(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式１で表される化合物、又はその薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物であって；
【化１】
0006645695.tif 000070
Ｒ1、Ｒ2及びＸは、各々独立して、Ｈを表し、
Ｒ3は、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよいナフチル、置換されていてもよいエチル、置換されていてもよいインドールから選択され、
ｍは、０であり、
前記Ａ環は、下記式２ないし式４から選択される一つの環で表され；
【化２】
0006645695.tif 000071
【化３】
0006645695.tif 000072
【化４】
0006645695.tif 000073
Ｙ、Ｙ'、Ｙ''及び Ｙ'''は、各々独立して、同一又は相違していてもよく、各々独立して、Ｈ、ハロゲン、又は置換されていてもよいアルキルを表し、
ｐは、０又は１、
ｑは、０、
ｒは、０、
ｓは、０又は１を表す。
【請求項２】
前記化合物が、下記式６ないし式２２で表されることを特徴とする、請求項１に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物。
【化５】
0006645695.tif 000074
【化６】
0006645695.tif 000075
【化７】
0006645695.tif 000076
【化８】
0006645695.tif 000077
【化９】
0006645695.tif 000078
【化１０】
0006645695.tif 000079
【化１１】
0006645695.tif 000080
【化１２】
0006645695.tif 000081
【化１３】
0006645695.tif 000082
【化１４】
0006645695.tif 000083
【化１５】
0006645695.tif 000084
【化１６】
0006645695.tif 000085
【化１７】
0006645695.tif 000086
【化１８】
0006645695.tif 000087
【化１９】
0006645695.tif 000088
【化２０】
0006645695.tif 000089
【化２１】
0006645695.tif 000090
【請求項３】
下記反応式１で表されるイミダゾピリジンアミン化合物を製造する方法であって、
(i) 置換アミン誘導体(1)を原料として、シアナミド化合物(2)との反応によりグアニジン化(3)し、
(ii)次に、共役ジアルデヒド化合物(4)と反応させてイミダゾール化合物(5)を形成し、
(iii)次いで、アンモニア塩(6)及びアルデヒド化合物(7)とイミンを形成し、続くアザ電子環化反応を進行させることでイミダゾピリジン環を形成することによりイミダゾピリジンアミン化合物(8)を製造することを特徴とする、製造方法。
【化２２】
0006645695.tif 000091
ただし、R1、R2、R3及び環Ａは、請求項１に記載の定義に従う。
【請求項４】
前記製造方法が、ワンポット法であることを特徴とする、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とする、医薬。
【請求項６】
請求項１又は２に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とする、神経変性疾患の予防又は治療のための医薬組成物。
【請求項７】
前記神経変性疾患は、アルツハイマー病、軽度認知障害、パーキンソン病、レビー小体型認知症、多発性硬化症から選択されることを特徴とする、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
請求項１又は２に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とする、多能性幹細胞から神経細胞への分化を促進するための神経細胞分化促進剤。
【請求項９】
請求項１又は２に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物をin vitroで培養細胞に添加するステップを含むことを特徴とする、神経細胞への分化を調節する化合物をスクリーニングするための方法。
【請求項１０】
前記培養細胞が、多能性幹細胞であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経細胞分化促進作用を有するイミダゾピリジンアミン化合物、その製造方法及び用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
５員環上の一位と三位に窒素原子を含む含窒素芳香複素環式化合物の一つであるイミダゾールは有機合成において幅広く応用されており、イミダゾール構造を含む様々な化合物が医薬品としても利用されている。例として、抗潰瘍剤（例：シメチジン）、抗高血圧剤 （例：ロサルタン）、抗喘息剤（例：オザグレル）などが知られているが、それ以外にも様々な生理活性があることが予想され、イミダゾール構造を持つ化合物の医薬品への応用が期待される。
【０００３】
また、幹細胞研究の進歩により脳内の中枢神経系の発生や分化を、多能性幹細胞を用いて再現する系（in vitro）が開発され、そのin vitro神経分化モデルなどを用いてアルツハイマー病やパーキンソン病などに代表される神経変性疾患の予防及び治癒に向けた新たな医薬組成物や多能性幹細胞から神経細胞への分化促進剤の開発が求められている。
【０００４】
一方、海洋生物由来のAgeladine A及びその誘導体が、単離又は合成され、強い血管新生抑制作用を有することが報告されている（特許文献１、非特許文献１）。Ageladine Aはジプロモピロール環を有するイミダゾピリジンアミン誘導体である。しかし、Ageladine Aの全合成及びその誘導体を合成する方法は、限定されており、その誘導体については、極めて限定された化合物しか合成されていない。また、これらの化合物の生理活性も知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許公開公報２０１１／０１５２３１３  Ａ１
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Shengule S Rら、J.Med.Chem. 2011, 54, 2492-2501
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
優れた神経細胞分化促進作用を有し、安全性の高い従来にないイミダゾピリジンアミン化合物又はその薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物、その製造方法、その神経変性疾患の予防又は治療のための医薬組成物、多能性幹細胞からの神経細胞への分化促進剤、及び神経細胞への分化を調節する化合物をスクリーニングするための方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、イミダゾピリジンアミン化合物の新たな合成方法を開発した。そこで、本発明者らは、従来にないイミダゾピリジンアミン化合物を合成し、その神経細胞誘導活性及び細胞毒性を評価し、優れた神経細胞分化促進作用と高い安全性を認め、これらの知見を基に本発明を完成させた。
【０００９】
具体的には、本発明は、下記式１で表される化合物、又はその薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物を提供する。
【化１】
0006645695.tif 000002
前記式１において、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＸは、同一又は相違してもよく、各々独立して、Ｈ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、置換されていてもよいアミノ、置換されていてもよいアシル、置換されていてもよいアルコキシ、置換されていてもよいカルバモイル、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいシクロアルケニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいアリールアルキル、置換されていてもよいアラルキル、置換されていてもよいヘテロシクロアルキル、置換されていてもよいヘテロアリール、又は、置換されていてもよいヘテロアリールアルキルを表し、
Ｒ１及びＲ２又はＲ１及びＲ３は、Ｎ原子と一緒になって、非置換又は置換されている５〜８員の複素環を形成してもよく、
ｍは、０、１又は２であり、
Ａ環は、置換されていてもよい炭素環又はヘテロ環を表す。
【００１０】
本発明の前記式１で表される化合物において、
Ｒ３は、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよいナフチル又は置換されていてもよいエチルから選択され、
前記Ａ環は、下記式２ないし式４から選択される一つの環であってもよい。
【化２】
0006645695.tif 000003
【化３】
0006645695.tif 000004
【化４】
0006645695.tif 000005
ここで、Ｙ、Ｙ’、Ｙ’’及びＹ’’’は、同一又は相違していてもよく、それぞれ独立して、ハロゲン、シアノ、ニトロ、置換されていてもよいアミノ、置換されていてもよいアシル、置換されていてもよいアルコキシ、置換されていてもよいカルバモイル、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいシクロアルケニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいアリールアルキル、置換されていてもよいアラルキル、置換されていてもよいヘテロシクロアルキル、置換されていてもよいヘテロアリール、又は、置換されていてもよいヘテロアリールアルキルを表し、
ｐは、０又は１〜４の整数、
ｑは、０、１又は２、
ｒは、０又は１〜４の整数、
ｓは、０又は１〜３の整数、
を表す場合がある。
【００１１】
本発明の前記化合物は、下記式５ないし式２２で表される化合物又はその薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物の場合がある。
【化５】
0006645695.tif 000006
【化６】
0006645695.tif 000007
【化７】
0006645695.tif 000008
【化８】
0006645695.tif 000009
【化９】
0006645695.tif 000010
【化１０】
0006645695.tif 000011
【化１１】
0006645695.tif 000012
【化１２】
0006645695.tif 000013
【化１３】
0006645695.tif 000014
【化１４】
0006645695.tif 000015
【化１５】
0006645695.tif 000016
【化１６】
0006645695.tif 000017
【化１７】
0006645695.tif 000018
【化１８】
0006645695.tif 000019
【化１９】
0006645695.tif 000020
【化２０】
0006645695.tif 000021
【化２１】
0006645695.tif 000022
【化２２】
0006645695.tif 000023
【００１２】
また、本発明は、下記反応式１で表されるイミダゾピリジンアミン化合物を製造する方法であって、
(i)置換アミン誘導体(1)を原料として、シアナミド化合物(2)との反応によりグアニジン化(3)し、
(ii)次に、共役ジアルデヒド化合物(4)と反応させてイミダゾール化合物(5)を形成し、
(iii)次いで、アンモニア塩(6)及びアルデヒド化合物(7)とイミンを形成し、続くアザ電子環化反応を進行させることでイミダゾピリジン環を形成することによりイミダゾピリジンアミン化合物(8)を製造する製造方法を提供する。
【化２３】
0006645695.tif 000024
【００１３】
前記製造方法において、前記製造方法が、ワンポット法である場合がある。
【００１４】
また、本発明は前記式１若しくは式５ないし式２２に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物を有効成分として含有する医薬を提供する。
【００１５】
また、本発明は前記式１若しくは式５ないし式２２に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物を有効成分として含有する神経変性疾患の予防又は治療のための医薬組成物を提供する。
【００１６】
本発明の医薬組成物において、前記神経変性疾患は、アルツハイマー病、軽度認知障害、パーキンソン病、レビー小体型認知症、多発性硬化症から選択される場合がある。
【００１７】
また、本発明は、前記式１若しくは式５ないし式２２の化合物又はその薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物を有効成分として含有する、多能性幹細胞から神経細胞への分化を促進するための神経細胞分化促進剤を提供する。
【００１８】
さらに、本発明は、前記式１若しくは式５ないし２２に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物をin vitroで培養細胞に添加するステップを含む、神経細胞への分化を調節する化合物をスクリーニングするための方法を提供する。
【００１９】
本発明のスクリーニングための方法において、前記培養細胞が、多能性幹細胞である場合がある。
【発明の効果】
【００２０】
本発明は、イミダゾピリジンアミン化合物をワンポット合成可能な製造方法、該製造方法で合成された化合物、神経細胞分化促進作用該化合物の医薬への用途、該化合物を含有する医薬組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】化合物１〜３及び陽性対照化合物であるハルミンの濃度依存的な神経細胞分化促進効果を評価した結果を表す図。
【図２】化合物１〜３及びハルミンのアストロサイトの分化促進効果を評価した結果を表す図。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
１．化合物、又はその薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物
本発明の実施態様の一つとして、下記式１で表される化合物、又はその薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物を提供する。
【化２４】
0006645695.tif 000025
前記式１において、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＸは、同一であってもよく又は置換されていてもよく、各々独立して、Ｈ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、置換されていてもよいアミノ、置換されていてもよいアシル、置換されていてもよいアルコキシ、置換されていてもよいカルバモイル、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいシクロアルケニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいアリールアルキル、置換されていてもよいアラルキル、置換されていてもよいヘテロシクロアルキル、置換されていてもよいヘテロアリール、又は、置換されていてもよいヘテロアリールアルキルを表し、
Ｒ１及びＲ２又はＲ１及びＲ３は、Ｎ原子と一緒になって、非置換又は置換されている５〜８員の複素環を形成してもよく、
ｍは、０、１又は２であり、
Ａ環は、置換されていてもよい炭素環又はヘテロ環を表す。
【００２３】
本明細書において、ハロゲンとしては、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩのいずれかの原子が挙げられる。
【００２４】
本明細書において、「アミノ」とは、一級アミノ基、二級アミノ基、三級アミノ基及び四級アミノ基が含まれる。
【００２５】
本明細書において、「アシル」の例としては、特に断りのない限り、例えば、ホルミル；カルボキシル；カルバモイル；アルキル−カルボニル；アルコキシ−カルボニル；シクロアルキル−カルボニル；アリール−カルボニル；アラルキル−カルボニル；アリールオキシ−カルボニル；アラルキルオキシ−カルボニル；モノ−又はジ−アルキル−カルバモイル；モノ−又はジ−アリール−カルバモイル；モノ−又はジ−シクロアルキル−カルバモイル；モノ−又はジ−アラルキル−カルバモイル等が挙げられる。
【００２６】
本明細書において、「アルコキシ」としては、特に断りのない限り、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシなどが挙げられる。
【００２７】
本明細書において、「カルバモイル」としては、特に断りのない限り、例えば、「モノ−又はジ−アルキル−カルバモイル」、「モノ−又はジ−アリール−カルバモイル」、「モノ−又はジ−シクロアルキル−カルバモイル」、「モノ−又はジ−アラルキル−カルバモイル」、「モノ−又はジ−５複素環−カルバモイル」などが挙げられる。
【００２８】
本明細書において、「アルキル」としては、特に断りのない限り、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシルなどが挙げられる。
【００２９】
本明細書において、「アルケニル」としては、特に断りのない限り、例えば、ビニル、プロペニル、イソプロペニル、２−ブテン−１−イル、４−ペンテン−１−イル、５−へキセン−１−イルなどが挙げられる。
【００３０】
本明細書において、「アルキニル」としては、特に断りのない限り、例えば、２−ブチン−１−イル、４−ペンチン−１−イル、５−へキシン−１−イルなどが挙げられる。
【００３１】
本明細書において、「シクロアルキル」としては、特に断りのない限り、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが挙げられる。
【００３２】
本明細書において、「シクロアルケニル」としては、特に断りのない限り、例えば、Ｃ3-8シクロアルケニル基（例えば2-シクロプロペニル、2-シクロブテニル、2-シクロペンテニル、3-シクロペンテニル、2-シクロヘキセニル、3-シクロヘキセニル、2-シクロヘプテニル、3-シクロヘプテニル、4-シクロヘプテニル、2-シクロオクテニル、3-シクロオクテニル、4-シクロオクテニルが挙げられる。これらはさらにフェニル基などのアリール基が縮合していてもよく、例えばインデニル、ベンゾシクロヘキセニル、ベンゾシクロヘプテニル、ベンゾシクロオクテニルなどが挙げられる。なかでも好ましくは2-シクロヘキセニル、2-シクロヘプテニル、シクロオクチル、インデニルなどが挙げられる。
【００３３】
本明細書において、「アリール」としては、特に断りのない限り、例えば、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、２−ビフェニリル、３−ビフェニリル、４−ビフェニリル、２−アンスリルなどが挙げられる。当該Ｃ６−１４アリールは、部分的に飽和されていてもよく、部分的に飽和されたＣ６−１４アリールとしては、例えば、テトラヒドロナフチルなどが挙げられる。
【００３４】
本明細書において、「アリールアルキル」は、前記「アルキル」に前記「アリール」が置換した基を意味し、具体的には例えばベンジル、１−フェネチル、２−フェネチル、ナフチルメチル、１−ナフチルエチル、２−ナフチルエチルが挙げられる。
【００３５】
本明細書において、「アラルキル」としては、特に断りのない限り、例えば、ベンジル、フェネチル、ジフェニルメチル、１−ナフチルメチル、２−ナフチルメチル、２，２−ジフェニルエチル、３−フェニルプロピル、４−フェニルブチル、５−フェニルペンチル、２−ビフェニリルメチル、３−ビフェニリルメチル、４−ビフェニリルメチルなどが挙げられる。
【００３６】
本明細書において、「ヘテロシクロアルキル」とは、酸素原子、窒素原子あるいは硫黄原子からなるヘテロ原子を１個ないし４個含有する３ないし７員環からなる単環式もしくはそれらの同一又は異なる単環が縮環した多環式の複素環基であり、具体例としては、ピペリジニル、ピロリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロフリル、テトラヒドロピラニル、モルホニル、アチジニル、イミダゾリジニル、オキサゾリジニル、ヘキサヒドロピロリチニル、オクタヒドロインドチニル、オクタヒドロキノリチニル、オクタヒドロインドリル、又はこれら置換基のオキソ酸化体などを挙げられる。
【００３７】
本明細書において、「ヘテロシクロアリール」とは、特に断りのない限り、例えば、炭素数が２ないし１２個であり、酸素原子、窒素原子あるいは硫黄原子からなるヘテロ原子を１個ないし４個含有する５ないし７員環からなる単環もしくはそれらの同一又は異なる２以上の単環が融合した多環式のヘテロアリール基、例えばピロール、フリル、チエニル、イミダゾリル、チアゾリル、ピラジル、インドリル、キノリル、イソキノリル、テトラゾリル、ピリジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル基などを挙げることができる。
【００３８】
本明細書において、「ヘテロアリールアルキル」としては、特に断りのない限り、例えば、ピリジルメチル基、ピリジルエチル基、チエニルメチル基、チエニルエチル基などが挙げられる。
【００３９】
本明細書において、「炭素環」とは、炭素を構成原子とする環状置換基をいい、特に断りのない限り、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロペンタジエニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニル、シクロヘプタニル、シクロオクタニルなどが挙げられる。
【００４０】
本明細書において、「ヘテロ環」（「複素環」）としては、特に断りのない限り、例えば、環構成原子として、炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子及び酸素原子から選ばれる１又は２種、１ないし４個のヘテロ原子を含む５ないし１４員（単環、２環又は３環式）複素環、好ましくは（i）５ないし１４員（好ましくは５ないし１０員）芳香族複素環、（ii）５ないし１０員非芳香族複素環などが挙げられる。なかでも５又は６員芳香族複素環が好ましい。具体的には、例えば、チエニル（例：２−チエニル、３−チエニル）、フリル（例：２−フリル、３−フリル）、ピリジル（例：２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル）、チアゾリル（例：２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル）、オキサゾリル（例：２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、５−オキサゾリル）、ピラジニル、ピリミジニル（例：２−ピリミジニル、４−ピリミジニル）、ピロリル（例：１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル）、イミダゾリル（例：１−イミダゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル）、ピラゾリル（例：１−ピラゾリル、３−ピラゾリル、４−ピラゾリル）、トリアゾリル（例：１−トリアゾリル、２−トリアゾリル）、テトラゾリル、ピリダジニル（例：３−ピリダジニル、４−ピリダジニル）、イソチアゾリル（例：３−イソチアゾリル、４−イソチアゾリル、５−イソチアゾリル）、イソキサゾリル（例：３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル）、インドリル（例：１−インドリル、２−インドリル、３−インドリル）、２−ベンゾチアゾリル、２−ベンズオキサゾリル、ベンズイミダゾリル（例：１−ベンズイミダゾリル、２−ベンズイミダゾリル）、ベンゾ［ｂ］チエニル（例：２−ベンゾ［ｂ］チエニル、３−ベンゾ［ｂ］チエニル）、ベンゾ［ｂ］フラニル（例：２−ベンゾ［ｂ］フラニル、３−ベンゾ［ｂ］フラニル）、キノリル（例：２−キノリル、３−キノリル、４−キノリル、５−キノリル、８−キノリル）、イソキノリル（例：１−イソキノリル、３−イソキノリル、４−イソキノリル、５−イソキノリル）などの芳香族複素環；例えば、ピロリジニル（例：１−ピロリジニル、２−ピロリジニル、３−ピロリジニル）、オキサゾリジニル（例：２−オキサゾリジニル）、イミダゾリニル（例：１−イミダゾリニル、２−イミダゾリニル、４−イミダゾリニル）、ピペリジニル（例：ピペリジノ、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−ピペリジニル）、ピペラジニル（例：１−ピペラジニル、２−ピペラジニル）、モルホリニル（例：２−モルホリニル、３−モルホリニル、モルホリノ）、チオモルホリニル（例：２−チオモルホリニル、３−チオモルホリニル、チオモルホリノ）、テトラヒドロピラニルなどの非芳香族複素環などが挙げられる。
【００４１】
本明細書においいて、「置換されていてもよい」とは、(i)非置換、又は、(ii)前記の「ハロゲン」、「シアノ」、「ニトロ」、「アミノ」、「アシル」、「アルコキシ」、「カルバモイル」、「アルキル」、「アルケニル」、「アルキニル」、「シクロアルキル」、「シクロアルケニル」、「アリール」、「アリールアルキル」、「アラルキル」、「ヘテロシクロアルキル」、「ヘテロアリール」、又は、「ヘテロアリールアルキル」などから選択される１又は２以上の同一又は相違する置換基がそれぞれ単独で、若しくは、２以上の置換基が組み合わせられて複合した状態で置換された構成を有する場合をいう。
【００４２】
前記式１で表される化合物は、下記の反応経路により合成することができる。
【化２５】
0006645695.tif 000026
【００４３】
置換アミン誘導体(1)を原料として、(i)シアナミド(2)との反応によるグアニジン化(3)、さらに(ii)共役ジアルデヒド(4)と反応させてイミンを形成させた後、(iii)分子内共役付加反応によりイミダゾール環を構築する。次いで、 (iv)アンモニウム塩を作用させることにより、もうー方のアルデヒドとの間でイミン・エナミン間の平衡を経て、さらに(v)新たに導入したアルデヒドとのイミン形成、続く(vi)アザ電子環化反応を進行させることでジヒドロピリジン環を形成させる。さらに(vii)自然酸化によりピリジン環へと変換した後、最後に(viii)アニリン由来のアリール基の除去を行う。
【００４４】
また、前記製造方法は、適当な時間間隔でフラスコ内に試薬を導入することにより、本件発明の化合物に至る全ての行程をワンポット法で合成できる。
【化２６】
0006645695.tif 000027
【００４５】
前記式１で表される化合物の好ましい例は、下記化合物１〜２２であるが、これらに限定されない。
【００４６】
化合物１：4-(pyridin-2-yl)-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-2-amineは下記式５で表される。
【化２７】
0006645695.tif 000028
【００４７】
化合物２：1-phenyl-4-(pyridin-2-yl)-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-2-amineは、下記式６で表される。
【化２８】
0006645695.tif 000029
【００４８】
化合物３：methyl (2S)-2-(acetylamino)5-[2-amino-4-(pyridin-2-yl)-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-1-yl]pentanoateは、下記式７で表される。
【化２９】
0006645695.tif 000030
【００４９】
化合物４：1-(4-fluorophenyl)-4-(pyridin-2-yl)-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-2-amineは、下記式８で表される。
【化３０】
0006645695.tif 000031
【００５０】
化合物５：1-(4-methyoxyphenyl)-4-(pyridin-2-yl)-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-2-amineは、下記式９で表される。
【化３１】
0006645695.tif 000032
【００５１】
化合物６：1-(3,4-dimethyoxyphenyl)-4-(pyridin-2-yl)-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-2-amineは、下記式１０で表される。
【化３２】
0006645695.tif 000033
【００５２】
化合物７：1-(2,4-dimethyoxyphenyl)-4-(pyridin-2-yl)-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-2-amineは、下記式１１で表される。
【化３３】
0006645695.tif 000034
【００５３】
化合物８：4-(pyridin-2-yl)-1-(3,4,5-trimthoxyphenyl)-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-2-amineは、下記式１２で表される。
【化３４】
0006645695.tif 000035
【００５４】
化合物９：4-[2-amino-4-(pyridin-2-yl)-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-1-yl]phenolは、下記式１３で表される。
【化３５】
0006645695.tif 000036
【００５５】
化合物１０：1-(4-tert-butylphenyl)-4-(pyridin-2-yl)-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-  2-amineは、下記式１４で表される。
【化３６】
0006645695.tif 000037
【００５６】
化合物１１：4-(pyridin-2-yl)-1-[4-(trifluoromethyl)phenyl]-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-2-amineは、下記式１５で表される。
【化３７】
0006645695.tif 000038
【００５７】
化合物１２：1-(2,4-dinitrophenyl)-4-(pyridin-2-yl)-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-2-amineは、下記式１６で表される。
【化３８】
0006645695.tif 000039
【００５８】
化合物１３：1-(naphthalen-1-yl)-4-(pyridin-2-yl)-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-2-amineは、下記式１７で表される。
【化３９】
0006645695.tif 000040
【００５９】
化合物１４：1-(3H-indol-6-yl)-4-(pyridin-2-yl)-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-2-amineは、下記式１８で表される。
【化４０】
0006645695.tif 000041
【００６０】
化合物１５：4-(isoquinolin-1-yl)-1-phenyl-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-2-amineは、下記式１９で表される。
【化４１】
0006645695.tif 000042
【００６１】
化合物１６：1-(3,4-dimethyoxyphenyl)-4-[6-(trifluoromethyl)pyridin-2-yl)-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-2-amineは、下記式２０で表される。
【化４２】
0006645695.tif 000043
【００６２】
化合物１７：4-(4,5-dibromo-2H-pyrrol-2-yl)-1-(3,4-dimethoxyphenyl)-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-2-amineは、下記式２１で表される。
【化４３】
0006645695.tif 000044
【００６３】
化合物１８：4-[2-amino-4-(4,5-dibromo-2H-pyrrol-2-yl)-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-1-yl]phenolは、下記式２２で表される。
【化４４】
0006645695.tif 000045
【００６４】
薬学的に許容可能な塩としては、例えば、金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性又は酸性アミノ酸との塩などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
金属塩の好適な例としては、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩などのアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩などが挙げられる。
【００６６】
有機塩基との塩の好適な例としては、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミンなどとの塩が挙げられる。
【００６７】
無機酸との塩の好適な例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。
【００６８】
有機酸との塩の好適な例としては、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。
【００６９】
塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、アルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
【００７０】
また、薬学的に許容可能な溶媒和物としては、前記式１で表される化合物又は前記化合物１〜１８と溶媒和物を形成するものであれば、特に限定されないが、水和物又はエタノール和物が好ましい。
【００７１】
２．医薬及び神経変性疾患の予防又は治療用の医薬組成物
また、本発明の別の実施形態として、前記式１で表される化合物又は化合物１〜１８の中、ある一種類の化合物を単独で投与、又は二種類以上の複数の化合物、もしくは、他の神経細胞分化促進剤（例：All-trans retinoic acid）などと併用して同時又は時間差で投与することにより、神経変性疾患の予防又は治療用医薬組成物として使用することができる。
【００７２】
本発明において、神経細胞分化促進作用とは、マウス胚性幹(ES)細胞由来神経幹細胞等の神経幹細胞から神経細胞への分化誘導過程においてその神経細胞への分化効率を促進させる作用のことをいう。
【００７３】
本発明における神経分化促進作用はin vitroにおける作用のことであるが、in vitroでその作用が認められた場合、in vivoや実際の生体内においても神経細胞分化促進作用があると予想できる。
【００７４】
本発明の化合物、又はその薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物を有効成分として含有する医薬製剤として、経口用製剤又は非経口用製剤を調製し、使用することができる。
【００７５】
前記式１で表される化合物又は前記化合物１〜１８、好ましくは、化合物１〜１８又はその薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物の少なくとも一つを、例えば、生理食塩水等の溶媒で所定の濃度及び用量に希釈して、薬学的に許容可能な添加剤を加え、医薬製剤として、患者に投与することができる。
【００７６】
前記医薬製剤は、前記神経細胞分化促進活性を有する化合物、又はその塩若しくは溶媒和物を有効成分として含有する医薬組成物であり、好ましくは、神経変性疾患の予防又は治療のための医薬組成物であるが、これに限定されない。
【００７７】
本明細書において、「神経変性疾患」とは、中枢神経系の神経細胞が徐々に変性して細胞死に陥る進行性疾患をいい、具体的には、これらに限定されない、アルツハイマー病、認知症、軽度認知障害、老年性認知症、パーキンソン病、レビー小体型痴呆症、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト-ヤコブ病、ファール病、ハンチントン病及び関連のポリグルタミン伸長疾患、メンケス病、多発性硬化症ならびにウィルソン病が含まれる。
【００７８】
前記製剤の調製に使用される薬学的に許容可能な医薬品添加剤は、当業者に公知の、安定化剤、抗酸化剤、pH調整剤、緩衝剤、懸濁剤、乳化剤、界面活性剤等の添加物を添加して、調製することができる。これらの医薬品添加剤の種類及びその用法・用量は、医薬品添加物事典2007（日本医薬品添加剤協会編、薬事日報社、2007年7月）などに記載され、これらの記載に従って調製し、使用することができる。
【００７９】
より具体的には、安定化剤として酒石酸、クエン酸、コハク酸、フマル酸等の有機酸が、抗酸化剤として例えばアスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン又は没食子酸プロピル等が、pH調整剤として希塩酸又は水酸化ナトリウム水溶液等が、緩衝剤としてクエン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸若しくはアスコルビン酸又はその塩類、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、アスパラギン酸、アラニン若しくはアルギニン又はその塩類、酸化マグネシウム、酸化亜鉛、水酸化マグネシウム、リン酸若しくはホウ酸又はその塩類が、懸濁剤又は乳化剤としてレシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート又はポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレン共重合物等が、界面活性剤として例えばポリソルベート80、ラウリル硫酸ナトリウム又はポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等が、使用できるが、これらに限定されない。
【００８０】
前記医薬組成物の処方例として、以下が挙げられるが、これらに限定されない。
製剤例１（カプセルの製造）
１）前記化合物３                                         1 mg
２）微粉末セルロース                                    10 mg
３）乳糖                                                18 mg
４）ステアリン酸マグネシウム                             1 mg
計   30 mg
前記１）、２）、３）及び４）を混合して、ゼラチンカプセルに充填する。
【００８１】
製剤例２（錠剤の製造）
１）前記化合物３                                         1 g
２）乳糖                                                50 g
３）トウモロコシデンプン                                14 g
４）カルボキシメチルセルロースカルシウム                44 g
５）ステアリン酸マグネシウム                             1 g
1000錠    計 110 g
前記１）、２）及び３）の全量と30gの４）とを水で練合し、真空乾燥後、整粒を行う。この整粒末に14gの４）及び1gの５）を混合し、打錠機により打錠する。このようにして、1錠あたり実施例１の化合物1mgを含有する錠剤1000錠を得る。
【００８２】
投与量は、通常約0.01〜30mg/kg/dayで投与することができるが、投与対象の疾患や症状により適宜変化させ、投与対象の年齢、性別、投与方法(例. 経口、非経口)などによっても適宜調節する。
【００８３】
また、本医薬組成物の使用態様として、前記式１で表される化合物又は化合物１〜１８、好ましくは、化合物１〜１８又はそれらの薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物の有効量を、神経変性疾患を有する患者に投与するステップを含む、神経変性疾患の予防又は治療方法として提供される場合がある。
【００８４】
３．神経細胞分化促進剤
さらに、本発明の他の実施態様の一つとして、多能性幹細胞から神経細胞分化促進剤を提供する。
【００８５】
前記神経細胞分化促進剤は、前記式１で表される化合物又は化合物１〜１８、好ましくは化合物１〜１８の１又は２以上の化合物、又はそれらの塩若しくは溶媒和物に添加剤を加えることにより調整することができる。
【００８６】
前記神経細胞分化促進剤は、例えば、前記式１で表される化合物又は化合物１〜１８に、その活性に影響を与えないことを条件に、当業者に公知の、安定化剤、抗酸化剤、pH調整剤、緩衝剤、懸濁剤、乳化剤、界面活性剤等の添加物を添加して、調製することができる。これらの医薬品添加剤の種類及びその用法・用量は、医薬品添加物事典2007（日本医薬品添加剤協会編、薬事日報社、2007年7月）などに記載され、これらの記載に従って調製し、使用することができる。また、医薬品添加物事典2007（日本医薬品添加剤協会編、薬事日報社、2007年7月）などに記載されていない公知の添加剤を使用することもできる。
【００８７】
具体的には、安定化剤として酒石酸、クエン酸、コハク酸又はフマル酸等の有機酸が、抗酸化剤として例えばアスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン又は没食子酸プロピル等が、pH調整剤として希塩酸又は水酸化ナトリウム水溶液等が、緩衝剤としてクエン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸若しくはアスコルビン酸又はその塩類、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、アスパラギン酸、アラニン若しくはアルギニン又はその塩類、酸化マグネシウム、酸化亜鉛、水酸化マグネシウム、リン酸若しくはホウ酸又はその塩類が、懸濁剤又は乳化剤としてレシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート又はポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレン共重合物等が、界面活性剤としてポリソルベート80、ラウリル硫酸ナトリウム又はポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等が、使用できるが、これらに限定されない。
【００８８】
培養多能性幹細胞とのインキュベーション時に予想される神経細胞分化促進剤の添加濃度は0.001〜10μMであるが、前記式１で表される化合物又は化合物１〜１８の単独又は複数、もしくは、他の神経細胞分化促進剤（例. All-trans retinoic acid）などとの併用も考えられ適宜変化する。
【００８９】
４．神経細胞分化促進活性を調節する化合物のスクリーニング方法
また、本発明の実施態様の一つとして、神経細胞分化促進活性を調節する化合物のスクリーニング方法を提供する。
【００９０】
本発明の神経細胞分化促進活性を調節する化合物のスクリーニング方法は、例えば、多能性幹細胞の培養細胞に、前記式１で表される化合物又は化合物１〜１８、好ましくは、前記化合物１〜１８を、神経細胞分化促進活性を発現する濃度で添加し、併せて、被験化合物を添加する。一定時間細胞を培養し、神経細胞へ分化した細胞の割合を測定し、被験化合物を添加しない対象群と比較することにより、神経細胞分化促進活性を調節する化合物を選別する。
【００９１】
前記方法で神経細胞分化促進活性が認められた被験化合物は、本発明の前記式１で表される化合物又は化合物１〜１８の神経細胞分化促進活性の作用点と相違する作用点を標的とする化合物を神経細胞分化促進剤の有効成分の候補として、使用することができる。
【００９２】
一方、前記方法で神経細胞分化抑制活性が認められた被験化合物は、神経腫等の神経細胞の分化増殖に基づく脳腫瘍等の疾患の予防又は治療のための医薬の有効性成分の候補として、使用できる。
【００９３】
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。ここに記述される実施例は本発明の実施形態を例示するものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例１】
【００９４】
＜化合物の合成＞
材料及び方法
合成経路について、下記化合物１〜１８を以下の反応式３で示される方法により製造した。
【化４５】
0006645695.tif 000046
【００９５】
置換アニリン誘導体などの置換アミン誘導体(1)を原料として、(i)シアナミド(2)との反応によるグアニジン化(3)、さらに(ii)共役ジアルデヒド(4)と反応させてイミンを形成させた後、(iii)分子内共役付加反応によりイミダゾール環(5)を構築した。次いで、(iv)アンモニウム塩(6)を作用させることにより、もうー方のアルデヒドとの間でイミン・エナミン間の平衡を経て、さらに(v)新たに導入したアルデヒド化合物(7)とのイミン形成、続く(vi)アザ電子環化反応を進行させることでイミダゾピリジン環を形成させ、イミダゾピリジンアミン化合物(8)を合成した。さらに(vii)自然酸化によりピリジン環へと変換した後、最後に(viii)アニリン由来のアリール基の除去を行った。なお、本発明の化合物１の合成においては、前記反応式のグアニジン誘導体(3)を単離し、その後の合成反応を行った。一方、本発明の化合物２〜１８については、適当な時間間隔でフラスコ内に試薬を導入することにより、全ての行程をワンポットで合成した。
【００９６】
化合物１：4-(pyridin-2-yl)-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-2-amineは下記式５で表される。
【化４６】
0006645695.tif 000047
【００９７】
化合物２：1-phenyl-4-(pyridin-2-yl)-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-2-amineは、下記式６で表される。
【化４７】
0006645695.tif 000048
【００９８】
化合物３：methyl (2S)-2-(acetylamino)5-[2-amino-4-(pyridin-2-yl)-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-1-yl]pentanoateは、下記式７で表される。
【化４８】
0006645695.tif 000049
【００９９】
化合物４：1-(4-fluorophenyl)-4-(pyridin-2-yl)-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-2-amineは、下記式８で表される。
【化４９】
0006645695.tif 000050
【０１００】
化合物５：1-(4-methyoxyphenyl)-4-(pyridin-2-yl)-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-2-amineは、下記式９で表される。
【化５０】
0006645695.tif 000051
【０１０１】
化合物６：1-(3,4-dimethyoxyphenyl)-4-(pyridin-2-yl)-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-2-amineは、下記式１０で表される。
【化５１】
0006645695.tif 000052
【０１０２】
化合物７：1-(2,4-dimethyoxyphenyl)-4-(pyridin-2-yl)-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-2-amineは、下記式１１で表される。
【化５２】
0006645695.tif 000053
【０１０３】
化合物８：4-(pyridin-2-yl)-1-(3,4,5-trimthoxyphenyl)-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-2-amineは、下記式１２で表される。
【化５３】
0006645695.tif 000054
【０１０４】
化合物９：4-[2-amino-4-(pyridin-2-yl)-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-1-yl]phenolは、下記式１３で表される。
【化５４】
0006645695.tif 000055
【０１０５】
化合物１０：1-(4-tert-butylphenyl)-4-(pyridin-2-yl)-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-2-amineは、下記式１４で表される。
【化５５】
0006645695.tif 000056
【０１０６】
化合物１１：4-(pyridin-2-yl)-1-[4-(trifluoromethyl)phenyl]-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-2-amineは、下記式１５で表される。
【化５６】
0006645695.tif 000057
【０１０７】
化合物１２：1-(2,4-di nitrophenyl)-4-(pyridin-2-yl)-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-2-amineは、下記式１６で表される。
【化５７】
0006645695.tif 000058
【０１０８】
化合物１３：1-(naphthalen-1-yl)-4-(pyridin-2-yl)-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-2-amineは、下記式１７で表される。
【化５８】
0006645695.tif 000059
【０１０９】
化合物１４：1-(3H-indol-6-yl)-4-(pyridin-2-yl)-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-2-amineは、下記式１８で表される。
【化５９】
0006645695.tif 000060
【０１１０】
化合物１５：4-(isoquinolin-1-yl)-1-phenyl-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-2-amineは、下記式１９で表される。
【化６０】
0006645695.tif 000061
【０１１１】
化合物１６：1-(3,4-dimethyoxyphenyl)-4-[6-(trifluoromethyl)pyridin-2-yl)-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-2-amineは、下記式２０で表される。
【化６１】
0006645695.tif 000062
【０１１２】
化合物１７：4-(4,5-dibromo-2H-pyrrol-2-yl)-1-(3,4-dimethoxyphenyl)-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-2-amineは、下記式２１で表される。
【化６２】
0006645695.tif 000063
【０１１３】
化合物１８：4-[2-amino-4-(4,5-dibromo-2H-pyrrol-2-yl)-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-1-yl]phenolは、下記式２２で表される。
【化６３】
0006645695.tif 000064
【０１１４】
具体的には、前記化合物１〜１８は、前記反応式３の反応式において、下記表１−１〜表１−３の出発原料(1)及びアルデヒド化合物(7)を使用して合成した。
【０１１５】
【表１−１】
0006645695.tif 000065
【０１１６】
【表１−２】
0006645695.tif 000066
【０１１７】
【表１−３】
0006645695.tif 000067
【０１１８】
化合物１及び化合物５の反応条件を以下に記載した。化合物２〜４及び６〜１８の合成については、化合物５の反応条件に従った。
【０１１９】
化合物１の合成方法
2,4-ジニトロフルオロベンゼン（3.0 mL、28 mmoL）とグアニジンヒドロクロライド（2.2 g、23 mmoL）を無水N,N-ジメチルホルムアミド（DMF、120 mL）中で混和し、トリエチルアミン（NEt3、6.5 mL、47 mmoL）を窒素雰囲気下室温で加えた。24時間撹拌後、0℃までゆっくり氷冷し、1.0 M 塩酸溶液（200 mL）を加えた。混合液をクロロホルム（3×100 mL）で洗浄後、水層を炭酸水素ナトリウムで中和し、クロロホルム（4×300 mL）で反応成績体を抽出した。有機層を硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ、減圧下で精製した。得られた粗精製物を酢酸エチルによる再結晶化し、黄色針状結晶として2,4-ジニトロフェニルグアニジンを得た（収量：2.8 g、収率：52.6%）。
【０１２０】
DMF（1.5 mL）中に溶解した2,4-ジニトロフェニルグアニジン（67.0 mg、 0.297 mmoL）とジアルデヒド（50.0 mg、0.595 mmol）を混合させ、室温で1時間撹拌後、塩化アンモニウム（79.5 mg、1.49 mmol）、メタノール（1.0 mL）及びピリジン-2-カルボアルデヒド（28.3 mg、0.297 mmol）を加え、75℃で2時間撹拌した。室温まで氷冷後、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（1.0 mL）及び2-メルカプトエタノール（1.0 mL）を加えて室温でさらに1時間撹拌した。得られた反応溶液から逆相HPLCを用いて化合物１を得た（収量：13.7 mg、収率：22%）。
【０１２１】
化合物５の合成方法
上記反応式３において、4-メトキシアニリン（45.5 mg、0.3 mmoL）を原料とし、シアナミド（37.8 mg、0.9 mmoL）とメタノール（0.3 mL）中で混合し、その溶液に濃塩酸溶液（75 μL）を添加した。還流条件で12時間撹拌後、室温まで冷やし、NEt3（125 μL、0.9 mmoL）で中和した。その後、ジアルデヒド（50.0 mg、0.6 mmoL）を加えた混合液を室温で1時間撹拌し、ピリジン-2-カルボアルデヒド（28.3 mg、0.3 mmoL）及びNH4Cl（79.5 mg、1.49 mmoL）を加えた。還流条件で2時間撹拌後、減圧濃縮した。逆相HPLCで精製し化合物５を得た。
【０１２２】
化合物の精製には、逆相高速液体クロマトグラフィー（逆相-HPLC、汎用HPLC Prominence、株式会社島津製作所（京都））を用いた。カラムはナカライテスク株式会社（5C18-AR300、10 × 250 mm、（京都））のものを使用し、0.1% トリフルオロ酢酸（TFA）含水及び0.1% TFA含アセトニトリル二相分配系で分取した。
【０１２３】
以下に、各化合物の性状、収量、収率、及び各物性スペクトルデータ（IR：赤外吸収、1H NMR：プロトン核磁気共鳴、13C NMR：炭素核磁気共鳴、HRMS：高分解能質量分析）を記載した。IRスペクトルはThermo Nicolet iS5（Thermo Fisher Scientific Inc.（米国））を用いて計測した。1H NMR及び13C NMRスペクトルは、日本電子株式会社（東京）製ECA600型NMRスペクトルメーター、同ECA500 型NMRスペクトルメーター及びJEOL USA Inc.（米国）製AL400 NMR型スペクトルメーター用いて以下の条件で計測した。
【０１２４】
HRMSについて、測定装置はBRUKER社製のmicroTOF-QIII、イオン化法は電子スプレーイオン化法（Electron Spray Ionization：ESI）で測定を行った（イオン化モード:ポジティブモード、測定温度:200℃、ガス流速:8.0 L/min）。
【０１２５】
化合物１
白色固体の化合物１を13.7 mgを得、その収率は22%であった。IR（neat、cm-1）3397、2368、2326、1683、1675、1436、1203、1136、1064、841；1H NMR（500 MHz、CD3OD、25℃）δ = 8.90（d、J = 8.0 Hz、1H）、8.85（d、J = 3.6 Hz、1H）、8.30（d、J = 6.6 Hz、1H）、8.08（dd、J = 7.8、7.8 Hz、1H）、7.59-7.56（m、2H）；13C NMR（125 MHz、CD3OD、25℃）162.6、160.7、150.9、150.1、149.1、139.0、135.9、133.9、126.6、125.0、107.8；HRMS（ESI）m/z calcd for C11H9N5[M+H]+ 212.0931、found 212.0929
【０１２６】
化合物２
褐色固体の化合物２を10.2 mg得、その収率は12%であった。IR（neat、cm-1）3111、1676、1617、1506、1437、1202、1131、800；1H NMR（500 MHz、CD3OD、25℃）δ= 9.30（d、J = 8.0 Hz、1H）、8.87（d、J = 5.0 Hz、1H）、8.29（d、J = 6.0 Hz、1H）、8.10（dd、J = 8.0、8.0 Hz、1H）、7.77-7.70（m、3H）、7.64-7.59（m、3H）、7.32（d、J = 6.0 Hz、1H）；13C NMR（125 MHz、CD3OD、25℃）δ = 161.8、161.6、160.5、150.8、148.7、139.1、134.5、134.2、133.6、132.0、131.9、128.3、126.9、126.8、105.8；HRMS（ESI）m/z calcd for C17H13N5 [M+H]+288.1244、found 288.1244
【０１２７】
化合物３
褐色固体の化合物３を6.0 mg得、その収率は5%であった。IR（neat、cm-1）3198、1734、1684、1653、1558、1507、1419、1229；1H NMR（500 MHz、CD3OD、25℃）δ = 9.14（d、J = 8.0 Hz、1H）、8.83（d、J = 4.5 Hz、1H）、8.34（d、J = 6.0 Hz、1H）、8.05（dd、J = 8.0、7.5 Hz、1H）、 7.74（d、J = 6.0 Hz、1H）、7.56（dd、J = 7.5、4.5 Hz、1H）、4.51（dd、J = 8.5、4.5 Hz、1H）、4.31-4.27（m、2H）、3.71（s、3H）、1.98（s、3H）、1.96-1.84（m、3H）、1.81-1.75（m、1H）；13C NMR（125 MHz、CD3OD、25℃）δ = 173.7、173.5、158.2、156.7、150.1、143.4、143.1、140.3、138.9、138.3、126.1、124.5、105.3、53.2、52.8、42.9、29.7、26.0、22.3；HRMS（ESI）m/z calcd for C19H23N6O3[M+H]+ 383.1826、found 383.1828
【０１２８】
化合物４
褐色固体の化合物４を2.1 mg得、その収率は2%であった。IR（neat、cm-1）3314、2354、1653、1539、1511、1419、1249、1212；1H NMR（500 MHz、CD3OD、25℃）δ = 8.75（d、J = 4.5 Hz、1H）、8.32（d、J = 8.0 Hz、1H）、8.24（d、J = 5.5 Hz、1H）、8.00（dd、J = 8.0、6.5 Hz、1H）、7.59（dd、J = 9.0、5.0 Hz、2H）、7.48（dd、J = 6.5、4.5 Hz、1H）、7.42（dd、J = 9.0、5.0 Hz、2H）、7.02（d、J = 5.5 Hz、1H）；13C NMR（125 MHz、CD3OD、25℃）δ =164.4（q、J = 246.8 Hz）、158.0、156.7、150.2、143.9（q、J = 35.9 Hz）、140.1、139.1、138.3、131.2、130.6（q、J = 9.5 Hz）、126.1、124.6、118.6、118.4、105.4；HRMS（ESI）m/z calcd for C17H13FN5 [M+H]+ 306.1150、found 306.1151
【０１２９】
化合物５
黄色固体の化合物５を21 mg得、その収率は37%であった。IR（neat、cm-1）3104、1684、1653、1559、1517、1457、1254、1201、1130；1H NMR（500 MHz、CD3OD、25℃）δ = 9.25（d、J = 8.0 Hz、1H）、8.85（d、J = 4.5 Hz、1H）、8.27（d、J = 6.0 Hz、1H）、8.08（dd、J = 8.0、8.0 Hz、1H）、7.58（dd、J = 8.0、4.5 Hz、1H）、7.52（d、J = 9.0 Hz、2H）、7.27-7.24（m、3H）、3.93（s、3H）；13C NMR（125 MHz、CD3OD、25℃）δ = 163.0、162.8、160.7、150.8、148.8、139.0、134.6、134.2、129.7、126.8、126.6、125.6、119.3、117.0、105.7、56.3；HRMS（ESI）m/z calcd for C18H16N5O [M+H]+ 318.1349、found 318.1351
【０１３０】
化合物６
黄色固体の化合物６を34.7 mg得、その収率は23%であった。IR（neat、cm-1）3067、1684、1653、1517、1457、1269、1200、1131、1023、799；1H NMR（500 MHz、CD3OD、25℃）δ = 9.18（d、J = 8.0 Hz、1H）、8.85（d、J = 4.5 Hz、1H）、8.27（d、J = 6.5 Hz、1H）、8.08（dd、J = 8.0、8.0 Hz、1H）、7.58（dd、J = 8.0、4.5 Hz、1H）、7.29（d、J = 6.5 Hz、1H）、7.24（d、J = 8.0 Hz、1H）、7.18（d、J = 2.5 Hz、1H）、7.26（dd、J = 8.0、2.5 Hz、1H）、3.96（s、3H）、3.90（s、3H）；13C NMR（125 MHz、CD3OD、25℃）δ = 160.4、152.3、152.1、150.8、149.8、148.4、139.3、139.0、135.2（2C）、126.6（2C）、126.0、121.0、113.7、111.8、105.8、56.8、56.7；HRMS（ESI）m/z calcd for C19H18N5O2[M+H]+ 348.1455、found 348.1456
【０１３１】
化合物７
褐色固体の化合物７を9.9 mg得、その収率は10%であった。IR（neat、cm-1）3236、1734、1684、1559、1521、1507、1204、1132；1H NMR（500 MHz、CD3OD、25℃）δ = 9.24（d、J = 8.0 Hz、1H）、8.86（d、J = 4.5 Hz、1H）、8.26（d、J = 6.5 Hz、1H）、8.08（dd、J = 8.0、8.0 Hz、1H）、7.58（dd、J = 8.0、4.5 Hz、1H）、7.44（d、J = 9.0 Hz、1H）、7.17（d、J = 6.5 Hz、1H）、6.88（d、J = 2.5 Hz、1H）、6.80（dd、J = 9.0、2.5 Hz、1H）、3.93（s、3H）、3.82（s、3H）；13C NMR（125 MHz、CD3OD、25℃）δ = 164.7、160.9、157.9、150.8、149.0（2C）、139.0、134.6、134.1、130.9、126.8、126.5、113.6、107.3、106.1、105.9、101.1、56.5、56.4；HRMS（ESI）m/z calcd for C19H18N5O2 [M+H]+348.1455、found 348.1454
【０１３２】
化合物８
褐色固体の化合物８を48.0 mg得、その収率は5%であった。IR（neat、cm-1）3337、2925、1684、1591、1558、1457、1419、1284、1229、1127、1107、801；1H NMR（500 MHz、CD3OD、25℃）δ = 8.75（d、J = 5.0 Hz、1H）、8.32（d、J = 8.0 Hz、1H）、8.24（d、J = 5.0 Hz、1H）、7.99（dd、J = 8.0、8.0 Hz、1H）、7.47（dd、J = 8.0、5.0 Hz、1H）、7.11（d、J = 5.0 Hz、1H）、6.85（s、2H）、3.89（s、6H）、3.86（s、3H）；13C NMR（125 MHz、CD3OD、25℃）δ = 157.9、156.7、155.8、150.2、144.1、143.6、140.9、140.0、139.1、138.3、130.6、126.1、124.6、105.8、105.7、61.2、56.9；HRMS（ESI）m/z calcd for C20H20N5O3 [M+H]+378.1561、found 378.1562
【０１３３】
化合物９
褐色固体の化合物９を9.8 mg得、その収率は11%であった。IR（neat、cm-1）3116、1675、1559、1517、1280、1132、799；1H NMR（500 MHz、CD3OD、25℃）δ = 9.22（d、J = 8.0 Hz、1H）、8.85（d、J = 4.5 Hz、1H）、8.28（d、J = 6.0 Hz、1H）、8.07（dd、J = 8.0、8.0 Hz、1H）、7.58（dd、J = 8.0、4.5 Hz、1H）、7.41（ddd、J = 9.5、2.5、2.5 Hz、2H）、7.27（d、J = 6.0 Hz、1H）、7.09（ddd、J = 9.5、2.5、2.5 Hz、2H）；13C NMR（125 MHz、CD3OD、25℃）δ = 161.0、160.6、150.8、148.9、148.8、139.0、138.8、134.8、134.2、129.7、126.8、126.5、124.2、118.3、105.8；HRMS（ESI）m/z calcd for C17H14N5O [M+H]+304.1193、found 304.1193
【０１３４】
化合物１０
褐色固体の化合物１０を8.4 mg得、その収率は8%であった。IR（neat、cm-1）3392、2955、1733、1652、1559、1539、1516、1419、1247、1110；1H NMR（500 MHz、CD3OD、25℃）δ = 8.75（d、J = 4.0 Hz、1H）、8.35（d、J = 8.0 Hz、1H）、8.23（d、J = 5.5 Hz、1H）、7.94（dd、J = 8.0、8.0 Hz、1H）、7.73（d、J = 8.5 Hz、1H）、7.49-7.46（m、3H）、7.04（d、J = 5.5 Hz、1H）、1.42（s、9H）；13C NMR（125 MHz、CD3OD、25℃）δ = 158.0、156.5、154.2、150.2、144.1、143.4、140.7、139.1、138.4、132.3、128.7、127.6、126.1、124.7、105.6、35.8、31.7；HRMS（ESI）m/z calcd for C21H22N5 [M+H]+ 344.1870、found 344.1874
【０１３５】
化合物１１
褐色固体の化合物１１を9.6 mg得、その収率は9%であった。IR（neat、cm-1）2919、2357、1733、1700、1684、1559、1539；1H NMR（500 MHz、CD3OD、25℃）δ = 8.75（d、J = 5.0 Hz、1H）、8.35（d、J = 8.0 Hz、1H）、8.26（d、J = 6.0 Hz、1H）、8.02-7.97（m、3H）、7.79（d、J = 8.0 Hz、2H）、7.47（dd、J = 7.5、5.0 Hz、1H）、7.10（d、J = 6.0 Hz、1H）；13C NMR（125 MHz、CD3OD、25℃）δ = 157.5、156.7、150.2、144.0、143.5、141.2、139.3、138.7、138.3、132.3（q、J = 33.4 Hz）、128.9、128.8（q、J = 3.6 Hz）、126.1、125.3（q、J = 269.4 Hz）、124.7、105.4；HRMS（ESI）m/z calcd for C18H13F3N5 [M+H]+356.1118、found 356.1118
【０１３６】
化合物１２
化合物１２を3.2 mg得、その収率は25%であった。HRMS（ESI）m/z calcd for C17H11N7O4[M+H]+ 378.0945、found 378.0945
【０１３７】
化合物１３
褐色固体の化合物１３を7.4 mg得、その収率は7%であった。IR（neat、cm-1）3324、2360、1684、1653、1559、1553、1203、1133、799；1H NMR（500 MHz、CD3OD、25℃）δ = 9.37（d、J = 8.0 Hz、1H）、8.89（d、J = 5.0 Hz、1H）、8.28（dd、J = 7.0、2.5 Hz、1H）、8.25（d、J = 6.5 Hz、1H）、 8.17-8.12（m、2H）、7.82-7.78（m、2H）、7.68（dd、J = 7.0、7.0 Hz、1H）、7.64-7.59（m、2H）、7.38（d、J = 8.0 Hz、1H）、7.06（d、J = 6.5 Hz、1H）；13C NMR（125 MHz、CD3OD、25℃）δ = 161.1、150.9、149.4、148.7、140.0、139.1、136.5、134.5、134.3、132.9、130.8、130.2、129.5、129.3、128.6、128.3、127.2、127.0、126.9、122.5、105.9；HRMS（ESI）m/z calcd for C21H16N5 [M+H]+338.1400、found 338.1402
【０１３８】
化合物１４
褐色固体の化合物１４を6.9 mg得、その収率は7%であった。IR（neat、cm-1）3239、2360、1734、1684、1653、1559、1540、1203、1135；1H NMR（500 MHz、CD3OD、25℃）δ = 9.30（d、J = 8.0 Hz、1H）、8.87（d、J = 5.0 Hz、1H）、8.28（d、J = 5.5 Hz、1H）、8.10（dd、J = 8.0、8.0 Hz、1H）、7.88（d、J = 8.5 Hz、1H）、7.65（s、1H）、7.60（dd、J = 8.0、5.0 Hz、1H）、7.50（d、J = 3.0 Hz、1H）、7.30（d、J = 5.5 Hz、1H）、7.16（dd、J = 8.5、1.5 Hz、1H）、6.66（d、J = 3.0 Hz、1H）；13C NMR（125 MHz、CD3OD、25℃）δ = 161.0、150.8、150.7、149.2、149.0、139.1、137.7、134.6、134.2、131.2、128.9、126.8、126.7、126.3、123.4、118.3、111.4、105.9、103.0；HRMS（ESI）m/z calcd for C19H15N6[M+H]+ 327.1353、found 327.1352
【０１３９】
化合物１５
化合物１５を9.1 mg得、その収率は9%であった。HRMS（ESI）m/z calcd for C21H15N5+H [M+H]+ 338.1400、found 338.1401.
【０１４０】
化合物１６
褐色固体の化合物１６を7.0 mg得、その収率は6%であった。IR（neat、cm-1）3311、2357、1774、1653、1559、1539、1457、1205、1132；1H NMR（500 MHz、CD3OD、25℃）δ = 9.56（d、J = 8.0 Hz、1H）、8.38-8.35（m、2H）、8.03（d、J = 8.5 Hz、1H）、7.39（d、J = 5.5 Hz、1H）、7.25（d、J = 8.5 Hz、1H）、7.20（d、J = 2.5 Hz、1H）、7.16（dd、J = 8.5、2.5 Hz、1H）、3.96（s、3H）、3.90（s、3H）；13C NMR（125 MHz、CD3OD、25℃）δ = 161.2、152.4、152.1、149.7、149.5、149.1（q、J = 35.8 Hz）、141.3、140.3、135. 3、132.2、129. 5、125.6、123.1、122.7（q、J = 271.8 Hz）、121.0、113.7、111.7、106.2、56.7（2C）；HRMS（ESI）m/z calcd for C20H17F3N5O2[M+H]+ 416.1329、found 416.1331
【０１４１】
化合物１７
褐色固体の化合物１７を2.7 mg得、その収率は13%であった。IR（neat、cm-1）3347、2360、1684、1653、1559、1539、1507、1204、1136；1H NMR（500 MHz、CD3OD、25℃）δ = 8.06（d、J = 6.5 Hz、1H）、7.28（s、1H）、7.22（d、J = 8.5 Hz、1H）、7.16-7.15（m、2H）、7.11（dd、J = 8.5、2.5 Hz、1H）、3.95（s、3H）、3.89（s、3H）；13C NMR（125 MHz、CD3OD、25℃）δ = 160.5、152.3、152.0、147.3、137.1、132.9、129.3、125.8、125.7、120.8、115.4、113.7、111.6、108.2、104.2、102.6、56.7（2C）；HRMS（ESI）m/z calcd for C18H16Br2N5O2 [M+H]+ 491.9665、found 491.9665
【０１４２】
化合物１８
褐色固体の化合物１８を4.5 mg得、その収率は3%であった。IR（neat、cm-1）3281、2360、1734、1700、1684、1653、1559、1506、1457、1204、1126；1H NMR（600 MHz、CD3OD、25℃）δ = 8.03（d、J = 6.0 Hz、1H）、7.37（d、J = 9.0 Hz、1H）、7.27（s、1H）、7.10（d、J = 6.0 Hz、1H）、7.07（d、J = 9.0 Hz、1H）；13C NMR（150 MHz、CD3OD、25℃）δ = 160.9、160.6、147.4、137.0、132.9、129.6、125.7、124.4、118.3、115.4、108.2、106.5、104.1、102.6；HRMS（ESI）m/z calcd for C16H12Br2N5O [M+H]+ 447.9403、found 447.9404
【実施例２】
【０１４３】
以下の方法により、本発明化合物の神経細胞分化誘導活性、細胞毒性、Dyrk1Aキナーゼ阻害活性、及びアストロサイトに及ぼす影響を評価した。なお、これらの評価に当たっては、β−カルボリン誘導体で、Dyrk1Aキナーゼ阻害活性を介して強い神経細胞分化促進作用が報告されているハルミン（Mazur-Kolecka Bら、J. Neurosci. Res. 2012, 90, 999-1010）を陽性対照として、比較した。なお、統計学的検定は、統計解析ソフトJMP（SAS Institute Inc.、米国）を用い、試験化合物非添加群を対象群としてDunnetの多重比較検定を行いp<0.05を有意差ありと判定した（post-hoc検定）。
【０１４４】
＜化合物１〜２２の神経分化誘導活性＞
神経細胞分化誘導活性
（１）神経細胞分化誘導活性の測定方法
神経細胞分化誘導活性の測定はマウスES細胞由来神経幹細胞を用いた。凍結保存した神経幹細胞を96 well plateに1×104 cells/well播種した。この際培養液としては、2%-B-27（gibco）、1% ペニシリン/ストレプトマイシン（Gibco、Thermo Fisher Scientific Inc.（米国））、20 ng/mL rhFGF-2（R&D Systems Inc.（米国））、20 ng/mL rh EGF（R&D Systems Inc.）を含むNeurobasal Medium（Gibco）を用い、5% CO2, 37℃のCO2インキュベータで培養した。その２日後に培地交換を行い、その翌日に培地を2%-B-27、1% ペニシリン/ストレプトマイシンを含むNeurobasal Mediumに変更させて、その際に、0.001、0.01、0.1及び1 μMの濃度で本発明化合物を添加した。さらに、その２日後に培地交換を行いその翌日に以下記述の免疫染色を行った。
【０１４５】
各wellの培地を除去し、PBS（タカラバイオ株式会社（滋賀））で2回洗浄した後、4%パラホルムアルデヒド（和光純薬工業株式会社（大阪））を添加し、4℃で30分間静置し固定した。パラホルムアルデヒドを除去後、PBSで3回洗浄し0.2% Triton X-100（Alfa Aesar、ジョンソン・マッセイ（英国））、5% Skim milk（和光純薬工業株式会社）を含むPBSを添加し4℃で30分間ブロッキングを行った。一次抗体を含む5% Skim milk入りPBS溶液を添加し4℃で一晩静置し抗原抗体反応を行った。一次抗体にはラビットモノクローナル抗MAP-2抗体（Merck Millipore（米国））を200倍希釈にして用いた。
【０１４６】
一次抗体を含む5% Skim milk入りPBS溶液を除去し、5% Skim milkを含むPBS溶液で3回洗浄を行った。溶液を除去後、蛍光標識した二次抗体を含む5% Skim milk入りPBS溶液を添加し室温で30分間静置した。二次抗体にはPE標識ドンキーポリクローナル抗ラビット抗体（Abcam（英国））を100倍希釈で使用した。
【０１４７】
二次抗体を含む5% Skim milk入りPBS溶液を除去し、0.2% Triton X-100を含むPBS溶液で3 回洗浄を行った後、Hoechst33342（株式会社  同人化学研究所（熊本））を1000倍希釈で添加し、観察には蛍光顕微鏡（オリンパス工業株式会社（東京））を使用した。
【０１４８】
各wellのHoechst33342陽性細胞数とMAP-2陽性細胞数をカウントし、（MAP-2陽性細胞数）/（Hoechst33342陽性細胞数）を神経細胞分化率として算出した。
【０１４９】
（２）神経細胞分化誘導活性の測定結果
対照群（試験化合物非添加群）と比較して、前記化合物１〜１８は、0.001〜1 μMの濃度範囲で、神経細胞の分化に対する調節作用を認め、その多くで分化率が増加した（個別の実験結果：非提示）。
【実施例３】
【０１５０】
＜化合物１〜３の神経分化誘導活性に関する濃度依存性試験＞
（１）実験方法
基本的に実施例２の方法と同様の方法で化合物１〜３の神経細胞分化促進作用に対する濃度依存性を評価した。化合物の添加濃度は0.001、0.01、0.1及び1.0 μMの4濃度で評価を行った。
【０１５１】
（２）実験結果
基本骨格を有する化合物１については、0.1 及び1 μMで促進活性を示し濃度依存性を示した。化合物２及び３は、0.01、0.1及び１ μMで促進活性を示し濃度依存性を示した（図１）。
【実施例４】
【０１５２】
＜化合物１〜１８の細胞毒性測定＞
（１）細胞毒性の測定方法
細胞毒性の測定についてはマウスES細胞由来神経幹細胞を用いた。凍結保存した神経幹細胞を96 well plateに1×104 cells/well播種した。この際培養液としては、2%-B-27、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、20 ng/mL rhFGF-2、20 ng/mL rhEGFを含むNeurobasal Medium を用い、5% CO2、37℃のCO2インキュベータで培養した。翌日に0.01、0.1、1、10 μMの濃度の本発明化合物を添加し、それからさらに３日間培養を続けた。
【０１５３】
その後、培地100 μL/1 wellに対して25 μLの1 mg/mL MTT（Invitrogen）溶液を加えて3時間インキュベート後培地を除去し、DMSO（Invitrogen）を150 μL添加し、マイクロプレートリーダー（PerkinElmer, Inc.（米国））を用いて吸光度測定を行い、コントロールの吸光度と化合物添加時の吸光度の比から細胞生存率を算出し細胞毒性を評価した。
【０１５４】
（２）細胞毒性の測定結果
結果を下記表２に示した。前記化合物１〜１８のいずれも、細胞毒性を示さないか、或いは弱い細胞毒性しか示さずIC50は5 μM以上であった。一方、比較例として使用したハルミンのIC50は4.0 μMであった。
【０１５５】
【表２】
0006645695.tif 000068
【実施例５】
【０１５６】
＜Dyrk1Aキナーゼ阻害活性の評価＞
（１）実験方法
化合物のDyrk1Aキナーゼに対する阻害活性については、カルナバイオサイエンス株式会社（神戸）に委託し、以下に記載のoff-chip mobility shift assay（MSA）を用いて行った。
【０１５７】
N末端にGST融合タンパク質を発現した全長ヒトDyrk1Aタンパク質はバキュロウイルス発現系を用いて発現させ、グルタチオンセファロースクロマトグラフィーを用いて精製した。試験化合物をDMSOに25 mMの濃度で溶解させ、アッセイバッファー（20 mM HEPES [pH 7.5]、0.01% Triton X-100、2 mM DTT：ジチオスレイトール）で1 mMまで希釈した。その後、前記溶液5 μLを5 μLのATP/基質/金属溶液（16 μM ATP、1000 nM 基質ペプチド、5 mM Mg）と混合し、200 μg/mL Dyrk1Aキナーゼ溶液を10 μL添加した。この混合液を室温状態で1時間反応させ、60 μLの反応停止緩衝液（QuickScout Screening Assist MSA；カルナバイオサイエンス株式会社）を用いて反応を終了させた。リン酸化ペプチドと非リン酸化ペプチドを分離し、LabChip system（PerkinElmer, Inc.）を用いて定量した。阻害率をリン酸化ペプチドの割合から算出した。
【０１５８】
実験結果
ピリジン誘導体（化合物１）及び数種類の化合物は阻害活性を示したが、顕著な誘導活性を示した新規化合物（化合物２〜４）などは阻害活性を示さず、神経分化誘導活性とDyrk1Aキナーゼ阻害活性との間に相関関係は見られなかった（表３）。
【０１５９】
【表３】
0006645695.tif 000069
【実施例６】
【０１６０】
＜化合物１〜４のアストロサイト分化誘導活性の測定＞
（１）実験方法
アストロサイト分化誘導活性の測定はマウスES細胞由来神経幹細胞を用いた。凍結保存した神経幹細胞を96 well plateに1×104 cells/well播種した。この際培養液としては、2%-B-27（Gibco）、1% ペニシリン/ストレプトマイシン（Gibco）、20 ng/mL rhFGF-2（R&D Systems Inc.）、20 ng/mL rh EGF（R&D Systems Inc.）を含むNeurobasal Medium （Gibco）を用い、5% CO2、37℃のCO2インキュベータで培養した。その２日後に培地交換を行い、その翌日に培地をAstrocyte Conditioned Medium（ACM、住友ベークライト株式会社（東京））に変更させて、その際に、0.001、0.01、0.1、1 μMの濃度で本発明化合物を添加した。さらに、その２日後に培地交換を行いその翌日に以下記述の免疫染色を行った。
【０１６１】
各wellの培地を除去し、PBS（タカラバイオ株式会社）で2回洗浄した後、4%パラホルムアルデヒド（和光純薬工業株式会社）を添加し、4℃で30分間静置し固定した。パラホルムアルデヒドを除去後、PBSで3回洗浄し0.2% Triton X-100（Alfa Aesar、ジョンソン・マッセイ）、5% Skim milk（和光純薬工業株式会社）を含むPBSを添加し4℃で30分間ブロッキングを行った。一次抗体を含む5% Skim milk入りPBS溶液を添加し4℃で一晩静置し抗原抗体反応を呈した。一次抗体にはマウスモノクローナル抗GFAP抗体（Merck Millipore）を500倍希釈にして用いた。
【０１６２】
一次抗体を含む5% Skim milk入りPBS溶液を除去し、5% Skim milkを含むPBS溶液で3回洗浄を行った。溶液を除去後、蛍光標識した二次抗体を含む5% Skim milk入りPBS溶液を添加し室温で30分間静置した。二次抗体にはChromeo488標識ゴートポリクローナル抗マウス抗体（Active motif）を200倍希釈で使用した。
【０１６３】
二次抗体を含む5% Skim milk入りPBS溶液を除去し、0.2% Triton X-100を含むPBS溶液で3 回洗浄を行った後、Hoechst33342（株式会社  同仁化学研究所（熊本））を1000倍希釈で添加し、観察には蛍光顕微鏡（オリンパス工業株式会社（東京））を使用した。
【０１６４】
各wellのHoechst33342陽性細胞数とGFAP陽性細胞数の数をカウントし、（GFAP陽性細胞数）/（Hoechst33342陽性細胞数）をアストロサイト分化率として算出した。
【０１６５】
実験結果
化合物１〜３はアストロサイト分化誘導に対する影響を示さなかった。一方、ハルミンは統計学的有意なアストロサイトの分化抑制作用を認めた（図２）。
【産業上の利用可能性】
【０１６６】
本発明化合物は、優れた神経細胞分化促進作用を有し、神経変性疾患の予防又は治療のための医薬組成物、多能性幹細胞から神経細胞への分化促進剤、及び培養細胞の分化調整剤のスクリーニング方法での使用に有用である。
【図１】
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【図２】
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