(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液中のボトリオコッカス藻体に、線量が50〜75GyのＸ線を照射する工程および浮遊したオイル高生産ボトリオコッカス藻体を採取する工程を含む、オイル高生産ボトリオコッカス藻体の分離方法。
【請求項２】
オイル高生産ボトリオコッカス藻体の乾燥した藻体中のオイル含有量が40重量％以上である、請求項１に記載のオイル高生産ボトリオコッカス藻体の分離方法。
【請求項３】
液中のボトリオコッカス藻体に、線量が50〜75GyのＸ線を照射する工程および浮遊したオイル高生産ボトリオコッカス藻体を採取し、採取したオイル高生産ボトリオコッカス藻体からオイルを分取する工程を含む、オイルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、放射線を用いたボトリオコッカスのオイル高生産体の分離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ボトリオコッカス（Botryococcus）をはじめとするオイルを高生産する微細藻類がバイオマス資源として注目されている。
このような藻体の回収技術としては、ナノバブルを用いて藻体を物理的に浮遊させる方法が知られている（特許文献１）。しかし、この方法によると、オイル含量の低い藻体も同時に浮遊してしまうという欠点があった。また、藻体の状態によってはナノバブルでは回収できない場合もあった。
【０００３】
一方、ボトリオコッカスと同じ緑藻であるクラミドモナスにおいて、窒素欠乏培地に交換することでオイルの生産量を高め浮遊させるという現象が報告されている（非特許文献１）。しかし、ボトリオコッカスの場合は、藻体回収が困難であり培地交換による方法を適用するのは困難であった。また、遠心分離法で藻体を回収しようとすると、オイル生産量が低く比重の重い藻体が優先的に回収されてしまう。そのため、培地交換を経ずに藻体を浮遊させる技術が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１２−０１６３１６号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Carrie Goodson, Robyn Roth, Zi Teng Wang, Ursula Goodenough、“Structural correlates of cytoplasmic and chloroplast lipid body synthesis in Chlamidomonas reinhardtii and stimulation of lipid body production with acetate boost”、Eukaryotic cell、平成23年10月28日、第10巻、p.1952-1606
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
かように、オイル生産量が高いボトリオコッカスのみを分離回収できる技術はこれまでになかった。したがって、本発明は、ボトリオコッカスの回収工程において、オイル生産量の高い藻体のみを選択的に分離する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、下記の方法により上述した課題を解決できることを見出し、本発明に想到するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、次の発明を提供するものである。
【０００９】
＜１＞
液中のボトリオコッカス藻体に、重イオンビーム又はＸ線を照射する工程および浮遊したオイル高生産ボトリオコッカス藻体を採取する工程を含む、オイル高生産ボトリオコッカス藻体の分離方法。
【００１０】
＜２＞
前記重イオンビーム又はＸ線の線量が25〜150Gyである＜１＞に記載の方法。
【００１１】
＜３＞
前記重イオンビームが、炭素イオンビーム又はアルゴンイオンビームである＜１＞又は＜２＞に記載の方法。
【００１２】
＜４＞
液中のボトリオコッカス藻体に、重イオンビーム又はＸ線を照射する工程および浮遊したオイル高生産ボトリオコッカス藻体を採取し、採取したオイル高生産ボトリオコッカス藻体からオイルを分取する工程を含む、オイルの製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法によれば、オイルを多量に生産した藻体のみを採取することができる。
また、増殖状態にある浮遊しなかった藻体は、さらに培養することで、オイル高生産ボトリオコッカス藻体とし、連続的にオイル高生産ボトリオコッカス藻体を回収でき、オイルを有利に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１はアルゴンイオンビーム又はＸ線照射後3時間静置したボトリオコッカス培養液の写真である。
【図２】図２ＡはＸ線照射後3時間静置し、浮遊したボトリオコッカスの明視野顕微鏡写真（左側）および蛍光顕微鏡写真（右側）である。図２ＢはＸ線照射後3時間静置し、沈殿したボトリオコッカスの明視野顕微鏡写真（左側）および蛍光顕微鏡写真（右側）である。蛍光画像の明るい部分は、BODIPYで染色されたオイルである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明では、ボトリオコッカスに放射線、具体的には重イオンビーム又はＸ線を照射する。
【００１６】
本発明で照射する重イオンビームとしては、例えば、アルゴンイオンビーム、炭素イオンビームなどが挙げられる。なかでも、アルゴンイオンビームが特に好ましい。
【００１７】
重イオンビーム又はＸ線照射の照射線量は、本発明の効果が得られ、かつ照射対象であるボトリオコッカスの生長に大きな影響を与えない範囲内である。この範囲は、25〜150Gyであるが、25〜100Gyが好ましく、50〜75Gyが特に好ましい。
【００１８】
本発明で照射対象として用いるボトリオコッカスは、ボトリオコッカス（Botryococcus）属の微細藻類であれば特に限定されず、湖沼や池などの野生で入手可能なものを使用することができる。通常、ボトリオコッカスといえばボトリオコッカス・ブラウニー（学名：Botryococcus braunii）を指す。
また、ボトリオコッカスは常法に従って培養したものを使用すればよい。例えば、培地としては、Chu13改変培地やChu10培地、BG11、BBM、BBMa培地、AF-6培地などが使用され、その中でもAF-6培地は多くのBotryococcus株で安定した増殖を示すためよく使われている。また、培養条件としては以下のような条件が挙げられる。
・温度:15〜40℃（至適温度は30℃前後）
・培地pH：5-9
・光強度：10-160μmol/m2/s
・明暗周期：連続光で光を与えることも可能だが、一日のうち数時間（2〜12時間）の暗期を設けることが望ましい。
・培養期間：窒素源となっている硝酸態窒素が培地中より枯渇すると増殖が停止するため、培養期間はこの濃度に依存することが多い。培地中の硝酸態窒素濃度が150mg/L程度の場合、3-4週間程度の培養期間を要する。
・エアレーション：空気あるいは10％程度までの二酸化炭素濃度になるように圧縮空気と混合して培地に与える。
【００１９】
上述の方法で培養したボトリオコッカスに重イオンビーム又はＸ線を照射する。照射は、定常期にある藻体に対して行ってもよく、増殖期にある藻体に対して行ってもよく、特に限定されない。
【００２０】
照射は液中、特に培養液中のボトリオコッカスに対して行うことが好ましく、重イオンビーム又はＸ線を照射後、暫く静置すればオイル高生産ボトリオコッカス藻体が浮遊する。ここで、オイル高生産ボトリオコッカス藻体とは、乾燥した藻体中、オイルを40重量％以上含有する藻体をさす。すなわち、照射から一定時間経過後、通常3時間程度でオイル高生産ボトリオコッカス藻体の浮遊が確認される。このときの条件は、特に限定されないが、培養時の条件、例えば、光量約100μmol/m2/secのもと、室温で静置することが好ましい。
【００２１】
浮遊したボトリオコッカスは、常法により採取すればよい。例えば、ピペットを用いて浮遊したボトリオコッカスを採取したり、デカンテーションにより行うことができる。
【００２２】
採取したボトリオコッカスから常法に従ってオイルを抽出することができる。ここで本発明において、ボトリオコッカスから得られる「オイル」は、多くの藻類が生産するトリグリセリド（いわゆる植物油）ではなく、炭化水素（いわゆる石油系オイル）を主成分とするものである。オイルの抽出方法としては、例えば、採取した藻体を凍結乾燥し、オイルを抽出することができる有機溶媒に浸漬し、遠心分離し、溶媒を濃縮する方法などが挙げられる。このとき、必要に応じてシリカゲルクロマトグラフィーなどでオイルの精製を行ってもよい。
【実施例】
【００２３】
以下、実施例および比較例を挙げて、本願発明をさらに詳細に説明するが、本願発明は下記の例に制限されるものではない。
【００２４】
野外の池から採取したボトリオコッカス（Hojo株）を培養し、実験に供した。
培養は、下記の通り行った。
・光条件；蛍光灯３本（約100μmol/m2/sec）
・明暗周期；明：暗＝17H：7H
・エアレーション；5% CO2（暗条件下ではCO2を含まない空気を通気）
・培養温度；25℃
・培地；組成を表１に示す。
【００２５】
【表１】
0006730582.tif 000002
【００２６】
重イオンビームとしては、理化学研究所仁科加速器研究センター施設内のリングサイクロトロンにおいて、アルゴンイオンビームを用いた。
Ｘ線の照射は、Ｘ線照射装置（RIGAKU）を用いた。
【００２７】
実施例１〜４
上記条件で培養した培養開始から12日後のボトリオコッカス培養液を200μLの８連チューブに入れ、表２に示す線量のアルゴンイオンビームをそれぞれ照射した。
アルゴンイオンビーム照射後、光量約100μmol/m2/sec、25℃で3時間静置した後チューブを観察したところ、アルゴンイオンビームの線量に依存して、藻体の浮遊がみられた。
【００２８】
実施例５
上記条件で培養した培養開始から12日後のボトリオコッカス培養液を200μLの８連チューブに入れ、4Gy/分の線量率で12.5分、50GyのＸ線を照射し、実施例１〜４と同様に光量約100μmol/m2/sec、25℃で3時間静置した後観察したところ、藻体の浮遊がみられた。
【００２９】
比較例１
アルゴンイオンビームおよびＸ線いずれも照射しなかった以外は同様にして培養液の観察を行った。
【００３０】
静置後の各チューブを撮影した写真を図１に示す。また、図１の写真から以下の方法で算出した浮遊指数を表２に示す。
【００３１】
［浮遊指数算出方法］
（１）画像解析ソフト ImageJに画像を取り込む。
（２）8-bit グレースケールに変換する。
（３）同一面積内の沈殿藻体の輝度を、各例につき3チューブずつ測定し平均値を算出する。
（４）（３）で算出した平均値に対し、比較例１の値を0、実施例３の値を100として、各例について浮遊指数を算出する。
【００３２】
【表２】
0006730582.tif 000003
【００３３】
アルゴンイオンビームの線量を一定以上にすると、オイル含量の高い藻体の浮遊がみられた。100Gyおよび150Gyを照射した場合には、藻体が浮遊した。Ｘ線50Gyを照射した場合でも、藻体が浮遊した。線質を問わず放射線照射により、藻体の浮遊現象が起こることを見出した。以後の解析をＸ線50Gyで行うこととした。
【００３４】
次に、浮遊藻体と沈殿藻体に脂溶性蛍光色素を作用させて顕微鏡観察を行った。
実施例５と同様の条件でボトリオコッカス培養液にＸ線を照射した。照射後、光量約100μmol/m2/sec、25℃で3時間静置し、浮遊藻体と沈殿藻体と分取した。浮遊藻体と沈殿藻体それぞれに脂溶性蛍光色素BODIPYを終濃度1μg/mLになるよう加えて10分間染色し、蛍光顕微鏡で観察した。図２に明視野顕微鏡写真（左側）及び蛍光顕微鏡写真を示す。
浮遊藻体にはBODIPYで染色される（図２の蛍光顕微鏡写真の白く明るい部分）藻体が多くみられ、沈殿藻体ではBODIPYの蛍光強度が弱かった。本実験において、浮遊藻体ではオイルが高生産していることが分かった。
【００３５】
最後に、定常期と増殖期にある藻体に対してＸ線照射を行い、オイル含量を分析した。
【００３６】
［定常期］
4日間培養した前培養液を1Lデュラン瓶に植菌（最終培地量800mL）し本培養を行い、培養開始から18日目にサンプリングした。培養5日目と18日目（藻体回収日サンプル）で増殖率速度μ(day-1)を求めると、0.038であった。
［増殖期］
7日間培養した前培養液を1L三角フラスコに植菌（最終培地量700mL）し本培養とした。本培養では、培養開始から13日目に栄養塩を添加し、培養最終日まで増殖状態を保たせた。培養13日目と26日目（藻体回収日サンプル）での増殖率速度μ(day-1)は、0.104であり、定常期に比べ約3倍の増殖能をもっていた。
【００３７】
次に、定常期にある培養18日目の藻体および増殖期にある培養26日目の藻体に対して、それぞれ培養液の濃縮を行った。各培養液は孔径20μmのナイロンメッシュフィルターを取り付けたロート（オートクレーブ滅菌済み）を使用して濃縮した。滅菌済み培地で3回洗浄後、50mL平型培養フラスコに移し、Ｘ線の照射試験に供した。
【００３８】
上述した培養液に対して、4Gy/分の線量率で12.5分、50GyのＸ線を照射した。照射後は、光量約100μmol/m2/sec、25℃で3時間静置した。その後、浮遊藻体と沈殿藻体とを分取した。
【００３９】
浮遊藻体と沈殿藻体それぞれに対して、以下の操作を行い、オイル含量を算出した。まず、分取した藻体を凍結乾燥し、一定量（1g前後）を正確に秤量し、10mLのヘキサン／エチルアルコール（3:1, v/v）に2時間浸漬した。次に、その藻体懸濁液を2,800rpm、20分間遠心分離後、溶媒部分を分取した。残渣に10mLのヘキサン／エチルアルコール（3:1, v/v）を加え、同様の操作で溶媒を分取した。抽出溶媒を合わせ、ロータリーエバポレーターで濃縮乾固した。残留物をn-ヘキサンに懸濁し、2mLのシリカゲルカラムに添加した。10mLのn-ヘキサン／クロロホルム（1:1, v/v）で溶出する画分を炭化水素画分とし、溶媒を窒素ガス気流下で完全に除いた後、残留したオイル画分の重量を秤量した。
得られたオイルの組成は、主にC33H56の炭化水素であった。
【００４０】
結果を表３に示す。定常期および増殖期いずれの場合も、浮遊藻体は沈殿藻体や非照射藻体よりもオイル含量が高かった。比重が小さくなって藻体が浮上すると考えられる。
【００４１】
【表３】
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【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明の方法を用いることにより、オイル含量の高い藻体のみを選択的に分離できる。また、増殖状態にある浮遊しなかったオイル含量の低い藻体をさらに培養することで、連続的にオイル高含量藻体を得ることができるため、多くのオイルを効率よく得られる。
【図１】
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【図２】
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