(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリイオンコンプレックスを有効成分として含むドライアイ処置用組成物であって、
ポリイオンコンプレックスが式Ｉ
【化１】
0006703408.tif 000007
式中、
Ｌ1は、同一または異なる連結基を表し、
Ｌ2は、独立して、−Ｃ1-6アルキレン−ＮＨ−（Ｃ1-6アルキレン）q−であり、ここでｑは０または１の整数であり、そして
Ｒは、独立して、各Ｒの総数ｍの少なくとも３０％が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
Ｙは、独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキルで置換されていてもよいフェニルチオカルボニル
チオ、Ｃ1-6アルキルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルオキシチオカルボニルチオまたはＳＨからなる群より選ばれ、
ｍは、独立して、３〜１，０００の整数であり、そして
ｎは、５〜５，０００の整数である
で表されるカチオン性トリブロックコポリマーを含み、かつ、
ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（スルホン酸）、ポリアニオン性多糖類からなる群より選ばれる１種またはそれ以上のポリアニオン性ポリマーを含み、
ポリイオンコンプレックスを水性媒体中に溶解または分散した場合にミセルを形成する、組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、前記ポリイオンコンプレックスが、さらに、式ＩＩ
【化２】
0006703408.tif 000008
式中、
Ｒは、独立して水素原子、Ｃ1-3アルキル基を表し、
ａは、１〜１２の整数であり、
ｍは、３〜１，０００の整数であり、
ｎは、５〜５，０００の整数である
で表されるカチオン性ボロン酸修飾ジブロックコポリマーを含む、
組成物。
【請求項３】
ポリアニオンがポリ（アクリル酸）またはポリ（メタクリル酸）である、請求項１または２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）を有効成分として含有するドライアイ処置用組成物及びそれらの一構成成分として含めることのできる新規ポリカチオン性ポリマーに関する。特に、ＰＩＣは、ポリカチオンとして、ペンダント基中に含まれる環状ニトロキシドラジカルがアミニレン（ＮＨ基）を介してポリマー主鎖に共有結合した複数の反復単位を含む２つのブロック間に挟まれたポリ（エチレングリコール）ブロックを含むトリブロックコポリマーを必須の成分として含んでなる。
【背景技術】
【０００２】
生体適合性を有する物質を利用した人工涙液やヒアルロン酸の液剤点眼剤がドライアイ治療薬として使用されてきた。しかしながら、組織表面での接着性および滞留性が低く頻回投与が求められることや、現在市販の点眼剤は渇いた眼組織への保水効果に焦点を当てており、十分なドライアイへの治療効果が得られない。さらにはマトリックス自体に高分子等を利用するため、そのマトリックス自身が炎症を引き起こす原因となる等、問題があった。そのため組織表面での高い滞留性を達成し投薬回数を削減し、ドライアイの原因の一つとされる炎症に対して十分な治療効果を示す材料の提供が求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
従来の人工涙液やヒアルロン酸の液剤点眼液剤は、主としてドライアイのコア・メカニズムとして涙液層の安定性の低下を防止することが目標とされているところ、かようなメカニズム全体により好適にマッチし、より効果的なドライアイ処置用剤または組成物に対するニーズは依然として存在する。したがって、本発明はこのようなニーズに答えることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明者らは近年、生体中でポリイオンコンプレックスが必ずしも十分に安定でないことに着目し、ポリアミン−ＰＥＧ−ポリアミンというＡ−Ｂ−Ａ型トリブロックコポリマーとポリアニオンとのＰＩＣが室温下で流動するフラワーミセルを形成するのに対し、このようなＰＩＣは生体環境下で緩み、ゲル化するとともに生体中で局所滞留性を示すこと見出した。さらにポリアミン部分に活性酸素種を消去するニトロキシドラジカルを導入することにより材料それ自体が、炎症を抑制するインテリジェントゲルとなることも見出し、このようなＰＩＣとその使用について提案した（ＷＯ  ２０１３／１１１８０１、ＷＯ  ２０１４／１９９９８２、ＷＯ  ２０１５／１１８９９３参照）。
【０００５】
これらの特許文献では、ＰＩＣゲルを滞留させる生体内局所として、歯周ポケット、癌病巣部、関節炎等、ＰＩＣゲル実験動物の足に皮下注射した場合にはその組織内滞留性が確認されており、また、このようなゲルが生体内で組織または器官どうしの接着を防ぐ物理的バリアーとして機能し、癒着防止効果を発揮することも記載されている。当該文献にいう生体内局所は何れも生成したゲル事態に物理的な外力が実質的にかからない箇所である。仮に、かようなゲルが、多量の水性媒体中で瞬き等の外力が頻繁にかかる眼球表面においても接着、滞留でき、しかも、視力に悪影響を及ぼさないのであるなら、ドライアイ処置用の組成物または製剤の有効成分として使用できるかも知れない。本発明者らはこのような想定の下、各種検討を行ったところ、前記フラワーミセルはｉｎ  ｖｉｖｏの涙液中でゲル化し、眼球表面上に安定に接着滞留できることが確認できた。くわえて、このように接着滞留したゲル中のニトロキシドラジカルが抗酸化ストレス能を発揮することも推認できた。具体的には、ＰＩＣ形成を駆動力とするフラワー型ミセル作成し，これを眼球
組織に投与すると、生体環境下に投与するとゲル化し、組織表面での滞留性が向上した。
【０００６】
さらに、前記ＰＩＣにおいて、ポリカチオン性ポリマー成分として、前記トリブロックコポリマーに加えて、カチオン性ボロン酸修飾ジブロックコポリマーをさらに含めた場合でも前記フラワーミセルの形成に悪影響を及ぼすことなく、安定なミセルが提供でき、ｉｎ  ｖｉｖｏ涙液中でゲル化し、さらに、該ゲルが眼球表面により強く接着滞留し、優れたドライアイ処置効果を発揮することも確認できた。これは、マトリックス表面に存在するフェニルボロン酸と眼表面ムチンとの結合により眼球表面での接着性が向上させたものと推認できる。
【０００７】
したがって、第一の態様の本発明として、次の組成物が提供される。
【０００８】
ポリイオンコンプレックスを有効成分として含むドライアイ処置用組成物であって、
ポリイオンコンプレックスが式Ｉ
【０００９】
【化１】
0006703408.tif 000002
【００１０】
式中、
Ｌ1は、同一または異なる連結基を表し、
Ｌ2は、独立して、−Ｃ1-6アルキレン−ＮＨ−（Ｃ1-6アルキレン）q−であり、ここでｑは０または１の整数であり、そして
Ｒは、独立して、各Ｒの総数ｍの少なくとも３０％が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
Ｙは、独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキルで置換されていてもよいフェニルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルチオカルボニルチオ、Ｃ1-6アルキルオキシチオカルボニルチオまたはＳＨからなる群より選ばれ、
ｍは、独立して、３〜１，０００の整数であり、そして
ｎは、５〜５，０００の整数である
で表されるカチオン性トリブロックコポリマーを含み、かつ、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（スルホン酸）、ポリアニオン性多糖類からなる群より選ばれる１種またはそれ以上のポリアニオン性ポリマーを含み、
ポリイオンコンプレックスを水性媒体中に溶解または分散した場合にミセルを形成する、組成物。
【００１１】
さらに、第二の態様または好適な態様の本発明として、次の組成物が提供される。
【００１２】
第一の態様の本発明組成物であって、前記ポリイオンコンプレックスが、さらに、式ＩＩ
【００１３】
【化２】
0006703408.tif 000003
【００１４】
式中、
Ｒは、独立して水素原子、Ｃ1-3アルキル基を表し、
ａは、１〜１２の整数であり、
ｍは、５〜１，０００の整数であり、
ｎは、３〜５，０００の整数である
で表されるカチオン性ボロン酸修飾ジブロックコポリマーを含む、
組成物。
【００１５】
さらに、該組成物それ自体、上記の特許文献に未載の組成物であり、前記カチオン性ボロン酸修飾ジブロックコポリマーを介してムチン質が存在または発現している生体における器官または細胞に結合することで、当該ＰＩＣが効果的に機能し得るいずれかの症状または障害の処置を必要とする広範な医療分野で使用できる。
【００１６】
また、上記式ＩＩで表されるカチオン性ボロン酸修飾ジブロックコポリマーは、本発明者らの知るところでは、従来技術文献未載である。したがって、第三の態様の本発明として、該ＩＩで表されるカチオン性ボロン酸修飾ジブロックコポリマーそれ自体が提供される。
【００１７】
＜発明の詳細な記述＞
以下、本発明の各構成について、詳述する。
【００１８】
「ドライアイ処置用」とは、ドライアイの防止もしくは予防および治療するための使用を意味し、単に治療のみを意味するものでない。
【００１９】
前述した本発明の作用効果については、理論により本発明の技術的範囲等が限定されるものでないが、次のように理解されている。前記ＰＩＣミセルはゲル化により表面に露出した式Ｉのトリブロックコポリマーのカチオン性ポリマー部分が、アニオン性物質により構成される眼組織と静電相互作用することにより該ゲルが眼球表面に接着することに起因し、特有の作用効果を発揮する。さらに、カチオン性ポリマー成分として式ＩＩのカチオン性ボロン酸修飾ジブロックコポリマーを含有せしめると、フェニルボロン酸部と眼球表面に存在するムチンと結合するので、眼球表面へのゲルのさらなる接着性が向上する。すなわち、本発明にしたがう前記ゲルは、単に涙液中の特定箇所に滞留することのみならず、眼球表面または角膜上皮に接着することにより瞬き等の物理的な外力がかかっても接着した箇所に安定に滞留できる。かような接着の結果、前記ＰＩＣは眼表面上の涙液層に安定に存在できることのみならず、上皮、特に角膜上皮が構成する層にニトロキシドラジカルが作用し、ドライアイの原因となる炎症を抑制できるので、より高い効能を有するドライアイ処置用組成物が提供できる。上記説明に関する概念図を図１に示す。
【００２０】
第一の態様の本発明おける、ＰＩＣそれ自体は、ＷＯ  ２０１５／１１８９９３に開示されたものをそのまま使用できる。したがって、この特許文献の記載内容、具体例として本願発明に整合する記載は、当該文献を引用することにより、本願明細書の内容となるが、以下、さらに説明を加える。
【００２１】
＜ポリカチオン性ポリマー＞
式Ｉで表されるカチオン性トリブロックコポリマーにおけるＬ1は、該トリブロックコポリマーとポリアニオン性ポリマーとのＰＩＣを水性媒体中で溶解または分散した場合にミセルを形成することができるものであれば、如何なる連結基であってもよい。しかし、限定されるものでないが、各Ｌ1は、例えば、独立して、単結合、−Ｓ−（ＣＨ2）c−、−Ｓ−（ＣＨ2）cＣＯ−、−（ＣＨ2）cＳ−、−ＣＯ（ＣＨ2）cＳ−、
【００２２】
【化３】
0006703408.tif 000004
【００２３】
からなる群より選ばれ、ここでｃは１ないし５の整数である、ことができる。本発明に関し、連結基を定義する具体的な基は、特記しないかぎり、式中において、記載した方向性を以って結合するものと理解されている。
【００２４】
式ＩのＹは、好ましくは、Ｈであるか、または−ＳＨ、
【００２５】
【化４】
0006703408.tif 000005
【００２６】
からなる群から選ばれる。
【００２７】
式ＩのＲは、独立して、各Ｒの総数ｍの、一般に少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは約１００％が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であることができる。Ｒ基のニトロキシドラジカルは、好ましくは、次式で表される。
式
【００２８】
【化５】
0006703408.tif 000006
【００２９】
上式中、Ｒ’はメチル基である、
式Ｉにおける、ｍは、独立して、一般に３〜１０００、好ましくは、５〜４００、より好ましくは１０〜１００の整数であり、そして
ｎは、好ましくは、５〜１０００、より好ましくは１０〜２００の整数であることができる。
【００３０】
式ＩＩで表されるカチオン性ボロン酸修飾ジブロックコポリマーにおいて、ホウ酸残基−Ｂ（ＯＨ）2はそれが結合するフェニレンのｏ−、ｍ−およびｐ−位のいずれに結合することもできるが、好ましくはｐ−位に結合し、ａは、一般に１〜１２の整数であるが、好ましくは、１〜６、さらには、１であることができる。ｍは、一般に３〜１，０００の整数であるが、好ましくは１０〜６００、より好ましくは１４〜１００であることができる。ｎは、一般に５〜５，０００であるが、好ましくは１０〜５００、より好ましくは２０〜３００であることができる。カチオン性ボロン酸修飾ジブロックコポリマーは、後述する製造例に準じて、必要により、開始剤として目的とするフェニルボロン酸に相当する開始剤を使用して製造できる。
【００３１】
本発明に関して、Ｃ1-6アルキルまたはそれらを含む基は、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ヘキシル等の分岐もしくは直鎖の低級アルキル基を挙げることができ、Ｃ1-12アルキレンに該当する基は、限定されるものではないが具体的には、メチレン、１，２−プロパンジイル、１，３−プロパンジイル、１，４−ブタンジイル、等の対応するアルキルのジイル基を挙げることができる。
【００３２】
＜ポリアニオン性ポリマー＞
本発明で用いる、ポリアニオン性ポリマーは、水性溶液中で前記式Ｉ表されるトリブロックコポリマーと安定なＰＩＣを形成でき、かつ、安定なできるＰＩＣミセルを形成できるものであれば、理論上、限定されるものでない。しかし、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（スルホン酸）、ポリアニオン性多糖類等からなる群から選ばれる１種またはそれ以上であり、ポリアニオン性多糖について、好ましいものとしては、カルボキシメチルデキストラン、カラギーナン、キサンタンガム、コンドロイチン硫酸、ヒアル酸、ヘパリンからなる群より選ばれるポリアニオン性多糖類を挙げることができる。特に、ポリ（アクリル酸）またはポリ（メタアクリル酸）が好ましい。これらのポリアニオン性ポリマーの分子量は、ポリマーの種類によって最適値が異なり、所期の目的を達成するものであれば限定されるものでない。しかし、ポリアクリル酸の場合、Ｍｎが、１０００〜１００００００、好ましくは、１０００〜１０００００、より好ましくは、１０００〜１００００であり、ポリアニオン性多糖類、例えばコンドロイチン硫酸の場合、ＭｎまたはＭｗが１０００〜１００００００、好ましくは１０００〜１０００００であり、これらは市販のものを、必要に応じて精製して使用することができる。
【００３３】
＜トリブロックコポリマーとポリアニオン性ポリマーの使用の態様＞
カチオン性トリブロックコポリマー（カチオン性ジブロックコポリマーが共存してもよ
い）とポリアニオン性ポリマーは、それらを含む組成物が、一般的な水性溶液または水性媒体（生理的ｐＨに緩衝化されていてもよい、水（純水もしくはイオン交換水））中でそれらの分子が会合してミセルを形成することにより、透明なポリイオンコンプレックスミセルとして存在し得る適当な割合で使用することが望ましい。このようなＰＩＣミセル溶液または分散液は、さらに本発明の目的に沿うためには、水性溶液中のイオン強度、ｐＨ、温度変化、特に、生体内環境下または生理学的条件下への変化により、不可逆的ゲルを形成することのできる割合でポリカチオン性ポリマーとポリアニオン性ポリマートリブロックコポリマーとポリアニオン性ポリマーが含められる。このような変化は、例えば、イオン強度が、イオン濃度０（ゼロ）もしくは数十ｍＭであり、室温から、生体の眼球上の涙液に倣うイオン濃度、例えば１５０ｍＭ及び３７℃付近以上の温度に変化することが挙げられる。
【００３４】
このような割合は、ポリカチオン性ポリマーのアミノ基（アミニレン基（もしくは第二アミン）または第三アミンを包含する）のモル数とポリアニオン性ポリマーのアニオン性基のモル数が１：４〜４：１、好ましくは、１：１〜４：１であり、より好ましくは前者のモル数が後者のモル数を数パーセント超えるものである。このようなＰＩＣから形成されるミセルは、限定されるものでないが、動的光散乱（ＤＬＳ）測定により決定するときに、４０〜１２０ｎｍの平均粒径を有する。
【００３５】
カチオン性トリブロックコポリマーとカチオン性ジブロックコポリマーが併用される場合には、総カチオン性ポリマーの重量当たり１５重量％未満、好ましくは、１３重量％未満、より好ましくは１１重量％未満のカチオン性ジブロックコポリマーを使用できる。
【００３６】
このような組成物中のＰＩＣは、必要により、生理学的に許容され得る希釈剤または賦形剤を含むＰＩＣミセルの水溶液として提供できる。このような希釈剤は、滅菌水、鉱酸を含む酸性水溶液、生理食塩水、生理的に許容される緩衝剤を含む溶液等であることができ、賦形剤は、例えば、ソビトール、デキストリン、ブドウ糖、マンニトール、アミノ酸（例えば、グリシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、グルタミン酸等）等であることができ、また、ＰＩＣミセルは凍結乾燥物として組成物に含めることができる。
【００３７】
本発明では、組成物に含まれるＰＩＣ、特に、そのミセル溶液は、必要により、当該技術分野で公知の滅菌方法、電子線照射等、により滅菌した後、投与する必要のある眼球表面に適宜、投与される。かような投与は、当該技術分野でそれ自体公知の点眼用デバイスを用いて注入可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本発明に従うＰＩＣミセルを含有溶液が点眼剤として作用する際の概念図である。図中、ＳｏｌはＰＩＣミセルが溶解または均質に分散している液（ゾル）を意味し、Ｇｅｌは眼球上皮にＰＩＣミセルがゲル化し接着している状態を表す。
【図２】製造例３で製造された脱保護前ＰＢＡ−ＰＥＧ−ＰＥＡＭＡジブロックコポリマーの1Ｈ  ＮＭＲスペクトルである。
【図３】製造例で製造された脱保護後のＰＢＡ−ＰＥＧ−ＰＥＡＭＡジブロックコポリマーの1Ｈ  ＮＭＲスペクトルである。
【図４】製造例４に基づいて得られるＰＢＡ−ＰＥＧ−ＰＥＡＭＡ含有ＰＩＣミセルの粒度分布（ａ）、平均粒径およびＰＤＩ（  多分散度  ）（ｂ）を表すグラフである。
【図５】製造例５に基づいて得られるＰＢＡ−ＰＥＧ−ＰＥＡＭＡ含有ＰＩＣミセル（ｐＨ＝６．２）のゲル化の様子を表す図に代わる写真である。
【図６】試験１によるＰＢＡ−ＰＥＧ−ＰＥＡＭＡ含有ＰＩＣミセル由来のインジェクタブルゲル（ＲＩＧ）の粘度測定の結果（ａ）およびゲル化温度の測定結果を表すグラフである。
【図７】試験２によるサンプル投与後のＩＶＩＳによる眼表面イメージング画像の写真（ａ）および眼表面滞留性の定量評価の結果を表すグラフである。
【図８】試験３による動物試験の手順の概略図およびサンプル投与群について説明する図である。
【図９】試験３によるドライアイモデルマウスに対するＲＩＧのドライアイ治療効果を表すグラフである。
【図１０】試験４によるＰＢＡ−ＰＥＧ−ＰＥＡＭＡ含有ＰＩＣミセルによるムチン接着評価の結果を表すグラフである。
【実施例】
【００３９】
以下に、具体例を挙げ、さらに本発明を具体的に説明するが、これらの具体例に本発明を限定することを意図するものでない。
【００４０】
製造例１（参考）：ポリクロロメチルスチレン−ｂ−ポリエチレングリコール−ｂ−ポリクロロメチルスチレン（ＰＣＭＳ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ）トリブロック共重合体の合成
両末端にチオール基を有しているポリエチレングリコール（ＨＳ−ＰＥＧ−ＳＨ）（Ｍｎ：１００００；０．５ｍｍｏｌ，５．０ｇ）を反応容器に加えた。次に、反応容器中を真空にした後、窒素ガスを吹き込む操作を３回繰り返すことにより、反応容器内を窒素雰囲気にした。反応容器に１アゾビスイソブチロニトリル／トルエン（０．５ｍｍｏｌ／１０ｍｌ）溶液とクロロメチルスチレン（３５ｍｍｏｌ，４．９３ｍＬ）を加え、６０℃まで加熱し、２４時間攪拌した。反応混合物をポリクロロエチルスチレンホモポリマーに対しての良溶媒であるジエチルエーテルを用いて３回洗浄操作を行った後、ベンゼン凍結乾燥を行い、白い粉体を得た。収量は、５．８２ｇであり、収率は８７％であった。得られたＰＣＭＳ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳトリブロック共重合体のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）測定と1Ｈ  ＮＭＲスペクトルの結果から、ＰＥＧブロックは実質的に上記Ｍｎ値を示し、ポリ（クロロメチルスチレン）の総Ｍｎが３３６８を示す目的のトリブロック共重合体が得られたことが確認できた。
【００４１】
製造例２（参考）：ＴＥＭＰＯを有するトリブロックポリマー（ＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴ）の合成
反応容器に、ＰＣＭＳ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ（Ｍｎ：１３３６８；４．０ｇ，  ０．３ｍｍｏｌ）を加えた。次に、４−アミノ−ＴＥＭＰＯ（５．７ｇ，１．５ｍｍｏｌ）を２０ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、反応容器に加え、室温で２４時間攪拌を行った。反応終了後、反応溶液を透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｕｔ−ｏｆｆ  ｓｉｚｅ  ３，５００  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ  ＴＸ）中に加え、２Ｌのメタノールに対して透析を行った。メタノールは２時間ごとに８回交換し、エバポレーションを行い、ベンゼン凍結乾燥を行った。収率は、８６％であった。1Ｈ  ＮＭＲ測定の結果より、クロロメチル基が１００％反応し、ＴＥＭＰＯが導入されていることが確認された。
【００４２】
製造例３（実施例）：ボロン酸−ポリエチレングリコール−ｂ−ジエチルアミノエチルメタクリレート（ＰＢＡ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＥＡＭＡ）ジブロック共重合体の合成
窒素下フラスコ中、２５ｍＬのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中に０．３ｇの４−（ヒドロキシメチル）フェニルボロン酸ピナコールエステルおよび化学当量のカリウムナフタレンのＴＨＦ溶液（１．０ｍｏｌスラッシュＬ）を加えたのち、６ｇのエチレンオキシドを加え、水冷下２日間攪拌した。その後６ｇのメタクリル酸（２−ジエチルアミノエチル）を加え、３０分反応させた。溶媒留去後図２に示す1Ｈ  ＮＭＲスペックトルを得た。
【００４３】
上記ポリマー１．０ｇをフラスコ中でＴＨＦにて溶解し、化学等量のジエタノールアミン（８．８ｍｌ）を加え室温で１時間反応させた。反応後、沈殿したポリマーをフィルターにて回収後、１．０ＭのＨＣｌを加え溶解し１時間反応させた。反応終了後、反応溶液を透析膜中に加え、２Ｌの水に対して透析を行った。透析外液は２時間ごとに８回交換し、溶媒蒸留後下記のＮＭＲを得た。
【００４４】
1Ｈ  ＮＭＲ測定の結果より、脱保護化反応によりボロン酸エステル（図２参照）からボロン酸（図３参照）へと脱保護されていることが認められた。
【００４５】
製造例４（実施例）：ポリイオンコンプレックスミセルの設計
ＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴトリブロックポリマーの粉末を０．１Ｍ  ＨＣｌ水溶液に溶解し、ＰＭＮＴ鎖のアミノ基を完全にプロトン化させ、水系の凍結乾燥を行い回収した。次に、ＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴトリブロックポリマーおよびＰＢＡ−ＰＥＧ−ＰＥＡＭＡジブロックポリマー、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ；Ｍｗ：５ｋ）をそれぞれリン酸バッファー（０．１Ｍ）に溶解し、濃度を５ｍｇ／ｍｌにしたカチオンＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴおよびＰＢＡ−ＰＥＧ−ＰＥＡＭＡ混合水溶液とアニオンＰＡＡ水溶液を調製した。ここでカチオン性水溶液はＰＢＡ−ＰＥＧ−ＰＥＡＭＡが重量比で０％、５％、１０％、１５％、２０％、１００％含まれる水溶液を調整した。その後、ＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴトリブロックポリマーおよびＰＢＡ−ＰＥＧ−ＰＥＡＭＡジブロックポリマー混合水溶液をＰＡＡ水溶液に撹拌しながら滴下し、ｐＨが６．２の条件下でポリイオンコンプレックスミセルを調製した。ここで、ポリカチオンとポリアニオンのモル比ｒ＝１：１となるように、ポリイオンコンプレックスミセルを調製した（モル比ｒ＝［ＰＡＡの活性化されたカルボキシル基のモル数］／［ＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴの活性化されたアミノ基のモル数］）。得られたポリイオンコンプレックスミセルの平均粒径を動的光散乱（ＤＬＳ）測定により行ったところ、単峰性の粒子を形成することが確認された（図４参照）。
【００４６】
製造例５（実施例）：ＰＢＡ−ＰＥＧ−ＰＥＡＭＡ含有インジェクタブルゲル（ＰＢＡ−ＲＩＧ）の設計
上記調製した各ポリイオンコンプレックスミセル溶液５ｍｇ／ｍｌを遠心エバポレーションにより濃縮し、イオン強度を１５０ｍＭに調整し、温度３７℃の水浴中でゲル化実験を試験管反転法により検討した。ｐＨ６．２のＰＩＣミセル溶液で、ＰＢＡ−ＰＥＧ−ＰＥＡＭＡジブロックポリマーの重量比が１０重量％まで含まれるＰＩＣミセルにおいて、イオン強度１５０ｍＭかつ温度３７℃の環境下で不可逆的ゲル化したことが確認された（図５参照）。
【００４７】
試験１：ＰＢＡ−ＰＥＧ−ＰＥＡＭＡ含有ＰＩＣミセルの粘弾性測定およびゲル化温度測定
さらに、ゲル化の挙動についてレオメーターを用いて解析し、温度昇温に伴う粘性の変化およびゲル化温度について評価を行った。ゲル化温度はレオメーター測定における貯蔵弾性率（Ｇ’）と損失弾性率（Ｇ”）がクロスポイントした温度と定義した。
【００４８】
ＰＢＡ−ＰＥＧ−ＰＥＡＭＡの含有率が重量比で１０％のＰＩＣミセルにおいて、生体温度付近で粘性の上昇が見られた。ＰＢＡ−ＰＥＧ−ＰＥＡＭＡの重量比が１５％のＰＩＣミセルにおいてはゲル化温度が３９．６℃と生体温度以上の値を示し、重量比１５％を超えるミセル溶液ではゲル転移を示さなかった。これらの結果から、ＰＢＡ−ＰＥＧ−ＰＥＡＭＡが重量比で１０％含まれるＰＩＣミセルでは生体環境下にてゲル化しうることが示唆された（図６参照）。
【００４９】
試験２：インジェクタブルゲル（ＲＩＧ）の眼組織表面滞留性評価
蛍光物質を担持したＲＩＧを使用して生体イメージング（ＩＶＩＳ）により、マウスの眼組織表面での滞留性を評価する実験を行った。蛍光物質には蛍光効率の優れたアミノフルオレセインを選択し、アミノフルオレセインをＰＡＡのカルボキシ基と反応させアミド化反応により共有結合にて結合させたのちに、ＰＭＮＴ−ＰＥＧ−ＰＭＮＴと混合することにより、蛍光物質アミノフルオレセインを担持したＦＬ−ＲＩＧを作製した。ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕマウス（ｎ＝２）の眼組織にＦＬ−ＲＩＧを５μＬ投与後、蛍光強度を追跡することで、ＲＩＧの眼組織上での滞留性を評価した。本試験では低分子アミノフルオレセイン溶液（ＡＦＬ）およびアミノフルオレセインを担持したナノ粒子（ＦＬ−ｉＲＮＰ）を対照群として使用した。
【００５０】
サンプル群：ＡＦＬ：低分子アミノフルオレセイン溶液
ＦＬ−ｉＲＮＰ：ＰＥＧ−ＰＭＮＴジブロックポリマーのアミノ基に対して
、アミノフルオレセインを修飾したＰＡＡを静電相互作用により反応させた
ＰＩＣミセル溶液
ＦＬ−ＲＩＧ：ＰＭＮＴ−ＰＥＧ−ＰＭＮＴトリブロックポリマーのアミノ
基に対してアミノフルオレセインを修飾したＰＡＡを静電相互作用により反
応させたインジェクタブルゲルとして機能するＰＩＣミセル溶液
【００５１】
サンプル投与後、フルオレセインの蛍光をＩＶＩＳを用いて検出した。（Ｅｘ５００ｎｍ，Ｅｍ：５４０ｎｍ）。サンプル投与直後に検出した蛍光強度を１００％として、蛍光強度の経時変化を追跡することで眼表面での滞留性を評価した。
【００５２】
図７にサンプル投与後の眼表面イメージング画像と眼表面での滞留性を定量化したグラフを示した。低分子のＡＦＬ溶液やミセル溶液であるＦＬ−ｉＲＮＰ溶液は迅速に眼表面から排出され１時間以内に蛍光強度が著しく減少した。液剤であるため、瞬き等により眼表面からサンプルが流れ、蛍光が皮膚や手から検出された。一方でＲＩＧ投与群においては眼表面でのゲル化により滞留性が向上し投与後数時間の間、眼表面組織から蛍光が検出された。また、ＡＦＬやＦＬ−ｉＲＮＰ投与群と比較し、投与部位からのみ蛍光が検出され、眼組織との高い接着性が示唆された。これはゲル化により表面に露出したカチオン性高分子とアニオン性物質により構成される眼組織が静電相互作用したためであると考察される。これらの結果から、作製したＲＩＧは生体環境に応答して眼表面でゲル化し高い滞留性を示すことが確認された。ハイドロゲルによる優れた保水効果や持続的な抗炎症作用により、優れたドライアイ治療薬としての効果が期待され、点眼剤の頻回投与の回数を削減しうることを示唆している。
【００５３】
試験３：インジェクタブルゲルのドライアイに対する治療効果の検討（Ｉｎ  ｖｉｖｏ）
作製したＲＩＧをドライアイモデルマウスに投与し、ドライアイへの治療効果の検討を行った。実験手順については図８に示す以下の通りである。
【００５４】
ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝６，４週齢）の眼組織に０．５％の塩化ベンザルコニウム水溶液を３μＬ１週間投与しドライアイモデルマウスを作製した。ドライアイモデルマウス作製後、同様に３μＬのサンプルを１週間投与しドライアイへの治療効果の検討を行った。本試験での実験群は非処置群（ＢＡＣ投与，サンプル投与なし）、ＴＥＭＰＯ投与群（ＢＡＣ投与，低分子ＴＥＭＰＯ溶液投与）、ｉＲＮＰ投与群（ＢＡＣ投与，ｉＲＮＰ投与）、ＲＩＧ投与群（ＢＡＣ投与，ＲＩＧ投与）の計４群である。なお、ドライアイの評価方法には涙液量検査用糸として使用される、ゾーンクイック（ＺＯＮＥ−ＱＵＩＣＫ）糸を用いた。ゾーンクイック糸は黄色いフェノールレッド糸であるが、涙液に触れると涙液の弱アルカリ性に反応し糸が赤く変化する。この性質を利用し、赤く変化した部分の長さを測定することにより、涙液の量を定量化する評価法である。イソフルランの吸入麻酔科でマウスの下瞼に約１ｍｍのフェノールレッド糸を一分間挿入した。赤くなった部分の長
さを測定しるサンプル投与による涙液量の変化を検証した。
【００５５】
図９にゾーンクイック糸にて測定した涙液量の経時変化を示した。どのグループにおいてもＢＡＣを投与した期間（ｄａｙ−７からｄａｙ  ０）で涙液量が低下したことからＢＡＣによるドライアイモデルマウスの作製に成功した。ミセル溶液であるｉＲＮＰ投与群においては涙液量の回復は見られずドライアイに対する治療効果は見られなかった。ミセル溶液のため眼組織から迅速に排出されたためであると考察できる。一方ＲＩＧ投与群においては投与開始から涙液量の増加が顕著に見られた。この結果からＲＩＧは生体投与後にミセル溶液からゲルへと転移することで、滞留性が向上し、ハイドロゲルの高い保水性と持続的な抗酸化ストレス能が効果的にドライアイの治療に貢献したものと結論付けられる。
【００５６】
試験４：ＰＢＡ−ＰＥＧ−ＰＥＡＭＡ含有ナノ粒子（ＰＢＡ−ｉＲＮＰ）によるムチンとの接着性評価
新規合成したＰＢＡ−ＰＥＧ−ＰＥＡＭＡの眼組織との接着性を評価するため、ＰＢＡ−ＰＥＧ−ＰＥＡＭＡ含有ナノ粒子を作製し、ムチンとの接着性を評価した。ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴジブロックポリマーおよびＰＢＡ−ＰＥＧ−ＰＥＡＭＡジブロックポリマー、ポリアクリル酸（ＰＡＡ；Ｍｗ：５ｋ）をそれぞれリン酸バッファー（０．１Ｍ）に溶解し、濃度を５ｍｇ／ｍｌにしたカチオンＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴおよびＰＢＡ−ＰＥＧ−ＰＥＡＭＡ混合水溶液とアニオンＰＡＡ水溶液を調製した。ここでカチオン性水溶液はＰＢＡ−ＰＥＧ−ＰＥＡＭＡが重量比で０％、１０％、２０％、含まれる水溶液を調整した。その後、ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴジブロックポリマーおよびＰＢＡ−ＰＥＧ−ＰＥＡＭＡジブロックポリマー混合水溶液をＰＡＡ水溶液に撹拌しながら滴下することでポリイオンコンプレックスナノ粒子（ＰＢＡ−ｉＲＮＰ）を調製した。それぞれのナノ粒子溶液を濃縮し３０ｍｇ／ｍＬとした後、ムチン（１ｍｇ／ｍＬ）とｐＨ＝７．４、８．０、８．２、８．４、８．６、８．８、９．０  条件下で反応させ、接着性をＰＡＳ（Ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ａｃｉｄ／Ｓｃｈｉｆｆ）染色法により評価した。
【００５７】
図１０に各ｐＨにおけるナノ粒子とムチンとの接着量を示した。ナノ粒子を使用することでムチンとの接着性が向上した。これは静電相互作用により形成しているナノ粒子が負電荷に帯電しているムチンと相互作用したためであると考察される。またｐＨが弱アルカリ領域であるｐＨ＝８．０付近でＰＢＡ−ｉＲＮＰのムチン接着能が向上した。これはＰＢＡ−ＰＥＧ−ＰＥＡＭＡポリマーをナノ粒子に組み込むことにより、フェニルボロン酸とムチンとの間での結合形成により有意に接着性が上昇したものと考えられる。これらの結果から、本研究で新規に合成したＰＢＡ−ＰＥＧ−ＰＥＡＭＡジブロックポリマーを、インテリジェントゲル（ＲＩＧ）に組み込むことにより、さらなる眼組織との接着性の向上が見込まれ、ドライアイ治療点眼剤として優れた機能を発揮するものと期待される。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明によれば、ドライアイの処置に用いることのできる組成物が提供される。したがって、本発明は少なくとも製薬業において利用可能である。
【図１】
0006703408.tif 000009
【図２】
0006703408.tif 000010
【図３】
0006703408.tif 000011
【図４】
0006703408.tif 000012
【図５】
0006703408.tif 000013
【図６】
0006703408.tif 000014
【図７】
0006703408.tif 000015
【図８】
0006703408.tif 000016
【図９】
0006703408.tif 000017
【図１０】
0006703408.tif 000018