(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウスを感染させるために修飾したＥＶ７１に１週齢〜２週齢の間に感染させた、４週齢までのマウスを含む、エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）神経感染の動物モデルであって、
該マウスは、１０５〜１０６の間の中央値細胞培養感染用量（ＣＣＩＤ５０）の修飾ＥＶ７１を腹腔内または筋組織内に注射することにより感染させられ、
該修飾ＥＶ７１は、ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖであって、
（ａ）タイプカルチャーコレクション中国センターに寄託され、そして寄託番号ＣＣＴＣＣ  Ｖ２０１４３８を割り当てられているか、または
（ｂ）配列番号２の配列を用いてウイルスＲＮＡを合成することを含む高度逆遺伝学を用いて回収されており、
該動物モデルは、急性脳脊髄炎、肺胞中の限局的出血およびタンパク質性液体、カテコールアミンの高血清レベル、および脳幹における徹底的な組織損傷を示し、それらは神経原性肺浮腫の徴候および症状である、前記動物モデル。
【請求項２】
ＣＣＩＤ５０が１０６である、請求項１の動物モデル。
【請求項３】
マウスが免疫適格性である、請求項１の動物モデル。
【請求項４】
マウスがＢＡＬＢ／ｃマウスである、請求項３の動物モデル。
【請求項５】
マウスが易感染性である、請求項１の動物モデル。
【請求項６】
マウスがＮＳＧマウスである、請求項５の動物モデル。
【請求項７】
抗ウイルス薬剤をスクリーニングする方法であって：動物の試験群および動物の対照群を提供し、ここで各群の動物は、請求項１〜６のいずれか一項の動物モデルを含む；試験群に抗ウイルス薬剤候補を投与し；試験群および対照群において、疾患進行を監視し；試験群における疾患進行を対照群における疾患進行に比較し；そして対照群に比較して試験群において疾患進行を減少させる抗ウイルス薬剤候補を選択する工程を含む、前記方法。
【請求項８】
抗ウイルス薬剤が、動物におけるスクリーニングの前に、まず、修飾エンテロウイルス７１に感染させた試験マウス細胞株においてスクリーニングされる、請求項７の方法。
【請求項９】
有効な抗ウイルスワクチンをスクリーニングする方法であって：動物の試験群および動物の対照群を提供し、ここで各群の動物は、請求項１〜６のいずれか一項の動物モデルを含む；試験群に抗ウイルスワクチン候補を投与し；試験群および対照群において、疾患進行を監視し；試験群における疾患進行を対照群における疾患進行に比較し；そして対照群に比較して試験群において疾患進行を減少させる抗ウイルスワクチン候補を選択する工程を含む、前記方法。
【請求項１０】
エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）神経感染の動物モデルを調製する方法であって、
（ｉ）１週齢〜２週齢の間のマウスを、該マウスを感染させるために修飾したＥＶ７１に感染させ、そして
（ｉｉ）感染したマウスを４週齢まで飼育し、
それによって、ＥＶ７１神経感染の動物モデルを準備する
工程を含み、
該マウスは、１０５〜１０６の間の中央値細胞培養感染用量（ＣＣＩＤ５０）の修飾ＥＶ７１を腹腔内または筋組織内に注射することにより感染させられ、
該修飾ＥＶ７１は、ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖであって、
（ａ）タイプカルチャーコレクション中国センターに寄託され、そして寄託番号ＣＣＴＣＣ  Ｖ２０１４３８を割り当てられているか、または
（ｂ）配列番号２の配列を用いてウイルスＲＮＡを合成することを含む高度逆遺伝学を用いて回収されており、
該動物モデルは、急性脳脊髄炎、肺胞中の限局的出血およびタンパク質性液体、カテコールアミンの高血清レベル、および脳幹における徹底的な組織損傷を示し、それらは神経原性肺浮腫の徴候および症状である、前記方法。
【請求項１１】
ＣＣＩＤ５０が１０６である、請求項１０の方法。
【請求項１２】
マウスが免疫適格性である、請求項１０または１１の方法。
【請求項１３】
マウスがＢＡＬＢ／ｃマウスである、請求項１２の方法。
【請求項１４】
マウスが易感染性である、請求項１０または１１の方法。
【請求項１５】
マウスがＮＳＧマウスである、請求項１４の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対するクロスリファレンス
[0001]本出願は、２０１５年２月１１日出願の米国仮特許出願第６２／１１４，８８０号および２０１５年１月２８日出願の米国仮特許出願第６２／１０８，８２８号に関連し、そしてこれらに優先権を請求する。各出願は、その全体が本明細書に援用される。
【０００２】
配列表の提出
[0002]本出願は、電子形式の配列表とともに提出されている。配列表は、２５７７２４３ＰＣＴＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと題され、２０１５年１２月２９日に作成され、そしてサイズは３２ｋｂである。配列表の電子形式での情報は、その全体が本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００３】
[0003]本発明は、エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）、動物モデルの開発、および候補抗ＥＶ７１化合物のスクリーニングに関する。
[0004]本発明の背景を明らかにするために本明細書で用いられる刊行物および他の資料、ならびに特に、実施に関するさらなる詳細を提供する実例は、本明細書に援用され、そして便宜上、以下の本文において、著者名および日付によって言及され、そして付随する参考文献一覧において、著者のアルファベット順に列挙される。
【０００４】
[0005]エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）は、直径およそ３０ｎｍの小型の非エンベロープ型ウイルスである。ウイルス・カプシドは、正二十面体対称を示し、そして６０の同一の単位（プロトマー）で構成され、各々は、４つのウイルス構造タンパク質ＶＰ１〜ＶＰ４からなる。カプシドは、７，４５０ヌクレオチド（ｎｔ）長の一本鎖プラスセンスＲＮＡゲノムのコアを取り巻く。ゲノムは、２１９３アミノ酸（ａａ）のポリタンパク質をコードし、そして７４５ｎｔの長い５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、および３’末端の可変長のポリＡトラクトを含む、８５ｎｔのより短い３’ＵＴＲが隣接する。ポリタンパク質は、３つの領域、すなわちＰ１、Ｐ２およびＰ３に分割される。Ｐ１は、４つのウイルス構造タンパク質１Ａ〜１Ｄ（ＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ１）をコードし；Ｐ２およびＰ３は、７つの非構造タンパク質２Ａ〜２Ｃおよび３Ａ〜３Ｄをコードする［１〜３］。主要カプシドタンパク質（ＶＰ１）遺伝子の系統学的分析によって、ＥＶ７１は６つの遺伝子型（Ａ〜Ｆと称される）に［６６］、そして遺伝子型ＢおよびＣは、さらに、下位遺伝子型Ｂ１〜Ｂ５およびＣ１〜Ｃ５に細分される［３］。
【０００５】
[0006]ＥＶ７１は、主に幼児および若年小児における、手足口病（ＨＦＭＤ）、無菌性髄膜炎、脳炎およびポリオ筋症様麻痺を含む、多数の臨床疾患を引き起こす［４、５］。該ウイルスは、１９６９年、米国カリフォルニア州において、急性脳炎の小児から最初に単離され、そして続いて、１９７４年にエンテロウイルス属の新規血清型として特徴付けられた［６］。神経学的合併症および死を伴うまたは伴わないＨＦＭＤの大流行が、世界の多様な地域で報告された［７〜２０］。１９９７年以来、ＥＶ７１感染は主要な公衆衛生上の負荷となってきており、そしてアジア太平洋領域において、一定の疫学的な懸念である。非常に神経毒性が高いＥＶ７１によるＨＦＭＤ大流行が、マレーシアにおいて発生して、１９９７年に４８人の死亡を生じ［２１、２２］、その後、１９９８年、台湾において、より大きい大流行が続き、この際、ＨＦＭＤは１２９，０００症例を超え、４０５例は重度の感染であり、そして神経学的心不全および肺浮腫を伴う、急性脳幹脳脊髄炎のための７８の死亡例があった［２３〜２６］。中華人民共和国において、２００８年に、１２６の死亡例を含む、４８８，９５５のＨＦＭＤ例を記録し、そして２００９年には、３５３の死亡者を含む、１，１５５，５２５症例に増加した［２８］。２０１０年、中国は、１７０万症例を超え、重度神経学的合併症を有する２７，０００人の患者、および９０５の死亡例を含む、これまでで最大のＨＦＭＤ大流行を経験している［２９］。
【０００６】
[0007]他のヒト・エンテロウイルスと同様、ＥＶ７１はヒト以外の動物を感染させることが不可能であるが、アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）およびカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｏｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）は実験的に感染可能である［３０〜３２］。これは主に、脱外被して、そしてマウス細胞内に進入するために、ＥＶ７１がその受容体に効率的に結合することが不可能であるためであり、該受容体は、最近、スカベンジャー受容体クラスＢメンバー２（ＳＣＡＲＢ２）タンパク質と同定されてきている［４７］。ヒトおよびネズミＳＣＡＲＢ２タンパク質は、わずか８４％のアミノ酸配列同一性しか示さず、そしてしたがって有意な構造相違を示し［４９、６７］、したがって、ＥＶ７１感染に対する非ヒト細胞の天然耐性の根底にある、ウイルス−受容体不適合性を引き起こす。ウイルスが、細胞表面上のＳＣＡＲＢ２受容体に成功裡に結合し、そして脱外被して細胞質内に入ると、ウイルスＲＮＡが翻訳され、多様なウイルス非構造タンパク質の発現が生じる。ウイルスＲＮＡは続いて複製され、カプシド内にパッケージングされ、そして環境内に自由に放出されて、健康な細胞を再感染させる。
【０００７】
[0008]ＥＶ７１が天然には小型齧歯類に感染不能であるため、適切な小動物モデルが存在せず、その病態形成および該ウイルスに対する特異的な療法の開発の理解が妨げられてきた。ＥＶ７１感染および疾患のマウスモデルを確立しようとする試みは、大部分、若い哺乳中のマウスにおいて、連続継代することによるウイルス適合を通じてなされてきた［３３〜３９］。いくつかのモデルは、臨床疾病の症状を再現することが可能であったが、２週齢またはそれより年上の免疫適格マウスにおいて、疾患を引き起こすと報告されているものはない。さらに、ヒトおよび実験サルにおけるＥＶ７１感染の疾患および病理の臨床的特徴は、易感染性インターフェロン受容体不全ＡＧ１２９マウスを例外として、マウスにおいて複製することができなかった［３５］。より最近、ヒトＰＳＧＬ−１［６８］およびヒトＳＣＡＲＢ２［６９、７０］タンパク質を発現するトランスジェニックマウスが利用可能になってきているが、これらは、ＥＶ７１感染に対する感受性において、わずかに最低限の改善しか示さない。
【０００８】
[0009]ＲＮＡウイルスは、その誤りがちな複製および高い突然変異率［４０〜４２］のため、擬似種として知られる関連変異体配列の群れとして複製される［４３、４４］。特定の環境において、最高の適合を示すマスター種、および特定の確率分布を持つ緊密に関連する突然変異体配列コレクションで構成される突然変異スペクトラムで構成される［４４、４５］。これらは、ＲＮＡウイルスにゲノム可塑性を与え、これは、変化する環境に迅速に適合する能力に反映される。
【０００９】
[0010]ＥＶ７１感染が致死性神経学的疾患を引き起こす機構は完全には理解されておらず、したがって、いくつかの研究グループが、アカゲザルおよびカニクイザル［１１４〜１２０］、実験マウス［１１２、１２１〜１２９］、および他の哺乳動物［１３０〜１３３］を含む実験動物において、ヒト感染の病理を再現することを試みてきている。不運なことに、これらのモデルはいずれも、ヒト症例で観察される神経学的特徴の全スペクトルを示さず、特に、劇症神経原性肺浮腫（ＮＰＥ）を伴う急性脳幹脳炎に寄与しうる特徴は示さない［２１、２２、１３４〜１３７］。実際、ヒトにおけるＥＶ７１感染の徴候および症状をより正確に複製する実験系においてさえ、根底にある機構は、ヒト患者において疾患を生じるものとは実質的に異なる。今日まで、いかなる単一の動物モデルも、ＥＶ７１誘導性ＮＰＥを決定的に複製はしていない。重要な相違は、ＥＶ７１がヒト患者においてはＣＮＳ組織に限定される［９２〜９４、１１１］一方、動物モデルにおいては、ウイルスがまた、骨格筋［３３〜３６、３８、９８］および肝臓［１１９］を含む非神経性組織においても検出されうることである。ヒトＥＶ７１受容体タンパク質ＰＳＧＬ−１（Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１）およびＳＣＡＲＢ２（スカベンジャー受容体クラスＢ、メンバー２）［６８〜７０、４７、１３８］を発現するトランスジェニックマウスを生成する努力がなされてきているが、これらのモデルはいずれもＮＰＥを示さず、したがって、ヒト患者のための新規介入を同定するための有用性は限定されている。
【００１０】
[0011]ＥＶ７１感染動物における感染および疾患進行を研究するための、あるいは抗ウイルス化合物または抗ウイルスワクチンをスクリーニングするために使用可能である、適切な動物モデルは存在しない。これらの目的のための動物モデルを開発することが望ましい。
【発明の概要】
【００１１】
[0012]本発明は、エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）、動物モデルの開発、および候補抗ＥＶ７１化合物のスクリーニングに関する。より具体的には、本発明は、齧歯類細胞株感染のために適合しているエンテロウイルス７１（ＥＶ７１）株、またはＶＰ１に突然変異を含有するクローニング由来ウイルスが、免疫適格性齧歯類および易感染性齧歯類において、疾患を引き起こすことが可能であるという発見に関する。
【００１２】
[0013]さらに、本発明は、ＮＩＨ／３Ｔ３マウス線維芽細胞を感染させるように適合した修飾株（例えばＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ）にＢＡＬＢ／ｃマウスを感染させることによる、ＥＶ７１誘導性神経学的疾患の臨床的真性モデルの開発に関する。このアプローチを用い、修飾ＥＶ７１を用いて、マウスにおいて、偽感染肺に比較して、肺腫脹および臓器重量増加によって特徴付けられる、神経原性肺浮腫に関連する急性脳脊髄炎を誘導する。肺または心臓組織炎症が存在しないにもかかわらず、肺胞中の限局的出血およびタンパク質性液体、カテコールアミンの高血清レベル、および脳幹、特に延髄における徹底的な組織損傷が観察された。これらのデータは、該モデルが、ヒトＥＶ７１誘導性神経原性肺浮腫の徴候および症状を正確に再現することを立証する。
【００１３】
[0014]したがって、１つの側面において、本発明は、本明細書において、修飾エンテロウイルス７１とときに称される、齧歯類に感染可能なエンテロウイルス７１に感染した齧歯類を含む、動物モデルに関する。１つの態様において、こうしたエンテロウイルス７１は、齧歯類細胞株適合性エンテロウイルス７１である。別の態様において、こうしたエンテロウイルス７１は、ＶＰ１中に突然変異を含有するクローン由来ウイルス（ＣＤＶ）である。いくつかの態様において、ＶＰ１中の突然変異は、ＣＤＶが齧歯類ＳＣＡＲＢ２タンパク質を用いて齧歯類細胞を感染させることを可能にする。１つの態様において、齧歯類は免疫適格性齧歯類である。別の態様において、齧歯類は易感染性齧歯類である。モデルとして使用するために適切な動物は、好ましくは哺乳動物、最も好ましくは好適な実験動物、例えばウサギ、ラット、マウス等である。１つの態様において、動物はマウスである。いくつかの態様において、マウスはＢＡＬＢ／ｃマウスである。別の態様において、齧歯類細胞株はマウス細胞株である。さらなる態様において、マウス細胞株はマウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞株である。別の態様において、マウス細胞株は、マウスＮｅｕｒｏ−２ａ細胞株である。１つの態様において、齧歯類細胞株適合エンテロウイルス７１は、ＥＶ７１：ＴＬＬｍである。別の態様において、齧歯類細胞株適合エンテロウイルス７１は、ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖである。１つの態様において、ＶＰ１中に突然変異を含有するクローン由来ウイルスは、ＣＤＶ：ＢＳＶＰ１［Ｋ９８Ｅ／Ｅ１４５Ａ／Ｌ１６９Ｆ］である。動物モデルは、ウイルスの全身伝播および動物モデルにおけるヒト疾患スペクトルを研究するために有用である。動物モデルはまた、抗ウイルス薬剤およびワクチンをスクリーニングするために有用である。
【００１４】
[0015]別の側面において、本発明は、ヒトにおいて観察される、ＥＶ７１誘導性神経学的感染、疾患および病理の全スペクトルを含む動物モデルを準備するための方法を提供する。いくつかの態様において、該方法は、本明細書記載の齧歯類を、本明細書記載の修飾エンテロウイルス７１に感染させ、そして最長約４週間、感染齧歯類を飼育する工程を含む。いくつかの態様において、感染させようとする齧歯類の年齢は、約１週〜約４週の間である。他の態様において、感染した齧歯類を約１週間〜約４週間飼育する。いくつかの態様において、齧歯類は、本明細書に記載するようなマウスである。他の態様において、修飾エンテロウイルス７１を齧歯類に接種することによって、齧歯類を感染させる。１つの態様において、接種は腹腔内（Ｉ．Ｐ．）である。別の態様において、接種は筋内（Ｉ．Ｍ．）である。いくつかの態様において、齧歯類内に接種されるウイルス用量は、約１０３〜約１０７の間の中央値細胞培養感染用量（ＣＣＩＤ５０）である。
【００１５】
[0016]さらなる側面において、本発明は、抗ウイルス薬剤をスクリーニングする方法を提供する。この側面にしたがって、方法は、以下の工程を含む：動物の試験群および動物の対照群を提供し、ここで各群の動物は、本明細書記載の動物モデルの動物である；試験群に抗ウイルス薬剤候補を投与し；試験群および対照群において、疾患進行を監視し；試験群における疾患進行を対照群における疾患進行に比較し；そして対照群に比較して試験群において疾患進行を減少させる抗ウイルス薬剤候補を選択する工程。１つの態様において、抗ウイルス薬剤は、動物におけるスクリーニングの前に、まず、齧歯類細胞株適合エンテロウイルス７１に感染した試験齧歯類細胞株においてスクリーニングされる。別の態様において、抗ウイルス薬剤は、動物におけるスクリーニングの前に、まず、ＶＰ１中に突然変異を含有するクローン由来ウイルス（ＣＤＶ）に感染した試験齧歯類細胞株においてスクリーニングされる。
【００１６】
[0017]さらなる側面において、本発明は、有効な抗ウイルスワクチンをスクリーニングする方法を提供する。この側面にしたがって、方法は、以下の工程を含む：動物の試験群および動物の対照群を提供し、ここで各群の動物は、本明細書記載の動物モデルの動物である；試験群に抗ウイルスワクチン候補を投与し；試験群および対照群において、疾患進行を監視し；試験群における疾患進行を対照群における疾患進行に比較し；そして対照群に比較して試験群において疾患進行を減少させる抗ウイルスワクチン候補を選択する工程。１つの態様において、抗ウイルスワクチン候補は、動物におけるスクリーニングの前に、まず、齧歯類細胞株適合エンテロウイルス７１に感染した試験齧歯類細胞株においてスクリーニングされる。別の態様において、抗ウイルスワクチン候補は、動物におけるスクリーニングの前に、まず、ＶＰ１中に突然変異を含有するクローン由来ウイルス（ＣＤＶ）に感染した試験齧歯類細胞株においてスクリーニングされる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】[0018]図１Ａ〜１Ｏは、多様な霊長類細胞株のウイルス感染後に観察される細胞変性効果（ＣＰＥ）を示す。１ＭＯＩのＥＶ７１：ＢＳ（図１Ａ、１Ｄ、１Ｇ、１Ｊおよび１Ｍ）、ＥＶ７１：ＴＬＬｍ（図１Ｂ、１Ｅ、１Ｈ、１Ｋおよび１Ｎ）、またはＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ（図１Ｃ、１Ｆ、１Ｉ、１Ｌおよび１Ｏ）ウイルスのいずれかに感染させた霊長類細胞：ＲＤ細胞（図Ａ１〜１Ｃ）、ＨｅＬａ細胞（図１Ｄ〜１Ｆ）、ＨＥｐ−２細胞（図１Ｇ〜１ｌ）、Ｖｅｒｏ細胞（図１Ｊ〜１Ｌ）、およびＣＯＳ−７細胞（図１Ｍ〜１Ｏ）を、細胞変性効果または細胞単層の細胞死に関して４８ｈｐｉに観察した。画像は、３回の独立の実験における結果の代表である。
【図２】[0019]図２Ａ〜２Ｏは、ＥＶ７１：ＢＳ、ＥＶ７１：ＴＬＬｍおよびＥＶ７１：ＴＬＬｍｖに感染した細胞株におけるウイルス抗原検出を示す。一晩植え付けた哺乳動物細胞株：ＨｅＬａ（図２Ａ〜２Ｃ）、ＨＥｐ−２（図２Ｄ〜２Ｆ）、ＣＨＯ−Ｋ１（図２Ｇ−２Ｉ）、ＮＲＫ（図２Ｊ〜２Ｌ）、およびＴＣＭＫ（図２Ｍ〜２Ｏ）を、１ＭＯＩのそれぞれのウイルスに感染させた。細胞を４８ｈｐｉに採取し、テフロンスライド上でコーティングし、そして冷アセトン中で固定した。細胞を汎エンテロウイルス抗体で探査し、そしてＦＩＴＣコンジュゲート化抗マウスＩｇＧで染色した。画像は、２回の独立の実験の代表である。
【図３】[0020]図３Ａ〜３Ｄは、ＮＩＨ／３Ｔ３およびＶｅｒｏ細胞において決定されたＥＶ７１：ＢＳ、ＥＶ７１：ＴＬＬｍおよびＥＶ７１：ＴＬＬｍｖの増殖動力学を示す。１ＭＯＩのそれぞれのウイルスに感染した多様な哺乳動物細胞由来の上清を、多様な時点で採取し、そして力価決定に供し、そしてＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈ法を用いて計数した。図３Ａ：Ｖｅｒｏ細胞において決定したＥＶ７１：ＢＳウイルス力価。図３Ｂ：ＮＩＨ／３Ｔ３細胞において決定したＥＶ７１：ＴＬＬｍｖウイルス力価。図３Ｃおよび３Ｄ：ＮＩＨ／３Ｔ３細胞において決定したＥＶ７１：ＴＬＬｍウイルス力価。増殖性感染を示さない細胞株由来の増殖曲線は示していない。
【図４】[0021]図４Ａ〜４Ｏは、多様な齧歯類細胞株のウイルス感染後に観察される細胞変性効果（ＣＰＥ）を示す。１ＭＯＩのＥＶ７１：ＢＳ（図４Ａ、４Ｄ、４Ｇ、４Ｊおよび４Ｍ）、ＥＶ７１：ＴＬＬｍ（４Ｂ、４Ｅ、４Ｈ、４Ｋおよび４Ｎ）、またはＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ（図４Ｃ、４Ｆ、４Ｉ、４Ｌおよび４Ｏ）ウイルスのいずれかに感染させた齧歯類細胞：ＮＩＨ／３Ｔ３細胞（図Ａ４〜４Ｃ）、Ｎｅｕｒｏ−２Ａ細胞（図４Ｄ〜４Ｆ）、ＴＣＭＫ細胞（図４Ｇ〜４Ｉ）、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（図４Ｊ〜４Ｌ）、およびＮＲＫ細胞（図４Ｍ〜４Ｏ）を、細胞変性効果または細胞単層の細胞死に関して４８ｈｐｉに観察した。画像は、３回の独立の実験に由来する結果の代表である。
【図５】[0022]図５Ａ〜５Ｄは、力価比によって決定される、ＮＩＨ／３Ｔ３における、ＥＶ７１：ＢＳ、ＥＶ７１：ＴＬＬｍおよびＥＶ７１：ＴＬＬｍｖのウイルス適合評価を示す。ＮＩＨ／３Ｔ３およびＶｅｒｏ細胞において別個に決定されたウイルス力価を用いて、ｌｏｇ［（ＮＩＨ／３Ｔ３細胞における力価）／（Ｖｅｒｏ細胞における力価）］としてウイルス適合を計算した。図３Ａ〜３Ｄに示すウイルス力価値から、（図５Ａ）ＥＶ７１：ＢＳ、（図５Ｂ）ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖおよび（図５Ｃおよび５Ｄ）ＥＶ７１：ＴＬＬｍのウイルス適合を計算した。増殖性感染を示さない細胞株から得たウイルス適合アッセイは示していない。
【図６】[0023]図６Ａおよび６Ｂは、ＥＶ７１：ＢＳウイルスＲＮＡでのＮＩＨ／３Ｔ３のトランスフェクションが、増殖性感染を誘導することを示す。一晩植え付けたＮＩＨ／３Ｔ３およびＶｅｒｏ細胞に、ＥＶ７１：ＢＳ、ＥＶ７１：ＴＬＬｍ、およびＥＶ７１：ＴＬＬｍｖから抽出したウイルスＲＮＡであらかじめトランスフェクションしたＮＩＨ／３Ｔ３細胞から採取したウイルス上清を接種した。図６Ａ：倒立光学顕微鏡を用いて２４ｈｐｉに細胞を画像化して、誘導されたＣＰＥを観察した。図６Ｂ：細胞を７ｄｐｉに採取し、テフロンスライド上でコーティングし、汎エンテロウイルス抗体で探査し、そして抗マウスＦＩＴＣコンジュゲート化抗体で染色した。
【図７】[0024]図７Ａおよび７Ｂは、３０℃のＮＩＨ／３Ｔ３およびＶｅｒｏ細胞におけるＥＶ７１：ＢＳ、ＥＶ７１：ＴＬＬｍ、およびＥＶ７１：ＴＬＬｍｖのウイルス適合評価を示す。ＥＶ７１：ＢＳ（パネルａ、ｄ、ｇ）、ＥＶ７１：ＴＬＬｍ（パネルｂ、ｅ、ｈ）、またはＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ（パネルｃ、ｆ、ｉ）に感染させた、一晩植え付けた（図７Ａ）ＮＩＨ／３Ｔ３および（図７Ｂ）Ｖｅｒｏ細胞を３０℃でインキュベーションし、そして位相差光学顕微鏡下で２４ｈｐｉ（パネルａ〜ｃ）、４８ｈｐｉ（パネルｄ〜ｆ）、および７２ｈｐｉ（パネルｇ〜ｉ）に観察した。撮った画像は、２回の独立の実験を代表する。
【図８】[0025]図８Ａおよび８Ｂは、３７℃のＮＩＨ／３Ｔ３およびＶｅｒｏ細胞におけるＥＶ７１：ＢＳ、ＥＶ７１：ＴＬＬｍ、およびＥＶ７１：ＴＬＬｍｖのウイルス適合評価を示す。ＥＶ７１：ＢＳ（パネルａ、ｄ、ｇ）、ＥＶ７１：ＴＬＬｍ（パネルｂ、ｅ、ｈ）、またはＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ（パネルｃ、ｆ、ｉ）に感染させた、一晩植え付けた（図８Ａ）ＮＩＨ／３Ｔ３および（図８Ｂ）Ｖｅｒｏ細胞を３７℃でインキュベーションし、そして位相差光学顕微鏡下で２４ｈｐｉ（パネルａ〜ｃ）、４８ｈｐｉ（パネルｄ〜ｆ）、および７２ｈｐｉ（パネルｇ〜ｉ）に観察した。撮った画像は、２回の独立の実験を代表する。
【図９】[0026]図９Ａおよび９Ｂは、３９℃のＮＩＨ／３Ｔ３およびＶｅｒｏ細胞におけるＥＶ７１：ＢＳ、ＥＶ７１：ＴＬＬｍ、およびＥＶ７１：ＴＬＬｍｖのウイルス適合評価を示す。ＥＶ７１：ＢＳ（パネルａ、ｄ、ｇ）、ＥＶ７１：ＴＬＬｍ（パネルｂ、ｅ、ｈ）、またはＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ（パネルｃ、ｆ、ｉ）に感染させた、一晩植え付けた（図９Ａ）ＮＩＨ／３Ｔ３および（図９Ｂ）Ｖｅｒｏ細胞を３９℃でインキュベーションし、そして位相差光学顕微鏡下で２４ｈｐｉ（パネルａ〜ｃ）、４８ｈｐｉ（パネルｄ〜ｆ）、および７２ｈｐｉ（パネルｇ〜ｉ）に観察した。撮った画像は、２回の独立の実験を代表する。
【図１０】[0027]図１０Ａ〜１０Ｌは、ウイルス複製の証拠に関してネズミ細胞株ＮＩＨ／３Ｔ３、Ｎｅｕｒｏ−２Ａ、およびＴＣＭＫのＥＶ７１：ＢＳウイルスＲＮＡでのトランスフェクションを示す。一晩植え付けたＮＩＨ／３Ｔ３、Ｎｅｕｒｏ−２Ａ、およびＴＣＭＫ細胞を、１０００ＣＣＩＤ５０のＥＶ７１：ＢＳウイルス（図１０Ａ、１０Ｃ、および１０Ｅ）に感染させるか、または等量のウイルスＲＮＡでトランスフェクションし（図１０Ｂ、１０Ｄ、および１０Ｆ）、そしてウイルス抗原検出のため、４８ｈｐｉに採取した。上清中のウイルスを、７ｄｐｉに採取し、そして新鮮なＶｅｒｏ（図１０Ｇ、１０Ｉ、および１０Ｋ）およびＮＩＨ／３Ｔ３細胞（図１０Ｈ、１０Ｊ、および１０Ｌ）上で継代した。細胞を４８ｈｐｉに採取し、そしてウイルス抗原に関して染色した。
【図１１】[0028]図１１Ａ〜１１Ｄは、ＥＶ７１：ＴＬＬｍおよびＥＶ７１：ＴＬＬｍｖのゲノムにおける適合突然変異のＶＰ１およびＶＰ２における位置を示す。ＤｅｅｐＶｉｅｗ／ＳｗｉｓｓＰＤＢｖｉｅｗｅｒ  ｖ３．７およびＥＶ７１カプシドＰ１領域の３Ｄ構造（ＰＤＢ  ＩＤ  ４ＡＥＤ）を用いて、ＥＶ７１：ＴＬＬｍ（図１１Ａおよび１１Ｃ）およびＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ（図１１Ｂおよび１１Ｄ）のＶＰ１（図１１Ａおよび１１Ｂ）およびＶＰ２（図１１Ｃおよび１１Ｄ）領域で観察される適合突然変異をモデル化した。突然変異は、示すタンパク質の表面曝露ループに最も局在することが観察された。
【図１２】[0029]図１２は、ＥＶ７１：ＢＳウイルスＲＮＡでトランスフェクションされたかまたは生存ウイルスに感染したかいずれかの細胞から採取されたウイルス上清のＶｅｒｏ細胞における力価に比較したＮＩＨ／３Ｔ３細胞における力価比を示す。ウイルスＲＮＡでトランスフェクションされたかまたは生ウイルスに感染したかいずれかのＮＩＨ／３Ｔ３、Ｎｅｕｒｏ−２Ａ、Ｖｅｒｏ、およびＴＣＭＫ由来の上清を採取し、そしてＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈ法によってウイルス計数に供した。Ｖｅｒｏ細胞において決定された力価に比較した、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞において決定されたｌｏｇ（力価）の比を示す。３Ｔ３−ＴＲＡＮＳ：ＲＮＡトランスフェクションＮＩＨ／３Ｔ３細胞；３Ｔ３−ＩＮＦ：ウイルス感染ＮＩＨ／３Ｔ３細胞。アステリスクは、ｐ値＜０．０５のスチューデントのｔ検定を示す。
【図１３】[0030]図１３Ａおよび１３Ｂは、感染動物の生存分析を示す。感染動物を毎日観察し、そして体重測定した。図１３Ａ：多様な感染後の日数での死亡数を示す、感染動物のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロット。図１３Ｂ：体重変化をプロットして、動物の全身の健康状態を決定した。
【図１４】[0031]図１４Ａ〜１４Ｄは、感染動物の症状および病理を示す。感染動物の大部分は、疾患の症状を示した。図１４Ａ：後肢の麻痺（矢印）。図１４Ｂ：壊死後の膨張した肺の肉眼的解剖所見（矢印）。組織切片をまた、ヘマトキシリンおよびエオジン染色で染色した（１０ｘの図１４Ｃおよび２０ｘの図１４Ｄ）。黒い矢印は、肺胞空間に浸潤する粘液性物質を指す。
【図１５】[0032]図１５Ａ〜１５Ｅは、霊長類および齧歯類細胞両方へのウイルスゲノムＲＮＡのトランスフェクションが生存ウイルスを生じることを示す。図１５Ａ：ＥＶ７１：ＢＳ、ＥＶ７１：ＴＬＬｍ、またはＥＶ７１：ＴＬＬｍｖのいずれかから抽出されたゲノムＲＮＡを、個々に、Ｖｅｒｏ、ＮＩＨ／３Ｔ３、およびＮｅｕｒｏ−２ａ細胞にトランスフェクションした（Ｐ０）。トランスフェクション上清を採取し、そしてＶｅｒｏまたはＮＩＨ／３Ｔ３細胞上に接種して（Ｐ１）、ウイルス子孫の生存度に関して評価した。Ｐ０細胞の感染を細胞変性効果（ＣＰＥ）の観察（図１５Ｂ）およびウイルス抗原の免疫蛍光検出（図１５Ｃ）によって評価した。同様に、ＥＶ７１：ＢＳ  ＲＮＡトランスフェクション細胞由来のＰ１細胞の感染を、ＣＰＥ誘導（図１５Ｄ）および発現されたウイルス抗原の免疫蛍光検出（図１５Ｅ）によって評価した。
【図１６】[0033]図１６Ａ〜１６Ｆは、マウス細胞適合ＥＶ７１：ＴＬＬｍのカプシドコード領域が、ＥＶ７１：ＢＳでのマウス細胞の増殖性感染を駆動することを示す。図１６Ａ：ＥＶ７１：ＢＳの全ゲノムの感染性ｃＤＮＡクローンを生成し、そしてＰ１領域をＥＶ７１：ＴＬＬｍカプシド由来の配列で置換して、キメラウイルス、ＥＶ７１：ＢＳ［Ｍ−Ｐ１］を生成した。図１６Ｂ：細胞をＥＶ７１：ＢＳまたはＥＶ７１：ＢＳ［Ｍ−Ｐ１］のいずれか由来のクローン由来ウイルス（ＣＤＶ）に感染させ、そして溶解性細胞変性効果（ＣＰＥ）（図１６Ｃ）およびウイルス抗原発現（図１６Ｄ）の誘導によって、感染を評価した。上清を新鮮な細胞上に再接種し、そして感染Ｖｅｒｏから得た継代（Ｐ１およびＰ２）から（図１６Ｅ）、ならびにＮＩＨ／３Ｔ３（３Ｔ３）およびＮｅｕｒｏ−２Ａ（Ｎ２ａ）細胞の継代Ｐ１から（図１６Ｆ）、ウイルス力価を測定した。エラーバーはＳＤを示す。＊ｐ＜０．０５。
【図１７】[0034]図１７Ａ〜１７Ｇは、カプシドにおけるＶＰ１−Ｌ１６９Ｆアミノ酸置換が、ネズミ細胞内へのＥＶ７１：ＢＳ進入を可能にするために十分であることを示す。図１７Ａ：ＶＰ１におけるアミノ酸置換：Ｋ９８Ｅ、Ｅ１４５Ａ、およびＬ１６９Ｆ；ならびにＶＰ２におけるアミノ酸置換：Ｓ１４４ＴおよびＫ１４９Ｉを、全長ＥＶ７１：ＢＳゲノム内に取り込むことによって、多様な突然変異体ｃＤＮＡクローンを生成した。アミノ酸置換に対応する突然変異を括弧内に記載する。溶解性細胞変性効果（ＣＰＥ）の誘導（図１７Ｂおよび１７Ｃ）およびウイルス抗原の発現（図１７Ｄおよび１７Ｅ）を評価することによって、クローン由来ウイルス（ＣＤＶ）での多様な細胞株の感染を監視した。感染Ｖｅｒｏ細胞（図１７Ｆ）およびＮＩＨ／３Ｔ３およびＮｅｕｒｏ−２ａ細胞（図１７Ｇ）由来のウイルス力価を決定して、生存ウイルス子孫の生成を評価した。エラーバーはＳＤを示す。
【図１８】[0035]図１８Ａ〜１８Ｅは、カプシドにおける組み合わせたＶＰ１アミノ酸置換を含むＥＶ７１：ＢＳウイルスが、マウス細胞感染の改善を示すことを示す。図１８Ａ：全長ＥＶ７１：ＢＳゲノム内に、ＶＰ１およびＶＰ２において、アミノ酸置換の組み合わせを取り込むことによって、多様な突然変異体ｃＤＮＡクローンを生成した。アミノ酸置換に対応する突然変異を括弧内に記載する。細胞変性効果（図１８Ｂ）、ウイルス抗原発現（図１８Ｃ）、ならびに感染Ｖｅｒｏ（図１８Ｄ）、およびＮＩＨ／３Ｔ３（３Ｔ３）およびＮｅｕｒｏ−２ａ（Ｎ２Ａ）細胞（図１８Ｅ）から得られるウイルス収量を評価することによって、クローン由来ウイルス（ＣＤＶ）での多様な細胞株の感染を監視した。ウイルスを生じない他のクローンは示さない。エラーバーはＳＤを示す。
【図１９】[0036]図１９Ａ〜１９Ｃは、カプシドにおける組み合わせたＶＰ１−Ｋ９８Ｅ、Ｅ１４５Ａ、Ｌ１６９Ｆアミノ酸置換を含むＥＶ７１：ＢＳウイルスが、マウス神経細胞株Ｎｅｕｒｏ−２ａにおいて安定に継代可能であることを示す。クローン由来ウイルスをＮｅｕｒｏ−２ａおよびＮＩＨ／３Ｔ３細胞において２回継代した。各継代時、ウイルス抗原発現（図１９Ａ）およびＶｅｒｏ細胞において測定されるウイルス力価（図１９Ｂ）の評価によって、感染を監視した（図１９Ｂ）。エラーバーはＳＤを示す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００５；＊＊＊ｐ＜０．０００５。図１９Ｃ：代表的なＣＤＶ：ＢＳＶＰ１［Ｋ９８Ｅ／Ｅ１４５Ａ／Ｌ１６９Ｆ］のゲノム配列を決定して、アミノ酸置換Ｋ９８Ｅ（Ａ２７３４Ｇ）、Ｅ１４５Ａ（Ａ２８７６Ｃ）、およびＬ１６９Ｆ（Ｃ２９４７Ｔ）の証拠を評価した。突然変異部位をアステリスクでマークする。
【図２０】[0037]図２０Ａ〜２０Ｆは、ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖがＳＣＡＲＢ２を利用して、霊長類およびネズミ細胞両方を感染させることを示す。テフロンスライド上に固定されたＮＩＨ／３Ｔ３細胞（図２０Ａ）およびＶｅｒｏ細胞（図２０Ｂ）の、ネズミＳＣＡＲＢ２（ｍＳＣＡＲＢ２）抗血清とのプレインキュベーションは、蛍光シグナル減少によって決定されるように、ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ結合を阻害する。Ｉｍａｒｉｓ画像化ソフトウェアを用いて、膜上の蛍光強度を測定した（ｎ＝１００）。ＮＳＰ（非特異的ウサギ血清）。ＮＩＨ／３Ｔ３細胞上に接種する前に、ｍＳＣＡＲＢ２（図２０Ｃ）またはヒトＳＣＡＲＢ２（ｈＳＣＡＲＢ２）（図２０Ｄ）のいずれかのＥＶ７１：ＴＬＬｍｖを組換え可溶性タンパク質とプレインキュベーションすると、免疫蛍光アッセイによって評価されるように、ウイルス感染重症度が減少する。ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖでの感染前に、ｈＳＣＡＲＢ２（図２０Ｅ）またはｍＳＣＡＲＢ２（図２０Ｆ）のいずれかと、生細胞ＮＩＨ／３Ｔ３細胞をプレインキュベーションすると、培養上清中のウイルス力価が減少する。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００５；＊＊＊ｐ＜０．０００５。
【図２１】[0038]図２１Ａ〜２１Ｄは、ネズミＳＣＡＲＢ２ウサギ抗血清とＮｅｕｒｏ−２Ａ細胞をインキュベーションすると、ＣＤＶ突然変異体での感染の重症度が減少したことを示す。ＣＤＶ：ＢＳＶＰ１［Ｋ９８Ｅ／Ｅ１４５Ａ／Ｌ１６９Ｆ］（図２１Ａおよび２１Ｂ）またはＣＤＶ：ＢＳ［Ｍ−Ｐ１］（図２１Ｃおよび２１Ｄ）での感染の前に、ウサギｍＳＣＡＲＢ２抗血清とプレインキュベーションした細胞における感染重症度を、細胞変性効果（ＣＰＥ）の誘導（図２１Ａおよび２１Ｃ）および感染７日後のウイルス収量（図２１Ｂおよび２１Ｄ）を評価することによって監視した。エラーバーはＳＤを示す；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００５。ＣＰＥの度合い：１（０〜２５％の細胞死）、２（２５〜５０％）、３（５０〜７５％）、４（７５〜１００％）。
【図２２】[0039]図２２ａ〜２２ｃは、１週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける重症疾患の誘導によって立証されるように、３つの修飾ウイルス株のうち、ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖが最も悪性であることを示す。図２２ａ：観察期間の終了時に評価した際に、ＥＶ７１：ＢＳ（ｎ＝６）、ＥＶ７１：ＴＬＬｍ（ｎ＝５）またはＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ（ｎ＝７）のいずれかに感染させたマウス（腹腔内；Ｉ．Ｐ．）から収集した血清における中和抗体力価。図２２ｂおよび２２ｃ：Ｉ．Ｐ．経路（図２２ｂ）または筋内（Ｉ．Ｍ．）経路（図２２ｃ）のいずれかを通じて、ＥＶ７１：ＢＳ、ＥＶ７１：ＴＬＬｍ、またはＥＶ７１：ＴＬＬｍｖの１０６  ＣＣＩＤ５０（中央値細胞培養感染性用量）を接種したマウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線。等しくない変動に関するＷｅｌｃｈ補正を含むｔ検定（図２２ａ）、またはＭａｎｔｅｌ−Ｃｏｘログランク検定（図２２ｂおよび２２ｃ）を用いて統計的有意性を決定した。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００５；＊＊＊ｐ＜０．０００５。
【図２３】[0040]図２３ａ〜２３ｈは、マウスにおけるＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ感染が、ヒト疾患スペクトルに似た急性重症疾患によって特徴付けられることを示す。図２３ａおよび２３ｂ：１週齢マウスにおけるＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ感染の用量依存性致死性。図２３ａ：多様な用量のＥＶ７１：ＴＬＬｍｖをＩ．Ｐ．注射された６日齢仔のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線。図２３ｂ：中央値人道的終点（ＨＤ５０）は、３．９８ｘ１０３  ＣＣＩＤ５０のウイルス用量に等価であった。図２３ｃ：Ｉ．Ｐ．またはＩ．Ｍ．経路を通じて、ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖを接種された１週齢マウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線。図２３ｄ：１０６  ＣＣＩＤ５０のウイルス用量を接種されたマウスにおける、ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ感染によって誘導される年齢および経路依存性致死性。図２３ｅおよび２３ｆ：末期症状のマウスで観察される臨床的徴候、このうち何匹かは、後肢（灰色の矢印）および／または前肢の麻痺を示した。他のものはまた、胴体に小さい無毛の病変を示した（黒い矢印）。図２３ｇおよび２３ｈ：Ｉ．Ｐ．経路（図２３ｇ）またはＩ．Ｍ．経路（図２３ｈ）を通じてＥＶ７１：ＴＬＬｍｖを接種した１週齢マウスの疾患分類。
【図２４】[0041]図２４ａ〜２４ｅは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ感染の重症度が、宿主の年齢、ウイルス用量、および投与経路に依存することを示す。図２４ａおよび２４ｂ：８〜１０匹のマウスの群に、Ｉ．Ｐ．経路（図２４ａ）またはＩ．Ｍ．経路（図２４ｂ）によって、ウイルスの１０６  ＣＣＩＤ５０を接種し、そして異なる年齢群の動物に関して、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線を決定した。図２４ｃおよび２４ｄ：Ｉ．Ｐ．経路（図２４ｃ）またはＩ．Ｍ．経路（図２４ｄ）のいずれかを通じて接種された、多様な年齢のマウスから、観察期間終了時に収集された血清中の中和抗体力価；１週（Ｉ．Ｐ．  ｎ＝７；Ｉ．Ｍ．  ｎ＝４）、２週（ｎ＝５、ｎ＝７）、３週（ｎ＝４；ｎ＝８）、および４週（ｎ＝４；ｎ＝６）。図２４ｅ：多様な用量のＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ；ＣＣＩＤ５０  １０２（ｎ＝５）、１０３（ｎ＝４）、１０４（ｎ＝４）、１０５（ｎ＝５）、または１０６（ｎ＝７）を接種された（Ｉ．Ｐ．）マウスから収集した血清中の中和抗体力価。Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘログランク検定（図２４ａおよび２４ｂ）または不等分散に関するウェルチ補正を伴うｔ検定（図２４ｃ、２４ｄおよび２４ｅ）によって、統計的有意性を決定した。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００５；＊＊＊ｐ＜０．０００５。
【図２５】[0042]図２５ａ〜２５ｋは、クラスＩＡマウスにおけるＥＶ７１誘導性神経原性肺浮腫（ＮＰＥ）の徴候を示す。図２５ａ〜２５ｄ：偽感染マウス（図２５ａ）、あるいは疾患クラスＩＡ（図２５ｂ）、クラスＩＢ（図２５ｃ）、またはクラスＩＩ（図２５ｄ）の徴候を示すＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ感染マウスから得た肺の代表的な肉眼的病理。画像は、上面図および側面図を示す。図２５ｂに現れる肺の不完全な圧潰に注目されたい（白い矢印）。図２５ｅ：偽感染マウス（ｎ＝４）、あるいは疾患クラスＩＡ（ｎ＝８）、クラスＩＢ（ｎ＝９）、またはクラスＩＩ（ｎ＝４）の徴候を示すＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ感染マウスから採取した肺の湿重量比較（図２５ｆ〜２５ｉ：ヘマトキシリン＆エオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色した肺組織切片（５μｍ）の代表的な画像。示すのは、偽感染マウス（図２５ｆ）、あるいは疾患クラスＩＡ（図２５ｇ）、クラスＩＢ（図２５ｈ）、またはクラスＩＩ（図２５ｉ）の徴候を示すＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ感染マウスから得た肺の低倍率および高倍率画像である。肺胞空間中のピンクのタンパク質性液体の存在に注目されたい（図２５ｇ、高倍率のアステリスク）。このうちいくつかはまた、赤血球に満たされている（図２５ｇ、高倍率の灰色の矢印））。図２５ｊおよび２５ｋ：偽感染マウス（ｎ＝９）、あるいは疾患クラスＩＡ（ｎ＝８）、クラスＩＢ（ｎ＝９）、またはクラスＩＩ（ｎ＝３）の徴候を示すＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ感染マウスにおいて決定した際の、アドレナリン／エピネフリン（図２５ｊ）およびノルアドレナリン／ノルエピネフリン（図２５ｋ）の血清レベル。エラーバーはＳＥＭを示す。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定（図２５ｅ）または不等分散に関するウェルチ補正を伴うｔ検定（図２５ｊおよび２５ｋ）によって、統計的有意性を決定した。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００５。
【図２６】[0043]図２６ａおよび２６ｂは、クラスＩＡマウスの肺および心臓組織におけるウイルス複製または炎症の欠如を示す。図２６ａ：ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖに感染したマウスの多様な群に由来し、そして組織病理検査のため、ヘマトキシリン＆エオジンで染色する（Ｈ＆Ｅ）か、またはウイルス抗原位置決定のため、ＥＶ７１抗原に対するウサギ血清で標識した（ＥＶ７１  ＩＨＣ）、肺組織切片（５μｍ）の代表的な画像。図２６ｂ：Ｈ＆ＥおよびＥＶ７１  ＩＨＣのためにプロセシングされた心臓組織切片（５μｍ）の代表的な画像。
【図２７】[0044]図２７ａ〜２７ｄは、クラスＩＡおよびクラスＩＢマウス脳の異なる領域におけるＥＶ７１抗原およびウイルス誘導性病変の局在および分布を示す代表的なマップを示す。小脳皮質（ＣＴＸ）（図２７ａ、２７ｂおよび２７ｃ）；視床下部（ＨＹ）（図２７ａおよび２７ｂ）；海馬（ＨＰ）（図２７ｂおよび２７ｃ）；視床（ＴＨ）（図２７ｂ）；中脳（ＭＢ）および脳橋（Ｐ）（図２７ｃ）；ならびに小脳（ＣＢＸ）および延髄（ＭＹ）（図２７ｄ）を示す。ウイルス抗原および病変が検出される領域を検出し、そして適宜示す。より大きいドットは、より強いシグナル／病変サイズを示す。テンプレート画像は、ｂｒａｉｎｓｔａｒｓ．ｏｒｇ１からダウンロードされ、そしてクリエイティブ・コモンズ・ジャパンのもとでライセンシングされた。脳組織冠状断面マップは、インタラクティブ・マウス脳アトラス（ｈｔｔｐ：／／ｍｏｕｓｅ．ｂｒａｉｎ−ｍａｐ／ｏｒｇ／ｓｔａｔｉｃ／ａｔｌａｓ）から得られた［１１３］。
【図２８】[0045]図２８ａ〜２８ｎは、マウスにおけるＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ感染が、神経組織破壊および大規模なウイルス複製に関連することを示す。図２８ａ〜２８ｌ：ヘマトキシリンおよびエオジンで染色した（Ｈ＆Ｅ）か、またはＥＶ７１抗原に対するウサギ血清で免疫染色した（ＥＶ７１  ＩＨＣ）脳組織切片（５μｍ）の代表的画像。疾患クラスＩＡ（左パネル）またはクラスＩＢ（右パネル）の徴候を示すマウスから切片を得た。脳中の病変には、浮腫（点線の囲み）、浸潤細胞（図２８ｋの左パネルの上部左象限の対角線領域および下部右象限の対角線領域）、神経貪食（図２８ａ〜２８ｃの左パネル中）、神経変性（黒いアステリスク）、およびプルキニエ細胞の変性（灰色のアステリスク）。図２８ｍおよび２８ｎ：疾患クラスＩＡ（図２８ｍ）またはクラスＩＢ（図２８ｎ）中のマウス由来の脊髄冠状断面の代表的なマップ。ウイルス抗原および病変が検出された領域を強調する。より大きいドットサイズは、より大規模なシグナル／病変を示す。Ｖ、背側；Ｄ、腹側。
【図２９】[0046]図２９ａ〜２９ｃは、クラスＩＡマウスの後脳の他の領域におけるＥＶ７１抗原およびウイルス誘導性病変を示す。図２９ａ：組織病理学的検査のため、ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）、またはウイルス抗原位置決定のため、ＥＶ７１抗原に対するウサギ血清（ＥＶ７１  ＩＨＣ）のいずれかで染色した、歯状核の代表的な画像。囲んだ領域を挿入図で拡大して示す。図２９ｂ：クラスＩマウス由来の尾側脳幹の代表的な画像。画像は、小脳皮質（ＣＢＸ）および延髄（ＭＹ）を示す。最後野（ＡＰ：アステリスク）および孤束核（ＮＴＳ；点線の円）もまた参考のため示す。ウイルス抗原および病変が検出される領域を示す。より大きいドットは、より強いシグナル／病変サイズを示す。テンプレート画像は、ｂｒａｉｎｓｔａｒｓ．ｏｒｇ１からダウンロードされ、そしてクリエイティブ・コモンズ・ジャパンのもとでライセンシングされた。脳組織冠状断面マップは、マウス脳アトラス（ｈｔｔｐ：／／ｍｏｕｓｅ．ｂｒａｉｎ−ｍａｐ／ｏｒｇ／ｓｔａｔｉｃ／ａｔｌａｓ）から得られた［１１３］。図２９ｃ：ＡＰおよびＮＴＳにおけるＨ＆ＥおよびＥＶ７１  ＩＨＣ染色パターンを示す、クラスＩＡマウス由来の髄質の代表的画像。
【図３０】[0047]図３０ａ〜３０ｆは、偽感染マウス（健康な対照）由来の神経組織の組織学的切片を示す。組織病理学的検査のため、ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）、またはウイルス抗原位置決定のため、ＥＶ７１抗原に対するウサギ血清（ＥＶ７１  ＩＨＣ）のいずれかで染色した、正常マウス組織切片（５μｍ）の代表的な画像。脳切片は、海馬におけるＣＡ３錐体ニューロン（図３０ａ）；視床下部（図３０ｂ）および視床（図３０ｃ）における網状ニューロン；中脳水道周囲灰白質におけるニューロン（図３０ｄ）；小脳皮質におけるプルキニエ細胞層（図３０ｅ）を示す。正常プルキニエ細胞形態（図３０ｅの左パネルにおける黒いアステリスク）；および延髄における網状ニューロン（図３０ｆ）に注目されたい。
【図３１】[0048]図３１ａ〜３１ｅは、他の神経組織におけるＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ誘導性病理およびウイルス抗原分布を示す。組織病理検査のため、ヘマトキシリン＆エオジン（Ｈ＆Ｅ）、または免疫組織化学分析のため、ＥＶ７１抗原に対するウサギ血清（ＥＶ７１  ＩＨＣ）いずれかで染色した、マウス組織切片（５μｍ）の代表的画像。ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ感染または偽感染マウスから脳切片を得た。脳冠状断面は、運動皮質錐体ニューロン（図３１ａ）；脳橋灰白ニューロン（図３１ｂ）；ならびに頸部（図３１ｃ）、胸部（図３１ｄ）、および腰部柱（図３１ｅ）の脊髄冠状断面を示す。運動皮質に見られる細胞浸潤物（図３１ａの左パネルの下部右象限）および神経壊死（図３１の第二のパネルの黒いアステリスク）に注目されたい。図３１ｃ〜３１ｅの囲み領域をそれぞれの挿入図で拡大して示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
[0049]本発明は、エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）、動物モデルの開発、および候補抗ＥＶ７１化合物のスクリーニングに関する。より具体的には、本発明は、齧歯類細胞株を感染させるように適合しているエンテロウイルス７１（ＥＶ７１）株またはＶＰ１中に突然変異を含有するクローン化由来ウイルスが、免疫適格齧歯類および易感染性齧歯類において、疾患を引き起こすことが可能であるという発見に関する。これらのＥＶ７１株は、本明細書において、ときに、修飾エンテロウイルス７１と称される。
【００１９】
[0050]さらに、本発明は、ＮＩＨ／３Ｔ３マウス線維芽細胞を感染させるように適合した修飾株（例えばＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ）でＢＡＬＢ／ｃマウスを感染させることによる、ＥＶ７１誘導性神経学的疾患の臨床的真性モデルの開発に関する。このアプローチを用い、修飾ＥＶ７１を用いて、マウスにおいて、偽感染肺に比較して、肺腫脹および臓器重量増加によって特徴付けられる、神経原性肺浮腫に関連する急性脳脊髄炎を誘導する。肺または心臓組織炎症が存在しないにもかかわらず、肺胞中の限局的出血およびタンパク質性液体、カテコールアミンの高血清レベル、および脳幹、特に延髄における徹底的な組織損傷が観察された。これらのデータは、該モデルが、ヒトＥＶ７１誘導性神経原性肺浮腫の徴候および症状を正確に再現することを立証する。
【００２０】
[0051]したがって、１つの側面において、本発明は、本明細書において、修飾エンテロウイルス７１とときに称される、齧歯類に感染可能なエンテロウイルス７１に感染した齧歯類を含む、動物モデルに関する。１つの態様において、こうした修飾エンテロウイルス７１は、齧歯類細胞株適合性エンテロウイルス７１である。別の態様において、こうした修飾エンテロウイルス７１は、ＶＰ１中に突然変異を含有するクローン由来ウイルス（ＣＤＶ）である。いくつかの態様において、ＶＰ１中の突然変異は、齧歯類ＳＣＡＲＢ２タンパク質を用いてＣＤＶが齧歯類細胞を感染させることを可能にする。１つの態様において、齧歯類は免疫適格性齧歯類である。別の態様において、齧歯類は易感染性齧歯類である。モデルとして使用するために適切な動物は、好ましくは哺乳動物、最も好ましくは好適な実験動物、例えばウサギ、ラット、マウス等である。１つの態様において、動物はマウスである。別の態様において、齧歯類細胞株はマウス細胞株である。さらなる態様において、マウス細胞株はマウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞株である。別の態様において、マウス細胞株はマウスＮｅｕｒｏ−２ａ細胞株である。１つの態様において、齧歯類細胞株適合エンテロウイルス７１は、ＥＶ７１：ＴＬＬｍである。別の態様において、齧歯類細胞株適合エンテロウイルス７１は、ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖである。１つの態様において、ＶＰ１中に突然変異を含有するクローン由来ウイルスは、ＣＤＶ：ＢＳＶＰ１［Ｋ９８Ｅ／Ｅ１４５Ａ／Ｌ１６９Ｆ］である。動物モデルは、ウイルスの全身伝播および動物モデルにおけるヒト疾患スペクトルを研究するために有用である。動物モデルはまた、抗ウイルス薬剤およびワクチンをスクリーニングするために有用である。
【００２１】
[0052]動物モデルを必要に応じて準備する。齧歯類細胞株適合ＥＶ７１株の大きな標準化ストックを調製し、力価決定し、そしてディープフリーザー（マイナス８０℃）中に維持する。「標準化」（統計計算に基づく）されたいくつかの齧歯類、例えばＢＡＬＢ／ｃマウスまたはＮＳＧマウスを、標準化された力価のウイルス株に感染させて、動物モデルを産生する。本発明の動物モデルは、感染に際して（ヒトにおいて発展しうるものと類似の）神経学的症状を発展させる。本明細書に示すように、修飾エンテロウイルス７１、例えば齧歯類細胞株適合ＥＶ７１ウイルス株は、脳、およびマウスにおいて現れる多様な神経学的疾患に影響を及ぼす。
【００２２】
[0053]いくつかの態様において、齧歯類細胞株適合エンテロウイルス７１は、ＥＶ７１：ＴＬＬｍである。ＥＶ７１：ＴＬＬｍは、最小限６０周期に関して、ＮＩＨ／３Ｔ３マウス細胞株において、ヒトＥＶ７１  ＢＳ株を連続継代した後に得られた。１つの態様において、ＥＶ７１：ＴＬＬｍは、武漢大学、武漢４３００７２、中華人民共和国に位置するタイプカルチャーコレクション中国センターに、ブダペスト条約の条件に基づいて、２０１５年１月１２日に寄託され、そして寄託番号ＣＣＴＣＣ  Ｖ２０１４３７を割り当てられた。別の態様において、ウイルスＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＫＦ５１４８７９；配列番号１）を用いて、ウイルスＲＮＡを合成した場合、ＥＶ７１：ＴＬＬｍは、高度逆遺伝学を用いて回収可能である。高度逆遺伝学の技術は、当該技術分野に周知である［８４〜８７］。
【００２３】
[0054]別の態様において、齧歯類細胞株適合エンテロウイルス７１は、ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖである。ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖは、さらに４０周期、ＮＩＨ／３Ｔ３マウス細胞株において、ＥＶ７１：ＴＬＬｍをさらに継代することから得られた。１つの態様において、ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖは、武漢大学、武漢４３００７２、中華人民共和国に位置するタイプカルチャーコレクション中国センターに、ブダペスト条約の条件に基づいて、２０１５年１月１２日に寄託され、そして寄託番号ＣＣＴＣＣ  Ｖ２０１４３８を割り当てられた。別の態様において、ウイルスＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＫＦ５１４８８０；配列番号２）を用いて、ウイルスＲＮＡを合成した場合、ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖは、高度逆遺伝学を用いて回収可能である。高度逆遺伝学の技術は、当該技術分野に周知である。
【００２４】
[0055]さらなる態様において、修飾エンテロウイルス７１は、修飾エンテロウイルス７１が齧歯類細胞を感染させるために齧歯類ＳＣＡＲＢ２タンパク質を使用することを可能にする、カプシドタンパク質ＶＰ１中に突然変異を有する、クローン由来ウイルス（ＣＤＶ）である。ＶＰ１中に突然変異を有する修飾エンテロウイルス７１は、当業者に知られる技術を用いて、または本明細書に記載するように、全長ゲノムｃＤＮＡクローンを調製することによって作製される。ＶＰ１またはエンテロウイルス７１の他のタンパク質における突然変異は、部位特異的突然変異誘発またはＣＲＩＳＰＲ技術を用いて作製される（例えば、ＰＣＴ公報第ＷＯ２０１４／１２７２８７号を参照されたい）。生ウイルス（クローン由来ウイルス（ＣＤＶ））は、当業者に知られる技術を用いて、または本明細書に記載するように、ｃＤＮＡクローンから調製される。異なる突然変異または突然変異のコレクションを有するＣＤＶを、次いで、齧歯類細胞を感染させる能力に関して試験する。あるいは、異なる突然変異または突然変異のコレクションを有するＣＤＶを、次いで、最初のスクリーニングとして、齧歯類ＳＣＡＲＢ２タンパク質に結合する能力に関して試験する。任意の適切なエンテロウイルス７１株を用いて、ＶＰ１に突然変異を有するＣＤＶを開発することも可能である。突然変異の数および特定の突然変異は、ターゲット齧歯類細胞において、本格的な感染を生じるために十分なＣＤＶを産生するため、各株に関して多様でありうる。したがって、いくつかの、多くのまたはすべての齧歯類、例えばマウス細胞株を感染させうる、多数の齧歯類病原性ＥＶ７１株を産生可能である。１つの態様において、ＶＰ１中に突然変異を有するＣＤＶを産生するために用いるＥＶ７１株は、エンテロウイルス７１  ＢＳ株である。１つの態様において、修飾エンテロウイルス７１は、ＣＤＶ：ＢＳＶＰ１［Ｋ９８Ｅ／Ｅ１４５Ａ／Ｌ１６９Ｆ］である。
【００２５】
[0056]別の側面において、本発明は、ヒトにおいて観察される、Ｅ７１誘導性神経学的感染、疾患および病理の全スペクトルを含む動物モデルを準備するための方法を提供する。いくつかの態様において、該方法は、本明細書記載の齧歯類を、本明細書記載の修飾エンテロウイルス７１に感染させ、そして最長約４週間、感染齧歯類を飼育する工程を含む。１つの態様において、修飾エンテロウイルス７１はＥＶ７１：ＴＬＬｍｖである。別の態様において、修飾エンテロウイルス７１はＥＶ７１：ＴＬＬｍである。さらなる態様において、修飾エンテロウイルス７１は、ＣＤＶ：ＢＳＶＰ１［Ｋ９８Ｅ／Ｅ１４５Ａ／Ｌ１６９Ｆ］である。いくつかの態様において、感染させようとする齧歯類の年齢は、約１週〜約４週の間である。他の態様において、感染させようとする齧歯類の年齢は、約１週〜約３週の間である。他の態様において、感染させようとする齧歯類の年齢は、約１週〜約２週の間である。１つの態様において、感染させようとする齧歯類の年齢は、約１週である。別の態様において、感染させようとする齧歯類の年齢は、約２週である。さらなる態様において、感染させようとする齧歯類の年齢は、約３週である。いくつかの態様において、感染齧歯類を約１週〜約４週飼育する。他の態様において、感染齧歯類を約１週〜約３週飼育する。他の態様において、感染齧歯類を約１週〜約２週飼育する。１つの態様において、感染齧歯類を約１週間飼育する。別の態様において、感染齧歯類を約２週間飼育する。さらなる態様において、感染齧歯類を約３週間飼育する。さらなる態様において、感染齧歯類を約４週間飼育する。いくつかの態様において、齧歯類は免疫適格性齧歯類である。いくつかの態様において、齧歯類は、本明細書に記載するようなマウスである。１つの態様において、免疫適格性マウスはＢａｌｂ／ｃマウスである。いくつかの態様において、齧歯類は易感染性齧歯類である。いくつかの態様において、齧歯類は、本明細書に記載するようなマウスである。１つの態様において、易感染性マウスはＮＳＧマウスである。他の態様において、齧歯類は、修飾エンテロウイルス７１を齧歯類に接種することによって感染する。１つの態様において、接種は腹腔内（Ｉ．Ｐ．）である。別の態様において、接種は筋内（Ｉ．Ｍ．）である。いくつかの態様において、齧歯類に接種するウイルス用量は、約１０３〜約１０７の間の中央値細胞培養感染用量（ＣＣＩＤ５０）である。他の態様において、齧歯類に接種するウイルス用量は、約１０３〜約１０６の間のＣＣＩＤ５０である。１つの態様において、齧歯類に接種するウイルス用量は、約４ｘ１０３〜約１０６の間のＣＣＩＤ５０である。別の態様において、齧歯類に接種するウイルス用量は、約１０４〜約１０６の間のＣＣＩＤ５０である。さらなる態様において、齧歯類に接種するウイルス用量は、約１０５〜約１０６の間のＣＣＩＤ５０である。１つの態様において、齧歯類に接種するウイルス用量は、約１０６のＣＣＩＤ５０である。
【００２６】
[0057]この方式で準備される動物モデルは、表面的妥当性を示し、すなわちこれらの動物は、ＮＰＥを含む、ヒト患者においてＥＶ７１感染によって誘導される神経学的疾患の全スペクトルに渡って観察可能な臨床的徴候の全範囲を示す、ＥＶ７１神経感染の真性マウスモデルである。この動物モデルはまた、疾患の肉眼的および組織病理学的特徴に関して、構成概念妥当性も示し、こうした特徴は、致死性ヒト症例で報告されるものによく似ている。この新規ｉｎ  ｖｉｖｏモデルは、ＥＶ７１神経病態形成における重要な事象を同定し、ＥＶ７１誘導性ＮＰＥの機構を解剖し、新規治療様式および潜在的な抗ウイルス療法を開発し、そして新規ワクチンの前臨床評価を行うための強力なツールに相当する。
【００２７】
[0058]さらなる側面において、本発明は、抗ウイルス薬剤をスクリーニングする方法を提供する。この側面にしたがって、方法は、以下の工程を含む：動物の試験群および動物の対照群を提供し、ここで各群の動物は、本明細書記載の動物モデルの動物である；試験群に抗ウイルス薬剤候補を投与し；試験群および対照群において、疾患進行を監視し；試験群における疾患進行を対照群における疾患進行に比較し；そして対照群に比較して試験群において疾患進行を減少させる抗ウイルス薬剤候補を選択する工程。１つの態様において、抗ウイルス薬剤は、動物におけるスクリーニングの前に、まず、齧歯類細胞株適合エンテロウイルス７１に感染した試験齧歯類細胞株においてスクリーニングされる。別の態様において、抗ウイルス薬剤は、動物におけるスクリーニングの前に、まず、ＶＰ１中に突然変異を含有するクローン由来ウイルス（ＣＤＶ）に感染した試験齧歯類細胞株においてスクリーニングされる。
【００２８】
[0059]さらなる側面において、本発明は、有効な抗ウイルスワクチンをスクリーニングする方法を提供する。この側面にしたがって、方法は、以下の工程を含む：動物の試験群および動物の対照群を提供し、ここで各群の動物は、本明細書記載の動物モデルの動物である；試験群に抗ウイルスワクチン候補を投与し；試験群および対照群において、疾患進行を監視し；試験群における疾患進行を対照群における疾患進行に比較し；そして対照群に比較して試験群において疾患進行を減少させる抗ウイルスワクチン候補を選択する工程。１つの態様において、抗ウイルスワクチン候補は、動物におけるスクリーニングの前に、まず、齧歯類細胞株適合エンテロウイルス７１に感染した試験齧歯類細胞株においてスクリーニングされる。別の態様において、抗ウイルスワクチン候補は、動物におけるスクリーニングの前に、まず、ＶＰ１中に突然変異を含有するクローン由来ウイルス（ＣＤＶ）に感染した試験齧歯類細胞株においてスクリーニングされる。
【００２９】
[0060]本発明の方法にしたがって、齧歯類細胞株適合ＥＶ７１株の大きな標準化ストックを調製し、力価決定し、そしてディープフリーザー（マイナス８０℃）中に維持する。あるいは、ＶＰ１株中に突然変異を含有するクローン由来ウイルス（ＣＤＶ）の大きな標準化ストックを調製し、力価決定し、そしてディープフリーザー（マイナス８０℃）中に維持する。「標準化」（統計計算に基づく）されたいくつかの動物、例えばＢａｌｂ／ｃマウスまたはＮＳＧマウスを、標準化された力価のウイルス株に感染させる。候補抗ウイルス薬剤または抗ウイルスワクチンを、感染齧歯類に、疾病の出現前に（予防的効果のアッセイのため）または疾患開始時（薬剤の療法効果のアッセイのため）、多様な標準化投薬量で投与する。１つの態様において、実施例に記載するものを含めて、本明細書に記載するものなどの、齧歯類細胞株適合ＥＶ７１ウイルス株による細胞溶解性感染に感受性である組織培養細胞株を用いて、抗ＥＶ７１化合物のハイスループットｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングを行う。別の態様において、実施例を含めて、本明細書に記載するものなどの、ＶＰ１株中に突然変異を含有するクローン由来ウイルス（ＣＤＶ）による細胞溶解性感染に感受性である組織培養細胞株を用いて、抗ＥＶ７１化合物のハイスループットｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングを行う。当該技術分野に周知の技術を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングを行う。ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングから選択した有望な化合物を、次いで、本明細書記載の動物モデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏでスクリーニングする。
【００３０】
[0061]実施例２〜８に示すように、ヒトＥＶ７１単離体（ＥＶ７１：ＢＳ）の連続継代は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養齧歯類細胞株を感染させる能力を得たウイルス株を生成した。ＮＩＨ／スイスマウス胚から得られたマウス接着性線維芽細胞株ＮＩＨ／３Ｔ３［４６］を用いて、ヒトＥＶ７１株を齧歯類細胞に感染するように適合させた。２つのこうしたＮＩＨ／３Ｔ３適合株は、ＥＶ７１：ＴＬＬｍおよびＥＶ７１：ＴＬＬｍｖと記載され、ここで、ＥＶ７１：ＴＬＬｍは、適合プロセスの初期段階（継代数６０）に相当し、そしてＥＶ７１：ＴＬＬｍｖは、後期（継代数１００）に相当する。ウイルス誘導性ＣＰＥの外見、高力価値の測定、および免疫染色を通じたウイルス抗原の陽性検出に基づいて、本発明者らは、細胞におけるウイルス誘導性感染を、増殖性または非増殖性のいずれかに分類した。増殖性感染は、ＣＰＥの観察に関わらず、陽性ウイルス抗原検出、ならびに高ウイルス力価を示す。一方、非増殖性感染は、ウイルス抗原検出および／またはＣＰＥの観察にも関わらず、カットオフアッセイ限界での測定不能なウイルス力価によって特徴付けられる。
【００３１】
[0062]臨床単離体ＥＶ７１：ＢＳは、霊長類細胞株のみに感染するが、ＥＶ７１：ＴＬＬｍは、霊長類および齧歯類細胞株の両方に増殖性に感染する。ＥＶ７１：ＴＬＬｍウイルスは、齧歯類細胞を感染させる能力を成功裡に達成したが、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞への適合度合いはより顕著でないことに注目することが重要である。Ｖｅｒｏ細胞を用いて決定したウイルス力価は、相対複製率（ＲＲＲ）アッセイ（図５Ｃおよび５Ｄ）における負の値によって示されるように、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞において決定されたものよりもはるかにより高い。さらに、ＥＶ７１：ＴＬＬｍは、Ｖｅｒｏ細胞を成功裡に感染させ、多様なインキュベーション温度で完全ＣＰＥを導く一方、感染ＮＩＨ／３Ｔ３においては、３７℃でのみ完全ＣＰＥを達成可能である（表１）。ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖウイルスを生じる、マウス細胞におけるさらなる適合は、マウス細胞により高い度合いの適合を示す（図５Ｂ）が、これと引き替えに、許容性宿主細胞スペクトルが狭まったウイルス株を生じた。ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖは、マウス細胞ほど効率的には霊長類細胞株を感染させないが、感染成功を示し、より広い範囲の温度でインキュベーションしたＮＩＨ／３Ｔ３細胞の完全ＣＰＥを導く（表１）。しかし、先祖ＥＶ７１：ＴＬＬｍに比較して、ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖは、サル腎臓ＣＯＳ−７細胞、ならびにヒトＨｅＬａおよびＨｅｐ−２細胞に進入し、そしてこれらの細胞の中で複製する能力を失っているようであった（図３Ｂ〜３Ｃ；図２Ｂ〜２Ｃ、２Ｅ〜２Ｆ、および２Ｈ〜２Ｉ）。ハムスターＣＨＯ−Ｋ１およびラットＮＲＫ細胞内で効率的に複製する能力もまた喪失していた（図３Ｂ〜３Ｄ；図２Ｋ〜２Ｌおよび２Ｎ〜２Ｏ）。これらの観察は、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞においてウイルスをさらに継代すると、他の起源の細胞株における感染能を喪失するのと引き替えに、マウス細胞における適合の度合いが増加することを示す。
【００３２】
[0063]どのアミノ酸置換がマウスＮＩＨ／３Ｔ３宿主細胞に適合性であるかを指摘することは不可能であるが、ウイルス全ゲノム配列決定は、潜在的な適合機構に光を当てる可能性もある。同定されるアミノ酸置換の大部分は、Ｐ１（カプシド）およびＲＮＡポリメラーゼ（３Ｄ領域）タンパク質中にあり（表２、３）、宿主細胞進入および複製におけるありうる改変されたウイルスタンパク質活性を示唆する。ＥＶ７１：ＴＬＬｍおよびＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ株が新規宿主細胞を感染させる能力の獲得から、Ｐ１領域中の突然変異の集積が予期される。ウイルスが、ウイルス受容体を通じて、許容性宿主細胞と相互作用を開始する構造的背景を、カプシドタンパク質が形成し、このウイルス受容体は、近年、スカベンジャー受容体クラスＢメンバー２（ＳＣＡＲＢ２）と同定されており［４７］、そして後に、ＥＶ７１の主要ウイルス脱外被受容体と特徴付けられ［４８］、そしてこれはまた、ヒトエンテロウイルスＡ（ＨＥＶ−Ａ）種のいくつかのメンバーによっても利用されている。ヒトＳＣＲＢ２タンパク質は、他の霊長類のものとおよそ９９％の配列同一性を共有する。一方、マウスＳＣＡＲＢ２タンパク質は、霊長類タンパク質に比較して、１５％の配列非類似性を示し［４９］、霊長類ＳＣＡＲＢ２からの有意な構造逸脱を示し、そしておそらくこれが天然ＥＶ７１感染に対する齧歯類細胞の不応性に寄与している。ウイルス・カプシドにおける適合性突然変異が、ウイルスがマウス細胞受容体への結合に適格であるようにし、そして進入および新規宿主感染の成功を生じる。
【００３３】
[0064]カプシドタンパク質突然変異のマッピングは、ウイルスＰ１領域における同定されるアミノ酸置換の大部分が、タンパク質の曝露された領域（図１１Ａ〜１１Ｄ）、特にＶＰ１表面上のＢ−Ｃ、Ｄ−Ｅ、Ｅ−Ｆ、およびＧ−Ｈループにあることを示す。ＶＰ１残基１５０〜１８０は、ＳＣＡＲＢ２タンパク質と結合するウイルス・カプシド・キャニオンを宿する。Ｇｌｎ−１７２を中心とするこの領域は、アミノ酸１６３〜１７７に主要ＶＰ１中和エピトープを含有する［３２］。ＥＶ７１：ＴＬＬｍおよびＥＶ７１：ＴＬＬｍｖはどちらも、ＶＰ１キャニオンのＥ−Ｆループ中に置換Ｅ１６７ＤおよびＬ１６９Ｆを示し（図１１Ａ〜１１Ｂ）、この遺伝子座は、以前報告されていないものである。ＳＣＡＲＢ２ドッキング部位近傍の他の重要なアミノ酸置換には、Ｂ−Ｃループ中のＮ１０４Ｄ、およびＧ−Ｈループ中のＳ２４１Ｌが含まれ、これらは、Ｇｌｎ−１７２から２０Å半径内に位置する。ＶＰ１  Ｓ２４１Ｌ突然変異は、Ｋ２４４Ｅと関連して、ＣＨＯ細胞株適合性ＥＶ７１のマウス継代から生じたことが、以前、報告されてきている［５０］。この突然変異は、ＶＰ２  Ｋ１４９Ｉと組み合わせて、５日齢マウス仔における非病原性表現型と関連することが見出された。しかし、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス脳組織における適合から、ＬｅｕからＳｅｒへのＶＰ１  ２４１の逆突然変異が生じると報告されており［５１］、そして該突然変異はマウス病原性表現型と関連することが見出された。ＳＣＡＲＢ２ドッキング部位とは離れ、そしてＤ−Ｅループ中に位置するＶＰ１  Ｅ１４５Ａ突然変異が、ネズミ細胞を感染させる能力を与える別の候補である。ＶＰ１  １４５突然変異は、以前報告されており［３４、３７］、そして単一Ｅ１４５Ａ突然変異は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて病原性を導く［５１］。Ｃ４遺伝子型ＥＶ７１のＶＰ１中の別の突然変異、Ｑ１４５Ｅは、５日齢マウスにおける病原性と関連する［５２］。ＶＰ２におけるマウス細胞適合性突然変異、特に残基１３６〜１５０の中和エピトープ内のもの［５３］もまた、齧歯類細胞を感染させるウイルスの能力に寄与しうる。ＶＰ２  Ｅ−Ｆループにおける２つの置換がＥＶ７１：ＴＬＬｍで観察され（図１１Ｃ）、一方、ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖでは３つの置換が存在した（図１１Ｄ）。これらの突然変異はいずれも以前記載されていないが、Ｅ−Ｆループ中のＶＰ２  １４９の近傍遺伝子座は文献に言及されており［３４、５０、５４］、そしてＰＳＧＬ−１過剰発現細胞における継代の適合性突然変異と記載されている［５５］。
【００３４】
[0065]宿主細胞進入のためにウイルス受容体に結合する際のＰ１領域突然変異のありうる役割を調べるため、ＥＶ７１：ＢＳウイルスＲＮＡをネズミ細胞にトランスフェクションした。ＥＶ７１：ＢＳ  ＲＮＡのマウス細胞質内への直接導入は、Ｖｅｒｏ細胞においてアッセイした際、ウイルス誘導性ＣＰＥおよび培養上清中の測定可能なウイルス力価の観察によって示唆されるように、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞において、増殖性感染を生じる（図１２）。しかし、新鮮なＮＩＨ／３Ｔ３細胞上にウイルス上清を再接種しても、増殖性感染を誘導するのには失敗し（図６Ａ）、そしてウイルス抗原は検出されなかった（図Ｓ４Ｈ）。同様に、Ｎｅｕｒｏ−２Ａ細胞内へのＥＶ７１：ＢＳ  ＲＮＡのトランスフェクションは、Ｎｅｕｒｏ−２Ａ細胞における陽性抗原染色（図１０Ｃおよび１０Ｄ）および測定可能なウイルス力価（図１２）を生じるが、直接ウイルス感染はこれらを生じなかった。新鮮なＶｅｒｏおよびＮＩＨ／３Ｔ３細胞上で継代したウイルス上清は、Ｖｅｒｏにおいて、陽性抗原染色を生じた（図１０Ｉ）が、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞においては生じなかった（図１０Ｊ）。これらのデータは、宿主細胞への進入のための受容体結合の必要性を回避することで、ＮＩＨ３Ｔ３およびＮｅｕｒｏ−２Ａ細胞における感染成功およびウイルス子孫産生が導かれたことを示す。これらのデータはまた、ヒトＥＶ７１：ＢＳがネズミ細胞受容体を通じては、マウスＮＩＨ／３Ｔ３およびＮｅｕｒｏ−２Ａ細胞に成功裡に進入できないことを裏付ける。さらに、これらのデータは、ＥＶ７１：ＴＬＬｍおよびＥＶ７１：ＴＬＬｍｖゲノムのＰ１領域内の突然変異が、ウイルスに、効率的な受容体結合のための能力を与え、そしてその結果、宿主細胞進入を可能にすることを示唆する。
【００３５】
[0066]いくつかのアミノ酸突然変異はまた、Ｐ２およびＰ３領域でも観察され、これらは、ウイルス複製、および宿主細胞タンパク質翻訳機構のハイジャックのために決定的である［５６］。これらの適合突然変異は、マウス細胞内のＥＶ７１ゲノム複製および翻訳を最適化する際に機能しうる。ウイルス３Ｄタンパク質は単独で、ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ中で８つのアミノ酸置換、およびＥＶ７１：ＴＬＬｍ中で４つの置換を集積させ、そしてどちらの株も３Ｂに各１つの突然変異、および３Ｃに各２つの突然変異を示した。ＴＣＭＫ細胞へのウイルスＲＮＡの直接接種は、ウイルスの非構造タンパク質における適合突然変異のありうる役割に関する洞察を与える。ＴＣＭＫ細胞は、ＥＶ７１：ＴＬＬｍおよびＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ感染に対して許容性であることが示されてきている（図３Ｂおよび３Ｄ；図４Ｑおよび４Ｒ）が、ＴＣＭＫ細胞内へのＥＶ７１：ＢＳウイルスＲＮＡのトランスフェクションは、感染成功を生じなかった。ウイルス抗原シグナルは、感染およびトランスフェクション細胞においては検出されず（図１０Ｅ〜１０Ｆ）、そして新鮮なＮＩＨ／３Ｔ３およびＶｅｒｏ細胞上でのウイルス上清の継代は、陽性ウイルス抗原検出を生じなかった（図１０Ｋおよび１０Ｌ）。さらに、感染およびトランスフェクション細胞の両方において、アッセイ可能なウイルス力価はなかった（図１２）。これらのデータは、カプシド領域中の突然変異とは別に、ＥＶ７１：ＴＬＬｍおよびＥＶ７１：ＴＬＬｍｖで見られるＰ２およびＰ３領域内の突然変異が、ＴＣＭＫ細胞を成功裡に感染させるために必要であることを示唆する。
【００３６】
[0067]これは、マウス細胞株において連続的に継代した後、いくつかの齧歯類細胞株を増殖性に感染させる能力を成功裡に獲得した、元来、ヒト臨床試料に由来する、ＥＶ７１株の最初の報告であると考えられる。ＲＮＡ複製中の比較的高い突然変異率は、将来の適合可能性のための表現型特質の遺伝的リザーバーとして働く変異体ゲノムを生じ、そして擬似種分布としてのその結果の複製［５７、５８］は、ＲＮＡウイルスゲノムの動的な可塑性を導き、変化する環境への適合可能性を与える［５９、６０］。ＥＶ７１感染哺乳マウス［３４、３７、３８、５１］および他の齧歯類（例えばスナネズミ）［３９］が以前報告されてきているが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養齧歯類細胞を増殖性感染させると報告されたものはなかった。これは、表現型および宿主範囲における大きな変化と関連する高い遺伝的障壁のためでありうる［５８］。興味深いことに、これは、ＥＶ７１のコンセンサス全ゲノム配列内の多数の適合突然変異の最初の報告である。以前文書化されたマウス適合ＥＶ７１は、ゲノム中の１０未満のアミノ酸置換を報告した［３４、３８、５１］が、本発明者らは、ＥＶ７１：ＴＬＬｍ中に２１、およびＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ中に３６を報告し、これはなお以前同定された適合突然変異の最大数よりも多かった［３７］。これらは、マウス組織におけるウイルスの数回の継代［３４、３６、３７］が、遺伝的障壁を破り、そして培養マウス細胞を感染させるようにウイルスを成功裡に適合させるためには十分でない可能性があることを示唆する。その代わり、本研究で観察されるように、数百回の連続継代が必要である可能性もある。
【００３７】
[0068]ＥＶ７１の宿主細胞制限は、近年、ＥＶ７１が、宿主細胞進入［４７］およびエンドソームにおけるウイルス脱外被［７２］のための機能性受容体として、スカベンジャー受容体クラスＢメンバー２（ＳＣＡＲＢ２）を利用することが立証されて説明されてきている。ヒトおよびネズミＳＣＡＲＢ２タンパク質は、わずか８４％のアミノ酸配列同一性しか示さず［６７］、２つのタンパク質間の構造相違が示唆される。このシナリオは、ＥＶ７１臨床的単離体が、マウス由来細胞を感染させることが一般的に不可能であり、同時に、ＥＶ７１実験感染に対してマウスおよび他の齧歯類が一般的に抵抗性であることを説明し、このことによって、ＥＶ７１感染の小動物モデルを開発する試みが困難になっている。しかし、このウイルス−受容体不適合性にもかかわらず、本発明者らは、感染の最初の段階、すなわち受容体仲介細胞進入が、細胞内へのウイルスＲＮＡトランスフェクションを通じてバイパスされた際には、いくつかのネズミ細胞がＥＶ７１感染を支持することを示した。ＥＶ７１：ＢＳはＮｅｕｒｏ−２ａおよびＮＩＨ／３Ｔ３細胞を感染させない［７１］が、ウイルスゲノムＲＮＡのトランスフェクションは、ＥＶ７１タンパク質の発現、溶解性細胞変性効果（ＣＰＥ）の誘導、および生存ウイルス子孫の産生を生じる。同様に、以前、ポリオウイルスＲＮＡを哺乳動物細胞内にトランスフェクションした後に、生ウイルスが生成されている［７３〜７５］が、用いた細胞（ＨｅＬａ）は、ポリオウイルス感染に対して許容性であることが知られていた。本発明者らの実験において、非許容性マウスニューロンＮｅｕｒｏ−２ａおよび線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３細胞が、細胞質へのＥＶ７１：ＢＳ  ＲＮＡのトランスフェクションに際して、ウイルス複製を支持し、そして生ウイルス子孫を生成することが立証され、ネズミ細胞の内部環境が、ＥＶ７１感染に必要な宿主因子を含有し、そしてウイルス感染周期の完了を支持すること、そしてＥＶ７１タンパク質がネズミ細胞質ゾルにおいて機能性であることが示唆された。これらの知見はまた、ウイルスを接種した際、ＮＩＨ／３Ｔ３およびＮｅｕｒｏ−２ａ細胞性感染が見られないのは、受容体仲介性宿主細胞進入および脱外被における欠陥のためでありうることを示し、これは主に、カプシドタンパク質の機能である。これらの結果は、本発明者らの以前の観察（上記または［７１］）に類似であり、そして本発明者らをＥＶ７１：ＢＳカプシドタンパク質における特定のアミノ酸置換が、受容体への結合を可能にし、したがって、ウイルス進入および脱外被を導き、そして続いてマウス細胞を感染させうるという仮説に導く。２つのユニークなツール、マウス細胞株（ＮＩＨ／３Ｔ３）適合ＥＶ７１株（ＥＶ７１：ＴＬＬｍおよびＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ）および２つのマウス細胞株（Ｎｅｕｒｏ−２ａおよびＮＩＨ／３Ｔ３）は、この仮説を調べる機会を提供した。
【００３８】
[0069]ＥＶ７１：ＴＬＬｍカプシドタンパク質を示すが、ＥＶ７１：ＢＳ非構造タンパク質を発現しているキメラクローン由来ウイルス（ＣＤＶ：ＢＳ［Ｍ−Ｐ１］）の感染表現型は、「マウス細胞進入表現型」が、マウス細胞株適合ＥＶ７１株由来のカプシドタンパク質によって与えられうることを確認した。これらのキメラＣＤＶは、マウス細胞適合ＥＶ７１株と同様に振る舞い、そしてＶｅｒｏ、ならびにＮＩＨ／３Ｔ３およびＮｅｕｒｏ−２ａ細胞において増殖性感染を誘導し、これは、ウイルス感染周期完了、すなわち生存ウイルス子孫の生成の直接の証拠を伴った。さらに、ＥＶ７１：ＢＳ  ＶＰ１にアミノ酸置換Ｋ９８Ｅ、Ｅ１４５Ａ、およびＬ１６９Ｆを導入する突然変異誘発、ならびにＶＰ２におけるＳ１４４ＴおよびＫ１４９Ｉは、ネズミ細胞の限定された感染を導いた。ＥＶ７１：ＴＬＬｍ  Ｐ１領域置換を含むＣＤＶ（ＣＤＶ：ＢＳ［Ｍ−Ｐ１］）および組み合わせたアミノ酸置換ＶＰ１−Ｋ９８Ｅ／Ｅ１４５Ａ／Ｌ１６９Ｆを有するＣＤＶ（ＣＤＶ：ＢＳＶＰ１［Ｋ９８Ｅ／Ｅ１４５Ａ／Ｌ１６９Ｆ］）のみが、Ｎｅｕｒｏ−２ａおよびＮＩＨ／３Ｔ３細胞において成功裡に継代されて、生じる培養上清中に生存ウイルス子孫を産生可能であった。個々にまたは多様な組み合わせのいずれかで、他のアミノ酸置換を含有するＣＤＶの残りは、ＣＰＥの観察および接種された細胞におけるウイルス抗原の検出によって裏付けられるように、ネズミ細胞への限定された進入しか示さず、１周期の複製しか導かなかった。健康なマウス細胞上に再接種しても、感染誘導に失敗したため、生ウイルス子孫は、感染細胞培養上清には存在しなかった。これらのＣＤＶに感染した細胞の培養上清における生存ウイルス子孫産生の失敗を引き起こした理由は明らかではないが、１つの可能性は、突然変異後に生じるカプシドが構造的に不安定であるためであることである。本発明者らは、導入されたアミノ酸が、タンパク質を構成する他のアミノ酸と不適合であり、したがって、全体のカプシドタンパク質フォールドに影響を及ぼし、そしてカプシド構造を改変する可能性もあると推測する。この仮定は、カプシドタンパク質組み立ての複雑性を強調し、ここで、４つのウイルスタンパク質（ＶＰ１〜４）は協同で相互作用して、機能カプシドを生成する。したがって、ウイルスが新規受容体に結合することを可能にしうるアミノ酸置換はまた、壊滅的な結果を有する可能性もあり、特に、これがタンパク質中の他のアミノ酸残基との不適合性のため、カプシド複合体を不都合に不安定化する場合はそうした可能性がある。
【００３９】
[0070]実施例１０〜１７に示す結果は、３つのＶＰ１置換：Ｋ９８Ｅ、Ｅ１４５Ａ、およびＬ１６９Ｆがマウス細胞上の受容体への結合に必要であり、そして十分であり、そしてＥＶ７１進入を可能にすることを明らかにする。ＶＰ１−１６９残基は、以前、文献中で言及されていないが、ＶＰ１−９８およびＶＰ１−１４５残基は、以前、白血球上のヒトＰＳＧＬ−１受容体タンパク質に結合するためのマーカーとして示されてきている［７６］。Ｇｅｎｂａｎｋに公表されているＥＶ７１臨床単離体の１，７０２のＶＰ１配列の分析によって、突然変異体組み合わせ、ＶＰ１  ９８Ｅ／１４５Ａが、稀ではあるが生存可能であることが確認され、これらはわずか５つの単離体で見られた（データベースの０．３％）。一方、ＶＰ１−１６９Ｆ変異体は、ＥＶ７１  ＶＰ１配列のサーベイデータベース中では観察されず、極端に稀であることが示された。ＣＤＶ：ＢＳＶＰ１［Ｋ９８Ｅ／Ｅ１４５Ａ／Ｌ１６９Ｆ］は、Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞上で安定して継代され、そして導入された突然変異を３回の継代に関してウイルスゲノム内に保持しながら、生ウイルス子孫を一貫して産生し、これによって、このウイルスは、少なくともＮｅｕｒｏ−２ａ細胞において、生存可能であり、そして安定であることが示唆された。したがって、他のＥＶ７１臨床単離体へのこれらの３つの残基：ＶＰ１  ９８Ｅ、１４５Ａ、および１６９Ｆの導入が、該単離体をネズミ細胞に感染可能にする可能性があるが、これはまだ立証しなければならない。
【００４０】
[0071]ＥＶ７１が、宿主細胞進入および細胞質ゾルへの脱外被のための受容体として、スカベンジャー受容体クラスＢメンバー２（ＳＣＡＲＢ２）タンパク質を利用するという以前の知見と同様［４７、７２、７７］、本発明者らのデータはまた、マウス細胞適合性ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖが、ネズミ細胞を感染させるために、マウスＳＣＡＲＢ２（ｍＳＣＡＲＢ２）を利用することも立証する。ウイルスは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで組換え可溶性ｍＳＣＡＲＢ２に直接結合し、そして健康な細胞上への接種の前に、生ウイルスを該タンパク質とプレインキュベーションすると、細胞感染の重症度が減少した。さらに、ｍＳＣＡＲＢ２に対するポリクローナル抗体での結合によって、宿主細胞上のｍＳＣＡＲＢ２の遊離表面をブロッキングすると、固定された細胞上へのウイルス結合が減少し、そして生細胞の感染も阻害された。結果はまた、ウイルスが霊長類を感染させるために用いる、ヒトＳＣＡＲＢ２（ｈＳＣＡＲＢ２）タンパク質へのＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ結合も示す。霊長類細胞のＥＶ７１：ＴＬＬｍｖでの結合および感染もまた、ｈＳＣＡＲＢ２に対する抗体によってブロッキングされた。本明細書に提示するデータは、ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖしか示さないが、結果はまた、ＥＶ７１：ＴＬＬｍにも拡張可能である。ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖは、ＮＩＨ／３Ｔ３ｃ細胞におけるＥＶ７１：ＴＬＬｍのさらなる継代から得られ、そして２つのマウス細胞株適合ＥＶ７１株の間では、わずかなアミノ酸置換しか観察されなかった。したがって、これらは、ＥＶ７１：ＴＬＬｍおよびＥＶ７１：ＴＬＬｍｖの両方が、齧歯類細胞の感染のため、細胞性ｍＳＣＡＲＢ２を利用することを示す。
【００４１】
[0072]同様に、ＣＤＶ：ＢＳ［Ｍ−Ｐ１］およびＣＤＶ：ＢＳＶＰ１［Ｋ９８Ｅ／Ｅ１４５Ａ／Ｌ１６９Ｆ］はどちらも、ネズミ細胞を感染させるためにｍＳＣＡＲＢ２を利用する。Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞をｍＳＣＡＲＢ２抗血清とプレインキュベーションすると、対照に比較してＣＰＥ誘導が減少し、そしてウイルス力価がより低くなることによって裏付けられるように、ウイルスでの細胞感染がブロッキングされた。最近のデータは、ＥＶ７１キャニオンへのＳＣＲＡＢ２結合が、カプシド・キャニオン内の脂質であり、成熟ビリオンを安定化させ、そしてＥＶ７１中のスフィンゴシンであると予測される「ポケット因子」の放出を誘発し［７８］、ウイルス脱外被における一連の事象：カプシド拡張（１３５−ＳまたはＡ粒子を形成する）、５倍軸カプシド接合部からエンドソーム膜内へのＶＰ１  Ｎ末端およびＶＰ４の突出、および宿主細胞質内へのウイルスゲノムＲＮＡの放出を引き起こすことを示した［７８〜８１］。最近のヒトＳＣＡＲＢ２結晶構造データはまた、タンパク質全体を横切る脂質トンネルも明らかにし［６７］、このトンネルは、リソソームにβ−グルコセレブロシダーゼを送達するＳＣＡＲＢ２機能の背景においては関連性を持たないが、これに対してＤａｎｇら［７２］は、これがＳＣＡＲＢ２結合中にカプシド・キャニオンからのスフィンゴシンの除去および輸送のための導管として働くと提唱した。ＳＣＡＲＢ２アミノ酸残基１４０〜１５１は、その配列がヒトおよびネズミタンパク質の間で非常に異なり、ＥＶ７１の主な結合部位である［４９］。この同じ領域は、ＳＣＡＲＢ２脂質トンネルの開閉を制御するゲートとして作用し、この事象は、ウイルス脱外被中の酸性ｐＨによって誘発される。ＶＰ１−１６９残基は、カプシド・キャニオン内にあり、そしておそらく、ＳＣＡＲＢ２結合において直接の機能を有する。この位でのロイシンからフェニルアラニンへの劇的な変化はキャニオン構造を改変し、ネズミＳＣＡＲＢ２タンパク質とのより優れた適合を生じる。ＶＰ１  ９８および１４５残基は、一方、カプシド・キャニオンを取り巻くフリンジ上にあり、そしてＳＣＡＲＢ２結合とは別の機能を有する可能性もある。これらは単に仮説であり、そして３つのＶＰ１アミノ酸置換が「マウス細胞進入表現型」を与えうる正確な機構を解明するためには、ネズミＳＣＡＲＢ２タンパク質の構造を解析して、そしてウイルス・カプシドとの相互作用をマッピングする必要があろう。
【００４２】
[0073]これは、天然には非許容性であるネズミ細胞の増殖性感染を誘導するＥＶ７１カプシド部位特異的突然変異の最初の科学的探査であると考えられる。以前の研究は、生存動物における継代の場合のように、選択的ウイルス適合を通じて、ウイルス宿主制限を克服して、マウスにおける感染プロファイルが改善された突然変異体を生成する［３４、３７、３８、８２］か、またはヒトＳＣＡＲＢ２タンパク質の異所発現によって細胞を改変する［４７、６９、７０、８３］ことを試みてきた。ネズミＳＣＡＲＢ２に対するＥＶ７１の不適合性は、一般に、ＥＶ７１感染に対してマウスが抵抗性であることが原因であり、したがってＥＶ７１感染のマウスモデルの開発が妨げられてきた。これはおそらくまた、野生型またはマウス適合性ウイルス株のいずれかを用いるＥＶ７１感染のマウスモデルの大部分が、重症ヒト感染で観察される疾患のスペクトルを再現することに失敗する理由も説明する［３４、３７、３８］。一方で、ヒトＳＣＡＲＢ２を発現するトランスジェニックマウスは、ウイルスのマウス適合の必要性を伴わず、より広範なＥＶ７１感染の特徴を示したが、ヒト疾患の全スペクトルは、明らかには再現できなかった［６９、７０］。ＥＶ７１における特定のアミノ酸置換が、ＥＶ７１をネズミ細胞に感染可能にすることを本明細書において立証したことから、マウス細胞株適合ＥＶ７１：ＴＬＬｍおよびＥＶ７１：ＴＬＬｍｖが培養齧歯類細胞を効率的に感染させることが可能である、分子機構を理解する最初のステップが提供される。さらに、これによって、ＥＶ７１感染のマウスモデルを生成し、詳細な病態形成を研究し、そしてヒト感染で見られる神経学的疾患の全スペクトルを再現する別のアプローチが提供されうる。
【００４３】
[0074]実施例２２〜２５において、マウス細胞適合性エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）を接種された若いＢＡＬＢ／ｃマウスが、感染ヒト患者で観察される病理とよく似た神経原性肺浮腫（ＮＰＥ）と関連する急性脳脊髄炎を示すことが立証される。適合ウイルス株ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖに曝露された動物は、麻痺、運動失調および振戦として提示され、そしてＥＶ７１感染の致死性症例において同定されるＣＮＳ局在病理と一致する、脳の錐体および錐体外領域の両方における、多様なレベルのウイルス誘導性組織損傷を示した［９１〜９５］。さらに、何匹かのマウスは、自律神経機能不全と適合する呼吸困難を示した。安楽死時点での疾患提示に基づいて、動物は、容易に４つの群：クラスＩＡ、クラスＩＢ、クラスＩＩおよび生存者に分けることが可能であった。生存者は疾患の徴候を提示せず、クラスＩＩのマウスは持続性弛緩性麻痺および重度の体重喪失を示す一方、クラスＩＡおよびクラスＩＢマウスは、さらに、急性神経学的疾患を患い、これは、３〜７ＤＰＩ以内に普遍的に致死性であった。クラスＩＡマウスはまた、明らかな重症呼吸困難を示し、これはうっ血性心不全または肺炎のいずれによるものでもなかった。その代わり、クラスＩＡの動物は、尾側脳幹、特に髄質における広範な組織損傷を示し、これはカテコールアミンの高血清レベルを伴い、これらのマウスにおいて観察される呼吸徴候が、神経原性肺浮腫（ＮＰＥ）の結果であることが強く示唆された。他の群由来のものと、クラスＩＡマウス由来の肺を肉眼的病理比較すると、剖検に際して不完全な肺圧潰、ならびに肺湿重量の有意な増加が明らかになり、これらはおそらく、出血および肺胞空間への液体漏出のためであった。これらの特徴は、非ウイルス誘導性ＮＰＥおよび劇症ＮＰＥを伴う致死性ヒト症例の実験動物モデルにおいて観察されるものとよく似ていた［９６、９７］。実際、クラスＩＡ動物の組織病理学的分析は、さらに、致死性ヒト症例における観察と一致して、タンパク質性および赤血球充填浸出物で満たされた肺胞空間の限局性領域を明らかにした［２１、９８〜１００］。
【００４４】
[0075]肺浮腫（ＰＥ）は、典型的には、肺の水内容中の血管外増加として定義され、４８、そして心臓原性または神経原性起源に基づいて、細分可能である。クラスＩＡマウス心臓組織は、正常組織を示し、そして疾患の明白な徴候を欠いていたため、本発明者らは、心臓原性ＰＥを排除することが可能であり、そして肺実質において、ウイルス複製または炎症が存在しなかったため、直接ウイルス誘導性肺傷害が排除された。その代わり、本発明者らは、クラスＩＡマウスにおいて、カテコールアミンの高血清レベルを検出し、これはこの群が、以前、重度の交感神経放電によって誘導されるカテコールアミン・ストームの結果として立証されている、神経原性ＰＥ（ＮＰＥ）を示すことを強く示した［９６、１０１］。このシナリオにおいて、自律神経系機能不全はカテコールアミン・ストームを誘発し、全身性および肺血管収縮を生じる。これは、全身から肺循環への血液体積のシフトを導き、これは、結果的に、静水機構を通じた、または直接肺内皮傷害による、肺胞空間への血漿漏洩および出血を招く［１０１〜１０４］。近年、非ウイルス誘導性ＮＰＥのいくつかの実験動物モデルが開発されている（概説に関しては、Ｓｅｄｙ［１０３］およびＤａｖｉｓｏｎ［１０４］を参照されたい）が、本発明者らのモデルは、ＥＶ７１感染のみを用いて、肺浮腫の古典的徴候を成功裡に誘導する最初のものである。したがって、本発明者らの新規モデルは、ＥＶ７１感染を制限し、そしてヒト患者において劇症ＮＰＥの開始を防止することが可能な、抗ウイルス療法および治療措置を追求する際の重要な進歩に相当する。肺浮腫が、ＥＶ７１感染に反応した宿主サイトカイン・ストームによってもまた誘導可能である可能性がある［１０５〜１０７］が、データは、ＥＶ７１誘導性ＮＰＥの主な機構が大規模な炎症反応を伴わず、そしてその代わり、脳の特定の領域における組織損傷と関連することを強く示唆する。
【００４５】
[0076]ＮＰＥ誘導と関連する脳領域は、トリガーゾーンと称されてきており、これは、視床下部脳室周囲および背内側核［１０１、１０３］、ならびに腹外側および背側髄質を含み、ＮＴＳおよびＡＰ領域を含む［９６、１０４、１０８〜１１０］。ＥＶ７１誘導性ＮＰＥは、以前、脳幹組織の広範な損傷に寄与することが示されてきており［２１、２２、９３、１１１］、そして本発明者らの新規ネズミモデルにおいて、本発明者らは、脳幹および脊髄において、ウイルス抗原および広範な損傷の両方を検出した。クラスＩＡおよびクラスＩＢマウスは、脳幹および脊髄において、病変の類似の分布およびウイルス抗原を、それとともに、血清カテコールアミンの匹敵する上方制御を示す一方、クラスＩＢ動物におけるＮＰＥの欠如は、ＮＴＳ、髄質網様核（ＭｄＲＮ）、および髄質のＡＰ領域、小脳の歯状核、および視床下部前野の背内側核における、減少した数および重症度の脳病変および／またはより低いウイルス抗原強度によって説明可能である。本発明者らは、したがって、ＥＶ７１感染宿主における、脳幹組織の急性で重度の破壊、特に血管運動領域に関連するものが、カテコールアミン・ストームを導き、そして既知のトリガーゾーンが十分に損傷を受けている場合、これがＮＰＥに進行しうることを提唱する。
【００４６】
[0077]要約すると、本発明は、表面的妥当性を示し［１１２］、すなわちこれらの動物は、ＮＰＥを含む、ヒト患者におけるＥＶ７１感染によって誘導される神経学的疾患の全スペクトルに渡って観察可能な臨床的徴候の全範囲を示す、ＥＶ７１神経感染の真性マウスモデルである。疾患のクラスＩＡ徴候を提示するＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ感染マウスにおける顕著な特徴の観察は、２匹の異なるクラスＩＡマウスの２つのビデオクリップを含むビデオによって作成された。どちらの動物も、姿勢保持（ｓｅｌｆ−ｒｉｇｈｔ）不能であり、そして昏睡状態にあった。肋骨下後退を伴う頻呼吸として提示される重度呼吸困難が、最初のマウスでは明らかであった。喘ぎ、肋骨下後退、および鼻孔から出る泡状の液体が、第二のマウスで見られた。疾患のクラスＩＢ徴候を提示するＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ感染マウスにおける顕著な特徴の観察は、１匹のクラスＩＢマウスのビデオによって作成された。姿勢保持不能であり、そして昏迷状態にあった。右肢の同側性麻痺および左後肢の持続性振戦もまた観察された。このモデルはまた、疾患の肉眼的および組織病理学的特徴に関して、構成概念妥当性も示し［１１２］、こうした特徴は、致死性ヒト症例で報告されるものによく似ている。この新規ｉｎ  ｖｉｖｏモデルは、ＥＶ７１神経病態形成における重要な事象を同定し、ＥＶ７１誘導性ＮＰＥの機構を解剖し、新規治療様式および潜在的な抗ウイルス療法を開発し、そして新規ワクチンの前臨床評価を行うための強力なツールに相当する。
【００４７】
[0078]本発明の実施は、別に示さない限り、当該技術分野の技術範囲内である、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、遺伝学、免疫学、細胞生物学、細胞培養およびトランスジェニック生物学の慣用技術を使用する。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら，  １９８２，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）；  Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  １９８９，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）；  ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，  ２００１，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  第３版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）；  ＧｒｅｅｎおよびＳａｍｂｒｏｏｋ，  ２０１２，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  第４版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）；  Ａｕｓｕｂｅｌら，  １９９２，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  定期的改訂を含む）；  Ｇｌｏｖｅｒ，  １９８５，  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ）；  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  １９８４，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｐｌａｎｔｓ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｃｏｕｒｓｅ  ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）；  Ａｎａｎｄ，  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅｓ，  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク，  １９９２）；  ＧｕｔｈｒｉｅおよびＦｉｎｋ，  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク，  １９９１）；  ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，  １９８８，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）；  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．  Ｄ．  ＨａｍｅｓおよびＳ．  Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ監修  １９８４）；  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．  Ｄ．  ＨａｍｅｓおよびＳ．  Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ監修  １９８４）；  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．  Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  １９８７）；  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８６）；  Ｂ．  Ｐｅｒｂａｌ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；論文、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎ．Ｙ．）；  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｓ．  １５４および１５５（Ｗｕら監修），  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ監修，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｏｎｄｏｎ，  １９８７）；  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  第Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．  Ｍ．  ＷｅｉｒおよびＣ．  Ｃ．  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ監修，  １９８６）；  Ｒｉｏｔｔ，  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  第６版，  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  オックスフォード，  １９８８；  Ｆｉｒｅら，  ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｆｒｏｍ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｏ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ケンブリッジ，  ２００５；  Ｓｃｈｅｐｅｒｓ，  ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，  ２００５；  Ｅｎｇｅｌｋｅ，  ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）：  Ｔｈｅ  Ｎｕｔｓ  ＆  Ｂｏｌｔｓ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ＤＮＡ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００３；  Ｇｏｔｔ，  ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，  Ｅｄｉｔｉｎｇ，  ａｎｄ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，  ニュージャージー州トトワ，  ２００４；  Ｓｏｈａｉｌ，  Ｇｅｎｅ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，  ＣＲＣ，  ２００４を参照されたい。
【実施例】
【００４８】
[0079]本発明は、以下の実施例に言及することによって記載され、該実施例は、例示のために提供され、そしていかなる方式でも本発明を限定することを意図されない。当該技術分野に周知の標準的技術、または以下に特に記載する技術を利用した。
【００４９】
実施例１
実施例２〜８のための材料および方法。
[0080]細胞株およびウイルス株：本研究で用いるすべての細胞株を、アメリカン組織タイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）から購入した。多様な哺乳動物細胞株；ヒト腺癌細胞株、ＨｅＬａ（ＣＣＬ−２）およびＨＥｐ−２（ＣＣＬ−２３）、および横紋筋肉腫ＲＤ（ＣＣＬ−１３６）；アフリカミドリザル（Ａｆｒｉｃａｎ  ｇｒｅｅｎ  ｍｏｎｋｅｙ）腎臓Ｖｅｒｏ（ＣＣＬ−８１）、およびサバンナモンキー（Ｖｅｒｖｅｔ  ｍｏｎｋｅｙ）腎臓線維芽細胞ＣＯＳ−７（ＣＲＬ−１６５１）；マウス神経芽腫Ｎｅｕｒｏ２Ａ（ＣＣＬ−１３１）、胚性線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３（ＣＲＬ−１６５８）、および腎臓上皮ＴＣＭＫ（ＣＣＬ−１３９）；ハムスター卵巣上皮様ＣＨＯ−Ｋ１（ＣＣＬ−６１）、ならびに正常ラット腎臓上皮ＮＲＫ（ＣＲＬ−６５０９）を用いて研究を行った。
【００５０】
[0081]ヒトＥＶ７１  ＢＳ株（ＥＶ７１：ＢＳ）は、ＥＶ７１に感染した死亡患者の脳幹から以前単離された。該ウイルスを、さらなる使用まで−８０℃で保存する前に、４周期、Ｖｅｒｏ細胞中で継代した。マウス細胞（ＮＩＨ／３Ｔ３）適合ＥＶ７１：ＴＬＬｍ株は、マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞において、連続継代（＞６０周期）を通じて、ＥＶ７１：ＢＳ株から得られた。ＥＶ７１：ＴＬＬｍ株をＮＩＨ／３Ｔ３細胞中でさらに継代して（４０周期）、マウス細胞適合病原性株（ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ）を生成した。
【００５１】
[0082]細胞株の維持およびウイルスでの感染：１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ｉ−ＤＮＡシンガポール）および０．２２％（ｗ／ｖ）重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を補充したダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）中ですべての細胞株を増殖させ、そして別に記載しない限り、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベーションした。すべての感染細胞を、維持培地（１％ＦＢＳおよび０．２２％ＮａＨＣＯ３を補充したＤＭＥＭ）中でインキュベーションした。
【００５２】
[0083]細胞（ウェルあたり２．５〜５．０ｘ１０５細胞）を組織培養処理６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に一晩植え付け、５００μｌのウイルス懸濁物（ＭＯＩ  １）に感染させ、そして３０℃、３７℃、または３９℃で２時間インキュベーションした。細胞を無菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）溶液中で２回洗浄した後、新鮮な維持培地（ＤＭＥＭ、１％ＦＢＳ）に添加した。感染細胞を、明らかな溶解性細胞変性効果（ＣＰＥ）の出現に関して毎日観察した。
【００５３】
[0084]ウイルス増殖動力学研究のため、感染細胞を含有するプレートを、多様な時点：感染後０、６、１２、２４、３６、４８、および５４時間（ｈｐｉ）で、−８０℃で凍結した。プレートを３周期の凍結融解に供し、そして溶解物を採取し、そして徹底的なボルテックスによって透明化し、その後、１，５００ｘｇで１０分間遠心分離した。透明化された上清を、さらなる使用まで、凍結バイアル（Ｎｕｎｃ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、−８０℃で保存した。
【００５４】
[0085]温度適合アッセイのため、接種したＶｅｒｏおよびＮＩＨ／３Ｔ３細胞を３０℃、３７℃、および３９℃でインキュベーションし、そしてＣＰＥの出現に関して毎日観察した。それぞれの培養上清を４８ｈｐｉで採取し、そしてさらなる使用まで、凍結バイアル中、−８０℃で保存した。
【００５５】
[0086]多様な哺乳動物細胞株、すなわちＲＤ、ＨｅＬａ、およびＨＥｐ−２（ヒト）、ＶｅｒｏおよびＣＯＳ−７（サル）、ＮＩＨ／３Ｔ３、Ｎｅｕｒｏ−２Ａ、およびＴＣＭＫ（マウス）、ＣＨＯ−Ｋ１（ハムスター）、ならびにＮＲＫ細胞（ラット）を、親ＥＶ７１：ＢＳまたは得られたＮＩＨ／３Ｔ３適合ＥＶ７１株に、１のＭＯＩ（感染多重度）で感染させ、そして３７℃で１０日間インキュベーションした。ＣＰＥの出現に関して、培養を毎日観察した。
【００５６】
[0087]ウイルス力価および相対複製率（ＲＲＲ）の決定：ウイルス上清を、終点力価決定に供し、そしてＮＩＨ／３Ｔ３およびＶｅｒｏ細胞の両方においてアッセイした。ＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈ法［６１］ならびにＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈ計算機［６２］を用いてウイルス力価を計数した。簡潔には、ＮＩＨ／３Ｔ３（ウェルあたり１ｘ１０４細胞）およびＶｅｒｏ細胞（ウェルあたり４ｘ１０３細胞）を、９６ウェルプレート中で一晩植え付けた。室温に融解させた凍結ウイルスを、無菌１％水性デオキシコール酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）中で希釈し（１０−１）、そして１５分間激しく混合して、ウイルスを脱凝集させた。脱凝集させたウイルスを、維持培地中で１０倍連続希釈に供し、そして１０−３希釈からの１００μｌ希釈ウイルスを、細胞の各ウェル上に添加した。プレートを３７℃でインキュベーションし、そして倒立光学顕微鏡下で、明らかなＣＰＥの出現に関して毎日観察した。ウイルス力価は体積あたりの５０％細胞培養感染用量（ＣＣＩＤ５０／ｍｌ）として報告された。
【００５７】
[0088]ＮＩＨ／３Ｔ３細胞においてＥＶ７１：ＴＬＬｍおよびＥＶ７１：ＴＬＬｍｖの適合度合いを評価するため、あらかじめ感染させた霊長類および齧歯類細胞株から採取したウイルス上清を、ＮＩＨ／３Ｔ３およびＶｅｒｏ細胞の両方を用いて、ウイルス力価アッセイに供した。ＮＩＨ／３Ｔ３およびＶｅｒｏ細胞において、相対複製率（ＲＲＲ）を測定するために用いる力価比を、以下の式を用いて計算した：
ＲＲＲ＝ｌｏｇ（Ａ／Ｂ）
式中、ＡはＮＩＨ／３Ｔ３細胞においてアッセイしたウイルス力価であり、そしてＢはＶｅｒｏ細胞においてアッセイしたウイルス力価である。
【００５８】
[0089]免疫蛍光アッセイによるウイルス抗原検出：有意なＣＰＥを示さない感染細胞に関しては、免疫蛍光（ＩＦ）染色を行って、感染を検証した。細胞を７２ｈｐｉにトリプシン処理し、無菌ＰＢＳ中で２回洗浄し、そしてテフロンスライド（Ｅｒｉｅ、ＵＳＡ）上にコーティングした。スライドをバイオセイフティキャビネット中で風乾し、そして１５分間ＵＶ処理して、生ウイルスを不活性化した後、冷アセトン中、４℃で１０分間固定した。スライドを、汎エンテロウイルス抗体（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）で探査し、そして続いて、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｅｖａｎ青色対比染色剤と混合したＦＩＴＣコンジュゲート化マウスＩｇＧ（ＤＡＫＯ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、デンマーク）で染色した。
【００５９】
[0090]ＥＶ７１ウイルスＲＮＡでの細胞のトランスフェクション：２４ウェルプレートに一晩植え付けたＶｅｒｏおよびＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ウェルあたり３ｘ１０４細胞）に、製造者のプロトコルにしたがって、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）を用いて、４ｘ１０６  ＣＣＩＤ５０ウイルスから抽出したウイルスＲＮＡをトランスフェクションした。ＥＶ７１：ＢＳ、ＥＶ７１：ＴＬＬｍ、およびＥＶ７１：ＴＬＬｍｖから、ウイルスＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）を用いて、ＲＮＡを抽出し、そして細胞上、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００と３７℃で６時間インキュベーションした。トランスフェクション細胞を、ＣＰＥの出現に関して、毎日観察した。７ｄｐｉに、感染細胞から上清を採取し、そして新鮮に植え付けたＶｅｒｏおよびＮＩＨ／３Ｔ３細胞上で継代した。細胞を、ＣＰＥの出現に関して、毎日観察し、そして７ｄｐｉに、細胞をトリプシン処理し、そして免疫蛍光ウイルス抗原検出のため、プロセシングした。
【００６０】
[0091]全長ゲノム配列決定およびＥＶ７１株の遺伝子マッピング：ＥＶ７１：ＢＳ、ＥＶ７１：ＴＬＬｍ、およびＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ株のウイルスＲＮＡを、ウイルスＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）を用いて抽出し、そしてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（ＳＩＩ−ＲＴ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）を用いて逆転写した。得たｃＤＮＡをＧｏＴａｑ  Ｇｒｅｅｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）および縮重ＥＶ７１プライマー（プライマーの配列は要求に応じて入手可能である）で増幅した。ＰＣＲクリーンナップキット（Ｇｅｎｅａｉｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、台湾）を用いて、アンプリコンを精製し、そしてｐＺｅｒｏ２ベクター（Ｌｉｆｅｔｅｃｈ、ＵＳＡ）内にクローニングした。カナマイシン・プレートからクローンを選択し、ＬＢブロス（５０μｇ／ｍｌカナマイシン）に接種し、そしてＱｉａＳｐｉｎミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）でのプラスミド抽出のため、３７℃で一晩増殖させた。続いて、同じプライマーを用いて、ＢｉｇＤｙｅターミネーター法（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）によってプラスミドを配列決定した。ＢｉｏＥｄｉｔ  ｖ７．０．９．０［６３］を用いて、得た５００ｂｐ断片配列を、ＥＶ７１シンガポール単離体３７９９−ＳＩＮ−９８（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＤＱ３４１３５４．１）の全ゲノム配列に対して整列させて、ＥＶ７１：ＢＳ、ＥＶ７１：ＴＬＬｍ、およびＥＶ７１：ＴＬＬｍｖの全ゲノム配列を再構築した。Ｄｅｅｐｖｉｅｗ／Ｓｗｉｓｓ  ｐｄｖｖｉｅｗｅｒバージョン３．７（ｈｔｔｐ：／／ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｓｐｄｂｖ／）およびＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬサーバー［６４、６５］を用いて、ＥＶ７１：ＴＬＬｍおよびＥＶ７１：ＴＬＬｍｖのプロモーターの分子モデリングを行った。
【００６１】
実施例２
霊長類細胞株はＥＶ７１：ＢＳによる感染に対して許容性であるが、齧歯類細胞株は許容性でない
[0092]本研究で用いたすべての霊長類細胞株は、ＥＶ７１：ＢＳウイルスによる感染に対して許容性であった。ヒトＲＤ細胞、ならびにサルＶｅｒｏおよびＣＯＳ−７細胞は、感染後４８時間（ｈｐｉ）以内で、完全溶解性細胞変性効果（ＣＰＥ）を示し（図１Ａ、１Ｊ、および１Ｍ）、そしてウイルス抗原が固定感染細胞において検出された（図２Ａ〜２Ｌ；ＲＤ、ＣＯＳ−７およびＶｅｒｏ細胞に関してデータ未提示）。多様な感染細胞株の上清から採取したウイルスの増殖動力学曲線によって、ＲＤ、Ｖｅｒｏ、およびＣＯＳ−７細胞における増殖性感染が確認された（図３Ａ）。ＲＤおよびＶｅｒｏ細胞から採取したウイルスは、３ｘ１０９  ＣＣＩＤ５０／ｍｌの終点力価に到達し、一方、ＣＯＳ−７由来のウイルス力価は１０６  ＣＣＩＤ５０／ｍｌであった（図３Ａ）。ＥＶ７１：ＢＳは、ＨｅＬａおよびＨｅｐ−２細胞（図１Ｄおよび１Ｇ）において、完全ＣＰＥを誘導せず、そして生じたウイルス力価は、アッセイカットオフ限界内で測定不能であった。しかし、ウイルス抗原は、ＨｅＬａ細胞（図２ａ）およびＨｅｐ−２細胞（図２Ｄ）の両方で、間接的な免疫蛍光染色によって検出され、ウイルスは細胞内に進入することに成功したが、不十分であったかまたは複製不全であり、測定可能なウイルス力価を生じなかった可能性があることが示された。
【００６２】
[0093]試験した齧歯類細胞株はすべて、ＥＶ７１：ＢＳ感染に対して非許容性であると決定された。細胞の溶解性ＣＰＥは、感染後、存在せず（図４Ａ、４Ｄ、４Ｇ、４Ｊおよび４Ｍ）、上清由来のウイルス力価は測定不能であり、そしてウイルス抗原は接種した細胞中で検出不能であった（図２Ｇ、２Ｊおよび２Ｍ；図１０Ａ、１０Ｃおよび１０Ｅ）。
【００６３】
実施例３
マウス細胞（ＮＩＨ／３Ｔ３）適合ＥＶ７１：ＴＬＬｍウイルスは、霊長類および齧歯類細胞株の両方を増殖性に感染させた
[0094]ＥＶ７１：ＴＬＬｍは、最低限６０周期、ＮＩＨ／３Ｔ３マウス細胞において、ＥＶ７１：ＢＳを連続継代した後に得られた。試験した霊長類および齧歯類細胞は、ＮＲＫ細胞を例外として、すべて、ＥＶ７１：ＴＬＬｍによる増殖性感染に対して許容性であった。ＲＤ、Ｖｅｒｏ、およびＣＯＳ−７（図１Ｂ、１Ｋ、および１Ｎ）、ならびにＮＩＨ／３Ｔ３およびＮｅｕｒｏ−２Ａ細胞（図４Ｂ、Ｅ）において、４８ｈｐｉに、完全ＣＰＥが観察された。ＮＲＫを除いて感染したすべての細胞株から採取した上清において、高ウイルス力価が測定可能であり（図３Ｃおよび３Ｄ）、そして感染細胞は間接的に免疫蛍光アッセイによって、ウイルス抗原に関して陽性の試験結果であった（図２Ｂ、２Ｅ、２Ｈ、２Ｋおよび２Ｎ）。完全ＣＰＥおよび測定可能ウイルス力価は、ＮＲＫ細胞においては観察されない（図４Ｎ；図３Ｄ）が、ウイルス抗原は検出可能であり（図２Ｋ）、ＥＶ７１：ＴＬＬｍによるＮＲＫ細胞内へのウイルス進入は成功したが、非効率なウイルス複製が、測定不能なウイルス力価を生じた可能性が示された。
【００６４】
実施例４
マウス細胞（ＮＩＨ／３Ｔ３）適合ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖウイルスは、齧歯類細胞株を増殖性に感染させるが、すべての霊長類株を感染させるわけではない
[0095]ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖウイルス株は、さらに４０周期のＮＩＨ／３Ｔ３細胞におけるＥＶ７１：ＴＬＬｍのさらなる継代から得られた。ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖは、より少ない数の細胞株、ＲＤ、Ｖｅｒｏ、ＮＩＨ／３Ｔ３、Ｎｅｕｒｏ−２Ａ、およびＴＣＭＫ細胞（図３Ｂ）において、溶解性ＣＰＥを引き起こし、そして完全ＣＰＥは、ＲＤ、ＮＩＨ／３Ｔ３、およびＮｅｕｒｏ−２Ａ細胞でしか観察されなかった（図１Ｃ；４Ｃ、Ｆ）。ＴＣＭＫ、ＣＨＯ−Ｋ１およびＮＲＫ細胞はまた、感染細胞における陽性ウイルス抗原検出によって示されるように、完全ＣＰＥに進行することなく、感染に対して許容性であることが注目された（図２Ｌ、２Ｏ、および２Ｒ）。
【００６５】
[0096]一方、霊長類細胞株ＨｅＬａ、Ｈｅｐ−２、およびＣＯＳ−７は、ＣＰＥの非存在（図１Ｆ、１Ｉ、および１Ｏ）、測定不能なウイルス力価（図３Ｂ）、および陰性ウイルス抗原検出（図２Ｃ、２Ｆ、およびデータ未提示）によって示されるように、ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ感染に対して非許容性であることが観察された。
【００６６】
実施例５
ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖウイルスは、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞に対して、より高い度合いの適合を示したが、ＥＶ７１：ＴＬＬｍは、Ｖｅｒｏ細胞における複製に対してより適合した
[0097]ＶｅｒｏおよびＮＩＨ／３Ｔ３細胞の両方において、ウイルス力価を計数することによって、感染細胞から採取した上清における生存ウイルスの量を、多様な時点で決定した。Ｖｅｒｏにおいてアッセイした力価値に対するＮＩＨ／３Ｔ３においてアッセイしたウイルス力価値の比を取ることによって計算した相対増殖比（ＲＲＲ）を、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞に対するウイルス適合の度合いの代理測定値として用いた。親ＥＶ７１：ＢＳウイルスは、ＲＤ、Ｖｅｒｏ、およびＣＯＳ−７に対する高い負のＲＲＲ値を示し（図５Ａ）、Ｖｅｒｏ細胞においてアッセイされたウイルス力価が、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞においてアッセイされた力価をはるかに超えていることが示された。他の細胞株に対する相対増殖比の値は、ウイルス力価が測定不能であるため、決定不能であった。一方、ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖウイルスは、Ｖｅｒｏ細胞で増殖させたウイルスを例外として、正のＲＲＲ値を示した（図５Ｂ）。正のＲＲＲ値は、Ｖｅｒｏ細胞に比較してＮＩＨ／３Ｔ３細胞における、より効率的な複製、そしてしたがってより高い力価値の指標であった。Ｖｅｒｏ細胞から採取されたＥＶ７１：ＴＬＬｍｖに関して決定された負のＲＲＲ値は、観察される緩慢な増殖動力学（図３Ｂ）およびより低いウイルス力価と一致した。ＥＶ７１：ＴＬＬｍは、負のＲＲＲ値を示した（図５Ｃおよび５Ｄ）が、ＥＶ７１：ＢＳに関するＲＲＲ値より低い度合いであった。これは、ＥＶ７１：ＴＬＬｍがいくつかの齧歯類細胞株を増殖性に感染させうるが、なお、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞よりもＶｅｒｏにおける複製により適合していることを示唆した。
【００６７】
実施例６
ＥＶ７１：ＴＬＬｍは、ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖよりも変化する温度によりよい適合可能性を示した
[0098]親ＥＶ７１：ＢＳおよび得られたＮＩＨ／３Ｔ３適合ＥＶ７１：ＴＬＬｍおよびＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ株に感染したＶｅｒｏおよびＮＩＨ／３Ｔ３細胞を、多様な温度、３０℃、３７℃、３９℃でインキュベーションして、温度変動または変化に対するウイルス適合性を決定した。ＥＶ７１：ＢＳは、最も限定された適合可能性を示し、３７℃でインキュベーションしたＶｅｒｏ細胞においてのみ完全ＣＰＥが観察された（図８Ｂ；表１）。ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖは、３７℃のＶｅｒｏ細胞において（図Ｓ２Ｂ）、そして３７℃および３９℃両方のＮＩＨ／３Ｔ３細胞において（図８Ａ、図９Ａ；表１）観察される完全ＣＰＥ誘導に基づいて、中程度の適合可能性を示した。ＥＶ７１：ＴＬＬｍは、一方、最高の適合可能性を示し、ここですべてのインキュベーション温度に関して、Ｖｅｒｏ細胞において完全ＣＰＥを誘導した（図７Ｂ、図８Ｂ、図９Ｂ）が、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞においては、３７℃でのみであった（図８Ａ；表１）。
【００６８】
表１
多様なインキュベーション温度で、ＮＩＨ／３Ｔ３およびＶｅｒｏ細胞において増殖させたＥＶ７１：ＢＳ、ＥＶ７１：ＴＬＬｍおよびＥＶ７１：ＴＬＬｍｖのウイルス適合可能性の評価
【００６９】
【表１】
0006772155.tif 000002
【００７０】
１溶解性細胞死の徴候および完全ＣＰＥの出現時間に関して、感染細胞を毎日観察した。
２感染細胞における完全ＣＰＥの欠如を示す。
【００７１】
３完全ＣＰＥの観察を示す。
４完全ＣＰＥの欠如を示し、括弧内の数字は細胞において観察されるＣＰＥの最大の度合いを示す。
【００７２】
実施例７
ＥＶ７１：ＴＬＬｍおよびＥＶ７１：ＴＬＬｍｖのウイルスゲノムは、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞に対する適合の結果として、多数のミスセンス突然変異を集積させた
[0099]ＥＶ７１：ＢＳ、ＥＶ７１：ＴＬＬｍ、ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖのウイルスＲＮＡをサンガー配列決定に供して、コンセンサスゲノム配列を決定し、そしてＮＩＨ／３Ｔ３細胞における適合プロセスから生じるありうる適合突然変異を同定した。擬似種の優性集団を代表するゲノムのコンセンサス配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に寄託されてきている。ＥＶ７１：ＢＳ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＫＦ５１４８７８；配列番号３）に対するＥＶ７１：ＴＬＬｍ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＫＦ５１４８７９；配列番号１）の全ゲノム配列の整列は、６０のヌクレオチド突然変異を明らかにし、このうち２１は、アミノ酸置換を生じた（表２）。一方、３６のアミノ酸置換を伴う８３の突然変異が、ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＫＦ５１４８８０；配列番号２）およびＥＶ７１：ＢＳのゲノムの間で見られた。ミスセンス突然変異の大部分は、Ｐ１（カプシドタンパク質遺伝子）領域（表２）に、特にＶＰタンパク質遺伝子内に（表３）、位置した。
【００７３】
[00100]Ｐ２およびＰ３領域内、最も顕著には、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（３Ｄ領域）でもまたアミノ酸変化が観察された。ＥＶ７１：ＴＬＬｍは、４つのアミノ酸変化を獲得し、大部分は、酵素の掌および親指ドメインであった（表４）。一方、ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖは、８つのアミノ酸変化を集積し、これらはやはり大部分ポリメラーゼの掌および親指ドメインにあった。ヌクレオチド突然変異もまた、ゲノムの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）で観察された。塩基変化とは別に、ＥＶ７１：ＴＬＬｍでは１塩基挿入が見られ、一方、ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ  ５’ＵＴＲでは、４ｂｐ挿入および２０ｂｐ欠失が観察された（表２および３）。一方、ＥＶ７１：ＴＬＬｍのＶＰ３および３Ａ領域ではアミノ酸置換は観察されず、ならびにＥＶ７１：ＴＬＬｍおよびＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ両方の３’ＵＴＲでも観察されなかった。
【００７４】
表２
ＥＶ７１：ＢＳに比較したＥＶ７１：ＴＬＬｍおよびＥＶ７１：ＴＬＬｍｖのゲノムにおけるヌクレオチドおよびアミノ酸変化
【００７５】
【表２】
0006772155.tif 000003
【００７６】
表３
ＥＶ７１：ＴＬＬｍおよびＥＶ７１：ＴＬＬｍｖウイルスゲノムの５’ＵＴＲおよびＰ１領域において観察される適合性突然変異
【００７７】
【表３−１】
0006772155.tif 000004
【００７８】
【表３−２】
0006772155.tif 000005
【００７９】
１成熟前の未切断ポリタンパク質におけるアミノ酸の番号付け。
２成熟タンパク質におけるアミノ酸の番号付け
３内部リボソーム進入部位。
突然変異は、参照ＥＶ７１：ＢＳゲノムとの整列に基づく。
【００８０】
表４
ＥＶ７１：ＴＬＬｍおよびＥＶ７１：ＴＬＬｍｖウイルスゲノムのＰ２およびＰ３領域において観察される適合性突然変異
【００８１】
【表４】
0006772155.tif 000006
【００８２】
１成熟前の未切断ポリタンパク質におけるアミノ酸の番号付け。
２成熟タンパク質におけるアミノ酸の番号付け
３ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの薬指ドメインに位置する突然変異。
【００８３】
４ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの掌ドメインに位置する突然変異。
５ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの親指ドメインに位置する突然変異。
突然変異は、参照ＥＶ７１：ＢＳゲノムとの整列に基づく。
【００８４】
実施例８
ネズミ細胞内へのＥＶ７１：ＢＳウイルスＲＮＡのトランスフェクションは、増殖性感染を生じたが、ウイルス子孫は同じマウス細胞を再感染させることができなかった
[0100]ウイルスＲＮＡでトランスフェクションしたＶｅｒｏおよびＮＩＨ／３Ｔ３細胞は、トランスフェクション７日後（ｄｐｔ）に完全ＣＰＥを示した（データ未提示）。ウイルス抗原は、ＥＶ７１：ＢＳのウイルスＲＮＡでトランスフェクションしたＮＩＨ／３Ｔ３細胞で検出されたが（図１０Ｂ）、該ウイルスでの感染に供されたＮＩＨ／３Ｔ３細胞では検出されなかった（図１０Ａ）。新鮮なＶｅｒｏおよびＮＩＨ／３Ｔ３細胞上に再接種されたウイルス上清は、Ｖｅｒｏ細胞においてのみ増殖性感染（１００％ＣＰＥ）を生じたが、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞では生じず（図６Ａ）、そしてウイルス抗原検出は、Ｖｅｒｏ細胞において感染を確認したが、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞では確認しなかった（図６Ｂ）。
【００８５】
実施例９
実施例１０〜１７の材料および方法
[0101]プラスミド、ウイルス、細菌、および細胞株：ネズミＳＣＡＲＢ２  ｃＤＮＡをコードするプラスミド（ｐＭＤ１８−ｍＳＣＡＲＢ２）（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＮＰ＿０３１６７０．１）をＳｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，  Ｉｎｃ．（中国・北京）より購入した。大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）細胞における可溶性ｍＳＣＡＲＢ２タンパク質の組換え発現のためのｐＱＥ３０ベクター（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）は、Ｋｉａｎ  Ｈｏｎｇ  Ｎｇ博士（Ｔｅｍａｓｅｋ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、シンガポール）からの寛大な贈り物であった。低コピー数プラスミドｐＡＣＹＣ１７７（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、シンガポール）を用いて、ＥＶ７１の全長ｃＤＮＡをコードするプラスミドを生成した。Ｔ７ポリメラーゼを発現するプラスミド構築物（ｐＣＭＶ−Ｔ７ｐｏｌ）は、シドニー大学、ニューサウスウェールズのＰｅｔｅｒ  ＭｃＭｉｎｎ博士からの寛大な贈り物であった。クローン由来ウイルスの断片配列決定に用いたプラスミドｐＺｅｒｏ−２を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）より購入した。
【００８６】
[0102]本研究に用いた臨床的単離体ＥＶ７１：ＢＳ（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＫＦ５１４８７８）、ＥＶ７１：ＴＬＬｍ（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＫＦ５１４８７９．１）、およびＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＫＦ５１４８８０．１）は、上記にまたは以前記載された［７１］。
【００８７】
[0103]本研究に用いたすべての細胞株、アフリカミドリザル腎臓Ｖｅｒｏ（ＣＣＬ−８１）；マウス神経芽腫Ｎｅｕｒｏ−２ａ（ＣＣＬ−１３１）、および線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３（ＣＲＬ−１６５８）細胞を、アメリカン組織培養コレクション（ＡＴＣＣ（登録商標）、ＵＳＡ）より購入した。上述のように、または以前記載されるように、細胞を増殖させ、そして維持した［７１］。
【００８８】
[0104]大腸菌細胞ＢＬ２１株（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、シンガポール）を高レベルタンパク質発現のために用い、ＴＯＰ１０株（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）を個々のクローンの断片配列決定のために用い、そしてＸＬ−１０  Ｇｏｌｄ超コンピテント株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＵＳＡ）を全長ゲノムｃＤＮＡクローンの生成のために用いた。
【００８９】
[0105]ＥＶ７１：ＢＳ全長ゲノムｃＤＮＡクローン、カプシドキメラクローン、およびＶＰ１／ＶＰ２突然変異体クローンの構築：ＥＶ７１：ＢＳ  ｃＤＮＡクローンを２段階クローニングによって生成した。ウイルスＲＮＡ抽出（ＱｉａｇｅｎウイルスＲＮＡキット、ドイツ）およびｃＤＮＡへの変換（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ−ＩＩ  ＲＴ、ＵＳＡ）は、上にまたは以前記載されてきている［７１］。５’ＵＴＲおよびＰ１領域をコードするゲノム近位断片を、プライマー対：ＥＶ７１＿ＢａｍＨＩ−ＰｆＦおよびＥＶ７１＿Ｐｆ−ＡａｔＩＩＲ（表５）を用いて増幅し、これらのプライマーは、プラスミドｐＡＣＹＣ１７７へのクローニングのため、ＢａｍＨＩおよびＡａｔＩＩ制限部位を含有する。Ｐ２、Ｐ３、および３’ＵＴＲをコードする遠位断片をプライマー対ＥＶ７１＿ＨｉｎｄＩＩＩ−ＤＦおよびＥＶ７１＿Ｄ−ＢａｍＨＩＲを用いて増幅し、これらの対はまた、クローニングのためのＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ制限部位も含有する。近位断片は、転写を容易にするため、５’ＵＴＲ上流にＴ７ポリメラーゼプロモーター領域を含有する。ＥａｇＩおよびＡａｔＩＩでの消化後、近位断片を遠位断片に連結し、そして全長ＥＶ７１：ＢＳクローンを産生した。
【００９０】
表５
プライマー
【００９１】
【表５−１】
0006772155.tif 000007
【００９２】
【表５−２】
0006772155.tif 000008
【００９３】
[0106]ＥＶ７１：ＢＳのＰ１領域をＥＶ７１：ＴＬＬｍのＰ１で置換するため、ＭｌｕＩ制限部位を５’ＵＴＲおよびＰ１の間の境界内に操作した（プライマー対ＳＤＭ＿ＭｌｕＩＦおよびＳＤＭ＿ＭｌｕＩ−Ｒ）。ＥＶ７１：ＴＬＬｍのＰ１  ｃＤＮＡ配列を増幅し（プライマー対ＭｌｕＩ−ＴＬＬｍ−Ｐ１ＦおよびＥａｇＩ−ＴＬＬｍ−Ｐ１Ｒ）、ＭｌｕＩおよびＥａｇＩで消化し、そして近位断片を宿する構築物内にクローニングした。この修飾近位断片を続いて、記載するように、遠位断片に連結させた。
【００９４】
[0107]ＶＰ２およびＶＰ１タンパク質においてアミノ酸置換を含むクローンを生成するため、遠位断片に連結する前に、近位断片において、部位特異的突然変異誘発を行った。ＶＰ２  Ｓ１４４Ｔ（ｎｔ  Ｇ１３８５Ｃ）アミノ置換を、特異的プライマー対ＶＰ２＿Ｇ１３８５Ｃ−ＦおよびＶＰ２＿Ｇ１３８５Ｃ−Ｒを含む近位断片内に導入した。異なるプライマー対を用いて、類似の方式で、ＶＰ２  Ｓ１４４Ｔ（ｎｔ  Ｇ１３８５Ｃ）、ＶＰ１  Ｋ９８Ｅ（ｎｔ  Ａ２７３４Ｇ）、Ｅ１４５Ａ（ｎｔ  Ａ２８７６Ｃ）、およびＥ１６７Ｅ（ｎｔ  Ｃ２９４７Ｔ）もまた生成した（表５）。
【００９５】
[0108]「マウス細胞進入表現型」の評価：生ウイルスを生成するため、製造者が推奨するプロトコルにしたがって、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）を用いて、Ｖｅｒｏ細胞内に、ｃＤＮＡクローンを、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現する別の構築物（ｐＣＭＶ−Ｔ７ｐｏｌ）と同時トランスフェクションした。トランスフェクション上清をトランスフェクション７〜１０日後に採取し、そして上述のように、または以前記載されるように［７１］、一晩植え付けた細胞株上に１ＭＯＩで接種した。細胞をウイルス上清と、３７℃で１時間インキュベーションし、そしてＰＢＳで２回洗浄した後、新鮮なＤＭＥＭ、１％ＦＢＳを含む培地で置換した。
【００９６】
[0109]感染表現型を評価するため、溶解性細胞変性効果（ＣＰＥ）誘導の進行を記録し、そして多様な時点で画像を取った。感染細胞もまた採取し、そして上述のように、または以前記載されるように［７１］、ウイルスタンパク質の免疫蛍光検出のためにプロセシングした。簡潔には、接着細胞をトリプシン処理し、そして培養上清からペレットした細胞を合わせ、無菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で２回洗浄し、そしてテフロンスライド上に固定した。固定細胞を汎エンテロウイルス・モノクローナル抗体（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）とインキュベーションし、そして標準的ＦＩＴＣコンジュゲート化抗マウスＩｇＧ抗体で検出した。感染細胞培養上清もまた採取し、透明にし、そしてＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈ法［６１］を用いたウイルス力価決定のため、連続希釈に供した。力価がひとたびわかると、上清を新鮮に植え付けたＮＩＨ／３Ｔ３およびＮｅｕｒｏ−２ａ細胞上に１ＭＯＩで継代し、そして本明細書に記載する方法を用いて、感染表現型を再び評価した。
【００９７】
[0110]可溶性ＳＣＡＲＢ２タンパク質の組換えタンパク質発現、およびＳＣＡＲＢ２ウサギ抗血清の産生：マウスＳＣＡＲＢ２の細胞外ドメイン（ａａ  Ａｒｇ２７〜Ｔｈｒ４３２）をコードするプラスミドｐＭＤ１８−ｍＳＣＡＲＢ２を、プライマー対ｐＱＥ−ｍＳＣＡＲＢ２ＦおよびｐＱＥ−ｍＳＣＡＲＢ２Ｒで増幅して、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を導入して、ｐＱＥ３０タンパク質発現ベクター内へのクローニングを容易にした。クローンをＢＬ２１大腸菌細胞に形質転換し、そして１ｍＭ  ＩＰＴＧ一晩で、タンパク質発現を誘導した。採取した細胞をリゾチーム（１ｍｇ／ｍｌ）消化し、そしてＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）、ドイツ）を用いて、未精製抽出物を精製した。透明にした溶解物を１ｍｌの５０％Ｎｉ−ＮＴＡスラリー中、穏やかに振盪しながら４℃で一晩インキュベーションした。タンパク質を洗浄緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）中で５回洗浄し、そして溶出緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）で溶出した。
【００９８】
[0111]２匹の健康な雄ウサギを、第０日、フロイントの完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））と混合した１．４μｇの精製マウスＳＣＡＲＢ２タンパク質で免疫した。フロイントの不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））と混合した０．８μｇ抗原を含有するブースターを、第２１日、第４２日、第６３日、第８４日、および第１０５日に注射した。心臓穿刺による最終出血を第１１７日に行い、そして収集した血液を４℃で一晩インキュベーションした後、３，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。透明になった血清を収集し、そしてさらなる使用のため、−２０℃で保存した。ＳＣＲＡＢ２ウサギ抗血清の産生は、Ｔｅｍａｓｅｋ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ施設動物飼育使用委員会（ＴＬＬ−ＩＡＣＵＣ）によって認可された［認可番号０４７／１７］。
【００９９】
[0112]ネズミＳＣＡＲＢ２タンパク質とのウイルス競合アッセイ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイを行って、マウスおよびヒトＳＣＡＲＢ２タンパク質とＥＶ７１：ＴＬＬｍｖの相互作用を確認した。ＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ウェルあたり６０００）を無菌テフロンコーティングスライド（Ｅｒｉｅ、ＵＳＡ）上に一晩植え付けた。ウイルス接種前、１００  ＭＯＩ  ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖを多様な濃度の組換えマウスＳＣＡＲＢ２（ｍＳＣＡＲＢ２）またはヒトＳＣＡＲＢ２（ｈＳＣＡＲＢ２）タンパク質（４．０μｇ、２．０μｇ、１．０μｇ、０．５μｇ、０．２５μｇ、０．１２５μｇ、および０μｇ）と、振盪プラットホーム中、３７℃で２時間インキュベーションした。ＣＰＥの徴候に関して感染細胞を毎日観察し、そして感染４８時間後、無水アセトン中で固定した（４℃、１０分間）。固定した細胞を汎エンテロウイルス抗体（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）、ＵＳＡ）で免疫蛍光的にアッセイした。直立蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、日本）でスライドを画像化した。
【０１００】
[0113]ウイルス−ＳＣＡＲＢ２結合アッセイ：抗体仲介性ＳＣＡＲＢ２ブロッキングアッセイを固定細胞上で行って、細胞表面ＳＣＡＲＢ２タンパク質をマスキングすると、ウイルス結合に影響を及ぼすかどうかを評価した。テフロンスライド上で培養したＮＩＨ／３Ｔ３およびＶｅｒｏ細胞を固定し（４％ＰＦＡ、２５分間、室温）、そしてＰＢＳ中の５％ＢＳＡで３７℃で１時間ブロッキングした。ｍＳＣＡＲＢ２に対して作製したポリクローナルウサギ血清（１：１００）中、３７℃で１時間、スライドをインキュベーションした。陰性対照のため、サフォードウイルスＬタンパク質に対して作製したポリクローナルウサギ血清と細胞をインキュベーションした。スライドをＰＢＳ中で洗浄した後、生ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ（１０００ＭＯＩ）と３７℃で１時間インキュベーションし、そして汎エンテロウイルス抗体で探査し、そしてＦＩＴＣコンジュゲート化抗体で検出した。スライドを、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０  Ｍｅｔａ倒立共焦点レーザー顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）で画像化し、そしてＩｍａｒｉｓ（ＢｉｔＰｌａｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ドイツ）画像化ソフトウェアを用いて、蛍光強度を測定した。Ｐｒｉｓｍ  ＧｒａｐｈＰａｄバージョン６．０１（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）を用いて、蛍光強度相違の統計分析を行った。
【０１０１】
[0114]ウサギ抗ＳＣＡＲＢ２ポリクローナル血清を用いたウイルス感染からの細胞防御アッセイ：細胞感染に対する影響を評価するため、生存細胞に対して、抗体仲介性ＳＣＡＲＢ２ブロッキングアッセイもまた行った。一晩植え付けたＮＩＨ／３Ｔ３細胞（９６ウェルプレート中、ウェルあたり１ｘ１０４細胞）を、マウスまたはヒトＳＣＡＲＢ２タンパク質のいずれかに対して作製したウサギポリクローナル血清の２倍連続希釈（１：２０〜１：６４０）と３７℃で１時間インキュベーションした。続いて、細胞に、１００  ＭＯＩのＥＶ７１：ＴＬＬｍｖまたはクローン由来ウイルス突然変異体ＣＤＶ：ＢＳ［Ｍ−Ｐ１］およびＣＤＶ：ＢＳＶＰ１［Ｋ９８Ｅ／Ｅ１４５Ａ／Ｌ１６９Ｆ］を３７℃で１時間接種した。細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、新鮮なＤＭＥＭ（１％ＦＢＳ）と交換した。ＣＰＥの徴候に関して細胞を毎日観察し、そして感染した細胞培養上清を感染３日後（ｄｐｉ）に採取した。上清を、以前のように［６、７１］、１％デオキシコール酸ナトリウム中、室温で１５分間激しくボルテックスすることによるウイルス脱凝集プロセスの後、ウイルス力価決定に供した。ウイルス力価をＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈ法［６１］で計数し、そして感染計算装置で、ＣＣＩＤ５０／ｍｌとして報告した［６２］。
【０１０２】
実施例１０
マウスニューロン性Ｎｅｕｒｏ−２ａおよび線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３細胞へのＥＶ７１：ＢＳゲノムＲＮＡのトランスフェクションは、生存ウイルス子孫を生じる
[0110]ネズミ線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３および神経芽腫Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞は、以前、ＥＶ７１：ＢＳ感染に対して非許容性であり、一方、Ｖｅｒｏ細胞は許容性であることが立証された（上記または［７１］）。どちらもＥＶ７１：ＢＳに由来する２つの株、ＥＶ７１：ＴＬＬｍおよびＥＶ７１：ＴＬＬｍｖは、これらのネズミ細胞内に成功裡に進入し、そしてその中で複製された。ＥＶ７１：ＢＳゲノムがこれらの非許容性細胞中で複製可能であるかどうかを決定するため、ＥＶ７１：ＢＳ由来のゲノムＲＮＡを抽出し、そしてＶｅｒｏ、ＮＩＨ／３Ｔ３、およびＮｅｕｒｏ−２ａ細胞内にトランスフェクションした。同様に、ＥＶ７１：ＴＬＬｍおよびＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ由来のゲノムＲＮＡを、比較のため、これらの３つの細胞株にトランスフェクションした。生じるウイルス子孫生存度を評価するため、トランスフェクション上清を続いて、新鮮な細胞上に再接種した（図１５Ａ）。
【０１０３】
[0111]Ｖｅｒｏ細胞への３つのウイルス株すべてのゲノムＲＮＡトランスフェクションは、トランスフェクション細胞単層において、溶解性細胞変性効果（ＣＰＥ）を生じた（図１５Ｂ）。ウイルス抗原発現はまた、死んだ細胞（図１５Ｃ）でも観察され、ウイルス複製成功が示された。同様の結果が、ＥＶ７１：ＴＬＬｍまたはＥＶ７１：ＴＬＬｍｖウイルスＲＮＡいずれかのＮＩＨ／３Ｔ３およびＮｅｕｒｏ−２ａ細胞単層へのトランスフェクションから観察された（図１５Ｂおよび１５Ｃ）。一方、ＮＩＨ／３Ｔ３およびＮｅｕｒｏ−２ａ細胞内へのＥＶ７１：ＢＳ  ＲＮＡのトランスフェクションは、ウイルス抗原発現を示すいくつかの細胞の死を導いたが、細胞単層の完全ＣＰＥは生じなかった。ＮＩＨ／３Ｔ３およびＮｅｕｒｏ−２ａ細胞の両方由来のＥＶ７１：ＢＳトランスフェクション上清の新鮮なＶｅｒｏ細胞へのさらなる継代は、細胞単層の完全溶解の誘導（図１５Ｄ）および死んだ細胞におけるウイルス抗原の検出（図１５Ｅ）を導いた。しかし、新鮮なＮＩＨ／３Ｔ３細胞上でのトランスフェクション上清の継代は、ＣＰＥ（図１５Ｄ）またはウイルス抗原発現（図１５Ｅ）のいずれも生じなかった。
【０１０４】
実施例１１
マウス細胞株適合ＥＶ７１：ＴＬＬｍのカプシドコードＰ１領域は、ネズミＮＩＨ／３Ｔ３およびＮｅｕｒｏ−２ａ細胞へのウイルス進入成功に関与する
[0112]以前の分析によって、ＥＶ７１：ＴＬＬｍおよびＥＶ７１：ＴＬＬｍｖのカプシドタンパク質は、ＮＩＨ／３Ｔ３およびＮｅｕｒｏ−２ａ細胞への進入成功に関与しうることが示唆される（上記または［７１］）。これを確認するため、ＥＶ７１：ＢＳゲノムの全長ｃＤＮＡクローンを、標準逆遺伝学によって生成した。ＥＶ７１：ＢＳの全長ｃＤＮＡクローンのＰ１（カプシド）領域を続いて、ＥＶ７１：ＴＬＬｍ  Ｐ１の遺伝子配列で置換して、キメラプラスミドクローンを生成した（図１６Ａ）。ＥＶ７１：ＢＳ  ｃＤＮＡクローンをＶｅｒｏ細胞にトランスフェクションして、クローン由来ウイルス（ＣＤＶ：ＢＳ）を生成した。同様に、キメラクローンをトランスフェクションして、ＥＶ７１：ＴＬＬｍのカプシドタンパク質を示し、そしてＥＶ７１：ＢＳの非構造タンパク質を発現する、ＣＤＶ：ＢＳ［Ｍ−Ｐ１］を生成した。これらのＣＤＶを多様な細胞株に再接種して、感染表現型を評価した（図１６Ｂ）。
【０１０５】
[0113]ＥＶ７１：ＢＳクローン由来ウイルス（ＣＤＶ：ＢＳ）は、Ｖｅｒｏ細胞においてＣＰＥを誘導したが、ＮＩＨ／３Ｔ３およびＮｅｕｒｏ−２ａ細胞では誘導せず、一方、ＣＤＶ：ＢＳ［Ｍ−Ｐ１］は、感染４８時間後（ｈｐｉ）、３つの細胞株すべてでＣＰＥを誘導した（図１６Ｃ）。ＣＤＶ：ＢＳ［Ｍ−Ｐ１］に感染したネズミ細胞は、死んだ細胞において、ウイルス抗原の検出を生じたが、ＣＤＶ：ＢＳでは生じなかった（図１６Ｄ）。最初の継代（Ｐ１）における生存ウイルス子孫の産生および放出を評価するため、感染細胞由来の透明にした培養上清を、同じ細胞株の新鮮な単層上に再接種し、そして７２ｈｐｉで、ウイルス収量を測定した。ＣＤＶ：ＢＳおよびＣＤＶ：ＢＳ［Ｍ−Ｐ１］両方のＶｅｒｏ細胞上での継代は、高いウイルス力価を示し、そしてさらなる継代（Ｐ２）後、有意な力価増加が観察された（図１６Ｅ）。一方、ＣＤＶ：ＢＳ［Ｍ−Ｐ１］の継代（Ｐ１）は、ＮＩＨ／３Ｔ３およびＮｅｕｒｏ−２ａ細胞両方における高いウイルス収量を生じたが、ＣＤＶ：ＢＳはそうではなかった（図１６Ｆ）。
【０１０６】
実施例１２
ＥＶ７１：ＢＳカプシドにおけるＶＰ１−Ｌ１６９Ｆアミノ酸置換は、ウイルスがネズミ細胞に進入し、そして限定された感染を誘導することを可能にする
[0114]マウス細胞適合ＥＶ７１：ＴＬＬｍのカプシドタンパク質は、ネズミ細胞へのＥＶ７１：ＢＳの進入を可能にし、そして本発明者らは、この新規表現型を与える特定の残基の同一性に興味を持った。ＥＶ７１：ＢＳおよびマウス細胞適合ＥＶ７１株のポリタンパク質配列整列の比較に関する以前のデータは、宿主細胞上のウイルス受容体結合に関与する可能性があるＶＰ１およびＶＰ２タンパク質における多数のアミノ酸置換を示した（上記または［７１］）。これらの残基には、ＶＰ１  Ｋ９８Ｅ、Ｅ１４５Ａ、およびＬ１６９Ｆ、ならびにＶＰ２  Ｓ１４４ＴおよびＫ１４９Ｉが含まれる。これらのアミノ酸置換のいずれがマウス細胞進入に必要であるかを決定するため、これらのアミノ酸置換を生じる個々の突然変異を、標準的部位特異的突然変異誘発を通じて、ＥＶ７１：ＢＳ全長ｃＤＮＡクローン内に導入した（図１７Ａ）。これらの修飾ｃＤＮＡクローンをＶｅｒｏ細胞に独立にトランスフェクションして、クローン由来ウイルス（ＣＤＶ）を生成し、そして採取した上清を、新鮮に植え付けたＶｅｒｏ、ＮＩＨ／３Ｔ３、およびＮｅｕｒｏ−２ａ細胞上に接種して、感染表現型を評価した。
【０１０７】
[0115]突然変異体クローン由来ウイルス（ＣＤＶ）すべてに感染したＶｅｒｏ細胞は、１００％ＣＰＥを示したが、ＶＰ１アミノ酸置換を宿するＣＤＶ、ＣＤＶ：ＢＳＶＰ１［Ｋ９８Ｅ］、ＣＤＶ：ＢＳＶＰ１［Ｅ１４５Ａ］、およびＣＤＶ：ＢＳＶＰ１［Ｌ１６９Ｆ］のみが、Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞における１００％ＣＰＥを生じた（図１７Ｂおよび１７Ｃ）。ウイルス抗原発現は、ＶＰ１（ＣＤＶ：ＢＳＶＰ１）およびＶＰ２（ＣＤＶ：ＢＳＶＰ２）にアミノ酸置換を含有するＣＤＶに感染させたＶｅｒｏおよびＮｅｕｒｏ−２ａ細胞において検出されたが、ＣＤＶ：ＢＳＶＰ２に感染したＮＩＨ／３Ｔ３細胞のみがウイルス抗原発現を示した（図１７Ｄおよび１７Ｅ）。さらに、すべての突然変異体ＣＤＶに感染したＶｅｒｏ細胞が、測定可能なウイルス力価を生じ（図１７Ｆ）、ウイルス生存性を示唆したが、ＣＤＶ：ＢＳＶＰ１［Ｌ１６９Ｆ］のみが、Ｖｅｒｏ細胞においてアッセイした際、感染ＮＩＨ／３Ｔ３およびＮｅｕｒｏ−２ａ細胞の培養上清中で測定可能なウイルス力価を生成した（図１７Ｇ）。しかし、ＣＤＶ：ＢＳＶＰ１［Ｌ１６９Ｆ］に感染したＮＩＨ／３Ｔ３およびＮｅｕｒｏ−２ａ細胞由来の培養上清の健康なネズミ細胞上のさらなる継代は、感染誘導に失敗した。
【０１０８】
実施例１３
ネズミ細胞における効率的な増殖性感染は、ＶＰ１での組み合わせアミノ酸置換を必要とする
[0116]ＶＰ１およびＶＰ２におけるアミノ酸置換の組み合わせがまた、ＥＶ７１：ＢＳをマウス細胞に進入させることが可能であるかどうかを評価するため、多様な組み合わせのアミノ酸置換を含むＥＶ７１：ＢＳの全長ゲノムｃＤＮＡクローン（ＢＳＶＰ２［Ｓ１４４Ｔ／Ｋ１４９Ｉ］、ＢＳＶＰ［Ｋ９８Ｅ／Ｅ１４５Ａ］、ＢＳＶＰ１［Ｋ９８Ｅ／Ｅ１４５Ａ／Ｌ１６９Ｆ］、およびＢＳ［ＶＰ１／ＶＰ２］）を生成した（図１８Ａ）。プラスミドクローンを独立にＶｅｒｏ細胞上にトランスフェクションし、そして生じた上清を用いて、Ｖｅｒｏ、ＮＩＨ／３Ｔ３、およびＮｅｕｒｏ−２ａ細胞に接種して、感染表現型を評価した。
【０１０９】
[0117]アッセイしたＣＤＶは、ＣＤＶ：ＢＳＶＰ２［Ｓ１４４Ｔ／Ｋ１４９Ｉ］を除くすべてが、ＶｅｒｏおよびＮｅｕｒｏ−２ａ細胞において、ＣＰＥを誘導した（図１８Ｂ）。多様なＣＤＶに感染させたすべての細胞においてもまた、ウイルス抗原が検出されたが、ネズミ細胞株を比較した際、免疫染色は、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞よりも、Ｎｅｕｒｏ−２ａにおいてより顕著であった（図１８Ｃ）。すべてのＣＤＶに感染したＶｅｒｏ細胞の培養上清において、高いウイルス力価が測定可能であった（図１８Ｄ）が、ＣＤＶ：ＢＳＶＰ１［Ｋ９８Ｅ／Ｅ１４５Ａ］およびＣＤＶ：ＢＳＶＰ１［Ｋ９８Ｅ／Ｅ１４５Ａ／Ｌ１６９Ｆ］は、Ｖｅｒｏ細胞においてアッセイした際、感染ＮＩＨ／３Ｔ３およびＮｅｕｒｏ−２ａ細胞の培養上清において、測定可能なウイルス力価を生じた（図１８Ｅ）。
【０１１０】
実施例１４
ＶＰ１  Ｋ９８Ｅ、Ｅ１４５Ａ、およびＬ１６９Ｆの組み合わせたアミノ酸置換を含むＥＶ７１：ＢＳウイルスは、マウスＮｅｕｒｏ−２ａ細胞において、成功裡に継代可能であった
[0118]クローン由来ウイルス単離体のうち４つ：ＣＤＶ：ＢＳ［Ｍ−Ｐ１］、ＣＤＶ：ＢＳＶＰ１［Ｌ１６９Ｆ］、ＣＤＶ：ＢＳＶＰ１［Ｋ９８Ｅ／Ｅ１４５Ａ］、およびＣＤＶ：ＢＳＶＰ１［Ｋ９８Ｅ／Ｅ１４５Ａ／Ｌ１６９Ｆ］は、これまでのところ、ＥＶ７１：ＢＳが培養マウス細胞株に進入し、そして感染させるのを可能にしてきた。これらのＣＤＶのうちいずれが多数回周期に関して、マウス細胞を安定感染させうるかを同定するため、同じ細胞株で２回、すなわちＮｅｕｒｏ−２ａから新鮮なＮｅｕｒｏ−２ａ細胞に、ウイルス上清を継代した。ＣＰＥ誘導およびウイルス抗原発現、ならびに生存ウイルス子孫の産生の評価によって感染を監視した。
【０１１１】
[0119]ウイルス抗原の検出（図１９Ａ）および測定可能なウイルス力価（図１９Ｂ）によって立証されるように、ＣＤＶ：ＢＳＶＰ１［Ｋ９８Ｅ／Ｅ１４５Ａ／Ｌ１６９Ｆ］およびＣＤＶ：ＢＳ［Ｍ−Ｐ１］のみがＮｅｕｒｏ−２ａ細胞において連続して継代成功が可能であった。継代２回目および３回目の両方において、陽性染色が観察され、そして最初の継代に比較して、継代２回目において、ウイルス力価の増加が記録された。一方、ＣＤＶ：ＢＳ［Ｍ−Ｐ１］は、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞において、ウイルス抗原の発現を誘導可能であった（図１９Ａ）が、生存可能なウイルス子孫は検出されなかった。Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞における３回目の継代から得られるＣＤＶ：ＢＳＶＰ１［Ｋ９８Ｅ／Ｅ１４５Ａ／Ｌ１６９Ｆ］のゲノム配列は、導入されたアミノ酸突然変異の変化を示した（図１９Ｃ）。
【０１１２】
実施例１５
マウス細胞株適合株ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖは、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方で、ＳＣＡＲＢ２タンパク質に結合する
[0120]ＥＶ７１は、スカベンジャー受容体クラスＢメンバー２（ＳＣＡＲＢ２）タンパク質を、宿主細胞進入のため、その受容体として利用することが、最近、証明された［４７］。マウス細胞株適合性ＥＶ７１株がまた、マウス細胞感染中、ＳＣＡＲＢ２を利用するかどうかを確認するため、競合的ウイルス結合アッセイを行った。まず、テフロンコーティングしたスライド中で、一晩増殖させ、そして４％パラホルムアルデヒドで穏やかに固定したＮＩＨ／３Ｔ３およびＶｅｒｏ細胞を、マウスＳＣＡＲＢ２タンパク質（ｍＳＣＡＲＢ２）に対するウサギ血清とインキュベーションした後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖと結合させた。汎エンテロウイルス・モノクローナル抗体を用いて、結合した細胞を蛍光検出し、そして蛍光強度を定量化した。ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を抗ｍＳＣＡＲＢ２血清とプレインキュベーションすると、ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ結合の有意な減少が生じ（図２０Ａ）、これは、細胞を非特異的血清（ＮＳＰ）とプレインキュベーションした際には観察されなかった。同様の結果がＶｅｒｏ細胞を用いた際に観察された（図２０Ｂ）。
【０１１３】
[0121]第二の実験において、生ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖを組換え可溶性ＳＣＡＲＢ２タンパク質とインキュベーションした後、植え付けたＮＩＨ／３Ｔ３細胞上に接種し、そして結合した汎エンテロウイルス・モノクローナル抗体の蛍光タグ付けによって、感染を評価した。可溶性ｍＳＣＡＲＢ２とウイルスをプレインキュベーションすると、用量依存方式で、細胞感染の重症度が減少した（図２０Ｃ）。ヒトＳＣＡＲＢ２（ｈＳＣＡＲＢ２）タンパク質をプレインキュベーションにおいて用いた際も同様の結果が得られた（図２０Ｄ）。
【０１１４】
実施例１６
ＳＣＡＲＢ２タンパク質に対して作製された血清とマウス細胞をプレインキュベーションすることによって、ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖでの細胞感染がブロッキングされる
[0122]ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖとＳＣＡＲＢ２の相互作用をブロッキングすることによって、細胞感染が減少するかどうかを評価するため、植え付けたＮＩＨ／３Ｔ３細胞を、多様な希釈のＳＣＡＲＢ２タンパク質抗血清とインキュベーションした後、生ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖを接種し、そして生ウイルス子孫の力価を測定することによって、感染を評価した。低希釈のｈＳＣＡＲＢ２抗血清（１：２０〜１：８０）と細胞のプレインキュベーションは、対照に比較して、ウイルス力価の有意な用量依存性減少を生じた（図２０Ｅ）。細胞をｍＳＣＡＲＢ２抗血清とプレインキュベーションした際、類似の結果が得られた（図２０Ｆ）。
【０１１５】
実施例１７
ＣＤＶ：ＢＳ［Ｍ−Ｐ１］およびＣＤＶ：ＢＳＶＰ１［Ｋ９８Ｅ／Ｅ１４５Ａ／Ｌ１６９Ｆ］は、ネズミＳＣＡＲＢ２タンパク質をネズミ細胞への進入のための機能的受容体として利用する
[0123]ＣＤＶ：ＢＳ［Ｍ−Ｐ１］およびＣＤＶ：ＢＳＶＰ１［Ｋ９８Ｅ／Ｅ１４５Ａ／Ｌ１６９Ｆ］はどちらも、マウスＮｅｕｒｏ−２ａ細胞を安定に感染させる。これらのＣＤＶもまた、マウス細胞適合ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ株と同様、ウイルス進入および脱外被のためにｍＳＣＡＲＢ２を利用するかどうかを決定するため、Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞をｍＳＣＡＲＢ２抗血清とインキュベーションした後、ＣＤＶ突然変異体に感染させた。ＣＤＶ：ＢＳＶＰ１［Ｋ９８Ｅ／Ｅ１４５Ａ／Ｌ１６９Ｆ］（図２１Ａ）またはＣＤＶ：ＢＳ［Ｍ−Ｐ１］（図２１Ｂ）のいずれかに感染させた細胞において、溶解性ＣＰＥの用量依存性減少が観察された。感染７日後（ｄｐｉ）の培養上清の力価決定は、対照に比較して、ＳＣＡＲＢ２抗血清とプレインキュベーションした細胞において、ＣＤＶ：ＢＳＶＰ１［Ｋ９８Ｅ／Ｅ１４５Ａ／Ｌ１６９Ｆ］ウイルス力価の有意な相違は明らかにしない。一方、対照に比較して、血清とプレインキュベーションしたＣＤＶ：ＢＳ［Ｍ−Ｐ１］感染細胞において、有意なウイルス力価減少が検出された（図２１Ｄ）。
【０１１６】
実施例１８
実施例１９の材料および方法
[0124]動物モデル：マウス細胞適合株（ＥＶ７１：ＴＬＬｍおよびＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ）の動物感染表現型を決定するため、５〜６日齢のＢａｌｂ／ｃマウスを１０６  ＣＣＩＤ５０のウイルスに感染させ、そして疾患および神経学的合併症の症状に関して観察した。動物を最大２８日間追跡し、その後、動物を屠殺して、そしてＥＶ７１特異的抗体の検出に関して、血清を収集した。
【０１１７】
実施例１９
Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるマウス細胞株適合ＥＶ７１（ＥＶ７１：ＴＬＬｍおよびＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ）の神経病原性研究
[0125]ＥＶ７１：ＴＬＬｍ（ｎ＝７）に感染した免疫適格動物のうち、感染８日後、２匹（２９％）は、重症および持続性（＞２４時間）麻痺で死亡した（図１３Ａ）。他の生存マウスのうち、５匹（５／７、７１．４％）は振戦および運動失調を示し、５匹は一方または両方の後肢に不全麻痺を示し、そして４匹（４／７、５７．１％）は一方または両方の後肢いずれかに一時的な麻痺を示した。一方、ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖに感染した動物は、疾患のより重度の臨床的な徴候を示した。１０匹の感染動物のうち９匹（９０％）は、感染８日以内に疾患に屈し（図１３Ａ）、９匹のうち６匹（６６．７％）が、感染後４日以内に死亡した。提示される他の症状には、振戦（５／１０、５０％）、一方または両方の後肢いずれかの麻痺（６／１０、６０％）、および一方または両方の後肢いずれかの麻痺（５／１０、５０％）が含まれる。偽感染動物に比較して、ＥＶ７１：ＴＬＬｍに感染したマウスの体重には相違はないようであるが、ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖに感染したマウスは、感染の最初の１０日以内に、体重の劇的な減少を示した（図１３Ｂ）。より興味深いことには、本発明者らは、ＥＶ７１感染マウスにおける新規症状を観察し、それによって、麻痺した動物（図１４Ａ、矢印）は、顕著な肋骨下後退を伴う頻呼吸を提示した。さらに、９匹のうち６匹（６６．７％）の死亡動物は、安楽死より前に、この症状を提示した。剖検に際して、本発明者らはまた、肺および心臓組織を収集する際の剖検の通常の処置である、胸腔の開放に際して、肺が圧潰不能である（図１４Ｂ、矢印）ことも観察し、肺浮腫が存在していることが示唆された。組織の組織学的検査によって、肺浮腫および肺の肺胞空間における出血の特徴が明らかになり（図１４Ｃ）、そしてより高い倍率の画像は、出血性タンパク質性物質の存在を示す（図１４Ｄ、矢印）。
【０１１８】
[0126]また、易感染性マウス、例えばＮＳＧマウスを用いても、本実施例を行った。疾患の重症度がより高く、そして死亡率がより高い以外は、類似の結果が得られた。
実施例２０
候補抗ＥＶ７１化合物のスクリーニング
[0127]ＥＶ７１：ＴＬＬｍまたはＥＶ７１：ＴＬＬｍｖウイルス株による細胞溶解性感染に感受性であることが示されているマウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞株を用いて、候補抗ＥＶ７１化合物のハイスループットｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングを行う。ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングから選択した有望な化合物を、次いで、動物モデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏ試験する。ｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングを達成するため、標準化された（統計計算に基づく）数のＢＡＬＢ／ｃマウスを、調製され、力価決定され、そしてディープフリーザー（−８０℃）中に維持された、マウス細胞株適合ＥＶ７１株（ＥＶ７１：ＴＬＬｍおよびＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ）の標準化されたストックから、ウイルス株の標準化された力価で感染させる。候補抗ＥＶ７１化合物を、候補化合物の潜在的な予防的効果をアッセイするため、疾病の出現前、または候補化合物の潜在的な療法的効果をアッセイするため、疾病の開始後のいずれかに、多様な標準化された投薬量で、感染マウスに投与する。
【０１１９】
実施例２１
実施例２２〜２５の材料および方法
[0128]マウスおよびウイルス株：成体ＢＡＬＢ／ｃマウスをＩｎＶｉｖｏｓ（シンガポール）から購入し、そして交配させて仔を得た。接種に用いたＥＶ７１株には、ＥＶ７１：ＢＳ、ＥＶ７１：ＴＬＬｍ、およびＥＶ７１：ＴＬＬｍｖが含まれ、これらの詳細および特徴は本明細書に記載されてきている。
【０１２０】
[0129]倫理記載：動物処置は、Ｔｅｍａｓｅｋ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ施設動物飼育使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって認可された（認可番号ＴＬＬ−１４−０２３）。瀕死となった感染動物は、Ｉ．Ｐ．経路を通じて９０ｍｇ／ｋｇペントバルビトンを注射することによって安楽死させた。カリフォルニア大学サンフランシスコ校施設動物飼育使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって設定されたガイドラインおよび標準処置にしたがって、神経学的検査を行った。安楽死の基準には、以前設定されたガイドラインが含まれた［３４］：（１）最大記録体重の＞２０％の喪失、（２）＞４８時間持続する麻痺、（３）摂食欠如または摂食不能、（４）姿勢保持不能、および（５）昏迷または昏睡いずれかとして提示される意識状態改変。仔を全部で２８日間観察し、そしてこの期間を生き延びた動物を、ペントバルビトンのＩ．Ｐ．注射によって安楽死させた。
【０１２１】
[0130]動物取り扱いおよび感染：多様な年齢（６日、１４日、２１日、または２８日齢）の８匹のマウスの群に、ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ（用量１０６  ＣＣＩＤ５０）をＩ．Ｐ．またはＩ．Ｍ．注射のいずれかによって接種した。ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖの最適用量を決定するため、６日齢の仔の群（群あたり８匹）を多様な用量のウイルス（１０６、１０５、１０４、１０３、または１０２  ＣＣＩＤ５０）に、Ｉ．Ｐ．経路を通じて曝露した。感染後の最初の１週間、疾患提示に関して、感染動物を１日２回観察した。瀕死の動物および観察期間を生き延びた動物の両方を、上述のように安楽死させた。２６Ｇ針を用い、心臓穿刺を通じて、ターミナル（terminal）血液収集を行った。
【０１２２】
[0131]剖検、肉眼的病理学的観察、および組織収集：標準的プロトコルを用いて、安楽死させた動物を剖検し、臓器を採取した。肉眼的病理検査もまた行い、そしてＩＡＣＵＣ認可を受けて写真を撮影した。肺表面を無菌ＰＢＳで２回フラッシュし、そしてフィルターペーパーでブロット・ドライした後、湿重量を測定した。組織学的研究のため採取した臓器を、１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）中、４℃で１週間保存した。
【０１２３】
[0132]組織ウイルス負荷の決定：テフロン乳棒を用いて凍結組織を柔らかくし、そして１ｍｌ  ＤＭＥＭ（１％ＦＢＳ）中で再構成した。次いで、試料を１時間混合し、そして２回遠心分離（２０ｇ、３０分間、４℃）して、組織破片を除去し、そして透明になったウイルスを得た。ウイルス試料を１％デオキシコール酸ナトリウム中で脱凝集させた［８８］後、１０倍連続希釈して、そしてＮＩＨ／３Ｔ３細胞上にトランスファーした。感染細胞を、細胞変性効果（ＣＰＥ）に関して毎日観察し、そして汎エンテロウイルス・モノクローナル抗体（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）で細胞を染色した［８８］。ウイルス力価を計数し、そしてｇ組織あたりのＣＣＩＤ５０として報告した。
【０１２４】
[0133]組織学的分析のための組織プロセシング：増加する濃度の７０％、９５％および１００％エタノール中で、固定組織を脱水した。組織を、アルコールの２回交換およびＨｉｓｔｏｃｌｅａｒ  ＩＩ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）の３回交換中でインキュベーションし、そして最後に、融解パラフィンワックスの４回交換で浸潤させた。すべてのインキュベーションは、１００ｒｐｍの穏やかな振動を伴う室温１時間であった。パラフィン浸潤を６５℃に設定したオーブン中で行った。マイクロトームを用いて、パラフィン包埋組織ブロックの切片作製（５μｍ）をし、ポリリジンコーティングガラススライド上に装填し、４２℃で一晩乾燥させ、そして次いで、さらなる使用まで、室温で保存した。
【０１２５】
[0134]組織切片の染色：Ｈｉｓｔｏｃｌｅａｒ  ＩＩの２回交換におけるインキュベーションによって組織切片を脱ワックスし、そして次いで、１００％、９５％、７０％、および５０％の減少するアルコール濃度中で、ゆっくりと脱水した。スライドを染色前に１０分間ＰＢＳ中でインキュベーションした。Ｈａｒｒｉｓのヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）にスライドを最初に浸し、そして室温（ＲＴ）で１５分間インキュベーションすることによって、ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を行った。次いで、スライドを水中でリンスし、１％酸アルコールで脱染色し（９５％エタノール、１％ＨＣｌ）、０．２％ＮＨ４ＯＨ中に浸し、そして水中で１０分間リンスした後、エオジン溶液中で対比染色した。スライドを次に、９５％エタノール中で脱染色し、無水アルコールの３回交換およびＨｉｓｔｏｃｌｅａｒ  ＩＩの２回交換によって脱水した。最後に、組織をＤＰＸマウンティング液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）中にセッティングした。
【０１２６】
[0135]免疫組織化学：脱ワックスおよび再水和後、スライドを、組織学等級電子レンジおよびクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中での９６℃３０分間のインキュベーションによって、熱誘導抗原回収に供した。３時間に渡ってスライドをＲＴまで冷却させ、そして続いて、５％正常ブタ血清で、ＲＴで１時間ブロッキングした。次いで、さらなる洗浄を伴わずに、ＥＶ７１に対するポリクローナル抗体（ＮＩＩＤ、日本の清水博之博士からの寛大な贈り物）を含有するウサギ血清中、スライドを４℃で一晩インキュベーションした。次いで、スライドをＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳ−Ｔ）中で５回洗浄し、そしてＴＢＳで２回リンスした後、３％Ｈ２Ｏ２をＲＴで１時間添加することによって、内因性ペルオキシダーゼを反応停止させた。スライドを続いてＴＢＳ中で２回洗浄した後、ブタ抗ウサギＩｇ−ＨＲＰ（Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、デンマーク）とＲＴで１時間インキュベーションした。洗浄後、スライドをジアミノベンジジン（ＤＡＢ）基質中でインキュベーションし、そしてヘマトキシリンで対比染色した。
【０１２７】
[0136]組織切片におけるウイルス抗原およびウイルス誘導性病変のマッピング：マウス脳の代表的な冠状断面のテンプレート画像を、ｗｗｗ．ｂｒａｉｎｓｔａｒｓ．ｏｒｇよりダウンロードした［８９］。これらの画像はクリエイティブ・コモンズ・ジャパンからのライセンスの元で、自由に使用し、そして加工することが可能である。観察された病変およびウイルス抗原をテンプレート画像上にマークした。冠状断片のマウス脳アトラス（ｗｗｗ．ｍｏｕｓｅ．ｂｒａｉｎ−ｍａｐ．ｏｒｇ／ｓｔａｔｉｃ／ａｔｌａｓ）を用いて、罹患脳領域を同定した［９０］。同様に、胸部脊髄の代表的な冠状断面図を、脊髄マップのテンプレートとして用いた。次いで、ウイルス抗原およびウイルス誘導性病変の存在が示される領域をテンプレート画像上にマークした。
【０１２８】
[0137]血清カテコールアミンレベルの測定：剖検中、瀕死の動物の心臓穿刺によって、血液試料を収集した。凝血試料を３０００ｇ、４℃で３０分間遠心分離することによって、血清を得て、次いで、製造者のプロトコルにしたがって、２−ＣＡＴ（Ａ−Ｎ）  ＥＬＩＳＡキット（Ｌａｂｏｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ  Ｎｏｒｄ、ドイツ）を用いて、カテコールアミンレベルを決定するまで、−２０℃で保存した。
【０１２９】
[0138]統計分析：ＷｉｎｄｏｗｓのためのＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（バージョン６．０１）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＵＳＡ、ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ）を用いて、すべてのグラフを生成し、そして統計分析を行った。
【０１３０】
[0139]ウイルス株ＥＶ７１：ＴＬＬｍおよびＥＶ７１：ＴＬＬｍｖによって誘導される感染表現型の比較：６日齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの仔に、１０６  ＣＣＩＤ５０用量のＥＶ７１：ＢＳ、ＥＶ７１：ＴＬＬｍ、またはＥＶ７１：ＴＬＬｍｖを腹腔内（Ｉ．Ｐ．）または筋内（Ｉ．Ｍ．）経路（群あたり、ｎ＝１０のマウス）で接種した。接種後の最初の１週間、疾患の徴候に関して、動物を１日２回観察し、そしてすでに記載したように、決定的な徴候が検出された際、安楽死させた。
【０１３１】
[0140]感染マウス由来の血清中の中和抗体レベルの測定：室温で凝血する前に、剖検時に心臓穿刺によって血液試料を収集し、そして３０００ｇ、４℃で２０分間遠心分離することによって、血清を得た。さらなる分析まで、試料を−２０℃で保存した。凍結ストックのランダム試料を、中和抗体力価に関してアッセイした。血清の２倍連続希釈（１：２０〜１：１２８０）を９６ウェルプレート中で調製し、そして１００  ＣＣＩＤ５０ウイルスと混合した。混合物を３７℃で１時間インキュベーションした後、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞（６，０００細胞／ウェル）を添加した。プレートを３７℃で数日間インキュベーションし、そして４〜１０日間の間、ＣＰＥに関して観察した。ＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈ法を用いて、中和抗体力価を決定した（ｍｌ血清あたりの単位として報告）。
【０１３２】
実施例２２
ネズミ宿主における修飾ＥＶ７１株の感染動力学
[0141]エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）誘導性神経学的疾患および病理の現在の動物モデルは、ヒト疾患を部分的にしか複製しない。本発明者らはしたがって、齧歯類および霊長類細胞株の両方に増殖性に感染可能である、マウス細胞（ＮＩＨ／３Ｔ３）適合ウイルス株ＥＶ７１：ＴＬＬｍおよびＥＶ７１：ＴＬＬｍｖを用いて疾患病理の臨床的真性モデルを開発することを目的とした［８８］。第一に、親株ＥＶ７１：ＢＳに比較したＥＶ７１：ＴＬＬｍおよびＥＶ７１：ＴＬＬｍｖの相対病原性を、腹腔内（Ｉ．Ｐ．）経路を通じてウイルスに感染させた１週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて疾患病理を評価することによって、評価した。接種動物すべてで血清変換が観察されたが、ＥＶ７１：ＴＬＬｍまたはＥＶ７１：ＴＬＬｍｖのいずれかに感染したマウスのみが、致死性疾患に進行した（図２２ａおよび２２ｂ）。同様に、適合株を代替筋内（Ｉ．Ｍ．）経路を通じて投与した際、これらは再び、親株ＥＶ７１：ＢＳに比較して減少した宿主生存と関連した（５７％生存；図２２ｃ）。Ｉ．Ｐ．およびＩ．Ｍ．感染経路を一緒に考慮した際、接種後の中央値生存時間はＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ感染に関しては感染４日後（ＤＰＩ）、そしてＥＶ７１：ＴＬＬｍ感染に関しては７  ＤＰＩであった（χ２＝６．８４０；ｐ＝０．０８９）。総合すると、これらのデータは、マウス細胞適合ウイルス株ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖは、致死性の最大のレベルと関連することを示し、そしてしたがって、続く実験すべてでこれを用いた。
【０１３３】
[0142]さらなるモデル開発のために使用する、最適ウイルス用量、接種経路、およびマウス年齢を次に評価した。まず、ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ感染マウスにおける疾患重症度は、ウイルス用量に依存性であり、最低生存率は、１０６の中央値細胞培養感染用量（ＣＣＩＤ５０）を接種された動物において観察され（図２３ａ）、そして中央値人道的終点（ＨＤ５０）は、３．９８ｘ１０３ＣＣＩＤ５０に同等である（図２３ｂ）ことが確認された。次いで、宿主生存に関する動物年齢および感染経路の影響を評価した；ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖを注射した１週齢のマウスの生存曲線は、接種経路には有意には影響を受けなかった（図２３ｃ）が、ウイルス注射部位とは無関係に、若い動物は、より高齢の動物よりも、一貫して劣った生存を示した（図２３ｄ）。より高齢の動物においてのみ、疾患重症度に対する感染経路の何らかの影響を識別することが可能であり；３週齢のマウスはＩ．Ｐ．感染に完全に耐性であったが、何匹かの動物は、Ｉ．Ｍ．経路を通じたウイルス注射を生き延びなかった（図２４ａおよび２４ｂ）。感染を生き延びたすべてのマウスでは、疾患のいかなる徴候も示さなかったものを含めて、血清変換が検出された（図２４ｃ、２４ｄおよび２４ｅ）。これらのデータは、ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖが、年齢１〜３週齢のマウスにおいて致死性である、急性および重症感染を誘導することを立証した。本明細書で試験した条件のうち、腹腔内または筋組織内いずれであっても、１０６  ＣＣＩＤ５０のウイルス用量を注射した１週齢マウスでは、疾患重症度がより大きかった。
【０１３４】
実施例２３
ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ感染マウスにおける疾患進行
[0143]ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖを接種された１週齢マウスの大部分は、疾患に屈し、そして神経学的疾病の多数の臨床的徴候を示した。感染動物は、安楽死の時点までに、一過性または持続性いずれかの、運動失調、局所または全身振戦、安定しない歩行、および四肢不全麻痺および麻痺を示した。臨床提示に基づき、病気の動物は、４つの群に容易に分類可能であった（表６）。生存者には、２８日の観察期間中のどの時点でも瀕死に見えなかったマウスが含まれた。クラスＩ動物は、わずか３〜７ＤＰＩ後、姿勢保持不能および昏迷または昏睡いずれかを含む、重度の徴候を示した。この群のすべてのマウスは、痙性四肢不全麻痺および／または麻痺（前肢、後肢、または両方）を示したが、何匹かの動物では呼吸症状を欠き（クラス１Ｂ）、他のものは、頻呼吸、しゃっくり、喘ぎ、および肋骨下後退を含む、呼吸困難の徴候によってさらに特徴付けられた（クラスＩＡ）。疾患のクラスＩＡ徴候を提示するＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ感染マウスにおける顕著な特徴の観察は、２匹の異なるクラスＩＡマウスの２つのビデオクリップを含むビデオによって行われた。どちらの動物も、姿勢保持不能であり、そして昏睡状態にあった。肋骨下後退を伴う頻呼吸として提示される重度呼吸困難が、最初のマウスでは明らかであった。喘ぎ、肋骨下後退、および鼻孔から出る泡状の液体が、第二のマウスで見られた。疾患のクラスＩＢ徴候を提示するＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ感染マウスにおける顕著な特徴の観察は、１匹のクラスＩＢマウスのビデオによって行われた。動物は、姿勢保持不能であり、そして昏迷状態にあった。右肢の同側性麻痺および左後肢の持続性振戦もまた観察された。最後に、クラスＩＩマウスは、７ＤＰＩ後、重度の体重喪失（＞２０％最大体重）とともに、四肢の持続性弛緩性麻痺（＞４８時間の期間）を含む感染の徴候を示した（図２３ｅ）。すべての疾患クラスにおいて、感染動物の何匹かは、数日間持続する、無毛病変または背中の脱毛スポットを示した（図２３ｆ）。ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖをＩ．Ｐ．接種した仔の大部分は、クラスＩに分類され（図２３ｇ）；クラスＩＡ動物は、１９．３％（ｎ＝１１；明らかな呼吸徴候）を構成し、一方、クラスＩＢ動物は４３．９％（ｎ＝２５；明らかでない呼吸徴候）を構成した。クラスＩＩ４動物は、感染仔のわずか１２．３％（ｎ＝７）にしか相当せず、そして生存者はすべての感染マウスの２４．５％（ｎ＝１４）を構成した。疾患カテゴリー間の分布の同様のパターンが、Ｉ．Ｍ．経路を通じて接種された仔でも観察された（図２３ｈ）。総合すると、これらのデータは、ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖに感染したマウスが、ヒト患者で観察される疾患の全スペクトルを反映する神経学的および呼吸症状の両方の多様な発生率および重症度を示すことを示した。
【０１３５】
表６
安楽死時点でのＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ感染ＢＡＬＢ／ｃマウスの臨床的特徴
【０１３６】
【表６】
0006772155.tif 000009
【０１３７】
ａ動物を観察期間の終了時（２８ＤＰＩ）に評価した
ｂ動物は姿勢保持不能であるが、爪先の物理的刺激に反応した。
ｃ動物は姿勢保持不能であり、そして爪先の物理的刺激に反応しなかった。
【０１３８】
ｄ頻脈は、クラスＩＢマウスの３５％で観察された
実施例２４
クラスＩＡ徴候を提示するマウスにおける神経原性肺浮腫
[0144]クラスＩＡマウスで観察される呼吸困難がウイルス誘導性肺浮腫（ＰＥ）の徴候であるかどうかをさらに調べた。クラスＩＡ、クラスＩＢ、およびクラスＩＩマウスの間の肉眼的な肺病理の比較によって、クラスＩＡ肺が膨らみ、剖検時に不完全に圧潰し（図２５ａ〜２５ｄ）、そして他の群由来の肺に比較して、増加した湿重量を示す（図２２Ｅ）ことが明らかになった。偽接種（図２５ｆ）およびクラスＩＡ肺由来の肺組織切片の比較によって、感染動物の肺胞空間にのみ、出血の限局性領域、ならびにタンパク質性および赤血球充填液体の集積があることが明らかになった（図２５ｇ）。これらの病理学的特徴は、クラスＩＢおよびクラスＩＩマウスの肺には存在しなかった（図２５ｈおよび２５ｉ）。さらに、本発明者らは、マウスのいかなる群から収集された肺においても、炎症性浸潤物またはウイルス抗原の証拠を見出さなかった（図２６ａ）。同様に、感染マウスの各クラスにおける心筋の組織化学的分析もまた、炎症性浸潤物、心筋壊死、またはウイルス抗原のいかなる証拠も見出すことが不可能であった（図２６ｂ）。総合すると、これらのデータは、クラスＩＡのマウスにおいて明らかな呼吸困難は、肺炎または鬱血性心不全のいずれにも起因しえないことを立証した。本発明者らはしたがって、この群で観察されるＰＥがニューロン原性のものであるかを決定することを試み、したがって、本発明者らは次に、カテコールアミンの血清レベルを測定して、神経伝達物質濃度が、呼吸徴候を伴うＥＶ７１：ＴＬＬｍｖ感染マウス（クラスＩＡ）において、調節されているかどうかを決定した。このアプローチを用いて、本発明者らは、アドレナリン（エピネフリン）およびノルアドレナリン（ノルエピネフリン）両方の血中濃度が、クラスＩＩマウスまたは偽感染動物のいずれかで検出されるものより、クラスＩＡマウスで有意により高いことを観察した（図２５ｊおよび２５ｋ）。これらのデータは、クラスＩＡマウスが、死亡前に、ＥＶ７１誘導性神経原性肺浮腫（ＮＰＥ）を示すことを強く示した。
【０１３９】
実施例２５
クラスＩＡ、クラスＩＢ、およびクラスＩＩマウスにおけるＥＶ７１：ＴＬＬｍｖウイルス向神経性
[0145]クラスＩＡマウスのみにおけるＮＰＥの選択的発展に寄与しうる因子を同定するため、各疾患群由来の動物の脳および脊髄におけるＥＶ７１：ＴＬＬｍｖおよびウイルス誘導性病変の分布を次に評価した。クラスＩＡおよびクラスＩＢの動物の大部分は、評価したＣＮＳ領域すべてに、ウイルス抗原の遍在性染色（＞１０の陽性ニューロンが検出された）および軽度の病変（＞５の病変が観察された）を示した（表７）。対照的に、クラスＩＩ疾患の５匹のマウスのうち１匹のみが、感覚皮質、海馬、間脳、中脳、延髄、または腰部脊髄にウイルス抗原および／または病変を示した。本発明者らは、ＣＮＳ外の、試験したいかなる組織でも、ウイルス抗原を検出することができなかった（Ｉ．Ｍ．経路を通じた接種後の骨格筋を除く；データ未提示）。
【０１４０】
表７
末期感染ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＥＶ７１抗原およびウイルス誘導性病変のＣＮＳ分布
【０１４１】
【表７】
0006772155.tif 000010
【０１４２】
ａスライドあたりで検出されるウイルス抗原の密度；＋、＜１０の陽性ニューロン；＋＋１０〜２０の陽性ニューロン；＋＋＋、＞２０の陽性ニューロン
ｂ明記する脳領域にウイルス抗原を示す動物の割合（ｎ＝５）
ｃ神経組織における病変の分布：＋、＜５の病変；＋＋５〜１０の病変；＋＋＋、＞１０の病変
ｄ明記する脳領域に病変を示す動物の割合（ｎ＝５）
[0146]クラスＩＡおよびクラスＩＢマウスの間のＣＮＳ病理を比較した際、組織病変およびウイルス抗原の両方が、海馬、間脳、中脳、小脳、および髄質内の同じ領域に局在しているが、病理はクラスＩＡ疾患を伴う動物でより重度である（表７および図２７ａ〜２７ｄ）ことが観察された。実際、クラスＩＢマウスと比較した際、クラスＩＡの動物は、海馬のＣＡ３ニューロンにおいて、より広範な神経変性、食作用、および壊死を示した（図２８ａおよび２８ｂ）。クラスＩＡマウスはまた、視床下部における強いウイルス抗原染色も示し、これには、顕著な組織炎症およびニューロン壊死が伴う一方、これらの病理学的特徴は、クラスＩＢ動物においては限定されていた（図２８ｃおよび２８ｄおよび図２７ｂ）。同様に、クラスＩＡマウスはまた、視床後腹側群（ｖｅｎｔｒｏ−ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｈａｌａｍｕｓ）（図２８ｅおよび２８ｆおよび図２７ｂ）、中脳水道周囲灰白質（ＰＡＧ）、中脳網状領域、および運動関連上丘を含む中脳関連組織（図２８ｇおよび２８ｈおよび図２７ｃ）、ならびに小脳のプルキニエ細胞および歯状核（図２８ｉおよび２８ｊ、図２７ｄおよび図２９ａ）において、より重度のウイルス誘導病理の特徴およびウイルス抗原強度を提示した。
【０１４３】
[0147]どちらの疾患群でも（クラスＩＡおよびクラスＩＢ）、ニューロン損傷および組織炎症を伴うウイルス抗原および病変の最も広範な分布が、延髄（図２８ｋおよび２８ｌ）、特に中間網状核（ＩＲＮ）、小細胞網状核（ＰＡＲＮ）、および三叉神経の脊髄路核（ｓｐｔＶ）の運動関連領域に検出された（図２７ｄおよび図２９ｂ）。しかし、クラスＩＡマウスのみが、髄質網状核（ＭｄＲＮ）の腹側および背側領域、孤束核（ＮＴＳ）および最後野（ＡＰ）において、ウイルス抗原および組織病変を示した（図２９ｂおよび２９ｃ）。比較のため、偽感染マウス由来の海馬、視床下部、視床、中脳、小脳、および髄質の代表的な画像もまた示す（図３０ａ〜３０ｆ）。対照的に、クラスＩＡおよびクラスＩＢマウスは、運動皮質、体性感覚皮質、脳橋または脊髄灰白質の前角内の、組織病変またはウイルス抗原染色の分布、局在または度合いに関して異ならず（図２８ｍおよび２８ｎ、図２７ａ〜２７ｃおよび図３１ａ〜３１ｅ）、これはＮＰＥが、全組織にわたる、ＥＶ７１誘導性病変の均一な増加よりも、特異的脳領域に対するウイルス誘発損傷によって引き起こされるという概念と一致する。
【０１４４】
[0148]本発明を説明する背景において（特に、以下の請求項の背景において）、用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」ならびに類似の参照対照の使用は、本明細書に別に示されるか、または背景によって明らかに矛盾しているのでない限り、単数形および複数形の両方を含むと見なされるものとする。用語「含む」、「有する」、「含まれる」および「含有する」は、別に示さない限り、無制限の（ｏｐｅｎ−ｅｎｄｅｄ）用語と見なされるものとする（すなわち「限定されるわけではないが含む」を意味する）。本明細書の値の範囲の列挙は、本明細書に別に示さない限り、範囲内に属する各別個の値に個々に言及する簡略化法として働くよう意図され、そして各別個の値は、本明細書に個々に言及されるかのように、本明細書内に取り込まれる。本明細書記載のすべての方法は、本明細書に別に示さない限り、または背景によって明らかに矛盾しているのではない限り、任意の適切な順で、実行可能である。本明細書に提供するあらゆる例、または例示的な言い方（例えば「例えば」）の使用は、単に、本発明の理解をより容易にすることを意図し、そして別に請求しない限り、本発明の範囲に対して限定を課さない。本明細書における言い方のいずれも、任意の非請求要素が、本発明の実施に必須のものであることを示すとは見なされないものとする。
【０１４５】
[0149]本発明の態様を本明細書に記載し、これには、本発明を実行するため、本発明者らに知られる最適な様式が含まれる。これらの態様の変型は、前述の説明を読むと、一般の当業者には明らかとなりうる。本発明者らは、当業者が、こうした変型を適切に使用することを予期し、そして本明細書に特に記載するものとは異なって本発明が実施されることを意図する。したがって、本発明には、適用可能な法律によって許可されるような、付随する請求項に列挙される主題のすべての修飾および同等物が含まれる。さらに、本明細書に別に示さない限り、または背景によって明らかに矛盾しない限り、すべてのありうる変型における上述の要素の任意の組み合わせが本発明に含まれる。
【０１４６】
参考文献一覧
【０１４７】
【化１−１】
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【０１４８】
【化１−２】
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【０１４９】
【化１−３】
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【０１５０】
【化１−４】
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【０１５１】
【化１−５】
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【０１５２】
【化１−６】
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【０１５３】
【化１−７】
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【０１５４】
【化１−８】
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【０１５５】
【化１−９】
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発明の態様
［態様１］齧歯類を感染させるために修飾したＥＶ７１に感染させた齧歯類を含む、エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）神経感染の動物モデル。
［態様２］修飾ＥＶ７１が齧歯類細胞株適合ＥＶ７１である、請求項１の動物モデル。
［態様３］修飾ＥＶ７１が、ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖである齧歯類細胞株適合ＥＶ７１である、請求項１または２の動物モデル。
［態様４］ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖが、タイプカルチャーコレクション中国センターに寄託され、そして寄託番号ＣＣＴＣＣ  Ｖ２０１４３８を割り当てられている、請求項３の動物モデル。
［態様５］修飾ＥＶ７１が、ＥＶ７１：ＴＬＬｍである齧歯類細胞株適合ＥＶ７１である、請求項１または２の動物モデル。
［態様６］ＥＶ７１：ＴＬＬｍが、タイプカルチャーコレクション中国センターに寄託され、そして寄託番号ＣＣＴＣＣ  Ｖ２０１４３７を割り当てられている、請求項５の動物モデル。
［態様７］修飾ＥＶ７１が、ＶＰ１に突然変異を含有するＥＶ７１クローン由来ウイルス（ＣＤＶ）である、請求項１の動物モデル。
［態様８］修飾ＥＶ７１が、ＥＶ７１  ＣＤＶ  ＣＤＶ：ＢＳＶＰ１［Ｋ９８Ｅ／Ｅ１４５Ａ／Ｌ１６９Ｆ］である、請求項１または７の動物モデル。
［態様９］齧歯類が免疫適格性である、請求項１〜６のいずれか一項の動物モデル。
［態様１０］齧歯類がマウスである、請求項９の動物モデル。
［態様１１］齧歯類細胞株がマウス細胞株ＮＩＨ／３Ｔ３である、請求項１０の動物モデル。
［態様１２］齧歯類が免疫適格性である、請求項７または８の動物モデル。
［態様１３］齧歯類がマウスである、請求項１２の動物モデル。
［態様１４］齧歯類細胞株がマウス細胞株ＮＩＨ／３Ｔ３またはマウス細胞株Ｎｅｕｒｏ−２ａである、請求項１３の動物モデル。
［態様１５］齧歯類が免疫適格性である、請求項１または２の動物モデル。
［態様１６］齧歯類がマウスである、請求項１５の動物モデル。
［態様１７］マウスがＢＡＬＢ／ｃマウスである、請求項１６の動物モデル。
［態様１８］抗ウイルス薬剤をスクリーニングする方法であって：動物の試験群および動物の対照群を提供し、ここで各群の動物は、請求項１〜１７のいずれか一項の動物モデルを含む；試験群に抗ウイルス薬剤候補を投与し；試験群および対照群において、疾患進行を監視し；試験群における疾患進行を対照群における疾患進行に比較し；そして対照群に比較して試験群において疾患進行を減少させる抗ウイルス薬剤候補を選択する工程を含む、前記方法。
［態様１９］抗ウイルス薬剤が、動物におけるスクリーニングの前に、まず、修飾エンテロウイルス７１に感染させた試験齧歯類細胞株においてスクリーニングされる、請求項１８の方法。
［態様２０］抗ウイルスワクチンをスクリーニングする方法であって：動物の試験群および動物の対照群を提供し、ここで各群の動物は、請求項１〜１７のいずれか一項の動物モデルを含む；試験群に抗ウイルスワクチン候補を投与し；試験群および対照群において、疾患進行を監視し；試験群における疾患進行を対照群における疾患進行に比較し；そして対照群に比較して試験群において疾患進行を減少させる抗ウイルスワクチン候補を選択する工程を含む、前記方法。
［態様２１］抗ウイルスワクチンが、動物におけるスクリーニングの前に、まず、修飾エンテロウイルス７１に感染させた試験齧歯類細胞株においてスクリーニングされる、請求項２０の方法。
［態様２２］齧歯類を、齧歯類を感染させるために修飾したＥＶ７１に感染させ、そして感染した齧歯類を飼育し、
それによって、ＥＶ７１神経感染の動物モデルを準備する
工程を含む、請求項１の動物モデルを調製する方法。
［態様２３］感染時の齧歯類の年齢が、約１週〜約４週の間である、請求項２２の方法。
［態様２４］感染齧歯類を、最長約４週間飼育する、請求項２２または２３の方法。
［態様２５］約１０３〜約１０７の中央値細胞培養感染用量を、齧歯類を感染させるために用いる、請求項２２〜２４のいずれか一項の方法。
［態様２６］修飾ＥＶ７１が、ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖである齧歯類細胞株適合ＥＶ７１である、請求項２２〜２５のいずれか一項の方法。
［態様２７］ＥＶ７１：ＴＬＬｍｖが、タイプカルチャーコレクション中国センターに寄託され、そして寄託番号ＣＣＴＣＣ  Ｖ２０１４３８を割り当てられている、請求項２６の方法。
［態様２８］修飾ＥＶ７１が、ＥＶ７１：ＴＬＬｍである齧歯類細胞株適合ＥＶ７１である、請求項２２〜２５のいずれか一項の方法。
［態様２９］ＥＶ７１：ＴＬＬｍが、タイプカルチャーコレクション中国センターに寄託され、そして寄託番号ＣＣＴＣＣ  Ｖ２０１４３７を割り当てられている、請求項２８の方法。
［態様３０］修飾ＥＶ７１が、ＶＰ１に突然変異を含有するＥＶ７１クローン由来ウイルス（ＣＤＶ）である、請求項２２〜２５のいずれか一項の方法。
［態様３１］修飾ＥＶ７１が、ＥＶ７１  ＣＤＶ  ＣＤＶ：ＢＳＶＰ１［Ｋ９８Ｅ／Ｅ１４５Ａ／Ｌ１６９Ｆ］である、請求項３０の方法。
［態様３２］齧歯類がマウスである、請求項２２〜３１のいずれか一項の方法。
［態様３３］マウスがＢＡＬＢ／ｃマウスである、請求項３２の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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