパク質と混合することを含む。（ｉｉ）標準対照と比較してＲＯＲ１タンパク質のＲＯＲ２タンパク質に対する結合の低下を検出し、これによりＲＯＲ１−ＲＯＲ２結合のインヒビターを同定する。
【０００７】
１つの態様において、実施形態を含めた本明細書中に記載されている方法により同定した抗体を提供する。
【０００８】
別の態様において、ＲＯＲ１−ＲＯＲ２相互作用を阻害する方法を提供する。その方法は、（ｉ）実施形態を含めた本明細書中に記載されている方法により同定した化合物を、ＲＯＲ１タンパク質及びＲＯＲ２タンパク質を含む複合体であるＲＯＲ１−ＲＯＲ２複合体と、接触させることを含む。（ｉｉ）化合物はＲＯＲ１タンパク質とＲＯＲ２タンパク質間の相互作用を阻害することができ、これによりＲＯＲ１−ＲＯＲ２相互作用が阻害される。
【０００９】
別の態様において、がんを治療する必要がある被験者におけるがんを治療する方法を提供する。その方法は、被験者に対して実施形態を含めた本明細書中に記載されている方法により同定した抗体、小分子、ペプチド、または核酸を治療有効量投与することを含む。
【００１０】
別の態様において、ＲＯＲ１及びＲＯＲ２タンパク質を含むタンパク質複合体のインヒビターを同定する方法を提供する。その方法は、（ｉ）ＲＯＲ１及びＲＯＲ２を収容している反応容器中で被験物質を混合し；（ｉｉ）標準対照と比較したＲＯＲ１及びＲＯＲ２を含むタンパク質複合体の分断を検出し、これによりＲＯＲ１及びＲＯＲ２タンパク質を含むタンパク質複合体のインヒビターを同定することを含む。ある実施形態では、検出は被験物質の存在下でタンパク質複合体中のＲＯＲ１及び／またはＲＯＲ２の低いレベルを検出することを含み、複合体中のＲＯＲ１及び／またはＲＯＲ２のレベルが標準対照と比較して低いことは該被験物質がＲＯＲ１及びＲＯＲ２タンパク質を含むタンパク質複合体のインヒビターであることを示す。ある実施形態では、検出は被験物質の存在下でタンパク質複合体中の非結合ＲＯＲ１及び／または非結合ＲＯＲ２の高いレベルを検出することを含み、非結合ＲＯＲ１及び／またはＲＯＲ２のレベルが標準対照と比較して高いことは該被験物質がＲＯＲ１及びＲＯＲ２タンパク質を含むタンパク質複合体のインヒビターであることを示す。
【００１１】
ある実施形態では、ＲＯＲ１及び／またはＲＯＲ２タンパク質は検出可能部分を含む。ある実施形態では、検出は被験物質の存在下でグアニン交換因子（ＧＥＦ）のレベルを検出することを含み、ＧＥＦのレベルが標準対照と比較して低いことは該被験物質がＲＯＲ１及びＲＯＲ２タンパク質を有するタンパク質複合体のインヒビターであることを示す。ある実施形態では、ＧＥＦはＲｈｏＡ、Ｒａｃ１、ＡＨＲＧＥＦ１、ＡＨＲＧＥＦ２、またはＡＨＲＧＥＦ６である。ある実施形態では、ＧＥＦは検出可能部分を含む。ある実施形態では、混合はＷｎｔ５ａタンパク質の存在下で行われる。ある実施形態では、反応容器は固体支持体を収容しているカラムである。
【００１２】
ある実施形態では、ＲＯＲ１及びＲＯＲ２を含むタンパク質複合体は細胞の不在下で存在している。ある実施形態では、ＲＯＲ１及びＲＯＲ２は細胞の表面上に存在している。ある実施形態では、細胞は腫瘍細胞である。ある実施形態では、腫瘍細胞は慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）細胞である。ある実施形態では、ＣＬＬ細胞はＭＥＣ１細胞である。ある実施形態では、細胞はインビトロ細胞培養物の一部を形成する。ある実施形態では、細胞は生物の一部を形成する。ある実施形態では、生物は哺乳動物である。ある実施形態では、生物はマウスである。
【００１３】
ある実施形態では、被験物質は抗体、小分子、ペプチド、タンパク質、または核酸である。ある実施形態では、被験物質は抗体である。ある実施形態では、抗体は抗ＲＯＲ１抗体である。ある実施形態では、抗体は抗ＲＯＲ２抗体である。ある実施形態では、抗体はＲＯＲ１タンパク質またはＲＯＲ２タンパク質に結合する。ある実施形態では、抗体はＫＮＧドメインに結合する。ある実施形態では、抗体はヒト化抗体である。ある実施形態では、抗体はキメラ抗体である。ある実施形態では、抗体はｓｃＦｖである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】Ｗｎｔ５ａはＲａｃ１及びＲｈｏＡのＲＯＲ１依存性活性化によりＣＬＬ増殖及び遊走を高める。図１Ａ：各ヒストグラムの左上に示すように外因性Ｗｎｔ５ａの存在または不在下でＣｔｒｌ−ＩｇＧまたはＵＣ−９６１で処理したＣＦＳＥ標識ＣＬＬ細胞（ｎ＝６）のＣＤ１５４誘導性増殖。１つの代表的ＣＬＬサンプルに対するアッセイの結果を各ヒストグラムの左下に示す非刺激細胞よりも少ない蛍光を有する細胞のパーセントで示す。
【図１Ｂ】Ｗｎｔ５ａはＲａｃ１及びＲｈｏＡのＲＯＲ１依存性活性化によりＣＬＬ増殖及び遊走を高める。図１Ｂ：バーは、下に示す各培養条件について６人の別々の患者の各々からの減少したＣＦＳＥ蛍光を有するＣＬＬ細胞の平均比率を示す。データを平均値±ＳＥＭとして示す；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１Ｃ】Ｗｎｔ５ａはＲａｃ１及びＲｈｏＡのＲＯＲ１依存性活性化によりＣＬＬ増殖及び遊走を高める。図１Ｃ：バーは、ＣＸＣＬ１２及び／またはＷｎｔ５ａとＣｔｒｌ−ＩｇＧまたはＵＣ−９６１に応答して遊走するＣＬＬ細胞（ｎ＝６）の平均比率を示す。データを平均値±ＳＥＭとして示す；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１Ｄ】Ｗｎｔ５ａはＲａｃ１及びＲｈｏＡのＲＯＲ１依存性活性化によりＣＬＬ増殖及び遊走を高める。図１Ｄ：無血清培地（血清飢餓）において培養した後、各レーンの上に示す時間にわたってＷｎｔ５ａで処理したＣＬＬ細胞において活性化したＲａｃ１及びＲｈｏＡを調べた。全細胞ライゼートも全Ｒａｃ１またはＲｈｏＡについてイムノブロット分析により試験した。各々のイムノブロットについて、各レーンの下の数字は未処理サンプルに対して正規化した活性化ＧＴＰアーゼ対全ＧＴＰアーゼのバンド密度の比である。
【図１Ｅ】Ｗｎｔ５ａはＲａｃ１及びＲｈｏＡのＲＯＲ１依存性活性化によりＣＬＬ増殖及び遊走を高める。図１Ｅ：ブロットの各組の上部に示すＣｔｒｌ−ＩｇＧまたはＵＣ−９６１で処理したＣＬＬ細胞におけるＲａｃ１（上パネル）またはＲｈｏＡ（下パネル）のＷｎｔ５ａ誘導性活性化。各々のイムノブロットについて、各レーンの下の数字は未処理サンプルに対して正規化した活性化対全ＧＴＰアーゼのバンド密度の比である。
【図１Ｆ】Ｗｎｔ５ａはＲａｃ１及びＲｈｏＡのＲＯＲ１依存性活性化によりＣＬＬ増殖及び遊走を高める。図１Ｆ：Ｗｎｔ５ａ及び／またはＣＤ１５４の不在または存在下で３０分間処理した血清飢餓ＣＬＬ細胞における活性化Ｒａｃ１。各々のイムノブロットについて、各レーンの下の数字は未処理サンプルに対して正規化した活性化対全ＧＴＰアーゼのバンド密度の比である。
【図１Ｇ】Ｗｎｔ５ａはＲａｃ１及びＲｈｏＡのＲＯＲ１依存性活性化によりＣＬＬ増殖及び遊走を高める。図１Ｇ：Ｗｎｔ５ａ及び／またはＣＸＣＬ１２の不在または存在下で３０分間処理した血清飢餓ＣＬＬ細胞における活性化ＲｈｏＡ。各々のイムノブロットについて、各レーンの下の数字は未処理サンプルに対して正規化した活性化対全ＧＴＰアーゼのバンド密度の比である。
【図１Ｈ】Ｗｎｔ５ａはＲａｃ１及びＲｈｏＡのＲＯＲ１依存性活性化によりＣＬＬ増殖及び遊走を高める。図１Ｈ：外因性Ｗｎｔ５ａの不在または存在下でＲａｃ１インヒビター（ＮＳＣ−２３７６６）またはＲｈｏＡインヒビター（Ｙ−２７６３２）で処理したＣＬＬ細胞（ｎ＝６）のＣＤ１５４誘導性増殖の分析。
【図１Ｉ】Ｗｎｔ５ａはＲａｃ１及びＲｈｏＡのＲＯＲ１依存性活性化によりＣＬＬ増殖及び遊走を高める。１つの代表的サンプルのＣＦＳＥ標識したＣＬＬ細胞に対するアッセイの結果をパネル図１Ａ及び１Ｉ中に示す。左上に示すように処理した６人の患者サンプルについて減少したＣＳＦＥ蛍光を有するＣＬＬ細胞の平均比率をパネルｂに示す。データを平均値±ＳＥＭとして示す；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１Ｊ】Ｗｎｔ５ａはＲａｃ１及びＲｈｏＡのＲＯＲ１依存性活性化によりＣＬＬ増殖及び遊走を高める。図１Ｊ：ＮＳＣ−２３７６６またはＹ−２７６３２の不在または存在下でＣＸＣＬ１２及び／またはＷｎｔ５ａに応答して遊走するＣＬＬ細胞（ｎ＝６）の平均比率。データを平均値±ＳＥＭとして示す；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図２Ａ】ＲＯＲ１はＲＯＲ２とカップリングする。図２Ａ：ＺＡＰ７０Ｎｅｇ／ｍｕ−ＩｇＶＨ（ＣＬＬ−１−４）またはＺＡＰ７０＋／ｕｍ−ＩｇＶＨ（ＣＬＬ−５−８）ＣＬＬ細胞のライゼート、または健康な被験者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中のＲＯＲ１またはＲＯＲ２についてのイムノブロット分析。精製した組換え細胞外ＲＯＲ１またはＲＯＲ２（ＲＯＲ１−ｅｘまたはＲＯＲ２−ｅｘ）を特異性対照として別のレーンに充填した。
【図２Ｂ】ＲＯＲ１はＲＯＲ２とカップリングする。図２Ｂ：ＣＤ５＋ＣＤ１９＋ＣＬＬ細胞上のＲＯＲ１またはＲＯＲ２をフローサイトメトリーにより検出。
【図２Ｃ】ＲＯＲ１はＲＯＲ２とカップリングする。図２Ｃ：健康なドナーのＰＢＭＣを抗ＲＯＲ２−Ａｌｅｘａ−４８８、抗ＣＤ１９−ＰＥ及び抗ＣＤ５−ＡＰＣ  ｍＡｂで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。ゲーティング戦略を、抗ＲＯＲ２  ｍＡｂ（灰色）対Ａｌｅｘａ−４８８コンジュゲートしたＣｔｒｌ−ＩｇＧ（白色ヒストグラム）とインキュベートした細胞の蛍光を示す各ヒストグラムの上部に特定したサブグループ毎の中央等高線図に示す。ＣＤ１９＋細胞サブセット毎のΔＭＦＩを右上に示す。
【図２Ｄ】ＲＯＲ１はＲＯＲ２とカップリングする。図２Ｄ：ＣＬＬサンプル（ｎ＝８０）、または健康なドナー（ｎ＝１５）のＰＢＭＣ中のゲートリンパ球サブセットの各々についてのＲＯＲ２のΔＭＦＩ。データを平均値±ＳＥＭとして示す；＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図２Ｅ】ＲＯＲ１はＲＯＲ２とカップリングする。図２Ｅ：新鮮分離したＣＬＬ細胞のライゼートからの抗ＲＯＲ１または抗ＲＯＲ２  ｉｐのＲＯＲ１のＲＯＲ２との会合を検出するイムノブロット分析。
【図２Ｆ】ＲＯＲ１はＲＯＲ２とカップリングする。図２Ｆ：無血清培地において培養した後、Ｗｎｔ５ａの不在（−）または存在（＋）下で処理したＣＬＬ細胞のライゼートからの抗ＲＯＲ１  ｉｐのイムノブロット分析。
【図２Ｇ】ＲＯＲ１はＲＯＲ２とカップリングする。図２Ｇ：ＣＬＬ患者（ｎ＝９）または同年齢の健康な対照被験者（Ｎｏｒｍａｌ，ｎ＝９）の血漿中のＷｎｔ５ａレベルをＥＬＩＳＡにより評価した。データを平均値±ＳＥＭとして示す；＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図３Ａ】ＵＣ−９６１はＲＯＲ１シグナル伝達を阻害する。図３Ａ：各列の右端に示す新鮮分離したＣＬＬ細胞＋／−Ｃｔｒｌ−ＩｇまたはＵＣ−９６１Ｇにおいて共焦点顕微鏡検査により検出されたＲＯＲ１及びＲＯＲ２の共局在化（矢印）（スケールバー：２μｍ）。
【図３Ｂ】ＵＣ−９６１はＲＯＲ１シグナル伝達を阻害する。図３Ｂ：図３Ａに示すように、Ｗｎｔ５ａの不在または存在下でＣｔｒｌ−ＩｇＧまたはＵＣ−９６１で処理した後、ＲＯＲ１及びＲＯＲ２について染色した血清飢餓ＣＬＬ細胞の共焦点顕微鏡検査。
【図３Ｃ】ＵＣ−９６１はＲＯＲ１シグナル伝達を阻害する。図３Ｃ：対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉＲＮＡ）、またはＲＯＲ１またはＲＯＲ２に対して特異的なｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＣＬＬ細胞（ｎ＝６）についてＷｎｔ５ａの不在または存在下でＣＸＣＬ１２に対して遊走する細胞の平均比率。データを平均値±ＳＥＭとして示す；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。
【図３Ｄ】ＵＣ−９６１はＲＯＲ１シグナル伝達を阻害する。図３Ｄ：活性化ＲｈｏＡまたはＲａｃ１を、Ｃｔｒｌ−ｓｉＲＮＡ、またはＲＯＲ１またはＲＯＲ２に対して特異的なｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、Ｗｎｔ５ａの存在または不在下で培養したＣＬＬ細胞のライゼートに対するＲｈｏファミリータンパク質活性プルダウンアッセイにより、調べた。全細胞ライゼートも全ＲｈｏＡまたはＲａｃ１に対するイムノブロット（下列）により調べた。各レーンの下の数字は、図１Ｄに示すように未処理サンプルに対して正規化した活性化ＧＴＰアーゼ対全ＧＴＰアーゼの密度である。
【図４Ａ】ＵＣ−９６１はＧＥＦのＷｎｔ５ａ誘導性補充及びＲｈｏＡ及びＲａｃ１の活性化を阻害する。図４Ａ：各列の左欄外に示すようにＷｎｔ５ａの不在（−）または存在（＋）下で培養したＣＬＬ細胞におけるＡＲＨＧＥＦ１とＲＯＲ１及びＲＯＲ２の共局在化（矢印）（スケールバー：５μｍ）。
【図４Ｂ】ＵＣ−９６１はＧＥＦのＷｎｔ５ａ誘導性補充及びＲｈｏＡ及びＲａｃ１の活性化を阻害する。図４Ｂ：図４Ａに示すようにＷｎｔ５ａの不在（−）または存在（＋）下で培養したＣＬＬ細胞におけるＡＲＨＧＥＦ２とＲＯＲ１−ＲＯＲ２の共局在化。
【図４Ｃ】ＵＣ−９６１はＧＥＦのＷｎｔ５ａ誘導性補充及びＲｈｏＡ及びＲａｃ１の活性化を阻害する。図４Ｃ：図４Ａに示すようにＷｎｔ５ａの不在（−）または存在（＋）下で培養したＣＬＬ細胞におけるＡＲＨＧＥＦ６とＲＯＲ１−ＲＯＲ２の局在化。
【図４Ｄ】ＵＣ−９６１はＧＥＦのＷｎｔ５ａ誘導性補充及びＲｈｏＡ及びＲａｃ１の活性化を阻害する。図４Ｄ：各グラフの右下に示すように、ＡＲＨＧＥＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２またはＡＲＨＧＥＦ６に対して特異的なｍＡｂを用いる、Ｗｎｔ５ａの不在（−）または存在（＋）下で培養したＣＬＬ細胞のライゼートからのｉｐのＲｈｏＡ（グラフの上２つの列）またはＲａｃ１（グラフの下２つの列）の継時的（分）インビトロ交換。線はバッファーのみを用いて観察されたＧＴＰアーゼ活性化を示す。
【図４Ｅ】ＵＣ−９６１はＧＥＦのＷｎｔ５ａ誘導性補充及びＲｈｏＡ及びＲａｃ１の活性化を阻害する。図４Ｅ：各グラフの下に示すように、ＡＲＨＧＥＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２またはＡＲＨＧＥＦ６に対して特異的なｍＡｂを用いる、ＵＣ−９６１またはＣｔｒｌ−ＩｇＧの存在下で培養したＣＬＬ細胞のライゼートからのｉｐのＲｈｏＡまたはＲａｃ１に対するインビトロ交換アッセイ。線はバッファーのみを使用するＧＴＰアーゼ活性化を示す。
【図４Ｆ】ＵＣ−９６１はＧＥＦのＷｎｔ５ａ誘導性補充及びＲｈｏＡ及びＲａｃ１の活性化を阻害する。図４Ｆ：Ｃｔｒｌ−ｓｉＲＮＡ、またはＡＲＨＧＥＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２またはＡＲＨＧＥＦ６に対して特異的なｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＣＬＬ細胞をＷｎｔ５ａの不在（−）または存在（＋）下で処理後のＲｈｏＡまたはＲａｃ１の活性化。全細胞ライゼートも全ＲｈｏＡまたはＲａｃ１についてイムノブロット分析により調べた。各レーンの下の数字は未処理サンプルに対して正規化した活性化ＧＴＰアーゼ対全ＧＴＰアーゼのバンド密度の比である。
【図５Ａ】ＲＯＲ１の機能的ドメインをマッピング。図５Ａ：ＲＯＲ１及び末端切断形態のＲＯＲ１の構造の概略図を示した。ＲＯＲ１とＲＯＲ２の相互作用を、ＭＥＣ１（Ｃｔｒｌ．）、ＭＥＣ１−ＲＯＲ１（ＲＯＲ１）、または末端切断形態のＲＯＲ１でトランスフェクトしたＭＥＣ１細胞からのライゼートを用いる抗ＲＯＲ１  ｉｐのイムノブロット分析により確認した。
【図５Ｂ】ＲＯＲ１の機能的ドメインをマッピング。図５Ｂ：ＭＥＣ１−ＲＯＲ１細胞におけるＡＲＨＧＥＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２またはＡＲＨＧＥＦ６とＲＯＲ１及びＲＯＲ２の共局在化（例えば、矢印）（スケールバー：２μｍ）。
【図５Ｃ】ＲＯＲ１の機能的ドメインをマッピング。図５Ｃ：活性化Ｒａｃ１またはＲｈｏＡをＭＥＣ１（Ｃｔｒｌ．）、ＭＥＣ１−ＲＯＲ１（ＲＯＲ１）、及び末端切断形態のＲＯＲ１を発現するＭＥＣ１細胞において測定した。全細胞ライゼートも全Ｒａｃ１またはＲｈｏＡについてイムノブロットにより試験した。各レーンの下の数字はＭＥＣ１サンプルに対して正規化した活性化ＧＴＰアーゼ対全ＧＴＰアーゼのバンド密度の比である。
【図５Ｄ】ＲＯＲ１の機能的ドメインをマッピング。図５Ｄ：ＭＥＣ１またはＭＥＣ１−ＲＯＲ１細胞におけるＲａｃ１活性化またはＲｈｏＡ活性化のＵＣ−９６１  ｍＡｂ及び抗Ｗｎｔ５ａ  ｍＡｂによる阻害。各レーンの下の数字は図５Ｃに示すようにＭＥＣ１に対して正規化したバンド密度の比である。
【図５Ｅ】ＲＯＲ１の機能的ドメインをマッピング。図５Ｅ：３連のウェルにおいてグラフの下に示す日数でＭＥＣ１（円）、ＭＥＣ１−ＲＯＲ１（四角）、または末端切断形態のＲＯＲ１（説明文に示す）の各々を発現するＭＥＣ１細胞の平均数。
【図５Ｆ】ＲＯＲ１の機能的ドメインをマッピング。図５Ｆ：３連のウェルにおいてＣｔｒｌ−ＩｇＧ（四角）、ＵＣ−９６１（三角）、または抗Ｗｎｔ５ａ（逆三角）と共に、記載の時間培養したＭＥＣ１−ＲＯＲ１細胞の平均数。
【図５Ｇ】ＲＯＲ１の機能的ドメインをマッピング。図５Ｇ：バーは、下に示すＣＣＬ２１の存在（＋）または不在（−）下で遊走するＭＥＣ１、ＭＥＣ１−ＲＯＲ１、または末端切断形態のＲＯＲ１（説明文に示す）の各々をトランスフェクトしたＭＥＣ１細胞の平均比率を示す。
【図５Ｈ】ＲＯＲ１の機能的ドメインをマッピング。図５Ｈ：バーは、Ｃｔｒｌ−ＩｇＧ、ＵＣ−９６１または抗Ｗｎｔ５ａの存在下、ＣＣＬ２１の存在（＋）または不在（−）下で遊走するＭＥＣ１−ＲＯＲ１細胞の平均比率を示す。図５Ｅ〜５Ｈ中のデータを平均値±ＳＥＭとして示す；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。
【図５Ｉ】ＲＯＲ１の機能的ドメインをマッピング。図５Ｉ：Ｒａｃ１及びＲｈｏＡを活性化するＧＥＦを補充するＲＯＲ１−ＲＯＲ２ヘテロダイマーの形成を誘導することによりＷｎｔ５ａが増殖及び遊走を高める分子メカニズムをモデル化するイラスト図解。
【図６Ａ】ＵＣ−９６１はＭＥＣ１−ＲＯＲ１の移植を阻害する。図６Ａ：１×１０６  個のＭＥＣ１またはＭＥＣ１−ＲＯＲ１細胞の静脈内輸液を受けてから３週間後のＲａｇ２−／−γｃ−／−マウスの代表的脾臓。同年齢の移植なしのＲａｇ２−／−γｃ−／−マウス（Ｎｏｒ）の脾臓を比較のために示す。
【図６Ｂ】ＵＣ−９６１はＭＥＣ１−ＲＯＲ１の移植を阻害する。図６Ｂ：右欄外に示すようにＭＥＣ１またはＭＥＣ１−ＲＯＲ１細胞を３週間前に移植したマウスの大腿または脛骨の骨髄から、または脾臓から、ＭＥＣ１またはＭＥＣ１−ＲＯＲ１細胞を集めた。４Ａ５−Ａｌｅｘａ−６４７（縦軸）及び抗ＣＤ１９−ＰＥ（横軸）で染色した細胞の蛍光を等高線図に示す。各等高線図の右上のパーセンテージは点線で示す閾値を超える蛍光を有する細胞の比率を示す。
【図６Ｃ】ＵＣ−９６１はＭＥＣ１−ＲＯＲ１の移植を阻害する。図６Ｃ：１×１０６  個のＭＥＣ１−ＲＯＲ１細胞の静脈内輸液、及びそれに次ぐＣｔｒｌ−ＩｇＧまたはＵＣ−９６１のどちらかでの処理を受けてから３週間後のＲａｇ２−／−γｃ−／−マウスの代表的脾臓。同年齢の移植なしのＲａｇ２−／−γｃ−／−マウス（Ｎｏｒ）の脾臓を比較のために示す。
【図６Ｄ】ＵＣ−９６１はＭＥＣ１−ＲＯＲ１の移植を阻害する。図６Ｄ：３週間前にＭＥＣ１−ＲＯＲ１細胞を移植した後、右に示すようにＣｔｒｌ−ＩｇＧまたはＵＣ−９６１のどちらかで処理したマウスの大腿及び脛骨の骨髄、または脾臓から、ＭＥＣ１−ＲＯＲ１細胞を集めた。図６Ｂに示すように、細胞をＭＥＣ１−ＲＯＲ１細胞を同定するために４Ａ５−Ａｌｅｘａ−６４７及び抗ＣＤ１９−ＰＥで染色した。各等高線図の右上のパーセンテージは点線で示す閾値を超える蛍光を有する細胞の比率を示す。
【図６Ｅ】ＵＣ−９６１はＭＥＣ１−ＲＯＲ１の移植を阻害する。図６Ｅ：バーは、３週間前にＭＥＣ１細胞（白色バー）またはＭＥＣ１−ＲＯＲ１細胞（黒色バー）を移植したマウスの骨髄（左）または脾臓（右）から集めたＣＤ１９＋  ヒト白血病細胞の平均数を示す。幾つかの群の動物を各ヒストグラムの下に示すようにＣｔｒｌ−ＩｇＧまたはＵＣ−９６１で処理した。データを動物（ｎ＝５）の群ごとに平均値±ＳＥＭとして示す。＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図７】ＣＤ１５４なしでＷｎｔ５ａにより誘導したＣＬＬ増殖についてのＣＦＳＥアッセイ。外因性Ｗｎｔ５ａの不在（左パネル）または存在（右パネル）下でＨｅＬａ細胞と６日間共培養した、ＣＦＳＥ標識したＣＬＬ細胞（ｎ＝６）の蛍光。１つの代表的ＣＬＬサンプルに対するアッセイの結果を各パネルの左下に示す分裂細胞のパーセントで示す。
【図８Ａ】ＣＬＬ細胞におけるＲＯＲ２発現。図８Ａ：抗ＲＯＲ１  ｍＡｂ対Ｃｔｒｌ−ＩｇＧをｉｐ後ＣＬＬ細胞から作成したタンパク質ライゼートからの２Ｄ−ｎａｎｏＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより同定したＲＯＲ２のユニークペプチドを示す質量スペクトル。
【図８Ｂ】ＣＬＬ細胞におけるＲＯＲ２発現。図８Ｂ：全ＲＮＡを３つのＣＬＬ患者サンプルの各々から抽出した。ＲＯＲ２  ｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、ＤＮＡ配列決定により確認した。ゲノムＤＮＡ汚染がなかったことを確認するために全ＲＮＡをＰＣＲテンプレートとして使用した。配列説明文：ＡＣＧＴＧＣＡＣＡＴＧＡＧＧＴＣＣＡＴＴ（配列番号１）；ＣＡＣＣＧＧＧＴＧＴＧＧＧＡＴＴＴＡＣＡ（配列番号２）；ＴＧＣＣＣＣＧＣＡＣＡＣＡＴＴＧＴＴＧＧＴＣＣＴＡＴＴＴＧＴＡＡＡＴＣＣＣＡ（配列番号３）；ＣＰＡＨＩＶＧＰＩＣＫＳＨ（配列番号４）。
【図８Ｃ】ＣＬＬ細胞におけるＲＯＲ２発現。図８Ｃ：下に示すようにＣＬＬサンプル（ｎ＝８０）または健康なドナー（ｎ＝１５）のＰＢＭＣ中のゲートリンパ球サブセットの各々の、ＲＯＲ１についてのΔＭＦＩ。
【図８Ｄ】ＣＬＬ細胞におけるＲＯＲ２発現。図８Ｄ：ＲＯＲ１−ｅｘ及びＲＯＲ２−ｅｘタンパク質を精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシー染色により分析した。
【図８Ｅ】ＣＬＬ細胞におけるＲＯＲ２発現。図８Ｅ：チャイニーズ卵巣（ＣＨＯ）細胞にｐｃＤＮＡ３．１（ベクター，左パネル）またはＲＯＲ２をエンコードするｐｃＤＮＡ３．１（ＲＯＲ２，右パネル）をトランスフェクトした後、フローサイトメトリーによる分析のためにＡｌｅｘａ−４８８標識したイソタイプ対照ｍＡｂ（白色ヒストグラム）または抗ＲＯＲ２−Ａｌｅｘａ−４８８  ｍＡｂで染色した。
【図９】共焦点顕微鏡検査による共局在化分析のためのネガティブ対照。共焦点顕微鏡検査による評価のために（スケールバー：２μｍ）、ＣＬＬ細胞を抗ＣＤ５−Ａｌｅｘａ−６４７及び抗ＣＤ１９−Ａｌｅｘａ−４８８；抗ＲＯＲ１−Ａｌｅｘａ−６４７及び抗ＣＤ１９−Ａｌｅｘａ−４８８；または抗ＣＤ５−Ａｌｅｘａ−６４７及び抗ＲＯＲ２−Ａｌｅｘａ−４８８で染色した。ＣＤ５とＣＤ１９、ＲＯＲ１とＣＤ１９、またはＣＤ５とＲＯＲ２の間に共局在化はない。
【図１０Ａ】ＣＬＬにおけるＲＯＲ１及びＲＯＲ２のサイレンシング。図１０Ａ：各レーンの上部に示すように、非特異的対照ｓｉＲＮＡ（Ｃｔｒｌ−ｓｉＲＮＡ）、ＲＯＲ１に対して特異的なｓｉＲＮＡ（ＲＯＲ１−ｓｉＲＮＡ）またはＲＯＲ２（ＲＯＲ２−ｓｉＲＮＡ）に対して特異的なｓｉＲＮＡで、ＣＬＬ細胞にトランスフェクトした。４８時間後、細胞をＲＯＲ１またはＲＯＲ２についてイムノブロット分析により検査した。各レーンの下の数字はＣｔｒｌ−ｓｉＲＮＡ処理サンプルに対して正規化したＲＯＲ１またはＲＯＲ２対β−アクチンのバンド密度の比である。
【図１０Ｂ】ＣＬＬにおけるＲＯＲ１及びＲＯＲ２のサイレンシング。図１０Ｂ：Ｃｔｒｌ−ｓｉＲＮＡ（黒色ヒストグラム）、またはＲＯＲ１−ｓｉＲＮＡもしくはＲＯＲ２−ｓｉＲＮＡ（灰色ヒストグラム）のどちらかをトランスフェクトした後、抗ＣＤ５−Ａｌｅｘａ−６４７（左パネル）または抗ＲＯＲ２−Ａｌｅｘａ−４８８（右パネル）で染色したＣＬＬ細胞のフローサイトメトリー。白色ヒストグラムはＡｌｅｘａ−４８８標識したイソタイプＣｔｒｌ−ＩｇＧ（イソタイプ）で染色した、対照またはトランスフェクトしたＣＬＬ細胞の蛍光を表す。
【図１１Ａ−１】ＲＯＲ１はＡＲＨＧＥＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２及びＡＲＨＧＥＦ６と相互作用する。図１１Ａ：抗ＲＯＲ１  ｍＡｂ対Ｃｔｒｌ−ＩｇＧのｉｐ後、ＣＬＬ細胞から調製したタンパク質ライゼートから２Ｄ−ｎａｎｏＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより同定したＡＲＨＧＥＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２またはＡＲＨＧＥＦ６のユニークペプチドを示す質量スペクトル。配列説明文：ＫＱＬＬＦＰＡＥＥＤＮＧＡＧＰＰＲＤ（配列番号５）；ＫＡＡＡＱＧＰＥＧＤＩＱＥＱＥＬＱＳＥＥＬＧＬＲＡ（配列番号６）；ＷＱＩＷＥＬＬＳＴＤＮＰＤＡＬＰＥ（配列番号７）。
【図１１Ａ−２】ＲＯＲ１はＡＲＨＧＥＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２及びＡＲＨＧＥＦ６と相互作用する。図１１Ａ：抗ＲＯＲ１  ｍＡｂ対Ｃｔｒｌ−ＩｇＧをｉｐ後ＣＬＬ細胞から調製したタンパク質ライゼートから２Ｄ−ｎａｎｏＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより同定したＡＲＨＧＥＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２またはＡＲＨＧＥＦ６のユニークペプチドを示す質量スペクトル。配列説明文：ＫＱＬＬＦＰＡＥＥＤＮＧＡＧＰＰＲＤ（配列番号５）；ＫＡＡＡＱＧＰＥＧＤＩＱＥＱＥＬＱＳＥＥＬＧＬＲＡ（配列番号６）；ＷＱＩＷＥＬＬＳＴＤＮＰＤＡＬＰＥ（配列番号７）。
【図１１Ａ−３】ＲＯＲ１はＡＲＨＧＥＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２及びＡＲＨＧＥＦ６と相互作用する。図１１Ａ：抗ＲＯＲ１  ｍＡｂ対Ｃｔｒｌ−ＩｇＧをｉｐ後ＣＬＬ細胞から調製したタンパク質ライゼートから２Ｄ−ｎａｎｏＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより同定したＡＲＨＧＥＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２またはＡＲＨＧＥＦ６のユニークペプチドを示す質量スペクトル。配列説明文：ＫＱＬＬＦＰＡＥＥＤＮＧＡＧＰＰＲＤ（配列番号５）；ＫＡＡＡＱＧＰＥＧＤＩＱＥＱＥＬＱＳＥＥＬＧＬＲＡ（配列番号６）；ＷＱＩＷＥＬＬＳＴＤＮＰＤＡＬＰＥ（配列番号７）。
【図１１Ｂ】ＲＯＲ１はＡＲＨＧＥＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２及びＡＲＨＧＥＦ６と相互作用する。図１１Ｂ：各レーンの上に示すように、新鮮分離したＣＬＬ細胞のライゼートを用いて得したｉｐの、ＲＯＲ１、ＡＲＨＧＥＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２またはＡＲＨＧＥＦ６に対して特異的なｍＡｂを用いるイムノブロット分析。イムノブロットを各サブパネルの左欄外に示すようにＲＯＲ１、ＡＲＨＧＥＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２またはＡＲＨＧＥＦ６に対して特異的な抗体を用いてプローブした。
【図１２Ａ−１】ＵＣ−９６１はＡＲＨＧＥＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２またはＡＲＨＧＥＦ６とＲＯＲ１またはＲＯＲ２の共局在化を阻害する。図１２Ａ：血清飢餓ＣＬＬ細胞＋／−Ｗｎｔ５ａ（左欄外に示す）及びＣｔｒｌ−ＩｇＧまたはＵＣ−９６１において共焦点顕微鏡検査により検出されたＲＯＲ１とＡＲＨＧＥＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２またはＡＲＨＧＥＦ６の共局在化（例えば、矢印）（スケールバー：５μｍ）。
【図１２Ａ−２】ＵＣ−９６１はＡＲＨＧＥＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２またはＡＲＨＧＥＦ６とＲＯＲ１またはＲＯＲ２の共局在化を阻害する。図１２Ａ：血清飢餓ＣＬＬ細胞＋／−Ｗｎｔ５ａ（左欄外に示す）及びＣｔｒｌ−ＩｇＧまたはＵＣ−９６１において共焦点顕微鏡検査により検出されたＲＯＲ１とＡＲＨＧＥＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２またはＡＲＨＧＥＦ６の共局在化（例えば、矢印）（スケールバー：５μｍ）。
【図１２Ａ−３】ＵＣ−９６１はＡＲＨＧＥＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２またはＡＲＨＧＥＦ６とＲＯＲ１またはＲＯＲ２の共局在化を阻害する。図１２Ａ：血清飢餓ＣＬＬ細胞＋／−Ｗｎｔ５ａ（左欄外に示す）及びＣｔｒｌ−ＩｇＧまたはＵＣ−９６１において共焦点顕微鏡検査により検出されたＲＯＲ１とＡＲＨＧＥＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２またはＡＲＨＧＥＦ６の共局在化（例えば、矢印）（スケールバー：５μｍ）。
【図１２Ｂ】ＵＣ−９６１はＡＲＨＧＥＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２またはＡＲＨＧＥＦ６とＲＯＲ１またはＲＯＲ２の共局在化を阻害する。図１２Ｂ：各グラフの右下に示すように、ＡＲＨＧＥＦ１（左サブパネル）またはＡＲＨＧＥＦ６（右サブパネル）に対して特異的なｍＡｂを用いる、Ｗｎｔ５ａの存在または不在下で培養したＣＬＬ細胞のライゼートからのｉｐのＲａｃ１（左パネル）またはＲｈｏＡ（右パネル）の継時的（分）インビトロ交換。線はバッファーのみを使用するＧＴＰアーゼ活性化を示す。
【図１２Ｃ】ＵＣ−９６１はＡＲＨＧＥＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２またはＡＲＨＧＥＦ６とＲＯＲ１またはＲＯＲ２の共局在化を阻害する。図１２Ｃ：各レーンの上部に示すように、非特異的Ｃｔｒｌ−ｓｉＲＮＡ、またはＡＲＨＧＥＦ１（ＡＲＨＧＥＦ１−ｓｉＲＮＡ）、ＡＲＨＧＥＦ２（ＡＲＨＧＥＦ２−ｓｉＲＮＡ）またはＡＲＨＧＥＦ６（ＡＲＨＧＥＦ６−ｓｉＲＮＡ）に対して特異的なｓｉＲＮＡを、ＣＬＬ細胞に一時的にトトランスフェクトした。４８時間後、細胞を、ＡＲＨＧＥＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２またはＡＲＨＧＥＦ６の発現についてイムノブロット分析により試験した。各レーンの下の数字はＣｔｒｌ−ｓｉＲＮＡサンプルに対して正規化した各ＧＥＦ対β−アクチンのバンド密度の比である。
【図１２Ｄ】ＵＣ−９６１はＡＲＨＧＥＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２またはＡＲＨＧＥＦ６とＲＯＲ１またはＲＯＲ２の共局在化を阻害する。図１２Ｄ：レーンの上部に示すように、Ｗｎｔ５ａの不在（−）または存在（＋）下で処理した後Ｃｔｒｌ−ｓｉＲＮＡ、ＡＲＨＧＥＦ１−ｓｉＲＮＡまたはＡＲＨＧＥＦ６−ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＣＬＬ細胞における、Ｒａｃ１またはＲｈｏＡの活性化。全細胞ライゼートも全Ｒａｃ１またはＲｈｏＡについてイムノブロット分析により試験した。各レーンの下の数字は未処理のＣｔｒｌ−ｓｉＲＮＡ−トランスフェクトしたサンプルに対して正規化した活性化ＧＴＰアーゼ対全ＧＴＰアーゼのバンド密度の比である。
【図１３Ａ】親ＭＥＣ１細胞、及び各種ＲＯＲ１構築物の各々をトランスフェクトしたＭＥＣ１細胞におけるＲＯＲ１、ＲＯＲ２及びＷｎｔ５ａの発現。図１３Ａ：蛍光色素標識したイソタイプ対照ｍＡｂ（白色ヒストグラム）、４Ａ５−Ａｌｅｘａ−６４７（上の段）または抗ＲＯＲ２−Ａｌｅｘａ−４８８（下の段）（灰色ヒストグラム）で染色したＭＥＣ１細胞、またはＲＯＲ１または末端切断形態のＲＯＲ１をエンコードするベクターでトランスフェクトしたＭＥＣ１細胞の蛍光。
【図１３Ｂ】親ＭＥＣ１細胞、及び各種ＲＯＲ１構築物の各々をトランスフェクトしたＭＥＣ１細胞におけるＲＯＲ１、ＲＯＲ２及びＷｎｔ５ａの発現。図１３Ｂ：Ｗｎｔ５ａの発現を原発性ＣＬＬ細胞またはＭＥＣ１細胞からのライゼートのイムノブロット分析により調べた。組換えＷｎｔ５ａ（１００ｎｇ）をポジティブ対照として使用し、β−アクチンを細胞ライゼートに対するローディング対照として使用した。
【図１４Ａ】ＲＯＲ１または各種の末端切断形態のＲＯＲ１を発現するように作成したＭＥＣ１細胞の共焦点顕微鏡検査。図１４Ａ：図面の各列の右に示すように各種ＲＯＲ１構築物の各々でトランスフェクトしたＭＥＣ１細胞におけるＲＯＲ１とＲＯＲ２の共局在化（例えば、矢印）（スケールバー：２μｍ）。
【図１４Ｂ】ＲＯＲ１または各種の末端切断形態のＲＯＲ１を発現するように作成したＭＥＣ１細胞の共焦点顕微鏡検査。図１４Ｂ：図面の各列の右に示すように各種ＲＯＲ１構築物の各々でトランスフェクトしたＭＥＣ１細胞におけるＲＯＲ１とＡＲＨＧＥＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２またはＡＲＨＧＥＦ６の共局在化（例えば、矢印）（スケールバー：２μｍ）。
【図１４Ｃ】ＲＯＲ１または各種の末端切断形態のＲＯＲ１を発現するように作成したＭＥＣ１細胞の共焦点顕微鏡検査。図１４Ｃ：図面の各列の右に示すように各種ＲＯＲ１構築物の各々でトランスフェクトしたＭＥＣ１細胞におけるＲＯＲ２とＡＲＨＧＥＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２またはＡＲＨＧＥＦ６の共局在化（例えば、矢印）（スケールバー：２μｍ）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
Ｉ．定義
別段の規定がない限り、本明細書中で使用されているすべての技術用語及び科学用語は通常、本発明が属している分野の当業者が一般的に理解しているのと同一の意味を有する。通常、本明細書中で使用されている専門語、並びに以下に記載されている細胞培養、分子遺伝学、有機化学及び核酸化学、及びハイブリダイゼーションにおける実験手法は当該分野で周知であり、一般的に使用されているものである。核酸及びペプチド合成のために標準技術を使用する。技術及び手順は通常当該分野の慣用の方法及び各種一般文献（一般的に、参照により本明細書に組み入れるＳａｍｂｒｏｏｋら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第２版（１９８９），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい）に従って実施され、これらは明細書の至るところに提示されている。
【００１６】
「核酸」は、一本鎖または二本鎖のどちらかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド及びそのポリマー、並びにその相補鎖を指す。用語「ポリヌクレオチド」はヌクレオチドの一次配列を指す。用語「ヌクレオチド」は、典型的にはポリヌクレオチドの単一ユニット、すなわちモノマーを指す。ヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはその修飾バージョンであり得る。本発明において考えられるポリヌクレオチドの例には、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡを含む）、及び一本鎖及び二本鎖のＤＮＡとＲＮＡの混合物を有するハイブリッド分子が含まれる。本明細書中で使用されている核酸は、天然に存在している核酸と同一の基本的化学構造を有する核酸をも指す。これらのアナログは修飾糖及び／または修飾環置換基を有しているが、天然に存在している核酸と同一の基本的化学構造を保持している。核酸模擬体は、核酸の一般的構造とは異なる構造を有するが、天然に存在している核酸と同様に機能する化合物を指す。前記アナログの例には、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド及びペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００１７】
本明細書中で使用されている「合成ｍＲＮＡ」は、標準のオリゴヌクレオチド合成技術またはクローニング技術のような非天然手段を介して誘導される任意のｍＲＮＡを指す。このようなｍＲＮＡには、天然に存在するヌクレオチドの非タンパク質原性の誘導体も含まれ得る。加えて、本発明の「合成ｍＲＮＡ」には、非限定的に原核細胞、真核細胞株及びウイルス方法を含む任意の発現ビヒクルを用いる組換え技術を介して発現されるか、または外因的に発現されるｍＲＮＡも含まれる。「合成ｍＲＮＡ」には、精製されたかまたは他の方法で発現ビヒクルまたは系から得られたｍＲＮＡが含まれる。
【００１８】
単語「相補的」または「相補性」は、ポリヌクレオチド中の核酸が第２ポリヌクレオチド中の別の核酸と塩基対を形成する能力を指す。例えば、配列Ａ−Ｇ−Ｔは配列Ｔ−Ｃ−Ａに対して相補的である。相補性は、核酸の一部のみが塩基対合に従って一致している、すなわち部分的であっても、またはすべての核酸が塩基対合に従って一致している、すなわち完全であってもよい。
【００１９】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれているときには「機能し得る形で連結されている」。例えば、プレ配列または分泌リーダーに対するＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるならば、ポリペプチドに対するＤＮＡに機能し得る形で連結されている；プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に機能し得る形で連結されている；または、リボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されているならば、コード１５配列に機能し得る形で連結されている。通常、「機能し得る形で連結されている」は、連結されるＤＮＡ配列が相互に近くにあり、分泌リーダーの場合には隣接して、リーディング相にあることを意味する。
【００２０】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すように本明細書中に互換可能に使用されており、前記ポリマーはアミノ酸から構成されない部分にコンジュゲートされ得る。用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学模擬体であるアミノ酸ポリマー、並びに天然に存在するアミノ酸ポリマー及び天然に存在しないアミノ酸ポリマーに当てはまる。用語は、大環状ペプチド、非ペプチド官能基で修飾されたペプチド、ペプチド模擬体、ポリアミド及びマクロラクタムに当てはまる。「融合タンパク質」は、１つの部分として組換え発現される２つ以上の別々のタンパク質配列をエンコードするキメラタンパク質を指す。
【００２１】
用語「ペプチジル」及び「ペプチジル部分」は一価ペプチドを意味する。
【００２２】
用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸、並びに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸アナログ及びアミノ酸模擬体を指す。天然に存在するアミノ酸は遺伝コードによりエンコードされるもの、及び後に修飾されるアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシルグルタミン酸及びＯ−ホスホセリンである。アミノ酸アナログは、天然に存在するアミノ酸と同一の基本的化学構造、すなわち水素、カルボキシル基、アミノ基及びＲ基に結合するα炭素を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。このようなアナログは修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または修飾ペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同一の基本的化学構造を保持している。アミノ酸模擬体は、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化合物を指す。用語「天然に存在しないアミノ酸」及び「非天然アミノ酸」は、天然に見られないアミノ酸アナログ、合成アミノ酸及びアミノ酸模擬体を指す。
【００２３】
本明細書中において、アミノ酸は、一般的に公知の三文字略号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生物化学命名法委員会が推奨している一文字略号のどちらかにより表記され得る。ヌクレオチドも同様に、一般的に受け入れられている一文字略号により表記され得る。
【００２４】
「保存的に修飾された変異体」はアミノ酸配列及び核酸配列の両方に当てはまる。具体的な核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体は同一または本質的に同一のアミノ酸配列をエンコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をエンコードしない場合には本質的に同一の配列を指す。遺伝コードの縮重ゆえに、多数の機能的に同一の核酸が、任意の所与のタンパク質をエンコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵはすべてアミノ酸アラニンをエンコードする。よって、アラニンをコドンにより特定しているすべての位置では、コドンはエンコードされるポリペプチドを変更することなしに、上記の対応のコドンのいずれかに変更され得る。このような核酸変異は、保存的に修飾された変異の１種である「サイレント変異」である。本明細書中のポリペプチドをエンコードする核酸配列はすべて、核酸のあらゆる可能なサイレント変異をも記載している。当業者は、核酸中のコドンの各々（通常メチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、及び通常トリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除いて）が、修飾されて機能的に同一の分子を生ずることができることを認識している。従って、発現産物に関して、記載されている配列の各々において、ポリペプチドをエンコードする核酸のサイレント変異の各々が示されているといえるが、実際のプローブ配列に関しては、示されているわけではない。
【００２５】
アミノ酸配列に関して、当業者は、エンコードされる配列中の単一アミノ酸または僅かな％のアミノ酸を変化させる、付加する、または欠失させる、核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加が、その変化が化学的に類似のアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす「保存的に修飾された変異体」であることを見分ける。機能的に類似のアミノ酸を与える保存的置換表は当該分野で周知である。このような保存的に修飾された変異体は、上記に加えて、本発明の多型変異体、種間ホモログ及び対立遺伝子であり、これらを除外しない。
【００２６】
以下の８つのグループの各々は、相互に保存的置換である以下のアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；及び８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照されたい）。ある実施形態では、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、または少なくとも４０個の保存的置換があり得る。ある実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０個の保存的置換があり得る。
【００２７】
「配列同一性のパーセンテージ」は、２つの最適にアラインさせた（ａｌｉｇｎｅｄ）配列を比較ウィンドウで比較することにより調べられ、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の一部は２つの配列の最適アラインメントのために（付加または欠失を含まない）参照配列と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、両配列中で同一の核酸塩基またはアミノ酸残基がある位置の数を調べて一致した位置の数を求め、一致した位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で割り、結果に１００をかけることによって配列同一性のパーセンテージを得ることにより、計算される。
【００２８】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の関係における用語「同一」または「同一性％」は、比較しそして比較ウィンドウまたは指定の領域で最大の対応関係（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ）となるようにアラインさせ、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いるかまたは手動アライメント及び目視検査によって評価した場合に、同一であるか、または同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定パーセンテージを有する（すなわち、例えば本発明の全ポリペプチド配列または本発明のポリペプチドの個々のドメインの特定領域にわたって、６０％同一、場合により６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である）２つ以上の配列またはサブ配列を指す。この場合、そのような配列は「実質的に同一」であると言われる。この定義は被験配列の相補鎖をも指す。場合により、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド長の領域、より好ましくは１００〜５００、または１０００またはそれ以上のヌクレオチド長の領域にわたって存在する。
【００２９】
配列比較のために、典型的には１つの配列を参照配列として用い、これに対して被験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを用いるときには被験配列及び参照配列をコンピューターに入力し、必要ならばサブシーケンス座標を設計し、シーケンスアルゴリズムプログラムパラメーターを設計する。デフォルトプログラムパラメーターを使用してもよく、または代替パラメーターを設計してもよい。その後、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメーターに基づいて参照配列と比較した被験配列の配列同一パーセントを計算する。
【００３０】
本明細書中で使用されている「比較ウィンドウ」は、例えば完全長配列、或いは２０〜６００、約５０〜約２００、または約１００〜約１５０アミノ酸またはヌクレオチドからなる群から選択される、任意の１つの隣接位置数のセグメントに対する言及を含み、この中で２つの配列を最適にアラインさせた後に、配列を同一数の隣接位置の参照配列と比較し得る。比較のための配列のアライメント方法は、当該分野で周知である。比較のための配列の最適アライメントは、例えばＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９７０），Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２ｃのローカルホモロジーアルゴリズムによってか、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３のホモロジーアライメントアルゴリズムによってか、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４の類似性検索方法によってか、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実装（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，ウィスコンシン州マディソン）によってか、または手動アライメント及び目視検査（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５補遺）を参照されたい）によって、実施され得る。
【００３１】
配列同一性及び配列類似性のパーセントを調べるために適したアルゴリズムの例は、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７），Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２及びＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０に記載されているＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを介して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、まずデータベース配列中の同一長さのワードとアラインさせたときに幾つかの正の値の閾値スコアＴと一致するかまたはＴを満たすクエリー配列中の長さＷのショートワードを同定することにより高スコアリング配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは隣接ワードスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，前掲）。これらの初期隣接ワードヒットは、ワードヒットを含有するより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシード（ｓｅｅｄ）として働く。ワードヒットは累積アライメントスコアが増加し得る限り各配列に沿って両方向に延びる。累積スコアは、ヌクレオチド配列の場合にはパラメーターＭ（マッチング残基の対に対するリワードスコア；常に＞０）及びＮ（ミスマッチング残基に対するペナルティースコア；常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列の場合、累積スコアを計算するためにスコアリングマトリックスを使用する。累積アライメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ落ちたとき、累積スコアが１つ以上のネガティブスコアリング残基アライメントの蓄積のために０またはそれ以下になったとき、またはいずれかの配列の末端に達したときに、ワードヒットの各方向への延長は停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ及びＸはアライメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に対して）はデフォルトとして１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、及び５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５を参照されたい）アライメント（Ｂ）、１０の期待値、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖の比較を用いる。
【００３２】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２つの配列間の類似性の統計分析をも実施する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５７８７を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより与えられる類似性の１つの尺度は、２つのヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間の一致が偶然に生ずる可能性の指標を与える最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、被験核酸の参照核酸に対する比較における最小合計確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満ならば、核酸は参照配列に類似しているとみなされる。
【００３３】
２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるという表示は、第１核酸によりエンコードされるポリペプチドは以下に記載する第２核酸によりエンコードされるポリペプチドに対する抗体と免疫学的に交差反応性であることである。例えば２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なっている場合には、ポリペプチドは典型的には第２ポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であるという別の表示は、２つの分子またはその相補鎖が以下に記載するストリンジェントな条件下で相互にハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であるというさらに別の表示は、配列を増幅させるために同一のプライマーを使用し得ることである。
【００３４】
アミノ酸またはヌクレオチド塩基「位置」は、Ｎ末端（すなわち、５’末端）に対する位置に基づいて参照配列中の各アミノ酸（または、ヌクレオチド塩基）を順次同定する数により示す。最適アライメントを調べるときに考慮されなければならない欠失、挿入、末端切断、融合等のために、単にＮ末端からカウントすることにより決められる被験配列中のアミノ酸残基の数は、通常、参照配列中の対応する位置の数と必ずしも同一でない。例えば、変異体がアラインさせた参照配列と比較して欠失を有している場合、変異体には参照配列中の欠失部位の位置に対応するアミノ酸がない。アラインさせた参照配列中に挿入がある場合、その挿入は参照配列中のナンバリングしたアミノ酸位置に対応しない。末端切断または融合の場合、参照配列またはアラインさせた配列のいずれかにおいて、対応配列中のいずれかのアミノ酸に対応しないアミノ酸のストレッチが存在し得る。
【００３５】
所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列のナンバリングの関係で使用するとき、用語「参照してナンバリングする」または「対応する」は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列を参照配列と比較するときの特定参照配列の残基のナンバリングを指す。ある実施形態では、参照配列に対する比較は所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列と参照配列との間の配列アライメントである。
【００３６】
例えば細胞、核酸またはタンパク質を参照して使用されているとき、用語「組換え」は、細胞、核酸またはタンパク質を異種核酸またはタンパク質の導入、または天然核酸またはタンパク質の改変により修飾されていること、または細胞が上記のように修飾された細胞に由来していることを示す。よって、例えば組換え細胞は、天然（非組み換え）形態の細胞内に見られない遺伝子を発現し、または天然形態の細胞中に見られるものから修飾させた遺伝子（例えば、天然のトランスポータータンパク質、例えば本明細書中に記載されているトランスポーターモチーフ配列における変異をエンコードする遺伝子または非天然トランスポータータンパク質エンコードする遺伝子）を発現する。例えば、組換えタンパク質は、（例えば、組換えタンパク質をエンコードする）異種核酸を導入することにより修飾された細胞または生物により発現されるタンパク質であり得る。
【００３７】
ＤＮＡ核酸配列（例えば、遺伝子）に関連して本明細書中で使用されている言葉「発現」または「発現された」は、該配列の転写産物及び／または翻訳産物を意味する。細胞中のＤＮＡ分子の発現レベルは、細胞内に存在する対応ｍＲＮＡの量、または細胞によって産生されるＤＮＡによりエンコードされるタンパク質の量のどちらかに基づいて測定され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１８．１−１８．８８）。
【００３８】
用語「遺伝子」は、タンパク質の産生に関与するＤＮＡのセグメントを意味する。遺伝子はコード領域の前及び後の領域（リーダー及びトレーラー）、及び個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含む。リーダー、トレーラー及びイントロンは、遺伝子の転写及び翻訳の間に必要な調節エレメントを含む。更に、「タンパク質遺伝子産物」は特定遺伝子から発現したタンパク質である。
【００３９】
用語「単離した」は、核酸、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、または通常結合している成分（他のタンパク質、核酸、細胞等）から部分的または完全に分離した他の成分を指す。ある実施形態では、単離したポリペプチドまたはタンパク質は組換えポリペプチドまたはタンパク質である。
【００４０】
「細胞培養物」は、生物の外側に存在する細胞のインビトロ集団である。細胞培養物は、細胞バンクまたは動物から単離した初代細胞、またはこれらのソースの１つから誘導し、長期間のインビトロ培養のために不死化した二次細胞から樹立され得る。
【００４１】
本明細書中で使用されている「細胞」は、そのゲノムＤＮＡを保存または複製するのに十分な代謝または他の機能を実施する細胞を指す。細胞は当該分野で周知の方法により同定され得、これらの方法には、例えば、インタクトな膜の存在、特定染料による染色、子孫細胞を産生する能力、または配偶子の場合は第２配偶子と結びついて生存能力のある子孫を生み出す能力が含まれる。細胞には原核細胞及び真核細胞が含まれ得る。原核細胞には細菌が含まれるが、これに限定されない。真核細胞には酵母細胞、及び植物及び動物に由来する細胞、例えば哺乳動物細胞、昆虫（例えば、スポドプテラ）細胞及びヒト細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【００４２】
用語「トランスフェクション」、「形質導入」、「トランスフェクトする」、または「形質導入する」は互換可能に使用され得、核酸分子及び／またはタンパク質を細胞に導入するプロセスとして定義される。核酸は非ウイルスベースまたはウイルスベースの方法を用いて細胞に導入され得る。核酸分子は完全タンパク質またはその機能性部分をエンコードする配列であり得る。典型的には、核酸ベクターはタンパク質発現のために必要なエレメント（例えば、プロモーター、転写開始部位等）を含む。トランスフェクションの非ウイルス方法には、核酸分子を細胞に導入するための送達システムとしてウイルスＤＮＡまたはウイルス粒子を使用しない任意の適切な方法が含まれる。代表的な非ウイルストランスフェクション方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポソームトランスフェクション、ヌクレオフェクション、ソノポレーション、ヒートショックを用いるトランスフェクション、マグネトフェクョン（ｍａｇｎｅｔｉｆｅｃｔｉｏｎ）及びエレクトロポレーションが含まれる。ウイルスベースの方法の場合、任意の有用なウイルスベクターが本明細書中に記載されている方法において使用され得る。ウイルスベクターの例には、レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス及びアデノ随伴ウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。幾つかの態様において、核酸分子はレトロウイルスベクターを用いて当該分野で周知の標準手順に従って細胞に導入される。用語「トランスフェクション」または「形質導入」は、タンパク質を外部環境由来の細胞に導入することも指す。典型的には、タンパク質の形質導入またはトランスフェクションは、細胞膜を横切ることができるペプチドまたはタンパク質を目的のタンパク質に付着させることに頼っている。例えば、Ｆｏｒｄら（２００１），Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，８：１−４及びＰｒｏｃｈｉａｎｔｚ（２００７），Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，４：１１９−２０を参照されたい。
【００４３】
用語「プラスミド」は、遺伝子の発現のために必要な遺伝子及び／または調節エレメントをエンコードする核酸分子を指す。プラスミド由来の遺伝子の発現はシスまたはトランスで起こり得る。遺伝子がシスで発現するならば、遺伝子及び調節エレメントは同一プラスミドによりエンコードされる。トランスでの発現は、遺伝子及び調節エレメントが別のプラスミドによりエンコードされる場合を指す。
【００４４】
用語「エピソーム（ｅｐｉｓｏｍａｌ）」は、細胞中のプラスミドの染色体外状態を指す。エピソームプラスミドは染色体ＤＮＡの一部ではなく、自立して複製する核酸分子である。
【００４５】
用語「外因性」は所与の細胞または生物の外側から派生する分子または物質（例えば、核酸またはタンパク質）を指す。逆に、用語「内因性」は、所与の細胞または生物に生得の、またはこれらの中に起源をもつ分子または物質を指す。
【００４６】
「ベクター」は別の核酸を細胞に輸送することができる核酸である。ベクターは、適切な環境中に存在するときにベクターより運ばれる１つ以上の遺伝子によりエンコードされる１つ以上のタンパク質の発現を指向することができる。
【００４７】
本明細書中で使用されている用語「特異的結合」または「特異的に結合する」は、２つの分子が生理的な条件下で比較的安定な複合体（例えば、ＲＯＲ１及びＲＯＲ２タンパク質を含むタンパク質複合体、または抗体に結合したＲＯＲ１及び／またはＲＯＲ２タンパク質を含むタンパク質複合体）を形成することを指す。
【００４８】
リガンド（例えば、抗体）がタンパク質（抗原）に結合するかどうか、及び／またはタンパク質に対するリガンドのアフィニティーを調べる方法は当該分野で周知である。例えば、リガンドのタンパク質への結合は各種技術を用いて検出及び／または定量され得る。前記技術には、ウェスタンブロット、ドットブロット、表面プラズモン共鳴方法（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ，スウェーデン国ウプサラ，及びニュージャージー州ピスカタウェイ）、バイオレイヤー干渉（ＢＬＩ）技術（例えば、Ｏｃｔｅｔ  ｓｙｓｔｅｍ；Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ，カリフォルニア州メンローパーク，ＣＡ）、等温滴定型熱量測定法（ＩＴＣ）、または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００４９】
リガンドの免疫特異性結合及び交差反応性を分析するために使用され得るイムノアッセイには、ウェスタンブロット、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、相補鎖結合アッセイ、免疫放射アッセイ及び蛍光イムノアッセイのような技術を用いる競合及び非競合アッセイシステムが含まれるが、これらに限定されない。
【００５０】
「標識」または「検出可能部分」は、分光、光化学、生化学、免疫化学、化学または他の物理的手段により検出可能な組成物である。例えば、有用な標識には、３２Ｐ、蛍光染料、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて慣用されているような酵素）、ビオチン、ジゴキシゲニンまたはハプテン、及びタンパク質（例えば、抗体）、または例えば放射標識をペプチドに取り込むことにより、または蛍光体を標的ペプチドと特異的に反応する抗体に共有結合させることにより検出可能となり得る他の物質が含まれる。抗体を標識にコンジュゲートするための当該分野で公知の任意の適当な方法は、例えばＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｉｎｉｑｕｅｓ  １９９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．，サンジェゴに記載されている方法を用いて使用され得る。
【００５１】
「標識したタンパク質またはポリペプチド」は、標識したタンパク質またはポリペプチドに結合した標識の存在を検出することにより標識したタンパク質またはポリペプチドの存在が検出され得るように、標識に対してリンカーまたは化学結合を介して共有結合されるか、またはイオン結合、ファンデルワールス結合、静電結合または水素結合を介して非共有結合されるかのどちらかである、タンパク質またはポリペプチドである。或いは、高アフィニティー相互作用を用いる方法は、同じ結果を達成し得るものであり、ここでは、結合パートナー対（例えばビオチン、ストレプトアビジン）の１方が他方に結合する。
【００５２】
「対照」サンプルまたは値は、被験サンプルと比較するための参照、通常は既知の参照として役立つサンプルを指す。例えば、被験サンプルを、試験条件下、例えば被験化合物の存在下で採取し、既知の条件下、例えば被験化合物の不在下（ネガティブ対照）または既知の化合物の存在下（ポジティブ対照）で得たサンプルと比較する。対照は、多数の試験または結果から集めた平均値を表してもよい。当業者は、任意の数のパラメーターを評価するために、対照が設計され得ることを認識している。例えば、対照は、薬理学的データ（例えば、半減期）または治療尺度（例えば、副作用の比較）に基づいて治療利益を比較するために考案されてもよい。当業者は、どの標準対照が所与の状況で最も適切であり、標準対照値との比較に基づいてデータを分析することができることを理解している。標準対照はデータの有意性（例えば、統計的有意性）を調べるためにも貴重であり得る。例えば、所与のパラメーターの値が標準対照中で広く異なるならば、被験サンプル中の変動は有意とみなされない。
【００５３】
用語「インヒビター」、「リプレッサー」、「アンタゴニスト」、または「ダウンレギュレーター」は互換可能に、所与の遺伝子またはタンパク質の発現または活性を検出可能に低下させることができる物質を指す。アンタゴニストは、アンタゴニストの不在下での対照と比較して発現または活性を１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上低下させ得、或いはアンタゴニストは、アンタゴニストの不在下での対照と比較して発現または活性を、上記したパーセンテージの任意の２つにより規定される範囲内の量で低下させ得る。ある例では、発現または活性は、アンタゴニストの不在下での発現または活性の１／１．５、１／２、１／３、１／４、１／５、または１／１０の低さであり、或いは発現または活性は、アンタゴニストの不在下での発現または活性より、上記した値の任意の２つにより規定される範囲内で低下する。
【００５４】
タンパク質−インヒビター（例えば、本明細書中に記載されている被験物質）相互作用に関連して本明細書中で規定されている用語「阻害」、「阻害する」、「阻害している」等は、インヒビター（例えば、被験物質）の不在下でのタンパク質の活性または機能と比較してタンパク質の活性または機能に悪影響を与える（例えば、低下させる）（例えば、例えばＲＯＲ１及びＲＯＲ２を含むタンパク質複合体中のＲＯＲ１のＲＯＲ２への結合、またはその逆を低下させること）ことを意味する。ある実施形態では、阻害は疾患または疾患の症状を軽減させることを指す。よって、阻害には、刺激の少なくとも一部を部分的にまたは全体的にブロックすること、活性化を低下、防止または遅延させること、またはシグナル伝達または酵素活性、またはタンパク質の量の不活性化、減感またはダウンレギュレーションを含む。同様に、「インヒビター」は、例えば酵素活性（例えば、ＲＯＲ１またはＲＯＲ２触媒活性）を結合する、部分的または完全にブロックする、低下させる、防止する、遅延させる、不活性化する、減感させる、またはダウンレギュレートすることによりＲＯＲ１またはＲＯＲ２活性を阻害する化合物またはタンパク質である。
【００５５】
本明細書中で使用されている用語「小分子」は５００ダルトン以下であるが、１ダルトン以上の分子量を有する化合物を指す。小分子は生物学的起源を有し得るが、小分子は典型的には非生理的である。
【００５６】
抗体は、複雑な内部構造を有する大きな複合体分子（分子量約１５０，０００、または約１３２０アミノ酸）である。自然抗体分子はポリペプチド鎖の２つの同一の対を含有し、各対は１つの軽鎖及び１つの重鎖を有する。軽鎖及び重鎖の各々は２つの領域、すなわち標的抗原の結合に関与する可変（“Ｖ”）領域、及び免疫系の他の成分と相互作用する定常（“Ｃ”）領域から構成される。軽鎖及び重鎖可変領域は三次元空間において一緒になって、抗原（例えば、細胞の表面上の受容体）に結合する可変領域を形成する。軽鎖または重鎖可変領域の各々内に、相補性決定領域（“ＣＤＲ”）と称される３つの短セグメント（平均１０アミノ酸長）がある。抗体可変ドメイン中の６個のＣＤＲ（軽鎖由来の３個及び重鎖由来の３個）は三次元空間において一緒に折りたたまれて、標的抗原上にドッキングする実際の抗体結合部位を形成する。ＣＤＲの位置及び長さは、Ｋａｂａｔ，Ｅ．ら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，米国保健福祉省，１９８３，１９８７により正確に規定されている。ＣＤＲ中に含まれない可変領域の部分はフレームワーク（“ＦＲ”）と称され、ＣＤＲに対する環境を形成する。
【００５７】
本明細書中で使用されている用語「相補性決定領域」及び「ＣＤＲ」は主に抗原結合に関与する領域を指す。軽鎖可変領域中には３個のＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３）、重鎖可変領域中には３個のＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３）がある。ある実施形態では、６個のＣＤＲを形成する残基は軽鎖可変領域中の残基２４−３４（ＣＤＲＬ１）、５０−５６（ＣＤＲＬ２）及び８９−９７（ＣＤＲＬ３）、及び重鎖可変領域中の３１−３５（ＣＤＲＨ１）、５０−６５（ＣＤＲＨ２）及び９５−１０２（ＣＤＲＨ３）である。Ｋａｂａｔら（１９９１），Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，メリーランド州ベセスダ（参照により本明細書に組み入れられる）。ある実施形態では、６個のＣＤＲを形成する残基は軽鎖可変領域中の残基２６−３２（ＣＤＲＬ１）、５０−５２（ＣＤＲＬ２）及び９１−９６（ＣＤＲＬ３）、及び重鎖可変領域中の２６−３２（ＣＤＲＨ１）、５３−５５（ＣＤＲＨ２）及び９６−１０１（ＣＤＲＨ３）である。Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ（１９８７），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（参照により本明細書に組み入れられる）。特定されていない限り、本明細書中で使用されているＣＤＲ残基のナンバリングはＫａｂａｔに従う。
【００５８】
従って、用語「抗体」は、当該分野で周知の意味に従って使用される。抗体は、例えばインタクト免疫グロブリンとして、または各種ペプチダーゼを用いる消化により生ずる多数の十分に特徴づけられた断片として存在する。よって、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域中のジスルフィド結合の下の抗体を消化して、Ｆ（ａｂ）’２を産生する。Ｆ（ａｂ）’２は、Ｆａｂのダイマーであり、Ｆａｂは、それ自体が軽鎖であり、ジスルフィド結合によりＶＨ−ＣＨ１に連結されている。Ｆ（ａｂ）’２は、温和な条件下で還元されて、ヒンジ領域中のジスルフィド結合が分解されることにより、Ｆ（ａｂ）’２ダイマーからＦａｂ’モノマーに変換され得る。Ｆａｂ’モノマーは、ヒンジ領域の一部を有し、本質的にはＦａｂである（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ編、第３版，１９９３を参照されたい）。各種抗体断片がインタクト抗体の消化の点で規定されるが、当業者はこのような断片が化学的に、または組換えＤＮＡ方法によりデノボ合成され得ることを認識している。よって、本明細書中で使用されている用語「抗体」には、抗体断片も含まれ、これは、完全抗体の修飾により産生される抗体断片であっても、または組換えＤＮＡ方法を用いてデノボ合成される（例えば、単鎖Ｆｖ）かもしくはファージディスプレイライブラリーを用いて同定される（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４（１９９０）を参照されたい）抗体断片であってもよい。本明細書中で使用されている用語「抗体断片」は抗体の一部を指す。抗体断片の例には、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片、及び抗体断片から形成される多特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。ある実施形態では、抗体断片は重鎖及び／または軽鎖可変領域の少なくとも一部を保持している。
【００５９】
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を作成するために、当該分野で公知の任意の技術が使用され得る（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７（１９７５）；Ｋｏｚｂｏｒら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，４：７２（１９８３）；Ｃｏｌｅら，ｐ．７７−９６，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９８５）を参照されたい）。「モノクローナル」抗体（ｍＡｂ）は単一クローンに由来する抗体を指す。単鎖抗体を作成するための技術（米国特許Ｎｏ．４，９４６，７７８）は、抗体を作成するために、本明細書中に開示されているポリペプチドに適応され得る。更に、ファージディスプレイ技術が、選択された抗原に特異的に結合する抗体及びヘテロマーＦａｂ断片を同定するために使用され得る。
【００６０】
ヒト化抗体は、マウス抗体（ラット、ハムスター、または他の非ヒト種でもあり得る「ドナー抗体」）由来の少なくとも１個のＣＤＲ（または、その機能的断片）をヒト抗体（「アクセプター抗体」）に移植した遺伝子改変抗体である。ある実施形態では、１個より多くのマウスＣＤＲを移植する（例えば、６個すべてのマウスＣＤＲを移植する）。アクセプター抗体の配列は、例えば成熟ヒト抗体配列（または、その断片）、ヒト抗体配列のコンセンサス配列（または、その断片）、または生殖細胞系領域配列（または、その断片）であり得る。よって、ヒト化抗体はドナー抗体由来の１個以上のＣＤＲ及び可変領域フレームワーク（ＦＲ）を有する抗体であり得る。加えて、高い結合アファニティーを保持するために、ヒトアクセプター配列中のアミノ酸はドナー配列由来の対応するアミノ酸により置換され得、例えば（１）アミノ酸はＣＤＲ中にあり、（２）アミノ酸はヒトフレームワーク領域中にある（例えば、アミノ酸はＣＤＲの１個に直接隣接している）。ヒト化抗体を構築するための詳細な説明を与える米国特許Ｎｏ．５，５３０，１０１及び５，５８５，０８９を参照されたい。これらは参照により本明細書に組み入れられる。ヒト化抗体はしばしばマウス抗体由来の６個すべてのＣＤＲを組み込む（例えば、Ｋａｂａｔが定義している通りであるが、しばしばＣｈｏｔｈｉａが定義している超可変ループＨ１をも含む）が、これらはより少ないマウスＣＤＲ及び／または完全ではないマウスＣＤＲ配列（例えば、ＣＤＲの機能的断片）を用いて作成されてもよい（例えば、Ｐａｓｃａｌｉｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６９：３０７６，２００２；Ｖａｊｄｏｓら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３２０：４１５−４２８，２００２；Ｉｗａｈａｓｈｉら，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３６：１０７９−１０９１，１９９９；Ｔａｍｕｒａら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６４：１４３２−１４４１，２０００）。
【００６１】
典型的には、本明細書中に記載されているヒト化抗体は、（ｉ）マウス抗体由来の少なくとも１個のＣＤＲ（本明細書中にてマウスＣＤＲとも称される）（しばしば、３個のＣＤＲ）及びヒト可変領域フレームワークを含む軽鎖；及び（ｉｉ）マウス抗体由来の少なくとも１個のＣＤＲ（しばしば、３個のＣＤＲ）及びヒト可変領域フレームワーク（ＦＲ）を含む重鎖を含み得る。軽鎖及び重鎖可変領域フレームワーク（ＦＲ）は各々、成熟ヒト抗体可変領域フレームワーク配列（または、その断片）、生殖細胞系可変領域フレームワーク配列（Ｊ領域配列と組み合わされる）（または、その断片）、またはヒト抗体可変領域フレームワーク配列のコンセンサス配列（または、その断片）であり得る。
【００６２】
キメラ抗体は、マウス（または、他の齧歯類）抗体の可変領域がヒト抗体の定常領域と組み合わされている抗体である；遺伝子工学を用いるその構築は周知である。この抗体はマウス抗体の結合特異性を保持しているが、ヒトのほぼ３分の２である。マウス抗体、キメラ抗体及びヒト化抗体中に存在する非ヒト配列の比率から、キメラ抗体の免疫原性はマウス抗体とヒト化抗体との中間であると示唆される。マウス抗体と比較して低い免疫原性を有し得る他のタイプの遺伝子改変抗体には、ファージディスプレイ方法（いずれも参照により本明細書に組み入れられるＤｏｗｅｒら，ＷＯ９１／１７２７１；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，ＷＯ９２／００１０４７；Ｗｉｎｔｅｒ，ＷＯ９２／２０７９１；及びＷｉｎｔｅｒ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２３：９２，１９９８）を用いて、またはトランスジェニック動物（いずれも参照により本明細書に組み入れられるＬｏｎｂｅｒｇら，ＷＯ９３／１２２２７；Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ，ＷＯ９１／１０７４１）を用いて作成されるヒト抗体が含まれる。
【００６３】
上記の米国特許Ｎｏ．５，５３０，１０１及び５，５８５，０８９に記載されている方法と同じ結果を得るために、ヒト化抗体を設計するための他の方法、例えば「スーパーヒト化（ｓｕｐｅｒｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）」（Ｔａｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６９：１１１９，２００２及び米国特許Ｎｏ．６，８８１，５５７を参照されたい）、またはＳｔｕｄｎｉｃａｋら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，７：８０５，１９９４の方法も使用され得る。更に、遺伝子改変した低い免疫原性ｍＡｂを作成するための他の方法には、例えばＶａｓｗａｍｉら，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１：１０５，１９９８；Ｒｏｇｕｓｋａら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，９：８９５，１９９６；及び米国特許Ｎｏｓ．６，０７２，０３５及び５，６３９，６４１；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，２００９；５２５：４０５−２３，Ｄｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｊｏｎｅｓ  ＴＤ１，Ｃｒｏｍｐｔｏｎ  ＬＪ，Ｃａｒｒ  ＦＪ，Ｂａｋｅｒ  ＭＰに記載されている「再形成（ｒｅｓｈａｐｉｎｇ）」、「ハイパーキメラ化（ｈｙｐｅｒｃｈｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）」、及び化粧張り／再舗装（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ／ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）が含まれる。
【００６４】
ｍＡｂのエピトープはその抗原にｍＡｂが結合する領域である。各々が抗原に対する他の結合を競合的に阻害（ブロック）するならば、２つの抗体は同一のエピトープまたは重複するエピトープに結合する。すなわち、１×、５×、１０×、２０×または１００×過剰の１つの抗体、或いは上記した量の任意の２つで規定される範囲内の量の一方の抗体は、競合結合アッセイ（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５０：１４９５，１９９０を参照されたい）で測定して、他方の抗体の結合を少なくとも３０％、好ましくは５０％、７５％、９０％または９９％、または上記した値の任意の２つで規定される範囲内で阻害する。或いは、一方の抗体の結合を低下または排除する抗原中の本質的にすべてのアミノ酸変異が他方の抗体の結合を低下または排除するならば、２つの抗体は同一のエピトープを有する。一方の抗体の結合を低下または排除する幾つかのアミノ酸変異が他方の抗体の結合を低下または排除するならば、２つの抗体は重複するエピトープを有する。
【００６５】
本明細書中で言及されている「ＲＯＲ１タンパク質」には、神経栄養性チロシンキナーゼ受容体関連１（ＮＴＲＫＲ１）としても公知のチロシン−タンパク質キナーゼ貫膜受容体（ＲＯＲ１）の組換え形態または天然に存在する形態、またはＲＯＲ１キナーゼ活性（例えば、ＲＯＲ１と比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の活性、または上記した値の任意の２つにより規定される範囲内の活性）を維持しているその変異体またはホモログのいずれかが含まれる。幾つかの態様において、変異体またはホモログは、全配列または配列の一部（例えば、５０、１００、１５０または２００の連続したアミノ酸部分、または上記した長さの任意の２つにより規定される範囲内）にわたって天然に存在するＲＯＲタンパク質と比較して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性、または上記した値の任意の２つにより規定される範囲内の同一性を有する。ある実施形態では、ＲＯＲ１タンパク質はＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ０１９７３（配列番号８）により同定されるタンパク質と実質的に同一であるか、またはこれに対して実質的な同一性を有する変異体またはホモログである。ある実施形態では、ＲＯＲ１タンパク質はＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ９Ｚ１３９（配列番号９）により同定されるタンパク質と実質的に同一であるか、またはこれに対して実質的な同一性を有する変異体またはホモログである。
【００６６】
本明細書中で言及されている「ＲＯＲ２タンパク質」には、神経栄養性チロシンキナーゼ受容体関連１（ＮＴＲＫＲ２）としても公知のチロシン−タンパク質キナーゼ貫膜受容体（ＲＯＲ２）の組換え形態または天然に存在する形態、またはＲＯＲ２キナーゼ活性（例えば、ＲＯＲ２と比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の活性、または上記した値の任意の２つにより規定される範囲内の活性）を維持しているその変異体またはホモログのいずれかが含まれる。幾つかの態様において、変異体またはホモログは、全配列または配列の一部（例えば、５０、１００、１５０または２００の連続したアミノ酸部分、または上記した長さの任意の２つにより規定される範囲内）にわたって天然に存在するＲＯＲ２タンパク質と比較して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性、または上記した値の任意の２つにより規定される範囲内の同一性を有する。ある実施形態では、ＲＯＲ２タンパク質はＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ０１９７４（配列番号１０）により同定されるタンパク質と実質的に同一であるか、またはこれに対して実質的な同一性を有する変異体またはホモログである。ある実施形態では、ＲＯＲ２タンパク質はＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ９Ｚ１３８（配列番号１１）により同定されるタンパク質と実質的に同一であるか、またはこれに対して実質的な同一性を有する変異体またはホモログである。
【００６７】
用語「ｓｉＲＮＡ」、「低分子干渉ＲＮＡ」等は、通常のかつ慣用的な意味で、典型的には２０〜２５塩基対の長さを有し、相補性ヌクレオチド配列を有する特定遺伝子の発現を干渉することによりＲＮＡ干渉経路内で働くＲＮＡ分子を指す。いかなる理論にも束縛されるつもりはないが、ｓｉＲＮＡは転写後のｍＲＮＡの分解を助けることにより、他の方法で発現される転写物が除去されると考えられる。用語「ｓｉＲＮＡがＲＯＲ１またはＲＯＲ２に対して特異的である」は、ｓｉＲＮＡが発現系、例えば細胞において接触するとＲＯＲ１またはＲＯＲ２の発現を低下または防止することを意味する。
【００６８】
本明細書中で言及されている「Ｗｎｔ５ａタンパク質」には、ｗｉｎｇｌｅｓｓ型ＭＭＴＶ組込部位ファミリーのメンバー５ａ（Ｗｎｔ５ａ）の組換え形態もしくは天然に存在する形態、またはＷｎｔ５ａ活性（例えば、Ｗｎｔ５ａと比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の活性、またはＷｎｔ５ａと比較して上記した値の任意の２つにより規定される範囲内の活性）を維持しているその変異体またはホモログのいずれかが含まれる。幾つかの態様において、変異体またはホモログは、全配列または配列の一部（例えば、５０、１００、１５０または２００の連続したアミノ酸部分、または上記した長さの任意の２つにより規定される範囲内）にわたって天然に存在するＷｎｔ５ａタンパク質と比較して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性、または上記した値の任意の２つにより規定される範囲内の同一性を有する。ある実施形態では、Ｗｎｔ５ａタンパク質はＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｐ４１２２１（配列番号１２）により同定されるタンパク質と実質的に同一であるか、またはこれに対して実質的な同一性を有する変異体またはホモログである。ある実施形態では、Ｗｎｔ５ａタンパク質はＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｐ２２７２５（配列番号１３）により同定されるタンパク質と実質的に同一であるか、またはこれに対して実質的な同一性を有する変異体またはホモログである。
【００６９】
本明細書中で言及されている「ＲｈｏＡタンパク質」または「ＲｈｏＡ」には、Ｒａｓホモログ遺伝子ファミリーメンバーＡ（ＲｈｏＡ）の組換え形態または天然に存在する形態、またはＲｈｏＡ  ＧＴＰアーゼ（グアノシントリホスファターゼ）活性（例えば、ＲｈｏＡと比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の活性、または上記した値の任意の２つにより規定される範囲内の活性）を維持しているその変異体またはホモログのいずれかが含まれる。幾つかの態様において、変異体またはホモログは、全配列または配列の一部（例えば、５０、１００、１５０または２００の連続したアミノ酸部分、または上記した長さの任意の２つにより規定される範囲内）にわたって天然に存在するＲｈｏＡタンパク質と比較して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性、または上記した値の任意の２つにより規定される範囲内の同一性を有する。ある実施形態では、ＲｈｏＡタンパク質はＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｐ６１５８６（配列番号１４）により同定されるタンパク質と実質的に同一であるか、またはこれに対して実質的な同一性を有する変異体またはホモログである。ある実施形態では、ＲｈｏＡタンパク質はＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ９ＱＵＩ０（配列番号１５）により同定されるタンパク質と実質的に同一であるか、またはこれに対して実質的な同一性を有する変異体またはホモログである。
【００７０】
本明細書中で言及されている「Ｒａｃ１タンパク質」または「Ｒａｃ１」には、Ｒａｓ関連Ｃ３ボツリヌストキシン基質１（Ｒａｃ１）の組換え形態または天然に存在する形態、またはＲａｃ１  ＧＴＰアーゼ（グアノシントリホスファターゼ）活性（例えば、Ｒａｃ１と比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の活性、または上記した値の任意の２つにより規定される範囲内の活性）を維持しているその変異体またはホモログのいずれかが含まれる。幾つかの態様において、変異体またはホモログは、全配列または配列の一部（例えば、５０、１００、１５０または２００の連続したアミノ酸部分、または上記した値の任意の２つにより規定される長さの範囲内）にわたって天然に存在するＲａｃ１タンパク質と比較して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性、または上記した値の任意の２つにより規定される範囲内の同一性を有する。ある実施形態では、Ｒａｃ１タンパク質はＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｐ６３０００（配列番号１６）により同定されるタンパク質と実質的に同一であるか、またはこれに対して実質的な同一性を有する変異体またはホモログである。ある実施形態では、Ｒａｃ１タンパク質はＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｐ６３００１（配列番号１７）により同定されるタンパク質と実質的に同一であるか、またはこれに対して実質的な同一性を有する変異体またはホモログである。
【００７１】
本明細書中で言及されている「ＡＲＨＧＥＦ１タンパク質」または「ＡＲＨＧＥＦ１」には、Ｒｈｏグアニンヌクレオチド交換因子１（ＡＲＨＧＥＦ１）の組換え形態または天然に存在する形態、またはＡＲＨＧＥＦ１活性（例えば、ＡＲＨＧＥＦ１と比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の活性、または上記した値の任意の２つにより規定される範囲内の活性）を維持しているその変異体またはホモログのいずれかが含まれる。幾つかの態様において、変異体またはホモログは、全配列または配列の一部（例えば、５０、１００、１５０または２００の連続したアミノ酸部分、または上記した値の任意の２つにより規定される長さの範囲内）にわたって天然に存在するＡＲＨＧＥＦ１タンパク質と比較して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性、または上記した値の任意の２つにより規定される範囲内の同一性を有する。ある実施形態では、ＡＲＨＧＥＦ１タンパク質はＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ９２８８８（配列番号１８）により同定されるタンパク質と実質的に同一であるか、またはこれに対して実質的な同一性を有する変異体またはホモログである。ある実施形態では、ＡＲＨＧＥＦ１タンパク質はＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ６１２１０（配列番号１９）により同定されるタンパク質と実質的に同一であるか、またはこれに対して実質的な同一性を有する変異体またはホモログである。
【００７２】
本明細書中で言及されている「ＡＲＨＧＥＦ２タンパク質」または「ＡＲＨＧＥＦ２」には、Ｒｈｏグアニンヌクレオチド交換因子２（ＡＲＨＧＥＦ２）の組換え形態または天然に存在する形態、またはＡＲＨＧＥＦ２活性（例えば、ＡＲＨＧＥＦ２と比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の活性、または上記した値の任意の２つにより規定される範囲内の活性）を維持しているその変異体またはホモログのいずれかが含まれる。幾つかの態様において、変異体またはホモログは、全配列または配列の一部（例えば、５０、１００、１５０または２００の連続したアミノ酸部分、または上記した値の任意の２つにより規定される長さの範囲内）にわたって天然に存在するＡＲＨＧＥＦ２タンパク質と比較して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性、または上記した値の任意の２つにより規定される範囲内の同一性を有する。ある実施形態では、ＡＲＨＧＥＦ２タンパク質はＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ９２９７４（配列番号２０）により同定されるタンパク質と実質的に同一であるか、またはこれに対して実質的な同一性を有する変異体またはホモログである。ある実施形態では、ＡＲＨＧＥＦ２タンパク質はＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ６０８７５（配列番号２１）により同定されるタンパク質と実質的に同一であるか、またはこれに対して実質的な同一性を有する変異体またはホモログである。
【００７３】
本明細書中で言及されている「ＡＲＨＧＥＦ６タンパク質」または「ＡＲＨＧＥＦ６」には、Ｒｈｏグアニンヌクレオチド交換因子６（ＡＲＨＧＥＦ６）の組換え形態または天然に存在する形態、またはＡＲＨＧＥＦ６活性（例えば、ＡＲＨＧＥＦ６と比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の活性、または上記した値の任意の２つにより規定される範囲内の活性）を維持しているその変異体またはホモログのいずれかが含まれる。幾つかの態様において、変異体またはホモログは、全配列または配列の一部（例えば、５０、１００、１５０または２００の連続したアミノ酸部分、または上記した値の任意の２つにより規定される長さの範囲内）にわたって天然に存在するＡＲＨＧＥＦ６タンパク質と比較して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性、または上記した値の任意の２つにより規定される範囲内の同一性を有する。ある実施形態では、ＡＲＨＧＥＦ６タンパク質はＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ１５０５２（配列番号２２）により同定されるタンパク質と実質的に同一であるか、またはこれに対して実質的な同一性を有する変異体またはホモログである。ある実施形態では、ＡＲＨＧＥＦ６タンパク質はＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ８Ｋ４Ｉ３（配列番号２３）により同定されるタンパク質と実質的に同一であるか、またはこれに対して実質的な同一性を有する変異体またはホモログである。
【００７４】
用語「ＵＣ−９６１」、「シルツズマブ」等は、通常のかつ慣用的な意味で、例えばＣＬＬ細胞の表面上で発現されるＲＯＲ１に結合することができるモノクローナル抗体薬物を指す。ＵＣ−９６１のＲＯＲ１への結合は細胞増殖及び生存をブロックし得る。
【００７５】
用語「蛍光共鳴エネルギー移動」、「ＦＲＥＴ」等は、通常のかつ慣用的な意味で、２つの感光性物質（例えば、発色団または蛍光体のような検出可能部分）間のエネルギー移動のメカニズムを指す。前記分子間のエネルギー移動は非発光双極子−双極子カップリングにより媒介され得、その効率は距離の６乗に反比例する。よって、ＦＲＥＴは、当該分野で公知のようにドナー−アクセプター感光性物質間の距離に非常に敏感であり得る。
【００７６】
用語「ＲＯＲ１のＫＮＧドメイン」等は、通常のかつ慣用的な意味で、ＲＯＲ１の細胞外クリングル（ＫＮＧ）ドメインを指す。用語「ＲＯＲ２のＫＮＧドメイン」等は、通常のかつ慣用的な意味で、ＲＯＲ２のＫＮＧドメインを指す。当該分野で公知のように、クリングルドメインはジスルフィド結合により安定化される特徴的な大ループに折りたたまれる自律タンパク質ドメインである。ある実施形態では、ＫＮＧドメインは配列番号８のアミノ酸残基３１０−３９２に相当する。ある実施形態では、ＫＮＧドメインは配列番号１０のアミノ酸残基３１４−３９５に相当する。
【００７７】
本明細書中で使用されている用語「がん」は、白血病、リンパ腫、黒色腫、神経内分泌腫瘍、癌（癌腫）及び肉腫を含めた、哺乳動物中で見られるすべてのタイプのがん、新生物または悪性腫瘍を指す。本明細書中に記載されている化合物、医薬組成物または方法で治療され得るがんの例には、リンパ腫、肉腫、膀胱がん、骨がん、脳腫瘍、子宮頸がん、結腸がん、食道がん、胃がん、頭頸部がん、腎臓がん、骨髄腫、甲状腺がん、白血病、前立腺がん、乳がん（例えば、トリプルネガティブ、ＥＲポジティブ、ＥＲネガティブ、化学療法抵抗性、ハーセプチン抵抗性、ＨＥＲ２ポジティブ、ドキソルビシン抵抗性、タモキシフェン抵抗性、管癌、小葉癌、原発性、転移性）、卵巣がん、膵臓がん、肝がん（例えば、肝細胞癌）、肺がん（例えば、非小細胞肺癌、扁平上皮細胞肺癌、腺がん、大細胞肺癌、小細胞肺癌、カルチノイド、肉腫）、多形性膠芽腫、グリオーマ、黒色腫、前立腺がん、去勢抵抗性前立腺がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、膠芽腫、卵巣がん、肺がん、扁平上皮細胞癌（例えば、頭部、頸部、または食道）、大腸がん、白血病、急性骨髄性白血病、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、または多発性骨髄腫が含まれる。追加の例には、甲状腺がん、内分泌系がん、脳腫瘍、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、頭頸部がん、食道がん、肝臓がん、腎臓がん、肺がん、非小細胞肺がん、黒色腫、中皮腫、卵巣がん、肉腫、胃がん、子宮がんまたは髄芽腫がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、グリオーマ、多形性膠芽腫、卵巣がん、横紋筋肉腫、原発性血小板増加症、原発性マクログロブリン血症、原発性脳腫瘍、がん、悪性膵インスリトーマ、悪性カルチノイド、膀胱がん、前がん性皮膚病変、精巣がん、リンパ腫、甲状腺がん、神経芽細胞腫、食道がん、尿生殖路がん、悪性高カルシウム血症、子宮内膜がん、副腎皮質がん、内分泌性または外分泌性の膵新生物、甲状腺髄様がん、甲状腺髄様癌、黒色腫、大腸がん、甲状腺乳頭がん、肝細胞癌、乳首のページェット病、葉状腫瘍、小葉癌、管癌、膵星細胞がん、肝星細胞がん、または前立腺がんが含まれる。
【００７８】
用語「白血病」は、広く造血器官の進行性悪性疾患を指し、通常、血液及び骨髄中のリンパ球及びその前駆体の異常な増殖及び発生を特徴とする。白血病は、通常、臨床的に（１）疾患の期間及び特徴−急性または慢性；（２）関与する細胞のタイプ；骨髄（骨髄性）、リンパ球（リンパ球性）、または単球性；及び（３）血液中の異常細胞の数の増加または非増加−白血性または非白血性（亜白血病性）に基づいて分類される。本明細書中に記載されている化合物、医薬組成物または方法で治療される白血病の例には、例えば急性非リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性前骨髄球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、非白血性白血病、白血球性白血病、好塩基性白血病、芽球性白血病、ウシ白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚白血病、胎児性白血病、好酸球性白血病、グロス白血病、有毛細胞白血病、血芽球性白血病、血球芽細胞性白血病、組織球性白血病、幹細胞白血病、急性単球性白血病、白血球低下性白血病、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、リンパ行性白血病、リンパ性白血病、リンパ肉腫細胞性白血病、肥満細胞性白血病、巨核芽球性白血病、小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄性白血病、骨髄性顆粒球性白血病、骨髄単球性白血病、ネーゲリ白血病、プラズマ細胞白血病、多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、前骨髄球性白血病、リーダー細胞性白血病、シリング白血病、幹細胞白血病、亜白血性白血病、または未分化細胞白血病が含まれる。
【００７９】
用語「肉腫」は、通常、胎生結合組織のような物質で構成され、通常、原繊維または均質物質中に埋め込まれたぎっしり詰まった細胞から構成される腫瘍を指す。本明細書中に記載されている化合物、医薬組成物または方法で治療され得る肉腫には、軟骨肉腫、線維肉腫、リンパ肉腫、黒色肉腫、粘液肉腫、骨肉腫、アベメシー肉腫、脂肪肉腫（ａｄｉｐｏｓｅ  ｓａｒｃｏｍａ）、脂肪肉腫（ｌｉｐｏｓａｒｃｏｍａ）、胞巣状軟部肉腫、エナメル上皮腫、ブドウ状肉腫、緑色腫性肉腫、絨毛癌、胎児性肉腫、ウイルムス腫瘍肉腫、子宮内膜肉腫、間質性肉腫、ユーイング肉腫、顔面肉腫、線維芽細胞性肉腫、巨細胞肉腫、顆粒球性肉腫、ホジキン肉腫、特発性多発性色素性出血性肉腫、Ｂ細胞の免疫芽球性肉腫、リンパ腫、Ｔ細胞の免疫芽球性肉腫、イエンセン肉腫、カポジ肉腫、クッパー星細胞肉腫、血管肉腫、白血肉腫、悪性間葉腫性肉腫、傍骨性肉腫、網状赤血球性肉腫、ラウス肉腫、漿液嚢胞性肉腫、滑膜肉腫、または毛細血管拡張性肉腫が含まれる。
【００８０】
用語「黒色腫」は、皮膚または他の臓器のメラニン細胞系から生ずる腫瘍を意味する。本明細書中に記載されている化合物、医薬組成物または方法により治療され得る黒色腫には、例えば末端黒子性黒色腫、無メラニン性黒色腫、良性若年性黒色腫、クラウドマン黒色腫、Ｓ９１黒色腫、ハーディング−パッセー黒色腫、若年性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、悪性黒色腫、結節型黒色腫、爪下黒色腫、または表在拡大型黒色腫が含まれる。
【００８１】
用語「癌（癌腫）」は、周囲組織に浸潤し、転移を生ずる傾向にある上皮細胞からなる悪性新生物を指す。本明細書中に記載されている化合物、医薬組成物または方法で治療され得る癌の例には、例えば甲状腺髄様癌、家族性髄様甲状腺癌、腺房癌、小胞状癌、腺様嚢胞癌、腺様嚢胞癌、腺癌、副腎皮質癌、肺胞細胞癌（ａｌｖｅｏｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肺胞細胞癌（ａｌｖｅｏｌａｒ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、基底細胞癌（ｂａｓａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、基底細胞癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｂａｓｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、基底状癌、基底扁平上皮細胞癌、細気管支肺胞上皮癌、細気管支癌、気管支原性癌、脳様癌、胆管細胞癌、絨毛膜癌、粘液癌、コメド癌、子宮体癌、篩状癌、鎧状癌、皮膚癌、円柱癌、円柱細胞癌、管癌、乳管癌、硬癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｄｕｒｕｍ）、胎児性癌、脳室様癌、類表皮癌、上皮性癌、外方増殖性癌、潰瘍癌、線維癌、ゼラチン状癌（ｇｅｌａｔｉｎｉｆｏｒｎｉ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ゼラチン様癌（ｇｅｌａｔｉｎｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、巨細胞癌（ｇｉａｎｔ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、巨細胞癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｇｉｇａｎｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、腺癌（ｇｌａｎｄｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、顆粒膜細胞癌、毛母癌、血液様癌、肝細胞癌、ヒュルトレ細胞癌、ヒアリン癌、副腎様癌、幼児型胎児性癌（ｉｎｆａｎｔｉｌｅ  ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、上皮内癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｓｉｔｕ）、表皮内癌、上皮内癌（ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、クロンペッカー癌、クロロチツキー細胞癌、大細胞癌、水晶体癌、レンズ状癌、脂肪腫癌、小葉癌、リンパ上皮癌、髄様癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｅｄｕｌｌａｒｅ）、髄様癌（ｍｅｄｕｌｌａｒｙ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、黒色性癌、軟性癌、粘液性癌（ｍｕｃｉｎｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｕｃｉｐａｒｕｍ）、粘液細胞癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｕｃｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、粘膜表皮癌（ｍｕｃｏｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｕｃｏｓｕｍ）、粘液性癌（ｍｕｃｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液腫癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｙｘｏｍａｔｏｄｅｓ）、鼻咽頭癌、燕麦細胞癌、骨化性癌、類骨癌、乳頭状癌、門脈周囲癌、浸潤前癌、有棘細胞癌、髄状癌、腎臓の腎細胞癌、予備細胞癌、肉腫様癌、シュナイダー癌、スキルス性癌、陰嚢癌、印環細胞癌、単純癌、小細胞癌、ソラノイド癌、スフェロイド細胞癌、紡錘細胞癌、海綿様癌、扁平上皮癌、扁平上皮細胞癌、数珠様癌、毛細血管拡張性癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｔｉｃｕｍ）、毛細血管拡張性癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔｏｄｅｓ）、移行上皮細胞癌、結節癌、管状癌、結節状癌、疣贅癌、または絨毛癌が含まれる。
【００８２】
本明細書中で使用されている用語「転移」、「転移性」及び「転移性がん」は互換可能に使用され得、増殖性疾患または障害、例えばがんの１つの臓器から別の非隣接臓器または身体部分への広がりを指す。がんは原発部位、例えば乳房で生じ、その部位は原発性腫瘍、例えば原発性乳がんと称される。原発性腫瘍または原発部位における幾つかのがん細胞は、局部域中の周囲の正常組織に浸透しそして浸潤する能力、及び／またはリンパ系または血管系を介して身体の他の部位及び組織に循環する系の壁に浸透する能力を獲得している。原発性腫瘍のがん細胞から形成される第２の臨床的に検出可能な腫瘍は、転移性腫瘍または続発性腫瘍と称される。がん細胞が転移すると、転移性腫瘍及びその細胞は原発腫瘍のものと類似していると推定される。よって、肺がんが乳房に転移すると、乳房の部位の続発性腫瘍は異常な肺細胞及び異常でない乳房細胞からなる。乳房における続発性腫瘍は転移性肺がんと称される。よって、フレーズ「転移性がん」は、被験者が原発性腫瘍を有しているか、または過去に有しており、１つまたはそれ以上の続発性腫瘍を有している疾患を指す。フレーズ「非転移性がん」または「転移性でないがんを有する被験者」は、被験者が原発性腫瘍を有しているが、１つまたはそれ以上の続発性腫瘍を有していない疾患を指す。例えば、転移性肺がんは、原発性肺腫瘍を有するかまたは原発性肺腫瘍の病歴を有し、第２の場所または複数の場所に、例えば乳房に、１つ以上の続発性腫瘍を有する被験者における疾患を指す。
【００８３】
疾患（例えば、糖尿病、がん（例えば、前立腺がん、腎臓がん、転移性がん、黒色腫、去勢抵抗性前立腺がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、神経膠芽腫、卵巣がん、肺がん、扁平上皮癌（例えば、頭部、頸部または食道）、大腸がん、白血病、急性骨髄性白血病、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、または多発性骨髄腫））に関連する物質、または物質の活性もしくは機能の文脈における用語「関連する」または「と関連する」は、疾患（例えば、肺がん、卵巣がん、骨肉腫、膀胱がん、子宮頸がん、肝臓がん、腎臓がん、皮膚がん（例えば、メルケル細胞癌）、精巣がん、白血病、リンパ腫、頭頸部がん、大腸がん、前立腺がん、膵臓がん、黒色腫、乳がん、神経芽細胞腫）が、物質、または物質の活性または機能によって（全体的または部分的に）引き起こされるか、または疾患の症状が、物質、または物質の活性または機能に（全体的または部分的に）起因していることを意味する。
【００８４】
ＩＩ．方法
原発性ＣＬＬ細胞中のＲＯＲ１関連タンパク質を調べた。予期せぬことに、ＲＯＲ１がＷｎｔ５ａに応答してＲＯＲ２にカップリングし、Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼを活性化するグアニン交換子（ＧＥＦ）を補充することが見出された。
【００８５】
Ｗｎｔ５ａは、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）細胞中のＧＴＰアーゼＲｈｏＡ及びＲａｃ１を活性化して、それぞれ白血病細胞の遊走及び増殖を高め得る。Ｗｎｔ５ａはＣＬＬ患者の血漿中に健康なドナー及び新鮮分離した白血病細胞と比較して高レベルで存在していることが見出された。
【００８６】
よって、１つの態様において、がんにかかっているかまたはがんにかかるリスクを有する被験者におけるＷｎｔ５ａタンパク質の発現レベルを測定する方法を提供する。方法は、（ｉ）被験者から生体サンプルを得；（ｉｉ）生体サンプル中のＷｎｔ５ａタンパク質の発現レベルを測定することを含む。ある実施形態では、測定は、（ａ）生体サンプル中でＷｎｔ５ａタンパク質をＷｎｔ５ａタンパク質結合物質と接触させ、これによりＷｎｔ５ａタンパク質−結合物質複合体を形成し；（ｂ）Ｗｎｔ５ａタンパク質−結合物質複合体を検出することを含む。本明細書中に記載されている「Ｗｎｔ５ａタンパク質結合物質」はＷｎｔ５ａタンパク質に結合することができる物質を指す。Ｗｎｔ５ａタンパク質結合物質は核酸またはタンパク質であり得る。ある実施形態では、Ｗｎｔ５ａタンパク質結合物質はアプタマーである。ある実施形態では、Ｗｎｔ５ａタンパク質結合物質はペプチドである。ある実施形態では、Ｗｎｔ５ａタンパク質結合物質は小分子である。ある実施形態では、Ｗｎｔ５ａタンパク質結合物質は抗体である。ある実施形態では、Ｗｎｔ５ａタンパク質結合物質は検出可能部分を含む。ある実施形態では、方法は更に、がんにかかっているかまたはがんにかかるリスクを有する被験者を選択することを含む。ある実施形態では、生体サンプルは被験者の血液由来生体サンプルである。ある実施形態では、血液由来生体サンプルは全血、血清、または血漿である。ある実施形態では、がんは慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）である。
【００８７】
いかなる特定の作用メカニズムにも束縛されないが、ＲＯＲ２を含めた慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）中のＲＯＲ１関連タンパク質がＣＬＬ細胞及びＣＤ５Ｂ細胞上に存在し得るという証拠が見つかった。Ｗｎｔ５ａはＲＯＲ１−ＲＯＲ２カップリング（結合）を誘導し、ＣＬＬ細胞の遊走及び増殖を高めるＡＲＨＧＥＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２及びＡＲＨＧＥＦ６、及び活性化したＲｈｏＡ及びＲａｃ１を補充する。ＣＬＬ細胞株ＭＥＣ１（ＲＯＲ１を欠くが、ＲＯＲ２及びＷｎｔ５ａを発現する）を用いて、親細胞と比較してＲＯＲ１を発現するように作成したＭＥＣ１はＲＯＲ１−ＲＯＲ２複合体を有し、これはグアニン交換因子を補充し、サイトカイン指向性遊走を高め、免疫不全マウスにおいて移植を強化することを見出した。ＲＯＲ１−ＲＯＲ２カップリング（結合）のためには細胞外クリングルドメインを必要とし、ＲＯＲ１−ＲＯＲ２へのグアニン交換因子のＷｎｔ５ａ誘導性補充のためにはシステインリッチドメインまたは細胞内プロリンリッチドメインを必要とする。更に、ＲＯＲ１のＲＯＲ２とのカップリング（結合）は、Ｗｎｔ５ａによる非古典的Ｗｎｔシグナル伝達のブロックにおけるその顕著な生物学的活性の理由となることが見出され、これがインビボでのがん細胞の増殖、生存及び転移を強化することが見出された。
【００８８】
今までに非古典的Ｗｎｔシグナル伝達のための要件として認識されていなかったので、ＲＯＲ１のＲＯＲ２とのカップリング（結合）を干渉し得る物質を試験するために利用できることが公知のアッセイはない。こうしたアッセイが本明細書中に記載されている。
【００８９】
この目的のために、抗体（例えば、我々の抗ＲＯＲ１  ｍＡｂ，ＵＣ−９６１）がＲＯＲ１のＲＯＲ２とカップリングする能力を阻害し得、これによりＷｎｔ５ａがＲｈｏＡ及びＲａｃ１の活性化の誘導においてがん細胞に対して有し得る効果をブロックできることも今回立証された。
【００９０】
これらの所見により、以下のことが本発明により提供できる：
１）ＲＯＲ１をＲＯＲ２とカップリングさせるＷｎｔ５ａの能力をモニターするためのアッセイ。
２）ＲＯＲ１のＲＯＲ２とカップリングする能力を阻害して、これによりＷｎｔ５ａ誘導性シグナル伝達をブロックすることができるＲＯＲ１またはＲＯＲ２に対する抗体。
３）ＲＯＲ１のＲＯＲ２とカップリングする能力を阻害し得るポリペプチドまたは小分子のスクリーニング。
４）Ｗｎｔ５ａ誘導性非古典的Ｗｎｔシグナル伝達のために必要なＲＯＲ１のＲＯＲ２とのカップリング（結合）をブロックするように意図される分子の相対的有効性の性質決定及びランキング。
【００９１】
ＲＯＲ１−ＲＯＲ２カップリング（結合）インヒビターのスクリーニングは、ＲＯＲ１のＲＯＲ２との共局在化をモニターするための蛍光共焦点顕微鏡検査または蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイを用いて、または細胞ベースアッセイのような他の手段により、実施され得る。スクリーニングは、ＲＯＲ１とＲＯＲ２とのカップリング（結合）を干渉する抗体または他の物質（小分子、ペプチド、薬物等）をスクリーニングするために使用され得るように自動化され得る。このようなカップリング（結合）を干渉する物質はＷｎｔ５ａにより誘導される非古典的Ｗｎｔシグナル伝達を干渉すると予想される。
【００９２】
本発明では、特に、ＲＯＲ１とＲＯＲ２との間の結合（例えば、ＲＯＲ１及びＲＯＲ２を含むタンパク質複合体の形成または維持）を阻害することができる物質を同定する方法を提供する。同定された物質は、ＲＯＲ１と相互作用し、これによりＲＯＲ１のＲＯＲ２への結合を防止することにより、ＲＯＲ１−ＲＯＲ２結合及び／またはＲＯＲ１及びＲＯＲ２を含むタンパク質複合体の形成または維持を阻害し得る。或いは、同定された物質はＲＯＲ２と相互作用し、これによりＲＯＲ１のＲＯＲ２への結合を防止することにより結合を阻害し得る。ＲＯＲ１のＲＯＲ２への結合及び／またはＲＯＲ１及びＲＯＲ２を含むタンパク質複合体の形成または維持を阻害する能力を通して、本明細書中に記載されている方法により同定された物質は、がん診断またはがん治療として有用であり得る。
【００９３】
「ＲＯＲ１とＲＯＲ２との間の結合」を言及している本明細書中に記載されている態様及び実施形態の場合、このフレーズはＲＯＲ１及びＲＯＲ２を含むタンパク質複合体の形成及び維持を含むと理解される。よって、１つの態様において、ＲＯＲ１−ＲＯＲ２結合及び／またはＲＯＲ１及びＲＯＲ２を含むタンパク質複合体の形成または維持のインヒビターを同定する方法を提供する。方法は、（ｉ）反応容器において被験物質をＲＯＲ１タンパク質及びＲＯＲ２タンパク質と混合することを含む。（ｉｉ）標準対照と比較してＲＯＲ１タンパク質のＲＯＲ２タンパク質への結合及び／またはＲＯＲ１及びＲＯＲ２を含むタンパク質複合体の形成または維持の低下を検出し、これによりＲＯＲ１−ＲＯＲ２結合及び／またはＲＯＲ１及びＲＯＲ２を含むタンパク質複合体の形成または維持のインヒビターを同定する。
【００９４】
１つの態様において、ＲＯＲ１−ＲＯＲ２結合のインヒビターの同定方法を提供する。方法は、（ｉ）反応容器において被験物質をＲＯＲ１タンパク質及びＲＯＲ２タンパク質と混合することを含む。（ｉｉ）標準対照と比較したＲＯＲ１タンパク質のＲＯＲ２タンパク質への結合の低下を検出し、これによりＲＯＲ１−ＲＯＲ２結合のインヒビターを同定する。本明細書中に記載されている用語「結合」は、ＲＯＲ１タンパク質とＲＯＲ２タンパク質との間の会合を指す。会合は、直接であっても（例えば、共有結合による）、または間接であっても（例えば、非共有結合（例えば、静電相互作用（例えば、イオン結合、水素結合、ハロゲン結合）、ファンデルワールス相互作用（例えば、双極子−双極子、双極子−誘起双極子、ロンドン分散）、リングスタッキング（ｐｉ効果）、疎水性相互作用等）による）よい。よって、用語「結合」は、ＲＯＲ１及びＲＯＲ２を含むタンパク質複合体の形成または維持を含む。本明細書中に記載されているＲＯＲ１のＲＯＲ２への結合及び／またはＲＯＲ１及びＲＯＲ２を含むタンパク質複合体の形成または維持は、「ヘテロオリゴマー化」または「カップリング」とも称され得る。ある実施形態では、ＲＯＲ１−ＲＯＲ２結合及び／またはＲＯＲ１及びＲＯＲ２を含むタンパク質複合体の形成または維持は、Ｗｎｔ５ａのＲＯＲ１またはＲＯＲ２への結合に先行する。ある実施形態では、ＲＯＲ１−ＲＯＲ２結合及び／またはＲＯＲ１及びＲＯＲ２を含むタンパク質複合体の形成または維持は、グアニン交換因子（ＧＥＦ）またはＧＴＰアーゼのレベルを上昇させる。ＲＯＲ１タンパク質とＲＯＲ２タンパク質との間の相互作用及び／またはＲＯＲ１及びＲＯＲ２を含むタンパク質複合体の形成または維持は、被験物質のＫＮＧドメインへの結合により阻害され得る。ある実施形態では、ＫＮＧドメインはＲＯＲ１タンパク質の一部を形成する。ある実施形態では、ＫＮＧドメインはＲＯＲ２タンパク質の一部を形成する。
【００９５】
実施形態を含めた本明細書中に記載されている方法の場合、ＲＯＲ１タンパク質及びＲＯＲ２タンパク質は、細胞により発現され得る。ある実施形態では、反応容器は細胞を含む。ある実施形態では、ＲＯＲ１タンパク質及びＲＯＲ２タンパク質は、細胞の表面上で発現する。細胞はインビトロ細胞培養物の一部を形成し得る。ある実施形態では、インビトロ細胞培養物はＷｎｔ５ａタンパク質を含む。よって、ある実施形態では、混合ステップは、Ｗｎｔ５ａタンパク質の存在下で行われる。ある実施形態では、細胞は、内因性Ｗｎｔ５ａタンパク質を発現する。ある実施形態では、ＲＯＲ１及びＲＯＲ２を含むタンパク質複合体の形成または維持は、Ｗｎｔ５ａタンパク質の存在下で行われる。ある実施形態では、細胞は、外因性Ｗｎｔ５ａタンパク質を発現する。よって、ある実施形態では、細胞にＷｎｔ５ａタンパク質をエンコードするベクターをトランスフェクトする。
【００９６】
ある実施形態では、反応容器は細胞培養物を含む。本明細書中に記載されている「細胞培養物」は、適切な細胞栄養素を含み、インビトロで細胞を維持することができる環境を指す。環境は、適切な容器（例えば、細胞培養皿）の中の液体環境、固体環境及び／または半固体環境（例えば、寒天、ゲル等）であり得る。細胞培地が、使用されてもよい。本明細書中で使用されている「細胞培地」は当該分野で通常認められている意味に従って使用される。細胞培地（当該分野及び本明細書において「培地」とも称される）は液体（例えば、増殖因子、ミネラル、ビタミン等）、または細胞の増殖（例えば、分裂、分化、維持等）を支持するように設計されたゲルを含む。ある実施形態では、実施形態を含めた本明細書中に記載されている組成物は更に、生理学的に許容され得る溶液を含む。本明細書中に記載されている「生理学的に許容され得る溶液」は、本明細書中に記載されている組成物がその生物学的特性を失うことなくその中に含まれ得る、任意の許容され得る水溶液（例えば、緩衝液）を指す。ある実施形態では、生理学的に許容され得る溶液は、細胞培地である。よって、ある実施形態では、細胞は、インビトロ細胞培養物の一部を形成する。
【００９７】
ある実施形態では、細胞はがん細胞である。ある実施形態では、がん細胞は慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）細胞である。ある実施形態では、ＣＬＬ細胞は慢性Ｂ細胞白血病細胞である。ある実施形態では、ＣＬＬ細胞はＭＥＣ１細胞である。慣用的な意味で、本明細書中に記載されているＭＥＣ１細胞は、Ｌｅｉｂｎｉｚ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＤＳＭＺ−Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託されており、受託番号ＡＣＣ  ４９７を有する細胞を指す。ある実施形態では、ＭＥＣ１細胞はＲＯＲ１タンパク質及びＲＯＲ２タンパク質を発現する。更なる実施形態では、ＲＯＲ１タンパク質は外因性タンパク質であり、ＲＯＲ２タンパク質は内因性タンパク質である。換言すると、ＭＥＣ１細胞は、ＲＯＲ２タンパク質を内因的に発現し得、ＲＯＲ１タンパク質を発現するベクターをトランスフェクトすることによりＲＯＲ１タンパク質及びＲＯＲ２タンパク質を発現するＭＥＣ１細胞を形成する。
【００９８】
ある実施形態では、ＲＯＲ１タンパク質及びＲＯＲ２タンパク質は単離タンパク質であり、方法は無細胞環境で実施される。ある実施形態では、混合は単離ＲＯＲ１タンパク質を固体支持体に結合させる（結合を可能にする）ことによって、結合ＲＯＲ１タンパク質を形成し、結合ＲＯＲ１タンパク質に、単離ＲＯＲ２タンパク質及び被験物質を接触させることを含む。よって、ある実施形態では、反応容器は固体支持体を収容したカラムである。本明細書中に記載されている「固体支持体」は、実施形態を含めた本明細書中に記載されている単離ＲＯＲ１タンパク質または単離ＲＯＲ２タンパク質、またはその断片を付着または会合させるために適切な別々の個々の部位を含むように改変され得、実施形態を含めた本明細書中に記載されている方法において使用され得る任意の材料を指す。固体支持体の例には、非限定的に、ガラス及び改質ガラスまたは機能化ガラス（例えば、カルボキシメチルデキストラン機能化ガラス）、プラスチック（アクリル、ポリスチレン、スチレンと他の材料のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロン（登録商標）等を含む）、多糖（例えば、セファロース、アガロース）、ナイロンまたはニトロセルロース、複合材料、セラミック及びプラスチック樹脂、シリコンや変性シリコン（例えば、模様つきシリコン）を含めたシリカまたはシリカ系材料、カーボン、金属、石英（例えば、模様つき石英）、無機ガラス、プラスチック、光ファイバーの束、及び各種の他のポリマーが含まれる。一般的に、基質は光学検出が可能であり、感知できるほどの蛍光は発しない。
【００９９】
ある実施形態では、検出は被験物質の存在下でＲＯＲ２タンパク質に結合したＲＯＲ１タンパク質のレベルを検出することを含み、ＲＯＲ２タンパク質に結合したＲＯＲ１タンパク質のレベルが標準対照と比較して低いことは、該被験物質がＲＯＲ１−ＲＯＲ２結合のインヒビターであることを示す。標準対照は、被験物質の不在下でのＲＯＲ１タンパク質のＲＯＲ２タンパク質への結合のレベルであり得る。ある実施形態では、標準対照は、ＲＯＲ１タンパク質のＲＯＲ２タンパク質への結合を阻害できない物質の存在下でのＲＯＲ１タンパク質のＲＯＲ２タンパク質への結合のレベルである。ある実施形態では、標準対照は、ＲＯＲ１タンパク質またはＲＯＲ２タンパク質に結合できない物質の存在下でのＲＯＲ１タンパク質のＲＯＲ２タンパク質への結合のレベルである。ある実施形態では、標準対照は、ＲＯＲ１タンパク質のＫＮＧドメインに結合できない物質の存在下でのＲＯＲ１タンパク質のＲＯＲ２タンパク質への結合のレベルである。ある実施形態では、標準対照は、ＲＯＲ１抗体の存在下でのＲＯＲ１タンパク質のＲＯＲ２タンパク質への結合のレベルである。更なる実施形態では、ＲＯＲ１抗体は４Ａ５抗体である。
【０１００】
ある実施形態では、検出は被験物質の存在下でＲＯＲ１及びＲＯＲ２を含むタンパク質複合体の形成または維持のレベルの検出を含み、複合体中のＲＯＲ１タンパク質またはＲＯＲ２タンパク質のレベルが標準対照と比較して低いことは、該被験物質がＲＯＲ１−ＲＯＲ２結合のインヒビターであることを示す。標準対照は、被験物質の不在下でのＲＯＲ１及びＲＯＲ２を含むタンパク質複合体の形成または維持のレベルであり得る。ある実施形態では、標準対照は、ＲＯＲ１タンパク質のＲＯＲ２タンパク質への結合を阻害しないことが既に判明している物質の存在下でのＲＯＲ１及びＲＯＲ２を含むタンパク質複合体の形成または維持である。ある実施形態では、標準対照は、ＲＯＲ１タンパク質またはＲＯＲ２タンパク質に結合しないことが既に判明している物質の存在下でのＲＯＲ１及びＲＯＲ２を含むタンパク質複合体の形成または維持のレベルである。ある実施形態では、標準対照は、ＲＯＲ１タンパク質のＫＮＧドメインに結合しないことが既に判明している物質の存在下でのＲＯＲ１及びＲＯＲ２を含むタンパク質複合体の形成または維持のレベルである。ある実施形態では、標準対照は、ＲＯＲ１抗体の存在下でのＲＯＲ１及びＲＯＲ２を含むタンパク質複合体の形成または維持のレベルである。更なる実施形態では、ＲＯＲ１抗体は４Ａ５抗体である。
【０１０１】
ある実施形態では、検出は被験物質の存在下で非結合ＲＯＲ１タンパク質または非結合ＲＯＲ２タンパク質のレベルを検出することを含み、非結合ＲＯＲ１タンパク質のレベルまたは非結合ＲＯＲ２タンパク質のレベルが標準対照と比較して高いことは、該被験物質がＲＯＲ１−ＲＯＲ２結合のインヒビターであることを示す。本明細書中に記載されている用語「非結合ＲＯＲ１タンパク質」は、複合体の一部を形成せず、またＲＯＲ２タンパク質に結合しないＲＯＲ１タンパク質を指す。本明細書中に記載されている用語「非結合ＲＯＲ２タンパク質」は、複合体の一部を形成せず、またＲＯＲ１タンパク質に結合しないＲＯＲ２タンパク質を指す。ある実施形態では、標準対照は、被験物質の不在下での非結合ＲＯＲ１タンパク質または非結合ＲＯＲ２タンパク質のレベルである。ある実施形態では、標準対照は、ＲＯＲ１タンパク質のＲＯＲ２タンパク質への結合を阻害できない物質の存在下での非結合ＲＯＲ１タンパク質または非結合ＲＯＲ２タンパク質のレベルである。ある実施形態では、標準対照は、ＲＯＲ１タンパク質またはＲＯＲ２タンパク質に結合できない物質の存在下での非結合ＲＯＲ１タンパク質または非結合ＲＯＲ２タンパク質のレベルである。ある実施形態では、標準対照は、ＲＯＲ１タンパク質のＫＮＧドメインに結合できない物質の存在下でのＲＯＲ１タンパク質のＲＯＲ２タンパク質への結合のレベルである。ある実施形態では、標準対照は、ＲＯＲ１抗体の存在下でのＲＯＲ１タンパク質のＲＯＲ２タンパク質への結合のレベルである。更なる実施形態では、ＲＯＲ１抗体は４Ａ５抗体である。
【０１０２】
ある実施形態では、検出は被験物質の存在下でＲＯＲ１及びＲＯＲ２を含むタンパク質複合体中の非結合ＲＯＲ１タンパク質または非結合ＲＯＲ２タンパク質のレベルを検出することを含み、非結合ＲＯＲ１タンパク質のレベルまたは非結合ＲＯＲ２タンパク質のレベルが標準対照と比較して高いことは、該被験物質がＲＯＲ１及びＲＯＲ２を含むタンパク質複合体の形成または維持のインヒビターであることを示す。ある実施形態では、標準対照は、被験物質の不在下でのＲＯＲ１及びＲＯＲ２を含むタンパク質複合体中の非結合ＲＯＲ１タンパク質または非結合ＲＯＲ２タンパク質のレベルである。ある実施形態では、標準対照は、ＲＯＲ１及びＲＯＲ２を含むタンパク質複合体の形成または維持を阻害できないことが既に判明している物質の存在下でのＲＯＲ１及びＲＯＲ２を含むタンパク質複合体中の非結合ＲＯＲ１タンパク質または非結合ＲＯＲ２タンパク質のレベルである。ある実施形態では、標準対照は、ＲＯＲ１タンパク質のＫＮＧドメインに結合しないことが既に判明している物質の存在下でのＲＯＲ１及びＲＯＲ２を含むタンパク質複合体の形成または維持のレベルである。ある実施形態では、標準対照は、ＲＯＲ１抗体の存在下でのＲＯＲ１及びＲＯＲ２を含むタンパク質複合体の形成または維持の結合のレベルである。更なる実施形態では、ＲＯＲ１抗体は４Ａ５抗体である。
【０１０３】
ある実施形態では、検出は被験物質の存在下でグアニン交換因子（ＧＥＦ）タンパク質活性またはグアノシントリホスファターゼ（ＧＴＰアーゼ）タンパク質活性のレベルを検出することを含み、ＧＥＦタンパク質活性またはＧＴＰアーゼタンパク質活性のレベルが標準対照と比較して低いことは、該被験物質がＲＯＲ１−ＲＯＲ２結合（例えば、ＲＯＲ１及びＲＯＲ２を含むタンパク質複合体の形成または維持）のインヒビターであることを示す。ある実施形態では、標準対照は、被験物質の不在下でのＧＥＦタンパク質活性またはＧＴＰアーゼタンパク質活性のレベルである。ある実施形態では、ＧＥＦタンパク質はＡＲＨＧＥＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２またはＡＲＨＧＥＦ６である。ある実施形態では、ＧＥＦタンパク質はＡＲＨＧＥＦ１である。ある実施形態では、ＧＥＦタンパク質はＡＲＨＧＥＦ２である。ある実施形態では、ＧＥＦタンパク質はＡＲＨＧＥＦ６である。ある実施形態では、ＧＴＰアーゼタンパク質はＲｈｏＡまたはＲａｃ１である。ある実施形態では、ＧＴＰアーゼタンパク質はＲｈｏＡである。ある実施形態では、ＧＴＰアーゼタンパク質はＲａｃ１である。
【０１０４】
ある実施形態では、ＲＯＲ１タンパク質及びＲＯＲ２タンパク質は検出可能部分を含む。ある実施形態では、ＧＥＦタンパク質またはＧＴＰアーゼタンパク質は検出可能部分を含む。検出可能部分は本明細書中に規定されているとおりである。ある実施形態では、検出可能部分は生物発光分子である。ある実施形態では、検出可能部分は光活性分子である。ある実施形態では、検出可能部分は蛍光体である。ある実施形態では、検出可能部分は蛍光体を含む抗体である。ある実施形態では、検出可能部分及びＲＯＲ１タンパク質は融合タンパク質を形成する。ある実施形態では、検出可能部分及びＲＯＲ２タンパク質は融合タンパク質を形成する。広範な種類の検出可能部分が使用され得、標識の選択は必要な感度、抗体とのコンジュゲーションのし易さ、安定性要件、及び利用可能な計器及び廃棄規定に依存する。適当な検出可能部分には、放射性核種、蛍光染料（例えば、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、オレゴン・グリーン（商標）、ローダミン、テキサスレッド、テトラローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５等）、蛍光マーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、フィコエリトリン等）、腫瘍関連プロテアーゼにより活性化される自己消光性蛍光化合物、酵素（例えば、ルシフェラーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）、ナノ粒子、ビオチン、ジゴキシゲニン等が含まれるが、これらに限定されない。ある実施形態では、検出可能部分は蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイまたは蛍光共局在化アッセイにおいて使用可能である。よって、ある実施形態では、反応容器は蛍光検出デバイスの一部を形成する。
【０１０５】
本明細書中に記載されている検出ステップは、当該分野で周知であり、文献に記載されているイムノアッセイ技術及びプロトコルを含み得る。Ｐｒｉｃｅ  ａｎｄ  Ｎｅｗｍａｎ，“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ”，第２版，Ｇｒｏｖｅ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｉｅｓ，１９９７；及びＧｏｓｌｉｎｇ，“Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００を参照されたい。競合及び非競合のイムノアッセイを含めた各種イムノアッセイ技術が使用され得る（例えば、Ｓｅｌｆら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７：６０−６５（１９９６）を参照されたい）。用語「イムノアッセイ」には、非限定的に酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、例えば酵素増幅イムノアッセイ技術（ＥＭＩＴ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ＩｇＭ抗体捕捉ＥＬＩＳＡ（ＭＡＣ  ＥＬＩＳＡ）及び微粒子酵素イムノアッセイ（ＭＥＩＡ）；キャピラリー電気泳動イムノアッセイ（ＣＥＩＡ）；ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）；免疫放射定量アッセイ（ＩＲＭＡ）；蛍光分極イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）；及び化学発光アッセイ（ＣＬ）を含む技術が包含される。所望ならば、このようなイムノアッセイは自動化され得る。イムノアッセイはまたレーザー誘起蛍光と共に使用され得る（例えば、Ｓｃｈｍａｌｚｉｎｇら，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１８：２１８４−９３（１９９７）；Ｂａｏ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．，６９９：４６３−８０（１９９７）を参照されたい）。フローインジェクションリポームイムノアッセイ及びリポソームイムノセンサーのようなリポソームイムノアッセイも本発明において使用するために適している（例えば、Ｒｏｎｇｅｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ，２０４：１０５−１３３（１９９７）を参照されたい）。加えて、タンパク質／抗体複合体が形成するとマーカー濃度の関数としてピーク速度シグナルに変換される多くの光散乱が生ずるネフェロメトリーアッセイが本発明の方法において使用するために適当である。ネフェロメトリーアッセイはＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ（カリフォルニア州ブレア，ＣＡ；キット番号４４９４３０）から市販されており、ベーリングネフェロメトリーアッセイアナライザー（Ｆｉｎｋら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７：２６１−２７６（１９８９））を用いて実施され得る。
【０１０６】
ＲＯＲ１タンパク質またはＲＯＲ２タンパク質に対する抗体または結合試薬の特異的免疫結合は直接または間接的に検出され得る。直接標識には、抗体に結合させた蛍光性または発光性のタグ、金属、染料、放射性核種等が含まれる。ヨウ素１２５（１２５Ｉ）で標識した抗体が、使用され得る。タンパク質マーカーに対して特異的な化学発光抗体を用いるケミルミネッセンスアッセイは、タンパク質レベルの高感度非放射性検出のために好適である。蛍光色素で標識した抗体もまた、好適である。蛍光色素の例には、ＤＡＰＩ、フルオレセイン、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８、Ｒ−フィコシアニン、Ｂ−フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン、ローダミン、テキサスレッド及びリサミンが含まれる。間接標識には、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ等のような当該分野で周知の各種酵素が含まれる。ホースラディッシュペルオキシダーゼ検出システムは、例えば過酸化水素の存在下で４５０ｎｍで検出可能な可溶性生成物を生ずる色素原基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と共に使用され得る。アルカリホスファターゼ検出システムは、例えば４０５ｎｍで容易に検出可能な可溶性生成物を生ずる色素原基質ｐ−ニトロフェニルホスフェートと共に使用され得る。同様に、β−ガラクトシダーゼ検出システムは、４１０ｎｍで検出可能な可溶性生成物を生ずる色素原基質ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）と共に使用され得る。ウレアーゼ検出システムは、ウレア−ブロモクレゾールパープル（Ｓｉｇｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ミズーリ州セントルイス）のような基質と共に使用され得る。
【０１０７】
直接標識または間接標識からのシグナルは、例えば色素原基質からの色を検出するための分光光度計；１２５Ｉを検出するためのガンマカウンターのような放射線を検出するための放射線カウンター；または特定波長の光の存在下で蛍光を検出するための蛍光光度計を用いて分析され得る。酵素結合抗体を検出するためには、定量分析はＥＭＡＸマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，カリフォルニア州メンローパーク）のような分光光度計を製造業者の指示に従って使用して行われる。所望ならば、本発明のアッセイは自動化されるかまたはロボット制御で実施されてもよく、複数のサンプルからのシグナルは同時に検出され得る。
【０１０８】
ある実施形態では、検出ステップは、ＲＯＲ１−ＲＯＲ２結合を共焦点顕微鏡検査により検出することを含む。カメラまたは他の記録デバイス（例えば、フォトダイオード及びデータ記憶デバイス）により観察した（場合により、記録した）光学画像は、場合により、本明細書中の実施形態のいずれかにおいて、例えば画像をデジタル化し、保存し、画像をコンピューターで分析することによって、さらに処理される。デジタル化し、保存し、そしてデジタル化したビデオまたはデジタル化した光学画像を分析するために、各種の市販されている周辺機器及びソフトウェアが利用可能である。
【０１０９】
１つの慣用のシステムは検体フィールドからの光を当該分野で慣用されている冷却電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラに運ぶ。ＣＣＤカメラは画素（ピクセル）のアレイを含む。検体からの光は、ＣＣＤにおいて画像化される。検体の領域に相当する特定の画素をサンプリングして、位置毎の光強度読み取りを得る。複数の画素が並行して処理されることにより、速度が上がる。本発明の装置及び方法は、任意のサンプルを、例えば蛍光または暗視野顕微鏡技術によって観察するために、容易に使用される。
【０１１０】
本明細書中に記載されている被験物質は、ＲＯＲ１タンパク質のＲＯＲ２タンパク質への結合（例えば、ＲＯＲ１及びＲＯＲ２を含むタンパク質複合体の形成または維持）を阻害できる任意の化合物であり得る。ある実施形態では、被験物質は、抗体、小分子、ペプチド、タンパク質、または核酸である。ある実施形態では、被験物質は抗体である。抗体は抗ＲＯＲ１抗体であり得る。ある実施形態では、抗体は抗ＲＯＲ２抗体である。よって、ある実施形態では、抗体はＲＯＲ１タンパク質またはＲＯＲ２タンパク質に結合する。ある実施形態では、抗体はＫＮＧドメインに結合する。ある実施形態では、抗体はヒト化抗体である。ある実施形態では、抗体はキメラ抗体である。ある実施形態では、抗体はｓｃＦｖである。ある実施形態では、被験物質は小分子である。ある実施形態では、被験物質はペプチドである。ある実施形態では、被験物質はタンパク質である。ある実施形態では、被験物質は核酸である。
【０１１１】
１つの態様において、実施形態を含めた本明細書中に記載されている方法により同定された抗体を提供する。ある実施形態では、抗体は抗ＲＯＲ１抗体である。ある実施形態では、抗体はＲＯＲ１タンパク質のＫＮＧドメインに結合する。ある実施形態では、抗体はシルムツズマブである。
【０１１２】
別の態様において、ＲＯＲ１−ＲＯＲ２相互作用（例えば、ＲＯＲ１及びＲＯＲ２を含むタンパク質複合体の形成または維持）を阻害する方法を提供する。方法は、（ｉ）実施形態を含めた本明細書中に記載されている方法により同定された化合物をＲＯＲ１タンパク質及びＲＯＲ２タンパク質を含む複合体であるＲＯＲ１−ＲＯＲ２複合体と接触させることを含む。（ｉｉ）化合物はＲＯＲ１タンパク質とＲＯＲ２タンパク質との間の相互作用を阻害することができ、これによりＲＯＲ１−ＲＯＲ２相互作用（例えば、ＲＯＲ１及びＲＯＲ２を含むタンパク質複合体の形成または維持）を阻害する。
【０１１３】
本発明で同定された物質は、特にがんの治療のために有用であり得る。よって、別の態様において、がんの治療の必要がある被験者におけるがんの治療方法を提供する。方法は、被験者に対して実施形態を含めた本明細書中に記載されている方法により同定された抗体、小分子、ペプチド、または核酸を治療有効量投与することを含む。
【０１１４】
「患者」または「その必要がある被験者」は、本明細書中に記載されている組成物または医薬組成物を投与することにより治療され得る疾患または状態を患っているかまたは患う傾向にある生存生物を指す。非限定例には、ヒト、他の哺乳動物、ウシ、ラット、マウス、イヌ、サル、ヤギ、ヒツジ、雌ウシ、シカ及び他の非哺乳動物が含まれる。ある実施形態では、患者はヒトである。
【０１１５】
用語「疾患」または「状態」は、本明細書中に記載されている化合物、医薬組成物または方法で治療することができる患者または被験者の体の状態または健康状態を指す。ある実施形態では、疾患は、がん（例えば、肺がん、卵巣がん、骨肉腫、膀胱がん、子宮頸がん、肝臓がん、腎臓がん、皮膚がん（例えば、メルケル細胞癌）、精巣がん、白血病、リンパ腫、頭頸部がん、大腸がん、前立腺がん、膵臓がん、黒色腫、乳がん、神経芽細胞腫）である。
【０１１６】
用語「治療する」または「治療」は、損傷、疾患、病理または状態の治療または改善の成功の任意の指標を指し、寛解；緩和；症状を軽くすること、または損傷、病理または状態を患者にとってより耐えられるようにすること；変性または衰弱の速度を遅らせること；変性の最終点の消耗を軽減させること；患者の肉体的または精神的健康状態を改善することなどの、任意の客観的または主観的なパラメーターを含む。症状の治療または改善は、身体検査、神経精神病学検査及び／または精神鑑定の結果を含む客観的または主観的なパラメーターに基づき得る。用語「治療する」及びその活用形には、損傷、病理、状態または疾患の予防が含まれる。ある実施形態では、「治療する」はがんの治療を指す。
【０１１７】
「有効量」は、化合物の不在と比較して記述されている目的（例えば、投与する、疾患を治療する、酵素活性を低下させる、酵素活性を高める、シグナル伝達経路を低下させる、または疾患または状態の１つ以上の症状を抑制する効果を達成する）を達成するために十分な化合物の量である。「治療有効量」の例は疾患の１つ以上の症状の治療、予防または軽減に寄与するのに十分な量であり、「治療有効量」とも称される。１つ以上の症状の「軽減」（及びこのフレーズの文法的均等物）は、症状の重症度または頻度の低下、または症状の離脱を意味する。正確な量は治療目的に依存し、公知技術（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ（ｖｏｌｓ．１−３，１９９２）；Ｌｌｏｙｄ，Ｔｈｅ  Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ（１９９９）；Ｐｉｃｋａｒ，Ｄｏｓａｇｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９９）；及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，第２０版，２００３，Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓを参照されたい）を用いて当業者により確認できる。
【０１１８】
「医薬的に許容され得る賦形剤」及び「医薬的に許容され得る担体」は、活性物質の被験者への投与及び被験者による吸収を助け、患者に対して重大な中毒副作用を引き起こすことなく本発明の組成物中に配合され得る物質を指す。医薬的に許容され得る賦形剤の非限定例には、水、ＮａＣｌ、生理食塩水、乳酸リンガー液、ノーマルスクロース、ノーマルグルコース、結合剤、増量剤、崩壊剤、滑沢剤、コーティング、甘味剤、フレーバー、塩溶液（例えば、リンガー液）、アルコール、油、ゼラチン、炭水化物（例えば、ラクトース、アミロースまたはデンプン）、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリジン及び着色剤等が含まれる。前記製剤は滅菌され得、所望ならば本発明の化合物と有害に反応しない補助物質、例えば滑沢剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、緩衝剤、着色剤及び／または芳香物質等と混合され得る。当業者は他の医薬賦形剤が本発明において有用であることを認識している。
【０１１９】
用語「製剤」は、カプセルを提供する担体である封入材料と活性化合物との処方物を含むことが意図され、カプセルの中では、含まれても含まれなくてもよい他の担体と活性成分とが担体によって囲まれることによって、この担体と結合している。同様に、カシェ剤及びトローチ剤も含まれる。経口投与のために適した固体投与形態として錠剤、散剤、カプセル剤、ピル剤、カシェ剤及びトローチ剤が使用され得る。
【０１２０】
本明細書中で使用されている用語「投与する」は、被験者に対する経口投与、座剤としての投与、局所接触、静脈内、非経口、腹腔内、筋肉内、病巣内、髄腔内、鼻腔内または皮下投与、或いはミニ浸透圧ポンプのような徐放デバイスの移植を意味する。投与は、非経口及び経粘膜（例えば、頬側、舌下、口蓋、歯肉、鼻、膣、直腸、または経皮）を含めた任意のルートによる。非経口投与には、例えば静脈内、筋肉内、細動脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内及び頭蓋内が含まれる。他の送達様式には、リポソーム処方物、静脈内輸液、経皮パッチ等の使用が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２１】
「共投与」とは、本明細書中に記載されている組成物を１つ以上の追加治療薬と同時に、その直前に、または直後に投与することを意味する。本発明の化合物は患者に対して単独で投与されても、または共投与されてもよい。共投与は、個々の化合物または組み合わせた化合物（２つ以上の化合物または物質）の同時投与または逐次投与を含むことを意味する。よって、所望ならば、製剤は（例えば、代謝分解を減らすための）他の活性物質と共に組み合わされ得る。
【０１２２】
本明細書中に開示されている組成物は、アプリケータースティック、溶液、懸濁液、エマルジョン、ゲル、クリーム、軟膏、ペースト、ゼリー、化粧品（ｐａｉｎｔ）、粉末及びエアロゾルとして処方されて局所経路により経皮的に送達され得る。経口製剤には、患者が摂取するのに適した錠剤、ピル剤、散剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、トローチ剤、カシェ剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁液剤等が含まれる。固体形態製剤には、散剤、錠剤、ピル剤、カプセル剤、カシェ剤、座剤及び分散性顆粒剤が含まれる。液体形態製剤には、溶液剤、懸濁液剤及びエマルジョン剤、例えば水または水／プロピレングリコール溶液が含まれる。本発明の組成物は、更に徐放性及び／または快適性を与えるための成分を含み得る。前記成分には、高分子量アニオン性擬似ムコポリマー、ゲル化多糖類及び微細薬物担体物質が含まれる。これらの成分は米国特許Ｎｏｓ．４，９１１，９２０、５，４０３，８４１、５，２１２，１６２及び４，８６１，７６０により詳細に検討されている。これらの特許の全内容はあらゆる目的のために参照により本明細書に組み入れる。本明細書中に開示されている組成物は体内に徐放するためのミクロスフェアとしても送達され得る。例えば、ミクロスフェアは、皮下的に徐放する薬物含有ミクロスフェアの皮内注射により（Ｒａｏ，Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍ．，第７版：６２３−６４５，１９９５を参照されたい）；生分解性の注射可能なゲル処方物として（例えば、Ｇａｏ  Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１２：８５７−８６３，１９９５を参照されたい）；または経口投与用ミクロスフェアとして（例えば、Ｅｙｌｅｓ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４９：６６９−６７４，１９９７を参照されたい）投与され得る。別の実施形態では、本発明の組成物の処方物は、細胞膜と融合するかまたはエンドサイトーシスされるリポソームを使用することにより、すなわち細胞の表面膜タンパク質受容体に結合してエンドサイトーシスを生じさせるリポソームに結合させた受容体リガンドを使用することにより送達され得る。特にリポソーム表面が標的細胞に対して特異的な受容体リガンドを有しているか、または他の方法で特定臓器に優先的に向けられている場合には、リポソームを用いることにより、インビボでの本発明の組成物の送達を標的細胞へ向けることができる（例えば、Ａｌ−Ｍｕｈａｍｍｅｄ，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ．，１３：２９３−３０６，１９９６；Ｃｈｏｎｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６：６９８−７０８，１９９５；Ｏｓｔｒｏ，Ａｍ．Ｊ．Ｈｏｓｐ．Ｐｈａｒｍ．，４６：１５７６−１５８７，１９８９を参照されたい）。組成物はナノ粒子としても送達され得る。
【０１２３】
医薬組成物には、活性成分（例えば、実施形態または実施例を含めた本明細書中に記載されている化合物）を治療有効量、すなわち所期の目的を達成するために有効な量含む組成物が含まれ得る。具体的用途に対して有効な実際の量は、特に治療しようする状態に依存する。疾患を治療するための方法において使用する場合、このような組成物は標的分子の活性を調節する、及び／または疾患の症状を軽減、解消またはその進行を遅延させるような所望の結果を達成するために有効な量の活性成分を含む。
【０１２４】
哺乳動物に対して投与する用量及び頻度（１回または複数回投与）は、各種要因、例えば哺乳動物が別の疾患を患っているかどうか、及びその投与ルート；レシピエントのサイズ、年齢、性別、健康、体重、ボディマス指数及び食餌；治療しようとする疾患の症状の性質及び程度、併用療法の種類、治療しようとする疾患からの合併症または他の健康関連問題に応じて異なり得る。他の治療レジメンまたは治療薬を本出願人の発明の方法及び化合物と一緒に使用してもよい。確立されている用量（例えば、頻度及び期間）の調節及び操作は、十分に当業者の技術範囲内である。
【０１２５】
本明細書中に記載されている任意の化合物の場合、治療有効量は、細胞培養物アッセイから、最初に決定され得る。目的濃度は、本明細書中に記載されているかまたは当該分野で公知の方法を用いて測定される、本明細書中に記載されている方法を達成可能な活性化合物の濃度である。
【０１２６】
当該分野で周知のように、ヒトに使用するための治療有効量は動物モデルからも決定され得る。例えば、ヒトに対する用量は動物において有効であると判明した濃度を達成するように処方され得る。ヒトにおける用量は、上記したように化合物の有効性をモニターし、用量を増加調整または減少調整することにより調整され得る。ヒトにおいて最大効果を達成するための用量の上記した方法及び他の方法に基づく調整は、十分に当業者の技術範囲内である。
【０１２７】
用量は、患者及び使用しようとする化合物の要件に応じて変更され得る。本発明の文脈において、患者に投与される用量は、患者において有効な治療応答を経時的に得るのに十分でなければならない。用量の大きさはまた、何らかの副作用の存在、性質及び程度によっても決定される。具体的状況ための正確な用量の決定は、医師の技術範囲内である。通常、治療は、化合物の最適用量未満であるより少ない用量で開始される。その後、ある状況下で最適効果が達成されるまで用量を少しずつ増加させる。投与量及び投与間隔は、治療しようとする具体的臨床的適応に対して有効な投与化合物のレベルを与えるように個別に調整され得る。これにより、個人の疾患の状態の重症度にふさわしい治療レジメンが与えられるであろう。
【実施例】
【０１２８】
以下の実施例は、本発明の特定の具体的実施形態を例示し、本発明の範囲を限定すると意図しない。
【０１２９】
本明細書中の実施形態を以下の実施例及び詳細プロトコルにより更に説明する。しかしながら、実施例は単に実施形態を説明するためと意図され、本発明の範囲を限定するとみなすべきではない。本明細書を通じて引用されているすべての参考文献、特許公開明細書及び特許出願明細書の内容は、本明細書により参照により組み入れる。
【０１３０】
我々は驚くべきことに、ＣＬＬ細胞が、明らかにＷｎｔ５ａに応答して、ＲＯＲ１とカップリングしたＲＯＲ２を発現することを、ここで示す。Ｗｎｔ５ａは、我々がＣＬＬ患者の血漿中に比較的高レベルで存在することを見出したものである。Ｗｎｔ５ａを欠く培地において培養すると、ＲＯＲ１−ＲＯＲ２複合体は解離したが、Ｗｎｔ５ａで処理することにより再形成され得、ＧＥＦの補充ならびにＲｈｏＡ及びＲａｃ１の活性化が誘導された。ＲｈｏＡの活性化は高いケモカイン誘導性遊走に関係していたのに対して、Ｒａｃ１の活性化は膜結合ＣＤ１５４及びＩＬ−４／１０に応答して高い白血病細胞増殖に関係した。ＲＯＲ１またはＲＯＲ２のどちらかの発現を阻害すると、ＵＣ−９６１での処理のようにＷｎｔ５ａの化学走性を高める能力が損なわれた。最適な非古典的Ｗｎｔシグナル伝達を達成するためのＲＯＲ２のＲＯＲ１とのカップリングへの依存性も、Ｗｎｔ５ａ及びＲＯＲ２を発現するがＲＯＲ１の発現を欠くＣＬＬ細胞株であるＭＥＣ１細胞でも観察された。ＲＯＲ１を発現させるためにＭＥＣ１をトランスフェクトすると、ＲＯＲ２とのカップリングを可能にし、これは親ＭＥＣ１細胞に比較してＧＥＦの補充、ＲｈｏＡ及びＲａｃ１のより高い活性化、高いケモカイン指向性細胞遊走及び高い増殖を伴った。そのような変化はＵＣ−９６１またはＷｎｔ５ａへの中和抗体での処理により阻害され得る。まとめると、我々の研究は、ＲＯＲ１及びＲＯＲ２の各々が独立して非古典的Ｗｎｔシグナル伝達を誘導するためにＷｎｔ５ａに対する受容体として働き得るという広く受けられている見解２７，３１−３３とは反対に、ＲＯＲ１もＲＯＲ２も、ＲｈｏＡまたはＲａｃ１のＷｎｔ５ａ誘導性活性化を可能にするのに十分でないことを示す。
【０１３１】
我々は、ＲＯＲ１がＲＯＲ２とカップリングするためにはＫＮＧドメインが必要であることを見出した。ＫＮＧドメインは、しばしばタンパク質−タンパク質相互作用に関与するポリペプチドループを規定するドメイン内ジスルフィド架橋を含む３４。従って、ＲＯＲ１及びおそらくはＲＯＲ２のＫＮＧドメインは、互いに相互作用して、Ｗｎｔ５ａに応答してヘテロダイマー複合体を形成し得る（例えば、図５Ｉ）。ＲＯＲ１細胞外ドメインの末端切断により導入される立体障害のためにΔＫＮＧ−ＲＯＲ１はＲＯＲ２とカップリングできなかったが、より大きな細胞外ＣＲＤを欠くΔＣＲＤ−ＲＯＲ１はＲＯＲ２とカップリングし得た。ＣＲＤはＷｎｔ結合のための推定部位であるので３５，３６、ＲＯＲ２に対するＷｎｔ５ａ結合はＲＯＲ２をＲＯＲ１とカップリングさせるのに十分であり得る。或いは、ＣＲＤはＷｎｔ５ａに結合しない限り通常上記カップリングを阻害する残基を有し得る。いずれの場合においても、ΔＣＲＤ−ＲＯＲ１も他の末端切断形態のＲＯＲ１の任意の１つも、ＧＥＦのＲＯＲ１−ＲＯＲ２への補充、またはトランスフェクトしたＭＥＣ１細胞におけるＲｈｏＡ及びＲａｃ１の活性化の増大を可能にしなかった。ΔＫＮＧ−ＲＯＲ１を除いて末端切断形態のＲＯＲ１の各々はＲＯＲ１がＲＯＲ２と複合体化することを可能にしたので、ＲＯＲ１のＲＯＲ２とのカップリングはＷｎｔ５ａ誘導性非古典的シグナル伝達のために十分ではないと考えられる。更に、ＧＥＦのドッキング（ｄｏｃｋｉｎｇ）及び／またはＲＯＲ１−ＲＯＲ２複合体へのタンパク質の足場かけ（ｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇ）を可能にし得る幾つかの推定ＳＨ３−結合部位を含むプロリンリッチドメイン（ＰＲＤ）を含めたＲＯＲ１の細胞内ドメインは、必要と考えられる。ΔＰＲＤ−ＲＯＲ１がＲＯＲ１−ＲＯＲ２複合体へのＧＥＦの補充を可能にしなかったことは、ＲＯＲ２のＰＲＤドメインが、上記ファクターを補充するためにも、Ｗｎｔ５ａに応答してＲｈｏＡまたはＲａｃ１の活性化の増大を誘導するためにも十分でないことを暗示している。
【０１３２】
これらの所見は、発生または新形成におけるＲＯＲ２またはＷｎｔ５ａの幾つかの明らかな相違する属性を説明し得るモデルを規定する。大きく重複するものの、ＲＯＲ２の発生組織発現はＲＯＲ１のものと完全に一致はせず、より広く分布していると考えられる。考えられるところでは、発生中にＲＯＲ及びＲＯＲ２の両方を共発現する細胞のみがＷｎｔ５ａに応答して高い非古典的Ｗｎｔシグナル伝達を有する；ＲＯＲ１の不足は発生スイッチとして働き得、細胞がＲｈｏ  ＧＴＰアーゼの活性化に対するＷｎｔ５ａの影響を逃れることを可能にする。これはまた、どのようにＲＯＲ２またはＷｎｔ５ａが発生における古典的Ｗｎｔシグナル伝達を抑制し得、及び／または腫瘍サプレッサーとして作用し得るかを説明し得る。ＭＥＣ１のように、細胞は、ＲｈｏＡ及びＲａｃ１の最適なＷｎｔ５ａ誘導性活性化をトリガーするためにはＲＯＲ１及びＲＯＲ２の両方の共発現を必要とし得る。ＲＯＲ１の不在下では、代わりにＷｎｔ５ａがＲＯＲ２を他のＦｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚｄ）受容体への結合に誘導する場合があり３７−３９、さもなければ、Ｗｎｔ３ａのような古典的Ｗｎｔファクターに応答したＬＲＰ５／６とのカップリングを誘導する２７，３２，３８，３９。考えられるところでは、ＲＯＲ２／Ｆｚｄ複合体はＬＰＲ／Ｆｚｄ複合体の形成と競合し得、これにより他のＷｎｔファクターが古典的Ｗｎｔシグナル伝達を誘導する能力が阻害され得る２７，３２，３８，３９。更に、ＲＯＲ２またはＷｎｔ５ａが腫瘍／増殖サプレッサー対腫瘍／増殖プロモーターとして働く能力は、部分的に、Ｗｎｔ５ａに応答してＲＯＲ２とカップリングし得るＲＯＲ１、ＬＰＲ５／６及びＦｚｄ受容体の相対的発現に依存し得る。
【０１３３】
ＲＯＲ２は、ＲＯＲ１よりも、出生後組織上でより広く発現するようであり、これはヘマトゴーン（ｈｅｍａｔｏｇｏｎｅｓ）と称される前駆体Ｂ細胞のまれな部分集団に限定されるようである１４。この研究で、我々は、ＣＬＬ４０に対する推定正常相対物である正常なＣＤ５  Ｂ細胞上にＲＯＲ２を見出した。考えられるところでは、前記細胞によるＲＯＲ１の獲得は白血病誘発の重要なステップであり得、我々がＣＬＬ患者の血漿中に比較的高いレベルで見出したＷｎｔ５ａに応答して腫瘍性Ｂ細胞はＲｈｏＡ及びＲａｃ１を活性化させ得る。我々は、抗ＲＯＲ１  ｍＡｂであるＵＣ−９６１でのＣＬＬ細胞の処理は、ＲＯＲ１のＲＯＲ２とのカップリングを混乱させ、Ｗｎｔ５ａに応答したＲｈｏ  ＧＴＰアーゼの活性化を干渉し得、これによりＷｎｔ５ａのケモカイン誘導性遊走またはＣＤ１５４誘導性増殖を高める能力が無効にされることを見出した。同様に、ＭＥＣ１−ＲＯＲ１細胞がインビトロでの増殖またはケモカイン誘導性遊走、またはインビボでの免疫不全マウスの移植の点で親ＭＥＣ１細胞よりもしのいでいたという優越性を、ＵＣ−９６１は、排除した。
【０１３４】
［実施例１］−Ｗｎｔ５ａはＣＬＬ増殖及び遊走を高める
ＣＬＬ細胞は、ＣＤ１５４を発現する細胞（ＨｅＬａＣＤ１５４）を外因性インターロイキン（ＩＬ）−４及びＩＬ−１０の存在下で培養すると増殖するように誘導され得る（図１ａ，ｂ）。外因性Ｗｎｔ５ａを添加すると、分裂細胞の割合、及びカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）を標識した細胞の蛍光から推測され得る細胞分裂の数が著しく高まった；Ｗｎｔ５ａにより誘導される増殖の増強は、抗ＲＯＲ１  ｍＡｂ（ＵＣ−９６１）によりＷｎｔ５ａなしの培養物中で観察されるレベルに匹敵するレベルまで抑制され得た（図１ａ，ｂ）。ＨｅＬａ細胞と共培養したＣＬＬ細胞は、たとえＩＬ−４／１０及び／またはＷｎｔ５ａの存在下でも、増殖を誘導されなかった（図７）。
【０１３５】
我々は、外因性Ｗｎｔ５はケモカイン、例えばＣＸＣＬ１２に向かうＣＬＬ細胞の遊走も高め得たことを確認した（図１ｃ）［４１］。遊走を高めるＷｎｔ５ａの能力はＵＣ−９６１により阻害され得た。しかしながら、ＣＸＣＬ１２の不在下での外因性Ｗｎｔ５ａはＣＬＬ細胞遊走を誘導せず、ＵＣ−９６１はＷｎｔ５ａの不在下でＣＬＬ細胞のＣＸＣＬ１２への遊走を阻害しなかった（図１ｃ）。
【０１３６】
Ｒｈｏファミリータンパク質は、増殖及び／または遊走の調節において重要な役割を果たし［４２］、Ｗｎｔ５ａは他の細胞型においてＲａｃ１及びＲｈｏＡを活性化すると報告されている［３８，４３］。我々は、Ｗｎｔ５ａは３０分以内にＲａｃ１及びＲｈｏＡの活性化を誘導し得たことを観察した（図１ｄ）。ＵＣ−９６１の添加はＲａｃ１及びＲｈｏＡのＷｎｔ５ａ誘導性活性化を阻害し得た（図１ｅ）。ＣＬＬ細胞をＨｅＬａ細胞ではなくＨｅＬａＣＤ１５４と共培養しても、Ｒａｃ１の活性化を誘導した（図１ｆ）。また、ＣＸＣＬ１２はＣＬＬ細胞においてＲｈｏＡを活性化した（図１ｇ）［４４］。いずれの場合も、外因性Ｗｎｔ５ａはそれぞれＣＤ１５４またはＣＸＣＬ１２により活性化されたＲａｃ１またはＲｈｏＡのレベルを高めた（図１ｆ，ｇ）。ｐ１６０ＲＯＣＫの選択的インヒビターであるＹ−２７６３２ではなく、Ｒａｃ１  ＧＴＰアーゼのインヒビターであるＮＳＣ−２３７６６は、外因性Ｗｎｔ５ａの存在または不在下でＨｅＬａＣＤ１５４により誘導される増殖を阻害し得た。一方、ＮＳＣ−２３７６６ではなく、Ｙ−２７６３２は外因性Ｗｎｔ５ａの存在または不在下でＣＸＣＬ１２への化学走性を阻害し得、Ｒａｃ１またはＲｈｏＡの活性化はそれぞれＣＬＬ細胞の増殖または遊走を促進し得るという見解が裏付けられる（図１ｈ−ｊ）。
【０１３７】
［実施例２］−ＣＬＬ及びＣＤ５  Ｂ細胞上のＲＯＲ２の検出
我々は、ＣＬＬ細胞ライゼートの抗ＲＯＲ１免疫沈降物（ｉｐ）に対して質量分析に基づくプロテオーム分析を実施した。驚くべきことに、我々はＲＯＲ１に加えてＲＯＲ２を検出した（図８Ａ）。あるグループはＣＬＬ細胞が特異的にＲＯＲ２の発現を欠くと報告しているので、ＲＯＲ２の検出は予期していなかった［１７］。しかしながら、我々は単離したＣＬＬ細胞においてＲＯＲ２  ｍＲＮＡを検出し（図８Ｂ）、イムノブロット分析により試験したすべてのサンプルにおいてＲＯＲ１及びＲＯＲ２の両方を検出した（図２ａ）。両タンパク質の表面発現は、ＣＤ５＋ＣＤ１９＋  ＣＬＬ細胞上において、フローサイトメトリーによっても検出された（図２Ｂ，２Ｄ及び８Ｃ）。
【０１３８】
我々は、ＣＤ５を共発現したＢ細胞を含めて、健康な成人のＣＤ１９＋血液Ｂ細胞もまた、ＲＯＲ２を発現したことを見出した（図２ｃ）。我々は、蛍光色素標識したイソタイプ対照ｍＡｂで染色した細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、抗ＲＯＲ２で染色した細胞のＭＦＩから差し引いて、ΔＭＦＩを求めた。健康な被験者のＣＤ５＋ＣＤ１９＋Ｂ細胞における平均ＲＯＲ２  ΔＭＦＩの５．１±０．３（ｎ＝１５）は、ＣＤ５ＮｅｇＣＤ１９＋Ｂ細胞の４．５±０．１よりも高いが、ＣＬＬ細胞の平均ＲＯＲ２  ΔＭＦＩ（２１．８±１．８，ｎ＝８０）よりも著しく低かった（図２ｄ）。我々は、ＣＤ１９Ｎｅｇ血液リンパ球上においてはＲＯＲ２を（図２ｃ，ｄ）、または健康ドナーの単核細胞上においてはＲＯＲ１を（図８Ｃ）検出しなかった。
【０１３９】
抗ＲＯＲ１または抗ＲＯＲ２  ｉｐのイムノブロット分析から、新鮮分離したＣＬＬ細胞においてＲＯＲ１がＲＯＲ２とカップリングしたことが確認された（図２ｅ）；しかながら、外因性Ｗｎｔ５ａで処理しない限り、ＲＯＲ１のＲＯＲ２とのカップリングはＷｎｔ５ａ欠乏培地において培養したＣＬＬ細胞ではあまり明らかでなかった（図２ｆ）。このことは、おそらく、外因性Ｗｎｔ５ａに応答して、ＲＯＲ１はインビボのＣＬＬ細胞において既にＲＯＲ２にカップリングしていたことを示す。この見解に一致して、我々はＣＬＬ患者血漿において同年齢の対照と比較して高レベルのＷｎｔ５ａを検出した（図２ｇ）。
【０１４０】
［実施例３］−ＵＣ−９６１はＲＯＲ１のＲＯＲ２とのカップリングを阻害する
我々は、ＵＣ−９６１により認識されたものとは異なるＲＯＲ１エピトープに対して特異的な非交差ブロッキングｍＡｂ（４Ａ５）を用いて蛍光共焦点顕微鏡検査を実施した。これにより、新鮮分離したＣＬＬ細胞ではＲＯＲ１はＲＯＲ２と共局在化したが（図３ａ）、ＣＤ５またはＣＤ１９とは共局在化しなかった（図９）ことが立証された。しかしながら、外因性Ｗｎｔ５ａで処理しない限り、培養ＣＬＬ細胞においてＲＯＲ１のＲＯＲ２との共局在化を検出することは難しかった（図３ｂ）。新鮮分離したまたはＷｎｔ５ａ処理したＣＬＬ細胞をＵＣ−９６１とインキュベートすると、ＲＯＲ１−ＲＯＲ２カップリングが明らかに分断していたが、非特異的ＩｇＧ（Ｃｔｒｌ−ＩｇＧ）とインキュベートした新たに単離したＣＬＬ細胞またはＷｎｔ５ａ処理したＣＬＬ細胞では、カップリングが容易に観察された（図３ａ，ｂ）。
【０１４１】
対照ｓｉＲＮＡではなく、それぞれＲＯＲ１またはＲＯＲ２に対して特異的なｓｉＲＮＡをＣＬＬ細胞にトランスフェクトすると、イムノブロット分析またはフローサイメトリーによりＲＯＲ１またはＲＯＲ２の発現のみが低下した（図１０Ａ−１０Ｂ）。ＲＯＲ１またはＲＯＲ２のいずれかのサイレンシングは、ＣＸＣＬ１２へのＣＬＬ細胞の遊走を高めるか（図３ｃ）、またはＲｈｏＡまたはＲａｃ１の活性化を誘導する（図３ｄ）Ｗｎｔ５ａの能力を阻害し、このことは、最適なＷｎｔ５ａ誘導性シグナル伝達がＲＯＲ１とＲＯＲ２との両方の共発現に依存したことを示す。
【０１４２】
［実施例４］−ＲＯＲ１−ＲＯＲ２複合体はＧＥＦを補充する
ＧＥＦは、ＲｈｏＡ及びＲａｃ１を活性化し得る［４５］。質量分析は、抗ＲＯＲ１  ｉｐにおいてＡＲＨＧＥＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２及びＡＲＨＧＥＦ６を検出した（図１１Ａ）。この関係は、抗ＲＯＲ１  ｉｐのイムノブロット分析により確認され、我々は、これらのＧＥＦの各々を含んでいることを見出した（図１１Ｂ）。更に、新鮮分離したＣＬＬ細胞のライゼートからＡＲＨＧＥＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２、またはＡＲＨＧＥＦ６のいずれかに対して特異的なｍＡｂを用いて得たｉｐは、それぞれが、イムノブロット分析により検出可能なＲＯＲ１を含んでいた（図１１Ｂ）。蛍光共焦点顕微鏡検査は、外因性Ｗｎｔ５ａで処理した培養ＣＬＬ細胞においてＲＯＲ１及びＲＯＲ２がＡＲＨＧＥＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２、またはＡＲＨＧＥＦ６と共局在化したことを示した（図４ａ−ｃ）。しかしながら、ＵＣ−９６１で処理すると、これらのＧＥＦのいずれか１つの、ＲＯＲ１またはＲＯＲ２のどちらかへの補充を誘導するＷｎｔ５ａの能力が阻害された（図１２Ａ）。
【０１４３】
我々は、Ｗｎｔ５ａで処理すると、ＡＲＨＧＥＦ１またはＡＲＨＧＥＦ２のいずれかに対して特異的があるが、ＡＲＨＧＥＦ６に対して特異的でないｍＡｂを用いて得たｉｐのＲｈｏＡに対するインビトロ交換活性が増大したことを見出した。更に、Ｗｎｔ５ａで処理すると、ＡＲＨＧＥＦ２またはＡＲＨＧＥＦ６のいずれかに対して特異的があるが、ＡＲＨＧＥＦ１に対して特異的でないｍＡｂを用いて得たｉｐを用いて、Ｒａｃ１に対するインビトロ交換活性が増大したことを見出した（図４Ｄ及び１２Ｂ）。ＵＣ−９６１で処理すると、それぞれ抗ＡＲＨＧＥＦ１または抗ＡＲＨＧＥＦ２から得たｉｐによるＲｈｏＡの活性化、または抗ＡＲＨＧＥＦ２または抗ＡＲＨＧＥＦ６のｉｐによるＲａｃ１の活性化を誘導するＷｎｔ５ａの能力が阻害された（図４ｅ）。
【０１４４】
Ｗｎｔ５ａは、ＡＲＨＧＥＦ１またはＡＲＨＧＥＦ２のずれかに対して特異的なｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＣＬＬ細胞では対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＣＬＬ細胞よりも、ＲｈｏＡの活性化において有効性が低かった（図４Ｆ及び１２Ｃ）。一方、Ｗｎｔ５ａはＡＲＨＧＥＦ２またはＡＲＨＧＥＦ６のいずれかに対して特異的なｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＣＬＬ細胞ではＲａｃ１の活性化において有効性が低かった（図４Ｆ及び１２Ｃ）。しかしながら、それぞれＡＲＨＧＥＦ１またはＡＲＨＧＥＦ６に対してサイレントなＣＬＬ細胞は、Ｒａｃ１またはＲｈｏＡのＷｎｔ５ａ誘導性活性化を減じておらず（図１２Ｄ）、ＡＲＨＧＥＦ１とＡＲＨＧＥＦ２、またはＡＲＨＧＥＦ２とＡＲＨＧＥＦ６がそれぞれ、ＲｈｏＡまたはＲａｃ１の最適Ｗｎｔ５ａ誘導性活性化のために必要であったことを示した。
【０１４５】
実施例５−ＲＯＲ１の機能的ドメインのマッピング
ＭＥＣ１細胞はＣＬＬに由来し、この白血病に対する細胞モデルとして使用されている［３０］。しかしながら、我々は、ＭＥＣ１細胞はＲＯＲ１を欠くが、ＲＯＲ２を発現したことを見出した（図１３Ａ）。完全長ＲＯＲ１、または別の構造ドメインを欠く各種末端切断形態のＲＯＲ１の各々をエンコードするベクターでＭＥＣ１を安定的にトランスフェクトすると、我々は、高レベルの表面ＲＯＲ１を発現したＭＥＣ１を得ることができた。これは、４Ａ５  ｍＡｂを用いるフローサイトメトリーにより検出することが可能であった（図１３Ａ）。ＲＯＲ１または各種末端切断形態のＲＯＲ１のいずれか１つを発現させても、表面ＲＯＲ２の発現レベルは変わらなかった（図１３Ａ）。
【０１４６】
ＭＥＣ１細胞は高レベルのＷｎｔ５ａを発現するので（図１３Ｂ）［４１］、我々はＲＯＲ１を発現するように作ったＭＥＣ１細胞において構成的ＲＯＲ１−ＲＯＲ２カップリングを評価した。我々は、細胞外ＫＮＧドメインを欠くＲＯＲ１をトランスフェクトしたＭＥＣ１（ＭＥＣ１−ΔＫＮＧ）を除いて、トランスフェクタントの各々においてＲＯＲ１とカップリングしたＲＯＲ２を検出した（図５Ａ及び１４Ａ）。蛍光共焦点顕微鏡検査から、ＲＯＲ１及びＲＯＲ２がＭＥＣ１−ＲＯＲ１細胞においてＡＲＨＧＥＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２またはＡＲＨＧＥＦ６と共局在化したことが立証された（図５ｂ）。しかしながら、我々は、末端切断形態のＲＯＲ１のいずれかを発現したＭＥＣ１細胞においてＲＯＲ１−ＲＯＲ２とこれらのＧＥＦのいずれか１つとの共局在化を観察しなかった（図１４Ｂ−１４Ｃ）。ＭＥＣ１−ＲＯＲ１細胞もＭＥＣ１よりも活性化したＲａｃ１及びＲｈｏＡのより高いレベルを有していた（図５ｃ）；こうした活性化の増大はＵＣ−９６１またはＷｎｔ５ａに対する中和抗体のどちらかで処理することにより阻害され得た（図５ｄ）。しかしながら、各種の末端切断形態のＲＯＲ１のいずれか１つをトランスフェクトしたＭＥＣ１細胞は、親ＭＥＣ１細胞よりも高レベルの活性化したＲａｃ１またはＲｈｏＡを有していなかった。
【０１４７】
我々は、ＭＥＣ１の増殖を各種ＲＯＲ１構築物の各々をトランスフェクトしたＭＥＣ１細胞と比較した。ＭＥＣ１−ＲＯＲ１細胞は、親ＭＥＣ１細胞または末端切断形態のＲＯＲ１のいずれか１つをトランスフェクトしたＭＥＣ１細胞よりも速く増殖した（図５ｅ）。Ｗｎｔ５ａに対する中和抗体またはＵＣ−９６１のどちらかで処理するとＭＥＣ１−ＲＯＲ１細胞の増殖が阻害され得た（図５ｆ）。更に、ＭＥＣ１−ＲＯＲ１は、ＭＥＣ１細胞、または末端切断形態のＲＯＲ１のいずれかを発現するＭＥＣ１よりもＣＣＬ２１に応答して非常にうまく遊走した（図５ｇ）。Ｗｎｔ５ａに対する中和抗体またはＵＣ−９６１のいずれかで処理すると、ＣＣＬ２１に応答してＭＥＣ１−ＲＯＲ１細胞の遊走が阻害され得た（図５ｈ）。まとめると、これらのデータは、ＲｈｏＡ及びＲａｃ１のＷｎｔ５ａ誘導性活性化に関与するＧＥＦを一緒に補充するＲＯＲ１のＲＯＲ２との共局在化をＷｎｔ５ａが誘導するモデルを裏付ける（図５ｉ）。
【０１４８】
実施例６−ＵＣ−９６１  ｍＡｂはインビボでＣＬＬの進行を阻害する
以前の研究は、ＭＥＣ１細胞を免疫不全マウスに移植し得たことを示した［４６］。同数のＭＥＣ１細胞またはＭＥＣ１−ＲＯＲ１細胞を静脈内注入してから３週間後にＭＥＣ１−ＲＯＲ１細胞を移植したＲａｇ２−／−γｃ−／−マウスは、ＭＥＣ１を注入した同腹子よりも有意により大きい脾臓腫大及びＣＤ１９＋ヒト白血病の骨髄転移を有していた（図６ａ，ｂ）。しかしながら、ＵＣ−９６１で処理するとＭＥＣ１−ＲＯＲ１の移植は大きく阻害された（図６ｃ−ｅ）。更に、ＵＣ−９６１で処理したマウスから収集したＭＥＣ１−ＲＯＲ１細胞はＲＯＲ１の発現が失われていたか、または減衰していた（図６ｄ）。
【０１４９】
【表１】
0006704000.tif 000002
0006704000.tif 000003
0006704000.tif 000004
0006704000.tif 000005
【０１５０】
ＩＶ．実施形態
本発明において考えられる実施形態は以下を含む。
【０１５１】
実施形態Ｐ１．  ａ．ＲＯＲ１及びＲＯＲ２を共発現するＣＬＬ細胞をＷｎｔ５ａと接触させ；ｂ．ＣＬＬ細胞を物質または対照と接触させ；ｃ．ＲＯＲ１とＲＯＲ２のカップリングの存在または不在を調べることを含む、ＲＯＲ１とＲＯＲ２のカップリングを分断させる物質の同定方法であって、対照細胞と比較して物質と接触させた細胞におけるＲＯＲ１とＲＯＲ２のカップリングの不在はＲＯＲ１とＲＯＲ２のカップリングの分断を示し、これによりＲＯＲ１とＲＯＲ２のカップリングを分断させる物質を同定する方法。
【０１５２】
実施形態Ｐ２．  物質は抗体、ペプチド、小分子、またはｓｉＲＮＡである、実施形態Ｐ１の方法。
【０１５３】
実施形態Ｐ３．  物質は抗体である、実施形態Ｐ１またはＰ２の方法。
【０１５４】
実施形態Ｐ４．  抗体はＵＣ−９６１である、実施形態Ｐ１〜Ｐ３の１つの方法。
【０１５５】
実施形態Ｐ５．  物質はｓｉＲＮＡである、実施形態Ｐ１〜Ｐ４の１つの方法。
【０１５６】
実施形態Ｐ６．  ｓｉＲＮＡはＲＯＲ１またはＲＯＲ２に対して特異的である、実施形態Ｐ５の方法。
【０１５７】
実施形態Ｐ７．  ＲＯＲ１とＲＯＲ２カップリングの存在または不在をＲＯＲ１とＲＯＲ２の共局在化またはＷｎｔ５ａ活性の阻害を測定することにより調べる、実施形態Ｐ１〜Ｐ６の１つの方法。
【０１５８】
実施形態Ｐ８．  ＲＯＲ１とＲＯＲ２の共局在化またはＷｎｔ５ａ活性の阻害を蛍光アッセイを用いて調べる、実施形態Ｐ７の方法。
【０１５９】
実施形態Ｐ９．  蛍光アッセイは蛍光共焦点顕微鏡検査、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、質量分光法及び細胞ベースアッセイからなる群から選択される、実施形態Ｐ８の方法。
【０１６０】
実施形態Ｐ１０．  Ｗｎｔ５ａ活性の阻害が、対照細胞と比較して物質と接触させた細胞におけるＲｈｏＡ及びＲＡＣ１活性の低下または欠如により示される、実施形態Ｐ７の方法。
【０１６１】
実施形態Ｐ１１．  Ｗｎｔ５ａ活性の阻害が、対照細胞と比較して物質に接触させた細胞におけるＡＲＨＧＥＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２及び／またはＡＲＨＧＥＦ６発現の低下または欠如により示される、実施形態Ｐ７の方法。
【０１６２】
実施形態Ｐ１２．  ＣＬＬ細胞はＭＥＣ１細胞である、実施形態Ｐ１〜Ｐ１１の１つの方法。
【０１６３】
実施形態Ｐ１３．  ＲＯＲ１とＲＯＲ２のカップリングを阻害する単離抗体。
【０１６４】
実施形態Ｐ１４．  抗体はモノクローナル、キメラ、ヒト、またはヒト化である、実施形態Ｐ１３の抗体。
【０１６５】
実施形態Ｐ１５．  抗体はＷｎｔ５ａ活性を阻害する、実施形態Ｐ１３の抗体。
【０１６６】
実施形態Ｐ１６．  Ｗｎｔ５ａ活性の阻害が、ＲｈｏＡ及び／またはＲａｃ１活性の阻害により示され、実施形態Ｐ１５の抗体。
【０１６７】
実施形態Ｐ１７．  Ｗｎｔ５ａ活性の阻害が、ＡＲＨＧＥＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２及び／またはＡＲＨＧＥＦ６の補充の低下または欠如により示される、実施形態Ｐ１５の抗体。
【０１６８】
実施形態Ｐ１８．  抗体はＲＯＲ１のＫＮＧドメインをＲＯＲ２とのカップリングからブロックする、実施形態Ｐ１３の抗体。
【０１６９】
実施形態Ｐ１９．  ＣＬＬの治療の必要がある被験者に対してＲＯＲ１とＲＯＲ２のカップリングを分断させる物質を投与することを含むＣＬＬの治療方法。
【０１７０】
本発明において考えられる更なる実施形態は以下を含む。
【０１７１】
実施形態１．  （ｉ）反応容器において被験物質をＲＯＲ１タンパク質及びＲＯＲ２タンパク質と混合し；（ｉｉ）標準対照と比較してＲＯＲ１タンパク質のＲＯＲ２タンパク質に対する結合の低下を検出し、これによりＲＯＲ１−ＲＯＲ２結合のインヒビターを同定することを含むＲＯＲ１−ＲＯＲ２結合のインヒビターの同定方法。
【０１７２】
実施形態２．  検出は被験物質の存在下でＲＯＲ２タンパク質に結合したＲＯＲ１タンパク質のレベルを検出することを含み、標準対照と比較してＲＯＲ２タンパク質に結合したＲＯＲ１タンパク質の低いレベルは該被験物質がＲＯＲ１−ＲＯＲ２結合のインヒビターであることを示す、実施形態１の方法。
【０１７３】
実施形態３．  検出は被験物質の存在下で非結合ＲＯＲ１タンパク質または非結合ＲＯＲ２タンパク質のレベルを検出することを含み、標準対照と比較して非結合ＲＯＲ１タンパク質の高いレベルまたは非結合ＲＯＲ２タンパク質の高いレベルは、該被験物質がＲＯＲ１−ＲＯＲ２結合のインヒビターであることを示す、実施形態１の方法。
【０１７４】
実施形態４．  ＲＯＲ１タンパク質及びＲＯＲ２タンパク質は検出可能部分を含む、実施形態１〜３の１つの方法。
【０１７５】
実施形態５．  検出は被験物質の存在下でグアニン交換因子（ＧＥＦ）またはグアノシントリホスファターゼ（ＧＴＰアーゼ）のレベルを検出することを含み、標準対照と比較してＧＥＦの低いレベルは、該被験物質がＲＯＲ１−ＲＯＲ２結合のインヒビターであることを示す、実施形態１の方法。
【０１７６】
実施形態６．  ＧＥＦはＡＲＨＧＥＦ１、ＡＲＨＧＥＦ２、またはＡＲＨＧＥＦ６である、実施形態５の方法。
【０１７７】
実施形態７．  ＧＴＰアーゼはＲｈｏＡまたはＲａｃ１である、実施形態５の方法。
【０１７８】
実施形態８．  ＧＥＦまたはＧＴＰアーゼは検出可能部分を含む、実施形態５〜７の１つの方法。
【０１７９】
実施形態９．  混合はＷｎｔ５ａタンパク質の存在下で行われる、実施形態１〜８の１つの方法。
【０１８０】
実施形態１０．  反応容器は固体支持体を含むカラムである、実施形態１〜９の１つの方法。
【０１８１】
実施形態１１．  反応容器は細胞を含む、実施形態１〜９の１つの方法。
【０１８２】
実施形態１２．  ＲＯＲ１タンパク質及びＲＯＲ２タンパク質は細胞の表面上で発現する、実施形態１１の方法。
【０１８３】
実施形態１３．  細胞はがん細胞である、実施形態１１または１２の方法。
【０１８４】
実施形態１４．  がん細胞は慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）細胞である、実施形態１３の方法。
【０１８５】
実施形態１５．  ＣＬＬ細胞はＭＥＣ１細胞である、実施形態１４の方法。
【０１８６】
実施形態１６．  細胞はインビトロ細胞培養物の一部を形成する、実施形態１１〜１４の１つの方法。
【０１８７】
実施形態１７．  細胞は生物の一部を形成する、実施形態１１〜１６の１つの方法。
【０１８８】
実施形態１８．  生物は哺乳動物である、実施形態１７の方法。
【０１８９】
実施形態１９．  生物はマウスである、実施形態１７の方法。
【０１９０】
実施形態２０．  被験物質は抗体、小分子、ペプチド、タンパク質、または核酸である、実施形態１〜１９の１つの方法。
【０１９１】
実施形態２１．  被験物質は抗体である、実施形態１〜１７の１つの方法。
【０１９２】
実施形態２２．  抗体は抗ＲＯＲ１抗体である、実施形態１７または１８の方法。
【０１９３】
実施形態２３．  抗体は抗ＲＯＲ２抗体である、実施形態１７または１８の方法。
【０１９４】
実施形態２４．  抗体はＲＯＲ１タンパク質またはＲＯＲ２タンパク質に結合する、実施形態１７〜２０の１つの方法。
【０１９５】
実施形態２５．  抗体はＫＮＧドメインに結合する、実施形態２１の方法。
【０１９６】
実施形態２６．  抗体はヒト化抗体である、実施形態１７〜２２の１つの方法。
【０１９７】
実施形態２７．  抗体はキメラ抗体である、実施形態１７〜２２の１つの方法。
【０１９８】
実施形態２８．  抗体はｓｃＦｖである、実施形態１７〜２２の１つの方法。
【０１９９】
実施形態２９．  実施形態１〜２２のいずれか１つの方法により同定した抗体。
【０２００】
実施形態３０．  （ｉ）実施形態１〜２２のいずれか１つの方法により同定した化合物をＲＯＲ１−ＲＯＲ２複合体と接触させ、ここで、ＲＯＲ１−ＲＯＲ２複合体はＲＯＲ１タンパク質及びＲＯＲ２タンパク質を含み；（ｉｉ）化合物によりＲＯＲ１タンパク質とＲＯＲ２タンパク質との間の相互作用を阻害させ、これによりＲＯＲ１−ＲＯＲ２相互作用を阻害することを含む、ＲＯＲ１−ＲＯＲ２相互作用の阻害方法。
【０２０１】
実施形態３１．  がんの治療の必要がある被験者に対して治療有効量の実施形態１〜２２の１つの方法により同定した抗体、小分子、ペプチド、または核酸を投与することを含む、前記被験者におけるがんの治療方法。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図１Ｊ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
0006704000.tif 000033
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
0006704000.tif 000055
【図１１Ａ−１】
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【図１１Ａ−２】
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【図１１Ａ−３】
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【図１１Ｂ】
0006704000.tif 000059
【図１２Ａ−１】
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【図１２Ａ−２】
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【図１２Ａ−３】
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【図１２Ｂ】
0006704000.tif 000063
【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
0006704000.tif 000065
【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
0006704000.tif 000069
【図１４Ｃ】
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【配列表】
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