(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の抗糖脂質抗体を、糖脂質抗原と抗原抗体反応させることにより測定する測定試薬において、イオン強度が０．１０ｍｏｌ／Ｌ以下であることを特徴とする測定試薬。
【請求項２】
糖脂質抗原がガングリオシド抗原である、請求項１記載の測定試薬。
【請求項３】
糖脂質抗原が担体に固定化されたものである、請求項１又は２記載の測定試薬。
【請求項４】
試料中の抗糖脂質抗体を、糖脂質抗原と抗原抗体反応させることにより測定する方法において、該抗原抗体反応の反応時のイオン強度が０．１０ｍｏｌ／Ｌ以下であることを特徴とする測定方法。
【請求項５】
糖脂質抗原がガングリオシド抗原である、請求項４記載の測定方法。
【請求項６】
糖脂質抗原が担体に固定化されたものである、請求項４又は５記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖脂質抗原を用いた試料中の抗糖脂質抗体の測定に関するものである。
本発明は、糖脂質分野、生化学分野、分析化学分野、臨床検査分野及び生命科学分野等において重要なものであるが、特に神経疾患等の診断において重要なものである。  
【背景技術】
【０００２】
糖脂質は、従来より神経組織に多く存在することが知られており、神経組織の糖脂質に反応する抗体が体液中に産生されると重篤な神経症状を起こすことが知られるようになってきた。
これらの自己抗体は、先行感染した菌体に対するものとして体内に産生され、これが神経組織の糖脂質抗原と交差反応し、自己抗体として神経を傷害する自己免疫型の神経疾患を起こすことが知られている。
【０００３】
例えば、糖脂質抗原に対する抗体（抗糖脂質抗体）の一つであるＩｇＧ型の抗ＧＭ１ａ抗体は、急性軸策型ギラン・バレー症候群などの運動神経疾患に関与することが知られている。
急性軸策型ギラン・バレー症候群の場合、食中毒菌として知られる菌体Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉが先行感染し、菌体のリポ多糖（ＬＰＳ）上のＧＭ１ａと類似の糖鎖構造部分に対する抗体が体内に産生されることにより発病する（例えば、非特許文献１）。
そして、この抗体は血液中に見い出されることが判明している（例えば、非特許文献２及び非特許文献３）。
【０００４】
また、別の抗糖脂質抗体であるＩｇＧ型の抗ＧＱ１ｂ抗体は、フィッシャー症候群やビッカースタッフ型脳幹脳炎などの神経疾患に関与しており、その所見は脳幹梗塞などの他の中枢神経系疾患と類似しているが、その治療法は全く異なる。
そして、この抗体も患者血清中に見い出されることが判明している（例えば、非特許文献４及び非特許文献５）。
その他、感覚失調型ポリニューロパシーで抗ＧＤ２抗体、抗ＧＴ１ｂ抗体、抗ＧＱ１ｂ抗体が上昇するとの報告や感覚神経疾患で抗スルファチド抗体が高いとの報告がある。
また、糖脂質抗原と反応する抗体が癌患者由来試料より検出されるとの報告もある。
【０００５】
以上のように、研究レベルでは各種疾患と抗糖脂質抗体の関係が解き明かされ、臨床現場で使用できる抗糖脂質抗体の測定方法として、ＥＬＩＳＡ法による測定が実用化されている（例えば、非特許文献６）。
【０００６】
しかしながら、抗糖脂質抗体の測定方法として使用されているＥＬＩＳＡ法は、検体によっては、その測定の感度が十分でないという問題があった。このため、試料中の抗糖脂質抗体の測定値を疾患の検査に利用しようとする場合、この疾患の診断を誤らせる可能性があった。
従って、試料中の抗糖脂質抗体を、糖脂質抗原と抗原抗体反応させることにより測定を行う場合、更なる測定感度の改善が望まれていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】結城ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８巻，１７７１〜１７７５頁，１９９３年
【非特許文献２】Ａ．Ｊ．Ｋｏｒｎｂｅｒｇら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，３５巻，２３４〜２３７頁，１９９４年
【非特許文献３】Ｌ．Ｈ．Ｖｉｓｓｅｒら，Ｂｒａｉｎ，１１８巻，８４１〜８４７頁，１９９５年
【非特許文献４】千葉ら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，３１巻，６７７〜６７９頁，１９９２年
【非特許文献５】結城ら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．，１１８巻，８３〜８７頁，１９９３年
【非特許文献６】小鷹ら，モダンメディア，５４巻３号，８２〜８６頁，２００８年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明の課題は、糖脂質抗原との抗原抗体反応による試料中の抗糖脂質抗体の測定を高感度に行えるようにし、正確な測定結果が得られる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題の解決を目指して鋭意検討を行った結果、試料中の抗糖脂質抗体を、糖脂質抗原と抗原抗体反応させることにより測定する測定試薬及び測定方法において、イオン強度を０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下にすることで、測定の感度を改善できることを初めて見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の発明を提供する。
（１）試料中の抗糖脂質抗体を、糖脂質抗原と抗原抗体反応させることにより測定する測定試薬において、イオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下であることを特徴とする測定試薬。
（２）糖脂質抗原がガングリオシド抗原である、前記（１）記載の測定試薬。
（３）糖脂質抗原が担体に固定化されたものである、前記（１）又は（２）に記載の測定試薬。
（４）試料中の抗糖脂質抗体を、糖脂質抗原と抗原抗体反応させることにより測定する方法において、該抗原抗体反応の反応時のイオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下であることを特徴とする測定方法。
（５）糖脂質抗原がガングリオシド抗原である、前記（４）記載の測定方法。
（６）糖脂質抗原が担体に固定化されたものである、前記（４）又は（５）に記載の測定方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、試料中の抗糖脂質抗体を、糖脂質抗原と抗原抗体反応させることにより測定する測定試薬及び測定方法において、イオン強度を０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下にすることで、抗糖脂質抗体の測定を高感度に行え、正確な測定結果が得られるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の測定試薬により試料中の抗糖脂質抗体の測定を行った結果を示した図である。
【図２】本発明の測定試薬により試料中の抗糖脂質抗体の測定を行った結果を示した図である。
【図３】本発明の測定試薬により試料中の抗糖脂質抗体の測定を行った結果を示した図である。
【図４】本発明の測定試薬により試料中の抗糖脂質抗体の測定を行った結果を示した図である。
【図５】本発明の測定試薬により試料中の抗糖脂質抗体の測定を行った結果を示した図である。
【図６】本発明の測定試薬により試料中の抗糖脂質抗体の測定を行った結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明するが、以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明はこの実施の形態に限定されるものではない。また、本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施することができる。
【００１４】
〔１〕発明の基本要件
本発明の測定試薬及び測定方法では、試料中の抗糖脂質抗体の測定において、イオン強度を０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下にすることが必須である。
このことにより、試料中の抗糖脂質抗体の測定に当たり、測定感度を上昇させることができる。
【００１５】
〔２〕糖脂質抗原
本発明において、糖脂質抗原とは、その分子内に水溶性糖鎖と脂溶性基の両者を含む物質（糖脂質）であり、測定を行おうとする抗糖脂質抗体と特異的に結合することが可能な物質のことである。
【００１６】
本発明における糖脂質抗原には、スフィンゴ糖脂質、及びグリセロ糖脂質等が含まれるものである。
【００１７】
また、本発明における糖脂質抗原には、シアル酸を含む糖脂質であるガングリオシド、硫酸を含む糖脂質であるスルファチド（スルホリピド）、ウロン酸を含む糖脂質、又はリン酸を含む糖脂質などの酸性糖脂質、及び中性糖脂質等が含まれるものである。
【００１８】
なお、ガングリオシド（シアロ糖脂質）は、シアル酸を含むスフィンゴ糖脂質の総称である。
このガングリオシドとしては、例えば、ＧＭ１、ＧＭ１ｂ、ＧＭ１−Ｆｕｃ、ＧＭ２、ＧＭ３、ＧＭ３（ＮｅｕＧｃ）、ＧＭ４、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＤ３（ＮｅｕＡｃ／ＮｅｕＧｃ）、ＧＤ３（ＮｅｕＧｃ）２、ＧＴ１ａ、ＧＴ１ｂ、ＧＴ１ｃ、ＧＱ１ａ、ＧＱ１ｂ、ＧＱ１ｃ、ＧＰ１ａ、ＧＰ１ｂ、ＧＰ１ｃ、又はＬＭ１等を挙げることができる。
【００１９】
本発明においては、糖脂質抗原がガングリオシド（ガングリオシド抗原）である場合に好適である。
【００２０】
〔３〕抗糖脂質抗体
本発明において、抗糖脂質抗体は、前記した糖脂質抗原に対して特異的に結合することができる抗体である。
【００２１】
本発明における抗糖脂質抗体としては、例えば、スフィンゴ糖脂質に対する抗体、又はグリセロ糖脂質に対する抗体等を挙げることができる。
【００２２】
更に、本発明において、抗糖脂質抗体としては、例えば、酸性糖脂質に対する抗体、又は中性糖脂質に対する抗体等を挙げることができる。
【００２３】
そして、酸性糖脂質に対する抗体としては、例えば、ガングリオシドに対する抗体、スルファチドに対する抗体、ウロン酸を含む糖脂質に対する抗体、又はリン酸を含む糖脂質に対する抗体等を挙げることができる。
【００２４】
また、ガングリオシドに対する抗体としては、例えば、抗ＧＭ１抗体、抗ＧＭ１ｂ抗体、抗ＧＭ１−Ｆｕｃ抗体、抗ＧＭ２抗体、抗ＧＭ３抗体、抗ＧＭ３（ＮｅｕＧｃ）抗体、抗ＧＭ４抗体、抗ＧＤ１ａ抗体、抗ＧＤ１ｂ抗体、抗ＧＤ２抗体、抗ＧＤ３抗体、抗ＧＤ３（ＮｅｕＡｃ／ＮｅｕＧｃ）抗体、抗ＧＤ３（ＮｅｕＧｃ）２抗体、抗ＧＴ１ａ抗体、抗ＧＴ１ｂ抗体、抗ＧＴ１ｃ抗体、抗ＧＱ１ａ抗体、抗ＧＱ１ｂ抗体、抗ＧＱ１ｃ抗体、抗ＧＰ１ａ抗体、抗ＧＰ１ｂ抗体、抗ＧＰ１ｃ抗体、又は抗ＬＭ１抗体等を挙げることができる。
【００２５】
本発明においては、抗糖脂質抗体がガングリオシドに対する抗体である場合に好適である。
【００２６】
〔４〕イオン強度
本発明では、試料中の抗糖脂質抗体の測定試薬及び測定方法において、イオン強度を０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下とすることにより、測定感度を上昇させることができる。
【００２７】
そして、イオン強度を０．１５ｍｏｌ／Ｌ以下にすることが、測定感度をより上昇させることができるため好ましい。同じ理由により、イオン強度を０．１０ｍｏｌ／Ｌ以下にすることが更に好ましい。  
【００２８】
なお、本発明の試料中の抗糖脂質抗体の測定において、イオン強度を０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下にするには、例えば、試料中の糖脂質抗体の測定試薬及び測定方法に、陽イオン及び陰イオンを含有又は存在させることにより行えばよい。
【００２９】
また、本発明におけるイオン強度は、例えば、測定反応時に緩衝剤やアジ化ナトリウム等の防腐剤などが存在している場合は、それらのイオン強度を含めたトータルのイオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下となっていればよい。
【００３０】
〔５〕陽イオン及び陰イオン
本発明において、イオン強度の調整のために試料中の抗糖脂質抗体の測定試薬及び測定方法に含有又は存在させる陽イオン及び陰イオンについて、以下説明を行う。
【００３１】
（１）陽イオン
本発明において、陽イオンは、正の電荷を有するイオンであれば、特に限定されず用いることができる。
【００３２】
この陽イオンとしては、１価の陽イオンであってもよく、又は２価以上の多価の陽イオンであってもよい。
【００３３】
そして、この陽イオンとしては、例えば、金属イオン、アンモニウムイオン、又はその他の陽イオン等を挙げることができる。
【００３４】
この金属イオンとしては、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、又はその他の金属イオン等を挙げることができる。
アルカリ金属イオンとしては、例えば、リチウムイオン、ナトリウムイオン、又はカリウムイオン等を挙げることができる。
アルカリ土類金属イオンとしては、例えば、ベリリウムイオン、マグネシウムイオン、又はカルシウムイオン等を挙げることができる。
その他の金属イオンとしては、例えば、マンガンイオン、鉄イオン、コバルトイオン、ニッケルイオン、銅イオン、亜鉛イオン、又はアルミニウムイオン等を挙げることができる。
【００３５】
アンモニウムイオンとしては、例えば、一級のアンモニウムイオン、二級のアンモニウムイオン、三級のアンモニウムイオン、又は四級のアンモニウムイオン等を挙げることができる。
【００３６】
その他の陽イオンとしては、例えば、炭素原子、ケイ素原子、ホウ素原子、窒素原子（アンモニウムイオン以外の場合において）、リン原子、若しくは硫黄原子などが正の電荷を帯びている原子、又は原子団等を挙げることができる。
この具体的な例としては、炭素原子が正の電荷を帯びているコリンイオン等を挙げることができる。
【００３７】
なお、この陽イオンとしては、１種類のものだけを用いてもよいし、又は複数種類のものを同時に用いてもよい。
【００３８】
（２）陰イオン
本発明において、陰イオンは、負の電荷を有するイオンであれば、特に限定されず用いることができる。
【００３９】
この陰イオンとしては、１価の陰イオンであってもよく、又は２価以上の多価の陰イオンであってもよい。
【００４０】
そして、この陰イオンとしては、例えば、有機化合物よりなる酸基、ハロゲンイオン、又はその他の無機化合物よりなる酸基等を挙げることができる。
【００４１】
この有機化合物よりなる酸基としては、例えば、酢酸イオン、クエン酸イオン、グルコン酸イオン、又はシュウ酸イオン等を挙げることができる。
【００４２】
ハロゲンイオンとしては、例えば、フッ素イオン、塩素イオン、臭素イオン、又はヨウ素イオン等を挙げることができる。
【００４３】
その他の無機化合物よりなる酸基としては、例えば、硫酸イオン、亜硫酸イオン、ピロ亜硫酸イオン、亜二チオン酸イオン、チオ亜硫酸イオン、硝酸イオン、亜硝酸イオン、次亜硝酸イオン、ペルオキソ亜硝酸イオン、リン酸イオン、亜リン酸イオン、ピロ亜リン酸イオン、次亜リン酸イオン、二リン酸イオン、ホウ酸イオン、炭酸イオン、シアン酸イオン、イソシアン酸イオン、又はケイ酸イオン等を挙げることができる。
【００４４】
また、この陰イオンとしては、１種類のものだけを用いてもよいし、又は複数種類のものを同時に用いてもよい。
【００４５】
また、前記の陽イオン及び陰イオンを含有又は存在させる方法であるが、この陽イオン及び陰イオンを、糖脂質抗原と試料中の抗糖脂質抗体との抗原抗体反応が行われる測定反応時に、イオン強度を０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下にすることができればいかなる方法でも良い。
【００４６】
例えば、前記陽イオンを含む化合物と、前記陰イオンを含む化合物を別々に添加することにより含有又は存在させて、測定試薬を調製してもよい。
また、前記陽イオンと前記陰イオンの両方を含む化合物を添加することにより含有又は存在させて、測定試薬を調製してもよい。
そしてその結果として、前記陽イオン及び前記陰イオンを各々前記の試料中の抗糖脂質抗体の測定試薬及び測定方法にイオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下となるように存在させられればよい。
【００４７】
また、前記の陽イオンと陰イオンの両方を含む化合物としては、例えば、この陽イオン及び陰イオンよりなる塩等を挙げることができる。
【００４８】
なお、本発明においては、例えば、前記の陽イオン及び陰イオンをイオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下となるように含有させた試料希釈液を調製し、この試料希釈液と試料との混合物と、糖脂質抗原を固定化した担体を含む試薬とを混合することによって、担体に固定化された糖脂質抗原と試料に含まれていた抗糖脂質抗体との、抗原抗体反応が行われる測定反応時に、陽イオン及び陰イオンを存在させるようにするのが好ましい。
【００４９】
〔６〕担体
本発明において、担体は、前記の糖脂質抗原を固定化することができるものであれば、特に制限なく用いることができる。
【００５０】
すなわち、糖脂質抗原との抗原抗体反応を利用して試料中の抗糖脂質抗体の測定を行う測定試薬及び測定方法に使用されている担体、又は使用することが可能な担体であればよい。
【００５１】
この担体の材質は、特に限定はなく、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ラテックス、リポソーム、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなるマイクロカプセル、ビーズ、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）、試験管、スティック又は試験片等の形状の固相担体を用いることができる。
【００５２】
本発明において、糖脂質抗原を担体に固定化することは、物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により行うことができる。
【００５３】
例えば、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号  臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１  タンパク質IV」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、糖脂質抗原と、担体とを、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、糖脂質抗原と、担体の、それぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と前記の二価性の架橋試薬とを反応させること等により行うことができる。
【００５４】
更に、糖脂質抗原を固定化した担体の自然凝集や、非特異的反応等を抑制するために処理を行う必要があれば、糖脂質抗原を固定化した担体の表面又は内壁面に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミン若しくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、担体のブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。
【００５５】
〔７〕試料
本発明において、試料とは、抗糖脂質抗体が存在する可能性があり、かつ抗糖脂質抗体の存在の有無、又は含有量（濃度）の測定を行おうとするものであれば、どのようなものでもよい。
このような試料としては、例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、髄液若しくは腹水などの体液、又は臓器、組織、若しくは筋肉などの抽出液、細胞若しくは菌体などの抽出液等、抗糖脂質抗体が含まれる可能性のあるものを挙げることができる。
【００５６】
〔８〕測定方法
本発明の測定方法は、試料中の抗糖脂質抗体を、糖脂質抗原と抗原抗体反応させることにより測定する方法において、該抗原抗体反応の反応時のイオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下であることを特徴とするものである。
【００５７】
本発明の測定方法において、試料中の抗糖脂質抗体を、糖脂質抗原と抗原抗体反応させることにより測定を行う方法の測定原理は、特に制限はなく、どのような測定原理のものであってもよい。
【００５８】
例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、酵素抗体法、蛍光抗体法、イムノクロマトグラフィー法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法、赤血球凝集反応法、粒子凝集反応法、特開平９−２２９９３６号公報及び特開平１０−１３２８１９号公報などに記載された測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定され、これで被覆された面を有する担体、及び測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定された粒子を用いる測定法、又はＤａｈｌｂｅａｃｋらが示したＥＬＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  Ｌｉｇａｎｄｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，７９巻，７６７〜７７２頁，１９９８年発行；ＷＯ９８／２３９６３）等を挙げることができる。
【００５９】
そして、本発明の測定方法を、酵素免疫測定などの標識免疫測定法を測定原理とする方法により実施する場合、サンドイッチ法、競合法、又は均一系法（ホモジニアス系法）等のいずれの手法においても本発明を適用することができる。
【００６０】
なお、本発明の測定方法においては、測定は用手法により行ってもよいし、又は分析装置等の装置を用いて行ってもよい。
【００６１】
また、測定は、１ステップ法（１試薬法）により行ってもよいし、又は２ステップ法（２試薬法）等の複数の操作ステップにより行う方法によって実施してもよい。
【００６２】
なお、本発明の測定方法においては、いずれの測定原理（測定法）に基づいて実施するにしても、その測定原理（測定法）の公知の手法に従って、測定を行えばよい。
【００６３】
本発明の測定方法を、酵素免疫測定法などの標識免疫測定法を測定原理とする方法により実施する場合を例にとって、以下具体的に説明を行う。
標識免疫測定法のサンドイッチ法により測定を行う場合の一例を示す。
【００６４】
（１）まず、以下のものを用意する。
担体：測定を行おうとする抗糖脂質抗体と特異的に結合することができる糖脂質抗原を固定化した担体（例えば、抗ＧＭ１抗体の測定においては、ＧＭ１をウェルに固定化したマイクロタイタープレート）
試料希釈液：イオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下である溶液
【００６５】
（２）試料（ヒト血清）と試料希釈液との混合物を、担体の糖脂質抗原を固定化した部位に一定量添加し、一定時間接触させる。
これにより、試料中に測定対象物質である抗糖脂質抗体が存在する場合には、抗原抗体反応により、「担体−糖脂質抗原−抗糖脂質抗体」の結合を形成させる。（例えば、「マイクロタイタープレートのウェル−ＧＭ１−抗ＧＭ１抗体」）
【００６６】
（３）この試料の添加、接触と同時に、若しくは一定時間のうちに、又は洗浄の後に、前記の抗糖脂質抗体と特異的に結合することができる物質に酵素等の標識物質を結合させたものの一定量を、担体の糖脂質抗原を固定化した部位に添加して、一定時間接触させる。
【００６７】
なお、抗糖脂質抗体と特異的に結合することができる物質としては、例えば、この抗糖脂質抗体に対する抗体、又はこの抗糖脂質抗体と結合することができる抗原等を挙げることができる。
【００６８】
より具体的には、この抗糖脂質抗体に対する抗体としては、例えば、抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＡ抗体、抗ヒトＩｇＭ抗体、抗ヒトＩｇＤ抗体、及び抗ヒトＩｇＥ抗体より選ばれる１種又は２種以上の抗体等を挙げることができる。
【００６９】
また、この抗糖脂質抗体と結合することができる抗原としては、例えば、この抗糖脂質抗体と結合することができる糖脂質抗原等を挙げることができる。（例えば、抗糖脂質抗体が抗ＧＭ１抗体である場合には、ＧＭ１を挙げることができる。）
【００７０】
この操作により、試料中に測定対象物質である抗糖脂質抗体が存在する場合には、「担体−糖脂質抗原−抗糖脂質抗体−抗糖脂質抗体と特異的に結合することができる物質−標識物質」の結合が形成される。（例えば「マイクロタイタープレートのウェル−ＧＭ１−抗ＧＭ１抗体−抗ヒトＩｇＧ抗体−標識酵素」）
【００７１】
（４）次に、担体に結合していない未結合の「標識物質を結合した、抗糖脂質抗体と特異的に結合することができる物質」を洗浄し、除去する。
【００７２】
（５）そして、「担体−糖脂質抗原−抗糖脂質抗体−抗糖脂質抗体と特異的に結合することができる物質−標識物質」の結合により担体に結合した標識物質を検出することにより、試料に含まれていた抗糖脂質抗体の測定を行う。
【００７３】
この測定においては、担体と標識物質が、試料に含まれていた抗糖脂質抗体を介して、「担体−糖脂質抗原−抗糖脂質抗体−抗糖脂質抗体と特異的に結合することができる物質−標識物質」と結合するので、担体に結合した標識物質の量を測定することにより、試料に含まれていた抗糖脂質抗体の有無、又は量を測定することができるものである。
【００７４】
なお、前記（３）において用いる「標識物質を結合した、抗糖脂質抗体と特異的に結合することができる物質」として、「標識物質を結合した、クラス別のヒト免疫グロブリンに対する抗体」を使用することにより、試料中の抗糖脂質抗体を免疫グロブリンのクラス別に測定することが可能となる。
このクラス別のヒト免疫グロブリンに対する抗体としては、例えば、抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＡ抗体、抗ヒトＩｇＭ抗体、抗ヒトＩｇＤ抗体、又は抗ヒトＩｇＥ抗体等を挙げることができる。
【００７５】
また、これらの「標識物質を結合した、クラス別のヒト免疫グロブリンに対する抗体」を、適当な割合で混合して使用することにより、免疫グロブリンのクラスに依存しない抗糖脂質抗体の測定を行うことができる。
【００７６】
更に、前記（３）において用いる「標識物質を結合した、抗糖脂質抗体と特異的に結合することができる物質」として、「標識物質を結合した、サブクラス別のヒト免疫グロブリンに対する抗体」を使用することにより、試料中の抗糖脂質抗体を免疫グロブリンのサブクラス別に測定することが可能となる。
このサブクラス別のヒト免疫グロブリンに対する抗体としては、例えば、抗ヒトカッパー（κ）抗体、抗ヒトラムダ（λ）抗体、抗ヒトＩｇＧ１抗体、抗ヒトＩｇＧ２抗体、抗ヒトＩｇＧ３抗体、又は抗ヒトＩｇＧ４抗体等を挙げることができる。
【００７７】
また、これらの「標識物質を結合した、サブクラス別のヒト免疫グロブリンに対する抗体」を、適当な割合で混合して使用することにより、免疫グロブリンのサブクラスに依存しない抗糖脂質抗体の測定を行うことができる。
【００７８】
なお、「担体−糖脂質抗原−抗糖脂質抗体−抗糖脂質抗体と特異的に結合することができる物質−標識物質」の結合により担体に結合した標識物質の検出であるが、酵素免疫測定法等の標識物質として酵素を用いて測定を行う方法及び試薬においては、標識酵素にその至適条件下で基質を反応させ、その反応生成物の量を反応促進物質の吸光度を測るなどの光学的方法等により測定を行う。
【００７９】
蛍光免疫測定法等の標識物質として蛍光物質を用いて測定を行う方法及び試薬においては、標識蛍光物質による蛍光強度を測定することにより測定を行う。
【００８０】
放射免疫測定法等の標識物質として放射性物質を用いて測定を行う方法及び試薬においては、標識放射性物質による放射線量を測定することにより測定を行う。
【００８１】
発光免疫測定法等の標識物質として発光反応に係わる物質を用いて測定を行う方法及び試薬においては、標識物質が係わる発光反応系における発光量を測定することにより測定を行う。
【００８２】
なお、前記の標識物質であるが、標識物質として酵素を用いる酵素免疫測定法等により測定を行う場合には、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素、又はα−アミラーゼ等の酵素を用いることができる。
【００８３】
また、標識物質として蛍光物質を用いる蛍光免疫測定法等により測定を行う場合には、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート、又はジクロロトリアジンイソチオシアネート等の蛍光物質を用いることができる。
【００８４】
そして、標識物質として放射性物質を用いる放射免疫測定法等により測定を行う場合には、トリチウム、ヨウ素１２５、又はヨウ素１３１等の放射性物質を用いることができる。
【００８５】
また、測定を発光免疫測定法により行う場合には、アクリジニウムエステル、アルカリ性ホスファターゼ、パーオキシダーゼ、又はグルコースオキシダーゼ等を標識物質として用い、アクリジニウムエステル系、ジオキセタン化合物系、ルミノール−過酸化水素−ＰＯＤ系、又はＮＡＤＨ−ＦＭＮＨ２−ルシフェラーゼ系等により担体に結合した標識物質の検出を行うことができる。
【００８６】
〔９〕測定試薬
本発明の測定試薬は、試料中の抗糖脂質抗体を、糖脂質抗原と抗原抗体反応させることにより測定する測定試薬において、イオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下であることを特徴とするものである。
【００８７】
本発明のイオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下の試薬を用いることにより、試料中の抗糖脂質抗体の測定に当たり、測定感度を上昇させることができる。
【００８８】
なお、陽イオン及び陰イオンについては、前記〔４〕及び〔５〕に記載した通りであり、試料中の抗糖脂質抗体の測定方法については、前記〔８〕に記載した通りである。
【００８９】
また、本発明の測定試薬においては、糖脂質抗原がガングリオシド（ガングリオシド抗原）である場合に好適である。
【００９０】
そして、本発明の測定試薬においては、糖脂質抗原が担体に固定化されている場合に好適である。
【００９１】
なお、本発明の試料中の抗糖脂質抗体の測定試薬は、そのもの単独にて、販売し、又は試料中の抗糖脂質抗体の測定に使用することができる。
また、本発明の試料中の抗糖脂質抗体の測定試薬は、他の試薬と組み合わせて、販売し、又は試料中の抗糖脂質抗体の測定に使用することもできる。
【００９２】
前記の他の試薬としては、例えば、緩衝液、試料希釈液、試薬希釈液、標識物質を含有する試薬、発色などのシグナルを生成する物質を含有する試薬、又は校正（キャリブレーション）を行うための物質を含有する物質の試薬等を挙げることができる。
【００９３】
〔１０〕測定時の他の成分
本発明における、試料中の抗糖脂質抗体の測定においては、溶媒として、各種の水系溶媒を用いることができる。
この水系溶媒としては、例えば、精製水、生理食塩水、又は、トリス緩衝液、リン酸緩衝液若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等を挙げることができる。
この緩衝液のｐＨについては、適宜適当なｐＨを選択して用いればよく、特に制限はないものの、通常は、ｐＨ３〜１２の範囲内のｐＨを選択して用いることが一般的である。
【００９４】
また、本発明における測定においては、前記の糖脂質抗原、前記の陽イオン並びに陰イオン、前記の糖脂質抗原を固定化した担体、及び／又は前記の抗糖脂質抗体等の抗体と酵素などの標識物質を結合させた標識抗体等の試薬成分の他に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼイン若しくはその塩などのタンパク質；各種塩類；各種糖類；脱脂粉乳；正常ウサギ血清などの各種動物血清；アジ化ナトリウムもしくは抗生物質などの各種防腐剤；活性化物質；反応促進物質；ポリエチレングリコールなどの感度増加物質；非特異的反応抑制物質；又は、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤若しくは陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等の１種又は２種以上を適宜用いてもよい。
そして、これらを測定に用いる際の濃度は特に限定されるものではないが、０．００１〜１０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、特に０．０１〜５％（Ｗ／Ｖ）が好ましい。
【００９５】
なお、前記の界面活性剤としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油若しくはポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤；酢酸ベタインなどの両性界面活性剤；又は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤等を挙げることができる。
【００９６】
〔１１〕測定感度を上昇させる方法
本発明における、試料中の抗糖脂質抗体測定の、測定感度を上昇させる方法は、試料中の抗糖脂質抗体測定において、イオン強度を０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下とすることによるものである。
この、試料中の抗糖脂質抗体の測定において、イオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下で測定を行うことにより、抗糖脂質抗体の測定感度を上昇させることができる。
また、本発明における測定感度を上昇させる方法を実施する際の試薬の構成成分や試料や条件等は、前記した通りである。
【実施例】
【００９７】
以下、実施例により本発明をより具体的に詳述するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００９８】
〔実施例１〕（異なるイオン強度での抗糖脂質抗体の測定）
塩化ナトリウム濃度を変えることによりイオン強度を変え、標識免疫測定法により試料中の抗ＧＭ１抗体（抗糖脂質抗体）の測定を行った。
【００９９】
１．試薬の調製
【０１００】
（１）試料希釈液の調製
１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する１０ｍＭリン酸緩衝液〔ｐＨ７．５〕を調製した。ここに、塩化ナトリウムを５０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ及び２００ｍＭの濃度となるように添加し、塩化ナトリウム濃度の異なる４種類の試料希釈液の調製を行った。
【０１０１】
（２）ＧＭ１抗原固相化担体の調製
ガングリオシドＧＭ１（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ Ｌｉｍｉｔｅｄ社）を１ウェル当たり２００ｎｇずつポリスチレンプレート〔ＰｏｌｙＳｏｒｐ〕（ヌンク社）のウェルに分注し、一定時間放置して、前記ガングリオシドＧＭ１を前記ポリスチレンプレートの各ウェルに固相化した。
【０１０２】
次に、このガングリオシドＧＭ１が固相化されたウェル内に１．５％ＢＳＡ溶液（ｐＨ７．７）を１ウェル当たり２００μＬずつ分注し、一定時間放置してブロッキング処理を行い、ＧＭ１抗原固相化担体を調製した。
【０１０３】
（３）洗浄液の調製
０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．５）を調製し、洗浄液とした。
【０１０４】
（４）酵素標識抗体
ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体〔Ｐ０２１４〕（ダコ社）を、酵素標識抗体として用いた。
【０１０５】
（５）発色液
０．０２％ペルオキシダーゼ基質液〔３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン〕（同仁化学研究所）を含有する２．５ｍＭ過酸化水素を発色液として用いた。
【０１０６】
２．試料
抗ＧＭ１抗体陽性血清：
抗ＧＭ１抗体を含むことが確認されている１１種類の血清を、抗ＧＭ１抗体陽性血清として用意した。
【０１０７】
３．試料中の抗糖脂質抗体の測定
（１）試料である本実施例の２の１１種類の抗ＧＭ１抗体陽性血清を本実施例の１の（１）の４種類の試料希釈液により、それぞれ１００倍に希釈して混合液を調製した。
【０１０８】
（２）前記（１）で調製した混合液の各々を、本実施例の（２）のＧＭ１抗原固相化担体の各ウェルに１００μＬずつ分注し、これを４℃にて一晩静置した。
これにより、担体に固相化されているＧＭ１抗原と試料に含まれていた抗ＧＭ１抗体を接触させ、反応させた。
【０１０９】
（３）次に、前記のウェルより、前記の混合液を吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の洗浄液で洗浄した。
【０１１０】
（４）本実施例の１の（４）の酵素標識抗体を、１％ＢＳＡを含むトリス緩衝液で２，０００倍希釈した。次にこれを、前記の洗浄操作を行ったウェルに１００μＬずつ分注して、室温で２時間反応させた。
【０１１１】
（５）その後、前記のウェルより、未結合の酵素標識抗体を吸引して除去した。そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の洗浄液で洗浄した。
【０１１２】
（６）次に、本実施例の１の（５）の発色液の１００μＬを、前記のウェルに分注し、室温で２０分間反応させた。
これにより、担体に固定化された標識酵素（ペルオキシダーゼ）と、発色液を反応させて、色素を生成させた。
【０１１３】
（７）前記の発色液の添加２０分後に、０．３５Ｍ硫酸の１００μＬを、前記のウェルに分注して、前記の反応を停止させた。
【０１１４】
（８）マイクロプレートリーダー〔６８０型〕（バイオラッド社）にて、前記のウェル中の液の吸光度（主波長：４５０ｎｍ、副波長：５５０ｎｍ）を測定して、吸光度測定値を得た。
【０１１５】
４．測定結果
これらの測定結果（吸光度測定値）を表１及び図１に示した。なお、表１において、かっこ内の数値は、各濃度の塩化ナトリウムを含有する試薬のイオン強度（ｍｏｌ／Ｌ）を示す。
【０１１６】
【表１】
0006733079.tif 000002
【０１１７】
５．考察
表１から明らかなように、塩化ナトリウム濃度が２００ｍＭ（すなわちイオン強度が０．２２６ｍｏｌ／Ｌ）の場合は、塩化ナトリウム濃度が１５０ｍＭ（すなわちイオン強度が０．１７６ｍｏｌ／Ｌ）の場合に比較して、全ての試料で、測定により得られる測定値（吸光度）が減少してしまっていることが分かる。すなわち、シグナルの生成が大きく減少し、測定の感度が低下してしまっていることが分かる。
【０１１８】
これに対して、塩化ナトリウム濃度が１００ｍＭ（すなわちイオン強度が０．１２６ｍｏｌ／Ｌ）の場合は、塩化ナトリウム濃度が１５０ｍＭ（すなわちイオン強度が０．１７６ｍｏｌ／Ｌ）の場合に比較して、測定により得られる測定値（吸光度）の減少が小さくなっており、生成するシグナルの増加、すなわち測定の感度が上昇していることが分かる。
【０１１９】
また、塩化ナトリウム濃度が５０ｍＭ（すなわちイオン強度が０．０７６ｍｏｌ／Ｌ）の場合は、塩化ナトリウム濃度が１５０ｍＭ（すなわちイオン強度が０．１７６ｍｏｌ／Ｌ）の場合に比較して、測定により得られる測定値（吸光度）は、いずれも減少しておらず、生成するシグナルの増加、すなわち測定の感度の上昇が顕著であることが分かる。
【０１２０】
これらのことより、試料中の抗糖脂質抗体を、糖脂質抗原と抗原抗体反応させることにより測定する測定試薬及び測定方法において、イオン強度を０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下にすることにより、試料中の抗糖脂質抗体を感度高く測定できることが確かめられた。
よって、本発明の試料中の抗糖脂質抗体測定試薬及び測定方法は、生成するシグナルの減少を防ぎ、測定の感度を上昇させ、正確な測定結果を得ることができることが確かめられた。
【０１２１】
〔実施例２〕（異なるイオン強度での抗糖脂質抗体の測定）
塩化ナトリウム濃度を変えることによりイオン強度を変え、標識免疫測定法により試料中の抗ＧＱ１ｂ抗体（抗糖脂質抗体）の測定を行った。
【０１２２】
１．試薬の調製
【０１２３】
（１）試料希釈液の調製
前記実施例１の１の（１）で調製した試料希釈液をそのまま使用した。
【０１２４】
（２）ＧＱ１ｂ抗原固相化担体の調製
ガングリオシドＧＱ１ｂ（Ｈｙｔｅｓｔ社）を１ウェル当たり２００ｎｇずつポリスチレンプレート〔ＰｏｌｙＳｏｒｐ〕（ヌンク社）のウェルに分注し、一定時間放置して、前記ガングリオシドＧＱ１ｂを前記ポリスチレンプレートの各ウェルに固相化した。
【０１２５】
次に、このガングリオシドＧＱ１ｂが固相化されたウェルに１．５％ＢＳＡ溶液（ｐＨ７．７）を１ウェル当たり２００μＬずつ分注し、一定時間放置してブロッキング処理を行い、ＧＱ１ｂ抗原固相化担体を調製した。
【０１２６】
（３）洗浄液の調製
前記実施例１の１の（３）で調製した洗浄液をそのまま使用した。
【０１２７】
（４）酵素標識抗体
前記実施例１の１の（４）の酵素標識抗体をそのまま使用した。
【０１２８】
（５）発色液
前記実施例１の１の（５）の酵素標識抗体をそのまま使用した。
【０１２９】
２．試料
抗ＧＱ１ｂ抗体陽性血清：
抗ＧＱ１ｂ抗体を含むことが確認されている１０種類の血清を、抗ＧＱ１ｂ抗体陽性血清として用意した。
【０１３０】
３．試料中の抗糖脂質抗体の測定
（１）試料である本実施例の２の１０種類の抗ＧＱ１ｂ抗体陽性血清を本実施例の１の（１）の４種類の試料希釈液により、それぞれ１００倍に希釈して混合液を調製した。
【０１３１】
（２）前記（１）で調製した混合液の各々を、本実施例の１の（２）のＧＱ１ｂ抗原固相化担体の各ウェルに１００μＬずつ分注し、これを４℃にて一晩静置した。
これにより、担体に固相化されているＧＱ１ｂ抗原と試料に含まれていた抗ＧＱ１ｂ抗体を接触させ、反応させた。
【０１３２】
（３）次に、前記のウェルより、前記の混合液を吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の洗浄液で洗浄した。
【０１３３】
（４）本実施例の１の（４）の酵素標識抗体を、１％ＢＳＡを含むトリス緩衝液で２，０００倍希釈した。次にこれを、前記の洗浄操作を行ったウェルに１００μＬずつ分注して、室温で２時間反応させた。
【０１３４】
（５）その後、前記のウェルより、未結合の酵素標識抗体を吸引して除去した。そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の洗浄液で洗浄した。
【０１３５】
（６）次に、本実施例の〔１〕の１の（５）の発色液の１００μＬを、前記のウェルに分注し、室温で２０分間反応させた。
これにより、担体に固定化された標識酵素（ペルオキシダーゼ）と、発色液を反応させて、色素を生成させた。
【０１３６】
（７）前記の発色液の添加２０分後に、０．３５Ｍ硫酸の１００μＬを、前記のウェルに分注して、前記の反応を停止させた。
【０１３７】
（８）マイクロプレートリーダー〔６８０型〕（バイオラッド社）にて、前記のウェル中の液の吸光度（主波長：４５０ｎｍ、副波長：５５０ｎｍ）を測定して、吸光度測定値を得た。
【０１３８】
４．測定結果
これらの測定結果（吸光度測定値）を表２及び図２に示した。なお、表２において、かっこ内の数値は、各濃度の塩化ナトリウムを含有する試薬のイオン強度（ｍｏｌ／Ｌ）を示す。
【０１３９】
【表２】
0006733079.tif 000003
【０１４０】
５．考察
表２から明らかなように、塩化ナトリウム濃度が２００ｍＭの場合（すなわちイオン強度が０．２２６ｍｏｌ／Ｌ）は、塩化ナトリウム濃度が１５０ｍＭの場合（すなわちイオン強度が０．１７６ｍｏｌ／Ｌ）に比較して、全ての試料で、測定により得られる測定値（吸光度）が減少してしまっていることが分かる。すなわち、シグナルの生成が大きく減少し、測定の感度が低下してしまっていることが分かる。
【０１４１】
これに対して、塩化ナトリウム濃度が１００ｍＭの場合（すなわちイオン強度が０．１２６ｍｏｌ／Ｌ）は、塩化ナトリウム濃度が１５０ｍＭの場合（すなわちイオン強度が０．１７６ｍｏｌ／Ｌ）に比較して、測定により得られる測定値（吸光度）の減少が小さくなっており、生成するシグナルの増加、すなわち測定の感度が上昇していることが分かる。
【０１４２】
また、塩化ナトリウム濃度が５０ｍＭの場合は、塩化ナトリウム濃度が１５０ｍＭ（すなわちイオン強度が０．１７６ｍｏｌ／Ｌ）の場合に比較して、測定により得られる測定値（吸光度）は、いずれも減少しておらず、生成するシグナルの増加、すなわち測定の感度の上昇が顕著であることが分かる。
【０１４３】
これらのことより、試料中の抗糖脂質抗体を、糖脂質抗原と抗原抗体反応させることにより測定する測定試薬及び測定方法において、イオン強度を０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下にすることにより、試料中の抗糖脂質抗体を感度高く測定できることが確かめられた。
よって、本発明の試料中の抗糖脂質抗体測定試薬及び測定方法は、生成するシグナルの減少を防ぎ、測定の感度を上昇させ、正確な測定結果を得ることができることが確かめられた。
【０１４４】
〔実施例３〕（異なるイオン強度での抗糖脂質抗体の測定）
試料希釈液中の緩衝液の濃度を変え、標識免疫測定法により試料中の抗ＧＭ１抗体（抗糖脂質抗体）の測定を行った。
【０１４５】
１．試薬の調製
（１）試料希釈液の調製
５ｍＭ、１０ｍＭ、５０ｍＭ及び１００ｍＭのリン酸緩衝液〔ｐＨ７．５〕に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を１％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウムを１００ｍＭとなるように添加し、緩衝液濃度の異なる４種類の試料希釈液の調製を行った。
【０１４６】
（２）ＧＭ１抗原固相化担体の調製
前記実施例１の１の（２）で調製したＧＭ１抗原固相化担体をそのまま使用した。
【０１４７】
（３）洗浄液の調製
前記実施例１の１の（３）で調製した洗浄液をそのまま使用した。
【０１４８】
（４）酵素標識抗体
前記実施例１の１の（４）の酵素標識抗体をそのまま使用した。
【０１４９】
（５）発色液
前記実施例１の１の（５）の酵素標識抗体をそのまま使用した。
【０１５０】
２．試料
（１）抗ＧＭ１抗体陽性血清
抗ＧＭ１抗体を含むことが確認されている６種類の血清を、抗ＧＭ１抗体陽性血清として用意した。
【０１５１】
３．試料中の抗糖脂質抗体の測定
（１）試料である本実施例の２の６種類の抗ＧＭ１抗体陽性血清を本実施例の１の（１）の４種類の試料希釈液により、それぞれ１００倍に希釈して混合液を調製した。
【０１５２】
（２）前記（１）で調製した混合液の各々を、本実施例の１の（２）のＧＭ１抗原固相化担体の各ウェルに１００μＬずつ分注し、これを４℃にて一晩静置した。
これにより、担体に固相化されているＧＭ１抗原と試料に含まれていた抗ＧＭ１抗体を接触させ、反応させた。
【０１５３】
（３）次に、前記のウェルより、前記の混合液を吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の洗浄液で洗浄した。
【０１５４】
（４）本実施例の１の（４）の酵素標識抗体を、１％ＢＳＡを含むトリス緩衝液で２，０００倍希釈した。次にこれを、前記（２）の洗浄操作を行ったウェルに１００μＬずつ分注して、室温で２時間反応させた。
【０１５５】
（５）その後、前記のウェルより、未結合の酵素標識抗体を吸引して除去した。そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の洗浄液で洗浄した。
【０１５６】
（６）次に、本実施例の１の（５）の発色液の１００μＬを、前記のウェルに分注し、室温で２０分間反応させた。
これにより、担体に固定化された標識酵素（ペルオキシダーゼ）と、発色液を反応させて、色素を生成させた。
【０１５７】
（７）前記の発色液の添加２０分後に、０．３５Ｍ硫酸の１００μＬを、前記のウェルに分注して、前記の反応を停止させた。
【０１５８】
（８）マイクロプレートリーダー〔６８０型〕（バイオラッド社）にて、前記のウェル中の液の吸光度（主波長：４５０ｎｍ、副波長：５５０ｎｍ）を測定して、吸光度測定値を得た。
【０１５９】
４．測定結果
これらの測定結果（吸光度測定値）を表３及び図３に示した。なお、表３において、かっこ内の数値は、各濃度の緩衝液を含有する試薬のイオン強度（ｍｏｌ／Ｌ）を示す。
【０１６０】
【表３】
0006733079.tif 000004
【０１６１】
５．考察
表３から明らかなように、緩衝液濃度が１００ｍＭ（すなわちイオン強度が０．３５６ｍｏｌ／Ｌ）の場合は、緩衝液濃度が５０ｍＭ（すなわちイオン強度が０．２２８ｍｏｌ／Ｌ）の場合に比較して、全ての試料で、測定により得られる測定値（吸光度）が減少してしまっていることが分かる。すなわち、シグナルの生成が大きく減少し、測定の感度が低下してしまっていることが分かる。
【０１６２】
これに対して、緩衝液濃度が１０ｍＭ（すなわちイオン強度が０．１２６ｍｏｌ／Ｌ）の場合は、緩衝液濃度が５０ｍＭ（すなわちイオン強度が０．２２８ｍｏｌ／Ｌ）の場合に比較して、測定により得られる測定値（吸光度）の減少が小さくなっており、生成するシグナルの増加、すなわち測定の感度が上昇していることが分かる。
【０１６３】
更に、緩衝液濃度が５ｍＭ（すなわちイオン強度が０．１１３ｍｏｌ／Ｌ）の場合は、緩衝液濃度が５０ｍＭ（すなわちイオン強度が０．２２８ｍｏｌ／Ｌ）の場合に比較して、測定により得られる測定値（吸光度）は、いずれも減少しておらず、生成するシグナルの増加、すなわち測定の感度の上昇が顕著であることが分かる。
【０１６４】
これらのことより、試料中の抗糖脂質抗体を、糖脂質抗原と抗原抗体反応させることにより測定する測定試薬及び測定方法において、イオン強度を０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下にすることにより、試料中の抗糖脂質抗体を感度高く測定できることが確かめられた。また、本発明におけるイオン強度は、測定反応時に存在している緩衝剤のイオン強度を含めたトータルのイオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下となっていればよいことが確かめられた。
よって、本発明の試料中の抗糖脂質抗体測定試薬及び測定方法は、生成するシグナルの減少を防ぎ、測定の感度を上昇させ、正確な測定結果を得ることができることが確かめられた。
【０１６５】
〔実施例４〕（異なるイオン強度での抗糖脂質抗体の測定）
緩衝液の濃度を変え、標識免疫測定法により試料中の抗ＧＭ１抗体（抗糖脂質抗体）の測定を行った。
【０１６６】
１．試薬の調製
【０１６７】
（１）試料希釈液の調製
５ｍＭ、１０ｍＭ、５０ｍＭ及び１００ｍＭのトリス緩衝液〔ｐＨ７．５〕に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を１％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウムを１００ｍＭとなるように添加し、緩衝液濃度の異なる４種類の試料希釈液の調製を行った。
【０１６８】
（２）ＧＭ１抗原固相化担体の調製
前記実施例１の１の（２）で調製したＧＭ１抗原固相化担体をそのまま使用した。
【０１６９】
（３）洗浄液の調製
前記実施例１の１の（３）で調製した洗浄液をそのまま使用した。
【０１７０】
（４）酵素標識抗体
前記実施例１の１の（４）の酵素標識抗体をそのまま使用した。
【０１７１】
（５）発色液
前記実施例１の１の（５）の発色液をそのまま使用した。
【０１７２】
２．試料
（１）抗ＧＭ１抗体陽性血清
前記実施例３の２の試料をそのまま使用した。
【０１７３】
３．試料中の抗糖脂質抗体の測定
（１）試料である本実施例の２の６種類の抗ＧＭ１抗体陽性血清を本実施例の１の（１）の４種類の試料希釈液により、それぞれ１００倍に希釈して混合液を調製した。
【０１７４】
試料希釈液として、本実施例の１の（１）の４種類の試料希釈液を用いる以外は実施例３の３の（１）〜（８）と同様にして試料中の抗ＧＭ１抗体の測定を行った。
【０１７５】
４．測定結果
これらの測定結果（吸光度測定値）を表４及び図４に示した。なお、表４において、かっこ内の数値は、各濃度の緩衝液を含有する試薬のイオン強度（ｍｏｌ／Ｌ）を示す。
【０１７６】
【表４】
0006733079.tif 000005
【０１７７】
５．考察
表４から明らかなように、緩衝液濃度が１００ｍＭ（すなわちイオン強度が０．１８０ｍｏｌ／Ｌ）の場合は、緩衝液濃度が５０ｍＭ（すなわちイオン強度が０．１４０ｍｏｌ／Ｌ）の場合に比較して、全ての試料で、測定により得られる測定値（吸光度）が減少してしまっていることが分かる。すなわち、シグナルの生成が大きく減少し、測定の感度が低下してしまっていることが分かる。
【０１７８】
これに対して、緩衝液濃度が１０ｍＭ（すなわちイオン強度が０．１０８ｍｏｌ／Ｌ）の場合は、緩衝液濃度が５０ｍＭ（すなわちイオン強度が０．１４０ｍｏｌ／Ｌ）の場合に比較して、測定により得られる測定値（吸光度）の減少が小さくなっており、生成するシグナルの増加、すなわち測定の感度が上昇していることが分かる。
【０１７９】
更に、緩衝液濃度が５ｍＭ（すなわちイオン強度が０．１０４ｍｏｌ／Ｌ）の場合は、緩衝液濃度が５０ｍＭ（すなわちイオン強度が０．１４０ｍｏｌ／Ｌ）の場合に比較して、測定により得られる測定値（吸光度）は、いずれも減少しておらず、生成するシグナルの増加、すなわち測定の感度の上昇が顕著であることが分かる。
【０１８０】
これらのことより、試料中の抗糖脂質抗体を、糖脂質抗原と抗原抗体反応させることにより測定する測定試薬及び測定方法において、イオン強度を０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下にすることにより、試料中の抗糖脂質抗体を感度高く測定できることが確かめられた。また、本発明におけるイオン強度は、測定反応時に存在している緩衝剤のイオン強度を含めたトータルのイオン強度が０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下となっていればよいことが確かめられた。
よって、本発明の試料中の抗糖脂質抗体測定試薬及び測定方法は、生成するシグナルの減少を防ぎ、測定の感度を上昇させ、正確な測定結果を得ることができることが確かめられた。
【０１８１】
〔実施例５〕（異なるイオン強度での抗糖脂質抗体の測定）
塩化ナトリウム濃度を変えることによりイオン強度を変え、標識免疫測定法により試料中の抗ＧＤ１ａ抗体（抗糖脂質抗体）の測定を行った。
【０１８２】
１．試薬の調製
【０１８３】
（１）試料希釈液の調製
前記実施例１の１の（１）で調製した試料希釈液をそのまま使用した。
【０１８４】
（２）ＧＤ１ａ抗原固相化担体の調製
ガングリオシドＧＤ１ａ（シグマ社）を１ウェル当たり２００ｎｇずつポリスチレンプレート〔ＰｏｌｙＳｏｒｐ〕（ヌンク社）のウェルに分注し、一定時間放置して、前記ガングリオシドＧＤ１ａを前記ポリスチレンプレートの各ウェルに固相化した。
【０１８５】
次に、このガングリオシドＧＤ１ａが固相化されたウェル内の液を除去した後、このウェルに１．５％ＢＳＡ溶液（ｐＨ７．７）を１ウェル当たり２００μＬずつ分注し、一定時間放置してブロッキング処理を行い、ＧＤ１ａ抗原固相化担体を調製した。
【０１８６】
（３）洗浄液の調製
前記実施例１の１の（３）で調製した洗浄液をそのまま使用した。
【０１８７】
（４）酵素標識抗体
前記実施例１の１の（４）の酵素標識抗体をそのまま使用した。
【０１８８】
（５）発色液
前記実施例１の１の（５）の発色液をそのまま使用した。
【０１８９】
２．試料
抗ＧＤ１ａ抗体陽性血清：
抗ＧＤ１ａ抗体を含むことが確認されている３種類の血清を、抗ＧＤ１ａ抗体陽性血清として用意した。
【０１９０】
３．試料中の抗糖脂質抗体の測定
（１）試料である本実施例の２の３種類の抗ＧＤ１ａ抗体陽性血清を本実施例の１の（１）の４種類の試料希釈液により、それぞれ１００倍に希釈して混合液を調製した。
【０１９１】
（２）前記（１）で調製した４種類の混合液の各々を、本実施例の（２）のＧＤ１ａ抗原固相化担体の各ウェルに１００μＬずつ分注し、これを４℃にて一晩静置した。
これにより、担体に固相化されているＧＤ１ａ抗原と試料に含まれていた抗ＧＤ１ａ抗体を接触させ、反応させた。
【０１９２】
（３）次に、前記のウェルより、前記の混合液を吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の洗浄液で洗浄した。
【０１９３】
（４）本実施例の１の（４）の酵素標識抗体を、１％ＢＳＡを含むトリス緩衝液で２，０００倍希釈した。次にこれを、前記の洗浄操作を行ったウェルに１００μＬずつ分注して、室温で２時間反応させた。
【０１９４】
（５）その後、前記のウェルより、未結合の酵素標識抗体を吸引して除去した。そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の洗浄液で洗浄した。
【０１９５】
（６）次に、本実施例の１の（５）の発色液の１００μＬを、前記のウェルに分注し、室温で２０分間反応させた。
これにより、担体に固定化された標識酵素（ペルオキシダーゼ）と、発色液を反応させて、色素を生成させた。
【０１９６】
（７）前記の発色液の添加２０分後に、０．３５Ｍ硫酸の１００μＬを、前記のウェルに分注して、前記の反応を停止させた。
【０１９７】
（８）マイクロプレートリーダー〔６８０型〕（バイオラッド社）にて、前記のウェル中の液の吸光度（主波長：４５０ｎｍ、副波長：５５０ｎｍ）を測定して、吸光度測定値を得た。
【０１９８】
４．測定結果
これらの測定結果（吸光度測定値）を表５及び図５に示した。なお、表５において、かっこ内の数値は、各濃度の塩化ナトリウムを含有する試薬のイオン強度（ｍｏｌ／Ｌ）を示す。
【０１９９】
【表５】
0006733079.tif 000006
【０２００】
５．考察
表５から明らかなように、塩化ナトリウム濃度が２００ｍＭ（すなわちイオン強度が０．２２６ｍｏｌ／Ｌ）の場合は、塩化ナトリウム濃度が１５０ｍＭ（すなわちイオン強度が０．１７６ｍｏｌ／Ｌ）の場合に比較して、全ての試料で、測定により得られる測定値（吸光度）が減少してしまっていることが分かる。すなわち、シグナルの生成が大きく減少し、測定の感度が低下してしまっていることが分かる。
【０２０１】
これに対して、塩化ナトリウム濃度が１００ｍＭ（すなわちイオン強度が０．１２６ｍｏｌ／Ｌ）の場合は、塩化ナトリウム濃度が１５０ｍＭ（すなわちイオン強度が０．１７６ｍｏｌ／Ｌ）の場合に比較して、測定により得られる測定値（吸光度）の減少が小さくなっており、生成するシグナルの増加、すなわち測定の感度が上昇していることが分かる。
【０２０２】
また、塩化ナトリウム濃度が５０ｍＭ（すなわちイオン強度が０．０７６ｍｏｌ／Ｌ）の場合は、塩化ナトリウム濃度が１５０ｍＭ（すなわちイオン強度が０．１７６ｍｏｌ／Ｌ）の場合に比較して、測定により得られる測定値（吸光度）は、いずれも減少しておらず、生成するシグナルの増加、すなわち測定の感度の上昇が顕著であることが分かる。
【０２０３】
これらのことより、試料中の抗糖脂質抗体を、糖脂質抗原と抗原抗体反応させることにより測定する測定試薬及び測定方法において、イオン強度を０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下にすることにより、試料中の抗糖脂質抗体を感度高く測定できることが確かめられた。
よって、本発明の試料中の抗糖脂質抗体測定試薬及び測定方法は、生成するシグナルの減少を防ぎ、測定の感度を上昇させ、正確な測定結果を得ることができることが確かめられた。
【０２０４】
〔実施例６〕（異なるイオン強度での抗糖脂質抗体の測定）
塩化ナトリウム濃度を変えることによりイオン強度を変え、標識免疫測定法により試料中の抗ＧＤ１ｂ抗体（抗糖脂質抗体）の測定を行った。
【０２０５】
１．試薬の調製
【０２０６】
（１）試料希釈液の調製
前記実施例１の１の（１）で調製した試料希釈液をそのまま使用した。
【０２０７】
（２）ＧＤ１ｂ抗原固相化担体の調製
ガングリオシドＧＤ１ｂ（シグマ社）を１ウェル当たり２００ｎｇずつポリスチレンプレート〔ＰｏｌｙＳｏｒｐ〕（ヌンク社）のウェルに分注し、一定時間放置して、前記ガングリオシドＧＤ１ｂを前記ポリスチレンプレートの各ウェルに固相化した。
【０２０８】
次に、このガングリオシドＧＤ１ｂが固相化されたウェルに１．５％ＢＳＡ溶液（ｐＨ７．７）を１ウェル当たり２００μＬずつ分注し、一定時間放置してブロッキング処理を行い、ＧＤ１ｂ抗原固相化担体を調製した。
【０２０９】
（３）洗浄液の調製
前記実施例１の１の（３）で調製した洗浄液をそのまま使用した。
【０２１０】
（４）酵素標識抗体
前記実施例１の１の（４）の酵素標識抗体をそのまま使用した。
【０２１１】
（５）発色液
前記実施例１の１の（５）の発色液をそのまま使用した。
【０２１２】
２．試料
抗ＧＤ１ｂ抗体陽性血清：
抗ＧＤ１ｂ抗体を含むことが確認されている２種類の血清を、抗ＧＤ１ｂ抗体陽性血清として用意した。
【０２１３】
３．試料中の抗糖脂質抗体の測定
（１）試料である本実施例の２の２種類の抗ＧＤ１ｂ抗体陽性血清を本実施例の１の（１）の４種類の試料希釈液により、それぞれ１００倍に希釈して混合液を調製した。
【０２１４】
（２）前記（１）で調製した混合液の各々を、本実施例の１の（２）のＧＤ１ｂ抗原固相化担体の各ウェルに１００μＬずつ分注し、これを４℃にて一晩静置した。
これにより、担体に固相化されているＧＤ１ｂ抗原と試料に含まれていた抗ＧＤ１ｂ抗体を接触させ、反応させた。
【０２１５】
（３）次に、前記のウェルより、前記の混合液を吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の洗浄液で洗浄した。
【０２１６】
（４）本実施例の１の（４）の酵素標識抗体を、１％ＢＳＡを含むトリス緩衝液で２，０００倍希釈した。次にこれを、前記の洗浄操作を行ったウェルに１００μＬずつ分注して、室温で２時間反応させた。
【０２１７】
（５）その後、前記のウェルより、未結合の酵素標識抗体を吸引して除去した。そして、このウェルを、本実施例の１の（３）の洗浄液で洗浄した。
【０２１８】
（６）次に、本実施例の１の（５）の発色液の１００μＬを、前記のウェルに分注し、室温で２０分間反応させた。
これにより、担体に固定化された標識酵素（ペルオキシダーゼ）と、発色液を反応させて、色素を生成させた。
【０２１９】
（７）前記の発色液の添加２０分後に、０．３５Ｍ硫酸の１００μＬを、前記のウェルに分注して、前記の反応を停止させた。
【０２２０】
（８）マイクロプレートリーダー〔６８０型〕（バイオラッド社）にて、前記のウェル中の液の吸光度（主波長：４５０ｎｍ、副波長：５５０ｎｍ）を測定して、吸光度測定値を得た。
【０２２１】
４．測定結果
これらの測定結果（吸光度測定値）を表６及び図６に示した。なお、表６において、かっこ内の数値は、各濃度の塩化ナトリウムを含有する試薬のイオン強度（ｍｏｌ／Ｌ）を示す。
【０２２２】
【表６】
0006733079.tif 000007
【０２２３】
５．考察
表６から明らかなように、塩化ナトリウム濃度が２００ｍＭ（すなわちイオン強度が０．２２６ｍｏｌ／Ｌ）の場合は、塩化ナトリウム濃度が１５０ｍＭ（すなわちイオン強度が０．１７６ｍｏｌ／Ｌ）の場合に比較して、いずれの試料も、測定により得られる測定値（吸光度）が減少してしまっていることが分かる。すなわち、シグナルの生成が大きく減少し、測定の感度が低下してしまっていることが分かる。
【０２２４】
これに対して、塩化ナトリウム濃度が１００ｍＭ（すなわちイオン強度が０．１２６ｍｏｌ／Ｌ）の場合は、塩化ナトリウム濃度が１５０ｍＭ（すなわちイオン強度が０．１７６ｍｏｌ／Ｌ）の場合に比較して、測定により得られる測定値（吸光度）の減少が小さくなっており、生成するシグナルの増加、すなわち測定の感度が上昇していることが分かる。
【０２２５】
また、塩化ナトリウム濃度が５０ｍＭ（すなわちイオン強度が０．０７６ｍｏｌ／Ｌ）の場合は、塩化ナトリウム濃度が１５０ｍＭ（すなわちイオン強度が０．１７６ｍｏｌ／Ｌ）の場合に比較して、測定により得られる測定値（吸光度）は、いずれも減少しておらず、生成するシグナルの増加、すなわち測定の感度の上昇が顕著であることが分かる。
【０２２６】
これらのことより、試料中の抗糖脂質抗体を、糖脂質抗原と抗原抗体反応させることにより測定する測定試薬及び測定方法において、イオン強度を０．１７ｍｏｌ／Ｌ以下にすることにより、試料中の抗糖脂質抗体を感度高く測定できることが確かめられた。
よって、本発明の試料中の抗糖脂質抗体測定試薬及び測定方法は、生成するシグナルの減少を防ぎ、測定の感度を上昇させ、正確な測定結果を得ることができることが確かめられた。
【図１】
0006733079.tif 000008
【図２】
0006733079.tif 000009
【図３】
0006733079.tif 000010
【図４】
0006733079.tif 000011
【図５】
0006733079.tif 000012
【図６】
0006733079.tif 000013