(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃａｔｈ−Ｄの触媒活性と、そのＬＲＰ１レセプターへの結合との両方を阻害する、単離されたヒトモノクローナル抗体であって、
Ｈ−ＣＤＲ１領域に配列番号：２、Ｈ−ＣＤＲ２領域に配列番号：３及びＨ−ＣＤＲ３領域に配列番号：４を含む重鎖可変領域と、Ｌ−ＣＤＲ１領域に配列番号：６、Ｌ−ＣＤＲ２領域に配列番号：７及びＬ−ＣＤＲ３領域に配列番号：８を含む軽鎖可変領域とを含む、単離されたヒトモノクローナル抗体。
【請求項２】
前記抗体の重鎖可変領域が、配列番号：１に記載されているアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
軽鎖可変領域が、配列番号：５に記載されているアミノ酸配列を有する、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体の重鎖可変領域が、配列番号：１に記載されているアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が、配列番号：５に記載されているアミノ酸配列を有する、請求項２又は３に記載の抗体。
【請求項５】
Ｈ−ＣＤＲ１領域に配列番号：１０、Ｈ−ＣＤＲ２領域に配列番号：１１及びＨ−ＣＤＲ３領域に配列番号：１２を含む重鎖可変領域と、Ｌ−ＣＤＲ１領域に配列番号：１４、Ｌ−ＣＤＲ２領域に配列番号：１５及びＬ−ＣＤＲ３領域に配列番号：１６を含む軽鎖可変領域とを含む、Ｃａｔｈ−Ｄの触媒活性と、そのＬＲＰ１レセプターへの結合との両方を阻害する、単離されたヒトモノクローナル抗体。
【請求項６】
前記抗体の重鎖可変領域が、配列番号：９に記載されているアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
軽鎖可変領域が、配列番号：１３に記載されているアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体の重鎖可変領域が、配列番号：９に記載されているアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が、配列番号：１３に記載されているアミノ酸配列を有する、請求項６又は７に記載の抗体。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の抗体の重鎖又は軽鎖をコードする、核酸。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項１１】
請求項９に記載の核酸又は請求項１０に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれかに記載の抗体を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
薬物として使用するための、請求項１〜８のいずれかに記載の抗体。
【請求項１４】
乳ガンを処置するための医薬組成物であって、請求項１〜８のいずれかに記載のヒト抗Ｃａｔｈ−Ｄモノクローナル抗体を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、ヒト抗Ｃａｔｈ−Ｄ中和モノクローナル抗体及びその使用に関する。より具体的には、本発明は、Ｃａｔｈ−Ｄの触媒活性と、そのＬＲＰ１（ＬＤＬレセプター関連タンパク質−１）レセプターへの結合との両方を阻害するヒトモノクローナル抗体フラグメントに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景：
乳ガンは、先進国における女性の主要な死亡原因の１つである［１］。発生率の高いトリプルネガティブ乳ガン（ＥＲ−及びＰＲ−、ＨＥＲ２非増幅）の治療は不十分な状態である。加えて、ＥＲ＋乳ガンは、ホルモン療法に対しても耐性になった。したがって、乳ガンの新規処置が緊急に必要とされている。腫瘍進行は、腫瘍細胞と、腫瘍間質として知られている周囲の支持組織との間のクロストークの進化の結果として認識されている［２］。ガン細胞は、細胞外マトリックス内のいくつかの正常細胞型、例えば線維芽細胞、浸潤性免疫細胞、内皮細胞及び脂肪細胞などと動的に相互作用する。間質細胞と腫瘍細胞とは、局所の細胞外マトリックスを改変し、遊走及び浸潤を刺激し、間質細胞及び腫瘍細胞の増殖及び生存を促進する酵素、成長因子及びサイトカインをやり取りする。過去１０年間において、メタロプロテイナーゼ、セリンプロテアーゼ、システイン及びアスパラギン酸カテプシンなどの分子が相互作用して腫瘍形成促進性タンパク質分解ネットワークを形成する細胞周囲の微小環境を腫瘍細胞が作り出すことが次第に明らかになっている［３］。したがって、細胞外プロテアーゼは、ガンにおいてディファレンシャルに発現するので、主要な創薬ターゲットである［４〜６］。
【０００３】
リソソームアスパラギン酸プロテアーゼカテプシンＤ（Ｃａｔｈ−Ｄ）は、タンパク質異化に関与する最も多く存在するリソソームエンドプロテイナーゼの１つである。ヒトＣａｔｈ−Ｄは、５２kDaの前駆体として合成され、エンドソーム内で４８kDaの活性な一本鎖中間体に変換され、次いでリソソーム内で、３４kDaの重鎖及び１４kDaの軽鎖からなる完全に活性な成熟プロテアーゼに変換される。Ｃａｔｈ−Ｄ触媒部位は、２つの重要なアスパラギン酸残基（アミノ酸３３及び２３１）を有する。Ｃａｔｈ−Ｄは、タンパク質分解活性を有するためには、酸性ｐＨを必要とする。Ｃａｔｈ−Ｄは、多くの固形腫瘍；乳ガン、メラノーマ、卵巣ガン、肺ガン、肝臓ガン、膵臓ガン、子宮内膜ガン、頭頸部ガン、膀胱ガン、悪性神経膠腫によって大量に過剰産生及び分泌される［７］。Ｃａｔｈ−Ｄは、転移に関連する乳ガンの十分に確立された独立した予後不良マーカーである［８、９］。いくつかのグループは、Ｃａｔｈ−Ｄがガン及び間質細胞挙動の両方に影響を与えることを示している。乳ガン細胞（ＢＣＣ）におけるＣａｔｈ−Ｄ発現の阻害は、腫瘍成長及び転移を減少させる［１０、１１］。ガン細胞にトランスフェクションされたヒトプロＣａｔｈ−Ｄ  ｃＤＮＡは、ガン細胞増殖、腫瘍成長及び血管新生並びに転移を促進する［１２〜１５］。ヒトプロＣａｔｈ−Ｄ  ｃＤＮＡでトランスフェクションされたＣａｔｈ−Ｄ−／−ＭＥＦ線維芽細胞は、三次元マトリックスにおいてより多くの伸長をもたらす［１６］。本発明者らは、乳ガン細胞によるＣａｔｈ−Ｄの過剰産生が、細胞外環境への５２kDaのプロＣａｔｈ−Ｄの自己分泌特異的過剰分泌につながることを示した［１７、１８］。プロＣａｔｈ−Ｄはまた、マクロファージ浸潤炎症性腫瘍によって、及び炎症性サイトカインに応じて内皮細胞によって分泌される［１９、２０］。分泌型ヒトプロＣａｔｈ−Ｄは、ＢＣＣの増殖［１７、１８］、線維芽細胞の伸長［１６］及び内皮細胞の成長［２１］を刺激する。in vitroでは、５２kDaの精製プロＣａｔｈ−Ｄは酸依存性の自己活性化を受けて、１８個の残基（２７〜４４）のプロセグメントを保持する５１kDaの触媒的に活性なシュードＣａｔｈ−Ｄを形成する［２２］。過剰な細胞酸の産生により、低酸素腫瘍及び炎症性腫瘍の細胞外微小環境は酸性であるので［２３〜２５］、５２kDaの分泌型プロＣａｔｈ−Ｄは、５１kDaのタンパク質分解的に活性なシュードＣａｔｈ−Ｄへと局所的に自己活性化し得る。腫瘍において見られる低ｐＨ（６．８〜５．５）では、ＢＣＣによって分泌されたＣａｔｈ−Ｄは、シスタチンＣ（システインカテプシンの最も強力な細胞外阻害因子の１つ）を分解する［２６］。そして、これがシステインカテプシンタンパク分解活性を増強するが、これは、プロテアーゼウェブの新たな関連性を示している［２７］。加えて、分泌型Ｃａｔｈ−Ｄはまた、その触媒活性とは無関係に、腫瘍微小環境のＢＣＣ及び間質細胞に影響を与える［１３、１６］。Vetvickaのグループは、ＢＣＣに対するＣａｔｈ−Ｄ自己分泌細胞分裂促進成長因子活性が、未知の細胞表面レセプターと相互作用するＣａｔｈ−Ｄプロペプチド内の９アミノ酸のストレッチ（ａａ３６〜４４）に局在するその活性化ペ���チドによって媒介されることを記載した［２８］。分泌型Ｃａｔｈ−Ｄはまた、ＬＲＰ１レセプター（ＬＤＬレセプター関連タンパク質−１）に対する結合を介して、乳房線維芽細胞の伸長を促進する［２９、３０］。まとめると、これらの知見は、タンパク質分解及び非タンパク質分解分子機構の両方によって、分泌型プロＣａｔｈ−Ｄの発ガン機能の十分な証拠を提供している。また、初期の乳ガン、メラノーマ、卵巣ガン及び肺ガンでは、抗Ｃａｔｈ−Ｄ自己抗体［３１］が検出されているが［３２〜３５］、これは、Ｃａｔｈ−Ｄが腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）と考えられ得ることを示している。
【０００４】
腫瘍微小環境に放出されたＣａｔｈ−Ｄのターゲティングは、その触媒活性の阻害剤の使用だけではなく、その相互作用機能を阻害する新たなツールの開発を必要とするであろう。腫瘍部位への治療剤の抗体ベースの送達は、現代抗ガン研究の新興分野であり、正常組織を害さずに生物活性分子を新生物病変に集中させることを保証する。本来、ガン細胞上の膜抗原に特異的なモノクローナル抗体は、腫瘍ターゲティング用途に使用されてきた。別のターゲット、例えば、腫瘍微小環境において過剰分泌されるプロテアーゼの抗体ベースのターゲティングは、薬理学的送達用途のためのさらなる魅力的な手段である［３６］。
【０００５】
トリプルネガティブ（ＥＲ−及びＰＲ−、ＨＥＲ２非増幅）及びホルモン耐性乳ガンのために、新たな処置が必要とされる。乳ガンの独立した予後不良マーカーであるアスパラギン酸プロテアーゼカテプシンＤ（Ｃａｔｈ−Ｄ）は、乳ガン微小環境において過剰発現及び過剰分泌される。分泌型Ｃａｔｈ−Ｄは、シスタチンＣ（最も強力なシステインカテプシン阻害因子）を分解することによって、及びＬＤＬレセプター関連タンパク質−１（ＬＲＰ１）を介して乳房線維芽細胞の伸長をトリガーすることによって、乳房腫瘍微小環境に影響を与え得る。したがって、乳ガンにおける分泌型Ｃａｔｈ−Ｄのターゲティングは、その触媒活性及びその相互作用機能の阻害剤の使用を必要とする。
【発明の概要】
【０００６】
第１の態様では、本発明は、Ｃａｔｈ−Ｄの触媒活性と、そのＬＲＰ１レセプターへの結合との両方を阻害する単離されたヒトモノクローナル抗体又はそのフラグメントに関する。
【０００７】
第２の態様では、本発明は、Ｈ−ＣＤＲ１領域に配列番号：２、Ｈ−ＣＤＲ２領域に配列番号：３及びＨ−ＣＤＲ３領域に配列番号：４を含む重鎖可変領域と、Ｌ−ＣＤＲ１領域に配列番号：６、Ｌ−ＣＤＲ２領域に配列番号：７及びＬ−ＣＤＲ３領域に配列番号：８を含む軽鎖可変領域とを含む単離されたヒトモノクローナル抗体又はそのフラグメントに関する。
【０００８】
第３の態様では、本発明は、Ｈ−ＣＤＲ１領域に配列番号：１０、Ｈ−ＣＤＲ２領域に配列番号：１１及びＨ−ＣＤＲ３領域に配列番号：１２を含む重鎖可変領域と、Ｌ−ＣＤＲ１領域に配列番号：１４、Ｌ−ＣＤＲ２領域に配列番号：１５及びＬ−ＣＤＲ３領域に配列番号：１６を含む軽鎖可変領域とを含む単離されたヒトモノクローナル抗体又はそのフラグメントに関する。
【０００９】
第４の態様では、本発明は、薬物として使用するための本発明の抗体又はそのフラグメントに関する。
【００１０】
第５の態様では、本発明は、乳ガンを処置するための方法において使用するための、単離されたヒト抗Ｃａｔｈ−Ｄモノクローナル抗体又はそのフラグメントに関する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明者らは、ファージディスプレイによる、Ｃａｔｈ−Ｄに特異的なヒトモノクローナル抗体ｓｃＦｖフラグメントの単離及び特性評価について記載した。Ｃａｔｈ−Ｄのタンパク質分解活性と、線維芽細胞ＬＲＰ１レセプターへの結合との両方を阻害する能力について、Ｃａｔｈ−Ｄ結合ｓｃＦｖを機能的にスクリーニングした。ＩｇＧ１、λフォーマットでクローニングした２つのｓｃＦｖ（抗Ｃａｔｈ−Ｄ  ＩｇＧ１  Ｆ１及びＥ２）は、トリプルネガティブ及びＥＲ＋乳ガン細胞の創傷治癒、コロニー形成及びマトリゲルにおける三次元伸長を阻害した。抗Ｃａｔｈ−Ｄ  ＩｇＧ１  Ｆ１及びＥ２は、ヌードマウスにおけるトリプルネガティブＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳ガン細胞の腫瘍成長を有意に減少させた。これらの知見は、乳房腫瘍微小環境内のＣａｔｈ−Ｄの抗体ベースのターゲティングが乳ガン処置に治療上有効であり得ることを強く示唆している。
【００１２】
定義：
本明細書を通じて、いくつかの用語が用いられ、以下の段落で定義される。
【００１３】
「Ｃａｔｈ−Ｄ」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、リソソームアスパラギン酸プロテアーゼカテプシン−Ｄを指す。Ｃａｔｈ−Ｄは、プロＣａｔｈ−Ｄと称される５２kDaの触媒的に不活性な前駆体として合成される。それは、エンドソーム内では４８kDaの活性な一本鎖中間体として存在し、続いてリソソーム内で、３４kDaの重鎖及び１４kDaの軽鎖から構成される完全に活性な成熟プロテアーゼに変換される。天然に存在するプロＣａｔｈ−Ｄタンパク質は、GenbankアクセッションナンバーＮＰ＿００１９００に示されているアミノ酸配列を有する。
【００１４】
「抗Ｃａｔｈ−Ｄ抗体」という用語は、Ｃａｔｈ−Ｄに対する抗体を指す。
【００１５】
本発明によれば、「抗体」又は「イムノグロブリン」という用語は、同一の意味を有し、本発明において同様に使用される。本明細書で使用される「抗体」という用語は、イムノグロブリン分子、及びイムノグロブリン分子の免疫学的活性部分（すなわち、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子）を指す。したがって、抗体という用語は、抗体分子全体だけではなく、抗体フラグメント、並びに抗体及び抗体フラグメントの変異体（誘導体を含む）を包含する。天然抗体では、２本の重鎖がジスルフィド結合によって互いに連結しており、各重鎖はジスルフィド結合によって軽鎖に連結している。ラムダ（ｌ）及びカッパ（ｋ）という２種類の軽鎖がある。抗体分子の機能活性を決定する主要な５つの重鎖クラス（又はアイソタイプ）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４などの区別可能なサブクラスを包含する）、ＩｇＡ及びＩｇＥがある。各鎖は、別個の配列ドメインを含有する。軽鎖は、２個のドメイン（可変ドメイン（ＶＬ）及び定常ドメイン（ＣＬ））を含む。重鎖は、４個のドメイン（可変ドメイン（ＶＨ）及び３個の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３。ＣＨと総称される））を含む。軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）の両方の可変領域は、抗原に対する結合認識及び特異性を決定する。軽鎖（ＣＬ）及び重鎖（ＣＨ）の定常領域ドメインは、重要な生物学的特性、例えば抗体鎖の会合、分泌、経胎盤移動性、補体結合、及びＦｃレセプター（ＦｃＲ）に対する結合を付与する。Ｆｖフラグメントは、免疫グロブリンのＦａｂフラグメントのＮ末端部分であり、１本の軽鎖及び１本の重鎖の可変部分から構成される。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基との間の構造的相補性にある。抗体結合部位は、超可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）に主に由来する残基から構成される。時には、非超可変領域又はフレームワーク領域（ＦＲ）に由来する残基が全体的なドメイン構造、したがって結合部位に影響を与える。相補性決定領域又はＣＤＲは、ネイティブな免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性及び特異性を共に規定するアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖はそれぞれ、３個のＣＤＲ（それぞれＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３及びＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３と称される）を有する。したがって、抗原結合部位は、重鎖及び軽鎖Ｖ領域のそれぞれに由来するＣＤＲセットを含む６個のＣＤＲを含む。フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲ間に介在するアミノ酸配列を指す。
【００１６】
本明細書で使用される「Ｆａｂ」という用語は、約５０，０００の分子量及び抗原結合活性を有する抗体フラグメントであって、ＩｇＧをプロテアーゼ（パパイン）で処理することによって得られるフラグメントのうち、Ｈ鎖のＮ末端側のほぼ半分及びＬ鎖全体がジスルフィド結合によって共に結合している抗体フラグメントを意味する。
【００１７】
本明細書で使用される「Ｆ（ａｂ’）２」という用語は、約１００，０００の分子量及び抗原結合活性を有する抗体フラグメントであって、ＩｇＧをプロテアーゼ（ペプシン）で処理することによって得られるフラグメントのうち、ヒンジ領域のジスルフィド結合によって結合している、Ｆａｂよりもわずかに大きな抗体フラグメントを指す。
【００１８】
本明細書で使用される「Ｆａｂ’」という用語は、約５０，０００の分子量及び抗原結合活性を有する抗体フラグメントであって、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによって得られる抗体フラグメントを指す。
【００１９】
本明細書で使用される「一本鎖Ｆｖ」（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドという用語は、ペプチドコードリンカーによって連結されたＶＨ及びＶＬコード遺伝子を含む遺伝子融合体から、通常、発現される共有結合ＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。
【００２０】
本明細書で使用される「ｄｓＦｖ」という用語は、ジスルフィド結合によって安定化されたＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。二価抗体フラグメント及び多価抗体フラグメントは、一価ｓｃＦｖの会合によって自然に形成し得るか、又はペプチドリンカーによって一価ｓｃＦｖをカップリングすることによって作製され得る（例えば、二価ｓｃ（Ｆｖ）２）。
【００２１】
本明細書で使用される「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントであって、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が同じポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結されたもの（ＶＨ−ＶＬ）を含む小さな抗体フラグメントを指す。同じ鎖上の２個のドメイン間のペアリングを可能にするには短過ぎるリンカーを使用することによって、前記ドメインを別の鎖の相補的ドメインと強制的にペアリングさせて、２つの抗原結合部位を作る。
【００２２】
本明細書で使用される「中和抗体」という用語は、該抗体が特異的に結合するエピトープを含むポリペプチドの少なくとも１つの活性を遮断又は低減する抗体を指す。中和抗体は、in cellulo及び／又はin vivo試験においてカテプシンＤの生物学的活性を低減する。典型的には、抗Ｃａｔｈ−Ｄ中和抗体フラグメントは、ＬＲＰ１に対するＣａｔｈ−Ｄの結合（これは、ＧＳＴプルダウンアッセイによって評価され得る）を遮断し、及び／又は成熟Ｃａｔｈ−Ｄの触媒活性（これは、下記のように、Ｃａｔｈ−Ｄによる蛍光発生基質、例えばＭ２２９５（シュードＣａｔｈ−Ｄの蛍光発生ペプチド基質）又はＭ０９３８（成熟Ｃａｔｈ−Ｄの蛍光発生ペプチド基質）の切断反応に基づく触媒活性アッセイによって評価され得る）も阻害する。
【００２３】
「ＬＲＰ１」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し（Strickland and Ranganathan, 2003; Lillis et al., 2005）、ＬＤＬレセプター関連タンパク質−１を指す。ＬＲＰ１は、５１５kDaの細胞外α鎖と、trans−ゴルジ画分内で６００kDaの前駆体ポリペプチドからタンパク質分解切断によって生成される８５kDaのβ鎖とから構成される。実際、ＬＲＰ１α鎖及びＬＲＰ１β鎖は、単一の転写産物から生じる。一例として、プロセシングされていない前駆体ＬＲＰ１のヒト全長は、SwissProtアクセッションナンバーＱ０７９５４に対応する。
【００２４】
「精製された」及び「単離された」は、本発明の抗体に言及する場合、同じ種類の他の生物学的高分子の実質的な非存在下で、示されている分子が存在することを意味する。好ましくは、本明細書で使用される「精製された」という用語は、少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、さらにより好ましくは少なくとも９５重量％、最も好ましくは少なくとも９８重量％の同じ種類の生物学的高分子が存在することを意味する。
【００２５】
本発明の抗体：
本発明は、単離された抗Ｃａｔｈ−Ｄ中和モノクローナル抗体又はそのフラグメントを提供する。
【００２６】
第１の態様では、したがって、本発明は、Ｃａｔｈ−Ｄの触媒活性と、そのＬＲＰ１レセプターへの結合との両方を阻害する単離されたヒトモノクローナル抗体又はそのフラグメントに関する。
【００２７】
一実施態様では、前記抗体は、以下：１２８ＡＡＫＦＤＧ１３４の、３４kDaのＣａｔｈ−Ｄに由来する配列番号：１７のペプチド（Ｃａｔｈ−Ｄのアミノ酸１２８〜１３４に及ぶペプチド）に特異的に結合する。
【００２８】
一実施態様では、前記抗体は、以下：１７２ＤＰＤＡＱＰＧＧ１７９の、３４kDaのＣａｔｈ−Ｄに由来する配列番号：１８のペプチド（Ｃａｔｈ−Ｄのアミノ酸１７２〜１７９に及ぶペプチド）に特異的に結合する。
【００２９】
一実施態様では、前記抗体は、以下：２９３ＫＶＳＱＡＧＫＴＬＣ３０２の、３４kDaのＣａｔｈ−Ｄに由来する配列番号：１９のペプチド（Ｃａｔｈ−Ｄのアミノ酸２９３〜３０２に及ぶペプチド）に特異的に結合する。
【００３０】
一実施態様では、前記抗体は、以下：２２０ＴＬＣＫＥＧＣＥＡ２２８の、３４kDaのＣａｔｈ−Ｄに由来する配列番号：２０のペプチド（Ｃａｔｈ−Ｄのアミノ酸２２０〜２２８に及ぶペプチド）に特異的に結合する。
【００３１】
特に、本発明者らは、抗体ファージディスプレイによって、５１kDaのヒトシュードｃａｔｈ  Ｄ及びヒト細胞成熟（３４＋１４kDa）Ｃａｔｈ−Ｄに対して選択された２つの完全ヒト抗Ｃａｔｈ−Ｄ一本鎖可変抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）（Ｅ２及びＦ１と称される）を単離した。
【００３２】
本発明者らは、前記ｓｃＦｖ  Ｅ２の軽鎖及び重鎖の可変ドメインをクローニング及び特性評価して、表１に記載されているように前記抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）ドメインを決定した：
【表１】
0006770533.tif 000002
【００３３】
したがって、本発明は、Ｃａｔｈ−Ｄに対する特異性を有する抗体であって、可変ドメインが、Ｈ−ＣＤＲ１については配列番号：２、Ｈ−ＣＤＲ２については配列番号：３、及びＨ−ＣＤＲ３については配列番号：４からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む重鎖を含む抗体に関する。
【００３４】
本発明はまた、Ｃａｔｈ−Ｄに対する特異性を有する抗体であって、可変ドメインが、Ｌ−ＣＤＲ１については配列番号：６、Ｌ−ＣＤＲ２については配列番号：７、及びＬ−ＣＤＲ３については配列番号：８からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む軽鎖を含む抗体に関する。
【００３５】
本発明の抗体は、可変ドメインが、Ｈ−ＣＤＲ１については配列番号：２、Ｈ−ＣＤＲ２については配列番号：３、及びＨ−ＣＤＲ３については配列番号：４からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む重鎖と、可変ドメインが、Ｌ−ＣＤＲ１については配列番号：６、Ｌ−ＣＤＲ２については配列番号：７、及びＬ−ＣＤＲ３については配列番号：８からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む軽鎖とを含み得る。
【００３６】
特に、本発明は、
−Ｈ−ＣＤＲ１領域に配列番号：２、Ｈ−ＣＤＲ２領域に配列番号：３及びＨ−ＣＤＲ３領域に配列番号：４を含む重鎖可変領域と、
−Ｌ−ＣＤＲ１領域に配列番号：６、Ｌ−ＣＤＲ２領域に配列番号：７及びＬ−ＣＤＲ３領域に配列番号：８を含む軽鎖可変領域とを含む抗Ｃａｔｈ−Ｄ抗体を提供する。
【００３７】
特定の実施態様では、前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号：１に記載されているアミノ酸配列を有し、かつ／又は軽鎖可変領域は、配列番号：５に記載されているアミノ酸配列を有する。
【００３８】
本発明者らはまた、前記ｓｃＦｖ  Ｆ１の軽鎖及び重鎖の可変ドメインをクローニング及び特性評価して、表２に記載されているように前記抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）ドメインを決定した：
【表２】
0006770533.tif 000003
【００３９】
したがって、本発明は、Ｃａｔｈ−Ｄに対する特異性を有する抗体であって、可変ドメインが、Ｈ−ＣＤＲ１については配列番号：１０、Ｈ−ＣＤＲ２については配列番号：１１、及びＨ−ＣＤＲ３については配列番号：１２からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む重鎖を含む抗体に関する。
【００４０】
本発明はまた、Ｃａｔｈ−Ｄに対する特異性を有する抗体であって、可変ドメインが、Ｌ−ＣＤＲ１については配列番号：１４、Ｌ−ＣＤＲ２については配列番号：１５、及びＬ−ＣＤＲ３については配列番号：１６からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む軽鎖を含む抗体に関する。
【００４１】
本発明の抗体は、可変ドメインが、Ｈ−ＣＤＲ１については配列番号：１０、Ｈ−ＣＤＲ２については配列番号：１１、及びＨ−ＣＤＲ３については配列番号：１２からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む重鎖と、可変ドメインが、Ｌ−ＣＤＲ１については配列番号：１４、Ｌ−ＣＤＲ２については配列番号：１５、及びＬ−ＣＤＲ３については配列番号：１６からなる群より選択される配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む軽鎖とを含み得る。
【００４２】
特に、本発明は、
−Ｈ−ＣＤＲ１領域に配列番号：１０、Ｈ−ＣＤＲ２領域に配列番号：１１及びＨ−ＣＤＲ３領域に配列番号：１２を含む重鎖可変領域と、
−Ｌ−ＣＤＲ１領域に配列番号：１４、Ｌ−ＣＤＲ２領域に配列番号：１５及びＬ−ＣＤＲ３領域に配列番号：１６を含む軽鎖可変領域とを含む抗Ｃａｔｈ−Ｄ抗体を提供する。
【００４３】
特定の実施態様では、前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号：９に記載されているアミノ酸配列を有し、かつ／又は軽鎖可変領域は、配列番号：１３に記載されているアミノ酸配列を有する。
【００４４】
本発明はさらに、Ｃａｔｈ−Ｄに対する前記抗体のフラグメント（限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２及びダイアボディを含む）を提供する。
【００４５】
抗体Ｅ２及びＦ１は、マウスＣａｔｈ−Ｄと交差反応することにも留意すべきである（これは、前臨床評価及び毒物学的研究にとって興味深いものである）。
【００４６】
（例えば、ＩｇＧ１アイソタイプを有する）抗体Ｅ２及びＦ１は、カテプシンＤに特異的に結合し、他のアスパラギン酸プロテアーゼ（例えば、カテプシンＥ、ペプシノゲンＡ及びペプシノゲンＣ）に結合しないことにさらに留意すべきである。
【００４７】
別の態様では、本発明は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５；配列番号：６；配列番号：７、配列番号：８；配列番号：９；配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３；配列番号：１４；配列番号：１５及び配列番号：１６からなる群より選択される配列を有するポリペプチドに関する。
【００４８】
別の態様では、本発明は、３４kDaのＣａｔｈ−Ｄに対する結合について、上記で定義される抗Ｃａｔｈ−Ｄ  ＩｇＧ１  Ｆ１及びＥ２と競合するモノクローナル抗体を提供する。
【００４９】
特定の実施態様では、本発明は、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９又は配列番号：２０のペプチドに対する結合について、上記で定義される抗Ｃａｔｈ−Ｄ  ＩｇＧ（特に、ＩｇＧ１）Ｆ１及びＥ２と競合するモノクローナル抗体を提供する。
【００５０】
競合的結合アッセイ：
したがって、本発明は、Ｃａｔｈ−Ｄに対する結合について、上記で定義される本発明の抗Ｃａｔｈ−Ｄ  ＩｇＧ（特に、ＩｇＧ１）Ｆ１及びＥ２と競合する単離されたモノクローナルｓｃＦｃフラグメントであって、Ｃａｔｈ−Ｄの触媒活性と、ＬＲＰ１線維芽細胞レセプターに対するその結合との両方を阻害する単離されたモノクローナルｓｃＦｃフラグメントに関する。
【００５１】
特定の実施態様では、本発明は、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９又は配列番号：２０のペプチドに対する結合について、上記で定義される抗Ｃａｔｈ−Ｄ  ＩｇＧ（特に、ＩｇＧ１）Ｆ１及びＥ２と競合し得るモノクローナル抗体を提供する。
【００５２】
エピトープビニングは、特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲内に含まれる抗体を同定するために使用され得る。エピトープビニングは、競合的結合アッセイを使用して、同時にＣａｔｈ−Ｄに結合することができる又は結合することができない抗体のペアを同定し、それにより、Ｃａｔｈ−Ｄ上の同じ又は重複するエピトープに結合する抗体のペアを同定することを指す。エピトープビニング実験は、抗原的に区別可能なエピトープが存在するという証拠を提供する。抗体又はフラグメントの任意のペアについて、結合の競合を評価し得る。例えば、適切な検出試薬を使用して、任意の供給源に由来する抗体又は結合フラグメントの結合特異性を、本明細書に開示されるモノクローナル抗体の結合特異性と比較し得る。エピトープビニングは、「単離された抗体」を用いて、又は細胞培養上清を用いて実施され得る。多くの場合、１回目のクローン上清を用いてビニングを実施して、さらに開発すべきクローンの選択を支援する。比較すべき抗体は、実質的に均一な抗原結合ドメインであるべきである。「二重特異性」又は「二官能性」抗体の場合、２つの異なる結合部位の結合特異性を独立して評価又はビニングする必要がある。
【００５３】
本発明の抗体は、当技術分野で公知の任意の方法によって、特異的結合についてアッセイされ得る。多くの異なる競合的結合アッセイフォーマットがエピトープビニングに使用され得る。使用され得るイムノアッセイとしては、限定されないが、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素アッセイ、ゲル拡散沈降素アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイ及び補体結合アッセイなどの技術を使用した競合アッセイシステムが挙げられる。このようなアッセイはルーチンであり、当技術分野で周知である（例えば、Ausubel et al., eds, 1994 Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & sons, Inc., New Yorkを参照のこと）。例えば、BIACORE（登録商標）(GE Healthcare, Piscaataway, NJ)は、モノクローナル抗体のパネルをエピトープビニングするためにルーチンに使用される様々な表面プラズモン共鳴アッセイフォーマットの１つである。加えて、ルーチンな交差ブロッキングアッセイ、例えばAntibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane, 1988に記載されているものが実施され得る。
【００５４】
本発明の抗体を生産する方法：
本発明の抗Ｃａｔｈ−Ｄ抗体は、当技術分野で公知の任意の技術、例えば限定されないが、任意の化学的技術、生物学的技術、遺伝的技術又は酵素学的技術（単独又は組み合わせのいずれか）によって生産され得る。
【００５５】
所望の配列のアミノ酸配列を認識することによって、当業者であれば、標準的なポリペプチド生産技術によって前記抗体を容易に生産し得る。例えば、それらは、周知の固相法を使用して、好ましくは商業的に入手可能なペプチド合成装置（例えば、Applied Biosystems, Foster City, Californiaによって作製された）を使用して、製造業者の説明書にしたがって合成され得る。あるいは、本発明の抗体は、当技術分野で周知のリコンビナントＤＮＡ技術によって合成され得る。例えば、抗体は、抗体をコードするＤＮＡ配列を発現ベクターに組み込み、このようなベクターを、所望の抗体を発現する適切な真核宿主又は原核宿主に導入した後に、ＤＮＡ発現産物として得ることができ、そこからそれらは、周知の技術を使用して後に単離され得る。
【００５６】
本明細書で使用される「ベクター」、「クローニングベクター」及び「発現ベクター」という用語は、宿主生物をトランスフォーメーションして導入配列の発現（例えば、転写及び翻訳）を促進するために、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）を宿主細胞に導入し得るビヒクルを意味する。
【００５７】
よって、本発明のさらなる態様は、本発明の核酸を含むベクターに関する。
【００５８】
このようなベクターは、被験体に投与されると前記抗体の発現を引き起こし又は指令するための調節要素、例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどを含み得る。動物細胞のための発現ベクターに使用されるプロモーター及びエンハンサーの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーター及びエンハンサー（Mizukami T. et al. 1987）、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーター及びエンハンサー（Kuwana Y et al. 1987）、イムノグロブリンＨ鎖のプロモーター（Mason JO et al. 1985）及びエンハンサー（Gillies SD et al. 1983）などが挙げられる。
【００５９】
ヒト抗体Ｃ領域をコードする遺伝子が挿入及び発現され得る限り、動物細胞のための任意の発現ベクターが使用され得る。適切なベクターの例としては、ｐＡＧＥ１０７（Miyaji H et al. 1990）、ｐＡＧＥ１０３（Mizukami T et al. 1987）、ｐＨＳＧ２７４（Brady G et al. 1984）、ｐＫＣＲ（O’Hare K et al. 1981）、ｐＳＧ１  ｂｅｔａ  ｄ２−４−（Miyaji H et al. 1990）などが挙げられる。
【００６０】
プラスミドの他の例としては、複製開始点を含む複製プラスミド、又はｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなどの組み込みプラスミドが挙げられる。
【００６１】
ウイルスベクターの他の例としては、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス及びＡＡＶベクターが挙げられる。このようなリコンビナントウイルスは、当技術分野で公知の技術によって、例えばパッケージング細胞のトランスフェクションによって、又はヘルパープラスミド若しくはウイルスによる一過性トランスフェクションによって生産され得る。ウイルスパッケージング細胞の典型的な例としては、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞などが挙げられる。このような複製欠損リコンビナントウイルスを生産するための詳細なプロトコールは、例えば、国際公開公報第９５／１４７８５号、国際公開公報第９６／２２３７８号、米国特許第５，８８２，８７７号、米国特許第６，０１３，５１６号、米国特許第４，８６１，７１９号、米国特許第５，２７８，０５６号及び国際公開公報第９４／１９４７８号に見られ得る。
【００６２】
本発明のさらなる態様は、本発明の核酸及び／又はベクターによってトランスフェクション、感染又はトランスフォーメーションされた宿主細胞に関する。
【００６３】
「トランスフォーメーション」という用語は、宿主細胞が導入遺伝子又は配列を発現して、所望の物質、典型的には導入遺伝子又は配列によってコードされるタンパク質又は酵素を産生するように、「外来」（すなわち、外因性又は細胞外）遺伝子、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列を宿主細胞に導入することを意味する。導入ＤＮＡ又はＲＮＡを受け取って発現する宿主細胞は、「トランスフォーメーション」されている。
【００６４】
本発明の核酸は、適切な発現系において本発明の抗体を生産するために使用され得る。「発現系」という用語は、例えば、ベクターによって運搬されて宿主細胞に導入される外来ＤＮＡによってコードされるタンパク質の発現のための適切な条件下にある宿主細胞及び適合ベクターを意味する。
【００６５】
一般的な発現系としては、E.coli宿主細胞及びプラスミドベクター、昆虫宿主細胞及びバキュロウイルスベクター、並びに哺乳動物宿主細胞及びベクターが挙げられる。宿主細胞の他の例としては、限定されないが、原核細胞（例えば、細菌）及び真核細胞（例えば、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など）が挙げられる。特定の例としては、E.coli、Kluyveromyces又はSaccharomyces酵母、哺乳動物細胞株（例えば、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞など）、及び初代哺乳動物細胞又は樹立哺乳動物細胞培養物（例えば、リンパ芽球、線維芽細胞、胚細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞などから生産される）が挙げられる。例としては、マウスＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸レダクダーゼ遺伝子（「ＤＨＦＲ遺伝子」）が欠損されたＣＨＯ細胞（Urlaub G et al; 1980）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６６２、以下、「ＴＢ２／０細胞」と称される）なども挙げられる。
【００６６】
本発明はまた、本発明の抗体を発現するリコンビナント宿主細胞を生産する方法であって、（ｉ）上記リコンビナント核酸又はベクターをコンピテント宿主細胞にin vitro又はex vivoで導入する工程、（ｉｉ）得られたリコンビナント宿主細胞をin vitro又はex vivoで培養する工程、並びに（ｉｉｉ）場合により、前記抗体を発現及び／又は分泌する細胞を選択する工程を含む方法に関する。このようなリコンビナント宿主細胞は、本発明の抗体の生産に使用され得る。
【００６７】
適切には、本発明の抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順、例えばプロテインＡセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーによって、培養培地から分離される。
【００６８】
本明細書に記載される抗体のアミノ酸配列改変が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。本発明の抗体の構造において、及びそれらをコードするＤＮＡ配列において、改変及び変更を行って、望ましい特徴を有する抗体をコードする機能分子を依然として得ることができる。
【００６９】
アミノ酸配列の変更を行う際、アミノ酸のヒドロパシー指標を考慮し得る。相互作用生物機能をタンパク質に付与する際のヒドロパシーアミノ酸指標の重要性は、当技術分野で一般に理解されている。アミノ酸の相対的ヒドロパシー特徴は、得られるタンパク質の二次構造に寄与し、そしてこれが、他の分子、例えば酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体及び抗原などとのタンパク質の相互作用を規定することが認められている。
【００７０】
各アミノ酸は、それらの疎水性特性及び電荷特性に基づいてヒドロパシー指標が割り当てられており、これらは、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）である。
【００７１】
したがって、本発明の抗体は、親和性成熟抗体であり得る。
【００７２】
「親和性成熟」抗体は、１つ以上のそのＣＤＲにおける１つ以上の変化であって、変化を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす変化を有するものである。好ましい親和性成熟抗体は、ターゲット抗原に対してナノモル又はピコモル親和性を有するであろう。親和性成熟抗体は、当技術分野で公知の手順によって生産される。Marks et al. Bio/Technology, 10:779-783 (1992)には、ＶＨ及びＶＬドメインシャッフリングによる親和性成熟が記載されている。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene, 1 69:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol., 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995);及びHawkins et al, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)に記載されている。
【００７３】
本発明のさらなる態様はまた、本発明の抗体の機能保存変異体を包含する。
【００７４】
「機能保存変異体」は、ポリペプチドの全体的なコンフォメーション及び機能の変化を伴わずに、タンパク質又は酵素中の所定のアミノ酸残基が変更されているものであり、限定されないが、類似の特性（例えば、極性、水素結合ポテンシャル、酸性、塩基性、疎水性、芳香性など）を有するアミノ酸によるアミノ酸の置き換えが挙げられる。類似の機能の任意の２つのタンパク質間のタンパク質又はアミノ酸配列類似性の割合は変動し得、アライメントスキームにしたがって、例えば類似性がＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づくクラスタ法によって決定した場合に７０％〜９９％であり得るように、保存されていると示されているもの以外のアミノ酸は、タンパク質において異なり得る。「機能保存変異体」はまた、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡアルゴリズムによって決定した場合に、少なくとも６０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、より一層好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドであって、比較されるネイティブな又は親のタンパク質と同じ又は実質的に同様の特性又は機能を有するポリペプチドを含む。
【００７５】
２つのアミノ酸配列は、アミノ酸の８０％超、好ましくは８５％超、好ましくは９０％超が同一であるか、又はより短い配列の全長にわたって約９０％超、好ましくは９５％超が類似（機能的に同一）である場合に「実質的に相同」又は「実質的に類似」である。好ましくは、類似配列又は相同配列は、例えば、ＧＣＧ（Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin）ｐｉｌｅｕｐプログラム、又はＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの配列比較アルゴリズムのいずれかを使用してアライメントによって同定される。
【００７６】
例えば、活性の認識可能な喪失を伴わなければ、特定のアミノ酸は、タンパク質構造中の他のアミノ酸によって置換され得る。タンパク質の相互作用能力及び性質は、タンパク質の生物学的機能活性を規定するので、同様の特性を有するタンパク質を得ながら、タンパク質配列において、及び当然ながらそのＤＮＡコード配列において、特定のアミノ酸置換を行い得る。したがって、生物学的活性の認識可能な喪失を伴わなければ、本発明の抗体の配列、又は前記抗体をコードする対応するＤＮＡ配列において、様々な変更を行い得ることが企図される。
【００７７】
特定のアミノ酸を、類似のヒドロパシー指標又はスコアを有する他のアミノ酸によって置換して、類似の生物学的活性を有するタンパク質を依然としてもたらすことができる（すなわち、生物機能的に同等のタンパク質を依然として得ることができる）ことが当技術分野で公知である。
【００７８】
したがって、上記のように、アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えばそれらの疎水性、親水性、電荷及びサイズなどに基づく。様々な上記特徴を考慮した例示的な置換は当業者に周知であり、アルギニン及びリジン；グルタミン酸及びアスパラギン酸；セリン及びトレオニン；グルタミン及びアスパラギン；並びにバリン、ロイシン及びイソロイシンが挙げられる。
【００７９】
したがって、本発明はまた、可変ドメインが、
−配列番号：２に記載されている配列と少なくとも９０％又は９５％の同一性を有するＨ−ＣＤＲ１、
−配列番号：３に記載されている配列と少なくとも９０％又は９５％の同一性を有するＨ−ＣＤＲ２、
−配列番号：４に記載されている配列と少なくとも９０％又は９５％の同一性を有するＨ−ＣＤＲ３、
−配列番号：６に記載されている配列と少なくとも９０％又は９５％の同一性を有するＬ−ＣＤＲ１、
−配列番号：７に記載されている配列と少なくとも９０％又は９５％の同一性を有するＬ−ＣＤＲ２、
−配列番号：８に記載されている配列と少なくとも９０％又は９５％の同一性を有するＬ−ＣＤＲ３
を含む重鎖を含み、かつ
−可変ドメインが、Ｈ−ＣＤＲ１については配列番号：２、Ｈ−ＣＤＲ２については配列番号：３、及びＨ−ＣＤＲ３については配列番号：４を含む重鎖と、可変ドメインが、Ｌ−ＣＤＲ１については配列番号：６、Ｌ−ＣＤＲ２については配列番号：７、及びＬ−ＣＤＲ３については配列番号：８を含む軽鎖とを含む抗体と実質的に同じ親和性で（より好ましくは、二価ｓｃＦｖ−Ｆｃ  Ｅ２と実質的に同じ親和性で）Ｃａｔｈ−Ｄに特異的に結合する抗体を提供する。
【００８０】
本発明はさらに、可変ドメインが、
−配列番号：１０に記載されている配列と少なくとも９０％又は９５％の同一性を有するＨ−ＣＤＲ１、
−配列番号：１１に記載されている配列と少なくとも９０％又は９５％の同一性を有するＨ−ＣＤＲ２、
−配列番号：１２に記載されている配列と少なくとも９０％又は９５％の同一性を有するＨ−ＣＤＲ３、
−配列番号：１４に記載されている配列と少なくとも９０％又は９５％の同一性を有するＬ−ＣＤＲ１、
−配列番号：１５に記載されている配列と少なくとも９０％又は９５％の同一性を有するＬ−ＣＤＲ２、
−配列番号：１６に記載されている配列と少なくとも９０％又は９５％の同一性を有するＬ−ＣＤＲ３
を含む重鎖を含み、かつ
−可変ドメインが、Ｈ−ＣＤＲ１については配列番号：１０、Ｈ−ＣＤＲ２については配列番号：１１、及びＨ−ＣＤＲ３については配列番号：１２を含む重鎖と、可変ドメインが、Ｌ−ＣＤＲ１については配列番号：１４、Ｌ−ＣＤＲ２については配列番号：１５、及びＬ−ＣＤＲ３については配列番号：１６を含む軽鎖とを含む抗体と実質的に同じ親和性で（より好ましくは、二価ｓｃＦｖ−Ｆｃ  Ｆ１と実質的に同じ親和性で）Ｃａｔｈ−Ｄに特異的に結合する抗体を提供する。
【００８１】
前記抗体は、当技術分野で公知の任意の方法によって、特異的結合についてアッセイされ得る。多くの異なる競合的結合アッセイフォーマットがエピトープビニングに使用され得る。使用され得るイムノアッセイとしては、限定されないが、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素アッセイ、ゲル拡散沈降素アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイ及び補体結合アッセイなどの技術を使用した競合アッセイシステムが挙げられる。このようなアッセイはルーチンであり、当技術分野で周知である（例えば、Ausubel et al., eds, 1994 Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & sons, Inc., New Yorkを参照のこと）。例えば、BIACORE（登録商標）(GE Healthcare, Piscaataway, NJ)は、モノクローナル抗体のパネルをエピトープビニングするためにルーチンに使用される様々な表面プラズモン共鳴アッセイフォーマットの１つである。加えて、ルーチンな交差ブロッキングアッセイ、例えばAntibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane, 1988に記載されているものが実施され得る。
【００８２】
本発明の人工抗体は、例えば抗体の特性を改善するために、ＶＨ及び／又はＶＬ内のフレームワーク残基に対して改変が行われている抗体を含む。典型的には、このようなフレームワーク改変は、抗体の免疫原性を減少させるために行われる。例えば、１つのアプローチは、１つ以上のフレームワーク残基を対応する生殖細胞系配列に「復帰突然変異」することである。より具体的には、体細胞突然変異を受けている抗体は、該抗体が由来する生殖細胞系配列と異なるフレームワーク残基を含み得る。このような残基は、抗体のフレームワーク配列と、該抗体が由来する生殖細胞系配列とを比較することによって同定され得る。フレームワーク領域配列をそれらの生殖細胞系構造に戻すために、体細胞突然変異は、例えば部位特異的突然変異誘発又はＰＣＲ媒介性突然変異誘発によって、生殖細胞系配列に復帰突然変異され得る。このような「復帰突然変異」抗体もまた、本発明によって包含されることが意図される。別の種類のフレームワーク改変は、フレームワーク領域内又は１つ以上のＣＤＲ領域内における１つ以上の残基を突然変異させてＴ細胞エピトープを除去し、それにより、抗体の潜在的免疫原性を減少させることを含む。このアプローチは「脱免疫化」とも称され、Carrらによる米国特許出願公開第２００３０１５３０４３号にさらに詳細に記載されている。
【００８３】
フレームワーク又はＣＤＲ領域内において行われる改変に加えて又は代えて、本発明の抗体は、典型的には抗体の１つ以上の機能的特性、例えば血清半減期、補体結合、Ｆｃレセプター結合及び／又は抗原依存性細胞傷害を変更するために、Ｆｃ領域内における改変を含むように操作され得る。さらに、本発明の抗体は、やはり抗体の１つ以上の機能的特性を変更するために、化学的に改変され得るか（例えば、１つ以上の化学的部分が抗体に付加され得る）、又はそのグリコシル化を変更するように改変され得る。これらの各実施態様は、以下にさらに詳細に記載されている。Ｆｃ領域における残基のナンバリングは、KabatのＥＵインデックスのものである。
【００８４】
一実施態様では、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域におけるシステイン残基の数が変更（例えば、増加又は減少）されるように改変される。このアプローチは、Bodmerらによる米国特許第５，６７７，４２５号にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域におけるシステイン残基の数は、例えば軽鎖及び重鎖のアセンブリを促進するように、又は抗体の安定性を増加若しくは減少させるように変更される。
【００８５】
別の実施態様では、抗体のＦｃヒンジ領域は、抗体の生物学的半減期を減少させるように突然変異される。より具体的には、抗体が、ネイティブなＦｃヒンジドメインＳｐＡ結合性と比べて低下した黄色ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）結合を有するように、１つ以上のアミノ酸突然変異がＦｃヒンジフラグメントのＣＨ２−ＣＨ３ドメインインターフェイス領域に導入される。このアプローチは、Wardらによる米国特許第６，１６５，７４５号にさらに詳細に記載されている。
【００８６】
別の実施態様では、抗体は、その生物学的半減期を増加させるように改変される。様々なアプローチが可能である。例えば、Wardによる米国特許第６，２７７，３７５号に記載されているように、以下の突然変異：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆの１つ以上が導入され得る。あるいは、生物学的半減期を増加させるために、抗体は、Prestaらによる米国特許第５，８６９，０４６号及び米国特許第６，１２１，０２２号に記載されているように、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから得られるサルベージレセプター結合エピトープを含有するようにＣＨ１又はＣＬ領域内において変更され得る。
【００８７】
また他の実施態様では、Ｆｃ領域は、抗体のエフェクター機能を変更するために、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置き換えることによって変更される。例えば、抗体が、エフェクターリガンドに対する変更された親和性を有するが親抗体の抗原結合能力を保持するように、１つ以上のアミノ酸が異なるアミノ酸残基で置き換えられ得る。親和性が変更されたエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃレセプター又は補体のＣ１要素であり得る。このアプローチは、Winterらによる米国特許第５，６２４，８２１号及び米国特許第５，６４８，２６０号にさらに詳細に記載されている。
【００８８】
別の実施態様では、抗体が、変更されたＣ１ｑ結合性、及び／又は減少若しくは抑制された補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を有するように、アミノ酸残基から選択される１つ以上のアミノ酸が異なるアミノ酸残基で置き換えられ得る。このアプローチは、ldusogieらによる米国特許第６，１９４，５５１号にさらに詳細に記載されている。
【００８９】
別の実施態様では、それにより抗体の補体結合能力を変更するように、１つ以上のアミノ酸残基が変更される。このアプローチは、Bodmerらによる国際公開公報第９４／２９３５１号にさらに記載されている。
【００９０】
また別の実施態様では、Ｆｃ領域は、１つ以上のアミノ酸を改変することによって、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介するための抗体の能力を増加させるように、及び／又はＦｃレセプターに対する抗体の親和性を増加させるように改変される。このアプローチは、Prestaによる国際公開公報第００／４２０７２号にさらに記載されている。また、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧＩ上の結合部位はマッピングされており、改善された結合性を有する変異体が記載されている（Shields, R. L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604、国際公開公報第２０１０１０６１８０号を参照のこと）。
【００９１】
さらに別の実施態様では、抗体のグリコシル化が改変される。例えば、脱グリコシル化抗体が作製され得る（すなわち、抗体は、グリコシル化を欠く）。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増加させるように変更され得る。このような炭水化物改変は、例えば、抗体配列内における１つ以上のグリコシル化部位を変更することによって達成され得る。例えば、１つ以上の可変領域フレームワークのグリコシル化部位の排除をもたらし、それにより、その部位におけるグリコシル化を排除する１つ以上のアミノ酸置換が行われ得る。このような脱グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増加させ得る。このようなアプローチは、Coらによる米国特許第５，７１４，３５０号及び米国特許第６，３５０，８６１号にさらに詳細に記載されている。
【００９２】
加えて又はあるいは、変更型のグリコシル化を有する抗体、例えば、フコシル残基の量が減少しているか、若しくはフコシル残基を有しない低フコシル化若しくは非フコシル化抗体、又は増加した二分岐ＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体が作製され得る。このような変更されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能を増加させることが実証されている。このような炭水化物改変は、例えば変更されたグリコシル化機構を有する宿主細胞で抗体を発現することによって達成され得る。変更されたグリコシル機構を有する細胞は、当技術分野で説明されており、本発明のリコンビナント抗体を発現し、それにより、変更されたグリコシル化を有する抗体を産生する宿主細胞として使用され得る。例えば、Hangらによる欧州特許出願公開第１，１７６，１９５号には、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が機能的に破壊された細胞株が記載されており、このような細胞株で発現された抗体は、低フコシル化を示すか、又はフコシル残基を欠く。したがって、一実施態様では、本発明の抗体は、低フコシル化又は非フコシル化パターンを示す細胞株、例えばフコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８の発現が欠損している哺乳動物細胞株におけるリコンビナント発現によって産生され得る。Prestaによる国際公開公報第０３／０３５８３５号には、Ａｓｎ（２９７）結合炭水化物にフコースを結合する能力が低下している変異体ＣＨＯ細胞株、Ｌｅｃｌ３細胞であって、その細胞株で発現される抗体の低フコシル化をもたらす変異体ＣＨＯ細胞株、Ｌｅｃｌ３細胞が記載されている（Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照のこと）。Umanaらによる国際公開公報第９９／５４３４２号には、人工細胞株で発現される抗体が、抗体のＡＤＣＣ活性の増加をもたらす二分ＧｌｃＮａｃ構造の増加を示すように、糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）−ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作された細胞株が記載されている（Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180も参照のこと）。Eureka Therapeuticsには、フコシル残基が欠けた変更された哺乳動物グリコシル化パターンを有する抗体を産生することができる遺伝子的に改変されたＣＨＯ哺乳動物細胞がさらに記載されている（http://www.eurekainc.com/a&boutus/companyoverview.html）。
【００９３】
あるいは、本発明の抗体は、哺乳動物様グリコシル化パターンについて改変され、グリコシル化パターンとしてフコースを欠く抗体を産生することができる酵母又は糸状菌で産生され得る（例えば、欧州特許第１２９７１７２号を参照のこと）。
【００９４】
本発明によって企図される本発明の抗体の別の改変は、ペグ化である。抗体は、例えば抗体の生物学的（例えば、血清）半減期を増加させるためにペグ化され得る。抗体のペグ化のために、通常、抗体又はそのフラグメントは、１つ以上のＰＥＧ基が抗体又は抗体フラグメントに結合する条件下で、ＰＥＧの反応性エステル又はアルデヒド誘導体などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と反応される。ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（又は、類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応によって行われ得る。本明細書で使用される「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ若しくはアリールオキシポリエチレングリコール、又はポリエチレングリコールマレイミドなどの、他のタンパク質を誘導体化するために使用されるＰＥＧの形態のいずれかを含むことを意図する。特定の実施態様では、ペグ化すべき抗体は、脱グリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化するための方法は、当技術分野で公知であり、本発明の抗体に適用され得る。例えば、Nishimuraらによる欧州特許第０１５４３１６号及びIshikawaらによる欧州特許第０４０１３８４号を参照のこと。
【００９５】
本発明によって企図される抗体の別の改変は、得られる分子の半減期を増加させるための、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン又はそのフラグメント）への本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域のコンジュゲート又はタンパク質融合である。このようなアプローチは、例えばBallanceらの欧州特許第０３２２０９４号に記載されている。別の可能性は、得られる分子の半減期を増加させるための、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）に結合することができるタンパク質への本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域の融合である。このようなアプローチは、例えばNygrenらの欧州特許第０４８６５２５号に記載されている。
【００９６】
イムノコンジュゲート：
本発明の抗体は、抗Ｃａｔｈ−Ｄイムノコンジュゲートを形成するために、検出可能な標識とコンジュゲートされ得る。適切な検出可能な標識としては、例えば放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識、生物発光標識又は金コロイドが挙げられる。このような検出可能に標識されたイムノコンジュゲートを作製及び検出する方法は、当業者に周知であり、以下により詳細に記載する。
【００９７】
検出可能な標識は、オートラジオグラフィーによって検出される放射性同位体であり得る。本発明の目的のために特に有用なアイソトープは、３Ｈ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ及び１４Ｃである。
【００９８】
抗Ｃａｔｈ−Ｄイムノコンジュゲートはまた、蛍光化合物によって標識され得る。蛍光標識された抗体の存在は、イムノコンジュゲートを適切な波長の光に曝露し、生じた蛍光を検出することによって決定される。蛍光標識化合物としては、フルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド及びフルオレスカミンが挙げられる。
【００９９】
あるいは、抗Ｃａｔｈ−Ｄイムノコンジュゲートは、抗体を化学発光化合物にカップリングすることによって検出可能に標識され得る。化学発光タグ化イムノコンジュゲートの存在は、化学的反応の過程の間に生じる発光の存在を検出することによって決定される。化学発光標識化合物の例としては、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びシュウ酸エステルが挙げられる。
【０１００】
同様に、生物発光化合物は、本発明の抗Ｃａｔｈ−Ｄイムノコンジュゲートを標識するために使用され得る。生物発光は、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を増加させる生物学的システムにおいて見出された化学発光の１つである。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することによって決定される。標識に有用な生物発光化合物としては、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及びイクオリンが挙げられる。
【０１０１】
あるいは、抗Ｃａｔｈ−Ｄイムノコンジュゲートは、酵素に抗Ｃａｔｈ−Ｄ抗体を結合させることによって検出可能に標識され得る。抗Ｃａｔｈ−Ｄ酵素コンジュゲートを適切な基質の存在下でインキュベーションすると、酵素部分が基質と反応して、例えば分光光度法、蛍光分析法又は可視的手段によって検出され得る化学的部分が生成する。多重特異的イムノコンジュゲートを検出可能に標識するために使用され得る酵素の例としては、βガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼが挙げられる。
【０１０２】
当業者であれば、本発明にしたがって使用され得る他の適切な標識を認識するであろう。抗Ｃａｔｈ−Ｄモノクローナル抗体に対するマーカー部分の結合は、当技術分野で公知の標準的な技術を使用して達成され得る。これに関する一般の方法論は、Kennedy et al., Clin. Chim. Acta 70:1, 1976; Schurs et al., Clin. Chim. Acta 81:1, 1977; Shih et al., Int’l J. Cancer 46:1101, 1990; Stein et al., Cancer Res. 50:1330, 1990；及び上記Coliganに記載されている。
【０１０３】
また、免疫化学検出の簡便性及び汎用性は、アビジン、ストレプトアビジン及びビオチンとコンジュゲートされた抗Ｃａｔｈ−Ｄモノクローナル抗体を使用することによって増強され得る（例えば、Wilchek et al. (eds.), “Avidin-Biotin Technology,” Methods In Enzymology (Vol. 184) (Academic Press 1990); Bayer et al., “Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology,” in Methods In Molecular Biology (Vol. 10) 149-162 (Manson, ed., The Humana Press, Inc. 1992).を参照のこと）。
【０１０４】
イムノアッセイを実施するための方法は、十分に確立されている（例えば、Cook and Self, “Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays,” in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application 180-208 (Ritter and Ladyman, eds., Cambridge University Press 1995); Perry, “The Role of Monoclonal Antibodies in the Advancement of Immunoassay Technology,” in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications 107-120 (Birch and Lennox, eds., Wiley-Liss, Inc. 1995); Diamandis, Immunoassay (Academic Press, Inc. 1996).を参照のこと）。
【０１０５】
別の態様では、本発明は、抗Ｃａｔｈ−Ｄ抗体−薬物コンジュゲートを提供する。本明細書で使用される「抗Ｃａｔｈ−Ｄ抗体−薬物コンジュゲート」は、治療剤にコンジュゲートされた本発明の抗Ｃａｔｈ−Ｄ抗体を指す。このような抗Ｃａｔｈ−Ｄ抗体−薬物コンジュゲートは、患者（例えば、Ｃａｔｈ−Ｄ発現性ガンを有する患者など）に投与した場合に、典型的には、単独で投与した場合だけではなく他の治療剤と組み合わせて投与した場合にも、Ｃａｔｈ−Ｄ発現細胞に対する臨床的に有益な効果をもたらす。
【０１０６】
典型的な実施態様では、抗Ｃａｔｈ−Ｄ抗体は、得られる抗体−薬物コンジュゲートが、Ｃａｔｈ−Ｄ発現細胞（例えば、Ｃａｔｈ−Ｄ発現ガン細胞）に取り込まれ、又はインターナリゼーションされると、前記細胞に対する細胞毒性効果又は細胞増殖抑制効果を発揮するように、細胞毒性薬にコンジュゲートされる。抗体にコンジュゲートするために特に適切な部分は、化学療法剤、プロドラッグ変換酵素、放射性同位体若しくは化合物又は毒素である。例えば、抗Ｃａｔｈ−Ｄ抗体は、細胞毒性薬、例えば化学療法剤又は毒素（例えば、細胞増殖抑制剤又は細胞破壊剤、例えばアブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素又はジフテリア毒素など）にコンジュゲートされ得る。
【０１０７】
細胞毒性薬の有用なクラスとしては、例えば、抗チューブリン剤、オーリスタチン、ＤＮＡマイナーグルーブ結合剤、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化剤（例えば、白金錯体、例えばシスプラチン、単核（白金）、二核（白金）及び三核白金錯体、並びにカルボプラチン）、アントラサイクリン、抗生物質、抗葉酸剤、代謝拮抗物質、化学療法増感剤、デュオカルマイシン、エトポシド、フッ化ピリミジン、イオノフォア、レキシトロプシン、ニトロソウレア、プラチノール、プレフォーミング化合物、プリン代謝拮抗物質、ピューロマイシン、放射線増感剤、ステロイド、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤又はビンカアルカロイドなどが挙げられる。
【０１０８】
個々の細胞毒性薬としては、例えばアンドロゲン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、アスパラギナーゼ、５−アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ブサルファン、ブチオニン、スルホキシミン、カンプトテシン、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ＣＣ−１０６５（Li et al., Cancer Res. 42:999-1004, 1982）、クロランブシル、シスプラチン、コルヒシン、シクロホスファミド、シタラビン、シチジンアラビノシド、シトカラシンＢ、ダカルバジン、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ダウノルビシン、デカルバジン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エストロゲン、５−フルオロデオキシウリジン、リン酸エトポシド（etopside phosphate）（ＶＰ−１６）、５−フルオロウラシル、グラミシジンＤ、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミン、メルファラン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ニトロイミダゾール、パクリタキセル、プリカマイシン、プロカルビジン、ストレプトゾトシン、テノポシド（ＶＭ−２６）、６−チオグアニン、チオＴＥＰＡ、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン及びビノレルビンが挙げられる。
【０１０９】
特に適切な細胞毒性薬としては、例えば、ドラスタチン（例えば、オーリスタチンＥ、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ）、ＤＮＡマイナーグルーブ結合剤（例えば、エンジイン及びレキシトロプシン）、デュオカルマイシン、タキサン（例えば、パクリタキセル及びドセタキセル）、ピューロマイシン、ビンカアルカロイド、ＣＣ−１０６５、ＳＮ−３８（７−エチル−１０−ヒドロキシ−カンプトテイン）、トポテカン、モルホリノ−ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルフォリノ−ドキソルビシン、エチノマイシン、コンブレタスタチン、ネトロプシン、エポチロンＡ及びＢ、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン、メイタンシノイド、ディスコデルモリド、エリュテロビン並びにミトキサントロンが挙げられる。特定の実施態様では、細胞毒性薬は、従来の化学療法剤、例えばドキソルビシン、パクリタキセル、メルファラン、ビンカアルカロイド、メトトレキサート、マイトマイシンＣ又はエトポシドなどである。加えて、ＣＣ−１０６５類似体、カリケアミシン、メイタンシン、ドラスタチン１０の類似体、リゾキシン及びパリトキシンなどの強力な薬剤を抗Ｃａｔｈ−Ｄ抗体に連結し得る。
【０１１０】
特定のバリエーションでは、細胞毒性薬又は細胞増殖抑制剤は、オーリスタチンＥ（当技術分野でドラスタチン１０としても公知である）又はその誘導体である。典型的には、オーリスタチンＥ誘導体は、例えば、オーリスタチンＥとケト酸との間で形成されるエステルである。例えば、オーリスタチンＥをパラアセチル安息香酸又はベンゾイル吉草酸と反応させて、ＡＥＢ及びＡＥＶＢをそれぞれ生成し得る。他の典型的なオーリスタチン誘導体としては、ＡＦＰ（ジメチルバリン−バリン−ドライソロイシン−ドラプロリン−フェニルアラニン−ｐ−フェニレンジアミン）、ＭＭＡＦ（ドバリン−バリン−ドライソロイシン−ドラプロリン−フェニルアラニン）及びＭＡＥ（モノメチルオーリスタチンＥ）が挙げられる。オーリスタチンＥ及びその誘導体の合成及び構造は、米国特許出願公開第２００３００８３２６３号；国際公開公報第２００２／０８８１７２号及び国際公開公報第２００４／０１０９５７号；並びに米国特許第６，８８４，８６９号；米国特許第６，３２３，３１５号；米国特許第６，２３９，１０４号；米国特許第６，０３４，０６５号；米国特許第５，７８０，５８８号；米国特許第５，６６５，８６０号；米国特許第５，６６３，１４９号；米国特許第５，６３５，４８３号；米国特許第５，５９９，９０２号；米国特許第５，５５４，７２５号；米国特許第５，５３０，０９７号；米国特許第５，５２１，２８４号；米国特許第５，５０４，１９１号；米国特許第５，４１０，０２４号；米国特許第５，１３８，０３６号；米国特許第５，０７６，９７３号；米国特許第４，９８６，９８８号；米国特許第４，９７８，７４４号；米国特許第４，８７９，２７８号；米国特許第４，８１６，４４４号；及び米国特許第４，４８６，４１４号に記載されている。
【０１１１】
他のバリエーションでは、細胞毒性薬は、ＤＮＡマイナーグルーブ結合剤である（例えば、米国特許第６，１３０，２３７号を参照のこと）。例えば、特定の実施態様では、マイナーグルーブ結合剤は、ＣＢＩ化合物である。他の実施態様では、マイナーグルーブ結合剤は、エンジインである（例えばカリケアミシン）。
【０１１２】
特定の実施態様では、抗体−薬物コンジュゲートは、抗チューブリン剤を含む。抗チューブリン剤の例としては、例えば、タキサン（例えば、Taxol（登録商標）（パクリタキセル）、Taxotere（登録商標）（ドセタキセル））、Ｔ６７（Tularik）、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン及びビノレルビン）並びにドラスタチン（例えば、オーリスタチンＥ、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ）が挙げられる。他の抗チューブリン剤としては、例えば、バッカチン誘導体、タキサン類似体（例えば、エポチロンＡ及びＢ）、ノコダゾール、コルチシン及びコルシミド、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン、マイタンシノイド、コンブレタスタチン、ディスコデルモリド並びにエリュテロビンが挙げられる。いくつかの実施態様では、細胞毒性薬は、他のグループの抗チューブリン剤であるメイタンシノイドである。例えば、特定の実施態様では、メイタンシノイドは、メイタンシン又はＤＭ−１である（ImmunoGen, Inc.；Chari et al., Cancer Res. 52:127-131, 1992も参照のこと）。
【０１１３】
他の実施態様では、細胞毒性薬は、代謝拮抗剤である。代謝拮抗剤は、例えば、プリンアンタゴニスト（例えば、アゾチオプリン又はミコフェノレートモフェチル）、ジヒドロフォレートレダクターゼ阻害剤（例えば、メトトレキサート）、アシクロビル、ガンシクロビル、ジドブジン、ビダラビン、リババリン、アジドチミジン、シチジンアラビノシド、アマンタジン、ジデオキシウリジン、ヨードデオキシウリジン、ポスカーネット又はトリフルリジンであり得る。
【０１１４】
他の実施態様では、抗Ｃａｔｈ−Ｄ抗体は、プロドラッグ変換酵素にコンジュゲートされる。プロドラッグ変換酵素は、公知の方法を使用して、抗体にリコンビナント融合又は化学的にコンジュゲートされ得る。例示的なプロドラッグ変換酵素は、カルボキシペプチダーゼＧ２、βグルクロニダーゼ、ペニシリン−Ｖ−アミダーゼ、ペニシリン−Ｇ−アミダーゼ、βラクタマーゼ、β−グルコシダーゼ、ニトロレダクターゼ及びカルボキシペプチダーゼＡである。
【０１１５】
治療剤をタンパク質（特に、抗体）にコンジュゲートするための技術は、周知である（例えば、Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy,” in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy (Reisfeld et al. eds., Alan R. Liss, Inc., 1985); Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery,” in Controlled Drug Delivery (Robinson et al. eds., Marcel Deiker, Inc., 2nd ed. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,” in Monoclonal Antibodies ‘84: Biological And Clinical Applications (Pinchera et al. eds., 1985); “Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy,” in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy (Baldwin et al. eds., Academic Press, 1985);及びThorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58を参照のこと。例えば、国際公開公報第８９／１２６２４号も参照のこと）。
【０１１６】
診断用途：
本発明のさらなる態様は、ガン疾患、及びＣａｔｈ−Ｄレベルが改変（増加又は減少）している他の疾患を診断及び／又はモニタリングするための本発明の抗Ｃａｔｈ−Ｄ抗体に関する。
【０１１７】
好ましい実施態様では、本発明の抗体は、蛍光分子、放射性分子又は上記の当技術分野で公知の任意の他の標識などの検出可能な分子又は物質を使用して標識され得る。例えば、本発明の抗体は、当技術分野で公知の任意の方法によって放射性分子を使用して標識され得る。例えば、放射性分子としては、限定されないが、シンチグラフ検査のための放射性原子、例えばＩ１２３、Ｉ１２４、Ｉｎ１１１、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８が挙げられる。本発明の抗体はまた、ヨウ素１２３、ヨウ素１３１、インジウム１１１、フッ素１９、炭素１３、窒素１５、酸素１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄などの核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（核磁気共鳴画像法、ＭＲＩとしても公知である）のためのスピン標識を使用して標識され得る。抗体の投与の後、患者内における抗体の分布が検出される。任意の特定の標識の分布を検出する方法は当業者に公知であり、任意の適切な方法が使用され得る。いくつかの非限定的な例としては、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、ポジトロン断層撮影（ＰＥＴ）、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、蛍光、化学発光及び超音波検査法が挙げられる。
【０１１８】
本発明の抗体は、Ｃａｔｈ−Ｄ過剰発現に関連するガン疾患を診断及び病期分類するために有用であり得る。Ｃａｔｈ−Ｄ過剰発現に関連するガン疾患としては、典型的には、限定されないが、乳ガン、メラノーマ、卵巣ガン、肺ガン、肝臓ガン、膵臓ガン、子宮内膜ガン、頭頸部ガン、膀胱ガン、悪性神経膠腫が挙げられる。
【０１１９】
本発明の抗体は、Ｃａｔｈ−Ｄ発現が増加しているガン以外の疾患、例えばアルツハイマー病を診断するために有用であり得る。
【０１２０】
典型的には、前記診断方法は、患者から得られた生物学的サンプルの使用を含む。本明細書で使用される「生物学的サンプル」という用語は、被験体から得られた様々な種類のサンプルを包含し、診断アッセイ又はモニタリングアッセイに使用され得る。生物学的サンプルとしては、限定されないが、血液及び他の生物起源の液体サンプル、生検材料若しくは組織培養物又はそれら由来の細胞及びその子孫などの固体組織サンプルが挙げられる。例えば、生物学的サンプルとしては、Ｃａｔｈ−Ｄ過剰発現に関連するガン疾患を有すると疑われる個体から回収された組織サンプルから、好ましい実施態様では、乳ガン、メラノーマ、卵巣ガン、肺ガン、肝臓ガン、膵臓ガン、子宮内膜ガン、頭頸部ガン、膀胱ガン、悪性神経膠腫から得られた細胞を含む。したがって、生物学的サンプルは、臨床サンプル、培養液中の細胞、細胞上清、細胞溶解液、血清、血漿、生物学的流体及び組織サンプルを包含する。
【０１２１】
治療用途：
本発明の抗体、フラグメント又はイムノコンジュゲートは、Ｃａｔｈ−Ｄ過剰発現に関連する任意の疾患（優先的には、ガン）を処置するために有用であり得る。本発明の抗体は単独で、又は任意の適切な薬剤と組み合わせて使用され得る。
【０１２２】
抗Ｃａｔｈ−Ｄ本発明の抗体は、Ｃａｔｈ−Ｄ過剰発現に関連する過剰増殖性疾患の処置として使用され得る。
【０１２３】
Ｃａｔｈ−Ｄ過剰発現に関連するこのような疾患の例は、乳ガン、メラノーマ、卵巣ガン、肺ガン、肝臓ガン、膵臓ガン、子宮内膜ガン、頭頸部ガン、膀胱ガン、悪性神経膠腫を包含する。
【０１２４】
特定の実施態様では、乳ガンは、エストロゲンレセプターポジティブ（ＥＲ＋）ホルモン耐性乳ガン又はトリプルネガティブ（ＥＲ−及びＰＲ−、ＨＥＲ２非増幅）乳ガンである。
【０１２５】
本明細書に記載される処置方法の各実施態様では、抗Ｃａｔｈ−Ｄ抗体又は抗Ｃａｔｈ−Ｄ抗体−薬物コンジュゲートは、処置しようとする疾患又は障害の管理に関連する従来の方法にしたがって送達される。本明細書の開示にしたがって、有効量の抗体又は抗体−薬物のコンジュゲートは、疾患又は障害を予防又は治療するために十分な時間及び条件下で、このような処置を必要とする患者に投与される。
【０１２６】
したがって、本発明の態様は、Ｃａｔｈ−Ｄの過剰発現に関連する疾患を処置するための方法であって、治療有効量の本発明の抗体、フラグメント又はイムノコンジュゲートを、それを必要とする患者に投与することを含む方法に関する。これとの関連では、本明細書で使用される「処置すること」又は「処置」という用語は、このような用語が適用される障害若しくは症状、又はこのような障害若しくは症状の１つ以上の症候の進行を回復、緩和、阻害又は予防することを意味する。本発明によれば、「患者」又は「それを必要とする患者」という用語は、Ｃａｔｈ−Ｄの過剰発現に関連する疾患に罹患しているか、又は罹患している可能性があるヒトを意図する。
【０１２７】
本発明の抗体の「治療有効量」は、医薬的治療に適用できる適切なベネフィット／リスク比において、Ｃａｔｈ−Ｄの過剰発現に関連する前記疾患、例えばガン（例えば、乳ガン）を処置するための抗体の十分な量を意味する。しかしながら、本発明の抗体及び組成物の１日当たりの総用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決められることが理解されよう。任意の特定の患者のための特定の治療的有効用量レベルは、処置される障害及び障害の重症度、使用される特定の抗体の活性、使用される特定の組成物、患者の年齢、体重、総合的な健康状態、性別及び食事、投与時間、投与経路、使用される特定の抗体の排出率、治療の期間、使用される特定の抗体と組み合わせで使用される又は同時に使用される薬物、並びに医学分野で周知の因子を含む様々な因子に依存するであろう。例えば、所望の治療効果を達成するために必要なレベルよりも低いレベルの化合物の用量で開始すること、及び所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加することは当業者に周知である。
【０１２８】
特定の実施態様では、抗Ｃａｔｈ−Ｄ抗体又は抗体−薬物コンジュゲートは、疾患又は障害の処置のための第２の薬物と組み合わせて使用される。ガンの処置に使用される場合、本発明の抗Ｃａｔｈ−Ｄ抗体又は抗体−薬物コンジュゲートは、例えば手術、放射線療法、化学療法又はそれらの組み合わせなどの従来のガン治療と組み合わせて使用され得る。
【０１２９】
本発明の別の態様は、乳ガンを処置するための方法において使用するための単離されたヒト抗Ｃａｔｈ−Ｄモノクローナル抗体又はそのフラグメントに関する。
【０１３０】
本発明はまた、乳ガンを処置するための方法であって、治療有効量の単離されたヒト抗Ｃａｔｈ−Ｄモノクローナル抗体又はそのフラグメントを、それを必要とする患者に投与することを含む方法に関する。
【０１３１】
医薬組成物：
投与のために、抗Ｃａｔｈ−Ｄ抗体又は抗体−薬物コンジュゲートは、医薬組成物として製剤化される。抗Ｃａｔｈ−Ｄ抗体又は抗体−薬物コンジュゲートを含む医薬組成物は、薬学的に有用な組成物を調製するための公知の方法にしたがって製剤化され得、それにより、治療分子は、薬学的に許容し得る担体との混合物で組み合わされる。組成物は、その投与がレシピエント患者に許容し得る場合、「薬学的に許容し得る担体」と言われる。滅菌リン酸緩衝生理食塩水は、薬学的に許容し得る担体の一例である。他の適切な担体は、当業者に周知である（例えば、Gennaro (ed.), Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19th ed. 1995)を参照のこと）。製剤は、１つ以上の賦形剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤、バイアル表面のタンパク質のロスを防止するためのアルブミンなどをさらに含み得る。
【０１３２】
医薬組成物の形態、投与経路、用量及びレジメンは、当然のことながら、処置すべき症状、疾患の重症度、患者の年齢、体重及び性別などに依存する。
【０１３３】
本発明の医薬組成物は、局所投与、経口投与、非経口投与、鼻内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与又は眼内投与などのために製剤化され得る。
【０１３４】
好ましくは、医薬組成物は、注射可能な製剤のための薬学的に許容し得るビヒクルを含有する。これらは、特に、等張滅菌生理食塩水溶液（リン酸一ナトリウム又は二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム又は塩化マグネシウムなど又はこのような塩の混合物）、又は乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物（これは場合に応じて、滅菌水又は生理学的食塩水の追加により、注射液の構成を可能にする）であり得る。
【０１３５】
投与に使用される用量は、様々なパラメータに応じて、特に、使用される投与様式、関連する病変、あるいは所望の処置期間に応じて適合され得る。
【０１３６】
医薬組成物を調製するために、有効量の抗体を薬学的に許容し得る担体又は水性媒体に溶解又は分散し得る。
【０１３７】
注射用途に適切な医薬形態としては、滅菌水溶液又は分散液；ゴマ油、ピーナッツ油又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び滅菌注射液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。全ての場合において、形態は滅菌されていなければならず、容易にシリンジで扱える程度に流動性でなければならない。それは製造及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して防腐されていなければならない。
【０１３８】
遊離塩基又は薬理学的に許容し得る塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製され得る。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びその混合物中で及び油中で調製され得る。通常の保存及び使用条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐための保存剤を含む。
【０１３９】
本発明の抗体は、中性形態又は塩形態の組成物に製剤化され得る。薬学的に許容し得る塩としては、（タンパク質の遊離アミノ基を用いて形成される）酸付加塩、及び無機酸（例えば、塩酸又はリン酸）又は有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）を用いて形成されるものが挙げられる。遊離カルボキシル基と形成される塩はまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム又は水酸化鉄）及び有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど）から誘導され得る。
【０１４０】
担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、適切なその混合物、及び植物油を含む、溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物作用の抑制は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に使用することによってもたらされ得る。
【０１４１】
必要に応じて上に列挙されている様々な他の成分と一緒に、必要量の活性化合物を適切な溶媒に組み込み、続いて滅菌ろ過することによって、滅菌注射液を調製する。一般に、基本分散媒体と上に列挙されている必要な他の成分とを含有する滅菌ビヒクルに様々な滅菌有効成分を組み込むことによって、分散液を調製する。滅菌注射液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌ろ過したその溶液から有効成分と任意のさらなる所望の成分との粉末が得られる真空乾燥及び凍結乾燥技術である。
【０１４２】
より濃縮された又は高濃縮された直接注射用溶液の調製も企図され、この場合、極めて迅速な浸透をもたらして高濃度の活性薬剤を小腫瘍領域に送達するために、溶媒としてＤＭＳＯを使用することが想定される。
【０１４３】
製剤化したら、投与製剤と適合性の方法によって治療有効量で溶液を投与する。製剤は、上記注射液型などの様々な剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども用いることができる。
【０１４４】
水溶液による非経口投与の場合、例えば、必要の場合には前記溶液を適切に緩衝化し、十分な生理食塩水又はグルコースを用いて液体希釈剤を最初に等張にすべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に特に適切である。これに関して、当業者であれば、本開示を考慮して、用いられ得る滅菌水性媒体を理解するであろう。例えば、１投与量を等張ＮａＣｌ溶液１mlに溶解し、皮下注入液１０００mlに追加し得るか、又は推奨注入部位に注射し得る（例えば、“Remington’s Pharmaceutical Sciences” 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580を参照のこと）。処置される被験体の症状に応じて、投与量のいくらかの変更が必ず生じるであろう。いずれにしても、投与責任者は、個々の被験体に適切な用量を決定するであろう。
【０１４５】
本発明の抗体は、１用量当たり約０．０００１〜１．０ミリグラム又は約０．００１〜０．１ミリグラム又は約０．１〜１．０又はさらには約１０ミリグラムほどを含むように治療混合物内に製剤化され得る。複数回用量も投与され得る。
【０１４６】
静脈内又は筋肉内注射などの非経口投与のために製剤化された化合物に加えて、他の薬学的に許容し得る形態としては、例えば、錠剤又は経口投与のための他の固体；徐放性カプセル；及び現在使用されている任意の他の形態が挙げられる。
【０１４７】
特定の実施態様では、抗体を宿主細胞に導入するために、リポソーム及び／又はナノ粒子の使用が企図される。リポソーム及び／又はナノ粒子の形成及び使用は、当業者に公知である。
【０１４８】
ナノカプセルは、一般に、化合物を安定かつ再現可能な方法で捕捉し得る。細胞内のポリマーオーバーローディングによる副作用を回避するために、一般に、in vivoで分解可能なポリマーを使用して、このような超微細粒子（約０．１μmのサイズ）を設計する。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリラートナノ粒子が本発明における使用に企図され、このような粒子は容易に作製され得る。
【０１４９】
水性媒体に分散されて多層状で同心円状の二層ベシクル（多層ベシクル（ＭＬＶ）とも称される）を自然に形成するリン脂質から、リポソームが形成される。ＭＬＶは、一般に、２５nm〜４μmの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理により、２００〜５００Åの範囲の直径を有する小単層ベシクル（ＳＵＶ）であって、コアに水溶液を含有する小単層ベシクルが形成される。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度及び二価カチオンの存在に依存する。
【０１５０】
キット：
最後に、本発明はまた、本発明の少なくとも１つの抗体を含むキットを提供する。本発明の抗体を含有するキットは、Ｃａｔｈ−Ｄの発現（増加又は減少）を検出する際に、又は治療的アッセイ若しくは診断的アッセイにおいて使用される。例えば、ＩｇＧ１  Ｅ２及びＦ１抗体は、免疫蛍光によって細胞カテプシンＤを認識する。本発明のキットは、例えば組織培養プレート又はビーズ（例えば、セファロースビーズ）などの固体支持体にカップリングされた抗体を含有し得る。例えば、ＥＬＩＳＡでは、Ｃａｔｈ−Ｄをin vitroで検出及び定量するための抗体を含有するキットが提供され得る。検出に有用なこのような抗体は、蛍光又は放射性標識などの標識と共に提供され得る。
【０１５１】
以下の図面及び実施例によって、本発明をさらに説明する。しかしながら、これらの実施例及び図面は、決して本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１５２】
【図１】抗Ｃａｔｈ−Ｄ  ｓｃＦｖの作製及び特性評価。（Ａ）ＥＬＩＳＡによるモノクローナル抗Ｃａｔｈ−Ｄ  ｓｃＦｖの選択。ヒトプロ−、シュード−及び成熟Ｃａｔｈ−Ｄに対する最良のｓｃＦｖクローン（４００個のスクリーニングしたクローンの８個）の細菌培養上清に対して実施したＥＬＩＳＡが示されている。ＨＲＰ標識抗Ｍｙｃ抗体を用いて、Ｃａｔｈ−Ｄに対するｓｃＦｖの結合を検出した。ＢＳＡ、陰性抗原；ＩＲ（無関係）：スクリーニングからの陰性ｓｃＦｖ。成熟Ｃａｔｈ−Ｄ抗原を用いてｓｃＦｖ（Ｆ６、Ｈ７、Ｆ１、Ｅ１２、Ｅ２）を単離し、シュードＣａｔｈ−Ｄ抗原を用いてｓｃＦｖ（Ｄ７、Ｂ１及びＨ２）を単離した。（Ｂ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＢＣＣ由来のヒトＣａｔｈ−Ｄに対する抗Ｃａｔｈ−Ｄ  ｓｃＦｖの結合。ＨＲＰにコンジュゲートした抗Ｈｉｓを使用して、分泌されたヒトプロｃａｔｈ−Ｄ、自己活性化シュードｃａｔｈ−Ｄ及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＢＣＣ由来の細胞ヒトＣａｔｈ−Ｄに対するＥＬＩＳＡによって、抗Ｃａｔｈ−Ｄ  ｓｃＦｖの結合をアッセイした。ＢＳＡ、陰性抗原；ＩＲ、陰性ｓｃＦｖ。（Ｃ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＢＣＣ由来のプロＣａｔｈ−Ｄ及びシュードＣａｔｈ−Ｄに対するＩｇＧ１  Ｆ１及びＥ２の結合。漸増濃度のＩｇＧ１  Ｆ１（上のパネル）又はＩｇＧ１  Ｅ２（下のパネル）の存在下でプレコーティング抗プロＣａｔｈ−Ｄ  Ｍ２Ｅ８マウスモノクローナル抗体に加えたＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＢＣＣの馴化培地（ＣＭ；ＦＣＳの存在下で７日間；酸性化又は非酸性化）に対して、サンドイッチＥＬＩＳＡをｐＨ７で実施した。ＨＲＰにコンジュゲートした抗ヒトＦｃ抗体を用いて、プロＣａｔｈ−Ｄに対するＩｇＧ１  Ｆ１及びＩｇＧ１  Ｅ２の結合を可視化した。ＥＣ５０値が示されている。
【図２】ＥＲ＋ＢＣＣにおけるヒト抗Ｃａｔｈ−Ｄ  ＩｇＧ１  Ｆ１及びＥ２の特性評価。（Ａ）ＭＣＦ−７  ＢＣＣ由来のヒトＣａｔｈ−Ｄに対する抗Ｃａｔｈ−Ｄ  ｓｃＦｖの結合。ＨＲＰにコンジュゲートした抗Ｈｉｓを使用して、分泌されたヒトプロｃａｔｈ−Ｄ、自己活性化シュードｃａｔｈ−Ｄ及びＭＣＦ−７  ＢＣＣ由来の細胞ヒトＣａｔｈ−Ｄに対するＥＬＩＳＡによって、抗Ｃａｔｈ−Ｄ  ｓｃＦｖの結合をアッセイした。ＢＳＡ、陰性抗原；ＩＲ、陰性ｓｃＦｖ。（Ｂ）ＭＣＦ−７  ＢＣＣ由来のプロＣａｔｈ−Ｄ及びシュードＣａｔｈ−Ｄに対するＩｇＧ１  Ｆ１及びＥ２の結合。漸増濃度のＩｇＧ１  Ｆ１（左のパネル）又はＩｇＧ１  Ｅ２（右のパネル）の存在下でプレコーティング抗プロＣａｔｈ−Ｄ  Ｍ２Ｅ８マウスモノクローナル抗体に加えたＭＣＦ−７  ＢＣＣの馴化培地（ＣＭ；ＦＣＳの存在下で７日間；；酸性化又は非酸性化）に対して、サンドイッチＥＬＩＳＡをｐＨ７で実施した。ＨＲＰにコンジュゲートした抗ヒトＦｃ抗体を用いて、プロＣａｔｈ−Ｄに対するＩｇＧ１  Ｆ１及びＩｇＧ１  Ｅ２の結合を可視化した。ＥＣ５０値が示されている。
【図３】シュードＣａｔｈ−Ｄのタンパク質分解活性に対する抗Ｃａｔｈ−Ｄ  ｓｃＦｖの阻害効果。Ｋｉ±ＳＤ（ｎ＝３）の概要が示されている。
【図４】成熟Ｃａｔｈ−Ｄのタンパク質分解活性に対するｓｃＦｖの阻害効果。Ｋｉ±ＳＤ（ｎ＝３）の概要が示されている。
【図５】Ｍ０９３８及びＭ２２９５基質を用いたシュードＣａｔｈ−Ｄ及び成熟Ｃａｔｈ−Ｄのミカエリス・メンテン反応速度。ミカエリス・メンテン式によるシュードＣａｔｈ−Ｄ（Ａ）及び成熟Ｃａｔｈ−Ｄ（Ｂ）の最適値は、それぞれＶｍａｘ＝５３１±２８AFU／分；Ｋｍ＝０．９±０．１μM及びＶｍａｘ＝３７４±２２AFU／分；Ｋｍ＝８．４±１．２μMである。
【図６】ＧＳＴ−ＬＲＰ１βフラグメントに対するプロＣａｔｈ−Ｄの結合に対する抗Ｃａｔｈ−Ｄ  ｓｃＦｖの効果。抗Ｃａｔｈ−Ｄ又は無関係なｓｃＦｖと共にプレインキュベーションした放射性標識プロＣａｔｈ−Ｄを、ＧＳＴ−ＬＲＰ１β（３０７〜４７９）（ＬＲＰ１β細胞外ドメインのアミノ酸３０７〜４７９）を含有するビーズ上にロードした。ｓｃＦｖの存在下でＧＳＴ−ＬＲＰ１βに結合したプロＣａｔｈ−Ｄの全ＧＳＴ−ＬＲＰ１βに対する比の定量は、無関係なｓｃＦｖに対する割合（％）として表されている（ＩＲ、スクリーニングからの無関係な陰性ｓｃＦｖ）。
【図７】ヒトＣａｔｈ−ＤとｓｃＦｖ  Ｆ１及びＥ２並びにＩｇＧ１  Ｆ１及びＥ２との相互作用。（Ａ）ＩｇＧ１及びｓｃＦｖ  Ｆ１及びＥ２間の競合ＥＬＩＳＡ。ＩｇＧ１  Ｆ１又はＥ２（およそのＥＣ５０値；４０ng/ml；０．２７nM，）又は漸増濃度（０．０４〜１０μg/ml）のｓｃＦｖ  Ｆ１、Ｅ２又はＩＲ（スクリーニングからの陰性ｓｃＦｖ）の存在下でプレコーティング抗プロＣａｔｈ−Ｄ  Ｍ２Ｅ８抗体に加えたＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＢＣＣの馴化培地（ＣＭ；ＦＣＳの存在下で７日間）を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡを実施した。ＨＲＰにコンジュゲートした抗ヒトＦｃ抗体を用いて、プロＣａｔｈ−Ｄに対するＩｇＧ１  Ｆ１及びＩｇＧ１  Ｅ２の結合を可視化した。（Ｂ）成熟Ｃａｔｈ−Ｄ上のｓｃＦｖ  Ｆ１及びＥ２のエピトープ。ヒトＣａｔｈ−Ｄの５２kDaのプロＣａｔｈ−Ｄの概略図。４kDaのＣａｔｈ−Ｄプロフラグメント、１４kDaの成熟軽鎖、及び３４kDaの成熟重鎖の位置が示されている。４８kDaの中間形態は、１４＋３４kDaの非切断鎖に対応する。［７２］によれば、１は、成熟Ｃａｔｈ−Ｄにおける１番目のアミノ酸に対応する。触媒部位の２つのアスパラギン酸の位置が示されており、Ｍ６Ｐモチーフを有する２本のグリコシル化鎖も示されている。Ｋ、キロダルトン。
【図８】無胸腺マウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍成長及び生存に対する抗Ｃａｔｈ−Ｄ  ＩｇＧ１  Ｆ１及びＥ２の効果。（Ａ）抗Ｃａｔｈ−Ｄ  ＩｇＧ１  Ｆ１及びＥ２で処置したマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片の成長。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（細胞１．５  １０６個）をマトリゲルと混合（比１：１）し、無胸腺マウスの側腹部に皮下注射した。１日後、ＩｇＧ１  Ｆ１及びＥ２（１５mg/kg）又はＮａＣｌをマウスに４５日間にわたって週３回腹腔内注射した。腫瘍体積が２０００mm3に達したらマウスを屠殺し、腫瘍成長曲線を停止した。腫瘍成長を週２回モニタリングした。腫瘍体積は、mm3±ＳＥＭで示されている（コントロール及びＩｇＧ  Ｆ１について、ｎ＝８；ＩｇＧ  Ｅ２について、ｎ＝７）。＊＊、ｐ＜０．０１；＊、ｐ＜０．０５；スチューデントｔ検定。（Ｂ）カプラン・マイヤー曲線。ログランク検定を使用して、統計的差異を評価した（ＩｇＧ  Ｆ１及びＩｇＧ  Ｅ２について、ｐ＜０．０５）。
【図９】無胸腺マウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１樹立腫瘍成長及び生存に対する抗ｃａｔｈ−Ｄ  ＩｇＧ  Ｆ１及びＥ２の効果。（Ａ）抗Ｃａｔｈ−Ｄ  ＩｇＧ１  Ｆ１及びＥ２で処置したマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片の成長。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（細胞１．５  １０６個）をマトリゲルと混合（比１：１）し、無胸腺マウスの側腹部に皮下注射した。腫瘍体積が５０mm3に達したら、ＩｇＧ１  Ｆ１（１５mg/kg）、ＩｇＧ  Ｅ２（１５mg/kg）又はＮａＣｌをマウスに３２日間にわたって週３回腹腔内注射した。腫瘍体積が２０００mm3に達したらマウスを屠殺し、腫瘍成長曲線を停止した。腫瘍成長を週２回モニタリングした。腫瘍体積は、mm3±ＳＥＭで示されている（コントロールについて、ｎ＝８；ＩｇＧ  Ｆ１及びＩｇＧ  Ｅ２について、ｎ＝６）。＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊、ｐ＜０．０１；＊、ｐ＜０．０５；スチューデントｔ検定。（Ｂ）カプラン・マイヤー曲線。ログランク検定を使用して、統計的差異を評価した（ＩｇＧ  Ｆ１及びＩｇＧ  Ｅ２について、ｐ＜０．０００５）。
【図１０】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍サイズ及び肉眼的外観に対する抗Ｃａｔｈ−Ｄ  ＩｇＧ１  Ｆ１及びＥ２の効果。抗Ｃａｔｈ−Ｄ  ＩｇＧ１  Ｆ１及びＥ２又はコントロールのリツキシマブで処置したマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片の腫瘍成長。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（細胞１．５  １０６個）をマトリゲルと混合（比１：１）し、無胸腺マウスの側腹部に皮下注射した。腫瘍体積が５０mm3に達したら、ＩｇＧ１  Ｆ１（１５mg/kg）、ＩｇＧ  Ｅ２（１５mg/kg）又はリツキシマブ（ＩｇＧコントロール、１５mg/kg）をマウスに２８日間にわたって週３回腹腔内注射した。コントロールの腫瘍体積が６００mm3に達した４４日目にマウスを屠殺した。腫瘍成長を週２回モニタリングした。腫瘍体積は、mm3±ＳＥＭで示されている（リツキシマブ、ＩｇＧ  Ｆ１及びＩｇＧ  Ｅ２について、ｎ＝９）。＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊、ｐ＜０．０１；スチューデントｔ検定。
【実施例】
【０１５３】
実施例：腫瘍微小環境におけるプロテアーゼカテプシンＤの抗体ターゲティングは、乳ガン成長を阻害する
材料及び方法
材料：酵母ツーハイブリッドアッセイによって同定したｐＹＥＳＴｒｐ２−ＬＲＰ１β（３０７〜４７９）由来のＬＲＰ１β（３０７〜４７９）をコードするＰＣＲ増幅ｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩによって以前に設計されたｐＧＥＸ−４Ｔ−１に挿入することによって、ＬＲＰ１β（３０７〜４７９）を作製した［２９］。５２−、４８−、３４−、１４−又は４kDaのヒトＣａｔｈ−Ｄ鎖をコードするＰＣＲ増幅ｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩによって以前に設計されたｐＧＥＸ−４Ｔ−１に挿入することによって、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１−Ｃａｔｈ−Ｄ構築物を得た［２９］。サンドイッチＥＬＩＳＡに使用したマウス抗ヒトＣａｔｈ−Ｄモノクローナル抗体Ｍ２Ｅ８は、５２kDaのプロＣａｔｈ−Ｄとのみ相互作用し、４８kDa又は３４kDaのＣａｔｈ−Ｄと相互作用しない［４６］。５２−、４８−及び３４kDa型のＣａｔｈ−Ｄを認識する抗ヒトＣａｔｈ−Ｄモノクローナル抗体（BD Biosciences）、１４kDaのＣａｔｈ−Ｄ軽鎖を認識する抗ヒトＣａｔｈ−Ｄ抗体（ABCAM; ab75811）及び４kDaのＣａｔｈ−Ｄプロドメインを認識する抗ヒトＣａｔｈ−Ｄ抗体（Pr. M. Fusek (Oklahoma Medical Research Foundation, Oklahoma City, OK, U.S.A.)［１８］の厚意による提供）をイムノブロッティングに使用した。ＨＲＰにコンジュゲートしたヤギポリクローナル抗ヒトＦｃ抗体（Ａ０１７０）、マウスモノクローナルＨＲＰ抗ｈｉｓ（Ａ７０５８）、細胞Ｃａｔｈ−Ｄ（ヒト肝臓由来）、Ｄ−エリスロ−セラミドＣ８１−リン酸（Ｃ８３５５）、ペプスタチンＡ、ＢＳＡ及びクリスタルバイオレットは、（Sigma Aldrich）から購入した。ポリクローナル抗マウスｃａｔｈＤ（ｓｃ−６４８６）、及びＨＲＰにコンジュゲートしたモノクローナル抗ｃ−Ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０）は（Santa Cruz Biotechnology）から購入し、リツキシマブ（抗ＣＤ２０抗体）はRocheから購入し、ＨＲＰにコンジュゲートしたモノクローナル抗Ｍ１３抗体（２７９４２１０１）は（GE Heathcare）から購入した。シュードＣａｔｈ−Ｄの蛍光発生ペプチド基質（Ｍ２２９５：Ａｃ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ（ＥＤＡＮＳ）−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（ＤＡＢＣＹＬ）−Ｇｌｕ−ＮＨ２）は（Sigma Aldrich）から購入し、成熟Ｃａｔｈ−Ｄの蛍光発生ペプチド基質（Ｍ０９３８：ＭＣＡ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＤＮＰ−Ａｒｇ−ＮＨ２）は（BACHEM）から購入した。５２kDaのリコンビナントヒトプロＣａｔｈ−Ｄは、（R&D Systems）から購入した。マトリゲルは、（BD Biosciences）から購入した。
【０１５４】
細胞株及び馴化培地及び細胞溶解物：１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、GibcoBRL, Life technologies, Carlsbad, CA, USA）を含むＤＭＥＭ中で、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＣＦ−７及びＴ４７Ｄ  ＢＣＣ及び野生型ＭＥＦ（マウス胎児線維芽細胞）を培養した。馴化培地及び細胞溶解物を生産するために、ＤＭＥＭ培地１０％ＦＣＳ中で、細胞を９０％コンフルエンスまで成長させた。馴化培地（ＦＣＳの非存在下で２４時間又はＦＣＳの存在下で７日間）を除去し、８００×ｇで１０分間遠心分離した。ＰＢＳ １ml中での５回の解凍凍結サイクルによって細胞を溶解し、１３，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離した後、細胞溶解物を単離した。
【０１５５】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＢＣＣにおけるｓｈＲＮＡの安定トランスフェクション：製造業者の説明書にしたがってNucleofector Technology (Amaxa biosystems)を使用して、抗Ｃａｔｈ−Ｄ  ｓｈＲＮＡ１又はｓｈＲＮＡ２発現ベクター（Invivogen）をＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＢＣＣにトランスフェクションし、ブラスチシジン（１０μg/ml）に対して耐性のクローンを単離した。抗Ｃａｔｈ−Ｄ  ｓｈＲＮＡ１をトランスフェクションしたクローンＳ１Ｃ４、及び抗Ｃａｔｈ−Ｄ  ｓｈＲＮＡ２をトランスフェクションしたクローンＳ２Ｃ６は、Ｃａｔｈ−Ｄサイレンシングについて選択した最良のクローンであった。
【０１５６】
５１kDaのシュードＣａｔｈ−Ｄへの５２kDaのプロＣａｔｈ−Ｄの自己活性化：５１kDaのシュードＣａｔｈ−Ｄを生産するために、２５mM ＭＥＳバッファー３０μl［ｐＨ６．５］＋１Ｍ酢酸Ｎａバッファー２μl［ｐＨ３．５］／２M ＮａＣｌ（最終ｐＨ３．９、次いでｄｅ  ＮａＨ２ＰＯ４２N ５０μlでｐＨ７に中和）中で、５２kDaのリコンビナントプロＣａｔｈ−Ｄ（１０μg）を３７℃で１５分間自己活性化した。他の実験では、以前に記載されているように［７１］、５１kDaのシュードＣａｔｈ−Ｄを５２kDaの分泌型からＢＣＣの馴化培地中に直接生産した。分泌型プロＣａｔｈ−Ｄをin vitroで自己活性化するために、１N ＨＣｌの追加によって３．５に調整したｐＨにおいて、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭで馴化した培養培地を３７℃で１時間インキュベーションし、次いで、１N ＮａＯＨでｐＨ７．４に中和した。
【０１５７】
抗体ファージディスプレイ：ＨｕｓｃＩライブラリーは、高レベルの発現に最適化された単一のフレームワークを使用する［３７］。多様性を５つのアミノ酸（Ｙ、Ｎ、Ｄ、Ｇ、Ｓ）に限定し、パラトープに最も寄与する残基に対応する位置の６つのＣＤＲに導入した［３８］。使用した抗原は、市販の５１kDaのヒトシュードｃａｔｈ  Ｄ及びヒト細胞成熟（３４＋４kDa）Ｃａｔｈ−Ｄであった。陰性抗原は、ＢＳＡであった。以前に記載されているように［３７］、ＨＵＳＣＩライブラリーからのｓｃＦｖの選択を実施した。シュードＣａｔｈ−Ｄ、成熟Ｃａｔｈ−Ｄ又はＢＳＡを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、１００ng／ウェルで９６ウェルプレート（Nunc Maxisorp）上に４℃で一晩コーティングした。（ＰＢＳ／ｔｗｅｅｎ０．１％）で洗浄した後、非特異的結合部位を１％ゼラチン／ＰＢＳＴでブロッキングし、以前に記載されているように［３７］、１ml当たり１０１０個のｓｃＦｖファージを各ウェルに室温で２時間アプライした。ＨＲＰにコンジュゲートした抗Ｍ１３抗体を使用して、可視化を行った。Ｃａｔｈ−Ｄ結合物中のポリクローナルｓｃＦｖ集団を濃縮するために、この実験を４回連続の選択ラウンドで反復した。Ｃａｔｈ−Ｄ結合物中の濃縮したポリクローナルｓｃＦｖをＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ細菌にトランスフォーメーションした。ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳコロニー（合計４００）を９６ウェルマイクロタイタープレートに採取して、自己誘導によってｓｃＦｖを生産し、以前に記載されているように［３７］溶解した。ヒトシュードＣａｔｈ−Ｄ、成熟Ｃａｔｈ−Ｄ又はＢＳＡを、１００ng／ウェルで９６ウェルプレート上に４℃で一晩コーティングした。（ＰＢＳ／ｔｗｅｅｎ０．１％）で洗浄し、非特異的結合部位を１％ゼラチン／ＰＢＳＴでブロッキングした後、モノクローナルｓｃＦｖを含有する全細菌溶解物を４℃で２時間アプライした。ＨＲＰにコンジュゲートした抗ｃ−Ｍｙｃ抗体を使用して、可視化を行った。
【０１５８】
ＳｃＦｖ抗体遺伝子の配列決定：細菌培養物から二本鎖ファージミドＤＮＡを抽出し、モノクローナルファージＥＬＩＳＡプレートの各陽性ウェルからエクスパンションし、Ｔ７及びＴ７末端プライマー（Eurofins Genomics）を用いて配列決定した。
【０１５９】
ｓｃＦｖ抗体フラグメントの精製：シャッフルしたｓｃＦｖ遺伝子を発現ベクターＰＥＴ２３ＮＮにサブクローニングして、ヘキサヒスチジンタグをｓｃＦｖのＣ末端に追加した。リコンビナントプラスミドｐＥＴ２ＮＮ−ｓｃＦｖを得、E. coli  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ（Invitrogen）にトランスフォーメーションし、製造業者のプロトコールにしたがってTALONコバルトカラムで精製した。以前に記載されているように、Ｃａｔｈ−Ｄに対する精製ｓｃＦｖの認識をＥＬＩＳＡによって実施し、ＨＲＰにコンジュゲートした抗Ｈｉｓを用いて可視化した。
【０１６０】
ＩｇＧのクローニング及び発現：ＳｃＦｖ（Ｆ１、Ｅ２及びＥ１２）をヒトＩｇＧ１、λフォーマットでサブクローニングし、Evitria AGが（ＣＨＯ）チャイニーズハムスター卵巣細胞株において発現させ、プロテイン−Ａ  HiTrapカラム（GE Healthcare）で精製した。
【０１６１】
ＧＳＴプルダウンアッセイ：TNT T7結合網状赤血球溶解物システム(Promega)を使用した転写及び翻訳によって、［３５Ｓ］メチオニン標識プレプロＣａｔｈ−Ｄを得た。イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（１mM）を３７℃で３時間使用してEscherichia coli B株ＢＬ２１において、ＧＳＴ−ＬＲＰ１β（３０７−４７９）フラグメントを生産した。グルタチオン−セファロースビーズ(Amersham Biosciences)によって、ＧＳＴ融合タンパク質を精製した。プルダウンアッセイのために、ＧＳＴ融合タンパク質を固定化したグルタチオン−セファロースビーズ２０μlを、１５mg/ml ＢＳＡ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＤＢバッファー５００μl（２０mM ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ［ｐＨ７．９］、１０％グリセロール、１００mM ＫＣｌ、５mM ＭｇＣｌ２、０．２mM ＥＤＴＡ、１mM ＤＴＴ、０．２mMフェニルメチルスルホニルフルオライド）中でｓｃＦｖ抗体と共にプレインキュベーションした［３５Ｓ］メチオニン標識タンパク質プレプロＣａｔｈ−Ｄと共に４℃で一晩インキュベーションした。ビーズをＰＤＢバッファー５００μlで洗浄し、結合したタンパク質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、クーマシーブルーで染色し、オートラジオグラフィーフィルムに露出した。
【０１６２】
Ｃａｔｈ−Ｄ活性及び定常反応速度のための触媒活性アッセイ：Ｄ−エリスロ−セラミドＣ８１−リン酸（１０μM）、Ｃａｔｈ−Ｄ（５nM）及びＭ２２９５（シュードＣａｔｈ−Ｄの蛍光発生ペプチド基質）又はＭ０９３８（成熟Ｃａｔｈ−Ｄの蛍光発生ペプチド基質）を含有する０．１M ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）バッファー［ｐＨ６］中で、開裂反応を１００μLで行った。それぞれ（０．０５μM〜５μM）及び（０．０５μM〜３０μM）で変動する濃度で試験したＭ２２９５又はＭ０９３８基質を用いて、シュードＣａｔｈ−Ｄ及び成熟Ｃａｔｈ−Ｄの反応速度パラメータ（Ｋｍ）を決定した。ホワイト９６ハーフウェルプレート（Corning）中で反応を実行し、BMG Labtech Fluostar Omega分光蛍光光度計によって基質の切断を測定した。ミカエリス・メンテン式を使用して、Ｋｍを決定した。非線形最小二乗回帰分析を使用して、SigmaPlot 12ソフトウェア(Systat Software Inc., San Jose, USA)の酵素反応速度モジュールが提供する単一基質反応速度モデルに対して、速度データをフィッティングした。ミカエリス・メンテン式（Ｖｉ＝Ｖｍａｘ＊Ｓ／Ｋｍ＋［Ｓ］）に対して、２つのペプチドの加水分解反応速度に対応する速度データをベストフィッティングした。競合酵素阻害式（Ｖｉ＝（Ｖｍａｘ＊［Ｓ］）／（Ｋｍ（１＋［Ｉ］／Ｋｉ）＋［Ｓ］））に対してデータを再フィッティングすることによって、Ｋｉ値を計算した。フィッティングの質を視覚化するために、実験データ点は、酵素反応速度ソフトウェアによってフィッティングした理論線と共にプロットとして示されている。シュードＣａｔｈ−Ｄのタンパク質分解活性に対するｓｃＦｖの阻害効果を評価するために、０．１M ＭＥＳバッファー［ｐＨ６］中で、Ｃａｔｈ−Ｄ（５nM）を、Ｄ−エリスロ−セラミドＣ８１−リン酸（１０μM）及びＫｍ値付近の３つの濃度のＭ２２９５基質と共に（１００μlの最終体積で）３７℃でインキュベーションした。各基質濃度について、様々な濃度のｓｃＦｖを使用して、シュードＣａｔｈ−Ｄに関する機構及び阻害定数（Ｋｉ）を決定した。Ｍ０９３８基質と共に成熟Ｃａｔｈ−Ｄを用いて、同様の実験を行った。
【０１６３】
表面プラズモン共鳴（BIAcore）：T200機器(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)を使用して表面プラズモン共鳴分析によって、様々なＣａｔｈ−Ｄアイソフォーム（シュードＣａｔｈ−Ｄ、成熟Ｃａｔｈ−Ｄ及びプロＣａｔｈ−Ｄ）に対するヒトＩｇＧ１  Ｆ１及びＥ２の結合を２５℃で測定した。ＨＢＳ−ＥＰバッファー：１０mM ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、３mM ＥＤＴＡ、１５０mM ＮａＣｌ及び０．００５％非イオン界面活性剤Ｐ２０（GE Healthcare）中、３０μl／分で、実験を実施した。製造業者の説明書にしたがって抗ヒトＦｃ（GE Healthcare）を使用して、ＩｇＧ１をＣＭ５センサーチップ表面上に捕捉した。ＨＢＳ−ＥＰバッファーで希釈したＣａｔｈ−Ｄを、ＩｇＧ１及びコントロールフローセルに対して０．６nM〜１６０nMの異なる濃度で注入した。会合及び解離段階の後、２M ＭｇＣｌ２で再生工程を行った。コントロールフローセルのシグナルを差し引くことによって、センサーグラムを補正した。BIAevaluationバージョン４．１．１ソフトウェアを使用してコンフォメーション変化モデルに対して、データをグローバルフィッティングした。逆スキーム分析では、アミンカップリングによって、シュードＣａｔｈ−Ｄを６８０RUでＣＭ５センサーチップ表面上に共有結合的に固定化した。一定範囲の濃度（０．５nM〜１２８nM）のＩｇＧ１  Ｆ１又はＥ２をシュードＣａｔｈ−Ｄに注入した。二価モデルによって、センサーグラムをグローバルフィッティングした。
【０１６４】
ＥＬＩＳＡ及び免疫沈降：サンドイッチＥＬＩＳＡでは、ＰＢＳ中のマウスモノクローナル抗ヒトプロＣａｔｈ−Ｄ  Ｍ２Ｅ８抗体（５００ng／ウェル）［４６］を９６ウェルプレートに４℃で一晩コーティングした。ＰＢＳ１×／ｔｗｅｅｎ０．１％／ＢＳＡ１％で非特異的部位をブロッキングした後、細胞溶解物又は馴化培地を４℃で２時間アプライした。ＰＢＳ／ｔｗｅｅｎ０．１％で洗浄した後、抗ｃａｔｈＤ  ＩｇＧ１  Ｅ２又はＦ１の連続希釈物を４℃で２時間追加した。ＨＲＰにコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＦｃ抗体を使用して、可視化を行った。シェーカー上で、抗Ｃａｔｈ−Ｄ（ＩｇＧ１  Ｅ２又はＦ１）モノクローナル抗体３μgと共に４℃で一晩インキュベーションし、次いで、１０％プロテインＧ−セファロース５０μlと共に４℃で２時間インキュベーションした細胞抽出物（１mg）に対して、免疫沈降を行った。セファロースビーズをＰＢＳで３回洗浄し、ＳＤＳサンプルバッファー中で５分間煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。他の実験では、イソプロピル−１−チオ−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（１mM）を３７℃で３時間使用してEscherichia coli  Ｂ株ＢＬ２１において生産したＧＳＴ−Ｃａｔｈ−Ｄ融合タンパク質を使用して、免疫沈降を実施した。得られたタンパク質を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、続いて、抗Ｃａｔｈ−Ｄイムノブロッティングに供した。
【０１６５】
伸長、コロニー形成及び創傷治癒アッセイ：伸長アッセイでは、抗Ｃａｔｈ−Ｄ  ＩｇＧ１  Ｅ２若しくはＦ１又は無関係な抗ＣＤ２０  ＩｇＧ１（最終１００μg/ml）の存在下でマトリゲル２００μl（８mg/ml）に４℃で包埋した５０，０００個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＢＣＣを、２４ウェルプレート中のマトリゲル（最終１００μg/mlでこれらのＩｇＧ１を含有する２００μl）のプリセットレイヤーに加え、最終１００μg/mlでＩｇＧ１を含有するＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ ５００μlで７日間カバーした［１４］。コロニー形成アッセイでは、３００個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＢＣＣをＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中の６ウェルプレートにプレーティングし、抗Ｃａｔｈ−Ｄ  ＩｇＧ１  Ｆ１若しくはＥ２又は無関係な抗ＣＤ２０  ＩｇＧ１で４８時間ごとに処置した。創傷治癒アッセイでは、１００，０００個の細胞を２４ウェルプレートに播種し、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中、３７℃で成長させた。２４時間後、ピペットチップを用いて各単層をスクラッチすることによって、創傷を生じさせた。次いで、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で、細胞を、抗Ｃａｔｈ−Ｄ  ＩｇＧ１  Ｆ１若しくはＥ２又は無関係な抗ＣＤ２０  ＩｇＧ１（最終１００μg/ml）と共にインキュベーションした。Nikon ECLIPSE TS100顕微鏡及びOlympus SP-510 UZカメラによって、創傷閉鎖をキャプチャした。
【０１６６】
in vivo腫瘍成長：認定機関において、フランス国の規制及び実験動物研究の倫理ガイドラインに準拠して、in vivo実験を実施した（契約番号Ｃ３４−１７２−２７）。１．５×１０６個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＢＣＣを６週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（Harlan, Le Malourlet, France）のいずれかの側腹部の皮下に移植した。対数増殖期に採取することによって、細胞を調製した；それらをＰＢＳで洗浄し、マトリゲルと１：１で混合した。処置群（ｎ＝１０）については、移植日に、マウスをランダムに分けた。ＩｇＧ１  Ｆ１（１５mg/kg）、ＩｇＧ１  Ｅ２（１５mg/kg）、リツキシマブ（１５mg/kg）又はＮａＣｌ（週３回）でマウスを腹腔内処置した。キャリパーを使用して腫瘍を測定し、式Ｖ＝（腫瘍の長さ  腫瘍の幅  腫瘍の奥行き）／２を使用して体積を計算した。
【０１６７】
結果
ファージディスプレイによる抗Ｃａｔｈ−Ｄ  ｓｃＦｖの選択及び機能的スクリーニング：オープンな触媒部位を有する５１kDaのヒトリコンビナントシュードＣａｔｈ−Ｄ、及び３４＋１４kDaの精製ヒト肝臓成熟Ｃａｔｈ−Ｄを、ファージ抗体ＨｕｓｃＩライブラリーからヒト抗体を単離するめの免疫原として使用した［３７］。このライブラリーは、高レベルの発現に最適化された単一のフレームワーク使用する［３７］。多様性を５つのアミノ酸（Ｙ、Ｎ、Ｄ、Ｇ、Ｓ）に限定し、パラトープに最も寄与する残基に対応する位置の６つのＣＤＲに導入した［３８］。固定化したシュードＣａｔｈ−Ｄ又は成熟Ｃａｔｈ−Ｄに対してＥＬＩＳＡで特異的結合を示すｓｃＦｖフォーマットのポリクローナル抗体を単離し、４ラウンドのバイオパニングによってライブラリーから濃縮した［３７］。本発明者らは、ＥＬＩＳＡによって、プロＣａｔｈ−Ｄ、シュードＣａｔｈ−Ｄ及び成熟Ｃａｔｈ−Ｄの全てに結合する８個のモノクローナルｓｃＦｖを選択した（図１Ａ）。これらのモノクローナルｓｃＦｖを精製した。ＥＬＩＳＡ分析により、精製ｓｃＦｖが、トリプルネガティブＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＢＣＣ（図１Ｂ）及びＥＲ＋ＭＣＦ−７  ＢＣＣ（図２Ａ）由来のヒト分泌型プロＣａｔｈ−Ｄ、シュードＣａｔｈ−Ｄ及び細胞Ｃａｔｈ−Ｄに結合し、ＭＥＦ細胞由来の成熟Ｃａｔｈ−Ｄ（２つの成熟タンパク質間で８０％の同一性）と交差反応したことが明らかになった。ｐＨ６におけるシュードＣａｔｈ−Ｄ（図３；図５）及び成熟Ｃａｔｈ−Ｄ（図４；図５）のタンパク質分解活性の阻害について、８個のｓｃＦｖをそれらのＫｉ値について特性評価した。シュードＣａｔｈ−Ｄ及び成熟Ｃａｔｈ−Ｄのタンパク質分解活性を阻害するより強力なｓｃＦｖは、Ｆ１、Ｅ２、Ｅ１２及びＨ２であった（表３）。また、ＧＳＴプルダウンアッセイにおいて、ＬＲＰ１線維芽細胞レセプターに対するプロＣａｔｈ−Ｄの相互作用を阻害する能力について、８個のｓｃＦｖをスクリーニングした［２９］（図６）。Ｈ７を除く全てのｓｃＦｖが、ＧＳＴ−ＬＲＰ１βフラグメントに対するプロＣａｔｈ−Ｄの結合を（５０〜７９％）阻害した（図６；表３）。これら２つの機能的スクリーニングに基づいて、本発明者らは、ｐＨ６におけるＣａｔｈ−Ｄのタンパク質分解活性と、ＬＲＰ１に対するその結合との両方を阻害したＦ１、Ｅ２及びＥ１２  ｓｃＦｖを用いて、本発明者らの実験を行った（表３）。
【０１６８】
表３．抗Ｃａｔｈ−Ｄ  ｓｃＦｖによるＣａｔｈ−Ｄのタンパク質分解活性及び／又はＣａｔｈ−Ｄ／ＬＲＰ１相互作用の阻害。シュードＣａｔｈ−Ｄ及び成熟Ｃａｔｈ−Ｄのタンパク質分解活性の阻害定数（Ｋｉ）、並びにプロＣａｔｈ−Ｄ／ＬＲＰ１β相互作用の阻害（％）を、各抗Ｃａｔｈ−Ｄ  ｓｃＦｖについて示す。
【表３】
0006770533.tif 000004
【０１６９】
抗Ｃａｔｈ−Ｄ  ＩｇＧ１のin vitro特性評価：抗Ｃａｔｈ−Ｄ  ｓｃＦｖ（Ｆ１、Ｅ２、Ｅ１２）を完全ヒトＩｇＧ１、λとしてクローニングし、ＣＨＯ細胞において生産し、アフィニティークロマトグラフィー（EVITRIA）によって培養培地から精製した。クーマシー染色によって、精製ＩｇＧ１  Ｆ１、Ｅ２、及びＥ１２を分析した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＢＣＣから分泌されたＣａｔｈ−Ｄに対するＩｇＧ１  Ｆ１及びＩｇＧ１  Ｅ２の結合能力を、それぞれ０．３nM及び０．４nMのＥＣ５０でサンドイッチＥＬＩＳＡによって検証した。対照的に、ＩｇＧ１フォーマットの下では、ｓｃＦｖ  Ｅ１２は、ＥＬＩＳＡにおいてその結合活性を喪失した。ＭＣＦ−７  ＢＣＣによって分泌されたＣａｔｈ−Ｄについても、ＩｇＧ１  Ｆ１及びＥ２の同様の結合が得られた（図２Ｂ）。腫瘍は、それらの微小環境において酸性ｐＨを示すので［２３〜２５］、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＢＣＣから分泌されたＣａｔｈ−Ｄに対するＩｇＧ１  Ｆ１及びＥ２の結合を異なるｐＨで分析した。ＩｇＧ１  Ｆ１及びＥ２は、７．５〜５．５のｐＨ範囲にわたって、同程度の親和性で固定化Ｃａｔｈ−Ｄに結合した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＣＦ−７細胞抽出物由来の細胞Ｃａｔｈ−Ｄに対して、ＩｇＧ１  Ｆ１、Ｅ２、及びＥ１２の結合能力を免疫沈降によって分析した。ＩｇＧ１  Ｆ１及びＥ２は両方とも、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＣＦ−７細胞由来の細胞Ｃａｔｈ−Ｄを免疫沈降した一方、ＩｇＧ  Ｅ１２は非効率的であった。シュードＣａｔｈ−Ｄ、成熟Ｃａｔｈ−Ｄ及びプロＣａｔｈ−Ｄに対するＩｇＧ１  Ｆ１及びＥ２の結合親和性を、表面プラズモン共鳴によって定量した。ＩｇＧ１  Ｆ１は、ＩｇＧ１  Ｅ２と比較して、全てのＣａｔｈ−Ｄアイソフォームについて最高の解離定数ＫＤを示した。ＩｇＧ１  Ｆ１及びＥ２は両方とも、プロＣａｔｈ−Ｄに対するＫＤが１０倍未満であった。同様のＫＤがｐＨ６において得られたが、これは、腫瘍微小環境の酸性ｐＨにおいて、ＩｇＧ１  Ｆ１及びＥ２が全てＣａｔｈ−Ｄアイソフォームに依然として結合していたことを示している。
【０１７０】
次に、本発明者らは、ＩｇＧ１  Ｆ１及びＥ２のＣａｔｈ−Ｄエピトープを調査した。競合ＥＬＩＳＡにより、ＩｇＧ１  Ｆ１及びＩｇＧ１  Ｅ２のエピトープは重複していることが示された（図７Ａ）。ＧＳＴ−Ｃａｔｈ−Ｄ融合フラグメントを使用して、ＩｇＧ１  Ｆ１及びＥ２は、５２−、４８−及び３４kDaのＣａｔｈ−Ｄ−ＧＳＴの全てを免疫沈降した一方、４kDaのＣａｔｈ−Ｄ−ＧＳＴプロフラグメント及び１４kDaの軽鎖Ｃａｔｈ−Ｄ−ＧＳＴは認識されなかった（図７Ｂ）。したがって、ＩｇＧ１  Ｆ１及びＥ２のＣａｔｈ−Ｄエピトープは、３４kDaの重鎖上に位置する。成熟Ｃａｔｈ−Ｄの三次元構造に対して、分子ドッキングモデルを実施した［３９］。このモデルによれば、抗Ｃａｔｈ−Ｄ  ｓｃＦｖ  Ｆ１及びｓｃＦｖ  Ｅ２は、突出したＬ１  ＣＤＲをプロテイナーゼの活性部位に挿入して、触媒部位のアスパラギン酸３３及び２３１の近傍で３４kDaのＣａｔｈ−Ｄ鎖と相互作用する。３４kDaのＣａｔｈ−Ｄ上に位置する推定エピトープ（１２８ＡＡＫＦＤＧ１３４（配列番号：１７）；１７２ＤＰＤＡＱＰＧＧ１７９（配列番号：１８））は、中性［４０］及び酸性ｐＨ［４１］では、成熟Ｃａｔｈ−Ｄのリボン結晶構造上に表現される。これらのエピトープを検証するために、ドットブロット実験が進行中である。
【０１７１】
ＢＣＣの挙動に対する抗Ｃａｔｈ−Ｄ  ＩｇＧ１  Ｆ１及びＥ２の効果：本発明者らは、in vitroにおけるＢＣＣの挙動に影響を与えるＩｇＧ１  Ｆ１及びＥ２の能力を最初に分析した。ＩｇＧ１  Ｆ１及びＥ２は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＢＣＣの創傷治癒を有意に阻害し、コロニー形成アッセイにおいてクローンの数及びサイズを減少させ、マトリゲルに包埋されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＢＣＣの三次元伸長を防止した。ｓｈＲＮＡアプローチによるＣａｔｈ−Ｄのサイレンシング（Ｓ１Ｃ４及びＳ２Ｃ６クローン）は、創傷治癒、コロニー形成及びマトリゲルにおける伸長の阻害を誘導したが、これは、これらのプロセスにおけるこのプロテアーゼの重要な役割を裏付けている。重要なことに、Ｓ１Ｃ４及びＳ２Ｃ６クローンにおいてＣａｔｈ−Ｄをサイレンシングしたところ、ＩｇＧ１  Ｆ１及びＥ２は、創傷治癒に影響を与えるには非効率的であった。最後に、ＭＣＦ−７及びＴ４７Ｄ  ＥＲ＋ＢＣＣを用いて実施した創傷治癒アッセイでは、ＩｇＧ１  Ｆ１及びＥ２の有意な阻害効果が観察された。まとめると、本発明者らのデータは、細胞外Ｃａｔｈ−Ｄの中和を介してＢＣＣの侵襲性を減少させるＩｇＧ１  Ｆ１及びＥ２の能力を強く示唆している。
【０１７２】
乳房腫瘍進行に対する抗Ｃａｔｈ−Ｄ抗体の効果：
設定実験では、マトリゲルと混合（１：１）し、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスの皮下に樹立した１又は２  １０６個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＢＣＣ異種移植片は、指数関数的な腫瘍成長を示し、１００％の取り込み及び十分な腫瘍サイズの均一性を伴って、４５日間で１０００mm3の腫瘍体積に達した（図Ｓ８）。次に、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片（マトリゲルと混合（１：１）した１．５  １０６個の細胞）を皮下に樹立し、ＩｇＧ１  Ｆ１及びＥ２（１５mg/kg、週３回）で４５日間にわたって直接腹腔内処置した。腫瘍体積が２０００mm3に達したら、マウスを屠殺した。ＩｇＧＦ１及びＥ２処置は両方とも、腫瘍成長を有意に阻害し（図８Ａ）、全生存を改善した（図８Ｂ）。
【０１７３】
５０mm3の樹立ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍異種移植片に対して、ＩｇＧ１  Ｆ１及びＥ２（１５mg/kg、週３回）を３２日間にわたって腹腔内投与したところ、ＩｇＧ１  Ｆ１及びＥ２の同様の阻害効果は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍成長に対しても観察され（図９Ａ）、全生存を改善した（図９Ｂ）。ＩｇＧ１  Ｆ１及びＥ２のin vivo作用機序を解明するために、５０mm3の樹立ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍に対して実施した前述の実験を繰り返し、２８日間の処置後の４４日目にマウスを屠殺した（図１０）。
【０１７４】
重要なことに、マウスＣＤ２０と交差反応しない抗ヒトＣＤ２０リツキシマブ抗体をネガティブコントロールとして使用したところ、ＮａＣｌと比較して同程度の腫瘍成長阻害効果が得られた（図１０Ａ）。光学的な写真により、抗Ｃａｔｈ−Ｄ  ＩｇＧ１  Ｆ１及びＩｇＧ  Ｅ２群と比較した、リツキシマブ群間の腫瘍サイズの差異を確認した。また、抗Ｃａｔｈ−Ｄ抗体処置群由来の腫瘍は、リツキシマブと比較して血痕が少なかったが、これは、腫瘍血管新生に対するＩｇＧ  Ｆ１及びＩｇＧ  Ｅ２のマイナス効果の可能性を示唆している（データは示さず）。
【０１７５】
考察：
本報告は、抗Ｃａｔｈ−ＤヒトＩｇＧ１  Ｆ１及びＥ２を使用して、乳ガン腫の微小環境において高レベルで発現されるＣａｔｈ−Ｄをターゲティング及び遮断する能力を示している。in vitroでは、これらの抗体は、ＢＣＣの創傷治癒、コロニー形成及び三次元伸長をin vitroで阻害し、トリプルネガティブＢＣＣの腫瘍成長をin vivoで減少させた。Ｃａｔｈ−Ｄが、リソソーム内タンパク質の異化及び細胞ホメオスタシスの維持に不可欠なカテプシンの遍在する重要な必須メンバーであることは注目に値する。Ｃａｔｈ−Ｄノックアウトマウスは、神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）表現型で出生後直ぐに死亡する［４２］。ヒトにおける先天的なＣａｔｈ−Ｄ突然変異は、その合成の減少又は酵素的に不活性なタンパク質の産生につながり、ＮＣＬをもたらす［４３］。したがって、（細胞内Ｃａｔｈ−Ｄを超える）病的な細胞外Ｃａｔｈ−Ｄを優先的にターゲティングするヒト抗体は、特異的細胞透過性小分子阻害剤と比較して、オフターゲット効果を回避するために重要である。
【０１７６】
本発明者らの知見は、抗Ｃａｔｈ−ＤヒトＩｇＧ１  Ｆ１及びＥ２が、ヒトＣａｔｈ−Ｄの３４kDaの重鎖を特異的に認識することを示している。抗体は、基質結合クレフトの縁の突出したループを優先的にターゲティングして、長い挿入ループを必要とせずに、プロテアーゼの触媒機構を妨害し得ることが提案されている［４４］。Ｆ１及びＥ２  ｓｃＦｖと成熟Ｃａｔｈ−Ｄの三次元構造との分子ドッキングは、Ｆ１及びＥ２  ｓｃＦｖが、Ｃａｔｈ−Ｄのアスパラギン酸触媒部位の近傍の同じ突出要素と相互作用することを強く示唆している。本発明者らの競合ＥＬＩＳＡにより、ＩｇＧＦ１及びＥ２エピトープは重複することが立証された。これは、活性部位への基質アクセスの妨害による、又はアロステリック機構による基質加水分解の潜在的な阻害を示している。２つのヒト抗Ｃａｔｈ−Ｄ抗体によるＣａｔｈ−Ｄ阻害の機構の構造的洞察を正確に明らかにするためには、さらなる研究が必要である。
【０１７７】
これまでに、Ｃａｔｈ−Ｄの触媒活性と、ＬＲＰ１線維芽細胞レセプターに対するその結合との両方を阻害するヒト抗体はまだ記載されていない。以前、ハイブリドーマ戦略は、高親和性のモノクローナルマウス抗Ｃａｔｈ−Ｄ抗体の作製をもたらした。Garcia及びその同僚は、ＭＣＦ−７  ＢＣＣ細胞から精製した５２kDaのプロＣａｔｈ−Ｄでマウスを免疫して、ヒトＣａｔｈ−Ｄに選択的なマウスモノクローナル抗体を作製した［４５］。３４kDaの重鎖を認識するこれらのモノクローナルマウス抗Ｃａｔｈ−Ｄ抗体の一部は、ｐＨ４．５でＣａｔｈ−Ｄのタンパク質分解活性を特異的に阻害したのに対して、Ｃａｔｈ−Ｄプロペプチドを特異的に認識するものはこれを阻害しなかった［４６］。次いで、Rochefortのグループは、３４kDaの鎖の異なるエピトープに対するこれらのモノクローナル抗体の２つ（Ｍ１Ｇ８及びＤ７Ｅ３）を使用して、乳ガン組織の細胞質ゾルにおける５２kDaのプロＣａｔｈ−Ｄ及びそのプロセシング形態（４８kDa及び３４kDaのタンパク質）の固相二部位免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）を開発した［４７、４８］。この二部位ＩＥＭＡは、転移リスク及びより短い生存に関連する乳ガンの予後不良マーカーとしてのＣａｔｈ−Ｄの臨床評価を可能にした［８、９］。これまでに、これらの抗ｃａｔｈ−Ｄマウス抗体の潜在的な抗腫瘍効果は、まだ未調査であった。対照的に、Vetvickaのグループは、Ｃａｔｈ−Ｄプロペプチド内のアミノ酸ストレッチ（ａａ２７〜４４）に対するマウスモノクローナルペプチド抗体であって、無胸腺ヌードマウスにおけるヒト乳房腫瘍の成長を阻害したマウスモノクローナルペプチド抗体を開発したが［４９］、さらなる検証はまだ全く発表されていない。本明細書では、本発明者らは、ヒトにおける適用に必要なヒトモノクローナル抗体の便利な単離方法である抗体ファージディスプレイ技術を使用した［５０］。乳ガンにおけるＣａｔｈ−Ｄの作用に関する本発明者らの以前の研究［２６、２９］に基づいて、２回の厳格な機能的スクリーニング（Ｃａｔｈ−Ｄのタンパク質分解活性を阻害するそれらの能力、及びそのＬＲＰ１線維芽細胞レセプターに対するその結合）によって、Ｃａｔｈ−Ｄ結合ｓｃＦｖを選択した。重要なことに、ヒトｓｃＦｖ抗体フォーマットは、結合特異性を治療用タンパク質に組み込むために適切であり［５１、５２］、本発明者らが本明細書で報告したように、インタクトなＩｇＧ１に容易に再フォーマットされ得る。インタクトな免疫グロブリンは、循環半減期が長いので、好ましいフォーマットである。したがって、腫瘍学における治療用抗体の大部分は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ（例えば、ハーセプチン及びセツキシマブ（Cetumximab））である。ＩｇＧ１はまた、ＮＫ細胞、マクロファージ及び白血球上で発現されるＦｃレセプター（ＦｃγＲ）の結合を介して、免疫エフェクター細胞の会合を可能にする［５３］。
【０１７８】
Ｃａｔｈ−Ｄは、腫瘍微小環境のリモデリングに関与しているいくつかのプロテアーゼの１つに過ぎない。マトリックスメタロプロテイナーゼは広く研究されており、多くは、腫瘍において有意なアップレギュレーションを示す［３］。開発されたマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤は、有望な前臨床結果を示したが、臨床試験では最終的に残念な結果に終わった。これは、少なくとも部分的には、それらの生理学的及び病態生理学的な役割の複雑さによるものであった［５４、５５］。その結果、システインカテプシン、特に、広範なガンにおいてアップレギュレーションされることが示されたＣａｔｈ−Ｂなどの他のプロテアーゼに対して注目が集まった［３］。しかしながら、近親相同性の結果として、システインカテプシンを対象とする特異的小分子阻害剤を開発する取り組みは、選択性を達成することができないために妨げられている［５６］。さらに、これらの阻害剤がリソソーム内に（特に、カテプシンが豊富な組織、例えば肝臓中に）蓄積することによって、副作用及び毒性がさらに悪化し得る［５７］。正常器官を害さずに治療効果を新生物病変に集中させるモノクローナル抗体の能力により、ガン治療におけるこれらの分子の使用は重要性を増し続けている［５８〜６０］。本来、ガン細胞上の膜抗原に特異的なモノクローナル抗体は、腫瘍ターゲティング用途に使用されてきたが、血管新生のマーカー［６１］、間質抗原［６２］、壊死部位で放出された細胞内タンパク質［６３、６４］、及び異常分泌されたプロテアーゼなどの別のターゲットが一層検討されている。ファージディスプレイ技術によって、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）及びウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーターｕＰＡに対する阻害抗体を得ることができた［５１、５２］。より最近では、腫瘍微小環境において放出されたシステインＣａｔｈ−Ｓの抗体媒介性ターゲティングが治療戦略候補として提案された［３６、６５〜６８］。あるいは、治療用放射性同位体１７７Ｌｕにコンジュゲートされたアンタゴニストヒト抗体を用いたｕＰＡレセプターのターゲティングが、侵襲性乳ガンにおいて報告された［６９］。
【０１７９】
本報告では、本発明者らは、腫瘍部位でアップレギュレーションされるＣａｔｈ−Ｄの抗体ベースのターゲティングが、乳ガンにおける治療用途のためのさらなる魅力的な手段であり得ることを提案する。小分子阻害剤の潜在的な危険性を考慮すると、Ｃａｔｈ−Ｄをアンタゴナイズするための抗体の適用は、ガン処置の重要な治療可能性を提供し得る。このアプローチは、Ｃａｔｈ−Ｄに対して特異的であり、かつエンドソーム分解によりリソソーム内に蓄積することもないであろう化合物の作製を可能にする。さらに、病的ｃａｔｈ−Ｄは腫瘍微小環境に分泌されるので、本調査で示されているように、それは抗体化合物に修正可能である。結論として、腫瘍環境においてＣａｔｈ−Ｄを選択的にアンタゴナイズし得る抗体の使用は、小分子阻害剤で生じる可能性のある毒性問題を回避するのに役立ち得る。抗Ｃａｔｈ−Ｄ抗体を用いたこれらの初発見の臨床的有用性は、前臨床モデルにおけるさらなる調査によって立証される必要がある。本発明者らは、２つのヒト抗Ｃａｔｈ−Ｄ  ＩｇＧ１がマウスＣａｔｈ−Ｄと交差反応ことを見出したので、同種マウスモデルにおいてさらなる毒性研究をすべきである。Ｃａｔｈ−ＤはＢＣＣの化学療法耐性に影響を与え得るので［７０］、抗ｃａｔｈ−Ｄヒト抗体を既存の乳ガン化学療法剤と組み合わせることが、近い将来において特に重要になるであろう。
【０１８０】
参考文献：
本出願を通して、様々な参考文献が、本発明が関係する現状技術を説明している。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み入れられる。
【表４】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【配列表】
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