(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベンジダミンおよび、ビホナゾール、ブトコナゾール、クロミダゾール、クロトリマゾール、クロコナゾール、エコナゾール、フェンチコナゾール、ケトコナゾール、イソコナゾール、ミコナゾール、ネチコナゾール、オモコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール、チオコナゾールを含む群から選択される、イミダゾール抗真菌薬（imidazole-antimycotic）またはその塩の相乗的組合せ、および少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む、カンジダ真菌症（ｍｙｃｏｓｉｓ）の治療に使用するための、医薬組成物。
【請求項２】
前記イミダゾール抗真菌薬が、ビホナゾール、ブトコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、フェンチコナゾール、ケトコナゾール、イソコナゾール、ミコナゾール、オモコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール、チオコナゾールまたはその塩を含む群から選択される、請求項１に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項３】
前記イミダゾール抗真菌薬が、ブトコナゾール、エコナゾール、フェンチコナゾール、イソコナゾール、ミコナゾール、スルコナゾールまたはその塩を含む群から選択される、請求項２に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項４】
前記イミダゾール抗真菌薬が、エコナゾール、ミコナゾールまたはその塩である、請求項３に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項５】
前記カンジダ真菌症（ｍｙｃｏｓｉｓ）が、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  Ａｌｂｉｃａｎｓ）、レアカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ   ｒｕｇｏｓａ）、カンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）およびカンジタ・デュブリニエンシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ）からなる群からなるカンジタ種によって引き起こされる、請求項１に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項６】
前記カンジダ真菌症（ｍｙｃｏｓｉｓ）が、粘膜カンジダ症、皮膚カンジダ症、爪甲真菌症（ｍｙｃｏｓｉｓ）、全身性カンジダ症、医原性カンジダ症、おむつカンジダ症、腸カンジダ症またはカンジダ亀頭炎である、請求項５に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項７】
前記粘膜カンジダ症が、口腔または外陰膣である、請求項６に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項８】
前記組成物が、局所使用のためである、請求項１〜７のいずれかに記載の、使用のための医薬組成物。
【請求項９】
前記組成物が、クリーム、軟膏、ローション、ゲル、泡、膣オビュール（ｏｖｕｌｅｓ）、持続放出膣オビュール（ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｖｕｌｅｓ）、膣灌注（ｖａｇｉｎａｌ  ｄｏｕｃｈｅ）、または外用溶液の形態である、請求項１〜８のいずれかに記載の、使用のため医薬組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、クリーム、軟膏、ローション、膣灌注（ｖａｇｉｎａｌ  ｄｏｕｃｈｅ）又は外用溶液の形態である、請求項９に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、クリームまたは膣灌注（ｖａｇｉｎａｌ  ｄｏｕｃｈｅ）である、請求項１０に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１２】
ベンジダミンが、０．００１重量％から１重量％、より好適には、０．０５重量％から０．５重量％、そしてさらにより好適には、０．０８重量％から０．２重量％の量で存在する、請求項１〜１１のいずれかに記載の、使用のための医薬組成物。
【請求項１３】
前記イミダゾール抗真菌薬、またはその塩が、０．０１重量％から４重量％、より好適には、０．１重量％から２重量％、そしてさらにより好適には、０．５重量％から１．５重量％の量で存在する、請求項１〜１１のいずれかに記載の、使用のための医薬組成物。
【請求項１４】
前記医薬組成物が、ＨＬＢが６から９の範囲を有する１つ以上の乳化剤と、９より大きく１２以下の範囲のＨＬＢを有する１つ以上の乳化剤を含有するクリームの形態である、請求項１乃至１３のいずれかに記載の、使用のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、ベンジダミン（ｂｅｎｚｙｄａｍｉｎｅ）と抗真菌活性成分との組み合わせを含む医薬組成物に関し、上記組み合わせは、真菌症（ｍｙｃｏｓｉｓ）の治療において相乗効果を有する、
【０００２】
［発明の背景］
カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する真菌類（ｆｕｎｇｉ）は、世界中の真菌感染症の最も一般的な原因の一つである。
カンジダの多くの種は、例えば、人間に対して、それらの宿主の無害な片利共生生物（ｃｏｍｍｅｎｓａｌｓ）や内部共生（ｅｎｄｏｓｙｍｂｉｏｎｔｓ）である。
【０００３】
カンジダ・アルビカンス種およびカンジダ・トロピカリス種に属する真菌類（ｆｕｎｇｉ）は、通常、口腔、胃腸管及び膣の粘膜上に存在する。しかしながら、たとえば、抗生物質による長い治療またはホルモンの変化により、粘膜の細菌叢が変化すると、真菌類（ｆｕｎｇｉ）は異常に増殖し、そして、カンジダ症として知られる、口腔または膣などの表在性感染症を引き起こすことがある。免疫が抑制された人々では、真菌類（ｆｕｎｇｉ）は、カンジダ血症（ｃａｎｄｉｄｅｍｉａ）として知られる重度の全身感染症を引き起こすことさえあり、時には致死的である。
【０００４】
真菌類（ｆｕｎｇｉ）によって引き起こされる外陰膣炎は、今日、膣感染症の約３０から３５パーセントを示し、主に、カンジダ・アルビカンス菌によって引き起こされる。
【０００５】
外陰膣炎は、膣のｐＨの変化を伴い、主な症状は、激しい膣および／または外陰部の痒み、漏出、炎症および疼痛である。
【０００６】
典型的には、治療は、クリーム、膣オビュール（ｖａｇｉｎａｌ  ｏｖｕｌｅｓ）および外用溶液の形態の、局所抗真菌薬の投与による。重度および／または再発性の感染症の場合、抗真菌薬は経口で投与される。
【０００７】
ＰｅｖａｒｙｌＴＭは、１重量％の硝酸エコナゾールを含有する、外陰膣真菌症（ｍｙｃｏｓｉｓ）の治療のための市販のクリームである。
【０００８】
エコナゾールは、広域スペクトルの抗真菌活性を有し、一般に、カンジダ・アルビカンス真菌症（ｍｙｃｏｓｉｓ）の治療のために使用される、イミダゾール誘導体である。
【０００９】
いくつかの特許出願は、口腔および外陰膣真菌症（ｍｙｃｏｓｉｓ）の治療に有用な有効成分の組み合わせを開示する。
【００１０】
国際公開第９６／２６７２４号は、抗炎症量のベンジダミンまたはその塩、抗真菌の有効量の抗真菌剤および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物を開示する。
【００１１】
米国公開第２００９／０２０８５５８号は、カンジダ真菌症（ｍｙｃｏｓｉｓ）の局所治療のための併用薬を製造するための、抗真菌剤および上皮細胞または内皮細胞接着阻害剤の使用に関する。
【００１２】
ほとんどの薬物の組み合わせは相加効果を示す。しかし、いくつかの例では、その組み合わせは、相加的効果よりも少ないかまたは多い効果を示す。これらの組み合わせは、それぞれ、拮抗的または相乗的と呼ばれる。拮抗的または相乗的効果は予測不可能であり、予想外の実験結果である。しかしながら、活性成分の非常に有効な組み合わせ、すなわち相乗的混合物を見出すことは困難である。医薬の潜在的な組み合わせの数は驚異的に多いため、セレンディピティは有効なルートではない。生物の多くの生物学的エンドポイントは、複数の経路によって影響を受けるので、メカニズムの知識から潜在的な組み合わせを導き出す他の通常の発見戦略も潜在的に限られている。これらの経路は、しばしば知られておらず、経路が知られている場合でさえ、その経路が、相互作用して生物学的最終効果を生み出す方法はほぼ知られていない。
【００１３】
［発明の概要］
本出願人は、当該分野で公知の組成物と比較したとき、改善された活性を有する真菌症（ｍｙｃｏｓｉｓ）の治療のための医薬組成物を提供するという問題に直面した。
本出願人は、ベンジダミンが、イミダゾールから誘導された抗真菌活性成分と一緒に使用され得ることを見出した。
特に、本出願人は、ここに、驚くべきことに、イミダゾールから誘導される抗真菌活性成分とベンジダミンの組み合わせが、カンジダ属に属する真菌類（ｆｕｎｇｉ）の増殖の阻害において相乗効果を有することを見出した。
【００１４】
したがって、第１の態様において、本発明は、カンジダ真菌症の治療に用いるための、ベンジダミンとイミダゾール−抗真菌剤またはその塩との組み合わせ、および、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物に関する。
【００１５】
好適には、本発明による組成物中のベンジダミンは、外陰膣の痒みおよび痛みを軽減する。
【００１６】
好ましくは、前記イミダゾール−抗真菌剤は、ビフォナゾール、ブトコナゾール、クロルミダゾール、クロトリマゾール、クロコナゾール、エコナゾール、フェンチコナゾール、ケトコナゾール、イソコナゾール、ミコナゾール、ネチコナゾール、オモコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール、チオコナゾールまたはその塩を含む群から選択される。
【００１７】
より好ましくは、前記イミダゾール−抗真菌剤は、ビフォナゾール、ブトコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、フェンチコナゾール、ケトコナゾール、イソコナゾール、ミコナゾール、オモコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール、チオコナゾールまたはそれらの塩を含む群において選択される。
【００１８】
さらにより好ましくは、上記イミダゾール−抗真菌剤は、ブトコナゾール、エコナゾール、フェンチコナゾール、イソコナゾール、ミコナゾール、スルコナゾールまたはそれらの塩を含む群において選択される。
【００１９】
好ましくは、前記イミダゾール−抗真菌剤は、エコナゾール、ミコナゾールまたはその塩である。
【００２０】
好ましくは、カンジダ真菌症（ｍｙｃｏｓｉｓ）は、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  Ａｌｂｉｃａｎｓ）、レアカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  Ｒｕｇｏｓａ）、カンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、またはカンジタ・デュブリニエンシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ）によって引き起こされる。
より好ましくは、当該カンジダ真菌症（ｍｙｃｏｓｉｓ）は、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  Ａｌｂｉｃａｎｓ）、レアカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）または，カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）によって引き起こされる。
【００２１】
より好ましくは、当該カンジダ真菌は、粘膜カンジダ症、皮膚カンジダ症、爪甲真菌症（ｍｙｃｏｓｉｓ）、全身性カンジダ症、医原性カンジダ症、おむつカンジダ症、腸カンジダ症またはカンジダ亀頭炎である。
【００２２】
さらにより好ましくは、前記粘膜カンジダ症は、口腔または外陰膣である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、１％〜０．０３％ｗ／ｖのクリームを用いた寒天希釈法による、カンジダ・アルビカンス株  ＡＴＣＣ１０２３１を含有するプレート上で試験した、実施例７のクリームＡ〜Ｃの活性の結果を視覚的に示す。
【図２】図２は、図１のプレート上で行われた濃度測定（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｉｃ）分析の結果をグラフで示す。
【００２４】
［発明の詳細な説明］
本明細書において、表現「相乗効果」は、ベンジダミンとイミダゾール−抗真菌剤の組み合わせが、カンジダ属に属する真菌類（ｆｕｎｇｉ）の株の増殖を、同一の株に対して単独で使用され、同じ阻害を得る、ベンジダミンと抗真菌性イミダゾールの濃度の合計よりも低い濃度で阻害することを意味する。換言すれば、相乗効果は、ベンジダミンとイミダゾール−抗真菌剤との組み合わせが、同じ株における各成分の相加効果以上を生成することに効果的であることを意味する。
【００２５】
相乗作用は、Ｍｅｌｅｔｉａｄｉｓ  Ｊら「抗真菌薬と化学療法」、２０１０年２月、６０２−６０９頁に記載されているように、各組み合わせで使用される個々の薬物のＦＩＣ（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）の合計である、ＦＩＣインデックスに関して、本明細書で定義される。厳密な科学的および好ましい定義においては、相乗効果は、０．５未満のＦＩＣインデックスによって定義される。すなわち、個々に使用された場合（すなわち、各薬物の最小阻止濃度（ＭＩＣ））、同じ効果を引き出すために必要とされる各薬物の濃度の４分の１以下の組み合わせから、５０％阻害が生じる場合である。
この厳密な定義の下、０．５のＦＩＣインデックスは、相加的応答を定義する。本明細書中の目的のために使用される、より広い定義の下で、相乗的に有効な量は、１．０未満のＦＩＣインデックス、すなわち、各薬物のＭＩＣの半分以下の組み合わせから、５０％阻害が生じる場合、によって定義される。
この、より広い定義の下で、１．０のＦＩＣインデックスは、相加的応答を定義する。この試験の下で、それぞれの株における、ベンジダミンおよび抗真菌−イミダゾールの種々の組み合わせについての用量応答曲線から、ベンジダミンについてのＦＩＣインデックスが１である線、と抗真菌性−イミダゾールについてのＦＩＣインデックスが１である線の下にある点によって示される相乗効果を有する、アイソボログラムを調製することができる。この規格は、相乗的混合物を達成するのに必要な、各成分のＭＩＣを提供するために、当業者が試験された組み合わせについてのＭＩＣを決定することを可能にする。正確な量は、例えば特定の株に依存する。
【００２６】
本明細書および以下の特許請求の範囲において、表現「イミダゾール−抗真菌薬」は、その化学構造中にイミダゾール環を含む抗真菌活性成分を示す。
【００２７】
好ましくは、本発明による医薬組成物は、０．００１重量％〜１重量％、より好ましくは０．０５重量％〜０．５重量％、さらにより好ましくは０．０８重量％〜０．２重量％の量でベンジダミンを含有する。
【００２８】
好ましくは、本発明による医薬組成物は、イミダゾール−抗真菌剤またはその塩を、０．０１重量％〜４重量％、より好ましくは０．１重量％〜２重量％、さらにより好ましくは０．５重量％〜１．５重量％の量で含む。
【００２９】
好ましくは、本発明による医薬組成物は、局所使用のためのものである。
【００３０】
好ましくは、本発明による医薬組成物は、クリーム、軟膏、ローション、ゲル、泡、オビュール（ｏｖｕｌｅｓ）、持続放出オビュール（ｏｖｕｌｅｓ）、腟灌注（ｖａｇｉｎａｌ  ｄｏｕｃｈｅｓ）又は外用溶液のような適切な剤形で調製される。
【００３１】
より好ましくは、前記剤形は、クリーム、軟膏、ローション、膣灌注（ｖａｇｉｎａｌ  ｄｏｕｃｈｅｓ）または外部使用のための溶液である。
【００３２】
さらにより好ましくは、前記剤形は、クリームまたは膣灌注（ｖａｇｉｎａｌ  ｄｏｕｃｈｅｓ）である。
【００３３】
薬学的に許容される賦形剤は、皮膚軟化剤、増粘剤、防腐剤、安定剤、界面活性剤、緩衝剤、浸透圧を調節するための塩、乳化剤などを含む群から選択することができる。
【００３４】
好ましくは、本発明の医薬組成物は、６〜９の範囲のＨＬＢを有する１つ以上の乳化剤と、９を超え〜１２のＨＬＢの範囲を有する１つ以上の乳化剤とを含む。
【００３５】
本発明に有用な、６〜９の範囲のＨＬＢを有する乳化剤としては、たとえば、セテアリル  アルコール、セテアレス−２０（ｃｅｔｅａｒｅｔｈ−２０）、ポリグリセリル−３−ジイソステアレート（ｐｏｌｙｇｌｙｃｅｒｙｌ−３−ｄｉｉｓｏｓｔｅａｒａｔｅ）、ソルビタンステアレート（ｓｏｒｂｉｔａｎ  ｓｔｅａｒａｔｅ）とスクロースソコエート（ｓｕｃｒｏｓｅ  ｓｏｃｏａｔｅ）の混合物、ＰＥＧ−４  ジラウレート（ＰＥＧ−４  ｄｉｌａｕｒａｔｅ）、メチルグルコースセスキステアレート（ｍｅｔｈｙｌ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｓｅｓｑｕｉｓｔｅａｒａｔｅ）、ラウレス−２（ｌａｕｒｅｔｈ−２）、ラウレス−３（ｌａｕｒｅｔｈ−３）、ＰＥＧ−８  ジオレエート（ＰＥＧ−８  ｄｉｏｌｅａｔｅ）、ポリグリセリル−５−ジオレエート（ｐｏｌｙｇｌｙｃｅｒｙｌ−５−ｄｉｏｌｅａｔｅ）、ステアロイルラクチレートナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｓｔｅａｒｏｙｌ  ｌａｃｔｙｌａｔｅ）、ソルビタンラウレート（ｓｏｒｂｉｔａｎ  ｌａｕｒａｔｅ）、ラウロイルマクロゴール−６グリセリド（ｌａｕｒｏｙｌ  ｍａｃｒｏｇｏｌ−６  ｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ）、ＰＥＧ−４０ソルビタンパーオレエート（ＰＥＧ−４０  ｓｏｒｂｉｔａｎ  ｐｅｒｏｌｅａｔｅ）、ポリグリセリル−３  ステアレート（ｐｏｌｙｇｌｙｃｅｒｙｌ−３  ｓｔｅａｒａｔｅ）、ポリグリセリル−２ラウレート（ｐｏｌｙｇｌｙｃｅｒｙｌ−２  ｌａｕｒａｔｅ）である。
【００３６】
本発明に有用な、９を超えて１２までのＨＬＢの範囲を有する乳化剤としては、たとえば、ラウレス−４（ｌａｕｒｅｔｈ−４）、ＰＥＧ−７  グリセリル  ココエート（ＰＥＧ−７  ｇｌｙｃｅｒｙｌ  ｃｏｃｏａｔｅ）、ＰＥＧ−２０  アーモンド  グリセリド（ＰＥＧ−２０  ａｌｍｏｎｄ  ｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ）、ポリグリセリル−３  パルミテート（ｐｏｌｙｇｌｙｃｅｒｙｌ−３  ｐａｌｍｉｔａｔｅ）、ＰＥＧ−２５硬化ヒマシ油（ＰＥＧ−２５  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ  ｃａｓｔｏｒ  ｏｉｌ）、ステアリン酸アミド（ｓｔｅａｒａｍｉｄｅ）、ステアリン酸  グリセリル（ｇｌｙｃｅｒｙｌ  ｓｔｅａｒａｔｅ）とステアリン酸ＰＥＧ−１００の混合物（ＰＥＧ−１００  ｓｔｅａｒａｔｅ）、ポリソルベート８５（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８５）、ＰＥＧ−７  オリベート（ＰＥＧ−７  ｏｌｉｖａｔｅ）、セテアリル  グルコシド（ｃｅｔｅａｒｙｌ  ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）、セテアリル  オリベート（ｃｅｔｅａｒｙｌ  ｏｌｉｖａｔｅ）、モノステアリン酸グリセリル（ｇｌｙｃｅｒｙｌ  ｍｏｎｏｓｔｅａｒａｔｅ）、ジイソステアリン酸ポリグリセリル−１０（ｐｏｌｙｇｌｙｃｅｒｙｌ−１０  ｄｉｉｓｏｓｔｅａｒａｔｅ）、ポリソルベート８５（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８５）、オレイン酸ポリグリセリル−５（ｐｏｌｙｇｌｙｃｅｒｙｌ−５  ｏｌｅａｔｅ）、オレイン酸ＰＥＧ−８（ＰＥＧ−８  ｏｌｅａｔｅ）、クエン酸ステアリン酸グリセリル（ｇｌｙｃｅｒｙｌ  ｓｔｅａｒａｔｅ  ｃｉｔｒａｔｅ）、ＰＥＧ−７  グリセリル  ココエート（ＰＥＧ−７  ｇｌｙｃｅｒｙｌ  ｃｏｃｏａｔｅ）、ポリグリセリル−３  メチルグルコース  ジステアレート（ｐｏｌｙｇｌｙｃｅｒｙｌ−３  ｍｅｔｈｙｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｉｓｔｅａｒａｔｅ）である。
【００３７】
ＨＬＢが９より高く１２以下の特に好ましい乳化剤は、ＰＥＧ−６およびＰＥＧ−３２パルミトステアレートおよびステアリン酸グリコールの混合物である、テフォース（Ｔｅｆｏｓｅ）６３、およびグリセロールモノステアレートおよびＰＥＧ−７５ステアレートの混合物である、ゲロット（Ｇｅｌｏｔ）６４であり、両者とも、Ｇａｔｔｅｆｏｓｓ  ＳＡＳ、フランスで製造されている。
【００３８】
６〜９の範囲のＨＬＢを有する特に好ましい乳化剤は、ラウロイルマクロゴール−６グリセリドの混合物である、Ｌａｂｒａｆｉｌ  Ｍ２１３０ＣＳと、オレオイルポリオキシル−６グリセリドの混合物である、Ｌａｂｒａｆｉｌ  Ｍ１９４４ＣＳであり、両者とも、フランスのＧａｔｔｅｆｏｓｓeＳＡＳによって製造されている。
【００３９】
以下の実施例は、本発明をさらに例示するためのものであるが、本発明を限定するものではない。
【００４０】
実施例
【００４１】
実施例１〜５に開示された試験の目的は、ベンジダミンとミダゾール−抗真菌の組み合わせの、カンジダ属に属する真菌類（ｆｕｎｇｉ）の株に対する、インビトロの殺菌活性を、評価することであった。
【００４２】
実施例１
【００４３】
１．１  真菌株の調製
【００４４】
−８０℃で保存したカンジダ株を解凍し、ＳＤＡプレート上に画線（ｓｔｒｅａｋｅｄ）し、そして、次いで、第２継代培養（ｓｅｃｏｎｄ  ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ）を行った。次いで、カンジダ株の懸濁液を、以下のように調製した。
【００４５】
１０ミリリットルの生理食塩水を、５０ミリリットルのファルコンチューブに、５ｇのガラスビーズと共に入れた。第２の継代培養のコロニーの細胞の輪の多いところ（Ｌｏｏｐｆｕｌ）を、生理食塩水に移し、ループを、チューブの濡れた壁にこすることによって懸濁し、細胞を除去した（ｄｉｓｌｏｄｇｅ）。次いで、チューブを、メカニカルシェーカーを使用して３分間にわたって振盪した。
【００４６】
懸濁液中の細胞の数は、マクファーランド濁度標準液（ＭｃＦａｒｌａｎｄ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ）０．５番規格に従って、５５０ｎｍで、光学密度を読み取って、生理食塩水を用いて、１．５×１０６から５．０×１０６のコロニー形成単位（ＣＦＵ）／ミリリットルに調整した。
【００４７】
計数のために、連続した１：１０の希釈液は、懸濁液の１０−４および１０−５の希釈液を得るために、生理食塩水を用いて調製された。各希釈液１００マイクロリットルのサンプルをプレートに広げ、そして、３７℃で、４８時間、インキュベートした。目視検査により、コロニーの数を数え、そして、細胞密度が、所望の範囲内にあることを確認した。
【００４８】
１．２  寒天希釈法
【００４９】
方法論は、Ｒ・ムーディーら「がん患者から回収された、カンジダ属およびトルロプシス‐グラブラタ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ  ｇｌａｂｒａｔａ）に対する、ミコナゾール、硝酸ミコナゾールおよびケトコナゾール単独、およびリファンピンとの組み合わせのインビトロ活性」、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ：１９８０，１７，８７１−８７５に開示されたものと同様である。
【００５０】
１．２．１   活性成分の溶液の調製
【００５１】
標準ペトリ皿（直径９２ｍｍ×高さ１６ｍｍ）を使用した。寒天を注いだ後、プレートを放冷し、直ちに使用した。
【００５２】
（Ａ）活性成分のＭＩＣを計算するために使用された溶液は、以下に記載するように調製した。
【００５３】
硝酸エコナゾールおよび硝酸ミコナゾールを、１００％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に、それぞれ、溶解して、濃度を、５．０ミリグラム／ミリリットルの活性薬物にした。次いで、連続、１：２希釈液を、ＤＭＳＯで調製し、５．０ミリグラム／ミリリットル〜０．０７８ミリグラム／ミリリットルの濃度に調製した。硝酸エコナゾールまたは硝酸ミコナゾール塩の各溶液の０．２５０ミリリットルを、溶融したＳａｂｏｕｒａｕｄ寒天（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅｓ社、デトロイト、ミシガン）の２４．７５ミリリットル（１：１００希釈）に添加し、混合し、そして、標準ペトリ皿に注ぎ、最終濃度を、５０マイクログラム／ミリリットル〜０．７８マイクログラム／ミリリットルにした。
【００５４】
ベンジダミンを水に溶解して、１２．５ミリグラム／ミリリットルの濃度にした。次いで、水で、１２．５ミリグラム／ミリリットル〜１．５６ミリグラム／ミリリットルの濃度までの、連続１：２希釈物を調製した。ベンジダミンの各溶液１ミリリットルを、２４ミリリットル（１：２５希釈）の溶融したＳａｂｏｕｒａｕｄ寒天に添加し、混合し、そして、標準ペトリ皿に注ぎ、最終濃度を０．５ミリグラム／ミリリットル〜０．０６２５ミリグラム／ミリリットルにした。
【００５５】
陽性対照として、１６００マイクログラム／ミリリットルのストック溶液から、アンホテリシンＢを、５０マイクログラム／ミリリットル〜６．２５マイクログラム／ミリリットルの濃度を有する溶液に、ＤＭＳＯで希釈した。これらの溶液を、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ寒天で、１：１００に希釈し、混合し、そして、０．５マイクログラム／ミリリットル〜０．０６２５マイクログラム／ミリリットルの最終濃度になるように、標準ペトリ皿に注いだ。
【００５６】
水、ＤＭＳＯおよび水＋ＤＭＳＯの陰性対照を、実験に含めた。
【００５７】
（Ｂ）相乗作用の研究のために、濃度２．５ミリグラム／ミリリットル〜０．０９８ミリグラム／ミリリットルの硝酸エコナゾールおよび硝酸ミコナゾールのさらなる溶液を、パラグラフ１．２．１（Ａ）に開示されるように、連続１：２希釈で、ＤＭＳＯを用いて調製した。
【００５８】
また、６．２５ミリグラム／ミリリットル〜１．５６ミリグラム／ミリリットルの濃度を有するベンジダミンのさらなる溶液を、パラグラフ１．２．１（Ａ）に開示されているように、連続１：２希釈で、水を用いて調製した。さらに、６．２５ミリグラム／ミリリットルの濃度を有するベンジダミンの溶液を、水で、１：１．４３に希釈して、４．３７ミリグラム／ミリリットルの濃度を有するベンジダミンの溶液を得た。
【００５９】
次いで、硝酸エコナゾールまたは硝酸ミコナゾールの各溶液０．２５０ミリリットルおよびベンジダミンの各溶液１ミリリットルを、溶融したＳａｂｏｕｒａｕｄ寒天（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅｓ社、デトロイト、ミシガン）の２３．７５０ミリリットルに添加し、混合し、そして、標準ペトリ皿に注いだ。こうして、最終濃度が、２５マイクログラム／ミリリットル〜０．０９８マイクログラム／ミリリットルである、エコナゾールまたはミコナゾールと、最終濃度が、０．２５ミリグラム／ミリリットル〜０．０６２５ミリグラム／ミリリットルおよび０．１７５ミリグラム／ミリリットルであるベンジダミンが得られた。
【００６０】
１．２．２  感受性試験
【００６１】
（Ａ）ＭＩＣの計算のために、
パラグラフ１．２．１（Ａ）に記載のように調製した、各標準ペトリ皿の表面は、パラグラフ１．１に記載のように、カンジダ株の懸濁液の４つのスポット（２０マイクロリットルの接種体積）で接種された。
【００６２】
アンフォテリシンＢで、標準ペトリ皿に接種された試験懸濁液は、陽性対照として使用された。
【００６３】
薬物を含まず、水、ＤＭＳＯおよび水＋ＤＭＳＯを含む標準ペトリ皿に接種した試験懸濁液を陰性対照として用いた。
【００６４】
すべてのペトリ皿を、３５℃で、４８時間、インキュベートした。
【００６５】
（Ｂ）相乗効果の研究のためには、パラグラフ１．２．１（Ｂ）に記載のように調製された各ペトリ皿の表面は、パラグラフ１．１に記載のように調製した、カンジダ株の懸濁液の４つのスポット（２０マイクロリットルの接種体積）で接種され、そして、３５℃で、４８時間、インキュベートした。
【００６６】
１．３  ブロス希釈法
【００６７】
ブロス希釈法に使用される方法論は、「ＥＵＣＡＳＴ  デフィニティブ文献  ＥＤｅｆ  ７．１：「発酵酵母のための、抗真菌剤の、ブロス希釈ＭＩＣｓを決定するための方法」（Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｎｆｅｃｔ  ２００８年；１４：３９８から４０８頁）
【００６８】
に開示されているものと類似する。
【００６９】
１．３．１  活性成分の溶液の調製  
【００７０】
（Ａ）活性成分のＭＩＣを計算するために使用された溶液は、以下に記載するように調製した。
【００７１】
硝酸エコナゾールおよび硝酸ミコナゾールを、それぞれ、１００ミリグラムのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して、１０．０ミリグラム／ミリリットルの活性薬物濃度にした。次いで、連続１：２希釈物を、ＤＭＳＯで、１０．０ミリグラム／ミリリットル〜０．０７８ミリグラム／ミリリットルの濃度に調製した。これらの溶液は、２％グルコース、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（シグマ社のＭＯＰＳ）を含み、ＮａＨＣＯ３を含まない、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＧＩＢＣＯ(R)）を用いて、さらに、１：１００に希釈し、１００マイクログラム／ミリリットル〜０．７８マイクログラム／ミリリットルの最終濃度にした。
【００７２】
硝酸クロトリマゾールを、１００％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して、１．２５０ミリグラム／ミリリットルの活性薬物濃度にした。次いで、連続１：２希釈物を、ＤＭＳＯで、１．２５０ミリグラム／ミリリットル〜０．０１９６ミリグラム／ミリリットルの濃度に調製した。
これらの溶液は、２％グルコース、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（シグマ社のＭＯＰＳ）を含み、ＮａＨＣＯ３を含まない、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＧＩＢＣＯ(R)）で、さらに、１：１００に希釈し、１２．５０マイクログラム／ミリリットル〜０．１９６マイクログラム／ミリリットルの最終濃度にした。
【００７３】
硝酸フルコナゾールを、１００％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、５．０ミリグラム／ミリリットルの活性薬物の濃度にした。次いで、連続１：２希釈物を、ＤＭＳＯで、調製し、５．０ミリグラム／ミリリットル〜０．３１２５ミリグラム／ミリリットルの濃度に調製した。
これらの溶液は、２％グルコース、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（シグマ社のＭＯＰＳ）を含み、ＮａＨＣＯ３を含まない、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＧＩＢＣＯ(R)）で、さらに、１：１００に希釈し、５０マイクログラム／ミリリットル〜３．１２５マイクログラム／ミリリットルの最終濃度にした。
【００７４】
ベンジダミンを、２５ミリグラム／ミリリットルの濃度に、水に溶解した。次いで、連続１：２希釈物を、２５ミリグラム／ミリリットル〜３．１２５ミリグラム／ミリリットルの濃度に、水で調製した。各溶液１ミリリットルを、２％グルコース、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（シグマ社のＭＯＰＳ）を含み、ＮａＨＣＯ３を含まない、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＧＩＢＣＯ(R)）の２４ミリリットル（１：２５希釈）に添加し、１ミリグラム／ミリリットル〜０．１２５ミリグラム／ミリリットルの最終濃度にした。
【００７５】
陽性対照として、１６００マイクログラム／ミリリットルのストック溶液から、アンフォテリシンＢを、２００マイクログラム／ミリリットル〜５０マイクログラム／ミリリットルの濃度を有する溶液に、ＤＭＳＯで希釈した。
これらの溶液を、２％グルコース、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（シグマ社のＭＯＰＳ）を含み、ＮａＨＣＯ３を含まない、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＧＩＢＣＯ(R)）で、１：１００に希釈し、２マイクログラム／ミリリットル〜０．５マイクログラム／ミリリットルの濃度にした。
【００７６】
水、ＤＭＳＯおよび水＋ＤＭＳＯの陰性対照を、実験に含めた。
【００７７】
（Ｂ）相乗効果の研究のために、パラグラフ１．３．１（Ａ）に記載されているように、１００マイクログラム／ミリリットル〜０．０４９マイクログラム／ミリリットルの濃度を有する、硝酸エコナゾール、硝酸ミコナゾール、硝酸クロトリマゾールおよび硝酸フルコナゾールのさらなる溶液を、ＲＰＭＩ−１６４０で調製した。
【００７８】
また、１ミリグラム／ミリリットル〜０．２５ミリグラム／ミリリットルの濃度を有するベンジダミンのさらなる溶液を、パラグラフ１．３．１（Ａ）に開示されるように、ＲＰＭＩ−１６４０で、調製した。さらに、１ミリグラム／ミリリットルの濃度を有するベンジダミンの溶液を、０．７ミリグラム／ミリリットルの濃度になるように、ＲＰＭＩ−１６４０でさらに１：１．４３に希釈した。
【００７９】
１．３．２  感受性試験
【００８０】
約３００マイクロリットル／ウェルの公称容量を有するウェルを含む、微量希釈プレートを使用した。
【００８１】
パラグラフ１．１に記載のように、調製したカンジダ株の懸濁液を、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ’ｓ寒天培地ＳＤＡ（Ｏｘｏｉｄ社）上で増殖させた。コロニーを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈し、そして、懸濁液を、マクファーランド比濁法０．５標準（Ｍｃ  Ｆａｒｌａｎｄ  ０．５  ｓｔａｎｄａｒｄ）を使用して、５５０ｎｍで光学密度を読み取りながら、約１−５×１０５  ＣＦＵ／ミリリットルに調整した。
【００８２】
標準接種材料は、マクファーランド比濁法０．５標準（０．５  Ｍｃ  Ｆａｒｌａｎｄ  ｓｔａｎｄａｒｄ）（約１〜５×１０５  ＣＦＵ／ミリリットル）と同様の光学密度を達成するように、カンジダ株の第２の継体培養から、単一コロニーを懸濁することによって調製した。
【００８３】
（Ａ）ＭＩＣの計算のために、
パラグラフ１．３．１（Ａ）に記載したようにして得られた活性成分の各溶液１００マイクロリットルを、各ウェルに、含む微量希釈プレートを調製した。次いで、ウェルは、１−５×１０５  ＣＦＵ／ミリリットルを含む、上記に開示されるように得られたカンジダ株の懸濁液１００マイクロリットルで、接種された。
【００８４】
各ウェルにおいて、最終接種密度及び活性成分の最終濃度は、使用したものの半分であった（すなわち、最終接種密度は、０．５〜２．５×１０５  ＣＦＵ／ミリリットルであり、エコナゾール及びミコナゾールの濃度は、５０マイクログラム／ミリリットル〜０．３９マイクログラム／ミリリットルであり、クロトリマゾールの濃度は、６．２５マイクログラム／ミリリットル〜０．０９８マイクログラム／ミリリットルであり、フルコナゾールの濃度は、５０マイクログラム／ミリリットル〜３．１２５マイクログラム／ミリリットル、および、ベンジダミンの濃度は０．５ミリグラム／ミリリットル〜０．０６２５ミリグラム／ミリリットル）であった。
【００８５】
同一のカンジダ懸濁液１００マイクロリットルで接種したアムホテリシンＢの１００マイクロリットルを含むウェルを、陽性対照として使用された。
【００８６】
水、ＤＭＳＯ及び水＋ＤＭＳＯの１００マイクロリットルと、同一のカンジダ懸濁液１００マイクロリットルを接種した無菌の薬剤フリー培地を含むウェルは、陰性対照として使用された。
【００８７】
微量希釈プレートを、３５℃で、４８時間、インキュベートした。
【００８８】
（Ｂ）相乗作用の研究のために、各ウェルに、５０マイクロリットルのエコナゾールおよびミコナゾールの各溶液５０マイクロリットルおよび１．３．１（Ｂ）パラグラフで開示したように得られたベンジダミンの各溶液５０マイクロリットルを含む、微量希釈プレートを調製した。次いで、ウェルを、１〜５×１０５ＣＦＵ／ミリリットルのカンジダ懸濁液１００マイクロリットルを接種した。各ウェルおいて、最終接種密度は、使用されたものの半分であった（すなわち、０．５〜２．５×１０５  ＣＦＵ／ミリリットル）および活性成分の最終濃度は、使用したものの四分の一であった（すなわち、エコナゾール及びミコナゾールの濃度は、２５マイクログラム／ミリリットル〜０．０９８マイクログラム／ミリリットル、クロトリマゾールの濃度は、０．７８マイクログラム／ミリリットル〜０．０４９マイクログラム／ミリリットル、フルコナゾールの濃度は２５マイクログラム／ミリリットル〜３．１２５マイクログラム／ミリリットル、および、ベンジダミンの濃度は、０．２５ミリグラム／ミリリットル〜０．０６２５ミリグラム／ミリリットルおよび０．１７５ミリグラム／ミリリットル）。
【００８９】
微量希釈プレートを、３５℃で，４８時間，インキュベートした。
【００９０】
１．４  ＭＩＣの計算
【００９１】
特定のカンジタ株の増殖の完全な阻害を生じた薬物の最低濃度は、当該株についての最小阻止濃度（ＭＩＣ）とみなした。
【００９２】
Ｃ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ  ＡＴＣＣ(R)３４４４９のＭＩＣ値は、パラグラフ１．２に開示された寒天希釈法を用いて得た。
【００９３】
Ｃ．アルビカンス  ＡＴＣＣ(R)ＭＹＡ−４２７、Ｃ．トロピカリス  ＡＴＣＣ(R)７５０、Ｃ．アルビカンス  ＡＴＣＣ(R)１０２３１およびＣ．アルビカンス  ＡＴＣＣ(R)ＭＹＡ−５７４フルコナゾール耐性、に対するＭＩＣ値は、パラグラフ１．３に開示されたブロス希釈法（ｂｒｏｔｈ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いて得た。
【００９４】
試験したカンジダ株に対する、硝酸エコナゾール、硝酸ミコナゾール、硝酸クロトリマゾール、硝酸フルコナゾール及びベンジダミンのＭＩＣ値は、以下の表１に開示される。
【００９５】
【表１】
0006714597.tif 000002
【００９６】
１．５  相乗効果
【００９７】
ベンジダミンと硝酸エコナゾールの組合せの殺真菌活性は、パラグラフ１．２に開示された寒天希釈法で、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ寒天培地で、Ｃ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ  ＡＴＣＣ(R)３４４４９に対して評価した。
【００９８】
ベンジダミンおよび硝酸エコナゾールを含む組み合わせの相乗効果は、Ｍｅｌｅｔｉａｄｉｓ  Ｊ．ら「抗菌薬と化学療法、２０１０年２月、６０２−６０９頁」に従って、ＦＩＣ（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）値を計算することによって評価した。
【００９９】
ＦＩＣ値は、ベンジダミンと硝酸エコナゾールを含む組合せの抗真菌活性を、単独で試験した各有効成分の抗真菌活性と比較した。
【０１００】
ベンジダミンと硝酸エコナゾール（ＦＩＣ［組合せｂ＋ｅ］）を含む組合せに対するＦＩＣ値を、以下の式を用いて各カンジタ株に対して計算した。
【０１０１】
ＦＩＣ［組合せｂ＋e］＝ＦＩＣ［b］＋ＦＩＣ［e］
【０１０２】
ここで、
ＦＩＣ［b］は、特定のカンジタ株に対するベンジダミンのＦＩＣであり、エコナゾールの最少抗菌濃度（ｓｕｂ−ＭＩＣ）量（ＭＩＣ（ｂ＋e））の存在下の、ベンジダミンのＭＩＣ値とベンジダミンの単独のＭＩＣ値（ＭＩＣ（ｂ））の比として、次のように計算される。
【０１０３】
ＦＩＣ（ｂ）＝ＭＩＣ（ｂ＋e）／ＭＩＣ（ｂ）
【０１０４】
ＦＩＣ［e］は、
特定のカンジタ株に対する、エコナゾールのＦＩＣであり、ベンジダミンの最少抗菌濃度（ｓｕｂ−ＭＩＣ）量（ＭＩＣ（e＋ｂ））の存在下の、エコナゾールのＭＩＣ値と、エコナゾールの単独のＭＩＣ値（ＭＩＣ（e））の比として、次のように計算される。
【０１０５】
ＦＩＣ（e）＝＝ＭＩＣ（e＋ｂ）／ＭＩＣ（e）
【０１０６】
Ｍｅｌｅｔｉａｄｉｓ  Ｊ．ら、「抗真菌剤と化学療法（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）」、２月．２０１０年、６０２−６０９頁に従って、ＦＩＣが、０．５より低い場合を、相乗効果と規定した。
【０１０７】
【表２】
0006714597.tif 000003
【０１０８】
ベンジダミンと硝酸エコナゾールとの組み合わせの、ＦＩＣ（ＦＩＣ［組合せｂ＋ｅ］）は、上記の式を用いて計算された。
【０１０９】
ＦＩＣ［ｂ］＝０．１２５／０．５＝０．２５
ＦＩＣ［ｅ］＝０．０９８／１．５６＝０．０６２８
ＦＩＣ［組合せｂ＋ｅ］＝０．０６２８＋０．２５＝０．３１２８
【０１１０】
上記の結果は、活性成分の、ベンジダミンと硝酸エコナゾールが、最少抗菌濃度（ｓｕｂ−ＭＩＣ）濃度で組合された場合、Ｃ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ  ＡＴＣＣ(R)３４４４９に対して、相乗的な殺真菌活性が観察されたことを実証した。
【０１１１】
以下の実施例２〜５は、他のカンジダ株に対して得られた結果を纏める。
【０１１２】
実施例２
【０１１３】
ベンジダミンおよび硝酸エコナゾールまたは硝酸ミコナゾールの殺真菌活性を、パラグラフ１．３に開示された、ブロス希釈法を用いて、ＲＰＭＩ−１６４０を用いて、Ｃ．アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）  ＡＴＣＣ(R)ＭＹＡ−４２７に対して評価した。
【０１１４】
結果を表３に要約する。
【０１１５】
【表３】
0006714597.tif 000004
【０１１６】
上記のデータは、ベンジダミンとの組み合わせが、表１に示す硝酸エコナゾールのＭＩＣ値を２５マイクログラム／ミリリットルから１．５６マイクログラム／ミリリットルに、そして、硝酸ミコナゾールのＭＩＣ値を、表１に示す２５マイクログラム／ミリリットルから０．７８マイクログラム／ミリリットルに減少させたことを明確に示す。
【０１１７】
実施例３
【０１１８】
ベンジダミンと、硝酸エコナゾール又は硝酸ミコナゾールの殺真菌活性を、パラグラフ１．３に開示されたブロス希釈法により、ＲＰＭＩ−１６４０を使用して、Ｃ．トロピカリス（Ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）  ＡＴＣＣ(R)７５０に対して評価した。
【０１１９】
結果を表４に纏める。
【０１２０】
【表４】
0006714597.tif 000005
【０１２１】
上記データは、ベンジダミンとの組み合わせが、表１に示す硝酸エコナゾールのＭＩＣ値を１２．５マイクログラム／ミリリットルから１．５６マイクログラム／ミリリットルに、表１に示す、硝酸ミコナゾールのＭＩＣ値を、６．２５マイクログラム／ミリリットルから０．７８マイクログラム／ミリリットルに減少させたことを明らかに示す。
【０１２２】
実施例３ａ
【０１２３】
ベンジダミンおよび、硝酸クロトリマゾール又は硝酸フルコナゾールの殺真菌活性は、パラグラフ１．３に開示されたブロス希釈法により、ＲＰＭＩ−１６４０を用いて、Ｃ．トロピカリス  ＡＴＣＣ(R)７５０に対して評価した。
【０１２４】
結果を表４ａに纏める。
【０１２５】
【表４ａ】
0006714597.tif 000006
【０１２６】
上記のデータは、ベンジダミンとの組み合わせが、表１に示す硝酸クロトリマゾールのＭＩＣ値を、６．２５マイクログラム／ミリリットルから０．０９８マイクログラム／ミリリットルに、そして、表１に示す５０マイクログラム／ミリリットルの硝酸フルコナゾールのＭＩＣ値を、６．２５マイクログラム／ミリリットルに減少させたことを明確に示す。
【０１２７】
ベンジダミンおよび硝酸クロトリマゾールの組み合わせのＦＩＣ（ＦＩＣ［組合せｂ＋ｃ］）は、上記の式で計算すると、０．３７の結果であった。
【０１２８】
ベンジダミンおよび硝酸フルコナゾールの組み合わせのＦＩＣ（ＦＩＣ［組合せｂ＋ｆ］）は、上記の式で計算すると、０．４８の結果であった。
【０１２９】
実施例４
【０１３０】
ベンジダミンおよび、硝酸エコナゾールまたは硝酸ミコナゾールの殺真菌活性は、パラグラフ１．３に開示されたブロス希釈法により、ＲＰＭＩ−１６４０を用いて、カンジダ・アルビカンス  ＡＴＣＣ(R)１０２３１に対して評価した。
【０１３１】
結果を表５に纏める。
【０１３２】
【表５】
0006714597.tif 000007
【０１３３】
上記のデータは、ベンジダミンとの組み合わせが、表１に示される、硝酸エコナゾールのＭＩＣ値を、２５マイクログラム／ミリリットルから３．１２５マイクログラム／ミリリットルに、および、表１に示す、６．２５マイクログラム／ミリリットルの硝酸ミコナゾールのＭＩＣ値を１．５６マイクログラム／ミリリットルに減少させたことを明確に示す。
【０１３４】
実施例５
【０１３５】
ベンジダミンおよび硝酸エコナゾールまたは硝酸ミコナゾールの殺真菌活性は、パラグラフ１．３に開示されたブロス希釈法により、ＲＰＭＩ−１６４０を用いて、フルコナゾール耐性カンジダ・アルビカンス  ＡＴＣＣ(R)ＭＹＡ−５７４に対して評価した。
【０１３６】
結果を表６に纏めた。
【０１３７】
【表６】
0006714597.tif 000008
【０１３８】
上記のデータは、ベンジダミンとの組み合わせが、表１に示される硝酸エコナゾールのＭＩＣ値を、２５マイクログラム／ミリリットルから１２．５マイクログラム／ミリリットルに、そして硝酸ミコナゾールのＭＩＣ値を、表１に示す５０マイクログラム／ミリリットルから１２．５マイクログラム／ミリリットルに減少させたことを明確に示す。
【０１３９】
また、ベンゾジアミンのＭＩＣは、表１に示す０．５ミリグラム／ミリリットルから、エコナゾールと組み合わせて０．１２５ミリグラム／ミリリットル、ミコナゾールと組み合わせて０．０６２５ミリグラム／ミリリットルに減少した。
【０１４０】
実施例６
【０１４１】
以下の表７は、局所適用のためのクリームの形態の、本発明に係る３種類の医薬組成物の製剤を示す。すべての値は、製剤の総含有量に対する重量％として表される。
【０１４２】
【表７】
0006714597.tif 000009
【０１４３】
クリーム製剤のＦ１は、適用から８時間後の活性物質のリリースを評価するための試験を行った。
【０１４４】
フランツ型拡散セル実験は、基質の膜を横断する、ベンジダミン塩酸塩のインビトロ経皮流動速度（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ｆｌｕｘ  ｒａｔｅ）を分析するために使用した。フランツ型拡散セルは、経皮流動速度を測定するための一般的かつ周知の方法である。一般的なフランツセル型の手順は、フランツ、ＴＪ、「経皮吸収：インビトロデータの関連性について」、Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ、Ｄｅｒｍ、６４：１９０−１９５（１９７５）に記載されている。以下は、本実施例で用いた方法であった。
【０１４５】
０．４５μｍの多孔度を有する、再生セルロース膜を使用した。膜は、孔から空気を除去する目的で、使用する前に、ＮａＣｌ、０．９％ｗ／ｖの溶液でコンディショニングした。
【０１４６】
製品と膜との接触面積は、０．６ｃｍ２であった。受容区画（ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）を、３７℃に温度調節した。クリーム調合物１の１グラムを、ドナーコンパートメント（ｄｏｎｏｒ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）中の膜上に塗布した。８時間、１時間ごとに、０．９ｗ／ｖ％の塩化ナトリウムの受信溶液（ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）０．３ミリリットルを回収し、そして、新鮮な溶液と交換した。
【０１４７】
収集されたサンプルは、ＨＰＬＣ法を用いて分析した。
【０１４８】
結果は、時間に対する単位面積当たりに放出される活性成分の累積量として報告された。試験の結果を以下の表８に纏めた。
【０１４９】
【表８】
0006714597.tif 000010
【０１５０】
実施例７
【０１５１】
表７（クリームＡ）のクリームＦ１と同じ成分を含有する、本発明のクリーム製剤の抗カンジダ活性を、１％の硝酸エコナゾールのみを含む市販のクリーム（クリームＢ）であるＰｅｖａｒｙｌ(R)クリーム、及びプラセボ（クリームＣ）の活性と比較して試験した。
【０１５２】
カンジダ・アルビカンス株ＡＴＣＣ  １０２３１は、クリームＡからＣの抗真菌特性を調べ、特に、ベンジダミンの存在が、エコナゾールの殺真菌活性に対する効果を持っていたことを、さらに、確認するために使用された。
【０１５３】
この目的のために、寒天希釈アッセイは、Ａｓｔｅｒｈｏｌｍら（Ａｃｔａ  Ｄｅｒｍ  Ｖｅｎｅｒｅｏｌ  ２０１０；９０：２３９-２４５）に従って、クリーム製剤を試験することができるように設定された。技術的ニーズのために、クリームは、最終的なクリームの濃度が、０．０３％から１％（ｗ／ｖ）の範囲内となるように、寒天で、希釈しなければならなかった。
【０１５４】
図１および２に報告されているように、プレートの目視検査および濃度測定分析は、ベンジダミンの存在が、エコナゾールの殺真菌活性を増加させたことが確認された。実際に、濃度測定分析のデータは、クリームＡの４倍低い濃度は、クリームＢで観察されたものと同様の増殖の減少を得るのに十分であることを示した。
【図１】
0006714597.tif 000011
【図２】
0006714597.tif 000012