(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
BoNT/Eの生物学的活性を測定するアッセイのための、BoNT/Eで切断されたSNAP-25に対して特異的に結合するモノクローナル抗体の使用であって、前記抗体が、2014年12月17日に、受託番号DSM ACC3261で、DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstraβe 7 B, 38124 Braunschweig, Germany)に寄託されたハイブリドーマ細胞株pCNEI 32-7-1, 3614-000によって産生されたモノクローナル抗体に含まれていたCDR-L1(配列番号１５)、CDR-L2(配列番号１６)、CDR-L3(配列番号１７)、CDR-H1(配列番号１８)、CDR-H2(配列番号１９)及びCDR-H3(配列番号２０)の相補性決定領域(CDR)を含む、前記使用。
【請求項２】
前記抗体が、配列番号１(「C-NEIDTQNRQIDR」)又は配列番号２(「NEIDTQNRQIDR」)に示されるアミノ酸配列を有するペプチドから成るエピトープに対して特異的に結合する、請求項１記載の使用。
【請求項３】
前記抗体が、2014年12月17日に、受託番号DSM ACC3261で、DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstraβe 7 B, 38124 Braunschweig, Germany)に寄託されたハイブリドーマ細胞株pCNEI 32-7-1, 3614-000によって産生されたモノクローナル抗体に含まれていたVH領域(配列番号２２)及びVL領域(配列番号２１)を含む、請求項１又は２記載の使用。
【請求項４】
細胞内でのBoNT/Eの生物学的活性を直接的に決定する方法であって、
a）BoNT/E中毒の影響を受けやすい細胞を、BoNT/Eと一緒に、前記BoNT/Eが、その生物学的活性を示すことを許容する時間及び条件下で、インキュベートすることと、
b）前記細胞を固定し、且つ任意に、界面活性剤で前記細胞を透過化することと、
c）前記細胞を、切断されていない及びBoNT/Eで切断されたSNAP-25に対して特異的に結合する少なくとも第１の捕捉抗体、並びにBoNT/Eで切断されたSNAP-25に対して特異的に結合する少なくとも第２の捕捉抗体と、切断されていない及びBoNT/Eで切断されたSNAP-25に対する第１の捕捉抗体の結合、並びにBoNT/Eで切断されたSNAP-25に対する第２の捕捉抗体の結合を許容する条件下で、接触させることであって、第２の捕捉抗体が、BoNT/Eで切断されたSNAP-25に対して特異的に結合するモノクローナル抗体であって、2014年12月17日に、受託番号DSM ACC3261で、DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstraβe 7 B, 38124 Braunschweig, Germany)に寄託されたハイブリドーマ細胞株pCNEI 32-7-1, 3614-000によって産生されたモノクローナル抗体に含まれていたCDR-L1(配列番号１５)、CDR-L2(配列番号１６)、CDR-L3(配列番号１７)、CDR-H1(配列番号１８)、CDR-H2(配列番号１９)及びCDR-H3(配列番号２０)の相補性決定領域(CDR)を含む、前記モノクローナル抗体である、接触させることと、
d）前記細胞を、第１の捕捉抗体に対して特異的に結合する少なくとも第１の検出抗体と、第１の捕捉抗体に対する第１の検出抗体の結合を許容する条件下で接触させ、その結果、第１の検出複合体を形成し、且つ第２の捕捉抗体に対して特異的に結合する少なくとも第２の検出抗体と、第２の捕捉抗体に対する第２の検出抗体の結合を許容する条件下で接触させ、その結果、第２の検出複合体を形成することであって、第１の検出抗体が、第２の検出抗体とは異なる、形成することと、
e）ステップd)の第１及び第２の検出複合体の量を決定することと、
f）第２の検出複合体によって、前記細胞内でのBoNT/Eで切断されたSNAP-25の量を算出し、
それによって、前記細胞内での前記BoNT/Eの生物学的活性を決定することと、
を含む、前記方法。
【請求項５】
前記BoNT/Eが、
a）配列番号１０、配列番号１２又は配列番号１４に示されるアミノ酸配列、及び、
b）配列番号１０、配列番号１２又は配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％又は100％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が、初代神経細胞、神経細胞に分化することができる神経芽腫細胞、P19細胞などの腫瘍細胞、又は人工多能性幹細胞(IPS)由来ニューロンから成る群より選択される神経細胞又は神経分化細胞である、請求項４又は５記載の方法。
【請求項７】
前記細胞の固定が、メタノール、エタノール、アセトン、ホルムアルデヒド又はこれらの混合物から成る群より選択される固化剤の添加によって行われる、請求項４〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
切断されていない及びBoNT/Eで切断されたSNAP-25に対して特異的に結合する第１の捕捉抗体が、ウサギポリクローナル抗SNAP-25抗体S9684、ウサギポリクローナル抗SNAP25抗体PA5-19708(Pierce Antibodies)、ウサギモノクローナル抗SNAP-25抗体ab108990(Abcam)又はウサギポリクローナル抗SNAP-25抗体PA5-19701(Pierce Antibodies)である、請求項４〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記第２の捕捉抗体が、配列番号１(「C-NEIDTQNRQIDR」)又は配列番号２(「NEIDTQNRQIDR」)に示されるアミノ酸配列を有するペプチドから成るエピトープに対して特異的に結合する、請求項４〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記第２の捕捉抗体が、2014年12月17日に、受託番号DSM ACC3261で、DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstraβe 7 B, 38124 Braunschweig, Germany)に寄託されたハイブリドーマ細胞株pCNEI 32-7-1, 3614-000によって産生されたモノクローナル抗体に含まれていたVH領域(配列番号２２)及びVL領域(配列番号２１)を含む、請求項４〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
第１の検出抗体が、アルカリホスファターゼ(AP)結合抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合抗体又は蛍光色素に結合した抗体である、請求項４〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
第２の検出抗体が、アルカリホスファターゼ(AP)結合抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合抗体、グルコースオキシダーゼ結合抗体、チロシナーゼ結合抗体又はβ-ガラクトシダーゼ抗体である、請求項４〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
前記HRP基質が、Amplex UltraRed、10-アセチル-3,7-ジヒドロキシフェノキサジン(ADHP)又は3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオン酸(HPPA)である、請求項１１又は１２記載の方法。
【請求項１４】
前記AP基質が、6,8-ジフルオロ-4-メチルウンベリフェリルホスフェート(DiFMUP)などの4-メチルウンベリフェリルホスフェート誘導体又はフルオレセインジホスフェート(FDP)である、請求項１１又は１２記載の方法。
【請求項１５】
請求項４〜１４のいずれか１項記載の方法を実施するためのキットであって、
a）第１の捕捉抗体、第２の捕捉抗体、第１の検出抗体及び第２の検出抗体の配合であって、前記第２の捕捉抗体が、BoNT/Eで切断されたSNAP-25に対して特異的に結合するモノクローナル抗体であって、2014年12月17日に、受託番号DSM ACC3261で、DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstraβe 7 B, 38124 Braunschweig, Germany)に寄託されたハイブリドーマ細胞株pCNEI 32-7-1, 3614-000によって産生されたモノクローナル抗体に含まれていたCDR-L1(配列番号１５)、CDR-L2(配列番号１６)、CDR-L3(配列番号１７)、CDR-H1(配列番号１８)、CDR-H2(配列番号１９)及びCDR-H3(配列番号２０)の相補性決定領域(CDR)を含む、前記モノクローナル抗体であり、且つ、前記配合が請求項４〜１４のいずれか１項記載の方法を実施することを許容する、前記配合と、
b）a)に記載の配合によって決定された第１及び第２の検出複合体の量に基づいて、BoNT/Eで切断されたSNAP-25の量を算出するための手段と、
c）前記方法を実施するための指示書と、
を含む、前記キット。
【請求項１６】
前記第２の捕捉抗体が、配列番号１(「C-NEIDTQNRQIDR」)又は配列番号２(「NEIDTQNRQIDR」)に示されるアミノ酸配列を有するペプチドから成るエピトープに対して特異的に結合する、請求項１５記載のキット。
【請求項１７】
前記第２の捕捉抗体が、2014年12月17日に、受託番号DSM ACC3261で、DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstraβe 7 B, 38124 Braunschweig, Germany)に寄託されたハイブリドーマ細胞株pCNEI 32-7-1, 3614-000によって産生されたモノクローナル抗体に含まれていたVH領域(配列番号２２)及びVL領域(配列番号２１)を含む、請求項１５又は１６記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、ＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５に対して特異的に結合するポリクローナルまたはモノクローナル抗体に関する。さらに、本願発明は、細胞内でのＢｏＮＴ／Ｅの生物学的活性を直接的に決定する方法を提供し、本方法は、ａ）ＢｏＮＴ／Ｅ中毒の影響を受けやすい細胞を、ＢｏＮＴ／Ｅと一緒に、当該ＢｏＮＴ／Ｅが、その生物学的活性を示すことを許容する時間及び条件下で、インキュベートすることと、ｂ）当該細胞を固定し、かつ任意に、界面活性剤で当該細胞を透過化することと、ｃ）当該細胞を、切断されていない、及びＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５に対して特異的に結合する少なくとも第１の捕捉抗体、ならびにＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５に対して特異的に結合する少なくとも第２の捕捉抗体と、示された基質に対する当該捕捉抗体の結合を許容する条件下で、接触させることであって、当該第２の捕捉抗体が、本願発明の抗体である、接触させることと、ｄ）当該細胞を、当該第１の捕捉抗体に対して特異的に結合する少なくとも第１の検出抗体と、当該第１の捕捉抗体に対する当該第１の検出抗体の結合を許容する条件下で接触させ、その結果、第１の検出複合体を形成し、かつ当該第２の捕捉抗体に対して特異的に結合する少なくとも第２の検出抗体と、当該第２の捕捉抗体に対する当該第２の検出抗体の結合を許容する条件下で接触させ、その結果、第２の検出複合体を形成することであって、当該第１の検出抗体が、当該第２の検出抗体とは異なる、形成することと、ｅ）ステップｄ）の当該第１及び第２の検出複合体の量を決定することと、ｆ）当該第２の検出複合体の手段によって、当該細胞内でのＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５の量を算出し、それによって、当該細胞内での当該ＢｏＮＴ／Ｅの生物学的活性を決定することと、を含む。さらに、本願発明は、本願発明の方法を実施するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）及び破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）は、非常に強力な神経毒を産生し、すなわち、ボツリヌス菌毒素（ＢｏＮＴ）及び破傷風菌毒素（ＴｅＮＴ）をそれぞれ産生する。これらのクロストリジウム神経毒（ＣＮＴ）は、神経細胞に対して特異的に結合し、そして、神経伝達物質の放出を攪乱する。各々の毒素は、不活性でプロセシングされていない約１５０ｋＤａの一本鎖タンパク質として合成される。翻訳後プロセシングは、ジスルフィド架橋の形成と、細菌プロテアーゼによる制限タンパク分解（ニッキング）とに関与する。
【０００３】
また、クロストリジウム神経毒は、異種細胞において産生することができ、すなわち、好適な宿主細胞において、神経毒をコードする核酸配列を発現することによって、組換え的に産生することができる。大腸菌でのクロストリジウム神経毒の組換え発現のための方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、ＷＯ００／１２７２８、ＷＯ０１／１４５７０、ＷＯ２００６／０７６９０２、または、ＷＯ２０１３／０９１８９５を参照されたい。ある事例において、軽鎖と重鎖が別々に取得され、次いで、インビトロで再構築されている、ＷＯ９５／３２７３８を参照されたい。
【０００４】
さらに、クロストリジウム神経毒は、ピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、メチロトローフ酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞、及び哺乳類細胞などの真核発現系で発現されている、ＷＯ２００６／０１７７４９を参照されたい。
【０００５】
これらの全発現系において、ジスルフィド結合によって結合された軽鎖と重鎖とを含む生物学的に活性なクロストリジウム神経毒最終タンパク質を生成するために、発酵プロセスでの宿主細胞酵素、あるいは、発酵後に単離された原料タンパク質物質へのタンパク質分解酵素の添加のいずれかによって、一本鎖神経毒前駆体をタンパク質分解的切断することが必要とされる。
【０００６】
活性な神経毒は、ジスルフィド結合で結合された約５０ｋＤａのＮ末端軽鎖と約１００ｋＤａのＣ末端重鎖との二本の鎖からなる。クロストリジウム神経毒は、構造的かつ機能的に、三つのドメイン、すなわち、触媒性軽鎖、転座ドメイン（Ｎ末端ハーフ）を含む重鎖、及び受容体結合ドメイン（Ｃ末端ハーフ）からなる、例えば、Ｋｒｉｅｇｌｓｔｅｉｎ  １９９０，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８８，３９、Ｋｒｉｅｇｌｓｔｅｉｎ  １９９１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０２，４１、Ｋｒｉｅｇｌｓｔｅｉｎ  １９９４，Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．１３，４９を参照されたい。これらのボツリヌス菌神経毒は、１５０ｋＤａ神経毒タンパク質と関連する非毒性タンパク質とを含む分子複合体として合成される。この複合体の大きさは、クロストリジウム株と個別の神経毒血清型によって異なるものであり、３００ｋＤａから、５００ｋＤａ超、及び９００ｋＤａの範囲にまで及ぶ。これらの複合体での非毒性タンパク質は、神経毒を安定させ、そして、分解から保護をしている、Ｓｉｌｂｅｒｓｔｅｉｎ  ２００４、Ｐａｉｎ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ４、Ｓ１９−Ｓ２６を参照されたい。
【０００７】
ボツリヌス菌は、Ａ〜Ｇと命名された抗原的に異なる７つの血清型のボツリヌス菌神経毒（ＢｏＮＴ）を分泌する。すべての血清型が共に、破傷風菌によって分泌された関連破傷風神経毒（ＴｅＮＴ）で、ＳＮＡＲＥタンパク質を切断することによって、シナプス開口放出をブロックするＺｎ２＋エンドプロテアーゼである、Ｃｏｕｅｓｎｏｎ，２００６，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１５２、７５９を参照されたい。クロストリジウム神経毒は、ボツリヌス菌中毒症や破傷風で認められる弛緩性の筋麻痺を引き起こす、Ｆｉｓｃｈｅｒ  ２００７，ＰＮＡＳ  １０４，１０４４７を参照されたい。
【０００８】
毒性作用があるにもかかわらず、ボツリヌス毒素複合体は、多くの疾患の治療剤として使用されている。ボツリヌス毒素血清型Ａは、斜視、眼瞼痙攣、及び他の障害の治療用として、１９８９年に、米国において、ヒトへの適用が承認された。ボツリヌス毒素Ａ（ＢｏＮＴ／Ａ）タンパク質製剤として、例えば、商標ＢＯＴＯＸ（Ａｌｌｅｒｇａｎ、Ｉｎｃ．）または商標ＤＹＳＰＯＲＴ／ＲＥＬＯＸＩＮ（Ｉｐｓｅｎ，Ｌｔｄ）が市販されている。複合体を含まない改良されたボツリヌス毒素Ａ製剤は、商標ＸＥＯＭＩＮ（Ｍｅｒｚ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＧｍｂＨ）で市販されている。治療的適応の場合、当該製剤は、処置する筋肉に直接に注射される。生理的ｐＨにおいて、この毒素は、当該タンパク質複合体から放出され、そして、所望の薬理効果を奏する。このボツリヌス毒素の効果は、ごく一時的なものでしかなく、このことが、治療効果を維持するために、ボツリヌス毒素の反復投与を必要とする理由となっている。
【０００９】
このクロストリジウム神経毒は、随意筋力を弱め、かつ斜視、頸部ジストニアを含む限局性筋失調症、そして、良性本態性眼瞼痙攣のための有効な治療法である。さらに、それらは、片側顔面痙攣及び限局性痙性を緩和することが示されており、またさらに、消化器疾患、多汗症、及び美容的皺矯正などの広範な他の症状にも効果的である、Ｊｏｓｔ  ２００７，Ｄｒｕｇｓ  ６７、６６９を参照されたい。
【００１０】
クロストリジウム神経毒の製造プロセスの間における、当該神経毒の定性的測定及び定量的測定、ならびに生物学的に活性な神経毒ポリペプチドの品質管理は、特に重要である。加えて、政府機関は、単純で、信頼性があり、しかも、検証されたボツリヌス毒素活性アッセイしか受け入れない。現在のところ、致死率試験である、マウスＬＤ５０バイオアッセイには、業者の製剤の効力を分析するために製薬業者によって使用されている「究極の判断基準（ｇｏｌｄ  ｓｔａｎｄａｒｄ）」が残っている、Ａｒｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１），ＪＡＭＡ  ２８５，１０５９−１０７０を参照されたい。しかしながら、近年になって、動物実験の必要性、また、この種の動物に依存したアッセイに関係するすべての短所、費用、それに、倫理的問題を軽減するために、代替手法を模索するための相当の努力が払われてきた。加えて、規制機関が、製薬企業に対して、ボツリヌス菌神経毒の有効性試験に「三つのＲ」の原則を適用することを推奨している。「削減、軽減、代替（Ｒｅｄｕｃｅ，Ｒｅｆｉｎｅ，Ｒｅｐｌａｃｅ）」，Ｓｔｒａｕｇｈａｎ，Ａｌｔｅｒｎ．Ｌａｂ．Ａｎｉｍ．（２００６），３４，３０５−３１３を参照されたい。その結果、生きた動物を用いた方法の適切な代替手法を提供するために、細胞を用いた試験系が開発されてきた。今までのところ、神経毒ポリペプチドに対して十分な感受性を示すような、神経毒の生物学的活性の測定のために利用可能な細胞試験系は、ほんの僅かしかない。これらの細胞に依存した試験系は、インビトロで分化される齧歯動物胚から単離された初代神経細胞（Ｐｅｌｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．４０４，３８８−３９２）、神経細胞分化した人工多能性幹細（Ｗｈｉｔｅｍａｒｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２），Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｓｃｉ．１２６，４２６−３５）、及びＳｉＭａ細胞株のサブクローン（ＷＯ２０１０／１０５２３４  Ａ１）の使用を含む。
【００１１】
しかしながら、初代神経細胞の単離は、動物の屠殺を必要とするものであり、かつ労力と時間も要する。さらに、異なる初代神経細胞を使用する試験系は、結果の分散が大きい。同様に、神経細胞分化した人工多能性幹細胞の生成は、困難で、しかも時間を要する。加えて、このような細胞の保存には、様々な問題がつきまとう。腫瘍細胞株を使用するアッセイは、ＢｏＮＴに対して十分な感受性を示さないことがよくある。さらに、当該腫瘍細胞株については分化プロトコールが必要とされるが、当該プロトコールは、当該細胞株を用いたアッセイの結果の分散が大きいこと、及び／または、高い失敗率を示す。
【００１２】
当該技術分野において周知のクロストリジウム神経毒の生物学的活性を決定するためのアッセイは、細胞溶解物に含まれる切断された神経毒基質の量によって、神経毒活性が定量されるウェスターンブロット分析を含む。他のアッセイにおいて、クロストリジウム神経毒の当該活性は、電気化学発光（ＥＣＬ）サンドイッチＥＬＩＳＡによって測定される、ＷＯ２００９／１１４７４８  Ａ１を参照されたい。また、この事例の場合、クロストリジウム神経毒の生物学的活性は、細胞溶解物から単離した後に、切断されたクロストリジウム神経毒基質の検出によって決定される。さらに、双方のアッセイにおいて、当該神経毒基質は、濃縮しなくてはならない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上記した事情から、政府機関が許容可能で、及び／または、動物に依存した試験系の代替手法を提供する、神経毒ポリペプチド活性の決定のためのさらなる試験系が、切に待望されている。
【００１４】
よって、本願発明の根底にある技術的課題は、上記した要望に沿った手段と方法の提供にあると思われる。当該技術的課題は、特許請求の範囲の欄ならびに本明細書の以下の記載で明らかにした実施形態によって解決される。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本願発明は、第１の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅで切断したＳＮＡＰ−２５に対して特異的に結合するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体に関する。さらに、本願発明は、ＢｏＮＴ／Ｅで切断したＳＮＡＰ−２５に対して特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する寄託したハイブリドーマ細胞株に関する。
【００１６】
本願発明は、ＢｏＮＴ／Ｅで切断したＳＮＡＰ−２５の開裂部位、すなわち、ＢｏＮＴ／Ｅで切断したＳＮＡＰ−２５に対して特異的に結合する新規の抗体を提供する。加えて、本願発明は、ＢｏＮＴ／Ｅで切断したＳＮＡＰ−２５に対して特異的に結合する本願発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株ｐＣＮＥＩ  ３２−７−１、３６１４−０００を提供する。このハイブリドーマ細胞株は、本出願人によって、２０１４年１２月１７日に、受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２６１で、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ，Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａβｅ  ７Ｂ，３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に寄託された。当該技術分野において周知の通り、ＳＮＡＰ−２５は、とりわけ、ＢｏＮＴ／Ｅ神経毒の基質である。ＳＮＡＰ−２５は、２０６アミノ酸残基の全長を有する。ＳＮＡＰ−２５でのＢｏＮＴ／Ｅ切断部位は、アルギニン（Ｒ）１８０とイソロイシン（Ｉ）１８１との間であって「Ｒ１８０Ｉ」と表記もされる箇所にある。したがって、ＢｏＮＴ／ＥによるＳＮＡＰ−２５２０６の切断とは、２つの断片、すなわち、アミノ酸残基１〜１８０からなるＮ末端断片であって、続いて「ＳＮＡＰ−２５１８０切断生成物（ＳＮＡＰ−２５１８０切断生成物）」と表記もされる断片と、アミノ酸残基１８１〜２０６からなるＣ末端断片とを意味する。本願発明の抗体は、以下の実施例での記載に従って調製され、また、特性が決定される。つまりは、免疫タンパク質が結合したペプチド「Ｃ−ＮＥＩＤＴＱＮＲＱＩＤＲ−ＯＨ」（配列番号１）で、マウスを免疫処置することによって、マウスモノクローナル抗体が産生される。ここに示したデータは、この抗体が、ＳＮＡＰ−２５１８０切断生成物を特異的に検出することを示している。したがって、ＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５を検出することでＢｏＮＴ／Ｅの生物学的活性を測定するアッセイに、この抗体は、特に適している。とりわけ、この抗体は、ＳＮＡＰ−２５２０６未切断基質に対する場合と比較して、ＳＮＡＰ−２５１８０切断生成物に対する親和性と特異性が大きいので、細胞内でＢｏＮＴ／Ｅの生物学的活性を直接に決定することを許容する本願発明の方法での第２の捕捉抗体として使用することができる。そのような抗体は、未だ市販されていない。本願発明がさらに企図しているものは、例えば、ペプチド「Ｃ−ＮＥＩＤＴＱＮＲＱＩＤＲ−ＯＨ」（配列番号１）を免疫タンパク質に結合し、そして、例えば、ウサギ、ヤギ、ウマ、ロバ、マウス、ラット、または、ラマなどを含むが、これらに限定されない種の動物を免疫処置することによって調製することができるポリクローナル抗血清またはポリクローナル抗体である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本願発明の細胞を使用するアッセイの作用機構を示した概略図である。ＢｏＮＴ／Ｅ中毒に対して感受性を示す細胞は、マルチウェルプレートに播種される。その後、当該細胞は、ＢｏＮＴ／Ｅを用いて中毒させ、そして、所定の中毒期間を経た後に、当該細胞は固定される。ＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５に対して特異的な抗体、及びＢｏＮＴ／Ｅで切断されていないＳＮＡＰ−２５に対して特異的な抗体は、ＳＮＡＰ−２５の特異的な結合部位に結合する。酵素が結合した抗宿主特異的二次抗体を用いて、これらの結合イベントは、当該ウェル内のＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５の濃度とＳＮＡＰ−２５の総量に相関する測定可能なシグナルを生成させるために使用することができる。ＢｏＮＴ／Ｅ濃度の増大に伴って、測定した開裂ＳＮＡＰ−２５の量が大きくなり、その結果、シグナルが得られることとなる。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書において、用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」とは、特定の抗原に応答して作られた、その抗原に対して特異的に結合する、免疫系によって生成される分子のことを指し、天然に存在する抗体と天然に存在しない抗体の両方を含む。本明細書で使用する「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」とは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗血清または抗体、一本鎖抗体、二量体もしくは多量体、キメラ化抗体、二重特異的抗体、二重特異的一本鎖抗体、多重特異的抗体、合成抗体、ヒト型化抗体、二官能性抗体、Ｉｇ受容体のような細胞結合性抗体、直鎖抗体、ダイアボディ、ミニボディ、または当該抗体のいずれかの断片を含む。当該抗体の断片には、例えば、Ｆａｂ、ＦｖもしくはｓｃＦｖ断片、またはこれら断片のいずれかの化学的に修飾された誘導体がある。抗体は、当該技術分野で周知の方法を使用して製造することができる、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  ＳＰＲｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８８を参照されたい。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  １９７５，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５及びＧａｌｆｒｅ  １９８１，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３，３に最初に記述された技術によって調製することができる。この技術は、マウス骨髄腫細胞と免疫化した哺乳動物から得られる脾臓細胞との融合を含む。抗体は、当該技術分野において周知の技術によってさらに改善することができる。例えば、Ｂｉａｃｏｒｅシステムで利用される表面プラスモン共鳴を使用して、エピトープに結合するファージ抗体の有効性を高めることができる、例えば、Ｓｃｈｉｅｒ  １９９６，Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ７，９７，Ｍａｌｍｂｏｒｇ  １９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８３，７を参照されたい。本明細書において、抗体は、抗体の機能的等価物、すなわち、ＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５基質の所望のエピトープまたは箇所に対して特異的に結合することができる薬剤も含む。一態様において、そのような機能的等価物は、当該特異的結合を媒介することができる、ＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５またはそのドメインに対して特異的に結合する結合タンパク質を含む。本明細書において、抗体は、ＶＨ及びＶＬドメインならびに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む完全長免疫グロブリン分子、または完全長免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｃ断片、Ｆｄ断片、もしくは、Ｆｖ断片などであることができる。抗体は、あらゆる脊椎動物種（例えば、ヒト、ヤギ、ウマ、ロバ、マウス、ラット、ウサギ、または、ニワトリ）から得ることができ、あらゆる型（例えば、ＩｇＧ，ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、もしくは、ＩｇＡ）、クラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、もしくは、ＩｇＭ）、または、サブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、もしくは、ＩｇＡ２）であることができる。天然に存在する抗体、天然に存在しない抗体、及びその抗原性化合物結合断片の構造に関する全般的な開示���ついては、例えば、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，ＳＰＲｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４），Ｂｏｒｒａｂｅｃｋ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい。天然に存在する抗体は、通常約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、２つの同一の軽鎖（Ｌ）及び２つの同一の重鎖（Ｈ）から構成される。各軽鎖は、１つのジスルフィド共有結合によって重鎖に連結されるが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で異なる。各重鎖及び各軽鎖は、規則的な間隔がある鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は一方の末端に、いくつかの定常ドメインが続く可変ドメイン（ＶＨ）を有する。各軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＬ）及び他方の末端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと整列しており、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間に界面を形成すると考えられている。
【００１９】
完全な抗原認識部位及び抗原結合部位は、抗体の可変ドメイン、すなわち、Ｆｖ断片に含有される。この断片は、隙間なく非共有結合性会合している１つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と１つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）との二量体を含む。各ドメインは、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）を含み、それらの領域は３つの超可変領域によって接続されたβシート構成を主にとり、その可変領域はβシート構造を接続するループを形成し、幾つかの事例では、βシート構造の一部を形成する。各超可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）に対応するアミノ酸配列を含む。全体で、抗原結合特異性を与える、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面において抗原結合部位を定義する６つのＣＤＲ領域（すなわち、軽鎖に関する３つのＣＤＲ、すなわち、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３と、重鎖に関する３つのＣＤＲ、すなわち、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３）からなる３次元構成をとる。例えば、Ｃｙｒｕｓ  Ｃｈｏｔｈｉａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎｓ、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２（６２５２）：ｐｐ．８７７−８８３（１９８９），Ｅｌｖｉｎ  Ａ．Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照されたい。抗体の定常ドメインは、抗体が抗原に結合するのに直接関係しないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与など、様々なエフェクター機能を呈する。
【００２０】
本明細書で使用する「選択的な結合（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ）」または「特異的結合（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ）」とは、本願発明の抗体が、ＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５に対して特異的に結合するが、一般的には、切断されていないＳＮＡＰ−２５、または、その他のポリペプチドに対して相当の程度まで交差反応しない、ことを意味する。エピトープ特異性は、本願発明の抗体の重要な特性である。本願発明の抗体は、配列番号１、２、３、４、５、６、７または８に示されるアミノ酸配列を有するペプチドからなるエピトープに対して特異的に結合する。特異的結合は、例えば、競合研究を含む様々な周知の技術で試験することができる。別の重要な特性は、当該抗体の感受性である。本願発明の一態様において、感受性とは、試料または細胞に含まれた少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％のＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５が結合されるものとする。感受性は、周知の技術によって試験することができる。当業者であれば、所定の実験を採用することによって、それぞれの決定に向けて、効果的なアッセイ条件及び最適なアッセイ条件を決定することができるであろう。結合試験のための従来の技術は、放射免疫測定、ＥＬＩＳＡ、平衡透析、等温マイクロカロリメトリー、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）アッセイ（表面プラスモン共鳴、ＳＰＲ）、または、他の表面吸着法を含む。当該ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）ＳＰＲ系は、抗体抗原相互作用を測定する。ＳＰＲ応答は、検出器表面で結合または解離している検体の質量濃度の変化を反映する。ＳＰＲに基づいて、リアルタイムＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）測定は、発生する相互作用を直接にモニターする、ＢＩＡａｐｐｌｉｃａｔｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ｖｅｒｓｉｏｎ  ＡＢ（増刷１９９８）、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）コード番号：ＢＲ−１００１−８６；ＢＩＡｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ｖｅｒｓｉｏｎ  ＡＢ（増刷１９９８），ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）コード番号：ＢＲ−１００１−８４を参照されたい。本願発明の抗体の感受性などの結合性は、原理上は、センサー表面に設けられた、配列番号２（「ＮＥＩＤＴＱＮＲＱＩＤＲ」）（リガンド）に示されるアミノ酸配列を有するペプチドなど、固定された抗原を用いる結合試験によって決定することができる。試験される抗体（検体）は、移動相、すなわち、溶液中に提供される。幾つかの事例において、当該抗原は、「捕捉分子（ｃａｐｕｔｕｒｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」と称される別の固定分子に対する結合を介して当該表面に間接的に結合される。当該抗体が、固定した抗原を有する当該表面を通って、離散パルスで注射される場合には、実質的に３つの相に細分することができる、（ｉ）試料を注射している間の抗体と抗原の会合、（ｉｉ）試料を注射している間の平衡状態または定常状態であって、抗体の結合速度と抗体抗原複合体からの解離速度とが均衡している状態、（ｉｉｉ）緩衝液を流している間の当該表面からの当該抗体の解離。検査される固定化した抗体と移動相としての溶液を含む抗原とを用いて、アッセイを代替的に行うことも可能であることが理解されるであ���う。会合相及び解離相は、検体−リガンド相互作用の反応速度に関する情報をもたらす（ｋａ及びｋｄ、複合体の形成及び解離の速度、ｋｄ／ｋａ＝ＫＤ）。均衡相は、検体リガンド相互作用の親和性に関する情報をもたらす（ＫＤ）。したがって、本明細書で使用する「選択的な結合（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ）」または「特異的結合（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ）」とは、例えば、結合親和性、結合特異性、及び結合力などの結合特性を含む、例えば、Ｄａｖｉｄ  Ｊ．Ｋｉｎｇ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐｐ．２４０（１９９８）を参照されたい。結合親和性とは、抗体が、そのエピトープ結合部位に存在する時間の長さのことを指し、抗体がそのエピトープを結合する強度と見ることができる。結合親和性は、抗体の平衡解離定数（ＫＤ）で表記することができ、ＫＤは平衡でのＫｄ／Ｋａ比と定義される。Ｋａは、抗体の結合速度定数であり、Ｋｄは、抗体の解離速度定数である。結合親和性は、結合と解離の両方によって決定され、高い結合または低い解離のいずれも単独では高い親和性を確実にすることができない。結合速度定数（Ｋａ）または会合速度定数（Ｋｏｎ）は、単位時間当たりの結合イベントの回数、または、抗体及び抗原が、その抗体抗原複合体へと可逆的に結合する傾向を測定する。結合速度定数は、Ｍ−１ｓ−１で表され、以下の通りに記号化される：［Ａｂ］×［Ａｇ］×Ｋｏｎ。結合速度定数が大きいほど、抗体は、より速やかに抗原に結合する、または、抗体と抗原との結合親和性が、より高くなる。解離速度定数（Ｋｄ）または分離速度定数（Ｋｏｆｆ）は、単位時間当たりの解離イベントの回数、または、抗体抗原複合体がその成分分子、すなわち、抗体及び抗原へと可逆的に分かれる（解離する）傾向を測定する。解離速度定数は、ｓ−１で表され、以下の通りに記号化される：［Ａｂ＋Ａｇ］×Ｋｏｆｆ。解離速度定数が小さいほど、抗体は、その抗原に対してより密接に結合する、または、抗体と抗原との結合親和性がより高くなる。平衡解離定数（ＫＤ）は、平衡において、新たな抗体抗原複合体が形成される速度が、抗体抗原複合体が解離する速度に等しいことを測定する。平衡解離定数はＭで表され、Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ＝［Ａｂ］×［Ａｇ］／［Ａｂ＋Ａｇ］と定義され、［Ａｂ］は、抗体のモル濃度であり、［Ａｇ］は、抗原のモル濃度であり、［Ａｂ＋Ａｇ］は抗体抗原複合体のモル濃度であり、系が平衡である場合には、すべての濃度が、かような成分となる。平衡解離定数が小さいほど、抗体はその抗原に対してより密接に結合する、または、抗体と抗原との間の結合親和性がより高くなる。
【００２１】
ＢｏＮＴ／Ｅ基質ＳＮＡＰ−２５などの標的抗原は、一般に、エピトープとも称される結合部位を１つ以上有しており、そのエピトープは、抗体のＣＤＲ形成抗原結合部位によって認識される。本明細書において、「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」は、「抗原決定基（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）」と同義であり、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的結合できるか、あるいは、分子と相互作用できる、例えば、ペプチド、ポリペプチド、多糖、または、脂質含有分子など標的抗原上の部位のことを指す。異なるエピトープに対して特異的に結合する各抗体は、異なる構造を有する。したがって、１つの抗原は、対応する抗体を複数有することができる。本明細書に記載の「特異的結合（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ）」とは、例えば、競合実験及びウェスターンブロットを含む様々な周知の技術で試験することができる。本願発明で使用されるエピトープは、抗体によって認識される、ＳＮＡＰ−２５でのＢｏＮＴ／Ｅ開裂部位の近傍に、隣接して、あるいは、その内部に位置することができる、ＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５にある抗原決定基に関する。本明細書で使用する用語「特異的（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」とは、選択的を意味し、固有の効果もしくは影響を有する、または、一方向だけに、もしくは、１つのものだけと反応することを指す。抗体または結合タンパク質、もしくは、結合ドメインに言及する場合、本明細書で使用する用語「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｓ）」または「選択的に結合する（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｂｉｎｄｓ）」とは、抗体または結合タンパク質／ドメインが、標的外エピトープと実質的に交差反応しないような、指示された標的エピトープに対する抗体または結合タンパク質／ドメインの差別的な結合のことを指す。本明細書において定義したように、ペプチドエピトープの最小のサイズは、約５アミノ酸残基であり、ペプチドエピトープは、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、または、少なくとも３０のアミノ酸残基を一般に含む。ペプチドエピトープは、線状または不連続なエピトープでもよい。不連続なエピトープは、ペプチドの一次構造において隣接はしていないが、ペプチドの二次、三次または四次構造によってエピトープへと作られるアミノ酸残基を含む。さらに、エピトープが、例えば、炭水化物部分、糖脂質もしくはリポタンパク質のような脂質部分、または、リン酸化アミノ酸のような化学修飾アミノ酸部分などのアミノ酸配列以外の分子の一部を含むことができることにも留意されたい。
【００２２】
本願発明のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の別の態様において、当該抗体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列（「Ｃ−ＮＥＩＤＴＱＮＲＱＩＤＲ−ＯＨ」）を有するペプチドからなるエピトープに対して特異的に結合する。好ましくは、本願発明の抗体は、配列番号２に示されるエピトープＳＮＡＰ−２５１６９−１８０「ＮＥＩＤＴＱＮＲＱＩＤＲ」、及び／または、ＳＮＡＰ−２５１８０、すなわち、ＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５を認識し、かつ特異的に結合する。より好ましくは、本願発明の抗体は、配列番号３に示されるエピトープＳＮＡＰ−２５１７０−１８０「ＥＩＤＴＱＮＲＱＩＤＲ」、及び／または、ＳＮＡＰ−２５１８０、配列番号４に示されるエピトープＳＮＡＰ−２５１７１−１８０「ＩＤＴＱＮＲＱＩＤＲ」、及び／または、ＳＮＡＰ−２５１８０、配列番号５に示されるエピトープＳＮＡＰ−２５１７２−１８０「ＤＴＱＮＲＱＩＤＲ」、及び／または、ＳＮＡＰ−２５１８０、配列番号６に示されるエピトープＳＮＡＰ−２５１７３−１８０「ＴＱＮＲＱＩＤＲ」、及び／または、ＳＮＡＰ−２５１８０、配列番号７に示されるエピトープＳＮＡＰ−２５１７４−１８０「ＱＮＲＱＩＤＲ」、及び／または、ＳＮＡＰ−２５１８０、または、配列番号８に示されるエピトープＳＮＡＰ−２５１７５−１８０「ＮＲＱＩＤＲ」、及び／または、ＳＮＡＰ−２５１８０を認識し、かつ特異的に結合する。
【００２３】
本願発明のモノクローナル抗体の一態様において、当該モノクローナル抗体は、本出願人が、ブダペスト条約に基づいて、２０１４年１２月１７日に、受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２６１で、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｋｕｌｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ，Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａβｅ  ７Ｂ，３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に寄託したハイブリドーマ細胞株ｐＣＮＥＩ  ３２−７−１、３６１４−０００によって産生される。
【００２４】
本願発明のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のさらなる態様において、当該抗体は、ＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５について、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、２ｎＭ未満、１ｎＭ未満、または、好ましくは、０．５ｎＭ未満の平衡解離定数を有する。
【００２５】
本願発明のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のさらに別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５についての当該抗体の平衡解離定数は、ＢｏＮＴ／Ｅによって切断されていないＳＮＡＰ−２５、すなわち、切断されていないＳＮＡＰ−２５のそれよりも、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、または、好ましくは少なくとも１００倍大きい。
【００２６】
本願発明のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の別の態様において、当該抗体は、受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２６１で寄託されたハイブリドーマ細胞株ｐＣＮＥＩ  ３２−７−１、３６１４−０００によって産生されたモノクローナル抗体に含まれるＣＤＲ−Ｌ１（配列番号１５）、ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号１６）、ＣＤＲ−Ｌ３（配列番号１７）、ＣＤＲ−Ｈ１（配列番号１８）、ＣＤＲ−Ｈ２（配列番号１９）及びＣＤＲ−Ｈ３（配列番号２０）から選択される相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちの少なくとも１つを含む。好ましくは、当該抗体は、上記したＣＤＲの内の２つ、３つ、４つ、５つ、または、６つすべてを含む。
【００２７】
本願発明のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のさらに別の態様において、当該抗体は、受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２６１で寄託されたハイブリドーマ細胞株ｐＣＮＥＩ  ３２−７−１、３６１４−０００によって産生されたモノクローナル抗体に含まれるＶＨドメインまたはＶＨ領域（配列番号２２）、及び／または、ＶＬドメインまたはＶＬ領域（配列番号２１）を含む。
【００２８】
これらの態様において、本願発明は、抗体、または、その断片に関するものであって、それらは、ＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５の開裂部位に対して特異的に結合し、かつ受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２６１で寄託されたハイブリドーマ細胞株ｐＣＮＥＩ  ３２−７−１、３６１４−０００によって産生されたモノクローナル抗体に含まれる、配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び／または、配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。さらに、本願発明によって包含されるものは、当該重鎖及び／または軽鎖可変領域またはドメインの１つ、２つ、または、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、抗体、または、その断片である。ＣＤＲ−Ｈ１（配列番号１８）、ＣＤＲ−Ｈ２（配列番号１９）及びＣＤＲ−Ｈ３（配列番号２０）の対応する配列、及びＣＤＲ−Ｌ１（配列番号１５）、ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号１６）及びＣＤＲ−Ｌ３（配列番号１７）の対応する配列は、それぞれ、受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２６１で寄託されたハイブリドーマ細胞株ｐＣＮＥＩ  ３２−７−１、３６１４−０００によって産生されたモノクローナル抗体に含まれる。
【００２９】
好ましくは、本願発明の抗体は、モノクローナル抗体である。より好ましくは、当該モノクローナル抗体は、以下の実施例で作り出し、そして、特徴づけされたマウスモノクローナル抗体、すなわち、受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２６１で寄託されたハイブリドーマ細胞株ｐＣＮＥＩ  ３２−７−１、３６１４−０００によって産生されたモノクローナル抗体である。上記したＣＤＲ、ＶＨ及びＶＬ配列は、当該抗体の対応配列である。
【００３０】
さらなる態様において、本願発明は、細胞内でのＢｏＮＴ／Ｅの生物学的活性を直接的に決定する方法であって、
ａ）ＢｏＮＴ／Ｅ中毒の影響を受けやすい細胞を、ＢｏＮＴ／Ｅと一緒に、当該ＢｏＮＴ／Ｅが、その生物学的活性を示すことを許容する時間及び条件下で、インキュベートすることと、
ｂ）当該細胞を固定し、かつ任意に、界面活性剤で当該細胞を透過化することと、
ｃ）当該細胞を、切断されていない、及びＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５に対して特異的に結合する少なくとも第１の捕捉抗体、ならびにＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５に対して特異的に結合する少なくとも第２の捕捉抗体と、切断されていない、及びＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５に対する前記第１の捕捉抗体の結合、ならびにＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５に対する当該第２の捕捉抗体の結合を許容する条件下で、接触させることであって、当該第２の捕捉抗体が、本願発明のポリクローナルまたはモノクローナル抗体である、接触させることと、
ｄ）当該細胞を、当該第１の捕捉抗体に対して特異的に結合する少なくとも第１の検出抗体と、当該第１の捕捉抗体に対する当該第１の検出抗体の結合を許容する条件下で接触させ、その結果、第１の検出複合体を形成し、かつ当該第２の捕捉抗体に対して特異的に結合する少なくとも第２の検出抗体と、当該第２の捕捉抗体に対する当該第２の検出抗体の結合を許容する条件下で接触させ、その結果、第２の検出複合体を形成することであって、当該第１の検出抗体が、当該第２の検出抗体とは異なる、形成することと、
ｅ）ステップｄ）の当該第１の及び第２の検出複合体の量を決定することと、及び
ｆ）第２の検出複合体の手段によって、当該細胞内でのＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５の量を算出し、それによって、当該細胞内での当該ＢｏＮＴ／Ｅの生物学的活性を決定することと、を含む方法を提供する。
【００３１】
本願発明の方法の一態様において、ステップｃ）で使用した当該第２の捕捉抗体は、本願発明のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。本願発明の方法の別の態様において、ステップｃ）で使用した当該第２の捕捉抗体は、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３２９（２００８）、ｐ．９２−１０１に記載されたＢｏＮＴ／Ｅ切断部位に特異的な抗体である。
【００３２】
本願発明の方法において、当該ＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５は、細胞内で直接的に検出することができる。この目的に向けて、本明細書の他の箇所でさらに詳細に定義したように、ＢｏＮＴ／Ｅ中毒の影響を受けやすい細胞は、ＢｏＮＴ／Ｅ神経毒ポリペプチドと一緒に、当該ＢｏＮＴ／Ｅ神経毒ポリペプチドが、その生物学的活性を示すことを許容する時間及び条件下で、インキュベートされる。次のステップにおいて、当該細胞は固定され、そして、使用した固化剤に応じて、例えば、メタノール、エタノール、アセトン、ホルムアルデヒドなどの固化剤、または、前述した固化剤の混合物などを添加して、透過化される。任意に、当該細胞を、本明細書の他の箇所で定義した少なくとも１つの界面活性剤、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ  ２０、サポニン、ジギトニン、または、ｎ−オクチル−ベータ−グルコピラノシドなどを用いて、さらに透過化することができる。当該界面活性剤は、ＰＢＳなどの適切な緩衝液に含有させることができる。その後、当該細胞は、切断されていない、及びＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５に対して特異的に結合する少なくとも第１の捕捉抗体と接触させられ、及びＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５に対して特異的に結合する少なくとも第２の捕捉抗体、例えば、ＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５の開裂部位に対して特異的に結合する抗体と接触させられるものであり、切断されていない、及びＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５に対する当該第１の捕捉抗体の結合、ならびにＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５に対する当該第２の捕捉抗体の結合を許容する条件下で、接触させられる。適切なエピトープ、ＳＮＡＰ−２５でのＢｏＮＴ／Ｅ切断部位、及びＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５に対して特異的に結合する抗体の作成方法は、本明細書の他の箇所に記載されている。加えて、本願発明者らは、以下の実施例において、ＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５に対して特異的に結合するモノクローナル抗体を作成し、また、特徴づけを行った。当該抗体は、ＳＮＡＰ−２５１８０切断生成物に対して高い結合特異性を示し、この性質は、未切断のＳＮＡＰ−２５２０６基質よりも、この切断生成物を優先して認識することを許容する。当該第１の捕捉抗体は、切断されていないＢｏＮＴ／ＥとＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５との双方に存在する適切なエピトープに対して特異的に結合することによって、細胞内のＢｏＮＴ／Ｅ基質ＳＮＡＰ−２５の総含量または総量を決定することができる。当該第２の捕捉抗体は、切断されていないＳＮＡＰ−２５には存在せず、当該ＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５にしか存在しないエピトープを認識し、かつ特異的に結合する。あるいは、上記した条件下で、当該細胞を、当該第１及び第２の捕捉抗体の混合物に接触させることができ、すなわち、当該細胞を、少なくとも第１の捕捉抗体と少なくとも第２の捕捉抗体とに同時に接触させることができる。次のステップにおいて、当該細胞は、第１の捕捉抗体に対して特異的に結合する少なくとも第１の検出抗体と接触させられるものであり、当該第１の捕捉抗体に対する当該第１の検出抗体��結合を許容し、その結果、第１の検出複合体を形成する条件下で接触させられる。続くステップにおいて、当該細胞は、第２の捕捉抗体に対して特異的に結合する少なくとも第２の検出抗体と接触させられるものであり、当該第２の捕捉抗体に対する当該第２の検出抗体の結合を許容し、その結果、第２の検出複合体を形成する条件下で接触させられる。あるいは、上記した条件下で、当該細胞を、当該第１及び第２の検出抗体の混合物に接触させることができ、すなわち、当該細胞を、少なくとも第１の検出抗体と少なくとも第２の検出抗体とに同時に接触させることができる。あるいは、上記した条件下で、透過化された細胞を、当該第１及び第２の捕捉抗体と当該第１及び第２の検出抗体との混合物に同時に接触させることができる。次のステップにおいて、当該第１及び第２の検出複合体の量が決定される。最後に、当該細胞内でＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５の量は、当該第２の検出複合体の手段によって算出される。本願発明の方法に従って用いられた用語「算出する（ｃａｌｃｕｌａｔｉｎｇ）」は、当該細胞内でのＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５の量を決定することを許容する数学的手法に関する。これにより、当該細胞内でのＢｏＮＴ／Ｅの生物学的活性が、直接的に決定される。このことは、当該技術分野で周知の方法で必要とされていた、細胞の溶解、及び細胞溶解物からの当該ＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５の単離または濃縮がもはや必要でない、ことを意味する。さらに、本願発明の方法は、所要時間を短縮し、労力を軽減し、また、当該技術分野で用いられていた、例えば、ＦＲＥＴ系アッセイよりも高精度である。
【００３３】
以下において、本願発明の方法を、さらに詳細に説明される。細胞培養の場合、まず、神経細胞、ＳｉＭａ細胞または人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）由来ニューロンなど本明細書に定義される神経毒中毒に感受性のある細胞は、９６ウェルマイクロタイタープレートに播種される。ＳｉＭａ細胞は、例えば、ＷＯ２０１０／１０５２３４に開示された手順によってニューロン表現型に分化され、ｉＰＳ由来ニューロンは、例えば、ＷＯ２０１２／１３５６２１に記載されたアッセイによってニューロン表現型に分化される。必要であれば、当該感受性、すなわち、ＢｏＮＴ／Ｅ神経毒ポリペプチドに対して感受的な細胞の各々の均質な感受性を、ＷＯ２０１５／１２４６１８に開示された特定の細胞の培養方法を用いて最適化することができる。次いで、細胞は、ＢｏＮＴ／Ａなどの神経毒ポリペプチドで、約７２時間、中毒させる。その後のステップにおいて、ＥＬＩＳＡアッセイの前に、細胞をマイクロタイタープレートに固定する。細胞を固定するために、例えば、氷冷メタノール（−２０℃）を、−２０℃で、２０分間、細胞に添加することができる。
【００３４】
ＥＬＩＳＡアッセイを実施する場合、まず、細胞は洗浄される。洗浄緩衝液として、例えば、１０ｍＭ  ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を使用することができる。その後、内因性プロテアーゼが、１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に０．６％  Ｈ２Ｏ２などの失活緩衝液によって失活され、続いて、別の洗浄ステップを行う。以下のステップにおいて、マイクロタイタープレート上の遊離の結合部位は、例えば、２％ＢＳＡを含む１０ｍＭ  ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）などの適当なブロッキング緩衝液によってブロッキングされる。その後、細胞は、上記したようにして、洗浄緩衝液によって洗浄される。
【００３５】
次のステップにおいて、透過化した細胞は、例えば、異なる２つの抗体の混合物と共にインキュベートされる。当該混合物は、切断されていない、及びＢｏＮＴ／Ｅで切断した基質ＳＮＡＰ−２５に対して特異的に結合する第１の捕捉抗体、ならびにＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５に対して特異的に結合する第２の捕捉抗体、例えば、ＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５でのＢｏＮＴ／Ｅ開裂部位に対して特異的に結合する抗体を含む。この目的のために、本願発明のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、特に適切である。当該第１及び第２の捕捉抗体を連続して適用することもできる。例えば、当該第１の捕捉抗体は、切断されていない、及びＢｏＮＴ／Ｅで切断したＳＮＡＰ−２５の両方に対して特異的に結合することができ、それにより、細胞内のＳＮＡＰ−２５、すなわち、ＢｏＮＴ／Ｅで切断されていないＳＮＡＰ−２５とＢｏＮＴ／Ｅで切断したＳＮＡＰ−２５の総含量または総量の定量化が可能になる。さらに、本明細書における評価の際には、当該第１の捕捉抗体を使用して細胞内のＢｏＮＴ／Ｅで切断したＳＮＡＰ−２５の量を標準化することができる。当該第２の捕捉抗体は、ＢｏＮＴ／Ｅで切断したＳＮＡＰ−２５の切断部位に対して特異的に結合し、したがって、ＢｏＮＴ／Ｅで切断したＳＮＡＰ−２５の決定及び検出が可能になる。
【００３６】
本願発明の方法における、すべての（ＢｏＮＴ／Ｅで切断されていない、及びＢｏＮＴ／Ｅで切断した）ＳＮＡＰ−２５及びＢｏＮＴ／Ｅで切断したＳＮＡＰ−２５の以下の検出は、マイクロタイタープレートまたは細胞培養皿上で、すなわち、細胞内で直接に実行することができる。したがって、有利なことに、本願発明の方法では、当該技術分野において周知の方法にあるような、細胞抽出物を調製し、細胞溶解物からＢｏＮＴ／Ｅで切断したＳＮＡＰ−２５を単離及び／または濃縮する必要がない。その後、細胞を洗浄して、それぞれの抗原に結合していない過剰な抗体を除去する。その後のステップにおいて、透過化した細胞を、少なくとも第１の検出抗体、及び少なくとも第２の検出抗体と接触させる。当該抗体を、混合物として、すなわち、同時にまたは連続して適用することができる。当該第１の検出抗体は、第１の捕捉抗体に対して特異的に結合する。そうすることで、第１の検出複合体が形成される。当該第１の検出抗体は、当該第１の捕捉抗体が由来する種に対して作ることができる。例えば、ＢｏＮＴ／Ｅで切断されていないＳＮＡＰ−２５とＢｏＮＴ／Ｅで切断した基質ＳＮＡＰ−２５に対して特異的に結合する第１の捕捉抗体としてウサギポリクローナル抗ＳＮＡＰ−２５抗体Ｓ９６８４（Ｓｉｇｍａ）が使用される場合、抗ウサギアルカリホスファターゼ結合抗体を第１の検出抗体として使用することができる。当該第２の検出抗体は、当該第２の捕捉抗体に対して特異的に結合する。そうすることで、第２の検出複合体が形成される。当該第２の検出抗体は、当該第２の捕捉抗体が由来する種に対して作ることができる。例えば、ＢｏＮＴ／Ｅで切断したＳＮＡＰ−２５に対して特異的に結合する第２の捕捉抗体として、以下の実施例で作り出し、そして、特徴づけされたマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が使用される場合、抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗体を、第２の検出抗体として使用することができる。本願発明の方法で用いられるように、第１の検出抗体と第２の検出抗体を異なる酵素に結合して、当該第１及び当該第２のそれぞれの捕捉抗体の特異的検出を可能にすることは、当業者に明らかである。例えば、本明細書の他の場所で記述されるＨＲＰに基づいた検出は、ＢｏＮＴ／Ｅで切断したＳＮＡＰ−２５に対して使用することができる、また、アルカリホスファターゼに基づく検出は、すべての（ＢｏＮＴ／Ｅで切断された、及びＢｏＮＴ／Ｅで切断されていない）ＳＮＡＰ−２５についてのものである。その後、細胞は、再び洗浄される。その後のステップにおいて、発蛍光性ＨＲＰ基質が細胞に添加される。ＨＲＰ基質として、例えば、５４０ｎｍで励起され、６００ｎｍで放射するＡｍｐｌｅｘ  ＵｌｔｒａＲｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用することができる。ＨＲＰ基質とのインキュベーションは、西洋ワサビペルオキシダーゼにより基質を充分に変換するのに充分な時間をかけて実行される。ＨＲＰ基質とのインキュベーションの後に、例えば、ＡＰ基質であるＤｉＦＭＵＰ（６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルリン酸、励起３６０ｎｍ、放射４５０ｎｍ）を、ＨＲＰ基質に添加することができ、それらの細胞は、前述し���２つの基質の混合物と共にインキュベートされる。前述したＡＰ基質とのインキュベーションは、アルカリホスファターゼにより基質を充分に変換できる時間をかけて実行される。当該技術分野において周知の通り、検出限界の定義により、基質は、測定されるシグナルが、ブランクの平均値＋３×平均の標準偏差と少なくとも同程度に高いような充分な量に変換されなければならない。検出限界は、文献に記載の通り決定することができる、例えば、Ａｒｍｂｒｕｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｐｒｙ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２００８、２９（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １）：Ｓ４９−Ｓ５２を参照されたい。アルカリホスファターゼのｐＨ最適条件がアルカリ性領域にあるので、対応する基質緩衝液は、強アルカリ性である。アルカリホスファターゼ基質がＨＲＰ基質に添加される場合、西洋ワサビペルオキシダーゼの反応は、アルカリ性ｐＨによって停止され、アルカリホスファターゼは、ＤｉＦＭＵＰを変換する。変換されたＨＲＰ基質は、アルカリ性ｐＨに影響されない。最後に、２つの基質の蛍光が、以下の通りに測定される。
【表１】
0006772138.tif 000002
【００３７】
当業者に理解されるように、使用される基質で異なる励起／放射波長を呈する発蛍光性基質だけが、本願発明の方法における当該第１及び当該第２の捕捉抗体の検出に適している。この場合においてだけ、それらは各抗原、すなわち、すべてのＳＮＡＰ−２５（ＢｏＮＴ／Ｅで切断されていない、及びＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５）及びＢｏＮＴ／Ｅで切断したＳＮＡＰ−２５の特異的検出を可能にする。そうすることで、あらゆるウェルまたは細胞培養皿中にあるＳＮＡＰ−２５の全含有量及びＢｏＮＴ／Ｅで切断したＳＮＡＰ−２５の含有量を同時に定量化することが可能になる。このことを踏まえて、有利なことに、本願発明の方法を自動化することが可能である。本明細書の他の箇所に記載しているように、本願発明の方法のために選ばれる発蛍光性基質は、それぞれの基質の特異的検出を可能にするために、励起／放射スペクトル間で充分な変移を呈するものが想定される。例えば、ＨＲＰ基質Ａｍｐｌｅｘ及びその誘導体の場合ならびにＡＰ基質ＤｉＦＭＵＰの場合、この要件は満たされる。最適な場合には、使用される発蛍光性基質の励起／放射スペクトル間に重複はないが、使用される発蛍光性基質の励起スペクトルのピーク領域において多くとも３０％の重複を許容できることが経験されてきた。
【００３８】
さらに、当業者であれば理解できる通り、本願発明の方法により、細胞内の神経毒ポリペプチドＢｏＮＴ／Ｅによって切断した基質ＳＮＡＰ−２５の直接検出及び定量化が可能になり、それによって、当該細胞内の当該ＢｏＮＴ／Ｅ神経毒ポリペプチドの生物学的活性を決定する。有利なことに、本願発明の方法は、当該技術分野において既知の方法に必要とされる、細胞溶解物もしくは抽出物の調製、及び細胞溶解物／抽出物からのＢｏＮＴ／Ｅで切断したＳＮＡＰ−２５の単離または濃縮を必要としない。その結果として、試料材料を節約することができる。さらに、本願発明の方法により、試料中のＳＮＡＰ−２５の総量とＢｏＮＴ／Ｅで切断したＳＮＡＰ−２５の量を同時に決定することができるので、試料の調製及び試料数を軽減することができる。当該技術分野で周知のアッセイでは、両方の抗原、すなわち、全神経毒基質と切断した神経毒基質を互いに別々に検出するには、試料を細分化しなければならない。本願発明の方法により、試料の細分化が不要になる。それにより、試料の細分化に起因する不均質性を回避することができ、試料材料を節約することができる。さらに、当該技術分野で周知のアッセイでは、抗原が分解する可能性があり、かようなアッセイでは、切断された神経毒基質を間違って検出する可能性がある。このことは、当該技術分野で周知のアッセイでは、細胞が界面活性剤含有溶解緩衝液と共にインキュベートされるが、神経毒ポリペプチドまたは他の内因性プロテアーゼを不活性化することができないため、試料の長期保存に際して神経毒基質が分解されることによる。先行技術に記載されているＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡでは細胞溶解物を使用する必要があるため、当該アッセイでは、さらに強力な溶解緩衝液を使用することはできない。これは、上述した抗原の凝集が、細胞培養皿またはマイクロタイタープレートのプラスチック表面に対する抗原の非特異的吸着をもたらし、適当な抗体による抗原の検出を妨げる可能性があることによる。抗原検出用の抗体も溶解物と接触するので、抗体が凝集する可能性もある。この場合、信頼性が高く、正確な抗原の検出は、もはや不可能である。本願発明者らは、当該技術分野で周知の神経毒活性の生物学的活性の検出に、ウェスタンブロットアッセイを使用することによって、そのような分解反応を経験した。新しい溶解物試料と比較して、−２０℃で溶解物を、さらに長期間保存した場合、ＳＮＡＰ−２５全体の検出シグナルが強く減少することが判明した。細胞培養皿上での凝集によりＢｏＮＴ／Ｅ神経毒基質ＳＮＡＰ−２５とＢｏＮＴ／Ｅ神経毒、もしくは、他の内因性プロテアーゼの両方が直ちに不活性化されるので、細胞培養皿上に細胞を直接に固定することによって、ＳＮＡＰ−２５の分解、及び／または、試料の不安定性を回避できることが、本願発明者らによって見出された。このことは、例えば、メタノール、もしくは、他の固定剤、あるいは、エタノール、アセトン、ホルムアルデヒド、もしくは、それらの混合物など、当該技術分野において周知の固化剤、または、本明細書に記載した他の固化剤で、細胞の固定を行うことによって達成することができる。この固定方法を使用して、例えば、親のＳｉＭａ細胞（ヒト神経芽細胞腫細胞、ＤＳＭＺ番号ＡＣＣ１６４）及びｉＰＳ由来ニューロン（Ｗｈｉｔｅｍａｒｓｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２），Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｓｃｉ．１２６、４２６−３５）の安定性の分析を行ったところ、新たな細胞培養皿で、冷蔵庫内に７日間貯蔵した場合に、いかなる差異も認められなかった。
【００３９】
本明細書では、文脈に特に明確な断りがない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、単数と複数の両方への言及を含む。例として、「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」とは、１つ以上の細胞のことを指す。
【００４０】
本明細書において、用語「約（ａｂｏｕｔ）」とは、記載された項目、数、パーセンテージ、または、期間の値に制限を加える場合に、記載された項目、数、パーセンテージ、または、期間の値の±１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％もしくは１％の範囲のことを指す。±１０パーセントの範囲が、好ましい
【００４１】
本明細書において使用した用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「から構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ  ｏｆ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、もしくは、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」と同義語であり、さらに、包括的または無制限であり、その他の記載されていないメンバー、要素、もしくは、方法ステップを除外しない。明らかに、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」を包含する。さらに具体的には、本明細書において使用した用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、特許請求の範囲が、記載された要素もしくは方法ステップのすべてを包含するが、その他の言及がされていない要素または方法ステップも含み得ることを意味する。例えば、ステップａ）、ｂ）、及びｃ）を含む方法とは、狭義には、ステップａ）、ｂ）、及びｃ）からなる方法を包含する。表現「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、組成（または装置、または方法）が、記載された要素（またはステップ）を有し、それ以上を有さないことを意味する。それに対して、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、ステップａ）、ｂ）、及びｃ）に加えて、さらなるステップ、例えば、ステップｄ）及びｅ）を含む方法も包含することができる。
【００４２】
「１〜５マイクロモル（μＭ）の濃度」などの数値の範囲が本明細書において使用される場合、その範囲は、１及び５マイクロモルのみならず、１〜５マイクロモルの間の任意の数値、例えば、２、３及び４マイクロモルも含む。
【００４３】
本明細書において使用した用語「インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）」とは、動物または人体に対して外側または外部であること意味する。本明細書において使用した用語「インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）」とは、「イクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）」を含むものと理解されるべきである。用語「イクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）」とは、一般的には、動物または人体から取り出されて、体外、例えば、培養容器中で維持または増殖される組織または細胞のことを指す。本明細書において使用した用語「インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）」とは、動物または人体に対して内側または内部を意味する。好ましくは、本願発明の方法は、インビトロ法である。
【００４４】
本明細書において使用した用語「神経毒ポリペプチド（Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」とは、ボツリヌス菌神経毒及び破傷風菌神経毒、すなわち、ボツリヌス毒素（ＢｏＮＴｓ）及び破傷風毒素（ＴｅＮＴ）のことを指す。具体的には、当該用語は、特に断りがない限り、ＢｏＮＴ／Ｅ神経毒ポリペプチドまたはＢｏＮＴ／Ｅ−ＭＤＭ２ポリペプチドのことを指す。ＢｏＮＴ／Ｅ−ＭＤＭ２ポリペプチド、及びそれをコードする核酸配列は、本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用するＷＯ２０１３／０６８４７６に定義及び特徴づけがされている。したがって、当該神経毒ポリペプチド、及び特に、その軽鎖と重鎖は、ＢｏＮＴ／Ｅから誘導可能である。ある態様において、当該神経毒ポリペプチドの当該軽鎖と重鎖は、ＢｏＮＴ／Ｅ神経毒の当該軽鎖と重鎖である。別の態様において、当該神経毒ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号９（ＢｏＮＴ／Ｅをコードする核酸配列）、配列番号１１（ＢｏＮＴ／Ｅ−ＭＤＭ２ポリペプチドをコードする核酸配列）、または、配列番号１３（ＢｏＮＴ／Ｅ−ＭＤＭ２ポリペプチドをコードする核酸配列）に示される核酸配列を含む。さらに、ある態様において、包含されているものは、配列番号１０（ＢｏＮＴ／Ｅ）、配列番号１２（ＢｏＮＴ／Ｅ−ＭＤＭ２ポリペプチド）、または、配列番号１４（ＢｏＮＴ／Ｅ−ＭＤＭ２ポリペプチド）に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドである。本願発明の手段及び方法のある態様において、さらに包含されているものは、配列番号１０（ＢｏＮＴ／Ｅ）、配列番号１２（ＢｏＮＴ／Ｅ−ＭＤＭ２ポリペプチド）、または、配列番号１４（ＢｏＮＴ／Ｅ−ＭＤＭ２ポリペプチド）に示されるアミノ酸配列を含む、あるいは、からなる神経毒ポリペプチドである。さらなる態様において、当該ボツリヌス菌神経毒は、ＷＯ２０１４／０６８３１７に記載のコドン最適化した核酸配列を使用することによって取得可能なＢｏＮＴ／Ｅ１である。
【００４５】
別の態様において、当該ポリヌクレオチドは、１つ以上のヌクレオチド置換、欠失、及び／または、付加を含む上述したポリヌクレオチドの変異体であり、さらに別の態様において、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、及び／または、付加を有するポリペプチドを生ずる場合がある。さらに、別の態様において、本願発明の変異体ポリヌクレオチドは、配列番号９、１１、または、１３に示される核酸配列と少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％同一である核酸配列変異体、または、配列番号１０、配列番号１２、または、配列番号１４に示されるアミノ酸配列と少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列変異体を含むものとする。本明細書において使用した用語「同一（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）」とは、２つの核酸配列間、または、２つのアミノ酸配列間で同一のアミノ酸の数を決定することによって特徴づけられる配列同一性のことを指し、配列は、最高の整列の一致が得られるように整列される。それは、例えば、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、または、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  １９９０、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５、４０３）など、コンピュータプログラムに体系化された公開されている技術または方法を使用して算出することができる。一態様において、パーセント同一性値は、全アミノ酸配列にわたって算出される。当業者は、異なる配列を比較するために、様々なアルゴリズムに基づく一連のプログラムが利用可能である。この文脈において、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈまたはＳｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムが、特に信頼性の高い結果を与える。配列の整列化を実行するために、プログラムＰｉｌｅＵｐ（Ｈｉｇｇｉｎｓ  １９８９，ＣＡＢＩＯＳ  ５，１５１）またはプログラムＧａｐ及びＢｅｓｔＦｉｔ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  １９７０，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４８，４４３，Ｓｍｉｔｈ  １９８１，Ａｄｖ  Ａｐｐｌ  Ｍａｔｈ  ２、４８２）を使用することができ、それらは、ＧＣＧソフトウェアパケット（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  １９９１，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ  ５３７１１）の一部である。本願発明の別の態様において、パーセント（％）で上記した配列同一性値は、全配列領域にわたって以下の設定：Ｇａｐ加重：５０、長さ加重：３、平均一致：１０．０００及び平均不一致：０．０００を用いてプログラムＧＡＰを使用して決定されたものであり、特に断りがない限りは、その設定は、配列整列化のための標準設定として常に使用されるものとする。ある態様において、上記した変異体ポリヌクレオチドの各々は、ＢｏＮＴ／Ｅ神経毒ポリペプチド、または、ＢｏＮＴ／Ｅ−Ｍ��Ｍ２ポリペプチドの生物学的特性の内の１つ以上、別の態様において、すべてを保持するポリペプチドをコードする。プロセッシングされていない前駆体が一部の生物学的機能に影響を及ぼし得る、または、部分的に活性であり得ると考えられる場合であっても、完全な生物学的活性はタンパク質分解性活性化の後にしか維持されないことは当業者によって理解されよう。本明細書で使用した「生物学的特性（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）」とは、（ａ）受容体結合、（ｂ）内部移行、（ｃ）エンドソーム膜を横断する細胞質ゾルへの移行、及び／または、（ｄ）シナプス小胞膜融合に関係するタンパク質の細胞内タンパク質分解的切断のことを指す。生物学的活性を評価するためのインビボアッセイには、Ｐｅａｒｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｐｅａｒｃｅ  １９９４，Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１２８：６９−７７）及びＤｒｅｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｄｒｅｓｓｌｅｒ  ２００５，Ｍｏｖ．  Ｄｉｓｏｒｄ．  ２０：１６１７−１６１９、Ｋｅｌｌｅｒ  ２００６，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １３９：６２９−６３７）によって記載されているマウスＬＤ５０アッセイ及びイクスビボマウス半横隔膜アッセイがある。生物学的活性は、一般に、マウスユニット（ＭＵ）で表記される。本明細書では、１ＭＵとは、腹腔内注射後に、指定されたマウス集団の５０％を殺す神経毒成分の量、すなわち、マウスｉ．ｐ．ＬＤ５０である。さらなる態様において、変異体ポリヌクレオチドは、改善または改変された生物学的特性を有するＢｏＮＴ／Ｅ神経毒またはＢｏＮＴ／Ｅ−ＭＤＭ２ポリペプチドをコードすることができ、例えば、それらは、酵素認識のために改善された切断部位を含んでもよく、受容体結合のために改善されていてもよく、生物学的活性の期間の改変、例えば、延長または短縮があってもよく、または、上記した他の特性を改変してもよい。
【００４６】
したがって、本明細書において使用した用語「ＢｏＮＴ／Ｅ神経毒ポリペプチドまたはＢｏＮＴ／Ｅ−ＭＤＭ２ポリペプチドの生物学的活性（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ＢｏＮＴ／Ｅ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｒ  ａ  ＢｏＮＴ／Ｅ−ＭＤＭ２  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」は、ＢｏＮＴ／Ｅ神経毒ポリペプチドに特徴的な生物学的特性、すなわち、（ａ）受容体結合、（ｂ）内部移行、（ｃ）エンドソーム膜を横断して細胞質ゾルへの移行、及び／または、（ｄ）シナプス小胞膜融合に関係するタンパク質の細胞内タンパク質分解的切断を意味する。本明細書では、ＢｏＮＴ／Ｅ神経毒ポリペプチドまたはＢｏＮＴ／Ｅ−ＭＤＭ２ポリペプチドは、上記の特性ａ）〜ｄ）のうちの少なくとも１つ、好ましくは、シナプス小胞膜融合に関係するタンパク質の細胞内タンパク質分解的切断、またはａ）〜ｄ）に記載の生物学的特性の内の２つ、もしくは、３つ、もしくは、４つすべてを呈すると想定される。
【００４７】
本開示の態様は、一部に、樹立細胞株由来の細胞を含む。本明細書で使用した用語「細胞（ｃｅｌｌ）」とは、例えば、ＢｏＮＴ／Ｅ神経毒ポリペプチドまたはＢｏＮＴ／Ｅ−ＭＤＭ２ポリペプチドなどの神経毒による神経毒中毒に感受性のある任意の真核細胞、または、ＢｏＮＴ／Ｅ神経毒ポリペプチドまたはＢｏＮＴ／Ｅ−ＭＤＭ２ポリペプチドを取り込むことができる任意の真核細胞のことを指す。用語細胞は、例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ウマ、霊長類及びヒト細胞など様々な生物由来の、例えば、ニューロン及び非ニューロンなど様々な細胞型由来の細胞を包含し、不均一な細胞集団、組織または生物から単離できるまたはその一部であることができる。本明細書で使用した用語「樹立細胞株（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）」は「不死化細胞株（ｉｍｍｏｒｔａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）」もしくは「形質転換細胞株（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）」と同義であり、生物、組織、または、器官供給源から得られる細胞集団の無限増殖に対して選択される細胞の細胞培養のことを指す。定義により、樹立細胞株は、初代細胞の細胞培養を除外する。本明細書で使用した用語「初代細胞（ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｅｌｌｓ）」は、新しい組織または器官から直接採取される細胞であり、無制限に増殖する潜在性を有さない。例えば、初代神経細胞を、本願発明の方法に使用することができる。樹立細胞株は、細胞の不均一な集団または細胞の均一な集団を含むことができる。単一細胞から得られる樹立細胞株は、クローン細胞株と称される。樹立細胞株は、細胞が細胞機構の全部を行うのに必要なすべての成分を内生的に発現し、そうすることで、ＢｏＮＴ／Ｅなどの神経毒が、ＳＮＡＰ−２５などの基質をタンパク質分解的に切断し、ＢｏＮＴ／Ｅ受容体に対するＢｏＮＴ／Ｅなど神経毒受容体に対する神経毒の結合、神経毒／受容体複合体の内部移行、細胞内小胞から細胞質へのＢｏＮＴ／Ｅ神経毒軽鎖の移行、及びＢｏＮＴ／Ｅ神経毒基質ＳＮＡＰ−２５のタンパク質分解的切断を包含する細胞であることができる。あるいは、樹立細胞株は、細胞が細胞機構の全部を行うのに必要な成分の少なくとも１つを外因性供給源から導入し、そうすることで、ＢｏＮＴ／Ｅなどの神経毒が、ＳＮＡＰ−２５などの基質をタンパク質分解的に切断し、ＢｏＮＴ／Ｅ受容体に対するＢｏＮＴ／Ｅなど受容体に対する神経毒の結合、神経毒／受容体複合体の内部移行、細胞内小胞から細胞質へのＢｏＮＴ／Ｅ神経毒軽鎖の移行、及びＢｏＮＴ／Ｅ神経毒基質ＳＮＡＰ−２５のタンパク質分解的切断を包含する細胞であることができる。そのような樹立細胞株由来の細胞は、遺伝子操作された細胞株とも称され、例えば、外因性ＦＧＦＲ２、外因性ＦＧＦＲ３、外因性ＳＶ２、外因性神経毒基質ＳＮＡＰ−２５、または、あらゆるそれらの組合せを発現することができる。
【００４８】
本明細書で使用した用語「ＢｏＮＴ／Ｅ神経毒中毒に感受性のある細胞（ｃｅｌｌ（ｓ）ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ  ｔｏ  ＢｏＮＴ／Ｅ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  ｉｎｔｏｘｉｃａｔｉｏｎ）」とは、細胞機構の全部を行うことができ、そうすることで、ＢｏＮＴ／Ｅ神経毒ポリペプチドが、ＢｏＮＴ／Ｅ神経毒基質ＳＮＡＰ−２５を切断し、また、その対応するＢｏＮＴ／Ｅ受容体に対するＢｏＮＴ／Ｅ神経毒の結合、神経毒／受容体複合体の内部移行、細胞内小胞から細胞質へのＢｏＮＴ／Ｅ神経毒軽鎖の移行、及びＢｏＮＴ／Ｅ神経毒基質ＳＮＡＰ−２５のタンパク質分解的切断を包含する細胞を意味する。ＢｏＮＴ／Ｅ神経毒ポリペプチドの生物学的活性を決定するためのアッセイは、当該技術分野において周知であり、本明細書の他の箇所にも記載されている、例えば、Ｐｅｌｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．４０４，３８８−３９２，Ｗｈｉｔｅｍａｒｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）、Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｓｃｉ．１２６，４２６−３５を参照されたい。したがって、本明細書で使用した「ＢｏＮＴ／Ｅ神経毒中毒に感受性のある細胞（ｃｅｌｌ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ  ｔｏ  ＢｏＮＴ／Ｅ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  ｉｎｔｏｘｉｃａｔｉｏｎ）」とは、ＢｏＮＴ／Ｅ神経毒感応性細胞のことを意味する。前述の用語は、細胞または細胞株、例えば、単離された初代細胞、もしくは、その細胞株、または、樹立細胞株の細胞、もしくは、樹立細胞株、例えば、本明細書の他の箇所で定義されるような神経細胞に分化することができる神経芽細胞腫細胞または神経芽細胞腫細胞株などの腫瘍細胞または腫瘍細胞株を含む。例えば、当該神経芽細胞腫細胞株は、ＤＳＭＺ（ＡＣＣ１６４）から市販されているＳｉＭａ細胞株とすることができる。細胞株ＳｉＭａの特異的クローンは、ＷＯ２０１０／１０５２３４にさらに開示がされている。本願発明の方法に使用することができる他の神経芽細胞腫細胞株は、以下のＡＴＣＣまたはＤＳＭＺ番号で、ＡＴＣＣまたはＤＳＭＺから入手することができる：ＣＲＬ−２２６３の細胞株Ｎ１Ｅ−１１５、ＣＣＬ−１３１の細胞株Ｎｅｕｒｏ２ａ、ＣＲＬ−２２６６の細胞株ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、ＣＲＬ−１７２１の細胞株ＰＣ１２、ＡＣＣ１５７（ＤＳＭＺ）のＭＨＨ−ＮＢ−１１細胞株、及びＣＲＬ−２２７１の細胞株ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）。神経毒中毒に感受性のある他の腫瘍細胞は、Ｐ−１９細胞（マウス胎児性癌細胞株）（ＤＳＭＺ番号ＡＣＣ３１６）である。人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）−由来ニューロン、好ましくは、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）−由来ニューロンが、ＢｏＮＴ／Ｅ神経毒中毒に感受性のある細胞にさらに包含される、例えば、先に引用した、Ｗｈｉｔｅｍａｒｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）を参照されたい。そのようなヒトｉＰＳ由来ニューロンも、例えば、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓから市販されている。ｉＰＳ細胞を生成する方法は、例えば、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００９年５月８日、３２４（５９２８）：７９７−８０１，Ｅｐｕｂ  ２００９）、ＷＯ２０１１／０５６９７１、及びＷＯ２０１１／０２５８５２に記載されている。いくつか��態様において、ｉＰＳは、適切な方法、例えば、ＷＯ２０１２／１３５６２１ならびに米国特許出願第ＵＳ２０１０／０２７９４０３号及び第ＵＳ２０１０／０２１６１８１号に記載されている方法を使用してニューロンに分化される。
【００４９】
用語「細胞を固定する（ｆｉｘｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌｓ）」または「細胞の固定（ｆｉｘａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ）」とは、当該技術分野において周知の方法を使用して細胞を固定することを意味する。一般に、固定とは、生物組織を腐食から守り、そうすることで、自己分解を妨げる化学プロセスである。固定は、進行中のあらゆる生化学反応を停止し、処理した組織の機械的強度または安定性を高めることもできる。固定は、検査または分析のために、組織または細胞などの生物材料の検体を、当該組織または細胞を準備するプロセスにおいて、可能な限りに天然に近い状態に保つ。この目的に向けて、固定剤は、通常は、内因性生体分子、特に、タンパク質分解酵素を無効にするように作用し、さもなければ、検体を消化または損傷する。さらに、固定剤は、一般的には、外的な損傷から検体を保護する。固定剤は、組織または細胞培養内に存在する可能性があるか、あるいは、固定した組織または細胞培養にコロニーを形成する可能性がある細菌を含む最も一般的な微生物に対して有毒である。加えて、多量の固定剤は、固定された物質を化学的に改変してしまい、日和見微生物に対して、消化作用が及びにくくなるか、あるいは、毒性を示しにくくなる。最終的に、固定剤は、分子レベルで細胞または組織をしばしば改変して、その機械的強度または安定性を高める。この強度及び剛性の増加は、分析用としてさらに加工される際に検体の形状及び構造などの形態を保つ上で役に立ち得る。固定剤及び固定手順の選択が、追加の加工ステップ及び予定される最終的な分析によって決定し得ることは、当業者に自明のことである。例えば、免疫組織化学は、特異的タンパク質標的である抗原に対して特異的に結合する抗体を使用する。長時間にわたる固定は、これらの標的を化学的にマスキングし、抗体結合を妨げる可能性がある。これらの場合、例えば、冷ホルマリンを使用する迅速固定方法を使用することができる。あるいは、細胞を、氷冷メタノール（−２０℃）を添加することによって、固定することができる。そのほか、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドなどのアルデヒド、及びエタノールまたはメタノールなどのアルコール、酸化剤、ＨＥＰＥＳグルタミン酸緩衝液媒介有機溶剤保護効果（ＨＯＰＥ）固定剤、アセトン、または、メタノールとアセトン、メタノールとエタノール、パラホルムアルデヒドとＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、または、パラホルムアルデヒドとメタノールの混合物など、それらの混合物を、固定手順に使用することができる。本願発明の方法の一態様において、細胞の固定は、メタノール、エタノール、アセトン、ホルムアルデヒド、または、それらの混合物からなる群から選択される固化剤の添加によって実行される。抗原に対する抗体の自由な接近を確実にする、及び／または、補助するために、任意に、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００など、少なくとも１つの界面活性剤を含む適当な透過化緩衝液を使用することによって細胞を透過化することができる。本願発明の方法に使用することができる透過化緩衝液は、例えば、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む１０ｍＭ  ＰＢＳ緩衝液である。本願発明の方法の他の態様において、細胞は、Ｔｗｅｅｎ２０、サポニ��、ジギトニン、または、ｎ−オクチル−β−グルコピラノシドから選択される少なくとも１つの界面活性剤を含むＰＢＳなどの透過化緩衝液を使用することによって透過化することができる。他の態様において、本明細書に記載した界面活性剤の２つ以上の混合物を、当該透過化緩衝液に使用することができる。一般に、細胞の場合、固定強度及び時間は、厚みがあって、構造的に複雑な組織切片よりかなり短い。免疫細胞化学の場合、検体調製は、標的細胞を、スライド、細胞培養皿、または、マイクロタイタープレートに固定するステップを基本的に伴う。完全な固定により、抗原が固定され、その一方で、細胞内及び亜細胞内構造がそのままに保持され、すべての細胞及び亜細胞内区画への抗体の自由な接近が可能になる。一般的に、先に例示した広範な固定剤が使用され、そして、方法の正しい選択は、検査される抗原の性質及び使用される抗体の特性によって決まることになる。一般的に、固定方法は、有機溶剤及び架橋試薬の２種類に分類される。アルコール及びアセトンなどの有機溶剤は、脂質を除去し、細胞を脱水し、その一方で、タンパク質を細胞構造に凝結させる。パラホルムアルデヒドなどの架橋試薬は、通常は、遊離アミノ基による分子間橋を形成し、そして、連結された抗原の網目を構築する。架橋剤は、有機溶剤よりも細胞構造の保持の面で優れるが、一部の細胞成分の抗原性を減少させ、そして、試料への抗体の接近を可能にするために、先に例示した透過化ステップを追加しなくてはならない、ことがよくある。両方の方法による固定は、タンパク質抗原を変性させることがあり、それが故に、変性タンパク質に対して調製した抗体が、細胞染色においてさらに有用になる場合がある。適切な固定方法は、関連する用途に従って選択されるべきである。細胞の固定方法は、当該技術分野において周知であり、また、当業者も熟知している、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ３７：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｄａｖｉｄ  Ｊ．  Ａｓａｉ編，１９９３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．を参照されたい。
【００５０】
本願発明の方法に従って使用された用語「接触させる（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）」は、物理的、及び／または、化学的相互作用が可能になるように、細胞及び各抗体を物理的に近接させることを意味する。特異的相互作用を可能にする適切な条件は、当業者に周知である。明らかなことに、当該条件は、本願発明の方法において適用される抗体及び細胞によって決まるものであって、当業者は、常法通りに適合させることができる。さらに、相互作用を可能にするのに十分な時間も、当業者であれば難なく決定することができる。細胞と本願発明の方法において記載した各抗体とを接触させる個々のステップの間に洗浄ステップを実施して、接触に適した条件を得ることができる、ことを理解されたい。例えば、本願発明の方法のステップｃ）において、細胞を、ＢｏＮＴ／Ｅで切断されていない基質ＳＮＡＰ−２５とＢｏＮＴ／Ｅで切断された基質ＳＮＡＰ−２５とに対して特異的に結合する少なくとも第１の捕捉抗体と、ＢｏＮＴ／Ｅで切断された基質ＳＮＡＰ−２５に対して特異的に結合する少なくとも第２の捕捉抗体とに接触させた後に洗浄ステップを組み込んで、第１の検出抗体、及び／または、第２の検出抗体を適用する前に、残りの溶液、及び／または、過剰な第１及び第２の捕捉抗体を除去することができる。同様に、細胞を、本願発明の方法における第１及び／または第２の検出抗体と接触させた後に、洗浄ステップを含めることができる。適当な洗浄緩衝液は、例えば、１０ｍＭ  ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）である。具体的には、本明細書で使用した用語「接触させる（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）」とは、本願発明の方法のステップｃ）において、当該細胞を、ＢｏＮＴ／Ｅで切断されていない基質ＳＮＡＰ−２５とＢｏＮＴ／Ｅで切断された基質ＳＮＡＰ−２５とに対して特異的に結合する少なくとも第１の捕捉抗体と、ＢｏＮＴ／Ｅで切断された基質ＳＮＡＰ−２５に対して特異的に結合する少なくとも第２の捕捉抗体とに接触させることであって、当該捕捉抗体と当該ＳＮＡＰ−２５との結合を許容する条件下で、接触させることを指す。当該第１及び第２の捕捉抗体を、例えば、混合物として同時に、または、連続して細胞に適用することができる。さらに、「接触させる（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）」とは、本願発明の方法のステップｄ）において、当該細胞を、当該第１の捕捉抗体に対して特異的に結合する少なくとも第１の検出抗体と接触させることであって、当該第１の検出抗体と当該第１の捕捉抗体との結合を許容する条件下で接触させること、及び当該第２の捕捉抗体に対して特異的に結合する少なくとも第２の検出抗体と接触させることであって、当該第２の検出抗体と当該第２の捕捉抗体との結合を許容する条件下で接触させることを指す。そうすることで、第１及び第２の検出複合体が形成される。あるいは、当該第１及び第２の検出抗体を、連続して適用することもできる。
【００５１】
本願発明の方法によると、当該「第１の捕捉抗体（ｆｉｒｓｔ  ｃａｐｔｕｒｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、ＢｏＮＴ／Ｅで切断されていない基質ＳＮＡＰ−２５及びＢｏＮＴ／Ｅで切断された基質ＳＮＡＰ−２５に含まれるエピトープに対して特異的に結合する。ＳＮＡＰ−２５は、ＢｏＮＴ／Ｅの既知の基質である。当該第１の捕捉抗体は、細胞内の切断されていないＳＮＡＰ−２５とＢｏＮＴ／Ｅで切断された基質ＳＮＡＰ−２５の双方に認められるエピトープに対して特異的に結合して、細胞内のＳＮＡＰ−２５の総量、すなわち、全含量の決定を許容する。ＢｏＮＴ／Ｅについて、ＢｏＮＴ／Ｅ切断部位（Ａｒｇ（Ｒ）１８０−Ｉｌｅ（Ｉ）１８１）のＮ末端側、すなわち、ＳＮＡＰ−２５のアミノ酸残基１〜１８０の間に位置するエピトープは、当該第１の捕捉抗体のために使用することができる。
【００５２】
本願発明の方法のある態様において、ＳＮＡＰ−２５は、ヒトＳＮＡＰ−２５ＡまたはＢ、あるいは、ラット、マウス、ウシ、ダニオ、フナ、アフリカツメガエル、シビレエイ、エゾバフンウニ、ヤリイカ、モノアラガイ、アカゲザル（赤毛猿（Ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅ））、チンパンジー、または、アメフラシ由来のホモログ、パラログ、または、それらのオルソログである。マウスＳＮＡＰ−２５またはヒトＳＮＡＰ−２５の対応するアミノ酸配列は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号第Ｐ６０８７９号及び第Ｐ６０８８０号にそれぞれ示されている。ＳＮＡＰ−２５は、天然、組換え、外因性、または、内因性の核酸分子またはポリペプチドとして使用することができる。上記したＳＮＡＰ−２５タンパク質でのＢｏＮＴ／Ｅ切断部位は、例えば、欧州特許第ＥＰ  １  ９２６  ７４４  Ｂ１号に開示されている。
【００５３】
本願発明の方法における第１の捕捉抗体として使用可能な適当な抗体の例として、例えば、  ウサギポリクローナル抗ＳＮＡＰ２５抗体Ｓ９６４８（Ｓｉｇｍａ）（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｌａｓ  Ｅ，Ｗａｎｇ  Ｊ，Ｍｏｌｉｎａ  Ｙ，Ｎｅｌｓｏｎ  ＪＢ，Ｊａｃｋｙ  ＢＰＳ，ｅｔ  ａｌ．，，（２０１２）Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  Ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ａ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｃｅｌｌ−Ｂａｓｅｄ  Ｐｏｔｅｎｃｙ  Ａｓｓａｙ  ｔｏ  Ｒｅｐｌａｃｅ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｂｉｏａｓｓａｙ，ＰＬｏｓ  ＯＮＥ  ７（１１）：ｅ４９５１６．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００４９５１６）、ウサギポリクローナル抗ＳＮＡＰ２５抗体ＰＡ５−１９７０８（Ｐｉｅｒｃｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、ウサギモノクローナル抗ＳＮＡＰ２５抗体ａｂ１０８９９０（Ａｂｃａｍ）、または、ウサギポリクローナル抗ＳＮＡＰ２５抗体ＰＡ５−１９７０１（Ｐｉｅｒｃｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）などがある。
【００５４】
本願発明の方法の別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅで切断されていない基質ＳＮＡＰ−２５、及びＢｏＮＴ／Ｅで切断された基質ＳＮＡＰ−２５に対して特異的に結合する第１の捕捉抗体は、例えば、１×１０５Ｍ−１ｓ−１未満、１×１０６Ｍ−１ｓ−１未満、１×１０７Ｍ−１ｓ−１未満、または、１×１０８Ｍ−１ｓ−１未満の結合速度定数を有することができる。別の態様において、ＢｏＮＴ／Ｅで切断されていない基質ＳＮＡＰ−２５、及びＢｏＮＴ／Ｅで切断された基質ＳＮＡＰ−２５に対して特異的に結合する第１の捕捉抗体は、例えば、１×１０５Ｍ−１ｓ−１超、１×１０６Ｍ−１ｓ−１超、１×１０７Ｍ−１ｓ−１超、または、１×１０８Ｍ−１ｓ−１超の結合速度定数を有することができる。さらなる態様において、ＢｏＮＴ／Ｅで切断されていない基質ＳＮＡＰ−２５、及びＢｏＮＴ／Ｅで切断された基質ＳＮＡＰ−２５に対して特異的に結合する第１の捕捉抗体は、例えば、１×１０−３ｓ−１未満、１×１０−４ｓ−１未満、１×１０−５ｓ−１未満、または、１×１０−６ｓ−１未満の分離速度定数を有することができる。なおさらなる態様において、ＢｏＮＴ／Ｅで切断されていない基質ＳＮＡＰ−２５、及びＢｏＮＴ／Ｅで切断された基質ＳＮＡＰ−２５に対して特異的に結合する第１の捕捉抗体は、例えば、１×１０−３ｓ−１超、１×１０−４ｓ−１超、１×１０−５ｓ−１超、または、１×１０−６ｓ−１超の分離速度定数を有することができる。当該技術分野において周知の通り、当該結合速度定数とは、当該抗体が、その標的に結合する速さを表すために用いた定数である。当該分離速度定数とは、当該抗体が、その標的から分離する速さを表すために用いた定数である。
【００５５】
さらなる態様において、当該第１の捕捉抗体は、細胞内のＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５の標準化のために使用される。
【００５６】
本願発明の方法のさらなる態様において、ＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５に対して特異的に結合する当該第２の捕捉抗体は、本願発明のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。したがって、本願発明の抗体に関する定義及び実施形態は、本願発明の方法において使用した当該第２の捕捉抗体に準用する。本願発明の方法の別の態様において、当該第２の捕捉抗体は、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３２９（２００８），ｐ．９２−１０１に記載されているようなＢｏＮＴ／Ｅ切断部位に特異的な抗体である。
【００５７】
本明細書で使用した用語「第１の検出抗体（ｆｉｒｓｔ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」とは、当該第１の捕捉抗体に対して特異的に結合する抗体である。当該第１の検出抗体により、第１の捕捉抗体の特異的検出が可能になる。当該第１の検出複合体内の結合した第１の検出抗体の量が、当該第１の検出複合体に含まれる第１の捕捉抗体の量（及び、したがって、ＳＮＡＰ−２５の全量、すなわち、ＢｏＮＴ／Ｅで切断したＳＮＡＰ−２５と未切断のＳＮＡＰ−２５の全量）と相関するので、結合している第１の検出抗体の量を測定することによって、第１の検出複合体の量を決定することができる。例えば、適当な種特異的な抗体を、第１の検出抗体として使用することができる：第１の捕捉抗体としてマウス抗体が使用される場合、当該第１の検出抗体は、マウス抗体に対して特異的に結合する抗マウス抗体であることができる。第１の検出抗体は、例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）結合抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗体、または、蛍光色素に結合された抗体とすることができる。例えば、グルタルアルデヒドを使用することによって、抗体へ酵素を結合することは、当該技術分野において周知である。
【００５８】
ほぼ４０年間、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して、広範な化合物及び病原体が定量化されてきた。当初は、放射活性を使用してアッセイを定量化したが、放射免疫測定法（ＲＩＡ）は、比色結果を得るために酵素を利用するアッセイに置き換わった。最近、蛍光及び発光生成物を生じるための新たな基質が開発された。新たなアッセイの基本的な原理は、比色アッセイと同じままである。基質は、特異性を与える抗体に結合されたタンパク質の酵素活性によって測定可能な化合物に変換される。
【００５９】
ＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用されている酵素複合体は、アルカリホスファターゼ、または、西洋ワサビペルオキシダーゼである。したがって、一態様において、当該第１の検出抗体は、例えば、アルカリホスファターゼ、または、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合することができる。本願発明の方法における第１の検出抗体として使用することができる酵素複合体のさらなる例として、基質としてグルコースを使用するグルコースオキシダーゼ、基質１−（４−メチル−クマリン−７−イル）−３−（４−ヒドロキシフェニル）尿素（ＰＡＰ−ＡＭＣ）を変換するチロシナーゼ（Ｓｔｒａｔｉｓ  Ａｖｒａｍｅａｓ，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌｕｍｅ  ６，Ｉｓｓｕｅ  １，１９６９年１月，Ｐａｇｅｓ  ４３−４８，ＩＮ９−ＩＮ１１，４９−５２）、または、基質６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルβ−ｄ−ガラクトピラノシド（ＤｉＦＭＵＧ）を変換するβガラクトシダーゼ（Ｇｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２７３，Ｉｓｓｕｅ  １，１９９９年８月，４１−４８）がある。基質を添加すると、酵素によって、当該基質は検出可能な形態に変換される。例えば、アルカリホスファターゼ酵素は、リン酸のエステルの切断を触媒する。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）結合抗体が、第１の検出抗体として使用される場合、４−メチルウンベリフェリルホスフェート誘導体、例えば、６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルホスフェート（ＤｉＦＭＵＰ）、または、フルオレセインジホスフェート（ＦＤＰ）などの適当な基質が使用される。６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルホスフェート（ＤｉＦＭＵＰ）は、ＡＰによって検出可能な形態、すなわち、発蛍光性生成物６，８−ジフルオロ−４−メチルウムベリフェロンに変換される。当該基質は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから提供されている。ＤｉＦＭＵＰのこの反応生成物の蛍光強度は、約３５８／４５０ｎｍの最大励起／放射を使用して測定することができる。この目的で使用することができるさらなる基質は、９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）ホスフェート（ＤＤＡＯ−ホスフェート、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、フルオレセインジホスフェート（ＦＤＰ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、または、４−メチルウンベリフェリルホスフェート（ＭＵＰ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。ＤＤＡＯ−ホスフェートは、ＡＰによって約６４６／６５９ｎｍの最大励起／放射を有する発蛍光性生成物ジメチルアクリジノン（ＤＤＡＯ）に変換される。ＡＰの基質としてＦＤＰが使用される場合、反応生成物は、約４９０／５１４ｎｍの最大励起／放射を有するフルオレセインである。ＭＵＰの場合、対応する反応生成物は、約３６０／４４９ｎｍの最大励起／放射を有する４−メチルウムベリフェロン（７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン）である。また、これらの基質は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから市販されている。あるいは、本願発明の方法の第１の検出抗体における酵素複合体として西洋ワサビペルオキシダーゼを使用することができる。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）から水（Ｈ２Ｏ）への還元を触媒する。水素供与体として作用する特異的基質の存在下で、ＨＲＰの作用は、無色または非蛍光性分子を発色した部分、及び／または、蛍光部分にそれぞれ変換する。例えば、Ａｍｐｌｅｘ（登録商標）Ｒｅｄ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、ＨＲＰ含有アッセイで使用する基質である。Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄは、ペルオキシダーゼ酵素の存在下で、１：１の化学量論でＨ２Ｏ２と反応して、５６３ｎｍ及び５８７ｎｍの最大吸収及び蛍光放射をそれぞれ有する赤色蛍光化合物であるレゾルフィンを生じる。ＨＲＰ基質の別の例は、Ａｍｐｌｅｘ（登録商標）ＵｌｔｒａＲｅｄ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。Ａｍｐｌｅｘ（登録商標）ＵｌｔｒａＲｅｄ試薬（約５７０／５８５ｎｍの励起／放射）は、Ａｍｐｌｅｘ（登録商標）Ｒｅｄ試薬の能力を改善し、西洋ワサビペルオキシダーゼ、または、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合酵素アッセイにおいて、より明るい蛍光を提供し、モルベース当たりの感度を向上させることが報告されている。酸化型Ａｍｐｌｅｘ（登録商標）ＵｌｔｒａＲｅｄ試薬（Ａｍｐｌｅｘ（登録商標）ＵｌｔｒａＲｅｄ試薬）の蛍光は、ｐＨにも不感応性であり、基質及びその酸化生成物は、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、または、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）などのチオールの存在下で、Ａｍｐｌｅｘ（登録商標）Ｒｅｄ試薬よりも高い安定性を呈する。本願発明の方法に使用することができるさらに適当なＨＲＰ基質には、例えば、１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン（ＡＤＨＰ、ＡｎａＳｐｅｃ）、または、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸（ＨＰＰＡ、ＡｎａＳｐｅｃ）（Ｔｕｕｍｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  １２，２９−４６）がある。
【００６０】
あるいは、当該第１の検出抗体は、第１の捕捉抗体の検出を可能にする適当な、検出可能な標識を持つことができる。標識は、直接的または間接的な方法によって行うことができる。直接標識は、当該第１の検出抗体に標識を直接に（共有結合的または非共有結合的に）結合させることを含む。間接標識は、当該第１の検出抗体に特異的に結合し、検出可能な標識を持つ薬剤の（共有結合的または非共有結合的な）結合を含む。そのような薬剤は、例えば、当該第１の検出抗体に対して特異的に結合する二次（より高次の）抗体であることができる。そのような場合において、当該二次抗体は、検出可能な標識に結合されることになる。加えて、当該第１の検出複合体の検出のために、さらにより高次の抗体を使用できることは理解されよう。さらに高次の抗体を使用して、シグナルが増強されることがよくある。適切な高次の抗体には、周知のストレプトアビジンビオチン系（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）、ならびに周知のＤａｋｏ  ＬＳＡＢ（商標）２、及びＬＳＡＢ（商標）＋（標識ストレプトアビジンビオチン）、または、Ｄａｋｏ  ＰＡＰ（ペルオキシダーゼ抗ペルオキシダーゼ）などもある。さらなる態様において、当該第１の検出抗体での当該標識は蛍光色素であり、すなわち、第１の抗体は、蛍光色素に結合される。この場合、蛍光は、蛍光リーダーによって直接に測定することができる。典型的な蛍光標識には、ＧＦＰ及びその誘導体などの蛍光タンパク質、Ｃｙ３またはＣｙ５などのＣｙ色素、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、フルオレセイン、及びＡｌｅｘａ色素、例えば、Ａｌｅｘａ  ５６８がある。
【００６１】
本明細書で使用した用語「第２の検出抗体（ｓｅｃｏｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」とは、当該第２の捕捉抗体に対して特異的に結合する抗体である。当該第２の検出抗体は、例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、または、チロシナーゼなどの酵素に結合することができる。したがって、一態様において、当該第２の検出抗体は、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）結合抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗体、グルコースオキシダーゼ結合抗体、または、チロシナーゼ結合抗体である。当該第２の検出抗体により、第２の捕捉抗体の特異的検出が可能になる。当該第２の検出複合体内の結合した第２の検出抗体の量が、当該第２の検出複合体に含まれる第２の捕捉抗体の量（及び、したがって、ＢｏＮＴ／Ｅで切断したＳＮＡＰ−２５の量）と相関するので、結合している第２の検出抗体の量を測定することによって、第２の検出複合体の量を決定することができる。例えば、第２の捕捉抗体としてマウス抗体が使用された場合、抗マウス抗体を第２の検出抗体として使用することができる。第１の検出抗体に関して本明細書の他の箇所に記載したように、第２の検出抗体は、上記した酵素または蛍光色素などの標識を持つ（すなわち、第２の検出抗体に、蛍光色素が結合される）ことができる。本願発明の方法の一態様において、本願発明の方法において、当該第１及び第２のそれぞれの捕捉抗体の特異的検出を可能にするには、当該第１の検出抗体に結合される酵素は、当該第２の検出抗体に結合される酵素と異なる。例えば、第１の検出抗体がＡＰ結合抗体である場合、第２の検出抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗体であり、または、その逆であることができる。さらに、ＡＰ及びＨＲＰの発蛍光性基質の励起／放射スペクトルは、実質的に重ならないが、互いに異なり、すなわち、そのスペクトルは、それぞれの生成物によって生成される蛍光強度の識別が可能になるように明らかな変移を示す。例えば、ＤｉＦＭＵＰは、約３５８／４５０ｎｍで励起／放射を呈するが、Ａｍｐｌｅｘ  ＵｌｔｒａＲｅｄは、約５７０／５８５ｎｍの励起／放射を呈し、それにより、それぞれの酵素による当該発蛍光性基質の変換によって生成される蛍光強度の正確な測定が可能になる。さらなる態様において、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）結合抗体は、細胞内に過剰に存在する抗原に対する第１の検出抗体として、すなわち、細胞内のすべての（ＢｏＮＴ／Ｅで切断した、及び切断されていない）ＳＮＡＰ−２５の量を測定するための第１の検出抗体として使用される。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗体は、細胞内に少量で存在する抗原のための第２の検出抗体として、すなわち、細胞内のＢｏＮＴ／Ｅで切断したＳＮＡＰ−２５の量を測定するための第２の検出抗体として使用される。当該技術分野において周知の通り、ＨＲＰ基質がＡＰ基質より感応性が高いことは、少量の検体を検出できることを意味している。ＨＲＰ抗体が、ＢｏＮＴ／Ｅで切断したＳＮＡＰ−２５の検出用二次抗体として使用される場合、少量のＢｏＮＴ／Ｅで切断したＳＮＡＰ−２５でも検出可能となる。同じく、少量のＢｏＮＴ／Ｅを決定することができ、それにより、アッセイの感度が高まる。ＡＰ抗体は細胞内のＳＮＡＰ−２５の全量を測定するので、過剰の検体があっても、高感度の基質を必要としない。
【００６２】
例えば、「少なくとも第１の捕捉抗体（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ａ  ｆｉｒｓｔ  ｃａｐｔｕｒｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」など、本明細書で使用した用語「少なくとも（ａｔ  ｌｅａｓｔ）」は、切断されていない基質、及びＢｏＮＴ／Ｅで切断した基質に対して特異的に結合する抗体に加えて、前述の特異性を持つ１つ以上のさらなる抗体が、本願発明の方法に使用できることを意味する。同様に、「少なくとも第２の捕捉抗体（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ａ  ｓｅｃｏｎｄ  ｃａｐｔｕｒｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、ＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５の開裂部位に対して特異的に結合する本願発明の抗体に加えて、前述の特異性を持つ１つ以上のさらなる抗体が、本願発明の方法に使用できることを意味する。さらに、１つの第１の検出抗体（または、複数の第１の検出抗体）に対して特異的に結合する１つ以上の第１の検出抗体を、本願発明の方法に使用することができる。同様に、１つの第２の検出抗体（または、複数の第２の検出抗体）に対して特異的に結合する１つ以上の第２の検出抗体を、本願発明の方法に使用することができる。
【００６３】
用語「第１の検出複合体（ｆｉｒｓｔ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ）」とは、切断されていない、及びＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５に対して特異的に結合し、そうすることで、細胞内のＳＮＡＰ−２５の全含有量の決定が可能になる第１の捕捉抗体と第１の検出抗体とを含む複合体のことを指す。第１の検出複合体の量は、特異的に結合している第１の検出抗体の量の決定によって、測定することができる。これは、酵素の性質、または、当該第１の検出抗体の標識に応じて、例えば、蛍光の強度を測定することによって実現することができる。
【００６４】
用語「第２の検出複合体（ｓｅｃｏｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ）」とは、ＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５の開裂部位に対して特異的に結合し、そうすることで、細胞内のＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５の全含有量の決定が可能になる第２の捕捉抗体と第２の検出抗体とを含む複合体のことを指す。第２の検出複合体の量は、特異的に結合している第２の検出抗体の量の決定によって、測定することができる。これは、酵素の性質、または、当該第２の検出抗体の標識に応じて、例えば、蛍光の強度を測定することによって実現することができる。
【００６５】
シグナル対ノイズ比が、形成された抗体抗原複合体からのシグナルとバックグラウンドシグナルとを統計的に有意な程度に区別できるという条件の下で、酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）に代えて、任意の検出系を使用して、本願発明の方法の態様を実施することも意図されている。免疫に基づく検出系の例として、ウェスタンブロッティングやドットブロッティングなどの免疫ブロット分析、免疫沈降分析、及びサンドイッチＥＬＩＳＡがあるが、これらに限定されない。シグナルの検出は、画像化または蛍光体画像化（ＡＵ）を伴うオートラジオグラフィー、生物発光（ＢＬ）、蛍光、共鳴エネルギー移動、平面偏光、比色またはフローサイトメトリー（ＦＣ）を使用して実施することができる。免疫に基づく検出系の説明は、例えば、Ｃｏｍｍｏｎｌｙ  Ｕｓｅｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ８．１−Ａ８−５５（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，ｅｄｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｖｏｌ．３，３．ｓｕｐ．ｒｄ  ｅｄ．２００１）、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａ９．１−Ａ９−４９（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，ｅｄｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｖｏｌ．３，３．ｓｕｐ．ｒｄ  ｅｄ．２００１）に開示されている。
【００６６】
本願発明の方法の一態様において、当該方法は、蛍光法である。
【００６７】
さらなる態様において、本明細書に記載された細胞、本願発明の抗体などの抗体、ＢｏＮＴ／Ｅなどの神経毒ポリペプチド、及びＳＮＡＰ−２５などの基質、または、本明細書に記載の他のあらゆる生成物とは、それぞれ、単離された細胞、抗体、神経毒ポリペプチド、神経毒基質、または、生成物である。単離された抗体など、本明細書で使用した用語「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」とは、ヒトが介在して自然環境から分離された分子のことを指す。
【００６８】
本願発明の方法の一態様において、当該ＢｏＮＴ／Ｅ神経毒ポリペプチドは、
ａ）配列番号１０、配列番号１２、または、配列番号１４に示されるアミノ酸配列、及び
ｂ）配列番号１０、配列番号１２、または、配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または、１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００６９】
本願発明の方法のさらなる態様において、当該細胞は、初代神経細胞、神経芽腫細胞などの神経細胞に分化することができる腫瘍細胞、Ｐ１９細胞、または、人工多能性幹細胞（ＩＰＳ）由来ニューロンからなる群から選択される神経細胞または神経分化細胞である。
【００７０】
願発明の方法のそしてさらなる態様において、細胞の固定は、メタノール、エタノール、アセトン、ホルムアルデヒド、または、これらの混合物からなる群から選択される固化剤の添加によって実施される。
【００７１】
本願発明の方法の別の態様において、切断されていない基質、及びＢｏＮＴ／Ｅで切断した基質に対して特異的に結合する当該第１の捕捉抗体は、ウサギポリクローナル抗ＳＮＡＰ２５抗体Ｓ９６４８、ウサギポリクローナル抗ＳＮＡＰ２５抗体ＰＡ５−１９７０８（Ｐｉｅｒｃｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、ウサギモノクローナル抗ＳＮＡＰ２５抗体ａｂ１０８９９０（Ａｂｃａｍ）、または、ウサギポリクローナル抗ＳＮＡＰ２５抗体ＰＡ５−１９７０１（Ｐｉｅｒｃｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）である。
【００７２】
本願発明の方法の一態様において、当該第１の検出抗体は、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）結合抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗体、または、蛍光色素に結合した抗体である。
【００７３】
本願発明の方法の一態様において、当該第２の検出抗体は、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）結合抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗体、グルコースオキシダーゼ結合抗体、チロシナーゼ結合抗体、または、β−ガラクトシダーゼ抗体である。好ましくは、当該第２の検出抗体は、当該第１の検出抗体と相違している。
【００７４】
本願発明の方法のさらなる態様において、当該ＨＲＰ基質は、Ａｍｐｌｅｘ  ＵｌｔｒａＲｅｄ、１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン（ＡＤＰＨ）、または、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸（ＨＰＰＡ）である。
【００７５】
本願発明の方法のそしてさらなる態様において、当該ＡＰ基質は、６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルホスフェート（ＤｉＦＭＵＰ）などの４−メチルウンベリフェリルホスフェート誘導体、または、フルオレセインジホスフェート（ＦＤＰ）である。
【００７６】
本願発明は、本願発明の方法を実施するためのキットであって、
ａ）第１の捕捉抗体、好ましくは、本願発明のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である第２の捕捉抗体、第１の検出抗体、及び第２の検出抗体の配合であって、本願発明の方法を実施することを許容する、配合と、
ｂ）ａ）に記載の当該配合によって決定された第２の検出複合体の量に基づいて、ＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５の量を算出するための手段と、
ｃ）本願発明の方法を実施するための指示書と、を含むキット、にも関する。
【００７７】
本明細書で使用した用語「キット（ｋｉｔ）」とは、一緒に梱包されていても、されていなくともよい、本願発明の上記手段または試薬の集まりのことを指す。キットの構成要素は、個別のバイアルに（すなわち、個別の部品のキットとして）含まれていてもよく、あるいは、単一のバイアルで提供されていてもよい。さらに、本願発明のキットは、本明細書に記載の方法を実施するために使用される、ことを理解されたい。一態様において、すべての構成要素が、本明細書に記載の方法を実施するために直ちに利用可能な方式で提供されることも意図されている。さらなる態様において、当該キットは、当該方法を実施するための指示書を含む。この指示書は、紙形態または電子形態のユーザーマニュアルによって提供され得る。例えば、このマニュアルは、本願発明のキットを使用して上記方法を実施した場合に得られる結果を解釈するための指示書を含むことができる。
【００７８】
最後に、別の態様において、本願発明は、（ｉ）本願発明の方法によってＢｏＮＴ／Ｅ神経毒またはＢｏＮＴ／Ｅ−ＭＤＭ２神経毒ポリペプチドの生物学的活性を決定すること、及び（ｉｉ）医薬品もしく化粧品用途に使用するためにＢｏＮＴ／Ｅ神経毒またはＢｏＮＴ／Ｅ−ＭＤＭ２神経毒ポリペプチドを製剤化して、製剤化されたＢｏＮＴ／Ｅ神経毒生成物またはＢｏＮＴ／Ｅ−ＭＤＭ２神経毒生成物が取得されること、を含む医薬品または化粧品用途に使用する製剤化されたＢｏＮＴ／Ｅ神経毒生成物またはＢｏＮＴ／Ｅ−ＭＤＭ２神経毒生成物の製造方法に関する。ＢｏＮＴ／Ｅ神経毒またはＢｏＮＴ／Ｅ−ＭＤＭ２神経毒ポリペプチドは、当該技術分野で周知の所望の用途目的に応じて定まる様々な技術によって、ＢｏＮＴ／Ｅ神経毒生成物またはＢｏＮＴ／Ｅ−ＭＤＭ２神経毒生成物へと製剤化することができる。例えば、（生物学的に活性な）ＢｏＮＴ／Ｅ神経毒ポリペプチドは、１つ以上の薬学的に許容できる担体と組み合わせて医薬組成物として使用することができる。薬学的に許容できる担体は、製剤の他の成分に適合しており、投与対象に有害でないという意味において許容可能でなければならない。利用される医薬用担体には、固体、ゲルまたは液体があり得る。固体担体の例として、ラクトース、白土、ショ糖、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などがある。液状担体の例として、グリセロール、リン酸緩衝生理食塩水、水、乳剤、各種湿潤剤などがある。適切な担体は、上記したもの、及び当該技術分野において周知の他の担体を含む、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａを参照されたい。一態様において、医薬組成物は、投与の前に希釈剤に溶解することができる。また希釈剤も、ＢｏＮＴ／ＥまたはＢｏＮＴ／Ｅ−ＭＤＭ２神経毒ポリペプチドの生物学的活性に影響を及ぼさないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水または生理的食塩水である。加えて、医薬組成物または製剤は、他の担体または非毒性、非治療的、非免疫原性安定剤などを含むこともできる。したがって、一態様において、製剤化されたＢｏＮＴ／Ｅ神経毒生成物またはＢｏＮＴ／Ｅ−ＭＤＭ２神経毒生成物は、液体または凍結乾燥形態で存在することができる。一態様において、それは、グリセロール、タンパク質安定剤（ＨＳＡ）、または、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ヒアルロン酸、または、遊離アミノ酸などの非タンパク質安定剤と一緒に存在することができる。一態様において、適切な非タンパク質安定剤は、ＷＯ２００５／００７１８５またはＷＯ２００６／０２０２０８に開示されている。一態様において、本願発明の方法によるステップ（ｉ）によって決定される生物学的活性は、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０または２００Ｕ（マウスＬＤ５０単位）のＢｏＮＴ／Ｅ神経毒またはＢｏＮＴ／Ｅ−ＭＤＭ２神経毒ポリペプチド活性に相当する。製剤化されたＢｏＮＴ／Ｅ神経毒生成物またはＢｏＮＴ／Ｅ−ＭＤＭ２神経毒生成物は、治療上有効な用量で様々な疾患もしくは���害のヒトもしくは動物療法にまたは美容上の目的に使用することができる。
【００７９】
本明細書に記載する疾患または障害は、随意筋力、頸部、頭蓋ジストニアを含む局所性ジストニア及び良性特発性眼瞼痙攣、片側顔面痙攣、及び局所性痙直、胃腸障害、多汗症、ならびに美容的皺矯正、眼瞼痙攣、顎開口型及び顎閉口型口下顎ジストニア、歯軋り、メージュ症候群、舌ジストニア、眼瞼失行、開口頸部ジストニア、頸部前屈、頸部後屈、頸部側屈、斜頸、咽頭ジストニア、喉頭ジストニア、痙攣性発声障害／内転筋型痙攣性呼吸困難、四肢ジストニア、腕ジストニア、動作特異性ジストニア、書痙、音楽家痙攣、ゴルファー痙攣、脚ジストニア、腿部内転、腿部外転、膝屈曲、膝伸展、足首屈曲、足首伸展、内反尖足、奇形足ジストニア、母指の過伸展、足指屈曲、足指伸展、軸性ジストニア、ピサ症候群、ベリーダンサージストニア、分節性ジストニア、片側性ジストニア、全身性ジストニア、ルーバッグ病でのジストニア、大脳皮質基底核変性症でのジストニア、ルーバッグ病でのジストニア、遅発性ジストニア、脊髄小脳失調でのジストニア、パーキンソン病でのジストニア、ハンチントン舞踏病でのジストニア、ハレルフォルデンスパッツ病でのジストニア、ドーパ誘発性ジスキネジア／ドーパ誘発性ジストニア、遅発性ジスキネジア／遅発性ジストニー、発作性ジスキネジア／ジストニア、運動性、非運動性、動作誘発性口蓋ミオクローヌス、ミオクローヌス、ミオキミア、筋波動症、硬直、良性筋痙攣、遺伝性顎振戦、奇異性顎筋活動、片側咀嚼筋痙攣、肥大性鰓弓ミオパチー、咬筋肥大、前脛骨筋肥大、眼振、動揺視、核上性注視麻痺、持続性部分てんかん、痙性斜頸手術の計画、声帯外転筋麻痺、難治性変異性発生障害、上部食道括約筋機能障害、声帯肉芽腫、吃音、ジルドラトゥレット症候群、中耳ミオクローヌス、防御性喉頭閉鎖、喉頭切除後言語障害、防御性眼瞼下垂、眼瞼内反、オッディ括約筋機能不全、偽アカラシア及び非アカラシア食道運動障害、腟痙、術後固定振戦、膀胱機能障害、排尿筋括約筋共同運動障害、膀胱括約筋痙攣、片側顔面痙攣、神経再生ジスキネジア、オトガイの窪み、スティッフパーソン症候群、強縮、前立腺肥大、肥満症、脳性小児麻痺性斜視治療、網膜剥離手術後、白内障手術後の混合性随伴麻痺、無水晶体筋炎斜視、筋障害性斜視での斜視手術に合併する交代性上斜位、内斜視、外斜視、アカラシア、裂肛、外分泌腺機能亢進、フレイ症候群、ワニの涙症候群、腋窩、手掌、足底多汗症、鼻漏、脳卒中での、パーキンソン病での、筋萎縮性側索硬化症、痙攣症状での、脳炎及び脊髄炎、自己免疫プロセス、多発性硬化症、横断性脊髄炎、デビック症候群、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、真菌感染での、遺伝性痙性対麻痺、卒中後症候群、大脳半球梗塞、脳幹梗塞、脊髄梗塞での、中枢神経系外傷、大脳半球病変、脳幹病変、脊髄病変での、中枢神経系出血、脳出血、クモ膜下出血、硬膜下出血、脊椎内出血での、腫瘍形成、大脳半球腫瘍、脳幹腫瘍、脊髄腫瘍及び膣痙での関連唾液分泌過多からなる群から選択される。美容用途は、目じりの皺の治療もしくは低減またはＧＦＬ、渋面、顔面非対称から選択される。
【００８０】
本明細書で引用されたすべての文献は、その全開示内容及び本明細書で具体的に言及した開示内容に関して、本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用する。
以下、本発明の実施形態を示す。
（１）ＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５に対して特異的に結合するポリクローナルまたはモノクローナル抗体。
（２）前記抗体が、配列番号１（「Ｃ−ＮＥＩＤＴＱＮＲＱＩＤＲ」）または配列番号２（「ＮＥＩＤＴＱＮＲＱＩＤＲ」）に示されるアミノ酸配列を有するペプチドからなるエピトープに対して特異的に結合する、（１）に記載のポリクローナルまたはモノクローナル抗体。
（３）前記抗体が、２０１４年１２月１７日に、受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２６１で、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａβｅ  ７Ｂ，３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に寄託されたハイブリドーマ細胞株ｐＣＮＥＩ  ３２−７−１、３６１４−０００によって産生されたモノクローナル抗体に含まれていたＣＤＲ−Ｌ１（配列番号１５）、ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号１６）、ＣＤＲ−Ｌ３（配列番号１７）、ＣＤＲ−Ｈ１（配列番号１８）、ＣＤＲ−Ｈ２（配列番号１９）、及びＣＤＲ−Ｈ３（配列番号２０）からなる群から選択される相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちの少なくとも１つを含む、（１）または（２）に記載のポリクローナルまたはモノクローナル抗体。
（４）前記抗体が、２０１４年１２月１７日に、受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２６１で、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａβｅ  ７Ｂ，３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に寄託されたハイブリドーマ細胞株ｐＣＮＥＩ  ３２−７−１、３６１４−０００によって産生されたモノクローナル抗体に含まれていたＶＨ領域（配列番号２２）及び／またはＶＬ領域（配列番号２１）を含む、（１）〜（３）のいずれか一に記載のポリクローナルまたはモノクローナル抗体。
（５）細胞内でのＢｏＮＴ／Ｅの生物学的活性を直接的に決定する方法であって、
ａ）ＢｏＮＴ／Ｅ中毒の影響を受けやすい細胞を、ＢｏＮＴ／Ｅと一緒に、前記ＢｏＮＴ／Ｅが、その生物学的活性を示すことを許容する時間及び条件下で、インキュベートすることと、
ｂ）前記細胞を固定し、かつ任意に、界面活性剤で前記細胞を透過化することと、
ｃ）前記細胞を、切断されていない、及びＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５に対して特異的に結合する少なくとも第１の捕捉抗体、ならびにＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５に対して特異的に結合する少なくとも第２の捕捉抗体と、切断されていない、及びＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５に対する前記第１の捕捉抗体の結合、ならびにＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５に対する前記第２の捕捉抗体の結合を許容する条件下で、接触させることであって、前記第２の捕捉抗体が、（１）〜（４）のいずれか一に記載のポリクローナルまたはモノクローナル抗体である、接触させることと、
ｄ）前記細胞を、前記第１の捕捉抗体に対して特異的に結合する少なくとも第１の検出抗体と、前記第１の捕捉抗体に対する前記第１の検出抗体の結合を許容する条件下で接触させ、その結果、第１の検出複合体を形成し、かつ前記第２の捕捉抗体に対して特異的に結合する少なくとも第２の検出抗体と、前記第２の捕捉抗体に対する前記第２の検出抗体の結合を許容する条件下で接触させ、その結果、第２の検出複合体を形成することであって、前記第１の検出抗体が、前記第２の検出抗体とは異なる、形成することと、
ｅ）ステップｄ）の前記第１及び第２の検出複合体の量を決定することと、
ｆ）前記第２の検出複合体によって、前記細胞内でのＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５の量を算出し、
それによって、前記細胞内での前記ＢｏＮＴ／Ｅの生物学的活性を決定することと、
を含む、方法。
（６）前記ＢｏＮＴ／Ｅが、
ａ）配列番号１０、配列番号１２、または配列番号１４に示されるアミノ酸配列、及び
ｂ）配列番号１０、配列番号１２、または配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、（５）に記載の方法。
（７）前記細胞が、初代神経細胞、神経細胞に分化することができる神経芽腫細胞、Ｐ１９細胞などの腫瘍細胞、または人工多能性幹細胞（ＩＰＳ）由来ニューロンからなる群から選択される神経細胞または神経分化細胞である、（５）または（６）に記載の方法。
（８）前記細胞の固定が、メタノール、エタノール、アセトン、ホルムアルデヒド、またはこれらの混合物からなる群から選択される固化剤の添加によって行われる、（５）〜（７）のいずれか一に記載の方法。
（９）前記切断されていない、及びＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５に対して特異的に結合する前記第１の捕捉抗体が、ウサギポリクローナル抗ＳＮＡＰ−２５抗体Ｓ９６８４、ウサギポリクローナル抗ＳＮＡＰ２５抗体ＰＡ５−１９７０８（Ｐｉｅｒｃｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、ウサギモノクローナル抗ＳＮＡＰ−２５抗体ａｂ１０８９９０（Ａｂｃａｍ）、またはウサギポリクローナル抗ＳＮＡＰ−２５抗体ＰＡ５−１９７０１（Ｐｉｅｒｃｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）である、（５）〜（８）のいずれか一に記載の方法。
（１０）前記第１の検出抗体が、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）結合抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗体、または蛍光色素に結合した抗体である、（５）〜（９）のいずれか一に記載の方法。
（１１）前記第２の検出抗体が、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）結合抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗体、グルコースオキシダーゼ結合抗体、チロシナーゼ結合抗体、または、β−ガラクトシダーゼ抗体である、（５）〜（１０）のいずれか一に記載の方法。
（１２）前記ＨＲＰ基質が、Ａｍｐｌｅｘ  ＵｌｔｒａＲｅｄ、１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン（ＡＤＨＰ）、または３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸（ＨＰＰＡ）である、（５）〜（１１）のいずれか一に記載の方法。
（１３）前記ＡＰ基質が、６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルホスフェート（ＤｉＦＭＵＰ）などの４−メチルウンベリフェリルホスフェート誘導体、または、フルオレセインジホスフェート（ＦＤＰ）である、（５）〜（１２）のいずれか一に記載の方法。
（１４）（５）〜（１３）のいずれか一に記載の方法を実施するためのキットであって、
ａ）第１の捕捉抗体、（１）〜（４）のいずれか一に記載の抗体である第２の捕捉抗体、第１の検出抗体、及び第２の検出抗体の配合であって、（５）〜（１３）のいずれか一に記載の方法を実施することを許容する、配合と、
ｂ）ａ）に記載の前記配合によって決定された前記第１及び第２の検出複合体の量に基づいて、ＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５の量を算出するための手段と、
ｃ）前記方法を実施するための指示書と、
を含む、キット。
【実施例】
【００８１】
本願発明を、以下の実施例で例示するが、それをもってして、本願発明の範囲を限定的に解釈すべきではない。
【００８２】
例１：ＢｏＮＴ／Ｅで切断した基質ＳＮＡＰ−２５の開裂部位に対して特異的に結合するモノクローナル抗体の生成
ＢｏＮＴ／Ｅで切断した基質ＳＮＡＰ−２５の開裂部位に対して特異的に結合するマウスモノクローナル抗体を、標準的なハイブリドーマ技術を使用して生成した。この目的のために、Ｂａｌｂ／ｃマウス（雌、８週齢）を、ペプチド「Ｃ−ＮＥＩＤＴＱＮＲＱＩＤＲ−ＯＨ」（配列番号１）で免疫処置した。当該Ｎ末端システイン残基は、ＳＮＡＰ−２５  アミノ酸配列に由来するものではないが、当該ペプチドをキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に連結するために導入された。ハイブリドーマ細胞を、マウス脾臓細胞とドイツ微生物及び細胞培養物保存機関（ＤＳＭＺ  ＧｍｂＨ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ＡＣＣ１４６）から購入した骨髄腫細胞系ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ２／０）との融合によって得た、Ｈｅｍｍｅｒｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００６，５，４１も参照されたい。ＢｏＮＴ／Ｅで切断した基質ＳＮＡＰ−２５の開裂部位に対して特異的に結合する抗体を、ＥＬＩＳＡでスクリーニングした。得られたクローンは、ＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５に対する特異性及び親和性に関して選択された。陰性対照として、切断されていないＳＮＡＰ−２５２０６にクローンが結合しないことを試験した。その結果、ハイブリドーマｐＣＮＥＩ  ３２−７−１、３６１４−０００によって産生された当該マウスモノクローナル抗体は、ＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５に対して非常に特異的であり、ＥＬＩＳＡ及びウェスターンブロットにおいてＳＮＡＰ−２５２０６に対して検出可能な交差反応性を示さなかった。当該モノクローナル抗体を産生する当該ハイブリドーマ細胞株ｐＣＮＥＩ  ３２−７−１、３６１４−０００は、本出願人によって、ブダペスト条約に基づいて、２０１４年１２月１７日に、受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３２６１で、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ，Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａβｅ  ７Ｂ，３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に寄託された。このモノクローナル抗体のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１８、１９及び２０に示している。このモノクローナル抗体のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１５、１６及び１７に示している。このモノクローナル抗体のＶＨ領域のアミノ酸配列は、配列番号２２に示しており、また、このモノクローナル抗体のＶＬ領域のアミノ酸配列は、配列番号２１に示している。
【００８３】
例２：二重−蛍光−ＣＢ−ＢｏＮＴ／Ｅ活性ＥＬＩＳＡ
細胞の固定
１．培地／毒素溶液を除去する。氷冷メタノール（−２０℃）１００μｌ／ウェルを添加し、−２０℃で、２０分間、インキュベートする。
注記：その後のすべてのステップを室温で行う。
【００８４】
細胞固定後：
１．メタノール溶液を除去し、ＰＢＳ緩衝液１００μｌ／ウェルを添加する。長期保存（＞１日）のためには、ＰＢＳ緩衝液３００μｌ／ウェルを添加し、パラフィルムでプレートを封入するべきである。プレートは、冷蔵庫に保管すべきである。
２．ＰＢＳ緩衝液を除去し、ＰＢＳ緩衝液３００μｌ／ウェルで細胞を３回洗浄する。各ステップは、穏やかに振盪しながら１分間実施されるべきである。
３．ＰＢＳ緩衝液を除去し、失活緩衝液１００μｌ／ウェルを添加し、穏やかに振盪しながら２０分間インキュベートする。
４．失活緩衝液を除去し、ＰＢＳ緩衝液３００μｌ／ウェルで穏やかに振盪しながら細胞を３分間、１回、洗浄する。
５．ＰＢＳ緩衝液を除去し、ブロッキング緩衝液２００μｌ／ウェルを添加し、穏やかに振盪しながら１時間インキュベートする。
６．ブロッキング緩衝液を除去し、各ウェルに対して１００μｌの一次抗体混合物（抗体希釈物を含むブロッキング緩衝液）を加える。穏やかに振盪しながら、終夜（１６〜１８時間）、インキュベートする。当該細胞は、２つの一次抗体、ＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５及びＳＮＡＰ−２５を認識するポリクローナルウサギ抗体（標準化のためにＳＮＡＰ−２５の総量を決定するための抗体）を、同時にインキュベートする。
７．一次抗体混合物を除去し、ＰＢＳ緩衝液３００μｌで細胞を４回洗浄する。各ステップは、穏やかに振盪しながら３分間実施されるべきである。
９．ＰＢＳ緩衝液を除去し、各ウェルに対して１００μｌの二次抗体混合物：ＨＲＰが結合した抗マウス二次抗体及びＡＰが結合した抗ウサギ二次抗体（抗体希釈物を含むブロッキング緩衝液）を添加し、穏やかに振盪しながら２．５〜３時間インキュベートする。
１０．二次抗体混合物を除去し、ＨＥＰＥＳ緩衝液３００μｌ／ウェルで細胞を６回洗浄する。各洗浄ステップは、穏やかに振盪しながら３分間実施されるべきである。
１１．プレートからＨＥＰＥＳ緩衝液を除去し、各ウェルに７５μｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ用発蛍光性基質（ＨＲＰ基質）を添加する。穏やかに振盪しながら５０分間インキュベートする。直射光からプレートを保護する。
１２．各ウェルに７５μｌのアルカリホスファターゼ用発蛍光性基質（ＡＰ基質）を添加し、穏やかに振盪しながらさらに５０分間インキュベートする。直射光からプレートを保護する
１３．蛍光プレートリーダーで、プレートを読み込む。
５４０ｎｍで励起、６００ｎｍで放射。
３６０ｎｍで励起、４５０ｎｍで放射。
【００８５】
１５．算出
標準化のために、ＢｏＮＴ／Ｅで切断されたＳＮＡＰ−２５のＲＦＵ値（６００ｎｍでの蛍光）を、各ウェルのすべてのＳＮＡＰ−２５のＲＦＵ（４５０ｎｍ）に対して標準化を行う。線図において、ＲＦＵをさらに明確に図示するために、以下の式を使用して、すべての値に１０００の係数を掛ける：
【数１】
0006772138.tif 000003
その後、各標準または試料について得られたＲＦＵ値は平均される。
【００８６】
試薬調製
ＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭ）：
リン酸緩衝生理食塩水（Ｓｉｇｍａ、＃Ｐ５３６８）（ｐＨ７．４）
失活緩衝液：
０．６％Ｈ２Ｏ２を含む１０ｍＭ  ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）
ブロッキング緩衝液：
２％ＢＳＡを含む１０ｍＭ  ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）
ＨＥＰＥＳ緩衝液：
５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）
ＨＲＰ基質：
５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）
０．００７％Ｈ２Ｏ２
１５０μＭ  Ａｍｐｌｅｘ  ＵｌｔｒａＲｅｄ
ＡＰ基質：
２５ｍＭ  ジエタノールアミン（ｐＨ９．８）
２ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１００μＭ  ＤｉＦＭＵＰ
【受託番号】
【００８７】
DSM ACC3261
0006772138.tif 000004
【図１】
0006772138.tif 000005
【配列表】
0006772138000001.app