(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞に対して活性な細胞毒性剤の産生体を特定するために変異原核細胞をスクリーニングするための方法であって
（ａ）産生体原核種の細胞を用意するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の細胞を活性化トランスポゾン（ＴｎＡ）でトランスポゾン変異生成することにより変異産生体細胞のプールを生成するステップであり、ここで前記ＴｎＡは、前記産生体細胞のＤＮＡにおけるその挿入部位又は近傍で遺伝子の転写を増加させることができる外向きプロモーター（ＴｎＡＰ）を含んでいる、ステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）のプールの個々のメンバーを、非混和性キャリア液体に懸濁されたある体積の水性増殖培地を含む微小液滴で１つ又は複数の標的細胞と共封入し、それにより、単一変異産生体細胞と１つ又は複数の標的細胞とをそれぞれ含む微小液滴のライブラリを生成するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の微小液滴ライブラリを、前記単一の変異産生体細胞と（１つ又は複数の）標的細胞との共培養に適切な条件下でインキュベートして微小培養物のライブラリを作製するステップであって、それによって、前記（１つ又は複数の）標的細胞に対して活性な細胞毒性剤を産生する変異産生体細胞が各微小培養物において標的細胞の増殖を追い越すステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の微小培養物のライブラリを、標的細胞が変異産生体細胞により増殖が追い越されているか又は圧倒されて消滅している微小培養物についてスクリーニングするステップと
を含む方法。
【請求項２】
標的細胞が変異産生体細胞により増殖が追い越されているか又は圧倒されて消滅している微小液滴における変異産生体細胞のＤＮＡをシーケンシングするステップをさらに含み、任意に、
（ｉ）前記ＴｎＡの挿入部位に隣接する又は近傍のＤＮＡが、例えば、トランスポゾン−細胞ＤＮＡジャンクションの選択的増幅を含むシーケンシングによって、配列決定され、並びに／或いは、
（ｉｉ）前記シーケンシングが、例えば、（ａ）逐次合成シーケンシング（ＳＢＳ）バイオケミストリー、及び／又は（ｂ）ナノポアシーケンシング、及び／又は（ｃ）トンネル電流シーケンシング、及び／又は（ｄ）パイロシーケンシング、及び／又は（ｅ）ライゲーションによるシーケンシング（ＳＯＬｉＤシーケンシング）、及び／又は（ｆ）イオン半導体、及び／又は（ｇ）質量分析シーケンシングから選択されるハイスループット超並列シーケンシングを含み、並びに／或いは、
（ｉｉｉ）前記ＴｎＡ挿入部位に隣接する又は近傍のＤＮＡの、約２５、５０、７５、１００又は１００を超える塩基対が配列決定され、並びに／或いは、
（ｉｖ）前記配列決定されるＤＮＡが、前記ＴｎＡ挿入部位に対して５’及び／又は３’である、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標的細胞が変異産生体細胞により増殖が追い越されているか又は圧倒されて消滅している微小液滴における変異産生体細胞のＴｎＡＰにより産生されたｍＲＮＡ転写物をシーケンシングして、ｍＲＮＡ転写プロファイルを作成するステップをさらに含み、任意に、
前記ｍＲＮＡ転写プロファイルが、
（ａ）ＴｎＡＰによって産生される前記ｍＲＮＡ転写物の配列、並びに／又は
（ｂ）ＴｎＡＰによって産生されるｍＲＮＡ転写物の開始及び終結、並びに／又は
（ｃ）ＴｎＡＰによって産生される前記ｍＲＮＡ転写物の長さ、並びに／又は
（ｄ）ＴｎＡＰによって産生される前記ｍＲＮＡ転写物の相対的存在量、並びに／又は
（ｅ）細胞ＤＮＡの転写部位、並びに／又は
（ｆ）ＴｎＡＰによって産生される前記ｍＲＮＡ転写物が、細胞ＤＮＡに関してセンス若しくはアンチセンスであるか、並びに／又は
（ｇ）ＴｎＡＰによって産生される前記ｍＲＮＡ転写物が、細胞ＤＮＡに関してＯＲＦに相当するか、並びに／又は
（ｈ）ＴｎＡＰによって産生される前記ｍＲＮＡ転写物が、原核タンパク質及び／若しくはタンパク質ドメインをコードしているか
の決定を含む、
請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）前記微小液滴が、実質的に球状であり、（ａ）１０μｍ〜５００μｍ、（ｂ）１０μｍ〜２００μｍ、（ｃ）１０μｍ〜１５０μｍ、（ｄ）１０μｍ〜１００μｍ、（ｅ）１０μｍ〜５０μｍ、又は（ｆ）約１００μｍの直径を有し、並びに／或いは、
（ｂ）前記微小液滴が、ゲル状態又は液体状態のある体積の水性増殖培地を含み、並びに／或いは、
（ｃ）前記微小液滴が、油外殻で包まれた水性増殖培地の内核と、連続水性相であるキャリア液体とを含み、任意に、
前記水性内核が、（ａ）１０μｍ〜５００μｍ、（ｂ）１０μｍ〜２００μｍ、（ｃ）１０μｍ〜１５０μｍ、（ｄ）１０μｍ〜１００μｍ、（ｅ）１０μｍ〜５０μｍ、若しくは（ｆ）約１００μｍの直径を有し、及び／又は、
前記油外殻が、（ａ）１０μｍ〜２００μｍ、（ｂ）１０μｍ〜２００μｍ、（ｃ）１０μｍ〜１５０μｍ、（ｄ）１０μｍ〜１００μｍ、（ｅ）１０μｍ〜５０μｍ、若しくは（ｆ）約１００μｍの厚さを有する、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記キャリア液体が、水非混和性液体であり、任意に、
（ｉ）、前記水非混和性液体が、油、例えば、（ａ）炭化水素油、（ｂ）フルオロカーボン油、（ｃ）エステル油、（ｄ）水性相の生物学的成分に対して低い溶解度を有する油、（ｅ）微小液滴間の分子拡散を阻害する油、（ｆ）疎水性及び疎油性である油、（ｇ）気体への良好な溶解度を有する油、及び／又は（ｈ）それらの任意の２種以上の組み合わせから選択される油であり、並びに／或いは、
（ｉｉ）前記微小液滴が、前記微小液滴が水性分散相を構成し、前記キャリア液体が連続油相を構成しているＷ／Ｏエマルジョンに含まれている、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記キャリア液体が、例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である、水性液体であり、並びに、
前記微小液滴が任意に、Ｗ／Ｏ／Ｗダブルエマルジョンに含まれ、ここで前記微小液滴が、（ａ）分散相としての油外殻で包まれた水性増殖培地の内核と、（ｂ）連続水性相としての前記キャリア液体とを含んでいる、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記微小液滴がエマルジョンに含まれ、ここで前記キャリア液体が連続相を構成し、前記微小液滴が分散相を構成し、前記エマルジョンがさらに界面活性剤及び任意選択で補助界面活性剤を含んでおり、任意に、
（ａ）前記界面活性剤及び／又は前記補助界面活性剤が、分散相と連続相との界面に位置しており、並びに／或いは、
（ｂ）前記微小液滴が、請求項６に記載のＷ／Ｏ／Ｗダブルエマルジョンに含まれ、前記界面活性剤及び／又は前記補助界面活性剤が、水性核と油殻との界面に位置しており、並びに／或いは、
（ｃ）前記界面活性剤及び／又は前記補助界面活性剤が、非イオン性頭部基を有するフルオロ界面活性剤を含んでおり、並びに／或いは、
（ｄ）前記界面活性剤及び／又は前記補助界面活性剤が、パーフルオロポリエーテル（ＰＦＰＥ）を含んでおり、並びに／或いは、
（ｅ）前記界面活性剤及び／又は前記補助界面活性剤が、ＰＦＰＥ−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ブロック共重合体を含んでおり、前記ＰＦＰＥ−ＰＥＧブロック共重合体が、例えば、ジブロック又はトリブロック共重合体、例えば、ＰＦＰＥ−ＰＥＧ−ＰＦＰＥトリブロック共重合体である、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記微小液滴が、単分散されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
（Ａ）前記共封入ステップ（ｃ）が、水非混和性液体に分散された水性増殖培地の微小液滴を含むＷ／Ｏ型シングルエマルジョンが形成される条件下、（ａ）変異産生体細胞のプール、（ｂ）標的細胞の集団、（ｃ）水性増殖培地、（ｄ）水非混和性液体、例えば請求項５に記載の油、及び（ｅ）界面活性剤、例えば、請求項７に記載の界面活性剤を混合することを含み、任意に、
前記インキュベートステップ（ｄ）の後に、水性キャリア液体、例えば請求項６に記載の水性キャリア液体を、水非混和性液体で包まれ水性キャリア液体に分散された水性増殖培地の微小液滴を含むＷ／Ｏ／Ｗダブルエマルジョンが形成される条件下、ステップ（ｃ）のシングルエマルジョンと混合することを含み、
或いは
（Ｂ）前記共封入ステップ（ｃ）が、水非混和性液体で包まれ水性キャリア液体に分散された水性増殖培地の微小液滴を含むＷ／Ｏ／Ｗダブルエマルジョンが形成される条件下、（ａ）変異産生体細胞のプール、（ｂ）標的細胞の集団、（ｃ）水性増殖培地、（ｄ）水非混和性液体、例えば請求項５に記載の油、（ｅ）界面活性剤、例えば、請求項７に記載の界面活性剤、及び（ｆ）水性キャリア液体、例えば請求項６に記載の水性キャリア液体を混合することを含み、任意に、
前記混合が、（ａ）ボルテックス及び／若しくは（ｂ）超音波処理、（ｃ）均質化、（ｄ）ピコインジェクション及び／若しくは（ｅ）フロー集束を含み、並びに／又は、
前記共封入ステップ（ｃ）が、（１つ又は複数の）変異産生体細胞及び／若しくは標的細胞を含まない空の微小液滴を除去することをさらに含み、例えば、前記変異産生体細胞及び／若しくは前記標的細胞が蛍光標識され、空の微小液滴がＦＡＤＳによって除去される、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記インキュベートステップ（ｄ）が、前記微小液滴ライブラリを１５℃〜９５℃の温度で少なくとも１時間維持することを含み、任意に、
（ａ）前記微小液滴ライブラリが、（ｉ）１５℃〜４２℃、（ｉｉ）２０℃〜４０℃、（ｉｉｉ）２０℃〜３７℃、（ｉｖ）２０℃〜３０℃、又は（ｖ）約２５℃、（ｖｉ）４０℃〜６０℃、（ｖｉｉ）６０℃〜８０℃、又は（ｖｉｉｉ）８０℃〜９８℃の温度で維持されており、
（ｂ）前記インキュベートステップ（ｄ）が、前記微小液滴ライブラリを、前記温度で、約２、４、６、１２、２４若しくは４８時間、又は、最長７日間、例えば１、２、３、４、５、６若しくは７日間、維持することを含み、
（ｃ）前記インキュベートステップ（ｄ）が、前記微小液滴ライブラリを、前記温度で、最長２週間、例えば、１週間又は２週間、維持することを含む、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）前記スクリーニングステップ（ｅ）が、（ｉ）標的細胞を含有する微小液滴を除去することを含み、任意に、前記標的細胞が蛍光標識され、前記標的細胞を含有する微小液滴がＦＡＤＳによって除去され、及び／又は、（ｉｉ）標的細胞が変異産生体細胞により増殖が追い越されているか又は圧倒されて消滅している微小液滴についてのＦＡＤＳ選別を含み、並びに／或いは、
（ｂ）前記方法が、前記インキュベートステップ（ｄ）の間に実施される効力解析ステップであって、変異産生体細胞と標的細胞との共培養における相対増殖速度が決定されるステップをさらに含み、任意に、（ｉ）前記効力解析ステップが、変異産生体細胞のみを含有する微小液滴のＦＡＤＳによる選択を含み、例えば、２回以上の連続的ラウンドのＦＡＤＳ選択が、インキュベーションの間に実施され、及び／又は、（ｉｉ）前記標的細胞が蛍光標識され、前記標的細胞を含有する微小液滴が連続的にインキュベーションにかけられる、
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
（Ａ）前記産生体原核種が、古細菌から選択され、例えば、（ａ）クレン古細菌門、（ｂ）ユリ古細菌門、（ｃ）コル古細菌門、（ｄ）ナノ古細菌門、及び（ｅ）タウム古細菌門、例えばハロフェラックス・ボルカニ若しくはスルホロブスｓｐｐ．の門から選択され、及び／又は、
前記産生体原核種が、細菌から選択され、例えば、（ａ）放線菌類、（ｂ）シュードモナスｓｐｐ．、及び（ｃ）バチルスｓｐｐ．から選択され、任意に、ストレプトマイセスｓｐｐ．、例えば、ストレプトマイセス・セリカラー、ストレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマイセス・ベネズエラ、ストレプトマイセス・グリセウス、ストレプトマイセス・エバミティリス、ストレプトマイセス・ビンチェンジェンシス、クツネリア・アルビダ、サッカロポリスポラ・エリスラエア、マイコバクテリウム・マリナム、バチルス・アミロリケファシエンス亜種プランタルム、及びミクロモノスポラ・エキノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）から選択され、並びに／或いは、
（Ｂ）前記標的細胞が、細菌又は真核細胞であり、任意に、真菌、哺乳動物、高等植物細胞、原生動物、蠕虫細胞、藻類、若しくは無脊椎動物細胞であり、例えば、がん細胞、例えば、ヒトがん細胞であり、又は、例えば、シュードモナス・エルギノーサ、アシネトバクター・バウマンニ、大腸菌、クレブシエラ・ニューモニアエ、スタフィロコッカス・アウレウス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・ファエカリス、及びエンテロバクターｓｐｐ．から選択される病原性細菌である、
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
（Ａ）ステップ（ｃ）の変異産生体細胞及び／若しくは（１つ又は複数の）標的細胞が、例えば蛍光標識で標識されており、及び／又は、前記スクリーニングステップ（ｅ）が、ＦＡＤＳを含み、並びに／或いは、
（Ｂ）前記変異産生体細胞のプールが、（ａ）少なくとも０．５×１０５変異体、例えば、少なくとも１×１０５変異体、（ｂ）少なくとも５×１０５変異体、（ｃ）少なくとも１×１０６変異体、（ｄ）０．５×１０６〜２×１０６変異体、（ｅ）約１×１０６変異体、又は（ｆ）最大１０×１０６変異体を含み、並びに／或いは、
（Ｃ）前記トランスポゾン変異生成ステップ（ｂ）が、（ａ）細菌ＤＮＡの５０塩基対あたり少なくとも１つのトランスポゾン、（ｂ）細菌ＤＮＡの３０塩基対あたり少なくとも１つのトランスポゾン、（ｃ）細菌ＤＮＡの２５塩基対あたり少なくとも１つのトランスポゾン、（ｄ）細菌ＤＮＡの１５塩基対あたり少なくとも１つのトランスポゾン、（ｅ）細菌ＤＮＡの１０塩基対あたり少なくとも１つのトランスポゾン、又は（ｆ）細菌ＤＮＡの５塩基対あたり少なくとも１つのトランスポゾンの挿入率を生じ、並びに／或いは、
（Ｄ）前記トランスポゾン変異生成ステップ（ｂ）が、ＴｎＡを、前記産生体原核種の細胞の（ａ）染色体（ゲノム）ＤＮＡ、（ｂ）プラスミドＤＮＡ、又は（ｃ）染色体（ゲノム）及びプラスミドＤＮＡの混合物に挿入することを含み、並びに／或いは、
（Ｅ）ステップ（ｂ）のトランスポゾン変異がｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで起こり、並びに／或いは、
（Ｆ）前記細胞毒性剤が、（ａ）抗生物質、（ｂ）抗悪性腫瘍剤、及び（ｃ）抗真菌剤から選択され、並びに／或いは、
（Ｇ）ステップ（ｂ）において、前記産生体原核種の細胞ＤＮＡへのＴｎＡ挿入が、
（ａ）潜在性細胞毒性剤遺伝子若しくはオペロンの上流で起こり、そこでＴｎＡＰが、転写増加を駆動し、延いては前記潜在性細胞毒性剤遺伝子若しくは前記オペロンの発現を導く、
（ｂ）潜在性細胞毒性剤遺伝子若しくはオペロンの活性化因子の上流で起こり、そこでＴｎＡＰが、トランスに作用する活性化因子の転写増加を駆動し、前記潜在性細胞毒性剤遺伝子若しくは前記オペロンの発現を増加させる、
（ｃ）潜在性細胞毒性剤遺伝子若しくはオペロンの抑制因子を挿入により不活性化し、それにより前記潜在性細胞毒性剤遺伝子若しくは前記オペロンの発現を増加させる、
（ｄ）細胞毒性剤合成に関与する酵素の上流で起こり、そこでＴｎＡＰが前記酵素の転写増加を駆動し、延いては前記酵素の発現増加を導く、
（ｅ）細胞毒性剤が基質となる酵素を挿入により不活性化し、それにより、前記細胞毒性剤のレベルを増加させる、
（ｆ）細胞毒性剤を副活性として生じる酵素の上流で起こり、そこでＴｎＡＰが転写増加を駆動し、延いては前記酵素の発現増加を導き、それにより、副活性を増加させて、前記細胞毒性剤のレベルを増加させる、
（ｇ）マルチドメイン酵素の１つ若しくは複数のドメインを挿入により不活性化し、それによりその機能を変化させて、直接的に若しくは間接的に、細胞毒性剤を合成する、
（ｈ）マルチドメイン酵素の１つ若しくは複数のドメインの上流で起こり、そこで、ＴｎＡＰが、前記１つ若しくは複数のドメインの転写増加を駆動し、それにより、前記酵素の機能を変化させて、直接的に若しくは間接的に細胞毒性剤を合成する、又は
（ｉ）コーディングレパートリーを変化させて、細胞毒性剤を直接的に若しくは間接的に発現させる、
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
細胞毒性剤を特定する方法であって、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法により、標的細胞に対して活性な細胞毒性剤の産生体を特定するために変異細菌をスクリーニングすることを含む方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法を含み、任意に、前記細胞毒性剤を、変異細菌から合成又は単離することをさらに含み、そして任意に、合成された又は単離された前記細胞毒性剤を、薬学的に許容される賦形剤と混合して、医薬組成物を製造することをさらに含む、細胞毒性剤を産生するためのプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的細胞（例えば、病原性細菌及び腫瘍細胞）に対して活性な細胞毒性剤（例えば、抗生物質及び抗がん剤）の産生体を特定するために変異原核細胞をスクリーニングするための方法、並びに、そのようなスクリーニング方法を含む細胞毒性剤を特定する方法に関する。さらに本発明は、本発明の方法を含む、細胞毒性剤を産生するためのプロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌は、生理活性天然産物、例えば、抗生物質、抗がん剤、作物保護剤、及び免疫抑制物質の主要な源である。例えば、放線菌類、特にストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ｓｐｐ．は、医薬（例えば、抗生剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、抗血栓剤、免疫調節剤、抗がん剤及び酵素阻害剤）並びに農業（例えば、殺虫剤、除草剤、殺菌剤、並びに植物及び動物のための増殖促進物質）において有用な多くの生理活性二次代謝物の産生体である。医薬において重要な放線菌類由来抗生物質としては、アミノグリコシド、アントラサイクリン、クロラムフェニコール、マクロライド及びテトラサイクリンが挙げられ、一方でブレオマイシン、ドキソルビシン、ラパマイシン及びミトラマイシンなどの天然細菌産物は、重要な抗がん治療薬の基盤である。
【０００３】
しかしながら、新たな毒素の出現及び既存の抗微生物薬に対する耐性に対抗するために、新たな細胞毒性剤、特に抗生剤が緊急に必要とされており、一方、抗がん剤の範囲は拡大される必要がある。
【０００４】
細胞毒性剤の産生体についての従来的スクリーニングは、候補産生体の純粋な株を固体又は液体培地中で標的細胞に対する活性について試験することを含む。前者の場合には、遺伝子変異を有する個々の産生細菌を標的細胞の叢に蒔いてもよく、所望の細胞毒性剤を産生する細胞は、出現する変異体コロニーを取りまく阻害／排除ゾーンが現れることによって特定され得る。しかしながら、この技術は煩雑で、通常、哺乳動物標的細胞の場合は適用できず、ハイスループット選抜にも適さない。
【０００５】
液体培地中の変異体をスクリーニングすることは、細胞毒性化合物を産生する目的の変異体が非常に様々な増殖速度を示す可能性があり、回収される産生体変異体の多様性を大きく減少させ得るという事実により複雑である。さらに、細胞毒性化合物を産生する標的変異体は、「チーター（ｃｈｅａｔｅｒ）」、つまり標的変異産生体細胞によって産生される細胞毒性化合物に耐性であるがそれ自体は細胞毒性剤を産生しない（したがって、より高い増殖速度に反映される代謝的利点を享受する）変異体によって、増殖が圧倒される場合がある。
【０００６】
液体培養中の産生体変異体のスクリーニングに関連するさらなる問題が、目的の細胞毒性化合物が比較的低い濃度で産生され、バルクの液体培養培地により、実際上希薄化され得るという事実から生じる。したがって、変異産生体細胞から生じる貴重なシグナルが検出されない場合がある（又は、より強力な細胞毒性剤を分泌する変異産生体細胞の作用により不鮮明になり得る）。
【０００７】
したがって、新たな生理活性天然産物の開発の主要な課題となっているのは、多数の産生体細菌を選抜して、所望の活性を有する産物を巧みに作り上げる細菌を特定する必要性であり、相俟って、選抜される候補産生体生物のレベルで豊富な生物学的多様性を有する供給源を確保する必要性である。さらに、ハイスループット超並列選抜で使用することができ、広範囲の様々な標的細胞に対して非常に多数の様々な産生体細胞変異体が選抜され得る方法も必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の態様によれば、標的細胞に対して活性な細胞毒性剤の産生体を特定するために変異原核細胞をスクリーニングするための方法であって、
（ａ）産生体原核種の細胞を用意するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の細胞を活性化トランスポゾン（ＴｎＡ）でトランスポゾン変異生成することにより変異産生体細胞のプールを生成するステップであり、ここでＴｎＡは、前記産生体細胞のＤＮＡにおけるその挿入部位又は近傍で遺伝子の転写を増加させることができる外向きプロモーター（ＴｎＡＰ）を含んでいる、ステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）のプールの個々のメンバーを、非混和性キャリア液体に懸濁されたある体積の水性増殖培地を含む微小液滴で１つ又は複数の標的細胞と共封入し、それにより、単一変異産生体細胞と１つ又は複数の標的細胞とをそれぞれ含む微小液滴のライブラリを生成するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の微小液滴ライブラリを、単一の変異産生体細胞と（１つ又は複数の）標的細胞との共培養に適切な条件下でインキュベートして、微小培養物のライブラリを作製するステップであって、それによって、（１つ又は複数の）標的細胞に対して活性な細胞毒性剤を産生する変異産生体細胞が各微小培養物において標的細胞の増殖を追い越すステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の微小培養物のライブラリを、標的細胞が変異産生体細胞により増殖が追い越されているか又は圧倒されて消滅している微小培養物についてスクリーニングするステップと
を含む方法が提供される。
【０００９】
封入ステップは、各微小液滴が、変異体プールの単一メンバーを、２以上（例えば、約１０）の標的細胞と共に含有するように、実施することが好ましい。採用する封入プロセスに応じて、微小液滴ライブラリは、細胞含量が不均一であってもよく、一部の微小液滴が空であってもよい。しかしながら、全てで必要とされることは、封入により、変異体プール由来の単一変異産生体細胞を１つ又は複数の標的細胞と共に含有する少なくとも一部の微小液滴の回収がもたらされることである。
【００１０】
本発明の方法は、標的細胞が変異産生体細胞により殺傷されている及び／又は増殖を追い越されている微小培養物の濃縮が可能であり、続いて変異体細胞を単離し、解析して、その細胞毒性活性の基礎を特定し得る。この分析は比較的小さい体積で実施されるため、変異産生体細胞により産生される各細胞毒性化合物の効果は、培地の多大な体積による希釈作用及び／又は他の変異産生体細胞により産生される他の（おそらくはより強力な）細胞毒性剤による交絡作用を受けずに検出され得る。したがって、方法は、変異産生体細胞により生成されるシグナルに対する感度がより一層高い。
【００１１】
さらに、方法は、「チーター」、つまり標的変異産生体細胞によって産生される細胞毒性化合物に耐性であるがそれ自体は細胞毒性剤を産生しない（したがって、より高い増殖速度に反映される代謝的利点を享受する）変異体、の「スワンピング（ｓｗａｍｐｉｎｇ）」効果も回避する。そのような「チーター」は、本発明の封入ステップによって個々の産生体細胞変異体から有効に仕切られていないならば、増殖において圧倒し、細胞毒性剤の変異産生体により生成されるシグナルを実際上消滅させる。
【００１２】
方法は、標的細胞がインキュベーションステップ中に変異産生体細胞により増殖が追い越されているか又は圧倒されて消滅している微小液滴における変異産生体細胞のＤＮＡをシーケンシングするステップをさらに含んでもよい。そのような微小液滴は、様々な選別技術（下記参照）によって単離することができ、細胞は、任意の利便性のある方法で（例えば、界面活性剤、洗浄剤の添加により、超音波処理により、浸透圧ショックにより、又は機械的若しくは物理化学的手段により）、微小液滴から放出させることができる。
【００１３】
ＴｎＡの挿入部位に隣接する又は近傍のＤＮＡは、例えば、トランスポゾン−細胞ＤＮＡ連結部の選択的増幅を含む方法により、配列決定されることが好ましい。
【００１４】
好ましい実施形態では、シーケンシングは、ハイスループット超並列シーケンシングを含む。例えば、（ａ）逐次合成シーケンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ＳＢＳ）バイオケミストリー、及び／又は（ｂ）ナノポアシーケンシング、及び／又は（ｃ）トンネル電流シーケンシング、及び／又は（ｄ）パイロシーケンシング、及び／又は（ｅ）ライゲーションによるシーケンシング（ＳＯＬｉＤシーケンシング）、及び／又は（ｆ）イオン半導体、及び／又は（ｇ）質量分析シーケンシングから選択される、その種の任意のシーケンシングを利用し得る。
【００１５】
ＴｎＡ挿入部位に隣接する又は近傍のＤＮＡの約２５、５０、７５、１００又は１００を超える塩基対が配列決定されることが好ましい。配列決定されるＤＮＡは、ＴｎＡ挿入部位に対して、５’及び／又は３’であり得る。
【００１６】
本発明の方法は、標的細胞が変異産生体細胞により増殖が追い越されているか又は圧倒されて消滅している微小液滴における変異産生体細胞のＴｎＡＰにより産生されたｍＲＮＡ転写物をシーケンシングして、ｍＲＮＡ転写プロファイルを作成するステップをさらに含んでもよい。そのような実施形態では、ｍＲＮＡ転写プロファイルは、
（ａ）ＴｎＡＰによって産生される前記ｍＲＮＡ転写物の配列、並びに／又は
（ｂ）ＴｎＡＰによって産生されるｍＲＮＡ転写物の開始及び終結、並びに／又は
（ｃ）ＴｎＡＰによって産生される前記ｍＲＮＡ転写物の長さ、並びに／又は
（ｄ）ＴｎＡＰによって産生される前記ｍＲＮＡ転写物の相対的存在量、並びに／又は
（ｅ）細胞ＤＮＡの転写部位、並びに／又は
（ｆ）ＴｎＡＰによって産生されるｍＲＮＡ転写物が、細胞ＤＮＡに関してセンス若しくはアンチセンスであるか、並びに／又は
（ｇ）ＴｎＡＰによって産生されるｍＲＮＡ転写物が、細胞ＤＮＡに関してＯＲＦに相当するか、並びに／又は
（ｈ）ＴｎＡＰによって産生されるｍＲＮＡ転写物が、原核タンパク質及び／若しくはタンパク質ドメインをコードしているか
の決定を含む。
【００１７】
微小液滴のサイズは、封入される細胞（産生体及び標的の両方）の性質、並びにインキュベーションステップの間に達成される倍加の回数を参照して選択される。通常、微小液滴は、１０００個の細胞を支持するために十分な体積の増殖培地を提供するサイズである。したがって、微小液滴は、実質的に球状で、（ａ）１０μｍ〜５００μｍ、（ｂ）１０μｍ〜２００μｍ、（ｃ）１０μｍ〜１５０μｍ、（ｄ）１０μｍ〜１００μｍ、（ｅ）１０μｍ〜５０μｍ、又は（ｆ）約１００μｍの直径を有し得る。
【００１８】
微小液滴は、ゲル状態のある体積の水性増殖培地を含んでもよいが、好ましい実施形態では、液体状態のある体積の水性増殖培地を含む。そのような実施形態では、微小液滴は、油外殻で包まれた水性増殖培地の内核と、連続水性相であるキャリア液体とを含んでもよい。ここで、水性内核は、（ａ）１０μｍ〜５００μｍ、（ｂ）１０μｍ〜２００μｍ、（ｃ）１０μｍ〜１５０μｍ、（ｄ）１０μｍ〜１００μｍ、（ｅ）１０μｍ〜５０μｍ、又は（ｆ）約１００μｍの直径を有し、一方で、油外殻は、（ａ）１０μｍ〜２００μｍ、（ｂ）１０μｍ〜２００μｍ、（ｃ）１０μｍ〜１５０μｍ、（ｄ）１０μｍ〜１００μｍ、（ｅ）１０μｍ〜５０μｍ、又は（ｆ）約１００μｍの厚さを有する。
【００１９】
Ｗ／Ｏ型シングルエマルジョンにおいて、キャリア液体は、任意の水非混和性液体、例えば油であり得、任意選択で、（ａ）炭化水素油、（ｂ）フルオロカーボン油、（ｃ）エステル油、（ｄ）水性相の生物学的成分に低溶解度を有する油、（ｅ）微小液滴間の分子拡散を阻害する油、（ｆ）疎水性及び疎油性である油、（ｇ）気体への良好な溶解度を有する油、及び／又は（ｈ）それらの任意の２種以上の組み合わせから選択され得る。
【００２０】
したがって、微小液滴は、微小液滴が水性分散相を構成し、キャリア液体が連続油相を構成しているＷ／Ｏエマルジョンに含まれていてもよい。
【００２１】
他の実施形態では、微小液滴は、Ｗ／Ｏ／Ｗダブルエマルジョンに含まれ、キャリア液体は水性液体であり得る。そのような実施形態では、水性液体は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）であってもよい。
【００２２】
したがって、微小液滴は、Ｗ／Ｏ／Ｗダブルエマルジョンに含まれ、ここで微小液滴が、（ａ）分散相としての油外殻で包まれた水性増殖培地の内核と、（ｂ）連続水性相としてのキャリア液体とを含んでいてもよい。
【００２３】
微小液滴がエマルジョンに含まれる実施形態では、キャリア液体が連続相を構成し、微小液滴が分散相を構成していてもよく、そのような実施形態では、エマルジョンがさらに界面活性剤及び任意選択で補助界面活性剤を含んでいてもよい。
【００２４】
界面活性剤及び／又は補助界面活性剤は、分散相と連続相の界面に位置してもよく、微小液滴がＷ／Ｏ／Ｗダブルエマルジョンに含まれるとき、界面活性剤及び／又は補助界面活性剤は、水性核と油殻の界面及び油殻と連続外相の界面に位置してもよい。
【００２５】
微小液滴は、（本明細書で定義されるように）単分散されていてもよい。
【００２６】
共封入ステップは、水非混和性液体に分散された水性増殖培地の微小液滴を含むＷ／Ｏ型シングルエマルジョンが形成される条件下、（ｉ）変異産生体細胞のプール、（ｉｉ）標的細胞の集団、（ｉｉｉ）水性増殖培地、（ｉｖ）水非混和性液体、例えば本明細書に記載の油、及び（ｖ）界面活性剤、例えば本明細書に記載の界面活性剤を混合することを含んでもよい。
【００２７】
一部の実施形態では、上述のＷ／Ｏ型シングルエマルジョンが、インキュベーションステップに使用される。このことは、連続的油相が（例えば、培養中に放出される水溶性生理活性産物により媒介される培養物間相互作用を予防又は制限することによって）微小培養の区画化を改善する状況において好ましい場合がある。そのような実施形態では、後続の操作、スクリーニング（及び特に選別）は、インキュベーション後のさらなる乳化ステップ、つまり水性キャリア液体、例えば本明細書に記載の水性キャリア液体を、水非混和性液体で包まれ水性キャリア液体に分散された水性増殖培地の微小液滴を含むＷ／Ｏ／Ｗダブルエマルジョンが形成される条件下、インキュベーションステップに使用されたシングルエマルジョンと混合するステップにより、促進され得る。
【００２８】
共封入ステップ（ｃ）は、水非混和性液体で包まれ水性キャリア液体に分散された水性増殖培地の微小液滴を含むＷ／Ｏ／Ｗダブルエマルジョンが形成される条件下、（ａ）変異産生体細胞のプール、（ｂ）標的細胞の集団、（ｃ）水性増殖培地、（ｄ）水非混和性液体、例えば、本明細書に記載の油、（ｅ）界面活性剤、例えば本明細書に記載の界面活性剤、及び（ｆ）水性キャリア液体、例えば本明細書に記載の水性キャリア液体を混合することを含んでもよい。
【００２９】
任意の手段を、混合ステップのために利用し得る。例えば、このステップは、（ａ）ボルテックス及び／又は（ｂ）超音波処理、（ｃ）均質化、（ｄ）ピコインジェクション（ｐｉｃｏ−ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）及び／又は（ｅ）フロー集束を含み得る。
【００３０】
上記で説明するように、採用する封入プロセスに応じて、微小液滴ライブラリは、細胞含量が不均一であってもよく、一部の微小液滴が空であってもよい。そのような状況において、共封入ステップ（ｃ）は、（１つ又は複数の）変異産生体細胞及び／又は標的細胞を含まない空の微小液滴を除去することをさらに含んでもよい。このステップは、蛍光活性化液滴選別（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｓｏｒｔｉｎｇ、ＦＡＤＳ）により都合よく達成され、そのような実施形態では、産生体細胞及び／又は標的細胞は、蛍光標識されている。
【００３１】
インキュベーションステップ（ｄ）は、選択された産生体細胞及び標的細胞の性質を参照して選択された期間及び条件下で実施される。したがって、このステップは、微小液滴ライブラリを１５℃〜９５℃の温度で少なくとも１時間維持することを含み得る。一部の実施形態では、微小液滴ライブラリは、（ａ）１５℃〜４２℃、（ｂ）２０℃〜４０℃、（ｃ）２０℃〜３７℃、（ｄ）２０℃〜３０℃、又は（ｅ）約２５℃、（ｆ）４０℃〜６０℃、（ｇ）６０℃〜８０℃、又は（ｈ）８０℃〜９８℃の温度で維持される。
【００３２】
インキュベーションステップ（ｄ）は、微小液滴ライブラリを、前記温度で、約２、４、６、１２、２４若しくは４８時間、又は最長７日間、例えば１、２、３、４、５、６若しくは７日間、維持することを含んでもよい。他の実施形態では、インキュベーションステップ（ｄ）は、微小液滴ライブラリを、前記温度で、最長２週間、例えば、１週間又は２週間、維持することを含む。
【００３３】
スクリーニングステップ（ｅ）は、標的細胞を含有する微小液滴を除去することを含んでもよい。これは、ＦＡＤＳにより都合よく達成され、この場合に、標的細胞は、蛍光標識されていてもよい。このようにして、標的細胞の増殖を追い越した又は圧倒して標的細胞を消滅させた変異産生体細胞（又は耐性産生体細胞変異体と共培養した産生体細胞）のみを含有する液滴を、選別によって単離することができ、標的細胞と比較して細胞毒性剤を精巧に作り上げる変異産生体細胞を大きく濃縮することができる。
【００３４】
さらに方法は、インキュベーションステップ（ｄ）の間に実施される効力解析ステップであって、変異産生体細胞と標的細胞との共培養における相対増殖速度が決定されるステップをさらに含んでもよい。このステップは、変異産生体細胞のみを含有する微小液滴を、インキュベーションステップの間に、例えば異なる時間点で、ＦＡＤＳによりサンプリングすることを含んでもよい。したがって、産生される細胞毒性剤の効力に基づいて、様々な種類の産生体変異体を回収するために、２回以上の連続的ラウンドのＦＡＤＳ選択をインキュベーションの間に実施してもよい。そのような実施形態では、標的細胞は、蛍光標識されていてもよく、標的細胞を含有する微小液滴は、連続的にインキュベーションにかけられる。
【００３５】
したがって、スクリーニングステップ（ｅ）は、標的細胞が、変異産生体細胞により増殖が追い越されているか又は圧倒されて消滅している微小液滴についてのＦＡＤＳ選別を含むことが好ましい。
【００３６】
産生体原核種は、古細菌から選択され得、例えば、（ａ）クレン古細菌門（Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａ）、（ｂ）ユリ古細菌門（Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ）、（ｃ）コル古細菌門（Ｋｏｒａｒｃｈａｅｏｔａ）、（ｄ）ナノ古細菌門（Ｎａｎｏａｒｃｈａｅｏｔａ）、及び（ｅ）タウム古細菌（Ｔｈａｕｍａｒｃｈａｅｏｔａ）、例えば、ハロフェラックス・ボルカニ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ）又はスルホロブス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）ｓｐｐ．の門から選択され得る。代替的に、産生体原核種は、細菌から選択され得、例えば、（ａ）放線菌類、（ｂ）シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｓｐｐ．、及び（ｃ）バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐｐ．から選択され得る。
【００３７】
好ましい実施形態では、産生体細菌種は、ストレプトマイセスｓｐｐ．から選択され、例えば、（ａ）ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、（ｂ）ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、（ｃ）ストレプトマイセス・ベネズエラ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ）、（ｄ）ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、（ｅ）ストレプトマイセス・エバミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｅｔｉｌｉｓ）、及び（ｆ）ストレプトマイセス・ビンチェンジェンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｂｉｎｇｃｈｅｎｇｇｅｎｓｉｓ）から選択される。
【００３８】
標的細胞は、細菌又は真核細胞であり得る。例えば、標的細胞は、（ａ）真菌、（ｂ）哺乳動物、（ｃ）高等植物細胞、（ｄ）原生動物、（ｅ）蠕虫細胞、（ｆ）藻類、又は（ｈ）無脊椎動物細胞であり得る。
【００３９】
一部の実施形態では、標的細胞は、がん細胞、例えば、ヒトがん細胞である。他の実施形態では、標的細胞は、病原性細菌である。
【００４０】
第２の態様では、本発明は、細胞毒性剤を特定する方法であって、上記に記載の方法により、標的細胞に対して活性な細胞毒性剤の産生体を特定するために変異細菌をスクリーニングすることを含む方法を提供する。
【００４１】
第３の態様では、本発明は、上記に記載の本発明の第２の態様の方法を含む、細胞毒性剤を産生するためのプロセスを提供する。ここで、プロセスは、前記細胞毒性剤を、変異細菌から合成又は単離することをさらに含んでもよく、合成又は単離された細胞毒性剤を、薬学的に許容される賦形剤と混合して、医薬組成物を製造することを、任意選択でさらに含んでもよい。
【００４２】
本発明の他の態様及び好ましい実施形態は、下記に示す他の請求項で定義及び記載されている。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本明細書で言及した全ての公開文献、特許、特許出願、及び他の参照文献は、それぞれ個々の公開文献、特許又は特許出願が、参照により組み込まれて詳細に及び個別に示され、その内容が完全に参照されているかのように、全ての目的についてその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４４】
定義及び一般的優先
本明細書で使用され、他に特別に特定されていない限り、以下の用語は、当該分野で享受し得るより広い（又はより狭い）用語の意味に加えて、以下の意味を有することが意図される。
【００４５】
文脈により他に必要とされない限り、本明細書における単数形の使用は複数形も含むとして読まれ、その逆も同様である。
【００４６】
実体に関連して使用される用語「ａ」又は「ａｎ」は、１つ又は複数の実体を参照すると読まれる。したがって、用語「ａ」（若しくは「ａｎ」）、「１つ又は複数（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」及び「少なくとも１つ（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」は、本明細書において相互に交換可能に使用される。
【００４７】
本明細書で使用するとき、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」又はその変形、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、任意の引用された完全体（例えば、特色、要素、特徴、特性、方法／プロセスステップ若しくは限定）又は完全体（例えば、特色、要素、特徴、特性、方法／プロセスステップ若しくは限定）のグループを含むが、任意の他の完全体又は完全体のグループを排除してはいないことを示していると読まれる。したがって、本明細書で使用するとき、用語「含む」は、包括的又は開放形であり、追加的な、引用されていない完全体又は方法／プロセスステップを排除しない。
【００４８】
遺伝子という用語は、染色体又はプラスミドの特定の位置を占め、生物の特定の特徴を決定するＤＮＡ配列からなる遺伝的単位を記述する用語である。遺伝子は、タンパク質又はタンパク質の一部を形成するポリペプチド鎖を特定することによって生物の特徴を決定している場合があり（構造遺伝子）、又はＲＮＡ分子をコードしている場合があり、又は他の遺伝子の操作を制御する若しくはそのような操作を抑制している場合があり、又は一部の他のまだ明らかにされていない機構により表現型に影響を与えている場合がある。
【００４９】
ゲノムＤＮＡという用語は、染色体外に維持されているプラスミドＤＮＡと区別して、染色体ＤＮＡを定義するために本明細書で使用される専門用語である。
【００５０】
ゲノムという用語は、生物の完全な遺伝的相当物を定義するために本明細書で使用され、したがって、染色体、プラスミド、プロファージ、及び任意の他のＤＮＡを含む、専門用語である。
【００５１】
グラム陽性細菌という用語は、ある特定の細胞壁染色特性に基づいて一緒にグループ化される細菌の特定の種類を定義する専門用語である。
【００５２】
低Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌という用語は、ＤＮＡ内の塩基組成に基づいて、グラム陽性内の進化的に関連する細菌の特定のサブクラスの種類を定義する専門用語である。このサブクラスには、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）ｓｐｐ．、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）ｓｐｐ．、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）ｓｐｐ．、バチルスｓｐｐ．、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）ｓｐｐ．、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）ｓｐｐ．及びラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐｐ．が含まれる。
【００５３】
高Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌という用語は、ＤＮＡ内の塩基組成に基づいて、グラム陽性内の進化的に関連する細菌の特定のサブクラスの種類を定義する専門用語である。このサブクラスには、放線菌類（放線菌門）、例えば、アクチノミセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）ｓｐｐ．、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｓｐｐ．、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐｐ．、フランキア（Ｆｒａｎｋｉａ）ｓｐｐ．、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）ｓｐｐ．、ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）ｓｐｐ．、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐｐ．、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）ｓｐｐ．、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐｐ．及びストレプトマイセスｓｐｐ．が含まれる。
【００５４】
グラム陰性細菌という用語は、ある特定の細胞壁染色特性に基づいて一緒にグループ化される細菌の特定の種類を定義する専門用語である。グラム陰性細菌属の例としては、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）及びナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）が含まれる。
【００５５】
用語「単分散」は、微小液滴に適用されるとき、１．０以下、０．５以下、好ましくは０．３以下の粒径分布係数εを示す任意のエマルジョンを意味する。前記係数εは、以下の式で定義される：
ε＝（９０Ｄｐ−１０Ｄｐ）／５０Ｄｐ（１）
式中、１０Ｄｐ、５０Ｄｐ及び９０Ｄｐは、エマルジョンについて相対累積粒度分布曲線から推定した累積頻度が、それぞれ１０％、５０％及び９０％であるときの粒度である。ε＝０である場合は、エマルジョン粒子が粒度散乱を全く示さない理想的状態を意味する。
【００５６】
本明細書で使用するとき、トランスポゾン挿入に適用される用語「挿入率」は、各細菌に１つのＴｎＡ挿入での、変異体プール全体に対するレベルのＴｎＡの挿入密度を示すために使用される。致死的ＴｎＡ挿入事象、例えば、必須遺伝子の挿入による不活性化から生じる致死的ＴｎＡ挿入事象は、変異体プールの生存メンバー中にはないことも理解される。したがって、本明細書で特定される挿入率は、ＤＮＡの非必須領域に適用される。
【００５７】
本明細書で使用するとき、用語「細胞毒性剤」は、標的細胞を殺傷するか又は標的細胞の増殖若しくは生物学的活性を予防若しくは制御するように作用する、任意の化合物（例えば、代謝物、タンパク質、ペプチド又は他のバイオポリマー）を定義する。
【００５８】
産生体原核細胞
古細菌及び細菌細胞を含む任意の原核細胞が、本発明に従って使用され得る。古細菌細胞は、以下の門から選択され得る：（ａ）クレン古細菌門、（ｂ）ユリ古細菌門、（ｃ）コル古細菌門、（ｄ）ナノ古細菌門、及び（ｅ）タウム古細菌。
【００５９】
例示的古細菌属としては、アシディアヌス（Ａｃｉｄｉａｎｕｓ）、アシディロブス（Ａｃｉｄｉｌｏｂｕｓ）、アシドコッカス（Ａｃｉｄｏｃｏｃｃｕｓ）、アシデュリプロファンダム（Ａｃｉｄｕｌｉｐｒｏｆｕｎｄｕｍ）、アエロピルム（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ）、アーケオグロブス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、バシロウイルス（Ｂａｃｉｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、カルディスファエラ（Ｃａｌｄｉｓｐｈａｅｒａ）、カルディウィルガ（Ｃａｌｄｉｖｉｒｇａ）、カルドコッカス（Ｃａｌｄｏｃｏｃｕｓ）、ケナルカエウム（Ｃｅｎａｒｃｈａｅｕｍ）、デスルフロコッカス（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ファログロボス（Ｆｅｒｒｏｇｌｏｂｕｓ）、フェロプラズマ（Ｆｅｒｒｏｐｌａｓｍａ）、ゲオゲンマ（Ｇｅｏｇｅｍｍａ）、ゲオグロボス（Ｇｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハラダプタツス（Ｈａｌａｄａｐｔａｕｓ）、ハラルカリコッカス（Ｈａｌａｌｋａｌｉｃｏｃｃｕｓ）、ハロアルカロフィラム（Ｈａｌｏａｌｃａｌｏｐｈｉｌｉｕｍ）、ハロアーキュラ（Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ）、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ハロバキュラム（Ｈａｌｏｂａｃｕｌｕｍ）、ハロビフォルマ（Ｈａｌｏｂｉｆｏｒｍａ）、ハロコッカス（Ｈａｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ハロフェラックス、ハロゲオメトリカム（Ｈａｌｏｇｅｏｍｅｔｒｉｃｕｍ）、ハロミクロビウム（Ｈａｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、ハロピガー（Ｈａｌｏｐｉｇｅｒ）、ハロプラヌス（Ｈａｌｏｐｌａｎｕｓ）、ハロクアドラツム（Ｈａｌｏｑｕａｄｒａｔｕｍ）、ハロラブダス（Ｈａｌｏｒｈａｂｄｕｓ）、ハロルブラム（Ｈａｌｏｒｕｂｒｕｍ）、ハロサルシナ（Ｈａｌｏｓａｒｃｉｎａ）、ハロシンプレックス（Ｈａｌｏｓｉｍｐｌｅｘ）、ハロスタゴニコラ（Ｈａｌｏｓｔａｇｎｉｃｏｌａ）、ハロテリジェナ（Ｈａｌｏｔｅｒｒｉｇｅｎａ）、ハロビバックス（Ｈａｌｏｖｉｖａｘ）、ハイパーサーマス（Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｕｓ）、イグニコッカス（Ｉｇｎｉｃｏｃｃｕｓ）、イグニスファエラ（Ｉｇｎｉｓｐｈａｅｒａ）、メタロスファエラ（Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ）、メタニミクロコッカス（Ｍｅｔｈａｎｉｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メタノブレビバクター（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）、メタノカルクルス（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｃｕｌｕｓ）、メタントクスアルドコッカス（Ｍｅｔｈａｎｔｘａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノセラ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ）、メタノコッコイドス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ）、メタノコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノコルプスクルム（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ）、メタノクレウス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ）、メタノフォリス（Ｍｅｔｈａｎｏｆｏｌｌｉｓ）、メタノゲニウム（Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ）、メタノハロビウム（Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ）、メタノハロフィラス（Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、メタノラシニア（Ｍｅｔｈａｎｏｌａｃｉｎｉａ）、メタノロブス（Ｍｅｔｈａｎｏｌｏｂｕｓ）、メタノメチロボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒａｎｓ）、メタノミクロビウム（Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メタノプラヌス（Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ）、メタノピルス（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ）、メタノレギュラ（Ｍｅｔｈａｎｏｒｅｇｕｌａ）、メタノサエタ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ）、メタノサルサム（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｌｓｕｍ）、メタノサルシナ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）、メタノスファエラ（Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ）、メタノスピリラム（Ｍｅｌｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、メタノサーモバクター（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ）、メタノサーモコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノサーマス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ）、メタノスリックス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｒｉｘ）、メタノトリス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｏｒｒｉｓ）、ナノアルカエウム（Ｎａｎｏａｒｃｈａｅｕｍ）、ナトリアルバ（Ｎａｔｒｉａｌｂａ）、ナトリネマ（Ｎａｔｒｉｎｅｍａ）、ナトロノバクテリウム（Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ナトロノコッカス（Ｎａｔｒｏｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ナトロノリムノビウス（Ｎａｔｒｏｎｏｌｉｍｎｏｂｉｕｓ）、ナトロノモナス（Ｎａｔｒｏｎｏｍｏｎａｓ）、ナトロノルブラム（Ｎａｔｒｏｎｏｒｕｂｒｕｍ）、ニトラコプミルス（Ｎｉｔｒａｃｏｐｕｍｉｌｕｓ）、パレオコッカス（Ｐａｌａｅｏｃｏｃｃｕｓ）、ピクロフィラス（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ）、ピロバクルム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）、ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ピロジクチウム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ）、ピロロブス（Ｐｙｒｏｌｏｂｕｓ）、スタフィロテルムス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｔｈｅｒｍｕｓ）、ステッテリア（Ｓｔｅｔｔｅｒｉａ）、スティギオロブス（Ｓｔｙｇｉｏｌｏｂｕｓ）、スルホロブス、スルフォポボコックス（Ｓｕｌｆｏｐｈｏｂｏｃｏｃｃｕｓ）、スルフリスファエラ（Ｓｕｌｆｕｒｉｓｐｈａｅｒａ）、サーモクラジウム（Ｔｈｅｒｍｏｃｌａｄｉｕｍ）、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）、サーモディスクス（Ｔｈｅｒｍｏｄｉｓｃｕｓ）、サーモフィルム（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍ）、サーモプラズマ（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）、サーモプロテウス（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ）、サーモスファエラ（Ｔｈｅｒｍｏｓｐｈａｅｒａ）及びバルカニサエタ（Ｖｕｌｃａｎｉｓａｅｔａ）。
【００６０】
例示的古細菌種としては、以下が挙げられる：アエロピュルム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ）、アルカエグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、アルカエオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、デスルフロコッカス（Ｄｅｓｕｌｆｏｒｃｏｃｃｕｓ）種ＴＯＫ、メタノバクテリウム・サーモアウトロピカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｎｔｏｒｏｐｈｉｃｕｍ）、メタノコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、ピロバクルム・アエロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）、ピロバクルム・カリディフォンティス（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ｃａｌｉｄｉｆｏｎｔｉｓ）、ピロバクルム・イスランディクム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）、ピロコッカスＧＢ−Ｄ、ピロコッカス・グリコボランス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｌｙｃｏｖｏｒａｎｓ）、ピロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、ピロコッカスｓｐｐ．ＧＥ２３、ピロコッカスｓｐｐ．ＳＴ７００、ピロコッカス・ウーゼイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｅｓｉｉ）、ピロディクティウム・オカルタム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ  ｏｃｃｕｌｔｕｍ）、スルホロブス・アシドカルダリウム（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｍ）、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌａｔａｒｉｃｕｓ）、スルホロブス・トコダイイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｌｉｉ）、サーモコッカス・アグレガンス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇｇｒｅｇａｎｓ）、サーモコッカス・バロシイ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｂａｒｏｓｓｉｉ）、サーモコッカス・セラー（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｅｌｅｒ）、サーモコッカス・フミコーランス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｍｉｃｏｌａｎｓ）、サーモコッカス・ゴルゴナリウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）、サーモコッカス・ヒドロサーマリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ）、サーモコッカス・オンヌリネウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｎｎｕｒｉｎｅｕｓ）ＮＡ１、サーモコッカス・パシフィカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｃｉｆｉｃｕｓ）、サーモコッカス・プロファンダス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｒｏｆｕｎｄｕｓ）、サーモコッカス・シクリ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｉｃｕｌｉ）、サーモコッカスｓｐｐ．ＧＥ８、サーモコッカスｓｐｐ．ＪＤＦ−３、サーモコッカスｓｐｐ．ＴＹ．、サーモコッカス・チオレドゥセンス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｉｏｒｅｄｕｃｅｎｓ）、サーモコッカス・ズイッリグティ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｉｌｌｉｇｔｉ）、サーモプラズマ・アシドフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、サーモプラズマ・ボルカニウム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ）、アシディアヌス・ホスピタリス（Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ｈｏｓｐｉｔａｌｉｓ）、アシジロブス・サチャロボランス（Ａ���ｉｄｉｌｏｂｕｓ  ｓａｃｈａｒｏｖｏｒａｎｓ）、アシデュリプロファンダム・ブーネイ（Ａｃｉｄｕｌｉｐｒｏｆｕｎｄｕｍ  ｂｏｏｎｅｉ）、アエロピュルム・ペルニクス、アルカエオグロブス・フルギダス、アルカエオグロブス・プロファンデュス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｐｒｏｆｕｎｄｕｓ）、アルカエオグロブス・ベネフィカス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｖｅｎｅｆｉｃｕｓ）、カルディウィルガ・マキリンジェンシス（Ｃａｌｄｉｖｉｒｇａ  ｍａｑｕｉｌｉｎｇｅｎｓｉｓ）、カンジダツス・コラルチャエウム・ククリプトフィラム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｋｏｒａｒｃｈａｅｕｍ  ｃｒｙｐｔｏｆｉｌｕｍ）、カンジダツス・メタノレグラ・ブーネイ（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｒｅｇｕｌａ  ｂｏｏｎｅｉ）、カンジダツス・ニトロソアルカエウム・リムニア（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｎｉｔｒｏｓｏａｒｃｈａｅｕｍ  ｌｉｍｎｉａ）、ケナルカエウム・シュンビオスム（Ｃｅｎａｒｃｈａｅｕｍ  ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ）、デスルフロコッカス・カムチャッケンシス（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｋａｍｃｈａｔｋｅｎｓｉｓ）、ファログロボス・プラシデュス（Ｆｅｒｒｏｇｌｏｂｕｓ  ｐｌａｃｉｄｕｓ）、フェロプラズマ・アシダルマヌス（Ｆｅｒｒｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄａｒｍａｎｕｓ）、ハラルカリコッカス・ジェオトガリ（Ｈａｌａｌｋａｌｉｃｏｃｃｕｓ  ｊｅｏｔｇａｌｉ）、ハロアーキュラ・ヒスパニカ（Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ  ｈｉｓｐａｎｉｃａ）、ハロアーキュラ・マリスモルツイ（Ｈｏｌａｏａｒｃｕｌａ  ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ）、ハロバクテリウム・サリナルム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｌｉｎａｒｕｍ）、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、ハロビフォルマ・ルシサルシ（Ｈａｌｏｂｉｆｏｒｍａ  ｌｕｃｉｓａｌｓｉ）、ハロフェラックス・ボルバニイ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｖａｎｉｉ）、ハロゲオメトリカム・ボリンクエンセ（Ｈａｌｏｇｅｏｍｅｔｒｉｃｕｍ  ｂｏｒｉｎｑｕｅｎｓｅ）、ハロミクロビウム・ムコハタエイ（Ｈａｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｍｕｋｏｈａｔａｅｉ）、ハロフィリック・アルカセオン（ｈａｌｏｐｈｉｌｉｃ  ａｒｃｈａｃｅｏｎ）ｓｐ．ＤＬ３１、ハロピガー・キサナデュエンシス（Ｈａｌｏｐｉｇｅｒ  ｘａｎａｄｕｅｎｓｉｓ）、ハロクアドラツム・ワルスビイ（Ｈａｌｏｑｕａｄｒａｔｕｍ  ｗａｌｓｂｙｉ）、ハロラブダス・チアマテア（Ｈａｌｏｒｈａｂｄｕｓ  ｔｉａｍａｔｅａ）、ハロラブダス・ウタヘンシス（Ｈａｌｏｒｈａｂｄｕｓ  ｕｔａｈｅｎｓｉｓ）、ハロルブラム・ラクスプロファンディ（Ｈａｌｏｒｕｂｒｕｍ  ｌａｃｕｓｐｒｏｆｕｎｄｉ）、ハロテリジェナ・トルクメニカ（Ｈａｌｏｔｅｒｒｉｇｅｎａ  ｔｕｒｋｍｅｎｉｃａ）、ハイパーサーマス・ブチリカス（Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｕｓ  ｂｕｔｙｌｉｃｕｓ）、イグニコッカス・ホスピタリス（Ｉｇｎｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｓｐｉｔａｌｉｓ）、イグニスファエラ・アグレガンス（Ｉｇｎｉｓｐｈａｅｒａ  ａｇｇｒｅｇａｎｓ）、メタロスファエラ・キュプリナ（Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ  ｃｕｐｒｉｎａ）、メタロスファエラ・セデュラ（Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅ��ａ  ｓｅｄｕｌａ）、メタノバクテリウムｓｐ．ＡＬ−２１、メタノバクテリウムｓｐ．ＳＷＡＮ−１、メタノバクテリウム・サーモアウトロピカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｒｏｐｈｉｃｕｍ）、メタノブレビバクター・ルミナンチウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）、メタノブレビバクター・スミティ（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｓｍｉｔｈｉｉ）、メタノカルドコックス・フェルベンス（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｅｒｖｅｎｓ）、メタノカルドコックス・インフェルヌス（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｆｅｒｎｕｓ）、メタノカルドコックス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、メタノカルドコックスｓｐ．ＦＳ４０６−２２、メタノカルドコックス・バルカニウス（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｕｌｃａｎｉｕｓ）、メタノセラ・コンラディ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｃｏｎｒａｄｉｉ）、メタノセラ・パルディコラ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）、メタノセラｓｐ．ライスクラスター（Ｒｉｃｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ）Ｉ（ＲＣ−Ｉ）、メタノコッコイドス・ブルトニー（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ  ｂｕｒｔｏｎｉｉ）、メタノコッカス・エオリカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｅｏｌｉｃｕｓ）、メタノコッカス・マリパルディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）、メタノコッカス・バニエリイ）（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｎｎｉｅｌｉｉ）、メタノコッカス・ボルタエ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｏｌｔａｅ）、メタノコルプスクルム・ラブレアンタム（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ  ｌａｂｒｅａｎｔｕｍ）、メタノクレウス・マリスニグリ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ  ｍａｒｉｓｎｉｇｒｉ）、メタノハロビウム・エベスチガツム（Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ）、メタノハロフィラス・マヒイ（Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ  ｍａｈｉｉ）、メタノプラヌス・ペトロレアリウス（Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｐｅｔｒｏｌｅａｒｉｕｓ）、メタノピルス・カンドレリ（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ）、メタノサエタ・コンシリ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｃｏｎｃｉｌｉｉ）、メタノサエタ・ハルンディナセア（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｈａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）、メタノサエタ・サーモフィラ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、メタノサルサム・ズィリナーエ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｌｓｕｍ  ｚｈｉｌｉｎａｅ）、メタノサルシナ・アセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ）、メタノサルシナ・バーケリー（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉ）、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ）、メタノスファエラ・スタッドマナエ（Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｔａｄｔｍａｎａｅ）、メタノスファエラ・パルストリス（Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒｕｌａ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、メタノスピリラム・ヒュンゲイテイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｕｌｌｕｍ  ｈｕｎｇａｔｅｉ）、メタノサーモバクター・マーブルゲンシス（Ｍａｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｂｕｒｇｅｎｓｉｓ）、メタノサーモコッカス・オキナウェンシス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｋｉｎａｗｅｎｓｉｓ）、メタノサーマス・フェルビダス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｅｒｖｉｄｕｓ）、メタノトリス・イグネウス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｏｒｒｉｓ  ｉｇｎｅｕｓ）、ナノアルカエウム・エクイタンス（Ｎａｎｏａｒｃｈａｅｕｍ  ｅｑｕｉｔａｎｓ）、ナトリアルバ・アジアティカ（Ｎａｔｒｉａｌｂａ  ａｓｉａｔｉｃａ）、ナトリアルバ・マガディイ（Ｎａｔｒｉａｌｂａ  ｍａｇａｄｉｉ）、ナトロノモナス・パラオニス（Ｎａｔｒｏｎｏｍｏｎａｓ  ｐｈａｒａｏｎｉｓ）、ニトロソプミルス・マリティマス（Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌｕｓ  ｍａｒｉｔｉｍｕｓ）、ピクロフィラス・トッリダス（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ  ｔｏｒｒｉｄｕｓ）、ピロバクルム・アエロフィラム、ピロバクルム・アルセナティクム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｒｓｅｎａｔｉｃｕｍ）、ピロバクルム・カリディフォンティス、ピロバクルム・イスランディクム、ピロバクルムｓｐ．１８６０、ピロコッカス・アビッシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、ピロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、ピロコッカスｓｐ．ＮＡ４２、ピロコッカス・ヤヤノシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｙａｙａｎｏｓｉｉ）、ピロロブス・フマリイ（Ｐｙｒｏｌｏｂｕｓ  ｆｕｍａｒｉｉ）、スタフィロテルムス・ヘレニカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｈｅｌｌｅｎｉｃｕｓ）、スタフィロテルムス・マリナス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ）、スルホロブス・アシドカルダリウム、スルホロブス・イスランディカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｉｓｌａｎｄｉｃｕｓ）、スルホロブス・ソルファタリカス、スルホロブス・トコダイイ、サーモコッカス・バロフィラス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｂａｒｏｐｈｉｌｕｓ）、サーモコッカス・ガンマトレランス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｍｍａｔｏｌｅｒａｎｓ）、サーモコッカス・コダカラエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎ
ｓｉｓ）、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、サーモコッカス・オンヌリネウス、サーモコッカス・シビリカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｉｂｉｒｉｃｕｓ）、サーモコッカスｓｐ．４５５７、サーモコッカスｓｐ．ＡＭ４、サーモフィラム・ペンデンス（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍ  ｐｅｎｄｅｎｓ）、サーモプラズマ・アシドフィラム、サーモプラズマ・ボルカニウム、サーモプロテウス・ニュートラフィラス（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｕｓ）、サーモプロテウス・テナックス（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ  ｔｅｎａｘ）、サーモプロテウス・ウゾニエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ  ｕｚｏｎｉｅｎｓｉｓ）、サーモスファエラ・アグリガンス（Ｔｈｅｒｍｏｓｐｈａｅｒａ  ａｇｇｒｅｇａｎｓ）、バルカニサエタ・ディストリビュータ（Ｖｕｌｃａｎｉｓａｅｔａ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔａ）及びバルカニサエタ・モウトノヴスキア（Ｖｕｌｃａｎｉｓａｅｔａ  ｍｏｕｔｎｏｖｓｋｉａ）。
【００６１】
本発明による産生体細胞として有用な古細菌細胞の特定の例としては、ハロフェラックス・ボルカニ又はスルホロブスｓｐｐ．が挙げられる。
【００６２】
細菌細胞は、放線菌門、例えば、次の科から選択されてもよい：アクチノミセス科（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）、プロピオニバクテリア科（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、フランキア科（Ｆｒａｎｋｉａｃｅａｅ）、ミクロコッカス科（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ミクロモノスポラ科（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）、ストレプトマイセス科（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）、マイコバクテリア科（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、コリネバクテリウム科（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、シュードノカルジア科（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）及びノカルジア科（Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）。
【００６３】
したがって、一部の実施形態では、産生体原核細胞は、サッカロポリスポラ（Ｓａｃｃａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ）ｓｐｐ．、例えば、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Ｓａｃｃａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒｅａ）から選択される。他の実施形態では、産生体原核細胞は、クツネリア（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ）ｓｐｐ．、例えば、クツネリア・アルビダ（Ｋｕｔｚｎｅｒｉａ  ａｌｂｉｄａ）から選択される。さらに他の実施形態では、産生体原核細胞は、マイコバクテリウムｓｐｐ．、例えば、マイコバクテリウム・マリナム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍ）から選択される。
【００６４】
好ましい実施形態では、産生体原核細胞は、ストレプトマイセスｓｐｐ．から選択される。ストレプトマイセス属は、５００を超える種を含み、いずれの種も、本発明による産生体株として使用し得る。したがって、産生体株は、次の種のいずれかから選択され得る：Ｓ．アンボファシエンス（Ｓ．ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ）、Ｓ．アクロモゲネス（Ｓ．ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アヌラトス（Ｓ．ａｎｕｌａｔｕｓ）、Ｓ．エバミティリス、Ｓ．セリカラー、Ｓ．クラブリゲルス（Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）、Ｓ．フェレウス（Ｓ．ｆｅｌｌｅｕｓ）、Ｓ．フェラリティス（Ｓ．ｆｅｒｒａｌｉｔｉｓ）、Ｓ．フィラメントサス（Ｓ．ｆｉｌａｍｅｎｔｏｓｕｓ）、Ｓ．グリセウス、Ｓ．ヒグロスコピクス（Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）、Ｓ．リソスーパーフィカス（Ｓ．ｉｙｓｏｓｕｐｅｒｆｉｃｕｓ）、Ｓ．リビダンス、Ｓ．ヌールセイ（Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ）、Ｓ．スキャビエス（Ｓ．ｓｃａｂｉｅｓ）、Ｓ．ソマリエンシス（Ｓ．ｓｏｍａｌｉｅｎｓｉｓ）、Ｓ．サーモバイオラセウス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｖｉｏｌａｃｅｕｓ）、Ｓ．ベネズエラ及びＳ．ヴィオラセオルバ（Ｓ．ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ）。
【００６５】
一部の実施形態では、産生体原核細胞は、（ａ）ストレプトマイセス・セリカラー、（ｂ）ストレプトマイセス・リビダンス、（ｃ）ストレプトマイセス・ベネズエラ、（ｄ）ストレプトマイセス・グリセウス、（ｅ）ストレプトマイセス・エバミティリス、及び（ｆ）ストレプトマイセス・ビンチェンジェンシスから選択される。
【００６６】
他の実施形態では、産生体原核細胞は、ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）ｓｐｐ．から選択され、この属はいくつかの種を含むが、その種のいずれも本発明による産生体株として使用し得る。したがって、産生体細胞は、次の種のいずれかから選択され得る：Ｍ．アウランティアカ（Ｍ．ａｕｒａｎｔｉａｃａ）、Ｍ．カーボナセア（Ｍ．ｃａｒｂｏｎａｃｅａ）、Ｍ．カルセア（Ｍ．ｃｈａｌｃｅａ）、Ｍ．ケルシナ（Ｍ．ｃｈｅｒｓｉｎａ）、Ｍ．シトレア（Ｍ．ｃｉｔｒｅａ）、Ｍ．コエルレア（Ｍ．ｃｏｅｒｕｌｅａ）、Ｍ．エキナウランティアカ（Ｍ．ｅｃｈｉｎａｕｒａｎｔｉａｃａ）、Ｍ．エキノフュスカ（Ｍ．ｅｃｈｉｎｏｆｕｓｃａ）、Ｍ．エキノスポラ（Ｍ．ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）、Ｍ．フルビビリディス（Ｍ．ｆｕｌｖｉｖｉｒｉｄｉｓ）、Ｍ．ガリカ（Ｍ．ｇａｌｌｉｃａ）、Ｍ．ハロフィティカ（Ｍ．ｈａｌｏｐｈｙｔｉｃａ）、Ｍ．イノシトラ（Ｍ．ｉｎｏｓｉｔｏｌａ）、Ｍ．イニョオネンシス（Ｍ．ｉｎｙｏｎｅｎｓｉｓ）、Ｍ．ニガー（Ｍ．ｎｉｇｒａ）、Ｍ．オリバステロスポラ（Ｍ．ｏｌｉｖａｓｔｅｒｏｓｐｏｒａ）、Ｍ．パリダ（Ｍ．ｐａｌｌｉｄａ）、Ｍ．ペウセティア（Ｍ．ｐｅｕｃｅｔｉａ）、Ｍ．パープレオクロモゲネス（Ｍ．ｐｕｒｐｕｒｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、Ｍ．ロザリア（Ｍ．ｒｏｓａｒｉａ）、Ｍ．サガミエンシス（Ｍ．ｓａｇａｍｉｅｎｓｉｓ）及びＭ．ビリディファシエンス（Ｍ．ｖｉｒｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ）。
【００６７】
細菌細胞は、ファーミキューテス門、例えば、次の綱から選択され得る：バチルス、クロストリジウム及びモリキュート。
【００６８】
例示的バチルスは、次の科のいずれかから選択されるものであり得る：アリシクロバチルス科（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、バチルス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、カリオファノン科（Ｃａｒｙｏｐｈａｎａｃｅａｅ）、リステリア科（Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ）、パエニバシラス科（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、プラノコッカス科（Ｐｌａｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、スポロラクトバチルス科（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、スタフィロコッカス科（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、サーモアクチノマイセス科（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）及びツリシバクター科（Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）。例示的クロストリジウムは、以下の科のいずれかから選択されるものであり得る：アシダミノコッカス科（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、クロストリジウム科（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ）、ユーバクテリウム科（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ヘリオバクテリウム科（Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）、ペプトコッカス科（Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ペプトストレプトコッカス科（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）及びシントロフォモナダス科（Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）。
【００６９】
一部の実施形態では、産生体原核細胞は、バチルスｓｐｐ．及びクロストリジウムｓｐｐ．、例えば、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）の亜種プランタルム（Ｐｌａｎｔａｒｕｍ）から選択される。
【００７０】
細菌細胞は、シュードモナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、例えば、シュードモナス属のメンバーから選択される。
【００７１】
本発明の方法に使用するための標的細胞
細菌標的細胞
本発明による使用のための標的細胞は、細菌細胞であり得る。そのような実施形態では、細菌は、（ａ）グラム陽性、グラム陰性及び／又はグラム染色細菌、（ｂ）胞子形成細菌、（ｃ）非胞子形成細菌、（ｄ）糸状細菌、（ｅ）細胞内細菌、（ｆ）絶対好気性菌、（ｇ）絶対嫌気性菌、（ｈ）通性嫌気性菌、（ｉ）微好気性細菌、及び／又は（ｆ）日和見性細菌病原体から選択されてもよい。
【００７２】
ある特定の実施形態では、本発明による使用のための標的細胞は、以下の属の細菌から選択され得る：アシネトバクター［例えば、Ａ．バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）］、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）［例えば、Ａ．ハイドロフィラ（Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）］、バチルス［例えば、Ｂ．アンシラシス（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）］、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）［例えば、Ｂ．フラギリス（Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）］、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）［例えば、Ｂ．パーツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）］、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）［例えば、Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）］、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）［例えば、Ｂ．アボルタス（Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓ）、Ｂ．カニス（Ｂ．ｃａｎｉｓ）、Ｂ．メリテンシス（Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）及びＢ．スイス（Ｂ．ｓｕｉｓ）］、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）［例えば、Ｂ．セパシア（Ｂ．ｃｅｐａｃｉａ）菌群］、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）［例えば、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）］、クラミディア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）［例えば、Ｃ．トラコマティス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、Ｃ．スイス（Ｃ．ｓｕｉｓ）及びＣ．ムリダルム（Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ）］、クラミドフィラ（Ｃ．Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）［例えば、（例えば、Ｃ．ニューモニアエ（Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｃ．ペコルム（Ｃ．ｐｅｃｏｒｕｍ）、Ｃ．シッタシ（Ｃ．ｐｓｉｔｔａｃｉ）、Ｃ．アボルタス（Ｃ．ａｂｏｒｔｕｓ）、Ｃ．フェリス（Ｃ．ｆｅｌｉｓ）及びＣ．カビアエ（Ｃ．ｃａｖｉａｅ）］、サイトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）［例えば、Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ（Ｃ．フレウンディイ）］、クロストリジウム［例えば、Ｃ．ボツリヌム（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、Ｃ．パーフリンゲンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）及びＣ．テタニ（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ）］、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）［例えば、Ｃ．ジフテリア（Ｃ．ｄｉｐｈｔｅｒｉａｅ）及びＣ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）］、エンテロバクター［例えば、Ｅ．クロアカエ（Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ）及びＥ．アエロゲネス（Ｅ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）］、エンテロコッカス［例えば、Ｅ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）及びＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）］、エシェリキア［例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）］、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）［例えば、Ｆ．ツラレンシス（Ｆ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）］、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）［例えば、Ｆ．ネクロフォーラム（Ｆ．ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ）］、ヘモフィラス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）（例えば、Ｈ．ソムナス（Ｈ．ｓｏｍｎｕｓ）、Ｈ．インフルエンザエ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）及びＨ．パラインフルエンザエ（Ｈ．ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）］、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）［例えば、Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）］、クレブシエラ［例えば、Ｋ．オキシトカ（Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ）及びＫ．ニューモニアエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）］、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）［例えば、Ｌ．ニューモフィラ（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）］、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）［例えば、Ｌ．インターロガンス（Ｌ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）］、リステリア［例えば、Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）］、モラクセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）［例えば、Ｍ．カタラリス（Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）］、モーガネラ（Ｍ．Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）［例えば、Ｍ．モーガニイ（Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ）］、マイコバクテリウム［例えば、Ｍ．レプラエ（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）及びＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）］、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）［例えば、Ｍ．ニューモニアエ（Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）］、ナイセリア［例えば、Ｎ．ゴノレエ（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）及びＮ．メニンジティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）］、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）［例えば、Ｐ．ムルトシダ（Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）］、ペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、プレボテーラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）［例えば、Ｐ．ミラビリス（Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）及びＰ．ブルガリス（Ｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）］、シュードモナス［例えば、Ｐ．エルギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）］、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）［例えば、Ｒ．リケッチイ（Ｒ．ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）］、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）［例えば血清型ティフィ（Ｔｙｐｈｉ）及びティフィムリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）］、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）［例えば、Ｓ．マルセッセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｅｎｓ）］、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）［例えば、Ｓ．フレクスナリア（Ｓ．ｆｌｅｘｎａｒｉａ）、Ｓ．ダイセンテリエ（Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）及びＳ．ソネイ（ｓｏｎｎｅｉ）］、スタフィロコッカス［例えば、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｓ．ヘモリティカス（Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、Ｓ．インターメディウス（Ｓ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、Ｓ．エビデルミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）及びＳ．サプロフィティカス（Ｓ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）］、ステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）［例えば、Ｓ．マルトフィリア（Ｓ．ｍａｌｔｏｐｈｉｌａ）］、ストレプトコッカス［例えば、Ｓ．アガラクティアエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、Ｓ．ニューモニアエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及び化膿レンサ球菌］、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）［例えば、Ｔ．パリダム（Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ）］、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）［例えば、Ｖ．コレラエ（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）］及びエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）［例えば、Ｙ．ペスティス（Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ）］。
【００７３】
本発明による使用のための標的細胞は、高Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌及び低Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌から選択され得る。
【００７４】
標的細胞としての病原性細菌
ヒト又は動物細菌病原体としては、レジオネラｓｐｐ．、リステリアｓｐｐ．、シュードモナスｓｐｐ．、サルモネラｓｐｐ．、クレブシエラｓｐｐ．、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）ｓｐｐ、ヘモフィラスｓｐｐ．、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）ｓｐｐ．、セラチアｓｐｐ．、シゲラｓｐｐ．、ビブリオｓｐｐ．、バチルスｓｐｐ．、カンピロバクターｓｐｐ．、エルシニアｓｐｐ．、クロストリジウムｓｐｐ．、エンテロコッカスｓｐｐ．、ナイセリアｓｐｐ．、ストレプトコッカスｓｐｐ．、スタフィロコッカスｓｐｐ．、マイコバクテリウムｓｐｐ．、エンテロバクターｓｐｐ．などの細菌が挙げられる。
【００７５】
病原性真菌細胞
これらには、酵母、例えば、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種、例えば、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｃ  クルーセイ（Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ）及びＣ  トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、及び糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）ｓｐｐ．及びペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）ｓｐｐ．及び白癬菌、例えば、トリコフィトン（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）ｓｐｐ．が挙げられる。
【００７６】
植物病原体
本発明による使用のための標的細胞は、植物病原体、例えば、シュードモナスｓｐｐ．、キシレラ（Ｘｙｌｅｌｌａ）ｓｐｐ．、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）ｓｐｐ．、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）ｓｐｐ．、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）ｓｐｐ．、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）ｓｐｐ．、フィトフトラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）ｓｐｐ．、ボトリチス（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）ｓｐｐ．、レプトスフェリア（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）ｓｐｐ．、うどんこ病菌（ｐｏｗｄｅｒｙ  ｍｉｌｄｅｗｓ）（子嚢菌）及びさび菌（担子菌）であり得る。
【００７７】
変異産生体細胞プール
本発明の方法は、トランスポゾン変異により、変異原核細胞のプールを生成することを含む。変異体プールのサイズは、方法の解像力に影響を与える：プールのサイズが増加するほど、さらに一層異なるＴｎＡ挿入を有する遺伝子が提示される（したがって効果的に分析される）。プールのサイズが減少するにつれて、方法の解像力は減少し、遺伝子は効果的に分析されなくなり、より多くの遺伝子が全く分析されなくなる。
【００７８】
理想的には、本発明の方法により生成される変異体プールは、どの（非必須）遺伝子への挿入も示されているという意味において、包括的である。このことを達成するために必要なＴｎＡ挿入変異体の数（つまり、変異体プールのサイズ）は、以下を含む様々な因子に依存する：（ａ）原核ゲノムのサイズ、（ｂ）遺伝子の平均的サイズ、及び（ｃ）任意のＴｎＡ挿入部位バイアス。
【００７９】
後者に関して、ゲノムの一部の領域は、頻度の低い挿入を引きつける（特にＧＣリッチ領域）。したがって、挿入し難い領域への挿入が確実であるように、十分大きい挿入頻度及びプールサイズであることが好ましい。
【００８０】
一般に、２５ｂｐあたりに１つのトランスポゾンの最小挿入率が、包括的なプール／ライブラリを達成するために必要とされ、この率は、通常、４〜７Ｍｂのゲノムサイズを有する原核細胞について、０．５×１０５〜１×１０５、例えば、５×１０５、好ましくは少なくとも約１×１０６変異体の最小プールサイズを必要とする。多くの場合において、１×１０６の変異体は、約３００，０００の異なる挿入部位の特定を可能にし、１３〜２３ｂｐごとに１つのトランスポゾン挿入（又は遺伝子あたり約４０〜７０の異なる挿入部位）に相当する。
【００８１】
しかしながら、本発明の方法は、有用なヒットを生成するために、必ずしも包括的変異体プール（上記に定義された意味における）を必要としない。むしろ、理想的な包括的プールよりも小さいサイズのプールが使用され得るが、但し、解像力の減少（及び付随してある特定の遺伝子の分析の失敗）が認容され得る場合である。これは、例えば、方法が、ヒットが特定されるまで繰り返し実行するように方法が設計される場合であり得る。そのような実施形態では、有効なプールサイズは、方法が繰り返されるごとに大きくなる。
【００８２】
トランスポゾン変異生成
転移性要素と称されることもあるトランスポゾンは、他のポリヌクレオチドに自身のコピーを挿入することができるポリヌクレオチドである。トランスポゾンという用語は、当業者にとって周知であり、基本の配列編成、例えば、各末端での短い逆方向反復、末端での直行的に反復された末端反復配列（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ、ＬＴＲ）、及びしばしば短縮された５’端を有するＲＮＡの３’端でのポリＡ、により区別し得るトランスポゾンの複数の種類を含む。
【００８３】
トランスポソームは、トランスポゾンがトランスポザーゼをコードしていない、トランスポザーゼ−トランスポゾン複合体である。したがって、いったん挿入されると、トランスポゾンは安定である。変異体プール安定性を確保するために、トランスポゾンはトランスポザーゼをコードせず、下記に記載されるように、トランスポソームの形態で（つまり、トランスポザーゼ酵素との複合体として）提供されることが好ましい。
【００８４】
本明細書で使用するとき、用語「活性化トランスポゾン」（以下、「ＴｎＡ」と略す）は、プロモーターを含むトランスポゾンと定義され、そのようなトランスポゾンの挿入は、挿入部位の又は近傍の遺伝子の転写を増加させる。そのようなトランスポゾンの例は、Ｔｒｏｅｓｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．６６８：１１７−３９、及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃｕｒｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７（４）：３９１−３９４に記載されている。
【００８５】
活性化トランスポゾン／トランスポソームは、当業者に周知の多種多様な標準的手法のいずれかにより、原核ゲノム（例えば、染色体及び／又はプラスミドＤＮＡ）に導入することができる。例えば、ＴｎＡトランスポソームは、エレクトロポレーション（又は任意の他の適切な形質転換方法）により導入され得る。
【００８６】
形質転換方法は、１×１０３〜５×１０３個の形質転換体／ｎｇのＤＮＡを生成することが好ましく、そのような形質転換効率はエレクトロポレーションを使用して一般的に達成可能である。
【００８７】
代替的に、ＴｎＡを使用するトランスポゾン変異は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、原核細胞に形質転換／形質導入される組換え分子で実施されてもよい。そのような実施形態では、トランスポソームは、市販のトランスポザーゼ酵素を、トランスポゾンＤＮＡ断片と混合することによって、標準的プロトコルに従って調製することができる。得られたトランスポソームを、次いで、目的の染色体外ＤＮＡと混合して転位させた後、ＤＮＡを、電気的形質転換を使用して宿主細菌株に導入し、染色体外ＤＮＡトランスポゾン変異体のプールを生成する。
【００８８】
変異生成がｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる実施形態では、トランスポソームをゲノムＤＮＡとｉｎ  ｖｉｔｒｏで混合し、次いで変異生成されたＤＮＡを（任意選択で断片化及び／又は環化の後に）、宿主原核細胞へ（例えば、エレクトロポレーションにより）導入し、内因性組換えにより、変異生成されたＤＮＡに機械的にゲノムに組み込んでもよい。そのようなアプローチは、天然に形質転換受容性がある（例えば、アシネトバクターｓｐｐ．）及び／又は相同的クロスオーバー（例えば、二重クロスオーバー）組み換え事象を介してＤＮＡを組み込むことができる原核生物の場合に特に有用であり得る。
【００８９】
本発明の方法に使用するための活性化トランスポゾン
任意の適切な活性化トランスポゾンを、本発明の方法で使用し得る。適切なトランスポゾンとしては、Ｔｎ３及びＴｎ３様（クラスＩＩ）トランスポゾンに基づくものが挙げられ、例えば、γδ（Ｔｎ１０００）、Ｔｎ５０１、Ｔｎ２５０１、Ｔｎ２１、Ｔｎ９１７及びその関連体が挙げられる。さらに、Ｔｎ１０、Ｔｎ５、ＴｎｐｈｏＡ、Ｔｎ９０３、ＴＮ５０９６、Ｔｎ５０９９、Ｔｎ４５５６、ＵＣ８５９２、ＩＳ４９３、バクテリオファージＭｕ及び関連する転位性バクテリオファージが挙げられる。様々な適切なトランスポゾンは市販もされており、例えば、ＥＺ−Ｔｎ５（商標）＜Ｒ６Ｋｙｏｒｉ／ＫＡＮ−２＞トランスポゾンが挙げられる。
【００９０】
好ましいトランスポゾンは、抗生物質耐性遺伝子を保有するものであるが、任意の選択マーカー、例えば、栄養要求性相補（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ）（トランスポゾンを保有する変異体の特定に有用であり得る）、例えばＴｎ５、Ｔｎ１０及びＴｎｐｈｏＡを使用することができる。例えば、Ｔｎ１０は、そのＩＳエレメント間にテトラサイクリン耐性遺伝子を保有しており、一方でＴｎ５は、カナマイシン、ストレプトマイシン及びブレオマイシンに耐性を付与するポリペプチドをコードする遺伝子を保有している。他の適切な耐性遺伝子としては、ネオマイシン、アプラマイシン、チオストレプトン及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（クロラムフェニコールに耐性を付与する）が挙げられる。
【００９１】
当然のことながら、ＩＳエレメント間に抗生物質耐性遺伝子の異なる組み合わせを挿入することにより、又はトランスポゾンモザイク末端間（好ましい）に抗生物質耐性遺伝子の組み合わせを挿入することにより、又はトランスポゾンのポリヌクレオチド配列を変化させることにより、例えばトランスポゾンにおける抗生物質耐性遺伝子のコーディング領域又は他の領域においてトランスポゾンの転位又は抗生物質耐性特徴に影響を与えない冗長な塩基置換又は任意の他の種類の塩基置換を作製することにより、新たなトランスポゾンを生成することも可能である。そのようなトランスポゾンは、本発明の範囲内に包含される。
【００９２】
多くの実施形態では、単一トランスポゾンが、変異体プールを生成するために使用される。しかし、上記のように、包括的プール又はライブラリを達成するために必要なＴｎ挿入変異体の数（つまり、変異体プールのサイズ）は、特に、いずれかのＴｎ挿入部位バイアスに依存する。したがって、トランスポゾン挿入部位バイアスが生じる場所では、２以上の異なるトランスポゾンが、挿入部位バイアスを減少又は除去するために使用され得る。例えば、Ｔｎ５及びＴｎ１０に基づく２つの異なるトランスポゾンの組み合わせを利用し得る。
【００９３】
活性化トランスポゾンに使用するためのプロモーター
ＴｎＡに存在するプロモーターの性質は、トランスポゾン及び最終的な原核宿主の性質に依存する。一般に、挿入部位に近傍の又は隣接するＤＮＡの構成的及び／又は高レベル転写を駆動する効率的な外指向プロモーターが選択される。
【００９４】
プロモーターは、以下を含み得る：（ａ）プリブノーボックス（−１０エレメント）、（ｂ）−３５エレメント及び／又は（ｃ）ＵＰエレメント。
【００９５】
例えば、ｌａｃプロモーターは、ＥＺ−Ｔｎ５（商標）＜Ｒ６Ｋｙｏｒｉ／ＫＡＮ−２＞トランスポゾンと共に使用することができ、そのような構築物は、例えば、大腸菌、エンテロバクターｓｐｐ．及び腸内細菌科、例えばクレブシエラｓｐｐ．の他のメンバーの分析に適切である。他の適切なプロモーターとしては、以下が挙げられる：ｒｐｌＪ（大リボソームサブユニットタンパク質、中強度のプロモーター）、ｔａｃ（人工ｌａｃ／ｔｒｐハイブリッド、強いプロモーター）、及びｒｒｎＢ（リボソームＲＮＡ遺伝子プロモーター、非常に強いプロモーター）。
【００９６】
さらに適切なプロモーターが、Ｒｈｏｄｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ：１−１８及びＺｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ．Ｂｉｏｌ．２（１１）：６６２−６６９に記載されるように、操作又は選択され得る。ＲＮＡ−ｓｅｑへの次世代シーケンシングの迅速な応用は、今やゲノムレベルでの転写開始部位の高解像度情報の富を与え、任意の所与の原核生物におけるプロモーター配列の特定を非常に簡素化する。これにより、全ゲノムについて、詳述されたプロモーターモデルの構築が可能である。ＲＮＡ−ｓｅｑは、転写物の豊富さ、延いてはプロモーター強度についても定量的情報を与え、プロモーター強度の予測的順位づけにも使用し得るプロモーター強度モデルの構築が可能である（Ｒｈｏｄｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ：１−１８参照）。
【００９７】
したがって、リアルタイムＰＣＲ及びＲＮＡ−ｓｅｑにより、選択された産生体細胞におけるハウスキーピング遺伝子の上流領域から、強力な構成型プロモーターを迅速に特定することが可能になる。
【００９８】
適切なプロモーターは、分析により特定することもできる。例えば、一連のプラスミドを構築して、実験的にプロモーター強度を試験してもよい。簡単に述べると、試験されるプロモーターを、抗生物質耐性遺伝子の上流に配置し、次いで関連する細菌に形質転換する。一般的クローニングアセンブリ及びプラスミド増幅を、大腸菌（アンピシリン耐性遺伝子及びｐＢＲ３２２ｏｒｉによって促進される）で実施してもよく、その後、標的細菌におけるプロモーターの活性を、関連抗生物質を用いた殺傷曲線を生成することによって、分析してもよく、非常に高レベルのプロモーターは、より抗生物質耐性発現が強く、したがってより高い抗生物質濃度で生存する。一連のプラスミドは、複製起点、（１つ又は複数の）耐性遺伝子及びプロモーターが容易に交換可能であるように、モジュラ型で設計する。
【００９９】
一般に放線菌類（特に、ストレプトマイセスｓｐｐ．）に使用するための適切なプロモーターとしては、Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ．Ｂｉｏｌ．２（１１）：６６２−６６９に記載の放線菌類ｇａｐｄｈ及びｒｐｓＬプロモーターが挙げられる。
【０１００】
異なる強度の多重プロモーターが使用される環境下（この点に関してさらなる詳細は下記参照）において、エガセラ・レンタ（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｌｅｎｔａ）由来のｇａｐｄｈ及びセルロモナス・フラビゲナ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｆｌａｖｉｇｉｎａ）由来のｒｐｓＬが、高強度プロモーターの基礎として使用され、Ｓ．グリセウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ）由来のｇａｐｄｈ及びｒｐｓＬが中強度プロモーターの基礎として使用され、Ｓ．グリセウス由来のｒｐｏＡ及びｒｐｏＢが低強度プロモーターの基礎として使用され得る（Ｓｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ．Ｂｉｏｌ．２（１１）：６６２−６６９を参照）。
【０１０１】
他の適切なプロモーターとしては、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ）由来のエリスロマイシン耐性遺伝子のプロモーターの変異バリアントであるｅｒｍＥ＊が挙げられる（例えば、Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４２：２００−２０４参照）。
【０１０２】
放線菌類と共に使用される適切なプロモーターは、Ｓｅｇｈｅｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９０（２）：６１５−６２３に記載されるように特定及び／又は操作することができ、ここでは発現レベルに重要な配列を特定するために、ランダム化した−１０及び−３５ボックスを使用することが記載されている。別のアプローチは、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７９（１４）：４４８４−４４９２に記載されている。
【０１０３】
バチルスｓｐｐ．を使用する適切なプロモーターは、モデル生物バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）について記載されている多くの異なるプロモーター、例えばＢ．サブティリス由来のＰ４３、ａｍｙＥ及びａｐｒＥプロモーターに基づくものであり得る（例えば、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １３（３）３１３−３１８参照）。
【０１０４】
多重ＴｎＡ／多重プロモーターの使用
本発明の一部の実施形態では、原核ゲノムは、異なる強度の外向きプロモーターを有する異なる活性化トランスポゾンの混合物を用いて探索される。一部の状況では、徐々に強度の低下する少なくとも３つの異なるプロモーターを有する活性化トランスポゾンの混合物を利用して変異体プールを生成する場合、抗生物質耐性及び／又は感受性に関与する一層広範囲の遺伝子が回収される。
【０１０５】
そのような状況では、様々な強度のプロモーターを有する複数の活性化トランスポゾンの使用は、実質的に全ての非必須遺伝子で生ずるトランスポゾン挿入が、最初の変異体プールで表れることを確実にする。その理由は、トランスポゾン挿入が、適切な（高すぎることもなく、低すぎることもない）転写レベルを生じる遺伝子活性化をもたらすことができるためである。
【０１０６】
そのような実施形態では、プロモーターの相対強度がＴｎＡＰ１＞ＴｎＡＰ２＞ＴｎＡＰ３である少なくとも３つの異なるプロモーターを使用することを条件として、多種多様なプロモーターが使用され得る。そのような原核ＤＮＡへのトランスポゾン挿入により、１つ又は複数の遺伝子がＴｎＡＰ１から転写され、１つ又は複数の遺伝子がＴｎＡＰ２から転写され、及び１つ又は複数の遺伝子がＴｎＡＰ３から転写されるメンバーを含有する変異体細胞のプールから生成される。
【０１０７】
標的細胞の存在下におけるインキュベーション及び変異体プールの培養に使用される条件下、変異生成原核宿主細胞において、ＴｎＡＰ１は、強いプロモーターであり、ＴｎＡＰ２は、中強度のプロモーターであり、ＴｎＡＰ３は、弱いプロモーターであることが好ましい。一部の実施形態では、ＴｎＡＰ１の相対転写開始速度は、これらの条件下でＴｎＡＰ３の速度よりも少なくとも３倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、又は少なくとも１００００倍高い。
【０１０８】
各プロモーターは、通常、（ａ）プリブノーボックス（−１０エレメント）、（ｂ）−３５エレメント、及び（ｃ）ＵＰエレメントを含む。当業者は、配列解析及び／又は発現構築物を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏ分析により、必要な相対強度を有するプロモーターを容易に特定することができる。
【０１０９】
適切なプロモーターとしては、大腸菌ｒｐｌＪプロモーター（大リボソームサブユニットタンパク質、中強度のプロモーター）、ｔａｃプロモーター（人工ｌａｃ／ｔｒｐハイブリッド、強いプロモーター）及びｒｒｎＢプロモーター（リボソームＲＮＡ遺伝子プロモーター、非常に強いプロモーター）が挙げられる。
【０１１０】
本明細書で使用するとき、ＰｒｐｌＪ及びＰｒｒｎＢという用語は、詳細には、それぞれ、５０Ｓリボソームサブユニットタンパク質Ｌ１０、及び１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のための大腸菌プロモーターを指す。他のグラム陰性細菌由来の、これら（及び他の）大腸菌プロモーターのオルソログも使用することができ、例えば、オルソロガスなシュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）又はアシネトバクター・バウマンニのプロモーターが特に挙げられる。
【０１１１】
例えば、大腸菌ｒｒｎＢ  ＰｒｒｎＢとオルソロガスなアシネトバクター・バウマンニ遺伝子は、遺伝子記号Ａ１Ｓ＿ｒ１２を有し、アシネトバクター・バウマンニ１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子をコードしており、対応するオルソロガスプロモーターは、本明細書でＰ（Ａ１Ｓ＿ｒ１２）と称される。したがって、方法がアシネトバクター・バウマンニに適用されるとき、ＴｎＰ１は、Ｐ（Ａ１Ｓ＿ｒ１２）であってもよい。
【０１１２】
同様に、本発明の方法がシュードモナス・エルギノーサに適用されるとき、ＴｎＰ２は、Ｐ．エルギノーサ由来の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子プロモーター（つまり、Ｐｓ．ＰｒｒｎＢ）であり得、一方、ＴｎＰ３は、Ｐ．エルギノーサ由来のｒｐｓＪ（小（３０Ｓ）リボソームサブユニットＳ１０タンパク質）遺伝子プロモーター（つまり、Ｐｓ．ＰｒｐｓＪ）及び大腸菌ＰｒｒｎＢから選択され得る。
【０１１３】
ＴｎＡ挿入の効果：細胞毒性化合物を発現する変異産生体細胞の生成
本発明の方法による活性化トランスポゾン（ＴｎＡ）を用いるトランスポゾン変異の使用は、非常に広範な範囲の表現型を産生可能であるが、その理由は、ＴｎＡの挿入の効果が、機能の全喪失、活性低下から様々な程度の活性増加まで変わり得、機能の変化（及び機能の獲得さえ）も起こり得るためである。
【０１１４】
このことは、ＴｎＡの原核産生体細胞ＤＮＡへの挿入の効果が、配列構成依存性であるという事実に従う。構造遺伝子のコーディング配列への挿入は、挿入による不活性化（及び機能の完全な喪失）をもたらし得る一方で、遺伝子又はオペロンの上流への挿入は、ＴｎＡＰ駆動による転写増加をもたらし、延いては遺伝子又はオペロンの発現を導くことができる（過剰発現の程度は、微妙な位置／極性効果に依存する）。
【０１１５】
ＴｎＡ挿入により、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方からの転写物が生じ得、変異原核産生体細胞のＤＮＡの非コーディング鎖のＴｎＡＰ駆動転写から生じるアンチセンス転写物の産生がもたらされ得るという事実により一層複雑さが増す。そのようなアンチセンス転写物は、遺伝子発現を抑制又は活性化し得る［例えば、前記原核細胞のＤＮＡの対応するコーディング（センス）鎖によりコードされる相補的ｍＲＮＡに結合することにより、遺伝子の発現を抑制し得る］、又は遺伝子抑制因子をコードする遺伝子の発現を抑制することにより遺伝子転写を活性化し得る。
【０１１６】
本発明の方法による活性化トランスポゾン（ＴｎＡ）を用いるトランスポゾン変異生成により、細胞毒性剤を発現する変異体を生じさせる機構の一部を以下に詳細に説明する。
【０１１７】
二次代謝プロセスの活性化
多くの細胞毒性化合物が、二次代謝経路の産物であり、したがって、増殖のために必要な一次代謝経路の優先性を維持するように働く制御性機構の支配下にある。これらの機構は、細胞毒性産物の産生を、共培養された標的細胞に対する活性について選抜することに基づく選抜では検出されない及び／又は不活性となるレベルまで、制限し得る。
【０１１８】
本発明の方法による活性化トランスポゾン（ＴｎＡ）を用いるトランスポゾン変異生成の使用によりもたらされ得る、産生体原核種の細胞ＤＮＡへのＴｎＡ挿入は、
（ａ）潜在性細胞毒性剤遺伝子若しくはオペロンの活性化因子の上流で起こり、そこでＴｎＡＰが、トランスに作用する活性化因子の転写増加を駆動し、潜在性細胞毒性剤遺伝子若しくはオペロンの発現を増加させる、又は
（ｂ）潜在性細胞毒性剤遺伝子若しくはオペロンの抑制因子を挿入により不活性化し、それにより潜在性細胞毒性剤遺伝子若しくはオペロンの発現を増加させる。
【０１１９】
いずれの場合においても、細胞毒性剤の産生を担う二次代謝経路の既存の制御が実際上無効にされた変異体が生成される。
【０１２０】
構造遺伝子の過剰発現及び不活性化
この文脈において、構造遺伝子は、制御に関連していない任意のＲＮＡ又はタンパク質産物をコードしている構造遺伝子であると解釈される。
【０１２１】
構造遺伝子過剰発現は、目的の細胞毒性化合物の産生を増加させ得、細胞毒性剤合成に関与する酵素の上流にＴｎＡを挿入することは、そこでＴｎＡＰが前記酵素の転写増加を駆動し、延いては前記酵素の発現増加を導くことから、目的の変異体の重要な種類の生成をもたらし得る。同様に、細胞毒性剤を副活性（ｓｉｄｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）として生じる酵素の上流にＴｎＡを挿入することは、そこでＴｎＡＰが転写増加を駆動し、延いては前記酵素の発現増加を導き、それにより、副活性を増加させて、細胞毒性剤のレベルを増加させる。
【０１２２】
構造遺伝子不活性化も、目的の細胞毒性化合物の産生を増加させ得る。これは、天然産物が、生合成的に、別のあまり有用でない化合物に変換される系に適用される時に、特に適用可能である。産生体原核種の細胞ＤＮＡにＴｎＡを挿入して、細胞毒性剤が基質となる酵素を挿入により不活化させることは、細胞毒性剤のレベルを増加させることから、目的の変異体の生成をもたらし得る。
【０１２３】
排出遺伝子の過剰発現
天然産物の生合成は、しばしば、ネガティブフィードバック制御の対象である。したがって、排出タンパク質又は排出システムによるネガティブフィードバック制御を媒介する化合物を細胞からクリアランスすることにより、目的の細胞毒性化合物の産生がもたらされ得る。例えば、ストレプトマイセス・ピウセチウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ）におけるドキソルビシン産生は、排出遺伝子ｄｒｒＡ及びｄｒｒＢの過剰発現により２倍を超えて増加され得る。
【０１２４】
したがって、細胞毒性剤合成のネガティブフィードバック制御を媒介する化合物のクリアランスに関与する排出遺伝子の上流にＴｎＡを挿入することは、そこでＴｎＡＰが前記排出遺伝子の転写増加を駆動し、延いては発現増加を導くことから、目的の変異体の別の重要な種類の生成をもたらし得る。
【０１２５】
前駆体供与
生合成経路におけるボトルネックは、天然産物の合成を制限している場合があり、一次代謝経路の重要な前駆体の提供を制限することに関連している場合がある。そのような制限は、そのようなボトルネックに関連する酵素をコードする遺伝子又はオペロンを上方調節することにより克服し得る。つまり、ボトルネック作用の減少に変換される酵素レベルを増加させると、延いては、目的の細胞毒性化合物の合成を改善することとなる。
【０１２６】
したがって、細胞毒性剤合成におけるそのようなボトルネックに関連する酵素の上流にＴｎＡを挿入することは、そこでＴｎＡＰが前記酵素の転写増加を駆動し、延いては発現増加を導くことから、目的の変異体のさらなる種類の生成をもたらし得る。
【０１２７】
潜在性遺伝子の活性化
多くの目的の細胞毒性化合物は、ほとんどの増殖条件下でサイレントである二次代謝プロセスの産物である。そのようなプロセスは、特定の増殖期にのみ、ある特定の増殖条件下、特定の発生段階（例えば、芽胞形成）の間に、細菌サイトカインによる誘導（例えば、クオラムセンシング系の一部として）、他の生物により産生される因子、栄養状態、温度、ストレス又は他の細胞内微生物制御因子により生じる刺激で誘導され得る。
【０１２８】
例えば、ストレプトマイセスｓｐｐ．を用いた最近のゲノムシーケンシングプロジェクトにより、この種が多くの「潜在性（ｃｒｙｐｔｉｃ）」抗生物質生合成経路を有すること、つまり、以前に実現されているよりも多くの抗生物質を産生する遺伝的能力を有することが明らかになった。これらの潜在性経路は、遺伝的遺物ではなく、活性化されて、新たな抗生物質の産生を指揮し得る。
【０１２９】
本発明の方法による活性化トランスポゾン（ＴｎＡ）を用いるトランスポゾン変異生成の使用によりもたらされ得る、産生体原核種の細胞ＤＮＡへのＴｎＡ挿入は、
（ａ）潜在性細胞毒性剤遺伝子若しくはオペロンの上流で起こり、そこでＴｎＡＰが、転写増加を駆動し、延いては潜在性細胞毒性剤遺伝子若しくはオペロンの発現を導く、又は
（ｂ）潜在性細胞毒性剤遺伝子若しくはオペロンの活性化因子の上流で起こり、そこでＴｎＡＰが、トランスに作用する活性化因子の転写増加を駆動し、潜在性細胞毒性剤遺伝子若しくはオペロンの発現を増加させる、又は
（ｃ）潜在性細胞毒性剤遺伝子若しくはオペロンの抑制因子を挿入により不活性化し、それにより潜在性細胞毒性剤遺伝子若しくはオペロンの発現を増加させる。
【０１３０】
いずれの場合においても、細胞毒性剤の産生を担う潜在性代謝経路を明らかにする変異体が、生成される。
【０１３１】
機能的ドメイン効果
細胞毒性剤の合成に関与する酵素は、多重の機能的に別個のドメインで構成され得る。産生体原核種の細胞ＤＮＡへのＴｎＡ挿入は、
（ａ）マルチドメイン酵素の１つ若しくは複数のドメインを挿入により不活性化し、それによりその機能を変化させて、直接的に若しくは間接的に、細胞毒性剤を合成する、又は
（ｂ）マルチドメイン酵素の１つ若しくは複数のドメインの上流で起こり、そこで、ＴｎＡＰが、前記１つ若しくは複数のドメインの転写増加を駆動し、それにより、前記酵素の機能を変化させて、直接的に若しくは間接的に細胞毒性剤を合成する
ことから、目的の変異体のさらに別の種類の生成に至り得る。
【０１３２】
最終的に、本発明の方法による活性化トランスポゾン（ＴｎＡ）を用いるトランスポゾン変異生成の使用は、産生体原核種の細胞ＤＮＡへのＴｎＡ挿入を生じさせることができ、これにより原核産生体細胞のコーディングレパートリーを変化させて、全く新規な細胞毒性剤が直接的又は間接的に発現させるようになる（つまり、得られる変異は、新形質であり得る）。
【０１３３】
ＴｎＡ挿入の配列構成の決定
上記で説明されるように、本発明の方法による活性化トランスポゾン（ＴｎＡ）を用いるトランスポゾン変異生成の使用により、多様性の豊富な変異体プールの産生がもたらされる。
【０１３４】
本発明のこの態様は、目的の細胞毒性剤の産生と関連するトランスポゾン挿入の配列構成を確立する能力によって補完される。これにより、細胞毒性剤、細胞内における細胞毒性剤が合成される代謝経路、及び細胞毒性剤の作用様式の特定が非常に容易になる（その理由は、変異体プール全体にわたるＴｎＡ挿入の分布により、共培養された原核細胞の耐性変異体における耐性因子／機構の独自性が明らかになり得るからである）。
【０１３５】
配列構成は、ＴｎＡ挿入部位（５’及び／又は３’）に隣接する又は近傍のＤＮＡをシーケンシング（例えば、ＴｎＡ−ゲノムＤＮＡ連結部を含むＤＮＡをシーケンシング）することによって決定されることが好ましい。通常、ＴｎＡの一方又は両方の末端の側方又は隣接する細菌ＤＮＡが配列決定される。
【０１３６】
配列決定される隣接ＤＮＡの長さは、広範囲である必要はなく、好ましくは比較的短い（例えば、２００塩基対未満）。
【０１３７】
様々な方法を使用して、ＤＮＡシーケンシングを使用するＴｎＡ挿入分布を決定することができる：そのような方法は、最近、Ｔｎ−ｓｅｑ手法と言い換えられている（ｖａｎ  Ｏｐｉｊｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６：７６７−７７２）。例えば、Ｔｎ−ｓｅｑ手法には、増幅されたＴｎ連結部のアフィニティ精製（Ｇａｗｒｏｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）ＰＮＡＳ  １０６：１６４２２−１６４２７）、特定の制限部位を使用する、トランスポゾン末端に遠位のゲノム配列へのアダプターのライゲーション（Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  ６：２７９−２８９；  ｖａｎ  Ｏｐｉｊｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６：７６７−７７２）、選択的増幅（Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９：２３０８−２３１６）、並びに、増幅及びエキソヌクレアーゼ消化によるゲノムＤＮＡの除去後のシーケンシングの鋳型として役立つ、Ｔｎ連結部を保持する一本鎖ＤＮＡサークルの生成（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）ｍＢｉｏ  ２（１）：ｅ００３１５−１０）が含まれる。
【０１３８】
任意の適切なハイスループットシーケンシング技術を使用することができ、本発明の方法で使用するために適切なシーケンシングプラットフォームが多数市販されている。逐次合成シーケンシング（ＳＢＳ）に基づくシーケンシングプラットフォームは、本発明の方法で使用するために特に適切である。例えば、イルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）（商標）システムは、比較的短い配列リード（５４、７５又は１００ｂｐ）を数百万も生成し、特に好ましい。
【０１３９】
他の適切な技術としては、可逆的ダイターミネーターに基づく方法が挙げられる。ここでは、ＤＮＡ分子が最初にスライド上のプライマーに接続され、局所的クローンコロニーが形成されるように増幅される（ブリッジ増幅）。４種のｄｄＮＴＰが加えられ、組み込まれないヌクレオチドは洗い流される。パイロシーケンシングと異なり、ＤＮＡは、１回に１つのヌクレオチドのみを延長することができる。カメラで蛍光標識されたヌクレオチドを撮像し、３’末端ブロッカーと一緒に色素をＤＮＡから化学的に除去すると、次のサイクルが可能になる。
【０１４０】
短い配列の読み取りが可能な他のシステムとしては、ＳＯＬｉＤ（商標）及びＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ技術［いずれもＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）より販売］が挙げられる。ＳＯＬｉＤ（商標）技術は、ライゲーションによるシーケンシングを利用する。ここでは、一定の長さの全ての可能性のあるオリゴヌクレオチドのプールを、シーケンシングされた位置に従って標識する。オリゴヌクレオチドをアニール及びライゲートし、ここでマッチング配列についてのＤＮＡリガーゼによる優先的ライゲーションは、その位置のヌクレオチドのシグナル情報となる。シーケンシングの前に、ＤＮＡを、エマルジョンＰＣＲによって増幅する。得られたビーズは、それぞれ同じＤＮＡ分子のコピーのみを含有しており、このビーズをガラススライド上に置く。結果は、イルミナシーケンシングに匹敵する量及び長さの配列となる。
【０１４１】
Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．は、標準的シーケンシング化学の使用を基礎とするが新規で半導体ベースの検出システムを開発した。このシーケンシング方法は、他のシーケンシングシステムで使用されている光学的方法とは対照的に、ＤＮＡの重合の間に放出される水素イオンの検出に基づく。配列決定される鋳型ＤＮＡ鎖を含有するマイクロウェルを、単一の種類のヌクレオチドで溢れさせる。導入されたヌクレオチドが先導の鋳型ヌクレオチドに相補的である場合は、伸長する相補鎖に組み込まれる。これにより水素イオンが放出され、水素イオンにより高感度イオンセンサーが作動して、反応が生じたことが示される。ホモポリマーの反復が鋳型配列内に存在する場合、単一サイクル中に多重ヌクレオチドが組み込まれる。これにより、対応する数の放出する水素及び比例的に高くなる電子シグナルが与えられる。
【０１４２】
変異体の機能的評価
上記の配列情報の解析は、細胞毒性剤の産生及び／又は作用様式における１つ又は複数の細胞要素の機能的役割の評価を可能にする。
【０１４３】
適切な解析技術としては、バイオインフォマティクスが挙げられ、ここでは、ＴｎＡ挿入により影響を受ける遺伝要素の（全長又は部分）配列を使用して、分析された原核細胞及び／又は他の種由来の情報を含む配列データベースを調べ、必須の（１つ又は複数の）生化学的機能が既に割り当てられている及び／又は必須であることが示されている遺伝子（例えば、他種におけるオルソロガス遺伝子）を特定する。
【０１４４】
適切なバイオインフォマティクスプログラムは当業者に周知であり、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）プログラムを含む（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）。適切なデータベースとしては、例えば、ＥＭＢＬ、ＧＥＮＢＡＮＫ、ＴＩＧＲ、ＥＢＩ、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ及びｔｒＥＭＢＬが挙げられる。
【０１４５】
代替的に、又は追加的に、関連づけられた遺伝子／遺伝的要素の（完全又は部分）配列を使用して、先行技術（例えば、Ｇａｗｒｏｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）ＰＮＡＳ  １０６：１６４２２−１６４２７；  Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  ６：２７９−２８９；  ｖａｎ  Ｏｐｉｊｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６：７６７−７７２；  Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９：２３０８−２３１６；  Ｇａｌｌａｇｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）ｍＢｉｏ  ２（１）：ｅ００３１５−１０）及び／又は国際公開第０１／０７６５１号（それらの内容は参照により組み込まれる）に示される）に記載の従来のＴｎ−ｓｅｑ方法を使用して先に構築されている遺伝子の独自性に関する情報を含む配列データベースを調べる。
【０１４６】
挿入されたプロモーターの位置を、関連する下流ＤＮＡ配列の転写増加への寄与に関して評価してもよい。この技術の数学的／技術的に直行的なバイオインフォマティクス成分により、推定される細胞毒性剤遺伝子の転写に対する挿入されたプロモーター配列の寄与を認識することができる。バイオインフォマティクスは、定義されたＲＮＡ転写終結配列が無い、挿入された検討トランスポゾンに隣接する遺伝子の下流の遺伝子に対する転写リードスルーの効果を可能にする。
【０１４７】
微小液滴共封入
本発明の方法は、ハイスループットスクリーニングに適切であるが、その理由は、方法が、スクリーニング分析を、別個の微小液滴の形態で、増殖培地の小体積に区画化することを含んでいるためである。これにより、各微小液滴を、別個の培養容器として処理することが可能となり、確立された微小流体及び／又は細胞選別方法を使用して、大多数の個々の液体共培養を迅速にスクリーニングすることが可能になる。
【０１４８】
したがって、本発明の微小液滴は、その中で産生体細胞及び標的細胞を、共培養、解析、操作、単離及び／又は選別することができる、個々の別個の培養容器として機能する。
【０１４９】
本発明による微小液滴に変異産生体細胞及び標的細胞を共封入するために、任意の適切な方法を利用し得る。例えば、変異産生体細胞及び標的細胞は、国際公開第９８／４１８６９号に記載の方法に従って、ゲル微小液滴中に共封入され得る。このように、ゲル液滴は、イオン又は熱ゲル化原理を使用して作製することができる。通常、産生体細胞及び標的細胞を、ゲルマトリックスの流体前駆体と混合する。次いで、これを重合により固化し、細胞への外傷ができるだけ少なくなるようにする。例えば、温度、浸透圧及びｐＨの変化から生じるショックは、最小化すべきである。ハイドロゲルの使用が一般に好ましいが、その理由は、ハイドロゲルが保水性及び多孔性が高く、栄養物及び廃棄産物の自由な拡散を可能にするためである。多くのそのようなマトリックスが、当該分野で既知であり、例えば、アルギネート、カラギーナン、アガロース、キトサン、セルロース、ペクチン及びポリアクリルアミドなどの多糖類が挙げられる。
【０１５０】
産生体細胞及び標的細胞をゲルマトリックス材料に添加して、懸濁液を形成し、マトリックスが液相中にある一方で均一に分散させてもよい。ゲル領域又はゲル液滴は、確立された技術を使用してゲルマトリックス懸濁液の個々の小体積を形成後、マトリックスを硬化することにより、形成される。適切な技術としては、例えば、油を用いた乳化、ボルテックス、超音波処理、均質化、シリンジ型装置を使用した滴下、懸濁液のリザーバに付けられたノズルの振動、微粒化とその後の静電分離、又は回転ワイヤを用いた切断が挙げられる。
【０１５１】
エマルジョン共封入
本発明では、共封入は、乳化によることが好ましい。下記に記載するように、シングル相及びダブル相の両方のエマルジョンを使用することができ、例えば、油中水（Ｗ／Ｏ）型及び水中油中水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）型エマルジョンを使用し得る。Ｗ／Ｏエマルジョンでは、分散相は、連続油相に懸濁された水性増殖培地の微小液滴を含んでもよい。Ｗ／Ｏ／Ｗエマルジョンでは、分散相は、水性増殖培地の微小液滴が油相に包まれ、次いで微小液滴が連続水性相に懸濁されている、微小液滴を含んでもよい。そのようなＷ／Ｏ／Ｗエマルジョンは、単純なＷ／Ｏエマルジョンを上回る向上したレオロジー特性を示し得る：例えば、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルジョンは、ＦＡＤＳを使用して選別されるとき及び／又は微小流体装置（下記参照）を使用して処理されるとき、より低い粘度を示し、より高い流速／より低い運転圧力を可能にし得る。
【０１５２】
したがって、本発明の最も簡易な実施形態では、共封入は、連続相としてのキャリア液体に分散された変異産生体細胞及び標的細胞を含有する液体増殖培地の微小液滴を含むエマルジョンの形成を含む。そのようなシングルエマルジョンは、Ｗ／Ｏ型であり、連続相として任意の適切な液体を使用し得るが、但し、産生体細胞及び標的細胞の共培養のために選択された増殖培地と非混和性であることを条件とする。しかしながら、通常は、キャリア液体は、油である。
【０１５３】
特に、連続相の性質（例えば、油の種類）及び液滴サイズに応じて、上記の種のシングルエマルジョンは、ある特定の微小流体及び／又は細胞選別技術による微小液滴の選別を困難にする粘度を有し得る。例えば、粘度により、達成可能な（例えば、ＦＡＤＳ（下記参照）の使用において１秒あたり１０〜１００微小液滴の範囲への）流速が制限される場合がある及び／又は好ましくない高い操作圧力が必要となる場合がある。
【０１５４】
ダブルエマルジョン
本発明によれば、Ｗ／Ｏ／Ｗ型のダブルエマルジョンが特に好ましい。そのようなエマルジョンは、非混和性液体（通常、油）の殻に包まれた、変異産生体細胞及び標的細胞を含有する液体水性増殖培地の水性核を含有する微小液滴を含み、これらの微小液滴が、連続相としての水性キャリア液体に分散されている。
【０１５５】
この方法で封入された共培養物は、非常に低い粘性を示し、したがって、例えばＦＡＤＳ（下記参照）を使用して非常に高い流速で選別することができ、１秒あたり１０，０００を超える微小液滴の選別を可能にする（例えば、Ｂｅｒｎａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２５：１５１−１５７参照）。
【０１５６】
ダブルエマルジョンの共封入は、広範囲の適切な水性増殖培地、キャリア油、及び界面活性剤を使用して、任意の多種多様な技術によって達成し得る。ダブルエマルジョンを作製するため（及びＦＡＣＳを使用してそれらを選別するため）の適切な技術は、例えば、Ｂｅｒｎａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２５：１５１−１５７に記載されている。
【０１５７】
エマルジョン共封入に使用するための界面活性剤
本明細書で説明するとき、本発明の微小液滴（及び対応する微小培養物）は、油中水（Ｗ／Ｏ）型シングルエマルジョン又は水中油中水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）型ダブルエマルジョンを含むことができ、そのような実施形態では、１つ又は複数の界面活性剤が、エマルジョンを安定化するために必要であり得る。
【０１５８】
（１つ又は複数の）界面活性剤及び／又は（１つ又は複数の）補助界面活性剤は、好ましくは、（１つ又は複数の）Ｗ／Ｏ界面）に組み込まれ、したがって、シングルＷ／Ｏ型エマルジョンが使用される実施形態において、（１つ又は複数の）界面活性剤及び又は（１つ又は複数の）補助界面活性剤は、水性増殖培地微小液滴と連続相（例えば、油相）との界面に存在し得る。同様に、Ｗ／Ｏ／Ｗ型ダブルエマルジョンが、本発明による共封入のために使用される場合、（１つ又は複数の）界面活性剤及び又は（１つ又は複数の）補助界面活性剤は、水性核と非混和性殻（例えば、油殻）との界面並びに油殻と連続水性相との界面の一方又は両方に存在し得る。
【０１５９】
広範囲の適切な界面活性剤が利用可能であり、当業者は、選択したスクリーニングパラメータに従って適切な界面活性剤（及び、必要であれば、補助界面活性剤）を選択することができる。例えば、適切な界面活性剤は、Ｂｅｒｎａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２５：１５１−１５７；  Ｈｏｌｔｚｅ及びＷｅｉｔｚ（２００８）Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ  ８（１０）：１６３２−１６３９；及びＨｏｌｔｚｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ．８（１０）：１６３２−１６３９に記載されている。
【０１６０】
（１つ又は複数の）界面活性剤は、生体適合性であることが好ましい。例えば、（１つ又は複数の）界面活性剤は、選抜で使用される変異産生体細胞及び標的細胞に非毒性であるように選択され得る。さらに選択された（１つ又は複数の）界面活性剤は、封入された細胞の増殖及び／又は生存能力に必要となり得る気体に良好な溶解度を有し得る。
【０１６１】
生体適合性は、任意の適切な分析を使用して決定することができ、例えば、参照感度生化学分析（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳）を用いた適合性試験に基づく分析は、細胞レベルの生体適合性の代わりとして役立つ。例えば、蛍光発生的基質（フルオレセインジ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＦＤＧ））を有する酵素β−ガラクトシダーゼをコードするプラスミドＤＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳（ＩＶＴ）を、生体適合性の指標として使用することができ、これは封入されたＤＮＡ、転写及び翻訳に関与する分子、並びに翻訳されたタンパク質が液滴界面に吸着せず、タンパク質の高次構造が完全に維持されるとき、蛍光産物が形成されるからである。
【０１６２】
さらに、（１つ又は複数の）界面活性剤は、微小液滴界面で生体分子の吸着を予防し得る。これにより、標的細胞が変異産生体細胞により分泌される細胞毒性剤に確実に完全に曝露され、選抜の感度が増加し得る。さらに、例えば、細胞増殖、遺伝子発現及び／又はシグナル伝達に必要な生体分子の隔離を予防することにより、生体適合性にも寄与し得る。
【０１６３】
さらに界面活性剤は、個々の微小液滴（及び対応する微小培養物）を単離する機能を有し得、したがって微小液滴（及び対応する微小培養物）は、変異産生体細胞及び標的細胞の共培養のための個々の微小容器として役立つ。そのような実施形態では、界面活性剤は、疎水性及び疎油性の両方であり得、したがって水性相の生物学的試薬に対して低い溶解度を示す一方で微小液滴間の分子拡散を阻害し得る。
【０１６４】
一部の実施形態では、界面活性剤は、インキュベーションステップの間に、油相に分散された水性培地（封入された細胞を含有）の液滴を含むシングルエマルジョンを安定化する（つまり、合体を防止する）。同様に、界面活性剤は、インキュベーションステップの間に、水中油中水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）型ダブルエマルジョンにおける水性培地（封入された細胞を含有）の液滴を安定化することができる。
【０１６５】
したがって、界面活性剤は、単一変異産生体細胞及び（１つ又は複数の）標的細胞の共培養のために採用された条件下で微小液滴ライブラリを安定化することができ、したがって、選択されたインキュベーション温度（例えば、約２５℃）で、選択されたインキュベーション時間（例えば、少なくとも１時間、及び一部の実施形態では最大１４日間）、微小液滴を安定化し得る。
【０１６６】
安定化性能は、例えば、位相差顕微鏡、光散乱、集束ビーム反射測定法、遠心分離、及び／又はレオロジーによりモニターすることができる。
【０１６７】
適切な界面活性剤の例としては、以下が挙げられる：Ａｂｉｌ  ＷＥ  ０９（Ｅｖｏｎｉｋ−セチルＰＥＧ／ＰＰＧ  １０／１ジメチコン、ポリグリセリル−４イソステアレート及びヘキシルラウレートの１：１：１混合物）、スパン（Ｓｐａｎ）（登録商標）８０、トゥイン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０、トゥイン（登録商標）８０、及びそれらの組み合わせ。
【０１６８】
エマルジョン共封入に使用するための油
水性増殖培地と非混和性の任意の液体を本発明による使用のための微小液滴エマルジョンの形成に使用し得ることが理解されるはずであるが、非混和性流体は通常、油である。
【０１６９】
油は、水性相の生物学的成分に対して溶解度が低い油から選択されることが好ましい。他の好ましい機能的特性としては、気体への良好な溶解度、微小液滴間の分子拡散を阻害する能力、及び／又は疎水性と疎油性の組み合わせが挙げられる。油は、炭化水素油であり得るが、好ましくは、軽油、フルオロカーボン又はエステル油である。上記油の２種以上の混合物も好ましい。
【０１７０】
適切な油の例としては、炭酸ジエチルヘキシル［テゴソフト（Ｔｅｇｏｓｏｆｔ）（登録商標）ＤＥＣ（Ｅｖｏｎｉｋ）］、軽油（Ｆｉｓｈｅｒ）、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１７１】
微小液滴乳化のためのプロセス
広範囲の様々な乳化方法が、当業者にとって既知であり、それらの方法のいずれも、本発明の微小液滴を作製するために使用し得る。
【０１７２】
多くの乳化技術は、２つの液体をバルクプロセスで混合することを含み、しばしば乱流を使用して液滴の分裂を増加させることを含む。そのような方法としては、ボルテックス、超音波処理、均質化、又はそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１７３】
乳化のためのこれらの「トップダウン」アプローチは、個々の液滴形成の制御にはほとんど利用できず、広い微小液滴サイズ分布が通常生じる。代替的「ボトムアップ」アプローチは、個々の液滴レベルで作用し、微小流体装置の使用を含むこともできる。例えば、エマルジョンは、微小流体装置において、油の流れと水の流れをＴ字ジャンクションで衝突させることにより形成することができ、得られた微小液滴は、各流れの流速に応じてサイズが変動する。
【０１７４】
本発明による使用のための微小液滴を作製するための好ましいプロセスは、フロー集束（例えば、Ａｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．８２（３）：３６４−３６６に記載）を含む。ここでは、分散相（集束された又はコア流体）の側方又は周囲の連続相流体（集束又はシース流体）が、両方の流体が押し出されるオリフィスの周辺で、液滴分断を生じさせる。フロー集束装置は、連続集束流体供与により加圧された加圧チャンバからなる。内側では、１つ又は複数の集束された流体が、先端が小さいオリフィスの前で開いているキャピラリー送管を通じて注入され、オリフィスは、加圧チャンバと外部の周囲環境とを繋ぐ。集束流体流は、流体メニスカスをカスプ型にし、オリフィスを通ってチャンバを出る安定なマイクロ又はナノ噴流を生じさせる：噴流のサイズは出口のオリフィスよりも非常に小さい。キャピラリー不安定により、安定な噴流が分かれて、均質な液滴又は泡になる。
【０１７５】
送管は、２以上の同心針と、化合物の液滴を導く様々な非混和性注入液体又は気体とで構成され得る。フロー集束は、噴流が分かれるとき、１秒あたり最大数百万の非常に高速の制御された液滴を確実に作製する。
【０１７６】
他の可能な微小流体液滴形成技術としては、ピコインジェクションが挙げられ、ここでは最初に水中油型液滴が形成された後、Ｔ字の上部に沿ってＴ字ジャンクションに送られ、次いで水性内相が油滴に注入され、ダブルエマルジョンが生成する。
【０１７７】
全ての場合において、選択した微小液滴形成プロセスの性能は、位相差顕微鏡、光散乱、集束ビーム反射測定法、遠心分離、及び／又はレオロジーによりモニターすることができる。
【０１７８】
蛍光活性化液滴選別
本明細書で説明されるように、本発明の方法は、ハイスループットスクリーニングに適切であるが、その理由は、方法が、スクリーニング分析を、個別の微小液滴の形態で、増殖培地の小体積に区画化することを含んでいるためである。これにより、各微小液滴を、別個の培養容器として処理することが可能となり、確立された微小流体及び／又は細胞選別方法を使用して、大多数の個々の液体共培養物を迅速にスクリーニングすることが可能になる。
【０１７９】
したがって、共封入ステップの後、得られた微小液滴は、十分確立された蛍光活性化細胞選別（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ、ＦＡＣＳ）装置及びプロトコルに適応させることにより、選別してもよい。この技術は、蛍光活性化液滴選別（ＦＡＤＳ）と称され、例えば、Ｂａｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ  ９：１８５０−１８５８に記載されている。
【０１８０】
ＦＡＤＳは、本発明の方法で微小液滴を形成した後の任意の段階で微小液滴を操作するために使用することができるが、好ましくは、標的細胞が変異産生体細胞により増殖が追い越されているか又は圧倒されて消滅している微小培養のライブラリを選抜するために少なくとも使用される。さらにＦＡＤＳは、共封入ステップの間に、例えば、（１つ又は複数）の変異産生体細胞及び／又は標的細胞を含まない空の微小液滴を除去するために使用し得る。
【０１８１】
ＦＡＤＳを可能とするために、変異産生体細胞及び標的細胞のいずれか又は両方を、蛍光標識してもよい。この目的のために、様々な蛍光タンパク質、例えばオワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）の野生型緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Ｃｈａｌｆｉｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：８０２−８０５）及び改変ＧＦＰ（Ｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．１９９５、Ｎａｔｕｒｅ  ３７３：６６３−４；ＰＣＴ国際公開第９６／２３８１０号）を、標識として使用することができる。代替的に、ＤＮＡ２．０のＩＰ−Ｆｒｅｅ（著作権）合成非オワンクラゲ属蛍光タンパク質を、様々な蛍光タンパク質をコードする、ＰＣＲにより増幅可能な配列の供給源として使用してもよく、又は側方ＢｓａＩ制限部位を使用して切り出し、任意の好ましい他の発現ベクターにクローニングしてもよい。
【０１８２】
この種のレポーター遺伝子が転写及び翻訳されると、細胞において蛍光タンパク質の蓄積をもたらし、細胞をＦＡＤＳで検査できるようになる。
【０１８３】
インキュベーション
インキュベーション条件及び水性増殖培地の性質は、選択された産生体細胞及び標的細胞の性質に従って選択され、当業者は、適切な培地、増殖温度及びインキュベーション期間を容易に設定することができる。
【０１８４】
例えば、中温性生物は、一般に、１５℃〜４２℃でインキュベートされ、一方で、中等度好熱菌は、より高い温度（通常、４０℃〜６０℃）で培養される。
【０１８５】
好熱菌及び超好熱菌は、より高い温度（典型的には、それぞれ６０℃〜８０℃及び８０℃〜９８℃）で培養し得る。
【実施例】
【０１８６】
本発明を、特別の例を参照して記載する。これらは単なる例示であり、例証を目的とするものにすぎない。これらはいかなる意味でも独占的請求項又は説明されている本発明を限定することを意図していない。これらの例は、本発明を実施するために意図される現在の最良の形態を構成する。
【０１８７】
実施例１：シングルエマルジョンを使用する封入
連続相のための油ミックス
７３％のテゴソフトＤＥＣ（Ｅｖｏｎｉｋ）と、２０％の軽油（Ｆｉｓｈｅｒ）と、７％のＡｂｉｌ  ＷＥ０９（Ｅｖｏｎｉｋ）（界面活性剤）
７０％のテゴソフトＤＥＣ（Ｅｖｏｎｉｋ）と、２０．３％の軽油（Ｆｉｓｈｅｒ）と、４．５％のスパン８０（界面活性剤）と、４．８％のトゥイン２０（界面活性剤）
９０％の軽油と、１０％のスパン８０（界面活性剤）
【０１８８】
全ての油ミックスは、少なくとも使用の３０分前に作製しておく必要があるが、永続的に保管することができる。
【０１８９】
分散相のための水性増殖培地
この培地は、以下から選択し得る：
ＳＯＣブロス（２０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、１０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＭｇＳＯ４及び２０ｍＭのグルコース）、
ＳＯＣ＋５％グリセロール、
ＬＢブロス（１０ｇ／Ｌのペプトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ）、
２×ＹＴ（１６ｇ／Ｌのトリプトン、１０ｇ／Ｌの酵母エキス、５ｇ／ＮａＣｌ）、
２×ＹＴ＋０．５％のグルコース及び５％のグリセロール、
２×ＹＴ＋５％のグリセロール、
ペプトングリセロール培地  ５ｇ／Ｌのペプトン、５％のグリセロール
【０１９０】
炭素源としてグリセロールを含有することにより、ボルテックスによる微小液滴の形成を促進することができる。
【０１９１】
１．作製される液滴あたり＜１個の産生体細胞及び≧１個の標的細胞となるような適切な細胞数で産生体細胞及び標的細胞を含有する０．５ｍｌ〜１０ｍｌの増殖培地。これを適切な容器（エッペンドルフチューブ１．５若しくは２ｍｌ、１５ｍｌ若しくは５０ｍｌのファルコン、又は２４ウェルプレートが許容され得る）に分割する。
２．次いで、この増殖培地を、１〜２倍体積の油ミックスで積層する。
３．これを３〜６分（通常５分）、１２，０００〜１８，０００ｒｐｍでボルテックスする。使用する油及び培地並びに所望の液滴サイズにより速さは変化するが、一般的法則として、速さが速く、ボルテックスが長いほど、平均液滴サイズは小さくなる（但し、サイズの幅が、この方法によって常に生じる）。
４．液滴の完全性及び内部の細胞の存在を、位相差を使用して顕微鏡下で視覚的に選抜する。代替的視覚化方法は、例えば蛍光を使用し得る。
５．次いで、液滴を、適切な温度で（通常、３７℃であるが、４℃〜９５℃で安定である）、１時間〜≧１４日間インキュベートする。
６．次いで、必要な及び所望の細胞が液滴から回収されたら、液滴をＦＡＤＳにより選別し得る。
７．液滴を分解するために、さらなる界面活性剤を添加し（例えばテゴソフト油に対して１％のＳＤＳであるが、トゥイン、サルコシル（Ｓａｒｃｏｓｙｌ）などの任意の適切な界面活性剤を使用し得る）、これにより液滴の完全性を崩壊させて、細胞を放出させる。
８．一部の油ミックスは、溶液を凍結して液滴を崩壊することにより溶解させてもよい。
９．次いで細胞を遠心分離により回収してもよく、又は試料を直接、ＤＮＡ抽出のためにカラムにかけてもよい。
【０１９２】
実施例２：ダブルエマルジョンを使用する封入
水性増殖培地
実施例１（上記）と同様。
水性外相を作製するために使用したミックス：
２％のトゥイン２０を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；１０ｍＭのリン酸緩衝液、１３７ｍＭのＮａＣｌ）、
２％のトゥイン８０（界面活性剤）を含むＰＢＳ。
【０１９３】
液滴殻のための油ミックス
１．作製される液滴あたり＜１個の産生体細胞及び≧１個の標的細胞となるような適切な細胞数で産生体細胞及び標的細胞を含有する０．５ｍｌ〜１０ｍｌの増殖培地。これを適切な容器（エッペンドルフチューブ１．５又は２ｍｌ、１５ｍｌ又は５０ｍｌのファルコン又は２４ウェルプレートが許容される）に分割する。
２．次いで、この増殖培地を、１〜２倍体積の油ミックスで積層する。
３．これを、３〜６分（通常５分）、１２，０００〜１８，０００ｒｐｍでボルテックスする。使用する油及び培地並びに所望の液滴のサイズにより速さは変化し、一般的法則として、速さが速く、ボルテックスが長いほど、平均液滴サイズは小さくなるが、サイズの幅が、この方法によって常に生じる。
４．液滴の完全性及び内部の細胞の存在を、位相差を使用して顕微鏡下で視覚的に選抜する。代替的視覚化方法は、例えば蛍光を使用し得る。
５．次いで、第２のボルテックスステップを導入して、ダブルエマルジョンを生成する。油体積と同体積の第２水性相を界面活性剤と共にシングルエマルジョンに加える。次いでこれを、より低いｒｐｍ（６，０００〜１０，０００ｒｐｍ）でほんの２〜３分間ボルテックスする。次いでダブルエマルジョン液滴の形成を、先と同様に、顕微鏡で可視化してもよい。
６．次いで、液滴を、適切な温度（通常、３７℃であるが、４℃〜９５℃で安定である）で、１時間〜≧１４日間インキュベートする。
７．必要な及び所望の細胞が液滴から回収されたら、次いで液滴をＦＡＤＳにより選別してもよい。
８．液滴を分解するために、さらなる界面活性剤を添加し（例えばテゴソフト油に対して１％のＳＤＳであるが、トゥイン、サルコシルなどの任意の適切な界面活性剤を使用し得る）、これにより液滴の完全性を崩壊させて、細胞を放出させる。
９．一部の油ミックスは、溶液を凍結して液滴を崩壊することにより溶解させてもよい。
１０．次いで細胞を遠心分離により回収してもよく、又は試料を直接、ＤＮＡ抽出のためにカラムにかけてもよい。
【０１９４】
実施例３：微小流体チップを使用する微小液滴の作製
微小流体中の液滴生成は、シングル及びダブルエマルジョンの生成を可能にする。最も単純な形態において、ダブルエマルジョンは、連続的な、水中油液滴の形成、及びそれに続く、同じ方法による第２水性相の形成により形成される。
【０１９５】
代替的な方法では、油中水性相、次いで水性培地の第２連続相中の油−水液滴の同時的共封入が含まれる。チップ上の液滴形成により、非常に均一なサイズの液滴が生成される。サイズは、直接的に、液滴を生成するために使用される流体のチャネルのサイズ及び流速に関係する。微小流体液滴形成は、液滴をバルクで「トップダウン」型式で作製するときは利用できない新たな油及び界面活性剤の使用を可能にする。
【０１９６】
適切な増殖培地における産生体細胞及び標的細胞は、適切な比率で混合されて、液滴あたり≦１個の産生体及び液滴あたり≧１個の標的細胞を可能にする。この細胞の水性混合物を、下記に記載するような油中水シングルエマルジョン液滴又はダブルエマルジョン液滴の形成を可能にする幾何配置の微小流体装置を通じてポンプで送り込む。
【０１９７】
これらの液滴を、インキュベーションに適切な容器中に回収し、次いで、液滴を、適切な温度（通常、３７℃であるが、４℃〜９５℃で安定である）で、１時間〜≧１４日間インキュベートする。
【０１９８】
必要な及び所望の細胞が液滴から回収されたら、次いで液滴をＦＡＤＳにより選別してもよい。
【０１９９】
液滴を分解するために、さらなる界面活性剤を添加し（例えばテゴソフト油に対して１％のＳＤＳであるが、トゥイン、サルコシルなどの任意の適切な界面活性剤を使用し得る）、これにより液滴の完全性を崩壊させて、細胞を放出させる。一部の油ミックスは、溶液を凍結して液滴を崩壊することにより溶解させてもよい。
【０２００】
次いで細胞を遠心分離により回収してもよく、又は試料を直接、ＤＮＡ抽出のためにカラムにかけてもよい。
【０２０１】
実施例４：フロー集束を使用するダブルエマルジョン微小液滴の作製
ここでは、油が側部から疎水性チャネルへと流れ、水性相の分断が生じ、油中水型液滴が生成される。この方法により良好なサイズ制御が可能となり、第２の液相の流速に応じて１秒あたり１０００個の液滴が生成される。
【０２０２】
２つのそのようなチップを直列に連結して使用して、ダブルエマルジョンを生成することができる。第１の液滴は、油中水性相であり、この液滴を、あたかも水性相、流れる側の油が、第２の水性相と置き換わるように、第２のチップ中に押し通す。
【０２０３】
両方のステップを、単一のチップ及びジャンクションのインターフェースとして統合することも可能であり、これにより、油中水型液滴が形成され、直ぐに水性外相に囲まれて、Ｗ／Ｏ／Ｗダブルエマルジョンが生成される。
【０２０４】
親水性及び疎水性コーティングは、第２のチップ上で反対になり、したがって、第２のチップは、同じ幾何配置であるが、キャリア／シース流体としての水性相の流れを促進するために反対の表面コーティングとなっている。これにより、２段階の封入が可能となる：第１段階は、産生体細胞及び標的細胞のインキュベーション及び共培養に使用される単一相エマルジョンを生成する段階であり、第２段階は、微小培養物をその後のＦＡＤＳのためにダブルエマルジョンに変換する段階である。
【０２０５】
実施例５：原核及び真核細胞の共培養条件
細菌及び真核細胞のバランスのとれた共培養（つまり、原核及び真核細胞の両方の倍加速度が、１つの種類の細胞の過剰増殖をもたらすようには異なっていない培養条件）は、適切な培養培地及びインキュベーション条件（特に曝気の程度及びインキュベーションの温度）の選択により容易に達成することができる。
【０２０６】
下記の表１は、市販の組織培養培地中で、一般に使用される哺乳動物培養培地中の哺乳動物細胞の培養に使用される条件と同一の条件下（つまり、３７℃）、共培養に使用された土壌細菌の増殖を示す。表２は、これらの条件下での選択真核細胞株の公開された増殖速度を示す。表３は、温度を３０℃（３７℃でなく）とする以外は表１に示したデータを取得するために使用した条件と同一の条件下、市販の組織培養培地中で共培養した土壌細菌の増殖を示す。
【０２０７】
【表１】
0006673575.tif 000002
【０２０８】
【表２】
0006673575.tif 000003
【０２０９】
【表３】
0006673575.tif 000004
【０２１０】
増殖速度は、各培養物を３０℃で所望の哺乳動物培養培地中で一晩新たに培養させて増殖させることにより計算した。これを新鮮な組織培養培地に入れて５０分の１に希釈した後、ＯＤ６００を、３７℃＋５％ＣＯ２又は３０℃で増殖させながら様々な時間点で測定した。培養対数増殖の間の倍加時間から３連で増殖させた個々の培養物に基づいて、増殖速度を計算した。
【０２１１】
上記データから理解できるように、共培養における原核細胞及び真核細胞の相対増殖速度は、バランスのとれた共培養を達成するために、特にインキュベーション温度を含む適切な培養条件を選択することにより、容易に制御し得る。
【０２１２】
均等
上記の説明は、本発明の現行での好ましい実施形態を詳細に述べたものである。これらの説明を検討するにあたり、その実施における多数の修飾及び変形が、当業者には予測される。これらの修飾及び変形は、添付の請求項の範囲内に包含されることが意図されている。