(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＰＶ誘発の高度子宮頸部前癌病変およびＨＰＶ誘発の侵食子宮頸部癌の改善された検出方法であって、
前記方法は、子宮頸部細胞におけるＦＡＭ１９Ａ４遺伝子のプロモーターのメチル化およびｈｓａ−ｍｉＲ１２４−２のプロモーターのメチル化の検出を含み、
前記ＦＡＭ１９Ａ４遺伝子のプロモーターのメチル化およびｈｓａ−ｍｉＲ１２４−２のプロモーターのメチル化は、ＨＰＶ誘発の高度子宮頸部前癌病変およびＨＰＶ誘発の侵食子宮頸部癌の有無を示し、
ここにおいて、メチル化されたＤＮＡの測定量が正常対照平均比率などの所定のカットオフ値を超えた場合に陽性と判断される、方法。
【請求項２】
前記ＨＰＶ誘発の侵食子宮頸部癌は、ハイリスク型ＨＰＶ誘発の侵食子宮頸部癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＦＡＭ１９Ａ４遺伝子のプロモーターのメチル化およびｈｓａ−ｍｉＲ１２４−２のプロモーターのメチル化は、進行ＣＩＮ３病変の有無を示す、請求項１または２に記載の前記方法。
【請求項４】
前記ＦＡＭ１９Ａ４遺伝子のプロモーターのメチル化は、配列番号９におけるＣｐＧに富む配列から検出される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＦＡＭ１９Ａ４遺伝子のプロモーターのメチル化は、同等な正常細胞と比較して、被検細胞におけるＦＡＭ１９Ａ４のＣｐＧに富むプロモーターの増加したメチル化である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
メチル化の検出において、ＢｓｓＨＩＩ、ＭｓｐＩ、ＮｏｔＩおよびＨｐａＩＩからなる群から選択されるメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼが用いられる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
メチル化の検出において、ＤＮＡの亜硫酸水素塩修飾に基づくメチル化特異的ＰＣＲが行われ、続いてＣｐＧに富む配列を標的にする特異的ＰＣＲ反応が行われる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
配列番号９で表される核酸配列ＦＡＭ１９Ａ４遺伝子に結合する核酸プローブまたはプライマーが使用される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸プローブまたはプライマーは、検出可能な標識を有する、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、癌の予防および医療診断の分野に関連し、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）により誘発された侵食子宮頸部癌および子宮頸部前癌病変のような侵食癌および高度前駆病変の分子診断マーカーに関する。特に、本発明は、ｈｒＨＰＶ誘発の侵襲性前癌病変およびｈｒＨＰＶ誘発の侵食癌のマーカーとして、ＰＲＤＭ１４のゲノム配列および調節配列とＦＡＭ１９Ａ４のゲノム配列および調節配列との使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
子宮頸部癌は、世界中の女性において、最もよく発生する癌の第３位であり、毎年約２５万人の癌死亡者を招く原因である。
【０００３】
子宮頸部扁平上皮癌の進行は、前癌病変により特徴付けられる。前癌病変は、子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）とも称され、それぞれ軽度の形成異常（ＣＩＮ１）、中度の形成異常（ＣＩＮ２）および重度の形成異常／上皮内癌（ＣＩＮ３）の１〜３に分級される。また、ＣＩＮ１は、低度扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ）と呼ばれ、ＣＩＮ２およびＣＩＮ３はともに、高度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）と呼ばれている。子宮頸腺癌の場合、上皮内腺癌（ＡＣＩＳ）は、公認された前駆病変である。原則として、これらの前癌病変は、可逆的である。しかしながら、病変がより深刻になれば、自然退縮の可能性がより低くなる。子宮頸部癌は、その前癌段階が剥離細胞診により検出することができ、必要に応じて、わずかな副作用で比較的容易に治療できるため、予防できると考えられる。子宮頸部検診は、高度な前癌であるが治療可能な前癌病変（すなわち、ＣＩＮ２、ＣＩＮ３および上皮内腺癌）を早期診断することを目的とし、侵食子宮頸部癌による死亡率を減少する。子宮頸部癌の発症を予防するために、一般的な医療行為は、形態学的に確認されたＣＩＮ２、ＣＩＮ３および上皮内腺癌を患うすべての女性に対する治療を含む。
【０００４】
過去１０年間において、子宮頸部発癌が高危険性のヒト乳頭腫ウイルス（ｈｒＨＰＶ）の感染により誘発されることは、確証された。それぞれｐ５３およびＲｂ腫瘍抑制経路を妨害するウイルス発癌遺伝子Ｅ６およびＥ７の発現が腫瘍形成の発症および悪性表現型の維持の両方に必須であることは、証明された。したがって、ｈｒＨＰＶの検出は、魅力的な一次検診ツールとして現れた。しかしながら、ｈｒＨＰＶ感染細胞から侵食癌細胞に進行するためには、発癌の多段階に一致して、宿主細胞ゲノムにおける追加的改変が必要である。高危険性のＨＰＶに感染された女性のうち、わずか一部は、高度子宮頸部前癌病変（ＣＩＮ２／３）に進行し、治療しない場合に子宮頸部癌に進行する。子宮頸部前癌病変を患うほとんどの女性に、病変が自然に退縮する。集団検診に参加した女性のうち、約５〜６％のｈｒＨＰＶ検査が陽性である。そのうち、最大２０％（参加した女性の１％）がＣＩＮ２／３以上の病変をもつ。したがって、ｈｒＨＰＶ検査陽性の女性をＣＩＮ２／３および上皮内腺癌以上の病変危険性に層別化することを可能にする子宮頸部癌検査にマーカーを適用しなければ、ｈｒＨＰＶ検査による一次検診は、女性の間に、多くの冗長なフォローアップ手順および不必要な不安を引き起こす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
主な課題は、ＨＰＶ検査陽性の女性の百分率を臨床的に意味のある病変をもつ女性の百分率に減少することである。１つの方法は、ｈｒＨＰＶ陽性の女性に対し、細胞診を二次検査（いわゆるトリアージ）として行うことである。細胞診を行っても、ｈｒＨＰＶ陽性の女性のうち、細胞診が正常である女性は、まだ多く（集団検診を受ける女性の３．５％）残される。そのうちの１０％は、ＣＩＮ３以上の病変をもっているまたは患っている。また、細胞診は、自宅で自己採取した子宮頸部膣頸の標本に適用できない。その理由は、自宅で自己サンプリングした頸膣標本が子宮頸部の細胞学的状態を代表するものではないからである。別の方法は、ＨＰＶ１６／１８の遺伝子型判定を使用することである。しかしながら、この方法は、より少なかったにもかかわらず、非ＨＰＶ１６／１８型と判定されたが、ＣＩＮ２／３および上皮内腺癌以上の病変危険性をもつ女性がまだ残される。したがって、ｈｒＨＰＶ陽性の女性を、ＣＩＮ２／３以上の病変および上皮内腺癌をもつ人間と、もたない人間とに層別化する補足的なトリアージツールまたは代替的なトリアージツールが必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
発明者らは、ＨＰＶ誘発の高度前癌病変およびＨＰＶ誘発の侵食癌を検出するための方法を発見した。この方法は、細胞におけるＰＲＤＭ１４および／またはＦＡＭ１９Ａ４遺伝子の過剰メチル化の検出を含む。過剰メチル化は、ＨＰＶ誘発の侵襲性前駆病変およびＨＰＶ誘発の侵食癌の有無を示す。好ましくは、このような方法において、ＨＰＶ誘発の高度前癌病変またはＨＰＶ誘発の侵食癌は、高度子宮頸部前癌病変または侵食子宮頸部癌であり、より好ましくは、ＨＰＶ誘発の高危険性の侵食癌である。
【０００７】
本発明の好ましい実施形態において、過剰メチル化は、図１および図２に示されたＣｐＧに富む配列から検出される。
【０００８】
また、本発明は、上記に定義された方法に関する。この方法において、過剰メチル化は、同等な正常細胞と比較して、被検細胞におけるＰＲＤＭ１４および／またはＦＡＭ１９Ａ４のＣｐＧに富むプロモーターおよび／またはゲノム配列の増加したメチル化である。
【０００９】
本発明の好ましい実施形態において、（過剰）メチル化の検出は、ＢｓｓＨＩＩ、ＭｓｐＩ、ＮｏｔＩおよびＨｐａＩＩからなる群から選択されるメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼを用いて行われる。本発明の代替的な好ましい実施形態において、（過剰）メチル化の検出は、ＤＮＡの重亜硫酸塩水素塩修飾に基づくメチル化特異的ＰＣＲ、続いてＣｐＧに富む配列を標的にする特異的ＰＣＲ反応を介して行われる。この方法において、好ましくは、図１または図２に示された核酸に結合する核酸プローブまたはプライマーが使用され、より好ましくは、核酸プローブまたはプライマーは、検出可能なランドマークを有する。
【００１０】
本発明の別の実施形態において、核酸プローブは、ａ）苛酷な条件の下で、図１に記載の配列ＰＲＤＭ１４または図２に記載の配列ＦＡＭ１９Ａ４とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列と、ｂ）上記ａ）のポリヌクレオチドと少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチドと、ｃ）上記ａ）のポリヌクレオチドの相補的ポリヌクレオチドと、ｄ）上記ａ）またはｂ）のヌクレオチドの少なくとも１５個の塩基を含むポリヌクレオチドとからなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する。
【００１１】
本発明の方法において、さらに好ましくは、ＰＲＤＭ１４遺伝子およびＦＡＭ１９Ａ４遺伝子の両方のメチル化は、決定される。また、好ましくは、ＦＡＭ１９Ａ４およびｈｓａ−ｍｉＲ−１２４−２のメチル化は、合わせて検出される。
【００１２】
また、本発明の一部は、ＨＰＶ誘発の高度前癌病変またはＨＰＶ誘発の侵食癌を検出するための分子診断マーカーとして、ＰＲＤＭ１４および／またはＦＡＭ１９Ａ４１４の使用に係る。好ましくは、このような使用において、マーカーのメチル化は、病変または癌の発生を予兆する。
【００１３】
また、本発明は、ＨＰＶ誘発の高度前癌病変またはＨＰＶ誘発の侵食癌を検出するための方法に使用される部品キットを含む。このキットは、ＰＲＤＭ１４および／またはＦＡＭ１９Ａ４のメチル化を検出するための手段を備え、この手段は、図１のＰＲＤＭ１４ヌクレオチド配列および／または図２のＦＡＭ１９Ａ４ヌクレオチド配列に特異的なプローブおよび／またはプライマーを含む。このキットは、ＨＰＶ感染を検出するための手段を備え、この手段は、ＨＰＶに特異的なプローブおよびプライマーを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１−１】ＰＲＤＭ１４の５′調節領域と、コード配列と、第１イントロン配列および転写された３′非コード配列のＣｐＧに富む部分とを示す図である。転写の開始は、太字で示され、コード配列は、大文字で示される。ＣｐＧに富む配列をともに含む１０００ｂｐのプロモーター配列および第１イントロンは、小文字で示される。
【図１−２】ＰＲＤＭ１４の５′調節領域と、コード配列と、第１イントロン配列および転写された３′非コード配列のＣｐＧに富む部分とを示す図である。転写の開始は、太字で示され、コード配列は、大文字で示される。ＣｐＧに富む配列をともに含む１０００ｂｐのプロモーター配列および第１イントロンは、小文字で示される。
【図２−１】ＦＡＭ１９Ａ４の５′調節領域と、コード配列と、第１イントロン配列および転写された３′非コード配列のＣｐＧに富む部分とを示す図である。転写の開始は、太字で示され、コード配列は、大文字で示される。ＣｐＧに富む配列をともに含む１０００ｂｐのプロモーター配列および第１イントロンは、小文字で示される。
【図２−２】ＦＡＭ１９Ａ４の５′調節領域と、コード配列と、第１イントロン配列および転写された３′非コード配列のＣｐＧに富む部分とを示す図である。転写の開始は、太字で示され、コード配列は、大文字で示される。ＣｐＧに富む配列をともに含む１０００ｂｐのプロモーター配列および第１イントロンは、小文字で示される。
【図３】ＤＮＡメチル化阻害剤（ＤＡＣ）を用いて処理することによってアップレギュレートすることができるＳｉＨａ細胞子宮頸部癌細胞におけるＰＲＤＭ１４のｍＲＮＡ発現を示す図である。ＳｉＨａ細胞子宮頸部癌細胞の処理は、メチル化阻害剤２′−デオキシ−５′アザシチジン（５′−ａｚａまたはＤＡＣ）を用いて、０．２μΜおよび５μΜ濃度で行った。他の処理は、ＰＢＳおよびエタノール（ＥｔＯＨ）であった。すべての処理は、正副二通に行われた。対照は、ヒト参照ＲＮＡおよびＲＴ無し対照（ｃＤＮＡ反応混合物に逆転写酵素を添加していない）である。
【図４】ＳｉＨａ細胞、ＣａＳｋｉ細胞および９３ＶＵ１４７Ｔ細胞におけるＰＲＤＭ１４の異所性発現の効果を示す図である。（Ａ）空白ベクター細胞と比較して、形質転換してから２４時間、４８時間および７２時間後、ＰＲＤＭ１４による形質転換された細胞におけるＧＦＰ＋細胞の低下百分率。（Ｂ）アネキシンＶおよびＰＩを用いて二重標識された細胞のフローサイトメトリー分析は、ＰＲＤＭ１４発現細胞集団において、初期アポトーシス細胞（アネキシンＶ＋／ＰＩ−）および後期アポトーシス細胞（アネキシンＶ＋／ＰＩ＋）の両方が増加していることを示している。
【図５】定量的メチル化特異的ＰＣＲを用いて、子宮頸部組織標本において測定したＰＲＤＭ１４およびＦＡＭ１９Ａ４のレベルの散布図である。ｙ軸は、メチル化されたＤＮＡのレベルを示し、ｘ軸は、各々の病期および組織型に分類されたサンプルを示している。ＰＲＤＭ１４およびＦＡＭ１９Ａ４のメチル化レベルは、疾患段階とともに増加し、実質的に全てのＳＣＣおよびＡｄＣＡにおいて検出される。疾患種類の間のメチル化レベルにおける有意差が示されている。
【図６】ｈｒＨＰＶ陽性頭頸部組織標本（ＨＮＳＣＣ：頭頸部ＳＣＣ）におけるＰＲＤＭ１４およびＦＡＭ１９Ａ４のメチル化レベルを示す図である。対照と比較して、メチル化レベルは、癌において有意に増加している。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
「ＨＰＶ誘発の侵食癌」という用語は、高危険性のＨＰＶにより誘発され、周辺組織を侵食する癌を指す。このような癌は、たとえば子宮頸部、口腔、中咽頭、肛門、直腸、陰茎、外陰部、膣などの関連臓器におけるすべてのＨＰＶ誘発癌組織型、すなわち、扁平上皮癌、腺癌、腺扁平上皮癌および神経内分泌癌、特に頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、子宮頸部扁平上皮細胞癌および子宮頸腺癌を含む。
【００１６】
「侵食子宮頸部癌」という用語は、周辺組織を侵食する子宮頸部癌を指す。このような癌は、すべての癌組織型、すなわち、扁平上皮癌、腺癌、腺扁平上皮癌および神経内分泌癌を含む。
【００１７】
「前癌病変」および「前駆病変」という用語は、細胞が癌に進行する多段階のうち、癌に進行する可能性が非常に高い段階を指す。病理学者は、伝統的な形態学を用いて、患者個体において、このような病変が進行するまたは退行するかを予測することができない。本発明は、侵食癌または高度前駆病変を予測できる方法に関する。
【００１８】
「高度子宮頸部前癌病変」という用語は、細胞が子宮頸部癌に進行する多段階のうち、子宮頸部癌に進行する可能性が非常に高い段階を指す。「特異的にハイブリダイズすることができる」という表現は、１つの核酸配列が相補的核酸配列と特異的な塩基対を形成することによって、相補的核酸配列に結合し、核酸二重鎖を形成することができることを指す。
【００１９】
「進行ＣＩＮ３病変」という用語は、はるかに前からｈｒＨＰＶにより感染され、著しく多いＤＮＡコピー数変化をもたらした癌組織型のＣＩＮ３病変を指す。したがって、このＣＩＮ３病変というサブ種類は、癌になる危険性が高くなった高次病期を表す。
【００２０】
「補足的配列」または「相補的配列」は、１つのヌクレオチド配列がWatson-Crick塩基対規則に従って、水素結合により別のヌクレオチド配列と二重鎖を形成することを意味する。たとえば、５′−ＡＡＧＧＣＴ−３′の相補的塩基配列は、３′−ＴＴＣＣＧＡ−５′である。
【００２１】
「苛酷なハイブリッド形成条件」という用語は、ハイブリッド体の安定性を影響するハイブリッド形成条件、たとえば、温度、塩濃度、ｐＨ、ホルムアミド濃度などを意味する。これらの条件は、プライマーまたはプローブと標的核酸配列との特異的な結合を最大にし且つ非特異的な結合を最小にするように、実験的に最適化される。使用された用語は、プローブまたはプライマーが、他の配列よりも、より大きな検出可能なレベル（たとえば、バックグラウンドよりも少なくとも２倍）で標的配列とハイブリダイズする条件の言及を含む。苛酷な条件は、配列に依存しており、異なる環境において異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、苛酷な条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおいて、特定配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。このＴｍは、（規定のイオン強度およびｐＨの下で）相補的標的配列の５０％が完全にマッチしたプローブまたはプライマーとハイブリダイズする温度である。一般的に、苛酷な条件は、塩濃度がｐＨ７．０〜８．３の下で、約１．０ＭのＮａイオン濃度未満、典型的には約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（または他の塩）であり、温度が短いプローブまたはプライマー（たとえば１０〜５０ヌクレオチド）の場合少なくとも約３０℃、長いプローブまたはプライマー（たとえば５０ヌクレオチドを超える）の場合少なくとも約６０℃であるという条件である。また、苛酷な条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成することができる。例示的な低い苛酷な条件または「苛酷さを低減した条件」は、３７℃で３０％のホルムアミド緩衝液、１ＭのＮａＣｌおよび１％のＳＤＳの中でハイブリッドを形成し、４０℃で２倍のＳＳＣ中で洗浄することを含む。例示的な高い苛酷な条件は、３７℃で５０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌおよび１％ＳＤＳの中でハイブリッドを形成し、６０℃で０．１倍のＳＳＣ中で洗浄することを含む。ハイブリッド形成の手順は、当技術分野で周知であり、たとえば、Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., 1994に記載されている。
【００２２】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、リン結合（たとえば、ホスホジエステル、アルキルホスフェートまたはアリールホスフェート、ホスホロチオエート）または非リン結合（たとえば、ペプチド、スルファメートおよびその他のもの）によって結合された短配列のヌクレオチドモノマー（通常、６〜１００ヌクレオチドを含む）を指す。オリゴヌクレオチドは、修飾された塩基（たとえば、５−メチルシトシン）と修飾された糖基（たとえば、２′−Ｏ−メチルリボシル、２′−Ｏ−メトキシエチルリボシル、２′−フルオロリボシル、および２′−アミノリボシルなど）とを有する修飾ヌクレオチドを含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、円形状、分岐形状または直線形状を有する二本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ若しくは二本鎖ＲＮＡまたは一本鎖ＲＮＡからなる天然存在の分子または合成分子であってもよく、必要に応じて安定な二次構造（たとえば、ステム−ループ構造またはループ−ステム−ループ構造）を形成することができるドメインを含んでもよい。
【００２３】
本明細書に使用された「プライマー」という用語は、核酸鎖と相補的であるプライマー伸長産物の合成を誘発する適切な条件下で、すなわち、ヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼなどの重合剤の存在下かつ適切な温度およびｐＨで、ＤＮＡポリメラーゼをＤＮＡ合成の開始点として付着させることを可能にする増幅標的物にアニーリングすることができるオリゴヌクレオチドを指す。増幅時に最大の効率を得るために、（増幅される）プライマーは、好ましくは一本鎖である。好ましくは、このプライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。このプライマーは、重合剤の存在下で伸長産物の合成をプライミングするのに十分な長さを有しなければならない。プライマーの正確な長さは、温度およびプライマー源を含む多くの因子に依存するだろう。本明細書に使用された「一対の双方向性プライマー」は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅などのＤＮＡ増幅技術分野によく使用されたもののように、１つの順方向プライマーおよび１つの逆方向プライマーを指す。
【００２４】
「プローブ」という用語は、標的の核酸配列分析物またはまたはそのｃＤＮＡ誘発体に存在する相補的配列を認識し、その相補的配列と水素結合により二重鎖を形成する一本鎖オリゴヌクレオチド配列を指す。
【００２５】
ＤＮＡメチル化は、高等生物において正常な発育に重要である生化学過程である。ＤＮＡメチル化は、シトシンのピリミジン環の５位にまたはアデニンのプリン環の６位Nにメチル基を追加することを含む。シトシンの５位のＤＮＡメチル化は、遺伝子発現を低下させる特定の効果を有し、調査したすべての脊椎動物に見られている。成体の体細胞組織において、ＤＮＡメチル化は、一般的に、ＣｐＧジヌクレオチドの前後に発生する。
【００２６】
ゲノム全域のＤＮＡメチル化スクリーニングを使用することによって分かったのは、遺伝子コード化ＰＲドメインジンクフィンガータンパク質１４（ＰＲＤＭ１４とも称される。遺伝子バンク受入番号：ＮＭ＿０２４５０４．２）、配列類似性を有する遺伝子コード化ファミリ１９（ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ））、およびメンバＡ４（ＦＡＭ１９Ａ４とも呼ばれる。遺伝子バンク受入番号：ＮＭ＿００１００５５２７．２）が、ウイルス性発癌遺伝子（ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７）による発現後、主要ケラチン合成細胞においてＤＮＡメチル化の標的とされること、およびＰＲＤＭ１４およびＦＡＭ１９Ａ４プロモーターのメチル化がｈｒＨＰＶ誘発の発癌の重要因子であることである。よって、ＰＲＤＭ１４およびＦＡＭ１９Ａ４のゲノム配列および調節配列は、侵食子宮頸部癌および高度前駆病変を診断する貴重なマーカーとなる。さらに、本発明は、非子宮頸部ｈｒＨＰＶ関連の侵食癌および高度前駆病変を診断するのに好適である。
【００２７】
子宮頸部癌は、殆ど例外なくヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）の感染に関連している。ヒト乳頭腫ウイルスは、ＤＮＡ配列における変異によって同定されたように、１００種類を超えるウイルスの群を構成する。さまざまなＨＰＶは、種々の皮膚疾患または粘膜疾患を引き起こす。ＨＰＶは、感染細胞において悪性変化を誘発する能力に基づき、低危険性種および高危険性種に広く分類される。１、２、４、６、１１、１３および３２などの低危険性種のＨＰＶは、主に、良性病変または尋常性疣贅に関連し、１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６および６８などの高危険性種のＨＰＶは、主に、前癌性上皮病変および悪性上皮病変に関連している。ＨＰＶ−６およびＨＰＶ−１１などの低危険性種のＨＰＶによって引き起こされた疣贅に比べて、高危険性のＨＰＶによって引き起こされた腫瘍は、通常平坦で、ほぼ無形である。現在分かったのは、高危険性種のＨＰＶが子宮頸部侵食癌を引き起こすとともに、肛門性器部領域および／または頭頸部領域の他の箇所に侵食癌を引き起こすということである。したがって、本発明は、ＰＲＤＭ１４および／またはＦＡＭ１９Ａ４に関連する侵食子宮頸部癌およびその前駆病変段階ではなく、ＨＰＶ特に高危険性種のＨＰＶによって誘発された他の侵食癌およびその前駆段階を検出するのに好適である。したがって、本発明は、任意のＨＰＶ誘発の高度前癌病変または侵食癌の危険性を評価するための方法を提供する。
【００２８】
本発明の文脈に適したＨＰＶ誘発の前駆病変および侵食癌は、子宮頸部前癌病変および侵食子宮頸部癌ではなく、口腔、中咽頭、肛門、直腸、陰茎、外陰部、膣など他の組織においてＨＰＶ誘発の高危険性前駆病変および侵食癌を含む。
【００２９】
被検細胞は、ＰＲＤＭ１４および／またはＦＡＭ１９Ａ４に関連されたＨＰＶ誘発の侵襲性前駆病変またはＨＰＶ誘発の侵食癌の存在が検出される（前）癌細胞、増殖性子宮頸部細胞、または他の任意の細胞であってもよい。
【００３０】
６４ｋＤａの核内たんぱく質をコード化するＰＲＤＭ１４遺伝子は、もともと、ヒト胚性幹細胞の維持に重要な調節因子として同定されており、自己再生および分化に関与している（Chiaら, Nature 2010, 468: 316-320）。ＰＲＤＭ１４は、ヒトリンパ系腫瘍（Dettmanら, Oncogene 2011, 30: 2859-73）および乳癌（Nishikawaら, Cancer Res 2007, 67: 9649-57）において発癌性たんぱく質として機能すると記載されている。また、ＰＲＤＭ１４プロモーターのメチル化は、ヒト乳癌から検出された（Nishikawaら, Cancer Res 2007, 67: 9649-57）。１６ｋＤａの分泌たんぱく質をコード化するＦＡＭ１９Ａ４遺伝子は、もともと、ヒトｃＤＮＡライブラリ（Strausbergら, PNAS, 2002, 99(26): 16899-903）の配列決定により同定された。この遺伝子は、小さな分泌たんぱく質をコード化する５つの高度な相同性を有する遺伝子から構成されたＴＡＦＡファミリの一員である。これらのたんぱく質は、固定位置にシステイン保存残基を含み、ＣＣケモカインファミリの一員であるＭＩＰ−１αとは遠縁である。ＴＡＦＡたんぱく質は、主に脳の特定の領域で発現され、免疫系細胞および神経細胞の調節因子として機能する脳特異的ケモカインまたはニューロカインとして機能する（Tom Tangら, Genomics 2004, 83(4): 727-34）と仮定されている。この遺伝子について、選択的にスプライシング転写物の変異体は、観察された。癌との関係は、まだ記載されていない。
【００３１】
本発明者らは、ＰＲＤＭ１４およびＦＡＭ１９Ａ４両方の遺伝子のプロモーターおよび第１イントロンなどのＣｐＧに富む領域のメチル化が、扁平上皮癌組織型、腺扁平上皮癌組織型、腺癌組織型および神経内分泌癌組織型ならびにそれらの高度前駆病変の両方の子宮頸部癌においてよくある現象であることを実証した。インビトロ研究では、子宮頸部癌の進行に機能的に関与するＰＲＤＭ１４の不活性化、たとえば、ＨＰＶ１６を含む子宮頸癌細胞株ＳｉＨａおよびＣａＳｋｉの細胞におけるＰＲＤＭ１４の過剰発現は、アポトーシスを誘発することを明らかにした。このことは、ＰＲＤＭ１４が子宮頸部癌において腫瘍抑制遺伝子として機能することを示しており、以前の記載によりこのたんぱく質がリンパ腫および乳癌細胞において発癌性機能を有するという事実（Dettmanら, Oncogene 2011, 30: 2859-73; Nishikawaら, Cancer Res 2007, 67:9649-57）を考慮すれば、非常に注目すべきである。ＦＡＭ１９Ａ４の正確な機能は、まだ定義されていない。
【００３２】
最も興味深いことに、本発明者らは、ＰＲＤＭ１４およびＦＡＭ１９Ａ４プロモーター（およびイントロン配列）の過剰メチル化は、子宮頸部の掻き取りサンプルから検出することができ、この特徴を用いて、高度ＣＩＮ病変または侵食癌の有無を予測することができることを示した。また、本発明者らは、ＰＲＤＭ１４およびＦＡＭ１９Ａ４プロモーターのメチル化は、自己サンプリングによって収集した頸膣標本から検出することができ、潜在的な高度ＣＩＮ病変または侵食子宮頸部癌の有無に関連していることを見出した。
【００３３】
したがって、本発明は、ＨＰＶ誘発の高度前癌病変およびＨＰＶ誘発の侵食癌を検出するための方法を提供する。この方法は、細胞におけるＰＲＤＭ１４および／またはＦＡＭ１９Ａ４遺伝子の過剰メチル化の検出を含む。過剰メチル化は、ＨＰＶ誘発の侵襲性前駆病変およびＨＰＶ誘発の侵食癌の有無を示す。
【００３４】
被検体の被検細胞は、ＨＰＶに関連された前駆病変または癌を検出する予定の子宮頸部細胞などの粘膜細胞サンプルからの細胞ならびに口腔、咽頭、陰茎、外陰部、肛門、直腸および他の組織からの細胞を含んでもよい。これらのサンプルのすべては、本発明の方法において、サンプルとして使用することができる。好ましくは、患者の細胞のサンプルは、被検細胞として子宮頸部細胞を含む。この子宮頸部細胞は、たとえば、組織学的サンプルまたは細胞学的サンプルとして提供されてもよい。細胞学的標本は、従来の子宮頸部塗抹標本および子宮頸部の薄片標本、ならびに自己サンプリングによって収集した頸膣標本または膣標本を含む。
【００３５】
本発明の方法は、高危険性のＨＰＶによって誘発され、ＰＲＤＭ１４および／またはＦＡＭ１９Ａ４に関連した高度前癌病変および侵食癌の検出に特に好適である。ＨＰＶ誘発の侵襲性高度前癌病変およびＨＰＶ誘発の侵食癌を検出する方法は、ＰＲＤＭ１４および／またはＦＡＭ１９Ａ４プロモーターおよび第１イントロンの測定を含んでもよい。
【００３６】
図１は、ＰＲＤＭ１４遺伝子のＣｐＧに富むプロモーター領域およびＣｐＧに富む第１イントロン配列ならびにコード配列および転写された３′非コード配列を示している。
【００３７】
図２は、ＦＡＭ１９Ａ４遺伝子のＣｐＧに富むプロモーター領域およびＣｐＧに富む第１イントロン配列の一部ならびにコード配列および転写された３′非コード配列を示している。
【００３８】
メチル化の検出は、ＤＮＡのような核酸上で行われる。使用される試薬は、典型的には、核酸（ＤＮＡ）プローブまたは（ＰＣＲ）プライマーまたは制限エンドヌクレアーゼであり、好ましくは、被検細胞ＤＮＡ上にメチル基の有無を検出するためのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼである。
【００３９】
被検細胞の成分は、上皮内から直接検出されてもよく、試薬と接触させる前に、当業者に公知の一般的な方法(たとえば、"Current Protocols in Molecular Biology", Ausubelら, 1995、4th edition, John Wiley and Sons; "A Laboratory Guide to RNA: Isolation, analysis and synthesis", Krieg (ed.), 1996, Wiley-Liss; "Molecular Cloning: A laboratory manual", J. Sambrook, E.F. Fritsch. 1989. Vol 3, 2nd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Pressを参照)によって、他の細胞成分から単離されてもよい。
【００４０】
本発明は、ＰＲＤＭ１４が腫瘍抑制遺伝子として機能することおよびＰＲＤＭ１４転写レベルの低下がＤＮＡメチル化の抑制によってアップレギュレートされ得ることを示しているため、ＰＲＤＭ１４遺伝子が過剰メチル化されたか否かを直接決定することが望ましい。同様に、ＦＡＭ１９Ａ４遺伝子が過剰メチル化されたか否かを直接決定することも望ましい。具体的には、主に遺伝子の５′調節領域に位置し、「ＣｐＧ島」と呼ばれるシトシンに富む領域は、通常メチル化されない。「過剰メチル化」という用語は、ＰＲＤＭ１４またはＦＡＭ１９Ａ４遺伝子配列の通常メチル化されていない位置に存在するシトシンのメチル化（たとえば、ＰＲＤＭ１４またはＦＡＭ１９Ａ４プロモーター、第１エクソン配列および第１イントロン配列（各々図１および図２を参照））を含む。ＤＮＡメチル化は、科学的研究に現在使用されている以下のような分析手法によって、検出することができる。
【００４１】
−  メチル化特異的ＰＣＲ法（ＭＳＰ）。この手法は、ＤＮＡと重亜硫酸塩水素ナトリウムとの化学反応に基づき、ＣｐＧのジヌクレオチド内のメチル化されていないシトシンをウラシルまたはＵｐＧに変換し、続いて従来のＰＣＲを行う。しかしながら、この過程において、メチル化されたシトシンが変換されず、メチル化されたかまたはメチル化されていないメチル化状態を決定することを可能にするために、プライマーが目的のＣｐＧ部位に重なるように設計されている。
【００４２】
−  ＢＳ−Ｓｅｑとも知られている全ゲノム重亜硫酸塩水素塩シークエンシング。この手法は、高スループットのゲノム全域のＤＮＡメチル化解析である。この手法は、前述したゲノムＤＮＡの重亜硫酸塩水素ナトリウム変換に基づき、続いて、次世代シークエンシングプラットフォームを用いて、変換されたＤＮＡの配列を決定する。その後、得られた配列は、参照ゲノムに再整列され、非メチル化されていないシトシンをウラシルに変換することにより生じた不一致に基づき、ＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を決定する。
【００４３】
−  ＨＥＬＰ分析。この手法は、メチル化されたＣｐＧのＤＮＡ部位およびメチル化されていないＣｐＧのＤＮＡ部位を認識して切断する制限酵素の分化能力に基づいている。
【００４４】
−  ＣｈＩＰオンチップ分析。この手法は、商業的に調製された抗体がＭｅＣＰ２のようなＤＮＡメチル化に関連するたんぱく質と結合する能力に基づいている。
【００４５】
−  制限ランドマークゲノム走査法。この手法は、制限酵素がメチル化されたＣｐＧ部位およびメチル化されていないＣｐＧ部位に対する認識の分化能力に基づいており、複雑であるため、現在めったに使われない。この手法は、内容的にＨＥＬＰ分析と類似する。
【００４６】
−  メチル化ＤＮＡ免疫沈降法（ＭｅＤＩＰ）。この手法は、クロマチン免疫沈降法に類似し、メチル化されたＤＮＡ断片を単離して、ＤＮＡマイクロアレイ（ＭｅＤＩＰチップ）またはＤＮＡシークエンシング（ＭｅＤＩＰ配列決定法）のようなＤＮＡ検出方法に入力するために使用される。
【００４７】
−  重亜硫酸塩処理ＤＮＡのピロシーケンス。この手法は、通常は順方向プライマーであり、ビオチン化により逆方向プライマーになるプライマーを用いて、選択の遺伝子をＰＣＲすることによって、単位複製配列（amplicon）を決定する方法である。その後、ピロシーケンス操作者は、ＤＮＡを変性し、ユーザによって与えられた配列に従って、一度に１つの塩基を混合物に添加することによって、サンプルを解析する。不一致がある場合、不一致が存在するＤＮＡおよびその百分率を記録し、提示する。これによって、ユーザに各ＣｐＧ島のメチル化百分率を提供する。
【００４８】
−  ＤＮＡのアデニンメチルトランスフェラーゼの活性を分析するための分子光分解手法。この手法は、制限酵素ＤｐｎＩの特異度に依存して、蛍光体および消光剤により標識されたオリゴヌクレオチド内のＧＡＴＣ部位を完全にメチル化（アデニンメチル化）する。アデニンメチルトランスフェラーゼは、オリゴヌクレオチドをメチル化することによって、オリゴヌクレオチドをＤｐｎＩの基質に形成する。ＤｐｎＩによるオリゴヌクレオチドの切断は、蛍光性を増加する。
【００４９】
−  メチル感受性サザンブロット法。この手法は、サザンブロット技術を用いて、制限消化を使用し、メチル化における遺伝子特異的な違いをプローブするが、ＨＥＬＰと類似している。この技術は、プローブの結合部位の近傍に局所的なメチル化を評価するために使用される。
【００５０】
好ましくは、過剰メチル化は、ＰＲＤＭ１４またはＦＡＭ１９Ａ４ポリヌクレオチド（遺伝子）の制限エンドヌクレアーゼ処理およびサザンブロット分析によって検出されることができる。ＣＧを認識部位の一部として含み、Ｃがメチル化されると抑制される任意の制限エンドヌクレアーゼを利用することができる。エンドヌクレアーゼの例としては、単独でまたは組合わせで使用されるＢｓｓＨＩＩ、ＭｓｐＩ、ＮｏｔＩまたはＨｐａＩＩが挙げられる。他のメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼは、当業者に公知であろう。
【００５１】
メチル化された配列を検査するための別の好ましい手段は、ＤＮＡの重亜硫酸塩水素塩修飾およびその後ＣｐＧに富む配列を標的とする特定のＰＣＲ反応に基づくメチル化特異的ＰＣＲである。
【００５２】
本発明の目的を達成するために、ＰＲＤＭ１４またはＦＡＭ１９Ａ４に特異的な核酸プローブを用いて、生物学的液体または組織におけるＰＲＤＭ１４またはＦＡＭ１９Ａ４ポリヌクレオチドの有無を（核酸プローブを用いて）検出することができる。ＰＲＤＭ１４またはＦＡＭ１９Ａ４配列中の任意のコード配列領域および調節配列領域に基づくオリゴヌクレオチドプライマーは、たとえばＰＣＲ法によって、ＤＮＡを増幅するために有用である。
【００５３】
ＰＣＲプライマー、核酸プローブまたは制限エンドヌクレアーゼを使用する場合に、（それぞれ図１および２に明記された）ＰＲＤＭ１４またはＦＡＭ１９Ａ４配列の５′調節領域、第１イントロン配列およびコード配列は、解析される。
【００５４】
検出可能な量のＰＲＤＭ１４またはＦＡＭ１９Ａ４ポリヌクレオチドを含有する任意標本を使用することができる。本発明の方法に従った検出用の好ましいサンプルは、（子宮頸部または膣）からの掻取り標本、頸膣の洗浄または掃除標本および／または（頸部）の生検標本などを含む。被検対象が任意の哺乳動物であってもよいが、好ましくは、被検対象がヒトである。
【００５５】
疾患検出のための診断方法は、検査用のサンプルを提供する方法を含む。サンプルは、子宮頸部または他の組織からの細胞調製物を含む。好ましくは、このようなサンプルは、塗抹標本または他の細胞学的サンプルとして提供される。
【００５６】
哺乳類、好ましくはヒトから得られた細胞サンプルまたは組織サンプルは、サンプルに含有された被検細胞の細胞ＤＮＡと、ＰＲＤＭ１４またはＦＡＭ１９Ａ４を検出し且つ同等な正常細胞に比べてＰＲＤＭ１４またはＦＡＭ１９Ａ４遺伝子のメチル化における変化を検出する試薬との接触を可能にするために、事前に適切に処理される。個々の細胞の観察を可能にするために、サンプルを適切な支持体に載せることができる。周知の支持体材料の例は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネートまたはポリウレタンを含み、サンプルの細胞接着および固定を改善するために、必要に応じて、これらの材料にポリ−Ｌ−リジンまたはシランからなる層を設ける。子宮頸部塗抹標本または生検標本は、たとえば、当業者に公知な方法によって、パパニコロー（Ｐａｐ）検査または任意の適切な修飾のために用意されてもよく、試薬を標的成分に適切に接触させることを可能にする手順によって固定されてもよい。本発明の特定の実施形態において、細胞学的標本は、従来の塗抹標本、子宮頸部細胞の薄片標本、液体系の細胞学的サンプル、または当業者に知られている他の種類の標本として、提供される。保存が必要な場合に、通常の手順によって、緩衝ホルマリンを用いて固定を行い、その後パラフィンを用いて包埋を行うことにより、よく保存された組織の基礎構造を提供する。免疫組織化学染色または免疫蛍光染色を可能にするために、サンプル材料の抗原性を取り戻す必要またはマスクを解除する必要がある。ホルムアルデヒドにより架橋されたたんぱく質の抗原性を取り戻す方法の１つは、たんぱく質分解酵素を用いて、サンプルを処理することを含む。この方法は、サンプル材料の（部分）消化を引き起こし、生成された元のたんぱく質の断片が、抗体によってアクセスすることができる。
【００５７】
本発明の方法の一実施形態において、同等の正常細胞に比べて、被検細胞におけるＰＲＤＭ１４および／またはＦＡＭ１９Ａ４プロモーターのメチル化の増加は、検出される。
【００５８】
別の実施形態において、メチル化を増加したｈｓａ−ｍｉＲ１２４−２配列と組合わせて、ＦＡＭ１９Ａ４プロモーターおよびイントロン配列の増加したメチル化を測定する分析手法は、好まれる。その理由は、感度が増加されたのである。
【００５９】
ｈｓａ−ｍｉＲ１２４の成熟配列（受入番号：ＭＩＭＡＴ００００４２２）は、３つの異なるゲノム領域に位置する３つの未熟マイクロＲＮＡ配列個体、すなわち染色体８ｐ２３．１に位置するｈｓａ−ｍｉＲ１２４−１（受入番号：ＭＩ００００４４３）、染色体８ｑ１２．３に位置するｈｓａ−ｍｉＲ１２４−２（受入番号：ＭＩ００００４４４）、および染色体２０ｑｌ２．３３に位置するｈｓａ−ｍｉＲ１２４−３（受入番号：ＭＩ００００４４５）によりコード化される（示された受入番号は、マンチェスター大学生命科学学部のｍｉＲＢａｓｅ（www.mirbase.org）のｍｉＲＮＡデータベースによるものである）。
【００６０】
（自己採取した）頸管塗抹サンプルにおいてＨＰＶ誘発の高度前癌病変およびＨＰＶ誘発の侵食癌の存在を検出または予測する方法に、ｈｓａ−ｍｉＲ１２４過剰メチル化の分析手法を使用ことは、国際公開公報２０１３／０３９３９４およびWiltingら（Mol. Cancer 2010: 9, 167）により記載されている。
【００６１】
本発明はまた、被検対象の被検細胞中のＰＲＤＭ１４および／またはＦＡＭ１９Ａ４に関連するＨＰＶ誘発の侵襲性前駆病変およびＨＰＶ誘発の侵食癌を検出する方法に使用され、特許請求の範囲により定義された部品キットを提供する。このようなキットは、好適には（子宮頸部）を掻き取るブラシまたはスパーテルと、収集媒体により充填され、被検細胞を収集する容器とを含むことができる。代替的には、頸膣洗浄によって子宮頸部細胞を収集するために、灌注注射器、使い捨てメス尿カテーテルおよび灌注流体を有する容器からなるサンプリング装置を含んでもよい。本発明に係るキットは、ＰＲＤＭ１４および／またはＦＡＭ１９Ａ４プロモーターのメチル化を検出するためのプライマーおよびプローブを含むことができる。
【００６２】
本発明による部品キットは、図１および／または図２のヌクレオチド配列とハイブリダイズできるメチル化感受性制限酵素、プローブまたはプライマーのような、ＰＲＤＭ１４および／またはＦＡＭ１９Ａ４プロモーターのメチル化を検出するための手段を備える。当然なことに、分析手法がｈｓａ−ｍｉＲ１２４−２のメチル化を検出する場合、この配列のメチル化を検出するためのプライマーおよびプローブを含んでもよい。
【００６３】
本発明のキットのさらに別の代替的な実施形態において、ＰＲＤＭ１４および／またはＦＡＭ１９Ａ４プロモーターのメチル化を検出するための手段は、ＨＰＶ感染、好ましくは高危険性ＨＰＶ感染を検出するための手段と組合わせられてもよい。当技術分野で知られているように、そのような手段は、ＨＰＶに特異的なプライマーまたはプローブ、ＨＰＶ感染用のたんぱく質マーカーまたはＨＰＶ感染用の代用マーカーを含んでもよい。
【００６４】
以下の非限定的な実施例を用いて、本発明を説明する。
実施例
【実施例１】
【００６５】
実施例１：ＨＰＶ誘発形質転換のメチル化ターゲットとしてのＰＲＤＭ１４およびＦＡＭ１９Ａ４の発見
インビトロのＨＰＶ誘発形質転換に関連するゲノム全域のＤＮＡメチル化の変化（ウイルスの癌遺伝子の発現および後続の主要ケラチン合成細胞の不死化）に対する総合的分析は、メチル化特異のデジタル染色体分析（ＭＳＤＫ）（Ｈｕら, ２００５）を用いて、行われた。ＭＳＤＫは、メチル化感受性制限酵素（ＡｓｃＩ）を用いるゲノムＤＮＡの切断に依存する配列依存方法であるため、公平な総合的メチル化プロファイリングを可能にする。この方法において、ゲノムの特定の場所から由来した２１ｂｐの配列タグは、高性能配列解読装置により連結され、解析される。我々は、形質導入されていない主要包皮ケラチン生成細胞（継代５）のメチル化パターンをＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７（継代７）が形質導入された初期継代対応物と比較することにより、ＨＰＶ１６のＥ６およびＥ７の発現から起因するゲノム全域のＤＮＡメチル化の変化を決定した。さらに、形質転換において、不死性の獲得、使い捨て点と謂われる臨界点および現象に関連する変更されたメチル化は、ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７が形質導入された不死性の誘発体（継代３０）を含むことによって分析された。
【００６６】
この手法によって、我々は、ＰＲＤＭ１４およびＦＡＭ１９Ａ４をＨＰＶ誘発形質転換の新規メチル化ターゲットとして特定した。不死性の形質導入において、ＰＲＤＭ１４およびＦＡＭ１９Ａ４のメチル化は、顕著であり、しかしながら初期継代細胞において、ＰＲＤＭ１４のメチル化は、まれであった。
【００６７】
ＰＲＤＭ１４およびＦＡＭ１９Ａ４プロモーター領域のメチル化は、ＨＰＶ形質転換された一連のケラチン合成細胞細胞の独立株に対する定量メチル化特異的ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）によって、確認された。ｑＭＳＰに使用されたプライマーおよびプローブは、表１に列挙されている。ＰＲＤＭ１４プロモーターのメチル化は、２つのＨＰＶ１６（ＦＫ１６Ａ、ＦＫ１６Ｂ）不死性ケラチン合成細胞細胞株および２つのＨＰＶ１８（ＦＫ１８Ａ、ＦＫ１８Ｂ）不死性ケラチン合成細胞細胞株において、検出された。また、高レベルのＰＲＤＭ１４メチル化は、３つのｈｒＨＰＶ陽性の子宮頸部癌細胞株（ＳｉＨａ細胞、ＨｅＬａ細胞およびＣａＳｋｉ細胞）およびＨＰＶ１６陽性の頭頸部癌細胞株（９３ＶＵ１４７Ｔ）において、検出された。ＨＰＶ陰性の主要ケラチン合成細胞（ＨＦＫ）の３つの分離株に対するＰＲＤＭ１４メチル化検査は、陰性であった（表２を参照）。
【００６８】
メチル化阻害剤５−アザ−２−デオキシシチジン（ＤＡＣ）を用いて、ＳｉＨａ子宮頸部癌細胞に対する処理は、ＰＲＤＭ１４のｍＲＮＡ発現の上方調節をもたらした。このことは、ＰＲＤＭ１４プロモーターのメチル化が子宮頸部癌細胞内の遺伝子発現を調節することを示している（図２）。
【００６９】
ＰＲＤＭ１４と同様に、ＦＡＭ１９Ａ４プロモーターのメチル化は、２つのＨＰＶ１６（ＦＫ１６Ａ、ＦＫ１６Ｂ）不死性ケラチン合成細胞細胞株および２つのＨＰＶ１８（ＦＫ１８Ａ、ＦＫ１８Ｂ）不死性ケラチン合成細胞細胞株ならびに子宮頸部癌細胞株（ＳｉＨａ細胞、ＨｅＬａ細胞およびＣａＳｋｉ細胞）および頭頸部癌細胞株（９３ＶＵ１４７Ｔ）において、検出された。後者は、最高レベルのＦＡＭ１９Ａ４メチル化を示す。ＨＰＶ陰性の主要ケラチン合成細胞（ＨＦＫ）の３つの分離株に対するＦＡＭ１９Ａ４メチル化検査は、陰性であった（表２を参照）。
【実施例２】
【００７０】
実施例２：子宮頸部発癌におけるＰＲＤＭ１４の機能的役割
子宮頸部発癌におけるＰＲＤＭ１４の潜在的な機能的役割を決定するために、我々は、ＰＲＤＭ１４発現ベクターまたは空白対照ベクター（ＧＦＰ）を用いて、子宮頸癌細胞株ＳｉＨａ細胞およびＣａＳｋｉ細胞を含むＨＰＶ１６の細胞を形質転換した。ＳｉＨａ細胞およびＣａＳｋｉ細胞のＰＲＤＭ１４形質転換体における異所ＰＲＤＭ１４発現は、ＲＴ−ＰＣＲにより確認された。形質転換後、細胞アポトーシス誘導は、アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）用に染色された細胞に対するＦＡＣＳ分析によって、測定された。空白対照ベクターの形質転換体および形質転換されていない親細胞と比較して、アポトーシスの強力な誘導は、ＰＲＤＭ１４過剰発現の細胞において顕著であった（図４）。子宮頸部癌細胞におけるＰＲＤＭ１４の異所性発現によるアポトーシスの強力な誘導は、子宮頸部発癌における腫瘍抑制の役割を示唆する。子宮頸部癌細胞株の結果と同様に、ＰＲＤＭ１４の異所性発現は、ＨＰＶ１６陽性頭頸部癌細胞株においても、アポトーシスを誘導した（図４）。したがって、これらのデータは、ＰＲＤＭ１４がＨＰＶ陽性頭頸部癌において、腫瘍抑制の役割を有することを示唆している。ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ）にＰＲＤＭ１４を導入しても、アポトーシスの誘導は観察されなかった。このことは、ＨＰＶ陽性の癌細胞株に観察されたアポトーシスの誘導は、形質転換のために使用された構造物の非特異的効果から起因していないことを示している。
【実施例３】
【００７１】
実施例３：高度ＣＩＮ病変、子宮頸部扁平上皮癌、腺癌、腺癌および神経内分泌癌に共通であるＰＲＤＭ１４およびＦＡＭ１９Ａ４プロモーターのメチル化
次に、我々は、実施例１に説明した定量メチル化特異的ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）を用いて、子宮頸部組織標本におけるＰＲＤＭ１４およびＦＡＭ１９Ａ４プロモーターのメチル化を解析した。ハウスキーピング遺伝子β−アクチン（ＡＣＴＢ）は、すべてのＤＮＡ入力の測定基準として選択された。すべてのサンプルに対し、メチル化されたＤＮＡの測定量をＡＣＴＢの量で除して、所定のカットオフ値（たとえば、正常対照平均比率（主要な外れ値を除く）＋２．５８×標準偏差）を超える比率を有するサンプルは、陽性に分類された。
【００７２】
我々は、ＰＲＤＭ１４プロモーターのメチル化が、１１％（２／１８）の正常子宮頸部対照サンプル、３３％（１３／４０）のＣＩＮ１病変、５５％（２３／４２）のＣＩＮ３病変、および１００％（４２／４２）の子宮頸部扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ）において検出可能であること（表３）を発見した。疾患の異なる段階で検出されたＰＲＤＭ１４のメチル化レベルは、図５に描画されている。
【００７３】
子宮頸部扁平上皮細胞癌の次に、我々はまた、子宮頸腺癌におけるＰＲＤＭ１４プロモーターのメチル化を解析した。全国範囲の子宮頸部検診プログラムによれば、子宮頸腺癌の発生率が国中で同一のレベルに止まりまたは増加しているため、子宮頸部癌の２０％を占める腺癌は、特に重視されている。このことは、子宮頸腺癌および子宮頸腺前駆病変、すなわち上皮内腺癌（ＡＣＩＳ）は、細胞学に基づく検診でしばしば見逃されることを示している。子宮頸部扁平上皮細胞癌と子宮頸腺癌との間の遺伝学および後成学の比較研究に基づいて、両方の腫瘍の組織型は、独特な発癌性経路によって発症することが分かった（Dongら, 2001, Kangら, 2005, Wiltingら, 2006, Henkenら, 2007）。その結果、子宮頸部扁平上皮癌を検出可能な殆どのバイオマーカーは、必ずしも子宮頸腺癌を検出できるとは限らない。
【００７４】
ＣＡＤＭ１、ＣＤＨ１、ＤＡＰＫ１およびＳＯＸ１７のようなメチル化マーカーは、扁平上皮癌に対してより特異的である一方、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＡＰＣ、ＤＫＫ３およびＳＦＲＰ２のようなマーカーは、腺癌において圧倒的にメチル化される（Overmeerら, 2008, Kangら, 2005, Dongら, 2001, van der Meideら, 2011）。
【００７５】
興味深いことに、殆どの公知マーカーとは対照的に、ＰＲＤＭ１４プロモーターのメチル化は、例外であり得る。ＰＲＤＭ１４プロモーターのメチル化は、扁平上皮癌と同様の頻度で子宮頸腺癌から検出される。すなわち、９７％（３０／３１）の腺癌は、ＰＲＤＭ１４プロモーターのメチル化を示し、５７％（１２／２１）の上皮内腺癌検査は、ＰＲＤＭ１４メチル化が陽性であった（図５、表３）。同様の結果は、子宮頸腺癌および神経内分泌癌からも得られている。
【００７６】
したがって、ＰＲＤＭ１４プロモーターのメチル化は、すべての子宮頸部癌組織型の共通メチル化マーカーであると考えられる。
【００７７】
ＦＡＭ１９Ａ４プロモーターのメチル化に対する分析は、１９％（３／１６）の正常子宮頸部対照サンプル、１２％（３／２６）のＣＩＮ１病変、４３％（１８／４２）のＣＩＮ３病変、１００％（４２／４２）の子宮頸部扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ）、５２％（１１／２１）の上皮内腺癌（ＡＣＩＳ）および９２％（２４／２６）の腺癌（ＡｄＣＡ）において、メチル化が陽性であること（表３）を解明した。疾患の異なる段階で検出されたＦＡＭ１９Ａ４のメチル化レベルは、図５に描画されている。したがって、ＦＡＭ１９Ａ４プロモーターのメチル化は、すべての子宮頸部癌組織型の共通メチル化マーカーである。
【実施例４】
【００７８】
実施例４：ｈｒＨＰＶ陽性の子宮頸部掻き取りサンプルにおけるＰＲＤＭ１４およびＦＡＭ１９Ａ４プロモーターのメチル化の検出
集団検診に参加した女性の症例対照設計を用いて、我々は、最大ＣＩＮ１の腫瘍と診断されたｈｒＨＰＶ陽性の女性（すなわち、対照）に対して、ＣＩＮ２以上腫瘍（２級の腫瘍を含む）と診断されたｈｒＨＰＶ陽性の女性（すなわち、症例）の子宮頸部掻き取りサンプルを研究した。これらの女性からの子宮頸部掻き取りサンプルは、核酸をよく保存する保存培地で収集した。
【００７９】
ＰＲＤＭ１４のメチル化は、２３％（８／３５）の正常な細胞診を有するｈｒＨＰＶ陽性対照女性および７４％（１７／２３）のＣＩＮ２以上の女性から検出された。ＦＡＭ１９Ａ４のメチル化は、３％（１／３５）の正常な細胞診を有するｈｒＨＰＶ陽性対照女性およびで５２％（１２／２３）のＣＩＮ２以上の女性から検出された。前向きな人口スクリーニング検査ＰＯＢＡＳＣＡＭ（Rijkaartら、ランセット・オンコロジー２０１２）に収集されたより大きな２００例の連続的ｈｒＨＰＶ陽性子宮頸部掻き取りサンプルに対し、ＣＩＮ＞の女性の正常な細胞診と対照女性、その後の検証解析は、ＦＡＭ１９Ａが特異度を５０％まで引き上げる分析閾値でＣＩＮ３を患う女性を８０％超える百分率で検出することを解明した。７０％の特異度に対応する閾値で、ＣＩＮ３を患う女性を７０％で検出した。
【００８０】
これらのデータは、ＰＲＤＭ１４およびＦＡＭ１９Ａ４両方のメチル化解析が、ｈｒＨＰＶ陽性子宮頸部掻き取りサンプルに潜在する子宮頸部疾患（ＣＩＮ２＋）の検出を可能にし、したがって、一次ＨＰＶ検査による子宮頸部検診に有望なトリアージマーカーを提供できることを示している。
【実施例５】
【００８１】
実施例５：短期ＨＰＶ感染および長期ＨＰＶ感染に関連したＣＩＮ３を患う女性の子宮頸部掻き取りサンプルにおけるＦＡＭ１９Ａ４のメチル化解析
過去の研究において、我々は、ＤＮＡコピー数の変化に関して、短期（＜５年）持続ＨＰＶ感染によるＣＩＮ３病変を患う女性と長期（≧５年）持続ＨＰＶ感染によるＣＩＮ３病変を患う女性とを比較した（Bierkensら, Int J Cancer 2012: 131(4):E579-85）。ｈｒＨＰＶ感染の持続期間は、ＣＩＮ３病変をそれぞれ低次病期および高次病期に割り当てることのできる病変時期の代用物としての役割を果たす。長期持続ｈｒＨＰＶ感染によるＣＩＮ３病変において著しく多いＤＮＡコピー数の変化が検出されたということは、この種類のＣＩＮ３病変が癌になる危険性が高くなった高次病期、いわゆる進行ＣＩＮ３病変を表すという仮説を実証した。
【００８２】
ＦＡＭ１９Ａ４メチル化解析がこれらの進行ＣＩＮ３病変を検出できるかどうかを判断するために、我々は、短期持続ｈｒＨＰＶ感染によるＣＩＮ３を患う１９人の女性および長期持続ｈｒＨＰＶ感染によるＣＩＮ３を患う２９人の女性からの子宮頸部掻き取りサンプルを分析した。最も興味深いことに、短期ｈｒＨＰＶ感染に関連したＣＩＮ３病変、いわゆる早期ＣＩＮ３病変を患う女性の掻き取りサンプルの４２％（８／１９）に対し、（長期持続ｈｒＨＰＶ感染による）進行ＣＩＮ３病変を患う女性からのすべての掻き取りサンプル（２９／２９、１００％）は、ＦＡＭ１９Ａ４メチル化によって検出された。メチル化陽性の検査結果は、特異度を７０％まで引き上げる分析閾値の設定に基づいたものであった。進行病変を患う女性においてこの非常に高い発症率は、ＦＡＭ１９Ａ４メチル化の検査による検出された進行ＣＩＮ３病変を患うすべての女性には膣鏡診の即時紹介が必要であることを示唆している。
【実施例６】
【００８３】
実施例６：癌患者の子宮頸部掻き取りサンプルにおけるＦＡＭ１９Ａ４プロモーターのメチル化
子宮頸部癌の患者からの合計６０例の子宮頸部掻き取りサンプルに対し、ＦＡＭ１９Ａ４メチル化の分析を行った。これらのサンプルは、１０例の腺癌、２例の上皮内腺癌、２例の腺癌、４３例の扁平上皮癌および３例の未分化癌を含む。１例の腺癌を除き、すべての癌は、ＦＡＭ１９Ａ４メチル化の検査（特異度７０％）が陽性であった。子宮頸部癌患者の掻き取りサンプルに加えて、子宮内膜癌の女性からの掻き取りサンプルのサブセットは、ＦＡＭ１９Ａ４メチル化が陽性であることが分かった。最も興味深いことに、すべての癌患者からの掻き取りサンプルに対し、ＦＡＭ１９Ａ４およびｈｓａ−ｍｉＲ１２４−２の組合わせのメチル化検査が陽性であることを判明した（Wiltingら, Mol Cancer 2010: 9, 167）。
【００８４】
したがって、子宮頸部掻き取りサンプルにおけるＦＡＭ１９Ａ４およびｈｓａ−ｍｉＲ１２４−２メチル化の総合検査は、子宮頸部および子宮内膜の両方から起源したすべての癌（１００％）の検出を可能にする。
【実施例７】
【００８５】
実施例７：自己採取した標本におけるＰＲＤＭ１４およびＦＡＭ１９Ａ４プロモーターのメチル化
我々は、前向き研究の期間中（www.trialregister.nl, 試験番号：NTR962 (PROHTECT試験)）に、二次リマインダーを送っても子宮頸部定期検診の要請に応答しなかった女性に合計４５０００自己採取パッケージを送った。そして、我々は、VibaBrush（登録商標、Rovers Medical Devices、Oss、オランダ）またはデルファイスクリーナー（Delphi BioScience、Scherpenzeel BV、オランダ）のいずれかを用いて自己採取された頸膣標本を分析した。定期検診の要請に応答しなかった女性にｈｒＨＰＶ検査用の自己採取パッケージを提供することは、最大３０％の女性を検診プログラムに再誘致した（Gokら，BMJ 2010; 340:cl040）。ＨＰＶ検査に関して、自己採取されたサンプルは、医師採取したものと同等である（Brinkら, J Clin Microbiol 2006; 44:2518-23）。この集団において、自己採取したサンプルに対するｈｒＨＰＶ検査は、同じ規模の女性応答者の集団で定期検診によって検出したＣＩＮ２以上の病変と少なくとも同様な数の病変を検出した（Baisら, Int J Cancer: 2007, 120: 1505-1510; Gokら, BMJ 2010; 340:c1040）。しかしながら、ＨＰＶ自己サンプリングに対し、ｈｒＨＰＶ陽性の女性をＣＩＮ２／３以上の病変および上皮内腺癌を患うものとそれを患っていないものとに分類するトリアージツールが必要とされる。従来の細胞診が自己採取した頸膣標本に確実に実行することができないが（Brinkら, J Clin Microbiol 2006; 44:2518-23）、ＤＮＡメチル化解析は、自己採取した頸膣洗浄物に適用することができる（Eijsinkら, Gynecol Oncol 2011; 120:280-3）。重要なことに、この発見は、メチル化マーカーＦＡＭ１９Ａ４およびＰＲＤＭ１４が自己採取の頸膣洗浄標本だけではなく、自己採取の膣ブラシサンプルにも適用されても、潜在的なＣＩＮ２＋を検出できることを示している。自己採取の膣ブラシサンプルは、従来の既知マーカーがしばしば低い臨床的感度で行われている標本である。したがって、ＰＲＤＭ１４およびＦＡＭ１９Ａ４マーカーは、医師採取の子宮頸部塗抹標本、自己採取の洗浄サンプルおよび自己採取の掻き取りサンプルに対し、同等に機能する汎用検出マーカーとして見なすことができる。
【００８６】
経過観察において臨床的な意味のある疾患を患う証拠の無い（すなわち、正常な細胞診／ＨＰＶまたはＣＩＮ０／ＣＩＮ１組織構造を有する）ｈｒＨＰＶ陽性の女性から自己採取した１７７例の膣ブラシサンプル、およびＣＩＮ３以上の病変（６８例のＣＩＮ３、４例のＳＣＣ、１例のＡＣＩＳおよび１例の３６ヶ月以内の腺細胞癌）を患うｈｒＨＰＶ陽性の女性から自己採取した７４例の膣ブラシサンプルに対し、ｑＭＳＰに従って、ＰＲＤＭ１４およびＦＡＭ１９Ａ４プロモーターのメチル化検査を行った。ＰＲＤＭ１４と組合わせても組合わせなくても、ＦＡＭ１９Ａ４のメチル化解析は、ＣＩＮ３以上の病変に対し、７０％の特異度で７０％の感度に達した。驚くべきことに、現在までは、ＦＡＭ１９Ａ４メチル化は、ｈｒＨＰＶ陽性の女性から自己採取した膣ブラシサンプルに潜在的に存在するＣＩＮ３以上の病変を許容可能な感度（＞６０％）で予測できる唯一のメチル化マーカーである。他のメチル化マーカーまたは他のマーカーの組合せを用いて、自己採取の膣ブラシサンプルに対する検出感度は、はるかに低かった。このような優れた性能が従来の掻き取りサンプルまたは頸膣洗浄標本から観察されなかったので、この発見は、予想外である。
【００８７】
さらに、経過観察において臨床的な意味のある疾患を患う証拠の無い（すなわち、正常な細胞診／ＨＰＶまたはＣＩＮ０／ＣＩＮ１の組織構造を有する）ｈｒＨＰＶ陽性の女性から自己採取した２７２例の頸膣洗浄標本、およびＣＩＮ３以上の病変を患うｈｒＨＰＶ陽性の女性から自己採取した７８例の頸膣洗浄標本を含むｈｒＨＰＶ陽性の女性から自己採取した３５０例の頸膣洗浄標本に対し、ＰＲＤＭ１４およびＦＡＭ１９Ａ４プロモーターのメチル化解析を行った。ＰＲＤＭ１４メチル化マーカーと組合わせても組合わせなくても、ＦＡＭ１９Ａ４は、７０％の特異度でＣＩＮ３以上の病変に対し、７０％の感度を示した。このことは、ＦＡＭ１９Ａ４がＰＲＤＭ１４メチル化マーカーまたは他のメチル化マーカーと組合わせても組合わせなくても、子宮頸部掻き取りサンプルおよび自己採取の（頸）膣ブラシサンプルまたは洗浄標本を含むさまざまな種類のサンプルに対し、汎用検出機能を有することを実証した。
【００８８】
さらなる研究において、我々は、ＰＲＤＭ１４以外のメチル化マーカーが自己採取した膣ブラシサンプルまたは洗浄サンプルに存在するＣＩＮ３以上の病変を検出するためのＦＡＭ１９Ａ４を相補的に補助できるか否かを究明した。７０％未満の特異度（６０％および５０％）で、メチル化マーカーｈｓａ−ｍｉＲ１２４−２（Wiltingら, Mol. Cancer 2010: 9, 167）は、ＦＡＭ１９Ａ４を単独に使用する検査に比べて、感度の増加をもたらす付加的な価値があるということを見出した。
【００８９】
これらのデータは、自己採取した膣ブラシサンプルおよび自己採取した頸膣洗浄標本の両方から得られた自己採取材料に対するＰＲＤＭ１４およびＦＡＭ１９Ａ４プロモーターのメチル化解析が十分可能であり、潜在的な高度子宮頸部疾患の検出を向上できることを示している。特に、ＦＡＭ１９Ａ４は、自己採取した膣ブラシサンプルおよび自己採取した頸膣洗浄標本の両方において、他のメチル化マーカーまたはＨＰＶ１６／１８の遺伝子型判定を超える高感度および高特異度（７０％、７０％）を達成した。ＦＡＭ１９Ａ４を単独に使用する場合に比べて、ＦＡＭ１９Ａ４およびＨＳＡ−ミール１２４−２の組合わせ解析は、５０％および６０％の特異度で優れていることを示した。
【実施例８】
【００９０】
実施例８：ｈｒＨＰＶ陽性の頭頸部扁平上皮癌、外陰部癌、外陰部前駆病変および肛門癌におけるＰＲＤＭ１４およびＦＡＭ１９Ａ４プロモーターのメチル化解析
ｈｒＨＰＶに関連する子宮頸部癌以外の上皮性悪性腫瘍からＰＲＤＭ１４およびＦＡＭ１９Ａ４プロモーターのメチル化を検出可能であるかどうかを決定するために、我々は、ｑＭＳＰに従って、２０例のｈｒＨＰＶ陽性頭頸部（すなわち口腔咽頭）扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）および２例の正常な口腔粘膜サンプルに対する分析を行った。正常な頭頸部粘膜サンプル（図６）に比べて、ＨＮＳＣＣにおいて、ＰＲＤＭ１４およびＦＡＭ１９Ａ４両方のメチル化レベルが有意に増加した（ｐ＜０．０５）。つまり、すべて（２０／２０）のＨＮＳＣＣにおいて、対照に比べて、ＰＲＤＭ１４のメチル化レベルが増加した。９０％（１８／２０）のＨＮＳＣＣにおいて、対照に比べて、ＦＡＭ１９Ａ４メチル化レベルが増加した。
【００９１】
さらに、我々は、ＰＲＤＭ１４およびＦＡＭ１９Ａ４メチル化に対し、３例のｈｒＨＰＶ陽性外陰部癌、４例の前癌外陰部病変（ＶＩＮ３）および３例のｈｒＨＰＶ陽性肛門癌を検査した。子宮頸部病変と同様に、全１１例の病変は、高レベルのＰＲＤＭ１４メチル化を示し、１例のＶＩＮ３病変を除き、残り３例のＶＩＮ３病変は、高レベルのＰＲＤＭ１４メチル化を示した。
【００９２】
これらのデータは、頭部および頸部ならびに外陰部および肛門を含むｈｒＨＰＶ陽性の非子宮頸部（前）癌病変は、ＦＡＭ１９Ａ４および／またはＰＲＤＭ１４のメチル化によって検出することができることを示している。
【００９３】
【表１】
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【００９４】
【表２】
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【００９５】
【表３】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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