(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物（ヒトを除く）の慢性弁膜疾患を診断する方法であって、
ａ．前記動物から生体試料を得るステップと、
ｂ．慢性弁膜疾患と関連するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の量について前記生体試料を分析するステップと、
ｃ．前記試料中で特定された前記ｍｉＲＮＡの量を、慢性弁膜疾患に罹患していない１個体以上の比較対照動物由来の試料中に存在する前記ｍｉＲＮＡの対応する量と比較するステップと、
ｄ．前記動物の試料中に見出される前記ｍｉＲＮＡの量が、前記対照動物の試料中に存在する前記ｍｉＲＮＡの量よりも少ない場合に、前記動物は慢性弁膜疾患であると診断するステップと、を含み、
前記ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−３０２ｄ、ｍｉＲ−３８０、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−５８２、ｍｉＲ−３２９ｂ、ｍｉＲ−４８７ｂ及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるｍｉＲＮＡを含む、方法。
【請求項２】
前記試料が血清試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記診断が、慢性弁膜疾患と関連する２つ以上のｍｉＲＮＡの量の決定に基づくものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記診断が、慢性弁膜疾患と関連する３つ以上のｍｉＲＮＡの量の決定に基づくものである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記診断が、上方制御される第２のｍｉＲＮＡの量に基づくものである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ｍｉＲＮＡが、さらにｍｉＲ−４９０を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記動物が、コンパニオンアニマルである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記コンパニオンアニマルがイヌ科動物である、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
[0001]本出願は、２０１５年２月１７日に出願された、米国特許仮出願第６２／１１７１８９号に対する優先権を主張するものであり、本開示は参照により本明細書に援用される。
【０００２】
[0002]本発明は、概して、慢性弁膜疾患を診断及び予測するための方法、並びに特に、慢性弁膜疾患と関連するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を測定することによって慢性弁膜疾患を診断及び予測するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]心臓病は、イヌにおいて、最も一般的な障害の１つである。変性性僧帽弁疾患（ＤＭＶＤ）としても知られている、慢性弁膜疾患（ＣＶＤ）は、全イヌの約９％が罹患しており、加齢に伴い増加し、全体的な累積罹患率は４０％超である。ＣＶＤは、房室弁、最も一般的には僧帽弁が進行性に変性及び変形して初期の僧帽弁閉鎖不全に至ることが特徴である。僧帽弁閉鎖不全になると、僧帽弁の不適切な閉鎖が原因で血液が左心房に逆流する僧帽弁逆流が生じ、これによる収縮期心雑音が発生するようになる。ＣＶＤに罹患したイヌは、最終的には、左房室の容量過負荷、肺水腫、心房拡張及び上室性不整脈を発症する。
【０００４】
[0004]罹患した弁の外科的又は内科的な治療が可能ではあるが、ペットの飼い主による栄養学的介入が好ましい。早期の発見及び治療が不可欠であるが、症状がほとんどないことから、発見が難しい場合がある。特許出願（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３４４０１１号）では、差次的に発現した遺伝子及び代謝産物を使用してＣＶＤを診断する方法が記載されている。しかしながら、遺伝子発現による方法は、侵襲的であるとされる心臓組織の採取を必要とする。加えて、ｍＲＮＡはあまり安定ではなく、実験的に取り扱うことが困難な場合がある。更に、血清由来の代謝産物測定は、生化学的性質及び該化合物の安定性に依存しているので、困難な場合がある。
【０００５】
[0005]従って、最も適切で有効なレベルの治療を提供するため、動物のＣＶＤを診断及び予測することへの必要性が依然としてある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
[0006]従って、本発明の目的は、動物における慢性弁膜疾患を診断及び予測するための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
[0007]本目的及びその他の目的は、動物における慢性弁膜疾患を診断及び予測するための、以下のステップを伴う方法を使用して達成される。すなわち、動物から試料を得るステップと、慢性弁膜疾患と関連するｍｉＲＮＡの量について該試料を分析するステップと、該試料中で特定された該ｍｉＲＮＡの量を、慢性弁膜疾患に罹患していない１個体以上の比較対照動物由来の試料中に存在する該ｍｉＲＮＡの対応する量と比較するステップと、該動物の試料中に見出される該ｍｉＲＮＡが、該対象動物の試料中とは差次的に発現している場合に、該動物は慢性弁膜疾患であると診断するステップ、である。
【０００８】
[0008]本発明の、その他の及び更なる目的、特徴並びに利点は、当業者には容易に明らかとなろう。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
（定義）
[0009]用語「動物」は、慢性弁膜疾患に罹患しやすい又は罹患している任意の動物を意味し、ヒト、鳥類、ウシ科動物、イヌ科動物、ウマ科動物、ネコ科動物、ヤギ類、オオカミ類、ネズミ科動物、ヒツジ類又はブタ類が挙げられる。
【００１０】
[0010]用語「ｍｉＲＮＡ」又は「バイオマーカー」は、約２１〜２５個のヌクレオチドを含む小型の一本鎖のノンコーディングＲＮＡ分子を意味し、かかるノンコーディングＲＮＡ分子のレベル又は強度は生体試料中で測定され、疾患状態を診断するためのマーカとして使用され得る。
【００１１】
[0011]用語「差次的発現」又は「差次的に発現」は、試料中のｍｉＲＮＡ量の、欠如、存在又は変化をもとに検出された通りの、ｍｉＲＮＡの発現の増加若しくは上方制御、又はｍｉＲＮＡの発現の減少若しくは下方制御を意味する。
【００１２】
[0012]用語「比較対照動物」は、同種及び同型の動物、又は、２つの異なる時点で評価される動物個体を意味する。
【００１３】
[0013]用語「対応する量」は、慢性弁膜疾患であると診断されている動物のｍｉＲＮＡに対応する比較対照動物由来のｍｉＲＮＡの量を意味し、該ｍｉＲＮＡは慢性弁膜疾患に関連している。
【００１４】
[0014]用語「コンパニオンアニマル」は、交友、娯楽、精神的な支援、審美目的（extrovert display）、及び人間がその他の種の動物と分かち合うことを必要とする全てのその他の効用のために、人間により飼育される、イヌ、ネコ、トリ、ウサギ、モルモット、フェレット、ハムスター、マウス、アレチネズミ、乗馬用のウマ（pleasure horses）、乳牛、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ブタ、及び更には外来種等の家畜を意味する。一態様では、コンパニオンアニマルはイヌ又はネコであり得る。ある特定の態様では、コンパニオンアニマルはイヌであり得る。
【００１５】
[0015]用語「診断する」は、動物が慢性弁膜疾患に罹患しているかを決定すること、又は、動物が慢性弁膜疾患に罹患しやすいかを予測することを意味する。
【００１６】
[0016]用語「初期段階」は、アメリカ獣医内科学会（American College of Veterinary Internal Medicine、ＡＣＶＩＭ）の、心臓病（ＨＦ）を診断するためのガイドラインに基づく、心臓病（ＨＦ）の臨床的兆候がないが、軽度から中等度の心肥大を伴う、ステージＢの心臓病（ＨＦ）を意味する。
【００１７】
[0017]用語「末期」は、ＡＣＶＩＭに基づく中等度のＨＦの臨床的兆候を伴う、ステージＣのＨＦを意味する。
【００１８】
[0018]本明細書において使用する場合、範囲は、該範囲内のありとあらゆる値を列挙及び記載する必要を回避するために、本明細書においては省略表現で使用する。該範囲内の任意の適切な値は、適宜、該範囲の上限値、下限値、又は境界値として選択できる。
【００１９】
[0019]本明細書で使用するとき、文脈により明確に記載のない限り、単語の単数形には複数形が包含され、逆に複数形には単数形が包含される。従って、「ａ」、「ａｎ］、及び「ｔｈｅ」の言及には、概してそれぞれの用語の複数形が包含される。例えば、「方法（a method）」と言った場合は、複数の「方法（methods）」が含まれる。同じように、「含む（comprise）」、「含む（comprises）」、及び「含む（comprising）」という用語は、排他的ではなく、むしろ包含的に解釈されるべきである。同様に、「含む（include）」、「含む（including）」及び「又は」という用語は全て、そのような解釈が文脈から明らかに妨げられていない限り、包含的なものであると解釈されるべきである。
【００２０】
[0020]本明細書に開示される方法及び組成物並びにその他の発展は、本明細書に記載された特定の方法論、手順及び試薬に限定されないが、その理由は、当業者であれば理解するであろうが、それらが変化し得るためだからである。更に、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載することのみを目的とするものであり、開示又は請求の範囲を制限することを意図するものではなく、また制限するものでもない。
【００２１】
[0021]別段の定めがない限り、本明細書において使用する全ての技術用語及び科学用語、専門用語、並びに頭字語は、本発明の分野（複数可）、又は該用語が使用される分野（複数可）の当業者により一般的に理解される意味を有する。
【００２２】
[0022]本明細書で引用又は参照される全ての特許、特許出願、出版物、技術及び／又は学術論文、並びにその他の参照文献を、法律によって許される範囲でそれらの全体を本明細書に援用する。これらの参照についての論考は、それらにおいてなされる主張を要約することを意図するにすぎない。そのような特許、特許出願、刊行物、若しくは参照文献の一切、又は、それらのいずれの部分も、関連する、必須の、又は先行する技術であると認めるものではない。そのような特許、特許出願、出版物、及びその他の参照文献が、関連性があり、必須であり、又は先行技術であるというあらゆる主張に対し、正確性及び妥当性に異議を申し立てる権利を明確に留保するものである。
【００２３】
本発明
[0023]本発明者らは、本明細書で記載されるｍｉＲＮＡが動物の生体試料中に存在し得ること、慢性弁膜疾患の閾値を示す又は予測することにより、試料中の該ｍｉＲＮＡの量が慢性弁膜疾患を診断するための生化学的指標として機能し得ることを発見した。そこで、本発見により獣医及びその他の臨床医は、試料中のこれらの「バイオマーカー」について試験を行い、動物が慢性弁膜疾患に罹患しやすい又は罹患しているか、及び更なる診断又は治療が必要であるかを決定することができる。更なる診断又は治療の必要性を確定するので、こうした更なる診断又は治療の費用及びリスクを適正化することができる。
【００２４】
[0024]上記によると、本発明は、動物の慢性弁膜疾患を診断するための方法を提供する。該方法は、動物から生体試料を得るステップと、慢性弁膜疾患と関連するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の量について該試料を分析するステップと、該試料中で特定された該ｍｉＲＮＡの量を、慢性弁膜疾患に罹患していない１個体以上の比較対照動物由来の試料中に存在する該ｍｉＲＮＡの対応する量と比較するステップと、該動物の試料中に見出される該ｍｉＲＮＡの量が、該対照動物の試料中とは差次的に発現している場合に、該動物は慢性弁膜疾患であると診断するステップと、を含む。
【００２５】
[0025]一実施形態では、動物の慢性弁膜疾患を診断するための方法は、動物から生体試料を得るステップと、慢性弁膜疾患と関連するｍｉＲＮＡの量について該試料を分析するステップと、該試料中で特定された該ｍｉＲＮＡの量を、慢性弁膜疾患に罹患していない１個体以上の比較対照動物由来の試料中に存在する該ｍｉＲＮＡの対応する量と比較するステップと、該動物の試料中に見出される該ｍｉＲＮＡの量が、該対照動物の試料中に存在する該ｍｉＲＮＡの量よりも多い場合に、該動物は慢性弁膜疾患であると診断するステップと、を含み得る。
【００２６】
[0026]その他の実施形態では、動物の慢性弁膜疾患を診断するための方法は、動物から生体試料を得るステップと、慢性弁膜疾患と関連するｍｉＲＮＡの量について該試料を分析するステップと、該試料中で特定された該ｍｉＲＮＡの量を、慢性弁膜疾患に罹患していない１個体以上の比較対照動物由来の試料中に存在する該ｍｉＲＮＡの対応する量と比較するステップと、該動物の試料中に見出される該ｍｉＲＮＡの量が、該対照動物の試料中に存在する該ｍｉＲＮＡの量よりも少ない場合に、該動物は慢性弁膜疾患であると診断するステップと、を含み得る。
【００２７】
[0027]各種実施形態では、慢性弁膜疾患と診断された動物ではなく、かつ慢性弁膜疾患に罹患していないと判断されている、１個体以上の比較対照動物を、ｍｉＲＮＡについて評価することができ、かかる評価結果は、ｍｉＲＮＡを評価される動物の結果と比較するための基準値として使用される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡの基準値は多数の比較対照動物を評価することによって決定することができる。
【００２８】
[0028]別の実施形態では、一匹の動物について、ｍｉＲＮＡの量を、該動物の生涯を通して何度も決定することができ、結果を用いて、該動物が、慢性弁膜疾患に罹患しやすい又は罹患しているかを、決定することができる。例えば、該動物の加齢と共に、ｍｉＲＮＡの量が増加又は減少する場合、該動物は、慢性弁膜疾患に罹患しやすい又は罹患していると診断することができる。ある実施形態において、動物を定期的に評価し、ｍｉＲＮＡの結果を記録することができる。次の評価で、ｍｉＲＮＡの量が前回の評価（複数含む）から増加又は減少している場合、該動物は慢性弁膜疾患に罹患しやすい又は罹患していると診断することができる。いくつかの態様では、ｍｉＲＮＡの特異的な変化を、慢性弁膜疾患の初期段階又は末期段階と相関させることができる。
【００２９】
[0029]本発明では、生体由来の任意の試料が有用となり得る。例としては、血液（血清／血漿）、脳脊髄液（ＣＳＦ）、尿、糞便、呼気、唾液又は任意の組織の生検が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、試料は、血清試料であり得る。本明細書では用語「血清」が使用されるが、当業者は、また、血漿又は全血若しくは全血分画を使用してもよいことを理解するであろう。
【００３０】
[0030]発現の減少又は増加を、ポリヌクレオチドの定量化に対して本技術分野において周知である任意の方法（例えば、ＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ法及びｑＰＣＲ法が挙げられるが、それらに限定されない）、配列決定法、ノーザンブロット法、マイクロアレイ法又はその他のハイブリダイゼーション法等）を使用して、ｍｉＲＮＡレベルで測定することができる。
【００３１】
[0031]慢性弁膜疾患を診断するためには、１つのｍｉＲＮＡを使用すれば十分ではあるが、１つ以上、２つ以上、３つ以上、又は４つ以上のそのようなｍｉＲＮＡを使用することも、本発明に包含される。ｍｉＲＮＡを、任意の組み合わせにて評価し、診断に使用することができる。このように、本方法としては、ｍｉＲＮＡの上方制御及びｍｉＲＮＡの下方制御に基づいてＣＶＤの診断を挙げることができる。
【００３２】
[0032]一実施形態では、診断は、動物の試料中に見出されるｍｉＲＮＡの量が対照動物の試料中に存在するｍｉＲＮＡの量と比較して多いかどうかの判断に基づくことができる。一態様では、ｍｉＲＮＡとしては、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−９８、ｌｅｔ−７ｃ、又はｌｅｔ−７ｂを挙げることができる。
【００３３】
[0033]一実施形態では、診断は、動物の試料中に見出されるｍｉＲＮＡの量が対照動物の試料中に存在するｍｉＲＮＡの量と比較して少ないかどうかの判断に基づくことができる。一態様では、ｍｉＲＮＡとしては、ｍｉＲ−３０２ｄ、ｍｉＲ−３８０、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−５８２、ｍｉＲ−４９０、ｍｉＲ−３２９ｂ、又はｍｉＲ−４８７ｂを挙げることができる。
【００３４】
[0034]差次的に発現したｍｉＲＮＡは、本明細書で例示されるように、統計学的に有意なものであり得る。いくつかの態様では、統計的有意性としては、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１あるいはｐ＜０．００１を挙げることができる。
【００３５】
[0035]各種実施形態では、動物はヒト又はコンパニオンアニマルであり得る。一態様では、コンパニオンアニマルは、イヌ等のイヌ科動物又はネコ等のネコ科動物であり得る。ある特定の態様では、動物はイヌ科動物であり得る。
【実施例】
【００３６】
[0036]本発明は、以下の実施例により更に例示することができるが、これらの実施例は、例示的な目的でのみ挙げられるものであり、別途記載のない限り、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことを理解されたい。
【００３７】
実施例１
[0037]罹患血清試料及び正常血清試料を比較する、差次的発現プロファイリング試験を通してｍｉＲＮＡを特定した。イヌを、認定心臓専門獣医により実施又は評価される心臓超音波検査、心臓の病理検査、又はそれらの両方により、健康な心臓又はＣＶＤのいずれかを有すると分類した。アメリカ獣医内科学会（ＡＣＶＩＭ）／ヨーロッパ獣医内科専門医会（European College of Veterinary Internal Medicine、ＥＣＶＩＭ）の段階分けスキームを使用して、イヌを、イヌの心臓病（ＨＦ）のステージに基づいて、３つのグループのいずれかに分類した。グループＡ（ステージＡ、危険はあるが罹患していない、６匹）、グループＢ（ステージＢ、軽度から中等度の心肥大はあるが、心臓病の臨床的徴候は見られない、６匹）、又はグループＣ（ステージＣ、中等度の心臓病の臨床的徴候を有する、６匹）とした（表１）。これらの３グループの犬を、年齢、体の大きさ及び性別により割り付けた。血清を各グループの犬から採取し、使用するまで−８０℃で保存した。
【表１】
0006760948.tif 000002
【００３８】
[0038]ＱｉａｇｅｎのｍｉＳｃｒｉｐｔ（登録商品）のｍｉＲＮＡ  ＰＣＲ  ａｒｒａｙ  ｓｙｓｔｅｍを使用してｍｉＲＮＡ抽出及び定量ＰＣＲを行う目的で試料をＱｉａｇｅｎに提出した。計２７７の既知のイヌ科動物のｍｉＲＮＡを分析した。データ分析を分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して実施した。ＡＮＯＶＡのＰ値を多重検定のために調整し、偽陽性率（ＦＤＲ）をＢｅｎｊａｍｉｎｉ  ａｎｄ  Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を使用して計算した。グループＢ対グループＡとの遺伝子発現比（expression fold change）（ＦＣ＿ＢｖＡ）及びグループＣ対グループＡとの遺伝子発現比（ＦＣ＿ＣｖＡ）を計算した。差次的に発現したｍｉＲＮＡを、ＦＤＲ＜０．０５の閾値を使用して選定した。計１１のｍｉＲＮＡを選定した（表２）。
【表２】
0006760948.tif 000003
【００３９】
[0039]明細書では、本発明の典型的な好ましい実施形態を開示してきた。具体的な用語が使用されるが、これらは一般的に、かつ説明目的でのみ使用されるものであり、限定を意図するものではない。本発明の範囲は、「特許請求の範囲」において規定する。上記の技術を考慮すれば、本発明には多くの改変及び変形が可能であることは明らかである。従って、具体的に記載のもの以外であっても、添付の特許請求の範囲内で、本発明が実施可能であると理解される。