(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体親和性高分子ブロックと間葉系幹細胞とを含み、複数個の間葉系幹細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体を含むトロフィックファクタ放出剤を含む炎症疾患処置剤であって、前記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが２０μｍ以上２００μｍ以下であり、前記細胞から放出されるトロフィクファクタがＴＳＧ−６を含む、炎症疾患処置剤。
【請求項２】
前記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが５０μｍ以上１２０μｍ以下である、請求項１に記載の炎症疾患処置剤。
【請求項３】
前記生体親和性高分子ブロックにおいて、生体親和性高分子が熱、紫外線または酵素により架橋されている、請求項１または２に記載の炎症疾患処置剤。
【請求項４】
前記生体親和性高分子ブロックが不定形である、請求項１から３の何れか一項に記載の炎症疾患処置剤。
【請求項５】
前記細胞構造体が、細胞１個当り０．００００００１μｇ以上１μｇ以下の生体親和性高分子ブロックを含む、請求項１から４の何れか一項に記載の炎症疾患処置剤。
【請求項６】
前記間葉系幹細胞が、脂肪由来間葉系幹細胞または骨髄由来間葉系幹細胞である、請求項１から５の何れか一項に記載の炎症疾患処置剤。
【請求項７】
生体親和性高分子が、ゼラチン、コラーゲン、アテロコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、プロネクチン、ラミニン、テネイシン、フィブリン、フィブロイン、エンタクチン、トロンボスポンジン、レトロネクチン（登録商標）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、またはキトサンである、請求項１から６の何れか一項に記載の炎症疾患処置剤。
【請求項８】
生体親和性高分子が、リコンビナントゼラチンである、請求項１から７の何れか一項に記載の炎症疾患処置剤。
【請求項９】
リコンビナントゼラチンが、下記式１で示される、請求項８に記載の炎症疾患処置剤。
式１：Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ］ｍ−Ｂ
式中、Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３〜１００の整数を示し、ｍは２〜１０の整数を示す。なお、ｎ個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
【請求項１０】
リコンビナントゼラチンが、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；または
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
である、請求項８または９に記載の炎症疾患処置剤。
【請求項１１】
前記間葉系幹細胞がヒトまたは犬由来の間葉系幹細胞である、請求項１から１０の何れか一項に記載の炎症疾患処置剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トロフィックファクタ放出剤および炎症疾患処置剤に関する。詳しくは、本発明は、生体親和性高分子ブロックと細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体を含む、トロフィックファクタ放出剤、並びに炎症疾患処置剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、細胞を局所投与し、細胞が産生するトロフィックファクタにより治療を行うトロフィックファクタ療法の検討がなされている。トロフィックファクタ療法としては、細胞を局所投与した際に、投与部に細胞を留まらせて生着させるために、局所投与する細胞を細胞塊として投与することが試みられる。【０００３】
非特許文献１には、スフェロイドとして培養されたヒト間葉系幹／間質細胞は自己活性化し、プロスタグランジンＥ２を産生することが記載されている。非特許文献２には、ヒト間葉系間質細胞のスフェロイドは、抗炎症タンパク質であるＴＳＧ−６を分泌することが記載されている。【０００４】
特許文献１には、生体適合性かつ生分解性材料を主成分とする微小粒子が記載されている。上記の生体適合性かつ生分解性材料は移植細胞を表面に有し、上記の微小粒子は、微小粒子中に取り込まれ、埋め込みの際に細胞またはその環境に対して活性である少なくとも１つの作用物質を含む。また上記微小粒子は１０〜５００μｍの直径を有し、そして細胞接着性化合物のコーティングをさらに含む。上記の作用物質は、成長因子、ホルモンおよびサイトカインからなる群より選択され、微小粒子によって持続して、かつ制御されて放出される。【０００５】
近年、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を用いた再生医療および細胞治療の研究が盛んになされている。中でも、その対象として難治性炎症疾患への治療効果が注目され、多種多様な研究が行われている。例えば、特許文献２にはＭＳＣを経静脈的に投与することによって、炎症性腸疾患を予防・治療するための方法が開示されている。いくつかの臨床研究や臨床試験も実施されている。しかしながら、現実的には十分な治療効果を示せていないことが分かってきた（非特許文献３）。ＭＳＣ自体に遺伝子導入することにより抗炎症能力を高めるための研究も行われている。（非特許文献４）しかしながら、細胞自体に遺伝子を導入することは、その有効性や安全性への影響を考えると必ずしも望ましい選択肢ではない。【０００６】
特許文献３には、生体親和性を有する高分子ブロックと細胞とを含み、上記複数個の細胞間の隙間に複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体が記載されている。特許文献３に記載の細胞構造体においては、外部から細胞構造体の内部への栄養送達が可能である。特許文献４には、生体親和性を有する高分子ブロックと少なくとも一種類の細胞とを含み、上記複数個の細胞間の隙間に複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞移植用細胞構造体が記載されている。特許文献４の実施例においては、細胞移植用細胞構造体を用いて血管形成できることが記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】JONI H. YLOSTALO,他、STEM CELLS 2012;30:2283-2296
【非特許文献２】Thomas J. Bartosh他、PNAS, August 3, 2010, vol. 107, no. 31, 13724-13729
【非特許文献３】Aliment Pharmacol Ther 2017; 45: 205-221
【非特許文献４】Inflamm. Res. (2015) 64:671-681
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第４８１９３５６号
【特許文献２】特開２００９−７３２１号公報
【特許文献３】国際公開ＷＯ２０１１／１０８５１７号
【特許文献４】特開２０１５−１３４１９３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
細胞移植治療としては、移植した細胞が放出するトロフィックファクタ（サイトカイン等）により宿主の再生を促進することによる治療が幾つか知られている。例えば、間葉系幹細胞は抗炎症効果を有するサイトカインを放出することが知られている。しかし、細胞だけの移植ではサイトカインが十分に放出されず、目的の効果を得られない場合が頻繁にある。本発明は、細胞塊を使用する場合と比較して、細胞が放出するトロフィックファクタの量を増大させたトロフィックファクタ放出剤を提供することを解決すべき課題とした。さらに本発明は、炎症疾患処置剤を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、生体親和性高分子ブロックと細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体においては、細胞が放出するトロフィックファクタの量が、生体親和性高分子ブロックを含まない細胞塊の場合と比較して増大すること、並びに上記細胞構造体が炎症疾患の処置に有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１１】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞  生体親和性高分子ブロックと細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体を含む、トロフィックファクタ放出剤であって、上記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが２０μｍ以上２００μｍ以下であり、上記細胞からトロフィックファクタが放出される、トロフィックファクタ放出剤。
＜２＞  上記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが５０μｍ以上１２０μｍ以下である、＜１＞に記載のトロフィックファクタ放出剤。
＜３＞  上記生体親和性高分子ブロックにおいて、生体親和性高分子が熱、紫外線または酵素により架橋されている、＜１＞または＜２＞に記載のトロフィックファクタ放出剤。
＜４＞  上記生体親和性高分子ブロックが不定形である、＜１＞から＜３＞の何れか一に記載のトロフィックファクタ放出剤。【００１２】
＜５＞  上記細胞構造体が、細胞１個当り０．００００００１μｇ以上１μｇ以下の生体親和性高分子ブロックを含む、＜１＞から＜４＞の何れか一に記載のトロフィックファクタ放出剤。
＜６＞  上記細胞が、体性幹細胞である、＜１＞から＜５＞の何れか一に記載のトロフィックファクタ放出剤。
＜７＞  上記トロフィックファクタが、サイトカインである、＜１＞から＜６＞の何れか一に記載のトロフィックファクタ放出剤。
＜８＞  生体親和性高分子が、ゼラチン、コラーゲン、アテロコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、プロネクチン、ラミニン、テネイシン、フィブリン、フィブロイン、エンタクチン、トロンボスポンジン、レトロネクチン（登録商標）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、またはキトサンである、＜１＞から＜７＞の何れか一に記載のトロフィックファクタ放出剤。【００１３】
＜９＞  生体親和性高分子が、リコンビナントゼラチンである、＜１＞から＜８＞の何れか一に記載のトロフィックファクタ放出剤。
＜１０＞  リコンビナントゼラチンが、下記式１で示される、＜９＞に記載のトロフィックファクタ放出剤。
式１：Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）n］m−Ｂ
式中、Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３〜１００の整数を示し、ｍは２〜１０の整数を示す。なお、ｎ個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
＜１１＞  リコンビナントゼラチンが、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；または
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
である、＜９＞または＜１０＞に記載のトロフィックファクタ放出剤。
＜１２＞  ＜１＞から＜１１＞の何れか一に記載のトロフィックファクタ放出剤を含む、炎症疾患処置剤。【００１４】
＜１３＞  生体親和性高分子ブロックと間葉系幹細胞とを含み、複数個の間葉系幹細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体を含む、炎症疾患処置剤であって、上記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが２０μｍ以上２００μｍ以下である、炎症疾患処置剤。
＜１４＞  上記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが５０μｍ以上１２０μｍ以下である、＜１３＞に記載の炎症疾患処置剤。
＜１５＞  上記生体親和性高分子ブロックにおいて、生体親和性高分子が熱、紫外線または酵素により架橋されている、＜１３＞または＜１４＞に記載の炎症疾患処置剤。
＜１６＞  上記生体親和性高分子ブロックが不定形である、＜１３＞から＜１５＞の何れか一に記載の炎症疾患処置剤。【００１５】
＜１７＞  上記細胞構造体が、細胞１個当り０．００００００１μｇ以上１μｇ以下の生体親和性高分子ブロックを含む、＜１３＞から＜１６＞の何れか一に記載の炎症疾患処置剤。
＜１８＞  上記間葉系幹細胞が、脂肪由来間葉系幹細胞または骨髄由来間葉系幹細胞である、＜１３＞から＜１７＞の何れか一に記載の炎症疾患処置剤。
＜１９＞  生体親和性高分子が、ゼラチン、コラーゲン、アテロコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、プロネクチン、ラミニン、テネイシン、フィブリン、フィブロイン、エンタクチン、トロンボスポンジン、レトロネクチン（登録商標）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、またはキトサンである、＜１３＞から＜１８＞の何れか一に記載の炎症疾患処置剤。【００１６】
＜２０＞  生体親和性高分子が、リコンビナントゼラチンである、＜１３＞から＜１９＞の何れか一に記載の炎症疾患処置剤。
＜２１＞  リコンビナントゼラチンが、下記式１で示される、＜２０＞に記載の炎症疾患処置剤。
式１：Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）n］m−Ｂ
式中、Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３〜１００の整数を示し、ｍは２〜１０の整数を示す。なお、ｎ個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
＜２２＞  リコンビナントゼラチンが、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；または
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
である、＜２０＞または＜２１＞に記載の炎症疾患処置剤。
＜２３＞  上記間葉系幹細胞がヒトまたは犬由来の間葉系幹細胞である、＜１３＞から＜２２＞の何れか一に記載の炎症疾患処置剤。【００１７】
さらに本発明によれば、以下の発明が提供される。
（Ａ）  生体親和性高分子ブロックと細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体であって、上記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが２０μｍ以上２００μｍ以下である細胞構造体を、トロフィックファクタを必要とする対象者に移植する工程を含むトロフィックファクタの放出方法。
（Ｂ）  生体親和性高分子ブロックと細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体であって、上記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが２０μｍ以上２００μｍ以下である細胞構造体を、炎症疾患の処置を必要とする対象者に移植する工程を含む炎症疾患の処置方法。【００１８】
（Ｃ）  トロフィックファクタ放出のための、および／またはトロフィックファクタ放出による処置のための、生体親和性高分子ブロックと細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体であって、上記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが２０μｍ以上２００μｍ以下である細胞構造体。
（Ｄ）  炎症疾患の処置のための、生体親和性高分子ブロックと細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体であって、上記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが２０μｍ以上２００μｍ以下である細胞構造体。【００１９】
（Ｅ）  トロフィックファクタ放出剤の製造のための、生体親和性高分子ブロックと細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体であって、上記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが２０μｍ以上２００μｍ以下である細胞構造体の使用。
（Ｆ）  炎症疾患処置剤の製造のための、生体親和性高分子ブロックと細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体であって、上記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが２０μｍ以上２００μｍ以下である細胞構造体の使用。
【発明の効果】
【００２０】
本発明のトロフィックファクタ放出剤およびそれを含む炎症疾患処置剤によれば、細胞塊を使用する場合と比較して、細胞が放出するトロフィックファクタの量を増大することができる。また、本発明の炎症疾患処置剤によれば、細胞塊を使用する場合と比較して、炎症疾患処置効果を増大することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、条件Ａに記載した実験の液温プロファイリングを示す。
【図２】図２は、条件Ｂに記載した実験の液温プロファイリングを示す。
【図３】図３は、条件Ｃに記載した実験の液温プロファイリングを示す。
【図４】図４は、炎症刺激ＴＮＦαに依存的なＴＳＧ−６産生放出量を測定した結果を示す。
【図５】図５は、炎症刺激ＴＮＦαに依存的なＴＳＧ−６産生放出量を一細胞当たりの産生放出量として求めた結果を示す。
【図６】図６は、２．５質量％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発マウスの体重を測定した結果を示す。
【図７】図７は、２．５質量％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発マウスの体重を測定した結果を示す。
【図８】図８は、３．０質量％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発マウスの体重を測定した結果を示す。
【図９】図９は、３.０質量％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発マウスの体重を測定した結果を示す。
【図１０】図１０は、３.０質量％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発マウスの大腸の長さを測定した結果を示す。
【図１１】図１１は、３.０質量％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発マウスの病理スコアを示す。
【図１２】図１２は、各マウス群の代表的なＨＥ組織染色像を示す。
【図１３】図１３は、各マウス群の代表的なＨＥ組織染色像を示す。
【図１４】図１４は、Ｔ細胞の平均分裂回数の測定結果を示す。
【図１５】図１５は、ＩＬ−２の定量結果を示す。
【図１６】図１６は、各マウス群の正常マウスに対する体重割合（％）の平均値を示す。
【図１７】図１７は、各マウス群の大腸の長さを測定した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明を実施するための形態を、詳細に説明する。
本発明において使用する細胞構造体は、本明細書中において、モザイク細胞塊（モザイク状になっている細胞塊）と称する場合もある。また本明細書において「〜」は、その前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示すものとする。
【００２３】
本発明は、生体親和性高分子ブロックと細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体を含む、トロフィックファクタ放出剤であって、上記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが２０μｍ以上２００μｍ以下であり、上記細胞からトロフィックファクタが放出される、トロフィックファクタ放出剤に関する。
【００２４】
後記する実施例に示す通り、モザイク細胞塊と細胞塊を用いて、放出された各種トロフィックファクタ量を測定した結果、細胞塊からの放出量に対して、モザイク細胞塊から放出されるトロフィックファクタが増大した（実施例８）。本発明は如何なる理論によっても拘束されるものではないが、トロフィックファクタの種類により放出量の増加の程度が異なることから、トロフィックファクタの放出量が増加する要因としては、モザイク細胞塊とすることによる生細胞数の増加のみではなく、その他の要因によっても放出量の増加効果が発揮されていることが推測される。
【００２５】
後記する実施例に示す通り、モザイク細胞塊と細胞塊を用いて、放出されたＴＳＧ−６量を測定したところ、細胞塊からの放出量に対して、モザイク細胞塊から放出されるトロフィックファクタが増大した（実施例１１）。また。モザイク細胞塊と細胞塊を用いて、ＴＮＦα刺激後に、放出されたＴＳＧ−６量を測定したところ、細胞塊からの放出量に対して、モザイク細胞塊から放出されるトロフィックファクタが極めて増大した（実施例１２）。
【００２６】
非特許文献１または非特許文献２には、ヒト間葉系幹／間質細胞のスフェロイド（細胞塊）がトロフィックファクタを産生することが記載されているが、モザイク細胞塊については記載がない。特許文献１には、生体適合性かつ生分解性材料を主成分とする微小粒子が、成長因子、ホルモンおよびサイトカインからなる群より選択される作用物質を含むことが記載されているが、上記作用物質は、細胞から放出されるものではなく、特許文献１には、細胞がトロフィックファクタを産生することについての記載はない。特許文献２にはモザイク細胞塊が記載されているが、細胞からトロフィックファクタが放出されることについての記載はない。
【００２７】
また非特許文献１の図６、および非特許文献２の図６には、平面培養と比較してスフェロイドの方がトロフィックファクタの産生量が大きいことが示されている。一般的には、平面培養の方がスフェロイドよりも細胞の栄養状態は良好であると考えられるので、トロフィックファクタ産生量は、細胞の栄養状態に依存するものではないものと推測される。特許文献２には、モザイク細胞塊の方がスフェロイドよりも栄養状態が良好であることが記載されているが、トロフィックファクタ産生量は、細胞の栄養状態に依存するものではないものと推測されていることから、本発明の効果は、非特許文献１および２、並びに特許文献１の記載から予想できるものではない。
【００２８】
上記の通り、生体親和性高分子ブロックと細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体において、細胞からのトロフィックファクタの放出量が、細胞塊の場合と比較して増大することは、従来技術からは全く予想できない効果である。
【００２９】
（１）生体親和性高分子ブロック
（１−１）生体親和性高分子
生体親和性とは、生体に接触した際に、長期的かつ慢性的な炎症反応などのような顕著な有害反応を惹起しないことを意味する。本発明で用いる生体親和性高分子は、生体に親和性を有するものであれば、生体内で分解されるか否かは特に限定されないが、生分解性高分子であることが好ましい。非生分解性材料として具体的には、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエステル、塩化ビニル、ポリカーボネート、アクリル、ステンレス、チタン、シリコーン、およびＭＰＣ（2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）などが挙げられる。生分解性材料としては、具体的には、天然由来のペプチド、リコンビナントペプチドまたは化学合成ペプチドなどのポリペプチド（例えば、以下に説明するゼラチン等）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、およびキトサンなどが挙げられる。上記の中でも、リコンビナントペプチドが特に好ましい。これら生体親和性高分子には細胞接着性を高める工夫がなされていてもよい。具体的には、「基材表面に対する細胞接着基質（フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン）や細胞接着配列（アミノ酸一文字表記で表される、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、およびＨＡＶ配列）ペプチドによるコーティング」、「基材表面のアミノ化、カチオン化」、または「基材表面のプラズマ処理、コロナ放電による親水性処理」といった方法を使用できる。
【００３０】
リコンビナントペプチドまたは化学合成ペプチドを含むポリペプチドの種類は生体親和性を有するものであれば特に限定されないが、例えば、ゼラチン、コラーゲン、アテロコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、プロネクチン、ラミニン、テネイシン、フィブリン、フィブロイン、エンタクチン、トロンボスポンジン、レトロネクチン（登録商標）が好ましく、最も好ましくはゼラチン、コラーゲン、アテロコラーゲンである。本発明で用いるためのゼラチンとしては、好ましくは、天然ゼラチン、リコンビナントゼラチンまたは化学合成ゼラチンであり、さらに好ましくはリコンビナントゼラチンである。ここでいう天然ゼラチンとは天然由来のコラーゲンより作られたゼラチンを意味する。
【００３１】
化学合成ペプチドまたは化学合成ゼラチンとは、人工的に合成したペプチドまたはゼラチンを意味する。ゼラチン等のペプチドの合成は、固相合成でも液相合成でもよいが、好ましくは固相合成である。ペプチドの固相合成は当業者に公知であり、例えば、アミノ基の保護としてＦｍｏｃ基（Fluorenyl-Methoxy-Carbonyl基）を使用するＦｍｏｃ基合成法、並びにアミノ基の保護としてＢｏｃ基（tert-Butyl Oxy Carbonyl基）を使用するＢｏｃ基合成法などが挙げられる。なお、化学合成ゼラチンの好ましい態様は、本明細書中後記するリコンビナントゼラチンに記載した内容を当てはめることができる。
【００３２】
本発明で用いる生体親和性高分子の親水性値「１／ＩＯＢ」値は、０から１．０が好ましい。より好ましくは、０から０．６であり、さらに好ましくは０から０．４である。ＩＯＢとは、藤田穆により提案された有機化合物の極性/非極性を表す有機概念図に基づく、親疎水性の指標であり、その詳細は、例えば、"Pharmaceutical Bulletin", vol.2, 2, pp.163-173（1954）、「化学の領域」vol.11, 10, pp.719-725（1957）、「フレグランスジャーナル」, vol.50, pp.79-82（1981）等で説明されている。簡潔に言えば、全ての有機化合物の根源をメタン（ＣＨ4）とし、他の化合物はすべてメタンの誘導体とみなして、その炭素数、置換基、変態部、環等にそれぞれ一定の数値を設定し、そのスコアを加算して有機性値（ＯＶ）、無機性値（ＩＶ）を求め、この値を、有機性値をＸ軸、無機性値をＹ軸にとった図上にプロットしていくものである。有機概念図におけるＩＯＢとは、有機概念図における有機性値（ＯＶ）に対する無機性値（ＩＶ）の比、すなわち「無機性値（ＩＶ）／有機性値（ＯＶ）」をいう。有機概念図の詳細については、「新版有機概念図−基礎と応用−」（甲田善生等著、三共出版、２００８）を参照されたい。本明細書中では、ＩＯＢの逆数をとった「１／ＩＯＢ」値で親疎水性を表している。「１／ＩＯＢ」値が小さい（０に近づく）程、親水性であることを表す表記である。
【００３３】
本発明で用いる高分子の「１／ＩＯＢ」値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ、吸水性が高くなることから、栄養成分の保持に有効に作用し、結果として、本発明にかかる細胞構造体（モザイク細胞塊）における細胞の安定化・生存しやすさに寄与するものと推定される。
【００３４】
本発明で用いる生体親和性高分子がポリペプチドである場合は、Grand average of hydropathicity（GRAVY）値で表される親疎水性指標において、０．３以下、マイナス９．０以上であることが好ましく、０．０以下、マイナス７．０以上であることがさらに好ましい。Grand average of hydropathicity（GRAVY）値は、『Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A.;Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server;(In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005). pp. 571-607』および『Gasteiger E., Gattiker A., Hoogland C., Ivanyi I., Appel R.D., Bairoch A.; ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.; Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003).』の方法により得ることができる。
【００３５】
本発明で用いる高分子のＧＲＡＶＹ値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ、吸水性が高くなることから、栄養成分の保持に有効に作用し、結果として、本発明にかかる細胞構造体（モザイク細胞塊）における細胞の安定化・生存しやすさに寄与するものと推定される。
【００３６】
（１−２）架橋
本発明で用いる生体親和性高分子は、架橋されているものでもよいし、架橋されていないものでもよいが、架橋されているものが好ましい。架橋されている生体親和性高分子を使用することにより、培地中で培養する際および生体に移植した際に瞬時に分解してしまうことを防ぐという効果が得られる。一般的な架橋方法としては、熱架橋、アルデヒド類（例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど）による架橋、縮合剤（カルボジイミド、シアナミドなど）による架橋、酵素架橋、光架橋、紫外線架橋、疎水性相互作用、水素結合、およびイオン性相互作用などが知られており、本発明においても上記の架橋方法を使用することができる。本発明で使用する架橋方法としては、さらに好ましくは熱架橋、紫外線架橋、または酵素架橋であり、特に好ましくは熱架橋である。
【００３７】
酵素による架橋を行う場合、酵素としては、高分子材料間の架橋作用を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはトランスグルタミナーゼまたはラッカーゼ、最も好ましくはトランスグルタミナーゼを用いて架橋を行うことができる。トランスグルタミナーゼで酵素架橋するタンパク質の具体例としては、リジン残基およびグルタミン残基を有するタンパク質であれば特に制限されない。トランスグルタミナーゼは、哺乳類由来のものであっても、微生物由来のものであってもよく、具体的には、味の素（株）製アクティバシリーズ、試薬として販売されている哺乳類由来のトランスグルタミナーゼ、例えば、オリエンタル酵母工業（株）製、Upstate USA Inc.製、Biodesign International製などのモルモット肝臓由来トランスグルタミナーゼ、ヤギ由来トランスグルタミナーゼ、ウサギ由来トランスグルタミナーゼなど、並びにヒト由来の血液凝固因子（Factor XIIIa、Haematologic Technologies， Inc.社）などが挙げられる。
【００３８】
架橋（例えば、熱架橋）を行う際の反応温度は、架橋ができる限り特に限定されないが、好ましくは、−１００℃〜５００℃であり、より好ましくは０℃〜３００℃であり、更に好ましくは５０℃〜３００℃であり、特に好ましくは１００℃〜２５０℃であり、最も好ましくは１２０℃〜２００℃である。
【００３９】
（１−３）リコンビナントゼラチン
本発明で言うリコンビナントゼラチンとは、遺伝子組み換え技術により作られたゼラチン類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは蛋白様物質を意味する。本発明で用いることができるリコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列（ＸおよびＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す）の繰り返しを有するものが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。好ましくは、細胞接着シグナルが一分子中に２配列以上含まれている。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとしては、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンを用いることができる。例えばＥＰ１０１４１７６、米国特許６９９２１７２号、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３、国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１等に記載のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして好ましいものは、以下の態様のリコンビナントゼラチンである。
【００４０】
リコンビナントゼラチンは、天然のゼラチン本来の性能から、生体親和性に優れ、且つ天然由来ではないことで牛海綿状脳症（ＢＳＥ）などの懸念がなく、非感染性に優れている。また、リコンビナントゼラチンは天然ゼラチンと比べて均一であり、配列が決定されているので、強度および分解性においても架橋等によってブレを少なく精密に設計することが可能である。
【００４１】
リコンビナントゼラチンの分子量は、特に限定されないが、好ましくは２０００以上１０００００以下（２ｋＤａ（キロダルトン）以上１００ｋＤａ以下）であり、より好ましくは２５００以上９５０００以下（２．５ｋＤａ以上９５ｋＤａ以下）であり、さらに好ましくは５０００以上９００００以下（５ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下）であり、最も好ましくは１００００以上９００００以下（１０ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下）である。
【００４２】
リコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列の繰り返しを有することが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ において、Ｇｌｙはグリシンを表し、ＸおよびＹは、任意のアミノ酸（好ましくは、グリシン以外の任意のアミノ酸）を表す。コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列とは、ゼラチン・コラーゲンのアミノ酸組成および配列における、他のタンパク質と比較して非常に特異的な部分構造である。この部分においてはグリシンが全体の約３分の１を占め、アミノ酸配列では３個に１個の繰り返しとなっている。グリシンは最も簡単なアミノ酸であり、分子鎖の配置への束縛も少なく、ゲル化に際してのヘリックス構造の再生に大きく寄与している。ＸおよびＹで表されるアミノ酸はイミノ酸（プロリン、オキシプロリン）が多く含まれ、全体の１０％〜４５％を占めることが好ましい。好ましくは、リコンビナントゼラチンの配列の８０％以上、更に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上のアミノ酸が、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙの繰り返し構造である。
【００４３】
一般的なゼラチンは、極性アミノ酸のうち電荷を持つものと無電荷のものが１：１で存在する。ここで、極性アミノ酸とは具体的にシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシンおよびアルギニンを指し、このうち極性無電荷アミノ酸とはシステイン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニンおよびチロシンを指す。本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいては、構成する全アミノ酸のうち、極性アミノ酸の割合が１０〜４０％であり、好ましくは２０〜３０％である。且つ上記極性アミノ酸中の無電荷アミノ酸の割合が５％以上２０％未満、好ましくは５％以上１０％未満であることが好ましい。さらに、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシンおよびシステインのうちいずれか１アミノ酸、好ましくは２以上のアミノ酸を配列上に含まないことが好ましい。
【００４４】
一般にポリペプチドにおいて、細胞接着シグナルとして働く最小アミノ酸配列が知られている（例えば、株式会社永井出版発行「病態生理」Ｖｏｌ．９、Ｎｏ．７（１９９０年）５２７頁）。本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、これらの細胞接着シグナルを一分子中に２以上有することが好ましい。具体的な配列としては、接着する細胞の種類が多いという点で、アミノ酸一文字表記で現わされる、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、およびＨＡＶ配列の配列が好ましい。さらに好ましくはＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＩＫＶＡＶ配列およびＨＡＶ配列、特に好ましくはＲＧＤ配列である。ＲＧＤ配列のうち、好ましくはＥＲＧＤ配列である。細胞接着シグナルを有するリコンビナントゼラチンを用いることにより、細胞の基質産生量を向上させることができる。
【００４５】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおけるＲＧＤ配列の配置としては、ＲＧＤ間のアミノ酸数が０〜１００の間で均一でないことが好ましく、ＲＧＤ間のアミノ酸数が２５〜６０の間で均一でないことがより好ましい。
この最小アミノ酸配列の含有量は、細胞接着・増殖性の観点から、タンパク質１分子中に好ましくは３〜５０個であり、さらに好ましくは４〜３０個であり、特に好ましくは５〜２０個であり、最も好ましくは１２個である。
【００４６】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいて、アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は少なくとも０．４％であることが好ましい。リコンビナントゼラチンが３５０以上のアミノ酸を含む場合、３５０のアミノ酸の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤモチーフを含むことが好ましい。アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は、より好ましくは少なくとも０．６％であり、更に好ましくは少なくとも０．８％であり、更に一層好ましくは少なくとも１．０％であり、特に好ましくは少なくとも１．２％であり、最も好ましくは少なくとも１．５％である。リコンビナントペプチド内のＲＧＤモチーフの数は、２５０のアミノ酸あたり、好ましくは少なくとも４、より好ましくは６、更に好ましくは８、特に好ましくは１２以上１６以下である。ＲＧＤモチーフの０．４％という割合は、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも１つのＲＧＤ配列に対応する。ＲＧＤモチーフの数は整数であるので、０．４％の特徴を満たすには、２５１のアミノ酸からなるゼラチンは、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含まなければならない。好ましくは、本発明のリコンビナントゼラチンは、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含み、より好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも３つのＲＧＤ配列を含み、さらに好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも４つのＲＧＤ配列を含む。本発明のリコンビナントゼラチンのさらなる態様としては、好ましくは少なくとも４つのＲＧＤモチーフを含み、より好ましくは６つのＲＧＤモチーフを含み、さらに好ましくは８つのＲＧＤモチーフを含み、特に好ましくは１２以上１６以下のＲＧＤモチーフを含む。
【００４７】
リコンビナントゼラチンは部分的に加水分解されていてもよい。
【００４８】
好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、式１：Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）n］m−Ｂで示されるものである。ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。ｍは好ましくは２〜１０の整数を示し、より好ましくは３〜５の整数を示す。ｎは３〜１００の整数が好ましく、１５〜７０の整数がさらに好ましく、５０〜６５の整数が最も好ましい。Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示す。なお、ｎ個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
【００４９】
より好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）63］3−Ｇｌｙ（式中、６３個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、６３個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、６３個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）で示されるものである。
【００５０】
繰り返し単位には天然に存在するコラーゲンの配列単位を複数結合することが好ましい。ここで言う天然に存在するコラーゲンとは天然に存在するものであればいずれでも構わないが、好ましくはＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、またはＶ型コラーゲンである。より好ましくは、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型コラーゲンである。別の形態によると、上記コラーゲンの由来は好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、マウスまたはラットであり、より好ましくはヒトである。
【００５１】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンの等電点は、好ましくは５〜１０であり、より好ましくは６〜１０であり、さらに好ましくは７〜９．５である。リコンビナントゼラチンの等電点の測定は、等電点電気泳動法（Ｍａｘｅｙ，Ｃ．Ｒ．（１９７６；Ｐｈｉｔｏｇｒ．Ｇｅｌａｔｉｎ ２，Ｅｄｉｔｏｒ Ｃｏｘ，Ｐ．Ｊ．Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌ．参照）に記載されたように、１質量％ゼラチン溶液をカチオンおよびアニオン交換樹脂の混晶カラムに通したあとのｐＨを測定することで実施することができる。
【００５２】
好ましくは、リコンビナントゼラチンは脱アミン化されていない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンはテロペプタイドを有さない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンは、アミノ酸配列をコードする核酸により調製された実質的に純粋なポリペプチドである。
【００５３】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして特に好ましくは、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；または
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上（さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
の何れかである
【００５４】
本発明における配列同一性は、以下の式で計算される値を指す。
％配列同一性＝［（同一残基数）／（アラインメント長）］×１００
２つのアミノ酸配列における配列同一性は当業者に公知の任意の方法で決定することができ、ＢＬＡＳＴ（(Basic Local Alignment Search Tool)）プログラム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）等を使用して決定することができる。
【００５５】
「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」における「１若しくは数個」とは、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。
【００５６】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、当業者に公知の遺伝子組み換え技術によって製造することができ、例えばＥＰ１０１４１７６Ａ２号公報、米国特許第６９９２１７２号公報、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３号、国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号等に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、所定のリコンビナントゼラチンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組み換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、リコンビナントゼラチンが産生されるので、培養物から産生されたリコンビナントゼラチンを回収することにより、本発明で用いるリコンビナントゼラチンを調製することができる。
【００５７】
（１−４）生体親和性高分子ブロック
本発明では、上記した生体親和性高分子からなるブロック（塊）を使用する。
本発明における生体親和性高分子ブロックの形状は特に限定されるものではない。例えば、不定形、球状、粒子状（顆粒）、粉状、多孔質状、繊維状、紡錘状、扁平状およびシート状であり、好ましくは、不定形、球状、粒子状（顆粒）、粉状および多孔質状である。不定形とは、表面形状が均一でないもののことを示し、例えば、岩のような凹凸を有する物を示す。なお、上記の形状の例示はそれぞれ別個のものではなく、例えば、粒子状（顆粒）の下位概念の一例として不定形となる場合もある。
【００５８】
本発明における生体親和性高分子ブロックの形状は上記の通り特に限定されるものではないが、タップ密度が、好ましくは１０ｍｇ／ｃｍ3以上５００ｍｇ／ｃｍ3以下であり、より好ましくは２０ｍｇ／ｃｍ3以上４００ｍｇ／ｃｍ3以下であり、さらに好ましくは４０ｍｇ／ｃｍ3以上２２０ｍｇ／ｃｍ3以下であり、特に好ましくは５０ｍｇ／ｃｍ3以上１５０ｍｇ／ｃｍ3以下である。
【００５９】
タップ密度は、ある体積にどれくらいのブロックを密に充填できるかを表す値であり、値が小さいほど、密に充填できない、すなわちブロックの構造が複雑であることが分かる。生体親和性高分子ブロックのタップ密度とは、生体親和性高分子ブロックの表面構造の複雑性、および生体親和性高分子ブロックを集合体として集めた場合に形成される空隙の量を表していると考えられる。タップ密度が小さい程、生体親和性高分子ブロック間の空隙が多くなり、細胞の生着領域が多くなる。また、小さ過ぎないことで、細胞同士の間に適度に生体親和性高分子ブロックが存在でき、細胞構造体とした場合に同構造体内部への栄養分送達を可能とすることから、上記の範囲に収まることが好適であると考えられる。
【００６０】
本明細書でいうタップ密度は、以下のように測定できる。測定のために（直径６ｍｍ、長さ２１．８ｍｍの円筒状：容量０．６１６ｃｍ3）の容器（以下、キャップと記載する）を用意する。まず、キャップのみの質量を測定する。その後、キャップにロートを付け、ブロックがキャップに溜まるようにロートから流し込む。十分量のブロックを入れた後、キャップ部分を２００回机などの硬いところにたたきつけ、ロートをはずし、スパチュラですりきりにする。このキャップにすりきり一杯入った状態で質量を測定する。キャップのみの質量との差からブロックのみの質量を算出し、キャップの体積で割ることで、タップ密度を求めることができる。
【００６１】
本発明における生体親和性高分子ブロックの架橋度は、特に限定されないが、好ましくは２以上であり、さらに好ましくは２以上３０以下であり、さらに好ましくは４以上２５以下であり、特に好ましくは４以上２２以下である。
【００６２】
生体親和性高分子ブロックの架橋度（１分子当たりの架橋数）の測定方法は、特に限定されないが、生体親和性高分子がＣＢＥ３の場合には、例えば、後記実施例に記載のＴＮＢＳ（2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸）法で測定することができる。具体的には、生体親和性高分子ブロック、ＮａＨＣＯ3水溶液およびＴＮＢＳ水溶液を混合して３７℃で３時間反応させた後に反応停止したサンプルと、生体親和性高分子ブロック、ＮａＨＣＯ3水溶液およびＴＮＢＳ水溶液を混合した直後に反応停止させたブランクとをそれぞれ調製し、純水で希釈したサンプルおよびブランクの吸光度（３４５nm）を測定し、以下の（式２）、および（式３）から架橋度（１分子当たりの架橋数）を算出することができる。
【００６３】
（式２）  （As-Ab）／１４６００×V／ｗ
（式２）は、生体親和性高分子ブロック１ｇ当たりのリジン量（モル等量）を示す。
（式中、Asはサンプル吸光度、Abはブランク吸光度、Vは反応液量（ｇ）、ｗは生体親和性高分子ブロック質量（ｍｇ）を示す。）
【００６４】
（式３）  １−（サンプル（式２）/未架橋の高分子（式２））×３４
（式３）は、１分子あたりの架橋数を示す。
【００６５】
本発明における生体親和性高分子ブロックの吸水率は、特に限定されないが、好ましくは３００％以上、より好ましくは４００％以上、さらに好ましくは５００％以上、特に好ましくは６００％以上、最も好ましくは７００％以上である。なお吸水率の上限は特に限定されないが、一般的には４０００％以下、または２０００％以下である。
【００６６】
生体親和性高分子ブロックの吸水率の測定方法は、特に限定されないが、例えば、後記実施例に記載の方法により測定することができる。具体的には、２５℃において３ｃｍ×３ｃｍのナイロンメッシュ製の袋の中に、生体親和性高分子ブロック約１５ｍｇを充填し、２時間イオン交換水中で膨潤させた後、１０分風乾させ、それぞれの段階において質量を測定し、（式４）に従って吸水率を求めることができる。
【００６７】
（式４）
吸水率＝（ｗ２−ｗ１−ｗ０）／ｗ０
（式中、ｗ０は、吸水前の材料の質量、ｗ１は吸水後の空袋の質量、ｗ２は吸水後の材料を含む袋全体の質量を示す。）
【００６８】
本発明における生体親和性高分子ブロック一つの大きさは、２０μｍ以上２００μｍ以下であり、好ましくは２０μｍ以上１５０μｍ以下であり、より好ましくは５０μｍ以上１２０μｍ以下であり、さらに好ましくは５３μｍ以上１０６μｍ以下である。
生体親和性高分子ブロック一つの大きさを上記の範囲内にすることにより、外部から細胞構造体の内部への栄養送達を良好にすることができる。なお、生体親和性高分子ブロック一つの大きさとは、複数個の生体親和性高分子ブロックの大きさの平均値が上記範囲にあることを意味するものではなく、複数個の生体親和性高分子ブロックを篩にかけて得られる、一つ一つの生体親和性高分子ブロックのサイズを意味するものである。
【００６９】
ブロック一つの大きさは、ブロックを分ける際に用いたふるいの大きさで定義することができる。例えば、１８０μｍのふるいにかけ、通過したブロックを１０６μｍのふるいにかけた際にふるいの上に残るブロックを、１０６〜１８０μｍの大きさのブロックとすることができる。次に、１０６μｍのふるいにかけ、通過したブロックを５３μｍのふるいにかけた際にふるいの上に残るブロックを、５３〜１０６μｍの大きさのブロックとすることができる。次に、５３μｍのふるいにかけ、通過したブロックを２５μｍのふるいにかけた際にふるいの上に残るブロックを、２５〜５３μｍの大きさのブロックとすることができる。
【００７０】
（１−５）生体親和性高分子ブロックの製造方法
生体親和性高分子ブロックの製造方法は、特に限定されないが、例えば、生体親和性高分子を含有する固形物（生体親和性高分子の多孔質体など）を、粉砕機（ニューパワーミルなど）を用いて粉砕することにより、生体親和性高分子ブロックを得ることができる。生体親和性高分子を含有する固形物（多孔質体など）は、例えば、生体親和性高分子を含有する水溶液を凍結乾燥して得ることができる。
【００７１】
上記の通り、生体親和性高分子を含有する固形物を粉砕することにより、表面形状が均一でない不定形の生体親和性高分子ブロックを製造することができる。
【００７２】
生体親和性高分子の多孔質体を製造する方法としては、特に限定されないが、生体親和性高分子を含む水溶液を凍結乾燥させることによっても得ることができる。例えば、溶液内で最も液温の高い部分の液温（内部最高液温）が、未凍結状態で「溶媒融点−３℃」以下となる凍結工程を含めることによって、形成される氷は球状とすることができる。この工程を経て、氷が乾燥されることで、球状の等方的な空孔（球孔）を持つ多孔質体が得られる。溶液内で最も液温の高い部分の液温（内部最高液温）が、未凍結状態で「溶媒融点−３℃」以上となる凍結工程を含まずに、凍結されることで、形成される氷は柱／平板状とすることができる。この工程を経て、氷が乾燥されると、一軸あるいは二軸上に長い、柱状あるいは平板状の空孔（柱／平板孔）を持つ多孔質体が得られる。生体親和性高分子の多孔質体を、粉砕し、生体親和性高分子ブロックを製造する場合には、粉砕前の多孔質体の空孔が、得られる生体親和性高分子ブロックの形状に影響を与えるため、上記の通り、凍結乾燥の条件を調整することにより、得られる生体親和性高分子ブロックの形状を調整することができる。
【００７３】
生体親和性高分子の多孔質体の製造方法の一例としては、
（ａ）溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が２．５℃以下であり、かつ、溶液内で最も液温の高い部分の温度が溶媒の融点以下で、生体親和性高分子の溶液を、未凍結状態に冷却する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた生体親和性高分子の溶液を凍結する工程、および
（ｃ）工程（ｂ）で得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する工程
を含む方法を挙げることができるが、上記方法に限定されるわけではない。
【００７４】
生体親和性高分子の溶液を未凍結状態に冷却する際に、最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が２．５℃以下（好ましくは２．３℃以下、より好ましくは２．１℃以下）、つまり温度の差を小さくすることによって、得られる多孔質のポアの大きさのばらつきが少なくなる。なお最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差の下限は特に限定されず、０℃以上であればよく、例えば０．１℃以上、０．５℃以上、０．８℃以上、または０．９℃以上でもよい。これにより、製造された多孔質体を用いて製造した生体親和性高分子ブロックを用いた細胞構造体は、高い細胞数を示すという効果が達成される。
【００７５】
工程（ａ）の冷却は、例えば、水よりも熱伝導率の低い素材（好ましくは、テフロン（登録商標））を介して冷却することが好ましく、溶液内で最も液温の高い部分は、冷却側から最も遠い部分と擬制することができ、溶液内で最も液温の低い部分は、冷却面の液温と擬制することができる。
【００７６】
好ましくは、工程（ａ）において、凝固熱発生直前の、溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が２．５℃以下であり、より好ましくは２．３℃以下であり、さらに好ましくは２．１℃以下である。ここで「凝固熱発生直前の温度差」とは、凝固熱発生時の１秒前〜１０秒前の間で最も温度差が大きくなるときの温度差を意味する。
【００７７】
好ましくは、工程（ａ）において、溶液内で最も液温の低い部分の温度は、溶媒融点−５℃以下であり、より好ましくは溶媒融点−５℃以下かつ溶媒融点−２０℃以上であり、更に好ましくは溶媒融点−６℃以下かつ溶媒融点−１６℃以上である。なお、溶媒融点の溶媒とは、生体親和性高分子の溶液の溶媒である。
【００７８】
工程（ｂ）においては、工程（ａ）で得られた生体親和性高分子の溶液を凍結する。工程（ｂ）にて凍結するための冷却温度は、特に制限されるものではなく、冷却する機器にもよるが、好ましくは、溶液内で最も液温の低い部分の温度より、３℃から３０℃低い温度であり、より好ましくは、５℃から２５℃低い温度であり、更に好ましくは、１０℃から２０℃低い温度である。
【００７９】
工程（ｃ）においては、工程（ｂ）で得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する。凍結乾燥は、常法により行うことができ、例えば、溶媒の融点より低い温度で真空乾燥を行い、さらに室温（２０℃）で真空乾燥を行うことにより凍結乾燥を行うことができる。
【００８０】
本発明では好ましくは、上記工程（ｃ）で得られた多孔質体を粉砕することによって、生体親和性高分子ブロックを製造することができる。
【００８１】
（２）細胞
本発明で使用する細胞は、その種類は特に限定されるものではなく、本発明の目的である、トロフィックファクタ放出する細胞を好適に用いることができ、実際の治療目的に応じて、任意の細胞を使用することができる。また、使用する細胞は１種でもよいし、複数種の細胞を組合せて用いてもよい。使用する細胞として、好ましくは、動物細胞であり、より好ましくは脊椎動物由来細胞、特に好ましくはヒト由来細胞である。脊椎動物由来細胞（特に、ヒト由来細胞）の種類は、万能細胞、体性幹細胞、前駆細胞、または成熟細胞の何れでもよく、特に好ましくは体性幹細胞である。
【００８２】
万能細胞としては、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、生殖幹（ＧＳ）細胞、または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を使用することができる。体性幹細胞としては、例えば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、造血幹細胞、羊膜細胞、臍帯血細胞、骨髄由来細胞（例えば、骨髄由来間ＭＳＣ等）、心筋幹細胞、脂肪由来幹細胞、または神経幹細胞を使用することができる。前駆細胞および成熟細胞としては、例えば、皮膚、真皮、表皮、筋肉、心筋、神経、骨、軟骨、内皮、脳、上皮、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、口腔内、角膜、骨髄、臍帯血、羊膜、または毛に由来する細胞を使用することができる。ヒト由来細胞としては、例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ＭＳＣ、軟骨細胞、骨芽細胞、骨芽前駆細胞、間充織細胞、筋芽細胞、心筋細胞、心筋芽細胞、神経細胞、肝細胞、ベータ細胞、線維芽細胞、角膜内皮細胞、血管内皮細胞、角膜上皮細胞、羊膜細胞、臍帯血細胞、骨髄由来細胞、または造血幹細胞を使用することができる。また、細胞の由来は、自家細胞または他家細胞の何れでも構わない。上記の中でも、細胞としては、間葉系幹細胞を使用することが好ましい。間葉系幹細胞としては、脂肪由来間葉系幹細胞または骨髄由来間葉系幹細胞が好ましい。間葉系幹細胞の由来としては、ヒト由来または犬由来が好ましい。
【００８３】
（３）細胞構造体
本発明の細胞構造体は、上記した本発明にかかる生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体である。本発明においては、上記した生体親和性高分子ブロックと上記した細胞とを用いて、複数個の細胞間の隙間に複数個の高分子ブロックをモザイク状に３次元的に配置させることによって、生体親和性高分子ブロックと細胞とがモザイク状に３次元配置されることにより、構造体中で細胞が均一に存在する細胞３次元構造体が形成され、前述したように、物質透過能を有することとなる。
【００８４】
本発明の細胞構造体は、複数個の細胞間の隙間に複数個の高分子ブロックが配置されているが、ここで、「細胞間の隙間」とは、構成される細胞により、閉じられた空間である必要はなく、細胞により挟まれていればよい。なお、すべての細胞間に隙間がある必要はなく、細胞同士が接触している箇所があってもよい。高分子ブロックを介した細胞間の隙間の距離、即ち、ある細胞とその細胞から最短距離に存在する細胞を選択した際の隙間距離は特に制限されるものではないが、高分子ブロックの大きさであることが好ましく、好適な距離も高分子ブロックの好適な大きさの範囲である。
【００８５】
また、本発明にかかる高分子ブロックは、細胞により挟まれた構成となるが、すべての高分子ブロック間に細胞がある必要はなく、高分子ブロック同士が接触している箇所があってもよい。細胞を介した高分子ブロック間の距離、即ち、高分子ブロックとその高分子ブロックから最短距離に存在する高分子ブロックを選択した際の距離は特に制限されるものではないが、使用される細胞が１〜数個集まった際の細胞の塊の大きさであることが好ましく、例えば、１０μｍ以上１０００μｍ以下であり、好ましくは１０μｍ以上１００μｍ以下であり、より好ましくは１０μｍ以上５０μｍ以下である。
【００８６】
なお、本明細書中、「構造体中で細胞が均一に存在する細胞３次元構造体」等、「均一に存在する」との表現を使用しているが、完全な均一を意味するものではない。
【００８７】
本発明の細胞構造体の厚さまたは直径は、所望の厚さとすることができるが、下限としては、２１５μｍ以上であることが好ましく、４００μｍ以上がさらに好ましく、７３０μｍ以上であることが最も好ましい。厚さまたは直径の上限は特に限定されないが、使用上の一般的な範囲としては３ｃｍ以下が好ましく、２ｃｍ以下がより好ましく、１ｃｍ以下であることが更に好ましい。また、細胞構造体の厚さまたは直径の範囲として、好ましくは、４００μｍ以上３ｃｍ以下、より好ましくは５００μｍ以上２ｃｍ以下、更に好ましくは７２０μｍ以上１ｃｍ以下である。
【００８８】
本発明の細胞構造体は、好ましくは、高分子ブロックからなる領域と細胞からなる領域がモザイク状に配置されている。尚、本明細書中における「細胞構造体の厚さまたは直径」とは、以下のことを示すものとする。細胞構造体中のある一点Ａを選択した際に、その点Ａを通る直線の内で、細胞構造体外界からの距離が最短になるように細胞構造体を分断する線分の長さを線分Ａとする。細胞構造体中でその線分Ａが最長となる点Ａを選択し、その際の線分Ａの長さのことを「細胞構造体の厚さまたは直径」とする。
【００８９】
本発明の細胞構造体においては、細胞と高分子ブロックの比率は特に限定されないが、好ましくは細胞1個当りの高分子ブロックの質量が０．００００００１μｇ以上１μｇ以下であることが好ましく、より好ましくは０．０００００１μｇ以上０．１μｇ以下、さらに好ましくは０．００００１μｇ以上０．０１μｇ以下、最も好ましくは０．００００２μｇ以上０．００６μｇ以下である。上記範囲とすることにより、より細胞を均一に存在させることができる。また、下限を上記範囲とすることにより、上記用途に使用した際に細胞の効果を発揮することができ、上限を上記範囲とすることにより、任意で存在する高分子ブロック中の成分を細胞に供給できる。ここで、高分子ブロック中の成分は特に制限されないが、後記する培地に含まれる成分が挙げられる。
【００９０】
（４）細胞構造体の製造方法
本発明で用いる細胞構造体は、生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを混合することによって製造することができる。より具体的には、本発明の細胞構造体は、生体親和性高分子ブロック（生体親和性高分子からなる塊）と、細胞とを交互に配置することにより製造できる。製造方法は特に限定されないが、好ましくは高分子ブロックを形成したのち、細胞を播種する方法である。具体的には、生体親和性高分子ブロックと細胞含有培養液との混合物をインキュベートすることによって、細胞構造体を製造することができる。例えば、容器中、容器に保持される液体中で、細胞と、予め作製した生体親和性高分子ブロックをモザイク状に配置する。配置の手段としては、自然凝集、自然落下、遠心、攪拌を用いることで、細胞と生体親和性基材からなるモザイク状の配列形成を、促進、制御することが好ましい。
【００９１】
用いられる容器としては、細胞低接着性材料、細胞非接着性材料からなる容器が好ましく、より好ましくはポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ガラス、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレートからなる容器である。容器底面の形状は平底型、Ｕ字型、Ｖ字型であることが好ましい。
【００９２】
上記の方法で得られたモザイク状細胞構造体は、例えば、（ａ）別々に調整したモザイク状細胞塊同士を融合させる、または（ｂ）分化培地または増殖培地下でボリュームアップさせる、などの方法により所望の大きさの細胞構造体を製造することができる。融合の方法、ボリュームアップの方法は特に限定されない。
【００９３】
例えば、生体親和性高分子ブロックと細胞含有培養液との混合物をインキュベートする工程において、培地を分化培地または増殖培地に交換することによって、細胞構造体をボリュームアップさせることができる。好ましくは、生体親和性高分子ブロックと細胞含有培養液との混合物をインキュベートする工程において、生体親和性高分子ブロックをさらに添加することによって、所望の大きさの細胞構造体であって、細胞構造体中に細胞が均一に存在する細胞構造体を製造することができる。
【００９４】
上記別々に調整したモザイク状細胞塊同士を融合させる方法とは、具体的には、複数個の生体親和性高分子ブロックと、複数個の細胞とを含み、上記複数の細胞により形成される複数個の隙間の一部または全部に、一または複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体を複数個融合させる工程を含む、細胞構造体の製造方法である。
【００９５】
本発明で用いる細胞構造体の製造方法における「生体親和性高分子ブロック（種類、大きさ等）」、「細胞」、「細胞間の隙間」、「得られる細胞構造体（大きさ等）」、「細胞と高分子ブロックの比率」等の好適な範囲は、本明細書中上記と同様である。
【００９６】
（５）トロフィックファクタ放出剤
本発明のトロフィックファクタ放出剤によれば、細胞構造体の細胞からトロフィックファクタが放出される。細胞からトロフィックファクタが放出されるとは、細胞内においてトロフィックファクタが産生し、細胞内で産生されたトロフィックファクタが細胞外に分泌されることを意味する。
【００９７】
トロフィックファクタとは、生理活性または生物活性を有する物質（特に細胞が産生する物質）を意味する。トロフィックファクタとしては、サイトカイン、ホルモンおよび増殖因子および酵素等が挙げられる。
サイトカインとは、細胞から放出され、細胞間相互作用を媒介するタンパク質性因子を意味する。
ホルモンとは、動物体内（一般的には内分泌腺）で産生され、体液中に分泌されて、特定の器官、組織または細胞等の活動に一定の変化を与える化学物質を意味する。
【００９８】
増殖因子とは、細胞の増殖を促進または制御する物質を意味する。
酵素とは、生体内の種々の化学反応を触媒するタンパク質を意味する。
なお、サイトカイン、ホルモンおよび増殖因子および酵素は、互いに排他的な意味を有するわけではない。
【００９９】
トロフィックファクタの具体例としては、ＴＳＧ−６（TNF-stimulated gene 6 protein）（TNFはTumor Necrosis Factor）、ＡＮＧ（Angiogenin）、ＥＧＦ（Epidermal Growth Factor）、ＥＮＡ−７８（epithelial-derived neutrophil-activating peptide 78）、ｂＦＧＦ（Basic fibroblast growth factor）、ＩＧＦ（Insulin-like growth factors）（ＩＧＦ−１等）、ＭＣＰ（Membrane Cofactor Protein）（ＭＣＰ−１等）、ＰＤＧＦ（Platelet-Derived Growth Factor）（ＰＤＧＦ−ＢＢ等）、ＴＧＦ（Transforming growth factor）（ＴＧＦβ等）、ＴＩＭＰ（tissue inhibitors of matrix metalloproteinase）（ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２等）、ＴＨＰＯ（Thrombopoietin）、ＶＥＧＦ（vascular endothelial growth factor）、ＶＥＧＦ−Ｄ（vascular endothelial growth factor D）、ＮＧＦ(nerve growth factor)、ＢＤＮＦ(Brain-derived neurotrophic factor)、Ｇ−ＣＳＦ（granulocyte-colony stimulating factor）、ＧＭ−ＣＳＦ（Granulocyte Macrophage colony-stimulating Factor）、ＥＰＯ（Erythropoietin）、ＴＰＯ（Thrombopoietin）、ＨＧＦ（Hepatocyte growth factor）、ＢＭＰ（(Bone Morphogenetic Protein）、ＦＧＦ（Fibroblast growth factor）、インターロイキン（ＩＬ−６（Interleukin-6）、ＩＬ−８（Interleukin-8）等）、ケモカイン、インターフェロン（ＩＦＮγ（Interferon gamma）等）、ＴＮＦ（Tumor Necrosis Factor）、アディポカイン、インヒビン、副甲状腺ホルモン、カルシトニン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、バソプレッシン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、性腺刺激ホルモン、プロオラクチン、メラトニン、オキシトシン、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン、甲状腺ホルモン、サイロキシン、副腎髄質ホルモン、アドレナリン、ノルアドレナリン、アンドロゲン、テストステロン、エストロゲン、プロゲステロン、アルドステロンおよびコルチゾール等が挙げられる。
【０１００】
トロフィックファクタは好ましくは、ＴＳＧ−６、ＡＮＧ、ＥＧＦ、ＥＮＡ−７８、ｂＦＧＦ、ＩＦＮγ、ＩＧＦ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＴＧＦβ、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＴＨＰＯ、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ−Ｄの何れか１種以上である。
トロフィックファクタはより好ましくは、ＴＳＧ−６、ＡＮＧ、ＥＧＦ、ＥＮＡ−７８、ＩＧＦ−１、ＩＬ−８、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＴＧＦβ、ＴＨＰＯ、およびＶＥＧＦ−Ｄの何れか１種以上である。
トロフィックファクタは特に好ましくは、ＴＳＧ−６である。
【０１０１】
別の態様において、トロフィックファクタは好ましくは、サイトカインであり、より好ましくは抗炎症サイトカインであり、特に好ましくは、ＴＳＧ−６である。
【０１０２】
抗炎症サイトカインとは、抗炎症効果を有するサイトカインを意味する。抗炎症サイトカインとしては、ＴＳＧ−６、ＴＧＦβ、ＩＬ−４ 、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−２２、ＩＬ−２７、ＩＬ−３３、ＩＬ−３７、ＩＬ−３８、インターロイキン-1レセプター・アンタゴニスト（IL-1ra（ Interleukin-1 Receptor Antagonist））、Fasリガンド(FasL（Fas ligand）)、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL (TNF-ralated apotosis-inducing ligand)）、I型インターフェロン（IFNα(Interferon alfa)、IFNβ(Interferon beta)）ヒト白血球型抗原-G5（HLA-G5（human leukocyte antigen G)、インドールアミン-2,3-ジオキシゲナーゼ（IDO（indoleamine-2,3-dioxigenase））およびプロスタグランジンE2（PGE2(Prostaglandin E2)）が挙げられる。
【０１０３】
なお、トロフィックファクタとしては、細胞塊における産生放出量とモザイク細胞塊における産生放出量の比が１．１倍以上のものが好ましく、１．２倍以上のものがより好ましく、１．３倍以上のものがさらに好ましく、１．４倍以上のものが特に好ましい。
産生放出量は、モザイク細胞塊と細胞塊をそれぞれ培養し３日後に培養上清へ放出されたトロフィックファクタ量を定量することにより測定することができる。トロフィックファクタ量の定量は、トロフィックファクタの種類に応じて市販のキット等を用いて常法により行うことができる。
【０１０４】
本発明のトロフィックファクタ放出剤は、生体に移植して使用することができる。移植方法としては、切開、注射、内視鏡といったものが使用可能である。本発明のトロフィックファクタ放出剤は、細胞シートといった細胞移植物とは異なり、構造体のサイズを小さくすることができるため、注射による移植といった低侵襲の移植方法が可能となる。
【０１０５】
本発明のトロフィックファクタ放出剤を移植する際の量は、移植対象者の状態などに応じて適宜選択することができるが、移植する細胞数としては、１．０×１０5 cells/kg以上２．０×１０9cells/kg以下が好ましく、１．０×１０6 cells/kg以上２．０×１０8cells/kg以下がより好ましい。
本発明のトロフィックファクタ放出剤の移植回数は、１回だけ移植してもよいし、必要に応じ２回以上の移植を行うこともできる。
【０１０６】
（６）炎症疾患処置剤
後記の実施例１２に示す炎症刺激ＴＮＦα依存的なＴＳＧ−６産生放出量試験の結果から分かるように、本発明のトロフィックファクタ放出剤においては、ＴＮＦαでの刺激を行わなかった場合と比べて、ＴＮＦα刺激を行うことで顕著なＴＳＧ−６産生放出が認められた。即ち、本発明のトロフィックファクタ放出剤は、炎症刺激への応答性が高く、抗炎症サイトカインを多く放出することができることから、炎症疾患処置剤として有用である。本発明によれば、上記した本発明のトロフィックファクタ放出剤を含む、炎症疾患処置剤が提供される。
【０１０７】
さらに後記の実施例に示す通り、生体親和性高分子ブロックと間葉系幹細胞とを含み、複数個の間葉系幹細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体は、炎症疾患処置効果を発揮することができる。本発明の炎症疾患処置剤は、抗炎症サイトカインの放出またはＴ細胞の増殖もしくは活性化の抑制等によって、炎症疾患処置効果を発揮すると考えられる。
【０１０８】
炎症疾患とは、生体中での炎症反応が認められることで病態を表す疾患のことである。
炎症疾患としては、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、腎炎、急性腎炎、慢性腎炎、糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、糖尿病性腎症、膜性腎症、水腎症、造影剤腎症、腎盂腎炎、腎不全、急性腎炎、慢性腎炎、間質性腎炎、腎障害、ネフローゼ症候群、高血圧性腎硬化症、糖尿病性糸球体硬化症、腎結石、アミロイド腎、腎静脈血栓症、Ａｌｐｏｒｔ症候群、肝炎、肝硬変、膵炎、肺炎、副鼻腔炎、鼻炎、関節炎、関節リウマチ、周期性発熱・アフタ性口内炎・咽頭炎・リンパ節炎症候群（ＰＦＡＰＡ）、成人発症型スティル病、ベーチェット病、痛風、偽痛風、Ｓｃｈｎｉｔｚｌｅｒ症候群、慢性再発性多発性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、クリオピリン関連周期熱症候群（ＣＡＰＳ）、家族性寒冷蕁麻疹、Ｍｕｃｋｌｅ−Ｗｅｌｌｓ症候群、慢性乳児神経皮膚関節炎症候群（ＣＩＮＣＡ症候群）／新生児発症多臓器炎症疾患（ＮＯＭＩＤ）、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）受容体関連周期性症候群（ＴＲＡＰＳ）、高ＩｇＤ症候群（メバロン酸キナーゼ欠損症）、ブラウ症候群／若年発症サルコイドーシス、家族性地中海熱、ＰＡＰＡ（化膿性関節炎・壊疽性膿皮症・座瘡）症候群、中條−西村症候群、Ｍａｊｅｅｄ症候群、ＮＬＲＰ１２関連周期熱症候群（ＮＡＰＳ１２）、インターロイキン１受容体アンタゴニスト欠損症（ＤＩＲＡ）、インターロイキン３６受容体アンタゴニスト欠損症（ＤＩＴＲＡ）、フォスフォリパーゼＣγ２関連抗体欠損・免疫異常症（ＰＬＡＩＤ）、ＨＯＩＬ−１欠損症、ＳＬＣ２９Ａ３欠損症、ＣＡＲＤ１４異常症、ＡＤＡ２（アデノシンデアミナーゼ２）欠損症、ＳＴＩＮＧ-Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖａｓｃｕｌｏｐａｔｈｙ  ｗｉｔｈ  Ｏｎｓｅｔ  ｉｎ  Ｉｎｆａｎｃｙ（ＳＡＶＩ）およびＮＬＲＣ４異常症が挙げられ、炎症性腸疾患が好ましい。
【０１０９】
処置とは、各種疾患に対する予防または治療などを意味する。
予防とは、対象となる疾患に特有な症状の進行を予め抑制することを意味し、発症の阻害、発症リスクの低減または発症の遅延などが含まれる。進行の抑制の程度は何ら限定されず、程度がごくわずかであっても進行が抑制され得る限り、予防に含まれる。
治療とは、対象となる疾患または状態の改善または進行の抑制などを意味する。
処置剤とは、処置の目的で供せられる物質を意味する。
【０１１０】
本発明の炎症疾患処置剤は、生体に移植して使用することができる。移植方法としては、切開、注射、内視鏡といったものが使用可能である。本発明の炎症疾患処置剤は、細胞シートといった細胞移植物とは異なり、構造体のサイズを小さくすることができるため、注射による移植といった低侵襲の移植方法が可能となる。
【０１１１】
本発明の炎症疾患処置剤を移植する際の量は、移植対象者の状態などに応じて適宜選択することができるが、移植する細胞数としては、１．０×１０5 cells/kg以上２．０×１０9cells/kg以下が好ましく、１．０×１０6 cells/kg以上２．０×１０8cells/kg以下がより好ましい。本発明の炎症疾患処置剤の移植回数は、１回だけ移植してもよいし、必要に応じ２回以上の移植を行うこともできる。
【０１１２】
（７）各種の用途
本発明によれば、本発明で規定する細胞構造体を、トロフィックファクタを必要とする対象者に移植する工程を含むトロフィックファクタの放出方法が提供される。本発明によれば、本発明で規定する細胞構造体を、炎症疾患の処置を必要とする対象者に移植する工程を含む炎症疾患の処置方法が提供される。上記方法において、細胞構造体およびトロフィックファクタの好ましい範囲は、前述と同様である。
【０１１３】
本発明によれば、トロフィックファクタ放出のための、および／またはトロフィックファクタ放出による処置のための、本発明で規定する細胞構造体が提供される。本発明によれば、炎症疾患の処置のための、本発明で規定する細胞構造体が提供される。上記細胞構造体において、細胞構造体およびトロフィックファクタの好ましい範囲は、前述と同様である。
【０１１４】
本発明によれば、トロフィックファクタ放出剤の製造のための、本発明で規定する細胞構造体の使用が提供される。本発明によれば、炎症疾患処置剤の製造のための、本発明で規定する細胞構造体の使用が提供される。上記使用において、細胞構造体およびトロフィックファクタの好ましい範囲は、前述と同様である。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【０１１５】
［実施例１］リコンビナントペプチド（リコンビナントゼラチン）
リコンビナントペプチド（リコンビナントゼラチン）として以下のＣＢＥ３を用意した（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報に記載）。
ＣＢＥ３：
分子量：５１．６ｋＤａ
構造：  ＧＡＰ［（ＧＸＹ）63］3Ｇ
アミノ酸数：５７１個
ＲＧＤ配列：１２個
イミノ酸含量：３３％
ほぼ１００％のアミノ酸がＧＸＹの繰り返し構造である。ＣＢＥ３のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシンおよびシステインは含まれていない。ＣＢＥ３はＥＲＧＤ配列を有している。
等電点：９．３４
ＧＲＡＶＹ値：−０．６８２
１／ＩＯＢ値：０．３２３
アミノ酸配列（配列表の配列番号１）（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報の配列番号３と同じ。但し末尾のＸは「Ｐ」に修正）
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G【０１１６】
[実施例２] リコンビナントペプチド多孔質体の作製
[PTFE厚・円筒形容器]
底面厚さ３ｍｍ、直径５１ｍｍ、側面厚さ８ｍｍ、高さ２５ｍｍのポリテトラフルオロエチレン（PTFE）製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は８ｍｍのPTFEで閉鎖されており、底面（平板の円形状）も３ｍｍのPTFEで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。よって、円筒カップの内径は４３ｍｍになっている。以後、この容器のことをPTFE厚・円筒形容器と呼称する。【０１１７】
[アルミ（アルミニウム）硝子板・円筒形容器]
厚さ１ｍｍ、直径４７ｍｍのアルミ製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は１ｍｍのアルミで閉鎖されており、底面（平板の円形状）も１ｍｍのアルミで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。また、側面の内部にのみ、肉厚１ｍｍのテフロン（登録商標）を均一に敷き詰め、結果として円筒カップの内径は４５ｍｍになっている。また、この容器の底面にはアルミの外に２．２ｍｍの硝子板を接合した状態にしておく。以後、この容器のことをアルミ硝子・円筒形容器と呼称する。【０１１８】
[温度差の小さい凍結工程、および乾燥工程]
PTFE厚・円筒形容器またはアルミ硝子板・円筒形容器にＣＢＥ３水溶液を流し込み、真空凍結乾燥機（ＴＦ５−８５ＡＴＮＮＮ：宝製作所）内で冷却棚板を用いて底面からＣＢＥ３水溶液を冷却した。この際の容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度、液量、および棚板温度の設定の組み合わせは、以下に記載の通りで用意した。【０１１９】
条件Ａ：
ＰＴＦＥ厚・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、水溶液量４ｍＬ。棚板温度の設定は、−１０℃になるまで冷却し、−１０℃で１時間、その後−２０℃で２時間、さらに−４０℃で３時間、最後に−５０℃で１時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−２０℃設定に戻してから−２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる（１．９×１０5Ｐａ）まで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。上記により多孔質体を得た。【０１２０】
条件Ｂ：
アルミ・硝子板・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、水溶液量４ｍＬ。  棚板温度の設定は、−１０℃になるまで冷却し、−１０℃で１時間、その後−２０℃で２時間、さらに−４０℃で３時間、最後に−５０℃で１時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−２０℃設定に戻してから−２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる（１．９×１０5Ｐａ）まで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。上記により多孔質体を得た。【０１２１】
条件Ｃ：
ＰＴＦＥ厚・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、水溶液量１０ｍＬ。棚板温度の設定は、−１０℃になるまで冷却し、−１０℃で１時間、その後−２０℃で２時間、さらに−４０℃で３時間、最後に−５０℃で１時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−２０℃設定に戻してから−２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる（１．９×１０5Ｐａ）まで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。上記により多孔質体を得た。【０１２２】
[各凍結工程での温度測定]
条件Ａ〜条件Ｃのそれぞれについて、溶液内で冷却側から最も遠い場所の液温（非冷却面液温）として容器内の円中心部の水表面液温を、また、溶液内で冷却側に最も近い液温（冷却面液温）として容器内の底部の液温を測定した。
その結果、それぞれの温度とその温度差のプロファイルは図１〜図３の通りとなった。【０１２３】
図１、図２、図３から条件Ａ、条件Ｂ、条件Ｃでは棚板温度−１０℃設定区間（−２０℃に下げる前）において液温が融点である０℃を下回り、かつその状態で凍結が起こっていない（未凍結・過冷却）状態であることがわかる。また、この状態で、冷却面液温と非冷却面液温の温度差が２．５℃以下となっていた。なお、本明細書において、「温度差」とは、「非冷却面液温」−「冷却面液温」を意味する。その後、棚板温度を−２０℃へ更に下げていくことによって、液温が０℃付近へ急激に上昇するタイミングが確認され、ここで凝固熱が発生し凍結が開始されたことが分かる。また、そのタイミングで実際に氷形成が始まっていることも確認できた。その後、温度は０℃付近を一定時間経過していく。ここでは、水と氷の混合物が存在する状態となっていた。最後０℃から再び温度降下が始まるが、この時、液体部分はなくなり氷となっている。従って、測定している温度は氷内部の固体温度となり、つまり液温ではなくなる。【０１２４】
以下に、条件Ａ、条件Ｂ、条件Ｃについて、非冷却面液温が融点（０℃）になった時の温度差、棚板温度を−１０℃から−２０℃へ下げる直前の温度差と、凝固熱発生直前の温度差を記載する。なお、本発明で言う「直前の温度差」とは、イベント（凝固熱発生等）の１秒前〜２０秒前までの間で検知可能な温度差の内、最も高い温度のことを表している。【０１２５】
条件Ａ
非冷却面液温が融点（０℃）になった時の温度差：１．１℃
−１０℃から−２０℃へ下げる直前の温度差：０．２℃
凝固熱発生直前の温度差：１．１℃【０１２６】
条件Ｂ
非冷却面液温が融点（０℃）になった時の温度差：１．０℃
−１０℃から−２０℃へ下げる直前の温度差：０．１℃
凝固熱発生直前の温度差：０．９℃【０１２７】
条件Ｃ
非冷却面液温が融点（０℃）になった時の温度差：１．８℃
−１０℃から−２０℃へ下げる直前の温度差：１．１℃
凝固熱発生直前の温度差：２．１℃【０１２８】
[実施例３] 生体親和性高分子ブロックの作製（多孔質体の粉砕と架橋）
実施例２で得られた条件Ａおよび条件ＢのＣＢＥ３多孔質体をニューパワーミル（大阪ケミカル、ニューパワーミルＰＭ−２００５）で粉砕した。粉砕は、最大回転数で１分間×５回、計５分間の粉砕で行った。得られた粉砕物について、ステンレス製ふるいでサイズ分けし、２５〜５３μｍ、５３〜１０６μｍ、１０６〜１８０μｍの未架橋ブロックを得た。その後、減圧下１６０℃で熱架橋（架橋時間は８時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間の６種類を実施した）を施して、生体親和性高分子ブロック（ＣＢＥ３ブロック）を得た。【０１２９】
以下、４８時間架橋を施した条件Ａの多孔質体由来ブロックをＥ、４８時間架橋を施した条件Ｂの多孔質体由来ブロックをＦと称する。ＥおよびＦは温度差の小さい凍結工程により製造した多孔質体から作られた温度差小ブロックである。なお、架橋時間の違いは本実施例の評価においては性能に影響が見られなかったため、以後、４８時間架橋したものを代表として使用した。また、ＥおよびＦでは性能に差が見られなかった。以下の実施例では、条件Ａ、サイズ５３〜１０６μｍ、架橋時間４８時間で作製した生体親和性高分子ブロックを使用した。【０１３０】
[実施例４] 生体親和性高分子ブロックのタップ密度測定
タップ密度は、ある体積にどれくらいのブロックを密に充填できるかを表す値であり、値が小さいほど、密に充填できない、すなわちブロックの構造が複雑であると言える。  タップ密度は、以下のように測定した。まず、ロートの先にキャップ（直径６ｍｍ、長さ２１．８ｍｍの円筒状：容量０．６１６ｃｍ3）が付いたものを用意し、キャップのみの質量を測定した。その後、ロートにキャップを付け、ブロックがキャップに溜まるようにロートから流し込んだ。十分量のブロックを入れた後、キャップ部分を２００回、机などの硬いところにたたきつけ、ロートをはずし、スパチュラですりきりにした。このキャップにすりきり一杯入った状態で質量を測定した。キャップのみの質量との差からブロックのみの質量を算出し、キャップの体積で割ることで、タップ密度を求めた。
その結果、実施例３の生体親和性高分子ブロックのタップ密度は９８ｍｇ/ｃｍ3であった。【０１３１】
[実施例５] 生体親和性高分子ブロックの架橋度測定
実施例３で架橋したブロックの架橋度（１分子当たりの架橋数）を算出した。測定はＴＮＢＳ（2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸）法を用いた。
＜サンプル調製＞
ガラスバイアルに、サンプル（約１０ｍｇ）、４質量％ＮａＨＣＯ3水溶液（１ｍＬ）および１質量％のＴＮＢＳ水溶液（２ｍＬ）を添加し、混合物を３７℃で３時間振とうさせた。その後、３７質量％塩酸（１０ｍＬ）および純水（５ｍＬ）を加えた後、混合物を３７℃で１６時間以上静置し、サンプルとした。【０１３２】
＜ブランク調整＞
ガラスバイアルに、サンプル（約１０ｍｇ）、４質量％ＮａＨＣＯ3水溶液（１ｍＬ）および１質量％ＴＮＢＳ水溶液（２ｍＬ）を添加し、直後に３７質量％塩酸（３ｍＬ）を加え、混合物を３７℃で３時間振とうした。その後、３７質量％塩酸（７ｍＬ）および純水（５ｍＬ）を加えた後、混合物を３７℃で１６時間以上静置し、ブランクとした。
純水で１０倍希釈したサンプル、および、ブランクの吸光度（３４５nm）を測定し、以下の（式２）、および（式３）から架橋度（１分子当たりの架橋数）を算出した。【０１３３】
（式２）  （As-Ab）／１４６００×V／ｗ
（式２）は、リコンビナントペプチド１ｇ当たりのリジン量（モル等量）を示す。
（式中、Asはサンプル吸光度、Abはブランク吸光度、Vは反応液量（ｇ）、ｗはリコンビナントペプチド質量（ｍｇ）を示す。）【０１３４】
（式３）  １−（サンプル（式２）/未架橋リコンビナントペプチド（式２））×３４
（式３）は、１分子あたりの架橋数を示す。【０１３５】
その結果、実施例３の生体親和性高分子ブロックの架橋度は、４．２であった。【０１３６】
[実施例６] 生体親和性高分子ブロックの吸水率測定
実施例３で作製した生体親和性高分子ブロックの吸水率を算出した。
２５℃において、３ｃｍ×３ｃｍのナイロンメッシュ製の袋の中に、生体親和性高分子ブロック約１５ｍｇを充填し、２時間イオン交換水中で膨潤させた後、１０分風乾させた。それぞれの段階において質量を測定し、（式４）に従って、吸水率を求めた。【０１３７】
（式４）
吸水率＝（ｗ２−ｗ１−ｗ０）／ｗ０
（式中、ｗ０は吸水前の材料の質量、ｗ１は吸水後の空袋の質量、ｗ２は吸水後の材料を含む袋全体の質量を示す。）【０１３８】
その結果、実施例３のブロックの吸水率は、７８６％であった。【０１３９】
[実施例７]  モザイク細胞塊の作製
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ：Human Mesenchymal Stem Cells）を増殖培地（タカラバイオ：MSCGM BulletKit（商標））に懸濁し、そこに実施例３で作製した生体親和性高分子ブロック（５３−１０６μｍ）を加えて、最終的にｈＭＳＣ（１．２×１０6cells）と生体親和性高分子ブロック（１ｍｇ）が４ｍＬの培地に懸濁された状態で、底面に窪み部を有する細胞非接着性の３５ｍｍディッシュであるEZSPHERE（登録商標）ディッシュ35mm Type903（スフェロイドウェル口径８００μｍ、スフェロイドウェル深さ３００μｍ、スフェロイドウェル数ウエル〜約１０００ウェル。ＡＧＣテクノグラス製）に播種した。【０１４０】
ＣＯ2インキュベーターにて３７℃で２０時間静置したところ、ｈＭＳＣと生体親和性高分子ブロックから成る直径０．４ｍｍ程度の球状としてモザイク細胞塊を複数個回収することができた。【０１４１】
尚、ディッシュとしてはＴｙｐｅ９００（ウェル口径４００〜５００μｍ、ウェル深さ１００〜２００μｍ）、Ｔｙｐｅ９０２（ウェル口径５００μｍ、ウェル深さ２００μｍ）、Ｔｙｐｅ９０４（ウェル口径８００μｍ、ウェル深さ４００μｍ）、またはＴｙｐｅ９０５（ウェル口径１４００μｍ、ウェル深さ６００μｍ）のいずれを使用した場合にも、上記と同様に球状のモザイク細胞塊を得られることが確認された。【０１４２】
[比較例１]  細胞のみの細胞塊の作製
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を増殖培地（タカラバイオ：MSCGM BulletKit（商標））に懸濁し、最終的にｈＭＳＣ（１．２×１０6cells）が４ｍＬの培地に懸濁された状態で、底面に窪み部を有する細胞非接着性の３５ｍｍディッシュであるEZSPHERE（登録商標）ディッシュ35mm Type903（スフェロイドウェル口径８００μｍ、スフェロイドウェル深さ３００μｍ、スフェロイドウェル数ウエル〜約１０００ウェル。ＡＧＣテクノグラス製）に播種した。【０１４３】
ＣＯ2インキュベーターにて３７℃で２０時間静置したところ、ｈＭＳＣのみから成る細胞塊を複数個回収することができた。【０１４４】
[実施例８]トロフィックファクタの放出量の測定
実施例７のモザイク細胞塊と比較例１の細胞塊をそれぞれ培養し３日後に培養上清へ放出されたトロフィックファクタ量を測定した。測定にあたってはHuman Angiogenesis Antibody Array C1 (#AAH-ANG-1-8, RayBio)のキットを使用した。その結果、細胞塊からの放出量と比較して、モザイク細胞塊から放出されるトロフィックファクタの量が増大することが分かった。具体的には、ＡＮＧが１．７４倍、ＥＧＦが１．９２倍、ＥＮＡ−７８が２．２２倍、ｂＦＧＦが１．０９倍、ＩＦＮγが１．１１倍、ＩＧＦ−１が１．４４倍、ＩＬ−６が１．３７倍、ＩＬ−８が１．８６倍、ＭＣＰ−１が１．２９倍、ＰＤＧＦ−ＢＢが３．６０倍、ＴＧＦβが１．４０倍、ＴＩＭＰ−１が１．１３倍、ＴＩＭＰ−２が１．３３倍、ＴＨＰＯが１．４３倍、ＶＥＧＦが１．３７倍、ＶＥＧＦ−Ｄが２．５４倍、モザイク細胞塊とすることで増大することが分かった。上記の結果から、モザイク細胞塊とすることでトロフィックファクタの産生放出量が増大することが明らかとなった（表１）。【０１４５】
【表１】
0006714699.tif 000002
【０１４６】
［実施例９］  モザイク細胞塊の作製（ｈＭＳＣ）
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）をＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium：ダルベッコ改変イーグル培地）＋１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum：ウシ胎児血清）培地にて１０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、実施例３で作製した生体親和性高分子ブロック５３−１０６μｍを０．１ｍｇ／ｍＬとなるように加えた後、２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト、底がＵ字型）に播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置し、直径１ｍｍの球状の、生体親和性高分子ブロックとｈＭＳＣ細胞からなるモザイク細胞塊を作製した（細胞1個当たり０．００１μｇのブロック）。なお、Ｕ字型のプレート中で作製したため、本モザイク細胞塊は球状であった。【０１４７】
［実施例１０］  モザイク細胞塊の作製（ｈＡＤＳＣ）
ヒト脂肪由来幹細胞（ｈＡＤＳＣ）（Human Adipose Derived Stem Cells）をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地にて１０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、実施例３で作製した生体親和性高分子ブロック５３−１０６μｍを０．１ｍｇ／ｍＬとなるように加えた後、２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト、底がＵ字型）に播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置し、直径１ｍｍの球状の、生体親和性高分子ブロックとｈＡＤＳＣ細胞からなるモザイク細胞塊を作製した（細胞1個当たり０．００１μｇのブロック）。なお、Ｕ字型のプレート中で作製したため、本モザイク細胞塊は球状であった。【０１４８】
［比較例２］  細胞塊の作製（ｈＭＳＣ）
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地にて１０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト、底がＵ字型）に播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置しｈＭＳＣ細胞のみからなる細胞塊を作製した。なお、Ｕ字型のプレート中で作製したため、本細胞塊は球状であった。【０１４９】
［比較例３］  細胞塊の作製（ｈＡＤＳＣ）
ヒト脂肪由来幹細胞（ｈＡＤＳＣ）をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地にて１０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト、底がＵ字型）に播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置しｈＡＤＳＣ細胞のみからなる細胞塊を作製した。なお、Ｕ字型のプレート中で作製したため、本細胞塊は球状であった。【０１５０】
[実施例１１]  抗炎症サイトカインＴＳＧ−６の放出量試験
実施例９および１０で得られたモザイク細胞塊、並びに比較例２および３で得られた細胞塊をそれぞれ培養し、３日後に培養上清に放出されるＴＳＧ−６を定量した。定量に当たってはRayBio Human TSG-6 ELISA Kit（cat#: ELH-TSG6  (RayBiotech社)）を使用した。
ＴＳＧ−６の定量の結果を図４（ＦＢＳ（＋）の欄を参照）に示す。その結果、ｈＭＳＣではモザイク細胞塊の方が細胞塊よりも１．４倍放出量が多く、ｈＡＤＳＣではモザイク細胞塊の方が細胞塊よりも１．８倍放出量が多いことが分かった。これによりＴＳＧ−６についてもモザイク細胞塊とすることで産生放出量が増大することが明らかとなった。【０１５１】
[実施例１２]  炎症刺激ＴＮＦα（Tumor Necrosis Factorα）依存的なＴＳＧ−６産生放出量試験
実施例９および１０で得られたモザイク細胞塊、並びに比較例２および３で得られた細胞塊について、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ培地に置換後、さらにＴＮＦα含有のＤＭＥＭ培地で４８時間培養を実施して、培養上清に放出されるＴＳＧ−６を定量した。定量に当たってはRayBio Human TSG-6 ELISA Kit（cat#: ELH-TSG6  (RayBiotech社)）を使用した。【０１５２】
ＴＳＧ−６の定量の結果を図４（ＴＮＦα（＋）の欄を参照）に示す。
その結果、ｈＭＳＣではモザイク細胞塊の方が細胞塊よりも５．７倍放出量が多く、ｈＡＤＳＣではモザイク細胞塊の方が細胞塊よりも３．１倍放出量が多いことが分かった。また、ＴＮＦαでの刺激を行わなかった場合と比べて、ＴＮＦα刺激を行うことで顕著なＴＳＧ−６産生放出が認められた（図４：ＴＮＦα（−）とＴＮＦα（＋）の欄を参照）。
なお、放出量を生細胞数で除した一細胞当たりの産生放出量でも同じことが認められた（図５）。【０１５３】
ＴＮＦα刺激がＴＳＧ−６産生を促進することは既知の事実であるが、このＴＮＦα刺激への応答性について、モザイク細胞塊にすると飛躍的に応答性が高くなることは全く想定外であった。これらのことから、ＴＳＧ−６については、モザイク細胞塊とすることで産生放出量が増大するだけでなく、ＴＮＦα刺激への応答性までも向上することが明らかとなった。このことは、モザイク細胞塊は、炎症刺激への応答性が高く、抗炎症サイトカインを多く放出することを示しており、モザイク細胞塊が抗炎症治療剤として非常に有用であることを示している。【０１５４】
［実施例１３］  モザイク細胞塊の作製（ｈＡＤＳＣ）
ヒト脂肪由来幹細胞（ｈＡＤＳＣ）を増殖培地（Ｌｏｎｚａ社：ＡＤＳＣ−ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（商標）、以下、ＡＤＳＣ用培地ともいう）に懸濁し、実施例３で作製した生体親和性高分子ブロック（５３−１０６μｍ）を加えて、ｈＡＤＳＣ（１．２×１０6ｃｅｌｌｓ）と生体親和性高分子ブロック（１ｍｇ）が４ｍＬの培地に懸濁された状態で、底面に窪み部を有する細胞非接着性の３５ｍｍディッシュであるEZSPHERE（登録商標）ディッシュ35mm Type903（スフェロイドウェル口径８００μｍ、スフェロイドウェル深さ３００μｍ、スフェロイドウェル数ウエル〜約１０００ウェル。ＡＧＣテクノグラス製）に播種した。【０１５５】
［実施例１４］２．５質量％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発マウス大腸炎モデルの作製と評価
マウスは、６−７週齢、体重１７−２１ｇのＳＰＦ  Ｃ５７ＢＬ／６ｎ雌性マウス（チャールスリバージャパン（株））を使用した。Ｃ５７ＢＬ／６ｎ雌性マウス６週齢に対して、２．５質量％ＤＳＳ（MP Biomedicals社:Dextran Sodium Sulfate, 分子量(MW) = 36,000-50,000）水溶液を自由飲水させ、自由飲水開始日を誘導開始日（Ｄａｙ０）とした。誘導開始日から７日間２．５質量％ＤＳＳ水溶液を自由飲水させ、７日目に上記２．５質量％ＤＳＳ水溶液を蒸留水に交換し、さらに７日間蒸留水を自由飲水させた。誘導開始日から０、１、２、５、６、７、８、９、１２、１３および１４日後に各マウスの体重を計測した。【０１５６】
大腸炎の評価は、体重および最終日（誘導開始から１４日目）の大腸の長さにより評価した。なお、炎症が進行すると体重が減少し、回復すれば体重が増加する。また、大腸の長さは炎症の程度の形態学的パラメーターとして利用されており、炎症が生じるほど大腸の短小化が生じる（JIN SEOK PARK他、J.CLIN. BIOCHEM.NUTR,2015;57:192-203）。
体重の評価は、各マウスについて正常マウスに対する体重割合（％）を算出し、評価した。なお、正常マウスに対する体重割合は以下の（式５）、および（式６）に従って求めた。また、体重回復率（％）を、（式７）に従って求めた。
（式５）  各マウスのＤａｙ０に対する体重比（％）＝（Ｗｔ／Ｗ０）×１００
（式中、Ｗ０は誘導開始日の体重計測値、Ｗｔは誘導開始日からｔ日後の体重計測値を示す。ただし、ｔは１、２、５、６、７、８、９、１２、１３または１４であり、Ｗ０とＷｔは同一個体の体重とする。）
（式６）  各マウスの正常マウスに対する体重割合（％）＝（Ｗｔ／Ｗ０）×１００×（１００／Ａｔ）
（式中、Ｗ０は誘導開始日の体重計測値、Ｗｔは誘導開始日からｔ日後の体重計測値を示す。Ａｔは、誘導開始日からｔ日後の各正常マウスについて、Ｄａｙ０に対する体重比（％）を（式５）に従ってそれぞれ算出し、それらの平均値を示す。ただし、ｔは１、２、５、６、７、８、９、１２、１３または１４であり、Ｗ０とＷｔは同一個体の体重とする。）
（式７）  体重回復率（％）＝（（Ｖｔ−Ｄｔ）−（Ｖｔ−Ｘｔ））／（Ｖｔ−Ｄｔ）
（式中、Ｖｔは誘導開始日からｔ日後の、正常マウスの「正常マウスに対する体重割合」の平均値を示す。Ｄｔは誘導開始日からｔ日後の、ＡＤＳＣ用培地マウス群の「正常マウスに対する体重割合」の平均値を示す。Ｘｔは誘導開始日からｔ日後の、各マウス群の「正常マウスに対する体重割合」の平均値を示す。ただし、ｔは１、２、５、６、７、８、９、１２、１３または１４である。正常マウス群の体重回復率は１００％、ＡＤＳＣ用培地マウス群の体重回復率は０％となる。）
大腸の長さは、各マウスの肛門先端から盲腸までの長さを計測し、（式８）に従って短腸化回復率を求めた。（正常マウス群の短腸化回復率は１００％、ＡＤＳＣ用培地群の短腸化回復率は０％となる。）
（式８）  短腸化回復率（％）＝（（Ｌｘ−Ｌ２）×１００）／（Ｌ１−Ｌ２）
（式中、Ｌ１は正常マウス群の大腸の長さの中央値、Ｌ２はＡＤＳＣ用培地マウス群の大腸の長さの中央値、Ｌｘは各マウス群の大腸の長さの中央値を示す。）【０１５７】
［実施例１５］  ２．５質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスへの、ｈＡＤＳＣのモザイク細胞塊の投与
実施例１４で作製した２．５質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスに対して、誘導開始日から１日後に、実施例１３で作製したＡＤＳＣモザイク細胞塊を腹腔内投与した。ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個（ｈＡＤＳＣ１．２×１０6ｃｅｌｌｓ＋生体親和性高分子ブロック１ｍｇ／匹）、またはｈＡＤＳＣモザイク細胞塊５０００個（ｈＡＤＳＣ６．０×１０6ｃｅｌｌｓ＋生体親和性高分子ブロック  ５ｍｇ／匹）を投与した。【０１５８】
［比較例４］  ２．５質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスへの、ｈＡＤＳＣ細胞懸濁液、またはＡＤＳＣ用培地の投与
実施例１４で作製した２．５質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスに対して、誘導開始日から１日後に、実施例１３と同じ細胞をＡＤＳＣ用培地２００μＬに懸濁した状態のｈＡＤＳＣ細胞懸濁液、またはＡＤＳＣ用培地２００μＬを腹腔内投与した。ｈＡＤＳＣ細胞懸濁液中に含まれる細胞数は、１．２×１０6ｃｅｌｌｓ／匹とした。【０１５９】
実施例１５および比較例４における、各マウス群の正常マウスに対する体重割合（％）の平均値を図６に示す。図６に示されているように、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個マウス群は、誘導開始日の１２、１３および１４日後において、比較例であるＡＤＳＣ培地マウス群より「正常マウスに対する体重割合」が高かった。ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個マウス群は、ＡＤＳＣ培地マウス群より体重の回復が早いことが示された。また、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊５０００個マウス群は、誘導開始日の２、５、６、７、８、９、１２、１３および１４日後において、比較例であるＡＤＳＣ培地マウス群より「正常マウスに対する体重割合」が高かった。ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊５０００個マウス群は、ＡＤＳＣ培地マウス群より体重の減少が抑えられ、さらにＡＤＳＣ培地マウス群より体重の回復が早いことが示された。最終日（誘導開始日の１４日後）において、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個マウス群では体重回復率が３９％、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊５０００個マウス群では体重回復率が９６％であった。ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個およびｈＡＤＳＣモザイク細胞塊５０００個では、体重減少の改善効果が見られた。また、この改善の効果はモザイク細胞塊の数が多い方が高かった。【０１６０】
比較例４における、各マウス群の正常マウスに対する体重割合（％）の平均値を図７に示す。図７に示されているように、ｈＡＤＳＣ細胞懸濁液マウス群は、誘導開始日の２、５、６、７、８および９日後において、ＡＤＳＣ培地マウス群と同様の体重の推移を示した。また、誘導開始日の１２、１３および１４日後において、ＡＤＳＣ培地マウス群より「正常マウスに対する体重割合」が低かった。最終日（誘導開始日の１４日後）において、ｈＡＤＳＣ細胞懸濁液マウス群では体重回復率が−４４％であった。以上のことから、ｈＡＤＳＣ細胞懸濁液は、２．５質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの体重減少を改善しないことが示された。【０１６１】
以上の体重の評価結果をまとめると、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個マウス群およびｈＡＤＳＣモザイク細胞塊５０００個マウス群では、２．５質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの体重減少を改善する効果が認められる。一方で、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個マウス群と同じ細胞数のｈＡＤＳＣ細胞懸濁液マウス群では、２．５質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの体重減少を改善する効果が認められなかった。【０１６２】
実施例１５において、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個マウス群では短腸化回復率７５％、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊５０００個マウス群では短腸化回復率５０％であった。ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個および、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊５０００個は、２．５質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの大腸の短腸化を改善したことが認められた。【０１６３】
比較例４において、ｈＡＤＳＣ細胞懸濁液マウス群では短腸化回復率１４％であった。ｈＡＤＳＣ細胞懸濁液は２．５質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの大腸の短腸化を改善することが認められたものの、同じ細胞数を投与しているｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個より大腸の短腸化への改善効果が低いことが示された。【０１６４】
以上の大腸の長さの評価結果をまとめると、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個およびｈＡＤＳＣモザイク細胞塊５０００個は、２．５質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの短腸化を改善する効果が認められ、それはｈＡＤＳＣ細胞懸濁液の短腸化を改善する効果より効果が高いことが示された。
以上の体重および大腸の長さの結果は、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊による２．５質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスへの炎症改善効果を示すものであり、さらにその効果はｈＡＤＳＣ細胞懸濁液よりも効果が高いこと示している。【０１６５】
［実施例１６］  ３．０質量％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発マウス大腸炎モデルの作製と評価
マウスは、６−７週齢、体重１７−２１ｇのＳＰＦ  Ｃ５７ＢＬ／６ｎ雌性マウス（チャールスリバージャパン（株））を使用した。
Ｃ５７ＢＬ／６ｎ雌性マウス６週齢に対して、３．０質量％ＤＳＳ（MP Biomedicals社:Dextran Sodium Sulfate, MW = 36,000-50,000）水溶液を自由飲水させた。自由飲水開始日を誘導開始日（Ｄａｙ０）とした。誘導開始日から７日間３．０質量％ＤＳＳ水溶液を自由飲水させ、７日目に上記３．０質量％ＤＳＳ水溶液を蒸留水に交換し、さらに６日間蒸留水を自由飲水させた。誘導開始日から０、１、２、５、６、７、８、９、１２および１３日後に各マウスの体重を計測した。大腸炎の評価は、実施例１４と同様にして、体重と、最終日（誘導開始から１３日目）の大腸の長さにより評価した。【０１６６】
［実施例１７］  ３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスへの、ｈＡＤＳＣのモザイク細胞塊の投与
実施例１６で作製した３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスに対して、誘導開始日から１日後に、実施例１３で作製したｈＡＤＳＣモザイク細胞塊を腹腔内投与した。ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個（ｈＡＤＳＣ１．２×１０6ｃｅｌｌｓ＋生体親和性高分子ブロック１ｍｇ／匹）、またはｈＡＤＳＣモザイク細胞塊５０００個（ｈＡＤＳＣ６．０×１０6ｃｅｌｌｓ＋生体親和性高分子ブロック  ５ｍｇ／匹）を投与した。【０１６７】
［比較例５］  ３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスへの、ＡＤＳＣ用培地の投与
実施例１６で作製した３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスに対して、誘導開始日から１日後に、ＡＤＳＣ用培地２００μＬを腹腔内投与した。【０１６８】
実施例１７および比較例５における、各マウス群の正常マウスに対する体重割合（％）の平均値を図８に示す。図８に示されているように、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個マウス群は、誘導開始日の１２および１３日後において、比較例であるＡＤＳＣ培地マウス群より「正常マウスに対する体重割合」が高かった。ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個マウス群は、ＡＤＳＣ培地マウス群より体重の回復が早いことが示された。また、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊５０００個マウス群は、誘導開始日の１２および１３日後において、比較例であるＡＤＳＣ培地マウス群より「正常マウスに対する体重割合」が高く、さらにｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個マウス群より体重割合が高いことが示された。最終日（誘導開始日の１３日後）において、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個マウス群の体重回復率は２０％、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊５０００個マウス群の体重回復率は６９％であった。ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個およびＡＤＳＣモザイク細胞塊５０００個では、体重減少の改善効果が認められた。また、この改善の効果はモザイク細胞塊の数が多い方が高かった。【０１６９】
実施例１７および比較例５において、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個マウス群では短腸化回復率６８％、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊５０００個マウス群では短腸化回復率８１％であった。ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個および、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊５０００個は、３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの大腸の短腸化を改善したことが認められた。
以上の体重および大腸の長さの結果から、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊による３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスへの炎症改善効果が認められた。【０１７０】
［実施例１８］  ３.０質量％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発マウス大腸炎モデルの作製と評価
マウスは、６−７週齢、体重１７−２１ｇのＳＰＦ  Ｃ５７ＢＬ／６ｎ雌性マウス（チャールスリバージャパン（株））を使用した。
Ｃ５７ＢＬ／６ｎ雌性マウス６週齢に対して、３．０質量％ＤＳＳ（MP Biomedicals社:Dextran Sodium Sulfate, MW = 36,000-50,000）水溶液を自由飲水させた。自由飲水開始日を誘導開始日（Ｄａｙ０）とした。誘導開始日から７日間３．０質量％ＤＳＳ水溶液を自由飲水させ、７日目に上記３．０質量％ＤＳＳ水溶液を蒸留水に交換し、さらに７日間蒸留水を自由飲水させた。誘導開始日から０、１、４、５、６、７、８、１１、１２、１３および１４日後に各マウスの体重を計測した。大腸炎の評価は、体重、最終日（誘導開始から１４日目）の大腸の長さ、および最終日の大腸の病理学的評価により評価した。
体重および大腸の長さの評価は、実施例１４と同様にして評価した。
病理学的評価は、最終日に摘出した大腸組織をホルマリン固定し、パラフィン包埋、薄切、ヘマトキシリン・エオジン染色(ＨＥ染色)を施した。
作製した標本について光学顕微鏡を用い、潰瘍の深度、潰瘍の広さ、浮腫、および炎症性細胞浸潤について評価した。潰瘍の深度の評価は、０点：上皮が完全である、１点：粘膜固有層に傷害がある、２点：粘膜下層まで傷害が達している、３点：漿膜まで傷害が達している、とした。潰瘍の広さの評価は、０点：傷害のある面積割合が０％、１点：傷害のある面積割合が０％より大きく２５％以下、２点：傷害のある面積割合が２５％より大きく５０％以下、３点：傷害のある面積割合が５０％より大きく７５％以下、４点：傷害のある面積割合が７５％より大きい、とした。浮腫、および炎症性細胞浸潤の評価は、０点：浮腫および炎症性細胞浸潤が認められない、１点：軽度、２点：中程度、３点：高度、４点：さらに高度、とした。以上の方法で、各マウスの結腸上部、結腸下部、直腸の３箇所について評価し、上記３箇所の合計スコアを病理スコアとして総合評価した。なお、病理スコアは炎症が生じるほどスコアが高い。【０１７１】
［実施例１９］  ３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスへの、ｈＡＤＳＣのモザイク細胞塊の投与
実施例１８で作製した３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスに対して、誘導開始日から７日後に、実施例１３で作製したｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個（ｈＡＤＳＣ１．２×１０6ｃｅｌｌｓ＋生体親和性高分子ブロック１ｍｇ）／匹をＡＤＳＣ用培地４００μＬに懸濁した状態で腹腔投与した。【０１７２】
［比較例６］  ３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスへの、ｈＡＤＳＣ細胞懸濁液、またはＡＤＳＣ用培地の投与
実施例１８で作製した３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスに対して、実施例１３と同じ細胞をＡＤＳＣ用培地４００μＬに懸濁した状態のｈＡＤＳＣ細胞懸濁液、またはＡＤＳＣ用培地４００μＬを腹腔内投与した。ｈＡＤＳＣ細胞懸濁液中に含まれる細胞数は、１．２×１０6ｃｅｌｌｓ／匹とした。【０１７３】
実施例１９および比較例６における、各マウス群の正常マウスに対する体重割合（％）の平均値を図９に示す。図９に示されているように、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個マウス群は、誘導開始日の１１、１２、１３、および１４日後において、比較例であるＡＤＳＣ用培地マウス群およびｈＡＤＳＣ細胞懸濁液マウス群より「正常マウスに対する体重割合」が高かった。ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個マウス群は、ＡＤＳＣ用培地マウス群およびｈＡＤＳＣ細胞懸濁液マウス群より体重の回復が早いことが示された。従って、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個は、体重減少の改善効果が認められた。【０１７４】
一方、図９に示されているように、ｈＡＤＳＣ細胞懸濁液マウス群は、誘導開始日の１１、１２、１３および１４日後において、ＡＤＳＣ用培地マウス群と同様の体重の推移を示した。従って、ｈＡＤＳＣ細胞懸濁液は、体重減少の改善効果が認められなかった。【０１７５】
以上の体重の評価結果をまとめると、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個は３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの体重減少を改善する効果が認められる。一方で、ｈＡＤＳＣ細胞懸濁液では、３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの体重減少を改善する効果が認められなかった。【０１７６】
実施例１９および比較例６における、各マウス群の大腸の長さを箱ひげ図として図１０に示す（図中、*:Ｐ＜０．０５  （ｔ検定））。
図１０に示されているように、ＡＤＳＣ用培地マウス群の大腸の長さは正常マウス群に対して有意に短いことが示された。
実施例１９において、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個マウス群の大腸の長さは、比較例であるＡＤＳＣ用培地マウス群に対して有意に長いことが示された。従って、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個は、３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの大腸の短腸化を改善したことが認められた。
一方、比較例６において、ｈＡＤＳＣ細胞懸濁液マウス群の大腸の長さは、比較例であるＡＤＳＣ用培地マウス群に対して差がないことが示された。従って、ｈＡＤＳＣ細胞懸濁液は、３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの大腸の短腸化を改善しないことが認められた。
なお、各マウス群の大腸の長さの中央値は、正常マウス群が７．４ｃｍ、ＡＤＳＣ用培地マウス群が６．０ｃｍ、ｈＡＤＳＣ細胞懸濁液マウス群が５．５ｃｍ、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個マウス群が７．１ｃｍであった。【０１７７】
以上の大腸の長さの評価結果をまとめると、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個は、３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの短腸化を改善する効果が認められた。一方で、ｈＡＤＳＣ細胞懸濁液は３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの短腸化を改善する効果が認められなかった。【０１７８】
実施例１９および比較例６における、各マウス群の病理スコアを箱ひげ図として図１１に示す（図中、*:Ｐ＜０．０５  （ｔ検定））。図１１に示されているように、実施例１９において、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個マウス群の病理スコアは、比較例であるＡＤＳＣ用培地マウス群、およびｈＡＤＳＣ細胞懸濁液マウス群に対して有意に低いことが示された。従って、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個は、３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの大腸の炎症を改善したことが認められた。
一方、比較例６において、ｈＡＤＳＣ細胞懸濁液マウス群の病理スコアは、比較例であるＡＤＳＣ用培地マウス群に対して差がないことが示された。従って、ｈＡＤＳＣ細胞懸濁液は、３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの大腸の炎症を改善しないことが認められた。
なお、各マウス群の病理スコアの中央値は、正常マウス群が０点、ＡＤＳＣ用培地マウス群が１３．０点、ｈＡＤＳＣ細胞懸濁液マウス群が１８．０点、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個マウス群が７．０点であった。
また、各マウス群の各箇所（結腸上部、結腸下部、および直腸）の病理スコアの中央値を表２に示す。【０１７９】
【表２】
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【０１８０】
実施例１９および比較例６における、各マウス群の代表的なＨＥ組織染色像を図１２および図１３に示す。図１２および図１３に示されているように、正常マウス群で潰瘍、炎症性細胞浸潤、および浮腫は認められなかった。比較例であるＡＤＳＣ用培地マウス群では、潰瘍、炎症性細胞浸潤、および浮腫が広範囲に認められた。ＡＤＳＣ用培地マウス群と同様に、ｈＡＤＳＣ細胞懸濁液マウス群では、潰瘍、炎症性細胞浸潤、および浮腫が広範囲に認められた。
一方、実施例１９において、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個マウス群では、潰瘍、および炎症性細胞浸潤の範囲が狭かった。また、浮腫は認められなかった。【０１８１】
以上の病理学的評価の結果をまとめると、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個は、３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの炎症に対する治療効果が認められた。一方で、ｈＡＤＳＣ細胞懸濁液は、３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの炎症に対する治療効果が認められなかった。
以上の体重、大腸の長さ、および病理学的評価の結果から、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊による３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスへの炎症改善効果が認められた。【０１８２】
[実施例２０]   ｈＢＭＳＣモザイク細胞塊の作製
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＢＭＳＣ：Human Bone Marrow Derived Mesenchymal Stem Cells）を増殖培地（タカラバイオ：MSCGM BulletKit（商標））に懸濁し、そこに実施例３で作製した生体親和性高分子ブロック（５３−１０６μｍ）を加えて、最終的にｈＢＭＳＣ（２．０×１０5cells）と生体親和性高分子ブロック（０．２ｍｇ）が４ｍＬの培地に懸濁された状態で、底面に窪み部を有する細胞非接着性の３５ｍｍディッシュであるEZSPHERE（登録商標）ディッシュ35mm Type903（スフェロイドウェル口径８００μｍ、スフェロイドウェル深さ３００μｍ、スフェロイドウェル数ウエル〜約１０００ウェル。ＡＧＣテクノグラス製）に播種した。【０１８３】
ＣＯ2インキュベーターにて３７℃で２０時間静置したところ、ｈＢＭＳＣと生体親和性高分子ブロックから成る直径０．２ｍｍ程度の球状としてモザイク細胞塊を複数個回収することができた。【０１８４】
[比較例７]  ｈＢＭＳＣ細胞塊の作製
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＢＭＳＣ）を増殖培地（タカラバイオ：MSCGM BulletKit（商標））に懸濁し、最終的にｈＢＭＳＣ（２．０×１０5cells）が４ｍＬの培地に懸濁された状態で、底面に窪み部を有する細胞非接着性の３５ｍｍディッシュであるEZSPHERE（登録商標）ディッシュ35mm Type903（スフェロイドウェル口径８００μｍ、スフェロイドウェル深さ３００μｍ、スフェロイドウェル数ウエル〜約１０００ウェル。ＡＧＣテクノグラス製）に播種した。【０１８５】
ＣＯ2インキュベーターにて３７℃で２０時間静置したところ、ｈＢＭＳＣのみから成る細胞塊を複数個回収することができた。【０１８６】
[実施例２１]  Ｔ細胞の増殖抑制試験（ｈＢＭＳＣモザイク細胞塊）
実施例２０で作製したｈＢＭＳＣモザイク細胞塊について、Ｔ細胞の増殖抑制能を評価した。２４wellプレート上で、ｈＢＭＳＣモザイク細胞塊（ｈＢＭＳＣ５．０×１０4ｃｅｌｌｓ＋生体親和性高分子ブロック０．２ｍｇ／well）、およびＣＦＳＥ(cat#:565082（BD Biosciences社）)で標識したＴ細胞（１．０×１０5ｃｅｌｌｓ／well）を5日間共培養した。培養は、2 mM glutamine,100 IU/mL  penicillin,100 ug/ml streptomycin,10%FBS,および50uMモノチオグリセロールを含有したＲＰＭＩ１６４０培地に抗ＣＤ３ＣＤ２８抗体ビーズ(Dynabeads(商標)：Human T-Activator CD3/CD28(cat#:DB11161（ベリタス社）)を添加した培養液（以下、Ｔ細胞培地ともよぶ）中で実施した。なお、抗ＣＤ３ＣＤ２８抗体ビーズは、製品の使用方法に従い、Ｔ細胞１．０×１０5ｃｅｌｌｓにつき１０μｌの抗ＣＤ３ＣＤ２８抗体ビーズを使用した。【０１８７】
５日間の共培養後、ｈＢＭＳＣモザイク細胞塊と共培養したＴ細胞の平均分裂回数を、ＣＦＳＥの蛍光強度を指標に測定した。共培養前に染色したＣＦＳＥの蛍光シグナルは、細胞分裂に伴い減衰するため、ＣＦＳＥの蛍光強度を測定することで、細胞分裂回数を同定できる。Ｔ細胞の平均分裂回数は、式９に従って算出した。
（式９）Ｔ細胞の平均分裂回数（回）＝（((０回分裂したＴ細胞数)×０)＋((１回分裂したＴ細胞数)×１)＋((２回分裂したＴ細胞数)×２) ＋((３回分裂したＴ細胞数)×３) ＋((４回分裂したＴ細胞数)×４) ＋((５回分裂したＴ細胞数)×５) ＋((６回分裂したＴ細胞数)×６)）／（０、１、２、３、４、５、および６回分裂したＴ細胞数の合計値）【０１８８】
[比較例８]  Ｔ細胞の増殖抑制試験（ｈＢＭＳＣ細胞塊）
実施例２１と同様に、比較例７で作製したｈＢＭＳＣ細胞塊について、Ｔ細胞の増殖抑制能を評価した。
２４wellプレート上で、ｈＢＭＳＣ細胞塊（ｈＢＭＳＣ５．０×１０4ｃｅｌｌｓ／well）、およびＣＦＳＥで標識したＴ細胞（１．０×１０5ｃｅｌｌｓ／well）を5日間共培養した。培養は、実施例２１と同様のＴ細胞培地中で行った。
５日間の共培養後、ｈＢＭＳＣ細胞塊と共培養したＴ細胞のＣＦＳＥ蛍光強度を測定し、式９に従ってＴ細胞の平均分裂回数を算出した。【０１８９】
Ｔ細胞の平均分裂回数の測定結果を図１４に示す（図中、***:Ｐ＜０．００１（ｔ検定））。その結果、Ｔ細胞のみで培養した場合に対して、ｈＢＭＳＣモザイク細胞塊、およびｈＢＭＳＣ細胞塊と共培養した場合のＴ細胞の平均分裂回数が有意に減少した。また、ｈＢＭＳＣ細胞塊と共培養した場合と比べて、ｈＢＭＳＣモザイク細胞塊と共培養した場合のＴ細胞の平均分裂回数は減少した。従って、ｈＢＭＳＣモザイク細胞塊、およびｈＢＭＳＣ細胞塊はＴ細胞の増殖抑制能を示し、その効果はｈＢＭＳＣモザイク細胞塊の方が高かった。
なお、各培養条件のＴ細胞の平均分裂回数は、Ｔ細胞のみで培養した場合が３．８７±２．６０回、ｈＢＭＳＣ細胞塊と共培養した場合が１．００±０．１２回、ｈＢＭＳＣモザイク細胞塊と共培養した場合が０．７７±０．１０回であった。【０１９０】
[実施例２２]  ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊の作製
ヒト脂肪由来幹細胞（ｈＡＤＳＣ）を増殖培地（Ｌｏｎｚａ社：ＡＤＳＣ−ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（商標）、以下、ＡＤＳＣ用培地ともいう）に懸濁し、実施例３で作製した生体親和性高分子ブロック（５３−１０６μｍ）を加えて、ｈＡＤＳＣ（２．０×１０5ｃｅｌｌｓ）と生体親和性高分子ブロック（０．２ｍｇ）が４ｍＬの培地に懸濁された状態で、底面に窪み部を有する細胞非接着性の３５ｍｍディッシュであるEZSPHERE（登録商標）ディッシュ35mm Type903（スフェロイドウェル口径８００μｍ、スフェロイドウェル深さ３００μｍ、スフェロイドウェル数ウエル〜約１０００ウェル。ＡＧＣテクノグラス製）に播種した。【０１９１】
ＣＯ2インキュベーターにて３７℃で２０時間静置したところ、ｈＡＤＳＣと生体親和性高分子ブロックから成る直径０．２ｍｍ程度の球状としてモザイク細胞塊を複数個回収することができた。【０１９２】
[実施例２３]  Ｔ細胞活性化抑制試験（ＩＬ−２放出量試験）
実施例２０および２２で得られたモザイク細胞塊（５．０×１０4ｃｅｌｌｓ＋生体親和性高分子ブロック０．２ｍｇ／well）をそれぞれT細胞と共培養し、４８時間後に培養上清に放出されるＩＬ−２を定量した。T細胞が活性化状態になるとＩＬ−２を分泌するため、ＩＬ−２を定量することでT細胞の活性化の程度を同定することができる。培養は、実施例２１と同様のＴ細胞培地中で行った。また、１wellあたりのT細胞数は、１．０×１０5ｃｅｌｌｓ／wellとした。
定量に当たってはHuman IL-2 ELISA Kit（cat#: RAB0286  (SIGMA-ALDRICH社)）を使用した。【０１９３】
[比較例９]   Ｔ細胞活性化抑制試験（ＩＬ−２放出量試験）
接着状態で培養した実施例２０および２２と同一細胞（５．０×１０4ｃｅｌｌｓ／well）をそれぞれT細胞と共培養し、４８時間後に培養上清に放出されるＩＬ−２を定量した。培養は、実施例２１と同様のＴ細胞培地中で行った。また、１wellあたりのT細胞数は、１．０×１０5ｃｅｌｌｓ／wellとした。
定量に当たってはHuman IL-2 ELISA Kit（cat#: RAB0286  (SIGMA-ALDRICH社)）を使用した。【０１９４】
実施例２３および比較例９で測定したＩＬ−２の定量結果を図１５に示す（図中、*:Ｐ＜０．０５、***:Ｐ＜０．００１（ｔ検定））。その結果、ｈＢＭＳＣモザイク細胞塊およびｈＢＭＳＣ（接着状態）と共培養した場合ではＴ細胞のＩＬ−２放出量は、T細胞のみで培養した場合と比較して有意に減少した。また、ｈＢＭＳＣ（接着状態）と共培養した場合と比べて、ｈＢＭＳＣモザイク細胞塊と共培養したＴ細胞のＩＬ−２放出量は有意に減少した。従って、ｈＢＭＳＣモザイク細胞塊、およびｈＢＭＳＣ（接着状態）はＴ細胞の活性化抑制能を示し、その効果はｈＢＭＳＣモザイク細胞塊の方が高かった。
同様に、ｈADSCのモザイク細胞塊およびｈADSＣ（接着状態）と共培養した場合のＩＬ−２放出量も、T細胞のみで培養した場合と比較して有意に減少した。また、ｈADSＣ（接着状態）と共培養した場合と比べて、ｈADSCモザイク細胞塊と共培養したＴ細胞のＩＬ−２分泌量は有意に減少した。従って、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊、およびｈＡＤＳＣ（接着状態）はＴ細胞の活性化抑制能を示し、その効果はｈＡＤＳＣモザイク細胞塊の方が高かった。【０１９５】
［実施例２４］犬由来細胞モザイク細胞塊の作製
イヌ脂肪由来幹細胞（ｃＡＤＳＣ：Canine Adipose Derived Stem Cells）を、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリンストレプトマイシンを含有したＤＭＥＭ培地（以下、ｃＡＤＳＣ用培地ともよぶ）に懸濁し、実施例３で作製した生体親和性高分子ブロック（５３−１０６μｍ）を加えて、ｃＡＤＳＣ（１．２×１０6ｃｅｌｌｓ）と生体親和性高分子ブロック（０．２５ｍｇ）が４ｍＬの培地に懸濁された状態で、底面に窪み部を有する細胞非接着性の３５ｍｍディッシュであるEZSPHERE（登録商標）ディッシュ35mm Type903（スフェロイドウェル口径８００μｍ、スフェロイドウェル深さ３００μｍ、スフェロイドウェル数ウエル〜約１０００ウェル。ＡＧＣテクノグラス製）に播種した。【０１９６】
ＣＯ2インキュベーターにて３７℃で６９時間静置したところ、ｃＡＤＳＣと生体親和性高分子ブロックから成る直径０．２ｍｍ程度の球状としてモザイク細胞塊を複数個回収することができた。【０１９７】
［実施例２５］  犬由来細胞モザイク細胞塊での炎症治療効果
実施例１９と同様にして、実施例１８の３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスに対して、炎症誘導開始日から７日後に、実施例２４で作製したｃＡＤＳＣモザイク細胞塊（ｃＡＤＳＣ１．２×１０6ｃｅｌｌｓ＋生体親和性高分子ブロック０．２５ｍｇ／匹）をｃＡＤＳＣ用培地４００μＬに懸濁した状態で腹腔投与した。【０１９８】
［比較例１０］ｃＡＤＳＣ細胞懸濁液、またはＡＤＳＣ用培地での炎症治療効果
実施例２５と同様にして、実施例１８の３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスに対して、誘導開始日から７日後に、ｃＡＤＳＣ用培地１００μＬ、または実施例２５と同じ細胞をｃＡＤＳＣ用培地１００μＬに懸濁した状態のｃＡＤＳＣ細胞懸濁液を尾静脈投与した。ｃＡＤＳＣ細胞懸濁液中に含まれる細胞数は、４．０×１０4ｃｅｌｌｓ／匹または１．２×１０6ｃｅｌｌｓ／匹とした。【０１９９】
実施例２５および比較例１０における、各マウス群の正常マウスに対する体重割合（％）の平均値を図１６に示す。図１６に示されているように、ｃＡＤＳＣモザイク細胞塊マウス群は、誘導開始日の１１、１２、１３、および１４日後において、比較例であるｃＡＤＳＣ用培地マウス群およびｃＡＤＳＣ細胞懸濁液マウス群より「正常マウスに対する体重割合」が高かった。ｃＡＤＳＣモザイク細胞塊マウス群は、ＡＤＳＣ用培地マウス群およびｃＡＤＳＣ細胞懸濁液マウス群より体重の回復が早いことが示された。従って、ｃＡＤＳＣモザイク細胞塊は、体重減少の改善効果が認められた。【０２００】
一方、図１６に示されているように、ｃＡＤＳＣ細胞懸濁液マウス群は、誘導開始日の１１、１２、１３および１４日後において、ｃＡＤＳＣ用培地マウス群より低い体重の推移を示した。従って、ｃＡＤＳＣ細胞懸濁液は、体重減少の改善効果が認められなかった。【０２０１】
以上の体重の評価結果をまとめると、ｃＡＤＳＣモザイク細胞塊は３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの体重減少を改善する効果が認められる。一方で、ｃＡＤＳＣ細胞懸濁液では、３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの体重減少を改善する効果が認められなかった。【０２０２】
実施例２５および比較例１０における、各マウス群の大腸の長さを箱ひげ図として図１７に示す（図中、*:Ｐ＜０．０５、**:Ｐ＜０．０１（ｔ検定））。図１７に示されているように、ｃＡＤＳＣ用培地マウス群の大腸の長さは正常マウス群に対して有意に短いことが示された。
実施例２５において、ｃＡＤＳＣモザイク細胞塊マウス群の大腸の長さは、比較例であるｃＡＤＳＣ用培地マウス群に対して有意に長いことが示された。従って、ｃＡＤＳＣモザイク細胞塊は、３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの大腸の短腸化を改善したことが認められた。
一方、比較例１０において、ｃＡＤＳＣ細胞懸濁液マウス群の大腸の長さは、比較例であるｃＡＤＳＣ用培地マウス群に対して差がないことが示された。従って、ｃＡＤＳＣ細胞懸濁液は、３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの大腸の短腸化を改善しないことが認められた。
なお、各マウス群の大腸の長さの中央値は、正常マウス群が７．５０ｃｍ、ｃＡＤＳＣ用培地マウス群が６．６４ｃｍ、４万ｃＡＤＳＣ細胞懸濁液マウス群が６．４８ｃｍ、１２０万ｃＡＤＳＣ細胞懸濁液マウス群が６．１４ｃｍ、ｃＡＤＳＣモザイク細胞塊マウス群が７．９８ｃｍであった。【０２０３】
以上の大腸の長さの評価結果をまとめると、ｃＡＤＳＣモザイク細胞塊は、３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの短腸化を改善する効果が認められた。一方で、ｃＡＤＳＣ細胞懸濁液は３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの短腸化を改善する効果が認められなかった。
以上の体重、および大腸の長さの結果から、ｃＡＤＳＣモザイク細胞塊による３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスへの炎症改善効果が認められた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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