(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）５’末端反復配列(ＬＴＲ)及び自己不活型３’ＬＴＲ；
ii）少なくとも１つのポリアデニル化シグナル；
iii）少なくとも１つのプロモーター；
iv）グロビン遺伝子の遺伝子座調節領域(ＬＣＲ)；
ｖ）アンキリン・インスレーター配列(Ａｎｋ)；
vi）ウッドチャック後調節エレメント(ＷＰＲＥ)、ここで、当該ＷＰＲＥは、前記自己不活型３’ＬＴＲの後に存在する；及び、
vii）βＴ８７Ｑ変異を含む改変ヒトβグロビン(Ｂ-グロビンＭ)をコードする配列に逆相補的な配列であって、ここで、Ｂ-グロビンＭをコードする配列は、当該Ｂ-グロビンＭ配列のエクソン１とエクソン２の間に第一イントロン(イントロン１)、及びエクソン２とエクソン３の間に第二イントロン(イントロン２)を含み、イントロン２は、ヒトＢ-グロビンＭイントロン２配列のヌクレオチドを４７６より多く含む；
を含むポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むレンチウイルス・ベクター。
【請求項３】
さらに、Ｌｄｂ１転写因子及びγ-グロビンプロモーターに特異的に結合する亜鉛フィンガー(ＺＦ)ドメインの融合物をコードする配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
さらに、トランスフェリン受容体１をコードするｍＲＮＡに逆相補性を有するＲＮＡポリヌクレオチドをコードする配列を含み、ここで、前記ＲＮＡポリヌクレオチドは、ミクロＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ配列を含み、ＲＮＡｉ-介在プロセスにおいて、トランスフェリン受容体１ｍＲＮＡを減少させる能力を有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記イントロン２が、完全長の成人ヒトＢ-グロビンＭイントロン２配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
異常ヘモグロビン症の治療用である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記異常ヘモグロビン症が、鎌状赤血球貧血(ＳＣＡ)又はβ-サラセミアである、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
赤血球及び／又は赤血球前駆細胞に、請求項１に記載のポリヌクレオチドを導入することを含む、赤血球及び／又は赤血球前駆細胞に、ヒトβ-グロビンの発現を誘導するインビトロ方法。
【請求項９】
前記赤血球前駆細胞がＣＤ３４＋細胞を含む、請求項８に記載のインビトロ方法。
【請求項１０】
前記ＣＤ３４＋細胞が、異常ヘモグロビン症を有する個体に由来する、請求項９に記載のインビトロ方法。
【請求項１１】
前記ヒトβ-グロビンが、成人ヘモグロビン、胎児ヘモグロビン、Ｂ-グロビンＭ、又はその組み合わせを含む、請求項８に記載のインビトロ方法。
【請求項１２】
ウイルス粒子を含む医薬組成物であって、前記ウイルス粒子がそれぞれ、請求項２に記載のレンチウイルス・ベクターを含むＲＮＡ鎖を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
一以上の異常ヘモグロビン症の予防及び／又は治療で使用するためのウイルス粒子製剤を製造する方法であって、請求項１に記載のポリヌクレオチドを、少なくとも１つのビリオンタンパク質をコードするＤＮＡパッケージング・プラスミド、エンベロープタンパク質をコードするＤＮＡエンベロープ・プラスミドを含むパッケージング細胞に導入すること、前記ビリオンタンパク質と前記エンベロープタンパク質を発現させ、ウイルス粒子を形成させること、及び前記パッケージング細胞から前記ウイルス粒子を分離することを含む、方法。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号３の配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、2015年1月21日に出願された米国仮出願62/105,829に基づく優先権を主張し、その開示は参照により本願に包含される。
【０００２】
この発明は、国立衛生研究所によって付与された契約番号1R01HL102449の下で政府支援を受けて完成された。政府は本発明に所定の権利を有する。
【技術分野】
【０００３】
本開示は、異常ヘモグロビン症の予防及び／又は治療に有用な組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
ヒト個体群の多くに影響を与える様々な異常ヘモグロビン症が存在する。例えば、鎌状赤血球貧血(SCA)は、ヘモグロビン分子の構造に影響を与える血液関連疾患である。SCAでは、ヘモグロビン分子に欠陥があり、全血液細胞に変形をもたらす(Steinberg, M.H., Forget, B.G., Higgs, D.R. & Nagel, R.L. Disorders of hemoglobin: Genetics, Pathophysiology and Clinical Management, (Cambridge University Press, Cambridge, UK, 2001)。これらの異常ヘモグロビン分子は血液循環に酸素を放出した後、集まってクラスターを形成し、長い杆体状の構造を形成する可能性があり、これらは硬化し、鎌形状となる。通常スムースでドーナツ型である健康な赤血球と異なり、鎌状の赤血球は、小さな血管内を通り抜けることができない。代わりに、それらは積み重なって閉塞状態をもたらし、臓器及び組織に、酸素を運搬する血液を届けない。これは、痛みの周期的な発現を引き起こし、最終的には組織及び生命の維持に必要不可欠な臓器にダメージを与え、他の深刻な医学的問題をもたらす可能性がある。正常な赤血球は、血流中で約120日間生きるが、鎌状赤血球は約10〜20日後に死ぬ。それらは十分な速度で置き換えられないため、血液は慢性的に赤血球不足となり、貧血をもたらす。
【０００５】
SCAは、世界中で何百万人に発症する。それは、祖先がサハラ以南のアフリカ、南米、キューバ、中米、サウジアラビア、インド及び地中海諸国(トルコ、ギリシャ、イタリアなど)出身の人々に特によく見られる。合衆国では、それは約72,000人に発症し、彼らの祖先の多くはアフリカ出身である。この疾患は、アフリカ系アメリカ人500人ごとに約１人、ヒスパニック系アメリカ人1000〜1400人ごとに１人に発症する。約二百万人のアメリカ人、又は12人のアフリカ系アメリカ人のうち１人が、鎌状赤血球対立遺伝子を保有する。
【０００６】
βサラセミアは、二つの最も一般的な先天性貧血のうちの一つであり、βグロビン鎖及びヘモグロビンの合成の部分的又は完全な障害に起因する。βサラセミアを発症した患者は、βグロビン遺伝子に変異を有する。世界保健機関(WHO)は、毎年50,000〜100,000の子供が、βサラセミアの症候性の特徴を有して生まれると推定している。重症型βサラセミアとしても知られるクーリー貧血は、この疾患の最も重症な例であり、生命を維持するために定期的な輸血を必要とする、無効赤血球生成(IE)及び髄外造血(EMH)を特徴とする。
【０００７】
中間型βサラセミアでは、より多数のβグロビン鎖が合成され、その臨床像はより軽度であり、患者は頻繁な輸血を必要としない(Musallam, K.M.等 Non-transfusion-dependent thalassemias. Haematologica 98, 833-844 (2013); Rivella, S. The role of ineffective erythropoiesis in non-transfusion-dependent thalassemia. Blood reviews 26 Suppl 1, S12-15 (2012); Ginzburg, Y. & Rivella, S. beta-thalassemia: a model for elucidating the dynamic regulation of ineffective erythropoiesis and iron metabolism. Blood 118, 4321-4330 (2011))。
しかしながら、ヘモグロビンレベルは、しばしば経時的に減少し、脾腫が現れ、患者は増加した消化管鉄吸収に起因する進行性の鉄過剰症を患う。現在の疾病管理には、出生前診断、輸血療法、鉄キレート化及び同種骨髄移植(BMT)が含まれるが、BMTは、適合する骨髄ドナーを見つける必要があるという制限を受け、多くのリスクと合併症を伴う。βサラセミア又はクーリー貧血は、社会一般だけでなく、それを発症した人の生命に深刻な影響を与える。それゆえ、これらの患者に治療を提供する有望な遺伝子治療アプローチは非常に意義がある。この関連で、クーリー貧血をもたらす変異は、ベータ０(例えば、ベータ0-39)に分類されるか(単一点突然変異が終始コドンを作り、βグロビンタンパク質が生成されない）、又はベータ+(例えば、ベータ+-IVS1-110)に分類されることができる(第一イントロン内の変異が、選択的スプライシング及び不十分なβグロビン鎖合成をもたらす) (Musallam, K.M.等 Non-transfusion-dependent thalassemias. Haematologica 98, 833-844 (2013); Rivella, S. The role of ineffective erythropoiesis in non-transfusion-dependent thalassemia. Blood reviews 26 Suppl 1, S12-15 (2012); Ginzburg, Y. & Rivella, S. beta-thalassemia: a model for elucidating the dynamic regulation of ineffective erythropoiesis and iron metabolism. Blood 118, 4321-4330 (2011))。
従前の研究は、レンチウイルス-媒介性βグロビン遺伝子導入によって、マウスモデルでβサラセミアを救うことができることを示した(May, C.等 Successful treatment of murine beta-thalassemia intermedia by transfer of the human beta-globin gene. Blood 99, 1902-1908. (2002); May, C.等 Therapeutic hemoglobin synthesis in beta-thalassaemic mice expressing lentivirus-encoded human beta-globin. Nature 406, 82-86 (2000); Rivella, S.等 A novel murine model of Cooley anemia and its rescue by lentiviral-mediated human beta-globin gene transfer. Blood 101, 2932-2939 (2003))。
しかしながら、これらの動物は、マウスβグロビン遺伝子の完全欠失を特徴とする。さらなる異常ヘモグロビン症は、鎌状赤血球貧血及び／又はβサラセミアに類似したさらなる異常βグロビン鎖及び病態生理学的後遺症をもたらすβグロビン遺伝子の変異を特徴とする。それゆえ、異常ヘモグロビン症を治療するための改良された組成物及び方法に対する、継続した満たされていない要求が存在する。本開示は、この要求に関する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、異常ヘモグロビン症の予防及び／又は治療のための組成物及び方法を提供する。一般に、異常ヘモグロビン症には、ヘモグロビン分子の合成の減少又は異常構造を特徴とする疾患が含まれる。サラセミアは、ある種の異常ヘモグロビン症は典型的な遺伝性単一遺伝子疾患(ヘモグロビン分子のグロビン鎖の１つに異常構造をもたらす)であるという理解から、一種の異常ヘモグロビン症と考えられ、その一方、サラセミアは、正常なグロビンタンパク質の産生不足と関連する他の種類の異常ヘモグロビン症(例えば、調節遺伝子の変異が原因で起こる症例など)とも考えられる。このように、本開示は、疾患を治療する必要がある個体に適切であり、前記疾患には、例えば、ヘモグロビンＣ症、ヘモグロビンＳ-Ｃ症、鎌状赤血球貧血における、及び当分野で周知の様々な種類のサラセミア(βサラセミアを含むが、必ずしもこれに限定されない)における変化したヘモグロビン構造を特徴とするものが含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。これは、混合異常ヘモグロビン症の特徴、例えば、ヘモグロビンＳ／サラセミアなどを有する患者にも適切である。
【０００９】
一面では、本開示は、個体における異常ヘモグロビン症の予防及び／又は治療で使用するために、赤血球中でヒトβグロビンの発現を誘発する方法を提供する。前記方法は、一般に、ｉ）5'末端反復配列(LTR：long terminal repeat)及び自己不活型3’LTR(自己不活型は、3'LTRが、その天然配列と比べて欠失を有し、それにより複製不全となることを意味する)；ii）少なくとも１つのポリアデニル化シグナル；iii）少なくとも１つのプロモーター；iv）グロビン遺伝子の遺伝子座調節領域(LCR)；ｖ）アンキリン・インスレーター配列(Ank)；vi）標的ゲノムに組込まれないよう構成されたウッドチャック後調節エレメント(WPRE)；及びvii）βT87Q変異を含む改変(修飾)ヒトβグロビン(B-グロビンM)をコードする配列に逆相補的な配列；をコードするポリヌクレオチドを、赤血球前駆細胞、典型的にはCD34+細胞に導入することを含む。ヒトB-グロビンMの配列は、本開示に含まれる。B-グロビンMは、ウイルスゲノムに由来する統合DNAから発現する。それゆえ、本開示の改変レンチウイルス・ベクターのRNAゲノム中のB-グロビンM配列は、B-グロビンMが二本鎖DNA(改変レンチウイルスゲノムの組込みに由来)との関連で発現するように構成される。前記発現は、ある実施形態において、特定の細胞種、例えば赤血球だけに限定されてもよい。ある例では、DNA配列が提供されるが、当業者はそのDNA配列のRNA等価物に容易に想到できる（例えば、DNA配列がレンチウイルスゲノムの特徴を説明するために用いられる場合）ことが認識される。
【００１０】
B-グロビンMをコードする配列は、エクソン１とエクソン２の間の第一イントロン(イントロン１)、及びエクソン２とエクソン３の間の第二イントロン(イントロン２)を含む。ある実施形態では、イントロン２は、ヒトB-グロビンMイントロン２配列のヌクレオチドを476より多くを含み、最大で完全なイントロン２配列を含んでもよい。赤血球前駆細胞内にレンチウイルス構築物を導入した後、前記レンチウイルス構築物は、前駆細胞内の一以上の染色体内にインテグレートし、前駆細胞が赤血球に分化する。赤血球前駆細胞から派生した赤血球は、βグロビンタンパク質を産生する。
【００１１】
本開示は、適切なコントロールよりも多くのヒトβグロビンを産生する改変赤血球を提供する。一実施形態では、前記コントロールは、コントロール細胞から得られたヒトβグロビン値を含む。非限定的な一アプローチでは、前記コントロール細胞は、異常ヘモグロビン症を有する個体からの赤血球を含み、ここで前記赤血球は、その中にコントロール・ウイルスベクターが導入された前駆細胞の子孫である。前記コントロール・ウイルスベクターは、例えば、5’LTR、3’LTR、少なくとも１つのポリアデニル化シグナル、少なくとも１つのプロモーター、LCR、Ank、WPRE、及びB-グロビンMをコードする配列を含むことができるが、コントロール・ウイルスベクター内のB-グロビンMをコードする配列は、ヒトB-グロビンMイントロン２配列の476以下のヌクレオチドを含む(すなわち、欠失のあるイントロン２を含む)。一実施形態では、前記改変赤血球は、コントロールと比べて、増加した成人ヘモグロビン、胎児ヘモグロビン、B-グロビンM、又はそれらの組み合わせを産生する。
【００１２】
一実施形態では、前記レンチウイルス・ベクターは、Ldb1転写因子と亜鉛フィンガー(ZF)ドメインの融合物をコードする配列をさらに含んでもよい。ある実施形態では、前記レンチウイルス・ベクターは、トランスフェリン受容体１をコードするmRNAに逆相補性を有するRNAポリヌクレオチドをコードする配列を含むことができる。前記RNAポリヌクレオチドは、例えば、RNAi-介在プロセスによって、トランスフェリン受容体１mRNAを減少させる能力がある。
【００１３】
あるアプローチでは、本開示は、CD34+細胞である赤血球前駆細胞を改変することを含む。CD34+細胞は、レンチウイルス・ベクターがそれらに導入される前に個体から分離されることができる。CD34+細胞は、レンチウイルス・ベクターの導入後に個体に導入されることができる。レンチウイルス・ベクターは、任意の適切な方法を使用して導入されることができる。一実施形態では、前記赤血球前駆細胞は、組換え+鎖ウイルスポリヌクレオチドなどのレンチウイルス・ベクターを含むウイルス粒子で感染される。ある実施形態では、細胞あたり約50の感染粒子(IP)が使用される。ある実施形態では、その中にベクターが導入された細胞は、ある細胞種、例えばCD34+細胞のために強化されることができる。あるアプローチでは、細胞は、その必要がある個体に導入される前に、感染後2〜3日の期間維持される。複数の実施形態において、前記細胞は凍結され、解凍後に患者に導入されることができる。前記レンチウイルス・ベクターは、任意の適切な方法を使用して患者に導入されることができる。あるアプローチでは、それらは静脈内注入によって投与され、前記静脈内注入は、任意の他の技術に引き続いて (例えば、骨髄細胞の枯渇、すなわち骨髄破壊の後に) 行われてもよい。当業者は、適切なベクターコピー数(VCN)によって特徴付けられる細胞が使用できることを認識するであろう。一実施形態では、VCNは細胞当たり約1 VCNである。
【００１４】
本開示は、レンチウイルス・ベクターそれ自体(その構成要素は、本開示の方法で使用するために上述した通り)を含む。レンチウイルス・ベクターは、改変、組換えポリヌクレオチドを含み、且つ、RNA又はDNAポリヌクレオチドを含むことができる。ある実施形態では、本開示のレンチウイルス・ベクターは、単離ポリヌクレオチド、又は前記レンチウイルス・ベクターを含むビリオンの単離調製物を含む。ある実施形態では、本開示の組換えレンチウイルス・ベクターは、CD34+細胞内に存在し、ここでCD34+細胞は、個体から分離されたものである。
【００１５】
また、一以上の異常ヘモグロビン症の予防及び／又は治療において使用するためのウイルス粒子製剤を作る方法も提供される。このアプローチは、上述のレンチウイルス・ベクターをコードするプラスミドをパッケージング細胞に導入することを含み、ここで前記パッケージング細胞は、少なくとも１つのビリオンタンパク質をコードするDNAパッケージング・プラスミドを含み、前記パッケージング細胞は、エンベロープタンパク質をコードするDNAエンベロープ・プラスミドを含む。前記パッケージング及びエンベロープ・プラスミドは、それぞれのタンパク質を発現し、本開示のRNAレンチウイルス・ベクターを含むビリオンの形成を促進する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
［図１］HbF/GFP発現細胞のレベルは、組込まれたGG1-SAベクターの分子の量に比例して増加する。（Ａ）配列内リボソーム進入部位(IRES)を通じて、アンキリンプロモーター(Ank Pr.)下でLdb1 SAドメイン及び緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現する２シストロン性カセットを保有するレンチウイルス構築物。ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子(WPRE)は、RNA安定性とタンパク質の収率を増加させる。（Ｂ）分化未処理赤血球細胞における(左)、又は平均で最大0.7コピーのZF-Ldb1-ウイルス分子を組込んだものにおける(中央及び右)、HPLCで測定したＦ,Ｓ及びＡ2ヘモグロビンのパーセント。未処理細胞における又は0.26及び0.67コピー/細胞のZF-Ldb1-ウイルス分子を組込んだ細胞における、フローサイトメトリーで測定した、（Ｃ）HbFの増加、及び（Ｄ）GFP発現細胞の増加。
【００１７】
［図２］pCL-ZF-Ldb1は、高レベルのγ-グロビン/ヘモグロビンＦ誘導をサポートし、同時に鎌状赤血球症(SCD)赤芽球における鎌状グロビンレベルを減少させる。（Ａ）β様グロビンmRNA含有量(γが左、βsが中央)は、Q-PCRで測定され、内在性GAPDH発現によって正規化された。β様グロビン発現の変化は、さらに、α-グロビン発現(未変化のままであり、サンプルにわたる分化の指標である)によって正規化された。右：処理サンプル中の遺伝子導入ZF-Ldb1 mRNA発現を、pCL-ZF-Ldb1の組込みに対してプロットする。（Ｂ）pCL-ZF-Ldb1 LVで処理された全てのSCDサンプル中のHbF(左)、HbS(中央)及びHbA2(右)の変化。（Ｃ）正味のHbF％増加及びHbS％-A2％減少。
【００１８】
［図３］未処理の及びpCL-ZF-Ldb1で処理したSCD細胞における四量体Hb及び単一グロビン鎖の定量化。（Ａ）pCL-ZF-Ldb1無し又は有りの赤血球細胞中のHbF含量の増加(左)、及び全てのHb(右)。（Ｂ）変性コンディションにおける、液体クロマトグラフィーによる単一グロビン定量化。左側では、単一β-及びγ-グロビン鎖の量(μg)が、単一α-グロビン鎖の量を分母として算出される。右側では、γA+G鎖／全てのβ様鎖エリアの平均が示される。溶血液中のHb又は単一グロビン鎖のμgは、既知のHb濃度の標準サンプルで得られた検量線から推定された。
【００１９】
［図４］HbFを発現するpCL-ZF-Ldb1-形質導入SCD細胞は、形質導入無しの細胞と比べて、減少したHbS発現を有する。（Ａ）pCL-ZF-Ldb1組込み後のGFP発現SCD赤芽球の数(右)が、形質導入無しの赤芽球(左)と比較される。（Ｂ）透過処理赤芽球(左、抗-HbF Ab無し)、形質導入無し(中央)、及びpCL-ZF-Ldb1形質導入赤芽球(右)におけるHbF産生細胞のパーセント。（Ｃ）ＢからのHbF陽性集団内のβ-グロビン発現細胞(中央及び右)が、透過処理細胞(左、抗-HbB Ab無し)と比較される。（Ｄ）HPLCで分析されたSCDサンプルのHbFの定量化(Ｂから)。
【００２０】
［図５］未処理の又はpCL-ZF-Ldb1 LVで処理された健康な細胞、鎌状赤血球におけるγ-グロビン抑制遺伝子の発現。（Ａ）Bcl11A、C-Myb、（Ｂ）SOX6及びKLF1遺伝子の発現は、細胞分化マーカーであるグリコホリンＡ(GPA)レベルの関数で発現し、GAPDH発現によって正規化された。KELの発現(Ｃ、左)、Kellをコードする遺伝子、血液型抗原は、内部標準として選択された。形質導入サンプル中の遺伝子導入Ldb1の発現(Ｃ、右)は、他のメッセンジャーRNAについて分析された同じサンプルで確認された。
【００２１】
［図６］インビトロにて、pCL-ZF-Ldb1 LVで及びHbF誘導剤で処理したCD34+由来SCD赤血球細胞におけるヘモグロビンＦ増加／鎌状ヘモグロビン減少。（Ａ）HbF誘導剤である、デシタビン、トラニルシプロミン、ヒドロキシウレア、ポマリドミド、ブチレートで、又はZF-Ldb1保有LVで処理されたSCD赤芽球中の、(上部)HbF％の正味の増加、及び(下部)HbS％の正味の減少。（Ｂ）各処理に関する赤血球細胞数(ヘモグロビン発現細胞、又はベンジジン＋染色細胞)は、未処理サンプルに対して正規化された。Ａ−Ｂにおいて、n＝11である（ただし、HuとpCL-ZF-Ldb1ではn＝10、Butではn＝9）。
【００２２】
［図７］pCL-ZF-Ldb1で処理された細胞内の異なる単一グロビン鎖の合成。（Ａ）未処理の(UT)又はpCL-ZF-Ldb1で処理された代表的な鎌状赤血球溶血液のクロマトグラフィー特性。（Ｂ）SCD遺伝子導入マウスの血液の既知のヘモグロビン濃度を使用して作成した検量線。（Ｃ）未処理のサンプル又はpCL-ZF-Ldb1処理後のサンプル(n＝5)における検量線(Ｂ)から推定された単一グロビン鎖のピーク下面積。
【００２３】
［図８］定常状態でのCD34+由来SCD赤血球細胞における中程度に上昇したHbFレベルの傾向。健康な及びSCDの赤血球サンプル間のHbF％の相対HPLC評価、ここでは、γ-グロビン抑制因子である、BCl11a、c-Myb、KLF1及びSOX6が定量された。
【００２４】
［図９］細胞傷害性効果と用量／応答較正。GG1-SAの〜１コピー／細胞の組込みと比べた、異なる用量の薬剤での細胞の赤血球細胞数測定(ベンジジンプラス数)(N＝2)。黒の矢印は、実験のバルクのために選択された各薬剤の用量を指す。
【００２５】
［図１０］異なる時間に、インビトロにて、pCL-ZF-Ldb1ベクターで及びHbF誘導剤で処理されたSCD赤血球細胞のHbF％の変動。表１(L)及びS1(E)に従って、HbF誘導剤である5-アザ-シチジンで又はZF-Ldb1保有LVで処理されたSCD赤芽球中のHbF％の正味の増加。Dunn's多重比較を用いたクラスカル・ワリス検定。
【００２６】
［図１１］ベクターのグラフィカル・マップ。最上段のベクターマップは、pCL-ZF-Ldb1であり、pCL20cアンキリンGG1DDiGFPとも呼ばれる。ベクターマップの２番目はALS-10である。ベクターマップの上から３番目はCT9Ankである。最下段のベクターマップは、ALS-10Tである。各ベクターは、5’及び 3’自己不活型末端反復配列(それぞれ、5’LTR及び3’SinLTR)を含む。「βT87Q」型として知られる変異βグロビンである「B-グロビンM」も示される。B-グロビンMは、周知のプロセスによりRNAゲノムから派生する組込みDNAから発現されるように、ベクター内に構成される。「Ank」はアンキリン・インスレーターである。「IRES」は配列内リボソーム進入部位である。 「P」はプロモーターを指す。「LCR」は遺伝子座調節領域である。「GFP」は高感度緑色蛍光タンパク質である。「pA」はポリアデニル化シグナルである。「WPRE」はウッドチャック後調節エレメントである。「fI1」は完全βグロビン遺伝子イントロン１である。「fI2」は完全βグロビン遺伝子イントロン２である。「I1S」は、トランスフェリン受容体を標的にするミクロRNAを含む、改変βグロビン遺伝子イントロン１である。「SV40 oriR-pA」は複製開始点及びポリアデニル化シグナルである。β-グロビン遺伝子エクソン１，２及び３は、適切に標識された。
【００２７】
［図１２］図１２は、β0/+又はβ0/0赤芽球患者CD34+細胞(その中にAnkT9W及びALS10ベクターが導入され、標識される)から得られた成人ヘモグロビン値(HbA)を比較した結果の、図によるまとめを提供する。
【００２８】
［図１３］図１３は、ZF-Ldb1ベクターの注釈付のポリヌクレオチドと、コードされているタンパク質配列及び前記RNAのDNA等価物を提供する。図１３のヌクレオチド配列は配列番号１である。ZF-LDB1 AA配列(HA末端アミノ酸配列を有する、GG1＝ZF及びDDi＝LDB1として示される)は配列番号２である。ボックスに表示されるベクターの特徴は、上に示す関連配列である。
【００２９】
［図１４］図１４は、RNAのDNA等価物としてのALS-10ベクターの注釈付のポリヌクレオチド配列と、コードされたタンパク質配列を提供する。図１４に示されるヌクレオチド配列は配列番号３として提供される。ボックスのベクターの特徴は、上に示す関連配列である。その逆平行構成におけるβT87Qβグロビン・メチオニンコドンを開始する位置は、5'−3'方向に読んで、βグロビン5’UTRの左隣の「CAT」トリプレットである。
【００３０】
［図１５］図１５は、未変異βグロビンcDNAの注釈付き配列を提供する。cDNA配列は配列番号４である。配列番号５として提示されるβグロビンのアミノ酸配列も示される。βT87Q変異は、配列の88位に示されるトレオニンで発生する。当該変異は慣習に従ってβT87Qと呼ばれ、その際、１位の最初のメチオニンは、アミノ酸のナンバリングに含まれない。βT87Q mRNAでは、88位のトレオニンのコドンは、グルタミンをコードするコドンに置き換えられる。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本開示は、異常ヘモグロビン症を予防及び／又は治療するための組成物及び方法を提供する。この関連で、当業界で周知のように、生後２〜３か月の子供は、α-及びβ-グロビン鎖(それぞれ、α-及びβグロビン遺伝子によってコードされる)からなる酸素運搬分子である成人ヘモグロビンを含む赤血球を産生し始める。多くの異常ヘモグロビン症では、βグロビン鎖をコードする遺伝子の変異が、成人ヘモグロビンの合成の障害、又は異常成人ヘモグロビン産生の原因となる。これは、赤血球の限られた生産又は異常赤血球の合成につながる。これらの理由により、患者は生存のために輸血を必要とする。出生前及び生後数か月の間、子供は胎児ヘモグロビンを発現し、これはγ-鎖とα-鎖を含む。一般的には、生後に、γ-鎖をコードする遺伝子が発現停止され、βグロビン遺伝子が活性化され、ヘモグロビンの産生が、胎児から成人へ切り替わる。まれに、γ-グロビン遺伝子を発現停止せず、βグロビン遺伝子の変異も保有する個体が、成人ヘモグロビンの生産低下又は異常生産に関連する疾患から免れている。それゆえ、胎児ヘモグロビンの再活性化は、βグロビン遺伝子の変異に関連する疾患の寛解に有効かもしれない。γ-グロビン遺伝子の活性化と発現抑制は、遺伝子座調節領域(LCR)と呼ばれるゲノム領域の近接に依存し、前記LCRはγ-及びβ-グロビン遺伝子の〜40−60キロベース上流に位置し、転写を活性化する多くの因子と関連している。この領域は「ループ」を形成し、活性化が必要な遺伝子のプロモーターに結合することが必要である。γ-グロビン遺伝子が発現されると、LCRはループを形成し、γ-グロビンプロモーターに結合する。生後、LCRはγ-グロビンプロモーターから離れ、ループを形成し、γ-遺伝子のサイレンシングとグロビン遺伝子の活性化をもたらすβグロビンプロモーターに結合する。転写補助因子Ldb1は、γ-及びβ-グロビン遺伝子のプロモーターへのLCRループ形成に関与する。Ldb1単独は、前記プロモーターへのLCRの結合を促進せず、さらなる因子を必要とする。人工亜鉛フィンガー(ZF)タンパク質は、DNAに特定配列を結合する能力を有する。Ldb1は、γ-グロビンプロモーターに結合する特定のZFタンパク質に融合される。遺伝子導入マウスでは、このタンパク質はLCRのループ形成と、γ-グロビン遺伝子のプロモーターへのLCRの結合を促進し、その発現を活性化する (Deng, W.等 Controlling long-range genomic interactions at a native locus by targeted tethering of a looping factor. Cell 149, 1233-1244 (2012))。
【００３２】
β-グロビン遺伝子における変異と関連する異常ヘモグロビン症の治療への別のアプローチ方法は、骨髄細胞への（及び、特に造血幹細胞又はHSCへの）機能性βグロビン遺伝子の挿入によって行われる。それゆえ、レンチウイルス・ベクターによるβ-グロビン遺伝子の非変異型の遺伝子導入は、患者においてヒトβ-グロビンタンパク質の産生を回復させる可能性があり、遺伝子治療の治験のために利用される可能性がある。レンチウイルス・ベクターは、感染し且つヒトβ-グロビン遺伝子をHSCへ挿入する能力が、十分に明らかになっている。この関連で、本開示は、異常ヘモグロビン症の予防及び／又は治療のためにデザインされた新規なウイルス・ベクターを提供する。前記ウイルス・ベクターは、レンチウイルス・ベクターを含むが、必ずしもこれに限定されない。様々な実施形態において、組換えレンチウイルス・ベクターを含む、単離された哺乳類の造血前駆細胞又は、単離された哺乳類の幹細胞が提供される。
【００３３】
本開示の対象であるレンチウイルス・ベクターの様々な実施形態が、図１１に示される。これらのベクターの特徴には、適切な細胞に導入された際、１）胎児ヘモグロビンの発現を再活性化する能力、及び／又は２）新規な導入遺伝子成人ヘモグロビンを発現させる能力、及び／又は、同時に、３）変異ヘモグロビンの発現を失活させる能力が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。ベクターの一定の特徴は、当該分野において既知であり、図１３及び１４は、それらの代表的な配列を提供する。特に、任意の適切なIRES配列を使用することができ、当業者は、本開示の利益の下、プロモーター配列が、本発明の実施形態における使用のために適応できることを認識するであろう。同様に、LCR配列は、例えば赤血球中で機能できる適切なポリアデニル化シグナルであることが、当該分野で既知である。図１３及び１４に示されているもののような、本開示の代表的な配列は、それらが赤血球に、治療的に有効な量の増加したグロビンを産生する能力を付与する限り、周知のパラメーターによって変更されることができる。あるケースでは、ポリヌクレオチド配列は、本願で提示されるものと同一であってもよく、又はそれらは、前記配列の隣接セグメントにわたって、少なくとも80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、又は99％の同一性を有していてもよい。
【００３４】
本開示のレンチウイルス・ベクターは、治療レベルのヘモグロビンの発現(従前のベクターではできなかった)をもたらすと予測される。複数の実施形態において、これらのベクターは、β-グロビンとγ-グロビンmRNAの産生、及びβサラセミア、鎌状赤血球貧血及び他の異常ヘモグロビン症に関連する様々な変異の存在下におけるタンパク質レベルを最適化するために特異的に適応させることができる。この開示のある面は、ゲノム・エレメントの組み合わせ(その具体的な実施形態は、図１１に模式的に示される)に関与する。本開示は、本願に開示されているありとあらゆるポリヌクレオチド配列、全てのDNAポリヌクレオチドのRNA等価物(すなわち、チミンがウラシルに置換されている)、及び全てのRNAの全てのDNA等価物、及び全てのポリヌクレオチド配列の相補的配列及び逆相補体を含む。本開示は、全てのアミノ酸配列、及び前記アミノ酸配列をコードする全てのポリヌクレオチド配列を含む。ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列の隣接セグメントも含まれる。非限定的な実施例では、本開示の配列は、本願に開示されている各ベクター構築物の隣接セグメント(図１１，１３，１４及び１５に示されるセグメント及び配列を含むが、これらに限定されない)、それらのRNA等価物、及びそれらのDNA及びRNA逆相補体のいずれか１つ又は任意の組み合わせを含むか、それからなることができる。本開示のある面では、本開示のレンチウイルス・ベクターの組込みは、組込まれた機能的グロビン遺伝子をもたらし、その発現は、異常グロビン症を有する個体に治療的有用性を提供するために有効であるグロビン分子を産生する。前記遺伝子は、赤血球では発現されるが、例えば前記レンチウイルス構築物に由来する組込みDNAセグメントを含む造血幹細胞では発現されないといった、条件的な発現を示してもよく、ここで、前記幹細胞はグロビン分子を発現する赤血球に分化する。本開示は、前記組換えポリヌクレオチドを含む細胞も含む。
【００３５】
本開示は、図１１に示すALS10レンチウイルス・ベクターを使用して、異常ヘモグロビン症の患者の細胞中のHbA産生を高めることを実証する。特に、本開示は、ALS10ベクターが、最も重度なサラセミア検体(すなわち、β0/0表現型を有する個体のもの)においてHbA産生を向上させるためにこれまでに利用できたアプローチより優れていることを実証する。この関連で、本開示は、ALS10を使用して、HbA産生が、適切なコントロールに対して向上するように、β0/0表現型患者のCD34+細胞を改変することの実証を提供し、当業者は本開示の利益の下で適切なコントロールを認識できるであろう。複数の実施形態において、前記コントロールは、単一の値又は値域であってもよい。例えば、コントロールは標準化曲線であってもグラフ上のエリアであってもよい。一実施形態では、前記コントロールには、Breda, L.らによる「Therapeutic hemoglobin levels after gene transfer in beta-thalassemia mice and in hematopoietic cells of beta-thalassemia and sickle cells disease patients. PLoS One, 2012. 7(3): p.e32345に記載の構築物(当該分野で「AnkT9W」として知られている)を使用して産生されたHbAの増加が含まれる。
【００３６】
より具体的には、そしていかなる特定の理論に拘束されることも意図しないが、本開示のアプローチは、組織特異的に、及びインサートされたウイルス分子の数と比例的に、サラセミア及びSCD細胞において、成人ヘモグロビンを増加させようとする努力に関与するものであった。ウイルスベクターの無作為取込みにって引き起こされると考えられるゲノム毒性を減らすため、我々は「平均２コピー/細胞」以内のウイルス取り込みを維持するよう努めた。
【００３７】
中程度から中間範囲のHbA減少(それぞれ、β+/+及びβ+/0)を有するサラセミア検体において、0.6コピーのAnkT9Wが、健康な細胞又はキャリア細胞で検出されるものと匹敵するHbAレベル(約80〜90％)を生じさせるのに十分であることがすでに実証されている(Breda等、Plos One, 2012)。しかしながら、最も重度な表現型であるβ0/0(成人HbAが観察されない)を有する検体では、0.6コピーのAnkT9Wは、健康な細胞又はキャリア細胞で観察される成人ヘモグロビンのレベル−我々が本開示で提供するアプローチで達成するよう努めた治療閾値であった−を満たすことができなかった。このことから、我々はAnkT9Wを改変し、ALS10を作成した。ALS10では、ウッドチャック後調節エレメント(WPRE)が、ベクターの安全性を高めるために、組込み配列から除去された。WPREは、LCRと3'LTRの間に位置するので、AnkT9Wの組込まれた部分の一部であった。WPREの本来の目的は、それが以前にその効果を有することが証明されているように、レンチウイルス力価を増加させることであったが、我々は、それが現在の位置に不要であると決定した。WPREはウイルス配列であり、βグロビン遺伝子の発現には必要ではない。患者の細胞のゲノムに組込まれるウイルス配列の量をできるだけ制限することがより安全であると考えられる。この理由のため、我々はベクター内のこの配列を、非組込み領域に動かした。これは、高力価のウイルス粒子を産生するWPREの能力を保持するが、患者細胞のゲノムからWPREを除外する。それを組込み配列内に保持することなく、ウイルス力価を増加させるWPREの能力を保つために、我々はWPREを、組込み部(3’LTRの前)から取り除き、それが標的細胞の染色体(単数又は複数)に組込まれる配列の外に位置するように、3'LTRの後に組み入れた。我々は、WPRE領域の後に強いウシ成長ホルモン・ポリＡテールも付け加えた(図１１に概要を示す)。我々のデータは、前記改変が、本開示の組成物の製造の間、ウイルス力価を減少させないことを示す。しかしながら、我々は、その中にレンチウイルス・ベクターが導入されたCD34+細胞に由来する赤血球中のHbAの発現をもたらす構築物のセグメントも改変した。特に、AnkT9W構築物中で削除されたβグロビン遺伝子イントロン２の部分を図１４に注釈付で示す。その注釈から分かるように、βグロビン遺伝子イントロン２は、ヌクレオチド4772−5621を包括的に包含し、それゆえ851ヌクレオチド長である。しかしながら、AnkT9Wのイントロン２は、ヌクレオチド5,164から5,537に渡る375ヌクレオチドの欠失を含む(図１４に示されるように)。その欠失の結果として、AnkT9Wβグロビン遺伝子イントロン２の長さは、476ヌクレオチドである。その一方、そしていかなる特定の理論に拘束されることも意図しないが、ALS10構築物との関連で、イントロン２のより長いセグメントの含有は、少なくとも部分的には、β0/0患者細胞中のHbAの予期せぬ且つ統計的に有意な増加の原因となると考えられる。この関連で、AnkT9Wと比較した際、ALS10は、最も重度なサラセミア患者の検体、すなわちβ0/0表現型において、有意な改善、及び特にはるかに高いレベルのHbAをもたらすことを示した。それゆえ、本アプローチはβ0/0表現型に必ずしも起因しない異常ヘモグロビン症、例えばSCDを有する患者の利益になることが合理的に予測される。ALS10のこの利点を実証する結果の要約を図１２に提示する。このように、本開示は、レンチウイルス・ベクター及びそれらを含む細胞、及び組込み構築物であって、その中でβグロビン遺伝子が、長さ476ヌクレオチドより多く且つ最大で長さ851ヌクレオチドであるイントロン２を含むものを含む。従って、前記イントロンは477−875ヌクレオチドの間であり、この値は包括的であり、その間に存在する全ての整数及び整数の範囲を含む。前記イントロン２は、それゆえ、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、827、828、829、830、831、832、833、834、835、836、837、838、839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851のヌクレオチドを含むか、又はそれからなる。ヒトβグロビン遺伝子の前記ポリヌクレオチド配列を、図１３に示す。それは、3’エンハンサーエレメント、3’非翻訳領域(UTR)、ポリＡシグナル、エクソン３、イントロン２、エクソン２、イントロン１、エクソン１、5’UTR、及びβグロビンプロモーター・セグメントを含む。それは3’−5’配向で示され、当該分野で周知のように、それは構築物の表示された残部に逆平行であり、及び、組込まれた後でのみ、及び二本鎖DNA領域の関連で発現され、前記二本鎖領域ではDNAの一本鎖が図１４に示すβグロビン遺伝子配列を含む。
【００３８】
ALS10では、鎌状βグロビン鎖の鎌状化を妨ぐ能力を増加させるために、βグロビン遺伝子の配列も改変される(図１１では「B-グロビンM」と称される)。この変異βグロビンは、第87位でのそのアミノ酸置換のために、βT87Q型として知られている。βT87Qは、SCAのSAD及びBERKマウスモデルの血液学的パラメータを向上させるためにすでに使用されている(Pawliuk, R.等 Correction of sickle cell disease in transgenic mouse models by gene therapy. Science 294, 2368-2371. (2001))。この型は、β0/βEサラセミアを有する患者を矯正する最初の成功的な臨床治験でも使用された(Cavazzana-Calvo, M.等 Transfusion independence and HMGA2 activation after gene therapy of human beta-thalassaemia. Nature 467, 318-322 (2010))。
【００３９】
当該分野で周知であり、AnkT9Wに存在したアンキリン・インスレーターは、ALS10にも存在する。ALS10は、3’LTR内にアンキリン・インスレーターを有し、他方、ベクターAnkT9Wは、プロモーターとLCRの間にアンキリン・インスレーターを有する。
【００４０】
本開示の一面では、βグロビン遺伝子のイントロン、又は3’UTRなどの他の位置を、トランスフェリン受容体１(TR1)の合成を標的とし減少させるポリヌクレオチドを含むように改変することができる。このアプローチの合理性は、赤血球の鉄摂取の減少が、βサラセミアで、及び潜在的に他の異常ヘモグロビン症で有益となり得る(これがヘム分子の形成を減少させるため)という我々の観察に基づいている。ヘムは通常はヘモグロビン分子に含まれるが、多くの異常ヘモグロビン症では、βグロビン鎖の合成の減少に起因して、ヘモグロビンに結合していない過剰なヘムが存在し、これらの分子は赤血球に有害である。過剰のヘムは、赤芽球アポトーシスの原因、及び活性酸素種(ROS)の細胞内含有量、生成を変化させる原因、及び赤血球の膜安定性及び可塑性を減少させる原因となり、それらの寿命の減少、溶血及び／又は鎌状化につながる。γ-グロビン及び同時に低分子ヘアピンRNAによるノックダウン鎌状βグロビンを発現するコンビネーション・ベクターがすでに報告されており(Samakoglu, S.等 A genetic strategy to treat sickle cell anemia by coregulating globin transgene expression and RNA interference. Nature biotechnology 24, 89-94 (2006))、このアプローチは本開示の実施形態に包含される(すなわち図１１、ALS-10T中「I1S」で示される)。TR1を標的とし、本開示のベクターに含まれることができるポリヌクレオチドに関して、shRNAは、RNAi介在アプローチの一つの非限定的な例である。しかし、RNAiに基づく抑制は、TR1 mRNAを標的とする任意の適切なRNAポリヌクレオチドを使用して達成することができる。shRNAに関して、それらは、当該分野において、対をなすセンス及びアンチセンス部、及び当該対をなすセンス及びアンチセンス部の間の短いループ配列を含む典型的なヘアピン二次構造をとることが知られている。shRNAは細胞質に送達され、そこでダイサーによってsiRNAへとプロセシングされる。siRNAは、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)によって認識され、一旦RISCに取り込まれると、siRNAは標的mRNAの切断と分解を促進する。複数の実施形態において、TR1発現の抑制に使用するために含まれる、それをコードするshRNAポリヌクレオチド・セグメント又はDNAセグメントは、45−100ヌクレオチドを含むか、又はそれからなることができ、前記値域は包括的であり、45と100の間の全ての整数を含む。shRNAの一部は、TR1 mRNAに逆相補性を有し、mRNAは21−29ヌクレオチドからなることができ、前記値域は包括であり、21と29の間の全ての整数を含む。別のアプローチでは、TR1 mRNAを特異的に切断できるリボザイムを含むことができる。別の実施形態では、TR1 mRNAを標的とするミクロRNA(μRNA)を使用することができる。
【００４１】
本開示は、Ldb1転写因子と亜鉛フィンガー(ZF)ドメイン(ZF-Ldb1)の融合物をコードするベクターが、ある異常ヘモグロビン症へのアプローチに有用であるという説明を提供する。ZF-Lbd1遺伝子は、いくつかの構造にて、本開示のベクターに組込まれることができる。代表的な例として図１１のALS-10を使用する一つの非限定的なアプローチでは、ZF-Ldb1遺伝子は、前記ベクターが、連続して(βグロビン・コード配列と同じストランド物で)、5’LTR、ポリアデニル化シグナル、ZF-Ldb1領域、及びプロモータ(ZF-Ldb1タンパク質をコードする別個のmRNAの発現を推進できるプロモーター)かIRESのどちらかを含むように配置され、前記ZF-Ldb1タンパク質をコードするmRNAは、βグロビンタンパク質をコードする同じmRNAとは、異なるタンパク質を作ることができる。ALSにZF-Ldb1を含ませる合理性は、以下の２要素からなる：１）ZF-Ldb1が、変異βグロビン遺伝子のプロモーターからLCRを、γ-グロビン遺伝子のものへ移動させる。このようにして、変異RNAの生成は低減されるか停止され、他方、機能的なγ-グロビン遺伝子の発現は活性化される：２）遺伝子導入βグロビン遺伝子(レンチウイルス・ベクターによって運ばれる潜在的に治療上有用な遺伝子と考えられている)の発現が、ZF-Ldb1の存在下で影響を受けない。理論に拘束されることは意図しないが、これは、両方のヘモグロビン：胎児ヘモグロビン(HbF、α2γ2、内在性座位から)、及び成人ヘモグロビン(HbA又はα2β2、治療ベクターから)の産生によって付加的な又は相乗的な効果をもたらすと予想される。ヒトにおける異常ヘモグロビンは300を超える変異によって特徴付けられるので、多くの又は全ての異常ヘモグロビン症が、本開示のベクターによって改善できると予想することは妥当である。この関連で、我々は、ZF-Ldb1カセット(pCL-ZF-Ldb1)をコードするレンチウイルス・ベクターが、健常な個体及びSCA患者のCD34-由来赤血球細胞において胎児ヘモグロビン(HbF、α2γ2)の合成を増加させることを実証した。HbFが増加するにつれ、成人ヘモグロビン(HbA)又は鎌状ヘモグロビン(HbS又はα2βs2)の合成は、健常な個体又はSCA患者に由来する細胞においてそれぞれ、減少した。我々は、細胞当たりに組込まれたベクターの数(平均)も研究した。この数は、細胞当たりの取込み数、又はベクターコピー数(VCN)として示される。我々は、VCNの増加が、正常及びSCA細胞の両方においてHbFの増加と関連することを観察した。フローサイトメトリーで測定されるHbF陽性細胞の数も、VCNと比例して増加した。定量的PCRで測定されるβ,γ-及びα-グロビンmRNAレベルも、ZF-Ldb1ベクターで処理したサンプルにおいて、相対比γ/αが増加する一方、β/α又はβS/αが減少することを示した。総合すると、これらのデータは、ZF-Ldb1が、β-グロビンプロモーターからγ-グロビンプロモーターへとLCR増強効果を向け直すことができることを示唆する。HbSの蓄積によって引き起こされる毒性を考えると、SCAでは、この効果は特に有益である。実施例１〜６は、さらに、ALS10にZF-Ldb1を含ませることによる潜在的有用性を確認する。特に、これらの実施例は、インビトロで、SCD患者の血液から単離した造血幹細胞の、レンチウイルス(ZF-Ldb1導入遺伝子を発現する)による感染と、成熟赤血球細胞へのそれらの分化を実証する。ZF-Ldb1によって誘導されるHbF合成は、ヒドロキ���ウレア及び様々なさらなるHbF誘導剤で処理した検体で得られたものと、比較された。ZF-Ldb1は、HbF合成を増加させ、同時に鎌状Hb(HbS)を減少させ、α-及び機能的β様グロビンの間のバランスのとれた合成を確立した。ZF-Ldb1で処理した細胞におけるHbFの誘導は、デシタビン及びポマリドミドを使用して観察されるものより、およそ３倍高かった(＋34％);トラニルシプロミンは中程度の効果を有し、他方ブチレートとヒドロキシウレアは、わずかなHbF誘導を示した。注目すべきことに、赤血球細胞分化と生存率は、ZF-Ldb1発現細胞において変化しなかった。それゆえ、レンチウイルス-介在ZF-Ldb1遺伝子導入は、SCD赤血球細胞に影響を与える既存の投薬計画より優れていると思われ、ALS10ベクターへのZF-の複合化は、様々な異常ヘモグロビン症の予防及び／又は治療への効果的なアプローチを提供すると予想することが妥当である。実施例は、β0/0患者細胞におけるALS10の有効性も実証する。
【００４２】
組換えレンチウイルス・ベクターを含む組成物が提供される。あるアプローチでは、医薬組成物が提供され、それは、例えば、本開示のレンチウイルス・ベクターを含むビリオンと、任意の適切な薬学的に許容されるキャリア、賦形剤及び／又は安定剤を混合することによって調製できる。有効成分との混合に適切な組成物のいくつかの例は、レミントンの薬学の科学と実践(2005)、第21版(フィラデルフィア、ペンシルベニア州、Lippincott Williams & Wilkins)に記載されている。
【００４３】
本開示は、異常ヘモグロビン症の予防及び／又は治療に使用するためのビリオン製剤を作る方法を含む。一実施形態では、この方法は、本開示のレンチウイルス・ベクターをコードするプラスミドを、パッケージング細胞に導入することを含む。前記パッケージング細胞は、少なくとも１種のビリオンタンパク質をコードするDNAパッケージング・プラスミド、及び適切なウイルスのエンベロープタンパク質をコードするDNAエンベロープ・プラスミドを含む。前記パッケージング及びエンベロープ・プラスミドは、それぞれのタンパク質を発現し、本開示の組換えRNAレンチウイルス・ベクターを含むビリオンの形成を促進する。本開示のビリオンを生産するのに適応させることができる適切なパッケージング・システムは、市場で入手可能である（例えば、Addgene(オーストラリア)から）。
【００４４】
以下の実施例は、本開示の様々な面を説明することを目的としており、いかなる方法による限定も意図しない。
【実施例１】
【００４５】
本実施例は、レンチウイルスによって発現されたZF-Ldb1が、CD34+由来鎌状赤芽球中のHbFレベルを上昇させることを実証する。ここに提示するデータを得るために、我々は、γ-グロビンプロモーターと特異的に結合する、Ldb1の自己会合(SA)ドメインと融合された亜鉛フィンガータンパク質、及び、緑色蛍光タンパク質を、赤血球特異的アンキリンプロモーターの制御の下で保有する、レンチウイルス・ベクターpCL-ZF-Ldb1(図１１、最上段のベクターマップ)を使用した。β-グロビン座位内でのクロマチン接触に対するZF-Ldb1発現の影響は、健康な成人赤芽球での3C実験を使用して示された。ZF-Ldb1発現は、γ-グロビンプロモーターとLCRの並置を促進し、転写をもたらす[Deng, W.等, Reactivation of developmentally silenced globin genes by forced chromatin looping. Cell, 2014. 158(4): p.849-60]。これは、成人グロビン遺伝子の発現における随伴性の減少を伴い、胎児及び成人プロモーターがLCRエンハンサー活性を競合するメカニズムと矛盾しない。この実施例は、鎌状赤血球患者から単離したCD34+細胞中の機能的ヘモグロビンの量を向上させる試みについて記載する。鎌状CD34+細胞は、インビトロにて、赤芽球にいったん分化されると、HbS(α2βs2)を主に産生する。HbF(α2γ2)及びHbA2(α2δ2)のような他のヘモグロビンも、低い度合で産生される(図１Ａ、左)。pCL-ZF-Ldb1ベクターによる感染後、鎌状赤血球は、ウイルス組込み体のコピー数に比例して、HbF合成を劇的に増加させた。代表的な実験では、細胞あたり平均0.26又は0.67ウイルス分子(VCN又はベクターコピー数)を形質導入された、同じSCD由来の赤血球細胞は、コントロール試料(図１Ａ、左に示される)よりも22％又は44％多い(それぞれ、図１Ａの中央及び右)HbFを産生する。同時に、連続的に高めたウイルス組込みにより、HbF(図１Ｂ)及びGFP(図１Ｃ)を発現する赤芽球の数は、フローサイトメトリー測定によって測定されるように、増加した。GFP+細胞のフラクションの増加はいくぶん低く、おそらくZF-Ldb1カセットとGFP遺伝子の間の配列内リボソーム進入部位(IRES)の下流でしばしば観察される減少した翻訳効率の結果と思われる。
【実施例２】
【００４６】
本実施例は、遺伝子導入ZF-Ldb1が、SCD赤芽球において、高レベルの胎児グロビン誘導をサポートし、同時に鎌状グロビンレベルを減らすことを実証する。特に、我々は、10のSCD被検者由来の赤芽球のmRNA及びタンパク質含量を分析した。末梢血単核球(PBMC)から単離したCD34+細胞は冷凍され、独立した反復実験のために使用された。前赤芽球へのpCL-ZF-Ldb1による感染は、増殖期の最初の10日以内に行われた。この時期には、細胞はなお高レベルのCD1117とCD44マーカーを発現し、グリコホリンＡは発現しない(データは示さない)(Breda, L.等, Therapeutic hemoglobin levels after gene transfer in beta-thalassemia mice and in hematopoietic cells of beta-thalassemia and sickle cells disease patients. PLoS One, 2012. 7(3): p.e32345)。
【００４７】
HbFを再活性化するZF-Ldb1の能力を評価するために、我々は未処理の又は形質導入後の細胞に発現したγ-グロビンmRNAの量を測定した。これらの値は、GAPDHに及びα-グロビン遺伝子発現(その発現は、細胞の赤血球分化ステージに正比例する)に対して正規化された。1.1コピーのpCL-ZF-Ldb1を有する細胞は、未処理細胞に比べて、平均で３倍増加したγ/αグロビン比(0.2±0.11から0.6±0.33へ)をもたらし、同時に、β/α比の減少を生じ(0.38±0.08から0.29±0.16へ)(図２Ａ、左及び中央)、LCRをβ-からγ-グロビンプロモーターに部分的に向け直すZF-Ldb1構築物の能力を確認した。これらの変化は、その発現がZF-Ldb1組込みのレベルに比例する遺伝子導入Ldb1を発現する細胞にのみ観察された(図２Ａ、右)。
【００４８】
平均すると、pCL-ZF-Ldb1で処理した細胞は、未処理細胞(27.27％±16.29)と比べてほぼ40％高いHbF(63.10％±14.01)を産生し(図２Ｂ、左)、HbS(-35.65％)及びHbA2(-5.18％)の産生は低下した(図２Ｂ、中央及び右)。HbA2の減少は、ZF-Ldb1の存在下で-グロビンとLCRとの間の接触頻度が減少した結果と思われる。正味のHbA増加、及びHbS及びHbA2減少のまとめを図３Ｃに示す。
【実施例３】
【００４９】
細胞のHbの総量に対するZF-Ldb1処理の効果を証明するために、我々は分化細胞当たりの絶対Hb量を測定した。重要なことに、胎児から成人グロビンへの割当の有意なシフトにも関わらず、総Hb合成増減(HbF＋HbS＋HbA2)は本質的に変化しなかった(図３Ａ、右)。このエビデンスを裏付けるのは、四量体のヘモグロビン存在量よりむしろ単一グロビン鎖の定量化を可能にする逆相液体クロマトグラフィーで分析した際(図３Ｂ及びＳ１)、ZF-Ldb1で処理した検体において両γA＋γG鎖が増加する一方、βS鎖は減少するという事実である。HbSの減少量は、フローサイトメトリーで確認された(図４)。GFP発現によって追跡できる、ZF-Ldb1-発現SCD赤芽球(図４Ａ)は、未形質導入SCD赤芽球と比べて、より大きなHbF陽性細胞のフラクションを有し(図４Ｂ)、及び、HbF陽性母集団内で、より低いHbSのフラクションを有する(図４Ｃ)。未処理のベースラインHbF陽性赤芽球(図４Ｂ、中央)は、ZF-Ldb1発現細胞と比べた際、より頻度が少なく、HbF/赤血球細胞が半分未満であった(図４Ｄ)。
【実施例４】
【００５０】
本実施例は、γ-グロビン遺伝子抑制因子SOX6及びKLF1が、鎌状赤芽球において減少することを実証する。特に、BCL11A、SOX6、C-MYb及びKLF1は、赤血球分化の間に、γ-グロビンの顕著な抑制因子として現れた。我々は、野生型及び鎌状赤血球症由来の赤血球細胞の両方におけるこれらの抑制因子の転写に、pCL-ZF-Ldb1が与える影響を研究した。RT-qPCR分析は、SCD患者から得た分化赤芽球が、健康な個体から得た赤芽球と比べて、γ-グロビン遺伝子発現の特定のネガティブ調節因子について異なる発現パターンを提示することを示唆する。KLF1とSOX6の両方が、健康なもの(それぞれ、0.55±0.43及び8.29±3.14)と比較して、SCD検体において有意な発現低下(それぞれ、0.17±0.05及び4.49±0.76)を示す一方(図５Ｂ)、BCL11A及びC-MYBメッセンジャーRNAは同程度の発現を示す(図５Ａ)。分析した全てのサンプルが、同程度のKELの発現と、分化水準とともに増加する内部標準mRNAを示す。これらの傾向は、導入遺伝子発現レベルから独立している(図５Ｃ及び５Ｃ，右)。これらのデータは、健康なものと比べて、これらの細胞において定常状態でのHbF含量がより高いという傾向によって示唆されるように、培養下のSCD細胞におけるγ-グロビン遺伝子のより許容的なクロマチン状態を示すことができる(図７)。
【実施例５】
【００５１】
この実施例は、ZF-Ldb1媒介性のSCD赤芽球におけるHbF誘導が、薬理学的誘導剤によって媒介される誘導より大きいことを実証する。実験手順の模式図を表１に示す。簡単に説明すると、赤血球前駆体SCD細胞は、増殖期の9〜11日内にpCL-ZF-Ldb1で感染させられるか、又は分化期の1及び3日目に、薬理学的誘導剤である5-アザ-2’-デオキシ-シチジン(0.5μM)、トラニルシプロミン(1.5μM)、ヒドロキシウレア(150μM)、ポマリドミド(30μM)、及びブチレート(100μM)で処理された。これらの濃度は、有効性(HbFの正味の増加)-対-毒性(細胞死)の評価を通じて決定された；最初のスケーリング投与量は最近の文献から推定した(図９)[Watanapokasin, Y.等, In vivo and in vitro studies of fetal hemoglobin induction by hydroxyurea in beta-thalassemia/hemoglobin E patients. Exp Hematol, 2005. 33(12): p.1486-92; Moutouh-de Parseval, L.A.等, Pomalidomide and lenalidomide regulate erythropoiesis and fetal hemoglobin production in human CD34+ cells. J Clin Invest, 2008. 118(1): p.248-58; Shi, L.等, Lysine-specific demethylase 1 is a therapeutic target for fetal hemoglobin induction. Nat Med, 2013. 19(3): p.291-4]。研究は、分化期の8日目に、高量のヘモグロビンが蓄積される正染性ステージで行なわれた。HPLCで測定されるように、pCL-ZF-Ldb1は、HbFの最も安定した増加と、HbSの減少を示した。具体的には、前記レンチウイルスで処理されたSCD赤芽球における正味のHbFの増加は、平均して、34.2％±12.53であり、これに対して、5-アザ-シチジンでは15.19％±12.77(p＜0.01)、トラニルシプロミンでは8.08％±6.28(p＜0.001)、ヒドロキシウレアでは2.39％±2.13(p＜0.001)、ポマリドミドでは11.84％±9.02(p＜0.01)、及びブチレートでは4.84％±5.03(p＜0.001)であった。ZF-Ldb1発現細胞は、未処理細胞よりも有意に高いHbFを示した(p＜0.001)(図６Ａ上段)。反対に、前記レンチウイルスで処理されたSCD赤芽球における正味のHbSの減少は、平均して-31.36％±11.61であり、これに対して、5-アザ-シチジンでは-17.30％±15.04、トラニルシプロミンでは-6.93％±6.64、ヒドロキシウレアでは-3.48％±4.68、ポマリドミドでは-11.61％±9.27、及びブチレートでは-4.90％±7.94であった(図６Ａ下段)。
［表１］
(上段)ヒトSCD CD-34+細胞の増殖、分化、及びpCL-ZF-Ldb1及び／又はHbF薬理学的誘導剤を用いた処理の実験フロー  (下段)本研究で使用したHbF誘導剤の種類、生物活性及び用量
0006760964.tif 000002
【００５２】
機能的Hbがより高レベルで回復しても、ZF-Ldb1を発現する細胞は、未処理サンプルと比べて生存率に有意な変化を示さなかったが、ポマリドミド、ブチレート及びヒドロキシウレアで処理した細胞は生存率の減少を示した(図６Ｂ)。これらの差は、薬剤応答への遅延に起因する傾向を排除するために、より早い時点にて薬理学的誘導剤で処理されたサンプルのサブセットで確認された(表２)(図１０)。総合すると、pCL-ZF-Ldb1は、HbF及びF-細胞レベルを増大する効果が、全ての試験化合物より優れており、重要なことに、最小の毒性を伴った。
［表２］
ヒトSCD CD-34+細胞の増殖、分化、及びpCL-ZF-Ldb1又はHbF薬理学的誘導剤を用いた処理の実験フロー
0006760964.tif 000003
【００５３】
上記のことから、γ-グロビンプロモーターに選択的に結合するZFタンパク質に連結したSA Ldb1ドメインを保有するレンチウイルス・ベクターが、HbF合成を有意に増加させ、前述の薬理学的誘導剤を上回ったことが明らかである。それゆえ、ZFタンパク質に連結したSA Ldb1ドメインの、本開示のALS10ベクターへの添加が、複合型ベクターの有利な性質を増大させると考えることは妥当である。
【実施例６】
【００５４】
本実施例は、実施例１〜５に記載された結果を得るために使用した材料及び方法の説明を提供する。
【００５５】
ヒト及び動物倫理
【００５６】
SCD患者からの抹消血サンプルは、モンテフィオーリ医療センターで、彼らの通常の臨床ケアの一環として、自動赤血球交換の間に採取された。前記サンプルは、非連結且つ非特定化された医療廃棄物であったため、モンテフィオーリ医療センター施設の治験審査委員会はそれらをIRB免除とみなした。
【００５７】
構築物
【００５８】
ヒトγ-グロビンプロモーターのHS2を標的とするZFは、当該分野で知られている。Ldb1のアミノ酸1〜200を含むSAドメインは、ZFのC末端に挿入された。前記SAドメインは、HAでタグされたGG1のC末端に付着された。
【００５９】
ベクターの製造と用量設定
【００６０】
エンベロープ・プラスミド(VSV-G)、パッケージング・プラスミド(pMDLg/p RRE)、及びpRSV-REVプラスミドと、遺伝子導入プラスミド(pCL-ZF-Ldb1)の、293T細胞へのコ・トランスフェクションによって、ウイルスのストックが産生された。10％ウシ胎児血清、100 U/mlペニシリン、及び100 mg/mlストレプトマイシンを含むイスコフ改変イーグル培地(DMEM, Cellgro、マナサッス、バージニア州)における、37℃、5％CO2下でのトランスフェクションの24時間前に、293T細胞の一定分量(5×106)を、細胞培養皿(10 cm)に蒔いた。培地はトランスフェクションの2時間前に交換された。沈殿物は、450 uLの0.1×TE(0.1×TEは10 mM Tris＋1 mM EDTA)と50μLの2 M CaCl2に前記プラスミドを添加し、その後、500μLの2×HEPES-緩衝食塩水(281 mM NaCl、100 mM HEPES、1.5 mM Na2HPO4)を滴下で添加することによって形成し、その後に沈殿物をボルテックスし、直ちに培養物に添加した。培地(10 mL)は16時間後に交換した。ウイルス上清を24及び48時間目に収集し、低速遠心分離でクリアにし、酢酸セルロース(0.2μm)を通してろ過した。超遠心分離法に続いて、濃縮ウイルスの段階希釈物(それぞれ、5、0.5及び0.05μL)を、最終濃度8μg/mLでポリブレンを補充されたトランスフェクション・バッファー(Millipore, ビルリカ、マサチューセッツ州)1mL中で、1×105 NIH 3T3細胞(ATCC、マナサッス、バージニア州)を感染させるために使用した。ゲノムDNAは、3日後に抽出した(Qiagen kit、バレンシア、カリフォルニア州)。感染多重度(MOI)は、以下の式を使用して計算した。
細胞の数(1×105)×希釈係数(1 mL/μL ウイルス標本)×VCN(リアルタイムPCRにより測定、WPREエレメント及びID遺伝子のためのオリゴを使用、PCR及びReal Time PCR参照)。
【００６１】
リアルタイム(RT)-PCR
【００６２】
全mRNAのレトロ転写は、SuperScriptTM II First Strand Kit(Invitrogen, カールズバッド、カリフォルニア州)を使用して行った。Q-PCR反応は、TaqMan(TaqMan PCR 2×Master mix；Applied Biosystems)又はSYBR Green(iTaqTM SYBR[登録商標] Green Supermix、Bio-Rad Laboratories、ハーキュリーズ、カリフォルニア州)ケミストリーのどちらかを用いた、ABI Prism 7700 Sequence Detection System(Applied Biosystems、フォスターシティ、カリフォルニア州)を使用して行った。グロビン及びGAPDH転写物の定量的リアルタイムPCRアッセイは、遺伝子特異的二重蛍光標識プローブを使用して行った。以下のプライマー及びプローブ配列を使用した(それぞれ、フォワード、リバース及びプローブ、使用時、各遺伝子の)：
β: Fw: 5′-CAAGAAAGTGCTCGGTGCCT-3′(配列番号６); Rev: 5′-GCAAAGGTGCCCTTGAGGT-3′(配列番号７); 5′-FAM-TAGTGATGGCCTGGCTCACCTGGAC-TAMRA-3′(配列番号８); α: Fw: 5′-TCCCCACCACCAAGACCTAC-3′(配列番号９); Rev: 5′-CCTTAACCTGGGCAGAGCC-3′(配列番号１０); 5′-FAM-TCCCGCACTTCGACCTGAGCCA-TAMRA-3′(配列番号１１); γ: Fw: 5′-TGGCAAGAAGGTGCTGACTTC-3′(配列番号１２); Rev: 5′-TCACTCAGCTGGGCAAAGG(配列番号１３); 5′-FAM-TGG GAGATGCCATAAAGCACCTGG-TAMRA-3′(配列番号１４); BCL11A: Fw: 5′-TGATGTGTGTCCATTGGTGTGAGC-3′(配列番号１５); Rev: 5′-TGCGAACTTGAACGTCAGGAGTCT, SOX-6(配列番号１６): Fw: 5′-AGCTGCTTTCGGCTTTCTCCCTTA-3′(配列番号１７); Rev: 5′-CCTTTGCATTTGCAGCAGTTCAGC-3′(配列番号１８); C-MYB: Fw: 5′-TCAACCGATCATCCCTCACACTCT-3′(配列番号１９); Rev: 5′-AATCAGCAGCGCTTCCATTCAAGG-3′(配列番号２０), KLF-1: Fw: 5′-GCTGCCTCCACCCAAGTG-3′(配列番号２１); Rev: 5′-ACCAACTCTGGGCAGTCACAT-3’(配列番号２２), Kell: Fw: 5′-AGCAACCACCCATGCCTGCC-3′(配列番号２３); Rev: 5′-CTCGGGCCAAAGGCCTCACG-3′(配列番号２４).
参照遺伝子のリアルタイムPCRのために、我々は内在性コントロールとして、ヒトグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(GAPDH)キットを使用した(キットにおいて、プローブはVICで蛍光標識されている(Applied Biosystems))。組込み数(VCN)は、oligos(Fw: 5′-CGGCTGTTGGGCACTGA-3′(配列番号２５); Rev: 5′-GGAAGGTCCGCTGGATTGA-3′(配列番号２６))及びプローブ(5′-FAM-ATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCC-TAMRA-3′(配列番号:27))を使用するQ-PCRで、ベクターに存在する特定配列(WPRE)について定量化し、それをゲノム(ID-1 Fw: 5′-AAGGTGAGCAAGGTGGAGATTC-3′(配列番号２８); Rev: 5′-TTCCGAGTTCAGCTCCAACTG-3′(配列番号２９))内の２コピーに存在する内在性コントロールと比較した。
【００６３】
二相液体培養、ベンジジン染色及び形質導入
【００６４】
血液サンプルからのCD34+細胞選択は、CD34マイクロビーズキット(Miltenyi Biotec Inc.、オーバーン、カリフォルニア州)を使用する、免疫磁気分離法によって行った。これらの細胞は、その後、Leberbauerと同僚によって記載されたプロトコルの修正版に従って増殖された。細胞は、50μLのStemSpan CC-100サイトカイン・カクテル(Stemcell Technologies、バンクーバー、BA、カナダ)、2 U/mLのエリスロポエチン(Amgen, Thousand Oaks、カリフォルニア州)、10−6 Mのデキサメタゾン(Sigma)及び1％のペニシリンストレプトマイシンを含む5 mLの無血清StemSpan(Stemcell Technologies、バンクーバー、BA、カナダ)に蒔かれた。CD34+培養物は、一週間に二度、培地を新しくすることによって未分化に保たれ、密度勾配遠心分離が、死細胞及び自発分化細胞の両方を除去するために使用された。この段階で、細胞は、冷凍されるか(50％ characterized Hyclone FBS、10％DMSO, Sigma、及び40％ Iscove's Modified DMEM, Cellgroを用いて)、又は実験のために使用された。フェーズＩにおける10日後に、細胞は、30％ウシ胎児血清及び10−5 Mβ-メルカプトエタノールを補充されたα-修正基本培地を含むフェーズII培地に移された。エリスロポエチンが、赤血球分化を刺激するために添加された(5 U/mL)。細胞は段階希釈したウイルスに感染させられた。細胞は、全ての分析について、フェーズIIの7〜10日目に収集された。分化のレベルはベンジジン染色で評価された。この段階で、細胞は、GFP、HbF及びHbB発現について、フローサイトメトリーで分析された。
【００６５】
HbF誘導剤を用いた処理
【００６６】
我々は、末梢血由来のCD34+細胞(手順参照)を、HbF誘導剤である、ヒドロキシウレア(HU)、5-アザシチジン、ポマリドミド、酪酸ナトリウム、トラニルシプロミン(TCP)で処理した。トラニルシプロミン(TCP)、5-アザ-2’-デオキシ-シチジン、ポマリドミド及び酪酸ナトリウム。我々は最初に、公開されたデータに従って、最も効率的で、毒性が少ない濃度を見つけるために、薬物の量を決定した。ヒドロキシウレア(HU；Sigma-Aldrich)は水に溶解され、最終濃度150μMで培地に添加された。トラニルシプロミン(Sigma-Aldrich)は水に溶解され、最終濃度1.5μMで培地に添加された。5-アザシチジン(DAC；Sigma-Aldrich)は水に溶解され、最終濃度0.5μMで培地に添加された。ポマリドミド(Sigma-Aldrich)はDMSOに溶解され、最終濃度30μMで培地に添加された。酪酸ナトリウム(Sigma-Aldrich)は水に溶解され、最終濃度100μMで培地に添加された。処理のタイムラインを表１に示す。
【００６７】
高速液体クロマトグラフィー(HPLC)による四量体及び単鎖分析
【００６８】
赤血球ペレットは、HPLC-用水で溶解され、得られた膜無しの溶血液はSystem Gold 126 Solvent Module instrument(Beckman Coulter, フラートン、カリフォルニア州)にかけられた。ヘモグロビンは弱陽イオン交換PolyCAT Aカラム(PolyLC, Inc, コロンビア、メリーランド州)で分離され、波長415 nmで検出された。Hbは、移動相Ａ(20 mmol/L Bis-Tris、2 mmol/L KCN、pH 6.96)でカラムに結合され、移動相Ｂ(20 mmoI/L Bis-Tris、2 mmol/L KCN、200mmol/L NaCl、pH 6.55)で溶出された。単鎖定量化は、逆相HPLCで評価した。このケースにおけるHbサンプルは、Zorbax 5 μm 300SB-C8 300 Å、LC 150×2.1 mmカラム(Agilent Technologies、サンタ・クララ、カリフォルニア州)及び0.1％トリフルオロ酢酸中の20％〜 60％アセトニトリルの勾配(25分)を使用し、215 nmのUV検出を有する、Hitachi D-7000 HSM Series apparatus(Hitachi Instruments, サンノゼ、カリフォルニア州)に注入された。既知の濃度のHbA及びHbFを有する段階希釈溶液(Analytical Control System, Inc, フィッシャーズ、インディアナ州)が、検量線(ピーク面積が濃度の値に対してプロットされる)を作成するために使用された。サンプル中のHbの種類と相対量は、標準ヘモグロビン・コントロールと比較することによって評価された。
【実施例７】
【００６９】
この実施例は、レンチウイルス・ベクターALS10をβ0/0表現型サンプル(すなわち、最も重度なサラセミア検体)のCD34+細胞に導入することにより、当該改変CD34+細胞由来の赤血球によって産生されるHbAレベルが統計的に有意に上昇することを実証する。HbAの上昇は、本実施例において比較コントロール(AnkT9W；Breda等, Plos One, 2012から)として使用され、完全なイントロン２を含まない、前述の構築物と比べたものである。このように、前述の構築物と比べて、ALS10は、図１２に示す結果によって実証されるように、有意且つ予期せぬ改善を示した。図１２に示す結果を得るために、以下の物質と方法が使用された。
【００７０】
ベクターの製造と用量設定
【００７１】
エンベロープ・プラスミド(VSV-G)、パッケージング・プラスミド(pMDLg/p RRE)、及びpRSV-REVベクターと、遺伝子導入プラスミド(GG1-SA)の、293T細胞へのコ・トランスフェクションによって、ウイルスのストックが産生された。10％ウシ胎児血清、100 U/mlペニシリン、及び100 mg/mlストレプトマイシンを含むイスコフ改変イーグル培地(DMEM, Cellgro、マナサッス、バージニア州)における、37℃、5％CO2下でのトランスフェクションの24時間前に、293T細胞の一定分量(5×106)を、細胞培養皿(10 cm)に蒔いた。培地はトランスフェクションの2時間前に交換された。沈殿物は、450 uLの0.1×TE(0.1×TEは10 mM Tris＋1 mM EDTA)と50μLの2 M CaCl2に前記プラスミドを添加し、その後、500μLの2×HEPES-緩衝食塩水(281 mM NaCl、100 mM HEPES、1.5 mM Na2HPO4)を滴下で添加することによって形成し、その後に沈殿物をボルテックスし、直ちに培養物に添加した。培地(10 mL)は16時間後に交換した。ウイルス上清を24及び48時間目に収集し、低速遠心分離でクリアにし、酢酸セルロース(0.2μm)を通してろ過した。超遠心分離法による濃縮後、濃縮ウイルスの段階希釈物(それぞれ、5、0.5及び0.05μL)を、最終濃度8μg/mLにてポリブレンを補充されたトランスフェクション・バッファー(Millipore, ビルリカ、マサチューセッツ州)1mL中で、1×105 NIH 3T3細胞(ATCC、マナサッス、バージニア州)を感染させるために使用した。ゲノムDNAは、3日後に抽出した(Qiagen kit、バレンシア、カリフォルニア州)。感染多重度(MOI)は、以下の式を使用して計算した。
細胞の数(1×105)×希釈係数(1 mL/μL ウイルス標本)×VCN(リアルタイムPCRにより測定、Psiエレメント及びID遺伝子のためのオリゴを使用、Real Time PCRより)。
【００７２】
二相液体培養、ベンジジン染色及び形質導入
【００７３】
β0/0を有する同意患者及び健康な個体から、20〜30mLの末梢血が提供された；あるいは、β0/0患者の30〜60mLの末梢血を、赤血球交換治療法からの廃棄血液から得た。我々は、CD34+細胞を、CD34マイクロビーズキット(Miltenyi Biotec Inc.、オーバーン、カリフォルニア州)を使用して、免疫磁気分離法によって選択し、その後これらの細胞を、Leberbauerと同僚によって記載されたプロトコルの修正版に従って増殖した。細胞は、50μLのStemSpan CC-100サイトカイン・カクテル(Stemcell Technologies、バンクーバー、BA、カナダ)、2 U/mLのエリスロポエチン(Amgen, Thousand Oaks、カリフォルニア州)、10−6 Mのデキサメタゾン(Sigma)及び1％のペニシリンストレプトマイシンを含む5 mLの無血清StemSpan(Stemcell Technologies、バンクーバー、BA、カナダ)に蒔かれた。CD34+培養物は、一週間に二度、培地を新しくすることによって未分化に保たれ、密度勾配遠心分離が、死細胞及び自発分化細胞の両方を除去するために使用された。この段階で、細胞は、冷凍されるか(50％ characterized Hyclone FBS、10％DMSO, Sigma、及び40％ Iscove's Modified DMEM, Cellgroを用いて)、又は実験のために使用された。フェーズＩにおける10日後に、細胞は、30％ウシ胎児血清及び10−5 Mβ-メルカプトエタノールを補充されたα-修正基本培地を含むフェーズII培地に移された。エリスロポエチンが、赤血球分化を刺激するために添加された(5 U/mL)。細胞は段階希釈したウイルスに感染させられた。細胞は、全ての分析について、フェーズIIの7〜10日目に収集された。分化のレベルはベンジジン染色で評価された。
【００７４】
高速液体クロマトグラフィー(HPLC)
【００７５】
細胞ペレットは、HPLC-用水で溶解され、System Gold 126 Solvent Module instrument(Beckman Coulter, フラートン、カリフォルニア州)にかけられた。ヘモグロビンは、ポリアスパラギン酸の結合コーティングを有するシリカ系物質を充填したPolyCAT Aカラム(PolyLC, Inc, コロンビア、メリーランド州)で分離され、波長415 nmで検出された。Hbは、移動相Ａ(20 mmol/L Bis-Tris、2 mmol/L KCN、pH 6.96)でカラムに結合され、移動相Ｂ(20 mmoI/L Bis-Tris、2 mmol/L KCN、200mmol/L NaCl、pH 6.55)で溶出された。既知の濃度のHbA及びHbFを有する段階希釈溶液(Analytical Control System, Inc, フィッシャーズ、インディアナ州)が、検量線(415nmで検出された吸光度が濃度の値に対してプロットされる)を作成するために使用された。サンプル中のヘモグロビンの種類と量は、標準ヘモグロビン・コントロールと比較することによって評価された。
【００７６】
本発明を、特定の実施形態を通じて説明してきたが、通常の変更は当業者に自明であり、そのような修正は本発明の範囲内である。
【図１】
0006760964.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１３−５】
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【図１３−６】
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【図１３−７】
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【図１３−８】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１４−５】
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【図１４−６】
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【図１４−７】
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【図１４−８】
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【図１４−９】
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【図１４−１０】
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【図１４−１１】
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【図１４−１２】
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【図１４−１３】
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【図１４−１４】
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【図１４−１５】
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【図１４−１６】
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【図１４−１７】
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【図１４−１８】
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【図１４−１９】
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【図１４−２０】
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【図１５】
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【配列表】
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