(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチド（Ｐ）の存在下で多能性幹細胞を培養する工程を含む多能性幹細胞の培養方法であって、
前記ポリペプチド（Ｐ）が、ＲＧＤ配列及びＧＡＧＡＧＳ配列（１）を含むタンパク質（Ａ１）、ＩＫＶＡＶ配列（３６）及びＧＡＧＡＧＳ配列（１）を含むタンパク質（Ａ２）並びに下記タンパク質（Ａ３）からなる群から選ばれる少なくとも１種のタンパク質であり、
前記タンパク質（Ａ１）が、ＲＧＤ配列がＧＡＧＡＧＳ配列（１）又はポリペプチド鎖（Ｙ）と交互に位置する配列であり、
前記ポリペプチド鎖（Ｙ）が、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２個以上連続して結合した配列であり、
前記タンパク質（Ａ１）において、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）とＲＧＤ配列との個数比率［（ＲＧＤ配列の個数）／｛ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の個数｝］が、０．００５〜０．５であり、
前記タンパク質（Ａ２）が、ＩＫＶＡＶ配列（３６）がＧＡＧＡＧＳ配列（１）又は前記ポリペプチド鎖（Ｙ）と交互に位置する配列であり、
前記タンパク質（Ａ２）において、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）とＩＫＶＡＶ配列（３６）との個数比率［（ＩＫＶＡＶ配列（３６）の個数）／｛ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の個数｝］が、０．００５〜０．５であり、
前記多能性幹細胞を培養する工程では、前記ポリペプチド（Ｐ）を培養液（Ｆ）に溶解して、前記ポリペプチド（Ｐ）を含む前記培養液（Ｆ）中で前記多能性幹細胞が集合した多能性幹細胞集合体を得ることを特徴とする多能性幹細胞の培養方法。
タンパク質（Ａ３）：タンパク質（Ａ１）又はタンパク質（Ａ２）にカルボキシル基、スルホ基、アミノ基、アンモニオ基及びヒドロキシル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の官能基（Ｋ）を導入した化学修飾タンパク質。
【請求項２】
前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、核移植ＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【請求項３】
前記多能性幹細胞集合体の個数平均粒子径が、５０〜５００μｍである請求項１又は２に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【請求項４】
更に、前記多能性幹細胞を培養液（Ｆ）の合計体積に基づいて５００〜１００，０００個／ｍＬの濃度で播種する工程を含む請求項１〜３のいずれかに記載の多能性幹細胞の培養方法。
【請求項５】
多能性幹細胞を播種する工程における前記ポリペプチド（Ｐ）の含有量が培養液（Ｆ）の合計体積に基づいて０．００１〜１０００μｇ／ｍＬである請求項４に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞の培養方法に関する。更に詳しくは、多能性幹細胞の分化多能性を維持したまま培養することができる培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療は、損傷や、機能を損失した臓器や組織に、体外で培養した細胞等を移植し、その損傷した組織や臓器の機能の復元を目指すものであり、現在治療が困難な症例に対し、唯一の治療法となり得る可能性を秘めた注目の技術である。移植される細胞の材料として想定されているのが、幹細胞である。特に、内胚葉、中胚葉、外胚葉の全てに分化可能な多能性幹細胞は、生体内の様々な細胞へと分化できる潜在的能力を有しているため、非常に有用な材料として期待されている。
【０００３】
多能性幹細胞を培養する方法としては、フィーダー細胞との共培養する方法及びマウスＥＨＳ肉腫から精製した基底膜成分であるマトリゲル（商品名）を用いる方法が知られている。しかし、これらの方法で培養した細胞は動物由来成分が混入するため、臨床用途では使用することができない。そのため、臨床用途では使用できる多能性幹細胞の培養方法として特定のタンパク質又は特定の高分子を含む培養基材を用いる方法が知られている。（例えば特許文献１、２）
【０００４】
しかし、特許文献１及び特許文献２に記載の方法では、高価な増殖因子等を用いるため、大量に培養することが困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１１−７８３７０号公報
【特許文献２】国際公開第２００６／０９３２０７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、高価な増殖因子を用いることなく臨床用途で使用できる多能性幹細胞を大量に培養することができる培養方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意研究を重ねてきた結果、本発明に到達した。
すなわち、本発明は細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）を１分子中に少なくとも１個有するポリペプチド（Ｐ）の存在下で多能性幹細胞を培養する工程を含むことを特徴とする多能性幹細胞の培養方法である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の多能性幹細胞の培養方法を用いると、高価なフィーダー細胞や動物由来成分を含まずに、分化多能性を維持した多能性幹細胞を効率的に大量に培養することが可能である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）を１分子中に少なくとも１個有するポリペプチド（Ｐ）の存在下で培養することを特徴とする多能性幹細胞の培養方法である。
ポリペプチド（Ｐ）は、多能性幹細胞の表面に存在する受容体と結合することができ、ポリペプチド（Ｐ）の種類に応じて多能性幹細胞に対して特異的な刺激を与えることによって、多能性幹細胞の分化多能性を維持したまま増殖させることや、特定の分化方向へ誘導をかけることができる。
【００１０】
本発明において細胞接着性とは、多能性幹細胞の表面に存在する受容体と結合することができる能力を意味する。
【００１１】
細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）とは、細胞に接着する能力を有するアミノ酸配列の最小単位であり、例えば、ＲＧＤ配列、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）又はＩＫＶＡＶ配列（３６）があげられる。
【００１２】
ポリペプチド（Ｐ）としては、ポリペプチド（Ｐ）の多能性幹細胞への結合性及びポリペプチド（Ｐ）の安定性の観点から、下記タンパク質（Ａ１）〜（Ａ３）からなる群から選ばれる少なくとも１種のタンパク質であることが好ましい。
タンパク質（Ａ１）：ＲＧＤ配列及びＧＡＧＡＧＳ配列（１）を含むタンパク質。
タンパク質（Ａ２）：ＩＫＶＡＶ配列（３６）及びＧＡＧＡＧＳ配列（１）を含むタンパク質。
タンパク質（Ａ３）：タンパク質（Ａ１）又はタンパク質（Ａ２）にカルボキシル基、スルホ基、アミノ基、アンモニオ基及びヒドロキシル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の官能基（Ｋ）を導入した化学修飾タンパク質。
これらのタンパク質（Ａ１）〜（Ａ３）は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００１３】
本発明において、タンパク質（Ａ１）及びタンパク質（Ａ２）としては、天然物から抽出されたものでもよく、人工的に製造されるものでもよいが、動物由来成分を排除する観点から、人工的に製造されるタンパク質が好ましい。人工的に製造する方法としては、有機合成法（酵素法、固相合成法及び液相合成法等）及び遺伝子組み換え法等が挙げられる。
有機合成法としては、「生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ（１９８１年７月１日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」及び「続生化学実験講座２、タンパク質の化学（下）（昭和６２年５月２０日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」に記載されている方法等が適用できる。
遺伝子組み換え法に関しては、特許第３３３８４４１号公報に記載されている方法等が適用できる。有機合成法及び遺伝子組み換え法のうち、アミノ酸配列を簡便に変更でき、安価に大量生産できるという観点等から、遺伝子組み換え法が好ましい。
【００１４】
タンパク質（Ａ１）はＲＧＤ配列及びＧＡＧＡＧＳ配列（１）を含むタンパク質である。
タンパク質（Ａ１）中に含まれる全アミノ酸数に対するＲＧＤ配列のアミノ酸の合計数の割合は、細胞結合性の観点から、１％〜２０％が好ましく、更に好ましくは１％〜８％である。
タンパク質（Ａ１）中に含まれる全アミノ酸数に対するＧＡＧＡＧＳ配列（１）のアミノ酸の合計数の割合は、熱安定性の導入効率の観点から、４０％〜９０％が好ましく、更に好ましくは６０％〜９０％である。
タンパク質（Ａ１）は、タンパク質（Ａ１）に含まれる細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）が細胞表面の受容体と結合することによってタンパク質が細胞接着性を発現する。
【００１５】
タンパク質（Ａ１）中に含まれる全アミノ酸数に対するＲＧＤ配列のアミノ酸数の合計数の割合は、下記条件によって求められる。
特定のアミノ酸残基で切断できる切断方法から２種類以上を用いて、タンパク質（Ａ１）を３０残基以下程度まで分解する。その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分離した後、プロテインシーケンサーにてアミノ酸配列を読み取る。得られたアミノ酸配列からペプチドマッピングして、タンパク質（Ａ１）の全配列を決定する。その後、以下記載の測定式にてタンパク質（Ａ１）中の全アミノ酸数に対する全てのＲＧＤ配列中のアミノ酸数の割合を算出する。
タンパク質（Ａ１）中の全アミノ酸数に対する全てのＲＧＤ配列中のアミノ酸数の割合（％）＝［｛ＲＧＤ配列の数｝×３］÷｛タンパク質（Ａ１）中の全アミノ酸数｝×１００
【００１６】
タンパク質（Ａ１）中に含まれる全アミノ酸数に対するＧＡＧＡＧＳ配列（１）のアミノ酸の合計数の割合は、上記のＲＧＤ配列と同様にして以下の数式にて求められる。
タンパク質（Ａ１）中に含まれる全アミノ酸数に対するＧＡＧＡＧＳ配列（１）のアミノ酸の合計数の割合（％）＝［｛ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の数｝×６］÷｛タンパク質（Ａ１）中の全アミノ酸数｝×１００
【００１７】
タンパク質（Ａ１）において、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）とＲＧＤ配列との個数比率［（ＲＧＤ配列の個数）／｛ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の個数｝］は、熱安定性と多能性幹細胞への結合性の観点とから、０．００５〜０．５が好ましく、更に好ましくは０．０１〜０．２である。
【００１８】
タンパク質（Ａ１）は、熱安定性の観点から、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２個以上連続して結合したポリペプチド鎖（Ｙ）を有することが好ましく、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が連続する個数は、２〜５０個が更に好ましく、より好ましくは２〜３３個であり、特に好ましくは２〜１６個である。
【００１９】
タンパク質（Ａ１）は、熱安定性の観点から、ＲＧＤ配列がＧＡＧＡＧＳ配列（１）又はポリペプチド鎖（Ｙ）と交互に位置することが好ましく、特に好ましくはＲＧＤ配列がポリペプチド鎖（Ｙ）とが交互に位置することである。
【００２０】
タンパク質（Ａ１）において、ＲＧＤ配列がＧＡＧＡＧＳ配列（１）又はポリペプチド鎖（Ｙ）と交互に位置する場合、タンパク質（Ａ１）はＲＧＤ配列とＧＡＧＡＧＳ配列（１）との繰り返し単位又はＲＧＤ配列とポリペプチド鎖（Ｙ）との繰り返し単位を有するが、タンパク質（Ａ１）に含まれるこれら両繰り返し単位の数は、タンパク質（Ａ１）の熱安定性及びタンパク質（Ａ１）の多能性幹細胞への結合性の観点から、１〜５０が好ましく、更に好ましくは２〜４０、特に好ましくは３〜３０、最も好ましくは４〜２０である。
【００２１】
タンパク質（Ａ１）において、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が連続する個数、ＲＧＤ配列とＧＡＧＡＧＳ配列（１）又はポリペプチド鎖（Ｙ）との繰り返し単位の数、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）とＲＧＤ配列のそれぞれの個数はタンパク質（Ａ１）のアミノ酸配列を前記のプロテインシーケンサーによって読み取ることで得られる。
また、タンパク質（Ａ１）におけるＧＡＧＡＧＳ配列（１）又はポリペプチド鎖（Ｙ）とＲＧＤ配列との位置関係もタンパク質（Ａ１）のアミノ酸配列を前記のプロテインシーケンサーによって読み取ることで得られる。
【００２２】
タンパク質（Ａ１）は、分岐鎖を有していてもよいし、環状構造を有していてもよいし、一部が架橋していてもよいが、多能性幹細胞への結合性という観点から、架橋されていないことが好ましく、環状構造を有しない構造がより好ましく、更に好ましいのは直鎖構造又は分岐鎖を有する構造であり、特に好ましいのは直鎖構造である。なお、直鎖構造には、βシート構造（直鎖ペプチドが折れ曲がって直鎖ペプチド同士が平行に並び、その間に水素結合が作られる二次構造）も含まれる。
【００２３】
タンパク質（Ａ１）は、熱安定性及びポリペプチド（Ｐ）の多能性幹細胞への結合性の観点から、ＲＧＤ配列とＧＡＧＡＧＳ配列（１）又はポリペプチド鎖（Ｙ）とが、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）又はポリペプチド鎖（Ｙ）とＲＧＤ配列との間に他のアミノ酸配列を介して、交互に化学結合してなる構造であってもよく、ＲＧＤ配列の末端に後述するアミノ酸配列（Ｔ）を有するアミノ酸配列とＧＡＧＡＧＳ配列（１）又はポリペプチド鎖（Ｙ）とが交互に化学結合してなる構造であってもよい。
【００２４】
ＲＧＤ配列の末端としては、Ｎ末端及びＣ末端があり、ＲＧＤ配列の末端に後述するアミノ酸配列（Ｔ）のうち、ＲＧＤ配列のＮ末端に結合するアミノ酸配列（Ｔ１）としては、多能性幹細胞への接合性の観点から、好ましいのは（ＧＶＰＧＶ）２ＧＧ配列（２）、ＲＫＬＰＤＡ配列（３）、ＧＡＡＶＴＧ配列（４）、ＧＬＰＧＰＫＧＤ配列（５）、ＧＧＰＡＶＴＧ配列（６）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡＶＴＧ配列（７）、ＧＡＡＶＣＥＰＧ配列（８）、ＧＡＡＬＣＶＳＥＰＧ配列（９）、ＳＰＡＳＡＡＬＣＶＳＥＰＧ配列（１０）、ＳＰＡＳＡＡＶＣＥＰＧ配列（１１）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡＶＣＥＰＧ配列（１２）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡＬＣＶＳＥＰＧ配列（１３）、ＧＰＡＶＣＥＰＧ配列（１４）、ＧＰＡＬＣＶＳＥＰＧ配列（１５）又はＧＡＡＰＧＡＳ配列（１６）であり、更に好ましいのは（ＧＶＰＧＶ）２ＧＧ配列（２）、ＲＫＬＰＤＡ配列（３）、ＧＡＡＶＴＧ配列（４）、ＧＬＰＧＰＫＧＤ配列（５）、ＧＧＰＡＶＴＧ配列（６）又はＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡＶＴＧ配列（７）であり、特に好ましいのは（ＧＶＰＧＶ）２ＧＧ配列（２）、ＲＫＬＰＤＡ配列（３）又はＧＡＡＶＴＧ配列（４）である。
【００２５】
ＲＧＤ配列の末端に後述するアミノ酸配列（Ｔ）のうち、ＲＧＤ配列のＣ末端に結合するアミノ酸配列（Ｔ２）としては、多能性幹細胞への接合性の観点から、好ましいものは（ＧＶＰＧＶ）２ＧＧ配列（２）、ＲＫＬＰＤＡ配列（３）、ＳＰＡＳＡＡＧＹ配列（１７）、ＳＰＡＳＡＡＬＣＶＳ配列（１８）、ＳＰＡＳＡＡＶＣ配列（１９）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰ配列（２０）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡＶＣ配列（２１）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡＬＣＶＳ配列（２２）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰ配列（２３）、ＳＰＡＳＡＡＧＰＶＧＳＰ配列（２４）、ＣＤＡＧＹ配列（２５）、ＣＤＡＧＰＶＧＳＰ配列（２６）又はＳＡＧＰＳＡＧＹ配列（２７）であり、更に好ましいのは（ＧＶＰＧＶ）２ＧＧ配列（２）、ＲＫＬＰＤＡ配列（３）、ＳＰＡＳＡＡＧＹ配列（１７）、ＳＰＡＳＡＡＬＣＶＳ配列（１８）、ＳＰＡＳＡＡＶＣ配列（１９）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰ配列（２０）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡＶＣ配列（２１）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡＬＣＶＳ配列（２２）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰ配列（２３）又はＳＰＡＳＡＡＧＰＶＧＳＰ配列（２４）であり、特に好ましいのは（ＧＶＰＧＶ）２ＧＧ配列（２）、ＲＫＬＰＤＡ配列（３）又はＳＰＡＳＡＡＧＹ配列（１７）である。
【００２６】
ＲＧＤ配列の末端にアミノ酸配列（Ｔ）を有するアミノ酸配列は、アミノ酸配列（Ｔ）を複数個有していてもよく、複数個ある場合のアミノ酸配列（Ｔ）はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
【００２７】
タンパク質（Ａ１）の好ましいものとしては、以下のものが挙げられる。
（ＧＡＧＡＧＳ）９配列（２８）（Ｙ１）、ＧＡＡＶＴＧ配列（４）、ＲＧＤ配列及びＳＰＡＳＡＡＧＹ配列（１７）が順に１３回繰り返してなる構造を有する数平均分子量（以下、Ｍｎと略記）約１１万の配列（２９）のタンパク質（Ａ１１）；
（ＧＡＧＡＧＳ）９配列（２８）（Ｙ１）、ＧＡＡＶＴＧ配列（４）、ＲＧＤ配列及びＳＰＡＳＡＡＧＹ配列（１７）が順に５回繰り返してなる構造を有するＭｎ約２万の配列（３１）のタンパク質（Ａ１２）；
（ＧＶＰＧＶ）２ＧＧ配列（２）、（ＧＡＧＡＧＳ）３配列（３０）（Ｙ２）、ＧＡＡＶＴＧ配列（４）、ＲＧＤ配列及びＳＰＡＳＡＡＧＹ配列（１７）が順に３回繰り返してなる構造を有するＭｎ約１万の配列（３２）のタンパク質（Ａ１３）等。
【００２８】
タンパク質（Ａ２）はＩＫＶＡＶ配列（３６）及びＧＡＧＡＧＳ配列（１）を含むタンパク質である。
タンパク質（Ａ２）中に含まれる全アミノ酸数に対する全てのＩＫＶＡＶ配列（３６）のアミノ酸の合計数の割合は、細胞結合性の観点から、１％〜２５％が好ましく、更に好ましくは１％〜１０％である。
タンパク質（Ａ２）中に含まれる全アミノ酸数に対するＧＡＧＡＧＳ配列（１）のアミノ酸の合計数の割合は、熱安定性の導入効率の観点から、４０％〜９０％が好ましく、更に好ましくは６０％〜９０％である。
タンパク質（Ａ２）は、タンパク質（Ａ２）に含まれる細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）が細胞表面の受容体と結合することによって細胞接着性を発現する。
タンパク質（Ａ２）中に含まれる全アミノ酸数に対するＩＫＶＡＶ配列（３６）のアミノ酸の合計数の割合及び全アミノ酸数に対するＧＡＧＡＧＳ配列（１）のアミノ酸の合計数の割合は、上記タンパク質（Ａ１）のアミノ酸数等を測定する方法と同様の方法で、プロテインシーケンサーによって全配列を決定することで求めることができ、タンパク質（Ａ１）におけるＲＧＤ配列を、ＩＫＶＡＶ配列（３６）と置き換えることで、計算することができる。
【００２９】
タンパク質（Ａ２）において、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）とＩＫＶＡＶ配列（３６）との個数比率［（ＩＫＶＡＶ配列（３６）の個数）／｛ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の個数｝］は、熱安定性と多能性幹細胞への結合性の観点とから、０．００５〜０．５が好ましく、更に好ましくは０．０１〜０．２である。
【００３０】
タンパク質（Ａ２）は、熱安定性の観点から、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２個以上連続して結合したポリペプチド鎖（Ｙ）を有することが好ましく、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が連続する個数は、２〜５０個が更に好ましく、より好ましくは２〜３３個であり、特に好ましくは２〜１６個である。
【００３１】
タンパク質（Ａ２）は、熱安定性の観点から、ＩＫＶＡＶ配列（３６）がＧＡＧＡＧＳ配列（１）又はポリペプチド鎖（Ｙ）と交互に位置することが好ましく、特に好ましくはＩＫＶＡＶ配列（３６）がポリペプチド鎖（Ｙ）と交互に位置することである。
【００３２】
タンパク質（Ａ２）において、ＩＫＶＡＶ配列（３６）がＧＡＧＡＧＳ配列（１）又はポリペプチド鎖（Ｙ）と交互に位置する場合、タンパク質（Ａ２）はＩＫＶＡＶ配列（３６）とＧＡＧＡＧＳ配列（１）との繰り返し単位又はＩＫＶＡＶ配列（３６）とポリペプチド鎖（Ｙ）との繰り返し単位を有するが、タンパク質（Ａ２）に含まれるこれら両繰り返し単位の数は、タンパク質（Ａ２）の熱安定性及びタンパク質（Ａ２）の多能性幹細胞への結合性の観点から、１〜５０が好ましく、更に好ましくは２〜４０、特に好ましくは３〜３０、最も好ましくは４〜２０である。
【００３３】
タンパク質（Ａ２）において、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が連続する個数、ＩＫＶＡＶ配列（３６）とＧＡＧＡＧＳ配列（１）又はポリペプチド鎖（Ｙ）との繰り返し単位の数、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）とＩＫＶＡＶ配列（３６）のそれぞれの個数はタンパク質（Ａ２）のアミノ酸配列を前記のプロテインシーケンサーによって読み取ることで得られる。
また、タンパク質（Ａ２）におけるＧＡＧＡＧＳ配列（１）又はポリペプチド鎖（Ｙ）とＩＫＶＡＶ配列（３６）との位置はアミノ酸配列を前記のプロテインシーケンサーによって読み取ることで得られる。
【００３４】
タンパク質（Ａ２）は、分岐鎖を有していてもよいし、環状構造を有していてもよいし、一部が架橋していてもよいが、多能性幹細胞への結合性という観点から、架橋されていないことが好ましく、環状構造を有しない構造がより好ましく、更に好ましいのは直鎖構造又は分岐鎖を有する構造であり、特に好ましいのは直鎖構造である。なお、直鎖構造には、βシート構造（直鎖ペプチドが折れ曲がって直鎖ペプチド同士が平行に並び、その間に水素結合が作られる二次構造）も含まれる。
【００３５】
タンパク質（Ａ２）は、熱安定性及びポリペプチド（Ｐ）の多能性幹細胞への結合性の観点から、ＩＫＶＡＶ配列（３６）とＧＡＧＡＧＳ配列（１）又はポリペプチド鎖（Ｙ）とが、ＩＫＶＡＶ配列（３６）とＧＡＧＡＧＳ配列（１）又はポリペプチド鎖（Ｙ）との間に他のアミノ酸配列を介して、交互に化学結合してなる構造であってもよく、ＩＫＶＡＶ配列（３６）の末端に後述するアミノ酸配列（Ｕ）を有するアミノ酸配列とＧＡＧＡＧＳ配列（１）又はポリペプチド鎖（Ｙ）とが交互に化学結合してなる構造であってもよい。
【００３６】
ＩＫＶＡＶ配列（３６）の末端としては、Ｎ末端及びＣ末端があり、ＩＫＶＡＶ配列（３６）の末端に後述するアミノ酸配列（Ｕ）のうち、ＩＫＶＡＶ配列（３６）のＮ末端に結合するアミノ酸配列（Ｕ１）としては、前記のＲＧＤ配列のＮ末端に結合するアミノ酸配列（Ｔ１）と同じ配列が挙げられ、好ましい配列も同じである。
【００３７】
ＩＫＶＡＶ配列（３６）の末端に後述するアミノ酸配列（Ｕ）のうち、ＩＫＶＡＶ配列（３６）のＣ末端に結合するアミノ酸配列（Ｕ２）としては、前記のＲＧＤ配列のＣ末端に結合するアミノ酸配列（Ｔ２）と同じ配列が挙げられ、好ましい配列も同じである。
【００３８】
ＩＫＶＡＶ配列（３６）の末端にアミノ酸配列（Ｕ）を有するアミノ酸配列は、アミノ酸配列（Ｕ）を複数個有していてもよく、複数個ある場合のアミノ酸配列（Ｕ）はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
【００３９】
タンパク質（Ａ２）のうち、好ましいものとしては、以下のものが挙げられる。
（ＧＡＧＡＧＳ）９配列（２８）（Ｙ１）、ＧＡＡＰＧＡＳ配列（１６）、ＩＫＶＡＶ配列（３６）及びＳＡＧＰＳＡＧＹ配列（２７）が順に１３回繰り返してなる構造を有するＭｎ約１１万の配列（３３）のタンパク質；
（ＧＡＧＡＧＳ）９配列（２８）（Ｙ１）、ＧＡＡＰＧＡＳ配列（１６）、ＩＫＶＡＶ配列（３６）及びＳＡＧＰＳＡＧＹ配列（２７）が順に５回繰り返してなる構造を有するＭｎ約２万の配列（３４）のタンパク質；
（ＧＶＰＧＶ）２ＧＧ配列（２）、（ＧＡＧＡＧＳ）３配列（３０）（Ｙ２）、ＧＡＡＰＧＡＳ配列（１６）、ＩＫＶＡＶ配列（３６）及びＳＡＧＰＳＡＧＹ配列（２７）が順に３回繰り返してなる構造を有するＭｎ約１万の配列（３５）のタンパク質等。
【００４０】
本発明におけるタンパク質（Ａ３）は、タンパク質（Ａ１）又はタンパク質（Ａ２）にカルボキシル基、スルホ基、アミノ基、アンモニオ基及びヒドロキシル基からなる群から選ばれる少なくとも１種の官能基（Ｋ）を導入した化学修飾タンパク質である。
【００４１】
タンパク質（Ａ１）又はタンパク質（Ａ２）への官能基（Ｋ）の導入は、タンパク質（Ａ１）又はタンパク質（Ａ２）が有する反応性基含有アミノ酸残基（Ｚ）にカルボキシル基、スルホ基、アミノ基、アンモニオ基及びヒドロキシル基からなる群から選ばれる少なくとも１種の官能基（Ｋ）を有する化合物（Ｂ）を反応して化学修飾することにより行うことができる。
なお、カルボキシル基及びスルホ基は、アルカリ金属カチオン（ナトリウムイオン及びカリウムイオン等）及びアルカリ土類金属カチオン（カルシウムイオン等）等との塩を形成していてもよい。
【００４２】
反応性基含有アミノ酸残基（Ｚ）とは、タンパク質（Ａ１）及びタンパク質（Ａ２）を構成するアミノ酸の主鎖を形成するペプチド結合に用いられるカルボキシル基及びアミノ基以外の反応性基を含有するアミノ酸残基を意味する。
【００４３】
反応性基含有アミノ酸残基（Ｚ）が含有する反応性基とは、化合物（Ｂ）と反応することができる反応性基であり、好ましいものとしてはヒドロキシル基、カルボキシル基、メルカプト基、第１級アミノ基及び第２級アミノ基が挙げられる。
反応性基のうち、化合物（Ｂ）との結合形成の容易さ、ポリペプチド（Ｐ）の多能性幹細胞への結合性の観点から、ヒドロキシル基、カルボキシル基及び第１級アミノ基が好ましく、更に好ましくはヒドロキシル基及びカルボキシル基、特に好ましくはヒドロキシル基である。
【００４４】
反応性基含有アミノ酸残基（Ｚ）としては、反応性基がヒドロキシル基であるセリン残基及びトレオニン残基、反応性基がカルボキシル基であるアスパラギン酸残基及びグルタミン酸残基、反応性基が第１級アミノ基であるリシン残基、反応性基が第１級及び第２級アミノ基であるアルギニン残基、並びに反応性基が第２級アミノ基であるヒスチジン残基及びトリプトファン残基、反応性基がメルカプト基であるシステイン残基等が挙げられる（バイオコンジュゲート  テクニークス、Ｇｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ著、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ発行、１９９６）。
反応性基含有アミノ酸残基（Ｚ）の内、化合物（Ｂ）との反応性の観点から、セリン残基、トレオニン残基、チロシン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、リシン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基及びトリプトファン残基が好ましく、更に好ましくはセリン残基、トレオニン残基、アスパラギン酸残基及びグルタミン酸残基であり、特に好ましくはセリン残基又はトレオニン残基である。
【００４５】
タンパク質（Ａ１）又はタンパク質（Ａ２）が有する反応性基含有アミノ酸残基（Ｚ）と化合物（Ｂ）との反応により官能基（Ｋ）が導入する場合、ポリペプチド（Ｐ）の多能性幹細胞への結合性の観点から、化合物（Ｂ）とタンパク質（Ａ１）又はタンパク質（Ａ２）とを物理吸着（ファンデルワールス力による吸着）及び化学結合（共有結合、イオン結合、水素結合等）等によって結合することが好ましく、化学結合によって結合することが更に好ましい。
【００４６】
化合物（Ｂ）とタンパク質（Ａ１）及びタンパク質（Ａ２）とを化学結合させる方法としては、公知の方法が適用でき、特開２００７−５１１２７号公報等に記載の方法が挙げられる。化学結合の内、結合の強さ、多能性幹細胞接着性、及び再現性の観点から、共有結合が好ましい。
なお、化学結合を形成する反応には反応溶媒を使用してもよく、反応溶媒としては公知のものが使用でき、例えば、水、臭化リチウム水溶液、過塩素酸リチウム水溶液、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、ジメチルスルフォキシド、ジメチルアセトアミド、テトラヒドロフラン及びこれらの少なくとも１種類を含む混合溶媒等が挙げられる。
【００４７】
タンパク質（Ａ１）又はタンパク質（Ａ２）が有する反応性基含有アミノ酸残基（Ｚ）と化合物（Ｂ）との反応により官能基（Ｋ）を共有結合により導入する方法としては、反応性基含有アミノ酸残基（Ｚ）が有する反応性基がヒドロキシル基である場合、官能基（Ｋ）を有するハロゲン化物である化合物を用いてタンパク質（Ａ１）又はタンパク質（Ａ２）とをエーテル化反応（ウイリアムソン合成法）する方法、及び官能基（Ｋ）を有するカルボン酸と反応性基含有アミノ酸残基（Ｚ）が有するヒドロキシル基をエステル化反応する方法等が挙げられる。
官能基（Ｋ）を有するハロゲン化物である化合物としては、炭素数２〜３０のカルボン酸のハロゲン化物、炭素数２〜３０のスルホン酸のハロゲン化物、炭素数２〜３０のアミノ基を有するハロゲン化物、炭素数２〜３０のアルコールのハロゲン化物及び炭素数２〜３０のアンモニオ基を有するハロゲン化物等が挙げられる。
官能基（Ｋ）を有するカルボン酸としては、炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するアルコール、炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するスルホン酸、炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するアミン及び炭素数２〜３０のアンモニオ基を有するカルボン酸等が挙げられる。
官能基（Ｋ）を有するカルボン酸と反応性基含有アミノ酸残基（Ｚ）が有するヒドロキシル基をエステル化反応する場合、炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するスルホン酸が有するスルホ基は、アルカリ金属カチオン（ナトリウムイオン及びカリウムイオン等）及びアルカリ土類金属カチオン（カルシウムイオン等）等との塩を形成していてもよい。
【００４８】
反応性基含有アミノ酸残基（Ｚ）が有する反応性基がカルボキシル基の場合、官能基（Ｋ）を有するアミンと反応性基含有アミノ酸残基（Ｚ）が有するカルボキシル基とをアミド化反応する方法及び官能基（Ｋ）を有するアルコールと反応性基含有アミノ酸残基（Ｚ）が有するカルボキシル基とをエステル化反応する方法等が挙げられる。
官能基（Ｋ）を有するアミンとしては、炭素数２〜３０のアミノ基を有するアルコール、炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するアミン及び炭素数２〜３０のスルホ基を有するアミン等が挙げられる。
官能基（Ｋ）を有するアルコールとしては、炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するアルコール、炭素数２〜３０のアミノ基を有するアルコール、炭素数２〜３０のスルホ基を有するアルコール及び炭素数２〜３０のアンモニオ基を有するアルコール等が挙げられる。
官能基（Ｋ）を有するアミンと反応性基含有アミノ酸残基（Ｚ）が有するカルボキシル基とをアミド化反応する場合において、炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するアミンのカルボキシル基及び炭素数２〜３０のスルホ基を有するアミンのスルホ基は、アルカリ金属カチオン（ナトリウムイオン及びカリウムイオン等）及びアルカリ土類金属カチオン（カルシウムイオン等）等との塩を形成していてもよい。
官能基（Ｋ）を有するアルコールと反応性基含有アミノ酸残基（Ｚ）が有するカルボキシル基とをエステル化反応する場合、炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するアルコールのカルボキシル基及び炭素数２〜３０のスルホ基を有するアルコールのスルホ基は、アルカリ金属カチオン（ナトリウムイオン及びカリウムイオン等）及びアルカリ土類金属カチオン（カルシウムイオン等）等との塩を形成していてもよい。
【００４９】
タンパク質（Ａ１）又はタンパク質（Ａ２）が有する反応性基含有アミノ酸残基（Ｚ）と化合物（Ｂ）とを用いて官能基（Ｋ）をイオン結合により導入する方法としては、反応性基含有アミノ酸残基（Ｚ）が有する反応性基がアミノ基である場合、官能基（Ｋ）を有するカルボン酸で反応性基含有アミノ酸残基（Ｚ）が有するアミノ基を中和反応する方法等が挙げられる。反応性基含有アミノ酸残基（Ｚ）が有するアミノ基を中和反応する場合、反応性基含有アミノ酸残基（Ｚ）が有するアミノ基を塩酸等の無機酸を用いて中和してから炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するスルホン酸又は炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するアルコールとのイオン交換反応を行っても良い。
官能基（Ｋ）を有するカルボン酸としては、炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するアルコール、炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するスルホン酸、炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するアミン及び炭素数２〜３０のアンモニオ基を有するカルボン酸等が挙げられる。
官能基（Ｋ）を有するカルボン酸で反応性基含有アミノ酸残基（Ｚ）が有するアミノ基を中和反応する場合、炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するスルホン酸が有するスルホ基は、アルカリ金属カチオン（ナトリウムイオン及びカリウムイオン等）及びアルカリ土類金属カチオン（カルシウムイオン等）等との塩を形成していてもよい。
【００５０】
炭素数２〜３０のカルボン酸のハロゲン化物はハロゲン化アシルではなく、炭素数２〜３０のカルボン酸が有する炭素原子に結合する水素原子をハロゲン原子で置換した化合物が挙げられ、フルオロ酢酸、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、２−クロロプロピオン酸、３−クロロプロピオン酸、ω−クロロオクタデカン酸、ω−ブロモエイコサン酸及びω−クロロトリコサン酸等が挙げられ、クロロ酢酸が好ましい。
【００５１】
炭素数２〜３０のスルホン酸のハロゲン化物はスルホン酸が有する炭素原子に結合した水素原子をハロゲン原子で置換した化合物が挙げられ、クロロスルホン酸（ＣｌＳＯ３Ｈ）、クロロエタンスルホン酸、フルオロスルホン酸、ｐ−クロロベンゼンスルホン酸、ω−クロロオクタデカンスルホン酸、ω−クロロトリコサンスルホン酸及びこれらの塩（アルカリ金属塩）等が挙げられ、クロロエタンスルホン酸が好ましい。
【００５２】
炭素数２〜３０のアミノ基を有するハロゲン化物としては、炭素数２〜１７のハロゲン化（塩素及び臭素等）アルキル基を有するアミンが挙げられ、アミノエチルクロリド、Ｎ−メチルアミノプロピルクロリド、ジメチルアミノエチルクロリド、ジエチルアミノエチルクロリド、ジベンジルアミノエチルブロミド、ジメチルアミノプロピルブロミド、ジエチルアミノプロピルクロリド及びジベンジルアミノプロピルクロリド等が挙げられる。
【００５３】
炭素数２〜３０のアルコールのハロゲン化物としては、２−フルオロエタノール、クロロエタノール、３−ブロモプロピルアルコール、ｐ−クロロフェノール、ω−クロロオクタデシルアルコール、ω−ブロモエイコシルアルコール及びω−クロロトリコシルアルコール等が挙げられ、クロロエタノールが好ましい。
【００５４】
炭素数２〜３０のアンモニオ基を有するハロゲン化物としては、前記の炭素数２〜３０のアミノ基を有するハロゲン化物が有するアミノ基を４級化剤（メチルクロリド、エチルクロリド、ベンジルクロリド、ジメチル炭酸、ジメチル硫酸及びエチレンオキシド等）によって４級化した化合物が挙げられ、クロロエチルトリメチルアンモニウムクロリドが好ましい。
【００５５】
炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するアルコールとしては、ヒドロキシ酢酸、ヒドロキシプロピオン酸、パントテン酸、グルクロン酸、サリチル酸、４−ヒドロキシ安息香酸、ヒドロキシ基を有するアミノ酸（Ｓｅｒ及びＴｈｒ）、ω−ヒドロキシオクタデカン酸、ω−ヒドロキシエイコサン酸及びω−ヒドロキシトリコサン酸等が挙げられる。
【００５６】
炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するスルホン酸としては、スルホ酢酸、スルホコハク酸、ｏ−スルホ安息香酸、ｍ−スルホ安息香酸、ｐ−スルホ安息香酸、２，４−ジスルホ安息香酸、３−スルホフタル酸、３，５−ジスルホフタル酸、４−スルホイソフタル酸、２−スルホテレフタル酸、２−メチル−４−スルホ安息香酸、２−メチル−３，５−ジスルホ安息香酸、４−プロピル−３−スルホ安息香酸、４−イソプロピル−３−スルホ安息香酸、２，４，６−トリメチル−３−スルホ安息香酸、２−メチル−５−スルホテレフタル酸、５−メチル−４−スルホイソフタル酸、５−スルホサリチル酸及び３−オキシ−４−スルホ安息香酸等が挙げられる。
【００５７】
炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するアミンとしては、炭素数２〜２０のアミノカルボン酸及び炭素数４〜３０のペプチドが挙げられ、２−アミノ酢酸、３−アミノプロピオン酸、ω−アミノオクタデカン酸、ω−アミノエイコサン酸、アミノ酸｛アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）及びバリン（Ｖａｌ）等｝及びアミノ酸が２〜１５個結合したペプチド等が挙げられる。
【００５８】
炭素数２〜３０のアンモニオ基を有するカルボン酸としては、前記の炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するアミンが有するアミノ基を４級化剤（メチルクロリド、エチルクロリド、ベンジルクロリド、ジメチル炭酸、ジメチル硫酸及びエチレンオキシド等）によって４級化した化合物が挙げられる。
【００５９】
炭素数２〜３０のアミノ基を有するアルコールとしては、炭素数２〜１０のアルカノールアミン［モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、モノプロパノールアミン、ジプロパノールアミン、トリプロパノールアミン、モノブタノールアミン、ジブタノールアミン、トリブタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン及びＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン等］及びこれらのアルキル（炭素数１〜１８）置換体［Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルエタノールアミン、Ｎ−エチルジエタノールアミン、Ｎ−オクタデシルジエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン及びＮ，Ｎ，Ｎ’−トリオクタデシル−Ｎ’−ヒドロキシエチルエチレンジアミン等］等が挙げられる。
【００６０】
炭素数２〜３０のスルホ基を有するアミンとしては、スルファニル酸、２−アミノエタンスルホン酸、３−アミノプロパンスルホン酸、ｐ−アミノベンゼンスルホン酸、ω−アミノオクタデカンスルホン酸、ω−アミノエイコサンスルホン酸及びω−アミノトリコサンスルホン酸等が挙げられる。
【００６１】
炭素数２〜３０のスルホ基を有するアルコールとしては、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、３−ヒドロキシプロパンスルホン酸、ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホン酸、ω−ヒドロキシオクタデカンスルホン酸、ω−ヒドロキシエイコサンスルホン酸、ω−ヒドロキシトリコサンスルホン酸、スルホエチレングリコール、２−スルホプロピレングリコール、１，２−ジスルホプロピレングリコール、２−スルホブタンジオール、２−スルホヘキサンジオール、１，５−ジスルホヘキサンジオール、２，５−ジスルホヘキサンジオール、１，３，５−トリスルホヘキサンジオール、１，２，４−トリスルホヘキサンジオール、２−スルホウンドデカンジオール、４−スルホウンドデカンジオール、６−スルホウンドデカンジオール、２，４−ジスルホウンドデカンジオール及び２，６，１０−トリスルホウンドデカンジオール等が挙げられる。
【００６２】
炭素数２〜３０のアンモニオ基を有するアルコールとしては、前記の炭素数２〜３０のアミノ基を有するアルコールが有するアミノ基を４級化剤（メチルクロリド、エチルクロリド、ベンジルクロリド、ジメチル炭酸、ジメチル硫酸及びエチレンオキシド等）によって４級化した化合物が挙げられる。
【００６３】
官能基（Ｋ）としては、ポリペプチド（Ｐ）の多能性幹細胞への結合性の観点から、カルボキシル基及びスルホ基が好ましい。
【００６４】
化合物（Ｂ）としては、ポリペプチド（Ｐ）の多能性幹細胞への結合性の観点から、炭素数２〜３０のカルボン酸のハロゲン化物、炭素数２〜３０のスルホン酸のハロゲン化物、炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するアルコール、炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するアミン及び炭素数２〜３０のスルホ基を有するアルコールが好ましく、更に好ましいのは炭素数２〜３０のカルボン酸のハロゲン化物及び炭素数２〜３０のスルホン酸のハロゲン化物であり、特に好ましいのはクロロ酢酸、クロロエタンスルホン酸、クロロスルホン酸及びこれらの塩（好ましくはアルカリ金属塩）であり、最も好ましくはクロロ酢酸、クロロエタンスルホン酸及びこれらの塩である。
【００６５】
タンパク質（Ａ３）が有する官能基（Ｋ）の平均個数は、ポリペプチド（Ｐ）の多能性幹細胞への結合性の観点から、タンパク質（Ａ３）１分子あたり１〜１５６個が好ましく、更に好ましくは１０〜１２０個、特に好ましくは３０〜１１５個、最も好ましくは６０〜９０個である。
【００６６】
官能基（Ｋ）の平均個数は、官能基（Ｋ）を有するハロゲン化物を使用してエーテル化反応により化学修飾した場合、用いた化学修飾前のタンパク質（Ａ１）、タンパク質（Ａ２）及び化学修飾されたタンパク質（Ａ３）について、以下のポストラベル法によるＨＰＬＣ測定による各アミノ酸のピーク面積から算出することができる。
【００６７】
＜ポストラベル法によるタンパク質（Ａ３）中の官能基（Ｋ）の平均個数＞
タンパク質（Ａ３）中の官能基（Ｋ）の平均個数は、タンパク質に塩酸等の酸を加え加熱することにより、タンパク質をアミノ酸に加水分解してからオルトフタルアルデヒド又はニンヒドリンを用いてラベル化したアミノ酸をＨＰＬＣにより、アミノ酸のピーク面積を求め、下記式により求める。なお、基準は化学修飾されないグリシンのピークを用いる。
タンパク質（Ａ３）中の官能基（Ｋ）の平均個数＝Σ｛γ−（βａ÷αａ）÷（β０÷α０）×γ｝
α０：タンパク質（Ａ１又はＡ２）中のグリシンのＨＰＬＣのピーク面積
β０：タンパク質（Ａ１又はＡ２）中の各アミノ酸のＨＰＬＣのピーク面積
αａ：タンパク質（Ａ３）中のグリシンのＨＰＬＣのピーク面積
βａ：タンパク質（Ａ３）中の各アミノ酸のＨＰＬＣのピーク面積
γ：タンパク質（Ａ１）中の各アミノ酸の数
【００６８】
官能基（Ｋ）を有するハロゲン化物以外の化合物（Ｂ）により化学修飾した場合、官能基（Ｋ）の平均個数は、用いた化学修飾前のタンパク質（Ａ１）、タンパク質（Ａ２）及び化学修飾されたタンパク質（Ａ３）について、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（Ｍａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）を用いてタンパク質の質量測定を行い、質量電荷比（ｍ／ｚ値）とそのピーク強度を求め、下記式により求める。
【００６９】
＜ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳの測定によるタンパク質（Ａ３）中の官能基（Ｋ）の平均個数＞
タンパク質（Ａ３）中の官能基（Ｋ）の平均個数＝｛［Σ（Ｍｎ×Ｎｎ）÷１００］−Ｍ０｝÷Ｌ
Ｍ０：タンパク質（Ａ１）又は（Ａ２）のｍ／ｚ値
Ｍｎ：タンパク質（Ａ３）のｍ／ｚ値
Ｎｎ：タンパク質（Ａ３）の全ピーク強度の和を１００％とした場合のＭｎのピーク強度の割合（％）
Ｌ：化合物（Ｂ）がタンパク質（Ａ１）又は（Ａ２）中の反応性基含有アミノ酸残基（Ｚ）に結合した際に増加する分子量である。例えば、化合物（Ｂ）がパントテン酸であり、パントテン酸のヒドロキシル基とタンパク質（Ａ１）に含まれる反応性基含有アミノ酸残基（Ｚ）の側鎖に有するカルボキシル基（反応性基）とを脱水縮合反応させた場合、Ｌは「２１９（パントテン酸の分子量）−１８（水の分子量）＝２０１」である。
【００７０】
本発明に用いるポリペプチド（Ｐ）は、必要に応じて滅菌処理を施してもよい。
滅菌処理の方法としては、特に限定されないが、放射線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、プラズマ滅菌、γ線滅菌、アルコール滅菌、オートクレーブ滅菌及びろ過滅菌等が挙げられる。
【００７１】
本発明における多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、核移植ＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等が挙げられる。多能性幹細胞は１種を単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００７２】
これらの多能性幹細胞のうち、ポリペプチド（Ｐ）の多能性幹細胞への結合性の観点から、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、核移植ＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が好ましく、更に好ましいのは胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）である。
【００７３】
多能性幹細胞の由来動物としては、特に限定されないが、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、カンガルー、サル、ラット、マウス及びヒト等の哺乳類動物が好ましく、更に好ましいのはマウス及びヒトである。
【００７４】
本発明の培養方法は、前記のポリペプチド（Ｐ）を含む培養液（Ｆ）中で多能性幹細胞が集合した多能性幹細胞集合体を得る工程を含むことが好ましい。
培養液（Ｆ）としては、無血清培地及び血清培地が好ましく、特に無血清培地が好ましい。
【００７５】
無血清培地としては、Ｇｒａｃｅ培地、ＩＰＬ−４１培地、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ’ｓ培地、Ｏｐｔｉ−ＰＲＯＴＭＳＦＭ培地、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭＴＭＩ培地、ＶＰ−ＳＦＭ培地、ＣＤ２９３培地、２９３ＳＦＭＩＩ培地、ＣＤ−ＣＨＯ培地、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３培地、ＣＤ−ＣＨＯ  ＡＧＴＴＭ培地、ＲＰＭＩ培地、ＤＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、ＧＭＥＭ培地、Ｅａｇｌｅ’ｓＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＡＳＦ１０３培地、ＡＳＦ１０４培地、ＡＳＦ３０１培地、ＴＣ−１００培地、Ｓｆ−９００ＩＩ培地、Ｅｘ−ｃｅｌｌ４０５培地、Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｆｉｖｅ培地、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２Ｋ培地及びこれらの混合培地等が挙げられる。
【００７６】
これらの内、多能性幹細胞の安定性の観点から、Ｏｐｔｉ−ＰＲＯＴＭＳＦＭ培地、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭＴＭＩ培地、ＶＰ−ＳＦＭ培地、ＣＤ２９３培地、２９３ＳＦＭＩＩ培地、ＣＤ−ＣＨＯ培地、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３培地、ＣＤ−ＣＨＯ  ＡＧＴＴＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＧＭＥＭ培地、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２Ｋ培地及びこれらの混合培地が好ましく、更に好ましくはＯｐｔｉ−ＰＲＯＴＭＳＦＭ培地、ＶＰ−ＳＦＭ培地、ＣＤ２９３培地、２９３ＳＦＭＩＩ培地、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３培地、ＤＭＥＭ培地、ＧＭＥＭ培地、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２Ｋ培地及びこれらの混合培地である。
【００７７】
血清培地としては、上記無血清培地に血清を加えたもの等が挙げられる。
血清培地に用いる上記無血清培地としては、ＤＭＥＭ培地、ＧＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ培地、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＡＳＦ１０３培地、ＡＳＦ１０４培地、ＡＳＦ３０１培地、ＴＣ−１００培地、Ｓｆ−９００ＩＩ培地、Ｅｘ−ｃｅｌｌ４０５培地、Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｆｉｖｅ培地、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地及びこれらの混合培地等が挙げられる。
血清としては、ヒト血清及び動物血清（ウシ血清、ウマ血清、ヤギ血清、ヒツジ血清、ブタ血清、ウサギ血清、ニワトリ血清、ラット血清及びマウス血清等）等が挙げられる。
培養液（Ｆ）としては、これらの無血清培地及び血清培地を１種を単独で用いても、２種以上を併用してもよい。
【００７８】
培養液（Ｆ）としては、必要に応じて血清、増殖因子及び／又は抗菌剤等を添加したものも利用できる。培養液、血清及びその使用量、増殖因子及びその使用量、並びに抗菌剤及びその使用量の具体例としては、特開２００５−２１０６号公報に記載されたものがそのまま利用できる。
【００７９】
ポリペプチド（Ｐ）を含む培養液（Ｆ）中において、多能性幹細胞を集合させ、多能性幹細胞集合体を形成させてもよい。
【００８０】
ポリペプチド（Ｐ）を含む培養液（Ｆ）中で多能性幹細胞を集合させ、多能性幹細胞集合体を得る工程は、多能性幹細胞の増殖性の観点から、１０ｒｐｍ〜２００ｒｐｍで撹拌下に行うことが好ましく、更に好ましくは５０ｒｐｍ〜１５０ｒｐｍである。
【００８１】
ポリペプチド（Ｐ）を含む培養液（Ｆ）中で多能性幹細胞を集合させ、多能性幹細胞集合体を得る工程は、培養容器としてフラスコを用い、ポリペプチド（Ｐ）を含む培養液（Ｆ）に多能性幹細胞を播種し、３０〜５０℃（好ましくは３５〜４０℃）の温度で二酸化炭素を３〜７容量％含む雰囲気下で行うことが好ましく、４．７〜５．３容量％含む雰囲気下で行うことが更に好ましい。
【００８２】
ポリペプチド（Ｐ）を含む培養液（Ｆ）中で多能性幹細胞が集合した多能性幹細胞集合体を得る工程において、培養後の多能性幹細胞集合体の個数平均粒子径は、細胞集合体の収率と多能性幹細胞の生存率の観点から、１０〜５００μｍが好ましく、５０〜５００μｍがより好ましく、より更に好ましくは５０〜３００μｍである。
なお、本発明における多能性幹細胞集合体の粒子径は、以下の方法により求めることができる。
【００８３】
＜多能性幹細胞集合体の粒子径の測定方法＞
得られた細胞が集合した多能性幹細胞集合体を含む培養液を、３８４ｗｅｌｌプレートに１００μＬずつ、１０ｗｅｌｌに添加し、多能性幹細胞集合体の顕微鏡画像（倍率４０倍、ＣＫＸ４１、ＯＬＹＭＰＵＳ社製）を取得し、多能性幹細胞集合体数の解析を行う。画像解析ソフト（ｉｍａｇｅ  Ｊ、アメリカ国立衛生研究所）及びマイクロメーター（目盛１０μｍ、目盛長１ｍｍ）を用いて解析することにより得られた多能性幹細胞集合体の粒子径を測定することができる。
なお、画像解析ソフトにより得られる数値の単位が「ピクセル」である場合、マイクロメーターにより画像を計測して１ピクセルが何μｍに相当するのかを算出し、実際の単位「μｍ」に換算する。
【００８４】
また、培養液に含まれる多能性幹細胞の全多能性幹細胞集合体に含まれる１００〜２００μｍの粒子径を有する多能性幹細胞集合体の割合が、全多能性幹細胞集合体の合計数に基づいて４０％以上であることが好ましい。この割合が大きいほど多能性幹細胞の生存率が高くなり、物性のそろった状態の良い多能性幹細胞が回収でき好ましい。
１００〜２００μｍの粒子径を有する細胞集合体の割合は、下記の計算方法で算出する。
ポリペプチド（Ｐ）を加えて浮遊培養した多能性幹細胞に含まれる１００〜２００μｍの細胞集合体の割合（％）＝｛１００〜２００μｍの細胞集合体数｝／｛全細胞集合体数｝×１００
【００８５】
本発明の培養方法は、ポリペプチド（Ｐ）を含む培養液（Ｆ）中で多能性幹細胞が集合した多能性幹細胞集合体を得る工程に加えて、細胞増殖性の観点から、多能性幹細胞を培養液（Ｆ）の合計体積に基づいて５００〜１００，０００個／ｍＬの濃度で播種する工程を有することが好ましく、更に好ましくは２，０００〜１０，０００個／ｍＬである。
【００８６】
多能性幹細胞を培養液（Ｆ）に播種する方法としては、多能性幹細胞を含む懸濁液をポリペプチド（Ｐ）を含む培養液（Ｆ）に加えることで行うことができる。
【００８７】
ポリペプチド（Ｐ）を含む培養液（Ｆ）中で多能性幹細胞が集合した多能性幹細胞集合体を得る工程で用いるポリペプチド（Ｐ）の使用量は、ポリペプチド（Ｐ）の多能性幹細胞への結合性の観点から、多能性幹細胞を播種する工程において培養液（Ｆ）の合計体積に基づいて好ましくは０．００１〜１０００μｇ／ｍＬであり、更に好ましくは０．０１〜１００μｇ／ｍＬであり、特に好ましくは０．１〜５０μｇ／ｍＬである。
【００８８】
ポリペプチド（Ｐ）を含む培養液（Ｆ）中で多能性幹細胞が集合した多能性幹細胞集合体を得る工程の後、多能性幹細胞集合体を回収する方法は、特開２００５−２１０６号公報に記載の方法等が利用できる。
【００８９】
本発明の培養方法は、ポリペプチド（Ｐ）を含む基質（Ｇ）の表面で接着培養する工程を含むことも好ましい。
ポリペプチド（Ｐ）を含む基質（Ｇ）の表面で接着培養する工程で用いる基質（Ｇ）としては、その表面にポリペプチド（Ｐ）を有していれば良く、特開２００５−２１０６号公報に記載されたものを適用することができ、ポリペプチド（Ｐ）を含むリン酸緩衝液を乾燥してなることが好ましく、基質（Ｇ）の表面はリン酸緩衝液で更に洗浄してあることが好ましい。
【００９０】
本発明の基質（Ｇ）に含まれるポリペプチド（Ｐ）の含有量は、細胞接着性の観点及び安定的に再現性よく培養する観点から、後記の接着培養方法に含まれる多能性幹細胞を播種する工程における基質（Ｇ）の表面に存在するポリペプチド（Ｐ）の含有量が、基質（Ｇ）の単位面積あたり、０．００１〜１０μｇ／ｃｍ２が好ましく、更に好ましくは０．０１〜１０μｇ／ｃｍ２、特に好ましくは０．５〜６．７μｇ／ｃｍ２である。
【００９１】
なお、本発明において、前記の単位面積は、細胞が接着し得る表面の表面積を意味し、細胞が入り込まないような微小な凹凸（例えば、１μｍ以下）は平坦な表面として取扱うが、単位面積を高める目的でリブ（畝）等が設けてあるものについてはそのリブの表面積を単位面積に含まれる。
単位面積あたりのポリペプチド（Ｐ）の含有量の測定方法は特に限定されないが、例えば、免疫学的測定法が利用でき、特開２００５−２１０６号公報に記載された方法で測定することができる。
【００９２】
ポリペプチド（Ｐ）を含む基質（Ｇ）の表面で接着培養する工程は、基質（Ｇ）に多能性幹細胞を播種し、３０〜５０℃（好ましくは３５〜４０℃）の温度で二酸化炭素を３〜７容量％含む雰囲気下で行うことが好ましく、４．７〜５．３容量％含む雰囲気下で行うことが好ましい。
【００９３】
本発明の培養方法は、ポリペプチド（Ｐ）を含む基質（Ｇ）の表面で接着培養する工程に加えて、細胞増殖性の観点から、多能性幹細胞を２００〜４０，０００個／ｃｍ２の濃度で基質（Ｇ）に播種する工程を有することが好ましく、更に好ましくは５００〜２０，０００個／ｃｍ２である。
【００９４】
多能性幹細胞を基質（Ｇ）に播種する方法としては、多能性幹細胞を含む懸濁液を基質（Ｇ）に加える方法等が挙げられる。多能性幹細胞を含む懸濁液にはピルビン酸ナトリウム、ＭＥＭ非必須アミノ酸、２−メルカプトエタノール及びＫｎｏｃｋ  Ｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ等の公知の添加剤を含んでいても良い。
【００９５】
本発明の基質（Ｇ）に播種した多能性幹細胞のうち、基質（Ｇ）に接着する多能性幹細胞の割合を示す細胞接着率は、細胞の収率及び再現性等の観点から、６０〜１００％であることが好ましく、更に好ましくは８０〜１００％である。
細胞接着率は、基質（Ｇ）中のポリペプチド（Ｐ）の割合を増やすことで上昇し、ポリペプチド（Ｐ）の割合を少なくすることで減少する。また、ポリペプチド（Ｐ）が、カルボキシル基、スルホ基、アミノ基、アンモニオ基及びヒドロキシル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の官能基（Ｋ）が導入されたタンパク質（Ａ３）であると、細胞接着率は高くなり、官能基（Ｋ）がカルボキシル基及びスルホ基であると更に好ましい。
【００９６】
多能性幹細胞がマウスＥＳ細胞である場合の細胞接着率の測定法の一例を以下に説明する。
基質（Ｇ）に、ポリペプチド（Ｐ）が付着した部分の面積に対して１３１．５μＬ／ｃｍ２の割合で０．０２Ｍリン酸緩衝液［ｐＨ７．２、９９．５重量％塩化ナトリウム水溶液を０．８５重量％含有するリン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳ溶液と略記）］を加えて２回洗浄する。
次に、ＧＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中に１００ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  ａｌｄｒｉｃｈ社製）を１質量％、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１質量％、５５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を０．１８質量％、Ｋｎｏｃｋ  Ｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を１０質量％、１  ｍｉｌｌｉｏｎ  ｕｎｉｔｓ／ｍＬ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ  （ＬＩＦ）  （ＭＥＲＣＫ  ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を０．２質量％でそれぞれ含むマウスＥＳ細胞用培地を作製し、作製したマウスＥＳ細胞用培地をポリペプチド（Ｐ）が付着した部分の面積に対して１３１．５μＬ／ｃｍ２の割合で加え、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター内で１０分間保存する。１０分後、マウスＥＳ細胞をポリペプチド（Ｐ）が付着した部分の面積に対して２×１０４個／ｃｍ２の割合で添加し、更に３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中にて２時間放置して培養する。
培養終了後、アスピレーターを用いて培地を除去し、細胞に直接当たらないように注意しながらＰＢＳ溶液をポリペプチド（Ｐ）が付着した部分の面積に対して１３１．５μＬ／ｃｍ２の割合で加えて２回洗浄した後、アスピレーターを用いてＰＢＳ溶液を除去する。次に、マウスＥＳ細胞用培地をポリペプチド（Ｐ）が付着した部分の面積に対して１３１．５μＬ／ｃｍ２の割合で加え、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター内で１０分間保存する。１０分後、Ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔ  ｒｅａｇｅｎｔ  ＳＦ溶液をＧＭＥＭ培地に対して１０μＬ／１００μＬの割合で加え、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％の条件下で２時間静置させる。その後、吸光度計（ＵＥＲＳＡｍａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、４５０ｎｍ及び６５０ｎｍの吸光度（それぞれ、ＯＤ４５０及びＯＤ６５０）を測定する。次いで、あらかじめ作製しておいた細胞数と吸光度（ＯＤ４５０−ＯＤ６５０）との検量線にあてはめ培養液中の接着細胞数（Ｘ）を算出する。
ポリペプチド（Ｐ）の代わりにフィブロネクチンを０．５μｇ／ｃｍ２で基材にコーティングした比較用基質を作製し、同様に細胞を播種し、培養２時間後にＰＢＳ溶液で洗浄しない以外は上記と同様の実験を行う。この比較用基質の接着細胞数（Ｘ０）を測定し、比較用基質の接着細胞数（Ｘ０）に対する培養液中の接着細胞数（Ｘ）の割合を細胞接着率として算出する。
なお、この測定においては、播種したすべての細胞が接着したことを顕微鏡観察で確認したものを用いる。
ここでは、多能性幹細胞がマウスＥＳ細胞である場合の細胞接着率の測定法を説明したが、多能性幹細胞が他の種類であったとしても、上記方法で用いた培地を別の種類の細胞用の培地に置換することで、同様に細胞接着率を測定することができる。
【実施例】
【００９７】
以下、実施例及び比較例により本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００９８】
＜製造例１＞
特表平３−５０２９３５号公報に記載の実験例１−３に記載の方法と同様にして、（ＧＡＧＡＧＳ）９配列（２８）（Ｙ１）、ＧＡＡＶＴＧ配列（４）、ＲＧＤ配列及びＳＰＡＳＡＡＧＹ配列（１７）が順に１３回繰り返してなる構造を有するＭｎ約１１万の配列（２９）のタンパク質を遺伝子組換え大腸菌により製造し、カラムクロマトグラフィーにて精製してポリペプチド（Ｐ−１）を得た。
【００９９】
＜製造例２＞
ポリペプチド（Ｐ−１）の作製方法と同様にして、（ＧＡＧＡＧＳ）９配列（２８）（Ｙ１）、ＧＡＡＰＧＡＳ配列（１６）、ＩＫＶＡＶ配列（３６）及びＳＡＧＰＳＡＧＹ配列（２７）が順に１３回繰り返してなる構造を有するＭｎ約１１万のアミノ酸配列（３３）のタンパク質を遺伝子組換え大腸菌により製造し、精製してポリペプチド（Ｐ−２）を得た。
【０１００】
＜製造例３＞
ポリペプチド（Ｐ−１）５０ｍｇとクロロ酢酸（和光純薬工業株式会社製）２３０ｍｇとを４．５Ｍ過塩素酸リチウム水溶液１．５ｍＬに溶解した後、その溶液を攪拌しながら、水酸化ナトリウム（和光純薬工業株式会社製）１００ｍｇを溶解した４．５Ｍ過塩素酸リチウム水溶液１．３２５ｍＬを一定速度で滴下した。室温（約２５℃）で１時間攪拌したのち、反応液を透析、凍結乾燥して、ポリペプチド（Ｐ−３）を得た。
【０１０１】
＜製造例４＞
「クロロ酢酸２３０ｍｇ」を「クロロエタンスルホン酸ナトリウム（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ社製）４０５ｍｇ」に変更したこと以外は製造例３と同様にして、ポリペプチド（Ｐ−４）を得た。
【０１０２】
＜製造例５＞
「クロロ酢酸２３０ｍｇ」を「クロロエタノール（和光純薬工業株式会社製）９４ｍｇ」に変更したこと以外は製造例３と同様にして、ポリペプチド（Ｐ−５）を得た。
【０１０３】
＜製造例６＞
「クロロ酢酸２３０ｍｇ」を「２−クロロエチルアミン（東京化成工業株式会社製）２８０ｍｇ」に変更したこと以外は製造例３と同様にしてポリペプチド（Ｐ−６）を得た。
【０１０４】
＜製造例７＞
「クロロ酢酸２３０ｍｇ」を「Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルクロリド（和光純薬工業株式会社製）１５０ｍｇ」に変更したこと以外は製造例３と同様にして、ポリペプチド（Ｐ−７）を得た。
【０１０５】
＜製造例８＞
「クロロ酢酸２３０ｍｇ」を「クロロエチルトリメチルアンモニウムクロリド（和光純薬工業株式会社製）３８０ｍｇ」に変更したこと以外は製造例３と同様にして、ポリペプチド（Ｐ−８）を得た。
【０１０６】
＜製造例９＞
ポリペプチド（Ｐ−２）５０ｍｇとクロロエタンスルホン酸ナトリウム（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ社製）４０５ｍｇとを４．５Ｍ過塩素酸リチウム水溶液１．５ｍＬに溶解した後、その溶液を攪拌しながら、水酸化ナトリウム（和光純薬工業株式会社製）１００ｍｇを溶解した４．５Ｍ過塩素酸リチウム水溶液１．３２５ｍＬを一定速度で滴下した。室温（約２５℃）で１時間攪拌したのち、反応液を透析、凍結乾燥して、ポリペプチド（Ｐ−９）を得た。
【０１０７】
＜製造例１０＞
「クロロエタンスルホン酸ナトリウム４０５ｍｇ」を「クロロエチルトリメチルアンモニウムクロリド（和光純薬工業株式会社製）３８０ｍｇ」に変更したこと以外は製造例９と同様にして、ポリペプチド（Ｐ−１０）を得た。
【０１０８】
＜ポリペプチド（Ｐ−３）中の官能基（Ｋ）の平均個数＞
ポリペプチド（Ｐ−３）１ｍｇを６Ｎ  塩酸２００μＬに加え脱気した。泡が発生しなくなるまで脱気した溶液を減圧密封下で１１０℃、２２時間の加水分解を行った。次に、エバポレーターを用いて６Ｎ塩酸（和光純薬工業株式会社製）を試料希釈液（アミノ酸自動分析用試料希釈液  Ｎａ型  ｐＨ２．２０）に置換した後、２ｍＬになるように試料希釈液で希釈した。希釈した溶液を試料希釈液で更に１０倍希釈し、０．２μｍのフィルターを通し測定用試料とした。
ラベル化試薬としてはオルトフタルアルデヒド、スタンダードとしてはアミノ酸混合標準液Ｈ型を用いてポストラベル法によるＨＰＬＣ測定を行った。ＨＰＬＣ測定での溶出時間からアミノ酸の種類を同定した。
更にポリペプチド（Ｐ−３）に代えてポリペプチド（Ｐ−１）を用いる以外は同様にして、ＨＰＬＣ測定を行った。
ポリペプチド（Ｐ−１）及びポリペプチド（Ｐ−３）のＨＰＬＣ測定でそれぞれ得られたシグナルのピーク面積から、下記式により官能基（Ｋ）の平均個数を算出した。
官能基（Ｋ）の平均個数＝Σ｛γ−（βａ÷αａ）÷（β０÷α０）×γ｝
なお、α０はポリペプチド（Ｐ−１）中のグリシンのＨＰＬＣのピーク面積を、β０はポリペプチド（Ｐ−１）中の各アミノ酸のＨＰＬＣのピーク面積を、αａはポリペプチド（Ｐ−３）中のグリシンのＨＰＬＣのピーク面積を、βａはポリペプチド（Ｐ−３）中の各アミノ酸のＨＰＬＣのピーク面積を、γはポリペプチド（Ｐ−１）中の各アミノ酸の数をそれぞれ表す。
なお、ＨＰＬＣ測定は、以下の条件で行った。
＜ＨＰＬＣ測定条件＞
カラム：Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ  Ａｍｉｎｏ−Ｎａカラム温度：６０℃
移動相：アミノ酸分析移動相セット（Ｎａ  型）（メーカー名：株式会社島津製作所）流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ検出波長：励起波長３５０ｎｍ，測定波長４５０ｎｍ
【０１０９】
＜ポリペプチド（Ｐ−４）〜（Ｐ−８）、（Ｐ−９）及び（Ｐ−１０）中の官能基（Ｋ）の平均個数＞
ポリペプチド（Ｐ−３）に代えてポリペプチド（Ｐ−４）〜（Ｐ−８）を用いたこと以外はポリペプチド（Ｐ−３）の場合と同様にして、ポリペプチド（Ｐ−４）〜（Ｐ−８）について、化学修飾により導入された官能基（Ｋ）の平均個数を求めた。また、ポリペプチド（Ｐ−３）に代えてポリペプチド（Ｐ−９）〜（Ｐ−１０）を用い、ポリペプチド（Ｐ−１）に代えてポリペプチド（Ｐ−２）を用いたこと以外はポリペプチド（Ｐ−３）の場合と同様にして、ポリペプチド（Ｐ−９）〜（Ｐ−１０）について、化学修飾により導入された官能基（Ｋ）の平均個数を求めた。これらの導入した官能基（Ｋ）の種類と共に結果を表１に示す。
【０１１０】
【表１】
0006714343.tif 000002
【０１１１】
＜実施例１：培養液中での多能性幹細胞の培養＞
１重量％ポリビニルアルコール（ＪＰ−１８、日本塩ビ・ポバール株式会社製）水溶液をコーティングして細胞が接着しないようにした細胞非接着性スピンナーフラスコ（Ｄｏｕｂｌｅ  ＣｅｌＳｔｉｒ  Ｓｐｉｎｎｅｒ  Ｆｌａｓｋ、Ｗｈｅａｔｏｎ社製）に、マウスＥＳ細胞用培地［１００ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  ａｌｄｒｉｃｈ社製）を１質量％で含み、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１質量％で含み、５５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を０．１８質量％で含み、Ｋｎｏｃｋ  Ｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を１０質量％で含み、１  ｍｉｌｌｉｏｎ  ｕｎｉｔｓ／ｍＬ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ  （ＬＩＦ）  （ＭＥＲＣＫ  ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を０．２質量％で含むＧＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）］９ｍＬ、マウスＥＳ細胞懸濁液１ｍｌ（１０５個／ｍＬ）［ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）製］、ポリペプチド（Ｐ−１）溶液１００μＬ（１０μｇ／ｍＬ）をそれぞれ加え、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中にて、１００ｒｐｍの速度で５日間旋回培養を行い、多能性幹細胞集合体が浮遊した培養液を得た。
得られた多能性幹細胞集合体の個数平均粒子径は１２０μｍであった。培養後、細胞培地を遠心管に移し、４℃、１０００ｒｐｍの条件で５分間遠心分離し上清を除去し、沈殿した細胞をＰＢＳ溶液１ｍＬで２回洗浄して培養した細胞（Ｃ１−１）を得た。
また、マウスＥＳ細胞用培地に代えて、αＭＥＭ培地（和光純薬工業社製）に細胞培養用ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＨｙＣｌｏｎｅ社製）を１０質量％で含んだマウスＥＳ細胞誘導用培地を使用したこと以外は、細胞（Ｃ１−１）を得る操作と同様の操作を行い、培養した細胞（Ｃ１−２）細胞を得た。
【０１１２】
培養で得られた多能性幹細胞集合体の個数平均粒子径は、以下の画像解析により求めた。結果を表２に示す。
多能性幹細胞集合体を含む培養液を、３８４ｗｅｌｌプレートに１００μＬずつ、１０ｗｅｌｌに添加し、顕微鏡画像（倍率４０倍、ＣＫＸ４１、ＯＬＹＭＰＵＳ社製）を取得し、画像解析ソフト（ｉｍａｇｅ  Ｊ、アメリカ国立衛生研究所）及びマイクロメーター（目盛１０μｍ、目盛長１ｍｍ）を用いて顕微鏡画像に含まれる細胞集合体の粒子径をそれぞれ測定し、顕微鏡画像に含まれる集合体の数平均値を算出して個数平均粒子径として表２に示す。
また、顕微鏡画像に含まれる細胞集合体のうち、１００〜２００μｍの細胞集合体数の割合を、下記の計算方法で算出して表２に示す。
１００〜２００μｍの細胞集合体の割合（％）＝｛顕微鏡画像に含まれる１００〜２００μｍの細胞集合体数｝／｛顕微鏡画像に含まれる全細胞集合体数｝×１００
なお、画像解析ソフトにより得られる数値の単位が「ピクセル」である場合、マイクロメーターにより画像を計測して１ピクセルが何μｍに相当するのかを算出し、実際の単位「μｍ」に換算した。
【０１１３】
得られた細胞（Ｃ１−１）及び（Ｃ１−２）について、以下の方法で細胞数と分化状態の評価を行った。結果を表２に示す。
【０１１４】
＜細胞数の測定＞
得られた細胞（Ｃ１−１）１ｍＬをマイクロチューブ（ＷＡＴＳＯＮ社製）に移し、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を捨て、更に細胞溶解液（０．０２重量％  ドデシル硫酸ナトリウム、０．１５Ｍ  塩化ナトリウム、１．５ｍＭ  クエン酸３ナトリウムを含む）を１ｍＬ加え、３７℃で３時間加温した。その後、１００μＬを９６穴ｂｌａｃｋ  ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に移した。更に蛍光基質溶液［０．１重量％  Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８（ナカイテスク社製）、０．０２重量％  ドデシル硫酸ナトリウム、０．１５Ｍ  塩化ナトリウム、１．５ｍＭ  クエン酸３ナトリウムを含む］を１００μＬ加え、励起波長３５５ｎｍ、吸収波長４６０ｎｍで蛍光強度を測定した。細胞数が分かっているサンプルで同様に蛍光強度を測定して作製した細胞数と蛍光強度との検量線を用いて蛍光強度から細胞数を算出した。得られた細胞（Ｃ１−２）についても同様に細胞数を算出した。
さらに、下記の比較例１の細胞（Ｃ’１−１）及び（Ｃ’１−２）についても同様に細胞数の測定を行い細胞数を算出した。下記の細胞（Ｃ’１−１）の細胞数に対する細胞（Ｃ１−１）の細胞数の倍数、及び、下記の細胞（Ｃ’１−２）の細胞数に対する細胞（Ｃ１−２）の細胞数の倍数を表２に示す。
培養後に得られた細胞数が多いほど収率が高くなり、培養条件として好ましいことを意味する。
【０１１５】
＜未分化状態の評価＞
得られた細胞（Ｃ１−１）５ｍＬを、１５ｍＬ遠心管チューブ（アズワン社製）に移し、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を捨て、更にＴＲＩｚｏｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）１ｍＬを加え、室温で５分間静置した。更にクロロホルム（和光純薬工業株式会社製）２００μＬを加え、氷中に１５分間静置した。その後、１４，０００ｇで１０分間、４℃で遠心分離し、上清を新しいマイクロチューブに移した。そこへ、イソプロパノール（和光純薬工業株式会社製）５００μＬ加え、−２０℃で１時間静置し、１４，０００ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。上清を捨て、７５％エタノールを１ｍＬ加え、１４，０００ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。上清を除去し、風乾し、沈殿が完全に乾燥した後、蒸留水（大塚製薬株式会社製）を２０μＬ加え、完全に溶解させた。
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）のプロトコールに従い、ｃＤＮＡを合成し、得られたｃＤＮＡと下記のプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲ測定を行い、未分化状態のマーカーとなるマーカー遺伝子の発現量から細胞の分化状態を解析した。未分化マーカー遺伝子の発現量はハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を１．０とした場合の相対値に換算し、更に下記の比較例１の細胞（Ｃ’１−１）について同様に行って得られた未分化マーカー遺伝子の発現量を１．０とした場合の相対値として算出し、分化状態を評価した。結果を表２に示す。未分化マーカー遺伝子の発現量が１．０に近いほど未分化状態を維持していることを示す。
【０１１６】
＜分化状態の評価＞
また、細胞（Ｃ１−２）も同様の操作を行い、ｃＤＮＡを合成し、得られたｃＤＮＡと下記のプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲ測定を行い、分化状態のマーカーとなるマーカー遺伝子の発現量から細胞の分化状態を解析した。各分化マーカー遺伝子の発現量はハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を１．０とした場合の相対値に換算し、更に下記の比較例１の細胞（Ｃ’１−２）について同様に行って得られた各分化マーカー遺伝子の発現量を１．０とした場合の相対値として算出し、分化状態を評価した。結果を表２に示す。各分化マーカー遺伝子の発現量の値が高いほど分化マーカー遺伝子に対応する細胞への分化が進んでいることを示す。
【０１１７】
＜未分化状態の評価及び分化状態の評価で用いたプライマー＞
・未分化マーカー遺伝子：Ｎａｎｏｇ（Ｎａｎｏｇ−Ｆ：ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＴＧＧ  ＧＡＡ  ＣＧＣ  ＣＴＣ  ＡＴＣ及びＮａｎｏｇ−Ｒ：ＣＣＴ  ＴＧＴ  ＣＡＧ  ＣＣＴ  ＣＡＧ  ＧＡＣ  ＴＴＧ）。
・分化マーカー遺伝子：
（ｉ）内胚葉マーカー遺伝子  Ｓｏｘ１７（Ｓｏｘ１７−Ｆ：ＧＧＡ  ＣＡＣ  ＧＡＣ  ＴＧＣ  ＧＧＡ  ＧＴＧ  ＡＡ及びＳｏｘ１７−Ｒ：ＧＧＴ  ＣＧＧ  ＣＡＡ  ＣＣＧ  ＴＣＡ  ＡＡＴ  Ｇ）。
（ｉｉ）中胚葉マーカー遺伝子  Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ−Ｆ：ＧＡＡ  ＣＡＧ  ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＡＡＣ  ＣＴＡ  ＴＧ及びＢｒａｃｈｙｕｒｙ−Ｒ：ＡＧＡ  ＣＴＧ  ＧＧＡ  ＴＡＣ  ＴＧＧ  ＣＴＡ  ＧＡＧ）。
（ｉｉｉ）外胚葉マーカー遺伝子  Ｎｅｓｔｉｎ（Ｎｅｓｔｉｎ−Ｆ：ＧＧＧ  ＣＣＡ  ＧＣＡ  ＣＴＣ  ＴＴＡ  ＧＣＴ  ＴＴＧ  ＡＴＡ及びＮｅｓｔｉｎ−Ｒ：ＴＧＡ  ＧＣＣ  ＴＴＣ  ＡＧＧ  ＧＴＧ  ＡＴＣ  ＣＡＧ）。
・ハウスキーピング遺伝子：ＧＡＰＤＨ（ＧＡＰＤＨ−Ｆ：ＴＧＴ  ＧＴＣ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＧＧＡ  ＴＣＴ  ＧＡ及びＧＡＰＤＨ−Ｒ：ＴＴＧ  ＣＴＧ  ＴＴＧ  ＡＡＧ  ＴＣＧ  ＣＡＧ  ＧＡＧ）。
【０１１８】
＜実施例２〜１０＞
ポリペプチド（Ｐ−１）を表２のものに変更したこと以外は実施例１の細胞（Ｃ１−１）を得る操作と同様にしてマウスＥＳ細胞の培養を行い、細胞（Ｃ２−１）〜（Ｃ１０−１）を得た。また、ポリペプチド（Ｐ−１）を表２のものに変更したこと以外は実施例１の細胞（Ｃ１−２）を得る操作と同様にしてマウスＥＳ細胞の培養を行い、細胞（Ｃ２−２）〜（Ｃ１０−２）を得た。また培養で得られた細胞集合体の個数平均粒子径及び１００〜２００μｍの細胞集合体の割合を実施例１と同様に測定した。下記の細胞（Ｃ’１−１）の細胞数に対する細胞（Ｃ２−１）〜（Ｃ１０−１）の細胞数の倍数、及び、下記の細胞（Ｃ’１−２）の細胞数に対する細胞（Ｃ２−２）〜（Ｃ１０−２）の細胞数の倍数を表２に示す。
【０１１９】
細胞（Ｃ２−１）〜（Ｃ１０−１）について実施例１の細胞（Ｃ１−１）と同様に細胞数と未分化状態の評価を行った。結果を表２に示す。また、細胞（Ｃ２−２）〜（Ｃ１０−２）について、実施例１の細胞（Ｃ１−２）と同様に分化状態の評価を行った。結果を表２に示す。
【０１２０】
＜比較例１＞
ポリペプチド（Ｐ−１）を使用しない以外は実施例１の細胞（Ｃ１−１）を得る操作と同様にして細胞（Ｃ’１−１）を得た。また、ポリペプチド（Ｐ−１）を使用しない以外は実施例１の細胞（Ｃ１−１）を得る操作と同様にして細胞（Ｃ’１−２）を得た。培養で得られた細胞集合体の個数平均粒子径及び１００〜２００μｍの細胞集合体の割合を実施例１と同様に測定した。細胞（Ｃ’１−１）について実施例１の細胞（Ｃ１−１）と同様に細胞数と未分化状態の評価を行った。結果を表２に示す。また、細胞（Ｃ’１−２）について、実施例１の細胞（Ｃ１−２）と同様に分化状態の評価を行った。結果を表２に示す。
【０１２１】
【表２】
0006714343.tif 000003
【０１２２】
表２に示すように、本発明の実施例１〜１０は、比較例１との比較において得られた細胞数が多く、粒子径が１００〜２００μｍの細胞集合体の割合が大きかった。更に、ポリペプチド（Ｐ−１）、（Ｐ−３）、（Ｐ−４）、（Ｐ−６）及び（Ｐ−７）を含む培養液中で培養した場合は未分化状態を維持しており、ポリペプチド（Ｐ−２）、（Ｐ−９）及び（Ｐ−１０）を含む場合は中胚葉に、ポリペプチド（Ｐ−５）を含む場合は外胚葉に、ポリペプチド（Ｐ−８）を含む場合は内胚葉に特定して分化していることがわかる。
【０１２３】
＜実施例１１：基質（Ｇ−１）を用いた培養＞
ポリペプチド（Ｐ―１）１ｍｇを４．５Ｍ過塩素酸リチウム水溶液５０μＬに溶解し、更にＰＢＳ溶液で希釈して、５０μｇ／ｍＬのポリペプチド（Ｐ−１）溶液を作製した。この溶液を６０ｍｍ  ｄｉｓｈのポリスチレンプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）１枚にそれぞれ２ｍＬ加え、３７℃で３０分間放置した。アスピレーターを用いて溶液を除去した後、ＰＢＳ溶液２ｍＬで２回洗浄し、基質（Ｇ−１）を得た。
以下の方法で基質表面に存在するポリペプチド量を測定した結果、基質（Ｇ−１）には、基質（Ｇ−１）の単位面積あたり６．６２５μｇ／ｃｍ２のポリペプチド（Ｐ−１）が存在していた。
続いて、マウスＥＳ細胞用培地にマウスＥＳ細胞を３．３３×１０４個／ｍＬの濃度で懸濁して作製した懸濁液を基質（Ｇ−１）に加え、更に３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター内で４日間培養し、細胞（Ｃ１１−１）を得た。
また、マウスＥＳ細胞用培地に代えて、マウスＥＳ細胞誘導用培地を使用したこと以外は、細胞（Ｃ１１−１）を得る操作と同様の操作を行い、培養した細胞（Ｃ１１−２）細胞を得た。
なお、播種時のマウスＥＳ細胞は、４，８００個／ｃｍ２の濃度であった。
細胞（Ｃ１１−１）及び（Ｃ１１−２）について下記の方法で細胞接着率及び細胞数を測定し、下記方法で分化状態の評価を行った。結果を表３に示す。
【０１２４】
＜基質表面に存在するポリペプチドの量の測定方法＞
Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡＴＭ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（ＴＨＥＲＭＯ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）のＲｅａｇｅｎｔ  Ａ溶液とＲｅａｇｅｎｔ  Ｂ溶液とＲｅａｇｅｎｔ  Ｃ溶液とを２５：２４：１の比率で混合し、混合液（Ｍ）を得た。
基質（Ｇ−１）に混合液（Ｍ）を１ｍＬ加え、３７℃で２時間静置した。
２時間後に、静置後の混合物を９６穴プレート（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）に１００μＬずつ８穴に分注し、次いで４５０ｎｍ（対照波長６３０ｎｍ）の吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＡ−３２）を用い表面のポリペプチド量を測定し、８穴分（８ウェル分）の平均の平均値とあらかじめウシ血清アルブミンにより作成した検量線とから単位面積当たりのポリペプチド量を算出した。
【０１２５】
＜細胞接着率及び細胞数の測定＞
［細胞接着率］
基質（Ｇ−１）に、ポリペプチド（Ｐ−１）を付着させた部分の面積に対して１３１．５μＬ／ｃｍ２の割合でＰＢＳ溶液を加えて２回洗浄した。次に、ＧＭＥＭ培地中に１００ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  ａｌｄｒｉｃｈ社製）を１質量％、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１質量％、５５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を０．１８質量％、Ｋｎｏｃｋ  Ｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を１０質量％、１  ｍｉｌｌｉｏｎ  ｕｎｉｔｓ／ｍＬ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ  （ＬＩＦ）  （ＭＥＲＣＫ  ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を０．２質量％でそれぞれ含むマウスＥＳ細胞用培地を作製し、作製したマウスＥＳ細胞用培地をポリペプチド（Ｐ−１）が付着した部分の面積に対して１３１．５μＬ／ｃｍ２の割合で加え、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター内で１０分間保存した。１０分後にマウスＥＳ細胞をポリペプチド（Ｐ−１）が付着した部分の面積に対して２×１０４個／ｃｍ２の割合で添加し、更に３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中にて２時間放置して培養した。
培養終了後、アスピレーターを用いて培地を除去し、細胞に直接当たらないように注意しながらＰＢＳ溶液をポリペプチド（Ｐ）が付着した部分の面積に対して１３１．５μＬ／ｃｍ２の割合で加えて２回洗浄した後、アスピレーターを用いてＰＢＳ溶液を除去した。次に、マウスＥＳ細胞用培地をポリペプチド（Ｐ−１）が付着した部分の面積に対して１３１．５μＬ／ｃｍ２の割合で加え、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター内で１０分間保存した。１０分後にＣｅｌｌ  ｃｏｕｎｔ  ｒｅａｇｅｎｔ  ＳＦ溶液をＧＭＥＭ培地に対して１０μＬ／１００μＬの割合で加え、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％の条件下で２時間静置させ、吸光度計（ＵＥＲＳＡｍａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、４５０ｎｍ及び６５０ｎｍの吸光度（それぞれ、ＯＤ４５０及びＯＤ６５０）を測定し、あらかじめ作製しておいた細胞数と吸光度（ＯＤ４５０−ＯＤ６５０）との検量線にあてはめ培養液中の接着細胞数（Ｘ）を算出した。
ポリペプチド（Ｐ−１）の代わりにフィブロネクチンを０．５μｇ／ｃｍ２で基材にコーティングした比較用基質を作製し、同様に細胞を播種し、培養２時間後にＰＢＳ溶液で洗浄しない以外は上記と同様の実験を行い、比較用基質の接着細胞数（Ｘ０）を同様に測定し、比較用基質の接着細胞数（Ｘ０）に対する培養液中の接着細胞数（Ｘ）の割合を細胞接着率として算出した。
［細胞数の測定］
得られた細胞（Ｃ１１−１）の上清をアスピレーターを用いて除去した後、ＰＢＳ溶液２ｍＬで２回洗浄した。洗浄した後、上清を捨て、更に細胞溶解液（０．０２重量％  ドデシル硫酸ナトリウム、０．１５Ｍ  塩化ナトリウム、１．５ｍＭ  クエン酸３ナトリウムを含む）を１ｍＬ加え、３７℃で３時間加温した。その後、１００μＬを９６穴ｂｌａｃｋ  ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に移した。更に蛍光基質溶液［０．１重量％  Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８（ナカイテスク社製）、０．０２重量％  ドデシル硫酸ナトリウム、０．１５Ｍ  塩化ナトリウム、１．５ｍＭ  クエン酸３ナトリウムを含む］を１００μＬ加え、励起波長３５５ｎｍ、吸収波長４６０ｎｍで蛍光強度を測定した。細胞数が分かっているサンプルで同様に蛍光強度を測定して作製した細胞数と蛍光強度との検量線を用いて蛍光強度から細胞数を算出した。また、得られた細胞（Ｃ１１−２）についても同様に細胞数を算出した。
さらに、下記比較例２の細胞（Ｃ’２−１）及び（Ｃ’２−２）についても同様に細胞数の測定を行い細胞数を算出した。下記の細胞（Ｃ’２−１）の細胞数に対する細胞（Ｃ１１−１）の細胞数の倍数、及び、下記の細胞（Ｃ’２−２）の細胞数に対する細胞（Ｃ１１−２）の細胞数の倍数を表３に示す。
【０１２６】
＜未分化状態の評価＞
得られた細胞（Ｃ１１−１）の上清をアスピレーターを用いて除去した後、ＰＢＳ溶液２ｍＬで２回洗浄した。洗浄した後、上清を捨て、更にＴＲＩｚｏｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）１ｍＬを加え、室温で５分間静置した。更にクロロホルム（和光純薬工業株式会社製）２００μＬを加え、氷中に１５分間静置した。その後、１４，０００ｇで１０分間、４℃で遠心分離し、上清を新しいマイクロチューブに移した。そこへ、イソプロパノール（和光純薬工業株式会社製）５００μＬ加え、−２０℃で１時間静置し、１４，０００ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。上清を捨て、７５％エタノールを１ｍＬ加え、１４，０００ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。上清を除去し、風乾し、沈殿が完全に乾燥した後、蒸留水（大塚製薬株式会社製）を２０μＬ加え、完全に溶解させた。
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）のプロトコールに従い、ｃＤＮＡを合成し、得られたｃＤＮＡと下記のプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲ測定を行い、未分化状態のマーカーとなるマーカー遺伝子の発現量から細胞の分化状態を解析した。未分化マーカー遺伝子の発現量はハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を１．０とした場合の相対値に換算し、更に下記の比較例２の細胞（Ｃ’２−１）について同様に行って得られた未分化マーカー遺伝子の発現量を１．０とした場合の相対値として算出し、分化状態を評価した。結果を表２に示す。未分化マーカー遺伝子の発現量が１．０に近いほど未分化状態を維持していることを示す。
【０１２７】
＜分化状態の評価＞
また、細胞（Ｃ１１−２）も同様の操作を行い、ｃＤＮＡを合成し、得られたｃＤＮＡと下記のプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲ測定を行い、分化状態のマーカーとなるマーカー遺伝子の発現量から細胞の分化状態を解析した。各分化マーカー遺伝子の発現量はハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を１．０とした場合の相対値に換算し、更に下記の比較例２の細胞（Ｃ’２−２）について同様に行って得られた各分化マーカー遺伝子の発現量を１．０とした場合の相対値として算出し、分化状態を評価した。
【０１２８】
＜実施例１２〜２０＞
ポリペプチド（Ｐ−１）を表３のものに変更したこと以外は実施例１１の細胞（Ｃ１１−１）を得る操作と同様にして、細胞（Ｃ１２−１）〜（Ｃ２０−１）を得た。また、ポリペプチド（Ｐ−１）を表３のものに変更したこと以外は実施例１の細胞（Ｃ１１−２）を得る操作と同様にしてマウスＥＳ細胞の培養を行い、細胞（Ｃ１２−２）〜（Ｃ２０−２）を得た。また、実施例１１〜２０について、実施例１と同様に細胞接着率及び細胞数を測定した。下記の細胞（Ｃ’２−１）の細胞数に対する細胞（Ｃ１２−１）〜（Ｃ２０−１）の細胞数の倍数、及び、下記の細胞（Ｃ’２−２）の細胞数に対する細胞（Ｃ１２−２）〜（Ｃ２０−２）の細胞数の倍数を表３に示す。
【０１２９】
細胞（Ｃ１２−１）〜（Ｃ２０−１）について実施例１１の細胞（Ｃ１１−１）と同様に細胞数と未分化状態の評価を行った。また、細胞（Ｃ１２−２）〜（Ｃ２０−２）について、実施例１１の細胞（Ｃ１１−２）と同様に分化状態の評価を行った。結果を表３に示す。
【０１３０】
＜比較例２＞
ポリペプチド（Ｐ−１）の代わりに、２０μｇ／ｍＬゼラチン溶液（ＳＩＧＭＡ  ａｌｄｒｉｃｈ社製）を使用したこと以外は実施例１１の細胞（Ｃ１１−１）を得る操作と同様にして、細胞（Ｃ’２−１）を得た。また、ポリペプチド（Ｐ−１）の代わりに、２０μｇ／ｍＬゼラチン溶液（ＳＩＧＭＡ  ａｌｄｒｉｃｈ社製）を使用したこと以外は実施例１１の細胞（Ｃ１１−２）を得る操作と同様にして、細胞（Ｃ’２−２）を得た。
細胞接着率及び細胞数は、実施例１１と同様に測定した。細胞（Ｃ’２−１）について実施例１１の細胞（Ｃ１１−１）と同様に未分化状態の評価を行った。結果を表３に示す。
細胞（Ｃ’２−２）について実施例１１の細胞（Ｃ１１−２）と同様に分化状態の評価を行った。結果を表３に示す。
【０１３１】
【表３】
0006714343.tif 000004
【０１３２】
表３に示すように、本発明の実施例１１〜２０は比較例２との比較において細胞接着率が高く、また得られた細胞数が多い。更に、ポリペプチド（Ｐ−１）、（Ｐ−３）、（Ｐ−４）、（Ｐ−６）及び（Ｐ−７）を含む培養液中で培養した場合は未分化状態を維持しており、ポリペプチド（Ｐ−２）、（Ｐ−９）及び（Ｐ−１０）を含む場合は中胚葉に、ポリペプチド（Ｐ−５）を含む場合は外胚葉に、ポリペプチド（Ｐ−８）を含む場合は内胚葉に特定して分化していることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０１３３】
本発明の多能性幹細胞の培養方法は、高価な増殖因子を用いることなく多能性幹細胞の分化多能性を維持したまま動物由来成分を混入させることなく増殖させることや、特定の分化方向へ誘導をかけることができる。そのため、治療等に極めて有用である。
【配列表】
0006714343000001.app