(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ又は複数のポリマー、及び、前記１つ又は複数のポリマーの少なくとも１つと共有結合するペプチドを含む、対象物表面用コーティングであって、前記ペプチドが、
ａ）限定された数の微生物の株、種又は属からなる第１の群に属する微生物により特異的に供与される第１の化合物により切断され、前記第１の群に属さない任意の微生物により供与される任意の化合物により切断されない、第１の切断部位、
ｂ）発光波長が６５０〜９００ｎｍである、第１の蛍光剤、
ｃ）吸収波長が６５０〜９００ｎｍであり、前記第１の蛍光剤の前記発光を消光する、第１の非蛍光剤を含み、
前記第１の切断部位での切断がコーティングからの前記第１の非蛍光剤の放出をもたらし、前記第１の非蛍光剤の放出が前記第１の群に属する微生物の存在を示し、
コーティングからの前記第１の非蛍光剤の放出時に、第１の蛍光剤が対象物表面用コーティングに共有結合したままである、
対象物表面用コーティング。
【請求項２】
前記１つ又は複数のポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールジアクリレート、ポリラクチド、ポリビニルアルコール、ポリＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド／ポリエチレングリコールコポリマー及びその組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の対象物表面用コーティング。
【請求項３】
前記ペプチドが、Ｎ若しくはＣ末端又は側鎖を介して、好ましくはＣ末端又は側鎖を介して、最も好ましくは側鎖を介して、Ｃ４〜Ｃ３０のヒドロカルビルリンカーによって前記１つ又は複数のポリマーの少なくとも１つに共有結合し、
Ｃ４〜Ｃ３０のリンカーが、環状ヒドロカルビル基又は環状複素環基を含み、好ましくは前記複素環基がトリアゾール基である、請求項１又は２に記載の対象物表面用コーティング。
【請求項４】
第１の切断部位が、グラム陽性菌又はグラム陰性菌、好ましくはグラム陽性菌、より好ましくはブドウ球菌属、連鎖球菌属、エンテロコッカス属及びバシラス属、コリネバクテリウム属、ノカルディア属、クロストリジウム属、アクチノバクテリア属及びリステリア属により供与される化合物によって切断される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の対象物表面用コーティング。
【請求項５】
第１の切断部位が、Ｖ８プロテアーゼ、ＩｇＡ１プロテアーゼ、オーレオリシンからなる群から選択されるプロテアーゼである、第１の化合物により切断される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の対象物表面用コーティング。
【請求項６】
第１の切断部位が、ＥＦＲＩＫ（配列番号１）、ＤＦＲＩＫ（配列番号２）、ＧＩＧＥＦＲＩＫ（配列番号４）、ＧＩＧＤＦＲＩＫ（配列番号５）からなる群から選択される、特定のアミノ酸モチーフを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の対象物表面用コーティング。
【請求項７】
前記第１の蛍光剤が、発光波長６５０〜９００ｎｍを有するシアニン色素であり、
前記第１の非蛍光剤が、吸収波長６５０〜９００ｎｍを有するシアニン色素である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の対象物表面用コーティング。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の対象物表面用コーティングを含む対象物であって、
医療用埋入物、医療機器、医療用綿棒、マイクロウェルプレート、食品調理用の表面及び調度品からなる群から選択される、
又は、
針、カテーテル、ガイドワイヤー、スクリュー、埋入板、及び埋入ピンの群から選択される、対象物。
【請求項９】
ａ）第１の蛍光剤、第１の非蛍光剤、第１の切断部位、及びアジド基を含むペプチドを用意するステップ、
ｂ）ステップａ）で得られるペプチドと、アルキン基を含むＣ５〜Ｃ２５ジアクリレートを接触させるステップ、
ｃ）ステップｂ）で得られるペプチド−ジアクリレートコンジュゲートを、１つ又は複数のポリマーで架橋するステップ
を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の対象物表面用コーティングを調製する方法。
【請求項１０】
対象物をコーティングする方法であって、
ａ）請求項１〜７のいずれか一項に記載の対象物表面用コーティングを用意するステップ、
並びに、
ｂ）ステップａ）の対象物表面用コーティングでコーティングしようとする、医療用埋入物及び医療機器からなる群から選択される対象物を浸漬コーティングするステップ、及び、
ｃ）ステップｂ）で得られる前記対象物を乾燥するステップ、
又は、
ｂ）医療用綿棒、マイクロウェルプレート、食品調理用の表面及び調度品からなる群から選択される対象物を、ステップａ）の対象物表面用コーティングと接触させるステップ
を含む、方法。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の対象物表面用コーティングを調製する方法であって、
ａ）反応基Ａをさらに含む１つ又は複数のポリマーを含む、対象物表面を用意するステップ、及び
ｂ）ステップａ）による対象物表面と、第１の蛍光剤、第１の非蛍光剤、第１の切断部位、並びに、反応基Ａ及び反応基Ｂが共有結合を形成するような、反応基Ａに相補的な反応基Ｂを含むペプチドを接触させて、前記対象物表面用コーティングを調製するステップ
を含み、
前記反応基Ａが、アルコール（ＯＨ）、チオール（ＳＨ）、アミン（ＮＨ２）、酸（ＣＯ２Ｈ）、アルキン、アルケン、アジド、好ましくはアルキン又はアジド、より好ましくはアルキンからなる群から選ばれ、
前記反応基Ｂが、アルコール（ＯＨ）、チオール（ＳＨ）、アミン（ＮＨ２）、酸（ＣＯ２Ｈ）、アルキン、アルケン、アジド、好ましくはアルキン又はアジド、より好ましくはアジドからなる群から選ばれる、方法。
【請求項１２】
波長が６５０〜９００ｎｍの光子で対象物を照射するステップ、及び放出した光子を検出するステップを含む、請求項８に記載の対象物からの光子放出を感知する方法。
【請求項１３】
対象物を体液の試料と接触させるステップ、及び放出した光子を検出するステップを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の対象物表面用コーティングでコーティングされた対象物からの光子放出を感知する方法。
【請求項１４】
感染細菌の存在を検出するための請求項８に記載の対象物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象物表面用コーティング、対象物表面用コーティングを調製する方法、並びに微生物を検出するための対象物表面用コーティングの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
表面の、例えば医療用具及び食品調理用の表面の病原微生物の増殖は、感染症の発症を引き起こす。現在、医療用具及び食品調理用の表面の病原微生物の存在を、安価で迅速に検出する手段はない。表面の微生物の存在を検出する現在の基準は、汚染されていると疑われる試料から採取した微生物の培養によっている。埋入された医療用具は、培養する試料を収集する前に取り除く必要がある。こうした試験は、時間がかかり、高価で労働集約的であり、埋入物の除去が必要な点で不利である。
【０００３】
医療用具についてのこうした問題を克服する試みは、先行技術で知られている。例えば、米国特許第６３０６４２２号には、環境変化により、治療用及び／又は診断用薬剤等の包理された放出性活性剤を含む、ハイドロゲルマトリクスによってコーティングされた埋入物が記載されている。埋入物の部位での宿主のｐＨ変化により、包理された活性剤が放出される。
【０００４】
こうした埋入物の欠点は、埋入物が特定の病原菌に応答せず、したがって病原菌が原因ではなく単に環境が原因で擬陽性となる可能性があることである。
【０００５】
微生物を検出するための対象物表面用コーティングは、先行技術で知られている。国際公開第２０１４０９８６０３号には、特定の病原菌の存在下で、対象物表面用コーティングからの治療用及び／又は診断用薬剤の放出が記載されている。こうしたコーティングの欠点は、蛍光剤がマトリクス又は周辺領域に放出されることである。したがって、放出された蛍光剤の検出は、表面用コーティングからの拡散に依存する。緩慢な拡散の場合、偽陰性となることがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
当技術分野の対象物表面用コーティングの問題を解決することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、１つ又は複数のポリマー及び上記１つ又は複数のポリマーの少なくとも１つと共有結合するペプチドを含む、対象物表面用コーティングを提供し、上記ペプチドが、
ａ）限定された数の微生物の株、種又は属からなる第１の群に属する微生物により特異的に供与される第１の化合物により切断され、上記第１の群に属さない任意の微生物により供与される任意の化合物により切断されない、第１の切断部位、
ｂ）発光波長が６５０〜９００ｎｍである、第１の蛍光剤、
ｃ）吸収波長が６５０〜９００ｎｍであり、上記第１の蛍光剤の上記発光を消光する、第１の非蛍光剤
を含み、
上記第１の切断部位での切断が、コーティングからの上記第１の消光剤の放出をもたらし、上記第１の薬剤の放出が、上記第１の群に属する微生物の存在を示す。
【０００８】
本発明は、
ａ）１つ又は複数のポリマー、
ｂ）発光波長が６５０〜９００ｎｍである、第１の蛍光剤、
ｃ）吸収波長が６５０〜９００ｎｍであり、上記第１の蛍光剤の上記発光を消光する、第１の非蛍光剤、
ｄ）吸収波長が６５０〜９００ｎｍであり、上記第１の蛍光剤及び第１の切断部位の上記発光を消光する、第１の非蛍光剤を含む、上記１つ又は複数のポリマーの少なくとも１つと共有結合するペプチド、
を含む、対象物表面用コーティングを提供し、
上記第１の切断部位が、限定された数の微生物の株、種又は属からなる第１の群に属する微生物により特異的に供与される第１の化合物により切断され、上記第１の群に属さない任意の微生物により供与される任意の化合物により切断されず、
上記第１の切断部位での切断が、コーティングからの上記第１の非蛍光剤の放出をもたらし、上記第１の非蛍光剤の放出が、上記第１の群に属する微生物の存在を示す。
【０００９】
本発明は、第１の切断部位の切断が同時に対象物表面用コーティングからの第１の非消光剤の切断をもたらし、その結果、第１の蛍光剤の発光を検出できる、対象物表面用コーティングを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
好ましい実施形態において、第１の切断部位の切断は、対象物表面用コーティングからの第１の蛍光剤の放出をもたらさない。換言すれば、第１の切断部位での切断後、第１の蛍光剤は、対象物表面用コーティングに共有結合したままである。
【００１１】
対象物表面用コーティングから第１の非蛍光剤のみを放出する効果は、対象物表面用コーティングが「暗い」状態すなわち波長６５０〜９００ｎｍの光を発光しない状態から、「明るい」状態すなわち波長６５０〜９００ｎｍの光を発光する状態に変換することであり、発光した光は適切な検出器で記録できる。こうした「暗い（オフ）」状態から「明るい（オン）」状態への変換の利点は、擬陽性の可能性を減らすことである。
【００１２】
例えば、本発明による非蛍光部分を含まない先行技術のコーティングにおいて、対象物表面用コーティングは、微生物の不在下で発光するが、微生物の存在下で蛍光剤は、コーティングから放出し、コーティングは発光しない暗い状態に変わる。しかし、この場合には、第１の蛍光剤がコーティングから拡散していない場合、対象物表面用コーティングはまだ発光することができ、したがって間違った結果が観測され得る。本発明によるコーティングにおいて、切断が起こるとすぐに、第１の蛍光剤と第１の非蛍光剤の間の距離が広がり、その結果、発光がもはや消光されないので、こうした擬陽性の可能性は減らされる。
【００１３】
理論に縛られることは望まないが、対象物表面用コーティングから第１の非蛍光剤を放出することは、第１の蛍光剤から発光した光を消光することが、先行技術のコーティングのように、対象物表面用コーティングからの第１の蛍光剤の拡散に依存しないことを意味する。
【００１４】
この切断は、限定された数の微生物の株、種又は属からなる群に属する微生物により供与される化合物によって起こる。微生物の株、種又は属のこの群（第１の群として簡易に示すこととする）のメンバーは、上記第１の切断部位を切断する化合物を特にもたらすことが可能である。用語「特に」は、上記第１の群に属さない微生物の株、種又は属が、上記第１の群のメンバーと対照的に、上記切断部位を認識し、切断することができる化合物をもたらす可能性がないことを意味する。化合物は、例えば、微生物からの上記化合物の放出によりもたらされることができ、又は、例えば、その外面に存在することができる。後者の場合、切断は微生物とコーティングの接触により起こることになるが、化合物が微生物から放出される場合、微生物からの放出後、放出された化合物がコーティングに達することができる限り、微生物はコーティングされた対象物から離れることができる。
【００１５】
特定の群に属する微生物が、宿主が感染すると、宿主により特有の化合物の放出又は生成を引き起こすことも可能である。後者の場合、この化合物は、上記群に属さない別の微生物に感染しても、宿主により生成又は放出されない。切断は化合物により起こすことができる、又は、例えば、複合体を形成する上記化合物と結合することで引き起こすことができ、複合体は、コーティングの環境下に存在する、すなわち、微生物又は微生物に感染し、対象物を含む宿主により供与される、切断因子により認識される。第１の群の菌株、種、又は属等の特定の群に属する微生物において、これらの微生物の存在は切断部位の切断を必ず引き起こすが、別の群由来の微生物により切断は引き起こされない。この切断は、同じ化合物により起こり得るが、これらの化合物が同じ上記切断部位の切断を引き起こす限り、複数の異なる化合物でも起こり得る。例えば、第１の群は３種の異なる細菌種を含み、第１及び第２の種は、コーティングの切断部位を切断する同じ化合物をもたらし、第３の種は、第１及び第２の種由来の化合物と異なり、コーティングの同じ切断部位も特異的に切断する化合物をもたらす。用語「限定された」は、こうした群が全ての微生物又は全ての細菌を含まず、より少ない、すなわち、限定された数を含み、その結果、第１の薬剤の放出が、実際に、１つ又は複数の微生物を示し、あらゆる微生物又は細菌などは示さないことを意味する。
【００１６】
一実施形態において、第１の蛍光剤の発光波長は、３００〜４５０ｎｍ、好ましくは４５０〜６５０ｎｍ、さらにより好ましくは６５０〜９００ｎｍである。
【００１７】
発光波長が６５０〜９００ｎｍである第１の蛍光剤は、必要な波長が６５０〜９００ｎｍで発光し、第１の非蛍光剤とスペクトルの重なりを有するため、第１の蛍光剤及び第１の非蛍光剤が対象物表面用コーティングの未切断のペプチドでともに存在する場合は発光しない、任意の化合物であり得る。
【００１８】
一実施形態において、発光波長が４５０〜６５０ｎｍである第１の蛍光剤は、必要な波長が４５０〜６５０ｎｍで発光し、第１の非蛍光剤とスペクトルの重なりを有するため、第１の蛍光剤及び第１の非蛍光剤が対象物表面用コーティングの未切断のペプチドでともに存在する場合は発光しない、任意の化合物であり得る。
【００１９】
別の実施形態において、発光波長が３００〜３５０ｎｍである第１の蛍光剤は、必要な波長が３００〜３５０ｎｍで発光し、第１の非蛍光剤とスペクトルの重なりを有するため、第１の蛍光剤及び第１の非蛍光剤が対象物表面用コーティングの未切断のペプチドでともに存在する場合は発光しない、任意の化合物であり得る。
【００２０】
吸収波長が６５０〜９００ｎｍである第１の非蛍光剤は、わずかな自家蛍光を有するか、又は自家蛍光を有さず、ほとんどバックグラウンドを必要としない近接したＮＩＲ蛍光体からの蛍光を効率的に消光できる化合物である。一実施形態において、第１の非蛍光色素は、シアニン分子である。シアニン分子（シアニン色素とも呼ぶ）として、ポリメチン鎖（式Ｉ）により結合した２つの置換又は非置換の窒素含有複素環を有する化合物が挙げられる。
【化１】
0006673597.tif 000002
【００２１】
一実施形態において、第１の蛍光剤は、式Ｉで示される一般式を有するシアニン色素であり、ここで、Ｒ１は、Ｈ、ヒドロカルビル、ハロ、カルボキシル、アミノ及びＳＣ３−Ｃａｔ＋からなる群から選択され、Ｃａｔ＋は、カチオン、好ましくはアルカリ土類金属、好ましくはナトリウム、カリウム又はリチウムであり；Ｚは、Ｈ、Ｏ、Ｓ、ＮＨ及びＮ−ヒドロカルビルからなる群から選択され；Ｒ２、Ｒ３、Ｒ９、Ｒ１０は、それぞれ独立して、Ｈ及びヒドロカルビルからなる群から選択され、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ１１、Ｒ１２は、それぞれ独立して、Ｈ、ヒドロカルビル及びスルホナトからなる群から選択され、又は結合した原子とともに芳香環を形成し；Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１３、Ｒ１４は、それぞれ独立して、Ｈ及びヒドロカルビルからなる群から選択され、又は結合した原子とともに芳香環を形成し；Ｒ８及びＲ１５は、それぞれ独立して、ヒドロカルビル、（ＣＨ２）ｑＦＧ又は（ＣＨ２）ｐＬＮからなる群から選択され、ここで、Ｒ８及びＲ１５の少なくとも１つは（ＣＨ２）ｑＦＧであり、ここで、ｑは１〜２０の整数であり、ＦＧはカルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基又はチオール基と直接反応しない官能基であり、ここで、ｐは１〜２０の整数であり、ＬＮはカルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基又はチオール基と反応するリンカー基であり；Ｒ１５は、Ｈ又はヒドロカルビルである。
【００２２】
第１の非蛍光剤はまた、例えば、ＢＨＱ３（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）、ＱＣ−１（Ｌｉ−ＣＯＲ．ｃｏｍ）、又は、こうした化合物を含む粒子、例えば、金ナノ粒子及びフェロナノ粒子であってもよい。
【００２３】
一実施形態において、１つ又は複数のポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールジアクリレート、ポリラクチド、ポリビニルアルコール、ポリＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド／ポリエチレングリコールコポリマー及びその組合せからなる群から選択される。
【００２４】
対象物表面用コーティングに有利なポリマーは、ポリエチレングリコール系ポリマーの生体適合性のため、ポリエチレングリコール系ポリマーであることが見出されている。
【００２５】
一実施形態において、ペプチドは、Ｎ若しくはＣ末端又は側鎖を介して、好ましくはＣ末端又は側鎖を介して、最も好ましくはＣ末端を介して、Ｃ４〜Ｃ３０のヒドロカルビルリンカーにより上記１つ又は複数のポリマーの少なくとも１つに共有結合する。
【００２６】
本明細書で使用する用語ヒドロカルビルは、水素原子及び炭素原子を含むリンカー（直鎖、分岐又は環状、飽和又は不飽和であって、アルキル、アルケニル及びアルキニル等；シクロアルキル、シクロアルケニル等の、脂環式置換基；芳香族）を意味する。リンカーは、１つ又は複数の非ヒドロカルビル置換基、例えば、ヘテロ原子で置換されてもよい。好ましいリンカーは、４個、５個、６個及び７個の炭素原子からなる群から選択される。
【００２７】
本発明者らは、Ｃ末端を介して対象物表面用コーティングの１つ又は複数のポリマーにペプチドを共有結合することによって、切断部位は、微生物による切断を促進するような方向に存在することを見出している。
【００２８】
一実施形態において、Ｃ４〜Ｃ３０のリンカーが環状ヒドロカルビル基又は環状複素環基を含み、好ましくは上記複素環基がトリアゾール基である、先行する請求項のいずれか一項に記載の対象物表面用コーティング。
【００２９】
本発明の一実施形態において、リンカーは、ペプチドのＮ若しくはＣ末端又は側鎖での反応基と、ポリマーの相補的反応基との反応を介して組み込むことができる。特に好ましい反応基はアジド基であり、好ましい相補的反応基はアルキン基である。アジド及びアルキンの反応は、意図しない副反応が起こることなく、第１の蛍光剤及び第１の非蛍光剤の存在下で進行する。
【００３０】
さらなる例として、様々なＰｄ（０）触媒カップリング反応、シュタウディンガーライゲーション、環化付加反応（ディールス−アルダー、１，３−双極子環化付加）、還元アルキル化、オキシム及びヒドラジンの形成、チオール付加反応、並びに酸化的カップリングが挙げられる。
【００３１】
一実施形態において、第１の切断部位は、グラム陽性菌又はグラム陰性菌、好ましくはグラム陽性菌、より好ましくはブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属及びバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）属及びリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属により供与される化合物により切断される。
【００３２】
本発明による対象物表面用コーティングの利点として、コーティングが微生物の特定の群にのみ応答するように、コーティングを設計できることがある。例えば、好ましい実施形態において、第１の切断部位は、ブドウ球菌、連鎖球菌、エンテロコッカス及びバシラス、コリネバクテリウム、ノカルディア、クロストリジウム、アクチノバクテリア及びリステリア等の、グラム陽性菌により供与される化合物により切断される。特に好ましい実施形態において、グラム陽性菌は、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、より好ましくはブドウ球菌属から選択される。
【００３３】
一実施形態において、第１の切断部位は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、フレキシネル赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、及びカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）等の、グラム陰性菌により供与される化合物により切断される。
【００３４】
一実施形態において、第１の化合物は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来のエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ  Ｖ８、ＩｇＡ１プロテアーゼ、オーレオリシンからなる群から選択されるプロテアーゼである。
【００３５】
グラム陽性菌に特異的な化合物の例としては、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃとしても知られる黄色ブドウ球菌由来のＶ８プロテアーゼ、Ｇｌｕ−Ｃプロテアーゼ、ブドウ球菌セリンプロテイナーゼ、ブドウ球菌Ｖ８セリンエンドペプチダーゼがある。このプロテアーゼは、アスパラギン酸残基及びグルタミン酸残基のカルボキシル側で特異的に切断する。
【００３６】
一実施形態において、第１の切断部位は、ＥＦＲＩＶ、ＥＦＲＩＫ、ＤＦＲＩＫ、ＧＩＧＥＦＲＩＫ、ＧＩＧＤＦＲＩＫからなる群から選択されるのが好ましい、特定のアミノ酸モチーフを含む。
【００３７】
好ましい実施形態において、切断部位は、セリン、トレオニン、アルギニン、リジン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸、好ましくはアスパラギン酸及びグルタミン酸の群から選択されるアミノ酸を含み、上記切断は、ブドウ球菌、連鎖球菌、エンテロコッカス及びバシラス、コリネバクテリウム、ノカルディア、クロストリジウム、アクチノバクテリア及びリステリアからなる群から選択される少なくとも１種の細菌由来の化合物に含まれる。
【００３８】
好ましい実施形態において、切断部位は、アラニン、ロイシン、バリン、イソロイシン、及びプロリンの群から選択されるアミノ酸を含み、切断は、大腸菌、フレキシネル赤痢菌、及びカンピロバクター・ジェジュニからなる群から選択される少なくとも１種の細菌由来の化合物に含まれる。
【００３９】
切断部位は、この結果、周知の意図を有する、すなわち、特定の化合物により切断され、それにより切断部位が１つ又は複数のアミド結合を含む、対象物表面用コーティングの分子構造の一部を有すると理解される。
【００４０】
切断部位は、構造ＸＹＺを有してもよい。ここで、Ｘは少なくとも１つのアミノ酸、Ｙは第１の切断部位を表す少なくとも２つのアミノ酸から構成される分子構造の一部、及びＺは少なくとも１つのアミノ酸である。用いられるアミノ酸は、任意のアミノ酸、好ましくは天然型アミノ酸の群から選ばれる、又は、合成アミノ酸の群から選ばれるアミノ酸、特に天然アミノ酸の誘導体であってもよい。アミノ酸は、好ましくは第１の切断部位の切断を起こす化合物の結合を可能とするものである。
【００４１】
一実施形態において、第１の切断部位は、ブドウ球菌、連鎖球菌、エンテロコッカス及びバシラス、コリネバクテリウム、ノカルディア、クロストリジウム、アクチノバクテリア及びリステリア等の、グラム陽性菌等の微生物により分泌されるプロテアーゼに対する基質及び／又は結合部位であるアミノ酸を含む。特に好ましい実施形態において、グラム陽性菌は、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、より好ましくはブドウ球菌属から選択される。
【００４２】
一実施形態において、第１の切断部位は、大腸菌、フレキシネル赤痢菌、及びカンピロバクター・ジェジュニ等の、グラム陰性菌等の微生物により分泌されるプロテアーゼに対する基質及び／又は結合部位であるアミノ酸を含む。
【００４３】
切断部位が位置するペプチドは、例えば４〜１４個のアミノ酸、例えば５〜１２個のアミノ酸、例えば６〜１１個のアミノ酸、例えば７〜１０個のアミノ酸、及び例えば８〜９個のアミノ酸を含むことができる。ペプチドは、６個のアミノ酸、７個のアミノ酸、８個のアミノ酸、９個のアミノ酸又は１０個のアミノ酸を含むことが好ましい。
【００４４】
切断部位は、標準手引き、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｅｄ．Ｌ  Ｓｔｒｙｅｒ、７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、２０１２、ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｐａｒｔ１、Ｃｈａｐｔｅｒ２  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅに記載された、いくつかのアミノ酸、例えば、少なくとも２つの、好ましくは少なくとも３つのアミノ酸、より好ましくは少なくとも４つのアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも５つのアミノ酸を含むのが好ましい。切断部位の分子構造の一部は、「アミノ酸モチーフ」とも呼ばれてもよい。本発明において、切断部位は、限定された数の微生物の株、種又は属からなる群に属する微生物により供与される化合物により認識されるように設計される。
【００４５】
好ましい実施形態において、第１の蛍光剤は、式
【化２】
0006673597.tif 000003
（式中、
ＺはＯであり、ここで、Ｒ１はＳＯ３−Ｎａ＋であり；Ｒ２、Ｒ３、Ｒ９、Ｒ１０はヒドロカルビル、Ｒ４及びＲ１１はＨ、Ｒ５及びＲ１２はスルホナト、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１３、Ｒ１４はＨ、Ｒ８は（ＣＨ３）ｑＳＯ３−、並びにＲ１５は（ＣＨ２）５−Ｈ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである）
であり、第１の蛍光剤は、テトラナトリウム６−（２−｛（Ｅ）−２−［（３Ｅ）−３−｛（２Ｅ）−２−［３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（４−スルホナトブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン］エチリデン｝−２−（４−スルホナトフェノキシ）−１−シクロヘキセン−１−イル］ビニル｝−３，３−ジメチル−５−スルホナト−３Ｈ−インドリウム−１−イル）ヘキサノエート及びその誘導体である。
【００４６】
一実施形態において、テトラナトリウム６−（２−｛（Ｅ）−２−［（３Ｅ）−３−｛（２Ｅ）−２−［３，３−ジメチル−５−スルホナト−１−（４−スルホナトブチル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン］エチリデン｝−２−（４−スルホナトフェノキシ）−１−シクロヘキセン−１−イル］ビニル｝−３，３−ジメチル−５−スルホナト−３Ｈ−インドリウム−１−イル）ヘキサノエートの誘導体は、アミド、カルボン酸又はマレイミドである。
【００４７】
一実施形態において、第１の蛍光剤、例えばシアニン色素、及び／又は、第１の非蛍光剤は、アミド結合、エステル、又はマイケル付加生成物の結合を介してペプチドに結合する。
【００４８】
一実施形態において、第１の蛍光剤は、式ＩＩＩによる化合物である：
【化３】
0006673597.tif 000004
（式中、
Ｒ２３及びＲ２５は、それぞれ独立して、Ｈ又はヒドロカルビルであり、Ｒ２４及びＲ２６は、それぞれ独立して、Ｈ、ヒドロカルビル、及び（ＣＨ２）ｑＦＧからなる群から選択され、ここで、ｑは１〜２０の整数であり、ＦＧはカルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基又はチオール基と直接反応しない官能基であり；Ｒ２７は、それぞれ独立して、Ｈ、ヒドロカルビル及びアリールからなる群から選択され、ここで、アリールは、任意選択でクロロ基、ハロ基又はアシル基で置換される）。
【００４９】
本発明で用いることができる適切な第１の蛍光剤の例として、限定されないが、アレクサフルオル（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ）（登録商標）３５０、アレクサフルオル（登録商標）４３０、アレクサフルオル（登録商標）４８８、アレクサフルオル（登録商標）５５５、アレクサフルオル（登録商標）５９４、アレクサフルオル（登録商標）６４７、アレクサフルオル（登録商標）６６０、アレクサフルオル（登録商標）６８０、アレクサフルオル（登録商標）７００、アレクサフルオル（登録商標）７５０、アットー（ＡＴＴＯ）６８０、アットー７００、ＤＹ−６４７、ＤＹ−６５０、ＤＹ−６７３、ＤＹ−６７５、ＤＹ−６７６、ＤＹ−６８０、ＤＹ−６８１、ＤＹ−６８２、ＤＹ−６９０、ＤＹ−７００、ＤＹ−７０１、ＤＹ−７３０、ＤＹ−７３１、ＤＹ−７３２、ＤＹ−７３４、ＤＹ−７５０、ＤＹ−７５１、ＤＹ−７５２、ＤＹ−７７６、ＤＹ−７８１、ＤＹ−７８２、ＤＹ−８３１、ラホヤブルー（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  Ｂｌｕｅ）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＩＲダイ（ＩＲＤｙｅ）（登録商標）８００ＣＷ、ＩＲダイ（登録商標）３８、ＩＲダイ（登録商標）８００ＲＳ、ＩＲダイ（登録商標）７００ＤＸ、ＩＲダイ（登録商標）６８０などが挙げられる。「アレクサフルオル」色素は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．社（アメリカ合衆国オレゴン州ユージーン）（ｗｗｗ．ｐｒｏｂｅｓ．ｃｏｍ）から入手できる。「アットー」色素は、ＡＴＴＯ−ｔｅｃ  ＧｍｂＨ社（ドイツ、ジーゲン）（ｗｗｗ．ａｔｔｏ−ｔｅｃ．ｃｏｍ）から入手できる。「ＤＹ」色素は、Ｄｙｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨ社（ドイツ、イェーナ）（ｗｗｗ．ｄｙｏｍｉｃｓ．ｃｏｍ）から入手できる。ラホヤブルーは、Ｈｙｐｅｒｉｏｎ  Ｉｎｃ．社から入手できる。「Ｃｙ」色素は、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（アメリカ合衆国ニュージャージー州ピスカットウェイ）（ｗｗｗ．ａｍｅｒｓｈａｍ．ｃｏｍ）から入手できる。「ＩＲダイ（登録商標）赤外線色素」は、ＬＩ−ＣＯＲ（登録商標）  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｃ．社（アメリカ合衆国ネブラスカ州リンカーン）（ｗｗｗ．ｌｉｃｏｒ．ｃｏｍ）から入手できる。
【００５０】
一実施形態において、第１の非蛍光剤は、吸収波長が６５０〜９００ｎｍであるシアニン色素である。近赤外線波長のシアニン色素の利点は、近赤外線検出が、バックグラウンド、測定する試料の他の化合物による散乱及び干渉を減らすことであり、ｅｘ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両システムでの本発明の方法の信頼性を改善する。さらに、こうした波長は、ｉｎ  ｖｉｖｏの適用にそのような染料が特に適するようにした組織を透過することができる。
【００５１】
好ましい実施形態において、非蛍光剤は、ジエチルアミノ−５−フェニルフェナジウム−７−ジアゾベンゼン−４”−（Ｎ−エチル−２−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル））−Ｎ−エチル−２−Ｏ（ＢＨＱ３）（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）、ＱＣ−１、ＩＲダイ（登録商標）８００ＲＳ（Ｌｉ−ＣＯＲ．ｃｏｍ）、金ナノ粒子及びフェロナノ粒子である。
【００５２】
一実施形態において、第１の非蛍光剤は、式ＩＶの化合物である：
【化４】
0006673597.tif 000005
（式中、
ＺはＯであり、ここで、Ｒ１はＳＯ３−Ｎａ＋であり；Ｒ２、Ｒ３、Ｒ９、Ｒ１０はヒドロカルビル、Ｒ４及びＲ１１及びＲ５及びＲ１２はＨ、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１３、Ｒ１４はＨ、Ｒ８は（ＣＨ３）ｑＳＯ３−、並びにＲ１５は（ＣＨ２）５−Ｈ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである）。
【００５３】
好ましい実施形態において、第１の蛍光剤が第１の非蛍光剤と同じである場合、上記第１の蛍光剤は、ＩＲダイ（登録商標）８００ＲＳである式ＩＶによる化合物である。この実施形態において、ＩＲダイ（登録商標）８００ＲＳは、コーティングの発光した光を自己消光する特性を有する。ＩＲダイ（登録商標）８００ＲＳの部分がコーティングから除去される場合、ＩＲダイ（登録商標）８００ＲＳ分子間の距離が広がり、その結果、程度の低い自己消光が起こり、ゆえにコーティングから発光する。
【００５４】
或いは、第１の非蛍光剤は、式Ｖの化合物である：
【化５】
0006673597.tif 000006
（式中、
Ｘは、Ｈ、塩素、フッ素、臭素、Ｏ−アリールからなる群から選択され、ここで、アリールは、スルホナト、ハロゲン、ヒドロキシル及びアミンからなる群から選択される基によりパラ置換され；Ｒ２、Ｒ３、Ｒ９、Ｒ１０は、それぞれ独立して、Ｈ又はヒドロカルビルであり、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ１１、Ｒ１２は、それぞれ独立して、Ｈ、ヒドロカルビル、スルホナト及びＮ−ヒドロカルビルからなる群から選択され、又は結合した原子とともに芳香環を形成し；Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１３、Ｒ１４は、それぞれ独立して、Ｈ、スルホナト  ヒドロカルビルからなる群から選択され、又は結合した原子とともに芳香環を形成し；Ｒ８及びＲ１５は、それぞれ独立して、ヒドロカルビル、（ＣＨ２）ｑＦＧ又は（ＣＨ２）ｐＬＮであり、ここで、Ｒ８及びＲ１５の少なくとも１つは（ＣＨ２）ｑＦＧであり、ここで、ｑは１〜２０の整数であり、ＦＧはカルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基又はチオール基と直接反応しない官能基であり、ここで、ｐは１〜２０の整数であり、ＬＮはカルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基又はチオール基と反応するリンカー基であり；Ｒ１５は、Ｈ又はヒドロカルビルである）。
【００５５】
式Ｖの化合物は、式中、Ｘが塩素であり；Ｒ２、Ｒ３、Ｒ９、Ｒ１０がヒドロカルビル、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１４がＨ、Ｒ５がＮ−ヒドロカルビルであり；Ｒ１３がスルホナト、Ｒ８が（ＣＨ３）ｑＳＯ３−及びＲ１５が（ＣＨ２）５−Ｈ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである化合物が好ましく、上記第１の非蛍光剤は、ナトリウム４−（（Ｅ）−６−（（Ｅ）−２−［３，３−ジメチル−１−（４−スルホナトブチル）−インドリン−２−イリデン］エチリデン｝−２−（（Ｅ）−２−（１−６−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イルオキシ）−６−オキシヘキシル）−３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム−２イル）ビニル）シクロヘックス−１−エニルオキシ）ベンゼンスルホネートである。
【００５６】
さらに別の実施形態において、第１の非蛍光剤は、式ＶＩによる化合物である：
【化６】
0006673597.tif 000007
（式中、
Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９及びＲ２０は、それぞれ独立して、ヒドロカルビル又は置換ヒドロカルビルであり、ここで、ヒドロカルビルは、ヒドロキシル基、ハロ基、蛍光体群又はスルホナト基で置換される）。
【００５７】
さらなる実施形態において、第１の非蛍光剤は、式ＶＩＩによる化合物である：
【化７】
0006673597.tif 000008
（式中、
Ｒ１７、Ｒ１８及びＲ１９は、それぞれ独立して、ヒドロカルビル又は置換ヒドロカルビルであり、ここで、ヒドロカルビルは、ヒドロキシル基、ハロ基、ホスホ基又はスルホナト基で置換され；Ｒ２０及びＲ２１は、Ｈ、ヒドロカルビル、アルコキシ基又はハロ基である）。
【００５８】
一実施形態において、第１の非蛍光剤の吸収波長は、３００〜４５０ｎｍ、好ましくは４５０〜６５０ｎｍ、さらにより好ましくは６５０〜９００ｎｍである。第１の非蛍光剤は、第１の蛍光剤と良好なスペクトルの重なりが得られるように選択され、その結果、上記第１の非蛍光剤と上記第１の蛍光剤が近接している場合、上記第１の蛍光剤の信号である発光が消光する。
【００５９】
第２の態様において、本発明は、先行する請求項のいずれか一項に記載の対象物表面用コーティングを調製する方法であって、
ａ）第１の蛍光剤、第１の非蛍光剤、第１の切断部位、及び反応性アルキンを含むペプチドを用意するステップ、
ｂ）ステップａ）で得られるペプチドと、アジド基を含むＣ５〜Ｃ２５ジアクリレートを接触させるステップ、
ｃ）ステップｂ）で得られるペプチド−ジアクリレートコンジュゲートを、１つ又は複数のポリマーで架橋するステップ
を含む、方法を提供する。
【００６０】
本発明者らは、コーティングにジアクリレート改変ペプチドの第１の蛍光剤及び第１の非蛍光剤を組み込むと、対象物表面用コーティングの合成は、先行技術の方法より効率的であることを見出している。先行技術において、蛍光標識させたポリマーに混合し、その後、混合したポリマーを架橋することは知られている。本発明による方法において、直接ポリマーを標識する必要はない。これにより、先行技術のものより、原子的に効率的で、時間的に効率的である合成をもたらす。
【００６１】
第３の態様において、本発明による対象物表面用コーティングを含む対象物が提供され、上記対象物は医療用埋入物、医療機器、医療用綿棒、マイクロウェルプレート、食品調理用の表面、調度品からなる群から選択される。
【００６２】
本発明の対象物表面用コーティングは、広範囲の基質の使用に適している。本発明の利点は、すなわち、医療用埋入物、医療機器及び調度品の細菌感染の存在を検出するのに用いられ得ることである。適切な調度品としては、例えば、表面を清潔に保ち、病原性細菌が存在した場合、素早く検出するのが好ましい、病院用ベッド、病院用テーブル、手術台である。
【００６３】
一実施形態において、対象物は、針、カテーテル、ガイドワイヤー、スクリュー、埋入板、及び埋入ピンの群から選択される。
【００６４】
本発明の対象物表面用コーティングは、体内に埋入する対象物で用いるのに特に適している。本発明のコーティングでコーティングした埋入物を用いることにより、細菌感染は容易に検出でき、ゆえに医師は次の治療方針を容易に決定できる。
【００６５】
第４の態様において、
ａ）本発明による対象物表面用コーティングを用意するステップ、
ｂ）ステップａ）の表面用コーティングでコーティングしようとする、医療用埋入物及び医療機器からなる群から選択される対象物を浸漬コーティングするステップ、
ｃ）ステップｂ）で得られる上記対象物を乾燥するステップ
を含む、対象物をコーティングする方法を提供する。
【００６６】
本発明による対象物は、浸漬コーティング、噴霧コーティング、回転コーティング、又は溶液流延等のコーティング技術を用いて上記ポリマーをコーティングしてもよい。生体材料表面への分子の化学的グラフト化を伴うコーティング技術も利用できる。自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）に基づいたナノ薄さの被膜、表面係留ポリマー（ポリマーブラシ）、又は多層集合に基づいた多層被膜により、化学基の位置及び方向は正確に制御され、被膜表面の生体分子は、種々の理由で、様々な被膜を整形外科用部品及び他の医療用具に付与する技術分野で、一般に知られている。Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｄａｖｉｓ、Ｊ．Ｒ．（Ｅｄ．）、Ｃｈａｐｔｅｒ９、「Ｃｏａｔｉｎｇｓ」２００３を参考にされたい。
【００６７】
第５の態様において、
ａ）本発明による対象物表面用コーティングを用意するステップ、
ｂ）医療用綿棒、マイクロウェルプレート、食品調理用の表面、調度品からなる群から選択される対象物と、ステップａ）の表面用コーティングを接触させるステップ
を含む、対象物をコーティングする方法を提供する。
【００６８】
特に好ましい実施形態において、対象物表面用コーティングは、溶媒、例えば、水性溶媒又は有機溶媒中で供給され、表面、例えば、医療用綿棒、マイクロウェルプレート、食品調理用の表面、調度品に適用できる。コーティングは、例えば、塗装により適用できる。或いは、コーティングは、接着テープに含むことができる。塗装又は接着テープによるコーティングの適用の利点は、病原微生物を検出するために表面用コーティングを対象物に付与する、容易で時間的に効率的な手段を提供することである。
【００６９】
第６の態様において、
ａ）反応基Ａを含む１つ又は複数の上記ポリマーを含む対象物表面を用意するステップ、及び
ｂ）ステップａ）による対象物表面と、第１の蛍光剤、第１の非蛍光剤、第１の切断部位、並びに、上記対象物表面用コーティングを調製するような反応基Ａに相補的な反応基Ｂを含むペプチドを接触させるステップ
を含む、本発明による対象物表面用コーティングを調製する方法を提供する。
【００７０】
本発明者らは、アルキニル基でコーティングされた表面、例えば、ガラス表面又はアルキニルＰＥＧポリマーでコーティングされたマイクロタイタープレートは、ペプチドと反応でき、このペプチドはアジド基を含み、上記アジド基は上記アルキニル基に相補的であることを見出している。驚いたことに、この方法は、ペプチドでコーティングされた表面を容易に生成することが可能であり、この表面は、細菌の存在下で、蛍光剤又は非蛍光剤を放出する。
【００７１】
一実施形態において、アルコール（ＯＨ）、チオール（ＳＨ）、アミン（ＮＨ２）、酸（ＣＯ２Ｈ）、アルキン、アルケン、アジド、好ましくはアルキン又はアジド、より好ましくはアルキンからなる群から選ばれる、上記反応基Ａ。
【００７２】
一実施形態において、アルコール（ＯＨ）、チオール（ＳＨ）、アミン（ＮＨ２）、酸（ＣＯ２Ｈ）、アルキン、アルケン、アジド、好ましくはアルキン又はアジド、より好ましくはアジドからなる群から選ばれる上記反応基Ｂ。
【００７３】
一実施形態において、反応基Ａと反応基Ｂの反応の生成物は、エステル、アミド、カルバメート、チオエステル、マレイミド及びマイケル付加生成物の結合からなる群から選ばれる基である。
【００７４】
一実施形態において、第１の切断部位並びに第１の蛍光剤及び第１の非蛍光剤を含むペプチドは、反応基Ａをさらに含む。上記反応基Ａは、アルコール、チオール、アミン、カルボン酸、アジド、又は、不飽和炭化水素基、例えばアルキン若しくはアルケンからなる群から選ばれる。上記ペプチドを、反応基Ａに相補的な反応基Ｂを含む対象物表面用コーティングに接触させる。反応基Ｂは、アルコール、チオール、アミン、カルボン酸、アジド、及び／又は、不飽和炭化水素基、例えばアルキン若しくはアルケンからなる群から選ばれる。ペプチドはアジドを含み、対象物表面はアルキンを含むことが好ましい。反応基Ｂは、対象物表面の１つ又は複数のポリマーに共有結合させてもよい。本発明において、ポリマーは、有機又は無機であってもよい。適切な有機ポリマーの例は、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールジアクリレート、ポリラクチド、ポリビニルアルコール、ポリＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド／ポリエチレングリコールコポリマー及びその組合せである。適切な無機ポリマーの例は、シリカポリマー、例えば、シロキサン、例として（−Ｏ−ＳｉＲ２−Ｏ）ｎ繰返し単位のシロキサン（ここで、Ｒはヒドロカルビル鎖）、好ましくはＣ１〜Ｃ２０ヒドロカルビルである。
【００７５】
一実施形態において、上記対象物表面には予備処理を施す。上記予備処理は、機械的又は化学的であってもよい。上記予備処理は、例えば金属又はプラスチックの表面の粗さ、手触り及び多孔性等の表面の形態を改善して、ポリマーコーティングの接着性を改善する。
【００７６】
一実施形態において、波長が６５０〜９００ｎｍの光子で対象物を照射するステップ、及び放出した光子を検出するステップを含む、本発明による対象物からの光子放出を感知する方法を提供する。
【００７７】
対象物表面用コーティングが、波長が６５０〜９００ｎｍの光で明るくなり、対象物表面用コーティングの切断部位に特異的な化合物を放出する病原微生物が存在する場合、適する検出器で、コーティングからの光子を検出する。こうした方法により、病原微生物の存在を決定する容易な手段を提供する。本発明の方法は、労働集約的で高価であり、時間のかかる微生物の培養を、例えば感染の存在を確定するために必要としないので、先行技術の方法より有利である。
【００７８】
一実施形態において、容器を体液の試料と接触させるステップ、及び放出した光子を検出するステップを含む、本発明による対象物表面用コーティングでコーティングされた容器からの光子放出を感知する方法を提供する。
【００７９】
対象物表面用コーティングが、体液、例えば、一般的に唾液又は尿又は細胞外液と接触し、その後、波長が６５０〜９００ｎｍの光で明るくなり、対象物表面用コーティングの切断部位に特異的な化合物を放出する病原微生物が存在する場合、適する検出器で、コーティングからの光子を検出する。こうした方法により、身体試料を採取した人で、病原微生物の存在を決定する容易な手段を提供する。本発明の方法は、労働集約的で高価であり、時間のかかる微生物の培養を、例えば感染の存在を確定するために必要としないので、先行技術の方法より有利である。
【００８０】
別の態様において、感染細菌の存在を検出するために、本発明による対象物の使用を提供する。
【００８１】
本発明の方法は、労働集約的で高価であり、時間のかかる微生物の培養を、例えば感染の存在を確定するために必要としないので、先行技術の方法より有利である。
【実施例】
【００８２】
以下の非限定的な例は、先行技術と比較して、本発明に特有な実施形態を示す。
【００８３】
ペプチド合成
ペプチド１及び２は、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（英国）から得られ、さらに精製せずに用いた。
ペプチド１：Ａｃ−Ｘ−［Ｋ（ＩＲダイ８００ＲＳ）］−ＧＬＬＥＦＲＩＶＡＫ（ＩＲダイ８００ＲＳ）−アミド（ここで、Ｘはδ−アジド−ノルバリン）。
ペプチド２：Ａｃ−Ｘ−ＧＬＬＥＦＲＩＶＡＣ（ＩＲダイ８００ＣＷ）アミド（ここで、Ｘはδ−アジド−Ｌ−ノルバリン）であり、（Ｓ）−５−アジド−２−（Ｆｍｏｃ−アミノ）ペンタン酸ともいう。
【００８４】
Ｖ８プロテアーゼ
細菌プロテアーゼは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（黄色ブドウ球菌Ｖ８由来のエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、Ｐ２９２２  ＳＩＧＭＡ）から得られ、本文書では「プロテアーゼＶ８」又は「Ｖ８」ともいう。
【００８５】
グランザイムＢプロテアーゼ
ヒト組換え体プロテアーゼは、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｅｐｏｒｅ社（３６８０４３  Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ，Ｈｕｍａｎ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，Ｅ．ｃｏｌｉ）から得られた。
【００８６】
アルキン官能化スライドガラス
アルキン官能化顕微鏡スライドグラス（１ｃｍ２あたり１０１３〜１０１４個のアルキン基、７５ｍｍ×２５ｍｍ）はＭｉｃｒｏｓｕｒｆａｃｅｓ，ｌｎｃ．社から得られ、ダイヤモンドガラスカッターにより大きさに切断した。スライドは、−２０℃の暗中で、密封袋で保管した。実験中、スライドは、Ｐ２Ｏ５を用いたデシケーター内で、暗い状態を保った。
【００８７】
実施例１
ペプチドのスライドガラスへの付着
ペプチド１及び２は、ガラス表面に付着させた。
【００８８】
陰性対照実験、ＣｕＳＯ４なし（共有結合はできない）
ペプチド１のペプチド保存溶液（１０ｍｇ／ｍＬ；ＤＭＳＯ中）１０μＬは、アスコルビン酸ナトリウム溶液（１ｍｇ／ｍＬ；ＤＭＳＯ中／水１／１）２６．５μＬと混合し、ＤＭＳＯ  １３．５μＬを加え、ペプチドの溶解度を高めた。最終的なＤＭＳＯ／水の比は、７３：２７であった。最終ペプチド濃度は０．６５ｍＭで、最終アスコルビン酸ナトリウム濃度は２．７ｍＭであった。
【００８９】
ペプチド１；ＣｕＳＯ４と結合
ペプチド３のペプチド保存溶液（１０ｍｇ／ｍＬ；ＤＭＳＯ中）１０μＬは、ＣｕＳＯ４溶液（１ｍｇ／ｍＬ；ＤＭＳＯ中／水１／１）１２．５μＬ及びアスコルビン酸ナトリウム溶液（１ｍｇ／ｍＬ；ＤＭＳＯ中／水１／１）１４μＬと混合し、ＤＭＳＯ  １３．５μＬを加え、ペプチドの溶解度を高めた。最終的なＤＭＳＯ／水の比は、７３：２７であった。最終ペプチド濃度は０．６５ｍＭ、最終ＣｕＳＯ４濃度は１ｍＭ、最終アスコルビン酸ナトリウム濃度は１．４ｍＭであった。
【００９０】
得られた溶液（５０μＬ）をスライドガラス上に分注し、スライドを１時間、加湿環境下に置いた。液滴は、ＤＭＳＯ：Ｈ２Ｏ  ８０／２０  １ｍＬで３回すすぐことで洗い流し；その後、スライドをＤＭＳＯ：Ｈ２Ｏ  ８０／２０の洗浄液に置き、１分間、穏やかに撹拌した。洗浄液は、水（５×１ｍＬ）ですすぎ落し、スライドを窒素の流れで乾燥した。
【００９１】
スライドガラスはＵＶ−ＶＩＳ分光法を用いて特徴付けられ、ペプチド及びＣｕＳＯ４で処理されたスライドのみが予想された波長域６００〜８００ｎｍで、典型的に最大で０．０１〜０．０５となる残留吸収を示した。
【００９２】
実施例２
ルミネセンス分光法による、ペプチド１の消化の監視
Ｖ８プロテアーゼ及びグランザイムＢプロテアーゼの存在下でのペプチド１の切断は、ルミネセンス分光法によって溶液中で監視された。フォトルミネセンススペクトルは、パーキンエルマールミネセンス分光器ＬＳ５０  Ｂにより測定された。スペクトルは、励起波長７２０ｎｍで用い、スリット幅１５ｎｍで適用して、２５０〜９００ｎｍを記録された。
【００９３】
溶液中の消化は、ガラスバイアル中で実施した。ペプチド１の保存溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）１００μＬは、Ｈ２Ｏ  ６２５μＬ及び１００ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ＝７．８）２５０μＬで希釈した。１０μＬの試料をｔ＝０で採取した。その後、Ｖ８又はグランザイムＢプロテアーゼ保存溶液（２５単位、±２５μｇ）５０μＬを加え、混合物を振盪し、室温に置いた。実験の期間中、インキュベーション溶液は透明のままであった（色素ペプチドの沈殿はない）。様々な時点（３０秒、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、９０、１２０、１５０及び１８０分、並びに１８時間で）で、インキュベートされた試料１０μＬは採取され、水３ｍＬで希釈させた。調製された希釈試料は、ルミネセンス分光法で測定されたが、それはペプチド１の消化による切断を監視したためである。素材として、試料溶液としての水と同量のＤＭＳＯの入ったキュベットを用いた。
【００９４】
Ｖ８プロテアーゼの不在下で、約１ＡＵのバックグラウンド蛍光を観測した。Ｖ８プロテアーゼを加えて３０秒後、蛍光強度は４ＡＵに増大し、６分以内には蛍光強度は６ＡＵになった。このことは、本発明によるペプチドが、数分以内に細菌を検出できることを示しており、有機材料に対するＡＴＰ系試験（典型的には４〜８時間）又は細菌培養（２４時間）等の先行技術の方法より大幅に向上している。
【００９５】
グランザイムＢの存在下で、ペプチド１は切断されず、バックグラウンド蛍光は、実験を通して１ＡＵで保たれた。グランザイムＢは、血漿中の規定濃度が２０〜４ｐｇ／ｍｌで存在するセリンプロテアーゼである。結果は、ペプチドが細菌プロテアーゼの存在に選択的であり、自己免疫応答の一部として人体により放出されたプロテアーゼの存在下で切断されないことを示す。
【００９６】
実施例３
ルミネセンス分光法による、表面結合ペプチド１の消化の監視
Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙ  ＣＬＸ用具を、Ｗｅｓｔｂｕｒｇ社（オランダ、ルースデン；Ｔｉｍｏ  Ｋｒｅｉｋｅ、Ｍｏｎｉｅｋ  Ｋｏｒｓ）で用いた。全てのＯｄｙｓｓｅｙ  ＣＬＸでの測定値は、８００ｎｍで励起して得られた。
【００９７】
Ｖ８プロテアーゼの存在下で、強度は約６０００単位〜２５０００単位に増大し、Ｖ８はペプチド１からの消光基の放出を引き起こす。
【００９８】
Ｖ８プロテアーゼの存在下で、ペプチド２で強度の変化は観測されなかった。観測された強度は８０００単位で保たれ、蛍光団が切断されることがあるとしても、蛍光団は表面から拡散せず、それゆえに信号の減少は観測されないために偽陰性の結果が得られることが示された。
【００９９】
結果は、本発明によるコーティングが、細菌の存在を検出でき、偽陰性の結果となりにくいことを示す。
【０１００】
実施例４
カテーテルコーティング
対象物用コーティングは、ＰＥＧポリマー（ＭｅＯ−ＰＥＧ−アルキン、ＩＲＩＳ  ｂｉｏｔｅｃｈ社）及び切断部位及び第１の蛍光剤及び第１の非蛍光剤を有するペプチドから構成される。比較例は、第１の非蛍光剤を含有しない。
【０１０１】
ペプチドは、標準試薬、結合及び精製技術を用いて、標準的な固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により合成された。
【０１０２】
ペプチドを第１の蛍光剤及び第１の非蛍光剤に結合することを、ペプチド精製後に実施し、システインに結合するマレイミド又はリジンに結合するアミドにより促進した。
【０１０３】
切断部位及び第１の蛍光剤及び第１の非蛍光剤を有するペプチドを結合することを、標準的なアジドアルキンヒュスゲン環化付加反応の条件を用いて実施した。
【０１０４】
用いたカテーテルは、長さ６ｍｍ、直径４．２ｍｍで用意された、１４ＦシリコーンＦｏｌｅｙカテーテルであった。各ポリマーコーティングの水性スラリーは準備され、カテーテルの各部品はスラリー状混合物に浸した。コーティングされたカテーテルは、浸漬処理を繰り返す前に、２０℃の暗中で１５分、保管した。プロセスは、合計で４回繰り返された。最終コーティング後、コーティングされたカテーテルは、３５℃で４８時間、保管して、コーティングの乾燥を促進した。
【０１０５】
実施例５
コーティングされた各カテーテル、及び、対照としてのコーティングされていない１つのカテーテルは、１ｍｌあたり２×１０６コロニー形成単位（ＣＦＵ）の黄色ブドウ球菌の存在下で、４時間インキュベートした。その後、コーティングされたカテーテルは、インキュベーターから取り除き、臨床用マルチスペクトル蛍光カメラ（Ｔ３−イメージングシステム、ＳｕｒｇＯｐｔｉｘ  ＢＶ社、オランダ、フローニンゲン）を、ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（励起：７１０ｎｍ、発光：８００ｎｍ、取得時間５秒、ビニング  ４、Ｆ−ｓｔｏｐ  ２、ＦＯＶ  ２１．２）で、露光した。
【０１０６】
ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ及びＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩから得られた結果は、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ４．２．（Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬＳ社、アメリカ合衆国マサチューセッツ州ホプキントン）で分析した。最適な検出限界は、正信号を陰性対照と容易に区別する、最も低い信号に設定した。信号強度は、対象領域（ＲＯＩ）を描写し、領域の平均カウントを計測することで決定した。信号は、対象の信号（本文中、ネットカウントとして呼ぶ）からバックグラウンド信号を引くことでバックグラウンドに対して補正した。強い近赤外線信号は、第１の蛍光剤に帰した。
【０１０７】
結果は表１に示す。
【表１】
0006673597.tif 000009
【０１０８】
結果は、第１の蛍光剤の発光スペクトルと重なる吸収スペクトルを有する非蛍光剤を含む本発明によるコーティング（実施例５．４）により、病原微生物、例えば、この場合、黄色ブドウ球菌の存在を、極めて良好に検出する。第１の非蛍光剤による消光は、第１の蛍光剤からの距離に厳密に依存し、ゆえに第１の非蛍光剤が切断されるとすぐ、発光した光を検出する。
【０１０９】
実施例５．４はまた、従来の微生物培養（実施例５．１）と同レベルの検出が、本発明によるコーティングを用いて得られることができるが、微生物培養の２４〜３６時間よりむしろ、４時間以内と、より迅速に結果が得られることを示す。
【０１１０】
実施例５．３は、第１の非蛍光剤としても機能する第１の蛍光剤がまた、微生物の検出に適切な手段をもたらすことを示す。しかし、切断された第１の蛍光剤の限定された拡散により、弱い信号のみを検出する。
【０１１１】
第１の蛍光剤のみを含むコーティングは、微生物の良好な検出を提供しない（比較例５．２）。これは、表面からの第１の蛍光剤の拡散の緩慢な速度に帰し、ゆえに発光した光の強度の小さい変化のみを検出する。
【配列表】
0006673597000001.app