(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造式（Ｉ）：
【化１】
0006730932.tif 000087
［式中、
Ｂは、核酸塩基または１−メチルアデニン、２−メチルアデニン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンチルアデニン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアデニン、８−ブロモアデニン、２−チオシトシン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、５−エチルシトシン、４−アセチルシトシン、１−メチルグアニン、２−メチルグアニン、７−メチルグアニン、２，２−ジメチルグアニン、８−ブロモグアニン、８−クロログアニン、８−アミノグアニン、８−メチルグアニン、８−チオグアニン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、５−エチルウラシル、５−プロピルウラシル、５−メトキシウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−（メチルアミノメチル）ウラシル、５−（カルボキシメチルアミノメチル）−ウラシル、２−チオウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−（２−ブロモビニル）ウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、プソイドウラシル、１−メチルプソイドウラシル、クエオシン、イノシン、１−メチルイノシン、ヒポキサンチン、キサンチン、２−アミノプリン、６−ヒドロキシアミノプリン、６−チオプリンおよび２，６−ジアミノプリンから選択されるその類似体であり；前記Ｂがアミジン核酸塩基保護基を含み、前記保護基が以下の構造：
【化２】
0006730932.tif 000088
によって示されるアセトアミジン保護基であり、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、直鎖状、分枝状もしくは環状の置換もしくは非置換アルキルであるか、または、Ｒ１とＲ２は一緒になって、５、６、７もしくは８員の非芳香族環を形成しており；
Ｒ３は、４，４’−ジメトキシトリチル、モノメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、ピキシルおよびピバロイルから選択される酸不安定性保護基であり；
Ｒは、ベンジルアルコール誘導体、α−メチルアリールアルコール誘導体、ナフタレンアルコール誘導体、二環式脂肪族アルコール誘導体、Ｓ−エチルチオエートアルコール誘導体およびアミノ酸誘導体からなる群から選択される基であり、ただし、Ｒはｏ−メチルベンジルではない］
を有する化合物。
【請求項２】
Ｂが核酸塩基または保護された核酸塩基であり、ここで、前記核酸塩基はアデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシルから選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ１およびＲ２が、それぞれ独立して、直鎖状、分枝状もしくは環状の置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ１８アルキルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ１およびＲ２が、それぞれ独立して、直鎖状または分枝状の非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルである、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
構造式（Ｉａ）：
【化３】
0006730932.tif 000089
を有する、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ１とＲ２が、一緒になって、５または６員の非芳香族環を形成しており、ここで、前記環は骨格中に０または１個のヘテロ原子を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ１とＲ２が、一緒になって、骨格中に０個のヘテロ原子を有する５員の非芳香族環を形成している、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
構造式（Ｉｂ）：
【化４】
0006730932.tif 000090
［式中、Ｒ４は、それぞれ、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルキルオキシから選択される］
を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
式Ｉｃ：
【化５】
0006730932.tif 000091
の構造を有する、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
構造式（Ｉｄ）：
【化６】
0006730932.tif 000092
［式中、Ｒ７は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ１〜Ｃ６アルキルオキシである］
を有する、請求項８に記載の化合物。
【請求項１１】
構造式（Ｉｆ）：
【化７】
0006730932.tif 000093
［式中、Ｒ８は、脂肪族基である］
を有する、請求項８に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒが、構造式（ＩＩ）：
【化８】
0006730932.tif 000094
［式中、
Ｒａは、水素またはアルキルであり；
Ｒ１１は、それぞれ独立して、水素、アルキル、アルコキシ、アルキル−Ｓ−、シアノ、メチルシアノまたはハロゲンであり；
ｎは、１、２または３である］
を有するベンジルアルコールの誘導体である、請求項１から９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒが、
【化９】
0006730932.tif 000095
［式中、Ｒ６は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、シアノ、メチルシアノおよびヒドロカルビルから選択される］
から選択されるベンジルアルコールの誘導体である、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｒが、構造：
【化１０】
0006730932.tif 000096
［式中、Ｒ７は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキルオキシおよび電子吸引基から独立して選択される１個または複数の置換基である］
を有するベンジルアルコールの誘導体である、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｒが、構造式（ＩＩＩ）：
【化１１】
0006730932.tif 000097
［式中、Ｘは、水素、ハロゲン、シアノ、メチルシアノまたはトリフルオロメチルであり；Ｙは、水素、アルキル、ハロアルキルまたはアルコキシアルキルであり；Ｒａは、水素またはアルキルである］
を有するα−メチルアリールアルコールの誘導体である、請求項１から９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｒが、
【化１２】
0006730932.tif 000098
［式中、
Ｒ９は、ハロゲン、シアノまたはトリフルオロメチルであり；
Ｒ１０は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルキルオキシから選択される］
から選択されるα−メチルアリールアルコールの誘導体である、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｒが、構造式（ＩＶ）：
【化１３】
0006730932.tif 000099
［式中、Ｒ７は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルキルオキシから選択され；Ｒ５は、水素およびヒドロカルビルから選択され；Ｒ１２は、水素およびアルコキシから選択される］
を有するナフタレンアルコールの誘導体である、請求項１から９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１８】
Ｒが、
【化１４】
0006730932.tif 000100
［式中、Ｒ１３は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルである］
から選択されるナフタレンアルコールの誘導体である、請求項１７に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｒが、構造式（Ｖ）または（ＶＩ）：
【化１５】
0006730932.tif 000101
［式中、Ｒ１４は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルキルオキシから選択され；Ｒ１５およびＲ１６は、それぞれ独立して、水素、シアノ、アルコキシまたはハロゲンであり；ｍは、１または２である］
を有する二環式脂肪族アルコールの誘導体である、請求項１から９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｒが、
【化１６】
0006730932.tif 000102
［式中、
Ｒ１４は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ１〜Ｃ６アルキルオキシであり；
Ｒ１５は、水素、ハロゲンまたはＣ１〜Ｃ６アルコキシであり；
Ｒ１６は、水素、シアノまたはハロゲンである］
から選択される二環式脂肪族アルコールの誘導体である、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２１】
Ｒが、
【化１７】
0006730932.tif 000103
［式中、Ｒ７は、水素、ハロゲン、ヒドロカルビルおよびアルキルオキシから選択される］
である、請求項１から９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２２】
Ｒが、
【化１８】
0006730932.tif 000104
から選択される、請求項１から９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２３】
Ｒが、
【化１９】
0006730932.tif 000105
［式中、Ｒ７は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ１〜Ｃ６アルキルオキシである］
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項２４】
Ｒが
【化２０】
0006730932.tif 000106
［式中、Ｒ８は脂肪族基である］
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項２５】
Ｂが、以下の構造：
【化２１】
0006730932.tif 000107
のいずれか１つによって示される、請求項１に記載の化合物。
【請求項２６】
Ｒが、
【化２２】
0006730932.tif 000108
［式中、Ｒ７は、水素、ハロゲン、ヒドロカルビルおよびアルキルオキシから選択される］
である、請求項２５に記載の化合物。
【請求項２７】
構造式（Ｉ）：
【化２３】
0006730932.tif 000109
［式中、
Ｂは、核酸塩基または１−メチルアデニン、２−メチルアデニン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンチルアデニン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアデニン、８−ブロモアデニン、２−チオシトシン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、５−エチルシトシン、４−アセチルシトシン、１−メチルグアニン、２−メチルグアニン、７−メチルグアニン、２，２−ジメチルグアニン、８−ブロモグアニン、８−クロログアニン、８−アミノグアニン、８−メチルグアニン、８−チオグアニン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、５−エチルウラシル、５−プロピルウラシル、５−メトキシウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−（メチルアミノメチル）ウラシル、５−（カルボキシメチルアミノメチル）−ウラシル、２−チオウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−（２−ブロモビニル）ウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、プソイドウラシル、１−メチルプソイドウラシル、クエオシン、イノシン、１−メチルイノシン、ヒポキサンチン、キサンチン、２−アミノプリン、６−ヒドロキシアミノプリン、６−チオプリンおよび２，６−ジアミノプリンから選択されるその類似体であり；前記Ｂがアミジン核酸塩基保護基を含み、前記アミジン保護基が以下の構造：
【化２４】
0006730932.tif 000110
［式中、Ｒ２１およびＲ２２は、それぞれ独立して、アルキル、置換アルキルであるか、または、Ｒ２１とＲ２２は環状的に連結して５もしくは６員の置換もしくは非置換複素環を形成している］
により示され、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、直鎖状、分枝状もしくは環状の置換もしくは非置換アルキルであるか、または、Ｒ１とＲ２は一緒になって、５、６、７もしくは８員の非芳香族環を形成しており；
Ｒ３は、４，４’−ジメトキシトリチル、モノメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、ピキシルおよびピバロイルから選択される酸不安定性保護基であり；
Ｒは、以下の（ａ）〜（ｇ）：
（ａ）構造：
【化２５】
0006730932.tif 000111
［式中、Ｒ７は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキルオキシおよび電子吸引基から独立して選択される１個または複数の置換基である］
を有するベンジルアルコールの誘導体；
（ｂ）
【化２６】
0006730932.tif 000112
［式中、
Ｒ９は、ハロゲン、シアノまたはトリフルオロメチルであり；
Ｒ１０は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルキルオキシから選択される］
から選択されるα−メチルアリールアルコールの誘導体；
（ｃ）構造式（ＩＶ）：
【化２７】
0006730932.tif 000113
［式中、Ｒ７は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルキルオキシから選択され；Ｒ５は、水素およびヒドロカルビルから選択され；Ｒ１２は、水素およびアルコキシから選択される］
を有するナフタレンアルコールの誘導体；
（ｄ）
【化２８】
0006730932.tif 000114
［式中、Ｒ１３は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルである］
から選択されるナフタレンアルコールの誘導体；
（ｅ）構造式（Ｖ）または（ＶＩ）：
【化２９】
0006730932.tif 000115
［式中、Ｒ１４は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルキルオキシから選択され；Ｒ１５およびＲ１６は、それぞれ独立して、水素、シアノ、アルコキシまたはハロゲンであり；ｍは、１または２である］
を有する二環式脂肪族アルコールの誘導体；
（ｆ）
【化３０】
0006730932.tif 000116
［式中、
Ｒ１４は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ１〜Ｃ６アルキルオキシであり；
Ｒ１５は、水素、ハロゲンまたはＣ１〜Ｃ６アルコキシであり；
Ｒ１６は、水素、シアノまたはハロゲンである］
から選択される二環式脂肪族アルコールの誘導体；及び
（ｇ）
【化３１】
0006730932.tif 000117
から選択される基、
からなる群から選択される基である］
を有する化合物。
【請求項２８】
構造式（ＶＩＩ）：
【化３２】
0006730932.tif 000118
［式中、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれイソプロピルであるか、またはＲ１とＲ２は、一緒になって、それらが結合されているＮとともにピロリジン複素環を形成しており；
Ｒ３は、４，４’−ジメトキシトリチル、モノメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、ピキシルおよびピバロイルから選択される酸不安定性保護基であり；
Ｒ'は、シアノエチル基およびメチル基から選択される基であり；
Ｂは、
【化３３】
0006730932.tif 000119
から選択される保護された核酸塩基である］
を有する化合物。
【請求項２９】
ポリヌクレオチドを合成する方法であって、
（ａ）保護されていないヒドロキシル基を有するヌクレオシド残基を用意することと；
（ｂ）前記ヌクレオシド残基を請求項１から２８のいずれか１項に記載のヌクレオシドモノマーと接触させて、前記ヌクレオシドモノマーを前記ヌクレオシド残基に共有結合させ前記ポリヌクレオチドを生成することと
を含む、方法。
【請求項３０】
前記ポリヌクレオチドを酸化剤に曝露することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記核酸を脱保護剤に曝露することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
接触するステップを少なくとも１回繰り返すことをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記ヌクレオシド残基が固相支持体に共有結合されている、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記核酸を前記固相支持体から切断して、遊離核酸を生成させることをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記核酸が、少なくとも２００ヌクレオチドの配列を有するＤＮＡである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記核酸が、２００ヌクレオチド〜１，０００ヌクレオチドの長さを有するＤＮＡである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＤＮＡが３００ヌクレオチド〜５００ヌクレオチドの長さを有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＤＮＡが１００ヌクレオチド当たり１つ以下の単一ヌクレオチド欠失を有する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
第１の遊離核酸を第２の遊離核酸とカップリングさせて、３００ヌクレオチド〜１０，０００ヌクレオチドの長さを有する伸長された遊離核酸を生成することをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
１つまたは複数のさらなる遊離核酸を前記伸長された遊離核酸にカップリングさせて、遺伝子を生成することをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、本願は、２０１４年４月３０日に出願された米国仮出願第６１／９８６，５９４号の出願日への優先権を主張し、その開示は、参照により本明細書に援用されるものとする。
【０００２】
本発明は、概して、核酸の合成に関する。より詳しくは、本発明は、新規のリン保護基および新規の核酸塩基保護基に関し、また、ＤＮＡの合成に有用である関連化合物、ならびにそれらの組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
序論
オリゴヌクレオチド、ＤＮＡおよびＲＮＡの合成鎖の化学合成は、明確な化学構造および配列を有する核酸の比較的短い断片の化学合成である。その技術は、現在の研究室での研究において多様な用途があるため、非常に重要かつ有用である。オリゴヌクレオチド合成は、所望の配列のカスタムメイドオリゴヌクレオチドへの迅速かつ低価格なアクセスを提供する。オリゴヌクレオチドは、分子生物学および医薬において様々な用途、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ、ＤＮＡ塩基配列決定および増幅用のプライマー、分子プローブなどが確認されている。
【０００４】
オリゴヌクレオチドの化学合成は、典型的には、ホスホラミダイト法および保護された２’−デオキシヌクレオシド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧおよびＴ）、リボヌクレオシド（Ａ、Ｃ、ＧおよびＵ）、または化学修飾されたヌクレオシド、例えば、２−Ｏ−メチル、２’−Ｆ、ＬＮＡなどから誘導されるホスホラミダイトビルディングブロックを使用する固相合成として、３’から５’方向に実施される。オリゴヌクレオチドを合成するため、そのビルディングブロックは、成長しているオリゴヌクレオチド鎖に所望の順序で逐次的にカップリングされる。鎖の構築が終了したら、生成物は、脱保護され、固相から溶液へ放出され、回収される（米国特許第４，４１５，７３２号；ＭｃＢｒｉｄｅ，ｅｔ  ａｌ．１９８３  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２４：２４５−２４８；Ｓｉｎｈａ，ｅｔ  ａｌ．１９８４  Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：４５３９−４５５７）。
【０００５】
シアノエチルホスホラミダイトを使用するＤＮＡ合成は、固相支持体（ｓｏｌｉｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ）合成およびアレイ合成で２００マー以下のオリゴヌクレオチドの合成を可能にするのに今も力強いものである。しかし、現在利用可能な化学は、より長いオリゴヌクレオチドの合成で困難に直面しており、それらの配列中に一塩基欠失（ＳＢＤ）および大型欠失（オリゴのより長いセグメントの欠失）が含まれることが判明している。一塩基欠失は不十分な段階カップリング収率によって生じている可能性があり、一方、オリゴヌクレオチドセグメントの大型欠失は、オリゴヌクレオチド合成中、強力な化学物質の反復処理に曝露されるホスホトリエステル連結の不安定性が原因となっている可能性がある。
【０００６】
したがって、既存の合成法では、エラーの数が合成されているオリゴヌクレオチドの長さとともに累積するので、望ましくない副反応は合成オリゴヌクレオチドの長さに現実的な限界を設定する（約２００ヌクレオチド残基以下）（Ｂｅａｕｃａｇｅ，ｅｔ  ａｌ．１９９２  ”Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４８  （１２）：２２２３；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．１９８７  ”Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ  ｍｅｔｈｏｄ”  Ｂｉｏｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ，ｅｄｓ．Ｋ．Ｓ．Ｂｒｕｚｉｋ，Ｗ．Ｊ．Ｓｔｅｃ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉ．Ｐｕｂｌ．，３−２１も参照）。所望の配列中のエラーが配列の長さの増大につれてより起こり得るので、８０塩基を超える配列（特に、２００塩基を超える配列）では、多くの場合、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって単離し、純度を高める必要がある。さらに、段階収率またはカップリング効率は、合成され得るオリゴヌクレオチドの長さを大幅に制限する。オリゴヌクレオチド合成における全収率は、ＯＹ＝ｙ（ｎ−１）として表され、ここで、ＯＹは全収率であり、ｙは段階カップリング収率であり、ｎはオリゴヌクレオチドの長さまたはオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの数である。したがって、９９．７％のカップリング収率で合成された２００マーのオリゴヌクレオチドは、ＯＹ＝ｙ１９９を有し、これはＯＹ＝０．９９７１９９＝０．５４９９６または５４．９９％と等しく、一方、９９．８％のカップリング効率で合成された２００マーは、ＯＹ＝０．６７１３９４または６７．１４％を有する。段階カップリング収率における０．１％の差が結果的にはＯＹに１２％の変化をもたらすことが本実施例で示されているとおり、段階カップリング収率は、こうした長いオリゴヌクレオチドに関する全収率に大きく影響する。そのため、段階カップリング効率の任意の改良によって完全長オリゴヌクレオチドのＯＹが大幅に増加すると考えられ、その改良が望まれている。
【０００７】
重要課題がオリゴヌクレオチドの化学合成において残っている。特に、段階カップリング収率を増加させる新しいリン保護基、および／または、既に論じたようなオリゴヌクレオチド合成中のホスホトリエステル連結の不安定性が回避されるように酸化ステップ中に除去することができるリン保護基が必要とされている。これは、許容され得る純度および収率を達成しながら、従来技術によって生成される核酸分子よりも長さの大きい核酸分子の信頼性の高い合成の新規の方法に対する、まだ対処されていない重要なニーズである。
【発明の概要】
【０００８】
本開示は、一つには、許容され得る純度および収率を達成しながら、従来技術によって生成される核酸分子よりも長さの大きい核酸分子を合成する新規の方法に基づく。本開示の態様は、長さが２００以上のモノマー単位の配列を有する長鎖ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）の合成を提供するリン保護基および／または核酸塩基保護基を使用する方法および組成物である。
【０００９】
段階カップリング収率の増加を促進するリン保護基および／または酸化ステップ中に除去することができるリン保護基を提供する。ポリヌクレオチド合成中の脱プリンに対する耐性を高め、例えば、アンモニアでのポリヌクレオチド切断中の核酸塩基の脱保護時間を短縮し、副産物、例えば、核酸塩基付加物を減少させながら粗製オリゴヌクレオチドの純度を高める本主題の組成物および方法における使用が見出されるアミジン核酸塩基保護基を提供する。ある場合には、本明細書に開示されている方法および組成物は、長さが２００以上のモノマー単位の配列を有するポリヌクレオチドの合成において、リン保護基および核酸塩基保護基の組合せを利用することができる。
【００１０】
一態様において、本開示は、概して、構造式（Ｉ）：
【化１】
0006730932.tif 000002
［式中、Ｂは、核酸塩基またはその類似体であり；Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、直鎖状、分枝状もしくは環状の、置換もしくは非置換アルキルであるか、または、Ｒ１とＲ２は一緒になって５、６、７または８員の非芳香族環を形成しており；Ｒ３は、酸不安定性保護基であり；Ｒは、ベンジルアルコール誘導体、α−メチルアリールアルコール誘導体、ナフタレンアルコール誘導体、二環式脂肪族アルコール誘導体または縮合環、Ｓ−エチルチオエート誘導体およびアミノ酸誘導体からなる群から選択される基であり、ただし、Ｒはｏ−メチルベンジルではない］
を有する化合物に関する。
【００１１】
別の態様において、本開示は、概して、本明細書に開示されている１つまたは複数の化合物を使用してポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）を合成する方法であって、合成されたＤＮＡが少なくとも約２００ヌクレオチドの長さのものである、方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、リン保護基として１−（４−ブロモフェニル）エタノールを使用するｄＴ２０の合成のＴＩＣおよびＨＰＬＣクロマトグラムならびに質量分析を示す。
【図２】図２は、リン保護基として１−メトキシ−２−ナフタレンメタノールを使用するｄＴ２０の合成のＴＩＣおよびＨＰＬＣクロマトグラムならびに質量分析を示す。
【図３】図３は、２−カルバモイル−２−シアノエチレン−１，１−ジチオレート処理した、リン保護基として２−ナフタレンメタノールを使用するｄＴ２０の合成のＴＩＣおよびＨＰＬＣクロマトグラムならびに質量分析を示す。
【図４】図４は、２−カルバモイル−２−シアノエチレン−１，１−ジチオレート処理した、リン保護基として６−ブロモ−２−ナフタレンメタノールを使用するｄＴ２０の合成のＴＩＣおよびＨＰＬＣクロマトグラムならびに質量分析を示す。
【図５】図５は、リン保護基として１−ヒドロキシインダン−５−カルボニトリルを使用するｄＴ２０の合成のＴＩＣおよびＨＰＬＣクロマトグラムならびに質量分析を示す。
【図６】図６は、２−カルバモイル−２−シアノエチレン−１，１−ジチオレート処理した、リン保護基として４−シアノベンジルアルコールを使用するｄＴ２０の合成のＴＩＣおよびＨＰＬＣクロマトグラムならびに質量分析を示す。
【図７】図７は、２−カルバモイル−２−シアノエチレン−１，１−ジチオレート処理した、リン保護基として３−シアノベンジルアルコールを使用するｄＴ２０の合成のＴＩＣおよびＨＰＬＣクロマトグラムならびに質量分析を示す。
【図８】図８は、２−カルバモイル−２−シアノエチレン−１，１−ジチオレート処理した、リン保護基として２−エチニルベンジルアルコールを使用するｄＴ２０の合成のＴＩＣおよびＨＰＬＣクロマトグラムならびに質量分析を示す。
【図９】図９は、リン保護基としてアセチル−Ｌ−トレオニンメチルエステルを使用するｄＴ２０の合成のＴＩＣおよびＨＰＬＣクロマトグラムならびに質量分析を示す。
【図１０】図１０は、リン保護基としてＳ−エチルベンゾチオエートを使用するｄＴ２０の合成のＴＩＣおよびＨＰＬＣクロマトグラムならびに質量分析を示す。
【図１１】図１１は、２−カルバモイル−２−シアノエチレン−１，１−ジチオレート処理した、リン保護基として４−シアノベンジルアルコールを使用するｄＴ２０の合成のＴＩＣおよびＨＰＬＣクロマトグラムならびに質量分析を示す。
【図１２】図１２は、リン保護基としてアセチル−Ｌ−トレオニンメチルエステルを使用するｄＴ６０の合成のＴＩＣおよびＨＰＬＣクロマトグラムならびに質量分析を示す。
【図１３】図１３は、リン保護基としてＳ−エチルベンゾチオエートを使用するｄＴ６０の合成のＴＩＣおよびＨＰＬＣクロマトグラムならびに質量分析を示す。
【図１４】図１４は、リン保護基としてＳ−エチルベンゾチオエートを使用して合成されたＴ６０および標準２−シアノエチルホスホラミダイトを用いて合成されたＴ６０のＴＩＣおよびＨＰＬＣクロマトグラムならびに質量分析の比較を示す。
【図１５】図１５は、図１〜図１４で選択し示したオリゴヌクレオチドの合成において使用された目的のホスホラミダイト化合物の構造（２２〜３１）を示す。
【図１６】図１６は、アデノシンのアミノＮ−６上の標準ベンゾイル保護基を用いて合成したｄ（ＡＡＴ）２０  ６０マーオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図１７】図１７は、アデノシンのアミノＮ−６上のＮ６−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミジノ）保護基（上図）およびＮ６−（１−（モルホリノ）エチリデン）−ｄＡ（下図）をそれぞれ用いて合成したｄ（ＡＡＴ）２０  ６０マーオリゴヌクレオチドの２種のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図１８】図１８は、Ｎ４アセチルｄＣ標準保護基（上図）およびＮ４−（Ｎ−メチル−２−ピロリジニルデン（ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌｄｅｎｅ））−ｄＣ（下図）をそれぞれ用いて合成した（ＣＣＴ）１９Ｃ３  ６０マーオリゴヌクレオチドの２種のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図１９】図１９は、Ｎ４−（１−（モルホリノ）エチリデン）−ｄＣを用いて合成したｄＣ４０のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図２０】図２０は、標準Ｎ２−（イソブチリル）−ｄＧを用いて合成したｄ（ＧＧＴ）２０  ６０マーオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図２１】図２１は、Ｎ２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミジノ）ｄＧ（上図）およびＮ２−（１−（モルホリノ）エチリデン）−ｄＧ（下図）をそれぞれ用いて合成したｄ（ＧＧＴ）２０  ６０マーオリゴヌクレオチドの２種のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図２２】図２２は、標準保護基およびアミジン保護基を用いて合成した６０マーオリゴヌクレオチドを比較した４種のＴＩＣクロマトグラムを示す。アミジン保護基を使用した場合、塩基付加物の減少が顕著である。
【図２３】図２３は、Ｎ６−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミジノ）−ｄＡ−３’Ｏ−Ｓ−（エチル）ベンゾチオエートホスホラミダイトを用いて合成したｄ（ＡＡＴ）１３  ３９マーオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図２４】図２４は、標準核酸塩基保護基（上図）およびアミジン保護基（下図）をそれぞれ用いて合成した２つの１００マーオリゴヌクレオチドを比較した２種のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図２５】図２５は、３’−Ｓ−（エチル）ベンゾチオエートホスホラミダイトおよびＮ６−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミジノ）ｄＡ（化合物１６、１７、１８、２０）を使用してアレイ上で合成した２００マーポリヌクレオチドの変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
定義
特定の官能基および化学用語の定義を以下においてより詳細に説明する。有機化学の一般的原理、ならびに、特定の官能部分および反応性は、”Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，Ｔｈｏｍａｓ  Ｓｏｒｒｅｌｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｏｏｋｓ，Ｓａｕｓａｌｉｔｏ：１９９９に記載されている。
【００１４】
本開示のある特定の化合物は、特に、幾何学的形態または立体異性形態で存在し得る。本開示は、本開示の範囲内にあるような、シス−異性体およびトランス−異性体、Ｒ−エナンチオマーおよびＳ−エナンチオマー、ジアステレオマー、（Ｄ）−異性体、（Ｌ）−異性体、それらのラセミ混合物、およびそれらの他の混合物を含む、このようなすべての化合物を意図している。追加の不斉炭素原子は、アルキル基などの置換基中に存在し得る。このようなすべての異性体、ならびにそれらの混合物は、本開示に包含されるものとする。
【００１５】
様々な異性体比の任意のものを含有している異性体混合物は、本開示に従って利用することができる。例えば、２種の異性体のみが合わせられる場合、５０：５０、６０：４０、７０：３０、８０：２０、９０：１０、９５：５、９６：４、９７：３、９８：２、９９：１または１００：０の異性体比を含有している混合物が本開示により意図される。より複雑な異性体混合物に関して類似の比が意図されることは、当業者には容易に認識されよう。
【００１６】
例えば、本開示の化合物の特定のエナンチオマーを所望する場合、それは不斉合成により、またはキラル補助基を用いる誘導体化により調製することができ、この場合、得られたジアステレオマーの混合物は分離され、補助基を切断して純粋な所望のエナンチオマーが提供される。あるいは、分子がアミノなどの塩基性官能基またはカルボキシルなどの酸性官能基を含有している場合、ジアステレオマー塩は適切な光学活性な酸または塩基を用いて形成され、続いて、こうして形成されたジアステレオマーは、当技術分野で周知の分別結晶化法またはクロマトグラフ法によって分割され、その後、純粋なエナンチオマーが回収される。
【００１７】
本開示の効果を想定して、本明細書に記載されているような合成方法が様々な保護基を利用することができることは当業者には認識されよう。本明細書で使用される用語「保護基」とは、特定の官能部分、例えば、Ｏ、Ｓ、Ｎが一時的に遮断され、その結果、反応が多官能化合物の別の反応部位で選択的に行なわれ得るようになることを意味する。好ましい実施形態において、保護基は、高収率で選択的に反応し、予定した反応に対して安定している保護された基質を生じ、保護基は、好ましくは、他の官能基を攻撃しない利用しやすい非毒性試薬により高収率で選択的に除去可能であるものとし、保護基は、（より好ましくは、新しい立体中心を生成することなく）容易に分離することができる誘導体を形成し、また、保護基は、反応のさらなる部位を回避するような最小限の追加官能基を有する。酸素保護基、硫黄保護基、窒素保護基および炭素保護基を利用することができる。様々な保護基の例は、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．ａｎｄ  Ｗｕｔｓ，Ｐ．Ｇ．，Ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：１９９９で確認することができる。
【００１８】
本明細書で使用されている核酸化学、生化学、遺伝学および分子生物学の用語および記号は、当該分野における標準論文およびテキスト、例えば、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２）；Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７５）；Ｓｔｒａｃｈａｎ  ａｎｄ  Ｒｅａｄ，Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１）；Ｇａｉｔ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８４）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）などのものに従う。さらに、ある特定の用語は、言及を明瞭にし、容易にするために、以下で定義している。
【００１９】
本明細書に記載されている化合物は、任意の数の置換基または官能部分で置換されていてもよいことは理解されよう。
【００２０】
用語「ヌクレオチド」または「ヌクレオチド部分」は、本明細書で使用される場合、リン酸基、糖基および複素環塩基を含む、核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらの類似体）のサブユニット、ならびにこのようなサブユニットの類似体を意味する。他の基（例えば、保護基）は、ヌクレオチドの任意の成分（複数可）に結合することができる。
【００２１】
用語「ヌクレオシド」または「ヌクレオシド部分」は、本明細書で使用される場合、糖基および複素環塩基を含む、核酸サブユニット、ならびに、このようなサブユニットの類似体を意味する。他の基（例えば、保護基）は、ヌクレオシドの任意の成分（複数可）に結合することができる。
【００２２】
用語「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」は、既知のプリン塩基およびピリミジン塩基、例えば、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、またはウラシル（Ｕ）だけでなく、修飾された他の複素環塩基も含有している部分を含むものとする。このような修飾としては、メチル化プリンもしくはメチル化ピリミジン、アルキル化プリンもしくはアルキル化ピリミジン、アシル化プリンもしくはアシル化ピリミジン、ハロゲン化プリンもしくはハロゲン化ピリミジン、デアザプリン、アルキル化リボース、または他の複素環が挙げられる。このような修飾としては、例えば、ジアミノプリンおよびその誘導体、イノシンおよびその誘導体、アルキル化プリンもしくはアルキル化ピリミジン、アシル化プリンもしくはアシル化ピリミジン、チオール化プリンもしくはチオール化ピリミジンなど、または保護基、例えば、アセチル、ジフルオロアセチル、トリフルオロアセチル、イソブチリル、ベンゾイル、９−フルオレニルメトキシカルボニル、フェノキシアセチル、および置換フェノキシアセチル、ジメチルホルムアミジン、ジブチルホルムアミジン、ピロリジノアミジン、モルホリノアミジン、および他のアミジン誘導体、Ｎ，Ｎ−ジフェニルカルバメートなどの付加が挙げられる。プリン塩基またはピリミジン塩基はまた、前述の類似体であってもよい。適切な類似体は当業者に公知であり、関連するテキストおよび文献に記載されている。一般的な類似体としては、限定するものではないが、７−デアザアデニン、１−メチルアデニン、２−メチルアデニン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンチルアデニン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアデニン、８−ブロモアデニン、２−チオシトシン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、５−エチルシトシン、４−アセチルシトシン、１−メチルグアニン、２−メチルグアニン、７−メチルグアニン、２，２−ジメチルグアニン、８−ブロモグアニン、８−クロログアニン、８−アミノグアニン、８−メチルグアニン、８−チオグアニン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、５−エチルウラシル、５−プロピルウラシル、５−メトキシウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−（メチルアミノメチル）ウラシル、５−（カルボキシメチルアミノメチル）−ウラシル、２−チオウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−（２−ブロモビニル）ウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、プソイドウラシル、１−メチルプソイドウラシル、クエオシン、イノシン、１−メチルイノシン、ヒポキサンチン、キサンチン、２−アミノプリン、６−ヒドロキシアミノプリン、６−チオプリンおよび２，６−ジアミノプリンが挙げられる。
【００２３】
「核酸塩基」は、ヌクレオシドまたはヌクレオチドの複素環塩基を言及している。
【００２４】
さらに、用語「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」は、従来のリボース糖およびデオキシリボース糖だけでなく、他の糖も同様に含有している部分を含む。修飾ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオチドはまた、例えば、ヒドロキシル基の１つまたは複数が、ＬＮＡとして公知であるロックド核酸およびＵＮＡアンロックド核酸、２’−フルオロ、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−エトキシメトキシを含む、ハロゲン原子または脂肪族基で置換されているか、あるいは、エーテル、アミンなどとして官能化されている、糖部分の修飾も含んでいる。
【００２５】
用語「類似体」は、本明細書で使用される場合、ミメティック、誘導体であり、類似構造を有していると文献において認識されている構造的特徴を有する分子、または他の同様の用語を意味し、例えば、非天然（通常は自然界に存在しない）ヌクレオチドが組み込まれているポリヌクレオチド、非天然ヌクレオチドミメティック、例えば、２’−修飾ヌクレオシド、ペプチド核酸、オリゴマーヌクレオシドホスホネート、および置換基、例えば、保護基または結合基が付加されたあらゆるポリヌクレオチドが挙げられる。
【００２６】
用語「核酸」は、本明細書で使用される場合、ヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドから構成されている任意の長さの、例えば、約２塩基より大きい、約１０塩基より大きい、約１００塩基より大きい、約５００塩基より大きい、１，０００塩基より大きい、約１０，０００以下またはそれを超える塩基のポリマーを意味し、酵素的または合成的に生成することができ（例えば、米国特許第５，９４８，９０２号およびそこで引用されている文献に記載されているＰＮＡ）、それらは２つの天然に存在するヌクレオチドの場合と同様に配列特異的方法で天然に存在する核酸とハイブリダイズさせることができ、例えば、ワトソン−クリック型塩基対相互作用に関与し得る。天然に存在するヌクレオチドとしては、グアノシンおよび２’−デオキシグアノシン、シチジンおよび２’−デオキシシチジン、アデノシンおよび２’−デオキシアデノシン、チミジンおよびウリジン（それぞれ、Ｇ、ｄＧ、Ｃ、ｄＣ、Ａ、ｄＡおよびＴ、Ｕ）が挙げられる。
【００２７】
核酸は、一本鎖形態または二本鎖形態で存在し得る。二本鎖核酸は、「第１の」鎖および「第２の」鎖またはいくつかの他の任意の呼称として本明細書で言及することができる、核酸の２つの相補鎖を有している。第１の鎖と第２の鎖は異なる分子であって、第１の鎖または第２の鎖である鎖の指定は任意であり、いかなる特定の向き、機能または構造も意味するものではない。いくつかの例示的な哺乳動物染色体領域（例えば、ＢＡＣ、アセンブリ、染色体など）、ならびに多くの病原体の第１の鎖のヌクレオチド配列は公知であり、例えば、ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋデータベースで確認することができる。領域の第２の鎖は、その領域に相補的である。
【００２８】
用語「オリゴヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、ヌクレオチドの、特に約２〜５００ヌクレオチドの一本鎖多量体を意味する。オリゴヌクレオチドは合成することができるか、または、酵素的に作製することができ、いくつかの実施形態において、１０〜５０ヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドモノマーを含有していてもよく（すなわち、オリゴリボヌクレオチドであってもよく）、またはデオキシリボヌクレオチドモノマーを含有していてもよい。オリゴヌクレオチドは、特に、例えば、長さが１０〜２０、２１〜３０、３１〜４０、４１〜５０、５１〜６０、６１〜７０、７１〜８０、８０〜１００、１００〜１５０、１５０〜５００のヌクレオチド、または、長さが５００を超えるヌクレオチドを含み得る。
【００２９】
用語「デオキシリボ核酸」および「ＤＮＡ」は、本明細書で使用される場合、ヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドから構成される核酸を意味する。
【００３０】
用語「リボ核酸」および「ＲＮＡ」は、本明細書で使用される場合、ヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドから構成される核酸を意味する。
【００３１】
「ヌクレオチド間結合」または「ヌクレオチド結合」は、２つのヌクレオシド部分の間の化学連結、例えば、自然界で確認された核酸におけるホスホジエステル連結、または核酸および核酸類似体の合成の当該分野で周知の連結を意味する。ヌクレオチド間結合はリン酸基または亜リン酸基を含んでいてもよく、リン酸基または亜リン酸基の１つまたは複数の酸素原子が置換基または保護基で修飾されているか、あるいは別の原子、例えば、硫黄原子、またはモノもしくはジ−アルキルアミノ基の窒素原子で置き換えられている連結を含んでいてもよい。
【００３２】
用語「複素環」、「複素環式」、「複素環基」または「ヘテロシクロ」は、本明細書で使用される場合、芳香族（「ヘテロアリール」）または非芳香族（例えば、３〜１３員の単環式環系、７〜１７員の二環式環系、または１０〜２０員の三環式環系）を含む、少なくとも１個の炭素原子含有環中に少なくとも１個のヘテロ原子を有する完全飽和または部分不飽和もしくは完全不飽和の環状基を意味する。ヘテロ原子を含有している複素環基のそれぞれの環は、窒素原子、酸素原子および／または硫黄原子から選択される１、２、３または４個のヘテロ原子を有していてもよく、ここで、窒素ヘテロ原子および硫黄ヘテロ原子は、任意選択的に酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は、任意選択的に四級化されていてもよい。複素環基は、環または環系の任意のヘテロ原子または炭素原子に結合し得る。多環複素環の環は、１つまたは複数のスピロ結合を介して縮合、架橋、および／または結合され得る。窒素含有塩基は、複素環の例である。他の例としては、ピペリジニル、モルホリニルおよびピロリジニルが挙げられる。
【００３３】
用語「電子吸引基」は、隣接する原子からの価電子を引きつける傾向がある部分を意味する（すなわち、置換基は、隣接する原子に関して電気陰性である）。電子求引能力のレベルの定量は、ハメットシグマ定数によって得られる。この周知の定数は、多くの文献、例えば、Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５１−５９，ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ  Ｂｏｏｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９７７）に記載さされている。電子吸引基としては、ニトロ、アシル、ホルミル、スルホニル、トリフルオロメチル、シアノ、クロリドなどが挙げられる。
【００３４】
用語「電子供与基」は、隣接する原子から価電子を放出する傾向がある部分を意味する（すなわち、置換基は、隣接する原子に関してそれほど電気陰性ではない）。電子供与基としては、アミノ、メトキシ、アルキル（直鎖状構造または分枝状構造を有し得るＣ１〜６アルキルを含む）、Ｃ４〜９シクロアルキルなどが挙げられる。
【００３５】
語句「保護基」は、本明細書で使用される場合、分子の一部が特定の化学反応を受けることを阻止するが、その反応の終了後に分子から除去され得る種を意味する。「保護基」は、例えば、Ｇｒｅｅｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，”Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１で教示されているように、所望する反応の特定条件下で、官能基を可逆的に反応させないようにする基として、従来の化学的意味において使用される。所望の反応の後に、保護基を除去し、保護された官能基を脱保護することができる。すべての保護基は、合成されている分子のかなりの部分を分解しないという条件下で、除去可能なものとする（したがって、化学変化をおこしやすいものとする）。保護基とは対照的に、「キャッピング基」は、分子のセグメントに永続的に結合し、そのセグメントのさらなるいかなる化学変化も阻止する。保護基によって保護されている官能基は保護基と呼ばれるものの一部であってもよいし、一部でなくてもよいことに留意されたい。
【００３６】
用語「ヒドロキシル保護基」または「Ｏ−保護基」は、本明細書で使用される場合、保護された基がヒドロキシルである保護基を意味する。「反応部位ヒドロキシル」は、３’−５’ポリヌクレオチド合成中の末端５’−ヒドロキシルであるか、または５’−３’ポリヌクレオチド合成中の３’−ヒドロキシルである。「遊離反応部位ヒドロキシル」は、ポリヌクレオチド合成中に反応し、（例えば、ホスホラミダイト官能基との）ヌクレオチド間結合を形成することができる反応部位ヒドロキシルである。
【００３７】
用語「アルキル」は、本明細書で使用される場合、（例えば、１〜２４個、典型的には１〜１２個の）炭素原子を有する飽和直鎖、分枝状または環状の炭化水素基、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、シクロペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、シクロヘキシル、３−メチルペンチル、２，２−ジメチルブチル、および２，３−ジメチルブチルなどを意味する。アルキルは、環状アルキル基、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルおよびシクロオクチルを意味する「シクロアルキル」を含む。
【００３８】
用語「アルケニル」は、本明細書で使用される場合、別段の指定がない限り、少なくとも１つの二重結合を含有する、２〜２４個、典型的には２〜１２個の炭素原子の分枝状、非分枝状または環状（例えば、Ｃ５およびＣ６の場合）の炭化水素基、例えば、エテニル、ビニル、アリル、オクテニル、デセニルなどを意味する。用語「低級アルケニル」は、２〜８個の炭素原子のアルケニル基を意味し、特にビニルおよびアリルを含む。用語「シクロアルケニル」は、環状アルケニル基を意味する。
【００３９】
用語「アルキニル」は、本明細書で使用される場合、別段の指定がない限り、少なくとも１つの三重結合を含有する、２〜２４個、典型的には２〜１２個の炭素原子の分枝状または非分枝状の炭化水素基、例えば、アセチレニル、エチニル、ｎ−プロピニル、イソプロピニル、ｎ−ブチニル、イソブチニル、ｔ−ブチニル、オクチニル、デシニルなどを意味する。用語「低級アルキニル」は、２〜８個の炭素原子のアルキニル基を意味し、例えば、アセチレニルおよびプロピニルを含み、用語「シクロアルキニル」は、環状アルキニル基を意味する。
【００４０】
用語「ヒドロカルビル」は、本明細書で使用される場合、アルキル、アルケニルまたはアルキニルを意味する。別段の指定がない限り、用語ヒドロカルビルは、概して、炭化水素骨格の１個または複数の炭素上の水素を置き換える置換基を有するヒドロカルビル部分を意味する、「置換ヒドロカルビル」を包含する。このような置換基としては、例えば、ヒドロキシル、ハロゲン、カルボニル（例えば、カルボキシル、アルコキシカルボニル、ホルミル、またはアシル）、チオカルボニル（例えば、チオエステル、チオアセテート、またはチオホルメート）、アルコキシル、ホスホリル、ホスホネート、ホスフィネート、アミノ、アミド、アミジン、イミン、シアノ、ニトロ、アジド、スルフヒドリル、アルキルチオ、スルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、スルホニル、複素環、アラルキル、または芳香族もしくは複素環式芳香族部分を挙げることができる。炭化水素鎖上で置換された部分は、それ自体、適切な場合には置換され得ることは、当業者には理解されよう。例えば、置換アルキルの置換基としては、置換形態および非置換形態のアミノ、アジド、イミノ、アミド、ホスホリル（ホスホネートおよびホスフィネートを含む）、スルホニル（スルフェート、スルホンアミド、スルファモイルおよびスルホネートを含む）、およびシリル基、ならびにエーテル、アルキルチオ、カルボニル（ケトン、アルデヒド、カルボキシレート、およびエステルを含む）、−−ＣＮなどを挙げることができる。シクロアルキルは、アルキル、アルケニル、アルコキシ、アルキルチオ、アミノアルキル、カルボニル置換アルキル、−ＣＮなどでさらに置換され得る。
【００４１】
用語「アルコキシ」または「アルキルオキシ」は、酸素に連結したアルキル基を意味し、式：Ｒ−Ｏ−（式中、Ｒはアルキル基を表す）によって表すことができる。一例は、メトキシ基ＣＨ３Ｏ−である。
【００４２】
用語「アリール」は、特に、０〜４個のヘテロ原子を含み得る、５、６、および７員の単環芳香族基または多環芳香族基、例えば、ベンゼン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジンおよびピリミジンなどを意味する。環構造中にヘテロ原子を有するそれらのアリール基はまた、「アリール複素環」または「複素環式芳香族」と呼ぶこともできる。用語「アリール」はまた、２個以上の炭素が２つの隣接する環に共通しており（環は「縮合環」である）、ここで、環の少なくとも１つが芳香族である（例えば、他の環状環は、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、および／または複素環であってよい）、２つ以上の環状環を有する多環式環系を含む。縮合環アリール基の一例は、ナフタレンである。「低級アリール」は、１８個以下の炭素、例えば、１４、１２、１０、８または６個以下の炭素を含有する。
【００４３】
芳香族環は、１つまたは複数の環位置で、置換ヒドロカルビルについて上述したような置換基、例えば、ハロゲン、アジド、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ケトン、アルデヒド、エステル、複素環式、芳香族もしくは複素環式芳香族部分、−ＣＦ３、−ＣＮなどで置換されていてもよい。
【００４４】
用語「ハロゲン」は、本明細書で使用される場合、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を意味する。
【００４５】
本明細書で使用される場合の「連結」とは、２つの他の部分が第１の部分を介して連結されている、２つの他の部分に結合されている第１の部分を意味する。典型的な連結としては、エーテル（−Ｏ−）、オキソ（−Ｃ（Ｏ）−）、アミノ（−ＮＨ−）、アミド（−Ｎ−Ｃ（Ｏ）−）、チオ（−Ｓ−）、ホスホ（−Ｐ−）、エステル（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−）が挙げられる。
【００４６】
用語「官能化された」は、本明細書で使用される場合、物質に結合されている特定の部分を有するように物質を修飾するプロセスを意味し、例えば、分子または基質を、特定の部分を有するように修飾するプロセスである。このように修飾された物質（例えば、分子または支持体）は、官能化された物質（例えば、官能化分子または官能化支持体）と呼ばれる。
【００４７】
化学構造、基、または部分を記載するために使用される場合の用語「置換されている（された）」は、１個または複数の置換基を含む構造、基、または部分を意味する。本明細書で使用される場合、第１の基が第２の基「で置換されている」場合、第１の基の部分（典型的には水素）が第２の基で置き換えられていることにより、第２の基は第１の基に結合されている。例えば、アルキル基が「Ｒ」基を有し、Ｒが水素である場合、アルキル基は、マークした位置で非置換であると考えられ、一方、その水素がハロゲンで置き換えられている場合、それはその位置でハロゲンによって置換されていると考えられる。
【００４８】
用語「置換基」は、本明細書で使用される場合、化学構造中の別の基を置き換える基を意味する。典型的な置換基としては、非水素原子（例えば、ハロゲン）、官能基（例えば、限定するものではないが、アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル、アルコキシ、カルボキシル、シリル、シリルオキシ、ホスフェートなど）、ヒドロカルビル基、および１個または複数のヘテロ原子で置換されているヒドロカルビル基が挙げられる。例示的な置換基としては、アルキル、低級アルキル、アリール、アラルキル、低級アルコキシ、チオアルキル、ヒドロキシル、チオ、メルカプト、アミノ、イミノ、ハロ、シアノ、ニトロ、ニトロソ、アジド、カルボキシ、スルフィド、スルホン、スルホキシ、ホスホリル、シリル、シリルオキシ、ボロニル、および修飾された低級アルキルが挙げられる。
【００４９】
「任意選択的な」または「任意選択的に」は、その後に記載されている状況が起こり得るか、または起こり得ないことを意味し、そのため、その記載はその状況が起こる場合と起こらない場合を含む。例えば、語句「任意選択的に置換されている」は、非水素置換基が存在し得るか、または存在し得ないことを意味し、したがってその記載は、非水素置換基が存在する構造、および非水素置換基が存在しない構造を含む。本明細書中の様々な箇所で、部分はゼロ回以上存在するものとして記載され得る。これはその部分が任意選択的であることと同等であり、その部分が存在する実施形態およびその部分が存在しない実施形態を含む。任意選択的な部分が存在しない（構造中にゼロ回存在する）ならば、任意選択的な部分によって連結されていると記載された隣接する基は、互いに直接連結されている。同様に、部分は、（１）２個の隣接する基を連結している基であるか、または（２）２個の隣接する基を連結している結合であると記載され得る。記述（１）および（２）は、部分が任意選択的であるのに等しく、また、部分が存在する実施形態、および部分が存在しない実施形態を含む。任意選択的な部分が存在しない（構造中でゼロ回存在する）場合、任意選択的な部分によって連結されていると記載された隣接する基は、互いに直接連結されている。
【００５０】
「単離された」または「精製された」は、概して、物質が存在する試料中の実質的な部分を物質が構成する（溶媒を除く）ように、すなわち、物質がその自然状態または非単離状態において典型的に確認される場合よりも多くなるように、物質（化合物、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、ポリペプチド、染色体など）を単離することを意味する。典型的には、試料の実質的な部分は、試料の少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％を構成する（溶媒を除く）。例えば、単離されたＲＮＡの試料は、典型的には、少なくとも約５％の全ＲＮＡを含み、ここで、パーセントは、この文脈では試料中の全ＲＮＡの質量（例えば、マイクログラム）を（試料中の全ＲＮＡ＋他の構成要素（溶媒を除く））の合計の質量（例えば、マイクログラム）で割ったものとして計算される。対象のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを精製する技術は当技術分野では周知であり、例えば、ゲル電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、フローソーティング、および密度による沈殿などが挙げられる。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド組成物（複数可）の１つまたは複数は単離された形態である。
【００５１】
本明細書で使用される場合、（Ｃｘ〜Ｃｙ）は、概して、ｘからｙ個（端数を含む）の炭素原子を有する基を意味する。したがって、例えば、Ｃ１〜Ｃ６とは、１、２、３、４、５、または６個の炭素原子を有する基を意味し、これは、Ｃ１〜Ｃ２、Ｃ１〜Ｃ３、Ｃ１〜Ｃ４、Ｃ１〜Ｃ５、Ｃ２〜Ｃ３、Ｃ２〜Ｃ４、Ｃ２〜Ｃ５、Ｃ２〜Ｃ６、およびすべての同様の組合せを包含する。（Ｃ１〜Ｃ２０）および同様のものは、同様に１〜２０個（端数を含む）の炭素原子の様々な組合せ、例えば、（Ｃ１〜Ｃ６）、（Ｃ１〜Ｃ１２）、および（Ｃ３〜Ｃ１２）を包含する。
【００５２】
用語「共有結合の」または「共有結合で」は、本明細書で使用される場合、原子間の化学結合相互作用の性質を意味する。共有結合は、原子間の電子対の共有を伴う化学結合である。それらが電子を共有する場合の原子間の引力および反発力の安定したバランスは、共有結合と呼ばれる。電子の共有によって、それぞれの原子は、安定した電子配置に対応する、完全な外殻と等しいものが得られる。共有結合は、様々な種類の相互作用、例えば、σ−結合、π−結合、金属−金属結合、アゴスティック相互作用、および三中心二電子結合などを含む。
【００５３】
用語「非共有結合の」または「非共有結合で」は、本明細書で使用される場合、原子間の化学結合相互作用の性質を意味する。非共有結合は、電子対の共有は伴わないが、電磁相互作用のより分散された変形を伴う、一種の化学結合である。一般に言及されている４種類の非共有結合相互作用があり、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力および疎水的相互作用である。
【００５４】
用語「精製された」または「精製すること」は、本明細書で使用される場合、試料からの成分（例えば、夾雑物）を除去することを意味する。
【００５５】
詳細な説明
本開示は、許容され得る純度および収率を達成しながら、従来技術によって生成される核酸分子よりも長さの大きい核酸分子の信頼性の高い合成の新規の方法を提供する。本開示の態様は、長さが２００以上のモノマー単位の配列を有する長鎖ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）の合成を提供するリン保護基および／または核酸塩基保護基を使用する方法および組成物である。
【００５６】
段階カップリング収率の増加を促進するリン保護基および／または酸化ステップ中に除去することができるリン保護基を提供する。ポリヌクレオチド合成中の脱プリンに対する耐性を高め、例えば、アンモニアでのポリヌクレオチド切断中の核酸塩基の脱保護時間を短縮し、副産物、例えば、核酸塩基付加物を減少させながら粗製オリゴヌクレオチドの純度を高める本主題の組成物および方法における使用が見出されるアミジン核酸塩基保護基を提供する。ある場合には、本明細書に開示されている方法および組成物は、長さが２００以上のモノマー単位の配列を有するポリヌクレオチドの合成において、リン保護基および核酸塩基保護基の組合せを利用することができる。
【００５７】
本開示の態様は、ヌクレオチド間結合が、次の酸化サイクル中に生じる加水分解反応（例えば、下記の概略図を参照）を受けにくいようにヨウ素酸化中に除去することができる、新しいリン保護基を含む。この新規の手法によって、大型欠失の少ないオリゴヌクレオチドが得られる。
【化２】
0006730932.tif 000003
【００５８】
ヌクレオチド間結合で本開示の保護基を使用することには、ホスホラミダイトのカップリング効率が上昇するという長所もある。固相ホスホラミダイトＤＮＡ合成で最も頻繁に使用されるリン保護基は、シアノエチル保護基である（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．１９６９  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９１（１２），３３６０−５）。この保護基は、以下のスキーム：
【化３】
0006730932.tif 000004
に示すように、ヘテロ塩基保護基がアンモニアまたはアルキルアミンを使用する合成の終了時に除去されるのと同一条件下でβ−脱離反応によって除去される。
【００５９】
本開示のさらなる態様は、現在のシアノエチルホスホラミダイト化学の実施で生じ得るホスホトリエステルヌクレオチド間結合の加水分解を最小限にするリン保護基の設計である。代わりに、ヨウ素酸化中、ホスホトリエステルヌクレオチド間中間体は、保護基の切断によって、加水分解に安定性のあるリン酸ジエステルヌクレオチド間連結に変換される。リン保護基の切断は、不完全、例えば、ほぼ５０％となり得るが、ヌクレオチド間結合の加水分解の阻止に対し、依然として有意な効果を有し得る。切断は５０％を超えるのが好ましく、１００％に近いことがより好ましい。本開示のさらなる態様は、ヨウ素酸化中に５０％〜１００％で切断され、次いで、例えば、チオラート試薬またはその誘導体を使用する求核攻撃によって、または塩基もしくは塩基性アミンもしくは組合せを使用するβ−脱離またはα断片化によって、オリゴヌクレオチド合成の終了時に完全に切断される保護基である。
【００６０】
本開示の別の態様は、酸化ステップ中にリン保護基の切断を促進し増加させるためのヨウ素酸化溶液への塩基の添加である。このような塩基の例としては、ｔ−ブチルアミン、ジイソプロピルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ＤＢＵ、および他の非求核性塩基が挙げられる。
【００６１】
一態様において、本開示は、概して、構造式（Ｉ）：
【化４】
0006730932.tif 000005
［式中、
Ｂは、核酸塩基またはその類似体であり；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、直鎖状、分枝状もしくは環状の置換もしくは非置換アルキルであるか、または、Ｒ１とＲ２は一緒になって５、６、７または８員の非芳香族環を形成しており；
Ｒ３は、酸不安定性保護基であり；
Ｒは、ベンジルアルコール誘導体（ｏ−メチルベンジルを除く）、α−メチルアリールアルコール誘導体、ナフタレンアルコール誘導体、二環式脂肪族アルコール誘導体、アシルチオアルキルアルコール誘導体、Ｓ−エチルチオエート誘導体およびアミノ酸誘導体からなる群から選択されるリン保護基である］
を有する化合物に関する。
【００６２】
いくつかの実施形態において、Ｂは、核酸塩基がアデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル、またはそれらの誘導体または類似体から選択される、核酸塩基または保護された核酸塩基である。
【化５】
0006730932.tif 000006
【００６３】
任意の都合のよい保護基を本主題の化合物において利用することができる。いくつかの実施形態において、Ｂは保護された核酸塩基である。ある特定の実施形態において、核酸塩基は、従来のプリン塩基もしくはピリミジン塩基、例えば、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）もしくはウラシル（Ｕ）、またはそれらの保護された形態であってよく、例えば、この場合、塩基は、アセチル、ジフルオロアセチル、トリフルオロアセチル、イソブチリル、ベンゾイル、フェノキシアセチル、４−（ｔ−ブチル）フェノキシアセチルなどの保護基で保護されている。ある特定の実施形態において、核酸塩基は、アミジン保護基（例えば、本明細書に記載されているもの）を含む。
【００６４】
プリン塩基またはピリミジン塩基はまた、前述のものの類似体であってもよい。適切な類似体としては、限定するものではないが、１−メチルアデニン、２−メチルアデニン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンチルアデニン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアデニン、８−ブロモアデニン、２−チオシトシン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、５−エチルシトシン、４−アセチルシトシン、１−メチルグアニン、２−メチルグアニン、７−メチルグアニン、２，２−ジメチルグアニン、８−ブロモグアニン、８−クロログアニン、８−アミノグアニン、８−メチルグアニン、８−チオグアニン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、５−エチルウラシル、５−プロピルウラシル、５−メトキシウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−（メチルアミノメチル）ウラシル、５−（カルボキシメチルアミノメチル）−ウラシル、２−チオウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−（２−ブロモビニル）ウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、プソイドウラシル、１−メチルプソイドウラシル、クエオシン、イノシン、１−メチルイノシン、ヒポキサンチン、キサンチン、２−アミノプリン、６−ヒドロキシアミノプリン、６−チオプリンおよび２，６−ジアミノプリンが挙げられる。
【００６５】
Ｒ１およびＲ２は、同一であっても、異なっていてもよい。Ｒ１およびＲ２は、両方とも直鎖状、両方とも分枝状もしくは環状、または混合のアルキル基であり得る。Ｒ１およびＲ２は、両方とも非置換アルキルであり得るか、または、それらのうちの１つが置換されているか、もしくは両方が置換されている。
【００６６】
一部の例では、Ｒ１およびＲ２は、５、６、７または８員の環状構造（以下に示す環Ｑ）、例えば、非芳香族環の構成要素であってもよく、それらは一緒になってこの構造を形成する。
【化６】
0006730932.tif 000007
【００６７】
ある特定の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、直鎖状、分枝状または環状の置換または非置換Ｃ１〜Ｃ１８アルキルである。ある特定の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、直鎖状または分枝状の非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、直鎖状のＣ１〜Ｃ３アルキル（すなわち、メチル、エチルおよびプロピル）である。ある特定の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、分枝状のＣ３〜Ｃ６アルキルである。例えば、式（Ｉａ）の化合物において、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ、式（Ｉａ）で示したように、イソプロピルであってもよく、またはイソブチルであってもよい。
【化７】
0006730932.tif 000008
【００６８】
ある特定の実施形態において、環Ｑは、環が骨格中に０または１個のヘテロ原子を有する、５または６員の非芳香族環である。ある特定の実施形態において、環Ｑは、骨格中に０個のヘテロ原子を有する５員の非芳香族環である。ある特定の実施形態において、環Ｑは、５員非芳香族の置換または非置換シクロアルキル環である。
【００６９】
構造式（Ｉｂ）は、Ｑが５員の非芳香族環である例示的な実施形態を示す。Ｒ４は任意の適切な基であってよく、例えば、それぞれ、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルキルオキシから独立して選択される。
【化８】
0006730932.tif 000009
【００７０】
ある特定の実施形態において、Ｒ４は水素であり（すなわち、非置換の環Ｑ）、その構造は式（Ｉｃ）として示される。
【化９】
0006730932.tif 000010
【００７１】
ある場合には、Ｒ３は、酸不安定性保護基である。目的のＲ３基の例としては、限定するものではないが、（４，４’−ジメトキシトリチル）（ＤＭＴ）、ＭＭＴ（モノメトキシトリチル）、トリメトキシトリチル、ピキシル（９−フェニルキサンチル）およびピバロイルが挙げられる（Ｆｉｓｈｅｒ，ｅｔ  ａｌ．１９８３  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１，１５８９−１５９９．）。
【００７２】
ある場合には、Ｒは、ベンジルアルコール誘導体（ｏ−メチルベンジルを除く）、α−メチルアリールアルコール誘導体、ナフタレンアルコール誘導体、二環式脂肪族アルコール誘導体、アシルチオアルキルアルコール誘導体、およびアミノ酸誘導体からなる群から選択される基である。ある特定の場合には、ＲはＳ−（エチル）ベンゾチオエートである。
【００７３】
アシルチオアルキルアルコール誘導体は、アルキル基に連結されているアシル化チオール基（例えば、Ｒ−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−アルキル−、式中、Ｒはヒドロカルビル、アリールまたはヘテロアリールである）を含む。場合によっては、アシルチオアルキルアルコール誘導体のアルキル基は、エチル基である。本明細書で使用される場合、用語「Ｓ−エチルチオエート」および「アシルチオエチル」は同義で使用されている。いくつかの実施形態において、アシルチオアルキルアルコール誘導体は、Ｓ−エチルチオエート誘導体である。ある特定の場合には、アシルチオアルキルアルコール誘導体は、Ｓ−（エチル）ベンゾチオエートである。ある特定の実施形態において、本開示の化合物は、
【化１０】
0006730932.tif 000011
［式中、Ｒ７は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、ヒドロカルビル（例えば、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル）およびアルキルオキシから選択される］
の構造式（Ｉｄ）を有する。
【００７４】
ある特定の実施形態において、本開示の化合物は、構造式（Ｉｅ）：
【化１１】
0006730932.tif 000012
［式中、Ｒ７は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、ヒドロカルビル（例えば、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル）およびアルキルオキシから選択される］
を有する。
【００７５】
ある特定の実施形態において、本開示の化合物は、構造式（Ｉｆ）：
【化１２】
0006730932.tif 000013
［式中、Ｒ８は脂肪族基である］
を有する。
【００７６】
ある特定の実施形態において、（上記の式（Ｉａ〜ｃ）中の）Ｒは、構造式（ＩＩ）：
【化１３】
0006730932.tif 000014
［式中、Ｒａは、水素、またはアルキルであり；Ｒ１１は、それぞれ独立して、水素、アルキル、アルコキシ、アルキル−Ｓ−、シアノ、メチルシアノまたはハロゲンであり；ｎは１、２、または３である］
を有するベンジルアルコール（ｏ−メチルベンジルを除く）の誘導体である。Ｒａが水素である式（ＩＩ）のいくつかの実施形態において、Ｒ１１は、オルト位でメチルではない。
【００７７】
Ｒが選択され得る例示的な基としては、ベンジルアルコールの誘導体、例えば、
【化１４】
0006730932.tif 000015
［式中、Ｒ６は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、シアノ、メチルシアノおよびヒドロカルビル（例えば、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル）から選択される］
が挙げられる。
【００７８】
特に、Ｒが誘導され得る例示的な基としては、
【化１５】
0006730932.tif 000016
［式中、Ｒ９は、水素、ハロゲン、シアノ、シアノエチル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキルオキシ、ニトロ、および他の電子吸引基から選択され、Ｒ７は、水素、ハロゲン、ヒドロカルビル（例えば、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル）、アルキルオキシ、および電子吸引基から独立して選択される１つまたは複数の置換基である］
が挙げられる。
【００７９】
いくつかの実施形態において、Ｒは、構造：
【化１６】
0006730932.tif 000017
［式中、Ｒ７は、水素、ハロゲン、ヒドロカルビル（例えば、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル）、アルキルオキシ、および電子吸引基からそれぞれ独立して選択される１つまたは複数の置換基である］
によって説明される。
【００８０】
ある特定の実施形態において、Ｒは、構造：
【化１７】
0006730932.tif 000018
［式中、Ｒ９は、水素、ハロゲン、シアノ、シアノエチル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキルオキシ、ニトロ、および電子吸引基から選択される］
によって説明される。
【００８１】
Ｒが誘導され得る例示的な基はまた、構造式（ＩＩＩ）：
【化１８】
0006730932.tif 000019
［式中、Ｘは、水素、ハロゲン、シアノまたはトリフルオロメチルであり；Ｙは、水素、アルキル、ハロアルキルまたはアルコキシアルキルであり；Ｒａは、水素またはアルキルである］
を有するα−メチルアリールアルコール誘導体が挙げられる。式（ＩＩＩ）のいくつかの実施形態において、ＸとＹは同時に水素ではなく、また、ＲａとＸの両方が水素である場合、Ｙはメチルではない。例示的なＲ基としては、
【化１９】
0006730932.tif 000020
［式中、Ｒ９は、ハロゲン、シアノまたはトリフルオロメチルであり；Ｒ１０は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキルオキシ、ニトロ、および他の電子吸引基から選択される］
が挙げられる。
【００８２】
Ｒはまた、構造式（ＩＶ）：
【化２０】
0006730932.tif 000021
［式中、Ｒ７は１個または複数の基であり、Ｒ７は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、シアノ、メチルシアノ、ヒドロカルビル（例えば、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル）およびアルキルオキシから選択され；Ｒ５は、水素およびヒドロカルビル（例えば、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル）から選択され；Ｒ１２は１個または複数の基であり、Ｒ１２は、それぞれ独立して、水素およびアルコキシから選択される］
を有するナフタレンアルコール誘導体から誘導され得る。ある特定の場合には、Ｒ７は単一の基であり、Ｒ１２は単一の基である。
【００８３】
Ｒが誘導され得る例示的な基としてはまた、
【化２１】
0006730932.tif 000022
［式中、Ｒ７は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、シアノ、メチルシアノ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルキルオキシから選択され；Ｒ５は、水素およびヒドロカルビル（例えば、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル）から独立して選択され；Ｒ１３はＣ１〜Ｃ６アルキルである］
が挙げられ、Ｒはまた、構造式（Ｖ）または（ＶＩ）：
【化２２】
0006730932.tif 000023
［式中、Ｒ１４は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルキルオキシから選択され；Ｒ１５およびＲ１６は、それぞれ独立して、水素、シアノ、シアノメチル、アルコキシまたはハロゲンであり、ｍは、１または２である］
を有する二環式脂肪族アルコール誘導体から選択することができる。
【００８４】
Ｒが誘導され得る例示的な基としてはまた、
【化２３】
0006730932.tif 000024
［式中、Ｒ１４は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルキルオキシから選択され；Ｒ１５は、水素、ハロゲンまたはＣ１〜Ｃ６アルコキシであり、Ｒ１６は、水素、シアノまたはハロゲンである］
が挙げられる。
【００８５】
さらに、Ｒが選択され得る例示的な基としては、
【化２４】
0006730932.tif 000025
［式中、Ｒ７は、それぞれ、水素、ハロゲン、シアノ、メチルシアノ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルキルオキシから選択され；Ｒ８は、脂肪族基である］
が挙げられる。
【００８６】
いくつかの実施形態において、Ｒは、以下の構造：
【化２５】
0006730932.tif 000026
［式中、Ｒ７は、水素、ハロゲン、シアノ、メチルシアノ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ１〜Ｃ６アルキルオキシである］
を有するＳ−（２−ヒドロキシルエチル）ベンゾチオエート−アルコールから誘導される。
【００８７】
いくつかの実施形態において、Ｒは、以下の構造：
【化２６】
0006730932.tif 000027
［式中、Ｒ８は脂肪族基である］
を有するＳ−（２−ヒドロキシルエチル）アルキルチオエート−アルコールから誘導される。
【００８８】
さらに、Ｒが選択され得る例示的な基は、
【化２７】
0006730932.tif 000028
が挙げられる。
【００８９】
方法
本開示の態様は、本主題の化合物を使用してポリヌクレオチドを合成する方法を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、（ａ）保護されていないヒドロキシル基を有するヌクレオシド残基を用意すること；（ｂ）ヌクレオシド残基を（例えば、本明細書に記載されているような）ヌクレオシドモノマーと接触させて、ヌクレオシドモノマーをヌクレオシド残基に共有結合させポリヌクレオチドを生成することとを含む。
【００９０】
いくつかの実施形態において、本方法は、ポリヌクレオチドを酸化剤に曝露することをさらに含む。任意の都合のよい酸化剤を利用することができる。いくつかの実施形態において、本方法は、核酸を脱保護剤に曝露して、例えば、末端の保護基（例えば、本明細書に記載されているような、３’または５’酸不安定性保護基）を脱保護し、さらなるカップリング反応が可能な遊離ヒドロキシル末端を生成することを含む。
【００９１】
いくつかの実施形態において、本方法は、接触させるステップを少なくとも一回繰り返すことをさらに含む。本方法のステップは、所望の長さのポリヌクレオチドが得られるまで繰り返すことができる。ある場合には、ポリヌクレオチド合成のサイクルは、所望の長さおよび配列のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）が得られるまで、２００回以上、例えば、２５０回以上、３００回以上、４００回以上、５００回以上、６００回以上、７００回以上、８００回以上、９００回以上、１０００回以上、またはそれより多く繰り返される。
【００９２】
本方法のいくつかの実施形態において、ヌクレオシド残基は、固相支持体に共有結合されている。任意の都合のよい支持体を本主題の方法において利用することができる。目的の支持体としては、限定するものではないが、アレイなどの平面表面、ビーズなどが挙げられる。適切な固相支持体は、ある場合にはポリマーであり、様々な形態および構成を有していてもよく、天然に存在する材料、合成的に修飾された天然に存在する材料、または合成材料由来である。適切な支持体材料の例としては、限定するものではないが、多糖類、例えば、アガロース（例えば、ＰｈａｒｍａｃｉａからＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）として市販されているもの）およびデキストラン（例えば、またＰｈａｒｍａｃｉａから商品名Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）およびＳｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）として市販されているもの）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルメタクリレートとメチルメタクリレートのコポリマー、シリカ、テフロン、ガラスなどが挙げられる。基質表面上で合成されるポリヌクレオチドの最初のモノマーは、ある場合には、連結部分に結合され、次に、これはシリカ基質上に存在する表面の親水基、例えば、表面のヒドロキシル部分に結合される。本方法のある特定の実施形態において、前記方法は、固相支持体から核酸を切断し、遊離のポリヌクレオチド（例えば、遊離核酸）を生成することをさらに含む。
【００９３】
任意の都合のよいポリヌクレオチド合成方法、ストラテジーおよび化学が本主題の組成物および方法を用いての使用に適し得る。本主題の方法における使用に適し得る目的のポリヌクレオチド合成化学および方法としては、限定するものではないが、ホスホラミダイト、Ｈ−ホスホネート、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、およびホスファイトトリエステル、ならびに、Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２２：１８５９、Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒらに対する米国特許第６，２２２，０３０号；Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒらに対する米国特許出願公開第ＵＳ２００２／００５８８０２Ａ１号；およびＳｅｉｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．４２  （４９）：８６５７−８６６０に記載されているそれらの方法および材料が挙げられる。
【００９４】
ある特定の実施形態において、３’から５’への合成については、以下の構造：
【化２８】
0006730932.tif 000029
［式中、
【化２９】
0006730932.tif 000030
は（任意選択的なリンカーを介して連結されている）固相支持体または支持体結合されたポリヌクレオチド鎖を表し；
Ｒは、水素、保護されたヒドロキシル基、フルオロ、アルコキシ、Ｏ−エチレンオキシアルキル（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＲ）、保護されたアミノ、保護されたアミド、または保護されたアルキルアミノであり、ここで、Ｒが水素である場合、支持体結合されたヌクレオシドは、ＤＮＡ合成で存在するようなデオキシリボヌクレオシドであり、また、Ｒが保護されたヒドロキシル基である場合、支持体結合されたヌクレオシドは、ＲＮＡ合成で存在するようなリボヌクレオシドであり；
Ｂは、核酸塩基または保護された核酸塩基、例えば、プリン塩基またはピリミジン塩基である］
を有する支持体結合されたヌクレオシド残基が提供される。
【００９５】
ある特定の実施形態において、核酸塩基は、従来のプリン塩基またはピリミジン塩基、例えば、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）もしくはウラシル（Ｕ）、または、例えば、塩基がアセチル、ジフルオロアセチル、トリフルオロアセチル、イソブチリル、ベンゾイルなどの保護基で保護されている、それらの保護された形態であってよい。プリン塩基またはピリミジン塩基はまた、前述のものの類似体であってもよい。適切な類似体としては、限定するものではないが、１−メチルアデニン、２−メチルアデニン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンチルアデニン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアデニン、８−ブロモアデニン、２−チオシトシン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、５−エチルシトシン、４−アセチルシトシン、１−メチルグアニン、２−メチルグアニン、７−メチルグアニン、２，２−ジメチルグアニン、８−ブロモグアニン、８−クロログアニン、８−アミノグアニン、８−メチルグアニン、８−チオグアニン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、５−エチルウラシル、５−プロピルウラシル、５−メトキシウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−（メチルアミノメチル）ウラシル、５−（カルボキシメチルアミノメチル）−ウラシル、２−チオウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−（２−ブロモビニル）ウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、プソイドウラシル、１−メチルプソイドウラシル、クエオシン、イノシン、１−メチルイノシン、ヒポキサンチン、キサンチン、２−アミノプリン、６−ヒドロキシアミノプリン、６−チオプリンおよび２，６−ジアミノプリンが挙げられる。
【００９６】
別の態様において、本開示は、本明細書に記載されている１つまたは複数の化合物を使用したＤＮＡを合成する方法を提供する。
【００９７】
ある特定の実施形態において、合成された核酸（例えば、ＤＮＡ）は、少なくとも約１５０ヌクレオチド、例えば、少なくとも約１５５ヌクレオチド、少なくとも約１６０ヌクレオチド、少なくとも約１６５ヌクレオチド、少なくとも約１７０ヌクレオチド、少なくとも約１７５ヌクレオチド、少なくとも約１８０ヌクレオチド、少なくとも約１８５ヌクレオチド、少なくとも約１９０ヌクレオチド、少なくとも約１９５ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド、少なくとも約２０５ヌクレオチド、少なくとも約２１０ヌクレオチド、少なくとも約２１５ヌクレオチド、少なくとも約２２０ヌクレオチド、少なくとも約２２５ヌクレオチド、少なくとも約２３０ヌクレオチド、少なくとも約２４０ヌクレオチド、少なくとも約２５０ヌクレオチド、少なくとも約２５５ヌクレオチド、少なくとも約２６０ヌクレオチド、少なくとも約２７０ヌクレオチド、少なくとも約２８０ヌクレオチド、少なくとも約３００ヌクレオチドの配列を有する。ある場合には、上述の実施形態のいずれか１つにおいて、合成された核酸（例えば、ＤＮＡ）は約５００ヌクレオチド以下、例えば、約４００ヌクレオチド以下、または約３００ヌクレオチド以下を有する配列を有する。ある特定の実施形態において、合成されたＤＮＡは、少なくとも約２００ヌクレオチドの配列を有する。ある特定の実施形態において、合成されたＤＮＡは、約１５０ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチド、例えば、約１５０ヌクレオチド〜約４００ヌクレオチド、約１５０ヌクレオチド〜約３００ヌクレオチド、または約２００ヌクレオチド〜約３００ヌクレオチドの配列を有する。
【００９８】
ある特定の実施形態において、合成されたＤＮＡは、約２００マー〜約１，０００マーの長さである（例えば、特に、約２００マー〜約８００マー、約２００マー〜約５００マー、約３００マー〜約８００マー、約３００マー〜約５００マーを含有する）。ある特定の実施形態において、合成されたＤＮＡは、１００ヌクレオチド当たり２つ以下の単一ヌクレオチド欠失を有する。ある特定の実施形態において、合成されたＤＮＡは、１００ヌクレオチド当たり１つ以下の単一ヌクレオチド欠失を有する。
【００９９】
いくつかの実施形態において、本方法は、第１の遊離核酸を第２の遊離核酸とカップリングさせ、特に、約３００〜約１０，０００ヌクレオチドの長さを有する伸長された遊離核酸を生成することをさらに含む。本明細書で使用される場合、用語、伸長された遊離核酸は、主題の直鎖段階合成法を使用して合成される、核酸断片の断片縮合によって生成される遊離核酸を意味する。任意の都合のよい核酸断片カップリング法を利用し、主題の直鎖段階合成法によって生成される、目的の核酸断片からより大きく伸長された核酸分子を構築することができる。ある特定の実施形態において、本方法は、１つまたは複数の追加の遊離核酸を伸長された遊離核酸をカップリングして（例えば、断片縮合）、遺伝子を生成することをさらに含む。
【０１００】
本開示の態様は、本主題の方法の核酸生成物をさらに含む。本開示の方法の核酸生成物、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡは、ある特定の実施形態において、２００以上、例えば、２５０以上、３００以上、３５０以上、４００以上、４５０以上、５００以上、またはそれ超のモノマー単位の長さの範囲でサイズが変動し得る。いくつかの実施形態において、核酸生成物は、特に、２００〜５００モノマー単位の長さ、例えば、２００〜４００モノマー単位、または３００〜５００モノマー単位の長さを含む、２００〜１０００モノマー単位の長さである。ある特定の実施形態において、核酸生成物は、１００ヌクレオチド当たり１つ以下（例えば、１５０ヌクレオチド中に１つ）の単一ヌクレオチド欠失を有し、多重ヌクレオチド欠失はない。
【０１０１】
前述のように、本開示の合成方法は、化学物質が結合し得る表面を有する固相支持体上で実施することができる。いくつかの実施形態において、合成されている複数のオリゴヌクレオチドは、同一固相支持体に直接的または間接的に結合され、アレイの一部を形成することができる。「アレイ」は、各配列の位置がわかるように、それぞれが空間的に画定され、物理的にアドレス可能な手法で配置されている公知のモノマー配列の個別の分子の集合体である。アレイ上に含有され得る分子の数、または「フィーチャー（ｆｅａｔｕｒｅ）」は、基質の表面積、フィーチャーのサイズ、およびフィーチャー間の間隔によってほぼ決定され、この場合、アレイ表面は、非フィーチャー領域によって表示されるローカルバックグランド領域を含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。アレイは、１ｃｍ２当たり数十万以下またはそれ超、例えば、２，５００〜２００，０００フィーチャー／ｃｍ２のフィーチャーの密度を有し得る。フィーチャーは、基質に共有結合されていてもよいし、されていなくてもよい。同義的に使用される「アレイ」または「化学アレイ」は、その領域と関連している特定の１つの化学部分または複数化学部分（例えば、リガンド、例えば、生体高分子、例としては、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列（核酸）、ポリペプチド（例えば、タンパク質）、炭水化物、脂質など）を担持するアドレス可能な領域の任意の一次元、二次元、または実質的に二次元（ならびに三次元）の配置を含む。アレイ上の特定の所定位置（すなわち、「アドレス」）における領域（すなわち、アレイの「フィーチャー」または「スポット」）が特定の標的または標的のクラスを検出するように（フィーチャーは、そのフィーチャーの非標的を付随的に検出し得るが）、アレイが異なる部分（例えば、異なるポリヌクレオチド配列）の多数の領域を有する場合、アレイは「アドレス可能」である。アレイフィーチャーは、典型的には、ただしそうである必要はないが、介在する空間によって分離されている。アレイの場合、「標的」は、様々な領域で基質に結合されているプローブ（「標的プローブ」）によって検出される可動相（典型的には液体）中の部分として言及される。しかし、「標的」または「プローブ」のいずれかが、他によって評価されるものであってもよい（したがって、いずれも、他と結合することによって評価される分析物、例えば、ポリヌクレオチドの未知の混合物であり得る）。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、アレイはマイクロ流体デバイスの一部であり、二次元または三次元である。このようなアレイを含む固相支持体は実質的に平面であってもよいし、または複数のマイクロ構造、例えば、ウェル、チャネルおよびマイクロチャネル、高架カラムまたは支柱を含んでいてもよい。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、合成されているオリゴヌクレオチドは、ビーズに直接的または間接的に付着されている。ビーズは、任意選択的に、ウェルまたはチャネルのアレイに配置することができる。適切な固相支持体は、様々な形態および構成を有していてもよく、天然材料、合成的に修飾された天然材料、または合成材料に由来するものであってよい。
【０１０４】
適切な支持体材料の例としては、限定するものではないが、シリカ、シリコンおよび酸化シリコン（半導体製作において使用される任意の材料を含む）、テフロン、ガラス、多糖類、例えば、アガロース（例えば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）およびデキストラン（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）およびＳｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）、これらもまたＰｈａｒｍａｃｉａ製）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルメタクリレートとメチルメタクリレートのコポリマーなどが挙げられる。基質表面上で合成されるオリゴヌクレオチドの最初のモノマーは、典型的には連結成分に結合され、次にこれは、シリカ基質上に存在する表面の親水基、例えば、表面のヒドロキシル部分に結合される。いくつかの実施形態において、ユニバーサルリンカーが使用される。いくつかの他の実施形態において、最初のモノマーは、例えば、表面のヒドロキシル部分と直接反応する。あるいは、オリゴヌクレオチドを、まず、本開示に従って合成し、合成後に当技術分野において公知の任意の方法によって固相支持体に付着させることができる。したがって、本開示は、オリゴヌクレオチドがアレイ上で合成されるか、または合成後にアレイ基質に付着される、オリゴヌクレオチドのアレイの調製に使用することができる。
【０１０５】
本方法の効率および容易性により、オリゴヌクレオチド合成は、小規模または大規模で実施することができる。したがって、本方法の（１つの容器中での）１回の完全な操作で作製されるオリゴヌクレオチドの量は、マイクログラム未満、またはマイクログラム、数十マイクログラム、数百マイクログラム、グラム、数十グラム、数百グラム、さらにキログラムであり得る。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、核酸のアレイは本開示の方法および組成物によって合成される。いくつかの実施形態において、核酸は、アレイ系用途（例えば、遺伝子発現、細胞遺伝学、遺伝子型決定、転写産物、またはエキソンプロファイリングなど）でそれらを使用するためにアレイに付着させて維持される。他の実施形態において、核酸は、すべて、または時としてサブセットのみが、固相支持体から遊離され、核酸の１つもしくは複数のライブラリー、または、固相支持体からの切断前もしくは切断後に任意選択的増幅され得るプールが生成される。核酸のプールまたはライブラリーは、例えば、選択的標的エンリッチメント用のベイトとして使用することができるか、またはインサイチュハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ｏ−ＦＩＳＨ）もしくは他のハイブリダイゼーションアッセイ、多重部位特異的変異誘発、多重ゲノム工学的手法および加速進化（ＭＡＧＥ）、ｓｉＲＮＡｓ、ｓｈＲＮＡｓ、ｍｉＲＮＡｓをコードしているライブラリーによる遺伝子ノックアウト、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡおよび／またはＣａｓタンパク質をコードしている核酸のライブラリーによるゲノム工学用のプローブとして使用することができるか、あるいは、遺伝子または遺伝子断片をコードしている核酸は、より長いＤＮＡ断片、遺伝子および／またはゲノムにさらに、構築され、連結され得る。いくつかの実施形態において、構築された核酸は、約３００ヌクレオチド〜約１０，０００ヌクレオチドの長さを有するＤＮＡである。他の実施形態において、構築された核酸の長さは、ある特定の実施形態において、長さが３００以上、例えば、４００以上、１，０００以上、２，０００以上、３，０００以上、４，０００以上、５，０００以上、６，０００以上、８，０００以上、１０，０００以上、またはさらにそれ超のヌクレオチドの範囲でサイズが変動し得る。
【０１０７】
また、本主題の組成物および方法を使用して生成された核酸のライブラリーも提供する。ライブラリーのいくつかの実施形態において、ライブラリーは複数の核酸を含んでおり、ここで、それぞれの核酸は、本明細書に記載されているような本主題の方法によって合成される。また、約３００ヌクレオチド〜約１０，０００ヌクレオチドの長さを有する複数の核酸を含むライブラリーも提供し、ここで、それぞれの核酸は、本明細書に記載されているような本主題の方法によって合成される、構築された核酸断片から構成されている。核酸は、遊離核酸であってよい。複数の核酸は、目的の遺伝子を一緒になって限定する配列を有し得る。ライブラリーの複数の核酸は、例えば、断片カップリングの任意の都合のよい方法を使用して、遺伝子へ構築され得る。
【０１０８】
生成物核酸は、研究、診断および治療用途を含む、様々な用途での使用が見出されている。例えば、生成物核酸は、例えば、ゲノミクス、細胞遺伝学、標的濃縮およびシーケンシング、部位特異的変異誘発、合成生物学、遺伝子合成、遺伝子アセンブリ、例えば、プローブ、プライマー、遺伝子断片、ＤＮＡ／ＲＮＡアレイ、核酸のライブラリーなどの研究用途での使用が見出されている。ゲノミクス、細胞遺伝学、腫瘍内科学、感染症、非侵襲的出生前検診（ＮＩＰＴ）、標的濃縮およびシーケンシングなどの診断用途に関して、生成物核酸はまた、プローブ（例えば、ｏｌｉｇｏＦＩＳＨ）、プライマー、遺伝子断片、転写産物、ＤＮＡ／ＲＮＡアレイ、核酸のライブラリー、転写産物のライブラリー、または診断プロトコルで用いられる他の薬剤として使用が見出され得る。治療用途に関しては、生成物核酸は、遺伝子治療用途、遺伝子編集、干渉ＲＮＡ（すなわち、ｉＲＮＡもしくはＲＮＡｉ）用途などにおいて、任意のＤＮＡ、ＲＮＡ、または他の核酸治療薬、例えば、アンチセンス核酸として使用が見出されている。
【実施例】
【０１０９】
以下の実施例は、本明細書に記載されている化合物（２２〜５４）の一般的な合成ストラテジーを示す。
様々な５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシリボチミジン３’−Ｏ−アリールホスホラミダイトの合成
【０１１０】
【化３０】
0006730932.tif 000031
ビス（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）クロロホスフィン（Ｃｈｅｍ  Ｇｅｎｅｓ、０．０１９ｍｏｌ、５．２０グラム）を、アルゴン下で、磁気撹拌棒および隔壁を備えた、火炎乾燥２５０ｍＬシュレンクフラスコ中の無水ジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶解した。この溶液に、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシリボチミジン（Ｃｈｅｍ  Ｇｅｎｅｓ、０．０１９ｍｏｌ、１．０当量）を添加した。２’−デオキシリボヌクレオシドが完全に溶解したら、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、０．０５７ｍｏｌ、３．０当量）を添加し、混合物を３０分間、室温にてアルゴン下で撹拌した。３０分後に３１Ｐ  ＮＭＲスペクトルは、出発物質が生成物へと完全に変換されたことを示した。溶媒を真空で除去した後、粗生成物を、１％トリエチルアミンを含有するヘキサン中の５０〜９０％勾配の酢酸エチルを使用したクロマトグラフィーによって単離した。３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ１１５．９（ｓ）。
【０１１１】
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシリボチミジン３’−Ｏ−ホスホロジアミダイト（２．５８ｍｍｏｌ、２グラム）およびアリールアルコール（１．０当量）を１００ｍＬ丸底フラスコ中の無水ジクロロメタン（１５ｍＬ）に溶解し、室温にてアルゴン下で撹拌した。１Ｈ−エチルチオテトラゾール（無水アセトニトリル中０．２５Ｍ、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＶＡ、１．０当量）を１５分間かけてシリンジによって混合物に滴下添加し、出発物質が高ランニングスポットへと完全に変換されたことをＴＬＣ分析が示すまで、混合物を室温にて窒素下で撹拌した。溶媒を真空で除去し、粗生成物を、１％トリエチルアミンを含有するヘキサン中の５０〜９０％勾配の酢酸エチルを使用したクロマトグラフィーによって単離した。
【化３１】
0006730932.tif 000032
【０１１２】
【表１】
0006730932.tif 000033
【０１１３】
【表２】
0006730932.tif 000034
【０１１４】
様々な５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシリボチミジン３’−Ｏ−Ｓ−（エチル）ベンゾチオエート−ピロリジニルホスホラミダイトの合成
【化３２】
0006730932.tif 000035
トリス（１−ピロリジニル）ホスフィン（０．０１６ｍｏｌ、４グラム）を、１００ｍＬ丸底フラスコ中の無水ジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶解し、室温にてアルゴン下で撹拌した。この溶液に、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシリボチミジン（Ｃｈｅｍ  Ｇｅｎｅｓ、０．０１６ｍｏｌ、１．０当量）を添加した。最後に、１Ｈ−エチルチオテトラゾール（無水アセトニトリル中０．２５Ｍ、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＶＡ、１．０当量）を１５分間かけてシリンジによって混合物に滴下添加し、混合物を３０分間、室温にて窒素下で撹拌し、この時、３１Ｐ  ＮＭＲスペクトルは、出発物質が生成物へと完全に変換されたことを示した。溶媒を真空で除去し、粗生成物を、１％トリエチルアミンを含有するジクロロメタン中の３０〜６０％勾配の酢酸エチルを使用したクロマトグラフィーによって単離した。３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ１３５．２（ｓ）。
【０１１５】
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシリボチミジン３’−Ｏ−ビス（１−ピロリジニル）ホスホロジアミダイト（２．８０ｍｍｏｌ、２グラム）およびチオエステル（１．０当量）を、１００ｍＬ丸底フラスコ中の無水ジクロロメタン（１５ｍＬ）に溶解し、室温にてアルゴン下で撹拌した。１Ｈ−エチルチオテトラゾール（無水アセトニトリル中０．２５Ｍ、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＶＡ、１．０当量）を１５分間かけてシリンジによって混合物に滴下添加し、出発物質が高ランニングスポットへと完全に変換されたことをＴＬＣ分析が示すまで、混合物を室温にて窒素下で撹拌した。溶媒を真空で除去し、粗生成物を、１％トリエチルアミンを含有するジクロロメタン中の３０〜６０％勾配の酢酸エチルを使用したクロマトグラフィーによって単離した。３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ１４４．１、１４４．３（ｄ）。
【化３３】
0006730932.tif 000036
【０１１６】
固相オリゴヌクレオチド合成に関する一般的手順。
合成は、０．２マイクロモル（６０マー）および１．０マイクロモル（２０マー）のスケールで、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから得たｄＴ−ＣＰＧカラム（２０マーについては５００オングストローム、６０マーについては１０００オングストローム）を使用し、ＡＢＩモデル３９４自動ＤＮＡ合成装置において標準ＤＮＡサイクルによって実施する。合成プロトコルは、従来のＤＭＴホスホラミダイト法に基づいた。すべての保護されたデオキシリボチミジン３’−Ｏ−アリールホスホラミダイトを１００ｍＭの濃度で無水アセトニトリルに溶解し、合成装置の適切なポートに置いた。合成前に、支持体結合した２’−デオキシリボヌクレオシド上の５’−ＤＭＴ基をジクロロメタン中の３％ジクロロ酢酸で除去した。活性化剤は、５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール（無水アセトニトリル中０．２５Ｍ、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＶＡ）であった。それぞれの縮合ステップ後、支持体を４０秒間、アセトニトリルで洗浄し、失敗配列をキャッピングするために、Ｕｎｉｃａｐホスホラミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＶＡ）をメーカーの推奨に従って使用した。酸化には、標準酸化試薬（ＴＨＦ／水／ピリジン中０．０２Ｍのヨウ素）を使用した。合成後オリゴマーは、アンモニア（Ｍａｃｒｏｎ、１０〜３５％アンモニアを含む溶液）で処理することによって固相支持体から切断した。いくつかの事例において、切断前に、ＣＰＧにまだ結合されているオリゴヌクレオチドを４〜８時間、２−カルバモイル−２−シアノエチレン−１，１−ジチオレートのＤＭＦ中１Ｍ溶液（１ｍＬ）で処理した。次いで、樹脂をＤＭＦで、続いてＭｅＯＨで洗浄し、アルゴン下で乾燥し、最後に、アンモニアで切断した。切断混合物は廃棄し、固相支持体をＳｐｅｅｄＶａｃで蒸発乾燥した。支持体に吸着されているＯＤＮ生成物を水に溶解し、ＬＣ−ＭＳで分析した。
【０１１７】
粗製オリゴヌクレオチドのＬＣ−ＭＳ分析
２０マーおよび６０マーの分析を、ネガティブモードでＡｇｉｌｅｎｔ６５３０精密質量Ｑ−ＴＯＦ  ＬＣ／ＭＳで実施した。データは、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｍａｓｓ  Ｈｕｎｔｅｒ定性分析Ｂ０４．００ソフトウェアで処理した。
【０１１８】
２つの異なる逆相カラム、２０マー分析用のＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８、１．７μｍ、２．１Ｘ１００ｎｍカラムと、６０マー分析用のＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＰｒＳＴ  Ｃ４、１．７μｍ、２．１ｍｍＸ１５０ｍｍカラムを使用した。複数の溶離系および数種類の勾配を使用した。
溶離系１
バッファーＡ：２００ｍｍＨＦＩＰ、８ｍＭＴＥＡ、水中５％メタノール
バッファーＢ：水中９０％メタノール
溶離系２
バッファーＡ：５ｍＭジブチルアンモニウムアセテート、水中５％有機成分
バッファーＢ：５ｍＭジブチルアンモニウムアセテート、有機成分中１０％水
有機成分：１：１アセトニトリル：２−イソプロパノール
【０１１９】
【表３】
0006730932.tif 000037
【０１２０】
【表４】
0006730932.tif 000038
【０１２１】
【表５】
0006730932.tif 000039
【０１２２】
試料はすべてネガティブモードで実施し、下記は、使用したすべての質量パラメーターのリストである。
【０１２３】
【表６】
0006730932.tif 000040
【０１２４】
すべての試料をＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ定性分析ソフトウェアで処理し、全イオンクロマトグラム（ＴＩＣ）、ＤＡＤクロマトグラムおよび抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）など、様々なシグナルタイプからクロマトグラムを抽出した。
【０１２５】
以下の実施例は、本明細書に記載されているホスホラミダイト（２２〜３１）を使用することによる２０マーおよび６０マーの分析を示す。特に、それぞれのオリゴヌクレオチドは、ＴＩＣ、ＤＡＤおよびＥＩＣクロマトグラムにより分析した。
【０１２６】
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシリボチミジン３’−Ｏ−α−メチル−ｐ−ブロモベンジルホスホラミダイト（２２）を使用するｄＴ２０
【化３４】
0006730932.tif 000041
リン保護基として１−（４−ブロモフェニル）エタノールを使用するｄＴ２０のＴＩＣ、ＤＡＤクロマトグラムおよび質量分析を図１に示す。
【０１２７】
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシリボチミジン３’−Ｏ−１−メトキシナフタレンホスホラミダイト（２３）を使用するｄＴ２０
【化３５】
0006730932.tif 000042
リン保護基として１−メトキシ−２−ナフタレンメタノールを使用するｄＴ２０のＴＩＣ、ＤＡＤクロマトグラムおよび質量分析を図２に示す。
【０１２８】
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシリボチミジン３’−Ｏ−ナフタレンホスホラミダイト（２４）を使用するｄＴ２０
【化３６】
0006730932.tif 000043
２−カルバモイル−２−シアノエチレン−１，１−ジチオレート処理した、リン保護基として２−ナフタレンメタノールを使用するｄＴ２０のＴＩＣ、ＤＡＤクロマトグラムおよび質量分析を図３に示す。
【０１２９】
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシリボチミジン３’−Ｏ−６−ブロモ−２−ナフタレンホスホラミダイト（２５）を使用するｄＴ２０
【化３７】
0006730932.tif 000044
２−カルバモイル−２−シアノエチレン−１，１−ジチオレート処理した、リン保護基として６−ブロモ−２−ナフタレンメタノールを使用するｄＴ２０のＴＩＣ、ＤＡＤクロマトグラムおよび質量分析を図４に示す。
【０１３０】
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシリボチミジン３’−Ｏ−１−インダン−５−カルボニトリルホスホラミダイト（２６）の使用によるｄＴ２０
【化３８】
0006730932.tif 000045
リン保護基として１−ヒドロキシインダン−５−カルボニトリルを使用するｄＴ２０のＴＩＣ、ＤＡＤクロマトグラムおよび質量分析を図５に示す。
【０１３１】
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシリボチミジン３’−Ｏ−４−シアノベンジルホスホラミダイト（２７）を使用するｄＴ２０
【化３９】
0006730932.tif 000046
２−カルバモイル−２−シアノエチレン−１，１−ジチオレート処理した、リン保護基として４−シアノベンジルアルコールを使用するｄＴ２０のＴＩＣ、ＤＡＤクロマトグラムおよび質量分析を図６に示す。
【０１３２】
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシリボチミジン３’−Ｏ−３−シアノベンジルホスホラミダイト（２８）を使用するｄＴ２０
【化４０】
0006730932.tif 000047
２−カルバモイル−２−シアノエチレン−１，１−ジチオレート処理した、リン保護基として３−シアノベンジルアルコールを使用するｄＴ２０のＴＩＣ、ＤＡＤクロマトグラムおよび質量分析を図７に示す。
【０１３３】
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシリボチミジン３’−Ｏ−２−エチニルベンジルホスホラミダイト（２９）の使用によるｄＴ２０
【化４１】
0006730932.tif 000048
２−カルバモイル−２−シアノエチレン−１，１−ジチオレート処理した、リン保護基として２−エチニルベンジルアルコールを使用するｄＴ２０のＴＩＣ、ＤＡＤクロマトグラムおよび質量分析を図８に示す。
【０１３４】
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシリボチミジン３’−Ｏ−アセチル−Ｌ−トレオニンメチルエステルホスホラミダイト（３０）を使用するｄＴ２０
【化４２】
0006730932.tif 000049
リン保護基としてアセチル−Ｌ−トレオニンメチルエステルを使用するｄＴ２０のＴＩＣ、ＤＡＤクロマトグラムおよび質量分析を図９に示す。
【０１３５】
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシリボチミジン３’−Ｏ−Ｓ−エチルベンゾチオエート−ピロリジニルホスホラミダイト（３１）を使用するｄＴ２０
【化４３】
0006730932.tif 000050
リン保護基としてＳ−エチルベンゾチオエートを使用するｄＴ２０のＤＡＤクロマトグラムおよび質量分析を図１０に示す。
【０１３６】
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシリボチミジン３’−Ｏ−４−シアノベンジルホスホラミダイト（２７）を使用するｄＴ６０
（２７）
２−カルバモイル−２−シアノエチレン−１，１−ジチオレート処理した、リン保護基として４−シアノベンジルアルコールを使用するｄＴ２０のＴＩＣ、ＤＡＤクロマトグラムおよび質量分析を図１１に示す。
【０１３７】
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシリボチミジン３’−Ｏ−アセチル−Ｌ−トレオニンメチルエステルホスホラミダイト（３０）を使用するｄＴ６０
リン保護基としてアセチル−Ｌ−トレオニンメチルエステルを使用するｄＴ６０のＴＩＣ、ＤＡＤクロマトグラムおよび質量分析を図１２に示す。
【０１３８】
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシリボチミジン３’−Ｏ−Ｓ−エチルベンゾチオエート−ピロリジニルホスホラミダイト（３１）の使用によるｄＴ６０
リン保護基としてＳ−エチルベンゾチオエートを使用するｄＴ６０のＴＩＣ、ＤＡＤクロマトグラムおよび質量分析を図１３に示す。
【０１３９】
リン保護基としてＳ−エチルベンゾチオエートを使用して合成されたＴ６０と標準２−シアノエチルホスホラミダイトを用いて合成されたＴ６０との比較を図１４に示す。
【０１４０】
以下の実施例は、本明細書に記載されている追加の化合物（１〜１５）の一般的な合成ストラテジーを示す。
【０１４１】
材料および方法：５’−ジメトキシトリチル−Ｎ６−ジメチルアミノアセトアミジン−２’−デオキシアデノシン、３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイトＤＭＡ−ｄＡ−ＣＥ、アデノシン水和物、グアノシン水和物、シチジン水和物、ジメトキシトリチル塩化物はＣｈｅｍ  Ｇｅｎｅｓから購入し、５’−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−デオキシシチジン、３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト（Ａｃ−ｄＣ−ＣＥ）、５’−ジメトキシトリチル−Ｎ２−イソブチリル−２’−デオキシグアノシン、３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト  ｉＢｕ−ｄＧ−ＣＥ、ｄＴ−ＣＥ、ｄＴ−ＣＰＧカラム（１μｍｏｌ）、ｄＣ−ＣＰＧカラム（１μｍｏｌ）、アセトニトリル中０．４５Ｍエチルチオ−テトラゾール、ＣＡＰ  Ｍｉｘ  Ａ（ＴＨＦ／ピリジン／Ａｃ２Ｏ）およびＣＡＰ  Ｍｉｘ  Ｂ（ＴＨＦ中の１６％ＭｅＩｍ）、ＴＨＦ／ピリジン／Ｈ２Ｏ中０．０２Ｍ  Ｉ２、ジクロロメタン中３％トリクロロ酢酸、無水アセトニトリルは、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから購入し、４−アセチルモルホリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドジエチルアセタール、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、無水ピリジン、硫酸ジメチル、ＮａＯＭｅは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【０１４２】
ＤＮＡ合成およびＬＣＭＳ試験：ＤＮＡを、３９４ＲＮＡ／ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ．０．２マイクロモル法）において合成した。ホスホラミダイト法のＰ（ＩＩＩ）化学を使用して標準の４ステップサイクル、すなわち、脱保護、活性化およびカップリング、酸化ならびにキャッピングでＤＮＡを合成した。ジクロロメタン中３％トリクロロ酢酸を脱保護に使用し、アセトニトリル中０．４５Ｍエチルチオ−テトラゾールを活性化剤として使用した。ＴＨＦ／ピリジン中０．０２Ｍ  Ｉ２は、アミダイトからリン酸塩への酸化に使用した。ＴＨＦ／ピリジン／Ａｃ２ＯおよびＴＨＦ中１６％Ｎ−メチルイミダゾールを使用してカップリングに失敗した配列をキャッピングした。制御式多孔質ガラス（ＣＰＧ）を、固定化相として使用した。短鎖ＤＮＡは、１マイクロモルスケールで５００Å細孔径のＣＰＧ上で合成し、一方、長鎖配列（＞２０ｂｐ）は、０．２マイクロモルスケールで１０００Å細孔径のＣＰＧ上で合成した。ＤＮＡを、５５℃で一晩、２８〜３０％のＮＨ４ＯＨでＣＰＧを処理することにより固相支持体から切断した。しかし、ＮＨ４ＯＨの切断および脱保護の効率は、周囲温度から５５℃までの変化温度で、２時間から一晩、アセトアミジン保護基およびモルホリノアセトアミジン保護基について検討した。
【０１４３】
切断したＤＮＡは、５％アセトニトリルを含有するＨ２Ｏへ抽出し、濾過した。濾過したＤＮＡは、ＬＣＭＳ試験に直接使用した。ＬＣＭＳスペクトルは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ６５００  Ｑ−ＴＯＦ  ＬＣ／ＭＳシステムで記録した。ＬＣ／ＭＳは、ジブチルアンモニウムアセテート／イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）／アセトニトリル（ＡＣＮ）を溶離バッファー系として使用することにより記録した。バッファーの組成物は、バッファーＡ：５ｍＭジブチルアンモニウムアセテート＋５％ＩＰＡ：ＡＣＮ（１：１）、バッファーＢ：５ｍＭジブチルアンモニウムアセテート＋９０％ＩＰＡ：ＡＣＮ（１：１）であった。ジブチルアンモニウムアセテートは、移動相に対し、より高い荷電状態の質量スペクトルシグナルを低減するよう選択した。これは、所望の質量のＤＮＡのＥＩＣスペクトルを抽出するのに有効であった。ＤＮＡの質量スペクトルは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ  Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｂ．０６．００によって分析した。所望の質量を有するオリゴのＥＩＣスペクトルは、ＤＮＡまたは付加物の正確な算出質量値を入力することによってＴＩＣクロマトグラムから抽出した。
【０１４４】
核酸塩基を保護するための前駆体試薬の合成。
Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドジエチルアセタール：
Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドジエチルアセタールは、ＭｃＢｒｉｄｅ，Ｌ．Ｊ；Ｋｉｅｒｚｅｋ，Ｒ．；Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９８６，１０８，２０４０−２０４８の手順に従って合成した。
【０１４５】
２，２−ジメトキシ−１−メチルピロリジン（Ｌｕ，Ｊ．；Ｋｈｄｏｕｒ，Ｏ．Ｍ．；Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｊ．Ｓ．；Ｈｅｃｈｔ，Ｓ．Ｍ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２０１０，１８，７６２８−７６３８）：
Ｎ−メチル−２−ピロリジノン（２６ｍＬ、２７３ｍｍｏｌ）および硫酸ジメチル（２６ｍＬ、２７８ｍｍｏｌ）の混合物を撹拌し、９０℃で９０分加熱し、次いで、室温まで冷却した。２５％メタノール性ナトリウムメトキシド６５ｍＬおよびメタノール１３５ｍＬを含有する溶液をおよそ１０℃で、１時間かけてアルゴン下で添加した。沈殿した白色の固体を濾過し、溶媒を減圧下で濃縮した。黄色の油状残留物をジエチルエーテル２５０ｍＬに溶解し、さらに１時間撹拌し、次いで、沈殿した固体を再び濾過した。固体をジエチルエーテルで洗浄した。エーテルを濃縮した後、残留物を真空で蒸留して、浅黄色の液体として化合物を得た：収率１４．８ｇ（３７％）。ＣＨＣｌ３中の１Ｈ  ＮＭＲは文献によるものである。
【０１４６】
４−（１，１−ジメトキシエチル）モルホリンの合成（Ｆｅｎｇ  Ｒ．，−Ｌ；Ｇｏｎｇ，Ｐ．；Ｆａｎｇ，Ｌ．；Ｈｏｎｇ，Ｗ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｕ，２００５，２１，１７７−１９２）：
４−アセチルモルホリン（３２ｍＬ、２７８ｍｍｏｌ）および硫酸ジメチル（２６ｍＬ、２７８ｍｍｏｌ）の混合物を撹拌し、９０℃で６０分間加熱し、次いで、室温まで冷却した。２５％メタノール性ナトリウムメトキシド６５ｍＬおよびメタノール１３５ｍＬを含有する溶液をおよそ１０℃で、２時間にわたりアルゴン下で添加した。沈殿した白色の固体を濾過し、溶媒を減圧下で濃縮した。黄色の油状残留物をジエチルエーテル２５０ｍＬに溶解し、さらに１時間撹拌し、次いで、沈殿した固体を再び濾過した。固体をジエチルエーテルで洗浄した。エーテルを濃縮した後、残留物を反応の次のステップに使用した。粗製油状物の重量は２２ｇであった。
【０１４７】
ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴ  ３’−（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイトの合成
スキーム１は、（ｉ）４−（１，１−ジメトキシエチル）モルホリン、室温、一晩；（ｉｉ）４，４−ジメトキシトリチルクロリド、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２時間）；（ｉｉｉ）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−シアノエチルホスホラミダイトクロリド、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、ＣＨ２Ｃｌ２（２時間）の条件下における化合物（３）の合成を示す。
【化４４】
0006730932.tif 000051
【０１４８】
６−Ｎ−（１−（モルホリノ）エチリデン）−２’−デオキシアデノシン（１）：
２．６９ｇ（１０ｍｍｏｌ）の２’−デオキシアデノシン一水和物を、３回ピリジンと共蒸発させ、無水メタノール２０ｍＬに懸濁した。１０ｇの４−（１，１−ジメトキシエチル）モルホリンを、アルゴン下で、撹拌しながらゆっくりと添加した。反応を、一晩継続させた。反応後、メタノールを回転蒸発によって除去した。粘性残留物をジエチルエーテルで数回洗浄して、非粘性の白色の粉末を得た。化合物を、溶離液としてＣＨＣｌ３を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによってさらに精製した。メタノール（０〜１０％）を勾配として使用した。溶媒を除去した後、純粋な化合物（１）が白色の泡状物として出現した。収率: 3.19 g (88%), Rf (CHCl3/MeOH 10/2 v/v): 0.43, 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ8.22 (s, 1H), 7.54 (s, 1H), 5.77 (t, J=6.11 Hz, 1H), 4.03 (d, J= 6.4 Hz, 1H), 3.88 (m, 2H), 3.64 (m, 1H), 3.37 (m, 4H. O(CH2)2), 2.83 (m, 4H, N(CH2)2), 2.51-2.29(m, 2H), 1.73 (s, 3H, C-CH3).13C NMR (CDCl3, 400 MHz): δ160.85, 154.22, 152.01, 147.94, 138.21, 122.11, 88.22, 83.19, 71.53, 68.12, 62.41, 46.36, 40.11, 22.38.
【０１４９】
５’−Ｏ−（ジ−ｐ−メトキシトリチル）−６−Ｎ−（１−（モルホリノ）エチリデン）−２’−デオキシアデノシン（２）：
４−Ｎ−（１−（ジメチルアミノ）エチリデン）−２’−デオキシアデノシン（１）（３．１９ｇ  ０．００８８ｍｏｌｅ）を無水ピリジン（２５ｍＬ）に溶解し、作製した溶液をアルゴンで飽和した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６．４２ｇ、０．０５ｍｏｌｅ、８．６５ｍＬ）を溶液に添加し、１０分間、アルゴン下で撹拌した。ジ−ｐ−メトキシトリチルクロリド（２．９５ｇ、０．００８８ｍｏｌｅ）の無水ピリジン２５ｍＬ中溶液を、アルゴン下で調製した。ＤＭＴ−Ｃｌ溶液を、アルゴンの連続流を用いて１の溶液に移した。反応を、アルゴン下で連続撹拌しながら２時間継続させた。溶液を濃縮し、ジクロロメタン１００ｍＬでさらに希釈した。混合物を、ＮａＨＣＯ３飽和水溶液（１００ｍＬ）で３回洗浄した。有機相をＮａＣｌ飽和水溶液（１００ｍＬ）でさらに洗浄した。有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。化合物を、３％トリエチルアミンを含むＣＨ２Ｃｌ２（ＭｅＯＨを勾配として使用、０〜２％）のシリカゲルカラムクロマトグラフィーによってさらに精製した。溶媒を除去した後、化合物（２）が白色の泡状物として出現した。収率: 4.54 g (78%); Rf (CH2Cl2/MeOH 10/0.5 v/v): 0.41; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ8.48 (s, 1H), 7.76 (s, 1H), 7.3-6.6 (m, 13H, アリール), 5.84 (t, J = 6.31 Hz, 1H), 4.13 (d, J= 7.3 Hz, 1H), 3.93 (m, 2H), 3.76 (s, 6H, (O-CH3)2), 3.54 (m, 1H), 3.33 (m, 4H. O(CH2)2), 2.91 (m, 4H, N(CH2)2), 2.55-2.31(m, 2H), 1.61 (s, 3H, C-CH3).. 13C NMR (CDCl3, 400 MHz): δ167.15, 157.62, 154.41, 150.37, 147.54, 140.22, 140.14, 133.97, 130.21, 128.33, 124.32, 122.38, 112.76, 91.22, 86.92, 80.27, 74.22, 67.21, 62.12, 59.37, 47.28, 41.19, 23.3.
【０１５０】
５’−Ｏ−（ジ−ｐ−メトキシトリチル）−６−Ｎ−（１−（モルホリノ）エチリデン）−２’−デオキシアデノシン−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト（３）：
５’−Ｏ−（ジ−ｐ−メトキシトリチル）−４−Ｎ−（１−モルホリノエチリデンアミノ）−２’−デオキシアデノシン（２）（１．６６ｇ、０．００２５ｍｏｌｅ）を１０ｍＬの無水ＣＨ２Ｃｌ２に溶解した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６ｍＬ）を、アルゴンの連続流と撹拌を用いて溶液に添加した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−Ｏ−シアノエチルクロロホスホラミダイト（５９０ｍｇ、０．００２５ｍｏｌｅ）を溶液に添加し、反応をアルゴン下で２時間継続した。反応の終了後、溶液を、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液３０ｍＬに注ぎ入れ、ＣＨ２Ｃｌ２（３×１０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を蒸発させた。得られた油状物を、３％トリエチルアミンを含有するＣＨ２Ｃｌ２を使用したカラムクロマトグラフィーによって精製して、白色の泡状物として最終化合物（３）を得た。化合物を、冷却ヘキサン沈殿によってジクロロメタン溶液からさらに精製した。収率: 1.51 g (71%). Rf (CH2Cl2/MeOH 10/0.5 v/v): 0.44, 31P NMR (CDCl3, 400 MHz):δ148.74, 147.91 (ジアステレオ異性体).
【０１５１】
スキーム２  １は、（ｉ）Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドジエチルアセタール、エタノール、６０℃、２４時間；（ｉｉ）４，４−ジメトキシトリチルクロリド、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、室温、２時間；（ｉｉｉ）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−シアノエチルホスホラミダイトクロリド、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、ＣＨ２Ｃｌ２（２時間）；（ｉｖ）４−（１，１−ジメトキシエチル）モルホリン、６０℃、一晩；（ｖ）４，４−ジメトキシトリチルクロリド、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３時間）；（ｖｉ）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−シアノエチルホスホラミダイトクロリド、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、ＣＨ２Ｃｌ２（２時間）の条件に従った化合物（９）の合成を示す。
【化４５】
0006730932.tif 000052
【０１５２】
２−Ｎ−（１−（ジメチルアミノ）エチリデン）−２’−デオキシグアノシン（４）：
２−Ｎ−（１−（ジメチルアミノ）エチリデン）−２’−デオキシグアノシンは、小修飾による文献の手順に従って合成した（Ｌｕ，Ｊ．；Ｋｈｄｏｕｒ，Ｏ．Ｍ．；Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｊ．Ｓ．；Ｈｅｃｈｔ，Ｓ．Ｍ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２０１０，１８，７６２８−７６３８）。２’−デオキシグアノシン脱水物（３．６６ｇ  １２ｍｍｏｌ）を無水エタノールに懸濁した。Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドジエチルアセタール（７．８ｇ、４４ｍｍｏｌ）を連続撹拌しながら懸濁液に添加した。混合物を、溶液が均質化されるまで（浅黄色）、１時間、およそ７０℃まで温めた。撹拌を２４時間継続した。エタノールを減圧下で回転蒸発によって除去した。粘性残留物を、残留物が非粘性の固体になるまで、ジエチルエーテルで数回洗浄した。化合物を、溶離液としてＣＨＣｌ３を使用して、カラムクロマトグラフィーによってさらに精製した。メタノールを勾配（０〜２０％）として使用した。最初に化合物が溶出した。カラムフラクションの溶媒を除去した後、化合物（４）が泡状物として出現した。収率: 1.95 g (48%); Rf (CHCl3/MeOH 10/2 v/v): 0.38; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ8.02 (s, 1H), 6.34 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 5.84 (m, 1H), 4.75 (s, 1H), 4.14 (d, J= 6.6 Hz, 1H), 4.14 (s, 1H), 3.86 (m, 2H), 3.5 (m, 2H), 3.16 (s, 6H, N(CH3)2), 2.71-2.19(m, 2H), 2.21 (s, 3H, C-CH3).13C NMR (CDCl3, 400 MHz): δ162.25, 158.66, 156.26, 147.26, 138.10, 88.70, 86.26, 71.67, 62.61, 40.95, 38.18, 30.29, 17.00; ESI MS: 337.1521 [MH]+
【０１５３】
５’−Ｏ−（ジ−ｐ−メトキシトリチル）−２−Ｎ−（１−（ジメチルアミノ）エチリデン）−２’−デオキシグアノシン（５）：
２−Ｎ−（１−（ジメチルアミノ）エチリデン）−２’−デオキシグアノシン（４）（３．９８ｇ  ０．０１１８ｍｏｌｅ）を無水ピリジン（２５ｍＬ）に溶解し、作製した溶液をアルゴンで飽和した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６．４２ｇ、０．０５ｍｏｌｅ、８．６５ｍＬ）をこの溶液に添加し、アルゴン下で１０分間撹拌した。無水ピリジン２５ｍＬ中のジ−ｐ−メトキシトリチルクロリド（４．２ｇ、０．０１２ｍｏｌｅ）溶液をアルゴン下で調製した。ＤＭＴ−Ｃｌ溶液を、アルゴンの連続流下で（４）の溶液に移した。反応を、アルゴン下で撹拌を続けながら２時間継続した。溶液を濃縮し、ジクロロメタン１００ｍＬでさらに希釈した。混合物をＮａＨＣＯ３飽和水溶液（１００ｍＬ）で３回洗浄した。有機相をＮａＣｌ飽和水溶液（１００ｍＬ）でさらに洗浄した。有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。化合物を、３％トリエチルアミンを含有するＣＨ２Ｃｌ２（ＭｅＯＨを、勾配として使用、０〜５％）のシリカゲルカラムクロマトグラフィーによってさらに精製した。溶媒を除去した後、化合物（５）が泡状物として出現した。収率: 5.51 g (73%); Rf (CH2Cl2/MeOH 10/0.5 v/v): 0.31; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ7.71 (s, 1H), 7.4-6.8 (m, 13H, アリール), 6.33 (t, J=7 Hz, 1H) 4.59 (m, 1H), 4.11 (m, 1H), 3.78 (s, 6H, (O-CH3)2), 3.6-3.2 (m, 4H), 3.12(s, 6H, N(CH3)2), 2.55 (m, 2H), 2.21 (s, 3H, C-CH3). 13C NMR (CDCl3, 400 MHz): δ162.27, 158.55, 156.39, 147.78, 144.53, 135.86, 130.01, 127.90, 126.91, 119.30, 113.20, 86.55, 85.52, 82.97, 72.47, 64.20, 55.26, 40.83, 38.56, 37.87, 30.20, 16.85, 7.94; ESI MS: 639.3019 [MH]+
【０１５４】
５’−Ｏ−（ジ−ｐ−メトキシトリチル）−２−Ｎ−（１−（ジメチルアミノ）エチリデン）−２’−デオキシグアノシン−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト（６）：
５’−Ｏ−（ジ−ｐ−メトキシトリチル）−２−Ｎ−（１−（ジメチルアミノ）エチリデン）−２’−デオキシグアノシン（５）（５９６ｍｇ、０．９３ｍｍｏｌｅ）を１０ｍＬの無水ＣＨ２Ｃｌ２に溶解した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１ｍＬ）を、アルゴンの連続流と撹拌を用いて溶液に添加した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−Ｏ−シアノエチルクロロホスホラミダイト（４４０ｍｇ、１．８６ｍｍｏｌ）をこの溶液に添加し、反応をアルゴン下で２時間継続した。反応の終了後、溶液を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液３０ｍＬに注ぎ入れ、ＣＨ２Ｃｌ２（３×１０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を蒸発させた。得られた油状物を、３％トリエチルアミンを含有するＣＨ２Ｃｌ２を使用したカラムクロマトグラフィーにより精製して、淡黄色の泡状物として最終化合物（６）を得た。収率: 0.74 g (94%).Rf (CH2Cl2/MeOH 10/0.6 v/v): 0.45; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ11.98 (s, 1H), 7.81 (d, J=8Hz, 1H), 7.48-6.77 (m, 13H, アリール), 6.21 (t, J=6.9 Hz, 1H), 4.83 (m, 1H), 4.11 (m, 1H), 3.78 (s, 6H, (O-CH3)2), 3.6-3.2 (m, 4H), 3.12 (s, 6H, N(CH3)2), 2.55 (m, 2H), 2.21 (s, 3H, C-CH3).31P NMR (CDCl3, 400 MHz):δ148.36, 147.86 (ジアステレオ異性体).
【０１５５】
２−Ｎ−（１−（モルホリノ）エチリデン）−２’−デオキシグアノシン（７）：
２’−デオキシグアノシン水和物２．８５ｇ（１０ｍｍｏｌ）を、３回ピリジンで共蒸発させ、無水メタノール２０ｍＬに懸濁した。１２ｇの４−（１，１−ジメトキシエチル）モルホリンをアルゴン下で撹拌しながらゆっくりと添加した。反応を、溶液が均質で浅黄色になるまで、６０℃で一晩、継続した。反応後、メタノールを回転蒸発により除去した。粘性の残留物をジエチルエーテルで数回洗浄して、非粘性の白色の固体を得た。化合物を、溶離液としてＣＨＣｌ３を使用したシリカゲルカラムクロマトグラフィーによってさらに精製した。メタノール（０〜２０％）を勾配として使用した。溶媒を除去した後、純粋な化合物（７）が白色の泡状物として出現した。収率: 3.31 g (82%), Rf (CHCl3/MeOH 10/2 v/v): 0.32, 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ7.92 (s, 1H), 6.04 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 5.67 (m, 1H), 4.17 (d, J= 5.8 Hz, 1H), 3.84 (m, 2H), 3.52 (m, 2H), 3.43 (m, 4H. O(CH2)2), 2.96 (m, 4H, N(CH2)2), 2.71-2.19(m, 2H), 2.03 (s, 3H, C-CH3).13C NMR (CDCl3, 400 MHz): δ160.15, 157.26, 154.51, 148.34, 137.11, 87.85, 84.16, 70.28, 66.22, 45.86, 42.35, 38.38, 29.69, 16.80.
【０１５６】
５’−Ｏ−（ジ−ｐ−メトキシトリチル）−２−Ｎ−（１−（モルホリノ）エチリデン）−２’−デオキシグアノシン（８）：
２−Ｎ−（１−（モルホリノ）エチリデン）−２’−デオキシグアノシン（７）（３．３１ｇ  ０．００８７ｍｏｌｅ）を無水ピリジン（２５ｍＬ）に溶解し、作製した溶液をアルゴンで飽和した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６．４２ｇ、０．０５ｍｏｌｅ、８．６５ｍＬ）を溶液に添加し、アルゴン下で１０分間撹拌した。無水ピリジン２５ｍＬ中のジ−ｐ−メトキシトリチルクロリド（２．９ｇ、０．００８７ｍｏｌｅ）溶液をアルゴン下で調製した。ＤＭＴ−Ｃｌ溶液を、アルゴンの連続流を用いて（１０）の溶液に移した。反応を、アルゴン下で撹拌しながら３時間継続した。溶液を濃縮し、ジクロロメタン１００ｍＬでさらに希釈した。混合物をＮａＨＣＯ３飽和水溶液（１００ｍＬ）で３回洗浄した。有機相をＮａＣｌ飽和水溶液（１００ｍＬ）でさらに洗浄した。有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。化合物を、３％トリエチルアミンを含有するＣＨ２Ｃｌ２（ＭｅＯＨを勾配として使用、０〜５％）においてカラムクロマトグラフィーによって精製した。溶媒を除去した後、化合物（８）が白色の泡状物として出現した。収率: 4.89 g (83%); Rf (CH2Cl2/MeOH 10/0.5 v/v): 0.36; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ7.78 (s, 1H), 7.3-6.6 (m, 13H, アリール), 6.03 (t, J=6.8 Hz, 1H) 4.59 (m, 1H), 3.84 (s, 6H, (O-CH3)2), 3.7-3.4 (m, 4H), 3.33 (m, 4H, O(CH2)2), 3.02(m, 4H, N(CH2)2), 2.55 (m, 2H), 2.16 (s, 3H, C-CH3). 13C NMR (CDCl3, 400 MHz): δ168.22, 160.29, 158.89, 156.19, 148.18, 143.23, 137.16, 132.11, 128.10, 127.21, 123.22, 120.24, 118.60, 113.28, 89.03, 86.55, 85.12, 82.27, 72.47, 66.90, 56.26, 45.83, 37.66, 32.87, 30.20, 16.95.
【０１５７】
５’−Ｏ−（ジ−ｐ−メトキシトリチル）−２−Ｎ−（１（モルホリノ）エチリデン）−２’−デオキシグアノシン−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト（９）：
５’−Ｏ−（ジ−ｐ−メトキシトリチル）−２−Ｎ−（１−（モルホリノ）エチリデン）−２’−デオキシグアノシン（８）（１．７ｇ、０．００２５ｍｏｌｅ）を１０ｍＬの無水ＣＨ２Ｃｌ２に溶解した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６ｍＬ）をアルゴンの連続流と撹拌を用いて溶液に添加した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−Ｏ−シアノエチルクロロホスホラミダイト（５９０ｍｇ、０．００２５ｍｏｌｅ）をこの溶液に添加し、反応をアルゴン下で２時間継続した。反応終了後、溶液を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液３０ｍＬに注ぎ入れ、ＣＨ２Ｃｌ２（３×１０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を蒸発させた。得られた油状物は、３％トリエチルアミンを含有するＣＨ２Ｃｌ２を使用したカラムクロマトグラフィーによって精製して、白色の泡状物として最終化合物を得た。化合物（９）を、冷却ヘキサン沈殿によってジクロロメタン溶液からさらに精製した。収率: 1.62 g (77%). Rf (CH2Cl2/MeOH 10/0.7 v/v): 0.49, 31P NMR (CDCl3, 400 MHz):δ147.56, 146.86 (ジアステレオ異性体).
【０１５８】
スキーム３は、（ｉ）２，２−ジメトキシ−１−メチルピロリジン、メタノール、ＲＴ（３ｈ）；（ｉｉ）４，４−ジメトキシトリチルクロリド、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２ｈ）；（ｉｉｉ）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−シアノエチルホスホルアミジテクロリド、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、ＣＨ２Ｃｌ２（２ｈ）；（ｉｖ）４−（１，１−ジメトキシエチル）モルホリン、ＲＴ、終夜；（ｖ）４，４−ジメトキシトリチルクロリド、ピリデイン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２ｈ）；（ｖｉ）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−シアノエチルホスホルアミジテクロリド、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、ＣＨ２Ｃｌ２（２ｈ）の条件に従った化合物（１５）の合成を示す。
【化４６】
0006730932.tif 000053
【０１５９】
４−Ｎ−（Ｎ−メチルピロリジン−２−イリデン）−２’−デオキシシチジン（１０）の合成：
２’−デオキシシチジン水和物（２ａ）２．５ｇ（１０ｍｍｏｌ）を無水メタノール２０ｍＬに懸濁した。２，２−ジメトキシ−１−メチルピロリジン３．８ｇ（２６ｍｍｏｌ）をアルゴン下で撹拌しながらゆっくりと添加した。反応を、溶液が均質で浅黄色になるまで３時間継続した。反応後、メタノールを回転蒸発によって除去した。粘性残留物をジエチルエーテルで数回洗浄して、非粘性の固体を得た。化合物を、溶離液としてＣＨ２Ｃｌ２を使用したシリカゲルカラムクロマトグラフィーによってさらに精製した。メタノール（０〜２０％）を勾配として使用した。溶媒を除去した後、純粋な化合物が白色の泡状物として出現した。収率: 2.61 g (85%); Rf (CH2Cl2/MeOH 10/2 v/v): 0.3; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ7.91 (d, J=7.8 Hz, 1H), 6.13 (t, J=7.1 Hz, 1H), 6.03 (d, J=8 Hz, 1H), 4.55 (m, 1H), 4.01 (m, 1H), 3.88 (m, 2H), 3.48 (m, 2H), 3.11 (m, 2H), 3.05 (, 3H), 2.41 (m, 2H), 2.06 (m, 2H); 13C NMR (CDCl3, 400 MHz): δ172.20, 169.00, 156.74, 141.98, 103.40, 87.53, 70.17, 61.71, 51.71, 40.56, 31.93, 30.53, 19.71; ESI MS: 309.1583 [MH]+
【０１６０】
５’−Ｏ−（ジ−ｐ−メトキシトリチル）−４−Ｎ−（Ｎ−メチルピロリジン−２−イリデン）−２’−デオキシシチジン（１１）の合成：
４−Ｎ−（Ｎ−メチルピロリジン−２−イリデン）−２’−デオキシシチジン（１０）４．２ｇ（０．０１３６ｍｏｌｅ）を無水ピリジン２５ｍＬに溶解した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン９．８８ｍＬをアルゴン下でこの溶液に添加し、１０分間撹拌した。４．８ｇ（０．０１４３ｍｏｌｅ）のＤＭＴ−Ｃｌをアルゴン下で撹拌しながら無水ピリジン２５ｍＬに溶解した。反応を、２時間継続した。溶液を濃縮し、ジクロロメタン１００ｍＬでさらに希釈した。混合物をＮａＨＣＯ３飽和水溶液（１００ｍＬ）で３回洗浄した。有機相をＮａＣｌ飽和水溶液（１００ｍＬ）でさらに洗浄した。有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。化合物を、３％トリエチルアミンを含有するＣＨ２Ｃｌ２（ＭｅＯＨを勾配として使用、０〜５％）においてカラムクロマトグラフィーにより精製した。溶媒を除去した後、化合物（１１）が浅黄色の泡状物として出現した。収率: 6.48 g (78%); Rf (CH2Cl2/MeOH 10/0.5 v/v): 0.4; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ7.90 (d, 1H), 7.44-6.80 (m, 13H, アリール), 6.42 (t, J=6.8 Hz, 1H), 5.81 (d, J=8 Hz, 1H), 4.54 (m, 1H), 4.15 (m, 1H), 3.80 (s, 6H, (O-CH3)2), 3.70-3.40 (m, 4H), 3.15 (t, J=6.8 Hz, 2H), 3.03 (s, 3H, N-CH3), 2.68 (m, 2H), 2.21 (m, 2H). 13C NMR (CDCl3, 400 MHz): δ172.09, 169.02, 158.53, 156.59, 144.54, 140.50, 130.10, 128.17, 127.91, 126.91, 113.22, 103.17, 86.64, 86.44, 86.01, 71.52, 63.31, 55.24, 51.55, 42.03, 31.82, 30.63, 19.71; ESI MS: 611.2997 [MH]+
【０１６１】
５’−Ｏ−（ジ−ｐ−メトキシトリチル）−４−Ｎ−（Ｎ−メチルピロリジン−２−イリデン）−２’−デオキシシチジン−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト（１２）
５’−Ｏ−（ジ−ｐ−メトキシトリチル）−４−Ｎ−（Ｎ−メチルピロリジン−２−イリデン）−２’−デオキシシチジン（１１）（４５６ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌｅ）を１０ｍＬの無水ＣＨ２Ｃｌ２に溶解した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１ｍＬ）をアルゴンの連続流と撹拌を用いてこの溶液に添加した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−Ｏ−シアノエチルクロロホスホラミダイト（３５０ｍｇ、１．４８ｍｍｏｌ）をこの溶液に添加し、反応をアルゴン下で２時間継続した。反応終了後、溶液を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液３０ｍＬに注ぎ入れ、ＣＨ２Ｃｌ２（３×１０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を蒸発させた。得られた油状物を、３％トリエチルアミンを含有するＣＨ２Ｃｌ２を使用したカラムクロマトグラフィーによって精製して、淡黄色の泡状物として最終化合物（１２）を得た。収率: 0.53 g (87%). Rf (CH2Cl2/MeOH 10/0.8 v/v): 0.5; 31P NMR (CDCl3, 400 MHz):δ149.48, 148.78 (ジアステレオ異性体)
【０１６２】
４−Ｎ−（１−（モルホリノ）エチリデン）−２’−デオキシシチジン（１３）：
２’−デオキシシチジン一水和物２．４５ｇ（１０ｍｍｏｌ）を３回ピリジンで共蒸発させ、無水メタノール２０ｍＬに懸濁した。１０ｇの４−（１，１−ジメトキシエチル）モルホリンをアルゴン下で撹拌しながらゆっくりと添加した。反応を一晩継続した。反応後、メタノールを回転蒸発によって除去した。非粘性の白色の粉末が得られるまで、粘性残留物をジエチルエーテルで数回洗浄した。化合物を、溶離液としてＣＨＣｌ３を使用したシリカゲルカラムクロマトグラフィーによってさらに精製した。メタノール（０〜１０％）を勾配として使用した。溶媒を除去した後、純粋な化合物（１３）が白色の泡状物として出現した。収率: 3.0 g (88%), Rf (CHCl3/MeOH 10/2 v/v): 0.38; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ7.53 (d, J=6.3 Hz, 1H), 6.01 (t, J=6.7 Hz, 1H), 5.27 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 4.35 (m, 1H), 3.91 (m, 1H), 3.88 (m, 2H), 3.55 (m, 4H, O(CH2)2), 2.91 (m, 4H, N(CH2)2), 2.5-2.3(m, 2H), 1.73 (s, 3H, C-CH3).13C NMR (CDCl3, 400 MHz): δ163.85, 160.12, 153.81, 142.14, 108.11, 92.17, 84.72, 71.60, 67.08, 60.40, 44.78, 40.92, 22.98.
【０１６３】
５’−Ｏ−（ジ−ｐ−メトキシトリチル）−４−Ｎ−（１−（モルホリノ）エチリデン）−２’−デオキシシチジン（１４）：
４−Ｎ−（１−（（モルホリノ）エチリデン））−２’−デオキシシチジン（１３）（２．９８ｇ  ０．００８８ｍｏｌｅ）を無水ピリジン（２５ｍＬ）に溶解し、作製した溶液をアルゴンで飽和させた。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６．４２ｇ、０．０５ｍｏｌｅ、８．６５ｍＬ）をこの溶液に添加し、アルゴン下で１０分間撹拌した。無水ピリジン２５ｍＬ中のジ−ｐ−メトキシトリチルクロリド（２．９５ｇ、０．００８８ｍｏｌｅ）溶液をアルゴン下で調製した。ＤＭＴ−Ｃｌ溶液を、アルゴンの連続流を用いて１６の溶液に移した。この反応を、アルゴン下で撹拌しながら２時間継続した。溶液を濃縮し、ジクロロメタン１００ｍＬでさらに希釈した。この混合物をＮａＨＣＯ３飽和水溶液（１００ｍＬ）で３回洗浄した。有機相をＮａＣｌ飽和水溶液（１００ｍＬ）でさらに洗浄した。有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。化合物は、３％トリエチルアミンを含有するＣＨ２Ｃｌ２（ＭｅＯＨを勾配として使用、０〜２％）においてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。溶媒を除去した後、化合物（１４）が白色の泡状物として出現した。収率: 4.25 g (75%); Rf (CH2Cl2/MeOH 10/0.5 v/v): 0.38; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ7.5-6.7 (m, 14H, アリール), 6.05 (t, J=6.7 Hz, 1H), 5.17 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 4.47 (m, 1H), 4.13 (m, 1H), 3.95 (m, 2H), 3.71 (s, 6H, (O-CH3)2), 3.48 (m, 4H, O(CH2)2), 2.87 (m, 4H, N(CH2)2), 2.6-2.3(m, 2H), 1.67 (s, 3H, C-CH3); 13C NMR (CDCl3, 400 MHz): δ164.75, 161.32, 158.07, 151.71, 147.11, 142.34, 136.21, 129.88, 127.62, 125.65, 115.23, 109.11, 92.17, 87.02, 84.72, 71.60, 68.09, 61.38, 54.28, 44.71, 41.22, 21.61.
【０１６４】
５’−Ｏ−（ジ−ｐ−メトキシトリチル）−４−Ｎ−（１−（モルホリノ）エチリデン）−２’−デオキシシチジン−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト（１５）：
５’−Ｏ−（ジ−ｐ−メトキシトリチル）−４−Ｎ−（１−モルホリノエチリデンアミノ）−２’−デオキシシチジン（１４）（１．６０ｇ、０．００２５ｍｏｌｅ）を１０ｍＬの無水ＣＨ２Ｃｌ２に溶解した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６ｍＬ）をアルゴン連続流と撹拌を用いてこの溶液に添加した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−Ｏ−シアノエチルクロロホスホラミダイト（５９０ｍｇ、０．００２５ｍｏｌｅ）をこの溶液に添加し、反応をアルゴン下で２時間継続した。反応終了後、この溶液を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液３０ｍＬに注ぎ入れ、ＣＨ２Ｃｌ２（３×１０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を蒸発させた。得られた油状物は、３％トリエチルアミンを含有するＣＨ２Ｃｌ２を使用したカラムクロマトグラフィーによって精製して、白色の泡状物として最終化合物を得た。化合物（１５）は、冷却ヘキサン沈殿によって、ジクロロメタン溶液からさらに精製した。収率: 1.4 g (66%). Rf (CH2Cl2/MeOH 10/0.5 v/v): 0.4, 31P NMR (CDCl3, 400 MHz):δ147.39, 146.13 (ジアステレオ異性体).
【０１６５】
以下の実施例は、本明細書に記述されている化合物（１６〜２１）の一般的な合成ストラテジーを示す。
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシリボヌクレオシド−３’−Ｏ−Ｓ−エチルベンゾチオエート−ピロリジニルホスホラミダイトの合成
【化４７】
0006730932.tif 000054
【０１６６】
ビス（１−ピロリジニル）クロロホスフィン（０．０１６ｍｏｌ、４グラム）を、２５０ｍＬ丸底フラスコ中の無水ジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（１当量）をこの溶液に添加し、室温にてアルゴン下で撹拌した。終了時に、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシリボヌクレオシド（０．０１６ｍｏｌ、１．０当量）をこの溶液に添加した。混合物を３０分間、室温にて窒素下で撹拌し、この時、３１Ｐ  ＮＭＲスペクトルは出発物質が生成物へと完全に変換されたことを示した。この時点で、エチルチオサリチル酸塩（１．０当量）を混合物に添加し、滴下直後に、１５分間かけてシリンジによって１Ｈ−エチルチオテトラゾール（無水アセトニトリル中０．２５Ｍ、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＶＡ、０．５当量）を添加した。３１Ｐ  ＮＭＲスペクトルがホスホロジアミダイトが完全に変換されたことを示すまで、混合物を室温にて窒素下で撹拌した。溶媒を真空で除去し、粗生成物は、２％トリメチルアミンを含有する酢酸エチル中のアセトニトリル０〜６０％勾配を使用したＡｇｉｌｅｎｔ分取ＨＰＬＣ  ＳＤ−１系によって単離した。以下のスキームは、上述の合成を示している。
【化４８】
0006730932.tif 000055
【０１６７】
化合物（１６）：５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシリボチミジン−３’−Ｏ−Ｓ−エチルベンゾチオエート−ピロリジニルホスホラミダイト。31P NMR (CD3CN): δ 143.22, 142.57(d). ESI-MS (m/z): 計算値826.2922 (M+H)+, 実測値826.2921 (M+H)+.
【化４９】
0006730932.tif 000056
【０１６８】
化合物（１７）：５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ６−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミジノ）−２’−デオキシリボアデノシン−３’−Ｏ−Ｓ−エチルベンゾチオエート−ピロリジニルホスホラミダイト。31P NMR (CD3CN): δ 142.92, 142.79(d). ESI-MS (m/z): 計算値904.3616 (M+H)+, 実測値904.3607 (M+H)+.
【化５０】
0006730932.tif 000057
【０１６９】
化合物（１８）：５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−デオキシリボシチジン−３’−Ｏ−Ｓ−エチルベンゾチオエート−ピロリジニルホスホラミダイト。31P NMR (CD3CN): δ 143.70, 143.17(d). ESI-MS (m/z): 計算値853.3031 (M+H)+, 実測値853.3035 (M+H)+.
【化５１】
0006730932.tif 000058
【０１７０】
化合物（１９）：５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−（Ｎ−メチル−２−ピロリジニルデン）−２’−デオキシリボシチジン−３’−Ｏ−Ｓ−エチルベンゾチオエート−ピロリジニルホスホラミダイト。31P NMR (CD3CN): δ 143.41, 142.80(d). ESI-MS (m/z): 計算値892.3504 (M+H)+, 実測値853.3506 (M+H)+.
【化５２】
0006730932.tif 000059
【０１７１】
化合物（２０）：５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−イソブチリル−２’−デオキシリボグアノシン−３’−Ｏ−Ｓ−エチルベンゾチオエート−ピロリジニルホスホラミダイト。31P NMR (CD3CN): δ 143.17, 143.13(d). ESI-MS (m/z): 計算値921.3406 (M+H)+, 実測値921.3385 (M+H)+.
【化５３】
0006730932.tif 000060
【０１７２】
化合物（２１）：５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミジノ）−２’−デオキシリボグアノシン−３’−Ｏ−Ｓ−エチルベンゾチオエート−ピロリジニルホスホラミダイト。31P NMR (CD3CN): δ 142.92, 142.79(d). ESI-MS (m/z): 計算値920.3566 (M+H)+, 実測値920.3561 (M+H)+.
【化５４】
0006730932.tif 000061
【０１７３】
アレイの合成
ＤＮＡマイクロアレイは、Ｌｅｐｒｏｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （２０１０），Ｖｏｌ．３８（８），ｐｐ  ２５２２−２５４０に記載されているＡｇｉｌｅｎｔ製造方法に従って、Ａｇｉｌｅｎｔアレイライター上で製造した。Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔを含有しており、１７８〜２０２ヌクレオチド長の範囲である、５，５２８ユニークオリゴヌクレオチド配列のセットは、化合物Ｔ（１６）、Ｃ（１８）、Ａ（１７）およびＧ（２０）を用いて合成した。オリゴヌクレオチドは、ウェハ内のシリル化された６．６２５ｘ６上の切断可能リンカー上でインサイチュ合成した。合成の終了時に、オリゴヌクレオチドを脱保護し、室温で一晩実施されたアンモニアガス処理によって個々のスライドから切断した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ系での配列決定分析の実施には、
・５’アダプター＝２９ヌクレオチド
・配列決定プライマー＝３２ヌクレオチド
・バーコード＝１６塩基
・照会配列＝７６塩基または１００塩基
・３’アダプター＝２５ヌクレオチド
を含むオリゴヌクレオチドの配列が必要であった。配列分析によって完全長配列の完全性および存在を確認した。さらに、単一２００マーオリゴヌクレオチド配列５’−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＣＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＡＧＴＴＣＴＡＣＡＧＴＣＣＧＡＣＧＡＴＣＧＡＣＧＴＴＣＣＣＡＧＧＡＴＡＣＴＴＡＴＡＧＧＡＧＧＧＧＣＡＡＡＣＣＴＣＴＴＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＣＴＧＧＴＣＣＴＡＴＣＣＡＧＴＡＡＡＣＣＡＣＴＴＧＧＴＴＡＡＴＧＴＡＡＧＡＧＧＣＣＣＧＣＣＴＴＴＣＧＡＴＣＡＧＡＡＡＣＧＴＣＴＧＧＡＴＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧＴ−３’（配列番号１）を同一プロトコルおよび同一ホスホラミダイト化合物Ｔ（１６）、Ａ（１７）、Ｃ（１８）およびＧ（２０）を使用してアレイ上で合成した。脱保護およびアレイからの切断は、上述のようにして実施した。生成物の変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により２００マーの合成の成功を確認した（図２５）。
【０１７４】
本明細書および添付の請求項において、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそれ以外のことを示さない限り、複数の言及を含んでいる。
【０１７５】
特に断りのない限り、本明細書において使用されているすべての技術用語および科学用語は、当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様または同等の任意の方法および材料もまた、本開示の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料をここに記載している。本明細書に列挙されている方法は、開示されている特定の順序に加えて、論理上可能なあらゆる順序で実施され得る。
【０１７６】
参照による援用
他の文献、例えば、特許、特許出願、特許公報、雑誌、書籍、論文、ウェブコンテンツなどの参照および引用を本開示で行っている。このようなすべての文献は、これにより、あらゆる目的のためにそれらの全体を参照することによって本明細書に援用する。参照によって本明細書に援用することを述べているが、本明細書に明示的に記載されている既存の定義、記述または別の開示資料と抵触する任意の事項またはそれらの一部は、援用事項と本開示の事項との間に抵触が生じない範囲でのみ援用される。抵触が生じた場合には、抵触は、好ましい開示としての本開示に対し有利に解決されるものとする。
【０１７７】
均等物
本明細書に開示されている代表的な実施例は本発明の説明を補うものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、また限定するものと解釈されるべきでない。実際、本明細書に提示および開示されているものに加えて、本発明の様々な変更およびそれらの多くのさらなる実施形態は、以下の実施例を含む本文書の全内容ならびに本明細書に引用されている科学文献および特許文献から当業者には明らかであろう。本明細書に記載されている実施例は、その様々な実施形態およびそれらの均等物において本発明の実施に適し得る重要なさらなる情報、例示およびガイダンスを含んでいる。
【０１７８】
実施形態
本開示の態様は、構造式（Ｉ）：
【化５５】
0006730932.tif 000062
［式中、Ｂは、核酸塩基またはその類似体であり；Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、直鎖状、分枝状もしくは環状の置換もしくは非置換アルキルであるか、または、Ｒ１とＲ２は一緒になって５、６、７もしくは８員の非芳香族環を形成しており；Ｒ３は、酸不安定性保護基であり；Ｒは、ベンジルアルコール誘導体、α−メチルアリールアルコール誘導体、ナフタレンアルコール誘導体、二環式脂肪族アルコール誘導体、Ｓ−エチルチオエートおよびアミノ酸誘導体からなる群から選択される基であり、ただし、Ｒはｏ−メチルベンジルではない］
を有する化合物を含む。
【０１７９】
本化合物のいくつかの実施形態において、Ｂは、核酸塩基または保護された核酸塩基であり、ここで、核酸塩基はアデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシルから選択され；Ｒ３は、ＤＭＴ、ＭＭＴ、ＴＭＴ、ピキシルおよびピバロイルから選択される基である。本化合物のいくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、直鎖状、分枝状もしくは環状の置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ１８アルキルである。本化合物のいくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、直鎖状または分枝状の非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。いくつかの実施形態において、本化合物は、構造式（Ｉａ）：
【化５６】
0006730932.tif 000063
を有する。
【０１８０】
本化合物のいくつかの実施形態において、Ｒ１とＲ２は、一緒になって、５または６員の非芳香族環を形成しており、ここで、環は骨格中に０または１個のヘテロ原子を有する。本化合物のいくつかの実施形態において、Ｒ１とＲ２は、一緒になって、骨格中に０個のヘテロ原子を有する５員の非芳香族環を形成する。いくつかの実施形態において、本化合物は、構造式（Ｉｂ）：
【化５７】
0006730932.tif 000064
［式中、Ｒ４は、それぞれ、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルキルオキシから選択される］
を有する。いくつかの実施形態において、本化合物は、式Ｉｃ：
【化５８】
0006730932.tif 000065
の構造を有する。
【０１８１】
いくつかの実施形態において、本化合物は、構造式（Ｉｄ）：
【化５９】
0006730932.tif 000066
［式中、Ｒ７は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ１〜Ｃ６アルキルオキシである］
を有する。
【０１８２】
いくつかの実施形態において、本化合物は、構造式（Ｉｆ）：
【化６０】
0006730932.tif 000067
［式中、Ｒ８は、脂肪族基である］
を有する。
【０１８３】
本化合物のいくつかの実施形態において、Ｒは、構造式（ＩＩ）：
【化６１】
0006730932.tif 000068
［式中、Ｒａは、水素またはアルキルであり；Ｒ１１は、それぞれ独立して、水素、アルキル、アルコキシ、アルキル−Ｓ−、シアノ、メチルシアノまたはハロゲンであり；ｎは、１、２または３である］
を有するベンジルアルコールの誘導体である。
【０１８４】
本化合物のいくつかの実施形態において、Ｒは、
【化６２】
0006730932.tif 000069
［式中、Ｒ６は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、シアノ、メチルシアノおよびヒドロカルビルから選択される］
から選択されるベンジルアルコールの誘導体である。本化合物のいくつかの実施形態において、Ｒは、構造：
【化６３】
0006730932.tif 000070
［式中、Ｒ７は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキルオキシおよび電子吸引基から独立して選択される１個または複数の置換基である］
を有するベンジルアルコールの誘導体である。
【０１８５】
本化合物のいくつかの実施形態において、Ｒは、構造式（ＩＩＩ）：
【化６４】
0006730932.tif 000071
［式中、Ｘは、水素、ハロゲン、シアノ、メチルシアノまたはトリフルオロメチルであり；Ｙは、水素、アルキル、ハロアルキルまたはアルコキシアルキルであり；Ｒａは、水素またはアルキルである］
を有するα−メチルアリールアルコールの誘導体である。
【０１８６】
本化合物のいくつかの実施形態において、Ｒは、
【化６５】
0006730932.tif 000072
［式中、Ｒ９は、ハロゲン、シアノまたはトリフルオロメチルであり；Ｒ１０は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルキルオキシから選択される］
から選択されるα−メチルアリールアルコールの誘導体である。
【０１８７】
本化合物のいくつかの実施形態において、Ｒは、構造式（ＩＶ）：
【化６６】
0006730932.tif 000073
［式中、Ｒ７は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルキルオキシから選択され；Ｒ５は、水素およびヒドロカルビルから選択され；Ｒ１２は、水素およびアルコキシから選択される］
を有するナフタレンアルコールの誘導体である。
【０１８８】
本化合物のいくつかの実施形態において、Ｒは、
【化６７】
0006730932.tif 000074
［式中、Ｒ１３は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルである］
から選択されるナフタレンアルコールの誘導体である。
【０１８９】
本化合物のいくつかの実施形態において、Ｒは、構造式（Ｖ）または（ＶＩ）：
【化６８】
0006730932.tif 000075
［式中、Ｒ１４は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルキルオキシから選択され；Ｒ１５およびＲ１６は、それぞれ独立して、水素、シアノ、アルコキシまたはハロゲンであり；ｍは、１または２である］
を有する二環式脂肪族アルコールの誘導体である。
【０１９０】
本化合物のいくつかの実施形態において、Ｒは、
【化６９】
0006730932.tif 000076
［式中、Ｒ１４は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ１〜Ｃ６アルキルオキシであり；Ｒ１５は、水素、ハロゲンまたはＣ１〜Ｃ６アルコキシであり；Ｒ１６は、水素、シアノまたはハロゲンである］
から選択される二環式脂肪族アルコールの誘導体である。
【０１９１】
本化合物のいくつかの実施形態において、Ｒは、
【化７０】
0006730932.tif 000077
［式中、Ｒ７は、水素、ハロゲン、ヒドロカルビルおよびアルキルオキシから選択される］
である。
【０１９２】
本化合物のいくつかの実施形態において、Ｒは、
【化７１】
0006730932.tif 000078
から選択される。
【０１９３】
本化合物のいくつかの実施形態において、Ｒは、
【化７２】
0006730932.tif 000079
[式中、Ｒ７は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ１〜Ｃ６アルキルオキシである]
である。
【０１９４】
本化合物のいくつかの実施形態において、Ｒは、
【化７３】
0006730932.tif 000080
［式中、Ｒ８は脂肪族基である］
である。
【０１９５】
本化合物のいくつかの実施形態において、Ｂは、アミジン核酸塩基保護基を含む。本化合物のいくつかの実施形態において、アミジン核酸塩基保護基はアセトアミジン保護基である。本化合物のいくつかの実施形態において、アセトアミジン保護基は、以下の構造：
【化７４】
0006730932.tif 000081
［式中、Ｒ２１およびＲ２２は、それぞれ独立して、アルキル、置換アルキルであるか、または、Ｒ２１とＲ２２は環状的に連結して５もしくは６員の置換もしくは非置換複素環を形成している］
により示される。本化合物のいくつかの実施形態において、Ｒ２１およびＲ２２はメチルである。本化合物のいくつかの実施形態において、Ｒ２１とＲ２２は環状的に連結して５もしくは６員の置換もしくは非置換複素環を形成しており、ここで、複素環は、モルホリン、ピペリジンおよびピロリジンからなる群から選択される。
【０１９６】
本化合物のいくつかの実施形態において、アセトアミジン保護基は、以下の構造：
【化７５】
0006730932.tif 000082
によって示される。
【０１９７】
本化合物のいくつかの実施形態において、Ｂは、以下の構造：
【化７６】
0006730932.tif 000083
の１つによって示される。
【０１９８】
本化合物のいくつかの実施形態において、Ｒは、
【化７７】
0006730932.tif 000084
［式中、Ｒ７は、水素、ハロゲン、ヒドロカルビルおよびアルキルオキシから選択される］
である。
【０１９９】
また、構造式（ＶＩＩ）：
【化７８】
0006730932.tif 000085
［式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれイソプロピルであるか、または、Ｒ１とＲ２は、一緒になって、それらが結合されているＮとともにピロリジン複素環を形成し；Ｒ３は、酸不安定性保護基であり；Ｒ’は、シアノエチル基およびメチル基から選択される基であり；Ｂは、
【化７９】
0006730932.tif 000086
から選択される保護された核酸塩基である］
を有する化合物を提供する。
【０２００】
また、ポリヌクレオチドを合成する方法であって、（ａ）保護されていないヒドロキシル基を有するヌクレオシド残基を用意することと；（ｂ）ヌクレオシド残基を（例えば、本明細書に記載されているような）ヌクレオシドモノマーと接触させて、ヌクレオシドモノマーをヌクレオシド残基に共有結合させポリヌクレオチドを生成することとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、ポリヌクレオチドを酸化剤に曝露することをさらに含む。いくつかの実施形態において、本方法は、核酸を脱保護剤に曝露することをさらに含む。いくつかの実施形態において、本方法は、接触させるステップを少なくとも一回繰り返すことをさらに含む。本方法のいくつかの実施形態において、ヌクレオシド残基は、固相支持体に共有結合されている。いくつかの実施形態において、本方法は、核酸を前記固相支持体から切断して、遊離核酸を生成させることをさらに含む。本方法のいくつかの実施形態において、核酸は、少なくとも約２００ヌクレオチドの配列を有するＤＮＡである。本方法のいくつかの実施形態において、核酸は、約２００ヌクレオチド〜約１，０００ヌクレオチドの長さを有するＤＮＡである。本方法のいくつかの実施形態において、ＤＮＡは、約３００ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチドの長さを有する。本方法のいくつかの実施形態において、ＤＮＡは、１００ヌクレオチド当たり２つ未満の単一ヌクレオチド欠失を有する。本方法のいくつかの実施形態において、ＤＮＡは、１００ヌクレオチド当たり１つ以下の単一ヌクレオチド欠失を有する。いくつかの実施形態において、本方法は、第１の遊離核酸を第２の遊離核酸とカップリングさせて、約３００ヌクレオチド〜約１０，０００ヌクレオチドの長さを有する伸長された遊離核酸を生成することをさらに含む。いくつかの実施形態において、本方法は、１つまたは複数の追加の遊離核酸を伸長された遊離核酸にカップリングして、遺伝子を生成することをさらに含む。
【０２０１】
また、上述の本主題の方法の実施形態のいずれか１つによって生成される核酸生成物も提供する。また、上述の本主題の方法の実施形態のいずれか１つによって合成される核酸のアレイも提供する。また、上述の本主題の方法の実施形態のいずれか１つによって合成される複数の核酸を含むライブラリーも提供する。また、それぞれの核酸が、上述の本主題の方法の実施形態のいずれか１つによって合成される、構築された核酸断片から構成されている、約３００ヌクレオチド〜約１０，０００ヌクレオチドの長さを有する複数の核酸を含むライブラリーも提供する。ライブラリーのいくつかの実施形態において、複数の核酸は遺伝子へ構築される。
【図１】
0006730932.tif 000120
【図２】
0006730932.tif 000121
【図３−１】
0006730932.tif 000122
【図３−２】
0006730932.tif 000123
【図４】
0006730932.tif 000124
【図５】
0006730932.tif 000125
【図６】
0006730932.tif 000126
【図７】
0006730932.tif 000127
【図８】
0006730932.tif 000128
【図９−１】
0006730932.tif 000129
【図９−２】
0006730932.tif 000130
【図１０】
0006730932.tif 000131
【図１１】
0006730932.tif 000132
【図１２−１】
0006730932.tif 000133
【図１２−２】
0006730932.tif 000134
【図１３】
0006730932.tif 000135
【図１４】
0006730932.tif 000136
【図１５−１】
0006730932.tif 000137
【図１５−２】
0006730932.tif 000138
【図１６】
0006730932.tif 000139
【図１７】
0006730932.tif 000140
【図１８】
0006730932.tif 000141
【図１９】
0006730932.tif 000142
【図２０】
0006730932.tif 000143
【図２１】
0006730932.tif 000144
【図２２】
0006730932.tif 000145
【図２３】
0006730932.tif 000146
【図２４】
0006730932.tif 000147
【図２５】
0006730932.tif 000148
【配列表】
0006730932000001.app