(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）３つのＣＤＲを含むＶＨ鎖及び（ｉｉ）３つのＣＤＲを含むＶＬ鎖を含む抗ＯＸ４０抗体であって、
ＶＨＣＤＲ１がアミノ酸配列GFTFSRYGMS（配列番号１０１）、ＶＨＣＤＲ２が、アミノ酸配列TINSNGGRTYYPDSVKG（配列番号１０２）、ＶＨＣＤＲ３がアミノ酸配列EGITTAYAMDY（配列番号１０３）、ＶＬＣＤＲ１がアミノ酸配列KASQSVDYDGDSYMH（配列番号１０４）、ＶＬＣＤＲ２がアミノ酸配列AASILES（配列番号１０５）及びＶＬＣＤＲ３がアミノ酸配列QQSNEDPRT（配列番号１０６）を有する、
抗ＯＸ４０抗体。
【請求項２】
モノクローナルである、請求項１に記載の抗ＯＸ４０抗体。
【請求項３】
ヒト化されている、請求項１に記載の抗ＯＸ４０抗体。
【請求項４】
アミノ酸配列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLELVATINSNGGRTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGITTAYAMDYWGQGTTVTVSS（配列番号２２）を有するＶＨ鎖及び
アミノ酸配列
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMHWYQQKPGQPPKLLIYAASILESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSNEDPRTFGGGTKVEIK（配列番号３２）を有するＶＬ鎖を含む、請求項３に記載の抗ＯＸ４０抗体。
【請求項５】
ＩｇＧである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体。
【請求項６】
ＩｇＧ１である、請求項５に記載の抗ＯＸ４０抗体。
【請求項７】
配列番号４１又は４２で表されるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号５１で表されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、請求項４に記載の抗ＯＸ４０抗体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体をコードするヌクレオチド配列を含む１以上の核酸。
【請求項９】
請求項８に記載の１以上の核酸を含む、１以上のベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の１以上のベクターで形質転換された真核宿主細胞。
【請求項１１】
請求項８に記載の１以上の核酸を発現するように操作された真核宿主細胞。
【請求項１２】
哺乳動物宿主細胞である、請求項１０又は１１に記載の真核宿主細胞。
【請求項１３】
抗ＯＸ４０抗体を産生する方法であって、（ａ）請求項１０又は請求項１１に記載の宿主細胞を培養するステップ及び（ｂ）抗ＯＸ４０抗体を回収するステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．関連出願の相互参照
本出願は、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下で、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１６年１２月１５日に出願された米国特許仮出願第６２／４３４，７６１号の利益を主張する。
【０００２】
２．配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０１７年１０月３０日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、３８１４９３−３６８ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、９７，９９９バイトのサイズである。
【０００３】
３．技術分野
本出願は、とりわけ、新規の抗ＯＸ４０抗体、抗体を含む組成物、抗体をコードする核酸並びにこれらを作製及び使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
４．背景
がん治療は、手術、放射線及び化学療法を含む、広範にわたる治療法を含む。多様な手法は、がんを処置する医療従事者に利用可能な、広範な処置の選択を可能とするが、既存の治療剤は、正常な健常細胞ではなく、がん細胞をターゲティングする選択性の欠如及びがんによる処置に対する耐性の発生のような、多数の欠点を抱えている。
【０００５】
正常細胞より優先的に、がん細胞の細胞過程に干渉する、ターゲティング型治療剤に基づく近年の手法は、放射線処置のような非ターゲティング療法と比較して、副作用の少ない化学療法レジメンをもたらしている。
【０００６】
がん免疫療法は、既存の標準治療を補完する、有望な治療法として出現した。例えば、Ｍｉｌｌｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ、２７、４３９〜４４９（２０１５）を参照されたい。このような免疫療法は、がん細胞を死滅させるように、免疫系をモジュレートするのに使用される抗体の開発を含む。
【０００７】
固形腫瘍を有する患者における抗腫瘍免疫応答は、生物学的薬剤を用いた処置により増強される。例えば、２つの抗ＰＤ−１モノクローナル抗体：ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））及びペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標））が承認され、市販されており、米国及び欧州において、切除不能性黒色腫又は転移性黒色腫及び転移性非小細胞肺がんのような疾患の処置に対する承認がなされている。これらの薬剤による患者の処置は、無進行生存及び／又は全生存の改善により測定される、抗腫瘍応答を結果としてもたらした。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｍｉｌｌｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ、２７、４３９〜４４９（２０１５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
近年において、ＯＰＤＩＶＯ（登録商標）を従来の化学療法と比較する臨床試験の、未処置患者集団においてＯＰＤＩＶＯ（登録商標）により進行性肺がんの進行を遅らせることの失敗は、既存の標準治療を補完する代替法及びさらなるがん処置に対する必要を強調する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
５．概要
本開示は、ＯＸ４０に特異的に結合し、これを活性化する抗ＯＸ４０抗体を提供する。下記の「発明を実施するための形態」において、例示的な相補性決定領域（ＣＤＲ）、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）領域及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）領域（すなわち、それぞれ、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖）、並びに例示的な抗ＯＸ４０抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列が提供される。本明細書において提供された抗ＯＸ４０抗体は、獲得免疫応答の活性化を結果としてもたらす。
【００１１】
抗ＯＸ４０抗体は、当技術分野において公知の通り、半減期を延長し、抗原依存性細胞介在性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を増大又は減少させるように、抗体の特性を変更する修飾及び／又は突然変異を含みうる。
【００１２】
本明細書において、本開示の抗ＯＸ４０抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が提供され、核酸を含むベクターも同様に提供される。加えて、本明細書において、開示された抗ＯＸ４０抗体をコードするヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換された原核及び真核宿主細胞のほか、ヌクレオチド配列を発現するように操作された（哺乳動物などの）真核宿主細胞も提供される。下記の「発明を実施するための形態」において、宿主細胞を培養し、抗体を回収することにより、抗体を産生する方法もまた提供され、論じられる。
【００１３】
別の態様では、本開示は、本明細書において記載された抗ＯＸ４０抗体を含む組成物を提供する。組成物は、一般に、本明細書において記載された、１つ以上の抗ＯＸ４０抗体及び１つ以上の賦形剤、担体又は希釈剤を含む。
【００１４】
本開示は、固形腫瘍を有すると診断されたヒト対象のような対象を、抗ＯＸ４０抗体により処置する方法を提供する。方法は、一般に、対象へと、治療的利益をもたらすのに有効な量の、本明細書において記載された抗ＯＸ４０抗体を投与するステップを伴う。対象は、新たに診断される場合もあり、再発する場合もあり、再発し、かつ、不応性の場合もある、多数の固形腫瘍のいずれか１つを有すると診断されうる。抗ＯＸ４０抗体は、２週間ごとに１回の静脈内注入として投与されうる。
【００１５】
抗ＯＸ４０抗体は、単一の治療剤（単剤療法）として投与される場合もあり、固形腫瘍の処置のために使用される治療剤が典型的であるが、必ずしもこれらではない、他の治療剤に加えて、又はこれらと共に投与される場合もある。治療剤は、それらの承認された用量、投与経路及び投与頻度において使用されることが典型的である。
【００１６】
抗ＯＸ４０抗体は、静脈内注入及び／又は静脈内注射並びに腫瘍内注射を含むがこれらに限定されない、様々な投与経路又は投与方式を介して投与されうる。投与される量は、投与経路、投与スケジュール、処置されるがんの種類、処置されるがんのステージ並びに患者年齢及び体重のような、当技術分野において周知の他のパラメータに依存する。
６．図面の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】例示的な抗ＯＸ４０抗体であるＨｕ３７３８による処置の後のインビトロにおける、ヒトＴ細胞の機能的な活性化を描示する図である。抗ＯＸ４０抗体であるＨｕ３７３８又は文献による抗体である１１Ｄ４若しくは１８Ｄ８による処置の後における、ヒト末梢血ＣＤ４＋  Ｔ細胞の増殖を描示する図である。
【図１Ｂ】例示的な抗ＯＸ４０抗体であるＨｕ３７３８による処置の後のインビトロにおける、ヒトＴ細胞の機能的な活性化を描示する図である。抗ＯＸ４０抗体であるＨｕ３７３８又は文献による抗体である１１Ｄ４若しくは１８Ｄ８による処置の後における、ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞による、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）の産生の増大を描示する図である。
【図１Ｃ】例示的な抗ＯＸ４０抗体であるＨｕ３７３８による処置の後のインビトロにおける、ヒトＴ細胞の機能的な活性化を描示する図である。Ｈｕ３７３８又は文献による抗体である１Ａ７による処置の後における、ヒト末梢血ＣＤ４＋  Ｔ細胞の増殖を描示する図である。
【図１Ｄ】例示的な抗ＯＸ４０抗体であるＨｕ３７３８による処置の後のインビトロにおける、ヒトＴ細胞の機能的な活性化を描示する図である。Ｈｕ３７３８又は文献による抗体である１Ａ７による処置の後における、ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞による、ＩＦＮ−γの産生の増大を描示する図である。
【図２Ａ】インビトロにおける、例示的な抗ＯＸ４０抗体であるＨｕ３７３８の、ヒト調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）媒介性抑制に対する効果を示す図である。Ｔｒｅｇ抑制アッセイは、ＣＤ４＋／ＣＤ２５−レスポンダーＴ細胞（Ｔｒｅｓｐ）の、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＣＤ１２７ｌｏｗ調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する、２つの異なる比を使用して準備した。Ｔｒｅｇ  Ｓｕｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｉｎｓｐｅｃｔｏｒ試薬ビーズ（Ｉｎｓｐ）を、刺激のために、培養物ウェルへと、１：１のビーズ対細胞比において添加した。白色バーは、Ｉｎｓｐの存在下における、Ｔｒｅｓｐ細胞の増殖を表す。抗ＯＸ４０抗体及びアイソタイプ対照ヒトＩｇＧ１抗体を、１：４の比の、架橋試薬（Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的抗体）の非存在下又は存在下、１０μｇ／ｍＬの最終濃度、三連において調べた。プレートを、５％のＣＯ２中、３７℃において、４日間にわたりインキュベートした。ウェル１つ当たり１μＣｉの３Ｈ−チミジンを添加し、プレートを、さらに１６時間にわたり、さらにインキュベートした。グラフは、１分間当たりのカウント（ｃｐｍ）において示される増殖を表す。Ｔｒｅｓｐ対Ｔｒｅｇの比を２：１としたときの結果を描示する図である。
【図２Ｂ】インビトロにおける、例示的な抗ＯＸ４０抗体であるＨｕ３７３８の、ヒト調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）媒介性抑制に対する効果を示す図である。Ｔｒｅｇ抑制アッセイは、ＣＤ４＋／ＣＤ２５−レスポンダーＴ細胞（Ｔｒｅｓｐ）の、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＣＤ１２７ｌｏｗ調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する、２つの異なる比を使用して準備した。Ｔｒｅｇ  Ｓｕｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｉｎｓｐｅｃｔｏｒ試薬ビーズ（Ｉｎｓｐ）を、刺激のために、培養物ウェルへと、１：１のビーズ対細胞比において添加した。白色バーは、Ｉｎｓｐの存在下における、Ｔｒｅｓｐ細胞の増殖を表す。抗ＯＸ４０抗体及びアイソタイプ対照ヒトＩｇＧ１抗体を、１：４の比の、架橋試薬（Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的抗体）の非存在下又は存在下、１０μｇ／ｍＬの最終濃度、三連において調べた。プレートを、５％のＣＯ２中、３７℃において、４日間にわたりインキュベートした。ウェル１つ当たり１μＣｉの３Ｈ−チミジンを添加し、プレートを、さらに１６時間にわたり、さらにインキュベートした。グラフは、１分間当たりのカウント（ｃｐｍ）において示される増殖を表す。Ｔｒｅｓｐ対Ｔｒｅｇの比を４：１としたときの結果を描示する図である。
【図３】可溶性ヒトＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）の存在下における、例示的な抗ＯＸ４０抗体であるＨｕ３７３８の結合の阻害を描示する図である。グラフは、ＯＸ４０Ｌ（μｇ／ｍＬ）の濃度と対比した、平均値蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。ヒトＯＸ４０を発現するＪｕｒｋａｔ細胞を、滴定量の標識化されていない可溶性ＯＸ４０Ｌ及び０．２μｇ／ｍＬのＨｕ３７３８又はアイソタイプ対照抗体と共に共染色した。
【図４Ａ】ヒトＯＸ４０（配列番号１）の、マウスＯＸ４０（配列番号３）との、アミノ酸配列のアライメントを示す図である。
【図４Ｂ】例示的な抗ＯＸ４０抗体であるＨｕ３７３８の、細胞表面において発現したヒトＯＸ４０分子、マウスＯＸ４０分子又は対応するヒト領域によりスワップアウトされたマウスシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）を含有する、キメラヒト−マウスＯＸ４０分子の結合活性を描示する図である。ヒトＯＸ４０は、「２９３ｓ−ｈｕＯＸ４０」として示され、マウスＣＲＤ  ＩとのキメラヒトＯＸ４０は、「２９３ｓ−ｈｕＯＸ４０−ｍｕＣＲＤ  Ｉ」として示され、マウスＣＲＤ  ＩＩとのキメラヒトＯＸ４０は、「２９３ｓ−ｈｕＯＸ４０−ｍｕＣＲＤ  ＩＩ」として示され、マウスＣＲＤ  ＩＩＩとのキメラヒトＯＸ４０は、「２９３ｓ−ｈｕＯＸ４０−ｍｕＣＲＤ  ＩＩＩ」として示され、マウスＣＲＤ  ＩＶとのキメラヒトＯＸ４０は、「２９３ｓ−ｈｕＯＸ４０−ｍｕＣＲＤ  ＩＶ」として示され、マウスＣＲＤ  ＩＩ及びマウスＣＲＤ  ＩＩＩとのキメラヒトＯＸ４０は、「２９３ｓ−ｈｕＯＸ４０−ｍｕＣＲＤ  ＩＩ＋ＩＩＩ」として示され、マウスＯＸ４０は、「２９３ｓ−ｍｕＯＸ４０」として示される。
【図５】例示的な抗ＯＸ４０抗体であるＨｕ３７３８又は文献による抗体（１１Ｄ４、１８Ｄ８、１０６−２２２、１１９−１２２又は１Ａ７）による、細胞表面ヒトＯＸ４０への結合についての競合を描示する図である。
【図６Ａ】添加された架橋剤の非存在下において、例示的な抗ＯＸ４０抗体であるＭｕ３７３８若しくはＨｕ３７３８又は文献抗体１１Ｄ４、１８Ｄ８、１０６−２２２若しくは１１９−１２２又はアイソタイプ対照により処置したときの、ヒトＯＸ４０をトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔレポーター細胞系における、ＮＦ−κＢの活性化を描示する図である。
【図６Ｂ】添加された架橋剤の存在下又は非存在下において、例示的な抗ＯＸ４０抗体であるＨｕ３７３８、文献抗体である１Ａ７又はアイソタイプ対照により処置したときの、ヒトＯＸ４０をトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔレポーター細胞系における、ＮＦ−κＢの活性化を描示する図である。
【図７】ＮＳＧマウスによる、ヒトＰＣ３養子細胞腫瘍モデルにおける、例示的な抗ＯＸ４０抗体であるＨｕ３７３８の抗腫瘍活性を描示する図である。
【図８】マウスを、７日ごとに１回ずつ、のべ４回の投与にわたり、１ｍｇ／ｋｇのＨｕ３７３８又はヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照により処置した後のＮＳＧマウスによるヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）媒介性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）モデルにおける、インターロイキン８（ＩＬ−８）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）及びインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）のレベルを描示する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
７．詳細な記載
本開示は、ＯＸ４０に特異的に結合する抗体及びこの断片、抗体を含む組成物、抗ＯＸ４０抗体をコードするポリヌクレオチド、抗体を産生することが可能な宿主細胞、抗体を作るために有用な方法及び組成物並びにこれらを使用する多様な方法に関する。
【００１９】
当業者により理解される通り、抗体及びこの断片は、天然において、「モジュール的」である。本開示を通して、抗ＯＸ４０抗体又はこの結合性断片を構成する多様な「モジュール」についての、多様な具体的実施形態が記載される。具体的な非限定例として述べると、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＶＨ鎖、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）ＣＤＲ鎖及びＶＬ鎖についての、多様な具体的実施形態が記載される。具体的な実施形態はいずれも、各具体的な組合せが、個別に、明示的に記載された場合と同様に、互いと組み合わされうることが意図される。
【００２０】
７．１．略号
多くの実施形態において、本明細書において記載された抗体、結合性断片及びポリヌクレオチドは、それらのそれぞれのポリペプチド配列又はポリヌクレオチド配列により記載される。そうでないことが指し示されない限りにおいて、ポリペプチド配列は、Ｎ→Ｃの方向で示され、ポリヌクレオチド配列は、５’→３’の方向で示される。ポリペプチド配列について、下記の表１において言及される通り、遺伝子によりコードされたアミノ酸のための、従来の３文字又は１文字による略号が使用されうる。
【００２１】
【表１】
0006772385.tif 000002
0006772385.tif 000003
【００２２】
ある特定の配列は、ある特定のクラス（例えば、脂肪族、疎水性など）に属するアミノ酸残基を指定する構造式により規定される。本明細書において使用された、遺伝子によりコードされたアミノ酸が属する多様なクラスは、下記の表２において言及される。一部のアミノ酸は、１つを超えるクラスに属しうる。スルフヒドリル基を含有するシステイン及びコンフォメーション的に拘束されたプロリンは、クラスを割り当てられない。
【００２３】
【表２】
0006772385.tif 000004
【００２４】
７．２．定義
そうでないことが規定されない限りにおいて、本開示との関連において使用された科学技術用語は、当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有するものとする。
【００２５】
７．３．抗ＯＸ４０抗体及び結合性断片
ＯＸ４０は、発生する免疫応答の増強において重要な役割を果たし、調節性Ｔ細胞活性を抑制するように同時的に作用する共刺激分子である。ＣＤ１３４又は腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー４（ＴＮＦＲＳＦ４）としてもまた公知のＯＸ４０は、活性化したばかりのＴ細胞上において、一過性に発現し、活性化した調節性Ｔ細胞上において、構成的に発現する、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーのＩ型膜貫通型細胞表面メンバーである。ＯＸ４０の細胞外リガンド結合ドメインは、３つのシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）及び第４の部分的ＣＲＤ（それぞれ、ＣＲＤ  Ｉ、ＣＲＤ  ＩＩ、ＣＲＤ  ＩＩＩ及びＣＲＤ  ＩＶ）から構成される。主に、活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞により発現するが、ＯＸ４０は、活性化の後の、Ｂ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞並びにナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞においても発現されうる。好中球もまた、ＯＸ４０を発現することが報告されており、ヒト好中球上におけるＯＸ４０シグナル伝達は、アポトーシス性細胞死を阻害する。ＯＸ４０のリガンド（ＯＸ４０Ｌ）であって、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー４（ＴＮＦＲＳＦ４）、ＣＤ２５２又は糖タンパク質３４（ｇｐ３４）としてもまた公知のＯＸ４０Ｌは、活性化抗原提示細胞及びＢ細胞により上方調節される。抗原により活性化したＴ細胞上のＯＸ４０へのリガンドの結合は、下流のＮＦ−κＢの転位及びＡＫＴ経路の活性化を結果としてもたらす。ＮＦ−κＢの転位は、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬのような生存促進分子の上方調節及び細胞の生存をもたらす。ＯＸ４０に方向付けられた抗体の活性化は、エフェクターＴ細胞の活性化及び分化を遷延させることにより、少なくとも部分的に、抗原特異的免疫応答を増強することが意図される。
【００２６】
抗原により活性化したエフェクターＴ細胞に対する影響に加えて、調節性Ｔ細胞により発現したＯＸ４０のターゲティングはまた、推定される作用機構にも寄与しうる。調節性Ｔ細胞は、腫瘍微小環境内において、高レベルのＯＸ４０を発現する。ＯＸ４０の活性化は、調節性Ｔ細胞の抑制能に影響し、腫瘍微小環境からの、ＯＸ４０陽性調節性Ｔ細胞の能動的枯渇をもたらすことが示されている。
【００２７】
一態様では、本開示は、ＯＸ４０に特異的に結合する抗体に関する。
【００２８】
本明細書において使用された「抗体」（Ａｂ）という用語は、特定の抗原（本明細書において、ＯＸ４０）に特異的に結合する免疫グロブリン分子を指す。一部の実施形態において、本開示の抗ＯＸ４０抗体は、ヒトＯＸ４０（配列番号１）（ＮＣＢＩ基準配列：ＮＰ００３３１８）に結合し、これにより、免疫系をモジュレートする。結果として得られる免疫系の応答は、腫瘍細胞に対して、細胞傷害性である。抗ＯＸ４０抗体は、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの両方における、超可変領域としてもまた公知の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。可変ドメインのうちの、より高度に保存的な部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。当技術分野において公知の通り、抗体の超可変領域を画定するアミノ酸位置／境界部は、文脈及び当技術分野において公知の多様な定義に応じて変動しうる。可変ドメイン内の一部の位置は、これらの位置が、１つの基準セット下において超可変領域内にあると解釈される一方、異なる基準セット下において超可変領域外にあると解釈されるという点で、ハイブリッドの超可変性位置として考えられうる。これらの位置のうちの１又は複数はまた、拡張型の超可変領域内にも見出されうる。本開示は、これらのハイブリッドの超可変位置内に修飾を含む抗体を提供する。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、主にβシートの立体構成をとる４つずつのＦＲ領域を含み、このβシート構造は、βシート構造をつなぎそして場合によってβシート構造の一部をも形成するループを形成する、３つのＣＤＲによりつなぎ合わされている。各鎖内のＣＤＲは、ＦＲ領域により、近接して一体に保持され、他の鎖に由来するＣＤＲと共に、抗体の標的結合性部位の形成に寄与する。Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．、１９８７）を参照されたい。本明細書で使用された、免疫グロブリンアミノ酸残基の番号付けは、そうでないことが指し示されない限り、Ｋａｂａｔらによる免疫グロブリンアミノ酸残基の番号付けシステムに従いなされている。
【００２９】
本開示の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体を含むがこれらに限定されない、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、遺伝子操作抗体及び／又は天然において、他の形において修飾された抗体でありうる。一部の実施形態において、定常領域は、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１又はＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）及びＩｇＭから選択されたアイソタイプである。具体的な実施形態において、本明細書において記載された抗ＯＸ４０抗体は、ＩｇＧ１を含む。他の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４を含む。本明細書において使用された、抗体の「定常領域」は、ヒトＩｇＧ１における、Ｄ３５６Ｅ及びＬ３５８Ｍ又はＡ４３１Ｇのような、天然の定常領域、アロタイプ又は天然の変異体を含む。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｉｓ及びＬｅｆｒａｎｃ、ＭＡｂｓ、１（４）：３３２〜３３８（２００９年７月〜８月）を参照されたい。
【００３０】
抗ＯＸ４０抗体の軽鎖定常領域は、カッパ（κ）軽鎖領域の場合もあり、ラムダ（λ）領域の場合もある。λ軽鎖領域は、公知のサブタイプ、例えば、λ１、λ２、λ３又はλ４のいずれか１つでありうる。一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、カッパ（κ）軽鎖領域を含む。
【００３１】
本明細書において使用された「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術により産生された抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、当技術分野において利用可能である、又は公知である任意の手段により、任意の真核細胞クローン、原核細胞クローン又はファージクローンを含む、単一のクローンに由来する。本開示と共に有用なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、組換え技術及びファージディスプレイ技術又はこれらの組合せの使用を含む、当技術分野において公知である、多種多様な技法を使用して調製されうる。抗ＯＸ４０抗体の、インビボのヒトにおける使用を含む、本開示の多くの使用において、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体が使用されうる。
【００３２】
本明細書において使用された「キメラ」抗体という用語は、ラット抗体又はマウス抗体のような、非ヒト免疫グロブリンに由来する可変配列、及び、典型的に、ヒト免疫グロブリン鋳型から選択された、ヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体を指す。キメラ抗体を産生するための方法は、当技術分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９（４７１９）：１２０２〜７；Ｏｉら、１９８６、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４：２１４〜２２１；Ｇｉｌｌｉｅｓら、１９８５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１２５：１９１〜２０２；米国特許第５，８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号及び同第４，８１６，３９７号を参照されたい。
【００３３】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する、最小限の配列を含有する、キメラ免疫グロブリンである。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てが、ヒト免疫グロブリンのＦＲ領域である。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的に、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の少なくとも一部も含みうる。抗体のヒト化法は、当技術分野において公知である。例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜７；Ｑｕｅｅｎらによる、米国特許第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６１号；同第５，６９３，７６２号及び同第６，１８０，３７０号；ＥＰ２３９４００；ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／０９９６７号；米国特許第５，２２５，５３９号；ＥＰ５９２１０６；ＥＰ５１９５９６；Ｐａｄｌａｎ、１９９１、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２８：４８９〜４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、１９９４、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．、７：８０５〜８１４；Ｒｏｇｕｓｋａら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９１：９６９〜９７３及び米国特許第５，５６５，３３２号を参照されたい。
【００３４】
「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリー又は１つ以上のヒト免疫グロブリンに対してトランスジェニックである動物から単離され、内因性免疫グロブリンを発現しない抗体を含む。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用するファージディスプレイ法を含む、当技術分野において公知の様々な方法により作ることができる。米国特許第４，４４４，８８７号及び同第４，７１６，１１１号並びにＰＣＴ公開第ＷＯ９８／４６６４５号；同第ＷＯ９８／５０４３３号；同第ＷＯ９８／２４８９３号；同第ＷＯ９８／１６６５４号；同第ＷＯ９６／３４０９６号；同第ＷＯ９６／３３７３５号及び同第ＷＯ９１／１０７４１号を参照されたい。ヒト抗体はまた、機能的な内因性免疫グロブリンを発現することが不可能であるが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現しうるトランスジェニックマウスを使用しても作ることができる。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９８／２４８９３号；同第ＷＯ９２／０１０４７号；同第ＷＯ９６／３４０９６号；同第ＷＯ９６／３３７３５号；米国特許第５，４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８８５，７９３号；同第５，９１６，７７１号及び同第５，９３９，５９８号を参照されたい。加えて、ＬａｋｅＰｈａｒｍａ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｌｍｏｎｔ、ＣＡ）又はＣｒｅａｔｉｖｅ  ＢｉｏＬａｂｓ（Ｓｈｉｒｌｅｙ、ＮＹ）のような企業は、上記において記載した技術と同様の技術を使用して、選択された抗原に対して方向付けられたヒト抗体を提供することに取り組むことができる。選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「誘導型選択」と称される技法を使用して生成されうる。この手法において、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウス抗体は、同じエピトープを認識する、完全なヒト抗体の選択を誘導するのに使用される（Ｊｅｓｐｅｒｓら、１９８８、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１２：８９９〜９０３を参照されたい）。
【００３５】
また、抗ＯＸ４０抗体の結合性断片も想定される。本開示の結合性断片は、ＯＸ４０に特異的に結合することが可能な結合性断片を含む。抗体の結合性断片の例は、限定ではなく、例を目的として述べると、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片及び単一ドメイン断片を含む。
【００３６】
Ｆａｂ断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆａｂ’断片は、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端における少数の残基であって、抗体のヒンジ領域に由来する、１つ以上のシステインを含む残基の付加により、Ｆａｂ断片と異なる。Ｆａｂ’断片は、Ｆ（ａｂ’）２の、ペプシンによる消化産物であるヒンジシステインにおける、ジスルフィド結合の切断によりもたらされる。抗体断片のさらなる化学的カップリングは、当業者に公知である。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片は、無傷抗体の結晶性断片（Ｆｃ）領域を欠き、動物の循環からより急速にクリアランスされ、無傷抗体より小さな非特異的組織結合をもたらしうる（例えば、Ｗａｈｌら、１９８３、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．、２４：３１６を参照されたい）。
【００３７】
当技術分野において一般に理解された「Ｆｃ」領域とは、抗原特異的結合性領域を含まない、抗体の結晶性断片定常領域である。抗体のアイソタイプである、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤにおいて、Ｆｃ領域は、抗体の２つの重鎖の、第２の定常ドメイン及び第３の定常ドメイン（それぞれ、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン）に由来する、２つの同一なタンパク質断片から構成される。ＩｇＭ  Ｆｃ領域及びＩｇＥ  Ｆｃ領域は、各ポリペプチド鎖内に、３つずつの重鎖定常ドメイン（ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン）を含有する。
【００３８】
「Ｆｖ」断片とは、完全な標的認識部位及び標的結合性部位を含有する、最小の抗体断片である。この領域は、緊密な非共有結合的会合下にある、１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体（ＶＨ−ＶＬ二量体）からなる。各可変ドメインの３つずつのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上において、標的結合性部位を規定するのは、この立体構成においてである。６つのＣＤＲは、標的結合特異性を、抗体に付与することが多い。しかし、場合によって、単一の可変ドメイン（又は標的に特異的な３つのＣＤＲだけを含むＦｖの半分）でもなお、全結合性部位より小さなアフィニティーにおいてではあるが、標的を認識し、標的に結合する能力を有しうる。
【００３９】
抗体の結合性断片である、「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」は、抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含むが、この場合、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖内に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインと、ＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーであって、ｓｃＦｖが、標的への結合に好適な構造を形成することを可能とするポリペプチドリンカーをさらに含む。
【００４０】
「単一ドメイン断片」は、ＯＸ４０に対する十分なアフィニティーを示す、単一のＶＨドメイン又はＶＬドメインから構成される。具体的な実施形態において、単一ドメイン断片は、ラクダ科動物化断片である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ、１９９９、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２３１：２５〜３８を参照されたい）。
【００４１】
本開示の抗ＯＸ４０抗体は、誘導体化抗体を含む。例えば、誘導体化抗体は、グリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、リン酸化、アミド化、公知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞性リガンド又は他のタンパク質への連結により修飾されることが典型的である。特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などを含むがこれらに限定されない、多数の化学的修飾のいずれかが、公知の技法により実行されうる。加えて、誘導体は、例えば、ａｍｂｒｘ技術（例えば、Ｗｏｌｆｓｏｎ、２００６、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３（１０）：１０１１〜２を参照されたい）を使用する、１つ以上の非天然のアミノ酸を含有しうる。
【００４２】
抗ＯＸ４０抗体は、配列が、少なくとも１つの、定常領域に媒介される生物学的エフェクター機能を変更するように修飾された抗体でありうる。例えば、一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、少なくとも１つの、定常領域に媒介される生物学的エフェクター機能を、非修飾抗体と比べて低減する、例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡ及び／又はＦｃγＲＩＩＩＢのようなＦｃ受容体（ＦｃγＲ）のうちの１又は複数への結合を低減するように、修飾されうる。ＦｃγＲへの結合は、抗体の免疫グロブリン定常領域セグメントを、ＦｃγＲ相互作用に必要な特定の領域において、突然変異させることにより低減されうる（例えば、Ｃａｎｆｉｅｌｄ及びＭｏｒｒｉｓｏｎ、１９９１、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７３：１４８３〜１４９１並びにＬｕｎｄら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：２６５７〜２６６２を参照されたい）。抗体の、ＦｃγＲへの結合能の低減はまた、ＦｃγＲとの相互作用に依拠する、他のエフェクター機能であって、オプソニン化、食作用及び抗原依存性細胞介在性細胞傷害作用（「ＡＤＣＣ」）のようなエフェクター機能も低減しうる。例示的な例において、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメイン内にＶ２６３Ｌ、Ｖ２７３Ｃ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｌ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３Ｓ又はＶ２７３Ｙの置換を有する変異体ＣＨ２ドメインは、ＦｃγＲＩＩＢに対し、対応する野生型定常領域と比較して低減されたアフィニティーを示しうる。
【００４３】
本明細書において記載された抗ＯＸ４０抗体は、非修飾抗体と比べて、少なくとも１つの、定常領域に媒介される生物学的エフェクター機能を獲得又は改善する、例えば、ＦｃγＲとの相互作用を増強するように修飾された抗体（例えば、米国特許出願第２００６／０１３４７０９号を参照されたい）を含む。例えば、本開示の抗ＯＸ４０抗体は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡ及び／又はＦｃγＲＩＩＩＢに、対応する野生型定常領域より大きなアフィニティーにより結合する定常領域を有しうる。例示的な例において、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメイン内にＶ２６３Ｌ、Ｖ２７３Ｃ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｌ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３Ｓ又はＶ２７３Ｙの置換を有する変異体ＣＨ２ドメインは、ＦｃγＲＩＩＩＡに対し、対応する野生型定常領域と比較して大きなアフィニティーを示しうる。
【００４４】
したがって、本開示の抗ＯＸ４０抗体は、オプソニン化、食作用又はＡＤＣＣの増大又は減少を結果としてもたらす、生物学的活性の変更を有しうる。このような変更は、当技術分野において公知である。例えば、ＡＤＣＣ活性を低減する、抗体内の修飾は、米国特許第５，８３４，５９７号において記載されている。例示的なＡＤＣＣ低下変異体は、残基２３４及び２３７（ＥＵ番号付けを使用する）が、アラニンにより置換された、「突然変異体３」（「Ｍ３」としてもまた公知であり、米国特許第５，８３４，５９７号の図４に示されている）に対応する。突然変異体３（「Ｍ３」としてもまた公知である）の変異は、多数の抗体アイソタイプ、例えば、ヒトＩｇＧ２  Ｍ３において使用されうる。
【００４５】
抗ＯＸ４０抗体の、ＦｃγＲへの結合及び／又はＡＤＣＣエフェクター機能を修飾しうる、さらなる置換は、Ｆｃ領域内のＫ３２２Ａ置換又はＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａの二重置換、例えば、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ二重置換を有するヒトＩｇＧ１を含む。例えば、Ｈｅｚａｒｅｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７５（２４）：１２１６１〜１２１６８（２００１）を参照されたい。
【００４６】
一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、低レベルのフコースを有する、又はフコースを欠く。フコースを欠く抗体は、とりわけ、低用量の抗体において、ＡＤＣＣ活性の増強と相関する。Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７：２６７３３〜２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａら、２００３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７８：３４６６〜７３を参照されたい。フコース非含有抗体を調製する方法は、ラット骨髄腫ＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６６２）内の増殖を含む。ＹＢ２／０細胞は、ポリペプチドのフコシル化に必要な酵素である、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードする、低レベルのＦＵＴ８  ｍＲＮＡを発現する。
【００４７】
抗ＯＸ４０抗体は、対応する野生型ＣＨ２領域又はＦｃ領域の結合と比較して、ＦｃγＲＩＩＢへの結合を増大させ、かつ／又はＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を低減するアミノ酸置換を含む修飾（又は変異体）ＣＨ２ドメイン又は全Ｆｃドメインを含みうる。変異体ＣＨ２ドメイン又は変異体Ｆｃドメインは、米国特許出願第２０１４／０３７７２５３号において記載されている。変異体ＣＨ２ドメイン又は変異体Ｆｃドメインは、典型的に、２６３位、２６６位、２７３位及び３０５位において、１つ以上の置換を含み、この場合、Ｆｃドメイン内の残基の番号付けは、Ｋａｂａｔにおける通り、ＥＵインデックスによる番号付けである。一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、野生型ＣＨ２ドメインと比べて、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２６６Ｌ、Ｖ２７３Ｃ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｌ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３Ｓ、Ｖ２７３Ｙ、Ｖ３０５Ｋ及びＶ３０５Ｗから選択される、１つ以上の置換を含む。具体的な実施形態において、ＣＨ２ドメインの、１つ以上の置換は、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインと比べて、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３Ｓ及びＶ２７３Ｙから選択される。例えば、ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインの、１つ以上の置換は、Ｖ２７３Ｅでありうる。別の具体的な実施形態において、本開示の抗ＯＸ４０抗体は、アミノ酸置換であるＶ２６３Ｌを含む、変異体のＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインを含む。
【００４８】
対応する野生型ＣＨ２領域又は野生型Ｆｃ領域の結合と比較して、ＦｃγＲＩＩＢへの結合の増大及び／又はＦｃγＲＩＩＩＡへの結合の低減をもたらしうる、変異体ＣＨ２ドメイン又は変異体Ｆｃドメインの他の例は、Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９（５）、１０３５〜１０４３（２０１３）において見出される例であって、ヒトＩｇＧ１における、Ｓ２６７Ｅ又はＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆのような例を含む。
【００４９】
一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、ＦｃＲｎとの相互作用に関与する特定の領域において、例えば、免疫グロブリン定常領域セグメントを突然変異させること（例えば、ＷＯ２００５／１２３７８０を参照されたい）により、胎児性Ｆｃ受容体であるＦｃＲｎへの、それらの結合アフィニティーを、増大又は減少させる修飾を含む。特定の実施形態において、ＩｇＧクラスの抗ＯＸ４０抗体は、重鎖定常領域のアミノ酸残基２５０、３１４及び４２８のうちの少なくとも１つが、単独において、又は２５０位及び４２８位において、若しくは２５０位及び３１４位において、若しくは３１４位及び４２８位において、若しくは２５０位、３１４位及び４２８位においてなど、これらの任意の組合せにおいて置換されるように突然変異させられるが、２５０位及び４２８位が具体的な組合せである。２５０位について、アミノ酸残基の置換は、トレオニン以外の任意のアミノ酸残基であって、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、バリン、トリプトファン又はチロシンを含むがこれらに限定されないアミノ酸残基でありうる。３１４位について、アミノ酸残基の置換は、ロイシン以外の任意のアミノ酸残基であって、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン又はチロシンを含むがこれらに限定されないアミノ酸残基でありうる。４２８位について、アミノ酸残基の置換は、メチオニン以外の任意のアミノ酸残基であって、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン又はチロシンを含むがこれらに限定されないアミノ酸残基でありうる。Ｆｃエフェクター機能を修飾することが公知の、例示的な置換は、Ｆｃ置換であるＴ２５０Ｑと組み合わせて生じうるＦｃ置換である、Ｍ４２８Ｌである。適するアミノ酸置換の、さらなる具体的な組合せは、米国特許第７，２１７，７９７号の表１において同定されている。このような突然変異は、ＦｃＲｎへの結合を増大させ、これは、抗体を、分解から保護し、その半減期を延長する。
【００５０】
抗ＯＸ４０抗体は、例えば、Ｊｕｎｇ及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、１９９７、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１０：８、９５９〜９６６；  Ｙａｚａｋｉら、２００４、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．１７（５）：４８１〜９、Ｅｐｕｂ、２００４年８月１７日及び米国特許出願第２００７／０２８０９３１号において記載されている通り、そのＣＤＲのうちの１又は複数へと、１つ以上のアミノ酸を挿入されている場合がある。
【００５１】
ヒトＯＸ４０（配列番号１）に対するアフィニティーが大きな抗ＯＸ４０抗体は、治療的使用及び診断的使用に所望でありうる。したがって、本開示は、ヒトＯＸ４０に対する結合アフィニティーが大きな抗体を想定する。具体的な実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、ヒトＯＸ４０に、少なくとも約１００ｎＭのアフィニティーにより結合する一方、高値のアフィニティー、例えば、少なくとも約９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０１ｎＭ又はなお高値のアフィニティーを示しうる。一部の実施形態において、抗体は、ヒトＯＸ４０に、約１ｐＭ〜約１００ｎＭの範囲のアフィニティー又は約０．００１〜１０ｎＭ、０．００１〜５ｎＭ、０．０１〜１００ｎＭ、０．０１〜５０ｎＭ、０．０１〜１０ｎＭ、０．０１〜５ｎＭ又は０．０１〜１ｎＭのような範囲であるがこれらに限定されない、前出の値のいずれかの間の範囲のアフィニティーにより結合する。
【００５２】
抗ＯＸ４０抗体の、ヒトＯＸ４０に対するアフィニティーは、例えば、限定を目的とするわけではないが、ＥＬＩＳＡ、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、表面プラズモン共鳴又は蛍光偏光アッセイのような、当技術分野において周知の技法又は本明細書において記載された技法を使用して決定されうる。
【００５３】
抗ＯＸ４０抗体は、一般に、本明細書において（Ｎ→Ｃの順序で）ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２及びＶＨ  ＣＤＲ３として言及される、３つの相補性決定領域（「ＣＤＲ」）を有する可変領域（ＶＨ）を含む重鎖、並びに本明細書において（Ｎ→Ｃの順序で）ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２及びＶＬ  ＣＤＲ３として言及される、３つの相補性決定領域を有する可変領域（ＶＬ）を含む軽鎖を、含む。本明細書において、例示的なＣＤＲのアミノ酸配列のほか、例示的な抗ＯＸ４０の重鎖及び軽鎖のＶＨ領域及びＶＬ領域のアミノ酸配列が提供される。抗ＯＸ４０抗体の具体的な実施形態は、これらの例示的なＣＤＲ並びに／又はＶＨ配列及び／若しくはＶＬ配列のほか、ヒトＯＸ４０への結合について、このような抗体と競合する抗体を含む。
【００５４】
一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体のＣＤＲのアミノ酸配列は、下記の表３：
【００５５】
【表３】
0006772385.tif 000005
0006772385.tif 000006
における、それらのそれぞれのＶＨ  ＣＤＲ配列及びＶＬ  ＣＤＲ配列から選択された配列を有する。
【００５６】
本明細書において、上記のＣＤＲを有する抗ＯＸ４０抗体の具体的で例示的な実施形態が記載される。一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、配列番号１０１、１０２、１０３、１０４、１０５及び１０６で表されるＣＤＲを有する。一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、配列番号１１１、１１２、１１３、１１４、１１５及び１１６で表されるＣＤＲを有する。一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、配列番号１２１、１２２、１２３、１１４、１２５及び１２６で表されるＣＤＲを有する。一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、配列番号１３１、１３２、１３３、１１４、１１５及び１３６で表されるＣＤＲを有する。
【００５７】
本明細書において記載されたＣＤＲは、本開示の抗ＯＸ４０抗体のＶＨ鎖及びＶＬ鎖の中のエレメントへの結合を形成する。下記の表４及び５は、上記において記載されたＣＤＲを含有する、例示的な抗ＯＸ４０抗体に対応するＶＨ鎖及びＶＬ鎖について記載する。下記の表４及び５において、ＣＤＲに下線が付される。一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、表４：
【００５８】
【表４】
0006772385.tif 000007
に記載されたアミノ酸配列を有するＶＨ鎖及び表５：
【００５９】
【表５】
0006772385.tif 000008
に記載されたアミノ酸配列を有するＶＬ鎖を含む。
【００６０】
一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、配列番号２１で表されるアミノ酸配列を有するＶＨ鎖及び配列番号３１で表されるアミノ酸配列を有するＶＬ鎖を含む。一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、配列番号２３で表されるアミノ酸配列を有するＶＨ鎖及び配列番号３３で表されるアミノ酸配列を有するＶＬ鎖を含む。一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、配列番号２５で表されるアミノ酸配列を有するＶＨ鎖及び配列番号３５で表されるアミノ酸配列を有するＶＬ鎖を含む。一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、配列番号２７で表されるアミノ酸配列を有するＶＨ鎖及び配列番号３７で表されるアミノ酸配列を有するＶＬ鎖を含む。
【００６１】
一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、ヒトへの投与に適する。具体的な実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、ヒト化されている。一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、配列番号２２で表されるアミノ酸配列を有するＶＨ鎖及び配列番号３２で表されるアミノ酸配列を有するＶＬ鎖を含む。一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、配列番号２４で表されるアミノ酸配列を有するＶＨ鎖及び配列番号３４で表されるアミノ酸配列を有するＶＬ鎖を含む。一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、配列番号２６で表されるアミノ酸配列を有するＶＨ鎖及び配列番号３６で表されるアミノ酸配列を有するＶＬ鎖を含む。一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、配列番号２８で表されるアミノ酸配列を有するＶＨ鎖及び配列番号３８で表されるアミノ酸配列を有するＶＬ鎖を含む。
【００６２】
当業者により、本明細書において記載された抗ＯＸ４０抗体内のＶＨ配列又はＶＬ配列の、ある特定の突然変異は、本開示の範囲内の抗ＯＸ４０抗体をもたらすことが理解される。突然変異は、著明な抗ＯＸ４０活性を保持しながら、本明細書で開示されたＶＨ配列又はＶＬ配列の、アミノ酸の置換、付加又は欠失を含みうる。したがって、一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、表４に示されたＶＨ配列のいずれか１つに対する、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨ配列を含む。抗ＯＸ４０抗体は、表４に示されたＶＨ配列のいずれか１つと比較して、最大で８カ所、最大で７カ所、最大で６カ所、最大で５カ所、最大で４カ所、最大で３カ所又は最大で２カ所の突然変異を有するＶＨ配列を含みうる。一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、表４に示されたＶＨ配列のいずれか１つと比較して、５カ所以下、４カ所以下、３カ所以下又は２カ所以下の突然変異を有するＶＨ配列を含みうる。一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、表５に示されたＶＬ配列のいずれか１つに対する、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＬ配列を含む。抗ＯＸ４０抗体は、表５に示されたＶＬ配列のいずれか１つと比較して、最大で８カ所、最大で７カ所、最大で６カ所、最大で５カ所、最大で４カ所、最大で３カ所又は最大で２カ所の突然変異を有するＶＬ配列を含みうる。一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、表５に示されたＶＬ配列のいずれか１つと比較して、５カ所以下、４カ所以下、３カ所以下又は２カ所以下の突然変異を有するＶＬ配列を含みうる。
【００６３】
全長重鎖アミノ酸配列及び全長軽鎖アミノ酸配列は、一般に、適切な免疫グロブリン定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ１又はヒトカッパ軽鎖の定常領域へと連結された、上記において記載されたＶＨ鎖又はＶＬ鎖を含む。抗体重鎖のＣ末端における、１つ以上の（例えば、１つ、２つ、３つ以上）アミノ酸残基の切断のような、抗ＯＸ４０抗体の全長配列に対する翻訳後修飾が生じうる。このような切断産物は、表された抗ＯＸ４０抗体の一部又は全部を含みうる。
【００６４】
したがって、一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、表６に記載された重鎖アミノ酸配列：
【００６５】
【表６】
0006772385.tif 000009
0006772385.tif 000010
0006772385.tif 000011
0006772385.tif 000012
及び表７に記載された軽鎖アミノ酸配列：
【００６６】
【表７】
0006772385.tif 000013
0006772385.tif 000014
を含み、ここで下線を付されたアミノ酸はＣＤＲを表し、イタリック体のアミノ酸は定常領域を表す。
【００６７】
一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、配列番号４１又は４２で表される重鎖アミノ酸配列及び配列番号５１で表される軽鎖アミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、配列番号４３又は４４で表される重鎖アミノ酸配列及び配列番号５２で表される軽鎖アミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、配列番号４５又は４６で表される重鎖アミノ酸配列及び配列番号５３で表される軽鎖アミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、配列番号４７又は４８で表される重鎖アミノ酸配列及び配列番号５４で表される軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００６８】
一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、配列番号４１〜４８のいずれか１つで表される重鎖配列に対する、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する重鎖配列を含む。抗ＯＸ４０抗体は、配列番号４１〜４８のいずれか１つで表される重鎖配列と比較して、最大で８カ所、最大で７カ所、最大で６カ所、最大で５カ所、最大で４カ所、最大で３カ所又は最大で２カ所の突然変異を有する重鎖配列を含みうる。一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、配列番号４１〜４８のいずれか１つで表される重鎖配列と比較して、５カ所以下、４カ所以下、３カ所以下又は２カ所以下の突然変異を有する重鎖配列を含みうる。
【００６９】
一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、配列番号５１〜５４のいずれか１つで表される軽鎖配列に対する、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する軽鎖配列を含む。抗ＯＸ４０抗体は、配列番号５１〜５４のいずれか１つで表される軽鎖配列と比較して、最大で８カ所、最大で７カ所、最大で６カ所、最大で５カ所、最大で４カ所、最大で３カ所又は最大で２カ所の突然変異を有する軽鎖配列を含みうる。一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、配列番号５１〜５４のいずれか１つで表される軽鎖配列と比較して、５カ所以下、４カ所以下、３カ所以下又は２カ所以下の突然変異を有する軽鎖配列を含みうる。
【００７０】
抗ＯＸ４０抗体のさらなる翻訳後修飾は、グリコシル化を含みうる。一般的な二分岐状複合体は、２つのＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、３つのマンノース並びに２つの分岐を形成するように、α−６マンノース及びα−３マンノースへと、β−１，２連結された、２つのＧｌｃＮＡｃ残基を有するコア構造から構成されうる。１つ以上のフコース（Ｆｕｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、高マンノースグリカンである、Ｍａｎ−５又はＭａｎ−９、バイセクティングＧｌｃＮＡｃ、及びＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）残基又はＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）残基を含むシアル酸が、コアへと接合しうる。Ｎ連結型糖形態は、Ｇ０（コア二分岐状グリコシル化構造を有するタンパク質）、Ｇ０Ｆ（フコシル化Ｇ０）、Ｇ０Ｆ  ＧｌｃＮＡｃ、Ｇ１（１つのガラクトース残基を有するコアグリコシル化構造を有するタンパク質）、Ｇ１Ｆ（フコシル化Ｇ１）、Ｇ２（２つのガラクトース残基を有するコアグリコシル化構造を有するタンパク質）及び／又はＧ２Ｆ（フコシル化Ｇ２）を含みうる。
【００７１】
一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、インビトロアッセイにおいて、ヒトＯＸ４０（配列番号１）への結合について、基準抗体と競合する。一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、ヒトＯＸ４０を発現する細胞において、ヒトＯＸ４０ｒへの結合について競合する。基準抗体は、本明細書において記載された抗ＯＸ４０抗体のいずれかでありうる。一部の実施形態において、基準抗体は、表４に記載されたＶＨで表されるＶＨ及び表５に記載されたＶＬで表されるＶＬを有する抗体である。具体的な実施形態において、基準抗体は、Ｍｕ３７２６  ＶＨ及びＭｕ３７２６  ＶＬ（「Ｍｕ３７２６」）を含むマウス抗体、Ｍｕ３７３８  ＶＨ及びＭｕ３７３８  ＶＬ（「Ｍｕ３７３８」）を含むマウス抗体、Ｍｕ３７３９  ＶＨ及びＭｕ３７３９  ＶＬ（「Ｍｕ３７３９」）を含むマウス抗体又はＭｕ３７４１  ＶＨ及びＭｕ３７４１  ＶＬ（「ＭＵ３７４１」）を含むマウス抗体である。一部の実施形態において、基準抗体は、Ｍｕ３７２６、Ｍｕ３７３８、Ｍｕ３７３９又はＭｕ３７４１のヒト化形である。ある特定の実施形態において、基準抗体は、配列番号４１又は４２で表される重鎖及び配列番号５１（「Ｈｕ３７３８」）で表される軽鎖を含むヒト化抗体、配列番号４３又は４４で表される重鎖及び配列番号５２（「Ｈｕ３７２６」）で表される軽鎖を含むヒト化抗体、配列番号４５又は４６で表される重鎖及び配列番号５３（「Ｈｕ３７３９」）で表される軽鎖を含むヒト化抗体又は配列番号４７又は４８で表される重鎖及び配列番号５４（「Ｈｕ３７４１」）で表される軽鎖を含むヒト化抗体である。
【００７２】
本明細書において記載された抗ＯＸ４０抗体は、一般に、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する。他の種、例えば、サル、例えば、カニクイザルに由来するＯＸ４０への結合についての抗体の交差反応性は、サルによる動物モデルにおいて、生物学的活性について調べる能力のような利点をもたらしうる。このような動物モデルによる試験は、有効性と関連する特性、例えば、好適な薬物動態又は安全性と関連する特性、例えば、肝毒性の低下を選択するように、抗ＯＸ４０抗体をスクリーニングするのに使用されうる。一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、カニクイザルＯＸ４０（配列番号２）（ＮＣＢＩ基準配列：ＸＰ００５５４５１７９）のほか、ヒトＯＸ４０に結合する。一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、マウスＯＸ４０（配列番号３）（ＮＣＢＩ基準配列：ＮＰ０３７１８１）に結合しない。
【００７３】
競合についてのアッセイは、放射性材料により標識化されたイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチＥＬＩＳＡ、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）アッセイ及び表面プラズモン共鳴アッセイを含むがこれらに限定されない。
【００７４】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイは、２つのタンパク質、例えば、レポーターシグナル又はレポータータグに対する必要をとせずに、ヒトＯＸ４０受容体及び抗ＯＸ４０抗体のような受容体及び抗体の間の結合反応速度の直接的な測定を可能とする。結合アフィニティーの尺度である、平衡解離定数のＫＤ並びにその２つの成分（結合反応速度定数であるｋａ（Ｍ−１×秒−１）（会合定数であるｋｏｎ又は「オン速度」）及びｋｄ（秒−１）（解離定数であるｋｏｆｆ又は「オフ速度」）のいずれも、ＳＰＲを使用して決定されうる。定数は、以下の式：
ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ
により関連づけられる。
【００７５】
一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、少なくとも約１００ｎＭのＫＤを有するが、高値のアフィニティー、例えば、少なくとも約９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０１ｎＭなお又は高値のアフィニティーを示しうる。一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、約１ｐＭ〜約１００ｎＭの範囲のＫＤ又は約０．００１〜１０ｎＭ、０．００１〜５ｎＭ、０．０１〜１００ｎＭ、０．０１〜５０ｎＭ、０．０１〜１０ｎＭ、０．０１〜５ｎＭ又は約０．０１〜１ｎＭのような範囲であるがこれらに限定されない、前出の値のいずれかの間の範囲のアフィニティーを有する。
【００７６】
一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、約１０秒−１を超えない、例えば、約１、０．５、０．２、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１秒−１なお又はこれより低値を超えない解離定数ｋｄを有する。一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、約０．００１秒−１〜約１０秒−１の範囲のｋｄ又は約０．０１〜１０秒−１、０．００１〜０．５秒−１、０．００１〜０．２秒−１、０．００１〜０．１秒−１、０．０１〜１秒−１、０．００１〜０．０５秒−１若しくは約０．００１〜１秒−１のような範囲であるがこれらに限定されない、前出の値のいずれかの間の範囲のｋｄを有する。
【００７７】
一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、少なくとも約１０４Ｍ−１×秒−１、例えば、少なくとも約１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７Ｍ−１×秒−１なお又はこれを超える会合定数ｋａを有する。一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、約１０４Ｍ−１×秒−１〜約１０７Ｍ−１×秒−１の範囲のｋｄ又は約５×１０４〜１×１０７Ｍ−１×秒−１、５×１０４〜５×１０６Ｍ−１×秒−１若しくは約１×１０４〜５×１０６Ｍ−１×秒−１のような範囲であるがこれらに限定されない、前出の値のいずれかの間の範囲のｋａを有する。
【００７８】
本開示の抗ＯＸ４０抗体は、本明細書において記載された例示的ＯＸ抗体のいずれか１つで測定された結合反応速度定数に近似する範囲のＫＤ、ｋｄ又はｋａを示しうる。例えば、一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、Ｈｕ３７３８、Ｈｕ３７２６、Ｈｕ３７３９及びＨｕ３７４１のいずれか１つのｋｄの、約０．０１〜約１００倍、例えば、約０．１〜約１０倍又は約０．５〜約５倍の範囲のｋｄである解離定数を有する。一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、Ｈｕ３７３８、Ｈｕ３７２６、Ｈｕ３７３９及びＨｕ３７４１のいずれか１つのｋａの、約０．０１〜約１００倍、例えば、約０．１〜約１０倍又は約０．５〜約５倍の範囲のｋａである会合定数を有する。
【００７９】
基準抗体と被験抗体との抗体競合アッセイ（種又はアイソタイプに関わらない）の実行において、まず、その後における同定を可能とするように、基準抗体を、フルオロフォア、ビオチン又は酵素（なお又は放射性）標識のような検出用標識により標識化することができる。この場合、ヒトＯＸ４０を発現する細胞を、標識化されていない被験抗体と共にインキュベートし、標識化された基準抗体を添加し、結合した標識の強度を測定する。被験抗体が、重複するエピトープへの結合により、標識化された基準抗体と競合する場合、強度は、被験抗体がない状態で実行された対照反応と比べて低下する。
【００８０】
このアッセイの具体的な実施形態において、アッセイ条件（例えば、特定の細胞密度）下において最大結合の８０％をもたらす標識化基準抗体の濃度（「ｃｏｎｃ８０％」）を、まず決定し、ｃｏｎｃ８０％の１０倍濃度の非標識化被験抗体及びｃｏｎｃ８０％の標識化基準抗体により、競合アッセイを実行する。
【００８１】
阻害は、以下の式：
Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋［基準Ａｂ濃度］／Ｋｄ）
に従い計算される阻害定数又はＫｉとして表すことができ、ここでＩＣ５０は、基準抗体の結合の５０％の低減をもたらす被験抗体の濃度であり、Ｋｄは、ヒトＯＸ４０に対するそのアフィニティーの尺度である、基準抗体の解離定数である。本明細書で開示された抗ＯＸ４０抗体と競合する抗体は、本明細書において記載されたアッセイ条件下において、１０ｐＭ〜１００ｎＭのＫｉを有しうる。
【００８２】
多様な実施形態において、被験抗体は、基準抗体濃度が、使用された具体的なアッセイ条件下における最大結合の８０％であり、被験抗体濃度が、基準抗体濃度の１０倍であるときに、基準抗体の結合を、少なくとも約２０％以上、例えば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％なお若しくはこれを超えて、又は前出の値のいずれかの間の範囲の百分率だけ減少する場合に、基準抗体と競合すると考えられる。
【００８３】
抗体が、ヒトＯＸ４０への結合について、本明細書において記載された基準抗体と競合するのかどうかを評価するために有用な、具体的なアッセイ及びアッセイ条件については、８．１．４節において示されている。
【００８４】
一部の実施形態において、本開示の抗ＯＸ４０抗体は、ヒトＯＸ４０（配列番号１）を活性化する。ＯＸ４０受容体の活性化は、多数の機構、例えば、ＯＸ４０受容体に対するリガンド様活性をもたらすことにより生じうる。このような場合、抗ＯＸ４０抗体は、ＯＸ４０受容体への結合について、ヒトＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ２５２；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｃｏｄｅ  Ｐ２３５１０．１）（配列番号４）と競合する。
【００８５】
本開示の抗ＯＸ４０抗体は、一般に、架橋の存在下において、ＯＸ４０受容体を活性化しうる。抗ＯＸ４０抗体が、架橋の存在下において、ＯＸ４０受容体、例えば、ヒトＯＸ４０受容体（配列番号１）を活性化しうるのかどうかを評価するために有用な、具体的なアッセイ及びアッセイ条件については、８．１．８節において示されている。一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、架橋の存在下において、約０．０１〜約３００ｎＭ、約０．０１〜約１００ｎＭ、約０．０１〜約１０ｎＭ、約０．０１〜約１ｎＭ、約０．１〜約３００ｎＭ、約０．１ｎＭ〜約１００ｎＭ、約１ｎＭ〜約１００ｎＭ又は約０．１ｎＭ〜約１００ｎＭのような範囲であるがこれらに限定されない、約１ｐＭ〜約５００ｎＭのＥＣ５０により、ヒトＯＸ４０受容体を活性化する。一部の実施形態において、１００μｇ／ｍＬにおける抗ＯＸ４０抗体は、ヒトＯＸ４０受容体を、架橋の存在下において、抗ＯＸ４０抗体の非存在下における、ヒトＯＸ４０受容体の活性と比較して、約３〜約１０００、例えば、約５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、２００、４００、５００、７００、８００又は約１０００倍のような、少なくとも約３倍の活性へと活性化しうる。
【００８６】
架橋は、外因性架橋剤の添加を含む多数の方法により、例えば、ヒト抗体又はヒト化抗体の重鎖、軽鎖若しくは可変領域に特異的な、抗体若しくは抗体Ｆ（ａｂ’）２断片により；可溶性プロテインＡ若しくは固定化させたプロテインＡにより；Ｆｃ受容体をトランスフェクトされた細胞系により；内因性Ｆｃ受容体を発現する細胞系により；プラスチック表面を、対象の抗体により直接コーティングすることにより；外因性の架橋抗体若しくはＦｃ受容体によりコーティングされたプラスチック表面により；又は上記のいずれかへとコンジュゲートさせたビーズにより施されうる。例示的な例において、対象の抗体は、ビオチンのようなタンパク質へとコンジュゲートさせることができ、可溶性アビジン若しくは固定化させたアビジン又は可溶性ストレプトアビジン若しくは固定化させたストレプトアビジンは、架橋剤として使用される。別の例において、インビボのヒトリンパ節において、抗ＯＸ４０抗体への結合の後におけるＯＸ４０の活性化は、内因性ＦｃγＲ＋抗原提示細胞により施される受容体の架橋の後において生じることが予測される。
【００８７】
一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、架橋の非存在下において、ヒトＯＸ４０受容体に結合し、これを活性化する。一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、ＯＸ４０Ｌ、例えば、ヒトＯＸ４０Ｌ（配列番号４）の非存在下において、ＯＸ４０受容体、例えば、ヒトＯＸ４０受容体（配列番号１）を活性化する。抗ＯＸ４０抗体が、架橋がない状態で、ＯＸ４０受容体を活性化しうるのかどうかを評価するために有用な、具体的なアッセイ及びアッセイ条件については、８．１．８節において示されている。一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、架橋がない状態で、約０．０１〜約３００ｎＭ、約０．０１〜約１００ｎＭ、約０．１〜約３００ｎＭ、約０．１ｎＭ〜約１００ｎＭ、約１ｎＭ〜約１００ｎＭ、約０．１ｎＭ〜約１００ｎＭ、約１〜約３００ｎＭ、約１〜約１００ｎＭ、約１〜約５０ｎＭ又は約１０〜約１００ｎＭのような範囲であるがこれらに限定されない、約１ｐＭ〜約５００ｎＭのＥＣ５０により、ヒトＯＸ４０受容体を活性化する。一部の実施形態において、１００μｇ／ｍＬにおける抗ＯＸ４０抗体は、ヒトＯＸ４０受容体を、架橋がない状態で、等量のアイソタイプ抗体を投与された場合のヒトＯＸ４０受容体の活性と比較して、約５〜約１０００、例えば、約５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、２００、３００、４００、５００、７００、８００又は約１０００倍のような、少なくとも約５倍の活性へと活性化しうる。一部の実施形態において、１０μｇ／ｍＬにおける抗ＯＸ４０抗体は、ヒトＯＸ４０受容体を、架橋がない状態で、等量のアイソタイプ抗体を投与された場合のヒトＯＸ４０受容体の活性と比較して、約３〜約３００、例えば、約３、５、６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、８０、１００、２００又は約３００倍のような、少なくとも約３倍の活性へと活性化しうる。一部の実施形態において、１μｇ／ｍＬにおける抗ＯＸ４０抗体は、ヒトＯＸ４０受容体を、架橋がない状態で、等量のアイソタイプ抗体を投与された場合のヒトＯＸ４０受容体の活性と比較して、約３〜約１５０、例えば、約３、４、５、６、７、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、８０、１００又は約１５０倍のような、少なくとも約３倍の活性へと活性化しうる。
【００８８】
一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、架橋の存在下において、架橋がない状態と比較して、高レベルにおいて、ＯＸ４０受容体、例えば、ヒトＯＸ４０受容体（配列番号１）を活性化する。抗ＯＸ４０抗体が、架橋がない状態で、ＯＸ４０受容体を活性化しうるレベルを決定するために有用な、具体的なアッセイ及びアッセイ条件については、８．１．８節において示されている。活性のレベルは、例えば、ＥＣ５０及び／又は観察された最大の活性化との関係において測定しうる。一部の実施形態において、１００μｇ／ｍＬにおける抗ＯＸ４０抗体は、架橋がない状態で、８．１．８節に従うアッセイにおいて、架橋がある状態のＮＦ−κＢ活性と比較して、約２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は約９０％のような、約２０％〜約９５％のＮＦ−κＢ活性において、ＯＸ４０受容体、例えば、ヒトＯＸ４０受容体（配列番号１）を活性化する。
【００８９】
一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、架橋がない状態で、８．１．８節に従うアッセイにおいて、約１ｎＭ〜約１００ｎＭ、約０．１ｎＭ〜約１００ｎＭ、約１〜約３００ｎＭ、約１〜約１００ｎＭ、約１〜約５０ｎＭ又は約１０〜約１００ｎＭのような範囲であるがこれらに限定されない、約０．１ｎＭ〜約５００ｎＭのＥＣ５０により、ヒトＯＸ４０受容体を活性化する。一部のこのような実施形態において、１０μｇ／ｍＬにおける抗ＯＸ４０抗体は、ヒトＯＸ４０受容体を、架橋がない状態で、等量のアイソタイプ抗体を投与された場合のヒトＯＸ４０受容体の活性と比較して、約３〜約３００、例えば、約３、５、６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、８０、１００、２００又は約３００倍のような、少なくとも約３倍の活性へと活性化しうる。一部のこのような実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、架橋の存在下において、８．１．８節に従うアッセイにおいて、約０．０１〜約３００ｎＭ、約０．０１〜約１００ｎＭ、約０．０１〜約１０ｎＭ、約０．０１〜約１ｎＭ、約０．１〜約３００ｎＭ、約０．１ｎＭ〜約１００ｎＭ、約１ｎＭ〜約１００ｎＭ又は約０．１ｎＭ〜約１００ｎＭのような範囲であるがこれらに限定されない、約１ｐＭ〜約３００ｎＭのＥＣ５０により、ヒトＯＸ４０受容体を活性化する。一部のこのような実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、架橋の存在下において、８．１．８節に従うアッセイにおいて、米国公開第２０１５／０３０７６１７号に記載された抗体１Ａ７のＥＣ５０と比較して、約１．５〜約１０倍、例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９又は約１０分の１のような、約１．５〜約１００分の１のような、低値のＥＣ５０において、ヒトＯＸ４０受容体を活性化しうる。
【００９０】
本発明の抗ＯＸ４０抗体は、架橋がない状態で、８．１．８節に従うアッセイにおいて、約１ｎＭ〜約１００ｎＭのＥＣ５０により、ヒトＯＸ４０受容体を活性化し、架橋の存在下にて、８．１．８節に従うアッセイにおいて、米国公開第２０１５／０３０７６１７号に記載された抗体１Ａ７のＥＣ５０と比較して、約１．５〜約１０分の１のような低値のＥＣ５０において、ヒトＯＸ４０受容体を活性化しうる。上記において列挙された特性を有する、例示的な抗ＯＸ４０抗体は、本明細書の実施例２〜８において記載されている、Ｍｕ３７３８及びＨｕ３７３８を含む。
【００９１】
一般に、抗ＯＸ４０抗体により処置されたときのＯＸ４０の活性化は、サイトカイン産生（例えば、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ））の増大及び／又は細胞増殖、例えば、ＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖の増大のようなシグナル伝達を結果としてもたらす。一部の実施形態において、１μｇ／ｍＬの抗ＯＸ４０抗体による処置の後における、ＩＦＮ−γの産生の増大は、等量のアイソタイプ抗体による処置の後におけるＩＦＮ−γの産生レベルの約１．５、２、３、４、５、６、８、１０、１５、２０、２５、３０、４０又は約５０倍のような、約１．５〜約５０倍である。一部の実施形態において、１μｇ／ｍＬの抗ＯＸ４０抗体による処置の後における、ＣＤ４＋  Ｔ細胞の増殖の増大は、等量のアイソタイプ抗体による処置の後におけるＣＤ４＋  Ｔ細胞の増殖レベルの約１．５、２、３、４、５、６、８、１０、１５又は約２０倍のような、約１．５〜約２０倍である。サイトカインレベルを決定するためのアッセイ又は細胞増殖レベルを決定するためのアッセイは、当技術分野において公知である。ＩＦＮ−γの産生及び／又はＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖を決定するための、具体的なアッセイ及びアッセイ条件は、本明細書の８．１．１２節において示されている。
【００９２】
７．４．抗ＯＸ４０抗体をコードするポリヌクレオチド、これらを作る発現系及び方法
本開示は、抗ＯＸ４０抗体のための免疫グロブリンの軽鎖遺伝子及び重鎖遺伝子をコードする核酸分子、このような核酸を含むベクター及び本開示の抗ＯＸ４０抗体を産生することが可能な宿主細胞を包摂する。
【００９３】
本開示の抗ＯＸ４０抗体は、宿主細胞内の免疫グロブリンの軽鎖遺伝子及び重鎖遺伝子の組換え発現により調製されうる。抗体を、組換えにより発現させるために、軽鎖及び重鎖が、宿主細胞内において発現し、任意選択的に、宿主細胞が培養され、抗体が回収される培地へと分泌されるように、宿主細胞に、抗体の免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡ断片を保有する、１つ以上の組換え発現ベクターをトランスフェクトする。抗体の重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子を得、これらの遺伝子を、組換え発現ベクターへと組み込み、ベクターを、宿主細胞へと導入するのに、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓ（編）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、１９８９）並びに米国特許第４，８１６，３９７号において記載されている組換えＤＮＡ法のような、標準的組換えＤＮＡ法が使用される。
【００９４】
このような抗ＯＸ４０抗体をコードする核酸を生成するために、まず、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域をコードするＤＮＡ断片を得る。これらのＤＮＡは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する、軽鎖及び重鎖の可変配列をコードする、生殖細胞系列のＤＮＡ又はｃＤＮＡの増幅及び修飾により得られうる。ヒト重鎖可変領域遺伝子及びヒト軽鎖可変領域遺伝子のための生殖細胞系列のＤＮＡ配列は、当技術分野において公知である（例えば、ヒト生殖細胞系列配列のデータベースである「ＶＢＡＳＥ」を参照されたい；また、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、１９９１、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ刊行物第９１−３２４２号；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２：１１６〜１９８；及びＣｏｘら、１９９４、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４：８２７〜８３６も参照されたい）。
【００９５】
抗ＯＸ４０抗体関連のＶＨセグメント及びＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られたら、これらのＤＮＡ断片は、標準的な組換えＤＮＡ法により、例えば、可変領域遺伝子を、全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子又はｓｃＦｖ遺伝子へと転換するように、さらに操作されうる。これらの操作において、ＶＬをコードするＤＮＡ断片又はＶＨをコードするＤＮＡ断片は、抗体の定常領域又は可撓性のリンカーのような、別のタンパク質をコードする、別のＤＮＡ断片へと作動的に連結される。この文脈において使用された、「作動的に連結された」という用語は、２つのＤＮＡ断片によりコードされたアミノ酸配列が、なおもインフレームにあるように、２つのＤＮＡ断片が接続されることを意味するように意図される。
【００９６】
ＶＨ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及び、任意選択的に、ＣＨ４）をコードする、別のＤＮＡ分子へと作動的に連結することにより、全長重鎖遺伝子へと転換されうる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野において公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、１９９１、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ刊行物第９１−３２４２号を参照されたい）、これらの領域を包摂するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅により得られうる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤの定常領域でありうるが、ある特定の実施形態において、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４である。Ｆａｂ断片の重鎖遺伝子のために、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域だけをコードする、別のＤＮＡ分子へと作動的に連結されうる。
【００９７】
ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域であるＣＬをコードする、別のＤＮＡ分子へと作動的に連結することにより、全長軽鎖遺伝子（並びにＦａｂ軽鎖遺伝子）へと転換されうる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野において公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、１９９１、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ刊行物第９１−３２４２号を参照されたい）、これらの領域を包摂するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅により得られうる。軽鎖定常領域は、カッパ又はラムダ定常領域でありうるが、ある特定の実施形態において、カッパ定常領域である。ｓｃＦｖ遺伝子を創出するために、ＶＨをコードするＤＮＡ断片及びＶＬをコードするＤＮＡ断片は、ＶＬ領域及びＶＨ領域が、可撓性のリンカーにより接続された、連続的な単鎖タンパク質として、ＶＨ配列及びＶＬ配列が表されうるように、可撓性のリンカーをコードする、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３（配列番号６０）をコードする別の断片へと作動的に連結される（例えば、Ｂｉｒｄら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３〜４２６；Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５８７９〜５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２〜５５４を参照されたい）。
【００９８】
本開示の抗ＯＸ４０抗体を発現させるために、上記において記載した通りに得られた、部分的軽鎖及び部分的重鎖又は全長軽鎖及び全長重鎖をコードするＤＮＡは、遺伝子が、転写制御配列及び翻訳制御配列へと作動的に連結されるように、発現ベクターへと挿入される。この文脈において、「作動的に連結された」という用語は、ベクター内の転写制御配列及び翻訳制御配列が、それらの意図された機能であって、抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節する機能を果たすように、抗体遺伝子が、ベクターへとライゲーションされることを意味するように意図される。発現ベクター及び発現制御配列は、使用される発現用宿主細胞と適合性となるように選択される。抗体の軽鎖遺伝子と、抗体の重鎖遺伝子とは、別個のベクターへと挿入される場合もありうるが、より典型的に、いずれの遺伝子も、同じ発現ベクターへと挿入される。
【００９９】
抗体遺伝子は、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子断片上の相補的な制限部位とベクターとのライゲーション又は制限部位が存在しない場合の、平滑末端によるライゲーション）により、発現ベクターへと挿入される。抗ＯＸ４０抗体関連の軽鎖配列又は重鎖配列を挿入する前に、発現ベクターは、既に、抗体の定常領域配列を保有しうる。例えば、抗ＯＸ４０モノクローナル抗体関連のＶＨ配列及びＶＬ配列を、全長抗体遺伝子へと転換する１つの手法は、ＶＨセグメントが、ベクター内のＣＨセグメントへと作動的に連結され、ＶＬセグメントが、ベクター内のＣＬセグメントへと作動的に連結されるように、重鎖定常領域及び軽鎖定常領域のそれぞれをあらかじめコードする発現ベクターへと、それらを挿入することである。加えて、又は代替的に、組換え発現ベクターは、抗体鎖の、宿主細胞からの分泌を容易とするシグナルペプチドをコードしうる。シグナルペプチドが、インフレームにおいて、抗体鎖遺伝子のアミノ末端へと連結されるように、抗体鎖遺伝子は、ベクターへとクローニングされうる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドの場合もあり、異種シグナルペプチド（すなわち、免疫グロブリン以外のタンパク質に由来するシグナルペプチド）の場合もある。
【０１００】
抗体鎖遺伝子に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞内の抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を保有する。「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー及び抗体鎖遺伝子の転写又は翻訳を制御する他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、「Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、１９９０において記載されている。当業者により、調節配列の選択を含む発現ベクターのデザインは、形質転換される宿主細胞の選択、所望されるタンパク質の発現レベルなどのような因子に依存しうることが理解される。哺乳動物宿主細胞の発現に適する調節配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶのプロモーター／エンハンサーのような）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーのような）、アデノウィルス（例えば、アデノウィルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））及びポリオーマウイルスに由来するプロモーター及び／又はエンハンサーのような、哺乳動物細胞内の、高レベルのタンパク質発現を方向付けるウイルス性エレメントを含む。ウイルス性調節エレメント及びこれらの配列のさらなる記載について、例えば、Ｓｔｉｎｓｋｉによる米国特許第５，１６８，０６２号、Ｂｅｌｌらによる米国特許第４，５１０，２４５号及びＳｃｈａｆｆｎｅｒらによる米国特許第４，９６８，６１５号を参照されたい。
【０１０１】
抗体鎖遺伝子及び調節配列に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞内のベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）及び選択用マーカー遺伝子のような、さらなる配列を保有しうる。選択用マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易とする（例えば、全てＡｘｅｌらによる、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，６３４，６６５号及び同第５，１７９，０１７号を参照されたい）。例えば、選択用マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に対して、Ｇ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキサートのような薬物に対する耐性を付与することが典型的である。適切な選択用マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサートによる選択／増幅を伴う、ＤＨＦＲ−宿主細胞における使用のための）及びｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８による選択のための）を含む。軽鎖及び重鎖を発現させるために、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターは、標準的な技法により、宿主細胞へとトランスフェクトされる。多様な形態にわたる「トランスフェクション」という用語は、外因性ＤＮＡを、原核宿主細胞又は真核宿主細胞へと導入するために一般に使用される多種多様な技法であって、例えば、電気穿孔、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどの技法を包摂することが意図される。
【０１０２】
本開示の抗ＯＸ４０抗体は、原核宿主細胞又は真核宿主細胞において発現させることが可能である。ある特定の実施形態において、抗体の発現は、真核細胞、例えば、フォールディングが適正であり、免疫学的に活性である抗体の分泌を最適とする、哺乳動物宿主細胞において実施される。本開示の組換え抗体を発現させるための、例示的な哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、Ｋａｕｆｍａｎ及びＳｈａｒｐ、１９８２、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５９：６０１〜６２１において記載されている、ＤＨＦＲ選択用マーカーと共に使用される、Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ、１９８０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４２１６〜４２２０において記載されている、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞を含む。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが、哺乳動物宿主細胞へと導入される場合、抗体は、宿主細胞内の抗体の発現又は宿主細胞が増殖する培養培地への抗体の分泌を可能とするのに十分な時間にわたり、宿主細胞を培養することにより産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製法を使用して、培養培地から回収されうる。宿主細胞はまた、Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖ分子のような、抗体の抗ＯＸ４０結合性断片を産生するのにも使用されうる。上記の手順に対する変動は、本開示の範囲内にあることが理解される。例えば、宿主細胞に、本開示の抗ＯＸ４０抗体の軽鎖又は重鎖（両方ではない）をコードするＤＮＡをトランスフェクトすることが所望されうる。
【０１０３】
組換えＤＮＡ技術はまた、ヒトＯＸ４０への結合に必要でない軽鎖及び重鎖の一方又は両方をコードするＤＮＡの一部又は全部を除去するのにも使用されうる。また、このような切断型ＤＮＡ分子から発現する分子も、本開示の抗体に包摂される。
【０１０４】
本開示の抗ＯＸ４０抗体を組換え発現させるために、宿主細胞に、本開示の２つの発現ベクターが共トランスフェクトされ得、ここで、第１のベクターが、重鎖に由来するポリペプチドをコードし、第２のベクターが、軽鎖に由来するポリペプチドをコードする。２つのベクターは、同一の選択用マーカーを含有する場合もあり、各々、個別の選択用マーカーを含有する場合もある。代替的に、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの両方をコードする、単一のベクターも使用されうる。
【０１０５】
抗ＯＸ４０抗体の１つ以上の部分をコードする核酸が得られたら、例えば、異なるＣＤＲ配列を有する抗体、Ｆｃ受容体に対するアフィニティーが低減された抗体又は異なるサブクラスの抗体をコードする核酸を生成するように、さらなる変更又は突然変異が、コード配列へと導入されうる。
【０１０６】
本開示の抗ＯＸ４０抗体はまた、化学合成によっても産生されうる（例えば、「Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、２版、１９８４、Ｔｈｅ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．において記載されている方法により）。変異体抗体はまた、無細胞プラットフォームを使用しても生成されうる（例えば、Ｃｈｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉａ、２号、２００１（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）及びＭｕｒｒａｙら、２０１３、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１７：４２０〜４２６を参照されたい）。
【０１０７】
本開示の抗ＯＸ４０抗体が、組換え発現により産生されたら、免疫グロブリン分子を精製するための、当技術分野において公知である、任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー及びサイズ除外カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差的可溶性又はタンパク質を精製するための他の任意の標準的な技法により精製されうる。さらに、本開示の抗ＯＸ４０抗体は、精製を容易とするように、本明細書において記載された異種ポリペプチド配列又は当技術分野において、他の形において公知の異種ポリペプチド配列へと融合されうる。
【０１０８】
単離されたら、抗ＯＸ４０抗体は、所望の場合、例えば、高速液体クロマトグラフィー（例えば、Ｆｉｓｈｅｒ、「Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｗｏｒｋ及びＢｕｒｄｏｎ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９８０を参照されたい）によりさらに精製される場合もあり、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）上のゲル濾過クロマトグラフィーによりさらに精製される場合もある。
【０１０９】
７．５．医薬組成物
本明細書において記載された抗ＯＸ４０抗体は、抗体並びに１つ以上の担体、賦形剤及び／又は希釈剤（これらの全ては、本明細書において、「担体」と称される）、すなわち、緩衝剤、安定化剤、保存剤、等張剤、非イオン性洗浄剤、抗酸化剤及びその他の添加剤を含む組成物の形態でありうる。「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、１６版（Ｏｓｏｌ編、１９８０）を参照されたい。組成物は、獣医学的使用又はヒトにおける医薬としての使用のような、具体的使用のために製剤化されうる。使用される組成物（例えば、乾燥粉末、液体製剤など）及び担体の形態は、抗体の意図される使用及び、治療的使用について、投与方式に依存する。
【０１１０】
治療的使用のために、組成物は、薬学的に許容される担体を含む、滅菌の医薬組成物の一部として供給されうる。この組成物は、任意の適切な形態でありうる（それを患者へと投与する所望の方法に応じて）。医薬組成物は、患者へと、静脈内、腫瘍内又は髄腔内のような、様々な経路により投与されうる。所与の任意の場合において、投与に最も適する経路は、特定の抗体、対象、並びに疾患の性格及び重症度並びに対象の全身状態に依存する。医薬組成物は、静脈内投与されることが典型的である。
【０１１１】
医薬組成物は、投与１回当たり所定量の、本明細書において記載された抗ＯＸ４０抗体を含有する単位剤形において提示されると好都合でありうる。単位用量中に含まれる抗ＯＸ４０抗体の数量は、処置される疾患のほか、当技術分野において周知である、他の因子に依存する。このような単位投与量は、単回の投与に適する量の抗体を含有する、凍結乾燥させた乾燥粉末の形態の場合もあり、液体の形態の場合もある。乾燥粉末による単位剤形は、シリンジ、適切な数量の担体及び／又は投与に有用な他の成分を有するキットにパッケージングされうる。液体形態の単位投与量は、単回の投与に適する数量の抗ＯＸ４０抗体により事前に充填されたシリンジの形態において供給されると好都合でありうる。
【０１１２】
医薬組成物はまた、複数回投与に適する数量の抗ＯＸ４０抗体を含有するバルク形態においても供給されうる。
【０１１３】
医薬組成物は、所望の純度を有する抗体を、当技術分野において、典型的に援用される、任意選択の、薬学的に許容される担体と混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液としての保存のために調製されうる。このような添加剤は、援用される投与量及び濃度において、レシピエントに対して非毒性でなければならない。
【０１１４】
例えば、静脈内投与のために、組成物は、滅菌水又は注射若しくは注入に適する他の溶液（例えば、０．９％の生理食塩液、リンゲル液、乳酸加リンゲル液など）により再構成すると、水性組成物をもたらす、凍結乾燥粉末の形態でありうる。
【０１１５】
７．６．使用法
７．６．１．治療的利益
本明細書において提供されたデータは、開示された抗ＯＸ４０抗体が、がん細胞の存在下において、ＯＸ４０受容体を活性化し、インビボにおいて、がんに対する、強力な抗がん活性を及ぼすことを裏付ける。したがって、抗ＯＸ４０抗体及び／又は抗ＯＸ４０抗体を含む医薬組成物は、がんを処置するために、治療的に使用されうる。
【０１１６】
一部の実施形態において、がんは、固形腫瘍である。抗ＯＸ４０抗体により処置されうる固形腫瘍は、膀胱がん、乳がん（例えば、トリプルネガティブ乳がん）、頭頸部がん、腎臓がん（例えば、腎細胞癌）、肝臓がん（例えば、肝細胞癌、胆管癌）、肺がん（例えば、非小細胞肺がん、中皮腫、小細胞肺がん）、黒色腫（例えば、切除不能性黒色腫又は転移性黒色腫、進行性悪性黒色腫）、皮膚がん（例えば、メルケル細胞癌）、卵巣がん、胃がん及びＤＮＡミスマッチ修復欠損の証拠を有する腫瘍を含む。がんは、ＯＸ４０を発現する細胞を含有する腫瘍を含む場合もあり；一部が、ＯＸ４０を発現する細胞を含有し、一部が、これらを含有しない腫瘍を含む場合もあり；ＯＸ４０を発現する細胞を欠く腫瘍を含む場合もある。がんは、新たに診断され、未処置の場合もあり、再発性、不応性又は再発性かつ不応性の場合もあり、固形腫瘍の転移性形態の場合もある。一部の実施形態において、固形腫瘍は、ＰＤ−１ターゲティング剤又はＰＤ−Ｌ１ターゲティング剤が未投薬である。他の実施形態において、固形腫瘍は、ＰＤ−１ターゲティング剤又はＰＤ−Ｌ１ターゲティング剤による処置の後において、再発性又は不応性である。一部の実施形態において、固形腫瘍は、膀胱がん、乳がん、頭頸部がん、腎臓がん、肺がん、黒色腫及び胃がんから選択される。一部の実施形態において、固形腫瘍は、黒色腫（例えば、切除不能性黒色腫又は転移性黒色腫）、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）及び腎細胞癌（例えば、進行性腎細胞癌）から選択される。一部の実施形態において、固形腫瘍は、トリプルネガティブ乳がん、卵巣がん、肝細胞癌、胃がん、小細胞肺がん、中皮腫、胆管癌、メルケル細胞癌及びＤＮＡミスマッチ修復欠損の証拠を有する腫瘍から選択される。ある特定の実施形態において、肺がんは、白金ベースの化学療法時又はこの後における進行を伴う、転移性非小細胞肺がんである。ある特定の実施形態において、肺がんは、白金ベースの治療及びＰＤ−１ターゲティング剤又はＰＤ−Ｌ１ターゲティング剤による治療が失敗した、局所進行性非小細胞肺がん又は転移性非小細胞肺がんである。ある特定の実施形態において、頭頸部がんは、局所治療若しくは全身治療による、治癒のための処置候補ではない、扁平上皮頭頸部癌又は局所治療により難治性であると考えられた、口腔、口腔咽頭、下咽頭及び喉頭の、転移性（播種性）頭頸部扁平上皮癌である。
【０１１７】
上記において論じられた通り、本開示の抗ＯＸ４０抗体は、免疫応答をモジュレートする。したがって、免疫系が損なわれた患者は、処置から除外されうる。一部の実施形態において、患者は、以下の基準のうちの１又は複数を満たした後に除外される：（１）活動性の自己免疫疾患若しくは過去２年以内に既往の記録がある自己免疫疾患（炎症性腸疾患、セリアック病、ウェゲナー症候群を含むがこれらに限定されない）（小児性アトピー性皮膚炎若しくは喘息、白斑、禿頭、橋本症候群、グレーブス病若しくは全身処置を要請しない乾癬（過去２年以内）を有する対象は、除外されない）；（２）原発性免疫不全症、骨髄移植、慢性リンパ球性白血病、固形臓器移植若しくは過去における結核の臨床診断の既往歴；（３）凝固障害若しくは血小板障害の既往歴；（４）ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）についての陽性検査結果の確認又は慢性若しくは活動性のＢ型肝炎若しくはＣ型肝炎を有する対象（Ｂ型肝炎又はＣ型肝炎の既往歴を有する対象であって、抗ウイルス療法の後における治癒の記録がある対象は、登録されうる）；（５）過去に、免疫療法（ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−１に対して方向付けられた薬剤を含むがこれらに限定されない）を施されたときの、グレード＞３の免疫媒介性神経毒性又は肺炎、加えて、他の任意の、過去に、免疫療法を施されたときの、グレード＞３の免疫媒介性有害事象であって、３カ月以内に消失しなかった、又は無症状性とならなかった有害事象；（６）抗ＯＸ４０抗体の初回投与の２８日間以内前における、弱毒化生ワクチンの施与。
【０１１８】
本開示の抗ＯＸ４０抗体は、単独（単剤療法）において投与される場合もあり、他の抗がん療法及び／又はターゲティング型抗がん剤若しくは非ターゲティング型抗がん剤に加えて、又はこれらと共に投与される場合もある。抗ＯＸ４０単剤療法として投与される場合、１つ以上の抗体が使用されうる。単剤療法として投与されるのであれ、他の治療又は薬剤に加えて、又はこれらと共に投与されるのであれ、抗ＯＸ４０抗体の量は、全体的な処置レジメンが、治療的利益をもたらすように投与される。
【０１１９】
治療的利益とは、患者におけるがんを処置する抗ＯＸ４０抗体の使用が、非治療（該当する場合）又は公知の標準治療と比較して、任意の、裏付けられた臨床利益を結果としてもたらすことを意味する。臨床利益は、当業者に公知である、任意の方法により評価されうる。一実施形態において、臨床利益は、客観的奏効率（ＯＲＲ）（ＲＥＣＩＳＴ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．１を使用して決定される）、奏効期間（ＤＯＲ）、無進行生存（ＰＦＳ）及び／又は全生存（ＯＳ）に基づき評価される。一部の実施形態において、完全奏効は、治療的利益を指し示す。一部の実施形態において、部分奏効は、治療的利益を指し示す。一部の実施形態において、安定は、治療的利益を指し示す。一部の実施形態において、全生存の増大は、治療的利益を指し示す。一部の実施形態において、治療的利益は、進行までの時間の改善及び／又は症状若しくは生活の質の改善を構成する。他の実施形態において、治療的利益は、疾患コントロール期間の延長ではなく、生活の質の改善を結果としてもたらす、症状負荷の顕著な低減へと置きかえられる。当業者に明らかな通り、治療的利益は、抗ＯＸ４０抗体を、単独（単剤療法）において使用して観察される場合もあり、他の抗がん療法及び／又はターゲティング型抗がん剤若しくは非ターゲティング型抗がん剤に加えて、又はこれらと共に使用して観察される場合もある。
【０１２０】
治療的利益は、がんのための新たな処置に対する応答を測定するようにデザインされた、標準的な臨床試験を使用して評価されることが典型的である。本明細書において記載された抗ＯＸ４０抗体の治療的利益を評価するために、以下の試験：（１）固形がん治療効果判定基準（ＲＥＣＩＳＴ）ｖｅｒｓｉｏｎ  １．１、（２）免疫関連ＲＥＣＩＳＴ（ｉｒＲＥＣＩＳＴ）、（３）米国東海岸癌臨床試験グループ（ＥＣＯＧ）パフォーマンスステータス、（４）免疫関連効果判定基準（ｉｒＲＣ）、（５）腫瘍抗原の評価により査定可能な疾患、（６）検証された患者報告型転帰スケール及び／又は（７）全生存及び無進行生存についてのカプラン−マイヤー推定値のうちの１つの又は組合せが使用されうる。
【０１２１】
腫瘍負荷の変化についての評価は、がん治療剤についての臨床査定の重要な特色である。腫瘍退縮（客観的奏効）及び進行の発生までの時間のいずれも、がん臨床試験における、重要な評価項目である。固形がん治療効果判定基準（ＲＥＣＩＳＴ）として公知の、標準化された奏効基準は、２０００年に公表された。改訂版（ＲＥＣＩＳＴ１．１）は、２００９年に発刊された。ＲＥＣＩＳＴ基準は、これらの転帰尺度が、解剖学的腫瘍負荷及び試験の経過にわたるその変化についての評価に基づくため、客観的奏効が主要研究評価項目である臨床試験のほか、安定、腫瘍進行についての評価又は進行までの時間についての解析が企図される試験においても使用されることが典型的である。表８は、本明細書において記載された抗ＯＸ４０抗体のような研究薬に対する、腫瘍の客観的応答を決定するのに使用された奏効基準の定義を提供する。
【０１２２】
【表８】
0006772385.tif 000015
【０１２３】
本明細書において記載された抗ＯＸ４０抗体の治療的利益を決定するのに使用されうる副次的転帰尺度は、客観的奏効率（ＯＲＲ）、無進行生存（ＰＦＳ）、全生存（ＯＳ）、奏効期間（ＤＯＲ）及び奏効の深さ（ＤｐＲ）を含む。ＯＲＲは、完全奏効（ＣＲ）又は部分奏効（ＰＲ）を達成する参加者の比率として規定される。ＰＦＳは、抗ＯＸ４０抗体の、初回の投与日から、進行又は死亡のいずれかが先に生じるまでの時間として規定される。ＯＳは、疾患についての診断日又は処置の開始日からの時間であって、疾患を有すると診断された患者が依然として生存している時間として規定される。ＤＯＲは、参加者の最初のＣＲ又はＰＲから、進行までの時間として規定される。ＤｐＲは、最大の応答時点において観察された腫瘍退縮の、ベースラインの腫瘍負荷と比較した百分率として規定される。ＯＲＲ及びＰＦＳのいずれについての臨床評価項目も、上記において記載されたＲＥＣＩＳＴ  １．１基準に基づき決定されうる。
【０１２４】
免疫療法による処置を受けるがん患者に特異的な臨床査定に使用されうる、さらなる基準は、標準化された免疫関連ＲＥＣＩＳＴ（ｉｒＲＥＣＩＳＴ）基準を含む。例えば、Ｎｉｓｈｉｎｏ，Ｍ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｒａｄｉｏｌ、８４（７）、１２５９〜１２６８頁（２０１５年７月）を参照されたい。これらのガイドラインは、潜在的な免疫調節効果を考慮して、上記のＲＥＣＩＳＴ  １．１基準を改訂した。表９は、本明細書において記載された抗ＯＸ４０抗体のような免疫調節薬に対する客観的応答を決定するのに使用された奏効基準の定義を提供する。
【０１２５】
【表９】
0006772385.tif 000016
【０１２６】
表１０に示されたＥＣＯＧパフォーマンスステータススケールは、自分自身をケアする能力、毎日の活動及び全身能力との関係における、患者の機能レベルについて記載するのに使用される。スケールは、現在、ＥＣＯＧ−ＡＣＲＩＮがん研究グループの一部である、米国東海岸癌臨床試験グループ（ＥＣＯＧ）により開発され、１９８２年に公表された。
【０１２７】
【表１０】
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【０１２８】
抗体ベースのがん療法のような、免疫療法剤に対する応答を完全に特徴付け、決定するのに使用されうる基準の別のセットは、固形腫瘍を測定するために、２００９年に開発され、２０１３年に改訂された、免疫関連効果判定基準（ｉｒＲＣ）（Ｗｏｌｃｈｏｋら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００９；１５（２３）：７４１２〜７４２０及びＮｉｓｈｉｎｏら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１３；１９（１４）：３９３６〜３９４３）である。改訂ｉｒＲＣ基準は、表１１に従い、本明細書において記載された抗ＯＸ４０抗体のような免疫療法剤の、腫瘍負荷に対する効果を評価し、応答を規定するのに使用されることが典型的である。
【０１２９】
【表１１】
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【０１３０】
単剤療法として投与されるのであれ、他の治療又は薬剤に加えて、又はこれらと共に投与されるのであれ、固形腫瘍を処置するための、本明細書において記載された抗ＯＸ４０抗体の使用から生じる、１つの例示的な治療的利益は、完全奏効である。単剤療法として投与されるのであれ、他の治療又は薬剤に加えて、又はこれらと共に投与されるのであれ、固形腫瘍を処置するための、抗ＯＸ４０抗体の使用から生じる、別の例示的な治療的利益は、部分奏効である。
【０１３１】
検証された患者報告型転帰スケールもまた、各患者により、具体的な報告システムを介して提供される応答を描示するのに使用されうる。このような転帰スケールは、焦点を当てられた疾患ではなく、慢性状態を管理しながら、保持される機能に関する。検証された患者報告型転帰スケールの、１つの非限定例は、米国国立保健研究所による、ＰＲＯＭＩＳ（登録商標）（Ｐａｔｉｎｅｔ  Ｒｅｐｏｒｔｅｄ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）である。例えば、成人がん患者のためのＰＲＯＭＩＳ（登録商標）Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔは、上肢（例えば、器用さ）、下肢（例えば、歩行又は運動）及び中心領域（例えば、頸部、背部の運動）の機能のための、自己報告された能力について査定することが可能であり、雑用のような、日常的な毎日の活動を含む。
【０１３２】
カプラン−マイヤー曲線（Ｋａｐｌａｎ及びＭｅｉｅｒ、Ｊ．Ａｍ．Ｓｔａｔ．Ａｓｓｏｃ．、１９５８；５３（２８２）：４５７〜４８１）もまた、抗ＯＸ４０抗体療法を受けるがん患者について、全生存及び無進行生存を、標準治療と比較して推定するのに使用されうる。
【０１３３】
７．６．２．併用療法
抗ＯＸ４０抗体は、抗がん特性を有する、他の薬剤又は処置であって、抗ＰＤ−１抗体療法のような標準治療を含む薬剤又は処置に加えて、又はこれらと共に使用されうる。併用される場合、抗ＯＸ４０抗体及び他の薬剤は、単一の組合せ医薬製剤中に、併せて製剤化される場合もあり、単一の協同的投与レジメン又は異なる投与レジメンにより、個別に製剤化され、投与される場合もある。抗ＯＸ４０抗体に加えて、又はこれと共に投与される薬剤は、抗体と他の薬剤とが、互いに対して有害な影響を及ぼし合わないように、抗ＯＸ４０抗体と相補的な活性を有することが典型的である。
【０１３４】
７．７．投与量及び投与レジメン
投与される抗ＯＸ４０抗体の量は、処置される特定の種類のがん、処置されるがんのステージ、投与方式、投与頻度、所望される治療的利益、並びに患者の年齢、体重及び他の特徴などのような他のパラメータを含むがこれらに限定されない、様々な因子に依存する。具体的な投与方式及び投与頻度について、治療的利益をもたらすのに有効な投与量の決定は、当業者の能力の範囲内にある。
【０１３５】
治療的利益をもたらすのに有効な投与量は、まず、インビボの動物モデルから推定されうる。多種多様な疾患に適する動物モデルは、当技術分野において公知である。
【０１３６】
本明細書で開示された抗ＯＸ４０抗体は、処置される状態に適切な、任意の経路により投与されうる。一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、配列番号４１〜４８のいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号５１〜５４のいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有する軽鎖を有するヒト化抗体のいずれか１つである。ある特定の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、配列番号４１又は４２で表されるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号５１で表されるアミノ酸配列を有する軽鎖を有する。抗ＯＸ４０抗体は、非経口投与、すなわち、非経口注入、静脈内（ＩＶ）注入、髄腔内注入、ボーラス注入、腫瘍内注射又は硬膜外注射されることが典型的である（Ｓｈｉｒｅら、２００４、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、９３（６）：１３９０〜１４０２）。一実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、バイアル内の凍結乾燥粉末として提供される。投与の前に、凍結乾燥粉末は、抗ＯＸ４０抗体を含有する溶液をもたらすように、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）又は他の適切な媒体により再構成される。一部の実施形態において、結果として得られる、再構成された溶液は、生理食塩液又は注入に適する他の媒体によりさらに希釈され、２週間ごと、すなわち、１３、１４又は１５日ごとに１回のＩＶ注入を介して投与される。
【０１３７】
一部の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ又は３．０ｍｇ／ｋｇにおける、２週間ごとに１回のＩＶ注入として投与される。
【０１３８】
他の化学療法剤のような、他の薬剤に加えて、又はこれと共に投与される場合、抗ＯＸ４０抗体は、他の薬剤と同じスケジュールにより投与される場合もあり、異なるスケジュールにより投与される場合もある。同じスケジュールにより投与される場合、抗ＯＸ４０抗体は、他の薬剤の前に投与される場合もあり、他の薬剤の後で投与される場合もあり、他の薬剤と同時的に投与される場合もある。
【０１３９】
当業者により理解される通り、上記において記載された多様な薬剤について推奨された投与量は、患者の応答を最適化し、治療的利益を最大化するように、調整される必要がある。
【実施例】
【０１４０】
８．実施例
本明細書において記載された抗ＯＸ４０抗体についての例示的な実施形態の、ある特定の特色及び特性を強調する、以下の実施例は、例示を目的として提供されるものであり、限定を目的として提供されるものではない。
【０１４１】
［実施例１］  材料及び方法
８．１．１．ＥＬＩＳＡによる、抗ＯＸ４０抗体の、ヒトＯＸ４０への結合
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ  ４ｘＨＢ  ９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、１μｇ／ｍＬのヒトＯＸ４０−ＦＣ（Ｒ＆Ｄ  系）により、４℃において、一晩にわたりコーティングした。プレートを、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）により、室温において、３０分間にわたりブロッキングし、次いで、プレート洗浄機を使用して、ＰＢＳＴ（０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０の入ったＰＢＳ）により、３回にわたり洗浄した。次いで、ＯＸ４０によりコーティングされたプレートを、表示濃度の被験抗体と共に、室温において、１時間にわたりインキュベートした。プレートを、ＰＢＳＴと共に、４回にわたり洗浄し、次いで、１％のＢＳＡを含有するＰＢＳ中に、１：５０００の希釈率となるように調製された、ヤギ抗ヒトＦａｂ断片特異的ビオチン（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）１００μＬと共に、室温において、１時間にわたりインキュベートした。次いで、プレートを、ＰＢＳＴ中において、５回にわたり洗浄し、希釈率を１：１０００とする、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）１００μＬを、各ウェルへと添加し、室温において、３０分間にわたりインキュベートした。その後、プレートを、ＰＢＳＴ中において、５回にわたり洗浄し、ＴＭＢ  Ｏｎｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ（Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ）１００μＬを、各ウェルへと添加し、発色するまで（約５〜１０分間）、室温（ＲＴ）においてインキュベートした。光学濃度（ＯＤ）を、６５０ｎｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍａｘ１９０）において読み取った。
【０１４２】
８．１．２．ＥＬＩＳＡによる、抗ＯＸ４０抗体の、カニクイザルＯＸ４０への結合
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ  ４ｘＨＢ  ９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、１μｇ／ｍＬのＣｙｎｏ  ＯＸ４０−Ｆｃ融合体により、４℃において、一晩にわたりコーティングした。プレートを、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳにより、ＲＴにおいて、３０分間にわたりブロッキングし、次いで、ＰＢＳＴ（０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０の入ったＰＢＳ）により、３回にわたり洗浄した。次いで、ＯＸ４０によりコーティングされたプレートを、表示濃度の抗ＯＸ４０抗体と共に、室温において、１時間にわたりインキュベートした。プレートを、ＰＢＳＴと共に、４回にわたり洗浄し、次いで、１％のＢＳＡを含有するＰＢＳ中に、１：５０００の希釈率となるように調製された、ヤギ抗ヒトＦＡＢ断片特異的ビオチン（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）１００μＬと共に、室温において、１時間にわたりインキュベートした。次いで、プレートを、ＰＢＳＴ中において、５回にわたり洗浄し、希釈率を１：１０００とする、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）１００μＬを、各ウェルへと添加し、室温において、３０分間にわたりインキュベートした。次いで、プレートを、ＰＢＳＴ中において、５回にわたり洗浄し、ＴＭＢ  Ｏｎｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ（Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ）１００μＬを、各ウェルへと添加し、発色するまで（約５〜１０分間）、室温においてインキュベートした。光学濃度（ＯＤ）を、６５０ｎｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍａｘ１９０）において読み取った。
【０１４３】
８．１．３．フローサイトメトリーによる、抗ＯＸ４０抗体の、アカゲザルＯＸ４０への結合
アカゲザル（マカカ・ムラッタ（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ））ＯＸ４０は、アミノ酸レベルにおいて、カニクイザル（マカカ・ファシクラリス（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））ＯＸ４０（配列番号２）と同一である。アカゲザルＯＸ４０を発現する２９３ＮＦ−κＢレポーター細胞系を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及びペニシリン／ストレプトマイシンを含有する、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中において培養した。結合アッセイのために、細胞を、１ｍＬ当たりの細胞５００万個において再懸濁させた。ウェル１つ当たり５０μＬ（細胞２５０，０００個）を、５００μＬのポリプロピレン製９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）の各ウェルへと移した。被験抗ＯＸ４０抗体又はアイソタイプ対照モノクローナル抗体の、２倍濃度の原液を、別個の希釈プレート内の培養培地中、６６６、３３３、１１１、３７．０３、１２．３４、４．１１、０．４５７、０．１５２、０．０５０８、０．０１６９、０．００５６４ｎＭにおいて調製した。モノクローナル抗体（ウェル１つ当たり５０μＬ）を、アッセイプレートの、それぞれのウェルへと移した。細胞を、一次抗体と共に、４℃において、３０分間にわたりインキュベートし、８００ｒｐｍにおいて、３分間にわたり遠心分離することにより、ウェル１つ当たり２５０μＬのＰＢＳにより、２回にわたり洗浄した。結合した抗体を、ＰＢＳ中に２μｇ／ｍＬ（ウェル１つ当たり５０μＬ）へと希釈されたＣｙ５−Ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）により、４℃において、３０分間にわたり検出した。細胞を、ウェル１つ当たり２５０μＬのＰＢＳにより、１回洗浄し、１％のホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中に再懸濁させ、デュアルレーザーＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上において解析した。
【０１４４】
８．１．４．表面プラズモン共鳴による、ヒトＯＸ４０及びアカゲザルＯＸ４０への、抗ＯＸ４０抗体の結合アフィニティー
抗ＯＸ４０抗体の、組換え可溶性ＯＸ４０  ＥＣＤ（細胞外ドメイン）への結合反応速度を、抗Ｆｃ捕捉アッセイ法を使用して、２５℃において、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００測定器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上においてなされた、表面プラズモン共鳴ベースの測定により決定した。ヒトＯＸ４０（残基１〜２１６）及びアカゲザルＯＸ４０（残基２８〜２１４）の組換え細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を購入し（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍａｒｔ）、１０ｍＭの４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ｐＨ  ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）中において、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するゲル濾過によりさらに精製した。アカゲザル（マカカ・ムラッタ）ＯＸ４０は、アミノ酸レベルにおいて、カニクイザル（マカカ・ファシクラリス）ＯＸ４０（配列番号２）と同一である。チップの調製及び結合反応速度の測定は、アッセイ緩衝液であるＨＢＳ−ＥＰ＋（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ  ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０）中において行った。抗Ｆｃ捕捉チップを調製するために、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中において、２５μｇ／ｍＬへと希釈された、約２０００共鳴単位（ＲＵ）のヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃポリクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）を、製造元の指示書及び手順に従い、標準的なアミンカップリングキットを使用して、ＣＭ５バイオセンサーチップにわたり、直接固定化させた。バイオセンサー表面において反応させない部分を、エタノールアミンによりブロッキングした。結合反応速度を測定するために、各アッセイサイクルは、以下のステップ：１）被験抗ＯＸ４０抗体の、被験表面上だけの捕捉；２）基準表面及び被験表面の両方における、８０μＬ／分において、２４０μＬにわたる、解析物の注入（ＯＸ４０ＥＣＤ又は緩衝液だけ）を行い、この後、８０μＬ／分において、９００秒間にわたり、解離をモニタリングした；３）１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ  １．５の、基準表面及び被験表面の両方における注入による、捕捉表面の再生からなった。アッセイにおいて、全ての測定値は、捕捉表面単独（すなわち、被験抗体の捕捉を伴わない）を参照基準とし、緩衝液だけの注入を、二重基準化のために使用した。ＯＸ４０の注入は、それぞれ、ランダム化された９倍又は３倍の希釈系列において、９００ｎＭ又は３００ｎＭ〜１１．１１ｎＭの濃度範囲にわたった。データを加工し、結合反応速度定数である、ｋａ（Ｍ−１秒−１）及びｋｄ（秒−１）並びに平衡解離定数ＫＤ（Ｍ）を決定するように、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、１：１結合モデルへと、全体的に当てはめた。
【０１４５】
８．１．５．抗ＯＸ４０抗体による、ＯＸ４０リガンドの遮断
ヒトＯＸ４０を安定的にトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞であって、ウェル１つ当たりの細胞２×１０５個において培養されたＪｕｒｋａｔ細胞を、丸底９６ウェルプレート内、ＲＴにおいて、３０分間にわたり、１％のＢＳＡを含有するＰＢＳ中、０．２μｇ／ｍＬの被験抗ＯＸ４０抗体及び滴定量の可溶性ヒトＯＸ４０Ｌ（Ｒ＆Ｄ  系）と同時にインキュベートした。細胞を、２回にわたり洗浄し、ウェル１つ当たり、希釈率を１：５００とする、ヤギ抗ヒトＦｃ  ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）１００μＬと共に、さらに３０分間にわたりインキュベートした。次いで、細胞を、２回にわたり洗浄し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して収集し、ＦＡＣＳＤｉｖａを使用して解析した。
【０１４６】
８．１．６．細胞表面に発現したヒトＯＸ４０への、抗ＯＸ４０抗体の結合
ヒトＯＸ４０タンパク質を発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦ−κＢレポーター細胞系を、１０％のＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）を含有するＤＭＥＭ中において培養した。結合アッセイのために、各細胞系を、１ｍＬ当たりの細胞５００万個において再懸濁させた。ウェル１つ当たり５０μＬ（細胞２５０，０００個）を、５００μＬのポリプロピレン製９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）の各ウェルへと移した。被験抗ＯＸ４０抗体又はアイソタイプ対照ｍＡｂの、２倍濃度の原液を、別個の希釈プレート内の培養培地中、６６６、３３３、１１１、３７．０３、１２．３４、４．１１、０．４５７、０．１５２、０．０５０８、０．０１６９、０．００５６４ｎＭにおいて調製した。各抗体（ウェル１つ当たり５０μＬ）を、アッセイプレートの、それぞれのウェルへと移した。細胞を、被験抗ＯＸ４０抗体又はアイソタイプ対照抗体と共に、４℃において、３０分間にわたりインキュベートし、８００ｒｐｍにおいて、３分間にわたり遠心分離することにより、ウェル１つ当たり２５０μＬのＰＢＳにより、２回にわたり洗浄した。結合した抗体を、ＰＢＳ中に２μｇ／ｍＬ（ウェル１つ当たり５０μＬ）へと希釈されたＣｙ５−Ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）により、４℃において、３０分間にわたり検出した。細胞を、ウェル１つ当たり２５０μＬのＰＢＳにより、１回洗浄し、１％のホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中に再懸濁させ、デュアルレーザーＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上において解析した。
【０１４７】
８．１．７．抗ＯＸ４０抗体の、キメラＯＸ４０受容体への結合
マウスＯＸ４０システインリッチドメイン（ＣＲＤ）を、対応するヒトＣＲＤへと、個別にスワップした、ヒトＯＸ４０分子のキメラ形を発現する、２９３ベースのトランスフェクタントを生成した。Ｇ４１８による選択の後において、生存細胞を、ＭｏＦｌｏフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ）上における発現：２９３ｓ−ｈｕＯＸ４０、２９３ｓ−ｈｕＯＸ４０−ｍｕＣＲＤ  Ｉ、２９３ｓ−ｈｕＯＸ４０−ｍｕＣＲＤ  ＩＩ、２９３ｓ−ｈｕＯＸ４０−ｍｕＣＲＤ  ＩＩＩ、２９３ｓ−ｈｕＯＸ４０−ｍｕＣＲＤ  ＩＶ、２９３ｓ−ｈｕＯＸ４０−ｍｕＣＲＤ  ＩＩ＋ＩＩＩ及び２９３ｓ−ｍｕＯＸ４０について分取した。各２９３  ＯＸ４０キメラトランスフェクタント細胞合計２×１０５個ずつを、ウェルごとに、５００μＬのポリプロピレン製９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）へと添加した。細胞を播種した後において、２μｇ／ｍＬのＨｕ３７３８又はアイソタイプ対照抗体５０μＬを、各細胞系について、二連において、対応するウェルへと添加し、氷上において、３０分間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、２００μＬのダルベッコリン酸緩衝生理食塩液（ＤＰＢＳ）を、各ウェルへと添加し、プレートを、１０００ｒｐｍにおいて、３分間にわたりスピンダウンした。各ウェルから上清を除去し、５０μＬのＣｙ５−Ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）二次抗体を、１：２５０の希釈率において添加し、次いで、これを、暗所内、氷上において、３０分間にわたりインキュベートした。インキュベーション時間の後、２００μＬのＤＰＢＳを、添加してから、プレートを、１０００ｒｐｍにおいて、３分間にわたりスピンダウンした。上清を除去し、各ウェルを、１００μＬのＤＰＢＳ＋１％ホルムアルデヒドと共に再懸濁させた。試料を、デュアルレーザーＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上において解析した。
【０１４８】
８．１．８．ヒトＯＸ４０及びアカゲザルＯＸ４０についての、ＮＦ−κＢ蛍光レポーター活性
それぞれ、ヒトＯＸ４０タンパク質及びアカゲザルＯＸ４０タンパク質を発現するＮＦ−κＢレポーター細胞系である、Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦ−κＢ−ｈｕＯＸ４０及び２９３−ＮＦ−κＢ−ＲｈＯＸ４０を、１０％のＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍＬ）を含有するＤＭＥＭを含む培養培地中において維持した。ＮＦ−κＢレポーターアッセイのために、Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦ−κＢ−ｈｕＯＸ４０細胞系を、増殖培地（培養培地と同一である）中に、１ｍＬ当たり１００万個（ウェル１つ当たりの最終的な細胞５０，０００個）において再懸濁させ、２９３−ＮＦ−κＢ−ＲｈＯＸ４０細胞系を、増殖培地中に、１ｍＬ当たり５０万個（ウェル１つ当たりの最終的な細胞２５，０００個）において再懸濁させた。ウェル１つ当たり５０μＬを、白色底／透明底９６ウェルアッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３９０３）の、内側の６０のウェルへと移した。以下の抗体：陰性対照抗体として使用された抗ＰＤ−１抗体及び抗ＯＸ４０抗体の、３倍濃度の原液を、別個のＵ字底９６ウェル希釈プレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）内において作った。外因性架橋剤がない状態で抗体の活性を調べる希釈系列は、培養培地中に、２０００、５００、１２５、３１．２５、７．８１２、１．９５３、０．４８８、０．１２２、０．０３０５、０．００７６２ｎＭを含んだ。架橋剤の、抗ＯＸ４０抗体の活性に対する効果を調べる希釈系列は、２００、５０、１２．５、３．１２５、０．７８１２、０．１９５３、０．０４８８、０．０１２２、０．００３０５、０．０００７６２ｎＭの抗体を含んだ。二連において、ウェル１つ当たり５０μＬの抗体を、アッセイプレートの、それぞれのウェルへと移した。抗体単独のプレートへ、ウェル１つ当たり５０μＬの培地を、内側の６０のウェルへと添加した。架橋剤希釈系列のために、ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を、希釈された８００、２００、５０、１２．５、３．１２５、０．７８１２、０．１９５３、０．０４８８、０．０１２２、０．００３０５ｎＭへと希釈し、ウェル１つ当たり５０μＬを、内側の６０のウェルへと移して、抗ＯＸ４０抗体及び架橋剤の、４：１の比を維持した。増殖培地（１５０μＬ）を、外側のウェルへと添加して、内側の６０のウェルにおける蒸発を防止した。プレートを、３７℃において、約１８時間にわたりインキュベートした。ルシフェラーゼ活性は、ＢｒｉｔｅＬｉｔｅ  Ｐｌｕｓ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）により定量化した。略述すると、基質を、販売元により提供された緩衝液１０ｍＬにより溶解させ、ウェル１つ当たり７５μＬの基質を、各プレートの、内側の６０のウェルへと添加した。プレートを、発光設定を使用して、Ｖｉｃｔｏｒ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）上において解析した。
【０１４９】
８．１．９．ＡＤＣＣレポーターアッセイ
ヒトＦｃγＲＩＩＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を発現するＡＤＣＣエフェクター細胞を融解させ、プロトコールの推奨に従い増殖させた。細胞を、使用の前に、２回にわたり分割した。ヒトＯＸ４０又はアカゲザルＯＸ４０を安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を、標的細胞として使用した。これらの細胞を、１０％の熱不活化ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）及び５μｇ／ｍＬのブラストサイジン（Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の入ったＨｙＣｌｏｎｅ（商標）ＤＭＥＭ中において繁殖させた。
【０１５０】
アッセイの前日に、ＯＸ４０を発現するＨＥＫ２９３標的細胞を、０．２５％のトリプシン（Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により採取した。細胞を、洗浄し、カウントし、９６−ｗｅｌｌ  Ｃｏｓｔａｒ  Ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）内に、ウェル１つ当たりの細胞１０，０００個において播種した。プレートを、１０％のＦＢＳの入ったＤＭＥＭ中、３７℃において、一晩にわたりインキュベートした。アッセイのために、ＡＤＣＣ  Ｂｉｏａｓｓａｙ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ，Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎモデルｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｇ７１０２に従った。エフェクター細胞対標的細胞比は、７．５：１であった。発光は、ＥｎＳｐｉｒｅＭａｎａｇｅｒソフトウェアを使用して、ＥｎＳｐｉｒｅ  Ａｌｐａｈａリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）により測定した。このアッセイにおける被験抗体は、アイソタイプ対照抗体及び抗ＯＸ４０抗体を含んだ。
【０１５１】
８．１．１０．抗ＯＸ４０抗体の、活性化ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞への結合
ヒトＰＢＭＣを、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）から購入されたバフィーコートから単離した。略述すると、バフィーコートを、マグネシウム及びカルシウムの入っていないＰＢＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により、１：１の比に希釈した。希釈された血液（３０ｍＬ）を、ＳｅｐＭａｔｅチューブ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内に含有された、マグネシウム及びカルシウムの入ってないＰＢＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中において調製された、９０％のＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）１５ｍＬ上において層状化させた。チューブを、１２００ｇにおいて、１０分間にわたりスピンした。界面相を回収し、１倍濃度のＰＢＳ中において、２回にわたり洗浄した。Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＣＤ４  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｋｉｔ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＣＤ４＋  Ｔ細胞を単離した。細胞を、ＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳ中、１ｍＬ当たりの細胞２×１０６個へと再懸濁させた。Ｄｙｎａｌ  ＣＤ３／２８ビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、１：１の比において添加した。細胞を、回転式ローテータ−上、室温において、２０分間にわたりインキュベートした。細胞を、６ウェルプレート内、３７℃において、２４時間にわたり培養した。
【０１５２】
２４時間後、ビーズを、磁石により除去した。細胞をカウントし、１ｍＬ当たりの細胞１．５×１０６個へと再懸濁させた。細胞懸濁液のアリコート（１００μＬ）を、染色のために使用した。被験抗体を、１μｇ／ｍＬに始まる４倍の希釈系列において滴定した。細胞を、３０分間にわたり染色し、２回にわたり洗浄した。ウェル１つ当たりの希釈率を１：２５０（４μｇ／ｍＬ）とする、ヤギ抗ヒトＦｃ特異的ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を、１％ＢＳＡを含有する、ウェル１つ当たり１００μＬのＰＢＳ中に添加した。細胞を、さらに３０分間にわたり染色し、２回にわたり洗浄し、チューブへと移し、ＢＤ  ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを使用して収集し、ＦＡＣＳＤｉｖａ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ８．０．１を使用して解析した。
【０１５３】
８．１．１１  抗ＯＸ４０抗体の、活性化カニクイザルＴ細胞への結合
カニクイザル全血液を、Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  Ｐｒｉｍａｔｅｓから購入した。ＰＢＭＣを単離するために、全血液を、マグネシウム及びカルシウムの入っていないＰＢＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により、１：１の比に希釈した。希釈された血液（３０ｍＬ）を、５０ｍＬの円錐型チューブ内の、マグネシウム及びカルシウムの入っていないＰＢＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中において調製された、９５％のＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）１３ｍＬ下において層状化させた。チューブを、１０００ｇにおいて、２５分間にわたりスピンした。界面相を回収し、１倍濃度のＰＢＳ中において、２回にわたり洗浄した。細胞を、ＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳ中、１ｍＬ当たりの細胞２×１０６個へと再懸濁させた。細胞を、６ウェルプレート内、１０ｍｇ／ｍＬのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）（Ｓｉｇｍａ）及び１００Ｕ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）；Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ）と共に、７２時間にわたりインキュベートした。２４時間後に、細胞を、洗浄し、カウントし、１ｍＬ当たりの細胞２×１０６個へと再懸濁させた。１００μＬの細胞を、染色のために使用した。被験抗ＯＸ４０抗体を、１μｇ／ｍＬに始まる４倍の希釈系列において滴定した。細胞を、３０分間にわたり染色し、２回にわたり洗浄した。１％のＢＳＡを含有するＰＢＳ  １００μＬ中の希釈率を１：２５０（４μｇ／ｍＬ）とする、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を、ウェルごとに添加した。細胞を、さらに３０分間にわたり染色し、２回にわたり洗浄し、チューブへと移し、ＢＤ  ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを使用して収集し、ＦＡＣＳＤｉｖａ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ８．０．１を使用して解析した。
【０１５４】
８．１．１２．活性化ヒトＴ細胞の増殖及びＩＦＮ−γの誘導
ヒトバフィーコートを、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）から購入した。ヒトＰＢＭＣを単離するために、バフィーコートを、マグネシウム及びカルシウムの入っていないＰＢＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により、１：１の比に希釈した。希釈された血液（３０ｍＬ）を、ＳｅｐＭａｔｅチューブ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内に含有された、マグネシウム及びカルシウムの入っていないＰＢＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中において調製された、９０％のＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）１５ｍＬ上において層状化させた。チューブを、１２００ｇにおいて、１０分間にわたりスピンした。界面相を回収し、１倍濃度のＰＢＳ中において、２回にわたり洗浄した。Ｅａｓｙ  Ｓｅｐ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＣＤ４＋  Ｔ細胞を、ＰＢＭＣから単離した。ＣＤ４＋  Ｔ細胞を、６ウェルプレート内、ＲＰＭＩ＋１０％のＦＣＳ＋２μｇ／ｍＬのＰＨＡ（Ｓｉｇｍａ）及び２０ＩＵ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）；Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ）中、１ｍＬ当たりの細胞２×１０６個において、７２時間にわたり培養した。
【０１５５】
Ｂｉｏｃｏａｔ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｐｌａｔｅ９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、ウェル１つ当たり１００μＬのＰＢＳ中に、２μｇ／ｍＬのヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）及び２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）により、４℃において、一晩にわたりコーティングした。プレートを、ＰＢＳ中、ウェル１つ当たりの１％  ＢＳＡ  ２００μＬ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）により、室温において、３０分間にわたりブロッキングした。プレートを、ウェル１つ当たり２００μＬのＰＢＳにより、２回にわたり洗浄した。４ｎｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３  ＯＫＴ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、ウェル１つ当たり１００μＬのＰＢＳ中に添加し、３７℃において、９０分間にわたりインキュベートした。プレートを、ウェル１つ当たり２００μＬのＰＢＳにより、２回にわたり洗浄した。５μｇ／ｍＬにおいて始まる、３倍希釈系列の、抗ＯＸ４０抗体及びアイソタイプ対照であるモノクローナル抗体を、プレートへと、１００μＬのＰＢＳ中に添加した。プレートを、３７℃において、９０分間にわたりインキュベートした。プレートを、ウェル１つ当たり２００μＬのＰＢＳにより、２回にわたり洗浄した。洗浄されたＰＨＡ及びＩＬ−２活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞（２×１０５）を、各ウェルへと添加した。
【０１５６】
３７℃における培養の４８時間後において、二連の各々から、３０μＬずつの上清を、Ｌｕｍｉｎｅｘ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によるＩＦＮ−γ解析のためにプールし、Ｂｉｏｐｌｅｘ  Ｍａｎａｇｅｒ  ６．０（ＢｉｏＲａｄ）上において解析した。プレートを、０．２５μＣｉの３Ｈ−チミジン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）により、一晩にわたり、パルス刺激し、翌朝、５ｍＬ  Ｕｌｔｉｍａ  Ｇｏｌｄ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｆｌｕｉｄ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）の入ったＦｉｌｔｅｒｍａｔｓ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）上において採取した。Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｓは、１４５０  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  Ｗａｌｌａｃ  Ｔｒｉｌｕｘ  ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）上においてカウントした。
【０１５７】
８．１．１３．ヒト調節性Ｔ細胞抑制アッセイ
採取したての末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、ＡｌｌＣｅｌｌｓ又はＳｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得た。細胞をスピンダウンし、細胞ペレットを、１倍濃度のＰＢＳにより再懸濁させ、室温、１２００ｒｐｍにおいて、１０分間にわたり、今一度スピンダウンした。上清を除去し、次いで、細胞を、ＲｏｂｏＳｅｐ緩衝液（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により再懸濁させた。Ｖｉ−Ｃｅｌｌ  ＸＲ  ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、細胞生存率及び細胞カウントを決定した。Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  ＥａｓｙＳｅｐ  Ｈｕｍａｎ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｋｉｔを使用するＣＤ４＋  Ｔ細胞エンリッチメントのために、細胞１億〜１億５０００万個を取り置いた。次いで、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  ＥａｓｙＳｅｐ  Ｈｕｍａｎ  ＣＤ２５＋  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔを使用して、エンリッチされたＣＤ４＋  Ｔ細胞から、ＣＤ２５＋細胞を枯渇させた。この工程は、精製されたＣＤ４＋／ＣＤ２５−レスポンダーＴ細胞（Ｔｒｅｓｐ）を結果としてもたらした。残留ＰＢＭＣを、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  ＥａｓｙＳｅｐ  Ｈｕｍａｎ  ＣＤ４＋／ＣＤ１２７ｌｏｗ／ＣＤ４９ｄ−  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｋｉｔによる指示書に従い、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を単離するために使用した。ＣＤ４＋／ＣＤ２５−  Ｔｒｅｓｐ及びＴｒｅｇを単離した後で、細胞を、１０％熱不活化させたＦＢＳ及び０．０１ｍＭの２−メルカプトエタノールの入ったＲＰＭＩ１６４０により、それぞれ、１ｍＬ当たりの細胞１×１０６個及び１ｍＬ当たりの細胞５×１０５個において再懸濁させた。
【０１５８】
Ｔｒｅｇ抑制アッセイは、Ｔｒｅｓｐ対Ｔｒｅｇの、２つの異なる比である、２：１及び４：１を使用して準備した。比を２：１とする場合、Ｔｒｅｓｐ細胞５×１０４個及びＴｒｅｇ細胞２．５×１０４を、９６ウェルＵ字底プレートへと添加した。比を４：１とする場合、Ｔｒｅｓｐ細胞５×１０４個及びＴｒｅｇ細胞１．２５×１０４を、９６ウェルプレートへと添加した。刺激のために、Ｔｒｅｇ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｉｎｓｐｅｃｔｏｒ  ｂｅａｄ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）もまた、ビーズ対細胞比を１：１として、ウェルへと添加した。抗ＯＸ４０抗体及びアイソタイプ対照ヒトＩｇＧ１を、比を１：４とする、Ｆ（ａｂ’）２抗ヒト（ＧｘＨｕ）ＩｇＧ  Ｆｃ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）の非存在下又は存在下、三連、１０μｇ／ｍＬの最終濃度において調べた。プレートを、５％のＣＯ２中、３７℃において、４日間にわたりインキュベートした。プレートを、ウェル１つ当たり１μＣｉの３Ｈ−チミジンにより処理し、３７℃、５％のＣＯ２中、さらに１６時間にわたり、さらにインキュベートした。インキュベーションの後、プレートを採取し、Ｕｌｔｉｍａ  Ｇｏｌｄ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｆｌｕｉｄ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）及び１４５０  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  Ｗａｌｌａｃ  Ｔｒｉｌｕｘ  ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、増殖を測定した。
【０１５９】
８．１．１４．ヒト免疫細胞生着ＰＣ−３マウス腫瘍モデル
接種日に、ヒトＴ細胞、自家ヒトｍｏＤＣ（単球由来樹状細胞）及びＰＣ−３細胞を、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ  ＸＲ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）によりカウントし、１００μＬのダルベッコリン酸緩衝生理食塩液（ＤＰＢＳ）（ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に、ＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪマウス）１匹当たりのＰＣ−３  １×１０７個、Ｔ細胞１×１０６個及びｍｏＤＣ  ５×１０５個の皮下注射を送達するように組み合わせた。処置群（群１つ当たりのマウスのｎ＝８）の、１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照モノクローナル抗体及び１０ｍｇ／ｋｇのＨｕ３７３８は、腹腔内注射のための、２００μＬのＤＰＢＳ中において調製した。単回の抗体投与は、細胞混合物の接種時に注射した。腫瘍増殖の測定は、標準的なキャリパー測定により評価し、腫瘍増殖体積を計算した（長さ×幅×高さ／２）。
【０１６０】
８．１．１５．ＮＳＧマウスにおける、ヒトＰＢＭＣ  ＧＶＨＤモデル
ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、ＡｌｌＣｅｌｌｓ（Ｏａｋｌａｎｄ、ＣＡ）から購入した。１日目に、免疫欠損ＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪマウス）に、ヒトＰＢＭＣ  ２×１０７を、腹腔内接種した。抗ＯＸ４０抗体であるＨｕ３７３８又はアイソタイプ対照を、１日目から、毎週１回、腹腔内投与した。マウスが、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の行動学的徴候（例えば、猫背の姿勢、逆毛）を示したら、血清試料を採取し、Ｌｕｍｉｎｅｘ  ｂｅａｄ  ａｒｒａｙ  ａｓｓａｙ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、血清中のサイトカインレベルを決定した。
【０１６１】
［実施例２］  マウス抗ＯＸ４０抗体の生成及びヒト化
当技術分野において公知の方法（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ、Ｄ．Ｌａｎｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９９８））に従い、マウスを免疫化した。Ｍｏｕｓｅ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、各モノクローナル抗体のアイソタイプを決定した。目的の抗体を産生するハイブリドーマクローンを精製し、アフィニティーについて、表面プラズモン共鳴により、リガンド競合について、ＦＡＣＳにより、さらに特徴付けた。
【０１６２】
発現ベクターのクローニング及び構築は、組換えモノクローナル抗体を発現させるための、当技術分野において公知の方法により達成した。
【０１６３】
抗体Ｖ領域のヒト化は、Ｑｕｅｅｎ，Ｃ．ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８９；８６：１００２９〜１００３３）により概括されている通りに実行した。カノニカルのＣＤＲ構造は、Ｈｕａｎｇら（Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００５；３６：３５〜４２）に従い決定した。同じＣＤＲカノニカル構造又は極めて類似するＣＤＲカノニカル構造を有するヒト可変生殖細胞系列配列を同定し、適切なヒトＶＨセグメント配列、ヒトＶＬセグメント配列及びヒトＪセグメント配列を選択して、抗ＯＸ４０可変領域のためのフレームワークをもたらした。コンピュータモデルが、ＣＤＲとの著明な接触を示唆したフレームワーク位置において、マウス抗ＯＸ４０Ｖ領域に由来するアミノ酸を、元のヒトフレームワークアミノ酸により置換した（復帰突然変異）。
【０１６４】
上記において記載した方法に従い、抗ＯＸ４０マウス抗体である、Ｍｕ３７２６、Ｍｕ３７３８、Ｍｕ３７３９及びＭｕ３７４１をヒト化した。Ｍｕ３７２６  ＶＨのヒト化形は、Ｉ４８Ｍ、Ｖ６７Ｉ、Ｍ６９Ｉ、Ｖ７１Ｒ、Ｆ７８Ｖ、Ａ９３Ｖ及びＲ９４Ｋからなる、７つの復帰突然変異を有する、ヒトＶＨ４−２８フレームワーク領域を有するＨｕ３７２６  ＶＨ．１ａであった。Ｈｕ３７２６  ＶＨ．１ａを、Ｙ４８Ｆ及びＦ７１Ｙからなる、２つの復帰突然変異を有する、ヒトＶＫ１−３９フレームワーク領域を有する、その対応するヒト化軽鎖であるＨｕ３７２６  ＶＬ．１ｂと組み合わせた。Ｍｕ３７３８  ＶＨのヒト化形は、Ｗ４７Ｌからなる、１つの復帰突然変異を有する、ヒトＶＨ３−７フレームワーク領域を有するＨｕ３７３８  ＶＨ．１ｂであった。Ｈｕ３７３８  ＶＨ．１ｂを、ヒトＶＫ４−１フレームワーク領域を有し、復帰突然変異を有さない、その対応するヒト化軽鎖であるＨｕ３７３８  ＶＬ．１と組み合わせた。Ｍｕ３７３９  ＶＨのヒト化形は、Ｍ４８Ｉ、Ｖ６７Ａ、Ｅ７３Ｔ及びＳ７６Ｎからなる、４つの復帰突然変異を有する、ヒトＶＨ１−６９フレームワーク領域を有するＨｕ３７３９  ＶＨ．１ｂであった。Ｈｕ３７３９  ＶＨ．１ｂを、Ｖ５８Ｌ及びＦ７１Ｙからなる、２つの復帰突然変異を有する、ヒトＶＫ１−３９フレームワーク領域を有する、その対応するヒト化軽鎖であるＨｕ３７３９  ＶＬ．１ｂと組み合わせた。Ｍｕ３７４１  ＶＨのヒト化形は、Ａ２４Ｖ、Ｖ４８Ｌ、Ｓ４９Ｇ、Ｆ６７Ｌ、Ｒ７１Ｋ、Ｎ７６Ｓ及びＬ７８Ｖからなる、７つの復帰突然変異を有する、ヒトＶＨ３−６６フレームワーク領域を有するＨｕ３７４１  ＶＨ．２ｂであった。Ｈｕ３７４１  ＶＨ．２ｂを、Ｙ３６Ｆ及びＦ７１Ｙからなる、２つの復帰突然変異を有する、ヒトＶＫ１−３９フレームワーク領域を有する、その対応するヒト化軽鎖であるＨｕ３７４１  ＶＬ．１ｃと組み合わせた。
【０１６５】
［実施例３］  抗ＯＸ４０抗体の結合アフィニティー
下記の表３−１は、例示的な抗ＯＸ４０抗体であるＨｕ３７３８又は米国特許第７，９６０，５１５号において記載された、文献による抗ＯＸ４０抗体１１Ｄ４若しくは１８Ｄ８についての、インビトロにおける結合アフィニティーデータを示す。１１Ｄ４及び１８Ｄ８の各々は、軽鎖カッパ領域を有するヒトＩｇＧ１である。
【０１６６】
本明細書において使用された１１Ｄ４は、
【０１６７】
【化１】
0006772385.tif 000019
で表されるアミノ酸配列を有するＶＨ及び
【０１６８】
【化２】
0006772385.tif 000020
で表されるアミノ酸配列を有するＶＬを有する。
【０１６９】
１８Ｄ８は、
【０１７０】
【化３】
0006772385.tif 000021
で表されるアミノ酸配列を有するＶＨ及び
【０１７１】
【化４】
0006772385.tif 000022
で表されるアミノ酸配列を有するＶＬを有する。
【０１７２】
Ｈｕ３７３８は、実施例１のアッセイにおいて測定された通り、表面プラズモン共鳴により、又はヒトＯＸ４０を発現する、トランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ  ＮＦ−κＢレポーター細胞において、ヒトＯＸ４０への、強力な結合特性を示し、ＳＰＲにより、Ｈｕ３７３９又はＨｕ３７４１と比較して、高度な結合アフィニティーを示した。
【０１７３】
【表１２】
0006772385.tif 000023
【０１７４】
例示的な抗ＯＸ４０抗体であるＨｕ３７３８は、カニクイザルＯＸ４０又はアカゲザル
ＯＸ４０に対する交差反応性を示したが、マウスＯＸ４０又はラットＯＸ４０に対する著明な結合を裏付けなかった。実施例１に記載されたアッセイにより決定された、Ｈｕ３７３８の、組換えヒトＯＸ４０若しくは組換えカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＯＸ４０又は細胞表面ヒトＯＸ４０若しくは細胞表面アカゲザルＯＸ４０への結合活性は、表３−２にまとめられる。
【０１７５】
【表１３】
0006772385.tif 000024
【０１７６】
［実施例４］  抗ＯＸ４０抗体であるＨｕ３７３８の、インビトロにおける生物学的活性
Ｈｕ３７３８の、内因的に発現したヒトＯＸ４０への結合を評価するために、活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞及び非刺激末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の両方を、フローサイトメトリーにより検討した。表４−１は、実施例１に記載されたアッセイに従い、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズにより活性化させたヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞又はフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）及びインターロイキン２（ＩＬ−２）により活性化させたカニクイザルＣＤ４＋  Ｔ細胞上の、細胞表面ＯＸ４０へのＨｕ３７３８の結合についてのデータをまとめる。表４−１において示される通り、Ｈｕ３７３８は、ヒトＴ細胞培養物中及びカニクイザルＴ細胞培養物中の、活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞上のＯＸ４０に、強力に結合した。
【０１７７】
【表１４】
0006772385.tif 000025
【０１７８】
ナノモル未満のＨｕ３７３８による、ヒトＯＸ４０への結合は、８．１．１２節において記載されたアッセイに従い、Ｈｕ３７３８によるインビトロ処置の後における、ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞による、ヒト末梢血ＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖の増大及びインターフェロンγ産生の増強により裏付けられる、機能的活性化をもたらした（図１Ａ、１Ｂ）。図１Ａにおいて描示された、典型的な実験において示される通り、Ｈｕ３７３８は、ヒト末梢血ＣＤ４＋  Ｔ細胞の増殖の、アイソタイプ対照ｈｕＩｇＧ１と比較して、約１．５〜約６倍の増大をもたらしたが、Ｔ細胞に、等量の、文献による抗ＯＸ４０抗体である、１１Ｄ４又は１８Ｄ８を投与した場合に観察された増殖の増大と同等であった、又はこれを超えた。Ｈｕ３７３８は、８例のドナーによる試行の平均において、ＥＣ５０＝０．１１ｎＭ（１６ｎｇ／ｍＬ）を示した。
【０１７９】
図１Ｃは、各々を、８．１．１２節において記載された、Ｔ細胞増殖アッセイに従い調べたところ、Ｈｕ３７３８によるインビトロ処置の後における、ヒト末梢血ＣＤ４＋  Ｔ細胞の増殖が、約０．００１〜約１μｇ／ｍＬという広範囲の抗体濃度にわたり、文献による抗ＯＸ４０抗体である１Ａ７と同様であったことを示す。
【０１８０】
米国公開第２０１５／０３０７６１７号において記載された抗体である１Ａ７は、カッパ軽鎖を有するヒトＩｇＧ１であって、
【０１８１】
【化５】
0006772385.tif 000026
で表されるＶＨアミノ酸配列及び
【０１８２】
【化６】
0006772385.tif 000027
で表されるＶＬアミノ酸配列を有するＩｇＧ１である。
【０１８３】
図１Ｂにおいて描示された、典型的な実験において示される通り、Ｈｕ３７３８により処置された場合、ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γの産生は、被験濃度範囲にわたり、約２〜約１０倍に増大した。ＩＦＮ−γの産生に関して、Ｈｕ３７３８は、９例のドナーによる試行の平均において、ＥＣ５０＝０．１６ｎＭ（２４ｎｇ／ｍＬ）を示した。文献による抗ＯＸ４０抗体である、１１Ｄ４及び１８Ｄ８もまた、これらのアッセイ条件下において、ＩＦＮ−γの産生に対する同様の効果を裏付けた。
【０１８４】
図１Ｄは、各々を、８．１．１２節において記載された、Ｔ細胞ＩＦＮ−γ産生アッセイに従い調べたところ、Ｈｕ３７３８が、ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞における、文献による抗ＯＸ４０抗体である１Ａ７と比較して、高度なＩＦＮ−γの産生の増大をもたらすことを示す。
【０１８５】
ＣＤ４＋  Ｔ細胞の増殖の増大及びＩＦＮ−γの産生の増強における、下流シグナル伝達の活性化効果に加えて、例示的な抗ＯＸ４０抗体であるＨｕ３７３８はまた、インビトロにおいて、ヒト調節性Ｔ細胞の活性も阻害したことから、身体による、腫瘍を攻撃する免疫応答を阻害しうる、固形腫瘍内の調節性Ｔ細胞を、Ｈｕ３７３８の投与により抑制しうることが示唆される。
【０１８６】
Ｈｕ３７３８の、調節性Ｔ細胞活性に対する効果は、８．１．１３節に記載されたアッセイに従い、インビトロにおいて評価した。自家ＣＤ４＋／ＣＤ２５−レスポンダーＴ細胞（Ｔｒｅｓｐ）を、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＣＤ１２７ｌｏｗ調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）及び活性化ビーズ（Ｉｎｓｐ）と共に、２：１又は４：１のＴｒｅｓｐ：Ｔｒｅｇ比において共培養した（図２Ａ、２Ｂ）。Ｔｒｅｇの非存在下において、Ｔｒｅｓｐ細胞は、活性化ビーズに応答して増殖した。Ｔｒｅｇの存在下において、増殖は、阻害された。１０μｇ／ｍＬのＨｕ３７３８の、培養培地への組入れは、Ｔｒｅｇ媒介性の抑制に対して、影響を及ぼさなかった。これらの調節性Ｔ細胞抑制アッセイのために使用されたアイソタイプ対照は、定常領域変異体である、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有するｈｕＩｇＧ１であった。架橋剤を有するｈｕＩｇＧ１アイソタイプ対照を使用して実施された別個の実験は、アッセイに対する影響を示さなかった。
【０１８７】
これに対して、外因性架橋剤の存在下において、Ｈｕ３７３８は、Ｔｒｅｓｐ増殖の完全な回復を結果としてもたらした（図２Ａ及び２Ｂ）。架橋剤の存在下におけるＨｕ３７３８は、このアッセイにおける増殖を、活性化ビーズ単独に対するＴｒｅｓｐ応答のレベルを上回って増強した。この結果は、ＯＸ４０シグナルが、調節性Ｔ細胞媒介性の抑制を克服することが可能であり、上記において報告された結果と符合する、抗原特異的応答を増強しうることを示唆した。
【０１８８】
８．１．９節において記載された、市販のＡＤＣＣレポーターアッセイを使用して、Ｈｕ３７３８により媒介されたＡＤＣＣ活性を査定した。このアッセイは、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ及び活性化Ｔ細胞（ＮＦＡＴ）レポーターの核因子を発現する操作Ｊｕｒｋａｔ細胞を、エフェクター細胞として活用した。ヒトＯＸ４０を発現するＨＥＫ２９３細胞を、標的細胞として使用したが、抗ＯＸ４０抗体は、標的細胞上において発現するＯＸ４０に結合することが予測された。加えて、Ｈｕ３７３８のＦｃ領域は、レポーター細胞の細胞表面上のＦｃγＲＩＩＩａ受容体に結合することが予測された。これらの結合イベントの結果として、２つの細胞型に対して、複数の架橋がもたらされることから、ＮＦＡＴ経路の活性化の結果として、発光リードアウトにより測定される効果である、ＡＤＣＣレポーター活性の活性化がもたらされる。アイソタイプ対照と比較して、Ｈｕ３７３８は、ＡＤＣＣレポーター活性を、ＥＣ５０＝０．５１ｎＭ（７７ｎｇ／ｍＬ）により増大させた。
【０１８９】
［実施例５］  例示的な抗ＯＸ４０抗体のエピトープ分類
８．５．１．Ｈｕ３７３８の、ヒト／マウスキメラＯＸ４０との結合
８．１．５節において記載された、ヒトＯＸ４０発現Ｊｕｒｋａｔ細胞アッセイにおいて、可溶性ＯＸ４０Ｌが、Ｈｕ３７３８の、ＯＸ４０への結合を、ＩＣ５０＝６７ｐＭ（１０ｎｇ／ｍＬ）により遮断した（図３）ことから、Ｈｕ３７３８が、分子のリガンド結合性領域内において、ヒトＯＸ４０に結合したことが示唆される。
【０１９０】
Ｈｕ３７３８抗体の結合についてのより詳細なエピトープマッピングのために、ヒト／マウスシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）スワップＯＸ４０分子を発現する、一連の細胞系を創出した。この方法は、Ｈｕ３７３８が、マウスＯＸ４０に結合しないという観察（図４Ｂ）に基づく。ヒトＯＸ４０（配列番号１）の、マウスＯＸ４０（配列番号３）との配列アライメントを、図４Ａに示す。配列についての解析から、スワップインマウスのＣＲＤ配列を有するヒトＯＸ４０受容体のキメラ形を発現する、一連の２９３トランスフェクタントを生成し、Ｈｕ３７３８により染色した。
【０１９１】
下線部として表示されたマウススワップイン領域を有する、ヒト−マウスＯＸ４０受容体キメラのアミノ酸配列（シグナル配列を含む）は、以下の通りである。マウスＣＲＤ  Ｉにより、ヒトＣＲＤ  Ｉを置きかえるヒトＯＸ４０キメラは、
【０１９２】
【化７】
0006772385.tif 000028
で表されるアミノ酸配列を有し、マウスＣＲＤ  ＩＩにより、ヒトＣＲＤ  ＩＩを置きかえるヒトＯＸ４０キメラは、
【０１９３】
【化８】
0006772385.tif 000029
で表されるアミノ酸配列を有し、マウスＣＲＤ  ＩＩＩにより、ヒトＣＲＤ  ＩＩＩを置きかえるヒトＯＸ４０キメラは、
【０１９４】
【化９】
0006772385.tif 000030
で表されるアミノ酸配列を有し、マウスＣＲＤ  ＩＶにより、ヒトＣＲＤ  ＩＶを置きかえるヒトＯＸ４０キメラは、
【０１９５】
【化１０】
0006772385.tif 000031
で表されるアミノ酸配列を有し、マウスＣＲＤ  ＩＩ及びマウスＣＲＤ  ＩＩＩにより、ヒトＣＲＤ  ＩＩ及びヒトＣＲＤ  ＩＩＩを置きかえるヒトＯＸ４０キメラは、
【０１９６】
【化１１】
0006772385.tif 000032
で表されるアミノ酸配列を有する。
【０１９７】
Ｈｕ３７３８の、この一連のキメラへの結合の決定を、８．１．７節において記載されたアッセイに従い実施して、結合部位を、具体的なＣＲＤ領域へと位置特定した。結合の喪失は、どのＣＲＤが、特定の抗体によるＯＸ４０の認識に重要であるのかを示唆した。この場合、マウスにおける特異的なＣＲＤスワップ領域への、検出可能な結合の非存在は、Ｈｕ３７３８により認識される、ヒトＯＸ４０受容体の領域を示唆した。ヒトＣＲＤ  ＩＩを、対応するマウスＣＲＤ  ＩＩにより置きかえた場合に、抗ＯＸ４０抗体であるＨｕ３７３８が、結合を喪失することが示されたことは、Ｈｕ３７３８の、ヒトＯＸ４０のＣＲＤ  ＩＩへの結合と符合する（図４Ｂ）。
【０１９８】
８．５．２．例示的な抗ＯＸ４０抗体Ｈｕ３７３８をヒトＯＸ４０に結合させた競合アッセイ
さらなる、文献によるヒト化抗ＯＸ４０抗体を生成して、本開示の、例示的な抗ＯＸ４０抗体と比較した。米国公開第２０１３／０２８０２７５号において記載された抗体である、１０６−２２２及び１１９−１２２は、カッパ軽鎖を有するヒトＩｇＧ１である。
【０１９９】
抗体である１０６−２２２は、
【０２００】
【化１２】
0006772385.tif 000033
で表されるＶＨアミノ酸配列及び
【０２０１】
【化１３】
0006772385.tif 000034
で表されるＶＬアミノ酸配列を有する。
【０２０２】
抗体である１１９−１２２は、
【０２０３】
【化１４】
0006772385.tif 000035
で表されるＶＨアミノ酸配列及び
【０２０４】
【化１５】
0006772385.tif 000036
で表されるＶＬアミノ酸配列を有する。
【０２０５】
直接的な競合研究により、Ｈｕ３７３８の、細胞表面において発現したＯＸ４０への結合は、全てではないが、一部の、文献による抗ＯＸ４０抗体と競合的であることが示された。次いで、その後、図５において示される通り、滴定用量の、文献による抗体により処置された、Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦ−κＢ−ｈｕＯＸ４０細胞を、２μｇ／ｍＬの蛍光ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７標識化Ｈｕ３７３８下に置いて、結合の競合を決定した。解析は、フローサイトメトリーにより実施した。文献による、抗ＯＸ４０抗体である１０６−２２２又は１Ａ７は、Ｈｕ３７３８と競合的であった。しかし、抗体である１１Ｄ４、１８Ｄ８又は１１９−１２２は、１００μｇ／ｍＬまでにおいて、Ｈｕ３７３８と競合しなかった。
【０２０６】
［実施例６］  例示的な抗ＯＸ４０抗体であるＨｕ３７３８による、ＯＸ４０の活性化
Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦ−κＢ細胞データは、架橋剤の非存在下においてもなお、例示的な抗ＯＸ４０抗体であるＨｕ３７３８の活性化能力を強調する（図６Ａ、６Ｂ）。図６Ａにおいて示される通り、約０．００１〜約１００μｇ／ｍＬの抗体濃度範囲にわたり、著明なＮＦ−κＢシグナル伝達活性を裏付けた、唯一の抗ＯＸ４０抗体は、Ｈｕ３７３８及び対応するマウスＭｕ３７３８であった。文献による抗ＯＸ４０抗体である、１１Ｄ４、１８Ｄ８、１０６−２２２及び１１９−１２２は各々、抗体を約１００μｇ／ｍＬまでとするとき、著明なＮＦ−κＢシグナル伝達効果を欠いた。
【０２０７】
外因性架橋の非存在下における、Ｈｕ３７３８の活性は、同じアッセイ条件下における、文献による他の抗ＯＸ４０抗体の活性の欠如と対照的であった。ＮＦ−κＢ細胞によるシグナル伝達データについての概要を、表６−１及び６−２に示す。注目すべきことは、Ｈｕ３７３８が、ヒトＯＸ４０に結合するのに、文献による抗ＯＸ４０抗体である１０６−２２２及び１Ａ７と競合したが、架橋剤の非存在下において、抗体の各々と比較して、異なる機能的活性を示したことである。
【０２０８】
【表１５】
0006772385.tif 000037
【０２０９】
外因性架橋剤の非存在下において、Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦ−κＢ−ｈｕＯＸ４０細胞内のＮＦ−κＢシグナル伝達をもたらすその能力に加えて、Ｈｕ３７３８はまた、架橋剤がある状態での、ＥＣ５０により測定される効力であって、文献による抗ＯＸ４０抗体である、１１Ｄ４、１８Ｄ８、１０６−２２２及び１１９−１２２と比較して大きな効力（表６−１）も裏付けた。
【０２１０】
Ｈｕ３７３８を、１Ａ７と対比した比較を、図６Ｂに示し、下記の表６−２にまとめる。外因性架橋剤の非存在下における、Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦ−κＢ−ｈｕＯＸ４０細胞内のＮＦ−κＢシグナル伝達の欠如に加えて、上記において記載された、文献による抗ＯＸ４０抗体の各々はまた、Ｈｕ３７３８と比較して低値のＥＣ５０も示した。
【０２１１】
【表１６】
0006772385.tif 000038
【０２１２】
［実施例７］  マウスのヒト細胞養子移植モデルにおける、Ｈｕ３７３８の抗腫瘍活性
Ｈｕ３７３８は、８．１．１４節において記載されたプロトコールに従い、単回投与による、ヒトＰＣ３細胞、ヒトＴ細胞及びヒト自家単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）の接種後の、インビボＮＳＧマウスモデルにおける抗腫瘍活性を裏付けた（図７）。接種日において、ヒトＴ細胞、ヒトｍｏＤＣ及びヒトＰＣ３細胞を、皮下注射により、各ＮＳＧマウスへと送達した。アイソタイプ対照モノクローナル抗体又はＨｕ３７３８（１０ｍｇ／ｋｇ）を、各々、各処置群内の動物ごとに（ｎ＝８）、接種時において注射された抗体用量により、腹腔内投与した。腫瘍増殖の測定は、標準的なキャリパー測定により評価し、腫瘍増殖体積を計算した（長さ×幅×高さ／２）。
【０２１３】
図７において示される通り、Ｈｕ３７３８は、接種の１７日後において、ＮＳＧマウスにおけるＰＣ３腫瘍の増殖を、等用量のアイソタイプ対照抗体と比較して、有意に阻害した。
【０２１４】
［実施例８］  インビボのヒトＰＢＭＣ  ＧＶＨＤモデルにおける免疫活性化
ＮＳＧマウスに、ヒトＰＢＭＣを、腹腔内接種した。次いで、マウスを、１ｍｇ／ｋｇのＨｕ３７３８又はｈｕＩｇＧ１アイソタイプ対照により、１日目における初回投与を、ヒト細胞の接種の直後とする、ｑ７ｄＸ４（すなわち、７日間ごとに１回ずつ、合計４回の投与）にわたり処置した。２２日目に、マウスを屠殺し、Ｌｕｍｉｎｅｘ  ｂｅａｄ  ａｒｒａｙ  ａｓｓａｙ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、血清中のサイトカインレベルを決定した。
【０２１５】
図８における結果は、抗ＯＸ４０抗体であるＨｕ３７３８を投与した後において、アイソタイプと比較した、インターロイキン８（ＩＬ−８）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）及びインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）の増強が観察されることを裏付けたことから、Ｈｕ３７３８に起因する、マウスにおける免疫応答の増大が示唆される。
【０２１６】
本出願において引用された、全ての刊行物、特許、特許出願及び他の文書は、各個別の刊行物、特許、特許出願又は他の文書が、全ての目的のために、参照により組み込まれることが個別に指し示された場合と同程度に、全ての目的のために、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０２１７】
多様な具体的実施形態が例示及び記載されているが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱しない限りにおいて、多様な変化が施されうることが理解される。
【図１Ａ】
0006772385.tif 000039
【図１Ｂ】
0006772385.tif 000040
【図１Ｃ】
0006772385.tif 000041
【図１Ｄ】
0006772385.tif 000042
【図２Ａ】
0006772385.tif 000043
【図２Ｂ】
0006772385.tif 000044
【図３】
0006772385.tif 000045
【図４Ａ】
0006772385.tif 000046
【図４Ｂ】
0006772385.tif 000047
【図５】
0006772385.tif 000048
【図６Ａ】
0006772385.tif 000049
【図６Ｂ】
0006772385.tif 000050
【図７】
0006772385.tif 000051
【図８】
0006772385.tif 000052
【配列表】
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