(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式ＩまたはＩＩに従った構造を有する化合物であって：
【化１】
0006730982.tif 000017
Ｒ１ａと、Ｒ１ｂと、Ｒ７ａと、Ｒ７ｂとは、Ｈ、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のシクロアルキル、置換または非置換のヘテロアルキル、及び、置換または非置換のヘテロシクロアルキルから、別々に選択され；
Ｒ１ａとＲ１ｂとは、これらに結合される炭素原子と共に、任意に接合され、置換または非置換のＣ３〜Ｃ７シクロアルキルと、置換または非置換の３〜７員ヘテロシクロアルキルとから選択される部材である環を生成し；
Ｒ７ａとＲ７ｂとは、これらに結合される炭素原子と共に、任意に接合され、置換または非置換のＣ３〜Ｃ７シクロアルキルと、置換または非置換の３〜７員ヘテロシクロアルキルとから選択される部材である環を生成し；Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ７ａ及びＲ７ｂの少なくとも一つは、Ｈではなく、Ｒ８は、Ｈ、
【化２】
0006730982.tif 000018
及び
【化３】
0006730982.tif 000019
から選択され、
Ｌｘは、結合、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のシクロアルキル、置換または非置換のヘテロアルキル、及び置換または非置換のヘテロシクロアルキルから選択され、
Ｌｘｓは、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のシクロアルキル、置換または非置換のヘテロアルキル、及び置換または非置換のヘテロシクロアルキルから選択され、
Ｒｓは、反応性官能基、結合部位、及び固体担持体から選択され、
Ｒｘは、反応性官能基、及び結合部位から選択され、それぞれの結合部位は、ヌクレオシド、ヌクレオシドへのリンカー、ヌクレオチド、ヌクレオチドへのリンカー、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドへのリンカー、核酸、核酸へのリンカー、キャリア分子、キャリア分子へのリンカー、固体担持体、及び固体担持体へのリンカーから、独立して選択される部材に共有結合される、前記化合物。
【請求項２】
Ｒ１ａと、Ｒ１ｂと、Ｒ７ａと、Ｒ７ｂとが、独立して、非置換のＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５及びＣ６アルキルから選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ１ａと、Ｒ１ｂと、Ｒ７ａと、Ｒ７ｂとがそれぞれ、メチルである、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ７ａとＲ７ｂとがそれぞれ、Ｈである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｌｘが、非置換のＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９及びＣ１０アルキルから選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の化合物。
【請求項６】
Ｌｘｓが、置換ヘテロアルキルである、請求項１〜４のいずれかに記載の化合物。
【請求項７】
Ｒｘが、ホスホラミダイトと、−ＯＨと、−ＯＤＭＴと、−ＣＯＯＨと、活性エステルと、−ＮＨ２とから選択される、請求項１〜６のいずれかに記載の化合物。
【請求項８】
Ｒｓが、−ＯＨと、−ＯＤＭＴと、固体担持体へのリンカーに共有結合的に結合する結合部位と、から選択される、請求項１〜４及び６のいずれかに記載の化合物。
【請求項９】
Ｒｘが、ホスホラミダイトと、−ＯＨと、−ＯＤＭＴと、−ＣＯＯＨと、活性エステルと、−ＮＨ２とから選択される、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒｘが、ヌクレオシドへのリンカーに共有結合される結合部位であり、
前記ヌクレオシドが、以下の構造を有し：
【化４】
0006730982.tif 000020
環標識Ｂが、核酸塩基であり;
Ｒｎ３が、−ＯＨまたはホスホラミダイトであり;
Ｒｎ５が、−ＯＨまたは−ＯＤＭＴである、請求項１〜５のいずれかに記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ８が、以下：
【化５】
0006730982.tif 000021
から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の化合物。
【請求項１２】
核酸標的配列を検出する方法であって、前記方法は、以下を備える：
（ａ）前記標的配列を検出部核酸に接触させることであって；
一本鎖ターゲット結合シーケンスを備え、前記検出部核酸は、これにリンクされた；
ｉ）蛍光体；及び
ｉｉ）請求項１〜６のいずれかに従った化合物であって、Ｒ８は、検出部核酸に（直接またはリンカーを通して）共有結合される結合部位を備える、前記化合物、を備え；
前記検出部核酸は、前記蛍光体が励起される際、前記蛍光体と前記化合物との間にドナー・アクセプターエネルギー移動ができるようにする立体構造である、前記標的配列を検出部核酸に接触させること；
（ｂ）前記ターゲット結合シーケンスを前記標的配列にハイブリダイズし、それにより検出部核酸の立体構造を改質し、蛍光パラメータを変化させること；及び、
（ｃ）前記蛍光パラメータの前記変化を検出し、それにより前記核酸標的配列を検出すること、
を備える、前記方法。
【請求項１３】
第１の核酸と第２の核酸とがハイブリダイズするか否かを確認する方法であって、
前記第１の核酸は、請求項１〜６のいずれかに従った化合物を備え、
Ｒ８は、（直接またはリンカーを通して）前記第１の核酸に共有結合される結合部位を備え、前記方法は：
（ａ）前記第１の核酸を前記第２の核酸に接触させること；及び
（ｂ）前記第１の核酸、前記第２の核酸及びその組合せから選択される部材の蛍光特性内で変更を検出し、それにより前記ハイブリダイゼーションが発生するか否かを確認すること、
を備える、前記方法。
【請求項１４】
核酸増幅反応を監視する方法であって、前記方法は：
（ａ）検出部核酸を備える増幅反応混合物を調製することであって、それにリンクされた
ｉ）蛍光体；及び
ｉｉ）請求項１〜６のいずれかに従った化合物であって、Ｒ８は前記検出部核酸に（直接またはリンカーを通して）共有結合で結合される結合部位を備える、前記化合物；
を有する、前記増幅反応混合物を調製すること；
（ｂ）増幅反応混合物を増幅条件に従わせること；
（ｃ）検出部核酸からの蛍光信号のために反応混合物を監視して、アッセイ結果を得ること；及び
（ｄ）核酸増幅反応をモニターするためにアッセイ結果を使用すること、
を備える、前記方法。
【請求項１５】
標的配列の増幅を検出する方法であって、前記方法は：
（ａ）標的配列の側面に位置したＰＣＲプライマーを有する標的配列を備えるサンプル核酸をハイブリダイズすること；
（ｂ）重合酵素でハイブリダイズされたプライマーを拡張してＰＣＲ製品を製作し、ＰＣＲ製品の２鎖を分離して標的配列の知覚及びアンチセンス鎖を利用可能にすること；
（ｃ）検出部核酸を、ＰＣＲ製品内の標的配列の知覚またはアンチセンス鎖にハイブリダイズすること、ここで、検出部核酸は：
ｉ）ＰＣＲ製品内の標的配列の知覚またはアンチセンス鎖の少なくとも一部に相補的であり、かつ、ＰＣＲプライマーの間の領域にハイブリダイズする、一本鎖ターゲット結合シーケンス；
ｉｉ）蛍光体；及び
ｉｉｉ）請求項１〜６のいずれかに従った化合物であって、Ｒ８は、前記検出部核酸に（直接またはリンカーを通して）共有結合で結合される結合部位を備える、前記化合物；
を備え、
ここで、その標的配列へのハイブリダイゼーションの前に、検出部核酸は、蛍光体が励起される際、蛍光体と化合物との間にドナー・アクセプターエネルギー移動ができるようにする立体構造であり；
それにより、検出部核酸の立体構造を改質して、蛍光パラメータを変化させること；及び
（ｄ）蛍光パラメータの変化を測定して、標的配列及びその増幅を検出すること、
を備える、前記方法。
【請求項１６】
前記活性エステルは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと、Ｎ−ヒドロキシベンズトリアゾールエステルと、チオエステルと、ｐ−ニトロフェニルエステルとから選択される、請求項７または９に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年５月９日に出願の米国仮出願第６１／９９０，９１３号の利点を、３５ＵＳＣ１１９（ｅ）により主張するものであり、その全体として全ての目的につき参照によりここに組み込まれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００２】
本発明は、励起状態エネルギーのクエンチャー、これらのクエンチャーを含むプローブ及び他の接合体、ならびに、それらの使用方法を提供する。本発明の他の対象、利点及び態様は、下記の詳細説明から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【０００３】
【図１】本発明の例示的な化合物を示す図である。
【図２】本発明の例示的な化合物の合成を概説する模式図である。
【図３】実時間ＰＣＲアッセイにおける、クエーサー６７０コスミッククエンチャー、クエーサー６７０−ＢＨＱ２、及びクエーサー６７０−ＢＢＱの、プローブに対する増幅微量を示す図である。
【図４】実時間ＰＣＲアッセイにおける、クエーサー７０５コスミッククエンチャー及びクエーサー７０５−ＢＨＱ２の、プローブに対する増幅微量を示す図である。
【図５Ａ】ヌクレアーゼ分解アッセイにおける、クエーサー６７０コスミッククエンチャー、クエーサー６７０−ＢＨＱ２、クエーサー６７０−ＢＢＱ、クエーサー７０５コスミッククエンチャー及びクエーサー７０５−ＢＨＱ２の、プローブに対する蛍光強度を示す図である。
【図５Ｂ】ヌクレアーゼ分解アッセイにおける、クエーサー６７０コスミッククエンチャー、クエーサー６７０−ＢＨＱ２、クエーサー６７０−ＢＢＱ、クエーサー７０５コスミッククエンチャー及びクエーサー７０５−ＢＨＱ２の、プローブに対するＳＮ比を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００４】
略語
ここに用いられる「ＢＨＱ」とは、一般に、１つ以上のジアゾ結合、及び特に「ブラックホールクエンチャー（商標）」を含む、ダーククエンチャーのことを指す。
【０００５】
例示的なＢＨＱのこれらは、米国特許第７，０１９，１２９号に記載されている。
【０００６】
ここに用いられる「ＦＥＴ」とは、「蛍光エネルギー移動」のことを指す。ここで用いられる「ＦＲＥＴ」とは、「蛍光共鳴エネルギー移動」を指す。
【０００７】
放射性及び非放射性エネルギー移動過程を指すために、これらの用語はここに用いられる。たとえば、光子を発するプロセス及び長距離電子移動に関与するそれらが、これらの用語に含まれる。
【０００８】
本明細書を通して、これらの現象の両方ともに、「ドナー・アクセプターエネルギー移動」との一般用語の下に包括される。「ＳＮＰ」は、「単一ヌクレオチド多型」を指す。
定義
【０００９】
以下の定義は、以下に述べられる本発明の実施形態の各々に、広く適用することが、可能である。他の定義を行わない限り、この発明の属する当業者により共通して理解されるように、ここに用いられる全ての技術的及び科学的用語は、同じ意義を一般に有している。一般に、ここに用いられる命名法、及び、細胞培養、分子遺伝学、有機化学及び核酸化学の実験室手順、並びに、下記に記載されるハイブリダイゼーションは、周知のものであり、一般に、当該技術分野で使用される。標準的な技術が、核酸及びペプチド合成に用いられる。分子生物学的技術及び手順は一般に、当該技術分野及び様々な一般的な参考文献においては、従来方法により実行される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，２ｄ ｅｄ．（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，を一般に参照されたい。これは参考文献によりここに組み込まれる）。ここに用いられる命名法及び分析化学の実験室手順、並びに有機合成は、非常に有名であり、一般に当該技術分野に使用される。標準技術またはその変形が、化学合成及び化学分析に用いられる。
【００１０】
用語「アルキル」とは、それ自体によりまたは他の置換基の一部として、特に明記しない限り、直鎖もしくは分枝鎖、または環式炭化水素ラジカル、またはこれらの組み合わせ、を指すものであり、これらの組み合わせは、完全飽和、単飽和もしくは多不飽和してもよく、かつ、指定される炭素原子数（すなわちＣ１〜Ｃ１０は１〜１０個の炭素を意味する）を有する一価、二価、三価及び四価のラジカルを含むことが可能である。飽和炭化水素ラジカルの非限定的な実例としては、例えばｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル等の、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、相同体及び異性体などの官能基を含んでいる。不飽和アルキル基とは、１つ以上の二重結合または三重結合を有する不飽和アルキル基である。不飽和アルキル基の非限定的な実例としては、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１、４−ペンタジエニル）、エチニル、１−及び３−プロピニル、３−ブチニル、ならびに、高級相同体及び異性体を含んでいる。また、用語「アルキル」は、特に明記しない限り、「ヘテロアルキル」等、下記に更に詳細に定義されるアルキルのそれらの誘導体を任意に含んでいる。炭化水素基に限定されるアルキル基は、「ホモアルキル」と呼ばれる。ここに用いられる用語「アルキル」は、アルキル、アルケニル及びアルキニル部分を指し、これらそれぞれは、原子価要求を満たすために適切な一価、二価、または多価の種とすることが可能である。アルキル基は、例えば、ここでは「アルキル基置換基」と呼ぶ１つ以上の官能基で、任意に置換される。
【００１１】
用語「アルキレン」とは、それ自体によりまたは他の置換基の一部として、アルキル部分から誘導される二価のラジカルを意味するものであり、これは−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−により非限定的に例証され、「ヘテロアルキレン」として下記に記載されるこれらの官能基を更に含んでいる。典型的に、アルキル（またはアルキレン）基は、１〜２４個の炭素原子を有することになっており、これらの官能基で炭素原子が１０以下である場合が、本発明では好まれる。アルキレン及びヘテロアルキレンリンカー基については、リンカー基の化学式を記載した方向により定義されるリンカー基の配向がないことは、任意である。例えば、化学式−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’は、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’を表すとともに、任意に−Ｒ’Ｃ（Ｏ）２を表している。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は、短い鎖状アルキルまたはアルキレン基であり、８個、７個、６個、５個またはこれより少ない炭素原子を、一般に有している。
【００１２】
用語「アルコキシ」、「アルキルアミノ」及び「アルキルチオ」（または、チオアルコキシ）は、これらの従来の意味で用いられ、これらのアルキル基がそれぞれ、酸素原子、アミノ基または硫黄原子を介して分子の残部に結合したものを指す。
【００１３】
用語「ヘテロアルキル」とは、それ自体によりまたは他の用語との併用により、特に明記しない限り、明示された炭素原子数、及び、Ｂ、Ｏ、Ｎ、Ｓｉ及びＳからなる群より選択された少なくとも１つのヘテロ原子からなる、安定な直鎖もしくは分枝鎖、または環式アルキル基を意味するものであり、このヘテロ原子は任意に酸化してもよく、この窒素原子は任意に四級化されてもよい。ヘテロ原子は、ヘテロアルキル基のいずれかの内部位置に、または鎖の末端、例えばアルキル基が分子の残部に結合する位置に、配置されてもよい。「ヘテロアルキル」基の実例は、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３、及び、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３を非限定的に含んでいる。２以上のヘテロ原子、例えば−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３と−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３とが、連続していてもよい。同様に、用語「ヘテロアルキレン」とは、それ自体によりまたは他の置換基の一部として、置換または非置換の二価ヘテロアルキルラジカルを指し、これは、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−、及び、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２に、非制限に例証される。ヘテロアルキレン基については、ヘテロ原子は、鎖末端のいずれかまたは両方を占拠する（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノ等）ことも可能である。
【００１４】
それら自身によりまたは他の用語との併用により、特に明記しない限り、用語「シクロアルキル」とは「アルキル」の環式バージョンを、「ヘテロシクロアルキル」とは「ヘテロアルキル」の環式バージョンを、それぞれ代表する。さらに、ヘテロシクロアルキルについては、ヘテロ原子は、ヘテロ環が分子の残部に結合する位置を占拠することができる。シクロアルキルの実例は、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチル、等を含むが、これに限定されるものではない。ヘテロシクロアルキルの実例は、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエノ−２−イル、テトラヒドロチエノ−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニル、等を含むが、これに限定されるものではない。
【００１５】
用語「ハロ」または「ハロゲン」とは、それら自身によりまたは他の置換基の一部として、特に明記しない限り、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素の原子を含む。さらに、「ハロアルキル」等の用語は、モノハロアルキル及びポリハロアルキルを含むことを意味している。例えば、用語「ハロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル」は、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、３−臭化プロピル、等を非限定的に含んでいることを意味している。
【００１６】
用語「アリール」とは、特に明記しない限り、単一環または複数環とすることが可能な多不飽和性、芳香性の置換基（好ましくは１環〜３環、この１つ以上が任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルである）であり、これらは一緒に融合するか、または共有結合により結合する。用語「ヘテロアリール」は、Ｎ、Ｏ及びＳから選択されるヘテロ原子を１〜４個含有するアリール基（または環）を指すものであり、窒素及び硫黄原子は任意に酸化し、窒素原子は任意に四級化される。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を介して分子の残部に結合することが可能である。アリール及びヘテロアリール基の非限定的な実例としては、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソオキサゾリル、４−イソオキサゾリル、５−イソオキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル及び６−キノリルが含まれる。上記に示されるアリール及びヘテロアリール環構造の各々に対する置換基は、下記に記載される「アリール基置換基」の基から選択される。
【００１７】
簡潔さのため、用語「アリール」は、他の用語（例えば、アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）との併用で用いられる場合は、上記に定義されたホモアリール及びヘテロアリール環を任意に含んでいる。したがって、用語「アリールアルキル」は、アリール基がアルキル基に結合する種類のラジカルを任意に含んでおり（例えばベンジル、フェネチル、ピリジルメチル等）、これは炭素原子（例えばメチレン基）が例えば酸素原子により置換される種類のアルキル基（例えばフェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピル等）を含んでいる。
【００１８】
アルキル及びヘテロアルキルラジカルに対する置換基（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル及びヘテロシクロアルケニルとしばしば指される基を含む）は、一般に「アルキル基置換基」を指し、これは以下の各種の基から１つ以上非限定的に選択することが可能である：−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮ及び−ＮＯ２であり、これらはゼロ〜（２ｍ’＋１）で変化する数であり、ここでｍ’は、このラジカルの全炭素原子数である。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’はそれぞれ、好ましく独立に、水素、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、例えば１〜３のハロゲンで置換されるアリール、置換または非置換アルキル、アルコキシ又はチオアルコキシ基、または、アリールアルキル基を指す。本発明の化合物が複数のＲ基を含むとき、例えば、これらの基の１つ以上が存在する場合、Ｒ基のそれぞれは、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’基のそれぞれとして独立に選択される。Ｒ’及びＲ’’が同じ窒素原子に結合する場合は、窒素原子に結合して５員環、６員環または７員環を生成することが可能である。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、非限定的に、１−ピロリジニル及び４−モルホリニルを含む筈である。置換基に関する上記の議論より、用語「アルキル」が、炭素原子が水素以外の基に結合する基を含むことを、当業者は理解するものであり、例えば、ハロアルキル（例えば−ＣＦ３及び−ＣＨ２ＣＦ３）及びアシル（例えば−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３である等）である。例示的なアルキル基置換基は、ここに「反応性官能基」及び「結合部位」と称する基を含んでいる。様々な実施形態において、アルキル基置換基は、リン含有部分であり、例えば、燐酸ジエステル又はここに記載される等の燐酸ジエステル改良品である。
【００１９】
アルキル基について記載する置換基と同様に、アリール基及びヘテロアリール基のための置換基は、「アリール基置換基」と一般的に呼ばれる。例示的な置換基は、アルキル基置換基及びその他のリストから選択され、例えば、ハロゲン、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮ及び−ＮＯ２、Ｒ’、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ、ならびに、フルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルを挙げることができ、これらはゼロから芳香族環構造上の開放結合価の全数までの数であり、そして、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、及びＲ’’’’は、水素、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のヘテロアルキル、置換または非置換のアリール及び置換または非置換のヘテロアリールから、好ましく独立して選択される。本発明の化合物が一つ以上のＲ基を含む場合は、たとえば、Ｒ基の各々は、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、及びＲ’’’’基として、これらの基の１つ以上が存在する場合に、独立して選択される。
【００２０】
アリールまたはヘテロアリール環の隣接原子の置換基の２つが、式−Ｔ−Ｃ（０）−（ＣＲＲ’）ｑ−Ｕ−の置換基で任意に交換されてもよく、ここで、Ｔ及びＵは、独立して−ＮＲ−、−Ｏ−、−ＣＲＲ’、−または単結合であり、ｑは０〜３の整数である。代替的に、アリールまたはヘテロアリール環の隣接原子の置換基２つが、式−Ａ−（ＣＨ２）ｒ−Ｂ−の置換基で任意に交換されてもよく、ここで、Ａ及びＢは、独立して−ＣＲＲ’−、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’、−または単結合であり、ｒは１〜４の整数である。このように形成される新しい環の単結合の１つが、二重化学結合で任意に交換されてもよい。代替的に、アリールまたはヘテロアリール環の隣接原子の置換基２つが、式−（ＣＲＲ’）ｓ−Ｘ−（ＣＲ’’Ｒ’’’）ｄ−の置換基と任意に交換してもよく、ここで、ｓ及びｄは、独立して０〜３の整数であり、Ｘは−Ｏ−、−ＮＲ’、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’である。置換基Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’及びＲ’’’は、水素または置換または非置換の（Ｃ１〜Ｃ１６）アルキルから独立して選択されることが好ましい。例示的なアリール基置換基は、ここで「反応性官能基」及び「結合部位」と称する基を含んでいる。
【００２１】
ここに用いられる場合において、語「異種原子」は、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）及びシリコン（Ｓｉ）を含んでいる。
【００２２】
記号「Ｒ」は、Ｈ、置換または非置換のアルキル基、置換または非置換のヘテロアルキル基、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のヘテロアリール基、及び、置換または非置換のヘテロシクリル基から選択される置換基を表す一般的な省略形である。Ｒは、アルキル基置換基及びアリール基置換基を参照することも可能である。
【００２３】
語「塩（複数も）」は、比較的無毒性の酸または塩基で調製される化合物の塩を含むものであり、ここに記載される化合物に見出される特定の置換基に左右される。本発明の化合物が比較的酸性の官能基性を含有する場合、このような化合物の中性形態を、ストレートで、または適切な不活性溶媒内で、十分な量の所望の塩基に接触させることにより、塩基付加塩を得ることが可能である。塩基付加塩の例は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノもしくはマグネシウム塩、または同様の塩、を含んでいる。本発明の化合物が比較的塩基性の官能基性を含有する場合、このような化合物の中性形態を、ストレートで、または適切な不活性溶媒内で、十分な量の所望の酸に接触させることにより、酸付加塩を得られることが可能である。酸付加塩の例としては、塩化水素酸、臭化水素酸、窒素酸、炭酸、一水素炭酸、リン酸、一水素リン酸、二水素リン酸、硫酸、一水素硫酸、ヨウ水素酸、又は亜燐酸など、無機酸から誘導される物質を含むとともに、酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、酪酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、コルク酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタール酸、ベンゼンスルホン酸、ｐトリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸、など、比較的無毒性の有機酸から誘導される塩を含んでいる。また、アルギニン酸等のアミノ酸の塩、及び、グルクロン酸またはガラクツロン酸等の有機酸の塩を含んでいる（例えば、Ｂｅｒｇｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、６６：１−１９（１９７７）を参照されたい）。本発明の所定の特定の化合物は、この化合物が塩基または酸付加塩の何れか一方に変換されるようになる塩基性及び酸性の機能を含有している。また、塩の水和物も含まれている。
【００２４】
ここに用いられる場合において、「核酸」は、例えばＤＮＡ、ＲＮＡのような、ヌクレオシド、ヌクレオシド、ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドを意味するものであり、これは一本鎖、二本鎖、またはこれより凝集性の高いハイブリダイゼーションモティーフ、及びそのあらゆる化学修飾であってもよい。修飾は、核酸リガンド核酸塩基に対する又は総じて核酸リガンドに対する、追加電荷、分極率、水素結合、静電的相互作用、及び、反応性を取り入れる化学基を提供する化合物を、非限定的に含んでいる。このような修飾は、燐酸ジエステル基修飾（例えば、ホスホロチオネート、メチルホスホナート）、糖修飾、５−位置ピリミジン修飾、８−位置プリン修飾、環外アミンにおける修飾、４−チオウリジン、５−ブロモまたは５−ヨード−ウラシル等の非標準または非自然の核酸塩基による代用；ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、モルホリノ等の主鎖修飾；２’−Ｏ−メチルヌクレオシド、５−メチル−２’−デオキシシチジン等のメチル化；イソ塩基、イソシチジン及びイソグアニジン等の通常でない塩基対合の組合せを、非限定的に含んでいる。「ヌクレオモノマー」は、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはこれらの修飾とし得る、単一核酸ユニットを指す。
【００２５】
ここで用いられる「核酸塩基」は、既知のプリン及びピリミジンヘテロ環及び本発明ピリミジンのみならず、ヘテロ環類似体及びそれらの互変異性体も含有する部分を含んでいる。プリンは、アデニン及びグアニンを含んでおり、例示的なプリン類似体は、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン及び７−デアザキサンチンを含んでいる。ピリミジンは、チミン、ウラシルならびにシトシン、及び、これらの類似体、例えば５‐メチルシトシン、５‐メチルウラシル及び４、４−エタノシトシン、を含んでいる。また、この語は、非自然の核酸塩基を含んでいる。代表的な非自然の核酸塩基としては、５‐フルオロウラシル、５‐ブロムウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２、２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５‐メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２‐チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキューオシン、５'−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−ソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２‐チオウラシル、２‐チオウラシル、４‐チオウラシル、５‐メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２‐チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、ニトロインドール及び２、６−ジアミノプリン、が含まれる。
【００２６】
様々な実施形態において、本発明の化合物は、５−位置で誘導体化されるピリミジンを含んでいる。この誘導体は、１−アルケニル−、１−アルキニル−、複素環式芳香系−、及び１−アルキニル−複素環式芳香系修飾である。「１−アルケニル」とは、オレフィン的−不飽和（二重結合含有）非環式基であることを意味する。「１−アルキニル」は、アセチレン的−不飽和（三重結合含有）非環式基であることを意味する。
【００２７】
ここに用いられる場合において、「ヌクレオシド」は、核酸のサブセットを意味し、この核酸のサブセットでは、核酸塩基が糖または糖類似体に共有結合するとともに、亜リン酸エステル、ホスホラミダイトまたはホスフィンを任意に含んでいる。ヌクレオシドとの語は、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、または、核酸塩基のＮ−グリコシドまたはＣ−グリコシドである他のいずれかのヌクレオシドを含んでいる。糖炭素の立体化学は、Ｄ−リボースのそれ以外とすることが可能である。また、ヌクレオシドは、例えば糖部分の修飾を含む種を含み、水酸基の一つ以上は、ハロゲン、ヘテロ原子、脂肪族基と置換され、または、エーテル、アミン、チオール等として機能される。ペントース部分は、ヘキソースで、または、シクロペンタン環、６員モルホリノ環等の代替構造で、置換することが可能である。また、ここに定義したヌクレオシドは、遊離カルボキシル基および／または遊離アミノ基を有するアミノ酸および／またはアミノ酸類似体に、および／または、これらの保護形態に、結合される核酸塩基を含んでいる。また、ヌクレオシドは、一つ以上の核酸塩基修飾、を任意に含んでおり、例えば、フルオロカルビル、アルケニルまたはアルキニル部分で修飾されている。リン酸ジエステルまたはリン酸ジエステル修飾を含むヌクレオシドを、ここではヌクレオチドと称する。また、ここに定義されるヌクレオシドは、遊離カルボキシル基および／または遊離アミノ基を有するアミノ酸および／またはアミノ酸類似体に、および／またはこれらの保護形態に、結合される核酸塩基を含むことを意図している。
【００２８】
ここに用いられる「糖修飾」は、２'-デオキシリボース以外のあらゆるペントースまたはヘキソース部分を意味している。修飾糖は、例えば、Ｄ-リボース、（２'−Ｏ−アルキル、２'アミノ、２'-ハロー官能性ペントース、ヘキソース等を含んでいる。例示的な糖修飾は、水酸基の一つ以上がハロゲン、ヘテロ原子、アルキル部分で置換される糖を含むか、または、エーテル、エステル等として官能化される。ペントース部分は、ヘキソースで、またはシクロペンタン環、６員モルホリノ環等の代替構造で、置換することが可能である。また、Ｄ-リボースのそれ以外の立体化学を有する糖も含まれる。
【００２９】
「リン酸ジエステル・グループ修飾」は、隣接したヌクレオモノマーを共有結合して結合させる本来のリン酸ジエステル・グループのあらゆる類似物を意味する。代替結合は、ホスホロチオネート及びメチルホスホン酸塩等のリン酸ジエステル類似体、及び、アセタール及びアミド等の非リン含有結合を含んでいる。
【００３０】
また、核酸修飾は、冷却器（例えば、ＢＨＱ）、蛍光体、挿入剤、副溝バインダー、フッ化炭素、安定化基、またはその他の部分とのラベリング等の、３'、５'及びベースの修飾を含んでいる。様々な実施例では、修飾または標識が、リンカー基を介してオリゴマーに共有結合で接合する。
【００３１】
オリゴマーは、リン酸ジエステルまたは接合リン酸ジエステル部分により、共有結合により互いに結合する二つ以上のヌクレオモノマーとここに定義される。したがって、オリゴマーが有することができるのは、わずか２個のヌクレオモノマー（二量体）であり、ヌクレオモノマーの上限は本質的に有していない。オリゴマーは、有能に結合することが可能であり、したがって、同族の一本鎖または二本鎖（または集積度がこれより高度な）核酸配列とのペアに基づくことができる。ここに記載されるように、オリゴマーはより長いオリゴマーのためのシントンとしても有効である。また、オリゴマーは、無塩基サイト及び偽ヌクレオシドを含有することも可能である。さまざまな実施例において、本発明のオリゴマーは、官能化される。オリゴマーを官能化する部分を、以下に述べる。特定の実施例を記載する際、用語「オリゴマー」を交互に用いて、オリゴマーの核酸配列、本発明のプローブを提供する接合核酸配列、または本発明の固体担持体を提供する変性核酸一次構造を参照する。
【００３２】
「ペプチド」とは、オリゴマーのことをいい、ここでは、モノマーは、アミノ酸であり、これらは代替的にポリペチドとしていわれるアミド結合を介して結合する。アミノ酸がａ−アミノ酸である場合、Ｌ−光学異性体またはＤ−光学異性体の何れか一方を用いることが可能である。さらに、非天然アミノ酸、例えば、β−アラニン、フェニルグリシン及びホモアルギニンも、含まれる。遺伝子コードされない一般に遭遇するアミノ酸が、本発明に用いられてもよい。本発明で用いられるアミノ酸の全てが、Ｄ−異性体またはＬ−異性体のいずれかであってもよい。Ｌ−異性体が、一般に推奨される。さらに、他のペプチド模倣薬も、本発明に有用である。一般的なレビューのため、ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ，ＰＥＰＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＰＲＯＴＥＩＮＳのＳｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，Ｂ． Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，編集Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２６７ページ（１９８３）を参照のこと。
【００３３】
「固体担体」とは、分子、化合物、細胞またはその他の実体の結合のために表面を有する固体物質、または、上記化学種がその表面に付着する固体物質、である。固体担体の表面は、平坦とすることができ、または別段に構成することができる。固体担体は多孔性とすることができ、または非多孔性とすることができる。固体担体は、表面を備えるチップまたはアレイであることができ、これは、ガラス、シリコン、ナイロン、ポリマー、プラスチック、陶器または金属を備えていてもよい。固体担体は、ナイロン、ニトロセルロース、または高分子膜等の膜、もしくはプレートまたは皿としてもよく、また、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネートまたはポリアロマーでできた９６穴プレート等、ガラス、陶器、金属またはプラスチックで成っていてもよい。固体担体は、任意の形状のビーズまたは粒子としてもよく、好ましくは球状またはほぼ球状であり、好ましくはビーズまたは粒子は、１ミリメートル以下、さらに好ましくは０．１〜１００ミクロン間の、の直径または最大幅を有している。このような粒子またはビーズは、任意の適切な物質、例えば、ガラスまたは陶器、及び／または１つ以上のポリマー、例えばナイロン、ポリ四フッ化エチレン、テフロン（商標）、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、セファロース、アガロース、セルロース、セルロース誘導体またはデキストラン、から成ることができ、及び／または、金属、特に常磁性金属、例えば鉄、を備えることができる。
【００３４】
固相合成のための担体は、当該技術分野で既知であり、これは、高架橋剤ポリスチレン（ＭｃＣｏｌｌｕｍ，ｅｔ ａｌ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３２：４０６９−４０７２ （１９９１）），ポリスチレン／ＰＥＧ共重合体（Ｇａｏ， ｅｔ ａｌ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ３２： ５４７７−５４８０ （１９９１）），シリカゲル（Ｃｈｏｗ， ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ９： ２８０７−２８１７ （１９８１））、ポリアミド結合シリカゲル（Ｇａｉｔ， ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １０： ６２４３−６２５４ （１９８２））、セルロース（Ｃｒｅａ， ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ８： ２３３１−２３４８ （１９８０））、及び制御細孔ガラス（ＣＰＧ）（Ｋｏｓｔｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ２４： ７４７−７５０ （１９８３））、を非限定的に含んでいる。例示的な固体担体は、ＣＰＧビーズである。ＣＰＧビードは、さまざまな方法でヌクレオモナーまたはオリゴマーの結合のために誘導体化することが可能である。例えば、ＣＰＧビーズは、３−アミノプロピルトリエトキシシランと処理して、オリゴヌクレオチド類似体モノマーまたはダイマーの結合のために、アミンのプロピルリンカーハンドルを加えることができ（Ｋｏｓｔｅｒ， ｅｔ ａｌ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ２４： ７４７−７５０ （１９８３））、又は好ましくは長鎖アルキルアミン基、最も好ましくは末端ヌクレオシドを含むものを、ＣＰＧに取り付けることが可能である（Ａｄａｍｓ， ｅｔ ａｌ， Ｊ． ＡＭ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １０５： ６６１−６６３ （１９８３））。オリゴヌクレオチド合成またはペプチド合成のための担体、例えばｄＴ−ＬＣＡＡ−ＣＰＧ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）は、市販である。
【００３５】
「インターカレータ」とは、隣接し合う核酸塩基同士の間の部分間挿及び重層ができる、平坦な芳香族または複素環式芳香族化合物部分のことをいう。これらの部分は、小型分子又は大型実体の部分、例えばタンパク質であってもよい。インターカレータの非限定的な例としては、アクリジン、アントラセン、アンスラサイクリン、アントラサイクリノン、メチレンブルー、インドール、アントラキノン、キノリン、イソキノリン、ジヒドロキノン、テトラサイクリン、ソラレン、クマリン、ハロゲン化エチジウム、エチジウムホモダイマー、オキサゾールイエロー２量体（ＹＯＹＯ）、チアゾールオレンジ（ＴＯＴＯ）、ダイネミシン、１，１０−フェナントロリン−銅、カリケアミシン、ポルフィリン、ジスタマイシン、ネトロプシン及びビオローゲンを含んでいる。
【００３６】
「副溝バインダー」とは、典型的には、約１５０〜約２０００ダルトンの分子量を有する部分のことをいう。この部分は、二本鎖（またはより高い凝集の）ＤＮＡ、ＲＮＡまたはこれらの混成の副溝非挿入方法で、好ましくは約１０３Ｍ−１を超える結合定数により、結合する。副溝結合化合物は、広く様々な化学構造を有するが、例示的な副溝バインダーは、三日月形の三次元構造を有している。その例としては、所定の自然発生的な化合物を含み、例えばネトロプシン、ジスタマイシン及びレキシトロプシン、ミトラマイシン、クロモマイシンＡ３、オリボマイシン、アントラマイシン、シビロマイシン、ならびに、さらに関連した抗生物質及び合成誘導体を含んでいる。所定のビスクォーターンに属するアンモニウム複素環化合物、ジアリールアミジン、例えばペンタミジン、スチルバミジン及びベレニル、ＣＣ−１０６５ならびに関連したピロロインドール及びインドールポリペチド、ヘキスト３３２５８、４'−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）ならびに自然発生的なまたは合成アミノ酸からなる多くのオリゴペプチドは、副溝バインダー化合物である。例示的な副溝バインダーは、米国特許第６,０８４，１０２号に記載される。このタイプの結合は、例えば紫外線（ｕ．ｖ．）及びＮＭＲ（ＮＭＲ）分光学等良好に確立した分光光度計法により、またゲル電気泳動により、検出することが可能である。副溝バインダー分子の結合に対するｕ．ｖ．スペクトルの変動、及び、「細胞核のオーバーハウザー」（ＮＯＳＥＹ）効果を利用したＮＭＲ分光法は、この目的のための特に周知であり、かつ、有用な技術である。ゲル電気泳動は、副溝バインダーの二本鎖ＤＮＡまたはその断片への結合を検出するが、その理由は、この二本鎖ＤＮＡの機動性の結合が変化するからである。
【００３７】
副溝バインダーは典型的には、約２０、約１５原子、約１０または約５原子の鎖を備えるリンカーを介して、オリゴマーまたは固体担体に結合する。
【００３８】
副溝バインダーが「三日月形の形状」またはこれに類似の形状であることに対して、挿入剤は平坦な芳香族（好ましくは多環式）の分子である事実に基づき、挿入部分または挿入剤は、副溝バインダーを容易に区別する。また、核オーバーハウザー効果を利用したＮＭＲ分光法により、実験的に区別することも可能である。
【００３９】
ここで用いられる語と「リンカー」または「Ｌ」とは、本発明の安定剤、クエンチャー、ヌクレオモノマーまたはオリゴマーに本発明の化合物の構成要素を共有結合で結びつける、例えば固体担体を結合するための、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ及びＰから成る群より選択された１〜３０の非水素原子に結合した単一共有結合（「ゼロ次」）または一連の安定共有結合のことをいい；または、本発明のアミダイトの核酸塩基に対して、クエンチャーを結合することまたは部分を安定させることをいう。例示的なリンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０の非水素原子を含む。特に明記しない限り、「結合する」、「結合した」、「結合」、「接合する」、「接合される」及び結合に関する類似した語は、リンカーを利用する技術及びリンカーを結合する化学種のことをいう。ここに定義されるように、例示的なリンカーは、結合サイトを含む。さらに、リンカーは、オリゴマーまたは初期のオリゴマー（オリゴマー合成間）を、本発明の固体担体に結合させることに有用である。従って、本発明はまた、リンカーを介して共有結合により固体担体（例えば本発明の固体担体）に結合する本発明のオリゴマーを提供する。本発明の固体担体及びオリゴマーは、固体担体とオリゴマーという、２つの構成要素間の切断可能リンカーを任意に含んでいる（例えば、オリゴマーと固体担体との間、蛍光体とオリゴマーとの間、クエンチャーとオリゴマーとの間、蛍光体とクエンチャーとの間、等。）。様々な実施形態において、オリゴマーに固体担体を接合するリンカーは、開裂可能リンカーである。
【００４０】
「開裂可能リンカー」とは、反応または条件の結果により切断可能な１つ以上の開裂可能基を有するリンカーである。例示的な開裂可能リンカーは、式ＩまたはＩＩのＲ８の中に位置し、合成した固体担体からの本発明の合成オリゴマーの便宜的な分離を実現するようにする。語「開裂可能基」とは、放出された部分を接合体の残りに結合する化学結合を切断することにより、本発明の固体担体またはオリゴマーの構成要素の放出を実現する部分のことをいう。本発明のオリゴマー及び固体担体の調製及び使用における、両方に有用な例示的な開裂機構は、酵素によりまたはその他化学により、実現される。
【００４１】
酵素開裂可能基に加えて、酵素以外の薬剤の動作により切断される１つ以上のサイトを含むことが、本発明の範囲内である。例示的な非酵素的開裂薬剤は、非限定的には、酸、塩基、光（例えばニトロベンジル誘導体、フェナシル基、オルト−ヒドロキシ桂皮酸エステル、ベンゾインエステル）、及び熱を含んでいる。多くの開裂可能基が、当該技術分野で知られている。例えば、Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， ７６１ ： １５２−１６２ （１９８３）；Ｊｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６５： １４５１８−１４５２５ （１９９０）；Ｚａｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ， １２４： ９１３−９２０ （１９８０）；Ｂｏｕｉｚａｒ ｅｔ ａｌ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １５５： １４１−１４７ （１９８６）；Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６１ ： ２０５−２１０ （１９８６）；Ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ， １４３： １８５９−１８６７ （１９８９）を参照されたい。さらに、広い範囲の開裂可能、二機能性（ホモ及びヘテロ二機能性）スペーサーアームが市販されている。
【００４２】
例示的な開裂可能基は、例えば水酸化ナトリウム、アンモニアまたはその他のアミン等の試薬により開裂可能である。様々な実施形態において、開裂可能リンカーは、室温で、または熱の下で、容易に切断される。一実施形態では、式ＩまたはＩＩのＲ８は、例えば有機溶媒内のアンモニアまたは本質的無水アミン等のアミンによる治療により切断される開裂可能リンカーを備えている。
【００４３】
「結合サイト」とは、２つ以上の構成要素（例えば機能的構成要素、固体担体、オリゴヌクレオチドまたはリンカー）を接続する部分である。この語は、相補的な反応パートナーの反応により形成される共有結合のことをいい、それぞれ、このパートナーのそれに対する相補的な反応性の官能基を有している。本発明の固体担体及びオリゴマーにおける結合サイトが、独立して選択される。例示的な結合サイトは、Ｓ、Ｓｃ（Ｏ）ＮＨ、ＨＮＣ（Ｏ）Ｓ、Ｓｃ（Ｏ）Ｏ、Ｏ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、（Ｏ）ＣＮＨ及びＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、ならびにＯＣ（Ｏ）ＮＨ、ＣＨ２Ｓ，ＣＨ２Ｏ、ＣＨ２ＣＨ２Ｏ、ＣＨ２ＣＨ２Ｓ、（ＣＨ２）ＯＯ、（ＣＨ２）ＯＳ，又は（ＣＨ２）ＯＹｘ−ＰＥＧを非限定的に含んでおり、ここでＹｘは、Ｓ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）ＮＨまたはＯであり、Ｏは、１〜５０の整数である。これらの例示的な結合サイトの各々において、ＮＨはＮＲ１’であってもよく、Ｒ１は、置換もしくは非置換のアルキルまたは置換もしくは非置換のヘテロアルキルである。結合サイトは、燐酸ジエステル基であってもよい。様々な実施形態において、結合サイトは、リンカーと蛍光体との間、リンカーとクエンチャーとの間、リンカーと安定化部分との間、又はリンカーと固体担体との間にある。本発明のオリゴマー及び固体担体の例示的な実施形態では、各結合サイトは異なっている。
【００４４】
ここで用いられる語「蛍光体」とは、本質的に蛍光性である部分のことをいい、又は、生体化合物または金属イオンとの結合、または酵素による代謝、すなわち蛍光発生における蛍光の変化を示す。蛍光体を置換して、蛍光体の溶解性、分光特性または物性を改質してもよい。多数の蛍光体が当業者に知られており、その非限定的な例としては、クマリン、アクリジン、フラン、ダンシル、シアニン、ピレン、ナフタレン、ベンゾフラン、キノリン、キナゾリノン、インドール、ベンズアゾール、ボラポリアザインダセン、オキサジン及びキサンテンを含んでおり、この後者には、フルオレセイン、ローダミン、ローザミン及びロードールを含んでいる。本発明において有用なこれら及びその他の蛍光体は、ハウグランド（Ｈａｕｇｌａｎｄ）の蛍光プローブ及び研究化学の分子プローブハンドブック（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＢＥＳ ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ ＰＲＯＢＥＳ ＡＮＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ）に記載されている。さらに有用な蛍光体は、一般に所有された米国の特許出願公報第２００５／０２１４８３３号及び第２００５／０１７０３６３号ならびにこれ以下に記載されている。
【００４５】
ここに用いられる場合、「クエンチャー」とは、蛍光体により発光される光の少なくとも一部分を減衰させることが可能な、本発明の任意の蛍光変更部分のことをいう。この減衰は、ここでは「クエンチング」と称する。従って、様々な実施形態において、クエンチング基の存在下での蛍光体の励起により、エミッション信号が予想されるより弱くなり、または完全に不在になる。クエンチングは典型的には、活発な蛍光体とクエンチング基との間でのエネルギー転移を通して発生する。
【００４６】
蛍光体またはクエンチャーは、置換基を含んでいてもよく、これにより、このような置換基がない場合「親」化合物と関連して、所望の特性、例えば水への溶解度、細胞透過性、または変化吸収及び発光スペクトル、が高められる。このように、本発明に有用な蛍光体またはクエンチャーは、改善置換基がない場合に、同一の親化合物と関連する所望の特性を高める置換基を含んでいる。
【００４７】
「機能的構成要素」とは、クエンチャー、蛍光体または安定化部分から選択される構造を有している本発明の化合物の部分のための総称である（非限定的に、インターカレータ、副溝結合性部分、安定化部分により改質される核酸塩基（例えばアルキニル部分及びフルオロアルキル部分）、及び、配座安定化部分、例えば一般に所有された米国特許出願公開番号第２００７／００５９７５２号に記載される配座安定化部分、を含んでいる）。
【００４８】
表現「ポリヌクレオチドの増幅」とは、非限定的に、ＰＣＲ法（ＰＣＲ）等の方法、結紮増幅（または合成酵素鎖反応、ＬＣＲ）及びＱ−ベータレプリカーゼの使用に基づく増幅方法を含んでいる。これらの方法は周知であり、当該技術分野で広く行われる。米国特許第４,６８３,１９５号及び第４，６８３，２０２号ならびにＩｎｎｉｓら、１９９０（ＰＣＲ用）；及びＷｕら、１９８９ａ（ＬＣＲ用）を参照されたい。ＰＣＲを実行するための試薬及びハードウェアは、市販されている。特定の遺伝子領域からシーケンスを増幅するために有用なプライマーは、ターゲット領域のシーケンスにまたはそのフランキング領域に対して、好ましくは相補的であり、かつ、特異的にハイブリダイズする。増幅により発生される核酸一次構造が、直接配列されてもよい。代替的に、増幅されたシーケンスが、シーケンス解析の前にクローン化されてもよい。酵素で増幅されたゲノム分節の直接のクローン化及びシーケンス解析のための方法が、Ｓｃｈａｒｆにより記載された（１９８６）。本発明は、増幅過程に有用なオリゴマープライマーを提供する。さらに、このプライマーを合成する際に有用な固体担体が提供される。プライマーに加えて、本発明は、プローブ及びこのようなプローブを使用して、増幅の製品を検出し、特性化し、および／または定量化する方法を提供し：また、これらのオリゴマープローブを総合するために有用な固体担体を提供する。
【００４９】
語「塩基−重層摂動」とは、塩基−重層での摂動、例えば塩基−ペアミスマッチ、その認識部位へのタンパク質結合、又はオリゴヌクレオチド付加生成物を形成する他のあらゆる実体、を生じさせる任意の現象のことをいう。本発明の様々なプローブは、このような塩基−重層摂動を、検出し、特性化し、及び／または定量化することができる。さらに、本発明は、このような塩基−重層摂動を検出し、特性化し、及び／または、定量化することが可能な統合的なプローブにおける有用な固体担体を提供する。
【００５０】
語「ハイブリッドされる」とは、完全にベース対であってもなくてもよい互いに関連し合う２つの核酸鎖をいい：一般に、この用語は、本発明のオリゴマーを含む結合をいい、固体担体に密接に結びつくか否かまたは溶液内か否かにかかわらない。
【００５１】
語「変性する」とは、核酸二本鎖（またはより高いレベルの集合体）の鎖が水素結合によってはベース対にされず、一本鎖分子から分離される、プロセスのことをいう。変性の方法は、当業者には周知であり、熱変性及びアルカリ性変性を含んでいる。この用語は一般に、そのターゲット核酸からの本発明のプローブの分離のことをいう。
【００５２】
語「ミスマッチ」とは、１００ %相補的でないハイブリッドされた核酸二本鎖（またはより高いレベルの集合体）内での核酸塩基のことをいう。ミスマッチは、例えばＡ：ＴまたはＧ：Ｃのようなワトソン-クリック塩基対でない核酸の相補鎖上に配置される２つの核酸塩基の核酸塩基の間におけるあらゆる不適当な組合せを含んでいる。削除、挿入、逆転、代用またはフレームシフト突然変異に起因して、全てのホモロジーが欠如する場合がある。さまざまな実施例では、本発明のオリゴマーは、そのターゲット核酸と比較したミスマッチを含んでおり、そのターゲット内での対応するミスマッチの、発見、及び／または特性評価、及び／または定量化を認めることが望ましい。特定の実施例では、ミスマッチは、単量のヌクレオチドのミスマッチである。
【００５３】
ここに用いられるように、語「多型」とは、遺伝子におけるシーケンス変化をいい、「突然変異」とは、表現型に関係して関連または信用される遺伝子におけるシーケンス変化をいう。「遺伝子」といの用語とは、機能的な製品タンパク質支配部位に対するゲノムコーディングの部分をいう。従属識別のために本発明に従って用いられる多形マーカーが、ゲノムのコーディングまたは非コーディング部位に位置してもよく、本発明のさまざまなプローブが、これらのマーカーを含む部位を核酸にハイブリッドするように設計される。ここに用いられる「対象」という用語とは、遺伝子試験の目的でターゲット核酸がそこから得られる試験検体を提供するための対象のことをいう。本発明のオリゴマーは、多型性及び突然変異を検出、及び／または特性化、及び／または定量化するために、有用である。更に、発明の固体担体は、多型性及び突然変異を検出、及び／または特性化、及び／または数量化するために使用するオリゴマーを合成するために、有用である。
【００５４】
ここに用いられる語「プローブ」とは、本発明の固体担体またはアミダイトを用いて準備される核酸オリゴマーのことをいう。さまざまな実施例では、プローブは、結合パートナーこの相互作用に関する検出可能な反応をもたらす。プローブは、結合パートナーとの相互作用に応じたプローブ状態の変化に検出可能なエネルギー移動ペアを形成する少なくとも１つの検出可能部分または一対部分を、含んでいる。本発明は、プローブを総合するために有用なプローブ及びアミダイトならびに固体担体を提供する。本発明の例示的なプローブは、多型性を見つけるには有用である。さまざまな実施例では、多型性とは、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）である。
【００５５】
ここに用いられる語「検出可能な応答」とは、観察または計装のいずれかによる直接または間接的に検出可能な信号内におけるまたはこの信号の発生における変化のこと、ならびに、試験検体内のプローブのためのターゲット結合パートナーの存在に応じた変化のことのことをいい、又は好ましくはこの変化の大きさがこの機能の存在である。典型的には、検出可能な応答は、波長分散パターン、または、吸光度もしくは蛍光発光の強さ、または、光散乱、蛍光量子収率、蛍光寿命、蛍光偏光法、励起もしくは放出波長の変動の変化、または、上記のパラメータの組合せが、変化を起こす、蛍光体からの光学応答である。所定の分光特性の検出可能な変化は一般に、蛍光強度の増加または減少である。しかしながら、蛍光発光または励起の波長変動をもたらす分光変化も有用である。イオン結合上の蛍光の変化は通常、インジケータの配座または電子変化によるものであり、これれは、イオン結合部の電子密度の変化による、結合したターゲット金属イオンによる蛍光クエンチングによる、または様々な影響の組み合わせによる、蛍光体の励起または基底状態により、生じてもよい。代替的に、検出可能な応答は、蛍光体が本質的に蛍光性であり金属イオンまたは生体化合物に結合した際に信号を変化させないような、信号の発生である。本発明は、検出可能な応答及び有用な固体担体を提供してこのようなプローブを合成するような、プローブを提供する。
【００５６】
ここに用いられる語「キャリア分子」とは、本発明の任意の化合物が結合される分子をいう。代表的なキャリア分子は、タンパク質（例えば酵素、抗体）、グリコプロテイン、ペプチド、サッカライド（例えば単糖、オリゴ糖及び多糖類）、ホルモン、レセプター、抗原、基板、メタボライト、遷移状態類似体、共同因子、阻止因子、ドラッグ、色素、栄養分、成育因子等を、非限定的に含む。また、「キャリア分子」とは、「分子」、例えば固体担持体（例えば合成担持体、クロマトグラフィ固定相、膜）、ウイルス及び微生物等の「分子」の古典的な定義に含まれることが、考慮されないかも知れない化学種のことをいう。
【００５７】
記号~~~は、化学結合に対して直交に示されており、示された部分が分子の残部に結合される点を示唆している。
【００５８】
ある実施形態では、ここに使用される語の定義は、ＩＵＰＡＣに従う。
コスミッククエンチャー
【００５９】
一つの態様では、本発明は、式Ｉまたは式ＩＩにより構造を有する化合物（クエンチャー）を提供する：
0006730982.tif 000002
。
【００６０】
Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ７ａ及びＲ７ｂは、Ｈから独立して選択され、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のシクロアルキル、置換または非置換のヘテロアルキル、及び、置換または非置換のヘテロシクロアルキルである。Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、これらに結合される炭素原子と共に、任意に接合され、置換または非置換のＣ３〜Ｃ７シクロアルキルと、置換または非置換の３〜７員ヘテロシクロアルキルとから選択される部材である環を形成する。Ｒ７ａ及びＲ７ｂは、これらに結合される炭素原子と共に、任意に接合され、置換または非置換のＣ３〜Ｃ７シクロアルキル及び置換または非置換の３〜７員ヘテロシクロアルキルから選択される部材である環を形成する。Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ７ａ及びＲ７ｂの少なくとも一つは、Ｈではない。Ｒ８は、Ｈ、
0006730982.tif 000003
及び、
0006730982.tif 000004
から選択される。Ｌｘ、Ｌｘｓ、Ｒｓ及びＲｘは、ここに定義されている。
【００６１】
Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ及びＲ８の組合せのいずれかは、この開示に含まれており、本発明により具体的に提供される。
【００６２】
ある実施形態では、Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれＨである。ある実施形態では、Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、非置換のＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５及びＣ６アルキルから独立して選択される。ある実施形態では、Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれメチルである。
【００６３】
ある実施形態では、Ｒ７ａ及びＲ７ｂは、それぞれＨである。ある実施形態では、Ｒ７ａ及びＲ７ｂは、非置換のＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５及びＣ６アルキルから独立して選択される。ある実施形態では、Ｒ７ａ及びＲ７ｂは、それぞれメチルである。
【００６４】
ある実施形態では、Ｒ１ａ及びＲ１ｂは非置換のＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５及びＣ６アルキルから独立して選択され、Ｒ７ａ及びＲ７ｂはそれぞれＨである。ある実施形態では、Ｒ１ａ及びＲ１ｂはそれぞれメチルであり、Ｒ７ａ及びＲ７ｂはそれぞれＨである。ある実施形態では、Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれＨであり、Ｒ７ａ及びＲ７ｂは、非置換のＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５及びＣ６アルキルから独立して選択される。ある実施形態では、Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれＨであり、Ｒ７ａ及びＲ７ｂは、それぞれメチルである。ある実施形態では、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ７ａ及びＲ７ｂは、非置換のＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５及びＣ６アルキルから独立して選択される。ある実施形態では、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ７ａ及びＲ７ｂは、それぞれメチルである。
【００６５】
ある実施形態では、Ｌｘは、化学結合、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のシクロアルキル、置換または非置換のヘテロアルキル、及び、置換または非置換のヘテロシクロアルキル、から選択される。ある実施形態では、Ｌｘは、非置換のＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９及びＣ１０アルキルから選択される。
【００６６】
ある実施形態では、Ｌｘｓは、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のシクロアルキル、置換または非置換のヘテロアルキル、及び、置換または非置換のヘテロシクロアルキルから選択される。ある実施形態では、Ｌｘｓは、置換されたヘテロアルキルである。
【００６７】
ある実施形態では、Ｒｓは、保護または非保護の反応性官能基、結合サイト、及び固体担持体から選択される。ある実施形態では、Ｒｓは−ＯＨ、−ＯＤＭＴ、及び、固体担持体へのリンカーに共有結合で結合される結合サイトから選択される。「ＤＭＴ」とは、４,４'−ジメトキシトリチルのことをいう。ある実施形態では、固体担持体は、多孔質ガラス（ＣＰＧ）である。
【００６８】
ある実施形態では、Ｒｘは、保護または非保護の反応性官能基及び結合サイトから選択される。ある実施形態では、Ｒｘは、ホスホラミダイト、−ＯＨ、−ＯＤＭＴ、−ＣＯＯＨ、活性エステル（例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル）、及び、−ＮＨ２から選択される。「ＤＭＴ」とは、４,４'−ジメトキシトリチルのことをいう。
【００６９】
ある実施形態では、結合サイトは、ヌクレオシド、ヌクレオシドへのリンカー、ヌクレオチド、ヌクレオチドへのリンカー、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドへのリンカー、核酸、核酸へのリンカー、キャリア分子、キャリア分子へのリンカー、固体担持体、及び、固体担持体へのリンカーから、独立して選択される部材に共有結合している。
【００７０】
ある実施形態では、Ｒｘは、前記ヌクレオシドへのリンカーに共有結合する結合サイトであり、以下の構造を有し：
0006730982.tif 000005
ここで、環標識Ｂは、核酸塩基であり；Ｒｎ３は−ＯＨまたはホスホラミダイトであり；Ｒｎ５は−ＯＨまたは−ＯＤＭＴである。「ＤＭＴ」は、４,４'−ジメトキシトリチルのことをいう。
【００７１】
ある実施形態では、Ｒ８は以下から選択される：
0006730982.tif 000006
モノマー
【００７２】
様々な実施形態において、本発明は、オリゴマーを内部修飾化に合成するために有用なモノマー核酸を提供する。代表的な実施形態では、モノマー核酸は、クエンチャー部分を支えている。この実施形態に従った例示的なモノマー核酸は、以下の式を有している：
0006730982.tif 000007
ここで、Ｑは、クエンチャー部分であり；
Ｌｎは、リンカーであり；
環標識Ｂは、核酸塩基であり；
Ｒｎ３は−ＯＨまたはホスホラミダイトであり；
Ｒｎ５は−ＯＨまたは−ＯＤＭＴである。
「ＤＭＴ」は、４,４'−ジメトキシトリチルのことをいう。
【００７３】
ある実施形態では、クエンチャー部分（Ｑ）は、以下の式ＩまたはＩＩによって構造を有し：
0006730982.tif 000008
ここで、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ及びＲ８は、ここに定義ものとしてあり；Ｒ８は、Ｌｎに共有結合で結合される結合サイトを備える。
【００７４】
ある実施形態では、Ｌは、化学結合、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のシクロアルキル、置換または非置換のヘテロアルキル及び置換または非置換のヘテロシクロアルキルから選択される。
【００７５】
例示的な核酸塩基は、以下を含む：
0006730982.tif 000009
オリゴマー
【００７６】
また、本発明のモノマーを使用しかつ合成されるモノマーの構成要素を含んで調製される、核酸オリゴマー、例えばプローブが、提供される。
【００７７】
例示的なオリゴマーは、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴデオキシリボヌクレオチド（２’−デオキシ−Ｄ−リボースまたはその変性形状を含む）、すなわち、ＤＮＡ、オリゴリボヌクレオチド（Ｄ−リボースまたはその変性形状を含む）、すなわち、ＲＮＡ、ならびに、プリンまたはピリミジン核酸塩基、もしくは、修正プリンまたはピリミジン核酸塩基のＮ−グリコシドまたはＣ−グリコシドである他のいずれかの種類のポリヌクレオチド、を含んでいる。また、ここに用いられるオリゴマーは、化合物を含んでおり、ここでは、隣接ヌクレオモノマーは、前述のとおり、アミド結合を介して結合される（Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９１） ２５４： １４９７−１５００）。通常オリゴマー内に見出される要素、例えばフラノース環及び／またはホスホジエステル結合を、任意の適切な機能的同等の要素に交換することが可能である。従って、「オリゴマー」は、核酸塩基の骨格または担持体として役目を果たす任意の構造を含むことを意図し、この骨格は、シーケンス依存法でターゲット核酸に結合できるようにする。
【００７８】
本発明のオリゴマー内でヌクレオモノマーを結合する例示的な官能基は、（ｉ）燐酸ジエステル及び燐酸ジエステル修飾（ホスホロチオネート、メチルホスホナート等）、（ｉｉ）非リン同配体を含む代替結合（フォルムアセタール、リボアセタール、カルバメート等）、（ｉｉｉ）モルホリノ残留物、炭素環式の残留物またはその他のフラノース糖、例えばアラビノース、または、リボースまたはデオキシリボースの代わりのヘキソース、及び、（ｉｖ）アミド結合を介して結合するヌクレオモノマー、または、いずれかの適切な代替結合を介して結合する非環式ヌクレオモノマー、を含んでいる。
【００７９】
本発明のオリゴマーは、変性の及び従来のヌクレオモノマーを使用して形成が可能であり、また、現在市販の標準固相（または溶液相）オリゴマー合成法を用いた合成が可能である。一般に、オリゴマーは、以下のステップを備える方法により合成が可能であるが、それは：保護基ならびに核酸塩基、及びヌクレオモノマーまたはオリゴマーへの結合が可能な結合官能基を有する、ヌクレオモノマーまたはオリゴマーシントンを合成すること；ヌクレオモノマーまたはオリゴマーシントンを、アクセプターヌクレオモノマーまたはアクセプターオリゴマーに結合させること；保護基を除去すること；及び、所望のオリゴマーが合成するまで必要に応じてサイクルを反復すること、である。
【００８０】
本発明のオリゴマーは、４０、５０または、１００のヌクレオモノマーを超えるヌクレオモノマーを含む任意の長にすることが可能である。様々な実施形態では、オリゴマーは、２〜１００のヌクレオモノマーを含んでいる。約１０〜４０以上またはこれと同等のヌクレオモノマーの長さは、治療または診断用途に有用である。２、３、４または、５のヌクレオモノマーを含む短いオリゴマーが、本発明で具体的には含まれており、例えば、シントンとして有用である。
【００８１】
ランダム化シーケンスを有し、かつ、２０未満、１５未満または１０未満のヌクレオモノマーを含むオリゴマーは、プライマーにおいて、例えば、重合酵素または逆転写酵素のためのプライマーとして用いることが可能なオリゴマーが残留物を含む場合に限った、ランダムなシーケンスプライマーを使用するクローン化または増幅プロトコルにおいて、有用である。
【００８２】
オリゴマーは従来のホスホジエステル結合を含むことができるまたは燐酸ジエステル修飾（例えばアミド亜リン酸エステル結合）を含むことができる。これらの代替結合は、非限定的に、以下の実施形態を含んでいる：
式の部分−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｓ）−Ｏ−（「ホスホロチオネート」）、−ＯＰ（Ｓ）−Ｏ−（「ホスホロジチオエート」）、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）−（Ｒ°２）−Ｘ−−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｒ°）−Ｏ−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒ°）−Ｏ−（「チオノーアルキルホスホナート」）、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｐ）−Ｘ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｘ−、又は、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）（ＮＲｐ２）−Ｘ−であり、ここで、Ｒ°は、Ｈ（または、塩）またはアルキル（１〜１２Ｃ）であり、Ｒｐはアルキル（１〜９Ｃ）であり、結合は、ヌクレオモノマーの炭素に結合される−Ｏ−または−Ｓ−を通して隣接ヌクレオモノマーに接合される。様々な実施形態において、本発明のオリゴマーに用いられる代替結合は、燐酸ジエステル、ホスホロチオネート、メチルホスホナート及びチオノメチルホスホネート結合を含んでいる。ホスホロチオネート及びメチルホスホナート結合は、生理的環境においてオリゴマーに添加安定性を与える。同じオリゴマーにおいてこれらの結合全てが等しいことが必要だというわけではが、本発明の特に好ましいオリゴマーは、ホスホロチオネート結合を一様に、またはメチルホスホナート結合を一様に、含んでいる。
【００８３】
オリゴマーまたはそのセグメントは、従来方式で合成され、本発明の化合物を使用して調製することが可能である。当該技術分野に既知でかつここに記載される合成方法を使用して、本発明の化合物を含むオリゴマーを合成することが可能であり、同様に、適切に保護されたヌクレオモノマーを使用して、当該技術分野に既知のその他の核酸塩基を合成することが可能である。オリゴマーの合成のための方法は、例えば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒ， Ｂ．， ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （１９８６） １４：５３９９−５４６７；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （１９８８） １６：４８３１−４８３９；Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ （１９８７） ６：２８７−２９１；Ｆｒｏｅｈｌｅｒ， Ｂ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． （１９８６） ２７：５５７５−５５７８；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ， Ｍ． Ｈ．，ｉｎ Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ （１９８９），Ｊ． Ｓ． Ｃｏｈｅｎ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｃｒｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ｐ７−２４；Ｒｅｅｓｅ， Ｃ． Ｂ． ｅｔ ａｌ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． （１９８５） ２６：２２４５−２２４８、に見出される。また、メチルホスホンアミダイト化学介してメチルホスホナートにリンクされたオリゴマーの合成が記載された（Ａｇｒａｗａｌ， Ｓ． ｅｔ ａｌ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． （１９８７） ２８：３５３９−３５４２；Ｋｌｅｍ， Ｒ． Ｅ．， ｅｔ ａｌ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＷＯ ９２／０７８６４）。
【００８４】
ここに開示されるように、本発明は、オリゴマーの「接合体」を提供する。たとえば、オリゴマーは、安定化部分、蛍光体、クエンチャー、インターカレータ及び、ＤＮＡ二重螺旋（副溝バインダー、「ＭＧＢ」）の副溝と具体的に相互作用する物質等、様々な機能的要素に共有結合することが可能である。その他の選択された接合部分は、放射性、蛍光性、酵素性、または、開裂リンカー等を使用している細胞結合を促進する部分等の標識とすることが可能である。適切な放射標識は、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ及び１４Ｃを含み；適切な蛍光標識は、フルオレセイン、レゾルフィン、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹ（分子プローブ）及びテキサスレッドを含み；適切な酵素は、アルカリホスファターゼ及びワサビペルオキシダーゼを含む。追加的な蛍光体はここに述べられており、当該技術分野で一般に認識される。その他の共有結合した部分は、ビオチン、抗体または抗体フラグメント及びタンパク質、例えばトランスフェリン及びＨＩＶＴａｔタンパク質、を含んでいる。
【００８５】
ここに議論され当該技術分野で認識されるように、オリゴマーは、任意の便利な結合を通して、誘導体化が可能である。例えば、副溝バインダー、蛍光体、クエンチャー、及びアクリジンまたはソラレン等のインターカレータは、例えば、オリゴマーの末端５'−位置、ＲＮＡの２’−位置、または、ＯＨ、ΝＨ２、ＣＯＯＨまたはピリミジンの５−位置に取り込まれるＳＨ等、任意の利用可能な−ＯＨまたは−ＳＨを介して本発明のオリゴマーに結合することが可能である。例えば５−位置での−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、又は−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＨを含む誘導体化された形態が、本発明に有用である。ポリリジンまたはリシンを含む接合体は、記載されるように合成することが可能であり、そのターゲット核酸一次構造へのオリゴマーの結合親和力をさらに高めることが可能である（Ｌｅｍａｉｔｒｅ， Ｍ． ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ （１９８７） ８４：６４８−６５２；Ｌｅｍａｉｔｒｅ， Ｍ． ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ （１９８７） ６：３１ １−３１５）。
【００８６】
結合または代替結合を介して結合する置換基を含む多種多様な置換基を、結合することが可能である。オリゴマーのホスホジエステル結合における−ＯＨ部分を、標準保護基または結合基により保護されるホスファート官能基により交換して、他のヌクレオモノマーへの追加的な結合を調製することが可能であり、または複合置換基に結合することが可能である。５’−ターミナルＯＨを燐酸化されることが可能であり；３’−末端での２’−ＯＨまたはＯＨ置換基を、燐酸化されることも可能である。またヒドロキシルを、標準保護基に誘導体化することも可能である。
【００８７】
本発明のオリゴマーは、開裂可能リンカーを使用する細胞結合を促進する部分に、共有結合的に誘導体化することが可能である。このような接合体に用いられるリンカーは、オリゴマー輸送薬剤接合体が細胞に侵入した後に減少されたジスルフィド結合を含むことが可能である。このタイプのジスルフィドを含むリンカーは、制御可能な半減期を有している。このリンカーは、ジスルフィド結合のレドックス電位が原因で細胞内の条件に関連にする細胞外条件下で安定である。
ドナー及びアクセプター部分
クエンチャー
【００８８】
本発明の例示的な固体担体及びオリゴマーは、任意にリンカーを介して、それに共有結合するクエンチャーを含んでいる。様々な実施形態では、クエンチャーは、式ＩまたはＩＩに従った構造を有する部分であり：
（Ｉ），（ＩＩ）
0006730982.tif 000010
Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ及びＲ８は、ここに定義され；Ｒは、（直接またはリンカーを通して）固体担持体に共有結合的に結合される結合サイト、（直接またはリンカーを通して）オリゴマーに共有結合的に結合される結合サイト、または、これら両方を備えている。
【００８９】
本発明の化合物の利点の一つとしては、クエンチャー官能化固体担体及びオリゴマーと併用して、エネルギードナー分子の広範囲を使用することが可能である。無数の蛍光体が、当業者に知られている。例えば、Ｃａｒｄｕｌｌｏ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ８７９０−８７９４ （１９８８）；Ｄｅｘｔｅｒ， Ｄ．Ｌ．， Ｊ． ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ ２１： ８３６− ８５０ （１９５３）；ＨＯＣＨＳＴＲＡＳＳＥＲ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４５： １３３−１４１ （１９９２）；Ｓｅｌｖｉｎ， Ｐ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２４６： ３００−３３４ （１９９５）；Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ， Ｉ． Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ４０： ８３− １１４ （１９７１）；Ｓｔｒｙｅｒ， Ｌ． Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ４７： ８１９−８４６ （１９７８）；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３１： ６４９３−６４９６ （１９９０）；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ６７： １ １９７−１２０３ （１９９５）、を参照されたい。
【００９０】
本発明のクエンチャーと併用して使用可能な例示的なドナーの非限定的なリストが、表１に提供される。
【００９１】
表１
ドナー−アクセプターエネルギー移動対のドナーまたはアクセプターとして選択されることが可能な適切な部分
４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２、２’ジスルホン酸
アクリジン及び誘導体：
アクリジン
アクリジンイソチオシアネート
５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）
４−アミノＮ−［３ ― ビニルスルホニル）フェニル］ナフトアーリムキタノウグイ−３ ,５ジスルホン酸エステル
Ｎ−（４−アニリノ −１−ナフチル）マレイミド
アントラニルアミド
ＢＯＤＩＰＹ
ブリリアントイエロー
クマリン及び誘導体：
クマリン
７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）
７−アミノ−４−トリフルオロメチルクルアリン（クマラン１５１）
シアニン色素
シアノシン
４',６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）
５',５''−ジブロモピロガロール−スルホンフタレイン（ブロモピロガロールレッド）
７−ジエチルアミノ−３−（４'−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン
ジエチレントリアミンペンタアセテート
４,４'−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２,２'−ジスルホン酸
４,４'−ジイソチオシアナトスチルベン−２,２'−ジスルホン酸
５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−ｌ−塩化スルホニル（ＤＮＳ、塩化ダンシル）
４−（４'−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）
４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４'−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）
エオシン及び誘導体：
エオシン
エオシンイソチオシアナート
エリトロシン及び誘導体：
エリトロシンＢ
エリトロシンイソチオシアネート
エチジウム
フルオレセイン及び誘導体：
５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）
５−（４,６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）
２'，７'−ジメトキシ−４'５'−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）
フルオレセイン
フルオレセインイソチオシアネート
ＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ）
フルオレサミン
ＩＲ１４４
ＩＲ１４４６
マラカイトグリーンイソチオシアネート
４‐メチルウンベリフェロン
オルトクレゾールフタレイン
ニトロチロシン
パラローザニリン
表１（続き）
ドナー−アクセプターエネルギー移動対のドナーまたはアクセプターとして選択されることが可能な適切な部分
フェノールレッド
Ｂ−フィコエリトリン
ｏ−フタルジアルデヒド
ピレン及び誘導体：
ピレン
ピレン酪酸塩
スクシンイミジル１−ピレン酪酸塩
量子ドット
反応性赤色４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ（商標）  ブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）
ローダミン及び誘導体：
６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）
６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）
リサミンローダミンＢ塩化スルホニルローダミン（Ｒｈｏｄ）
ローダミンＢ
ローダミン１２３
ローダミンＸイソチオシアネート
スルホローダミンＢ
スルホローダミン１０１
スルホローダミン１０１（テキサスレッド）の塩化スルホニル派生物
Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）
テトラメチルローダミン
テトラメチルローダミン‐イソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）
リボフラビン
ロゾール酸
金属キレート、例えばランタニドキレート（例えばユウロピウムテルビウムキレート）、ルテニウムキレート。
【００９２】
ここでは、Ｐｅｓｃｅ ｅｔ ａｌ， Ｅｄｓ．， ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＳＰＥＣＴＲＯＳＣＯＰＹ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７１）；Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ， ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＡＮＡＬＹＳＩＳ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７０)；などの参照により例証されるように、特定のプローブのために適切なドナー・アクセプター対を選択するための文献に利用可能な、相当量の実用的ガイダンスが存在する。また、文献では、蛍光及び発色分子の網羅的なリストを提供する基準、及び、リポータ−クエンチャー対を選択するためのそれらの関連した光学的性質を、含んでいる（例えば、Ｂｅｒｌｍａｎ、ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＳＰＥＣＴＲＡ ＯＦ ＡＲＯＭＡＴＩＣ ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７１)；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ， ＣＯＬＯＵＲ ＡＮＤ ＣＯＮＳＴＩＴＵＴＩＯＮ ＯＦ ＯＲＧＡＮＩＣ ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７６)；Ｂｉｓｈｏｐ， Ｅｄ．， ＩＮＤＩＣＡＴＯＲＳ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， １９７２)；Ｈａｕｇｌａｎｄ， ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ ＰＲＯＢＥＳ ＡＮＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ， １９９２)Ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍ， ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＡＮＤ ＰＨＯＳＰＨＯＲＥＳＣＥＮＣＥ（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９４９)；など。）。さらに、以下の基準により例証されるように、核酸に加えられることが可能な共通反応基を介した共有結合性結合のために、リポータ及びクエンチャー分子を誘導体化するために、広範なガイダンスが、文献に存在する：Ｈａｕｇｌａｎｄ（上記）；Ｕｌｌｍａｎら、米国特許第３,９９６,３４５号；Ｋｈａｎｎａら、米国特許第４,３５１,７６０号。従って、特定の用途のためにエネルギー交換対を選択することと、核酸、ペプチドまたは他のポリマー等のプローブ分子にこの対の部材を接合することとは、当業者の能力の範囲内である。
【００９３】
一般に、クエンチャーの吸光度帯が、ドナーの蛍光発光帯に実質的に重なっていることが好ましい。ドナー（蛍光体）が、ドナー・アクセプターエネルギー移動を利用するプローブの要素である場合、ドナー部分が励起している際に、ドナー及びアクセプター部分がドナー・アクセプターエネルギー移動を示すように、本発明のドナー蛍光部分及びクエンチャー（アクセプター）が選択されることが好ましい。蛍光体・クエンチャー対を選択する際に考慮される１つの要因は、これらの間でのドナー・アクセプターエネルギー移動の効率である。好ましくは、ドナー及びアクセプター部分との間のＦＲＥＴの効率は、少なくとも１０％であり、より好ましくは少なくとも５０％であり、さらに好ましくは少なくとも８０％である。ＦＲＥＴの効率は、ここに記載され当該技術分野で知られる両方の方法を使用して、実験により容易に試験を行うことが可能である。
【００９４】
また、ドナー及びアクセプター基の能力を変化させて二量体化するまたは密接に結合することにより、ドナー・アクセプター対間のエネルギー移動の効率を調節することも可能である。ドナー及びアクセプター部分が密接に結合することが、既知でありまたは決定される場合、ドナーとアクセプターとの間で、リンカー部分の長さまたはプローブ自体の長さを調節することにより、結合の増加または減少を促進することが可能である。疎水性もしくはイオン相互作用、またはプローブ構造物の立体反発を、調整することにより、ドナー・アクセプター対が結合する能力を増減されることが可能である。従って、ドナー・アクセプター対の結合の原因となる分子内相互作用を、増強することができ、または減衰することができる。従って、例えば、全体のネガティブ電荷を支えているドナー及び総合正電荷を有するアクセプターを利用することにより、例えばドナー・アクセプター対間の結合を、増加させることが可能である。
【００９５】
また、直接プローブに結合される蛍光体に加えて、間接的な手段により蛍光体を結合させられることも可能である。この実施形態では、リガンド分子（例えばビオチン）は一般に、プローブ化学種に共有結合される。リガンドはその後、本質的に検出可能な、または信号システムに共有結合的に結合する、他の分子（例えばストレプトアビジン）に結合するものであり、これは例えば蛍光化合物、又は非蛍光性化合物の変換により蛍光化合物を発生する酵素である。標識としての関心の有用な酵素は、例えば、ヒドロラーゼ、特にホスファターゼ、エステラーゼ及びグリコシダーゼ、ヒドロラーゼ、ペプチダーゼ、または、オキシダーゼ、特にペルオキシダーゼ、及びその他を含んでいる。蛍光化合物は、上記のように、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどを含んでいる。使用可能なシステムを製作する様々な標識または信号のレビューとして、米国特許第４,３９１,９０４号を参照されたい。
【００９６】
本発明のクエンチャーと併用して有用なドナーは、例えば、キサンテン色素を含んでおり、これは、フルオレセイン、シアニン色素及びローダミン色素を含んでいる。これらの化合物の多くの適切な形状が、核酸に対する接着の場所としてまたは結合のための接着機能として使用可能なこれらのフェニル部分上で、置換基と共に商業的に広く利用可能である。本発明のクエンチャーとともに有用な蛍光化合物の他の基は、アルファまたはベータ位でアミノ基を有するナフチルアミンである。１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホン酸エステル、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホン酸エステル及び２−ｐ−トルイジニル−６−ナフタレンスルホン酸エステルが、このナフタイルアミノ化合物の間に含まれる。他のドナーとしては、３−フェニル−７−イソシアナートクマリン、アクリジン、例えば９−イソチオシアナトアクリジン及びアクリジンオレンジ；Ｎ−（ｐ−（２−ベンゾオキサゾリル）フェニル）マレイミド；ベンゾオキサジアゾール、スチルベン、ピレン、等が含まれる。
【００９７】
例示の明瞭さのため、下記の議論は、クエンチャー及び蛍光体を核酸に結合させることに注目する。核酸プローブの上の焦点は、クエンチャーの取り付けが可能なプローブ分子の範囲を制限することを意図しない。当業者は、クエンチャーが、標準合成化学を使用して、小型分子、タンパク質、ペプチド、合成ポリマー、固体担持体などに結合可能でもある点を、評価するだろう。
【００９８】
プローブが核酸プローブである例示的な実施形態では、蛍光体は、Ｑｕａｓａｒ（商標）色素である（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）。蛍光体は、内部サイトも利用可能でありかつ選択された目的のために有用性を有しているものの、核酸の３’−または５’−末端のいずれかに結合されていることが好ましい。蛍光体が結合するどの末端でも、クエンチャーは一般に、その鏡像異性体に、または核酸鎖内部の位置に、結合される。ドナー基は、ドナーのアミダイト誘導体を使用して導入されることが好ましい。代替的に、反応性官能基を備えるドナー基（例えばイソチオシアネート、活性エステルなど）が、反応性官能基との反応を通して、核酸（例えば、ヘキシルアミン）に結合されるテザーまたはリンカーアーム上に導入することが可能である。
【００９９】
さらに別の実施形態では、ドナー部分を、誘導体化合成担持体の使用により、核酸の３'−末端に取り付けることが可能である。例えば、ＴＡＭＲＡ（テトラメチルローダミンカルボン酸）は、この蛍光体の類似体で誘導体化される固体担持体を使用して、核酸の３’−末端に結合される（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）。
【０１００】
小型分子の核酸に対する接合に関する文献の充実した本文を考慮すれば、ドナー／アクセプター対を核酸に結合させる他の多くの方法が、当業者にとって明らかである。例えば、ローダミン及びフルオレセイン色素は、ホスホラミダイト部分により誘導体化される色素により、固相合成の終結の際、核酸の５’−ヒドロキシルに便宜に結合される（例えば、Ｗｏｏらの米国特許第５,２３１,１９１号；及びＨｏｂｂｓ，Ｊｒ．の米国特許第４,９９７,９２８号を参照のこと）。
【０１０１】
すなわち、以下の基準により例証されるように、基を核酸の５'−または３'−末端に結合させるための多くのリンカー部分及び方法論が存在する：Ｅｃｋｓｔｅｉｎ， ｅｄｉｔｏｒ， Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ＡＰＰＲＯＡＣＨ （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， １９９１)；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ ｅｔ ａｈ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １５： ５３０５−５３２１ (１９８７) （３'−ｔｈｉｏｌ Ｇｒｏｕｐ ｏｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ)；Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９： ３０１９ (１９９１) (３'−ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ）；Ｇｉｕｓｔｉ ｅｔ ａｈ， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ２： ２２３−２２７ （１９９３）ならびに、Ｆｕｎｇら、米国特許第４、７５７、１４１号（Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州）から利用可能なＡｍｉｎｏｌｉｎｋ（商標）ＩＩを介した５'−燐酸アミノ基。）；Ｓｔａｂｉｎｓｋｙ、米国特許第４,７３９,０４４号（３−アミノアルキルホスホリル基）；Ａｇｒａｗａｌら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３１：１５４３−１５４６（１９９０）（アミド亜リン酸エステル結合を介した結合）；Ｓｐｒｏａｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５：４８３７（１９８７）（５−メルカプト基）；Ｎｅｌｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７：７１８７−７１９４（１９８９）（３'−アミノ基）、など。
【０１０２】
蛍光標識を検出する手段は、当業者には周知である。従って、例えば、蛍光標識は、適切な波長の光で蛍光体を励起し、派生した蛍光を検出することにより、検出することが可能である。電荷結合素子（ＣＣＤ）または光電子増倍管等の電子検出部の使用により、蛍光を、写真フィルムにより視覚的に検出することが可能である。同様に、酵素及び派生した反応生成物を検出するために、適切な基板を提供することにより、酵素の標識を検出してもよい。
反応性官能基
【０１０３】
本発明の化合物の要素（例えばリンカー、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、キャリア分子及び固体担持体）は、第１の反応性官能基及び第２の反応性官能基の反応により形成される結合サイトに、結合してもよい。反応性官能基は、相補的反応性であり、これらが、ここに結合サイトと呼ばれる化合物の２つの要素の間で反応して、共有結合性結合を形成する。例えば、ＲｘまたはＲｓが反応性官能基である式（Ｉ）または（ＩＩ）に従った化合物を、他の要素（例えばリンカー、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、キャリア分子及び固体担持体）上で、相補的反応性の反応性官能基と反応させて、派生結合サイトを介して要素を共有結合させることが可能である。相補的反応性の反応性官能基を、他の要素（リンカー、ヌクレオシドその他）の任意の位置、例えば、アルキルもしくはヘテロアルキル、アリールもしくはヘテロアリール核、または、アリールもしくはヘテロアリール核上の置換基、に位置させることが可能である。様々な実施形態において、反応基を、アルキル（もしくはヘテロアルキル）または置換アルキル（もしくはヘテロアルキル）鎖に結合させる際、反応基をこの鎖の末端位置に位置させることが好ましい。
【０１０４】
本発明を行うために有用な反応の反応基及び階層は一般に、生体共役反応化学における当該技術分野で周知である。本発明のオリゴマーの反応前駆体に対して利用可能な反応の階層は、比較的穏やかな条件の下で進行することが好ましい。求核置換（例えばハロゲン化アシルによるアミン及びアルコールの反応、活性エステル）、求電子置換（例えばエナミン反応）及び炭素−炭素及び炭素−異種原子複合結合への付加（例えばミカエル反応、ディールス・アルダー付加）が、非限定的に含まれる。これら及び他の有用な反応は、例えば、Ｍａｒｃｈ， ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ， ３ｒｄ Ｅｄ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８５；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ， ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， １９９６；及び、Ｆｅｅｎｅｙ ｅｔ ａｌ， ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ；Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ， Ｖｏｌ． １９８， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．， １９８２で議論される、
【０１０５】
一例として、本発明における有用な反応性官能基は、非限定的に、オレフィン、アセチレン、アルコール、フェノール、エーテル、酸化物、ハロゲン化物、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、アミド、シアネート、イソシアネート、チオシアン酸エステル、イソチオシアネート、アミン、ヒドラジン、ヒドラゾン、ヒドラジド、ジアゾ、ジアゾニウム、ニトロ、ニトリル、メルカプタン、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホン酸、スルフィン酸、アセタール、ケタール、無水物、硫酸塩、スルフェン酸イソニトリル、アミジン、イミド、イミダート、ニトロン、ヒドロキシルアミン、オキシム、ヒドロキサム酸チオヒドロキサム酸、アレン、オルトエステル、亜硫酸エステル、エナミン、イナミン、尿素、イソ尿素、セミカルバジド、カルボジイミド、カルバメート、イミン、アジド、アゾ化合物、アゾキシ化合物、及び、ニトロソ化合物を含む。また、反応性官能基は、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、マレイミド等の生体共役反応を調製するために使用されるこれらを含んでいる。これらの官能基の各々を調製する方法は、当該技術分野で周知であり、これらの特定の目的の用途または修飾は、当業者の能力の範囲内である（例えば、Ｓａｎｄｌｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｏ， ｅｄｓ． ＯＲＧＡＮＩＣ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ Ｇｒｏｕｐ ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮＳ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， １９８９を参照されたい）。
【０１０６】
有用な反応性官能基変換としては、例えば、以下を含んでいる：
（ａ）非限定的な例として活性エステル（例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシベンズトリアゾールエステル、チオエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル）、酸ハロゲン化物、アシルイミダゾール、アルキル、アルケニル、アルキニル及び芳香族エステルを含む、様々な誘導体に容易に変換されるカルボキシル基；
（ｂ）エステル、エーテル、ハロゲン化物、アルデヒド等に変換可能な水酸基；
（ｃ）後にハロゲン化物をアミン、カルボキシレートアニオン、チオールアニオン、カルバニオンまたはアルコキシドイオン等の求核基に置換することにより、ハロゲン原子の部位で新しい基の共有結合性結合とすることが可能なハロアルキル基；
（ｄ）マレイミド基等、ディールス‐アルダー反応に参加することが可能なジエノフィル基；
（ｅ）以降の誘導体化が、イミン、ヒドラゾン、セミカルバゾンまたはオキシム等のカルボニル誘導体の形成を通して可能であり、又はグリニヤール付加またはアルキルリチウム付加としての機構を通して可能である、アルデヒドまたはケトン基；
（ｆ）例えばスルホンアミドを形成するための、アミンによる後続反応を行う、スルホニルハロゲン化物基；
（ｇ）例えばジスルフィドに変換可能またはハロゲン化アシルと反応可能な、チオール基；
（ｈ）例えばアシル化が可能、アルキル化が可能、または酸化が可能な、アミンまたはスルフヒドリル基；
（ｉ）例えば付加環化、アシル化、マイケル付加等を経ることが可能な、アルケン；
（ｊ）例えばアミン及びヒドロキシル化合物と反応することが可能なエポキシド；及び、
（ｋ）核酸合成に有用なホスホラミダイト及び他の標準官能基。
【０１０７】
反応性官能基を選択して、これらが本発明のオリゴマーを組立てるのに必要な反応物に参加せず、またはそれに干渉しなくなるようにすることが、可能である。代替的に、反応性官能基を、保護基の存在により反応に関与することから保護することが可能である。選択した一組の反応条件は妨げないためには、どのように官能基を保護すればよいかを、当業者は理解する。有用な保護基の例としては、例えば、ＧｒｅｅｎｅらによるＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１を参照されたい。
共有結合部分
【０１０８】
オリゴマーと標的配列との間に共有結合を少なくとも一つ生じさせることが可能な反応性官能基部分が、本発明のオリゴマーの一部に含まれる。また、これら多数の部分を提供することによっても、複合の共有結合を形成されることが可能である。共有結合は、ターゲット鎖内の核酸塩基残留物に存在していることが好ましいが、糖または燐酸ジエステルを含む、ターゲットの他の部分で作製することも可能である。架橋剤を生じるこの部分の反応性は、二重鎖内のターゲットの性質を決定する。架橋剤部分がアシル化薬剤及びアルキル化薬剤を含むことが好ましく、特に、鎖内のターゲット位置での反応を可能にするように、配列特異性をもたらす部分に関連して配置されることが好ましい。
【０１０９】
架橋剤部分が、オリゴマーのシーケンスにおいて、類似のピリミジンまたはプリン残留物として便宜に配置されることが可能である。この配置は、５'−及び／または３'−末端に、シーケンスの内部に、または、上記の組合せに、配置することが可能である。末端に配置して、柔軟性を上げることができることが、推奨される。また、類似した部分を、ペプチド主鎖に結合させることも可能である。
【０１１０】
本発明に有用なアルキル化部分の例としては、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン及びＮ６，Ｎ６−エタノアデニンを含んでいる。
【０１１１】
核酸塩基が必ずプリンまたはピリミジンとはならないことが明らかであり；実際、反応性機能を取り付ける部分は、核酸塩基である必要はなく、糖、リンカー、クエンチャー、安定化部分、蛍光体、または本発明のオリゴマーのこれらの要素の一部の組合せであってもよい。任意の反応基を結合させる手段は、位置決めが適切である限りにおいて、十分である。
合成
【０１１２】
本発明の化合物（例えば固体担持体、モノマー（例えばホスホラミダイト）、及び、本発明のオリゴマーまたはそのセグメント）は、一般に従来方式で合成される。例えば、米国特許第７,０１９,１２９号；米国特許第８,４６６,２６６号；及び米国特許第７,８７９,９８６号を参照されたい。当該技術分野で知られかつここに記載される合成方法を使用し、適切に保護されたヌクレオモノマーを用いて、本発明の化合物を含むオリゴマー、ならびに当該技術分野で知られる他の核酸塩基を、合成することが可能である。オリゴマーの合成のための方法は、例えば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒ， Ｂ．， ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （１９８６） １４：５３９９−５４６７；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （１９８８） １６：４８３１−４８３９；Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ （１９８７） ６：２８７−２９１；Ｆｒｏｅｈｌｅｒ， Ｂ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ （１９８６） ２７：５５７５−５５７８；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ， Ｍ． Ｈ． ｉｎ Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ (１９８９），Ｊ． Ｓ． Ｃｏｈｅｎ， ｅｄｉｔｏｒ， Ｃｒｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ｐ７−２４；Ｒｅｅｓｅ， Ｃ． Ｂ． ｅｔ ａｌ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ （１９８５） ２８：２２４５−２２４８、に見出される。メチルホスホンアミダイト化学を通した、メチルホスホナートリンクオリゴマーの合成が、記載された（Ａｇｒａｗａｌ， Ｓ． ｅｔ ａｌ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ （１８７） ２８：３５３９−３５４２；Ｋｌｅｍ， Ｒ． Ｅ．， ｅｔ ａｌ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＷＯ ９２／０７８６４）。
【０１１３】
本発明の様々な化合物の例示的な合成が、図２及び実施例１に記載される。
【０１１４】
例示的な実施形態では、ヌクレオモノマーは、標準合成条件及び試薬を用いて、オリゴマーまたはその利便なフラグメントに直接統合される。この方法により作製される例示的な結合は、燐酸ジエステル、ホスホロチオネート、リンアミダート、メチルホスホナート、ホスホロジチオエート、炭酸塩、モルホリノカルバメート及びスルホン酸エステルを含んでいる。
【０１１５】
様々な実施形態において、合成は、適切な前駆体から開始するショートなシントン（ダイマー、トリマー等）の合成を含んでいる。このアプローチは、Ｎ−メチルヒドロキシルアミン、ジメチルヒドラゾ、スルファミン酸塩、カルバメート、スルホン酸エステル、スルホンアミド、ギ酸アセタールチオギ酸アセタール及び炭酸塩を含む結合の合成には、適切である。
【０１１６】
本発明のオリゴマーは、アミダイト、トリエステルまたは水素ホスホナートの結合方法及び条件を含む任意の適切な化学により合成することが可能である。オリゴマーは、適切な開始シントンから合成されることが好ましく、これは、ＤＭＴ、ＭＭＴ、ＦＭＯＣ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）、ＰＡＣＯ（フェノキシアセチル）、ＴＢＤＭＳ（ｔ−ブチルジフェニルシリル）またはＴＭＳ（トリメチルシリル）等のシリルエーテルと、５’−位置で保護されていること、及び、エステル、H−ホスホナート、β−シアノエチルホスホラミダイト等のアミダイト、ＴＢＤＭＳまたはＴＭＳ等のシリルエーテル、またはｔ−ブチルジフェニルと、３’−位置で活性化されることが、好ましい。代替的に、例えばブロックされた５−ヨード−２’−デオキシウリジン、５−ヨード−２’−Ｏ−アルキルウリジン、５−臭化−２’−デオキシウリジン、５−トリフルオロメタンスルホン酸塩−２’−デオキシウリジン、５−臭化−２’−Ｏ−アルキルウリジン、又は、ブロックされ保護された５−ヨード−２’−デオキシシチジン、５−ブロモ−２’−デオキシシチジン、５−トリフルオロメタンスルホン酸塩−２’−デオキシシチジン、５−ヨード−２’−Ｏ−アルキルシチジン、５−ブロモ−２’−Ｏ−アルキルシチジン等の、適切なウリジンまたはシチジン前駆体は、その後誘導体化されて適切なシントン及びロングのオリゴマーを産出するダイマー、トリマー、テトラマー、五量体またはロングのシントン等のショートなオリゴマーに、便宜に統合することが可能である。
【０１１７】
約４以上のヌクレオモノマー残留物を含んだオリゴマーの例示的な合成が、適切な結合基をアミダイト、H−ホスホナートまたはトリエステル化学の用途に輸送するモノマー、ダイマーまたはトリマー等のシントンを用いて、達成される。シントンを使用して、燐酸ジエステルまたは燐酸ジエステル以外の燐を含む結合（例えばホスホロチオネート、メチルホスホナート、チオノーメチルホスホナート、アミド亜リン酸エステル等）を通して、オリゴマーの要素を結合することが可能である。
【０１１８】
他の非燐含有置換結合の合成は、当該技術分野で知られる適切な前駆体を用いて達成することが可能である。
【０１１９】
所望の核酸を合成した後、固体担持体上にこれを合成した及び処理した場合の固体担持体から、当該技術分野で知られる方法によりこれを切断して、存在する任意の保護基を除去する（例えば６０℃、５時間、濃縮アンモニア）ことが好ましい。塩基感作性基を核酸（例えば、ＴＡＭＲＡ）に結合させる実施形態において、脱保護は、より穏やかな条件（例えばブチルアミン：水が１：３、８時間、７０℃）を使用することが好ましいだろう。これらの条件の下の脱保護は、高速脱保護アミダイト（例えばｄｃ−アセチル、ｄｇ−ｄｍｆ）の使用により促進される。
【０１２０】
担持体及び脱保護からの開裂の後、クロマトグラフィ、抽出及びゲル精製を含む当該技術分野で知られる任意の方法により、核酸は精製される。好ましい実施形態では、ＨＰＬＣを使用して核酸を精製する。分光光度計により２６０ｎｍで光学濃度を測定することにより、単離した核酸の濃度及び純度を決定することが好ましい。
本発明の分析及びオリゴマープローブ
【０１２１】
様々な実施形態において、本発明は、１つ以上のアッセイフォーマットで有用なオリゴマーを提供する。選択された実施形態では、オリゴマーは、そのターゲットとの結合またはそのターゲットからの分離に関する検出可能な信号の発生に関与する。本発明のオリゴマープローブは、任意の特定のアッセイフォーマットに使用中に限定されていない。したがって、以下の説明は、本発明のオリゴマーの使用を見出す典型的な分析フォーマットを例示することを意図するものであり、オリゴマーが有用な分析フォーマットは制限するということを意図するものではない。
分析
【０１２２】
以下の議論は一般に、ここに記載される分析に関連する。この議論では、所定の好ましい実施形態への基準により本発明を例示することを意図するものであり、本発明の化合物が使用を見出すプローブ及び分析タイプの範囲を制限することと解釈されてはならない。本発明の化合物を利用する他のアッセイフォーマットは、当業者にとって明らかである。
【０１２３】
一般に、例えば未知数の核酸等、標的分子の濃度を決定するため、一定量のプローブが、既知量の範囲に亘った核酸標準で接触する参考データを入手することが好ましい。それぞれの基準混合物からの蛍光発光の強さを用いて、グラフまたは標準曲線を誘導し、そこでは、未知の濃度を、既知の標準の強さと比較する。例えば、プローブは以下である：ａ）は、ターゲット核酸の内部でシーケンスにハイブリダイズする；ｂ）は、標識の部位である５'及び３'末端で、蛍光体及びクエンチャー修飾を有している；及び、ｃ）は、未結合の立体構造内でクエンチした後に、ターゲット核酸に結合する際に信号をリリースする、蛍光発生特性を有しており、この参考データを得るために使用することが可能である。このようなプローブは、特性蛍光発光を与え、そこでは、ターゲット核酸の濃度が増加すれば、信号が増加する。その後、未知量のターゲットを有するサンプルがプローブと接触し、混合物からの蛍光強度が決定される。その後、蛍光発光の強度を参照標準と比較して、試験混合物内のターゲットの濃度を得る。
複合解析
【０１２４】
他の実施形態では、混合物内で１つ以上の化学種を検出するために複合分析で用いるプローブまたは１つ以上のプローブの構成要素として、本発明の固体担体及びオリゴマーを利用する。
【０１２５】
本発明の固体担体またはオリゴマーに基づくプローブは、複合型の解析及び分析を実行する際に、特に有用である。典型的な複合解析においては、２つ以上のプローブを用いて、２つ以上の異なった化学種（または１つ以上の化学種の領域）を検出するが、そこでは、プローブのそれぞれには、別々の蛍光体についてのラベルがついている。ドナー・アクセプターのエネルギー移動に頼った複合解析において用いられる好ましい化学種は、少なくとも２つの基準を満たす：蛍光化学種は明瞭であり、良好にスペクトルで分割されること;及び、蛍光化学種とクエンチャーとの間のエネルギー移動は、効率的であること、である。
【０１２６】
本発明の固体担体及びオリゴマーは、多重化分析のデザインを可能とし、そこでは、２以上の蛍光リポーターを、１つ以上のクエンチャー構造と組み合わせる。発明の固体担体またはオリゴマーを用いた多くの別々の多重化分析は、当該技術分野の１つには明らかになるだろう。１つの例示的な分析では、少なくとも２の異なった蛍光リポーターのそれぞれを、それらの各オリゴマー上の同じタイプのクエンチャー構造と組み合わせて、ＦＲＥＴまたは接触クエンチングのいずれかを介して信号を調整する。代替的に、少なくとも２の異なる蛍光リポーターのクエンチャー構造が異なるように組まれる分析を行うことが可能であり、そこでは、これら蛍光特性がより適切に「マッチング」する。蛍光体は、クエンチャーとしての同じ分子に、または、別々の分子に密接に結びついてもよい。さらに、クエンチャー及び蛍光体に同様に、例えば蛍光体とクエンチャーとを共有結合により鎖で結びつけるオリゴシーケンス等、特定の分析システムに有用なキャリア分子は、同じ又は別々のいずれかとすることが可能である。
【０１２７】
上述の混合物に加えて、本発明はまた、特定の分子化学種の存在を検出するための質的方法を提供する。この方法は、以下を含む：(ａ)化学種を、本発明の固体担体またはオリゴマーを含有する混合物に接触させること；及び(ｂ)生じる混合物の１つ以上の構成要素の蛍光特性における変化を検出して、分子化学種の存在を検出すること。
【０１２８】
ドナー・アクセプターのエネルギー移動を用いた２つ以上のプローブの同時使用は、従来技術で知られている。例えば、シーケンス選択性の異なる核酸プローブを用いる複合分析が、記載されていた。蛍光プローブは、個体が、特定の変異に対して同型接合性野生体か、同型接合性変異体か、または異型かにつき、決定するために用いられてきた。例えば、一方の野生型シーケンスを認識するクエンチされたフルオレセイン分子ビーコン及び他方の突然変異対立遺伝子を認識するローダミンをクエンチされた分子ビーコンを用いて、β−ケモカインレセプターのための遺伝子型個体が可能である（Ｋｏｓｔｒｉｋｉｓ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９： １２２８−１２２９ （１９９８））。フルオレセイン信号のみの存在は、個体が野生型であることを示すものであり、ローダミン信号のみの存在は、個体がホモ接合の変異体であることを示すものである。ローダミン及びフルオレセイン信号の存在は、ヘテロ接合体診断である。Ｔｙａｇｉ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６： ４９−５３ （１９９８））は、対立遺伝子識別のための４つの標識の異なる分子ビーコンの同時使用を記載し、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２７： ３４２−３４９ （１９９９）は、６つのＰＣＲ製品の７色の同種検出を記載した。
【０１２９】
本発明のクエンチャーは、実質的に任意の種を検出および／または定量化するように設計された複合的な分析に使用することが可能であり、この任意の種は例えば、細胞全体、ウイルス、タンパク質（例えば酵素、抗体、レセプター）、グリコプロテイン、リポタンパク質、細胞小器官粒子、生物体（例えばサルモネラ）、核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ及びその類似体）、多糖類、リポポリサッカリド、脂質、脂肪酸、非生物重合体、及び、小型分子（例えば毒素、ドラッグ、農薬、メタボライト、ホルモン類、アルカロイド、ステロイド）を含んでいる。
核酸プローブ
【０１３０】
本発明の固体担持体及びオリゴマーは、有効な核酸プローブであり、これらは、例えば、５’−ヌクレアーゼアッセイ、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸一次構造ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を含んだ、様々なＤＮＡ増幅／数量化戦略の検出薬剤の要素として用いることができ、ならびに、溶液相または固相（例えばアレイ）分析におけるターゲットの直接検出のために用いることができる。更に、固体担持体及びオリゴマーは、実質的にいずれかのフォーマットのプローブで用いることが可能であり、例えば、分子ビーコンから選択されるフォーマット、スコーピオンプローブ（商標）、サンライズプローブ（商標）、配座アシストプローブ、着火プローブ、インベーダー検出プローブ及びタックマン（商標）プローブが含まれる。例えば、Ｃａｒｄｕｌｌｏ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８５：８７９０−８７９４ （１９８８）；Ｄｅｘｔｅｒ， Ｄ．Ｌ．， Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓｉｃｓ， ２１：８３６−８５０ （１９５３）；Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ， Ｒ．Ａ．， ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ４５： １３３−１４１ （１９９２） ；Ｓｅｌｖｉｎ， Ｐ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ２４６：３００−３３４ （１９９５）；Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ， Ｉ．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ４０：８３−１１４ （１９７１）；Ｓｔｒｙｅｒ， Ｉ，．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ４７：８１９−８４６ （１９７８）；Ｗａｎｇ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ３１：６４９３−６４９６ （１９９０）；Ｗａｎｇ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， ６７： １ １９７−１２０３ （１９９５）；Ｄｅｂｏｕｃｋ， Ｃ， ｅｔ ａｌ， ｉｎ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｔｏ ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ２１：４８−５０ （１９９９）；Ｒｅｈｍａｎ， Ｆ．Ｎ．， ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２７：６４９−６５５ （１９９９）；Ｃｏｏｐｅｒ， Ｊ．Ｐ．， ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２９：９２６１−９２６８ （１９９０）；Ｇｉｂｓｏｎ， Ｅ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ６：９９５−１００１ （１９９６）；ＨＯＣＨＳＴＲＡＳＳＥＲ， Ｒ．Ａ．， ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ４５： １３３−１４１ （１９９２）；
Ｈｏｌｌａｎｄ， Ｐ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ， ８８：７２７６−７２８９ （１９９１）；Ｌｅｅ， Ｌ．Ｇ．， ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｓｃｋ， ２１：３７６１−３７６６ （１９９３）；Ｌｉｖａｋ， Ｋ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ （１９９５）；Ｖａｍｏｓｉ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ， ７１：９７２−９９４ （１９９６）；Ｗｉｔｔｗｅｒ， Ｃ．Ｔ．， ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ２２： １７６−１８１ （１９９７）；Ｗｉｔｔｗｅｒ， Ｃ．Ｔ．， ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ２２： １３０−３８（１９９７）；Ｇｉｅｓｅｎｄｏｒｆ， Ｂ．Ａ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ４４：４８２−４８６ （１９９８）；Ｋｏｓｔｒｉｋｉｓ， Ｌ．Ｇ．， ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７９： １２２８−１２２９ （１９９８）；Ｍａｔｓｕｏ， Ｔ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ， １３７９： １７８− １８４ （１９９８）；Ｐｉａｔｅｋ， Ａ．Ｓ．， ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １６：３５９−３６３ （１９９８）；Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ， Ｐ．， ｅｔ ａｌ， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ６３： １１４３−１１４７ （１９９７）；Ｔｙａｇｉ Ｓ．， ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １６：４９−５３ （１９９８）；Ｔｙａｇｉ Ｓ．， ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：３０３−３０８（１９９６）；
Ｎａｚａｒｅｎｋｏ， ＬＡ．， ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２５：２５１６−２５２１ （１９９７）；Ｕｅｈａｒａ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ２６：５５２−５５８ （１９９９）；Ｄ． Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ， ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １７：８０４−８０７ （１９９９）；Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ， Ｖ．， ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １７：２９２ （１９９９）；Ｄａｕｂｅｎｄｉｅｋ， ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １５：２７３−２７７ （１９９７）；Ｌｉｚａｒｄｉ， Ｐ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １９：２２５−２３２ （１９９８） ；Ｗａｌｋｅｒ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２０： １６９１−１６９６ （１９９２）；Ｗａｌｋｅｒ， Ｇ．Ｔ．， ｅｔ ａｌ， Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ４２：９−１３ （１９９６）；及び、Ｃｏｍｐｔｏｎ， Ｊ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３５０：９１−９２ （１９９１）、を参照されたい．
【０１３１】
従って、本発明は、核酸標的配列を検出するための方法を提供する。本方法は、以下を含む：（ａ）標的配列を検出部核酸（例えば本発明のオリゴマー）に接触させること；（ｂ）ターゲット結合シーケンスを標的配列にハイブリダイズし、それにより検出部核酸の立体構造を改質し、蛍光パラメータを変化させること；及び、（ｃ）蛍光パラメータの変化を検出し、それにより核酸標的配列を検出すること。
【０１３２】
ここに記載される方法では、特に明記しない限り、好ましい検出部核酸は、一本鎖ターゲット結合シーケンスを含んでいる。結合配列は：ｉ）蛍光体；及びｉｉ）クエンチャーを、それに結合した。結合配列は、任意にさらに、安定化部分をそれに結合した。さらに、その相補配列へのハイブリダイゼーションに先立ち、検出部核酸は、蛍光体が励起される際に、蛍光体とクエンチャーとの間へのドナー・アクセプターエネルギー移動ができるようにする立体構造であることが好ましい。更に、このセクションに記載される方法のそれぞれにおいて、蛍光の変化は、標的配列の存在の徴候として検出される。蛍光の変化は、実時間での検出であることが好ましい。
【０１３３】
現在好ましい核酸プローブは、官能基に対するプローブのための二次構造を採用する核酸を、必要とはしていない。この方法では、そして、このセクションで記載される他の方法を特に明記しない限り、検出部核酸は、いずれかの分子内に結合された二次構造を引き受けることが実質的に可能であるが、この構造は、ヘアピン、ステム−ループ構造、プソイドノット、三重螺旋及び配座的にアシストされた構造から選択される部材であることが好ましい。さらに、分子内塩基対の二次構造は、ターゲット結合シーケンスの部分を備えていることが好ましい。
【０１３４】
別の態様では、本発明は、標的配列の増幅を検出するための方法を提供する。この方法は、増幅反応（例えばＰＣＲ）の使用を含んでいる。例示的な増幅反応は、以下のステップの一つ以上を含んでいる：
（ａ）標的配列の側面に位置するＰＣＲプライマーを有する対象とする標的配列を備えるサンプル核酸を、ハイブリダイズすること；
（ｂ）重合酵素でハイブリダイズされたプライマーを拡張して、ＰＣＲ製品を製作すること、及び、ＰＣＲ製品の二鎖を分離して、標的配列の知覚及びアンチセンス鎖を利用可能にすること；
（ｃ）検出部核酸を、ＰＣＲ製品内の標的配列の知覚またはアンチセンス鎖にハイブリダイズすること、
ここで、検出部核酸は：
ｉ）ＰＣＲ製品内の標的配列の知覚またはアンチセンス鎖の少なくとも一部に相補的であり、かつ、ＰＣＲプライマーの間の領域にハイブリダイズする、一本鎖ターゲット結合シーケンス；
ｉｉ）蛍光体；及び
ｉｉｉ）本発明のクエンチャー；を含み、
ここで、その標的配列へのハイブリダイゼーションの前に、検出部核酸は、蛍光体が励起される際、蛍光体とクエンチャーとの間にドナー・アクセプターエネルギー移動ができるようにする立体構造であり；
それにより、検出部核酸の立体構造を改質（例えば、クエンチング能率に貢献する任意の二次構造またはランダムコイル立体構造を線形化）して、蛍光パラメータ（例えば信号強度）を変化させること；及び
（ｄ）蛍光パラメータの変化を測定して、標的配列及びその増幅を検出すること。
任意に、重合酵素が、プライマー伸長（上記のステップ（ｂ））の間にハイブリダイズ検出部核酸に遭遇し、かつ、重合酵素の二次ヌクレアーゼ活性を経由する等により蛍光体及びクエンチャーを結合するオリゴマーを加水分解する場合に、蛍光パラメータの変化を、永続的とすることが可能となる。
【０１３５】
その上更なる実施形態では、本発明は、第１の核酸及び第２の核酸がハイブリダイズするか否かを確認する方法を提供する。この方法では、第１の核酸は、本発明に従ったオリゴマー（溶液内のまたは固体担持体に結合する）である。方法は、以下を含む：（ａ）第１の核酸を第２の核酸に接触させること；（ｂ）第１の核酸、第２の核酸及びその組合せから選択される部材の蛍光特性内で変更を検出して、それによりハイブリダイゼーションが発生するか否かを確認すること。
【０１３６】
様々な実施形態において、本発明は、核酸標的配列内で多型を検出する際に有用なプローブ及び方法を提供する。多型は、ある集団内で２以上の遺伝的が与えられた選択すべきシーケンスまたは対立遺伝子の発生のことをいう。多型マーカーまたは部位は、発散が生じる場所である。好ましいマーカーは、少なくとも２つの対立遺伝子を有しており、そのそれぞれは１％を超える頻度で生じ、より好ましくは選択された集団の１０％を超えるまたは２０％で生じている。多型場所は、１つの塩基対と同程度に小さくてもよい。多型マーカーは、制限断片長多形性、タンデムリピート（ＶＮＴＲの）変数、高度変異部、ミニサテライト、ジヌクレオチド反複、トリヌクレオチド反複、テトラヌクレオチド反複、単純なシーケンス反複、及び、Ａｌｕ等の挿入配列、を含んでいる。第１の識別された対立遺伝子の形態は、基準形態に任意に指定され、他の対立遺伝子の形態は、選択すべきまたは変形の対立遺伝子に指定される。選択された集団内で最も高い頻度で生じる対立遺伝子の形態は、野生型形態と時折いわれる。２倍体生物は、対立遺伝子の形態に対する同種接合または異種接合体であってもよい。２対立遺伝子の多型は、２つの形態を有する。３対立遺伝子の多型は、３つの形態を有する。
【０１３７】
例示的な実施形態では、本発明のプローブは、単一ヌクレオチド多型を検出するために利用される。単一ヌクレオチド多型は、単一ヌクレオチドにより占められる多型部位で生じ、これは対立遺伝子のシーケンス間での変形物の部位である。部位は通常、対立遺伝子が高度に保存されたシーケンスにより先行され、それにより追従される（例えば、集団の１／１００または１／１０００未満の部材で変化するシーケンス）。単一ヌクレオチド多型は通常、多型部位における他のものに対する１つのヌクレオチドの置換が原因で、発生する。移行は、他のプリンによる１つのプリンの置換、または、他のピリミジンによる１つのピリミジンの置換である。転換は、ピリミジンによるプリンの置換、またはその逆である。単一ヌクレオチド多型は、基準対立遺伝子に関連した、ヌクレオチドの削除、またはヌクレオチドの間挿から生じることも可能である。
【０１３８】
クエンチャー及び蛍光体を支持する本発明のオリゴマーを用いることが可能であり、または代替的には、１つ以上の核酸を単独でエネルギー移動対（例えばクエンチャーまたは蛍光体）の単一部材で標識することが可能である。単独でクエンチャーで標識される核酸がプローブである場合、クエンチャーと核酸との間で相互作用を観察することにより、またはより好ましくは、第２の核酸に結合される蛍光体の蛍光のクエンチャーによりクエンチングを行うことにより、第１核酸と第２の核酸との間の相互作用を検出することが可能である。
【０１３９】
ある実施形態では、本発明のクエンチャーと蛍光体との間の基底状態複合体が形成される。例示的な実施形態では、クエンチャー及び蛍光体が、同じ核酸オリゴマーに接合される。
【０１４０】
核酸の増幅、多型、及び、検出ならびに数量化を研究するように設計されたプローブのそれらの一般的な有用性に加えて、本発明の固体担持体及びオリゴマーは、ここで知らるまたは後に発見される実質的にいずれかの核酸プローブフォーマットで用いられることが可能である。例えば、本発明の固体担持体及びオリゴマーを、プローブモティーフに統合することが可能であり、例えばタックマン（商標）プローブ（Ｈｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ６： ９８６−９９４ （１９９６），Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８： ７２７６−７２８０ （１９９１），Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２１： ３７６１−３７６６ （１９９３）），分子ビーコン（Ｔｙａｇｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３０３−３０８ （１９９６），Ｊａｙａｓｅｎａらの１９９９年１１月２３日出願の米国特許第５,９８９,８２３号））、スコーピオンプローブ（Ｗｈｉｔｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７： ８０４−８０７ （１９９９）），サンライズプローブ（Ｎａｚａｒｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５： ２５１６−２５２１ （１９９７）），配座的にアシストされたプローブ（Ｃｏｏｋ，Ｒ．の出願中の及び同一出願人による１９９９年６月９日に出願の米国特許出願第２００７／００５９７５２号）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）−ベースのライトアッププローブ（Ｋｕｂｉｓｔａ ｅｔ ａｌ， ＷＯ ９７／４５５３９， Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９７），二本鎖特異的ＤＮＡ色素（Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０： ４１３−４１７ （１９９２），Ｗｉｔｔｗｅｒ ｅｔ ａｌ， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２２： １３０−１３８ （１９９７））、等である。本発明のクエンチャーを用いることが可能な、これら及び他のプローブモティーフが、ＮＯＮＩＳＯＴＯＰＩＣ ＤＮＡ ＰＲＯＢＥ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９２により検討されている。
【０１４１】
本発明のプローブに用いられるオリゴマーは、任意の適切なサイズとすることができ、好ましくは約２〜約１００のヌクレオチドの範囲であり、さらに好ましくは約１０〜約８０のヌクレオチド、なお好ましくは約１０〜約４０のヌクレオチドである。二重標識（蛍光体−クエンチャー）されたプローブでは、ドナー部分は、少なくとも約６、好ましくは少なくとも８、好ましくは少なくとも１０のヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも約１５のヌクレオチドで、クエンチャーから分離されることが好ましい。様々な実施形態において、ドナー部分は、プローブの３'−または５'−ターミナルヌクレオチドのいずれかに、結合されることが好ましい。また、クエンチャー部分は、プローブの３'−または５'−ターミナルヌクレオチドのいずれかに、結合されることが好ましい。より好ましくは、ドナー及びアクセプター部分は、プローブの３'−または５'−又は５'−または３'−ターミナルヌクレオチドにそれぞれ結合されるが、内部配置も有効である。
【０１４２】
本発明の核酸プローブの正確なシーケンス及び長さは、それが結合するターゲットポリヌクレオチドの性質に、ある程度左右される。結合位置及び長さを変化させて、特定の実施形態のために適切なアニーリング及び溶融特性を実現してもよい。このデザイン選択を作製するためのガイダンスを、多くの芸術認識基準に見出すことが可能である。
【０１４３】
ある実施形態では、核酸プローブの３'末端ヌクレオチドは、核酸重合酵素により、ブロックされまたは伸張ができなくなる。このブロッキングは、直接によるか、またはリンカー部分によるかのいずれか一方による、核酸プローブの末端３'−位置へのドナーまたはアクセプター部分の付着により、便宜に遂行される。
【０１４４】
核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはキメラ型混合物、または、誘導体またはその変性バージョンを備えることが可能である。プローブ及びターゲット核酸は、一本鎖、二重鎖、三本鎖その他として存在することができる。さらに、核酸は、核酸塩基部分、糖部分、または、例えば放射性標識、副溝バインダー、挿入剤、アセチレン化不飽和炭化水素、蛍光アルキル基、ドナー及び／またはアクセプター部分等の他の基によるホスファート主鎖により、改質することが可能である。
【０１４５】
本発明のオリゴマーは、別々のシーケンスであるプライマーとして、またはランダムなシーケンスによるプライマーとして、有効である。ランダムなシーケンスプライマーは、一般に長さが約６または７のヌクレオモノマーである。このプライマーは、様々な核酸増幅プロトコル（ＰＣＲ、合成酵素鎖反応その他）に、またはクローン化プロトコルに用いることが可能である。本発明の５’末端上の置換は、プライマーとして機能するオリゴマーのキャパシティを、一般に妨げない。３'末端残留物以外の部位に２’−修飾を有する本発明のオリゴマー、オリゴマーＲＮアーゼＨを不能にするする他の修飾、又は、別の面で安定なヌクレアーゼは、細胞抽出物内またはヌクレアーゼ含有他の溶液内で、ＲＮＡまたはＤＮＡの塩基配列のためのプローブまたはプライマーとして有利に用いることが可能である。従って、ターゲット核酸を含むサンプルに、オリゴマーを混合し、その後ターゲット核酸にオリゴマーのハイブリダイゼーションを行い、ＰＣＲ、ＬＣＲまたは他の適切な方法によりターゲット核酸を増幅することにより、サンプル内で核酸を増幅するために、オリゴマーをプロトコルに用いることが可能である。
【０１４６】
ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡまたは１、２−ジアミノシクロヘキサン酢酸類似体等のキレート薬剤で誘導体化されるオリゴマーは、記載される（米国特許第４,７７２,５４８号、第４，７０７，４４０号及び第４，７０７，３５２号）ように、様々な試験管内での診断分析に利用することが可能である。代替的に、本発明のオリゴマーは、例えば５−（３−ヨードアセトアミドプロプ−１−イル）−２’−デオキシウリジン、又は、５−（３−（４−ブロモブチルアミド）プロプ−１−イル）−２’−デオキシウリジン等の架橋剤薬剤で、誘導体化することが可能であり、記載される（国際特許公開第ＷＯ９０／１４３５３号）ように、様々なアッセイ方法またはキットで用いられる。
【０１４７】
前述の用途に加えて、遺伝子形質発現を妨げるオリゴマーの能力は、対象細胞内または組換え型システム内での発現のレベルを任意の適切な方法で測定することにより、試験管内のシステムで実証されることができる（Ｇｒａｅｓｓｍａｎｎ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （１９９１） １９：５３−５９）。
【０１４８】
本発明のオリゴマーとターゲット核酸分子との間のハイブリダイゼーションを支持する条件は、当業者による実験で決定することが可能であり、オリゴヌクレオチド類似体プローブの最適な培養温度、塩濃度、長さ、及び核酸塩基組成物、ならびに、サンプルのオリゴマー及び核酸分子の濃度を含むことができる。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、少なくとも１ミリモルのマグネシウムの存在下及び６．０を超えるｐＨで実行される。ある実施形態では、ハイブリダイゼーションの前に、サンプルの核酸分子を一本鎖にするためにサンプルを処理することが、必要でもよく、または望ましくてもよい。この治療の例は、非限定的に、塩基による処理（好ましくは中和により追従される）、高温のインキュベーション、または、ヌクレアーゼによる処理が、含まれる。
【０１４９】
さらに、核酸へのハイブリダイゼーションの塩依存が、ハイブリダイズオリゴヌクレオチド類似体の主鎖の電荷密度により主として決定されるため、非標準ヌクレオチド類似体を本発明のオリゴマーに結合すれば、ハイブリダイゼーションの塩依存を増減することができる。この調整は、本発明の方法の利点に用いることが可能であり、ここで、例えば塩条件を変化させることにより、ハイブリダイゼーションの厳密性を増大できること、または、塩濃度を低減することにより、ハイブリダイズ核酸をリリースできることを、ある意味では望ましくさせることが可能となる。本発明のさらに他の態様では、極めて少量の塩で、本発明のオリゴヌクレオチド類似体の核酸への結合が高親和性となることを望ましくすることが可能である。この場合、非荷電主鎖部分を有するヌクレオチドモノマーを本発明のオリゴヌクレオチド内に配置することが有利である。
【０１５０】
ターゲット核酸分子と結合する際の本発明のオリゴマーの選択性の程度が高くなれば、実務家が、１つ以上のオリゴマーの少なくとも一部に対して完全相補的なシーケンスの範囲を備える核酸配列と、実質的補完シーケンス内に少数の非相補的核酸塩基を備えるシーケンスの範囲を備えるターゲット核酸分子との間での識別を支持することが可能な、ハイブリダイゼーション状態を選択することが可能になる。例えば、ハイブリダイゼーションまたは洗浄温度を選択することが可能であり、この選択により、本発明のオリゴマーとターゲット核酸分子との間の安定したハイブリッドを容認するものであり、これはシーケンスの範囲に沿って完全に相補的になるが、他方では、本発明のオリゴマーとターゲット核酸分子との間でのハイブリッドの分離を促進し、これはさほど完全に相補的でなく、補完的なシーケンスの範囲に沿って１または２の核酸塩基のミスマッチを備えていることを含んでいる。他の状態に関して、ハイブリダイゼーション及び洗浄のための温度の選択に、少なくともある程度依存することができ、この状態は例えば、塩濃度、オリゴマー及びターゲット核酸分子の濃度、オリゴマーのターゲット核酸分子に対する相対比率、ハイブリッドされるオリゴマーの長さ、オリゴマーとターゲット核酸分子との核酸塩基組成物、オリゴヌクレオチドの類似体分子のモノマー組成物、等である。さらに、完全相補分子の安定したハイブリッドを支持する状態、及び、１つ以上の核酸塩基により不適当ミスマッチしたオリゴマーとターゲット核酸分子との間で安定したハイブリッドを支持しない状態を、選択する場合、追加的な状態を考慮することが可能となり、そして、望ましい場合、変化した場合は、非限定的に、ハイブリッドされるオリゴヌクレオチド類似体の長さ、オリゴマーとターゲット核酸分子との間の相補性のシーケンスの範囲の長さ、相補性のシーケンスの範囲内での非相補的核酸塩基の数、ミスマッチの核酸塩基の素性、ミスマッチの核酸塩基の近くの核酸塩基の素性、及び、相補性の範囲に沿った任意のミスマッチの核酸塩基の相対的な位置、が含まれる。核酸ハイブリダイゼーションの当業者は、本発明のオリゴマーを用いる際に、特定の用途に依存して、ターゲット核酸分子へのハイブリダイゼーションに対して、好ましいハイブリダイゼーション及び洗浄条件を決定することが可能である。「好ましい状態」は、オリゴマーとターゲット核酸分子との間での安定したハイブリッドを支持する状態とすることができ、これは、少なくとも一部は実質的に相補的であり、１つ以上のミスマッチを備えるものが含まれる。
【０１５１】
「好ましい状態」は、少なくとも一部が、完全に相補的であるものの、完全に相補的でない分子間の不人気または不安定化のハイブリッドである、オリゴマーとターゲット核酸分子との間で、安定したハイブリッドを支持状態とすることができる。
【０１５２】
ここに開示される方法等の方法を用い、異なるシーケンスのターゲット核酸分子にハイブリッドされる本発明のオリゴマーの溶融温度を、決定することが可能であり、及び、所定の用途の好ましい状態を決定する際に用いることが可能である。また、例えばターゲット核酸分子を固体担体に取付けられたオリゴマーにハイブリッドし、かつ、ハイブリッドされた複合体を検出することにより、実験的に好ましいハイブリダイゼーション状態を決定することが可能である。
【０１５３】
本発明の固体担体またはオリゴマープローブに密接に結びつくターゲット核酸分子を、検討個体群が結合しない核酸分子から、固体担体へのオリゴマープローブの直接的または間接的な接続品により、便宜かつ効率的に分離することができる。オリゴマープローブに結合しない核酸分子を取り除くため、固体担体を、高い厳密性で洗浄することが可能である。しかしながら、オリゴマープローブの固体担体への接続品は、本発明の必要条件ではない。例えば、一部の用途では、マトリックスによる遠心分離により、または相分離により、または分離の他の形式の一部（たとえば差動沈降）により、結合核酸分子及び不結合核酸分子を分離することが可能であり、これはオリゴマープローブ内に取り込まれる化学基によって任意に援助されてもよい（Ｎｉｅらによる２０００年５月９日に出願の米国特許第６,０６０,２４２号を参照されたい）。
核酸キャプチャーのプローブ
【０１５４】
１つの実施形態では、クエンチャーを備える固定化核酸は、キャプチャープローブとして用いられる。固定化核酸は、安定化部分を任意に更に含んでいる。例えば、プローブの固体担体への３’−または５’−末端ヌクレオチドの接続品により、核酸プローブを固体担体に直接取付けることができる。しかしながら、より好ましくは、プローブはリンカー（上記）により、固体担体に接続されている。リンカーは、プローブを固体担体から遠ざける役目を果たす。リンカーは、最も望ましくは長さで約５〜約３０原子であり、望ましくは長さで約１０〜約５０原子である。
【０１５５】
様々な実施形態において、固体担持体はまた、オリゴマー（プローブ）を調製する際の合成担持体として用いられる。固体担持体と第１の核酸の３’−ユニットとの間でのリンカーの長さ及び化学的安定性は、サポート結合した核酸の効率的な合成及びハイブリダイゼーションに、重要な役割を果たす。オートメーション化した合成の間に、高収率（＞９７％）を実現できるよう、リンカーアームは十分に長いことが好ましい。リンカーの必須の長さは、用いられる特有の固体担持体に左右される。例えば、６原子のリンカーは、高度の架橋ポリスチレンを固体担持体として用いる際の核酸の自動合成において、＞９７％の収率を実現するには、一般に十分である。固体担持体としてＣＰＧを用いる際の自動合成中に高度な収率（＞９７％）を達成するためには、リンカーアームは、少なくとも２０原子の長さであることが好ましい。
【０１５６】
固体担持体上で固定されるプローブのハイブリダイゼーションは、プローブが、少なくとも３０原子、より好ましくは少なくとも５０原子により固体担持体から分離されることが一般に必要である。この分離を実現するため、リンカーは、リンカーと３'−末端との間に配置されるスペーサーを一般に含んでいる。核酸合成のために、リンカーアームは通常、エステル結合により３'−末端の３'−ＯＨに結合されるが、このエステル結合を塩基性の試薬で切断して核酸を固体担持体から解放することが可能である。
【０１５７】
多種多様なリンカーは、当該技術分野で知られており、これを用いて、核酸プローブを固体担持体に結合させてもよい。リンカーは、固体担持体に結合されるプローブへの標的配列のハイブリダイゼーションを大きく妨げない任意の化合物を、形成してもよい。リンカーは、例えば、自動合成によりリンカーに容易に添加が可能なホモポリマーの核酸を形成してもよい。代替的に、官能化ポリエチレングリコールのようなポリマーを、リンカーとして用いることが可能である。このポリマーは、ホモポリマーの核酸であることが、現在好ましいが、何故なら、これがプローブのターゲット核酸へのハイブリダイゼーションを著しく妨げないからである。ポリエチレングリコールは特に推奨されるものであり、何故なら、それは、商業的に利用可能であり、有機及び水性媒体に可溶であり、官能化が容易であり、かつ、核酸合成及びポスト合成条件で完全に安定だからである。
【０１５８】
固体担持体と、リンカーと、プローブとの間の結合部位は、核酸塩基保護基の合成中または除去中、塩基性の条件下、高温では、切断されないことが好ましい。これらの結合は、しかしながら、様々な条件下で、開裂可能である基から選択することが可能である。現在好ましい結合の例としては、カルバメート、エステル及びアミド結合が含まれる。
サンプル内の核酸の検出
【０１５９】
本発明の固体担持体及びオリゴマーは、核酸の検出に用いることが可能である。この検査法は、以下を含む：サンプルを提供すること、核酸分子へのオリゴマーのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、サンプルに対する本発明の少なくとも１つのオリゴヌクレオチド類似体を接触させること、及び、本発明の１つ以上のオリゴマーにハイブリダイズしたサンプルの１つ以上の核酸分子を検出すること。
【０１６０】
サンプルは、任意のソースからとすることができ、また、生体サンプル、例えば生物体からのサンプルまたは同一または相異する種からの生物体の基、であるとすることができる。生体サンプルは、例えば、血液サンプル、血清サンプル、リンパサンプル、骨髄サンプル、腹水液、胸膜液、骨盤洗浄液、眼液、尿、精液、痰または唾液等の、身体上の流体のサンプルとすることが可能である。生体サンプルは、皮膚、鼻、咽喉、または生殖スワブ、または糞便物質の抽出液からの抽出物とすることもできる。生体サンプルは、腫瘍を含む器官または組織のサンプルとすることもできる。生体サンプルは、原核生物の及び真核生物細胞の細胞株及び一次培養を含む、細胞培養のサンプルであることも可能である。
【０１６１】
サンプルは、環境からとすることができ、例えば、水の本体からまたは土から、または食物、飲料から、または水源、工業発生源、職場領域、公共の場または居室面積、とすることができる。サンプルは、抽出物，例えば土の液体抽出物または食物サンプルとすることが可能である。サンプルは、洗浄または浸漬から作製される溶液とすること、または、ツール、衣類の物品、人工品または他の物質等の物質から、スワブを懸濁することが可能である。
【０１６２】
サンプルは、未処理のまたは処理のサンプルとすることが可能であり；処理とは、サンプルの要素の純度、濃度またはアクセスしやすさを増大して、サンプルの解析を容易にするステップを含むことが可能である。非限定的な例として、処理は、サンプル量を低減する、サンプルの要素を除去するまたは分離する、サンプルまたは１つ以上のサンプル要素を可溶化する、または、サンプルの要素を破壊する、改質する、露出する、放出するまたは絶縁するための、各ステップを、含むことが可能である。この手順の非限定的な例としては、遠心、沈降、濾過、ホモジナイゼーション、溶菌、抗体の結合、菌体分離等である。
例えば、本発明の一部の好ましい実施形態では、サンプルは、例えば、赤血球の除去により、濃度により、１つ以上の細胞またはウイルス型（たとえば、白血球または病原性細胞）の選択により、又は細胞の細胞溶解等により、少なくとも部分的に処理される血液サンプルである。
【０１６３】
例示化合物は、少なくとも部分的に精製された核酸分子の溶液を含んでいる。核酸分子は、単一ソースまたは複合のソースからとすることができ、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはこれら両者を備えることができる。例えば、核酸分子の溶液は、溶菌、濃度、抽出、沈降、核酸選択（例えばポリＡＲＮＡの選択、またはＡｌｕ要素を備えたＤＮＡの塩基配列の選択）、または１つ以上の酵素による処理、におけるステップのいずれかに従ったサンプルとすることが可能である。また、サンプルは、合成核酸分子を備える溶液とすることも可能である。
【０１６４】
本発明のオリゴマーまたは固体担持体は、ここに開示されるいずれかのオリゴマーフォーマットとすることができ、または、ここに開示されるモノマー、ダイマーまたは非核酸要素（例えばリンカー、蛍光体、クエンチャー、安定化部分）を備えているいずれかのオリゴマーとすることができる。本発明の方法で用いられるオリゴヌクレオチド類似体は、任意の長さ及び任意の核酸塩基組成物とすることができ、部分、ペプチド、タンパク質脂質、炭水化物、ステロイド、ならびに他の生化学及び化学部分を、１つ以上の核酸に備えることができる。本発明のオリゴヌクレオチド類似体は、溶液に提供すること、または固体担持体に結合することが、可能である。本発明の一部の好ましい実施形態では、オリゴマーは、非標準ヌクレオチド類似体を備えている。
【０１６５】
結合核酸のための検査法は、当該技術分野では周知であり、調査集団の核酸分子に結合されるまたは統合される、または、ハイブリダイズターゲット核酸分子もしくはハイブリダイズターゲット核酸分子複合体に結合されるまたは統合される、検出可能標識の使用を含むことが可能である。核酸分子の検出可能な標識は周知の技術であり、蛍光体（ここに述べられるそれらを含む）、ラジオアイソトープ、質量変化化学基、信号発生分子により検出が可能なビオチン等の特異的結合部材、等の蛍光分子を備えている。また、検出可能な標識は、例えば、信号オリゴマーを用いたサンドイッチハイブリダイゼーションを検出に用いる場合、又は、オリゴマー／ターゲット核酸分子複合体を認識する抗体等の特異的結合部材を用いて検出を実行する場合に、本発明のオリゴマーに統合されるまたは結合されることも可能である。固体担持体を、スキャンでき、膜に露出でき、視覚的に検査できる等により、検出可能な標識の存在を決定し、それにより、固体担持体上に、例えば本発明のそれら上に固定されるオリゴマーへの、ターゲット核酸分子の結合を確定する。
キット
【０１６６】
本発明の１つの態様は、先に述べたように、本発明の化合物（例えば本発明の固体担持体または本発明のモノマー）を用いた合成の実行、及び、本発明のオリゴマーを用いたアッセイ、を促進する、キットの配合である。本発明のキットは典型的には、接合体を調製するために有効な化学的に反応種として存在する、又は、オリゴマーが特異的結合対部材である場合の完成されたオリゴマーとして存在する、のいずれか一方における、本発明の化合物（例えば本発明の固体担持体または本発明のオリゴマー）を備えている。キットは随意、１つ以上のバッファ剤（典型的に水溶液として存在する）をさらに備えている。本発明のキットは随意、追加的な検出試薬、生じた標識物質を精製するための精製媒体、発光標準、酵素、酵素阻害剤、有機溶媒、または、本発明のアッセイを遂行するための指示をさらに備えている。キットのための他の構成は、当業者にとって明らかになるであろうし、また、本発明の範囲内にある。
【０１６７】
一例として、例示化合物において、本発明は、式ＩまたはＩＩに従った構造を有する化合物：
（Ｉ），（ＩＩ）
0006730982.tif 000011
を有しており、ここで、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ７ａ及びＲ７ｂは、Ｈ、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のシクロアルキル、置換または非置換のヘテロアルキル、及び、置換または非置換のヘテロシクロアルキルから、別々に選択される。Ｒ１ａとＲ１ｂとは、これらに結合される炭素原子と共に、任意に接合され、置換または非置換のＣ３−Ｃ７シクロアルキルと、置換または非置換の３〜７員ヘテロシクロアルキルとから選択される部材である環を生成する。Ｒ７ａとＲ７ｂとは、それに結合される炭素原子と共に、随意に接合されて、置換または非置換のＣ３−Ｃ７シクロアルキルと、置換または非置換の３〜７員ヘテロシクロアルキルとから選択される部材である環を生成する。Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ７ａ及びＲ７ｂの少なくとも一つは、Ｈではない。
Ｒ８は、Ｈ、
0006730982.tif 000012
及び
0006730982.tif 000013
から選択される。Ｌｘは、結合、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のシクロアルキル、置換または非置換のヘテロアルキル、及び置換または非置換のヘテロシクロアルキルから選択される。Ｌｘｓは、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のシクロアルキル、置換または非置換のヘテロアルキル、及び置換または非置換のヘテロシクロアルキルから選択される。Ｒｓは、保護または非保護の反応性官能基、結合部位、及び固体担持体から選択される。Ｒｘは、保護または非保護の反応性官能基、及び結合部位から選択される。それぞれの結合部位は、ヌクレオシド、ヌクレオシドへのリンカー、ヌクレオチド、ヌクレオチドへのリンカー、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドへのリンカー、核酸、核酸へのリンカー、キャリア分子、キャリア分子へのリンカー、固体担持体、及び固体担持体へのリンカーから、独立して選択される部材に共有結合されている。
【０１６８】
前項に従った化合物であって、Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、独立して、非置換のＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５及びＣ６アルキルから選択される。
【０１６９】
前項に従った化合物であって、Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれメチルである。
【０１７０】
任意の前項に従った化合物であって、Ｒ７ａ及びＲ７ｂは、それぞれＨである。
【０１７１】
任意の前項に従った化合物であって、Ｒ７ａ及びＲ７ｂは、独立して、非置換のＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５及びＣ６アルキルから選択される。
【０１７２】
任意の前項に従った化合物であって、Ｒ７ａ及びＲ７ｂは、それぞれメチルである。
【０１７３】
任意の前項に従った化合物であって、Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれＨである。
【０１７４】
任意の前項に従った化合物であって、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ７ａ及びＲ７ｂは、独立して、非置換のＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５及びＣ６アルキルから選択される。
【０１７５】
任意の前項に従った化合物であって、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ７ａ及びＲ７ｂは、それぞれメチルである。
【０１７６】
任意の前項に従った化合物であって、Ｌｘは、非置換のＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９及びＣ１０アルキルから選択される。
【０１７７】
任意の前項に従った化合物であって、Ｌｘｓは、置換ヘテロアルキルである。
【０１７８】
任意の前項に従った化合物であって、Ｒｘは、ホスホラミダイト、−ＯＨ、−ＯＤＭＴ、−ＣＯＯＨ、活性エステル、及び−ＮＨ２から選択される。
【０１７９】
任意の前項に従った化合物であって、Ｒｓは、−ＯＨ、−ＯＤＭＴ、及び、固体担持体へのリンカーに共有結合的に結合する結合部位から選択される。
【０１８０】
任意の前項に従った化合物であって、Ｒｘは、ホスホラミダイト、−ＯＨ、−ＯＤＭＴ、−ＣＯＯＨ、活性エステル及び−ＮＨ２から選択される。
【０１８１】
任意の前項に従った化合物であって、Ｒｘは、ヌクレオシドへのリンカーに共有結合される結合部位であり、ヌクレオシドは、構造を有する：
0006730982.tif 000014
環標識Ｂは、核酸塩基である。Ｒｎ３は、−ＯＨまたはホスホラミダイトである。Ｒｎ５は、−ＯＨまたは−ＯＤＭＴである。
【０１８２】
任意の前項に従った化合物であって、Ｒ８は以下から選択される：
0006730982.tif 000015
【０１８３】
核酸標的配列を検出する方法であって、該方法は、
（ａ）標的配列を検出部核酸に接触させることであって；一本鎖ターゲット結合シーケンスを備え、この検出部核酸は、これにリンクされた；
ｉ）蛍光体；及び
ｉｉ）任意の前項に従った化合物であって、Ｒ８は、検出部核酸に（直接またはリンカーを通して）共有結合される結合部位を備える、前記化合物、を備え；この検出部核酸は、蛍光体が励起される際、蛍光体と化合物との間にドナー・アクセプターエネルギー移動ができるようにする立体構造である、前記標的配列を検出部核酸に接触させること；
（ｂ）ターゲット結合シーケンスを標的配列にハイブリダイズし、それにより検出部核酸の立体構造を改質し、蛍光パラメータを変化させること；及び、
（ｃ）蛍光パラメータの変化を検出し、それにより核酸標的配列を検出すること、を備えている。
【０１８４】
第１の核酸及び第２の核酸がハイブリダイズするか否かを確認する方法であって、第１の核酸は、任意の前項に従った化合物を備え、Ｒ８は、第１の核酸に（直接またはリンカーを通して）共有結合される結合部位を備え；この方法は、
（ａ）第１の核酸を第２の核酸に接触させること；及び
（ｂ）第１の核酸、第２の核酸及びその組合せから選択される部材の蛍光特性内で変更を検出し、それによりハイブリダイゼーションが発生するか否かを確認すること、を備えている。
【０１８５】
核酸増幅反応を監視する方法であって、この方法は、
（ａ）検出部核酸を備える増幅反応混合物を調製することであって、それにリンクされた
ｉ）蛍光体；及び
ｉｉ）任意の前項に従った化合物であって、Ｒ８は、検出部核酸に（直接またはリンカーを通して）共有結合で結合される結合部位を備える、前記化合物；
を有する、前記増幅反応混合物を調製すること、
（ｂ）増幅反応混合物を増幅条件に従わせること；
（ｃ）検出部核酸からの蛍光信号のために反応混合物を監視して、アッセイ結果を得ること；及び
（ｄ）核酸増幅反応をモニターするためにアッセイ結果を使用すること、を備えている。
【０１８６】
標的配列の増幅を検出する方法であって、この方法は、
（ａ）標的配列の側面に位置したＰＣＲプライマーを有する標的配列を備えるサンプル核酸をハイブリダイズすること；
（ｂ）重合酵素でハイブリダイズされたプライマーを拡張してＰＣＲ製品を製作し、ＰＣＲ製品の２鎖を分離して標的配列の知覚及びアンチセンス鎖を利用可能にすること；
（ｃ）検出部核酸を、ＰＣＲ製品内の標的配列の知覚またはアンチセンス鎖にハイブリダイズすること、ここで、検出部核酸は：
ｉ）ＰＣＲ製品内の標的配列の知覚またはアンチセンス鎖の少なくとも一部に相補的であり、かつ、ＰＣＲプライマーの間の領域にハイブリダイズする、一本鎖ターゲット結合シーケンス；
ｉｉ）蛍光体；及び
ｉｉｉ）任意の前項に従った化合物であって、Ｒ８は、検出部核酸に（直接またはリンカーを通して）共有結合で結合される結合部位を備える、前記化合物；
を有し、
ここで、その標的配列へのハイブリダイゼーションの前に、検出部核酸は、蛍光体が励起される際、蛍光体と化合物との間にドナー・アクセプターエネルギー移動ができるようにする立体構造であり；
それにより、検出部核酸の立体構造を改質して、蛍光パラメータを変化させること；及び
（ｄ）蛍光パラメータの変化を測定して、標的配列及びその増幅を検出すること、を備えている。
【実施例】
【０１８７】
本発明の物質及び方法は、あとに続く実施例により、さらに示される。これらの実施例は、請求項に係る発明を例示するために提供されるが、これを制限するものではない。
実施例
実施例１：本発明の例示化合物の合成
【０１８８】
本発明の様々な例示化合物の合成が、図２に概説される。
【０１８９】
ヒドロキシテトラメチルユロリジン２は、クロマトグラフィの必要なしで、２つのステップ（色素及び顔料２００３、５９、６３）に対して約５０％の全収率で、ヒドロキシアニリン１を介して調製された。スケールアップにより、相対的な容易さで、２の９５ｇを提供した。ファーストブラックＫ（ＦＢＫ）塩による２のテスト反応により、濃いブルーダイ３を発生させた。無水条件下でのＤＭＦ内で過剰な塩化ヘキサノール及び炭酸カリウムを用いて、２のＣ６−ヒドロキシル化合物４への変換を生じた。乾燥ＤＭＦ内で水素化ナトリウムを用いたアルキル化の文献方法を防止して、大量生産中の困難を最小にした。ファーストブラックＫ塩のメタノール水溶液の４をメタノール溶液に付加することにより、アゾ色素アルコール５を提供し、これをアミダイト６に変換した。スケールアップにより、アミダイト約１３ｇを与えた。アミダイトを用いて、５'標識ポリＴオリゴを作製し、これは二重ＨＰＬＣであり、精製された後に用いられ、色素のための吸光係数を確定した。
【０１９０】
上記の２によるブロモヘキサン酸の反応では、所望の化合物７を提供しなかった。ブロモヘキサン酸を、そのメチルエステル８に変換し、その後２に結合し、それぞれの単離していないＣ６−エステル化合物９を与えた。ＴＨＦ内で２Ｍの水性硫酸を用いていてメチルエステルを開裂し、Ｃ６酸化合物７を与えた。ＦＢＫ塩への結合により酸−アゾ色素１０を与え、これを用いてＤＭＴ保護セリノール誘導体１１を調製した。これは順次、グリコール酸１２に、その後ＣＰＧ１３に変換した。ＣＰＧを用いて３'標識ポリＴオリゴを作製し、これは二重ＨＰＬＣであり、精製された後に用いられ、色素のための吸光係数を確定した。５’−標識されたオリゴヌクレオチドと同様に、塩基性の条件下の脱保護の後、天然オリゴヌクレオチドサンプル内のＨＰＬＣによる色素分解または副産物の顕著な痕跡は、見られなかった。酸性アゾ色素１０は、活性エステル１４に変換された。
実施例２：ＢＨＱ２、ＢＢＱ及びコスミッククエンチャー性能比較
序論
【０１９１】
より長い波長でのクエンチ色素発光に対するコスミッククエンチャー（下記に示す）性能が、評価された。具体的には、蛍光体クエーサー６７０及びクエーサー７０５からの信号を消すクエンチャーの能力が、検討された。基準として、ＢＨＱ２及びブラックベリークエンチャー（ＢＢＱ−６５０（商標）；Ｂｅｒｒｙ ＆ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ．；米国特許第７,８７９,９８６号に記載）の性能が、これら同一蛍光体と提携される際に、検討された。これらのクエンチャーのそれぞれを含むタックマンプローブが、リアルタイムＰＣＲ及びヌクレアーゼ分解アッセイにより評価された。
コスミッククエンチャー
ＢＨＱ２
ＢＢＱ−６５０
0006730982.tif 000016
スキーム。クエンチャー部分。
方法
【０１９２】
モデルタックマンアッセイは、この研究において全ての比較のために利用され、コリン受容体、ムスカリニック３に対する人間の遺伝子を検出するよう設計された（ＧｅｎｅＩＤ ＣＨＲＭ３、受入れ番号ｎｍ＿０００７４０）。プローブ配列は、５' −［蛍光体］−ＴＣＣＴＴＴＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＣＡＴＣＴ− ［クエンチャー］−３'であり、ＰＣＲプライマー５'−ＴＴＧＧＧＴＣＡＴＣＴＣＣＴＴＴＧ−３'及び５'−ＧＣＡＣＡＧＴＴＣＴＣＴＴＴＣＣＡ−３'の増幅製品を表示する。このプローブ配列を、５つの異なる蛍光体クエンチャー組合せ：クエーサー６７０コスミッククエンチャー、クエーサー６７０−ＢＨＱ２、クエーサー６７０−ＢＢＱ、クエーサー７０５コスミッククエンチャー、及び、クエーサー７０５−ＢＨＱ２、のそれぞれで合成した。それぞれのプローブは、同一プライマーセットに提携され、それらのクエンチング能率は、ヒトゲノムＤＮＡ２５ｎｇからのＰＣＲ増幅の３倍の反応で評価された。それぞれの反応の組成物は、以下の通りである：
成分（標準濃度）                            体積                終濃度
・ヌクレアーゼフリー水                    １０．２５μＬ        Ν／Α
・プラチナタックＰＣＲバッファ（１０Ｘ）    ５．００μＬ    １Ｘ
・タックマンプローブ（１０μΜ）            ０．５０μＬ    １００ｎΜ
・ＭｇＣｌ２（５０ｍＭ）                    ２．００μＬ    ２．０ｍＭ
・ｄＮＴＰ（それぞれ２．５ｍＭ）            ４．００μＬ    それぞれ２００μΜ
・ヒトゲノムＤＮＡ（１５０ｐｇ／μＬ）      ２５．０μＬ  反応につき３．７５ｎｇ
・プラチナタック重合酵素（１Ｕ／μΚ）      ０．２５μＬ    反応につき１．２５ユニット
・前プライマー（１０μΜ）                    １．５０μＬ    ３００ｎｍ
・逆プライマー（１０μΜ）                    １．５０μＬ    ３００ｎｍ
全体積：５０．０μＬ。
「赤」チャネルで検出されるクエーサー６７０（６２５ｎｍのソース、６６０ｎｍの検出部、ゲイン＝５）、及び、「深紅」チャネルで検出されるクエーサー７０５（６８０ｎｍのソース、７１０ｎｍの検出部、ゲイン＝１０）に対して、リアルタイムＰＣＲ反応を、ＲｏｔｏｒＧｅｎｅ６０００（Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）の上で循環した。その後、ヌクレアーゼ分解アッセイにより５プローブを検討し、そこでは、４００ｎｍの濃度でプローブを有する１００μＬヌクレアーゼバッファ溶液に、１．５ユニットの球菌ヌクレアーゼを加える。１０分の間隔で進行するよう、消化を実現する。この間隔の後、以下の設定で、テカンサファイア蛍光光度計上の信号強さを測定する：
設定      クエーサー６７０    クエーサー７０５
測定態様：    蛍光トップ    蛍光トップ
励起波長：    ６４１ｎｍ    ６８０ｎｍ
放出波長：    ６７６ｎｍ    ７１５ｎｍ
励起帯域幅：    １２ｎｍ    １２ｎｍ
放出帯域幅：    １２ｎｍ    １２ｎｍ
ゲイン：          １５０    １５０
フラッシュ数：    ２０    ２０
ラグタイム：    ０μｓ    ０μｓ
積分時間：    ２０μｓ    ２０μｓ
それぞれからのバッファブランクの信号を最初に減算した後に、ヌクレアーゼで処理する反応内でのプローブの蛍光強度を、未治療反応内の同一プローブの強度で除算することにより、信号対ノイズ値を算出する。
実時間ＰＣＲ結果
【０１９３】
クエーサー６７０プロット（図３）内では、固体増幅痕跡は、コスミッククエンチャープローブを表し、破線の痕跡は、ブラックベリークエンチャー（ＢＢＱ）プローブを表し、ドットの痕跡は、ＢＨＱ２プローブを表す。クエーサー７０５プロット（図４）内では、固体痕跡は、コスミッククエンチャープローブを示す一方、ドットの痕跡は、ＢＨＱ２プローブを示している。増幅の開始前のベースライン信号強度により明示されるように、いずれか一方の蛍光体では、コスミッククエンチャーは、ＢＨＱ２またはＢＢＱよりも効率性の高いクエンチングを示している。
ヌクレアーゼ分解結果
【０１９４】
両方の蛍光体、特にＢＨＱ２よりも１／６の背景蛍光を示すクエーサー７０５で、コスミッククエンチャーにより最も効率的にクエンチされることを、ヌクレアーゼアッセイは明らかにする。その優れたクエンチング能率により、コスミッククエンチャーは、クエーサー７０５に対して最も高度なＳ／Ｎ比を示すものであり、そして、クエーサー６７０に対して２番目に高度な比を示している。
【０１９５】
図５Ａは、ヌクレアーゼアッセイの、クエーサー６７０コスミッククエンチャー、クエーサー６７０−ＢＨＱ２、クエーサー６７０−ＢＢＱ、クエーサー７０５コスミッククエンチャー、及びクエーサー７０５−ＢＨＱ２で標識される、プローブの消化有り及び無しにおける測定蛍光強度を表す。図５Ｂは、ヌクレアーゼ分解アッセイのクエーサー６７０コスミッククエンチャー、クエーサー６７０−ＢＨＱ２、クエーサー６７０−ＢＢＱ、クエーサー７０５コスミッククエンチャー、及びクエーサー７０５−ＢＨＱ２で標識される、プローブの消化及び未消化の蛍光から算出されるＳ／Ｎ比を表す。
【０１９６】
ここに記載される実施例及び実施形態は、実例となる目的のためのみであり、様々な修飾またはその光の変化は、技術に熟達せる人に提案されるものであり、この適用の精神及び範囲内に含まれるものにあり、かつ、添付の特許請求の範囲の範囲内で考慮されることが、理解されるものである。ここに引用される全ての公表、特許及び特許出願は、全ての目的のために完全に、参照によりここに統合される。
【図１】
0006730982.tif 000022
【図２】
0006730982.tif 000023
【図３】
0006730982.tif 000024
【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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