(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プライマーセットで増幅した特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を、インターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、マイコプラズマ・ニューモニエ２３Ｓ  ｒＲＮＡを検出する方法であって、
前記プローブが配列番号３０または３２に記載の塩基配列であり、
前記プライマーセットが、
試料中に含まれるマイコプラズマ・ニューモニエ２３Ｓ  ｒＲＮＡもしくは２３Ｓ  ｒＤＮＡの特定塩基配列の３’末端部と相補的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定塩基配列の５’末端部と相同的な配列を有する第二のプライマーとからなる、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットであって、以下の（１）〜（５）の何れかである、方法：
（１）第一のプライマーが配列番号３に記載の塩基配列であり、第二のプライマーが配列番号１３または１６に記載の塩基配列であるプライマーセット、
（２）第一のプライマーが配列番号５に記載の塩基配列であり、第二のプライマーが配列番号１６または１７に記載の塩基配列であるプライマーセット、
（３）第一のプライマーが配列番号６に記載の塩基配列であり、第二のプライマーが配列番号１７に記載の塩基配列であるプライマーセット、
（４）第一のプライマーが配列番号７に記載の塩基配列であり、第二のプライマーが配列番号１７または１８に記載の塩基配列であるプライマーセット、
（５）第一のプライマーが配列番号１０に記載の塩基配列であり、第二のプライマーが配列番号２２に記載の塩基配列であるプライマーセット。
【請求項２】
プライマーセットと、配列番号３０または３２に記載の塩基配列からなるインターカレーター性蛍光色素を標識した核酸プローブとを含む、マイコプラズマ・ニューモニエ２３Ｓ  ｒＲＮＡ検出試薬であって、
前記プライマーセットが、
試料中に含まれるマイコプラズマ・ニューモニエ２３Ｓ  ｒＲＮＡもしくは２３Ｓ  ｒＤＮＡの特定塩基配列の３’末端部と相補的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定塩基配列の５’末端部と相同的な配列を有する第二のプライマーとからなる、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットであって、以下の（１）〜（５）の何れかである、試薬：
（１）第一のプライマーが配列番号３に記載の塩基配列であり、第二のプライマーが配列番号１３または１６に記載の塩基配列であるプライマーセット、
（２）第一のプライマーが配列番号５に記載の塩基配列であり、第二のプライマーが配列番号１６または１７に記載の塩基配列であるプライマーセット、
（３）第一のプライマーが配列番号６に記載の塩基配列であり、第二のプライマーが配列番号１７に記載の塩基配列であるプライマーセット、
（４）第一のプライマーが配列番号７に記載の塩基配列であり、第二のプライマーが配列番号１７または１８に記載の塩基配列であるプライマーセット、
（５）第一のプライマーが配列番号１０に記載の塩基配列であり、第二のプライマーが配列番号２２に記載の塩基配列であるプライマーセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に含まれるマイコプラズマ・ニューモニエを迅速、高感度かつ特異的に検出するためのオリゴヌクレオチドプライマー、および当該プライマーを用いたマイコプラズマ・ニューモニエの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は人に感染すると気管支炎と肺炎（以下マイコプラズマ肺炎）といった疾患を引き起こし、市中肺炎としての頻度も高い。日本では晩秋から早春にかけて報告数が多くなり、罹患年齢は幼児期、学童期、青年期が中心である。従来４年周期での流行がみられたが、近年この傾向は崩れつつある。昔から「異形肺炎」として、肺炎にしては元気で一般状態も悪くないことが特徴とされてきたが、重症肺炎となることもある（非特許文献１）。マイコプラズマ・ニューモニエには通常外来でよく使用されるβ−ラクタム系の抗菌薬が効かず、適切かつ迅速な治療が必要となる。
【０００３】
臨床的に用いられているマイコプラズマ・ニューモニエの検出法として、マイコプラズマ・ニューモニエ抗原に対する抗体を用いて検出する方法や、マイコプラズマ・ニューモニエ特異的ＩｇＭ抗体を測定する方法、マイコプラズマ・ニューモニエ特有の塩基配列を増幅して検出する方法等があげられる。しかし、マイコプラズマ・ニューモニエ抗原に対する抗体を用いて検出する方法は感度が６０％程度と低く、一部市販キットでは近縁種であるマイコプラズマ・ゲニタリウムと交差反応を示すことが知られている。マイコプラズマ・ニューモニエ特異的ＩｇＭ抗体を測定する方法は異なる日に２回血液を採取する必要があり、迅速性が無い。ＬＡＭＰ法（特許文献１、非特許文献２）、ＰＣＲ法（非特許文献３、非特許文献４）等の核酸増幅による検出法は、感度、特異性とも極めて高いが、検査に時間がかかり迅速性が不足しており、操作が煩雑である。このため、感度が高く迅速で簡便な検査が望まれている。
【０００４】
本発明で使用されたＴＲＣ法（特許文献２、特許文献３）では精製から検出まで一体となった装置が市販されており、１時間程度で結果を得ることができるため、十分な迅速性を備えている。また、感度、特異度ともに他の核酸増幅による検出法と遜色はない。
【０００５】
増幅対象核酸がマイコプラズマ・ニューモニエ２３Ｓ  ｒＲＮＡ（リボゾーム  ＲＮＡ）またはその遺伝子の場合、他の菌種の２３Ｓ  ｒＲＮＡ（またはその遺伝子）との間で塩基配列の相同性が高いものが多数存在する。特に、マイコプラズマ・ゲニタリウムとは２３Ｓ  ｒＲＮＡの相同性が９６％もある。このため、マイコプラズマ・ニューモニエ２３Ｓ  ｒＲＮＡまたはその遺伝子を高感度かつ特異的に検出するプライマーセットやオリゴヌクレオチドプローブを設計することは極めて困難であった。特に比較的低温の一定温度（例えば、４０℃から５０℃）条件下でＲＮＡの増幅が可能な増幅方法を利用する場合、増幅対象核酸が高次構造を形成しやすくなるため、当該プライマーセットやオリゴヌクレオチドプローブの設計はさらに困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−１３１１７４号公報
【特許文献２】特開２０００−１４４００号公報
【特許文献３】特開２００１−３７５００号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】感染症の辞典（２００４）
【非特許文献２】日本臨床微生物学雑誌Ｖｏｌ．  ２３  Ｎｏ．  ２  ２０１３．
【非特許文献３】Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．（１９９６）１７３（６）：１４４５−１４５２．
【非特許文献４】国立感染症研究所「マイコプラズマ肺炎検査マニュアル」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、試料中に存在するマイコプラズマ・ニューモニエに由来する核酸を高感度、迅速に増幅し、かつ偽陽性が発生しにくい特異的なオリゴヌクレオチドプライマー、および当該プライマーを用いたマイコプラズマ・ニューモニエの検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は以下のとおりである。
（１）  試料中に含まれるマイコプラズマ・ニューモニエ２３Ｓ  ｒＲＮＡもしくは２３Ｓ  ｒＤＮＡの特定塩基配列の３’末端部と相補的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定塩基配列の５’末端部と相同的な配列を有する第二のプライマーとからなる、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットであって、
第一のプライマーが、配列番号１または８に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが、配列番号１１または２０に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである、
前記プライマーセット。
（２）  第一のプライマーが少なくとも２２塩基からなり、第二のプライマーが少なくとも１７塩基からなるオリゴヌクレオチドである、（１）に記載のプライマーセット。
（３）  第一のプライマーが、配列番号２または９に記載の塩基配列中、少なくとも連続する２２塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが、配列番号１２または２１に記載の塩基配列中、少なくとも連続する１７塩基からなるオリゴヌクレオチドである、
（１）または（２）に記載のプライマーセット。
（４）  第一のプライマーが配列番号３から７または１０のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが、配列番号１３から１９または２２から２８のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、
（１）〜（３）いずれかに記載のプライマーセット。
（５）  （１）から（４）のいずれかに記載のプライマーセットで増幅した特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を、前記核酸の一部とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能な、インターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、マイコプラズマ・ニューモニエ２３Ｓ  ｒＲＮＡを検出する方法。
（６）  （１）から（４）のいずれかに記載のプライマーセットと、配列番号２９または３１に記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドにインターカレーター性蛍光色素を標識した核酸プローブとを含む、マイコプラズマ・ニューモニエ２３Ｓ  ｒＲＮＡ検出試薬。
【００１１】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００１２】
本発明中において試料とは、咽頭ぬぐい液、喀痰、培養液などがあげられる。
【００１３】
本発明において特定塩基配列とは、マイコプラズマ・ニューモニエ２３Ｓ  ｒＲＮＡのうち、第ニのプライマーとの相同領域の５’末端から第一のプライマーとの相補領域の３’末端までの塩基配列のことをいう。すなわち本発明では前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸が増幅されることになる。
【００１４】
本発明におけるストリンジェントな条件の例として、４２℃において、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％のポリビニルピロリドン、５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムが存在する条件や、本明細書の実施例に記載の核酸増幅条件があげられる。また、前述したストリンジェントな条件下で、前記特定塩基配列と、十分に特異的かつ高効率にハイブリダイゼーション可能であれば、第一及び第二のプライマーの塩基配列は、前記特定塩基配列と比較して置換、欠失、付加、修飾があってもよい。第一及び第二のプライマーの長さは任意に設定できるが、好ましくは１０塩基から５０塩基までの範囲である。なお、もっとも好ましい態様では、ストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドとは、対象塩基配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【００１５】
本発明は、試料中に含まれるマイコプラズマ・ニューモニエ２３Ｓ  ｒＲＮＡの特定塩基配列の３’末端部と相補的な配列を有する第一のプライマーとして、配列番号１に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＲ＿０７７０５６．１の２１７１番目から２２１０番目までの塩基配列）または配列番号８に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＲ＿０７７０５６．１の２３２４番目から２３４５番目までの塩基配列）とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを、また試料中に含まれるマイコプラズマ・ニューモニエ２３Ｓ  ｒＲＮＡの特定塩基配列の５’末端部と相同的な配列を有する第二のプライマーとして、配列番号１１に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＲ＿０７７０５６．１の１８５３番目から１８９０番目までの塩基配列の相補配列）または配列番号２０に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＲ＿０７７０５６．１の２０８４番目から２１３０番目までの塩基配列の相補配列）とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いることを特徴としている。
【００１６】
その中でも第一のプライマーが少なくとも２２塩基からなり、第二のプライマーが少なくとも１７塩基からなることが好ましい。
【００１７】
第一のプライマーの一例として、配列番号１に記載の塩基配列の相補配列である配列番号２に記載の塩基配列中、少なくとも連続する２２塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号３（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＲ＿０７７０５６．１の２１８３番目から２２０９番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号４（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＲ＿０７７０５６．１の２１８４番目から２２０８番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号５（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＲ＿０７７０５６．１の２１８３番目から２２０６番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号６（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＲ＿０７７０５６．１の２１８６番目から２２１０番目までの塩基配列の相補配列）および配列番号７（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＲ＿０７７０５６．１の２１７１番目から２２９７番目までの塩基配列の相補配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
【００１８】
また第一のプライマーの一例として、配列番号８に記載の塩基配列の相補配列である配列番号９に記載の塩基配列中、少なくとも連続する２２塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号１０（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＲ＿０７７０５６．１の２３２４番目から２３４５番目までの塩基配列の相補配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
【００１９】
第ニのプライマーの一例として、配列番号１１に記載の塩基配列の相補配列である配列番号１２に記載の塩基配列中、少なくとも連続する１７塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号１３（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＲ＿０７７０５６．１の１８６６番目から１８９０番目までの塩基配列）および配列番号１４（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＲ＿０７７０５６．１の１８６８番目から１８９０番目までの塩基配列）、配列番号１５（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＲ＿０７７０５６．１の１８５５番目から１８８２番目までの塩基配列）、配列番号１６（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＲ＿０７７０５６．１の１８６２番目から１８７８番目までの塩基配列）、配列番号１７（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＲ＿０７７０５６．１の１８５６番目から１８７８番目までの塩基配列）、配列番号１８（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＲ＿０７７０５６．１の１８６５番目から１８９０番目までの塩基配列）、配列番号１９（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＲ＿０７７０５６．１の１８５３番目から１８８２番目までの塩基配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
【００２０】
また第ニのプライマーの一例として、配列番号２０に記載の塩基配列の相補配列である配列番号２１に記載の塩基配列中、少なくとも連続する１７塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号２２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＲ＿０７７０５６．１の２０９０番目から２１１９番目までの塩基配列）、配列番号２３（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＲ＿０７７０５６．１の２０８４番目から２１１３番目までの塩基配列）、配列番号２４（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＲ＿０７７０５６．１の２１０３番目から２１３０番目までの塩基配列）、配列番号２５（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＲ＿０７７０５６．１の２１０１番目から２１２２番目までの塩基配列）、配列番号２６（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＲ＿０７７０５６．１の２０８５番目から２１１１番目までの塩基配列）、配列番号２７（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＲ＿０７７０５６．１の２０８６番目から２１１３番目までの塩基配列）、配列番号２８（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＲ＿０７７０５６．１の２０９０番目から２１１９番目までの塩基配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
【００２１】
中でもマイコプラズマ・ニューモニエ２３Ｓ  ｒＲＮＡを迅速かつ特異的に検出可能であるという点で、第一のプライマーが配列番号３、５、６、７、１０のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが、配列番号１３、１６、１７、１８、２２のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるプライマーセットが好ましい。その中でも第一のプライマーと第二のプライマーの組み合わせが、配列番号３と１３、３と１６、５と１６、５と１７、６と１７、７と１８、７と１７、１０と２２のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるプライマーセットが更に好ましい。
【００２２】
本発明のプライマーセットは、ＲＴ−ＰＣＲ法等、当業者が通常用いる核酸増幅法を利用した、マイコプラズマ・ニューモニエ２３Ｓ  ｒＲＮＡの特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットとして有用である。なお、第一または第二のプライマーのいずれか一方の５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターをさらに付加させると、前記プロモーターに対応したＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを付加した特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸が合成されるため、これら核酸からＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法といった一定温度でＲＮＡを増幅する方法を用いて、ＲＮＡを増幅させることができる点で好ましい。プライマーの５’末端側に付加するプロモーターは、ＲＮＡ増幅に用いるＲＮＡポリメラーゼ（例えば、分子生物学の分野で汎用される、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼやＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ）に対応したプロモーターを用いればよい。また前記プロモーターに、転写効率に影響を及ぼすことが知られている転写開始領域をさらに付加してもよい。ＲＮＡ増幅に用いるＲＮＡポリメラーゼとしてＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いたときの、プライマーの５’末端側に付加するプロモーター（Ｔ７プロモーター）の具体例として、配列番号３３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
【００２３】
本発明のプライマーセットを用いて増幅したマイコプラズマ・ニューモニエ２３Ｓ  ｒＲＮＡの特定塩基配列またはその相補配列を含む核酸の検出は、従来から知られた核酸検出方法を利用することができる。具体的には、
（Ａ）電気泳動や液体クロマトグラフィーを用いた方法、
（Ｂ）検出可能な標識で標識されたオリゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーション法、
（Ｃ）当該増幅産物の塩基配列の一部とハイブリダイズすることで蛍光特性が変化するように設計された蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブを用いた方法、
などがあげられる。前記（Ｃ）の蛍光色素標識プローブの一例として、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を利用した蛍光標識プローブや、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブがあげられる。
【００２４】
前記インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブの一例として、マイコプラズマ・ニューモニエ２３Ｓ  ｒＲＮＡの特定塩基配列または当該特定塩基配列の相補配列を含む核酸の一部とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの３’末端側、５’末端側、リン酸ジエステル部または塩基部分に、適当なリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブがある。前記プローブはマイコプラズマ・ニューモニエ２３Ｓ  ｒＲＮＡの特定塩基配列（または当該特定塩基配列の相補配列）と相補的２本鎖を形成すると、インターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的２本鎖部分にインターカレートすることで蛍光特性が変化するプローブである。標識するインターカレーター性蛍光色素に特に限定はなく、オキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、エチジウムブロマイド、ヘミシアニン等の汎用されている蛍光色素、およびこれらの誘導体の中から、蛍光強度や蛍光特性を考慮して、適宜選定すればよい。なお３’末端側に蛍光色素を標識する場合を除き、オリゴヌクレオチドの３’末端側は当該末端側からの核酸伸長反応を防止する意味で、グリコール酸などの適当な修飾がされているとよい。
【００２５】
前記インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを構成するオリゴヌクレオチドの好ましい例として、配列番号２９または３１に記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを上げることができる。更に好ましくは、配列番号３０に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＲ＿０７７０５６．１の２０９５番目から２１１２番目までの塩基配列）またはその相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド、配列番号３２に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＲ＿０７７０５６．１の２１９３番目から２２０８番目までの塩基配列）またはその相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドがあげられる。
【００２６】
本発明のプライマーセットを用いてマイコプラズマ・ニューモニエ２３Ｓ  ｒＲＮＡを検出するには、例えば以下の（１）から（６）に示す工程により実施すればよい。
（１）配列番号１または８に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである第一のプライマーがマイコプラズマ・ニューモニエ２３Ｓ  ｒＲＮＡにハイブリダイズし、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成し、前記ＲＮＡとのＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を生成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素により、前記ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）該１本鎖ＤＮＡに、配列番号１１または２０に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである第二のプライマーがハイブリダイズし（ここで前記第一または第二のプライマーのいずれか一方はその５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターが付加される）、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、特定塩基配列または特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーターを含む２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生産する工程、
（５）該ＲＮＡ転写産物が、前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（６）配列番号２９または３１またはその相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドにインターカレーター性蛍光色素を標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、前記ＲＮＡ転写産物量を経時的に測定する工程。
【００２７】
前記（１）の工程で用いるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、前記（２）の工程で用いるＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素、および前記（３）の工程で用いるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素は、それぞれ別個あるいは種々の組合せで添加することもできるが、前記活性を併せ持つレトロウイルス由来の逆転写酵素を使用することもできる。該逆転写酵素は特に限定されないが、分子生物学の分野で汎用される、ＡＭＶ（Ａｖｉａｎ  Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＲＡＶ（Ｒｏｕｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素などが使用できる。
【００２８】
前述した態様によるマイコプラズマ・ニューモニエ２３Ｓ  ｒＲＮＡ検出方法における反応温度は、使用する各酵素の耐熱性や活性、ならびにプライマー／プローブのＴｍ等に依存するが、使用する酵素がＡＭＶ逆転写酵素およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼであり、プライマー／プローブの長さが１７から３０塩基の範囲である場合は、３５から６５℃の範囲で反応温度を設定すればよく、４０から５０℃の範囲で設定するとより好ましい。
【００２９】
前述した態様によるマイコプラズマ・ニューモニエ２３Ｓ  ｒＲＮＡ検出方法は、蛍光強度を経時的に測定することから有意な蛍光増加が認められた任意の時間で測定を終了することが可能であり、核酸増幅および測定をあわせて通例２０分以内で終了することが可能である。
【００３０】
前述した態様によるマイコプラズマ・ニューモニエ２３Ｓ  ｒＲＮＡ検出方法は、前述した第一のプライマー、第二のプライマー、およびインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含むマイコプラズマ・ニューモニエ２３Ｓ  ｒＲＮＡ試薬に試料を添加し、経時的に蛍光検出可能な温調ブロックに載置することで、自動的にマイコプラズマ・ニューモニエ２３Ｓ  ｒＲＮＡを増幅し検出することができる。本発明のマイコプラズマ・ニューモニエ２３Ｓ  ｒＲＮＡ検出試薬において、オリゴヌクレオチドプローブを構成するオリゴヌクレオチドは、配列番号３０または３２に記載の塩基配列からなるものが好ましい。
【発明の効果】
【００３１】
本発明のプライマーセットはマイコプラズマ・ニューモニエ２３Ｓ  ｒＲＮＡに特異的な配列（特定塩基配列）およびその相補配列の一部にそれぞれハイブリダイズすることより、マイコプラズマ・ニューモニエ２３Ｓ  ｒＲＮＡの特定塩基配列またはその相補配列を特異的に増幅させることができる。
【００３２】
本発明のプライマーセットを用いたマイコプラズマ・ニューモニエ２３Ｓ  ｒＲＮＡ検出法は、試料中に含まれるマイコプラズマ・ニューモニエを迅速、高感度に検出でき、かつ偽陽性の発生も極めて少なく、特異性が高い。そのため、検査結果を早急に医師に提示することが可能となり、感染拡大防止や、適切な薬剤の投与による耐性菌の発生防止に寄与するものと考えられる。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００３４】
実施例１  標準ＲＮＡ調製
後述の実施例で使用する、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）標準ＲＮＡ、マイコプラズマ・ゲニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）標準ＲＮＡを以下に示す方法でそれぞれ調製した。なお調製した各標準ＲＮＡの定量は、２６０ｎｍにおける吸光度を基に実施した。
（１）マイコプラズマ・ニューモニエ標準ＲＮＡ
マイコプラズマ・ニューモニエ２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＲ＿０７７０５６．１）に基づき人工的に２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を作製し、インビトロ転写した後、転写産物を精製することで、マイコプラズマ・ニューモニエ標準ＲＮＡを調製した。
（２）マイコプラズマ・ゲニタリウム標準ＲＮＡ
マイコプラズマ・ゲニタリウムの２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＲ＿０７７０５４．１）に基づき人工的に２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を作製し、インビトロ転写した後、転写産物を精製することで、マイコプラズマ・ゲニタリウム標準ＲＮＡを調製した。
【００３５】
実施例２  インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドの調製
下記（Ａ）に示す、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（以下、ＩＮＡＦプローブと記載する）を特開２０００−３１６５８７号公報で開示の方法に基づき作製した。
（Ａ）配列番号３０（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＲ＿０７７０５６．１の２０９５番目から２１１２番目までの塩基配列）または配列番号３２からなるオリゴヌクレオチドの５’末端から１５番目のチミンと１６番目のアデニンとの間に、リンカーを介してチアゾールオレンジを標識したもの。
【００３６】
実施例３  マイコプラズマ・ニューモニエ２３Ｓ  ｒＲＮＡ検出用オリゴヌクレオチドの検討
表１に示す、第一のプライマー、第二のプライマーおよびＩＮＡＦプローブの組み合わせ（以下、オリゴヌクレオチドの組み合わせと記載する）を用いて、以下に示す方法で評価した。なお表１に記載のＩＮＡＦプローブは実施例２で作製したプローブである。
（１）実施例１で調製した標準ＲＮＡのうち、マイコプラズマ・ニューモニエ標準ＲＮＡ（実施例１（１））は、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％  コール酸ナトリウム）を用いて１０００コピー／１５μＬになるように、マイコプラズマ・ゲニタリウム標準ＲＮＡ（実施例１（２））は、前記ＲＮＡ希釈液を用いて１０８コピー／１５μＬになるように、それぞれ希釈し、これらをＲＮＡ試料として用いた。
（２）以下の組成からなる反応液を蒸発乾燥用チューブに分注し、蒸発乾燥した。
【００３７】
反応液の組成：濃度はＲＮＡ試料、開始液、添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３５）
３００ｍＭ  トレハロース
各０．４８ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各１ ．８ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ
１．３ｍＭ  ＧＴＰ
２．９ｍＭ  ＩＴＰ
０．２μＭ  第一のプライマー（各配列番号の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの５’末端側にＴ７プロモータ（配列番号３３）を付加したもの）
０．２μＭ  第二のプライマー
５０ｎＭ  ＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製したもの）
０．０２５ｍｇ／ｍＬ  牛血清アルブミン
１４２Ｕ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ
６．４Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素
（３）上記の蒸発乾燥後にＲＮＡ試料を１５μＬ添加後、４６℃で５分間保温し、その後、以下の組成からなる開始液１５μＬを添加し撹拌した。
【００３８】
酵素液の組成：反応時（３０μＬ中）の最終濃度
１０．０７％  ジメチルスルホキシド
２１ｍＭ  塩化マグネシウム
１０５ｍＭ  塩化カリウム
（４）引き続き蒸発乾燥用チューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度を経時的に２０分間測定した。
【００３９】
開始液を加え撹拌を終えた時点を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした。結果を表１および２に示す。実験は表１，２に記載された回数実施した。表２の「Ｎ．Ｄ．」は反応開始後２０分後の蛍光強度比が１．２以下（陰性判定）であったことを意味する。
【００４０】
マイコプラズマ・ニューモニエ２３Ｓ  ｒＲＮＡの検出性能（表１）については、本実施例で検討したオリゴヌクレオチドの組み合わせ（Ａ０１からＡ４０）いずれもが１０００コピー／ｔｅｓｔのマイコプラズマ・ニューモニエ２３Ｓ  ｒＲＮＡを１５分以内に検出した。特に、オリゴヌクレオチドの組み合わせＡ０１からＡ０８、Ａ１０からＡ１５、Ａ１７からＡ１９、Ａ２１からＡ２２、Ａ２４からＡ４０は１０００コピー／ｔｅｓｔのマイコプラズマ・ニューモニエ２３Ｓ  ｒＲＮＡを平均で８分以内に検出しており、マイコプラズマ・ニューモニエ２３Ｓ  ｒＲＮＡを迅速に検出可能なオリゴヌクレオチドの組み合わせといえる。
【００４１】
【表１】
0006733215.tif 000002
交差反応性（表２）については、本実施例で検討したオリゴヌクレオチドの組み合わせのうち、Ａ０１、Ａ０４、Ａ１８、Ａ１９、Ａ２６、Ａ２９、Ａ３０およびＡ３４が１０８コピー／ｔｅｓｔのマイコプラズマ・ゲニタリウム２３Ｓ  ｒＲＮＡを検出せず、マイコプラズマ・ニューモニエ２３Ｓ  ｒＲＮＡに対して高い特異性を有しており、マイコプラズマ・ニューモニエ２３Ｓ  ｒＲＮＡを特異的に検出可能なオリゴヌクレオチドの組み合わせといえる。
【００４２】
【表２】
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【配列表】
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