(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分類によってメチロピラ（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｉｌａ  Ｓｐ．）ｃｘｚｙ−Ｌ０１３菌株と名づけ、２０１６年９月１８日にＣＣＴＣＣ  ＮＯ．  Ｍ２０１６４９４という保存番号で中国典型培養物保存センターに保存されたメチロピラ。
【請求項２】
メチロピラは、２０１６年９月１８日でＣＣＴＣＣ  ＮＯ．Ｍ２０１６４９４という保存番号で中国典型培養物保存センターに保存されたメチロピラｃｘｚｙ−Ｌ０１３菌株である、前記メチロピラの選択的分割による（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
【請求項３】
（１）細胞固定化方法によってメチロピラの菌液に処理を行い、固定化分割酵素を含む固定化菌剤を得るステップと、
（２）（Ｒ，Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチルを基質とし、一定量の水を加えて前記固定化菌剤と分割反応させ、（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチルを得るステップと、
（３）固定化エステル加水分解酵素による又はアルカリによる加水分解によって（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩を得るステップと、
を含むことを特徴とする、請求項２に記載のメチロピラの選択的分割による（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
【請求項４】
前記メチロピラの菌液は、メチロピラを利用して斜面培養、シード液培養、接種発酵、濃縮というステップによって得られた５０ｗｔ％以上の湿菌体を含む酵素含有菌懸濁液であることを特徴とする、請求項３に記載のメチロピラの選択的分割による（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
【請求項５】
前記細胞固定化方法は、メチロピラの菌液を緩衝液に溶かし、一種の吸着剤及び／又は一種の架橋剤を少なくとも加え、撹拌して吸引ろ過し、固定化菌剤を得るものであり、
前記吸着剤は、ケイソウ土及び活性炭から選ばれるいずれか１種であり、
前記架橋剤は、グルタルアルデヒド、トリレンジイソシアネート及びジアゾベンジジンから選ばれるいずれか１種であることを特徴とする、請求項３に記載のメチロピラの選択的分割による（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
【請求項６】
前記細胞固定化方法によって実現される固定化菌剤における固定化分割酵素の酵素活性の回収率は９０％以上であり、吸着率は９５％以上であり、固定化菌剤を繰り返して利用できる回数は３５回であることを特徴とする、請求項５に記載のメチロピラの選択的分割による（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
【請求項７】
前記細胞固定化方法は、まず吸着剤を加え、撹拌して均一になるまで混合してから架橋剤を加えるものであることを特徴とする、請求項６に記載のメチロピラの選択的分割による（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
【請求項８】
前記架橋剤を加える時、ポリエチレンイミンを加えることを特徴とする、請求項７に記載のメチロピラの選択的分割による（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
【請求項９】
前記分割反応は、その温度が２５〜３７℃であり、１５〜２５ｖ／ｖ％の炭酸ナトリウム水溶液を滴下して反応過程においてｐＨ６．５〜８．５になるように調節し、２〜１５時間反応することを特徴とする、請求項３に記載のメチロピラの選択的分割による（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
【請求項１０】
前記分割反応において、（Ｒ，Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチルの反応系における質量濃度は１６０〜５００ｇ／Ｌであることを特徴とする、請求項９に記載のメチロピラの選択的分割による（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
【請求項１１】
前記固定化菌剤は湿重量で、反応系における投入濃度が５〜２５ｇ／Ｌであることを特徴とする、請求項１０に記載のメチロピラの選択的分割による（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
【請求項１２】
分割反応が終了した後、ＨＰＬＣ検出による鏡像体過剰率ｅ．ｅ．ｓ（％）は９９．５以上であり、転化率は４９％以上であることを特徴とする、請求項１１に記載のメチロピラの選択的分割による（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
【請求項１３】
前記ステップ（２）の後、水相における（Ｒ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸を回収し、ラセミ化とエステル形成によって出発物の基質を得ることを特徴とする、請求項３に記載のメチロピラの選択的分割による（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
【請求項１４】
前記ステップ（３）において、固定化エステル加水分解酵素による加水分解によって（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩を得た後、濃縮結晶してその粗製品を得ることを特徴とする、請求項３に記載のメチロピラの選択的分割による（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
【請求項１５】
前記ステップ（３）において、アルカリによる加水分解に用いられるアルカリ液は２００〜４００ｇ／Ｌのイオン膜によるアルカリ液であり、反応ｐＨが１３以下に低下しないように、反応温度１０℃〜２０℃で基質の加水分解反応が終了するまで反応した後、濃縮結晶してその粗製品を得ることを特徴とする、請求項３に記載のメチロピラの選択的分割による（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体触媒技術分野に属し、具体的には、メチロピラ及びその選択的分割による（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩の調製における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
レベチラセタム（Ｌｅｖｅｔｉｒａｃｅｔａｍ）は、化学的に（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−アセトアミドピロリジンと名づけ、アセチルピロリジン系化合物の新しい抗てんかん薬の一つである。この薬物は治療指数が高いだけでなく、薬物動態学的特徴も独特であり、経口吸収が速くて安全で、生物学的利用能が１００％に達でき、高効果で毒性・副作用が小さい広域抗てんかん薬の一つであり、極めて高い開発価値を有する。文献報告によると、デキストロ体の（Ｒ）−α−エチル−２−オキソ−１−アセトアミドピロリジンは、てんかん発症の抑制にただ軽い又は著しくない効果を有するが、レベチラセタムは安全で高効果の抗てんかん薬の一つである。
【０００３】
レベチラセタムの合成にとって重要なことは反応過程においてラボ体の光学純度を調節することにある。（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチルをエステル加水分解して（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸を得ることができ、このような立体配置の酸はレベチラセタムの合成にとって重要なカイラル中間体であり、その構造式は以下のとおりである。
【化１】
0006720420.tif 000002
【０００４】
単一の鏡像異性体は、化学法、酵素法又は化学・酵素法などによって調製できる。従来の文献に、レベチラセタムのラセミ中間体である（±）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸と光学純度のための分割試薬である（Ｒ）−（＋）−α−フェニルエチルアミン又はカイラルホスフィンから塩を生成し、冷却して結晶し、対応する２つの鏡像体に分離するレベチラセタムの調製プロセスが紹介されていた。従来の鏡像体分割過程は、消費エネルギーが高くて操作が煩雑であり、収率が低くて生成物の純度が低く、環境汚染が深刻であるなどの問題があり、製薬企業の省エネ・廃棄物排出低減には不利である。
【０００５】
化学法に比べると、生体触媒法は、触媒反応が通常に高い立体選択性とドメイン選択性を示し、またその条件が温和であり、消費エネルギーが低くて効率が高いというメリットがある。中国特許「Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ  ｙｒｏｓｉｎｏｓｏｌｖｅｎｓ及びこれを触媒とする（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸の調製」（特許文献１）には、カイラル生体触媒による（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸の調製に用いられるＴｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ  ｙｒｏｓｉｎｏｓｏｌｖｅｎｓが開示され、前記方法は生産率が４８．１％に達したが、その反応時間（１２〜６０時間）が長すぎ、反応基質の濃度（ラセミ体基質の濃度５．２〜３１．２ｇ／Ｌ）が低すぎ、酵素（湿菌体細胞５．２〜３１．２ｇ／Ｌ）の投入量が大き過ぎるため、工業的に生産し難い。中国特許出願「微生物を触媒とする（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エステルの調製方法及び菌株」（特許文献２）には、セレウス菌が開示され、ラセミα−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エステルを基質とし、前記菌が生じたエステル加水分解酵素を触媒とし、（Ｒ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エステルを立体選択的に加水分解してＳ立体配置の生成物を得る方法が開示され、この技術において、基質の投入量は最大１００ｇ／Ｌであり、反応時間は６０時間で長く、最も高い生産率は４８．９％であるため、工業的生産に適用され難い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】中国特許出願公開第１０１７４８０８７号明細書
【特許文献２】中国特許出願公開第１０２９９４４２９号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、新しいメチロピラを提供することにあり、もう一つの目的は、前記メチロピラの立体選択的分割による（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩の調製における利用を提供し、大規模の工業的生産に適用されるようになる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記メチロピラｃｘｚｙ−Ｌ０１３（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｉｌａ  Ｓｐ．ｃｘｚｙ−Ｌ０１３）は、中国典型培養物保存センター（ＣＣＴＣＣ）に保存された（所在地：中国武漢大学、４３００７２、保存日付：２０１６年９月１８日、保存番号：ＣＣＴＣＣ  ＮＯ．Ｍ２０１６４９４）。
【０００９】
前記メチロピラｃｘｚｙ−Ｌ０１３（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｉｌａ  Ｓｐ．ｃｘｚｙ−Ｌ０１３）は、Ｚｈｅｊｉａｎｇ  Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，  Ｌｉｎｈａｉ  Ｓｈｉ，  Ｄｕｑｉａｏ  Ｚｈｅｎ，  Ｈｕａｈａｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｆａｃｔｏｒｙにおける土壌に、プレートでコロニーを特徴的に初期スクリーニングし、一次発酵によってそれぞれ振盪フラスコに培養し、酵素活性を検出することによって、立体選択的エステル加水分解酵素の酵素活性の大きさを比較して得られたものである。
【００１０】
前記コロニーのコロニー形態としては、ＬＢ寒天プレートに３０℃で４８〜７２時間培養した後、コロニーは、規則的な円形を呈し、辺縁が平滑であり、直径０．５〜１ｍｍであり、表面が凸起し、瑞々しくて艶あり、乳白色である。菌体は、短い円柱状を呈し、一つ一つ分散して配列し、０．３〜０．４μｍ×１．０〜１．２μｍの大きさを有し、グラム陰性細菌である。特に、グルコース、グリセリン、エチルアルコールを炭素源とする培地に成長が遅いが、メチルアルコール、メチルアミン塩酸塩、ギ酸アンモニウムを炭素源とする場合、成長が速い。メチロピラｃｘｚｙ−Ｌ０１３の１６ＳｒＤＮＡ配列表は、配列番号．１に示すとおりである。
【００１１】
本発明は、メチロピラｃｘｚｙ−Ｌ０１３の立体選択的分割による（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩の調製における利用を提供する。また、前記メチロピラｃｘｚｙ−Ｌ０１３によって立体選択的に分割して（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩を調製する方法を提供し、前記方法は具体的に、
（１）細胞固定化方法によって前記メチロピラｃｘｚｙ−Ｌ０１３の菌液に処理を行い、固定化分割酵素を含む固定化菌剤を得るステップと、
（２）（Ｒ，Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチルを基質として、一定量の水を加えて前記固定化菌剤と分割反応させ、（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチルを得るステップと、
（３）固定化エステル加水分解酵素による加水分解又はアルカリによる加水分解によって（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩を得るステップと、を含む。
【００１２】
前記メチロピラｃｘｚｙ−Ｌ０１３の菌液は、メチロピラｃｘｚｙ−Ｌ０１３を利用して斜面培養、シード液培養、接種発酵、濃縮というステップによって得られた５０ｗｔ％以上の湿菌体を含む酵素含有菌懸濁液である。具体的に、以下のステップによって得られた。
【００１３】
斜面培養
グリセリンチューブにおけるメチロピラｃｘｚｙ−Ｌ０１３菌株でＬＢ斜面試験管に画線し、３０℃で２〜３日間培養した。
【００１４】
シード液培養
斜面の菌体をシード培地に接種し、３０℃で２〜３日間培養し、シード液を得た。前記シード培地の濃度配合は、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １．０ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  １．８ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  １．０ｇ／Ｌ、粉末酵母エキス５．０ｇ／Ｌ、体積分率７５％のメチルアルコール溶液５．０ｍＬ／Ｌ（接種前加入）であり、アンモニア水でｐＨ７．０に調節した。
【００１５】
接種発酵
シード液を接種量１〜１０ｖ／ｖ％で発酵缶に接種して発酵温度３０℃で発酵する。アンモニア水でｐＨ６．５〜７．０に調節し、０．５〜１ｖｖｍの通気量で、１００〜１０００ｒ／ｍｉｎで機械的に撹拌し、発酵過程において濃度５．０ｍＬ／Ｌの７５％メチルアルコールを間接的に追加し、発酵期間は３〜４日間である。ｐＨが低下しなくて上昇する場合、缶を開けて菌体を収集すれば良い。この場合、ＯＤ６００≧４０であり、菌体の湿重は７０〜９０ｇ／Ｌに達することができる。
【００１６】
前記発酵培地の濃度配合は、ＮａＣｌ  ０．５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ３．６ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  １．０ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  １．０ｇ／Ｌ、粉末酵母エキス６．０ｇ／Ｌ、体積分率７５％のメチルアルコール溶液５．０ｍＬ／Ｌ（接種前加入）である。
【００１７】
本発明は接種培養において、培地の炭素源として、メチルアルコール、メチルアミン塩酸塩、ギ酸アンモニウムから選ばれるいずれか１種の利用を含むが、これに制限されなく、メチルアルコールが好ましい。その代わりにグルコース、グリセリン、エチルアルコールを炭素源として利用する場合、菌体の成長は非常に遅い。
【００１８】
５０ｗｔ％以上の酵素含有菌懸濁液を得るために、発酵液を高速遠心機で遠心分離して酵素含有湿菌体を得、湿菌体と水を同質量で希釈して均一に撹拌し、利用されるように冷蔵した。あるいは、発酵液を直接的に精密ろ過フィルムで含有湿菌体の質量分率が約５０ｗｔ％である菌懸濁液に濃縮させ、利用されるように冷蔵した。
【００１９】
前記細胞固定化方法としては、メチロピラｃｘｚｙ−Ｌ０１３の菌液を緩衝液に溶かし、一種の吸着剤及び／又は一種の架橋剤を少なくとも加え、撹拌して吸引ろ過し、固定化分割酵素を含有する固定化菌剤を得る。前記吸着剤は、ケイソウ土及び活性炭から選ばれるいずれか１種である。前記架橋剤は、グルタルアルデヒド、トリレンジイソシアネート及びジアゾベンジジンから選ばれるいずれか１種である。当該固定化方法によって実現される固定化分割酵素の酵素活性の回収率は９０％以上であり、吸着率は９５％以上であり、固定化菌剤を繰り返して利用できる回数は３５回以上である。
【００２０】
細胞又は酵素が固定化された後の酵素活性の回収率は、
Ａ＝Ｗ０／（Ｗ１−Ｗ２）×１００％
の式によって算出される。
（式において、Ａは固定化分割酵素の酵素活性の回収率であり、Ｗ１は追加された遊離酵素の全活性であり、Ｗ２は固定化後の上澄みにおける酵素の全活性であり、Ｗ０は固定化分割酵素の全活性である。）
【００２１】
細胞又は酵素が固定化された後の吸着率は、
Ｂ＝（Ｗ１−Ｗ２）／Ｗ１×１００％
の式によって算出される。
（式において、Ｂは固定化分割酵素の吸着率であり、Ｗ１は追加された遊離酵素の全活性であり、Ｗ２は固定化後の上澄みにおける酵素の活性である。）
【００２２】
細胞固定化技術において、包埋法、架橋法、吸着法、共有結合固定法は常用な技術手段である。包埋法は一般に、アルギン酸ナトリウム、カラギーナンを用いて細胞又は酵素を包埋するが、包埋された固定化ペレットは機械的強度が小さくて撹拌過程において破砕し易い。吸着法は操作が簡単で固定化が実現し易く、条件が温和で且つ固定化担体が安くて入手し易く、また繰り返して利用できるが、吸着された酵素又は細胞はその数が限られ、また担体との結合能が比較的に弱くて脱落し易いため、活性が低下して反応生成物を汚染してしまう。共有結合法において、酵素におけるアミノ基、カルボキシル基、フェーノル基、メルカプト基、ヒドロキシル基及びイミダゾール基などの機能基は共有結合に関与でき、その中、アミノ基とカルボキシル基による結合法は最も汎用され、通常、当該方法によって得られた固定化酵素には酵素と担体の結合が強固で酵素脱落現象が生じ難いが、酵素タンパク高次構造は比較的に激しい反応条件で潰される。架橋法によって調製された固定化細胞又は酵素は安定性が良く、ポットライフが長い。グルタルアルデヒドは最も汎用される架橋剤であり、二機能のアルデヒド基を有する小分子物質によって細胞又は酵素における官能基であるアミノ基とシッフ塩基反応することができ、細胞又は酵素を架橋させて更に細胞又は酵素構造を安定化させる目的を実現するが、架橋法だけを利用して得られた固定化細胞は嵩が悪く、触媒反応過程における固定化細胞と反応液の効果的な分離を解決し難い。
【００２３】
本発明において、前記細胞固定化方法としては、まず吸着剤を加え、撹拌して均一になるまで混合してから架橋剤を加えることがより好ましい。まず吸着法によって包埋ボールを形成し、そして架橋法によって連結することにより、機械的強度とその安定性を顕著に向上できる。
【００２４】
本発明において、前記架橋剤を加える時に、ポリエチレンイミンを加えることが更に好ましい。ポリエチレンイミンは高い付着性と吸着性を有し、そのアミノ基は細胞又は酵素分子におけるヒドロキシル基と反応して水素結合を生成でき、カルボキシル基と反応してイオン結合を生成でき、カルボニル基と反応して共有結合も生成できる。それとともに、極性基（アミノ基）と疎水基（ビニル基）構造を有するため、異なる物質と結合できる。
【００２５】
本発明において、細胞固定化ステップにおいて、湿菌体の含有質量分率が約５０ｗｔ％である菌懸濁液２０ｇをギ酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍＬに溶かし、撹拌して均一に混合し、ケイソウ土又は活性炭０．６ｇを加え、５％ポリエチレンイミン３ｍＬを加えて１時間架橋し、そして２５％グルタルアルデヒド１ｍＬを加えて１時間架橋し、最後に、真空吸引ろ過して固定化菌剤を得、水道水で２回洗浄して吸引ろ過し、４℃で冷蔵保存することが最も好ましい。
【００２６】
グルタルアルデヒドとポリエチレンイミンを共同して利用することによって、グルタルアルデヒドにおけるアルデヒド基とポリエチレンイミンにおけるアミノ基が重合して緊密な網目状構造を形成して菌体細胞を包む。ケイソウ土を加えることによって、吸着作用に寄与するとともに、固定化酵素のペレット形成程度と嵩を向上させ、固定化後のペレット分離がより易くようになる。
【００２７】
前記細胞固定化方法によって得られた固定化分割酵素を含む固定化菌剤は、ラセミ体基質を分割し、これで基質の濃度を大幅に向上でき、大規模の工業的生産が可能になる。前記（Ｒ，Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチルは５００〜９００ｇ／Ｌのトルエン溶液であり、その濃度は７００〜８００ｇ／Ｌであることが好ましい。
【００２８】
前記ステップ２において、分割反応の条件としては、反応温度が２５〜３７℃であり、１５〜２５ｖ／ｖ％の炭酸ナトリウム水溶液を滴下して反応過程においてｐＨ６．５〜８．５に調節し、２〜１５時間反応する。
【００２９】
更に、（Ｒ，Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチルの反応系における質量濃度は１６０〜５００ｇ／Ｌである。前記固定化菌剤は湿重量で、反応系における投入濃度が５〜２５ｇ／Ｌである。
【００３０】
分割反応が終了した後、ＨＰＬＣ検出による反応転化結果としては、鏡像体過剰率ｅ．ｅ．ｓ（％）が９９．５以上であり、転化率が４９％以上である。
【００３１】
分割反応後の混合液の分離精製方法としては、反応液を直接、高速遠心機で遠心して又はプレートフィルタでろ過し、液体分を分層させて有機相を採取し、水相に１：０．３〜１．５のトルエンを加えて３〜５回抽出し、有機相を合わせて３５〜６０℃でトルエンを留去し、濃縮物の（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチルを得る。
【００３２】
本発明において、ステップ（２）の後、水相における（Ｒ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸を回収し、ラセミ化とエステル形成によって出発物の基質を得ることがより好ましい。
【００３３】
得られた（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチルは更に、固定化エステル加水分解酵素による酵素加水分解方法によって、（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩を得ても良い。例えば、反応器に１部の工業用水と１〜２部の（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチルの濃縮物をそれぞれ加え、１／２０〜１／５部の固定化エステル加水分解酵素を加えて撹拌し、エステル加水分解反応が終了するまで温度とｐＨを調節し、固定化エステル加水分解酵素をろ過し、（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩溶液を得、そして濃縮結晶して（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩の固体粗製品を製造する。
【００３４】
更に説明する。前記固定化エステル加水分解酵素は、その概念が前記固定化酵素と異なる。前記固定化分割酵素は本発明に係る前記メチロピラｃｘｚｙ−Ｌ０１３菌株が生じたものであって、特異性を有してラセミ体基質の（Ｒ，Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチルを分割し、その中の（Ｒ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチルを加水分解して（Ｒ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸［（Ｒ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸］にして水に溶かさせ、水に溶解しない対応する単一異性体の（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチルを得る。固定化エステル加水分解酵素は通用性があり、本発明において、（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチルにおけるエステル結合の加水分解に用いられ、この酵素に最適である温度とｐＨで反応し、得られた塩溶液を濃縮して結晶を製造する。この酵素の固定化方法としては、従来の包埋法、架橋法、共有結合固定法、吸着法のいずれか１種の利用を含むが、これに制限されなく、業者が把握する知識と従来技術の示唆に基いて選択的に利用できる。固定化エステル加水分解酵素の固定化は、得られた加水分解物の（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩に含む不純物がより少なくなって、粗製品分離に更に寄与し、一次粗製品の収率と純度を向上できるという目的がある。
【００３５】
得られた（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチルは、アルカリによる加水分解方法によって（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩を得ても良い。例えば、反応器に２〜３部の脱イオン水と２〜３部の（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチルの濃縮物をそれぞれ加えて撹拌し、そして反応ｐＨが１３以下に低下しないように１〜２部の２００〜４００ｇ／Ｌのイオン膜によるアルカリ液を加え、１０〜２０℃で基質の加水分解反応が終了するまで１〜５時間加水分解し、（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩溶液を得、そして濃縮結晶して（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩の固体粗製品を製造する。
【００３６】
本発明はまた、細胞固定化菌剤を提供し、この菌剤によれば、（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチルをそのラセミ体の溶液から分割させることができ、前記細胞固定化菌剤の固定化酵素活性の回収率は９０％以上であり、吸着率は９５％以上であり、固定化菌剤を繰り返して利用できる回数は３５回以上である。
【００３７】
この菌剤は、請求項１に記載のメチロピラｃｘｚｙ−Ｌ０１３の菌液を緩衝液に溶かし、一種の吸着剤及び／又は一種の架橋剤を少なくとも加え、撹拌して吸引ろ過し、固定化菌剤を得る方法によって得られた。前記吸着剤は、ケイソウ土及び活性炭から選ばれるいずれか１種である。前記架橋剤は、グルタルアルデヒド、トリレンジイソシアネート及びジアゾベンジジンから選ばれるいずれか１種である。
【００３８】
好ましくは、吸着法と架橋法を共同して利用して細胞固定を行うことによって、固定化酵素の酵素活性の回収率と吸着率を効果的に向上できる。
【００３９】
より好ましくは、吸着剤を加えた後、まずポリエチレンイミンを加え、そして架橋剤を加え、前記吸着剤としてケイソウ土を利用し、架橋剤としてグルタルアルデヒドを利用する。
【発明の効果】
【００４０】
本発明に係る分離スクリーニングによって得られたメチロピラｘｃｚｙ−Ｌ０１３菌株は、メチロピラ属微生物の発酵工程における利用において、その生じた酵素がラセミ体基質の（Ｒ，Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチルの加水分解反応に対して極めて高い立体選択性を有すことが初めて発見された。メチロピラｃｘｚｙ−Ｌ０１３菌種が発酵した酵素生成菌体細胞に改良された固定化プロセスを行い、この固定化菌剤を利用し、ラセミ体基質の（Ｒ，Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチルに対して一定条件で立体選択的にエステル加水分解反応を行うことによって、５０．０％以上の最も高い転化率を実現でき、立体選択性が良く、（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチル鏡像体過剰率ｅ．ｅ．ｓ（％）が９９．５以上である。また、触媒効率が高く、分割反応におけるラセミ体基質の最も高い濃度は５００ｇ／Ｌに達し、反応時間は１５時間を超えず、細胞固定化後に繰り返して利用できる回数は３５回以上であり、工業的生産がし易く、下流分離が簡単で環境汚染が少ない。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸のピーク出現クロマトグラムである。
【図２】ラセミ（Ｒ，Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸のピーク出現クロマトグラムである。
【図３】触媒によってラセミ（Ｒ，Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチルを３時間分割する場合の有機相のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図４】触媒によってラセミ（Ｒ，Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチルを３時間分割する場合の水相のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図５】触媒によるラセミ（Ｒ，Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチル分割が終了した時の有機相のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図６】触媒によるラセミ（Ｒ，Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチル分割が終了した時の水相のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図７】試験例３において酵素利用回数に伴う反応時間の動向図である。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
以下、具体的な実施例に基いて更に本発明を説明する。特に説明しない限り、以下のパーセント濃度はいずれも質量パーセント濃度である。
【００４３】
（実施例１）
メチロピラｃｘｚｙ−Ｌ０１３（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｉｌａ  Ｓｐ．ｃｘｚｙ−Ｌ０１３）は、中国典型培養物保存センター（ＣＣＴＣＣ）に保存された（所在地：中国武漢大学、４３００７２、保存日付：２０１６年９月１８日、保存番号：ＣＣＴＣＣ  ＮＯ．Ｍ２０１６４９４）。
【００４４】
メチロピラｃｘｚｙ−Ｌ０１３（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｉｌａ  Ｓｐ．ｃｘｚｙ−Ｌ０１３）は、Ｚｈｅｊｉａｎｇ  Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，  Ｌｉｎｈａｉ  Ｓｈｉ，  Ｄｕｑｉａｏ  Ｚｈｅｎ，  Ｈｕａｈａｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｆａｃｔｏｒｙにおける土壌に、プレートでコロニーを特徴的に初期スクリーンし、一次発酵によってそれぞれ振盪フラスコに培養し、酵素活性を検出することによって、立体選択的エステル加水分解酵素の酵素活性の大きさを比較して得られたものである。
【００４５】
このコロニーの特徴としては、コロニー形態について、ＬＢ寒天プレートに３０℃で４８〜７２時間培養した後、コロニーは、規則的な円形を呈し、辺縁が平滑であり、直径０．５〜１ｍｍであり、表面が凸起し、瑞々しくて艶あり、乳白色である。菌体は、短い円柱状を呈し、一つ一つ分散して配列し、０．３〜０．４μｍ×１．０〜１．２μｍの大きさを有し、グラム陰性細菌である。特に、グルコース、グリセリン、エチルアルコールを炭素源とする培地に成長が遅く、メチルアルコール、メチルアミン塩酸塩、ギ酸アンモニウムを炭素源とする場合、成長が速い。
【００４６】
（実施例２）
実施例１で得られたメチロピラｃｘｚｙ−Ｌ０１３を更に培養して活性化させ、発酵させてメチロピラｃｘｚｙ−Ｌ０１３の菌液を得た。具体的なステップは以下のとおりである。
【００４７】
斜面培養
グリセリンチューブにおけるメチロピラｃｘｚｙ−Ｌ０１３でＬＢ斜面試験管に画線し、３０℃で２〜３日間培養した。
【００４８】
シード液培養
斜面の菌体をシード培地に接種し、３０℃で２〜３日間培養し、シード液を得た。前記シード培地の濃度配合は、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １．０ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  １．８ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  １．０ｇ／Ｌ、粉末酵母エキス５．０ｇ／Ｌ、体積分率７５％のメチルアルコール溶液５．０ｍＬ／Ｌ（接種前加入）であり、アンモニア水でｐＨ７．０に調節した。
【００４９】
接種発酵
シード液を７Ｌ発酵缶に接種して発酵させる。接種量は１００ｍＬであり、発酵温度は３０℃であり、発酵液の初期体積は５Ｌであり、アンモニア水でｐＨ６．５〜７．０に調節し、通気量は０．５ｖｖｍであり、ＤＯ≧３０％になるように機械的撹拌を１００ｒ／ｍｉｎから９００ｒ／ｍｉｎに徐々に増加させ、発酵過程において濃度５．０ｍＬ／Ｌの７５％メチルアルコールを間接的に追加し、３日間発酵し、ｐＨが低下しなくて上昇する場合、缶を開けて菌体を収集すれば良い。この場合、ＯＤ６００≧４０であり、菌体の湿重は７０〜９０ｇ／Ｌに達することができる。
【００５０】
発酵培地の濃度配合は、ＮａＣｌ  ０．５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ３．６ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  １．０ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  １．０ｇ／Ｌ、粉末酵母エキス６．０ｇ／Ｌ、体積分率７５％のメチルアルコール溶液５．０ｍＬ／Ｌ（接種前加入）である。
【００５１】
表１に示すように、発酵過程において用いられたメチルアルコールの代わりにグルコース、グリセリン、エチルアルコールを炭素源として利用する場合、菌体の成長が非常に遅く、メチルアルコールは炭素源として他の３種の炭素源より著しく優れることが分ける。用いられた培地配合は炭素源以外、いずれもシード液の培地配合と同じであり、培養方法もシード液培養と同じである。
【表１】
0006720420.tif 000003
【００５２】
表２に示すように、発酵培地における粉末酵母エキスの代わりに粉末コーンスティープリカー、トリプトン、牛肉エキスなどを炭素源として利用する場合、菌体の成長速度が普通であり、粉末酵母エキスは他の３種の炭素源より優れる。用いられた培地配合は炭素源以外、いずれもシード液の培地配合と同じであり、培養方法もシード液培養と同じである。
【表２】
0006720420.tif 000004
【００５３】
５０ｗｔ％以上の酵素含有菌懸濁液を得るために、発酵液を高速遠心機で遠心分離して酵素含有湿菌体を得、湿菌体と水を同質量で希釈して均一に撹拌し、利用するために冷蔵した。又は、直接的に発酵液を精密ろ過フィルムで湿菌体の含有質量分率が約５０ｗｔ％である菌懸濁液に濃縮させ、利用するために冷蔵した。
【００５４】
（実施例３）
実施例１のメチロピラｃｘｚｙ−Ｌ０１３を利用し、以下のようなステップを含む方法によって立体選択的に分割して（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩を調製した。
【００５５】
（１）細胞固定化方法によってメチロピラｃｘｚｙ−Ｌ０１３の菌液に処理を行い、固定化分割酵素を含む固定化菌剤を得た。メチロピラｃｘｚｙ−Ｌ０１３の菌液の取得方法は既に実施例２に記載された。
【００５６】
（２）（Ｒ，Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチルを基質として、一定量の水と固定化菌剤を加えて分割反応させ、（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチルを得た。
【００５７】
（３）固定化エステル加水分解酵素による加水分解又はアルカリによる加水分解によって（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩を得た。
【００５８】
（４）ステップ（２）の後、水相における（Ｒ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸を回収し、ラセミ化とエステル形成によって出発物の基質を得た。
【００５９】
その中、ステップ（１）において、細胞固定化方法としては、まず吸着剤を加え、撹拌して均一になるまで混合してから架橋剤を加える。まず吸着法によって包埋ボールを形成し、そして架橋法によって連結することにより、機械的強度を顕著に向上できる。細胞固定化方法によって実現される固定化分割酵素の酵素活性の回収率は９０％以上であり、吸着率は９５％以上であり、固定化菌剤を繰り返して利用できる回数は３５回以上である。
【００６０】
ステップ（２）において、（Ｒ，Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチルは５００〜９００ｇ／Ｌのトルエン溶液であり、その濃度は７００〜８００ｇ／Ｌであることが好ましい。（Ｒ，Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチルの反応系における質量濃度は１６０〜５００ｇ／Ｌである。固定化菌剤は湿重量で、反応系における投入濃度は５〜２５ｇ／Ｌである。
【００６１】
分割反応の条件としては、反応温度が２５〜３７℃であり、体積分率１５〜２５％の炭酸ナトリウム（Ｖ／Ｖ）水溶液を滴下して反応過程においてｐＨ６．５〜８．５に調節し、２〜１５時間反応する。ＨＰＬＣ検出による反応転化結果としては、鏡像体過剰率ｅ．ｅ．ｓ（％）が９９．５以上であり、最も高い転化率が５０％である。
【００６２】
分割反応後の混合液の分離精製方法としては、反応液を直接、高速遠心機で遠心して又はプレートフィルタでろ過し、液体分を分層させて有機相を採取し、水相に１：０．３〜１．５のトルエンを加えて３〜５回抽出し、有機相を合わせて３５〜６０℃でトルエンを留去し、濃縮物の（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチルを得た。
【００６３】
ステップ（３）において、（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチルのエステル結合を加水分解できるいずれの固定化エステル加水分も利用できる。反応器に１部の工業用水と１〜２部の（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチルの濃縮物をそれぞれ加え、１／２０〜１／５部の固定化エステル加水分解酵素を加えて撹拌し、エステル加水分解反応が終了するまで温度とｐＨを調節し、エステル加水分解酵素を濾去して（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩溶液を得、濃縮結晶して（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩の固体粗製品を製造した。
【００６４】
ステップ（３）において、得られた（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチルは更に、アルカリによる加水分解方法によって（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩を得ても良い。例えば、反応器に２〜３部の脱イオン水と２〜３部の（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチルの濃縮物をそれぞれ加えて撹拌し、そして１〜２部の３００ｇ／Ｌのイオン膜によるアルカリ液を加えてｐＨ１４に達させ、１０〜２０℃で基質の加水分解反応が終了するまで１〜５時間加水分解し、（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩溶液を得、濃縮結晶して（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩の固体粗製品を製造した。
【００６５】
（実施例４）
本実施例は実施例３に基くが、ステップ（１）における細胞固定化方法のステップは更に改良された。好適例として、湿菌体質量分率５０％の菌懸濁液２０ｇをギ酸アンモニウム緩衝液１００ｍＬ（ｐＨ７．０）に溶かし、撹拌して均一に混合し、ケイソウ土又は活性炭０．４〜０．８ｇを加え、５％ポリエチレンイミン３〜４．５ｍＬを加えて１時間架橋し、そして２５％グルタルアルデヒド１〜１．５ｍＬを加えて１時間架橋し、最後に真空吸引ろ過して固定化分割酵素を含む固定化菌剤を得、水道水で２回洗浄して吸引ろ過し、４℃で冷蔵保存した。固定化分割酵素の酵素活性の回収率は９０％以上であり、吸着率は９５％以上である。
【００６６】
（実施例５）
本実施例は実施例３の方法に基いて、固定化エステル加水分解酵素として日本天野エンザイム株式会社製のＰｒｏｔｉｎ  ＡＰ  Ｃｏｎｃ．脂肪酵素を選択して利用し、（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩を得た。
【００６７】
前記ＰＲｏｔｉｎ  ＡＰ  Ｃｏｎｃ．脂肪酵素パウダー２ｇを精製水１００ｍＬに溶かし、アルギン酸ナトリウム２ｇを加え、完全に溶解するまで緩やかに撹拌し、ニードル又はノズルで混合液をポンプアップして１００ｍＭの塩化カルシウム溶液に均一に仕込み、緩やかに撹拌し、ビーズ状のゲルが硬化した後、蒸留水で２〜３回繰り返して洗浄し、アルギン酸カルシウムに固定化されたエステル加水分解酵素を得、利用されるように４℃で保存した。
【００６８】
（実施例６）
細胞固定化菌剤であり、この菌剤によれば、（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチルをラセミ体の溶液から分割させることができ、固定化分割酵素の酵素活性の回収率は９０％以上であり、吸着率は９５％以上であり、固定化菌剤を繰り返して利用できる回数は３５回以上である。前記細胞固定化菌剤は以下のような方法によって得られたものである。
【００６９】
実施例２に記載のメチロピラｃｘｚｙ−Ｌ０１３（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｉｌａ  Ｓｐ．ｃｘｚｙ−Ｌ０１３）の菌液を緩衝液に溶かし、吸着剤として少なくともケイソウ土を加え、その後ポリエチレンイミンを加え、そして架橋剤としてグルタルアルデヒドを加え、撹拌して固定化細胞溶液を得た。真空吸引ろ過によって前記固定化菌剤を得た。（具体的な方法は実施例４参照。）
【００７０】
（実施例７）
本実施例は実施例３に基いて、ステップ（２）における（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチルの分割ステップを更に説明する。
【００７１】
３００ｍＬ触媒反応系を例とする。（Ｒ，Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチルの濃度が約５００ｇ／Ｌであるトルエン溶液１００ｍＬを利用し、実施例４及び実施例６の方法に従って細胞固定化菌剤を調製した。
【００７２】
具体的には、５００ｍＬの転化フラスコに水２００ｍＬを加え、（Ｒ，Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチル約５０ｇを含むトルエン溶液１００ｍＬを加え、（Ｒ，Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチルの反応系における初期濃度は約１６６ｇ／Ｌになる。撹拌を開始し、Ｎａ２ＣＯ３溶液（２０％、Ｖ／Ｖ）でｐＨ７．０に調節し、実施例６で調製された細胞固定化菌剤２ｇを加え、固定化菌剤の投入濃度が６．６ｇ／Ｌになり、３７℃でＮａ２ＣＯ３溶液（２０％、Ｖ／Ｖ）をｐＨ７．０〜７．５に維持し、２〜３時間分割反応した。ＨＰＬＣ検出による反応転化結果としては、鏡像体過剰率が９９．８ｅ．ｅ．ｓ（％）であり、転化率が５０．０％である。
【００７３】
（実施例８〜実施例１３）
実施例８〜実施例１３の分割方法は実施例７とほぼ同じであるが、細胞固定化菌剤の投入量、利用基質のトルエン溶液における濃度、基質の反応系における濃度は異なり、表３から見れば、異なる実施例の分割効果の差が分かる。
【表３】
0006720420.tif 000005
【００７４】
実施例８〜実施例１３から分かるように、トルエン溶液における基質の投入量が多い場合、反応時間が長くて転化率が低下してしまう。トルエン溶液における基質の濃度が高ければ、反応系における投入量が大きくなり、反応時間が長くなるが、固定化菌剤の投入量を適切に増加する方法によって、転化率はやはり望ましい効果に達することができる。
【００７５】
試験例１    分割反応液の監視
機器：ＵＶ検出器付き高速液体クロマトグラフィー
クロマトカラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＡＳ−Ｈ  ２５０×４．６ｍｍ  ５μｍ
移動相：ｎ−ヘキサン：イソプロピルアルコール：トリフロロ酢酸＝８０：２０：０．２（％Ｖ／Ｖ／Ｖ）
移動速度９９０．８ｍＬ／ｍｉｎ、波長：２１０ｎｍ、カラム温度：３０℃、運転時間：３０ｍｉｎ、サンプリング量：２０μＬ
希釈液：移動相、ブランク液：希釈液
【００７６】
供試品溶液：供試品２０ｍｇを量り、１０ｍＬ容量フラスコに入れ、希釈液で溶解して定容した。供試品はラセミ（Ｒ，Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチル及びその単量体、ラセミ（Ｒ，Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸及びその単量体を含む。
【００７７】
サンプル処理：実施例４の方法のステップに基いて、反応液を１００倍希釈し、均一に混合した後、孔径０．４５μｍの精密ろ過フィルムでろ過し、サンプリングに供される。
【００７８】
（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチルの鏡像体過剰率ｅ．ｅ．と基質の転化率Ｃは、
【数１】
0006720420.tif 000006
（式１）
【数２】
0006720420.tif 000007
（式２）
によって算出される。
（式において、［Ｃ］Ｓと［Ｃ］Ｒはそれぞれクロマトグラムが測定されたサンプルにおけるＳ型基質とＲ型基質の含有量であり、ｅ．ｅ．ｓ（％）は分割反応による（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチルの鏡像体過剰率であり、ＣＰは生成物のモル濃度であり、ＣＳは残された基質のモル濃度であり、Ｃ（％）は転化率である。
【００７９】
図１〜図６から分かるように、（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチルのピーク出現時間は９．４分間であり、（Ｒ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチルのピーク出現時間は１５．９分間であり、（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸のピーク出現時間は１１．５分間であり、（Ｒ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸のピーク出現時間は１０．４分間である。
【００８０】
図５は、触媒によるラセミ（Ｒ，Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチル分割が終了した時のＨＰＬＣの有機相のクロマトグラムであり、これによって、（Ｒ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチルが完全に加水分解したことが分かる。
【００８１】
試験例２    固定化方法の比較
本発明は固定化方法において吸着剤と架橋剤を共に利用し、グルタルアルデヒドと共にポリエチレンイミンを利用して架橋効果を向上させ、細胞の固定効果が顕著に高めた。更に高濃度の有機基質と一緒に酵素触媒反応に参与する場合、工業的生産という目的を実現し易い。
【００８２】
固定化対象：実施例２においてメチロピラｃｘｚｙ−Ｌ０１３菌種が発酵した菌体細胞、超音波によって菌体細胞を破砕して得られた酵素液
【００８３】
本試験例はまず、吸着法、包埋法及び吸着・架橋法の利用を比較し、菌液処理方法の異なりによる細胞における酵素固定効果の差を説明し、表４に示すような結果になった。
【表４】
0006720420.tif 000008
【００８４】
次に、試験セットＤに対して、吸着剤（ケイソウ土又は活性炭）と架橋剤の投入量それぞれに改良された固定化実験を行い、表５に示す結果になった。
【表５】
0006720420.tif 000009
【００８５】
試験例３    細胞固定化に繰り返して利用される回数の検証
検証方法：実施例４で得られた固定化菌剤５ｇを触媒としてラセミ（Ｒ，Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチル１００ｍＬを反応させ、前記ラセミ体基質のトルエンにおける含有量は５００ｇ／Ｌであり、反応系は３００ｍＬであり、３０ｍＬのＮａ２ＣＯ３溶液（２０％、Ｖ／Ｖ）の消費を反応終点とし、反応が終了した後の固定化菌剤を吸引ろ過し、吸引ろ過された固定化菌剤を同じ反応系に投入し、同じ反応条件で次の反応を行った。
【００８６】
図７は利用回数の増加に伴って反応が終了するまでに要する時間の変化傾向図であり、図から分かるように、１回目の反応は終了するまで１．２時間が要するが、その後反応時間が次第に延長し、７回目は２．６時間になるが、８回目の反応時間が低下し始め、酵素を繰り返して吸引ろ過すること及び利用重量の損失があるという理由を考えると、１２回目後、反応時間が全体的に上昇動向にあるが、細胞固定化菌剤を３６回利用しても反応時間がほぼ５時間以内に維持し、予定の望ましい効果が得られた。
【００８７】
以上は本発明の好ましい実施態様のみであり、業者にとって、本発明の原理から逸脱することなく、いくつかの改良及び変更を加えることができるが、このような改良及び変更は、本発明の保護範囲に含まれるべきである。
【００８８】
（付記）
（付記１）
分類によってメチロピラ（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｉｌａ  Ｓｐ．）ｃｘｚｙ−Ｌ０１３菌株と名づけ、２０１６年９月１８日にＣＣＴＣＣ  ＮＯ．  Ｍ２０１６４９４という保存番号で中国典型培養物保存センターに保存されたメチロピラ。
【００８９】
（付記２）
メチロピラは、２０１６年９月１８日でＣＣＴＣＣ  ＮＯ．Ｍ２０１６４９４という保存番号で中国典型培養物保存センターに保存されたメチロピラｃｘｚｙ−Ｌ０１３菌株である、前記メチロピラの選択的分割による（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
【００９０】
（付記３）
（１）細胞固定化方法によってメチロピラの菌液に処理を行い、固定化分割酵素を含む固定化菌剤を得るステップと、
（２）（Ｒ，Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチルを基質とし、一定量の水を加えて前記固定化菌剤と分割反応させ、（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチルを得るステップと、
（３）固定化エステル加水分解酵素による又はアルカリによる加水分解によって（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩を得るステップと、
を含むことを特徴とする、付記２に記載のメチロピラの選択的分割による（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
【００９１】
（付記４）
前記メチロピラの菌液は、メチロピラを利用して斜面培養、シード液培養、接種発酵、濃縮というステップによって得られた５０ｗｔ％以上の湿菌体を含む酵素含有菌懸濁液であることを特徴とする、付記３に記載のメチロピラの選択的分割による（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
【００９２】
（付記５）
前記細胞固定化方法は、メチロピラの菌液を緩衝液に溶かし、一種の吸着剤及び／又は一種の架橋剤を少なくとも加え、撹拌して吸引ろ過し、固定化菌剤を得るものであり、
前記吸着剤は、ケイソウ土及び活性炭から選ばれるいずれか１種であり、
前記架橋剤は、グルタルアルデヒド、トリレンジイソシアネート及びジアゾベンジジンから選ばれるいずれか１種であることを特徴とする、付記３に記載のメチロピラの選択的分割による（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
【００９３】
（付記６）
前記細胞固定化方法によって実現される固定化菌剤における固定化分割酵素の酵素活性の回収率は９０％以上であり、吸着率は９５％以上であり、固定化菌剤を繰り返して利用できる回数は３５回であることを特徴とする、付記５に記載のメチロピラの選択的分割による（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
【００９４】
（付記７）
前記細胞固定化方法は、まず吸着剤を加え、撹拌して均一になるまで混合してから架橋剤を加えるものであることを特徴とする、付記６に記載のメチロピラの選択的分割による（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
【００９５】
（付記８）
前記架橋剤を加える時、ポリエチレンイミンを加えることを特徴とする、付記７に記載のメチロピラの選択的分割による（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
【００９６】
（付記９）
前記分割反応は、その温度が２５〜３７℃であり、１５〜２５ｖ／ｖ％の炭酸ナトリウム水溶液を滴下して反応過程においてｐＨ６．５〜８．５になるように調節し、２〜１５時間反応することを特徴とする、付記３に記載のメチロピラの選択的分割による（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
【００９７】
（付記１０）
前記分割反応において、（Ｒ，Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸エチルの反応系における質量濃度は１６０〜５００ｇ／Ｌであることを特徴とする、付記９に記載のメチロピラの選択的分割による（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
【００９８】
（付記１１）
前記固定化菌剤は湿重量で、反応系における投入濃度が５〜２５ｇ／Ｌであることを特徴とする、付記１０に記載のメチロピラの選択的分割による（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
【００９９】
（付記１２）
分割反応が終了した後、ＨＰＬＣ検出による鏡像体過剰率ｅ．ｅ．ｓ（％）は９９．５以上であり、転化率は４９％以上であることを特徴とする、付記１１に記載のメチロピラの選択的分割による（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
【０１００】
（付記１３）
前記ステップ（２）の後、水相における（Ｒ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸を回収し、ラセミ化とエステル形成によって出発物の基質を得ることを特徴とする、付記３に記載のメチロピラの選択的分割による（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
【０１０１】
（付記１４）
前記ステップ（３）において、固定化エステル加水分解酵素による加水分解によって（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩を得た後、濃縮結晶してその粗製品を得ることを特徴とする、付記３に記載のメチロピラの選択的分割による（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
【０１０２】
（付記１５）
前記ステップ（３）において、アルカリによる加水分解に用いられるアルカリ液は２００〜４００ｇ／Ｌのイオン膜によるアルカリ液であり、反応ｐＨが１３以下に低下しないように、反応温度１０℃〜２０℃で基質の加水分解反応が終了するまで反応した後、濃縮結晶してその粗製品を得ることを特徴とする、付記３に記載のメチロピラの選択的分割による（Ｓ）−α−エチル−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸塩の調製における使用。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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