(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水、グルコース−１−リン酸、セロデキストリン、および配列番号２または配列番号６と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むセロデキストリンホスホリラーゼ酵素を含む酵素反応物であって、前記セロデキストリンホスホリラーゼ酵素は、少なくとも１５の重量平均重合度（ＤＰw）を有する不溶性セルロースを合成する、酵素反応物。
【請求項２】
前記不溶性セルロースは、１５〜５０のＤＰwを有する、
請求項１に記載の酵素反応物。
【請求項３】
前記不溶性セルロースは、１５〜３０のＤＰwを有する、
請求項２に記載の酵素反応物。
【請求項４】
前記不溶性セルロースは、少なくとも１７のＤＰwを有する、
請求項１に記載の酵素反応物。
【請求項５】
前記不溶性セルロースは、１７〜５０のＤＰwを有する、
請求項４に記載の酵素反応物。
【請求項６】
前記セロデキストリンホスホリラーゼ酵素は、配列番号２または配列番号６と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項１〜５の何れか１項に記載の酵素反応物。
【請求項７】
前記セロデキストリンは、セロビオースを含む、
請求項１〜６の何れか１項に記載の酵素反応物。
【請求項８】
前記酵素反応物は、分離された酵素反応物である、
請求項１〜７の何れか１項に記載の酵素反応物。
【請求項９】
（ｉ）少なくとも１５の重量平均重合度（ＤＰw）を有する不溶性セルロース、と
（ｉｉ）配列番号２または配列番号６と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むセロデキストリンホスホリラーゼ酵素、と
を含む、分離された組成物。
【請求項１０】
前記不溶性セルロースは、１５〜５０のＤＰwを有する、
請求項９に記載の分離された組成物。
【請求項１１】
前記不溶性セルロースは、１５〜３０のＤＰwを有する、
請求項９に記載の分離された組成物。
【請求項１２】
前記セロデキストリンホスホリラーゼ酵素は、配列番号２または配列番号６と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項９〜１１の何れか１項に記載の単離された複合物。
【請求項１３】
不溶性セルロースを製造する方法であって、
少なくとも水、グルコース−１−リン酸、セロデキストリン、および配列番号２または配列番号６と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むセロデキストリンホスホリラーゼ酵素を接触させる工程であって、少なくとも１５の重量平均重合度（ＤＰw）を有する不溶性セルロースが生成される、工程を含む方法。
【請求項１４】
前記不溶性セルロースは、１５〜５０のＤＰwを有する、
請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記不溶性セルロースは、１５〜３０のＤＰwを有する、
請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記不溶性セルロースは、少なくとも１７のＤＰwを有する、
請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記不溶性セルロースは、１７〜５０のＤＰwを有する、
請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記セロデキストリンホスホリラーゼ酵素は、配列番号２または配列番号６と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１３〜１７の何れか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記グルコース−１−リン酸は第２の反応を行うことによって接触工程で供給され、
該第２の反応の生成物はグルコース−１−リン酸を含む、
請求項１３〜１８の何れか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２の反応は、
（ｉ）水、無機リン酸塩、デンプン、およびデンプンホスホリラーゼを接触させるか、
（ｉｉ）水、無機リン酸塩、スクロース、およびスクロースホスホリラーゼ酵素を接触させるか、または、
（ｉｉｉ）水、無機リン酸塩、セルロースバイオマス、エンドグルカナーゼ、およびセロデキストリンホスホリラーゼを接触させる
ことによって、グルコース−１−リン酸を生成する、
請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、国際出願ＰＣＴ／中国特許出願公開第２０１４／０９４５９４号明細書（２０１４年１２月２３日出願）およびＰＣＴ／中国特許出願公開第２０１４／０９４５９３号明細書（２０１４年１２月２３日出願）の利益を主張するものであり、いずれも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、多糖類の分野に属する。より具体的には、本開示は、低分子量の不溶性セルロースおよびその合成のための酵素反応物に関する。本開示はまた、粘度調節および膜形成などの様々な用途でのセルロースの使用に関する。
【０００３】
電子的手段によって提出された配列表の参照
配列表の認証謄本が、２０１５年１２月９日作成のＣＬ６３９２ＷＯＰＣＴ２＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５というファイル名の、３９．４キロバイトのサイズを有するＡＳＣＩＩフォーマットの配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出され、本明細書と同時に出願される。このＡＳＣＩＩフォーマットの文書に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
酵素合成または遺伝子工学により、新しい構造多糖類を見出すという要求の高まりから、研究者は、生分解性でありかつ継続的に供給可能な材料から経済的に製造できる多糖類を見出した。そのような多糖類の１つが、セルロース、すなわちベータ−１，４−グリコシド結合を有することを特徴とするグルカンポリマーである。
【０００５】
微結晶セルロース（ＭＣＣ）は、有機および無機汚染物質を実質的に含まない、白色、無臭、無味で比較的自由に流動する結晶性粉末である。それは、繊維質の植物材料（例えば、木材）からパルプとして得られるアルファセルロースを、通常、鉱酸で加水分解することによって得られる、精製されかつ部分的に解重合されたセルロースである。ＭＣＣは、セルロース材料の非晶質（繊維状セルロース）領域を除去することによって得られる結晶性一次凝集体からなる高結晶性の粒子状セルロースである。ＭＣＣは、食品、医薬品および化粧品などの様々な用途に使用される。ＭＣＣが様々な用途に使用されているにもかかわらず、この種のセルロースの製造は困難かつ高価である。また、ＭＣＣの活性化には高い剪断を必要とする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
様々な用途でその潜在的有用性を示す新しい形態のセルロースを開発することが要望されている。新規の酵素法の開発は、新しい型のセルロース材料を製造するうえで有用な手段になるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一実施形態において、本開示は、水、グルコース−１−リン酸、セロデキストリン、および不溶性セルロースを合成するセロデキストリンホスホリラーゼ酵素を含む酵素反応物に関する。
【０００８】
他の実施形態では、セロデキストリンホスホリラーゼ酵素は、配列番号２または配列番号６と少なくとも９０％相同のアミノ酸配列を含み、かつ不溶性セルロースを合成する。
【０００９】
他の実施形態では、セルロースの重量平均重合度（ＤＰｗ）は、（ｉ）約１０〜約３０または（ｉｉ）約１０〜約１０００である。
【００１０】
他の実施形態では、セロデキストリンは、セロビオースを含む。
【００１１】
他の実施形態では、本開示は不溶性セルロースを製造する方法に関する。この方法は、ａ）少なくとも水、グルコース−１−リン酸、セロデキストリン、およびセロデキストリンホスホリラーゼ酵素、例えば、配列番号２または配列番号６と少なくとも９０％相同のアミノ酸配列を含む酵素を接触させる工程であって、不溶性セルロースが生成される、工程と、ｂ）任意選択により、工程（ａ）で生成される不溶性セルロースを分離する工程とを含む。
【００１２】
他の実施形態では、本方法の工程（ａ）で生成されるセルロースは、（ｉ）約１０〜約３０または（ｉｉ）約１０〜約１０００の重量平均重合度（ＤＰｗ）を有する。他の実施形態では、本方法の工程（ａ）で生成されるセルロースは、セルロースＩＩ型結晶構造を有する。
【００１３】
他の実施形態では、本方法で使用されるセロデキストリンは、セロビオースを含む。
【００１４】
他の実施形態では、グルコース−１−リン酸は、本方法の工程（ａ）において第２の反応を行うことによって供給され、第２の反応の生成物は、グルコース−１−リン酸を含む。他の実施形態では、第２の反応は、（ｉ）水、無機リン酸塩、デンプン、デンプンホスホリラーゼ、および任意選択によりデンプン脱分枝酵素、例えばプルラナーゼまたはイソアミラーゼを接触させるか、（ｉｉ）水、無機リン酸塩、スクロース、およびスクロースホスホリラーゼ酵素を接触させるか、または（ｉｉｉ）水、無機リン酸塩、セルロースバイオマス、エンドグルカナーゼ、セロデキストリンホスホリラーゼ、ならびに任意選択により溶解性多糖類モノオキシゲナーゼおよび／またはセロビオヒドロラーゼを接触させることによってグルコース−１−リン酸を生成する。他の実施形態では、第２の反応は、工程（ａ）が実施される容器と同じ容器で行われ、第２の反応は、工程（ａ）の前におよび／または工程（ａ）に続いて実施される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）を使用して、ルミノコッカス・チャンパネレンス（Ｒ．ｃｈａｍｐａｎｅｌｌｅｎｓｉｓ）セロデキストリンホスホリラーゼ酵素により合成された不溶性セルロースのコロイド分散液を乾燥して作製された薄膜を分析した。シート構造の厚さは約５ｎｍである。実施例４を参照。
【図１Ｂ】原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）を使用して、ビブリオ・ルバー（Ｖ．ｒｕｂｅｒ）セロデキストリンホスホリラーゼ酵素により合成された不溶性セルロースのコロイド分散液を乾燥して作製された薄膜を分析した。シート構造の厚さは約４．８ｎｍである。実施例４を参照。
【図２】ルミノコッカス・チャンパネレンス（Ｒ．ｃｈａｍｐａｎｅｌｌｅｎｓｉｓ）セロデキストリンホスホリラーゼ（青色ダイヤモンド形、試料１、２．５ｗｔ％（水中））、またはビブリオ・ルバー（Ｖ．ｒｕｂｅｒ）セロデキストリンホスホリラーゼ（赤色四角、試料２、１．７ｗｔ％（水中））により合成された不溶性セルロース材料のコロイド分散液について測定された粘度対剪断速度である。実施例４を参照。
【図３】ルミノコッカス・チャンパネレンス（Ｒ．ｃｈａｍｐａｎｅｌｌｅｎｓｉｓ）セロデキストリンホスホリラーゼ（２．５ｗｔ％（水中））、またはビブリオ・ルバー（Ｖ．ｒｕｂｅｒ）セロデキストリンホスホリラーゼ（１．７ｗｔ％（水中））により合成された不溶性セルロース材料のコロイド分散液について測定された粘度と比較した、種々の商業的に入手可能な水溶性多糖類（カルボキシメチルセルロース［ＣＭＣ］およびスクレログルカン）の水中での粘度である。ＤＰｗ３２００および２０００のＣＭＣはＣＰ  Ｋｅｌｃｏ製であり、ＤＰｗ５０、３６０および１２００のＣＭＣは、ＣＰ  Ｋｅｌｃｏ製のＦＩＮＮＦＩＸという商標名のＣＭＣであった。スクレログルカンはＣａｒｇｉｌｌ（ＡＣＴＩＧＵＭ）製であった。粘度は、１０  １／ｓの剪断速度での測定を報告する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
【表１】
0006770519.tif 000002
【００１７】
引用する全ての特許文献および非特許文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００１８】
別段の開示がなされていなければ、本明細書で使用される用語「１つの（ａ）］および「１つの（ａｎ）」は、１つ以上の（すなわち、少なくとも１つの）参照されるものを包含するものとする。
【００１９】
存在する場合、特に明記されていなければ、全ての範囲は包括的かつ結合可能である。例えば、「１〜５」と記載されているとき、記載範囲は「１〜４」、「１〜３」、「１〜２」、「１〜２および４〜５」、「１〜３および５」などの範囲を含むと解釈されるべきである。
【００２０】
用語「セロデキストリンホスホリラーゼ」、「セロデキストリンホスホリラーゼ酵素」などは、本明細書では同義語として使用される。セロデキストリンホスホリラーゼは、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ（ＥＣ）番号２．４．１．４９のものであり、ＣＡＺｙ（糖質関連酵素）データベースによれば、グリコシルヒドロラーゼファミリー９４（ＧＨ９４）に属する。セロデキストリンホスホリラーゼは可逆的にアルファ−Ｄ−グルコース−１−リン酸およびセロデキストリン（基質）からのセルロースおよび遊離リン酸（生成物）の合成を触媒することができる。そのような反応は、グルコース−１−リン酸＋（１，４−ベータ−Ｄ−グルコシル）ｎ−１→（１，４−ベータ−グルコシル）ｎ＋リン酸と記述することができ、「（１，４−ベータ−Ｄ−グルコシル）ｎ−１」はセロデキストリンであり、「（１，４−ベータ−グルコシル）ｎ」はセルロースである。本明細書に記載のある態様では、セロデキストリンホスホリラーゼは、水性組成物に不溶な低分子量のセルロース（例えば、ＤＰｗが１０〜３０）を合成することができる。本明細書に記載のある態様では、セロデキストリンホスホリラーゼは、配列番号２または６と少なくとも９０％相同のアミノ酸配列を含む。
【００２１】
「セルロース」という用語は、ベータ−１，４−結合Ｄ−グルコースモノマー単位の直鎖を有するグルカン多糖類を指す。セルロースは、場合により（１，４−ベータ−Ｄ−グルコシル）ｎと表され得る。ここで、ｎは本明細書で開示の低分子量セルロースのＤＰｗ値と同じ値（例えば、１０〜３０）であり得る。本明細書では、「グルカン」という用語は、グリコシド結合の１種である、グルコシド結合により結合したＤ−グルコースモノマーの多糖を指す。
【００２２】
本明細書では、「セルロースＩＩ型構造」、「セルロースＩＩ型結晶構造」、「セルロースＩＩ型」などは、同義語として使用される。セルロースＩＩ型構造は、例えばＫｏｌｐａｋ  ａｎｄ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ９：２７３−２７８）およびＫｒｏｏｎ−Ｂａｔｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｋｒｏｏｎ（Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊ．１４：６７７−６９０）で報告されており、いずれも参照により本明細書に組み込まれる。セルロースＩＩ型構造を特徴付ける支配的な水素結合は、Ｏ２−Ｈ−−−Ｏ６、Ｏ６−Ｈ−−−Ｏ６およびＯ２−Ｈ−−−Ｏ２であるが、セルロースＩ型は支配的な水素結合としてＯ２−Ｈ−−−Ｏ６を有する。セルロースＩＩ型の構造は、鎖の折り畳みを含み、解くのは困難である。セルロースＩＩ型は逆平行鎖を含むが、対照的にセルロースＩ型の鎖は平行である。
【００２３】
本明細書では、「グリコシド結合（ｌｉｎｋａｇｅ）」、「グリコシド結合（ｂｏｎｄ）」などの用語は同義語として使用され、炭水化物分子を他の炭水化物分子に結合する共有結合を指す。「グルコシド結合（ｌｉｎｋａｇｅ）」、「グルコシド結合（ｂｏｎｄ）」などの用語は同義語として使用され、グルカン中の２つのグルコース分子間のグリコシド結合を指す。本明細書で使用する「ベータ−１，４−グルコシド結合」という用語は、グルカン中の隣接するグルコース分子の炭素１および４を介してグルコース分子を互いに結合する共有結合を指す。
【００２４】
本明細書では、セルロースのグリコシド結合プロファイルは、当該技術分野で知られている任意の方法を使用して決定することができる。例えば、結合プロファイルは、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法を使用する方法（例えば、１３Ｃ  ＮＭＲまたは１Ｈ  ＮＭＲ）により決定することができる。使用可能なこれらの方法および他の方法は、Ｆｏｏｄ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｓ．Ｗ．Ｃｕｉ．Ｅｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３，Ｓ．Ｗ．Ｃｕｉ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｇｒｏｕｐ  ＬＬＣ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，２００５）に開示されており、この文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【００２５】
本明細書では、セルロースなどのサッカライドポリマーの「分子量」は、数平均分子量（Ｍｎ）として、または重量平均分子量（Ｍｗ）として表すことができ、その単位はダルトンまたはグラム／モルである。あるいは、分子量は、ＤＰｗ（重量平均重合度）またはＤＰｎ（数平均重合度）として表すことができる。当該技術分野では、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、またはゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を用いる、これらの分子量測定値を算出する各種の手段が知られている。
【００２６】
本明細書で使用される「セロデキストリン」という用語は、２つ以上のベータ−１，４−結合グルコースモノマーの長さを有する、１種以上のグルコースポリマーを指す。セロデキストリンは、通常、セルロースの（酵素）加水分解により生成される。「セロビオース」は、のベータ−１，４−結合グルコースモノマーを含むセロデキストリンの１種である（すなわち、セロビオースは二糖類の１種である）。
【００２７】
本明細書で使用される「グルコース−１−リン酸」（Ｇ１Ｐ）は、１−炭素にリン酸基を有するグルコース分子を指す。本明細書に記載のＧ１Ｐはアルファ−Ｄ−グルコース−１−リン酸であり得る。
【００２８】
「酵素反応」、「セロデキストリンホスホリラーゼ反応」などの用語は、本明細書では同義語として使用され、特に明記されていなければ、セロデキストリンホスホリラーゼ酵素によりなされる反応を指す。酵素反応物は、一般に、水、グルコース−１−リン酸およびセロデキストリン（例えば、セロビオース）、ならびに任意選択により他の成分を含む溶液中に、少なくとも１種の活性なセロデキストリンホスホリラーゼ酵素を含む溶液を指す。水、グルコース−１−リン酸、セロデキストリンおよびセロデキストリンホスホリラーゼ酵素の接触工程が行われるのは、セロデキストリンホスホリラーゼ反応物においてである。「適切な反応条件下で」などの用語は、セロデキストリンホスホリラーゼ酵素の活性により、基質を低分子量の不溶性セルロースへ変換するのを支える反応条件を指す。本明細書に記載のセロデキストリンホスホリラーゼ反応物は天然には存在しない。セロデキストリンホスホリラーゼ反応物が不溶性セルロースを生成すると、そのようなセルロースが溶液外に存在することは理解されよう。
【００２９】
本明細書で使用される対照酵素反応物は、例えば、配列番号２または６と少なくとも９０％相同のアミノ酸配列を含まないセロデキストリンホスホリラーゼを用いる反応物を指し得る。対照反応溶液の他の全ての特徴（例えば、基質濃度、温度、ｐＨ、時間）は、それと比較される反応物と同じにすることができる。
【００３０】
本明細書で使用される「第２の反応物」は、セロデキストリンホスホリラーゼ反応物（「第１の反応物」）に追加され、第１の反応物にＧ１Ｐ基質を提供する反応物を指す。
【００３１】
「Ｐｉ」と表記し得る「無機ホスフェート」は、溶液中における遊離リン酸イオンを指し、種々のリン酸エステルにおいて結合しているリン酸とは区別される。
【００３２】
「Ｇ１Ｐ−生成酵素」は、少なくとも１種の生成物がＧ１Ｐである生成物の合成を触媒する酵素を指し得る。Ｇ１Ｐ生成酵素の例としては、デンプンホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼおよびセロデキストリンホスホリラーゼ（上記反応を逆方向に触媒する場合、すなわちセルロースの加水分解）が挙げられる。
【００３３】
本明細書で使用される「デンプンホスホリラーゼ」は、ＥＣ番号２．４．１．１のものであり、デンプンおよび無機リン酸からグルコース−１−リン酸への変換を触媒することができる。そのような反応は、以下のように記述することもできる：（１，４−アルファ−Ｄ−グルコシル）ｎ＋リン酸→（１，４−アルファ−Ｄ−グルコシル）ｎ−１＋アルファ−Ｄ−グルコース−１−リン酸（但し、「（１，４−アルファ−Ｄ−グルコシル）ｎ」はデンプンを指す）。
【００３４】
本明細書で使用される「デンプン脱分岐酵素」は、デンプンの分岐点である１，６−アルファ−Ｄ−グルコシド結合の加水分解を触媒することができる酵素を指す。本明細書に記載のデンプン脱分岐酵素の例としては、プルラナーゼおよびイソアミラーゼが挙げられる。本明細書で使用される「プルラナーゼ」は、ＥＣ番号３．２．１．４１のものである。本明細書で使用される「イソアミラーゼ」は、ＥＣ番号３．２．１．６８のものである。
【００３５】
本明細書では、「スクロース」という用語は、α−１，２−グリコシド結合により結合した、アルファ−Ｄ−グルコース分子およびベータ−Ｄ−フルクトース分子からなる非還元性二糖類を指す。スクロースは、通常、食卓砂糖として知られている。
【００３６】
本明細書で使用される「スクロースホスホリラーゼ」は、ＥＣ番号２．４．１．７のものであり、スクロースおよびリン酸からフルクトースおよびＧ１Ｐへの変換を触媒することができる。そのような反応は、以下のように記述することもできる：スクロース＋リン酸→フルクトース＋アルファ−Ｄ−グルコース−１−リン酸。
【００３７】
本明細書では、「セルロース系バイオマス」、「セルロース含有バイオマス」などは同義語として使用され、食品成分または醗酵基質として直接使用することができない、植物の構造部分（例えば、木部、茎）を含む材料を指す。
【００３８】
本明細書では、「エンドグルカナーゼ」および「ベータ−１，４−エンドグルカナーゼ」は同義語として使用され、セルロース鎖の内部結合を切断し、セルロース鎖をより短くすることができる酵素を指す。そのようなより短い鎖は、上記反応を逆向きに触媒する場合（すなわち、セルロースの加水分解）には、セロデキストリンホスホリラーゼにとって適切な基質となる。
【００３９】
「体積パーセント（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｂｙ  ｖｏｌｕｍｅ）」、「体積パーセント（ｖｏｌｕｍｅ  ｐｅｒｃｅｎｔ）」、「ｖｏｌ％」、「ｖ／ｖ％」などの用語は、本明細書では同義語として使用される。溶液中の溶質の体積パーセントは、次式を用いて決定することができる：［（溶質の体積）／（溶液の体積）］×１００％。
【００４０】
「重量パーセント（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｂｙ  ｗｅｉｇｈｔ）」、「重量パーセント（ｗｅｉｇｈｔ  ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ）（ｗｔ％）」、「重量−重量パーセント（％ｗ／ｗ）」などは、本明細書では同義語として使用される。物質の重量パーセントは、物質が組成物、混合物または溶液中に含まれる際の質量基準のパーセントを指す。
【００４１】
本明細書で使用される「増加した」という用語は、増加した量または活性が比較される量または活性より、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、５０％、１００％または２００％多い量または活性を指し得る。本明細書では、「増加した」、「高められた」、「優れた」、「より大きい」、「改善された」などの用語は同義語として使用される。
【００４２】
本明細書では、「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」などの用語は同義語として使用される。これらの用語はヌクレオチド配列などを包含する。ポリヌクレオチドは、場合により、合成の、非天然の、または改変されたヌクレオチド塩基を含有する、一本鎖または二本鎖のＤＮＡポリマーまたはＲＮＡポリマーであり得る。ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはこれらの混合物の１つ以上のセグメントから構成され得る。
【００４３】
本明細書で使用される「遺伝子」という用語は、コード領域からＲＮＡ（ＲＮＡはＤＮＡポリヌクレオチド配列から転写される）を発現するポリヌクレオチド配列を指し、このＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（タンパク質をコードする）または非タンパク質コードＲＮＡであり得る。遺伝子はコード領域のみを指し得、コード領域の上流および／または下流の調節配列（例えば、プロモーター、５’−非翻訳領域、３’−転写終結領域）を含み得る。本明細書では、タンパク質をコードするコード領域を、また、「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）と呼び得る。「天然の」または「内在性の」遺伝子は、それ自体の調節配列とともに天然に見出されたままの遺伝子を指し；そのような遺伝子は宿主細胞のゲノムの本来の場所に位置する。「キメラ」遺伝子は、天然には一緒に見出されることがない（すなわち、調節領域およびコード領域は互いに非相同である）調節配列およびコード配列を含む、天然遺伝子でない遺伝子を指す。したがって、キメラ遺伝子は、異なる起源から誘導される調節配列およびコード配列、または同一起源から誘導される調節配列およびコード配列を含み得るが、天然に見出されるのと異なる方法で配置される。「外来」または「異種」遺伝子は、遺伝子導入によって宿主有機体に導入された遺伝子を指す。外来／異種遺伝子は、非天然有機体に挿入された天然遺伝子、天然宿主の新たな場所に導入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含むことができる。本明細書で開示されるある態様では、ポリヌクレオチド配列は異種である。「導入遺伝子」は、遺伝子導入手順（例えば、形質転換）によりゲノムに導入された遺伝子である。「コドン最適化」オープンリーディングフレームは、宿主細胞の好ましいコドン使用頻度を模倣するよう設計されたコドン使用頻度を有する。
【００４４】
本明細書に記載の細胞または有機体に含まれる「非天然の」アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列は、そのような細胞または有機体の天然の（自然の）カウンターパート中では生じない。
【００４５】
本明細書で使用される「調節配列」は、遺伝子の転写開始部位の上流に位置するヌクレオチド配列（例えば、プロモーター）、５’非翻訳領域、イントロンおよび３’非コード領域を指し、遺伝子から転写されるＲＮＡの転写、プロセシングもしくは安定性、および／または翻訳に影響を及ぼし得る。本明細書に記載の調節配列としては、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、５’非翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、ステムループ構造、および遺伝発現の調節に関与する他の要素が挙げられる。本明細書に記載の１種以上の調節エレメント（例えば、プロモーター）は、本明細書では、コード領域に対して異種であり得る。
【００４６】
本明細書で使用される「機能可能に結合される」という用語は、一方の機能が他方により影響されるような２つ以上の核酸配列の結合を指す。例えば、プロモーターがコード配列の発現に影響を及ぼすことができるとき、それはコード配列に機能可能に結合している。すなわち、コード配列はプロモーターの転写調節下にある。コード配列は、例えば、１つ（例えば、プロモーター）またはそれを超える（例えば、プロモーターおよびターミネーター）調節配列と機能可能に結合することができる。
【００４７】
「組み換え」という用語は、プラスミド、ベクターまたはコンストラクトなどのＤＮＡ配列を特徴付けるために本明細書で使用されるとき、そうしなければ配列の２つの別々のセグメントであったものを、例えば化学合成により、および／または核酸の分離したセグメントを遺伝子工学の手法で操作することにより人工的に組み合わせることを指す。本明細書に記載の、組み換えコンストラクト／ベクターを調製する方法は、例えばＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒｕｓｓｅｌｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１）；Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８４）；およびＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，２００２）により記載される、標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術に従って行うことができる。
【００４８】
本明細書で使用される「形質転換」という用語は、任意の方法により核酸分子を宿主有機体または宿主細胞に移行させることを指す。有機体／細胞に形質転換された核酸分子は、有機体／細胞中で自律的に複製するもの、有機体／細胞のゲノムに組み込まれるもの、または複製もしくは組み込みされずに細胞内に一時的に存在するものであり得る。形質転換に適した核酸分子の非限定的な例は、プラスミドおよび直鎖状ＤＮＡ分子など、本明細書に開示されている。形質転換核酸配列を含有する、本明細書に記載の宿主有機体／細胞は、例えば、「トランスジェニックの」、「組み換えの」、「形質転換されている」、遺伝子操作されている、「形質転換体」、および／または「外因性遺伝子発現のために改変され」ていると称することができる。
【００４９】
ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列に関して、本明細書で使用される「配列相同性」または「相同性」という用語は、特定の比較窓上で最大の一致が得られるよう整列させたときに同一である２つの配列中の核酸塩基またはアミノ酸残基を指す。したがって、「配列相同性のパーセント」または「パーセント相同性」は、比較窓上で最適に整列させた２つの配列を比較することにより決定された値を指すが、比較窓内のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列部分は、２つの配列の最適なアライメントのために参照配列（これは付加または欠失を含まない）と比較すると、付加または欠失（すなわちギャップ）を含み得る。パーセントは、両配列で同じ核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定して、一致した位置の数を得、その一致した位置の数を比較窓内の位置の総数で除し、かつその結果に１００を乗じて、配列相同性のパーセントを得ることにより算出することができる。ＤＮＡ配列とＲＮＡ配列との間の配列相同性を計算するとき、ＤＮＡ配列のＴ残基は、ＲＮＡ配列のＵ残基と合致し、したがってＲＮＡ配列のＵ残基と「同一である」と見なし得ることは理解されよう。第１および第２のポリヌクレオチドの「パーセント相補性」を決定する目的では、これは、（ｉ）例えば、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの相補配列間のパーセント相同性（逆も同じ）、および／または（ｉｉ）標準的なワトソン・クリック塩基対を形成するであろう第１および第２のポリヌクレオチド間の塩基のパーセントを決定することにより得ることができる。
【００５０】
オンラインにより全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）ウェブサイトで利用できるＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）のアルゴリズムが、例えば、本明細書で開示される、２つ以上のポリヌクレオチド配列（ＢＬＡＳＴＮアルゴリズム）またはポリペプチド配列（ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム）間のパーセント相同性を測定するために使用することができる。あるいは、配列間のパーセント相同性は、Ｃｌｕｓｔａｌアルゴリズム（例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＣｌｕｓｔａｌＶ、またはＣｌｕｓｔａｌ−Ｏｍｅｇａ）を使用して行うことができる。Ｃｌｕｓｔａｌアライメント法を使用するマルチプルアライメントでは、既定値はＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に対応し得る。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用するペアワイズ整列およびタンパク質配列のパーセント相同性計算のための既定のパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５であり得る。核酸では、これらのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝４であり得る。あるいはさらに、配列間のパーセント相同性は、ＢＬＯＳＵＭマトリックス（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２）を使用し、ＧＡＰ  ＯＰＥＮ＝１０、ＧＡＰ  ＥＸＴＥＮＤ＝０．５、ＥＮＤ  ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝ｆａｌｓｅ、ＥＮＤ  ＧＡＰ  ＯＰＥＮ＝１０、ＥＮＤ  ＧＡＰ  ＥＸＴＥＮＤ＝０．５などのパラメータでＥＭＢＯＳＳアルゴリズム（例えばｎｅｅｄｌｅ）を使用して行い得る。
【００５１】
種々のポリペプチドアミノ酸配列およびポリヌクレオチド配列が、ある態様の特徴として本明細書で開示されている。本明細書で開示される配列に対して少なくとも約７０〜８５％、８５〜９０％または９０％〜９５％相同である、これらの配列の変異型を使用することができる。あるいは、変異型アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列は、本明細書で開示される配列に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有することができる。変異型アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列は、開示した配列と同一の機能／活性、または開示した配列の少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の機能／活性を有する。メチオニンで始まらない、本明細書に開示のポリペプチドアミノ酸配列はいずれも、通常、アミノ酸配列のＮ末端に少なくとも開始メチオニンをさらに含むことができる。メチオニンで始まる、本明細書に開示のポリペプチドアミノ酸配列はいずれも、場合により、このメチオニン残基なしで考えることができる（すなわち、ポリペプチド配列は、配列のＣ−末端残基の２位の残基に関して参照することができる）。
【００５２】
本明細書で使用される「分離された」という用語は、完全にまたは部分的に精製されたポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはセルロース物質を指す。いくつかの例では、分離されたポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはセルロース材料は、より大きい組成物、バッファ系または試薬混合物の一部である。例えば、分離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチド分子は、細胞または有機体の内部に異種的に含まれ得る。そのような異種構成要素および／または１つ以上の遺伝子欠失を含む細胞または有機体は、天然には存在しない。他の例には、分離されたセロデキストリンホスホリラーゼ酵素または反応物がある。本明細書に記載のセルロース組成物、ならびにこれらの組成物を製造するために使用される酵素および反応物は、合成物／人工物であり、かつ／または天然では存在しないと考えられる特性を示す。
【００５３】
本明細書に記載の「水性組成物」は、例えば、少なくとも約１０ｗｔ％の水を含む液体成分を有す。水性組成物の例としては、例えば、混合物、溶液、分散液（例えば、コロイド分散液）、懸濁物および乳化物が挙げられる。ある実施形態では、水性組成物は、本明細書に開示されている不溶性セルロースを含むことができ、この場合、セルロースが不溶性であるとすると、水性組成物は、場合により、液体中固体組成物と見なすことができる。
【００５４】
本明細書で使用されるとき、「コロイド分散液」という用語は、分散相および分散媒体を有する不均一系を、すなわち、微視的に分散した不溶性粒子が別の物質（例えば、水または水性溶液などの水性組成物）全体に懸濁していることを指す。本明細書に記載のコロイド分散液の例は、親水コロイドである。親水コロイドなどのコロイド分散液の粒子の全てまたは一部は、本開示のセルロースを含むことができる。「ディスパーサント」および「分散剤」という用語は、本明細書では、同義語として使用され、分散液の生成および／または安定性を促進する物質を指す。
【００５５】
「親水コロイド」および「ハイドロゲル」という用語は、本明細書では、同義語として使用される。親水コロイドは、水または水性溶液が分散媒体であるコロイド系を指す。
【００５６】
「水性溶液」という用語は、本明細書では、溶媒が水を含む溶液を指す。水性溶液は、本明細書に記載のある態様では、ディスパーサントとしての役割を果たし得る。ある実施形態では、セルロースは、水性溶液に分散または混合することができる。
【００５７】
本明細書で使用される「粘度」という用語は、親水コロイドなどの流体または水性組成物の、それを流れさせようとする力に抵抗する程度の測定値を指す。本明細書で使用することができる粘度の各種単位としては、センチポアズ（ｃＰｓ）およびパスカル−秒（Ｐａ・ｓ）が挙げられる。センチポアズはポアズの１００分の１であり、１ポアズは０．１００ｋｇ・ｍ−１・ｓ−１、または１ｍＰａ・ｓである。したがって、本明細書で使用される「粘度モディファイアー」、「粘度調節剤」などの用語は、流体または水性組成物の粘度を変化／調節することができる任意のものを指す。
【００５８】
本明細書で使用される「ずり減粘挙動」という用語は、剪断速度が増大するときの、水性組成物の粘度の減少を指す。「剪断速度」は、本明細書では、水性組成物に進行的な剪断変形が加えられる速度を指す。剪断変形は、例えば、回転により加えることができる。
【００５９】
水性組成物の粘度を増加させる方法に関して、本明細書で使用される「接触」という用語は、水性組成物に本開示のセルロースを取り込むことにつながるあらゆる作用を指す。接触は、例えば、混合、振盪または均質化など、当該技術分野で知られている任意の手段により行うことができる。
【００６０】
本明細書で使用される「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシドを指し、これは式（ＣＨ３）２ＳＯで表される。
【００６１】
本明細書で使用される「ＤＭＡｃ」はＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドを指し、これは式ＣＨ３ＣＯＮ（ＣＨ３）２の化学式で表される。
【００６２】
本明細書では、「マーセル化」、「マーセル化プロセス」などの用語は同義語として使用され、セルロース材料を、通常水酸化ナトリウムを含む苛性アルカリ条件下で処理するプロセスを指す。本明細書中のある態様で開示されるセルロースは、マーセル化されていない。
【００６３】
本明細書では、「誘導体化」、「誘導体化プロセス」などの用語は、同義語として使用され、１つ以上のセルロース−ＯＨ基の水素の異なる部分／官能基（例えば、カルボキシメチル基）による置換を導く条件下で、セルロース物質を処理するプロセスを指す。本明細書中のある実施形態で開示されるセルロースは、誘導体化されていない。
【００６４】
本明細書で使用される「膜」という用語は、薄い視覚的に連続した物質を指す。膜は材料の上に薄層またはコーティングとして構成されてもよく、また、単独であってもよい（例えば、材料表面に付着していない）。本明細書で使用される「コーティング」は材料表面を覆う薄層を指す。
【００６５】
本明細書に記載の膜またはコーティングを特徴付けるために使用される「一様な厚さ」という用語は、（ｉ）膜／コーティングの全領域の少なくとも２０％であり、かつ（ｉｉ）厚さの標準偏差が、例えば、約５０ｎｍ未満である連続領域を指し得る。
【００６６】
本明細書に記載の膜またはコーティングは、特定の物質に対して「低透過性」であると特徴付けることができる（その物質に対する膜／コーティングの透過性が、対象の技術分野で一般に割り当てられている閾値未満である場合）。説明のために、ＳＭＣ（スーパーマルチコート）剥離膜の分野では、スチレン透過性の閾値は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒ，５３ｒｄ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｐｒｅｐｒｉｎｔ  Ｎｏ．３２ｄ（Ｂｉｘｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｃｈａｅｌｓ，１９６４）に記載の方法を用いた測定で、２００×１０−９ｇ  ｃｍ／ｃｍ２／ｈである。膜またはコーティングは、長時間（例えば、１日以上）にわたって特定の物質を通過させない場合、その物質に対して「不透過性」であると特徴付けることができる。
【００６７】
様々な用途に潜在的有用性を付与する新しい形態のセルロースを開発することが望まれている。新規の酵素プロセスの開発は、新しい種類のセルロース材料を生成する有用な手段になる可能性がある。
【００６８】
本開示の実施形態は、少なくとも水、グルコース−１−リン酸、セロデキストリン、およびセルロースを合成するセロデキストリンホスホリラーゼ酵素を含む酵素反応物に関する。例えば、セロデキストリンホスホリラーゼ酵素は、（ｉ）配列番号２または配列番号６と少なくとも９０％相同のアミノ酸配列を含み、かつ（ｉｉ）セルロースを合成することができる。意義深いことに、そのような酵素反応により、乾燥および水性の両条件下で優れた特性を示す低分子量の不溶性セルロースを生成することが可能になり、そのようなセルロースを広汎な適用性を有するものとする。
【００６９】
ここに開示する酵素反応物での使用に適したセロデキストリンホスホリラーゼ活性を有する酵素は、例えば、配列番号２または配列番号６と少なくとも９０％相同のアミノ酸配列を含み得る。ある実施形態では、そのような酵素は、配列番号２または配列番号６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同のアミノ酸配列を含むか、またはそれから構成され得る。配列番号２を含むセロデキストリンホスホリラーゼ酵素の非限定的な例としては、配列番号４と１００％相同であるか、または少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％相同のアミノ酸配列を含むか、またはそれから構成されるセロデキストリンホスホリラーゼ酵素が挙げられる。配列番号６を含むセロデキストリンホスホリラーゼ酵素の非限定的な例としては、配列番号８と１００％相同であるか、または少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％相同のアミノ酸配列を含むか、またはそれから構成されるセロデキストリンホスホリラーゼ酵素が挙げられる。変異型セロデキストリンホスホリラーゼ酵素（例えば、配列番号２、４、６または８に対し９０〜９９％のアミノ酸相同性を有する参照配列）は、対応する非変異型参照配列の酵素活性（上記定義を参照）の一部（例えば、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％）または全部を有するであろう。
【００７０】
配列番号２または配列番号４をコードするポリヌクレオチド配列は、任意選択によりそれぞれ配列番号１または３と１００％相同であるか、または少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％相同のヌクレオチド配列を含んでもよい。配列番号６または配列番号８をコードするポリヌクレオチド配列は、任意選択によりそれぞれ配列番号５または７と１００％相同であるか、または少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％相同のヌクレオチド配列を含んでもよい。
【００７１】
あるアミノ酸が互いに類似した構造的特徴および／または電荷の特徴を共有する（すなわち、保存されている）場合、本明細書に記載のセロデキストリンホスホリラーゼ（および／または本明細書に記載の他のタイプのポリペプチド）の１個以上のアミノ酸は、以下のように、保存アミノ酸残基で置換されてもよい（「保存的アミノ酸置換」）：
１．次の小さな無極性の、または僅かに極性のある脂肪族残基は、互いに置換し得る：
Ａｌａ（Ａ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｇｌｙ（Ｇ）；
２．次の極性のある、負の電荷を有する残基、およびそれらのアミドは、互いに置換し得る：Ａｓｐ（Ｄ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｎ（Ｑ）；
３．次の極性のある、正の電荷を有する残基は、互いに置換し得る：Ｈｉｓ（Ｈ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｌｙｓ（Ｋ）；
４．次の無極性の脂肪族残基は、互いに置換し得る：Ａｌａ（Ａ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、および
５．以下の大きな芳香族残基は、互いに置換し得る：Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｔｒｐ（Ｗ）。
【００７２】
本明細書に記載のセロデキストリンホスホリラーゼ活性を有する酵素は、任意の微生物源、例えば、細菌または真菌（例えば、酵母）から得ることができる。適切な細菌の例としては、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）種およびルミノコッカス属（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）種が挙げられる。適切なビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）種の例としては、Ｖ．ルバー（Ｖ．ｒｕｂｅｒ）、コレラ菌（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）、Ｖ．アダプタツス（Ｖ．ａｄａｐｔａｔｕｓ）、Ｖ．アルギノリチカス（Ｖ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）、Ｖ．ミミカス（Ｖ．ｍｉｍｉｃｕｓ）、Ｖ．パラヘモリティカス（Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、Ｖ．プロテオリチカス（Ｖ．ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）、およびＶ．バルニフィカス（Ｖ．ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）が挙げられる。適切なルミノコッカス属（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）種の例としては、Ｒ．チャンパネレンス（Ｒ．ｃｈａｍｐａｎｅｌｌｅｎｓｉｓ）、Ｒ．アルブス（Ｒ．ａｌｂｕｓ）、Ｒ．ブロミイ（Ｒ．ｂｒｏｍｉｉ）、Ｒ．フラベファシエンス（Ｒ．ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｒ．グナバス（Ｒ．ｇｎａｖｕｓ）、Ｒ．ラクタリス（Ｒ．ｌａｃｔａｒｉｓ）、Ｒ．オベウム（Ｒ．ｏｂｅｕｍ）、およびＲ．トロクエス（Ｒ．ｔｏｒｑｕｅｓ）が挙げられる。
【００７３】
本明細書に記載のセロデキストリンホスホリラーゼ活性を有する酵素の例は、本明細書に開示されるアミノ酸配列、ならびにさらにＮ末端およびＣ末端に１〜３００（またはその範囲の任意の整数［例えば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０］）の残基を含むアミノ酸配列であり得る。そのような付加的残基は、例えば、（Ｎ末端またはＣ末端での）エピトープタグ（例えば、６個のヒスチジンなどのＨｉｓタグ）などの異種配列、または（Ｎ末端での）異種シグナルペプチドであり得る。異種アミノ酸配列がＮ末端で導入される実施形態では、そのような異種配列は、例えば、セロデキストリンホスホリラーゼの元の開始メチオニンに隣接してもよく、元の開始メチオニンに置き換わってもよい。後者の実施形態では、付加された異種配列のＮ末端に新しい開始メチオニンを使用することができる。
【００７４】
ここに開示するセロデキストリンホスホリラーゼ活性を有する酵素は、通常、Ｎ末端シグナルペプチドを欠く。しかしながら、セロデキストリンホスホリラーゼ酵素の発現系は、場合により、細胞外分泌を指示するＮ末端シグナルペプチドをコードする配列をさらに含む酵素コードポリヌクレオチドを使用することができる。そのような実施形態におけるシグナルペプチドは、分泌過程で酵素から切断される。本明細書に開示されるセロデキストリンホスホリラーゼ酵素（例えば、配列番号２および配列番号６）は、天然に発現するシグナルペプチドとは結合しないと考えられることから、付加されたシグナルペプチドは、酵素とは異種であると考えられ得る。本明細書において有用なシグナルペプチドの例は、細菌（例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、例えば、バチルス・ズブチルス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））由来のものである。細菌シグナルペプチドの例は、ａｐｒＥシグナルペプチド、例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（例えば、バチルス・ズブチルス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｖｏｇｔｅｎｔａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．５５：４０−５２を参照（この文献は参照により本明細書に組み込まれる））由来のものである。
【００７５】
いくつかの実施形態では、セロデキストリンホスホリラーゼ酵素は天然には存在せず、例えば、本明細書に記載の酵素は微生物から天然に分泌されるものではないと考えられる（本明細書に記載のセロデキストリンホスホリラーゼ酵素は、微生物から誘導されたものであろう）。
【００７６】
本明細書に記載のセロデキストリンホスホリラーゼ酵素は、適切に遺伝子操作された微生物株の発酵によって製造することができる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株（例えば、バチルス・ズブチルス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ならびにアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属種（例えば、アスペルギルス・アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ））およびトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属種（例えば、トリコデルマ・レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ））（例えば、Ａｄｒｉｏ  ａｎｄ  Ｄｅｍａｉｎ，Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ４：１１７−１３９を参照（この文献は参照により本明細書に組み込まれる））などの微生物株を用いる発酵による組み換え酵素の製造は、当該技術分野ではよく知られている。
【００７７】
本開示のセロデキストリンホスホリラーゼ酵素は、任意の精製状態（例えば、純粋、または非純粋）で使用し得る。例えば、セロデキストリンホスホリラーゼ酵素は、使用前に精製および／または分離することができる。非純粋のセロデキストリンホスホリラーゼ酵素の例としては、細胞溶解物形態のものが挙げられる。細胞溶解物または細胞抽出物は、酵素を異種発現させるために使用された細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））から調製することができる。例えば、細菌は、フレンチプレス細胞破砕機を用いて破砕することができる。代替の実施形態では、細菌は、ホモジナイザー（例えば、ＡＰＶ、Ｒａｎｎｉｅ、Ｇａｕｌｉｎ）を用いて均質化することができる。セロデキストリンホスホリラーゼ酵素は、通常、これらの調製物中に溶解する。本明細書中の細菌細胞の溶解物、抽出物またはホモジネート物は、本明細書に記載の酵素反応物中に約０．１５〜０．３体積％で使用することができる。他の実施形態では、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有する酵素は、発現後、分離することができる。例えば、酵素は、結合／洗浄法、または結合／洗浄／抽出法（例えば、他の固定表面のカラムに酵素を結合し、次いで、洗浄し、場合により、カラムまたは他の固定表面から酵素を溶出させる）により分離することができる。酵素の分離法は、ある実施形態では、異種アミノ酸配列タグを付したセロデキストリンホスホリラーゼ酵素を結合させる工程を含み得る。この場合、そうした結合は異種アミノ酸配列タグ（例えば、Ｈｉｓタグ）によって行われる。セロデキストリンホスホリラーゼ酵素は、例えば、細胞溶解物または他の任意の組成物（例えば、酵素が場合により分泌される培地）から分離することができる。ある態様では、セロデキストリンホスホリラーゼ調製物は、グルコース−１−リン酸活性を欠くことができる。ある態様では、セロデキストリンホスホリラーゼ酵素は、（例えば、マトリックスに）固定、または細胞表面に発現させることができる。ある態様では、セロデキストリンホスホリラーゼ酵素は、例えば、任意選択によりポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾することができる。
【００７８】
本開示のセロデキストリンホスホリラーゼ酵素は、水性組成物に不溶な低分子量のセルロースを合成することができる。例えば、本明細書中の酵素反応に使用されるセロデキストリンホスホリラーゼは、低分子量の不溶性セルロースを生成することができる。
【００７９】
ある実施得形態では、セロデキストリンホスホリラーゼ酵素によって生成されるセルロースは、約１０〜１０００のＤＰｗまたはＤＰｎを有し得る。例えば、本明細書において、セルロースのＤＰｗまたはＤＰｎは、約１０〜５００、１０〜２５０、１０〜１００、１０〜７５、１０〜５０、１０〜４５、１０〜４０、１０〜３５、１０〜３０、１０〜２５、１５〜５０、１５〜４５、１５〜４０、１５〜３５、１５〜３０、もしくは１５〜２５であり得る。ある態様では、セルロースのＤＰｗまたはＤＰｎは、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０であるか、少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０であるか、または約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０未満であり得る。
【００８０】
ある態様では、セロデキストリンホスホリラーゼ酵素によって生成されるセルロースは、約１７００〜１７００００、１７００〜８６０００、１７００〜４３０００、１７００〜１７０００、１７００〜１３０００、１７００〜８５００、１７００〜６８００、１７００〜５１００、２５５０〜５１００、もしくは２５５０〜４２５０のＭｗを有し得る。ある態様では、Ｍｗは、約１７００、１９００、２１００、２３００、２５００、２７００、２９００、３１００、３３００、３５００、３７００、３９００、４１００、４３００、４５００、４７００、４９００、もしくは５１００、少なくとも約１７００、１９００、２１００、２３００、２５００、２７００、２９００、３１００、３３００、３５００、３７００、３９００、４１００、４３００、４５００、４７００、４９００、もしくは５１００、または約１７００、１９００、２１００、２３００、２５００、２７００、２９００、３１００、３３００、３５００、３７００、３９００、４１００、４３００、４５００、４７００、４９００、もしくは５１００未満であり得る。
【００８１】
本明細書では、セロデキストリンホスホリラーゼ酵素によって生成されるグリコシド結合の約１００％は、例えば、ベータ−１，４結合である。他の態様では、セルロースは、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のベータ−１，４結合のグリコシド結合プロファイルを有し得る。したがって、本明細書中、酵素により製造されるセルロースは、例えば、ベータ−１，４以外のグリコシド結合が、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％未満であり得る。
【００８２】
本明細書中、セロデキストリンホスホリラーゼ酵素により製造されるセルロースの主鎖は、直鎖状／非分岐状であり得る。あるいは、セルロースには、分岐があり得る。したがって、ある実施形態では、セルロースは、ポリマー中に、分岐点が、グリコシド結合の割合として、全くないか、または約５％、４％、３％、２％もしくは１％未満であり得る。
【００８３】
本明細書中のある態様では、セロデキストリンホスホリラーゼ酵素によって生成されるセルロースは、セルロースＩＩ型結晶構造を有し得る。例えば、本明細書中のセルロースは、セルロースＩＩ型結晶構造のセルロースを約１００重量％含み得る。他の例では、セルロースは、セルロースＩＩ型結晶構造のセルロースを少なくとも約８０重量％、８１重量％、８２重量％、８３重量％、８４重量％、８５重量％、８６重量％、８７重量％、８８重量％、８９重量％、９０重量％、９１重量％、９２重量％、９３重量％、９４重量％、９５重量％、９６重量％、９７重量％、９８重量％、もしくは９９重量％含み得る。いくつかの態様では、セルロースは、セルロースＩ型、ＩＩＩ型および／またはＩＶ型結晶構造のセルロース材料を約２０重量％、１９重量％、１８重量％、１７重量％、１６重量％、１５重量％、１４重量％、１３重量％、１２重量％、１１重量％、１０重量％、９重量％、８重量％、７重量％、６重量％、５重量％、４重量％、３重量％、２重量％、１重量％未満含み得る。セルロースＩＩ型結晶構造は、例えば、Ｋｏｌｐａｋ  ａｎｄ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ９：２７３−２７８）、およびＫｒｏｏｎ−Ｂａｔｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｋｒｏｏｎ（Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊ．１４：６７７−６９０）に記載されており、これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる。セルロースＩＩ型構造を特徴付ける支配的な水素結合は、Ｏ２−Ｈ−−−Ｏ６、Ｏ６−Ｈ−−−Ｏ６およびＯ２−Ｈ−−−Ｏ２であり、一方、セルロースＩ型は、支配的な水素結合としてＯ２−Ｈ−−−Ｏ６を有する。セルロースＩＩ型の構造は、鎖の折り畳み構造を含み、解くのは困難である。
【００８４】
セルロースは、本開示のセロデキストリンホスホリラーゼ酵素により、セルロースＩＩ型として直接生成される。ここに開示するセルロースと対照的に、天然に（例えば、植物中に）生成するセルロース（例えば、植物のセルロース）は、通常、セルロースＩ型構造を有し、一般に、セルロースＩＩ型へ変換するには、マーセル化および／または他の化学的処理（例えば、誘導体化後の非誘導体化、再生セルロースの生成）を必要とする。本明細書中のある実施形態では、セルロースは、水性および乾燥の両条件下でセルロースＩＩ型結晶状態にある。
【００８５】
本明細書において製造されるセルロースは、水などの水性溶媒に不溶である。しかしながら、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および／またはＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）を含む溶媒には溶解することができる。そのような溶媒の例としては、単独のＤＭＳＯもしくはＤＭＡｃの、または塩化リチウム（ＬｉＣｌ）をさらに含むＤＭＳＯまたはＤＭＡｃ（例えば、ＤＭＳＯ／ＬｉＣｌおよびＤＭＡｃ／ＬｉＣｌ）が挙げられる。本明細書において、ＤＭＳＯ／ＬｉＣｌ溶媒またはＤＭＳＯ／ＬｉＣｌ溶媒は、ＬｉＣｌを、例えば、約０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０ｗｔ％含むか、またはＬｉＣｌ飽和溶媒であり得る。本明細書において、セルロースの非水性溶媒、例えばＤＭＳＯおよび／またはＤＭＡｃを含む溶媒中の濃度は、例えば、約０．１〜３０ｗｔ％、０．１〜２０ｗｔ％、０．１〜１０ｗｔ％、もしくは０．１〜５ｗｔ％であるか、または約もしくは少なくとも約０．１、０．３、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、もしくは３０ｗｔ％であり得る。ある態様では、本明細書中のＤＭＳＯ含有溶媒およびＤＭＡｃ含有溶媒は、酸をさらに含まない。本明細書中のセルロースは、例えば、前述のＤＭＳＯをベースとした溶媒およびＤＭＡｃをベースとした溶媒のいずれにも、比較的低温で、例えば、１５〜３０℃、２０〜３０℃または２０〜２５℃（例えば、室温）で溶解することができる。好ましい実施形態では、セルロースの溶解に熱を加える必要はない。
【００８６】
本開示の酵素反応は、セロデキストリンを含む。本明細書中の酵素反応での使用に適したセロデキストリンの例としては、セロビオース（ＤＰ２）、セロトリオース（ＤＰ３）、セロテトラオース（ＤＰ４）、セロペンタオース（ＤＰ５）およびセロヘキサノース（ＤＰ６）が挙げられる。ある態様では、セロビオースがセロデキストリンとして使用される。本明細書において適したセロデキストリンの他の例としては、セルロースの分解（例えば、酵素による分解）により得られる７つ以上のベータ−１，４−結合グルコースモノマーからなるグルコースポリマーが挙げられる。いくつかの実施形態では、上記種類のセロデキストリンの１種以上（例えば、２、３、４または５つ以上の混合物）を使用することができる。本明細書に記載の酵素反応物では、非リン酸化グルコースモノマーは、通常、使用されない。
【００８７】
セロデキストリンホスホリラーゼ酵素を含む本明細書に記載の酵素反応物の温度は、必要に応じて調節することができる。ある実施形態では、温度は、約５℃〜約５０℃である。ある他の実施形態では、温度は、約２０℃〜約４０℃である。さらに他の実施形態では、温度は、約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０℃であってよい。酵素反応物の温度は、当該技術分野で知られている種々の手段により維持することができる。例えば、温度は、所望の温度に設定した空気または水浴インキュベーターに反応物を含む容器を置くことによって維持することができる。
【００８８】
本明細書中のある実施形態では、酵素反応物のｐＨは約５．０〜約９．０であり得る。あるいは、ｐＨは、約５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、または９．０であり得る。ｐＨは、適切なバッファ、例えば、限定はされないが、リン酸塩、トリス、クエン酸塩、またはそれらの組み合わせを添加または導入することによって調節または制御することができる。酵素反応物におけるバッファ濃度は、例えば、０ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約１０、２５、５０もしくは７５ｍＭであり得る。
【００８９】
ここに開示するセロデキストリンホスホリラーゼ反応物におけるグルコース−１−リン酸（Ｇ１Ｐ）の初期濃度は、例えば、約または少なくとも約１〜１００ｍＭであり得る。その他のＧＩＰ初期濃度は、例えば、約または少なくとも約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００ｍＭ、または約１０〜５０ｍＭであり得る。ここに開示するセロデキストリンホスホリラーゼ反応物におけるセロデキストリン（例えば、セロビオース）ホスホリラーゼの初期濃度は、例えば、約１〜５０ｍＭであり得る。その他のセロデキストリンの初期濃度は、例えば、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０ｍＭ、または約５〜１０ｍＭであり得る。Ｇ１Ｐまたはセロデキストリンなどの基質の「初期濃度」は、全ての反応成分が添加された直後の酵素反応物（少なくとも、水、ＧＩＰ、セロデキストリン、セロデキストリンホスホリラーゼ酵素）における基質濃度を指す。
【００９０】
本明細書中のセロデキストリンホスホリラーゼ酵素の活性は、ある実施形態では、酵素タンパク質１ｍｇ当たり約１〜３０単位であり得る。酵素活性は、例えば、酵素タンパク質１ｍｇ当たり約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、１０〜２０、または１５〜２０単位であり得る。セロデキストリンホスホリラーゼ酵素活性は、当該技術分野で知られている任意の方法で決定することができる。セロデキストリンホスホリラーゼ活性の１単位は、例えば、以下の条件下、１分当たり１マイクロモルの無機リンを放出する（セロビオースからから放出される）酵素量を指す：Ｇ１Ｐ約１０ｍＭ、セロビオース約５ｍＭ、トリスＨＣｌバッファ約２５ｍＭ、約ｐＨ７．０、約３７℃で保持、場合により１０分間。セロビオースからの無機リン酸塩の放出は、遊離リン酸塩を検出するように設計された試薬またはキット（例えば、ＰｉＢｌｕｅＴＭＰｈｏｓｐｈａｔｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）を用いて測定することができる。
【００９１】
ある態様では、酵素反応に含まれるセロデキストリンホスホリラーゼ酵素の量は、約０．１〜２．０または０．５〜１．０単位／ｍＬであり得る。例えば、少なくとも約０．２、０．４、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、または２．０単位／ｍＬの酵素を反応物に使用することができる。
【００９２】
本開示の実施形態は、また、セルロースを製造する方法であって、
ａ）少なくとも水、グルコース−１−リン酸、セロデキストリン、およびセロデキストリンホスホリラーゼ酵素（例えば、配列番号２または配列番号６と少なくとも９０％相同のアミノ酸配列を含むもの）を接触させる工程であって、不溶性セルロースが生成される、工程と、
ｂ）任意選択により、工程（ａ）で生成された不溶性セルロースを分離する工程と
を含む方法に関する。
【００９３】
本明細書に記載の方法におけるセルロースを生成する接触工程は、場合により、本開示の、水、グルコース−１−リン酸、セロデキストリン、およびセロデキストリンホスホリラーゼ酵素を含む酵素反応物を供給する工程と見なすことができる。本明細書に記載のセルロース製造方法における接触工程は、様々な方法で行うことができる。例えば、所望する量のＧ１Ｐおよび／またはセロデキストリン（例えば、セロビオース）を、まず水に溶解し（任意選択により他の成分、例えばバッファ成分もこの調製段階で添加してもよい）、次いで、１種以上のセロデキストリンホスホリラーゼ酵素を添加することができる。反応は、例えば、静置してもよく、撹拌器またはオービタルシェーカーによって撹拌してもよい。反応は細胞フリーであってよく、通常、細胞フリーである。
【００９４】
セルロース製造方法の酵素反応物は、本明細書に開示される１以上の反応条件を適用するのに適した任意の容器に収容することができる。例えば、特定の反応物を収容するのに適した大きさのステンレス鋼、プラスチックまたはガラスからなる容器を使用することができる。そのような容器は、任意選択により撹拌装置を備えることができる。
【００９５】
ある実施形態では、セルロースの製造方法の終了は、視覚（例えば、不溶性セルロースの蓄積がもはや認められない）および／または反応物中に残存する基質（ＧＩＰおよび／またはセロデキストリン）量の測定（例えば、基質濃度が経時的にもはや減少しない）によって決定することができる。開示した方法の反応は、通常、完了するまでに、例えば、約１２、１８、２４、３０、３６、４８、６０、７２、８４または９６時間かかり得る。反応時間は、例えば、基質量および／または使用するセロデキストリンホスホリラーゼ酵素などの因子に依存し得る。
【００９６】
開示される方法で製造される不溶性セルロースは、任意選択により分離してもよい。例えば、不溶性セルロースは、遠心分離または濾過によって分離することができる。その場合、セルロースは、水、残留基質、および反応副生物を含む反応溶液から分離される。
【００９７】
本明細書中のセルロース製造方法の接触工程で生成される不溶性セルロースは、本明細書中に開示されるあらゆる特徴を有し得る。例えば、水不溶性、ＤＰｗ（例えば、１０〜３０のＤＰｗ）および／またはＭｗ、グリコシド結合プロファイル、主鎖構造（例えば、直鎖性）、セルロースＩＩ型構造含有量、ならびに／あるいは本明細書中の他の箇所で開示される、ある非水性組成物中における溶解度はいずれも、工程（ａ）で生成されるセルロースを特徴付けることができる。
【００９８】
ある態様のセルロース製造方法の接触工程で生成される不溶性セルロースは、セルロースＩＩ型結晶構造を有し得る（すなわち、セルロースは、酵素により直接セルロースＩＩ型として合成される。ここに開示するセルロースとは対照的に、天然に（例えば、植物中に）生成するセルロースは、通常、セルロースＩ型構造を有し、一般に、セルロースＩＩ型へ変換するには、マーセル化および／または他の化学的処理（例えば、誘導体化後の非誘導体化、再生セルロースの生成）を必要とする。本明細書中のある実施形態では、セルロースは、水性および乾燥の両条件下でセルロースＩＩ型結晶状態にある。
【００９９】
酵素反応の実施形態を特徴付ける本明細書に開示される特徴は全てセルロース製造方法の接触工程の実施において使用することができる。例えば、セロデキストリンホスホリラーゼ酵素アミノ酸配列およびアミノ酸源、基質濃度、温度、ｐＨおよびバッフア濃度、ならびに／または本明細書中の他の箇所で開示される酵素活性／酵素量はいずれも、接触工程で生成される反応を特徴付けることができる。
【０１００】
いくつかの態様におけるセルロース製造方法の接触工程は、セロビオースをセロデキストリンとして含み得る。本明細書中の酵素反応での使用に適したセロデキストリンの他の例としては、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオースおよびセロヘキサノースが挙げられる。本明細書において適したセロデキストリンのさらに他の例としては、セルロースの分解（例えば、酵素による分解）により得られる７つ以上のベータ−１，４−結合グルコースモノマーからなるグルコースポリマーが挙げられる。いくつかの実施形態では、上記種類のセロデキストリンの１種以上（例えば、２、３、４または５つ以上の混合物）を使用することができる。
【０１０１】
セルロース製造方法の接触工程で供給されるグルコース−１−リン酸（Ｇ１Ｐ）は、例えば、分離されたＧＩＰ（例えば、商業的供給源から得られるＧＩＰ）を添加することにより、直接供給することができる。あるいは、ＧＩＰは、接触工程において、少なくとも第２の反応を提供することによって供給することができる。第２の反応の生成物はＧ１Ｐを含む（すなわち、第２の反応は、生成物としてＧＩＰを生成する）。「第２の反応」は、接触工程で行われるセロデキストリンホスホリラーゼ反応（場合により、「第１の反応」と表記することができる）に加えて行われ、セロデキストリンホスホリラーゼ反応物用ＧＩＰ基質を供給する反応を指す。第２の反応は、場合により、デンプンホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、またはセロデキストリンホスホリラーゼ（セルロースの加水分解を触媒する場合）などの「Ｇ１Ｐ−生成酵素」の使用と見なすことができる。
【０１０２】
ある態様では、ＧＩＰを供給するための第２の反応は、セロデキストリンホスホリラーゼ酵素反応が行われるのと同じ容器で提供され得る。あるいは、第２の反応は、セロデキストリンホスホリラーゼ酵素反応が行われる容器の外で（別に）行われ得る。第２の反応は、セルロース製造方法のセロデキストリンホスホリラーゼ酵素反応の前、および／または連続して行われ得る。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、第２の反応は、水、無機リン酸塩、デンプン、デンプンホスホリラーゼ、および任意選択によりデンプン脱分岐酵素、例えば、プルラナーゼおよび／またはイソアミラーゼを接触させることを含み得る。この種の第２の反応は、場合により、デンプンホスホリラーゼ反応と見なすことができる。本明細書での使用に適したデンプンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．１）としては、例えば、米国特許出願公開Ｐｕｂｌ．第２００２／０１３３８４９号明細書、およびＴｉｗａｒｉ  ａｎｄ  Ｋｕｍａｒ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．７：６９−８３）に記載されているものが挙げられる。これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの態様では、デンプンホスホリラーゼは、植物の、微生物の（例えば、細菌の）または真菌の（例えば、酵母の）デンプンホスホリラーゼであり得る。本明細書での使用に適したプルラナーゼ（ＥＣ３．２．１．４１）としては、例えば、米国特許第８３５４１０１号明細書、同第７９０６３０６号明細書、同第７４４９３２０号明細書および同第７３９９６２３号明細書に開示されているものが挙げられる。これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの態様では、プルラナーゼは、植物の、微生物の（例えば、細菌の）、または真菌の（例えば、酵母の）デンプルラナーゼであり得る。本明細書での使用に適したイソアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６８）としては、例えば、米国特許第５３５２６０２号明細書、同第５８１１２７７号明細書、同第７６１５３６５号明細書および同第８７３５１０５号明細書に開示されているものが挙げられる。これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの態様では、イソアミラーゼは、植物の、微生物の（例えば、細菌の）、または真菌の（例えば、酵母の）イソアミラーゼであり得る。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、第２の反応は、水、無機リン酸塩、スクロース、およびスクロースホスホリラーゼ酵素を接触させることを含み得る。この種の第２の反応は、場合により、スクロースホスホリラーゼ反応と見なすことができる。本明細書での使用に適したスクロースホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．７）としては、例えば、米国特許第５７１６８３７号明細書、同第７２２９８０１号明細書および同第７９６８３０９号明細書に記載されているものが挙げられる。これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの態様では、スクロースホスホリラーゼは、植物の、微生物の（例えば、細菌の）、または真菌の（例えば、酵母の）スクロースホスホリラーゼであり得る。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、第２の反応は、水、無機リン酸塩、セルロースバイオマス（リグノセルロース系バイオマスなどのセルロース含有バイオマス）、エンドグルカナーゼ、セロデキストリンホスホリラーゼ、ならびに任意選択により溶解性多糖類モノオキシゲナーゼおよび／またはセロビオヒドロラーゼを接触させることを含み得る。本明細書での使用に適したエンドグルカナーゼ（例えば、セルラーゼ、ベータ−１，４−グルカナーゼ）としては、例えば、米国特許第４４３５３０７号明細書、同第５７７６７５７号明細書および同第７６０４９７４号明細書に開示されているものが挙げられる。これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの態様では、エンドグルカナーゼ（例えば、セルラーゼ）は、植物の、微生物の（例えば、細菌の）、または真菌の（例えば、酵母の）エンドグルカナーゼであり得る。本明細書での使用に適したセロデキストリンホスホリラーゼは、例えば、ここに開示されている、または米国特許第８８８９３７９号明細書または米国特許出願公開Ｐｕｂｌ．第２０１４／００８７４３５号明細書、同第２０１４／００５７３２３号明細書および同第２０１３／００５９３４０号明細書に開示されているセロデキストリンホスホリラーゼの任意のものであり得る。これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる。この種の第２の反応（すなわち、エンドグルカナーゼ＋セロデキストリンホスホリラーゼ）は、通常、本明細書に記載のセルロース製造方法のセロデキストリンホスホリラーゼ酵素反応と別に行われ得る。本明細書での使用に適した溶解性多糖類モノオキシゲナーゼとしては、例えば、Ｉｓａｋｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９：２６３２−２６４２）ａｎｄ  Ｅｉｂｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｏｃｔ  ３１，２０１４，ｐｉｉ：ｊｂｃ．Ｍ１１４．６０２２２７［電子ジャーナル版］）に開示されているものが挙げられる。これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０６】
本開示の実施形態は、さらに、配列番号２と少なくとも９０％相同のアミノ酸配列を含む酵素であって、セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有する酵素を含む組成物に関する。意義深いことに、そのような酵素は、乾燥および水性の両条件下で優れた特性を示す低分子量の不溶性セルロースを生成することができ、そのようなセルロースを広汎な適用性を有するものとする。配列番号２と少なくとも９０％相同のアミノ酸配列を有するセロデキストリンホスホリラーゼ酵素を含む組成物の非限定的な例は、少なくとも水、グルコース−１−リン酸、および１種以上のセロデキストリンも含むものなどの酵素反応物である。
【０１０７】
セロデキストリンホスホリラーゼ活性を有する本明細書に記載の酵素は、配列番号２と少なくとも９０％相同のアミノ酸配列を含み得る。他の実施形態では、そのような酵素は、配列番号２と１００％相同であるか、または少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％相同のアミノ酸配列を含むか、またはそれから構成され得る。配列番号２を含むセロデキストリンホスホリラーゼ酵素の非限定的な例としては、配列番号４と１００％相同であるか、または少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％相同のアミノ酸配列を含むか、またはそれから構成されるセロデキストリンホスホリラーゼ酵素が挙げられる。変異型セロデキストリンホスホリラーゼ酵素（例えば、配列番号２または４に対して９０〜９９％のアミノ酸相同性を有する参照配列）は、対応する非変異型参照配列の酵素活性（上記定義を参照）の一部（例えば、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％）または全部を有するであろう。
【０１０８】
本開示のセロデキストリンホスホリラーゼ活性を有する酵素は、場合により、水、グルコース−１−リン酸およびセロデキストリンを含む反応物中でセルロースを合成することができる。そのような反応物中で生成されるセルロースは、不溶性（水不溶性）であり得、約１０〜約３０の重量平均重合度（ＤＰｗ）を有する。
【０１０９】
本明細書中のある態様は、配列番号２と少なくとも９０％相同のアミノ酸配列を含むセロデキストリンホスホリラーゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列に関する。例えば、本明細書に記載されるアミノ酸配列はいずれも、そのヌクレオチド配列によってコードされ得る。ヌクレオチド配列は、場合により、プロモーター配列（例えば、異種プロモーター）と機能可能なように結合していてもよい。いくつかの実施形態は、例えば、配列番号２と少なくとも９０％相同のアミノ酸配列を含むセロデキストリンホスホリラーゼをコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチド（例えば、ベクターまたはコンストラクト）を含む。そのようなコード領域は、場合により、例えば、細胞（例えば、細菌細胞；酵母、昆虫もしくは哺乳類細胞などの真核細胞）、またはインビトロタンパク質発現系での発現に適したプロモーター配列（例えば、異種プロモーター）に機能可能なように結合することができる。ベクターまたはコンストラクトの例としては、環状ポリヌクレオチド分子（例えば、プラスミド）および非環状ポリヌクレオチド分子（例えば、増幅ＤＮＡ配列などの直鎖状ＤＮＡ）が挙げられる。
【０１１０】
本明細書中のある実施形態は、配列番号２と少なくとも９０％相同のアミノ酸配列を含むセロデキストリンホスホリラーゼを製造する方法に関する。この方法は、配列番号２と少なくとも９０％相同のアミノ酸配列（例えば、本明細書に開示されるアミノ酸配列）を含むセロデキストリンホスホリラーゼをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド配列を供給する工程と、ポリヌクレオチド配列からセロデキストリンホスホリラーゼを発現させ、それによりセロデキストリンホスホリラーゼを生成する工程とを含み得る。そのような方法における発現工程は、任意選択により細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞；酵母［例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）］、昆虫もしくは哺乳類細胞などの真核細胞）で行うことができる。あるいは、発現は、インビトロタンパク質発現系（例えば、細胞フリーのタンパク質発現系、例えば、ウサギ網状赤血球溶血液または小麦胚芽抽出物を使用する発現系）などのもの）で行うことができる。発現工程で生成されたセロデキストリンホスホリラーゼはまた、任意選択により分離することができる。そのような分離は、例えば、本明細書に開示される特性（例えば、純度、ｐＨ、バッファおよび／または塩濃度）を有する組成物を製造する方法で行うことができる。
【０１１１】
本開示の実施形態は、さらに、セルロースを含む組成物であって、そのセルロースが
（ｉ）約１０〜約１０００の重量平均重合度（ＤＰｗ）を有し、
（ｉｉ）セルロースＩＩ型結晶構造を有し、かつ
（ｉｉｉ）水性組成物に不溶である
組成物に関する。
意義深いことに、そのような低分子量の不溶性セルロースは、本明細書中にさらに記載されるように、乾燥および水性の両条件で優れた特性を示すため、汎用性を有する。
【０１１２】
ここに記載される組成物のセルロースは、低分子量のセルロースであり、かつ水に不溶である。ある実施形態では、セルロースは、約１０〜１０００のＤＰｗまたはＤＰを有する。本明細書におけるセルロースのＤＰｗまたはＤＰｎは、例えば、約１０〜５００、１０〜２５０、１０〜１００、１０〜７５、１０〜５０、１０〜４５、１０〜４０、１０〜３５、１０〜３０、１０〜２５、１５〜５０、１５〜４５、１５〜４０、１５〜３５、１５〜３０、もしくは１５〜２５であり得る。いくつかの態様では、ＤＰｗまたはＤＰｎは、約または少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０であり得る。
【０１１３】
本明細書におけるいくつかの態様では、セルロースは、約１７００〜１７００００、１７００〜８６０００、１７００〜４３０００、１７００〜１７０００、１７００〜１３０００、１７００〜８５００、１７００〜６８００、１７００〜５１００、２５５０〜５１００、もしくは２５５０〜４２５０のＭｗを有し得る。いくつかの例では、Ｍｗは、約または少なくとも約１７００、１９００、２１００、２３００、２５００、２７００、２９００、３１００、３３００、３５００、３７００、３９００、４１００、４３００、４５００、４７００、４９００、もしくは５１００であり得る。
【０１１４】
例えば、ここに開示するセルロースのグリコシド結合の約１００％が、ベータ−１，４結合である。他の態様では、セルロースは、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％がベータ−１，４結合であるグリコシド結合プロファイルを有し得る。したがって、本明細書に記載のセルロースは、ベータ−１，４以外のグリコシド結合が、例えば、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満であり得る。
【０１１５】
本明細書に開示されるセルロースの主鎖は、直鎖状／非分岐状であり得る。あるいは、セルロースは分岐を有し得る。したがって、ある実施形態では、セルロースは、分岐点を全く有さないか、またはポリマー中のグリコシド結合の割合として、分岐点が約５％、４％、３％、２％または１％未満であり得る。
【０１１６】
本明細書に開示されるセルロースは、セルロースＩＩ型結晶構造を有し得る。例えば、本明細書に記載のセルロースは、セルロースＩＩ型結晶構造のセルロースを約１００重量％含み得る。他の例として、セルロースは、セルロースＩＩ型結晶構造のセルロースを少なくとも約８０重量％、８１重量％、８２重量％、８３重量％、８４重量％、８５重量％、８６重量％、８７重量％、８８重量％、８９重量％、９０重量％、９１重量％、９２重量％、９３重量％、９４重量％、９５重量％、９６重量％、９７重量％、９８重量％、または９９重量％含み得る。いくつかの態様では、セルロースは、セルロースＩ、ＩＩＩおよび／またはＩＶ型結晶構造のセルロース材料を約２０重量％、１９重量％、１８重量％、１７重量％、１６重量％、１５重量％、１４重量％、１３重量％、１２重量％、１１重量％、１０重量％、９重量％、８重量％、７重量％、６重量％、５重量％、４重量％、３重量％、２重量％、または１重量％含み得る。セルロースＩＩ型結晶構造については、例えば、Ｋｏｌｐａｋａｎｄ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ９：２７３−２７８）、およびＫｒｏｏｎ−Ｂａｔｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｋｒｏｏｎ（Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊ．１４：６７７−６９０）に記載されており、これらの両文献は参照により本明細書に組み込まれる。セルロースＩＩ型構造を特徴付ける支配的な水素結合は、Ｏ２−Ｈ−−−Ｏ６、Ｏ６−Ｈ−−−Ｏ６およびＯ２−Ｈ−−−Ｏ２であり、一方、セルロースＩ型は、支配的な水素結合としてＯ２−Ｈ−−−Ｏ６を有する。セルロースＩＩ型の構造は、鎖の折り畳み構造を含み、解くのは困難である。
【０１１７】
例えば、本明細書に記載のセルロースは、分離されるものとして特徴付けることができる。ここに記載されるセルロースを含む組成物は、天然には存在しないと考えられている。
【０１１８】
本明細書に開示されるセルロースは、場合により、ナノメートルスケールのフレーク形状、またはフレーク様形状を有するものとして特徴付けることができる。セルロースによって形成されるフレーク形状、フレーク様形状は、ナノサイズの大きさを有し、本実施例で開示されるような適切な顕微鏡技術を用いると、平らで薄い物質片として表れ得る。本明細書に記載のセルロースは、他の態様では、誘導体化されることはなく、また、誘導体化されてもいない。したがって、本明細書に開示されるセルロースは、エーテル基（例えば、カルボキシメチル基）またはエステル基（例えば、アセテート基）などの付加官能基を含まない。
【０１１９】
本明細書において、ここで開示される組成物のセルロースは、配列番号２または配列番号６と少なくとも９０％相同のアミノ酸配列を含むか、またはそれから構成されるセロデキストリンホスホリラーゼの生成物であり得る。他の実施形態では、セルロースは、配列番号２または配列番号６と１００％相同であるか、または少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％相同のアミノ酸配列を含むか、またはそれから構成されるセロデキストリンホスホリラーゼの生成物であり得る。配列番号２を含むセロデキストリンホスホリラーゼ酵素の非限定的な例としては、配列番号４と１００％相同であるか、または少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％相同のアミノ酸配列を含むか、またはそれから構成されるセロデキストリンホスホリラーゼ酵素が挙げられる。配列番号６を含むセロデキストリンホスホリラーゼ酵素の非限定的な例としては、配列番号８と１００％相同であるか、または少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％相同のアミノ酸配列を含むか、またはそれから構成されるセロデキストリンホスホリラーゼ酵素が挙げられる。変異型セロデキストリンホスホリラーゼ酵素（例えば、配列番号２、４、６または８に対して９０〜９９％のアミノ酸相同性を有する参照配列）は、対応する非変異型参照配列の酵素活性（上記定義を参照）の一部（例えば、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％）または全部を有するであろうセロデキストリンホスホリラーゼ酵素によりセルロースの生成は、例えば、本明細書に開示される酵素反応により達成することができる。
【０１２０】
本開示のセロデキストリンホスホリラーゼ酵素により生成されるセルロースは、セルロースＩＩ型結晶構造を有することができ、そのようなセルロースは、マーセル化または誘導体化プロセスを受けていない。本明細書に記載のセルロースは、セロデキストリンホスホリラーゼ酵素による酵素合成後、直ちにまたは短時間（例えば、約．５、１、５、１０、１５、３０、６０、９０または１２０分未満）でセルロースＩＩ型結晶構造のセルロースを含むことができる。ここに開示するセルロースと対照的に、天然に（例えば、植物において）産生するセルロースは、通常、セルロースＩ型構造を有し、一般に、セルロースＩＩ型へ変換するには、マーセル化および／または他の化学的処理（例えば、誘導体化後の非誘導体化、再生セルロースの生成）を必要とする。本明細書中のある実施形態では、セルロースは、水性および乾燥の両条件下でセルロースＩＩ型結晶状態にあるセルロースを含む。
【０１２１】
ここに開示される組成物のセルロースは、水などの水性溶媒に不溶である。対照的に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および／またはＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）を含む溶媒などのある非水性溶媒には可溶である。そのような溶媒の例としては、ＤＭＳＯまたはＤＭＡｃの単独、またはさらに塩化リチウム（ＬｉＣｌ）をさらに含むもの（例えば、ＤＭＳＯ／ＬｉＣｌおよびＤＭＡｃ／ＬｉＣｌ）が挙げられる。本明細書において、ＤＭＳＯ／ＬｉＣｌ溶媒またはＤＭＳＯ／ＬｉＣｌ溶媒は、ＬｉＣｌを、例えば、約０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０ｗｔ％含むか、またはＬｉＣｌ飽和溶媒であり得る。本明細書において、セルロースの非水性溶媒、例えばＤＭＳＯおよび／またはＤＭＡｃを含む溶媒中の濃度は、例えば、約０．１〜３０ｗｔ％、０．１〜２０ｗｔ％、０．１〜１０ｗｔ％、もしくは０．１〜５ｗｔ％であるか、または約もしくは少なくとも約０．１、０．３、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５もしくは３０ｗｔ％であり得る。ある態様では、本明細書中のＤＭＳＯ含有溶媒およびＤＭＡｃ含有溶媒は、酸をさらに含まない。本明細書中のセルロースは、例えば、前述のＤＭＳＯをベースとした溶媒およびＤＭＡｃをベースとした溶媒のいずれにも、比較的低温で、例えば、１５〜３０℃、２０〜３０℃または２０〜２５℃（例えば、室温）で溶解することができる。好ましい実施形態では、セルロースの溶解に熱を加える必要はない。
【０１２２】
本明細書中のセルロースを含む組成物は、非水性（例えば、乾燥組成物であり得る。そのような実施形態の例としては、膜／コーティング、粉末、顆粒、マイクロカプセル、フレーク、または他の任意の形状の粒状物質が挙げられる。他の例としては、ペレット、棒、粒状物、ビーズ、錠剤、スティック、または他の凝集体が挙げられる。本明細書中の非水性または乾燥組成物に含まれる水は、通常、３、２、１、０．５または０．１ｗｔ％未満である。非水性または乾燥組成物中に含まれる本明細書中のセルロースの量は、例えば、約または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、もしくは９９．９ｗｔ％であり得る。
【０１２３】
本開示のある実施形態では、セルロースを含む組成物は、場合により、少なくとも約１００ｃＰｓの粘度を有する水性組成物であり得る。本明細書中の水性組成物は、例えば、少なくとも約１００、２５０、５００、７５０、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００、２００００、２５０００、３００００、３５０００、４００００、４５０００もしくは５００００ｃＰｓ（または１００〜５００００の任意の整数ｃＰｓ）の粘度を有し得る。本明細書中の水性組成物の例としては、コロイド分散液が挙げられる。
【０１２４】
本明細書中の水性組成物の粘度は、例えば、約３℃〜約１１０℃の任意の温度（または３〜１１０の任意の整数℃）で測定することができる。あるいは、粘度は、例えば、約４℃〜３０℃、または約２０〜２５℃の温度で測定することができる。粘度は、大気圧（約７６０ｔｏｒｒ）または他の任意のより高い圧力またはより低い圧力で測定することができる。
【０１２５】
本明細書に開示される水性組成物の粘度は、粘度計もしくはレオメータ、または当該技術分野で知られている他の任意の手段によって測定することができる。ずり減粘挙動を示す（すなわち、流動条件で変わる粘度を有する）本明細書中の水性組成物の粘度の測定に、粘度計またはレオメータを使用することができることは、当業者であれば理解されよう。
【０１２６】
そのような実施形態の粘度は、例えば、約０．１〜１０００ｒｐｍ（１分間当たりの回転数）の回転剪断速度で測定することができる。いくつかの実施形態では、粘度は、約１０、６０、１５０、２５０または６００ｒｐｍの回転剪断速度で測定することができる。
【０１２７】
本明細書に開示される水性組成物のｐＨは、例えば、約２．０〜約１２．０であり得る。あるいは、ｐＨは、例えば、約２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１１．０、１２．０、５．０〜約１２．０、約４．０〜８．０、または約５．０〜８．０であり得る。
【０１２８】
本明細書中の水性組成物は、少なくとも約１０または２０ｗｔ％の水を含む溶媒を含み得る。他の実施形態では、溶媒は、例えば、少なくとも約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００ｗｔ％の水（または１０〜１００ｗｔ％の任意の整数値）を含む。
【０１２９】
本開示のセルロースは、例えば、水性組成物中に不溶性物質として、約または少なくとも約０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、もしくは９０％含まれ得る。下記の実施例４は、ある態様におけるセルロースが、比較的低い濃度で水性組成物に高粘度を付与することを示している。したがって、本開示のある実施形態は、本明細書中のセルロースを約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、または０．５ｗｔ％未満含有する水性組成物に導かれる。
【０１３０】
本明細書における水性組成物は、開示したセルロースに加え、他の成分を含み得る。例えば、水性組成物は、１種以上の塩、例えば、ナトリウム塩（例えば、ＮａＣｌ、Ｎａ２ＳＯ４）を含み得る。塩の他の非限定的な例としては、（ｉ）アルミニウム、アンモニウム、バリウム、カルシウム、クロム（ＩＩもしくはＩＩＩ）、銅（ＩもしくはＩＩ）、鉄（ＩＩもしくはＩＩＩ）、水素、鉛（ＩＩ）、リチウム、マグネシウム、マンガン（ＩＩもしくはＩＩＩ）、水銀（ＩもしくはＩＩ）、カリウム、銀、ナトリウム、ストロンチウム、スズ（ＩＩもしくはＩＶ）、または亜鉛のカチオン、および（ｉｉ）酢酸、ホウ酸、臭素酸、臭化物、カルボン酸、塩素酸、塩化物、亜塩素酸、クロム酸、シアナミド、シアン化物、重クロム酸、ニ水素リン酸、フェリシアン化物、フェロシアン化物、フッ化物、炭酸水素、リン酸水素、硫酸水素、硫化水素、亜硫酸水素、水素化物、水酸化物、次亜塩素酸、ヨード酸、ヨウ化物、硝酸、窒化物、亜硝酸、シュウ酸、酸化物、過塩素酸、過マンガン酸、過酸化物、リン酸、リン化物、亜リン酸、ケイ酸、スズ酸、硫酸、硫化物、亜硫酸、酒石酸またはチオシアン酸のアニオンが挙げられる。したがって、例えば、上記（ｉ）からのカチオンおよび上記（ｉｉ）からのアニオンを有する塩は全て水性組成物であり得る。本明細書において、塩は水性組成物中に、例えば、約（または少なくとも約）．０１〜約１０．００（または．０１〜１０．００で１００分の１ずつ増加させた任意の数）ｗｔ％含まれ得る。
【０１３１】
本明細書に記載のセルロースを含む水性組成物は、例えば、コロイド分散液であり得る。コロイド分散液中のセルロース粒子の平均サイズ／直径は、通常、約１ｎｍ〜２０００００ｎｍ（２００マイクロメートル）の範囲である。平均粒径は、いくつかの例では、約１〜１００ｎｍ、１〜１０００ｎｍ、１〜１００００ｎｍ、１〜１０００００ｎｍ、１〜２０００００ｎｍ、１０〜１００ｎｍ、１０〜１０００ｎｍ、１０〜１００００ｎｍ、１０〜１０００００ｎｍ、１０〜２０００００ｎｍ、１００〜１０００ｎｍ、１００〜１００００ｎｍ、１００〜１０００００ｎｍ、１００〜２０００００ｎｍ、１０００〜１００００ｎｍ、１０００〜１０００００、１０００〜２０００００ｎｍ、１００００〜１０００００ｎｍ、または１００００〜２０００００ｎｍであり得る。
【０１３２】
ある実施形態では、水性組成物はずり減粘挙動を有する。ずり減粘挙動は、剪断速度が増大するときの、水性組成物の粘度の減少として観察される。水性組成物のずり減粘挙動の変化は、本明細書に記載のセルロースの水性組成物への混合に起因し得る。したがって、本開示の１種以上のセルロース材料は、水性組成物に添加することにより、そのレオロジープロファイルを変化させることができる（すなわち、水性の液体、溶液または混合液の流動特性が変化する）。また、本明細書に記載の１種以上のセルロース材料は、水性組成物に添加することにより、その粘度を変化させることができる。
【０１３３】
本明細書に記載の水性組成物のレオロジープロファイルは、回転剪断速度が増加する間の粘度を測定することによって観察し得る。例えば、本明細書に開示される水性組成物のずり減粘挙動は、回転剪断速度が約１０ｒｐｍから６０ｒｐｍへ、１０ｒｐｍから１５０ｒｐｍへ、１０ｒｐｍから２５０ｒｐｍへ、６０ｒｐｍから１５０ｒｐｍへ、６０ｒｐｍから２５０ｒｐｍへ、または１５０ｒｐｍから２５０ｒｐｍへ増加するときの、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％（または５％〜９５％の任意の整数）までの粘度（ｃＰｓ）の減少として観察され得る。
【０１３４】
本明細書中に開示される組成物および方法の非限定的な例としては以下のものが挙げられる：
１．水、グルコース−１−リン酸、セロデキストリン、および不溶性セルロースを合成するセロデキストリンホスホリラーゼ酵素（例えば、配列番号２または配列番号６と少なくとも９０％相同のアミノ酸配列を含み、かつ不溶性セルロースを合成するセロデキストリンホスホリラーゼ酵素）を含む酵素反応物。
２．セルロースは、（ｉ）約１０〜約３０、または（ｉｉ）約１０〜約１０００の重量平均重合度（ＤＰｗ）を有する、実施形態１の酵素反応物。
３．セロデキストリンは、セロビオースを含む、実施形態１または２の酵素反応物。
４．不溶性セルロースを製造する方法であって、
ａ）少なくとも水、グルコース−１−リン酸、セロデキストリン、およびセロデキストリンホスホリラーゼ酵素、例えば、配列番号２または配列番号６と少なくとも９０％相同のアミノ酸配列を含む酵素を接触させる工程であって、不溶性セルロースが生成される、工程と、
ｂ）任意選択により、工程（ａ）で生成された不溶性セルロースを分離する工程と
を含む方法。
５．工程（ａ）で生成されるセルロースは、（ｉ）約１０〜約３０または（ｉｉ）約１０〜約１０００の重量平均重合度（ＤＰｗ）を有する、実施形態４の方法。
６．工程（ａ）で生成されるセルロースは、セルロースＩＩ型結晶構造を有する、実施形態４または５の方法。
７．セロデキストリンは、セロビオースを含む、実施形態４、５または６の方法。
８．グルコース−１−リン酸は、工程（ａ）において第２の反応を行うことによって供給され、第２の反応の生成物は、グルコース−１−リン酸を含む、実施形態４、５、６または７の方法。
９．第２の反応は、
（ｉ）水、無機リン酸塩、デンプン、デンプンホスホリラーゼ、および任意選択によりデンプン脱枝酵素、例えばプルラナーゼもしくはイソアミラーゼを接触させるか、
（ｉｉ）水、無機リン酸塩、スクロース、およびスクロースホスホリラーゼ酵素を接触させるか、または
（ｉｉｉ）水、無機リン酸塩、セルロースバイオマス、エンドグルカナーゼ、セロデキストリンホスホリラーゼ、ならびに任意選択により溶解性多糖類モノオキシゲナーゼおよび／またはセロビオヒドロラーゼと接触させる
ことによってグルコース−１−リン酸を生成する、実施形態８の方法。
１０．第２の反応は、工程（ａ）が実施される容器と同じ容器で提供され、第２の反応は、工程（ａ）の前におよび／または工程（ａ）に続いて実施される、実施形態８または９の方法。
【実施例】
【０１３５】
以下の実施例において本開示をさらに示す。これらの実施例が本明細書中のある好ましい態様を示す一方、単に説明の目的でのみ示されていることは理解されるべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者であれば、開示された実施形態の必須の特徴を確認することができ、かつその趣旨および範囲を逸脱しない範囲で、種々の用途および条件に適合させるために種々の変更形態および改変形態がなし得る。
【０１３６】
実施例１
ビブリオ・ルバー（Ｖｉｂｒｉｏ  ｒｕｂｅｒ）セロデキストリンホスホリラーゼ
この実施例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における推定ビブリオ・ルバー（Ｖｉｂｒｉｏ  ｒｕｂｅｒ）セロデキストリンホスホリラーゼの発現を記載する。また、この実施例は、この酵素が酵素比活性の解析により、実際にセロデキストリンホスホリラーゼであることを示す。
【０１３７】
推定セロデキストリンホスホリラーゼ、ＶｒｕＣｄｐ１（本明細書中では、「ＣＲＣ０３３６２−ＶｒｕＣｄｐ１」とも称する。）をビブリオ・ルバー（Ｖｉｂｒｉｏ  ｒｕｂｅｒ）ＤＳＭ１４３７９において特定した。ＶｒｕＣｄｐ１をコードする核酸配列をゲノム配列に基づいて予測し、配列番号１として示す。配列番号１によってコードされるＶｒｕＣｄｐ１のアミノ酸配列を、配列番号２として示す。
【０１３８】
次に、以下のようにして、推定ＶｒｕＣｄｐ１セロデキストリンホスホリラーゼを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において異種発現させた。ＶｒｕＣｄｐ１をコードするポリヌクレオチド配列を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させるためにコドン最適化した。Ｇｅｎｅｒａｙ（Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ）により、この配列（配列番号３）をｐＥＴ３０ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）発現ベクターにＮｄｅＩ部位およびＸｈｏＩ部位で挿入して、プラスミドｐＺＺＨ６３４を得た。配列番号３は、コドン最適化オープンリーディングおよびＣ末端に２つの追加アミノ酸（Ｌｅｕ−Ｇｌｕ）および６×Ｈｉｓタグをコードする配列を含む。配列番号３でコードされたアミノ酸配列を配列番号４として示す。ｐＺＺＨ６３４プラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）にトランスフォームし、これを、カナマイシン５０ｐｐｍを補充したＬＢ寒天培地プレートにプレーティングした。ＰＣＲおよびシークェンシングによって確認された正しく形質転換されたコロニーを、カナマイシン５０ｐｐｍを補充したＬＢ培地５ｍｌに接種し、振盪しながら３７℃で約１６時間培養した。次いで、約１ｍＬの培養物を、カナマイシン５０ｐｐｍを補充したＬＢ培地２５ｍｌに接種し、振盪しながら３７℃で、ＯＤ６００が約０．４〜１．０に到達するまで培養した。次いで、ＩＰＴＧを、最終濃度が１００ｍＭになるように培養物に添加して、ＶｒｕＣｄｐ１を発現させた。次いで、培養物を１６℃で１２〜１６時間培養した。
【０１３９】
このＶｒｕＣｄｐ１発現誘発期間後、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞をペレット化し、溶解バッファ（５０ｍＭトリス  ｐＨ７．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．１％ツイン−２０）に再懸濁し、１０分間の超音波処理により氷上で溶解した（３５％出力、２０分、２秒オン／２秒オフ）（ＳＣＩＥＮＴ２−ＩＩ  Ｄ、Ｎｉｎｇｂｏ  Ｓｃｉｅｎｔｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）。溶解物を１３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して不純物を取り除いた（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ，ＡｖａｎｔｉＴＭＪＥ）。不純物を除去した溶解物を、５０ｍＭトリス  ｐＨ７．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、および１０％グリセロールで予め平衡化したＨｉｓ  ＴｒａｐＴＭＨＰ（５ｍＬ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。標的タンパク質（ＶｒｕＣｄｐ１）を、０〜２５０ｍＭイミダゾール／平衡化バッファの直線勾配を用いてカラムから溶出させた。標的タンパク質を含む画分をプールし、１０Ｋ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａデバイスを用いて濃縮および平硬化バッファとの交換を行い、使用するまで４０％グリセロール中に−２０℃で貯蔵した。
【０１４０】
（上記で分離した）ＶｒｕＣｄｐ１の活性を、１０ｍＭ  Ｇ−１−Ｐ（Ｓｉｇｍａ  Ｇ７０００、α−Ｄ−グルコース１−リン酸二ナトリウム水和物）および５ｍＭセロビオース（Ｓｉｇｍａ  Ｃ７２５２、Ｄ−（＋）−セロビオース）を基質として用いて測定した。測定は、２５ｍＭトリス−ＨＣｌバッファ、ｐＨ７．０中、３７℃、１０分間で行った。酵素反応物からのリンの放出を、ＰｉＢｌｕｅＴＭ試薬（ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳ）により定量した。セロデキストリンホスホリラーゼ活性１単位を、測定条件下で１分当たりに無機リン１μｍｏｌを放出する酵素の量と定義した。分離したＶｒｕＣｄｐ１の比活性は、１８．４単位／ｍｇと決定された。この観察に基づき、ＶｒｕＣｄｐ１は、グリコシルヒドラーゼファミリー（ＧＨ９４、ＣＡＺｙ番号）に属するセロデキストリンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．４９）であると決定された。
上述したように、配列番号２を含む酵素（ＶｒｕＣｄｐ１）が発現し、分離され、およびセロデキストリンホスホリラーゼ活性を有することが示された。
【０１４１】
実施例２
ルミノコッカス・チャンパネレンス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｈａｍｐａｎｅｌｌｅｎｓｉｓ）セロデキストリンホスホリラーゼ
この実施例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における推定ルミノコッカス・チャンパネレンス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｈａｍｐａｎｅｌｌｅｎｓｉｓ）セロデキストリンホスホリラーゼの発現を記載する。また、この実施例は、この酵素が、酵素比活性の解析により、実際、セロデキストリンホスホリラーゼであることを示す。
【０１４２】
推定セロデキストリンホスホリラーゼ、ＲｃｈＣｄｐ１（本明細書中では、「ＣＲＣ０３３５９−ＲｃｈＣｄｐ１」とも称する。）をルミノコッカス・チャンパネレンス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｈａｍｐａｎｅｌｌｅｎｓｉｓ）１８Ｐ１３において特定した。ＲｃｈＣｄｐ１をコードする核酸配列（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＮＣ＿０２１０３９．１のポジション２３７３１４１〜２３７５５３７）を配列番号５として示す。配列番号５によってコードされたＲｃｈＣｄｐ１のアミノ酸配列を、配列番号６として示す。
【０１４３】
次に、以下のようにして、推定ＲｃｈＣｄｐ１セロデキストリンホスホリラーゼを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において異種発現させた。ＲｃｈＣｄｐ１をコードするポリヌクレオチド配列を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させるためにコドン最適化した。Ｇｅｎｅｒａｙ（Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ）により、この配列（配列番号７）をｐＥＴ３０ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）発現ベクターにＮｄｅＩ部位およびＸｈｏＩ部位で挿入して、プラスミドｐＺＺＨ６３１を得た。配列番号７は、コドン最適化オープンリーディングおよびＣ末端に２つの追加アミノ酸（Ｌｅｕ−Ｇｌｕ）および６×Ｈｉｓタグをコードする配列を含む。配列番号７でコードされたアミノ酸配列を配列番号８として示す。ｐＺＺＨ６３１プラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）にトランスフォームし、これを、カナマイシン５０ｐｐｍを補充したＬＢ寒天培地プレートにプレーティングした。ＰＣＲおよびシークェンシングによって確認された正しく形質転換されたコロニーを、カナマイシン５０ｐｐｍを補充したＬＢ培地５ｍｌに接種し、振盪しながら３７℃で約１６時間培養した。次いで、約１ｍＬの培養物を、カナマイシン５０ｐｐｍを補充したＬＢ培地２５ｍｌに接種し、振盪しながら３７℃で、ＯＤ６００が約０．４〜１．０に到達するまで培養した。次いで、ＩＰＴＧを、最終濃度が１００ｍＭになるように培養物に添加して、ＲｃｈＣｄｐ１を発現させた。次いで、培養物を１６℃で１２〜１６時間培養した。
【０１４４】
このＲｃｈＣｄｐ１発現誘発期間後、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞をペレット化し、溶解バッファ（５０ｍＭトリス  ｐＨ７．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．１％ツイン−２０）に再懸濁し、１０分間の超音波処理により氷上で溶解した（３５％出力、２０分、２秒オン／２秒オフ）（ＳＣＩＥＮＴ２−ＩＩ  Ｄ、Ｎｉｎｇｂｏ  Ｓｃｉｅｎｔｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）。溶解物を１３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して不純物を取り除いた（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ，ＡｖａｎｔｉＴＭＪＥ）。不純物を除去した溶解物を、５０ｍＭトリス  ｐＨ７．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、および１０％グリセロールで予め平衡化したＨｉｓ  ＴｒａｐＴＭＨＰ（５ｍＬ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。標的タンパク質（ＲｃｈＣｄｐ１）を、０〜２５０ｍＭイミダゾール／平衡化バッファの直線勾配を用いてカラムから溶出させた。標的タンパク質を含む画分をプールし、１０Ｋ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａデバイスを用いて濃縮および平硬化バッファとの交換を行い、使用するまで４０％グリセロール中に−２０℃で貯蔵した。
【０１４５】
（上記で分離した）ＲｃｈＣｄｐ１の活性を、１０ｍＭ  Ｇ−１−Ｐ（Ｓｉｇｍａ  Ｇ７０００、α−Ｄ−グルコース１−リン酸二ナトリウム水和物）および５ｍＭセロビオース（Ｓｉｇｍａ  Ｃ７２５２、Ｄ−（＋）−セロビオース）を基質として用いて測定した。測定は、２５ｍＭトリス−ＨＣｌバッファ、ｐＨ７．０中、３７℃、１０分間で行った。酵素反応物からのリンの放出を、ＰｉＢｌｕｅＴＭ試薬（ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳ）により定量した。セロデキストリンホスホリラーゼ活性１単位を、測定条件下で１分当たりに無機リン１μｍｏｌを放出する酵素の量と定義した。分離したＲｃｈＣｄｐ１の比活性は、１５．４単位／ｍｇと決定された。この観察に基づき、ＲｃｈＣｄｐ１は、グリコシルヒドラーゼファミリー（ＧＨ９４、ＣＡＺｙ番号）に属するセロデキストリンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．４９）であると決定された。
上述したように、配列番号６を含む酵素（ＲｃｈＣｄｐ１）が発現し、分離され、およびセロデキストリンホスホリラーゼ活性を有することが示された。
【０１４６】
実施例３
低分子量の不溶性セルロースを製造するためのビブリオ・ルバー（Ｖ．ｒｕｂｅｒ）セロデキストリンホスホリラーゼおよびルミノコッカス・チャンパネレンス（Ｒ．ｃｈａｍｐａｎｅｌｌｅｎｓｉｓ）セロデキストリンホスホリラーゼの使用
この実施例は、Ｇ−１−Ｐおよびセロデキストリンを含む反応物に適用した場合における、セルロースを製造するための実施例１および２に記載のセロデキストリンホスホリラーゼの使用を記載する。
【０１４７】
ビブリオ・ルバー（Ｖ．ｒｕｂｅｒ）セロデキストリンホスホリラーゼ（ＶｒｕＣｄｐ１、実施例１を参照））の存在下、Ｇ−１−Ｐおよびセロビオースを含む反応物は、不溶性多糖類を生成した。十分に解析できるだけの不溶性多糖類を生成するために、Ｇ−１−Ｐ  １ｇ、セロビオース０．２５ｇ、および分離したＶｒｕＣｄｐ１  ４００μｇ（〜７．４単位）を、２５ｍＭトリスバッファｐＨ７．０、８０ｍＬを含有するガラス瓶に添加することにより、規模を大きくした反応を行った。
【０１４８】
反応物を終夜、３７℃でインキュベートした。３０００ｒｐｍで２０分間、遠心分離して、不溶性多糖類生成物を回収した。この材料が低分子量セルロースであることが決定された（下記の実施例４を参照）。
ルミノコッカス・チャンパネレンス（Ｒ．ｃｈａｍｐａｎｅｌｌｅｎｓｉｓ）セロデキストリンホスホリラーゼ（ＲｃｈＣｄｐ１、実施例２を参照））の存在下、Ｇ−１−Ｐおよびセロビオースを含む反応物は、不溶性多糖類を生成した。十分に解析できるだけの不溶性多糖類を生成するために、Ｇ−１−Ｐ  １ｇ、セロビオース０．２５ｇ、および分離したＲｃｈＣｄｐ１  ４００μｇ（〜６．２単位）を、２５ｍＭトリスバッファｐＨ７．０、８０ｍＬを含有するガラス瓶に添加することにより、規模を大きくした反応を行った。
【０１４９】
反応物を終夜、３７℃でインキュベートした。３０００ｒｐｍで２０分間、遠心分離して、不溶性多糖類生成物を回収した。この材料が低分子量セルロースであることが決定された（下記の実施例４を参照）。
【０１５０】
上述したように、配列番号２（ＶｒｕＣｄｐ１）または配列番号６（ＲｃｈＣｄｐ１）を含む酵素は、Ｇ−１−Ｐおよびセロデキストリン（例えば、セロビオース）基質を含む反応物として提供された場合、低分子量の不溶性セルロースを生成する。これらの酵素がこの特定のセルロース合成活性を有することは、同様に発現し解析した他の１６種のセロデキストリンホスホリラーゼがこのような能力を有しなかったことを考慮すると（データは示さず）、注目すべきことである。
【０１５１】
実施例４
ビブリオ・ルバー（Ｖ．ｒｕｂｅｒ）およびルミノコッカス・チャンパネレンス（Ｒ．ｃｈａｍｐａｎｅｌｌｅｎｓｉｓ）セロデキストリンホスホリラーゼにより生成された不溶性多糖類の解析
この実施例は、実施例３に記載の反応で得られた不溶性多糖類生成物の種々の解析を記載する。これらの解析は、生成物が低分子量の不溶性セルロースを含むことを示す。
【０１５２】
ビブリオ・ルバー（Ｖ．ｒｕｂｅｒ）およびルミノコッカス・チャンパネレンス（Ｒ．ｃｈａｍｐａｎｅｌｌｅｎｓｉｓ）セロデキストリンホスホリラーゼにより生成された不溶性物質（実施例３）について、１Ｈ−ＮＭＲ解析を行った。簡単に記載すると、各試料１３．８ｍｇを６０℃で１時間撹拌することにより、０．８ｍｌのＤＭＳＯ−ｄ６、３ｗｔ％ＬｉＣｌに溶解した。溶解した試料について、５−ｍｍ  ＣＰＣ  Ｑ１クライオプローブを備えたＡＶＡＮＣＥ  ＩＩＩ  ＨＤ  ＮＭＲデバイスを用いてＮＭＲを測定した。この解析により不溶性物質がセルロースに特有の結合であるベータ−１，４結合を有するポリマーであることが示された。したがって、ビブリオ・ルバー（Ｖ．ｒｕｂｅｒ）およびルミノコッカス・チャンパネレンス（Ｒ．ｃｈａｍｐａｎｅｌｌｅｎｓｉｓ）のセロデキストリンホスホリラーゼによって生成された不溶性物質はセルロースを含む。
【０１５３】
各不溶性セルロースをさらに、トリプル検出器ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）により分析して、分子量（Ｍｗ）を決定した。簡単に記載すると、各試料をＤＭＳＯ、２ｗｔ％ＬｉＣｌ中に０．１〜０．３ｗｔ％濃度で溶解し、ＳＥＣにかけた。各試料のＭｗは、約３〜４ｋＤａ（ＤＰｗ〜１８〜２４）であることがわかった（表２）。
【０１５４】
【表２】
0006770519.tif 000003
【０１５５】
このように、ＲｃｈＣｄｐ１酵素およびＶｒｕＣｄｐ１酵素それぞれによって生成されたセルロース試料は、綿、木材パルプおよび微生物源から得られるセルロースに比べ、はるかに低分子量であった。
【０１５６】
低分子量セルロース試料は、ＤＭＳＯ／ＬｉＣｌ（上記ＳＥＣ分析用に提供される調製物）およびＤＭＡｃ／ＬｉＣｌ（５ｗｔ％ＬｉＣｌ（ＤＭＡｃ中））に室温で容易に溶解することができ、また濾過することができる。例えば、木材パルプから得られるセルロースは、通常、ＤＭＳＯ／ＬｉＣｌに溶解せず、またＤＭＡｃ／ＬｉＣｌに溶解させるためには高い温度（例えば、約１００℃）および時間（例えば、１日以上）を必要とするため、これは注目すべきことである。各試料の粘度計による観察には明確なピークがあるため（データは示さず）、酵素により製造される低分子量のセルロース分子は、剛性ロッドとして挙動する。
【０１５７】
アズメイド（ａｓ−ｍａｄｅ）（実施例３に記載のように生成され、水中で貯蔵されているが、乾燥していない）で、乾燥したセルロース材料（ＲｃｈＣｄｐ１酵素およびＶｒｕＣｄｐ１酵素により生成）はいずれも、広角Ｘ線散乱法（ＷＡＸＳ）による分析で、セルロースの最も安定した結晶型であるセルロースＩＩ型結晶を示す反射を示した。酵素による生成後のアズメイド試料は多量の水中で提供される（ＲｃｈＣｄｐ１酵素およびＶｒｕＣｄｐ１酵素によるセルロース生成物でそれぞれ９８．５ｗｔ％および９７．５ｗｔ％）が、水の広い非晶質回折に重なって、明瞭な反射が依然として観察されたことは注目すべきことである。セルロースＩＩ型はある化学的プロセス工程（例えば、マーセル化、誘導体化（その後に非誘導体化セルロースの回収が行われる））の後に得られると考えられることから、このセルロースＩＩ型構造の観察は興味深いことである（Ｋｒｏｏｎ−Ｂａｔｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｋｒｏｏｎ，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊ．１４：６７７−６９０）。対照的に、本実施例は、ＲｃｈＣｄｐ１酵素およびＶｒｕＣｄｐ１酵素を含む反応物において直接生成されるセルロースが、合成後にいかなる化学処理も行わずとも、セルロースＩＩ型結晶構造を有することを示している。
【０１５８】
ＲｃｈＣｄｐ１酵素およびＶｒｕＣｄｐ１酵素によって合成された不溶性セルロースのコロイド分散液を乾燥させることによって作られた薄膜を、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を使用して解析した。簡単に記載すると、不溶性セルロースの〜２ｗｔ％分散液を、３−ｍｉｌ厚のブレードコータを用いてキャストして膜を製膜した。室温でコーティングした湿った膜からゆっくりと水分を蒸散させ乾燥した。乾燥したコーティングの原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）解析（図１Ａおよび１Ｂ）により、約５ｍｍの均一性の高い厚みと数百ナノメータの幅を有する特有の形態を有するシートであることが示された。そのような２次元のグラフェン様セルロースコーティングは、これまでに示されていないと考えられる。それどころか、通常、ナノ結晶セルロースおよび微生物源由来セルロースなどのセルロース材料は、ロッド用コロイドを形成し、２次元のフレーク様構造を形成しない。フレーク様２次元構造は多くの利点を有すると考えられる。例えば、そのような構造特性を有するセルロース材料は、おそらく優れた酸素および／または水のバリア性を有しているであろう。さらに、本明細書に示すセルロース材料の高結晶性は、従来の熱可塑性ポリマーの機械的特性を高めるであろう。
【０１５９】
上で調製された不溶性セルロースのコロイド分散液は容易に塗布することができ、透明な連続膜を形成することができるであろう。そのような膜は、粗さが約３００ｎｍで、１〜２ミクロンの非常に薄い厚さを有した（データは示さず）。したがって、本明細書に示されるこの低分子量の不溶性セルロース材料は、多くの用途を可能にする水性コーティング系に有用であると考えられる。そのような用途の例としては、プラスチックを包装する酸素バリア膜および水蒸気バリア膜、ならびに製品の保存期間を延ばす果物および野菜に適用する食用のコーティングなどが挙げられる。さらに、開示されるコーティングは、種子のコーティング用途、および医薬組成物の活性成分の放出に有用であり得る。
【０１６０】
ＲｃｈＣｄｐ１酵素およびＶｒｕＣｄｐ１酵素のいずれかで合成された不溶性セルロースを１．７〜２．５重量含有するコロイド水分散液の粘度を分析した。簡単に記載すると、ブルックフィールドレオメータ―を使用して、粘度対剪断速度データを得、その曲線から剪断速度１０（１／ｓ）の粘度を求めた。コロイド分散液は両方とも、水の粘度の１００００倍という高い粘度を示すことがわかった（図２）。また、分散液はずり減粘挙動（粘度が剪断速度の関数として減少する）を示した。その挙動は多くの増粘化用途で所望されているものである。各不溶性セルロース試料が低ＤＰｗ（ＤＰｗが２５未満、表２）であることを考慮すると、そのような高レベルの粘度が得られたことは注目すべきことである。実際、商業的に入手可能なカルボキシメチルセルロース（水溶性）では、水中粘度を、本明細書に提示の不溶性セルロースを使用した場合に観察される粘度と同じ程度まで増大させるために、ＤＰｗ（約１０００以上）を大きく増大させる必要があった（図３）。
上記のように、ビブリオ・ルバー（Ｖ．ｒｕｂｅｒ）およびルミノコッカス・チャンパネレンス（Ｒ．ｃｈａｍｐａｎｅｌｌｅｎｓｉｓ）のセロデキストリンホスホリラーゼによって生成された不溶性多糖類物質は低分子量の不溶性セルロースを含む。このセルロースは、約１８〜２４のＤＰｗを有し、セルロースＩＩ型結晶構造を示す。セルロースＩＩ型結晶構造は、マーセル化、誘導体化／非誘導体化処理などの化学的プロセスの結果ではなく、むしろ、不溶性セルロース材料を特徴付けるものである。なぜなら、それが酵素により直接生成されているからである。本明細書に示された不溶性セルロースの特有の特性は、粘度およびレオロジーの変性用途、ならびに膜／バリア用途における使用など、この材料に汎用性を付与するものである。
【０１６１】
以上、本発明を要約すると下記のとおりである。
１．水、グルコース−１−リン酸、セロデキストリン、および配列番号２または配列番号６と少なくとも９０％相同のアミノ酸配列を含むセロデキストリンホスホリラーゼ酵素を含む酵素反応物であって、前記セロデキストリンホスホリラーゼ酵素は、不溶性セルロー
スを合成する、酵素反応物。
２．前記セルロースは、１０〜１０００の重量平均重合度（ＤＰｗ）を有する、上記１に記載の酵素反応物。
３．前記セルロースは、１０〜３０の重量平均重合度（ＤＰｗ）を有する、上記１に記載の酵素反応物。
４．前記セロデキストリンは、セロビオースを含む、上記１に記載の酵素反応物。
５．不溶性セルロースを製造する方法であって、
ａ）少なくとも水、グルコース−１−リン酸、セロデキストリン、および配列番号２または配列番号６と少なくとも９０％相同のアミノ酸配列を含むセロデキストリンホスホリラーゼ酵素を接触させる工程であって、不溶性セルロースが生成される、工程と、
ｂ）任意選択により、工程（ａ）で生成される前記不溶性セルロースを分離する工程とを含む方法。
６．工程（ａ）で生成される前記セルロースは、約１０〜約１０００の重量平均重合度（ＤＰｗ）を有する、上記５に記載の方法。
７．工程（ａ）で生成される前記セルロースは、約１０〜約３０の重量平均重合度（ＤＰｗ）を有する、上記５に記載の方法。
８．工程（ａ）で生成される前記セルロースは、セルロースＩＩ型結晶構造を有する、上記５に記載の方法。
９．前記セロデキストリンは、セロビオースを含む、上記５に記載の方法。
１０．前記グルコース−１−リン酸は、工程（ａ）において第２の反応を行うことによって供給され、前記第２の反応の生成物は、グルコース−１−リン酸を含む、上記５に記載の方法。
１１．前記第２の反応は、
（ｉ）水、無機リン酸塩、デンプン、デンプンホスホリラーゼ、および任意選択によりデンプン脱枝酵素、例えばプルラナーゼまたはイソアミラーゼを接触させるか、
（ｉｉ）水、無機リン酸塩、スクロース、およびスクロースホスホリラーゼ酵素を接触させるか、または
（ｉｉｉ）水、無機リン酸塩、セルロースバイオマス、エンドグルカナーゼ、セロデキストリンホスホリラーゼ、ならびに任意選択により溶解性多糖類モノオキシゲナーゼおよび／またはセロビオヒドロラーゼを接触させる
ことによってグルコース−１−リン酸を生成する、上記１０に記載の方法。
１２．前記第２の反応は、工程（ａ）が実施される容器と同じ容器で行われ、前記第２の反応は、工程（ａ）の前におよび／または工程（ａ）に続いて実施される、上記１０に記載の方法。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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