(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミトリプチリン及びメフロキン、又は、その薬学的に許容される塩を含む治療用組成物。
【請求項２】
大うつ病性障害（ＭＤＤ）、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、不安、全般不安症（ＧＡＤ）、社交不安症（ＳＡＤ）、パニック症、神経障害性疼痛、抵抗性疼痛、線維筋痛症、禁煙、慢性筋骨格痛、パーキンソン病における無動症、脱力発作、片頭痛、パーキンソン病、閉経期の血管運動症状、月経前不快気分障害（ＰＭＤＤ）、不安症候群（Ｗｉｌｌｉｓ−Ｅｋｂｏｍ病）、唾液分泌過多（よだれ、流涎過多）、筋委縮性側索硬化症における唾液分泌過多（よだれ、流涎過多）、双極Ｉ型障害、過食症、強迫性障害（ＯＣＤ）、疲労、アルツハイマー病、ハンチントン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、ストレス、うつ病、パーキンソン病及びレビー小体型認知症におけるうつ病、統合失調症、自閉症、不眠症、夜尿症、夜驚症、睡眠時歯ぎしり、線維筋痛症における睡眠障害、呼吸障害、ＲＥＭ睡眠障害、睡眠時無呼吸又は結合織炎を予防及び／又は治療するために、その必要がある対象において使用するための、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項３】
大うつ病性障害、神経障害性疼痛、不安、線維筋痛症、閉経期の血管運動症状又は夜尿症を予防及び／又は治療するために使用するための、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項４】
帯状疱疹後神経障害性疼痛、糖尿病性神経障害性疼痛、外科後神経障害性疼痛、化学療法後神経障害性疼痛、脳卒中後神経障害性疼痛、癌治療後神経障害性疼痛若しくは化学的予防後神経障害性疼痛、ＨＩＶ後神経障害性疼痛、慢性背部神経障害性疼痛、腰背部神経障害性疼痛、外傷性神経障害、多発性硬化症疾患若しくは他の免疫疾患に関連する神経障害性疼痛、又は、脊髄損傷によって誘発される神経障害性疼痛を予防及び／又は治療するために使用するための、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項５】
メフロキンの投与計画が、１日あたり約１０μｇ乃至５０ｍｇ、好ましくは１日あたり１００μｇ乃至２５ｍｇ、より好ましくは１日あたり１ｍｇ乃至２５ｍｇの範囲内である、請求項２乃至４のいずれか一項に記載の使用のための、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項６】
アミトリプチリンの投与計画が、１日あたり１０μｇ乃至１５０ｍｇ、好ましくは１日あたり１ｍｇ乃至７５ｍｇ、より好ましくは１日あたり１ｍｇ乃至５０ｍｇである、請求項２乃至５のいずれか一項に記載の使用のための、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項７】
錠剤、飲用に適した溶液、外用クリーム又はパッチである、請求項２乃至６のいずれか一項に記載の使用のための、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項８】
アミトリプチリン又はその薬学的に許容される塩の治療効果を増強するために、その必要がある対象において使用するためのメフロキン又はその薬学的に許容される塩を含む治療用組成物。
【請求項９】
メフロキンの投与計画が、１日あたり約１０μｇ乃至５０ｍｇ、好ましくは１日あたり約１００μｇ乃至２５ｍｇ、より好ましくは１日あたり１ｍｇ乃至２５ｍｇの範囲内である、請求項８に記載の治療用組成物。
【請求項１０】
パッチ、飲用に適した溶液、外用クリーム又は錠剤である、請求項８又は９に記載の治療用組成物。
【請求項１１】
大うつ病性障害（ＭＤＤ）、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、不安、全般不安症（ＧＡＤ）、社交不安症（ＳＡＤ）、パニック症、神経障害性疼痛、抵抗性疼痛、線維筋痛症、禁煙、慢性筋骨格痛、パーキンソン病における無動症、脱力発作、片頭痛、パーキンソン病、閉経期の血管運動症状、月経前不快気分障害（ＰＭＤＤ）、不安症候群（Ｗｉｌｌｉｓ−Ｅｋｂｏｍ病）、唾液分泌過多（よだれ、流涎過多）、筋委縮性側索硬化症における唾液分泌過多（よだれ、流涎過多）、双極Ｉ型障害、過食症、強迫性障害（ＯＣＤ）、疲労、アルツハイマー病、ハンチントン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、ストレス、うつ病、パーキンソン病及びレビー小体型認知症におけるうつ病、統合失調症、自閉症、不眠症、夜尿症、夜驚症、睡眠時歯ぎしり、線維筋痛症における睡眠障害、呼吸障害、ＲＥＭ睡眠障害、睡眠時無呼吸又は結合織炎を予防及び／又は治療するために、その必要がある対象において同時に、別々に又は交互に使用するための、アミトリプチリン及びメフロキン、又は、その薬学的に許容される塩を含むコンビネーション製品。
【請求項１２】
大うつ病性障害、神経障害性疼痛、不安、線維筋痛症、閉経期の血管運動症状又は夜尿症を予防及び／又は治療するために同時に、別々に又は交互に使用するための、請求項１１に記載のコンビネーション製品。
【請求項１３】
帯状疱疹後神経障害性疼痛、糖尿病性神経障害性疼痛、外科後神経障害性疼痛、化学療法後神経障害性疼痛、脳卒中後神経障害性疼痛、癌治療後神経障害性疼痛若しくは化学的予防後神経障害性疼痛、ＨＩＶ後神経障害性疼痛、慢性背部神経障害性疼痛、腰背部神経障害性疼痛、外傷性神経障害、多発性硬化症疾患若しくは他の免疫疾患に関連する神経障害性疼痛、又は、脊髄損傷によって誘発される神経障害性疼痛を予防及び／又は治療するために同時に、別々に又は交互に使用するための、請求項１１に記載のコンビネーション製品。
【請求項１４】
メフロキンの投与計画が、１日あたり約１０μｇ乃至５０ｍｇ、好ましくは１日あたり１００μｇ乃至２５ｍｇ、より好ましくは１日あたり１ｍｇ乃至２５ｍｇの範囲内である、請求項１１乃至１３のいずれか一項に記載の同時に、別々に又は交互に使用するためのコンビネーション製品。
【請求項１５】
アミトリプチリンの投与計画が、１日あたり１０μｇ乃至１５０ｍｇ、好ましくは１日あたり１ｍｇ乃至７５ｍｇ、より好ましくは１日あたり１ｍｇ乃至５０ｍｇである、請求項１１乃至１４のいずれか一項に記載の同時に、別々に又は交互に使用するためのコンビネーション製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中枢神経系（ＣＮＳ）におけるコネキシンヘミチャネル（ＨＣ）の阻害剤としてのアミトリプチリンの使用に関する。このＨＣ遮断薬は、誤調節されたＨＣを伴う障害（特に、神経障害性疼痛、神経変性障害、虚血性脳傷害及び炎症性の腸の状態）を治療するために有利に使用される。加えて、本発明は、アミトリプチリンのその共通の効能に対する治療効果を高める方法を提供する。本発明の方法は、アミトリプチリンを別のＨＣ遮断薬であるメフロキンと組み合わせることを含む。
【背景技術】
【０００２】
三環系抗うつ剤（ＴＣＡ）は、１９５０年代初めに発見され、その後１０年以内に市販された化学化合物である。
【０００３】
多くの副作用が、ＴＣＡの抗ムスカリン作用の特性に関連している。これらの副作用には、口内乾燥、鼻内乾燥、かすみ目、胃腸運動の低下又は便秘、尿閉、認知及び／又は記憶の機能障害並びに体温の上昇が含まれる。他の副作用には、眠気、不安、感情鈍麻（無感情／快感消失）、混乱、不穏状態、めまい、静座不能、過敏症、食欲及び体重における変化、発汗、性機能障害、筋攣縮、脱力、吐き気及び嘔吐、血圧低下、頻脈症、及び、まれに、不規則な心臓のリズムが含まれる。
【０００４】
副作用は、治療が低用量で開始され、次いで徐々に増加する場合にはあまり厄介ではないかもしれないが、これは有益な効果を遅延させる可能性もある。
【０００５】
アミトリプチリンは、大うつ病性障害（ＭＤＤ）、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、全般不安症（ＧＡＤ）、社交不安症（ＳＡＤ）、パニック症、神経障害性疼痛、抵抗性疼痛（ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｐａｉｎ）、線維筋痛症、禁煙、慢性筋骨格痛、パーキンソン病における無動症、脱力発作、片頭痛、パーキンソン病、閉経期の血管運動症状、夜尿症、月経前不快気分障害（ＰＭＤＤ）、双極Ｉ型障害、過食症及び強迫性障害（ＯＣＤ）に対する第一選択治療として頻繁に推奨されてきた三環系抗うつ剤である（Ｆｉｎｎｅｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ  ２０１５）。
【０００６】
しかし、アミトリプチリンは、他のＴＣＡと同様に、有効性に限界があり、耐容性の低い副作用が与えられる（Ｍｏｏｒｅ，２０１５）。
【０００７】
これに関連して、本発明者等は、アミトリプチリンの治療効果を、その副作用を悪化させることなく増強する（及びその副作用をより良好に低減する）ことを目的とした。
【０００８】
三環系抗うつ剤アミトリプチリンが示される主な症状である神経障害性疼痛は、ＨＣ活性を関係づけている（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２０１２；Ｏ´Ｃａｒｒｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ，２０１３）。より正確には、最近の研究は、神経障害性疼痛の生理病理学におけるアストログリアのコネキシン４３（Ｃｘ４３）の意味を指摘している。コネキシンは、隣接する細胞間で小さなイオン及び分子（＜１ｋＤａ）の交換を可能にするギャップ結合を確立することにより細胞間結合に関与するタンパク質のファミリーを構成する（Ｇｉａｕｍｅ  ｅｔ  ａｌ，２０１３）。これらの膜貫通タンパク質は集合して、細胞内及び細胞外区画の伝達に要求される、イオン及び小分子に対する拡散経路として役立つ六量体のヘミチャネル（コネクソンとも呼ばれる）を構築することもできる（Ｏｒｅｌｌａｎａ  ＪＡ  ｅｔ  ａｌ，２０１２）。メフロキンは、いくつかのコネキシン、例えばＣｘ２６（Ｌｅｖｉｔ，２０１５）、Ｃｘ３６（Ｐｉｚａｒｒｏ−Ｄｅｌｇａｄｏ，２０１４）、Ｃｘ４６及びＣｘ５０（Ｓｒｉｎｉｖａｓ，２００５）及びＣｘ４３（Ｋｈａｗａｊａ，２０１１）等で構成されたヘミチャネルを効率的に遮断する。さらに、メクロフェナム酸（ＭＦＡ）は、ヘミチャネルブロッカーとも呼ばれる（Ｒｉｃｈｔｅｒ，２０１４）。
【０００９】
神経障害性疼痛の前臨床モデルにおいて、Ｃｘ４３の発現も機能も増加し、Ｃｘ４３がこの疾患に関与し得るということを示唆している。これは、神経障害性疼痛の周縁モデル並びに中心モデルにおいて観察されてきた（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ  ２０１２，Ｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ  ２００８）。加えて、薬理学的又は遺伝学的アプローチによるＣｘ４３の遮断は、抗侵害受容作用に関連しており（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２０１２）、Ｃｘ４３がこの疾患に関係づけられるであろうという事実を補強している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
これに関連して、本発明者等は、アミトリプチリンの治療効果は、ＨＣ活性の調節に（少なくとも部分的に）よるものであると仮定した。従って、ＣＮＳヘミチャネルに対するアミトリプチリンのｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの効果を研究し、驚くべきことに、アミトリプチリンは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨＣ活性を効率的に遮断することができるということを見出した。
【００１１】
結果的に、本発明者等は、アミトリプチリンを使用して、神経変性障害、虚血性脳傷害及び炎症性の腸の状態等、ＨＣ活性を伴うことが知られている症状を治療することを提案する。
【００１２】
アミトリプチリンの治療効果を増強する方法を探して、本発明者等は、さらに、神経障害性疼痛、うつ病、睡眠障害を患う動物モデルにおいて、アミトリプチリンとメフロキンとの間に相乗効果が生じることを観察した。本発明者等は、さらに、この相乗効果が、神経変性障害及び精神障害のモデルとして、神経炎症においてアミトリプチリンとメフロキンとの間に生じることを観察した（図２〜５、７、１０及び１３）。興味深いことに、この相乗作用は、これら２つの有効成分に非常に特異的であるように思われ、アミトリプチリンが低用量のメフロキンと組み合わされた場合にｉｎ  ｖｉｖｏにおいてのみ生じた（図７、８及び１１）。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
従って、本発明は、アミトリプチリンに感受性があることが知られている対象、すなわち、神経障害性疼痛、うつ病又は睡眠障害を患う対象を予防及び／又は治療するための、アミトリプチリン及び低用量のメフロキンを含有するコンビネーション製品を使用することを提案する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】皮質星状細胞培養物における臭化エチジウム摂取によって研究したＨＣ活性を表した図である。ＬＰＳ及びアミトリプチリンを、２４時間の間に、細胞培地にそれぞれ１μｇ／ｍＬ及び５、１０及び２０μＭ添加した。蛍光強度は臭化エチジウム摂取の量に関連している。１つの条件につきｎ＝４−７、ＬＰＳ群と比較して***ｐ＜０．００１、ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ、Ｄｕｎｎ’ｓ  ｔｅｓｔ。
【図２】ＳＮ−ＣＣＩラットにおける慢性投与後の、メフロキンによるアミトリプチリンの抗痛覚過敏効果の増強を表した図である。１日２回、腹腔内投与されたメフロキン０．５ｍｇ／ｋｇ又は生理食塩水と組み合わされた、皮下浸透圧ポンプにより送達されたアミトリプチリン１２ｍｇ／ｋｇ又は生理食塩水の慢性投与の効果を、坐骨神経に対する一側性の絞扼性神経損傷（ＳＮ−ＣＣＩ）を有するラットにおけるＲａｎｄａｌｌ＆Ｓｅｌｉｔｔｏ  ｔｅｓｔに対する行動反応において評価した。足の引き込み（ｐａｗ  ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ）（Ａ、Ｂ）及び啼鳴（Ｃ、Ｄ）をトリガする圧力閾値を、手術に先立ち（横軸上のＣ）、次に、ポンプ移植及びメフロキン又は生理食塩水の腹腔内注入直前の２週間後（横軸上の０）、及び、１４日の治療の間に決定した。データは、ｎ＝８−１４のラットの平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍである。ヒストグラム（Ｂ、Ｄ）は、それぞれの時間曲線の曲線下面積ＡＵＣ（ｇｘ日）を例示している。同時の「生理食塩水＋生理食塩水」群と比較して*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｔｅｓｔ；アミトリプチリン群間で比較して、≠ｐ＜０．０５、≠≠ｐ＜０．０１、ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ  ｔｅｓｔ。
【図３】ＳＮ−ＣＣＩラットにおける繰返しの投与後の、メフロキンによるアミトリプチリンの抗痛覚過敏効果の増強を表した図である。アミトリプチリン１；３ｍｇ／ｋｇ及びメフロキン１ｍｇ／ｋｇを、坐骨神経に対する一側性の絞扼性神経損傷（ＳＮ−ＣＣＩ）を有するラットにおいて１５０分ごとに腹腔内投与し、足の引き込みをＲａｎｄａｌｌ＆Ｓｅｌｉｔｔｏ  ｔｅｓｔに対する行動反応において評価した。データは、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍである。ｎ＝９−１０、対照と比較して*ｐ＜０．０５、***ｐ＝０．００１、****ｐ＜０．０００１、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｐｏｓｔ  ｔｅｓｔ。
【図４】ＦＳＴを受けたマウスにおける水泳時間に対する、メフロキン１ｍｇ／ｋｇと同時投与されたか又はされなかったアミトリプチリン（１２及び２４ｍｇ／ｋｇ）の単一経口投与の効果を表した図である。結果は、第２の３分の期間の間に得られた。対照と比較してｐ＜０．０５、ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｐｏｓｔ  ｔｅｓｔ。
【図５】アミトリプチリン単独又はメフロキンと組み合わせたアミトリプチリンによる急速眼球運動（ＲＥＭ）睡眠の抑制を表した図である。ＲＥＭ睡眠持続時間を、メフロキン１ｍｇ／ｋｇと組み合わせた又は組み合わせていないアミトリプチリン１ｍｇ／ｋｇで処置した後のマウスにおいて定量化した。データは平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍである。１つの群あたりｎ＝８−９、対照とアミトリプチリン＋メフロキンの群との間で*ｐ＜０．０５、ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙ  ｐｏｓｔ  ｔｅｓｔ。
【図６】ＬＰＳ、ＬＰＳ＋メフロキン又はＬＰＳ＋ＭＦＡで処置した皮質星状細胞培養物における臭化エチジウム摂取によって研究したＨＣ活性を表した図である。ＬＰＳ１μｇ／ｍＬ及び１０μＭの用量のメフロキン又はメクロフェナム酸（ＭＦＡ）を、細胞培地に２４時間の間に添加した。蛍光強度は、臭化エチジウム摂取の量に関連している。１つの条件につきｎ＝３、ＬＰＳ群と比較して***ｐ＜０．００１、ＭＦＡとメフロキンとの間で≠≠≠ｐ＜０．００１、ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ、Ｄｕｎｎ’ｓ  ｔｅｓｔ。
【図７】ＳＮ−ＣＣＩラットにおける慢性投与後のメフロキンによる（ただし、ＭＦＡによるものではない）アミトリプチリンの抗痛覚過敏効果の増強を表した図である。１日２回、腹腔内投与されたＭＦＡ０．５ｍｇ／ｋｇ（Ａ）及びメフロキン０．５ｍｇ／ｋｇ（Ｂ）又は生理食塩水と組み合わされた、皮下浸透圧ポンプにより送達されたアミトリプチリン１２ｍｇ／ｋｇ又は生理食塩水の慢性投与の効果を、坐骨神経に対する一側性の絞扼性神経損傷（ＳＮ−ＣＣＩ）を有するラットにおけるＲａｎｄａｌｌ＆Ｓｅｌｉｔｔｏ  ｔｅｓｔに対する行動反応において評価した。啼鳴をトリガする圧力閾値を、手術に先立ち（横軸上のＣ）、次に、ポンプ移植及びメフロキン又は生理食塩水の腹腔内注入直前の２週間後（横軸上の０）、及び、１４日の治療の間に決定した。データは、ｎ＝８−１４のラットの平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍである。同時の「生理食塩水＋生理食塩水」群と比較して*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１、アミトリプチリン群の間で比較して≠ｐ＜０．０５、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｔｅｓｔ。
【図８】アミトリプチリン及びメフロキンによるＨＣ抑制を表した図である。アミトリプチリン１０μＭ及びメフロキン０．５μＭを、実験の２４時間前に細胞培地に添加した。ＨｅＣ活性を、皮質星状細胞培養物における臭化エチジウム摂取によって研究した。ＬＰＳを１μｇ／ｍＬ２４時間の間に添加した。蛍光強度は、臭化エチジウム摂取の量に関連している。１つの条件につきｎ＝４−６、ＬＰＳ群と比較して***ｐ＜０．００１、ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ、Ｄｕｎｎ’ｓ  ｔｅｓｔ。
【図９】メフロキン処置の非存在下又は存在下でのアミトリプチリンの薬物動態を表した図である。アミトリプチリンの薬物動態は、メフロキン処置後のＳＮ−ＣＣＩラットの血清及び脳において変化しない。アミトリプチリンの濃度を、コネキシンモジュレーターメフロキン（０．５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、１日２回）と組み合わせた又は組み合わせていないアミトリプチリン（１２ｍｇ／ｋｇ、浸透圧ポンプ）の慢性投与の１４日後のＳＮ−ＣＣＩ血清（Ａ１）及び脳（Ａ２）においてＨＰＬＣによって測定した。脳／血漿の比も定量化した（Ａ３）。１つの条件につきｎ＝８、有意差なし、対応のないｔ検定。
【図１０Ａ】アミトリプチリン６ｍｇ／ｋｇ単独（ＡＭＩＴ  ６）、又は、０．１ｍｇ／ｋｇのメフロキンと共にアミトリプチリン６ｍｇ／ｋｇ（ＡＭＩＴ  ６＋ＭＥＦＬＯ  ０．１）の２５日間の慢性投与後にｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｔｅｓｔを受けたマウスから得られた足の引き込みの閾値の比較を示した図である。
【図１０Ｂ】アミトリプチリン６ｍｇ／ｋｇ単独（ＡＭＩＴ  ６）、又は、０．３３ｍｇ／ｋｇのメフロキンと共にアミトリプチリン６ｍｇ／ｋｇ（ＡＭＩＴ  ６＋ＭＥＦＬＯ  ０．３３）の２５日間の慢性投与後にｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｔｅｓｔを受けたマウスから得られた足の引き込みの閾値の比較を示した図である。
【図１０Ｃ】アミトリプチリン６ｍｇ／ｋｇ単独（ＡＭＩＴ  ６）、又は、１ｍｇ／ｋｇのメフロキンと共にアミトリプチリン６ｍｇ／ｋｇ（ＡＭＩＴ  ６＋ＭＥＦＬＯ  １）の２５日間の慢性投与後にｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｔｅｓｔを受けたマウスから得られた足の引き込みの閾値の比較を示した図である。
【図１０Ｄ】アミトリプチリン６ｍｇ／ｋｇ単独（ＡＭＩＴ  ６）又はアミトリプチリン１２ｍｇ／ｋｇ単独（ＡＭＩＴ  １２）のいずれかで処置したマウスの足の引き込みの閾値を示した図である。
【図１０Ｅ】曲線下面積の分析を表した図である。
【図１１】アミトリプチリン６ｍｇ／ｋｇを、０．３３ｍｇ／ｋｇのメフロキン（ＡＭＩＴ  ６＋ＭＥＦＬＯ  ０．３３）、メクロフェナム酸（０．５ｍｇ／ｋｇ、ＭＦＡ）又はニフルミン酸（０．５ｍｇ／ｋｇ、ＮＩＦＬＵ）のいずれかと共に投与した後にｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｔｅｓｔを受けたマウスから得られた足の引き込みの閾値の比較を表した図である（Ａ）。曲線下面積の分析が示されている（Ｂ）。
【図１２】アミトリプチリン（６、１２ｍｇ／ｋｇ）単独又はメフロキン（０．１、０．３、１ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせたアミトリプチリンによって処置したマウスの、１８日間の処置後の血漿中の（Ａ）アミトリプチリン及び（Ｂ）メフロキンの濃度（ｎｇ／ｍｌ）を表した図である。データは、平均値±ＳＥＭとして示されている。Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓに続いてＤｕｎｎ’ｓ  ｐｏｓｔ  ｔｅｓｔ：**ｐ＜０．０１。ここでは、アミトリプチリン（６、１２ｍｇ／ｋｇ）単独又はメフロキン（０．１、０．３、１ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせたアミトリプチリンによって処置したマウスの個々の値として示されている、１８日間の処置後の脳中の（Ｃ）アミトリプチリン及び（Ｄ）メフロキンの濃度（ｎｇ／ｍｌ）。Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓに続いてＤｕｎｎ’ｓ  ｐｏｓｔ  ｔｅｓｔ：**ｐ＜０．０１。
【図１３】神経炎症のＬＰＳ誘発モデルにおける処置の３時間後に評価したコートステートスコア（ｃｏａｔ  ｓｔａｔｅ  ｓｃｏｒｅｓ）を表した図である（左のグラフ）。右のグラフは、神経炎症のＬＰＳ誘発モデルにおける処置の３時間後と処置の直前の体重減少の量を表している（右のグラフ）。対照のマウスに生理食塩水を腹腔内注入した。処置を、溶媒（ＣＯＮＴＲＯＬ及びＶＥＨ）、メフロキン１ｍｇ／ｋｇと組み合わせたアミトリプチリン１ｍｇ／ｋｇ（ＡＭＩＴ  １＋ＭＥＦＬＯ  １）又はアミトリプチリン１ｍｇ／ｋｇ単独（ＡＭＩＴ  １）を用いて経口投与した。両方のグラフにおいて：１つの群あたりｎ＝４−６のマウスで、データは、平均値±ＳＥＭとして示され、さらに、ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡに続くＴｕｋｅｙ’ｓ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ｔｅｓｔと比較され、ＣＯＮＴＲＯＬ処置マウスに対して*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０５及び**ｐ＜０．０１であった。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
アミトリプチリンは、以下の２Ｄの式、
【００１６】
【化１】
0006720301.tif 000002
を有する。その完全な化学名は、３−（５，６−ジヒドロジベンゾ［２，１−ｂ：２´，１´−ｆ］［７］アンヌレン−１１−イリデン）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−１−アミンであり、そのＣＡＳ番号は、５０−４８−６である。
【００１７】
分子的な観点から、アミトリプチリンは、ノルエピネフリン及びセロトニン等の伝達物質アミンの再取り込みの原因となる膜ポンプ機構を抑制し、その結果、脳のシナプス間隙におけるその濃度を上げている。
【００１８】
アミトリプチリンは、アセチルコリンのムスカリン受容体及びアルファ１アドレナリン受容体のアンタゴニストとして作用する（Ｍａｊ  ｅｔ  ａｌ，１９８２）。さらに、アミトリプチリンは、カルシウム電位依存性チャネルのブロッカー並びにカリウムブロッカーである（Ｇｅｒｎｅｒ，２００３；Ｗｏｏｌｔｏｒｔｏｎ，１９９５）。しかし、その主要な特性は、ノルエピネフリン及びセロトニン等の伝達物質アミンの再取り込みの原因となる膜ポンプ機構の抑制を含む。従って、これは、後者のアミン濃度が脳のシナプス間隙において高くなることを可能にする。最後に、全ての三環系抗うつ剤として、アミトリプチリンはヒスタミンＨ１受容体のアンタゴニストであることも知られており、従って鎮静作用を誘発する。
【００１９】
アミトリプチリンは、主に、ノルトリプチリン（ＮＴ）を形成するＣＹＰ２Ｃ１９による脱メチル化によって、及び、Ｅ−１０−ヒドロキシル−アミトリプチリン（ＥＨＡＴ）及びＺ−１０−ヒドロキシル−アミトリプチリン（ＺＨＡＴ）の形成をもたらすヒドロキシル化によって代謝される。ＮＴは、デスメチルノルトリプチリン（ＮＮＴ）にさらに脱メチル化され、さらに、Ｅ−１０−ヒドロキシ−ノルトリプチリン（ＥＨＮＴ）及びＺ−１０−ヒドロキシ−ノルトリプチリン（ＺＨＮＴ）にヒドロキシル化される。アミトリプチリン及びＮＴの脱メチル化は、主に、ＣＹＰ２Ｃ１９によって触媒され、より高い薬物濃度における他のＣＹＰ酵素の形態（ＣＹＰ１Ａ２、３Ａ４、２Ｃ９）の関与が伴う。ＣＹＰ２Ｄ６は、アミトリプチリンのヒドロキシル化を媒介する唯一の酵素である（Ｒａｆａｅｌ，２００８）。より正確には、ＣＹＰ３Ａ４は、ｉｎ  ｖｉｖｏでアミトリプチリンクリアランスにおいて比較的マイナーな役割を果たす。
【００２０】
本発明に関連して、「アミトリプチリン」という用語は、アミトリプチリンのあらゆる形態（アミトリプチリン塩酸塩又はアミトリプチリンのあらゆる他の塩）、並びに、その前駆体又は人体において代謝することができる代謝物（ＮＴ、ＮＮＴ、ＥＨＡＴ、ＺＨＡＴ、ＥＨＮＴ又はＺＨＮＴ等）及びその誘導体（例えば、１つ又は複数のハロゲン置換及び／又は保護基の付加から生じる化学的誘導体等）を示す。好ましい誘導体は、例えば、ノルトリプチリン、デスメチルノルトリプチリン、Ｚ−１０−ヒドロキシ−ノルトリプチリン、Ｅ−１０−ヒドロキシ−ノルトリプチリン、Ｚ−１０−ヒドロキシル−アミトリプチリン及びＥ−１０−ヒドロキシル−アミトリプチリンである。
【００２１】
「アミトリプチリン」という用語は、さらに、上記の分子の全ての薬学的に許容される塩及び全ての複合体（例えば、水和物、溶媒和化合物及び包接物等）を包含する。特に好ましいアミトリプチリンの塩はアミトリプチリン塩酸塩である。この塩は、異なる商標名（Ｅｌａｖｉｌ、Ｔｒｙｐｔａｎｏｌ、Ｅｎｄｅｐ、Ｅｌａｔｒｏｌ、Ｔｒｙｐｔｉｚｏｌ、Ｔｒｅｐｉｌｉｎｅ、Ｌａｒｏｘｙｌ、Ｒｅｄｏｍｅｘ）で商品化され、通常、経口投与又は局所投与される。
【００２２】
アミトリプチリンは、鎮静特性を有する広く使用される三環系抗うつ剤である。より正確には、アミトリプチリンは、大うつ病性障害（ＭＤＤ）、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、全般不安症（ＧＡＤ）、社交不安症（ＳＡＤ）、パニック症、神経障害性疼痛、抵抗性疼痛、線維筋痛症、禁煙、慢性筋骨格痛、パーキンソン病における無動症、脱力発作、片頭痛、パーキンソン病、閉経期の血管運動症状、小児における夜尿症、月経前不快気分障害（ＰＭＤＤ）、双極Ｉ型障害、過食症及び強迫性障害（ＯＣＤ）の治療に現在使用されている。
【００２３】
この薬剤は現在、１日あたり７５乃至１２５ｍｇにてうつ病の治療、１日あたり５０乃至１５０ｍｇにて成人における末梢神経の神経障害性疼痛の治療、及び、小児の年齢に応じて１日あたり１０乃至５０ｍｇにて小児における夜尿症の治療又は予防に使用されている。
【００２４】
本発明者等は、本明細書において、アミトリプチリンはＣＮＳヘミチャネルの活性、特にＣｘ４３ベースのＨＣ活性を効率的に遮断することができるということを実証している（実施例１．２．１及び図１を参照）。
【００２５】
この結果は、近年の出版物が抗うつ剤による発現及び機能両方におけるＣｘ４３の増加をむしろ示しているため、完全に予期せぬものであった。実際に、ＳＳＲＩ（選択的セロトニン再取り込み阻害剤）フルオキセチン及びＳＮＲＩ（セロトニンノルエピネフリン再取り込み阻害剤）デュロキセチンは、ラットにおける２１日の処置後に前頭前野においてＣｘ４３発現を増加させるとして記載されてきた（Ｆａｔｅｍｉ  ｅｔ  ａｌ，２００８；Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１２）。アミトリプチリン自体も、マウスの皮質星状細胞培養において、Ｃｘ４３発現の増加に関連させられてきた（Ｍｏｒｉｏｋａ  ｅｔ  ａｌ，２０１４）。結果的に、アミトリプチリン投与がＣｘ４３発現及び細胞結合の増加をトリガするであろうとこれまで考えられていた。驚くべきことに、本発明者等の結果はむしろＣｘ機能の１つの減少を示している。
【００２６】
コネキシンは、「コネクソン」又は「ヘミチャネル」（ＨＣ）と呼ばれる六量体に多量体化するタンパク質サブユニットである。ヘミチャネルは、細胞質と細胞外媒体の間の直接的な伝達を可能にし、ＡＴＰ、ＮＡＤ＋及びグルタミン酸等、約１ｋＤａまでのサイズが異なる分子の放出をもたらす。
【００２７】
ヒトにおいて異なるコネキシンアイソフォームをコードする２１の遺伝子があり、ヘミチャネルの組成に関与するコネキシンモノマーの異なる組み合わせが記載されている。特に、コネキシン２６（Ｃｘ２６）、３６（Ｃｘ３６）、４３（Ｃｘ４３）、３２（Ｃｘ３２）、３７（Ｃｘ３７）及び３０（Ｃｘ３０）が、中枢神経系又は末梢神経系の細胞上でヒトにおいて発現する（Ｎａｋａｓｅ＆Ｎａｕｓ，２００４；Ｂａｒｏｊａ−Ｍａｚｏ，２０１３；Ｏｒｅｌｌａｎａ，２０１３）。
【００２８】
中枢神経系において、コネキシンは、星状細胞において主に存在し、コネキシン４３（Ｃｘ４３）を主に発現する。従って、Ｃｘ４３ヘミチャネルは、中枢神経系の最も一般的なヘミチャネルである。
【００２９】
第１の態様によると、本発明は、ＨＣ遮断薬としてのｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでのアミトリプチリンの使用に関係する。特に、本発明は、ＨＣ遮断薬として使用するためのアミトリプチリンに関する。
【００３０】
ヘミチャネルは、生理学的条件下では、通常閉鎖されており、低い開確率を有する。負の膜電位、高濃度の細胞外Ｃａ２＋及び細胞内Ｈ＋イオンは、ヘミチャネルを閉じる異なる条件であり、正の膜電位及び低い細胞外Ｃａ２＋は、ヘミチャネルを開く。さらに、病理学的条件が、ヘミチャネルの開口を駆動する。例えば、脳卒中、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症及びアルツハイマー病等、神経障害性疼痛、虚血性脳傷害及び神経変性障害は、ヘミチャネルの開口によって特徴づけられる。これは、アストログリオーシス及び神経興奮性においてそれぞれ暗示されるＡＴＰ及びグルタミン酸の放出をもたらす。
【００３１】
ＨＣは、異なるコネキシン（Ｃｘ３６、４３、３２、２６、３７、３０）によって構成され、従って、ＣＮＳ由来の又は由来ではない細胞（Ｂａｒｏｊａ−Ｍａｚｏ，２０１３；Ｏｒｅｌｌａｎａ，２０１３）：Ｃｘ３６由来の細胞（神経細胞、小膠細胞）、Ｃｘ４３由来の細胞（星状細胞、小膠細胞、角膜内皮細胞、心臓、軟骨細胞、平滑筋細胞）、Ｃｘ２６由来の細胞（星状細胞、神経細胞、蝸牛支持の内リンパ表面及び上皮細胞）、Ｃｘ３２由来の細胞（オリゴデンドロサイト、小膠細胞、神経細胞）、Ｃｘ３７由来の細胞（神経細胞、単球、内皮細胞）、Ｃｘ３０由来の細胞（蝸牛支持の内リンパ表面及び上皮細胞）によって発現される。
【００３２】
現在、異なる薬理学的ツールを使用して、ヘミチャネルを遮断することができる。カルベノキソロン等の非特異的なコネキシンヘミチャネルブロッカー、又は、擬態性ペプチドとしての特異的なコネキシンヘミチャネルブロッカー、ｇａｐ２６、ｇａｐ２７。ランタン（Ｌａ２＋）も、コネキシンヘミチャネルを特異的に遮断するために使用することができる。メフロキンは、Ｃｘ２６（Ｌｅｖｉｔ，２０１５）、Ｃｘ３６（Ｐｉｚａｒｒｏ−Ｄｅｌｇａｄｏ，２０１４）、Ｃｘ４６及びＣｘ５０（Ｓｒｉｎｉｖａｓ，２００５）、Ｃｘ４３（Ｋｈａｗａｊａ，２０１１）で構成されたヘミチャネルを、それらのアイソフォームに対して異なる選択性を有して（Ｓｒｉｎｉｖａｓ，２００５）、効率的に遮断する。ＭＦＡは、ヘミチャネルブロッカーとも呼ばれる（Ｒｉｃｈｔｅｒ，２０１４）。
【００３３】
以下の実験部分において開示されているように、アミトリプチリンは、コネキシンＣｘ４３から生成されるＨＣを抑制するのに特に効果的である。
【００３４】
従って、本発明は、抗コネキシン剤としてのアミトリプチリンのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用に関する。好ましくは、この薬剤を使用して、Ｃｘ２３、Ｃｘ２５、Ｃｘ２６、Ｃｘ３０、Ｃｘ３０．２、Ｃｘ３０．３、Ｃｘ３１、Ｃｘ３１．１、Ｃｘ３１．９、Ｃｘ３２、Ｃｘ３６、Ｃｘ３７、Ｃｘ４０、Ｃｘ４０．１、Ｃｘ４３、Ｃｘ４５、Ｃｘ４６、Ｃｘ４７、Ｃｘ５０、Ｃｘ５９及びＣｘ６２を含む群において選択されるコネキシンから生成されるＨＣを抑制することができる。好ましい実施形態では、アミトリプチリンは、Ｃｘ４３から生成されるＨＣを遮断するために使用される。
【００３５】
本明細書において、「ＨＣを遮断する」又は「ＨＣを抑制する」とは、ＨＣを発現する細胞において色素（蛍光色素、ＥｔＢｒ等）の拡散が有意に減少するか、又は、消滅さえすることを意味する。上記の細胞は、例えば、ＬＰＳによって活性化され、Ｃｘ４３を主に発現する皮質星状細胞である。薬剤の存在下での色素拡散の１５％、好ましくは３０％の減少は、本発明による「遮断」効果に相当する。色素の取り込み（ＥｔＢｒ、ＬＹ、ＹｏＰｒｏの取り込み等）、グルタミン酸の放出に対する比色分析のティーツェ法／比色分析アッセイ、グルタミン酸の放出に対するＨＰＬＣ分析、ＡＴＰの放出に対する生物発光ＡＴＰイメージング、ＡＴＰの放出に対するルシフェリン／ルシフェラーゼアッセイ、ＡＴＰ又はグルタミン酸の放出に対する酵素結合蛍光定量アッセイ、電気生理学的方法、ＨＣ電流の記録等、ＨＣに対する潜在的な遮断活性を同定するための他の方法が提案されてきた（Ｇｉａｕｍｅ，２０１３；Ｇｉａｕｍｅ，２０１０）。
【００３６】
好ましい実施形態では、アミトリプチリンは、Ｃｘ４３を遮断するために使用される。
【００３７】
アミトリプチリンは、その抗コネキシン活性のため、例えば癌（ＷＯ２００６／１３４４９４）、心血管疾患（ＷＯ２００６／１３４４９４）、創傷（ＷＯ２００６／１３４４９４）、片頭痛（Ｄｕｒｈａｍ  ａｎｄ  Ｇａｒｒｅｔｔ、２００９）、てんかん（Ｐａｔｅｌ  ２０１２）、神経学的状態及び神経変性障害（Ｔａｋｅｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）、虚血（Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１３）、薬物性肝障害（Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ，２０１２）、感染症（ＷＯ２０１１／０６７６０７）、化学療法剤によって誘発される細胞毒性（Ｔｏｎｇ  Ｘ  ｅｔ  ａｌ，２０１３）及び炎症性障害（ＷＯ２００６／１３４４９４）等、コネキシン活性を伴うことが知られている多くの障害及び状態の治療に使用することができる。
【００３８】
アミトリプチリンは、そのＨＣ遮断活性のため、ＨＣ活性を伴うことが知られている多くの障害及び状態の治療に使用することができる。これらの障害及び状態には：
・神経障害性疼痛［神経障害性疼痛におけるＨｅＣ活性の増加に関連するＡＴＰ放出及び膠細胞活性化の増加（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２０１２；Ｏ´Ｃａｒｒｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ，２０１３）］
・脳卒中、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症及びアルツハイマー病等の神経変性障害［ＨｅＣを経たＡＴＰ及びグルタミン酸の放出を介する（Ｏｒｅｌｌａｎａ  ｅｔ  ａｌ，２０１０；Ｋｏｕｌａｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ，２０１２；Ｔａｋｅｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ，２０１４）
・虚血性脳傷害（Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１３；Ｂａｒｏｊａ−Ｍａｚｏ，２０１３）
・胃炎及び消化性潰瘍疾患、炎症性の腸の状態、急性肝不全、胆汁うっ滞、肝炎及び脂肪肝、肝線維症及び肝硬変、感染性胃腸症状、並びに、胃腸癌及び肝癌（Ｍａｅｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１５）
・アテローム性動脈硬化症（Ｂａｒｏｊａ−Ｍａｚｏ，２０１３）
・視神経疾患（Ｚｈａｎｇ，２０１４）
・細菌感染症及びウイルス感染症（Ｖｅｇａ，２０１３）
・特定のＣｘ突然変異における異常なＨＣ機能に付随する白内障（先天性白内障、膨張性白内障、初期の皮質白内障、成熟皮質白内障、過熟皮質白内障、モルガーニ白内障、前嚢下白内障、後嚢下白内障又は核白内障）等の水晶体の症状（Ｂｅｙｅｒ，２０１４；Ｍａｎｄａｌ，２０１５；Ｒｈｏｄｅｓ，２００９）
・染色体６（ｑ２１〜ｑ２３．２）に位置するＣｘ４３遺伝子における突然変異によって引き起こされる主に常染色体優性遺伝疾患である眼歯指症候群又は眼歯指形成異常（ＯＤＤＤ）（特定の突然変異が、ＨＣ機能の増加をもたらし、ＨＣ阻害剤による異常なＨＣ過剰活性の減少が、ＯＤＤＤのいくつかの症状を治療し得る）（Ａｖｓｈａｌｕｍｏｖａ，２０１４；Ｐａｚｎｅｋａｓ，２００９；Ｄｅ  Ｂｏｃｋ  ２０１３）
・視神経症（例えば、脱髄、非動脈炎性、虚血性、動脈炎性、浸潤性、圧迫性、中毒性／栄養性、遺伝性、外傷性、傍腫瘍性障害又は放射線による）（Ｂｅｈｂｅｈａｎｉ，２００７；Ｙ．Ｓ．Ｃｈｅｎ，２０１３；Ｄａｎｅｓｈ−Ｍｅｙｅｒ，２０１２）
・角膜炎（及びヤマアラシ皮状）魚鱗癬聾（ＫＩＤ／ＨＩＤ）症候群（ＨＣの異常な過剰活性が、この症候群に付随し、この異常な過剰活性の減少がこれらのタイプの難聴症候群を治療し得る）（Ｊａｎ，２００４；Ｓａｎｃｈｅｚ、２０１４）
・クロウストン症候群又は発汗性外胚葉形成異常症（ＨＥＤ）（特定のＣｘ突然変異における異常なＨＣ機能に付随する）（Ｂａｂｏｕ，２０１５）
・胎児及び新生児において発生する低酸素性脳虚血（仮死）（ヘミチャネル機能の低下が、脳活動の回復の改善、発作活動の減少、及び、胎児睡眠状態の循環へのより迅速な復帰に付随し、出産が近い胎児における虚血に続く。（Ｖａｎｎｕｃｃｉ，２０００；Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ２００１）
・Ｐｅｌｉｚａｅｕｓ−Ｍｅｒｚｂａｃｈｅｒ病（ＰＭＤ）及び関連する白質ジストロフィー（特定のＣｘ突然変異における異常なＨＣ機能に付随する）（Ｈｏｂｓｏｎ，２０１２；Ｄｉｅｋｍａｎｎ，２０１０）
・若年型神経セロイドリポフスチン症（ＪＮＣＬ）又は若年型Ｂａｔｔｅｎ病（特定のＣｘ突然変異における異常なＨＣ機能に付随する）（Ｗａｎｇ，２０１２；Ｂｕｒｋｏｖｅｔｓｋａｙａ，２０１４）
が含まれる（がこれらに限定されない）。
【００３９】
より好ましくは、アミトリプチリンは、脳卒中、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症及びアルツハイマー病等の神経変性障害又は虚血性脳傷害の予防及び／又は治療に使用することができる。
【００４０】
さらにより好ましくは、アミトリプチリンは、胃炎及び消化性潰瘍疾患、炎症性の腸の状態、急性肝不全、胆汁うっ滞、肝炎及び脂肪肝、肝線維症及び肝硬変、感染性胃腸症状、並びに、胃腸及び肝臓の癌の予防及び／又は治療に使用することができる。
【００４１】
さらにより好ましくは、アミトリプチリンは、白内障（先天性白内障、膨張性白内障、初期の皮質白内障、成熟皮質白内障、過熟皮質白内障、モルガーニ白内障、前嚢下白内障、後嚢下白内障又は核白内障）等の水晶体の症状、眼歯指症候群又は眼歯指形成異常（ＯＤＤＤ）、視神経症、角膜炎（及びヤマアラシ皮状）魚鱗癬聾（ＫＩＤ／ＨＩＤ）症候群、クロウストン症候群又は発汗性外胚葉形成異常症（ＨＥＤ）、胎児及び新生児において発生する低酸素性脳虚血（仮死）、Ｐｅｌｉｚａｅｕｓ−Ｍｅｒｚｂａｃｈｅｒ病（ＰＭＤ）及び関連する白質ジストロフィー、又は、若年型神経セロイドリポフスチン症（ＪＮＣＬ）又は若年型Ｂａｔｔｅｎ病の予防及び／又は治療に使用することができる。
【００４２】
これらの適応症において、アミトリプチリンは、例えば、成人の対象に対しては１日当たり１乃至１５０ｍｇ、及び、子供に対しては１日当たり１乃至５０ｍｇの間等、以前に開示された用量で使用することができる。
【００４３】
上述のように、アミトリプチリンは有効性に限界があり、耐容性の低い副作用が与えられる（Ｍｏｏｒｅ，２０１５）。従って、本発明者等は、アミトリプチリンの治療効果を増強し、治療対象に対するその副作用を低減することを目的とした。
【００４４】
本発明者等は、神経変性及び精神障害のモデルとして、神経障害性疼痛、うつ病、睡眠障害又は神経炎症を患う動物モデルにおいてアミトリプチリンとメフロキンとの間に相乗効果が生じるということを見出した（図２〜５、７、１０及び１３を参照）。興味深いことに、この相乗作用は、アミトリプチリンがより効率的なＨＣ遮断薬（メクロフェナム酸、図７及び１１を参照）又は別のＨＣ遮断薬（ニフルミン酸、図１１を参照）と組み合わされた場合には観察されなかったように、非常に特異的である。
【００４５】
さらに、この相乗作用をｉｎ  ｖｉｖｏでのみ観察した：アミトリプチリンをメフロキンと組み合わせることは、Ｃｘ４３を発現する活性化された皮質性の星状細胞の細胞においてｉｎ  ｖｉｔｒｏでそのＨＣ遮断活性を増強しない。これは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのアミトリプチリンのメフロキン媒介の増強が、おそらくＨＣ遮断以外の１つ又は複数の機構を含むことを示唆している。
【００４６】
メフロキンは、（Ｒ*，Ｓ*）−（±）−α−２−ピペリジニル−２，８−ビス（トリフルオロメチル）−４−キノリンメタノールの特定の化学名を有する４−キノリンメタノール誘導体である。そのＣＡＳ番号は５３２３０−１０−７である。その２Ｄ式は次のとおりである。
【００４７】
【化２】
0006720301.tif 000003
メフロキンは、１つの主要な薬理学的に不活性な代謝産物、カルボキシメフロキン（２，８−ビス−トリフルオロメチル−４−キノリンカルボン酸）まで、及び、より少ない程度でヒドロキシメフロキンまでＣＹＰ３Ａ４によって代謝される（Ｆｏｎｔａｉｎｅ，２０００）。
【００４８】
主な代謝産物は、２，８−ビストリフルオロメチル−４−キノリンカルボン酸である。カルボン酸代謝産物は、１回の経口投与の２乃至４時間後に血漿中に現れた。メフロキンよりも約５０％高かった最大血漿濃度は、２週間後に達した。その後、主な代謝産物及びメフロキンの血漿レベルは、類似の速度で低下した。主な代謝産物の血漿濃度時間曲線下面積（ＡＵＣ）は、親薬物の３乃至５倍であった。他の代謝産物であるヒドロキシメフロキンは、少量でしか存在しない。
【００４９】
メフロキン塩酸塩の錠剤が、熱帯熱マラリア原虫のメフロキン感受性株（クロロキン感受性及び耐性両方の株）によって、又は、三日熱マラリア原虫によって引き起こされる軽度から中等度の急性マラリアの予防又は治療のために示される。
【００５０】
「メフロキン」という用語は、さらに、全ての薬学的に許容される塩、全ての複合体（例えば、水和物、溶媒和化合物及び包接化合物）、上記の分子の全てのプロドラッグ及び全ての誘導体（例えば、カルボキシ−メフロキン（２，８−ビス−トリフルオロメチル−４−キノリンカルボン酸）及びヒドロキシル−メフロキン（Ｆｏｎｔａｉｎｅ，２０００））を包含する。メフロキンの特に好ましい塩は、メフロキン塩酸塩である。この塩は、Ｌａｒｉａｍ、Ｍｅｐｈａｑｕｉｎ又はＭｅｆｌｉａｍの商品名で商品化され、経口投与される。
【００５１】
他のＨＣ遮断薬ＭＦＡとして、メフロキンは神経障害性疼痛の治療として既に提案されてきた。しかし、ｉｎ  ｖｉｖｏモデルではいかなる効果も示さなかった（Ｉｚｚｏ，１９９１；Ｘｕ，２０１４）。
【００５２】
従来のメフロキン（Ｌａｒｉａｍ）の用量は、マラリアを患うヒト成人を治療するために単一用量で約１２５０ｍｇであり、マラリア予防には１週あたり約２５０ｍｇである。小児（体重４５ｋｇ未満）には、マラリア治療のために１回の投与で２０〜２５ｍｇ／ｋｇ、及び、マラリア予防のために１週あたり５ｍｇ／ｋｇ投与することができる。
【００５３】
メフロキンは４つの異なる立体異性体を有する。この薬物は現在、エリスロ−（Ｒ，Ｓ）−及びエリスロ−（Ｓ，Ｒ）−エナンチオマーのラセミ体として製造及び販売されている。しかし、本発明のコンビネーション製品において使用される「メフロキン」という用語は、各エナンチオマー（（Ｒ，Ｓ）又は（Ｓ，Ｒ））又は立体異性の混合物（ラセミ体）のそれぞれであり得る。ジアステレオ異性体スレオ−メフロキンも使用することができる（Ｂｅｒｍｕｄｅｚ，２０１２；Ｍｕｌｌｅｒ，２０１３）。
【００５４】
本発明においては、アミトリプチリン系抗うつ剤の活性を増強するために、メフロキンのいかなる立体異性体（Ｓ−エリスロ−メフロキン、Ｒ−エリスロ−メフロキン、Ｓ−スレオ−メフロキン又はＲ−スレオ−メフロキン等）を使用することができる。
【００５５】
メフロキンと部分的な構造的同一性を有する分子を、さらに、本発明のコンビネーション製品において使用することができる。これらの分子は、例えば、キノリンメタノール、より正確にはキニーネ及びキニジンであり、キナツリーの樹皮から単離される抗マラリア剤である。また、クロロキン、プリマキン、タフェノキン、パマキン、アモジアキン、ペンタキン、イソペンタキン、キノシド、エルバキン（ｅｌｕｂａｑｕｉｎｅ）及びブラキン（ｂｕｌａｑｕｉｎｅ）に言及することができ、これらも本発明のコンビネーション製品に使用することができる。
【００５６】
この場合、「増強する」という用語は、メフロキンがアミトリプチリンの治療効果を有意に増加させることを意味する。従って、メフロキンとアミトリプチリンとの組み合わせは、上記の向精神薬の用量を減らし、従って、上記の向精神薬の副作用を制限し、及び／又は、上記の向精神薬の用量を増加させることなくより強い治療効果を得ることを可能にする。
【００５７】
メフロキンの増強効果は、対象へのアミトリプチリンの投与の前、投与と同時又は投与の後に、上記の対象にメフロキン（その塩、そのプロドラッグ、誘導体又はエナンチオマー）を投与することによって達成することができる。
【００５８】
結果的に、本発明は、精神障害及び／又は神経変性障害を有する対象を治療する方法を記載しており、当該方法は、ａ）メフロキン（その塩、そのプロドラッグ、誘導体又はエナンチオマー）及びｂ）アミトリプチリン（又はその塩、プロドラッグ若しくは誘導体）の上記の対象への投与を含み、当該方法において、上記の化合物ａ）及びｂ）は、同時に、別々に又は時間と共に間隔をあけて投与される。
【００５９】
重要なことに、アミトリプチリンの治療効果を高めるには、低用量のメフロキンで十分である。本明細書において「低用量のメフロキン」とは、それ自体では、治療される対象においていかなる治療効果も誘発することができない用量を意味する。従って、上記の用量は、典型的に、マラリアを予防又は治療するための現在承認されている用量よりも低い。この低用量は、好ましくは、成人の対象に対して１日あたり１０μｇ乃至５０ｍｇの間に含まれる。より好ましくは、成人の対象に対して、１日あたり１００μｇ乃至２５ｍｇの間、さらにより好ましくは１日あたり５００μｇ乃至２０ｍｇの間、さらにより好ましくは１日あたり１ｍｇ乃至２５ｍｇの間、さらに、最も好ましくは１日あたり１ｍｇ乃至１０ｍｇの間に含まれる。これらの用量は、明らかに、小児に対して調整されなければならない。
【００６０】
本発明者等は、アミトリプチリンの最適な増強を誘発するメフロキンの用量は、ヒトにおいて従来使用されるメフロキンの用量（通常１０００乃至２０００ｎｇ／ｍＬ）で得られる血漿曝露の約１０％の血漿曝露をもたらすことを実証した。より多い、すなわち、従来使用されているものに近いメフロキンの用量は、アミトリプチリンを増強する効果があまりない（図１０及び１２）。
【００６１】
例えば、Ｍａｒｇｉｎｅａｎｕ  ａｎｄ  Ｋｌｉｔｇａａｒｄ，２００６は、１００乃至２００μＭのメフロキン脳濃度を有するコネキシンのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抑制効果を記載している。対照的に、本発明者等は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのアミトリプチリンの増強が、マイクロモルスケールの血漿及び脳中のメフロキン濃度、すなわち１００倍未満で最適であることを実証した（図１２）。
【００６２】
この治療を必要としている対象は、例えば、大うつ病性障害（ＭＤＤ）、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、不安、全般不安症（ＧＡＤ）、社交不安症（ＳＡＤ）、パニック症、神経障害性疼痛、抵抗性疼痛、線維筋痛症、禁煙、慢性筋骨格痛、パーキンソン病における無動症、脱力発作、片頭痛、夜尿症、小児における夜尿症、夜驚症、呼吸障害、パーキンソン病、閉経期の血管運動症状、月経前不快気分障害（ＰＭＤＤ）、不安症候群（Ｗｉｌｌｉｓ−Ｅｋｂｏｍ病）、唾液分泌過多（よだれ、流涎過多）、筋委縮性側索硬化症における唾液分泌過多（よだれ、流涎過多）、双極Ｉ型障害、過食症及び強迫性障害（ＯＣＤ）を含む群に含まれるもの等、アミトリプチリンによって治療されるとして既知の精神障害、神経障害及び／又は神経変性障害を有し得る。
【００６３】
より正確には、上記の対象は、異なる種類の疼痛、例えば、神経障害性疼痛と同じ疾病分類学的実体に属する帯状疱疹後神経障害性疼痛、糖尿病性神経障害性疼痛、外科後神経障害性疼痛、化学療法後神経障害性疼痛、脳卒中後神経障害性疼痛、癌治療後神経障害性疼痛若しくは化学的予防後神経障害性疼痛、ＨＩＶ後神経障害性疼痛、慢性背部神経障害性疼痛、腰背部神経障害性疼痛、外傷性神経障害、多発性硬化症疾患若しくは他の免疫疾患に関連する神経障害性疼痛、又は、脊髄損傷によって誘発される神経障害性疼痛を患い得る（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，２００６；Ｐａｓｅｒｏ，２００４）。
【００６４】
本発明者等は、強制水泳試験（ＦＳＴ）を受けたマウスに対する本発明のコンビネーション製品の相乗効果を実証した（図４）。この試験は、多くの神経障害：  
−  大うつ病性障害（Ｙａｎｋｅｌｅｖｉｔｃｈ−Ｙａｈａｖ，２０１５）
−  双極性障害（ｖａｎ  Ｅｎｋｈｕｉｚｅｎ，２０１５）
−  疲労（Ｇｕｏ，２０１５年）
−  （神経障害性疼痛に付随する）うつ病（ＥＩＢａｔｓｈ，２０１５）
−  統合失調症における陰性症状（Ｍｏｕｒｉ，２００７；Ｎａｂｅｓｈｉｍａ，２００６；Ｒｕｓｓｏ，２０１３）
−  統合失調症における過度のアルコール飲酒による負の効果（Ｌｅｅ，２０１５）
−  パーキンソン病及びレビー小体型認知症におけるうつ病（Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ，２００３）
のモデルとして提案されてきた。
【００６５】
従って、本発明のコンビネーション製品は、上記の障害のいずれも予防及び／又は治療するために効率的に使用することができる。
【００６６】
さらに、本発明者等は、マウスのＲＥＭ睡眠持続時間に対する本発明のコンビネーション製品の相乗効果を実証した（図５）。このバイオマーカーは、多くの神経障害：
−  大うつ病性障害（ＭＤＤ）（Ｐａｌａｇｉｎｉ，２０１３）
−  不眠症（うつ病との併存疾患）（Ｓｔａｎｅｒ，２０１０）
−  特発性ＲＥＭ睡眠障害（Ｐｏｓｔｕｍａ，２０１５）
−  睡眠時歯ぎしり（Ｓａｈｉｎ  Ｏｎａｔ，２０１４）
−  線維筋痛症における睡眠障害（Ｒｏｉｚｅｎｂｌａｔｔ，２０１１）
−  睡眠時無呼吸（Ｍｕｓａ，１９８８）
−  多発性硬化症（Ｖｅａｕｔｈｉｅｒ，２０１５）
−  神経変性疾患（パーキンソン病、レビー小体型認知症、アルツハイマー病、多系統萎縮症）（Ｆｅｒｉｎｉ−Ｓｔｒａｍｂｉ，２０１４；Ｆｅｒｍａｎ，１９９９）
に付随してきた。
【００６７】
従って、本発明のコンビネーション製品は、上記の障害のいずれも予防及び／又は治療するために効率的に使用することができる。
【００６８】
さらに、本発明者等は、マウスに対してＬＰＳモデルを使用して、神経炎症に対する本発明のコンビネーション製品の相乗効果を実証した（図１３）。このモデルは、多くの神経変性障害：
−  アルツハイマー病
−  パーキンソン病
−  ハンチントン病
−  多発性硬化症
−  筋萎縮性側索硬化症
及び、精神障害：
−  ストレス
−  うつ病
−  双極性障害
−  統合失調症
−  自閉症
（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｒｅｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）
に付随する神経炎症を特徴づけるために広く使用されてきた（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｒｅｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【００６９】
従って、本発明のコンビネーション製品は、大うつ病性障害（ＭＤＤ）、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、不安、全般不安症（ＧＡＤ）、社交不安症（ＳＡＤ）、パニック症、神経障害性疼痛、抵抗性疼痛、線維筋痛症、禁煙、慢性筋骨格痛、パーキンソン病における無動症、脱力発作、片頭痛、夜尿症、小児における夜尿症、夜驚症、呼吸障害、不眠症、パーキンソン病、閉経期の血管運動症状、月経前不快気分障害（ＰＭＤＤ）、不安症候群（Ｗｉｌｌｉｓ−Ｅｋｂｏｍ病）、唾液分泌過多（よだれ、流涎過多）、筋委縮性側索硬化症における唾液分泌過多（よだれ、流涎過多）、双極Ｉ型障害、過食症、強迫性障害（ＯＣＤ）、疲労、アルツハイマー病、ハンチントン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、ストレス、うつ病、パーキンソン病及びレビー小体型認知症におけるうつ病、統合失調症、自閉症、ＲＥＭ睡眠障害、特発性ＲＥＭ睡眠障害、睡眠時歯ぎしり、線維筋痛症における睡眠障害、睡眠時無呼吸、結合織炎を含む上記の障害のいずれも予防及び／又は治療するために効率的に使用することができる。
【００７０】
同時使用の場合、本発明の治療の２つの有効成分は同時に対象に投与される。本発明のこの実施形態によると、２つの有効成分は、共に、混合物の形態で包装することができるか、又は、別々に包装され、その後、患者に共に投与される前に即座に混合することができる。
【００７１】
好ましい実施形態では、２つの有効成分は、経口投与されるように、溶液、カプセル、錠剤、シロップ、ペースト、ゲル、速崩壊錠、遅延放出錠剤、マイクロドーズ錠剤、軟膏、クリーム、粉末、エアロゾルスプレー、ロゼンジ等に含まれる。
【００７２】
別の好ましい実施形態では、２つの有効成分は、局所的に適用されるように、クリーム、軟膏、スプレー、ペースト、接着パッチ等に含まれ得る。
【００７３】
或いは、本発明の治療の２つの有効成分は、別々に投与することができる。特に、その投与経路は異なっていてもよい。その投与は、異なる部位にて行うこともできる。この実施形態では、２つの有効成分は、同時に、経時的に、又は、例えば（数時間あけて）同じ日又は１日、１週間又は１ヶ月の間隔等、時間と共に間隔をあけて投与することができる。
【００７４】
別々の投与の場合、先に開示された形態のいずれかで、メフロキンは経口投与することができ、アミトリプチリンは局所投与することができる。或いは、２つの有効成分は、先に開示された形態のいずれかで経口的に（ただし別々に）投与することができる。また、２つの有効成分は、先に開示された形態のいずれかで局所的に提供することができる。
【００７５】
メフロキンはアミトリプチリンの効果を増強するため、上記の向精神薬の用量を減少させ、その結果、その有害作用を制限し、及び／又は、失敗及び退薬のリスクを低減するために有利に使用することができる。
【００７６】
アミトリプチリンの効果的な等価用量、すなわち、メフロキンと組み合わせて投与された場合に、有効な薬理学的用量にてアミトリプチリン単独で投与された場合と類似又は同一の生理学的効果又は薬理学的特性を誘発するアミトリプチリンの用量は、約０．５である。言い換えると、メフロキンと組み合わせた場合、アミトリプチリンの用量を２分の１に（２倍）減少させることが可能である。この（メフロキンと組み合わせた）半用量の治療効果は、アミトリプチリン単独の完全用量の治療効果と同様である。
【００７７】
本明細書において「対象」とは、いかなる動物又はヒトも意味する。当該対象は、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。
【００７８】
別の態様によると、本発明は、メフロキン及びアミトリプチリンを含む組成物、特に医薬組成物に関係する。この組成物は、好ましくは、先に開示された精神障害及び／又は神経変性障害を患っている患者に対して処方される。メフロキン及びアミトリプチリンに加えて、組成物は、当技術分野において頻繁に使用されるいかなる薬剤溶媒、安定化剤、アジュバント等も含み得る。
【００７９】
薬学的に許容される溶媒の例として：水；限定されないが、塩化ナトリウム溶液、リンゲル液、ブドウ糖溶液、ブドウ糖及び塩化ナトリウムの溶液、及び、乳酸リンゲル液等の水性溶媒；限定されないが、エチルアルコール、ポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコール等の水混和性溶媒；並びに、限定されないが、コーン油、綿実油、ピーナッツ油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル及び安息香酸ベンジル等の非水性溶媒；が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
上記のように、本発明の組成物は、好ましくは、経口投与（頬側口腔又は舌下を含む）又は局所投与のために処方される。他の興味深い処方には、腹腔内（ｉ．ｐ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、経皮的、経皮性、くも膜下腔内及び頭蓋内投与のための処方が含まれる。さらに他の処方には、硬膜外、粘膜下、鼻腔内、眼球結膜嚢（ｏｃｕｌａｒ  ｃｕｌ−ｄｅ−ｓａｃ）及び直腸の経路の投与、並びに、肺吸入による投与が含まれる。
【００８１】
経口投与の場合、上記の組成物は、溶液、カプセル、錠剤、シロップ、ペースト、ゲル、速崩壊錠、遅延放出錠剤、マイクロドーズ錠剤、軟膏、クリーム、粉末、エアロゾルスプレー又はロゼンジであり得る。
【００８２】
局所投与の場合、上記の組成物は、クリーム、軟膏、スプレー、ペースト又は接着パッチであり得る。
【００８３】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、（成人に対して）１乃至１５０ｍｇ／日又は（小児に対して）１０乃至５０ｍｇ／日のアミトリプチリンを送達することを可能にする（又は含有する）。
【００８４】
別の好ましい実施形態によると、本発明の組成物は、１日あたり１０μｇ乃至１５０ｍｇ、好ましくは１日あたり１００μｇ乃至５０ｍｇのアミトリプチリンを送達することを可能にする（又は含有する）。
【００８５】
別の好ましい実施形態によると、本発明の組成物は、１日あたり１ｍｇ乃至１００ｍｇ、好ましくは１日あたり１ｍｇ乃至７５ｍｇ、より好ましくは１日あたり１ｍｇ乃至５０ｍｇ、さらにより好ましくは１日あたり１ｍｇ乃至５０ｍｇのアミトリプチリンを送達することを可能にする（又は含有する）。
【００８６】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、１日あたり１０μｇ乃至５０ｍｇのメフロキンを送達する（又は含有する）ように処方される。より好ましくは、上記のメフロキンの用量は、成人の対象に対して、１日あたり１００μｇ乃至２５ｍｇ、さらにより好ましくは１日あたり５００μｇ乃至２０ｍｇ、さらにより好ましくは１日あたり１ｍｇ乃至２５ｍｇ、さらに、最も好ましくは１日あたり１ｍｇ乃至１０ｍｇ含まれる。これらの用量は、明らかに、小児に対して調整されなければならない。
【００８７】
より好ましい実施形態では、本発明の組成物は、１日あたり１ｍｇ乃至１００ｍｇのアミトリプチリン、好ましくは１日あたり１ｍｇ乃至７５ｍｇのアミトリプチリン、より好ましくは１日あたり１ｍｇ乃至５０ｍｇのアミトリプチリン、さらにより好ましくは１日あたり１ｍｇ乃至１５ｍｇのアミトリプチリン、並びに、成人の対象に対して１日あたり１ｍｇ乃至２５ｍｇのメフロキン、より好ましくは成人の対象に対して１日あたり１ｍｇ乃至１０ｍｇのメフロキンを送達するように処方される。この組成物は、例えばパッチ又は錠剤である。
【００８８】
好ましくは、上記の組成物は、１日あたり所定の用量の有効成分を容易に送達するパッチ又は錠剤である。従って、本発明は、上記の１日量の２つの有効成分、メフロキン及びアミトリプチリン（例えば、１ｍｇ乃至５０ｍｇのアミトリプチリン及び１ｍｇ乃至２５ｍｇのメフロキン）を含有するパッチ又は錠剤を対象とする。
【００８９】
さらに、本発明は、大うつ病性障害（ＭＤＤ）、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、不安、全般不安症（ＧＡＤ）、社交不安症（ＳＡＤ）、パニック症、神経障害性疼痛、抵抗性疼痛、線維筋痛症、禁煙、慢性筋骨格痛、パーキンソン病における無動症、脱力発作、片頭痛、夜尿症、小児における夜尿症、夜驚症、呼吸障害、不眠症、パーキンソン病、閉経期の血管運動症状、月経前不快気分障害（ＰＭＤＤ）、不安症候群（Ｗｉｌｌｉｓ−Ｅｋｂｏｍ病）、唾液分泌過多（よだれ、流涎過多）、筋委縮性側索硬化症における唾液分泌過多（よだれ、流涎過多）、双極Ｉ型障害、過食症、強迫性障害（ＯＣＤ）、疲労、アルツハイマー病、ハンチントン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、ストレス、うつ病、パーキンソン病及びレビー小体型認知症におけるうつ病、統合失調症、自閉症、ＲＥＭ睡眠障害、特発性ＲＥＭ睡眠障害、睡眠時歯ぎしり、線維筋痛症における睡眠障害、睡眠時無呼吸、結合織炎等の疾患及び状態の予防及び／又は治療に使用されることが意図される薬物の調製におけるメフロキン及びアミトリプチリン（好ましくはその塩酸塩）の使用に特に関する。
【００９０】
好ましい実施形態では、本発明は、疲労、不眠症、夜尿症、夜驚症、睡眠時歯ぎしり、呼吸障害、ＲＥＭ睡眠障害、睡眠時無呼吸、結合織炎の予防及び／又は治療に使用されることが意図される薬物の調製におけるメフロキン及びアミトリプチリン（好ましくはその塩酸塩）の使用に関する。
【００９１】
より好ましい実施形態では、本発明は、大うつ病性障害、神経障害性疼痛、不安、線維筋痛症、閉経期の血管運動症状、夜尿症を予防及び／又は治療するためのメフロキン及びアミトリプチリンの使用に関する。
【００９２】
より好ましい実施形態では、本発明は、異なる種類の疼痛、例えば、帯状疱疹後神経障害性疼痛、糖尿病性神経障害性疼痛、外科後神経障害性疼痛、化学療法後神経障害性疼痛、脳卒中後神経障害性疼痛、癌治療後神経障害性疼痛若しくは化学的予防後神経障害性疼痛、ＨＩＶ後神経障害性疼痛、慢性背部神経障害性疼痛、腰背部神経障害性疼痛、外傷性神経障害、多発性硬化症疾患若しくは他の免疫疾患に関連する神経障害性疼痛、又は、脊髄損傷によって誘発される神経障害性疼痛を予防及び／又は治療するためのメフロキン及びアミトリプチリンの使用に関する。
【００９３】
別の態様では、本発明は、神経障害性疼痛、睡眠障害又はうつ病を予防及び／又は治療するのに効率的である（従って、そのために使用することができる）化学化合物を同定するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法に関し、当該方法は、上記の化合物が、ＨＣ、特にＣｘ４３に基づくＨＣを遮断することができるかどうかを試験することを含む。
【００９４】
試験された化合物は、使用されるモデルにおいてＨＣ活性を有意に遮断することを可能にする場合に選択されることになる（１５％のＨＣ活性低下が、試験された化合物が神経障害性疼痛、睡眠障害又はうつ病に対して有望な治療効果を有すると考えるのに十分である）。
【００９５】
この方法において、ＨＣ遮断活性は、例えば、ＥｔＢｒ等の色素又は拡散分子の存在下で、上記の化合物を、活性化された皮質星状細胞培養物と接触させることによって、上記のように検出することができる。
【００９６】
本発明の他の特徴はまた、本発明の枠組みで実施され、且つ、本発明の範囲を限定することなく必要な実験的支持を与える生物学的アッセイに続く記載の過程で明らかになる。
【実施例１】
【００９７】
神経障害性疼痛（痛覚過敏）、うつ病及び睡眠障害に対するアミトリプチリン及びメフロキンの効果並びに増強の特異性
１．１．材料及び方法
細胞培養物
星状細胞培養物を、以前に記載されたようにラット及びマウスの皮質から調製した（Ｍｅｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。細胞を、ポリオルニチンで覆われた３５ｍｍディッシュ（５×１０５細胞／ディッシュ）上に又は１００ｍｍ直径のプラスチックディッシュ内に、３×１０６細胞／ディッシュの密度で播種した。８乃至１０日後、直径が３５ｍｍのプラスチック培養ディッシュ内に増殖した細胞がコンフルエンスに達したときに、１μＭのシトシン−アラビノシドを培地に添加した。加えて、１００ｍｍのプラスチック培養ディッシュ内に増殖した細胞がコンフルエンスに達したときに、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて回収した。次に、細胞を、２４ラウンドウェルプレートの内側に置いたカバーガラス上に二次培養として再播種した（１つのウェルあたり２×１０５細胞）。最後に、その細胞をコンフルエンスになるまで増殖させ、シトシン−アラビノシドを添加した。実験が実行されるまで、培地を全ての細胞に対して週２回変えた。
【００９８】
スクレープ負荷／色素移動技術
３５ｍｍのプラスチック培養ディッシュ内に増殖した初代星状細胞について実験を行った。簡単に説明すると、まず、細胞をＨＥＰＥＳ緩衝塩溶液において１０分間インキュベートした。次に、細胞を１分間Ｃａ２＋を含まないＨＥＰＥＳ溶液において洗浄し、さらに、以前に記載されているように１ｍｇ／ｍＬのルシファーイエロー（ＬＹ）を含有する同じＣａ２＋を含まない溶液においてスクレープ負荷／色素移動を達成した（Ｇｉａｕｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。１分後、その細胞をＨＥＰＥＳ溶液で洗浄し、細胞において負荷されたＬＹを、８分の間にＧＪＣを介して拡散させた。全ての実験において、ＧＪＣを介したダイカップリングを、蛍光画像を撮ることによってスクレープから８分後に評価した。
【００９９】
皮質の星状細胞培養物における色素摂取
既に報告されているように、臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）の摂取によって皮質の星状細胞の二次培養物においてヘミチャネル活性を評価した（Ｏｒｅｌｌａｎａ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）。実験の２４時間前に、細胞を、Ｃｘ４３ＨｅＣを開くと知られている１μｇ／ｍｌのＬＰＳで前処理したか又はしなかった。実験の日、まず細胞をＨＥＰＥＳ緩衝溶液においてプレインキュベートした。次に、細胞を、室温にて１０分間、５μＭのＥｔＢｒに曝露した。次に、細胞を同じ緩衝液で洗浄した後、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで固定した。固定した細胞を、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて４０ｘで検査した。０．４９μｍ間隔で撮影した１０の連続した共焦点画像のスタックを取得した。各実験条件に対して、６枚の画像をキャプチャし、次に、Ｉｍａｇｅ  Ｊ  ｐｒｏｇｒａｍ（ＮＩＨソフトウェア）を用いて分析した。
【０１００】
動物
神経障害性疼痛、睡眠覚醒及びＦＳＴの実験に対して、雄のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット、Ｃ５７ＢＬ／６マウス及びＳｗｉｓｓ  ＣＤ１雄マウスをそれぞれ使用した。
【０１０１】
動物を全て、到着時に、少なくとも１週間、いかなる行動試験又は手術の前に収容設備に慣れさせた。動物を同じ条件下で維持した。全ての実験を、神経科学研究における動物の使用に対する国内法及び国際法並びに方針を遵守した機関のガイドラインと一致して行った。
【０１０２】
坐骨神経に対する絞扼性神経損傷及び行動試験
その到着の１週間後、ラットをペントバルビタールナトリウムで麻酔した後で、一般的な坐骨神経を露出させた。  Ｂｅｎｎｅｔｔの論文に記載されているように、４つのクロム腸線（５−０）の結紮を、坐骨神経三枝分岐（ｓｃｉａｔｉｃ  ｔｒｉｆｕｒｃａｔｉｏｎ）の近位にゆるく結んだ（Ｂｅｎｎｅｔｔ  ａｎｄ  Ｘｉｅ，１９８８）。
【０１０３】
全ての行動評価を、静かな部屋で午前９時から午後５時まで遂行した。痛覚過敏様の行動を評価するために、ＳＮ−ＣＣＩ（坐骨神経−絞扼性神経損傷）ラットの右後肢に増加する圧力を加えた（Ｖｉｇｕｉｅｒ  ａｎｄ  ａｌ，２０１３）。値は、ラットの足の引き込みをもたらす圧力閾値に対応し、次に、ラットの啼鳴をもたらす圧力閾値に対応する。
【０１０４】
ラットの脳及び血清におけるアミトリプチリンの薬物動態
アミトリプチリン及びメフロキンでの１４日間の処置の後、ラットを頭切除術により屠殺した。血液を採取し、１時間４℃で維持した。次に、血清及び脳を採取した。アミトリプチリンを、ＨＰＬＣ及び質量分析法によって定量化した（Ｃｒｅｐｔａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。
【０１０５】
睡眠覚醒エピソードの定量化
マウスに皮質及び筋肉の電極を移植して、脳波（ＥＥＧ）及び筋電図（ＥＭＧ）を記録し、さらに、睡眠−覚醒のサイクルをモニターした。この移植によって、安定し且つ持続性のある睡眠ポリグラフの記録が可能になる（Ｐａｒｍｅｎｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００２）。
【０１０６】
覚醒状態（Ｗ）、徐波睡眠（ＳＷＳ）、及び、逆説睡眠又は急速眼球運動（ＲＥＭ）睡眠に対して、１０秒毎に睡眠ポリグラフの記録を視覚的にスコア化した。
【０１０７】
ＦＳＴ
ＦＳＴは、抗うつ剤のスクリーニングに最も使用される齧歯類モデルである（Ｐｏｒｓｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ，１９７７）。マウスを、２５℃の水で１０ｃｍ満たしたガラスシリンダー（高さ２５ｃｍ、直径９ｃｍ）内に個々に落とした。この実験を、ガラスシリンダーの前に置いたカムコーダを用いて記録した。ビデオを後に、処置が知らされていない実験者によってスコア化した。うつ病関連行動の指標は、不動時間、水泳時間及びクライミング時間である。
【０１０８】
薬理学的処置
ｉ）慢性神経障害性疼痛及び薬物動態学的実験に対して、１ｍｇ／ｋｇのメフロキン又は溶媒（０．０１７％ＤＭＳＯを有する０．９％生理食塩水）と組み合わせて、１２ｍｇ／ｋｇのアミトリプチリン又は０．９％生理食塩水を、神経障害のラットに投与した。続く１４日間アミトリプチリン又は溶媒を送達する浸透圧ミニポンプ（Ａｌｚｅｔ，ｍｏｄｅｌ  ２ＭＬ２）を皮下に移植した。メフロキン又はその溶媒を、１４日間の処置の間に腹腔内投与した。
【０１０９】
神経障害性疼痛に対する別のプロトコルを、１５０分毎のアミトリプチリン１；３ｍｇ／ｋｇ及びメフロキン１ｍｇ／ｋｇの繰返しの投与で行った。
【０１１０】
ｉｉ）睡眠覚醒の実験に対して、記録前の午前１０時３０分に、アミトリプチリン１ｍｇ／ｋｇ及びメフロキン１ｍｇ／ｋｇでマウスを腹腔内処置した。
【０１１１】
ｉｉｉ）ＦＳＴの実験に対して、メフロキン（１０ｍｇ／ｋｇ）の溶媒、２４ｍｇ／ｋｇの有効用量のアミトリプチリンの溶媒、及び、それぞれ６及び１２ｍｇ／ｋｇの２つの無効用量のアミトリプチリンの単独の又は３つの用量（１、３、１０ｍｇ／ｋｇ）のメフロキンと組み合わせた溶媒によって、マウスを経口的及び急性的に処置した。
【０１１２】
１．２．結果
＜１．２．１．アミトリプチリンによるＨＣ活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抑制＞
ＬＰＳを、Ｃｘ４３ヘミチャネルを開くために２４時間の間にマウスの皮質の星状細胞培養物に添加し、さらに、アミトリプチリンも同じ時間の間に添加して、臭化エチジウムの細胞内取り込みによって定量化されるヘミチャネル活性に対するその作用を評価した。
【０１１３】
結果は図１に表示されている。
【０１１４】
予想通りに、細胞培地へのＬＰＳの添加は、その活性の増加に関連するヘミチャネルの開口を誘発した。
【０１１５】
驚くべきことに、アミトリプチリンは、３つの試験された用量にてこの増加を逆転させ、Ｃｘ４３ヘミチャネルの開口を減少させることができる。
【０１１６】
この結果は、近年の出版物がむしろ抗うつ剤による発現及び機能の両方におけるＣｘ４３の増加を示しているため、全く予期せぬものであった。実際に、ＳＳＲＩ（選択的セロトニン再取り込み阻害剤）フルオキセチン及びＳＮＲＩ（セロトニンノルエピネフリン再取り込み阻害剤）デュロキセチンは、ラットにおける２１日の処置後に前頭前野においてＣｘ４３発現を増加させるとして記載されてきた（Ｆａｔｅｍｉ  ｅｔ  ａｌ，２００８；Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１２）。三環系抗うつ剤（ＴＣＡ）のアミトリプチリンも、マウスの皮質の星状細胞培養物におけるＣｘ４３の発現並びにＣｘ４３ギャップ結合チャネルの増加に関連づけられてきた（Ｍｏｒｉｏｋａ  ｅｔ  ａｌ，２０１４）が、ヘミチャネル活性については評価されたことはない。結果的に、抗うつ剤投与がＣｘ４３発現及び細胞結合の増加をトリガするとこれまで考えられていたが、本発明者等の結果はむしろＣｘ機能の減少を示している。
【０１１７】
＜１．２．２．ｉｎ  ｖｉｖｏでのアミトリプチリン活性の増強＞
１．２．２．１．メフロキンによるアミトリプチリンの抗痛覚過敏効果の増強
メフロキンは、Ｃｘ３６  ＨＣ、Ｃｘ３０  ＨＣ及びＣｘ４３  ＨＣを抑制するとして既知である（文献に記載）。
【０１１８】
より正確には、メフロキンは、いくつかのコネキシン、例えばＣｘ２６（Ｌｅｖｉｔ，２０１５）、Ｃｘ３６（Ｐｉｚａｒｒｏ−Ｄｅｌｇａｄｏ，２０１４）、Ｃｘ４６及びＣｘ５０（Ｓｒｉｎｉｖａｓ，２００５）及びＣｘ４３（Ｋｈａｗａｊａ，２０１１）等で構成されるヘミチャネルを効率的に遮断する。
【０１１９】
従って、本発明者等は、メフロキンのＨＣ遮断効果をアミトリプチリンのＨＣ遮断効果と組み合わせることは、後者の治療効果を増強するであろうと仮定した。
【０１２０】
ａ）ラットを坐骨神経上で結紮し、次に、手術の１４日後にＲａｎｄａｌｌ＆Ｓｅｌｉｔｔｏ  ｔｅｓｔを用いて試験して、圧力閾値として定量化される痛覚過敏を評価した。次に、手術後の圧力閾値の低下によって特徴づけられる神経障害のラットを、１４日間処置し、さらに、この期間の間にＲａｎｄａｌｌ＆Ｓｅｌｉｔｔｏ  ｔｅｓｔにより試験した。
【０１２１】
結果は図２に開示されている。
【０１２２】
アミトリプチリン１２ｍｇ／ｋｇの慢性投与は、生理食塩水と比較して１４日目の足の引き込み閾値の有意な上昇並びに啼鳴閾値の上昇を誘発した。
【０１２３】
メフロキンは、両方の反応に対して有意な効果を示さなかったが、６日目から１４日目にアミトリプチリンの痛覚過敏特性を有意に増強した。
【０１２４】
曲線下面積の分析により、この増強が確認された（図２Ｂ）。同様の結果が、啼鳴閾値の定量化によって得られた（図２Ｃ及びＤ）。
【０１２５】
ｂ）坐骨神経の結紮後、ラットを、１５０分（アミトリプチリン半減期）毎にアミトリプチリン及びメフロキンによって処置し、次に、Ｒａｎｄａｌｌ＆Ｓｅｌｉｔｔｏ  ｔｅｓｔを用いて３０、９０、２４０及び３９０分に試験した。
【０１２６】
結果は図３に開示されている。
【０１２７】
アミトリプチリンの有意な効果を、Ｒａｎｄａｌｌ＆Ｓｅｌｉｔｔｏ  ｔｅｓｔにおいて、１ｍｇ／ｋｇの用量で、足の引き込みに対して３９０分にて観察した。
【０１２８】
加えて、メフロキンは、アミトリプチリンの抗痛覚過敏効果を有意に改善し、実際には有意なより高い値を、アミトリプチリンはそれ自体では有意な効果を誘発しなかったのに対し、９０及び２４０分にて得た。
【０１２９】
１．２．２．２．メフロキンによるアミトリプチリンの抗うつ効果の増強
アミトリプチリン及びメフロキンの投与後、マウスにＦＳＴを受けさせた。ＦＳＴ試験は、抗うつ剤によって一般的に逆転される絶望行動を評価する。ＦＳＴの間、各マウスの水泳時間を、各１分の期間、第１の３分の期間及び第２の３分の期間で測定した。
【０１３０】
結果は図４に開示されている。
【０１３１】
第２の３分の期間の間に、最高用量（２４ｍｇ／ｋｇ）にて、水泳時間の有意な増加を示したアミトリプチリンの用量効果を得た。
【０１３２】
加えて、メフロキン１ｍｇ／ｋｇは、アミトリプチリン１２ｍｇ／ｋｇを増強することができた。
【０１３３】
興味深いことに、１２ｍｇ／ｋｇの用量での両方の薬剤の組み合わせは、メフロキン１ｍｇ／ｋｇの存在下でのみ有意であった（アミトリプチリン１２ｍｇ／ｋｇ単独の効果は有意ではなかった）。
【０１３４】
１．２．２．３．ＲＥＭ睡眠に対するメフロキンによるアミトリプチリンの増強
マウスを、脳波によって登録して、睡眠覚醒エピソードを定量化した。次に、アミトリプチリン及びメフロキンの急性投与に続いて、急速眼球運動（ＲＥＭ）睡眠を含む異なる睡眠ポリグラフの記録を定量化した。
【０１３５】
結果は図５に開示されている。
【０１３６】
ＲＥＭ睡眠は、マウスにおいてアミトリプチリン＋メフロキンによって有意に減少したが、アミトリプチリンはそれ自体では有意な減少を誘発しなかった。
【０１３７】
従って、この結果は、ＲＥＭ睡眠に対するアミトリプチリンの阻害剤効果のメフロキンによる増強を支持している。
【０１３８】
まとめると、アミトリプチリンの臨床応用（神経障害性疼痛、うつ病）又はその活性のマーカーの臨床応用（ＲＥＭ睡眠の減少）に関連した異なる関連している前臨床モデルで得たこれらの結果は、アミトリプチリンの抗うつ効果を増強するためにメフロキンがｉｎ  ｖｉｖｏで相乗的に作用することを明らかに示している。重要なことに、アミトリプチリンの効果を増強するために使用されるメフロキンの用量は非常に少ない（従って、メフロキンはそれ自体では効果を有さない）。
【０１３９】
＜１．２．３．メフロキンによるアミトリプチリン増強の特異性＞
１．２．３．１．ＭＦＡは強力なＨＣ遮断薬である。
【０１４０】
メクロフェナム酸（ＭＦＡ）は、ヘミチャネルブロッカー（Ｒｉｃｈｔｅｒ，２０１４）と呼ばれる。
【０１４１】
これを検証するために、ＬＰＳを、Ｃｘ４３ヘミチャネルを開くために２４時間の間にマウスの皮質の星状細胞培養物に添加し、さらに、メフロキン又はメクロフェナム酸（ＭＦＡ）も同じ時間の間に添加して、臭化エチジウムの細胞内取り込みによって定量化されるヘミチャネル活性に対するその作用を評価した。
【０１４２】
結果は図６に開示されている。
【０１４３】
予想通りに、細胞培地へのＬＰＳの添加は、その活性の増加に関連するヘミチャネルの開口を誘発した。ＭＦＡ及びメフロキンはどちらも、この効果をそれ自体での効果の間に有意差を有して逆転させたが、ＭＦＡはより高い阻害剤の効果を示した。
【０１４４】
従って、ＭＦＡ及びメフロキンは、異なる抑制の程度を有してＣｘ４３ヘミチャネル開口部を減らすことができ、この点でメフロキンはあまり効率的ではない。
【０１４５】
１．２．３．２．しかし、ＭＦＡはｉｎ  ｖｉｖｏでアミトリプチリン効果を増強しない。
【０１４６】
ラットを坐骨神経上で結紮し、次に、手術の１４日後にＲａｎｄａｌｌ＆Ｓｅｌｉｔｔｏ  ｔｅｓｔを用いて試験して、圧力閾値として定量化される痛覚過敏を評価した。次に、手術後の圧力閾値の低下によって特徴づけられる神経障害のラットを、１４日間処置し、さらに、この期間の間にＲａｎｄａｌｌ＆Ｓｅｌｉｔｔｏ  ｔｅｓｔにより試験した。
【０１４７】
結果は図７に開示されている。
【０１４８】
アミトリプチリン１２ｍｇ／ｋｇの慢性投与は、生理食塩水と比較して１４日目の足の引き込み閾値の有意な上昇並びに啼鳴閾値の上昇を誘発した。ＭＦＡはアミトリプチリンのいかなる改善された効果も示さなかったが、メフロキンは１４日目にアミトリプチリンの痛覚過敏を有意に増強した。
【０１４９】
１．２．３．３．メフロキンと組み合わせたアミトリプチリンの存在下での相乗的なＨＣ活性は無し
アミトリプチリン及び／又はメフロキンを用いたラットの皮質の星状細胞培養物の２４時間の処理後、Ｃｘ４３ヘミチャネル活性をＥｔＢｒの取り込みによって評価した。
【０１５０】
結果は図８に表示されている。
【０１５１】
ヘミチャネル活性に対する両方の処理の有意な抑制効果を、培養されたラットの皮質の星状細胞における臭化エチジウム摂取の評価によって同定した。２４時間の処理後の各処置群において約３０％の減少が観察されたが、いかなる相乗効果もなかった。
【０１５２】
ｉｎ  ｖｉｖｏで観察されたメフロキンによるアミトリプチリンの相乗効果は、両方の処置の組み合わせがアミトリプチリン単独よりも高い阻害剤の効果を誘発しなかったことを考慮すると、改善されたヘミチャネルの抑制には特有の形で関連しないようである。さらに、アミトリプチリンと組み合わせた場合、ＭＦＡによるＨＣ活性の抑制の増加はｉｎ  ｖｉｖｏでの増強をもたらすことはない。加えて、これらの結果は、アミトリプチリンの抗痛覚過敏効果を改善するためのメフロキンの特異性を強化する。
【０１５３】
＜１．２．４．メフロキンの存在下でのアミトリプチリンの薬物動態＞
ラットを坐骨神経上で結紮し、さらに、手術の１４日後に、メフロキンと組み合わせたか又は組み合わせずにアミトリプチリンによって処置した。１４日の処置後、従って、手術から２８日後、ラットを屠殺し、脳並びに血清サンプルを採取して、アミトリプチリンを定量化した。
【０１５４】
結果は図９に表示されている。
【０１５５】
メフロキンの１４日間の処置後に、血清の薬物動態に対しても脳の薬物動態に対してもアミトリプチリン濃度の変化は観察されなかった。
【０１５６】
ＭＦＡ、メフロキン、及び、より驚くべきことにアミトリプチリンは、コネキシンヘミチャネルを抑制する。より重要なことに、ＭＦＡは、これらのヘミチャネルをメフロキンよりも良好に抑制するが、アミトリプチリンの抗痛覚過敏特性を増強せず、メフロキンは有意に増強する。この最後の増強は、血液中又は脳内のアミトリプチリンの薬物動態学的改変によるものではない。
【実施例２】
【０１５７】
アロディニアに対するアミトリプチリン及びメフロキンの効果（「カフモデル」）
２．１．材料及び方法
＜手術＞
神経障害性疼痛を、右坐骨神経の主枝（ｍａｉｎ  ｂｒａｎｃｈ）にカフを装着することにより、成体雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｌ´Ａｒｂｒｅｓｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）に誘発した（詳細な説明及びビデオによる例証については：Ｙａｌｃｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１４，Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ  ８９：ｅ５１６０８）。手術は、ケタミン（６８ｍｇ／ｋｇ）／キシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）腹腔内（ｉ．ｐ．）麻酔下で行った（Ｃｅｎｔｒａｖｅｔ，Ｔａｄｄｅｎ，Ｆｒａｎｃｅ）。右坐骨神経の共通の枝（ｃｏｍｍｏｎ  ｂｒａｎｃｈ）を露出させ、標準化された長さ（２ｍｍ）のＰＥ−２０ポリエチレンチューブのカフ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｌｅｓ  Ｕｌｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）をその周りに一方向に挿入した（カフ群）。剪毛した皮膚は、縫合糸を使用して閉じた。
【０１５８】
＜動物の処置＞
マウスに、アミトリプチリン（６、１２ｍｇ／ｋｇ）及びメフロキン（０．１、０．３３、１ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注入を、２５日の間に１０ｍＬ／ｋｇの量で受けさせた。注入を、治療の最初の１７日間、１日１回午後に行った。１日あたり単一投与では効果がなかったため、次に、処置の最後の８日間、１日２回、午前と午後に処置を行った。
【０１５９】
＜機械的アロディニアの評価＞
機械的アロディニアを、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙヘアを使用して試験し、結果をグラムで表した（詳細な説明及びビデオによる例証については：Ｙａｌｃｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１４，Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ  ８９：ｅ５１６０８）。試験は、午前中に行い、点灯の少なくとも２時間後に開始した。マウスを、高架式メッシュスクリーン上の透明なＰｌｅｘｉｇｌａｓボックス（７ｃｍ×９ｃｍ×７ｃｍ）内に置いた。較正されたｖｏｎ  Ｆｒｅｙフィラメント（Ｂｉｏｓｅｂ，Ｖｉｔｒｏｌｌｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を、曲がるところまで各後足の足底表面に、機械的閾値まで一連の上昇する力で適用した。フィラメントを１つの足あたり５回試験し、足の引き込み閾値を、５回の試みのうち３回以上の引き込みが観察された２つの連続したフィラメントのうちの低い方として定めた。
【０１６０】
＜機械的アロディニアに対する異なる組み合わせの効果の比較＞
マウスに坐骨神経カフを装着させ、次に、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｔｅｓｔを用いて試験して、圧力閾値として定量化されるアロディニアを評価した。次に、手術後の圧力閾値の低下によって特徴づけられる神経障害のマウスを、１４日間、メフロキン（０．３３ｍｇ／ｋｇ、ＭＥＦＬＯ）、メクロフェナム酸（０．５ｍｇ／ｋｇ、ＭＦＡ）及びニフルミン酸（０．５ｍｇ／ｋｇ、ＮＩＦＬＵ）に付随したアミトリプチリン６ｍｇ／ｋｇで処置し、この期間中ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｔｅｓｔによって試験した。
【０１６１】
２．２．結果
＜２．２．１．アロディニアに対するアミトリプチリン活性の増強（「カフモデル」）＞
マウスに坐骨神経カフを装着させ、次に、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｔｅｓｔを用いて試験して、圧力閾値として定量化されるアロディニアを評価した。次に、手術後の圧力閾値の低下によって特徴づけられる神経障害のマウスを、２５日間処置し、この期間中ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｔｅｓｔによって試験した。
【０１６２】
結果は図１０に開示されている。
【０１６３】
アミトリプチリン１２ｍｇ／ｋｇの慢性投与は、アミトリプチリン６ｍｇ／ｋｇと比較して、３２日目から３４日目までの足の引き込み閾値の有意な増加を誘発した。この低用量では、アミトリプチリンは、神経障害のマウスにおいて足の引き込みの変化を誘発しなかった。
【０１６４】
３つの試験された用量でのメフロキンは、アミトリプチリン６ｍｇ／ｋｇを有意に増強した。さらに、最も低い用量のメフロキン（０．１及び０．３３ｍｇ／ｋｇ）は、アミトリプチリン１２ｍｇ／ｋｇと同様の抗アロディニア効果を誘発したが、最高用量（１ｍｇ／ｋｇ）は、アミトリプチリンを増強する効率がより低かった。
【０１６５】
曲線下面積の分析により、この増強を確認した。
【０１６６】
これらの結果は、神経障害性疼痛疾患、特に神経障害性疼痛の特定の症状の１つ（アロディニア）において、メフロキンによるアミトリプチリンの有益な効果の増強を示している。
【０１６７】
＜２．２．２．メフロキンによるアミトリプチリン増強の特異性＞
図１１は、アミトリプチリンとメフロキンとの組み合わせが、アミトリプチリンとメクロフェナム酸及びニフルミン酸等の他のコネキシン阻害剤との組み合わせ（Ｒｅｔａｍａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）よりも有意に効率的であることを示しており、これは、この特定の組み合わせに対してアロディニアはより急速に逆転させられるためである。
【０１６８】
アミトリプチリンとメクロフェナム酸及びニフルミン酸との組み合わせと比較したメフロキンと組み合わされたアミトリプチリンのこのより強力な相乗効果は、ＡＵＣ定量化（Ｏｎｅ−Ｗａｙ  Ａｎｏｖａに続くＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ多重比較試験）を介してさらに確認される。
【実施例３】
【０１６９】
マウスにおけるアミトリプチリン／メフロキンの薬物動態
３．１．材料及び方法
＜動物＞
成体雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｌ´Ａｒｂｒｅｓｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用した。マウスを、餌及び水は自由に摂取させた実験的試験の前に１週間、設備に慣れさせるために集団のケージの中で保持した。マウスは、８時に開始される光及び２１℃±１℃の制御された温度で、１２時間の明／暗サイクルで維持した。
【０１７０】
＜処置＞
マウスに、アミトリプチリン（６、１２ｍｇ／ｋｇ）及びメフロキン（０．１、０．３及び１ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注入を、１８日の間に１０ｍＬ／ｋｇの量で受けさせた。注入は２回行った。
【０１７１】
＜血液及び脳の採取＞
処置の１８日目に、マウスに、午前中の注入を受けさせ、注入の２時間後にサンプリングを行った。サンプリングの直前にマウスに麻酔をかけ（ケタミン６８ｍｇ／ｋｇ、キシラジン１０ｍｇ／ｋｇ）、さらに、心臓穿刺（Ｖａｃｕｅｔｔｅチューブ、リチウム／ヘパリンゲルと共に）により血液を採取した。次に、マウスを断頭し、脳を抽出して、ドライアイスで急速凍結した。
【０１７２】
血液を有したＶａｃｕｅｔｔｅチューブを遠心分離し（３０００ｒｐｍ、２０分間）、血漿を回収し、さらに、ドライアイスで輸送するまで−８０℃で保存した。
【０１７３】
＜アミトリプチリン及びメフロキンの決定＞
脳及び血清において、アミトリプチリン及びメフロキンを、液体クロマトグラフィー及び質量分析（ＬＣ−ＭＳ）法によって両方とも定量化した。
【０１７４】
３．２．結果
坐骨神経カフ装着後のアロディニアに対して以前に試験したマウスにおいて、１８日の処置後に、血漿及び脳においてアミトリプチリン及びメフロキンを定量化した。
【０１７５】
図１２は、メフロキン及びアミトリプチリンの濃度が血液及び脳の組織において用量依存的であることを示している。
【０１７６】
加えて、図１２は、どちらの化合物も増強効果を可能にする用量（すなわち、６及び１２ｍｇ／ｋｇのアミトリプチリン及び０．１、０．３及び１ｍｇ／ｋｇのメフロキン）で使用される場合に、メフロキンがアミトリプチリンの薬物動態特性を調節しないことを示している。重要なことに、メフロキンは、最高用量のメフロキンであっても、血液及び脳におけるアミトリプチリンの濃度の増加を誘発しない。
【０１７７】
興味深いことに、これらの結果は、最適な増強用量が、従来使用されているメフロキンの用量（通常１０００乃至２０００ｎｇ／ｍＬ）で得られる血漿暴露の約１０％と同等の血漿暴露につながることを示している。より多い用量のメフロキン、すなわち従来使用されているものに近いものは、アミトリプチリンを増強するのにあまり効果的ではない。ここで、ｉｎ  ｖｉｖｏでの増強は、マイクロモルスケールの濃度で最適である。
【０１７８】
例えば、Ｍａｒｇｉｎｅａｎｕ  ａｎｄ  Ｋｌｉｔｇａａｒｄ，２００６は、１００乃至２００μＭのメフロキン脳濃度を有するコネキシンのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抑制効果を記載している。対照的に、本発明者等は、アミトリプチリンのｉｎ  ｖｉｖｏでの増強が、マイクロモルスケールの、すなわち１００分の１の（１００倍少ない）血漿及び脳中のメフロキン濃度で最適であることを実証した（図１２）。
【実施例４】
【０１７９】
神経炎症に対するアミトリプチリン／メフロキンの効果（ＬＰＳモデル）
４．１．材料及び方法
＜動物＞
成体スイス雄性マウスをＬＰＳモデルにおいて使用した。マウスを、実験的試験の前に１週間、設備に慣れさせるために集団のケージの中で保持した。その後、餌及び水は自由に摂取させた状態で開始した実験の２日前に個々のケージにおいて収容した。マウスは、８時に開始される光及び２１℃±１℃の制御された温度で、１２時間の明／暗サイクルで維持した。
【０１８０】
実験者には処置が知らされていなかった。
【０１８１】
＜ＬＰＳモデル＞
個々のケージにおいて２日間単離した後、マウスに、０．３３ｍｇ／ｋｇのリポ多糖類（ＬＰＳ；０１２７：Ｂ７，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）又は生理食塩水を腹腔内注入した。最初の注入の２１時間後、マウスに、処置を経口的に受けさせた。
【０１８２】
＜毛づくろいの活動＞
コートステートスコアを、処置の３時間後に評価した。スコアは、同数の段階的な身体部分（頭部、頸部、背部コート、腹部コート並びに後脚及び生殖器領域）に対応する５つの記録（０又は１）の合計として定義した。これら５つの身体部分のそれぞれについて、清浄度の毛皮の状態を評価した。０の記録は白くきれいな毛皮に起因し、１の記録は変化した毛皮（スパイクのような毛皮、黄色がかった色の毛皮、脂っこい毛皮）に起因するものであった。
【０１８３】
＜体重減少＞
動物の一般的な生理学的状態を、処置の３時間後（Ｔ０＋２４時間）及び処置の直前（Ｔ０＋２１時間）の体重測定値の差として定義された、正規化された体重減少によって評価した。
【０１８４】
４．１．結果
炎症は、いくつかの神経変性疾患（アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症及び筋萎縮性側索硬化症）の原因の構成要素としてこれまで記載されており、神経炎症及び神経毒性に関与するＩＬ−１β及びＴＮＦα等の炎症性サイトカインの放出及び脳の小膠細胞の活性化を関係づけている（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【０１８５】
ＬＰＳの末梢投与が炎症性サイトカインの放出をトリガし、従って、神経変性疾患の病態生理を模倣することが実証されてきた。さらに、ＬＰＳにより誘発される神経炎症が、ヒト及び動物モデルにおいて、ストレス、うつ病、双極性障害、統合失調症及び自閉症等の精神障害の症状／特徴も模倣し得るということが最近報告されてきた。従って、ＬＰＳモデルは、神経炎症における新たな分子を特徴づけるために広く使用されており、さらに、神経変性障害及び精神障害を標的とする新薬をスクリーニングする興味深いモデルであり得る（Ｒｅｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【０１８６】
コートステートスコアは、毛づくろいの活動を評価することを可能にする。この活動は、マウスによって経験されたストレスを反映するものとして記載されてきた。実際、ストレスが与えられたマウスは、毛づくろいをし且つ清潔に保つために時間をかけない。従って、一般的なコートステートスコアは上昇することになる。図１３の左のパネルは、動物のコートステートスコアの平均値を表している。ＬＰＳは、対照（生理食塩水＋溶媒）マウスと比較してスコアにおいて有意な増加（ｐ＜０．０１）を誘発する。アミトリプチリン処置は、被毛の状態の悪化を抑える傾向がある。しかし、アミトリプチリン及びメフロキンが同時投与されると、被毛の状態の悪化における抑えが著しく増加した。
【０１８７】
体重測定は、神経炎症によって誘発される病気の一般的な状態を評価することを可能にする。図１３の右のパネルは、ＬＰＳが投与されたマウスが対照マウスよりも有意に少ない体重を有することを示している。アミトリプチリンの処置は、体重減少の低下を誘発している。アミトリプチリン及びメフロキンの組み合わせを用いた処置は、体重減少において有意な低下を誘発している。
【０１８８】
これらの結果は、神経炎症におけるメフロキンによるアミトリプチリンの有益な効果の増強を示している。
【０１８９】
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【図１】
0006720301.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
0006720301.tif 000017
【図１１】
0006720301.tif 000018
【図１２】
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【図１３】
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