(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子を含む免疫賦活化のための組成物であって、該核酸分子が配列番号１の配列と少なくとも８９％の配列相同性を有し、少なくとも２００のＣｐＧジヌクレオチドを含み、該核酸分子は抗生物質耐性遺伝子を含まず、免疫原をコードしないことを特徴とする、前記組成物。
【請求項２】
前記核酸分子が、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％からなる群から選択される、配列番号１の配列との配列相同性を有する核酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記核酸分子が配列番号１を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
医薬的に許容可能な担体をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
配列番号４の配列と少なくとも８４％の配列相同性を有し、少なくとも２００のＣｐＧジヌクレオチドを含む核酸分子を含み、該核酸分子は抗生物質耐性遺伝子を含まず、免疫原をコードしないことを特徴とする、免疫賦活化のための組成物。
【請求項６】
前記核酸分子が、配列番号４の配列と少なくとも８５％の配列相同性を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記核酸分子が、配列番号４の配列と少なくとも８６％の配列相同性を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
前記核酸分子が、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％からなる群から選択される、配列番号４の配列との配列相同性を有する核酸配列を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
前記核酸分子が配列番号４を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項１０】
医薬的に許容可能な担体をさらに含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項１１】
ａ．配列番号１の配列と少なくとも８９％の配列相同性を有し、少なくとも２００のＣｐＧジヌクレオチドを含む核酸分子と；
ｂ．リポソーム送達ビヒクルと、
を含み、前記核酸分子は抗生物質耐性遺伝子を含まず、免疫原をコードしないことを特徴とする、免疫賦活化のための組成物。
【請求項１２】
前記核酸分子が、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％からなる群から選択される、配列番号１の配列との配列相同性を有する核酸配列を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記核酸分子が配列番号１を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記リポソーム送達ビヒクルが、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）およびコレステロール；Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）およびコレステロール；１−［２−（オレオイルオキシ）エチル］−２−オレイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）およびコレステロール；ならびにジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）およびコレステロールからなる群から選択される脂質ペアを含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
医薬的に許容可能な担体をさらに含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１６】
ａ．配列番号４の配列と少なくとも８４％の配列相同性を有し、少なくとも２００のＣｐＧジヌクレオチドを含む核酸分子と、
ｂ．リポソーム送達ビヒクルと、
を含み、前記核酸分子は抗生物質耐性遺伝子を含まず、免疫原をコードしないことを特徴とする、免疫賦活化のための組成物。
【請求項１７】
前記核酸分子が、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％からなる群から選択される、配列番号４の配列との配列相同性を有する核酸配列を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記核酸分子が配列番号４を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
前記リポソーム送達ビヒクルが、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）およびコレステロール；Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）およびコレステロール；１−［２−（オレオイルオキシ）エチル］−２−オレイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）およびコレステロール；ならびにジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）およびコレステロールからなる群から選択される脂質ペアを含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２０】
医薬的に許容可能な担体をさらに含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２１】
組成物を対象に投与することを含む、対象において免疫反応を刺激する方法に用いるための該組成物であって、配列番号１の配列と少なくとも８９％の配列相同性を有し、少なくとも２００のＣｐＧジヌクレオチドを含む核酸配列と、リポソーム送達ビヒクルと、を含み、前記核酸配列は抗生物質耐性遺伝子を含まず、免疫原をコードしないことを特徴とする、組成物。
【請求項２２】
前記リポソーム送達ビヒクルが、多重膜小胞脂質および押出脂質からなる群から選択される脂質を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記リポソーム送達ビヒクルが、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）およびコレステロール；Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）およびコレステロール；１−［２−（オレオイルオキシ）エチル］−２−オレイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）およびコレステロール；ならびにジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）およびコレステロールからなる群から選択される脂質ペアを含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
投与が、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、噴霧によるもの、エアロゾルによるもの、胚内、経口、眼内、気管内および鼻腔内からなる群から選択される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２５】
生物学的製剤をさらに含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２６】
前記生物学的製剤が、免疫促進物質タンパク質、免疫原、ワクチン、抗菌剤およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記投与が感染性病原体への曝露前である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２８】
前記投与が感染性病原体への曝露後である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２９】
前記刺激される免疫反応が、非抗原特異的免疫反応、抗原特異的免疫反応、自然免疫反応、適応免疫反応、液性免疫反応、細胞性免疫反応またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項３０】
前記対象が、哺乳類、水産養殖物類および鳥類からなる群から選択される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項３１】
医薬的に許容可能な担体をさらに含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項３２】
組成物を対象に投与することを含む、対象において免疫反応を刺激する方法に用いるための該組成物であって、配列番号４の配列と少なくとも８４％の配列相同性を有し、少なくとも２００のＣｐＧジヌクレオチドを含む核酸配列と、リポソーム送達ビヒクルと、を含み、前記核酸配列は抗生物質耐性遺伝子を含まず、免疫原をコードしないことを特徴とする、組成物。
【請求項３３】
前記リポソーム送達ビヒクルが、多重膜小胞脂質および押出脂質からなる群から選択される脂質を含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記リポソーム送達ビヒクルが、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）およびコレステロール；Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）およびコレステロール；１−［２−（オレオイルオキシ）エチル］−２−オレイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）およびコレステロール；ならびにジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）およびコレステロールからなる群から選択される脂質ペアを含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３５】
投与が、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、噴霧によるもの、エアロゾルによるもの、胚内、経口、眼内、気管内および鼻腔内からなる群から選択される、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３６】
生物学的製剤をさらに含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３７】
前記生物学的製剤が、免疫促進物質タンパク質、免疫原、ワクチン、抗菌剤およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記投与が感染性病原体への曝露前である、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３９】
前記投与が感染性病原体への曝露後である、請求項３２に記載の組成物。
【請求項４０】
前記刺激される免疫反応が、非抗原特異的免疫反応、抗原特異的免疫反応、自然免疫反応、適応免疫反応、液性免疫反応、細胞性免疫反応またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３２に記載の組成物。
【請求項４１】
前記対象が、哺乳類、水産養殖物類および鳥類からなる群から選択される、請求項３２に記載の組成物。
【請求項４２】
医薬的に許容可能な担体をさらに含む、請求項３２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般的に、免疫賦活プラスミドに関する。本プラスミドは、抗生物質耐性遺伝子を含まない。本プラスミドは、抗生物質耐性遺伝子ではない、選択可能またはスクリーニング可能マーカー遺伝子（例えばＬａｃＺ遺伝子）を含み得る。あるいは、本プラスミドは、何らかの選択可能またはスクリーニング可能マーカー遺伝子を欠き得る。
【背景技術】
【０００２】
非メチル化ＣｐＧモチーフは、脊椎動物ＤＮＡよりも細菌ＤＮＡにおいて高頻度で現れる。これらのモチーフは、宿主防御機構を活性化し、自然および獲得免疫反応へと導く。ＣｐＧモチーフおよびそれらの免疫賦活効果は、Ｋｒｉｅｇ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：７０９−７６０（２００２）で概説されている。
【０００３】
多くのＣｐＧモチーフを含有する免疫賦活プラスミドが以前開発され、プラスミドおよび陽イオン性リポソーム送達ビヒクルを含む免疫調節物質組成物中で鳥類およびウシ亜科の動物に投与する場合、免疫反応を誘発するために有効であることが示されている。それらの全体において両者の内容が参照により本明細書によって組み込まれる、米国特許出願公開第２０１２／００６４１５１号明細書（鳥類）および２０１３／０２９５１６７号明細書（ウシ亜科）を参照。このプラスミド、ｐＭＢ７５．６は、４２４２ｂｐ長であり、２８８個のＣｐＧジヌクレオチドを含有する。ｐＭＢ７５．６のマップは図１で示され、ｐＭＢ７５．６のヌクレオチド配列は配列番号２として提供される。米国特許出願公開第２０１２／００６４１５１号明細書に記載のように、ｐＭＢ７５．６を含有する免疫調節物質組成物は、胚内投与した場合に感染性疾患からヒヨコを防御する非抗原特異的な免疫反応を誘発する。この非抗原特異的な免疫反応は、少なくとも１つの生物学的製剤、例えばワクチンなどの投与によってさらに促進された。さらに、ｐＭＢ７５．６プラスミドを含有する免疫調節物質組成物は、アジュバント効果を有し、ワクチンの有効性の向上を誘発することが分かった。同様に、米国特許出願公開第２０１３／０２９５１６７号明細書に記載のように、ｐＭＢ７５．６を含有する免疫調節物質組成物は、感染性疾患から家畜を防御した、家畜における非抗原特異的免疫反応を誘発した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１２／００６４１５１号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１３／０２９５１６７号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｋｒｉｅｇ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：７０９−７６０（２００２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、図１で示されるように、ｐＭＢ７５．６プラスミドは、カナマイシン耐性遺伝子（ＫａｎＲ）を含有する。抗生物質に基づく選択および産生系は、環境中での細菌への抗生物質耐性遺伝子の水平伝播に関する懸念ゆえに次第に好まれなくなってきている。抗生物質耐性遺伝子の潜在的な水平伝播は、対象に直接投与されるベクターに対して特に懸念されている（例えば、遺伝子治療またはＤＮＡワクチン接種のために使用されるｐＭＢ７５．６またはベクターなどの免疫賦活プラスミド）。したがって、対象において免疫反応を誘発可能であり、また一方で抗生物質耐性遺伝子を欠損している免疫賦活プラスミドが当技術分野で必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、免疫賦活プラスミドに関する。本免疫賦活プラスミドは、配列番号１、配列番号４の配列またはそれらの組み合わせと少なくとも８９％の配列同一性を有する核酸配列を含み得る。いくつかの態様において、本免疫賦活プラスミドは、配列番号４の配列と少なくとも８４％の配列同一性を有する核酸分子を含み得る。いくつかの態様において、本免疫賦活プラスミドは、配列番号１の配列を含み得る。いくつかの態様において、本免疫賦活プラスミドは、配列番号４の配列を含み得る。
【０００８】
他の態様において、本免疫賦活プラスミドは、配列番号１、配列番号４の配列またはそれらの組み合わせと少なくとも８９％の配列同一性を有する核酸配列からなり得る。いくつかの態様において、本免疫賦活プラスミドは、配列番号４の配列と少なくとも８４％の配列同一性を有する核酸分子からなり得る。いくつかの態様において、本免疫賦活プラスミドは、配列番号１の配列からなり得る。いくつかの態様において、本免疫賦活プラスミドは、配列番号４の配列からなり得る。
【０００９】
いくつかの態様において、本免疫賦活プラスミドは、好ましくは、全長または機能的選択可能またはスクリーニング可能マーカーをコードする核酸配列を含まない。他の態様において、本免疫賦活プラスミドは、抗生物質耐性遺伝子ではない選択可能またはスクリーニング可能マーカーをコードする核酸配列を含む。
【００１０】
本発明はまた、本明細書中に記載の免疫賦活プラスミドまたはＤＮＡ配列の何れかと、医薬的に許容可能な担体と、を含む製剤処方にも関する。
【００１１】
本発明はさらに、陽イオン性リポソーム送達ビヒクルと、本明細書中に記載の免疫賦活プラスミドまたはＤＮＡ配列の何れかと、を含む免疫調節物質組成物に関する。
【００１２】
いくつかの態様において、本発明は、本明細書中に記載の免疫賦活プラスミドまたはＤＮＡ配列を使用する方法に関する。適切な使用方法は、対象への治療的投与を含む。このような治療投与は、対象または複数の対象の、予防的処置、メタフィラキシス的な（ｍｅｔａｐｈｙｌａｃｔｉｃ）処置および感染後処置を含む。
【００１３】
本発明は、対象において免疫反応を刺激または誘発する方法に関する。いくつかの態様において、本方法は、本明細書中に記載の免疫調節物質組成物を対象に投与することによって対象において免疫反応を刺激することを含む。いくつかの態様において、本方法は、本明細書中に記載の免疫賦活プラスミドまたはＤＮＡ配列を対象に投与することによって対象において免疫反応を刺激することを含む。
【００１４】
他の目的および特性は、一部分は明らかであり、一部分は本明細書中で以後指摘する。
【００１５】
次の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある一定の態様をさらに明らかにするために含まれる。本発明は、本明細書中で与えられる具体的な実施形態の詳細な記載と組み合わせてこれらの図面の１以上を参照することによって、より良好に理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ｐＭＢ７５．６プラスミドのマップを示す。
【図２】図２は、ｐＧＣＭＢ７５．６プラスミドのマップを示す。
【図３】図３は、ｐＬａｃＺ７５．６プラスミドのマップを示す。
【図４Ａ】図４は、本明細書中に記載の免疫調節物質組成物が病原性ウイルスを負荷した受容対象の生存性を向上させることを図示する（図４Ａおよび図４Ｂ）。
【図４Ｂ】図４は、本明細書中に記載の免疫調節物質組成物が病原性ウイルスを負荷した受容対象の生存性を向上させることを図示する（図４Ａおよび図４Ｂ）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明によれば、受容対象において免疫反応を誘発可能な組成物ならびに使用方法が発見された。特に、本発明は、新規核酸組成物または免疫調節物質組成物およびその使用に関する。このような免疫調節物質組成物は、ＧＣ含量、ＣｐＧモチーフが増加し、抗生物質耐性遺伝子またはコード配列を含むことなく増殖させられる、本明細書中に記載のＤＮＡ配列を含み得ることを発見した。本発明の核酸配列は、対象において免疫反応を刺激または促進して、感染性疾患を予防または処置するために使用され得、当技術分野で公知の他の予防および処置方法よりも安全性が顕著に向上している。本発明は、ウイルス、細菌、カビ、真菌、酵母、寄生虫および当技術分野で公知の他の病原菌などであるが限定されない微生物により引き起こされる感染性疾患の処置および予防において特に有用である。本組成物および本免疫調節物質組成物を使用する方法を下記でより詳細に論じる。
【００１８】
Ｉ．組成物
本明細書中に記載のものなど、本発明において有用な組成物は、一般に、感染性疾患に対する、予防的治療、メタフィラキシス的な（ｍｅｔａｐｈｙｌａｃｔｉｃ）治療または処置的治療として使用することができる。このような組成物は、本明細書中で免疫調節物質組成物と呼ぶ。本免疫調節物質組成物は、少なくとも、受容対象において免疫反応を誘発可能な免疫賦活プラスミドまたは免疫賦活ＤＮＡ配列を含む。いくつかの態様において、本免疫調節物質組成物は、リポソーム送達ビヒクルも含み得る。
【００１９】
Ａ．核酸
いくつかの態様において、本発明は、感染性疾患を引き起こす病原体の処置または予防に有用な核酸分子に関する。本明細書中に記載の核酸分子は、直鎖状２本鎖または１本鎖ＤＮＡ、アミノ酸配列、リボ核酸（ＲＮＡ）またはそれらの組み合わせとして、免疫賦活プラスミドに含まれ得る。いくつかの態様において、本発明は、本免疫賦活プラスミドまたは免疫賦活ＤＮＡ配列を含有する、核酸分子、ベクターおよび宿主細胞（インビトロ、インビボまたはエクスビボ）に関する。
【００２０】
いくつかの態様において、本発明は、抗生物質耐性遺伝子を含まない、免疫賦活プラスミドまたはＤＮＡ配列に関する。本プラスミドは、何らかの選択可能またはスクリーニング可能マーカー遺伝子を欠き得る。例えば、本明細書中に記載のｐＧＣＭＢ７５．６プラスミドは、全長または機能的選択可能もしくはスクリーニング可能マーカー遺伝子を全く含まない。ｐＧＣＭＢ７５．６の配列は、配列番号１で提供される。
【００２１】
いくつかの態様において、本明細書中に記載の免疫賦活プラスミドは、好ましくは、全長または機能的選択可能もしくはスクリーニング可能マーカーをコードする核酸配列を含まない。いくつかの態様において、本免疫賦活プラスミドは、抗生物質耐性遺伝子を含まない。例えば、本プラスミドは、カナマイシン耐性遺伝子を含まない。いくつかの態様において、本明細書中に記載のプラスミドは、好ましくは免疫原をコードしない。
【００２２】
いくつかの態様において、本免疫賦活プラスミドは、抗生物質耐性遺伝子ではない選択可能またはスクリーニング可能マーカー遺伝子をコードする核酸配列を含み得る。例えば、本明細書中に記載のｐＬａｃＺＭＢ７５．６プラスミドは、スクリーニング可能マーカーとしてＬａｃＺ遺伝子を含む。ｐＬａｃＺＭＢ７５．６のマップは、図３で提供され、ｐＬａｃＺＭＢ７５．６のヌクレオチド配列は配列番号４として提供される。図３で示されるように、ｐＬａｃＺＭＢ７５．６は、ｐＧＣＭＢ７５．６と類似するが、ＬａｃＺスクリーニング可能マーカーを含有する。
【００２３】
当然のことながら、ｐＧＣＭＢ７５．６またはｐＬａｃＺＭＢ７５．６プラスミドのヌクレオチド配列は、それらの免疫賦活特性に顕著な悪影響なくある程度まで変動させ得る。いくつかの態様において、本発明は、ｐＧＣＭＢ７５．６（配列番号１）の配列と少なくとも８９％の配列同一性を有する核酸配列を含む免疫賦活プラスミドに関する。本免疫賦活プラスミドは、好ましくは、ｐＧＣＭＢ７５．６の配列（配列番号１）と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの態様において、免疫賦活プラスミドは、より好ましくは、ｐＧＣＭＢ７５．６の配列（配列番号１）を含む。
【００２４】
いくつかの態様において、本発明は、ｐＬａｃＺＭＢ７５．６の配列（配列番号４）と少なくとも８４％の配列同一性を有する核酸配列を含む免疫賦活プラスミドに関する。本免疫賦活プラスミドは、好ましくは、ｐＬａｃＺＭＢ７５．６の配列（配列番号４）と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの態様において、本免疫賦活プラスミドは、より好ましくは、ｐＬａｃＺＭＢ７５．６の配列（配列番号４）を含む。
【００２５】
いくつかの態様において、本発明は、ｐＧＣＭＢ７５．６の配列（配列番号１）と少なくとも８９％の配列同一性を有する核酸配列からなる免疫賦活プラスミドに関する。本免疫賦活プラスミドは、好ましくは、ｐＧＣＭＢ７５．６の配列（配列番号１）と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列からなる。いくつかの態様において、本免疫賦活プラスミドは、より好ましくは、ｐＧＣＭＢ７５．６の配列（配列番号１）からなる。
【００２６】
いくつかの態様において、本発明は、ｐＬａｃＺＭＢ７５．６の配列（配列番号４）と少なくとも８４％の配列同一性を有する核酸配列からなる免疫賦活プラスミドに関する。本免疫賦活プラスミドは、好ましくは、ｐＬａｃＺＭＢ７５．６の配列（配列番号４）と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列からなる。いくつかの態様において、本免疫賦活プラスミドは、より好ましくは、ｐＬａｃＺＭＢ７５．６の配列（配列番号４）からなる。
【００２７】
本発明の別の重要な態様は、配列番号１または配列番号４に対して高ストリンジェンシー条件下でハイブリッド形成する核酸配列を含む、免疫反応を刺激することが可能な、免疫賦活ＤＮＡ配列または免疫賦活プラスミドを提供する。適切な核酸配列は、本発明の核酸と、相同であるか、実質的に類似しているかまたは同一であるものを含む。いくつかの態様において、相同核酸配列は、配列番号１または個々の相補配列に対して少なくとも約８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列類似性を有する。他の態様において、相同核酸配列は、配列番号４または個々の相補配列に対して少なくとも約８４％、８５％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列類似性を有する。配列類似性は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０，１９９０に記載のＢＬＡＳＴなどの当技術分野で公知のいくつかのアルゴリズムを使用して計算し得る。本核酸は、遺伝コードの縮重ゆえに、上記核酸からの配列と異なり得る。一般に、参照配列は、１８ヌクレオチド、より一般的には３０以上のヌクレオチドであり、比較目的のための組成物の核酸配列全体を含み得る。
【００２８】
配列番号１または配列番号４とハイブリッド形成することができるヌクレオチド配列が本明細書中で企図される。ストリンジェントなハイブリッド形成条件には、５０℃以上で０．１Ｘ  ＳＳＣ（１５ｍＭ塩化ナトリウム／１．５ｍＭクエン酸ナトリウム）でのハイブリッド形成などの条件が含まれる。別の例は、５０％ホルムアミド、５Ｘ  ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸トリナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５Ｘデンハート溶液、１０％硫酸デキストランおよび２０μｇ／ｍＬ変性せん断サケ精子ＤＮＡの溶液中で４２℃で一晩温置し、続いて約６５℃で０．１Ｘ  ＳＳＣ中で洗浄することである。代表的なストリンジェントなハイブリッド形成条件は、上記の具体的な条件と同程度にストリンジェントなものの少なくとも約８０％、８５％、９０％または９５％であるハイブリッド形成条件である。他のストリンジェントなハイブリッド形成条件は当技術分野で公知であり、本発明の核酸の相同体を同定するためにも使用され得る（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔ  ６，ｐｕｂ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．１９８９）。
【００２９】
突然変異体が本明細書中で記載のように免疫反応刺激能を維持する核酸配列を含む限り、本明細書中に記載のＤＮＡ分子の突然変異ヌクレオチドを使用し得る。このような突然変異のＤＮＡ配列は、通常、１以上のヌクレオチドまたはアミノ酸が異なっている。配列の変化は、置換、挿入、欠失またはそれらの組み合わせであり得る。クローニングされた遺伝子の突然変異誘発のための技術は当技術分野で公知である。部位特異的な突然変異誘発のための方法は、Ｇｕｓｔｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：２２，１９９３；Ｂａｒａｎｙ，Ｇｅｎｅ  ３７：１１１−２３，１９８５；Ｃｏｌｉｃｅｌｌｉら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：５３７−９，１９８５；およびＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９，ｐｐ．１５．３−１５．１０８で見出され得、全て、参照により本明細書中に組み込まれる。まとめると、本発明は、対象において免疫反応を刺激することが可能な核酸配列およびそれらの変異体または突然変異体に関する。また、本発明は、記載される核酸配列によりコードされる中間ＲＮＡならびに何らかの得られるコードされるアミノ酸配列を包含する。
【００３０】
本免疫賦活プラスミドのヌクレオチド配列は配列番号１および４で提供される配列から変動する場合、プラスミド中のＣｐＧジヌクレオチドは、好ましくはインタクトなままである。あるいは、ＣｐＧジヌクレオチドが除去されるようにプラスミドのヌクレオチド配列が変更される場合、プラスミド中のＣｐＧジヌクレオチドの総数が同じままであるようにプラスミドの配列を別の位置で変化させ得る。ｐＧＣＭＢ７５．６またはｐＬａｃＺＭＢ７５．６のヌクレオチド配列に既に存在するものに加えて、さらなるＣｐＧジヌクレオチドもプラスミドに導入し得る。したがって、例えば本明細書中に記載の免疫賦活プラスミドは、好ましくは、少なくとも約２００、少なくとも約２２０、少なくとも約２４０、少なくとも約２６０、少なくとも約２７０、少なくとも約２７５、少なくとも約２８０、少なくとも約２８３、少なくとも約２８５または少なくとも約２８８ＣｐＧジヌクレオチドを含む。例えば、本免疫賦活プラスミドは、２８３ＣｐＧジヌクレオチドを含み得る。
【００３１】
特に、本発明は、本明細書中に記載の免疫賦活プラスミドまたはＤＮＡ配列の何れかと、医薬的に許容可能な担体と、を含む製剤処方に関する。
【００３２】
Ｂ．免疫調節物質
本明細書中に記載の免疫賦活プラスミドとの使用に対する適切な免疫調節物質組成物は、米国特許出願公開第２０１２／００６４１５１号明細書（鳥類）および同第２０１３／０２９５１６７号明細書（ウシ亜科）に記載されており、この両方の内容はそれらの全体において参照により本明細書によって組み込まれる。
【００３３】
本免疫調節物質組成物は、リポソーム送達ビヒクルと、本明細書中に記載の免疫賦活プラスミドまたはＤＮＡ配列のうち少なくとも１つと、を含む。
【００３４】
適切なリポソーム送達ビヒクルは、処置対照の組織に核酸分子を送達可能である脂質組成物を含む。リポソーム送達ビヒクルは、好ましくは、核酸分子および／または生物学的製剤を送達するのに十分な時間、対象において安定なまま残留可能である。例えば、本リポソーム送達ビヒクルは、少なくとも約５分間、少なくとも約１時間または少なくとも約２４時間、受容対象において安定である。
【００３５】
本発明のリポソーム送達ビヒクルは、核酸分子を細胞に送達するために細胞の形質膜と融合可能な脂質組成物を含む。核酸分子が１以上のタンパク質をコードする場合、核酸：リポソーム複合体は、好ましくは、少なくとも約１ピコグラム（ｐｇ）の発現タンパク質／ミリグラム（ｍｇ）総組織タンパク質／マイクログラム（μｇ）被送達核酸の遺伝子移入効率を有する。例えば、核酸：リポソーム複合体の遺伝子移入効率は、少なくとも約１０ｐｇ発現タンパク質／ｍｇ総組織タンパク質／μｇ被送達核酸；または少なくとも約５０ｐｇ発現タンパク質／ｍｇ総組織タンパク質／μｇ被送達核酸であり得る。複合体の遺伝子移入効率は、１フェムトグラム（ｆｇ）発現タンパク質／ｍｇ総組織タンパク質／μｇ被送達核酸程度に低いものであり得、上記量がより好ましい。
【００３６】
本発明の好ましいリポソーム送達ビヒクルは、直径約１００から５００ナノメートル（ｎｍ）の間である。例えば、本リポソーム送達ビヒクルは、直径約１５０から４５０ｎｍまたは約２００から４００ｎｍの間であり得る。
【００３７】
適切なリポソームは、例えば当業者にとって公知の遺伝子送達法で一般的に使用されるものなど、何れかのリポソームを含む。好ましいリポソーム送達ビヒクルは、多重膜小胞（ＭＬＶ）脂質および押出脂質（ｅｘｔｒｕｄｅｄ  ｌｉｐｉｄ）を含む。ＭＬＶの調製のための方法は当技術分野で周知である。より好ましいリポソーム送達ビヒクルは、ポリ陽イオン性脂質組成物を有するリポソーム（すなわち陽イオン性リポソーム）および／またはポリエチレングリコールに複合化されたコレステロール骨格を有するリポソームを含む。代表的な陽イオン性リポソーム組成物としては、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）およびコレステロール、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）およびコレステロール、１−［２−（オレオイルオキシ）エチル］−２−オレイル−３−（２−ヒドロキシエチル）−イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）およびコレステロール、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）およびコレステロールおよびそれらの組み合わせが挙げられるが限定されない。送達ビヒクルとしての使用のための最も好ましいリポソーム組成物としてはＤＯＴＩＭおよびコレステロールが挙げられる。
【００３８】
適切な核酸分子は、本明細書中に記載の免疫賦活プラスミドの何れかを含む。コード核酸配列は、タンパク質またはペプチドの少なくとも一部をコードし、一方で非コード配列はタンパク質またはペプチドの何れの部分もコードしない。本発明によれば、「非コード」核酸は、プロモーター領域など、転写単位の制御領域を含み得る。「空ベクター」という用語は、「非コード」という用語と交換可能に使用することができ、特に、遺伝子挿入がないプラスミドベクターなど、タンパク質コード部分がない核酸配列を指す。本明細書中に記載のプラスミドによりコードされるタンパク質の発現は非抗原特異的な免疫反応の誘発に必要ではなく；したがって、本プラスミドは、転写調節配列に操作可能に連結されるコード配列を全く含有する必要がない。しかし、本組成物中に免疫原および／またはサイトカインをコードする核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含むことによって、さらなる長所が得られ得る（すなわち、抗原特異的免疫性および免疫性向上）。免疫原および／またはサイトカインをコードするこのような核酸配列は、本明細書中に記載の免疫賦活プラスミド中に含まれ得るか、または本組成物中の個々の核酸（例えば個々のプラスミド）中に含まれ得る。
【００３９】
リポソームを本明細書中に記載の免疫賦活プラスミドと複合化することは、当技術分野で標準であるかまたは内容がその全体において参照により本明細書によって組み込まれる米国特許第６，６９３，０８６号明細書に記載の方法を用いて達成し得る。リポソームに添加するためのプラスミドの適切な濃度は、全身性免疫反応が誘発されるように十分な量のプラスミドを対象に送達するのに有効な濃度を含む。例えば、約０．１μｇから約１０μｇのプラスミドは約８ｎｍｏｌリポソームと組み合わせることができ、約０．５μｇから約５μｇのプラスミドは約８ｎｍｏｌリポソームと組み合わせることができ、または約１．０μｇのプラスミドは約８ｎｍｏｌリポソームと組み合わせることができる。本組成物中のプラスミドと脂質との比率（μｇプラスミド：ｎｍｏｌ脂質）は、重量で少なくとも約１：１プラスミド：脂質（例えば１μｇプラスミド：１ｎｍｏｌ脂質）であり得る。例えば、プラスミドと脂質との比率は、少なくとも約１：５、少なくとも約１：１０または少なくとも約１：２０であり得る。本明細書中で表される比率は、本組成物中の陽イオン性脂質の量に基づき、本組成物中の脂質の総量に基づくものではない。本発明の組成物中のプラスミドと脂質との比率は適切に、重量で約１：１から約１：８０プラスミド：脂質；重量で約１：２から約１：４０プラスミド：脂質；重量で約１：３から約１：３０プラスミド：脂質；または重量で約１：６から約１：１５プラスミド：脂質である。
【００４０】
Ｃ．生物学的製剤
本明細書中に記載の免疫調節物質組成物の何れも、リポソーム送達ビヒクルおよび本明細書中に記載のプラスミドの少なくとも１つに加えて、少なくとも１つの生物学的製剤をさらに含み得る。
【００４１】
適切な生物学的製剤は、鳥類またはウシ亜科疾患を予防または処置するのに有効である物質である。このような生物学的製剤としては、免疫促進物質タンパク質、免疫原、ワクチン、抗菌剤または何らかのそれらの組み合わせが挙げられる。適切な免疫促進物質タンパク質は、免疫を促進することが知られているタンパク質である。非限定例として、タンパク質のファミリーを含むサイトカインが、既知の免疫促進タンパク質ファミリーである。適切な免疫原は、対象への免疫原の投与が対象の組織内で遭遇する同じまたは類似のタンパク質に対する免疫原特異的な免疫反応を高めるように液性および／または細胞性免疫反応を誘発するタンパク質である。免疫原は、細菌、ウイルス、寄生虫または真菌により発現される病原性抗原を含み得る。好ましい抗原としては、対象において感染性疾患を引き起こす生物由来の抗原が挙げられる。本発明によれば、免疫原は、液性および／または細胞性免疫反応を誘発する、天然のまたは合成由来のタンパク質の何れかの部分であり得る。このように、抗原または免疫原のサイズは、約５から１２アミノ酸と小さく、全長タンパク質程度に大きいものであり得、その間のあらゆるサイズを含み得る。抗原は、マルチマータンパク質または融合タンパク質であり得る。抗原は精製抗原であり得る。あるいは、本免疫促進物質タンパク質または免疫原は、本免疫賦活プラスミドによるかまたは免疫調節物質組成物中に含まれる別の核酸によりコードされ得る。免疫促進物質タンパク質または免疫原が本免疫調節物質組成物中の核酸分子によりコードされる場合、免疫促進物質タンパク質または免疫原をコードする核酸配列は、免疫原が対象の組織において発現され、それによって、非特異的な免疫反応に加えて、対象において免疫原特異的な免疫反応を誘発するように、転写調節配列に操作可能に連結される。病原体抗原免疫原性またはサイトカイン活性など、免疫原性についてスクリーニングするための技術は、当業者にとって公知であり、様々なインビトロおよびインビボアッセイを含む。
【００４２】
生物学的製剤がワクチンである場合、ワクチンとしては、生、感染性、ウイルス性、細菌性または寄生虫性ワクチンまたは死滅不活性化、ウイルス性、細菌性または寄生虫性ワクチンが挙げられ得る。１以上のワクチン、生または死滅ウイルスワクチンは、本発明の免疫調節物質組成物と組み合わせて使用し得る。適切なワクチンには、鳥類またはウシ亜科に対して当技術分野で公知であるものが含まれる。
【００４３】
鳥類にとって代表的なワクチンとしては、マレック病ウイルス（ＭＤＶ）、ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、鶏貧血ウイルス（ＣＡＶ）、伝染性ファブリキウス嚢疾患ウイルス（ＩＢＤＶ）、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）、鶏脳脊髄炎ウイルス（ＡＥＶ）、鶏痘ウイルス（ＦＰＶ）、家禽コレラ、鳥インフルエンザウイルス（ＡＩＶ）、レオウイルス、鳥白血病ウイルス（ＡＬＶ）、細網内皮症ウイルス（ＲＥＶ）、鳥アデノウイルスおよび出血性腸炎ウイルス（ＨＥＶ）、コクジウムおよび当技術分野で公知の他の疾患に対する予防のために当技術分野で使用されるものが挙げられるが限定されない。別の例において、ワクチンは、米国特許第５，４２７，７９１号明細書、同第６，０４８，５３５号明細書および同第６，４０６，７０２号明細書により記載されるようなワクチンであり得る。例えば、マレック病に対する予防のためのワクチンは、本発明の免疫調節物質組成物と組み合わせて使用され得る。
【００４４】
ウシ亜科に対する代表的なワクチンとしては、ウシ伝染性鼻気管炎（ＩＢＲ）（１型ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ１））、３型パラインフルエンザウイルス（ＰＩ３）、ウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）、ウシウイルス性下痢ウイルス（１および２型ＢＶＤＶ）、ヒストフィルス・ソムニ（Ｈｉｓｔｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｏｍｎｉ）、マイコプラズマ・ボビス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂｏｖｉｓ）および当技術分野で公知の他の疾患に対する予防のために当技術分野で使用されるものが挙げられるが限定されない。例えば、本発明の免疫調節物質組成物と組み合わせてマンへイミア・ヘモリチカ（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）に対する防御のためのワクチンを使用し得る。
【００４５】
生物学的製剤は抗菌剤であり得る。適切な抗菌剤としては、キノロン、好ましくはフルオロキノロン、β−ラクタムおよびマクロライド−リンコサミド−ストレプトグラミン（ＭＬＳ）抗生物質が挙げられる。
【００４６】
適切なキノロンとしては、ベノフロキサシン、ビンフロキサシン、シノキサシン、シプロフロキサシン、クリナフロキサシン、ダノフロキサシン、ジフロキサシン、エノキサシン、エンロフロキサシン、フレロキサシン、ゲミフロキサシン、イバフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、マルボフロキサシン、モキシフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、オルビフロキサシン、パズフロキサシン、プラドフロキサシン、ペルフロキサシン、サラフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシンおよびトスフロキサシンが挙げられる。好ましいフルオロキノロンとしては、シプロフロキサシン、ダノフロキサシン、エンロフロキサシン、モキシフロキサシンおよびプラドフロキサシンが挙げられる。適切なナフチリドンとしてはナリジクス酸が挙げられる。
【００４７】
適切なβ−ラクタムとしては、ペニシリン系（例えば、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、ベンザチンペニシリン、ベンジルペニシリン、カルベニシリン、クロキサシリン、コ−アモキシクラブ［すなわちアモキシシリン／クラブラン酸］、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メチシリン、メズロシリン、ナフシリン、オキサシリン、フェノキシメチルペニシリン、ピペラシリン、プロカインペニシリン、テモシリンおよびチカルシリン）；セファロスポリン系（例えば、セファクロル、セファロニウム、セファマンドール、セファプリリン（ｃｅｆａｐｒｉｒｉｎ）、セファゾリン、セフェピム、セフィキシム、セフォタキシム、セフォキシチン、セフピロム、セフポドキシム、セフキノム、セフタジジム、セフチオフル、セフトリアキソン、セフロキシム、セファレキシン、セファロチンおよびデフォテタン（ｄｅｆｏｔｅｔａｎ））；カルバペネムおよびペネム系（例えば、ドリペネム、エルタペネム、ファロペネム、イミペネムおよびメロペネム）；モノバクタム（例えば、アズトレオナム、ノカルジシンＡ、タブトキシニン−β−ラクタムおよびチゲモナム）；およびβ−ラクタマーゼ阻害剤（例えばクラブラン酸、スルバクタムおよびタゾバクタム）が挙げられる。好ましいβ−ラクタムとしては、セファロスポリン、特にセファゾリンが挙げられる。
【００４８】
適切なＭＬＳ抗生物質としては、クリンダマイシン、リンコマイシン、ピルリマイシンおよび何らかのマクロライド系抗生物質が挙げられる。好ましいリンコサミド抗生物質はピルリマイシンである。
【００４９】
他の抗菌剤としては、アミノグリコシド、クロピドール、ジメトリダゾール、エリスロマイシン、フラマイセチン、フラゾリドン、ハロフジノン、２−ピリドン、ロベニジン、スルホンアミド、テトラサイクリン、トリメトプリム、様々なプレウロムチリン（例えばチアムリンおよびバルネムリン）および様々なストレプトマイシン（例えば、モネンシン、ナラシンおよびサリノマイシン）が挙げられる。
【００５０】
ＩＩ．方法
本発明の目的は、非感染対象に対する防御免疫、感染対象に対する防御免疫、非感染対象に対する免疫向上、感染対象に対する免疫向上、感染対象に対する治療的免疫またはそれらの組み合わせを誘発する、免疫調節物質組成物、免疫賦活プラスミド（またはＤＮＡ配列）および方法を提供することである。このように、本発明の組成物は、対象において予防的に免疫付与するために使用され得るか、または対象を処置するために使用され得る。本明細書中に記載の方法には、本明細書中に記載の免疫賦活プラスミドまたはＤＮＡ配列を対象に投与することが含まれる。
【００５１】
Ａ．免疫刺激の方法
本発明は、受容対象において免疫反応を誘発する方法に関する。本方法は、免疫反応を誘発するために有効量の免疫調節物質組成物を対象に投与することを含む。いくつかの態様において、免疫調節物質組成物は、単独で有効である非抗原特異的な免疫反応を誘発する。いくつかの態様において、本免疫調節物質組成物は、ワクチンなどの少なくとも１つの生物学的製剤の作用を、このようなワクチンの前に投与された場合に、ワクチンと同時投与された場合に、ワクチン接種後に投与された場合に、またはワクチンと混合して投与された場合に、促進する。いくつかの態様において、本方法は、感染性疾患から受容対象を防御し、感染性疾患を有する集団を処置するための新しい処置ストラテジーを提供する。いくつかの態様において、本方法は、ワクチンと組み合わせて本免疫調節物質を使用する場合に、本免疫調節物質組成物なしでワクチンを使用する場合と比較して、疾患に対する、より迅速で、より長く、より良好な防御を提供する。
【００５２】
本明細書中に記載のリポソーム送達ビヒクルの何れかと、本明細書中に記載の免疫賦活プラスミド（ＤＮＡ配列用）の何れかと、本明細書中に記載の生物学的製剤の何れかと、を含む、有効量の免疫調節物質組成物を投与することによって、受容対象において免疫反応を誘発することができる。生物学的製剤を本免疫調節物質と混合し得るか、またはこれと同時投与し得るか、または独立に投与し得ることが企図される。独立投与は、本免疫調節物質の投与の前または後であり得る。免疫促進を拡大するために本免疫調節物質または生物学的製剤の複数回投与が使用され得ることも企図される。さらに、複数の生物学的製剤を本免疫調節物質とともに同時投与するか、本免疫調節物質の前に投与するか、本免疫調節物質の投与後に投与するか、または本免疫調節物質と同時に投与し得る。
【００５３】
有効量の本明細書中に記載の免疫調節物質組成物の何れかを対象に投与し得る。有効量は、受容対象において免疫反応を誘発するのに十分である。このような有効量は、受容対象において免疫反応を引き起こす何れかの量である。免疫反応を測定する方法は当技術分野で周知である。また熟練者は、有効量が年齢、体重、感染のステージならびに当技術分野で公知の他の要因に依存することも認識しよう。適切な有効量は、約０．１μｇから１，０００μｇ／対象の範囲であり得る。いくつかの態様において、有効量は、約０．１μｇから約１０μｇ、約０．１μｇから約５μｇ、約０．５μｇから約５μｇ、約０．２５μｇから約５μｇ、約０．０５μｇから約１０μｇ、約５μｇから約１５μｇ、約１０μｇから約１５μｇ、約１０μｇから約２０μｇ、約２０μｇから約３０μｇ、約３０μｇから約４０μｇ、約４０μｇから約５０μｇ、約５０μｇから約７０μｇ、約７０μｇから約９０μｇ、約５０μｇから約１００μｇ、約１００μｇから約１５０μｇ、約１５０μｇから約２００μｇ、約２００μｇから約２５０μｇ、約２５０μｇから約３００μｇ、約３００μｇから約３５０μｇ、約３５０μｇから約４００μｇ、約４００μｇから約４５０μｇ、約４５０μｇから約５００μｇ、約５００μｇから約５５０μｇ、約５５０μｇから約６００μｇ、約６００μｇから約６５０μｇ、約６５０μｇから約７００μｇ、約７００μｇから約７５０μｇ、約７５０μｇから約８００μｇ、約８００μｇから約８５０μｇ、約８５０μｇから約９００μｇ、約９００μｇから約９５０μｇ、約９５０μｇから約１０００μｇの範囲であり得る。好ましくは、いくつかの態様において、有効量は、約０．５μｇから約１０μｇの範囲である。また、好ましくは、他の態様において、有効量は、約５０μｇから約１００μｇの範囲である。好ましくは、他の態様において、有効量は、約４０μｇから約７０μｇの範囲である。
【００５４】
いくつかの態様において、有効量の本明細書中に記載の免疫調節物質組成物の何れかを鳥類のメンバーに投与することによって、鳥類のメンバーにおいて免疫反応を誘発することができる。有効量は、鳥類のメンバーにおいて免疫反応を誘発するのに十分である。例えば、鳥類に対する本免疫調節物質の有効量は、約０．０５μｇから約１０μｇ、約０．１μｇから約５μｇ、約０．５μｇから約１．５μｇまたは約１．０μｇから約１０μｇであり得る。例として、鳥類である対象に対する適切な有効量は、約０．１μｇ、０．２μｇ、０．３μｇ、０．４μｇ、０．５μｇ、０．６μｇ、０．７μｇ、０．８μｇ、０．９μｇ、１．０μｇ、１．２μｇ、１．４μｇ、１．６μｇ、１．８μｇ、２．０μｇ、２．５μｇ、３．０μｇ、３．５μｇ、４．０μｇ、４．５μｇ、５．０μｇ、５．５μｇ、６．０μｇ、６．５μｇ、７．０μｇ、７．５μｇ、８．０μｇ、８．５μｇ、９．０μｇ、９．５μｇ、１０．０μｇ、９．５μｇ、１０．０μｇ、１０．５μｇ、１１．０μｇ、１２μｇ、１３μｇ、１４μｇまたは１５μｇであり得る。
【００５５】
いくつかの態様において、有効量の本明細書中に記載の免疫調節物質組成物の何れかをウシ亜科のメンバーに投与することによって、ウシ亜科のメンバーにおいて免疫反応を誘発することができる。有効量は、ウシ亜科のメンバーにおいて免疫反応を誘発するのに十分である。例えば、ウシ亜科に対する本免疫調節物質の有効量は、約１μｇから約１０００μｇ／動物、約５μｇから約５００μｇ／動物、約１０μｇから約１００μｇ／動物、約１０μｇから約５０μｇ／動物または約４０μｇから約６０μｇ／動物であり得る。例として、ウシ亜科である対象に対する適切な有効量は、約３０μｇ、３５μｇ、４０μｇ、４５μｇ、５０μｇ、５５μｇ、６０μｇ、６５μｇ、７０μｇ、７５μｇ、８０μｇ、８５μｇ、９０μｇ、９５μｇ、１００μｇ、１１０μｇ、１２０μｇ、１３０μｇ、１４０μｇ、１５０μｇ、１６０μｇ、１７０μｇ、１８０μｇ、１９０μｇ、２００μｇまたは５００μｇ以下または１０００μｇ以下であり得る。
【００５６】
Ｂ．使用のための条件
本発明の方法は、対象が、免疫反応の誘発に適している疾患から防御されるように、対象において免疫反応を誘発する。本明細書中で使用される場合、「疾患から防御される」という句は、疾患の症状を軽減すること；疾患の発症率を低下させること；疾患の臨床または病理的な重症度を低下させること；または疾患を引き起こす病原体の脱粒（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）を減少させることを指す。対象を防御することは、本発明の治療用組成物が、対象に投与された場合に、疾患の発症を予防する、疾患症状、臨床徴候、病態または原因を治癒させる、および／または改善するかまたは軽減する能力を指し得る。例えば、非限定で、ウシ呼吸器疾患（ＢＲＤ）の臨床徴候としては、肺損傷、体温上昇、抑うつ（例えば食欲不振、外的刺激に対する反応性低下、垂れ耳）、鼻汁および呼吸特性（例えば呼吸数、呼吸努力）が挙げられる。本明細書中に記載の免疫調節物質組成物は、ＢＲＤの上記臨床徴候を予防するかまたはその重症度を低下させるために、ＢＲＤに曝露されている疑いがあるウシに投与し得る。さらなる例として、非限定で、鳥類対象におけるマレック病の臨床徴候としては、孵化率および鳥類生存率の低下が挙げられる。本明細書中に記載の免疫調節物質組成物は、マレック病の上記の臨床徴候を予防するかまたはその重症度を低下させるためにマレック病ウイルスに曝露されている疑いがある鳥類対象に投与し得る。
【００５７】
このようにして、疾患から対象を防御することは、疾患発症を予防すること（予防的処置）および疾患を有する対象を処置（治療的処置）することの両方を包含する。特に、対象を疾患から防御することは、一部の例において、さらに、過度なまたは有害な免疫反応をさらに抑制し、軽減し、阻害するかまたは阻止し得る、有益または防御的な免疫反応を誘導することによって、対象において免疫反応を誘発することにより完遂される。「疾患」という用語は、対象の正常な健康からの何らかの逸脱を指し、疾患症状が存在する場合の状態ならびに逸脱（例えば、感染、遺伝子突然変異、遺伝子欠陥など）が起こっているが症状がまだ発現していない状態を含む。
【００５８】
本発明の方法は、疾患の予防、疾患に対するエフェクター細胞免疫の刺激、疾患の排除、疾患の緩和および原発疾患の発症の結果起こる二次疾患の予防のために使用し得る。
【００５９】
いくつかの態様において、本明細書中に記載の方法は、ワクチンと同時投与される場合に、ワクチン単独の投与に対して、対象の獲得免疫反応を向上させるために使用し得る。一般に、一旦投与されたワクチンは、獲得免疫を刺激するために時間がかかるので、対象をすぐには防御しない。「向上させる」という用語は、本発明において、ワクチンが対象を防御し始め、および／またはワクチンにより与えられる獲得免疫を介して防御期間を延長させるまで、対象において自然免疫反応を誘発することを指す。
【００６０】
いくつかの態様において、本発明の方法は、多岐にわたる病原体の感染に対して防御するために本組成物を投与することを含む。投与される組成物は、特異的な反応を誘発するための特異的な抗原を含んでもよいし、または含まなくてもよい。本発明の方法は、ウイルス、細菌、真菌および寄生虫を含むが限定されない感染性微生物病原体により生じる疾患から受容対象を防御するであろうことが企図される。熟練者にとって当然のことながら、本明細書中に記載のような免疫調節物質組成物は、列挙するには多すぎる多くの感染性病原体に対して有効である。本明細書中で提供される感染性病原体は、代表的な目的のために提供され、使用の範囲の限定なく提供される。
【００６１】
鳥類での代表的なウイルス感染性疾患としては、鶏伝染性貧血ウイルス（ＣＩＡＶ）、マレック病ウイルス（ＭＤＶ）、鶏ヘルペスウイルス（ＨＣＶ）、七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＴＶ）、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）、３型パラミクソウイルス、鶏脳脊髄炎（ＡＥＶ）、鶏痘ウイルス（ＦＰＶ）、家禽コレラ、鳥インフルエンザウイルス（ＡＩＶ）、レオウイルス、鳥白血病ウイルス（ＡＬＶ）、細網内皮症ウイルス（ＲＥＶ）、鳥アデノウイルス、出血性腸炎ウイルス（ＨＥＶ）、肺炎ウイルス、鳩ポックスウイルス、それらの組み換え体および当技術分野で公知の他のウイルスでの感染により生じるものが挙げられるが限定されない。
【００６２】
鳥類で感染性がある代表的な細菌としては、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌または真菌、例えばボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・コリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｏｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、エリシペロスリクス・インシディオサ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｉｎｓｉｄｉｏｓａ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ヘモフィルス・ガリナルム（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、マイコプラズマ・ガリセプチカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）、マイコプラズマ・メレアグリディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）、マイコプラズマ・シノビエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｙｎｏｖｉａｅ）、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、リエメレラ・アナティペステイファー（Ｒｉｅｍｅｒｅｌｌａ  ａｎａｔｉｐｅｓｔｉｆｅｒ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、サルモネラ・ガリナルム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、サルモネラ・プロルム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐｕｌｌｏｒｕｍ）および当技術分野で公知の他の細菌などでの感染により生じるものが挙げられるが限定されない。
【００６３】
鳥類での代表的な真菌またはカビ感染としては、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｅｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）および当技術分野で公知の他の感染性真菌またはカビでの感染により生じるものが挙げられるが限定されない。代表的な疾患状態としては、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌または真菌からの毒素、例えばクロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）毒素、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）毒素、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）エンテロトキシン、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）マイコトキシン、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）ロイコトキシン、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）毒素および当技術分野で公知の他の毒素などから生じるものが挙げられるが限定されない。
【００６４】
鳥類における代表的な寄生虫としては、アスカリディア・ガリ（Ａｓｃａｒｉｄｉａ  ｇａｌｌｉ）、カピラリア・アニュレータ（Ｃａｐｉｌｌａｒｉａ  ａｎｎｕｌａｔａ）、カピラリア・コントルタ（Ｃａｐｉｌｌａｒｉａ  ｃｏｎｔｏｒｔａ）、カピラリア・オブシグナータ（Ｃａｐｉｌｌａｒｉａ  ｏｂｓｉｇｎａｔａ）、コクシジア属（ｃｏｃｃｉｄｉａ  ｓｐｐ．）、エイメリア・メレアグリディス（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）、ヘテラキス・ガリネ（Ｈｅｔｅｒａｋｉｓ  ｇａｌｌｉｎａｅ）、シンガムス・トラケ（Ｓｙｎｇａｍｕｓ  ｔｒａｃｈｅａ）および当技術分野で公知の他の寄生虫が挙げられるが限定されない。
【００６５】
ウシ亜科における代表的なウイルス感染性疾患としては、ブルータングウイルス、ウシアデノウイルス、ウシカリシウイルス、ウシコロナウイルス（ＢＣＶ）、ウシエンテロウイルス、ウシ１型ヘルペスウイルス（ＢＨＶ１）、ウシ４型ヘルペスウイルス（ＢＨＶ４）、ウシ白血病ウイルス、ウシパルボウイルス、ウシレオウイルス、ウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）、ウシライノウイルス、ウシ１型ウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ１）、ウシ２型ウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ２）、ウシ伝染性鼻気管炎（ＩＢＲ）、悪性カタル熱ウイルス、３型パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ３）、狂犬病ウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、それらの組み換え体および当技術分野で公知の他のウイルスでの感染により生じるものが挙げられるが限定されない。
【００６６】
ウシ亜科の代表的な細菌感染としては、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌またはマイコバクテリア、例えばアルカノバクテリウム・ピオゲネス（Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、バチルス・アンスラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、バチルス・アンスラクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｘ）、ブルセラ・アボルツス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）、カンピロバクター・フェツス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｔｕｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ショウベイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｈａｕｖｅｏｉ）、クロストリジウム・コリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｏｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ヘモリチクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・ノビイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎｏｖｙｉ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム・セプチクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｅｐｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、フソバクテリウム・ネクロホラム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ヒストフィルス・ソムニ（Ｈｉｓｔｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｏｍｎｉ）、ヒストフィルス属（Ｈｉｓｔｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ．）、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐｐ．）、マンへイミア・ヘモリチカ（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、モラキセラ属（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ムエレリウス属（Ｍｕｅｌｌｅｒｉｕｓ  ｓｐｐ．）、マイコバクテリウム・パラツベキュロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、マイコプラズマ・ボビリニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂｏｖｉｒｈｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・ボビス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂｏｖｉｓ）、マイコプラズマ・ディスパー（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｄｉｓｐａｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．）、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｐｐ．）、ウレアプラズマ・ディベルスム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｄｉｖｅｒｓｕｍ）および当技術分野で公知の他の細菌などでの感染により生じるものが挙げられるが限定されない。
【００６７】
ウシ亜科での代表的な真菌またはカビ感染としては、アクチノバクテリム属、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）およびヒストモナス属（Ｈｉｓｔｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）および当技術分野で公知の他の感染性真菌またはカビでの感染により生じるものが挙げられるが限定されない。
【００６８】
ウシ亜科での代表的な寄生虫としては、アナプラズマ属（Ａｎａｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．）、アナプラズマ・マルギナーレ（Ａｎａｐｌａｓｍａ  ｍａｒｇｉｎａｌｅ）、バベシア属（Ｂａｂｅｓｉａ  ｓｐｐ．）、コリオプテス属（Ｃｈｏｒｉｏｐｔｅｓ  ｓｐｐ．）、クーペリア（Ｃｏｏｐｅｒｉａ）、シスチセルクス属（Ｃｙｓｔｉｃｅｒｃｕｓ  ｓｐｐ．）、ダマリニア・ボビス（Ｄａｍａｌｉｎｉａ  ｂｏｖｉｓ）、デルマトフィルス属（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ．）、ジクチロカウルス属（Ｄｉｃｔｙｌｏｃａｕｌｕｓ  ｓｐｐ．）、エイメリア属（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｓｐｐ．）、エペリスロゾーン属（Ｅｐｅｒｙｔｈｒｏｚｏｏｎ  ｓｐｐ．）、ファスシオロイデス属（Ｆａｓｃｉｏｌｏｉｄｅｓ  ｓｐｐ．）、ヘモンクス属（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ  ｓｐｐ．）、メロファグス属（Ｍｅｌｏｐｈａｇｕｓ  ｓｐｐ．）、ムエレリウス属（Ｍｕｅｌｌｅｒｉｕｓ  ｓｐｐ．）、ネマトディルス属（Ｎｅｍａｔｏｄｉｒｕｓ  ｓｐｐ．）、ネオスポラ属（Ｎｅｏｓｐｏｒａ  ｓｐｐ．）、エストルス属（Ｏｅｓｔｒｕｓ  ｓｐｐ．）、オステルタギア属（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ  ｓｐｐ．）、ソロプテス属（Ｐｓｏｒｏｐｔｅｓ  ｓｐｐ．）、サルコプテス属（Ｓａｒｃｏｐｔｅｓ  ｓｐｐ．）、セルペンス属（Ｓｅｒｐｅｎｓ  ｓｐｐ．）、ストロンギロイデス属（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ  ｓｐｐ．）、トキソプラズマ属（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．）、トリコフィトン属（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｓｐｐ．）、トリコストロンギルス（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）、トリクリス属（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ  ｓｐｐ．）およびトリトリコモナス属（Ｔｒｉｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）および当技術分野で公知の他の寄生虫が挙げられるが限定されない。
【００６９】
ウシ亜科での代表的な感染性疾患病原体としてはまた、乳房炎、子宮炎、クリプトスポリジウム症およびウシ亜科が感染し易い何らかの他の感染性疾患を引き起こす病原体も挙げられる。
【００７０】
Ｃ．投与
様々な投与経路を利用可能である。選択される特定の方式は、当然ではあるが、選択される特定の生物学的製剤、対象の年齢および総体的健康状態、処置されている特定の状態および治療的有効性のために必要とされる投与量に依存する。本発明の方法は、臨床的に許容できない悪影響を引き起こすことなく免疫反応の有効レベルを生じさせる何れかの投与方式を用いて実施され得る。本組成物は都合よく、単位剤形で与えられ得、当技術分野で周知の方法の何れかにより調製され得る。
【００７１】
免疫調節物質組成物は、静脈内に、筋肉内に、皮内に、腹腔内に、皮下に、噴霧により、羽嚢法により胚内に、経口で、眼内に、気管内に、鼻腔内に、または当技術分野で公知の他の方法により投与され得る。ある態様において、本免疫調節物質は、皮下投与される。別の態様において、本免疫調節物質は、筋肉内投与され得る。別の態様において、本免疫調節物質は噴霧として投与される。別の態様において、本免疫調節物質は、経口投与され得る。
【００７２】
ある点において、本免疫調節物質は、負荷（または感染）前に対象に単独で投与され得る。別の態様において、本免疫調節物質は、負荷（または感染）後に対象に単独で投与され得る。別の態様において、本免疫調節物質は、負荷（または感染）と同時に対象に単独で投与され得る。
【００７３】
いくつかの態様において、本免疫調節物質組成物は、負荷前にワクチン接種と同時に同時投与され得る。いくつかの態様において、本免疫調節物質組成物は、負荷（または感染）と同時のワクチン接種と同時に同時投与され得る。いくつかの態様において、同時投与は、対象の同じ身体部位に、互いに隣り合う２つの異なる箇所に（すなわち対象の頸部の互いに隣り合う注射）、同じ身体部位の対象の反対側に（すなわち頸部の各側に１箇所）または同じ対象の異なる部位に、ワクチンおよび免疫調節物質を投与することを含み得る。いくつかの態様において、本免疫調節物質組成物は、ワクチン接種および負荷前に投与され得る。いくつかの態様において、本免疫調節物質組成物は、ワクチン接種後であるが負荷前に投与され得る。本免疫調節物質組成物は、負荷（または感染）前にワクチン接種された対象への負荷後に投与され得る。
【００７４】
熟練者は、投与経路が、対象およびその健康または状態に依存して変動し得ることを認識するであろう。鳥類およびウシ亜科に対して提供される投与経路は、代表的な目的に対するものであり、限定なく提供される。
【００７５】
鳥類のワクチン接種は、あらゆる齢で行われ得る。ワクチン接種は、生きている微生物の場合は１８日齢胚（胚内）以上および不活性微生物または他のタイプのワクチンの場合は３週齢以上に投与し得る。胚内ワクチン接種の場合、ワクチン接種は、発生の最後の四半期に行われ得る。ワクチンは、皮下に、羽嚢法によって、噴霧によって、経口で、眼内に、気管内に、鼻腔内に、胚内に、または当技術分野で公知の他の方法によって、投与し得る。経口ワクチンは、飲用水中で投与し得る。さらに、定期的なワクチン接種計画に基づいて本発明の方法を使用し得ることが企図される。
【００７６】
本免疫調節物質組成物はまた、皮下に、羽嚢法によって、噴霧によって、眼内に、気管内に、鼻腔内に、胚内に、または当技術分野で公知の他の方法によって、鳥類にも投与し得る。例えば、本免疫調節物質組成物は、胚内で投与し得る。あるいは、本免疫調節物質組成物は、噴霧として投与し得る。
【００７７】
本免疫調節物質組成物は、鳥類胚にその発生の最後の四半期に胚内投与し得る。例えば、本免疫調節物質組成物は、１８日齢または１９日齢胚に胚内投与し得る。卵への投与は、負荷（または感染）前または負荷後であり得る。
【００７８】
本免疫調節物質は、負荷の約１から約１４日前にまたは負荷の約１から約１４日後に鳥類またはウシ亜科の動物に投与し得る。例えば、本免疫調節物質は、負荷の約１から約７日前にまたは負荷の約１から約７日後に投与し得る。本免疫調節物質は、負荷の１、２、３、４、５、６、７日前または負荷の１、２、３、４、５、６、７日後に適切に投与する。
【００７９】
ウシ亜科のワクチン接種は、あらゆる齢で行われ得る。ワクチンは、静脈内に、筋肉内に、皮内に、腹腔内に、皮下に、噴霧により、経口で、眼内に、気管内に、鼻腔内に、または当技術分野で公知の他の方法により投与し得る。さらに、定期的なワクチン接種計画に基づいて本明細書中に記載の方法を使用し得ることが企図される。
【００８０】
他の送達系は、徐放、遅延放出または持続放出送達系を含み得る。このような系は、本組成物の反復投与を回避し得、したがって利便性が高くなる。多くのタイプの放出送達系が利用可能であり、当業者にとって公知である。これらは、ポリ（ラクチド−グリコリド）、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸およびポリ酸無水物などのポリマーに基づく系を含む。薬物を含有する前述のポリマーのマイクロカプセルは、例えば米国特許第５，０７５，１０９号明細書に記載される。
【００８１】
送達系はまた、コレステロール、コレステロールエステルおよび脂肪酸などのステロールまたはモノ、ジおよびトリグリセリドなどの中性脂肪を含む脂質である非ポリマー系；ヒドロゲル放出系；サイラスチック系；ペプチドに基づく系；ワックスコーティング；従来の結合剤および賦形剤を用いた圧縮錠剤；部分融合埋め込み物（ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｆｕｓｅｄ  ｉｍｐｌａｎｔ）なども含む。具体例としては、米国特許第４，４５２，７７５号明細書、同第４，６７５，１８９号明細書および同第５，７３６，１５２号明細書に記載のものなどの、マトリクス内の形態で本発明の物質が含有される浸食系および米国特許第３，８５４，４８０号明細書、同第５，１３３，９７４号明細書および同第５，４０７，６８６号明細書に記載のものなどの、ポリマーから制御速度で活性成分が浸透する拡散系が挙げられるが限定されない。さらに、ポンプに基づくハードウェア送達系を使用することができ、これらの一部は埋め込みに適応する。
【００８２】
本発明の範囲から逸脱することなく、上記組成物、生成物および方法において、様々な変更がなされ得るので、以上の記載および以下で与えられる実施例に含有されるものは全て、例示として、意味を限定するものではなく解釈されるものとする。
【００８３】
定義
「有効量」という用語は、所望の生物学的効果を実現するのに必要であるかまたは十分である量を指す。例えば、感染性疾患を処置または予防するための免疫調節物質の有効量は、病原菌に曝露された際に免疫反応の発現を引き起こす、したがって対象内の病原菌の量の減少および好ましくは病原菌の根絶を引き起こすのに必要な量である。何らかの特定の適用のための有効量は、処置されている疾患もしくは状態、対象の体格または疾患もしくは状態の重症度といった要因に依存して変動し得る。当業者は、過度の実験を必要とすることなく、免疫調節物質の有効量を経験的に決定することができる。
【００８４】
「サイトカイン」という用語は、免疫促進タンパク質ファミリーを指す。サイトカインファミリーとしては、造血成長因子、インターロイキン、インターフェロン、免疫グロブリンスーパーファミリー分子、腫瘍壊死因子ファミリー分子およびケモカイン（すなわち細胞、特に食細胞の遊走および活性化を制御するタンパク質）が挙げられる。代表的なサイトカインとしては、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターフェロン−α（ＩＦＮα）およびインターフェロン−γ（ＩＦＮγ）が挙げられるが限定されない。
【００８５】
「誘発する」という用語は、活性化する、刺激する、生じさせるまたは上方制御するという用語と交換可能に使用することができる。
【００８６】
対象において「免疫反応を誘発する」という用語は、具体的に、免疫反応の活性を調節するかまたはこれに影響を与えることを指し、これには、免疫反応を活性化すること、免疫反応を上方制御すること、免疫反応を促進すること、および／または免疫反応を変化させること（あるタイプの免疫反応を誘発し、次に、対象において優勢なタイプの免疫反応を、有害であるかまたは無効であるものから、有益であるかまたは防御的であるものに、変化させることによるなど）が含まれ得る。
【００８７】
「操作可能に連結される」という用語は、宿主細胞に遺伝子移入された場合（すなわち、形質転換、形質導入または遺伝子移入）、分子を発現することが可能なように、核酸分子を転写調節配列に連結することを指す。転写調節配列は、転写の、開始、伸長および終結を調節する配列である。特に重要な転写調節配列は、転写開始を調節するもの、例えばプロモーター、エンハンサー、オペレーターおよびリプレッサー配列である。様々なこのような転写調節配列が当業者にとって公知である。好ましい転写調節配列としては、鳥類、魚類、哺乳動物、細菌、ウイルス、植物および昆虫細胞において機能するものが挙げられる。何らかの転写調節配列が本発明とともに使用され得る一方で、この配列には、免疫原または免疫刺激タンパク質をコードする配列と天然に付随する天然の転写調節配列が含まれ得る。
【００８８】
「核酸分子」および「核酸配列」という用語は、交換可能に使用することができ、これらには、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡもしくはＲＮＡの何れかの誘導体が含まれる。これらの用語はまた、オリゴヌクレオチドおよびより大きい配列、例えばプラスミドなど、例えば本明細書中に記載の免疫賦活プラスミドなども含み、タンパク質またはそれらの断片をコードする両核酸分子および制御領域、イントロンまたは他の非コードＤＮＡまたはＲＮＡを含む核酸分子を含む。一般的には、オリゴヌクレオチドは、約１から約５００ヌクレオチドからの核酸配列を有し、より一般的には、これは少なくとも約５ヌクレオチド長である。核酸分子は、哺乳動物、魚類、細菌、昆虫、ウイルス、植物、合成起源またはそれらの組み合わせを含むあらゆる起源由来であり得る。核酸分子は、組み換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、増幅、クローニング）または化学合成など、一般的に当技術分野で公知の方法により生成させることができる。核酸分子には、天然の核酸分子およびその相同体が含まれ、これには、天然の対立遺伝子変異体および、核酸分子の、本発明の方法に有用な免疫反応の誘発能を修飾によって実質的に妨害しないように、ヌクレオチドが、挿入、欠失、置換または反転されている修飾核酸分子が含まれるが限定されない。核酸相同体は、当業者にとって公知の多くの方法を用いて生成させ得る（例えば、参照により本明細書中に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｓ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９参照）。
【００８９】
「選択可能マーカー」および「選択可能マーカー遺伝子」という用語は、通常は生物を死滅させるかまたはその成長を阻害する選択物質（例えば抗生物質）または状態から、その遺伝子が発現される生物を防御する生成物をコードする遺伝子を指す。選択可能マーカー遺伝子は、最も一般的には抗生物質耐性遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子など）である。このように、例えば、カナマイシン耐性遺伝子をコードするプラスミドを導入するための形質転換手順にＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を供し、次いでカナマイシンを含有する培地上または培地中で増殖させる場合、プラスミドの取り込みに成功し、カナマイシン耐性遺伝子を発現するＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のみが生存する。「選択可能マーカー」および「選択可能マーカー遺伝子」という用語はまた、生物の増殖に必須である化合物の合成に関与する酵素をコードする遺伝子も含む。必須化合物を合成することができない栄養要求性の生物に導入する場合、このような遺伝子は、必須化合物を補給された培地中で生物を増殖させることを可能にする。例えば、リジン生合成に関与する酵素を欠く突然変異ゆえにアミノ酸リジンに対して栄養要求性である細菌細胞は通常、リジンが補給されていない培地上で増殖できない。このような細菌がリジン生合成に関与する酵素をコードするプラスミドを導入するための形質転換手順に供されるとき、リジンが補給されていない培地上で増殖させる場合、プラスミドの取り込みに成功し、酵素を発現する細菌が生存する。「選択可能マーカー」および「選択可能マーカー遺伝子」という用語は、毒／解毒薬選択を可能にする遺伝子をさらに含む。例えば、ｃｃｄＢ遺伝子は、細胞分裂に対する必須酵素であるＤＮＡジャイレースに結合するタンパク質をコードする。ＤＮＡジャイレースに対する結合において、ｃｃｄＢ遺伝子産物は、遺伝子複製を損ない、細胞死を誘導する。したがって、ｃｃｄＢ遺伝子産物を発現する細菌は生存できない。ｃｃｄＡ遺伝子は、ｃｃｄＢ遺伝子産物の天然の阻害剤として作用するタンパク質（「解毒薬」）をコードする。したがって、それらの細菌ゲノムにおいてｃｃｄＢ遺伝子を有する細菌がｃｃｄＡ遺伝子産物をコードするプラスミドを導入するための形質転換手順に供される場合、プラスミドの取り込みに成功し、ｃｃｄＡ遺伝子を発現する細胞のみが生存する。
【００９０】
「スクリーニング可能マーカー」および「スクリーニング可能マーカー遺伝子」という用語は、観察者がスクリーニング可能マーカー遺伝子を発現している細胞とスクリーニング可能マーカー遺伝子を発現していない細胞とを区別できるようにする産物をコードする遺伝子を指す。スクリーニング可能マーカー遺伝子系は当技術分野で周知であり、例えば、ｌａｃＺ遺伝子および蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）またはシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）など、をコードする遺伝子を含む。
【００９１】
本明細書中で使用される場合、「対象」という用語は、中枢神経系を有する生物を指す。特に、対象としては、ヒト対象または患者およびペット動物が挙げられるが限定されない。代表的なペット動物としては、飼い慣らされている哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ、ウマ）、大きな商業的価値がある哺乳動物（例えば、鳥類、ウシ亜科、乳牛、肉牛、スポーツ用動物）、大きな科学的価値のある哺乳動物（例えば、絶滅危惧種の捕獲または自由標本）または他の点で価値がある哺乳動物が挙げられ得る。適切な対象としてはまた、マウス、ラット、イヌ、ネコ、有蹄動物、例えばウシ、ブタ、ヒツジ、ウマおよびヤギなど、ウサギ類、例えばウサギおよびノウサギなど、他のげっ歯類および霊長類、例えばサル、チンパンジーおよび類人猿なども挙げられ得る。対象は、家畜であれ、または野生であれ、鳥類の何れかのメンバーであり得、繁殖、食肉または産卵用に商業的に飼育され得る。代表的な鳥類としては、ニワトリ、七面鳥、ガチョウ、アヒル、キジ、ウズラ、ハト、ダチョウ、愛玩鳥、動物学的コレクションおよび鳥飼育場の鳥などが挙げられるが限定されない。対象は、家畜であれ、または野生であれ、ウシ亜科の何れかのメンバーであり得、繁殖、食肉またはミル生産のために商業的に飼育され得る。代表的なウシ亜科としては、レイヨウ、水牛、ヤク、ウシ、バイソンなどが挙げられるが限定されない。ウシの種としては、乳牛、種牛、去勢雄牛、若雌牛、雄牛、肉牛、乳牛などが挙げられるが限定されない。対象は、魚類、甲殻類、軟体動物、淡水または海水中の生物の何れかの種を含むが限定されない、水産養殖種の何れかのメンバーであり得る。いくつかの態様において、対象は、感染性疾患であると診断され得るか、感染性疾患のリスクがあり得るか、または感染性疾患に罹患している可能性がある。対象は、子宮中、新生期、青年期、成熟期、中年期または高齢を含む何れかの齢であり得る。
【００９２】
［実施例］
次の非限定例は、本発明をさらに例示するために提供される。
【００９３】
［実施例１］：ｐＧＣＭＢ７５．６プラスミドの調製
ｐＧＣＭＢ７５．６のマップは図２で示す。ｐＧＣＭＢ７５．６において、ｐＭＢ７５．６のカナマイシン耐性遺伝子（図１参照）は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２から非コード配列により置き換えられている。ｐＧＣＭＢ７５．６プラスミドを作製するために、カナマイシン耐性遺伝子の５’部位でｐＭＢ７５．６にＡｓｃＩシングルカッター（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｕｔｔｅｒ）制限部位を導入して、ｐＭＢ７５．６＿ＡｓｃＩ（配列番号３）を作製した。ＡｓｃＩ制限部位を導入するために、ｐＧＣＭＢ７５．６の配列に存在するアデニンをグアニンに突然変異させ、それによってｐＧＣＭＢ７５．６プラスミド中の配列ＡＧＣＧＣＧＣＣをＧＧＣＧＣＧＣＣに変化させた。増幅中のライゲーションによる突然変異誘発に基づくアプローチを用いて、この修飾を完遂した。その中間でＡｓｃＩ制限部位を保有した単一プライマーを使用した。
【００９４】
Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって１７７９ｎｔ長のＡｓｃＩ（ＧＧＣＧＣＧＣＣ）／ＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）断片を合成した。この断片は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２（ｅｘｃｈａｎｇｅｓ  １−５、図２で「ｅｘｃ．１」、「ｅｘｃ．２」などと略称）、Ｆ１複製起点および短縮型ｌａｃＺ遺伝子（図２参照）からの、非コード配列を含む５つの領域を含有した。ｅｘｃｈａｎｇｅ  ４の場合、プラスミドのＧＣ含量を増加させるために、いくつかの位置でＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）配列を手作業で変化させた。さらに、ｅｘｃｈａｎｇｅ  ２の場合、１個のヌクレオチドを変化させてＤｒａＩ制限部位を欠失させ、プラスミド中にＤｒａＩ部位が１個だけ存在するようにした。
【００９５】
図２で示されるように、ｐＧＣＭＢ７５．６は、いくつかの制御エレメント（Ｆ１複製起点、ＣＭＶプロモーターおよびｐＵＣ複製起点）および多重クローニング部位を含有する。ｐＧＣＭＢ７５．６はまた短縮型ｌａｃＺ遺伝子も含有する。しかし、ｐＧＣＭＢ７５．６は、全長または機能的選択可能またはスクリーニング可能マーカー遺伝子を全く含まない。ｐＧＣＭＢ７５．６は４２４２ｂｐ長であり、２８３ＣｐＧジヌクレオチドを含有する。
【００９６】
新しい導入ＡｓｃＩ部位を保有する１個の陽性クローン（ｐＭＢ７５．６＿ＡｓｃＩ）をＡｓｃＩ（ＧＧＣＧＣＧＣＣ）／ＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）で消化して、ＣＭＶプロモーター、多重クローニング部位およびｐＵＣ複製起点を含有する２４６３断片を作製した（図２参照）。１７７９ｎｔ  ＡｓｃＩ（ＧＧＣＧＣＧＣＣ）／ＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）合成断片もＡｓｃＩ／ＸｈｏＩで消化した。
【００９７】
ＱｉａｇｅｎからのＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを用いることによって、両断片（２４６３ｎｔベクター断片および１７７９ｎｔ挿入断片）を１％アガロースゲルからゲル溶出した。１６℃で一晩、２０μＬの総体積中、６００ｎｇの１７７９ｎｔ断片および４００ｎｇの２４６３ｎｔ  ｐＭＢ７５．６＿ＡｓｃＩベクター断片を用いて、ライゲーションを行った。次いで、氷上で２０ｍＬのＨ２Ｏに対して２０μＬを２時間透析し、次いで５μＬエレクトロ−コンピーテントＤＨ５αＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞および４０μＬのＨ２Ｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｆ−ｆ８０ｌａｃＺΔＭ１５Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９ｒｅｃＡ１  ｅｎｄＡ１  ｈｓｄＲ１７（ｒｋ−、ｍｋ＋）ｇａｌ−ｐｈｏＡ  ｓｕｐＥ４４  λ−ｔｈｉ−１  ｇｙｒＡ９６  ｒｅｌＡ１；Ｌｏｔ  ｎｏ．１３７６４８１、Ｐａｒｔ  ｎｏ．４４−００９７）と混合した。形質転換およびＳＯＣ培地中での１時間の再生後、１０−４希釈でカナマイシンなしのＬＢプレート上に細胞をプレーティングした。この希釈によって、個々のクローンの単離が可能になった。
【００９８】
表１で列挙される次のプライマーを用いて、個々のクローンにおいてコロニーＰＣＲを行った。
【表１】
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【００９９】
プライマーに対するＡＨ−１３ｒｅｖおよびＡＨ−２２の位置を図２で示す。Ｔａｑポリメラーゼを含有するプレミックスを使用した。臭化エチジウムを含有する１％アガロースゲル上にＰＣＲ反応物を載せた。正しいプラスミド（ｐＧＣＭＢ７５．６）を保有した陽性クローンは、６０６ｂｐの生成物を示した。
【０１００】
全部で１０，０００個を超えるクローンをスクリーニングし、３個の陽性クローンを同定した。３個の陽性クローンを新鮮なＬＢプレートにすぐに移し、３つのＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ（研究用細胞バンク）（ＲＣＢ；Ｓｙｓ  ３７３３、Ｓｙｓ  ３７３４およびＳｙｓ  ３７３５）を作製するために使用した。
【０１０１】
並行して、培地にこれらの３個のクローンを接種し、プラスミドＤＮＡを作製した。表２で列挙される次のプライマーを用いて、３個のサブクローンそれぞれの完全配列確認を行った。
【表２】
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【０１０２】
［実施例２］：ｐＬａｃＺＭＢ７５．６プラスミドの作製
ｐＬａｃＺＭＢ７５．６プラスミド（図３；配列番号４）を作製するために、１３０７ｎｔ  ＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）／ＤｒａＩ（ＴＴＴＡＡＡ）断片をＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成させた。この１３０７ｎｔ断片は、ｌａｃＺ遺伝子（２６５ｎｔ）の一部を含有した。したがって、ｐＧＣＭＢ７５．６にライゲーションした場合、この断片は、ＸｈｏＩ制限部位の上流に位置する短縮型ＬａｃＺ遺伝子を伸長させ、ＬａｃＺ遺伝子を発現できるようにする（図２および図３を比較）。さらに、新たに導入されたＬａｃＺ遺伝子領域との配列相同性を削除し、組み換えを回避するために、９１ｎｔの多重クローニング部位をＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）非コード配列で置き換えた。さらに、プラスミドｐＧＣＭＢ７５．６と同じサイズのプラスミドを作製するために、ＣＭＶプロモーターの５’領域を欠失させた（２６５ｎｔ）。
【０１０３】
ｐＧＣＭＢ７５．６および１３１１ｎｔ合成断片を両方ともＸｈｏＩおよびＤｒａＩで消化した。ＱｉａｇｅｎからのＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを用いることによって、両断片を１％アガロースゲルからゲル溶出した。
【０１０４】
２０μＬの総体積中、１６℃で一晩、２４０ｎｇの１３１１ｎｔ断片および２４０ｎｇのベクター断片を用いて、ライゲーションを行った。３μＬを１０μＬエレクトロ−コンピーテントＤＨ５α  Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｆ−ｆ８０ｌａｃＺΔＭ１５Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９  ｒｅｃＡ１  ｅｎｄＡ１  ｈｓｄＲ１７（ｒｋ−、ｍｋ＋）ｇａｌ−  ｐｈｏＡ  ｓｕｐＥ４４  λ−ｔｈｉ−１  ｇｙｒＡ９６  ｒｅｌＡ１；Ｌｏｔ  ｎｏ．１３７６４８１、Ｐａｒｔ  ｎｏ．４４−００９７）および４０μＬの１０％グリセリン溶液と混合した。形質転換およびＳＯＣ培地中での１時間の再生後、１０−２および１０−４希釈でカナマイシンなしのＬＢ  Ｘ−Ｇａｌ／ＩＰＴＧプレート上に細胞をプレーティングした。この希釈によって、個々のクローンの単離が可能になった。
【０１０５】
青色／白色選択を介してプラスミド入りのコロニーの同定を行い、表３で列挙される次のプライマーを使用してコロニーＰＣＲを行い、確認した。
【表３】
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【０１０６】
ＡＨ−１５およびＡＨ−３９プライマーの位置を図３で示す。Ｔａｑポリメラーゼを含有するプレミックスを使用した。臭化エチジウムを含有する１％アガロースゲル上にＰＣＲ反応物を載せた。正しいプラスミド（ｐＬａｃＺＭＢ７５．６）を保有した陽性クローンは、７７７ｂｐの生成物を示した。
【０１０７】
４個の陽性クローンを同定し、新鮮なＬＢプレートにすぐに移し、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ（研究用細胞バンク）（ＲＣＢ；Ｓｙｓ３７３６、Ｓｙｓ３７３７、Ｓｙｓ３７３８およびＳｙｓ３７３９）を作製するために使用した。
【０１０８】
並行して、培地にこれらの４個のクローンを接種し、プラスミドＤＮＡを作製した。ｐＧＣＭＢ７５．６と同じプライマーを用いて４個のサブクローンのそれぞれの完全配列確認を行ったが、プライマーＡＨ−１６（配列番号１０）を用いる代わりにプライマーＡＨ−２４を使用した（表４参照）。
【表４】
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【０１０９】
［実施例３］：免疫調節物質組成物
本免疫調節物質は、陽イオン性脂質および本明細書中に記載の非コードＤＮＡ配列を含む組成物である。直径およそ２００ｎｍのリポソームを作製するために、合成免疫調節物質脂質成分［１−［２−［９−（Ｚ）−オクタデセノイルオキシ］］−２−［８］（Ｚ）−ヘプタデセニル］−３−［ヒドロキシエチル］イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）および合成中性脂質コレステロールを処方する（米国特許第６，６９３，０８６号明細書参照）。ＤＮＡ成分は、ｐＧＣＭＢ７５．６またはｐＬａｃＺＭＢ７５．６である。負に荷電しているので、プラスミドＤＮＡは正に荷電した（陽イオン）リポソームと会合する（米国特許第６，６９３，０８６号明細書参照）。
【０１１０】
［実施例４］：哺乳動物モデルへの免疫調節物質組成物の投与によって、ウイルス負荷における生存率が上昇した。
【０１１１】
病原体を負荷した哺乳動物モデルにおいて本明細書中に記載の免疫調節物質組成物の有効性を評価した。腹腔内注射を介してマウスにｐＧＣＭＢ７５．６ＤＮＡおよび陽イオン性リポソームを含有する本免疫調節物質組成物を投与した。本免疫調節物質組成物を０．０１μｇ、０．０２μｇ、０．０４μｇおよび１．００μｇ濃度で投与した。腹腔内注射を介して対照マウスに０．９％ＮａＣｌ溶液を投与した。免疫調節物質投与から２４時間後に、腹腔内注射を介して全ての動物にウイルス適用物を負荷した（０．２ｍＬ  １０３．４ＫＩＤ５０／ｍＬ）。負荷ウイルスは仮性狂犬病（ＰＲ）であった。生存率を図４で示す。本明細書中に記載の免疫調節物質組成物を投与されたマウスは、対照マウスよりも高い用量依存性の生存率を有した。
【０１１２】
［実施例５］：鳥類モデルへの免疫調節物質組成物の投与によって、病原体負荷における孵化率および生存率が上昇した。
【０１１３】
第Ｅ１９日（１９日胚）に噴霧によって病原体を負荷した鳥類モデルにおいて本明細書中に記載の免疫調節物質組成物の有効性を評価した。第Ｅ１８日（１８日胚）での胚内投与を介してニワトリ卵にｐＧＣＭＢ７５．６ＤＮＡおよび陽イオン性リポソームを含有する本免疫調節物質組成物を投与した。対照卵にはプラセボ対照希釈液を投与した（Ｄ５Ｗ）（胚内）。疑似負荷としてＢＨＩブロス（噴霧）を使用した（Ｔ１）。研究処置群の詳細は以下の表５で提供する。
【表５】
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【０１１４】
本免疫調節物質組成物のＤＮＡ成分は、ｐＧＣＭＢ７５．６ＤＮＡの３個の単離クローン（すなわちＪｖ７７、Ｘ５８７２またはＸ５９２８）のうち１つを含んだ。以下の表６でまとめられる結果から観察することができるように、本明細書中に記載の免疫調節物質組成物を投与した場合、対照処置を受けた卵と比較して、平均孵化率および平均生存率の両方が上昇した。
【表６】
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【０１１５】
本発明または（１または複数の）その好ましい実施形態の要素を導入するとき、冠詞「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「この（ｔｈｅ）」および「前記（ｓａｉｄ）」は、要素の１以上があることを意味するものとする。「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、包括的であり、列挙される要素以外のさらなる要素があり得ることを意味するものとする。
【０１１６】
上記を考慮すれば、本発明のいくつかの目的が達成され、他の有利な結果が得られることが分かるであろう。
【０１１７】
本発明の範囲から逸脱することなく、上記生成物、組成物および方法において、様々な変更がなされ得るので、以上の記載に含有されるものおよび添付の図面で示されるものは全て、例示として解釈され、意味を限定するものではないものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【配列表】
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