(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐ−ニトロフェニル硫酸塩の製造方法であって、
（Ａ）ｐ−ニトロフェノールと三酸化硫黄錯体とを反応させる工程、および
（Ｂ）前記工程Ａによる生成物をtert−ブトキシ塩で中和する工程を含み、
前記工程ＡおよびＢが、ｐ−ニトロフェノールの溶解度が高く、且つ、前記ｐ−ニトロフェニル硫酸塩の溶解度が低い溶媒中で実施され、
前記溶媒が、ｐ−ニトロフェノールの溶解度が２５℃で１．５％（ｗ／ｗ）以上であり、且つ、前記ｐ−ニトロフェニル硫酸塩の溶解度が２５℃で０．２％（ｗ／ｗ）以下である溶媒である、方法。
【請求項２】
前記溶媒が、前記ｐ−ニトロフェニル硫酸塩の溶解度が２５℃で０．０５％（ｗ／ｗ）以下の溶媒である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記溶媒が、ｐ−ニトロフェノールの溶解度が２５℃で５％（ｗ／ｗ）以上の溶媒である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記溶媒が、テトラヒドロフランおよびイソプロピルアルコールからなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記三酸化硫黄錯体が、三酸化硫黄ピリジン錯体および三酸化硫黄トリメチルアミン錯体からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記tert−ブトキシ塩が、アルカリ金属のtert−ブトキシドおよびアルカリ土類金属のtert−ブトキシドからなる群より選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記tert−ブトキシ塩が、tert−ブトキシカリウムおよびtert−ブトキシナトリウムからなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記工程Ａが、３０分以上実施される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記工程Ａが、２０時間以下実施される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記工程Ａが、０℃〜６０℃で実施される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記工程Ｂによりｐ−ニトロフェニル硫酸塩の結晶が析出する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記析出したｐ−ニトロフェニル硫酸塩の結晶を回収する工程を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ｐ−ニトロフェニル硫酸塩が、ｐ−ニトロフェニル硫酸カリウムおよびｐ−ニトロフェニル硫酸ナトリウムからなる群より選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｐ−ニトロフェニル硫酸カリウム（PNPS-K）等のｐ−ニトロフェニル硫酸塩（PNPS塩）の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
非特許文献１には、二硫化炭素とN,N-ジメチルアニリンの混合溶媒中でp-ニトロフェノールと塩化スルホン酸を反応させ、KOHにて中和してPNPS-Kを生成後、減圧濃縮、エーテ
ル洗浄、及びエタノールによる結晶化を経て、PNPS-Kを得る方法が開示されている。本合成方法によるPNPS-Kの収率は30％と記載されている。このように、本合成方法は煩雑で収率が低く、工業化に適していない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Marzec, Krzysztof. Bulletin of the polish academy of science. Chemistry. 37, 371-373, (1990)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、効率的なｐ−ニトロフェニル硫酸塩（PNPS塩）の製造法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本願発明者らは、鋭意検討の結果、テトラヒドロフラン（THF）等の特定の溶媒中でｐ
−ニトロフェノール（PNP）を三酸化硫黄錯体と反応させ、反応産物をtert−ブトキシ塩
で中和することでｐ−ニトロフェニル硫酸塩（PNPS塩）の結晶が高い収率で得られることを見出し、本発明を完成させた。
【０００６】
すなわち、本発明は以下の通り例示できる。
［１］
ｐ−ニトロフェニル硫酸塩の製造方法であって、
（Ａ）ｐ−ニトロフェノールと三酸化硫黄錯体とを反応させる工程、および
（Ｂ）前記工程Ａによる生成物をtert−ブトキシ塩で中和する工程を含み、
前記工程ＡおよびＢが、ｐ−ニトロフェノールの溶解度が高く、且つ、前記ｐ−ニトロフェニル硫酸塩の溶解度が低い溶媒中で実施される、方法。
［２］
前記溶媒が、ｐ−ニトロフェノールの溶解度が２５℃で１．５％（ｗ／ｗ）以上であり、且つ、前記ｐ−ニトロフェニル硫酸塩の溶解度が２５℃で０．２％（ｗ／ｗ）以下である溶媒である、前記方法。
［３］
前記溶媒が、前記ｐ−ニトロフェニル硫酸塩の溶解度が２５℃で０．０５％（ｗ／ｗ）以下の溶媒である、前記方法。
［４］
前記溶媒が、ｐ−ニトロフェノールの溶解度が２５℃で５％（ｗ／ｗ）以上の溶媒である、前記方法。
［５］
前記溶媒が、テトラヒドロフランおよびイソプロピルアルコールからなる群より選択される、前記方法。
［６］
前記三酸化硫黄錯体が、三酸化硫黄ピリジン錯体および三酸化硫黄トリメチルアミン錯体からなる群より選択される、前記方法。
［７］
前記tert−ブトキシ塩が、アルカリ金属のtert−ブトキシドおよびアルカリ土類金属のtert−ブトキシドからなる群より選択される、前記方法。
［８］
前記tert−ブトキシ塩が、tert−ブトキシカリウムおよびtert−ブトキシナトリウムからなる群より選択される、前記方法。
［９］
前記工程Ａが、３０分以上実施される、前記方法。
［１０］
前記工程Ａが、２０時間以下実施される、前記方法。
［１１］
前記工程Ａが、０℃〜６０℃で実施される、前記方法。
［１２］
前記工程Ｂによりｐ−ニトロフェニル硫酸塩の結晶が析出する、前記方法。
［１３］
前記析出したｐ−ニトロフェニル硫酸塩の結晶を回収する工程を含む、前記方法。
［１４］
前記ｐ−ニトロフェニル硫酸塩が、ｐ−ニトロフェニル硫酸カリウムおよびｐ−ニトロフェニル硫酸ナトリウムからなる群より選択される、前記方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、ｐ−ニトロフェニル硫酸塩を効率よく製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
＜１＞本発明の方法
本発明の方法は、（Ａ）ｐ−ニトロフェノールと三酸化硫黄錯体とを反応させる工程、および（Ｂ）前記工程Ａによる生成物をtert−ブトキシ塩で中和する工程を含み、前記工程ＡおよびＢが、ｐ−ニトロフェノールの溶解度が高く、且つ、前記ｐ−ニトロフェニル硫酸塩の溶解度が低い溶媒中で実施される、ｐ−ニトロフェニル硫酸塩の製造方法である。工程Ａを「硫酸化工程」、工程Ｂを「中和工程」ともいう。
【００１０】
＜１−１＞硫酸化工程
硫酸化工程は、ｐ−ニトロフェノール（PNP）と三酸化硫黄錯体とを反応させる工程で
ある。硫酸化工程により、PNPが硫酸化され、ｐ−ニトロフェニル硫酸（PNPS）が生成す
る。
【００１１】
硫酸化工程は、PNPと三酸化硫黄錯体とを溶媒中で共存させることにより実施できる。
例えば、反応容器内の溶媒中で、PNPと三酸化硫黄錯体とを混合することにより、硫酸化
工程を実施できる。硫酸化工程は、静置して実施してもよく、撹拌や振盪して実施してもよい。硫酸化工程は、撹拌や振盪して実施するのが好ましい。
【００１２】
「三酸化硫黄錯体」とは、三酸化硫黄とルイス塩基との錯体をいう。ルイス塩基としては、エーテル、アミド、アミン、スルフィドが挙げられる。すなわち、三酸化硫黄錯体としては、三酸化硫黄エーテル錯体、三酸化硫黄アミド錯体、三酸化硫黄アミン錯体、三酸化硫黄スルフィド錯体が挙げられる。三酸化硫黄エーテル錯体としては、三酸化硫黄ジオ
キサン錯体、三酸化硫黄ジオキソラン錯体、三酸化硫黄ジメチルエーテル錯体、三酸化硫黄エチルメチルエーテル錯体、三酸化硫黄ジエチルエーテル錯体が挙げられる。三酸化硫黄アミド錯体としては、三酸化硫黄Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド錯体が挙げられる。三酸化硫黄アミン錯体としては、三酸化硫黄ピリジン錯体、三酸化硫黄トリエチルアミン錯体、三酸化硫黄トリメチルアミン錯体、三酸化硫黄Ｎ−エチルジイソプロピルアミン錯体が挙げられる。三酸化硫黄スルフィド錯体としては、三酸化硫黄ジメチルスルフィド錯体、三酸化硫黄エチルメチルスルフィド錯体、三酸化硫黄ジエチルスルフィド錯体が挙げられる。中でも、三酸化硫黄アミン錯体が好ましく、三酸化硫黄ピリジン錯体（PySO3）お
よび三酸化硫黄トリメチルアミン錯体（TMASO3）からなる群より選択されるものがより好ましい。三酸化硫黄錯体としては、１種の成分を用いてもよく、２種またはそれ以上の成分を組み合わせて用いてもよい。
【００１３】
溶媒としては、PNPの溶解度が高く、且つ、PNPS塩の溶解度が低い溶媒を用いる。「PNPの溶解度が高い溶媒」とは、PNPの溶解度が、硫酸化工程が進行する程度に高い溶媒をい
う。「PNPの溶解度が高い溶媒」とは、具体的には、例えば、PNPの溶解度が、２５℃で、１．５％（ｗ／ｗ）以上、３％（ｗ／ｗ）以上、または５％（ｗ／ｗ）以上である溶媒であってよい。PNPの溶解度は、実施例に記載の手順で測定することができる。すなわち、
溶媒1mLにPNP 55mgを添加し、25℃で12hr撹拌し、スラリーを0.2μのフィルターでろ過し、濾過液中のPNP濃度を測定し、得られたPNP濃度をPNPの溶解度とする。「PNPS塩の溶解
度が低い溶媒」とは、PNPS塩の溶解度が、中和工程においてPNPS塩の結晶が析出する程度に低い溶媒をいう。「PNPS塩の溶解度が低い溶媒」とは、具体的には、例えば、PNPS塩の溶解度が、２５℃で、０．２％（ｗ／ｗ）以下、０．１％（ｗ／ｗ）以下、０．０５％（ｗ／ｗ）以下、０．０３％（ｗ／ｗ）以下、または０．０１％（ｗ／ｗ）以下である溶媒であってよい。PNPS塩の溶解度は、実施例に記載の手順で測定することができる。すなわち、溶媒1mLにPNPS塩100mgを添加し、25℃で12hr撹拌し、スラリーを0.2μのフィルター
でろ過し、濾過液中のPNPS塩濃度を測定し、得られたPNPS塩濃度をPNPS塩の溶解度とする。PNP濃度およびPNPS塩濃度は、いずれも、HPLC等の、化合物の検出または同定に用いら
れる公知の手法により測定することができる。溶媒としては、テトラヒドロフラン（THF
）やイソプロピルアルコール（IPA）が挙げられる。中でも、THFが好ましい。溶媒としては、１種の成分を用いてもよく、２種またはそれ以上の成分を組み合わせて用いてもよい。
【００１４】
硫酸化工程の反応条件（各成分の反応系での濃度、反応温度、反応時間等）は、所望の程度にPNPSが生成する限り、特に制限されない。すなわち、反応条件は、所望の収量や収率でPNPSが生成するように、適宜設定することができる。
【００１５】
PNPの濃度は、例えば、１０ｍＭ以上、５０ｍＭ以上、１００ｍＭ以上、または３００
ｍＭ以上であってもよく、３Ｍ以下、１Ｍ以下、または５００ｍＭ以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。PNPの濃度は、例えば、１０ｍＭ〜３Ｍであっても
よい。
【００１６】
三酸化硫黄錯体の濃度は、例えば、１０ｍＭ以上、５０ｍＭ以上、１００ｍＭ以上、または３００ｍＭ以上であってもよく、３Ｍ以下、１Ｍ以下、または５００ｍＭ以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。三酸化硫黄錯体の濃度は、例えば、１０ｍＭ〜３Ｍであってもよい。また、三酸化硫黄錯体の使用量は、PNPの使用量等の諸条件
に応じて適宜設定することができる。三酸化硫黄錯体の使用量は、PNPの使用量に対し、
モル比で、例えば、等量以上であってよい。三酸化硫黄錯体の使用量は、PNPの使用量に
対し、モル比で、例えば、等量〜２倍量、または等量〜１．５倍量であってもよい。
【００１７】
反応温度は、溶媒の種類や反応時間等の諸条件に応じて適宜設定することができる。反
応温度は、例えば、溶媒の沸点未満であってよい。反応温度は、例えば、０℃以上、１０℃以上、または２０℃以上であってもよく、１００℃以下、８０℃以下、または６０℃以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。反応温度は、例えば、０℃〜６０℃であってもよい。
【００１８】
反応時間は、反応温度等の諸条件に応じて適宜設定することができる。反応時間は、例えば、５分以上、３０分以上、または１時間以上であってもよく、１００時間以下、５０時間以下、または２０時間以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。反応時間は、例えば、３０分〜２０時間であってもよい。
【００１９】
硫酸化工程は、アルゴン等の不活性ガスの雰囲気下で実施してもよい。
【００２０】
硫酸化工程の反応条件は、硫酸化工程の開始から終了まで均一であってもよく、硫酸化工程の過程において変化してもよい。例えば、硫酸化工程中に反応温度が変化してもよい。また、PNP、三酸化硫黄錯体、溶媒等の成分は、単独で、あるいは任意の組み合わせで
、追加的に反応系に供給されてもよい。これらの成分は、１回または複数回間欠的に供給されてもよく、連続的に供給されてもよい。
【００２１】
このようにして、硫酸化工程を実施することにより、PNPSが生成する。すなわち、硫酸化工程により、PNPSを含む反応液が得られる。PNPSは、遊離酸（フリー体）、塩、またはそれらの組み合わせとして反応液中に含まれていてよい。例えば、PNPSは、三酸化硫黄錯体に由来するルイス塩基との塩を形成して反応液中に含まれ得る。
【００２２】
PNPSが生成したことは、化合物の検出または同定に用いられる公知の手法により確認することができる。そのような手法としては、例えば、HPLC、LC/MS、GC/MS、NMRが挙げら
れる。これらの手法は、単独で、あるいは適宜組み合わせて用いることができる。
【００２３】
本発明においては、高い反応収率でPNPSが生成すると期待される。本発明においては、例えば、５０％以上、６０％以上、７０％以上、または８０％以上の反応収率でPNPSが生成してよい。反応収率は、用いたPNPに対する生成したPNPSの比率（モル比）として算出
される。PNPSの生成量は、上記のような、化合物の検出または同定に用いられる公知の手法により測定できる。
【００２４】
＜１−２＞中和工程
中和工程は、硫酸化工程による生成物をtert−ブトキシ塩で中和する工程である。中和工程は、具体的には、硫酸化工程により生成したPNPSをtert−ブトキシ塩で中和する工程である。中和工程により、PNPS塩が生成する。PNPS塩としては、PNPSとアルカリ金属の塩やPNPSおよびアルカリ土類金属の塩が挙げられる。PNPSとアルカリ金属の塩としては、ｐ−ニトロフェニル硫酸カリウム（PNPS-K）やｐ−ニトロフェニル硫酸ナトリウム（PNPS-Na）が挙げられる。なお、ここでいう「中和」には、遊離酸（フリー体）として存在するPNPSからPNPS塩を形成することに限られず、三酸化硫黄錯体に由来するルイス塩基等の塩
基と既に塩を形成しているPNPSを所望のPNPS塩に変換することも含まれる。
【００２５】
中和工程は、PNPSとtert−ブトキシ塩を溶媒中で共存させることにより実施できる。溶媒としては、上述した、PNPの溶解度が高く、且つ、PNPS塩の溶解度が低い溶媒を用いる
。すなわち、硫酸化工程により得られた反応液（PNPSを含む反応液）を中和工程の溶媒として利用することができる。硫酸化工程により得られた反応液（PNPSを含む反応液）は、そのまま、あるいは適宜、希釈や濃縮等の処理に供してから、中和工程に供してよい。例えば、反応容器内で、硫酸化工程で得られた反応液（PNPSを含む反応液）とtert−ブトキシ塩とを混合することにより、中和工程を実施できる。中和工程は、静置して実施しても
よく、撹拌や振盪して実施してもよい。中和工程は、撹拌や振盪して実施するのが好ましい。
【００２６】
tert−ブトキシ塩としては、アルカリ金属のtert−ブトキシドおよびアルカリ土類金属のtert−ブトキシドが挙げられる。アルカリ金属のtert−ブトキシドとしては、tert−ブトキシカリウム（t-BuOK）およびtert−ブトキシナトリウム（t-BuONa）が挙げられる。tert−ブトキシ塩は、製造するPNPS塩の種類に応じて選択できる。すなわち、例えば、t-BuOKを用いてPNPS-Kを、t-BuONaを用いてPNPS-Naを、それぞれ製造することができる。
【００２７】
中和工程の反応条件（各成分の反応系での濃度、反応温度、反応時間等）は、所望の程度にPNPS塩が生成する限り、特に制限されない。すなわち、反応条件は、所望の収量や収率でPNPS塩が生成するように、適宜設定することができる。
【００２８】
tert−ブトキシ塩の濃度は、例えば、１０ｍＭ以上、５０ｍＭ以上、１００ｍＭ以上、または３００ｍＭ以上であってもよく、３Ｍ以下、１Ｍ以下、または５００ｍＭ以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。tert−ブトキシ塩の濃度は、例えば、１０ｍＭ〜３Ｍであってもよい。また、tert−ブトキシ塩の使用量は、PNPの使用量やPNPSの反応収率等の諸条件に応じて適宜設定することができる。tert−ブトキシ塩の使用量
は、PNPの使用量に対し、モル比で、例えば、０．５倍量以上であってよい。tert−ブト
キシ塩の使用量は、PNPの使用量に対し、モル比で、例えば、０．５倍量〜２倍量、また
は０．５倍量〜１．５倍量であってもよい。tert−ブトキシ塩の使用量は、PNPSの生成量に対し、モル比で、例えば、等量以上であってよい。tert−ブトキシ塩の使用量は、PNPSの生成量に対し、モル比で、例えば、等量〜２倍量、または等量〜１．５倍量であってもよい。アルカリ土類金属のtert−ブトキシド等の多価のtert−ブトキシ塩を用いる場合、tert−ブトキシ塩の使用量は、上記使用量をtert−ブトキシ塩の価数で除した量とすればよい。
【００２９】
反応温度は、溶媒の種類や反応時間等の諸条件に応じて適宜設定することができる。反応温度は、例えば、溶媒の沸点未満であってよい。反応温度は、例えば、０℃以上、１０℃以上、または２０℃以上であってもよく、１００℃以下、８０℃以下、または６０℃以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。反応温度は、例えば、０℃〜６０℃であってもよい。
【００３０】
反応時間は、反応温度等の諸条件に応じて適宜設定することができる。反応時間は、例えば、５分以上、３０分以上、または１時間以上であってもよく、２０時間以下、１０時間以下、または５時間以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。反応時間は、例えば、３０分〜５時間であってもよい。
【００３１】
中和工程は、アルゴン等の不活性ガスの雰囲気下で実施してもよい。
【００３２】
中和工程の反応条件は、硫酸化工程の開始から終了まで均一であってもよく、中和工程の過程において変化してもよい。また、PNPS（例えば硫酸化工程により得られた反応液）、tert−ブトキシ塩、溶媒等の成分は、単独で、あるいは任意の組み合わせで、追加的に反応系に供給されてもよい。これらの成分は、１回または複数回間欠的に供給されてもよく、連続的に供給されてもよい。
【００３３】
このようにして、中和工程を実施することにより、PNPS塩が生成する。すなわち、中和工程により、PNPS塩を含む反応液が得られる。生成したPNPS塩の少なくとも一部は結晶として析出する。すなわち、中和工程により、PNPS塩の結晶が析出する。よって、中和工程により、例えば、PNPS塩の結晶を含むスラリーが得られる。
【００３４】
生成したPNPS塩は、適宜回収することができる。すなわち、本発明の方法は、生成したPNPS塩を回収する工程を含んでいてよい。例えば、本発明の方法は、析出したPNPS塩の結晶を回収する工程を含んでいてよい。PNPS塩を回収する手段は、特に制限されない。PNPS塩を回収する手段としては、膜処理法や沈殿法等の、化合物の分離精製に用いられる公知の手法が挙げられる。例えば、析出したPNPS塩の結晶は、遠心分離や濾過等の固液分離手法により回収することができる。また、反応液中に溶解しているPNPS塩を晶析し、回収することもできる。例えば、反応液中の溶媒よりもPNPS塩の溶解度が低い溶媒を反応液に混合することや、反応液を濃縮することにより、反応液中に溶解しているPNPS塩を晶析することができる。回収したPNPS塩の結晶は適宜洗浄できる。洗浄には、例えば、PNPS塩の溶解度が低い溶媒を用いることができる。洗浄に用いる溶媒は、硫酸化工程や中和工程に用いた溶媒と同一であってもよく、そうでなくてもよい。また、PNPS塩の湿結晶を乾燥させ、PNPS塩の乾燥結晶を得ることができる。
【００３５】
本発明においては、高い単離収率でPNPS塩が得られると期待される。本発明においては、例えば、５０％以上、６０％以上、または７０％以上の単離収率でPNPS塩が得られてよい。単離収率は、用いたPNPに対する回収されたPNPS塩の比率（モル比）として算出され
る。PNPS塩の回収量は、PNPS塩結晶の回収量にPNPS塩の純度を乗算することにより算出できる。PNPS塩結晶中のPNPS塩の純度は、結晶組成を解析することにより算出できる。結晶組成は、上記のような、化合物の検出または同定に用いられる公知の手法により解析できる。
【００３６】
＜２＞PNPS塩の利用
PNPS塩は、硫酸基供与体として硫酸化反応に利用することができる。PNPS塩は、例えば、ヘパロサン（heparosan）からヘパリン（heparin）等の抗凝固活性を有するヘパラン硫酸を製造する際の硫酸化に利用することができる。よって、本発明の方法により得られたPNPS塩を用いることで、ヘパロサンから抗凝固活性を有するヘパラン硫酸を安価に製造することができると期待される。ヘパリン等の抗凝固活性を有するヘパラン硫酸は、例えば、医薬品の成分として利用できる。
【００３７】
ヘパロサンは、例えば、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア・コリ等の細菌を利用した発酵法により製造できる（WO2015/050184、公開技報番号2015-501775）。
【００３８】
ヘパリンは、例えば、ヘパロサンを出発物質として、（１）N-脱アセチル化、（２）N-硫酸化、（３）C5-エピメリ化、（４）2-O-硫酸化、（５）6-O-硫酸化、および（６）α
−Ｄ−グルコサミン（GlcN）残基の3-O-硫酸化の工程を経ることにより、製造できる（Zhang Z. et al., (2008) "Solution Structures of Chemoenzymatically Synthesized Heparin and Its Precursors." J Am Chem Soc., 130(39): 12998-13007.）。このようなヘ
パリンの製造法は、さらに、低分子化の工程を含んでいてもよい。また、得られたヘパリンを分画して低分子ヘパリンを取得することもできる。このようなヘパロサンからヘパリンを製造する工程の実施順序は、所望の性質を有するヘパリンが得られる限り、特に制限されない。
【００３９】
また、例えば、ヘパロサンを部分的にN-脱アセチル化した後にヘパリナーゼＩＩＩ（heparinase III）で低分子化し、生成した低分子化物を抗凝固活性を有するヘパラン硫酸に変換することにより、所望の平均糖連結数を有する、抗凝固活性を有するヘパラン硫酸を製造することができる。低分子化物を抗凝固活性を有するヘパラン硫酸に変換することは、例えば、N-硫酸化、C5-エピメリ化、2-O-硫酸化、GlcN残基の3-O-硫酸化、および6-O-
硫酸化の工程から選択される１またはそれ以上、例えば全て、の工程により達成できる。このような低分子化物を抗凝固活性を有するヘパラン硫酸に変換する工程の種類および実
施順序は、所望の性質を有するヘパラン硫酸が得られる限り、特に制限されない。Ｎ−脱アセチル化は、例えば、Ｎ−アセチル基の残存率が１％〜３３％、７％〜３３％、または１１％〜１７％となるように実施することができる。例えば、Ｎ−アセチル基の残存率１１％〜１７％は、概ね、Ｎ−アセチル基が１２〜１８糖残基に１つ（二糖残基として６〜９残基に１つ）の比率で存在していることに相当する。ヘパリナーゼＩＩＩにより、Ｎ−アセチル基が残存するグルコサミン残基の部位を優先的に切断することができる。低分子化は、例えば、平均糖連結数が６〜３０糖残基または１２〜１８糖残基の低分子化物が得られるように実施することができる。したがって、このようなヘパラン硫酸の製造法によれば、例えば、平均糖連結数が６〜３０糖残基または１２〜１８糖残基のヘパラン硫酸を製造することができる。このようにして製造されるヘパラン硫酸は、例えば、公知のヘパラン硫酸（例えばヘパリン）と同様の構造を有していてもよく、そうでなくてもよい。
【００４０】
このように、ヘパロサンから抗凝固活性を有するヘパラン硫酸を製造する場合、位置選択的O-硫酸化が実施され得る。位置選択的O-硫酸化は、例えば、対応するＯ−硫酸転移酵素（O-sulfotransferase；OST）を利用して実施することができる。すなわち、2-O-硫酸
化、GlcN残基の3-O-硫酸化、および6-O-硫酸化は、それぞれ、2-O-硫酸転移酵素（2-OST
）、3-O-硫酸転移酵素（3-OST）、および6-O-硫酸転移酵素（6-OST）を利用して実施することができる。OSTは3'-ホスホアデノシン-5'-ホスホ硫酸（3'-Phosphoadenosine-5'-phosphosulfate；PAPS）を硫酸基供与体として利用して水酸基を硫酸化する。その際に生成
する3'-ホスホアデノシン-5'-リン酸（3'-Phosphoadenosine-5'-phosphate；PAP）は、PNPS塩を利用してPAPSに再生できる。具体的には、PNPS塩を硫酸基供与体としてアリール硫酸転移酵素（arylsulfotransferase；AST）の作用によりPAPを硫酸化してPAPSを再生できる（Chen J, et al., "Enzymatic redesigning of biologically active heparan sulfate." J Biol Chem. 2005 Dec 30;280(52):42817-25.）。ASTとしては、AST-IVが挙げられ
る。すなわち、OSTとPAPSによる位置選択的O-硫酸化は、AST-IVとPNPS塩によるPAPSの再
生系とカップリングさせて実施できる。このように、PNPS塩は、ヘパロサンから抗凝固活性を有するヘパラン硫酸を製造する際の位置選択的O-硫酸化に利用することができる。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例をもとに、本発明をより具体的に説明する。
【００４２】
実施例：PNPS塩の製造
表１の試験例No.１〜７に示す条件でPNPS塩を合成した。
【００４３】
具体的には、試験例No.３の場合、以下の手順でPNPS塩を合成した。100 mL四つ口フラ
スコをAr置換し、THF 50 mL、p-ニトロフェノール2.21 g（15.9 mmol；318 mM）、三酸化硫黄ピリジン錯体3.13 g（19.7 mmol；394 mM）を加え25℃で2時間撹拌した（硫酸化工程）。更にt-BuOK 1.78 g（15.9 mmol；318 mM）を添加し25℃で2時間撹拌したところ、結
晶の析出が認められた（中和工程）。生成したスラリーを濾過しTHF 10mLで結晶洗浄した。得られた湿結晶を40℃で12時間減圧乾燥し、乾燥結晶4.32 gを得た。硫酸化工程後に反応液の一部を分取し、PNPSをHPLCで定量したところ、反応収率90％でPNPSの生成が認められた。また、得られた乾燥結晶をHPLCによる成分分析に供してPNPS塩の純度を算出したところ、PNPS-Kの単離収率77％であった。
【００４４】
同様に、表１の試験例No.１、２、４〜７に示す条件でPNPS塩を合成した。すなわち、
合成スケールに応じた四つ口フラスコをAr置換し、溶媒、p-ニトロフェノール（318 mM）、硫酸化試薬（394 mM）を加えて撹拌した（硫酸化工程）。更に塩基（318 mM）を添加し25℃で2時間撹拌した（中和工程）。結晶の析出が認められた場合、スラリーを濾過しTHF
10mLで結晶洗浄した。得られた湿結晶を40℃で12時間減圧乾燥し、乾燥結晶を得た。必
要により、硫酸化工程後に反応液の一部を分取し、PNPSの生成量を定量し、反応収率（Re
action Yield）を求めた。また、得られた乾燥結晶を成分分析に供してPNPS塩の純度を算出し、単離収率（Isolation Yield）を求めた。なお、表中、「Reaction Temp. (℃)」および「Reaction Time (hr)」は、それぞれ硫酸化工程の温度および時間を示す。試験例No.４の「Reaction Temp. (℃)」は、5℃（氷浴）で硫酸化工程を開始し、終夜で撹拌した
ところ、硫酸化工程の終了時には温度が25℃まで上昇していたことを示す。また、表中、「Py」はピリジン、「TEA」はトリエチルアミンを示す。また、表中、「先行技術」は、Marzec, Krzysztof. Bulletin of the polish academy of science. Chemistry. 37, 371-373, (1990)に記載のデータを抜粋した。
【００４５】
結果を表１に示す。THFを溶媒として用いることで、PNPSが８０％以上の高い収率で生
成し、且つ、PNPS塩の結晶が６０〜８０％の高い収率で得られた。
【００４６】
【表１】
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【００４７】
参考例１：PNPS-K溶解度測定
表２に示す溶媒について、PNPS-Kの溶解度を以下の手順で測定した。溶媒1mLにPNPS-K
（Aldrich製）100mgを添加し、25℃で12hr撹拌した。スラリーを0.2μのフィルターでろ
過し、濾過液中のPNPS-K濃度をHPLC分析結果から算出し、PNPS-Kの溶解度とした。結果を表２に示す。
【００４８】
【表２】
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【００４９】
参考例２：PNP溶解度測定
表３に示す溶媒について、PNPの溶解度を以下の手順で測定した。溶媒1mLにPNP（東京
化成製）55mgを添加し、25℃で12hr撹拌した。スラリーを0.2μのフィルターでろ過し、
濾過液中のPNP濃度をHPLC分析結果から算出し、PNPの溶解度とした。結果を表３に示す。
【００５０】
【表３】
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【００５１】
参考例３：成分分析法
実施例および参考例１におけるHPLC分析の条件は以下の通りである。
＜LC部分析条件＞
システム    ：  SHIMADZU LC-10シリーズ
カラム      ：  資生堂製  Capcell Pak AQ 5μ 2.0mm×250mm
カラム温度  ：  40℃
溶離液流量  ：  0.2 mL/min
検出        ：  UV 254 nm
注入量      ：  10μL
溶離液組成  ：  A液  10 mM-HCOONH4 (pH3.0)
B液  CH3CN
Gradient Program, 表４
分析サイクル：  45min
溶出時間    ：  PNP 22 min, PNPS-K 25 min
【００５２】
【表４】
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