(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) ニューレグリン（NRG）ポリペプチド及び(b) 緩衝剤を含み、pHが3〜5.7である、NRGの医薬製剤であって、該NRGポリペプチドが、配列番号：2に記載されたアミノ酸配列を含むポリペプチドである、前記製剤。
【請求項２】
前記NRG製剤が：(c) 安定剤をさらに含む、請求項1記載の製剤。
【請求項３】
前記NRG製剤が：(d) 塩をさらに含む、請求項1又は2記載の製剤。
【請求項４】
前記NRGポリペプチドが配列番号：2に記載されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項1〜3のいずれか1項記載の記載の製剤。
【請求項５】
前記NRGポリペプチドの濃度が約0.01 g/L〜約1 g/Lの範囲内である、請求項1〜3のいずれか1項記載の製剤。
【請求項６】
前記NRGポリペプチドが0.25 g/Lの濃度の配列番号：2に記載されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項5記載の製剤。
【請求項７】
前記緩衝剤がpH緩衝剤である、請求項1〜3のいずれか1項記載の製剤。
【請求項８】
前記pH緩衝剤が約0.1 mM〜約500 mMの範囲内である、請求項7記載の製剤。
【請求項９】
前記緩衝剤がクエン酸塩、リン酸塩、酢酸塩、ヒスチジン、グリシン、炭酸水素塩、HEPES、トリス、希HCl、希NaOH及びこれらの薬剤の組合せからなる群から選択される、請求項7記載の製剤。
【請求項１０】
前記緩衝剤がリン酸塩である、請求項9記載の製剤。
【請求項１１】
前記pHが3〜4である、請求項10記載の製剤。
【請求項１２】
前記製剤が液体製剤である、請求項1記載の製剤。
【請求項１３】
前記NRGポリペプチドが配列番号：2に記載されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項12記載の製剤。
【請求項１４】
前記緩衝剤がリン酸塩である、請求項12記載の製剤。
【請求項１５】
前記NRGポリペプチドが0.25 g/Lの濃度の配列番号：2に記載されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記緩衝剤が10 mMリン酸塩であり、かつ前記pHが約3.4である、請求項12記載の製剤。
【請求項１６】
前記安定剤が約0.1 g/L〜約200 g/Lの濃度である、請求項2記載の製剤。
【請求項１７】
前記安定剤がマンニトール、ソルビトール、キシリトール、スクロース、トレハロース、マンノース、マルトース、ラクトース、グルコース、ラフィノース、セロビオース、ゲンチオビオース、イソマルトース、アラビノース、グルコサミン、フルクトース、ヒト血清アルブミン及びこれらの安定剤の組合せからなる群から選択される、請求項2記載の製剤。
【請求項１８】
前記安定剤が約2 g/Lの濃度のヒト血清アルブミンである、請求項2記載の製剤。
【請求項１９】
前記塩が約100 mM〜約500 mMの濃度範囲である、請求項3記載の製剤。
【請求項２０】
前記塩が塩化ナトリウムである、請求項3記載の製剤。
【請求項２１】
前記塩化ナトリウムが約150 mMの濃度である、請求項20記載の製剤。
【請求項２２】
前記NRGポリペプチドが約0.25 g/Lの濃度の配列番号：2に記載されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、ここで、前記緩衝剤が約10 mMの濃度のリン酸塩であり、前記pHが5.7であり、前記安定剤が約2 g/Lの濃度のヒト血清アルブミンであり、かつ前記塩が約150 mMの濃度の塩化ナトリウムである、請求項3記載の製剤。
【請求項２３】
賦形剤を追加した請求項1〜22のいずれか1項記載の製剤の凍結乾燥により調製した、ニューレグリン（NRG）の凍結乾燥医薬製剤。
【請求項２４】
前記賦形剤がヒト血清アルブミン、マンニトール、グリシン、ポリエチレングリコール、及びこれらの賦形剤の組合せからなる群から選択される、請求項23記載の製剤。
【請求項２５】
前記賦形剤が、1 mlの再懸濁溶液で約60 mgの前記製剤を再懸濁した後に、約0.1 g/L〜約200 g/Lの濃度である、請求項23記載の製剤。
【請求項２６】
前記賦形剤がマンニトールである、請求項23記載の製剤。
【請求項２７】
前記マンニトールが1 mlの再懸濁溶液で約60 mgの前記製剤を再懸濁した後に、約50 g/Lの濃度である、請求項26記載の製剤。
【請求項２８】
前記再懸濁溶液が滅菌DI水又は生理食塩水である、請求項25又は27記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
概して本発明は心臓血管疾患、例えば心不全の治療のための医薬調合剤に関する。特に、本発明はニューレグリン調合剤の処方に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
米国人のおよそ500万人が心不全に罹患しており、毎年550,000人を超える新たな患者がこの病態であると診断される。現在の心不全の薬物治療は主にアンギオテンシン変換酵素（ACE）阻害剤を対象とし、該阻害剤は血管の拡張を引き起こし、血圧を降下させ、かつ心臓の作業負荷を低下させる血管拡張剤である。死亡率の低下割合が重要とされてきたが、ACE阻害剤による実際の死亡率低下は平均してわずか3％〜4％であり、いくつかの潜在的な副作用が存在する。追加的な制約は、心不全を予防し、又は治療するための他の選択肢と関連する。例えば、心臓移植は明らかに薬物治療より高額で侵襲的であり、ドナーの心臓が利用できるかどうかによってさらに制約を受ける。両心室ペースメーカーのような機械的装置の使用は同様に侵襲的であり、高額である。従って、現在の治療法の欠点を考慮した新しい治療法が必要とされている。
【０００３】
1つの有望な新規治療法は、心不全に罹患している、又は心不全を発症するリスクのある患者へのニューレグリン（本明細書において、以下 「NRG」呼ぶ）の投与を伴う。NRGはEGF様成長因子のファミリーであり、NRG1、NRG2、NRG3及びNRG4並びにこれらのアイソフォームを含む構造的に関連した成長因子及び分化因子のファミリーを含み、数々の生物学的応答：乳癌細胞分化の刺激及び乳タンパク質の分泌；神経堤細胞のシュワン細胞への分化誘導；骨格筋細胞のアセチルコリン受容体合成の刺激；並びに心筋細胞の生存及びDNA合成の促進に関与する。心筋小柱形成及び後根神経節発生に重度の欠陥があるニューレグリン遺伝子をターゲティングしたホモ接合マウス胚のインビボ試験により、ニューレグリンが心臓及び神経の発生に必須であることが示されている。
【０００４】
NRGは、EGFR、ErbB2、ErbB3及びErbB4を含むEGF受容体ファミリーと結合し、そのそれぞれは細胞成長、細胞分化、及び細胞生存を含む複数の細胞機能において重要な役割を果たす。それらは、細胞外のリガンド結合ドメイン、膜貫通キナーゼドメイン、及び細胞質チロシンキナーゼドメインからなるタンパク質チロシンキナーゼ受容体である。NRGがErbB3又はErbB4の細胞外ドメインに結合した後、それは、ErbB3、ErbB4、及びErbB2の間のヘテロ二量体形成又はErbB4自体の間のホモ二量体形成をもたらす立体構造変化を誘導し、それによって細胞膜の内側にある受容体のC末端ドメインのリン酸化が起こる。次に、リン酸化された細胞内ドメインは細胞内の追加のシグナルタンパク質と結合し、対応する下流のAKT又はERKシグナル伝達経路を活性化し、細胞増殖、細胞分化、細胞アポトーシス、細胞遊走、又は細胞接着の刺激又は低下などの、一連の細胞反応を誘導する。これらの受容体のうち、主にErbB2及びErbB4が心臓で発現される。
【０００５】
サイズが50〜64個のアミノ酸の範囲であるNRG-1のEGF様ドメインは、これらの受容体に結合して、それらを活性化するのに十分であることが示されている。過去の試験により、ニューレグリン-1β（NRG-1β）は、高い親和性でErbB3及びErbB4に直接結合することができることが示されている。オーファン受容体であるErbB2は、ErbB3ホモ二量体又はErbB4ホモ二量体よりも高い親和性で、ErbB3及びErbB4とヘテロ二量体を形成することができる。神経発生の研究は、交感神経系の形成には、完全なNRG-1β、ErbB2、及びErbB3シグナル伝達系が要求されることを示した。NRG-1β又はErbB2又はErbB4のターゲティングによる破壊は、心臓の発生異常による胚性致死をもたらした。また、最近の試験は、心臓血管の発生並びに成体の正常な心機能の維持におけるNRG-1β、ErbB2、及びErbB4の役割を強調した。NRG-1βは、成体心筋細胞におけるサルコメアの組織化を強化することが示されている。組換えNRG-1βのEGF様ドメインの投与により、心不全の異なる動物モデル並びに臨床試験において、心筋の能力が顕著に改善され、又は心筋の能力の悪化から保護される。これらの結果はNRG-1を、様々な通常疾患に起因する心不全に対する広スペクトルの治療薬、又はリード化合物として有望なものとする。大抵の場合、医薬タンパク質製剤は注射薬の形態で投与されることが意図される。しかしながら、安定性の問題を呈する活性タンパク質が一部には存在することが一般に知られている。従って、当技術分野において、NRGを含む安定な医薬製剤を開発することが必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
（発明の概要）
本発明は：(a) ニューレグリン（NRG）ポリペプチド；(b) 緩衝剤を含み、pHが3〜7である、NRGの医薬製剤を提供する。いくつかの実施態様において、該NRG製剤は：(c) 安定剤をさらに含む。いくつかの実施態様において、該NRG製剤は：(d) 塩をさらに含む。いくつかの実施態様において、該製剤は液体製剤である。いくつかの実施態様において、該製剤は、凍結乾燥製剤である。
【０００７】
本明細書に提供される製剤中のNRGポリペプチドは：
a) 配列番号：2に記載されたアミノ酸配列を含むポリペプチド；
b) NRGのEGF様ドメインを含むポリペプチド；
c) a) のポリペプチドの生物学的に活性な類似体、断片又はバリアント；
d) 配列番号：1に記載されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
e) d) のポリペプチドの生物学的に活性な類似体、断片又はバリアント；及び
f) 中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号：1に記載されたポリヌクレオチドとハイブリッド形成するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
からなる群から選択される。いくつかの実施態様において、該NRGポリペプチドは配列番号：2に記載されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである。いくつかの実施態様において、NRGポリペプチドの濃度は約0.01 g/L〜約1 g/Lの範囲内である。追加の実施態様において、本発明によって提供される製剤中のNRGポリペプチドは、約0.25 g/Lの濃度の配列番号：2に記載されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【０００８】
いくつかの実施態様において、本発明によって提供される製剤はpH緩衝剤を含む。関連する実施態様において、該pH緩衝剤は約0.1 mM〜約500 mMの範囲内である。該緩衝剤は、クエン酸塩、リン酸塩、酢酸塩、ヒスチジン、グリシン、炭酸水素塩、HEPES、トリス、希HCl、希NaOH又はこれらの薬剤の組合せからなる群から選択される。一実施態様において、本発明によって提供される製剤中の緩衝剤は、リン酸塩である。いくつかの実施態様において、本発明の製剤はpHが約6.0である。いくつかの実施態様において、本発明の製剤はpHが約3.4である。
【０００９】
いくつかの実施態様において、本発明によって提供される製剤は安定剤を含む。さらなる実施態様において、本発明によって提供される製剤は約0.1 g/L〜約200 g/Lの濃度である。追加の実施態様において、該安定剤はマンニトール、ソルビトール、キシリトール、スクロース、トレハロース、マンノース、マルトース、ラクトース、グルコース、ラフィノース、セロビオース、ゲンチオビオース、イソマルトース、アラビノース、グルコサミン、フルクトース、ヒト血清アルブミン及びこれらの安定剤の組合せからなる群から選択される。いくつかの実施態様において、該安定剤は約2 g/Lの濃度のヒト血清アルブミンである。
【００１０】
追加の実施態様において、本発明によって提供される製剤は、塩を含む。いくつかの実施態様において、該塩は約100 mM〜約500 mMの濃度範囲である。特定の実施態様において、該塩は塩化ナトリウムである。関連する実施態様において、本発明の製剤中の塩濃度は、約150 mMである。
【００１１】
いくつかの実施態様において、本発明によって提供される製剤中のNRGポリペプチドは、配列番号：2に記載されたアミノ酸配列からなり；ここで、該緩衝剤は10 mMの濃度のリン酸塩であり、かつ該pHは約6.0である。
【００１２】
いくつかの実施態様において、本発明によって提供される製剤中のNRGポリペプチドは、約0.25 g/Lの濃度の配列番号：2に記載されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、該緩衝剤は約10 mMの濃度のリン酸塩であり、前記pHは約6.0であり、該安定剤は約2 g/Lの濃度のヒト血清アルブミンであり、かつ該塩は約150 mMの濃度の塩化ナトリウムである。
【００１３】
いくつかの実施態様において、本発明によって提供される製剤は、液体医薬製剤である。追加の実施態様において、本発明によって提供されるNRG液体医薬製剤中のNRGポリペプチドは、約0.25 g/Lの濃度の配列番号：2に記載されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、該緩衝剤は約10 mMの濃度のリン酸塩であり、前記pHは、約3.4である。
【００１４】
いくつかの実施態様において、本発明によって提供される製剤は、NRGの凍結乾燥医薬製剤であり、賦形剤の追加された先述の製剤のいずれかを凍結乾燥することにより調製される。いくつかの実施態様において、該賦形剤はヒト血清アルブミン、マンニトール、グリシン、ポリエチレングリコール、及びこれらの賦形剤の組合せからなる群から選択される。具体的な実施態様において、該賦形剤はマンニトールである。関係のある実施態様において、該賦形剤は1 mlの再懸濁溶液で約60 mgの該製剤を再懸濁した後に、約0.1 g/L〜約200 g/Lの濃度である。具体的な実施態様において、マンニトールは1 mlの再懸濁溶液で約60 mgの該製剤を再懸濁した後に、約50 g/Lの濃度である。
【００１５】
さらなる実施態様において、本発明は：(a) ニューレグリン（NRG）ポリペプチド；(b) 緩衝剤、及び(c) 賦形剤を含むNRGの凍結乾燥医薬製剤を提供する。追加の実施態様において、該凍結乾燥医薬製剤は、安定剤をさらに含む。追加の実施態様において、該凍結乾燥医薬製剤は、塩をさらに含む。
【００１６】
具体的な実施態様において、本発明の凍結乾燥医薬製剤は、(a) 配列番号：2に記載されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、(b) 該緩衝剤としてのリン酸塩、(c) 該賦形剤としてのマンニトール、(d) 該安定剤としてのヒト血清アルブミン、及び(e) 該塩としての塩化ナトリウムを含み、ここで、1 mlの再懸濁溶液で約60 mgの該製剤を再懸濁した後に、(a) が約0.25 g/Lの濃度であり；(b) が約10 mMの濃度であり、かつ該pHが約6であり；(c) が約50 g/Lの濃度であり、(d) が約2 g/Lの濃度であり、かつ(e) が約150 mMの濃度である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
（図面の簡単な説明）
【図１】図1：組換えヒトニューレグリン-1（rhNRG-1）希釈液及び該希釈液中0.25 mg/mLに調製された標準溶液の代表的なクロマトグラム。
【００１８】
【図２】図2：pH 3〜10に対しての代表的なSDS-PAGEクロマトグラム。
【００１９】
【図３】図3：40℃、pH 3〜8での濃度対時間プロファイルの結果。
【００２０】
【図４】図4：40℃、pH 2.3〜4.3での濃度対時間プロファイルの結果。
【００２１】
【図５】図5：50℃、pH 2.3〜4.3での濃度対時間プロファイルの結果。
【００２２】
【図６】図6：60℃、pH 3〜8に対しての濃度対時間プロファイルの結果。
【００２３】
【図７】図7：60℃で保存されたpH 2.3〜4.3での濃度対時間プロファイルの結果。
【００２４】
【図８】図8：pH 3〜8に対するpH対分解速度（傾き）プロファイルの結果。
【００２５】
【図９】図9：pH 2.3〜4.3に対するpH対分解速度（傾き）プロファイルの結果。
【００２６】
【図１０】図10：2.3〜8の範囲のpHに対するpH対分解速度（傾き）プロファイルの結果。
【００２７】
【図１１】図11：pH対予測貯蔵期間T(90)の図示。
【００２８】
【図１２】図12：40℃で77時間保存した、pH 3〜8に対する代表的なクロマトグラム。
【００２９】
【図１３】図13：pH 2.3〜3.8に対する代表的なクロマトグラム。
【００３０】
【図１４】図14：ストレス下においた溶液の代表的なクロマトグラム（上から下へ向かって：標準0.255 mg/mL、H2O2 20分後、H2O2 2時間25分後、H2O2 4時間30分後、H2O2 7時間7分後）。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
（発明の詳細な説明）
本件開示は一部において、ニューレグリンの特定の医薬製剤がニューレグリンポリペプチドの驚くべき予想外の安定性を達成するという発見に基づいている。この点に関し、安定性の予想外の改善は、本発明のニューレグリン製剤をより低いpHに適応させることにより達成され得ることが発見された。本明細書に記載される方法と類似の又は等価の任意の方法を本発明の実施において用いることができるが、好ましい方法及び材料は、本明細書に記載されている。
【００３２】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」、及び「該（the）」は、その内容からそうでないことが明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。従って例えば、「1つの緩衝剤」の言及は、2以上の緩衝剤などの混合物を含む。
【００３３】
用語「約」は、特に所与の量の言及において、±10パーセントの偏差を包含することを意味する。
【００３４】
添付の特許請求の範囲を含む本願において使用される単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」、及び「該（the）」はその内容からそうでないことが明確に指示されない限り、複数の指示対象を含み、かつ「少なくとも1つ」及び「1以上」と互換的に使用される。
【００３５】
本明細書で使用される用語「含む（comprises）」、「含んでいる（comprising）」、「含む（includes）」、「含んでいる（including）」、「含む（contains）」、「含んでいる（containing）」、及び任意のこれらの変形は、非排他的な包括を網羅することが意図され、その結果要素または要素の表を含み（comprises）、含み（includes）、又は含む（contains）プロセス、方法、プロダクトバイプロセス、又は物質の組成物がこれらの要素のみを含むだけでなく、明記されていないか、又はそのようなプロセス、方法、プロダクトバイプロセス、又は物質の組成物に固有の他の要素も含むことができる。
【００３６】
本明細書で使用される「ポリペプチド」はペプチド結合を介して結合されたアミノ酸残基、構造バリアント、関連する天然に存在する構造バリアント、及びそれらの合成非天然類似体から構成される多量体を指す。合成ポリペプチドは、例えば、自動ポリペプチド合成機を用いて調製される。用語「タンパク質」は典型的に大きなポリペプチドを指す。用語「ペプチド」は典型的に短いポリペプチドを指す。
【００３７】
本明細書で使用される「タンパク質」は、その内容からそうでないことが明確に指示されない限り、「ポリペプチド」又は「ペプチド」と同義である。
【００３８】
本明細書で使用されるポリペプチドの「断片」は、全長のポリペプチド又はタンパク質発現産物よりも小さい任意のポリペプチド又はタンパク質の部分を指すことが意図される。
【００３９】
本明細書で使用される「類似体」は、構造が実質的に類似しており、同じ生物活性を有するが、活性の程度が様々であり得る任意の2以上のポリペプチドを指し、分子全体又はその断片のいずれかを指す。類似体は1以上のアミノ酸を他のアミノ酸へ変える置換、欠失、挿入及び/又は付加を含む1以上の変異に基づくそれらのアミノ酸配列の組成において異なる。置換は置換されるアミノ酸及びそれに置き換わるアミノ酸の物理化学的又は機能的関連性に基づいて保存的又は非保存的となり得る。
【００４０】
本明細書で使用される「バリアント」は、通常はその分子の一部ではない追加的な化学的部分を含むように改変されたポリペプチド、タンパク質又はそれらの類似体を指す。そのような部分は分子の溶解性、吸収性、生物学的半減期などを変化させることができる。あるいは該部分は該分子の毒性を減少させ、かつ該分子のいかなる有害な副作用をも排除し、又は弱めるなどすることができる。そのような作用に介在することができる部分はレミントン薬科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）(1980)に開示されている。分子にそのような部分を連結させる手順は当技術分野において周知である。例えば限定されることなく、一態様において該バリアントはインビボでタンパク質により長い半減期を付与する化学的修飾を有する血液凝固因子である。様々な態様において、ポリペプチドは糖鎖付加、ペグ化、及び/又はポリシアル化によって修飾される。
【００４１】
断片、バリアント及び類似体をコードするポリヌクレオチドは、当業者によって容易に生成され、天然に存在する分子と同じか、又は類似した生物活性を有する、天然に存在する分子の生物学的に活性な断片、バリアント、又は類似体をコードすることができる。様々な態様において、これらのポリヌクレオチドはPCR技術、及び分子をコードするDNAの消化/連結などを用いて調製される。従って、当業者であれば、限定はされないが、部位指定変異誘発を含む当技術分野で公知の任意の方法を用いて、DNA鎖に一塩基変化を生成させ、変化したコドン及びミスセンス変異をもたらすことができるであろう。本明細書で使用される語句「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、例えば、50％ホルムアミド中42℃でハイブリダイゼーションを行い、0.1×SSC、0.1％ SDS中60℃で洗浄することを意味する。これらの条件において、変異が、ハイブリダイズされる配列の長さ及びGCヌクレオチド塩基含有量に基づいて生じることが、当業者によって理解される。当技術分野の標準である式は、正確なハイブリダイゼーション条件を決定するために適切である。Sambrookらの文献, 「分子クローニング（Molecular Cloning）」中9.47-9.51, Cold Spring Harbor Laboratory Press社, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)を参照されたい。
【００４２】
本明細書で使用される「心不全」は、心臓が代謝する組織の要求に必要とされる速度で血液を拍出しなくなる心臓機能の異常を意味する。心不全は鬱血性心不全、心筋梗塞、頻脈性不整脈、家族性肥大型心筋症、虚血性心疾患、特発性拡張型心筋症、及び心筋炎などの広範囲の疾患状態を含む。心不全は限定されることなく、虚血性、鬱血性、リウマチ性、ウイルス性、毒性又は特発性形態を含むいくつもの因子により引き起こされ得る。慢性心肥大は鬱血性心不全及び心停止の前兆である顕著に病的な状態である。
【００４３】
本明細書で使用されるように、本発明で使用される「ニューレグリン」又は「NRG」は、ErbB2、ErbB3、ErbB4、又はそれらのホモ二量体若しくはヘテロ二量体と結合し、かつ活性化させることができるタンパク質又はペプチドを指し、限定はされないが、全てのニューレグリンアイソフォーム、ニューレグリンEGFドメイン単独、ニューレグリンEGF様ドメインを含むポリペプチド、ニューレグリン変異体若しくは誘導体、及び以下に詳細を記載する上述の受容体もまた活性化させる任意の種類のニューレグリン様遺伝子産物を含む。また、ニューレグリンはNRG-1、NRG-2、NRG-3及びNRG-4タンパク質、ペプチド、断片並びにニューレグリンの活性を模倣する化合物を含む。本発明で使用されるニューレグリンは上述のErbB受容体を活性化させ、それらの生物学的反応を調節することができ、例えば、骨格筋細胞におけるアセチルコリン受容体合成を刺激し；かつ/又は心筋細胞の分化、生存及びDNA合成を改善させることができる。また、ニューレグリンはその生物活性を実質的に変化させない保存的アミノ酸置換を有するそれらのバリアントを含む。適当なアミノ酸の保存的置換は当業者に公知であり、一般に、得られる分子の生物活性を変化させることなく施すことができる。当業者には一般に、ポリペプチドの重要でない領域の単一アミノ酸置換は実質的に生物活性を変化させないことが認識されている（例えば、Watsonらの文献, 「遺伝子の分子生物学（Molecular Biology of the Gene）」, 第4版, 1987, Benjamin Cummings, p.224を参照されたい）。好ましい実施態様において、本発明で使用されるニューレグリンはErbB2/ErbB4ヘテロ二量体又はErbB2/ErbB3ヘテロ二量体と結合し、これらを活性化させることができるタンパク質又はペプチド、例えば、制限を意図するものではないが、EGF様ドメインを含むNRG-1 β2アイソフォームの177〜237断片を含むペプチドを指す。該断片のアミノ酸配列は、以下からなる：
【化１】
0006703483.tif 000002
【００４４】
本明細書で使用される「上皮増殖因子様ドメイン」又は「EGF様ドメイン」は、ErbB2、ErbB3、ErbB4、又はそれらのホモ二量体若しくはヘテロ二量体と結合し、これらを活性化し、かつその内容が全て引用により本明細書に組み込まれているWO 00/64400, Holmesらの文献, Science, 256:1205-1210 (1992); 米国特許第5,530,109号及び第5,716,930号; Hijaziらの文献, Int. J. Oncol., 13:1061-1067 (1998); Changらの文献, Nature, 387:509-512 (1997); Carrawayらの文献, Nature, 387:512-516 (1997); Higashiyamaらの文献, J. Biochem., 122:675-680 (1997);並びにWO 97/09425に開示されているEGF受容体結合ドメインとの構造的類似性を有するニューレグリン遺伝子によってコードされたポリペプチドモチーフを指す。特定の実施態様において、EGF様ドメインはErbB2/ErbB4ヘテロ二量体又はErbB2/ErbB3ヘテロ二量体と結合し、これらを活性化させる。特定の実施態様において、EGF様ドメインは、NRG-1の受容体結合ドメインのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様において、EGF様ドメインはNRG-1のアミノ酸残基177〜226、177〜237、又は177〜240に対応するアミノ酸配列を含む。特定の実施態様において、EGF様ドメインはNRG-2の受容体結合ドメインのアミノ酸配列を含む。特定の実施態様において、EGF様ドメインはNRG-3の受容体結合ドメインのアミノ酸配列を含む。特定の実施態様において、EGF様ドメインはNRG-4の受容体結合ドメインのアミノ酸配列を含む。特定の実施態様において、EGF様ドメインは米国特許第5,834,229号に記載された通りのアミノ酸配列
【化２】
0006703483.tif 000003
を含む。
【００４５】
本発明はNRG製剤を提供し、高度に安定な医薬組成物をもたらす。該安定な医薬組成物は心不全に罹患している個体又は心不全を発症するリスクのある個体の治療における治療薬として有用である。
【００４６】
一実施態様において、NRGの医薬製剤が提供され、該医薬製剤は：(a) NRGタンパク質又はポリペプチド；(b) 1以上の緩衝剤を含み；該NRGタンパク質又はポリペプチドは：
a) 配列番号：2に記載されたアミノ酸配列を含むタンパク質又はポリペプチド；
b) NRGのEGF様ドメインを含むNRGタンパク質；
c) a) のポリペプチドの生物学的に活性な類似体、断片又はバリアント；
d) 配列番号：1に記載されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
e) d) のポリペプチドの生物学的に活性な類似体、断片又はバリアント；及び
f) 中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号：1に記載されたポリヌクレオチドとハイブリッド形成するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドからなる群から選択され；NRGタンパク質又はポリペプチドの濃度は約0.01 g/L〜約1 g/Lの範囲内である；いくつかの好ましい実施態様において、該濃度は約0.01 g/L〜約0.8 g/L、約0.01 g/L〜約0.6 g/L、約0.01 g/L〜約0.4 g/L、約0.01 g/L〜約0.2 g/Lの範囲内である。追加の実施態様において、該NRGタンパク質又はポリペプチドは約1.0 g/L、約0.90 g/L、約0.80 g/L、約0.70 g/L、約0.60 g/L、約0.50 g/L、約0.45 g/L、約0.40 g/L、約0.35 g/L、約0.30 g/L、約0.25 g/L、約0.20 g/L、約0.15 g/L、約0.10 g/L、約.05 g/L又はそれ未満とすることができる。
【００４７】
好ましい一実施態様において、該NRGタンパク質又はポリペプチドは0.25 g/Lの濃度であり；該緩衝剤は約0.1 mM〜約500 mMの範囲内のpH緩衝剤であり、かつ前記pHは約2.0〜約12.0の範囲内であり；該緩衝剤はクエン酸塩、リン酸塩、酢酸塩、ヒスチジン、グリシン、炭酸水素塩、HEPES、トリス、希HCl、希NaOH及びこれらの薬剤の組合せからなる群から選択される。いくつかの好ましい実施態様において、該pHは約3.0〜約10.0、約3.0〜約7.0、約2.3〜3.8の範囲内である。いくつかの実施態様において、該pH値は約2.0、約2.1、約2.2、約2.3、約2.4、約2.5、約2.6、約2.7、約2.8、約2.9、約3.0、約3.1、約3.2、約3.3、約3.4、約3.5、約3.6、約3.7、約3.8、約3.9又は約4.0、約4.1、約4.2、約4.3、約4.4、約4.5、約4.6、約4.7、約4.8、約4.9又は約5.0、約5.1、約5.2、約5.3、約5.4、約5.5、約5.6、約5.7、約5.8、約5.9又は約6.0である。好ましい一実施態様において、該緩衝剤はリン酸塩であり、該pH値は約6である。好ましい一実施態様において、該緩衝剤はリン酸塩であり、該pH値は約3〜約4である。別の好ましい実施態様において、該緩衝剤はリン酸塩であり、該pH値は約3.4である。
【００４８】
本発明の具体的な一実施態様において、該NRG製剤は配列番号：2に記載されたアミノ酸配列を有するNRGポリペプチドを含み；緩衝剤はリン酸塩であり、かつ該pHは約6.0である。本発明の具体的な一実施態様において、該NRG製剤は配列番号：2に記載されたアミノ酸配列を有するNRGポリペプチドを含み；緩衝剤はリン酸塩であり、かつ該pHは約3.4である。
【００４９】
別の実施態様において、NRGの安定な医薬製剤が提供され、該医薬製剤は：(a) NRGタンパク質又はポリペプチド；(b) 1以上の緩衝剤；及び(c) 1以上の安定剤を含み；該安定剤はマンニトール、ソルビトール、キシリトール、スクロース、トレハロース、マンノース、マルトース、ラクトース、グルコース、ラフィノース、セロビオース、ゲンチオビオース、イソマルトース、アラビノース、グルコサミン、フルクトース、ヒト血清アルブミン及びこれらの安定剤の組合せからなる群から選択され；該安定剤は約0.1 g/L〜約200 g/Lの濃度である。いくつかの好ましい実施態様において、該安定剤は約50 g/Lの濃度のマンニトールである。いくつかの好ましい実施態様において、該安定剤は約2 g/L〜約8 g/Lの濃度のヒト血清アルブミンである。
【００５０】
本発明の具体的な一実施態様において、該NRG製剤は配列番号：2に記載されたアミノ酸配列を有するNRGポリペプチドを含み；緩衝剤はpHが約6.0の約10 mMの濃度のリン酸塩であり；安定剤は約2 g/Lの濃度のヒト血清アルブミンである。
【００５１】
さらに別の実施態様において、NRGの安定な医薬製剤が提供され、該医薬製剤は：(a) NRGタンパク質又はポリペプチド；(b) 1以上の緩衝剤；及び(c) 1以上の賦形剤を含み；該1以上の賦形剤はヒト血清アルブミン、マンニトール、グリシン、ポリエチレングリコール、及びこれらの賦形剤の組合せからなる群から選択され；該1以上の賦形剤は約0.1 g/L〜約200 g/Lの濃度である。いくつかの好ましい実施態様において、該賦形剤は約2 g/L〜約8 g/Lの濃度のヒト血清アルブミンである。いくつかの好ましい実施態様において、該賦形剤は約50 g/Lの濃度のマンニトールである。
【００５２】
さらに別の実施態様において、NRGの安定な医薬製剤が提供され、該医薬製剤は：(a) NRGタンパク質又はポリペプチド；(b) 1以上の緩衝剤；(c) 1以上の安定剤；及び(d) 1以上の賦形剤を含む。いくつかの好ましい実施態様において、該安定剤はヒト血清アルブミンである。いくつかの好ましい実施態様において、該賦形剤はマンニトールである。
【００５３】
さらに別の実施態様において、NRGの安定な医薬製剤が提供され、該医薬製剤は：(a) NRGタンパク質又はポリペプチド；(b) 1以上の緩衝剤；(c) 1以上の安定剤；(d) 1以上の賦形剤；及び(e) 1以上の塩を含む。
【００５４】
いくつかの実施態様において、本発明によって提供される製剤は、賦形剤を追加した上記の製剤のいずれかの凍結乾燥により調製された、凍結乾燥医薬製剤である。いくつかの実施態様において、該賦形剤はヒト血清アルブミン、マンニトール、グリシン、ポリエチレングリコール、及びこれらの賦形剤の組合せからなる群から選択される。具体的な実施態様において、該賦形剤はマンニトールである。
【００５５】
別の実施態様において、ニューレグリンの該凍結乾燥医薬製剤は：(a) NRGタンパク質又はポリペプチド；(b) 1以上の緩衝剤；(c) 1以上の賦形剤；(d) 1以上の安定剤；及び(e) 1以上の塩を含み、ここで、1 mlの再懸濁溶液で約60 mgの該製剤を再懸濁した後に、(a) が約0.01 g/L〜1 g/Lの濃度であり；(b) が約0.1 mM〜約500 mMの濃度であり、かつ該pHが約3〜約7であり；(c) が約0.1 g/L〜約200 g/Lの濃度であり、(d) が約0.1 g/L〜約200 g/Lの濃度であり、並びに(e) が約100 mM〜約500 mMの濃度である。
【００５６】
特定の一実施態様において、本発明によって提供される凍結乾燥医薬製剤は、(a) 配列番号：2に記載されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、(b) 該緩衝剤としてのリン酸塩、(c) 該賦形剤としてのマンニトール、(d) 該安定剤としてのヒト血清アルブミン、及び(e) 該塩としての塩化ナトリウムを含み、ここで、1 mlの再懸濁溶液で約60 mgの該製剤を再懸濁した後に、(a) が約0.25 g/Lの濃度であり；(b) が約10 mMの濃度であり、かつ該pHが約6であり；(c) が約50 g/Lの濃度であり、(d) が約2 g/Lの濃度であり、かつ(e) が約150 mMの濃度である。
【００５７】
（凍結乾燥）
【００５８】
一態様において、本発明のNRGポリペプチドを含む製剤は、凍結乾燥により凍結乾燥医薬製剤へと調製することができる。凍結乾燥は当該技術分野で一般的な技術を用いて実行され、開発する組成物に対して最適化されるべきである[Tangらの文献, Pharm Res. 21:191-200, (2004) 及びChangらの文献, Pharm Res. 13:243-9 (1996)]。
【００５９】
一態様において、凍結乾燥サイクルは、3つの工程：凍結、一次乾燥、及び二次乾燥から構成される[A. P. Mackenzie, Phil Trans R Soc London, Ser B, Biol 278:167 (1977)]。該凍結工程において、溶液を冷却して氷形成を開始させる。さらに、この工程は充填剤の結晶化を誘導する。該氷は該一次乾燥段階において昇華する。該一次乾燥段階は昇華を促進するために真空を用い、熱を導入しながら氷の蒸気圧より下へとチャンバ内を減圧させることにより遂行される。最後に、二次乾燥段階ではチャンバの減圧下高い保存温度で吸着水又は結合水が除去される。このプロセスは凍結乾燥ケーキとして知られる物質を生じる。その後該ケーキは滅菌水又は適当な注射用希釈液により再構成することができる。
【００６０】
該凍結乾燥サイクルは賦形剤の最終物理状態を決定するだけでなく、再構成時間、外観、安定性及び最終水分含有量のような他のパラメータにも影響する。凍結状態の組成物構造は特定の温度で起こるいくつかの転移（例えば、ガラス転移、湿潤、及び結晶化）を通じて進行し、該構造を使用して、凍結乾燥プロセスを理解し、最適化することができる。ガラス転移温度（Tg及び/又はTg'）は溶質の物理状態に関する情報を提供することができ、かつ示差走査熱量測定（DSC）によって決定することができる。Tg及びTg'は凍結乾燥サイクルを設計する際に考慮しなくてはならない重要なパラメータである。例えば、Tg'は一次乾燥にとって重要である。さらに、乾燥状態において、ガラス転移温度は最終生成物の保存温度に関する情報を提供する。
【００６１】
（緩衝液及び緩衝剤）
【００６２】
本明細書で使用される「緩衝液」又は「緩衝剤」は、溶液のpHを許容し得る範囲である約2.0〜約9.0に維持する薬剤又は薬剤の組合せを包含する。適当な緩衝液は、他の成分と化学反応を起こさず、かつ所望の程度のpHの緩衝を提供するに十分な量存在する緩衝液である。
【００６３】
医薬として活性のあるタンパク質製剤の安定性は、通常狭いpH範囲内で最大となることが観察される。この最適安定性のpH範囲は、前製剤試験において早期に特定する必要がある。加速安定性試験及び熱量測定スクリーニング試験のようないくつかのアプローチが、この試みにおいて有用である（Remmele R. L. Jr.らの文献, Biochemistry, 38(16): 5241-7 (1999)）。いったん製剤が完成したら、該タンパク質を製造し、貯蔵期間を通じて維持しなくてはならない。そのため、該製剤中のpHを制御するために、緩衝剤がほとんど常に利用される。
【００６４】
緩衝種の緩衝能は、pKaと等しいpHにおいて最大となり、この値から離れるようにpHが上昇するか、又は減少すると、減少する。該緩衝能の90パーセントがそのpKaの1つのpH単位内に存在する。また、緩衝能は緩衝液濃度の上昇と比例して上昇する。
【００６５】
緩衝液を選ぶ際に、いくつかの要素を考慮する必要がある。第一にまず、該緩衝種及びその濃度はそのpKa及び所望の製剤pHに基づいて定義される必要がある。同様に重要なのは、該緩衝液が該タンパク質及び他の製剤賦形剤と適合し、かついかなる分解反応も触媒しないことが保証されることである。考慮すべき第三の重要な態様は、投与に際し該緩衝液が誘発し得る刺激感及び炎症である。例えば、クエン酸塩は注射に際し刺激感を引き起こすことが公知である（Laursen Tらの文献, Basic Clin Pharmacol Toxicol., 98(2): 218-21 (2006)）。刺激感及び炎症の可能性は、皮下（SC）又は筋肉内（IM）経路を介して投与される薬物に対してより大きい。SC又はIM経路においては、該製剤が投与に際し血液中へと速やかに希釈されるIV経路によって投与される場合と比較して、薬物溶液は相対的に長期間その場所にとどまる。直接IV注入により投与される製剤については、緩衝液の総量（及び任意の他の製剤成分）をモニタリングする必要がある。患者において心臓血管作用を誘発し得る、リン酸カリウム緩衝液の形態で投与されるカリウムイオンについては、特に注意を払わねばならない（Hollander-Rodriguez J Cらの文献, Am. Fam. Physician., 73(2): 283-90 (2006)）。
【００６６】
凍結乾燥製剤のための緩衝液は、さらに考慮することを必要とする。酢酸塩及びイミダゾールのような一般的な緩衝液の中には、凍結乾燥のプロセスの間に昇華又は蒸発するおそれがあり、それによって凍結乾燥の間、又は再構成の後に製剤のpHを変化させるものもある。
【００６７】
該組成物中に存在する緩衝液系は、生理学的に適合し、医薬製剤を所望のpHに維持するように選択される。一実施態様において、溶液のpHは、pH 2.0〜pH 12.0である。例えば、溶液のpHは、例えば、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、11.0、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、又は12.0とすることができる。
【００６８】
pH緩衝化合物は、製剤のpHを所定のレベルに維持するのに適当な任意の量存在し得る。一実施態様において、pH緩衝濃度は0.1 mM〜500 mMである。例えば、pH緩衝剤は少なくとも0.1、0.5、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.5、1.7、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、又は500 mMであることが意図される。
【００６９】
本明細書に記述される製剤を緩衝するのに用いられる例示的なpH緩衝剤には、限定はされないが、有機酸、グリシン、ヒスチジン、グルタミン酸塩、コハク酸塩、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、トリス、HEPES、及び限定はされないが、アスパラギン酸塩、ヒスチジン、及びグリシンを含むアミノ酸又はアミノ酸の混合物がある。本発明の一実施態様において、該緩衝剤はリン酸塩である。
【００７０】
（安定剤及び充填剤）
【００７１】
本医薬製剤の一態様において、安定剤（又は、安定剤の組合せ）は、保存により誘発される凝集及び化学的分解を防止し、又は低下させるために追加される。再構成に際して溶液にもやがかかったり、又は溶液が濁ったりしたら、タンパク質が沈殿したか、又は少なくとも凝集したことを示している。用語「安定剤」は、凝集、又は水性状態における化学的分解（例えば、自己分解、脱アミド化、酸化など）を含む、物理的分解を防止することのできる賦形剤を意味する。意図される安定剤には、限定はされないが、スクロース、トレハロース、マンノース、マルトース、ラクトース、グルコース、ラフィノース、セロビオース、ゲンチオビオース、イソマルトース、アラビノース、グルコサミン、フルクトース、マンニトール、ソルビトール、グリシン、アルギニンHCL、デキストラン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、シクロデキストリン、N-メチルピロリデン、セルロース、及びヒアルロン酸などの多糖を含むポリヒドロキシ化合物がある[Carpenterらの文献, Develop. Biol. Standard 74:225, (1991)]。本製剤において、該安定剤は約0.1、0.5、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.5、1.7、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、又は200 g/Lの濃度で組み込まれる。本発明の一実施態様において、マンニトールは安定剤として使用される。
【００７２】
また、所望の場合、該製剤は適当な量の充填剤及び浸透圧調節剤も含む。充填剤には、例えば限定されることなく、マンニトール、グリシン、スクロース、多量体（例えばデキストラン、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース）、ラクトース、ソルビトール、トレハロース、又はキシリトールがある。
【００７３】
（製剤及び賦形剤）
【００７４】
賦形剤は薬物生産品（例えば、タンパク質）に安定性及び送達を与えるか、又は該薬物生産品の安定性及び送達を高める添加物である。それらを含める理由に関わらず、賦形剤は製剤の一部を構成する成分であり、従って安全で、患者によく認容される必要がある。タンパク質薬物については、賦形剤の選択は特に重要であり、それは、該賦形剤が該薬物の有効性及び免疫原性の両方に影響し得るためである。従って、タンパク質製剤は適当な安定性、安全性、及び市場性を与える賦形剤を適切に選択することにより、開発する必要がある。
【００７５】
タンパク質製剤開発の主要な困難は、生産品を製造、輸送、及び保存時のストレスに対し安定化させることである。製剤賦形剤の役割は、これらのストレスに対する安定化を提供することである。また、賦形剤は高濃度タンパク質製剤の送達を可能とし、患者の利便を高めるため、該高濃度タンパク質製剤の粘性を低下させるために利用される。一般に、賦形剤は該賦形剤がタンパク質を様々な化学的及び物理的ストレスに対し安定化させる機構に基づいて分類することができる。一部の賦形剤は、特定のストレスの作用を軽減し、又は特定のタンパク質の特定の感受性を調節するために使用される。他の賦形剤は、タンパク質の物理的安定性及び共有結合性安定性に対するより一般的な作用を有する。本明細書に記載される賦形剤は、その化学的類型又は製剤におけるその機能的役割によって整理されている。安定化形態についての簡潔な記載を、それぞれの賦形剤の種類を議論する際に提供する。
【００７６】
賦形剤の量又は範囲は、生物薬剤（例えば、タンパク質）の安定性の保持を促進する、本発明の生物医薬製剤を達成する任意の特定の製剤中に含めることができる。例えば、本発明の生物医薬製剤中に含まれる塩の量及び種類は、所望の浸透圧（すなわち、等張、低張又は高張）の最終溶液並びに該製剤中に含まれる他の成分の量及び浸透圧に基づいて選択される。
【００７７】
さらに、特定の賦形剤がモル濃度で報告される場合、当業者は溶液の当量パーセント（％）w/v（例えば、（溶液の溶液試料/mL中の物質のグラム数）×100％）もまた意図されることを認識するであろう。
【００７８】
本明細書に記載される賦形剤の濃度は、特定の製剤内での相互依存性を共有する。例として、充填剤濃度は例えば、タンパク質が高濃度で存在する場合、又は例えば、安定剤が高濃度で存在する場合に、降下させることができる。充填剤が存在しない特定の製剤の等張性を維持するために、安定剤濃度が適宜調節されるであろう（すなわち、安定剤の「浸透圧調整」量が使用されるであろう）。賦形剤には、例えば限定されることなく、ヒト血清アルブミン、マンニトール、グリシン、ポリエチレングリコール、及びこれらの賦形剤の組合せがある。
【００７９】
（塩）
【００８０】
塩はしばしば、タンパク質の溶解性、物理的安定性、及び等張性にとって重要となり得る製剤のイオン強度を上昇させるために追加される。塩は様々な様式でタンパク質の物理的安定性に作用し得る。イオンはタンパク質表面の電荷を帯びた残基に結合することにより、未変性状態のタンパク質を安定化することができる。あるいは、塩はタンパク質骨格（--CONH--）に沿ってペプチド基に結合することにより、変性状態を安定化させることができる。また、塩はタンパク質分子内での残基間の反発性静電的相互作用を遮蔽することにより、タンパク質の未変性立体構造を安定化させることができる。また、タンパク質製剤中の塩は、タンパク質の凝集及び不溶性をもたらし得るタンパク質分子間の誘引性静電的相互作用を遮蔽することができる。提供される製剤において、塩濃度は約1、10、20、30、40、50、80、100、120、150、200、300、及び500 mMの間である。
【００８１】
（調製方法）
【００８２】
本発明は医薬製剤の調製方法をさらに意図する。
【００８３】
本方法は以下の工程の1以上をさらに含む：凍結乾燥前に前記混合物に本明細書に記載の安定剤を追加すること、凍結乾燥前に前記混合物にそのそれぞれが本明細書に記載されている充填剤、浸透圧調節剤、及び賦形剤から選択される、少なくとも1つの薬剤を追加すること。
【００８４】
凍結乾燥物質の標準的な再構成の実践は、純水又は滅菌注射用水（WFI）（典型的には、凍結乾燥中に除去された体積と等しい）を追加して体積を戻すことであるが、抗菌剤の希釈溶液が時折、非経口投与用の医薬の生産において使用される[Chenの文献, Drug Development and Industrial Pharmacy, 18:1311-1354 (1992)]。従って、再構成されたNRG組成物を調製するための方法が提供され、該方法は本発明の凍結乾燥NRG組成物に希釈液を追加する工程を含む。
【００８５】
凍結乾燥物質は、水溶液として再構成され得る。様々な水性担体、例えば滅菌注射用水、複数回用量使用のための防腐剤を含む水、又は適量の界面活性剤を含む水（例えば、水性懸濁液の製造に適した賦形剤と混合された活性化合物を含む該水性懸濁液）。様々な態様において、そのような賦形剤は、懸濁剤、例えば限定されることなく、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、及びアラビアゴムであり；分散剤又は湿潤剤は、天然に存在するホスファチド、例えば限定されることなく、レシチン、又はアルキレンオキシドの脂肪酸との縮合産物、例えば限定されることなくステアリン酸ポリオキシエチレン、又はエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールの縮合産物、例えば限定されることなく、ヘプタデカエチル-エンオキシセタノール、又はエチレンオキシドと脂肪酸に由来する部分エステルの縮合産物及びモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトールのようなヘキシトール、又はエチレンオキシドと脂肪酸に由来する部分エステルの縮合産物、及びヘキシトール無水物、例えば限定されることなく、モノオレイン酸ポリエチレンソルビタンである。また、様々な態様において、水性懸濁液は1以上の防腐剤、例えば限定されることなく、エチル、又はn-プロピル、p-ヒドロキシ安息香酸塩を含む。
【００８６】
（投与）
【００８７】
ヒト又は試験動物に組成物を投与するために、一態様において、該組成物は1以上の医薬として許容し得る担体を含む。語句「医薬として」又は「薬理学的に」許容し得るとは、安定で、凝集及び切断産物のようなタンパク質分解を阻害し、それに加えて以下に記載するように、当技術分野で周知の経路を用いて投与された場合にアレルギー性反応、又は他の有害反応を引き起こさない、分子実体及び組成物を指す。「医薬として許容し得る担体」は、任意の及び全ての臨床上有用な溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含み、先に開示したこれらの薬剤を含む。
【００８８】
本明細書で使用される「再懸濁溶液」は、溶液、例えばいかなるアレルギー反応又はいかなる他の有害反応も引き起こすことなく、臨床的に使用することができる滅菌DI水又は生理食塩水を指す。
【００８９】
該医薬製剤は、経口的に、局所的に、経皮的に、非経口的に、吸入噴霧により、経膣的に、経直腸的に、又は頭蓋内注射により投与される。本明細書で使用される用語、非経口的は、皮下注射、静脈内、筋肉内、大槽内への注射、又は注入技術を含む。静脈内、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内、髄膜下、眼球後方、肺内注射及び/又は特定の部位での外科的植込みによる投与が、同様に意図される。一般的に、組成物は発熱物質並びに受容者にとって有害となり得る他の不純物を本質的に含まない。
【００９０】
該組成物の単一の又は複数回の投与は、治療する医師によって選択された投与量レベル及び様式をもって実行される。疾患の予防又は治療について、適当な投薬量の決定は、先に定義したように、治療される疾患の種類、該疾患の重症度及び経過、薬物が予防目的又は治療目的のいずれで投与されるか、過去の療法、患者の病歴及び薬物への反応、並びに主治医の裁量に依存する。
【００９１】
（キット）
【００９２】
追加の態様として、本発明は対象に投与するためのその使用を促進する様式で包装された1以上の凍結乾燥組成物を含むキットを含む。一実施態様において、そのようなキットは本明細書に記載された医薬製剤（例えば、治療用タンパク質又はペプチドを含む組成物）を含み、密封ボトル又は密封容器のような容器中に包装され、該方法の実践における該化合物又は組成物の使用を記載するラベルが容器に添付されるか、又は包装中に含まれる。一実施態様において、該キットは治療用タンパク質又はペプチド組成物を有する第一容器及び該組成物用の生理学的に許容し得る再構成溶液を有する第二容器を含む。一態様において、該医薬製剤は単位剤形中に包装される。該キットは特定の投与経路に従う該医薬製剤の投与に適当な装置をさらに含むことができる。好ましくは、該キットは該医薬製剤の使用を記載したラベルを含む。
【００９３】
（投薬量決定）
【００９４】
本明細書に記載される状態を治療するための方法に関わる投薬レジメンは、薬物の作用を変化させる様々な因子、例えば該患者の年齢、状態、体重、性別及び食事、何らかの感染の重症度、投与時間、並びに他の臨床的因子を考慮して主治医により決定されるものとする。
【００９５】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者によって共通に理解されているものと同じ意味を有する。本節に記載される定義が引用により本明細書に組み込まれている特許、出願、公開出願及び他の刊行物に記載された定義と対立するか、又はそうでなくとも一致しない場合、本節に記載された定義を引用により本明細書に組み込まれた定義に優先する。
【００９６】
先行する記載から、本明細書に記載される発明に変形及び改変を施して、該発明を様々な使用法及び条件に採択することができることは、明らかであろう。また、そのような実施態様は以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【００９７】
本明細書における変数のいかなる定義においても、要素の表の列挙はあらゆる単一の要素又は表に記載された要素の組合せ（若しくはサブコンビネーション）としての変数の定義を含む。本明細書における実施態様の列挙は、任意の単一の実施態様又は任意の他の実施態様若しくはそれらの部分との組み合わせとしての実施態様を含む。
【００９８】
本明細書に言及される全ての特許及び刊行物は、それぞれの独立の特許及び刊行物が具体的かつ個別的に引用により組み込まれることが示される場合と同程度に、引用により本明細書に組み込まれる。
【００９９】
以下の実施例は例示として提供されるが、限定するものではない。
【実施例】
【０１００】
（実施例）
本発明はいかなる様式においても限定することを意図するものではない以下の実施例により例示される。本明細書で使用されるように、該実施例で使用される「rhNRG-1」は、配列番号：2のアミノ酸配列からなるタンパク質又はペプチドを指す。
【０１０１】
（実施例1：rhNRG-1のpH安定性プロファイリング）
【０１０２】
（1：実験の目的）
【０１０３】
1.1 様々なpH緩衝液（pH 3〜pH 10）におけるrhNRG-1のpH安定性プロファイルをSDS-PAGEにより生成するため。
【０１０４】
1.2 様々なpH緩衝液(pH 3〜pH 8)及びDI水におけるrhNRG-1のpH安定性プロファイルをRP-HPLCにより生成するため。
【０１０５】
1.3 目的1.2からの発見に基づき、狭い作業pH範囲（pH 2.3〜4.3）のpH安定性プロファイルを生成する。
【０１０６】
1.4 該狭いpH安定性試験に基づき、rhNRG-1製剤に対する最適pHを決定する。
【０１０７】
（2. 実験手順）
【０１０８】
2.1 RP-HPLC法を開発し、rhNRG-1薬物物質の純度を決定する。
【０１０９】
表1：方法条件
【表１】
0006703483.tif 000004
【０１１０】
1.24 mg/mL rhNRG-1、20 mMリン酸緩衝液及び0.5M NaCl、pH 5.5（「API」）を含むrhNRG-1のバッチ201204001を、全てのHPLC分析の標準溶液の調製に使用した。
【０１１１】
rhNRG-1用希釈液及び該希釈液中で0.25 mg/mLに調製された標準溶液の代表的なクロマトグラムが、図1に示されている（それぞれ、上及び下）。
【０１１２】
表2：0.25 mg/mLの標準を6回注入することによって評価された方法の正確さ
【表２】
0006703483.tif 000005
＊生成されたピーク面積に対するRSDは0.4であった。これは、正確さの許容し得る基準である＜2.0の範囲内である。
【０１１３】
2.2 pH 3〜pH 10の緩衝液を調製する。
【０１１４】
15 mLのプラスチックチューブ中に、API及びDI水又は新しい緩衝液を加える。0.25 mg/mL rhNRG-1、10 mM新緩衝液、4 mMリン酸塩（APIに由来）及び0.1M NaCl（APIに由来）を含む溶液中に混合する。
【０１１５】
表3：最終pH及び新しい緩衝液
【表３】
0006703483.tif 000006
【０１１６】
表4：ガラスバイアル中に密封され保存されたそれぞれの溶液の状況
【表４】
0006703483.tif 000007
【０１１７】
2.3 SDS-PAGEにより純度を検出する。
【０１１８】
40℃については、10日後にSDS-PAGEにより試験する。脱染I（45％水、45％メタノール、10％酢酸、直前に作製）；0.1％クマシーブルー染色；ランニングゲル（12％〜15％）が個別のポリペプチドを別個のバンドへと分離する助けとなる。
【０１１９】
2.4 RP-HPLCにより溶液を検出する。
【０１２０】
60℃については、150 μLを取り、0、7.5、24、48、65及び77時間後にHPLCで試験する。
【０１２１】
40℃については、150 μLを取り、28.5、49及び77時間後にHPLCで試験する。
【０１２２】
狭いpH試験（pH 2.3〜4.3）のための準備：
【０１２３】
プラスチックチューブ中に、API及びDI水を加える。0.25 mg/mL rhNRG-1、4 mMリン酸塩（API由来）及び0.1M NaCl（API由来）を含む溶液中に混合する。希HClを用いてpHを下げて調節する。いったん第一の目標値に達したら、約8 mLを別々のプラスチックチューブに移し、滴定を続けて次の目標値に到達させ、それぞれの目標値（すなわち、4.29、3.90、3.78、3.47、3.36、3.17、3.02、2.85、2.58、2.37及び2.33）で約8 mLを収集する。それぞれのpHについて、ガラスバイアルに移し、それぞれのレベルで合わせて5つのバイアルとする。1つのバイアルをそれぞれ2〜8、25、40、50及び60℃に置く。
【０１２４】
60℃について、200 μLを取り、0、3.7、4.7及び5.7日後にHPLCで試験する。
【０１２５】
50℃について、200 μLを取り、0、4.7及び11日後にHPLCで試験する。
【０１２６】
40℃について、200 μLを取り、0、5.7、7及び11日後にHPLCで試験する。
【０１２７】
狭い範囲のpH-速度（安定性）プロファイルをそれぞれの温度で構築する。
【０１２８】
アレニウスの等式を導き、5℃での有効期間を予測する。
【０１２９】
（3. 結果及び結論）
【０１３０】
pH 3〜10に対する代表的なSDS-PAGEクロマトグラムを図2に示す。
【０１３１】
RP-HPLC法によって測定されたrhNRG-1の初期濃度及びストレス後濃度を以下に列挙する。
【０１３２】
表5：40℃、pH 3〜8での結果
【表５】
0006703483.tif 000008
【０１３３】
表6：60℃、pH 3〜8での結果
【表６】
0006703483.tif 000009
NT：試験していない。
【０１３４】
表7：40℃、pH 2.3〜4.3での結果
【表７】
0006703483.tif 000010
【０１３５】
表8：50℃、pH 2.3〜4.3での結果
【表８】
0006703483.tif 000011
NA：利用可能でない
【０１３６】
表9：60℃、pH 2.3〜4.3での結果
【表９】
0006703483.tif 000012
NA：利用可能でない
【０１３７】
40℃、pH 3〜8での濃度対時間プロファイルは図3に示されている。
【０１３８】
40℃、pH 2.3〜4.3での濃度対時間プロファイルは図4に示されている。
【０１３９】
50℃、pH 2.3〜4.3での濃度対時間プロファイルは図5に示されている。
【０１４０】
60℃、pH 3〜8での濃度対時間プロファイルは図6に示されている。
【０１４１】
60℃、pH 2.3〜4.3での保存時の濃度対時間プロファイルは図7に示されている。
【０１４２】
それぞれの濃度対時間プロファイルについて、線形回帰分析を実施し、回帰式の傾きを用いて、零次速度過程を仮定の下分解速度をmg/mL/時間で表した。
【０１４３】
pH 3〜8についてのpH対分解速度（傾き）プロファイルを、図8に示す。
【０１４４】
pH 2.3〜4.3についてのpH対分解速度（傾き）プロファイルを、図9に示す。
【０１４５】
2.3〜8の範囲のpHについてのpH対分解速度（傾き）プロファイルを、図10に示す。
【０１４６】
それぞれのpH（3〜8）及び温度において評価された分解速度及びT90（初期濃度又は0.025 mg/mLの10％が分解する時間）は、以下の通りに提供される（表10）：
【表１０】
0006703483.tif 000013
。
【０１４７】
それぞれのpH（2.3〜3.9）についての40、50及び60℃でのデータを使い、アレニウスプロットを用いて5℃、それぞれのpHレベルでの有効期間を予測した。アレニウスプロットから計算されるT90値は、以下の通り提供される（表11）：
【表１１】
0006703483.tif 000014
。
【０１４８】
図11はpH対予測された有効期間T(90)の図式的表現である。
【０１４９】
40℃、pH 3〜8で77時間保存時のクロマトグラムを図12に示す。
【０１５０】
pH 2.3〜3.8についてのクロマトグラムを図13に示す。
【０１５１】
（結論：）
1. 溶液中でのrhNRG-1の安定性は、顕著にpH依存的であり、該rhNRG-1は酸性溶液（pH 3.0〜7.0）中において、塩基性溶液（pH 8.0〜10.0）中におけるよりも安定である。
2. 該rhNRG-1に関して観察される最も高い安定性は、最も低いpH（3.2）におけるものである。
3. 低pHでは、T90はpH 4.2でのT90の約2倍であり、又はその元の緩衝液（pH 5.5、無調整）中におけるT90の約20倍である。従って、rhNRG-1溶液について低pHに適応させることにより、安定性の大きな向上が期待できる。
4. 狭いpH試験により、最も高い安定性はpH 3.4（± 0.2）において示された。
【０１５２】
（実施例2：強制分解試験）
【０１５３】
（1. 実験の目的）
【０１５４】
rhNRG-1の安定性を試験するため。
【０１５５】
（2. 実験手順）
【０１５６】
API溶液を以下の通りに強制的に分解させた（表12）：
【表１２】
0006703483.tif 000015
。
時点で収集された試料をRP-HPLCにより分析した。
【０１５７】
（3. 結果及び結論）
表13：酸化曝露の結果
【表１３】
0006703483.tif 000016
ストレスを受けた溶液の代表的なクロマトグラムを図14に示す（上から下へ向かって：標準0.255 mg/mL、H2O2、20分後、H2O2、2時間25分後、H2O2、4時間30分後、H2O2、7時間7分後）。
【０１５８】
（結論：）
【０１５９】
1. rhNRG-1は過酸化物に対する感受性が非常に高く、酸化を受けやすい。
【０１６０】
2. 安定性を高めるために抗酸化剤及び安定剤を製剤中に使用することが考慮されるべきである。
【０１６１】
（実施例3：rhNRG-1製剤の安定性に対する異なる賦形剤の作用）
（1. 実験の目的）
【０１６２】
rhNRG-1製剤の安定性に対する異なる賦形剤の作用を試験するため。
【０１６３】
（2. 実験材料）
【０１６４】
2.1 16のrhNRG-1製剤が表14に列挙された。
【０１６５】
2.2 SHELLAB/Model1535サーモスタット付き容器（Sheldon社）
【０１６６】
2.3 HPLC Angilent 1200 (Angilent社)
【０１６７】
2.4 ZORBAX GF-250ゲルカラム(4.6 mm×250 mm) 
【０１６８】
表14 試験製剤表
【表１４】
0006703483.tif 000017
【０１６９】
（3. 実験手順）
【０１７０】
3.1 試料を37℃に5日間置いた。
【０１７１】
3.2 SEC-HPLCにより試料純度を試験する。
【０１７２】
移動相：0.7 M NaCl、30 mM PB（pH7.0）
【０１７３】
HPLCクロマトグラフィー条件：流速0.5 ml/分、注入量20 μl、決定された波長450 nm、記録時間20分。
【０１７４】
（4. 結果）
【０１７５】
面積正規化（area normalization）法により分析を実行し、それぞれの試料の純度を計算した。4つのrhNRG-1製剤の試験結果を表15に列挙する。
【０１７６】
表15：5日後の試験製剤の純度
【表１５】
0006703483.tif 000018
【０１７７】
グルカン製剤（C1＆C2）、アルギニン製剤（E1＆E2）及びスクロース製剤（F1＆F2）の純度データは一致しない。そのためグルカン、アルギニン及びスクロースはrhNRG-1製剤のための優れた賦形剤ではない。PVP（ポリビニルピロリドン）は充填剤であり、PVPを含むrhNRG-1製剤はSEC-HPLCによる純度データを提供できない。この結果はラクトース、トレハロース、マンニトール及びグリシンがrhNRG-1製剤のための好ましい賦形剤であることを示していた。
【０１７８】
（実施例4：NRG製剤の生物活性へのヒト血清アルブミン（HSA）濃度の作用）
【０１７９】
（1. 要旨）
【０１８０】
HER2/neu遺伝子はチロシンタンパク質キナーゼである膜貫通タンパク質p185をコードする。ErbB3又はErbB4とのニューレグリン-1の結合はヘテロ二量体ErbB3-ErbB2及びErbB4-ErbB2の形成を誘発し、かつHER2にコードされたチロシンタンパク質キナーゼを活性化させ、これらはニューレグリン-1の機能性シグナル伝達の媒体となる。ニューレグリン-1とその受容体との結合がErbB2タンパク質のリン酸化の誘因となるという事実に基づいて、インビトロで定量的に組換えニューレグリン-1の生物活性を決定するための、迅速で高感度かつ高流量の方法が確立された。
【０１８１】
（2. 実験の目的）
【０１８２】
NRG製剤の生物活性に対する異なる濃度のHSAの作用を試験するため。
【０１８３】
（3. 実験材料）
【０１８４】
（3.1 rhNRG-1製剤）
【０１８５】
参照試料：0 g/L HSA、250 μg/L rhNRG-1、10 mMリン酸緩衝試薬、150 mM NaCl、50 g/L マンニトール
【０１８６】
試験試料A：0.5 g/L HSA、250 μg/L rhNRG-1、10 mMリン酸緩衝試薬、150 mM NaCl、50 g/Lマンニトール
【０１８７】
試験試料B：2 g/L HSA、250 μg/L rhNRG-1、10 mMリン酸緩衝試薬、150 mM NaCl、50 g/L マンニトール
【０１８８】
試験試料C：8 g/L HSA、250 μg/L rhNRG-1、10 mMリン酸緩衝試薬、150 mM NaCl、50 g/Lマンニトール
【０１８９】
3.2 96穴細胞培養プレート（Corning社）；Costar 96穴ELISA検出プレート。
【０１９０】
3.3 U.S. ATCCから導入したヒト乳癌細胞株を37℃、50％ CO2下、基礎培地中で培養した。
【０１９１】
3.4 所与の量のDMEMを計量し、対応する体積を定量化し、3.7 g/LのNaHCO2、0.1 g/Lグルタミン及び5.5 g/LのHEPESを追加する。
【０１９２】
3.5 基礎培地。4℃で保存された10％ウシ胎仔血清及びインスリン9 mg/Lを含むDMEM培地。
【０１９３】
3.6 滅菌PBS（0.01M、pH 7.4）。
【０１９４】
3.7 Ca2+及びMg2+フリーPBSを用いて調製された0.25％膵臓酵素。
【０１９５】
3.8 抗ErbB2モノクローナル抗体、コーティング緩衝液、洗浄液。ErbB3及びErbB4との交差反応性を有さないマウス抗ヒトErbB2細胞外機能性ドメインH4モノクローナル抗体を選択する。コーティング緩衝液；pH 9.6, 0.05M炭酸塩緩衝液。洗浄液：0.01M PBS＋0.05％ Tween-20。
【０１９６】
3.9 西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識されたマウス抗ヒトリン酸化プロテアーゼモノクローナル抗体（抗P-tyr-HRP）。
【０１９７】
3.10 基質、基質緩衝液。基質（TMB）：2 mg/ml TMB（無水アルコールで調製）。基質緩衝液：0.2 Mクエン酸＋0.1 M Na2HPO4 (pH 5.0)。作用基質：基質緩衝液9 ml＋TMB 1 ml＋3％ H2O2 10 μl（必要に応じて調製）。
【０１９８】
3.11 終結剤 2N H2SO4。
【０１９９】
3.12 細胞断片化解消（defragmentation）溶液。150 mM NaCl＋50 mM Hepes＋1％ Triton-X 100＋2 mM (オルトバナジウム酸ナトリウム)+0.01％ (チメロソール（thimerosol）)。混合プロテアーゼ阻害剤の錠剤（Tabletten, Proteasen-Irhibitoren-Cocktail）を1つ、操作前に全ての25 mlに追加する。
【０２００】
（4. 実験手順）
【０２０１】
4.1 試料を37℃に4日間置いた。
【０２０２】
4.2 細胞の接種
【０２０３】
MCF-7細胞を所与の量まで増幅させ、滅菌PBS溶液で洗浄し、続いて0.25％トリプシナーゼで消化した。計数後、細胞の濃度を基礎培地で調節した。96穴細胞培養プレートに細胞を5×104/穴、100 μl/穴だけ加え、37℃、5％ CO2下、培養箱中で一晩培養した。
【０２０４】
4.3 細胞飢餓
【０２０５】
96穴プレート中の培地を全て吸引し、それぞれの穴を37℃に温めたPBSで洗浄し、続いて100 μl DMEM培地（ウシ血清フリーかつインスリンを含まない）を加える。細胞を37℃、5％ CO2下、培養箱中で24時間培養した。
【０２０６】
4.4 コーティング
【０２０７】
抗ErbB2細胞外機能性ドメインH4抗体をコーティング緩衝液で希釈して6 μg /mlとし、続いて96穴ELISAプレートに穴当たり50 μlを加え、4℃で一晩（16〜18時間）置く。
【０２０８】
4.5 試験する予定の対照溶液及び試料溶液を希釈する。
【０２０９】
試験する予定の対照溶液及び試料をそれぞれDMEM培地（ウシ血清フリーかつインスリンを含まない）で希釈して2 μg/mlとし、続いて再び3回の勾配希釈を実行し、合わせて9倍希釈する。
【０２１０】
4.6 細胞のリン酸化
【０２１１】
飢餓後の96穴細胞培地を吸引し、標準物質及び試験する予定の試料を穴当たり100 μl加え、それぞれの濃度について2つの2連の穴を準備する。同時に陰性対照（すなわち、DMEM培地プラセボ対照）を準備する。37℃で20分の反応。
【０２１２】
4.7 細胞の分解
【０２１３】
試料を速やかに吸引し、PBSで一度洗浄し、それぞれの穴に100 μlの断片化溶液を追加し、4℃の冷蔵庫中で30分間断片化させた。全ての係留依存的な（anchorage-dependent）細胞が沈降するまで氷浴条件下で水平に撹拌し、4℃、15,000 rpmで15分間遠心する。
【０２１４】
4.8 ELISA検出プレートの密封
【０２１５】
プレートを5回洗浄する。洗浄液を用いて5％スキムミルクを調製し、プレートのそれぞれの穴に200 μlを加え、37℃で2時間置く。
【０２１６】
4.9 試料を追加する。
【０２１７】
密封ELISAプレートを3回洗浄し、穴当たり90 μlの標準細胞断片化溶液及び試験試料断片化溶液を加え、同時に陰性対照を準備し、37℃で1時間置く。
【０２１８】
4.10 酵素標識抗体を加える。
【０２１９】
プレートを5回洗浄し、1:500の洗浄液でHRP酵素結合マウス抗リン酸化チロシンタンパク質抗体を希釈し（規準を用いた、かつ時間を用いた産物により決定された）、プレートのそれぞれの穴に100 μlを加える。37℃で1時間置く。
【０２２０】
4.11 基質の発色
【０２２１】
プレートを5回洗浄し、調製された基質作業溶液を穴当たり100 μl加え、37℃で10分間置く。
【０２２２】
4.12 終結
【０２２３】
2N H2SO4を穴当たり50 μl加え、反応を終結させた。
【０２２４】
4.13 OD値読み取り
【０２２５】
ELISAリーダー上での比色定量分析、450 nmの波長、655 nmの参照波長を決定し、結果を記録する。
【０２２６】
（5. 結果）
【０２２７】
組換えヒトニューレグリン-1の濃度対OD値による構築及び分析を、試験する予定のそれぞれの試料の半有効投与量を計算する線形回帰法を用いて実行した。4つのrhNRG-1製剤の試験結果を表16に列挙する。
【０２２８】
表16  試験試料の生物活性
【表１６】
0006703483.tif 000019
【０２２９】
試料B及び試料Cの生物活性データ（表16を参照されたい）は、明らかに参照試料及び試料Aのデータより優れている。この結果は、2 g/L（試料B）又は8 g/L（試料C）のHSA濃度が、rhNRG-1製剤に対して好ましい濃度であることを示していた。
【０２３０】
（実施例5：加速及び長期安定性試験）
【０２３１】
（1. 実験の目的）
【０２３２】
rhNRG-1の最終薬物生産品の安定性を試験するため。
【０２３３】
（2. 実験手順）
【０２３４】
実験材料：Zensun社で製造された4つのrhNRG-1最終薬物生産品（FDP）バッチ。該rhNRG-1 FDPは約250 μg/L rhNRG-1、約pH 6.0の約10 mMリン酸緩衝液、約50 g/Lマンニトール、約2 g/L HSA及び約150 mM NaClを含む溶液を凍結乾燥させることにより得た。凍結乾燥後、それぞれのバイアル中の生産品の量は約60 mgである。
【０２３５】
推奨保存条件及び上昇保存条件の両方で保存したrhNRG-1最終薬物生産品（FDP）の安定性を評価するために試験を遂行し、表17中に見出すことができる。試料は試験期間のpH値、生物活性及びrhNRG-1の量の項目を試験する際に、1 mlの水で分離した（resolved）。
【０２３６】
現在の指定は残余水分≦3.0％である（Karl Fischer法を用いて決定した）。ロットrhNRG#1、rhNRG#2、rhNRG#3及びrhNRG#4はそれぞれ水分レベル1.49％、1.51％、1.62％、及び1.35％で解放された。類似のバイアル及び栓構成を伴う他の生産品での過去の経験に基づいて、残余水分およそ1.7％で解放されるいかなるrhNRG-1のロットも、提案される有効期間の終了時（すなわち、5℃±3℃の意図された保存温度で24か月）に≦3.0％の指定限界を満たすことが期待される。
【０２３７】
推奨保存条件（すなわち、5℃±3℃）及び上昇温度（すなわち、25℃±2℃）での長期安定性試験をZensun社により製造された4つのrhNRG-1 FDPロットについて遂行した。これらの試験により個別の臨床ロットの安定性挙動を示すのに十分なデータが提供された。
【０２３８】
表17  それぞれのバッチの保存条件＆試験期間
【表１７】
0006703483.tif 000020
【０２３９】
（3. 結果及び結論）
【０２４０】
それぞれのバッチを試験期間における外観、pH値、残余水分、生物活性及びrhNRG-1の量を含む項目について試験した。
【０２４１】
安定性指示検定及び安定性容認基準の記載を含む安定性プロトコルは、表18に見出さすことができ、表18はまた、安定性試験において評価されたrhNRG-1 FDPのロットに関する情報も含む。
【０２４２】
結果を表18に列挙した。
【０２４３】
表18  それぞれのバッチの安定性試験結果
【表１８】
0006703483.tif 000021
0006703483.tif 000022
0006703483.tif 000023
【０２４４】
ロットrhNRG#1、rhNRG#2、rhNRG#3及びrhNRG#4に対する残余水分において観察された変動は、容認基準≦3.0％より十分に低く維持され、生物活性に影響を与えなかった。非臨床試験及び臨床試験での使用目的に適するように製造されたロットの定性的分析技術（すなわち、外観、SDS-PAGE分析など）に対する安定性の結果において、変化は観察できなかった。同様に、保存中の全タンパク質分析、rhNRG-1量の分析に対し安定性の減少傾向はなかった。
【０２４５】
これらのrhNRG-1 FDPロットは5℃±3℃で最大24か月の保存にわたってrhNRG-1の生物活性を維持していた。この結果は上昇温度保存条件での安定性が6か月にわたることを示し、このことから冷蔵条件下では有効期間が2年超であると推定できる。
【０２４６】
（提案される保存条件及び有効期間）
【０２４７】
rhNRG-1 FDPに対して推奨される保存条件は5℃±3℃である。従って、推奨保存条件で保存した場合は、rhNRG-1 FDPに対し24か月という暫定有効期間が提案される。rhNRG-1 FDPロットの有効期間はより長期の保存期間に対して生成される追加データに基づいてさらに延長できる見込みがある。
【０２４８】
先の実施例は例示のみの目的で含まれており、本発明の範囲を限定することを意図しない。先に記載の内容に対する多くの変形が可能である。先に記載の実施例に対する改変及び変形は当業者にとって明らかであるため、本発明は添付する特許請求の範囲の範囲によってのみ限定されることが意図される。
本件出願は、以下の構成の発明を提供する。
（構成１）
(a) ニューレグリン（NRG）ポリペプチド及び(b) 緩衝剤を含み、pHが3〜7である、NRGの医薬製剤。
（構成２）
前記NRG製剤が：(c) 安定剤をさらに含む、構成1記載の製剤。
（構成３）
前記NRG製剤が：(d) 塩をさらに含む、構成1又は2記載の製剤。
（構成４）
前記NRGポリペプチドが：
a) 配列番号：2に記載されたアミノ酸配列を含むポリペプチド；
b) NRGのEGF様ドメインを含むポリペプチド；
c) a) のポリペプチドの生物学的に活性な類似体、断片又はバリアント；
d) 配列番号：1に記載されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
e) d) のポリペプチドの生物学的に活性な類似体、断片又はバリアント；及び
f) 中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号：1に記載されたポリヌクレオチドとハイブリッド形成するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
からなる群から選択される、構成1〜3のいずれか1項記載の製剤。
（構成５）
前記NRGポリペプチドが配列番号：2に記載されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである、構成4記載の製剤。
（構成６）
NRGポリペプチドの濃度が約0.01 g/L〜約1 g/Lの範囲内である、構成1〜3のいずれか1項記載の製剤。
（構成７）
前記NRGポリペプチドが0.25 g/Lの濃度の配列番号：2に記載されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである、構成6記載の製剤。
（構成８）
前記緩衝剤がpH緩衝剤である、構成1〜3のいずれか1項記載の製剤。
（構成９）
前記pH緩衝剤が約0.1 mM〜約500 mMの範囲内である、構成8記載の製剤。
（構成１０）
前記緩衝剤がクエン酸塩、リン酸塩、酢酸塩、ヒスチジン、グリシン、炭酸水素塩、HEPES、トリス、希HCl、希NaOH及びこれらの薬剤の組合せからなる群から選択される、構成8記載の製剤。
（構成１１）
前記緩衝剤がリン酸塩である、構成10記載の製剤。
（構成１２）
前記pHが約6である、構成11記載の製剤。
（構成１３）
前記pHが3〜4である、構成11記載の製剤。
（構成１４）
前記製剤が液体製剤である、構成1記載の製剤。
（構成１５）
前記NRGポリペプチドが配列番号：2に記載されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである、構成14記載の製剤。
（構成１６）
前記緩衝剤がリン酸塩である、構成14記載の製剤。
（構成１７）
前記NRGポリペプチドが0.25 g/Lの濃度の配列番号：2に記載されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記緩衝剤が10 mMリン酸塩であり、かつ前記pHが約3.4である、構成14記載の製剤。
（構成１８）
前記安定剤が約0.1 g/L〜約200 g/Lの濃度である、構成2記載の製剤。
（構成１９）
前記安定剤がマンニトール、ソルビトール、キシリトール、スクロース、トレハロース、マンノース、マルトース、ラクトース、グルコース、ラフィノース、セロビオース、ゲンチオビオース、イソマルトース、アラビノース、グルコサミン、フルクトース、ヒト血清アルブミン及びこれらの安定剤の組合せからなる群から選択される、構成2記載の製剤。
（構成２０）
前記安定剤が約2 g/Lの濃度のヒト血清アルブミンである、構成2記載の製剤。
（構成２１）
前記塩が約100 mM〜約500 mMの濃度範囲である、構成3記載の製剤。
（構成２２）
前記塩が塩化ナトリウムである、構成3記載の製剤。
（構成２３）
前記塩化ナトリウムが約150 mMの濃度である、構成22記載の製剤。
（構成２４）
前記NRGポリペプチドが約0.25 g/Lの濃度の配列番号：2に記載されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、ここで、前記緩衝剤が約10 mMの濃度のリン酸塩であり、前記pHが約6.0であり、前記安定剤が約2 g/Lの濃度のヒト血清アルブミンであり、かつ前記塩が約150 mMの濃度の塩化ナトリウムである、構成3記載の製剤。
（構成２５）
賦形剤を追加した構成1〜24のいずれか1項記載の製剤の凍結乾燥により調製した、ニューレグリン（NRG）の凍結乾燥医薬製剤。
（構成２６）
前記賦形剤がヒト血清アルブミン、マンニトール、グリシン、ポリエチレングリコール、及びこれらの賦形剤の組合せからなる群から選択される、構成25記載の製剤。
（構成２７）
前記賦形剤が、1 mlの再懸濁溶液で約60 mgの前記製剤を再懸濁した後に、約0.1 g/L〜約200 g/Lの濃度である、構成25記載の製剤。
（構成２８）
前記賦形剤がマンニトールである、構成25記載の製剤。
（構成２９）
前記マンニトールが1 mlの再懸濁溶液で約60 mgの前記製剤を再懸濁した後に、約50 g/Lの濃度である、構成25記載の製剤。
（構成３０）
(a) 配列番号：2に記載されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、(b) 前記緩衝剤としてのリン酸塩、(c) 前記賦形剤としてのマンニトール、(d) 前記安定剤としてのヒト血清アルブミン、及び(e) 前記塩としての塩化ナトリウムを含み、ここで、1 mlの再懸濁溶液で約60 mgの前記製剤を再懸濁した後に、(a) が約0.25 g/Lの濃度であり；(b) が約10 mMの濃度であり、かつ前記pHが約6であり；(c) が約50 g/Lの濃度であり、(d) が約2 g/Lの濃度であり、かつ(e) が約150 mMの濃度である、構成25記載の製剤。
（構成３１）
前記再懸濁溶液が生理食塩水である、構成30記載の製剤。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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