(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
0006730183.tif 000161
［式中、
Ａｒ１は、任意選択で置換されていてもよい１，４−フェニレン基であり、
Ａｒ２は、任意選択で置換されていてもよい１，４−フェニレン基であり、
Ａｒ３は、任意選択で置換されていてもよい１，４−フェニレン基であり、
Ａｒ４は、任意選択で置換されていてもよい１，４−フェニレン基であり、
Ａｒ５は、任意選択で置換されていてもよい１，４−フェニレン基であり、
Ｌ１は、ＮＨＣＯであり［式中、窒素原子はＡｒ１と結合］、
Ｌ２は、ＮＨＣＯであり［式中、窒素原子はＡｒ２と結合］、
Ｌ３は、次の一般式で表される基であり、
【化２】
0006730183.tif 000162
（式中、NH基は、Ａｒ３と結合し、Ｒ３０は、水素原子またはＣ１−３アルキル基であり）
Ｌ４は、ＮＨＣＯ（式中、窒素原子はＡｒ４と結合）であり、
Ｒ１は、式−ＮＨ２、−ＮＯ２、ＣＯＯＲ１１、または−ＣＯＮＲ１２Ｒ１３（式中、Ｒ１１、Ｒ１２、及びＲ１３は、互いに独立に、水素原子またはＣ１−６アルキル基であり）
Ｒ２は、式−ＮＨ２、−ＮＯ２、ＣＯＯＲ１１ａ、または−ＣＯＮＲ１２ａＲ１３ａ（式中、Ｒ１１ａ、Ｒ１２ａ、及びＲ１３ａは、互いに独立に、水素原子またはＣ１−６アルキル基である）］
で示される化合物またはその医薬上許容される塩、溶媒和物もしくは水和物。
【請求項２】
Ｌ３が、次の一般式で表される基であり、
【化３】
0006730183.tif 000163
そして、Ｒ３０が水素原子である、請求項１に記載の化合物またはその医薬上許容される塩、溶媒和物もしくは水和物。
【請求項３】
Ｒ１が式−ＣＯＯＨである、請求項１又は２に記載の化合物またはその医薬上許容される塩、溶媒和物もしくは水和物。
【請求項４】
Ｒ２が式−ＮＨ２、または−ＮＯ２である、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物またはその医薬上許容される塩、溶媒和物もしくは水和物。
【請求項５】
式（ＶＩＩ）
【化４】
0006730183.tif 000164
［式中、
Ｒ５１は、水素原子またはＣ１−６アルキル基であり、
Ｒ５３は、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１−６アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１−６アルキルの基であり、
Ｄは、ＣＲ５６であり、
Ｒ５６は、水素原子、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１−６アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１−６アルキルの基であり、
Ｒ５７は、水素原子、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１−６アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１−６アルキルの基であり、
Ｒ５８は、水素原子、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１−６アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１−６アルキルの基であり、
Ｒ５９は、水素原子、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１−６アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１−６アルキルの基であり、
Ｒ６０は、水素原子、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１−６アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１−６アルキルの基であり、
Ｒ６１は、水素原子、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１−６アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１−６アルキルの基であり、
Ｒ８は、下記一般式で表される基である
【化５】
0006730183.tif 000165
（式中、Ｒ９は、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ２であり、Ｒ１０は、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ２である）］
で示される請求項１に記載の化合物またはその医薬上許容される塩、溶媒和物もしくは水和物。
【請求項６】
式（ＩＶ）
【化６】
0006730183.tif 000166
［式中、
Ｒ５は、式−Ｏ−Ｃ１−６アルキルの基であり、
Ｒ６は、ヒドロキシ基であり、
Ｒ７は、式−Ｏ−Ｃ１−６アルキルの基であり、
Ｒ８は、下記一般式で表される基である
【化７】
0006730183.tif 000167
（式中、Ｒ９は、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ２であり、Ｒ１０は、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ２である）］
で示される請求項１に記載の化合物またはその医薬上許容される塩、溶媒和物もしくは水和物。
【請求項７】
以下から選択される化合物。
【化８】
0006730183.tif 000168
シストバクトアミドＡ（１）
【化９】
0006730183.tif 000169
シストバクトアミドＢ（２）
【化１０】
0006730183.tif 000170
シストバクトアミドＣ（３）
【化１１】
0006730183.tif 000171
シストバクトアミドＤ（４）
【化１２】
0006730183.tif 000172
シストバクトアミドＥ（５）（Ｒ’はＮＨ２又はＯＨ、Ｒ”はＮＨ２又はＯＨ）
【化１３】
0006730183.tif 000173
シストバクトアミドＦ（６），        シストバクトアミドＧ（７）
【化１４】
0006730183.tif 000174
シストバクトアミドＨ（８）
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか一項に記載の化合物と、任意選択で、１以上の担体物質および／または１以上のアジュバントとを含む医薬組成物。
【請求項９】
細菌感染の治療または予防において使用するための、請求項１ないし８のいずれか一項に記載の化合物または医薬組成物。
【請求項１０】
請求項７に記載の化合物の調製方法であって、
（ａ）シストバクター・ベラタス（Ｃｙｓｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｅｌａｔｕｓ）株ＭＣｙ８０７１（ＤＳＭ２７００４）を培養する工程と、
（ｂ）化合物を培養液から分離し、保持する工程と
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
シストバクトアミドは、粘液細菌シストバクター・ベラタス（Ｃｙｓｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｅｌａｔｕｓ）（ＭＣｙ８０７１；内部名：シストバクター・フェルギネウス（Ｃｙｓｔｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｒｒｕｇｉｎｅｕｓ））から単離された新規天然物である。シストバクトアミドは、特に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）およびＡ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）などの選択されたグラム陰性菌に対して、良好な抗生物質活性を、ならびにグラム陽性菌に対して幅広い活性を示す。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
本発明は、式（Ｉ）
【化１】
0006730183.tif 000002
［式中、
Ａｒ１は、酸素、硫黄および窒素から選択される１、２、３または４個のヘテロ原子を含む５または６個の環原子を有する、任意選択で置換されていてもよいフェニレン基または任意選択で置換されていてもよいヘテロアリーレン基であり、
Ａｒ２は、酸素、硫黄および窒素から選択される１、２、３または４個のヘテロ原子を含む５または６個の環原子を有する、任意選択で置換されていてもよいフェニレン基または任意選択で置換されていてもよいヘテロアリーレン基であり、
Ａｒ３は、酸素、硫黄および窒素から選択される１、２、３または４個のヘテロ原子を含む５または６個の環原子を有する、任意選択で置換されていてもよいフェニレン基または任意選択で置換されていてもよいヘテロアリーレン基であり、
Ａｒ４は、存在しないか、または酸素、硫黄および窒素から選択される１、２、３もしくは４個のヘテロ原子を含む５もしくは６個の環原子を有する、任意選択で置換されていてもよいフェニレン基もしくは任意選択で置換されていてもよいヘテロアリーレン基であり、
Ａｒ５は、存在しないか、または酸素、硫黄および窒素から選択される１、２、３もしくは４個のヘテロ原子を含む５もしくは６個の環原子を有する、任意選択で置換されていてもよいフェニレン基もしくは任意選択で置換されていてもよいヘテロアリーレン基であり、
Ｌ１は、結合、酸素原子、硫黄原子または式ＮＨ、ＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＣＯＯ、ＯＣＯ、ＣＯＮＲ３、ＮＲ３ＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＯＣＯＮＲ３、ＮＲ３ＣＯＯ、ＮＲ３ＣＯＮＲ４、ＮＲ３、−ＣＮＲ３−、−ＣＯ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２ＮＨ−、−ＮＨＳＯ２−、−ＳＯ２ＮＲ３−、−ＮＲ３ＳＯ２−、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＯ−、−ＣＯＣＲ３Ｒ４−、−ＣＲ３Ｒ４ＣＯ−、−ＮＨＣＳＮＨ−、−ＮＲ３ＣＳＮＲ４、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＲ３＝ＣＲ４−の基または酸素、硫黄および窒素から選択される１、２もしくは３個のヘテロ原子を含む５もしくは６個の環原子を有するヘテロアリーレン基またはヘテロアルキレン基であり、
Ｌ２は、結合、酸素原子、硫黄原子または式ＮＨ、ＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＣＯＯ、ＯＣＯ、ＣＯＮＲ３、ＮＲ３ＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＯＣＯＮＲ３、ＮＲ３ＣＯＯ、ＮＲ３ＣＯＮＲ４、ＮＲ３、−ＣＮＲ３−、−ＣＯ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２ＮＨ−、−ＮＨＳＯ２−、−ＳＯ２ＮＲ３−、−ＮＲ３ＳＯ２−、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＯ−、−ＣＯＣＲ３Ｒ４−、−ＣＲ３Ｒ４ＣＯ−、−ＮＨＣＳＮＨ−、−ＮＲ３ＣＳＮＲ４、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＲ３＝ＣＲ４−の基または酸素、硫黄および窒素から選択される１、２もしくは３個のヘテロ原子を含む５もしくは６個の環原子を有するヘテロアリーレン基またはヘテロアルキレン基であり、
Ｌ３は、存在しないか、または結合、酸素原子、硫黄原子または式ＮＨ、ＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＣＯＯ、ＯＣＯ、ＣＯＮＲ３、ＮＲ３ＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＯＣＯＮＲ３、ＮＲ３ＣＯＯ、ＮＲ３ＣＯＮＲ４、ＮＲ３、−ＣＮＲ３−、−ＣＯ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２ＮＨ−、−ＮＨＳＯ２−、−ＳＯ２ＮＲ３−、−ＮＲ３ＳＯ２−、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＯ−、−ＣＯＣＲ３Ｒ４−、−ＣＲ３Ｒ４ＣＯ−、−ＮＨＣＳＮＨ−、−ＮＲ３ＣＳＮＲ４、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＲ３＝ＣＲ４−の基または酸素、硫黄および窒素から選択される１、２もしくは３個のヘテロ原子を含む５もしくは６個の環原子を有するヘテロアリーレン基またはヘテロアルキレン基であり、
Ｌ４は、存在しないか、または結合、酸素原子、硫黄原子または式ＮＨ、ＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＣＯＯ、ＯＣＯ、ＣＯＮＲ３、ＮＲ３ＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＯＣＯＮＲ３、ＮＲ３ＣＯＯ、ＮＲ３ＣＯＮＲ４、ＮＲ３、−ＣＮＲ３−、−ＣＯ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２ＮＨ−、−ＮＨＳＯ２−、−ＳＯ２ＮＲ３−、−ＮＲ３ＳＯ２−、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＯ−、−ＣＯＣＲ３Ｒ４−、−ＣＲ３Ｒ４ＣＯ−、−ＮＨＣＳＮＨ−、−ＮＲ３ＣＳＮＲ４、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＲ３＝ＣＲ４−の基または酸素、硫黄および窒素から選択される１、２もしくは３個のヘテロ原子を含む５もしくは６個の環原子を有するヘテロアリーレン基またはヘテロアルキレン基であり、
Ｒ１は、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、アミノ基、チオール基、ニトロ基、式−ＣＯＯＨ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２もしくは−ＣＮの基、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルキルシクロアルキル、ヘテロアルキルシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルまたはヘテロアラルキル基であり、
Ｒ２は、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、アミノ基、チオール基、ニトロ基、式−ＣＯＯＨ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２もしくは−ＣＮの基、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルキルシクロアルキル、ヘテロアルキルシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルまたはヘテロアラルキル基であり、
基Ｒ３は、互いに独立に、水素原子またはＣ１〜６アルキル基であり、
基Ｒ４は、互いに独立に、水素原子またはＣ１〜６アルキル基である］
で示される化合物またはその医薬上許容される塩、溶媒和物もしくは水和物または医薬上許容される製剤を提供する。
【０００３】
表現アルキルとは、１〜２０個の炭素原子、好ましくは、１〜１５個の炭素原子、特に、１〜１０個（例えば、１、２、３または４個）の炭素原子を含有する飽和、直鎖または分岐炭化水素基、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、２，２−ジメチルブチルまたはｎ−オクチル基を指す。
【０００４】
表現アルケニルおよびアルキニルとは、２〜２０個の炭素原子、好ましくは、２〜１５個の炭素原子、特に、２〜１０個（例えば、２、３または４個）の炭素原子、例えば、エテニル（ビニル）、プロペニル（アリル）、イソ−プロペニル、ブテニル、エチニル、プロピニル、ブチニル、アセチレニル、プロパルギル、イソプレニルまたはヘキサ−２−エニル基を含有する、少なくとも部分的に不飽和の、直鎖または分岐炭化水素基を指す。好ましくは、アルケニル基は、１または２（特に、好ましくは、１）つの二重結合を有し、アルキニル基は、１または２（特に、好ましくは、１）つの三重結合を有する。
【０００５】
さらに、用語アルキル、アルケニルおよびアルキニルとは、１個以上の水素原子が、ハロゲン原子（好ましくは、ＦまたはＣｌ）によって置換されている基、例えば、２，２，２−トリクロロエチルまたはトリフルオロメチル基などを指す。
【０００６】
表現ヘテロアルキルとは、１個以上（好ましくは、１〜８個、特に、好ましくは、１、２、３または４個）の炭素原子が、酸素、窒素、リン、ホウ素、セレン、ケイ素もしくは硫黄原子によって（好ましくは、酸素、硫黄もしくは窒素原子によって）またはＳＯもしくはＳＯ２基によって置換されている、アルキル、アルケニルまたはアルキニル基を指す。表現ヘテロアルキルとは、さらに、カルボン酸またはカルボン酸に由来する基、例えば、アシル、アシルアルキル、アルコキシカルボニル、アシルオキシ、アシルオキシアルキル、カルボキシアルキルアミドまたはアルコキシカルボニルオキシなどを指す。
【０００７】
好ましくは、ヘテロアルキル基は、１〜１２個の炭素原子ならびに酸素、窒素および硫黄（特に、酸素および窒素）から選択される１〜８個のヘテロ原子を含有する。特に、好ましくは、ヘテロアルキル基は、１〜６個（例えば、１、２、３または４個）の炭素原子ならびに酸素、窒素および硫黄（特に、酸素および窒素）から選択される１、２、３または４（特に、１、２または３）個のヘテロ原子を含有する。用語Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキルとは、１〜６個の炭素原子ならびにＯ、Ｓおよび／またはＮ（特に、Ｏおよび／またはＮ）から選択される１、２または３個のヘテロ原子を含有するヘテロアルキル基を指す。用語Ｃ１〜Ｃ４ヘテロアルキルとは、１〜４個の炭素原子ならびにＯ、Ｓおよび／またはＮ（特に、Ｏおよび／またはＮ）から選択される１、２または３個のヘテロ原子を含有するヘテロアルキル基を指す。さらに、用語ヘテロアルキルとは、１個以上の水素原子が、ハロゲン原子（好ましくは、ＦまたはＣｌ）によって置換されている基を指す。
【０００８】
特に、好ましくは、表現ヘテロアルキルとは、１個以上（好ましくは、１〜６個、特に、好ましくは、１、２、３または４個）の炭素原子が、酸素、硫黄または窒素原子によって置換されている、上記で定義されるような（直鎖または分岐）アルキル基を指し、この基は、好ましくは、１〜６個（例えば、１、２、３または４個）の炭素原子ならびに酸素、窒素および硫黄（特に、酸素および窒素）から選択される１、２、３または４個（特に、１、２または３個）のヘテロ原子を含有し、この基は、好ましくは、１個以上の（好ましくは、１〜６個、特に、好ましくは、１、２、３または４個）のフッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素原子またはＯＨ、＝Ｏ、ＳＨ、＝Ｓ、ＮＨ２、＝ＮＨ、Ｎ３、ＣＮもしくはＮＯ２基によって置換されていてもよい。
【０００９】
表現ヘテロアルキレン基とは、二価ヘテロアルキル基を指す。
【００１０】
ヘテロアルキル基の例として、式：Ｒａ−Ｏ−Ｙａ−、Ｒａ−Ｓ−Ｙａ−、Ｒａ−ＳＯ−Ｙａ−、Ｒａ−ＳＯ２−Ｙａ−、Ｒａ−Ｎ（Ｒｂ）−Ｙａ−、Ｒａ−ＣＯ−Ｙａ−、Ｒａ−Ｏ−ＣＯ−Ｙａ−、Ｒａ−ＣＯ−Ｏ−Ｙａ−、Ｒａ−ＣＯ−Ｎ（Ｒｂ）−Ｙａ−、Ｒａ−Ｎ（Ｒｂ）−ＣＯ−Ｙａ−、Ｒａ−Ｏ−ＣＯ−Ｎ（Ｒｂ）−Ｙａ−、Ｒａ−Ｎ（Ｒｂ）−ＣＯ−Ｏ−Ｙａ−、Ｒａ−Ｎ（Ｒｂ）−ＣＯ−Ｎ（Ｒｃ）−Ｙａ−、Ｒａ−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−Ｙａ−、Ｒａ−Ｎ（Ｒｂ）−Ｃ（＝ＮＲｄ）−Ｎ（Ｒｃ）−Ｙａ−、Ｒａ−ＣＳ−Ｙａ−、Ｒａ−Ｏ−ＣＳ−Ｙａ−、Ｒａ−ＣＳ−Ｏ−Ｙａ−、Ｒａ−ＣＳ−Ｎ（Ｒｂ）−Ｙａ−、Ｒａ−Ｎ（Ｒｂ）−ＣＳ−Ｙａ−、Ｒａ−Ｏ−ＣＳ−Ｎ（Ｒｂ）−Ｙａ−、Ｒａ−Ｎ（Ｒｂ）−ＣＳ−Ｏ−Ｙａ−、Ｒａ−Ｎ（Ｒｂ）−ＣＳ−Ｎ（Ｒｃ）−Ｙａ−、Ｒａ−Ｏ−ＣＳ−Ｏ−Ｙａ−、Ｒａ−Ｓ−ＣＯ−Ｙａ−、Ｒａ−ＣＯ−Ｓ−Ｙａ−、Ｒａ−Ｓ−ＣＯ−Ｎ（Ｒｂ）−Ｙａ−、Ｒａ−Ｎ（Ｒｂ）−ＣＯ−Ｓ−Ｙａ−、Ｒａ−Ｓ−ＣＯ−Ｏ−Ｙａ−、Ｒａ−Ｏ−ＣＯ−Ｓ−Ｙａ−、Ｒａ−Ｓ−ＣＯ−Ｓ−Ｙａ−、Ｒａ−Ｓ−ＣＳ−Ｙａ−、Ｒａ−ＣＳ−Ｓ−Ｙａ−、Ｒａ−Ｓ−ＣＳ−Ｎ（Ｒｂ）−Ｙａ−、Ｒａ−Ｎ（Ｒｂ）−ＣＳ−Ｓ−Ｙａ−、Ｒａ−Ｓ−ＣＳ−Ｏ−Ｙａ−、Ｒａ−Ｏ−ＣＳ−Ｓ−Ｙａ−（式中、Ｒａは、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニルまたはＣ２〜Ｃ６アルキニル基であり、Ｒｂは、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニルまたはＣ２〜Ｃ６アルキニル基であり、Ｒｃは、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニルまたはＣ２〜Ｃ６アルキニル基であり、Ｒｄは、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニルまたはＣ２〜Ｃ６アルキニル基であり、Ｙａは、結合、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレンまたはＣ２〜Ｃ６アルキニレン基である）の基があり、ここで、各ヘテロアルキル基は、少なくとも１個の炭素原子を含有し、１個以上の水素原子が、フッ素また塩素原子によって置換されてもよい。
【００１１】
ヘテロアルキル基の具体的な例として、メトキシ、トリフルオロメトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ、イソプロピルオキシ、ブトキシ、ｔ−ブチルオキシ、メトキシメチル、エトキシメチル、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｍｅ、メトキシエチル、１−メトキシエチル、１−エトキシエチル、２−メトキシエチルまたは２−エトキシエチル、メチルアミノ、エチルアミノ、プロピルアミノ、イソプロピルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、イソプロピルエチルアミノ、メチルアミノメチル、エチルアミノメチル、ジイソプロピルアミノエチル、メチルチオ、エチルチオ、イソプロピルチオ、エノールエーテル、ジメチルアミノメチル、ジメチルアミノエチル、アセチル、プロピオニル、ブチリルオキシ、アセチルオキシ、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロピオニルオキシ、アセチルアミノまたはプロピオニルアミノ、カルボキシメチル、カルボキシエチルまたはカルボキシプロピル、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルカルバモイルまたはＮ−メチルカルバモイルがある。ヘテロアルキル基のさらなる例として、ニトリル、イソニトリル、シアネート、チオシアネート、イソシアネート、イソチオシアネートおよびアルキルニトリル基がある。
【００１２】
表現シクロアルキルとは、１つ以上の環（好ましくは、１つまたは２つ）を含有し、３〜１４個の環炭素原子、好ましくは、３〜１０個の（特に、３、４、５、６または７個の）環炭素原子を含有する、飽和または部分不飽和（例えば、シクロアルケニル基）環式基を指す。表現シクロアルキルとはさらに、１個以上の水素原子が、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素原子によって、またはＯＨ、＝Ｏ、ＳＨ、＝Ｓ、ＮＨ２、＝ＮＨ、Ｎ３もしくはＮＯ２基によって置換されている基、従って、例えば、環式ケトン、例えば、シクロヘキサノン、２−シクロヘキセノンまたはシクロペンタノンなどを指す。シクロアルキル基のさらなる具体的な例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、スピロ［４，５］デカニル、ノルボルニル、シクロヘキシル、シクロペンテニル、シクロヘキサジエニル、デカリニル、ビシクロ［４．３．０］ノニル、テトラリン、シクロペンチルシクロヘキシル、フルオロシクロヘキシルまたはシクロヘキサ−２−エニル基がある。
【００１３】
表現ヘテロシクロアルキルとは、１個以上（好ましくは、１、２または３個）の環炭素原子が、酸素、窒素、ケイ素、セレン、リンまたは硫黄原子によって（好ましくは、酸素、硫黄または窒素原子によって）またはＳＯ基もしくはＳＯ２基によって置換されている、上記で定義されるようなシクロアルキル基を指す。ヘテロシクロアルキル基は、好ましくは、３〜１０個（特に、３、４、５、６または７個）の環原子（好ましくは、Ｃ、Ｏ、ＮおよびＳから選択される）を含有する、１つまたは２つの環を有する。表現ヘテロシクロアルキルとは、フッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素原子によって、またはＯＨ、＝Ｏ、ＳＨ、＝Ｓ、ＮＨ２、＝ＮＨ、Ｎ３もしくはＮＯ２基によって置換されている基をさらに指す。例として、ピペリジル、プロリニル、イミダゾリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、ウロトロピニル、ピロリジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフリルまたは２−ピラゾリニル基、同様にラクタム、ラクトン、環式イミドおよび環式無水物がある。
【００１４】
表現アルキルシクロアルキルとは、上記の定義に従う、シクロアルキルと、アルキル、アルケニルまたはアルキニル基も両方を含有する基、例えば、アルキルシクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アルキルシクロアルケニル、アルケニルシクロアルキルおよびアルキニルシクロアルキル基を指す。アルキルシクロアルキル基は、好ましくは、３〜１０個（特に、３、４、５、６または７個）の環炭素原子を有する１つまたは２つの環および１個または２〜６個の炭素原子を有する１または２つのアルキル、アルケニルまたはアルキニル基（特に、アルキル基）を含有するシクロアルキル基を含有する。
【００１５】
表現ヘテロアルキルシクロアルキルとは、１個以上の（好ましくは、１、２または３個）の炭素原子が、酸素、窒素、ケイ素、セレン、リンまたは硫黄原子によって（好ましくは、酸素、硫黄または窒素原子によって）またはＳＯ基もしくはＳＯ２基によって置換されている、上記で定義されるようなアルキルシクロアルキル基を指す。ヘテロアルキルシクロアルキル基は、好ましくは、３〜１０個（特に、３、４、５、６または７個）の環原子を有する１つまたは２つの環および１個または２〜６個の炭素原子を有する、１または２つのアルキル、アルケニル、アルキニルまたはヘテロアルキル基（特に、アルキルまたはヘテロアルキル基）を含有する。このような基の例として、アルキルヘテロシクロアルキル、アルキルヘテロシクロアルケニル、アルケニルヘテロシクロアルキル、アルキニルヘテロシクロアルキル、ヘテロアルキルシクロアルキル、ヘテロアルキルヘテロシクロアルキルおよびヘテロアルキルヘテロシクロアルケニルがあり、環式基は、飽和または一不飽和、二不飽和もしくは三不飽和である。
【００１６】
表現アリールとは、６〜１４個の環炭素原子、好ましくは、６〜１０個（特に、６個）の環炭素原子を含有する、１つ以上の環を含有する芳香族基を指す。表現アリールとはさらに、フッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素原子によって、またはＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、Ｎ３もしくはＮＯ２基によって置換されている基を指す。例として、フェニル、ナフチル、ビフェニル、２−フルオロフェニル、アニリニル、３−ニトロフェニルまたは４−ヒドロキシフェニル基がある。
【００１７】
表現ヘテロアリールとは、５〜１４個の環原子、好ましくは、５〜１０個（特に、５または６または９または１０個）の環原子を含有する１つ以上の環を含有し、１個以上の（好ましくは、１、２、３または４個）の酸素、窒素、リンまたは硫黄環原子（好ましくは、Ｏ、ＳまたはＮ）を含有する芳香族基を指す。表現ヘテロアリールとはさらに、フッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素原子によって、またはＯＨ、ＳＨ、Ｎ３、ＮＨ２もしくはＮＯ２基によって置換されている基を指す。例として、ピリジル（例えば、４−ピリジル）、イミダゾリル（例えば、２−イミダゾリル）、フェニルピロリル（例えば、３−フェニルピロリル）、チアゾリル、イソチアゾリル、１，２，３−トリアゾリル、１，２，４−トリアゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、インドリル、インダゾリル、テトラゾリル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、オキサゾリル、イソキサゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、イソキサゾリル、インダゾリル、インドリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ピリダジニル、キノリニル、イソキノリニル、ピロリル、プリニル、カルバゾリル、アクリジニル、ピリミジル、２，３’−ビフリル、ピラゾリル（例えば、３−ピラゾリル）およびイソキノリニル基がある。
【００１８】
表現アラルキルとは、上記の定義に従って、アリールと、アルキル、アルケニル、アルキニルおよび／またはシクロアルキル基も両方含有する基、例えば、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アリールシクロアルキル、アリールシクロアルケニル、アルキルアリールシクロアルキルおよびアルキルアリールシクロアルケニル基などを指す。アラルキルの特定の例として、トルエン、キシレン、メシチレン、スチレン、ベンジルクロリド、ｏ−フルオロトルエン、１Ｈ−インデン、テトラリン、ジヒドロナフタレン、インダノン、フェニルシクロペンチル、クメン、シクロヘキシルフェニル、フルオレンおよびインダンがある。アラルキル基は、好ましくは、各々、６〜１０個の炭素原子を含有する、１または２つの芳香環系（特に、１または２つの環）と、１または２〜６個の炭素原子を含有する１もしくは２つのアルキル、アルケニルおよび／もしくはアルキニル基および／または５もしくは６個の環炭素原子を含有するシクロアルキル基を含有する。
【００１９】
表現ヘテロアラルキルとは、上記の定義に従って、それぞれ、アリールまたはヘテロアリールと、アルキル、アルケニル、アルキニルおよび／またはヘテロアルキルならびに／あるいはシクロアルキルおよび／またはヘテロシクロアルキル基も両方を含有する基を指す。ヘテロアラルキル基は、好ましくは、各々、５個もしくは６〜９個もしくは１０個の環炭素原子を含有する１つもしくは２つの芳香環系（特に、１または２つの環）、１個もしくは２〜６個の炭素原子を含有する１つもしくは２つのアルキル、アルケニルおよび／もしくはアルキニル基および／または１〜６個の炭素原子と、Ｏ、ＳおよびＮから選択される１、２もしくは３個のヘテロ原子を含有する１つもしくは２つのヘテロアルキル基ならびに／あるいは各々、５もしくは６個の環炭素原子を含有する１つもしくは２つのシクロアルキル基および／または各々、１、２、３もしくは４個の酸素、硫黄もしくは窒素原子を含む５もしくは６個の環原子を含有する１もしくは２個のヘテロシクロアルキル基を含有する。
【００２０】
例として、アリールヘテロアルキル、アリールヘテロシクロアルキル、アリールヘテロシクロアルケニル、アリールアルキルヘテロシクロアルキル、アリールアルケニルヘテロシクロアルキル、アリールアルキニルヘテロシクロアルキル、アリールアルキルヘテロシクロアルケニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロアリールヘテロアルキル、ヘテロアリールシクロアルキル、ヘテロアリールシクロアルケニル、ヘテロアリールヘテロシクロアルキル、ヘテロアリールヘテロシクロアルケニル、ヘテロアリールアルキルシクロアルキル、ヘテロアリールアルキルヘテロシクロアルケニル、ヘテロアリールヘテロアルキルシクロアルキル、ヘテロアリールヘテロアルキルシクロアルケニルおよびヘテロアリールヘテロアルキルヘテロシクロアルキル基があり、環式基は、飽和または一不飽和、二不飽和もしくは三不飽和である。具体的な例として、テトラヒドロイソキノリニル、ベンゾイル、２−または３−エチルインドリル、４−メチルピリジノ、２−、３−または４−メトキシフェニル、４−エトキシ−フェニル、２−、３−または４−カルボキシフェニルアルキル基がある。
【００２１】
上記ですでに述べたように、表現シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルキルシクロアルキル、ヘテロアルキルシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルおよびヘテロアラルキルはまた、フッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素原子によって、またはＯＨ、＝Ｏ、ＳＨ、＝Ｓ、ＮＨ２、＝ＮＨ、Ｎ３もしくはＮＯ２基によって置換されている基を指す。
【００２２】
表現「任意選択で置換されていてもよい」とは、特に、フッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素原子によって、またはＯＨ、＝Ｏ、ＳＨ、＝Ｓ、ＮＨ２、＝ＮＨ、Ｎ３もしくはＮＯ２基によって任意選択で置換されていてもよい基を指す。この表現は、さらに、１、２、３つまたはそれ以上の非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、Ｃ１〜Ｃ１０ヘテロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１８シクロアルキル、Ｃ２〜Ｃ１７ヘテロシクロアルキル、Ｃ４〜Ｃ２０アルキルシクロアルキル、Ｃ２〜Ｃ１９ヘテロアルキルシクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１８アリール、Ｃ１〜Ｃ１７ヘテロアリール、Ｃ７〜Ｃ２０アラルキルまたはＣ２〜Ｃ１９ヘテロアラルキル基によって置換されていてもよい基を指す。この表現はさらに、特に、１、２、３つまたはそれ以上の非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル、Ｃ２〜Ｃ９ヘテロシクロアルキル、Ｃ７〜Ｃ１２アルキルシクロアルキル、Ｃ２〜Ｃ１１ヘテロアルキルシクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ１〜Ｃ９ヘテロアリール、Ｃ７〜Ｃ１２アラルキルまたはＣ２〜Ｃ１１ヘテロアラルキル基によって置換されていてもよい基を指す。
【００２３】
特に、好ましくは、基Ａｒ１、Ａｒ２、Ａｒ３、Ａｒ４およびＡｒ５で、表現「任意選択で置換されていてもよい」とは、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、式−Ｏ−アルキル（例えば、−ＯＭｅ、−ＯＥｔ、−Ｏ−ｎＰｒ、−Ｏ−ｉＰｒ、−Ｏ−ｎＢｕ、−Ｏ−ｉＢｕまたは−Ｏ−ｔＢｕなどの−Ｏ−Ｃ１〜６アルキル）、−ＮＨ２、−ＮＲ５ａＲ６ａ（式中、Ｒ５ａおよびＲ６ａは、互いに独立に、水素原子またはＣ１〜６アルキル基などのアルキル基である）、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＣＯＮＨ２、−ＣＮ、−アルキル（例えば、−Ｃ１−６アルキル、−ＣＦ３）、−ＳＨ、−Ｓ−アルキル（例えば、−Ｓ−Ｃ１−６アルキル）の基から独立に選択される１、２または３つの基によって任意選択で置換されていてもよい基を指す。
【００２４】
最も好ましくは、基Ａｒ１、Ａｒ２、Ａｒ３、Ａｒ４およびＡｒ５で、表現「任意選択で置換されていてもよい」とは、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、式−Ｏ−Ｃ１〜６アルキル（特に、−ＯＭｅ、−ＯＥｔ、−Ｏ−ｎＰｒ、−Ｏ−ｉＰｒ、−Ｏ−ｎＢｕ、−Ｏ−ｉＢｕまたは−Ｏ−ｔＢｕなどの−Ｏ−Ｃ１〜４アルキル）および−Ｃ１−６アルキル（例えば、−ＣＨ３または−ＣＦ３などの−Ｃ１~４アルキル）の基から独立に選択される１、２または３つの基によって任意選択で置換されていてもよい基を指す。
【００２５】
特に、好ましくは、基Ａｒ６で、表現「任意選択で置換されていてもよい」とは、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、式−Ｏ−アルキル（例えば、−ＯＭｅ、−ＯＥｔ、−Ｏ−ｎＰｒ、−Ｏ−ｉＰｒ、−Ｏ−ｎＢｕ、−Ｏ−ｉＢｕまたは−Ｏ−ｔＢｕなどの−Ｏ−Ｃ１〜６アルキル）、−ＮＨ２、−ＮＲ５ａＲ６ａ（式中、Ｒ５ａおよびＲ６ａは、互いに独立に、水素原子またはＣ１〜６アルキル基などのアルキル基である）、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＣＯＮＨ２、−ＣＮ、−アルキル（例えば、−Ｃ１〜６アルキル、−ＣＦ３）、−ＳＨ、−Ｓ−アルキル（例えば、−Ｓ−Ｃ１~６アルキル）およびＮＯ２の基から独立に選択される１、２または３つの基によって任意選択で置換されていてもよい基を指す。
【００２６】
最も好ましくは、基Ａｒ６で、表現「任意選択で置換されていてもよい」とは、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、−ＮＨ２、−ＮＯ２、式−Ｏ−Ｃ１〜６アルキル（特に、−ＯＭｅ、−ＯＥｔ、−Ｏ−ｎＰｒ、−Ｏ−ｉＰｒ、−Ｏ−ｎＢｕ、−Ｏ−ｉＢｕまたは−Ｏ−ｔＢｕなどの−Ｏ−Ｃ１〜４アルキル）および−Ｃ１〜６アルキル（例えば、−ＣＨ３または−ＣＦ３などの−Ｃ１〜４アルキル）の基から独立に選択される１、２または３つの基によって任意選択で置換されていてもよい基を指す。
【００２７】
用語ハロゲンとは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを指す。
【００２８】
好ましい具体例によれば、本明細書に記載されるすべてのアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルキルシクロアルキル、ヘテロアルキルシクロアルキル、アラルキルおよびヘテロアラルキル基は、互いに独立に、任意選択で置換されていてもよい。
【００２９】
アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、アルキルシクロアルキル、ヘテロアルキルシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アラルキルまたはヘテロアラルキル基が、２つ以上の環を含有する場合には、これらの環は、単結合もしくは二重結合によって互いに結合していてもよく、またはこれらの環は、環状であってもよい。
【００３０】
式（Ｉ）の化合物は、その置換によって、１つ以上のキラリティーの中心を含有し得る。したがって、本発明は、すべての純粋な鏡像異性体およびすべての純粋なジアステレオ異性体の両方と、任意の混合比のそれらの混合物も含む。本発明はさらに、一般式（Ｉ）の化合物のすべてのシス／トランス異性体と、それらの混合物も含む。本発明はさらに、式（Ｉ）の化合物のすべての互変異性形態を含む。
【００３１】
Ａｒ４が存在しない場合には、同様にＬ３も存在しないことが好ましい。
【００３２】
Ａｒ５が存在しない場合には、同様にＬ４も存在しないことがさらに好ましい。
【００３３】
Ａｒ１は、酸素、硫黄および窒素から選択される１、２または３個のヘテロ原子を含む５個の環原子を有する、任意選択で置換されていてもよい１，４−フェニレン基または任意選択で置換されていてもよい１，３−ヘテロアリーレン基であることが好ましい。
【００３４】
Ａｒ１は、任意選択で置換されていてもよい１，４−フェニレン基であることがさらに好ましい。
【００３５】
Ａｒ２は、酸素、硫黄および窒素から選択される１、２または３個のヘテロ原子を含む５個の環原子を有する、任意選択で置換されていてもよい１，４−フェニレン基または任意選択で置換されていてもよい１，３−ヘテロアリーレン基であることが好ましい。
【００３６】
Ａｒ２は、任意選択で置換されていてもよい１，４−フェニレン基であることがさらに好ましい。
【００３７】
Ａｒ３は、酸素、硫黄および窒素から選択される１、２または３個のヘテロ原子を含む５個の環原子を有する、任意選択で置換されていてもよい１，４−フェニレン基または任意選択で置換されていてもよい１，３−ヘテロアリーレン基であることが好ましい。
【００３８】
Ａｒ３は、任意選択で置換されていてもよい１，４−フェニレン基であることがさらに好ましい。
【００３９】
Ａｒ４は、酸素、硫黄および窒素から選択される１、２または３個のヘテロ原子を含む５個の環原子を有する、任意選択で置換されていてもよい１，４−フェニレン基または任意選択で置換されていてもよい１，３−ヘテロアリーレン基であることが好ましい。
【００４０】
Ａｒ４は、任意選択で置換されていてもよい１，４−フェニレン基であることがさらに好ましい。
【００４１】
Ａｒ５は、酸素、硫黄および窒素から選択される１、２または３個のヘテロ原子を含む５個の環原子を有する、任意選択で置換されていてもよい１，４−フェニレン基または任意選択で置換されていてもよい１，３−ヘテロアリーレン基であることが好ましい。
【００４２】
Ａｒ５は、任意選択で置換されていてもよい１，４−フェニレン基であることがさらに好ましい。
【００４３】
Ａｒ４は、存在しないことがさらに好ましい。
【００４４】
Ａｒ５は、存在しないことがさらに好ましい。
【００４５】
用語、酸素、硫黄および窒素から選択される１、２または３個のヘテロ原子を含む５個の環原子を有する、１，３−ヘテロアリーレン基は、特に、好ましくは、以下の基：
【化２】
0006730183.tif 000003
［式中、Ａは、Ｏ、ＳまたはＮＨであり、Ｕは、ＮまたはＣＨであり、Ｖは、ＮまたはＣＨであり、Ｗは、ＮまたはＣＨであり、Ｘは、ＮまたはＣＨである］
のうち１種を指す。
【００４６】
Ｌ１は、式−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＳＯ２ＮＨ−、−ＮＨＳＯ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＲ３＝ＣＲ４−の基または酸素、硫黄および窒素から選択される１、２もしくは３個のヘテロ原子を含む５個の環原子を有する任意選択で置換されていてもよいヘテロアリーレン基であり、Ｒ３およびＲ４は互いに独立に、Ｃ１〜６アルキル基であることがさらに好ましい。
【００４７】
Ｌ２は、式−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＳＯ２ＮＨ−、−ＮＨＳＯ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＲ３＝ＣＲ４−の基または酸素、硫黄および窒素から選択される１、２もしくは３個のヘテロ原子を含む５個の環原子を有する任意選択で置換されていてもよいヘテロアリーレン基であり、Ｒ３およびＲ４は互いに独立に、Ｃ１〜６アルキル基であることがさらに好ましい。
【００４８】
Ｌ３は、存在しないか、または式−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＳＯ２ＮＨ−、−ＮＨＳＯ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＲ３＝ＣＲ４−の基もしくは酸素、硫黄および窒素から選択される１、２もしくは３個のヘテロ原子を含む５個の環原子を有する任意選択で置換されていてもよいヘテロアリーレン基であり、Ｒ３およびＲ４は互いに独立に、Ｃ１〜６アルキル基であることがさらに好ましい。
【００４９】
Ｌ４は、存在しないか、または式−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＳＯ２ＮＨ−、−ＮＨＳＯ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＲ３＝ＣＲ４−の基もしくは酸素、硫黄および窒素から選択される１、２もしくは３個のヘテロ原子を含む５個の環原子を有する任意選択で置換されていてもよいヘテロアリーレン基であり、Ｒ３およびＲ４は互いに独立に、Ｃ１〜６アルキル基であることがさらに好ましい。
【００５０】
Ｌ１は、ＮＨＣＯ（式中、窒素原子は、Ａｒ１と結合している）または以下の式：
【化３】
0006730183.tif 000004
［（ＮＨ基は、Ａｒ１と結合している）、Ｒ３０は、水素原子またはＣ１〜３アルキル基である］
で示される基であることがさらに好ましい。
【００５１】
Ｌ１は、ＮＨＣＯ（式中、窒素原子は、Ａｒ１と結合している）であることが特に好ましい。
【００５２】
Ｌ２は、ＮＨＣＯ（窒素原子は、Ａｒ２と結合している）または以下の式：
【化４】
0006730183.tif 000005
［（ＮＨ基は、Ａｒ２と結合している）、Ｒ３０は、水素原子またはＣ１〜３アルキル基である］
で示される基であることがさらに好ましい。
【００５３】
Ｌ２は、ＮＨＣＯ（式中、窒素原子は、Ａｒ１と結合している）であることが特に好ましい。
【００５４】
Ｌ３は存在しないか、または以下の式：
【化５】
0006730183.tif 000006
［（式中、ＮＨ基は、Ａｒ３と結合している）、Ｒ３０は、水素原子またはＣ１〜３アルキル基である］
で示される基であることがさらに好ましい。
【００５５】
Ｌ４は、存在しないか、またはＮＨＣＯ（式中、窒素原子は、Ａｒ４と結合している）であることがさらに好ましい。
【００５６】
Ｒ３０は、水素原子であることがさらに好ましい。
【００５７】
Ｒ１は、水素原子、ハロゲン原子または式−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＣＮ、−アルキル（例えば、−ＣＦ３）、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−ＣＯ−アルキル、−ＮＨ−アルキル、−ＮＨ−ＣＯ−アルキルの基または酸素、硫黄および窒素から選択される１、２、３もしくは４個のヘテロ原子を含む５個の環原子を有する、任意選択で置換されていてもよいヘテロアリール基または酸素、硫黄および窒素から選択される１、２、３もしくは４個のヘテロ原子を含む５個の環原子を有する、任意選択で置換されていてもよいヘテロシクロアルキル基であることがさらに好ましい。
【００５８】
Ｒ２は、水素原子、ハロゲン原子または式−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＣＯＮＨ２、−ＮＯ２、−ＣＮ、−アルキル（例えば、−ＣＦ３）、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−ＣＯ−アルキル、−ＮＨ−アルキル、−ＮＨ−ＣＯ−アルキルの基または酸素、硫黄および窒素から選択される１、２、３もしくは４個のヘテロ原子を含む５個の環原子を有する、任意選択で置換されていてもよいヘテロアリール基または酸素、硫黄および窒素から選択される１、２、３もしくは４個のヘテロ原子を含む５個の環原子を有する、任意選択で置換されていてもよいヘテロシクロアルキル基であることがさらに好ましい。
【００５９】
基Ｒ１およびＲ２としての、酸素、硫黄および窒素から選択される１、２、３もしくは４個のヘテロ原子を含む５個の環原子を有する、任意選択で置換されていてもよいヘテロアリール基および酸素、硫黄および窒素から選択される１、２、３もしくは４個のヘテロ原子を含む５個の環原子を有する、任意選択で置換されていてもよいヘテロシクロアルキル基の好ましい例として、以下の式：
【化６】
0006730183.tif 000007
で示される基などのカルボン酸のアイソスターがあり、すべてのこれらの基は、任意選択でさらに置換されていてもよい。
【００６０】
Ｒ１は、式−ＮＨ２、−ＮＯ２、ＣＯＯＲ１１または−ＣＯＮＲ１２Ｒ１３の基であり、式中、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３は独立に、水素原子またはＣ１〜６アルキル基であることが特に好ましく、Ｒ１は、式−ＣＯＯＨの基であることがさらに好ましい。
【００６１】
Ｒ２は、式−ＮＨ２、−ＮＯ２、ＣＯＯＲ１１ａまたは−ＣＯＮＲ１２ａＲ１３ａの基であり、式中、Ｒ１１ａ、Ｒ１２ａおよびＲ１３ａは独立に、水素原子またはＣ１〜６アルキル基であることがさらに特に好ましく、Ｒ２は、式−ＮＨ２または−ＮＯ２の基であることがさらに好ましい。
【００６２】
Ｒ１は、ヒドロキシ基によって置換されている、酸素、硫黄および窒素から選択される１、２、３もしくは４個のヘテロ原子を含む５個の環原子を有するヘテロアリール基であることがさらに特に好ましい。
【００６３】
Ｒ２は、ヒドロキシ基によって置換されている、酸素、硫黄および窒素から選択される１、２、３もしくは４個のヘテロ原子を含む５個の環原子を有するヘテロアリール基であることがさらに特に好ましい。
【００６４】
式（Ｉ）
【化７】
0006730183.tif 000008
［式中、
Ａｒ１は、任意選択で置換されていてもよい１，４−フェニレン基であり、
Ａｒ２は、任意選択で置換されていてもよい１，４−フェニレン基であり、
Ａｒ３は、任意選択で置換されていてもよい１，４−フェニレン基であり、
Ａｒ４は、存在しないか、または任意選択で置換されていてもよい１，４−フェニレン基であり、
Ａｒ５は、存在しないか、または任意選択で置換されていてもよい１，４−フェニレン基であり、
Ｌ１は、式−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＳＯ２ＮＨ−もしくは−ＮＨＳＯ２−の基または以下の式：
【化８】
0006730183.tif 000009
（式中、ＮＨ基は、Ａｒ１と結合している）
で示される基であり、
Ｌ２は、式−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＳＯ２ＮＨ−または−ＮＨＳＯ２−の基であり、
Ｌ３は、存在しないか、または式−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＳＯ２ＮＨ−もしくは−ＮＨＳＯ２−の基または以下の式：
【化９】
0006730183.tif 000010
（式中、ＮＨ基は、Ａｒ３と結合している）
で示される基であり、
Ｌ４は、存在しないか、または式−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＳＯ２ＮＨ−もしくは−ＮＨＳＯ２−の基であり、
Ｒ３０は、水素原子またはＣ１〜３アルキル基（特に好ましくは、水素原子）であり、
Ｒ１は、式−ＮＨ２、−ＮＯ２、ＣＯＯＲ１１または−ＣＯＮＲ１２Ｒ１３の基であり、式中、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３は独立に、水素原子またはＣ１〜６アルキル基であり（Ｒ１は、式−ＣＯＯＨの基であることが特に好ましい）、
Ｒ２は、式−ＮＨ２、−ＮＯ２、ＣＯＯＲ１１ａまたは−ＣＯＮＲ１２ａＲ１３ａの基であり、式中、Ｒ１１ａ、Ｒ１２ａおよびＲ１３ａは独立に、水素原子またはＣ１〜６アルキル基であり（Ｒ２は、式−ＮＨ２または−ＮＯ２の基であることが特に好ましい）］
で示される化合物またはその医薬上許容される塩、溶媒和物もしくは水和物または医薬上許容される製剤が特に好ましい。
【００６５】
そこで、Ｌ１は、式−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＳＯ２ＮＨ−または−ＮＨＳＯ２−の基であり、Ｌ３は、存在しないか、または以下の式：
【化１０】
0006730183.tif 000011
（式中、ＮＨ基は、Ａｒ３と結合している）
で示される基であることが好ましい。
【００６６】
式（ＩＩ）
【化１１】
0006730183.tif 000012
［式中、Ａｒ１、Ａｒ２、Ａｒ３、Ｌ１、Ｌ２、Ｒ１およびＲ２は、上記で定義されるとおりである］
で示される化合物がさらに好ましい。
【００６７】
式（ＩＩＩ）
【化１２】
0006730183.tif 000013
［式中、ｎは、０、１、２、３または４であり、
ｍは、０、１、２、３または４であり、
ｐは、０、１、２、３または４であり、
基Ｒ２１は独立に、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、式−Ｏ−アルキル（例えば、−ＯＭｅ、−ＯＥｔ、−Ｏ−ｎＰｒ、−Ｏ−ｉＰｒ、−Ｏ−ｎＢｕ、−Ｏ−ｉＢｕまたは−Ｏ−ｔＢｕなどの−Ｏ−Ｃ１〜６アルキル）、−ＮＨ２、−ＮＲ５ａＲ６ａ（式中、Ｒ５ａおよびＲ６ａは互いに独立に、水素原子またはＣ１−６アルキル基などのアルキル基である）、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＣＯＮＨ２、−ＣＮ、−アルキル（例えば、−Ｃ１~６アルキル、−ＣＦ３）、−ＳＨ、−Ｓ−アルキル（例えば、−Ｓ−Ｃ１~６アルキル）の基から選択され、基Ｒ２２は独立に、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、式−Ｏ−アルキル（例えば、−ＯＭｅ、−ＯＥｔ、−Ｏ−ｎＰｒ、−Ｏ−ｉＰｒ、−Ｏ−ｎＢｕ、−Ｏ−ｉＢｕまたは−Ｏ−ｔＢｕなどの−Ｏ−Ｃ１〜６アルキル）、−ＮＨ２、−ＮＲ５ａＲ６ａ（式中、Ｒ５ａおよびＲ６ａは互いに独立に、水素原子またはＣ１−６アルキル基などのアルキル基である）、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＣＯＮＨ２、−ＣＮ、−アルキル（例えば、−Ｃ１〜６アルキル、−ＣＦ３）、−ＳＨ、−Ｓ−アルキル（例えば、−Ｓ−Ｃ１~６アルキル）の基から選択され、基Ｒ２３は独立に、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、式−Ｏ−アルキル（例えば、−ＯＭｅ、−ＯＥｔ、−Ｏ−ｎＰｒ、−Ｏ−ｉＰｒ、−Ｏ−ｎＢｕ、−Ｏ−ｉＢｕまたは−Ｏ−ｔＢｕなどの−Ｏ−Ｃ１〜６アルキル）、−ＮＨ２、−ＮＲ５ａＲ６ａ（式中、Ｒ５ａおよびＲ６ａは互いに独立に、水素原子またはＣ１〜６アルキル基などのアルキル基である）、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＣＯＮＨ２、−ＣＮ、−アルキル（例えば、−Ｃ１~６アルキル、−ＣＦ３）、−ＳＨ、−Ｓ−アルキル（例えば、−Ｓ−Ｃ１~６アルキル）の基から選択され、
Ｒ１、Ｒ２、Ｌ１およびＬ２は、上記で定義されるとおりである］
で示される化合物がさらに好ましい。
【００６８】
式（ＩＶ）
【化１３】
0006730183.tif 000014
［式中、
Ｒ５は、式−Ｏ−Ｃ１〜６アルキルの基であり、
Ｒ６は、ヒドロキシ基であり、
Ｒ７は、式−Ｏ−Ｃ１〜６アルキルの基であり、
Ｒ８は、水素原子、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルキルシクロアルキル、ヘテロアルキルシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルまたはヘテロアラルキル基である］
で示される化合物がさらに好ましい。
【００６９】
Ｒ８は、水素原子または以下の式：
【化１４】
0006730183.tif 000015
［式中、Ｒ９は、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ２であり、Ｒ１０は、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ２である］
で示される基であることが好ましい。
【００７０】
Ｒ５は、式−Ｏ−Ｃ１〜４アルキルの基であり、Ｒ７は、式−Ｏ−Ｃ１〜４アルキルの基であることがさらに好ましい。
【００７１】
式（Ｖ）
【化１５】
0006730183.tif 000016
［式中、
Ｒ５１は、水素原子またはＣ１〜６アルキル基であり、
Ｒ５２は、水素原子、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１〜６アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１〜６アルキルの基であり、
Ｒ５３は、水素原子、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１〜６アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１〜６アルキルの基であり、
Ｒ５４は、水素原子、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１〜６アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１〜６アルキルの基であり、
Ｒ５５は、水素原子、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１〜６アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１〜６アルキルの基であり、
Ｄは、ＮまたはＣＲ５６であり、
Ｅは、ＮまたはＣＲ５７であり、
Ｇは、ＮまたはＣＲ５８であり、
Ｍは、ＮまたはＣＲ５９であり、
Ｒ５６は、水素原子、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１〜６アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１〜６アルキルの基であり、
Ｒ５７は、水素原子、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１〜６アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１〜６アルキルの基であり、
Ｒ５８は、水素原子、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１〜６アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１〜６アルキルの基であり、
Ｒ５９は、水素原子、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１〜６アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１〜６アルキルの基であり、
Ａｒ６は、酸素、硫黄および窒素から選択される１、２、３または４個のヘテロ原子を含む５または６個の環原子を有する、任意選択で置換されていてもよい（例えば、Ｒ２、Ｒ８またはＮＨＲ８などの１つ２つまたはそれ以上の置換基によって）フェニル基または任意選択で置換されていてもよい（例えば、Ｒ２、Ｒ８またはＮＨＲ８などの１つ２つまたはそれ以上の置換基によって）ヘテロアリール基である］
で示される化合物またはその医薬上許容される塩、溶媒和物もしくは水和物または医薬上許容される製剤がさらに好ましい。
【００７２】
式（Ｖ）［式中、
Ｒ５１は、水素原子またはＣ１〜４アルキル基であり、
Ｒ５２は、水素原子、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１〜４アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１〜４アルキルの基であり、
Ｒ５３は、水素原子、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１〜４アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１〜４アルキルの基であり、
Ｒ５４は、水素原子、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１〜４アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１〜４アルキルの基であり、
Ｒ５５は、水素原子、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１〜４アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１〜４アルキルの基であり、
Ｄは、ＮまたはＣＲ５６であり、
Ｅは、ＮまたはＣＲ５７であり、
Ｇは、ＮまたはＣＲ５８であり、
Ｍは、ＮまたはＣＲ５９であり、
Ｒ５６は、水素原子、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１〜４アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１〜４アルキルの基であり、
Ｒ５７は、水素原子、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１〜４アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１〜４アルキルの基であり、
Ｒ５８は、水素原子、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１〜４アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１〜４アルキルの基であり、
Ｒ５９は、水素原子、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１〜６アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１〜４アルキルの基である］
で示される化合物が特に好ましい。
【００７３】
Ｄ、Ｅ、ＧおよびＭのうち１つまたは２つのみ（特に、１つのみ）がＮであることが特に好ましい。
【００７４】
式（ＶＩ）
【化１６】
0006730183.tif 000017
［式中、
Ｒ５１は、水素原子またはＣ１〜６アルキル基であり、
Ｒ５３は、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１〜６アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１〜６アルキル（特に好ましくは、式−Ｏ−Ｃ１〜６アルキルの基）の基であり、
Ｄは、ＮまたはＣＲ５６であり、
Ｒ５６は、水素原子、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１〜６アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１〜６アルキルの基であり、
Ｒ５７は、水素原子、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１〜６アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１〜６アルキルの基であり、
Ｒ５８は、水素原子、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１〜６アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１〜６アルキルの基であり、
Ｒ５９は、水素原子、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１〜６アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１〜６アルキルの基であり、
Ａｒ６は、酸素、硫黄および窒素から選択される１、２、３または４個のヘテロ原子を含む５または６個の環原子を有する、任意選択で置換されていてもよい（例えば、Ｒ２、Ｒ８またはＮＨＲ８などの１つ２つまたはそれ以上の置換基によって）フェニル基または任意選択で置換されていてもよい（例えば、Ｒ２、Ｒ８またはＮＨＲ８などの１つ２つまたはそれ以上の置換基によって）ヘテロアリール基である］
で示される化合物またはその医薬上許容される塩、溶媒和物もしくは水和物または医薬上許容される製剤がさらに好ましい。
【００７５】
Ｒ５１が、水素原子またはＣ１〜４アルキル基であり、
Ｒ５３が、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１〜４アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１〜４アルキルの基（特に、好ましくは、式−Ｏ−Ｃ１〜４アルキルの基）であり、
Ｄが、ＮまたはＣＲ５６であり、
Ｒ５６が、水素原子、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１〜４アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１〜４アルキルの基であり、
Ｒ５７が、水素原子、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１〜４アルキル基、または式−Ｏ−Ｃ１〜４アルキルの基であり、
Ｒ５８が、水素原子、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１〜４アルキル基、または式−Ｏ−Ｃ１〜４アルキルの基であり、
Ｒ５９が、水素原子、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１〜４アルキル基、または式−Ｏ−Ｃ１〜４アルキルの基である、式（ＶＩ）の化合物が特に好ましい。
【００７６】
式（ＶＩＩ）
【化１７】
0006730183.tif 000018
［式中、
Ｒ５１は、水素原子またはＣ１〜６アルキル基であり、
Ｒ５３は、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１〜６アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１〜６アルキルの基（特に、好ましくは、式−Ｏ−Ｃ１〜６アルキルの基）であり、
Ｄは、ＮまたはＣＲ５６であり、
Ｒ５６は、水素原子、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１〜６アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１〜６アルキルの基であり、
Ｒ５７は、水素原子、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１〜６アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１〜６アルキルの基であり、
Ｒ５８は、水素原子、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１〜６アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１〜６アルキルの基であり、
Ｒ５９は、水素原子、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１〜６アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１〜６アルキルの基であり、
Ｒ６０は、水素原子、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１〜６アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１〜６アルキルの基であり、
Ｒ６１は、水素原子、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１〜６アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１〜６アルキルの基であり、
Ｒ８は、水素原子、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルキルシクロアルキル、ヘテロアルキルシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルまたはヘテロアラルキル基である］
で示される化合物またはその医薬上許容される塩、溶媒和物もしくは水和物または医薬上許容される製剤がさらに好ましい。
【００７７】
Ｒ５１が、水素原子またはＣ１〜４アルキル基であり、
Ｒ５３が、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１〜４アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１〜４アルキルの基（特に、好ましくは、式−Ｏ−Ｃ１〜４アルキルの基）であり、
Ｄが、ＮまたはＣＲ５６であり、
Ｒ５６が、水素原子、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１〜４アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１〜４アルキルの基であり、
Ｒ５７が、水素原子、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１〜４アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１〜４アルキルの基であり、
Ｒ５８が、水素原子、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１〜４アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１〜４アルキルの基であり、
Ｒ５９が、水素原子、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１〜４アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１〜４アルキルの基であり、
Ｒ６０が、水素原子、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１〜４アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１〜４アルキルの基であり、
Ｒ６１が、水素原子、Ｆ、Ｃｌ、ヒドロキシ基、Ｃ１〜４アルキル基または式−Ｏ−Ｃ１〜４アルキルの基である、式（ＶＩＩ）の化合物が、特に好ましい。
【００７８】
Ｒ８は、水素原子または以下の式：
【化１８】
0006730183.tif 000019
［式中、Ｒ９は、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ２であり、Ｒ１０は、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ２である］
で示される基であることが好ましい。
【００７９】
以下の化合物：
【化１９】
0006730183.tif 000020
【化２０】
0006730183.tif 000021
【化２１】
0006730183.tif 000022
【化２２】
0006730183.tif 000023
【化２３】
0006730183.tif 000024
（Ｒ’は、ＮＨ２またはＯＨであり、Ｒ”は、ＮＨ２またはＯＨである）
が特に好ましい。
【００８０】
以下の化合物：
【化２４】
0006730183.tif 000025
【化２５】
0006730183.tif 000026
がさらに特に好ましい。
【００８１】
以下の化合物：
【化２６】
0006730183.tif 000027
【化２７】
0006730183.tif 000028
がさらに好ましい。
【００８２】
本発明は、本明細書に記載される１種以上の化合物またはその医薬上許容される塩、溶媒和物もしくは水和物を、任意選択で、１種以上の担体物質および／または１種以上のアジュバントと組み合わせて含む医薬組成物をさらに提供する。
【００８３】
本発明はさらに、特に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ａ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、その他のグラム陰性菌およびグラム陽性菌によって引き起こされる細菌感染の治療および／または予防において使用するための、本明細書に記載されるような化合物または医薬組成物を提供する。
【００８４】
さらに好ましくは、本発明は、特に、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）およびその他のグラム陰性菌によって引き起こされる細菌感染の治療および／または予防において使用するための化合物を提供する。
【００８５】
特に、選択されたグラム陰性菌およびグラム陽性菌によって引き起こされる細菌感染の治療および／または予防のための医薬の調製のために、本明細書に記載されるような化合物または本明細書に定義されるような医薬組成物を提供することが本発明のさらなる目的である。
【００８６】
十分に塩基性の化合物の薬理学的に許容される塩の例として、塩酸、臭化水素酸、硫酸およびリン酸のような生理学的に許容される無機酸の塩またはメタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、乳酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸およびサリチル酸のような有機酸の塩がある。さらに、十分に酸性の化合物は、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウムまたはマグネシウム塩、アンモニウム塩または有機塩基性塩、例えば、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、水酸化コリン、メグルミン、ピペリジン、モルホリン、トリス−（２−ヒドロキシエチル）アミン、リシンまたはアルギニン塩を形成し得、それらのすべてもまた、本明細書に記載される化合物の塩のさらなる例である。本明細書に記載される化合物は、溶媒和、特に水和され得る。水和（ｈｙｄｒａｔｉｚａｔｉｏｎ）／水和（ｈｙｄｒａｔｉｏｎ）は、製造プロセスの際に、または最初は水を含まない化合物の吸湿性の結果として起こり得る。溶媒和物および／または水和物は、例えば、固体または液体形態で存在し得る。
【００８７】
本明細書に記載された化合物、それぞれ、その薬理学的に許容される塩、溶媒和物および水和物ならびに製剤および医薬組成物の治療的使用も、本発明の範囲内にある。
【００８８】
本発明の医薬組成物は、本明細書に記載される少なくとも１種の化合物と、任意選択で、１種または複数の担体物質および／またはアジュバントとを含む。
【００８９】
上記のように、本明細書に記載された化合物、その溶媒和物、塩または製剤を含有する治療上有用な薬剤も、本発明の範囲中に含まれる。一般に、本明細書に記載された化合物は、当技術分野で公知の、既知の許容される様式を使用し、単独でまたは任意のその他の治療薬と組み合わせて投与される。
【００９０】
経口投与のために、このような治療上有用や薬剤は、以下の経路：経口、例えば、錠剤、糖衣錠、コート錠、丸剤、半固体、ソフトまたはハードカプセル剤、例えば、ソフトおよびハードゼラチンカプセル剤、水性または油性溶液、エマルジョン、懸濁液またはシロップ、例えば、注射用溶液または懸濁液として静脈内、筋肉内および皮下注射を含めた非経口、坐剤として直腸、例えば、粉末製剤として、微結晶として、またはスプレー（例えば、液体エアロゾル）として吸入または吹送によって、経皮、例えば、有効成分を含有する軟膏剤などの経皮送達系（ＴＤＳ）によって、または鼻腔内のうち１種によって投与され得る。このような錠剤、丸剤、半固体、コート錠、糖衣錠およびハード、例えば、ゼラチン、カプセル剤の製造のために、治療上有用な製品を、例えば、ラクトース、スクロース、グルコース、ゼラチン、麦芽、シリカゲル、デンプンまたはそれらの誘導体、タルク、ステアリン酸（ｓｔｅａｒｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）またはそれらの塩、脱脂粉乳などのように、医薬上不活性の、無機または有機賦形剤と混合してもよい。ソフトカプセル剤の製造のために、例えば、野菜、石油、動物または合成油、ワックス、脂肪およびポリオールのように、賦形剤を使用してもよい。液体溶液、エマルジョンまたは懸濁液またはシロップの製造のために、賦形剤として、例えば、水、アルコール、生理食塩水、水性デキストロース、ポリオール、グリセリン、脂質、リン脂質、シクロデキストリン、野菜、石油、動物または合成油を使用してもよい。脂質が特に好ましく、リン脂質がより好ましく（天然起源のものが好ましい、３００〜３５０ｎｍの間の粒径を有するものが特に好ましい）、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ＝７〜８、好ましくは、７．４）中であることが好ましい。坐剤用には、例えば、野菜、石油、動物または合成油、ワックス、脂肪およびポリオールのように、賦形剤を使用してもよい。エアゾール製剤用には、例えば、酸素、窒素および二酸化炭素のように、この目的に適した圧縮ガスを使用してもよい。医薬上有用な薬剤はまた、保存、安定化のための添加剤、例えば、ＵＶ安定化剤、乳化剤、甘味料、芳香剤、浸透圧を変更するための塩、バッファー、コーティング添加剤および抗酸化物質を含有し得る。
【００９１】
一般に、約８０ｋｇの体重の成人ヒトへの経口または非経口投与の場合には、約１ｍｇ〜約１０，０００ｍｇ、好ましくは、約５ｍｇ〜約１，０００ｍｇという一日投与量が、適当でなくてはならないが、示される場合には、上限が超えられることもある。一日投与量は、単回用量として投与されてもよく、もしくは分割用量で投与されてもよい、または非経口投与用には、連続注入もしくは皮下注射として与えられてもよい。
【００９２】
本発明の化合物は、発酵によって（例えば、株ＭＣｙ８０７１  ＤＳＭ２７００４の発酵によって）または当業者に公知の手順を適用する化学合成によって調製できる。
【００９３】
例えば、本発明の化合物は、以下の手順に従って調製できる：
それぞれ、任意選択で置換されていてもよい構成要素（例えば、Ａｒ１、Ａｒ２、Ａｒ３、Ａｒ４およびＡｒ５）から出発し、これらの構成要素を、当業者に公知の酸塩化物またはカップリング試薬を使用し、例えば、以下の反応スキーム：
【化２８】
0006730183.tif 000029
に従って互いに連結できる。
【００９４】
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３および／またはＬ４が、式−ＣＨ＝ＣＨ−の基（または別のオレフィン基）である場合には、それぞれの任意選択で置換されていてもよい構成要素（例えば、Ａｒ１、Ａｒ２、Ａｒ３、Ａｒ４およびＡｒ５）を、ウィティッヒまたはホーナー反応を使用し、例えば、以下の反応スキーム：
【化２９】
0006730183.tif 000030
に従って互いに連結できる。
【００９５】
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３および／またはＬ４が、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリール基である場合には、それぞれの任意選択で置換されていてもよい構成要素（例えば、Ａｒ１、Ａｒ２、Ａｒ３、Ａｒ４およびＡｒ５）を、同様の反応条件を適用して互いに連結できる。
【００９６】
シストバクトアミド生合成遺伝子クラスターを同定する工程：
シストバクトアミド産生株のゲノムを、ショットガン配列決定によって配列決定した。シストバクトアミドの主な構成要素が非タンパク新生アミノ酸ｐ−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）であるので、Ｃｂｖ３４のゲノム中の推定シストバクトアミド生合成クラスターの同定のためのクエリーとして、ｐ−アミノ安息香酸シンターゼ（クエリー、ＮＰ＿４１５６１４）を使用した。重要なことに、コンピュータによって予測された約４８ｋｂの大きなＮＲＰＳクラスターとの関連で非リボソームペプチドシンターゼ（ＣｙｓＧ、ＨおよびＫ）を含むオペロンを形成する（図１２、帰属：表Ａ）、ｐ−アミノ安息香酸シンターゼ相同体が同定され得る（ＣｙｓＤ、図１２および表Ａ）。このＮＲＰＳクラスター中の遺伝子をｐｆａｍ、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴおよびｐｈｙｒｅ２によって分析した。ｐ−アミノ安息香酸シンターゼ相同体とは別に、クラスター中に２種のさらなるＰＡＢＡ生合成酵素：アミノデオキシコリスミ酸リアーゼ（Ｃｙｓｌ）および３−デオキシ−ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−ホスフェート（ＤＡＨＰ）シンターゼ（ＣｙｓＮ）を見い出すことができる。ＤＡＨＰシンターゼ（ＣｙｓＮ）は、シキミ酸およびコリスミ酸の産生のための重要な酵素である。シキミ酸経路の主要部では、Ｄ−エリスロース４−ホスフェートおよびホスホエノールピルビン酸（ＤＡＨＰシンターゼ）が、シキミ酸によって、コリスミ酸に変換される。ＣｙｓｌおよびＣｙｓＤは、コリスミ酸からのＰＡＢＡの直接生合成を可能にする。さらに、クラスターは、ｐ−アミノ安息香酸Ｎ−オキシゲナーゼ相同体（ＣｙｓＲ）を含有する。
【００９７】
図１２は、本発明のシストバクトアミド生合成クラスターを示す。
【００９８】
シストバクトアミドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨからなる群から選択されるシストバクトアミドを合成可能な組換え生合成クラスターであって、配列番号４０〜７３のポリペプチドまたはその機能的変異体のすべてを含むクラスター。
【００９９】
用語「機能的変異体」は、本明細書において、本明細書に記載されるポリペプチド配列と少なくとも８５％、９０％、９５％または９９％同一である配列を有するポリペプチドを表す。ポリペプチドの「機能的変異体」は、本来ポリペプチドの保存されたものとして認識されるアミノ酸残基を保持し得、および／または保存されていないアミノ酸残基を有し得る。アミノ酸は、天然ポリペプチドに対して、置換（異なる）、挿入または欠失されてもよいが、変異体は、全般的に、本明細書に記載されるポリペプチドと比較して、同様の（酵素）活性または機能を有する。「機能的変異体」は、自然界において見出される場合も、その遺伝子操作された突然変異株（組換え体）である場合もある。
【０１００】
用語「同一性」とは、その類似性または関係を測る配列の特性を指す。同一性は、同一残基の数を残基の総数によって除し、商に１００を乗することによって測られる。
【０１０１】
用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「ペプチド」は、本明細書において、直鎖に配置された２個以上のアミノ酸残基から作られている有機化合物を定義し、有機化合物中の個々のアミノ酸は、ペプチド結合、すなわち、隣接するアミノ酸残基間に形成されるアミド結合によって連結されている。慣例により、タンパク質の一次構造は、アミノ末端（Ｎ）の先端から出発して、カルボキシル末端（Ｃ）の先端に向かって報告される。
【０１０２】
本明細書において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「を特徴とする（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ）」およびそれらの文法上の等価物は、さらなる、列挙されていない要素または方法ステップを排除しない包括的なまたは制約のない用語である。「含む（Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などは、より制限的な用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」を含むと解釈されるべきである。
【０１０３】
本明細書において、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、特許請求の範囲において特定されない任意の要素、ステップまたは成分を排除する。
【０１０４】
本明細書において商標が使用される場合には、商標製品製剤、後発医薬品および商標製品の有効活性成分（単数または複数）を独立に含むものとする。
【０１０５】
一般に、別に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているものと同一の意味を有し、一般的な教本および辞書と一致する。
【０１０６】
本発明のＮＲＰＳ酵素は、天然に存在しないＮＲＰＳであることが好ましい。本発明のＮＲＰＳはまた、２種以上のＮＲＰＳに由来する、または１種以上のポリケタイドシンターゼ（ＰＫＳ）に由来する、そのモジュール、ドメインおよび／もしくは部分またはその機能的変異体を含むハイブリッドＮＲＰＳであり得る。
【０１０７】
本発明のシストバクトアミド生合成クラスターは、表Ａの要素を含むことが好ましい。
【０１０８】
【表１】
0006730183.tif 000031
【０１０９】
本発明はまた、本発明のＮＲＰＳをコードする単離された、合成または組換え核酸を提供する。前記核酸は、本発明のＮＲＰＳの一部またはすべてを含む核酸、プロモーターならびに翻訳開始および終結配列などの調節配列をさらに含む核酸を含み、宿主細胞における安定な維持を促進する配列、すなわち、複製起点の機能を提供するか、または相同組換えによる宿主細胞染色体もしくはその他のＤＮＡへの組込みを促進する配列をさらに含み得る。これらのＮＲＰＳは、研究ツールとして、または組換えＮＲＰＳもしくはＰＫＳクラスター中のモジュールとして使用され得る。
【０１１０】
好ましくは、本発明は、
（ｉ）シストバクトアミド生合成クラスターをコードする配列であって、配列番号１の全長配列に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％または９９．５％〜１００％の配列同一性を有する配列と、
（ｉｉ）ＮＲＰＳをコードする配列であって、配列番号８、９、１２または１３のいずれかの全長配列に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％または９９．５％〜１００％の配列同一性を有する配列と、
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）のいずれかの核酸配列の全長配列に対して完全に相補的な配列、または、
（ｉｖ）配列番号４６、４７、５０または５１のいずれかのポリペプチドをコードする配列
を含む単離された、合成または組換え核酸に関する。
【０１１１】
語句「核酸」または「核酸配列」とは、本明細書において、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはこれらのいずれかの断片、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよく、センス鎖に相当しても、アンチセンス鎖に相当してもよい、起源が天然もしくは合成のゲノムもしくは合成起源のＤＮＡを指す。「オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成され得る、一本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは２種の相補的ポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかを含む。このような合成オリゴヌクレオチドは、５’ホスフェートを有さず、従って、キナーゼの存在下でＡＴＰを用いてホスフェートを付加せずに別のオリゴヌクレオチドとライゲートすることはない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていない断片とライゲートし得る。特定のポリペプチドまたはタンパク質を「コードするヌクレオチド配列」またはこれらの「コード配列」は、適当な調節配列の制御下に置かれた場合にポリペプチドまたはタンパク質に転写および翻訳される核酸配列である。本発明を実施するために使用される核酸は、種々の供給源から単離されても、遺伝子操作されても、増幅および／または発現／遺伝子組換えされてもよい。例えば、サブクローニング、プローブの標識（例えば、クレノーポリメラーゼ、ニックトランスレーション、増幅を使用するランダムプライマー標識）、配列決定、ハイブリダイゼーション等などの核酸の操作のための技術は、科学文献および特許文献に十分に記載されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ編、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（第２版）、第１〜３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、（１９８９年）；ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ａｕｓｕｂｅｌ編  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９７年）；ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ  ＩＮ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ：ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ  ＷＩＴＨ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＰＲＯＢＥＳ、第Ｉ部  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ、Ｔｉｊｓｓｅｎ編  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．  （１９９３年）を参照のこと。本発明のポリペプチドをコードする核酸は、翻訳されたポリペプチドまたはその断片の分泌を指示可能なリーダー配列とともに適当な相にアセンブルされる。
【０１１２】
用語「単離された」とは、本明細書において、材料、例えば、核酸、ポリペプチド、ベクター、細胞が、その元の環境、例えば、天然に存在する場合には天然環境から取り出されることを意味する。例えば、生存動物中に存在する天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されていないが、天然系中に同時に存在する材料の一部またはすべてから分離された同一ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。このようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部であり得、および／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部であり得、このようなベクターまたは組成物が天然環境の一部ではないという点で、依然として、単離され得る。
【０１１３】
用語「合成」とは、本明細書において、材料、例えば、核酸が、例えば、Ａｄａｍｓ（１９８３年）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第１０５巻：６６１頁；Ｂｅｌｏｕｓｏｖ（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第２５巻：３４４０〜３４４４頁；Ｆｒｅｎｋｅｌ（１９９５年）Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．第１９巻：３７３〜３８０頁；Ｂｌｏｍｍｅｒｓ（１９９４年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第３３巻：７８８６〜７８９６頁；Ｎａｒａｎｇ（１９７９年）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．第６８巻：９０頁；Ｂｒｏｗｎ（１９７９年）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．第６８巻：１０９頁；Ｂｅａｕｃａｇｅ（１９８１年）Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．第２２巻：１８５９頁において記載されたような周知の化学合成技術によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成されたことを意味する。
【０１１４】
用語「組換え」とは、核酸が、その天然環境では隣接していない「骨格」核酸と隣接していることを意味する。本発明の骨格分子は、クローニングおよび発現ベクターなどの核酸、自己複製性核酸、ウイルス、組み込み核酸および対象の核酸挿入部分を維持または操作するために使用されるその他のベクターまたは核酸を含む。これらの核酸から作製された本発明の組換えポリペプチドは、個々に単離またはクローニングされ、所望の活性について試験され得る。細菌、哺乳類、酵母、昆虫または植物細胞発現系を含め、任意の組換え発現系を使用することができる。
【０１１５】
また、本発明の少なくとも１種の核酸を含むベクターも提供される。ベクターは、クローニングベクター、発現ベクターまたは人工染色体であり得る。
【０１１６】
本明細書において、用語「ベクター」とは、連結されている別の核酸を輸送可能な核酸分子を指す。クローニングおよび発現ベクターを含めたベクターは、本発明の核酸またはその機能的等価物を含む。本発明の核酸は、組換え複製可能ベクター、例えば、クローニングまたは発現ベクターに組み込むことができる。ベクターは、適合する宿主細胞において核酸を複製するために使用され得る。したがって、本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを、複製可能なベクター中に導入する工程、ベクターを適合する宿主細胞中に導入する工程およびベクターの複製を引き起こす条件下で宿主細胞を増殖させる工程によって本発明のポリヌクレオチドを作製する方法を提供する。ベクターは、宿主細胞から回収することができる。適した宿主細胞を、以下に記載する。本発明の発現カセットまたは核酸が挿入されるベクターは、組換えＤＮＡ手順に都合よく付され得る任意のベクターであり得、ベクターの選択は、導入される予定の宿主細胞に応じて変わることが多い。原核生物および真核生物宿主とともに使用するための種々のクローニングおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．  Ｙ．、（１９８９年）によって記載されている。
【０１１７】
本発明のベクターは、自律的に複製するベクター、すなわち、染色体外実体として存在し、その複製が染色体複製から独立しているベクター、例えば、プラスミドであり得る。あるいは、ベクターは、宿主細胞中に導入されると、宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、組み込まれている染色体（単数または複数）と一緒に複製されるものであり得る。
【０１１８】
ある種のベクターは、「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントがライゲートされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターとして、ウイルスベクターがあり、これでは、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノム中にライゲートされ得る。特定のベクターは、導入される宿主細胞において自己複製可能である（例えば、細菌複製起点およびエピソーム哺乳類ベクターを有する細菌ベクター）。その他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それによって、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、作動可能に連結している遺伝子の発現を指示可能である。このようなベクターは、本明細書において、「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。プラスミドは、ベクターの最もよく使用される形態であるので、用語「プラスミド」および「ベクター」は、本明細書において同義的に使用され得る。しかし、本発明は、コスミド、ウイルスベクター（例えば、複製に欠損のあるレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）および同等の機能を果たすファージベクターなどの、発現ベクターのこのようなその他の形態を含むものとする。
【０１１９】
本発明のベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えば、ＲＮＡの製造のために使用され得るか、または宿主細胞をトランスフェクトもしくは形質転換するために使用され得る。
【０１２０】
本発明のベクターは、例えば、過剰発現のために、２種以上、例えば、３、４または５種の本発明の核酸を含み得る。
【０１２１】
本発明の組換え発現ベクターは、本発明の核酸を宿主細胞における核酸の発現に適した形態で含み、これは、組換え発現ベクターが、発現される核酸配列と作動可能に連結している、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択された１種以上の調節配列を含むことを意味する。
【０１２２】
発現ベクターなどのベクター内で、「作動可能に連結された」とは、対象のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にする方法（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞中に導入される場合には宿主細胞において）で調節配列（単数または複数）と連結していることを意味するものとし、すなわち、用語「作動可能に連結された」とは、記載される成分が、それらがその意図される方法で機能することを可能にする関係にある並置を指す。コード配列と「作動可能に連結している」プロモーター、エンハンサーまたはその他の発現調節シグナルなどの調節配列は、コード配列の発現が、制御配列と適合する条件下で達成されるか、または配列が、それらが意図される目的のために協調して機能する、例えば、転写がプロモーターで始まり、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列によって進行するように配置されるような方法で位置付けられる。
【０１２３】
用語「調節配列」または「制御配列」は、プロモーター、オペレーター、エンハンサー、アテニュエーターおよびその他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むものとする。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ  （１９９０年）に記載されている。
【０１２４】
用語調節または制御配列は、多数の種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指示する配列および特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指示するもの（例えば、組織特異的調節配列）を含む。
【０１２５】
したがって、所与の宿主細胞のためのベクターまたは発現構築物は、本発明のポリペプチドをコードする配列のコーディング鎖に対して５’末端から３’末端に連続した順序で、互いに作動可能に連結している以下の要素を含み得る：（ｉ）所与の宿主細胞におけるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の転写を指示可能なプロモーター配列；（ｉｉ）任意選択で、所与の宿主細胞から培養培地へのポリペプチドの分泌を指示可能なシグナル配列；（ｉｉｉ）任意選択で、ポリペプチドの精製、検出または標識を可能にする、Ｃ末端、Ｎ末端または中間のエピトープタグ配列をコードする配列または前記の組合せ；（ｉｖ）本発明のポリペプチドをコードする本発明の核酸配列；好ましくは、また（ｖ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の下流の転写を終結可能な転写終結領域（ターミネーター）。特定の名付けられた細菌プロモーターとして、ｌａｄ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６、Ｋ１Ｆ、ｔａｃ、ｔｅｔ、ｇｐｔ、ラムダＰＲ、ＰＬおよびｔｒｐが挙げられる。真核生物プロモーターとして、レトロウイルスおよびマウスメタロチオネイン−Ｉに由来する、ＣＭＶ最初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、ＬＴＲが挙げられる。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者のレベル内である。本発明のヌクレオチド配列の下流に、１つ以上の転写終結部位（例えば、ターミネーター）を含有する３’非翻訳領域があってもよい。ターミネーターの起源は、あまり重要ではない。ターミネーターは、例えば、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列にとって天然であり得る。ターミネーターは、宿主細胞（ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が発現される）にとって内因性であることが好ましい。翻訳のためのリボソーム結合部位は、転写領域中に存在し得る。構築物によって発現された成熟した転写物のコーディング部分は、最初に翻訳開始ＡＵＧ（または原核生物中のＴＵＧまたはＧＵＧ）および翻訳されるポリペプチドの末端に適宜位置付けられた終結コドンを含む。
【０１２６】
本発明のポリヌクレオチドの増強された発現はまた、発現および必要に応じて、発現宿主からの対象のタンパク質の分泌レベルを増大するよう、および／または本発明のポリペプチドの発現の誘導可能な制御を提供するよう働き得る、異種調節領域、例えば、プロモーター、分泌リーダーおよび／またはターミネーター領域の選択によって達成され得る。当業者ならば、発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどといった因子に応じて変わり得るということは理解されよう。本発明の発現ベクターなどのベクターは、宿主細胞中に導入され、それによって、本明細書に記載されるような核酸によってコードされるタンパク質またはペプチドを製造し得る。
【０１２７】
本発明の組換え発現ベクターなどのベクターは、原核細胞または真核細胞における本発明のＮＲＰＳの一部またはすべての発現のために設計することができる。例えば、本発明のＮＲＰＳの一部またはすべては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用する）、糸状菌、酵母細胞または哺乳類細胞などの細菌細胞において発現させることができる。適した宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ第１８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０年）においてさらに論じられている。適当な宿主の代表例を、本明細書において以下に記載する。上記の宿主細胞にとって適当な培養培地および条件は、当技術分野で公知である。
【０１２８】
上記で示されるように、用語「制御配列」または「調節配列」は、ポリペプチドの発現にとって必須であり、および／または有利であり得る少なくとも任意の成分を含むよう本明細書において定義される。任意の制御配列は、ポリペプチドをコードする本発明の核酸配列にとって天然である場合も外来である場合もある。このような制御配列は、それだけには限らないが、プロモーター、リーダー、最適翻訳開始配列（Ｋｏｚａｋ、１９９１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６６巻：１９８６７〜１９８７０頁に記載されるような）、分泌シグナル配列、プロペプチド配列、ポリアデニル化配列、転写ターミネーターを含み得る。最小で、制御配列は、通常、プロモーターならびに転写および翻訳停止シグナルを含む。安定に形質転換された微生物とは、増殖中の培養物中で導入された分子が、維持、複製および分離されるよう、１種以上のＤＮＡ断片が導入されたものである。安定な形質転換は、複数または単一染色体組込みによる、またはプラスミドベクターなどの染色体外要素によってであり得る。プラスミドベクターは、特定のＤＮＡ断片によってコードされるポリペプチドの発現を指示可能である。発現は、構成的であってもよく、または特定のポリペプチドをコードする機能的に関連しているＤＮＡ断片の高レベルの転写を可能にする誘導可能な（または抑制可能な）プロモーターによって調節されてもよい。
【０１２９】
本発明の発現ベクターはまた、形質転換された細菌株の選択を可能にする選択マーカー遺伝子、例えば、細菌をクロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、テトラサイクリンならびにアンピシリンおよびカルベニシリンのようなその他のペニシリン誘導体などの薬剤に対して耐性にする遺伝子を含み得る。選択マーカーはまた、ヒスチジン、トリプトファンおよびロイシン生合成経路中のものなどの生合成遺伝子を含み得る。
【０１３０】
適当なポリヌクレオチド配列を、種々の手順によってベクター中に挿入できる。一般に、ポリヌクレオチド配列は、適当な制限エンドヌクレアーゼを用いる挿入部分およびベクターの消化後にベクター中の所望の位置にライゲートされる。あるいは、挿入部分およびベクター両方中の平滑末端がライゲートされる場合もある。種々のクローニング技術は、ＡｕｓｕｂｅｌらＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ５０３  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．１９９７年およびＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）に開示されている。また、ポリヌクレオチド配列は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏならびにｉｎ  ｖｉｖｏ組換えを含めた相同組換え技術を使用してクローニングしてもよい。このような手順およびその他のものは、当業者の範囲内にあると思われる。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子またはファージの形態であり得る。その他のベクターとして、ＳＶ４０の染色体、非染色体および合成ポリヌクレオチド配列、誘導体；細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドおよびバクテリオファージＤＮＡの組合せに由来するベクター、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルスおよび仮性狂犬病などのウイルスＤＮＡが挙げられる。
【０１３１】
本発明はまた、遺伝子操作された宿主細胞または組換え宿主細胞、すなわち、本発明の核酸配列を異種または非天然ポリヌクレオチド、例えば、シストバクトアミド生合成クラスターまたは本発明のＮＲＰＳをコードする配列として含む、または本発明のベクターを含む形質転換細胞を提供する。宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞または植物細胞などの原核細胞、真核細胞を含めた、当業者によく知られている宿主細胞のいずれかであり得る。
【０１３２】
好ましい哺乳類細胞として、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、ＰｅｒＣ６細胞、ハイブリドーマ、Ｂｏｗｅｓ黒色腫または任意のマウスまたは任意のヒト細胞株が挙げられる。例示的昆虫細胞として、ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２およびスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ−９を含めた、スポドプテラ属（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）またはドロソフィラ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の任意の種が挙げられる。例示的真菌細胞として、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の任意の種が挙げられる。好ましい酵母細胞として、例えば、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クリベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）またはヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の株に由来する細胞が挙げられる。より好ましくは、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）またはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）由来である。本発明によれば、宿主細胞は、原核細胞であり得る。好ましくは、原核生物の宿主細胞は、細菌細胞である。用語「細菌細胞」は、グラム陰性およびグラム陽性ならびに古細菌微生物の両方を含む。適した細菌は、例えば、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）、カウロバクター属（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）（シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ））、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）またはストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）から選択され得る。好ましくは、細菌細胞は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．プンティス（ｐｕｎｔｉｓ）、Ｂ．メガテリウム（ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．ハロデュランス（ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．プミルス（ｐｕｍｉｌｕｓ）、Ｇ．オキシダンス（ｏｘｙｄａｎｓ）、カウロバクター・クレセンタス���Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）ＣＢ１５、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）、パラコッカス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｃ．グルタミクム（ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、スタフィロコッカス・カルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、シノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｏｔｉ）およびリゾビウム・ラジオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選択される。適当な宿主の選択は、当業者の能力の範囲内である。
【０１３３】
ベクターは、形質転換、トランスフェクション、形質導入、ウイルス感染、遺伝子銃またはＴｉ媒介性遺伝子導入を含め、種々の技術のいずれかを使用して宿主細胞に導入することができる。特定の方法として、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションが挙げられる（Ｄａｖｉｓ，Ｌ、Ｄｉｂｎｅｒ，Ｍ．、Ｂａｔｔｅｙ，Ｉ．、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、（１９８６年））。本発明の核酸またはベクターは、スクリーニングのために細胞中に導入してもよく、このようにして、核酸は、核酸のその後の発現に適した方法で細胞に入る。導入方法は、標的とされる細胞の種類によって大きく左右される。
【０１３４】
例示的方法として、ＣａＰＯ４沈殿、リポソーム融合、リポフェクション（例えば、リポフェクチン（商標））、エレクトロポレーション、ウイルス感染などが挙げられる。候補核酸は、宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれ得る（例えば、レトロウイルス導入を用いて）または細胞質中に一時的にもしくは安定に存在し得る（すなわち、伝統的なプラスミドの使用によって、標準調節配列、選択マーカーなどを利用して）。多数の医薬上重要なスクリーニングは、ヒトまたはモデル哺乳類細胞標的を必要とするので、このような標的をトランスフェクト可能なレトロウイルスベクターが使用され得る。
【０１３５】
必要に応じて、遺伝子操作された宿主細胞を、プロモーターを活性化する、形質転換体を選択するまたは本発明の核酸を増幅するのに適当なように修飾された従来の栄養培地で培養することができる。適した宿主株の形質転換および宿主株の適当な細胞密度への増殖後、選択されたプロモーターを、適当な手段（例えば、温度シフトまたは化学誘導）によって導入してもよく、細胞を、それらが所望のポリペプチドまたはその断片を製造することを可能にするさらなる期間培養してもよい。細胞は、遠心分離によって回収し、物理的または化学的手段によって破壊することができ、得られた粗抽出物は、さらなる精製のために保持される。タンパク質の発現のために使用される微生物細胞は、凍結−解凍循環、超音波処理、機械的破壊または細胞溶解剤の使用を含めた任意の従来法によって破壊することができる。このような方法は、当業者に周知である。発現されるポリペプチドまたはその断片は、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿法、酸抽出、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた方法によって、組換え細胞培養物から回収し、精製することができる。ポリペプチドの立体配置の完了において、必要に応じて、タンパク質再フォールディング工程を使用してもよい。必要な場合には、最終精製工程に高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用することができる。宿主細胞中の構築物は、組換え配列によってコードされる遺伝子産物を製造するために従来法で使用できる。組換え製造手順において使用される宿主に応じて、ベクターを含有する宿主細胞によって製造されるポリペプチドは、グリコシル化される場合も、非グリコシル化である場合もある。本発明のポリペプチドは、最初のメチオニンアミノ酸残基を含む場合も含まない場合もある。本発明のポリペプチドを製造するために、細胞を含まない翻訳系を使用してもよい。細胞を含まない翻訳系は、ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸と作動可能に連結しているプロモーターを含むＤＮＡ構築物から転写されたｍＲＮＡを使用できる。いくつかの態様では、ＤＮＡ構築物を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応を実施する前に直線化してもよい。次いで、転写されたｍＲＮＡを、ウサギ網状赤血球抽出物などの適当な細胞を含まない翻訳抽出物とともにインキュベートして、所望のポリペプチドまたはその断片を製造する。
【０１３６】
対象のポリヌクレオチド、例えば、本発明の核酸を含有する宿主細胞は、プロモーターを活性化する、形質転換体を選択するまたは遺伝子を増幅するのに適当なように修飾された従来の栄養培地で培養することができる。温度、ｐＨなどといった培養条件は、発現のために選択された宿主細胞とともにこれまでに使用されたものであり、当業者には明らかであろう。次いで、特定の酵素活性を有すると同定されるクローンを配列決定して、本発明のＮＲＰＳの一部またはすべてをコードするポリヌクレオチド配列を同定してもよい。
【０１３７】
組換えＤＮＡは、それだけには限らないが、プラスミド、コスミド、ファージ、酵母人工染色体または遺伝子エレメントの宿主細胞への移動を媒介するその他のベクターを含めた任意の手段によって宿主細胞中に導入することができる。これらのベクターは、ベクターの複製を制御するシス作用性制御エレメントおよびベクターによって保持される遺伝子エメレントとともに、複製起点を含み得る。選択マーカーは、遺伝子エレメントが導入されている宿主細胞の同定に役立つようベクター上に存在し得る。遺伝子エレメントの宿主細胞への導入（例えば、クローニング）のための手段は、当業者に周知である。その他のクローニング法として、それだけには限らないが、遺伝物質の染色体への直接組込みが挙げられる。これは、本明細書に記載された遺伝子エレメントを、宿主染色体の相同ＤＮＡ配列によってフランキングされた非複製プラスミド上にクローニングすることを含め種々の手段によって起こり得、前記組換えプラスミドを宿主に形質転換する際に、ＤＮＡ組換えによって染色体中に遺伝子エレメントが導入され得る。組み込まれるＤＮＡ断片が抗生物質耐性などの選択マーカーを含有する場合には、このような組換え株を回収することができる。あるいは、非複製プラスミドを使用せずに、遺伝子エレメントを宿主細胞の染色体中に直接導入することもできる。これは、宿主染色体の相同ＤＮＡ配列も含有する、本発明に従う遺伝子エレメントのＤＮＡ断片を合成によって製造することによって行うことができる。これらの合成ＤＮＡ断片が選択マーカーも含有する場合にはやはり、遺伝子エレメントを宿主染色体中に挿入することができる。
【０１３８】
シストバクトアミド生合成クラスターまたは本発明のＮＲＰＳは、上記の宿主細胞のいずれかにおいて好都合に発現され得る。したがって、本発明は、１種以上の単離された、合成もしくは組換え核酸および／または本発明のＮＲＰＳを含む多種多様な宿主細胞を提供する。宿主細胞は、適した条件下で培養された場合には、そうでなければ製造しないか、または本発明の核酸の不在下では低レベルでしか製造しないシストバクトアミドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨからなる群から選択されるシストバクトアミドを製造可能である。
【０１３９】
本発明はまた、配列番号４０〜７３のいずれかのアミノ酸配列または本発明の核酸によってコードされるアミノ酸配列を有する、単離された、合成または組換えポリペプチドに関する。
【０１４０】
本発明は、シストバクトアミドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨからなる群から選択されるシストバクトアミドを調製する方法をさらに提供し、前記方法は、概して、本発明の宿主細胞を提供する工程と、シストバクトアミドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨからなる群から選択される少なくとも１種のシストバクトアミドが製造されるような適した条件下で適した培養培地で前記宿主細胞を培養する工程とを含む。方法は、シストバクトアミドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨからなる群から選択されるシストバクトアミドを単離する工程、すなわち、培養液から化合物を分離し、保持する工程をさらに含み得る。単離工程は、アフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィーを使用して実施され得る。
【実施例】
【０１４１】
製造の条件
製造のための株
株シストバクター・ベラタス（Ｃｙｓｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｅｌａｔｕｓ）ＭＣｙ８０７１は、ミキソコッカス目（Ｍｙｘｏｃｏｃｃａｌｅｓ）（マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ））、シストバクター亜目（Ｃｙｓｔｏｂａｃｔｅｒｉｎｅａｅ）、シストバクター科（Ｃｙｓｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）、シストバクター属（Ｃｙｓｔｏｂａｃｔｅｒ）に属する。部分１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の、公開データベース（ＮＣＢＩ、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）によって提供されたＢＬＡＳＴ、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）の配列との比較は、シストバクター・ベラタス（Ｃｙｓｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｅｌａｔｕｓ）株ＤＳＭ  １４７１８に対して１００％の類似性を示した。
【０１４２】
ＭＣｙ８０７１は、１９８２年に集められた中国の土壌サンプルからヘルムホルツ感染研究センター（Ｈｅｌｍｈｏｌｔｚ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（ＨＺＩ、かつてはＧＢＦ）で単離された。株は、命名ＤＳＭ  ２７００４の下、２０１３年３月にブラウンシュバイク（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）のＧｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＤＳＭ）に寄託された。
【０１４３】
培養
株ＭＣｙ８０７１は、酵母寒天（ＶＹ／２：０．５％  サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、０．１４％  ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ、０．５μｇビタミンＢ１２／ｌ、１．５％寒天、ｐＨ７．４）、ＣＹ−寒天（カシトン０．３％、酵母抽出物０．１％、ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ  ０．１％、寒天１．５％、ｐＨ７．２）およびＰ−寒天（ペプトンＭａｒｃｏｒ  ０．２％、デンプン０．８％、単細胞タンパク質プロビオン０．４％、酵母抽出物０．２％、ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ  ０．１％、ＭｇＳＯ４  ０．１％、Ｆｅ−ＥＤＴＡ  ８ｍｇ／ｌ、１．５％寒天、ｐＨ７．５）で良好に増殖する。作業培養物を、液体培地ＣＹ／Ｈ（５０％  ＣＹ−培地＋５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、５０％  Ｈ−培地：ダイズ粉０．２％、グルコース０．８％、デンプン０．２％、酵母抽出物０．２％、ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ  ０．１％、ＭｇＳＯ４  ０．１％、Ｆｅ−ＥＤＴＡ  ８ｍｇ／ｌ、Ｈｅｐｅｓ  ５０ｍＭ  ｐＨ７．４）中で育てた。液体培養物は、１８０ｒｐｍで３０℃で振盪した。保存アリコートのために、２ｍｌの３日齢培養物を−８０℃で保存した。数年後でさえ、上記の寒天プレート上または２０ｍｌのＣＹ／Ｈ−培地（栓およびアルミニウムキャップを備えた１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中）中で再活性化には問題がなかった。１〜２日後、２０ｍｌの培養物を１００ｍｌにアップスケールすることができる。
【０１４４】
形態学的説明
液体培地ＣＹ／Ｈ中で２日後、株ＭＣｙ８０７１の桿状細胞は、９．０〜１４．５μｍの長さおよび０．８〜１．０μｍの幅を有する。上記の寒天プレート上で、スウォーミングは環状である。ＶＹ／２−寒天上では、スウォームは薄く、透明である。ＶＹ／２−寒天上では酵母分解を視認できる。ＣＹ−寒天上では、培養物は、透明な橙色に見える。Ｐ−寒天上では、細胞塊製造が、特徴的であり、スウォーミング挙動は減少する。コロニーの色は、橙〜褐色である。Ｐ−寒天中のデンプンは分解される。
【０１４５】
ＭＣｙ８０７１は、以下の抗生物質に対して耐性である：アンピシリン、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、ポリマイシン、バシトラシン、スペクチノマイシン、ネオマイシンおよびフシジン酸（ｆｕｓｉｄｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）。セファロスポリンおよびカスガマイシンを用いると、弱い増殖が可能であり、チオストレプトン、トリメトプリン（ｔｒｉｍｅｔｈｏｐｒｉｎ）、カナマイシンおよびオキシテトラサイクリンを用いる場合には、増殖が全く不可能である（すべての抗生物質の最終濃度は、５０μｇ  ｍｌ−１に調整した）。
【０１４６】
シストバクトアミドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨの製造
株は、複合培地で製造する。単細胞タンパク質（Ｐｒｏｂｉｏｎ）のような窒素含有栄養分およびペプトン、トリプトン、酵母抽出物、ダイズ粉および肉抽出物のようなタンパク質分解の生成物を好む。ここで、製造は、記載されたタンパク質混合物のうちいくつかを用いた場合に、単一のものと比較して良好である。
【０１４７】
シストバクトアミドは、増殖の対数期から静止期内で製造される。１００リットルの発酵（培地Ｅ）中で２日後、生成物の量は、もはや増加しなかった。
【０１４８】
シストバクトアミドは、培地に送達され、ＸＡＤ−吸収体樹脂と結合する。ＸＡＤを金属篩によって篩にかけ、アセトンで溶出する。種々の製造温度を試験し（２１℃、３０℃、３７℃および４２℃）、それによって、４２℃で製造は不可能であった。最適温度は、最大通気を伴って３０℃であった。
【０１４９】
ＭＣｙ８０７１の発酵を、１００リットルの培地Ｅ（スキムミルク０．４％、ダイズ粉０．４％、酵母抽出物０．２％、デンプン１．０％、ＭｇＳＯ４  ０．１％、Ｆｅ−ＥＤＴＡ  ８ｍｇ／ｌ、グリセリン０．５％；ｐＨ７．４）を用い１５０リットルの発酵槽中で、および７０リットルの培地Ｍ（ダイズ−ペプトン１．０％、マルトース１．０％、ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ  ０．１％、ＭｇＳＯ４  ０．１％、Ｆｅ−ＥＤＴＡ  ８ｍｇ／ｌ；ｐＨ７．２）を用い１００リットルの発酵槽中で３０℃で４日間実施した。ｐＨを水酸化カリウム（２．５％）および硫酸を用いて７．２から７．４の間に調節した。撹拌速度は、１００〜４００ｒｐｍとし、０．０５ｖｖｍの圧縮空気を用いて通気した。発酵培養液内の溶解酸素含量を、撹拌速度によってｐＯ２  ４０％に調節した。シストバクトアミドを結合するために、発酵培養液に１％吸収体樹脂を添加した。発酵槽に５リットルの３日齢プレ培養物（それぞれ、ＥまたはＭ−培地）を播種した。発酵プロセスの間の製造は、ＨＰＬＣ−ＭＳ解析および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）に対するメタノール抽出物の段階希釈試験によって調べた。これらの株は、シストバクトアミドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨを製造する。
【０１５０】
ノックアウト実験
シストバクトアミド生合成遺伝子クラスターがシストバクトアミドの製造に預かっていることを確認するために、ＣｙｓＫ（ＮＲＰＳ）およびＣｙｓＬ（ベンゾイル−ＣｏＡリガーゼ）がそれぞれノックアウトされたノックアウト（ＫＯ）実験を実施した。具体的には、Ｔａｑポリメラーゼを使用してＭＣｙ８０７１ゲノムＤＮＡからＣｙｓＫおよびＣｙｓＬ遺伝子の１０００ｂｐ断片のＰＣＲ産物を製造した。プライマーは、ＰＣＲ産物の先端に３つの停止コドンを付加するよう設計した。
0006730183.tif 000032
【０１５１】
ＰＣＲ産物を、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ製のＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ（登録商標）ゲルおよびＰＣＲ精製キットを使用してゲル精製し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにクローニングした。構築物を熱ショックによって、化学的にコンピテントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＳ９９６中に組み込み、カナマイシンを補給したＬＢ寒天プレートで選択を行った。アルカリ溶解プラスミド調製およびＥｃｏＲＩによる制限消化によって、正しい構築物について単一コロニーをスクリーニングした。次いで、配列相同性を保証するために構築物を配列決定した。
【０１５２】
各ＫＯの正しい構築物を、非メチル化化学的コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＣＳ１１０に形質転換した。Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のＧｅｎｅＪＥＴ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用してプラスミドを調製し、エレクトロポレーションによってＭＣｙ８０７１に組み込んだ。形質転換されたクローンの選択は、カナマイシンを補給したＣＴＴ寒天プレートで行った。ＫＯ突然変異体および野生型培養物を、吸収体樹脂（ＸＡＤ−１６）の存在下で並行して増殖させ、培養物の粗抽出物のサンプルを分析した。
【０１５３】
結果は、ＫＯ突然変異体では、シストバクトアミド製造が完全に存在せず、シストバクトアミドの製造にはＣｙｓＫおよびＣｙｓＬが必須であるということを示した。さらに、結果は、シストバクトアミドの製造のためのシストバクトアミド生合成遺伝子クラスターの必須の性質を示す。
【０１５４】
構造解析：
シストバクトアミドＡ（１）のＨＲＥＳＩ（＋）ＭＳ解析は、擬似分子式イオン（Ｍ＋Ｈ）＋を返し、分子式Ｃ４６Ｈ４５Ｎ７Ｏ１４と一致し、２８の二重結合等価物（ＤＢＥ）を必要とした。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）データは、７つのエステル／アミドカルボニル（δＣ  １６３．７〜１６９．６）およびさらなる３０のｓｐ２共鳴（δＣ  １１４．２〜１５０．８）を示し、２２のＤＢＥに相当する。１Ｄおよび２Ｄ  ＮＭＲデータ（表１）を考慮すると、５つの芳香族スピン系のセットが示され、そのうち３つは、パラ置換、１，３，４−三置換および１，２，３，４−四置換ベンゼン環に起因する。芳香族シグナルＨ−６，６’（δΗ  ７．９６）およびＮＨ（δΗ  ８．９２）対アミドカルボニルＣ−４（δＣ  １６６．５）；ＮＨ（δΗ  １０．８２）対Ｃ−７／７’（δＣ  １１９．８）および対第２のアミドカルボニルＣ−１０（δＣ  １６４．６）；Ｈ−１２／１２（δΗ  ８．２０）対Ｃ−１０から得られたＨＭＢＣ相関のセットは、２つのパラ置換芳香環系の結合性を確立した（図１）。１ＨおよびＣＯＳＹ  ＮＭＲデータのさらなる検査によって、アミドＮＨ（δΗ  ８．９２）のメチンＨ−２（δΗ  ４．９６）およびＨ−１（δΗ  ４．７０）を通る結合性が確立された。Ｈ−１（δＣ  ７９．４）のダウンフィールド特徴は、酸素による置換を示唆し、これは、Ｈ−１対１−ＯＭｅ（δΗ  ３．５３、δＣ  ５９．６）から得られたＨＭＢＣ相関から確認された。また、サブユニットＡの構築につながる、Ｈ−１およびＨ−２対エステル／アミドカルボニル（δＣ  １６９．６）から得られたＨＭＢＣ相関が観察された（図１）。
【０１５５】
１，３，４三置換ベンゼン環について、Ｈ−１７（δＨ  ７．５８）対エステル／アミドカルボニルＣ−１５（δＣ  １６７．３）、オキシ第四級炭素Ｃ−１８（δＣ  １４６．８）、Ｃ−１９（δＣ  １３３．６）およびＣ−２１（δＣ  １２２．９）からＨＭＢＣ相関が観察された。１，２，３，４四置換ベンゼン環の単離されたスピン系は、Ｃ−２４およびＣ−２８に対する相関を示すフェノール性ヒドロキシル（δＨ  １１．２５）とともに、ｉ）Ｈ−２５（δＨ  ７．８２、ｄ、８．７）対エステル／アミドカルボニルＣ−２３（δＣ  １６３．７）、Ｃ−２７（δＣ  １３６．２）および第四級オキシ炭素Ｃ−２９（δＣ  １５０．８）；ｉｉ）Ｈ−２６（δΗ  ７．４２）対Ｃ−２４（δＣ  １１７．３）およびＣ−２８（δＣ  １３９．５）から得られたＨＭＢＣ相関を示した。三および四置換ベンゼン環は、アミドＮＨ（δΗ  １０．９８）対Ｃ−２０（δＣ  １１９．８）Ｃ−１８（δＣ  １４６．７）およびＣ−２３（δＣ  １６３．７）から得られたＨＭＢＣ相関によって互いにパラに結合されていた（図１）。パラ置換芳香族スピン系Ｈ−３３／３３’（δΗ  ８．１１、ｄ、８．３）およびＨ−３４／３４’（δΗ７．４４、ｄ、８．３）の最後は、アミドＮＨ（δΗ  ９．８８）およびＨ−３３／３３’対アミドカルボニルＣ−３１（δＣ  １６４．３）のＨＭＢＣ相関によって１，２，３−三置換ベンゼン環との結合を示した。ＣＯＳＹデータのさらなる解釈は、イソプロポキシ残基（Ｈ３−３９（δΗ  １．３８）−Ｈ−３８（δΗ  ４．７６）−Ｈ−４０（δΗ  １．３８））および（Ｈ３−４２（δΗ  １．２５）−Η−４１（δΗ  ４．３０）−Η３−４３（δΗ  １．２５）の２つのセットを示した。２つのイソプロポキシ残基は、Ｈ−３８／Ｈ−３９対Ｈ−１７／ＮＨおよびＨ−４２／４３対ＮＨ２９−ＯＨ／Ｈ−３３／３３’から得られたＲＯＥＳＹ相関に基づいて、オキシ第四級炭素Ｃ−１８（δＣ  １４６．７）およびＣ−２８（δＣ  １３９．５）と結合していると確認された（図１）。サブユニットＡおよびＢ間の連結は確立されなかったが、シストバクトアミドＢに対する構造類似性に基づいて、サブユニットＡおよびＢの結合点が推測された。共鳴の大部分に相当しており、Ｎ２Ｏ３Ｈ２および１つのＤＢＥが相当するままであった。化合物のＵＶスペクトルは、３０１および３２０ｎｍのλｍａｘを示し、これは、サブユニットＡで芳香族系とのニトロ官能性パラ−の結合によってのみ生成されることが可能である共役系を示唆した。残りのＭＦは、サブユニットＢ中の１，２，３−置換芳香環でカルボン酸残基（Ｃ−１５）を生成するよう調整され、これが、４−アミノ−３−イソプロポキシ安息香酸部分を生成し、シストバクトアミドＡの平面構造の構築につながる。
【０１５６】
シストバクトアミドＢ（２）のＨＲＥＳＩ（＋）ＭＳ解析は、擬似分子式イオン（Ｍ＋Ｈ）＋を返し、分子式Ｃ４６Ｈ４４Ｎ６Ｏ１５と一致し、２８の二重結合等価物（ＤＢＥ）を必要とした。２のＮＭＲデータ（表２）は、（１）と高度に類似しており、ここで、ＮＨ（δΗ  １０．１９）およびオキシメチンＨ−１（δΗ  ４．３２）はカルボニルＣ−３７（δＣ  １６８．６）を見ており、サブユニットＡおよびＢの結合点が確認される。これに加えて、唯一の変化は、カルボニルアミドは、ここでカルボン酸に調整されるということであり、これは後に、シストバクトアミドＢジメチルエステルの生成によって証明された。
【０１５７】
シストバクトアミドＣ（３）のＨＲＥＳＩ（＋）ＭＳ解析は、擬似分子式イオン（Ｍ＋Ｈ）＋を返し、分子式Ｃ２７Ｈ２９Ｎ３Ｏ７と一致し、１５（ＤＢＥ）を必要とした。シストバクトアミドＣの１Ｈ  ＮＭＲデータは、シストバクトアミドＡおよびＢの暗示である芳香族シグナルを示したが、パラ置換芳香族ユニットの２セットについて芳香族共鳴を欠いていた。ＣＯＳＹデータは、１セットのパラ置換芳香環系とともに既存の２セットのイソプロポキシ残基を示した。１Ｄおよび２Ｄ  ＮＭＲデータ（表３、図２）の解釈から、シストバクトアミドＡおよびＢの東部分（ｅａｓｔｅｒｎ  ｐａｒｔ）に対して類似性を有し、３−イソプロポキシ安息香酸、２−ヒドロキシ−３−イソプロポキシベンズアミドおよびパラ−アミノベンズアミドユニットからなるシストバクトアミドＣ（３）を同定した。
【０１５８】
【表２】
0006730183.tif 000033
【０１５９】
【表３】
0006730183.tif 000034
【０１６０】
【表４】
0006730183.tif 000035
【０１６１】
シストバクトアミドＤ（４）のＨＲＥＳＩ（＋）ＭＳ解析は、擬似分子式イオン（Ｍ＋Ｈ）＋を示し、分子式（Ｃ４２Ｈ３７Ｏ１４Ｎ７）を示し、２８の二重結合等価物を必要とした。ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）データ（表４）の解釈により、第１のパラ置換ベンゼン環に相当する、磁気的に同等な芳香族プロトンＨ−１２’／１２（δΗ  ８．１７、ｄ、８．０）およびＨ−１３／１３’（δΗ  ８．３６、ｄ、８．０）が示された。１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹデータのさらなる解釈によって、２つのさらなるパラ置換ベンゼン環、（Ｈ−３５／３５’）（δΗ  ７．８０、ｄ、８．１）およびＨ−３６／３６’（δΗ  ７．９４、ｄ、８．１）の存在が示され、芳香族の第２のセットは、激しく重複していた（Ｈ−６／６’）および（Ｈ−７／７’（δΗ  ７．８８）。芳香族プロトン（Ｈ−１２／１２’）対アミドカルボニルＣ−１０（δＣ  １６５．１）の特徴的なＨＭＢＣ相関は、Ｃ−１０、Ｃ−７／７’にカップリングされた交換可能な（ＮＨ）（δΗ  １０．８２）とともに、２つのパラ置換芳香環の結合性を確立し（図３）、これは、ＮＨ／Ｈ−１２およびＮＨ／Ｈ−７間のＲＯＥＳＹ相関によってさらに裏付けられた。ＣＯＳＹデータは、オキシメチンＨ−１（δΗ  ４．０８、ｄ、８．０）からα−プロトンＨ−２（δΗ  ４．９１  、ｄｄ、８．０、７．７）を通って、交換可能なプロトン（ＮＨ）（δΗ  ８．４７）へのさらなるスピン系を示した。（ｉ）Ｈ−２対３つのアミドカルボニルＣ−４（δＣ  １６６．４）、Ｃ−１５（δＣ  １７１．８）およびＣ−３２（δＣ  １６９．２）、（ｉｉ）ＮＨ（δΗ  ８．４８）対Ｃ−４、（ｉｉｉ）ＮＨ（δΗ  １０．５４）対Ｃ−３５／３５’（δＣ  １１９．５）、（ｉｖ）Ｈ−６／６’対Ｃ−４から得られるＨＭＢＣ相関は、シストバクトアミドＤ（４）の部分構造をさらに伸長した。１−Ｄおよび２−Ｄ  ＮＭＲデータの考慮によって、さらなる１，３，４−三置換および１，２，３，４−四置換ベンゼン環が示された。芳香族プロトンＨ−２７（δΗ  ７．５５）およびＨ−２９（δΗ  ７．６０）対カルボニルＣ−３１（δＣ  １６７．８）および第四級炭素Ｃ−２５（δＣ  １３３．０）から得られたＨＭＢＣ相関が観察され、一方で、Ｈ−３０（δΗ  ８．４７、ｄ、７．０）およびメトキシシグナル（δΗ  ３．９６）は、酸素保有炭素Ｃ−２６（δＣ  １４９．１）にカップリングされ、従って、４−アミノ−３−メトキシ安息香酸部分を示し、これは、後にエステル化によって確認された。さらに、交換可能なプロトン（ＮＨ）（δΗ  ７．４６）対酸素保有炭素Ｃ−１（δＣ  ８０．８）、Ｃ−１８（δＣ  １４１．０）および芳香族炭素Ｃ−２２（δＣ  １１６．２）から得られたＨＭＢＣ相関が観察され、一方で、Ｈ−２２（δΗ  ７．４８、ｄ、８．８）およびメトキシは、Ｃ−１８へのカップリングを示し、Ｈ−２１（δΗ  ７．７７、ｄ、８．８）は、アミドカルボニルＣ−２３（δＣ  １６４．８）にカップリングされた。メトキシのヒドロキシル官能性オルトの存在は、後にエステル化によって確認され（４ａ）（図４）、４−アミノ−２−ヒドロキシ−３−メトキシベンズアミドの存在を示した。４−アミノ−３−メトキシ安息香酸および４−アミノ−２−ヒドロキシ−３−メト���シベンズアミド置換基の結合は、シストバクトアミドＤジメチルエステル（４ａ）から観察された交換可能なＮＨから得られたＲＯＥＳＹおよびＨＭＢＣ相関によって確認された。Ｃ−１４（δＣ  １５０．０）およびカルボニルＣ−３８に、欠けている置換基が割り当てられるべきであった。Ｃ−１４のλｍａｘ（３２０ｎｍ）およびダウンフィールドケミカルシフトは、４の平面構造を生成する、Ｃ−１４でのニトロ置換基およびカルボニルＣ−３８と結合している第一級アミンを示唆する。
【０１６２】
【表５】
0006730183.tif 000036
【０１６３】
【表６】
0006730183.tif 000037
【０１６４】
シストバクトアミドＥ（５）のＨＲＥＳＩ  （＋）ＭＳ解析は、擬似分子式イオン（Ｍ＋Ｈ）＋を示し、分子式（Ｃ２６Ｈ２３Ｏ９Ｎ５）を示し、１８の二重結合等価物を必要とした。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、シストバクトアミドＤと同様であり、主な相違は、４−アミノ−３−メトキシ安息香酸および４−アミノ−２−ヒドロキシ−３−メトキシベンズアミド部分を暗示するシグナルがないことである。１−Ｄおよび２−Ｄ  ＮＭＲデータ（表６）の詳細な解析は、シストバクトアミドＥ（５）の平面構造につながる。
【０１６５】
【表７】
0006730183.tif 000038
【０１６６】
シストバクトアミドＦ（６）のＨＲＥＳＩ（＋）ＭＳ解析は、擬似分子式イオン（Ｍ＋Ｈ）＋を返し、分子式Ｃ４３Ｈ３９Ｎ７Ｏ１３と一致し、２８のＤＢＥを必要とした。ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）データ（表７）の解釈は、ＣＯＳＹによって接続され得る３セットの磁気的に等価な芳香族プロトン（６／６’および７／７’、１２／１２’および１３／１３’、３３／３３’および３４／３４’）、さらに、すべてのその他のシストバクトアミドとは対照的に、ＣＯＳＹによって同様に接続され得る磁気的に等価な芳香族プロトンのセット（２６／２６’および２７／２７’）を示した。これら４セットは、すべてのその他のシストバクトアミドにおいて見出されたような３つの代わりに、分子中の４個のパラ置換ベンゼン環に相当した。１，２，３，４−四置換ベンゼン環のみが検出され得、これでは、炭素Ｃ−１８（ｄＣ  １３７．１）およびＣ−２０（ｄＨ  １１４．０）に対する芳香族プロトンＨ−２２（ｄΗ  ７．２２）のＨＭＢＣ相関および芳香族プロトンＨ−２１（ｄＨ  ７．５１）対Ｃ−２３（ｄＣ  １６７．３）から得られたＨＭＢＣ相関が観察され得る。プロトンＨ−２１およびＨ−２２は、ＣＯＳＹ相関によって接続され得る。炭素Ｃ−１７、Ｃ−１９およびＣ−２２は、観察できなかったので、すべてのペプチド断片のＨＲ−ＭＳ／ＭＳ質量が確立され、それぞれの断片中に７個の炭素、１１個のプロトンおよび１個の窒素および３個の酸素の存在が示され、この位置での１，２，３，４置換パラ−アミノベンゼン部分の存在が確認された（図１を参照のこと）。ＨＭＢＣデータから、Ｈ−３７（ｄＨ  ４．９３）のＣ−１８（ｄＣ  １３７．１）との接続がさらに確認された。ＨＭＢＣおよびＣＯＳＹデータから、シストバクトアミドＤにおいて見出されたように、分子の２つの芳香族部分間に同一リンカーが確認された。交換可能なプロトンＨ−９（ｄＨ  １０．８２）対Ｃ−１０（ｄＣ  １６３．９）およびＣ−７／７’（ｄｃ  １１９．４）、Ｈ−３（ｄＨ  ８．４９）対Ｃ−４（ｄＣ  １６５．１）、Ｈ−３１（ｄＨ  １０．５６）対Ｃ−３０（ｄＣ  １６８．３）およびＣ−３２（ｄＣ  １４１．５）ならびにＨ−１６（ｄＨ  ８．９１）対Ｃ−３６（ｄｃ  １６３．１）およびＣ−１８（ｄｃ  １３７．１  ）から得られたＨＭＢＣ相関ならびにＨ−２（ｄＨ  ４．９２）対交換可能なプロトンＨ−３（ｄＨ  ８．４９）から得られたＣＯＳＹ相関ならびにＨＲＭＳ断片データから、すべての断片の連続する接続性が確立された。ＨＲ−ＭＳ／ＭＳフラグメントを使用して、芳香族鎖間のリンカー中のニトロ基の位置および遊離アミド基の存在が確立され、それぞれの断片の合計式をもたらした。
【０１６７】
【表８】
0006730183.tif 000039
【０１６８】
シストバクトアミドＧ（７）のＨＲＥＳＩ（＋）ＭＳ解析は、擬似分子式イオン（Ｍ＋Ｈ）＋を返し、分子式Ｃ４４Ｈ４１Ｎ７Ｏ１４と一致し、２８のＤＢＥを必要とした。ＤＭＳＯ−ｄ６中の重複する芳香族シグナルのために、メタノール−ｄ４において獲得されたＮＭＲデータを使用して、芳香族およびリンカー断片の部分構造を確立した（表８）。パラ置換ベンゼン環は、ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣおよびＨＭＢＣ相関によって確立され得る。１，３，４−三置換ベンゼン環（４−アミノ−３メトキシ−ベンズアミド）およびメトキシ置換基（１−ＯＭｅ、（ｄｃ  ５５．２、ｄＨ  ３．５０）の立体配置が、ＨＳＱＣ、ＣＯＳＹおよびＨＭＢＣ相関によって確立された。１，２，３，４−置換ベンゼン部分上のすべてではないシグナルが、メタノール−ｄ４において検出され得るので、ＤＭＳＯ−ｄ６において測定されたＮＭＲデータが解釈されて、４−アミノ−３−イソプロポキシ−２−ヒドロキシ−ベンズアミドおよびシストバクトアミドＤにおいて同定されたものと同一の芳香族部分間のリンカーが確立された。Ｃ−３９（ｄＣ  ７４．４）および炭素Ｃ−４０／４０’（ｄＣ  ２２．７）間の接続が、Ｈ−３９（ｄＨ  ４．８２）およびＨ−４０／４０’（ｄＨ  １．３１）のＣＯＳＹ相関によって確立され、１，２，３，４−置換ベンゼン環およびＨ−３９（ｄＨ  ４．８２）間の接続性が、ｈ−３９対Ｃ−１８のＨＭＢＣ相関（ＤＭＳＯ−ｄ６においてｄｃ  １３７．３）によって確立された。Ｈ−２２（ｄＨ  ７．０４）対Ｃ−１８（ｄｃ  １３７．３）およびＣ−２０（ｄｃ  １１６．１）のＤＭＳＯ−ｄ６におけるＨＭＢＣ相関およびＨ−２１（ｄＨ  ７．４５）対Ｃ−２３（ｄｃ  １６５．４）のＨＭＢＣ相関ならびにＨ−２１対Ｈ−２２から得られたＣＯＳＹ相関を用いて、ベンゼン部分の立体配置がさらに確認された。配列全体で、ＨＲ−ＭＳ／ＭＳフラグメントを使用して、芳香族鎖間のリンカー中のニトロ基の位置および遊離アミド基の存在が確立され、それぞれの断片の合計式をもたらした。
【０１６９】
【表９】
0006730183.tif 000040
【０１７０】
シストバクトアミドＨ（８）のＨＲＥＳＩ（＋）ＭＳ解析は、擬似分子式イオン（Ｍ＋Ｈ）＋を返し、分子式Ｃ４３Ｈ３９Ｎ７Ｏ１４と一致し、２８のＤＢＥを必要とした。芳香族鎖間のリンカー立体配置は、シストバクトアミドＤにおいて見られたものと同一であるとわかった。ＤＭＳＯ−ｄ６において獲得されたＨＳＱＣ、ＨＭＢＣおよびＣＯＳＹデータの解釈によって、シストバクトアミドＡ、Ｂ、Ｄ、ＦおよびＧにおいて見られたような３つのパラ置換ベンゼンユニットが示された。ＣＯＳＹ、ＨＳＧＣおよびＨＭＢＣデータのさらなる解釈によって、シストバクトアミドＦ（１−ＯＭｅ（ｄＨ  ３．２７）対Ｃ−２６（ｄＣ  １４７．４）のＨＭＢＣ相関によって確認された）を除き、すべてのその他のシストバクトアミドにおいて見られたものと同一の１，３，４−三置換ベンゼン部分が示され、これは、メトキシ基に対するＨＭＢＣ相関を示した。ＮＭＲデータの解析によって、その他のシストバクトアミドと一致して、１，２，３，４−置換ベンゼン部分が示された。メチレンプロトンＨ−３９（ｄＨ  ４．１７）対メチル基Ｈ−４０（ｄＨ  １．２７）のＣＯＳＹ相関およびメチレン基Ｈ−３９（ｄＨ  ４．１７）対Ｃ−１８（ｄＣ  １３９．５）のＨＭＢＣ相関によるエトキシユニットの確立によって大きな変更がもたらされ、それによって、位置３での４−アミノ−２−ヒドロキシ−３−Ｘ−ベンズアミド部分の置換パターンが、Ｘ＝メトキシ、イソプロポキシまたはエトキシへ拡大された。交換可能なプロトンＨ−９（ｄＨ  １０．９３）対Ｃ−１０（ｄＣ  １６３．９）およびＣ−７／７’（ｄＣ  １１９．６）、Ｈ−３３（ｄＨ  １０．８５）対Ｃ−３２（ｄＣ  １６８．７）およびＣ−３５／３５’（ｄＣ  １１８．８）、Ｈ−１６（ｄＨ  ８．９１）対Ｃ−３８（ｄＣ  １６３．１）、Ｃ−１８（ｄＣ  １３９．５）およびＣ−２２（ｄＣ  １００．４）およびＨ−２４（ｄＨ  １４．７１）対Ｃ−２０（ｄＣ  １１６．１）、Ｃ−２５（ｄＣ  １３１．０）、Ｃ−２６（ｄＣ  １４７．４）およびＣ−３０（ｄＣ  １１８．５）およびＨ−２（ｄＨ  ４．８５）対Ｃ−４（ｄＣ  １６５．５）のＨＭＢＣ相関ならびにＨＲ−ＭＳ２フラグメンテーションデータによって、シストバクトアミドＨの連続的配列が確立され、これらはまた、リンカー部分中のニトロ基の位置特定および遊離アミド基の確立も可能にした。
【０１７１】
【表１０】
0006730183.tif 000041
【図面の簡単な説明】
【０１７２】
【図１】シストバクトアミドＡ（１）の重要な２Ｄ  ＮＭＲ相関（７００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）を示す図である。
【図２】シストバクトアミドＣ（３）の重要な２Ｄ  ＮＭＲ相関（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）を示す図である。
【図３】シストバクトアミドＤ（４）の重要な２Ｄ  ＮＭＲ相関（７００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）を示す図である。
【図４】シストバクトアミドＤジメチルエステル（４ａ）の重要な２Ｄ  ＮＭＲ相関を示す図である。
【図５】シストバクトアミドＥ（５）の重要な２Ｄ  ＮＭＲ相関を示す図である。
【図６】シストバクトアミドＦ（６）の重要な２Ｄ  ＮＭＲ相関（７００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）を示す図である。
【図７】シストバクトアミドＧ（７）の重要な２Ｄ  ＮＭＲ相関（７００ＭＨｚ、ＭｅＯＨ−ｄ４）を示す図である。
【図８】シストバクトアミドＨ（８）の重要な２Ｄ  ＮＭＲ相関（７００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）を示す図である。
【０１７３】
シストバクトアミドの生物学的評価
表１０ａ／ｂに要約されるように、シストバクトアミドを、いくつかの微生物および細胞株に対して評価した。すべての誘導体は、ナリジクス酸耐性（ＮＡＬＲ）分離株を含めた種々の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株で強力な阻害効果を実証した。試験した誘導体の全体的な性能（平均ＭＩＣ値）は以下の順序で増大した：ＣｙｓＡ１、ＣｙｓＣ＜ＣｙｓＢ＜ＣｙｓＡ、ＣｙｓＧ＜ＣｙｓＦ。重要なことに、病原性グラム陰性株Ａ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）および緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）も、最も活性な誘導体、ＣｙｓＡ、ＣｙｓＢ、ＣｙｓＧおよびＣｙｓＦによって、低いμｇ／ｍｌ範囲で阻害され、これは、ＭＩＣ値の点で、参照薬物シプロフロキサシンのものよりも１桁高い。
【０１７４】
フェカリス菌（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）および肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）などのグラム陽性菌に対する平均ＭＩＣ値は、部分的にμｇ／ｍｌ未満の範囲であり、ＣｙｓＡおよびＣｙｓＢの平均効力は、シプロフロキサシンのものを超えた。
【０１７５】
さらに、シストバクトアミドは、それぞれ、酵母および哺乳類細胞の増殖を阻害しないことが示された。したがって、シストバクトアミドは、明らかな細胞毒性を引き起こさなかった。
【０１７６】
突然変異株大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株のシストバクトアミドに対する感受性
キノロンは、ＩＩ型トポイソメラーゼ、ＤＮＡジャイレースおよびトポイソメラーゼＩＶを標的とする、広く使用されているクラスの抗生物質である。そのため、キノロンに対する耐性は、薬物標的における変更につながる染色体遺伝子における突然変異によって媒介されることが多い。ＧｙｒＡでは、キノロン耐性決定領域（ＱＲＤＲ）は、アミノ酸６７と１０６の間に位置するが、アミノ酸８３（Ｓｅｒ）および８７（Ａｓｐ）が関与していることが最も多い［１，２］。ＰａｒＣの類似領域、キノロンの第２の標的では、アミノ酸８０（Ｓｅｒ）の変化が、キノロン耐性を付与するとわかっている［３，４］。
【０１７７】
ｇｙｒＡおよびｐａｒＣ遺伝子に典型的な突然変異を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株のパネルを使用して、シストバクトアミドをスクリーニングした（表１１）。シプロフロキサシンを用いた場合、ＭＩＣ値は、単一工程ｇｙｒＡ突然変異（株ＭＩおよびＷＴ−３．２）についておよそ３０倍増大する。しかし、両ｇｙｒＡ突然変異の組合せ（株ＷＴ−３）は、すでにほぼ臨床耐性をもたらす（１ｍｇ／Ｌ）。ｐａｒＣ突然変異（株ＷＴ−４  Ｍ２．１）は、シプロフロキサシンのＭＩＣの２倍の増大をもたらす。しかし、シストバクトアミドのＭＩＣ値は、ｇｙｒＡおよびｐａｒＣ突然変異株大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株について増大しないか、またはわずかに増大するだけであり、これは、シストバクトアミドは、ＧｙｒＡのアミノ酸８７および８３ならびにＰａｒＣのアミノ酸８０を、シプロフロキサシンについて観察されたものよりも低い程度に干渉し得ることを示唆する。
【０１７８】
高レベルのキノロン耐性は、いくつかの標的部位突然変異および変更された排出機序の組合せに起因することが多い。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択された突然変異株ＷＴ  ＩＩＩ（ｍａｒＲ  Δ７４ｂｐ）は、ｍａｒＡ発現のレプレッサーとして作用する機能的ＭａｒＲを製造しない。これは、順に、ＭａｒＡおよびＡｃｒＡＢの過剰産生につながり、ＡｃｒＡＢ排出ポンプの過剰発現は、ＭＡＲ（多重抗生物質耐性）表現型と関連している［５］。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＷＴ  ＩＩＩは、シプロフロキサシン処理に対して感受性が約４倍低い（ｃｐ．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＷＴ）。比較では、シストバクトアミドＢ、ＦおよびＧのＭＩＣ値は、依然として、μｇ／ｍｌ範囲のままであった。特に、株大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＷＴ  ＩＩＩに対するＣｙｓＦのＭＩＣは、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＳＭ−１１１６と比較して、２倍増大しただけであったが、シプロフロキサシンのＭＩＣは、約１０倍増大した。
【０１７９】
【表１１】
0006730183.tif 000042
【０１８０】
【表１２】
0006730183.tif 000043
【０１８１】
【表１３】
0006730183.tif 000044
【０１８２】
【表１４】
0006730183.tif 000045
【０１８３】
試験手順細胞ベースのアッセイ
細胞株および一次細胞。ヒトＨＣＴ−１１６結腸癌腫細胞（ＣＣＬ−２４７）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手し、チャイニーズハムスター卵巣ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＣＣ−１１０）は、Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＤＳＭＺ）から入手した。両細胞株は、それぞれの供託者によって推奨される条件下で培養した。一次ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞；単一ドナー）は、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、以下の栄養補助剤：２％  ＦＣＳ、０．４％  ＥＣＧＳ、０．１ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ、１ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ、９０μｇ／ｍｌヘパリン、１μｇ／ｍｌヒドロコルチゾンを含有する内皮細胞成長培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）で培養した。
【０１８４】
細菌株。感受性アッセイにおいて使用される細菌野生型株は、本発明者らの株収集物の一部であるか、またはＧｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｓｉｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  （ＤＳＭＺ）からもしくはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＷＴ［６］および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）突然変異体は、Ｐｒｏｆ．  Ｄｒ．Ｐ．Ｈｅｉｓｉｇ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈａｍｂｕｒｇによって親切に提供された。
【０１８５】
細胞毒性アッセイ。細胞は、完全培地（１８０μｌ）中で９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＣｅｌｌＢｉｎｄ（登録商標））のウェルあたり６×１０３個の細胞で播種し、段階希釈でメタノールに溶解したシストバクトアミドを用いて直接処理した。化合物ならびに内部溶媒対照を２連で５日間試験した。５日間インキュベートした後、ウェルあたり、ＰＢＳ（２０μＬ）中、５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴを添加し、３７℃で２時間さらにインキュベートした［７］。次いで、培地を廃棄し、ＰＢＳ（１００μｌ）を用いて細胞を洗浄し、その後、ホルマザン顆粒剤を溶解するために、２−プロパノール／１０Ｎ  ＨＣｌ（２５０：１、ｖ／ｖ；１００μｌ）を添加した。マイクロプレートリーダー（ＥＬ８０８、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）を使用して５７０ｎｍでの吸光度を測定した。
【０１８６】
感受性試験。ＭＩＣ値は、微量希釈アッセイで決定した。適当な増殖培地で一晩培養物を希釈し、１０４〜１０６ｃｆｕ／ｍＬの播種材料を達成した。酵母は、Ｍｙｃ培地（１％  ファイトンペプトン、１％グルコース、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０）で、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）およびフェカリス菌（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）は、トリプシンダイズ培養液（ＴＳＢ：１．７％ペプトンカゼイン、０．３％ペプトンダイズカス、０．２５％グルコース、０．５％ＮａＣｌ、０．２５％Ｋ２ＨＰＯ４；ｐＨ７．３）で；スメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）は、１０％  Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ＡＤＣ濃縮物および２ｍｌ／ｌグリセロールを補給したＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ９培地で増殖させた。すべてのその他の列挙された細菌は、Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ培養液（０．２％牛肉注入固体、１．７５％カゼイン加水分解物、０．１５％デンプン、ｐＨ７．４）で増殖させた。シストバクトアミドおよび参照薬物は、滅菌９６ウェルプレート中の培養物に２連で直接添加し、段階希釈を調製した。非振盪条件（３７℃、５％  ＣＯ２、１８時間）で増殖させた肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）を除いて、微生物は、マイクロプレートシェーカー（７５０ｒｐｍ、３０〜３７℃、１８〜４８時間）で増殖させた。増殖阻害は、目視検査によって評価し、ＭＩＣは、可視的増殖を阻害した化合物の最低濃度として定義した。
【０１８７】
標的同定
シストバクトアミドの抗ジャイレース活性を試験するために、市販の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ジャイレース高次コイル形成キット（Ｉｎｓｐｉｒａｌｉｓ）を使用した。シストバクトアミドＡは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ジャイレース（２０．５ｎＭ当量  １ユニット）を阻害し、６μΜの見かけのＩＣ５０を示した。シストバクトアミドＡ１は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ジャイレース（２０．５ｎＭ当量  １ユニット）を阻害し、２．５μΜの見かけのＩＣ５０を示した。シストバクトアミドＤは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ジャイレース（２０．５ｎＭ当量  １ユニット）を阻害し、１μΜの見かけのＩＣ５０を示した。シストバクトアミドＣは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ジャイレース（２０．５ｎＭ当量  １ユニット）を阻害し、７．７μΜの見かけのＩＣ５０を示した。したがって、シストバクトアミドは、細菌ＤＮＡジャイレースの新規阻害剤である。
【０１８８】
ジャイレース阻害アッセイにおけるシストバクトアミドＡ〜ＤのＩＣ５０値
【０１８９】
【表１５】
0006730183.tif 000046
【０１９０】
図９ａは、ジャイレース阻害アッセイの結果を示す。ジャイレース反応は、種々の濃度のシストバクトアミドＡ、Ａ１、ＣおよびＤを用いて用量設定し、アガロースゲル電気泳動によって分離した。ＩＣ５０決定のために、高次コイルプラスミドのバンド強度は、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用して決定し、［シストバクトアミド］に対してプロットし、Ｈｉｌｌの方程式を使用してフィッティングした。
【０１９１】
原核生物のＤＮＡジャイレースおよびトポイソメラーゼＩＶは、高度の相同性を共有し、ジャイレース阻害剤は、通常、トポイソメラーゼＩＶ阻害活性を示す８。トポイソメラーゼＩＶに対するシストバクトアミドの影響を試験するために、市販の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）トポイソメラーゼＩＶキット（Ｉｎｓｐｉｒａｌｉｓ）を使用した。
【０１９２】
シストバクトアミドＡは、８１５μΜの最高試験濃度でのみ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｔｏｐｏ  ＩＶの活性を阻害した。シストバクトアミドＡ１は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｔｏｐｏ  ＩＶを阻害し、６．４＋／−１．８μΜのＩＣ５０値を示した。シストバクトアミドＣは、３００μΜの最大試験濃度でのみ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｔｏｐｏ  ＩＶの活性を阻害した。シストバクトアミドＤは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｔｏｐｏ  ＩＶを阻害し、１０＋／−３μΜのＩＣ５０値を示した。
【０１９３】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）トポイソメラーゼＩＶ阻害アッセイにおけるシストバクトアミドＡ〜ＤのＩＣ５０値：
【０１９４】
【表１６】
0006730183.tif 000047
【０１９５】
図９ｂは、トポイソメラーゼＩＶ阻害アッセイの結果を示す。ｔｏｐｏ  ＩＶ反応は、種々の濃度のＡ〜Ｄを用いて用量設定し、アガロースゲル電気泳動によって分離した。ＩＣ５０決定のために、高次コイルプラスミドのバンド強度は、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用して決定し、［シストバクトアミド］に対してプロットし、Ｈｉｌｌの方程式を使用してフィッティングした。
【０１９６】
原核生物のＤＮＡトポイソメラーゼＩＶおよび真核生物のトポイソメラーゼＩＩは、高度の相同性を共有し（ｌｌａ型トポイソメラーゼ）、原核生物酵素の阻害剤はまた、真核生物の対応物も阻害することが多い８。真核生物のトポイソメラーゼＩＶに対するシストバクトアミドの影響を試験するために、市販のヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）トポイソメラーゼＩＩキット（Ｉｎｓｐｉｒａｌｉｓ）を使用した。
【０１９７】
シストバクトアミドＡは、８１５μΜの最高試験濃度でのみヒトｔｏｐｏ  ＩＩの活性を阻害した。シストバクトアミドＡ１は、ヒトｔｏｐｏ  ＩＩを阻害し、９＋／−０．０３μΜのＩＣ５０値を示した。シストバクトアミドＣは、ヒトｔｏｐｏ  ＩＩの活性を３００μΜの最高試験濃度でのみ阻害した。シストバクトアミドＤは、ヒトｔｏｐｏ  ＩＩを阻害し、４１．２＋／−３μΜのＩＣ５０値を示した。
【０１９８】
ヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）トポイソメラーゼＩＩ阻害アッセイにおけるシストバクトアミドＡ〜ＤのＩＣ５０値：
【０１９９】
【表１７】
0006730183.tif 000048
【０２００】
図９ｃは、トポイソメラーゼＩＩ阻害アッセイの結果を示す。ｔｏｐｏ  ＩＩ反応は、種々の濃度のＡ〜Ｄを用いて用量設定し、アガロースゲル電気泳動によって分離した。ＩＣ５０決定のために、高次コイルプラスミドのバンド強度は、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用して決定し、［シストバクトアミド］に対してプロットし、Ｈｉｌｌの方程式を使用してフィッティングした。
【０２０１】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ジャイレース、ｔｏｐｏｌＶおよびヒトｔｏｐｏＩＩのようなＡＴＰ依存性ＩＩａ型トポイソメラーゼとは別に、ＡＴＰ非依存性ヒトトポイソメラーゼＩに対するシストバクトアミドの活性を同様に試験した。
【０２０２】
ヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）トポイソメラーゼＩ阻害アッセイにおけるシストバクトアミドＡ〜ＤのＩＣ５０値：
【０２０３】
【表１８】
0006730183.tif 000049
【０２０４】
図９ｄは、トポイソメラーゼＩ阻害アッセイの結果を示す。ｔｏｐｏ  Ｉ反応は、種々の濃度のＡ〜Ｄを用いて用量設定し、アガロースゲル電気泳動によって分離した。ＩＣ５０決定のために、高次コイルプラスミドのバンド強度は、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用して決定し、［シストバクトアミド］に対してプロットし、Ｈｉｌｌの方程式を使用してフィッティングした。
【０２０５】
シストバクトアミドＡ〜ＤのＩＣ５０（ジャイレース）対ＩＣ５０（トポイソメラーゼＩＶ）値比較：
【０２０６】
【表１９】
0006730183.tif 000050
【０２０７】
シストバクトアミドＡおよびＣは、分子標的としてのジャイレースにとって強力に好ましいと示す（ジャイレースについて４０〜１００倍強力に好ましい）。Ａ１およびＤは両方とも、ジャイレースを標的として、トポイソメラーゼＩＶもほぼ同等に良好である（ジャイレースについて２．６〜１０倍強力に好ましい）。
【０２０８】
一般に、ジャイレース阻害剤について、２つの記載された阻害様式／結合部位がある：
１．フルオロキノロンのような化合物は、ＧｙｒＡ  ＤＮＡ複合体と結合し、ニックの入ったｄｓＤＮＡ（ジャイレース中毒）の再ライゲーションを避ける、
２．他方、アミノクマリンは、ＧｙｒＢ上のＡＴＰ結合ポケットと結合する（競合阻害）８。
【０２０９】
シストバクトアミドが、それら２種の阻害様式のいずれかをたどるかどうかを試験するために、ＤＮＡ／ジャイレース複合体直線化アッセイ（Ａ）およびＡＴＰ競合アッセイ（Ｂ）を、シストバクトアミドＤを使用して実施した。（Ａ）ここでは、ＤＮＡおよびジャイレースの複合体を、ＳＤＳを使用して捕捉し、プロテイナーゼＫを使用してジャイレースを消化する。１型のジャイレース阻害薬によってジャイレース／ＤＮＡ複合体を捕捉する場合には、これは、直線化されたプラスミドの形成につながる（再ライゲーションが阻害されるので）。２型阻害薬が結合している、または化合物を含まないサンプルは、直線化されたプラスミドの形成を示さない。アッセイの結果は図１０ａに示されている。シプロフロキサシン（公知のジャイレース／ＤＮＡ安定剤）およびシストバクトアミドＤは、プロテイナーゼＫ処理後に直線化されたプラスミドの形成を示す。この効果は、未処理対照については見られない。したがって、シストバクトアミドは、共有結合ＧｙｒＡ−ＤＮＡ複合体をフルオロキノロンに匹敵する様式で安定化するように思われる。（Ｂ）ここで、標準ジャイレース反応は、一定量のシストバクトアミドＤを使用して阻害され、漸増量のＡＴＰを用いて用量設定された。ＡＴＰおよびシストバクトアミドＤが、ジャイレースＧｙｒＢサブユニット上のＡＴＰ結合ポケットで結合について競合する場合には、漸増量のＡＴＰは、アッセイにおいて高次コイルプラスミドの形成につながる。図１０ｂは、アッセイ結果を示す。１０ｍＭの最高ＡＴＰ濃度（２０００倍シストバクトアミド濃度）でさえ、ジャイレース活性は回復されず、これは、ＡＴＰ結合ポケットが、シストバクトアミドの結合部位ではないことを示す。この結果は、直線化アッセイ結果と一致する。
【０２１０】
図１１は、ＤＮＡ／ジャイレース複合体直線化アッセイの結果を示す。
【０２１１】
試験手順
ジャイレース高次コイル形成アッセイ
シストバクトアミドの抗ジャイレース活性を試験するために、市販の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ジャイレース高次コイル形成キット（Ｉｎｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｎｏｒｗｉｃｈ、ＵＫ）を使用した３。標準反応のために、１×反応バッファー（３０μｌ最終容量、キットマニュアルを参照のこと）中で、０．５μｇのほどけたプラスミドを、１ユニット（約２０．５ｎＭ）の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ジャイレースと混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含有するＤＮＡゲルローディングバッファーの添加によって反応をクエンチした。サンプルを、０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上で分離し、Ｒｏｔｉ−ＧｅｌＳｔａｉｎ（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ）を使用してＤＮＡを可視化した。
【０２１２】
すべての天然物保存溶液および希釈液を１００％  ＤＭＳＯで調製し、高次コイル形成反応物に添加して、５％（ｖ／ｖ）の最終ＤＭＳＯ濃度とした。シプロフロキサシン保存溶液および希釈液は、１０ｍＭ  ＨＣｌおよび５０％  ＤＭＳＯで調製し、最終アッセイにおいて１：１０を使用した。
【０２１３】
アッセイにおいて以下の天然物濃度を使用した：
0006730183.tif 000051
【０２１４】
対照反応は以下とした：５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯの存在下での酵素なしおよび標準反応。
【０２１５】
すべての反応サンプルを、ＤＮＡの不在下で、室温で１０分間平衡化した。次いで、反応を開始するためにほどけたプラスミドを添加した。
【０２１６】
プロテイナーゼＫ直線化アッセイ
シストバクトアミドが、ＤＮＡジャイレースおよびニックの入ったＤＮＡ基質間の共有結合複合体を安定化するかどうかを試験するために、プロテイナーゼＫ直線化アッセイを実施した（ａを参照のこと）。標準ジャイレース高次コイル形成アッセイは、シストバクトアミドＤ（１８μΜ；１．８μΜ）の存在下で行った。対照反応は、ジャイレースも、阻害剤も、既知ジャイレース／ＤＮＡ複合体安定剤シプロフロキサシン（１μΜ）も含有していなかった。１／１０容量の１０％  ＳＤＳの添加によって反応をクエンチした。ニックの入ったＤＮＡ−ジャイレース複合体を線状化するために、反応物に５０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。サンプルを、０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲルで分離し、Ｒｏｔｉ−ＧｅｌＳｔａｉｎ（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ）を使用してＤＮＡを可視化した。直線化されたプラスミドバンドを検出するために、単一切断制限酵素Ｎｄｅｌによってほどけたプラスミドを消化した。
【０２１７】
種々のＡＴＰ濃度を用いるジャイレース高次コイル形成アッセイ
シストバクトアミドが、ＧｙｒＢ上のＡＴＰ結合ポケットとの結合についてＡＴＰと競合するかどうかを試験するために、種々のＡＴＰ濃度を用いる標準ジャイレース高次コイル形成アッセイ（ａを参照のこと）を実施した。標準反応混合物（１ｍＭ  ＡＴＰ）に、ＡＴＰ（０．５Ｍ  ＡＴＰ保存溶液、ＡＴＰはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した）を、２．５、５および１０ｍＭの最終ＡＴＰ濃度に補給した。すべての反応は、３連で実施した。
【０２１８】
トポイソメラーゼＩＶ弛緩アッセイ
シストバクトアミドの抗トポイソメラーゼＩＶ活性を試験するために、市販の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）トポイソメラーゼＩＶ弛緩キット（Ｉｎｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｎｏｒｗｉｃｈ、ＵＫ）を使用した４。標準反応のために、１×反応バッファー（キットマニュアルを参照のこと）中で、０．５μｇの高次コイルプラスミドを、１ユニット（約２０．５ｎＭ）の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）トポイソメラーゼＩＶと混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含有するＤＮＡゲルローディングバッファーの添加によって反応をクエンチした。サンプルを、０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上で分離し、Ｒｏｔｉ−ＧｅｌＳｔａｉｎ（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ）を使用してＤＮＡを可視化した。
【０２１９】
アッセイにおいて以下の天然物濃度を使用した：
0006730183.tif 000052
【０２２０】
対照反応は以下とした：５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯの存在下での酵素なしおよび標準反応。すべての反応サンプルを、ＤＮＡの不在下で室温で１０分間平衡化した。次いで、反応を開始するためにほどけたプラスミドを添加した。
【０２２１】
トポイソメラーゼＩＩ弛緩アッセイ
シストバクトアミドの抗トポイソメラーゼＩＩ活性を試験するために、市販のヒトトポイソメラーゼＩＶ弛緩キット（Ｉｎｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｎｏｒｗｉｃｈ、ＵＫ）を使用した４。標準反応のために、１×反応バッファー（キットマニュアルを参照のこと）中で、０．５μｇの高次コイルプラスミドを、１ユニット（約２０．５ｎＭ）の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）トポイソメラーゼＩＩと混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含有するＤＮＡゲルローディングバッファーの添加によって反応をクエンチした。サンプルを、０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上で分離し、Ｒｏｔｉ−ＧｅｌＳｔａｉｎ（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ）を使用してＤＮＡを可視化した。
【０２２２】
アッセイにおいて以下の天然物濃度を使用した：
0006730183.tif 000053
【０２２３】
対照反応は以下とした：５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯの存在下での酵素なしおよび標準反応。すべての反応サンプルを、ＤＮＡの不在下で室温で１０分間平衡化した。次いで、反応を開始するためにほどけたプラスミドを添加した。
【０２２４】
トポイソメラーゼＩ弛緩アッセイ
シストバクトアミドの抗トポイソメラーゼＩＩ活性を試験するために、市販のヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）トポイソメラーゼＩ弛緩キット（Ｉｎｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｎｏｒｗｉｃｈ、ＵＫ）を使用した４。標準反応のために、１×反応バッファー（キットマニュアルを参照のこと）中で、０．５μｇの高次コイルプラスミドを、１ユニット（約２０．５ｎＭ）のヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）トポイソメラーゼＩと混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含有するＤＮＡゲルローディングバッファーの添加によって反応をクエンチした。サンプルを、０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上で分離し、Ｒｏｔｉ−ＧｅｌＳｔａｉｎ（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ）を使用してＤＮＡを可視化した。
【０２２５】
アッセイにおいて以下の天然物濃度を使用した：
0006730183.tif 000054
【０２２６】
対照反応は以下とした：５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯの存在下での酵素なしおよび標準反応。すべての反応サンプルを、ＤＮＡの不在下で室温で１０分間平衡化した。次いで、反応を開始するためにほどけたプラスミドを添加した。
【０２２７】
定量化および解析
ＩＣ５０値を決定するために、高次コイル（ジャイレース）またはほどけた（トポイソメラーゼＩ、ＩＩ  ＩＶ）プラスミドの形成を、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用して定量化した（ヒストグラム様式）。これらの値を、化合物濃度に対してプロットすることによって、シグモイド型の曲線が得られ、これをＨｉｌｌの方程式（Ｏｒｉｇｉｎ  Ｐｒｏ  ８．５）を使用してフィッティングした。すべての決定されたＩＣ５０値は、３回の独立実験の平均である。
【０２２８】
引用文献：
0006730183.tif 000055
【０２２９】
シストバクトアミドＡおよびＣの合成
まず、シストバクトアミドＣの合成を記載し、これを、その他のシストバクトアミドに向けてさらに詳しく述べることができる。
【０２３０】
１．１．シストバクトアミドＣ
以下のスキーム１および２は、個々の芳香族構成要素の合成の概要と、それに続いて、これらを組み立ててシストバクトアミドＣを作製することを提供する。
【０２３１】
あるいは、ｉＰｒＯＨの代わりに別のアルコール（Ｒ’ＯＨ）を使用することによって、スキーム１中の工程ｅ）を修飾することができる。例えば、ＥｔＯＨを使用する場合には、シストバクトアミドＨの構成要素を調製することができる。同じことが、スキーム１で与えられる第２の反応シークエンス中の工程ｂ）に当てはまる。ここで、またｉＰｒＯＨは、別のその他のアルコール（Ｒ’ＯＨ）によって交換されてもよい。例えば、ＭｅＯＨを使用する場合には、シストバクトアミドＣ、ＧおよびＨの構成要素を調製することができる。シストバクトアミドＦの調製のためには、構成要素Ｂの代わりに、ｐ−アミノ安息香酸などのｐ−アミノ−安息香酸誘導体または対応するＮ保護されたアミノ安息香酸誘導体およびｐ−ニトロ安息香酸を使用する。
【０２３２】
スキーム１：アレーンＡおよびＢの合成とそれに続くアミドカップリング
（中心芳香族部分）
【０２３３】
【化３０】
0006730183.tif 000056
【０２３４】
（末端三置換芳香族部分）
【０２３５】
【化３１】
0006730183.tif 000057
【０２３６】
（併合芳香族部分ＡおよびＢ）
【０２３７】
【化３２】
0006730183.tif 000058
【０２３８】
スキーム２：シストバクトアミドＣ合成の仕上げ
【０２３９】
シストバクトアミドＣ（合成の仕上げ）
【０２４０】
【化３３】
0006730183.tif 000059
【０２４１】
１．２シストバクトアミドＡ
より複雑なシストバクトアミドは、シストバクトアミドＣに相当するビスアミド、ビスアリールアミド（断片Ｃ）およびキラルリンカー要素からなる。この節では、断片Ｃおよびキラルリンカー要素が、最初に報告され、３種の要素すべてを組み立てて、シストバクトアミドＡを提供することがそれに続く。
【０２４２】
１．２．１  ビスアレーンＣの合成
スキーム３：活性化された断片Ｃの合成
断片Ｃ
【０２４３】
【化３４】
0006730183.tif 000060
【０２４４】
１．２．２  ビスアレーンＣが結合しているキラル構成要素Ｄの合成
合成は、ケイ皮酸メチルから出発し、シャープレス不斉ジヒドロキシル化によってキラリティーを導入する。フェニル環は、第２のカルボキシレートの保護基として働き、これは酸化的に遊離される。最後に、構成要素Ｃを、遊離アミノ基と結合させる。ＡＤ混合物βの代わりにＡＤ混合物αを使用して、対応する鏡像異性断片（ｅｎｔ）−Ｄを調製した。
【０２４５】
スキーム４：ケイ皮酸メチルから出発するカルボン酸Ｄの合成
【０２４６】
【化３５】
0006730183.tif 000061
【０２４７】
スキーム５：シストバクトアミドＡ合成の仕上げ
シストバクトアミドＡ（合成の仕上げ）
【０２４８】
【化３６】
0006730183.tif 000062
【０２４９】
２．実験
２．１  一般的な実験情報
すべての反応は、別に記載のない限り、窒素ガスの雰囲気下、オーブン乾燥したガラス器具中で実施した。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶＳ−４００を用いて４００ＭＨｚで、またはＢｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ−５００を用いて５００ＭＨｚで記録した。１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶＳ−４００を用いて１００ＭＨｚで、およびＢｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ−５００を用いて１２５ＭＨｚで記録した。多重度は、以下の略語を使用して記載する：ｓ＝一重項、ｄ＝二重項、ｔ＝三重項、ｑ＝四重項、ｍ＝多重項、ｂ＝ブロード。１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルのケミカルシフト値は、内部標準としての残存する溶媒シグナルに対するｐｐｍでの値として全般に報告する。多重度とは、オフ共鳴のデカップリングスペクトルにおける共鳴を指す。これらは、偏光譲渡による歪みのない強化（ｄｉｓｔｏｒｔｉｏｎｌｅｓｓ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｂｙ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）（ＤＥＰＴ）スペクトル編集技術を使用し、９０°および１３５°で二次パルスを用いて解明した。多重度は、以下の略語を使用して報告する：ｓ＝一重項（第四級炭素による）、ｄ＝二重項（メチン）、ｔ＝三重項（メチレン）、ｑ＝四重項（メチル）。マススペクトル（Ｅｌ）は、７０ｅＶで、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｑｕｉｔｙ  Ｕｌｔｒａｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＬＣシステムと組み合わせて、ＶＧ型Ａｕｔｏｓｐｅｃスペクトロメーター（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）を用い、ＬＣＴ型（ＥＳＩ）（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）を用い、またはＱ−ＴＯＦ型（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）スペクトロメーターを用いて得た。プレコーティングされたシリカゲル６０  Ｆ２５４プレート（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）を使用して、分析薄層クロマトグラフィーを実施し、２５４ｎｍでＵＶ光を用いて、あるいは、過マンガン酸カリウム、ホスホモリブデン酸、２，４−ジニトロフェノールもしくはｐ−アニスアルデヒド溶液で染色することによってスポットを可視化した。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を、ナトリウム／ベンゾフェノンから窒素下で蒸留した。溶媒精製系（ＳＰＳ）を使用してジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）を乾燥させた。市販の試薬を、供給されたものとして使用した。カラムを備えたＭｅｒｃｋ  Ｈｉｔａｃｈｉ  ＬａＣｈｒｏｍシステム（ポンプＬ−７１５０、インターフェースＤ−７０００、ダイオードアレイ検出器Ｌ−７４５０（λ＝２２０〜４００ｎｍ、好ましくは、λ＝２３０ｎｍでモニタリング））を使用する分取高性能液体クロマトグラフィー（括弧中に示されるこの実験部分において参照される略語）：ガードカラム、４０×８ｍｍを備えたＴｒｅｎｔｅｃ  Ｒｅｐｒｏｓｉｌ−Ｐｕｒ  １２０  Ｃ１８  ＡＱ  ５μｍ、２５０×８ｍｍ（Ｃ１８−ＳＰ）。フラッシュカラムクロマトグラフィーを、Ｍｅｒｃｋシリカゲル６０（２３０〜４００メッシュ）で実施した。フラッシュクロマトグラフィーに使用した溶出物を、使用に先立って蒸留した。ＳＲＳ  ＯｐｔｉＭｅｌｔ装置を使用して融点を測定した。旋光度［α］は、５８９ｎｍの波長でＰｏｌａｒｉｍｅｔｅｒ３４１（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で測定し、１０−１度ｃｍ２ｇ−１で示されている。
【０２５０】
２．２  特定の手順
４−アミノメチルベンゾエート
【０２５１】
【化３７】
0006730183.tif 000063
【０２５２】
ＭｅＯＨ（２００ｍＬ）をフラスコ中に提供し、塩化アセチル（２．６ｍＬ、３６．５ｍｍｏｌ、１当量）をゆっくりと添加した。次いで、４−アミノ安息香酸（５．００ｇ、３６．５ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を室温で７日間撹拌した。溶媒を減圧下で除去すると、４−アミノメチルベンゾエート（５．３８ｇ、３５．５９ｍｍｏｌ、定量的）がベージュ色の固体として得られた。
【０２５３】
標題化合物は、その融点に達する前に分解する。
0006730183.tif 000064
【０２５４】
４−（４−ニトロベンズアミド）メチルベンゾエート
【０２５５】
【化３８】
0006730183.tif 000065
【０２５６】
ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）中の、Ｐ（ＯＭｅ）３（３．５ｍＬ、２９．８ｍｍｏｌ）の溶液を氷浴を用いて冷却し、次いで、Ｉ２（７．５６ｇ、２９．８ｍｍｏｌ）を添加した。固体ヨウ素を完全に溶解した後、ｐ−ニトロ安息香酸（５．５２ｇ、２９．８ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（４．７０ｍＬ、３３．７ｍｍｏｌ）を逐次添加し、溶液を冷却浴中で１０分間撹拌した。４−アミノメチルベンゾエート（３．００ｇｒ、１９．９ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を１０分間撹拌した。冷却浴を取り除いたのち、反応混合物を室温で３日間撹拌し、次いで、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を用いて希釈し、ジクロロメタン（３×）で抽出した。合わせた有機層を、Ｈ２Ｏ、１Ｍ  ＨＣｌ、Ｈ２Ｏおよびブラインを用いて逐次洗浄した。合わせた有機層を無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、溶媒を真空濃縮すると、標題化合物（４．４ｇ、１４．６５ｍｍｏｌ、７５％）がベージュ色の固体として得られた。
0006730183.tif 000066
【０２５７】
４−（４−ニトロベンズアミド）ベンゾエート
【０２５８】
【化３９】
0006730183.tif 000067
【０２５９】
４−（４−ニトロベンズアミド）メチルベンゾエート（４．３２ｇ、１４．３８ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ／Ｈ２Ｏの混合物１／１（７７／７７ｍＬ）に溶解した。次いで、固体ＬｉＯＨ（５．１６ｇ、２１５．６６ｍｍｏｌ）を添加し、系を室温で１７時間撹拌した。１Ｍ  ＨＣｌを、ｐＨ約１まで添加し、得られた固体を濾過し、真空乾燥させた。標題化合物（３．３ｇ、１１．５４ｍｍｏｌ、８０％）が淡黄色の固体として得られた。
0006730183.tif 000068
【０２６０】
（エチルカルボニック）４−（４−ニトロベンズアミド）安息香酸無水物
【０２６１】
【化４０】
0006730183.tif 000069
【０２６２】
０℃で、アセトン中の、４−アミノ安息香酸（１．５ｇ、１０．９ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジメチルアニリン（２．０ｇ、１０．９ｍｍｏｌ）撹拌溶液に、４−ニトロベンゾイルクロリドを添加した。次いで、反応混合物を室温に加温させ、さらに１時間撹拌した。得られた固体を濾過し、ＤＭＦ中での再結晶化によって精製すると、４−（４−ニトロ−ベンゾイルアミノ）−安息香酸（２．７５ｇ、８８％）が得られた。
【０２６３】
４−（４−ニトロ−ベンゾイルアミノ）−安息香酸（０．６ｇ、２．１ｍｍｏｌ）を、１４ｍｌのＣＨ３ＣＮ中に溶解した。次いで、０℃でＥｔ３Ｎ（０．３１ｍｌ、２．２ｍｍｏｌ）を添加した。この得られた溶液に、クロロギ酸エチルを添加した。０℃で３０分間撹拌した後、白色沈殿を濾過し、冷ＣＨ３ＣＮで洗浄し、次いで、室温で高真空下で乾燥させると、標題無水物０．５ｇ、６７％が得られた。
0006730183.tif 000070
【０２６４】
３−ヒドロキシ−４−ニトロメチルベンゾエート
【０２６５】
【化４１】
0006730183.tif 000071
【０２６６】
０℃のトルエン／メタノール（８１／３６ｍＬ）の混合物中の３−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸（２．５０ｇ、１３．６５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＭＳＣＨＮ２（Ｅｔ２Ｏ中、２．０Ｍ、１３．２０ｍＬ、２６．４８ｍｍｏｌ）を添加した。０℃で３０分間撹拌した後、溶媒を真空蒸発させると、油性残渣が得られ、これをフラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル＝９：１）によって精製すると、標題化合物（２．４３ｇ、１２．３３ｍｍｏｌ、９０％）が、黄色固体として得られた。
0006730183.tif 000072
【０２６７】
３−イソプロポキシ−４−ニトロメチルベンゾエート
【０２６８】
【化４２】
0006730183.tif 000073
【０２６９】
３−ヒドロキシ−４−ニトロメチルベンゾエート（２．３０ｇ、１０．８９ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（１００ｍＬ）中に溶解した。ｉＰｒＯＨ（１．１０ｍＬ、１４．１６ｍｍｏｌ）およびＰＰｈ３（３．９０ｇ、１４．７０ｍｍｏｌ）を添加し、混合物をすべての成分が溶解するまで撹拌した。ＤＥＡＤ（トルエン中、２．２Ｍ、１４．１６ｍｍｏｌ、６．５０ｍＬ）を添加し、混合物を室温で１７時間撹拌した。溶媒を真空蒸発させると、油性残渣が得られ、これをフラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル＝９５：５）によって精製すると、標題化合物（２．６１ｇ、１０．９１ｍｍｏｌ、定量的）が黄色オイルとして得られた。
0006730183.tif 000074
【０２７０】
３−イソプロポキシ−４−アミノメチルベンゾエート
【０２７１】
【化４３】
0006730183.tif 000075
【０２７２】
３−イソプロポキシ−４−ニトロメチルベンゾエート（２．６０ｇ、１０．８７ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（９１．０ｍＬ）中に溶解し、脱気した。Ｐｄ／Ｃ（１０重量％、０．５８ｇ、０．５４ｍｍｏｌ）を添加し、冷却下で真空を適用して空気を除去した。Ｈ２を用いてフラスコをフラッシュし、懸濁液を室温で１７時間撹拌した。触媒をセライト（登録商標）で濾過し、ＭｅＯＨで洗浄し、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル／ＥｔＯＡｃ＝７／３）によって精製した。３−イソプロポキシ−４−アミノメチルベンゾエートが淡橙色の固体として得られた（２．２７ｇ、１０．８５ｍｍｏｌ、定量的）。
0006730183.tif 000076
【０２７３】
６−ブロモ−２，３−ジヒドロキシベンズアルデヒド
【０２７４】
【化４４】
0006730183.tif 000077
【０２７５】
−３０℃で、ＣＨ２Ｃｌ２（２７０ｍＬ）中の６−ブロモ−２−ヒドロキシ−３−メトキシベンズアルデヒド（２５．０ｇ、１０８．２ｍｍｏｌ）の溶液に、さらなる漏斗を介してＢＢｒ３（ＣＨ２Ｃｌ２中、１Ｍ、２００．０ｍＬ、２００．０ｍｍｏｌ）を、４５分間かけてゆっくりと添加した。溶液を室温に加温させ、１７時間撹拌した。Ｈ２Ｏを添加し、反応混合物をさらに３０分間撹拌した。次いで、溶液をＥｔＯＡｃ（３×）を用いて抽出し、Ｈ２Ｏで洗浄した。合わせた有機層を無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空濃縮すると、標題化合物（２２．１６ｇ、１０２．１１ｍｍｏｌ、９５％）が黄色固体として得られた。
0006730183.tif 000078
【０２７６】
４−ブロモ−３−ヒドロキシメチルベンゼン−１，２−ジオール
【０２７７】
【化４５】
0006730183.tif 000079
【０２７８】
−４０℃のＴＨＦ（６５０ｍＬ）中の６−ブロモ−２，３−ジヒドロキシベンズアルデヒド（２２．１６ｇ、１０２．１０ｍｍｏｌ）の溶液を、ＮａＢＨ４（３．８６ｇ、１０２．１０ｍｍｏｌ）を用いて少しずつ（３ｘ）処理した。得られた混合物を室温で３０分間撹拌した。ＮＨ４Ｃｌの飽和水溶液を添加し、混合物をさらに１０分間撹拌し、その後、１Ｍ  ＨＣｌを用いて最終的に処理した。さらに１０分間撹拌した後、水相をＥｔＯＡｃ（３ｘ）を用いて抽出した。合わせた有機抽出物を無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過した。溶媒を減圧下で除去すると、標題化合物（２０．２７ｇ、９２．５３ｍｍｏｌ、９１％）が、無色の固体として得られた。
0006730183.tif 000080
【０２７９】
５−ブロモ−２−フェニル−４Ｈ−ベンゾ−［１，３］−ジオキシン−８−オール
【０２８０】
【化４６】
0006730183.tif 000081
【０２８１】
ＴＨＦ（５５０ｍＬ）中の４−ブロモ−３−ヒドロキシメチルベンゼン−１，２−ジオール（２０．２７ｇ、９２．５３ｍｍｏｌ）の溶液を、ＰｈＣＨ（ＯＭｅ）２（２０．８ｍＬ、１３８．８ｍｍｏｌ）およびｐＴＳＡ．Ｈ２Ｏ（０．１９ｇ、１．０２ｍｍｏｌ）を用いて処理した。混合物を室温で５日間撹拌した。ＣＨ２Ｃｌ２を添加し、次いで、５％ＮａＨＣＯ３水溶液およびブラインを用いて連続的に洗浄した。水相をＥｔＯＡｃ（３ｘ）を用いて抽出した。合わせた有機抽出物を、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。フラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル／ＥｔＯＡｃ＝９５／５）によって精製すると、５−ブロモ−２−フェニル−４Ｈ−ベンゾ−［１，３］−ジオキシン−８−オール（１６．０２ｇ、５２．１６ｍｍｏｌ、５６％）が無色の固体として得られた。
0006730183.tif 000082
【０２８２】
５−ブロモ−７−ニトロ−２−フェニル−４Ｈ−ベンゾ−［１，３］−ジオキシン−８−オール
【０２８３】
【化４７】
0006730183.tif 000083
【０２８４】
５−ブロモ−２−フェニル−４Ｈ−ベンゾ−［１，３］−ジオキシン−８−オール（６．００ｇ、１９．５４ｍｍｏｌ；最大量）を、アセトン（２５０ｍＬ）に溶解した。次いで、Ｎｉ（ＮＯ３）２．５Ｈ２Ｏ（５．６８ｇ、１９．５４ｍｍｏｌ）およびｐＴＳＡ．Ｈ２Ｏ（３．７２ｇ、１９．５４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で２．５時間撹拌した。反応混合物をセライト（登録商標）で濾過し、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、真空濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ドライロード：ＳｉＯ２＋ＣＨ２Ｃｌ２；石油エーテル／酢酸エチル＝９：１）による精製によって、標題化合物（５．０８ｇ、１４．４３ｍｍｏｌ、７４％）が鮮黄色の固体として得られた。
0006730183.tif 000084
【０２８５】
５−ブロモ−８−イソプロポキシ−７−ニトロ−２−フェニル−４Ｈ−ベンゾ−［１，３］−ジオキシン
【０２８６】
【化４８】
0006730183.tif 000085
【０２８７】
５−ブロモ−７−ニトロ−２−フェニル−４Ｈ−ベンゾ−［１，３］−ジオキシン−８−オール（１３．７９ｇ、３９．１６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（４２９ｍＬ）に溶解した。ｉＰｒＯＨ（４．００ｍＬ、５０．９１ｍｍｏｌ）およびＰＰｈ３（１３．８７ｇ、５２．８７ｍｍｏｌ）を添加し、混合物をすべての成分が溶解するまで撹拌した。ＤＥＡＤ（トルエン中、２．２Ｍ、２３．１ｍＬ、５０．９１ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加し（シリンジポンプによって）、混合物を室温で１７時間撹拌した。溶媒を真空蒸発させると、油性残渣が得られ、これをフラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル＝９６：４）によって精製すると、標題化合物（１３．０８ｇ、３３．１８ｍｍｏｌ、８５％）が無色の固体として得られた。
0006730183.tif 000086
【０２８８】
８−イソプロポキシ−７−ニトロ−２−フェニル−４Ｈ−ベンゾ−［１，３］−ジオキシン、７３
【０２８９】
【化４９】
0006730183.tif 000087
【０２９０】
１，４−ジオキサン（２８ｍＬ）中に、５−ブロモ−８−イソプロポキシ−７−ニトロ−２−フェニル−４Ｈ−ベンゾ−［１，３］−ジオキシン７２（４．００ｇ、１０．１５ｍｍｏｌ）、Ｐｄ２（ｄｂａ）３（０．９３ｇ、１．０１ｍｍｏｌ）、（ＰｈＯ）３Ｐ（０．５３ｍＬ、２．０３ｍｍｏｌ）、Ｃｓ２ＣＯ３（４．３０ｇ、１３．１９ｍｍｏｌ）およびｉＰｒＯＨ（４．７ｍＬ、６０．８８ｍｍｏｌ）を溶解した。油浴を６０℃に予め加熱し、混合物を８０℃で１．５時間撹拌した。反応混合物をセライト（登録商標）を通して濾過し、ＥｔＯＡｃで洗浄した。合わせた有機抽出物を、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、真空濃縮した。粗材料をフラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル＝９６：４）によって精製すると、標題化合物（２．２４ｇ、７．１０ｍｍｏｌ、７０％）が淡黄色の固体として得られた。
0006730183.tif 000088
【０２９１】
６−ヒドロキシメチル−２−イソプロポキシ−３−ニトロフェノール
【０２９２】
【化５０】
0006730183.tif 000089
【０２９３】
０℃の、ＭｅＯＨ（１０２ｍＬ）中の８−イソプロポキシ−７−ニトロ−２−フェニル−４Ｈ−ベンゾ−［１，３］−ジオキシン（４．２４ｇ、１３．４３ｍｍｏｌ）およびＣＨ２Ｃｌ２（４２ｍＬ）の混合物に、カンファースルホン酸(camphor sufonic acid)（３．１２ｇ、１３．４３ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で１７時間撹拌した。反応混合物を、ｐＨ約８までＥｔ３Ｎを用いてクエンチし、真空濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル＝７：３）によって精製すると、標題化合物（２．７５ｇ、１２．０９ｍｍｏｌ、９０％）が褐色を帯びた固体として得られた。
0006730183.tif 000090
【０２９４】
２−ヒドロキシ−３−イソプロポキシ−４−ニトロベンズアルデヒド
【０２９５】
【化５１】
0006730183.tif 000091
【０２９６】
ＣＨ２Ｃｌ２（５８ｍＬ）中に６−ヒドロキシメチル−２−イソプロポキシ−３−ニトロフェノール（２．９７ｇ、１３．０５ｍｍｏｌ）を溶解した。次いで、ＭｎＯ２（１１．３５ｇ、１３０．５３ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で１７時間撹拌した。混合物をセライト（登録商標）で濾過し、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した。溶媒を濃縮すると、標題化合物（２．３８ｇ、１０．５７ｍｍｏｌ、８１％）が褐色のオイルとして得られた。
0006730183.tif 000092
【０２９７】
２−ヒドロキシ−３−イソプロポキシ−４−ニトロ安息香酸
【０２９８】
【化５２】
0006730183.tif 000093
【０２９９】
２−ヒドロキシ−３−イソプロポキシ−４−ニトロベンズアルデヒド（２．３６ｇ、１０．４９ｍｍｏｌ）をｔ−ブタノール（７１ｍＬ）に溶解した。２−メチル−２−ブテン（ＴＨＦ中、２Ｍ、３６．７ｍＬ、７３．４５ｍｍｏｌ）ならびにＨ２Ｏ（５１ｍＬ）中のＮａＣｌＯ２（２．８５ｇ、３１．４８ｍｍｏｌ）およびＮａＨ２ＰＯ４（６．３２ｇ、４７．２２ｍｍｏｌ）の溶液を逐次添加した。反応混合物を室温で１７時間撹拌した。６Ｍ  ＮａＯＨをｐｈ約１０まで添加し、溶媒を真空濃縮した。Ｈ２Ｏを添加し、有機層を石油エーテル（２ｘ）を用いて抽出した。水層を、ｐＨ約１まで６Ｍ  ＨＣｌを用いて酸性化し、酢酸エチル（３ｘ）を用いて抽出した。有機抽出物を合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過した。溶媒を真空濃縮すると、標題化合物（１．９０ｇ、７．８７ｍｍｏｌ、７５％）が暗色のワックスとして得られた。
0006730183.tif 000094
【０３００】
２−ヒドロキシ−３−イソプロポキシ−４−ニトロベンゾエート
【０３０１】
【化５３】
0006730183.tif 000095
【０３０２】
０℃のトルエン／メタノール（１０．４／２ｍＬ）の混合物中の、２−ヒドロキシ−３−イソプロポキシ−４−ニトロ安息香酸（０．３２ｇ、１．３５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＭＳＣＨＮ２（Ｅｔ２Ｏ中、２．０Ｍ、０．８７ｍＬ、１．７５ｍｍｏｌ）を添加した。０℃で３０分間撹拌した後、溶媒を真空蒸発させると、油性残渣が得られ、これを、フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２．Ｅｔ３Ｎ；石油エーテル／酢酸エチル＝９５：５）によって精製すると、標題化合物（０．２４ｇ、０．９４ｍｍｏｌ、５７％）が黄色のオイルとして得られた。
0006730183.tif 000096
【０３０３】
２−ベンジルオキシ−３−イソプロポキシ−４−ニトロベンゾエート
【０３０４】
【化５４】
0006730183.tif 000097
【０３０５】
ＴＨＦ（７．５ｍＬ）に、２−ヒドロキシ−３−イソプロポキシ−４−ニトロベンゾエート（０．１７ｇ、０．６９ｍｍｏｌ）を溶解した。ＢｎＯＨ（９２．６μＬ、０．８９ｍｍｏｌ）およびＰＰｈ３（０．２４ｇ、０．９３ｍｍｏｌ）を添加し、混合物をすべての成分が溶解するまで撹拌した。ＤＥＡＤ（トルエン中、２．２Ｍ、０．４１ｍＬ、０．８９ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加し（シリンジポンプによって）、混合物を室温で１７時間撹拌した。溶媒を真空蒸発させると、油性残渣が得られ、これを、フラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル＝９５：５）によって精製すると、標題化合物（０．２０ｇ、０．５８ｍｍｏｌ、８５％）が無色のオイルとして得られた。
0006730183.tif 000098
【０３０６】
２−ベンジルオキシ−３−イソプロポキシ−４−ニトロ安息香酸
【０３０７】
【化５５】
0006730183.tif 000099
【０３０８】
２−ベンジルオキシ−３−イソプロポキシ−４−ニトロベンゾエート（０．２３ｇ、０．６７ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ／Ｈ２Ｏの混合物１／１（３．５／３．５ｍＬ）に溶解した。次いで、固体ＬｉＯＨ（０．１６ｇ、６．６７ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で１７時間撹拌した。水層を、ｐＨ約１まで１Ｍ  ＨＣｌを用いて酸性化し、ＥｔＯＡｃ（３ｘ）を用いて抽出した。有機抽出物を合わせ、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過した。溶媒を真空濃縮すると、標題化合物（０．２１ｇ、０．６３ｍｍｏｌ、９５％）が黄色のワックスとして得られた。
0006730183.tif 000100
【０３０９】
４−（２−（ベンジルオキシ）−３−イソプロポキシ−４−ニトロベンズアミド）−３−イソプロポキシベンゾエート
【０３１０】
【化５６】
0006730183.tif 000101
【０３１１】
２−ベンジルオキシ−３−イソプロポキシ−４−ニトロ安息香酸（５１．５ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（８ｍＬ）に溶解し、Ｇｈｏｓｅｚの試薬（６６．０μＬ、０．５０ｍｍｏｌ）を用いて４０℃で３時間予め活性化した。３−イソプロポキシ−４−アミノメチルベンゾエート（０．１２ｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（８ｍＬ）に溶解し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を添加した（０．２０ｍＬ、１．１２ｍｍｏｌ）。次いで、酸塩化物を含有する溶液を添加し、反応混合物を４０℃で２日間撹拌した。次いで、溶媒を除去し、粗生成物を、分取ＨＰＬＣ（ＲＰ−１８；実施時間１００分、Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ＝１００：０→０：１００；ｔｒ＝８０分）によって精製すると、標題化合物（５６．９ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、６８％）が淡黄色のオイルとして得られた。
0006730183.tif 000102
【０３１２】
４−（４−アミノ−２−ヒドロキシ−３−イソプロポキシベンズアミド）−３−イソプロポキシベンゾエート
【０３１３】
【化５７】
0006730183.tif 000103
【０３１４】
４−［２−（ベンジルオキシ）−３−イソプロポキシ−４−ニトロベンズアミド］−３−イソプロポキシ−ベンゾエート（７．９ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ（０．５ｍＬ）に溶解し、脱気した。Ｐｄ／Ｃ（１０重量％、２ｍｇ、０．００１４ｍｍｏｌ）を添加し、冷却下で真空を適用して空気を除去した。Ｈ２を用いてフラスコをフラッシュし、懸濁液を室温で３時間撹拌した。触媒をセライト（登録商標）で濾去し、ＭｅＯＨで洗浄し、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル＝７：３）によって精製し、標題化合物が黄色のオイルとして得られた（５．８ｇ、０．０１４ｍｍｏｌ、９６％）。
0006730183.tif 000104
【０３１５】
４−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）安息香酸
【０３１６】
【化５８】
0006730183.tif 000105
【０３１７】
４−アミノ安息香酸（１．００ｇ、７．２９ｍｍｏｌ）を、１，４−ジオキサン（１５ｍＬ）およびＨ２Ｏ（７ｍＬ）中に溶解した。溶液に、Ｅｔ３Ｎ（２．０ｍＬ、１４．５８ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で５分間撹拌した。溶液に、ジ−ｔ−ブチルジカーボネート（３．１８ｇ、１４．５８ｍｍｏｌ）を一度に添加し、反応混合物を２４時間撹拌した。溶媒を真空で除去した後、残渣に３Ｍ  ＨＣｌを添加すると、白色沈殿が得られた。次いで、スラリーを濾過し、Ｈ２Ｏで洗浄し、その後、高真空下で乾燥させた。温メタノールからの再結晶化によって、標題化合物が無色の固体として得られた（１．６３ｇ、６．８５ｍｍｏｌ、９４％収率）。
0006730183.tif 000106
【０３１８】
分光分析データは、文献（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２年、第１３４巻、７４０６〜７４１３頁）に報告されるものと一致する。
【０３１９】
メチル−４−（４−（４−（ｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ベンズアミド）−２−ヒドロキシ−３−イソプロポキシベンズアミド−３−イソプロポキシベンゾエート
【０３２０】
【化５９】
0006730183.tif 000107
【０３２１】
４−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）安息香酸（４０．０ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（８．４ｍＬ）に溶解し、Ｇｈｏｓｅｚの試薬（２２．５μＬ、０．１７ｍｍｏｌ）を用いて室温で２時間予め活性化した。４−（４−アミノ−２−ヒドロキシ−３−イソプロポキシベンズアミド）−３−イソプロポキシベンゾエート（６８．４ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（８．４ｍＬ）に溶解し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を添加した（５９．２μＬ、０．３４ｍｍｏｌ）。次いで、酸塩化物を含有する溶液を添加し、反応混合物を室温で１日間撹拌した。次いで、溶媒を除去し、粗生成物を分取ＨＰＬＣ（ＲＰ−１８；実施時間１００分、Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ＝１００：０→０：１００；ｔｒ＝７０分）によって精製すると、標題化合物が淡黄色のオイルとして得られた（４７．３ｍｇ、０．０７６ｍｍｏｌ、７２％）。
0006730183.tif 000108
【０３２２】
メチル−４−（４−（４−アミノベンズアミド）−２−ヒドロキシ−３−イソプロポキシベンズアミド）−３−イソプロポキシベンゾエート
【０３２３】
【化６０】
0006730183.tif 000109
【０３２４】
メチル−４−（４−（４−（ｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ベンズアミド）−２−ヒドロキシ−３−イソプロポキシベンズアミド）−３−イソプロポキシベンゾエート（４０．０ｍｇ、０．０６４ｍｍｏｌ）を、混合物１０／１ジクロロメタン／トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）中に溶解し、室温で１７時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残った酸を高真空下で除去すると、標題化合物（３３．４ｍｇ、０．０６４ｍｍｏｌ、定量的）が黄色のオイルとして得られた。
0006730183.tif 000110
【０３２５】
シストバクトアミドＣ
【０３２６】
【化６１】
0006730183.tif 000111
【０３２７】
メチル−４−［４−（４−アミノベンズアミド）−２−ヒドロキシ−３−イソプロポキシベンズアミド］−３−イソプロポキシベンゾエート（３０．０ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ／Ｈ２Ｏの混合物１／１（０．３／０．３ｍＬ）中に溶解した。次いで、固体ＬｉＯＨ（１３．９ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で１７時間撹拌した。水層を、ｐＨ約１まで１Ｍ  ＨＣｌを用いて酸性化し、酢酸エチル（３ｘ）を用いて抽出した。有機抽出物を合わせ、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過した。溶媒を真空濃縮すると、標題化合物（２７．４ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ、９３％）が黄色のオイルとして得られた。
0006730183.tif 000112
【０３２８】
（２Ｓ，３Ｒ）−メチル２，３−ジヒドロキシ−３−フェニルプロパノエート
【０３２９】
【化６２】
0006730183.tif 000113
【０３３０】
ＡＤ混合物β（２０．０ｇ）を、２５℃のｔＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１；１４２ｍＬ）の混合物中に溶解した。後に、ＣＨ３ＳＯ２ＮＨ２（１．３６ｇ、１４．３ｍｍｏｌ、１．０当量）を添加し、反応混合物を０℃に冷却した。次いで、ケイ皮酸メチル（２．３１ｇ、１４．３ｍｍｏｌ、１．０当量）を添加し、得られた混合物を、０℃で１６時間激しく撹拌した。２５℃でさらに６時間撹拌を継続した。Ｎａ２ＳＯ３水溶液（２１．４ｇ、１７０ｍｍｏｌ、１２．０当量）の添加によって反応混合物を加水分解し、さらに２．５時間撹拌を継続した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、層を分離した。水層をＥｔＯＡｃ（３ｘ）を用いて抽出した。合わせた有機層をＨ２Ｏ（１ｘ）を用いて洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル＝１：１）によって精製すると、所望のジオール（２．２１ｇ、１１．３ｍｍｏｌ、７９％）が無色の固体として得られた。分光分析データは、文献に報告されるものと一致する。
0006730183.tif 000114
【０３３１】
（２Ｒ，３Ｓ）−メチル２−アセトキシ−３−ブロモ−３−フェニルプロパノエート（３）
【０３３２】
【化６３】
0006730183.tif 000115
【０３３３】
２５℃で、（２Ｓ，３Ｒ）−メチル２，３−ジヒドロキシ−３−フェニルプロパノエート（２．１５ｇ、１０．９ｍｍｏｌ、１．０当量）に、ＨＢｒ／ＨＯＡｃ（３３％；１６．９ｍＬ）を滴加した。得られた混合物を４５℃に加熱し、３０分間撹拌した。次いで、反応混合物を２５℃に冷却し、氷冷ＮａＨＣＯ３溶液（４０ｍＬ）中に注ぎ入れた。水層をＥｔ２Ｏ（３ｘ）で抽出した。合わせた有機層を、Ｈ２Ｏ（１ｘ）を用い、またブラインを用いて洗浄した。次いで、合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル＝１２．５：１）による精製によって、標題化合物（２．３２ｇ、７．７１ｍｍｏｌ、７１％）が無色の固体として得られた。分光分析データは、文献において報告されたものと一致する。
0006730183.tif 000116
【０３３４】
（２Ｓ，３Ｒ）−メチル２−アセトキシ−３−アジド−３−フェニルプロパノエート
【０３３５】
【化６４】
0006730183.tif 000117
【０３３６】
２５℃で、（２Ｓ，３Ｒ）−メチル２−アセトキシ−３−アジド−３−フェニルプロパノエート（２．２７ｇ、７．５５ｍｍｏｌ、１．０当量）を、ＤＭＦ（２７．０ｍＬ）中に溶解した。次いで、ＮａＮ３（１．９６ｇ、３０．２ｍｍｏｌ、４．０当量）を添加し、得られた混合物を最大４０℃で３時間加熱した。冷却後、反応混合物を２５℃に冷却し、ＥｔＯＡｃを添加した。有機層をＨ２Ｏ（２ｘ）、続いて、ブライン（１ｘ）を用いて洗浄した。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル＝１０：１）によって精製すると、標題化合物（１．７７ｇ、６．７１ｍｍｏｌ、８９％）が黄色のオイルとして得られた。分光分析データは、文献に報告されたものと一致する。
0006730183.tif 000118
【０３３７】
（２Ｓ，３Ｒ）−メチル３−アジド−２−メトキシ−３−フェニルプロパノエート
【０３３８】
【化６５】
0006730183.tif 000119
【０３３９】
（２Ｓ，３Ｒ）−メチル２−アセトキシ−３−アジド−３−フェニルプロパノエート（２．５ｇ、１．０当量）を、０℃の１９０ｍｌのＴＨＦに溶解した。次いで、ＫＯＨ（０．５Ｍ、１０．０当量）の溶液を滴加し、反応混合物を０℃で５時間撹拌した。後に、反応混合物に水性２Ｎ  ＨＣｌを添加し、水相を酢酸エチルで抽出した。有機相を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮すると、粗酸が得られ、これを、さらなる精製を行わずに次の工程に直接使用した。粗材料（０．５ｇ、１．０当量）を、１７ｍｌのヨウ化メチル中に溶解した。次いで、ＣａＳＯ４（２．６ｇ、８．０当量）およびＡｇ２Ｏ（１．７ｇ、３．０当量）を添加し、懸濁液の撹拌を暗所、室温で２２時間実施した。次いで、粗混合物を濾過し、真空濃縮すると、標題化合物（収率７０％）が得られ、これは、さらなる精製を行わずに次の工程に直接使用することができる。
0006730183.tif 000120
【０３４０】
（２Ｓ，３Ｓ）−ｔ−ブチル３−アジド−２−メトキシ−３−フェニルプロパノエート
【０３４１】
【化６６】
0006730183.tif 000121
【０３４２】
１００ｍｌのＴＨＦ中の（２Ｓ，３Ｒ）−メチル３−アジド−２−メトキシ−３−フェニルプロパノエート（１．２ｇ、１．０当量）の撹拌溶液に、ＫＯＨの水溶液（０．５Ｍ、１０．０当量）を滴加した。反応混合物を室温で５時間撹拌し、２Ｎ  ＨＣｌの添加によって加水分解した。水相を酢酸エチルで抽出し、合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮すると、カルボン酸（１．２ｇ、収率９８％）が得られ、これを、さらなる精製を行わずに次の反応に付す。粗酸（０．３ｇ、１．０当量）および３．９ｍｌジメチルホルムアミドジ−ｔ−ブチルアセタール（３．９ｍｌ、１２当量）を、室温の８ｍｌのトルエンに溶解した。得られた反応混合物を最大８０℃に加熱し、７時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル＝３０：１）によって精製すると、標題化合物（０．３４ｇ、収率８９％）が得られた。
0006730183.tif 000122
【０３４３】
（２Ｓ，３Ｓ）−４−ｔ−ブチル１−メチル２−アジド−３−メトキシスクシネート
【０３４４】
【化６７】
0006730183.tif 000123
【０３４５】
３ｍｌのＣＨＣｌ３、１３ｍｌのＣＨ３ＣＮおよび２６ｍｌのＨ２Ｏの溶媒混合物中の、（２Ｓ，３Ｓ）−ｔ−ブチル３−アジド−２−メトキシ−３−フェニルプロパノエート（３１０ｍｇ、１．０当量）の撹拌溶液に、ＮａＩＯ４（７．２ｇ、３０当量）およびＲｕＣｌ３（０．３当量、６９ｍｇ）を室温で少量ずつ添加した。反応混合物を還流条件下で３時間加熱した。室温への冷却の際に白色沈殿が形成された。固体を濾去し、濾液をジエチルエーテルで抽出した。合わせた有機相を減圧下で濃縮すると、粗生成物が得られた。この材料を、９ｍｌのヨウ化メチル中に溶解した。次いで、ＣａＳＯ４（１．２ｇ、８．０当量）およびＡｇ２Ｏ（７７８ｍｇ、３．０当量）を添加し、反応混合物を暗所、室温で２２時間撹拌した。濾過後、濾液を減圧下で濃縮すると、標題化合物が、純粋な形態で得られ、その結果、それは、さらなる精製を行わずに次の工程において直接使用することができる。
0006730183.tif 000124
【０３４６】
（２Ｓ，３Ｒ）−１−ｔ−ブチル４−メチル２−メトキシ−３−［４−（４−ニトロベンズアミド）ベンズアミド］スクシネート
【０３４７】
【化６８】
0006730183.tif 000125
【０３４８】
粗混合物（２Ｓ，３Ｓ）−４−ｔ−ブチル１−メチル２−アジド−３−メトキシスクシネートを、１２ｍｌのＴＨＦ中に溶解し、次いで、０．５ｍｌの水およびＰＰｈ３（８８１ｍｇ、３．０当量）を添加した。得られた反応混合物を最大５０℃に加温し、撹拌を１２時間継続した。次いで、溶媒を減圧下で除去すると、粗生成物が得られ、これは、次の工程に直接使用するのに十分純粋であった。粗生成物を、５ｍｌのＤＭＦに溶解し、（エチルカルボニック）４−（４−ニトロベンズアミド）安息香酸無水物（４８１ｍｇ、１．２当量）を室温で添加した。２０時間撹拌した後、水を添加し、水溶液を酢酸エチルで抽出した。合わせた有機相を減圧下で濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル＝２：１）によって精製すると、標題化合物（８１ｍｇ、４工程にわたって１６％）が得られた。
0006730183.tif 000126
【０３４９】
【化６９】
0006730183.tif 000127
【０３５０】
室温で、２．５ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２中の（２Ｓ，３Ｒ）−１−ｔ−ブチル４−メチル２−メトキシ−３−［４−（４−ニトロベンズアミド）ベンズアミド］スクシネート（７４．３ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、１．５ｍｌのＴＦＡを添加した。５時間撹拌した後、反応混合物に水を添加し、酢酸エチルで抽出した。合わせた有機相を水（３回）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮すると、標題化合物が定量的収量で得られた（６５．９ｍｇ、定量的）。
0006730183.tif 000128
【０３５１】
その他のエナンチオマーの旋光度：
【０３５２】
【化７０】
0006730183.tif 000129
【０３５３】
0006730183.tif 000130
【０３５４】
メチル−４−（４−（４−（（２Ｓ，３Ｓ）−２，４−ジメトキシ−３−（４−（４−ニトロベンズアミド）ベンズアミド）−４−オキソブタンアミド）ベンズアミド）−２−ヒドロキシ−３−イソプロポキシベンズアミド）−３−イソプロポキシベンゾエート
【０３５５】
【化７１】
0006730183.tif 000131
【０３５６】
メチル−４−［４−（４−アミノベンズアミド）−２−ヒドロキシ−３−イソプロポキシベンズアミド］−３−イソプロポキシベンゾエート（１５．３ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ）および（２Ｓ，３Ｒ）−２，４−ジメトキシ−３−［４−（４−ニトロベンズアミド）ベンズアミド］スクシネート（１４．２ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（３．４ｍＬ）中に溶解し、０℃に冷却した。次いで、ＨＯＡｔ（５．９ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（７．７μＬ、０．０４４ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ  ＨＣｌ（６．９ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を０℃から室温まで１７時間撹拌した。溶媒を真空濃縮すると、油性残渣が得られ、これを、フラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル＝９４／６）によって精製すると、標題化合物（２０．１ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ、７３％）が無色のオイルとして得られた。
0006730183.tif 000132
【０３５７】
シストバクトアミドＡ
【０３５８】
【化７２】
0006730183.tif 000133
【０３５９】
メチル−４−４−［４−（（２Ｓ，３Ｓ）−２，４−ジメトキシ−３−（４−（４−ニトロベンズアミド）ベンズアミド）−４−オキソブタンアミド］ベンズアミド］−２−ヒドロキシ−３−イソプロポキシベンズアミド）−３−イソプロポキシベンゾエート（１５．２ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ／Ｈ２Ｏの混合物１／１（０．２／０．２ｍＬ）中に溶解した。次いで、固体ＬｉＯＨ（３．８ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で１７時間撹拌した。水層を、ｐＨ約１まで１Ｍ  ＨＣｌを用いて酸性化し、酢酸エチル（３ｘ）を用いて抽出した。有機抽出物を合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過した。溶媒を真空濃縮すると、標題化合物（１３．３ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ、９０％）が黄色のワックスとして得られた。
0006730183.tif 000134
【０３６０】
シストバクトアミドＣ誘導体の合成
【０３６１】
【化７３】
0006730183.tif 000135
【０３６２】
【化７４】
0006730183.tif 000136
【０３６３】
【化７５】
0006730183.tif 000137
【０３６４】
１．１．種々の使用される個々の環の合成
シストバクトアミドＣ誘導体の合成の際に使用された種々の個々の環の調製を以下に記載する。
【０３６５】
環Ｃの調製
【０３６６】
【化７６】
0006730183.tif 000138
【０３６７】
環Ｂの調製
【０３６８】
【化７７】
0006730183.tif 000139
【０３６９】
環Ａの調製
【０３７０】
【化７８】
0006730183.tif 000140
【０３７１】
１．２．種々の調製されたＢＣ断片を得るための環ＢおよびＣのカップリング
【０３７２】
【化７９】
0006730183.tif 000141
【０３７３】
【化８０】
0006730183.tif 000142
【０３７４】
１．３．環Ａの、ＢＣ断片とのカップリング
１．３．１．シストバクトアミドＣ誘導体（１ａ）〜（２３ａ）を合成するための、環Ａの、ＢＣ断片（ＢＣ１、ＢＣ２、ＢＣ３、ＢＣ５、ＢＣ６、ＢＣ７）とのカップリング
【０３７５】
【化８１】
0006730183.tif 000143
【０３７６】
【表２０】
0006730183.tif 000144
【０３７７】
１．３．２．シストバクトアミドＣ誘導体（２４ａ）〜（３１ａ）を合成するための、環Ａの、ＢＣ１断片とのカップリング
【０３７８】
【化８２】
0006730183.tif 000145
【０３７９】
【表２１】
0006730183.tif 000146
【０３８０】
１．３．３．シストバクトアミドＣ誘導体（３２ａ）〜（３３ａ）を合成するための、環Ａの、ＢＣ４断片とのカップリング
【０３８１】
【化８３】
0006730183.tif 000147
【０３８２】
２．実験
２．１．一般的な実験情報
出発材料および溶媒は、商業的供給業者から購入し、さらなる精製を行わずに使用した。すべての化学収率は、精製された化合物を指し、最適化されない。反応進行は、ＴＬＣシリカゲル６０Ｆ２５４アルミニウムシートを使用してモニタリングし、可視化は、２５４ｎｍのＵＶによって達成した。フラッシュクロマトグラフィーは、シリカゲル６０Å（４０〜６３μｍ）を使用して実施した。分取ＲＰ−ＨＰＬＣは、２７６７サンプルマネージャー、２５４５バイナリー勾配モジュール、２９９８ＰＤＡ検出器および３１００エレクトロンスプレーマススペクトロメーターを含有するＷａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ設定で実施した。精製は、Ｗａｔｅｒｓ  ＸＢｒｉｄｇｅカラム（Ｃ１８、１５０×１９ｍｍ、５μｍ）を使用して実施し、溶出剤としてのバイナリー溶媒系ＡおよびＢ（Ａ＝０．１％ギ酸を有する水、Ｂ＝０．１％ギ酸を有するＭｅＣＮ）、２０ｍＬ／分の流速および８分で６０％〜９５％Ｂの勾配を適用した。融点は、Ｓｔｕａｒｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ融点装置ＳＭＰ３（Ｂｉｂｂｙ  Ｓｔｅｒｉｌｉｎ、ＵＫ）で決定し、補正されない。ＮＭＲスペクトルは、３００Ｋで、Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ−５００（１Ｈ、５００ＭＨｚ；１３Ｃ、１２６ＭＨｚ）またはＢｒｕｋｅｒ  Ｆｏｕｒｉｅｒ  ３００（１Ｈ、３００ＭＨｚ；１３Ｃ、７５ＭＨｚ）スペクトロメーターのいずれかで記録した。ケミカルシフトは、内部標準として重水素化溶媒の加水分解残渣を参照してｐｐｍ単位でのδ値として記録される（ＣＤＣｌ３：δ＝７．２６、７７．０２；ＤＭＳＯ−ｄ６：δ＝２．５０、３９．９９）。分裂パターンは見かけの多重度を説明し、ｓ（一重項）、ｂｒ  ｓ（ブロードな一重項）、ｄ（二重項）、ｄｄ（二重項の二重項）、ｔ（三重項）、ｑ（四重項）、ｍ（多重項）と表される。カップリング定数（Ｊ）は、Ｈｅｒｔｚ（Ｈｚ）で示される。生物学的アッセイにおいて使用されるすべての化合物の純度は、ＬＣ／ＭＳ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ  Ｓｕｒｖｅｙｏｒ  ＭＳＱ  Ｐｌｕｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｄｒｅｉｅｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって測定されるように≧９５％であった。この系は、ＬＣポンプ、オートサンプラー、ＰＤＡ検出器およびシングル四重極ＭＳ検出器ならびに操作のための標準ソフトウェアＸｃａｌｉｂｕｒからなる。固定相としてＲＰ  Ｃ１８  Ｎｕｃｌｅｏｄｕｒ  １００−５（１２５×３ｍｍ）カラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ  ＧｍｂＨ、Ｄｕｈｒｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し、バイナリー溶媒系ＡおよびＢ（Ａ＝０．１％  ＴＦＡを有する水；Ｂ＝０．１％  ＴＦＡを有するＭｅＣＮ）を移動相として使用した。勾配実施では、Ｂのパーセンテージは、０分で０％の初期濃度から１５分で１００％に増大し、１００％で５分間維持した。注射容量は、１０μＬとし、流速は、８００μＬ／分に設定した。ＭＳ（ＥＳＩ）解析は、３８００Ｖのスプレー電圧、３５０℃のキャピラリー温度および１０Ｖの供給源ＣＩＤで実施した。スペクトルは、ＵＶトレースのために、１００から１０００ｍ／ｚのポジティブモードで、および２５４ｎｍで獲得した。
【０３８３】
２．２．トリアリール誘導体のＬＣ／ＭＳデータ
【０３８４】
【表２２】
0006730183.tif 000148
【０３８５】
２．３一般的な合成手順：
ａ）１００ｍｌ  ＤＭＦ中の、酸（２５ｍｍｏｌ）、イソプロピルブロミド（５２ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（５２ｍｍｏｌ）の混合物を、９０℃で一晩加熱した。次いで、過剰のＤＭＦを減圧下除去し、残存する残渣を、水と酢酸エチルとに分配した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、次いで、過剰の溶媒を減圧下で除去すると、純粋な生成物が得られた。
【０３８６】
ｃ）ＥｔＯＨ（６０ｍＬ）中のニトロ誘導体（１０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、５５℃で鉄粉末（２．８０ｇ、５０ｍｍｏｌ）、続いて、水中のＮＨ４Ｃｌ（２６６ｍｇ、５ｍｍｏｌ）溶液（３０ｍＬ）を添加した。反応物を１〜２時間還流し、次いで、熱い間に鉄を濾過し、濾液を真空下で濃縮乾固した。残渣を水（３０ｍＬ）で希釈し、ＮａＨＣＯ３（飽和水溶液）によってｐＨ７〜８に塩基性化した。混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機抽出物をブラインで洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、溶媒を真空蒸留によって除去した。得られた粗材料をｎ−ヘキサンでトリチュレートし、濾過によって集めた。
【０３８７】
ｄ）エステル加水分解は、以下の報告された手順に従って実施した１。エステル（０．１ｍｍｏｌ）、水酸化ナトリウム１Ｍ（３ｍＬ）および無水メタノールを４５℃で一晩加熱した。冷却の際に、反応混合物をｐＨ１に酸性化し（３ｍＬ、塩酸１Ｍ）、ジクロロメタン（３×１５０ｍＬ）を用いて抽出した。有機物を、硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下で除去すると、純粋な生成物が得られた。
【０３８８】
ｍ）アミド形成は、以下の報告された手順に従って行った２。キシレン２．５ｍｌ中の酸（１ｍｍｏｌ）およびアミン（１ｍｍｏｌ）の沸騰溶液を、ＣＨ２Ｃｌ２中のＰＣｌ３（０．４ｍｍｏｌ）の２Ｍ溶液を用いて処理した。２時間後、過剰の溶媒を蒸発させ、カラムクロマトグラフィーを使用して残渣を精製した。
【０３８９】
ｎ）窒素雰囲気下、無水ＣＨＣｌ３（５０ｍＬ）中の酸（２ｍｍｏｌ）、アミン（２．４ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ジクロロトリフェニルホスホラン（３．０ｇ、９ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を８０℃で５時間加熱した。溶媒を真空蒸留によって除去した。次いで、フラッシュクロマトグラフィーを使用して残渣を精製した。
【０３９０】
２．４特定の合成手順：
メチル３−メトキシ−４−ニトロベンゾエート
【０３９１】
【化８４】
0006730183.tif 000149
【０３９２】
ＤＭＦ（１５０ｍＬ）中の、３−ヒドロキシ−４−ニトロ安息香酸（９．１６ｇ、５０ｍｍｏｌ）およびＫ２ＣＯ３（１５．２ｇ、１１０ｍｍｏｌ）の撹拌混合物に、硫酸ジメチル（２５．２ｇ、２００ｍｍｏｌ）を少しずつ添加し、次いで、反応物を９０℃で一晩撹拌した。冷却後、混合物を氷冷水（４００ｍＬ）上に注ぎ、沈殿物を濾過し、冷水、次いで、ｎ−ヘキサンで洗浄した。
収率９５％（淡黄色固体）、ｍ／ｚ（ＥＳＩ＋）２１２［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０３９３】
３−メトキシ−４−ニトロ安息香酸
【０３９４】
【化８５】
0006730183.tif 000150
【０３９５】
ＭｅＯＨ（３０ｍＬ）中のメチル３−メトキシ−４−ニトロベンゾエート（２．１１ｇ、１０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、水（３０ｍＬ）中のＫＯＨ（１．６８ｇ、３０ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を２時間還流し、次いで、ＭｅＯＨを真空蒸留によって蒸発させた。残渣を水（２０ｍＬ）で希釈した。溶液を、氷浴中で冷却し、ＫＨＳＯ４（飽和水溶液）によってｐＨ３〜４に酸性化した。沈殿した固体を濾過によって回収し、冷水、次いで、ｎ−ヘキサンで洗浄した。
収率９６％（灰白色の固体）、ｍ／ｚ（ＥＳＩ＋）１９８［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０３９６】
６−クロロ−２−イソプロポキシ−３−ニトロピリジン
【０３９７】
【化８６】
0006730183.tif 000151
【０３９８】
トルエン（３０ｍＬ）中の２，６−ジクロロ−３−ニトロピリジン（３．８６ｇ、２０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、イソプロパノール（１．４４ｇ、２４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を０℃で１５分間撹拌し、次いで、ＮａＨ（鉱油中、５０〜６０％、１．２２ｇ、２８ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で少しずつ添加し、反応物を室温で一晩撹拌させた。反応物をブラインでクエンチし、次いで、水で希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機抽出物をブラインで洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、溶媒を真空蒸留によって除去した。残渣をトルエンに溶解し、フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ｎ−ヘキサン−ＥｔＯＡｃ＝５：１）を使用して精製した。
収率７０％（黄色を帯びた白色の結晶）、ｍ／ｚ（ＥＳＩ＋）２１７［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０３９９】
２−イソプロポキシ−３−ニトロ−６−ビニルピリジン
【０４００】
【化８７】
0006730183.tif 000152
【０４０１】
トルエン（２０ｍＬ）中の６−クロロ−２−イソプロポキシ−３−ニトロピリジン（６５０ｍｇ、３ｍｍｏｌ）およびトリブチル（ビニル）スズ（１．０ｇ、３．１５ｍｍｏｌ）撹拌溶液に、窒素雰囲気下、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（１８０ｍｇ、５％当量）を添加した。反応物を一晩還流した。ブラインを添加し、反応物をＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機抽出物をブラインで洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、溶媒を真空蒸留によって除去した。粗生成物を、さらなる精製を行わずに次の工程に直接使用した。収率９０％（黄色の液体）、ｍ／ｚ（ＥＳＩ＋）２０８［Ｍ］＋。
【０４０２】
６−イソプロポキシ−５−ニトロピリジン−２−カルボン酸
【０４０３】
【化８８】
0006730183.tif 000153
【０４０４】
アセトン（１０ｍＬ）中の２−イソプロポキシ−３−ニトロ−６−ビニルピリジン（６２５ｍｇ、３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、５０％アセトン水溶液（５０ｍＬ）中のＫＭｎＯ４（１．９ｇ、１２ｍｍｏｌ）溶液を添加した。反応物を室温で２４時間撹拌した。ＮａＯＨ０．５Ｍ（５ｍＬ）を添加し、次いで、混合物を濾過し、濾液を真空濃縮した。残渣を氷浴中で冷却し、ＫＨＳＯ４（飽和水溶液）によってｐＨ４〜５に注意深く酸性化し、次いで、ＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機抽出物をブラインで洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、溶媒を真空蒸留によって除去した。合わせた粗材料をｎ−ヘキサンを用いてトリチュレートし、濾過によって回収した。
収率７５％（ベージュ色の固体）、ｍ／ｚ（ＥＳＩ＋）２２７［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０４０５】
イソプロピル３−イソプロポキシ−４−｛［（６−イソプロポキシ−５−ニトロピリジン−２−イル）カルボニル］アミノ｝ベンゾエート
【０４０６】
【化８９】
0006730183.tif 000154
【０４０７】
無水ＣＨＣｌ３（５ｏｍＬ）およびＤＭＦ（１ｍＬ）の混合物中の、６−イソプロポキシ−５−ニトロピリジン−２−カルボン酸（２２６ｍｇ、１ｍｍｏｌ）およびイソプロピル４−アミノ−３−イソプロポキシベンゾエート（２３７ｍｇ、１ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、窒素雰囲気下、ＨＯＢｔ（６７６ｍｇ、５ｍｍｏｌ）を０℃で、続いて、ＥＤＣ．ＨＣｌ（９５８ｍｇ、５ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を０℃で２時間、次いで、室温で一晩撹拌させた。溶媒を真空蒸留によって除去した。残渣をトルエンに溶解し、フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ｎ−ヘキサン−ＥｔＯＡｃ＝２：１）を使用して精製した。収率７０％（淡黄色固体）、ｍ／ｚ（ＥＳＩ＋）４４６［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０４０８】
２−ホルミル−６−メトキシフェニルアセテート
【０４０９】
【化９０】
0006730183.tif 000155
【０４１０】
ＤＣＭ（４０ｍＬ）中の、３−メトキシサリチルアルデヒド（４．５６ｇ、３０ｍｍｏｌ）およびピリジン（２．４３ｍＬ、３０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、塩化アセチル（２．３６ｇ、３０ｍｍｏｌ）を滴加した。反応物を、室温で一晩撹拌し、次いで、溶媒を真空蒸留によって除去した。残渣を、冷希釈ＨＣｌ中でトリチュレートし、濾過し、冷水、次いで、ｎ−ヘキサンで洗浄した。
収率９４％（灰白色固体）、ｍ／ｚ（ＥＳＩ＋）１９５［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０４１１】
６−ホルミル−２−メトキシ−３−ニトロフェニルアセテート
【０４１２】
【化９１】
0006730183.tif 000156
【０４１３】
ＣＨＣｌ３（１５ｍＬ）中の、２−ホルミル−６−メトキシフェニルアセテート（１．９４ｇ、１０ｍｍｏｌ）およびＫＮＯ３（１．０１ｇ、１０ｍｍｏｌ）の撹拌氷冷懸濁液に、トリフルオロ無水酢酸（１２ｍＬ）を添加した。反応物を、氷浴中で２時間、次いで、室温で一晩撹拌した。反応物を水（５０ｍＬ）で極めて注意深く希釈し、ＣＨＣｌ３で抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、溶媒を真空蒸留によって除去した。残渣をトルエンに溶解し、フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ｎ−ヘキサン−ＥｔＯＡｃ＝３：１）を使用して精製した。収率４５％（黄色半固体）、ｍ／ｚ（ＥＳＩ＋）２３９［Ｍ］＋。
【０４１４】
２−ヒドロキシ−３−メトキシ−４−ニトロベンズアルデヒド
【０４１５】
【化９２】
0006730183.tif 000157
【０４１６】
水（３０ｍＬ）中の６−ホルミル−２−メトキシ−３−ニトロフェニルアセテート（９５７ｍｇ、４ｍｍｏｌ）の撹拌懸濁液に、ＮａＯＨ（０．８ｇ、２０ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を２時間還流し、次いで、室温で一晩撹拌させた。溶液を氷浴中で冷却し、ＨＣｌ  ２ＭによってｐＨ３〜４に酸性化した。沈殿した固体を濾過によって回収し、冷水、次いで、ｎ−ヘキサンで洗浄した。
収率９０％（黄色を帯びた褐色の固体）、ｍ／ｚ（ＥＳＩ＋）１９７［Ｍ］＋。
【０４１７】
２−ヒドロキシ−３−メトキシ−４−ニトロ安息香酸
【０４１８】
【化９３】
0006730183.tif 000158
【０４１９】
水（５０ｍＬ）中の、２−ヒドロキシ−３−メトキシ−４−ニトロベンズアルデヒド（７８８ｍｇ、４ｍｍｏｌ）およびＮａＯＨ（０．８ｇ、２０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＡｇＮＯ３（３．４ｇ、２０ｍｍｏｌ）を少しずつ添加した。反応物を一晩還流し、次いで、放冷し、セライトを通して濾過した。濾液を氷浴中で冷却し、ＨＣｌ３７％を用いてｐＨ３〜４に酸性化した。沈殿した固体を濾過によって回収し、冷水、次いで、ｎ−ヘキサンを用いて洗浄した。収率６５％（ベージュ色の固体）、ｍ／ｚ（ＥＳＩ＋）２１３［Ｍ］＋。
【０４２０】
イソプロピル３−イソプロポキシ−４−［（｛６−イソプロポキシ−５−［（４−ニトロベンゾイル）アミノ］ピリジン−２−イル｝カルボニル）アミノ］ベンゾエート
【０４２１】
【化９４】
0006730183.tif 000159
【０４２２】
ＤＣＭ（２０ｍＬ）中の、イソプロピル４−｛［（５−アミノ−６−イソプロポキシピリジン−２−イル）カルボニル］アミノ｝−３−イソプロポキシベンゾエート（２０７ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）およびピリジン（０．１ｍＬ）の撹拌溶液に、４−ニトロベンゾイルクロリド（１８５ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で一晩撹拌し、次いで、ＨＣｌ  ２Ｍ（２０ｍＬ）を添加した。混合物をＤＣＭ、次いで、ＥｔＯＡｃを用いて抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、溶媒を真空蒸留によって除去した。残渣をトルエンに溶解し、フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ｎ−ヘキサン−ＥｔＯＡｃ＝１：１）を使用して精製した。収率８０％（黄色の結晶）、ｍ／ｚ（ＥＳＩ＋）５６５［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０４２３】
５．参考文献：
0006730183.tif 000160
【０４２４】
６．これらの化合物の活性
これらの化合物のうちいくつかを、上記の手順に従って、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（ＴｏｌＣ欠損）に対するその活性について試験した。ほとんどの試験化合物は、１〜３２０μＭの活性（ＭＩＣ）を示した。
【図１】
0006730183.tif 000175
【図２】
0006730183.tif 000176
【図３】
0006730183.tif 000177
【図４】
0006730183.tif 000178
【図５】
0006730183.tif 000179
【図６】
0006730183.tif 000180
【図７】
0006730183.tif 000181
【図８】
0006730183.tif 000182
【図９ａ】
0006730183.tif 000183
【図９ｂ】
0006730183.tif 000184
【図９ｃ】
0006730183.tif 000185
【図９ｄ】
0006730183.tif 000186
【図１０】
0006730183.tif 000187
【図１１】
0006730183.tif 000188
【図１２】
0006730183.tif 000189
【配列表】
0006730183000001.app