(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２３の５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインと少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドであって、
Ｈｅｒ２のドメインIVのエピトープに結合する抗体と特異的に結合すること、ならびに
配列番号２３の２３〜２１７番目のアミノ酸配列に対応するＨｅｒ２のドメインＩ、配列番号２３の２１８〜３４１番目のアミノ酸配列に対応するＨｅｒ２のドメインII、配列番号２３の３４２〜５１０番目のアミノ酸配列に対応するＨｅｒ２のドメインIII、およびＨｅｒ２の細胞内ドメインを含んでいないことを特徴とし、
前記細胞外ドメインがリンカーを介して膜貫通ドメインと連結し、
前記リンカーが、配列番号４５のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項２】
前記ＨＥＲ２ポリペプチドが、配列番号２３の５８０番目のグルタミン酸、５８２番目のアスパラギン酸、５９２番目のアスパラギン酸、５９５番目のフェニルアラニンおよび６２４番目のグルタミン、ならびに配列番号２３の５６３〜６５２番目のアミノ酸配列または配列番号２３の６５３〜６７５番目のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
細胞表面発現を可能とするリーダーペプチドをさらに含み、該リーダーペプチドが配列番号１７に示される配列を含むリーダーペプチドである、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記抗体がＨｅｒ２受容体に結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
【請求項６】
第一のキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項５に記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
前記第一のキメラ抗原受容体が、抗原結合ドメイン、スペーサードメイン、膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの刺激ドメインを含むこと、ならびに
前記第一のキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドが、配列番号２６の配列を有するＴ２Ａリンカーを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに連結されていることを特徴とする、請求項６に記載の単離された核酸分子。
【請求項８】
前記第一のキメラ抗原受容体が、配列番号２に示されるアミノ酸配列または配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の単離された核酸分子。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項５〜８のいずれか一項に記載の単離された核酸分子を発現する単離された宿主細胞であって、
ＣＤ８ Ｔ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ４ナイーブＴ細胞、ＣＤ８ナイーブＴ細胞、ＣＤ８セントラルメモリー細胞およびＣＤ４セントラルメモリー細胞からなる群から選択される、宿主細胞。
【請求項１０】
第２のキメラ抗原受容体と遺伝子タグとを含む第２のポリペプチドを含む、請求項９に記載の単離された宿主細胞。
【請求項１１】
前記単離されたポリペプチドが、配列番号２に示される配列を含む第１のキメラ抗原受容体と、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含む第２のキメラ抗原受容体とを含む、請求項９または１０に記載の単離された宿主細胞。
【請求項１２】
遺伝子タグがＥＧＦＲｔを含む、請求項１０または１１に記載の単離された宿主細胞。
【請求項１３】
自己由来かつ抗原特異的であり、Ｔ細胞前駆細胞または造血幹細胞由来である、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の単離された宿主細胞。
【請求項１４】
前記宿主細胞上の第１のキメラ抗原受容体または第１および第２のキメラ抗原受容体によって認識される腫瘍抗原を有するがんの治療において使用するための、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の単離された宿主細胞。
【請求項１５】
前記宿主細胞上の第１のキメラ抗原受容体または第１および第２のキメラ抗原受容体と、遺伝子タグに特異的に結合する抗体とによって認識される腫瘍抗原を有するがんの治療において使用するための、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の単離された宿主細胞。
【請求項１６】
前記抗体が細胞傷害薬と結合しており、かつ／または検出可能な標識で標識されている、請求項１５に記載の単離された宿主細胞。
【請求項１７】
前記抗体がハーセプチン（登録商標）またはアービタックス（登録商標）である、請求項１５に記載の単離された宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2014年10月2日に出願された米国仮特許出願62/058,973号、2014年4月10日に出願された米国仮特許出願61/977,751号、2014年4月30日に出願された米国仮特許出願61/986,479号、2014年12月9日に出願された米国仮特許出願62/089,730号、2014年12月11日に出願された米国仮特許出願62/090845号、および2014年12月5日に出願された米国仮特許出願62/088,363号に係る優先権を主張するものである。前記出願の開示は、参照によりその全体が明示的に本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列、配列表またはコンピュータープログラムにより作成した配列に関する情報
本願は電子形式の配列表とともに出願されたものである。この配列表は、SCRI-066WO-SEQUENCE_LISTING.TXTのファイル名で2015年4月7日に作成された47kbのファイルとして提供されたものである。この電子形式の配列表に記載された情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本発明は、細胞における導入遺伝子の発現の検出に有用な組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
細胞において導入遺伝子を発現させることは、様々な状態に対する治療アプローチとして重要視されつつある。たとえば、養子免疫療法においては、ヒトＴリンパ球が遺伝子移入により改変され、腫瘍細胞上に発現した表面分子に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する。キメラ受容体は、細胞外リガンド結合ドメインを含む合成受容体であり、該細胞外リガンド結合ドメインは、最も一般的には、細胞内シグナル伝達成分に連結されたモノクローナル抗体一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）であり、該細胞内シグナル伝達成分は、最も一般的には、ＣＤ３ζ単独、または１つ以上の共刺激ドメインと組み合わせられたＣＤ３ζである。導入遺伝子で改変された細胞で治療される状態としては、サラセミア、血友病、心筋梗塞、および重症複合型免疫不全が挙げられる。しかし、内在性遺伝子に匹敵するレベルで導入遺伝子を安定に発現させるには、大きな問題がある。したがって、導入遺伝子を高発現する細胞を選択および／または検出するための組成物および方法を特定する必要性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
遺伝子治療戦略において臨床的成功を収め、再現性を高めるには、均質な製品を選択し、それを使用することが不可欠である。本明細書では、細胞を改変するための遺伝子タグ候補および遺伝子ツール候補について述べる。いくつかの実施形態においては、遺伝子タグは、ヒトＨｅｒ２に基づくエピトープを含み、これをＨｅｒ２ｔと呼ぶ。特定の実施形態においては、Ｈｅｒ２ｔはＨｅｒ２の細胞内成分を全く含んでいないが、Ｈｅｒ２の膜貫通領域、モノクローナル抗体であるトラスツズマブ（ハーセプチン）により認識される高次構造的に完全なエピトープ（conformationally intact epitope）、および表面発現を容易とするペプチドを含んでいる。Ｈｅｒ２ｔ構築物の３種のバリアント、すなわち、Ｈｅｒ２ドメインIVの完全長を含む１つの構築物と、ハーセプチンと複合体化したＨｅｒ２の三次元構造（Garrett et al J. Immunology 178:7120 (2007); Cho et al 2003）から設計した２つのコンフォメーショナルエピトープとをレンチウイルスパッケージングプラスミドepHIV7に組み込み、ＣＨＯ細胞においてその特性を評価した。
【０００６】
いくつかの態様において、Ｈｅｒ２ｔを遺伝子タグとして使用することによって、目的の導入遺伝子を発現する治療用細胞の均質な集団をエクスビボで選択かつ精製することが可能となる。さらに、Ｈｅｒ２ｔを使用することによって、インビボで治療用細胞を追跡することができる。たとえば、血液、骨髄および脳脊髄液吸引液のハーセプチン染色の標的としてＨｅｒ２ｔを使用することによって、導入遺伝子を発現している治療用細胞の持続性を確認し、患者におけるがんの寛解から治療の持続までを追跡することができる。Ｈｅｒ２ｔをＥＧＦＲｔなどの別の遺伝子タグとともに使用する場合、複数の導入遺伝子を発現する細胞を同時に精製することができ、これによってＣＡＲ療法の治療用途を拡大することができる。
【０００７】
いくつかの実施形態において、本発明の開示は、単離されたポリペプチドであって、
配列番号２３において膜貫通ドメインに連結した５１１〜６５２番目または５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインからなるポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、
Ｈｅｒ２のドメインIVのエピトープに結合する抗体に特異的に結合すること、および
完全長成熟ＨＥＲ２ではないこと
を特徴とする単離されたポリペプチドを提供する。
この単離されたポリペプチドをコードする核酸も本発明に包含される。
【０００８】
別の実施形態においては、単離されたポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞であって、該単離されたポリペプチドが、配列番号２３において膜貫通ドメインに連結した５１１〜５６２番目または５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインからなるポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、Ｈｅｒ２のドメインIVのエピトープに結合する抗体に特異的に結合することを特徴とする宿主細胞が提供される。宿主細胞は、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ４ナイーブＴ細胞、ＣＤ８ナイーブＴ細胞、ＣＤ８セントラルメモリー細胞、ＣＤ４セントラルメモリー細胞およびこれらの組み合わせからなる群から選択することができる。宿主細胞は、第２の遺伝子タグに連結された第２のキメラ抗原受容体をコードする第２の核酸をさらに含むことができる。いくつかの実施形態においては、前記第２の核酸は、単離されたポリペプチドをコードする核酸として、同じ宿主細胞に導入することができ、この単離されたポリペプチドは、配列番号２３において膜貫通ドメインに連結した５１１〜５６２番目または５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインからなるポリペプチドと少なくとも９５％の配列同一性を有し、Ｈｅｒ２のドメインIVのエピトープに結合する抗体に特異的に結合することを特徴とする。別の実施形態では、前記第２の核酸は第２の宿主細胞集団に導入され、第１の宿主細胞集団および第２の宿主細胞集団を含む少なくとも２つの宿主細胞集団を組み合わせて単一の組成物とする。いくつかの実施形態においては、前記Ｔ細胞はＴ細胞前駆細胞を含む。いくつかの実施形態においては、前記Ｔ細胞前駆細胞は造血幹細胞である。
【０００９】
本開示の別の態様は、本明細書に記載の宿主細胞を含む組成物の製造方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、
単離された核酸を宿主細胞に導入すること、および
少なくとも１つの増殖因子を含む培地中で前記宿主細胞を培養すること
を含み、
前記核酸は、たとえば、配列番号２３において膜貫通ドメインに連結した５１１〜６５２番目または５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメイン（ＥＣＤ）からなるポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する単離されたポリペプチドをコードする核酸であり、
該単離されたポリペプチドは、Ｈｅｒ２のドメインIVのエピトープに結合する抗体に特異的に結合する。
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、前記培養工程の前もしくは後またはその前後に、ＥＣＤを発現している宿主細胞を選択することをさらに含む。別の実施形態においては、前記製造方法は、第２のキメラ抗原受容体および第２の遺伝子タグをコードする第２の核酸を前記宿主細胞に導入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記培養工程の前もしくは後またはその前後に、前記第２の遺伝子タグを発現している宿主細胞を選択することをさらに含む。
【００１０】
別の実施形態では、
単離された第１の核酸を第１の宿主細胞に導入すること、
ＥＣＤを発現している第１の宿主細胞を選択すること、
第２のキメラ抗原受容体および第２の遺伝子タグをコードする第２の核酸を第２の宿主細胞に導入すること、
前記第２の遺伝子タグを発現している第２の宿主細胞を選択すること、ならびに
任意に、少なくとも１つの増殖因子を含む培地中で前記第１の宿主細胞および第２の宿主細胞を培養すること
を含み、
前記核酸が、たとえば、配列番号２３において膜貫通ドメインに連結した５１１〜６５２番目または５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインからなるポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する単離されたポリペプチドをコードする核酸であること、
該単離されたポリペプチドが、Ｈｅｒ２のドメインIVのエピトープに結合する抗体に特異的に結合すること
を特徴とする方法が提供される。
別の実施形態では、組成物は第１の宿主細胞集団および第２の宿主細胞集団を含む。
【００１１】
本発明の開示の別の態様は、がんの治療方法および該治療のための前記組成物の使用、前記組成物中の前記細胞をインビボで追跡するための方法および該追跡のための前記組成物の使用、ならびに前記組成物中の前記細胞をインビボで殺傷するための方法および該殺傷のための前記組成物の使用に関する。いくつかの実施形態においては、腫瘍抗原を発現しているがん患者を治療することを含む方法が提供され、該方法は、遺伝子タグに連結されたキメラ抗原受容体をコードする１つ以上の核酸を含む宿主細胞を含む組成物の有効量を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記組成物中の宿主細胞は、第１の遺伝子タグに連結された第１のキメラ抗原受容体をコードする第１の核酸と、第２の遺伝子タグに連結された第２のキメラ抗原受容体をコードする第２の核酸とを含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記遺伝子タグに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記第１遺伝子タグに結合する抗体を投与するか、または前記第２の遺伝子タグに特異的に結合する抗体を投与するか、あるいは両方の抗体を投与する。いくつかの実施形態においては、前記抗体は検出可能な標識または細胞傷害薬と結合されているか、あるいはこれらの両方と結合されている。
【００１２】
いくつかの実施形態においては、単離されたポリペプチドであって、
配列番号２３において膜貫通ドメインに連結した５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインからなるポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、
Ｈｅｒ２のドメインIVのエピトープに結合する抗体に特異的に結合すること、および
完全長成熟ＨＥＲ２ではないこと
を特徴とする単離されたポリペプチドが提供される。
いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、配列番号２３の５８０番目のグルタミン酸、５８２番目のアスパラギン酸、５９２番目のアスパラギン酸、５９５番目のフェニルアラニンおよび６２４番目のグルタミンを含む。いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、配列番号２３の５６３〜６５２番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは、配列番号２３の６５３〜６７５番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、前記単離されたポリペプチドは、細胞表面発現を可能とするリーダーペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記リーダーペプチドは配列番号１７で表される配列を有する。いくつかの実施形態では、前記抗体はトラスツズマブである。
【００１３】
いくつかの実施形態においては、単離されたポリペプチドであって、
配列番号２３において膜貫通ドメインに連結した５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインからなるポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、
Ｈｅｒ２のドメインIVのエピトープに結合する抗体に特異的に結合すること、
完全長成熟ＨＥＲではないこと、および
前記配列番号２３の５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインが、GGGSGGGS（配列番号４５）で示されるアミノ酸を含む配列を介して前記膜貫通ドメインに連結されていること
を特徴とする単離されたポリペプチドが提供される。
いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、配列番号２３の５８０番目のグルタミン酸、５８２番目のアスパラギン酸、５９２番目のアスパラギン酸、５９５番目のフェニルアラニンおよび６２４番目のグルタミンを含む。いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、配列番号２３の５６３〜６５２番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは、配列番号２３の６５３〜６７５番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、前記単離されたポリペプチドは、細胞表面発現を可能とするリーダーペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記リーダーペプチドは、配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記抗体はトラスツズマブである。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドをコードする単離された核酸が提供される。
いくつかの実施形態においては、前記単離されたポリペプチドは、
配列番号２３において膜貫通ドメインに連結した５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインからなるポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、
Ｈｅｒ２のドメインIVのエピトープに結合する抗体に特異的に結合すること、および
完全長成熟ＨＥＲ２ではないこと
を特徴とする。
いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、配列番号２３の５８０番目のグルタミン酸、５８２番目のアスパラギン酸、５９２番目のアスパラギン酸、５９５番目のフェニルアラニンおよび６２４番目のグルタミンを含む。いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、配列番号２３の５６３〜６５２番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは、配列番号２３の６５３〜６７５番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、前記単離されたポリペプチドは、細胞表面発現を可能とするリーダーペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記リーダーペプチドは配列番号１７で表される配列を有する。いくつかの実施形態では、前記抗体はトラスツズマブである。
いくつかの実施形態においては、前記単離されたポリペプチドは、
配列番号２３において膜貫通ドメインに連結した５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインからなるポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、
Ｈｅｒ２のドメインIVのエピトープに結合する抗体に特異的に結合すること、
完全長成熟ＨＥＲではないこと、および
前記配列番号２３の５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインが、GGGSGGGS（配列番号４５）で示されるアミノ酸を含む配列を介して前記膜貫通ドメインに連結されていること
を特徴とする。
いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、配列番号２３の５８０番目のグルタミン酸、５８２番目のアスパラギン酸、５９２番目のアスパラギン酸、５９５番目のフェニルアラニンおよび６２４番目のグルタミンを含む。いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、配列番号２３の５６３〜６５２番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは、配列番号２３の６５３〜６７５番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、前記単離されたポリペプチドは、細胞表面発現を可能とするリーダーペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記リーダーペプチドは、配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記抗体はトラスツズマブである。いくつかの実施形態では、前記単離された核酸はプロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記単離された核酸は導入遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、抗原結合ドメイン、スペーサードメイン、膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、自己切断リンカーを有する前記ＨＥＲ２ポリペプチドをコードする前記核酸に連結されている。
いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、
配列番号２３において膜貫通ドメインに連結した５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインからなるポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、
Ｈｅｒ２のドメインIVのエピトープに結合する抗体に特異的に結合すること、および
完全長成熟ＨＥＲ２ではないことを特徴とする。
いくつかの実施形態においては、前記自己切断リンカーは、配列LEGGGEGRGSLLTCG（配列番号２６）を有するＴ２Ａリンカーである。いくつかの実施形態においては、前記キメラ抗原受容体は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記キメラ抗原受容体は、配列番号２５（ＣＤ２０ＣＡＲ）のアミノ酸配列を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドをコードする単離された核酸を含む宿主細胞が提供される。
いくつかの実施形態においては、前記単離されたポリペプチドは、
配列番号２３において膜貫通ドメインに連結した５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインからなるポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、
Ｈｅｒ２のドメインIVのエピトープに結合する抗体に特異的に結合すること、および
完全長成熟ＨＥＲ２ではないこと
を特徴とする。
いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、配列番号２３の５８０番目のグルタミン酸、５８２番目のアスパラギン酸、５９２番目のアスパラギン酸、５９５番目のフェニルアラニンおよび６２４番目のグルタミンを含む。いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、配列番号２３の５６３〜６５２番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは、配列番号２３の６５３〜６７５番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、前記単離されたポリペプチドは、細胞表面発現を可能とするリーダーペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記リーダーペプチドは配列番号１７で表される配列を有する。いくつかの実施形態では、前記抗体はトラスツズマブである。
いくつかの実施形態においては、前記単離されたポリペプチドは、
配列番号２３において膜貫通ドメインに連結した５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインからなるポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、
Ｈｅｒ２のドメインIVのエピトープに結合する抗体に特異的に結合すること、
完全長成熟ＨＥＲではないこと、および
前記配列番号２３の５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインが、GGGSGGGS（配列番号４５）で示されるアミノ酸を含む配列を介して前記膜貫通ドメインに連結されていること
を特徴とする。
いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、配列番号２３の５８０番目のグルタミン酸、５８２番目のアスパラギン酸、５９２番目のアスパラギン酸、５９５番目のフェニルアラニンおよび６２４番目のグルタミンを含む。いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、配列番号２３の５６３〜６５２番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは、配列番号２３の６５３〜６７５番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、前記単離されたポリペプチドは、細胞表面発現を可能とするリーダーペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記リーダーペプチドは、配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記抗体はトラスツズマブである。いくつかの実施形態では、前記単離された核酸はプロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記単離された核酸は導入遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、抗原結合ドメイン、スペーサードメイン、膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、自己切断リンカーを有する前記ＨＥＲ２ポリペプチドをコードする前記核酸に連結されている。
いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、
配列番号２３において膜貫通ドメインに連結した５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインからなるポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、
Ｈｅｒ２のドメインIVのエピトープに結合する抗体に特異的に結合すること、および
完全長成熟ＨＥＲ２ではないことを特徴とする。
いくつかの実施形態においては、前記自己切断リンカーは、配列L E G G G E G R G S L L T C G（配列番号２６）を有するＴ２Ａリンカーである。いくつかの実施形態においては、前記キメラ抗原受容体は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記キメラ抗原受容体は、配列番号２５（ＣＤ２０ＣＡＲ）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ４ナイーブＴ細胞、ＣＤ８ナイーブＴ細胞、ＣＤ８セントラルメモリー細胞、ＣＤ４セントラルメモリー細胞およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は自己由来である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は抗原特異的である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は造血幹細胞である。
【００１６】
いくつかの実施形態においては、ポリペプチドをコードする単離された核酸を含む宿主細胞を含む組成物が提供される。
いくつかの実施形態においては、前記単離されたポリペプチドは、
配列番号２３において膜貫通ドメインに連結した５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインからなるポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、
Ｈｅｒ２のドメインIVのエピトープに結合する抗体に特異的に結合すること、および
完全長成熟ＨＥＲ２ではないこと
を特徴とする。
いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、配列番号２３の５８０番目のグルタミン酸、５８２番目のアスパラギン酸、５９２番目のアスパラギン酸、５９５番目のフェニルアラニンおよび６２４番目のグルタミンを含む。いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、配列番号２３の５６３〜６５２番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは、配列番号２３の６５３〜６７５番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、前記単離されたポリペプチドは、細胞表面発現を可能とするリーダーペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記リーダーペプチドは配列番号１７で表される配列を有する。いくつかの実施形態では、前記抗体はトラスツズマブである。
いくつかの実施形態においては、前記単離されたポリペプチドは、
配列番号２３において膜貫通ドメインに連結した５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインからなるポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、
Ｈｅｒ２のドメインIVのエピトープに結合する抗体に特異的に結合すること、
完全長成熟ＨＥＲではないこと、および
前記配列番号２３の５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインが、GGGSGGGS（配列番号４５）で示されるアミノ酸を含む配列を介して前記膜貫通ドメインに連結されていること
を特徴とする。
いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、配列番号２３の５８０番目のグルタミン酸、５８２番目のアスパラギン酸、５９２番目のアスパラギン酸、５９５番目のフェニルアラニンおよび６２４番目のグルタミンを含む。いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、配列番号２３の５６３〜６５２番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは、配列番号２３の６５３〜６７５番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、前記単離されたポリペプチドは、細胞表面発現を可能とするリーダーペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記リーダーペプチドは、配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記抗体はトラスツズマブである。いくつかの実施形態では、前記単離された核酸はプロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記単離された核酸は導入遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、抗原結合ドメイン、スペーサードメイン、膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、自己切断リンカーを有する前記ＨＥＲ２ポリペプチドをコードする前記核酸に連結されている。
いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、
配列番号２３において膜貫通ドメインに連結した５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインからなるポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、
Ｈｅｒ２のドメインIVのエピトープに結合する抗体に特異的に結合すること、および
完全長成熟ＨＥＲ２ではないことを特徴とする。
いくつかの実施形態においては、前記自己切断リンカーは、配列L E G G G E G R G S L L T C G（配列番号２６）を有するＴ２Ａリンカーである。いくつかの実施形態においては、前記キメラ抗原受容体は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記キメラ抗原受容体は、配列番号２５（ＣＤ２０ＣＡＲ）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ４ナイーブＴ細胞、ＣＤ８ナイーブＴ細胞、ＣＤ８セントラルメモリー細胞、ＣＤ４セントラルメモリー細胞およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は自己由来である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は抗原特異的である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は造血幹細胞である。
【００１７】
いくつかの実施形態においては、組成物の製造方法であって、
単離された核酸を宿主細胞に導入すること、および
少なくとも１つの増殖因子を含む培地中で前記宿主細胞を培養すること
を含む方法が提供される。
いくつかの実施形態においては、前記単離された核酸はポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態においては、前記単離されたポリペプチドは、
配列番号２３において膜貫通ドメインに連結した５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインからなるポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、
Ｈｅｒ２のドメインIVのエピトープに結合する抗体に特異的に結合すること、および
完全長成熟ＨＥＲ２ではないことを特徴とする。
いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、配列番号２３の５８０番目のグルタミン酸、５８２番目のアスパラギン酸、５９２番目のアスパラギン酸、５９５番目のフェニルアラニンおよび６２４番目のグルタミンを含む。いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、配列番号２３の５６３〜６５２番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは、配列番号２３の６５３〜６７５番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、前記単離されたポリペプチドは、細胞表面発現を可能とするリーダーペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記リーダーペプチドは配列番号１７で表される配列を有する。いくつかの実施形態では、前記抗体はトラスツズマブである。
いくつかの実施形態においては、前記単離されたポリペプチドは、
配列番号２３において膜貫通ドメインに連結した５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインからなるポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、
Ｈｅｒ２のドメインIVのエピトープに結合する抗体に特異的に結合すること、
完全長成熟ＨＥＲではないこと、および
前記配列番号２３の５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインが、GGGSGGGS（配列番号４５）で示されるアミノ酸を含む配列を介して前記膜貫通ドメインに連結されていること
を特徴とする。
いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、配列番号２３の５８０番目のグルタミン酸、５８２番目のアスパラギン酸、５９２番目のアスパラギン酸、５９５番目のフェニルアラニンおよび６２４番目のグルタミンを含む。いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、配列番号２３の５６３〜６５２番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは、配列番号２３の６５３〜６７５番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、前記単離されたポリペプチドは、細胞表面発現を可能とするリーダーペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記リーダーペプチドは、配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記抗体はトラスツズマブである。いくつかの実施形態では、前記単離された核酸はプロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記単離された核酸は導入遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、抗原結合ドメイン、スペーサードメイン、膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、自己切断リンカーを有する前記ＨＥＲ２ポリペプチドをコードする前記核酸に連結されている。
いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、
配列番号２３において膜貫通ドメインに連結した５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインからなるポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、
Ｈｅｒ２のドメインIVのエピトープに結合する抗体に特異的に結合すること、および
完全長成熟ＨＥＲ２ではないこと
を特徴とする。
いくつかの実施形態においては、前記自己切断リンカーは、配列L E G G G E G R G S L L T C G（配列番号２６）を有するＴ２Ａリンカーである。いくつかの実施形態においては、前記キメラ抗原受容体は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記キメラ抗原受容体は、配列番号２５（ＣＤ２０ＣＡＲ）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ４ナイーブＴ細胞、ＣＤ８ナイーブＴ細胞、ＣＤ８セントラルメモリー細胞、ＣＤ４セントラルメモリー細胞およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は自己由来である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は抗原特異的である。いくつかの実施形態においては、前記増殖因子は、ＩＬ−１５、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＩＬ−２およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態においては、前記方法は、前記Ｈｅｒ２ｔポリペプチドを発現している細胞を選択することをさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞は、前記培地中での培養前に選択される。いくつかの実施形態においては、前記細胞は、Ｈｅｒ２のドメインIVに結合する抗体を使用して選択する。いくつかの実施形態では、前記抗体はトラスツズマブである。いくつかの実施形態においては、前記方法は、第２の遺伝子タグに連結されたキメラ抗原受容体をコードする第２の単離された核酸を導入することをさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記方法は、前記第２の遺伝子タグを発現している細胞を選択することをさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記第２の遺伝子タグはＥＧＦＲｔを含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は造血幹細胞である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】Ｈｅｒ２ｔの概略図である。（パネルＡ）Ｈｅｒ２ｔの細胞外領域および膜貫通領域の分子モデル（中央）とＨｅｒ２の分子モデル（ＥｒｂＢ２；左）を示す。ハーセプチンのＦａｂ部分と複合体化したＨｅｒ２ｔを示す（右）。（パネルＢ）表面発現を可能にするためのＧＭＣＳＦ受容体α鎖シグナル配列（GMCSFRss）からなるリーダーペプチドを含むＨｅｒ２ｔの模式図である。残りのＨｅｒ２ｔ配列は、Ｈｅｒ２（ＥｒｂＢ２）のドメインIV（８９アミノ酸長）のエピトープおよび２３アミノ酸長の膜貫通領域からなる。（パネルＣ）Ｈｅｒ２ｔを、ＣＡＲおよびＴ２Ａの下流にインフレームでクローニングし、共発現させた。
【００１９】
【図２】Ｈｅｒ２ｔがトラスツズマブ（ハーセプチン）と協同して免疫磁気的にＨｅｒ２ｔ発現細胞を濃縮することを示す。（パネルＡ）Ｈｅｒ２発現細胞株に対するビオチン化ハーセプチンの滴定を示す。（パネルＢ）ビオチン化ハーセプチンおよび抗ビオチンマイクロビーズ（Miltenyi）を使用した選択前および選択後のＨｅｒ２ｔ形質導入Ｋ５６２細胞を示す。９５％の細胞がＨｅｒ２ｔ陽性を示すまで精製した。（パネルＣ）Ｈｅｒ２ｔのエピトープは、ハーセプチンにより特異的に認識され、市販のＨｅｒ２ｔ抗体により認識されない。（パネルＤ）市販抗体（上段）またはビオチン化ハーセプチン（下段）でのウェスタンブロット分析を示し、Ｈｅｒ２ｔ（２５ｋＤａ）とＥｒｂＢ２（２５０ｋＤａ）のｋＤａ単位でのサイズの差異を例示している。レーンは、左から右へ順に（１〜４）、分子量ラダー、Ｋ５６２親細胞（parental）、Ｋ５６２ Ｈｅｒ２ｔ、Ｋ５６２ ＥｒｂＢ２（Ｈｅｒ２）を示す。
【００２０】
【図３】セントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ）において、Ｈｅｒ２ｔは、ＥＧＦＲｔと協同して機能する効果的な選択マーカーであることを示す。（パネルＡ）２段階カラム精製スキームを使用したＰＢＭＣからのＣＤ８ Ｔｃｍの精製を示す。まず、（ＣＤ８陽性細胞を濃縮するための）ＣＤ８単離キットおよび（ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞を除去するための）ＣＤ４５ＲＡマイクロビーズを使用して、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−細胞を選択する。その後、ＣＤ６２Ｌマイクロビーズを使用してＣＤ６２Ｌ陽性細胞が選択される。（パネルＢ）CD19CAR-T2A-Her2で形質導入したＣＤ８ Ｔｃｍ、CD20CAR-T2A-EGFRtで形質導入したＣＤ８ Ｔｃｍ、またはこれら両方で形質導入したＣＤ８ Ｔｃｍを、ビオチン化ハーセプチンまたはビオチン化アービタックスと抗ビオチンマイクロビーズとを使用して選択した。CD19CAR-T2A-Her2tおよびCD20CAR-T2A-EGFRtで形質導入したＣＤ８ Ｔｃｍ（図中Both）を順次精製することにより、ＣＡＲ療法のための二重特異的Ｔ細胞を得ることができる。５番目のパネルは、２段階精製したＴｃｍ（Both）のヒストグラムである。上段のヒストグラムは、２段階精製したＴｃｍに対するハーセプチンＳＡ−ＰＥ染色（Ｈｅｒ２ｔ＋）を示し、下段のヒストグラムは、同じＴｃｍに対するアービタックスＳＡ−ＰＥ染色（ＥＧＦＲｔ＋）を示す。（パネルＣ）Ｈｅｒ２ｔまたはＥＧＦＲｔにより精製したＣＤ８ Ｔｃｍ細胞の溶解物を、ＣＤ３ζ特異的抗体を使用したウェスタンブロットで分析した結果を示す。レーンは、左から右へ順に（１〜４）、分子量ラダー、Mock形質導入、CD19CAR-T2A-Her2t形質導入、CD19CAR-T2A-EGFRt形質導入を示す。パネルＢにおいてＨｅｒ２ｔ染色した細胞ではＭＦＩは低いが、Ｈｅｒ２ｔにより精製した細胞では、ＥＧＦＲｔにより精製した細胞よりも導入遺伝子の発現レベルが高いことがバンド強度から分かる。上段のバンドはＣＤ１９ＣＡＲであり、下段のバンドは内在性ＣＤ３ζである。ＣＡＲζ鎖（上段パネル−５０ｋＤａ）と、宿主Ｔ細胞の内部ζ鎖（下段パネル−１５ｋＤａ）との強度の比較により、ＣＡＲ-Ｈｅｒ２ｔ構築物を発現させた細胞は、ＣＡＲ-ＥＧＦＲｔ構築物を発現させた細胞よりもＣＡＲの発現が約２倍高かったことが分かる。
【００２１】
【図４】Ｈｅｒ２ｔ形質導入細胞およびＨｅｒ２ｔ／ＥＧＦＲｔ形質導入細胞が、エフェクター表現型および標的特異性を維持していることを示す。（パネルＡ）Ｋ５６２標的パネルの特性評価を示す。左から右へ順に、K562親細胞（parental）、K562 CD19、K562 CD20、およびK562 CD19/CD20を示す。（Ｘ軸：CD19+；Ｙ軸：CD20+）。（パネルＢ）CD19-CAR T細胞およびCD20-CAR T細胞がＫ５６２標的パネル細胞に対して特異性を有することを示す４時間クロム放出アッセイを示す。ＣＤ８ ＴｃｍとＫ５６２標的細胞を、５０：１、２５：１、１２．５：１または６．２５：１の比率で共培養した。二重形質導入Ｔ細胞のみが、すべての抗原発現Ｋ５６２細胞を標的とすることができた。CD19CAR-T2A-Her2t CD8 TcmおよびCD19CAR-T2A-EGFRt CD8 Tcmは、類似した溶解能力を示す。（パネルＣ）２４時間サイトカイン放出アッセイを示す。ＣＤ８ ＴｃｍとＫ５６２標的細胞を、Ｔ細胞：標的細胞＝２：１の比率で２４時間共培養した後、上清中にエフェクターサイトカインが含まれるかどうかを分析した。CD19CAR-T2A-Her2t形質導入ＣＤ８ Ｔｃｍは、CD19CAR-T2A-EGFRt形質導入ＣＤ８ Ｔｃｍと比較して、エフェクターサイトカインのレパートリーが多く、これらのサイトカインの産生量も多かった。パネルＣの内訳は、パネルＡおよびパネルＢと同様である（左から右へ順に、K562親細胞（parental）、K562 CD19、K562 CD20およびK562 CD19/CD20）。ＣＤ４ Ｔｃｍについても類似した結果が認められた（データは示さず）。（パネルＤ）２４時間サイトカイン放出アッセイによる典型的な相対的サイトカイン産生量を示す。Ｈｅｒ２ｔ（CD19CAR-Her2t）により精製されたＣＤ８ Ｔｃｍは、ＣＤ１９発現Ｋ５６２とともに共培養した場合（上記参照）、CD19CAR-EGFRtよりも有意に高レベルでＩＬ−２、ＩＦＮγおよびＴＮＦαなどのエフェクターサイトカインを産生する。Studentのｔ検定はＰ＞０．０５であった。
【００２２】
【図５】遺伝子改変細胞のインビボ検出および蛍光染色のためのマーカーとしてのＨｅｒ２ｔの使用を示す。（パネルＡ）CD19CAR-T2A-Her2tまたはCD19CAR-T2A-EGFRtを発現しているＣＤ４ ＴｃｍおよびＣＤ８ Ｔｃｍ（１０７）をそれぞれNOD/scid IL-2RγCnullマウスに静脈内注射するとともに、５×１０６個のNS0-IL15細胞を皮下注射して、ヒトＩＬ−１５を全身に供給した。注射の１４日後に骨髄を採取し、細胞懸濁液をフローサイトメトリーにより分析した。（パネルＢ）３つのパネルは、生存可能細胞（リンパ球９３．６％）、単一細胞（９８．８％）、および生存細胞（９９．９％）でゲーティングした細胞を示す。（Ｂ）左から右へ（Mock、CD19CAR-T2A-Her2t Tcm、CD19CAR-T2A-EGFRt Tcm）のＣＤ８染色およびＣＤ４５染色を示す。生存可能細胞、単一細胞および生存細胞でゲーティングしたところ、少なくとも１×１０７細胞が記録された。したがって、ＣＤ４５＋細胞は細胞集団中約１％であるが、１×１０５個の細胞に相当する。残りの細胞はマウス骨髄細胞である。（パネルＣ）ヒトＣＤ４５＋細胞をビオチン化ハーセプチンまたはビオチン化アービタックスとＳＡ−ＡＰＣとで共染色した。骨髄由来のＨｅｒ２ｔ発現ＴｃｍまたはＥＧＦＲｔ発現Ｔｃｍが同定された。（パネルＤ）ポリ−Ｌ−リシンを使用して、ＴＭ−ＬＣＬ親細胞（parental）、Ｈｅｒ２（ＥｒｂＢ２）発現細胞またはＨｅｒ２ｔ発現細胞をスライドに接着させ、ビオチン化ハーセプチンおよびＳＡ−ＡＦ６４７を使用して染色した。ビオチン化ハーセプチンおよびＳＡ−ＡＦ６４７で染色すると、Ｈｅｒ２またはＨｅｒ２ｔを発現している細胞のみが染色された。
【００２３】
【図６】マルチソーティングによるＨｅｒ２ｔ陽性Ｔ細胞およびＥＧＦＲｔ陽性Ｔ細胞の精製を示す。Ｈ９細胞（５×１０６個の親細胞、Ｈｅｒ２ｔ＋細胞、ＥＧＦＲｔ＋細胞、またはＨｅｒ２ｔ＋／ＥＧＦＲｔ＋細胞）を混合し、精製を行った。まず、ビオチン化ハーセプチンおよび抗ビオチンマルチソートビーズを使用して細胞を精製した。その後、マルチソートビーズを除去した後、アービタックス−ＡＰＣおよび抗ＡＰＣマイクロビーズを使用して陽性画分を精製した。最終的に得られた陽性画分は、Ｈｅｒ２ｔおよびＥＧＦＲｔに対して二重陽性であった。
【００２４】
【図７】抗体であるハーセプチンに対する結合を増強させるため設計された、Ｈｅｒ２ｔの３種のバリアント（ＣＤ２８ヒンジ、ＩｇＧ４ヒンジまたはＨｅｒ２ｔＧ）を示す。Ｈｅｒ２ｔに新たな配列が挿入されたことを示す概略図を示す。
【００２５】
【図８】Ｈｅｒ２ｔＧによりハーセプチンへの結合が増強されたことを示す。Ｈｅｒ２ｔまたはＨｅｒ２ｔＧを有するＭＯＩ＝１のレンチウイルスでＨ９細胞に形質導入した。製造元のプロトコルに従って、形質導入細胞をビオチン化ハーセプチンおよび抗ビオチンマイクロビーズで精製した。ビオチン化ハーセプチンおよびストレプトアビジン−ＰＥを使用して、精製した細胞集団のＨｅｒ２ｔ染色またはＨｅｒ２ｔＧ染色を行った。ヒストグラムは、Ｈｅｒ２ｔＧへの結合性の方が強かったことを示す。
【００２６】
【図９】Ｈｅｒ２ｔＧがハーセプチンに対して最も強い結合能力を有することを示す。０．０５μｌ、０．１μｌ、０．２５μｌ、０．５μｌ、１μｌおよび３μｌのレンチウイルス（図中、左から右）でＨ９細胞に形質導入した後、５日後にハーセプチンに対する結合性を分析した。Ｈｅｒ２ｔのバリアントであるＨｅｒ２ｔ（ＣＤ２８ヒンジ）は、元のＨｅｒ２ｔと同様のレベルでハーセプチンに結合することができた（Ｈｅｒ２ｔ染色は示していないが、過去の実験に基づく）。Ｈｅｒ２ｔ（ＩｇＧ４ヒンジ）では、Ｈｅｒ２ｔまたはＨｅｒ２ｔ（ＣＤ２８ヒンジ）と比べて、ハーセプチンに対する結合性が増強されたのに対し、Ｈｅｒ２ｔＧのバリアントは、ハーセプチンに対して最も強い結合性を示し、形質導入Ｈ９細胞を最も強く染色した。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
用語の定義
特に記載がない限り、本明細書で使用されている技術用語および科学用語はいずれも、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解される意味を有すると見なされる。
【００２８】
本明細書において「約」は、測定値について述べる場合、所定値から±２０％または±１０％の変動を意味し、より好ましくは±５％の変動、さらにより好ましくは±１％の変動、さらにより好ましくは±０．１％の変動を意味する。
【００２９】
本明細書に記載の「抗原」または「Ａｇ」は、免疫応答を引き起こす分子を指す。この免疫応答は、抗体産生もしくは特異的な免疫担当細胞の活性化、またはこれらの両方を包含することができる。抗原が組換え技術により作製、合成および産生可能であること、または生体サンプルから得ることができることは容易に理解される。そのような生体サンプルとしては、組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞または体液（たとえば血液、血漿および腹水）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
本明細書に記載の「抗腫瘍効果」は、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移巣の減少、余命の延長、またはがん症状と関連した種々の生理学的症候の減少によって示される生物学的効果を指す。また、「抗腫瘍効果」は再発の減少または再発までの時間の延長によって示すことができる。いくつかの実施形態では、患者を治療する方法であって、有効量の組成物を投与することを含み、該組成物が細胞を含み、該組成物中の該細胞が、がん細胞上に発現される腫瘍抗原に結合する抗原結合ドメインと遺伝子タグとを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、前記組成物は抗腫瘍効果を有する。
【００３１】
本明細書に記載の「キメラ受容体」は、抗体配列または他のタンパク質配列に由来するリガンド結合ドメインを含む合成設計された受容体を指し、該リガンド結合ドメインは、上記疾患または障害に関連する分子と結合し、Ｔ細胞受容体またはその他の受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン（たとえば共刺激ドメイン）の１つ以上とスペーサードメインを介して連結されている。キメラ受容体は、人工Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、キメラ免疫受容体、およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とも呼ぶことができる。ＣＡＲは、任意の特異性を免疫受容体細胞に付与することが可能な遺伝子改変受容体である。研究者によっては、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、抗体または抗体フラグメント、スペーサー、シグナル伝達ドメインおよび膜貫通領域を含むものであるとされる。しかしながら、ＣＡＲの様々な成分すなわちドメイン（たとえばエピトープ結合領域（たとえば、抗体フラグメント、ｓｃＦｖまたはそれらの一部）、スペーサー、膜貫通ドメインおよび／またはシグナル伝達ドメインなど）は改変されており、この改変によって驚くべき効果が得られたことから、本明細書のいくつかの実施形態においてはＣＡＲの構成要素は個々に独立している。ＣＡＲが様々な特徴を有することから、たとえば、特定のエピトープに対しての結合親和性がさらに強くなることがある。
【００３２】
本明細書に記載の「共刺激ドメイン」は、たとえばＴＣＲ／ＣＤ３複合体のＣＤ３ζ鎖によって提供される一次シグナルに加えて、活性化、増殖、分化、サイトカイン分泌などの（ただしこれらに限定されない）Ｔ細胞応答を媒介するシグナルをＴ細胞に提供するシグナル伝達部分を指す。共刺激ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３などの分子全体、および／またはＣＤ８３と特異的に結合するリガンド全体、またはこれらの分子やリガンドの一部を含んでいてもよいが、これらに限定されない。いくつかの実施形態においては、共刺激ドメインは、他の細胞内メディエーターと相互作用することによって、活性化、増殖、分化、サイトカイン分泌などの細胞応答を媒介する細胞内シグナル伝達ドメインである。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、前記キメラ抗原受容体は共刺激ドメインを含む。
【００３３】
本明細書において「コードする」は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中の特定のヌクレオチド配列が、特定のアミノ酸配列などの別の巨大分子を合成する際にテンプレートとして機能する特性を指す。「コードする（coding for）」という用語は、「コードする（encoding）」という用語と同じ意味で使用することができる。したがって、ある遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳がなされた結果、細胞または他の生物系においてタンパク質が産生された場合、その遺伝子はタンパク質をコードすると言える。「ポリペプチドをコードする核酸配列」は、同じアミノ酸配列をコードするあらゆる縮重ヌクレオチド配列を包含する。
【００３４】
本明細書に記載の「細胞傷害性Ｔリンパ球」（ＣＴＬ）は、表面上にＣＤ８を発現するＴリンパ球（すなわちＣＤ８＋Ｔ細胞）を指す。いくつかの実施形態において、そのような細胞は、抗原を経験したことのある「メモリー」Ｔ細胞（ＴＭ細胞）であることが好ましい。
【００３５】
本明細書に記載の「セントラルメモリー」Ｔ細胞（または「ＴＣＭ」）は、抗原を経験したＣＴＬであり、ナイーブ細胞と比較して、その表面上にＣＤ６２ＬまたはＣＣＲ−７、およびＣＤ４５ＲＯを発現するが、ＣＤ４５ＲＡを発現していないか、ＣＤ４５ＲＡの発現が低下しているＣＴＬを指す。いくつかの実施形態において、セントラルメモリー細胞は、ナイーブ細胞と比較して、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ、および／もしくはＣＤ９５の発現が陽性であり、かつ／またはＣＤ５４ＲＡの発現が低下している。いくつかの実施形態では、抗原に特異的な宿主細胞が提供される。いくつかの実施形態では、前記細胞はセントラルメモリーＴ細胞である。
【００３６】
本明細書に記載の「エフェクターメモリー」Ｔ細胞（または「ＴＥＭ」）は、抗原を経験したＴ細胞であり、セントラルメモリー細胞と比較して、その表面上にＣＤ６２Ｌを発現していないか、ＣＤ６２Ｌの発現が低下しており、ナイーブ細胞と比較して、ＣＤ４５ＲＡを発現していないか、ＣＤ４５ＲＡの発現が低下しているＴ細胞を指す。いくつかの実施形態において、エフェクターメモリー細胞は、ナイーブ細胞またはセントラルメモリー細胞と比較して、ＣＤ６２ＬおよびＣＣＲ７の発現が陰性であり、ＣＤ２８およびＣＤ４５ＲＡの発現が陽性あるいは陰性である。いくつかの実施形態では、抗原に特異的な宿主細胞が提供される。いくつかの実施形態では、前記細胞はエフェクターメモリーＴ細胞である。
【００３７】
本明細書に記載の「ナイーブ」Ｔ細胞は、抗原を経験していないＴリンパ球であり、セントラルメモリー細胞またはエフェクターメモリー細胞と比較して、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＡを発現しており、ＣＤ４５ＲＯを発現していないＴリンパ球を指す。いくつかの実施形態において、ナイーブＣＤ８＋Ｔリンパ球は、ナイーブＴ細胞の表現型マーカーの発現によって特徴付けられ、ナイーブＴ細胞の表現型マーカーとしては、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ１２７、および／またはＣＤ４５ＲＡが挙げられる。いくつかの実施形態では、抗原に特異的な宿主細胞が提供される。いくつかの実施形態では、前記細胞はナイーブＴ細胞である。
【００３８】
本明細書に記載の「エフェクター」Ｔ細胞または「ＴＥ」Ｔ細胞は、抗原を経験した細胞傷害性Ｔリンパ球であり、セントラルメモリー細胞またはナイーブＴ細胞と比較して、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、および／もしくはＣＤ２８を発現していないか、またはＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、および／もしくはＣＤ２８の発現が低下しており、かつグランザイムＢ陽性および／またはパーフォリンに陽性であるＴリンパ球を指す。いくつかの実施形態では、抗原に特異的な宿主細胞が提供される。いくつかの実施形態では、前記細胞はエフェクターＴ細胞である。
【００３９】
本明細書に記載の「Ｔ細胞前駆細胞」は、胸腺へと遊走して、Ｔ細胞前駆細胞となり得るリンパ球前駆細胞を指し、Ｔ細胞前駆細胞はＴ細胞受容体を発現しない。すべてのＴ細胞は、骨髄中の造血幹細胞に由来する。造血幹細胞由来の造血前駆細胞（リンパ球系前駆細胞）は胸腺に移行し、細胞分裂により増殖し、未熟な胸腺細胞の大集団を作り出す。最も初期の胸腺細胞はＣＤ４もＣＤ８も発現せず、したがって、ダブルネガティブ（ＣＤ４−ＣＤ８−）細胞に分類される。これらは成長により発達し、ダブルポジティブ胸腺細胞（ＣＤ４＋ＣＤ８＋）となり、最終的にシングルポジティブ（ＣＤ４＋ＣＤ８−またはＣＤ４−ＣＤ８＋）胸腺細胞に成熟して、その後、胸腺から末梢組織に放出される。
【００４０】
胸腺細胞の約９８％は、胸腺での発達過程においてポジティブ選択およびネガティブ選択により選抜されずに死滅し、残りの２％が生存して胸腺を去り、成熟した免疫担当Ｔ細胞になる。
【００４１】
Ｔ細胞前駆細胞は、ダブルネガティブ（ＤＮ）段階においては主に機能的β鎖を産生し、ダブルポジティブ（ＤＰ）段階では主に機能的α鎖を産生し、その結果、最終的に機能性αβ Ｔ細胞受容体を産生する。４つのＤＮ段階（ＤＮ１、ＤＮ２、ＤＮ３およびＤＮ４）を経て胸腺細胞が発達するに従って、Ｔ細胞はインバリアントα鎖を発現するが、β鎖の遺伝子は再編成される。再編成されたβ鎖がインバリアントα鎖と対を為すことに成功した場合、β鎖の再編成を止めるシグナルが産生され（さらに、もう一方のアレルが抑制され）、細胞の増殖が起こる。これらのシグナルが産生されるには、この前駆ＴＣＲが細胞表面上に発現されていなければならないが、これらのシグナル自体は前駆ＴＣＲに結合するリガンドに依存する。このように発達した胸腺細胞はその後、ＣＤ４およびＣＤ８の両方を発現し、α鎖が選択されるダブルポジティブ（ＤＰ）段階を経る。再編成β鎖がシグナル伝達を全くもたらさない場合（たとえば、インバリアントα鎖との対合ができなかった結果）、この細胞は無視され（シグナル伝達を受けることなく）、死滅すると考えられている。
【００４２】
本明細書に記載の「造血幹細胞」または「ＨＳＣ」は、骨髄系細胞に分化しうる前駆細胞であり、該骨髄系細胞としては、たとえば、マクロファージ、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞およびリンパ系細胞（たとえば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞など）が挙げられる。ＨＳＣは３種の幹細胞が存在する異種細胞集団であり、これらの幹細胞は血液中のリンパ系子孫細胞と骨髄系子孫細胞との比（Ｌ／Ｍ）により識別される。
【００４３】
本明細書において、混合物中の特定の細胞種の量について述べる際に使用される「濃縮された」および「除去された」という用語は、細胞の混合物中において「濃縮された」細胞種の数を増加させる方法もしくは工程で細胞混合物を処理すること、または細胞の混合物中の「除去された」細胞の数を低減させる方法もしくは工程で細胞混合物を処理することを指す。したがって、濃縮工程に付された細胞の由来に応じて、混合物または組成物において、「濃縮された」細胞は（細胞数で）全体の６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％以上、またはこれらの値のいずれかにより示される２つのエンドポイントの間の任意の整数値で表されるパーセンテージを占めていてもよく、かつ「除去された」細胞は（細胞数で）全体の４０％、３０％、２０％、１０％、５％もしくは１％以下、またはこれらの値のいずれかにより示される２つのエンドポイントの間の任意の整数値で表されるパーセンテージを占めていてもよい。
【００４４】
本明細書に記載の「エピトープ」は、抗体、Ｔ細胞および／またはＢ細胞を含む免疫系によって認識される抗原または分子の一部を指す。エピトープは、通常、少なくとも７つのアミノ酸を有し、線状であっても高次構造を有していてもよい。
【００４５】
「Ｈｅｒ２」すなわち「ＥｒｂＢ２」は、リガンドに結合するために共受容体を必要とする膜結合型プロテインキナーゼ受容体を意味する。Ｈｅｒ２の典型的な参照ポリペプチド配列は、UniprotレコードP04626および配列番号２３（表８）に記載されている。表８に示すように、完全長の参照配列は１２５５アミノ酸長であり、１〜２２番目のアミノ酸からなるシグナル配列、２３〜６５２番目のアミノ酸からなる細胞外ドメイン、６５３〜６７５番目のアミノ酸からなる膜貫通ドメイン、および６７６〜１２５５番目のアミノ酸からなる細胞内ドメインを含む。完全長成熟ポリペプチドにはリーダー配列が含まれないため、完全長成熟ポリペプチド配列は１２３３アミノ酸長である。天然のバリアントおよび天然のアイソフォームが数多く知られている。参照核酸配列は、Genbank X03363/gI 31197に記載されている。前記細胞外ドメインは、４つの領域を有し、すなわち、配列番号２３の２３〜２１７番目のアミノ酸からなるドメインＩ；２１８〜３４１番目のアミノ酸からなるドメインII；３４２〜５１０番目のアミノ酸からなるドメインIII；および５１１〜５６２番目のアミノ酸からなるドメインIVを有する。
【００４６】
「Ｈｅｒ２ｔ」は、Ｈｅｒ２配列のフラグメントを意味し、導入遺伝子発現の遺伝子タグとして有用である。いくつかの実施形態において、Ｈｅｒ２ｔは、Ｈｅｒ２の細胞外ドメインであるドメインIVを含み、完全長Ｈｅｒ２は含まない。いくつかの実施形態において、Ｈｅｒ２ｔは、Ｈｅｒ２のドメインIVに特異的な抗体に特異的に結合する。他の実施形態において、Ｈｅｒ２ｔは、配列番号２３の５１１〜５６２番目または５６３〜６５２番目のアミノ酸を含む。
【００４７】
「単離された」という用語は、本明細書において開示される種々のポリペプチドについて述べる際に使用され、ポリペプチドまたは核酸が本来存在する環境にある他の成分から同定、分離かつ／または回収されたポリペプチドまたは核酸を意味する。単離されたポリペプチドまたは核酸は、これらが本来関連する他の成分を全く含まないことが好ましい。単離されたポリペプチドまたは核酸が本来存在する環境にある不純物としては、典型的には、該ポリペプチドまたは核酸の診断用途または治療用途を妨害するような物質であり、たとえば、酵素、ホルモンおよび他のタンパク性の溶質または非タンパク性の溶質が挙げられる。
【００４８】
本明細書に記載の「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、リンパ球を活性化する分子（ここでは、キメラ受容体分子）の１つ以上のドメイン全体またはその一部を指す。そのような分子の細胞内ドメインは、細胞メディエーターと相互作用することによってシグナルを媒介し、増殖、分化、活性化、およびその他のエフェクター機能をもたらす。いくつかの実施形態において、そのような分子として、ＣＤ２８、ＣＤ３、および／もしくは４−１ＢＢの全体もしくはその一部、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
【００４９】
本明細書に記載の「リガンド」は、別の物質と特異的に結合して複合体を形成する物質を指す。リガンドとしては、抗原上のエピトープ、受容体に結合する分子、基質、阻害物質、ホルモン、および活性化物質が挙げられる。本明細書に記載の「リガンド結合ドメイン」は、リガンドに結合する物質またはその一部を指す。リガンド結合ドメインとしては、抗体の抗原結合部分、受容体の細胞外ドメイン、および酵素の活性部位が挙げられる。
【００５０】
本明細書に記載の「作動可能に連結される」は、制御配列と異種核酸配列との間の機能的な連結を指し、これは該異種核酸配列の発現をもたらす。たとえば、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的に関係して配置されている場合、該第１の核酸配列は該第２の核酸配列と作動可能に連結されていると言える。たとえば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、該プロモーターは該コード配列に作動可能に連結されていると言える。通常、作動可能に連結されるＤＮＡ配列は連続しており、２つのタンパク質コード領域の連結が必要とされる場合、これらは同じリーディングフレーム内に存在する。
【００５１】
本明細書に記載の遺伝子タグポリペプチド配列における「アミノ酸配列同一性（％）」は、参照配列中のアミノ酸残基と一致している候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。このアミノ酸配列同一性は、配列同一性（％）の最大値を算出するため、必要に応じて配列をアラインしてギャップを挿入した後に算出され、保存的置換を配列同一性としては考慮しない。アミノ酸配列同一性（％）を決定するためのアラインメントは、当技術分野の範囲にある種々の方法で行うことができ、たとえば、一般公開されているコンピュータソフトウェア、たとえばBLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2、またはMegalign（DNASTAR）ソフトウェアを用いて実施することができる。当業者であれば、アラインメントを測定するのに適切なパラメータを決定することができ、このようなパラメータとしては、比較される複数の配列の全長にわたってアラインメントを最大とするのに必要な任意のアルゴリズムが挙げられる。たとえば、WU-BLAST-2コンピュータープログラム［Altschul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996)］を用いてアミノ酸配列同一性（％）を算出するには、いくつかの検索パラメータを用いるが、それらのほとんどはデフォルト値に設定されている。デフォルト値に設定されないパラメータ（すなわち調整可能なパラメータ）は、overlap span=1, overlap fraction=0.125, word threshold (T) =11およびscoring matrix=BLOSUM62と設定される。アミノ酸配列同一性（％）は、（ａ）ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２によって決定された、配列番号２３の５６３〜６５２番目のアミノ酸または配列番号１５に記載の参照Ｈｅｒ２配列のポリペプチドアミノ酸配列すべてまたは各配列と、目的の比較アミノ酸配列との間で一致したアミノ酸残基の数を、（ｂ）目的のポリペプチドのアミノ酸残基の総数で割ることによって決定される。
【００５２】
本明細書に記載の「遺伝子タグのバリアントのポリヌクレオチド」は、以下に定義されるように、配列番号１５に示したポリヌクレオチド配列、そのヌクレオチド、またはこれらに由来する特定のフラグメントと少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有する、ポリペプチドをコードする核酸分子を指す。通常、ポリヌクレオチドのバリアントまたはそのフラグメントは配列番号１４に示した核酸配列またはそれに由来するフラグメントと少なくとも約８０％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９９％の核酸配列同一性、またはこれらの核酸配列同一性（％）の値のいずれか２つの間の任意の核酸配列同一性（％）を有する。バリアントは、自体が由来するヌクレオチド配列を包含しない。これは、遺伝コードの縮重によるものであり、当業者であれば、配列番号１８のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列または配列番号１４のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有する様々なキメラ受容体バリアントのポリヌクレオチドを容易に認識するであろう。
【００５３】
「実質的に精製された」は、目的の分子以外の他の分子や他の細胞が全体の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％以下、またはこれらの精製率（％）の値のいずれか２つの間の任意の値しか占めていないことを指す。また、「実質的に精製された細胞」は、天然の状態において通常関連する他の細胞種から分離された細胞を指す。場合によっては、実質的に精製された細胞の集団は、均質な細胞集団を指すこともある。
【００５４】
正常細胞上の腫瘍抗原または他の分子の存在に関して述べる際に使用される「実質的に存在しない」という用語は、腫瘍抗原または他の分子を有する正常細胞のパーセンテージおよび／または正常細胞上の腫瘍抗原の密度を指す。いくつかの実施形態において、「実質的に存在しない」は、腫瘍細胞または他の疾患細胞に存在する細胞の数または抗原の量と比較して、腫瘍抗原または他の分子が正常細胞の５０％未満に存在し、かつ／または正常細胞上の腫瘍抗原の密度が５０％未満であることを意味する。
【００５５】
本明細書に記載の「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」は、どのような哺乳動物から得られたものであってもよく、霊長類から得られたものであることが好ましく、該哺乳動物としては、サル、イヌおよびヒトが挙げられる。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞はレシピエント対象と同種異系（同種であるが異なるドナーに由来するもの）である。いくつかの実施形態においては、Ｔ細胞は自己由来である（ドナーとレシピエントは同じである）。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は同質遺伝子型である（ドナーとレシピエントは異なるが、一卵性双生児である）。
【００５６】
「ベクター」または「構築物」は、様々な制御要素を有する細胞中に異種核酸を導入するために使用される核酸であり、この導入によって該異種核酸が発現される。ベクターとしては、プラスミド、ミニサークル（minicircle）、酵母、およびウイルスゲノムが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
本発明の開示によって、導入遺伝子を発現している細胞のための選択マーカーおよび／または同定マーカーを提供することに有用な遺伝子タグポリペプチドまたはそのバリアントおよび該遺伝子タグをコードする核酸が提供される。
【００５８】
導入遺伝子の遺伝子タグ、ポリペプチドおよびバリアント
本開示の一態様は、細胞における導入遺伝子の安定な発現を可能とする、導入遺伝子の発現のための遺伝子タグを提供する。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子タグを使用することによって、内在性遺伝子と同等のレベルで導入遺伝子を発現している形質導入細胞の選択が可能となる。いくつかの実施形態においては、前記遺伝子タグは、細胞表面に発現され、免疫原性が低減されており、ベクター内の遺伝子ペイロードを増やすことが実質的になく、かつ／または様々な細胞における導入遺伝子の発現を可能にする。
【００５９】
いくつかの実施形態において、前記遺伝子タグは、抗Ｈｅｒ２抗体により認識されるエピトープを少なくとも含む、Ｈｅｒ２のフラグメントであり、このフラグメントをＨｅｒ２ｔと呼ぶ。いくつかの実施形態において、前記抗体は、Ｈｅｒ２のドメインIVに特異的に結合する。別の実施形態において、前記抗体は、Ｈｅｒ２のドメインIVに特異的に結合するが、Ｈｅｒ２のドメインＩ、II、および／またはIIIのエピトープには結合しない。いくつかの実施形態において、前記抗Ｈｅｒ２抗体は、がんの治療に有用な治療抗体である。いくつかの実施形態において、前記エピトープはトラスツズマブ（ハーセプチン）により認識される。いくつかの実施形態において、前記エピトープは、トラスツズマブにより認識され、かつ／またはトラスツズマブと結合に対して競合するが、その他の抗Ｈｅｒ２抗体（たとえば、Ｈｅｒ２のドメインＩ、II、および／またはIII中のエピトープに結合する抗体）とは競合しない抗体により認識される。
【００６０】
特定の実施形態において、前記エピトープは、ハーセプチンのＦａｂ部分と複合体化したＨｅｒ２の結晶構造（Cho et al., Nature (2003) 421:756）により決定されるアミノ酸を含む。Ｈｅｒ２とハーセプチンの相互作用は、ドメインIVの３つのループ領域（２つの静電領域と１つの疎水性領域）で起こる。ハーセプチンと相互作用するＨｅｒ２の重要なアミノ酸としては、５８０〜５８４番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列EADQC（５８０番目のＧｌｕおよび５８２番目のＡｓｐを含む）（配列番号４２）を含むループ１（静電領域）、５９２〜５９５番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列DPPF（５９２番目のＡｓｐおよび５９５番目のＰｈｅを含む）（配列番号４３）を含むループ２（疎水性領域）、ならびに６１６〜６２５番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列FPDEEGACQP（６２４番目のＧｌｎを含む）（配列番号４４）を含むループ３（静電気的）が挙げられる（アミノ酸のナンバリングは、シグナル伝達配列を含む配列番号２３の完全長ＥｒｂＢ２（Ｈｅｒ２）配列に基づき、この配列を表８に示す）。シグナル配列から２２個のアミノ酸を除いたＣｈｏらによるナンバリングシステムに基づくと、ハーセプチンと相互作用するＨｅｒ２のアミノ酸としては、ループ１の５５８番目のＧｌｕおよび５６０番目のＡｓｐ、ループ２の５７０番目のＡｓｐおよび５７３番目のＰｈｅ、ならびにループ３の６０２番目のＧｌｎが挙げられる。いくつかの実施形態において、Ｈｅｒ２のフラグメントは、少なくともこれらのアミノ酸残基を含み、さらに、細胞表面上に発現された場合に、トラスツズマブと結合するＨｅｒ２のフラグメント、またはトラスツズマブと競合する抗体と結合に対して結合するＨｅｒ２のフラグメントが選択される。本開示の範囲を限定することを意図するものではないが、５６３〜６５２番目のアミノ酸を少なくとも含むＨｅｒ２ｔフラグメントは、トラスツズマブに結合することができるエピトープを含むと考えられる。これは、５７８〜６５２番目のアミノ酸を含む、上記エピトープよりも小さいエピトープは、トラスツズマブに結合しなかったためである。いくつかの実施形態において、前記Ｈｅｒ２ｔフラグメントは、Ｈｅｒ２ｔの５６３〜６５２番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、Ｈｅｒ２ｔフラグメントは、Ｈｅｒ２ｔの５８０〜５８４番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列、Ｈｅｒ２ｔの５９２〜５９５番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列、およびＨｅｒ２ｔの６１６〜６２５番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含む。
【００６１】
特定の実施形態において、Ｈｅｒ２のフラグメントは、表６（配列番号１８）に示すように、５１１〜６５２番目（ドメインIV）または５６３〜６５２番目のアミノ酸を含むか、実質的にこれらのアミノ酸からなるか、またはこれらのアミノ酸からなる。いくつかの実施形態において、Ｈｅｒ２フラグメントのバリアントは、細胞表面に発現されてトラスツズマブに結合する場合、配列番号１８の配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性、またはこれらのパーセンテージのいずれか２つにより定義される範囲にある配列同一性（％）を有する。いくつかの実施形態において、前記フラグメントのバリアントは、少なくとも９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、または１個のアミノ酸置換を有し、この置換は保存的アミノ酸置換であることが好ましい。このような置換は、ハーセプチンのＦａｂ部分と複合体化したＨｅｒ２の結晶構造（Cho et al., Nature (2003)）から特定することができる。いくつかの実施形態において、前記フラグメントのバリアントは、本明細書に記載されているような、トラスツズマブとの結合に関与する残基においてアミノ酸置換を含んでいない。いくつかの実施形態において、前記フラグメントは、Ｈｅｒ２のドメインIVに含まれる残基を含んでいるが、ドメインＩ、ドメインII、ドメインIII、および／または細胞内ドメインなどの、Ｈｅｒ２の１つ以上のその他のドメインを含んでいない。
【００６２】
いくつかの実施形態において、前記遺伝子タグは、免疫応答をほとんど起こさないか、免疫応答を全く起こさない。いくつかの実施形態において、内在性タンパク質であれば対象において忍容性が得られることから、前記遺伝子タグは内在性タンパク質から選択される。いくつかの実施形態において、前記遺伝子タグは、抗原エピトープを予測するためのソフトウェアを用いて解析され、このようなソフトウェアとしては、ＭＨＣ−Ｉ抗原性ペプチドを処理することが可能な予測アルゴリズムなどが挙げられる。MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPCHPECQPQNGSVT（配列番号１６）で表される配列を解析することによって、抗原決定基を決定する。いくつかの実施形態において、人工の導入遺伝子構築物または合成導入遺伝子構築物中に組み込むため、生殖細胞系配列に由来した遺伝子タグの核酸配列、および／または生殖細胞系配列から改変した遺伝子タグの核酸配列を使用する。
【００６３】
いくつかの実施形態において、前記遺伝子タグは、膜貫通ドメインをさらに含む。該膜貫通ドメインは、天然由来であってもよく、合成由来であってもよい。天然由来である場合、前記膜貫通ドメインは、膜結合型タンパク質であっても膜貫通型タンパク質であってもよく、これらのタンパク質はどのようなものであってもよい。膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のα鎖、β鎖もしくはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７および／またはＣＤ１５４の膜貫通領域を少なくとも含む。特定の実施形態において、前記膜貫通ドメインは、表６に示すＨｅｒ２の膜貫通ドメインのアミノ酸（たとえば、６５３〜６７５番目のアミノ酸（配列番号２０））を含む。Ｈｅｒ２の膜貫通ドメインをコードする典型的なポリヌクレオチド配列（配列番号１９）を表６に示す。
【００６４】
いくつかの実施形態において、合成膜貫通ドメインまたは膜貫通ドメインのバリアントは、主に疎水性残基、たとえば、ロイシンおよびバリンを含む。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、表６に示す膜貫通ドメインと、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは１００％のアミノ酸配列同一性、またはこれらのパーセンテージのいずれか２つにより定義される範囲にある配列同一性（％）を有してもいてもよい。膜貫通ドメインのバリアントは、Kyte Doolittle法により算出された疎水性スコアが少なくとも５０であることが好ましい。
【００６５】
いくつかの実施形態において、遺伝子タグは、自体の表面発現を増強するペプチドを含む。このようなペプチドとしては、たとえば、顆粒球・マクロファージ刺激因子のシグナル配列、内在性Ｈｅｒ２のリーダーペプチド（１〜２２番目のアミノ酸）、Ｉ型シグナルペプチド、ＩｇＧκのシグナルペプチド、および／またはＣＤ８のリーダー配列が挙げられる。いくつかの実施形態において、リーダー配列は、配列番号１７の配列を有する。
【００６６】
特定の実施形態において、遺伝子タグは、トラスツズマブに結合するＨｅｒ２のフラグメント、および配列番号２０により例示されるような膜貫通ドメインを含む。別の特定の実施形態では、遺伝子タグは、表面発現を増強するペプチド、トラスツズマブに結合するＨｅｒ２のフラグメント、および配列番号１５により例示されるような膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子タグのバリアントは、細胞表面に発現されてトラスツズマブに結合する場合、配列番号１６または配列番号２０の配列と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性、またはこれらのパーセンテージのいずれか２つにより定義される範囲にある配列同一性（％）を有する。いくつかの実施形態において、前記フラグメントのバリアントは、少なくとも９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、または１個のアミノ酸置換を有し、この置換は保存的アミノ酸置換であることが好ましい。いくつかの実施形態において、前記フラグメントのバリアントは、トラスツズマブとの結合に関与する残基においてアミノ酸置換を含んでいない。
【００６７】
リンカー配列は、前記遺伝子タグ配列よりも上流に位置していてもよく、かつ／または該遺伝子タグのための１つ以上の機能性ドメイン（たとえば、表面発現を増強するペプチド、遺伝子タグ、膜貫通ドメイン）を隔てて存在していてもよい。リンカー配列は切断可能であってもよく、たとえば、Ｔ２Ａ配列（表１に示す）であってもＩＲＥＳ配列であってもよい。切断可能なリンカー配列は通常、核酸構築物において前記遺伝子タグ配列よりも上流に位置する。その他のリンカー配列としては、通常、約２〜１５アミノ酸長の短いペプチドが挙げられ、この短いペプチドは、前記遺伝子タグのための複数の機能性ドメイン（たとえば、表面発現を増強するペプチド、遺伝子タグ、および膜貫通ドメインなど）を隔てて存在している。いくつかの実施形態において、前記リンカーは、２アミノ酸長、３アミノ酸長、４アミノ酸長、５アミノ酸長、６アミノ酸長、７アミノ酸長、８アミノ酸長、９アミノ酸長、１０アミノ酸長、１１アミノ酸長、１２アミノ酸長、１３アミノ酸長、１４アミノ酸長または１５アミノ酸長であり、前記遺伝子タグのための複数の機能性ドメイン（たとえば、表面発現を増強するペプチド、遺伝子タグ、および膜貫通ドメインなど）を隔てて存在している。いくつかの実施形態において、前記リンカーは切断可能なリンカーである。いくつかの実施形態において、前記リンカーは切断可能なＴ２Ａ配列である。いくつかの実施形態において、前記リンカーはＩＲＥＳ配列を含む。
【００６８】
いくつかの実施形態において、前記システムは１つ以上のさらなる遺伝子タグをさらに含む。一実施形態において、該さらなる遺伝子タグ配列は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）配列のフラグメントである。このような配列の例を表７に示す。通常、遺伝子タグ配列は、形質導入細胞の選択および／または検出を可能にする機能特性を有する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子タグ配列は、ヒトリンパ球の形質導入に適合している。
【００６９】
別の実施形態において、さらなる遺伝子タグは、ポジティブ選択マーカーである。ポジティブ選択可能な遺伝子タグは遺伝子であってもよく、これは、宿主細胞に導入されると、該遺伝子を持つ細胞のポジティブ選択を可能にする表現型を優位に発現する。このような遺伝子は当技術分野において公知であり、具体的には、ハイグロマイシンＢに対する耐性を与えるハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｈ）、抗生物質であるＧ４１８に対する耐性をコードするＴｎ５由来のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏまたはａｐｈ）、メトトレキサートに対する耐性を与えるジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子、ＤＨＦＲ ｄｍ、ピューロマイシンに対する耐性を与えるｐａｃ遺伝子、ゼオシンを不活化するＳｈ ｂｌｅ遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子（ＡＤＡ）、および多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子などが挙げられる。これらの薬剤の存在下で培養されて生き残った形質導入細胞が選択されることになる。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は造血幹細胞である。
【００７０】
一実施形態において、第１の核酸は、遺伝子タグ配列をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子タグ配列は、Ｈｅｒ２ｔ配列である。Ｈｅｒ２ｔの典型的なポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を表６に示し、これらはそれぞれ配列番号１４および配列番号１５で示される。一実施形態において、前記遺伝子タグ配列は、表７に示す上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）のフラグメントである。末端切断型上皮成長因子受容体の典型的なポリヌクレオチド配列は、配列番号２２である。
【００７１】
遺伝子タグをコードするポリヌクレオチドは、アミノ酸配列に基づいて合成法または組換え法により容易に作製することができる。いくつかの実施形態においては、遺伝子タグ配列をコードするポリヌクレオチドは、リンカー配列をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、遺伝子タグ配列をコードする前記ポリヌクレオチドは、該コード配列の５’末端および／または３’末端に１つ以上の制限酵素部位をさらに有していてもよく、これによって、タグ配列をコードするポリヌクレオチドを切断して、別の遺伝子タグ配列をコードする別のポリヌクレオチドと置換することが容易となる。いくつかの実施形態において、マーカー配列をコードする前記ポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞における発現、好ましくはヒト細胞における発現を目的としてコドン最適化されている。
【００７２】
いくつかの実施形態において、２つ以上の遺伝子タグ配列を用いることができる。いくつかの実施形態において、第１の遺伝子タグ配列は、第１のキメラ抗原受容体に作動可能に連結され、該第１のＣＡＲが形質導入細胞において発現されていることの指標となる。別の実施形態において、第２の遺伝子タグ配列は、第１のＣＡＲとは異なる第２のＣＡＲに作動可能に連結され、該第２のＣＡＲが形質導入細胞において発現されていることの指標となる。
【００７３】
核酸およびベクター
本開示の別の態様は、本明細書に記載の遺伝子タグをコードする核酸構築物およびそのバリアントを含む。
【００７４】
いくつかの実施形態において、核酸は、Ｈｅｒ２のフラグメントまたはそのバリアントのアミノ酸配列をコードする。特定の一実施形態において、核酸は、配列番号１８のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。特定の一実施形態において、核酸は、配列番号１５のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。一実施形態において、前記遺伝子タグ配列は、表７に示す上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）のフラグメントである。末端切断型上皮成長因子受容体の典型的なポリヌクレオチド配列は、配列番号２１である。核酸は、ヒトにおける発現を目的としてコドン最適化された核酸配列、縮重配列、およびバリアント配列を含む。
【００７５】
ベクター
いくつかの実施形態において、ベクターは、遺伝子タグをコードする核酸を含む。遺伝子タグをコードする核酸は、独立した構築物としてベクター内にパッケージングされていてもよく、導入遺伝子をコードする核酸に連結されていてもよい。いくつかの実施形態において、遺伝子タグをコードする核酸は、独立した構築物としてベクター内にパッケージングされるか、あるいは導入遺伝子をコードする核酸に連結される。
【００７６】
形質導入および導入遺伝子の発現を効率的に実施することが可能な様々なベクターの組み合わせを構築することができる。いくつかの実施形態において、前記ベクターはデュアルパッケージウイルスベクターまたは単一の（オールインワン）ウイルスベクターである。別の実施形態においては、前記ベクターとして、ウイルスベクターとプラスミドベクターの組み合わせが挙げられる。別のウイルスベクターとしては、フォーミーウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、およびレンチウイルスベクターが挙げられる。一実施形態において、前記ベクターは、レンチウイルスベクターである。
【００７７】
いくつかの実施形態において、プラスミドベクターまたはウイルスベクターは、遺伝子タグをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子タグは、Ｈｅｒ２ｔをコードするポリヌクレオチドを含み、プロモーター、表面発現を増強するペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／または膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。特定の実施形態において、前記第１の核酸は、プロモーターに作動可能に連結された配列番号１８、配列番号２０もしくは配列番号１５の配列またはそのバリアントを有するポリペプチドをコードする。
【００７８】
いくつかの実施形態において、プラスミドまたはウイルスベクターは、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含み、このキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドは、遺伝子タグをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態においては、前記キメラ抗原受容体は、ＣＤ１９またはＣＤ２０を標的とし、前記遺伝子タグは、Ｈｅｒ２ｔフラグメントを含む。いくつかの実施形態においては、前記ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、自己切断リンカーを介して前記遺伝子タグに作動可能に連結されている。別の実施形態においては、プラスミドまたはウイルスベクターは、ＣＤ１９キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含み、該ＣＤ１９キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドは、Ｈｅｒ２ｔまたはＥＧＦＲｔをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。別の実施形態においては、プラスミドまたはウイルスベクターは、ＣＤ２０キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含み、該ＣＤ２０キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドは、Ｈｅｒ２ｔまたはＥＧＦＲｔをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。
【００７９】
前記核酸の各構成要素は、リンカー配列を介して、好ましくは、Ｔ２Ａ自己切断配列などの自己切断リンカーを介して、互いに隔てられている。
【００８０】
別の実施形態において、外来性（前記ベクター、たとえばレンチウイルスベクターにとって外来性）の核酸配列は、ベクター中にパッケージされうる他の遺伝子成分の量によって制限される。いくつかの実施形態においては、構築物は、前記ウイルスベクターにとって外来性の遺伝子を少なくとも２つ含有する。いくつかの実施形態においては、前記構築物に含まれる、前記ウイルスベクターにとって外来性の遺伝子は４つ以下である。前記ウイルスベクター中にパッケージすることが可能な、該ベクターにとって外来性の遺伝子の数は、１つ以上の導入遺伝子の発現を検出すること、および細胞の少なくとも１０％に形質導入することが可能であり、かつ／または細胞の少なくとも１０％において該導入遺伝子の発現が検出可能なベクター構築物を選択することによって決定することができる。
【００８１】
いくつかの実施形態において、レンチウイルスはデュアルパッケージされたウイルスである。デュアルパッケージされたウイルスは、キメラ抗原受容体および第１の遺伝子タグをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を少なくとも１つ含む。該核酸は、サイトカインおよび／またはケモカイン受容体をコードするポリヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。デュアルパッケージされたウイルスは、キメラ抗原受容体および第２の遺伝子タグをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を少なくとも１つ含む。該核酸は、サイトカインおよび／またはケモカイン受容体をコードするポリヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。２つの構築物を含むシステムのいくつかの実施形態においては、それぞれの構築物は、別々のウイルスベクターにパッケージされおり、該ウイルスベクターを混合して使用することによって細胞集団に形質導入することができる。いくつかの実施形態においては、前記第１の遺伝子タグと前記第２の遺伝子タグは異なるものである。
【００８２】
いくつかの実施形態においては、前記デュアルパッケージされたウイルスは、単一の細胞における少なくとも２種の導入遺伝子（たとえば、ＣＡＲ構築物）の発現を可能とする。複数の異なる遺伝子タグを使用することによって、２種の形質が導入された細胞を選択することが可能となる。特定の一実施形態においては、プラスミドまたはウイルスベクターは、ＣＤ１９キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含み、該ＣＤ１９キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドは、Ｈｅｒ２ｔをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。別の実施形態においては、前記プラスミドまたはウイルスベクターは、ＣＤ２０キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含み、該ＣＤ２０キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドは、ＥＧＦＲｔをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。
【００８３】
いくつかの実施形態において、前記ベクターはミニサークル（minicircle）である。ミニサークルは、細菌プラスミドのＤＮＡ骨格を含んでいない環状の発現カセットとして作製されたエピソーマルＤＮＡベクターである。ミニサークルの分子サイズは小さいためより効率的な形質移入が可能になり、また、数日間しか機能しない標準的なプラスミドベクターに比べて、数週間にわたる持続発現が可能となる。いくつかの実施形態において、ミニサークルは、遺伝子タグに作動可能に連結されたキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドに連結されたプロモーターを含む。１つ以上のミニサークルを使用することができる。いくつかの実施形態において、ミニサークルは、キメラ抗原受容体および第１の遺伝子タグをコードするポリヌクレオチドに連結されたプロモーターを含み、別のミニサークルは、キメラ抗原受容体および第２の別の遺伝子タグをコードするポリヌクレオチドに連結されたプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、前記構築物それぞれの各構成要素は、自己切断Ｔ２Ａ配列をコードする核酸などの核酸を介して隔てられている。いくつかの実施形態においては、それぞれのミニサークルに含まれるキメラ抗原受容体が互いに異なっており、たとえば、スペーサーの長さおよびスペーサーの配列、細胞内シグナル伝達ドメイン、ならびに／または遺伝子タグ配列が異なっている（ただし、これらに限定されない）。
【００８４】
いくつかの実施形態において、前記ベクターは、PiggyBacトランスポゾンである。PiggyBac（PB）トランスポゾンは、「カット＆ペースト」機構を介してベクターと染色体との間を効率的に移動する転移性遺伝因子である。転移に際して、PBトランスポゼースは、トランスポゾンベクターの両末端に存在するトランスポゾン特異性逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を認識し、ＩＴＲに挟まれた配列を元の部位から効率的に移動させて、これをＴＴＡＡ染色体部位に効率的に組み込む。PiggyBacトランスポゾンシステムの強力な活性によって、PBベクターの２つのＩＴＲに挟まれた目的の遺伝子を標的ゲノムへと容易に移動することができる。
【００８５】
いくつかの実施形態において、ＰＢは、遺伝子タグに作動可能に連結されたキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドに連結されたプロモーターを含む。１つ以上のＰＢトランスポゾンを
使用することができる。いくつかの実施形態において、ＰＢは、キメラ抗原受容体および第１の遺伝子タグをコードするポリヌクレオチドに連結されたプロモーターを含み、別のＰＢは、キメラ抗原受容体および第２の別の遺伝子タグをコードするポリヌクレオチドに連結されたプロモーターを含む。前記構築物それぞれの各構成要素は、自己切断Ｔ２Ａ配列をコードする核酸などの核酸を介して隔てられている。いくつかの実施形態において、それぞれのＰＢに含まれるキメラ抗原受容体が互いに異なっており、たとえば、スペーサーの長さおよびスペーサーの配列、細胞内シグナル伝達ドメイン、ならびに／または遺伝子タグ配列が異なっている（ただし、これらに限定されない）。
【００８６】
いくつかの実施形態においては、第１の核酸は、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１のプロモーターを含み、該キメラ抗原受容体はリガンド結合ドメインを含み、該リガンド結合ドメインはリガンドに結合し、該リガンドが、腫瘍に特異的な分子、ウイルス分子、またはリンパ球による認識および排除の媒介に適切な標的細胞集団上に発現されるその他の分子であり、第１の核酸は、前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生を対照のキメラ受容体よりも増強するポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、およびｄ）細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記第１の核酸は遺伝子タグをさらに含む。
【００８７】
いくつかの実施形態において、第２の核酸は、第１のキメラ抗原受容体とは異なる第２のキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む。第１のキメラ抗原受容体と第２のキメラ抗原受容体は互いに異なっていてもよく、その差異は、リガンド結合ドメイン、標的抗原、標的抗原のエピトープ、スペーサードメインの長さおよびスペーサードメインの配列（短い配列、中程度の配列または長い配列）、ならびに細胞内シグナル伝達ドメインにあってもよい。いくつかの実施形態において、第２の核酸は、第１の核酸の遺伝子タグとは異なる第２の遺伝子タグをさらに含む。
【００８８】
いくつかの実施形態において、単一のレンチウイルス構築物では、第１の核酸と第２の核酸は、ゲノムのインスレーターの核酸配列を介して隔てられていてもよく、該インスレーターは、たとえば、ウニのインスレーターのクロマチンドメインであってもよい。
【００８９】
いくつかの実施形態において、本明細書で使用されるプロモーターは、誘導性プロモーターであっても構成的プロモーターであってよい。誘導性プロモーターとしては、タモキシフェン誘導性プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、およびドキシサイクリン誘導性プロモーター（たとえば、ｔｒｅプロモーター）が挙げられる。構成的プロモーターとしては、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＵＢＣ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、およびＣＡＧＧが挙げられる。
【００９０】
これらのベクターのうち１つ以上を組み合わせて使用することによって、標的細胞に形質導入し、キメラ抗原受容体を発現することができる。
【００９１】
導入遺伝子
本発明の態様はいくつかの導入遺伝子も包含する。
【００９２】
本明細書に記載の遺伝子タグは、導入遺伝子により形質導入され、該遺伝子を発現している細胞の選択、追跡、および殺傷に有用である。前記遺伝子タグは、様々な導入遺伝子とともに使用することができ、該導入遺伝子は特に限定されない。本開示では、キメラ抗原受容体を有する導入遺伝子を例示しているが、類似の原理を、形質導入細胞において発現されるその他の導入遺伝子の設計、同定および選択に適用することができる。
【００９３】
キメラ抗原受容体
本明細書に記載の実施形態においては、いくつか種類のキメラ抗原受容体を使用することができる。
【００９４】
キメラ抗原受容体の発現システムは、第１の核酸を含み、該第１の核酸は、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドに連結された第１のプロモーターを含み、該キメラ抗原受容体はリガンド結合ドメインを含み、該リガンド結合ドメインはリガンドに結合し、該リガンドが、腫瘍に特異的な分子、ウイルス分子、またはリンパ球による認識および排除の媒介に適切な標的細胞集団上に発現されるその他の分子であり、第１の核酸は、前記リガンドに応答したＴ細胞の増殖および／またはサイトカインの産生を対照のキメラ受容体よりも増強するポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチド、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、およびｄ）細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。別の実施形態においては、キメラ抗原受容体をコードする別のポリヌクレオチドは、構成的プロモーターの制御下にある。
【００９５】
リガンド結合ドメイン
本明細書に記載の実施形態においては、様々なリガンド結合ドメインを使用することができる。
【００９６】
いくつかの実施形態において、前記キメラ受容体の核酸配列は、リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、前記リガンド結合ドメインは、腫瘍抗原または特定のウイルス抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、前記リガンド結合ドメインとしては、受容体またはその一部、小さいペプチド、ペプチドミメティック、基質、およびサイトカイン等が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態においては、前記リガンド結合ドメインは抗体またはそのフラグメントである。抗体または抗体フラグメントをコードする核酸配列は容易に決定することができる。特定の実施形態においては、前記ポリヌクレオチドは、ＣＤ１９と特異的に結合する一本鎖Ｆｖをコードする。別の特定の実施形態のいくつかにおいて、前記ポリヌクレオチドは、ＣＤ２０、ＨＥＲ２、ＣＥ７、ｈＢ７Ｈ３、またはＥＧＦＲと特異的に結合する一本鎖Ｆｖをコードする。これらの抗体の配列は、当業者に知られており、当業者によって容易に決定される。
【００９７】
腫瘍抗原は、免疫応答を誘発する腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。本開示のリガンド結合ドメインは、治療されるがんの種類に応じて選択され、腫瘍抗原またはその他の腫瘍細胞表面分子を標的とすることができる。対象由来の腫瘍サンプルは、特定のバイオマーカーまたは細胞表面マーカーの存在について特性を評価することができる。たとえば、対象由来の乳がん細胞は、Ｈｅｒ２Ｎｅｕ、エストロゲン受容体、および／またはプロゲステロン受容体のそれぞれについて陽性であっても陰性であってもよい。個々の対象の腫瘍細胞上に見出される腫瘍抗原または細胞表面分子が選択される。腫瘍抗原および細胞表面分子は、当技術分野において周知であり、たとえば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異抗原、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンＢ２、ＣＤ１９、ＣＤ１７１、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ１２３、ＣＳ−１、ＣＥ７、ｈＢ７Ｈ３、ＲＯＲ１、メソテリン（mesothelin）、ｃ−Ｍｅｔ、ＧＤ−２、および／またはＭＡＧＥ Ａ３ ＴＣＲが挙げられる。いくつかの実施形態において、標的分子は、腫瘍細胞上に存在する細胞表面分子であり、正常組織上に実質的に存在しないか、またはその発現が重要視されない正常組織に制限されている。
【００９８】
一実施形態において、腫瘍上の標的分子は、悪性腫瘍と関連する１つ以上のエピトープを含む。悪性腫瘍は、Ｔ細胞受容体またはキメラ受容体により媒介される認識のための標的抗原として機能しうるタンパク質を多数発現している。その他の標的分子としては、細胞の形質転換に関連する分子の一群に属するものが挙げられ、たとえばＣＤ１９またはＣＤ２０が挙げられる。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、同じ組織型の対照細胞と比較して、腫瘍細胞上に選択的に発現されるか、あるいは過剰発現される。別の実施形態において、腫瘍抗原は細胞表面ポリペプチドである。
【００９９】
キメラ受容体の標的となりうる腫瘍細胞表面分子を同定した後、この標的分子のエピトープを選択し、その特性を評価する。腫瘍細胞表面分子と特異的に結合する抗体は、モノクローナル抗体を得る方法、ファージディスプレイ法、ヒト抗体もしくはヒト化抗体を製造する方法、またはヒト抗体を得るために遺伝子改変されたトランスジェニック動物もしくはトランスジェニック植物を用いる方法を用いて製造することができる。部分的に合成した抗体または全合成抗体のファージディスプレイライブラリが入手可能であり、このライブラリから、標的分子に結合することができる抗体またはそのフラグメントをスクリーニングすることができる。ヒト抗体のファージディスプレイライブラリも入手可能である。いくつかの実施形態において、抗体は、腫瘍細胞表面分子に特異的に結合し、ウシ血清アルブミンやその他の無関係な抗原などの非特異的成分とは交差反応しない。前記抗体をコードするアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列を同定した後、これらの配列を単離し、かつ／または配列決定することができる。いくつかの実施形態においては、部分的に合成した抗体または全合成抗体のファージディスプレイライブラリから、標的分子に結合することができる抗体またはそのフラグメントをスクリーニングすることができる。
【０１００】
抗体または抗原結合フラグメントとしては抗体の全体またはその一部が挙げられ、該抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、および線状抗体が挙げられる。「抗体フラグメント」は、完全な抗体の一部を含み、好ましくは完全な抗体の抗原結合領域または可変領域であり、これらは容易に調製することができる。抗体フラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；二機能性抗体；線状抗体；単鎖抗体分子；および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が挙げられる。
【０１０１】
いくつかの実施形態においては、特定の単一の腫瘍細胞表面分子に結合する様々な抗体を多数単離されることがあり、これらの特性を評価することができる。いくつかの実施形態においては、前記抗体は、標的分子のエピトープに対する特異性に基づいて特徴が表される。また、いくつかの実施形態においては、エピトープに対する抗体の親和性に基づいて、同じエピトープに結合する抗体が選択されうる。いくつかの実施形態において、前記抗体は少なくとも１ｍＭの親和性を有し、５０ｎＭ未満の親和性を有することが好ましい。いくつかの実施形態においては、別の抗体よりもエピトープに対する親和性が高い抗体が選択される。たとえば、同じエピトープに結合する対照の抗体と比較して、親和性が少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍である抗体が選択される。いくつかの実施形態においては、同じエピトープに結合する対照の抗体と比較して、親和性が少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、もしくは少なくとも５０倍である抗体、または親和性がこれらの値のいずれかの間の任意の倍数で表される抗体が選択される。
【０１０２】
いくつかの実施形態においては、標的分子は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＥ７、ｈＢ７Ｈ３、ＥＧＦＲ、ＣＤ１２３、ＣＳ−１、ＲＯＲ１、メソテリン（mesothelin）、Ｈｅｒ２、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、ＧＤ−２、および／またはＭＡＧＥ Ａ３ ＴＣＲ、ならびにこれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態において、Ｈｅｒ２ ＣＡＲ構築物が望ましい場合、前記遺伝子タグは、該ＣＡＲ構築物において使用される抗Ｈｅｒ２ ｓｃＦｖには結合しないエピトープを含む。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ ＣＡＲ構築物が望ましい場合、前記遺伝子タグは、該ＣＡＲ構築物において使用される抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖには結合しないエピトープを含む。
【０１０３】
特定の実施形態において、前記標的抗原はＣＤ１９である。ＣＤ１９に特異的な抗体は当業者に多数知られており、その配列、エピトープに対する結合性および親和性について容易に特性を評価することができる。特定の一実施形態において、前記キメラ受容体構築物は、ＦＭＣ６３抗体由来のｓｃＦＶ配列を含む。別の実施形態において、前記ｓｃＦＶはヒトｓｃＦｖまたはヒト化ｓｃＦｖであり、これらのｓｃＦｖは、RASQDISKYLNで表されるＣＤＲＬ１配列（配列番号２７）、SRLHSGVで表されるＣＤＲＬ２配列（配列番号２８）、およびGNTLPYTFGで表されるＣＤＲＬ３配列（配列番号２９）を含む軽鎖可変領域を含む。別の実施形態において、前記ｓｃＦＶはヒトｓｃＦｖまたはヒト化ｓｃＦｖであり、これらのｓｃＦｖは、DYGVSで表されるＣＤＲＨ１配列（配列番号３０）、VIWGSETTYYNSALKSで表されるＣＤＲＨ２配列（配列番号３１）、およびYAMDYで表されるＣＤＲＨ３配列（配列番号３２）を含む重鎖可変領域を含む。本開示はまた、ＦＭＣ６３由来のｓｃＦｖの可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のアミノ酸配列同一性、またはこれらのパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲にある配列同一性（％）を有し、かつＣＤ１９に対する親和性がＦＭＣ６３由来のｓｃＦｖの可変領域と少なくとも同等である可変領域も包含する。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、ＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔのナンバリングに基づいて抗体領域内に見出され、軽鎖は、２４〜３４番目のアミノ酸からなるＣＤＲＬ１；５０〜５６番目のアミノ酸からなるＣＤＲＬ２；および８９〜９７番目のアミノ酸からなるＣＤＲＬ３を含み、重鎖は、３１〜３５番目のアミノ酸からなるＣＤＲＨ１；５０〜６５番目のアミノ酸からなるＣＤＲＨ２；９５〜１０２番目のアミノ酸からなるＣＤＲＨ３を含む。抗体中のＣＤＲ領域は容易に決定することができる。
【０１０５】
特定の実施形態において、前記標的抗原はＣＤ２０である。ＣＤ２０に特異的な抗体は当業者に多数知られており、その配列、エピトープに対する結合性および親和性について容易に特性を評価することができる。特定の一実施形態において、前記キメラ受容体構築物は、表９に示したｓｃＦＶ配列を含む。別の実施形態において、前記ｓｃＦＶはヒトｓｃＦｖまたはヒト化ｓｃＦｖであり、これらのｓｃＦｖは、R A S S S V N Y M Dで表されるＣＤＲＬ１配列（配列番号３３）、A T S N L A Sで表されるＣＤＲＬ２配列（配列番号３４）、およびQ Q W S F N P P Tで表されるＣＤＲＬ３配列(配列番号35)を含む軽鎖可変領域を含む。別の実施形態において、前記ｓｃＦＶはヒトｓｃＦｖまたはヒト化ｓｃＦｖであり、これらのｓｃＦｖは、S Y N M Hで表されるＣＤＲＨ１配列（配列番号３６）、A I Y P G N G D T S Y N Q K F K Gで表されるＣＤＲＨ２配列（配列番号３７）、およびS N Y Y G S S Y W F F D Vで表されるＣＤＲＨ３配列（配列番号３８）を含む重鎖可変領域を含む。これらのＣＤＲ配列は、前記ｓｃＦｖのアミノ酸配列から容易に決定することができる。本開示はまた、抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖの可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のアミノ酸配列同一性、またはこれらのパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲にある配列同一性（％）を有し、かつＣＤ２０に対する親和性が抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖの可変領域と少なくとも同等である可変領域も包含する。
【０１０６】
いくつかの実施形態においては、リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドは、スペーサー領域をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態においては、リガンド結合ドメインをコードする前記ポリヌクレオチドは、該コード配列の５’末端および／または３’末端に１つ以上の制限酵素部位をさらに有していてもよく、これによって、リガンド結合ドメインをコードする前記ポリヌクレオチドを切断することが容易となり、該ポリヌクレオチドとは別の抗原をコードするか、あるいは別の結合特性を有するリガンド結合ドメインをコードする別のポリヌクレオチドと置換することが容易となる。たとえば、制限部位ＮｈｅＩを前記リーダー配列の上流にコードし、かつヒンジ領域内の３’末端にＲｓｒIIを配置することよって、キメラ受容体ベクターに所望のｓｃＦｖをサブクローニングすることが可能となる。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、哺乳類細胞における発現を目的としてコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、ヒト細胞における発現を目的としてコドン最適化されている。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、リガンド結合ドメインをコードする前記ポリヌクレオチドは、シグナルペプチドに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、該シグナルペプチドは、顆粒球コロニー刺激因子のシグナルペプチドである。ＣＤ８αなどの他のシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用することもできる。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、リガンド結合ドメインをコードする前記ポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結されている。哺乳類細胞において前記キメラ抗原受容体の発現を可能とするプロモーターが選択される。特定の一実施形態においては、前記プロモーターは、誘導可能なプロモーターである。
【０１０９】
リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドの特定の態様を表１に示すが、これは、ＣＤ１９に特異的に結合する抗体（ＦＭＣ６３など）に由来するｓｃＦｖである。アミノ酸配列GSTSGSGKPGSGEGSTKG（配列番号３９）を含むフレキシブルリンカーをコードするポリヌクレオチドを介して、ｓｃＦｖ中のＶＨ鎖とＶＬ鎖とが隔てられている。前記リンカーを含む前記ｓｃＦｖのアミノ酸配列を表１（配列番号２）に示す。ＳＪ２５Ｃ１およびＨＤ３７などの他のＣＤ１９標的抗体も知られている（SJ25C1: Bejcek et al. Cancer Res 2005, PMID 7538901; HD37: Pezutto et al. JI 1987, PMID 2437199）。
【０１１０】
リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドの特定の態様を表９に示すが、これは、ＣＤ２０に特異的に結合する抗体由来のｓｃＦｖである。アミノ酸配列GSTSGSGKPGSGEGSTKG（配列番号３９）を含むフレキシブルリンカーをコードするポリヌクレオチドを介して、ｓｃＦｖ中のＶＨ鎖とＶＬ鎖とが隔てられている。前記ｓｃＦｖのアミノ酸配列を表９（配列番号２５）に示す。１Ｆ５（Budde et al. 2013, PLOS One）などのその他のＣＤ２０標的抗体が知られている。
【０１１１】
スペーサー
いくつかの実施形態において、前記キメラ受容体の核酸配列は、スペーサー領域をコードするポリヌクレオチドを含む。スペーサー領域は、典型的には、キメラ受容体のリガンド結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置する。いくつかの実施形態において、スペーサー領域は、前記リガンド結合ドメインに柔軟性を持たせ、かつリンパ球において高レベル発現を可能とする。約２２９アミノ酸長のスペーサードメインを有するＣＤ１９特異的キメラ受容体の抗腫瘍活性は、改変ＩｇＧ４ヒンジのみからなる短いスペーサー領域を有するＣＤ１９特異的キメラ受容体の抗腫瘍活性よりも低い。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、スペーサー領域は、少なくとも１０〜２２９アミノ酸長、１０〜２００アミノ酸長、１０〜１７５アミノ酸長、１０〜１５０アミノ酸長、１０〜１２５アミノ酸長、１０〜１００アミノ酸長、１０〜７５アミノ酸長、１０〜５０アミノ酸長、１０〜４０アミノ酸長、１０〜３０アミノ酸長、１０〜２０アミノ酸長、もしくは１０〜１５アミノ酸長であるか、またはこれらのアミノ酸長のいずれか２つによって定義される範囲にある長さを有する。いくつかの実施形態においては、スペーサー領域は、１２アミノ酸長以下でありかつ１アミノ酸長よりも長く、１１９アミノ酸長以下でありかつ１アミノ酸長よりも長く、または２２９アミノ酸長以下でありかつ１アミノ酸長よりも長い。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、前記スペーサー領域は、免疫グロブリン様分子のヒンジ領域に由来する。いくつかの実施形態において、スペーサー領域は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、またはヒトＩｇＧ４に由来するヒンジ領域の全体またはその一部を含み、１つ以上のアミノ酸置換を含んでいてもよい。前記ヒンジ領域の典型的な配列を表５に示す。いくつかの実施形態においては、前記ヒンジ領域の一部は、重鎖可変領域とコアとの間に存在するアッパーヒンジ領域のアミノ酸配列、およびポリプロリン領域を含むコアヒンジ領域のアミノ酸配列を含む。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、二量体化などの望ましくない構造間の相互作用を回避するため、ヒンジ領域の配列は１つ以上のアミノ酸が改変されていてもよい。特定の一実施形態において、前記スペーサー領域は、表１または表５（配列番号１０）に示すような、ＩｇＧ４に由来する改変されたヒトヒンジ領域の一部を含む。改変されたＩｇＧ４ヒンジ領域の一部をコードするポリヌクレオチドの典型的な配列を表１に示す（配列番号１）。いくつかの実施形態において、ヒンジ領域は、表１または表５に示したヒンジ領域のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、約９２％、約９５％または約１００％の配列同一性を有していてもよい。特定の一実施形態において、ＩｇＧ４に由来するヒトヒンジ領域の一部は、コアヒンジ領域のアミノ酸配列においてＣＰＳＰがＣＰＰＣに置換されている。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、前記ヒンジ領域の全体またはその一部は、免疫グロブリンの定常領域の１つ以上と組み合わされる。たとえば、ヒンジ領域の一部は、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインまたはそれらのバリアントの全体またはその一部と組み合わせてもよい。いくつかの実施形態において、前記スペーサー領域は、ＣＤ８αに由来する４７〜４８アミノ酸長のヒンジ領域配列およびＣＤ２８分子の細胞外部分を含むスペーサー領域を含んでいない。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、短いスペーサー領域は、約１２アミノ酸長以下でありかつ１アミノ酸長よりも長く、かつＩｇＧ４のヒンジ領域配列またはそのバリアントの全体もしくはその一部を含む。中程度の長さのスペーサー領域は、約１１９アミノ酸長以下でありかつ１アミノ酸長よりも長く、かつＩｇＧ４のヒンジ領域配列またはそのバリアントの全体またはその一部と、ＣＨ３領域またはそのバリアントの全体またはその一部とを含む。長いスペーサーは、約２２９アミノ酸長以下でありかつ１アミノ酸長よりも長く、かつＩｇＧ４のヒンジ領域配列またはそのバリアントの全体またはその一部と、ＣＨ２領域またはそのバリアントの全体またはその一部と、ＣＨ３領域またはそのバリアントの全体またはその一部とを含む。
【０１１７】
スペーサー領域をコードするポリヌクレオチドは、アミノ酸配列に基づいて合成法または組換え法により容易に作製することができる。いくつかの実施形態においては、スペーサー領域をコードするポリヌクレオチドは、膜貫通領域をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、スペーサー領域をコードする前記ポリヌクレオチドは、該コード配列の５’末端および／または３’末端に１つ以上の制限酵素部位をさらに有していてもよく、これによって、該ポリヌクレオチドを切断して、別のスペーサー領域をコードする別のポリヌクレオチドと置換することが容易となる。いくつかの実施形態において、前記スペーサー領域をコードする前記ポリヌクレオチドは、哺乳類細胞における発現を目的としてコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記スペーサー領域をコードする前記ポリヌクレオチドは、ヒト細胞における発現を目的としてコドン最適化されている。
【０１１８】
一実施形態において、前記スペーサー領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４に由来するヒンジ領域配列またはその一部、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４に由来するヒンジ領域配列とＣＨ２領域またはそのバリアントの全体またはその一部との組み合わせ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４に由来するヒンジ領域配列とＣＨ３領域またはそのバリアントの全体またはその一部との組み合わせ、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４に由来するヒンジ領域配列とＣＨ２領域もしくはそのバリアントおよびＣＨ３領域もしくはそのバリアントの全体またはその一部との組み合わせから選択される。いくつかの実施形態において、短いスペーサー領域は、１２アミノ酸長以下でありかつ１アミノ酸長を超える長さを有する改変ＩｇＧ４ヒンジ配列（配列番号１０）であり、中程度の長さの配列は、１１９アミノ酸長以下でありかつ１アミノ酸長を超える長さを有する、ＣＨ３配列を備えたＩｇＧ４ヒンジ配列であるか、または２２９アミノ酸長以下でありかつ１アミノ酸長を超える長さを有する、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を備えたＩｇＧ４ヒンジ配列である。いくつかの実施形態において、短いスペーサー領域は、１アミノ酸長、２アミノ酸長、３アミノ酸長、４アミノ酸長、５アミノ酸長、６アミノ酸長、７アミノ酸長、８アミノ酸長、９アミノ酸長、１０アミノ酸長、１１アミノ酸長、もしくは１２アミノ酸長、またはこれらのアミノ酸長のいずれか２つによって定義される範囲にあるサイズを有する。いくつかの実施形態において、中程度の長さのスペーサー領域は、１３アミノ酸長、２０アミノ酸長、３０アミノ酸長、４０アミノ酸長、５０アミノ酸長、６０アミノ酸長、７０アミノ酸長、８０アミノ酸長、９０アミノ酸長、１００アミノ酸長、１１０アミノ酸長、もしくは１１９アミノ酸長、またはこれらのアミノ酸長のいずれか２つによって定義される範囲にあるサイズを有する。いくつかの実施形態において、スペーサー領域は、１２０アミノ酸長、１３０アミノ酸長、１４０アミノ酸長、１５０アミノ酸長、１６０アミノ酸長、１７０アミノ酸長、１８０アミノ酸長、１９０アミノ酸長、２００アミノ酸長、２１０アミノ酸長、もしくは２１９アミノ酸長、またはこれらのアミノ酸長のいずれか２つによって定義される範囲にあるサイズを有する。
【０１１９】
膜貫通ドメイン
いくつかの実施形態において、前記キメラ受容体の核酸配列は、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む。該膜貫通ドメインは、前記キメラ受容体を膜につなぎ止める役割を果たす。いくつかの実施形態においては、前記キメラ抗原受容体の前記膜貫通ドメインは、前記遺伝子タグの膜貫通ドメインとは異なる。
【０１２０】
一実施形態において、他からの作用を必要とせずに、前記キメラ受容体中のドメインのうちの１つと関連し合う膜貫通ドメインが用いられる。場合によっては、前記キメラ受容体中のこのようなドメインが、同じまたは異なる表面膜タンパク質に由来する様々な膜貫通ドメインに結合することを回避できるようなアミノ酸置換に基づいて前記膜貫通ドメインを選択してもよく、あるいはこのようなアミノ酸置換によって前記膜貫通ドメインを改変してもよく、これによって、前記受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限にすることができる。
【０１２１】
該膜貫通ドメインは、天然由来であってもよく、合成由来であってもよい。天然由来である場合、前記膜貫通ドメインは、膜結合型タンパク質であっても膜貫通型タンパク質であってもよく、これらのタンパク質はどのようなものであってもよい。膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のα鎖、β鎖もしくはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７および／またはＣＤ１５４の膜貫通領域を少なくとも含む。特定の一実施形態において、前記膜貫通ドメインは、表２に示すＣＤ２８膜貫通ドメインのアミノ酸配列を含む。ＣＤ２８膜貫通ドメインをコードする典型的なポリヌクレオチド配列を表１（の配列番号２）に示す。
【０１２２】
膜貫通ドメインは、合成されたものであってもよく、天然の膜貫通ドメインのバリアントであってもよい。いくつかの実施形態において、合成膜貫通ドメインまたは膜貫通ドメインのバリアントは、主に疎水性残基、たとえば、ロイシンおよびバリンを含む。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、表２または表６に示す膜貫通ドメインと、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは１００％のアミノ酸配列同一性、またはこれらのパーセンテージのいずれか２つにより定義される範囲にあるパーセンテージの配列同一性を有してもいてもよい。膜貫通ドメインのバリアントは、Kyte Doolittle法により算出された疎水性スコアが少なくとも５０であることが好ましい。
【０１２３】
膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチドは、合成法または組換え法により容易に作製することができる。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチドは、細胞内シグナル伝達領域をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインをコードする前記ポリヌクレオチドは、該コード配列の５’末端および／または３’末端に１つ以上の制限酵素部位をさらに有していてもよく、これによって、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチドを切断して、別の膜貫通ドメインをコードする別のポリヌクレオチドと置換することが容易となる。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインをコードする前記ポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞における発現、好ましくはヒト細胞における発現を目的としてコドン最適化されている。
【０１２４】
細胞内シグナル伝達ドメイン
いくつかの実施形態において、前記キメラ受容体の核酸配列は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む。該細胞内シグナル伝達ドメインが存在することによって、前記キメラ受容体を発現する形質導入細胞が腫瘍細胞上に発現されたリガンドに結合すると、該形質導入細胞の１つの機能が活性化される。いくつかの実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、前記形質導入細胞の少なくとも１つの機能を活性化する細胞内シグナル伝達ドメインの一部および／またはそのバリアントである。
【０１２５】
本開示のキメラ受容体に用いられる細胞内シグナル伝達ドメインとしては、ＣＤ３ζ鎖の細胞内配列、および／またはキメラ受容体が結合するとこれと協同してシグナル伝達を開始する補助受容体の細胞内配列、これらの配列の任意の誘導体またはバリアント、ならびに同じ機能を有する任意の合成配列が挙げられる。Ｔ細胞の活性化は、２種類の細胞内シグナル伝達配列によって媒介されると考えられており、これらの２種類の細胞内シグナル伝達配列は、抗原依存性一次活性化を開始し、かつＴ細胞受容体様シグナルを提供する細胞内シグナル伝達配列（一次細胞内シグナル伝達配列）と、抗原非依存性に、二次シグナルまたは共刺激シグナルを提供する細胞内シグナル伝達配列（二次細胞内シグナル伝達配列）とである。刺激性に作用する一次細胞内シグナル伝達配列は、受容体チロシン活性化モチーフすなわちＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含んでいてもよい。一次細胞内シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭとしては、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、および／またはＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。いくつかの実施形態において、前記一次シグナル伝達細胞内ドメインは、表４に示す配列を有するＣＤ３ζと少なくとも８０％、８５％、９０％もしくは９５％の配列同一性、またはこれらのパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲にある配列同一性（％）を有していてもよい。いくつかの実施形態において、ＣＤ３ζのバリアントは、表４に示すＩＴＡＭ領域を少なくとも１つ、２つもしくは３つ、またはこれらのＩＴＡＭ領域をすべて有する。
【０１２６】
好ましい実施形態において、前記キメラ受容体の前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを単独で、あるいは他の任意の所望される単一または複数の細胞内ドメインと組み合わせて含むように設計することができる。たとえば、前記キメラ受容体の前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ鎖および共刺激シグナル伝達領域を含んでいてもよい。
【０１２７】
前記共刺激シグナル伝達領域は、共刺激分子の前記細胞内ドメインを含む、キメラ受容体の一部分を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の応答に必要とされる抗原受容体やそのリガンド以外の細胞表面分子である。そのような分子としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ  １３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ζ鎖関連プロテインキナーゼ（ＺＡＰ７０）、および／またはＣＤ８３と特異的に結合するリガンドが挙げられる。いくつかの実施形態においては、前記共刺激シグナル伝達ドメインは、表２に示すＣＤ２８の細胞内ドメインまたは表３に示す配列を有する４−１ＢＢと少なくとも８０％、８５％、９０％もしくは９５％のアミノ酸配列同一性、またはこれらのパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲にある任意の配列同一性（％）を有していてもよい。一実施形態においては、前記ＣＤ２８細胞内ドメインのバリアントは、１８６〜１８７番目のアミノ酸がＬＬからＧＧに置換されている。
【０１２８】
キメラ受容体に複数存在する細胞内シグナル伝達配列は、ランダムな順序または指定された順序で互いに連結されていてもよい。これらの細胞内シグナル伝達配列は、短いオリゴペプチドリンカーまたは短いポリペプチドリンカーによって連結されていてもよく、これらのリンカーは２〜１０アミノ酸長であることが好ましい。いくつかの実施形態において、短いオリゴペプチドリンカーまたは短いポリペプチドリンカーは、２アミノ酸長、３アミノ酸長、４アミノ酸長、５アミノ酸長、６アミノ酸長、７アミノ酸長、８アミノ酸長、９アミノ酸長、もしくは１０アミノ酸長、またはこれらのサイズのいずれか２つによって定義される範囲にあるサイズを有する。一実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインまたはそのバリアントの全体または一部と、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインまたはそのバリアントの全体またはその一部とを含む。別の実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインまたはそのバリアントの全体またはその一部と、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインまたはそのバリアントの全体またはその一部とを含む。さらに別の実施形態においては、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインまたはそのバリアントの全体またはその一部と、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインまたはそのバリアントの全体または一部と、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインまたはそのバリアントの全体またはその一部とを含む。特定の一実施形態における、ＣＤ３ζのバリアントと４−１ＢＢの細胞内シグナル伝達ドメインの一部とを含む前記細胞内シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列を表１に示す。典型的な核酸配列を表１（の配列番号２）に示す。
【０１２９】
一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドは、ＣＤ３ζドメインの一部に連結された４−１ＢＢの細胞内ドメインを含む。別の実施形態においては、４−１ＢＢ細胞内ドメインおよびＣＤ２８細胞内ドメインは、ＣＤ３ζドメインの一部に連結されている。
【０１３０】
細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドは、アミノ酸配列に基づいて合成法または組換え法により容易に作製することができる。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする前記ポリヌクレオチドは、該コード配列の５’末端および／または３’末端に１つ以上の制限酵素部位をさらに有していてもよく、これによって、細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドを切断して、別の細胞内シグナル伝達ドメインをコードする別のポリヌクレオチドと置換することが容易となる。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする前記ポリヌクレオチドは、哺乳類細胞における発現を目的としてコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする前記ポリヌクレオチドは、ヒト細胞における発現を目的としてコドン最適化されている。
【０１３１】
リンカードメイン
いくつかの実施形態においては、ＣＡＲ構築物中のドメイン間に柔軟性を持たせることを目的として、リンカードメインが使用される。以下に示すように、Ｈｅｒ２ｔＧ構築物は、Ｈｅｒ２ｔのドメインIVと膜貫通ドメインとの間にリンカー（配列番号４５）を有する。このリンカーは、タンパク質ドメイン間に柔軟性を持たせることを目的として使用される。別の例では、ＣＡＲのｓｃＦｖの多くは、ＣＡＲのｓｃＦｖのＶｈドメインとＶｌドメインとの間に４つの連続的Ｇ３Ｓサブユニットを含む。これにより、２つのｓｃＦｖドメインに柔軟性を付与することができ、ｓｃＦｖを折りたたむことが可能となる。典型的な一実施形態において、２つのＧ３Ｓリンカーサブユニットを使用するという原理を利用することによって、Ｈｅｒ２ｔＧの柔軟性を増加することができると考えられる。
【０１３２】
２つのＧ３Ｓリンカーサブユニットを連結して１つにしたリンカー（配列番号４５）を使用することによっても、ＣＤ２８のヒンジ領域およびＩｇＧ４のヒンジ領域のスペーサーの長さを模倣することができた。ＣＤ２８のヒンジ領域およびＩｇＧ４のヒンジ領域は、機能性ＣＡＲのｓｃＦｖと膜貫通領域との間のスペーサーとして使用されたことが報告されている。ＣＤ２８のヒンジ領域およびＩｇＧ４のヒンジ領域は、二量体化を容易にするシステインを含む。この二量体化はＣＡＲには有利であるが、Ｈｅｒ２ｔの柔軟性を抑制するため、ハーセプチンによって有効に認識されない可能性がある。３つまたは４つのＧ３Ｓリンカーよりも２つのＧ３Ｓリンカー（配列番号４５）を使用することの利点は、ベクターのペイロードを抑制できること、不要だと考えられる配列を排除し、かつ機能性を向上させることであった。
【０１３３】
いくつかの実施形態においては、単離されたポリペプチドであって、
配列番号２３において膜貫通ドメインに連結した５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインからなるポリペプチドと少なくとも９５％の配列同一性を有し、
Ｈｅｒ２のドメインIVのエピトープに結合する抗体に特異的に結合すること、
完全長成熟ＨＥＲではないこと、および
前記配列番号２３の５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインが、GGGSGGGS（配列番号４５）で示されるアミノ酸を含む配列を介して前記膜貫通ドメインに連結されていること
を特徴とする単離されたポリペプチドが提供される。
いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、配列番号２３の５８０番目のグルタミン酸、５８２番目のアスパラギン酸、５９２番目のアスパラギン酸、５９５番目のフェニルアラニンおよび６２４番目のグルタミンを含む。いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、配列番号２３の５６３〜６５２番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは、配列番号２３の６５３〜６７５番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、前記単離されたポリペプチドは、細胞表面発現を可能とするリーダーペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記リーダーペプチドは、配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記抗体はトラスツズマブである。
【０１３４】
宿主細胞および組成物：Ｔリンパ球集団
本明細書に記載の組成物は、本明細書に記載のベクターおよび／または構築物を含む遺伝子改変宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、前記宿主細胞はＣＤ４＋Ｔリンパ球および／またはＣＤ８＋Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は造血幹細胞である。
【０１３５】
Ｔリンパ球は、公知の技術によって回収することができ、フローサイトメトリーおよび／または免疫磁気選択のような、抗体との親和性結合などの公知の技術によって濃縮または除去することができる。濃縮工程および／または除去工程を行った後、当業者であれば容易に理解できる公知の技術またはその変法によって所望のＴリンパ球をインビトロで増殖させることができる。いくつかの実施形態では、前記Ｔ細胞は患者から得られた自己由来Ｔ細胞である。
【０１３６】
たとえば、所望のＴ細胞集団またはＴ細胞亜集団の増殖は、増殖前のＴリンパ球集団をインビトロにおいて培地に添加すること、非分裂末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）などのフィーダー細胞を該培地に添加すること（たとえば、添加後の細胞集団が、増殖培養される最初の集団中の各Ｔリンパ球１個あたり、少なくとも５個、１０個、２０個、もしくは４０個もしくはそれ以上、またはこれらの量のいずれか２つによって定義される範囲にある量のＰＢＭＣフィーダー細胞を含むような比率で加える）、および該培地を（たとえばＴ細胞数の増加に十分な時間にわたって）インキュベートすることによって行うことができる。前記非分裂フィーダー細胞は、γ線が照射されたＰＢＭＣフィーダー細胞を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、細胞分裂を防ぐため、3000〜3600radのγ線を前記ＰＢＭＣに照射する。いくつかの実施形態においては、前記ＰＢＭＣの細胞分裂を防ぐため、3000rad、3100rad、3200rad、3300rad、3400rad、3500rad、もしくは3600radのγ線、またはこれらの値のいずれか２つで示されるエンドポイントの間にある任意の放射線値のγ線を前記ＰＢＭＣに照射する。培地にＴ細胞またはフィーダー細胞を添加する順序は必要に応じて入れ替えてもよい。典型的には、Ｔリンパ球の増殖に適した温度などの条件下で培養物をインキュベートすることができる。ヒトＴリンパ球を増殖させるための温度としては、たとえば、通常、少なくとも２５℃、好ましくは少なくとも３０℃、より好ましくは約３７℃である。いくつかの実施形態において、ヒトＴリンパ球を増殖させるための温度は、２２℃、２４℃、２６℃、２８℃、３０℃、３２℃、３４℃、３６℃、もしくは３７℃、またはこれらの値のいずれか２つで示されるエンドポイントの間にある他の任意の温度である。
【０１３７】
増殖させたＴリンパ球としては、ヒト腫瘍または病原体上に存在する抗原に特異的であってもよいＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）およびＣＤ４＋ヘルパーＴリンパ球が挙げられる。
【０１３８】
前記増殖方法は、ＥＢＶで形質転換された非分裂リンパ芽球様細胞（ＬＣＬ）をフィーダー細胞として加える工程をさらに含んでもよい。6000〜10,000radのγ線をＬＣＬに照射してもよい。いくつかの実施形態においては、6000rad、6500rad、7000rad、7500rad、8000rad、8500rad、9000rad、9500rad、もしくは10,000radのγ線、またはこれらの値のいずれか２つで示されるエンドポイントの間にある任意の放射線量のγ線を前記ＬＣＬに照射する。前記ＬＣＬフィーダー細胞は任意の適切な量で提供することができ、たとえば、ＬＣＬフィーダー細胞と増殖開始時のＴリンパ球との比は少なくとも約１０：１であってもよい。
【０１３９】
前記増殖方法は、（たとえば、少なくとも約０．５ｎｇ／ｍｌの濃度で）抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体を培地に加える工程をさらに含んでもよい。前記増殖方法は、ＩＬ−２および／またはＩＬ−１５を培地に加える工程をさらに含んでもよい（ＩＬ−２の濃度は、たとえば、少なくとも約１０単位／ｍｌである）。
【０１４０】
Ｔリンパ球を単離し、増殖を行う前または増殖を行った後に、細胞傷害性Ｔリンパ球およびヘルパーＴリンパ球をそれぞれ、ナイーブＴ細胞亜集団、メモリーＴ細胞亜集団、およびエフェクターＴ細胞亜集団にソートすることができる。
【０１４１】
ＣＤ８＋細胞は、標準的な方法を用いることによって得ることができる。いくつかの実施形態において、ＣＤ８＋細胞は、ナイーブＣＤ８＋細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋細胞、およびエフェクターメモリーＣＤ８＋細胞それぞれと関連する細胞表面抗原を同定することによって、ナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞、およびエフェクターメモリー細胞にさらにソートされる。いくつかの実施形態において、メモリーＴ細胞は、ＣＤ８＋末梢血リンパ球由来のＣＤ６２Ｌ＋サブセットおよびＣＤ６２Ｌ−サブセットの両方に存在する。ＰＢＭＣは、抗ＣＤ８抗体および抗ＣＤ６２Ｌ抗体で染色した後に、ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ８＋画分およびＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ８＋画分にソートされる。いくつかの実施形態において、セントラルメモリーＴＣＭの表現型マーカーの発現は、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、およびＣＤ１２７を含み、グランザイムＢは陰性であるか、低発現を示す。いくつかの実施形態において、セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ８＋のＴ細胞である。いくつかの実施形態において、エフェクターＴＥは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、およびＣＤ１２７が陰性であり、グランザイムＢおよびパーフォリンは陽性である。いくつかの実施形態において、ナイーブＣＤ８＋Ｔリンパ球は、ナイーブＴ細胞の表現型マーカーの発現によって特徴付けられ、ナイーブＴ細胞の表現型マーカーとしては、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ１２７、およびＣＤ４５ＲＡが挙げられる。
【０１４２】
ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞は、細胞表面抗原を有する細胞集団を同定することによって、ナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞、およびエフェクター細胞にソートされる。ＣＤ４＋リンパ球は、標準的な方法によって得ることができる。いくつかの実施形態において、ナイーブＣＤ４＋Ｔリンパ球は、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４＋のＴ細胞である。いくつかの実施形態において、セントラルメモリーＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ４５ＲＯ＋である。いくつかの実施形態において、エフェクターＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ−およびＣＤ４５ＲＯ−である。
【０１４３】
細胞または細胞集団が特定の細胞表面マーカーについて陽性であるかどうかは、該表面マーカーに特異的な抗体およびアイソタイプを一致させたコントロール抗体による染色を使用したフローサイトメトリーによって判定することができる。細胞集団において特定のマーカーが陰性であることは、アイソタイプコントロールと比べて特異的抗体で強く染まる細胞集団が見られないことを指し、陽性は、アイソタイプコントロールと比べて特異的抗体で均一染まる細胞集団が見られることを指す。いくつかの実施形態において、１つ以上のマーカーの発現の減少は、対照の細胞集団と比較して、平均蛍光強度の低下が1 log10であること、および／またはマーカーを発現する細胞のパーセンテージが細胞全体の少なくとも２０％に低下すること、細胞全体の少なくとも２５％に低下すること、細胞全体の少なくとも３０％に低下すること、細胞全体の少なくとも３５％に低下すること、細胞全体の少なくとも４０％に低下すること、細胞全体の少なくとも４５％に低下すること、細胞全体の少なくとも５０％に低下すること、細胞全体の少なくとも５５％に低下すること、細胞全体の少なくとも６０％に低下すること、細胞全体の少なくとも６５％に低下すること、細胞全体の少なくとも７０％に低下すること、細胞全体の少なくとも７５％に低下すること、細胞全体の少なくとも８０％に低下すること、細胞全体の少なくとも８５％に低下すること、細胞全体の少なくとも９０％に低下すること、細胞全体の少なくとも９５％に低下すること、もしくは細胞全体の少なくとも１００％に低下すること、もしくは２０〜１００％の範囲の任意のパーセンテージに低下すること、もしくは、マーカーを発現する細胞のパーセンテージが、対照の細胞集団と比較して、前記値のいずれかで示されるパーセンテージの間にある任意のパーセンテージに低下することを指す。いくつかの実施形態において、細胞集団が１つ以上のマーカーについて陽性であることは、対照の細胞集団と比較して、マーカーを発現する細胞のパーセンテージが細胞全体の少なくとも５０％であること、細胞全体の少なくとも５５％であること、細胞全体の少なくとも６０％であること、細胞全体の少なくとも６５％であること、細胞全体の少なくとも７０％であること、細胞全体の少なくとも７５％であること、細胞全体の少なくとも８０％であること、細胞全体の少なくとも８５％であること、細胞全体の少なくとも９０％であること、細胞全体の少なくとも９５％であること、もしくは細胞全体の少なくとも１００％であること、またはこれらのパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲にある任意のパーセンテージであることを指す。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、抗原特異的なＣＤ４＋集団およびＣＤ８＋集団は、ナイーブＴリンパ球または抗原特異的Ｔリンパ球を抗原で刺激することによって得ることができる。たとえば、サイトメガロウイルス抗原に対して特異的なＴ細胞株またはＴ細胞クローンは、サイトメガロウイルス抗原に感染した対象からＴ細胞を単離し、インビトロにおいてサイトメガロウイルス抗原で該細胞を刺激することによって作製することができる。ナイーブＴ細胞を使用することもできる。Ｔ細胞応答を誘導するための標的として使用する、腫瘍細胞に由来する抗原の数は特に限定されない。いくつかの実施形態において、本発明の養子細胞免疫療法組成物は、固形腫瘍、血液悪性腫瘍、乳がん、または黒色腫を含む疾患または障害の治療に有用である。
【０１４５】
Ｔリンパ球集団の改変
いくつかの実施形態においては、本発明の開示による免疫療法に使用する前記Ｔ細胞に機能性遺伝子を導入することが望ましい場合がある。たとえば、単一の遺伝子または複数の遺伝子をＴ細胞に導入することによって、体内に移入された該Ｔ細胞の生存能および／または機能を向上することができ、それによって治療法の有効性を改善することができる。あるいは、上記単一または複数の遺伝子を導入することによって、遺伝子マーカーを提供することができ、この遺伝子マーカーを利用することによって、インビボにおける生存Ｔ細胞および／または移行Ｔ細胞の選択および／または評価が可能となる。あるいは、上記単一または複数の遺伝子をＴ細胞に導入することによって、たとえば、該導入遺伝子の発現制御により該Ｔ細胞を調節することができ、それによって免疫療法の安全性を改善することができる。これらは、本発明の開示を踏まえ、当業者であれば容易に理解できる公知の技術に従って行うことができる。
【０１４６】
いくつかの実施形態においては、Ｔ細胞は、本明細書に記載の遺伝子タグをコードするベクターで改変される。いくつかの実施形態においては、細胞は、遺伝子タグに作動可能に連結されたキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで改変される。別の実施形態においては、細胞は、遺伝子タグのみをコードするポリヌクレオチドを含むベクターで改変される。いくつかの実施形態において、前記Ｔ細胞は、処置を受ける対象から得られ、別の実施形態においては、前記リンパ球は同種異系のヒトドナー、好ましくは健常ヒトドナーから得られる。
【０１４７】
キメラ受容体は、たとえば抗体分子などに由来する抗原結合フラグメントまたは抗体可変ドメインを利用することによって、任意の細胞表面マーカーに対する特異性を備えるように構築することができる。前記抗原結合分子は、１つ以上の細胞シグナル伝達モジュールに連結することができる。いくつかの実施形態において、前記細胞シグナル伝達モジュールとしては、ＣＤ３膜貫通ドメイン、ＣＤ３細胞内シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ２８膜貫通ドメインが挙げられる。いくつかの実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ細胞内ドメインに連結されたＣＤ２８膜貫通シグナル伝達ドメインを含む。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、ＣＤ４＋Ｔリンパ球集団およびＣＤ８＋Ｔリンパ球集団のそれぞれに導入されるキメラ受容体は同じでも異なっていてもよい。いくつかの実施形態においては、これらの細胞集団のそれぞれに導入されるキメラ受容体のリガンド結合ドメインは、腫瘍細胞上または感染細胞上の同じリガンドに特異的に結合するか、または異なる抗原もしくは異なるエピトープに特異的に結合する。前記細胞シグナル伝達モジュールもそれぞれ異なっていてもよい。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の前記細胞内シグナル伝達ドメインは、前記ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の前記細胞内シグナル伝達ドメインと同一のものである。別の実施形態では、前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の前記細胞内シグナル伝達ドメインは、前記ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の前記細胞内シグナル伝達ドメインと異なるものである。各キメラ受容体は、それぞれ別の遺伝子タグに作動可能に連結され、これによって、両方のキメラ抗原受容体を発現する形質導入細胞の選択および同定が可能となる。
【０１４９】
本発明の実施形態は、本明細書に記載の宿主細胞を含む組成物の製造方法を包含する。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、
単離された核酸を宿主細胞に導入すること、および
少なくとも１つの増殖因子を含む培地中で前記宿主細胞を培養することを含み、
前記単離された核酸は、たとえば、単離されたポリペプチドをコードする核酸であり、
該単離されたポリペプチドは、配列番号２３において膜貫通ドメインに連結した５１１〜６５２番目または５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインからなるポリペプチドと少なくとも９５％の配列同一性を有し、Ｈｅｒ２のドメインIVのエピトープに結合する抗体に特異的に結合することを特徴とする。
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、前記培養工程の前もしくは後またはその前後に、Ｈｅｒ２ｔを発現している宿主細胞を選択することをさらに含む。別の実施形態においては、本発明の製造方法は、第２のキメラ抗原受容体および第２の遺伝子タグをコードする第２の核酸を前記宿主細胞に導入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記培養工程の前もしくは後またはその前後に、前記第２の遺伝子タグを発現している宿主細胞を選択することをさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は造血幹細胞である。
【０１５０】
別の実施形態では、本発明の方法は、
単離された第１の核酸を第１の宿主細胞に導入すること、
Ｈｅｒ２ｔを発現している第１の宿主細胞を選択すること、
第２のキメラ抗原受容体および第２の遺伝子タグをコードする第２の核酸を第２の宿主細胞に導入すること、
前記第２の遺伝子タグを発現している第２の宿主細胞を選択すること、ならびに
任意に、少なくとも１つの増殖因子を含む培地中で前記第１の宿主細胞および第２の宿主細胞を培養することを含み、
前記核酸が、たとえば、配列番号２３において膜貫通ドメインに連結した５１１〜６５２番目または５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインからなるポリペプチドと少なくとも９５％の配列同一性を有する単離されたポリペプチドをコードする核酸であること、ならびに
該単離されたポリペプチドが、Ｈｅｒ２のドメインIVのエピトープに結合する抗体に特異的に結合することを特徴とする方法が提供される。
別の実施形態では、組成物は第１の宿主細胞集団および第２の宿主細胞集団を含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は造血幹細胞である。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、ＣＤ４ Ｔリンパ球またはＣＤ８ Ｔリンパ球はそれぞれ、本明細書に記載の形質導入の前に、ナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞、エフェクターメモリー細胞またはエフェクター細胞にソートすることができる。いくつかの実施形態において、ＣＤ４ Ｔリンパ球またはＣＤ８ Ｔリンパ球はそれぞれ、形質導入を行った後に、ナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞、エフェクターメモリー細胞またはエフェクター細胞にソートすることができる。
【０１５２】
本明細書に記載のように、いくつかの実施形態において、ナイーブＣＤ４
＋細胞は、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、セントラルメモリーＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ＋および／またはＣＤ４５ＲＯ＋である。いくつかの実施形態において、エフェクターＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ−および／またはＣＤ４５ＲＯ＋である。これらの集団はそれぞれ別個にキメラ受容体で改変することができる。
【０１５３】
本明細書に記載されているように、いくつかの実施形態において、メモリーＴ細胞は、ＣＤ８＋末梢血リンパ球由来のＣＤ６２Ｌ＋サブセットおよび／またはＣＤ６２Ｌ−サブセットの両方に存在する。ＰＢＭＣは、抗ＣＤ８抗体および抗ＣＤ６２Ｌ抗体で染色した後に、ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ８＋画分および／またはＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ８＋画分にソートされる。いくつかの実施形態において、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の表現型マーカーの発現は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、および／またはＣＤ１２７を含み、グランザイムＢは陰性であるか、低発現を示す。いくつかの実施形態において、セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、および／またはＣＤ８＋のＴ細胞である。いくつかの実施形態において、エフェクターＴ細胞（ＴＥ）は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、および／またはＣＤ１２７が陰性であり、グランザイムＢおよび／またはパーフォリンは陽性である。いくつかの実施形態において、ナイーブＣＤ８＋Ｔリンパ球は、ＣＤ８＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ１２７＋、および／またはＣＤ４５ＲＯ＋によって特徴付けられる。これらの集団はそれぞれ別個にキメラ受容体で改変することができる。
【０１５４】
遺伝子送達のための組換え感染性ウイルス粒子を利用した様々な形質導入技術が開発されてきた。このような形質導入技術は、本発明のＴリンパ球を形質導入するためのアプローチとして現時点では好ましい。この形質導入技術に通常使用されるウイルスベクターとしては、シミアンウイルス４０、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクター、およびレトロウイルスに由来するウイルスベクターが挙げられる。このように、遺伝子導入方法および発現方法としては様々なものが存在するが、このような方法は、哺乳類細胞に遺伝物質を導入して発現させることを本質的な機能とする。前記形質導入技術のいくつかは、造血細胞またはリンパ球に形質導入することを目的として使用され、このような形質導入技術としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポーレーション、組換えアデノウイルスによる感染、アデノ随伴ウイルスによる感染、およびレトロウイルスベクターによる感染が挙げられる。初代Ｔリンパ球の形質導入は、エレクトロポーレーションおよびレトロウイルスまたはレンチウイルスの感染によって成功を収めている。
【０１５５】
レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターを使用することによって、真核細胞への遺伝子導入を非常に効率的に行うことができる。さらに、レトロウイルスまたはレンチウイルスの組み込みは制御下で行うことができ、細胞１個あたり１コピーまたは数コピーの新しい遺伝情報を安定して組み込むことができる。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを使用して、真核細胞に遺伝子を導入する。いくつかの実施形態では、前記細胞はヒト細胞である。
【０１５６】
刺激因子(たとえばリンホカインまたはサイトカイン)の過剰発現は、治療を受ける個体に対して毒性がある場合がある。したがって、本発明は、インビボにおけるネガティブ選択に対する感受性を本発明のT細胞に付与する遺伝子セグメントをさらに包含する。「ネガティブ選択」は、個体のインビボ状態を変化させることによって該個体に注入した細胞を排除できることを意味する。ネガティブ選択が可能な表現型は、投与される薬剤(たとえば化合物)に対する感受性を付与する遺伝子を挿入することによって発現される。いくつかの実施形態においては、さらに、遺伝子タグ配列Ｈｅｒ２ｔは、インビボにおけるネガティブ選択を可能とする。たとえば、遺伝子タグＨｅｒ２ｔを有するＣＡＲ発現細胞を取り除きたい場合、Ｈｅｒ２のドメインIVに結合する抗体（たとえばトラスツズマブ）またはＨｅｒ２のドメインIVに結合する抗体と結合に対して競合する抗体を対象に投与する。形質導入細胞が取り除かれる好ましい実施形態においては、Ｆｃ領域を含む前記抗体を使用して抗体依存性細胞傷害反応を活性化し、形質導入細胞を殺傷する。別の実施形態においては、前記抗体またはそのフラグメントは細胞傷害薬に連結されている。抗体-細胞傷害薬複合体は、ＣＡＲおよびＨｅｒ２ｔを発現する細胞に結合し、これらの細胞を殺傷する。この方法によれば、毒性または有害な副作用に関連する投与細胞を除去することができる。
【０１５７】
その他のネガティブ選択可能な遺伝子も当技術分野において知られており、たとえば、ガンシクロビルに対する感受性を付与する単純ヘルペスウイルスＩ型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−Ｉ ＴＫ）遺伝子、細胞由来ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子、細胞由来アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）遺伝子、および細菌シトシンデアミナーゼなどが挙げられる。
【０１５８】
Ｔリンパ球に形質を導入するため、当技術分野において公知の様々な方法を使用することができる。いくつかの実施形態においては、レンチウイルスベクターを用いて形質導入を行う。
【０１５９】
いくつかの実施形態において
は、キメラ受容体をコードする発現ベクターを使用して、ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞をそれぞれ別々に改変し、所定の集団を形成することができる。いくつかの実施形態においては、細胞は、ＣＡＲおよび第１の遺伝子タグをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、ならびに／またはＣＡＲおよび第２の別の遺伝子タグをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを使用して、別々に改変することができる。いくつかの実施形態において、前記ＣＡＲ構築物は、同じものであっても異なるものであってもよい。たとえば、ＣＤ８ Ｔ細胞は、第１の遺伝子タグを有するＣＡＲ構築物で形質導入され、ＣＤ４ Ｔ細胞は、第２の遺伝子タグを有する同じＣＡＲで形質導入される。
【０１６０】
いくつかの実施形態においては、これらの細胞は、次いで、前述したナイーブ細胞の亜集団、セントラルメモリー細胞の亜集団、およびエフェクター細胞の亜集団のそれぞれに固有の細胞表面抗原でソートすることによって、これらの亜集団にソートされる。また、ＣＤ４＋細胞集団およびＣＤ８＋細胞集団は、それらのサイトカインプロファイルまたは増殖活動によって選択することができる。たとえば、抗原で刺激した後の、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＮＦα、および／またはＩＦＮγなどのサイトカインの産生が、偽形質導入細胞や形質導入ＣＤ８＋細胞よりも増強されたＣＤ４＋Ｔリンパ球を選択することができる。別の実施形態において、ＩＬ−２および／またはＴＮＦαの産生が増強されたナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞またはセントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞が選択される。同様に、偽形質導入ＣＤ８＋細胞よりもＩＦＮγの産生が増強されたＣＤ８＋細胞が選択される。いくつかの実施形態においては、ＣＤ４＋細胞集団およびＣＤ８＋細胞集団は、それらのサイトカインプロファイルまたは増殖活動によって選択される。いくつかの実施形態においては、抗原で刺激した後の、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＮＦα、および／またはＩＦＮγなどのサイトカインの産生が、偽形質導入細胞や形質導入ＣＤ８＋細胞よりも増強されたＣＤ４＋Ｔリンパ球が選択される。
【０１６１】
いくつかの実施形態においては、抗原を有する細胞に対して細胞傷害性を示すＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞が選択される。いくつかの実施形態においては、ＣＤ４＋細胞は、ＣＤ８＋細胞よりも低い細胞傷害性を示すと予想される。好ましい一実施形態においては、特定の種類のがんについて確立されたインビボ動物モデルにおいて、このがんの腫瘍細胞を殺傷する能力を発揮する形質導入リンパ球（たとえばＣＤ８＋セントラルメモリー細胞）が選択される。
【０１６２】
さらに
別の実施形態において、形質導入細胞は、遺伝子タグの発現によって選択される。いくつかの実施形態において、形質導入を行った後、たとえば、前記遺伝子タグに結合する抗体を使用して、Ｈｅｒ２ｔまたはＥＧＦＲｔを発現する細胞を選択する。いくつかの実施形態においては、前記抗体を使用することによって、遺伝子タグ陽性の細胞を少なくとも８０〜１００％含む細胞集団が選択される。
【０１６３】
選択された細胞は、ウェスタンブロットまたはフローサイトメトリーなどの技術を使って、導入遺伝子
の発現の評価をすることができる。いくつかの実施形態において、遺伝子タグの発現により選択された細胞は、たとえば、刺激ドメイン（たとえば、ＣＤ３ζ）の量、プロテインＬの量、およびＴ２Ａの量を分析することなどによって、ＣＡＲの発現がさらに評価される。いくつかの実施形態においては、ＣＡＲの発現と遺伝子タグの発現の比率が約１：０．１〜１０：０．１である細胞が選択される。いくつかの実施形態においては、ＣＡＲの発現と遺伝子タグの発現の比率が、１：０．１、２：０．１、３：０．１、４：０．１、５：０．１、６：０．１、７：０．１、８：０．１、９：０．１、もしくは１０：０．１である細胞、またはＣＡＲの発現と遺伝子タグの発現の比率が、これらの比率のいずれかの間にある細胞が選択される。いくつかの実施形態においては、ＣＡＲの発現が低い場合、ＥＧＦＲｔよりも導入遺伝子の発現レベルが良好なＨｅｒ２ｔ遺伝子タグを使用することができる。いくつかの実施形態において、Ｈｅｒ２ｔ遺伝子タグは、ＥＧＦＲｔ遺伝子タグの少なくとも１．５倍、２倍、５倍、もしくは１０倍の導入遺伝子発現の増加をもたらし、またはこれらの値のいずれか２つの間の倍率の導入遺伝子発現の増加をもたらす。
【０１６４】
さらに別の実施形態においては、特定の種類のがんについて確立されたインビボ動物モデルにおいて持続可能な、形質導入キメラ受容体発現Ｔ細胞が選択される。いくつかの実施形態においては、形質導入キメラ受容体ＣＤ８＋セントラルメモリー細胞は、インビボ動物モデルに導入後、約３日間以上、１０日間以上、２０日間以上、３０日間以上、４０日間以上、もしくは５０日間以上にわたって、またはこれらの値のいずれか２つの間にある任意の他の期間にわたってインビボで持続したことが示された。インビボにおける持続性は、Ｈｅｒ２ｔやＥＧＦＲｔなどの遺伝子タグに結合する検出可能な標識抗体を使用したイメージングによって測定することができる。
【０１６５】
本開示は、本発明の組成物においてＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の組み合わせを使用することを包含する。一実施形態において、キメラ受容体により形質導入されたＣＤ４＋細胞の組み合わせは、同じリガンドに特異的である形質導入キメラ受容体発現ＣＤ８＋細胞と組み合わせてもよく、あるいは異なる腫瘍リガンドおよび異なる遺伝子タグに特異的であるＣＤ８＋Ｔ細胞と組み合わせてもよい。別の実施形態においては、形質導入キメラ受容体発現ＣＤ８＋細胞は、腫瘍上に発現された別のリガンドに特異的な形質導入キメラ受容体発現ＣＤ４＋細胞と組み合わせる。さらに別の実施形態においては、キメラ受容体で改変されたＣＤ４＋細胞とＣＤ８＋細胞とを組み合わせる。いくつかの実施形態においては、ＣＤ８＋細胞とＣＤ４＋細胞は、様々な比率で組み合わせることができ、たとえば、ＣＤ８＋とＣＤ４＋とを１：１の比率で組み合わせることができ、ＣＤ８＋とＣＤ４＋とを１０：１の比率で組み合わせることができ、ＣＤ８＋とＣＤ４＋とを１００：１の比率で組み合わせることができ、またはこれらの比率のいずれか２つの間にある任意の他の比率でＣＤ８＋とＣＤ４＋とを組み合わせることができる。いくつかの実施形態においては、組み合わされた細胞集団は、インビトロおよび／またはインビボにおいて細胞増殖を試験し、細胞の増殖が見られる細胞比率を選択する。
【０１６６】
形質導入を行う前もしくは形質導入を行った後、および／またはキメラ受容体を有する細胞を選択する前もしくは選択した後に、得られた各細胞集団は、ヒト対象中への少なくとも１回の注入に十分な数に達するまでインビトロにおいて増殖させることが好ましく、少なくとも１回の注入に十分な細胞数としては、典型的には、約１０４細胞／ｋｇ〜１０９細胞／ｋｇが挙げられる。いくつかの実施形態においては、前記形質導入細胞は、抗原を有する細胞、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、およびＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、および／もしくはＩＬ−２１、またはそれらの組み合わせの存在下で培養される。
【０１６７】
ＣＤ４＋細胞の亜集団とＣＤ８＋細胞の亜集団とを組み合わせてもよい。特定の一実施形態においては、改変されたナイーブＣＤ４＋細胞またはセントラルメモリーＣＤ４＋細胞と、改変されたセントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞とを組み合わせることによって、抗原を有する細胞（たとえば腫瘍細胞）に対して相乗的な細胞傷害性効果を提供する。
【０１６８】
組成物
本発明の開示は、本明細書に記載の遺伝子改変Ｔリンパ球製剤を含む養子細胞免疫療法組成物を提供する。
【０１６９】
いくつかの実施形態においては、前記Ｔリンパ球製剤は、キメラ受容体を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を含み、該キメラ受容体は、本明細書に記載されているように、前記疾患または障害に関連するリガンドに特異的な細胞外抗体可変ドメイン、スペーサー領域、膜貫通ドメイン、Ｔ細胞受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン、および遺伝子タグを含む。別の実施形態においては、養子細胞免疫療法組成物は、キメラ受容体により改変された腫瘍特異的ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球製剤をさらに含み、該細胞傷害性Ｔリンパ球製剤が、細胞性免疫応答を提供し、キメラ受容体を有するＣＤ８＋Ｔ細胞を含み、該キメラ受容体が、本明細書に記載されているように、前記疾患または障害に関連するリガンドに特異的な細胞外一本鎖抗体、スペーサー領域、膜貫通ドメイン、Ｔ細胞受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン、および遺伝子タグを含むことを特徴とする。いくつかの実施形態においては、本発明において開示された、前記キメラ受容体により改変されたＴ細胞集団は、インビボにおいて少なくとも約３日またはそれ以上にわたって持続可能である。別の実施形態においては、前記の各細胞集団は互いに組み合わせることも、別の細胞種と組み合わせることもでき、これによって組成物が提供される。
【０１７０】
本発明の実施形態は、本明細書に記載のＣＤ４および／またはＣＤ８宿主細胞を包含する。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、
単離された核酸と、
第２のキメラ抗原受容体および第２の遺伝子タグをコードする第２の核酸とを含み、
前記単離された核酸は、たとえば、単離されたポリペプチドをコードする核酸であり、
該単離されたポリペプチドは、
配列番号２３において膜貫通ドメインに連結した５１１〜６５２番目または５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインからなるポリペプチドと少なくとも９５％の配列同一性を有し、
Ｈｅｒ２のドメインIVのエピトープに結合する抗体に特異的に結合することを特徴とする。
いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は造血幹細胞である。
【０１７１】
別の実施形態では、組成物は、
単離された第１の核酸を含む第１の宿主細胞と、
第２のキメラ抗原受容体および第２の遺伝子タグをコードする第２の核酸を含む第２の宿主細胞とを含み、
前記単離された核酸は、たとえば、単離されたポリペプチドをコードする核酸であり、
該単離されたポリペプチドは、
配列番号２３において膜貫通ドメインに連結した５１１〜６５２番目または５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインからなるポリペプチドと少なくとも９５％の配列同一性を有し、
Ｈｅｒ２のドメインIVのエピトープに結合する抗体に特異的に結合することを特徴とする。
いくつかの実施形態においては、前記第１宿主細胞および前記第２の宿主細胞は、同じ種類の宿主細胞であっても異なる種類の宿主細胞であってもよく、たとえば、前記第１の宿主細胞がＣＤ８セントラルメモリー細胞であり、かつ前記第２の宿主細胞がナイーブＣＤ４細胞であってもよい。いくつかの実施形態においては、第１の宿主細胞および第２の宿主細胞はそれぞれ、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ４ナイーブＴ細胞、ＣＤ８ナイーブＴ細胞、ＣＤ８セントラルメモリー細胞、ＣＤ４セントラルメモリー細胞およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【０１７２】
いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ４＋ヘルパーリンパ球は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞であり、該ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ−Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞、およびＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。
【０１７３】
いくつかの実施形態においては、前記細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞およびバルクＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態においては、前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球は、セントラルメモリーＴ細胞であり、該セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞、ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。さらに別の実施形態では、前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球はセントラルメモリーＴ細胞であり、前記ＣＤ４＋ヘルパーＴリンパ球はナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞またはセントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞である。
【０１７４】
方法
本発明の開示は、養子免疫療法組成物の製造方法、および、疾患または障害を有する対象において細胞免疫療法を行うための、該組成物の使用、または疾患または障害を有する対象において組成物を使用して細胞免疫療法を行う方法を提供する。
【０１７５】
本発明の実施形態は、本明細書に記載の宿主細胞を含む組成物の製造方法を包含する。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、
単離された核酸を宿主細胞に導入すること、および
少なくとも１つの増殖因子を含む培地中で前記宿主細胞を培養することを含み、
前記単離された核酸は、たとえば、単離されたポリペプチドをコードする核酸であり、
該単離されたポリペプチドは、
配列番号２３において膜貫通ドメインに連結した５１１〜６５２番目または５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインからなるポリペプチドと少なくとも９５％の配列同一性を有し、
Ｈｅｒ２のドメインIVのエピトープに結合する抗体に特異的に結合することを特徴とする。
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、前記培養工程の前もしくは後またはその前後に、Ｈｅｒ２ｔを発現している宿主細胞を選択することをさらに含む。別の実施形態においては、本発明の製造方法は、第２のキメラ抗原受容体および第２の遺伝子タグをコードする第２の核酸を前記宿主細胞に導入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記培養工程の前もしくは後またはその前後に、前記第２の遺伝子タグを発現している宿主細胞を選択することをさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は造血幹細胞である。
【０１７６】
別の実施形態では、本発明の方法は、
単離された第１の核酸を第１の宿主細胞に導入すること、
Ｈｅｒ２ｔを発現している第１の宿主細胞を選択すること、
第２のキメラ抗原受容体および第２の遺伝子タグをコードする第２の核酸を第２の宿主細胞に導入すること、
前記第２の遺伝子タグを発現している第２の宿主細胞を選択すること、ならびに
任意に、少なくとも１つの増殖因子を含む培地中で前記第１の宿主細胞および第２の宿主細胞を培養することを含み、
前記核酸が、たとえば、配列番号２３において膜貫通ドメインに連結した５１１〜６５２番目または５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインからなるポリペプチドと少なくとも９５％の配列同一性を有する単離されたポリペプチドをコードする核酸であること、ならびに
該単離されたポリペプチドが、Ｈｅｒ２のドメインIVのエピトープに結合する抗体に特異的に結合することを特徴とする方法が提供される。
別の実施形態では、組成物は第１の宿主細胞集団および第２の宿主細胞集団を含む。
【０１７７】
いくつかの実施形態においては、前記組成物の製造方法は、改変されたナイーブＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞またはセントラルメモリーＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞を得ることを含み、前記改変されたヘルパーＴリンパ球製剤が、キメラ受容体を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を含み、該キメラ受容体が、本明細書に記載されているように、腫瘍細胞の表面分子に特異的なリガンド結合ドメイン、スペーサードメイン、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメインおよび遺伝子タグを含むことを特徴とする。
【０１７８】
別の一実施形態においては、本発明の方法は、改変されたＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞を得ることをさらに含み、前記改変されたセントラルメモリーＣＤ８ Ｔリンパ球製剤が、キメラ受容体を有するＣＤ８＋細胞を含み、該キメラ受容体が、本明細書に記載されているように、腫瘍細胞の表面分子に特異的なリガンド結合ドメイン、スペーサードメイン、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメインおよび遺伝子タグを含むことを特徴とする。別の実施形態では、ＣＤ８＋細胞は、誘導可能なプロモーターの制御下にあるサイトカイン受容体またはケモカイン受容体を有する。
【０１７９】
前記改変されたＣＤ４＋Ｔ細胞および前記改変されたＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞におけるキメラ抗原受容体および遺伝子タグは、同じものであっても異なるものであってもよい。たとえば、前記改変されたＣＤ４＋Ｔ細胞が第１のＣＡＲおよび第１の遺伝子タグを有し、前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞が、第１のＣＡＲおよび第１の遺伝子タグとは異なる第２のＣＡＲおよび第２の遺伝子タグを有するＣＤ８＋細胞を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋細胞集団およびＣＤ８＋細胞集団において前記ポリヌクレオチドによってコードされるキメラ抗原受容体は、同じものであってもよい。これらの２種のＣＡＲ構築物の差異としては、抗原またはエピトープに対するリガンド結合ドメインの特異性または親和性、スペーサー領域の長さおよび配列、ならびに細胞内シグナル伝達成分が挙げられる。
【０１８０】
キメラ受容体で改変されたＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞の調製は、上記および実施例で説明したとおりである。抗原特異的Ｔリンパ球は、疾患または障害を有する患者から得ることができ、また、抗原の存在下、インビトロにおいてＴリンパ球を刺激することによっても調製することができる。抗原特異性によって選択されなかったＣＤ４＋Ｔリンパ球亜集団およびＣＤ８＋Ｔリンパ球亜集団も本明細書に記載の方法で単離することができ、前記製造方法に組み込むことができる。細胞集団は、Ｈｅｒ２ｔおよび／またはＥＧＦＲｔなどの、１つ以上の遺伝子タグの発現により選択すると有利である。
【０１８１】
いくつかの実施形態においては、このような細胞集団の組み合わせは、細胞表面マーカーの均一性、すなわち少なくとも２世代にわたり増殖する能力を評価して、均一な細胞分化状態を有するかどうかを確認することができる。品質管理は、前記遺伝子タグの発現に対するＣＡＲの発現の比を測定することによって行うことができる。前記キメラ受容体により改変されたＴ細胞の細胞分化状態および細胞表面マーカーは、フローサイトメトリーによって測定することができる。いくつかの実施形態において、前記ＣＤ８＋細胞の前記マーカーおよび細胞分化状態は、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４５ＲＯおよび／またはＣＤ４５ＲＡを含む。いくつかの実施形態において、前記ＣＤ４＋細胞の前記マーカーおよび細胞分化状態は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４、ＣＤ４５ＲＯおよび／またはＣＤ４５ＲＡを含む。
【０１８２】
いくつかの実施形態においては、本明細書に記載のキメラ受容体により改変されたＴ細胞は、インビボにおいて少なくとも３日間または少なくとも１０日間にわたって持続可能である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のキメラ受容体により改変されたＴ細胞は、インビボにおいて少なくとも３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日もしくは１０日にわたって、またはこれらの時間点のいずれか２つにより定義される範囲にある任意の時間にわたって持続することができる。いくつかの実施形態においては、前記キメラ受容体により改変されたＴ細胞は、ＣＦＳＥ色素希釈により測定した場合、少なくとも２世代または少なくとも３世代をわたってインビボで増殖することができる。前記キメラ受容体により改変されたＴ細胞の増殖および持続性は、前記疾患または障害の動物モデルを使用し、該細胞を投与し、次いで、アービタックス（ＥＧＦＲｔ）および／またはハーセプチン（Ｈｅｒ２ｔ）などの、前記遺伝子タグに結合しかつ検出可能な標識で標識された抗体を使用して前記細胞の検出を行うことで、移入された該細胞の持続能力および／または増殖能力を測定することにより評価することができる。導入遺伝子を発現する細胞をインビボで検出するための抗体または抗原結合フラグメントを使用する場合、抗体または抗原結合フラグメントは、ＡＤＣＣ反応を最小限にするため、Ｆｃ部分を含まないことが好ましい。別の実施形態のいくつかにおいて、増殖および活性化は、抗原を有する細胞を使用して複数回にわたって活性化することによって、インビトロで試験することができる。
【０１８３】
また、本発明の開示は、疾患または障害を有する対象において細胞免疫療法を行う方法であって、本明細書に記載の1つ以上のキメラ抗原受容体および遺伝子タグを発現するリンパ球を含む組成物を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、疾患または障害を有する対象において細胞免疫療法を行う方法であって、１つ以上のキメラ抗原受容体および遺伝子タグを発現するリンパ球を含む組成物を投与することを含む方法が提供される。
【０１８４】
いくつかの実施形態は、腫瘍抗原を発現しているがん患者を治療する方法であって、本明細書に記載の組成物の有効量を投与することを含み、該組成物中の前記細胞が、がん細胞上に発現される腫瘍抗原に結合する抗原結合ドメインと遺伝子タグとを含むキメラ抗原受容体を発現することを特徴とする方法を包含する。いくつかの実施形態においては、前記がんは、前記細胞上の前記キメラ抗原受容体によって認識される腫瘍抗原を有する。いくつかの実施形態では、前記がんは、乳がん、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、リンパ腫、ＡＬＬ、ＣＬＬおよび多発性骨髄腫からなる群から選択される。
【０１８５】
いくつかの実施形態においては、腫瘍抗原を発現しているがん患者を治療する方法は、本明細書に記載の組成物の有効量を投与することを含み、該組成物中の前記細胞は、がん細胞上に発現される腫瘍抗原に結合する抗原結合ドメインと第１の遺伝子タグとを含む第１のキメラ抗原受容体、およびがん細胞上に発現される腫瘍抗原に結合する抗原結合ドメインと第２の遺伝子タグとを含む第２のキメラ抗原受容体を発現する。
【０１８６】
いくつかの実施形態においては、腫瘍抗原を発現しているがん患者を治療する方法は、組成物の有効量を投与することを含み、該組成物は、がん細胞上に発現される腫瘍抗原に結合する抗原結合ドメインと第１の遺伝子タグとを含む第１のキメラ抗原受容体を発現する第１の宿主細胞、およびがん細胞上に発現される腫瘍抗原に結合する抗原結合ドメインと第２の遺伝子タグとを含む第２のキメラ抗原受容体を含む第２の宿主細胞を含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は造血幹細胞である。
【０１８７】
別の実施形態では、がんを有するかつ／または腫瘍抗原を発現している患者を治療する方法であって、本明細書に記載の組成物の有効量と、前記遺伝子タグに特異的に結合する抗体とを投与することを含み、該組成物中の前記細胞が、がん細胞上に発現される腫瘍抗原に結合する抗原結合ドメインと遺伝子タグとを含むキメラ抗原受容体を発現することを特徴とする方法が提供される。いくつかの実施形態においては、前記抗体は、Ｈｅｒ２のドメインIVに結合するか、ＥＧＦＲｔに結合する。いくつかの実施形態においては、前記抗体は、ハーセプチンまたはアービタックスである。
【０１８８】
いくつかの実施形態において、組成物の毒性作用が見られる場合には、前記遺伝子タグに結合する抗体が投与される。該抗体は、前記組成物中の前記ＣＡＲ発現細胞に結合し、これを殺傷することによって、毒性および／または致命的な副作用を回避することができる。いくつかの実施形態においては、前記抗体または抗原結合フラグメントは、ＡＤＣＣ反応を活性化するために、Ｆｃフラグメントを含むことが好ましい。別の実施形態においては、前記抗体または抗原結合フラグメントは、細胞傷害薬に結合されている。細胞傷害薬としては、cantansinoid、カリチアマイシンおよび／またはオーリスタチンが挙げられる。いくつかの実施形態において、前記細胞傷害薬は、cantansinoid、カリチアマイシンおよび／またはオーリスタチンを含む。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、インビボ
において細胞の追跡を可能にするため、抗体は検出可能な標識で標識される。いくつかの実施形態において、インビボでの検出に抗体を使用する場合、ＡＤＣＣ反応を回避するため、前記抗体または抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域全体またはその一部を含んでいないことが好ましい。検出可能な標識としては、ビオチン、Hisタグ、mycタグ、放射標識、および／または蛍光標識が挙げられる。いくつかの実施形態において、検出可能な標識は、ビオチン、Hisタグ、mycタグ、放射標識、および／または蛍光標識を含む。
【０１９０】
別の実施形態においては、本発明の方法は、
遺伝子改変細胞傷害性Ｔリンパ球製剤および／または遺伝子改変ヘルパーＴリンパ球製剤を対象に投与することを含み、
前記細胞傷害性Ｔリンパ球製剤が、細胞性免疫応答を提供し、かつキメラ受容体を有するＣＤ８＋Ｔ細胞を含み、該キメラ受容体が、本明細書に記載されているように、腫瘍細胞の表面分子に特異的なリガンド結合ドメイン、スペーサードメイン、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメインおよび第１の遺伝子タグを含むこと、ならびに
前記ヘルパーＴリンパ球製剤が、腫瘍の直接認識を誘導するとともに、前記遺伝子改変細胞傷害性Ｔリンパ球製剤が細胞性免疫応答を媒介する能力を増強し、かつキメラ受容体を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を含み、該キメラ受容体が、腫瘍細胞の表面分子に特異的なリガンド結合ドメイン、スペーサードメイン、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメインおよび第２の遺伝子タグを含むことを特徴とする。
【０１９１】
別の一実施形態は、疾患または障害を有する対象において細胞免疫療法を行う方法であって、
前記対象の生体試料を分析して、前記疾患または障害に関連する標的分子の存在を検出すること、および
本明細書に記載の養子免疫療法組成物を投与することを含み、前記キメラ受容体が、前記標的分子に特異的に結合することを特徴とする方法に関する。
【０１９２】
本発明によって治療することができる対象は、通常、ヒトまたは他の霊長類の対象であり、たとえば、獣医学の対象となるサルおよび類人猿である。対象は雄性でも雌性でもよく、任意の適切な年齢であってもよく、たとえば、幼児、幼年者、若年者、成人、および高齢者の対象が挙げられる。いくつかの実施形態では、前記対象は霊長類である対象またはヒトである。
【０１９３】
本発明の方法は、たとえば、血液悪性腫瘍、黒色腫、乳がん、その他の上皮悪性腫瘍または固形腫瘍の治療に有用である。いくつかの実施形態において、これらの疾患または障害と関連する分子は、オーファンチロシンキナーゼ受容体ＲＯＲ１、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、ＣＥ７、ｈＢ７Ｈ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン（mesothelin）、ＣＥＡ、およびＢ型肝炎表面抗原からなる群から選択される。
【０１９４】
治療可能な対象としては、がんに罹患した対象が挙げられ、該がんとしては、大腸がん、肺がん、肝臓がん、乳がん、腎臓がん、前立腺がん、卵巣がん、皮膚がん（黒色腫を含む）、骨がん、および脳がんなどが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態においては、腫瘍関連抗原または腫瘍関連分子が知られており、該腫瘍としては、黒色腫、乳がん、扁平上皮腫、大腸がん、白血病、骨髄腫、および前立腺がんなどが挙げられる。別の実施形態においては、前記腫瘍関連分子は、遺伝子改変キメラ受容体を発現する遺伝子改変Ｔ細胞で標的化することができる。前記がんとしては、Ｂ細胞リンパ腫、乳がん、前立腺がん、および白血病が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、前記対象は、Ｂ細胞リンパ腫、乳がん、前立腺がん、および／または白血病を有する。
【０１９５】
前述のように製造された細胞は、本発明の開示を踏まえ、当業者であれば容易に理解できる公知の技術またはその変法に従って、養子免疫療法のための方法および組成物において使用することができる。
【０１９６】
いくつかの実施形態において、前記細胞の製剤化は、まず該細胞を培地から回収し、次いで該細胞を洗浄し、投与に適した培地および容器システム（「薬学的に許容され得る」担体）中において該細胞を治療有効量まで濃縮することによって行われる。適切な注入用培地は、任意の等張性培地製剤であってもよく、典型的には、生理食塩水、Normosol R（アボット）もしくはPlasma-Lyte A（バクスター）、５％デキストロース水溶液、または乳酸リンゲル液を使用することができる。前記注入用培地には、ヒト血清アルブミン、ウシ胎児血清、またはその他のヒト血清成分を添加してもよい。
【０１９７】
いくつかの実施形態において、組成物中の細胞の治療有効量とは、形質導入されたＣＤ４細胞もしくはＣＤ８細胞の量、または少なくとも２つの細胞サブセット（たとえば、ＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞の１つのサブセットとＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の１つのサブセット）の量を指し、より典型的には、１０２個を超えかつ１０６個以下の細胞であり、または１０８個以下または１０９個以下の細胞であり、たとえば、１０８個または１０９個であってもよく、１０１０個を超える数の細胞であってもよく、またはこれらの値のいずれかの２つにより示されるエンドポイントの間にある任意の細胞数であってもよい。
【０１９８】
細胞の数は、前記組成物の最終的な用途や、該組成物に含まれる細胞種などによって決定される。たとえば、特定の抗原に特異的な細胞が所望される場合、前記集団を占める該細胞の割合は７０％を超え、一般的には、８０％を超え、８５％を超え、あるいは前記集団全体の９０〜９５％を占め、またはこれらのパーセンテージのいずれか２つによって定義される範囲にある任意のパーセンテージを占める。
【０１９９】
本明細書に記載の用途において、前記細胞の量は通常１Ｌ以下でありかつ１ｎｌより多くてもよく、５００ｍｌ以下でありかつ１ｎｌより多くてもよく、さらには２５０ｍｌ以下もしくは１００ｍｌ以下でありかつ１ｎｌより多くてもよく、これらの値のいずれかにより示される２つエンドポイントの間にある任意の量であってもよい。
【０２００】
したがって、前記所望の細胞の密度は、典型的には、１０４細胞／ｍｌよりも大きく、通常１０７細胞／ｍｌよりも大きく、通常１０８細胞／ｍｌ以上である。臨床用途に適したこのような数の免疫細胞は、複数の注入に分割して投与してもよく、その累積投与量は１０６個、１０７個、１０８個、１０８個、１０９個、１０１０個、もしくは１０１１個の細胞、もしくはこれらの細胞数以上の細胞、またはこれらの量のうちの２つによって定義される範囲にある任意の細胞数に相当する。
【０２０１】
いくつかの実施形態において、前記リンパ球は、個体に免疫を付与するために使用することができる。「免疫」は、病原体の感染に対する応答またはリンパ球反応の標的となる腫瘍に対する応答に伴う１つ以上の身体症状を軽減することを意味する。前記細胞の投与量は、通常、病原体に対する免疫を備える正常個体の体内に存在する量の範囲内である。したがって、細胞は、通常、注入によって投与され、１回の注入あたり２個以上から少なくとも１０６個〜３×１０１０個までの範囲の数の細胞が投与され、少なくとも１０７個〜１０９個の細胞を注入することが好ましく、またはこれらの量のうちの２つによって定義される範囲にある任意の細胞数であってもよい。
【０２０２】
前記Ｔ細胞は、単回の注入によって、または特定の期間における複数回の注入によって投与することができる。しかしながら、個体によって反応性が異なると考えられるため、注入する細胞の種類および細胞の量、ならびに注入の回数および複数回の注入を実施する期間は主治医によって決定され、日常的な検査によっても決定することができる。十分な量のＴリンパ球（細胞傷害性Ｔリンパ球および／またはヘルパーＴリンパ球を含む）の作製は、本明細書に例示したような、本発明による迅速な増殖方法を用いて容易に行うことができる。
【０２０３】
いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の組成物は、静脈内投与、腹腔内投与、腫瘍内投与、骨髄内投与、リンパ節内投与、かつ／または脳脊髄液内投与される。いくつかの実施形態において、キメラ受容体により遺伝子改変された前記組成物は、腫瘍部位に送達される。あるいは、本明細書に記載の組成物は、本発明の細胞を腫瘍または免疫コンパートメントに標的化させるとともに、肺などの部位を避けることが可能な化合物と組み合わせることができる。
【０２０４】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、化学療法剤および／または免疫抑制剤とともに投与される。別の一実施形態においては、まず、本発明の免疫細胞以外の免疫細胞を抑制または殺傷する化学療法剤で患者を処置してから、本明細書に記載の組成物を投与する。場合によっては、化学療法を完全に省いてもよい。後述の実施例において、本発明をさらに説明する。
【０２０５】
さらなる実施形態
いくつかの実施形態においては、単離されたポリペプチドであって、
配列番号２３において膜貫通ドメインに連結した５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインからなるポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、
Ｈｅｒ２のドメインIVのエピトープに結合する抗体に特異的に結合すること、および
完全長成熟ＨＥＲ２ではないことを特徴とする単離されたポリペプチドが提供される。
いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、配列番号２３の５８０番目のグルタミン酸、５８２番目のアスパラギン酸、５９２番目のアスパラギン酸、５９５番目のフェニルアラニンおよび６２４番目のグルタミンを含む。いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、配列番号２３の５６３〜６５２番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは、配列番号２３の６５３〜６７５番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、前記単離されたポリペプチドは、細胞表面発現を可能とするリーダーペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記リーダーペプチドは配列番号１７で表される配列を有する。いくつかの実施形態では、前記抗体はトラスツズマブである。
【０２０６】
いくつかの実施形態においては、単離されたポリペプチドであって、
配列番号２３において膜貫通ドメインに連結した５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインからなるポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、
Ｈｅｒ２のドメインIVのエピトープに結合する抗体に特異的に結合すること、
完全長成熟ＨＥＲではないこと、および
前記配列番号２３の５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインが、GGGSGGGS（配列番号４５）で示されるアミノ酸を含む配列を介して前記膜貫通ドメインに連結されていることを特徴とする単離されたポリペプチドが提供される。
いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、配列番号２３の５８０番目のグルタミン酸、５８２番目のアスパラギン酸、５９２番目のアスパラギン酸、５９５番目のフェニルアラニンおよび６２４番目のグルタミンを含む。いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、配列番号２３の５６３〜６５２番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは、配列番号２３の６５３〜６７５番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、前記単離されたポリペプチドは、細胞表面発現を可能とするリーダーペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記リーダーペプチドは、配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記抗体はトラスツズマブである。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドをコードする単離された核酸が提供される。
いくつかの実施形態においては、前記単離されたポリペプチドは、
配列番号２３において膜貫通ドメインに連結した５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインからなるポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、
Ｈｅｒ２のドメインIVのエピトープに結合する抗体に特異的に結合すること、および
完全長成熟ＨＥＲ２ではないことを特徴とする。
いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、配列番号２３の５８０番目のグルタミン酸、５８２番目のアスパラギン酸、５９２番目のアスパラギン酸、５９５番目のフェニルアラニンおよび６２４番目のグルタミンを含む。いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、配列番号２３の５６３〜６５２番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは、配列番号２３の６５３〜６７５番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、前記単離されたポリペプチドは、細胞表面発現を可能とするリーダーペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記リーダーペプチドは配列番号１７で表される配列を有する。いくつかの実施形態では、前記抗体はトラスツズマブである。
いくつかの実施形態においては、前記単離されたポリペプチドは、
配列番号２３において膜貫通ドメインに連結した５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインからなるポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、
Ｈｅｒ２のドメインIVのエピトープに結合する抗体に特異的に結合すること、
完全長成熟ＨＥＲではないこと、および
前記配列番号２３の５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインが、GGGSGGGS（配列番号４５）で示されるアミノ酸を含む配列を介して前記膜貫通ドメインに連結されていることを特徴とする。
いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、配列番号２３の５８０番目のグルタミン酸、５８２番目のアスパラギン酸、５９２番目のアスパラギン酸、５９５番目のフェニルアラニンおよび６２４番目のグルタミンを含む。いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、配列番号２３の５６３〜６５２番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは、配列番号２３の６５３〜６７５番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、前記単離されたポリペプチドは、細胞表面発現を可能とするリーダーペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記リーダーペプチドは、配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記抗体はトラスツズマブである。いくつかの実施形態では、前記単離された核酸はプロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記単離された核酸は導入遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、抗原結合ドメイン、スペーサードメイン、膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、自己切断リンカーを有する前記ＨＥＲ２ポリペプチドをコードする前記核酸に連結されている。
いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、
配列番号２３において膜貫通ドメインに連結した５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインからなるポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、
Ｈｅｒ２のドメインIVのエピトープに結合する抗体に特異的に結合すること、および
完全長成熟ＨＥＲ２ではないことを特徴とする。
いくつかの実施形態においては、前記自己切断リンカーは、配列L E G G G E G R G S L L T C G（配列番号２６）を有するＴ２Ａリンカーである。いくつかの実施形態においては、前記キメラ抗原受容体は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記キメラ抗原受容体は、配列番号２５（ＣＤ２０ＣＡＲ）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記単離された核酸の大きさとしては、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂもしくは１４．９ｋｂ、またはこれらの大きさのいずれか２つの間にある任意の大きさが挙げられる。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドをコードする単離された核酸を含む宿主細胞が提供される。
いくつかの実施形態においては、前記単離されたポリペプチドは、
配列番号２３において膜貫通ドメインに連結した５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインからなるポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、
Ｈｅｒ２のドメインIVのエピトープに結合する抗体に特異的に結合すること、および
完全長成熟ＨＥＲ２ではないことを特徴とする。
いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、配列番号２３の５８０番目のグルタミン酸、５８２番目のアスパラギン酸、５９２番目のアスパラギン酸、５９５番目のフェニルアラニンおよび６２４番目のグルタミンを含む。いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、配列番号２３の５６３〜６５２番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは、配列番号２３の６５３〜６７５番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、前記単離されたポリペプチドは、細胞表面発現を可能とするリーダーペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記リーダーペプチドは配列番号１７で表される配列を有する。いくつかの実施形態では、前記抗体はトラスツズマブである。
いくつかの実施形態においては、前記単離されたポリペプチドは、配列番号２３において膜貫通ドメインに連結した５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインからなるポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、
Ｈｅｒ２のドメインIVのエピトープに結合する抗体に特異的に結合すること、
完全長成熟ＨＥＲではないこと、および
前記配列番号２３の５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインが、GGGSGGGS（配列番号４５）で示されるアミノ酸を含む配列を介して前記膜貫通ドメインに連結されていることを特徴とする。
いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、配列番号２３の５８０番目のグルタミン酸、５８２番目のアスパラギン酸、５９２番目のアスパラギン酸、５９５番目のフェニルアラニンおよび６２４番目のグルタミンを含む。いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、配列番号２３の５６３〜６５２番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは、配列番号２３の６５３〜６７５番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、前記単離されたポリペプチドは、細胞表面発現を可能とするリーダーペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記リーダーペプチドは、配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記抗体はトラスツズマブである。いくつかの実施形態では、前記単離された核酸はプロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記単離された核酸は導入遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、抗原結合ドメイン、スペーサードメイン、膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、自己切断リンカーを有する前記ＨＥＲ２ポリペプチドをコードする前記核酸に連結されている。
いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、
配列番号２３において膜貫通ドメインに連結した５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインからなるポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、
Ｈｅｒ２のドメインIVのエピトープに結合する抗体に特異的に結合すること、および
完全長成熟ＨＥＲ２ではないことを特徴とする。
いくつかの実施形態においては、前記自己切断リンカーは、配列L E G G G E G R G S L L T C G（配列番号２６）を有するＴ２Ａリンカーである。いくつかの実施形態においては、前記キメラ抗原受容体は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記キメラ抗原受容体は、配列番号２５（ＣＤ２０ＣＡＲ）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ４ナイーブＴ細胞、ＣＤ８ナイーブＴ細胞、ＣＤ８セントラルメモリー細胞、ＣＤ４セントラルメモリー細胞およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は自己由来である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は抗原特異的である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記単離された核酸の大きさとしては、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂもしくは１４．９ｋｂ、またはこれらの大きさのいずれか２つの間にある任意の大きさが挙げられる。
【０２０９】
いくつかの実施形態においては、ポリペプチドをコードする単離された核酸を含む宿主細胞を含む組成物が提供される。
いくつかの実施形態においては、前記単離されたポリペプチドは、
配列番号２３において膜貫通ドメインに連結した５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインからなるポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、
Ｈｅｒ２のドメインIVのエピトープに結合する抗体に特異的に結合すること、および
完全長成熟ＨＥＲ２ではないことを特徴とする。
いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、配列番号２３の５８０番目のグルタミン酸、５８２番目のアスパラギン酸、５９２番目のアスパラギン酸、５９５番目のフェニルアラニンおよび６２４番目のグルタミンを含む。いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、配列番号２３の５６３〜６５２番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは、配列番号２３の６５３〜６７５番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、前記単離されたポリペプチドは、細胞表面発現を可能とするリーダーペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記リーダーペプチドは配列番号１７で表される配列を有する。いくつかの実施形態では、前記抗体はトラスツズマブである。
いくつかの実施形態においては、前記単離されたポリペプチドは、
配列番号２３において膜貫通ドメインに連結した５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインからなるポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、
Ｈｅｒ２のドメインIVのエピトープに結合する抗体に特異的に結合すること、
完全長成熟ＨＥＲではないこと、および
前記配列番号２３の５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインが、GGGSGGGS（配列番号４５）で示されるアミノ酸を含む配列を介して前記膜貫通ドメインに連結されていることを特徴とする。
いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、配列番号２３の５８０番目のグルタミン酸、５８２番目のアスパラギン酸、５９２番目のアスパラギン酸、５９５番目のフェニルアラニンおよび６２４番目のグルタミンを含む。いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、配列番号２３の５６３〜６５２番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは、配列番号２３の６５３〜６７５番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、前記単離されたポリペプチドは、細胞表面発現を可能とするリーダーペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記リーダーペプチドは、配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記抗体はトラスツズマブである。いくつかの実施形態では、前記単離された核酸はプロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記単離された核酸は導入遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、抗原結合ドメイン、スペーサードメイン、膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、自己切断リンカーを有する前記ＨＥＲ２ポリペプチドをコードする前記核酸に連結されている。
いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、
配列番号２３において膜貫通ドメインに連結した５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインからなるポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、
Ｈｅｒ２のドメインIVのエピトープに結合する抗体に特異的に結合すること、および
完全長成熟ＨＥＲ２ではないことを特徴とする。
いくつかの実施形態においては、前記自己切断リンカーは、配列L E G G G E G R G S L L T C G（配列番号２６）を有するＴ２Ａリンカーである。いくつかの実施形態においては、前記キメラ抗原受容体は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記キメラ抗原受容体は、配列番号２５（ＣＤ２０ＣＡＲ）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ４ナイーブＴ細胞、ＣＤ８ナイーブＴ細胞、ＣＤ８セントラルメモリー細胞、ＣＤ４セントラルメモリー細胞およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は自己由来である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は抗原特異的である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞はＴ細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記単離された核酸の大きさとしては、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂもしくは１４．９ｋｂ、またはこれらの大きさのいずれか２つの間にある任意の大きさが挙げられる。
【０２１０】
いくつかの実施形態においては、組成物の製造方法であって、
単離された核酸を宿主細胞に導入すること、および
少なくとも１つの増殖因子を含む培地中で前記宿主細胞を培養することを含む方法が提供される。
いくつかの実施形態においては、前記単離された核酸はポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態においては、前記単離されたポリペプチドは、
配列番号２３において膜貫通ドメインに連結した５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインからなるポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、
Ｈｅｒ２のドメインIVのエピトープに結合する抗体に特異的に結合すること、および
完全長成熟ＨＥＲ２ではないことを特徴とする。
いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、配列番号２３の５８０番目のグルタミン酸、５８２番目のアスパラギン酸、５９２番目のアスパラギン酸、５９５番目のフェニルアラニンおよび６２４番目のグルタミンを含む。いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、配列番号２３の５６３〜６５２番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは、配列番号２３の６５３〜６７５番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、前記単離されたポリペプチドは、細胞表面発現を可能とするリーダーペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記リーダーペプチドは配列番号１７で表される配列を有する。いくつかの実施形態では、前記抗体はトラスツズマブである。
いくつかの実施形態においては、前記単離されたポリペプチドは、
配列番号２３において膜貫通ドメインに連結した５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインからなるポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、
Ｈｅｒ２のドメインIVのエピトープに結合する抗体に特異的に結合すること、
完全長成熟ＨＥＲではないこと、および
前記配列番号２３の５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインが、GGGSGGGS（配列番号４５）で示されるアミノ酸を含む配列を介して前記膜貫通ドメインに連結されていることを特徴とする。
いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、配列番号２３の５８０番目のグルタミン酸、５８２番目のアスパラギン酸、５９２番目のアスパラギン酸、５９５番目のフェニルアラニンおよび６２４番目のグルタミンを含む。いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、配列番号２３の５６３〜６５２番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは、配列番号２３の６５３〜６７５番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、前記単離されたポリペプチドは、細胞表面発現を可能とするリーダーペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記リーダーペプチドは、配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記抗体はトラスツズマブである。いくつかの実施形態では、前記単離された核酸はプロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記単離された核酸は導入遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、抗原結合ドメイン、スペーサードメイン、膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、自己切断リンカーを有する前記ＨＥＲ２ポリペプチドをコードする前記核酸に連結されている。
いくつかの実施形態においては、前記ＨＥＲ２ポリペプチドは、
配列番号２３において膜貫通ドメインに連結した５６３〜６５２番目のアミノ酸配列を有するＨＥＲ２ポリペプチド細胞外ドメインからなるポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、
Ｈｅｒ２のドメインIVのエピトープに結合する抗体に特異的に結合すること、および
完全長成熟ＨＥＲ２ではないことを特徴とする。
いくつかの実施形態においては、前記自己切断リンカーは、配列L E G G G E G R G S L L T C G（配列番号２６）を有するＴ２Ａリンカーである。いくつかの実施形態においては、前記キメラ抗原受容体は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記キメラ抗原受容体は、配列番号２５（ＣＤ２０ＣＡＲ）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ４ナイーブＴ細胞、ＣＤ８ナイーブＴ細胞、ＣＤ８セントラルメモリー細胞、ＣＤ４セントラルメモリー細胞およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は自己由来である。いくつかの実施形態においては、前記宿主細胞は抗原特異的である。いくつかの実施形態においては、前記増殖因子は、ＩＬ−１５、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＩＬ−２およびこれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態においては、前記方法は、前記Ｈｅｒ２ｔポリペプチドを発現している細胞を選択することをさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記細胞は、前記培地中での培養前に選択される。いくつかの実施形態においては、前記細胞は、Ｈｅｒ２のドメインIVに結合する抗体を使用して選択する。いくつかの実施形態では、前記抗体はトラスツズマブである。いくつかの実施形態においては、前記方法は、第２の遺伝子タグに連結されたキメラ抗原受容体をコードする第２の単離された核酸を導入することをさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記方法は、前記第２の遺伝子タグを発現している細胞を選択することをさらに含む。いくつかの実施形態においては、前記第２の遺伝子タグはＥＧＦＲｔを含む。
【０２１１】
Ｈｅｒ２ｔマーカー配列を有するＣＡＲを含む形質導入細胞の調製を以下に述べる。
【実施例】
【０２１２】
抗体およびフローサイトメトリー
蛍光色素標識アイソタイプコントロール、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ４５、Ｈｅｒ２、およびストレプトアビジンはBD Biosciencesから入手した。セツキシマブ（アービタックス）およびトラスツズマブ（ハーセプチン）はシアトル小児病院から購入した。製造元の説明書に従って、アービタックスおよびハーセプチンをビオチン化（Pierce）するか、あるいはＡＰＣ（Solulink）に直接結合させた。データは、LSRFortessa（BD Biosciences）測定し、分析した領域中の細胞のパーセンテージは、FlowJoデータ解析ソフトウェアを使用して算出した。
【０２１３】
細胞株
別途の記載がない限り、細胞株はいずれも、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、２５ｍＭ HEPES（Irvine Scientific）および１０％加熱不活性化ウシ胎仔血清（HycloneまたはAtlas）を添加したRPMI 1640培地中で維持した。Ｋ５６２赤白血病標的細胞株は、Stanley Riddell博士（Ｆred Hutchinson Cancer Research Center）から提供を受けた。その他の細胞株、すなわちＨ９ Ｔリンパ芽球、Raji（ヒトバーキットリンパ腫）、および２９３Ｔ（高効率に遺伝子を導入することが可能なヒト胎児腎２９３細胞）は、American Type Culture Collectionから入手した。過去の報告（Pelloquin et al. 1986）に従って、エプスタインバーウイルスで形質転換したリンパ芽球様細胞株（TM-LCL）を末梢血単核球（PBMC）から作製した。GFP:ffluc発現細胞株をGFP:ffluc_epHIV7で形質導入し、BD FACSJazzソーターを使用してソートした。
【０２１４】
ベクターの構築およびＨｅｒ２ｔまたはＥＧＦＲｔをコードするレンチウイルスの作製
第２世代41BB-ζ CD19CAR-T2A-EGFRt_epHIV7レンチウイルス構築物は、過去に報告（Hudecek et al. 2013）されている（表１）。
【０２１５】
CD20CAR-T2A-EGFRt_epHIV7は、CD19CAR（4-1BB-ζ）
と同じシグナル伝達成分と、ＩｇＧ４のヒトＩｇＧ４ヒンジ−ＣＨ３（１１９アミノ酸長）スペーサードメイン部分に融合させたＬｅｕ１６（マウス抗ヒトＣＤ２０）ｓｃＦｖとを含む（表９）。
【０２１６】
pDONR223-ErbB2（Addgene）をテンプレートとして
用い、epHIV7レンチウイルスベクターをレシピエントとして使用して、Ｈｅｒ２ｔをＰＣＲにより合成した（表６および表８）。最終生成物であるHer2t_epHIV7は、ドメインIV（５６３〜６５２番目のアミノ酸）およびＨｅｒ２の膜貫通成分（６５３〜６７５番目のアミノ酸）にインフレームで融合させたヒト顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子受容体のリーダーペプチド（GMCSFRss）を含む。CD19CAR-T2A-EGFRt_epHIV7構築物は、ＰＣＲおよびGibsonクローニングによってＨｅｒ２ｔをＥＧＦＲｔで置換することにより作製した。ＥＧＦＲｔは、過去の報告（Wang et al. 2011）に従って合成した（表７）。
【０２１７】
CD19CAR-T2A-Her2tをコードするレンチウイルス、CD19CAR-T2A-EGFRtをコードするレンチウイルス、CD20CAR-T2A-EGFRtをコードするレンチウイルス、Ｈｅｒ２ｔをコードするレンチウイルス、およびＥＧＦＲｔをコードするレンチウイルスを、パッケージベクターpCHGP-2、pCMV-Rev2、およびpCMV-Gを使用して２９３Ｔ細胞
において産生させた。
【０２１８】
ＣＡＲ発現細胞株、Ｈｅｒ２ｔ発現細胞株および／またはＥＧＦＲｔ発現細胞株の作製
ＣＤ４セントラルメモリーＴ細胞またはＣＤ８セントラルメモリーＴ細胞を作製するため、Ficoll-Paque（Pharmacia Biotech）を使用して、健常ドナーの血液処分キット（Puget Sound Blood Center）からヒトＰＢＭＣを単離した。製造元のプロトコルに従って、各ドナー由来のＰＢＭＣを２つのグループ（ＣＤ４セントラルメモリーＴ細胞またはＣＤ８セントラルメモリーＴ細胞の単離用）に分け、次いで、ＣＤ４単離キットまたはＣＤ８単離キットおよび抗ＣＤ４５ＲＡマイクロビーズ（Miltenyi Biotec）を使用して、AutoMACSで不要な細胞を除去した。その後、抗ＣＤ６２Ｌマイクロビーズを使用して除去画分をAutoMACSでポジティブ選択し、CD4+CD45RO+CD62L+セントラルメモリーＴ細胞またはCD8+CD45RO+CD62L+セントラルメモリーＴ細胞を得た。次に、単離された細胞を５０Ｕ／ｍｌインターロイキン−２（ＩＬ−２）、２ｎｇ／ｍｌインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、および抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Life Technologies）で刺激した。初代Ｔ細胞株を硫酸プロタミン（１：１００希釈）およびＭＯＩ＝１のウイルスで活性化した３日目に形質導入を行い、３２℃、８００×ｇで４５分間遠心分離した。他の細胞株はいずれも少ない継代数で同様に形質導入した。
【０２１９】
ビオチン
で標識したハーセプチンまたはアービタックスと抗ビオチンマイクロビーズ（Miltenyi）とを使用して免疫磁気選択を行うことにより、各細胞株のＨｅｒ２ｔ＋サブセットまたはＥＧＦＲｔ＋サブセットを濃縮した。５０Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２および２ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１５の存在下、放射線照射（8000 rad）したＴＭ−ＬＣＬをＴ細胞：ＴＭ−ＬＣＬ＝１：７の比率で使用して、選択されたＣＤ１９ＣＡＲ＋Ｔ細胞またはＣＤ２０ＣＡＲ＋Ｔ細胞を刺激することによって、形質導入後１２〜１８日間増殖させた。ビオチン化ハーセプチンおよび抗ビオチンマルチソートマイクロビーズ（Miltenyi）を使用してCD19CAR-T2A-Her2t＋Ｔ細胞またはCD20CAR-T2A-EGFRt＋Ｔ細胞をソートし、次いでビーズを除去し、アービタックス−ＡＰＣで細胞を標識し、抗ＡＰＣマイクロビーズ（Miltenyi）を使用してソートした。
【０２２０】
タンパク質分析
プロテアーゼ阻害剤反応混液を含むＲＩＰＡ緩衝液中で細胞溶解を行った。細胞溶解物をＢＣＡアッセイ（Pierce）により分析し、ゲルに同量で載せ、Ｈｅｒ２一次抗体、phospho−Ｈｅｒ２一次抗体（いずれもCell Signaling Technology）、抗ＣＤ２４７（ＣＤ３ζ）、ビオチン化ハーセプチン、または抗βアクチン（ローディングコントロール）を使用してウェスタンブロットを行った。製造元の説明書に従って、IRDye800CW標識ストレプトアビジン二次抗体またはヤギ抗マウス抗体もしくはヤギ抗ウサギ抗体（LI-COR）を加えた。Odyssey赤外イメージングシステム（LI-COR）でブロットを画像化した。
【０２２１】
細胞傷害性、サイトカインの分泌、および増殖アッセイ
細胞傷害性：
過去の報告（Wang et al. 2011）に従って、４時間クロム放出アッセイを実施した。ＣＤ１９またはＣＤ２０を発現している５×１０３個のＣｒ５１標識Ｋ５６２細胞との共培養において、Ｈｅｒ２ｔマーカーを有するＣＤ１９ＣＡＲを発現しているＴｃｍ細胞、ＥＧＦＲｔマーカーを有するＣＤ２０ＣＡＲを発現しているＴｃｍ細胞、ＣＤ１９ＣＡＲ−Ｈｅｒ２ｔおよびＣＤ２０ＣＡＲ−ＥＧＦＲｔを発現しているＴｃｍ細胞、ならびにＥＧＦＲｔマーカー配列を有するＣＤ１９ＣＡＲを発現しているＴｃｍ細胞をエフェクター細胞として最大で２．５×１０５個使用して、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を測定した。
【０２２２】
サイトカインの分泌：
Ｔ細胞（５×１０５個）と標的細胞をＥ：Ｔ＝２：１の比率で９６ウェルプレートに三連で播種し、製造元の説明書に従ってBio-Plex Human Cytokine Panel（Bio-Rad）を使用して、上清をcytometric bead arrayにより解析した。
【０２２３】
増殖：
０．２μＭのカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ；Invitrogen）でＴ細胞を標識し、洗浄後、外因性サイトカインを含まない培地中に刺激細胞とともに三連で播種した。７２時間のインキュベーションの後、細胞を抗ＣＤ３で標識して生死染色法し、次いでフローサイトメトリーで分析して生存していたＣＤ３＋細胞の細胞分裂を評価した。
【０２２４】
インビボにおけるＴ細胞移植およびＡＤＣＣ
マウスを用いた実験は、Seattle Children’s Research Instituteの実験動物委員会によって承認された。NOD/Scid IL2RγCnullマウスをJackson Laboratoryから入手するか、研究所内で繁殖させた。
【０２２５】
移植：
６〜１０週齢のNOD/Scid IL2RγCnullマウスに、０日目において１０７個のＨｅｒ２ｔ／ＥＧＦＲｔ陰性（Mock）、選択されたＨｅｒ２ｔＴ細胞または選択されたＥＧＦＲｔＴ細胞を静脈内に注射し、５×１０６個の生存可能なNS0-IL15細胞を皮下に注射して、ヒトＩＬ−１５をインビボ全身に供給した。１４日後にマウスを屠殺して骨髄を採取し、BD Biosciencesから入手した抗ＣＤ４５、生死染色、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、ビオチン化ハーセプチン、ビオチン化アービタックス、およびストレプトアビジン−ＡＰＣを使用して、細胞懸濁液をフローサイトメトリーにより分析した。これとは別に、大腿骨を１０％のホルマリンで２４時間固定し、２時間脱灰し（Richard-Allan Scientific）、パラフィンに包埋した後、製造元の説明書に従って、抗ＣＤ４５（ＤＡＫＯ）、抗ＥＧＦＲ（クローン３１Ｇ７；Invitrogen）、またはビオチン化ハーセプチンおよびＳＡ−ＡＦ６４７を使用して免疫組織化学的染色を行い、Hoechstで対比染色した。同様に、Ｈｅｒ２＋細胞株またはＨｅｒ２ｔ＋細胞株をポリ−Ｌ−リシンを使用してスライドに接着させ、ビオチン化ハーセプチンおよびＳＡ−ＡＦ６４７を使用して染色した。Nuance FX Biomarker Imaging Systemを使用して蛍光像を取得した。
【０２２６】
統計解析
Prism Software（GraphPad）を使用して統計解析を行った。対応のある両側検定として、９５％の信頼区間でスチューデントのｔ検定を行い、０．０５未満のＰ値を有する結果を有意と見なした。生存の統計解析をログランク検定により行い、０．０５未満のＰ値を有する結果を有意と見なした。
【０２２７】
ヒトＥｒｂＢ２（Ｈｅｒ２）に基づいた多機能表面エピトープの設計および初期特性評価
養子療法戦略において臨床的成功を収め、再現性を高めるには、均質な免疫細胞製品を選択し、それを使用することが不可欠である。これを目的として、ヒトＨｅｒ２に基づいた非免疫原性エピトープ（Ｈｅｒ２ｔと呼ぶ）を、細胞を改変するための遺伝子タグ候補および遺伝子ツール候補として設計した（図１パネルＡ）。Ｈｅｒ２ｔはＨｅｒ２の細胞内成分を全く含んでいないが、Ｈｅｒ２の膜貫通領域、モノクローナル抗体であるトラスツズマブ（ハーセプチン）により認識される高次構造的に完全な結合エピトープ（conformationally intact binding epitope）、および表面発現を容易とするＧＭＣＳＦＲｓｓを含んでいる（図１パネルＢ）。まず、Ｈｅｒ２ｔ構築物の３種のバリアント、すなわち、Ｈｅｒ２ドメインIVの完全長を含む１つの構築物と、ハーセプチンと複合体化したＨｅｒ２の三次元構造（Garrett et al 2007; Cho et al 2003）から設計した２つの最小コンフォメーショナルエピトープとをレンチウイルスパッケージングプラスミドｅｐＨIV７に組み込み、ＣＨＯ細胞においてその特性を評価した。図１のパネルＢに概略を示した５６３〜６５２番目のアミノ酸を含むＨｅｒ２ｔ構築物は、ビオチン化ハーセプチンおよびストレプトアビジン標識蛍光色素を使用したフロー分析によって、最も高い一時的な表面発現を示したことから、さらに下流の特性評価を行うために選択した（データ示さず）。
【０２２８】
Ｈｅｒ２ｔは実用可能で、機能的に不活性な遺伝子タグである
一時的発現の分析を最初に実施した後、Ｈｅｒ２ｔを含むepHIV7を使用して、VSV-g偽型自己不活性化レンチウイルスを作製した。その後、得られたウイルスを複数種の細胞に形質導入し、８．２〜６５％の細胞がＨｅｒ２ｔ＋である集団を複数得た（データは示さず）。その代表例として、形質導入されたＫ５６２赤白血病細胞（１３．８％の細胞がＨｅｒ２ｔ＋）を示す（図２パネルＡ）。導入遺伝子を有する細胞集団を選択的に濃縮するための標的としてＨｅｒ２ｔが有用であるかどうかを評価するために、ビオチン化ハーセプチンおよび抗ビオチンマイクロビーズを使用して、形質導入Ｋ５６２集団を２段階で免疫磁気精製した。この処理により、９５％以上の細胞がＨｅｒ２ｔ＋である細胞集団が一貫して得られた（図２パネルＢ）。その後の滴定実験により、１０６個のＨｅｒ２ｔ＋細胞を最大限に標識するには、１．２ｎｇ以下のビオチン化ハーセプチンで十分であったことが明らかになった（図２パネルＡ）。
【０２２９】
本発明者の分子モデル（図１パネルＡ）で示したように、Ｈｅｒ２ｔは細胞外ドメインＩ〜IIIを含んでおらず、抗体認識に必要なドメインIV結合エピトープを含んでいる。したがって、Ｈｅｒ２ｔは市販のＨｅｒ２抗体に結合できないと予測され、ハーセプチンにより特異的に認識されると予測された。フロー分析により、ハーセプチンはＨｅｒ２ｔ発現Ｋ５６２細胞および完全長Ｈｅｒ２発現Ｋ５６２細胞を効率的に認識し、染色することができたが、市販の抗体は完全長Ｈｅｒ２しか認識できないことが確認された（図２パネルＣ）。
【０２３０】
ハーセプチン
で選択されたＨｅｒ２ｔ＋発現細胞または完全長Ｈｅｒ２＋発現細胞について、Ｈｅｒ２ｔおよび完全長Ｈｅｒ２のウエスタン免疫ブロット分析をそれぞれ同様に実施した。予測されたように、市販のＨｅｒ２抗体を使用した場合、１８５ｋＤａの完全長Ｈｅｒ２タンパク質は、完全長Ｈｅｒ２発現細胞の溶解物のみで検出された。同様に、Ｈｅｒ２のリン酸化は、ニューレグリンで処理した完全長Ｈｅｒ２発現細胞の溶解物のみで検出された。ビオチン化ハーセプチンで検出した場合、Ｈｅｒ２ｔのバンドはＨｅｒ２ｔ＋細胞の溶解物のみで検出された（図２パネルＤ）。
【０２３１】
Ｈｅｒ２ｔは、Ｔ細胞療法のための、高度にストリンジェントでありかつ相補的な選択エピトープである
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現している治療用Ｔ細胞を選択するための非常に効率的な選択エピトープ（ＥＧＦＲｔと呼ばれる）は、過去に同定されている（Wang et al 2011）。本願では、ＣＡＲ含有ウイルスベクターにおいてＨｅｒ２ｔを同調発現させることによって、広範囲に適用可能なエクスビボ遺伝子改変ＣＡＲ治療薬の臨床適用が容易になるかどうかを評価した。さらに、Ｈｅｒ２ｔを使用することによって、ＣＡＲリダイレクト治療用Ｔ細胞の選択マーカーとして使用可能な非免疫原性選択マーカーのレパートリーを増やすことができ、また、Ｈｅｒ２ｔは、ＥＧＦＲｔによる選択の代替または補助的手段として使用することができる（すなわち、複数の腫瘍抗原候補に対する二重特異性をＴ細胞に付与するものである）。
【０２３２】
ＣＡＲ療法におけるＨｅｒ２ｔの有用性
の評価を目的として、Ｈｅｒ２ｔとの共発現を誘導するため、過去に報告されているＣＤ１９ＣＡＲ（Hudecek et al 2013）とリボソームスキップＴ２Ａ配列とを含むマルチドメインＤＮＡ構築物を構築した（図１パネルＣ）。その後、得られたCD19CAR-T2A-Her2t構築物をepHIV7に組み込み、前述のようにウイルスを作製した。
【０２３３】
ＥＧＦＲｔ
の発現と比較したときの選択マーカーとしてのＨｅｒ２ｔの機能、またはＥＧＦＲｔの発現と同調させたときの選択マーカーとしてのＨｅｒ２ｔの機能を評価するために、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋セントラルメモリー（Ｔｃｍ）細胞（図３パネルＡ）を、各種のCAR-T2A-Her2t含有ウイルスベクターおよび／またはCAR-T2A-EGFRt含有ウイルスベクターで形質導入した（図３パネルＢ）。単一のＣＡＲ含有ベクターで形質導入したＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔｃｍでは、ビオチン化ハーセプチン（Ｈｅｒ２ｔ）またはビオチン化アービタックス（ＥＧＦＲｔ）と抗ビオチンマイクロビーズとを使用した免疫磁気選択を行う前は２２〜７２％の細胞がＨｅｒ２ｔ＋またはＥＧＦＲｔ＋であったが、免疫磁気選択を行った後では、一貫して均一な純度（＞９０％）に濃縮された（図３Ｂ）。これとは別に、マルチソートと抗ＡＰＣビーズとの組み合わせ（「材料および方法」参照）を使用して、Ｈｅｒ２ｔ＋およびＥＧＦＲｔ＋の二重形質導入細胞を免疫磁気的にソートしたところ、９０％を超える導入遺伝子二重陽性細胞が得られた（図６）。
【０２３４】
別法として、ビーズによる除去の代わりに、遊離ビオチンまたはストレプトアビジンを使用して、二重形質導入細胞株をソートすることができる。フローサイトメトリーによる平均蛍光強度（ＭＦＩ）の解析により、Ｈｅｒ２ｔで選択されたＴｃｍ集団における導入遺伝子の発現は、ＥＧＦＲｔで選択されたＴｃｍ集団における導入遺伝子の発現よりも低かったことが示唆されため（図３パネルＢ）、本発明者は次に、Ｈｅｒ２ｔレベルがＣＡＲ発現の低下に直接に相関するかどうかを調べた。これを行うために、Ｈｅｒ２ｔまたはＥＧＦＲｔにより選択されたＣＤ１９ＣＡＲ発現Ｔｃｍを溶解し、ＣＤ３ζ標的化ウェスタンブロット分析によりこの細胞溶解物を解析した。この結果、Ｈｅｒ２ｔを付加した導入遺伝子は、ＥＧＦＲｔを付加した導入遺伝子よりも高い発現レベル（たとえば、約２倍）で選択されることが分かった（図３パネルＣ）。これらの結果から、Ｈｅｒ２ｔを使用すると、ＥＧＦＲｔによる選択よりもストリンジェントな選択を行うことができることが示された。ウェスタンブロット分析では、二重選択ＴｃｍにおけるＣＤ１９ＣＡＲおよびＣＤ２０ＣＡＲの共発現も示された（図３パネルＣ）。
【０２３５】
二重選択されたＴｃｍはインビトロにおいてエフェクター表現型および標的特異性を維持する
多くのがんでは、標的抗原をダウンレギュレートさせたり変異させたりすることによって、治療を回避している。したがって、複数の腫瘍関連抗原を同時に標的とすることは、腫瘍による回避を克服するための有望な治療アプローチであり、治療用Ｔ細胞の治療用途の拡大しうるものである。表面マーカー（Ｈｅｒ２ｔおよびＥＧＦＲｔ）の選択による２種のＣＡＲ（CD19-CARおよびCD20-CAR）の共発現によって、ＣＡＲリダイレクトＴ細胞の機能特性を向上させることできるかどうかを評価するため、二重ＣＡＲ発現Ｔｃｍのインビトロにおける機能を、単一のＣＡＲを発現するＴｃｍと比較した。細胞傷害性分析の結果、ＣＡＲリダイレクトＴｃｍサブセット（CD19-CAR発現Tcmサブセット、CD20-CAR発現Tcmサブセット、またはCD19-CARとCD20-CARとを共発現するTcmサブセット）はいずれも、ＣＤ１９発現Ｋ５６２細胞、ＣＤ２０発現Ｋ５６２細胞、またはＣＤ１９およびＣＤ２０を発現するＫ５６２細胞に対して類似したレベルの特異的な溶解性を示したが（図４パネルＡ）、ＣＤ１９−／ＣＤ２０−のＫ５６２標的親細胞の認識を媒介しなかったことが示された（図４パネルＢ）。
【０２３６】
次に
、Ｋ５６２標的パネルに対する、二重ＣＡＲ発現ＴｃｍのＣＤ１９およびＣＤ２０による協同機能を試験したところ（図４パネルＢ）、いずれの標的発現Ｋ５６２細胞に対しても特異的な溶解性を示したのは二重ＣＡＲ発現Ｔｃｍのみであったことが分かった。これに対して、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ発現Ｔｃｍ細胞またはＣＤ２０特異的ＣＡＲ発現Ｔｃｍ細胞は、これらのコグネイト標的抗原を発現しているＫ５６２細胞の細胞溶解活性を誘導するのに留まった（図４パネルＢ）。
【０２３７】
Ｋ５６２標的パネル
による刺激に応答したサイトカイン産生の定量分析では、前記と類似した特異性が示されている。ＣＡＲを発現していないＴｃｍでは、Ｋ５６２親細胞との共培養に応答してサイトカインが産生された。これに対して、二重ＣＡＲ発現Ｔｃｍでは、いずれの標的発現細胞とも共培養に応答してＩＬ−２、ＩＦＮγおよびＴＮＦαが産生されたが、単一のＣＡＲを発現するＴｃｍでは、サイトカインの産生はK562/CD19-CD20標的細胞およびK562/CD19標的細胞またはK562/CD20標的細胞でしか見られなかった（図４パネルＣ）。これらの結果から、二重ＣＡＲ発現ＴｃｍのみがＣＤ１９およびＣＤ２０に対する二重特異性を示し、ＣＤ１９およびＣＤ２０のいずれかの抗原と遭遇したときにＴ細胞の活性化および標的化を媒介できることが示された。興味深いことに、Ｈｅｒ２ｔにより選択されたＣＤ１９ＣＡＲ発現Ｔｃｍは、ＥＧＦＲｔにより選択されたＣＤ１９ＣＡＲ発現Ｔｃｍと比較して、多様性が増しており、（たとえば約２〜３倍に）亢進されたサイトカインプロファイルを示した（図３パネルＤ）。これは、Ｈｅｒ２ｔを使用することによってストリンジェントな選択が可能となり、Ｈｅｒ２ｔにより選択されたＴｃｍでは総ＣＡＲの発現量が増加していることに起因していると考えられる。
【０２３８】
ＣＡＲ
の抗腫瘍活性は、移入したＴ細胞の増殖および生存と相関するため、ＣＡＲ改変Ｔｃｍをそれぞれの標的と接触させた場合の増殖をＣＦＳＥ希釈アッセイにより分析した。刺激を加えた後の二重ＣＡＲ発現によるＴｃｍの増殖は、ＣＤ１９ＣＡＲ発現Ｔｃｍと同等のレベルまで亢進されたことが見出された。
【０２３９】
養子移入されたＨｅｒ２ｔ＋Ｔ細胞のフローサイトメトリーおよび免疫組織化学法による追跡
現在まで、ＣＡＲ療法臨床試験の大部分では、ＰＣＲに基づく技術によって、治療投与後の遺伝子改変細胞の持続性を定量してきた。Ｈｅｒ２ｔなどの治療特異的遺伝子タグを使用することによって、多くのパラメータによる表現型の分析が可能となり、また、注入されたＣＡＲ Ｔ細胞サブセットのうち、治療応答と相関しうるもの特定することが可能となる。
【０２４０】
インビボでの追跡薬剤としてのＨｅｒ２ｔの有用性を試験するために、NOD/Scid IL-2RγC
nullマウスにCD19CAR+Her2t+CD4 TcmおよびCD19CAR+Her2t+CD8 Tcmを移植し、このマウスから骨髄検体を採取し、検体を処理した後、試料をフローサイトメトリーで分析した（図５パネルＡ）。マーカー陰性かつＨｅｒ２ｔ＋ＥＧＦＲｔ＋の細胞を投与したマウスと同等レベルのＣＤ４５＋Ｔ細胞の生着が認められた（図５パネルＢ）。ＣＤ４５＋Ｔ細胞サブセットのうち、ＣＤ８の二重染色が１１．７〜４５．７％の細胞で見られ、ＣＤ４＋Ｔ細胞が優位に増殖されたことが示された。さらに、ビオチン化ハーセプチンおよびＡＰＣ標識ストレプトアビジンを使用したＨｅｒ２ｔの共染色により、Ｈｅｒ２ｔ＋Ｔ細胞とＨｅｒ２ｔ陰性Ｔ細胞とを区別することができた（図５パネルＣ）。これらの結果から、Ｈｅｒ２ｔは養子移入されたＴ細胞の有効な追跡マーカーであることが示された。
【０２４１】
次に、Ｈｅｒ２ｔが免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色に
おいて有効な標的となるかどうかを判定した。予備試験として、Ｈｅｒ２ｔ＋細胞をスライドに接着させ、ビオチン化ハーセプチンおよび蛍光色素標識ストレプトアビジンで染色した（図５パネルＤ）。
【０２４２】
ハーセプチンのＨｅｒ２ｔへの結合は、ヒトＴ細胞に対してＡＤＣＣを引き起こす
治療中に有害な臨床的事象が発生した場合に備えて、投与するＴ細胞に安全機構を組み込むことは有利である。ＧＭＣＳＦ刺激ＰＢＭＣとハーセプチンまたはアービタックスとを加えて共培養することによって、Ｈｅｒ２ｔ＋Ｔ細胞またはＥＧＦＲｔ＋Ｔ細胞のインビトロ細胞傷害性分析を行う。
【０２４３】
Ｈ９（Ｔ細胞）細胞（５
×１０６個の親細胞、Ｈｅｒ２ｔ＋細胞、ＥＧＦＲｔ＋細胞、またはＨｅｒ２ｔ＋／ＥＧＦＲｔ＋細胞）を混合し、精製を行った（図６）。まず、ビオチン化ハーセプチンおよび抗ビオチンマルチソートビーズを使用して細胞を精製した。その後、マルチソートビーズを除去した後、アービタックス−ＡＰＣおよび抗ＡＰＣマイクロビーズを使用して陽性画分を精製した。最終的に得られた陽性画分は、Ｈｅｒ２ｔおよびＥＧＦＲｔに対して二重陽性であった（図６）。
【０２４４】
この系では、刺激されたＰＢＭＣは、抗体の存在下
において、抗体依存性細胞傷害を誘導することが可能なエフェクター細胞として機能する。ハーセプチンまたはアービタックスを共培養に加え、Ｈｅｒ２ｔ＋細胞またはＥＧＦＲｔ＋細胞を選択的に除去することを目的とする。これらの試験は、Ｈｅｒ２ｔまたはＥＧＦＲｔを共発現するffluc+Tcmを使用することによって、インビボで行うことができる。この実験条件では、ＴｃｍはNOD/Scid IL-2RγCnullマウスに移植され、続いて、ハーセプチンまたはアービタックスと新たに活性化させたＰＢＭＣとが投与される。移入されたＴｃｍのインビボでの生着および抗体媒介性除去は、インビボでのバイオフォトニックイメージングにより測定される。ハーセプチンまたはアービタックスにより媒介された除去は、Ｈｅｒ２ｔ発現Ｔｃｍ、ＥＧＦＲｔ発現Ｔｃｍ、またはその両方のマーカーを発現しているＴｃｍに特異的である必要がある。
【０２４５】
Ｈｅｒ２ｔとＥＧＦＲｔとの組み合わせによる選択はインビボにおける二重ＣＡＲ特異性を付与する
この実験は、インビボにおいて選択的な抗腫瘍活性を付与することを目的とする。CD19+、CD20+、またはCD19/CD20+であるK562 ffluc+腫瘍細胞は、NOD/Scid IL-2RγCnullマウスの左脇腹または右脇腹に皮下注射することによって樹立する。腫瘍が樹立された後、CD19CAR-Her2t発現Tcm、CD19CAR-EGFRt発現Tcm、CD20CAR-EGFRt発現TcmまたはCD19CAR-Her2t発現TcmおよびCD20 CAR発現Tcmを静脈内に注射し、バイオフォトニックイメージングによりＴ細胞特異性を測定する。腫瘍のルシフェラーゼ活性（総光子量）の低下によって、腫瘍の縮小が示される。
【０２４６】
二重ＣＡＲ発現Ｔｃｍでマウス
を処置した場合、すべての標的腫瘍において腫瘍の縮小が起こると考えられるが、コグネイトなＣＡＲを発現しているＴｃｍでマウスを処置した場合は、ＣＤ１９またはＣＤ２０のみを発現するＫ５６２腫瘍が退縮すると考えられる。あるいは、前述のようにＣＤ１９＋Ｋ５６２細胞、ＣＤ２０＋Ｋ５６２細胞、またはＣＤ１９／ＣＤ２０＋Ｋ５６２細胞を樹立し、腫瘍が樹立された後にffluc+CAR+Tcmを投与する。ＣＡＲ特異性に基づくＴｃｍの局在は、バイオフォトニックイメージングにより決定される。二重選択Ｈｅｒ２ｔ＋ＥＧＦＲｔ＋Ｔ細胞は、Ｋ５６２腫瘍上の標的抗原に関係なくＣＤ１９および／ＣＤ２０が陽性の細胞に局在化すると考えられるが、ＣＤ１９またはＣＤ２０のＣＡＲ発現細胞は、それらの標的抗原に特異的なＫ５６２腫瘍に局在化すると考えられる。
【０２４７】
Ｈｅｒ２のドメインIVと膜貫通ドメインとの間へのリンカードメインの導入（Ｈｅｒ２ｔＧ）は、抗体であるハーセプチンへの結合性を向上する
Ｈｅｒ２ｔおよびＨｅｒ２ｔＧの一次配列の模式図を図７に示す。Ｈｅｒ２ｔＧは、Ｈｅｒ２のドメインIVと膜貫通領域との間にリンカー配列が付加された点でＨｅｒ２ｔとは異なり、配列GGGSGGGS（配列番号４５）を含み、このような構築物をＨｅｒ２ｔＧと呼ぶ。Ｈｅｒ２ｔまたはＨｅｒ２ｔＧを有するレンチウイルスをＭＯＩ＝１で使用して、Ｈ９細胞に形質導入した。その後、製造元のプロトコルに従って、ビオチン化ハーセプチンおよび抗ビオチンマイクロビーズにより形質導入細胞を精製した。その後、ビオチン化ハーセプチンおよびストレプトアビジン−ＰＥを使用して、精製した細胞集団のＨｅｒ２ｔ染色またはＨｅｒ２ｔＧ染色を行った。ヒストグラムは、Ｈｅｒ２ｔＧへの結合の方が強いことを示す（図８）。図９に示すように（左のグラフから右のグラフの方向に参照されたい）、０．０５μｌ、０．１μｌ、０．２５μｌ、０．５μｌ、１μｌまたは３μｌのレンチウイルスでＨ９細胞に形質導入した５日後にハーセプチンへの結合について分析した。Ｈｅｒ２ｔのバリアントであるＨｅｒ２ｔ（ＣＤ２８ヒンジ）は、元のＨｅｒ２ｔと同レベルでハーセプチンに結合することができた（Ｈｅｒ２ｔ染色は示していないが、過去の実験に基づく）。Ｈｅｒ２ｔ（ＩｇＧ４ヒンジ）は、Ｈｅｒ２ｔまたはＨｅｒ２ｔ（ＣＤ２８ヒンジ）よりもハーセプチンへの結合が増強されたが、Ｈｅｒ２ｔＧバリアントは、ハーセプチンに結合する能力が最も高く、形質導入Ｈ９細胞を染色する能力も最も高かった。
【０２４８】
この実験で示したように、Ｈｅｒ２ｔＧ構築物は、Ｈｅｒ２ｔのドメインIVと膜貫通ドメインとの間にリンカー（配列番号４５）を有する。このリンカーは、タンパク質ドメイン間に柔軟性を持たせることを目的として使用される。別の例では、ＣＡＲのｓｃＦｖの多くは、ＣＡＲのｓｃＦｖのＶｈドメインとＶｌドメインとの間に４つの連続的Ｇ３Ｓサブユニットを含む。これにより、２つのｓｃＦｖドメインに柔軟性を付与することができ、ｓｃＦｖを折りたたむことが可能となる。ここでの原理は、２つのＧ３Ｓリンカーサブユニットを使用することによって、Ｈｅｒ２ｔＧの柔軟性をＨｅｒ２ｔと同レベルまで高めることができるということである。
【０２４９】
２つのＧ３Ｓリンカーサブユニット（配列番号４５）を使用することによっても、ＣＤ２８のヒンジ領域およびＩｇＧ４のヒンジ領域のスペーサーの長さを模倣することができた。ＣＤ２８のヒンジ領域およびＩｇＧ４のヒンジ領域は、機能性ＣＡＲのｓｃＦｖと膜貫通領域との間のスペーサーとして使用されている。ＣＤ２８のヒンジ領域およびＩｇＧ４のヒンジ領域は、二量体化を容易にするシステインを含む。この二量体化はＣＡＲには有利であるが、Ｈｅｒ２ｔの柔軟性を抑制するため、ハーセプチンによって有効に認識されない可能性がある。３つまたは４つのＧ３Ｓリンカーよりも２つのＧ３Ｓリンカー（配列番号４５）を使用することの利点は、ベクターのペイロードを抑制できること、不要だと考えられる配列を排除し、かつ機能性を向上させることであった。
【０２５０】
本明細書において多目的細胞表面マーカーを述べるが、このマーカーをＨｅｒ２ｔと呼ぶ。この新規のマーカーは、完全長Ｈｅｒ２を構成する１２５５個のアミノ酸のうち、わずか１１３個のアミノ酸を含み、完全なＨｅｒ２の細胞内シグナル伝達に関与する細胞外ドメインまたは細胞内ドメインを含んでいない。造血細胞はＨｅｒ２発現を欠いていることから、Ｈｅｒ２ｔを導入遺伝子選択マーカーの有力な候補とすることができ、この選択マーカーは、機能的には不活性であるがドナーＴ細胞を精製することができる均一な導入遺伝子発現治療用製品として設計することができる。Ｈｅｒ２ｔの設計は、ヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体α鎖のリーダーペプチドにＮ末端Ｈｅｒ２ｔフラグメントを融合させることを含む。この融合は、Ｈｅｒ２ｔの表面発現を容易にすることができ、医薬品グレードのモノクローナル抗体トラスツズマブ（ハーセプチン）により最小単位の結合エピトープを特異的に認識させることが可能となる。
【０２５１】
Ｈｅｒ２ｔ
は、ｃＤＮＡフットプリントが最低限の大きさのため、単独で発現させることができ、あるいは、生物学的に活性な導入遺伝子、すなわちキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とともに自己不活性化型レンチウイルスベクターに同調的に組み込むこともできることが示された。Ｔ２Ａリボソームスキップリンカーを介してＨｅｒ２ｔをＣＡＲに付加することによって同調的な導入遺伝子の発現が達成され、この同調的な導入遺伝子の発現は、Ｈｅｒ２ｔにより精製されたＣＤ８セントラルメモリーＴ細胞をフロー分析およびウェスタンブロット分析することによって検証された。さらに、Ｈｅｒ２ｔは、ＥＧＦＲｔによる選択よりもストリンジェントな選択を行うことができる選択エピトープであり、ＣＡＲの発現が強くかつエフェクターサイトカインの産生が増加したＴ細胞をエクスビボで選択することを可能にするものであることも示された。このような特徴は、ＣＡＲ療法を複数の種類の腫瘍の治療に適用する場合のように、さらに高い導入遺伝子の発現が望まれる場合に有利であると考えられる。
【０２５２】
Ｔ細胞
において導入遺伝子の発現レベルを高めることに加えて、複数の腫瘍抗原に対する二重特異性を個々のＴ細胞に付与することも臨床的に有益であると考えられる。実際に、標的抗原のダウンレギュレーションや変異は、様々な種類のがんにおいて見られ、そのため、単一のＣＡＲによる治療戦略を超えた戦略が必要とされている。これに伴って、Ｈｅｒ２ｔは、ＥＧＦＲｔに対する相補的な選択エピトープであることが示され、このような選択エピトープをそれぞれのＣＡＲに付加した場合に、マルチソーティングによる二重ＣＡＲ発現Ｔ細胞の精製が容易になることが示された。細胞傷害性活性およびエフェクターサイトカインの産生は、単一のＣＡＲを発現するＴ細胞と二重ＣＡＲ発現Ｔ細胞との間でほとんど差がなかったことから、Ｈｅｒ２ｔおよびＥＧＦＲｔを個別に発現させたり、これらを同調的に発現させても、何ら明白な機能障害は生じないことが示された。
【０２５３】
ハーセプチンは
、ビオチン化または化学標識に適している。ハーセプチンは市販用に製剤化されているため、臨床グレードのＨ２Ｏで再構築され、ビオチン化された後でもＨｅｒ２に特異的な結合親和性が高いまま保持されている。このような理由と、ｃＧＭＰグレードの抗ビオチンマイクロビーズ（Miltenyi Biotec）の入手が容易であることから、CliniMACS装置上での治療的に有意義なＨｅｒ２ｔ＋細胞の選択が可能となる。１３．８％程度のＨｅｒ２ｔ陽性しか含まない細胞集団を、９０％を超える純度にまで免疫磁気的に濃縮することができることが示された。さらに、これらの結果から、Ｔ細胞マーカーを標的とする抗体とビオチン化ハーセプチンとを組み合わせて、多くの表現型パラメータを分析すること、および治療的ＣＡＲ発現Ｔ細胞のインビボでの分布を追跡することが可能になることが示された。
【０２５４】
ＣＡＲ免疫療法の治療
適用範囲は、血液由来腫瘍の治療における最初の成功を踏まえて、急速に拡大し続けている。本質的に非免疫原性で、Ｔ細胞集団に特異的であり、かつ高効率に選択できる遺伝子タグの代替が必要とされているのは明らかである。Ｈｅｒ２ｔは、上述の特徴を包含し、ＣＡＲ療法に使用可能な選択エピトープのレパートリーを増やすことができる。さらに、Ｈｅｒ２ｔは、マルチプレックス遺伝的システムによるＣＡＲ治療薬を同調的に選択するための有力な候補である。
【０２５５】
Ｈｅｒ２ｔ
を使用することの利点は、その小さいサイズにある。したがって、Ｈｅｒ２ｔは、自体よりも大きな構築物においてパッケージング効率がよいという利点を有する。このシステムを利用するためには、５ｋｂ未満の構築物にすることが好ましい。いくつかの実施形態において、構築物のサイズは、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１４．９ｋｂ、またはこれらの構築物サイズのいずれか２つの間の任意のサイズである。１５ｋｂを超える構築物は力価が低くなる可能性があるため、構築物のサイズは小さくする必要がある。
【０２５６】
前述の
実施例は本発明を例示するものであり、本発明をなんら限定するものではない。本発明は、以下の請求項によって定義され、請求項の等価物も本発明に含まれる。本明細書において引用した参考文献および論文はいずれも参照により本明細書に組み込まれる。
0006772068.tif 000002
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
0006772068.tif 000023
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ−１】
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【図４Ｃ−２】
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【図４Ｃ−３】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【配列表】
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