(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＡＧＡＧＳ配列（１）並びに下記アミノ酸配列（Ｘ）及び／又は下記アミノ酸配列（Ｘ’）を有するタンパク質（Ａ）を含むタンパク質組成物であって、前記タンパク質（Ａ）の全アミノ酸の個数のうちアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の占める合計数の割合が４０〜８０％であり、
前記タンパク質（Ａ）の全アミノ酸の個数のうち前記ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の占める合計数の割合が５〜４５％であり、
前記タンパク質（Ａ）の円二色性スペクトル法によるβシート構造率が６０〜８０％であり、
前記タンパク質（Ａ）を１２．５ｗｔ％となるように脱イオン水に溶解させた溶液についてのレオメーターによる複素弾性率が４×１０２〜１×１０４Ｐａであるタンパク質組成物。
アミノ酸配列（Ｘ）：ＶＰＧＶＧ配列（７）、ＧＶＧＶＰ配列（８）及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（９）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列。
アミノ酸配列（Ｘ’）：アミノ酸配列（Ｘ）の１又は２個のアミノ酸がそれぞれリシン又はアルギニンで置換されたアミノ酸配列。
【請求項２】
前記タンパク質（Ａ）の前記ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の個数と前記アミノ酸配列（Ｘ）及び前記アミノ酸配列（Ｘ’）の合計個数との比［ＧＡＧＡＧＳ配列（１）：｛アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計｝］が１：０．１〜１：６である請求項１に記載のタンパク質組成物。
【請求項３】
前記タンパク質（Ａ）が、前記アミノ酸配列（Ｘ）の１種が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又は下記ポリペプチド鎖（Ｙ’）を有し、
前記タンパク質（Ａ）中の前記ポリペプチド鎖（Ｙ）と前記ポリペプチド鎖（Ｙ’）の合計個数が１〜１００個である請求項１又は２に記載のタンパク質組成物。
ポリペプチド鎖（Ｙ’）：前記ポリペプチド鎖（Ｙ）中の全アミノ酸の個数の０．１〜２０％のアミノ酸がリシン（Ｋ）及び／又はアルギニン（Ｒ）で置換されたポリペプチド鎖。
【請求項４】
前記タンパク質（Ａ）が、前記ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ）を有する請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質組成物。
【請求項５】
前記タンパク質（Ａ）が有するアミノ酸配列が、（ＧＡＧＡＧＳ）７配列（４）及び（ＧＶＧＶＰ）２ＧＫＧＶＰ配列（１２）、（ＧＡＧＡＧＳ）１１配列（６）及びＧＶＧＶＰ配列（８）又は（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（３）及び（ＧＶＧＶＰ）３ＧＫＧＶＰ配列（１７）である請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質組成物。
【請求項６】
前記タンパク質（Ａ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法による分子質量が４０〜２００ｋＤａである請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質組成物。
【請求項７】
タンパク質組成物の重量に基づいて、タンパク質組成物中のタンパク質（Ａ）が、５〜４０重量％であり、水が６０〜９５重量％である請求項１〜６のいずれかに記載のタンパク質組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、βシート構造が高く、ゲル化速度の速いタンパク質組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
感温ゲル化性タンパク質としてエラスチン由来のタンパク質があり、高い生体適合性を持っていることから、医療用途や化粧品用途、食品用途への利用が考えられている（特許文献１）。一方で、エラスチン由来のタンパク質は、加熱による複素粘弾性率の上昇速度が低く、短時間でゲル化による効果を得たい場合には、タンパク質濃度を上げる方法や、アミノ酸配列を変えることによりβシート構造率を増やす方法が取られるが、有効性能の悪化、コストの増加などの問題があった。また、アミノ酸配列を変えるだけでは、βシート構造率を高める限界があり、目標ゲル化速度に到達しない問題もあった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１４−１７７４５２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、βシート構造が高く、ゲル化速度が速いタンパク質組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、鋭意研究を重ねてきた結果、本発明に到達した。すなわち、本発明のタンパク質組成物は、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）並びに下記アミノ酸配列（Ｘ）及び／又は下記アミノ酸配列（Ｘ’）を有するタンパク質（Ａ）を含むタンパク質組成物であって、
前記タンパク質（Ａ）の全アミノ酸の個数のうちアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の占める合計数の割合が４０〜８０％であり、
前記タンパク質（Ａ）の全アミノ酸の個数のうち前記ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の占める合計数の割合が５〜４５％であり、
前記タンパク質（Ａ）の円二色性スペクトル法によるβシート構造率が６０〜８０％であり、
前記タンパク質（Ａ）を１２．５ｗｔ％となるように脱イオン水に溶解させた溶液についてのレオメーターによる複素弾性率が４×１０２〜１×１０４Ｐａであるタンパク質組成物。
アミノ酸配列（Ｘ）：ＶＰＧＶＧ配列（７）、ＧＶＧＶＰ配列（８）及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（９）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列。
アミノ酸配列（Ｘ’）：アミノ酸配列（Ｘ）の１又は２個のアミノ酸がそれぞれリシン又はアルギニンで置換されたアミノ酸配列。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のタンパク質組成物はβシート構造率が高く、ゲル化速度が速いという効果を奏する。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明において、タンパク質（Ａ）は、天然物からの抽出、有機合成法（酵素法、固相合成法及び液相合成法等）及び遺伝子組み換え法等によって得られる。有機合成法に関しては、「生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ（１９８１年７月１日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」又は「続生化学実験講座２、タンパク質の化学（下）（昭和６２年５月２０日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」に記載されている方法等が適用できる。遺伝子組み換え法に関しては、特許第３３３８４４１号公報に記載されている方法等が適用できる。天然物からの抽出、有機合成法及び遺伝子組み換え法はともに、タンパク質（Ａ）を得られるが、アミノ酸配列を簡便に変更でき、安価に大量生産できるという観点等から、遺伝子組み換え法が好ましい。
【０００８】
本発明のタンパク質組成物は、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）並びに下記アミノ酸配列（Ｘ）及び／又は下記アミノ酸配列（Ｘ’）を有するタンパク質（Ａ）を含むタンパク質組成物である。
アミノ酸配列（Ｘ）：ＶＰＧＶＧ配列（７）、ＧＶＧＶＰ配列（８）及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（９）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列。
アミノ酸配列（Ｘ’）：アミノ酸配列（Ｘ）中の１〜２個のアミノ酸がそれぞれリシン又はアルギニンで置換されたアミノ酸配列。
【０００９】
本発明において、タンパク質（Ａ）は、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）を有するが、生体適合性の観点から、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ）を有することが好ましく、さらに好ましくは２〜５０個であり、特に好ましくは２〜１０個である。
【００１０】
本発明において、 アミノ酸配列（Ｘ）としては、ＶＰＧＶＧ配列（７）、ＧＶＧＶＰ配列（８）及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（９）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列である。生体適合性及びタンパク質（Ａ）がゲル化する観点から、ＶＰＧＶＧ配列（７）及び／又はＧＶＧＶＰ配列（８）が好ましい。
【００１１】
本発明において、アミノ酸配列（Ｘ’）としては、アミノ酸配列（Ｘ）中の１〜２個のアミノ酸がそれぞれリシン又はアルギニンで置換されたアミノ酸配列である。具体的には、ＧＫＧＶＰ配列（１２）、ＧＫＧＫＰ配列（１３）、ＧＫＧＲＰ配列（１４）及びＧＲＧＲＰ配列（１５）等が挙げられる。
アミノ酸配列（Ｘ’）は、生体適合性及びタンパク質（Ａ）がゲル化する観点から、ＧＫＧＶＰ配列（１２）、ＧＫＧＫＰ配列（１３）及びＧＲＧＲＰ配列（１５）からなる群より選ばれる少なくとも１種の配列が好ましく、さらに好ましくはＧＫＧＶＰ配列（１２）及び／又はＧＫＧＫＰ配列（１３）である。
【００１２】
本発明において、前記タンパク質（Ａ）の全アミノ酸の個数のうちアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の占める合計個数の割合が４０〜８０％であり、前記タンパク質（Ａ）の全アミノ酸の個数のうち前記ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の占める合計個数の割合が５〜４５％である。
前記タンパク質（Ａ）の全アミノ酸の個数のうちアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の占める合計個数の割合及び／又は前記タンパク質（Ａ）の全アミノ酸の個数のうち前記ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の占める合計個数の割合が上記範囲外である場合、ゲル化速度が悪化する。生体適合性の観点から、前記タンパク質（Ａ）の全アミノ酸の個数のうちアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の占める合計の割合が好ましくは４０〜８０％であり、前記タンパク質（Ａ）の全アミノ酸の個数のうち前記ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の占める合計の割合が好ましくは５〜４５％である。
【００１３】
本発明において、タンパク質（Ａ）の全アミノ酸の個数のうちアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の占める合計個数の割合は、アミノ酸配列が既知の場合は、その配列情報より計算することができる。また、アミノ酸配列が未知の場合は、プロテインシークエンサーによって求めることができる。具体的には、下記の測定法により求めることができる。
＜タンパク質（Ａ）の全アミノ酸の個数のうちアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の占める合計個数の割合の測定方法＞
特定のアミノ酸残基で切断出来る切断方法から２種類以上を用いて、タンパク質（Ａ）を３０残基以下程度まで分解する。その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分離した後、プロテインシークエンサーにてアミノ酸配列を読み取る。得られたアミノ酸配列からペプチドマッピングして、タンパク質（Ａ）の全配列を決定する。その後、下式（１）にてタンパク質（Ａ）のアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の占める合計個数の割合を算出する。
アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計の割合（％）＝［｛アミノ酸配列（Ｘ）の数｝＋｛アミノ酸配列（Ｘ’）の数｝］／｛（Ａ）のアミノ酸の総数｝×１００        （数式１）
【００１４】
本発明において、タンパク質（Ａ）の全アミノ酸の個数のうち前記ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が占める合計の割合は、アミノ酸配列が既知の場合は、その配列情報より計算することができる。また、アミノ酸配列が未知の場合は、プロテインシークエンサーによって求めることができる。具体的には、下記の測定方法により求める。
＜タンパク質（Ａ）の全アミノ酸の個数のうち前記ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が占める合計個数の割合の測定方法＞
特定のアミノ酸残基で切断出来る切断方法の２種類以上を用いて、タンパク質（Ａ）を３０残基以下程度まで分解する。その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分離した後、プロテインシークエンサーにてアミノ酸配列を読み取る。得られたアミノ酸配列からペプチドマッピングして、タンパク質（Ａ）の全配列を決定する。その後、下式（２）にてタンパク質（Ａ）の全アミノ酸の個数のうち前記ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が占める合計の割合を算出する。
ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が占める合計の割合（％）＝［｛ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の数｝／｛（Ａ）中の全アミノ酸の個数｝×１００        （数式２）
【００１５】
前記タンパク質（Ａ）中の前記ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の数と前記アミノ酸配列（Ｘ）及び前記アミノ酸配列（Ｘ’）の合計数との比［ＧＡＧＡＧＳ配列（１）：｛アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計｝］が、生体適合性及びタンパク質（Ａ）がゲル化する観点から、好ましくは1：０．１〜１：６であり、さらに好ましくは１：０．５〜１：５である。
【００１６】
タンパク質（Ａ）は、生体適合性及びタンパク質（Ａ）がゲル化する観点から、アミノ酸配列（Ｘ）の１種が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又は下記ポリペプチド鎖（Ｙ’）を有することが好ましい。
ポリペプチド鎖（Ｙ’）：（Ｙ）において、（Ｙ）中の全アミノ酸の個数の０．１〜２０％のアミノ酸がそれぞれリシン又はアルギニンで置換されたポリペプチド鎖。
【００１７】
ポリペプチド鎖（Ｙ）は、具体的には、（ＶＰＧＶＧ）b配列、（ＧＶＧＶＰ）c配列及び（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ）d配列である。（なお、ｂ〜ｄは、それぞれ、アミノ酸配列（Ｘ）の連続する個数であり、２〜２００の整数である）。
タンパク質（Ａ）１分子中に、ポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有する場合は、（ＶＰＧＶＧ）b配列、（ＧＶＧＶＰ）c配列及び（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ）d配列からなる群から選ばれる１種を有してもよく、２種以上を有してもいい。
また、タンパク質（Ａ）中にポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有する場合は、上記（Ｘ）の連続する個数は、Ｙ）ごとに同一でも異なっていてもよい。すなわち、（Ｘ）の連続する個数ｂ〜ｄが同じポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有してもよく、ｂ〜ｄが異なるポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有してもよい。
ポリペプチド鎖（Ｙ）としては、生体適合性、ゲル化性、βシート構造率を適度にする観点から、（ＶＰＧＶＧ）b配列及び／又は（ＧＶＧＶＰ）c配列が好ましい。
【００１８】
ポリペプチド鎖（Ｙ）は、生体適合性、ゲル化性、βシート構造率を適度にする観点から、アミノ酸配列（Ｘ）が、好ましくは２〜２００個連続した（上記ｂ〜ｄが２〜２００）ポリペプチド鎖であるが、連続する個数は、さらに好ましくは２〜１００個（上記ｂ〜ｄが２〜１００）であり、特に好ましくは２〜５０個（上記ｂ〜ｄが２〜５０）である。
【００１９】
また、ポリペプチド鎖（Ｙ’）は、生体適合性、ゲル化性、βシート構造率を適度にする観点から、（Ｙ）における全アミノ酸数の好ましくは０．１〜２０％のアミノ酸がそれぞれリシン又はアルギニンで置換されたポリペプチド鎖であり、具体的には、アミノ酸配列（Ｘ）が連続したポリペプチド鎖（Ｙ）において、アミノ酸配列（Ｘ）の一部又は全部がアミノ酸配列（Ｘ’）に置き換わったポリペプチド鎖が含まれる。
ポリペプチド鎖（Ｙ’）において、（Ｙ）中の全アミノ酸数のうちリシン又はアルギニンで置換された合計割合は、（Ａ）の水への溶解性、生体適合性及びゲル化の観点から、０．５〜１０％が好ましく、さらに好ましくは１〜５％である。
【００２０】
ポリペプチド鎖（Ｙ’）であるかどうかは、タンパク質（Ａ）の配列中の全てのＫ及びＲを、他のアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｐ又はＨ）に置きかえたときに、ポリペプチド鎖（Ｙ）となるかによって判断する。
【００２１】
タンパク質（Ａ）中の（Ｙ）と（Ｙ’）との合計個数は、（Ａ）の水への溶解性、生体適合性及びゲル化の観点から、１〜１００個が好ましく、さらに好ましくは１〜８０個であり、特に好ましくは１〜６０個である。
【００２２】
タンパク質（Ａ）中に、（Ｘ）の種類及び／又は連続する個数が異なる（Ｙ）を有している場合は、それぞれを１個として数え、（Ｙ）の個数はその合計である。（Ｙ’）も同様である。
【００２３】
タンパク質（Ａ）が、ポリペプチド鎖（Ｙ）、ポリペプチド鎖（Ｙ’）、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）及びポリペプチド鎖（Ｓ）を合計２個以上有する場合は、ポリペプチド鎖とポリペプチド鎖との間に、介在アミノ酸配列（Ｚ）を有していてもいい。（Ｚ）は、アミノ酸が１個又は２個以上結合したペプチド配列であって、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）、アミノ酸配列（Ｘ）及び（Ｘ’）では無いペプチド配列である。（Ｚ）を構成するアミノ酸の数は、生体適合性及びゲル化の観点から、１〜３０個が好ましく、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個である。（Ｚ）として、具体的には、ＶＡＡＧＹ配列（２０）、ＧＡＡＧＹ配列（２１）及びＬＧＰ配列等が挙げられる。
（Ａ）中の（Ｚ）の含有量（質量％）は、（Ａ）の分子質量を基準として、生体適合性及びゲル化の観点から、０〜２０質量％が好ましく、さらに好ましくは０〜１０質量％である。
【００２４】
タンパク質（Ａ）は、ＧＡＧＡＧＳ、（Ｘ）、（Ｘ’）、（Ｚ）以外にも、両末端に末端アミノ酸配列（Ｔ）を有していてもよい。（Ａ）の両末端の構造が、（Ｙ）に（Ｔ）が結合した構造であることが好ましい。（Ｔ）は、アミノ酸が１個又は２個以上結合したペプチド配列であって、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）、アミノ酸配列（Ｘ）及び（Ｘ’）では無いペプチド配列である。（Ｔ）を構成するアミノ酸の数は、生体適合性及びゲル化の観点から、１〜１００個が好ましく、さらに好ましくは１〜５０個、特に好ましくは１〜４０個である。（Ｔ）として、具体的には、ＭＤＰＶＶＬＱＲＲＤＷＥＮＰＧＶＴＱＬＮＲＬＡＡＨＰＰＦＡＳＤＰＭ配列（１９）等が挙げられる。
タンパク質（Ａ）中の（Ｔ）の含有量（質量％）は、（Ａ）の分子質量を基準として、生体適合性及びゲル化の観点から、０〜１０質量％が好ましく、さらに好ましくは０〜５質量％である。
【００２５】
タンパク質（Ａ）は、上記（Ｔ）以外に、発現させた（Ａ）の精製又は検出を容易にするために、（Ａ）のＮ又はＣ末端に特殊なアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド（以下これらを「精製タグ」と称する）を有してもいい。精製タグとしては、アフィニティー精製用のタグが利用される。そのような精製タグとしては、ポリヒスチジンからなる６×Ｈｉｓタグ、Ｖ５タグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、ＡＵ１タグ、Ｔ７タグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、ＤＤＤＤＫタグ、Ｓタグ、ＣｒｕｚＴａｇ０９TM、ＣｒｕｚＴａｇ２２TM、ＣｒｕｚＴａｇ４１TM、Ｇｌｕ−Ｇｌｕタグ、Ｈａ．１１タグ及びＫＴ３タグ等がある。
以下に、各精製タグ（ｉ）とそのタグを認識結合するリガンド（ｉｉ）との組み合わせの一例を示す。
（ｉ−１）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＴＳ）  （ｉｉ−１）グルタチオン
（ｉ−２）マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）  （ｉｉ−２）アミロース
（ｉ−３）ＨＱタグ  （ｉｉ−３）ニッケル
（ｉ−４）Ｍｙｃタグ  （ｉｉ−４）抗Ｍｙｃ抗体
（ｉ−５）ＨＡタグ  （ｉｉ−５）抗ＨＡ抗体
（ｉ−６）ＦＬＡＧタグ  （ｉｉ−６）抗ＦＬＡＧ抗体
（ｉ−７）６×Ｈｉｓタグ  （ｉｉ−７）ニッケル又はコバルト
前記精製タグ配列の導入方法としては、発現用ベクターにおけるタンパク質（Ａ）をコードする核酸の５’又は３’末端に精製タグをコードする核酸を挿入する方法や市販の精製タグ導入用ベクターを使用する方法等が挙げられる。
【００２６】
タンパク質（Ａ）において、ポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又は（Ｙ’）並びにＧＡＧＡＧＳ配列（１）及び／又はポリペプチド鎖（Ｓ）を含む場合、生体適合性及びゲル化の観点から、ポリペプチド鎖（Ｙ）又は（Ｙ’）とＧＡＧＡＧＳ配列（１）又はポリペプチド鎖（Ｓ）とが交互に化学結合していることが好ましい。
また、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の数と、アミノ酸配列（Ｘ）及び（Ｘ’）の数との比［配列（１）：｛（Ｘ）及び（Ｘ’）｝］は、生体適合性及びゲル化の観点から、１：１〜１：１２が好ましく、さらに好ましくは１：１〜１：６であり、次にさらに好ましくは１：１〜１：４である。
【００２７】
タンパク質（Ａ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法による分子質量は、生体適合性及びゲル化の観点から、４０〜２００ｋＤａが好ましい。
【００２８】
タンパク質（Ａ）が有するアミノ酸配列が、生体適合性及びゲル化の観点から、（ＧＡＧＡＧＳ）7配列（４）及び（ＧＶＧＶＰ）2ＧＫＧＶＰ配列（１６）、（ＧＡＧＡＧＳ）11配列（６）及びＧＶＧＶＰ配列（８）又は（ＧＡＧＡＧＳ）4配列（３）及び（ＧＶＧＶＰ）3ＧＫＧＶＰ配列（１７）であることが好ましい。
【００２９】
好ましいタンパク質（Ａ）の一部を以下に例示する。
（Ａ１）アミノ酸配列（Ｘ）がＧＶＧＶＰ配列（８）であるタンパク質
（Ａ１１）ＧＶＧＶＰ配列（８）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ１）中のアミノ酸がＫ（リシン）で置換されたポリペプチド鎖（Ｙ’１）とＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ１）とを有するタンパク質
（Ａ１１−１）ＧＶＧＶＰ配列（８）が８個連続したポリペプチド鎖（Ｙ１１）の１個のアミノ酸がＫで置換された（ＧＶＧＶＰ）4ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）3配列（１８）（Ｙ’１１）と、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ１）を有するタンパク質
（Ａ１１−１−１）ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）4配列（３）と（ＧＶＧＶＰ）4ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）3配列（１８）とを有するタンパク質
具体的には、下記タンパク質が含まれる。
（ｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）4配列（３）を１２個及び（ＧＶＧＶＰ）4ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）3配列（１８）を１３個有し、これらが交互に化学結合してなるものに、（ＧＡＧＡＧＳ）2配列（２）が化学結合した分子質量が約８０ｋＤａの配列（２２）のタンパク質（ＳＥＬＰ８Ｋ）
（ｉｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）2配列（２）及び（ＧＶＧＶＰ）4ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）3配列（１８）をそれぞれ１７個有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有する分子質量が約８２ｋＤａの配列（２３）のタンパク質（ＳＥＬＰ０Ｋ）
【００３０】
（Ａ１２）ＧＶＧＶＰ配列（８）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ１）とＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ１）とを有するタンパク質
具体的には、下記タンパク質が含まれる。
（ｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）8配列（５）及び（ＧＶＧＶＰ）8配列（１０）をそれぞれ１２個有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有する分子質量が約９０ｋＤａの配列（２４）のタンパク質（ＳＥＬＰ３）
（ｉｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）8配列（５）及び（ＧＶＧＶＰ）40配列（１１）をそれぞれ５個有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有する分子質量が約１１０ｋＤａの配列（２５）のタンパク質（ＳＥＬＰ６．１）
【００３１】
本発明のタンパク質（Ａ）は、（Ａ）の円二色性スペクトル法によるβシート構造率が６０〜８０％であるタンパク質である。（Ａ）の円二色性スペクトル法によるβシート構造率が数値範囲外である場合ゲル化速度が悪化する。
タンパク質の配列が同じでも、タンパク質の作製方法、タンパク質の精製方法、タンパク質を溶解させる溶媒のｐＨ及び溶媒の極性等によりβシート構造率は異なる。βシート構造率は、ゲル化速度の観点から、好ましくは６５〜８０％であり、さらに好ましくは７０〜８０％である。
βシート構造率は、タンパク質組成物をゲル化した後に、凍結乾燥をする工程までを繰り返すことによって増加させることができ、繰り返し回数は１〜１０回が好ましく、さらに好ましくは４〜８回であり、特に好ましくは４〜６回である。また、変性剤でタンパク質（Ａ）を変性させることによってβシート構造率を低下させることができる。
（Ａ）の円二色性スペクトル法によるβシート構造率は、下記測定方法により算出する。
＜タンパク質（Ａ）のβシート構造率の測定方法＞
タンパク質（Ａ）を０．３ｍｇ／ｍｌとなるように脱イオン水（４℃）に溶解し、タンパク質の水溶液を作製する。作製した（Ａ）の水溶液を円二色性スペクトル測定器（日本分光株式会社製、「Ｊ−８２０」）にて測定し（測定温度：４℃）、二次構造解析プログラム（ＪＷＳＳＥ型−４８０型：日本分光株式会社製）にてβシート構造率を算出する。
【００３２】
本発明において、βシート構造率が上記範囲であることで、タンパク質（Ａ）のＧＡＧＡＧＳ配列（１）とアミノ酸配列（Ｘ）及び／又はアミノ酸配列（Ｘ’）が効率よくゲル化構造を形成することができ、タンパク質（Ａ）について以下の方法で測定した複素弾性率が４×１０２〜１×１０４Ｐａとなる。ゲル化性の観点から、５×１０２〜１×１０４Ｐａが好ましく、さらに好ましくは１×１０３〜１×１０４Ｐａである。
複素弾性率は、βシート構造率を上昇させることで大きくすることができる。
（Ａ）の複素弾性率は、下記測定方法により算出する。
＜タンパク質（Ａ）の複素弾性率の測定方法＞
複素弾性率は、タンパク質（Ａ）を１２．５ｗｔ％となるように脱イオン水（４℃）に溶解させた複素弾性率測定用のタンパク質組成物について、以下の条件で、レオメーター（ＡＲ１０００レオメータ、ＴＡインスツルメント社）を用いて動的粘弾性率を測定した。
プレート：２５ｍｍスチール  フラット
振動    ：１Ｈｚ
変位    ：２％
温度    ：３７℃
時間    ：１０分
複素弾性率：上記の複素弾性率測定用のタンパク質組成物を３７℃で１０分、レオメーター（１Ｈｚ）にて複素弾性率を測定したときの値。
【００３３】
本発明のタンパク質組成物は、上記タンパク質（Ａ）及び水を含むことができる。
タンパク質組成物中のタンパク質（Ａ）の含有量は、（Ａ）の水への溶解性、（Ａ）がゲル化する観点及び適用のしやすさの観点から、タンパク質組成物の重量を基準として、好ましくは５〜４０重量％であり、さらに好ましくは７〜４０重量％であり、特に好ましくは１０〜４０重量％である。
タンパク質組成物中の水の含有量は、（Ａ）の水への溶解性、（Ａ）がゲル化する観点及び適用のしやすさの観点から、タンパク質組成物の重量を基準として、好ましくは６０〜９５重量％であり、さらに好ましくは６０〜９０重量％であり、特に好ましくは６０〜８５重量％である。
【００３４】
タンパク質組成物の水としては、特に限定するものではない。水を滅菌する場合は、０．２μｍ以下の孔径を持つ精密ろ過膜を通した水、限外ろ過膜を通した水、逆浸透膜を通した水及びオートクレーブで１２１℃２０分加熱して過熱滅菌した脱イオン水等が挙げられる。
【００３５】
本発明のタンパク質組成物は、タンパク質（Ａ）及び水以外に無機塩及び／又はリン酸（塩）を含んでもいい。
【００３６】
無機塩として、具体的には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素カルシウム及び炭酸水素マグネシウム等が挙げられる。リン酸塩は無機塩に含まない。
タンパク質組成物中の無機塩の含有量（重量％）は、生体親和性の観点から、タンパク質組成物の重量を基準として０．４〜１．３重量％が好ましく、さらに好ましくは０．５〜１．２重量％であり、特に好ましくは０．６〜１．１重量％である。
【００３７】
リン酸（塩）は、リン酸及び／又はリン酸塩を意味する。
リン酸（塩）としては、リン酸及びリン酸塩が挙げられる。
塩としては、アルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩が挙げられ、具体的には、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩等が挙げられる。
タンパク質組成物中のリン酸（塩）の含有量（重量％）は、生体親和性の観点から、タンパク質組成物の重量を基準として０．１０〜０．３０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．１２〜０．２８重量％であり、特に好ましくは０．１４〜０．２６重量％である。
【００３８】
タンパク質組成物のｐＨは、（Ａ）の安定性及び生体親和性の観点から、５〜９が好ましく、さらに好ましくは６〜８．５である。
【００３９】
本発明のタンパク質組成物は、各成分を混合することにより得られ、製造方法は特に限定されるものではない。１例を下記に示す。
（１）本発明のタンパク質（Ａ）及び水を４〜２５℃で混合し、タンパク質組成物とする。水中には必要により塩及び／又はリン酸（塩）を含んでもいい。また、タンパク質（Ａ）を水に溶解させた後、必要により塩及び／又はリン酸（塩）を含むようにしてもよい。
【００４０】
本発明のタンパク質組成物は、ハンドリング性の観点から、タンパク質（Ａ）及び水等を混合した直後は溶液状であるが、時間の経過、熱等の刺激を加える等により流動性が低くなりゲル化することが好ましい。
タンパク質組成物をゲル化させる温度は、タンパク質組成物を短時間でゲル化させる観点から、タンパク質組成物を２５℃〜８０℃が好ましい。８０℃以下であると、組織再生用材料の機能を低下させずにゲル化させることができ、また、ゲル化までの時間が適度である。
また、タンパク質組成物を使用する場合、適用時のタンパク質組成物の温度は、タンパク質（Ａ）の熱安定性及びハンドリング性の観点から、４〜８０℃が好ましく、さらに好ましくは４〜６０℃であり、次にさらに好ましくは２５〜５０℃、特に好ましくは３０〜４０℃である。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例及び比較例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、本発明の実施例及び比較例に使用したタンパク質（Ａ）の全アミノ酸の個数のうちアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の占める合計数の割合及びタンパク質（Ａ）の全アミノ酸の個数のうち前記ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の占める合計数の割合を表１に示した。
【００４２】
＜比較例１＞
○ＳＥＬＰ８Ｋの作製
特開２０１４−１７７４５２公報中の実施例記載の方法に準じて、遺伝子組換え大腸菌により製造し、精製した。
＜比較例２＞
○ＳＥＬＰ８Ｋ-Ｃ１の作製
特開２０１４−１７７４５２公報中の実施例記載の方法に準じて、遺伝子組換え大腸菌により製造し、精製した。１２．５重量％となるように、ＳＥＬＰ８Ｋを純水に溶解した。３７℃で、ＳＥＬＰ８Ｋ溶液がゲル化するまで加温（以下、ゲル化工程とする。）し、凍結乾燥を行った。ゲル化工程から凍結乾燥工程まで１回行った。
＜比較例３＞
○ＳＥＬＰ８Ｋ-Ｃ２の作製
ゲル化工程から凍結乾燥工程までの工程を２回行った以外、比較例２と同様に行った。
＜比較例４＞
○ＳＥＬＰ８Ｋ-Ｃ３の作製
ゲル化工程から凍結乾燥工程までの工程を３回行った以外、比較例２と同様に行った。
＜実施例１＞
○ＳＥＬＰ８Ｋ-Ｃ４の作製
ゲル化工程から凍結乾燥工程までの工程を４回行った以外、比較例２と同様に行った。
＜実施例２＞
○ＳＥＬＰ８Ｋ-Ｃ５の作製
ゲル化工程から凍結乾燥工程までの工程を５回行った以外、比較例２と同様に行った。
＜実施例３＞
○ＳＥＬＰ８Ｋ-Ｃ６の作製
ゲル化工程から凍結乾燥工程までの工程を６回行った以外、比較例２と同様に行った。
＜実施例４＞
○ＳＥＬＰ８Ｋ-Ｃ７の作製
ゲル化工程から凍結乾燥工程までの工程を７回行った以外、比較例２と同様に行った。
【００４３】
＜βシート構造率の測定＞
タンパク質を０．３ｍｇ／ｍｌとなるように脱イオン水（４℃）に溶解し、タンパク質の水溶液を作製する。作製した（Ａ）の水溶液を円二色性スペクトル測定器（日本分光株式会社製、「Ｊ−８２０」）にて測定し（測定温度：４℃）、二次構造解析プログラム（ＪＷＳＳＥ型−４８０型：日本分光株式会社製）にてβシート構造率を算出する。
【００４４】
＜複素弾性率の測定＞
タンパク質を１２．５重量％となるように脱イオン水（４℃）で溶解させた複素弾性率測定用のタンパク質組成物について、以下の条件で、レオメーター（ＡＲ１０００レオメータ、ＴＡインスツルメント社）を用いて動的粘弾性率を測定した。
プレート：２５ｍｍスチール  フラット
振動    ：１Ｈｚ
変位    ：２％
温度    ：３７℃
時間    ：１０分
複素弾性率：上記の複素弾性率測定用のタンパク質組成物を３７℃で１０分、レオメーター（１Ｈｚ）にて複素弾性率を測定したときの値。
【００４５】
＜タンパク質のゲル化速度の測定＞
タンパク質を１２．５重量％となるように脱イオン水（４℃）で溶解し、マイクロチューブに作製した。３７℃で加温し、所定時間でマイクロチューブを転倒し、垂れてこなくなる時間をゲル化時間とした。評価結果は表１に示す。
【００４６】
＜生体適合性の評価＞
タンパク質を１２．５重量％となるように脱イオン水（４℃）で溶解し、タンパク質溶液を作製した。タンパク質溶液をマウス皮膚下に埋植し、所定期間飼育した。埋植部位の炎症等を確認した。また、埋植部位から凍結切片を作製した。凍結切片を、免疫染色し、組織学的に評価をした。評価結果は表２に示す。
【００４７】
＜ゲル中での細胞培養の評価＞
タンパク質を１２．５、２０．０、３０．０重量％となるようにＤＭＥＭで溶解し、タンパク質溶液を作製した。タンパク質溶液９０μｌと、３Ｔ３細胞懸濁溶液（１×１０５Ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）１０μｌを混合し、９６ウェルプレートにいれ、３７℃で２０分間インキュベートし、ゲル化させた。ゲルにＤＭＥＭを１００μｌ加え、５重量％ＣＯ２、３７℃、湿潤条件下で３日間培養した。試験数は４回で実施し、細胞増殖率は以下の式により算出した。
細胞増殖率（％）＝培養３日目の平均細胞数／播種した細胞数      （数式３）
評価結果は表３に示す。
【００４８】
【表１】
0006730834.tif 000002
【００４９】
【表２】
0006730834.tif 000003
【００５０】
【表３】
0006730834.tif 000004
【００５１】
表１からゲル化工程から凍結乾燥までの処理を行う事により、βシート構造率、複素弾性率が上昇し、ゲル化速度が速くなっていることがわかる。また、ゲル化工程から凍結乾燥工程までの処理を４回以上繰り返すことで、ゲル化時間が３０分以内となり、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ゲルなどで好適に用いることができる。
表２から、生体内に本発明のタンパク質組成物を適用しても問題ないことがわかり、表３からは、本発明のタンパク質組成物でゲル化及び凍結乾燥処理を行っても、細胞の増殖性に影響を与えないことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明のタンパク質組成物は、ゲル化速度が速いため、組織同士の接着剤、癒着防止剤、体液の漏出防止剤、細胞移植用基材などに好適に用いることができる。
【配列表】
0006730834000001.app