(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
上部基板及び下部基板と、
上部基板と下部基板との間に配置された横方向平面と
を含むマイクロ流体デバイスであって、
前記下部基板は、横方向平面に沿って区画を移動させるように構成された電極アレイを含み、
前記横方向平面は、近位端から遠位端に、
（ａ）（ｉ）試料充填ゾーンと、（ｉｉ）それぞれが試料充填ゾーンと連絡している、水リザーバー及び１つ以上の試薬リザーバーと、（ｉｉｉ）区画生成ゾーンと、を含む調製ゾーンと、
（ｂ）１つ以上の加熱要素と熱連絡している増幅ゾーンであって、前記加熱要素は、前記増幅ゾーンにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅の温度プロトコールを適用するように構成されている、前記増幅ゾーンと、
（ｃ）１つ以上の追加の加熱要素と熱連絡している融解曲線ゾーンであって、前記加熱要素は、前記融解曲線ゾーンに温度勾配を適用して、増幅産物の融解プロフィールを生成するように構成されている、前記融解曲線ゾーンと
を含む、複数のゾーンを含む、
マイクロ流体デバイス。
【請求項２】
前記試料充填ゾーンは、各々が区画を収容するように構成された複数の試料充填領域を含む、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項３】
前記試料充填ゾーンは、最大１００ｎＬまでの体積の区画を収容するように構成されている、請求項１又は２のいずれか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項４】
前記増幅ゾーンが、近位端から遠位端に、前記増幅ゾーン内の温度を上昇させるように構成された１つ以上の加熱要素と熱連絡している、請求項１〜３のいずれか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項５】
前記増幅ゾーンが温度勾配通路を含み、前記温度勾配通路に沿って、区画が前記増幅ゾーンを通ってを移動する、請求項４に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項６】
前記電極アレイが、前記温度勾配通路に沿って前記区画を前後に移動させるように構成されている、請求項５に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項７】
前記融解曲線ゾーンが、１つ以上の追加の加熱要素と熱連絡しており、前記加熱要素は、前記融解曲線ゾーンを通って区画を温度勾配へと移動させるように構成されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項８】
前記増幅ゾーン及び前記融解曲線ゾーンの１つ以上が、前記増幅ゾーン内に配置された区画から放出される光シグナルを検出するように適合された検出システムと光連絡している、請求項７に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項９】
前記調製ゾーンが複数の希釈チャンバーを含む試料希釈ステージングゾーンをさらに含み、ここで、前記希釈チャンバーのそれぞれは前記水リザーバーと連絡している、請求項１〜８のいずれか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１０】
前記調製ゾーンが、複数のステージングチャンバーを含むＰＣＲ試薬ステージングゾーンをさらに含み、ここで、前記ステージングチャンバーのそれぞれは前記１つ以上のＰＣＲ試薬リザーバーと連絡している、請求項１〜９のいずれか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１１】
前記区画生成ゾーンが、複数の区画生成ステージングチャンバーを含む区画生成ステージング領域を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１２】
前記調製ゾーンが、複数の希釈チャンバーを含む試料希釈ステージングゾーンをさらに含み、ここで、前記複数の希釈チャンバーの少なくとも１つの希釈チャンバーが、試料充填領域及び水リザーバーと連絡している、請求項２〜１１のいずれか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１３】
前記調製ゾーンが、複数のステージングチャンバーを含むＰＣＲ試薬ステージングゾーンをさらに含み、ここで、前記ステージングチャンバーのそれぞれは、１つ以上のＰＣＲ試薬リザーバーと連絡しており、前記複数の希釈チャンバーの少なくとも１つの希釈チャンバーが、前記複数のステージングチャンバーの少なくとも１つのステージングチャンバーと連絡している、請求項１２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１４】
前記区画生成ゾーンが、複数の区画生成ステージングチャンバーを含む区画生成ステージング領域を含み、ここで、前記少なくとも１つのステージングチャンバーが、少なくとも１つの区画生成ステージングチャンバーと連絡している、請求項１３に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１５】
電気湿潤に基づくマイクロ流体デバイス上でデジタルＰＣＲを実施する方法であって、以下の順序の工程を含む方法：
（ａ）試料を含む区画を前記デバイス上に配置された試料充填ゾーンに加える工程；
（ｂ）前記区画をある量の水で希釈する工程；
（ｃ）前記区画をＰＣＲ試薬混合物と混合する工程；
（ｄ）前記区画を複数の区画に分割する工程；
（ｅ）前記複数の区画に温度プロトコールを適用して、１つ以上のアンプリコン含有区画を生成する工程；及び
（ｆ）前記１つ以上のアンプリコン含有区画に温度勾配を適用して、それにより前記１つ以上のアンプリコン含有区画のそれぞれについて融解プロフィールを生成する工程。
【請求項１６】
第１セットの区画に工程（ａ）〜（ｆ）が適用され、１つ以上の追加セットの区画に工程（ａ）〜（ｆ）が適用され、ここで前記１つ以上の追加セットの区画内の試料が、前記第１セットの区画内の試料に対して連続的に希釈される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
電気湿潤に基づくマイクロ流体デバイス上で多重デジタルＰＣＲ分析を実施する方法であって、以下の順序の工程を含む方法：
（ａ）複数の標的配列を含む試料を含む区画を、デバイス上に配置された試料充填ゾーンに添加する工程；
（ｂ）前記区画をある量の水で希釈する工程；
（ｃ）前記区画をＰＣＲ試薬混合物と混合する工程；
（ｄ）前記区画を複数の区画に分割する工程；
（ｅ）前記複数の区画に温度プロトコールを適用して１つ以上のアンプリコン含有区画を生成する工程；
（ｆ）前記１つ以上のアンプリコン含有区画に温度勾配を適用して、それにより１つ以上のアンプリコン含有区画のそれぞれについて融解プロフィールを生成する工程；及び
（ｇ）前記１つ以上のアンプリコンのそれぞれについての融解プロフィールに基づいて、複数の標的配列内の各標的配列の存在及び／又は非存在を検出する工程。
【請求項１８】
第１セットの区画に工程（ａ）〜（ｇ）が適用され、１つ以上の追加セットの区画に工程（ａ）〜（ｇ）が適用され、ここで、前記１つ以上の追加セットの区画内の試料が、前記第１セットの区画内の試料に対して連続的に希釈される。請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
工程（ｅ）に続いて、前記複数の区画の各々が、ゼロ又は１つの標的配列を含む、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅の分野、より詳細にはデジタルマイクロ流体技術（digital microfluidics）を用いたデジタルポリメラーゼ連鎖反応のためのシステム及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）は従来のＰＣＲの改良であり、核酸、例えばＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡを直接定量及びクローン的に増幅するために使用することができる。従来のＰＣＲは、一般に核酸量を測定するために使用され、１試料当たり１回の反応によって実施されている。ｄＰＣＲ方法を利用しても１試料についても１回の反応が行われるが、試料は多数の区画（partition）に分離され、反応が各区画で個々に行われる。この分離により、核酸量のより信頼性の高い回収及び高感度な測定が可能になる。
【０００３】
ｄＰＣＲでは、試料は分割されて、試料内の個々の核酸分子が局在化され、多くの別個の領域内に濃縮される。個々の核酸分子の捕捉又は単離は、マイクロウェルプレート、キャピラリー、エマルジョンの分散相、及び小型チャンバーのアレイ中、ならびに核酸結合表面上で行うことができる。試料の分割により、分子集団がポアソン分布に従うと仮定することによって、異なる分子の数を推定することを可能にする。その結果、分割された各試料は、それぞれ「０」個又は「１」個の分子（すなわちそれぞれ陰性反応又は陽性反応）を含むであろう。ＰＣＲ増幅後、ＰＣＲ最終生成物を含む領域（陽性反応）を数えることによって核酸を定量することができる。従来のＰＣＲでは、ＰＣＲ増幅サイクルの数は開始コピー数に比例する。しかしｄＰＣＲは、最初の試料量を決定するための増幅サイクルの数に依存せず、標的核酸を定量するための不確実な指数関数データに頼ることを排除し、従って絶対的定量法を提供する。
【０００４】
既存のｄＰＣＲシステム及び方法は、ワークフローを断片化し、ユーザー介入を必要としている。従って、ｄＰＣＲ反応及び分析を実施するためのより効率的で信頼性の高いシステム及び方法の必要性が、当該分野には存在する。
【発明の概要】
【０００５】
区画生成、ＰＣＲと核酸融解のための温度勾配中の移動、及びシグナル検出（全て、単一の消耗器具中で）のために使用することができる、ピコリットル〜ナノリットルサイズの区画の正確な移動のために構成されたデジタルマイクロ流体技術を用いた、デジタルＰＣＲを実施するためのシステム及び方法が記載される。さらにユーザーは、高分解能融解／融解曲線技術を使用して定量的多重化（quantiitative multiplexing）を行うことができる［１，２］。
【０００６】
ある実施態様において、マイクロ流体デバイスを含むデジタルＰＣＲシステムが提供され、前記デバイスは、
流体試料を受け取るための少なくとも１つのウェルを含む試料充填ゾーンと、
試料を希釈するための第１の試薬リザーバーを含む連続希釈ゾーンと、
第２の試薬リザーバーを含むＰＣＲセットアップゾーンと、
前記試料の複数の区画を生成するように構成された区画生成ゾーンと、
ＰＣＲ増幅のための温度プロトコールを規定する第１の温度領域と第２の温度領域とを含む少なくとも１つの熱領域を含むＰＣＲゾーンと、
ＰＣＲ増幅産物の融解プロフィールを生成するように構成された温度勾配を含む融解曲線ゾーンと、
を備えている。
【０００７】
いくつかの実施態様において、上部基板及び下部基板と、上部基板と下部基板との間に配置された横方向平面とを含むデバイスが提供され、下部基板は、横方向平面に沿って区画を移動させるように構成された電極アレイを含み、前記横方向平面は、近位端から遠位端に、
（ａ）（ｉ）試料充填ゾーンと、（ｉｉ）それぞれが試料充填ゾーンと連絡 (communication)している、水リザーバー及び１つ以上の試薬リザーバーと、（ｉｉｉ）区画生成ゾーンと、を含む調製ゾーンと；
（ｂ）１つ以上の加熱要素と熱連絡 (thermal communication) している増幅ゾーンであって、前記加熱要素は、前記増幅ゾーンにＰＣＲ増幅の温度プロトコールを適用するように構成されている、前記増幅ゾーンと、
（ｃ）１つ以上の追加の加熱要素と熱連絡している融解曲線ゾーンであって、前記加熱要素は、前記融解曲線ゾーンに温度勾配を適用して、増幅産物の融解プロフィールを生成するように構成されている、前記融解曲線ゾーンと、
を含む、複数のゾーンを含む。
【０００８】
さらに電気湿潤に基づくマイクロ流体デバイス上でデジタルＰＣＲを実施する方法も提供され、この方法は、以下の順序の工程を含む：
（ａ）試料を含む区画をデバイス上に配置された試料充填ゾーンに加える工程；
（ｂ）前記区画をある量の水で希釈する工程；
（ｃ）前記区画をＰＣＲ試薬混合物と混合する工程；
（ｄ）前記区画を複数の区画に分割する工程；
（ｅ）前記複数の区画に温度プロトコールを適用して、１つ以上のアンプリコン含有区画を生成する工程；及び
（ｆ）前記１つ以上のアンプリコン含有区画に温度勾配を適用して、それにより前記１つ以上のアンプリコン含有区画のそれぞれについて融解プロフィールを生成する工程。
【０００９】
この方法のいくつかの実施態様において、第１セットの区画に工程（ａ）〜（ｆ）が適用され、１つ以上の追加セットの区画に工程（ａ）〜（ｆ）が適用され、ここで、前記１つ以上の追加セットの区画内の試料の体積は、前記第１セットの試料の体積よりも少なく、ここで前記方法は、最適なポアソン分布が達成されるまで繰り返される。さらに前記方法は、第１セットの区画に工程（ａ）〜（ｆ）を適用する工程と、１つ以上の追加セットの区画に工程（ａ）〜（ｆ）を適用する工程とを含むことができ、ここで１つ以上の追加セットの区画内の試料は、第１セットの区画内の試料に対して連続的に希釈される。この点で、１つ以上の後続セットの区画に工程（ａ）〜（ｆ）を適用することができ、ここで１つ以上の後続セットの区画内の試料は、第１セット及び１つ以上の追加セットの区画内の試料に対して連続的に希釈される。
【００１０】
さらに本開示は、電気湿潤（electrowetting）に基づくマイクロ流体デバイス上で多重デジタルＰＣＲ分析を実施する方法を提供し、この方法は、以下の順序の工程を含む：
（ａ）複数の標的配列を含む試料を含む区画を、デバイス上に配置された試料充填ゾーンに添加する工程；
（ｂ）前記区画をある量の水で希釈する工程；
（ｃ）前記区画をＰＣＲ試薬混合物と混合する工程；
（ｄ）前記区画を複数の区画に分割する工程；
（ｅ）前記複数の区画に温度プロトコールを適用して１つ以上のアンプリコン含有区画を生成する工程；
（ｆ）前記１つ以上のアンプリコン含有区画に温度勾配を適用して、それにより１つ以上のアンプリコン含有区画のそれぞれについて融解プロフィールを生成する工程；及び
（ｇ）前記１つ以上のアンプリコンのそれぞれについての融解プロフィールに基づいて、複数の標的配列内の各標的配列の存在及び／又は非存在を検出する工程。
【００１１】
この実施態様において、第１セットの区画に工程（ａ）〜（ｇ）が適用され、１つ以上の追加セットの区画に（ａ）〜（ｇ）が適用され、ここで、前記１つ以上の追加セットの区画内の試料の体積は、前記第１セットの試料の体積よりも少なく、ここで前記方法は最適なポアソン分布が得られるまで繰り返される。さらに、第１セットの区画に工程（ａ）〜（ｇ）が適用され、１つ以上の追加セットの区画に工程（ａ）〜（ｇ）が適用され、ここで前記追加セットの区画内の試料は、第１セットの区画内の試料に対して連続的に希釈される。さらに、１つ以上の後続セットの区画に工程（ａ）〜（ｇ）が適用され、ここで１つ以上の後続セットの区画内の試料は、第１セット及び１つ以上の追加セットの区画内の試料に対して連続的に希釈される。
【００１２】
最後に、本明細書に記載される方法において、工程（ｅ）に続いて、複数の区画の各々は、ゼロ又は１つの標的配列を含む。
【００１３】
本主題の１つ以上の実施態様の詳細は、添付の図面及び以下の説明に記載されている。他の特徴、目的、及び利点は、図面及び詳細な説明、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】上部基板及び下部基板とこれらの間に配置された横方向平面とを含むマイクロ流体デバイスの特定のサブコンポーネントを示し、ここで前記横方向平面は、本明細書に記載の複数のゾーンを含む。
【図２Ａ】マイクロ流体デバイスの追加のサブコンポーネントを示す。図２Ａは、近位端から遠位端まで、調製ゾーン（２０１）、増幅ゾーン（２０２）、及び融解曲線ゾーン（２０３）を含む単一の消耗品デバイス（２００）を示す。
【図２Ｂ】マイクロ流体デバイスの追加のサブコンポーネントを示す。図２Ｂは、デバイス２００の調製ゾーンの代替実施態様を示す。
【図２Ｃ】マイクロ流体デバイスの追加のサブコンポーネントを示す。図２Ｃは、デバイス２００の調製ゾーンの代替実施態様を示す。
【図２Ｄ】マイクロ流体デバイスの追加のサブコンポーネントを示す。図２Ｄは、試料希釈ステージングゾーン、ＰＣＲ試薬ステージングゾーン、区画生成ステージングゾーン、及び増幅ゾーンと融解曲線ゾーンの拡大図を示す。
【図２Ｅ】マイクロ流体デバイスの追加のサブコンポーネントを示す。図２Ａは、近位端から遠位端まで、調製ゾーン（２０１）、増幅ゾーン（２０２）、及び融解曲線ゾーン（２０３）を含む単一の消耗品デバイス（２００）を示す。図２Ｅは、区画ソーティングゾーンを含むデバイスの実施態様を示す。
【図２Ｆ】マイクロ流体デバイスの追加のサブコンポーネントを示す。図２Ｆは、増幅ゾーンの具体的な構成を示す。
【図２Ｇ】デバイス２００を使用するように構成されたシステムを示す。
【図３Ａ】図３Ａは、同じ試料の再検査のためにデバイス２００がどのように使用されるかを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、所望の精度が達成されるまでの試料の一部の反復希釈を示す。
【図４】リアルタイムＰＣＲにおいて融解曲線及びＨＲＭ分析が、如何にデジタルＰＣＲによって行われるものと同等でないかを示す。
【図５Ａ】本明細書に記載のデバイス及び方法が、多重化ｄＰＣＲ測定にどのように使用され得るかを示す。
【図５Ｂ】本明細書に記載のデバイス及び方法が、多重化ｄＰＣＲ測定にどのように使用され得るかを示す。
【図５Ｃ】本明細書に記載のデバイス及び方法が、多重化ｄＰＣＲ測定にどのように使用され得るかを示す。
【図６Ａ】標的濃度が高い試料と標的濃度が低い試料とを用いた、動的分割を伴う及び伴わない定量的多重化を説明する４つのシナリオを示す。
【図６Ｂ】標的濃度が高い試料と標的濃度が低い試料とを用いた、動的分割を伴う及び伴わない定量的多重化を説明する４つのシナリオを示す。
【図６Ｃ】標的濃度が高い試料と標的濃度が低い試料とを用いた、動的分割を伴う及び伴わない定量的多重化を説明する４つのシナリオを示す。
【図６Ｄ】標的濃度が高い試料と標的濃度が低い試料とを用いた、動的分割を伴う及び伴わない定量的多重化を説明する４つのシナリオを示す。
【図７】Bio-Rad 社の QX200 分析ソフトウェアの低陽性区画の影響を示す。
【図８】低陽性区画で得られた結果を良好に識別するためのＨＲＭ又は融解曲線データの使用を示す。
【図９】デジタルマイクロ流体技術を用いた試料ターンアラウンド時間（turnaround time）を示す。
【図１０】時間当たりの試料スループットを示すチャートを示す。
【図１１Ａ】希釈を連続的に処理するのに必要な時間を示す。
【図１１Ｂ】希釈を連続的に処理するのに必要な時間を示す。
【図１１Ｃ】希釈を連続的に処理するのに必要な時間を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（発明の詳細な説明）
本開示の目的のために、用語「連絡している (communicate)」は、２つ以上の構成要素又は要素間の、構造的、機能的、機械的、光学的、熱的、又は流体的関係、又はこれらの任意の組み合わせを示すために使用される。ある構成要素が第２の構成要素と連絡していると言われていることは、追加の構成要素が、第１の構成要素と第２の構成要素との間に存在し得るか、及び／又は機能できる形で関連しているか又は連動していることを排除することを意図しない。
【００１６】
さらに、本開示の目的のために、任意の形態の液体（例えば、動いているか又は静止している区画、液滴、又は連続体）が、ある表面、電極、アレイ、又はデバイス「に接して上に（on）」、「の場所に (at)」、「から離れて上に (over)」あると記載される時、そのような液体は、表面、電極、アレイ、若しくはデバイス、又はこれらの構成要素と直接接触しているか、又は液体と、表面、電極、アレイ、若しくはデバイス、又はこれらの構成要素との間に配置された１つ以上の層又は膜と接触することができると理解されるであろう。
【００１７】
本開示の目的のために、区画はバルク体積の分離された部分である。区画は、バルク体積を形成する調製された試料などの試料から生成された試料区画であってもよい。区画は、サイズが実質的に均一であってもよく、又は異なるサイズ（例えば２つ以上の個別の均一なサイズの区画のセット）を有してもよい。区画の例は液滴である。区画はまた、所定のサイズ分布で又はランダムなサイズ分布で、サイズが連続的に変化してもよい。液滴は区画の一例であり、本明細書において液滴は、エマルジョンの連続相のような不混和性流体によって封入された、典型的には球形の少量の液体である。エマルジョン内の小滴の体積及び／又はエマルション内の液滴の平均体積は、例えば、約１マイクロリットル未満、約１ナノリットル未満、又は約１ピコリットル未満であり得る。液滴（又はエマルションの液滴）は、特に約１０００、１００、又は１０マイクロメートル未満、又は約１０００〜１０マイクロメートルの直径（又は平均直径）を有し得る。液滴は、球形でも非球形でもよい。液滴は、単純な液滴又は複合液滴、すなわち、少なくとも１つの液滴が少なくとも１つの他の液滴を封入する液滴であってもよい。
【００１８】
本明細書で使用される用語「試薬」は、試料と反応し、試料を希釈し、溶媒和し、懸濁し、乳化し、封入し、試料と相互作用し、又は試料に添加するのに有用な、任意の物質又は２つ以上の物質の混合物を表す。試薬は、細胞などの生存物又は非生存物でもよい。核酸増幅反応のための試薬には、特に限定されないが、緩衝液、ポリメラーゼ、プライマー、鋳型核酸、ヌクレオチド、標識、色素、ヌクレアーゼなどが含まれる。
【００１９】
デジタルマイクロ流体技術は、電気湿潤又は誘電泳動を使用して、表面張力と電場の組み合わせを利用することによって、液体の個別の区画、例えば液滴を操作する。１９８７年に Cytonix で最初に実施されたデジタルマイクロ流体技術は、電界を利用して区画を表面全体に移動させることを可能にする。簡潔には、液体区画が疎水性表面上に置かれると、区画は表面上に液滴を形成する。電界が印加されると表面は親水性になり、その結果液体区画が表面に付着する。疎水性表面上で区画の周囲表面を変化させることによって、区画は帯電した親水性表面に移動し、区画移動が生じる。従って、区画は、より高速で表面の周りを移動させることができる。ナノリットルの液滴を９０Ｈｚで移動させることができることが実証されている［３］。本主題の実施態様は、デジタルマイクロ流体技術を取り込み、これをデジタルＰＣＲに適用する。
【００２０】
融解曲線（解離曲線）は、反応の温度が上昇して二本鎖ＤＮＡが一本鎖ＤＮＡに解離又は「融解」するときに観察される蛍光の変化をグラフ化する。例えば二本鎖ＤＮＡが加熱されると、融点（Ｔｍ）に達したところで突然蛍光の低下が検出される。増幅後の融解曲線分析を使用して、プライマー二量体アーティファクト及び混入を検出し、反応特異性を確実にすることができる。核酸のＴｍは、特に長さ、ＧＣ含量、及び塩基ミスマッチの存在によって影響されるため、異なるＰＣＲ産物はそれらの融解特性によって区別することができる。さらに、反応産物、例えばプライマー二量体対アンプリコンの融解曲線分析による特性決定は、時間のかかるゲル電気泳動の必要性を低下させた。リアルタイムＰＣＲアッセイの特異性は、使用されるプライマー及び反応条件によって決定される。しかしながら、うまく設計されたプライマーでさえプライマー二量体を形成するか、非特異的な産物を増幅する可能性が常に存在する。またｑＲＴ−ＰＣＲを行う際に、ＲＮＡ試料がゲノムＤＮＡを含む可能性もあり、これも増幅されている可能性がある。ｑＰＣＲ又はｑＲＴ−ＰＣＲ反応の特異性は、融解曲線分析を使用して確認することができる。
【００２１】
高分解能融解曲線（ＨＲＭ）分析は、例えばＳＮＰ、新規突然変異、及びメチル化パターンを同定するための均一なＰＣＲ後の方法である。ＨＲＭ分析は伝統的な融解曲線プロフィール化に対するより高感度なアプローチであり、二本鎖ＤＮＡが一本鎖ＤＮＡに解離する温度（Ｔｍ）がモニターされる。増幅後、蛍光を同時にモニターしながら、機器の温度をゆっくり上昇させる。蛍光レベルは、温度が生成物のＴｍに近づきＴｍに非常に近くなるまでゆっくりと低下し、試料が二本鎖ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡに移行するとき蛍光の劇的な低下が観察される。特定のＤＮＡ配列は特徴的なプロフィールを有する。突然変異はＴｍの移動として、又は融解曲線の形状の変化として検出される。伝統的な融解曲線分析とは対照的に、ＨＲＭはアンプリコン間で単一ヌクレオチド識別を提供することができる。
【００２２】
本明細書に記載のデバイスと方法は、増幅ゾーンで生成された生成物の融解プロフィールを生成するように構成される。本明細書で使用される「融解プロフィール」は、従来の融解曲線分析ならびにＨＲＭ分析を含む。
【００２３】
本明細書に記載のデバイスの１つの実施態様は、上部基板と、下部基板と、上部基板及び下部基板の間に配置された横方向平面とを含む、マイクロ流体デバイスである。下部基板は、横方向平面に沿って区画を移動させるように構成された電極アレイを含む。これに加えて又はこれに代えて、電極を上部基板に配置することができる（ここで基板は、下部基板上に配置された電極を有すると記載されているが、当業者であれば、電極が上部基板上に配置されるという代替構成が適切な代替物であることを理解するであろう）。デバイスの横方向平面は、近位端から遠位端まで、
（ａ）（ｉ）試料充填ゾーンと、（ｉｉ）それぞれが試料充填ゾーンと連絡している、水リザーバー及び１つ以上の試薬リザーバーと、（ｉｉｉ）区画生成ゾーンと、を含む調製ゾーンと、
（ｂ）１つ以上の加熱要素と熱連絡している前記増幅ゾーンであって、前記加熱要素は、前記増幅ゾーンにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅の温度プロトコールを適用するように構成されている、前記増幅ゾーンと、
（ｃ）１つ以上の追加の加熱要素と熱連絡している融解曲線ゾーンであって、前記加熱要素は、前記融解曲線ゾーンに温度勾配を適用して、増幅産物の融解プロフィールを生成するように構成されている、前記融解曲線ゾーンと
を含む、複数のゾーンを含む。
【００２４】
マイクロ流体デバイスのこの実施態様及びその使用方法は、以下により詳細に記載される。
【００２５】
図１は、上部基板と、下部基板と、これらの間に配置された横方向平面とを示す。デバイス１００は、下部基板１０１上に配置された薄膜エレクトロニクス１０２を有する下部基板１０１を含む。前記エレクトロニクスは、１つ以上のアレイ要素電極、例えば１０３を駆動するように配置される。複数のアレイ要素電極１０３は、Ｍ×Ｎ要素（Ｍ及びＮは整数である）を有する電極アレイ１０４内に配置される。具体的な実施態様において、ＭとＮはそれぞれ２以上である。液滴１０５などの液体区画が下部基板と上部基板（それぞれ１０１と１０６）との間に封入される（本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、複数の区画を上部基板と下部基板の間に配置することができる）。スペーサ１０７が、下部基板と上部基板（デバイス内に配置されている）との間に配置され、これらの２つの基板間に適切なギャップを生成し、そして油などの非イオン性流体（図示せず）が、区画によって占有されない容積を満たす。薄膜エレクトロニクスの適切な設計及び動作によって、アレイ内の異なる電極に異なる電圧が印加され、それにより表面の疎水性が制御され、上部基板と下部基板の間の横方向平面（１０８）内の区画の移動が容易になる。この点に関して、電極アレイの１つ以上のセグメントに印加される電圧を変化させて、デバイスの１つのゾーン又は領域から別のゾーン又は領域に区画を移動させることによって、横方向平面内の流体ネットワークがデバイス内に生成される。適切な電気湿潤に基づくデジタルマイクロ流体デバイスのさらなる詳細は、米国特許出願公開第２０１３／００６２２０５号に記載されている。
【００２６】
図２Ａ〜２Ｆは、図１に示したデバイスの追加の構成要素を示す。図２Ａは、近位端から遠位端まで、調製ゾーン（２０１）、増幅ゾーン（２０２）、及び融解曲線ゾーン（２０３）を含む単一の消耗品デバイス（２００）を示す。各ゾーンの要素は以下で詳しく説明される。
【００２７】
調製ゾーンは、それぞれが試料の乳化体積を含む液滴などの区画を収容するように構成された複数の試料充填ゾーン（例えば２０５）を含む試料充填ゾーン（２０４）を含む。いくつかの実施態様において、各試料充填領域は、区画が１つのゾーンから次のゾーンにそれに沿って移動するデバイス上の少なくとも１つのレーン又は通路に、機能できる形で接続される。図１を参照して上述したように、各レーン又は通路は、デバイス内に配置された電極アレイの１つ以上の要素への電圧の適切な印加によって規定される。従って、レーン又は通路は線状又は非線状である。各試料充填領域は、シリンジ、ピペット、又は試料を含むＰＣＲチューブを受け入れるように構成された試料注入口（図示せず）を含む。図２Ａ〜図２Ｆに示すデバイスは、マルチチャンネルピペットを用いて装填することができる複数の試料充填領域、例えば１６個の別個の領域を含む。しかし当業者であれば、本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、この構成をユーザーのニーズに基づいて調整できることを容易に理解するであろう。また調製ゾーンは、１つ以上の試料充填領域とそれぞれ連絡している水リザーバー又は一連の水リザーバー（２０６）と１つ以上の試薬リザーバー（２０７）を含む。いくつかの実施態様において、水リザーバー及び試薬リザーバーに機能できる形で接続された試料充填ゾーンに試料が加えられ、それにより、調製ゾーンの１つ以上の領域内で、電極アレイへの制御された電圧の印加を介して、デバイスの横方向平面に沿って調製ゾーンの１つの領域から別の領域に区画を移動させることによって、試料区画は希釈され試薬と混合される。試料の初期区画が希釈されて試薬と混合されると、区画は次に、デバイスの横方向平面に沿って、調製ゾーン内に配置された区画生成ゾーン（２０８）に移動される。区画生成ゾーンは、区画をさらに分割するように構成され、区画生成ゾーン内の電極アレイへの電圧の適切な印加によって、さらなる区画作成が達成される。
【００２８】
次に区画は、調製ゾーンから増幅ゾーン（２０２）に移され、ここで、区画に増幅のための温度プロトコールが適用される。増幅ゾーンは、増幅ゾーン内の温度を近位端から遠位端へ増加させるように構成された１つ以上の加熱要素（図示せず）と熱連絡している。例えば増幅ゾーンは、少なくとも２つの加熱要素と熱連絡しており、増幅ゾーン内の第１の加熱要素は、増幅ゾーンの変性領域（図示せず）をＤＮＡが変性される温度、例えば９５℃、に加熱するように構成され、第２の加熱要素は、増幅ゾーンのアニーリング領域（図示せず）をＤＮＡがアニーリングされる温度（例えば、アニーリング温度はプライマーのＴｍよりも約５℃低い）に加熱するように構成されている。特定の標的上の任意の所定のプライマー対についての最適なアニーリング温度（ＴａＯｐｔ）は、ＴａＯｐｔ＝０．３×（プライマーのＴｍ）＋０．７×（生成物のＴｍ）−２５、により計算することができ、ここでプライマーのＴｍは、より安定性の低いプライマー−鋳型対の融解温度であり、生成物のＴｍは、ＰＣＲ産物の融解温度である。いくつかの実施態様において、区画は、増幅ゾーン内の線状又は非線状の通路に沿って移動される。通路は任意選択的に循環しており、従って所望のサイクル数に達するまで、区画は変性領域とアニーリング領域との間のゾーンを行き来して移動する。増幅ゾーンは、増幅ゾーン内の区画から放出された光シグナルを検出するように構成された検出システム（図示せず）と光連絡 (optical comminication)することができる。
【００２９】
いったん増幅ゾーン内で増幅が完了すると、各区画は、区画に温度勾配を適用して融解プロフィールを生成するように構成された融解曲線ゾーン（２０３）に移動する。増幅ゾーンと同様に融解曲線ゾーンは、融解曲線ゾーンを通って移動する区画に温度勾配を適用するように構成された１つ以上の追加の加熱要素と熱連絡している。融解曲線ゾーンは、融解曲線ゾーン内の区画から放出された光シグナルを検出するように構成された検出システム（図示せず）と光連絡している。任意選択的に、必要な場合、配列決定などの下流ワークフローを補助するために、区画は様々な隔離リザーバー（２０９）に収集される。ワークフローの完全な統合のこのアプローチは、等温増幅技術のために使用することができ、そしてある温度に較正された増幅ゾーンでも使用することができる。
【００３０】
増幅ゾーン及び融解曲線ゾーンに関して上述したように、デバイスは、デバイスを操作するオペレーティングシステム及びデバイスが操作される関連システムの１つ以上の構成要素によって制御される１つ以上の加熱要素と、熱的に関連している（例えば図２Ｇを参照）。オペレーティングシステムは、所望のプロトコールに従って１つ以上の加熱要素を作動させるように構成されたプロセッサ、例えばコンピュータを含む。
【００３１】
デバイス２００の調製ゾーンの別の実施態様の詳細図を図２Ｂ〜２Ｃに示す。試料は、それぞれ乳化された体積の試料を含む液滴などの区画を収容するように構成された複数の試料充填領域（例えば２１１）を含む試料充填ゾーン（２１０）を介して導入される。試料充填ゾーンは、共通の水リザーバー（２１２）と連絡している。区画は、電気湿潤を介して、試料充填領域から試料希釈ステージング（staging）ゾーン（２１３、複数の希釈チャンバー、例えば２１４を含む）へ移動される。いったん希釈されると、区画はＰＣＲ試薬ステージングゾーン（２１５、複数のステージングチャンバー、例えば２１６を含む）へ移動される。ＰＣＲ試薬ステージングゾーンは、１つ以上のＰＣＲ試薬リザーバー（２１７）と連絡しており、その結果、区画は、電気湿潤を介して、適切な体積及び濃度のＰＣＲ試薬と混合される。区画は、ＰＣＲ試薬ステージングゾーンから、区画生成ステージング領域（２１８、複数の区画生成ステージングチャンバー、例えば２１９を含む）に移動され、ここで、区画はさらに分割された後、増幅ゾーン（２２０）に移動し、ここで増幅のための温度プロトコールが適用される。いったん増幅が行われると、各区画は、融解プロフィールを生成するために区画に温度勾配を適用するように構成された融解曲線ゾーン（２２１）を通過する。最後に、必要な場合、配列決定などの下流ワークフローを補助するために、区画は様々な隔離リザーバー（２２２）に収集される。図２Ｃは、デバイス（２００）の１つのレーンの拡大図を含む。
【００３２】
図２Ｄは、試料希釈ステージングゾーン（２１３）、ＰＣＲ試薬ステージングゾーン（２１５）、区画生成ステージングゾーン（２１８）、増幅ゾーン（２２０）、及び融解曲線ゾーン（２２１）の拡大図を提供する。図２Ｄに示すように、１つの区画はさらに複数の区画に分割され、それぞれが、増幅ゾーン及び融解曲線ゾーン中で、複数のレーン、例えば最大２０レーンまで移動する。さらに、増幅後に多数の区画が陰性であり得るという事実を考慮して、デバイスは、融解曲線ゾーンに移動する前に陰性区画の除去を容易にする区画選別ゾーン（図２Ｅに示す２２３）を含むように改変することができる。陰性区画は廃棄チャンバー（２３５）に移動させることができ、例えば、陽性／陰性区画を、増幅ゾーンの遠位端で、各区画からの検出可能なシグナルの光学的検出を介して分析することができる。従って増幅ゾーンは、任意選択的に、例えば陽性区画の存在を示す蛍光シグナルの放出を介して、各区画からの光シグナルを検出するように構成された検出システムと光連絡している。この機能により、融解曲線ゾーンを通って移動する区画の数が減り、それにより区画の移動速度が低下し、試料を迅速に処理することができる。
【００３３】
増幅ゾーンの構成の非限定的な例を図２Ｆに示す。図２Ｆに示すようにデバイスは、増幅ゾーンの近位端（２２４）から遠位端（２２５）に温度を上昇させるように構成された１つ以上の加熱要素及び冷却要素（図示せず）と、熱連絡している。区画が移動するチャネル又は通路（２２６）は、増幅ゾーンを通る線状通路でも、又は図２Ｆに示されるように、所望のサイクル数に達するまで、区画を増幅ゾーンの近位端から遠位端に移動させ、再度後退させることを繰り返す迂回通路でもよい。
【００３４】
デバイス２００を使用するように構成されたシステムが図２Ｇに示される。システム（２２７）は、ユーザーインタフェース（２２８）と、コンピュータによって実行されるとデバイス（２００）を使用してシステムに分析を実行させるコンピュータプログラムを保存しているコンピュータ可読媒体を含むシステムに機能できる形で結合しているコンピュータ（２２９）と、試料／試薬導入及び調製チャンバー（２３０）と、光学検出サブシステム（２３２）と、及びデバイス２００を受け取るように改変された取外し可能な引き出し（２３３）とを含む。取外し可能な引き出しは、前記増幅ゾーン及び融解曲線ゾーンにおいて前記下部基板及び／又は前記上部基板に熱的に接触するように構成された、１つ以上の加熱要素と冷却要素（２３４）を含む。あるいは、１つ以上の加熱要素をデバイスの上部基板に組み込むことができ、冷却要素をデバイスの下部基板（図示せず）と熱連絡している引き出しに組み込むことができる。コンピュータプログラムは、システム制御プログラム、例えば特に限定されないが、選択されたゾーン、通路、及び／又はレーン内に位置する区画を分離（分割）するために、デバイスの１つ以上のゾーン、通路、及び／又はレーン内の電極アレイの１つ以上の要素への選択的な電圧印加を制御するように構成された、区画制御プログラムを含む。
【００３５】
デバイス２００は、体積が１０ｎＬ未満、具体的には５ｎＬ未満、より具体的には約２ｎＬ（すなわち、約２１０μｍピクセルに対応する）の区画を収容し操作するように構成される。いくつかの実施態様において、デバイスは、１ｎＬ（約１０５μｍピクセルに対応する）未満でデバイスあたり約２０，０００区画を移動させるように構成される。デバイスのスループットは、デバイスの幅１ｍｍ当たり１秒に約１０〜３０区画、すなわち約３６〜５４ｅｌ／秒の区画速度である。
【００３６】
例えば、本明細書に記載のデバイスは、少なくとも１，０００，０００に区画化された複数の試料を分析するように構成されている。より具体的にはデバイスは、少なくとも１００，０００、例えば２０，０００〜５０，０００に区画化された複数の試料を分析することができる。いくつかの実施態様においてデバイスは、２０，０００に区画化された複数の試料を分析することができる。デバイスは、最大１００個の試料、例えば最大５０個の試料、最大２５個の試料、より具体的には最大１６個の試料を分析することができる。さらにデバイスは複数の試料を、５００秒未満、例えば２５０秒未満、１５０秒未満、いくつかの実施態様において１２５〜５００秒間、又は特に１４０〜４６０秒間で分析するように構成されている。
【００３７】
いくつかの実施態様においてデバイスは、２０，０００に区画化された少なくとも１６個の試料を５００秒未満で分析するように改変される。
【００３８】
別の実施態様において、デバイスは、１００，０００に区画化された少なくとも１６個の試料を５００秒未満で分析するように改変される。デバイスはまた、１，０００，０００に区画化された少なくとも１６個の試料を５００秒未満で分析するように改変される。
【００３９】
本明細書に記載されたデバイスの活性領域のおよその長さは、約１１〜１６ｃｍ、すなわち増幅ゾーンについて５〜１０ｃｍ、融解曲線ゾーンについて約４ｃｍ、及び調製ゾーンについて約２ｃｍである。
【００４０】
本明細書に記載されたデバイスは、デジタルＰＣＲ分析を以下の方法により実施するように構成される：
（ａ）試料を含む区画をデバイス上に配置された試料充填ゾーンに加える工程；
（ｂ）前記区画をある体積の水で希釈する工程；
（ｃ）前記区画をＰＣＲ試薬混合物と混合する工程；
（ｄ）前記区画を複数の区画に分割する工程；
（ｅ）前記複数の区画に温度プロトコールを適用して、１つ以上のアンプリコン含有区画を生成する工程；及び
（ｆ）前記１つ以上のアンプリコン含有区画に温度勾配を適用して、それにより１つ以上のアンプリコン含有区画のそれぞれについて融解プロフィールを生成する工程。
【００４１】
ある実施態様において、第１セットの区画に工程（ａ）〜（ｆ）が適用される；及び１つ以上の追加セットの区画に工程（ａ）〜（ｆ）が適用され、ここで前記１つ以上の追加セットの前記区画内の試料の体積は、前記第１セットの試料の体積よりも少なく、前記方法は最適なポアソン分布が達成されるまで繰り返される（詳細は後述する）。さらにこの方法は、第１セットの区画に工程（ａ）〜（ｆ）を適用し、１つ以上の追加セットの区画に工程（ａ）〜（ｆ）を適用することを含むことができ、ここで１つ以上の追加セットの区画内の試料が、第１セットの区画内の試料に対して連続的に希釈される。さらに、１つ以上の後続セットの区画に工程（ａ）〜（ｆ）が適用されてもよく、１つ以上の後続セットの区画内の試料は、第１セット及び１つ以上の追加セットの区画内の試料に対して連続的に希釈される。
【００４２】
さらに、本明細書に記載のデバイスは、多重化デジタルＰＣＲ分析を実施する方法において使用されるように構成され、この方法は、以下の順序の工程を含む：
（ａ）複数の標的配列を含む試料を含む区画をデバイス上に配置された試料充填ゾーンに添加する工程；
（ｂ）前記区画をある体積の水で希釈する工程；
（ｃ）前記区画をＰＣＲ試薬混合物と混合する工程；
（ｄ）前記区画を複数の区画に分割する工程；
（ｅ）前記複数の区画に温度プロトコールを適用して、１つ以上のアンプリコン含有区画を生成する工程；
（ｆ）前記１つ以上のアンプリコン含有区画に温度勾配を適用し、それにより１つ以上のアンプリコン含有区画のそれぞれについて融解プロフィールを生成する工程；及び
（ｇ）前記１つ以上のアンプリコンのそれぞれについての融解プロフィールに基づいて、複数の標的配列内の各標的配列の存在及び／又は非存在を検出する工程。
【００４３】
この方法では、第１セットの区画に工程（ａ）〜（ｇ）が適用される；及び１つ以上の追加セットの区画に工程（ａ）〜（ｇ）が適用され、ここで前記１つ以上の追加セットの前記区画内の試料の体積は、前記第１セットの試料の体積よりも少なく、前記方法は最適なポアソン分布が達成されるまで繰り返される。さらに、第１セットの区画に工程（ａ）〜（ｇ）が適用され、１つ以上の追加セットの区画に工程（ａ）〜（ｇ）を適用することができ、ここで１つ以上の追加セットの区画内の試料は、第１セットの区画内の試料に対して連続的に希釈される。さらに、１つ以上の後続セットの区画に工程（ａ）〜（ｇ）が適用されてもよく、ここで１つ以上の後続セットの区画内の試料は、第１セット及び１つ以上の追加セットの区画内の試料に対して連続的に希釈される。最後に、本明細書に記載の方法において、工程（ｅ）に続いて、複数の区画のそれぞれは、ゼロ又は１つの標的配列を含むことができる。
【００４４】
本明細書に記載のデバイスは、分析された区画の結果に基づいて、同じ試料の将来の区画を動的に変更することができるフィードバックループを可能にするように、ワークフロー全体をシームレスに流すことができるように構成することができる。融解プロフィールは、定量的な多重化を可能にするだけでなく、陽性又は陰性として識別することが困難な区画を分類する助けとなる。この消耗品は、光イメージングを通じてリアルタイムで分析することができ、各区画が消耗品デバイスを通過する際にそれを追跡し、ＰＣＲ増幅及び融解プロフィール分析からのシグナル強度などのデータを捕捉する。また、このデバイスが他の手段を使用して、リアルタイムの追跡及びデータ収集を行うことも可能である。
【００４５】
当業者は、本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、デバイスの相対的なサイズ及び形状がユーザーの要求に基づいて変化し得ることを理解するであろう。本明細書に記載のデバイスは、寸法にかかわらず、以下のオンボードプロセスを可能にするように構成されている：（１）オンボード希釈による、必要に応じた試料濃度調整；（２）ＰＣＲ及び融解曲線分析のための区画調製；（３）区画の生成；（４）区画のＰＣＲ増幅；（５）融解曲線分析。デバイス構成により、シームレスなワークフローとフィードバックループが可能になり、分析された区画の結果に基づいて、同じ試料の後続区画を動的に変更することができる。融解プロフィールは定量的な多重化を容易にし、陽性区画と陰性区画を同定し識別するためにも使用することができる。デバイスは、例えば光イメージングを介してリアルタイムで分析され、デバイスを流れる各区画を追跡し、ＰＣＲ増幅及び融解プロフィール分析からのシグナル強度などのデータを捕捉する。
【００４６】
現在のデジタルＰＣＲシステムは、ユーザーの介入を必要とするワークフローを断片化している。しかし、本明細書に記載されたデバイスを使用すると、多くの利点が達成される。これらの利点は、以下の非限定的な実施例においてより詳細に記載される。
【実施例】
【００４７】
実施例１．試料濃度に基づく動的分割
デジタルＰＣＲのダイナミックレンジは、試料を分割するために使用される区画の数に基づいている［４］。デジタルＰＣＲは、ポアソン統計を適用して１区画あたり２つ以上の標的コピーのランダムな確率を考慮しながら、陽性区画の数対陰性区画の数を単純にカウントすることを可能にする。従って、２０，０００個の標的コピーを有する試料が従来のｄＰＣＲシステムで測定される場合、ユーザーは約１２，６５２個の陽性区画を観察するであろう。ただし、一部の区画には標的が１つであり、他の区画は２，３，４，５，６、又は７個の標的を有する。ポアソン統計は、１２，６５２個の陽性区画の以下の分布を予測するであろう。
【表１】
0006673938.tif 000002
【００４８】
ポアソン統計を適用した後、２０，０００個のうち１２，６５２の陽性区画を示す未知の試料を使用して、試料は約１９，９９９個の標的コピーと定量され、標準偏差が１１８で変動係数（ＣＶ）が０．５９である。ＣＶが許容される場合、ユーザーは次の試料を定量化し続けることができる。未知の標的の濃度が高く、例えば遺伝子発現及びウイルス量定量において可能な５０万個の標的である場合、同じ２０，０００個の区画システムは、許容される精度でこの試料を定量することができないであろう。このシナリオでは、未知の標的が高濃度のため、ポアソン統計は次の陽性区画分布を予測するであろう。
【表２】
0006673938.tif 000003
【００４９】
未知試料が、区画の数によって確実に定量化できる数よりもはるかに多くの標的を有するこれらの場合、ユーザーは、例えば希釈によって試料の使用量を少なくしなければならない。このシナリオでは、１０マイクロリットルの試料体積当たり５０万個の標的コピーの試料は、許容可能な標準偏差及び変動係数に達するまで連続的に希釈することができるであろう：
【表３】
0006673938.tif 000004
【００５０】
この場合ユーザーは、５００，０００からＣＶが０．８９％で５０，０００を得るために、試料を１０倍希釈する必要がある。残念なことに、ユーザーは初期開始濃度を知らないため、効率的なワークフロースループットを維持し、繰り返しラン (run)のコストを管理するために、予備的定量が必要である。
【００５１】
理想的には、任意の未知試料濃度に対応するダイナミックレンジを拡張するように、単に区画の数を増やすだけにしたい。しかし現在のデジタルＰＣＲシステムは、例えば、Bio-Rad QX100/200 液滴デジタルPCRシステム、Fluidigm BioMark HD、Thermo QuantStudio 3D、Formulatrix Constellation、Raindance Raindrop システムを使用すると、各試料について、固定数又は固定サイズの区画を含む。あるアプローチは、さまざまなサイズの区画を使用してダイナミックレンジを大幅に拡大し、試料濃度を数学的に決定している［５］。しかしこのアプローチは、最適濃度決定を確実にするために、試料濃度にカスタマイズすることができない区画の静的な数及びサイズに依然として依存する。マイクロ流体技術は、個々のピコリットル〜ナノリットルサイズの区画の容易な分析を可能にしたが、１つのコピー標的から１０10までの範囲の、リアルタイムＰＣＲの広いダイナミックレンジと比較するために、デジタルＰＣＲにおいては依然として大幅な進歩が必要である。リアルタイムＰＣＲのダイナミックレンジに達するために、デジタルＰＣＲは、試料を迅速な試験を可能にするには高すぎるスケール（例えば、１０10の区画）に分割する必要がある。現在の従来のｄＰＣＲシステムは、せいぜい反応体積５０マイクロリットルの試料あたり１０7の区画を生成することができるのみであり、スループットにかなりの限界（例えば２４時間あたり約８試料）を有する。ウイルス負荷試験（例えばＢ型肝炎ウイルス）に見られる標的コピー数が大きい試料は、最大で１０9の標的に到達することができる。このような試料を現在のデジタルＰＣＲで試験する場合、これらの試料は正確に定量されないか、又は例えば分光光度計又は蛍光光度計を使用して予備的定量化工程が必要とされるであろう。もしこれらの試料がデジタルＰＣＲシステムのダイナミックレンジを超えて事前に定量されるなら、ユーザーはシステムのダイナミックレンジに達するように連続希釈を実行するなどの予備的試料操作を実行する必要がある。このシナリオでは、ワークフローははるかに面倒であり、試料プロセスのスループットが低下し、手動的連続希釈工程のために定量の追加誤差が導入される。
【００５２】
本開示で具体化される１つの解決法は、試料の濃度に基づいて、区画の数又は区画のサイズを柔軟かつ動的にすることを可能にすることである。これを実現するために、デジタルＰＣＲワークフロー全体が、区画生成から区画内の標的増幅まで、そして最終的に区画生成物のシグナル検出まで、単一のデバイスに統合される。このアプローチは、必要に応じて、区画を作成、分離、統合、及び移動するための、単純で洗練されたアプローチを提供するデジタルマイクロ流体技術を使用して構想されている。
【００５３】
本明細書に記載されたデバイスでは、いくつかの初期の区画、例えば１００区画が生成され、増幅され、検出されて、その結果は、陽性又は陰性の区画がいくつあるかの予備的分析を与える。陽性区画と陰性区画のこの比は、初期試料濃度を提供する。その結果に基づいて、その試料から作成される将来の区画を調整することができる。例えば、次のように区画サイズを変更する方法がある：
【００５４】
未知試料の出発濃度が２０マイクロリットルあたり１０，０００，０００の標的アンプリコンであると仮定すると、以下の方法を使用することができる：
（ａ）統計的にすべての区画が陽性となるように、理論的に各区画について５００の標的コピーを含む開始試料から、１ナノリットル区画サイズで１００個の初期区画を取る。デバイス上の別のリザーバーに試薬を入れておくと、システムは試薬と試料を自動的に組合せ、次に増幅と検出を行う。ポアソン統計に基づく結果の計算された標的濃度は何の結果をもたらさないであろう：
【表４】
0006673938.tif 000005
【００５５】
（ｂ）１００％陽性の区画／全ての区画の結果に基づいて、システムは、同じ開始試料から１ピコリットル区画サイズで１００区画の第２セットを採取する。従って、その小さなサイズのために、各区画は１区画当たり約０．５コピーを生成するであろう。ポアソン推定は、以下の結果を与えるであろう。
【表５】
0006673938.tif 000006
【００５６】
（ｃ）次にユーザーは、定量のための最初の２０マイクロリットルの試料体積の０．１００１マイクロリットル（１００個の１ナノリットル区画の第１セットの１００ナノリットルと、１００個の１ピコリットル区画の第２セットの１００ピコリットル）、すなわち試料体積の０．５％を使用して進めるであろう。このような少ない体積の使用は、次世代の配列決定、将来の応用のための試料バンキングなどの他の用途のための出発試料を節約するという追加の利点がある。
【００５７】
（ｄ）システムが残りの試料を定量化し続けることは可能であるが、０．１０１マイクロリットルが計算を行うのに十分に正確であれば、それは必要ないかもしれない。
【００５８】
２つのセット間の区画の数は同じである必要はない。これは、計算が区画の数に応じて調整するため調整できる。さらに、最終的に最適なポアソン分布を達成するのに必要なセットの数は、上述したように２に限定されず、むしろ試料が許容可能に定量化されるまで、必要に従う。
【００５９】
この方法は、システムが自動的に初期セットを分割し、定量精度を評価し、測定し、必要であれば同じ試料の再試験のために希釈する、ことを可能にする（図３Ａ）。ワークフロー全体が、ユーザーの介入なしに完全な自動化を可能にする。ソフトウェアアルゴリズムは、結果に基づいて次の工程を決定することができる。ユーザーは、所望の標準偏差又はＣＶのレベルを簡単に指定することができ、システムは、所望の精度が達成されるまで、試料の一部を繰り返し希釈するであろう（図３Ｂ）。
【００６０】
もう１つのアプローチは、各セット間で試料を希釈することであろう。上記と同じシナリオを仮定すると、未知試料の開始濃度は、２０マイクロリットル当たり１０，０００，０００個の標的アンプリコンである。次の方法を使用することができる：
【００６１】
（ａ）開始試料からの１ナノリットルの区画サイズの１００個の初期区画は、理論的には各区画について５００個の標的コピーを含み、これは、統計的にすべての区画が陽性であることを意味する。ポアソン統計に基づく結果の計算された標的濃度は何の結果をもたらさないであろう：
【表６】
0006673938.tif 000007
【００６２】
（ｂ）１００％陽性の区画／全ての区画の結果に基づいて、システムは、消耗品に載っている水リザーバーを使用して、最初の１，０００倍の試料希釈、すなわち９９９ナノリットルの水による１ナノリットルの試料の希釈を行うであろう。あるいは、この場合に示されるような１回の１０００倍希釈の代わりに、連続希釈を行って１：１０００倍希釈を達成することができる。
【００６３】
（ｃ）１：１０００に希釈した試料から、１ナノリットルの区画サイズの１００個の区画の第２セットを採取する。従ってその小さなサイズのために、各区画は１区画当たり約０．５個のコピーを生成するであろう。ポアソン推定はこれらの結果を与えるであろう：
【表７】
0006673938.tif 000008
【００６４】
（ｄ）次にユーザーは、定量のための最初の２０マイクロリットルの試料体積の０．１００１マイクロリットル（倍率希釈からの、１００個の１ナノリットル区画の第１セットの１００ナノリットルと、１００個の１ピコリットル区画の第２セットの１００ピコリットル）、すなわち試料体積の０．５％を使用して行うであろう。このような少ない体積の使用は、次世代の配列決定、将来の応用のための試料バンキングなどの他の用途のための出発試料を節約するという追加の利点がある。
【００６５】
（ｅ）システムが残りの試料を定量化し続けることは可能であるが、０．１０１マイクロリットルが計算を行うのに十分に正確であれば、それは必要ないかもしれない。
【００６６】
上述したように、２つのセット間の区画サイズは同じである必要はない。これは、区画の数に応じて計算により調整されるため、調整できる。同様に、最終的に最適なポアソン分布を達成するのに必要なセットの数は、上述したように２つに限定されず、むしろ試料が許容可能に定量化されるまで、必要に従う。最後に、上記の方法を参照して説明したように、この方法は、システムが自動的に初期セットを分割し、定量精度を評価し、測定し、同じ試料の再試験のために必要であれば希釈することを可能にする。これと比較して、以下の工程は、今日のデジタルＰＣＲシステムのユーザーの典型的な方法であろう（２０マイクロリットルあたり１０，０００，０００個の標的アンプリコンの未知試料の開始濃度を用いて、上記と同じシナリオを仮定する）。
【００６７】
（ｉ）予備的定量のために試料の初期量を手動で分注する。典型的には、標準的なピペッター及びワークフローを用いて、典型的には１〜２マイクロリットルがこの工程に使用される。
（ｉｉ）分光光度計又は蛍光光度計を使用して、この１〜２マイクロリットルの体積内の核酸濃度を概算する。
（ｉｉｉ）試料からの総核酸濃度を計算する。
（ｉｖ）総核酸濃度から標的アンプリコンの濃度を推定する、すなわち、例えば１００万〜１，０００万個の標的アンプリコンを推定する。
（ｖ）２０，０００個の区画を与えるｄＰＣＲシステムを使用して、１マイクロリットルの試料を用いて１０００倍の連続希釈を行う。
（ｖｉ）希釈した試料を使用してＰＣＲ反応の準備をする。
（ｖｉｉ）デジタルＰＣＲワークフローに従って作業する。
（ｖｉｉｉ）ワークフローの終わりに、結果を分析して元の試料濃度を決定する。予備的定量工程（ｉｖ）に関連する誤差があるため、標準偏差又はＣＶが許容可能なレベル内にない場合がある。その場合、現在の結果に基づいてより正確な希釈を用いて工程（ｖ）から、プロセスを繰り返されなければならない。
【００６８】
このワークフローで消費される試料量は２〜３マイクロリットルである。これは、本開示において想定されているより顕著に多い。
【００６９】
これらの３つのアプローチと比較して、最初の２つが本開示で想定される。その利点は、（１）ユーザーが、分光測光／蛍光測定／電気泳動などの別の方法によって試料を予め定量する必要がなくなり、（２）システムが、試料を定量するのに必要ような試料の最小量が最適化されるため、試薬コストが削減される、（３）同じ消耗品を使用して複数回の定量を行うことができるため、消耗品コストが画削減される、（４）試料が節約されるため、デジタルＰＣＲシステムのダイナミックレンジに入れるために希釈が必要になっても、２回目のランに追加試料を必要としない。さらに、デジタルマイクロ流体技術は、手動ピペット法に固有の誤差を最小限に抑えることによって定量精度を最大化する。さらに、現在のデジタルＰＣＲシステムにおける試料の最終的な定量測定は、ＰＣＲ反応体積を設定しながら、希釈に基づいて元の開始試料を計算することをユーザーに要求する手動プロセスである。デジタルマイクロ流体技術を使用すると、このシステムは希釈を調整するための必要な計算を自動的に実行するため、元の開始試料濃度を自動的に決定することができる。
【００７０】
デジタルマイクロ流体技術を使用した自動希釈を使用する別の用途は、融解曲線［６］又は高分解能融解［７］を使用する用途を多重化することである。これについては、次のセクションでさらに詳しく説明する。
【００７１】
実施例２．単一蛍光物質を用いた定量的多重化
現在のデジタルＰＣＲ及びリアルタイムＰＣＲシステムは、蛍光物質により多重化が限定され、典型的には最大６つの標的である。しかし、理想的にデジタルＰＣＲにおいて１つの区画が１つの標的アンプリコンのみを有するように個々の標的を分割することは、３つ以上の標的を定量的に多重化する能力を可能にする。リアルタイムＰＣＲにおける融解曲線又は高分解能融解（ＨＲＭ）による定性分析は、デジタルＰＣＲにおいて定量分析となる。ＨＲＭ又は融解曲線を使用して、デジタルＰＣＲの感度と精度に対する定量的な多重化を、２つを超える標的及び数百の標的で達成することができる［１，２，８］。複数のアンプリコンをよりよく識別するために融解曲線を使用する能力に注目するリアルタイムＰＣＲアッセイのいくつかの例がありるが、デジタルＰＣＲ様定量のレベルは不可能である（例えば Seegene TOCE Technology 及びRoche SeptiFast キットを参照）。市販のデジタルＰＣＲシステムは、現在、融解曲線又はＨＲＭを用いた定量的多重化を利用していない。融解曲線／ＨＲＭを用いた現在の多重化は、異なる蛍光物質シグナルに依然として依存するが、デジタルＰＣＲにより、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎのようなインターカレーティングＤＮＡ結合色素又は分子ビーコンのようなプローブベースの化学物質のような単一蛍光物質を用いて、定量的多重化が可能である。
【００７２】
この方法を使用して新規な突然変異を検出し、検証することができる。本明細書で考察されるように、リアルタイムＰＣＲにおける典型的な融解プロフィールは、試料内の全ての種の平均的融解プロフィールである。これは、標的とわずかな変異体との間の敏感な区別は不可能である。デジタルＰＣＲは標的と変異体を異なる区画に分離するため、各区画の融解プロフィールは別個であって互いに区別することができ、未知の変異体の同定を可能にする。このアプローチの応用には、治療を受けている患者がウイルス性突然変異のために抵抗性を発症し得るウイルス性変異研究（ＨＩＶなど）が含まれる。新しいウイルス性突然変異がいつ発生するかを特定することができるアッセイで、治療中に患者を監視できることは、研究の観点から価値があるが、臨床的にも重要である。この実施態様はまた、配列決定のような下流の分析における検証のための変異体の単離を可能にする。
【００７３】
デジタルマイクロ流体技術は、高分解能の融解を行うために使用されている［９］。本開示においてＨＲＭは、デジタルＰＣＲにおける定量、特に定量的多重化のために提供される。
【００７４】
多重化は、リアルタイムＰＣＲ及びデジタルＰＣＲのユーザーから、長年にわたり要求されてきた。しかし、蛍光物質を識別する能力は、わずかな多重化を可能にしただけである。Nanostring（商標）は、一度に最大８００個の標的を多重化する新しい方法を導入した１つの技術である。しかしその感度はＰＣＲベースの方法に匹敵するものではなく、コストとスループットが制限されている。デジタルＰＣＲでは、区画化は、標的の限定された希釈と、必ずしも同じ区画中ではない様々な区画中の標的の確率的分布により、多重化を一重に低下させるため、本明細書に記載されているアプローチでは、多重化に通常伴う困難なしに、何百もの標的を多重化することが可能であろう（図３参照）。
【００７５】
このレベルの量的多重化によって、最終的に市場の定量的多重化のニーズに対処することができた［１，２］；例えば、敗血症診断市場、ミクロバイオーム分析、及びＰＣＲ感度の恩恵を受けるが、２〜数百の標的を多重化することができる遺伝子的バイオマーカーパネル。
【００７６】
リアルタイムＰＣＲにおける融解曲線分析及びＨＲＭ分析は、デジタルＰＣＲによって実行されるものと同等ではない。デジタルＰＣＲでは、各区画は増幅前の元の出発材料として単一の鋳型のみを含むため、ＰＣＲ増幅後の各区画についてのアンプリコン産物の全ては均一である。この均一性は、より良好な融解曲線／ＨＲＭデータが他の区画から識別することを可能にする［１，２，８］。リアルタイムＰＣＲでは、増幅後の複数の標的の異種試料は依然として不均一であり、従って融解曲線／ＨＲＭはその異質性を反映するであろう。これは、融解曲線／ＨＲＭを介して複数の標的を識別することを困難にし、従って、多重化を行うために蛍光物質に依存する。
【００７７】
図４はこの説明を例示する。２つの標的を有する異種リアルタイムＰＣＲ試料の融解曲線／ＨＲＭは、両方のアンプリコン生成物の融解プロフィールを反映する曲線を生じる。対照的に、デジタルＰＣＲ融解曲線は、１つの標的鋳型のみを有する各区画について生成されるであろう。リアルタイムＰＣＲ融解プロフィールでは、２つのピークを識別することは可能であるが、各ピークの原因となる鋳型の数を定量化することはできないであろう。また、多重パネルに追加される標的が増えるにつれて、単一の塩基対変化が融解曲線において非常に微妙な変化を有する突然変異検出の場合（例えばＳＮＰ分析）には、融解プロフィールはほとんど区別できない。異種リアルタイムＰＣＲ試料の融解曲線／ＨＲＭの分析は、最終的にユーザーが、例えば分子ビーコン、TaqMelt、二重オリゴハイブリダイゼーションプローブなどを使用して、ハイブリダイゼーションプローブ化学を変更することが必要である。これに対して、デジタルＰＣＲを使用すると、ピークの数を数え、ユニークな融解プロフィールによってこれらのピークを分類すると、４つの区画にわたって２つの生成物がそれぞれ２つの鋳型に分割されていると結論付けることができる。
【００７８】
さらに、リアルタイムＰＣＲを使用する場合、すべての標的は同じ反応容器内にある。このアプローチは、目的の標的を強調し定量化するために、異なるシグナル／蛍光物質が利用可能であることを必要とする。スペクトルの重複を考慮した蛍光物質の数に対する現在の制限のため、６つを超える標的の多重化には役立たない。おそらく、より小さなスペクトルプロフィールを有する将来の蛍光物質が、リアルタイムＰＣＲを使用する高度の多重化を可能にするであろう。本明細書に記載の方法を使用するいくつかの実施態様において、すべての標的は個々の区画に分離されているため、各区画にどの区画があるかを同定するために、１つのシグナルしか必要とされない。しかし、現在のデジタルＰＣＲシステムで例示されているエンドポイントＰＣＲシグナルとしてのシグナル強度だけでは、各区画にどの標的があるかを識別するのに十分ではない。融解プロフィールを通して核酸解離特性を使用することにより、標的同定が可能になるであろう。各区画は理想的には１つの出発鋳型を有するため、同様の融解プロフィールによってグループ分けされた陽性区画の数を単純に数えるだけで、定量的多重化が可能になるであろう。本開示は、試料分割の利点と融解プロフィール分析を組み合わせて、これを達成する。
【００７９】
いくつかの実施態様は、インターカレーティングＤＮＡ結合色素を用いた定量的多重化を可能にする。現在のリアルタイムＰＣＲにおける定量的多重化は、複数の蛍光物質を使用して行われる。長年にわたって多くのユーザーは、多重アッセイにおいてインターカレーティングＤＮＡ結合色素を使用することにより、コスト削減を試みた。これらのアッセイは、定量的でないことが多いが、しばしばＳＮＰ解析や感染因子同定などの標的の有無を同定することがある［１０，１１］。本開示では、標的分割（例えば、デジタルＰＣＲ）で見られる正確度と精度を融解プロフィール分析と組合せて、費用効果のあるインターカレーティングＤＮＡ結合色素を使用して定量的多重化を達成することができる。
【００８０】
リアルタイムＰＣＲに共通する蛍光物質のような複数のシグナルが使用される場合、これは、多重化できる標的の数を増加させる。図５Ａに示すように、リアルタイムＰＣＲでは単一の融解プロフィールが検出され、これは試料内のすべてのアンプリコンについての複合融解プロフィールである。対照的に図５Ｂにおいて、ｄＰＣＲは、各区画について別個の融解プロフィールの検出を可能にする。図５Ｃに示されているように、２つの異なる標的が、同じ融解プロフィール、例えば３対４、又は２対５、又は１対６のような融解プロフィールを共有する場合、それぞれは蛍光物質の色に基づいて識別され得る。従って、４つの蛍光物質の組み合わが、及び３０の標的が各蛍光物質について３０の別個の融解プロフィールを使用して同定できる場合、多重化パネルを使用して１２０個の標的（３０×４）を同定することができるであろう。
【００８１】
さらに、示されているような定量的多重化は、標的の数を増やすことができる。最近の文献は、十分な試料分割によって、９２個の多重アッセイが可能であることを示している［１］。この文献に記載されている実施の難しさは、標的の数に応じて、及び１つの区画内に１つの標的鋳型のみがあるような各標的に応じて、試料を比例して希釈する必要があるということであろう。本開示は、試料濃度に基づく動的分割の使用を記載している。上記のように動的分割を使用することにより、これは定量的多重アッセイの実施を可能にするであろう。
【００８２】
また図６Ａ〜図６Ｄは、標的濃度が高い試料と標的濃度が低い試料とを用いた動的分割の有無による、定量的多重化を説明する４つのシナリオを示す。図６Ａのシナリオ１では、標的の数が４０で、それぞれが平均して２０，０００個の標的を有すると仮定すると（例えば、遺伝子発現、マイクロバイオーム分析、ＳＮＰ分析などの研究の範囲内で）、２０マイクロリットルの反応体積で、それぞれが約８０万個の標的が存在するであろう。すべての区画が１０個以上の標的を有する場合、これはリアルタイムＰＣＲのような異種混合物に類似しているであろう。区画体積が減少するにつれて、ポアソン分布は、より多くの区画がより少ない標的を含むようになり、最終的にすべての標的の９９．６％（７９６，８２１／８００，０００）が、１区画当たり１標的に分配されることを示す。これにより、増幅後及び融解曲線解析後の各区画内の均一混合物が、４０個の標的のどれがその特定の区画内にあるかを、高度に識別可能にかつ同定可能にすることを可能にする。
【００８３】
いくつかの実施態様では、区画の分割及び融合を容易に行うことができるため、区画体積を変更することが可能になるであろう。図６Ｂのシナリオ２では、シナリオ１と同じ条件を仮定すると、約８０万個の標的が存在する。区画の体積を変更するのではなく、最初に１００の区画の初期セットを用いて動的分割ワークフローを使用して、試料をサンプリングする。１００個すべての区画が陽性であることを示すと、１０倍希釈を使用することができる。このレベルでの定量的多重化は、１区画当たり２つ以上の標的を有する陽性区画が異種試料であり、従って正確に定義できないため、困難である。しかし、さらに希釈するとポアソン分布が見られ、陽性区画の９６％（７７０／８００）は区画当たり１つのみの標的を有する。これは、均一な融解プロフィールを可能にし、それぞれ異なる標的の同定及び定量化を助けるであろう。
【００８４】
いくつかの実施態様は、試料の最初の分析、続いて同じ試料の動的分割と希釈により、最終的に１つの区画当たり１つの標的を達成し、それにより融解プロフィールによる定量的多重化を可能にするであろう。１区画当たり２つ以上の標的、例えば２つの標的が存在する場合、いずれの標的単独からの融解プロフィールでも区別可能であり、同定とそれらの区画の試料定量への組み込みは充分可能であろう。
【００８５】
図６Ｂのシナリオ３は、高レベルの多重化が望まれる低標的コピー数の例を示す。敗血症検査、血液スクリーニング又は日常的な臨床診断に見られるような低ウイルス負荷スクリーニング（例えば、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＣＭＶ、ＥＢＶ、呼吸パネルなど）、及びウイルス潜伏試験が、可能性のある用途である。２０マイクロリットルでそれぞれ平均５コピーを有する４０個の異なる標的を仮定すると、合計２００個の標的を定量する必要がある。少数の標的に対する区画の数の比率が高い場合、ポアソン分布で観察されるように、区画サイズの影響は重要ではない。従って、例示された任意の区画サイズは、正確な定量的多重化を可能にするであろう。これは、動的分割を使用した場合も同じ結論である。
【００８６】
初期濃度が大幅に異なる複数の標的を定量する場合、リアルタイムＰＣＲによる多重化はさらなる欠点を有する。ある標的が反応中に１０コピーのみを有する一方、別の標的が１０7コピーを有する場合、理論的にはリアルタイムＰＣＲシステムのダイナミックレンジは両方を定量することができるはずである。しかしリアルタイムＰＣＲの出現以来、多数の標的と少数の標的が一緒に増幅される場合、増幅効率は影響を受けることが広く考察されている［１２］。表８（下記）は、現在、濃度が大きく異なる２つの標的が多重化される場合、標的２の生成物の量がほとんど反応を支配して、Ｔａｑポリメラーゼ及びｄＮＴＰをはるかに速く枯渇させ、標的１の増幅効率に影響を及ぼし、その正確な定量を困難にすることを示す。その結果、リアルタイムＰＣＲシステムのユーザーは、別々のウェル内の各標的について、それらのアッセイを分離し定量アッセイを実行する必要がある。
【表８】
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【００８７】
いくつかの実施態様において、上記のような動的分割及び融解プロフィール分析により、経験的に最適濃度に到達することができれば、互いに大きく異なる標的を正確に定量化することができる。１つの区画当たり１つの標的しか無いため、反応中のＴａｑポリメラーゼとｄＮＴＰｓ試薬に対する競合は、分割によって除去される。単一の試料から、標的濃度の変動を心配する必要のない定量的多重化を使用することができる。
【００８８】
デジタルマイクロ流体技術は、試料のデジタル分割及び融解プロフィール分析と組み合わせると、この多重化を容易にする。１つの鋳型を含む個々の区画が温度ゾーンを通過する（例えば融解曲線プロトコール）と、二本鎖ＤＮＡの融解が観察され得る。これらの通過する区画を検出するために、様々な技術を使用することができる。従来の蛍光物質化学（例えば、分子ビーコン、TaqMelt、ハイブリダイゼーションプローブ）を使用することができる。別のアプローチは、ＤＮＡに結合する電気化学的インターカレーティング色素又は電気化学的分子ビーコン様プローブを使用することである［１３〜２３］。酸化還元反応を介して、区画のコンダクタンスを測定して、ＰＣＲアンプリコンが存在するかどうかを決定することができる。これらの区画は温度勾配を通過するため、ＰＣＲアンプリコンが解離する時、コンダクタンスの変化をデジタルマイクロ流体技術によって直接測定することができる。
【００８９】
デジタルＰＣＲにおける定量的多重化のもう一つの応用は、遺伝的連鎖を決定することである。１つの例は、敗血症における細菌薬耐性試験である。リアルタイムＰＣＲにおける多重試験は、試料を使用して複数の感染性因子を同定することができる。これは薬物耐性遺伝子を同定するために使用することもできる。どの病原体が薬剤耐性遺伝子を保有しているかを知ることに臨床的意味がある。しかしリアルタイムＰＣＲでは、全ての標的が単一の反応容器内にあるため、どの感染性因子が薬剤耐性遺伝子を有するかを決定することは不可能である。デジタルＰＣＲでは、各感染性因子のゲノムは互いに分離されている。従って、リアルタイムＰＣＲで使用されたのと同じ多重アッセイでは、ＰＣＲ産物は同じ区画に共局在するため、どの感染性因子が薬剤耐性遺伝子を有するかを同定することが可能である。最終的には、これらの区画をデバイス上に隔離し、確認のための配列決定などの下流の用途用に単離することができる。
【００９０】
実施例３．低陽性又は偽陽性区画の解消
デジタルＰＣＲはエンドポイントＰＣＲであるため、現在のデジタルＰＣＲの結果は、低陽性又は偽陽性区画の問題がある。一部の研究者は、低い偽陽性は、貧弱な増幅、プローブの自発的加水分解、分割断片、又は汚染による真の偽陽性をもたらす貧弱なアッセイデザインから生じると提唱している。ユーザーにとっての難しさは、結果の価値又は関連に関する不確実性をもたらす、陽性区画が低陽性か汚染イベントかどうかを正確に判定することができないことである。増幅サイクルの増加（従ってターンアラウンド時間の短縮）及び／又はアッセイプライマー及びプローブの再設計により、アッセイを改良して低陽性区画を減少させるために、多大な時間及び資源が費やされてきた。低陽性区画はまれであり、臨床又は研究用途にほとんど影響しないと主張されているが、ＨＩＶ潜伏期試験で経験したようにユーザーがまれなイベントを見ている場合、これは必ずしも真実ではない［２４〜２７］。ほんのわずかな陽性区画が予測される場合のいくつかの低陽性は、臨床又は研究用途に重大な影響を及ぼす可能性がある。図７は、これを Bio-Rad 社の QX200 分析ソフトウェアから説明する図である。
【００９１】
０〜約１５，５００のイベントは１つの試料に属し、１５，５０１〜３２，０００のイベントは異なる試料に属する。試料１では、ユーザーはｙ軸上で約４２００（１区画あたりのシグナル強度）の陽性区画と約１０００の陰性区画を観察する。試料２では、約２０００の陽性区画と約９００の陰性区画がある。両方の例において、陽性又は陰性のグループに属さない区画がある。これらの区画は一般に「レイン（rain）」と呼ばれる。レインの存在は結果の精度に影響する。例えば血液スクリーニング又は臨床診断、敗血症試験、ウイルス潜伏期試験などについて少ないウイルス量などの、少ない数の標的が予測される用途では、既に数少ない陽性区画内のいくつかのレイン区画が、重大な不確実性を示す可能性がある。
【００９２】
この不確実性は、現在のリアルタイムＰＣＲでは存在しない。すべての鋳型は１つの容器内で増幅されるため、この不確実性のいずれかをマスクする平均読み取り値が得られる。予測されるアンプリコンが生成されたかどうかを確認するために、リアルタイムＰＣＲではしばしば融解プロフィールが用いられる。現在のデジタルＰＣＲユーザーにとって、ほとんどすべての試料に一定量のレインがある。
【００９３】
この分野では現在、レインを排除するために統計的アルゴリズムを使用し、主に平均と標準偏差を使用して、陽性−陰性区画判断閾値を確立している。このアプローチの難点は、同じアッセイが試料毎かつ日毎に変化することがあり、従って陽性区画の決定を困難にすることである。試料結果の正しい決定を確実にするために、各試料を手動で調べる必要があるため、デジタルＰＣＲの自動化は困難になる。
【００９４】
いくつかの実施態様は、融解プロフィールを使用してレインに関連する問題を解決する。ＨＲＭ又は融解曲線データを使用することにより、低陽性区画が異なる生成物であるか又は高バックグラウンド蛍光であるかを、より良好に識別するための追加情報を得ることができる。各区画の融解曲線プロフィールにより、ユーザーは、正しいアンプリコンが生成されたかどうかをより正確に判断することができ、従って自動化分割を容易にすることができる。プライマー−ダイマー又はアーティファクト増幅からのレインは無視し、低増幅効率が含めることができる（図８参照）。
【００９５】
実施例４．臨床用途のためのアッセイの検証
デジタルＰＣＲは、定量的ＰＣＲ市場への強力な逆風を作り出している。サイクル毎の増幅効率の代わりにポアソン統計を使用すること、及び分割による試料の合成濃縮のために、リアルタイムＰＣＲよりも優れた感度のために、デジタルＰＣＲは、試料材料が限定的である場合にその精度がより良い診断信頼性を可能にする低ウイルス量の定量及び希な突然変異検出のニッチ用途に、位置を占めた。しかしながらレインに関連する問題のために、デジタルＰＣＲシステム上で開発されたアッセイの検証は困難である。
【００９６】
デジタルマイクロ流体技術により、陽性区画の単離は、ユーザーが特定の区画（例えば、陽性区画対陰性区画、レイン区画対高シグナル区画）を単離して、アッセイ性能を検証するための配列決定などの下流分析を行うことを可能にする。液滴区画又は固定区画を使用する市場の現在のシステムは、特定の区画を分類し分離することを困難にしている。デジタルマイクロ流体技術はすべての区画の動きを制御するため、この課題を容易に扱うことができる。下流の用途のために収集すべき目的の区画を保持するために、消耗品のリザーバーが設計されている（図２Ｃ参照）。図２Ｃの右端には、様々な区画を保持することができるリザーバー（例えば（２２２））がある。ユーザーは、特定の融解プロフィールを有する特定の陽性区画のみを単離することができる。リザーバーの数は、ユーザーのニーズに応じて柔軟に変更することができる。
【００９７】
実施例５．迅速なワークフロー、ターンアラウンド時間、及び高試料スループット
次世代配列決定の応用が拡大しているため、ユーザーの課題の１つは、核酸試料の品質が適切であることを保証することである。鋳型断片化の程度、試料の純度、及び鋳型の濃度は、結果に大きな影響を及ぼす可能性がある。例えば Agilent Bioanalyzer や Thermo Fisher NanoDrop 及び Qubit などのキャピラリー電気泳動、分光光度測定、蛍光測定技術は、試料が次世代ワークフローのために十分に調製されているかどうかを判断する際にしばしば使用される。次世代配列決定自体が配列決定前のライブラリー調製段階中にＰＣＲを必要とするため、試料品質の最終的な決定は試料を増幅できるかどうかであるため、一部のユーザーは代わりにリアルタイムＰＣＲを使用し始めた。Illumina’s MiSeq 及び HiSeq によって実現される次世代配列決定技術の１つの限界は、試料レーンのオーバークラスタリング又はアンダークラスタリングに対する感度である。クラスタが重複するとオーバークラスタリングの結果は不正確になり、アンダークラスタリングは配列世代の性能低下を引き起こし、結果として試料が再試験される。電気泳動／分光光度測定／蛍光測定に対してリアルタイムＰＣＲを行う際の時間と資源の大きな相違を考えると、多くのユーザーは、これらの他の方法の代わりにリアルタイムＰＣＲを採用することが遅れている。
【００９８】
いくつかの実施態様は、区画生成、区画移動、必要に応じて連続希釈、ＰＣＲ、融解曲線、及び分析からのワークフロー全体が１つのシステムに統合されるため、著しく速い結果を可能にする。またデジタルマイクロ流体技術の現状に基づいて、区画処理の速度は、結果を得るまでの時間を４５〜６０分から６分未満まで短縮することができ、キャピラリー電気泳動、分光高度測定、蛍光測定技術と時間的に同様にしており、ライブラリ構築が次世代配列決定応用に直接移行できるという追加の利点がある。
【００９９】
現在のデジタルマイクロ流体技術に基づいて、区画を高速で、例えば最大１００区画／秒で生成し移動させることができる［３］。いくつかの実施態様において、区画は様々な温度ゾーンに移動するため、ＰＣＲ増幅はリアルタイムＰＣＲよりも著しく速く起こり得る。Thermo QuantStudio 6、Bio-Rad CFX96、Agilent MX3005P、Roche LightCycler などの現在のリアルタイムＰＣＲシステムの多くは、試料を固定し、試料周囲の温度を加熱し冷却している。加熱及び冷却速度は、４０〜６０分の典型的なＰＣＲランの時間の約７５％であることを考慮すると、実質的に制限的である。Bio-Rad QX200、Thermo QuantStudio 3D、Formulatrix Constellation、Fluidigm BioMark、Raindance Raindrop などの現在のデジタルＰＣＲシステムでも、同じ原理でＰＣＲ熱サイクリング工程が設計されている。残念ながら、区画を取り囲む追加の油／プラスチック／金属は、より大きな質量を熱サイクリングすることを必要とし、従ってより長い傾斜速度及び温度保持時間を必要とする。いくつかの実施態様において、区画の温度ゾーンへの移動は、温度上昇速度及び温度下降速度の遅延を排除し、時間を大幅に節約する。各区画は順番に移動しているため、熱質量が少なく、適切な温度に達するのが速い。図９の表は、デジタルマイクロ流体技術を用いた試料ターンアラウンド時間を示す。
【０１００】
区画を１０区画て７．０分で融解曲線がプロフィール化される。記載［３］のように区画の移動を１００区画／秒に上げることができれば、ターンアラウンド時間は０．７分に短縮される。
【０１０１】
１００区画／秒で２０レーンを使用してより高体積の試料を定量するために１００，０００個の区画が必要な場合、試料は２．７分で完了することができる。
【０１０２】
この迅速なターンアラウンド時間は、より高いスループットを可能にする。図１０は、１時間当たりの試料スループットを示すチャートである。これらの計算の背後にある仮定は、１消耗品あたり２０レーンを有する１６個の試料に基づく。１試料につき４０レーンを使用すると、試料数／消耗品の数が１６試料スロットから８試料スロットに減少し、より速いターンアラウンド時間から２０〜４０レーンのゲインを相殺するため、試料スループットは同じままである。この速いターンアラウンド時間は、分光光度計／蛍光光度計に匹敵する速度で定量的多重化法での核酸定量を可能にするであろう。
【０１０３】
いくつかの実施態様はまた、配列決定ワークフローにおけるライブラリー調製にも使用することができる（図２Ａ参照）。ＰＣＲのための試薬リザーバーを、異なるアッセイを受け入れるように設定することができる。各独自の試薬（アッセイ）は、区画生成前に分割して各試料と組み合わせることができる。これは、複数の試料に対して複数のアッセイパネルを実行する必要がある場合、容易なＰＣＲセットアップを可能にする。これは、様々なアッセイパネルが実行される試料に適用することができる。配列決定のためのライブラリー構築は、いくつかの実施態様を利用することもできる。
【０１０４】
いくつかの実施態様は、各試料に対して多数のレーンを使用する。これにより区画の高速処理が容易になり、これは２０，０００又はそれ以上でかなり重要になる。現在の設計では、これは２０レーンに設定されているが、２レーン以上の任意のレーンにすることができる。
【０１０５】
１10の試料濃度、０．５ナノリットルの区画サイズ、及び１０倍の連続希釈の試料が１０区画／秒で区画を横切ると仮定した時。図１１Ａ〜図１１Ｃは、各連続希釈液を順番に処理するのにどれくらいの時間がかかるかを示す。
【０１０６】
２００区画の第１セットを処理するには、結果が得られるまでに３．０分必要である。ライン３で最初の希釈が行われた場合、１６０個の区画は２．８分を追加して、最初の２００と２番目の１６０で合計５．８分となる。最終的に各希釈物を連続的に分析する場合、システムがポアソン分布によって定義される定量可能な範囲に達するまでには、２４．３分かかるであろう。理想的には定量化された結果は、ＳＤとＣＶが低く２８．１分かかるライン９が良好であろう。
【０１０７】
多くのレーンが存在するため、シリーズ内の希釈ごとに各レーンを割り当てると、すべての区画が並行して処理されるようにすることができる。この例では、システムは１２レーンにわたってすべての希釈系列を自動的に実行する。これにより、結果を得るまでの合計時間が２４．３分から４分未満に短縮される。定量に使用された区画数でＳＤ及びＣＶが許容される場合、システムは停止することができる。しかしながら、より高いＳＤ又はＣＶが必要な場合、システムはどの希釈が最適であるかを特定し、すべてのレーンを割り当てて、その希釈工程からの区画を処理することができる。
【０１０８】
同様に、各レーンを独立して使用するこのアプローチは、多重標的を定量するように改変することができる。多重アッセイは、一方の標的が１００コピー／μｌであり、他方の標的が１００，０００，０００，０００コピー／μｌである広範囲の量の標的を定量することができる。従って１つの標的に対して１つの希釈が最適であり、異なる標的に対して異なる希釈が最適である。次に、各標的を定量するために異なるレーンを割り当てることができる。例えば図２Ｄは、これを実施することができる消耗品の領域を示す。エリア１〜４（２１５）は、１つ以上のＰＣＲ試薬がその領域に存在する区画と混合されるＰＣＲ試薬ステージング領域である。エリア１は１００コピー／μｌ希釈混合物を含み、エリア２は１００，０００，０００コピー／μｌ希釈混合物を含むことができる。これらの領域で、両方ともＰＣＲ試薬と混合される。いったん試料とＰＣＲ混合物の正しい混合が行われると、エリア１及び２の内容物が、デジタルマイクロ流体技術を介してそれぞれエリア５及びエリア６に順次移される。次にエリア５は、レーン１又はそれ以上、例えば最大レーン１０まで区画を分注し、エリア６はレーン１１又はそれ以上、例えばレーン１１〜２０間に区画を分注する。従って、同じ試料が異なるレーン中で異なる標的について定量される。開始標的が大幅に異なっても、異なるチャンバー中の試料の連続希釈と、その後の異なるレーン中のＰＣＲ及び融解プロフィールによる区画の分離は、適切な標的濃度で試料を定量することを可能にする。最高濃度の標的が消耗品のダイナミックレンジに希釈されるように、試料全体を希釈することは技術的には可能であるが、このアプローチでは多量の区画が生成され、これがかなりの時間が要し、試料スループットを低下させる可能性がある。
【０１０９】
前述の発明は、明瞭化および理解を目的としてある程度詳細に記載されているが、本開示を読むことにより、本発明の真の範囲から逸脱することなく、形態および詳細の様々な変更が可能であることは当業者には明らかであろう。例えば、上述した全ての技術及び装置は、様々な組み合わせで使用することができる。
【０１１０】
参考文献
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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