(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のＳＥＱ−１２、ＳＥＱ−１９、ＳＥＱ−２９、ＳＥＱ−５１、ＳＥＱ−５２、ＳＥＱ−５６、ＳＥＱ−６０、ＳＥＱ−７３、ＳＥＱ−７４、ＳＥＱ−８６、ＳＥＱ−８９、ＳＥＱ−９４、ＳＥＱ−１０６、ＳＥＱ−１２２、ＳＥＱ−１２３、ＳＥＱ−１２４、ＳＥＱ−１２７、ＳＥＱ−１３９、ＳＥＱ−１４０、ＳＥＱ−１４１、ＳＥＱ−１４２、ＳＥＱ−１４３及びＳＥＱ−１４４からなる群から選択される、マイクロＲＮＡ−１４３誘導体：
【化１】
0006730717.tif 000034
【化２】
0006730717.tif 000035
配列中、Ａ、Ｕ、ＧおよびＣは、それぞれアデニン、ウラシル、グアニンまたはシトシンを含むＲＮＡを表し、ｄＴおよびｄＧは、それぞれチミンまたはグアニンを含むＤＮＡを表し、ＲＮＡｆは２’−ＦＲＮＡを表し、ＲＮＡｍは２’−ＯＭｅＲＮＡを表し、＾は−Ｐ（Ｓ）ＯＨ−を表し、＊は−Ｐ（Ｏ）ＯＨ−を表し、Ａｂ（Ａｂａｓｉｃ）は、以下で示される基を表し：
【化３】
0006730717.tif 000036
ＡＳ−４２の５’末端のＶＰ−およびオリゴヌクレオチドの末端のＵｍは、以下で示される基を構成しており、式：＝ＣＨ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２が５’末端修飾（ＶＰ−）に該当する。
【化４】
0006730717.tif 000037
【請求項２】
請求項１に記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体を含有する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のマイクロＲＮＡ−１４３（以下、「ｍｉＲ-１４３」とも称する）誘導体に関する。また、該ｍｉＲ-１４３誘導体を含有する医薬組成物に関する。さらに、本発明は、該ｍｉＲ-１４３誘導体及びＥＧＦＲ阻害剤の併用に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロＲＮＡ（以下、「ｍｉＲＮＡ」と称する。）は、ゲノム上にコードされた内在性の２０〜２５塩基程度の非コード（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ）ＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、ゲノムＤＮＡ上のｍｉＲＮＡ遺伝子から、まず数百〜数千塩基程度の長さの一次転写物（Ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｉＲＮＡ、Ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）として転写され、次にプロセッシングを受けて約６０〜１１０塩基程度のヘアピン構造を有するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅｃｕｓｏｒ  ｍｉＲＮＡ）となる。その後、核から細胞質内へ移動し、スプライシングによって、２０〜２５塩基程度の二本鎖ｍｉＲＮＡとなる。二本鎖ｍｉＲＮＡは、ＲＩＳＣと呼ばれるタンパク質に取り込まれ、１本鎖ｍｉＲＮＡ（ガイド鎖、アンチセンス鎖）となり、より不安定な１本鎖（パッセンジャー鎖、センス鎖）は分解される。１本鎖ｍｉＲＮＡが、部分相補的な塩基配列をもつ標的遺伝子のｍＲＮＡに結合することで、標的遺伝子の翻訳を阻害する働きをする。【０００３】
ｍｉＲＮＡは、ヒトやマウス等で１０００種類以上が知られており、それぞれが複数の標的遺伝子の発現を調節し、細胞の増殖や分化等、様々な生命現象に関与すること、癌、心血管疾患、神経変性疾患、精神疾患、慢性炎症疾患等の発症と進行に関わっていることが示唆されている。なかでもｍｉＲＮＡが癌細胞の増殖に深く関与していることは多くの研究者らによって指摘されており、核酸医薬品として研究開発が行われている。【０００４】
ｍｉＲ-１４３も癌との関わりが示唆されているｍｉＲＮＡの１つである。非特許文献１には、ｍｉＲ-１４３が大腸癌の細胞（ＤＬＤ−１、ＳＷ４８０）増殖を抑制することが記載されている（Ｆｉｇｕｒｅ３参照）。また、特許文献１、非特許文献２及び３には、ｍｉＲ-１４３の４箇所のミスマッチ配列のうちセンス鎖の少なくとも１〜３箇所をマッチさせ、センス鎖及びアンチセンス鎖の３’末端をベンゼン−ピリジン誘導体（ＢＰ）で修飾した修飾体が、天然型のｍｉＲ-１４３と比較して優れた癌細胞増殖抑制作用を有することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０３２７０４号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔ，  １６，  ８４５−８５０（２００６）
【非特許文献２】Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  １７，  ３９８−４０８，（２０１０）
【非特許文献３】Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ３０７，  ２１１−２２０（２０１１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、核酸医薬品として利用可能な新規のｍｉＲ-１４３誘導体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意研究の結果、ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ（配列番号１及び２からなる天然型のヒトｍｉＲ-１４３）と比較してセンス鎖（第１鎖）の３’末端が１塩基だけ短く、アンチセンス鎖（第２鎖）は同じであるＳＥＱ−２２と、第１鎖が配列番号３記載の配列であり、第２鎖が配列番号５である本発明のｍｉＲ-１４３誘導体（実施例中のＳＥＱ−０１）を比較すると、ＳＥＱ−２２と比較して、ＳＥＱ−０１は強い腫瘍増殖抑制効果を示すことを見出した（図１０）。さらに、ＳＥＱ−２２の第２鎖の３’末端の２塩基を欠失させ、３’末端修飾（＾ｄＴ＾ｄＴ）を導入したＳＥＱ−２３と比較しても、ＳＥＱ−０１は強い腫瘍増殖抑制効果を示すことを見出した（図１０）。
また、第１鎖が配列番号３記載の配列であり、かつ、３’末端修飾を有さず、第２鎖が配列番号４（つまり、ＳＥＱ−０１の第２鎖の３’末端の２塩基が欠失）であり、かつ、３’末端修飾を有する本発明のｍｉＲ-１４３誘導体（実施例中のＳＥＱ−１０〜１２、１９〜２１、２４〜１４４）が、ＳＥＱ−０１以上の腫瘍増殖抑制効果を示し、天然型のｍｉＲ-１４３や他のｍｉＲ-１４３誘導体（実施例中のＳＥＱ−０２〜０４、０７〜０９、１３〜１８）と比較して、優れた細胞増殖抑制効果を示すことを見出した（図１〜３、表１３）。本発明のｍｉＲ-１４３誘導体は、核酸医薬品、特に癌の治療又は悪性化の抑制のための医薬として非常に有用である。【０００９】
また、本発明者らは、ＥＧＦＲ阻害剤であるセツキシマブと本発明のｍｉＲ-１４３誘導体（ＳＥＱ−０１又はＳＥＱ−１２）を併用すると、ＫＲＡＳ変異型の癌に対しても抗腫瘍効果があることを見出した（図４、図５）。ＥＧＦＲ阻害剤はＫＲＡＳ変異が存在すると薬理効果が期待できない可能性が高いとされており、例えば、セツキシマブ製剤であるアービタックス（登録商標）の日本の添付文書においては、効能・効果として「ＥＧＦＲ陽性の治癒切除不能な進行・再発の結腸・直腸癌頭頸部癌」が記載されているが、「ＲＡＳ（ＫＲＡＳ及びＮＲＡＳ）遺伝子変異の有無を考慮した上で、適応患者の選択を行うこと」と注意書きがされている。ＥＧＦＲ阻害剤と本発明のｍｉＲ-１４３誘導体を併用することにより、これまでＥＧＦＲ阻害剤の投与が難しかった患者への投与が可能となるため、本発明のｍｉＲ-１４３誘導体は、非常に有用である。【００１０】
すなわち、本発明は、以下に関する。
（Ｉ−１）第１鎖が
配列番号３記載の配列、又は、
配列番号３記載の配列において、１若しくは２塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
かつ、３’末端修飾は有さず、５’末端修飾を有していてもよく、
第２鎖が
配列番号４記載の配列、若しくは、
配列番号４記載の配列において、１若しくは２塩基が置換、欠失若しくは挿入された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
かつ、３’末端修飾を有し、５’末端修飾を有していてもよく、
又は
配列番号５記載の配列、若しくは、
配列番号５記載の配列において、１若しくは２塩基が置換若しくは挿入された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
かつ、３’末端修飾は有さず、５’末端修飾を有していてもよく、
ここで、
３’末端修飾は、ヌクレオシド誘導体及び／若しくは修飾ヌクレオシド間結合を含んでいてもよい１〜５ｍｅｒのオリゴヌクレオチド誘導体又はベンゼン‐ピリジン誘導体であり、
５’末端修飾は、リン酸エステル部分又は式：＝ＣＱ１−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２（式中、Ｑ１は水素、ハロゲン、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル又は置換若しくは非置換のアルキルオキシである。）で示される基である、
マイクロＲＮＡ−１４３誘導体。
（Ｉ−２）第１鎖が、配列番号３記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
第２鎖が、配列番号４又は５記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである、（Ｉ−１）記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体。
（Ｉ−３）オリゴヌクレオチド誘導体が、１又は２ｍｅｒである、（Ｉ−１）又は（Ｉ−２）記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体。
（Ｉ−４）該ヌクレオシド誘導体が、
糖の２’位に置換基を有するヌクレオシド、又は
糖の４’位と２’位との間に架橋構造を有するヌクレオシドである、（Ｉ−１）〜（Ｉ−３）記載いずれかに記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体。
（Ｉ−５）該置換基が、Ｆ、ＯＣＨ３又はＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３である、（Ｉ−４）記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体。
（Ｉ−６）該架橋構造が、４’−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−２’（ｍは１〜４の整数）又は４’−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ３−２’（Ｒ３は、水素原子又はアルキルである）である、（Ｉ−４）記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体。
（Ｉ−７）修飾ヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート結合である、（Ｉ−１）〜（Ｉ−６）いずれかに記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体。
（Ｉ−８）ＳＥＱ−１２、ＳＥＱ−１９、ＳＥＱ−２９、ＳＥＱ−５１、ＳＥＱ−５２、ＳＥＱ−５６、ＳＥＱ−６０、ＳＥＱ−７３、ＳＥＱ−７４、ＳＥＱ−８６、ＳＥＱ−８９、ＳＥＱ−９４、ＳＥＱ−１０６、ＳＥＱ−１２２、ＳＥＱ−１２３、ＳＥＱ−１２４、ＳＥＱ−１２７、ＳＥＱ−１３９、ＳＥＱ−１４０、ＳＥＱ−１４１、ＳＥＱ−１４２、ＳＥＱ−１４３及びＳＥＱ−１４４からなる群から選択される、（Ｉ−１）記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体。
（Ｉ−９）（Ｉ−１）〜（Ｉ−８）いずれかに記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体を含有する医薬組成物。【００１１】
（Ｉ−１０）（Ｉ−１）〜（Ｉ−８）いずれかに記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体及びＥＧＦＲ阻害剤を組み合わせてなる医薬。
（Ｉ−１１）配合剤である、（Ｉ−１０）記載の医薬。
（Ｉ−１２）（Ｉ−１）〜（Ｉ−８）いずれかに記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体及びＥＧＦＲ阻害剤が併用されることを特徴とする、（Ｉ−１０）記載の医薬。
（Ｉ−１３）（Ｉ−１）〜（Ｉ−８）いずれかに記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体及びＥＧＦＲ阻害剤が同時又は順次に投与されることを特徴とする、（Ｉ−１２）記載の医薬。
（Ｉ−１４）（Ｉ−１）〜（Ｉ−８）いずれかに記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体及びＥＧＦＲ阻害剤が別々に投与されることを特徴とする、（Ｉ−１２）記載の医薬。
（Ｉ−１５）ＥＧＦＲ阻害剤が、セツキシマブである、（Ｉ−１０）〜（Ｉ−１４）いずれかに記載の医薬。
（Ｉ−１６）癌の治療又は悪性化の抑制のために用いられる、（Ｉ−１０）〜（Ｉ−１５）いずれかに記載の医薬。
（Ｉ−１７）（Ｉ−１）〜（Ｉ−８）いずれかに記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体を含有する、ＥＧＦＲ阻害剤の癌の治療効果の増強剤。
（Ｉ−１８）ＥＧＦＲ阻害剤を含有する、（Ｉ−１）〜（Ｉ−８）いずれかに記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体の癌の治療効果の増強剤。
（Ｉ−１９）（Ｉ−１）〜（Ｉ−８）いずれかに記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体を有効成分として含む、ＥＧＦＲ阻害剤と併用するための医薬組成物。
（Ｉ−２０）ＥＧＦＲ阻害剤を有効成分として含む、（Ｉ−１）〜（Ｉ−８）いずれかに記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体と併用するための医薬組成物。
（Ｉ−２１）癌の治療又は悪性化の抑制のために用いられる、（Ｉ−１９）又は（Ｉ−２０）記載の医薬組成物。【００１２】
さらに、本発明は、以下に関する。
（ＩＩ−１）第１鎖がヌクレオシド間結合がホスホジエステル結合であるＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、
第２鎖がヌクレオシド誘導体及び／又は修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドであり、
第２鎖の３’末端に、式：ｄＸ１ｄＸ２（ここで、Ｘ１又はＸ２は、それぞれ独立してＡ、Ｇ、Ｃ又はＴである）で示される基又はベンゼン‐ピリジン誘導体が結合している
マイクロＲＮＡ−１４３誘導体。
（ＩＩ−２）ヌクレオシド誘導体が、
糖の２’位に置換基を有するヌクレオシド及び／又は
糖の４’位と２’位との間に架橋構造を有するヌクレオシドである、（ＩＩ−１）記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体。
（ＩＩ−３）該置換基が、Ｆ、ＯＣＨ３又はＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３である、（ＩＩ−２）記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体。
（ＩＩ−４）該架橋構造が、４’−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−２’（ｍは１〜４の整数）又は４’−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ３−２’（Ｒ３は、水素原子又はアルキルである）である、（ＩＩ−２）記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体。
（ＩＩ−５）修飾ヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート結合である、（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−４）いずれかに記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体。
（ＩＩ−６）第２鎖の５’末端に、リン酸エステル部分が結合している、（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−５）いずれかに記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体。
（ＩＩ−７）Ｘ１及びＸ２が、Ｔである、（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−６）いずれかに記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体。
（ＩＩ−８）第１鎖が、配列番号１若しくは３に記載の配列、又は、
配列番号１若しくは３に記載の配列において、１若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失及び／若しくは付加された配列を含む
３０塩基以下のオリゴヌクレオチドであり、
第２鎖が、配列番号２若しくは４に記載の配列、又は、
配列番号２若しくは４に記載の配列において、１若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失及び／若しくは付加された配列を含む
３０塩基以下のオリゴヌクレオチドである、
（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−７）いずれかに記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体。
（ＩＩ−９）第１鎖が配列番号３記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
第２鎖が配列番号４記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである、（ＩＩ−８）記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体。
（ＩＩ−１０）（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−９）いずれかに記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体を含有する医薬組成物。【００１３】
（ＩＩ−１１）第１鎖が配列番号３記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
第２鎖が配列番号５記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである、マイクロＲＮＡ−１４３誘導体。
（ＩＩ−１２）（ＩＩ−１１）記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体を含有する医薬組成物。【００１４】
（ＩＩ−１３）（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−９）及び（ＩＩ−１１）いずれかに記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体及びＥＧＦＲ阻害剤を組み合わせてなる医薬。
（ＩＩ−１４）配合剤である、（ＩＩ−１３）記載の医薬。
（ＩＩ−１５）（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−９）及び（ＩＩ−１１）いずれかに記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体及びＥＧＦＲ阻害剤が併用されることを特徴とする、（ＩＩ−１３）記載の医薬。
（ＩＩ−１６）（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−９）及び（ＩＩ−１１）いずれかに記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体及びＥＧＦＲ阻害剤が同時又は順次に投与されることを特徴とする、（ＩＩ−１５）記載の医薬。
（ＩＩ−１７）（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−９）及び（ＩＩ−１１）いずれかに記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体及びＥＧＦＲ阻害剤が別々に投与されることを特徴とする、（ＩＩ−１５）記載の医薬。
（ＩＩ−１８）ＥＧＦＲ阻害剤が、セツキシマブである、（ＩＩ−１３）〜（ＩＩ−１７）いずれかに記載の医薬。
（ＩＩ−１９）癌の治療又は悪性化の抑制のために用いられる、（ＩＩ−１３）〜（ＩＩ−１８）いずれかに記載の医薬。
（ＩＩ−２０）（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−９）及び（ＩＩ−１１）いずれかに記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体を含有する、ＥＧＦＲ阻害剤の癌の治療効果の増強剤。
（ＩＩ−２１）ＥＧＦＲ阻害剤を含有する、（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−９）及び（ＩＩ−１１）いずれかに記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体の癌の治療効果の増強剤。
（ＩＩ−２２）（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−９）及び（ＩＩ−１１）いずれかに記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体を有効成分として含む、ＥＧＦＲ阻害剤と併用するための医薬組成物。
（ＩＩ−２３）ＥＧＦＲ阻害剤を有効成分として含む、（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−９）及び（ＩＩ−１１）いずれかに記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体と併用するための医薬組成物。
（ＩＩ−２４）癌の治療又は悪性化の抑制のために用いられる、（ＩＩ−２２）又は（ＩＩ−２３）記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のｍｉＲ-１４３誘導体は、優れた細胞増殖阻害作用を示し、癌の治療又は悪性化の抑制のための医薬として非常に有用である。また、本発明のｍｉＲ-１４３誘導体とＥＧＦＲ阻害剤の組み合わせは、特に、ＥＧＦＲ阻害剤の投与が難しいとされているＫＲＡＳ変異型の癌の治療又は悪性化の抑制のための医薬として非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＤＬＤ−１細胞を用いたｍｉＲ-１４３誘導体の腫瘍増殖抑制効果
【図２】ＤＬＤ−１細胞を用いたｍｉＲ-１４３誘導体の腫瘍増殖抑制効果
【図３】ＤＬＤ−１細胞を用いたｍｉＲ-１４３誘導体の腫瘍増殖抑制効果
【図４】抗ＥＧＦＲ抗体（アービタックス（登録商標））のＤＬＤ−１細胞に対する腫瘍増殖抑制効果
【図５】ｍｉＲ-１４３誘導体処置後の抗ＥＧＦＲ抗体（アービタックス（登録商標））の腫瘍増殖抑制効果
【図６】ｍｉＲ１４３が制御するタンパク質ならびにＲＡＳ経路下流タンパク質の発現解析
【図７】ｍｉＲ-１４３誘導体処置後のＫＲＡＳ遺伝子の発現解析
【図８】ＫＲＡＳ遺伝子に対する２種類のｓｉＲＮＡの設計箇所に関する説明。ＫＲＡＳには２種類のアイソフォーム（ＫＲＡＳａ及びＫＲＡＳｂ）が存在し、発現量はＫＲＡＳｂが多い（上）。ｓｉＲ−ＫＲＡＳａはＫＲＡＳａアイソフォームのエクソン４ａを標的にしており、ｓｉＲ−ＫＲＡＳは２つのアイソフォームに共通の３’非翻訳領域を標的にしている。
【図９】（上）ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ処置後のＫＲＡＳタンパク質の発現解析ならびに（下）ｓｉＲＮＡ処置後のアービタックス（登録商標）の腫瘍増殖抑制効果
【図１０】ＤＬＤ−１細胞を用いたｍｉＲ-１４３誘導体の腫瘍増殖抑制効果
【図１１】Ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるｍｉＲ-１４３誘導体の腫瘍増殖抑制効果
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書において使用される用語は、特に言及する場合を除いて、当該分野で通常用いられる意味で用いられる。
本発明においては、当該分野で公知の遺伝子操作方法の使用が可能である。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （２００１）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （２００３）に記載された方法等が挙げられる。
【００１８】
以下に本明細書中で使用する各用語を説明する。なお、本明細書中、各用語は単独で使用されている場合も、又は他の用語と一緒になって使用されている場合も、特に記載の無い限り、同一の意義を有する。
【００１９】
ｍｉＲ-１４３は、公知のマイクロＲＮＡである。天然型のヒトｍｉＲ-１４３としては、例えば、配列番号１（５’‐ＧＧＵＧＣＡＧＵＧＣＵＧＣＡＵＣＵＣＵＧＧＵ‐３’）（ＭＩＭＡＴ０００４５９９、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３−５ｐ）又は配列番号２（５’‐ＵＧＡＧＡＵＧＡＡＧＣＡＣＵＧＵＡＧＣＵＣ‐３’）（ＭＩＭＡＴ００００４３５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３−３ｐ）記載の配列からなる１本鎖ＲＮＡ、配列番号１記載の配列及び配列番号２記載の配列からなる２本鎖ＲＮＡ等が挙げられる。
【００２０】
ヌクレオシドとは、核酸塩基と糖とがＮ−グリコシド結合をした化合物を意味する。
オリゴヌクレオチドとは、同一又は異なるヌクレオシドがヌクレオシド間結合で複数個結合したヌクレオチドを意味する。
【００２１】
本明細書において、「ＤＮＡヌクレオシド」又は「ＲＮＡヌクレオシド」とは、天然のＤＮＡヌクレオシド又は天然のＲＮＡヌクレオシドであり、オリゴヌクレオチドを構成する１単位であるヌクレオチドの一部を意味する。「天然のＤＮＡヌクレオシド」とは、以下を意味する。
【化１】
0006730717.tif 000002
(式中、ＢＸ１（核酸塩基）は、アデニン、グアニン、シトシン又はチミンである。)
「天然のＲＮＡヌクレオシド」とは、以下を意味する。
【化２】
0006730717.tif 000003
（式中、ＢＸ２（核酸塩基）は、アデニン、グアニン、シトシン又はウラシルである。）
【００２２】
「ＲＮＡオリゴヌクレオチド」とは、ＲＮＡヌクレオシドがヌクレオシド間結合で複数個結合したオリゴヌクレオチドである。
【００２３】
本明細書において、「ヌクレオシド誘導体」とは、上記ＤＮＡヌクレオシド又は上記ＲＮＡヌクレオシドの核酸塩基及び／又は糖部位に人工的な修飾がなされたヌクレオシドを意味する。当該分野で公知のヌクレオシドの修飾であれば、いずれも利用可能である。
【００２４】
当該分野で公知のヌクレオチドの修飾及び修飾方法については、例えば、以下の特許文献にも開示されている。
国際公開第９８／３９３５２号、国際公開第９９／０１４２２６号、国際公開第２０００／０５６７４８号、国際公開第２００５／０２１５７０号、国際公開第２００３／０６８７９５号、国際公開第２０１１／０５２４３６号、国際公開第２００４／０１６７４９号、国際公開第２００５／０８３１２４号、国際公開第２００７／１４３３１５号、国際公開第２００９／０７１６８０号、国際公開第２０１４／１１２４６３号、国際公開第２０１４／１２６２２９号等。
【００２５】
核酸塩基の修飾としては、例えば、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、５−プロピニルシトシン等が挙げられる。
【００２６】
また、「ヌクレオシド誘導体」には、式：
【化３】
0006730717.tif 000004
（式中、Ｘは水素又はＯＨである）
で示される核酸塩基が欠失した誘導体（Ａｂａｓｉｃ）も含まれる。
【００２７】
糖部位の修飾としては、例えば、糖の２’位の置換が挙げられる。具体的には、２’−Ｆ、２’−ＯＣＨ３（２’−ＯＭｅ）、２’-ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３（２’-ＭＯＥ）等である。
また、例えば、以下の糖の４’位と２’位との間の架橋構造が挙げられる。
４’−（ＣＲ１Ｒ２）ｍ−Ｏ−２’、４’−（ＣＲ１Ｒ２）ｍ−Ｓ−２’、４’−（ＣＲ１Ｒ２）ｍ−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−２’、４’−（ＣＲ１Ｒ２）ｍ−ＮＲ３−Ｏ−（ＣＲ１Ｒ２）ｍ１−２’、４’−（ＣＲ１Ｒ２）ｍ１-Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ３−２’ 、４’−（ＣＲ１Ｒ２）ｍ２-Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ３−Ｙ４−２’、４’−（ＣＲ１Ｒ２）ｍ１−ＳＯ２−ＮＲ３−２’、４’−（ＣＲ１Ｒ２）ｍ−ＮＲ３−２’又は
【化４】
0006730717.tif 000005
であり、
ここで、
Ｙ４は、Ｏ、Ｓ、ＮＨ又はＣＨ２であり、
Ｒ１は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン、シアノ、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
Ｒ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン、シアノ、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
Ｒ３は、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル、置換若しくは非置換の芳香族炭素環式基、置換若しくは非置換の非芳香族炭素環式基、置換若しくは非置換の芳香族複素環式基、置換若しくは非置換の非芳香族複素環式基、置換若しくは非置換の芳香族炭素環アルキル、置換若しくは非置換の非芳香族炭素環アルキル、置換若しくは非置換の芳香族複素環アルキル又は置換若しくは非置換の非芳香族複素環アルキルであり、
Ｙ１はＣＲ４又はＮであり、
Ｙ２はＣＲ５又はＮであり、
Ｙ３はＣＲ６又はＮであり、
Ｒ４、Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン、シアノ、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル、置換若しくは非置換のアミノ、置換若しくは非置換のアルキルオキシ、置換若しくは非置換のアルキルカルボニルアミノ、置換若しくは非置換のアルケニルカルボニルアミノ、置換若しくは非置換のアルキニルカルボニルアミノ、置換若しくは非置換のアルキルカルバモイル、置換若しくは非置換のアルケニルカルバモイル又は置換若しくは非置換のアルキニルカルバモイルであり、
ｍは、１〜４の整数であり、
ｍ１は、０〜３の整数であり、
ｍ２は、０又は１である。
【００２８】
Ｒ１及びＲ２は、好ましくは、水素原子である。
【００２９】
Ｒ３は、好ましくは、水素原子、アルキル、アルケニル、アルキニル、芳香族炭素環式基、非芳香族炭素環式基、芳香族複素環式基、非芳香族複素環式基、芳香族炭素環アルキル、非芳香族炭素環アルキル、芳香族複素環アルキル又は非芳香族複素環アルキルであり、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい。
α群は、ヒドロキシ基、アルキル、アルキルオキシ、メルカプト、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ又はハロゲンである。
【００３０】
該架橋構造として、好ましくは、４’−（ＣＲ１Ｒ２）ｍ−Ｏ−２’又は４’−（ＣＲ１Ｒ２）ｍ１-Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ３−２’（ＡｍＮＡ、Ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）であり、
ここで、
Ｒ１は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン、シアノ、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
Ｒ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン、シアノ、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
Ｒ３は、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
ｍは、１〜４の整数であり、
ｍ１は、０〜２の整数である。
【００３１】
該架橋構造として、特に好ましくは、４’−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−２’（ｍは１〜４の整数）又は、４’−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ３−２’（Ｒ３は、水素原子又はアルキルである）である。
４’−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−２’（ｍは１〜４の整数）の中で、特に好ましくは４’−ＣＨ２−Ｏ−２’（ＬＮＡ、Ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）である。具体例及びその調製方法は、国際公開第９８／３９３５２号、国際公開第２００３／０６８７９５号、国際公開第２００５／０２１５７０号等に記載されている。
４’−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ３−２’（Ｒ３は、水素原子又はアルキルである）の中で、特に好ましくは４’−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＣＨ３−２’である。具体例及びその調製方法は、国際公開第２０１１／０５２４３６号に記載されている。
【００３２】
さらに、糖部位に修飾を有する「ヌクレオシド誘導体」としては、式：
【化５】
0006730717.tif 000006
（式中、ＢＸ３は、修飾されていてもよい核酸塩基である。）
で示される糖が開環した基も含まれる。その他、２’，５’−ＲＮＡ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９８，  ３７，  ７４７８−７４８６）も含まれる。
【００３３】
「ハロゲン」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、及びヨウ素原子を包含する。特にフッ素原子、及び塩素原子が好ましい。
【００３４】
「アルキル」とは、炭素数１〜１５、好ましくは炭素数１〜１０、より好ましくは炭素数１〜６、さらに好ましくは炭素数１〜４の直鎖又は分枝状の炭化水素基を包含する。例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、ｎ−へプチル、イソヘプチル、ｎ−オクチル、イソオクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル等が挙げられる。
「アルキル」の好ましい態様として、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチルが挙げられる。さらに好ましい態様として、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチルが挙げられる。
【００３５】
「アルケニル」とは、任意の位置に１以上の二重結合を有する、炭素数２〜１５、好ましくは炭素数２〜１０、より好ましくは炭素数２〜６、さらに好ましくは炭素数２〜４の直鎖又は分枝状の炭化水素基を包含する。例えば、ビニル、アリル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル、イソブテニル、プレニル、ブタジエニル、ペンテニル、イソペンテニル、ペンタジエニル、ヘキセニル、イソヘキセニル、ヘキサジエニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニル、ウンデセニル、ドデセニル、トリデセニル、テトラデセニル、ペンタデセニル等が挙げられる。
「アルケニル」の好ましい態様として、ビニル、アリル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニルが挙げられる。
【００３６】
「アルキニル」とは、任意の位置に１以上の三重結合を有する、炭素数２〜１０、好ましくは炭素数２〜８、さらに好ましくは炭素数２〜６、さらに好ましくは炭素数２〜４の直鎖又は分枝状の炭化水素基を包含する。例えば、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニル、ノニニル、デシニル等を包含する。これらはさらに任意の位置に二重結合を有していてもよい。
「アルキニル」の好ましい態様として、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニルが挙げられる。
【００３７】
「アルキルアミノ」には、モノアルキルアミノとジアルキルアミノが含まれる。２個の場合、２つのアルキル基は、同一でも異なっていてもよい。
「アルキルカルボニルアミノ」、「アルケニルカルボニルアミノ」又は「アルキニルカルボニルアミノ」とは、それぞれアルキルカルボニル、アルケニルカルボニル又はアルキニルカルボニルがアミノ基の窒素原子と結合している水素原子１個又は２個と置き換わった基を意味する。２個の場合、２つのアルキルカルボニル基、アルケニルカルボニル基又はアルキニルカルボニル基は、同一でも異なっていてもよい。
「アルキルカルバモイル」、「アルケニルカルバモイル」又は「アルキニルカルバモイル」とは、それぞれアルキル、アルケニル又はアルキニルがカルバモイル基の窒素原子と結合している水素原子１個又は２個と置き換わった基を意味する。２個の場合、２つのアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基は、同一でも異なっていてもよい。
【００３８】
「置換若しくは非置換のアルキル」、「置換若しくは非置換のアルケニル」、「置換若しくは非置換のアルキニル」、「置換若しくは非置換のアルキルオキシ」、「置換若しくは非置換のアルキルカルボニルアミノ」、「置換若しくは非置換のアルケニルカルボニルアミノ」、「置換若しくは非置換のアルキニルカルボニルアミノ」、「置換若しくは非置換のアルキルカルバモイル」、「置換若しくは非置換のアルケニルカルバモイル」又は「置換若しくは非置換のアルキニルカルバモイル」の置換基としては、次の置換基が挙げられる。任意の位置の炭素原子が次の置換基から選択される１以上の基と結合していてもよい。
置換基：ハロゲン、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、イミノ、ヒドロキシアミノ、ヒドロキシイミノ、ホルミル、ホルミルオキシ、カルバモイル、スルファモイル、スルファニル、スルフィノ、スルホ、チオホルミル、チオカルボキシ、ジチオカルボキシ、チオカルバモイル、シアノ、ニトロ、ニトロソ、アジド、ヒドラジノ、ウレイド、アミジノ、グアニジノ、トリアルキルシリル、アルキルオキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、ハロアルキルオキシ、アルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルキニルカルボニル、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルスルホニル、アルケニルスルホニル、アルキニルスルホニル、モノアルキルカルボニルアミノ、ジアルキルカルボニルアミノ、モノアルキルスルホニルアミノ、ジアルキルスルホニルアミノ、アルキルイミノ、アルケニルイミノ、アルキニルイミノ、アルキルカルボニルイミノ、アルケニルカルボニルイミノ、アルキニルカルボニルイミノ、アルキルオキシイミノ、アルケニルオキシイミノ、アルキニルオキシイミノ、アルキルカルボニルオキシ、アルケニルカルボニルオキシ、アルキニルカルボニルオキシ、アルキルオキシカルボニル、アルケニルオキシカルボニル、アルキニルオキシカルボニル、アルキルスルファニル、アルケニルスルファニル、アルキニルスルファニル、アルキルスルフィニル、アルケニルスルフィニル、アルキニルスルフィニル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、モノアルキルスルファモイル、ジアルキルスルファモイル、芳香族炭素環式基、非芳香族炭素環式基、芳香族複素環式基、非芳香族複素環式基、芳香族炭素環オキシ、非芳香族炭素環オキシ、芳香族複素環オキシ、非芳香族複素環オキシ、芳香族炭素環カルボニル、非芳香族炭素環カルボニル、芳香族複素環カルボニル、非芳香族複素環カルボニル、芳香族炭素環オキシカルボニル、非芳香族炭素環オキシカルボニル、芳香族複素環オキシカルボニル、非芳香族複素環オキシカルボニル、芳香族炭素環アルキルオキシ、非芳香族炭素環アルキルオキシ、芳香族複素環アルキルオキシ、非芳香族複素環アルキルオキシ、芳香族炭素環アルキルオキシカルボニル、非芳香族炭素環アルキルオキシカルボニル、芳香族複素環アルキルオキシカルボニル、非芳香族複素環アルキルオキシカルボニル、芳香族炭素環アルキルアミノ、非芳香族炭素環アルキルアミノ、芳香族複素環アルキルアミノ、非芳香族複素環アルキルアミノ、芳香族炭素環スルファニル、非芳香族炭素環スルファニル、芳香族複素環スルファニル、非芳香族複素環スルファニル、非芳香族炭素環スルホニル、芳香族炭素環スルホニル、芳香族複素環スルホニル、及び非芳香族複素環スルホニル。なお、上記α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい。
【００３９】
「芳香族炭素環式基」とは、単環又は２環以上の、環状芳香族炭化水素基を意味する。例えば、フェニル、ナフチル、アントリル、フェナントリル等が挙げられる。
「芳香族炭素環式基」の好ましい態様として、フェニルが挙げられる。
【００４０】
「非芳香族炭素環式基」とは、単環又は２環以上の、環状飽和炭化水素基又は環状非芳香族不飽和炭化水素基を意味する。２環以上の非芳香族炭素環式基は、単環又は２環以上の非芳香族炭素環式基に、上記「芳香族炭素環式基」における環が縮合したものも包含する。
さらに、「非芳香族炭素環式基」は、以下のように架橋している基、又はスピロ環を形成する基も包含する。
【化６】
0006730717.tif 000007
単環の非芳香族炭素環式基としては、炭素数３〜１６が好ましく、より好ましくは炭素数３〜１２、さらに好ましくは炭素数４〜８である。例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、シクロヘキサジエニル等が挙げられる。
２環以上の非芳香族炭素環式基としては、例えば、インダニル、インデニル、アセナフチル、テトラヒドロナフチル、フルオレニル等が挙げられる。
【００４１】
「芳香族複素環式基」とは、Ｏ、Ｓ及びＮから任意に選択される同一又は異なるヘテロ原子を環内に１以上有する、単環又は２環以上の、芳香族環式基を意味する。
２環以上の芳香族複素環式基は、単環又は２環以上の芳香族複素環式基に、上記「芳香族炭素環式基」及び／又は「非芳香族炭素環式基」における環が縮合したものも包含する。
単環の芳香族複素環式基としては、５〜８員が好ましく、より好ましくは５員又は６員である。例えば、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアゾリル、トリアジニル、テトラゾリル、フリル、チエニル、イソオキサゾリル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、イソチアゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル等が挙げられる。
２環の芳香族複素環式基としては、例えば、インドリル、イソインドリル、インダゾリル、インドリジニル、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、プリニル、プテリジニル、ベンズイミダゾリル、ベンズイソオキサゾリル、ベンズオキサゾリル、ベンズオキサジアゾリル、ベンズイソチアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾフリル、イソベンゾフリル、ベンゾチエニル、ベンゾトリアゾリル、イミダゾピリジル、トリアゾロピリジル、イミダゾチアゾリル、ピラジノピリダジニル、オキサゾロピリジル、チアゾロピリジル等が挙げられる。
３環以上の芳香族複素環式基としては、例えば、カルバゾリル、アクリジニル、キサンテニル、フェノチアジニル、フェノキサチイニル、フェノキサジニル、ジベンゾフリル等が挙げられる。
【００４２】
「非芳香族複素環式基」とは、Ｏ、Ｓ及びＮから任意に選択される同一又は異なるヘテロ原子を環内に１以上有する、単環又は２環以上の、環状非芳香族環式基を意味する。
２環以上の非芳香族複素環式基は、単環又は２環以上の非芳香族複素環式基に、上記「芳香族炭素環式基」、「非芳香族炭素環式基」及び／又は「芳香族複素環式基」におけるそれぞれの環が縮合したものも包含する。
さらに、「非芳香族複素環式基」は、以下のように架橋している基、又はスピロ環を形成する基も包含する。
【化７】
0006730717.tif 000008
単環の非芳香族複素環式基としては、３〜８員が好ましく、より好ましくは５員又は６員である。例えば、ジオキサニル、チイラニル、オキシラニル、オキセタニル、オキサチオラニル、アゼチジニル、チアニル、チアゾリジニル、ピロリジニル、ピロリニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピペリジル、ピペラジニル、モルホリニル、モルホリノ、チオモルホリニル、チオモルホリノ、ジヒドロピリジル、テトラヒドロピリジル、テトラヒドロフリル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロチアゾリル、テトラヒドロチアゾリル、テトラヒドロイソチアゾリル、ジヒドロオキサジニル、ヘキサヒドロアゼピニル、テトラヒドロジアゼピニル、テトラヒドロピリダジニル、ヘキサヒドロピリミジニル、ジオキソラニル、ジオキサジニル、アジリジニル、ジオキソリニル、オキセパニル、チオラニル、チイニル、チアジニル等が挙げられる。
２環以上の非芳香族複素環式基としては、例えば、インドリニル、イソインドリニル、クロマニル、イソクロマニル等が挙げられる。
【００４３】
「置換若しくは非置換の芳香族炭素環式基」、「置換若しくは非置換の非芳香族炭素環式基」、「置換若しくは非置換の芳香族複素環式基」、及び「置換若しくは非置換の非芳香族複素環式基」の「芳香族炭素環」、「非芳香族炭素環」、「芳香族複素環」及び
「非芳香族複素環」の環上の置換基としては、次の置換基が挙げられる。環上の任意の位置の原子が次の置換基から選択される１以上の基と結合していてもよい。
置換基：ハロゲン、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、イミノ、ヒドロキシアミノ、ヒドロキシイミノ、ホルミル、ホルミルオキシ、カルバモイル、スルファモイル、スルファニル、スルフィノ、スルホ、チオホルミル、チオカルボキシ、ジチオカルボキシ、チオカルバモイル、シアノ、ニトロ、ニトロソ、アジド、ヒドラジノ、ウレイド、アミジノ、グアニジノ、トリアルキルシリル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アルキルオキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、ハロアルキルオキシ、アルキルオキシアルキル、アルキルオキシアルキルオキシ、アルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルキニルカルボニル、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルスルホニル、アルケニルスルホニル、アルキニルスルホニル、モノアルキルカルボニルアミノ、ジアルキルカルボニルアミノ、モノアルキルスルホニルアミノ、ジアルキルスルホニルアミノ、アルキルイミノ、アルケニルイミノ、アルキニルイミノ、アルキルカルボニルイミノ、アルケニルカルボニルイミノ、アルキニルカルボニルイミノ、アルキルオキシイミノ、アルケニルオキシイミノ、アルキニルオキシイミノ、アルキルカルボニルオキシ、アルケニルカルボニルオキシ、アルキニルカルボニルオキシ、アルキルオキシカルボニル、アルケニルオキシカルボニル、アルキニルオキシカルボニル、アルキルスルファニル、アルケニルスルファニル、アルキニルスルファニル、アルキルスルフィニル、アルケニルスルフィニル、アルキニルスルフィニル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、モノアルキルスルファモイル、ジアルキルスルファモイル、芳香族炭素環式基、非芳香族炭素環式基、芳香族複素環式基、非芳香族複素環式基、芳香族炭素環オキシ、非芳香族炭素環オキシ、芳香族複素環オキシ、非芳香族複素環オキシ、芳香族炭素環カルボニル、非芳香族炭素環カルボニル、芳香族複素環カルボニル、非芳香族複素環カルボニル、芳香族炭素環オキシカルボニル、非芳香族炭素環オキシカルボニル、芳香族複素環オキシカルボニル、非芳香族複素環オキシカルボニル、芳香族炭素環アルキル、非芳香族炭素環アルキル、芳香族複素環アルキル、非芳香族複素環アルキル、芳香族炭素環アルキルオキシ、非芳香族炭素環アルキルオキシ、芳香族複素環アルキルオキシ、非芳香族複素環アルキルオキシ、芳香族炭素環アルキルオキシカルボニル、非芳香族炭素環アルキルオキシカルボニル、芳香族複素環アルキルオキシカルボニル、非芳香族複素環アルキルオキシカルボニル、芳香族炭素環アルキルオキシアルキル、非芳香族炭素環アルキルオキシアルキル、芳香族複素環アルキルオキシアルキル、非芳香族複素環アルキルオキシアルキル、芳香族炭素環アルキルアミノ、非芳香族炭素環アルキルアミノ、芳香族複素環アルキルアミノ、非芳香族複素環アルキルアミノ、芳香族炭素環スルファニル、非芳香族炭素環スルファニル、芳香族複素環スルファニル、非芳香族複素環スルファニル、非芳香族炭素環スルホニル、芳香族炭素環スルホニル、芳香族複素環スルホニル、及び非芳香族複素環スルホニル。なお、上記α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい。
【００４４】
また、「置換若しくは非置換の非芳香族炭素環式基」及び「置換若しくは非置換の非芳香族複素環式基」は「オキソ」で置換されていてもよい。この場合、以下のように炭素原子上の２個の水素原子が置換されている基を意味する。
【化８】
0006730717.tif 000009
【００４５】
本明細書において、「修飾ヌクレオシド間結合」とは、天然のオリゴヌクレオチド中のヌクレオシド間の結合（糖と糖の間の結合）であるホスホジエステル（Ｄ−オリゴ）結合が、人工的に修飾された結合又はリン原子を有していない結合を意味する。ヌクレオシド間結合として当該分野で公知の結合であれば、いずれも利用可能である。人工的に修飾がなされた結合としては、ホスホロチオエート（Ｓ−オリゴ）結合、メチルホスホネート（Ｍ−オリゴ）結合、ボラノホスホネート結合等が挙げられる。また、国際公開第２０１３／０２２９６６号、国際公開第２０１１／００５７６１号、国際公開第２０１４／０１２０８１号、国際公開第２０１５／１２５８４５号等に記載の結合も利用可能である。リン原子を有していない結合としては、アルキル、非芳香族炭素環式基、ハロアルキル、ハロゲンで置換された非芳香族炭素環式基等から誘導される二価の置換基が挙げられる。例えば、シロキサン、スルフィド、スルホキシド、スルホン、アセチル、ギ酸アセチル、チオギ酸アセチル、メチレンギ酸アセチル、チオギ酸アセチル、アルケニル、スルファマート、メチレンイミノ、メチレンヒドラジノ、スルホナート、スルホンアミド、アミド等から誘導される二価の置換基である。オリゴヌクレオチド中、全て同じ結合でもよいし、異なる結合を含んでいてもよい。
【００４６】
「式：ｄＸ１ｄＸ２（ここで、Ｘ１又はＸ２は、それぞれ独立してＡ、Ｇ、Ｃ又はＴである）で示される基」とは、２つのＤＮＡヌクレオシドがヌクレオシド間結合を介して結合している基を意味する。具体的には、以下の基を意味する。
【化９】
0006730717.tif 000010
（式中、Ｘ１及びＸ２は、それぞれ独立してアデニン、グアニン、シトシン又はチミンである。Ｙ１及びＹ２は、それぞれ独立してＯ又はＳである。）
【００４７】
本明細書において、「ベンゼン‐ピリジン誘導体」とは以下の基を意味する。
【化１０】
0006730717.tif 000011
（式中、Ｘ３及びＸ４は、それぞれ独立してＮ又はＣＨを意味し、Ｚは、
【化１１】
0006730717.tif 000012
であり、Ｙ３及びＹ’は、それぞれ独立してＯ又はＳである。）
具体例及びその調製方法は、特許文献１、国際公開第２０１１／０７１０７８号等に記載されている。
【００４８】
以下に本発明について詳細に説明する。
本発明は下記「ｍｉＲ-１４３誘導体（Ｉ）」を包含する。
（Ｉ）第１鎖が
配列番号３記載の配列、又は、
配列番号３記載の配列において、１若しくは２塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
かつ、３’末端修飾は有さず、５’末端修飾を有していてもよく、
第２鎖が
配列番号４記載の配列、若しくは、
配列番号４記載の配列において、１若しくは２塩基が置換、欠失若しくは挿入された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
かつ、３’末端修飾を有し、５’末端修飾を有していてもよく、
又は
配列番号５記載の配列、若しくは、
配列番号５記載の配列において、１若しくは２塩基が置換若しくは挿入された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
かつ、３’末端修飾は有さず、５’末端修飾を有していてもよく、
ここで、
３’末端修飾は、ヌクレオシド誘導体及び／若しくは修飾ヌクレオシド間結合を含んでいてもよい１〜５ｍｅｒのオリゴヌクレオチド誘導体又はベンゼン‐ピリジン誘導体であり、
５’末端修飾は、リン酸エステル部分又は式：＝ＣＱ１−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２（式中、Ｑ１は水素、ハロゲン、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル又は置換若しくは非置換のアルキルオキシである。）で示される基である、
マイクロＲＮＡ−１４３誘導体。
【００４９】
また、本発明は下記「ｍｉＲ-１４３誘導体（Ａ）」を包含する。
（Ａ）第１鎖がヌクレオシド間結合がホスホジエステル結合であるＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、
第２鎖がヌクレオシド誘導体及び／又は修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドであり、
第２鎖の３’末端に、式：ｄＸ１ｄＸ２（ここで、Ｘ１又はＸ２は、それぞれ独立してＡ、Ｇ、Ｃ又はＴである）で示される基又はベンゼン‐ピリジン誘導体が結合している
マイクロＲＮＡ−１４３誘導体。
【００５０】
ｍｉＲ-１４３誘導体（Ａ）のオリゴヌクレオチドの塩基配列は、天然型の「ｍｉＲ-１４３」に限定されるものではなく、細胞増殖抑制作用が保持される限り、天然型の「ｍｉＲ-１４３」の塩基配列（第１鎖のオリゴヌクレオチドが配列番号１記載の配列であり、第２鎖のオリゴヌクレオチドが配列番号２記載の配列である）にそれぞれ独立して１若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失及び／又は付加されていてもよい。
【００５１】
ｍｉＲ-１４３誘導体（Ａ）の第１鎖及び第２鎖のオリゴヌクレオチドは、好ましくは以下の通りである。
第１鎖が、配列番号１若しくは３に記載の配列、又は、
配列番号１若しくは３に記載の配列において、１若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失及び／若しくは付加された配列
を含む３０塩基以下のオリゴヌクレオチドであり、
第２鎖が、配列番号２若しくは４に記載の配列、又は、
配列番号２若しくは４に記載の配列において、１若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失及び／若しくは付加された配列
を含む３０塩基以下のオリゴヌクレオチドである。
【００５２】
「１若しくは数個の塩基」とは、１〜５個、１〜３個又は１若しくは２個の塩基を意味する。
【００５３】
ｍｉＲ-１４３誘導体（Ｉ）又はｍｉＲ-１４３誘導体（Ａ）は、第１鎖及び／又は第２鎖のオリゴヌクレオチドに「置換、欠失、挿入若しくは付加」、「置換若しくは挿入」、「置換、挿入、欠失及び／若しくは付加」の変異が入る場合であっても、ｍｉＲ−１４３としての活性、つまり、「細胞増殖抑制作用」を有する。「細胞増殖抑制作用」は、当該分野で公知の方法により測定し、確認することが可能である。例えば、下記実施例２記載の方法により測定することができる。ｍｉＲ-１４３誘導体（Ｉ）の２塩基又はｍｉＲ-１４３誘導体（Ａ）の数個の塩基が変異している場合、それぞれ、変異（置換、欠失、挿入若しくは付加）の種類は同じであっても異なっていてもよい。
【００５４】
ｍｉＲ-１４３誘導体（Ｉ）又はｍｉＲ-１４３誘導体（Ａ）の第１鎖又は第２鎖のオリゴヌクレオチドの長さは、同じであっても異なっていてもよい。ｍｉＲ-１４３誘導体（Ａ）の第１鎖又は第２鎖のオリゴヌクレオチドは、それぞれ独立して、３０塩基以下である。例えば、１５〜３０塩基、２０〜２５塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基又は２５塩基である。
【００５５】
ｍｉＲ-１４３誘導体（Ｉ）又はｍｉＲ-１４３誘導体（Ａ）の第１鎖及び第２鎖のオリゴヌクレオチドとして、特に好ましくは、第１鎖が配列番号３記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第２鎖が配列番号４記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである。
【００５６】
ｍｉＲ-１４３誘導体（Ｉ）の第１鎖及び／又は第２鎖のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド誘導体及び／又は修飾ヌクレオシド間結合を含んでいてもよい。
ｍｉＲ-１４３誘導体（Ａ）の第２鎖のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド誘導体及び／又は修飾ヌクレオシド間結合を１以上含む。
【００５７】
ｍｉＲ-１４３誘導体（Ｉ）の第１鎖及び／若しくは第２鎖、又は、ｍｉＲ-１４３誘導体（Ａ）の第２鎖のオリゴヌクレオチドに含まれるヌクレオシド誘導体の種類、数、箇所は制限されない。オリゴヌクレオチド中、含まれるヌクレオシド誘導体の種類は全て同じでもよいし、異なっていてもよい。好ましい種類は、糖の２’位に置換基を有するヌクレオシドの場合、糖の２’位にＦ、ＯＣＨ３（ＯＭｅ）又はＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３（ＭＯＥ）を有するヌクレオシドであり、特に好ましくは、糖の２’位にＦ又はＯＣＨ３（ＯＭｅ）を有するヌクレオシドである。糖の４’位と２’位との間の架橋構造の場合、特に好ましくは、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’である。また、好ましい種類として、式：
【化１２】
0006730717.tif 000013
（式中、Ｘは水素又はＯＨであり、ＢＸ３は、修飾されていてもよい核酸塩基である。）
で示される基も挙げられる。ヌクレオチド誘導体として「Ａｂａｓｉｃ」を用いる場合は、核酸塩基が存在しないことから、塩基配列上、該当箇所の塩基は欠失する。
【００５８】
ｍｉＲ-１４３誘導体（Ｉ）の第１鎖及び／若しくは第２鎖、又は、ｍｉＲ-１４３誘導体（Ａ）の第２鎖のオリゴヌクレオチドに含まれる修飾ヌクレオシド間結合の種類、数、箇所は制限されない。オリゴヌクレオチド中、含まれる修飾ヌクレオシド間結合の種類は全て同じでもよいし、異なっていてもよい。好ましい種類は、ホスホロチオエート結合である。好ましい数及び箇所はオリゴヌクレオチドの３’末端及び／又は５’末端部位に、それぞれ独立して、１〜数個、好ましくは１〜３個、さらに好ましくは２個である。特に好ましくはオリゴヌクレオチドの５’末端部位に２個である。
【００５９】
ｍｉＲ-１４３誘導体（Ｉ）又はｍｉＲ-１４３誘導体（Ａ）において第１鎖のオリゴヌクレオチドと第２鎖のオリゴヌクレオチドは、２本鎖を形成するが、ストリンジェントな条件でハイブリダイズできる限り、ハイブリダイズする部位において、１又は数個のミスマッチが存在するオリゴヌクレオチドも含まれる。
例えば、第１鎖（センス鎖）のオリゴヌクレオチドのハイブリダイズする部位が、第２鎖（アンチセンス鎖）のオリゴヌクレオチドの相補配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、もっとも好ましくは９５％以上の相同性を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。ここで、相同性は、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１５，４０３−４１０（１９９０））の開発したアルゴリズムを使用した検索プログラムＢＬＡＳＴを用いることにより、スコアで類似度が示される。
【００６０】
「ストリンジェントな条件」とは、ある塩基配列が特定配列とハイブリット（いわゆる特異的ハイブリット）を形成し、同等の機能を有しない塩基配列は該特定配列とハイブリット（いわゆる非特異的ハイブリット）を形成しない条件を意味する。当業者は、ハイブリダイゼーション反応及び洗浄時の温度や、ハイブリダイゼーション反応液及び洗浄液の塩濃度等を変化させることによって、このような条件を容易に選択することができる。具体的には、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ  ＮａＣｌ，０．０９Ｍ  クエン酸三ナトリウム）又は６×ＳＳＰＥ（３Ｍ  ＮａＣｌ，０，２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４，２０ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ，ｐＨ７．４）中４２℃でハイブリダイズさせ、さらに４２℃で０．５×ＳＳＣにより洗浄する条件が、本発明のストリンジェントな条件の１例として挙げられるが、これに限定されるものではない。ハイブリダイゼーション方法としては、当該分野において周知慣用な手法、例えば、サザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることができる。具体的には、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９５）（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００６１】
「１又は数個のミスマッチ」とは、１〜１０個、好ましくは１〜８個、さらに好ましくは１〜５個のミスマッチを意味している。
天然型のヒトｍｉＲ-１４３の二本鎖オリゴヌクレオチド（配列番号１及び配列番号２）は４箇所のミスマッチを有している。特許文献１に記載のように、該ミスマッチ配列のうちセンス鎖の少なくとも１〜３箇所をマッチさせ、活性を向上させることもでき得る。ｍｉＲ-１４３誘導体（Ｉ）のミスマッチ数として、特に好ましくは、天然型のヒトｍｉＲ-１４３のミスマッチを含めて３〜５個である。
【００６２】
ｍｉＲ-１４３誘導体（Ｉ）の第２鎖のオリゴヌクレオチドが配列番号４記載の配列又は配列番号４記載の配列において、１若しくは２塩基が置換、欠失若しくは挿入された配列からなるオリゴヌクレオチドである場合、３’末端修飾を有する。ここで、「３’末端修飾」とは、ヌクレオシド誘導体及び／若しくは修飾ヌクレオシド間結合を含んでいてもよい１〜５ｍｅｒのオリゴヌクレオチド誘導体又はベンゼン‐ピリジン誘導体である。
【００６３】
「オリゴヌクレオチド誘導体」の長さは１〜５ｍｅｒであり、好ましくは１〜３ｍｅｒであり、特に好ましくは、１又は２ｍｅｒである。
【００６４】
「オリゴヌクレオチド誘導体」に含まれるヌクレオシド誘導体の種類、数、箇所は制限されない。オリゴヌクレオチド誘導体中、含まれるヌクレオシド誘導体の種類は全て同じでもよいし、異なっていてもよい。糖の２’位に置換基を有するヌクレオシドの場合、糖の２’位にＦ、ＯＣＨ３（ＯＭｅ）又はＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３（ＭＯＥ）を有するヌクレオシドであり、特に好ましくは、糖の２’位にＦ又はＯＣＨ３（ＯＭｅ）を有するヌクレオシドである。糖の４’位と２’位との間の架橋構造の場合、特に好ましくは、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’である。また、好ましい種類として、式：
【化１３】
0006730717.tif 000014
（式中、ＢＸ３は、修飾されていてもよい核酸塩基である。）
で示される基も挙げられる。ヌクレオチド誘導体として「Ａｂａｓｉｃ」を用いる場合は、核酸塩基が存在しないことから、塩基配列上、該当箇所の塩基は欠失する。
【００６５】
「オリゴヌクレオチド誘導体」に含まれるヌクレオシド間結合の種類、数、箇所は制限されない。オリゴヌクレオチド誘導体中、含まれる修飾ヌクレオシド間結合の種類は全て同じでもよいし、異なっていてもよい。好ましい種類は、ホスホロチオエート結合である。特に好ましくは、オリゴヌクレオチド誘導体に含まれる全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。
【００６６】
「オリゴヌクレオチド誘導体」として特に好ましくは、以下の式：ｄＸ１ｄＸ２（ここで、Ｘ１又はＸ２は、それぞれ修飾されていてもよい核酸塩基である）で示される基である。
ｍｉＲ-１４３誘導体（Ａ）は、第２鎖のオリゴヌクレオチドの３’末端に、式：ｄＸ１ｄＸ２（ここで、Ｘ１又はＸ２は、それぞれ独立してＡ、Ｇ、Ｃ又はＴである）で示される基又はベンゼン‐ピリジン誘導体が結合している。
式：ｄＸ１ｄＸ２として好ましくは、
【化１４】
0006730717.tif 000015
（式中、Ｘ１及びＸ２は、それぞれ独立してアデニン、グアニン、シトシン又はチミンである。Ｙ１及びＹ２は、それぞれ独立してＯ又はＳである。）で示される基である。さらに好ましくは、Ｘ１及びＸ２が、チミン（Ｔ）であり、Ｙ１及びＹ２はＳである。
【００６７】
３’末端修飾を有する場合、オリゴヌクレオチドの３’末端の水酸基に修飾が結合する。修飾がオリゴヌクレオチド誘導体の場合、上記式：ｄＸ１ｄＸ２が結合する場合と同様に、５’末端のリン酸部位がオリゴヌクレオチドの３’末端に結合する。
【００６８】
ｍｉＲ-１４３誘導体（Ｉ）の第１鎖及び／若しくは第２鎖のオリゴヌクレオチドは、５’末端修飾を有していてもよい。ここで「５’末端修飾」とは、リン酸エステル部分又は式：＝ＣＱ１−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２（式中、Ｑ１は水素、ハロゲン、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル又は置換若しくは非置換のアルキルオキシである。）で示される基である。
また、ｍｉＲ-１４３誘導体（Ａ）の第２鎖のオリゴヌクレオチドの５’末端はリン酸エステル部分が結合していてもよい。
５’末端修飾がリン酸エステル部分の場合、オリゴヌクレオチドの５’末端の水酸基にリン酸エステル部分が結合する。
５’末端修飾が式：＝ＣＱ１−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２（式中、Ｑ１は水素、ハロゲン、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル又は置換若しくは非置換のアルキルオキシである。）で示される基の場合、以下の様にオリゴヌクレオチドに結合する。Ｑ１として好ましくは、水素、ハロゲン、アルキル又はアルキルオキシであり、特に好ましくは水素又はハロゲンである。
【化１５】
0006730717.tif 000016
（式中Ｘ’は、水素、ＯＨ、Ｆ、ＯＣＨ３又はＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３であり、Ｑ１は水素、ハロゲン、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル又は置換若しくは非置換のアルキルオキシである。）
「リン酸エステル部分」とは、リン酸エステル並びに修飾リン酸エステルが含まれる、末端リン酸基を意味する。具体的には、式：−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２で示される基又はその修飾基である。つまり、Ｏ及びＯＨの１以上が、Ｈ、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｒ’）（ここでＲ’は、Ｈ、アミノ保護基又は置換若しくは非置換のアルキルである）又はアルキルで置換されていてもよい。リン酸エステル部分は、置換又は非置換の１〜３のリン酸基を含んでいてもよい。
【００６９】
「アミノ保護基」とは、核酸合成の際に安定してアミノを保護し得るものであれば、特に限定されない。具体的には、酸性又は中性条件で安定であり、加水素分解、加水分解、電気分解及び光分解のような化学的方法により開裂し得る保護基である。例えば、ホルミル、ベンゾイル等が挙げられる。
【００７０】
本発明は、さらに、以下の「ｍｉＲ-１４３誘導体（Ｂ）」を包含する。
（Ｂ）第１鎖が配列番号３記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであり、かつ、
第２鎖が配列番号５記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである、マイクロＲＮＡ−１４３誘導体。
第１鎖及び第２鎖共に、好ましくは、ＲＮＡオリゴヌクレオチドである。また、ヌクレオシド間結合はホスホジエステル結合が好ましい。
【００７１】
また、天然型のヒトｍｉＲ-１４３が有する４つのミスマッチをマッチさせる検討を行った結果、ミスマッチ数として、特に好ましくは、天然型のヒトｍｉＲ-１４３のミスマッチを含めて３〜５個であった。
よって、本発明のｍｉＲ-１４３誘導体として、特に以下のｍｉＲ-１４３誘導体が好ましいと考えられる。
（ＩＩＩ−１）第１鎖が
配列番号３記載の配列において、５位、７位、１５位、２２位の核酸塩基のうち１塩基が置換された配列、又は、
配列番号３記載の配列において、５位、７位、１５位、２２位以外の核酸塩基のうち１塩基が置換された配列
からなるオリゴヌクレオチドである、（Ｉ−１）記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体。
【００７２】
また、本発明のｍｉＲ-１４３誘導体は、第１鎖がヌクレオシド誘導体及び修飾ヌクレオシド間結合を含んでいないＲＮＡオリゴヌクレオチドである場合、第２鎖がＳＥＱ−１２と全く同じであり、第１鎖が配列番号３の５’末端の３塩基が欠失したｍｉＲ-１４３誘導体ではＳＥＱ−１２と比較して腫瘍増殖抑制効果が大きく下がることが判明している。つまり、センス鎖が天然の配列である場合、センス鎖の塩基長が活性に重要と考えられる。
よって、本発明のｍｉＲ-１４３誘導体として、特に以下のｍｉＲ-１４３誘導体が好ましいと考えられる。
（ＩＶ−１）第１鎖が
配列番号３記載の配列、又は、
配列番号３記載の配列において、１若しくは２塩基が置換された配列
からなる修飾ヌクレオシド間結合を含んでいてもよいＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、
第２鎖が
配列番号４記載の配列からなるヌクレオシド誘導体及び／又は修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドである、（Ｉ−１）記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体。
【００７３】
また、本発明のｍｉＲ-１４３誘導体は、アンチセンス鎖オリゴヌクレオチド中全てのヌクレオシドがヌクレオシド誘導体からなる場合、腫瘍増殖抑制効果が高い。よって、本発明のｍｉＲ-１４３誘導体として、特に以下のｍｉＲ-１４３誘導体が好ましいと考えられる。
（Ｖ−１）第１鎖が
配列番号３記載の配列、又は、
配列番号３に記載の配列において、１若しくは２塩基が置換された配列
からなるヌクレオシド誘導体及び／又は修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドであり、
第２鎖が
配列番号４記載の配列からなり、
該配列中全てのヌクレオシドがヌクレオシド誘導体からなり、修飾ヌクレオシド間結合を含んでいてもよいオリゴヌクレオチドである、（Ｉ−１）記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体。
【００７４】
また、本発明のｍｉＲ-１４３誘導体は、オリゴヌクレオチド中のピリミジン塩基を有するヌクレシドのみ同じ種類のヌクレオシド誘導体からなり、プリン塩基を有するヌクレオシドがＲＮＡヌクレオシドである場合、腫瘍増殖抑制効果が高い。よって、本発明のｍｉＲ-１４３誘導体として、特に以下のｍｉＲ-１４３誘導体が好ましいと考えられる。
（ＶＩ−１）第１鎖が
配列番号３記載の配列、又は、
配列番号３に記載の配列において、１若しくは２塩基が置換された配列
からなる修飾ヌクレオシド間結合を含んでいてもよいオリゴヌクレオチドであり、
第２鎖が
配列番号４記載の配列からなる
修飾ヌクレオシド間結合を含んでいてもよいオリゴヌクレオチドであり、
該オリゴヌクレオチドのピリミジン塩基を有するヌクレオシドは全て同一種類のヌクレオシド誘導体であり、プリン塩基を有するヌクレオシドは全てＲＮＡヌクレオシドである、（Ｉ−１）記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体。
（ＶＩ−２）該ヌクレオシド誘導体が、糖の２’位に置換基を有するヌクレオシドであり、該置換基が、Ｆ又はＯＣＨ３である、（ＶＩ−１）記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体。
【００７５】
また、本発明のｍｉＲ−１４３誘導体は、第２鎖の３’末端修飾を含む３’末端位置から１〜８番目までの修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である場合、腫瘍増殖抑制効果が高い。また、該第２鎖がオリゴヌクレオチド中に修飾ヌクレオシド間結合としてホスホロチオエート結合が１つおきに配置されている修飾を含むこと、さらに、該第２鎖が５’末端修飾を有することが腫瘍増殖抑制効果につながっていると思われる。よって、本発明のｍｉＲ−１４３誘導体として、特に以下のｍｉＲ−１４３誘導体が好ましいと考えられる。
（ＶＩＩ−１）第２鎖が
配列番号４記載の配列からなり、
配列番号４の３’末端から１〜６番目までの修飾ヌクレオシド間結合の少なくとも１以上がホスホロチオエート結合であるオリゴヌクレオチドである、（Ｉ−１）記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体。
（ＶＩＩ−２）配列番号４の３’末端から１〜６番目までの修飾ヌクレオシド間結合の少なくとも３以上がホスホロチオエート結合である、（ＶＩＩ−１）記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体。
（ＶＩＩ−３）配列番号４の３’末端から１〜６番目までの修飾ヌクレオシド間結合の全てがホスホロチオエート結合である、（ＶＩＩ−１）記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体。
（ＶＩＩ−４）配列番号４の５’末端から２〜１４位に位置する修飾ヌクレオシド間結合に、式：Ｎ’＾Ｎ’＊（式中、Ｎ’はヌクレオシド、＾は−Ｐ（Ｓ）ＯＨ−を、＊は―Ｐ（Ｏ）ＯＨ−を意味する。）で示される形式を連続して１〜７個有するオリゴヌクレオチドである、（ＶＩＩ−１）〜（ＶＩＩ−３）いずれかに記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体。
（ＶＩＩ−５）式：Ｎ’＾Ｎ’＊で示される形式を連続して７個有する、（ＶＩＩ−４）記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体。
（ＶＩＩ−６）第２鎖が５’末端修飾を有する、（ＶＩＩ−１）〜（ＶＩＩ−５）いずれかに記載のマイクロＲＮＡ−１４３誘導体。
【００７６】
本発明のｍｉＲ-１４３誘導体中の第１鎖及び第２鎖のオリゴヌクレオチドは、当該分野の常法によって合成することができ、例えば、市販の核酸自動合成装置（例えば、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、（株）大日本精機製等）によって容易に合成することができる。合成法はホスホロアミダイトを用いた固相合成法、ハイドロジェンホスホネートを用いた固相合成法等がある。例えば、下記実施例１、特許文献１、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２，  １８５９−１８６２  （１９８１）等に開示されている。
【００７７】
合成された第１鎖及び第２鎖は、例えば、下記実施例１に開示されているような公知の方法でハイブリダイズさせることにより二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する。
【００７８】
本発明は、本発明のｍｉＲ-１４３誘導体を含有する医薬組成物も包含する。本発明の医薬組成物の投与方法及び製剤は、当該分野で公知のｍｉＲＮＡの投与方法及び製剤であれば、いずれも利用可能である。ｍｉＲＮＡの投与方法及び製剤は、例えば、以下の文献にも開示されている。
Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，  １３，  ６２２−６３８（２０１４）
特許文献１、国際公開第２０１０／０５０３２８号、国際公開第２０１１／０６４１３０号、国際公開第２０１１／１５３５４２号、国際公開第２０１３／１６３２５８号、国際公開第２０１３／１９２４８６号等。
【００７９】
本発明の医薬組成物は、局所的あるいは全身的な治療のいずれが望まれるのか、又は治療すべき領域に応じて、様々な方法により投与することができる。投与方法としては、例えば、局所的（点眼、膣内、直腸内、鼻腔内、経皮を含む）、経口的、又は、非経口的であってもよい。非経口的投与としては、静脈内注射若しくは点滴、皮下、腹腔内若しくは筋肉内注入、吸引若しくは吸入による肺投与、硬膜下腔内投与、脳室内投与等が挙げられる。好ましくは、静脈内注射又は皮下投与である。
【００８０】
本発明の医薬組成物を局所投与する場合、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴下剤、坐剤、噴霧剤、液剤、散剤等の製剤を用いることができる。
経口投与用組成物としては、散剤、顆粒剤、水若しくは非水性媒体に溶解させた懸濁液又は溶液、カプセル、粉末剤、錠剤等が挙げられる。
非経口、硬膜下腔、又は、脳室内投与用組成物としては、バッファー、希釈剤及びその他の適当な添加剤を含む無菌水溶液等が挙げられる。
【００８１】
本発明の医薬組成物は、本発明のｍｉＲ-１４３誘導体の有効量にその剤型に適した賦形剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤等の各種医薬用添加剤を必要に応じて混合して得ることができる。注射剤の場合には適当な担体と共に滅菌処理を行なって製剤とすればよい。
【００８２】
賦形剤としては乳糖、白糖、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム又は結晶セルロース等が挙げられる。結合剤としてはメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン又はポリビニルピロリドン等が挙げられる。崩壊剤としてはカルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末又はラウリル硫酸ナトリウム等が挙げられる。滑沢剤としてはタルク、ステアリン酸マグネシウム又はマクロゴール等が挙げられる。坐剤の基剤としてはカカオ脂、マクロゴール又はメチルセルロース等を用いることができる。また、液剤又は乳濁性、懸濁性の注射剤として調製する場合には通常使用されている溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤、保存剤、等張剤等を適宜添加しても良い。経口投与の場合には嬌味剤、芳香剤等を加えても良い。
【００８３】
ｍｉＲ-１４３誘導体の標的細胞内への導入を促進するために、本発明の医薬組成物は更に核酸導入用試薬を含むことができる。該核酸導入用試薬としては、アテロコラーゲン；リポソーム；ナノパーティクル；リポフェクチン、リポフェクタミン、ＤＯＧＳ（トランスフェクタム）、ＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰ、ＤＤＡＢ、ＤＨＤＥＡＢ、ＨＤＥＡＢ、ポリブレン、あるいはポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）等の陽イオン性脂質等を用いることができる。
【００８４】
本発明の医薬組成物の投与は、治療される病態の重度と反応度に依存し、治療コースは、数日から数ヶ月、あるいは、治癒が実現されるまで、又は、病状の減退が達成されるまで持続する。最適投与スケジュールは、生体における薬剤蓄積の測定から計算が可能である。当該分野の当業者であれば、最適用量、投与法、及び、繰り返し頻度を定めることができる。最適用量は、個々のｍｉＲ-１４３誘導体の相対的効力に応じて変動するが、一般に、インビトロ及びインビボの動物実験におけるＩＣ５０又はＥＣ５０に基づいて計算することが可能である。例えば、ｍｉＲ-１４３誘導体の分子量（ｍｉＲ-１４３誘導体の配列及び化学構造から導かれる）と、例えば、ＩＣ５０のような効果的用量（実験的に導かれる）が与えられたならば、ｍｇ／ｋｇで表される用量が通例にしたがって計算される。
【００８５】
本発明の医薬組成物は、細胞増殖抑制効果を有するため、細胞増殖が関連する疾患の予防又は治療のために用いることができる。本発明の医薬組成物は、特に、癌の治療又は悪性化の抑制のために用いることができる。「癌」としては、ヒ卜、愛玩動物、家畜等が罹患する癌であれば特に限定されない。固形癌であっても浸潤癌であってもよく、例えば、乳癌、非小細胞肺癌、胃癌、頭頸部癌、食道癌、大腸癌、肝臓癌、腎臓癌、膀胱癌、子宮体癌、前立腺癌、血管肉腫、子宮頸癌、脳腫瘍、胚細胞腫瘍（精巣腫瘍、卵巣腫瘍、性腺外腫瘍）等が挙げられる。
【００８６】
本発明のｍｉＲ-１４３誘導体と公知の抗腫瘍剤とを併用することにより、さらなる細胞増殖抑制効果を得ることもできる。
公知の抗腫瘍剤としては、具体的には、タキサン類（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル）等の微小管作用薬、アルキル化剤（例えば、イホスファミド、シクロホスファミド）、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、フルオロウラシル）、抗腫瘍性抗生物質（例えば、マイトマイシンＣ、アドリアマイシン）、抗腫瘍性抗体・分子標的薬（例えば、トラスツズマブ、リツキシマブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、セツキシマブ、パニツムマブ、メシル酸イマチニブ）、その他の抗腫瘍剤（例えば、シスプラチン、ニブルマブ、ペムブロリズマブ、イピリムマブ）等が挙げられる。
【００８７】
本発明のｍｉＲ-１４３誘導体と公知の抗腫瘍剤とを組み合わせて用いる場合、投与時期は限定されず、投与対象に対し、同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。さらに、本発明のｍｉＲ-１４３誘導体と該公知の抗腫瘍剤とは、それぞれの活性成分を含む複数の製剤として投与されてもよいし、両方の活性成分を含む単一の製剤として投与されてもよい。本発明のｍｉＲ-１４３誘導体の投与量は、癌の治療又は悪性化の抑制を達成し得る範囲内で特に限定されず、上記の「本発明の医薬組成物の投与」を参考に決定することができる。公知の抗腫瘍剤の投与量は、臨床において当該抗腫瘍剤を単剤で投与する際に採用される投与量に準じて決定することができる。本発明のｍｉＲ-１４３誘導体と組み合わせて用いる場合、２種以上の公知の抗腫瘍剤を用いてもよい。
【００８８】
下記実施例３に示す通り、本発明のｍｉＲ-１４３誘導体とＥＧＦＲ阻害剤の組み合わせは、ＫＲＡＳ変異型の癌の治療又は悪性化の抑制のための医薬として非常に有用である。
ＥＧＦＲ阻害剤は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤又はＥＧＦＲ標的の細胞外ドメインを標的とするものが挙げられる。好ましくは、抗ＥＧＦＲ抗体、さらに好ましくは、モノクローナル抗体である。具体的には、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ）、又はＥＧＦＲ細胞外ドメインを標的とする分子（例えば、セツキシマブ、パニツムマブ）等が挙げられる。
【００８９】
つまり、本発明は、「本発明のｍｉＲ-１４３誘導体及びＥＧＦＲ阻害剤を組み合わせてなる医薬」を包含する。より具体的には上記の（Ｉ−１０）〜（Ｉ−２１）、（ＩＩ−１３）〜（ＩＩ−２４）を包含する。
【００９０】
（Ｉ−１９）及び（ＩＩ−２２）に記載の「マイクロＲＮＡ−１４３誘導体を有効成分として含む、ＥＧＦＲ阻害剤と併用するための医薬組成物」には、同一パッケージ内に、ｍｉＲ-１４３誘導体を含む医薬組成物、及び、ＥＧＦＲ阻害剤を併用する使用方法を記載した添付文書を含むキットが包含される。
（Ｉ−２０）及び（ＩＩ−２３）に記載の「ＥＧＦＲ阻害剤を有効成分として含む、ｍｉＲ-１４３誘導体と併用するための医薬組成物」には、同一パッケージ内に、ＥＧＦＲ阻害剤を含む医薬組成物、及び、ｍｉＲ-１４３誘導体を併用する使用方法を記載した添付文書を含むキットが包含される。
【実施例】
【００９１】
以下に本発明の実施例及び参考例、ならびに試験例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。【００９２】
実施例１  ｍｉＲ１４３誘導体の合成
固相合成
すべてのオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ自動合成装置ｎＳ−８（Ｇｅｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｉｎｃ．）を用いて、１ｕｍｏｌスケールにてホスホロアミダイト法により合成した。モノマーは標準的な保護基を有するＲＮＡアミダイト、２’Ｆ−ＲＮＡアミダイト、２’ＯＭｅ−ＲＮＡアミダイト（すべてＰｒｏｌｉｇｏ  Ｒｅａｇｅｎｔｓより購入）を用いて、０．１Ｍアセトニトリル溶液に調製した。カップリング時間は５分間とし、１つのモノマーの縮合に１０当量のアミダイト体を用いた。ＰＯ酸化には０．０２ｍｏｌ／Ｌヨウ素（テトラヒドロフラン／水／ピリジン／ヨウ素＝９０．５４／９．０５／０．４１／０．４３（ｖ／ｖ／ｖ／ｗ）を使用し、ＰＳ酸化には０．０５ｍｏｌ／Ｌ［（ジメチルアミノ―メチリデン）アミノ］―３Ｈ−１，２，４―ジチアゾリン―３−チオン（ＤＤＴＴ）のアセトニトリル／ピリジン１／４（ｖ／ｖ）溶液を用いた。【００９３】
脱保護Ｉ  （樹脂からの切り出し、塩基及びリン酸の脱保護）
ＲＮＡ含有オリゴヌクレオチド（Ｓ−１〜３、７、８、ＡＳ−１〜３）の切り出しは２８％アンモニア水／メチルアミン／エタノール＝６／１／３（ｖ／ｖ）を用いて、室温下で２４時間振とうした。樹脂を５０％エタノール水で洗浄後、ろ過液を減圧下で濃縮した後、凍結乾燥にて白色粉末を得た。
その他オリゴヌクレオチド（Ｓ−４、９、１０、ＡＳ−４、７）の切り出しは２８％アンモニア水／４０％メチルアミン水溶液／エタノール混液７／１／２（ｖ／ｖ）を用いて、室温下で１５時間振とうした。樹脂を５０％エタノール水で洗浄後、減圧下で濃縮した。【００９４】
脱保護ＩＩ  （２’−ＴＢＳ基の脱保護）
得られた白色粉末に、Ｎ−メチルピロリドン／トリエチルアミン／３−フッ化水素トリエチルアミン＝６／１／２（ｖ／ｖ）を加えて６５℃下で１．５時間撹拌した。反応液に同量のエトキシトリメチルシランを加えて室温下で１０分間激しく撹拌すると沈殿物が得られた。２５００ｘｇ（２分間）にて遠心分離後、有機溶媒層を注意深く除去した。得られた沈殿物にジエチルエーテルを加えて激しく撹拌後、同様に遠心分離を行い、有機溶媒を除去して、粗ＲＮＡ体（白色固体）を得た。【００９５】
精製
すべてのオリゴヌクレオチドは、逆相モードで精製を行った。精製条件は以下の通り。移動相Ａ液：１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴＥＡＡ（ｐＨ７）、Ｂ液：アセトニトリル、Ｂ濃度グラジエント５−２０％（２０分間）、Ｃｏｌｕｍｎ：ＹＭＣ  Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ  Ｃ１８（２０ｘ１００ｍｍ）（ＹＭＣ）、流速４ｍＬ／ｍｉｎ。各フラクションを逆相ＨＰＬＣにより分析し、純度８５％以上のフラクションを回収し、減圧下濃縮した。【００９６】
オリゴヌクレオチドの配列及び純度分析
得られたオリゴヌクレオチド（Ｓ−１〜１０、ＡＳ−１〜７）は、ＵＰＬＣ／ＭＳ測定による実測分子量が理論分子量と一致することで、目的の配列が合成できていることを確認した。Ｘｅｖｏ  Ｇ２  Ｔｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ），Ｃｏｌｕｍｎ：Ａｑｕｉｔｙ  ＯＳＴ  Ｃ１８（２．１ｘ５０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ），移動相Ａ液：２００ｍＭ  １，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール／８ｍＭトリエチルアミン，Ｂ液：メタノール，Ｂ濃度グラジエント：１０−３０％（１０ｍｉｎ），温度５０℃，流速０．２ｍＬ／ｍｉｎ。【００９７】
ＡＳ−９〜２３、２７、２８、３１〜３４、３７、４０、４１、４３〜５７に関しても、固相合成〜オリゴヌクレオチドの配列及び純度分析まで上記と同様の手法で合成し、目的の配列が合成できていることを確認した。
なお、５’末端にＶＰ体を含むオリゴ（ＡＳ−４２）の合成はＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ２０１６，１７，９８５〜９８９の記載を参考に合成し、上記と同様の手法で目的の配列が合成できていることを確認した。
Ｓ−１１〜２６、 ＡＳ−８、２４〜２６、２９、３０、３５、３６、３８、３９に関しては、Ｇｅｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｉｎｃ．より購入した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ測定（ａｕｔｏｆｌｅｘ  ｓｐｅｅｄ、Ｂｒｕｋｅｒ）による実測分子量が理論分子量と一致することで、目的の配列が合成できていることを確認した。【００９８】
二重鎖核酸の調製
ＳＥＱ−０１〜２１の二重鎖核酸は以下のようにして調製した。各オリゴヌクレオチドを等モル量混合した後、蒸留水を加えて濃度０．１ｍｍｏｌ／Ｌ溶液とした。その後８５℃下で１０分間静置後、室温まで自然冷却させることで二重鎖核酸を得た。二重鎖形成の確認は、サイズ排除クロマトグラフィーにより実施した。Ｃｏｌｕｍｎ：ＹＭＣ−ＰＡＣ  Ｄｉｏｌ−１２０（４．６ｘ３００ｍｍ）（ＹＭＣ製），移動相：１０％アセトニトリル含有１ｘＰＢＳ溶液、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ，温度：室温。
ＳＥＱ−２２〜１４４の二重鎖核酸は以下のようにして調製した。各オリゴヌクレオチドを等モル量混合した後、１ｘＰＢＳ溶液を加えて濃度０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ溶液とした。その後９５℃下で５分間静置後、室温まで自然冷却させることで二重鎖核酸を得た。【００９９】
評価系のネガティブコントロールとして、レニーラルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ（ＳＥＱ−０５、０６）を、Ｇｅｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｉｎｃ．より購入した。【０１００】
以下に、合成したオリゴヌクレオチドの配列を示す。表１及び表２はセンス鎖（第１鎖）、表３〜表６はアンチセンス鎖（第２鎖）、表７及び表８はｍｉＲＮＡを示す。
【０１０１】
【表１】
0006730717.tif 000017
【０１０２】
【表２】
0006730717.tif 000018
【０１０３】
【表３】
0006730717.tif 000019
【０１０４】
【表４】
0006730717.tif 000020
【０１０５】
【表５】
0006730717.tif 000021
【０１０６】
【表６】
0006730717.tif 000022
【０１０７】
【表７】
0006730717.tif 000023
【０１０８】
【表８】
0006730717.tif 000024
【０１０９】
なお、ＳＥＱ−０１、１０〜１２、１９〜２１、２４〜１４４が本発明のｍｉＲ-１４３誘導体であり、ＳＥＱ−０２〜０４、０７〜０９、１３〜１８、２２、２３は比較例である。ＳＥＱ−０５、０６はネガティブコントロール（レニーラルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ）である。【０１１０】
なお、表１〜６において、Ｎ（大文字）はＲＮＡを、ｄＮはＤＮＡを、Ｎｆは２’−ＦＲＮＡを、Ｎｍは２’−ＯＭｅＲＮＡを示す。
＾は−Ｐ（Ｓ）ＯＨ−を、＊は―Ｐ（Ｏ）ＯＨ−を意味する。
【化１６】
0006730717.tif 000025
【０１１１】
また、ＮＬ、ＵＮＡ（ｎ）、Ａｂ（Ａｂａｓｉｃ）は、以下で示される基である。
【化１７】
0006730717.tif 000026
【０１１２】
ＡＳ−４２の５’末端の「ＶＰ−」及びオリゴヌクレオチドの末端のＵｍは、以下で示される基であり、式：＝ＣＨ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２が５’末端修飾（ＶＰ−）に該当する。
【化１８】
0006730717.tif 000027
【０１１３】
ＢｕＰは、以下で示される基である。
【化１９】
0006730717.tif 000028
【０１１４】
以下にオリゴヌクレオチドの質量分析結果（理論値と実測値）を示す。
【表９】
0006730717.tif 000029
【０１１５】
【表１０】
0006730717.tif 000030
【０１１６】
【表１１】
0006730717.tif 000031
【０１１７】
【表１２】
0006730717.tif 000032
【０１１８】
実施例２  ｍｉＲ１４３誘導体の腫瘍増殖抑制効果
細胞培養
ヒト大腸がん細胞株  ＤＬＤ−１（ＫＲＡＳ  ｍｕｔａｎｔ；Ｇ１３Ｄ）はＪａｐａｎｅｓｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋより購入した。ＤＬＤ−１細胞は１０％ＦＢＳ含有Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（０８４５６−６５；Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ）において５％ＣＯ２、３７℃の条件下で培養した。
生細胞数は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｇ７５７０；Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して評価した。あらかじめ９６ウェルホワイトプレートにて培養している各ウェルに対して、培地と当量のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）  Ｒｅａｇｅｎｔを添加し、細胞を溶解させるためにシェーカーで２分間撹拌した。その後、発光シグナルを安定させるために、室温で１０分間プレートを静置し、ルミノメーター（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｌ  ＭｉｃｒｏＰｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）にて５７０ｎｍの発光を測定した。コントロール細胞に対する生細胞数（％）を細胞生存率とした。【０１１９】
培養細胞へのｍｉＲＮＡ導入方法
ＤＬＤ−１細胞は８×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで９６ウェルホワイトプレートに播種した。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）４．６μＬにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００を０．４μＬ加え、室温で５分間放置した。別のチューブで、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地４μＬに１０μＭの各ｍｉＲＮＡ  １μＬを加えた。両チューブの内容物を混ぜ、５分放置し、ｍｉＲＮＡ−Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００複合体を調製した。培養細胞液中に濃度（４０ｎＭ）になるようにｍｉＲＮＡ−Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００複合体を１０μＬ／ｗｅｌｌで加え、これを７２時間培養した。次いで、生細胞数の測定を行なった。【０１２０】
ｍｉＲ-１４３誘導体の腫瘍増殖抑制効果
ヒト大腸がん細胞株  ＤＬＤ−１に対して、濃度４０ｎＭの各ｍｉＲ-１４３誘導体とともに７２時間培養した後、残存する生細胞数をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）  Ｒｅａｇｅｎｔを用いて発光シグナルとして検出した。なお、図１〜３及び１０のＮＴ（ｎｏｎ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）はｍｉＲＮＡを導入していないコントロール細胞であり、ＳＥＱ−０５、０６はネガティブコントロールである。
まずｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ（配列番号１及び２からなる天然型のヒトｍｉＲ-１４３）と比較してセンス鎖（第１鎖）の３’末端が１塩基だけ短く、アンチセンス鎖（第２鎖）は同じであるＳＥＱ−２２と本発明のｍｉＲ-１４３誘導体であるＳＥＱ−０１を比較すると、ＳＥＱ−２２と比較して、ＳＥＱ−０１は強い腫瘍増殖抑制効果を示した（図１０）。さらに、本発明のＳＥＱ−２２のアンチセンス鎖の３’末端のＵＣの代わりにオリゴヌクレオチド誘導体（＾ｄＴ＾ｄＴ）を導入したＳＥＱ−２３と比較しても、ＳＥＱ−０１は強い腫瘍増殖抑制効果を示した（図１０）。
次に、ｍｉＲ-１４３の安定性向上を狙い、二重鎖中に存在する４つのミスマッチ塩基対のうち２つをマッチ塩基対とし、さらに両鎖の３’末端にオリゴヌクレオチド誘導体を導入した（ＳＥＱ−０２，０３，０４）。その結果、ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅとミスマッチ塩基対が同じであり、かつ、ヌクレオシド誘導体を有さないＳＥＱ−０１と比較して、腫瘍増殖抑制効果が向上する配列は認められなかった(図１)。
次に、アンチセンス鎖をｗｉｌｄ  ｔｙｐｅと同様のホスホジエステル結合かつＲＮＡに固定し、センス鎖の３’末端にオリゴヌクレオチド誘導体の導入を検討したところ、いずれも腫瘍増殖抑制効果が認められなかった（図２  ＳＥＱ−０７〜０９，図３  ＳＥＱ−１３〜１５）。なお、ＳＥＱ−０７〜０９は、二重鎖中に存在する４つのミスマッチ塩基対のうち２つをマッチ塩基対とした配列であり、ＳＥＱ−１３〜１５は、ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅと同様の４つのミスマッチ塩基対を有する配列である。
一方、センス鎖をｗｉｌｄ  ｔｙｐｅと同様のホスホジエステル結合かつＲＮＡに固定し、アンチセンス鎖の３’末端へのヌクレオシド誘導体の導入を検討した結果、ＳＥＱ−０１と比較して、腫瘍増殖抑制効果の向上が認められた（図２  ＳＥＱ−１０〜１２）。特にアンチセンス鎖の配列内部を２’−ＯＭｅ体と２’−Ｆ体で交互に修飾したＳＥＱ−１２において、強い増殖抑制効果が確認できた。さらに、ＳＥＱ−１２のアンチセンス鎖の５’末端に末端修飾としてリン酸エステル部分を導入すると、抑制効果がさらに向上することが認められた（図２  ＳＥＱ−１９）。なお、ＳＥＱ−１０〜１２及び１９は、ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅと同様の４つのミスマッチ塩基対を有する配列である。
また、アンチセンス鎖の３’末端へのヌクレオシド誘導体の導入し、かつ、両鎖の配列内部にヌクレオシド誘導体及び／又は修飾ヌクレオシド間結合の導入を検討した結果、ＳＥＱ−１と同等以上の腫瘍増殖抑制効果が認められた（図３  ＳＥＱ−２０及び２１）。しかし、センス鎖の３’末端にもオリゴヌクレオチド誘導体を導入すると、腫瘍増殖抑制効果が低下した（図３  ＳＥＱ−１６〜１８）。なお、ＳＥＱ−１６〜２１は、ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅと同様の４つのミスマッチ塩基対を有する配列である。
同様に、ＳＥＱ−２４〜ＳＥＱ−１４３に関しても、ＳＥＱ−１以上の腫瘍増殖抑制効果が認められた。特に活性が強かったｍｉＲ-１４３誘導体の結果を以下に示す。
【０１２１】
【表１３】
0006730717.tif 000033
上記結果のように、ｍｉＲ-１４３誘導体の配列においては、第１鎖の３’末端の化学修飾（オリゴヌクレオチド誘導体）の許容性は低く、一方で、第２鎖の３’末端へのオリゴヌクレオチド誘導体又はベンゼン‐ピリジン誘導体の導入により、腫瘍増殖抑制効果を向上させることが可能である。さらに配列内部に対するヌクレオシド誘導体及び／又は修飾ヌクレオシド間結合の導入やアンチセンス鎖の５’末端にリン酸エステル部分又は式：＝ＣＱ１−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２（式中、Ｑ１は水素、ハロゲン、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル又は置換若しくは非置換のアルキルオキシである。）で示される基を導入することにより、腫瘍増殖抑制効果を向上させることが可能である。【０１２２】
実施例３  抗ＥＧＦＲ抗体（アービタックス（登録商標））とｍｉＲ-１４３誘導体の併用による腫瘍増殖抑制効果の増強
細胞培養
ヒト大腸がん細胞株  ＤＬＤ−１（ＫＲＡＳ  ｍｕｔａｎｔ；Ｇ１３Ｄ）はＪａｐａｎｅｓｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋより購入した。細胞は購入後６カ月以内もしくはＭｙｃｏＡｌｅｒｔ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＬＴ０７−１１８；Ｌｏｎｚａ）で管理したものを使用した。ＤＬＤ−１は１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０  ｍｅｄｉｕｍ（１８９−０２０２５；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において５％ＣＯ２、３７℃の条件下で培養した。
生細胞数は、トリプシンで処理し、トリパンブルー色素排除試験法により評価した。培養後の細胞溶液をトリパンブルーと等量混合し、血球計算盤にて生細胞数を計数した。コントロール細胞に対する生細胞数（％）を細胞生存率とした。【０１２３】
遺伝子導入実験
各細胞は０．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で６ウェルプレートに播種した。ＤＬＤ−１細胞をトランスフェクションを行う２４時間前に播種し、プレートに接着させた。コントロールとして、ｎｅｇａｉｔｉｖｅ  ｍｉＲＮＡをＤｈａｒｍａｃｏｎより購入した。公知のｍｉＲ−１４３誘導体として、ｍｉｒＶａｎａＴＭ  ｍｉＲＮＡ  ｍｉｍｉｃ（以下、該誘導体を「ａｍｂｉｏｎ」と記載）をＡｍｂｉｏｎから購入した。各ｍｉＲＮＡはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してカチオン性リポソームを形成させ、細胞内に導入した。アービタックス（登録商標）（メルク）は導入後、４８時間で投与し、その２４時間後に生細胞の計数及びウェスタンブロット解析を行った。【０１２４】
抗ＥＧＦＲ抗体とｍｉＲ-１４３誘導体の併用効果
ＫＲＡＳは低分子ＧＴＰ結合タンパクであり、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）からの増殖シグナルを下流に伝達する。しかし、大腸癌の約４０％でＫＲＡＳ変異が認められており、これまでに数々の抗ＥＧＦＲ抗体、ＥＧＦＲ阻害剤が開発されているが、ＫＲＡＳ変異のため効果は十分でないと言われている。Ｇ１３Ｄ変異を有するヒト大腸がん細胞株  ＤＬＤ−１に対して、アービタックス（登録商標）を濃度を変えて２４時間作用させても、有意な細胞増殖抑制効果は確認できなかった（図４）。そこで、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００９，２８（１０），１３８５−９２．、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，５（１４），５４１６−２７．等でＲａｓタンパク質の発現を抑制していることが報告されているｍｉＲ−１４３と抗ＥＧＦＲ抗体の併用療法について検討を行った。ヒト大腸がん細胞株  ＤＬＤ−１に対して、最初に濃度１０ｎＭの各ｍｉＲ-１４３誘導体（ａｍｂｉｏｎ、ＳＥＱ−０１、１２）又はｎｅｇａｉｔｉｖｅ  ｍｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）とともに４８時間培養し、続いて各濃度のアービタックス（登録商標）を添加後、さらに２４時間培養した。残存する生細胞数をトリパンブルー色素排除試験法によりカウントした。その結果、ｍｉＲ-１４３誘導体を加えない場合（アービタックス（登録商標）処置のみ、Ｃｏｎｔｒｏｌ）ではＫＲＡＳに変異を持つＤＬＤ−１細胞増殖抑制効果は確認されなかった。また、公知のｍｉＲ-１４３誘導体（ａｍｂｉｏｎ）を用いても有意な抑制効果は確認できなかった。一方、鋭意検討により見出したｍｉＲ-１４３誘導体（ＳＥＱ−０１、１２）は、単独でも増殖抑制効果を示すが、併用するアービタックス（登録商標）の添加量を増やしていくと、濃度依存的にその効果が増強されることが確認された（図５）。また、ヌクレオシド誘導体及び修飾ヌクレオシド間結合の導入により核酸分解酵素に対する耐性能を向上させたＳＥＱ−１２がより強い増殖抑制効果を示すことが明らかになった（図５）。【０１２５】
実施例４  ｍｉＲ-１４３誘導体の腫瘍増殖抑制メカニズム解析
ウェスタンブロット解析
１）タンパク質抽出
タンパク質抽出液には、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４０、０．１％デオキシコール酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に１％  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ、Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ  ＩＩ及びＩＩＩを混合して用いた。タンパク質抽出液に回収した細胞を懸濁させ、２０分間氷中に静置させた。その後、１３，０００ｒｐｍ、４℃、２０分間遠心分離した。遠心分離した上清を回収し、タンパク質サンプルとした。核及び細胞質のタンパク質の分画抽出にはＣｅｌＬｙｔｉｃ  ｎｕｃｌｅａｒ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用した。タンパク質定量は、ＤＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて行った。定量したタンパク質をＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ（６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、５０ｍＭ  ＤＴＴ、０．０１％ブロモフェノールブルー）と混和して５０μｇ／μＬに調整し、９８℃で５分間煮沸処理した後、氷上で５分間静置した。
２）電気泳動及び転写
電気泳動には、イージーセパレーター（Ｗａｋｏ）及びＳｕｐｅｒ  Ｓｅｐ  Ａｃｅ（Ｗａｋｏ）を用いた。泳動後、ゲルをｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．２Ｍ  グリシン、２０％メタノール）に５分間浸した。ＰＶＤＦメンブレン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）はメタノールに３分間浸し、超純水に５分間浸した。その後、ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒに５分間浸した。陽極側から、ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒに浸したろ紙、ＰＶＤＦメンブレン、ゲル、ろ紙の順に重ね、１５Ｖ、３７０ｍＡで４０分間転写した。
転写後、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０含有５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ＴＢＳＴ）で洗浄し、５％スキムミルク溶液に浸して１時間ブロッキングした。ＴＢＳＴで洗浄し、抗体希釈液（２％ＢＳＡ、０．０１％アジ化ナトリウム、ＴＢＳＴ）で希釈した一次抗体に浸して４℃で一晩反応させた。ＴＢＳＴで洗浄した後、５％スキムミルク溶液で希釈した二次抗体に浸して室温で１時間静置させた。その後再びＴＢＳＴで洗浄し、Ｌｕｍｉｎａｔａ  Ｆｏｒｔｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＨＲＰ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＷＢＬＵＦ０５００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で発光させた後に、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｚｅｒ  ＬＡＳ−４０００  ＵＶ  ｍｉｎｉ（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）を用いて検出した。コントロールにはａｎｔｉ−β−ａｃｔｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ａ５３１６；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用した。【０１２６】
Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ
１）ＲＮＡ抽出
細胞及び組織中のＲＮＡはＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ｍｉＲＮＡ  ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）を使用し抽出した。ＲＮＡ量はＵＶ  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙにて定量した。
２）ｍＲＮＡの定量
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）を使用し、３７℃  １５分、８５℃  ５秒、４℃  でＲＮＡサンプルの逆転写反応を行い、鋳型ｃＤＮＡを合成した。Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）反応にはＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ＳＹＢＲ  ｓｅｌｅｃｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量を内部コントロールとした。９５℃  ３０秒で初期変性を行った後、９５℃  ５秒の変性反応及び６０℃  ６０秒のアニーリング・伸長反応を４０サイクル行い、９５℃  １５秒、６０℃  ３０秒、９５℃  １５秒のステップで融解曲線を分析した。各サンプルの反応は３回ずつ行い、ΔΔＣｔ法にてｍＲＮＡ量を計算した。
抗体
ウェスタンブロッティングに用いた抗体ＰＡＲＰ−１（＃９５４２）、ＬＣ３Ｂ（＃３８６８）、Ａｋｔ（＃９２７２）、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３；＃４０６０）、Ｅｒｋ、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｅｒｋ、ＥＲＫ５はＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙより購入した。ＫＲＡＳに対する抗体はａｂｃａｍから購入した。
ＫＲＡＳ標的ｓｉＲＮＡの準備
図８に示すように、ＫＲＡＳにはＫＲＡＳａ及びＫＲＡＳｂの２つのアイソフォームの存在が知られている。ＫＲＡＳノックダウン用として、２つの遺伝子配列に対するｓｉＲＮＡを、インビトロジェン社の設計ソフトにより導き出されるリストからランクの高いものを購入した。以下には各ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖配列を記載しており、センス鎖はアンチセンス鎖と１００％相補的な配列となる。
（１）ｓｉＲＮＡ  ｆｏｒ  ＫＲＡＳ（３’ＵＴＲ領域、ＮＭ００４９８５．４）
５’−ＡＡＵＧＣＡＵＧＡＣＡＡＣＡＣＵＧＧＡＵＧＡＣＣＧ（配列番号１０）
（２）ｓｉＲＮＡ  ｆｏｒ  ＫＲＡＳａ（ＫＲＡＳａ特異的エクソン４ａ、ＯＲＦ領域、ＮＭ０３３３６０．３）
５’−ＵＡＵＵＧＵＣＧＧＡＵＣＵＣＣＣＵＣＡＣＣＡＡＵＧ（配列番号１１）【０１２７】
ｍｉＲ-１４３誘導体のメカニズム解析
ヒト大腸がん細胞株  ＤＬＤ−１に対して、濃度１０ｎＭの各ｍｉＲ-１４３誘導体（ＳＥＱ−０１、１２）とともに４８時間培養し、続いて各濃度のアービタックス（登録商標）を添加後、さらに２４時間培養した。ウェスタンブロット解析の結果、標的遺伝子ＥＲＫ５と同様、ＫＲＡＳのｍＲＮＡ及び蛋白発現を顕著に低下させることが確認された（図６、７）。また、下流の増殖シグナルであるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ、ＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２）シグナルを抑制することが明らかとなった。一方で、ｓｉＲＮＡと抗ＥＧＦＲ抗体との併用効果を検討した。インビトロジェン社から購入した２種類のｓｉＲＮＡのうち、３’ＵＴＲ（非翻訳領域）に設計したｓｉＲ−ＫＲＡＳがＫＲＡＳタンパク質の発現量を抑えることが認められた（図９上）。このｓｉＲ−ＫＲＡＳを用いて事前にＫＲＡＳをノックダウンした場合は、アービタックス（登録商標）の有意な併用効果は認められなかったことから、ＫＲＡＳ生成をｓｉＲＮＡで抑えるだけでは抗ＥＧＦＲ抗体の腫瘍増殖抑制効果を向上させない（図９下）。以上のことから、本発明のｍｉＲ-１４３誘導体（ＳＥＱ−０１、１２）は、標的遺伝子ＫＲＡＳのｍＲＮＡの分解、タンパク質への翻訳抑制が顕著に高く、さらにＫＲＡＳの生成過程に関わる複数の遺伝子をサイレンシングすることで、ＫＲＡＳのｍＲＮＡレベルを顕著に低下させていることが示唆される。その結果、ＫＲＡＳの発現亢進を抑制し、ＥＧＦＲ阻害剤（例えば、アービタックス（登録商標））が効果的に働くと考えられる。【０１２８】
実施例５  ｍｉＲ１４３誘導体の動物モデルにおける腫瘍増殖抑制評価
ＫＲＡＳ変異を有するヒト膀胱癌由来細胞株（Ｃａｋｉ−１）を３．０×１０６  ｃｅｌｌｓ／１００ｕＬでマウスの背部皮下へ移植した。移植日を０日に設定した。Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｄｓＲＮＡ（北海道システムサイエンス社（ＨＳＳ，  Ｓａｐｐｏｒｏ）にて合成）及び本発明のｍｉＲ１４３誘導体（ＳＥＱ−１２）（各０．１  ｎｍｏｌ）の  ５０ｕＬ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ溶液に２ｕＬのカチオン性リポソーム試薬（ＬｉｐｏＴｒｕｓｔ，  ＨＳＳ，  Ｓａｐｐｏｒｏ）を混合し、移植後１４日目のマウス腫瘍に投与を開始した。移植後１４日目から移植後２３日目まで、これらの各混合物をマウスの右心房より７２時間毎に投与し、腫瘍体積を経時的に測定した。腫瘍体積は次の式により算出した。腫瘍体積＝０．５２３６×Ｌ１×（Ｌ２）２、  Ｌ１は腫瘍長径、Ｌ２は腫瘍短径を表す。コントロールＲＮＡ二重鎖を投与されたマウス群と比較して、ＳＥＱ−１２を投与されたマウス群では、約４４％の腫瘍増殖抑制効果が示された（図１１）。なお、本実施例で使用したＣｏｎｔｒｏｌ  ｄｓＲＮＡの配列は以下のとおりである。
（第１鎖）  ５’−ＧＵＡＧＧＡＧＵＡＧＵＧＡＡＡＧＧＣＣ−３’  （配列番号２３）
（第２鎖）  ５’−ＧＧＣＣＵＵＵＣＡＣＵＡＣＵＣＣＵＡＣ−３’  （配列番号２４）
【産業上の利用可能性】
【０１２９】
本発明のｍｉＲ-１４３誘導体は、優れた細胞増殖抑制効果を示す。さらに、本発明のｍｉＲ−１４３はＥＧＦＲ阻害剤と併用することにより、ＫＲＡＳ変異癌に対して優れた細胞増殖抑制効果を示す。従って、本発明のｍｉＲ-１４３誘導体は、核酸医薬品、特に癌の治療又は悪性化の抑制のための医薬として非常に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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