(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、抗菌活性を有するタンパク質、
を含む、抗菌剤。
【請求項２】
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、抗放線菌活性を有するタンパク質、
を含む、抗放線菌剤。
【請求項３】
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と、
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、抗菌活性を有するタンパク質と、
（ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなり、分泌されて抗菌活性を有するタンパク質と、
（ｄ）配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、分泌されて抗菌活性を有するタンパク質と、
からなる群から選択されたタンパク質をコードする塩基配列からなる核酸を含有する、抗菌タンパク質発現ベクター。
【請求項４】
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と、
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、抗菌活性を有するタンパク質と、
（ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなり、分泌されて抗菌活性を有するタンパク質と、
（ｄ）配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、分泌されて抗菌活性を有するタンパク質と、
からなる群から選択されたタンパク質をコードする塩基配列からなる核酸を含有する、抗菌遺伝子組み換え植物。
【請求項５】
ジャガイモである、
請求項４に記載の抗菌遺伝子組み換え植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗菌剤、抗放線菌剤、抗菌タンパク質発現ベクターおよび抗菌遺伝子組み換え植物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ジャガイモそうか病は、放線菌、主にＳｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ  ｓｃａｂｉｅｓ（以下、「ＳＣ」とする）によって引き起こされる土壌伝染病害である。ＳＣは、罹病したジャガイモの植えつけ、および汚染土壌の飛散などによって伝染する。ジャガイモそうか病に罹病したジャガイモの根茎表面には、淡褐色のかさぶた状の病斑が多数形成される。ジャガイモそうか病は、ジャガイモの安全性には特に影響しないが、見た目が非常に悪くなることに加え、根茎内のデンプンの含有量を低下させる。また、ジャガイモそうか病はジャガイモを腐りやすくするため、ジャガイモの流通が困難になる。このため、ジャガイモそうか病によって、食用あるいは加工用のジャガイモとしての商品価値が著しく低下する。
【０００３】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（以下、「ＢＴ」とする）がＳＣに対する抗菌活性を示すことが明らかになっている（例えば、特許文献１参照）。ＢＴは、カイコの卒倒病の病原菌として発見された好気性のグラム陽性菌である。ＢＴは、胞子形成時に巨大な結晶性タンパク質を形成する。当該結晶性タンパク質は、殺虫活性を有する。このため、ＢＴは、生物農薬として利用されてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−２８９８７８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、ＢＴの多くの菌株は、下痢型食中毒の原因であるセレウス菌の産生するエンテロトキシンと免疫学的に類似する毒素を産生する。ＢＴは、菌株によっては動物試験で毒性を示すことがあるため、安全性に関する監視が必要とされている。このように抗菌剤としてのＢＴの使用は、食品衛生上の問題が生じるおそれがある。
【０００６】
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、より安全性の高い抗菌剤、抗放線菌剤、抗菌タンパク質発現ベクターおよび抗菌遺伝子組み換え植物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明者は、ＳＣに対するＢＴの抗菌作用の活性本体を同定するために鋭意研究を重ねたところ、活性本体を同定するに到り、本発明を完成させた。すなわち、
本発明の第１の観点に係る抗菌剤は、
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、抗菌活性を有するタンパク質、
を含む。
本発明の第２の観点に係る抗放線菌剤は、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、抗放線菌活性を有するタンパク質、
を含む。
【０００８】
本発明の第３の観点に係る抗菌タンパク質発現ベクターは、
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と、
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、抗菌活性を有するタンパク質と、
（ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなり、分泌されて抗菌活性を有するタンパク質と、
（ｄ）配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、分泌されて抗菌活性を有するタンパク質と、
からなる群から選択されたタンパク質をコードする塩基配列からなる核酸を含有する。
【０００９】
本発明の第４の観点に係る抗菌遺伝子組み換え植物は、
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と、
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、抗菌活性を有するタンパク質と、
（ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなり、分泌されて抗菌活性を有するタンパク質と、
（ｄ）配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、分泌されて抗菌活性を有するタンパク質と、
からなる群から選択されたタンパク質をコードする塩基配列からなる核酸を含有する。
【００１０】
この場合、上記本発明の第４の観点に係る抗菌遺伝子組み換え植物は、
ジャガイモである、
こととしてもよい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、より安全性の高い抗菌剤、抗放線菌剤、抗菌タンパク質発現ベクターおよび抗菌遺伝子組み換え植物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】Ｗｅｌｌ−ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ法における阻止円の一例を示す図である。（ａ）は、抗菌活性がない場合を示す。（ｂ）は、抗菌活性がある場合を示す。
【図２】ＢＴ培養上清に係る溶出画分の吸光度および塩化ナトリウムの濃度を示す図である。
【図３】ＢＴ培養上清に係る精製画分の吸光度の相対値および電気伝導率を示す図である。
【図４】精製画分の抗菌活性を示す図である。
【図５】抗菌活性を有する精製画分のトリシンＳＤＳＰＡＧＥの結果を示す図である。（ａ）は、２４番の精製画分の結果を示す。（ｂ）は、２８番および３１番の精製画分の結果を示す。
【図６】形質転換した大腸菌のソニケーション後の上清についてのトリシンＳＤＳＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図７】大腸菌で発現させたタンパク質の抗菌活性を示す図である。
【図８】精製画分に含まれるタンパク質の抗菌活性のｐＨ依存性を示す図である。（ａ）は、ｐＨ４で１日間保存後の抗菌活性を示す。（ｂ）は、各ｐＨで３日間保存後の抗菌活性を示す。
【図９】大腸菌で発現させたタンパク質の１日間保存後のｐＨ４およびｐＨ９での抗菌活性を示す図である。
【図１０】大腸菌で発現させたタンパク質の１日間保存後のｐＨ４〜９での抗菌活性を示す図である。
【図１１】精製画分に含まれるタンパク質の抗菌活性の温度依存性を示す図である。
【図１２】大腸菌で発現させたタンパク質の抗菌活性の温度依存性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明に係る実施の形態について説明する。
（実施の形態１）
まず、実施の形態１について詳細に説明する。本実施の形態に係る抗菌剤は、例えば、配列番号１または２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を含む。当該タンパク質は、ＢＴ由来のタンパク質である。当該タンパク質は、放線菌、好ましくはストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ）属の細菌に抗菌活性を有する。ストレプトマイセス属の細菌は、上記ＳＣの他に、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｃｉｄｉｓｃａｂｉｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｃａｂｉｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｕｒｇｉｄｉｓｃａｂｉｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃａｖｉｓｋａｂｉｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｕｒｉｄｉｓｃａｂｉｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｎｉｖｅｉｓｃａｂｉｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｎｉｃｉｓｃａｂｉｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｎｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓなどである。特に、当該タンパク質は、土壌伝染病害の原因である細菌、好ましくはＳＣおよびＳｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ  ｔｕｒｇｉｄｉｓｃａｂｉｅｓに対する抗菌活性を有する。ここで、「抗菌活性」とは、細菌の生育もしくは増殖を阻害する効果、または細菌を死滅させる効果をいう。
【００１４】
上記タンパク質は、配列番号１または２に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。「数個」とは、配列番号１または２のアミノ酸配列の長さによって異なり、抗菌活性を維持する限り、例えば、１０個〜１個、５個〜１個、または３個〜１個である。
【００１５】
上記タンパク質は、配列番号１または２に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。一般に、２つのタンパク質間で、アミノ酸配列の配列同一性が８０％以上であれば、立体構造および機能が極めて類似する。このため、配列番号１または２に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質は、抗菌活性を有する。アミノ酸配列の配列同一性が高ければ、立体構造の類似性も高くなるため、配列同一性は、抗菌活性を維持する限り、８５％以上または９０％以上であるのが好ましく、９５％以上であればさらに好ましい。
【００１６】
本実施の形態に係る上記タンパク質は、公知の方法で合成することができる。例えば、当該タンパク質は、化学的なポリペプチド合成法で合成されてもよいし、大腸菌などを用いた遺伝子工学的な方法で合成されてもよい。例えば、ポリペプチド合成法としては、液相法または固相法を挙げることができる。液相法は、反応を溶液状態で行い、反応混合物から生成物を単離精製し、得られた生成物を中間体として次のペプチド伸長反応に用いる方法である。一方、固相法は、反応溶媒に対して不溶の固相担体にアミノ酸を結合させ、このアミノ酸に縮合反応を順次行い、ペプチドを伸長する方法である。上記タンパク質は、タンパク質を構成する部分ペプチドまたはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより合成することもできる。
【００１７】
遺伝子工学的な方法では、例えば、上記タンパク質をコードする遺伝子を発現する発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、形質転換体を培養することによって該タンパク質を得ることができる。上記タンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させるための種々の調節エレメント（プロモーター、リボゾーム結合部位、ターミネーター、エンハンサーおよび発現レベルを制御する種々のシスエレメントなど）とを用いて、宿主細胞に応じた発現ベクターを構築することができる。構築した発現ベクターは、例えば、大腸菌などの宿主細胞にエレクトロポレーションなどの方法により導入すればよい。当該宿主細胞を所定の条件で培養することにより、本実施の形態１に係るタンパク質が宿主細胞内で発現され、当該タンパク質を抽出することができる。
【００１８】
得られたタンパク質は、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、またはエドマン分解法などにより精製および解析してもよい。
【００１９】
本実施の形態に係る抗菌剤は、植物、または土壌、マット、固形培地などの構造体、養液栽培における養液、および水栽培における水などの植物成長媒体に投与すればよい。なお、植物成長媒体は、植物が成長する媒体であれば任意のものでよい。
【００２０】
上記抗菌剤の投与対象となる植物は、放線菌、特にストレプトマイセス属の細菌の病害が及び得るものであれば任意の種類であってよい。上記ストレプトマイセス属の細菌は、ジャガイモ、カブ、ダイコン、テンサイ、ニンジンおよびゴボウなどに感染して、表面にかさぶた状の病斑を形成する。また、上記ストレプトマイセス属の細菌は、コムギ、ダイズおよびインゲンマメの根などにも寄生する。このため上記抗菌剤の投与対象となる植物は、ジャガイモ、カブ、ダイコン、テンサイ、ニンジン、ゴボウ、コムギ、ダイズおよびインゲンマメなどである。特に当該抗菌剤は、ジャガイモそうか病に有効である。よって、当該抗菌剤は、種々の植物における抗そうか病剤または抗ジャガイモそうか病剤としても使用できる。
【００２１】
当該抗菌剤を、噴霧などにより植物成長媒体に投与することで、植物成長媒体で生育する植物に放線菌が感染すること、あるいは放線菌による病害が及ぶことを防止できる。また、当該抗菌剤を、噴霧などにより植物に投与することで、病原性の放線菌に未感染の植物であれば、該植物への放線菌の感染、あるいは放線菌の病害が該植物に及ぶことを防止できる。病原性の放線菌に感染後の植物であれば、当該抗菌剤を投与することで病害の拡大を阻止できる。
【００２２】
本実施の形態に係る抗菌剤は、所望の効果が得られる限り、上記タンパク質を任意の濃度で含む。例えば、抗菌剤は、滅菌水、脱イオン水または緩衝液などに懸濁した状態で、上記タンパク質を１μｇ／ｍＬ〜１ｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ、または１００μｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの濃度で含有する。植物に投与する場合、抗菌剤は、植物個体あたり１μＬ〜１０００ｍＬ、１０μＬ〜１００ｍＬ、１００μＬ〜１０ｍＬ、１〜５ｍＬを投与してもよく、これ以上の任意の量で投与してもよい。植物に投与する場合、当該抗菌剤を注射筒に入れ、圧迫接種してもよいし、注射針を介して接種してもよい。液剤としての当該抗菌剤を植物成長媒体に投与する場合、例えば、植物成長媒体の表面積１ｍ２あたり、１μＬ〜１０００ｍＬ、１０μＬ〜１００ｍＬ、１００μＬ〜１０ｍＬ、または１〜５ｍＬを散布してもよく、これ以上の任意の量で投与してもよい。なお、当該抗菌剤は、液剤に限らず、上記タンパク質の抗菌活性を維持しうる限り、該タンパク質を凍結乾燥などにより固体として製剤されてもよい。
【００２３】
本実施の形態に係る抗菌剤は、植物または植物成長媒体に単回で投与されてもよいし、任意の時間間隔で植物または植物成長媒体に複数回投与されてもよい。具体的には、当該抗菌剤は、１週間に１回または複数回、あるいは２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回などの間隔で植物などに投与すればよい。投与間隔は、投与対象の植物または植物成長媒体に応じて、適宜決定することができる。
【００２４】
本実施の形態に係る抗菌剤は、有効成分である上記タンパク質以外にも、一般に薬学的または植物学的に許容される他の物質、組成物などを含んでもよい。
【００２５】
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る抗菌剤は、抗菌活性の活性本体であるタンパク質を含み、病原性因子となりうる菌体を排除しているため、安全性が高い。また、本実施の形態に係る抗菌剤は、放線菌を原因とする植物の病害、特にはジャガイモそうか病の発症もしくは病害拡大を予防できる。また、当該抗菌剤は、ジャガイモそうか病菌の防除にも使用できる。
【００２６】
なお、本実施の形態に係る抗菌剤に含まれるタンパク質のアミノ酸配列は、抗菌活性が維持される限り、Ｎ末端またはＣ末端に数個のアミノ酸残基が付加されていてもよい。
【００２７】
（実施の形態２）
次に、実施の形態２について詳細に説明する。本実施の形態に係る抗菌剤は、例えば、配列番号１または２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列からなる核酸を含有する発現ベクターを含む。
【００２８】
上述の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は、ＢＴでは、菌体外への移行を促すシグナルペプチドをＮ末端に含む前駆体タンパク質として発現し、プロセシングを受けて分泌される。そこで、本実施の形態に係る抗菌剤は、当該前駆体タンパク質のアミノ酸配列である配列番号３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列からなる核酸を含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を含んでもよい。
【００２９】
また、上述の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は、ＢＴにおいてはシグナルペプチドに加え、菌体外で分解され、タンパク質の構造維持に関わるプロペプチドをＮ末端に含む前駆体タンパク質として発現する。当該前駆体タンパク質のアミノ酸配列を配列番号４に示す。また、配列番号４に示すアミノ酸配列からシグナルペプチドのアミノ酸配列を除いたアミノ酸配列を配列番号５に示す。本実施の形態に係る抗菌剤は、配列番号４または配列番号５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列からなる核酸を含有する発現ベクターを含んでもよい。
【００３０】
配列番号１〜５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、それぞれ配列番号６〜１０に示す塩基配列が挙げられる。
【００３１】
上記核酸は、既知の方法で合成することができる。当該核酸は、例えば、固相ホスホルアミダイト法などの任意の合成法により化学的に合成される。当該核酸は、トリエステル法でも合成できる。また、当該核酸は、種々の自動合成装置で合成することもできる。当該核酸の合成には、マルチヌクレオチド合成法も適宜使用することができる。この他、当該核酸は、ＢＴのゲノムを鋳型にして、プライマーを用いたＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）で合成することもできる。
【００３２】
例えば、上記発現ベクターは、上述の核酸を含む。当該発現ベクターは、宿主細胞中でプロモーターが配列番号１ないし５のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を発現するように、上記核酸を適切な発現ベクター内のプロモーターの下流に連結することにより構築することができる。
【００３３】
ベクターの種類は、上記タンパク質を発現することができるものであれば特に制限されない。発現ベクターとしては、プラスミドベクター、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、ウイルスベクター、ファージベクター、レトロウイルスベクター、染色体ベクター、エピソームベクターおよびウイルス由来ベクターなどを用いることができる。
【００３４】
上記タンパク質を発現させるためには、エレクトロポレーションなどによって上記発現ベクターを宿主細胞に導入すればよい。宿主細胞の具体例としては、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ（ＤＥ３）株およびＢＬ２１（ＤＥ３）株などが挙げられる。
【００３５】
上記タンパク質が確実に発現するか否かを確認するために、発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーをコードする核酸を含むことが好ましい。選択マーカーとしては、例えば、各種の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。また、その他にも宿主細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用いて、当該マーカーと上記タンパク質をコードする塩基配列を発現ベクターとして宿主細胞に導入してもよい。こうすることで、マーカーの発現に基づいてタンパク質の導入を確認することができる。
【００３６】
さらに、上記発現ベクターは、転写開始、転写終結のための部位および転写領域中に翻訳のためのリボゾーム結合部位を含むことが好ましい。発現ベクターによって発現される転写物のコード部分は、翻訳されるべき領域の始めに開始コドンを含み、終わりの適切な位置に終止コドンを含むことになる。
【００３７】
上記発現ベクターは、上記タンパク質を過剰に発現させることができる。例えば、発現ベクターとしてウイルスベクターまたはプラスミドを含む抗菌剤を植物に注射することで、該植物において抗菌活性を有する上述のタンパク質を発現させることができる。
【００３８】
当該抗菌剤の投与量は、例えば、リアルタイムＰＣＲ法による絶対定量で算出した発現ベクターのコピー数に応じて決めることができる。例えば、発現ベクターとしてウイルスベクターを用いた場合、１．０×１０８〜１．０×１０１０コピー／μｌのウイルス溶液を、好ましくは０．１〜５０μｌ、より好ましくは０．５〜１０μｌ、特に好ましくは１〜５μｌ投与すればよい。
【００３９】
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る抗菌剤は、放線菌に対して抗菌活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる核酸を含有する発現ベクターを含むため、植物に投与することで、当該タンパク質を過剰に発現させることができる。この結果、放線菌を原因とする植物の病害の発症または病害拡大を予防できる。
【００４０】
なお、上述の発現ベクターは、配列番号１ないし５のいずれかに示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列からなる核酸を含有してもよい。また、上述の発現ベクターは、配列番号１ないし５のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列からなる核酸を含有してもよい。
【００４１】
（実施の形態３）
次に、実施の形態３について詳細に説明する。本実施の形態に係る遺伝子組み換え植物は、配列番号１ないし５のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列からなる核酸を含有する。配列番号１ないし５のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、ＢＴ由来のタンパク質であるため、当該核酸を植物が有することはない。そこで、上記発現ベクターを植物に導入することで当該遺伝子組み換え植物を得ることができる。形質転換の対象となる植物は、任意であるが、例えば、カブ、ダイコン、テンサイ、ニンジン、ゴボウ、コムギ、ダイズおよびインゲンマメ、特に好ましくは、ジャガイモである。
【００４２】
例えば、当該遺伝子組み換え植物は、上記発現ベクターで植物を形質転換することで作製できる。上記発現ベクターで植物細胞を形質転換する方法は、特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、アグロバクテリウム、パーティクル・ガン法、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染などの公知の方法を用いることができる。
【００４３】
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る遺伝子組み換え植物は、放線菌に対して抗菌活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる核酸を含有するため、当該タンパク質を発現し、分泌することができる。こうすることで、放線菌を原因とする植物の病害、特にはそうか病の発症または病害拡大を予防できる。
【００４４】
本実施の形態では、本実施の形態に係る遺伝子組み換え植物は、ジャガイモであってもよいこととした。こうすることで、ＳＣに起因するジャガイモそうか病に罹患する危険性を極力低下させることができる。
【００４５】
なお、当該遺伝子組み換え植物は、ジャガイモに限定されず、イネ、ニンジン、サツマイモ、ナス、トマト、カブ、ダイコン、テンサイ、ゴボウ、ダイズおよびインゲンマメなどであってもよい。
【実施例】
【００４６】
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００４７】
（実施例１：活性測定）
ＳＣに対する抗菌活性は、Ｗｅｌｌ−ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ法を用いて測定した。３０℃のマルトースベネット培地で、２日間振とう培養したＳＣ（独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンターより取得）を、約１〜２ｍｌのマルトースベネット寒天培地に播いた。次に、直径５ｍｍの鉄パイプで当該寒天培地に穴を開け、その穴に活性測定対象の試料を２０〜５０μｌ加えた。その後２８℃で一晩培養した。なお、マルトースベネット培地の組成は、１ｇの魚肉（カツオ）エキス（和光純薬工業社製）、１ｇの酵母エキス（ナカライテスク社製）、１０ｇのマルトース（ナカライテスク社製）、２ｇのＮＺ−アミン（和光純薬工業社製）、および１０００ｍｌの脱イオン水である。マルトースベネット寒天培地の場合、上記マルトースベネット培地の組成に、さらに２０ｇの寒天を加えた。
【００４８】
図１（ａ）に示す試料に抗菌活性がない場合に対して、試料に抗菌活性化がある場合、図１（ｂ）に示すように穴の周囲に阻止円が形成される。以下のＳＣに対する抗菌活性は、阻止円の有無または阻止円の直径で評価した。
【００４９】
（実施例２：ＢＴ由来抗菌物質の精製）
まず、ブイヨン液体培地にＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  Ａ２９７株（以下「Ａ２９７」とする）を植菌し、３０℃で一晩振とう培養した。培養後、遠心分離（１２００×ｇ、５分間）で培養上清を回収した。ブイヨン液体培地の組成は、１０ｇの魚肉（カツオ）エキス、１０ｇのポリペプトン（和光純薬工業社製）、２ｇの塩化ナトリウム（和光純薬工業社製）、および１０００ｍｌの脱イオン水である。
【００５０】
次に、１５０ｍｌのゲル（ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標））を、ｐＨ４の２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液で緩衝化した。緩衝化したゲルをカラム（６０ｍｍ×１００ｍｍ）に充填した。上述の回収した１０００ｍｌの培養上清を、６Ｎの塩酸でｐＨ４にし、ゲルに吸着させた。その後、ゲルを通過した２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液の吸光度が０付近になるまでゲルを洗浄した。洗浄後、０〜０．８Ｍ塩化ナトリウムでグラジエント溶出を行った。溶出画分の体積は１１ｍｌとし、溶出時間は１本あたり１５分とした。回収した溶出画分のｐＨを、０．５Ｍリン酸緩衝液で８付近にした後、抗菌活性を測定した。
【００５１】
抗菌活性が認められた上記溶出画分をエバポレータで濃縮し、限外ろ過で脱塩した。脱塩した試料をＴｓｋｇｅｌ  ＣＭ−５ＰＷを用いて精製した。Ｔｓｋｇｅｌ  ＣＭ−５ＰＷを、ｐＨ４の２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液で緩衝化した。ｐＨ４に調整した試料をゲルに吸着させた。その後、ゲルを通過した２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液の吸光度が０付近になるまでゲルを洗浄した。洗浄後、０〜０．５Ｍ塩化ナトリウムでグラジエント溶出を行った。溶出画分の体積は１ｍｌとし、溶出時間は１本あたり１分とした。回収した溶出画分（以下、「精製画分」とする）のｐＨを、ｐＨ０．８の０．５Ｍリン酸緩衝液で７付近にした後、精製画分の抗菌活性を測定した。抗菌活性が認められた精製画分を限外ろ過で濃縮かつ脱塩した。
【００５２】
精製を確認するため、抗菌活性が認められた精製画分についてトリシンＳＤＳＰＡＧＥ（１６．５％Ｔ、３％Ｃ）を行った。精製画分が分離ゲルに入るまで定電圧３０Ｖで泳動した。ＢＰＢがゲルの先端から５ｍｍの位置に移動するまで定電圧１００Ｖで泳動した。泳動後のゲルを、ＣＢＢ液で染色し、バックグラウンドが消えるまで脱色液に浸漬した。分離ゲルの組成は、１０ｍｌのアクリルアミド（３％Ｃ）、１０ｍｌのゲル緩衝液（ｐＨ８．４５）、４ｇのグリセロール、６ｍｌの蒸留水、１５０μｌの１０％過硫酸アンモニウム、および１５μｌのテトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）である。
【００５３】
（結果）
図２は、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）を用いたときの溶出画分の吸光度（２８０ｎｍ）および塩化ナトリウムの濃度を示す。抗菌活性を測定したところ、４９番から７１番の溶出画分に抗菌活性が認められた。
【００５４】
図３は、精製画分の吸光度（２８０ｎｍ）の相対値および電気伝導率を示す。タンパク質の存在を示すピークが２番、２４番、２８番および３１番の精製画分に確認できた。抗菌活性を測定したところ、図４に示すように２４番、２８番〜３１番の精製画分に抗菌活性が認められた。
【００５５】
図５は、トリシンＳＤＳＰＡＧＥの結果を示す。抗菌活性が認められた２４番の精製画分は、１７ｋＤａ付近に単一なバンドを示した（図５（ａ）参照）。また、２８番および３１番の精製画分は、８ｋＤａ付近に単一なバンドを示した（図５（ｂ）参照）。
【００５６】
（実施例３：抗菌活性を有するタンパク質のＮ末端配列の解析）
２４番、２８番および３１番の精製画分をＰＤＶＦ膜に染み込ませ、プロテインシーケンサー（ＰＳＱ、島津製作所製）を用いて、抗菌活性を有するタンパク質のＮ末端配列を解析した。
【００５７】
（結果）
２４番、２８番および３１番の各精製画分に含まれるタンパク質のＮ末端のアミノ酸配列は以下であることが示された。
２４番  ＳＶＫＬＳＳＹＹＤＧＫＮＰＡＴ
２８番  ＡＥＡＫＧＤＴＶＧＹＹＧＡＫＭＲＳＧＹＴＶＥＳＰ
３１番  ＡＡＥＡＫＧＤＴＶＧ
【００５８】
（実施例４：クローニング）
ブイヨン液体培地にＡ２９７を植菌した後、３０℃で一晩培養した。その後、ＰｕｒｅＬｉｎｋ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）を使用してＡ２９７のゲノムを抽出した。
【００５９】
２４番および２８番の精製画分のＮ末端のアミノ酸配列各々について、データベース（ＫＥＧＧ）を検索し、相同性の高い機能未知タンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ同定した。同定した機能未知タンパク質のアミノ酸配列に基づいてプライマーを設計し、ＰＣＲを行った。
【００６０】
２４番の精製画分に含まれるタンパク質をコードする塩基配列を含む領域を増幅するためのフォワードプライマーの塩基配列を配列番号１１に、リバースプライマーの塩基配列を配列番号１２に示す。２８番の精製画分に含まれるタンパク質をコードする塩基配列を含む領域を増幅するためのフォワードプライマーの塩基配列を配列番号１３に、リバースプライマーの塩基配列を配列番号１４に示す。
【００６１】
上記ＰＣＲの反応液の組成を次に示す。
５×ＰｒａｉｍｅＳｔａｒ  ＧＸＬ  Ｂｕｆｆｅｒ：１０μｌ（終濃度は１×）
ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）：４μｌ（終濃度は各２００μＭ）
フォワードプライマー：１．５μｌ（終濃度は０．３μＭ）
リバースプライマー：１．５μｌ（終濃度は０．３μＭ）
テンプレートＤＮＡ：１μｌ（終濃度は４ｎｇ／μｌ）
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（タカラバイオ社製）：１μｌ（終濃度は０．０２５Ｕ／μｌ）
脱イオン水：３１μｌ
【００６２】
ＰＣＲにおける増幅反応の条件は、９４℃で２分の後、９８℃で１０秒→５０℃で１５秒→６８℃で１分を３０サイクル繰り返した後、６８℃で１０分を経て終了した。
【００６３】
（結果）
アガロースゲル電気泳動によって、得られたＰＣＲ産物の塩基配列の長さを評価したところ、２４番の精製画分に由来するＰＣＲ産物の塩基配列の長さは７８０ｂｐ、２８番の精製画分に由来するＰＣＲ産物の塩基配列の長さは７５０ｂｐであった。
【００６４】
（実施例５：サブクローニング）
上記ＰＣＲ産物をアガロースゲルから切り出し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ（商標）  ＩＩＩキット（Ｑ−Ｂｉｏｇｅａｎｅ社製）を用いてＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡを、ＨｉｎｃＩＩで制限酵素処理したｐＨＳＧ３９６プラスミドベクターに導入した。次に、エレクトロポレーションによってプラスミドを大腸菌に導入し、ブルーホワイト選択法によりＬＢ培地上で形質転換体を選択した。ＬＢ培地の組成は、１０ｇのトリプトン、５ｇの酵母エキス、１０ｇの塩化ナトリウム、１０００ｍｌの脱イオン水および２０ｇの寒天である。
【００６５】
ブルーホワイト選択法では、ＬＢ培地にクロラムフェニコール（３０ｍｇ／ｍｌ）、Ｘ−ＧＡＬ（２５ｍｇ／ｍｌ）、ＩＰＴＧ（２５ｍｇ）を５０μｌずつ添加した。当該ＬＢ培地にエレクトロポーション後の大腸菌を散布した。一晩放置後、色がはっきりと区別できるまで培養し、白色のコロニーを選択した。
【００６６】
続いて、Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＬａｂｏＰａｓｓ（登録商標）  Ｍｉｎｉ、北海道システムサイエンス社製）を用いて、選択したコロニー中の大腸菌からプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドを、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで制限酵素処理した。アガロースゲル電気泳動によって、得られた断片の塩基配列の長さを評価したところ、目的のＤＮＡのクローニングが確認できた。以下では、２４番の精製画分に由来するＰＣＲ産物から構築したプラスミドを「２４−ｐＨＳＧ」とし、２８番の精製画分に由来するＰＣＲ産物から構築したプラスミドを「２８−ｐＨＳＧ」とする。
【００６７】
（実施例６：内部配列の取得）
２４−ｐＨＳＧおよび２８−ｐＨＳＧのＤＮＡの内部配列を解析した（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社）。２４−ｐＨＳＧの内部配列がコードするタンパク質（以下、「タンパク質２４ａ」とする）のアミノ酸配列を配列番号３に示す。２８−ｐＨＳＧの内部配列がコードするタンパク質（以下、「タンパク質２８ａ」とする）のアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【００６８】
（実施例７：大腸菌発現系の構築）
タンパク質２４ａのアミノ酸配列には、Ｎ末端から３０残基にわたって、シグナルペプチドのアミノ酸配列が含まれる。一方、タンパク質２８ａのアミノ酸配列には、Ｎ末端から２３残基にわたってシグナル配列が含まれ、さらにＮ末端から数えて２４番目から３９番目の１６残基にわたって、プロペプチドのアミノ酸配列が含まれる。そこで、タンパク質２４ａおよびタンパク質２８ａからシグナルペプチドをそれぞれ除いたタンパク質の発現系を以下のように構築した。
【００６９】
タンパク質２４ａからシグナルペプチドを除いたタンパク質（以下、「タンパク質２４ｂ」とする）のアミノ酸配列を配列番号１に示す。タンパク質２８ａからシグナルペプチドを除いたタンパク質（以下、「タンパク質２８ｂ」とする）のアミノ酸配列を配列番号５に示す。
【００７０】
上記実施例５で構築した２４−ｐＨＳＧまたは２８−ｐＨＳＧをテンプレートＤＮＡとして、上記実施例４と同じ条件でＰＣＲを行った。タンパク質２４ｂのアミノ酸配列をコードする塩基配列を増幅させるためのフォワードプライマーの塩基配列を配列番号１５に、リバースプライマーの塩基配列を配列番号１６に示す。タンパク質２８ｂのアミノ酸配列をコードする塩基配列を増幅させるためのフォワードプライマーの塩基配列を配列番号１７に、リバースプライマーの塩基配列を配列番号１８に示す。
【００７１】
アガロースゲル電気泳動によって、得られたＰＣＲ産物の塩基配列の長さを確認後、ＰＣＲ産物をアガロースゲルから切り出してＤＮＡを抽出した。抽出したＰＣＲ産物とｐＥＴ３２ｂプラスミドベクターとを、ＮｄｅＩとＸｈｏＩで制限酵素処理し、ＰＣＲ産物をｐＥＴ３２ｂプラスミドベクターに挿入した。エレクトロポレーションにて大腸菌に導入した後、アンピシリンとＩＰＴＧが散布されたＬＢ培地に植菌し、形質転換体の選択を行った。２４−ｐＨＳＧをテンプレートＤＮＡとしたＰＣＲ産物から構築したプラスミドを「２４−ｐＥＴ３２ｂ」とし、２８−ｐＨＳＧをテンプレートＤＮＡとしたＰＣＲ産物から構築したプラスミドを「２８−ｐＥＴ３２ｂ」とする。
【００７２】
次に、２４−ｐＥＴ３２ｂを大腸菌ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ（ＤＥ３）株に、エレクトロポレーションで導入した。一方、２８−ｐＥＴ３２ｂを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株にエレクトロポレーションで導入した。その後、アンピシリンを添加したＬＢ培地に各菌をそれぞれ植菌し、形質転換体を選択した。それぞれ得られた形質転換体を２４−ｐＥＴ３２ｂ株、２８−ｐＥＴ３２ｂ株とする。
【００７３】
ｐＥＴ  ｓｙｓｔｅｍ  Ｍａｎｕａｌに従って、２４−ｐＥＴ３２ｂ株および２８−ｐＥＴ３２ｂ株の誘導操作を行った。誘導操作後、菌体を遠心分離で回収し、脱イオン水で洗浄した。その後、ソニケーションによって細胞を破壊し、遠心分離して上清を回収した。回収した上清について、トリシンＳＤＳＰＡＧＥを行い、発現を確認した。
【００７４】
（結果）
図６は、回収した上清におけるトリシンＳＤＳＰＡＧＥの結果を示す。矢印Ａおよび矢印Ｂで示すバンドが、それぞれタンパク質２４ｂおよびタンパク質２８ｂに対応するバンドを示す。タンパク質２４ｂおよびタンパク質２８ｂの発現が、ＩＰＴＧ存在下で促進されていることを確認した。
【００７５】
大腸菌で発現させたタンパク質２４ｂおよびタンパク質２８ｂは、図７に示すように、抗菌活性を有することが示された。なお、ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ（ＤＥ３）株およびＢＬ２１（ＤＥ３）株ともに遺伝子を導入していない場合は抗菌活性がないことを確認した。以上の結果より、タンパク質２４ｂおよびタンパク質２８ｂは、ＳＣに対する抗菌活性を有することが示された。
【００７６】
（実施例８：各タンパク質のｐＨ安定性および温度安定性の検討）
実施例２で精製した２８番の精製画分に含まれるタンパク質、タンパク質２４ｂおよびタンパク質２８ｂについて、抗菌活性が得られるｐＨおよび温度を評価した。
【００７７】
ｐＨ安定性は、次の方法で評価した。限外濾過（分画分子量３５００、Ａｍｉｎｉｃｏｎ（商標）Ｕｌｔｒａ  ０．５ｍｌ）でサンプルの溶媒を脱イオン水に置換した。その後、ｐＨ４〜９のバッファーを用いて、サンプルの各ｐＨを調整した。ｐＨ４およびｐＨ５の調整には、それぞれｐＨ４およびｐＨ５の０．５Ｍ酢酸バッファーを用いた。ｐＨ６、ｐＨ７およびｐＨ８の調整は、それぞれｐＨ６、ｐＨ７およびｐＨ８の０．５Ｍリン酸バッファーを用いた。ｐＨ９の調整には、ｐＨ９の０．５Ｍトリス塩酸バッファーを用いた。各ｐＨで１日間または３日間冷蔵保存し、抗菌活性を測定した。
【００７８】
温度安定性は、サンプルを所定温度で３０分間インキュベートし、氷冷後、抗菌活性を測定することで評価した。
【００７９】
（結果）
図８（ａ）は、２８番の精製画分に含まれるタンパク質について、ｐＨ４で１日間保存後の抗菌活性を示す。図８（ｂ）は、各ｐＨで３日間保存後の抗菌活性を示す。抗菌活性を定量的に評価するために、表１に示すように、阻止円の直径を測定した。酸性条件下であってもアルカリ性条件下であっても、２８番の精製画分に含まれるタンパク質は、３日間保存後において抗菌活性を有していた。ｐＨ４の条件下では、１日間保存後に対して３日間保存後で抗菌活性の低下がみられた。このため、２８番の精製画分に含まれるタンパク質の抗菌活性は、ｐＨ４以下では、経時的に低下することが示唆された。
【００８０】
【表１】
0006714323.tif 000002
【００８１】
図９は、１日間保存後のタンパク質２４ｂのｐＨ４およびｐＨ９での抗菌活性を示す。図１０は、１日間保存後のタンパク質２８ｂのｐＨ４〜９での抗菌活性を示す。これにより、タンパク質２４ｂおよびタンパク質２８ｂは、ｐＨ４〜９で抗菌活性を安定に維持できることが示された。
【００８２】
図１１および表２は、２８番の精製画分に含まれるタンパク質について、各温度での抗菌活性を示す。２８番の精製画分に含まれるタンパク質は、５０℃程度までは抗菌活性を有する一方、６０℃以上では失活することが示された。なお、図１１のクルードは、実施例２で回収した精製前の培養上清である。
【００８３】
【表２】
0006714323.tif 000003
【００８４】
図１２は、タンパク質２４ｂおよびタンパク質２８ｂ各々の各温度での抗菌活性を示す。タンパク質２４ｂは、６０℃まで抗菌活性を有していた。一方タンパク質２８ｂは、５０℃以上で失活した。
【００８５】
上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内およびそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明は、抗菌剤および遺伝子組み換え植物に好適である。本発明に係る抗菌剤および遺伝子組み換え植物は、ＳＣに対する抗菌活性を有するので、ＳＣによって引き起こされる病害の防除、改善および拡大防止に寄与する。
【図１】
0006714323.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
0006714323.tif 000013
【図１１】
0006714323.tif 000014
【図１２】
0006714323.tif 000015
【配列表】
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