(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
本質的に微粉化ＥＳＭからなり、平均粒子径が１００μｍ未満である粒子を含み、
（ｉ）細胞外マトリクス（ＥＣＭ）タンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対するマトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）活性レベルが不適切、ならびに／あるいは、
（ｉｉ）  過度の炎症反応
の恐れがあるかまたは現にそうである慢性創傷の治癒を促進するのに使用されるための組成物であって、
前記粒子は、創傷の表面又は内部に直接適用される、前記使用のための組成物。
【請求項２】
前記粒子の平均粒子径は、８０μｍ以下、６０μｍ以下、４０μｍ以下、２０μｍ以下、１５μｍ以下、１０μｍ以下、５μｍ以下、または１μｍ以下である、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項３】
前記粒子の平均粒子径は、１μｍ以上、５μｍ以上、１０μｍ以上、１５μｍ以上、２０μｍ以上、４０μｍ以上、６０μｍ以上、または８０μｍ以上である、請求項１または２に記載の使用のための組成物。
【請求項４】
前記ＥＳＭは、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、ホロホロチョウ、ダチョウ、ハト、キジ、ウズラ、ライチョウ、またはカモメのＥＳＭであり、好ましくはガルス・ガルス・ドメスティクス（Gallus gallus domesticus）のＥＳＭである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項５】
前記ＥＳＭは、相当する鳥類源由来の天然ＥＳＭと比較すると、化学的には、実質的に未分解、未消化、および／または未変性である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項６】
前記ＥＳＭは、実質的に加水分解されていない、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項７】
前記ＥＳＭは、中性ｐＨにおいて実質的に水に不溶である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項８】
前記創傷に前記粒子を適用した後に、前記創傷における、ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対する１種類のＭＭＰ活性は、低減されるかまたは制限される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項９】
前記ＭＭＰは、ＭＭＰ−２、およびＭＭＰ−９のうちの１つ以上から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項１０】
前記創傷に前記粒子を適用した後に、前記創傷における炎症が、低減されるかまたは制限される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項１１】
前記創傷に前記粒子を適用した後に、前記創傷に存在する微生物の生存能力および／または成長もまた阻害され、前記微生物は、エシェリヒア属（Escherichia）である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項１２】
前記微生物は、大腸菌（Escherichia coli）である、請求項１１に記載の使用のための組成物。
【請求項１３】
前記創傷に前記粒子を適用した後に、前記創傷組織細胞の生存能力および／または成長もまた促進される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項１４】
前記創傷に前記粒子を適用した後に、前記創傷組織細胞の前記創傷への移動もまた促進される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項１５】
前記創傷は、皮膚創傷および／または埋め込み型医療用デバイスを含有する創傷である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項１６】
前記粒子が、創傷被覆材の形態で創傷に適用される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項１７】
前記創傷被覆材は、ヒドロコロイド被覆材またはヒドロゲル被覆材である、請求項１６に記載の使用のための組成物。
【請求項１８】
前記創傷被覆材は、アルギン酸塩を含んでいる、請求項１６または１７に記載の使用のための組成物。
【請求項１９】
前記粒子は、埋め込み型医療用デバイスの形態で前記創傷に適用され、該埋め込み型医療用デバイスの感染しやすい表面またはその一部が、請求項１〜７に記載の組成物のうちの１つ以上を用いて前処理されている、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項２０】
感染しやすい表面またはその一部が、請求項１〜７に記載の組成物のうちの１つ以上を用いて前処理されている、埋め込み型医療用デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、創傷治癒を促進するために行う創傷治療の分野に関する。より具体的には、本発明は、ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対するＭＭＰ活性レベルが不適切、ならびに／あるいは過度の炎症反応、の恐れがあるかまたは現にそうである火傷などの慢性創傷の治癒を含む創傷治癒の促進に特に有利となる性質を、創傷内または創傷上に存在する場合に示すことが見出されている卵殻膜（ＥＳＭ）のマイクロ粒子およびナノ粒子を提供するものである。本発明は、さらに、このような治療に用いる微粉化ＥＳＭ粒子を含有する医薬組成物、創傷被覆材、および埋め込み型医療用デバイスを提供する。本発明は、さらに、微粉化ＥＳＭ粒子、ならびにこれを含有する組成物、被覆材、および埋め込み型医療用デバイスの製造方法を提供する。
【０００２】
創傷は、無傷またはむき出しの組織、一般的には皮膚、に生じる傷であり、ヒトおよび他の動物が生きていく上で、その発生は避けることができない。創傷は、物理的障害（機械的損傷；過度の加熱または冷却などの結果生じる熱損傷；電位源との接触などによる電気的損傷；および赤外線、紫外線、または電離放射線に長期にわたり過度に曝露されることなどによる放射線損傷など）により、または皮膚潰瘍（静脈性潰瘍、糖尿病性潰瘍、または褥瘡など）、肛門裂傷、口腔内潰瘍、および尋常性座瘡などの自然発生的な損傷により、外科的に生じ得る。
【０００３】
医療分野において、創傷は、典型的には急性創傷または慢性創傷のいずれかとして定義される。急性創傷とは、止血後、長引くことなく、その治癒プロセスにおいて広く認められている３つの段階（すなわち、炎症期、増殖期、および再構築期）が順に進行する創傷である。慢性創傷とは、治癒することがない創傷、または火傷などによって過度に皮膚が欠損している創傷と定義される。このような創傷は、治癒段階のうちの１つにおいて停止してしまうため、治癒プロセスにおいて、生化学的事象を順に完遂することはない。慢性創傷は、一般的に、炎症期で停止する。慢性創傷は、患者の死亡の主要な原因である。
【０００４】
創傷治癒のための治療の重要な目標は、失血や、創傷の下にある組織の感染を防ぐために、皮膚創傷でいう表皮などの傷付いた組織の外層を、閉じるかまたは再生することである。急性創傷の場合、これは、負傷者の自然治癒プロセスに大いに依存する治療によって比較的容易に行うことができる。しかしながら、慢性創傷の場合、この治癒プロセスは本来あるべきようには機能していないので、その治療における重要な目標は、身体反応を増強かつ増大し、損傷を受けた組織または傷ついた組織が身体によって再生されるのを助けることである。
【０００５】
従来の創傷治癒のための治療は、止血期、過剰な滲出物の吸収、および皮膚の損傷が治癒する間の感染を防ぐ無菌バリアの維持、に焦点を当てている。従来の製品によっても、抗生物質およびステロイドクリームなどの局所用医薬品をインサイチュにおいて維持することを助け、衣服などとの接触によって侵食されるのを防ぎ得る。最新の創傷治癒用の製品は、このような特徴も共有し得るが、その重要な役割は、湿潤な治癒環境を維持することである。最適な創傷治癒のためには、創傷床が、湿潤ではあるが過度に湿ってはいないことが重要である。過度に湿っていると、創傷床のみならず周囲の皮膚にも浸軟が生じてしまう。最新の創傷手入れ用製品は、抗生物質または成長因子などの創傷治癒を助ける医薬品を含有している場合もある。
【０００６】
しかしながら、慢性創傷が進展する主な原因は、止血後の創傷修復周期が不均衡であるためであり、先行技術の手法は、その他の治癒段階、すなわち、具体的には、炎症期、増殖期、および組織再構築期（最上皮化など）に焦点を当てていない。
【０００７】
したがって創傷での過度の炎症反応に対処することができる創傷治癒のための治療が、有利となる。さらに、最近、炎症期中の治癒プロセスの不均衡によって、ＭＭＰ（ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−８、およびＭＭＰ−９など）、コラゲナーゼ、エラスターゼ、およびプラスミンなどのプロテアーゼが、創傷床において過剰発現し、かつ／または過活性化し得ることが示された。これにより、創傷床内において、新規に合成された細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の分解、および内在的に産生された成長因子および分化因子の分解が起こる。この不均衡は、レグラネクス（Regranex）（商標）（組換え型ヒトＰＤＧＦ）などの刺激性成長因子を添加することで対処することができるが、このような場合でも、外因性ＰＤＧＦは、プロテアーゼによって急速に不活性化される。これに対処することができる別の方法は、このプロテアーゼに優先的に結合し、ＥＣＭの構成要素およびＰＤＧＦなどのタンパク質成長因子の、このプロテアーゼによるタンパク質分解が起こらないようにするタンパク質または他の物質を添加することで行われる。このような製品としては、プロモグラン（Promogran）（商標）などのコラーゲン系の物質、およびブタ小腸粘膜下組織（オアシス（Oasis（商標）））などの複合ＥＣＭ系の物質が挙げられる。しかしながら、これらの製品は、哺乳動物源、通常はウシまたはブタ由来であり、ある特定のウイルスまたはＴＳＥが移動する恐れがある。したがって、非哺乳動物源が好ましいであろう。
【０００８】
ＭＭＰなどのプロテアーゼによるＥＣＭの再構築は、新生物（腫瘍）などにおける血管形成過程、および悪性新生物の転移過程においても観察される。これらの過程において、プロテアーゼは、成長中の血管細胞または新生物細胞の周囲のＥＣＭを少なくとも部分的に分解すると考えられ、これによって、このような細胞は、自由に移動し、新しい場所に成長中の血管の壁または続発性悪性新生物を生じることができる。血管形成は、正常な生理学的プロセスであるが、成長中の新生物においては、このプロセスは、新生物に毛細血管ネットワークを提供するためにも用いられ、これによってさらに成長が可能となる。これらの生理学的状況下でプロテアーゼを阻害することのできる試薬は、新生物（特に、外科的摘出後）を抑制し、転移を防ぐ可能性を有するであろう。
【０００９】
最近、無処置の雌鶏卵殻膜（ＥＳＭ）を用い、無処置フィルムとして損傷を受けた肌に被せた場合に、創傷治癒が促進されることが示された（Ｙａｎｇ， Ｊ-Ｙら， ２００３． Ｃｈａｎｇ Ｇｕｎｇ Ｍｅｄ Ｊ）。
【００１０】
ＥＳＭは、鳥類の卵において卵白と卵殻との間に見出される、タンパク質に富んだ繊維状の複合二層構造である。このような膜は、約９０重量％のタンパク質（コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチンペプチド成長因子、オボトランスフェリン、リジルオキシダーゼ、およびリゾチームなど）ならびにデスモシン、イソデスモシン、およびグリコサミノグリカン（硫酸デルマタン、硫酸コンドロイチン、およびヒアルロン酸など）を含有することが研究によって明らかにされている。様々な機械的手段によって、卵殻および卵の内部成分からＥＳＭを容易に分離して、本質的に純粋なＥＳＭ製剤を作成することができる。
【００１１】
ＥＳＭを無処置シートとして皮膚創傷に被せると、半透過性膜として機能して、水蒸気の透過を可能にし、創傷床内の湿度を管理する。その特性は、バイオブレイン（Biobrane）（商標）などの合成物質と同様である。しかしながら、創傷治癒に用いるのに適切な大きさの無処置ＥＳＭを、商業的に実現可能な量で調製するのは困難である。無処置ＥＳＭは、使用可能な大きさを維持するために、手動の調製を必要とし、それでも、個々の膜を寄せ集めて用いる必要がある。処理中、このもろい物質は、残留結合カルシウムおよび付随している卵白成分からの分離と、無菌的な処理または最終的な滅菌のいずれかとを必要とする。その結果、上述のような医薬製品の製造に足るプロセスおよび品質管理は、技術的または経済的に実現不可能である。
【００１２】
局所的な投与経路を介する特定の創傷の治療に対して、１００〜５００μｍのＥＳＭ粉末もまた提案されている（国際公開公報第２００４/０８０４２８号）。この提案の根拠は不明であり、また、治療が成功したことの証拠も提供されていない。
【００１３】
全身投与経路、特に経口投与経路を介する、関節炎および他の炎症性疾患の痛みおよび炎症の治療に対して、１００〜５００μｍのＥＳＭ粉末もまた提案されている（米国特許第８５８０３１５号）。
【００１４】
より小さなＥＳＭ粒子が説明されており、これを急性皮膚創傷の治療に用いること、および新しくできた創傷用に置換用皮膚移植片として用いることが提案されている（米国特許第３１９６０７５号および米国特許第３１９４７３２号）。慢性創傷の炎症期に与える影響については、何ら開示されておらず、慢性創傷における有用性については提案されていない。
【発明の概要】
【００１５】
驚くべきことに、平均粒子径が１００μｍ未満の微粉化ＥＳＭ粒子は、（ｉ）特に、ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対するマトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）活性レベルが不適切、ならびに／あるいは、（ｉｉ）過度の炎症反応、の恐れがあるか、または現にそうである火傷などの慢性創傷の治癒を促進するために、慢性創傷の治療に特に有利となる特定の性質をすべて有していることが現時点でわかっている。
【００１６】
この性質としては、（ｉ）例えば、創傷において、ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対するＭＭＰ活性を低減することにより、ＥＣＭおよび／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子の分解を抑える能力；（ｉｉ）抗炎症効果；（ｉｉｉ）抗菌効果；（ｉｖ）創傷組織細胞の創傷への移動を促進すること、ならびに／あるいは、例えばこれらの細胞の足場として働く能力によって、これらの細胞の成長および／または分化を促進することにより、組織の新規形成を促進する能力；（ｖ）湿潤な治癒環境の維持を妨げない能力；および（ｖｉ）担体マトリクス（例えば、ヒドロゲルおよびヒドロコロイドゲルなどのゲルマトリクス）内での処理に対する従順性、などが挙げられる。
【００１７】
したがって、第１の態様においては、
（ｉ）ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対するＭＭＰ活性レベルが不適切、ならびに／あるいは、
（ｉｉ）過度の炎症反応
の恐れがあるかまたは現にそうである慢性創傷の治癒を促進する方法であって、
本質的に微粉化卵殻膜（ＥＳＭ）からなり、平均粒子径が１００μｍ未満である粒子の１つ以上が、創傷の治癒を促進する十分量で該創傷に適用される、方法、が提供される。
【００１８】
あるいは、本発明の本態様は、本質的に微粉化ＥＳＭからなり、平均粒子径が１００μｍ未満である粒子であって、
（ｉ）ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対するＭＭＰ活性レベルが不適切、ならびに／あるいは、
（ｉｉ）過度の炎症反応
の恐れがあるかまたは現にそうである慢性創傷の治癒を促進するのに用いられる、粒子、を提供する。
さらに、本発明の本態様は、本質的に微粉化ＥＳＭからなり、平均粒子径が１００μｍ未満である粒子の、薬物の製造における使用であって、該薬物は、
（ｉ）ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対するＭＭＰ活性が不適切、ならびに／あるいは、
（ｉｉ）過度の炎症反応
の恐れがあるかまたは現にそうである慢性創傷の治癒を促進するのに用いられる薬物である、使用、を提供する。
【００１９】
ある実施形態において、上記創傷は、ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対するＭＭＰ−２、ＭＭＰ−８および／またはＭＭＰ−９の活性レベルが不適切、すなわち過剰となる恐れがあるかまたは現にそうである創傷である。他の実施形態において、上記創傷は、全体的なＭＭＰ活性レベルが不適切、すなわち過剰となる恐れがあるかまたは現にそうである創傷である。他の実施形態において、上記創傷は、ＥＣＭおよび／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子の分解レベルが不適切、すなわち過剰となる恐れがあるかまたは現にそうである創傷である。これらの特徴を有する創傷は、ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子の分解を測定する上述した方法、またはＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子、あるいは創傷基質全般に対する全体的なＭＭＰ活性または特定のＭＭＰ活性を測定する上述した方法を用いて、同定されてもよい。
【００２０】
ある実施形態において、対象の創傷は、免疫細胞（マクロファージ、単球、肥満細胞および／または好中球など）、および／または適切でないレベル、すなわち過剰なレベルの炎症誘発マーカー（本明細書で開示されるものなど）、および／または適切でないレベル、すなわち不十分なレベルの抗炎症マーカー（本明細書で開示されるものなど）を含有する創傷などの、炎症を起こす恐れがあるかまたは現に炎症を起こしている創傷、あるいはそのようなものでもある創傷である。
【００２１】
以下において、簡潔さおよび明瞭さのために、「創傷」または「対象の創傷」に関する言及は、特に指示がなければ、上記の慢性創傷に関する言及である。
【００２２】
創傷治癒の促進とは、本明細書に記載の微粉化ＥＳＭ含有粒子を用いて創傷を治療すると、当該創傷の治癒プロセス（すなわち、創傷が、その治癒プロセスにおいて広く認められている３つの段階を進行すること）が加速されることを意味する。治癒プロセスの加速は、治癒段階（すなわち、炎症期、増殖期および／または再構築期）のうち、１つ、２つ、またはすべてを通じて進行速度が増加することとして現れてもよい。治癒段階のうちの１つにおいて創傷が停止する場合、加速は、停止後の線型的で連続的な治癒プロセスの再開として現れてもよい。換言すると、治療は、創傷を、非治癒状態から治癒段階を進行し始める状態に転換する。再開後の進行は、標準的な速度で進んでもよいし、標準的な急性創傷が治癒する速度と比較して、遅い速度で進んでもよい。創傷治癒を促進することで、当該創傷の治癒プロセスの減速が防止されると考えてもよい。治癒プロセスの減速は、治癒段階のうち、１つ、２つ、またはすべてを通じて進行速度が減少することとして現れてもよい。停止後の線型的で連続的な治癒プロセスを創傷が再開している場合、減速は、治癒段階のうちの１つにおいて再度停止することとして現れてもよい。言い換えると、治療は、創傷が、治癒状態から非治癒状態に転換するのを防止する。さらに、創傷治癒を促進することで、既存の創傷が治療され、かつ既存の創傷が成長すること、および／または既存の治癒中の創傷が、治癒が不十分な創傷もしくは慢性創傷になることが防止されると考えてもよい。
【００２３】
治癒を促進するために、本明細書に記載の微粉化ＥＳＭ含有粒子（この語は、本明細書において、「ＥＳＭ粒子」および「ＥＳＭの粒子」と区別なく用いられる）を用いて対象の創傷を治療すると、創傷におけるＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対するＭＭＰの活性が、低減または制限され得る。したがって、本発明は、創傷におけるＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対するＭＭＰの活性を低減または制限する、創傷の治癒を促進する方法であって、本明細書に記載のＥＳＭ粒子の１つ以上が、創傷におけるＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対するＭＭＰの活性を低減または制限する十分量で該創傷に適用される、方法、を包含するものと見なすことができる。
【００２４】
ＭＭＰ−２（７２ｋＤａ ＩＶ型コラゲナーゼまたはゼラチナーゼＡともいう）、ＭＭＰ−８（好中球コラゲナーゼまたはＰＭＮＬコラゲナーゼともいう）、および／またはＭＭＰ−９（９２ｋＤａ ＩＶ型コラゲナーゼ、９２ｋＤａ ゼラチナーゼ、またはゼラチナーゼＢともいう）は、通常、創傷、特に慢性創傷において見出され、好ましい実施形態において、具体的には、ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対するこれらのＭPＰの活性が低減される。
【００２５】
ある実施形態において、創傷におけるＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対するＭＭＰの活性は、治療中の創傷の治癒プロセスに不利益にならないレベルまで低減または制限される。この低減は、創傷（または創傷液）におけるＥＣＭタンパク質（コラーゲンおよびエラスチンなど）および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子の断片の減少として観察されてもよい。これらの断片は、ひいてはこれらのタンパク質の分解を示すものであり、免疫組織化学法／免疫細胞化学法、および／または生体分子（タンパク質など）染色などの常用の技術によって、あるいはクロマトグラフ法を用いて創傷液を解析することによって、検出されてもよい。制限は、このようなレベルが維持されていることとして観察されてもよい。
【００２６】
創傷は、それぞれ、ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対するＭＭＰ活性として、異なる（例えば、低減された）レベルを必要とするものであり、この点で同じ創傷でも、時間がたてば必要とするものが異なる場合もある。これは、必要であれば、過度の負担なく、当業者によって決定されてもよいが、本明細書で開示される微粉化ＥＳＭ含有粒子の重要な利点は、効果的なレベルでＭＭＰを阻害することが比較的容易であるので、煩わしい投与量の最適化を、日常的に行う必要がないということである。実際、たいていの場合、本明細書に記載のＥＳＭ粒子によるＭＭＰ活性の低減は、創傷治癒の促進に効果的であろう。
【００２７】
数値的に表すと、本発明で用いる微粉化ＥＳＭ含有粒子を、治療中の創傷に適用した後、創傷におけるＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対するＭＭＰ活性（または、ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子の全体的な分解）は、好ましくは、少なくとも５％低減され、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％低減される。ある実施形態において、ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対するＭＭＰ活性（または、ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子の全体的な分解）は、あるレベルで維持される必要があってもよく、このような実施形態において、ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対するＭＭＰ活性（または、ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子の全体的な分解）において、低減されるのは９０％以下であり、例えば、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、または５％以下が低減される。これらの値の組み合わせに由来するあらゆる範囲の端点が、具体的に企図される。
【００２８】
理論に拘束されることを望むものではないが、ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対するＭＭＰ活性（または、ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子の全体的な分解）は、多くの機構によって低減または制限され得る。これは、創傷ＭＭＰの直接阻害、創傷ＭＭＰの吸収および不活性化、別の基質または過剰な基質を加えることによる創傷ＭＭＰの滴定、創傷ＭＭＰの活性化に関わる酵素（プラスミン、好中球エラスターゼおよび肥満細胞キマーゼを含むセリンプロテアーゼなど）の阻害、ならびに、創傷の細胞および／または単球、マクロファージ、好中球、肥満細胞などの炎症細胞によるＭＭＰの発現および／または分泌を阻害する内在性ＭＭＰ阻害物質（ＴＩＭＰ（組織性メタロプロテアーゼ阻害物質）など）の創傷における上方制御を含み得るが、これらに限定されるものではない。当業者であれば、市販されているものもある常用の解析技術を用いて、過度の負担なく、創傷におけるこのような効果を測定することができるであろう。上記引用した低減の割合は、ここでも適用される。
【００２９】
ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対するＭＭＰ活性の低減または制限は、治療中の創傷における全体的なＭＭＰ活性の低減または維持に反映されてもよい。全体的なＭＭＰ活性は、すべてのＭＭＰの、すべての創傷基質に対する活性の目安である。全体的なＭＭＰ活性は、市販されているものもある常用の解析技術を用いて、過度の負担なく、測定することができる。数値的に表すと、本発明で用いるＥＳＭ粒子を、治療中の創傷に適用した後、創傷における全体的なＭＭＰ活性は、好ましくは、少なくとも５％低減され、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％低減される。
【００３０】
ある実施形態において、全体的なＭＭＰ活性、および、特に、ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対するＭＭＰ活性は、あるレベルで維持される必要があってもよく、このような実施形態において、全体的なＭＭＰ活性、特にＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対するＭＭＰ活性において、低減されるのは９０％以下であり、例えば、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、または５％以下が低減される。これらの値に由来するあらゆる範囲の端点の組み合わせが、具体的に企図される。
【００３１】
他の実施形態において、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−８および／またはＭＭＰ−９などの特定のＭＭＰの全体的な活性が考慮される。これらの実施形態において、全体的なＭＭＰ活性は、すべての創傷基質に対する当該特定ＭＭＰの活性である。
【００３２】
一実施形態において、本発明の方法は、ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対するＭＭＰ活性（または、ＭＭＰ活性の全体的なレベル）が、適切でないレベル、すなわち過剰なレベルである恐れがあるか、あるいはＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対するＭＭＰ活性（または、ＭＭＰ活性の全体的なレベル）が低減または制限（例えば、維持）されることで恩恵を受ける創傷を有していると被験体が診断されるステップを含んでいてもよい。他の実施形態において、本発明の方法は、ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子の分解レベルが、適切でないレベル、すなわち過剰なレベルである恐れがある創傷を有すると被験体が診断されるステップを含んでいてもよい。
【００３３】
さらなる実施形態において、本発明の方法は、本発明で用いるＥＳＭ粒子を、創傷に適用した後、ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子の分解を測定する、かつ／あるいはＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対するＭＭＰ活性を測定する、かつ／あるいは全体的なＭＭＰ活性を測定するステップを含んでいてもよい。他の実施形態において、ＭＭＰ全般の代わりに、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−８および／またはＭＭＰ−９が考えられる。あるいは、または、さらに、本発明の方法は、本発明で用いるＥＳＭ粒子を、創傷に適用した後、創傷の臨床指標（例えば、創傷のサイズ（深さおよび／または面積）、治癒時間、創傷もしくは周囲組織全体の不快感または痛み）を測定するステップを含んでいてもよい。これらの測定ステップは、本発明で用いるＥＳＭ粒子を創傷に適用する直前に、または被験体の治療最初期の別の時点に、同じ測定基準と比較することを含んでいてもよい。
【００３４】
本態様において、本発明で用いるＥＳＭ粒子の「十分量（または、有効量）」とは、上述したＭＭＰ活性ならびにＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子の分解に影響を及ぼし、それによって創傷の治癒を促進する、本明細書に記載のＥＳＭ粒子の量である。当業者であれば、常用の投与反応プロトコールと、好都合なことには、上記および実施例３において例示するＭＭＰ活性ならびにＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子の分解を評価する常用の技術とに基づいて、ＥＳＭ粒子の有効量（十分量）がどれだけであるかを容易に決定することができるであろう。
【００３５】
治癒を促進するために、本明細書に記載のＥＳＭ粒子を用いて対象の創傷を治療することによって、創傷における炎症が低減または制限されてもよく、あるいは追加的に低減または制限されてもよい。したがって、本発明は、創傷における炎症が低減または制限されているものであるか、あるいは低減または制限されてもいるものである、創傷の治癒を促進する方法であって、本明細書に記載のＥＳＭ粒子が、炎症を低減または制限する十分量で該創傷に適用される、方法、を包含するものと見なすことができる。
【００３６】
創傷における炎症は、紅斑、腫脹、局所熱感、浮腫、および／または膿として認識され得る。これらの炎症の兆候の１つ以上について、解剖学的範囲および／または強度を低減することで、炎症が低減される。これらの炎症の兆候の１つ以上について、解剖学的範囲および／または強度を維持すること、またはこれらが増加することを防止することで、炎症が制限される。
【００３７】
あるいは、または、さらに、炎症誘発マーカー、および／またはサイトカインやケモカインなどの抗炎症マーカー、および／または免疫細胞の創傷におけるレベルまたは活性を、創傷組織サンプルおよび／または創傷内部サンプルなどにおいて測定してもよい。より具体的には、ＴＮＦα、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＮＦ−ｋＢ、ＲＯＳ、ヒスタミン、マクロファージ、単球、肥満細胞、および／または好中球のレベルまたは活性を測定してもよい。これは、例えば、創傷サンプルの免疫アッセイまたはフローサイトメトリー、あるいは適切な活性測定法によって行われてもよい。
【００３８】
創傷サンプルにおいて、炎症誘発マーカーおよび／または免疫細胞のうち１つ以上のレベルまたは活性を低減することで、創傷における炎症が低減されてもよい。同様に、創傷サンプルにおいて、抗炎症マーカーのうちの１つ以上のレベルまたは活性を増加させることで、創傷における炎症が低減されてもよい。創傷サンプルにおいて、炎症誘発マーカーおよび／または免疫細胞のうち１つ以上のレベルまたは活性を維持すること、またはこれらが増加することを防止することで、あるいは抗炎症マーカーのうちの１つ以上のレベルまたは活性を維持すること、またはこれらが低減されるのを防止することで、創傷における炎症が制限されてもよい。
【００３９】
本態様において、本発明で用いるＥＳＭ粒子の「十分量（または、有効量）」とは、上述の創傷における炎症、特に、炎症誘発マーカーおよび／もしくは抗炎症マーカーのレベルまたは活性、ならびに／あるいは免疫細胞のレベルまたは活性に影響を及ぼし、それによって創傷の治癒を促進する、ＥＳＭ粒子の量である。当業者であれば、常用の投与反応プロトコールと、好都合なことには、上記および実施例２において例示する創傷の炎症を評価する常用の技術とに基づいて、ＥＳＭ粒子の有効量（十分量）がどれだけであるかを容易に決定することができるであろう。
【００４０】
一実施形態において、本発明の方法は、炎症を発症する恐れがあるかまたはそのような恐れもある創傷、あるいは炎症が治療される（すなわち、低減されるか制限される）ことで恩恵を受ける創傷を有していると被験体が診断されるステップを含んでいてもよい。
【００４１】
さらなる実施形態において、本発明の方法は、本発明で用いるＥＳＭ粒子を創傷に適用した後、創傷における炎症の程度を測定するステップを含んでいてもよい。これらの測定ステップは、本発明で用いるＥＳＭ粒子を創傷に適用する直前に、または被験体の治療最初期の別の時点に、同じ測定基準と比較することを含んでいてもよい。
【００４２】
ある実施形態において、本発明で用いるＥＳＭ粒子は、平均粒子径が９５μｍ未満であり、例えば９０μｍ未満、８５μｍ未満、８０μｍ未満、７５μｍ未満、７０μｍ未満、６５μｍ未満、６０μｍ未満、５５μｍ未満、５０μｍ未満、４５μｍ未満、４０μｍ未満、３５μｍ未満、３０μｍ未満、２５μｍ未満、２０μｍ未満、１５μｍ未満、１０μｍ未満、５μｍ未満、または１μｍ未満であり、例えば９００ｎｍ未満、８５０ｎｍ未満、８００ｎｍ未満、７５０ｎｍ未満、７００ｎｍ未満、６５０ｎｍ未満、６００ｎｍ未満、５５０ｎｍ未満、５００ｎｍ未満、４５０ｎｍ未満、４００ｎｍ未満、３５０ｎｍ未満、３００ｎｍ未満、２５０ｎｍ未満、２００ｎｍ未満、１５０ｎｍ未満、１００ｎｍ未満、５０ｎｍ未満、１０ｎｍ未満、５ｎｍ未満、または１ｎｍ未満である。
【００４３】
ある実施形態において、本発明で用いるＥＳＭ粒子は、また、平均粒子径が、１ｎｍ以上であり、例えば５ｎｍ以上、１０ｎｍ以上、５０ｎｍ以上、１００ｎｍ以上、１５０ｎｍ以上、２００ｎｍ以上、２５０ｎｍ以上、３００ｎｍ以上、３５０ｎｍ以上、４００ｎｍ以上、４５０ｎｍ以上、５００ｎｍ以上、５５０ｎｍ以上、６００ｎｍ以上、６５０ｎｍ以上、７００ｎｍ以上、７５０ｎｍ以上、８００ｎｍ以上、８５０ｎｍ以上、９００ｎｍ以上、または９５０ｎｍ以上であり、あるいは１μｍ以上であり、例えば５μｍ以上、１０μｍ以上、１５μｍ以上、２０μｍ以上、２５μｍ以上、３０μｍ以上、３５μｍ以上、４０μｍ以上、４５μｍ以上、５０μｍ以上、５５μｍ以上、６０μｍ以上、６５μｍ以上、７０μｍ以上、７５μｍ以上、８０μｍ以上、８５μｍ以上、９０μｍ以上、または９５μｍ以上である。これらの値の組み合わせに由来するあらゆる範囲の端点が、具体的に企図される。
【００４４】
粒子は、どのような立体形状であってもよい。本質的に、対称であっても非対称であってもよい。本質的に、球状であっても、擬角柱であっても、円筒状であってもよい。本質的に、不規則であっても、規則的であっても、両方の領域があってもよい。角形でも、丸くても、先細でもあってもよく、それらの領域があってもよい。ある実施形態において、粒子は、長さ寸法の１つが他の長さ寸法よりも有意に大きく、そのために、例えば、棒状、針状、または繊維状（ロッド、ニードル、または繊維）と呼ばれてもよく、有意に大きい長さ寸法に対して実質的に垂直な断面に応じて円筒状または擬角柱（立方体など）と称されてもよい。
【００４５】
ある実施形態において、本発明で用いる粒子は、第１の長さ寸法と、これに垂直に配される第２の長さ寸法とのアスペクト比が、少なくとも１．５（第１の長さ寸法：第２の長さ寸法）であり、例えば少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、または少なくとも１００である。他の実施形態において、本発明で用いる粒子は、第１の長さ寸法と、これに実質的に垂直に配される第２の長さ寸法とのアスペクト比が、２以下（第１の長さ寸法：第２の長さ寸法）であり、例えば３以下、４以下、５以下、６以下、７以下、８以下、９以下、１０以下、１２以下、１４以下、１６以下、１８以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、５５以下、６０以下、６５以下、７０以下、８０以下、９０以下、または１００以下である。これらの値の組み合わせに由来するあらゆる範囲の端点が、具体的に企図され、例えば、本発明で用いる粒子は、アスペクト比が、５、６、７、８、９、または１０のうちのいずれかの値と２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、または７０のうちのいずれかの値との比であってよい
【００４６】
これらの実施形態において、第１の長さ寸法は、粒子において最長の長さ寸法であり、長手方向寸法と呼ばれてもよい。したがって、第２の長さ寸法は、横方向寸法と呼ばれてもよい。第２の長さ寸法は、最長の横方向寸法、または、例えば長手方向寸法の長さに沿って測定された粒子の横方向寸法の平均値である。
【００４７】
ある実施形態において、長手方向寸法は、０．１〜５００μｍであり、例えば０．１〜４００μｍ、０．１〜３００μｍ、０．１〜２００μｍ、０．１〜１００μｍ、０．１〜８０μｍ、０．１〜６０μｍ、０．１〜４０μｍ、０．１〜２０μｍ、０．１〜１０μｍ、０．１〜１μｍ、０．１〜０．５μｍ、０．５〜５００μｍ、０．５〜４００μｍ、０．５〜３００μｍ、０．５〜２００μｍ、０．５〜１００μｍ、０．５〜８０μｍ、０．５〜６０μｍ、０．５〜４０μｍ、０．５〜２０μｍ、０．５〜１０μｍ、０．５〜１μｍ、１〜５００μｍ、１〜４００μｍ、１〜３００μｍ、１〜２００μｍ、１〜１００μｍ、１〜８０μｍ、１〜６０μｍ、１〜４０μｍ、１〜２０μｍ、１〜１０μｍ、１０〜５００μｍ、１０〜４００μｍ、１０〜３００μｍ、１０〜２００μｍ、１０〜１００μｍ、１０〜８０μｍ、１０〜６０μｍ、１０〜４０μｍ、１０〜２０μｍ、２０〜５００μｍ、２０〜４００μｍ、２０〜３００μｍ、２０〜２００μｍ、２０〜１００μｍ、２０〜８０μｍ、２０〜６０μｍ、２０〜４０μｍ、４０〜５００μｍ、４０〜４００μｍ、４０〜３００μｍ、４０〜２００μｍ、４０〜１００μｍ、４０〜８０μｍ、４０〜６０μｍ、６０〜５００μｍ、６０〜４００μｍ、６０〜３００μｍ、６０〜２００μｍ、６０〜１００μｍ、６０〜８０μｍ、８０〜５００μｍ、８０〜４００μｍ、８０〜３００μｍ、８０〜２００μｍ、８０〜１００μｍ、１００〜５００μｍ、１００〜４００μｍ、１００〜３００μｍ、１００〜２００μｍ、２００〜５００μｍ、２００〜４００μｍ、２００〜３００μｍ、３００〜５００μｍ、３００〜４００μｍ、または４００〜５００μｍである。
【００４８】
ある実施形態において、横方向寸法またはその平均は、０．０１〜２０μｍであり、例えば０．０１〜１６μｍ、０．０１〜１２μｍ、０．０１〜８μｍ、０．０１〜４μｍ、０．０１〜２μｍ、０．０１〜１．６μｍ、０．０１〜１．２μｍ、０．０１〜０．８μｍ、０．０１〜０．４μｍ、０．０１〜０．２μｍ、０．０１〜０．１μｍ、０．０１〜０．０５μｍ、０．０５〜２０μｍ、０．０５〜１６μｍ、０．０５〜１２μｍ、０．０５〜８μｍ、０．０５〜４μｍ、０．０５〜２μｍ、０．０５〜１．６μｍ、０．０５〜１．２μｍ、０．０５〜０．８μｍ、０．０５〜０．４μｍ、０．０５〜０．２μｍ、０．０５〜０．１μｍ、０．１〜２０μｍ、０．１〜１６μｍ、０．１〜１２μｍ、０．１〜８μｍ、０．１〜４μｍ、０．１〜２μｍ、０．１〜１．６μｍ、０．１〜１．２μｍ、０．１〜０．８μｍ、０．１〜０．４μｍ、０．１〜０．２μｍ、０．２〜２０μｍ、０．２〜１６μｍ、０．２〜１２μｍ、０．２〜８μｍ、０．２〜４μｍ、０．２〜２μｍ、０．２〜１．６μｍ、０．２〜１．２μｍ、０．２〜０．８μｍ、０．２〜０．４μｍ、０．４〜２０μｍ、０．４〜１６μｍ、０．４〜１２μｍ、０．４〜８μｍ、０．４〜４μｍ、０．４〜２μｍ、０．４〜１．６μｍ、０．４〜１．２μｍ、０．４〜０．８μｍ、０．８〜２０μｍ、０．８〜１６μｍ、０．８〜１２μｍ、０．８〜８μｍ、０．８〜４μｍ、０．８〜２μｍ、０．８〜１．６μｍ、０．８〜１．２μｍ、１．２〜２０μｍ、１．２〜１６μｍ、１．２〜１２μｍ、１．２〜８μｍ、１．２〜４μｍ、１．２〜２μｍ、１．２〜１．６μｍ、１．６〜２０μｍ、１．６〜１６μｍ、１．６〜１２μｍ、１．６〜８μｍ、１．６〜４μｍ、１．６〜２μｍ、２〜２０μｍ、２〜１６μｍ、２〜１２μｍ、２〜８μｍ、２〜４μｍ、４〜２０μｍ、４〜１６μｍ、４〜１２μｍ、または４〜８μｍである。
【００４９】
上述した長手方向寸法と横方向寸法とのあらゆる組み合わせ、およびその範囲が、特に、あらゆるアスペクト比およびその範囲において、具体的に企図される。前述のことに鑑みると、本発明で用いるある特定の粒子は、ロッド、ニードル、または繊維である。
【００５０】
したがって、実質的に、例えば本質的に、球状でない粒子について、粒子形に関する本発明の一般性に鑑みると、粒子径に関する言及は、同等の球径に関する言及である。これらの実施形態において、粒子は、用いた粒子サイズ測定技術において該直径を有する同物質の組成物の球体と同じ大きさの示度となる大きさ寸法で定められた形状を有する。ある実施形態において、用いる大きさ寸法は、体積または表面積であり、好ましくは体積である。
【００５１】
平均径、または同等の球径は、抵抗パルス／コールター法、沈降分離（重力または遠心分離）、光学イメージング（ＳＥＭ、静止画像解析、動画像解析など）、レーザー回折、または光散乱などの簡便な手段で評価してもよいが、本発明の目的では、波長可変抵抗パルスセンシングの形態でコールター法を用いるか、または光学手段を用いて粒子サイズを決定するものとする。
【００５２】
ＥＳＭは、鳥類の卵、例えば、野鶏（猟鳥／陸鳥（キジ目）および水鳥（カモ目））および家禽、特に、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、ホロホロチョウ、ダチョウ、ハト、キジ、ウズラ、ライチョウ、またはカモメの卵の卵白と卵殻との間に見出される、繊維状の二重層である。ガルス・ガルス・ドメスティクス（Gallus gallus domesticus）、すなわち飼い鶏の卵が特に好ましい。二重層のうちのどちらか一層、またはその両方が、本発明に基づいて用いられてもよい。
【００５３】
本発明で用いる粒子は、本質的に、このような膜の微粉化形態からなる。「本質的に〜からなる」とは、粒子が、少なくとも８０％ｗ／ｗの微粉化ＥＳＭを含有することを意味し、例えば少なくとも８５％ｗ／ｗ、少なくとも９０％ｗ／ｗ、少なくとも９１％ｗ／ｗ、少なくとも９２％ｗ／ｗ、少なくとも９３％ｗ／ｗ、少なくとも９４％ｗ／ｗ、少なくとも９５％ｗ／ｗ、少なくとも９６％ｗ／ｗ、少なくとも９７％ｗ／ｗ、少なくとも９８％ｗ／ｗ、少なくとも９９％ｗ／ｗ、少なくとも９９．５%ｗ／ｗ、または少なくとも９９．９％ｗ／ｗの微粉化ＥＳＭを含有することを意味する。ある実施形態において、粒子は、微粉化ＥＳＭからなる。これらの実施形態において、水分、すなわち水は、ｗ／ｗの計算結果には含まれず、すなわち、水ではない成分に基づいて計算が行われる。しかしながら、粒子は、さらに、幾分かの水分を含有していても良く、例えば、粒子の全質量の２０％、１５％、１０％、５％、または１％までが水分子であってもよい。微粉化ＥＳＭの個々の粒子は、例えば上述した形状などの、どのような形状であってもよい。微粉化ＥＳＭの形状は、本発明で用いる粒子の形状と同じであってもよいし、異なっていてもよい。複数の微粉化ＥＳＭ粒子が存在する場合、その形状は、本質的に同じであってもよいし（すなわち、本発明で用いる粒子における微粉化ＥＳＭの形状は、本質的に同質であってもよい）、異なっていてもよい（異質であってもよい）。ある実施形態において、本発明で用いる粒子における微粉化ＥＳＭ粒子は、繊維、ロッド、またはニードルである。
【００５４】
本発明で用いる粒子は、上記の定義で許容される程度に、本明細書で開示される賦形剤またはさらなる治療薬などの非ＥＳＭ物質をさらに含有していてもよい。粒子は、好ましくは、本質的に、卵白、卵黄、および／または卵殻（炭酸カルシウム）などの他の（非ＥＳＭである）卵成分（これは、ＥＳＭに対して「不純」物質と見なしてよい）を含まない。「本質的に含まない」とは、粒子が、５％ｗ／ｗ以下の非ＥＳＭ卵成分を含有する、例えば４％ｗ／ｗ以下、３％ｗ／ｗ以下、２％ｗ／ｗ以下、１％ｗ／ｗ以下、０．５％ｗ／ｗ以下、０．１％ｗ／ｗ以下、０．０５％ｗ／ｗ以下、または０．０１％ｗ／ｗ以下の非ＥＳＭ卵成分を含有することを意味する。
【００５５】
ある実施形態において、粒子のＥＳＭ成分は、単一の微粉化ＥＳＭの粒子であり、特に微粉化ＥＳＭの繊維、ロッド、またはニードルである。
例えば繊維、ロッド、ニードルなどのアスペクト比が高い微粉化ＥＳＭからなる、上述の大きさの粒子（本明細書において、区別なく、大きさに応じて、マイクロ繊維、マイクロロッドおよびマイクロニードル、あるいはナノ繊維、ナノロッド、およびナノニードルと呼んでもよい）は、少なくとも本明細書に記載の薬物治療に関しては、ＥＳＭの他の形態（国際公開公報第２００４/０８０４２８号の形態など）よりも、ある特定の物理的優位性を有すると考えられる。特に、このような配合により、創傷治癒および組織工学用被覆材／足場に関して、表面積、代謝回転速度、湿潤性、水分保持、適用性、および、特にＭＭＰ阻害のレベルが理想的なものとなると考えられる。
【００５６】
ある実施形態において、本発明で用いる粒子は、実質的に、例えば本質的に球状ではなく、すなわち、上記のアスペクト比が１．５未満、例えば１．４未満、１．３未満、１．２未満、または１．１未満の粒子ではない。他の実施形態において、本発明で用いる粒子は、球体ではなく、すなわち、上記のアスペクト比が１の粒子ではない。
【００５７】
さらなる態様において、本質的に微粉化卵殻膜（ＥＳＭ）からなる粒子であって、該粒子は、平均粒子径が１００μｍ未満である、粒子、が提供される。
本発明で用いる粒子のＥＳＭは、簡便な手段によって、他の卵成分から分離されてもよい。ＥＳＭが分離されてもよい卵は、有精卵であってもよいし、無精卵であってもよい。卵は、無処置のもの、すなわち孵化前のものであってもよいし、空のもの、すなわち孵化後または卵の内容物（卵白および卵黄）抽出後の残部であってもよい。適した手段は、例えば、その内容が参照により本明細書に援用される国際公開公報第２００４/０８０４２８号および米国特許第８５８０３１５号に記載のものである。ＥＳＭは、好ましくは、その内容が参照により本明細書に援用される国際公開公報第２０１５/０５８７９０号（ＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０７２０４９）に開示されている商業用卵処理施設の生産ライン中で卵殻膜を採取する方法によって調製される。国際公開公報第２０１５/０５８７９０号は、割卵ユニットにおいて生じ、卵殻部分および膜部分を含む卵殻残部を処理する方法であって、卵殻残部（例えば、粒子サイズが約０．５〜約４０ｍｍで、湿量基準の水分含量が約３〜約４０％である）を、割卵ユニットから、温度が約８５℃未満（好ましくは約６０℃未満）で速度が約６０ｍ／ｓを越える（好ましくは約７０〜約３４０ｍ／ｓ）処理ガスで駆動するサイクロンへ供給することを含む、方法、を提供する。サイクロン内では、卵殻残部を処理する渦によって、粒子サイズが減少し、膜部が卵殻部からはがされて、卵殻部が膜部から分離される。サイクロンの上部排出口からは、主に、処理ガス、水蒸気、および水滴の混合物が放出され、サイクロンの底部排出口からは、主に、分離された卵殻部および膜部の混合物が放出される。次いで、放出された混合物は、選別デバイスにおいて、卵殻部部分と膜部部分とに分離される。結果として得られるＥＳＭは、本明細書に記載されているように、好ましくはステップを挟まずに、ＥＳＭ粒子へとさらに処理されてもよい。
【００５８】
ある実施形態において、ＥＳＭを調製する方法は、全体の処理ガス供給速度に対する卵殻残部供給速度を、例えば間隔が約０．５〜約２０秒、好ましくは約１〜約５秒に調製することで、卵殻残部をサイクロンに供給してから混合物が放出されるまでの時間を制御するさらなるステップを含む。ある実施形態において、本方法は、卵殻残部をサイクロンに供給する前に、遠心分離するステップをさらに含む。ある実施形態において、供給ステップは連続的である。他の実施形態において、選別ステップは、圧搾空気によって膜部部分を選別スクリーンから取り外し、選別デバイスから排出することを含んでいる。本方法は、膜部分を乾燥する最終ステップを含んでいてもよい。
【００５９】
大きさが約１〜約１０ｍｍ2の範囲内にあるフレーク状のＥＳＭ材料は、再編または処理を行って、無処置のＥＳＭと同じ特性を有するシートにすることはできない。しかしながら、本発明は、このような材料を、創傷表面に提示し、創傷治癒を促進する方法を提供する。
【００６０】
ある実施形態において、本発明で用いる粒子のＥＳＭ（または少なくともそのタンパク質成分）は、実質的に、殻−膜分離プロセスで得られるものである。換言すると、本発明で用いる粒子のＥＳＭは、相当する鳥類源由来の天然ＥＳＭと比較すると、実質的に化学変性されていない。
【００６１】
より具体的には、本発明で用いる粒子のＥＳＭは、相当する鳥類源由来の天然ＥＳＭと比較すると、化学的には、実質的に未分解、未消化（例えば、化学的に、または酵素学的に）、および／または未変性である。「実質的に未分解」とは、相当する鳥類源由来の天然ＥＳＭと比較すると、ＥＳＭ成分のうち２０％未満、例えば１５％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満が分解の兆候を示すことを意味する。未消化および未変性については、それに応じて解釈されるべきである。ＥＳＭの分解／消化／変性の程度は、ＥＳＭの相対的溶解度および／またはＥＳＭ中のコラーゲン繊維の相対的な大きさまたは構造を測定することで評価することができる。これは、免疫組織化学法／免疫細胞化学法、および／または生体分子（タンパク質など）染色などの常用の技術によって実現されてもよい。
【００６２】
特に、本発明で用いる粒子のＥＳＭは、加水分解反応またはジスルフィド結合還元反応、例えば化学的または酵素学的な反応、特にアルカリ加水分解反応にさらされていない。換言すると、本発明で用いる粒子のＥＳＭは、実質的に加水分解されておらず、これは、相当する鳥類源由来の天然ＥＳＭと比較すると、ＥＳＭ成分のうち２０％未満、例えば１５％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満が加水分解の兆候を示すことを意味する。ＥＳＭの加水分解の程度は、ＥＳＭの相対的溶解度、および／またはコラーゲン繊維の相対的な大きさ、および／またはＥＳＭ中のコラーゲンの架橋の程度を測定することで評価することができる。これは、免疫組織化学法／免疫細胞化学法、および／またはタンパク質染色などの常用の技術によって実現されてもよい。
【００６３】
他の実施形態において、本発明で用いる粒子のＥＳＭは、実質的に、例えば本質的に、ｐＨ６．８〜７．２などの中性ｐＨにおいて、水に不溶である。本発明の目的では、不溶性物質は、１ｇの溶質を溶解するのに、１０Ｌを越える溶媒を必要とする。
【００６４】
本発明で用いる粒子のＥＳＭは、ボールミル粉砕、ビーズミル粉砕、ジェットミル粉砕、ボルテックスミル粉砕などの、簡便な粒子サイズ低減技術手段、微粉化技術手段、研磨技術手段、粉末化技術手段、または粉砕技術手段によって微粉化され、次いで篩い分けおよびスクリーニングなどのサイズ選別を行ってもよい。選択された粒子サイズ低減法は、乾燥状態で行われても、液状媒体を用いて行われてもよい。凍結粉砕が用いられてもよい。ある実施形態における粒子サイズ低減プロセス、およびある実施形態における先行するＥＳＭ調製プロセスは、必要な大きさのＥＳＭ繊維（すなわち、マイクロ繊維およびナノ繊維）が生成されるという点に基づいて、選択される。とりわけ、回転刃混合機で乾燥ＥＳＭを粉末化することが、この点で有効であることが示されている（図５）。
【００６５】
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載の微粉化ＥＳＭ含有粒子を調製する方法であって、該方法は、例えば本明細書に記載されているＥＳＭを提供することと、ＥＳＭを微粉化プロセスおよび粒子サイズ選別プロセスに供することと、を含む方法、を提供する。ＥＳＭは、好ましくは、非ＥＳＭ卵成分を本質的に含まない状態で提供される。非ＥＳＭ卵成分を本質的に含まないＥＳＭを提供することは、より好ましくは、例えば国際公開公報第２０１５/０５８７９０号（ＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０７２０４９）および上記記載の通り、非ＥＳＭ卵成分からＥＳＭを分離することと、約０．１％塩酸または酢酸の水溶液などの弱酸溶液（この語は、弱酸性溶液を含む）でそのようにして得られたＥＳＭを洗浄し、これによってＥＳＭ中の残存炭酸カルシウムを除去することと、を含む。他の実施形態において、微粉化ＥＳＭは、上記弱酸溶液で洗浄される。この弱酸による洗浄、特に約０．１％塩酸溶液での処理によって、ＥＳＭが脱塩されてＥＳＭ中の無機塩の量が最小化されるだけでなく、微生物（本明細書に記載のものなど）、プリオン、およびウイルスなどの感染源が除去され、かつ／または不活性化される。
【００６６】
図５に示すように、この方法で調整されたＥＳＭの微粉化によって、長さ１０〜１００μｍ、厚さ１〜５μｍのＥＳＭ繊維（すなわち、マイクロ繊維およびナノ繊維）を作成する。
【００６７】
本発明で用いる微粉化ＥＳＭ含有粒子の追加的な成分を、微粉化プロセスの前に含有させてもよいし、当該プロセス中に含有させてもよいし、当該プロセス後に含有させてもよい。本方法によって得られた、または得ることができる微粉化ＥＳＭ含有粒子は、本発明のさらなる態様である。
【００６８】
本発明で用いる粒子は、典型的には、複数の当該粒子の一部として提供され、複数の粒子の粒子径の最頻値は、１００μｍ未満であり、例えば９５μｍ未満、９０μｍ未満、８５μｍ未満、８０μｍ未満、７５μｍ未満、７０μｍ未満、６５μｍ未満、６０μｍ未満、５５μｍ未満、５０μｍ未満、４５μｍ未満、４０μｍ未満、３５μｍ未満、３０μｍ未満、２５μｍ未満、２０μｍ未満、１５μｍ未満、１０μｍ未満、５μｍ未満、または１μｍ未満であり、例えば９００ｎｍ未満、８５０ｎｍ未満、８００ｎｍ未満、７５０ｎｍ未満、７００ｎｍ未満、６５０ｎｍ未満、６００ｎｍ未満、５５０ｎｍ未満、５００ｎｍ未満、４５０ｎｍ未満、４００ｎｍ未満、３５０ｎｍ未満、３００ｎｍ未満、２５０ｎｍ未満、２００ｎｍ未満、１５０ｎｍ未満、１００ｎｍ未満、５０ｎｍ未満、１０ｎｍ未満、５ｎｍ未満、または１ｎｍ未満である。
【００６９】
ある実施形態において、複数の粒子の粒子径の最頻値は、また、１ｎｍ以上であり、例えば５ｎｍ以上、１０ｎｍ以上、５０ｎｍ以上、１００ｎｍ以上、１５０ｎｍ以上、２００ｎｍ以上、２５０ｎｍ以上、３００ｎｍ以上、３５０ｎｍ以上、４００ｎｍ以上、４５０ｎｍ以上、５００ｎｍ以上、５５０ｎｍ以上、６００ｎｍ以上、６５０ｎｍ以上、７００ｎｍ以上、７５０ｎｍ以上、８００ｎｍ以上、８５０ｎｍ以上、９００ｎｍ以上、または９５０ｎｍ以上であり、あるいは１μｍ以上であり、例えば５μｍ以上、１０μｍ以上、１５μｍ以上、２０μｍ以上、２５μｍ以上、３０μｍ以上、３５μｍ以上、４０μｍ以上、４５μｍ以上、５０μｍ以上、５５μｍ以上、６０μｍ以上、６５μｍ以上、７０μｍ以上、７５μｍ以上、８０μｍ以上、８５μｍ以上、９０μｍ以上、または９５μｍ以上である。これらの値の組み合わせに由来するあらゆる範囲の端点が、具体的に企図される。
【００７０】
ある実施形態において、複数の粒子中の粒子数の２５％未満、例えば２０％未満、１５％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５%、または０．１％未満の粒子の平均粒子径は、１００μｍ以上である。
【００７１】
ある実施形態において、分散度が低い複数の粒子を提供することが、有利であってもよい。このことから、選択された平均粒子径（上記の通り）についての粒子の変動係数（ＣＶ）は、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満、さらに好ましくは２％未満である。ＣＶは、以下の通り、百分率で決定される。
ＣＶ＝１００×標準偏差／平均
【００７２】
ここで、平均は、平均粒子径であり、標準偏差は粒子径の標準偏差である。ＣＶは、好ましくは、主最頻値に基づいて、すなわち、検出された粒子サイズ分布に、単峰性分布曲線を当てはめることによって、計算される。したがって、サイズの最頻値より大きい、またはそれよりも小さい粒子の一部は、例えば全粒子数（すなわち、検出可能な粒子）の約９０％に基づいてもよい計算では、考慮に入れなくてもよい。このようにＣＶを決定することは、コールターＬＳ１３０粒子サイズ分析器上で実行可能である。
【００７３】
他の実施形態において、複数の粒子は、本質的に単分散である。
【００７４】
一方、他のある実施形態において、広範囲の粒子サイズ、または複数のより狭い粒子サイズ範囲が選択されて、本明細書に記載されている種々の生理学的効果の１つ以上が実現されてもよい。理論に拘束されることを望むものではないが、本発明で用いるＥＳＭ粒子の平均粒子径がサイズ範囲の上端であると、足場形成効果をより大きくすることで創傷細胞の移動が容易になり得、本発明で用いるＥＳＭ粒子の平均粒子径がサイズ範囲の下端であると、ＭＭＰおよび炎症に対する阻害効果がより大きくなり得る。本発明で用いるＥＳＭ粒子の生理学的効果を調整するために、異なるサイズ範囲を選択することが有利であってもよい。
【００７５】
さらなる実施形態において、用いられるＥＳＭの粒子は、上述よりも大きくてもよく、例えば、粒子の平均粒子径が、５００μｍまで、例えば４５０μｍまで、４００μｍまで、３００μｍまで、３５０μｍまで、２００μｍまで、１５０μｍまで、または１２５μｍまでであってもよく、これらのいずれかの値と先に挙げた値との組み合わせに由来するあらゆる範囲の端点が、具体的に企図される。ＥＳＭ粒子の物理的特徴およびその生成についての先の議論は、適宜変更を加えて、本発明のこの部分に適用される。
【００７６】
上述した通り、創傷は、上皮性関門に欠け、微生物の付着およびコロニー形成のための基質および表面として有用であることから、感染、特に慢性感染にとって理想的な環境である。問題としては、創傷の感染によって、創傷および創傷の周囲組織において炎症およびネクローシスが増加するため、治癒が遅れることがよくあり、そのため、創傷が、確立された（慢性の）感染をより起こしやすくなる。治癒しようとしている創傷の多くで感染が起こっているので、創傷における感染（いわゆる創傷の生物負荷）に対処し得る創傷治癒の治療は、特に有利であろう。
【００７７】
ある実施形態において、治癒を促進するために、本明細書に記載のＥＳＭ粒子を用いて創傷を治療することは、創傷に存在する微生物の生存能力および／または成長を阻害し、それによって、創傷に存在する微生物感染を抑制してもよい。したがって、本発明は、創傷に存在する微生物の生存能力および／または成長を阻害しもする、あるいは創傷における微生物感染を抑制しもする、創傷治癒を促進する方法であって、本明細書に記載のＥＳＭ粒子のうちの１つ以上が、微生物の生存能力および／または成長を阻害する、あるいは微生物感染を抑制する十分量で該創傷に適用される、方法、を包含するものと見なすことができる。
【００７８】
本明細書における「微生物」なる語は、あらゆる細胞性微生物、すなわち、顕微鏡的である、つまり小さすぎて裸眼では見ることができない、あらゆる細胞性生物を含む。特に、本明細書におけるこの語は、典型的に微生物であると考えられる生物、特に、細菌、真菌、古細菌、藻類、および原生生物を含む。微生物は、原核生物であってもよいし、真核生物であってもよく、微生物のどの綱、属、または種に属していてもよい。微生物は、好気性であってもよいし、嫌気性であってもよい。微生物は、病原性であってもよいし、非病原性であってもよく、または、腐敗性微生物であってもよいし、指標性微生物であってもよい。微生物は、薬剤（すなわち、抗生物質または抗真菌剤などの抗菌剤）耐性であってもよいし、多剤耐性であってもよい。特に好ましい実施形態において、微生物は、創傷にコロニーを形成し、創傷治癒を遅らせることができる。
【００７９】
細菌または真菌は、微生物の好ましい分類を代表しているので、本発明で用いるＥＳＭ粒子は、好ましくは、抗菌活性または抗真菌活性（例えば、殺菌性があるか、または静菌性である、あるいは殺真菌性があるか、または静真菌性である）を有するものと考えてもよい。
【００８０】
細菌は、好ましくは、以下の属から選択される：アクロモバクター属（Achromobacter）、アシネトバクター属（Acinetobacter）、アクチノバシルス属（Actinobacillus）、アエロモナス属（Aeromonas）、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）、アルカリゲネス属（Alcaligenes）、アルテロモナス属（Alteromonas）、バクテロイデス属（Bacteroides）、バルトネラ属（Bartonella）、ボレリア属（Borrelia）、ボルデテラ属（Bordetella）、ブルセラ属（Brucella）、バークホルデリア属（Burkholderia）、カンピロバクター属（Campylobacter）、カルジオバクテリウム属（Cardiobacterium）、クラミジア属（Chlamydia）、クラミドフィラ属（Chlamydophila）、クロモバクテリウム属（Chromobacterium）、カイセオバクテリウム（Chyseobacterium）、クリセオモナス属（Chryseomonas）、シトロバクター属（Citrobacter）、クロストリジウム属（Clostridium）、コマモナス属（Comamonas）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、コキシエラ属（Coxiella）、クリプトバクテリウム属（Cryptobacterium）、エドワードシエラ属（Edwardsiella）、エイケネラ属（Eikenella）、エンテロバクター属（Enterobacter）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、エルビニア属（Erwinia）、キンゲラ属（Kingella）、クレブシエラ属（Klebsiella）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、レジオネラ属（Legionella）、レプトスピラ属（Leptospira）、レプトトリキア属（Leptotrichia）、ロイコノストック属（Leuconostoc）、リステリア属（Listeria）、リストネラ属（Listonella）、モビルンカス属（Mobiluncus）、モラクセラ属（Moraxella）、モルガネラ属（Morganella）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）、マイコプラズマ属（Mycoplasma）、ナイセリア属（Neisseria）、ノカルジア属（Nocardia）、ノカルジオプシス属（Nocardiopsis）、パントエア属（Pantoea）、パラクラミジア属（Parachlamydia）、パスツレラ属（Pasteurella）、ペプトコッカス属（Peptococcus）、ペプトストレプトコッカス属（Peptostreptococcus）、プレボテラ属（Prevotella）、プロピオニバクテリウム属（Propionibacterium）、プロテウス属（Proteus）、プロビデンシア属（Providencia）、シュードモナス属（Pseudomonas）、ラルストニア属（Ralstonia）、リケッチア属（Rickettsia）、サルモネラ属（Salmonella）、シェウェネラ属（Shewenella）、シゲラ属（Shigella）、スフィンゴバクテリウム属（Sphingobacterium）、スフィンゴモナス属（Sphingomonas）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、ステノトロホモナス属（Stenotrophomonas）、ストレプトバチルス属（Streptobacillus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、ストレプトミセス属（Streptomyces）、トレポネム属（Treponem）、およびエルシニア属（Yersinia）。
【００８１】
したがって、細菌は、グラム陽性細菌であってもよいし、グラム陰性細菌であってもよいし、実際はグラム陽性かグラム陰性かが不確かな細菌であってもよい。グラム陰性細菌が重要である。グラム陰性細菌の中で、腸内細菌科およびグラム陰性非発酵細菌が、特に重要である。
【００８２】
腸内細菌科としては、アリシェワネラ属（Alishewanella）、アルテロコッカス属（Alterococcus）、アクアモナス属（Aquamonas）、アラニコラ属（Aranicola）、アゾチビルガ属（Azotivirga）、ブレネリア属（Brenneria）、ブドビシア属（Budvicia）、ブチオーキセラ属（Buttiauxella）、セデセア属（Cedecea）、シトロバクター属（Citrobacter）、クロノバクター属（Cronobacter）、ディケヤ属（Dickeya）、エドワードシエラ属（Edwardsiella）、エンテロバクター属（Enterobacter）、エルビニア属（Erwinia）、エシェリヒア属（Escherichia）、エウィンゲラ属（Ewingella）、グリモンテラ属（Grimontella）、ハフニア属（Hafnia）、クレブシエラ属（Klebsiella）、クルイベラ属（Kluyvera）、レクレルシア属（Leclercia）、レミノレラ属（Leminorella）、モエレレラ属（Moellerella）、モルガネラ属（Morganella）、オブスムバクテリウム属（Obesumbacterium）、パントエア属（Pantoea）、ペクトバクテリウム属（Pectobacterium）、フロモバクター属（Phlomobacter）、フォトラブダス属（Photorhabdus）、プレシオモナス属（Plesiomonas）、プラジア属（Pragia）、プロテウス属（Proteus）、プロビデンシア属（Providencia）、ラーネラ属（Rahnella）、ラオウルテラ属（Raoultella）、サルモネラ属（Salmonella）、サムソニア属（Samsonia）、セラチア属（Serratia）、シゲラ属（Shigella）、ソダリス属（Sodalis）、タツメラ属（Tatumella）、トラブルシエラ属（Trabulsiella）、ウィグルスウォーチア属（Wigglesworthia）、キセノラブダス属（Xenorhabdus）、エルシニア属（Yersinia）、ヨケネラ属（Yokenella）などに属する細菌が挙げられるが、これらに限定されない。腸内細菌科の好ましい属はエシェリヒア属（Escherichia）、クレブシエラ属（Klebsiella）、サルモネラ属（Salmonella）、シゲラ属（Shigella）、およびエルシニア属（Yersinia）、ならびにプロビデンシア属（Providencia）である。
【００８３】
非発酵グラム陰性細菌としては例えば、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、アシネトバクター・バウマニ（Acinetobacter baumannii）、ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）、およびバークホルデリア属の一種（Burkholderia spp.）などの、シュードモナス属（Pseudomonas）、アシネトバクター属（Acinetobacter）、ステノトロホモナス属（Stenotrophomonas）、およびバークホルデリア属（Burkholderia）、アクロモバクター属（Achromobacter）、アルガリゲネス属（Algaligenes）、ボルデテラ属（Bordetella）、ブレバンディモナス属（Brevundimonas）、コマモナス属（Comamonas）、エリザベスキンギア属（Elizabethkingia （前クリセオバクテリウム属（Chryseobacterium））、メチロバクテリウム属（Methylobacterium）、モラクセラ属（Moraxella）、オクロバクテリウム属（Ochrobactrum）、オリゲラ属（Oligella）、サイクロバクター属（Psychrobacter）、ラルストニア属（Ralstonia）、ロゼオモナス属（Roseomonas）、シェウァネラ属（Shewanella）、スフィンゴバクテリウム属（Sphingobacterium）などに属する細菌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８４】
細菌は、好ましくは、シュードモナス属（Pseudomonas）、アシネトバクター属（Acinetobacter）、バークホルデリア属（Burkholderia）、エシェリヒア属（Escherichia）、クレブシエラ属（Klebsiella）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、プロビデンシア属（Providencia）、モラクサラ属（Moraxalla）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）などの属から選択され、例えば緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、アシネトバクター・バウマニ（Acinetobacter baumannii）、バークホルデリア属の一種（Burkholderia spp.）、大腸菌（E. coli）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、バークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）、バークホルデリア・マルチボランス（Burkholderia multivorans）、鼻疽菌（Burkholderia mallei）、類鼻疽菌（Burkholderia pseudomallei）、アシネトバクター・ルオフィイ（Acinetobacter lwoffii）、プロビデンシア・スチュアルティイ（Providencia stuartii）、プロビデンシア・レットゲリ（Providencia rettgeri）、プロビデンシア・アルカリファシエンス（Providencia alcalifaciens）、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）、シュードモナス・アンギリセプチカ（Pseudomonas anguilliseptica）、シュードモナス・オリジハビタンス（Pseudomonas oryzihabitans）、シュードモナス・プレコグロッシシダ（Pseudomonas plecoglossicida）、シュードモナス・ルテオラ（Pseudomonas luteola）、モラクサラ・カタラーリス （Moraxalla catarrhalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、ストレプトコッカス・オラリス（Streptococcus oralis）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（ＭＲＳＡなど）などである。
【００８５】
したがって、代表例として、微生物は、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、シュードモナス属（Pseudomonas）、レジオネラ属（Legionella）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）、プロテウス属（Proteus）、クレブシエラ属（Klebsiella）、フゾバクテリウム属（Fusobacterium）、あるいは他の腸内細菌または大腸菌群であってもよい。
【００８６】
微生物は、真菌または真菌由来であってもよく、その例として、原生生物として分類されているかもしれない、または分類されていたかもしれない真菌、例えば、カンジダ属（Candida）、アスペルギルス属（Aspergillus）、ニューモシスチス属（Pneumocystis）、ペニシリウム属（Penicillium）、およびフザリウム属（Fusarium）に属する真菌が挙げられる。代表的な真菌の種としては、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・デュブリニエンシス（Candida dubliniensis）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、ヒストプラマ・カプスラーツム（Histoplama capsulatum）、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、コクシジオデス・イミティス（Coccidiodes immitis）、パラコクシジオデス・ブラジリエンシス（Paracoccidiodes brasiliensis）、ブラストミセス・デルミティディス（Blastomyces dermitidis）、ネオモシスチス・カリニ（Pneomocystis carnii）、ペニシリウム・マルネッフィ（Penicillium marneffi）、アルテルナリア・アルテルナーテ（Alternaria alternate）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８７】
微生物は、例えば、根足虫類、胞子虫類、繊毛虫類、および鞭毛虫類のメンバーなどの原生生物であってもよい。代表的な原生生物としては、トキソプラズマ（Toxoplasma gondii）などのトキソプラズマ種、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）、四日熱マラリア原虫（Plasmodium malariae）などのマラリア原虫種、ブルーストリパノソーマ（Trypanosoma brucei）、クルーズトリパノソーマ（Trypanosoma cruzi）などのトリパノソーマ種、大型リーシュマニア（Leishmania major）などのリーシュマニア種、および赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica）などのエントアメーバ種が挙げられる。
【００８８】
微生物は、好ましくは、次の属から選択される：シトロバクター属（Citrobacter）、エンテロバクター属（Enterobacter）、エシェリヒア属（Escherichia）、ハフニア属（Hafnia）、セラチア属（Serratia）、エルシニア属（Yersinia）、ペプトストレプトコッカス属（Peptostreptococcus）、バクテリオデス属（Bacteriodes）、シュードモナス属（Pseudomonas）、レジオネラ属（Legionella）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、クレブシエラ属（Klebsiella）、カンジダ属（Candida）、プロテウス属（Proteus）、バークホルデリア属（Burkholderia）、フゾバクテリウム属（Fusobacterium）、およびマイコバクテリウム属（Mycobacterium）。これらの例としては、大腸菌（Escherichia coli）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、バークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）、および化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）などが挙げられる。緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）などのシュードモナス属（Pseudomonas）による感染、およびシュードモナス属（Pseudomonas）の感染が、特に重要である。
【００８９】
微生物は、バイオフィルム中に存在していてもよく、換言すると、微生物は、バイオフィルム形態で成長していてもよい。「バイオフィルム」とは、基層もしくは界面に付着するか、または細胞同士が付着して、細胞外ポリマー（より具体的には、細胞が産生する細胞外ポリマー）のマトリクスに埋まる付着性細胞が優勢である（運動性細胞がいくらか存在していてもよい）という特徴がある微生物の群衆であって、このコロニーの微生物は、成長速度および遺伝子の転写に関して、異なる表現型を示す（例えば、「非バイオフィルム」性または浮標性または浮遊性の同等物と比較した場合）ことで特徴付けられる微生物の群衆を意味する。「バイオフィルム中」とは、微生物が、（完全に、または部分的に）バイオフィルムのポリマーマトリクス内にあるか、その上にあるか、または結合していることを意味する。見方を変えると、「バイオフィルム中に存在していない」微生物は、遊離している、例えば浮遊しているか、または、複数の微生物の凝集物中に存在している場合は、その凝集物が有機的構造を持たない、かつ／またはバイオフィルムのマトリクス特性を持たないかのいずれかである。それぞれの場合において、個々の微生物は、バイオフィルムに存在する同等物で観察される異なる表現型は示さない。
【００９０】
「微生物の生存能力」なる語は、創傷などの所与の条件下において、微生物が生き延びる能力を意味する。生き延びるとは、生き続けることと同等と見なすことができる。本発明で用いるＥＳＭ粒子は、殺菌効果によって、微生物の生存能力を低減してもよい。微生物の生存能力は、以下で詳述する微生物の細胞死（および生存能力）を測定する技術を用いて決定することができる。
【００９１】
したがって、微生物の「生存能力を阻害すること」は、微生物の生存能力を低減する効果、または微生物が生き延びにくく、もしくは生存不能にする効果を含み得る。特に、この語は、微生物を殺すこと、または破壊することを包含する。
【００９２】
「微生物を殺す」なる語は、微生物が生きた状態でいることを停止させる、すなわち、死んだ状態にする行為をいう。通常、微生物の成長を援助する培地中に入れた際に、複製および／もしくは成長を誘導することができれば、または少なくとも形態学的変化を呈することができれば、ならびに／あるいは微生物が、栄養素を代謝して、細胞機能を援助するためのエネルギーを放出していれば、微生物は生きていると見なされる。微生物は、典型的には、細胞膜の完全性が失われた場合に、死んでいると見なされる。
【００９３】
微生物が生きているか（生存可能である）か死んでいるかを決定するために、多くの常用のアッセイを利用することができる。選択肢の１つは、通常、微生物の成長を援助する条件下に微生物をおき、例えば、微生物の大きさ、微生物の形態、コロニー中の微生物の経時的な数、培地中の栄養素の消費などを測定することなどの、適切な標準的手段によって、微生物の成長を測定することである。別の選択肢は、ネクローシスまたはアポトーシス小体、膜泡状突起、核凝縮および一定の大きさの断片へのＤＮＡの切断、破壊された細胞壁または細胞膜および細胞外環境への細胞内容物の漏洩などの、細胞死に特徴的な形態に関して、微生物を評価することである。他の方法は、死んだ微生物における細胞膜の完全性の特徴的な喪失を利用する。膜不透過性染料（トリパンブルーおよびヨウ化プロピジウムなど）を慣行的に用いて、膜の完全性を評価する。さらなる選択肢は、微生物の代謝を測定することである。これは、慣行的に、多くの方法で行うことができる。例えば、ＡＴＰレベルを測定することができる。
【００９４】
「微生物の成長」とは、微生物の大型化、または微生物成分の量および／もしくは体積（核酸の量、タンパク質の量、核の数、細胞小器官の数または大きさ、細胞質の体積など）の増加と、微生物数の増加、すなわち微生物の複製回数の増加との両方を意味する。
【００９５】
「微生物の成長を阻害すること」とは、微生物の測定可能な成長（複製など）またはその速度を低減することを意味する。微生物の測定可能な成長（複製など）またはその速度は、好ましくは少なくとも５０％低減され、より好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％低減され、例えば少なくとも９５％低減される。測定可能な成長（複製など）は、好ましくは、停止される。微生物の大型化または拡大などの観点から見た成長は、複製とは関係なく阻害されてもよく、逆の場合も同じである。本発明で用いるＥＳＭ粒子は、静菌効果および／または殺菌効果によって、微生物の生存能力を阻害してもよい。
【００９６】
したがって、本発明は、創傷における微生物感染を抑制するのに用いる、特に創傷における微生物感染を治療するのに用いる本明細書に記載のＥＳＭ粒子、または、創傷における微生物感染を抑制するのに用いる、特に創傷における微生物感染を治療するのに用いる薬物の製造における、本明細書に記載のＥＳＭ粒子の使用、を提供するものと見なすこともできる。本態様では、感染は、被験体において、微生物の成長および／または生存能力を阻害することによって抑制されてもよいということがわかるであろう。感染は、バイオフィルム感染であってもよい。
【００９７】
「感染を抑制すること」は、例えば、感染の形成を防止または阻害すること、感染を低減または除去すること、感染を成すコロニー中の微生物数を低減すること、感染および／またはそこにいる微生物の成長速度を低減または停止すること、感染中の微生物数の拡大速度を低減または停止することを含む、感染の治療または防止と見なすことができる。「バイオフィルムを抑制すること」は、防止的手段および保守的手段の両方、または防止的治療および保守的治療の両方を含む。したがって、バイオフィルムを抑制することは、バイオフィルムの形成を防止または阻害すること、バイオフィルムを除去または低減すること、バイオフィルムを小型化すること、バイオフィルムコロニー中の微生物数を低減すること、バイオフィルムの成長速度を低減または停止すること、バイオフィルムコロニー中の微生物数の拡大速度を低減または停止すること、バイオフィルムの物理的な完全性を低減すること、抗菌剤または宿主の免疫防御機構に対するバイオフィルムコロニー中の微生物の感受性を増大すること、および抗菌剤または宿主の免疫防御機構に対するバイオフィルムの透過性を増大することを包含する。
【００９８】
これらの実施形態において、本発明で用いるＥＳＭ粒子を創傷に適用した後、微生物は粒子と接触する。「接触する」なる語は、微生物に粒子を直接適用すること、または創傷に粒子を適用した後で微生物が創傷と接触することを包含する。
【００９９】
微生物は、より具体的には、本発明で用いるＥＳＭ粒子の有効量と、さらに具体的には、本発明で用いるＥＳＭ粒子が、微生物の生存能力を直接阻害する（例えば、殺す）か、または微生物の成長を直接阻害する量と、接触する。
【０１００】
「直接」とは、本発明で用いるＥＳＭ粒子が、生理学的システムまたは生理学的機構（免疫システムなど）をリクルートせずに、その殺菌効果または静菌効果（細胞毒性または細胞分裂抑制性）を付与することを意味する。もっと正確に言えば、本発明で用いるＥＳＭ粒子は、微生物に直接作用する。
【０１０１】
これらの実施形態において、本発明で用いるＥＳＭ粒子の「十分量（または有効量）」とは、上述した殺菌効果または静菌効果をもたらすか、または感染を効果的に抑制し、これによって創傷の治癒を促進する、ＥＳＭ粒子の量である。当業者であれば、常用の投与反応プロトコールと、好都合なことには、上述した微生物の死または成長阻害などを評価する常用の技術とに基づいて、ＥＳＭ粒子の有効量（十分量）がどれだけであるかを容易に決定することができるであろう。本発明で用いるＥＳＭ粒子の直接的な効果は、殺菌効果または静菌効果の評価を妨げ得る完全な生理学的システムまたは生理学的機構を欠く、当業者であればよく知っている常用のインビトロのシステム（例えば、実施例１で開示するような、簡便な細胞培養システム、遊離細胞／ウイルスシステムなど）を用いて、評価することができる。
【０１０２】
一実施形態において、本発明の方法は、感染症を発症する恐れもある創傷、または感染症が治療されることで恩恵を受ける創傷を有していると被験体が診断されるステップを含んでいてもよい。
【０１０３】
さらなる実施形態において、本発明の方法は、本発明で用いるＥＳＭ粒子を創傷に適用した後、創傷における微生物の成長および／または生存能力、あるいは感染の程度を測定するステップを含んでいてもよい。これらの測定ステップは、本発明で用いるＥＳＭ粒子を創傷に適用する直前に、または被験体の治療最初期の別の時点に、同じ測定基準と比較することを含んでいてもよい。
【０１０４】
上述した通り、通常の創傷治癒プロセスは、創傷組織細胞が創傷へと移動し、かつ／または増殖して新規組織を形成する増殖期を含むが、治癒プロセスは、先行する段階で停止する場合もある。
【０１０５】
したがって、創傷組織細胞の生存能力および／または成長を促進し得る創傷治癒の治療は、特に有利であろう。
【０１０６】
よって、ある実施形態において、治癒を促進するために、本明細書に記載のＥＳＭ粒子を用いて創傷を治療することは、創傷組織細胞の生存能力および／または成長を促進してもよい。したがって、本発明は、創傷組織細胞の生存能力および／または成長も促進する、創傷治癒を促進する方法であって、本明細書に記載のＥＳＭ粒子が、創傷組織細胞の生存能力および／または成長を促進する十分量で該創傷に適用される、方法、を包含するものと見なすことができる。
【０１０７】
「生存能力および／または成長」なる語は、微生物についての上記議論と矛盾がないように解釈されるべきであるが、この場合、成長は、創傷組織細胞の分化を含んでいてもよい。
【０１０８】
「創傷組織細胞の成長を促進する」とは、創傷組織細胞の測定可能な成長（複製および／または分化など）またはその速度が増大すること、あるいは少なくとも維持されるかまたはその減少が防止されるということを意味する。創傷組織細胞の測定可能な成長（複製および／または分化など）またはその速度は、好ましくは少なくとも５％増大され、より好ましくは少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、または少なくとも４０％増大され、例えば少なくとも５０％増大される。
【０１０９】
一実施形態において、本発明の方法は、創傷組織細胞の生存能力および／または成長が促進されることでも恩恵を受ける創傷を有すると被験体が診断されるステップを含んでいてもよい。
さらなる実施形態において、本発明の方法は、本発明で用いるＥＳＭ粒子を創傷に適用した後、創傷組織細胞の生存能力および／または成長、ならびに／あるいは新規組織の形成を測定するステップを含んでいてもよい。これらの測定ステップは、本発明で用いるＥＳＭ粒子を創傷に適用する直前に、または被験体の治療最初期の別の時点に、同じ測定基準と比較することを含んでいてもよい。
【０１１０】
したがって、創傷組織細胞の創傷への移動も促進し得る創傷治癒の治療は、特に有利であろう。
【０１１１】
よって、ある実施形態において、治癒を促進するために、本明細書に記載のＥＳＭ粒子を用いて創傷を治療することは、創傷組織細胞の創傷への移動を促進してもよい。したがって、本発明は、創傷組織細胞の創傷への移動も促進する、創傷治癒を促進する方法であって、本明細書に記載のＥＳＭ粒子が、創傷組織細胞の創傷への移動を促進する十分量で該創傷に適用される、方法、を包含するものと見なすことができる。
【０１１２】
「移動を促進する」とは、創傷組織細胞の創傷への測定可能な移動またはその速度が増大すること、あるいは少なくとも維持されるかまたはその減少が防止されるということを意味する。創傷組織細胞の創傷への測定可能な移動またはその速度は、好ましくは、少なくとも５％増大され、より好ましくは少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、または少なくとも４０％増大され、例えば少なくとも５０％増大される。
【０１１３】
一実施形態において、本発明の方法は、創傷組織細胞の創傷への移動が促進されることでも恩恵を受ける創傷を有すると被験体が診断されるステップを含んでいてもよい。
【０１１４】
さらなる実施形態において、本発明の方法は、本発明で用いるＥＳＭ粒子を創傷に適用した後、創傷組織細胞の創傷への移動、ならびに／あるいは新規組織の形成の程度を測定するステップを含んでいてもよい。これらの測定ステップは、本発明で用いるＥＳＭ粒子を創傷に適用する直前に、または被験体の治療最初期の別の時点に、同じ測定基準と比較することを含んでいてもよい。
【０１１５】
本発明で用いるＥＳＭ粒子が創傷組織細胞の足場として働くことによって、創傷細胞の移動および／または増殖が促進されてもよい。移動および／または増殖が促進されることで、新規組織の形成が促進されてもよい。創傷組織細胞の創傷への移動、足場の提供におけるＥＳＭ粒子の役割、および創傷における新規組織の形成は、創傷またはそのサンプルを顕微鏡解析することで、測定および定量化されてもよい。このような解析は、創傷組織細胞上の分子マーカーおよび／または創傷における新規組織上の分子マーカーを検出する化学染色および／または免疫化学染色を含んでいてもよい。
【０１１６】
これらの実施形態において、本発明に記載のＥＳＭ粒子の「十分量（または有効量）」とは、上述した増殖推進効果または移動推進効果をもたらすか、または新規組織の形成を促進し、これによって創傷の治癒を促進する、ＥＳＭ粒子の量である。当業者であれば、常用の投与反応プロトコールと、好都合なことには、上述した創傷細胞の生存能力、成長、および移動を評価する常用の技術とに基づいて、ＥＳＭ粒子の有効量（十分量）がどれだけであるかを容易に決定することができるであろう。
【０１１７】
これらの実施形態において、本発明で用いるＥＳＭ粒子を創傷に適用した後、創傷細胞は粒子と接触する。創傷細胞は、より具体的には、創傷組織細胞の生存能力および／または成長を促進するか、または創傷組織細胞の創傷への移動を促進するか、または新規組織の形成を促進するのに有効な、本発明で用いるＥＳＭ粒子の有効量と接触する。
【０１１８】
本発明で用いる微粉化ＥＳＭ含有粒子は、湿潤な治癒環境の維持を妨げない製剤への配合に適しているという利点をさらに有する。したがって、本明細書で開示される本発明の方法では、本発明で用いるＥＳＭ粒子が、例えば、湿潤な治癒環境の維持を妨げないように適合させた、本明細書に記載されているような製剤または被覆材中で、湿潤な治癒環境の維持を妨げないように創傷に適用される。
【０１１９】
ある実施形態において、本発明の方法は、上述した追加的な創傷効果、すなわち、（ｉ）ＥＣＭおよび／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子の分解阻害（特に、ＥＣＭおよび／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対するＭＭＰ活性の阻害）、ならびに上述した追加的な創傷効果のうちの１つ以上またはすべて、特に抗菌効果および／または抗炎症効果；および／または、（ｉｉ）創傷における炎症の低減、ならびに上述した追加的な創傷効果のうちの１つ以上またはすべて、特に抗菌効果および／またはＭＭＰ阻害効果、のうちの１つ以上またはそのすべてによって、創傷治癒を促進する。
【０１２０】
創傷は、被験体内に見出されてもよいし、被験体上に見出されてもよい。「被験体内」なる語は、本明細書において、被験体の体内にある場所または位置、あるいは被験体上、例えば外部体表面などの場所または位置を含んで広く用いられ、また、特に、埋め込み型医療用デバイスを含有する創傷を含んでいてもよい。
【０１２１】
したがって、創傷は、皮膚の中または上、あるいは口腔（歯肉、歯肉溝、歯周ポケットなど）、生殖管（子宮頸管、子宮、卵管など）、腹膜、消化管、耳、目、前立腺、尿路、脈管系、気道、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、神経系、もしくは脳の感染しやすい表面の中または上に見出されてもよい。「創傷組織細胞」は、これに応じて解釈されるべきである。創傷は、好ましくは、皮膚（真皮）の創傷であり、換言すると、真皮創傷または皮膚科学的創傷であって、これは、表皮および／または真皮、ならびにその下にある組織の、あらゆる深さにある創傷を含む。
【０１２２】
埋め込み型医療用デバイスとしては、創傷をもたらす経皮デバイスおよび／または経皮管路（中心静脈カテーテル、特に、ダクロン（Dacron）またはコラーゲンカフなどのカフ付きカテーテルなど）や、心臓弁、人工関節、歯科インプラントおよび軟組織インプラント（胸部インプラント、臀部インプラント、口唇インプラントなど）などの補綴具、ステント、ペースメーカー、気管切開チューブなどのあらゆる種類のデバイスが挙げられるが、これらに限定されない。「埋め込み型」医療用デバイスは、その一部分が体内に入っているデバイスを含んでいてもよく、すなわち、デバイスは、全体が埋め込まれていてもよいし、部分的に埋め込まれていてもよい。
【０１２３】
創傷は、物理的障害（機械的損傷；過度の加熱または冷却などの結果生じる熱損傷；電位源との接触などによる電気的損傷；および赤外線、紫外線、または電離放射線に長期にわたり過度に曝露されることなどによる放射線損傷など）により、または皮膚潰瘍（静脈性潰瘍、糖尿病性潰瘍、または褥瘡など）、肛門裂傷、口腔内潰瘍、および尋常性座瘡などの自然発生的な損傷により、外科的に生じ得る。外科的に移植された組織は、創傷と見なされる。
【０１２４】
医療分野において、創傷は、典型的には急性創傷または慢性創傷のいずれかとして定義される。急性創傷とは、止血後、長引くことなく、その治癒プロセスにおいて広く認められている３つの段階（すなわち、炎症期、増殖期、および再構築期）が順に進行する創傷である。慢性創傷とは、治癒することがない創傷、または火傷などによって過度に皮膚が欠損している創傷と定義される。このような創傷は、治癒段階のうちの１つにおいて停止してしまうため、治癒プロセスにおいて生化学的事象を順に完遂することはない。慢性創傷は、一般的に、炎症期で停止する。慢性創傷は、患者の死亡の主要な原因である。
【０１２５】
本発明の特定の態様にしたがって、慢性創傷は、期待された日数で治癒しなかった、例えば治癒するのに期待したよりも少なくとも５日、少なくとも１０日、少なくとも１５日、少なくとも２０日、または少なくとも３０日長くかかった、創傷であると見なし得る。慢性創傷は、形成されてから、少なくとも３０日後、少なくとも４０日後、具体的には少なくとも５０日後、より具体的には少なくとも６０日後、更に具体的には少なくとも７０日後に治癒しなかった創傷としてもよい。
【０１２６】
慢性創傷となった火傷による創傷も、特に重要である。あらゆる火傷、特に、重篤な火傷は、被験体の上皮性関門および／または内皮性関門の完全性に著しい衝撃を与え、このような外傷の治療は、非常に時間のかかるプロセスとなることが多い。したがって、本発明の方法は、火傷が原因の慢性創傷の治癒を促進する方法と見なし得る。
【０１２７】
火傷を起こす典型的な原因は、極端な温度（過度な温度の火、液体、気体など）、電気、腐食性薬品、摩擦、および放射である。この原因の強度／強さとともに、曝露の程度および期間によって、火傷のひどさが変化する。熱湯熱傷（すなわち、高温の液体および／または気体に関連した外傷）は火傷と見なされる。
【０１２８】
ある実施形態において、対象の創傷は、例えば本明細書に開示されているような、微生物感染の恐れがあるか、現に感染している、創傷である。感染は、急性でも、あるいは慢性でもよく、例えば、少なくとも５日間、または少なくとも１０日間、具体的には少なくとも２０日間、より具体的には少なくとも３０日間、さらに具体的には少なくとも４０日間、持続する感染である。
【０１２９】
ある実施形態において、対象の創傷は、創傷組織細胞の創傷への移動レベル、および／または創傷組織細胞の増殖もしくは分化レベル、および／または新規組織の形成レベルが適切でない、すなわち十分でない恐れがあるか、または現にそうである、創傷でもある。
【０１３０】
さらなる実施形態において、対象の創傷では、（ｉ）ＭＭＰが過活性化（特に、ＥＣＭおよび成長因子に対して）しているか、またはＥＣＭおよび成長因子が過剰に分解されており、上述した創傷の特徴のうちの１つ以上、特に微生物感染および炎症が起こっている；ならびに／あるいは（ｉｉ）炎症が過剰に起こっており、上述した創傷の特徴のうちの１つ以上、特に微生物感染およびＭＭＰ過活性化（特に、ＥＣＭおよび成長因子に対して）またはＥＣＭおよび成長因子の過剰な分解が起こっている。
【０１３１】
本明細書に記載の微粉化ＥＳＭ含有粒子の慢性創傷治癒効果に加えて、新生物を外科的に除去した箇所が、本明細書に記載のＥＳＭ粒子を用いて治療を行うことでも恩恵を受けることが期待される。何故なら、このような治療は、（ｉ）外科的な除去手順を行った後に残っている新生物の残部における血管形成を阻害することで、新生物を抑制することができ、また、（ｉｉ）新生物の外科的な除去またはアブレーションを行った箇所におけるＭＭＰ活性を阻害することで、外科的な除去手順を行った後に残っている新生物の残部が転移するのを防ぐことができるからである。
【０１３２】
したがって、本発明は、新生物またはその一部を外科的に除去した箇所において、新生物を抑制するまたは新生物の転移を防ぐ方法であって、本明細書に記載のＥＳＭ粒子のうち１つ以上が、残された新生物を抑制するまたは残された新生物の転移を防ぐ十分量で該箇所または該箇所のすぐ近傍に適用される、方法、をさらに提供する。
【０１３３】
これらの実施形態において、外科的に除去した箇所またはそのすぐ近傍に本明細書に記載のＥＳＭ粒子を適用した後、残された新生物の細胞は粒子と接触する。「接触する」なる語は、残された新生物の細胞に粒子を直接適用すること、または外科的に除去した箇所もしくはそのすぐ近傍に粒子を適用した後で、残された新生物が創傷と接触することを包含する。「すぐ近傍」とは、除去された新生物の大きさに対して相対的に解釈されるべきである。いくつかの例では、外科的な除去またはアブレーションを行った箇所のすぐ近傍とは、外科的に除去された箇所の境界から、この箇所で幅が最大である部分の５０％以下、例えば４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または２％以下の距離だけ延長した範囲である。
【０１３４】
「新生物を外科的に除去した箇所において新生物を抑制する」とは、新生物の再生を防止、制限、または阻害するために、外科的に除去した新生物の残部を処理すること、新生物の残部を低減または排除すること、その箇所において残された新生物の細胞数を低減すること、残された新生物および／または新生物中もしくはその箇所にある新生細胞の成長速度を低減または停止すること、残された新生物中もしくはその箇所にある新生細胞数の拡大速度を低減または停止すること、と見なすことができる。
【０１３５】
上記の通り、理論に拘束されることを望むものではないが、この抑制効果は、残された新生物における血管形成を防止、阻害、制限、または排除することによって、少なくとも部分的に実現され、これは、ひいては本明細書に記載のＥＣＭタンパク質に対するＭＭＰ活性を低減または制限することで引き起こされる。このような効果の詳細な議論は、適宜変更を加えて、本発明のこの部分に適用される。他の機構が、ＥＳＭ粒子それ自体による成長血管の阻害に関わっていてもよい。
【０１３６】
「新生物を外科的に除去した箇所において新生物の転移を防ぐ」とは、外科的に除去した新生物の細胞の転移を防止、制限、または阻害するために、このような新生物の残部を処理することと見なすことができる。この処理によって、すべての転移が起こることを防ぎ得るか、あるいは転移が起こることを既存の比率もしくは蓋然性にまで制限し得るか、または転移の比率もしくは蓋然性を下げ得る（阻害し得る）。
【０１３７】
上記の通り、理論に拘束されることを望むものではないが、転移に対するこの効果は、本明細書に記載のＥＣＭタンパク質に対するＭＭＰ活性を低減または制限することで実現される。このような効果の詳細な議論は、適宜変更を加えて、本発明のこの部分に適用される。
【０１３８】
したがって、本発明のこの態様は、被験体から外科的に除去された新生物の再成長または再発を防ぐ方法、および／または被験体の癌の再燃または再発を防ぐ方法、および／または被験体から新生物を外科的に除去した後、寛解の可能性を向上させる方法、を包含するものと見なすことができる。
【０１３９】
新生物は、本明細書に記載の組織および体の部分などの、被験体の体のどの組織の新生物であってもよい。ある実施形態において、新生物は、悪性新生物であり、特に、転移の可能性または蓋然性が高い新生物である。したがって、新生物は、細胞の堆積（塊）によって特徴付けられる限りにおいて、肉腫、癌腫、胚細胞腫、リンパ腫、白血病、芽細胞種、乳頭腫、および腺腫であってもよい。このような堆積または塊は、塊がびまん性であり、かつ／または空隙を含んでいたとしても、「固形物」と表現されてもよい。ある実施形態において、腫瘍は、肉腫、癌腫、胚細胞腫、芽細胞種、リンパ腫または白血病などの、悪性腫瘍または前癌性腫瘍である。
【０１４０】
より具体的な実施形態において、新生物は、結腸直腸腫瘍（結腸腫瘍、直腸腫瘍、または大腸腫瘍としても知られる）、前立腺腫瘍、精巣腫瘍、皮膚腫瘍（黒色腫および非黒色腫など（例えば、基底細胞腫瘍、扁平細胞腫瘍））、乳房腫瘍、腎臓（腎）腫瘍（ウィルムス腫瘍など）、卵巣腫瘍、胃腫瘍、腸腫瘍（十二指腸腫瘍、回腸腫瘍、空腸腫瘍、小腸腫瘍など）、肝臓（肝）腫瘍、膵臓腫瘍、肺腫瘍、食道腫瘍、口腔腫瘍、咽喉腫瘍、脳腫瘍（膠芽腫、随芽腫など）、副腎腫瘍（副腎皮質腫瘍など）、甲状腺腫瘍（未分化甲状腺癌腫など）、子宮腫瘍（子宮癌肉腫など）、血液腫瘍（血液悪性腫瘍としても知られる）（白血病、リンパ腫、骨髄腫などの造血器悪性腫瘍およびリンパ系悪性腫瘍）であってもよい。
【０１４１】
より具体的な実施形態において、腫瘍は、結腸直腸癌（結腸癌、直腸癌、大腸癌としても知られる）、前立腺癌、精巣癌、皮膚癌（黒色腫および非黒色腫など（例えば、基底細胞癌、扁平細胞癌））、乳癌、腎臓（腎）癌（ウィルムス腫瘍など）、卵巣癌、胃癌、腸癌（十二指腸癌、回腸癌、空腸癌、小腸癌など）、肝臓（肝）癌、膵臓癌、肺癌、食道癌、口腔癌、咽喉癌、脳腫瘍（膠芽腫、随芽腫など）、副腎癌（副腎皮質癌など）、甲状腺癌（未分化甲状腺癌腫など）、子宮癌（子宮癌肉腫など）、血液癌（血液悪性腫瘍としても知られる）（白血病、リンパ腫、骨髄腫などの造血器悪性腫瘍およびリンパ系悪性腫瘍）、またはこれらの解剖学的部位における非悪性腫瘍（結腸直腸ポリープ、毛質腫、血管腫、骨腫、軟骨腫、脂肪腫、線維腫、リンパ管腫、平滑筋腫、横紋筋種、星細胞腫、髄膜腫、神経細胞腫、乳頭腫、腺腫など）であってもよい。
【０１４２】
外科的な除去方法は限定されず、例えば、機械的手段、熱的手段もしくはレーザー手段、または焼灼などによる摘出またはアブレーションによって行われてもよい。腫瘍アブレーションは、腫瘍またはその一部が、物理的手段によって破壊されるプロセスであり、典型的には、アブレーションステップの結果生じる腫瘍の残部が、インサイチュに残される。したがって、外科的な「除去」は、これに応じて解釈されるべきである。代表的な腫瘍アブレーション法としては、凍結アブレーション、水熱アブレーション、電離放射線アブレーション（体外照射療法または小線源照射療法）、電波アブレーション、超音波アブレーション、レーザーアブレーション、マイクロ波アブレーション、および電気アブレーションなどが挙げられるが、これらに限定されない。このような方法は、癌療法の分野において、盛んに行われている。
【０１４３】
被験体は、ヒト被験体であってもよいし、ヒト以外の動物被験体であってもよいが、より具体的には、ヒトまたはヒト以外の脊椎動物、例えば、哺乳類、鳥類、両生類、魚類、および爬虫類から選択されるヒト以外の動物であってもよい。哺乳類の被験体が好ましい。ヒト以外の動物は、実験動物または動物園もしくは動物保護区域の動物を含む、家畜であってもよいし、飼育された動物であってもよいし、商品価値のある動物であってもよい。したがって、代表的なヒト以外の動物としては、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、モルモット、ハムスター、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ニワトリ、シチメンチョウ、ホロホロチョウ、アヒル、ガチョウ、オウム、セキセイインコ、ハト、サケ、マス、ティラピア、ナマズ、ブリーム、バラマンディ、ハタ、ボラ、カンパチ、ニベ、ローフー、ハゼ、タラ、ハドック、シーバス、およびコイが挙げられる。よって、本発明の獣医学的な使用が含まれる。被験体は、患者と見なしてもよい。被験体は、好ましくはヒトである。
【０１４４】
本発明にしたがって、被験体における医学的状態（創傷など）または感染の治療に関連して用いられる「治療」は、本明細書において、症状に対する、または感染に関連する、あらゆる治療効果、すなわち有利な効果を含んで、広く用いられる。したがって、症状／感染の根絶または排除、あるいはその症状／感染被験体の治療だけでなく、被験体の症状／感染の改善も含まれる。よって、例えば、症状／感染の自覚的兆候または客観的兆候の改善、あるいは症状／感染の臨床的に許容される指標の改善（例えば、創傷のサイズ（深さおよび／または面積）の低減、治癒時間の加速、本明細書に記載の創傷効果のうちの１つ以上、あるいは、創傷もしくは周囲組織全体の不快感または痛みの低減）が含まれる。よって、治療は、例えば、既往のまたは診断された感染／症状の、治癒的療法および緩和療法の両方、すなわち保守的治療を含む。
【０１４５】
本明細書で用いられる「防止」とは、予防効果または防止効果のことをいう。したがって、症状（創傷サイズの増大または慢性創傷もしくは治癒が不十分な創傷の進展など）または感染、あるいは症状／感染または１つ以上のそれらの兆候もしくは指標の発症を、予防的治療を行う前の症状／感染または兆候もしくは指標と比べて、相対的に遅延、制限、低減、または防止することを含む。よって、予防は、症状／感染またはそれらの兆候もしくは指標の発生または発症の完全な防止と、症状／感染または兆候もしくは指標の発症または進展の遅延、あるいは症状／感染または兆候もしくは指標の進展または進行の低減または制限との両方を、明確に含む。
【０１４６】
具体的には、本明細書に記載の微粉化ＥＳＭ含有粒子は、例えば、創傷感染を防止するか、またはその恐れを少なくとも最小化する、あるいは創傷サイズの増大または治癒が不十分な創傷もしくは慢性創傷の進展を防止するか、またはその恐れを少なくとも最小化する、予防的治療薬とすることができる。
【０１４７】
本発明で用いる微粉化ＥＳＭ含有粒子の「薬学的に有効」または「生理学的に有効」な量は、対象の創傷の治癒を測定可能に促進する、粒子の量である。より具体的には、これは、上述した様々な生理学的効果を実現するのに十分な（有効な）上述した量であってもよい。
【０１４８】
薬学的／生理学的に有効な量を実現し得る本発明で用いる微粉化ＥＳＭ含有粒子の適当な用量は、被験体によって異なり、医師または獣医師が、被験体の体重、年齢、および性別、症状／感染のひどさ、投与形態、ならびに選択された具体的なＥＳＭ粒子にしたがって決定することができる。
【０１４９】
「創傷に適用する」とは、主として被験体の血液循環またはリンパ循環を介して本発明で用いる微粉化ＥＳＭ含有粒子を創傷に到達させることを意図して行うＥＳＭ粒子の全身投与を、被験体に対して行わない、すなわち、被験体の血液循環またはリンパ循環とは異なる点から、本発明で用いる微粉化ＥＳＭ含有粒子を創傷と接触させることを意味する。これは、局部適用と見なしてもよいし、局所適用と見なしてもよい。本発明で用いる微粉化ＥＳＭ含有粒子は、典型的には、創傷の表面および／または内部に直接適用される。
【０１５０】
本発明で用いる微粉化ＥＳＭ含有粒子は、簡便な局所様式で創傷に適用（投与）されてもよい。最も簡便なものだと、粒子は、さらなる配合を行っていない乾燥粉末として適用されてもよい。乾燥粉末製剤は、創傷表面を覆うように、例えば０．５ｍｍ以下の層となるまで粉末をふりかけることで、創傷表面に適用されてもよい。ＥＳＭは、固有の水分吸収能を有していないので、ある実施形態においては、例えば以下で論じる種類の追加的な創傷被覆材を、粉末処理した創傷の最上面に配置することが有利であり得る。創傷清拭が必要な乾燥した創傷の場合は、軟ゲル製剤または液体／流体ゲル製剤（ヒドロゲルまたは軟ヒドロコロイドゲルなど）を用いて創傷表面を処理し、次いでＥＳＭの乾燥粒子をゲルの最上面に適用することが有利であり得る。
【０１５１】
しかしながら、当業者であれば、当該技術分野において公知であり、広く文献に記載されている従来の方法のいずれかにしたがって、局所投与に適用される医薬組成物に、本発明で用いる微粉化ＥＳＭ含有粒子を配合することもできるであろう。
【０１５２】
本発明で用いるＥＳＭ粒子を、場合によっては他の活性薬剤とともに、従来の担体、希釈剤、および／または賦形剤のうちの１つ以上と混合して、粉末、ビーズ、小袋、懸濁液、乳濁液、溶液、エアロゾル（固体として、または液体培地中で）、スプレー（鼻腔スプレーなど）、軟膏、膏薬、クリーム、ペースト、フィルム、ゲル（ヒドロゲルまたはヒドロコロイドゲルなど）、フォームなどの従来の局所用製剤を生産する。単なる参照であるが、実施例５では、ヒドロコロイドＥＳＭ粒子ゲルの生産について説明している。このようなゲルは、適用される創傷を水和し、水による創傷清拭を可能とし、上述したＥＳＭの利点をもたらすことが期待される。このような組成物は、ネクローシスを起こしている乾燥した創傷に用いるのに適している。実施例６〜９では、さらに具体的な実施形態が提供される。
【０１５３】
したがって、本発明は、例えば、上記の本発明の方法または薬物治療のいずれかに用いる、医薬組成物であって、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤のうちの少なくとも１つとともに、本明細書に記載の微粉化ＥＳＭ含有粒子を含む、医薬組成物も提供する。
【０１５４】
適切な担体、賦形剤、および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、不活性アルギン酸塩、トラガカントゴム、ゼラチン、ペクチン、フィブロネクチン、エラスチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース（酸化再生セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースなど）、水シロップ、水、水／エタノール、水／グリコール、水／ポリエチレン、高張食塩水、グリコール、プロピレングリコール、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイル、または硬質脂肪などの脂肪分、あるいはこれらの適切な混合物などが挙げられる。この組成物は、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などを追加的に含んでいてもよい。アルギン酸の一価、二価、または三価の金属カチオン塩、特にアルギン酸ナトリウム、アルギン酸カルシウム、アルギン酸亜鉛、およびアルギン酸銀が重要である。
【０１５５】
本発明で用いる微粉化ＥＳＭ含有粒子を、製織乾燥繊維（織物）被覆材および不織乾燥繊維（織物）被覆材、フィルム系被覆材、ゲル系被覆材、またはこれらの種類の被覆材を組み合わせた被覆材などの創傷被覆材に混合させることもできる。創傷への適用前または適用中の被覆材に、本発明で用いる微粉化ＥＳＭ含有粒子を適用してもよいし、製造中に混合させてもよい。被覆材は、使用中、典型的には、本発明で用いる微粉化ＥＳＭ含有粒子が創傷または創傷液に曝露されるように、適応させるか、または用いる。
【０１５６】
本発明で用いる繊維被覆材は、綿系被覆材、アルギン酸塩系被覆材、セルロース（酸化再生セルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースなど）系被覆材、繊維コラーゲン系被覆材、およびＥＳＭ（米国特許第７７６７２９７号、参照により本明細書に援用される）系被覆材を含んでもよい。
【０１５７】
フィルム系被覆材は、典型的には、水半透過性または水不透過性で柔軟であり、ポリウレタン、ポリ塩化ビニルなどの適切なプラスチックから形成され得る。
【０１５８】
ヒドロゲルおよびヒドロコロイドゲルを含むゲル系被覆材は、アルギン酸塩、セルロース（酸化再生セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースなど）、コラーゲン、ペクチン、エラスチン、フィブロネクチンを含むが、これらに限定される過剰の高分子物質から形成され得る。生体高分子、ゴム、または樹脂（ゼラチンなど）を含むと、被覆材が確実に創傷表面にゆるく付着するのに役立つことができる。アルギン酸塩を含むと、ゲルマトリクスの可能含水量が増加し得る。創傷治癒用のこのような塩基性アルギン酸塩ゲルは、米国特許第６２０１１６４号に記載がある。
【０１５９】
ゲル系被覆材は、深い空隙を有する創傷、または健康な皮膚の下を貫通しているかもしれない創傷に適合されていてもよい。後者の種類の創傷では、ゲルをシリンジに詰めた後、空隙に放出されて、創傷表面がすべて確実に覆われるようにしてもよい。使用中、ゲルの配置を維持し、かつ／またはゲルおよび創傷に水分を保持し、かつ／または微生物に対するバリアとして働くために、ゲル系被覆材を、繊維被覆材および／またはフィルム被覆材などの第２の被覆材で覆うことが有利であり得る。本発明のゲル系被覆材は、ゲル要素と一体化するこのような第２の要素を有するように設計されてもよい。
【０１６０】
適切であることが予想されるさらなる局所システムは、インサイチュの薬剤送達システムであり、例えば、固体、半固体、非結晶、または液晶のゲルマトリクスがインサイチュで形成され、本発明で用いる微粉化ＥＳＭ含有粒子を含んでいてもよいゲルである。このようなマトリクスは、好都合に、マトリクスからの粒子の放出を制御するように設計することができ、例えば、選択された期間、放出を遅延および／または持続させることができる。このようなシステムは、生体組織または体液と接触した時にのみ、ゲルを形成し得る。ゲルは、典型的には、生体接着性である。プレゲル組成物を維持できるか、または維持できるように適合することができる体内部位への送達を、このような送達技術の目標とすることができる。このようなシステムについては、国際公開公報第２００５／０２３１７６号に記載がある。
【０１６１】
創傷の処置に用いるヒドロコロイドゲルは、軟ゲルまたは流体／液体ゲル、あるいは硬い固体ゲルのいずれかとして供給され得る。硬いヒドロコロイドゲルの例としては、グラニュフレックス（Granuflex）（登録商標）およびデュオダーム（Duoderm）（登録商標）のブランド名で市販されているものが挙げられる。それらは、適度な体液吸収性を有し、創傷床および周囲の皮膚への浸軟を誘導することなく、湿潤な創傷床を維持する。湿潤に応じて、それらは膨潤して粘性を維持し、吸収した体液を保持する。創傷に用いるのに適した軟ゲルまたは流体／液体ヒドロゲルについては、米国特許第５５０３８４７号など、当該技術分野において記載がある。
【０１６２】
さらに具体的な実施形態において、本発明は、好ましくはヒドロコロイド被覆材またはヒドロゲル被覆材である、創傷被覆材であって、例えば、適切な場合は本発明の方法及び薬物治療に用いる本明細書に記載の微粉化ＥＳＭ含有粒子を含む、創傷被覆材、をさらに提供する。
【０１６３】
好ましい実施形態において、選択された搬送システムは、ＥＳＭ成分が寄与するのとは別に、創傷治癒プロセスを増強してもよい。
【０１６４】
一実施例において、本発明で用いる微粉化ＥＳＭ含有粒子を含む機能的ヒドロコロイドゲル創傷被覆材は、ペクチン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、およびプロピレングリコールから製造することができ、ここで、例えば、ペクチンが０．０５重量％および１重量％、ＣＭＣが２重量％および４．５重量％、プロピレングリコールが１５〜２０重量％、ＥＳＭ粒子が０．５重量％および１０重量％で存在し、残部を水として１００重量％とする。本実施形態において、この製剤は、さらに、創傷を洗浄および創傷清拭し、適度な量の滲出物を吸収することができる。これらの機能によって、プロテアーゼに結合して、プロテアーゼによる創傷床の破壊を防ぎ、また、創傷床を通じた細胞の付着および移動を可能にする足場として働くと考えられる微粉化ＥＳＭ含有粒子の活性が増大される。このヒドロコロイド製剤は、深い空隙を有する創傷、または健康な皮膚の下を貫通しているかもしれない創傷に理想的に適している。後者の種類の創傷では、ゲルをシリンジに詰めた後、空隙に放出されて、創傷表面がすべて確実に覆われるようにしてもよい。
【０１６５】
さらなる実施形態において、本発明で用いる微粉化ＥＳＭ含有粒子は、実質的な純水／ヒドロキシエチルセルロースからなるヒドロゲルに配合されてもよい。このような製剤は、振動させながら、または攪拌しながらＨＥＣを水に溶解し、ＥＳＭをＨＥＣ水溶液に分散させることで調製し得る。次いでＥＳＭ−ＨＥＣヒドロゲルは、チューブなどの簡便な容器に詰められ、充填された容器を、例えば２５ｋＧｙでガンマ線照射を行うことで滅菌してもよい。
【０１６６】
無菌バリアとしてだけでなく、創傷表面の水分管理機能としても働く半透過性の裏地シートを含む、固体ゲルまたは硬ゲルのヒドロコロイドを製造してもよい。このような固体材料は、ポリマー、ゴム、樹脂、またはゼラチンを含んで、被覆材が確実に創傷表面にゆるく付着するようにする。このような製品は、軽度から中程度までの滲出が見られる空隙を有しない創傷の治療に適しているであろう。このような被覆材は、被覆材が動かないようにするための、または抗菌性バリアを提供するための第２の被覆材を必要とはしないであろう。
【０１６７】
ヒドロコロイドゲルは、場合によっては、基材マトリクスゲルの可能含水量を増加させるために、アルギン酸塩を含有してもよい。これは、滲出物が中程度の創傷から滲出物が多い創傷にまで、好ましいものである。このような塩基性アルギン酸塩ゲルは、米国特許第６２０１１６４号に記載がある。
【０１６８】
上記のことから明らかなように、例えば繊維状またはゲル状であり、乾燥しているか実質的に乾燥しているか湿潤である、アルギン酸塩系創傷被覆材は、本発明で用いる微粉化ＥＳＭ含有粒子のための、注目すべき送達システムである。アルギン酸塩系創傷被覆材は、多くの異なる方法および形態でＥＳＭ粒子を創傷に送達することを可能にし得る、柔軟で適応可能な技術の代表例である。本発明で用いるＥＳＭ粒子をアルギン酸塩および創傷被覆材またはその要素と結合させた、ＥＳＭ−アルギン酸塩複合被覆材が特に重要であり、これは、その複合混合物から製造されるか、またはインサイチュで形成される。このような被覆材は、滲出物が多い創傷の処置に特に有用である。複合被覆材は、ＥＳＭが再生組織と接触することを容易にしつつ過剰な滲出物を吸収しながら、創傷床において好都合な水分レベルを維持する。このような被覆材またはそのＥＳＭ−アルギン酸塩複合物含有要素は、創傷液を吸収することができる乾燥形態、実質的乾燥形態、または湿潤形態で提供されてもよい。
【０１６９】
アルギン酸塩は、十分量の二価または三価金属カチオン（Ｃａ2+、Ｂｅ2+、Ｍｇ2+、Ｓｒ2+、Ｂａ2+、Ｆｅ2+、Ｆｅ3+、Ａｌ3+、またはＺｎ2+など）存在下での架橋ゲル形成能を有するので、ＥＳＭ−アルギン酸塩複合被覆材は可能である。しかしながら、十分量の二価または三価金属カチオンがない場合、または一価の金属カチオン（Ｎａ+、Ｌｉ+、Ｋ+、Ｒｂ+、またはＣｓ+）存在下では、アルギン酸塩は、保水性が高く、非架橋ゲル形成能を有するが、本質的に水溶液に可溶である。最も簡便なものだと、ＥＳＭを流体アルギン酸塩溶液と混合し、その後、続いて、例えば創傷自体において、創傷中のＣａ2+と接触した際に、架橋または沈殿を開始させてもよい。
【０１７０】
二価または三価の金属イオン−アルギン酸塩ゲルは、とりわけ、物質の水分吸収性、これは、ひいては二価または三価の金属イオンの置換の程度によって決定されるのだが、その水分吸収性によって決定される性質が多岐にわたっている。したがって、アルギン酸塩含有混合物における一価の金属イオンに対する二価または三価の金属イオンの比率（Ｃａ2+およびＮａ+など）を変化させることによって、広範囲の性質を有する様々なゲルを調製することができる。このようなゲルから使用前に水分を除去することで、使用中に顕著な水分吸収性を有する、繊維などの乾燥形態を調製することができる。吸収性アルギン酸塩被覆材は、有利には、アルギン酸の二価または三価の金属イオンの塩およびアルギン酸の一価の金属イオンの塩の混合物に基づいていてもよい。アルギン酸の二価または三価の金属イオンの塩は、被覆材の構造強度に寄与し、アルギン酸の一価の金属イオンの塩は、吸収を促進する。アルギン酸の二価または三価の金属イオンの塩が過剰であると、物質中の二価または三価の金属イオンの濃度に逆らうことができないため、被覆材が、創傷部位に見出される生理溶液による柔軟なゲル形態に戻ることができなくなるので、バランスはとらないといけない。アルギン酸の一価の金属イオンの塩が過剰であると、強度が低下し、取り扱い性が悪くなり、特に繊維の品質が低下する。それでも、Ｃａ2+への曝露がインサイチュで起こり、それによってインサイチュにおいて架橋ゲルを形成する、すなわち、インサイチュにおいて被覆材を形成することができるので、アルギン酸の一価の金属イオンの塩とＥＳＭ粒子との複合混合物は役に立つ場合がある。
【０１７１】
実施例６〜９で述べるように、アルギン酸の一価の金属イオンの塩（アルギン酸ナトリウム）の溶液に、本発明で用いるＥＳＭ粒子を添加し、次いで、Ｃａ2+溶液（ＣａＣｌ2）または創傷自体に由来するＣａ2+を用いて、その混合物をゲル化することで、ＥＳＭ−アルギン酸塩複合被覆材の基部を、例えば顆粒、ゲルパッド、および繊維の形態で、形成することができる。このような形態を乾燥して水分含量を低下させ、それによって、使用中の吸収性および保存性を向上し、また輸送および保存を容易にしてもよい。当業者にとっては、その他多くの構造体が明らかであり、それらの構造体は、過度の負担なく調製し得る。例えば、噴霧乾燥、またはＥＳＭ粒子とアルギン酸の一価の金属イオンの塩との溶液を、二価または三価の金属イオン溶液に噴霧することで、粉末を形成してもよい。アルギン酸塩の繊維の調製について、Ｑｉｎ， Ｙ．， ２００８， Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， ５７：１７１〜１８０に概説されており、その内容は参照により本明細書に援用される。したがって、本発明で用いるＥＳＭ粒子は、例えばＱｉｎで説明されているように、アルギン酸カルシウム、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カルシウム−ナトリウム、アルギン酸亜鉛、およびアルギン酸銀、ならびにアルギン酸からなる繊維に含まれていてもよい。
【０１７２】
したがって、さらなる具体的な実施形態において、本発明は、創傷被覆材またはその構造要素であって、本明細書に記載の微粉化ＥＳＭ含有粒子とアルギン酸塩との複合混合物を含む（例えば、複合混合物から形成される）、創傷被覆材またはその構造要素、をさらに提供する。被覆材は、適切な場合は本発明の方法及び薬物治療に用いるために提供されてもよい。
【０１７３】
アルギン酸塩に関する言及は、指示がなければ、アルギン酸を含む。被覆材のアルギン酸塩は、アルギン酸であってもよいし、例えば上記引用した塩であり、特にそれぞれアルギン酸Ｃａ2+およびアルギン酸Ｎａ+である、アルギン酸の二価の金属イオンの塩、アルギン酸の三価の金属イオンの塩、および／またはアルギン酸の一価の金属イオンの塩であってもよい。本明細書に記載の微粉化ＥＳＭ含有粒子と創傷被覆材のアルギン酸塩との複合混合物は、好ましくは架橋ゲルなどのゲルであり、このようなゲルから形成される繊維、パッド、顆粒、および粉末を含む。アルギン酸塩は、典型的には、例えば少なくとも３５ｋＤａのポリマー、または大きさの異なる複数のポリマーであるが、そのポリマーの代わりに、またはそのポリマーと組み合わせて、より小さなオリゴマーを用いてもよい。
【０１７４】
本明細書に記載の微粉化ＥＳＭ含有粒子と創傷被覆材のアルギン酸塩との複合混合物は、乾燥していてもよいし（乾燥減量試験法によって測定された水分が２重量％未満）、実質的に乾燥していてもよいし（水分が５重量％未満）、湿潤であってもよい（水分が５重量％を越える）。
【０１７５】
あるいは、本明細書に記載の微粉化ＥＳＭ含有粒子と創傷被覆材のアルギン酸塩との複合混合物は、粉末、顆粒、大規模固形担体（パッドまたはスポンジなど）または繊維の形態であってもよい。創傷被覆材は、本質的に、粉末、顆粒、大規模固形担体、または繊維のうちの１つ以上からなるものであってもよい。他の実施形態において、創傷被覆材は、例えば、上述したフィルム系被覆材、繊維系被覆材、またはゲル系被覆材におけるフィルム、繊維、およびゲルから形成される構造要素である、第２の構造要素を少なくとも含んでいてもよい。不透過性の裏地が重要である場合がある。
【０１７６】
カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、またはペクチンなどの、さらなるゲルレオロジー改質物質を、複合混合物に混合して、例えば、複合物の保水性および／または複合物の機械的性質をさらに改質してもよい。
【０１７７】
本発明で用いる微粉化ＥＳＭ含有粒子を、埋め込み型医療用デバイスの中または上に含ませることもでき、それによって、創傷への適用が、この方法によって実現されてもよい。このような医療用デバイスは、創傷をもたらす経皮デバイスおよび／または経皮管路（中心静脈カテーテル、特に、ダクロン（Dacron）またはコラーゲンカフなどのカフ付きカテーテルなど）や、心臓弁、人工関節、歯科インプラントおよび人工軟組織インプラント（胸部インプラント、臀部インプラント、口唇インプラントなど）などの補綴具、ステント、ペースメーカー、気管切開チューブなどのあらゆる種類のデバイスを含むがこれらに限定されない、本明細書に記載のデバイスであってもよい。
【０１７８】
血液透析用カテーテルなどのカテーテルの臨床での有用性は、これらが感染すると、制限される。（Ｗａｙｎｅら ２００５； Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ １６：１４５３〜１４６２）。出口部位を抗生物質で処理して、細菌の成長を抑制してもよいが、このような使用は、抗生物質抵抗性の発現につながることが多い。多くの場合、一旦、出口部位が慢性的に感染すると、そのカテーテルは取り外さねばならない。例えば、本明細書に記載の微粉化ＥＳＭ含有粒子は、出口部位周辺において創傷の修復および組織の成長を促進し、また細菌の成長を阻害することで、カテーテルの、感染が起こらない臨床的有効寿命を引き延ばすであろう。本明細書に記載の微粉化ＥＳＭ含有粒子で被覆されたカテーテルの外側で成長中の組織は、出口部位を通る潜在的な感染経路を、効果的に封止するであろう。
【０１７９】
したがって、さらなる態様において、本発明は、例えば経皮カフなどの、感染しやすい表面またはその一部が、本明細書に記載の微粉化ＥＳＭ含有粒子を用いて前処理されている、埋め込み型医療用デバイスを提供する。
【０１８０】
「前処理」とは、被験体に埋め込む前に、本明細書に記載の微粉化ＥＳＭ含有粒子が、創傷治癒または本明細書に記載の創傷効果のいずれかを促進するのに十分な期間、感染しやすい表面に残存する方法で、感染しやすい表面を本明細書に記載の微粉化ＥＳＭ含有粒子に、かなりの期間曝露させることを意味する。粒子は、好ましくは、実質的に、表面の有効寿命の間残存する。例えば、前処理によって、実質的に永続する本明細書に記載の微粉化ＥＳＭ含有粒子の被覆が形成される。したがって、前処理された表面／デバイスは、本明細書に記載の微粉化ＥＳＭ含有粒子が適用され、残存している、表面／デバイスである。このようなデバイス／表面は、被覆デバイス／表面、および／または含浸デバイス／表面であってもよい。被覆は、好ましくは、複数の、すなわち少なくとも２つのＥＳＭ粒子の層を含む。
【０１８１】
前処理は、簡便な手段で、例えば、噴霧乾燥、本明細書に記載の微粉化ＥＳＭ含有粒子を含むポリマーを用いるポリマーコーティング、または硬ヒドロゲルもしくはヒドロコロイドの表面への配置などの、本明細書に記載の微粉化ＥＳＭ含有粒子を表面に適用する、特に表面を被覆する様式で、実施することができる。埋め込む直前、または埋め込まれている間に、被覆が行われてもよい。本明細書に記載の微粉化ＥＳＭ含有粒子を含有するこのような「被覆」組成物は、本発明のさらなる態様である。あるいは、デバイスまたはその感染しやすい部品を製造する材料に、本明細書に記載の微粉化ＥＳＭ含有粒子を含ませるか、または含浸させることができる。この方法は、プラスチックおよびシリコーンなどのポリマーから製造されるデバイスまたはその構成部品に適している。したがって、微粉化ＥＳＭ含有粒子の被覆または被覆組成物を含む不活性表面を有するか、あるいは本明細書に記載の微粉化ＥＳＭ含有粒子を含むか、または含浸させた埋め込み型医療用デバイスが企図される。
【０１８２】
本発明は、本明細書に記載の微粉化ＥＳＭ含有粒子を含む組成物、創傷被覆材、または埋め込み型デバイスを調製または製造するための、本明細書に記載の微粉化ＥＳＭ含有粒子の使用も提供する。
【０１８３】
本発明による使用を提案された微粉化ＥＳＭ含有粒子は、他の治療薬と組み合わせて、例えば、単一の医薬製剤、組成物、被覆材またはデバイス（本明細書に記載のものなど）中で一緒に投与されてもよいし、別々に投与（すなわち、個別投与、逐次投与、または同時投与）されてもよい。したがって、本発明で用いる微粉化ＥＳＭ含有粒子は、例えば調剤キットにおいて、または結合（「組み合わせ」）製品として、第２の（または、さらなる）治療上活性な薬剤と組み合わせてもよい。さらなる治療薬は、簡便な手段で投与されてもよく、必ずしも、非経口的手段または経腸的手段などの局所的手段である必要はない（例えば、経口、静脈内、または吸入など）。薬剤は、別々に用いられてもよいし、同じ組成物、被覆材、またはデバイスにおいて一緒に、または同時に、または逐次に、あるいは、例えば所望の時間間隔をあけて別々に用いられてもよい。
【０１８４】
本発明の有利な一実施形態において、本明細書に記載の微粉化ＥＳＭ含有粒子は、本発明の方法において、第２の、またはさらなる臨床的に有効な抗菌剤（以下、「さらなる抗菌剤」）とともに、または組み合わせて用いられてもよい。薬剤は、別々に用いられてもよいし、同じ組成物、被覆材、またはデバイスにおいて一緒に、または同時に、または逐次に、あるいは、例えば所望の時間間隔をあけて別々に用いられてもよい。
【０１８５】
したがって、代表例として、さらなる抗菌剤は、粒子が創傷に適用された後に用いられてもよいが、先行して、または同時に用いることが、状況によっては役立つ場合がある。
【０１８６】
代表的な抗生物質としては、アミノグリコシド（アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシンなど）；カルベセフェム（ロラカルベフなど）；第１世代のセファロスポリン（セファドロキシル、セファゾリン、セファレキシンなど）；第２世代のセファロスポリン（セファクロル、セファマンドール、セファレキシン、セフォキシチン、セフプロジル、セフロキシムなど）；第３世代のセファロスポリン（セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソンなど）；第４世代のセファロスポリン（セフェピムなど）；マクロライド（アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、トロレアンドマイシンなど）；モノバクタム（アズトレオナムなど）；ペニシリン（アモキシシリン、アンピシリン、カルベニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、ピペラシリン、チカルシリンなど）；ポリペプチド抗生物質（バシトラシン、コリスチン、ポリミキシンＢなど）；キノロン（シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、トロバフロキサシンなど）；スルホンアミド（マフェニド、スルファセタミド、スルファメチゾール、スルファサラジン、スルフィソキサゾール、トリメトプリム−スルファメトキサゾールなど）；テトラサイクリン（デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリンなど）；カルバペネム（イミペネム、メロペネム、エルタペネム、ドリペネム、パニペネム／ベタミプロン、ビアペネム、ＰＺ−６０１など）；クロラムフェニコール；クリンダマイシン、エタンブトール；ホスホマイシン；イソニアジド；リネゾリド；メトロニダゾール；ニトロフラントイン；ピラジンアミド；キヌプリスチン／ダルホプリスチン；リファムピン；スペクチノマイシン；およびバンコマイシンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８７】
代表的な消毒剤としては、塩素系漂白剤（次亜塩素酸ナトリウム）、四級アンモニウム化合物（塩化ベンズアルコニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩化セチルピリジニウムなど）、過酸化水素、フェノール化合物（ＴＣＰ トリクロサンなど）、アルコール（エタノールなど）、ビルコン（Virkon）（登録商標）、ヨウ素化合物（ポビドンヨウ素など）、銀化合物（銀元素ナノ粒子／マイクロ粒子)などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８８】
抗菌界面活性剤は、消毒剤の別種である。これらは、微生物の細胞膜および他の構成要素を破壊し、その結果、微生物の成長および／または生存能力を阻害する化合物である。抗菌界面活性剤および抗菌組成物におけるその使用は、当該技術分野において周知されており、さらなる手引きが必要であれば、“Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ−ｆｒｅｅ ａｎｄ ｓｅｌｆ−ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｄｒｕｇｓ − Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ”，Ｋａｂａｒａ ａｎｄ Ｏｒｔｈ編，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ，ＮＹ，１９９７の抗菌界面活性剤についての概説の全内容が、参照により明示的に援用される。抗菌界面活性剤は、アニオン性であってもよいし、カチオン性であってもよいし、ノニオン性であってもよいし、両性であってもよい。アニオン性抗菌界面活性剤としては、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ラウリル硫酸ナトリウム）、 ドデシルアミノプロピオン酸ナトリウム、リシノール酸ナトリウム、胆汁酸、アルキルアリルスルホン酸、グリロサン（Grillosan）ＤＳ７９１１、ウンデシレン酸モノエタノールアミドスルホコハク酸二ナトリウムなどが挙げられるが、これらに限定されない。カチオン性抗菌界面活性剤としては、例えば、四級アンモニウム化合物、アミンイミド、およびクロルヘキシジン化合物などが挙げられるが、これらに限定されない。ノニオン性抗菌界面活性剤としては、例えば、脂肪酸モノエステル、アルキルジヒドロキシ安息香酸のポリエチレングリコモノエステル、グルコサミン誘導体、およびＮ−ラウロイルジペプチドのジエタノールアミドなどが挙げられるが、これらに限定されない。両性抗菌界面活性剤としては、例えば、アルキルベタイン、アルキルアミドプロピルベタイン、アルキルアミノプロピオン酸、アルキルイミノジプロピオン酸、およびアルキルイミダゾリンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８９】
代表的な抗真菌剤としては、ポリエン（ナタマイシン、リモシジン、フィリピン、ニスタチン、アンホテリシンＢ、カンジシンなど；イミダゾール（ミコナゾール、ケトコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、ビホナゾール、ブトコナゾール、フェンチコナゾール、イソコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール、チオコナゾールなど）；トリアゾール（フルコナゾール、イトラコナゾール、イサブコナゾール、ラブコナゾール、ポサコナゾール、ボリコナゾール,テルコナゾールなど）；アリルアミン（テルビナフィン、アモロルフィン、ナフチフィン、ブテナフィンなど）；およびエキノカンジン（アニデュラフンジン、カスポフンジン、ミカフンジンなど）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９０】
代表的な抗ウイルス剤としては、アバカビル、アシクロビル、アデホビル、アマンタジン、アンプレナビル、アルビドール、アタザナビル、アトリプラ、ボセプレビル、シドホビル、コンビビル、ダルナビル、デラビルジン、ジダノシン、ドコサノール、エドクスジン、エファビレンツ、エムトリシタビン、エンフビルチド、エンテカビル、ファムシクロビル、ホミビルセン、ホスアンプレナビル、ホスカルネット、ホスホネット、ガンシクロビル、イバシタビン 、イムノビル、イドクスウリジン、イミキモド、インジナビル、イノシン、III型インターフェロン、II型インターフェロン、I型インターフェロン、ラミブジン、ロピナビル、ロビリド、マラビロク、モロキシジン、ネルフィナビル、ネビラピン、ネクサビル、オセルタミビル、ペンシクロビル、ペラミビル、プレコナリル、ポドフィロトキシン、ラルテグラビル、リバビリン、リマンタジン、リトナビル、サキナビル、スタブジン、テノホビル、テノホビル ジイソプロキシル、チプラナビル、トリフルリジン、トリジビル、トロマンタジン、ツルバダ、バラシクロビル、バルガンシクロビル、ビクリビロク、ビダラビン、ビラミジン、ザルシタビン、ザナミビル、およびジドブジンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９１】
さらなる抗菌剤は、好都合には、本発明で用いる微粉化ＥＳＭ含有粒子の前に適用されてもよいし、それと同時に適用されてもよいし、その後に適用されてもよい。さらなる抗菌剤は、好都合には、ＥＳＭ粒子と実質的に同じ時に適用されてもよいし、その後で適用されてもよい。例えば、さらなる抗菌剤は、ＥＳＭ粒子を投与してから、少なくとも１時間後、好ましくは少なくとも３時間後、より好ましくは少なくとも５時間後、さらに好ましくは少なくとも６時間後に適用される。他の実施形態において、さらなる抗菌剤は、好都合には、ＥＳＭ粒子の前に、例えばＥＳＭ粒子の少なくとも１時間前、少なくとも３時間前、または少なくとも６時間前に、適用または投与されてもよい。これらの実施形態において、ＥＳＭ粒子は、さらなる抗菌剤のさらなる適用があってもなくても、適用または投与することができる。さらなる抗菌剤の抗菌効果を最適化するために、用いる薬剤に適した時点において、さらなる抗菌剤を繰り返し与える（例えば、投与または送達する）ことができる。当業者であれば、適切な用量または使用計画を工夫することができるであろう。長期の治療において、ＥＳＭ粒子を繰り返し用いることもできる。これは、さらなる抗菌剤と同じ頻度とすることができるが、より少ない頻度であってもよい。必要とされる頻度は、コロニー組成、用いる抗菌剤、およびその投与経路次第であり、当業者であれば、用量または使用パターンを最適化して、最適な結果を得ることができるであろう。
【０１９２】
ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ、ｈＧＦなどの成長因子と組み合わせて、またはともに、本明細書に記載の微粉化ＥＳＭ含有粒子を用いることも、役立つ場合がある。適切な治療計画は、さらなる抗菌剤の使用についての説明の通りである。
【０１９３】
抗炎症ステロイドまたはＮＳＡＩＤなどの抗炎症剤と組み合わせて、またはともに、本明細書に記載の微粉化ＥＳＭ含有粒子を用いることも、役立つ場合がある。代表的なＮＳＡＩＤとしては、サリチル酸塩（アスピリン（アセチルサリチル酸）など）、トリサリチル酸コリンマグネシウム、ジフルニサル、サルサレート、プロピオン酸誘導体（イブプロフェン、デクスイブプロフェン、デクスケトプロフェン、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、ケトプロフェン、ロキソプロフェン ナプロキセン、オキサプロジンなど）、酢酸誘導体（アセクロフェナク、ジクロフェナク、エトドラク、インドメタシン、ケトロラク、ナブメトン、トルメチン、スリンダクなど）、エノール酸誘導体（ドロキシカム、イソキシカム、ロルノキシカム、メロキシカム、ピロキシカム、テノキシカムなど）、アントラニル酸誘導体（フルフェナム酸、メクロフェナム酸、メフェナム酸、トルフェノム酸など）および選択的ＣＯＸ−２阻害剤（コキシブ（Coxibs）；セレコキシブ、エトリコキシブ、ルミラコキシブ、パレコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブなど）などが挙げられるが、これらに限定されない。プロピオン酸誘導体（イブプロフェン、デクスイブプロフェン、デクスケトプロフェン、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、ケトプロフェン、ロキソプロフェン ナプロキセン、オキサプロジンなど）が好ましく、イブプロフェンが最も好ましい。適切な治療計画は、さらなる抗菌剤の使用についての説明の通りである。
【図面の簡単な説明】
【０１９４】
本発明を、以下の限定されない実施例を参照してさらに説明する。実施例において、
【図１】図１は、平均粒子径が１００μｍのＥＳＭ粒子非存在下または存在下における、大腸菌の細菌成長曲線を示す（添加したＥＳＭ粒子は０．００３ｇまたは０．０１ｇ）。下の２本がＥＳＭを添加したものである。
【図２】図２は、平均粒子径が１００μｍ未満のＥＳＭ粒子が、ＮＦ−ｋＢ制御ルシフェラーゼレポーターのコンストラクトを含有するＵ９３７ヒト単球細胞のＬＰＳに対する炎症反応に及ぼす効果を、ＮＦ−ｋＢ活性によって測定したものを示す。コントロール：ＥＳＭ未添加。ＬＰＳなし：左側の棒グラフ；ＬＰＳ：右側の棒グラフ。
【図３】図３は、平均粒子径が１００μｍ未満のＥＳＭ粒子が、組換え型ＭＭＰ−９の活性に及ぼす効果を示す。ＭＭＰ９なし：左側の棒グラフ；ＭＭＰ９あり：右側の棒グラフ。
【図４】図４は、図３に示す結果を得るのに用いたのと同じアッセイにおいて、ＭＭＰ阻害剤ＧＭ６００１が、ＭＭＰ−９活性に及ぼす効果を示す。
【図５】図５は、回転刃混合機で乾燥ＥＳＭフレークを粉末化して形成したＥＳＭ繊維を示す。乾燥ＥＳＭフレークは、国際公開公報第２０１５/０５８７９０号（ＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０７２０４９）および上記記載の通り、非ＥＳＭ卵成分からＥＳＭを分離し、そのようにして得られたＥＳＭフレークを０．１％塩酸で洗浄し、これによってＥＳＭフレーク中の残存炭酸カルシウムを除去し、ＥＳＭフレークを乾燥することで調製された。
【図６】図６は、ＥＳＭ粒子の異なる４つの製剤が、ｄｂ／ｄｂ糖尿病マウスの全層切除創傷の閉合に及ぼす効果を、処理後に残った創傷面積の割合で測定したものを示す。４つのＥＳＭ製剤については、実施例１０で説明する。これらの処理で得られたデータを、「未治療」群（ネガティブコントロール）、ポジティブコントロール群（０．５％ＨＰＭＣ（ヒドロキシプロピルメチルセルロース）中で、血小板由来成長因子−ＢＢ（ｒｈ−ＰＤＧＦ−ＢＢ（１０μｇ））、および形質転換成長因子−α（ｒｈ−ＴＧＦ−α（１μｇ））で処理）に対してプロットした。
【図７】図７は、図６のネガティブコントロールおよびポジティブコントロールのデータを示す。
【図８】図８は、図６のネガティブコントロール、ポジティブコントロール、およびＥＳＭ−３０のデータを示す。
【図９】図９は、図６のネガティブコントロール、ポジティブコントロール、およびＥＳＭ−１０のデータを示す。
【図１０】図１０は、図６のネガティブコントロール、ポジティブコントロール、およびＥＳＭ−３のデータを示す。
【図１１】図１１は、図６のネガティブコントロール、ポジティブコントロール、およびＥＳＭ−１のデータを示す。
【図１２】図１２は、平均粒子径が異なるＥＳＭ粒子を同じ質量用いた場合に、ＮＦ−ｋＢ制御ルシフェラーゼレポーターのコンストラクトを含有するＵ９３７ヒト単球細胞のＬＰＳに対する炎症反応に及ぼす効果を、ＮＦ−ｋＢ活性によって測定したものを示す。未処理：１ｍｍを越えるＥＳＭ断片；ＡおよびＢ：サイズが２５０μｍ未満の粉砕ＥＳＭ粒子；Ｃ：サイズが１２０μｍ未満の粉砕ＥＳＭ粒子；Ｄ：サイズが８０μｍ未満の粉砕ＥＳＭ粒子。
【０１９５】
実施例１
ＥＳＭの抗菌活性
序文
自動バイオスクリーン（Bioscreen）ＣシステムにおいてＥＳＭ粒子存在下／非存在下で培養した菌液の成長曲線を測定することで、ＥＳＭ粒子（平均粒子径は１００μｍ）の抗菌活性を調べた。
【０１９６】
材料および方法
大腸菌を、ＢＨＩアガー（Brain heart infusion agar）上で３７℃で２４時間培養し、アガープレートからコロニーを１つ取ってＢＨＩ培地５ｍｌに再懸濁することで、大腸菌の種菌を調製した。その後、１０μｌの接種菌液を３５０μｌのＢＨＩ培地に接種し、ハニカム状マイクロプレートに蒔いた。大腸菌を接種していない滅菌ＢＨＩ培地を、コントロールとして用いた。
ＯＤ６００（吸光度）の各測定まで振盪しながら、３７℃で２４時間、自動バイオスクリーンＣシステムにおいてＥＳＭ粒子非存在下で最初の培養を行った。２４時間培養後、滅菌したＥＳＭ粒子（０．００３ｇおよび０．０１ｇ）を、大腸菌サンプルおよび滅菌培地に添加した。滅菌ＢＨＩ培地にＥＳＭ粒子を加えたものと加えなかったものを、コントロールとして用いた。
【０１９７】
結果と結論
０．００３ｇまたは０．０１ｇのＥＳＭ粒子添加後の成長曲線は、ＥＳＭ粒子を添加しなかったサンプルの場合と４０時間まで同じであり、その後、ＥＳＭ粒子を添加しなかったサンプルでは増加を示したのに対して、劇的に低下した。この結果から、ＥＳＭ粒子が、大腸菌の生存能力および／または成長を阻害することが示された（図１）。
【０１９８】
実施例２
ＥＳＭの抗炎症効果
序文
転写因子ＮＦ−ｋＢは、ストレス反応および炎症反応において、重要な役割を果たしている。Ｕ９３７ ３ｘ ＮＦ−ｋＢ−ＬＵＣ細胞系は、ヒト単球細胞株（Ｕ９３７）に３ｘ ＮＦ−ｋＢ−ルシフェラーゼレポーターのコンストラクトを安定的に導入したものであるが、これを用いて、細胞性炎症反応に対するＥＳＭ粒子（平均粒子径１００μｍ）の潜在的生物活性を、ＮＦ−ｋＢの発現によって調べた。
【０１９９】
材料および方法
接着性でないＵ９３７ ３ｘ ＮＦ−ｋＢ−ＬＵＣ細胞を、９６穴のタイタープレート中、ＤＭＥＭ培地（シグマ社（Sigma））に播種し、３７℃、ＣＯ2濃度５％で培養した。異なる濃度（０ｍｇ／ｍｌ、０．５および１ｍｇ／ｍｌ）のＥＳＭ粒子の抗炎症効果を、炎症効果（ルシフェラーゼ活性に比例）を誘導するための５時間のＬＰＳ処理（１．０μｇ／ｍｌ）を行う３０分前にインキュベーションすることで調べた。インキュベーション終了時に、ブライト−グロー・ルシフェラーゼアッセイ（Bright-Glo Luciferase assay）（プロメガ社（Promega））を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。このアッセイにおいて、ＬＰＳ曝露に応じたルシフェラーゼ活性が低いほど、抗炎症効果が高い。
【０２００】
結果と結論
ＬＰＳ誘発性炎症反応は、抗炎症効果を示すＥＳＭ粒子によって、用量依存的に低下した。図２は、濃度が１ｍｇ／ｍｌのＥＳＭ粒子の効果を示す。
【０２０１】
実施例３
ＭＭＰ調節効果
序文
マトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）は、細胞外マトリクス成分を消化することができる分泌型タンパク質または膜結合型タンパク質のファミリーである。センソライト（登録商標） ジェネリックＭＭＰアッセイキット「フルオリメトリック」（SensoLyteR Generic ＭＭＰ Assay Kit "Fluoremetric"）（アナスペック社（AnaSpec））を用いて、ＭＭＰ−９活性に及ぼすＥＳＭ粒子（平均粒子径１００μｍ）の効果を調べた。組換え型ＭＭＰを用いてＭＭＰの誘導物質または阻害物質をスクリーニングすることは、このアッセイキットにより可能である。
【０２０２】
材料および方法
センソライト（登録商標） ジェネリックＭＭＰアッセイキットは、５−ＦＡＭ（蛍光物質）と、ＱＸＬ５２０（商標）（消光剤）でラベルされたＦＲＥＴペプチド基質とを用いて、酵素活性を連続的に測定する。未処置のＦＲＥＴペプチドでは、５−ＦＡＭの蛍光は、センソライト（登録商標）によって消光される。ＭＭＰがＦＲＥＴペプチドを切断すると、５−ＦＡＭの蛍光が回復し、励起／発光＝４９０ｎｍ／５２０ｎｍで連続的に測定することができる。
組換え型ＭＭＰ−９（アナスペック社）に、異なる量のＥＳＭ粒子を添加し、製品の手順にしたがって酵素活性を測定した。さらに、インビトロのシステムにおける阻害のポジティブコントロールとして、ＭＭＰ活性の一般的な阻害剤であるＧＭ６００１を用いた。
【０２０３】
結果と結論
組換え型ＭＭＰ−９の活性は、ＥＳＭ粒子を添加することで低下した。これは、ＭＭＰ活性に対するＥＳＭ粒子の負の効果を示している（図３）。
【０２０４】
実施例４
創傷に適用される微粉化ＥＳＭ粒子の調製
精製し、粉砕した後のＥＳＭは、医療用デバイスとしての先進的な処理に適した、低エンドトキシンで低生物負荷の物質である。乾燥粉末製剤は、アルミニウム箔またはタイベック（Tyvec）材料で作られた１ｇの小袋に、精製したＥＳＭ材料を梱包することで製造される。密封された小袋は、その後、ガンマ線線照射（好ましくは２５ｋＧｙ）により滅菌される。
【０２０５】
乾燥粉末製剤は、創傷表面を覆うように、０．５ｍｍ以下の層となるまで粉末をふりかけることで、創傷表面に適用されてもよい。ＥＳＭは、固有の水分吸収能を有していないので、ヒドロコロイド、アルギン酸塩、または繊維被覆材などの追加的な創傷被覆材を、被覆された創傷の最上面に配置すべきである。同様に、創傷清拭が必要な乾燥した創傷の場合は、まず、ヒドロゲル製剤で創傷表面を処理し、次いで乾燥粉末ＥＳＭをヒドロゲルの最上面にふりかけるべきである。
【０２０６】
治療中および被覆材を交換する時は、生理食塩水または他の生理溶液で洗浄することで、創傷からＥＳＭ製品を容易に洗い流し得る。これは、被覆材の交換中や、創傷の感染または治癒状況を検査するのに必要とされるであろう。
【０２０７】
最適には、ＥＳＭ処理された創傷を第２の被覆材で覆うことで、ＥＳＭが動かないようにし、また組織の再成長のための湿潤環境を促進する。滲出物が多い創傷では、例えばアクアセル（Aquacel）といった含水繊維被覆材などの高容量被覆材で創傷を覆うことが好ましいであろう。
【０２０８】
実施例５
ヒドロコロイドＥＳＭ粒子ゲルの製造および適用
ヒドロコロイドゲルは、創傷の処置に用いられ、軟ゲルまたは水性ゲル、あるいは硬い固体ゲルのいずれかとして供給され得る。硬いヒドロゲルは、グラニュフレックス（Ｇｒａｎｕｆｌｅｘ）およびデュオダーム（Ｄｕｏｄｅｒｍ）のブランド名で市販されている。それらは、適度な体液吸収性を有し、創傷床および周囲の皮膚への浸軟を誘導することなく、湿潤な創傷床を維持する。湿潤に応じて、それらは膨潤して粘性を維持し、吸収した体液を保持する。軟ゲルまたは水性ヒドロゲルについては、米国特許第５５０３８４７号など、当該技術分野において記載がある。
【０２０９】
ＥＳＭを含む機能的ヒドロゲルは、ペクチン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、およびプロピレングリコールから製造することができる。本実施例において、ペクチン濃度は０．０５〜１％、ＣＭＣ濃度は２〜４．５％、プロピレングリコールの濃度は１５〜２０重量％、ＥＳＭの濃度は０．５〜１０％である。残部を水として１００重量％とする。本実施形態において、この製剤は、創傷を洗浄および創傷清拭し、適度な量の滲出物を吸収することができる。これらの機能によって、プロテアーゼに結合して、プロテアーゼによる創傷床の破壊を防ぎ、また、創傷床を通じた細胞の付着および移動を可能にする足場として働くＥＳＭの活性が増大される。
【０２１０】
最初に、ペクチンを水に分散させ、約５０℃の穏やかな加熱によって溶解させる。次に、混合しながらプロピレングリコールを添加し、その後、激しく混合しながらＣＭＣを徐々に添加する。２０〜３０℃まで冷却し、混合しながらＥＳＭ粒子を添加する。いったん混合すると、ＥＳＭ粒子は、懸濁物質として、ヒドロコロイド中で均等に分散する。次に、アルミニウムチューブまたは同様のチューブ、あるいは小袋にゲルを分注し、好ましくは２５ｋＧｙでガンマ線照射を行い滅菌する。ゲルは、５℃で冷蔵保存されてもよいし、室温で保存されてもよい。
【０２１１】
ヒドロコロイド製剤は、深い空隙を有する創傷、または健康な皮膚の下を貫通しているかもしれない創傷に理想的に適している。後者の種類の創傷では、ゲルをシリンジに詰めた後、空隙に放出されて、創傷表面がすべて確実に覆われるようにしてもよい。
【０２１２】
さらなる実施形態において、ＥＳＭ粒子は、実質的な純水／ヒドロキシエチルセルロースからなるヒドロゲルに配合されてもよい。このような製剤は、振動させながら、または攪拌しながらＨＥＣを水に溶解し、ＥＳＭをＨＥＣ水溶液に分散させることで調製し得る。次いでＥＳＭ−ＨＥＣヒドロゲルは、チューブまたは小袋などの簡便な容器に詰められ、充填された容器を、例えば２５ｋＧｙでガンマ照射を行うことで滅菌してもよい。
【０２１３】
最適には、その後、創傷を、半透性膜などの第２の被覆材で覆うことで、湿潤環境を維持し、またヒドロコロイドが動かないようにする。
【０２１４】
無菌バリアとしてだけでなく、創傷表面の水分管理機能としても働く半透過性の裏地シートを含む、固体ゲルまたは硬ゲルのヒドロコロイドを製造してもよい。このような固体材料は、ポリマー、ゴム、樹脂、またはゼラチンを含んで、被覆材が確実に創傷表面にゆるく付着するようにする。このような製品は、軽度から中程度までの滲出が見られる空隙を有しない創傷の治療に適しているであろう。このような被覆材は、被覆材が動かないようにするための、または抗菌性バリアを提供するための第２の被覆材を必要とはしないであろう。
【０２１５】
最適には、ヒドロコロイドは、基材マトリクスゲルの可能含水量を増加させるために、アルギン酸塩を含有してもよい。これは、滲出物が中程度の創傷から滲出物が多い創傷にまで、好ましいものである。このような塩基性アルギン酸ゲルは、米国特許第６２０１１６４号に記載がある。
【０２１６】
実施例６
ＥＳＭアルギン酸ナトリウム複合顆粒の製造
本実施例では、本発明で用いるＥＳＭ粒子（繊維）をアルギン酸ナトリウムと組み合わせて、顆粒を形成する。顆粒は、直径が約１００〜２００μｍの比較的大きな粒子である。このサイズ範囲により、製品を、最終的なパッケージ容器から手で直接ふりかけて、比較的容易に創傷に散布適用することができる。創傷と接触すると、アルギン酸塩成分が体液、創傷滲出物（Ｃａ2+を含有する）を吸収し、膨潤してゲルとなる（インサイチュ被覆物）。その後、ＥＳＭ粒子は、創傷から直接的に、またはゲルから間接的に、水和し、創傷表面と接触する。
【０２１７】
具体的には、顆粒は、４０重量％のＥＳＭ粒子と６０重量％の４０％アルギン酸Ｎａ溶液とを組み合わせて形成される。この組み合わせを、粘稠性が均一になるまで回転ドラムミキサーで混合する。この物質は、ウエットケークに似ている。次に、これを流動層乾燥機に移し、乾燥減量試験法または同等の方法によって、水分が５％ｗ／ｗ未満になるまで、風乾する。この物質は、今度は粗いパンくずに似ている。次に、これを２００μｍのふるいを用いてコーンミル粉砕し、ＥＳＭとアルギン酸塩とが結合した、２００μｍ未満の顆粒を作成する。さらにスクリーニングして、より小さい粒子を除去してもよい。次に、顆粒製品を梱包し、好ましくはガンマ線照射または酸化エチレン処理によって滅菌する。
【０２１８】
カルボキシメチルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロースなどの追加的な物質を顆粒に混合して、複合物の保水性をさらに改質してもよい。
【０２１９】
実施例７
ＥＳＭアルギン酸ナトリウム複合パッドの製造
４０重量％のＥＳＭ粒子と６０重量％の４０％アルギン酸Ｎａ溶液とを組み合わせて、粘稠性が均一になるまで回転ドラムミキサーで混合する。この物質は、ウエットケークに似ている。次に、このウエットケークを鋳型に詰め、その後、凍結乾燥または真空乾燥を行って、パッドを作成する。乾燥減量によって水分濃度が５％ｗ／ｗを下回るまで、乾燥を続ける。
【０２２０】
創傷と接触すると、パッドのアルギン酸塩成分が体液、創傷滲出物（Ｃａ2+を含有する）を吸収し、膨潤してゲルとなる（インサイチュ被覆物）。その後、ＥＳＭ粒子は、創傷から直接的に、またはゲルから間接的に、水和し、創傷表面と接触する。
【０２２１】
パッドを他の材料と組み合わせて、例えば水不透過性の裏地を有する被覆材などの、ハイブリッド被覆材を作成し、滲出物が多い創傷からの漏出を防いでもよい。
【０２２２】
カルボキシメチルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロースなどの追加的な物質をパッドに混合して、複合物の保水性をさらに改質してもよい。
【０２２３】
実施例８
ＥＳＭアルギン酸カルシウム複合パッドの製造
本実施例では、ＥＳＭ粒子を、溶液中でアルギン酸ナトリウムと組み合わせる。次に、ＣａＣｌ2を添加することで、可溶性アルギン酸塩を溶液から沈殿させて、ＥＳＭが分配されたアルギン酸Ｃａの不溶性ゲルマトリクスを形成する。
【０２２４】
具体的には、最初に、本発明で用いる乾燥ＥＳＭ粒子（繊維）を１％ｗ／ｖで水に懸濁し、次に、十分量のアルギン酸Ｎａ粉末と組み合わせて、アルギン酸塩の２％ｗ／ｖ溶液を得る。アルギン酸Ｎａを溶解させるために、懸濁液を約５０℃まで加熱しないといけない場合がある。次に懸濁液を、硬化用の鋳型に入れる。次に、１０％ＣａＣｌ2溶液を、最終濃度が２％になるまで、各鋳型にゆっくりと添加して、２４時間、０〜３０℃で完全に硬化させる。２４時間後、硬化およびアルギン酸Ｃａ形成中にゲルから遊離した過剰な水を吸引して除去し、鋳型を凍結乾燥機または真空乾燥機に入れる。乾燥減量によって水分濃度が５％ｗ／ｗを下回るまで、乾燥を続ける。次に、製品を梱包し、好ましくはガンマ線照射または酸化エチレン処理によって滅菌する。
【０２２５】
パッドを他の材料と組み合わせて、例えば水不透過性の裏地を有する被覆材などの、ハイブリッド被覆材を作成し、滲出物が多い創傷からの漏出を防いでもよい。
【０２２６】
カルボキシメチルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロースなどの追加的な物質をパッドに混合して、複合物の保水性をさらに改質してもよい。
【０２２７】
実施例９
ＥＳＭアルギン酸カルシウム複合繊維の製造
本実施例では、紡績製造プロセスの間に、アルギン酸Ｃａ繊維にＥＳＭ粒子を混合する。アルギン酸ナトリウムとＥＳＭとの混合物を、紡糸口金を通して、ＣａＣｌ2溶液に押し出す。ＣａＣｌ2処理によって、アルギン酸塩のポリマーが沈殿して、ＥＳＭ材料が混合された不溶性繊維となる。適切なスプレー手段を用いると、顆粒およびビーズを同様に形成することができるであろう。
【０２２８】
具体的には、ｐＨが約７．０の脱イオン水、アルギン酸Ｎａ、および本発明で用いるＥＳＭ粒子（繊維）を用いて、紡績溶液を調製する。最終的なアルギン酸塩繊維の太さおよび直径は、溶液の粘度で規定され、溶液の粘度は、ひいては紡績溶液の濃度に依存する。最初に、ＥＳＭ粒子を１〜５０％ｗ／ｖで水に懸濁し、次に、アルギン酸Ｎａ粉末を、濃度が約５〜６％ｗ／ｖになるまで添加する。懸濁液を、剪断により混合する。アルギン酸Ｎａを溶解させるために、懸濁液を約５０℃まで加熱しないといけない場合がある。次に、混合物を、２％のＣａＣｌ2を含有する水浴に混ぜ入れて、Ｃａ錯体（ゲル）としてアルギン酸塩を沈殿させる。このプロセスの間、ＥＳＭ粒子はアルギン酸Ｃａマトリクス中に分散し、複合繊維構造体を形成する。
【０２２９】
次に、紡績された繊維をドラムローラ上に集めて、Ｑｉｎに記載されているようにさらに処理し、ゲル性および吸収性を改質する。洗浄プロセス中のＮａ+によるＣａ2+のイオン交換によって、繊維の水分吸収性が向上する。したがって、広範な種類の創傷に適した、様々な性質を有する繊維が得られる。他のカチオン（亜鉛および銀など）とのイオン交換によって、繊維がさらに機能的なものにされてもよい。
【０２３０】
次に、紡績された繊維から、Ｑｉｎ（上掲）に記載されているような標準的な技術によって、網を形成する。紡績された繊維を他の材料と組み合わせて、例えば水不透過性の裏地を有する被覆材などの、ハイブリッド被覆材を作成し、滲出物が多い創傷からの漏出を防いでもよい。次に、これらの製品を梱包して、例えば使用前に、ガンマ線照射によって滅菌してもよい。
【０２３１】
カルボキシメチルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロースなどの追加的な物質を繊維に混合して、複合物の保水性をさらに改質してもよい。
【０２３２】
実施例１０
ｄｂ／ｄｂ糖尿病マウスの全層切除創傷の治癒に及ぼすＥＳＭ粒子の影響の検討
序文
創傷治癒遅延の動物モデルとして広く認められ、また用いられている糖尿病（ｄｂ／ｄｂ）マウスモデル（すなわち、ＢＫＳ．Ｃｇ−ｍ Ｄｏｃｋ７m＋／＋ Ｌｅｐｒdb／Ｊマウス）を用いた本研究を行うことで、４つのＥＳＭ粒子製剤について、創傷管理および組織修復への将来的な応用の観点から、広く認められている創傷治癒遅延のインビボモデルにおける組織修復促進能を評価した。
【０２３３】
４つの製剤のそれぞれを用いて処理した創傷の治癒応答を、相互に比較し、また（ｉ）「未治療」（ネガティブコントロール）および（ｉｉ）ポジティブコントロール処理（０．５％ＨＰＭＣ中、血小板由来成長因子−ＢＢ（ｒｈ−ＰＤＧＦ−ＢＢ）＋形質転換成長因子−α（ｒｈ−ＴＧＦ−α））の治癒応答と比較した。
【０２３４】
本実施例では、４つのＥＳＭ粒子製剤が、糖尿病マウスの全層切除皮膚創傷の閉合（創傷の開放面積の経時的な減少）に及ぼす影響について詳述する。創傷の閉合データは、各判定時点における各創傷を撮影した目盛付きの創傷画像から決定した。所与の時点における所与の創傷の面積を、傷を付けた直後（すなわち０日）の創傷の面積に対する割合として表した。残存創傷面積の平均割合（および標準誤差）を、各群について算出し、図６〜１１にグラフとして示す。
【０２３５】
【表１】
0006772160.tif 000002
【０２３６】
材料および方法
ＥＳＭ粒子はすべて、精製した材料の同バッチのものとし、過剰量を１０ｍｌの共栓付き圧着ガラスバイアルに分取し、ガンマ線照射（約２５ｋＧｙ）によって滅菌した。３０ｍｇおよび１０ｍｇを単位としたものは、乾燥粉末として、創傷に直接適用した。３ｍｇおよび１ｍｇを単位としたものは、５０μｌの注射用水で水和し、懸濁液として創傷表面にピペットで垂らした。
【０２３７】
ポジティブコントロールを０．５％ＨＰＭＣ賦形剤（ヒドロキシプロピルメチルセルロース、シグマ・アルドリッチ社（Sigma Aldrich）、英国）中で調製した。０．５ｇのヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）を、温め、攪拌し、冷却することで、１００ｍｌの蒸留水に溶解させた。ｐＨが７．０に達するまで、水酸化ナトリウムを添加した。
【０２３８】
結果
１）「経時的な残存創傷面積％」データによる創傷閉合のグラフは、異なる治療群間において著しく異なるということが分かった（図６）。成長因子の組み合わせ（ポジティブコントロール）を処方した創傷は、最も速い閉合速度を示すことがわかった。傷をつけてから１６日後までに、創傷がほぼ完全に閉合したこと、また研究期間の８日目以降、未治療の創傷に比べて創傷の閉合レベルが有意に大きいこと（ｐ＝０．０００、マン・ホイットニーのＵ検定）が示された（図７）。
【０２３９】
２）ＥＳＭ−３０を処方した創傷は、初期に創傷面積の増加を示すことがわかった（４日目に観察された）。これは、未治療の創傷に比べて統計的に有意であることがわかった（ｐ≦０．０２、マン・ホイットニーのＵ検定）。この治療群では、創傷の閉合（創傷の拡大ではない）は、８日目以降に観察された。しかしながら、８日目では、平均創傷面積は、未治療の創傷よりもわずかに大きいままであった。未治療の創傷に対して創傷閉合が有意に増加したことは、１２日目以降に観察された（ｐ≦０．００５、マン・ホイットニーのＵ検定）（図８）。
【０２４０】
３）他のすべての治療群、ＥＭＳ−１０、ＥＭＳ−３、およびＥＭＳ−１の創傷では、８日目以降、未治療の創傷に比べて創傷閉合が有意に増加したことを示すことがわかった（ｐ≦０．０００、マン・ホイットニーのＵ検定）（図９〜１１）。
【０２４１】
４）ＥＭＳ処理群を比較した。
ｉ．ＥＭＳ−３０を処方した創傷は、４日目および８日目において、ＥＭＳ−１０を処方した創傷よりも有意に大きいことがわかった（ｐ＝０．００１）。
ｉｉ．ＥＭＳ−３０を処方した創傷は、４〜１２日目において、ＥＭＳ−３またはＥＭＳ−１のいずれかを処方した創傷よりも有意に大きいことがわかった（ｐ＝０．０３８）。
ｉｉｉ．８日目および１２日目には、ＥＳＭ濃度が最も高いもの（ＥＳＭ−３０）で、最も低い閉合レベルが観察され、ＥＳＭ濃度が最も低いもの（ＥＳＭ−１）で、最大量の創傷閉合が観察された。
ｉｖ．８日目に、ＥＳＭ−１では、ＥＳＭ−１０およびＥＳＭ−３と比べてほぼ有意な創傷閉合の増加が観察されたことがわかった（それぞれｐ＝０．０７５およびｐ＝０．０６３、マン・ホイットニーのＵ検定）。
ｖ．ＥＳＭ−３０において、２０日目に、平均残存創傷面積が１６日目と比べて少し増加したことが観察された。
【０２４２】
５）ポジティブコントロールと、ｉ）１６日目および２０日目のＥＳＭ−１０、ならびにｉｉ）２０日目のＥＳＭ−１との間に、有意な違いは観察されなかった。
【０２４３】
実施例１１
大きさの異なるＥＳＭ粒子の抗炎症効果
材料および方法
接着性でないＵ９３７ ３ｘ ＮＦ−ｋＢ−ＬＵＣ細胞を、９６穴のタイタープレート中、ＤＭＥＭ培地（シグマ社（Sigma））に播種し、３７℃、ＣＯ2濃度５％で培養した。大きさの異なるＥＳＭ粒子（２５０μｍ未満、１２０μｍ未満、および８０μｍ未満）の抗炎症効果を調べた。設定した質量の粒子を、炎症効果（ルシフェラーゼ活性に比例）を誘導するための５時間のＬＰＳ処理（１．０μｇ／ｍｌ）を行う３０分前に細胞に適用した。インキュベーション終了時に、ブライト−グロー・ルシフェラーゼアッセイ（プロメガ社）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。このアッセイにおいて、ＬＰＳ曝露に応じたルシフェラーゼ活性が低いほど、被験物質の抗炎症効果が高い。
【０２４４】
結果と結論
図１２に示すように、ＥＳＭ粒子の大きさと抗炎症活性との間には間接的な関係がある。８０μｍ未満の粒子は、これよりも大きい粒子より、効果が高かった。図１２において未処理（untreated）とラベルされている、１ｍｍよりも大きいＥＳＭの大粒子または断片は、活性が最も低い。
【図１】
0006772160.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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