(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水中試験における線虫またはその他の生物に対する有効成分の活性を測定する方法であって、
ａ）細胞培養皿（３０）の少なくとも１つのウェル（３１）を前記生物および有効成分で充填する工程；
ｂ）細胞培養皿（３０）を、以下の(i)〜(iii)：
(i)中で生物を有効成分で充填できる複数のウェル（３１）を備える細胞培養皿（３０）のためのホルダー（１３）であって、該細胞培養皿（３０）が、底部（３３）および上部（３２）とともに、底部（３３）と上部（３２）との間に伸びる側壁を備えるものである、ホルダー（１３）；
(ii)好ましくは細胞培養皿（３０）の底部（３３）、の画像を記録するために用いられるカメラ（１１）
(iii)細胞培養皿（３０）を照射する第一光源（１５）を少なくとも備えている照明機構（１４）；
を含んでなる装置（１）であって、
第一光源（１５）と取り付けられた状態の細胞培養皿（３０）の第一側壁（３４）との間に、第一光源（１５）の光を、第一側壁（３４）を通過して、細胞培養皿（３０）の底部（３３）の方向へ方向づける第一光学装置が配置されている装置（１）中に、配置する工程；
ｃ）経時的に次から次へと続く、細胞培養皿（３０）の複数の画像を作成する工程；
ｄ）細胞培養皿（３０）の照射に依存して作成された画像を二値化する工程；
ｅ）１つの基本画像および複数の追跡画像を有する第一組の画像について、ウェルに基づき、第一測定曲線を決定する工程であって、各追跡画像が差分法にて基本画像と比較され、差分ピクセル数が決定される、工程；
ｆ）第二組の画像について、ウェルに基づき、少なくとも第二測定曲線を決定する工程であって、第二組に対しては、第二組の基本画像として第一組の追跡画像が使用され、第二組の追跡画像として少なくとも１つの第一組のさらなる追跡画像が使用される、工程；
ｇ）第一測定曲線および少なくとも第二測定曲線に基づいて平均曲線を決定する工程
を含んでなる、方法。
【請求項２】
前記第二組の基本画像に使用するものが、第一組の基本画像に直ちに続く第一組の第一追跡画像であり、第二組の追跡画像として第二組に使用されるものが、第一組の第一追跡画像を除く全ての第一組の追跡画像であり、かつ、第二組が、１個の追加の追跡画像によって完成されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１つの組の基本画像と最終追跡画像との間の記録時間（ＴＡ）が、該記録時間（ＴＡ）内に、未処置生物が中に入れられたウェルについての差分ピクセル数が漸近極限ＡＷに達するように確立されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
第一組の基本画像と最終組の最終追跡画像との間に総時間が確立されることを特徴とし、その総時間が、記録時間（ＴＡ）のおよそ２倍に相当することを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
２個の連続する画像間の時間間隔が一定であり、かつ１〜５秒であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
１つの組の画像が、８〜１２個の画像を含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記平均曲線が、８〜１２の測定曲線に基づいて決定されることを特徴とする、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水中試験における線虫およびその他の生物に対する有効成分の活性を測定する装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの種の線虫（線形動物）は、根系に侵入した結果として植物代謝を深刻に損傷し得るため、農業害虫に相当する。線虫による攻撃に対する種々の化学物質、いわゆる殺線虫剤は、既に開発されている。しかしながら、効果的に線虫を防除できるさらなる有効成分を同定する需要は高い。
【０００３】
Macellino, Gut et al.による出版物（Marcellino C, Gut J, Lim KC, Singh R, McKerrow J, et al. (2012) WormAssay: A Novel Computer Application for Whole-Plate Motion-based Screening of Macroscopic Parasites. PLoS Negl Trop Dis 6(1): e1494. doi:10.1371/journal.pntd.0001494）には、ミミズを有効成分で満たすことができる複数のウェルを備えた細胞培養皿用のホルダーを含んでなる、ミミズに対する有効成分の活性測定装置が開示されている。当該細胞培養皿は、底部、上部および細胞培養皿の底部と上部との間に伸びた側壁を備えている。装置は、さらに、細胞培養皿の底部の画像を記録するために用いられるカメラを備えてなる。装置の照明機構は、細胞培養皿を照らす少なくとも１つの光源を有する。
【０００４】
細胞培養皿のフィルムカバー上の凝縮滴状物等の破壊的な影響によって、実験結果が大いに影響され得ることが明らかとなっている。照明機構の調節が不十分であると、実験結果が使用できないことにつながり得る。
【発明の概要】
【０００５】
従って、線虫に対する有効成分の活性を測定するための装置であって、破壊的影響を最小化することができ、これにより有効成分活性の信頼できる測定を可能とする装置を提供することが本発明の目的である。
【０００６】
本発明に内在する目的は、請求項１に記載の特徴の組み合わせによって達成される。本発明の例示的な実施態様は、請求項２〜８から集めることができる。
【０００７】
請求項１によれば、第一光源と取り付けられた状態の細胞培養皿の第一側壁との間に、細胞培養皿の底部の方向に第一光源の光を第一側壁を通して方向付ける第一光学装置が設置されている。一つの例示的な実施態様において、光学装置は、第一光源の光を、細胞培養皿の底部の方向へ方向づけ、および／または合焦させるレンズを備えてなる。
【０００８】
光学装置は、細胞培養皿の第一側壁の全長に実質的に及ぶロッドレンズを備え得る。これに関連して、ロッドレンズは第一側壁に平行して散らばり得る。ロッドレンズの中心軸は、細胞培養皿の上部の平面と細胞培養皿の底部の平面との間であることが好ましい。
【０００９】
第一光源は、好ましくは同様に細胞培養皿の第一側壁の全長に及ぶ線状光導体（Limienlichtleiter）を備え得る。従って、光は第一側壁全体にわたって細胞培養皿に供給され、ロッドレンズによって、光は細胞培養皿の底部の方向へ方向づけられ、および／または合焦させられる。線状光導体またはその中央軸は、ホルダーで支持した細胞培養皿の上部の平面と底部の平面の間にあることが好ましい。これに関連して、線状光導体からの光線は、細胞培養皿の上部の平面または底部の平面と実質的に平行に流れ、次いで、ロッドレンズに当たり、次いで、ロッドレンズは光を底部の方向へ方向づける。
【００１０】
一つの例示的な実施態様において、光学装置は、細胞培養皿の上部ウェル・カバーへの直接照射を防止する。当該上部ウェル・カバーは、例えば、凝縮した水が上に形成され得るフィルムの形態に設計してもよい。しかしながら、これら凝縮滴状物による、調査結果への破壊的影響は、細胞培養皿の標的照射によって低減または完全に排除することができる。
【００１１】
代替的または追加的に、光学装置は、光の、カメラの対物レンズへの直接侵入が防止されるように設計することができる。これも、調査結果の品質および信頼性に必要であることが見出されている。
【００１２】
本発明の一つの例示的態様において、第一光源とロッドレンズとの間の隙間は２〜４ｃｍである。好ましくは、自由に選択可能な様式で光源とロッドレンズとの隙間を特定の限度に設定することが可能な調節機構が提供される。これに関連して、調節機構により、光源とロッドレンズとの間の（水平的）隙間だけでなく、光源とロッドレンズとの間の高さ補正も設定可能であることが好ましい。
【００１３】
一つの例示的態様において、ホルダーは透明材料からなる。好ましくは、ＰＭＭＡ（アクリル製ガラス）等の熱可塑性物質が用いられる。
【００１４】
照明機構は、第二光源および細胞培養皿の第二側壁に配置された第二光学装置を備えることができ、当該第二側壁は、第一側壁と向かい合っている。これに関連して、第二光学装置は、第一光学装置と同一であり得る。加えて、第二光学装置に対する第二光源の配置は、第一光源と第一光学装置との間に存在しているような配置に相当し得る。
【００１５】
調査する線虫に対する有効成分の活性について、有効成分が多数であるため、有効成分を可能な限り最短の時間で調査することを可能とする装置である上記の装置を用いた方法を提供する必要がある。従って、線虫に対する有効成分活性の測定法であって、可能な限り多くの有効成分を短時間で調査することを可能とする方法を提供することは本発明のさらなる目的である。
【００１６】
この目的は、請求項９に記載の方法によって達成される。本発明による方法の例示的な実施態様は、請求項９に従属する請求項から集めることができる。
【００１７】
水中試験における線虫およびその他の生物に対する有効成分の活性を測定するための本発明の方法は、第一に、細胞培養皿の少なくとも１つのウェルを線虫および有効成分で充填することを想定している。次いで、細胞培養皿を、上記設計による装置に設置する。ここで、代替的に、細胞培養皿を請求項１〜８による設計と異なる装置中に設置することができることに留意すべきである。
【００１８】
次いで、好ましくは底部からの細胞培養皿の、経時的に次から次へと続く複数のデジタル画像が作成される。当該画像は、画像の各ピクセルが第一群（例えば、「黒」）または第二群（例えば、「白」）に割り当てられて二値化される。二値化において、閾値は次の通り定義／確立することができる：その強度が当該閾値より小さい場合、背景に属するピクセル、一方で、その強度が当該閾値より大きい場合、線虫に割り当てられるピクセル。これに関連して、閾値のレベルは、細胞培養皿の照射に依存し、従って使用される照明機構に依存する。
【００１９】
画像を二値化する前に形態学的画像処理フィルターを用いることが有用である。これには、サイズが調査する生物のものより大きい物体を除去することが含まれる。従って、この処理工程には、調査する生物のサイズを特定する入力サイズが必要である。
【００２０】
二値化後、第一組の記録に対して第一測定曲線が決定され、当該第一測定曲線は、少なくとも１つのウェルに基づくもの、従って当該ウェルに予め充填された有効成分に基づくものである。これに関連して、第一組の記録は、基本画像および複数の追跡画像を有し、追跡画像を、基本画像と、差分法においておよび各場合において測定された差分ピクセル数で比較する。さらに、少なくとも、第二組の記録に対して、ウェルに基づく第二測定曲線が決定され、第二組に対しては、第一組からの追跡画像が基本画像として用いられ、第一組の少なくとも１つのさらなる追跡画像が、第二組の追跡画像として用いられる。最後に、第一測定曲線および少なくとも第二測定曲線に基づき、平均曲線を決定する。
【００２１】
個々の画像が、種々の測定曲線に用いられるため、記録される画像数、ひいてはそれに必要な時間を最小化することが可能である。複数の測定曲線を作成することで、それらはその後平均曲線に含められるのであるが、平均曲線に基づき、有効成分の活性についての再現可能かつ信頼できる第一情報を提供することが可能な程度まで統計的分散または統計的拡散を低減させることが可能となる。
【００２２】
本発明の一つの設計において、第二組の基本画像に使用されるのは、第一組の第一追跡画像であり、その第一追跡画像は、第一組の基本画像に直ちに続くものである（即ち、合間に記録されている画像はない）。さらに、第二組の追跡画像として第二組に使用されるものは、第一組の第一追跡画像を除く全ての第一組の追跡画像である。その結果、第二組はただ単に１個の追加の追跡画像だけで完成される。例えば、第一組が１個の基本画像と９個の追跡画像からなる場合、第一組の９個の追跡画像は、第二組に使用され、ここで第一組の第一追跡画像が第二組の基本画像として使用され、第一組の残りの８個の追跡画像が全て第二組の追跡画像として使用される。第二組も同様に９個の追跡画像を有するため、当該第二組は１つの追加の画像によって完成されなければならない。従って、異なる時間で差分ピクセル数を表す１０点（０点を含む）をそれぞれ含む第一測定曲線および第二測定曲線を作成するためには、経時的に次から次へと続く全部で１１個の画像で十分である。
【００２３】
１つの組の基本画像と最後の追跡画像との間の記録時間は、当該記録時間内に、未処置の線虫が入れられたウェルの差分ピクセル数について漸近極限に達するように確立することができる。漸近極限のバックグラウンドは、単純化のために単に１匹の回虫が充填されているウェルの例を用いて明確にされるであろう。
【００２４】
例えば、５０の白ピクセルをこの個別の回虫に割り当てることができた場合、基本画像（ｔ＝０の時点）を、後に続く追跡画像と比較することにより生じる差分ピクセルの最大数は、１００である。１００という数は、回虫がその元の位置から完全に移動した場合に上昇する（ｔ＝０の時点）。第一に、回虫の元の５０白ピクセルは、今や黒である。第二に、以前は黒であったその他の５０ピクセルは、回虫の新しい位置によって今や白である。しかしながら、当該回虫がその後さらに移動すれば、差分ピクセル数は、一定のまま維持される。従って、この単純化モデルにおいて、記録時間は、未処置回虫がその元の位置（基本画像から明らかとなる）から完全に移動するのに必要な時間に相当する。好ましくは、通常５０〜１００匹の線虫がウェルに充填されるため、漸近値は必ずしも「白」と分類されたピクセルの２倍に相当する必要はない。しかしながら、差分ピクセル数が漸近極限に不利となることが明らかとなる。
【００２５】
総時間は、第一組の基本画像と最終組の最後の追跡画像との間に確立することができ、その総時間は、記録時間のおよそ２倍に相当し得る（１．５〜２．５の範囲内）。
【００２６】
２つの連続する画像の間の時間間隔は、各場合において一定であり得、１〜５秒であり得る。１つの組の画像は、８〜１２個の画像からなり得る。平均曲線は、８〜１２の測定曲線に基づき決定し得る。
【００２７】
例えば、未処置線虫を含むウェルについて、漸近極限に達する３０秒の記録時間を測定した場合、総期間は６０秒であり得る。従って、経時的に次から次へと続く２個の画像間の３秒の間隔によって、１記録時間について、１組あたり１１個の画像が出来る（１個の基本画像と１０個の追跡画像、基本画像はｔ＝０の時点で記録されたもの）。従って、第一画像がｔ＝０の時点で記録され、最終画像がｔ＝６０秒の時点で記録された６０秒の総期間によって、全部で２１個の画像が出来あがり、ひいては、それぞれ１１個の測定点を含む（ゼロ点も含む）１１の測定曲線が出来上がる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
本発明は、以下の図に描かれた例示的な実施態様に基づきより詳細に説明されるものとする。
【図１】図１は、本発明の装置の１つの例示的な実施態様を横断的に示した概略図である。
【図２】図２は、細胞培養皿の配置および図１の装置の照明機構を示した概略図である。
【図３】図３は、本発明の方法の１つの例示的な実施態様のフロー・チャートを示した図である。
【図４】図４は、未処置線虫を含むウェルの測定曲線および有効成分で処置された線虫の測定曲線を示した図である。
【発明の具体的説明】
【００２９】
図１は、線虫に対する有効成分の活性測定用装置を横断的に示した概略図である。装置１は、ハウジング１０を備え、そこに対物レンズ１２を備えているカメラ１１が配置されている。さらに、ハウジング１０には、複数のウェル３１を備えてなる細胞培養皿３０用にホルダー１３が提供されている。細胞培養皿３０は、上部３２および底部３３を備えている。長方形の細胞培養皿３０の上部３２と底部３３との間に配置されるのは、４つの側壁であり、そのうち第一側壁３４および向かい合っている第二側壁３５は、図１の描写にて確認することができる。
【００３０】
第一光源１５および第二光源１６を備えている照明機構１４も同様にハウジング１０内に配置されている。第一光源１５と第一側壁３４との間に配置されているのは、第一光学装置の一部として、第一光源１５と同様に、第一側壁３４の全長に及ぶロッドレンズ１７である。ロッドレンズ１８も第二光源１６と第二側壁３５との間に配置されている。
【００３１】
装置１０によって、カメラ１１を用いて、経時的に次から次へと続く、細胞培養皿３０の複数のデジタル画像を作成することが可能であり、その画像は、細胞培養皿３０の底部３３から記録される。従って、カメラ１１とその対物レンズ１２は、細胞培養皿３０用のホルダー１３の下に配置されている。ここで、装置１０は、これ以上描写がないが、カメラ１１によって記録された画像を保存する手段および処理する手段を有している。あるいは、装置１０を適切な（コンピューター）手段に接続してもよい。
【００３２】
図２は、倍尺で細胞培養皿３０ならびに第一光源１５および第二光源１６を備えている照明機構１４の配置を示した図である。中に５０〜１００匹の線虫および調査する有効成分が入れられた、細胞培養皿３０の個々のウェル３１は、水溶液３６で充填される。図２は、一列に配置された８個のウェル３１を描写し、そして互いに隣り合っている１２の列は、全部で９６個の個別ウェル３１となる。細胞培養皿３０の、例えば、４×６のパターンまたは６×８のパターンなどのその他のパターンも可能である。
【００３３】
異なるウェル３１に異なる有効成分を充填することができる。加えて、有効成分無しで水溶液に線虫のみが入ったウェルがあってもよい。
【００３４】
ロッドレンズ１７、１８によって光源１５、１６の光が底部３３の方向へ方向づけられる。同時に、ロッドレンズ１７、１８によって光源１５、１６の光が細胞培養皿３０の上部３２に直接到達することが防止され、その上部３２上には、上から個々のウェル３１を覆うフィルム３７が提供されている。加えて、ロッドレンズ１７、１８またはロッドレンズ１７、１８の配置は、カメラ１１の対物レンズ１２に光が直接入りこまないように設計されている。１７ａおよび１７ｂは、ロッドレンズ１７から発する光線を表している。ロッドレンズ１８に相当する出射光線は１８ａ、１８ｂで表している。
【００３５】
図２から、細胞培養皿３０が、装置１０のホルダー１３（当該培養皿３０用）の内に置かれた際に、ロッドレンズ１７、１８は、少なくともその中心軸が図面に垂直に広がっていて、細胞培養皿３０の上部３２と底部３３との間に配置されていることが明らかである。
【００３６】
図３は、本発明の方法の、１つの例示的な実施態様のフロー・チャートを示した図である。このフロー・チャートは、開始ブロック１００から始まる。ブロック１０１にて、未処置線虫に基づき、漸近値ＡＷが測定される。これに関連して、漸近値ＡＷは、追跡画像を基本画像と比較した際に最大に上昇し得る差分ピクセル数である。図４は、未処置線虫に対する測定曲線５０についてのそのような漸近値ＡＷを示している。これに関連して、個々の測定点は、異なる時間で記録された追跡画像を、ｔ＝０時点で記録した基本画像と比較したことで発生する差分ピクセル数を反映する。これに関連して、漸近値ＡＷは、測定曲線５０が少なくともほぼ漸近極限ＡＷに達するうちの記録時間ＴＡに結びつく。本例において、記録時間は２７秒とし、２つの隣り合う追跡画像の合間または第一追跡画像と基本画像（ｔ＝０）との合間は、３秒とする。従って、基本画像（ｔ＝０）を含む、１測定曲線あたりの画像数ｎＡＷは１０に等しい。
【００３７】
図４は、処置線虫の（平均）測定曲線５１を例示した図である。処置線虫はより遅く移動するか、またはもはや移動しないものもいるため、確認できるのは、測定曲線５１が未処置線虫の測定曲線５０を下回ることである。測定曲線５１下の面積が、未処置線虫の測定曲線下の面積に対して小さければ小さいほど、対応する有効成分の活性が強い。平均化した測定曲線５１は以下により詳細に説明される。
【００３８】
未処置線虫に基づく漸近値ＡＷの測定後、および１測定曲線あたりまたは１組あたり（ブロック１０１）の画像数ｎＡＷ個の確立後、次に起こるのは、図３ブロック１０２によれば、特定数の画像（画像＿１〜画像＿ｘ）の記録である。この時点で、カメラ１１は、毎回、全てのウェルと一緒に培養皿３０の全体画像を作成し、その後画像＿１〜画像＿ｘの画像が、ウェルを基本とした様式で、個々の各ウェルに対して切り出されるかまたは作成されることに留意すべきである。次いで、当該画像は、ブロック１０３において二値化される。二値化において、個々のピクセルは線虫（白ピクセル）または背景（黒ピクセル）のいずれかに割り当てられる。ブロック１０３における二値化は、ピクセルを「白」と「黒」に分けることを可能にする値である、ピクセル強度の閾値の確立よりも下流で行われなければならない。
【００３９】
第一測定曲線ｍ＝１（ブロック１０４参照）について、画像＿２〜画像＿ｎＡＷの画像がそこで使用され、ここで最初に第一追跡画像  画像＿２と基本画像  画像＿１との間の差分ピクセル数は、差分法の手段（ブロック１０５およびブロック１０６参照）によって測定される。これに関連して、ループの一部として複数回ブロック１０６を通るため、差分ピクセル数は、複数の追跡画像（画像＿２−画像＿１；  画像＿３−画像＿１；  画像＿４−画像＿１；  …；  画像＿ｎＡＷ−画像＿１）に対して測定される。第一測定曲線のための画像数が、ｎ＝ｎＡＷ＋ｍ−１の値に達し、かつループ１０７内に提供された質問１０８に対して「はい（ja）」で回答できない場合にループ１０７を脱出する。この場合、第一測定曲線ｍ＝１（ブロック１０９参照）を作成するための全ての値が利用可能である。
【００４０】
第一測定曲線ｍ＝１の作成後、次いでループ１１０を用いてさらなる測定曲線（ｍ＝２、ｍ＝３、…、ｍ＝ｍ最大）を作成する。これに関連して、第二測定曲線は異なる画像、画像＿３−画像＿２；画像＿４−画像＿２；…；画像＿ｎＡＷ＋１−画像＿２に基づいている。従って、画像＿３は、例えば、第一測定曲線ｍ＝１の作成と第二測定曲線ｍ＝２の両方に使用される。
【００４１】
ループ１１０内の質問１１１に対して「はい（ja）」で回答できない場合、ループ１１０を脱出する。今や、全ての測定曲線１、２、…、ｍ最大が利用可能であるため、これら測定組をブロック１１２にて平均化することができる。大部分について同一の画像に頼る、個々の測定組のこの平均化によって、統計的拡散を相当に低減することができることが見出されている。従って、全部でｍ＋ｎＡＷ−１個の画像を用いて、ｎＡＷ個の測定点（ゼロ点を含む）をそれぞれ含んだｍ個の測定組を作成することが可能である。
【００４２】
ブロック１１３にて、平均曲線の積分が計算され、次いで当該積分を、未処置線虫の測定曲線５０下の面積と比較することができる（ブロック１１４参照）。
【００４３】
図４において既に上記で言及された測定組５１が、ブロック１１２の平均測定組に相当すること、および、測定曲線５０下の面積がＩ５０＝１００の面積単位を含んでなり、かつ（平均）測定曲線下の面積がＩ５１＝６５の面積単位を含んでなることを仮定すると、次の式に従い、有効成分の効果に関する情報を提供することができる：（Ｉ５０（未処置）−Ｉ５１（処置））／Ｉ５０（未処置）・１００％。ここで基本とした数例の場合、結果、３５％という値が発生するであろう。
【００４４】
従って、例えば、９６個のウェルを備えた細胞培養皿の場合、１００に近い有効成分を同時に調査することが可能である。統計的に信頼できる結果を達成するために、十分な測定点と伴に十分な数の測定組を作成するのに必要な画像を記録するには、時として６０秒で十分である。従って、本発明は、線虫または類似の生物に対する有効成分の効果について、迅速かつ効果的な調査を可能とする。
【符号の説明】
【００４５】
１   装置
１０ ハウジング
１１ カメラ
１２ 対物レンズ
１３ ホルダー
１４ 照明機構
１５ 第一光源
１６ 第二光源
１７ ロッドレンズ（１７ａ、１７ｂ出射光線）
１８ ロッドレンズ（１８ａ、１８ｂ出射光線）
３０ 細胞培養皿
３１ ウェル
３２ 上部
３３ 底部
３４ 第一側壁
３５ 第二側壁
３６ 溶液
３７ ウェル・カバー
１００     出発ブロック
１０１     ブロック
１０２     ブロック
１０３     ブロック
１０４     ブロック
１０５     ブロック
１０６     ブロック
１０７     ループ
１０８     質問
１０９     ブロック
１１０     ループ
１１１     質問
１１２     ブロック
１１３     ブロック
１１４     ブロック
【図１】
0006772150.tif 000002
【図２】
0006772150.tif 000003
【図３】
0006772150.tif 000004
【図４】
0006772150.tif 000005