(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖を含む免疫動員性抗がんモノクローナルＴ細胞受容体（ＩｍｍＴＡＣ）の生成方法であって、
（ａ）
成長温度及び成長撹拌速度を含む成長相、
成長温度からより低い生成温度への温度移行、成長攪拌速度からより低い生成攪拌速度への攪拌速度移行、ならびに
生成温度及び生成撹拌速度を含む生成相、
を含む条件下で、培養培地において、前記ＩｍｍＴＡＣの前記ＴＣＲアルファ鎖及び前記ＴＣＲベータ鎖を発現させるように、前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞を培養することであって、それによって、発現時に、前記ＴＣＲアルファ鎖及び前記ＴＣＲベータ鎖が折り畳まれ、かつ組み立てられて、前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞において生物学的に活性のＩｍｍＴＡＣを形成し、
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、
（１）前記ＩｍｍＴＡＣの前記ＴＣＲアルファ鎖をコードする、第１の翻訳単位、
（２）前記ＩｍｍＴＡＣの前記ＴＣＲベータ鎖をコードする、第２の翻訳単位、ならびに
（３）ペプチジル−プロリルイソメラーゼ、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、少なくとも１つのシャペロンタンパク質をコードする、第３の翻訳単位、
を含む、ポリヌクレオチドを含み、
前記成長温度が成長相中約３０℃〜約３４℃の範囲内であり、前記生成温度が生成相中約２５℃〜約２９℃の範囲内であり、かつ前記成長撹拌速度が、前記生成撹拌速度を５０〜２５０ｒｐｍ上回る、前記培養することと、
（ｂ）前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞から前記生物学的に活性のＩｍｍＴＡＣを回収することと、を含む、前記方法。
【請求項２】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、
（１）前記ＩｍｍＴＡＣの前記ＴＣＲアルファ鎖をコードする、第１の翻訳単位、
（２）前記ＩｍｍＴＡＣの前記ＴＣＲベータ鎖をコードする、第２の翻訳単位、
（３）第１のシャペロンタンパク質をコードする、第３の翻訳単位、
（４）第２のシャペロンタンパク質をコードする、第４の翻訳単位、及び
（５）第３のシャペロンタンパク質をコードする、第５の翻訳単位、
を含む、ポリヌクレオチドを含み、
前記第１、第２、及び第３のシャペロンタンパク質が、ペプチジル−プロリルイソメラーゼ、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、
前記成長温度が成長相中約３０℃〜約３４℃の範囲内であり、前記生成温度が生成相中約２５℃〜約２９℃の範囲内であり、かつ前記成長撹拌速度が、前記生成撹拌速度を５０〜２５０ｒｐｍ上回る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが、プロモータの３つのコピーを更に含み、第１のコピーが、前記第１の翻訳単位と動作可能に組み合わされ、第２のコピーが、前記第２の翻訳単位と動作可能に組み合わされ、第３のコピーが、前記第３の翻訳単位と動作可能に組み合わされ、前記ＴＣＲアルファ鎖、前記ＴＣＲベータ鎖、及び前記シャペロンタンパク質の転写を駆動し、任意選択的に前記プロモータが、誘導プロモータであり、任意選択的に前記誘導プロモータが、ＩＰＴＧ誘導の不在下で、前記ＴＣＲアルファ鎖、前記ＴＣＲベータ鎖、及び前記シャペロンタンパク質の転写を駆動するＩＰＴＧ誘導プロモータであり、かつ任意選択的に前記誘導プロモータが、前記培養培地中のリン酸塩が枯渇したとき、前記ＴＣＲアルファ鎖、前記ＴＣＲベータ鎖、及び前記シャペロンタンパク質の転写を駆動するＰｈｏプロモータである、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが、選択可能なマーカを更に含み、前記培養培地が、前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞に前記ポリヌクレオチドを保持させるように、単一の抗生物質からなる選択剤を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の翻訳単位が、前記ＴＣＲアルファ鎖のコード領域と動作可能に組み合わされた第１の翻訳開始領域（ＴＩＲ）を含み、前記第２の翻訳単位が、前記ＴＣＲベータ鎖のコード領域と動作可能に組み合わされた第２の翻訳開始領域（ＴＩＲ）を含み、前記第１及び第２のＴＩＲの相対的翻訳強度が、約１．０〜約３．０である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つのシャペロンタンパク質、または前記第１のシャペロンタンパク質が、ペプチジル−プロリルイソメラーゼを含み、任意選択的に前記ペプチジル−プロリルイソメラーゼが、ＦｋｐＡタンパク質であり、かつ任意選択的に前記ＦｋｐＡが、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＦｋｐＡである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つのシャペロンタンパク質が更に、または前記第２のシャペロンタンパク質及び前記第３のシャペロンタンパク質のうちの一方もしくは両方が、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼを含み、任意選択的に前記タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼが、ＤｓｂＡタンパク質及びＤｓｂＣタンパク質のうちの一方または両方であり、任意選択的に前記少なくとも１つのタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼが、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤｓｂＡ及びＥ．ｃｏｌｉ  ＤｓｂＣのうちの一方または両方である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、ｄｅｇｐＳ２１０Ａ突然変異を有する株である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、Ｗ３１１０  ΔｆｈｕＡ  ΔｐｈｏＡ  ｉｌｖＧ２０９６（Ｖａｌｒ）  Δｐｒｃ  ｓｐｒ４３Ｈ１  ΔｄｅｇＰ  ΔｍａｎＡ  ｌａｃＩＱ  ΔｏｍｐＴ  ΔｍｅｎＥ  ｄｅｇｐＳ２１０Ａの遺伝子型を有する株である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＴＣＲアルファ鎖が、ＴＣＲアルファ鎖可変ドメイン及びＴＣＲアルファ鎖定常ドメインを含み、前記ＴＣＲベータ鎖が、ＴＣＲベータ鎖可変ドメイン及びＴＣＲベータ鎖定常ドメインを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＩｍｍＴＡＣの前記２つの鎖が、少なくとも１つのジスルフィド結合によって互いに連結される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＩｍｍＴＡＣが、Ｔ細胞に結合し、Ｔ細胞応答を活性化する抗体断片を更に含み、任意選択的に前記抗体断片が、抗ＣＤ３単鎖抗体断片を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＩｍｍＴＡＣが、操作されなかったＴＣＲの抗原に対する親和性と比較して、前記抗原に対する改善された親和性を保持するように操作されたＴＣＲを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＩｍｍＴＡＣが、前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞のペリプラズムから回収される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記成長撹拌速度が、前記生成相中の前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞におけるピーク酸素取り込み速度を０．５〜２．５ｍｍｏｌ／Ｌ／分上回る、前記成長相中の前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞における酸素取り込み速度を達成するために十分である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記成長相中の前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞の前記ピーク酸素取り込み速度が、３．５〜４．５ｍｍｏｌ／Ｌ／分の範囲内であり、前記生成相中の前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞の前記ピーク酸素取り込み速度が、１．０〜３．０ｍｍｏｌ／Ｌ／分の範囲内である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記成長撹拌速度が、前記生成撹拌速度よりも１０％〜４０％高い、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１１月５日に出願された米国仮出願第６２／０７５，７９８号の利益を主張するものであり、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
ＡＳＣＩＩテキストファイルによる配列表の提出
以下のＡＳＣＩＩテキストファイルによる提出の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。コンピュータ可読形態（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：１４６３９２０３５１４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０１５年１１月５日、サイズ：２ＫＢ）。
【０００３】
本開示は、免疫動員性抗癌モノクローナルＴ細胞受容体（ＩｍｍＴＡＣ）タンパク質等の組み換えポリペプチドの生成方法に関する。より具体的には、本開示は、最適化された発現ベクター及び培養プロセスの利用による、細菌における異種分泌タンパク質の生成方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
原核宿主細胞における組み換えタンパク質生成は、１９７８年の大腸菌におけるヒトインスリンの生成以来、多くの重要な治療薬剤の源となっている。分子生物学ツール及び知識が発達するにつれて、組み換え治療薬の複雑性もまた増している。これらの組み換えタンパク質の生成において、生成物が、適切な翻訳、折り畳み、組み立て、ジスルフィド結合、及びペリプラズムへの輸送等の特性を呈することを必要とする。多くの組み換えタンパク質、特に、ジスルフィド結合を有するもの（例えば、抗体及び抗体断片を含むが、これらに限定されない、２鎖タンパク質）の発現により、原核宿主細胞において封入体が形成されるということが知られている（Ｓｐａｄｉｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３２：５４，２０１４）。したがって、産業規模で、原核宿主細胞における適切に折り畳まれ、かつ組み立てられた２鎖タンパク質の組み換え生成のための発現系及びプロセスが必要とされている。
【０００５】
モノクローナル抗体は、最も速く成長しているタイプの組み換え治療薬剤のうちの１つに相当し、多数のモノクローナル抗体が、種々の疾患の治療のために既に承認されているか、または審査中である（Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，９：７６７，２０１０）。従来のモノクローナル抗体は、単一の標的抗原に結合する。多くの疾患では、２つ以上の標的抗原に結合する抗体、すなわち、多特異性抗体を採用することが有利であり得る。かかる抗体は、複数の治療的標的を対象とする組み合わせアプローチにおいて採用することができる（例えば、Ｂｏｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２３：１６１０，２００９、及びＷｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２５：１２９０，２００７を参照されたい）。例えば、癌細胞の表面上で発現したエピトープ、及びＴ細胞上で発現したエピトープに同時に結合して、腫瘍細胞のＴ細胞媒介殺滅を誘導する、二重特異性抗体を生成することができる（Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７４：１８５，１９９５）。
【０００６】
診療所における二重特異性抗体の使用では、産業上関連する量の２鎖タンパク質を生成する能力が必要とされる。原核宿主細胞における組み換えタンパク質生成を改善するベクター構成要素が説明されているが（例えば、Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，１９：３８５，２００６、及びＳｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６３：１３３，２００２を参照されたい）、そこで説明されている結果は、発現ベクターへの修飾のみでは、２鎖タンパク質の製造中に直面する生成の問題全てが解決されるわけではないということを実証する。調製規模で抗体断片及び半抗体等の組み換え２鎖タンパク質を効率的に生成するための最適な方法が依然として必要とさている。
【０００７】
特許出願、特許公報、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号を含む、本明細書において引用される全ての参考文献は、各個々の参考文献が、参照によって組み込まれているように具体的かつ個々に示されているかのように、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【０００８】
一態様において、原核宿主細胞における２つの鎖を含むポリペプチドの生成方法が提供され、該方法は、（ａ）ポリペプチドの２つの鎖を発現させるように、宿主細胞を培養することであって、それによって、発現時に、２つの鎖が折り畳まれ、かつ組み立てられて、宿主細胞において生物学的に活性のポリペプチドを形成し、宿主細胞は、（１）ポリペプチドの第１の鎖をコードする第１の翻訳単位、（２）ポリペプチドの第２の鎖をコードする第２の翻訳単位、ならびに（３）ペプチジル−プロリルイソメラーゼ、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、少なくとも１つのシャペロンタンパク質をコードする第３の翻訳単位、を含む、ポリヌクレオチドを含み、宿主細胞は、成長温度及び成長撹拌速度を含む成長相、ならびに生成温度及び生成撹拌速度を含む生成相を含む条件下で、培養培地において培養され、成長温度は、生成温度を２〜１０℃上回り、成長撹拌速度は、生成撹拌速度を５０〜２５０ｒｐｍ上回る、培養することと、（ｂ）宿主細胞から生物学的に活性のポリペプチドを回収することと、を含む。また、原核宿主細胞におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖を含む免疫動員性抗癌モノクローナルＴ細胞受容体（ＩｍｍＴＡＣ）の生成方法も提供され、該方法は、（ａ）成長温度及び成長撹拌速度を含む成長相、ならびに生成温度及び生成撹拌速度を含む生成相を含む条件下で、培養培地において、ＩｍｍＴＡＣのＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖を発現させるように宿主細胞を培養することであって、それによって、発現時に、ＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖が折り畳まれ、かつ組み立てられて、宿主細胞において生物学的に活性のＩｍｍＴＡＣを形成し、宿主細胞は、（１）ＩｍｍＴＡＣのＴＣＲアルファ鎖をコードする第１の翻訳単位、（２）ＩｍｍＴＡＣのＴＣＲベータ鎖をコードする第２の翻訳単位、ならびに（３）ペプチジル−プロリルイソメラーゼ、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、少なくとも１つのシャペロンタンパク質をコードする第３の翻訳単位、を含む、ポリヌクレオチドを含み、成長温度は、生成温度を２〜１０℃上回り、成長撹拌速度は、生成撹拌速度を５０〜２５０ｒｐｍ上回る、培養することと、（ｂ）宿主細胞から生物学的に活性のＩｍｍＴＡＣを回収することと、を含む。また、原核宿主細胞における２つの鎖を含むポリペプチドの生成方法も提供され、該方法は、（ａ）ポリペプチドの２つの鎖を発現させるように、宿主細胞を培養することであって、それによって、発現時に、２つの鎖が折り畳まれ、かつ組み立てられて、宿主細胞において生物学的に活性のポリペプチドを形成し、宿主細胞は、（１）ポリペプチドの第１の鎖をコードする第１の翻訳単位、（２）ポリペプチドの第２の鎖をコードする第２の翻訳単位、（３）第１のシャペロンタンパク質をコードする第３の翻訳単位、（４）第２のシャペロンタンパク質をコードする第４の翻訳単位、ならびに（５）第３のシャペロンタンパク質をコードする第５の翻訳単位（第１、第２、及び第３のシャペロンタンパク質は、ペプチジル−プロリルイソメラーゼ、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される）を含むポリヌクレオチドを含み、宿主細胞は、成長温度及び成長撹拌速度を含む成長相、ならびに生成温度及び生成撹拌速度を含む生成相を含む条件下で、培養培地において培養され、成長温度は、生成温度を２〜１０℃上回り、成長撹拌速度は、生成撹拌速度を５０〜２５０ｒｐｍ上回る、培養することと、（ｂ）宿主細胞から生物学的に活性のポリペプチドを回収することと、を含む。また、原核宿主細胞におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖を含む免疫動員性抗癌モノクローナルＴ細胞受容体（ＩｍｍＴＡＣ）の生成方法も提供され、該方法は、（ａ）成長温度及び成長撹拌速度を含む成長相、ならびに生成温度及び生成撹拌速度を含む生成相を含む条件下で、培養培地において、ＩｍｍＴＡＣのＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖を発現させるように、宿主細胞を培養することであって、それによって、発現時に、ＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖が折り畳まれ、かつ組み立てられて、宿主細胞において生物学的に活性のＩｍｍＴＡＣを形成し、宿主細胞は、（１）ＩｍｍＴＡＣのＴＣＲアルファ鎖をコードする第１の翻訳単位、（２）ＩｍｍＴＡＣのＴＣＲベータ鎖をコードする第２の翻訳単位、（３）第１のシャペロンタンパク質をコードする第３の翻訳単位、（４）第２のシャペロンタンパク質をコードする第４の翻訳単位、ならびに（５）第３のシャペロンタンパク質をコードする第５の翻訳単位（第１、第２、及び第３のシャペロンタンパク質は、ペプチジル−プロリルイソメラーゼ、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される）を含む、ポリヌクレオチドを含み、成長温度は、生成温度を２〜１０℃上回り、成長撹拌速度は、生成撹拌速度を５０〜２５０ｒｐｍ上回る、培養することと、（ｂ）宿主細胞から生物学的に活性のＩｍｍＴＡＣを回収することと、を含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、３つ、４つ、または５つの鎖を含む。一部の実施形態において、培養培地のｐＨは、生成相中、６．７〜７．３の範囲内のｐＨに維持される。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、プロモータの３つのコピーを更に含み、第１のコピーは、第１の翻訳単位と動作可能に組み合わされ、第２のコピーは、第２の翻訳単位と動作可能に組み合わされ、第３のコピーは、第３の翻訳単位と動作可能に組み合わされ、第１の鎖、第２の鎖、及びシャペロンタンパク質の転写を駆動する。一部の実施形態において、３つのシャペロンタンパク質のうちの２つをコードする翻訳単位のうちの２つは、単一の転写単位（２シストロン単位）の一部である。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、各翻訳単位と動作可能に組み合わされたプロモータを更に含む。一部の実施形態において、プロモータは、誘導プロモータである。一部の実施形態において、誘導プロモータは、ＩＰＴＧ誘導の不在下で、第１の鎖、第２の鎖、及びシャペロンタンパク質の転写を駆動するＩＰＴＧ誘導プロモータである。一部の実施形態において、誘導プロモータは、ＩＰＴＧ誘導の不在下で、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、及びシャペロンタンパク質の転写を駆動するＩＰＴＧ誘導プロモータである。一部の実施形態において、誘導プロモータは、培養培地中のリン酸塩が枯渇したとき、第１の鎖、第２の鎖、及びシャペロンタンパク質の転写を駆動するＰｈｏプロモータである。一部の実施形態において、誘導プロモータは、培養培地中のリン酸塩が枯渇したとき、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、及びシャペロンタンパク質の転写を駆動するＰｈｏプロモータである。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、選択可能なマーカを更に含み、培養培地は、宿主細胞にポリヌクレオチドを保持させるように、単一の抗生物質からなる選択剤を含む。一部の実施形態において、第１の翻訳単位は、第１の鎖のコード領域と動作可能に組み合わされた第１の翻訳開始領域（ＴＩＲ）を含み、第２の翻訳単位は、第２の鎖のコード領域と動作可能に組み合わされた第２の翻訳開始領域（ＴＩＲ）を含み、第１及び第２のＴＩＲの相対的翻訳強度は、約１．０〜約３．０である。一部の実施形態において、第１の翻訳単位は、ＴＣＲアルファ鎖のコード領域と動作可能に組み合わされた第１の翻訳開始領域（ＴＩＲ）を含み、第２の翻訳単位は、ＴＣＲベータ鎖のコード領域と動作可能に組み合わされた第２の翻訳開始領域（ＴＩＲ）を含み、第１及び第２のＴＩＲの相対的翻訳強度は、約１．０〜約３．０である。一部の実施形態において、少なくとも１つのシャペロンタンパク質、または第１のシャペロンタンパク質は、ペプチジル−プロリルイソメラーゼを含む。一部の実施形態において、ペプチジル−プロリルイソメラーゼは、ＦｋｐＡタンパク質である。一部の実施形態において、ＦｋｐＡは、大腸菌ＦｋｐＡである。一部の実施形態において、少なくとも１つのシャペロンタンパク質は更に、または第２のシャペロンタンパク質及び第３のシャペロンタンパク質のうちの一方もしくは両方は、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼを含む。一部の実施形態において、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼは、ＤｓｂＡタンパク質及びＤｓｂＣタンパク質のうちの一方または両方である。
一部の実施形態において、少なくとも１つのタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼは、大腸菌ＤｓｂＡ及び大腸菌ＤｓｂＣのうちの一方または両方である。一部の実施形態において、原核宿主細胞は、グラム陰性細菌である。一部の実施形態において、グラム陰性細菌は、大腸菌である。一部の実施形態において、大腸菌は、内因性プロテアーゼ活性を欠く株のものである。一部の実施形態において、大腸菌は、ｄｅｇｐＳ２１０Ａ突然変異を有する株である。一部の実施形態において、大腸菌は、Ｗ３１１０  ΔｆｈｕＡ  ΔｐｈｏＡ  ｉｌｖＧ２０９６  （Ｖａｌｒ）  Δｐｒｃ  ｓｐｒ４３Ｈ１  ΔｄｅｇＰ  ΔｍａｎＡ  ｌａｃＩＱ  ΔｏｍｐＴ  ΔｍｅｎＥ  ｄｅｇｐＳ２１０Ａの遺伝子型を有する株である。一部の実施形態において、ポリペプチドは、宿主細胞に対して異種である。一部の実施形態において、ポリペプチドは、ヘテロ二量体（例えば、二重特異性抗体）のモノマーである。一部の実施形態において、ＴＣＲアルファ鎖は、ＴＣＲアルファ鎖可変ドメイン及びＴＣＲアルファ鎖定常ドメインを含み、ＴＣＲベータ鎖は、ＴＣＲベータ鎖可変ドメイン及びＴＣＲベータ鎖定常ドメインを含む。一部の実施形態において、ポリペプチドの２つの鎖は、少なくとも１つのジスルフィド結合によって互いに連結される。一部の実施形態において、ＩｍｍＴＡＣの２つの鎖は、少なくとも１つのジスルフィド結合によって互いに連結される。一部の実施形態において、ＩｍｍＴＡＣは、Ｔ細胞に結合し、Ｔ細胞応答を活性化する抗体断片を更に含む。一部の実施形態において、抗体断片は、抗ＣＤ３単鎖抗体断片を含む。一部の実施形態において、ＩｍｍＴＡＣは、操作されなかったＴＣＲの抗原に対する親和性と比較して、抗原に対する改善された親和性を保持するように操作されたＴＣＲを含む。一部の実施形態において、ポリペプチドの２つの鎖は、ポリペプチドリンカーによって互いに連結される。一部の実施形態において、ポリペプチドは、第１の鎖及び第２の鎖が免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を含む、一価抗体である。一部の実施形態において、免疫グロブリン重鎖は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプである。一部の実施形態において、一価抗体は、抗原に特異的に結合することが可能である。一部の実施形態において、抗原は、サイトカインである。一部の実施形態において、サイトカインは、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、及び腫瘍壊死因子からなる群から選択される。一部の実施形態において、成長因子は、血管内皮成長因子である。一部の実施形態において、抗原は、ＩＬ−４、ＩＬ１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１７、ＶＥＧＦＡ、及びＶＥＧＦＣからなる群から選択される。一部の実施形態において、ポリペプチドは、宿主細胞のペリプラズムから回収される分泌タンパク質である。一部の実施形態において、ＩｍｍＴＡＣは、宿主細胞のペリプラズムから回収される。一部の実施形態において、ポリペプチドは、抗ＣＤ３単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に融合される、溶解親和性が向上したＴ細胞受容体を含む免疫動員性抗癌モノクローナルＴ細胞受容体（ＩｍｍＴＡＣ）である。一部の実施形態において、成長温度は、成長相中、約３０℃���約３４℃の範囲内であり、生成温度は、生成相中、約２５℃〜約２９℃の範囲内である。一部の実施形態において、成長撹拌速度は、成長相中、約６００〜８００ｒｐｍの範囲内であり、生成撹拌速度は、生成相中、約３００〜約５００ｒｐｍの範囲内である。一部の実施形態において、成長撹拌速度は、生成相中の宿主細胞におけるピーク酸素取り込み速度を０．５〜２．５ｍｍｏｌ／Ｌ／分上回る、成長相中の宿主細胞における酸素取り込み速度を達成するために十分である。一部の実施形態において、成長相中の宿主細胞のピーク酸素取り込み速度は、３．５〜４．５ｍｍｏｌ／Ｌ／分の範囲内であり、生成相中の宿主細胞の酸素取り込み速度は、１．０〜３．０ｍｍｏｌ／Ｌ／分の範囲内である。一部の実施形態において、成長撹拌速度は、生成撹拌速度よりも約１０％〜約４０％（ｒｐｍ／ｒｐｍ）高い。
【０００９】
本明細書において説明される種々の実施形態の特性のうちの１つ、一部、または全てが、組み合わされて、本開示の他の実施形態を形成し得るということが理解されるものとする。本開示のこれらの態様及び他の態様は、当業者には明らかとなるであろう。本開示のこれらの実施形態及び他の実施形態は、以下の発明を実施するための形態によって更に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】ｘＩＬ１３半抗体（ｈＡｂ）生成ベクターからの全軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）のサブユニットの生成を示す。図１Ａは、ＲＰ−ＨＰＬＣによって測定されるＴＩＲ１，１（黒色の棒）及びＴＩＲ２，２（縞模様の棒）生成ベクターから生成されるＬＣ及びＨＣに関する全サブユニットのグラフを提供する。図１Ｂは、ＴＩＲ１，１生成ベクターからのＬＣ及びＨＣ（黒色の棒）または可溶性ＬＣ及びＨＣ（灰色の棒）に関して生成される全サブユニットのグラフを提供する。図１Ｃは、ＴＩＲ２，２生成ベクターからの全ＬＣ及びＨＣ（黒色の棒）または可溶性ＬＣ及びＨＣ（灰色の棒）に関して生成される全サブユニットのグラフを提供する。
【図１Ｂ】ｘＩＬ１３半抗体（ｈＡｂ）生成ベクターからの全軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）のサブユニットの生成を示す。図１Ａは、ＲＰ−ＨＰＬＣによって測定されるＴＩＲ１，１（黒色の棒）及びＴＩＲ２，２（縞模様の棒）生成ベクターから生成されるＬＣ及びＨＣに関する全サブユニットのグラフを提供する。図１Ｂは、ＴＩＲ１，１生成ベクターからのＬＣ及びＨＣ（黒色の棒）または可溶性ＬＣ及びＨＣ（灰色の棒）に関して生成される全サブユニットのグラフを提供する。図１Ｃは、ＴＩＲ２，２生成ベクターからの全ＬＣ及びＨＣ（黒色の棒）または可溶性ＬＣ及びＨＣ（灰色の棒）に関して生成される全サブユニットのグラフを提供する。
【図１Ｃ】ｘＩＬ１３半抗体（ｈＡｂ）生成ベクターからの全軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）のサブユニットの生成を示す。図１Ａは、ＲＰ−ＨＰＬＣによって測定されるＴＩＲ１，１（黒色の棒）及びＴＩＲ２，２（縞模様の棒）生成ベクターから生成されるＬＣ及びＨＣに関する全サブユニットのグラフを提供する。図１Ｂは、ＴＩＲ１，１生成ベクターからのＬＣ及びＨＣ（黒色の棒）または可溶性ＬＣ及びＨＣ（灰色の棒）に関して生成される全サブユニットのグラフを提供する。図１Ｃは、ＴＩＲ２，２生成ベクターからの全ＬＣ及びＨＣ（黒色の棒）または可溶性ＬＣ及びＨＣ（灰色の棒）に関して生成される全サブユニットのグラフを提供する。
【図２】二重カラムＲＰ−ＨＰＬＣによって測定されるＴＩＲ１，１（黒色の棒）またはＴＩＲ２，２（縞模様の棒）ｈＡｂ生成ベクターを使用したｘＩＬ１３  ｈＡｂの力価を示す。
【図３Ａ】細菌宿主細胞におけるタンパク質の折り畳み及び組み立てを示す。図３Ａは、細菌タンパク質生成を描写する概略図であり、シャペロンを使用したペリプラズムにおけるタンパク質の折り畳み及び組み立てを示す。図３Ｂは、ペプチジル−プロリルイソメラーゼ（「Ｐｐｉａｓｅ」）、オキシドレダカターゼ（ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃａｔａｓｅ）、及び他のシャペロンを含む、シャペロンタンパク質の一覧である。
【図３Ｂ】細菌宿主細胞におけるタンパク質の折り畳み及び組み立てを示す。図３Ａは、細菌タンパク質生成を描写する概略図であり、シャペロンを使用したペリプラズムにおけるタンパク質の折り畳み及び組み立てを示す。図３Ｂは、ペプチジル−プロリルイソメラーゼ（「Ｐｐｉａｓｅ」）、オキシドレダカターゼ（ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃａｔａｓｅ）、及び他のシャペロンを含む、シャペロンタンパク質の一覧である。
【図４】図４Ａは、ＦｋｐＡ変異形をスクリーニングするために使用される適合性の系を示す。図４Ｂは、抗体ＬＣ、ＨＣ、及びＦｋｐＡをコードする単一のｘＩＬ１３プラスミド（ｐｘＩＬ１３．２．２．ＦｋｐＡｃ１３）の産生を示す。
【図５Ａ】ＦｋｐＡ発現の滴定時のｘＶＥＧＦ  ＩｇＧ１  ｈＡｂの生成を示す。図５Ａは、異なるレベルのＦｋｐＡの発現時のｈＡｂ及び可溶性モノマー重鎖蓄積を示すウェスタンブロットを描写し、クマシー染色ゲルは、各条件下での全可溶性タンパク質生成を示す。図５Ｂのグラフは、異なるレベルのＦｋｐＡの発現時に生成されるｈＡｂの力価を示す。
【図５Ｂ】ＦｋｐＡ発現の滴定時のｘＶＥＧＦ  ＩｇＧ１  ｈＡｂの生成を示す。図５Ａは、異なるレベルのＦｋｐＡの発現時のｈＡｂ及び可溶性モノマー重鎖蓄積を示すウェスタンブロットを描写し、クマシー染色ゲルは、各条件下での全可溶性タンパク質生成を示す。図５Ｂのグラフは、異なるレベルのＦｋｐＡの発現時に生成されるｈＡｂの力価を示す。
【図６Ａ】異なるレベルのＦｋｐＡの発現時のｘＩＬ１３  ＩｇＧ４  ｈＡｂの生成を示す。図６Ａは、異なるベクター系を使用して生成されるｘＩＬ１３  ｈＡｂの力価を示すグラフを提供し、各条件におけるｈＡｂ及び可溶性モノマー重鎖蓄積を示すウェスタンブロットを伴う。図６Ｂは、異なるベクター系を使用して生成されるＦｋｐＡの量を示すグラフを提供し、各条件におけるＦｋｐＡの発現を示すウェスタンブロットを伴う。両方のパネルにおいて、「内因性ＦｋｐＡレベル」は、ＦｋｐＡをコードするプラスミドを含有しない細菌宿主細胞を指し、「適合性ＦｋｐＡレベル」は、別個の（適合性）プラスミドからのｘＩＬ１３及びＦｋｐＡの発現を指し、「単一のＦｋｐＡレベル」は、ｘＩＬ１３及びＦｋｐＡの両方を発現する単一のベクターを指す。
【図６Ｂ】異なるレベルのＦｋｐＡの発現時のｘＩＬ１３  ＩｇＧ４  ｈＡｂの生成を示す。図６Ａは、異なるベクター系を使用して生成されるｘＩＬ１３  ｈＡｂの力価を示すグラフを提供し、各条件におけるｈＡｂ及び可溶性モノマー重鎖蓄積を示すウェスタンブロットを伴う。図６Ｂは、異なるベクター系を使用して生成されるＦｋｐＡの量を示すグラフを提供し、各条件におけるＦｋｐＡの発現を示すウェスタンブロットを伴う。両方のパネルにおいて、「内因性ＦｋｐＡレベル」は、ＦｋｐＡをコードするプラスミドを含有しない細菌宿主細胞を指し、「適合性ＦｋｐＡレベル」は、別個の（適合性）プラスミドからのｘＩＬ１３及びＦｋｐＡの発現を指し、「単一のＦｋｐＡレベル」は、ｘＩＬ１３及びＦｋｐＡの両方を発現する単一のベクターを指す。
【図７Ａ】ＦｋｐＡの誘導発現時のｘＩＬ４  ＩｇＧ４  ｈＡｂの生成を示す。図７Ａは、ｈＡｂ及び可溶性モノマー重鎖蓄積を示すウェスタンブロットを描写する。図７Ｂは、ＦｋｐＡの誘導発現を使用して生成されるｘＩＬ４  ｈＡｂの力価を示すグラフを提供し、ＦｋｐＡの発現を示すウェスタンブロットを伴う。両方のパネルにおいて、試料１は、ｘＩＬ４  ｈＡｂの生成のためのＴＩＲ１，１ベクターを使用し、ＦｋｐＡを過剰発現せず、試料２は、ｘＩＬ４  ｈＡｂの生成のためのＴＩＲ２，２ベクターを使用し、ＦｋｐＡを過剰発現せず、試料３は、ＴＩＲ１，１を使用して、ｘＩＬ４  ｈＡｂ及びＩＰＴＧを生成して、ＦｋｐＡ発現を誘導し、試料４は、ＴＩＲ２，２を使用して、ｘＩＬ４  ｈＡｂ及びＩＰＴＧを生成して、ＦｋｐＡ発現を誘導する。
【図７Ｂ】ＦｋｐＡの誘導発現時のｘＩＬ４  ＩｇＧ４  ｈＡｂの生成を示す。図７Ａは、ｈＡｂ及び可溶性モノマー重鎖蓄積を示すウェスタンブロットを描写する。図７Ｂは、ＦｋｐＡの誘導発現を使用して生成されるｘＩＬ４  ｈＡｂの力価を示すグラフを提供し、ＦｋｐＡの発現を示すウェスタンブロットを伴う。両方のパネルにおいて、試料１は、ｘＩＬ４  ｈＡｂの生成のためのＴＩＲ１，１ベクターを使用し、ＦｋｐＡを過剰発現せず、試料２は、ｘＩＬ４  ｈＡｂの生成のためのＴＩＲ２，２ベクターを使用し、ＦｋｐＡを過剰発現せず、試料３は、ＴＩＲ１，１を使用して、ｘＩＬ４  ｈＡｂ及びＩＰＴＧを生成して、ＦｋｐＡ発現を誘導し、試料４は、ＴＩＲ２，２を使用して、ｘＩＬ４  ｈＡｂ及びＩＰＴＧを生成して、ＦｋｐＡ発現を誘導する。
【図８Ａ】ＦｋｐＡの発現時のｘＶＥＧＦＣ  ＩｇＧ１  ｈＡｂの生成を示す。図８Ａは、異なるベクター系を使用して生成されるｘＶＥＧＦＣ  ｈＡｂの力価を示すグラフを提供する。図８Ｂは、標識されるＦｋｐＡバンドを伴う、両方の条件下での全可溶性タンパク質生成を示すゲルを描写する。図８Ｃは、ｘＶＥＧＦＣ  ｈＡｂ及び可溶性モノマー重鎖の蓄積を示す、ウェスタンブロットを描写する。全てのパネルにおいて、試料１は、ｘＶＥＧＦＣ  ｈＡｂの生成のためのＴＩＲ２，２ベクターを使用し、ＦｋｐＡの発現のためのプラスミドを含有せず、試料２は、ｘＩＬ４  ｈＡｂ及びＩＰＴＧの生成のためのＴＩＲ２，２ベクターを使用して、ＦｋｐＡ発現を誘導する。
【図８Ｂ】ＦｋｐＡの発現時のｘＶＥＧＦＣ  ＩｇＧ１  ｈＡｂの生成を示す。図８Ａは、異なるベクター系を使用して生成されるｘＶＥＧＦＣ  ｈＡｂの力価を示すグラフを提供する。図８Ｂは、標識されるＦｋｐＡバンドを伴う、両方の条件下での全可溶性タンパク質生成を示すゲルを描写する。図８Ｃは、ｘＶＥＧＦＣ  ｈＡｂ及び可溶性モノマー重鎖の蓄積を示す、ウェスタンブロットを描写する。全てのパネルにおいて、試料１は、ｘＶＥＧＦＣ  ｈＡｂの生成のためのＴＩＲ２，２ベクターを使用し、ＦｋｐＡの発現のためのプラスミドを含有せず、試料２は、ｘＩＬ４  ｈＡｂ及びＩＰＴＧの生成のためのＴＩＲ２，２ベクターを使用して、ＦｋｐＡ発現を誘導する。
【図８Ｃ】ＦｋｐＡの発現時のｘＶＥＧＦＣ  ＩｇＧ１  ｈＡｂの生成を示す。図８Ａは、異なるベクター系を使用して生成されるｘＶＥＧＦＣ  ｈＡｂの力価を示すグラフを提供する。図８Ｂは、標識されるＦｋｐＡバンドを伴う、両方の条件下での全可溶性タンパク質生成を示すゲルを描写する。図８Ｃは、ｘＶＥＧＦＣ  ｈＡｂ及び可溶性モノマー重鎖の蓄積を示す、ウェスタンブロットを描写する。全てのパネルにおいて、試料１は、ｘＶＥＧＦＣ  ｈＡｂの生成のためのＴＩＲ２，２ベクターを使用し、ＦｋｐＡの発現のためのプラスミドを含有せず、試料２は、ｘＩＬ４  ｈＡｂ及びＩＰＴＧの生成のためのＴＩＲ２，２ベクターを使用して、ＦｋｐＡ発現を誘導する。
【図９】ｘＩＬ１３  ｈＡｂの発現のための第１のプラスミド（ｐｘＩＬ１３．２．２．ＦｋｐＡｃ１３）、ならびにＤｓｂＡ及びＤｓｂＣの発現のための第２のプラスミド（ｐＪＪ２４７）を採用する、適合性プラスミド系を示す。
【図１０】ＩＰＴＧ誘導を伴う、また伴わない、ｘＩＬ１３．２．２．ＦｋｐＡｃ１３生成プラスミド、ならびにＤｓｂＡ及びＤｓｂＣの発現のための適合性プラスミドを使用した、経時的なｘＩＬ１３  ｈＡｂの生成を示すグラフを提供する。
【図１１】図１１Ａは、ｘＩＬ１４  ｈＡｂの適合性プラスミド系を示す。図１１Ｂは、ｘＩＬ１４  ｈＡｂ  ＬＣ及びＨＣ、ＦｋｐＡ、ＤｓｂＡ、ならびにＤｓｂＣをコードする単一プラスミドの産生を示す。
【図１２】ＦｋｐＡ、ＤｓｂＡ、及びＤｓｂＣ発現の不在下における、ＴＩＲ１，１またはＴＩＲ２，２ベクターを用いた（標識される１及び２）、ＩＰＴＧ誘導ＦｋｐＡ発現の存在下における（標識される３及び４）、ならびにＩＰＴＧの不在下における、ＦｋｐＡ、ＤｓｂＡ、及びＤｓｂＣを伴うプラスミドの存在下における（標識される５及び６）、ｘＩＬ４  ｈＡｂの生成を示す。図１２Ａは、種々の条件下でのｘＩＬ４  ｈＡｂ及び可溶性モノマー重鎖の蓄積を示す、ウェスタンブロットを描写する。図１２Ｂは、種々の条件下で生成されるｘＩＬ４  ｈＡｂの力価を示すグラフを提供し、ＦｋｐＡの発現を示すウェスタンブロットを伴う。
【図１３】ＦｋｐＡ、ＤｓｂＡ、及びＤｓｂＣ発現の不在下における、ＴＩＲ２，２ベクターを用いた（カラム１）、ＩＰＴＧ誘導ＦｋｐＡ発現の存在下における（カラム２）、ならびにＩＰＴＧの不在下における、ＦｋｐＡ、ＤｓｂＡ、及びＤｓｂＣを伴うプラスミドの存在下における（カラム３）、ｘＶＥＧＦＣ  ｈＡｂの生成を示す。
【図１４】ＦｋｐＡ、ＤｓｂＡ、及びＤｓｂＣ発現の不在下における、ＴＩＲ１，１またはＴＩＲ２，２ベクターを用いた（標識される１及び３）、ならびにＩＰＴＧの不在下における、ＦｋｐＡ、ＤｓｂＡ、及びＤｓｂＣを伴うプラスミドの存在下における（標識される２及び４）、ｘＶＥＧＦＡ  ＩｇＧ１  ｈＡｂの生成を示す。
【図１５】ＦｋｐＡ、ＤｓｂＡ、及びＤｓｂＣが同じベクターから発現される場合の（「単一」）、ならびにＦｋｐＡ、ＤｓｂＡ、及びＤｓｂＣが、第２の適合性ベクターから発現される場合の（「適合性」）、併せて、抗体発現ベクターがなく、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＣ、及びＦｋｐＡ過剰発現がない陰性対照（「対照」）の、ＴＩＲ２，２ベクターを用いたｘＩＬ４  ｈＡｂの生成を示す。ウェスタンブロットは、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＣ、及びＦｋｐＡの発現を示す。
【図１６】図１６Ａは、既に記載したｐｘＩＬ１３．２．２．ＦｋｐＡｃ１３生成プラスミド及び適合性オキシドレダクターゼプラスミド（ｐＪＪ２４７）を利用する、ｘＩＬ１３適合性プラスミド系を示す。図１６Ｂは、ｐｘＩＬ１３．２．２．ＦｋｐＡｃ１３及びｐＪＪ２４７からのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を組み込む単一プラスミド（ＭＤ１５７）の産生を示す。
【図１７】ＦｋｐＡ、ＤｓｂＡ、及びＤｓｂＣが、同じベクターから発現される場合（「単一」）の、ならびにＤｓｂＡ及びＤｓｂＣが、適合性ベクターから発現され、かつＦｋｐＡが、ｘＩＬ１３．２．２．ＦｋｐＡｃ１３ベクターから発現される場合（「適合性」）の、ＴＩＲ２，２ベクターを用いたｘＩＬ１３  ｈＡｂの経時的な生成を示す。これらのベクターは、ｐｈｏＡプロモータを使用してＦｋｐＡ発現を駆動する。
【図１８】２つのベクターを保有する細胞の一定の撹拌速度下で成長させた培養における経時的な平均酸素取り込み速度（ＯＵＲ）を示す。２つのベクターとは、ｘＩＬ１３  ｈＡｂ及びＦｋｐＡを発現しているＴＩＲ２，２ベクター、ならびにＩＰＴＧ誘導プロモータの下でＤｓｂＡ及びＤｓｂＣを発現しているベクターである。ＩＰＴＧの存在下または不在下で成長させた培養についてのＯＵＲを示す。各条件に対して使用した試料の数を提供する（「Ｎ」）。
【図１９】２つのベクターを保有する細胞の一定の撹拌速度下で成長させた培養における平均浸透圧を示す。２つのベクターとは、ｘＩＬ１３  ｈＡｂ及びＦｋｐＡを発現しているＴＩＲ２，２ベクター、ならびにＩＰＴＧ誘導プロモータの下でＤｓｂＡ及びＤｓｂＣを発現しているベクターである。ＩＰＴＧの存在下または不在下で成長させた培養についての浸透圧を示す。各条件に対して使用した試料の数を提供する（「Ｎ」）。
【図２０】２つのベクターを保有する細胞から経時的に生成されたｘＩＬ１３  ｈＡｂの平均力価を示す。２つのベクターとは、ｘＩＬ１３  ｈＡｂ及びＦｋｐＡを発現しているＴＩＲ２，２ベクター、ならびにＩＰＴＧ誘導プロモータの下でＤｓｂＡ及びＤｓｂＣを発現しているベクターである。ＩＰＴＧの存在下または不在下で成長させた培養についての生成された抗体の力価を示す。各条件に対して使用した試料の数を提供する（「Ｎ」）。
【図２１】２６時間６５０ｒｐｍにて撹拌しながら成長させ、その後、標識されたＯＵＲ設定値を達成するために十分なより低い撹拌速度に移行して撹拌しながら成長させた培養における経時的な平均ＯＵＲを示す。細胞は、ｘＩＬ１３  ｈＡｂ及びＦｋｐＡを発現しているＴＩＲ２，２、及びＩＰＴＧの不在下でＤｓｂＡ及びＤｓｂＣを発現しているベクターという２つのベクターを保有した。各条件に対して使用した試料の数を提供する（「Ｎ」）。
【図２２】２６時間６５０ｒｐｍにて撹拌しながら成長させ、その後、標識されたＯＵＲ設定値を達成するために十分なより低い撹拌速度に移行して撹拌しながら成長させた培養における経時的な平均浸透圧を示す。細胞は、ｘＩＬ１３  ｈＡｂ及びＦｋｐＡを発現しているＴＩＲ２，２、及びＩＰＴＧの不在下で発現しているベクターという２つのベクターを保有した。各条件に対して使用した試料の数を提供する（「Ｎ」）。
【図２３】２６時間６５０ｒｐｍにて撹拌しながら成長させ、その後、標識されたＯＵＲ設定値を達成するために十分なより低い撹拌速度に移行させて撹拌しながら成長させた培養における、２つの時点（５４時間及び７２時間）でのｘＩＬ１３  ｈＡｂ生成の平均力価を示す。細胞は、ｘＩＬ１３  ｈＡｂ及びＦｋｐＡを発現しているＴＩＲ２，２、及びＩＰＴＧの不在下でＤｓｂＡ及びＤｓｂＣを発現しているベクターという２つのベクターを保有した。各条件に対して使用した試料の数を提供する（「Ｎ」）。
【図２４】ＩＰＴＧの不在下でｐｈｏＡプロモータによって駆動されるＦｋｐＡ、ならびにｔａｃＩＩプロモータによって駆動されるＤｓｂＡ及びＤｓｂＣもコードしたＴＩＲ２，２ベクター由来のｘＩＬ１３  ｈＡｂを生成する培養の経時的な平均細胞密度（ＯＤ５５０ｎｍ）を示す。培養物を、２８℃または３０℃のいずれかの成長相及び生成相（Ｔｇ／Ｔｐ）の両方に対して一定温度で成長させた。撹拌移行を２６時間行って、発酵させた。各条件に対して使用した試料の数を提供する（「Ｎ」）。
【図２５】ＩＰＴＧの不在下でｐｈｏＡプロモータによって駆動されるＦｋｐＡ、ならびにｔａｃＩＩプロモータによって駆動されるＤｓｂＡ及びＤｓｂＣもコードしたＴＩＲ２，２ベクター由来のｘＩＬ１３  ｈＡｂを生成する細胞の培養の経時的な平均ＯＵＲを示す。培養物を、２８℃または３０℃のいずれかの成長相及び生成相（Ｔｇ／Ｔｐ）の両方に対して一定温度で成長させた。各条件に対して使用した試料の数を提供する（「Ｎ」）。
【図２６】ＩＰＴＧの不在下でｐｈｏＡプロモータによって駆動されるＦｋｐＡ、ならびにｔａｃＩＩプロモータによって駆動されるＤｓｂＡ及びＤｓｂＣもコードしたＴＩＲ２，２ベクター由来のｘＩＬ１３  ｈＡｂを生成する細胞の培養の経時的な平均リン酸塩濃度を示す。培養物を、２８℃または３０℃のいずれかの成長相及び生成相（Ｔｇ／Ｔｐ）の両方に対して一定温度で成長させた。各条件に対して使用した試料の数を提供する（「Ｎ」）。
【図２７】ＩＰＴＧの不在下でｐｈｏＡプロモータによって駆動されるＦｋｐＡ、ならびにｔａｃＩＩプロモータによって駆動されるＤｓｂＡ及びＤｓｂＣもコードしたＴＩＲ２，２ベクター由来の細胞の培養において生成されたｘＩＬ１３  ｈＡｂの平均力価を示す。培養物を、２８℃または３０℃のいずれかの成長相及び生成相（Ｔｇ／Ｔｐ）の両方に対して一定温度で成長させた。
【図２８】ＩＰＴＧの不在下でｐｈｏＡプロモータによって駆動されるＦｋｐＡ、ならびにｔａｃＩＩプロモータによって駆動されるＤｓｂＡ及びＤｓｂＣもコードしたＴＩＲ２，２ベクター由来のｘＩＬ１３  ｈＡｂを生成する培養の経時的な平均細胞密度（ＯＤ５５０ｎｍ）を示す。培養物を、２８℃または３０℃（それぞれ、Ｔｇ／Ｔｐ  ２８℃またはＴｇ／Ｔｐ  ３０℃）の一定温度で成長させるか、あるいは成長相の間は３０℃、その後、生成相については２８℃に移行させて（Ｔｇ  ３０  Ｔｐ  ２８）成長させた。各条件に対して使用した試料の数を提供する（「Ｎ」）。
【図２９】ＩＰＴＧの不在下でｐｈｏＡプロモータによって駆動されるＦｋｐＡ、ならびにｔａｃＩＩプロモータによって駆動されるＤｓｂＡ及びＤｓｂＣもコードしたＴＩＲ２，２ベクター由来のｘＩＬ１３  ｈＡｂを生成する細胞の培養の経時的な平均リン酸塩濃度を示す。培養物を、２８℃または３０℃（それぞれ、Ｔｇ／Ｔｐ  ２８℃またはＴｇ／Ｔｐ  ３０℃）の一定温度で成長させるか、あるいは成長相の間は３０℃、その後、生成相については２８℃に移行させて（Ｔｇ  ３０  Ｔｐ）成長させた。各条件に対して使用した試料の数を提供する（「Ｎ」）。
【図３０】ＩＰＴＧの不在下でｐｈｏＡプロモータによって駆動されるＦｋｐＡ、ならびにｔａｃＩＩプロモータによって駆動されるＤｓｂＡ及びＤｓｂＣもコードしたＴＩＲ２，２ベクター由来のｘＩＬ１３  ｈＡｂを生成する細胞の培養の経時的なＯＵＲを示す。培養物を、２８℃または３０℃（それぞれ、Ｔｇ／Ｔｐ  ２８℃またはＴｇ／Ｔｐ  ３０℃）の一定温度で成長させるか、あるいは成長相の間は３０℃、その後、生成相については２８℃に移行させて（Ｔｇ  ３０  Ｔｐ  ２８）成長させた。各条件に対して使用した試料の数を提供する（「Ｎ」）。
【図３１】ＩＰＴＧの不在下でｐｈｏＡプロモータによって駆動されるＦｋｐＡ、ならびにｔａｃＩＩプロモータによって駆動されるＤｓｂＡ及びＤｓｂＣもコードしたＴＩＲ２，２ベクターから経時的に生成されたｘＩＬ１３  ｈＡｂの平均力価を示す。培養物を、標識（それぞれ、Ｔｇ／Ｔｐ  ２８℃またはＴｇ／Ｔｐ  ３０℃）のように２８℃または３０℃の一定温度で成長させるか、あるいは成長相の間は３０℃、その後、生成相については２８℃に移行させて（Ｔｇ  ３０  Ｔｐ  ２８）成長させた。
【図３２】添付の表におけるパターンによって特定される異なるプロセス条件下で単一プラスミド（ＭＤ１５７）を用いたｘＩＬ１３  ｈＡｂ力価の一部要因実験計画（ＤｏＥ）分析の結果を示す。
【図３３】ＩＰＴＧの不在下でｔａｃＩＩプロモータによって駆動されるＦｋｐＡ、ＤｓｂＡ、及びＤｓｂＣもコードしたＴＩＲ２，２ベクターから生成されたｘＩＬ４  ｈＡｂの力価を示す。培養物を、３０℃（Ｔｇ／Ｔｐ  ３０℃）の一定温度で成長させるか、あるいは成長相の間は３４℃、その後、生成相については２５℃に移行させて（Ｔｇ  ３４  Ｔｐ  ２５）成長させた。
【図３４】添付の表におけるパターンによって特定される異なるプロセス条件下で単一プラスミド（ＭＤ３４１）を用いたｘＩＬ１７  ｈＡｂ力価の一部要因実験計画（ＤｏＥ）分析の結果を示す。
【図３５】まずシャペロンタンパク質の共発現を最適化し、次に処理ステップ（例えば、撹拌速度、Ｔｇ、及びＴｐ）を最適化することがｘＩＬ１３  ｈＡｂ力価に与える影響を示す。
【図３６】図３６Ａは、６６Ｆ８及び６７Ａ６宿主株中で行った発酵の可溶性ｘＩＬ１３  ｈＡｂ力価を示す。図３６Ｂは、６６Ｆ８宿主株と６７Ａ６宿主株との両方における７２時間の時点での全ｘＩＬ１３軽鎖及び重鎖の濃度を示す。両方の条件について、Ｎ＝２である。
【図３７Ａ】図３７Ａは、一定の発酵温度で６６Ｆ８及び６７Ａ６宿主株中で行った発酵からの可溶性ｘＩＬ４  ｈＡｂ力価を示す。図３７Ｂは、温度移行を用いた発酵条件下で６６Ｆ８及び６７Ａ６宿主株中で行った発酵の全可溶性ｘＩＬ４  ｈＡｂ力価を示す。両方の条件について、Ｎ＝２である。
【図３７Ｂ】図３７Ａは、一定の発酵温度で６６Ｆ８及び６７Ａ６宿主株中で行った発酵からの可溶性ｘＩＬ４  ｈＡｂ力価を示す。図３７Ｂは、温度移行を用いた発酵条件下で６６Ｆ８及び６７Ａ６宿主株中で行った発酵の全可溶性ｘＩＬ４  ｈＡｂ力価を示す。両方の条件について、Ｎ＝２である。
【図３８Ａ】図３８ＡはｘＩＬ４軽鎖力価を示す。図３８Ｂは、温度移行を用いた発酵条件下で６６Ｆ８及び６７Ａ６宿主株中で行った発酵からｘＩＬ４重鎖力価を示す。両方の条件について、Ｎ＝２である。
【図３８Ｂ】図３８ＡはｘＩＬ４軽鎖力価を示す。図３８Ｂは、温度移行を用いた発酵条件下で６６Ｆ８及び６７Ａ６宿主株中で行った発酵からｘＩＬ４重鎖力価を示す。両方の条件について、Ｎ＝２である。
【図３９】ｘＩＬ３３  ｈＡｂ分泌プラスミドのマップを提供する。ＬＣ及びＨＣオープンリーディングフレームを、ＴＩＲ２と動作可能に組み合わせて独立して配置した。
【図４０】３０℃の一定温度でシャペロンＤｓｂＡ、ＤｓｂＣ、ＦｋｐＡの共発現の不在下で行った発酵（規範事例）、ならびに同じプロセス条件下でシャペロンＤｓｂＡ、ＤｓｂＣ、及びＦｋｐＡ共発現の存在下で行った発酵（シャペロンによる）におけるｘＩＬ３３  ｈＡｂの蓄積を図示する。
【図４１】シャペロンＦｋｐＡ、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＣを含有するｘＩＬ３３  ｈＡｂ単一プラスミドを用いて行った実験計画（ＤｏＥ）からのａＩＬ３３  ｈＡｂ力価の差異を示す。ＤｏＥ因子は、ｐＨ、成長温度（Ｔｇ）、生成温度（Ｔｐ）、及び生成相標的酸素取り込み速度（ＯＵＲ）を含んだ。
【図４２】ＴＩＲ１（配列番号１）、ＴＩＲ２（配列番号２）、及びＴＩＲ３（配列番号３）ＦｋｐＡシグナル配列変異形のヌクレオチド配列を提供する。単一のヌクレオチド置換を特異的コドンの第３位において行うが、これはＦｋｐＡシグナルペプチド配列のアミノ酸配列（配列番号４）を改変しない同義的コドンの変化を表す。
【図４３】ＴＩＲ１  ＦｋｐＡ変異形（プラスミド１９）と比較したＦｋｐＡ  ＴＩＲ変異形の定量的強度を示す。
【図４４】ＴＩＲ１、ＴＩＲ２、及びＴＩＲ３  ＦｋｐＡ  ＴＩＲ変異形を用いて行った発酵におけるｘＩＬ１３  ｈＡｂの蓄積を示す。各条件において生成された力価は、ＴＩＲ１、ＴＩＲ２、及びＴＩＲ３変異形について、それぞれ、１．５、２．５、及び４．０ｇ／Ｌであった。
【図４５】ＴＩＲ１、ＴＩＲ２、及びＴＩＲ３  ＦｋｐＡ  ＴＩＲ変異形を用いて行った発酵におけるｘＩＬ３３  ｈＡｂの蓄積を示す。
【図４６】ＴＩＲ１、ＴＩＲ２、及びＴＩＲ３  ＦｋｐＡ変異形を用いて行った発酵におけるｘＩＬ１７  ｈＡｂの蓄積のプロットを示す。
【図４７】図４７Ａは、ＦｋｐＡ変異形を用いて行った発酵におけるｘＩＬ１３  ｈＡｂの蓄積のプロットを示す。図４７Ｂは、発酵終了時にｘＩＬ１３  ｈＡｂプロセスからの可溶性画分中に存在するＦｋｐＡのレベルを示す。
【図４８Ａ】改変酸素移動速度（ＯＴＲ）及び対照発酵条件についての酸素取り込み速度（ＯＵＲ）を示す。改変ＯＴＲ及び対照発酵は、約５ｍｍｏｌ／Ｌ／分の類似したピークＯＵＲ、及び２．７５ｍｍｏｌ／Ｌ／分の類似した撹拌移行後の標的ＯＵＲを達成した。
【図４８Ｂ】改変ＯＴＲ及び対照発酵条件についての成長プロファイルを示す。改変ＯＴＲ及び対照発酵は、類似した成長プロファイルを有し、共に２５０のピークＯＤ５５０を達成した。ｘＩＬ１３  ｈＡｂ対照（Ｃｔｒｌ）最良条件＝１バールの背圧（ＢＰ）、２０毎分標準リットル（ＳＬＰＭ）、及び６５０から４７５ｒｐｍへの撹拌速度移行。ｘＩＬ１３  ｈＡｂ改変ＯＴＲ条件＝０．３バールの背圧、１３ＳＬＰＭ、及び８８０から６５０ｒｐｍへの撹拌速度移行。
【図４９】改変ＯＴＲ及び対照条件についてのｘＩＬ１３  ｈＡｂ蓄積プロファイルを示す。改変及び対照条件は、発酵中に類似した蓄積プロファイルを有し、共に、それぞれ、４．１及び４．２ｇ／Ｌの７２時間の時点での最大平均力価を達成した。
【図５０Ａ】ＴＩＲ１，１  ＩｍｍＴＡＣ１生成プラスミド（図５０Ａ）のプラスミド構成を、ＴＩＲ１，１の描写（図５０Ｂ）と共に示す。
【図５０Ｂ】ＴＩＲ１，１  ＩｍｍＴＡＣ１生成プラスミド（図５０Ａ）のプラスミド構成を、ＴＩＲ１，１の描写（図５０Ｂ）と共に示す。
【図５１】ＩｍｍＴＡＣを生成するために使用された元々の（すなわち非最適化）発酵プロセスを示す。
【図５２】発酵プロセス終了時に蓄積した、組み立てられたＩｍｍＴＡＣの量、ならびにアルファ及びベータサブユニットの全量を示す。
【図５３】ＩｍｍＴＡＣ生成プラスミドのプラスミドマップ及びｔａｃプロモータの制御下でＦｋｐＡ  ＯＲＦを含有する適合性プラスミドのプラスミドマップを提供する。
【図５４】図５４Ａは、以下の条件に対する、可溶性及び可溶性が低下した抗アルファ及び抗ベータウェスタンブロットを示す。シャペロンを有しない場合（ＴＩＲ１，１）、ＦｋｐＡを有する場合（＋ＦｋｐＡ）、陰性対照（−）、及びＩｍｍＴＡＣ１陽性対照（ＩｍｍＴＡＣ  ＤＰ）。矢印は、組み立てられたＩｍｍＴａｃを示す。図５４Ｂは、ＴＩＲ１，１単独の最終力価及びＦｋｐＡ条件を有するＴＩＲ１，１の最終力価を示す。
【図５５】ＩｍｍＴＡＣを生成するために使用された改善された発酵プロセス条件を示す。
【図５６Ａ】以下の条件に対する、可溶性及び可溶性が低下した抗アルファ（図５６Ａ）及び抗ベータ（図５６Ｂ）ウェスタンブロットを示す。シャペロンを有しない場合（ＴＩＲ１，１）、ＦｋｐＡを有する場合（＋ＦｋｐＡ）、ＦｋｐＡ及び新たなプロセス条件を有する場合（新たなプロセス条件＋ＦｋｐＡ）、陰性対照（−）、及びＩｍｍＴＡＣ１陽性対照（ＩｍｍＴＡＣ  ＤＰ）。
【図５６Ｂ】以下の条件に対する、可溶性及び可溶性が低下した抗アルファ（図５６Ａ）及び抗ベータ（図５６Ｂ）ウェスタンブロットを示す。シャペロンを有しない場合（ＴＩＲ１，１）、ＦｋｐＡを有する場合（＋ＦｋｐＡ）、ＦｋｐＡ及び新たなプロセス条件を有する場合（新たなプロセス条件＋ＦｋｐＡ）、陰性対照（−）、及びＩｍｍＴＡＣ１陽性対照（ＩｍｍＴＡＣ  ＤＰ）。
【図５７】以下の条件の最終力価を示す。ＴＩＲ１，１、ＦｋｐＡを有するＴＩＲ１，１、ならびにＦｋｐＡ及び新たなプロセス条件を有するＴＩＲ１，１。
【図５８】ｐｈｏＡプロモータの制御下でＩｍｍＴＡＣアルファ鎖及びベータ鎖ＯＲＦ、ならびにＦｋｐＡ  ＯＲＦを組み込む単一のプラスミドの構築を示す。
【図５９Ａ】ＦｋｐＡ  ＯＲＦを組み込むＴＩＲ１，１、ＴＩＲ１，２、及びＴＩＲ２，３の単一プラスミドに対する最終的なＩｍｍＴＡＣ１の力価を示す。
【図５９Ｂ】ＦｋｐＡ  ＯＲＦを組み込むＴＩＲ１，１、ＴＩＲ１，２、及びＴＩＲ２，３の単一プラスミドに対するアルファ及びベータＩｍｍＴＡＣ鎖の両方の最終サブユニット蓄積を示す。
【図６０Ａ】ＩｍｍＴＡＣ  ＴＩＲ１，１生成プラスミド、及び適合性ＦｋｐＡプラスミド、ならびにＦｋｐＡ  ＯＲＦを含有する単一のＴＩＲ１，１プラスミドを用いて行った発酵からのＦｋｐＡに関してプローブされるウェスタンブロットを示す。
【図６０Ｂ】以下の条件の最終力価を示す。ＴＩＲ１，１のみ、ＦｋｐＡを有するＴＩＲ１，１、ＴＩＲ１，１  ＦｋｐＡ適合性プラスミド系、及びＴＩＲ１，１  ＦｋｐＡ単一プラスミド系。
【図６１】ＦｋｐＡ、アルファ鎖及びベータ鎖ＯＲＦを含有するＩｍｍＴＡＣ生成プラスミドのプラスミドマップ、ならびにｔａｃプロモータの制御下でオキシドレダクターゼ（例えばＤｓｂＣ）を含有する適合性プラスミドのプラスミドマップを提供する。
【図６２】ＦｋｐＡ  ＯＲＦを、ＤｓｂＡ単独、ＤｓｂＣ単独、またはＤｓｂＡとＤｓｂＣとの組み合わせのＯＲＦ（複数可）を含有した適合性プラスミドと共に組み込んだＴＩＲ１，１単一プラスミドを用いて行った発酵からの最終力価を示す。
【図６３】ＴＩＲ１，１単一プラスミド単独、ＤｓｂＣ適合性プラスミドを有するＴＩＲ１，１単一プラスミド、及びＤｓｂＣ適合性プラスミドを有するＴＩＲ２，３単一プラスミドを用いて行った発酵からの最終力価を示す。
【図６４】上述の最適化を使用する、最初のＴＩＲ１，１生成プラスミドからＤｓｂＣ適合性プラスミドを有するＴＩＲ２，３単一プラスミドの最終力価における累積増加を示す。
【図６５Ａ】ＦｋｐＡ  ＯＲＦを組み込む単一ＴＩＲ１，１及びＴＩＲ２，３プラスミドとして、かつＦｋｐＡ  ＯＲＦを適合性ＤｓｂＣプラスミドと共に組み込む単一ＴＩＲ１，１及びＴＩＲ２，３プラスミドとしての適合性ＦｋｐＡプラスミドを有する及び有さないＴＩＲ２，３生成プラスミドを用いて試験されたＩｍｍＴＡＣ２分子を示す。アルファ（図６５Ａ）及びベータ（図６５Ｂ）鎖の生成を示すウェスタンブロットが提供される。
【図６５Ｂ】ＦｋｐＡ  ＯＲＦを組み込む単一ＴＩＲ１，１及びＴＩＲ２，３プラスミドとして、かつＦｋｐＡ  ＯＲＦを適合性ＤｓｂＣプラスミドと共に組み込む単一ＴＩＲ１，１及びＴＩＲ２，３プラスミドとしての適合性ＦｋｐＡプラスミドを有する及び有さないＴＩＲ２，３生成プラスミドを用いて試験されたＩｍｍＴＡＣ２分子を示す。アルファ（図６５Ａ）及びベータ（図６５Ｂ）鎖の生成を示すウェスタンブロットが提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書に提供される例は、複数の鎖タンパク質の各鎖（例えば、半抗体の軽鎖及び重鎖）をコードする翻訳単位と組み合わせた１つ以上の特異的なシャペロンタンパク質の同時発現により、原核宿主細胞系における組み立てられた複数の鎖タンパク質の生成が増加することを示す。これらの例は、後続のプロセスの改善、例えば、発酵のある特定の相のための特定の温度及び撹拌速度により、発現ベクターの改善をこえて、生成及び頑健性が顕著に向上することを更に示す。全体として、本明細書に記載の方法は、例示的な２鎖ポリペプチド（例えば、半抗体）の生成において少なくとも１０倍の増大を達成する。
【００１２】
一態様において、宿主細胞を培養してポリペプチドの２つの鎖を発現させることによって原核宿主細胞に２つの鎖を含有するポリペプチドを生成する方法が本明細書で提供され、この場合、発現時に、２つの鎖が折り畳まれ組み立てられて宿主細胞中に生物学的に活性のポリペプチドを形成し、宿主細胞は、
（１）ポリペプチドの第１の鎖をコードする第１の翻訳単位、（２）ポリペプチドの第２の鎖をコードする第２の翻訳単位、ならびに（３）ペプチジル−プロリルイソメラーゼ、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼ、及びこれらの組み合わせから選択される、少なくとも１つのシャペロンタンパク質をコードする第３の翻訳単位、を含む、ポリヌクレオチドを含有し、宿主細胞は、成長温度及び成長撹拌速度を含む成長相、ならびに生成温度及び生成撹拌速度を含む生成相を含む条件下で、培養培地において培養され、成長温度は、生成温度を２〜１０℃上回り、成長撹拌速度は、生成撹拌速度を５０〜２５０ｒｐｍ上回り、かつ（ｂ）宿主細胞から生物学的に活性のポリペプチドが回収される。一態様において、本ポリペプチドは２つの鎖からなるが、別の態様においては、ポリペプチドは、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の鎖を含む。
【００１３】
別の態様においては、発現時に、２つの鎖が折り畳まれ、かつ組み立てられて、宿主細胞において生物学的に活性のポリペプチドを形成し、宿主細胞は、（１）ポリペプチドの第１の鎖をコードする第１の翻訳単位、（２）ポリペプチドの第２の鎖をコードする第２の翻訳単位、（３）第１のシャペロンタンパク質をコードする第３の翻訳単位、（４）第２のシャペロンタンパク質をコードする第４の翻訳単位、（５）第３のシャペロンタンパク質をコードする第５の翻訳単位（第１、第２、及び第３のシャペロンタンパク質は、ペプチジル−プロリルイソメラーゼ、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼ、及びこれらの組み合わせから選択される）、を含む、ポリヌクレオチドを含有する、ポリペプチドの２つの鎖を発現させるように宿主細胞を培養することによる原核宿主細胞における２つの鎖を含むポリペプチドの生成方法が本明細書で提供され、宿主細胞は、成長温度及び成長撹拌速度を含む成長相、ならびに生成温度及び生成撹拌速度を含む生成相を含む条件下で、培養培地において培養され、成長温度は、生成温度を２〜１０℃上回り、成長撹拌速度は、生成撹拌速度を５０〜２５０ｒｐｍ上回り、かつ（ｂ）宿主細胞から生物学的に活性のポリペプチドが回収される。一態様において、本ポリペプチドは２つの鎖からなるが、別の態様においては、ポリペプチドは、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の鎖を含む。
【００１４】
Ｉ．定義
本開示を詳細に説明する前に、本開示は、特定の組成物または生体系に限定されず、言うまでもなく多様であり得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定を意図するものではないことも理解されたい。
【００１５】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、内容により別途明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「１つの分子」への言及は、任意に、２つ以上のかかる分子の組み合わせ等を含む。
【００１６】
本明細書で使用される「約」は、当業者であれば容易に分かるそれぞれの値に対する通常の誤差範囲を指す。本明細書における「約」の値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（かつ説明する）。値に関して本明細書で使用される「約」という用語は、最大でその値の９０％〜１１０％を包含する（例えば、約１．０〜約３．０の第１及び第２のＴＩＲの相対的翻訳強度は、０．９〜３．３の範囲にある相対的翻訳強度を指す）。
【００１７】
本明細書に記載される本開示の態様及び実施形態は、態様及び実施形態を「含む」、態様及び実施形態「からなる」、及び態様及び実施形態「から本質的になる」を含むことを理解されたい。
【００１８】
本明細書で使用される「２つの鎖を含むポリペプチド」（「２鎖タンパク質」及び「２鎖ポリペプチド」という用語も本明細書で互換的に使用され得る）という用語は、１つ超の別個のポリペプチド鎖を含有する任意のポリペプチドを指すように意図される。一部の実施形態において、２鎖タンパク質は、ジスルフィド結合を含むがこれに限定されない１つ以上の分子間連結を介して共に連結する２つ以上のポリペプチドの高分子複合体を含み得る。一部の実施形態において、２鎖タンパク質は、アミノ酸配列が、ポリペプチドリンカーによって連結する２つの別個のポリペプチド鎖（例えば、抗体重鎖及び抗体軽鎖）に属する、単一のポリペプチドを含み得る。この場合、２鎖タンパク質は、物理的には単一の鎖を表すが、単一の鎖の２つ以上の部分は、２つの別個のタンパク質鎖であるかのように機能的に挙動し得る。例えば、単一の鎖抗体は、機能的重鎖及び機能的軽鎖を含んでもよく、これらの機能的重鎖及び機能的軽鎖は、ポリペプチドリンカーによって接合されるが、それにもかかわらず、分子間連結（例えば、１つ以上のジスルフィド結合）によってのみ会合している別個のポリペプチドであるかのように折り畳まれ組み立てられる。
【００１９】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、連結している別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指すように意図される。ベクターの１つの種類は「プラスミド」であり、これは環状二本鎖ＤＮＡループを指し、これに追加のＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る。ベクターの別の種類はファージベクターである。ベクターの別の種類はウイルスベクターであり、これにおいて、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムへとライゲーションされる。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞における自己複製が可能である（例えば、細菌起源の複製を有する細菌ベクター及びエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに統合することができるため、宿主ゲノムと共に複製される。更に、ある特定のベクターは、それらが動作可能に連結されている遺伝子の発現を導くことが可能である。かかるベクターは、本明細書において「組み換え発現ベクター」（または単純に「組み換えベクター」）と称される。一般に、組み換えＤＮＡ技法における利用される発現ベクターは、プラスミドの形態である場合が多い。本明細書では、「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であるため、互換的に使用され得る。
【００２０】
本明細書で使用される「シストロン」という用語は、ポリペプチド鎖及び隣接する制御領域をコードするヌクレオチド配列を含む翻訳単位と広義で等しい遺伝要素を指すように意図される。「シストロン」は、例えば、１つ以上のオープンリーディングフレーム、翻訳開始領域（本明細書中の以下において定義するＴＩＲ）、シグナル配列、及び終結領域を含み得る。
【００２１】
「多シストロン性」発現ベクターは、１つの単一プロモータの調節制御下にある複数のシストロンを含有してそれを発現する単一のベクターを指す。多シストロン性ベクターの一般的な例は、１つのプロモータの制御下にある２つの異なるポリペプチドを含有してそれを発現する「２シストロン性」ベクターである。２シストロン性または多シストロン性ベクターの発現の際、複数の遺伝子は、まず単一の転写単位として転写され、その後、別個に翻訳される。
【００２２】
「転写単位」は、単一のＲＮＡ転写産物として転写されるポリヌクレオチドを指す。「翻訳単位」は、ポリペプチドをコードし、翻訳時にポリペプチドを生成するポリヌクレオチドのセグメントを指す。上記のように、多シストロン性ポリヌクレオチドは、複数の翻訳単位を有する単一の転写単位を含有し得る。
【００２３】
本開示に従う「別個のシストロン」発現ベクターは、少なくとも２つの別個のプロモータ−シストロン対を含む単一のベクターを指し、各シストロンは、それ自体のプロモータの制御下にある。別個のシストロン発現ベクターの発現時、異なる遺伝子の転写プロセス及び翻訳プロセスの両方は、別個の独立したもである。
【００２４】
本明細書で使用される「シャペロンタンパク質」は、２鎖タンパク質を含むがこれに限定されない他の高分子の折り畳みまたは組み立てに役立つ任意のタンパク質を指す。一般に、シャペロンタンパク質は、多くの異なる機構によって、タンパク質折り畳みまたは組み立てを促進するように作用し得る。例えば、シャペロンタンパク質は、タンパク質折り畳み及び／または組み立ての促進、鎖内ジスルフィド結合の形成の触媒、（例えば、凝集またはミスフォールドしたタンパク質または多タンパク質複合体の）タンパク質アンフォールディング及び／または分解の促進、凝集の防止、タンパク質分解の支援等を行っても良い。
【００２５】
本明細書で使用される「翻訳開始領域」またはＴＩＲもしくは翻訳開始領域または翻訳開始配列は、目的の遺伝子の翻訳開始効率を提供する核酸領域を指す。一般に、特定のシストロン内のＴＩＲは、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）及びＲＢＳへの５’及び３’配列を包含する。ＲＢＳは、シャインダルガーノ領域及び開始コドン（ＡＵＧ）を最低限含有するように定義される。したがって、ＴＩＲはまた、翻訳される核酸配列の少なくとも一部分を含む。好ましくは、本開示のＴＩＲは、シストロン内の軽鎖または重鎖をコードする配列に先行する、シグナルペプチドをコードする分泌シグナル配列を含む。ＴＩＲ変異形は、ＴＩＲの特性、例えば、本明細書の以下において定義されるその翻訳強度を改変する、ＴＩＲ領域内の配列変異（特に置換）を含有する。好ましくは、本開示のＴＩＲ変異形は、シストロン内の軽鎖または重鎖をコードする配列に先行する分泌シグナル配列の最初の２〜約１４個、好ましくは約４〜１２個、より好ましくは約６個のコドン内の配列置換を含有する。
【００２６】
本明細書で使用される「翻訳強度」は、制御系における分泌されたポリペプチドの測定値を指し、ここでは、ＴＩＲの１つ以上の変異形を使用してポリペプチドの分泌を導き、結果を同じ培養条件及びアッセイ条件下の野生型ＴＩＲまたは何らかの他の対照と比較する。いずれか１つの理論にも限定されるものではないが、本明細書で使用される「翻訳強度」は、例えば、ｍＲＮＡ安定性、リボソームのリボソーム結合部位への結合の効率等の測定を含むが、これらに限定されない。
【００２７】
「分泌シグナル配列」または「シグナル配列」は、新たに合成された目的のタンパク質を、細胞膜、通常は原核細胞の内膜または内膜及び外膜の両方を介して導くために使用することができる、ショートシグナルペプチドをコードする核酸配列を指す。このように、免疫グロブリン軽鎖または重鎖ポリペプチド等の目的のタンパク質は、原核宿主細胞のペリプラズム中または培養培地中に分泌される。分泌シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドは、宿主細胞に対して内因性であっても良く、またはこれらは外因性であっても良く、発現されるポリペプチドに特有のシグナルペプチドを含む。分泌シグナル配列は、典型的には、発現されるポリペプチドのアミノ末端に存在し、典型的には、生合成とポリペプチドの細胞質からの分泌との間で酵素的に除去される。したがって、シグナルペプチドは、通常、成熟タンパク質産物中には存在しない。
【００２８】
「動作可能に連結した」は、２つ以上の構成要素の並立を指し、そのように説明される構成要素は、それらがその意図される様式で機能することを可能する関係にある。例えば、プロモータは、連結した配列の転写を制御または調節するためにシスにおいて作用する場合、コード配列に動作可能に連結する。一般的に、「動作可能に連結する」ＤＮＡ配列は、必ずしも隣接しているわけではないが、２つのタンパク質コード領域を接合する必要がある場合、または分泌リーダーの場合には、隣接し、かつリーディングフレーム内にある。しかしながら、動作可能に連結したプロモータは、概して、コード配列の上流に位置するが、必ずしもそれと隣接するわけではない。動作可能に連結したエンハンサーは、プロモータから相当な距離を置いて、コード配列の上流、その中、またはその下流に位置し得る。連結は、当該技術分野で既知の組み換え方法によって、例えば、ＰＣＲ法を使用して、アニールによって、または都合の良い制限部位でのライゲーションによって、達成される。都合の良い制限酵素部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、慣行に従って使用される。
【００２９】
本明細書で使用される、「調節要素」は、異種ポリペプチドをポリペプチドにコードするポリヌクレオチドの転写及び翻訳に不可欠な、シスに存在するヌクレオチド配列を指す。転写調節要素は、通常、発現される遺伝子配列のプロモータ５’、転写開始部位及び終結部位、ならびにポリアデニル化シグナル配列を含む。「転写開始部位」という用語は、一次転写産物、すなわち、ｍＲＮＡ前駆体に組み込まれる第１の核酸に対応する構築物中の核酸を指し、この転写開始部位はプロモータ配列と重複し得る。
【００３０】
「プロモータ」は、遺伝子またはそれが動作可能に連結している配列の転写を制御するポリヌクレオチド配列を指す。プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼの結合及び転写の開始のためのシグナルを含む。使用されるプロモータは、選択された配列の発現が企図される細胞型の宿主細胞において機能的となる。多様な異なるソースに由来する構成的な誘導及び抑制プロモータを含む多数のプロモータが当該技術分野で周知であり（かつＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースにおいて特定され）、クローンポリヌクレオチドとして、またはクローンポリヌクレオチド内で利用可能である（例えば、ＡＴＣＣ等の受託機関及び他の商業的または個人的ソースから）。誘導プロモータについては、プロモータの活性は、シグナル、例えば、ＩＰＴＧの存在またはリン酸塩枯渇に応答して増加または減少する。
【００３１】
本明細書で使用される、「宿主細胞」（または「組み換え宿主細胞」）は、遺伝子的に改変されているか、または組み換えプラスミドもしくはベクター等の外因性ポリヌクレオチドの導入よって遺伝子的に改変されることができる細胞を指すように意図される。かかる用語は、特定の対象細胞だけでなく、かかる細胞の子孫も指すように意図されることを理解されたい。突然変異または環境的影響のいずれかに起因して、後続の世代においてある特定の修飾が起こる場合があるため、かかる子孫は、実際には、親細胞と同一でない場合があるが、本明細書で使用される用語「宿主細胞」の範囲内に依然として含まれる。
【００３２】
「医薬製剤」という用語は、活性成分の生物活性を有効にするような形態であり、製剤が投与される対象にとって許容できないほど有毒である追加の構成成分を何ら含有しない調製物を指す。かかる製剤は滅菌されている。「薬学的に許容される」賦形剤（ビヒクル、添加物）は、対象の哺乳動物に合理的に投与して、用いる活性成分の効果的用量を提供するものである。
【００３３】
治療する「対象」または「個体」は、ヒト、飼育動物及び家畜、ならびに動物園の動物、競技用の動物、または愛玩動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ等を含む、哺乳動物に分類される任意の動物を指す。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００３４】
本明細書における「抗体」という用語は、最も広義に使用され、所望の生物学的活性を示す限り、具体的には、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を網羅する。
【００３５】
「単離された抗体」は、その天然環境の成分から同定されている、分離されている、かつ／または回収されている抗体である。その天然環境の汚染成分は、抗体の研究的、診断的、または治療的使用に干渉し得る物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。一部の実施形態において、抗体は、（１）例えばローリー法によって決定される９５重量％超の抗体、一部の実施形態において、９９重量％超まで精製される、（２）例えば、スピニングカップ配列決定器（Ｓｐｉｎｎｉｎｇ  Ｃｕｐ  Ｓｅｑｕｅｎａｔｏｒ）の使用によって、Ｎ末端のまたは内部のアミノ酸配列の少なくとも１５残基を取得するのに十分な程度まで精製されるか、または、（３）例えばクマシーブルーまたは銀染色を使用する、還元条件下または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均質に至るまで精製される。単離された抗体は、抗体の天然環境における少なくとも１つの成分が存在しないため、組み換え細胞内のインサイツの抗体を含む。しかしながら、通常は、単離された抗体は、少なくとも１つの精製ステップによって調製されることになる。
【００３６】
「天然抗体」は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖で構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、１つのジスルフィド共有結合によって重鎖に連結するが、ジスルフィド連結の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重鎖及び軽鎖はまた、規則的に離間した鎖間ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、それに続いていくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）、またその別の端部に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１の定常ドメインと整列し、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間で干渉を形成すると考えられている。
【００３７】
「定常ドメイン」という用語は、免疫グロブリンの他の部分である抗原結合部位を含有する可変ドメインよりもアミノ酸配列が保存されている免疫グロブリン分子の一部を指す。定常ドメインは、重鎖のＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメイン（まとめてＣＨ）、ならびに軽鎖のＣＨＬ（またはＣＬ）ドメインを含有する。
【００３８】
抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖の可変ドメインは、「ＶＨ」と称され得る。軽鎖の可変ドメインは、「ＶＬ」と称され得る。これらのドメインは、概して、抗体の最も可変する部分であり、抗原結合部位を含有する。
【００３９】
「可変」という用語は、可変ドメインのある特定の部分が、抗体間の配列において広範囲に異なり、各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合及び特異性において使用されることを指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体で均一には分布しない。これは、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの両方における超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つのセグメントに集中する。より高度に保存された可変ドメインの部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、４つのＦＲ領域を含み、これらの大部分は、ベータシート構成を用い、ベータシート構造を接続している、また一部の場合にはその一部を形成しているループを形成する３つのＨＶＲによって接続される。各鎖におけるＨＶＲは、ＦＲ領域によって互いに近接して保持され、他の鎖からのＨＶＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）参照）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接的には関与しないが、抗体依存性の細胞毒性への抗体の関与等、種々のエフェクター機能を呈する。
【００４０】
任意の哺乳動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（「κ」）及びラムダ（「λ」）と呼ばれる２つの明確に異なるタイプのうちの一方に割り当てることができる。
【００４１】
本明細書で使用されるＩｇＧ「アイソタイプ」または「サブクラス」という用語は、その定常領域の化学的特性及び抗原特性によって定義される免疫グロブリンのサブクラスのうちのいずれかを意味する。
【００４２】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体（免疫グロブリン）を異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス：（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ）が存在し、これらのうちのいくつかは、更に、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に分類され得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、γ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び３次元構成は周知であり、例えば、Ａｂｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  ｅｄ．（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｃｏ．，２０００）において概して説明されている。抗体は、１つ以上の他のタンパク質またはペプチドとの抗体の共有結合または非共有結合によって形成される、より大きい融合分子の一部であり得る。
【００４３】
本明細書で使用される「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書において、以下で定義される抗体断片ではなく、その実質的にインタクトな形態の抗体を指すように互換的に使用される。これらの用語は、特に、Ｆｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
【００４４】
本明細書の「裸の抗体」は、細胞傷害性部分または放射標識に複合されていない抗体を指す。
【００４５】
「抗体断片」とは、インタクトな抗体の部分、好ましくは、その抗原結合領域を含む。一部の実施形態において、本明細書に記載の抗体断片は、抗原結合断片である。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；二重特異性抗体；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多特異的抗体が挙げられる。
【００４６】
抗体のパパイン消化は、２つの同一の抗原結合断片（「Ｆａｂ」断片と呼ばれ、各々、単一の抗原結合部位を有する）、及び残りの「Ｆｃ」断片を生成し、この名称は容易に結晶化する能力を反映する。ペプシン処理は、Ｆ（ａｂ’）２断片を生成し、これは、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原を架橋することができる。
【００４７】
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含有する最小の抗体断片である。一実施形態において、２本鎖Ｆｖ種は、堅固な非共有結合により会合した１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体から成る。１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種において、１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインは、軽鎖及び重鎖が２本鎖Ｆｖ種のものと類似する「二量体」構造で会合し得るように、フレキシブルなペプチドリンカーによって共有的に連結し得る。この構成において、各可変ドメインの３つのＨＶＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を定義する。集合的に、６つのＨＶＲが、抗体に抗原結合特異性を与える。しかしながら、単一の可変ドメイン（または、抗原に特異的なＨＶＲを３つのみを含むＦｖの半分）でさえも、抗原を認識して結合する能力を有するが、親和性は結合部位全体の親和性よりも低い。
【００４８】
Ｆａｂ断片は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含有し、また軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端にいくつかの残基が追加されるという点で、Ｆａｂ断片と異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書では、定常ドメインのシステイン残基（単数または複数）が遊離チオール基を保有するＦａｂ’に対する記号である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元々、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生されたものである。抗体断片の他の化学カップリングも既知である。
【００４９】
「１本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。概して、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーを更に含み、これにより、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することが可能となる。ｓｃＦｖの総論については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４），ｐｐ．２６９−３１５を参照されたい。
【００５０】
「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する抗体断片を指し、この断片は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、このドメインを別の鎖の相補的なドメインと対形成させて、２つの抗原結合部位を創出する。ダイアボディは、二価性または二重特異性であっても良い。ダイアボディについては、例えば、ＥＰ  ４０４，０９７、ＷＯ  ９３／０１１６１、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）により詳細に記載されている。トリアボディ及びテトラボディもまた、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）に記載される。
【００５１】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を指し、例えば、その集団に含まれる個々の抗体は、少量で存在し得る想定される突然変異、例えば、自然発生突然変異を除いて同一である。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、個別の抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示す。ある特定の実施形態において、かかるモノクローナル抗体は、典型的には、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を典型的に含み、この場合、標的に結合するポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列からの単一の標的に結合するポリペプチド配列の選択を含むプロセスによって得られたものである。例えば、選択プロセスは、ハイブリドーマクローン、ファージクローン、または組み換えＤＮＡクローンのプール等の複数のクローンから固有のクローンを選択することであり得る。選択される標的に結合する配列を更に改変して、例えば、標的に対する親和性の改善、標的に結合する配列のヒト化、細胞培養におけるその生成の改善、そのインビボの免疫原性の減少、多重特異性抗体の創出等を行うことができること、及び改変された標的に結合する配列を含む抗体も本開示のモノクローナル抗体であることを理解されたい。異なる決定基（エピトープ）を対象とする異なる抗体を典型的に含む、ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対象とする。これらの特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、典型的に、他の免疫グロブリンによって汚染されない点でも有利である。
【００５２】
「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示すものであり、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されないものとする。例えば、本開示に従って使用されるモノクローナル抗体は、多様な技法によって作製され得、これらの技法としては、例えば、原核宿主細胞における発現、ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−９７（１９７５）、Ｈｏｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１４（３）：２５３−２６０（１９９５）、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１））、組み換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）、ファージディスプレイ法（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）、Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）、及びＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座またはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部または全てを有する動物におけるヒト抗体またはヒト様抗体を生成するための技術（例えば、ＷＯ  １９９８／２４８９３、ＷＯ  １９９６／３４０９６、ＷＯ  １９９６／３３７３５、ＷＯ  １９９１／１０７４１、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１（１９９３）、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８（１９９３）、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３（１９９３）、米国特許第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、及び同第５，６６１，０１６号、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８１２−８１３（１９９４）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５−８５１（１９９６）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８２６（１９９６）、及びＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ��Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照されたい）が挙げられる。
【００５３】
本明細書におけるモノクローナル抗体は、具体的には、重鎖及び／または軽鎖の一部分が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における配列における対応する配列と同一であるかまたは同種である一方で、鎖（複数可）の残りが、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるかまたは同種である、「キメラ」抗体、ならびにかかる抗体の断片を、これらが所望の生物学的活性を呈する限り含む（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、及びＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５（１９８４）を参照されたい）。キメラ抗体としては、ＰＲＩＭＡＴＴＺＥＤ（登録商標）抗体が挙げられ、抗体の抗原結合領域は、例えば、マカクザルを目的の抗原で免疫することによって産生された抗体に由来する。
【００５４】
「ヒト化」形態の非ヒト（例えば、ネズミ）抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含むキメラ抗体である。一実施形態において、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、これにおいては、レシピエントのＨＶＲ由来の残基が、所望の特異性、親和性、及び／またはキャパシティを有する、マウス、ウサギ、または非ヒト霊長類等の非ヒト種（ドナー抗体）のＨＶＲ由来の残基によって置き換えられる。一部の例においては、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体中で見出されない残基を含んでも良い。これらの修飾を行うことで、抗体性能を更に改良し得る。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになり、その超可変ループの全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、そのＦＲの全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン配列のものに対応する。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分を任意に含むことになる。更なる詳細については、例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）、及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。また、例えば、Ｖａｓｗａｎｉ  ａｎｄ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ  ＆  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５−１１５（１９９８）、Ｈａｒｒｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ２３：１０３５−１０３８（１９９５）、Ｈｕｒｌｅ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８−４３３（１９９４）、ならびに米国特許第６，９８２，３２１号及び第７，０８７，４０９号を参照されたい。
【００５５】
「ヒト抗体」は、ヒトによって生成された抗体、及び／または本明細書の開示のヒト抗体を作製するための技法のいずれかを使用して作製された抗体のものに対応するアミノ酸配列を保有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を具体的に除外する。ヒト抗体は、ファージディスプレイ法を含む当該技術分野で既知の種々の技法を使用して生成することができる。Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１（１９９１）。また、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能な方法は、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）、Ｂｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１）：８６−９５（１９９１）に記載されている。ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８−７４（２００１）も参照されたい。ヒト抗体は、抗原投与に応答してかかる抗体を生成するように修飾されているが内在遺伝子座が無効化されたトランスジェニック動物、例えば、免役した異種マウス（ｘｅｎｏｍｉｃｅ）に抗原を投与することによって調製することができる（例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術については、米国特許第６，０７５，１８１号及び第６，１５０，５８４号を参照されたい。）また、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術によって産生されるヒト抗体については、例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７−３５６２（２００６）を参照されたい。
【００５６】
「種依存性抗体」は、第２の哺乳動物種由来のその抗原のホモログに対する結合親和性よりも強い第１の哺乳動物種由来の抗原に対する結合親和性を有するものである。通常、種依存性抗体は、ヒト抗原に「特異的に結合」する（例えば、約１×１０−７Ｍ以下、好ましくは約１×１０−８Ｍ以下、好ましくは約１×１０−９Ｍ以下の結合親和性（Ｋｄ）値を有する）が、第２の非ヒト哺乳動物種由来の抗原のホモログに対しては、ヒト抗原に対する結合親和性の少なくとも約５０分の１、または少なくとも約５００分の１、または少なくとも約１０００分の１の結合親和性を有する。種依存性抗体は、上で定義される種々のタイプの抗体のいずれかでもあり得るが、好ましくは、ヒト化またはヒト抗体である。
【００５７】
本明細書で使用される「超可変領域」、「ＨＶＲ」、または「ＨＶ」という用語は、配列が超可変性であり、かつ／または構造的に規定されたループを形成する、抗体可変ドメインの領域を指す。一般に、抗体は、６つのＨＶＲを含み、このうち３つがＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）にあり、３つがＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）にある。天然抗体では、Ｈ３及びＬ３は、６つのＨＶＲの中で最大の多様性を示し、特にＨ３は、抗体に好適な特異性を与えることにおいて固有の役割を果たすと考えられる。例えば、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３：３７−４５（２０００）、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗｕ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４８：１−２５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３）を参照されたい。実際に、重鎖のみからなる自然発生ラクダ抗体は、軽鎖の不在下で機能的であり安定している。例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８（１９９３）、Ｓｈｅｒｉｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：７３３−７３６（１９９６）を参照されたい。
【００５８】
いくつかのＨＶＲ描写が本明細書で使用されて含まれる。Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列可変性に基づき、最も一般的に使用されているものである（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）参照）。Ｃｈｏｔｈｉａは、代わりに構造的ループの位置に言及している（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））。ＡｂＭ  ＨＶＲは、ＫａｂａｔのＨＶＲとＣｈｏｔｈｉａの構造的ループとの間の妥協点を示し、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用される。「接触」ＨＶＲは、利用可能な複合体結晶構造の分析に基づく。これらのＨＶＲの各々に由来する残基を以下に記載する。
0006770966.tif 000002
【００５９】
ＨＶＲは、次のような「延長ＨＶＲ」を含み得る。ＶＬにおける２４−３６または２４−３４（Ｌ１）、４６−５６または５０−５６（Ｌ２）、及び８９−９７または８９−９６（Ｌ３）、ならびにＶＨにおける２６−３５（Ｈ１）、５０−６５または４９−６５（Ｈ２）、及び９３−１０２、９４−１０２、または９５−１０２（Ｈ３）。可変ドメイン残基は、これらの定義の各々について、上記のＫａｂａｔらに従って付番される。
【００６０】
「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書で定義されるＨＶＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
【００６１】
「Ｋａｂａｔにおける可変ドメイン残基付番」または「Ｋａｂａｔにおけるアミノ酸位置付番」、及びこれらの変化形は、上記のＫａｂａｔにおける抗体のコンピレーションの重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに使用される付番システムを指す。この付番システムを使用して、実際の線状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＨＶＲの短縮またはそれへの挿入に対応するより少ないアミノ酸または追加のアミノ酸を含有し得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入物（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）を含み、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃ）を含んでも良い。残基のＫａｂａｔ付番は、「標準的な」Ｋａｂａｔによって付番される配列との抗体の配列の相同領域での整列によって、所与の抗体に対して決定され得る。
【００６２】
Ｋａｂａｔ付番システムは、概して、可変ドメインにおける残基（ほぼ軽鎖の残基１〜１０７及び重鎖の残基１〜１１３）を参照するときに使用される（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）参照）。「ＥＵ付番システム」または「ＥＵインデックス」は、概して、免疫グロブリン重鎖定常領域における残基を参照するときに使用される（例えば、上記のＫａｂａｔらで報告されているＥＵインデックス）。「ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の残基付番を指す。
【００６３】
発現「線状抗体」は、Ｚａｐａｔａら（１９９５  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ，８（１０）：１０５７−１０６２）に記載されている抗体を指す。簡潔に述べると、これらの抗体は、相補的な軽鎖ポリペプチドと共に抗原結合領域の対を形成するタンデムＦｄ部分（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）の対を含む。線状抗体は、二重特異性または単一特異性であり得る。
【００６４】
ＩＩ．分子最適化
宿主細胞を培養してポリペプチドの２つの鎖を発現させることによって原核宿主細胞に２つの鎖を含有するポリペプチドを生成する方法が本明細書で提供され、この場合、発現時に、２つの鎖が折り畳まれ組み立てられて宿主細胞中に生物学的に活性のポリペプチドを形成し、宿主細胞は、
（１）ポリペプチドの第１の鎖をコードする第１の翻訳単位、（２）ポリペプチドの第２の鎖をコードする第２の翻訳単位、ならびに（３）ペプチジル−プロリルイソメラーゼ、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼ、及びこれらの組み合わせから選択される、少なくとも１つのシャペロンタンパク質をコードする第３の翻訳単位、を含む、ポリヌクレオチドを含有する。また、ポリペプチドの２つの鎖を発現させるように宿主細胞を培養することによる原核宿主細胞における２つの鎖を含むポリペプチドの生成方法であって、発現時に、２つの鎖が折り畳まれ、かつ組み立てられて、宿主細胞において生物学的に活性のポリペプチドを形成し、宿主細胞は、（１）ポリペプチドの第１の鎖をコードする第１の翻訳単位、（２）ポリペプチドの第２の鎖をコードする第２の翻訳単位、（３）第１のシャペロンタンパク質をコードする第３の翻訳単位、（４）第２のシャペロンタンパク質をコードする第４の翻訳単位、（５）第３のシャペロンタンパク質をコードする第５の翻訳単位（第１、第２、及び第３のシャペロンタンパク質は、ペプチジル−プロリルイソメラーゼ、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼ、及びこれらの組み合わせから選択される）、を含む、ポリヌクレオチドを含有する、方法が本明細書で提供される。
【００６５】
一部の実施形態において、宿主細胞は、ポリペプチドの２つの鎖を発現するように培養され、ここでは、発現時に、２つの鎖が折り畳まれ、かつ組み立てられて、宿主細胞において生物学的に活性のポリペプチドを形成する。本明細書で使用されるとき、２つの鎖の折り畳み及び組み立てとは、適切な３次元２鎖タンパク質立体構造、２鎖タンパク質組み立て、またはその両方の最終的な適合を促進する任意または全てのステップを指し得る。折り畳み及び組み立ては、各鎖をその適切な立体構成及び折り畳みに折り畳むこと及び組み立てることを指しても良く、または２つのタンパク質鎖の分子連結によって創出される複合体の折り畳み及び組み立てを指しても良い。同様に、各鎖は、折り畳まれ組み立てられて生物学的に活性のポリペプチドを形成しても良く、または２つのタンパク質鎖の分子連結によって創出される複合体は概して、折り畳まれ組み立てられて生物学的に活性のポリペプチドを形成しても良い。
【００６６】
生物学的に活性のポリペプチドは、ポリペプチドに起因する機能を実行することができる任意のポリペプチドを指し得る。生物学的に活性のポリペプチドの機能としては、適切な折り畳みまたは組み立て、別の高分子との結合または他の相互作用、及び酵素活性が挙げられるが、これらに限定されない。例示を目的として、生物学的に活性の抗体は、抗体に起因する少なくとも１つの機能を実行することができる抗体を指しても良く、これらの機能としては、以下でより詳述するように、エピトープへの結合または抗体Ｆｃ領域の特性の保有が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
シャペロンタンパク質
一部の実施形態において、本開示のポリヌクレオチドは、少なくとも１つのシャペロンタンパク質をコードする翻訳単位を含有する。上記のように、シャペロンタンパク質は、２鎖タンパク質を含むがこれに限定されない他の高分子の折り畳みまたは組み立てに役立つ任意のタンパク質を指し得る。シャペロンタンパク質の例としては、ペプチジル−プロリルイソメラーゼ、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼ、及び熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、及びＨｓｐ１００タンパク質等）を挙げることができるが、これらに限定されない。シャペロンタンパク質はまた、タンパク質を膜を通して輸送すること、例えば、原形質膜または小胞体膜を通したポリペプチド鎖の転座に役立ち得る。
【００６８】
一部の実施形態において、シャペロンタンパク質はペプチジル−プロリルイソメラーゼであっても良い。ペプチジル−プロリルイソメラーゼ（「プロリルイソメラーゼ」、「ロタマーゼ」、及び「ＰＰｉａｓｅ」という用語が本明細書で互換的に使用され得る）は、プロリンまたはプロリル−イミノペプチド結合のシス及びトランス異性体の相互変換を触媒する任意の酵素を指し得る。この反応のＥＣ番号はＥＣ  ５．２．１．８である。このＥＣ番号によって表される反応を触媒することが知られるまたは予測される任意のタンパク質も、本開示のペプチジル−プロリルイソメラーゼであり得る。ペプチジル−プロリルイソメラーゼ活性はまた、ＧＯ：０００３７５５というＧＯタームＩＤによって表されても良い。このＧＯタームＩＤによって表される分子機能を保有することが知られるまたは予測される任意のタンパク質も、本開示のペプチジル−プロリルイソメラーゼであり得る。
【００６９】
ペプチジル−プロリルイソメラーゼ活性は、タンパク質折り畳み及び組み立てを促進することが当該技術分野では知られている。一部の実施形態において、ペプチジル−プロリルイソメラーゼは、適切に折り畳まれた構造がシスプロリル結合を含むタンパク質について、トランスプロリル結合をシスプロリル結合に変換することで、タンパク質折り畳み及び組み立てに役立ち得る。一部のペプチジル−プロリルイソメラーゼは、シスプロリル結合を欠くタンパク質の折り畳み及び組み立てを向上させることも知られている（Ｂｏｔｈｍａｎｎ  Ｈ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ａ  ２０００  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１００）。一部の実施形態において、ペプチジル−プロリルイソメラーゼは、シスプロリル結合を欠くタンパク質のタンパク質折り畳み及び組み立てに役立ち得る。したがって、ペプチジル−プロリルイソメラーゼ活性は、本明細書に記載される方法に有用であるシャペロンタンパク質を特定するための機能特性として機能し得るが、ペプチジル−プロリルイソメラーゼの有用性は、その触媒活性自体に必ずしも限定されない。
【００７０】
一部の実施形態において、ペプチジル−プロリルイソメラーゼは、ＦｋｐＡタンパク質である。一部の実施形態において、ＦｋｐＡタンパク質は、大腸菌ＦｋｐＡである。大腸菌ＦｋｐＡは、大腸菌種に属する細菌の任意の株または単離物におけるｆｋｐＡ遺伝子によってコードされる任意のポリペプチドを指し得る。一部の実施形態において、大腸菌ＦｋｐＡは、ＥｃｏＧｅｎｅ受託番号ＥＧ１２９００によって表されるｆｋｐＡ遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。一部の実施形態において、大腸菌ＦｋｐＡは、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ受託番号ＮＰ＿４１７８０６によって表される配列を有するタンパク質を指す。
【００７１】
他のＦｋｐＡタンパク質が当該技術分野で既知である。ＦｋｐＡタンパク質の例としては、ボイド赤痢菌ペプチジル−プロリルイソメラーゼ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ番号ＷＰ＿０００８３８２５２）、シトロバクターヨウンゲ（Ｃ．ｙｏｕｎｇａｅ）ペプチジル−プロリルイソメラーゼ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ番号ＷＰ＿００６６８７３６６）、クレブシエラオキシトカペプチジル−プロリルイソメラーゼ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ番号ＷＰ＿００４１２５９４３）、サルモネラエンテリカペプチジル−プロリルイソメラーゼ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ番号ＷＰ＿０００８３８２３３）、肺炎桿菌ペプチジル−プロリルイソメラーゼ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ番号ＷＰ＿０１９７０４６４２）、サッカロマイセスセレヴィシエＦＰＲ３ｐ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿０１３６３７）、ムスムスクルスＦｋｐｂ１ａ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿０３２０４５）、ムスムスクルスＦｋｐｂ２（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿０３２０４６）、ホモサピエンスＦＫＢＰ２（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿００１１２８６８０）、キイロショウジョウバエＣＧ１４７１５（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿６５０１０１）を挙げることができるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、本開示のＦｋｐＡタンパク質は、大腸菌ＦｋｐＡと少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する。
【００７２】
一部の実施形態において、シャペロンタンパク質は、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼであっても良い。タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼ（「タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ」及び「チオール−ジスルフィドイソメラーゼ」という用語が本明細書で互換的に使用され得る）は、タンパク質におけるジスルフィド結合の再配列を触媒する任意の酵素を指し得る。例えば、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼは、システインの酸化を触媒して、タンパク質におけるジスルフィド結合を形成し得る。タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼはまた、タンパク質における不対合ジスルフィド結合の異性化を触媒しても良い。この反応のＥＣ番号はＥＣ  ５．３．４．１である。このＥＣ番号によって表される反応を触媒することが知られるまたは予測される任意のタンパク質は、本開示のタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼであり得る。タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼ活性はまた、ＧＯ：００１５０３５というＧＯタームＩＤによって表されても良い。このＧＯタームＩＤによって表される分子機能を保有することが知られるまたは予測される任意のタンパク質も、本開示のタンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼであり得る。
【００７３】
タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼ活性は、タンパク質折り畳み及び組み立てを促進することが当該技術分野では知られている。例えば、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼ活性は、タンパク質折り畳み及び組み立ての最中に適切な分子内及び分子間ジスルフィド結合の形成を促進する。具体的には、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼ活性は、原核細胞のペリプラズムにおいて発現されるジスルフィド結合を有するタンパク質にとって重要である。
【００７４】
一部の実施形態において、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼはＤｓｂＡタンパク質である。一部の実施形態において、ＤｓｂＡタンパク質は大腸菌ＤｓｂＡである。大腸菌ＤｓｂＡは、大腸菌種に属する細菌の任意の株または単離物におけるｄｓｂＡ遺伝子によってコードされる任意のポリペプチドを指し得る。一部の実施形態において、大腸菌ＤｓｂＡは、ＥｃｏＧｅｎｅ受託番号ＥＧ１１２９７によって表されるｄｓｂＡ遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。一部の実施形態において、大腸菌ＤｓｂＡは、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ受託番号ＮＰ＿４１８２９７によって表される配列を有するタンパク質を指す。
【００７５】
他のＤｓｂＡタンパク質が当該技術分野で既知である。ＤｓｂＡタンパク質の例としては、シゲラフレックスネリチオール−ジスルフィドイソメラーゼ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ番号ＷＰ＿０００７２５３３５）、志賀赤痢菌チオール−ジスルフィドイソメラーゼ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ番号ＷＰ＿０００７２５３４８）、シトロバクターヨウンゲ（Ｃ．ｙｏｕｎｇａｅ）チオール−ジスルフィドイソメラーゼ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ番号ＷＰ＿００６６８６１０８）、及びサルモネラエンテリカチオール−ジスルフィドイソメラーゼ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ番号ＷＰ＿０２３２４０５８４）を挙げることができるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、本開示のＤｓｂＡタンパク質は、大腸菌ＤｓｂＡに対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する。
【００７６】
一部の実施形態において、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼはＤｓｂＣタンパク質である。一部の実施形態において、ＤｓｂＣタンパク質は、大腸菌ＤｓｂＣである。大腸菌ＤｓｂＣは、大腸菌種に属する細菌の任意の株または単離物におけるｄｓｂＣ遺伝子によってコードされる任意のポリペプチドを指し得る。一部の実施形態において、大腸菌ＤｓｂＣは、ＥｃｏＧｅｎｅ受託番号ＥＧ１１０７０によって表されるｄｓｂＣ遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。一部の実施形態において、大腸菌ＤｓｂＣは、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ受託番号ＮＰ＿４１７３６９によって表される配列を有するタンパク質を指す。
【００７７】
他のＤｓｂＣタンパク質が当該技術分野で既知である。ＤｓｂＣタンパク質の例としては、シゲラソネイタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ番号ＷＰ＿０００７１５２０６）、志賀赤痢菌タンパク質−ジスルフィドイソメラーゼ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ番号ＷＰ＿０００７１５２０９）、エシェリキアフェルグソニイ（Ｅ．ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ）タンパク質−ジスルフィドイソメラーゼ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ番号ＷＰ＿０００７１５２２５）、サルモネラボンゴリ（Ｓ．ｂｏｎｇｏｒｉ  ｔｈｉｏｌ）：ジスルフィド交換タンパク質ＤｓｂＣ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ番号ＷＰ＿０２０８４５１６１）、及びサルモネラエンテリカタンパク質ジスルフィドイソメラーゼＤｓｂＣ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ番号ＷＰ＿０２３１８３５１５）を挙げることができるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、本開示のＤｓｂＣタンパク質は、大腸菌ＤｓｂＣに対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する。
【００７８】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、配列を最適な比較目的のために整列させる（例えば、最適な整列のためにギャップを第１及び第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方に導入し得、比較目的で非相同配列を無視し得る）。一実施形態において、比較目的で整列させた参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも５０％、典型的には少なくとも７５％、更により典型的には少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％である。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有される場合には、分子は、その位置にて同一である（本明細書で使用されるとき、アミノ酸または核酸「同一性」は、アミノ酸または核酸「相同性」と等しい）。
【００７９】
２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップの数、及び２つの配列の最適な整列のために導入する必要がある各ギャップの長さを考慮した、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。配列比較のために、典型的には、１つの配列が参照配列として機能し、これと試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じてサブシーケンス座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用することができ、または代替的なパラメータを指定することができる。その後、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを算出する。同一性について２つの配列を比較するとき、配列が隣接している必要はないが、いずれのギャップも、全体的な同一性パーセントを減少させ得るペナルティを持ち得る。ｂｌａｓｔｎについては、デフォルトのパラメータは、ギャップ隙間ペナルティが５、ギャップ延長ペナルティが２である。ｂｌａｓｔｐについては、デフォルトのパラメータは、ギャップ隙間ペナルティが１１、ギャップ延長ペナルティが１である。
【００８０】
本明細書で使用される「比較ウィンドウ」は、２０〜６００、通常は約５０〜約２００、更に通常は約１００〜約１５０からなる群から選択される隣接位置の数のうちのいずれか１つのセグメントへの言及を含み、この中で、配列が、２つの配列を最適に整列させた後で同じ数の隣接位置の参照配列と比較する。比較のための配列整列方法は、当該技術分野で周知である。比較のための配列の最適な整列は、既知のアルゴリズムを使用して（例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ  Ａｐｐｌ  Ｍａｔｈ，２：４８２，１９８１のローカル相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，４８：４４３，１９７０の相同性整列アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８５：２４４４，１９８８の類似性方法の調査によって、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）における、アルゴリズムＦＡＳＴＤＢ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡのコンピュータ化された実装によって、または手動の整列及び目視検査によって実施することができる。
【００８１】
配列同一性パーセント及び配列類似性を決定するのに好適なアルゴリズムの好ましい例は、ＦＡＳＴＡアルゴリズム（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８５：２４４４，１９８８、及びＰｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，２６６：２２７−２５８，１９９６）である。同一性パーセントを算出するためにＤＮＡ配列のＦＡＳＴＡ整列において使用される好ましいパラメータを最適化する。ＢＬ５０  Ｍａｔｒｉｘ  １５：−５、ｋタプル＝２、ジョイニングペナルティ＝４０、最適化＝２８、ギャップペナルティ−１２、ギャップ長さペナルティ＝−２、及び幅＝１６。
【００８２】
配列同一性パーセント及び配列類似性を決定するのに好適なアルゴリズムの別の好ましい例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムである（それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２５：３３８９−３４０２，  １９７７、及びＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２１５：４０３−４１０，１９９０）。本明細書に記載のパラメータを用いてＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ  ２．０を使用し、本開示の核酸及びタンパク質についての配列同一性パーセントを決定する。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のウェブサイトを介して一般に利用可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列における同じ長さのワードと整列するときに何らかの正値の閾値スコアＴと一致するかまたはそれを満たす、問い合わせ配列における長さの短いワードＷを特定することによって、高スコアの配列対（ＨＳＰ）を特定することを伴う。Ｔは、近傍のワードスコア閾値と称される。これらの最初の近傍のワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見出すために検索を開始するためのシード値として機能する。ワードヒットは、累積整列スコアが増加することができる限り、各配列に沿って両方向に延びる。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（マッチする残基の対に対するリワードスコア；常に０超）及びＮ（ミスマッチの残基に対するペナルティスコア；常に０未満）を使用して算出する。アミノ酸配列については、スコア化マトリックスを使用して累積スコアを算出する。ワードヒットの各方向への延長は、累積整列スコアがその最大の実績値から量Ｘだけ減少する場合、累積スコアが、１つ以上の負のスコアの残基整列の蓄積に起因してゼロ以下になる場合、またはいずれかの配列の終端に達する場合に停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及びＸは、整列の感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両方の鎖の比較をデフォルトで使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３のワード長、及び１０の期待値（Ｅ）、ならびに５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコア化マトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８９：１０９１５，１９８９）整列（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両方の鎖の比較をデフォルトで使用する。
【００８３】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計的分析を行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９０：５８７３−５７８７，１９９３を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムが提供する類似性の１つの測定は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の一致が偶然に起こり得る確率の指標を提供する。例えば、核酸は、試験核酸と参照核酸とを比較した際の最小合計確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合に、参照配列に類似していると見なされる。
【００８４】
有用なアルゴリズムの別の例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、関係及び配列同一性パーセントを示すために進歩的な対整列を使用して関係する配列の群から複数の配列整列を創出する。これはまた、整列を創出するために使用されるクラスター関係を示す系図または樹状図をプロットする。ＰＩＬＥＵＰは、公開されている方法（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３，１９８９）と類似した方法を用いる進歩的整列方法の単純化を使用する（Ｆｅｎｇ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ，３５：３５１−３６０，１９８７）。プログラムは、最大で３００配列を整列させることができ、各々のヌクレオチドまたはアミノ酸の最大長は５，０００である。複数整列手順は、２つの最も類似した配列の対整列から開始し、２つの整列した配列のクラスタを生成する。その後、このクラスタを、次に最も関係のある配列または整列した配列のクラスタに整列させる。配列の２つのクラスタを、２つの個々の配列の対整列の単純な延長によって整列させる。最後の整列は、一連の進歩的な対整列によって達成される。本プログラムは、特定の配列及びそのアミノ酸またはヌクレオチド座標を配列比較の領域に対して示すこと、ならびにプログラムパラメータを示すことによって実行される。ＰＩＬＥＵＰを使用することにより、参照配列を他の試験配列と比較し、以下のパラメータを使用して配列同一性パーセントの関係を決定する。使用するパラメータは次の通りである。デフォルトのギャップ重量（３．００）、デフォルトのギャップ長重量（０．１０）、及び加重した終端ギャップ。ＰＩＬＥＵＰは、ＧＣＧ配列分析ソフトウェアパッケージ、例えば、バージョン７．０から得ることができる（Ｄｅｖｅｒｅａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１２：３８７−３９５，１９８４）。
【００８５】
複数のＤＮＡ及びアミノ酸配列整列に好適なアルゴリズムの別の好ましい例は、ＣＬＵＳＴＡＬＷプログラムである（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ，２２：４６７３−４６８０，１９９４）。クラスタＷは、配列群間の複数の対比較を行い、それらを相同性に基づいて集めて複数整列にする。ギャップ隙間ペナルティ及びギャップ延長ペナルティは、それぞれ、１０及び０．０５であった。アミノ酸整列については、ＢＬＯＳＵＭアルゴリズムをタンパク質重量マトリックスとして使用することができる（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９，１９９２）。
【００８６】
発現カセット及びベクター
一部の実施形態において、宿主細胞は、（１）ポリペプチドの第１の鎖をコードする第１の翻訳単位、（２）ポリペプチドの第２の鎖をコードする第２の翻訳単位、ならびに（３）ペプチジル−プロリルイソメラーゼ、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼ、及びこれらの組み合わせから選択される、少なくとも１つのシャペロンタンパク質をコードする第３の翻訳単位、を含む、ポリヌクレオチドを含有する。一部の実施形態において、宿主細胞は、（１）ポリペプチドの第１の鎖をコードする第１の翻訳単位、（２）ポリペプチドの第２の鎖をコードする第２の翻訳単位、（３）第１のシャペロンタンパク質をコードする第３の翻訳単位、（４）第２のシャペロンタンパク質をコードする第４の翻訳単位、ならびに（５）第３のシャペロンタンパク質をコードする第５の翻訳単位（第１、第２、及び第３のシャペロンタンパク質は、ペプチジル−プロリルイソメラーゼ、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される）を含む、ポリヌクレオチドを含有する。本開示の発見は、適切に折り畳まれ組み立てられた２鎖タンパク質の生成の増大が、単一プラスミド系（すなわち、２鎖タンパク質の各鎖をコードする翻訳単位及び１つ以上のシャペロンタンパク質をコードする１つ以上の翻訳単位を含む単一のポリヌクレオチド）または適合性プラスミド系（すなわち、２鎖タンパク質の各鎖をコードする翻訳単位を含む第１のポリヌクレオチド、及び１つ以上のシャペロンタンパク質をコードする１つ以上の翻訳単位を含む第２のポリヌクレオチド）を使用して達成され得ることである。
【００８７】
一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、プロモータの３つのコピーを更に含有し、第１のコピーは、第１の翻訳単位と動作可能に組み合わされ、第２のコピーは、第２の翻訳単位と動作可能に組み合わされ、第３のコピーは、第３の翻訳単位と動作可能に組み合わされ、第１の鎖、第２の鎖、及びシャペロンタンパク質の転写を駆動する。一部の実施形態において、３つのシャペロンタンパク質のうちの２つをコードする翻訳単位のうちの２つは、単一の翻訳単位の一部である。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、各翻訳単位と動作可能に組み合わせたプロモータを更に含有する。
【００８８】
一部の実施形態において、プロモータは、誘導プロモータである。上記のように、誘導プロモータの活性は、シグナルに応答して増加または減少する。例えば、ＩＰＴＧ等の誘導プロモータは、シグナルが存在することに応答して転写を促進しても良い。リン酸塩等の誘導プロモータは、シグナルが不在であることに応答して転写を促進しても良い。これらのシナリオのいずれにおいても、転写の量は、シグナルの量またはその欠如に比例する場合もしない場合もある。原核宿主細胞に好適な誘導プロモータの多数の例が当該技術分野で既知である。これらの例としては、ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏ、ｒｅｃＡ、ｔｅｔＡ、ｎａｒ、ファージＰＬ、ｃｓｐＡ、Ｔ７、及びＰＢＡＤプロモータが挙げられるが、これらに限定されない（より詳細な説明については、Ｔｅｒｐｅ  Ｋ．２００６  Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７２：２１１を参照されたい）。一部の実施形態において、別個の翻訳単位、例えば、２鎖タンパク質及びシャペロンタンパク質の両方の鎖の発現を協調させるように駆動するために、誘導プロモータの３つのコピーを使用する。
【００８９】
一部の実施形態において、誘導プロモータはＩＰＴＧ誘導プロモータである。ＩＰＴＧ誘導プロモータは、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、または乳糖オペロンからの転写を促進することができる任意の他のラクトース誘導体（例えば、アロラクトース）に応答する様式で転写を促進する任意のポリヌクレオチド配列を指し得る。ＩＰＴＧ誘導プロモータの多くの例が当該技術分野で既知であり、これらの例としては、ｔａｃ（例えば、ｔａｃＩ、ｔａｃＩＩ等）プロモータ、ｌａｃプロモータ、及びこれらの誘導体（例えば、ｌａｃＵＶ５、ｔａｃｌａｃ等）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９０】
一部の実施形態において、誘導プロモータは、第１の鎖、第２の鎖、及びシャペロンタンパク質の転写を駆動する、ＩＰＴＧ誘導プロモータである。本開示の驚くべき発見は、シャペロンタンパク質の発現を調節するＩＰＴＧ誘導プロモータが、ＩＰＴＧによる誘導なしで、ＩＰＴＧ誘導プロモータがＩＰＴＧによって誘導される場合のシャペロンタンパク質の発現と比較してより高い産物力価を促進するレベルでシャペロンタンパク質の発現を促進し得ることである。
【００９１】
一部の実施形態において、誘導プロモータは、培養培地中のリン酸塩が枯渇したとき、第１の鎖、第２の鎖、及びシャペロンタンパク質の転写を駆動するｐｈｏプロモータである。ｐｈｏプロモータは、細胞外リン酸塩（例えば、無機リン酸塩）に応答する様式で転写を促進する任意のポリヌクレオチド配列を指し得る。例えば、大腸菌におけるリン酸塩（Ｐｈｏ）レギュロンは、細胞外リン酸塩を感知し、リン酸塩レベルに応答してＰｈｏプロモータを介して多数の下流遺伝子の発現を調節するタンパク質成分を含む（より詳細な説明については、Ｈｓｉｅｈ  ＹＪ  ａｎｄ  Ｗａｎｎｅｒ  ＢＬ  ２０１０  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３（２）：１９８を参照されたい）。細菌を培養培地中で成長させる場合、このＰｈｏレギュロンの発現は、リン酸塩（例えば、無機リン酸塩、Ｐｉ）が培地中で得られるときに抑制され、リン酸塩が枯渇しているときに誘導されることが知られている。本明細書に記載される方法において使用されるｐｈｏプロモータの１つの非限定的な例は、大腸菌ｐｈｏＡプロモータである。このプロモータは広く知られており、原核宿主細胞における組み換えタンパク質発現を、細胞培養培地中のリン酸塩濃度に依存する様式で調節するために当該技術分野で使用される（より詳細な記載については、Ｌｕｂｋｅ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．１９９５  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１０）：９２３を参照されたい）。
【００９２】
一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、選択可能なマーカを更に含有し、培養培地は、宿主細胞にポリヌクレオチドを保持させるために単一の抗生物質を有する選択剤を含む。有利にも、本明細書に記載される方法により、１つ以上のシャペロンタンパク質が共発現する２鎖タンパク質の鎖の生成が可能となり、その結果、これらの成分の各々をコードする翻訳単位が全て単一のポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載される発現プラスミドまたは単一プラスミド系）に含まれるようになる。かかる系の利点は、これらの成分の全てが同じプラスミドによってコードされるため、原核宿主細胞におけるこれらのポリヌクレオチドの維持に必要とされる選択可能なマーカが１つのみである点である。
【００９３】
選択可能なマーカは、細胞が、選択、すなわち、選択可能なマーカを欠く細胞（複数可）の存在量と比較して選択可能なマーカを保有する細胞（複数可）の存在量を選択的に増加させるために使用される任意の条件に曝露されるときに、宿主細胞の生存を促進するタンパク質をコードする任意のポリヌクレオチドを指し得る。選択可能なマーカの例は、抗生物質の存在下で宿主細胞の生存を促進する遺伝子である。多数の選択可能なマーカ、及び単一の抗生物質を有する対応する選択剤が、当該技術分野で既知である。例えば、非限定的に、多くの選択可能なマーカ及び対応する抗生物質が、Ｊａｎｇ  ＣＷ  ａｎｄ  Ｍａｇｎｕｓｏｎ  Ｔ  ２０１３  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ８（２）：ｅ５７０７５において説明され、引用されている。一部の実施形態において、選択可能なマーカは、宿主細胞のゲノム内に存在する遺伝子欠失を補う遺伝子（例えば、プラスミドから発現される遺伝子）を指し得る。これらの例では、細胞を選択するとき（すなわち、宿主ゲノムから欠失した遺伝子の活性を必要とする条件下での成長）、プラスミドによって供給される遺伝子のコピーが宿主ゲノムの欠乏を補い、それにより外因性相補遺伝子を保有する細胞（複数可）を選択する。かかる遺伝子としては、細胞培地において欠乏している特定の栄養素を生成するために必要とされる栄養要求性マーカまたは遺伝子を挙げることができ、これらの例は、本明細書で更に記載される。いくつかの例示的な選択可能なマーカ及び抗生物質は、以下で更に記載される。
【００９４】
一部の実施形態において、第１の翻訳単位は、第１の鎖のコード領域と動作可能に組み合わされた第１の翻訳開始領域（ＴＩＲ）を含み、第２の翻訳単位は、第２の鎖のコード領域と動作可能に組み合わされた第２の翻訳開始領域（ＴＩＲ）を含む。翻訳開始領域（ＴＩＲ）は、原核宿主細胞における組換えタンパク質の翻訳に重要であることが知られている（例えば、Ｓｉｍｍｏｎｓ  ＬＣ  ａｎｄ  Ｙａｎｓｕｒａ  ＤＧ  １９９６  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：６２９、及びＶｉｍｂｅｒｇ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ．２００７  ＢＭＣ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８：１００を参照されたい）。ＴＩＲは、翻訳単位の翻訳の効率を決定し得る。ＴＩＲは、典型的には、開始コドン、シャインダルガーノ（ＳＤ）配列、及び翻訳エンハンサー等の翻訳単位特性を含む。ＴＩＲは、シグナルペプチドをコードする分泌シグナル配列を更に含んでも良い。配列及びＴＩＲの特性間の離間により翻訳開始効率が調節され得る。
【００９５】
一部の実施形態において、第１及び第２のＴＩＲの相対的翻訳強度は、約１．０〜約３．０である。２鎖タンパク質の各鎖をコードする翻訳単位を含むベクターが本明細書に記載される。各翻訳単位がＴＩＲを含み得る。本明細書で使用される「翻訳強度」は、翻訳単位の翻訳を介したポリペプチドの生成を指し得る。この生成は、いくつかの特徴に依存しても良く、これらの特徴としては、ｍＲＮＡ翻訳、ｍＲＮＡ安定性、リボソームのｍＲＮＡへの結合効率、ならびにそれによってコードされるポリペプチドの折り畳み、組み立て、及び／または転座が挙げられるが、これらに限定されない。相対的翻訳強度は、実験ＴＩＲと対照ＴＩＲとの両方が、同じ条件下で培養した類似の原核宿主細胞（例えば、同じ属及び種）によって発現されるときに、野生型または対照ＴＩＲを有する翻訳単位によってコードされるポリペプチドの生成と比較して、特異的または実験ＴＩＲを有する翻訳単位によってコードされるポリペプチドの生成を指し得る。ＴＩＲの更なる説明は、米国特許第８，３６１，７４４号で見出され得る。
【００９６】
組み換えポリペプチド
本開示のある特定の態様は、２つの鎖を有するポリペプチドの生成方法に関する。有利にも、本明細書に記載される方法は、多くの異なる種類のタンパク質、特に、上記のような２鎖タンパク質等のジスルフィド結合を有するものの発現、折り畳み、及び組み立てを促進するのに有用であり得る。特定の２鎖タンパク質を以下に記載するが、本明細書に記載される方法は、これらの特定の実施形態に限定されない。本明細書で使用される２鎖タンパク質は、１つ超の別個のポリペプチド鎖を含有するタンパク質を含み得る。本明細書に記載の多くの実施形態は２つのポリペプチド鎖を含む２鎖タンパク質を伴うが、２つ超のポリペプチド鎖（例えば、３つ以上のポリペプチド）を有する２鎖タンパク質が企図され、本明細書に記載される方法によって生成されても良い。上記のように、さもなければ、２つの別個のポリペプチド鎖（例えば、単鎖抗体、単鎖可変断片等）である場合に結合する、単一のポリペプチド鎖からなる２鎖タンパク質が企図され、本明細書に記載される方法によって生成されても良い。
【００９７】
一部の実施形態において、本開示の２鎖ポリペプチドの２つの鎖は、少なくとも１つのジスルフィド結合によって互いに連結する。ジスルフィド結合は、２つのチオール群を連結している任意の共有結合を指し得る。ポリペプチドにおけるジスルフィド結合は、典型的には、システイン残基のチオール基の間で形成される。ポリペプチドジスルフィド結合は、本開示の２鎖タンパク質等の多くのポリペプチドの折り畳み及び組み立てに重要であることが当該技術分野で知られている。ポリペプチドジスルフィド結合は、単一のポリペプチド鎖におけるシステイン残基間のジスルフィド結合（すなわち、分子内または鎖内ジスルフィド結合）を含んでも良い。ポリペプチドジスルフィド結合はまた、別個のポリペプチド鎖上で見いだされるシステイン残基間のジスルフィド結合（すなわち、分子内または鎖内ジスルフィド結合）を含んでも良い。したがって、一部の実施形態において、２鎖ポリペプチドの２つの鎖は、少なくとも１つのジスルフィド結合によって互いに連結する。
【００９８】
ジスルフィド結合は、抗体及び抗体断片の折り畳み及び組み立てに重要であることが当該技術分野で既知である。異なる抗体同位体、及び同位体内の異なるサブクラスは、異なるパターンのジスルフィド結合を保有することが知られている。例えば、ＩｇＧ抗体は、特定のＩｇＧサブクラスに応じて、鎖内ジスルフィド結合を１２個、各軽鎖とその対応する重鎖との間の鎖内ジスルフィド結合を１個、重鎖間の鎖内ジスルフィド結合を２〜１１個含有しても良い（より詳細な説明については、Ｌｉｕ  Ｈ  ａｎｄ  Ｍａｙ  Ｋ  ２０１２  ＭＡｂｓ．４（１）：１７を参照されたい）。ＩｇＭ（例えば、Ｗｉｅｒｓｍａ  ＥＪ  ａｎｄ  Ｓｈｕｌｍａｎ  ＭＪ  １９９５  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（１０）：５２６５を参照されたい）、ＩｇＥ（例えば、Ｈｅｌｍ  ＢＡ  ｅｔ  ａｌ．１９９１  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１（６）：１５４３を参照されたい）、ＩｇＡ（例えば、Ｃｈｉｎｔａｌａｃｈａｒｕｖｕ  ＫＲ  ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９（９）：５０７２を参照されたい）、及びＩｇＤ（例えば、Ｓｈｉｎ  ＳＵ  ｅｔ  ａｌ．１９９２  Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３（２）：６５を参照されたい）も、折り畳み及び組み立て中にジスルフィド結合を形成することが知られている。
【００９９】
一部の実施形態において、本開示の２鎖ポリペプチドは、宿主細胞に対して異種である。本明細書で使用されるとき、宿主細胞に関連して使用される場合の異種ポリペプチドは、宿主細胞において内因的に発現されない、すなわち、宿主細胞が自然から単離される場合の任意のポリペプチドを指し得る。異種ポリペプチドはまた、宿主細胞によって内因的に発現され得るが、宿主細胞が自然から単離される場合とは異なる規制の下で発現されるポリペプチドを指しても良い。異なる規制の例としては、発現の異なる量の発現、異なる刺激因子に応答した発現、または異種プロモータ、例えば誘導プロモータの使用によるもの等の、任意の他の改変された量の発現を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１００】
一部の実施形態において、本開示の２鎖ポリペプチドは、ヘテロ二量体のモノマーである。本明細書で使用されるとき、ヘテロ二量体は、動作可能に連結している２つの別個のポリペプチドまたはポリペプチド複合体を含有する任意のポリペプチド複合体を指し得る。ヘテロ二量体の非限定的な例は、２つの別個の抗体モノマーで構成される二重特異性または二価抗体（すなわち、動作可能に連結している軽鎖−重鎖対）である。この例では、第１の抗原を認識する第１の重鎖−軽鎖対の折り畳み及び組み立ては、第１の抗体モノマーを生成する。第２の抗原を認識する第２の重鎖−軽鎖対の折り畳み及び組み立ては、第２の抗体モノマーを生成する。これらのモノマーは、当該技術分野で既知である任意の手段（二重特異性抗体に関して以下でより詳細に記載される）によって組み立てられて、ヘテロ二量体を形成し得る。例示的なヘテロ二量体抗体形成に関する更なる詳細については、Ｒｉｄｇｗａｙ  ＪＢＢ  ｅｔ  ａｌ．１９９６  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．９（７）：６１７を参照されたい。
【０１０１】
一部の実施形態において、本開示の２鎖ポリペプチドは、第１の鎖及び第２の鎖が免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を表す一価抗体である。本明細書で使用されるとき、一価抗体は、共に動作可能に連結して重鎖−軽鎖対を形成する抗体重鎖及び抗体軽鎖から作製される任意のポリペプチド複合体を指しても良く、これにおいて、重鎖−軽鎖対は第２の重鎖−軽鎖対に動作可能に連結しない。「半抗体（ｈＡｂ）」という用語が本明細書では互換的に使用され得る。
【０１０２】
一部の実施形態において、本開示の一価抗体は、抗原と特異的に結合することができる。本明細書で使用されるとき、「結合する」、「特異的に結合する」、または「〜に特異的である」という用語は、標的と（すなわち、生体分子を含む不均一な分子集団の存在下での標的の存在を決定する抗体と）の間の結合等の測定可能かつ再現可能な相互作用を指す。例えば、標的（エピトープであり得る）と結合するまたは特異的に結合する抗体は、それが他の標的と結合する場合よりも優れた親和性、結合力で、より容易に、かつ／またはより長い期間にわたってこの標的と結合する抗体である。一実施形態において、無関係の標的への抗体の結合の程度は、例えば、放射免疫測定法（ＲＩＡ）によって測定した、標的への抗体の結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態において、標的と特異的に結合する抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．１ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する。ある特定の実施形態において、抗体は、異なる種に由来するタンパク質の間で保存されるタンパク質上のエピトープと特異的に結合する。別の実施形態において、特異的結合は、排他的結合を含み得るが、それを必要とするわけではない。
【０１０３】
一部の実施形態において、本開示の２鎖ポリペプチドは分泌タンパク質である。本明細書で使用されるとき、分泌タンパク質は、宿主細胞によって宿主細胞ペリプラズムまたは細胞外環境に分泌される任意のタンパク質を指し得る。分泌タンパク質は、宿主細胞によって内因的に分泌されるタンパク質であっても良く、または分泌タンパク質は、宿主細胞によって内因的に分泌されないが、その分泌を促進するような方法で修飾されるタンパク質であっても良い。例えば、典型的にはポリペプチドのＮ末端で見られるシグナル配列の存在により、ポリペプチドが分泌のための分泌経路に導かれ得る。多数のシグナル配列が当該技術分野で既知であり、分泌タンパク質の分泌を促進するため、または宿主細胞によって自然に分泌されないタンパク質を分泌させるために有用であり得る。例えば、Ｐｉｃｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４２：２６９−２７５（１９８３）、Ｓｉｍｍｏｎｓ  ａｎｄ  Ｙａｎｓｕｒａ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：６２９−６３４（１９９６）、及びＨｕｍｐｈｒｅｙｓ  ＤＰ  ｅｔ  ａｌ．２０００  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２０（２）：２５２を参照されたい。シグナル配列の１つの非限定的な例は、耐熱性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）シグナル配列である。
【０１０４】
一部の実施形態において、本開示の２鎖ポリペプチドは、免疫動員性抗癌モノクローナルＴ細胞受容体（ＩｍｍＴＡＣ）である。ＩｍｍＴＡＣは、抗ＣＤ３単鎖抗体断片（またはＴ細胞に結合し、Ｔ細胞応答を活性化する類似の抗体断片）と可溶性モノクローナルＴ細胞受容体（ＴＣＲ）とを組み合わせる融合タンパク質を指し得る。一部の実施形態において、ＩｍｍＴＡＣの可溶性モノクローナルＴＣＲは、操作されなかったＴＣＲの抗原（例えば、自然発生ＴＣＲ）に対する親和性と比較して、特定の抗原に対する改善された親和性を保持するように操作され得る。ＩｍｍＴＡＣは、ＩｍｍＴＡＣによって認識される同族の抗原を示す、腫瘍細胞等の細胞に対するＴ細胞応答の活性化を含むが、これらに限定されないいくつかの用途に使用され得る。一部の実施形態において、可溶性モノクローナルＴＣＲは、ＴＣＲアルファ鎖可変ドメイン及びＴＣＲベータ鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態において、可溶性モノクローナルＴＣＲは、天然または非天然ジスルフィド結合によって連結されるＴＣＲアルファ鎖定常ドメイン及びＴＣＲベータ鎖定常ドメインを更に含む。ＩｍｍＴＡＣのより詳細な説明については、例えば、米国特許第７，５６９，６６４号、Ｌｉｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１８：９０８−７（２０１２）、及びＯａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｊａｋｏｂｓｅｎ，ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ２：ｅ２２８９１（２０１３）を参照されたい。
【０１０５】
一部の実施形態において、本開示の分泌タンパク質は、宿主細胞のペリプラズムから回収される。ペリプラズムは、グラム陰性細菌性細胞の内膜または細胞膜と外膜との間の空間を指すことが当該技術分野で知られている。理論に束縛されることを意図するものではないが、ペリプラズムは、ジスルフィド結合の形成を促す酸化環境であると考えられる。したがって、ジスルフィド結合をその適切に折り畳まれて組み立てられた構造の一部として有するポリペプチド（例えば、本開示の２鎖タンパク質）をペリプラズムに局在させることが有利であり得る（より詳細な説明については、Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．２００６  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１９（８）：３８５を参照されたい）。
【０１０６】
ペリプラズムタンパク質を回収するための多数の方法が当該技術分野で既知である。ペリプラズムタンパク質の大規模な精製の１つの非限定的な例は、欧州特許第ＥＰ１３５６０５２  Ｂ１号に記載されている（例えば、実施例４を参照されたい）。ペリプラズムタンパク質は、ペリプラズム画分をスフェロブラスト（ｓｐｈｅｒｏｂｌａｓｔ）調製から抽出することによって回収しても良い（例えば、Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．２００６  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１９（８）：３８５を参照されたい）。ペリプラズム抽出物が産生されると、ペリプラズムタンパク質は、当該技術分野で既知の任意の標準的なタンパク質精製技法、例えば、親和性精製、クロマトグラフィー等によって精製され得る。
【０１０７】
抗体
本明細書に記載される２鎖タンパク質は、当該技術分野で既知である任意の好適な技法によって調製され得る。２鎖タンパク質の１つの例示的なクラスは抗体である。以下に記載されるように、抗体は、抗体を産生するための当該技術分野で利用可能な技法を使用して調製され、その例示的な方法は、以下の節により詳細に記載される。当業者であれば、以下に記載の方法の多くが抗体以外の２鎖タンパク質に適用され得ることを認識することになる。
【０１０８】
抗体は、目的の抗原（例えば、非限定的に、ＰＤ−Ｌ１（ヒトＰＤ−Ｌ１等）、ＨＥＲ２、またはＣＤ３（ヒトＣＤ３等）、ＩＬ１３、ＩＬ４、ＶＥＧＦＣ、ＶＥＧＦＡ、及びＶＥＧＦ）を対象とする。好ましくは、抗原は、生物学的に重要なポリペプチドであり、障害に罹患する哺乳動物に本抗体を投与することにより、その哺乳動物において治療的利益がもたらされ得る。
【０１０９】
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、１μＭ以下、１５０ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、または０．００１ｎＭ以下（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３  Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。
【０１１０】
一実施形態において、Ｋｄは、目的の抗体のＦａｂバージョン及びその抗原と共に行われる、放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって、次のアッセイで説明されるように測定される。抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、未標識抗原の一連の滴定の存在下で、最小濃度の（１２５Ｉ）標識抗原とＦａｂを平衡化し、次いで、抗Ｆａｂ抗体コーティングプレートで結合した抗原を捕捉することによって測定される（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照されたい）。アッセイのための条件を確立するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が、５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中の５μｇ／ｍｌの捕捉抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）で一晩コーティングされ、その後、室温（およそ２３℃）で２〜５時間、ＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンで遮断される。非吸着性のプレート（Ｎｕｎｃ番号２６９６２０）内で、１００ｐＭまたは２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を、目的のＦａｂの段階希釈液と混合する。次いで、目的のＦａｂを一晩インキュベートするが、確実に平衡に到達するように、インキュベーションはより長い期間（例えば、約６５時間）継続してもよい。その後、混合物を、室温での（例えば、１時間にわたる）インキュベーションのために、捕捉プレートに移す。次いで溶液を除去し、プレートを、０．１％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））含有ＰＢＳで８回洗浄する。プレートが乾燥したとき、１５０μＬ／ウェルのシンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０（商標）；Ｐａｃｋａｒｄ）を添加し、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）γ計数器（Ｐａｃｋａｒｄ）により１０分間計数する。最大結合の２０％以下をもたらす各Ｆａｂの濃度を、競合結合アッセイにおいて使用するために選定する。
【０１１１】
別の実施形態によれば、Ｋｄは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いる表面プラズモン共鳴アッセイを使用して、２５℃で、約１０応答単位（ＲＵ）で固定化された抗原ＣＭ５チップを用いて測定される。簡潔に述べると、供給業者の指示に従って、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）を、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）により活性化する。抗原を１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍＬ（約０．２μＭ）まで希釈した後、カップリングされたタンパク質のおよそ１０応答単位（ＲＵ）を達成するように、５μＬ／分の流速で注射する。抗原の注入後、１Ｍのエタノールアミンを注入して、未反応の基をブロッキングする。動態測定のために、Ｆａｂの２倍段階希釈液（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を、０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（商標））界面活性剤を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中に、２５℃で、およそ２５μＬ／分の流速で注入する。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を、単純な１対１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ第３．２版）を使用して、会合センサグラム及び解離センサグラムを同時に適合することによって、算出する。平衡解離定数（Ｋｄ）は、比率ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出する。例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照されたい。オン速度が、上記表面プラズモン共鳴アッセイによって、１０６Ｍ−１ｓ−１を超える場合、オン速度は、撹拌されたキュベットを備えるストップトフロー装着分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または８０００−シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）等の分光計において測定される、漸増濃度の抗原の存在下で、２５℃で、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中２０ｎＭ抗−抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍ帯域通過）の増加または減少を測定する、蛍光消光技法を使用することによって、決定することができる。
【０１１２】
（ｉ）抗原調製
任意に他の分子と複合させた可溶性抗原またはその断片を、抗体を産生するための免疫原として使用することができる。受容体等の膜貫通分子については、これらの断片（例えば、受容体の細胞外ドメイン）を免疫原として使用することができる。代替的に、膜貫通分子を発現している細胞を免疫原として使用することができる。かかる細胞は、天然源（例えば、癌細胞株）に由来することができ、または組み換え技法によって膜貫通分子を発現するように形質転換された細胞であっても良い。他の抗原及びその抗体の調製に有用な形態は、当業者には明らかとなるであろう。
【０１１３】
（ｉｉ）ある特定の抗体に基づく方法
ポリクローナル抗体は、関連抗原及びアジュバントを複数回皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射することにより動物で産生するのが好ましい。二機能性または誘導化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介した複合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタールアルデヒド、コハク酸無水物、ＳＯＣｌ２、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、Ｒ及びＲ１は異なるアルキル基である）を使用し、関連抗原を、免疫する種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシン阻害剤と複合することが有用であり得る。
【０１１４】
例えば、タンパク質または複合体１００μｇまたは５μｇを（それぞれウサギまたはマウスに対して）完全フロイントアジュバント３容量と組み合わせ、この溶液を複数部位に皮内注射することにより、動物を抗原、免疫原性複合体、または誘導体に対して免疫する。１ヶ月後に、完全フロイントアジュバント中の、最初の量の１／５〜１／１０のペプチドまたは複合体を複数箇所に皮下注射することにより動物をブーストする。７〜１４日後に動物から採血し、血清の抗体力価をアッセイする。力価がプラトーに達するまで動物をブーストする。好ましくは、同じ抗原の複合体であるが、異なるタンパク質と複合したもの及び／または異なる架橋試薬によるものを用いて動物をブーストする。複合体は組換え細胞培養中でタンパク質融合物として作製することもできる。アラム等の凝集剤も免疫応答を向上させるために使用するのに適している。
【０１１５】
本開示のモノクローナル抗体はハイブリドーマ法を使用して作製することができ、このハイブリドーマ法は、最初にＫｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって説明され、例えば、Ｈｏｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１４（３）：２５３−２６０（１９９５）、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）、Ｎｉ，Ｘｉａｎｄａｉ  Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５−２６８（２００６）（ヒト−ヒトハイブリドーマに関する）において更に説明されている。追加の方法としては、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株由来のモノクローナルヒト天然ＩｇＭ抗体の生成に関する）に記載されているものが挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術（Ｔｒｉｏｍａ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）は、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７−９３７（２００５）、及びＶｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５−９１（２００５）に記載されている。所望のモノクローナル抗体がハイブリドーマから単離されると、それらのコードしているポリヌクレオチドを原核発現ベクターへとサブクローニングすることができ、本明細書に記載される方法のいずれかによって原核宿主細胞中で発現させることで抗体を生成することができる。
【０１１６】
（ｉｉｉ）ライブラリ由来抗体
本開示の抗体は、コンビナトリアルライブラリを、所望の活性（単数または複数）を有する抗体についてスクリーニングすることによって、単離されても良い。例えば、ファージディスプレイライブラリを生成し、かかるライブラリを、所望の結合特性を保有する抗体についてスクリーニングするための方法、例えば、実施例３に記載の方法等の多様な方法が当該技術分野で知られている。追加の方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）において概説されており、例えば、ｔｈｅ  ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）、Ｍａｒｋｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｄｂｕｒｙ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４８：１６１−１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）、Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）、及びＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）において更に説明されている。
【０１１７】
ある特定のファージディスプレイ法では、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別々にクローニングし、ファージライブラリ内でランダムに組み換え、次いでそれらを、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−４５５（１９９４）に記載されているように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは典型的に、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片としてまたはＦａｂ断片としてのいずれかで、抗体断片を提示する。免疫された源のライブラリは、ハイブリドーマを構築する必要なしに、免疫原に対する高親和性抗体を提供する。代替的に、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ，１２：７２５−７３４（１９９３）に記載されているように、いかなる免疫も行うことなく、ナイーブレパートリーを（例えば、ヒトから）クローニングして、広範な非自己抗原及びまた自己抗原に対する抗体の単一源を提供することができる。最後に、ナイーブライブラリは、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１−３８８（１９９２）に記載されているように、再配列されていないＶ遺伝子セグメントを幹細胞からクローニングし、ランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを使用して高度可変ＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再配列を実行することによって、合成的に作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリについて説明している特許公開には、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、ならびに米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、同第２００５／０１１９４５５号、同第２００５／０２６６０００号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０１６０５９８号、同第２００７／０２３７７６４号、同第２００７／０２９２９３６号、及び同第２００９／０００２３６０号が挙げられる。
【０１１８】
ヒト抗体ライブラリから単離された抗体または抗体断片は、本明細書でヒト抗体またはヒト抗体断片と見なされる。
【０１１９】
（ｉｖ）キメラ、ヒト化、及びヒト抗体
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、キメラ抗体である。ある特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、及びＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））に記載される。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサル等の非ヒト霊長類に由来する可変領域）、及びヒト定常領域を含む。更なる実施例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変更された、「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体には、それらの抗原結合断片が含まれる。
【０１２０】
ある特定の実施形態において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的に、非ヒト抗体は、親の非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低減するためにヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（またはそれらの部分）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（またはそれらの部分）がヒト抗体配列に由来する、１つ以上の可変ドメインを含む。また、ヒト化抗体は任意に、ヒト定常領域の少なくとも一部分も含む。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体におけるいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性または親和性を復元するまたは改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。
【０１２１】
ヒト化抗体及びそれらを作製する方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）に概説されており、また、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３（１９８９）、米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号、及び同第７，０８７，４０９号、Ｋａｓｈｍｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：２５−３４（２００５）（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフティングを記載している）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９−４９８（１９９１）（「リサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）」を記載している）、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：４３−６０（２００５）（「ＦＲシャフリング」を記載している）、ならびにＯｓｂｏｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：６１−６８（２００５）、及びＫｌｉｍｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２−２６０（２０００）（ＦＲシャフリングへの「誘導選択」アプローチを記載している）に更に記載されている。
【０１２２】
ヒト化に使用され得るヒトフレームワーク領域には、「ベストフィット」法を使用して選択されるフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）を参照されたい）、軽鎖可変領域または重鎖可変領域の特定の下位集団のヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）、及びＰｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３）を参照されたい）、ヒト成熟（体細胞突然変異）フレームワーク領域またはヒト生殖系列フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）を参照されたい）、及びＦＲライブラリのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８−１０６８４（１９９７）、及びＲｏｓｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１−２２６１８（１９９６）を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２３】
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野において既知の種々の技法を使用して生成され得る。ヒト抗体は、一般に、ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８−７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０−４５９（２００８）に記載される。ヒト抗体は、例えば、非限定的に、本明細書に記載される方法のいずれかによって原核発現ベクターから原核宿主細胞中で発現させることによって作製することができる。
【０１２４】
ヒト抗体はまた、ヒト由来ファージディスプレイライブラリから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成されてもよい。かかる可変ドメイン配列は、所望のヒト定常ドメインと組み合わされてもよい。抗体ライブラリからヒト抗体を選択するための技法が、以下に記載される。
【０１２５】
（ｖ）抗体断片
抗体断片は、酵素消化等の従来の手段によって、または組み換え技法によって産生され得る。ある特定の状況においては、全抗体ではなく抗体断片を使用する利点がある。断片サイズがより小さいと、急速なクリアランスが可能となり、これにより固形腫瘍へのアクセスが改善され得る。ある特定の抗体断片の概説については、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４を参照されたい。
【０１２６】
種々の技法が抗体断片の生成のために開発されている。従来、これらの断片は、インタクトな抗体のタンパク質分解消化によって得られた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７（１９９２）、及びＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照されたい）。しかしながら、現在、これらの断片は、組み換え宿主細胞によって直接生成することができる。Ｆａｂ、Ｆｖ、及びＳｃＦｖ抗体断片はすべて、大腸菌中で発現されて、それから分泌され得るため、これらの断片を容易に大量に生成することができる。抗体断片は、上記の抗体ファージライブラリから単離することができる。代替的に、Ｆａｂ’−ＳＨ断片を大腸菌から直接回収し、化学カップリングして、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成させることができる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２））。別のアプローチに従うと、Ｆ（ａｂ’）２断片は、組み換え宿主細胞培養から直接単離することができる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、インビボ半減期が増加したＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片については、米国特許第５，８６９，０４６号で説明されている。抗体断片の生成のための他の技法は、当業者には明らかとなる。ある特定の実施形態において、抗体は１本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ  ９３／１６１８５、米国特許第５，５７１，８９４号、及び同第５，５８７，４５８号を参照されたい。Ｆｖ及びｓｃＦｖは、定常領域を欠くインタクトな結合部位を有する唯一の種であり、このため、これらはインビボ使用中の非特異的結合の減少に好適であり得る。ｓｃＦｖ融合タンパク質は、ｓｃＦｖのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかにてエフェクタータンパク質の融合が生じるように構築されても良い。上記のＡｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｅｄ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋを参照されたい。抗体断片はまた、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載されているように「線状抗体」であっても良い。かかる線状抗体は、単一特異性または二重特異性であっても良い。
【０１２７】
（ｖｉ）多特異性抗体
多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有し、これらのエピトープは、通常、異なる抗原由来である。かかる分子は、通常、２つの異なるエピトープ（すなわち、二重特異性抗体、ＢｓＡｂ）のみに結合することになるが、本明細書で使用される場合、三重特異性抗体等の追加の特異性を有する抗体がこの発現に包含される。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製され得る。
【０１２８】
二重特異性抗体の作製方法は、当該技術分野で既知である。完全長二重特異性抗体の従来の生成は、２つの鎖が異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づく（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のランダムな分類により、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は１０個の異なる抗体分子（そのうちの１個のみが正しい二重特異性構造を有する）の潜在的な混合物を生成する。通常は親和性クロマトグラフィーステップによって行われる正しい分子の精製は幾分煩雑であり、産物収率が低い。同様の手順は、ＷＯ  ９３／０８８２９及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５−３６５９（１９９１）に開示されている。
【０１２９】
二重特異性抗体を作製するための当該技術分野で既知である１つのアプローチは、「ノブ−イン−ホール」または「空洞への隆起（ｐｒｏｔｕｂｅｒａｎｃｅ−ｉｎｔｏ−ｃａｖｉｔｙ）」アプローチである（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照されたい）。このアプローチにおいて、２つの免疫グロブリンポリペプチド（例えば、重鎖ポリペプチド）は各々、界面を含む。一方の免疫グロブリンポリペプチドの界面は、もう一方の免疫グロブリンポリペプチド上の対応する界面と相互作用することで、２つの免疫グロブリンポリペプチドを会合させる。これらの界面は、一方の免疫グロブリンポリペプチドの界面に位置する「ノブ」または「隆起」（これらの用語は本明細書では互換的に使用され得る）が、もう一方の免疫グロブリンポリペプチドの界面に位置する「ホール」または「空洞」（これらの用語は本明細書では互換的に使用され得る）と対応するように操作されても良い。一部の実施形態において、ホールは、ノブと同一または類似のサイズのものであり、２つの界面が相互作用するときに、一方の界面のノブがもう一方の界面の対応するホールの中に位置付け可能となるように、好適に位置付けられる。理論に束縛されることを意図するものではないが、これは、ヘテロ多量体を安定させ、他の種、例えば、ホモ多量体の形成と比較してヘテロ多量体の形成を優先すると考えられる。一部の実施形態において、このアプローチを使用して、２つの異なる免疫グロブリンポリペプチドのヘテロ多量体化を促進し、異なるエピトープに対する結合特異性を有する２つの免疫グロブリンポリペプチドを含む二重特異性抗体を創出しても良い。
【０１３０】
一部の実施形態において、ノブは、小型のアミノ酸側鎖を大型の側鎖で置き換えることによって構築し得る。一部の実施形態において、ホールは、大型のアミノ酸側鎖を小型の側鎖で置き換えることによって構築し得る。ノブまたはホールは、元々の界面中に存在しても良く、または、合成によって導入されても良い。例えば、ノブまたはホールは、界面をコードする核酸配列を改変して少なくとも１つの「元々の」アミノ酸残基を少なくとも１つの「移入」アミノ酸残基で置き換えることによって合成によって導入されても良い。核酸配列の改変方法としては、当該技術分野で周知の標準的な分子生物学的技法を挙げることができる。種々のアミノ残基の側鎖体積を以下の表に示す。一部の実施形態において、原型残基は、小型の側鎖体積（例えば、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、セリン、トレオニン、またはバリン）を有し、ノブを形成するための移入残基は、自然発生アミノ酸であり、アルギニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンを含み得る。一部の実施形態において、原型残基は、大型の側鎖体積（例えば、アルギニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン）を有し、ホールを形成するための移入残基は、自然発生アミノ酸であり、アラニン、セリン、トレオニン、及びバリンを含み得る。
0006770966.tif 000003
ａアミノ酸の分子量から水の分子量を減算したものである。値は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，４３ｒｄ  ｅｄ．Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｕｂｂｅｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，１９６１からのものである。
ｂ値は、Ａ．Ａ．Ｚａｍｙａｔｎｉｎ，Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：１０７−１２３，１９７２からのものである。
ｃ値は、Ｃ．Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：１−１４，１９７５からのものである。利用可能な表面積は、この参照文献の図６〜２０において定義される。
【０１３１】
一部の実施形態において、ノブまたはホールを形成するための原型残基は、ヘテロ多量体の３次元構造に基づいて特定される。３次元構造を得るための当該技術分野で既知の技法としては、Ｘ線結晶学及びＮＭＲを挙げることができる。一部の実施形態において、界面は、免疫グロブリン定常ドメインのＣＨ３ドメインである。これらの実施形態において、ヒトＩｇＧ１のＣＨ３／ＣＨ３界面は、４個の逆平行β鎖上に位置する各ドメイン上の１６個の残基を伴う。理論に束縛されることを意図するものではないが、突然変異した残基は、好ましくは、ノブがパートナーＣＨ３ドメインにおける補償ホールではなく周囲の溶媒によって収容され得る危険性を最低限に抑えるように、２つの中央の逆平行β鎖上に位置する。一部の実施形態において、２つの免疫グロブリンポリペプチドにおける対応するノブ及びホールを形成する突然変異は、以下の表で提供される１つ以上の対と対応する。
0006770966.tif 000004
突然変異は、原型残基、続くＫａｂａｔ付番システムを使用した位置、その後の移入残基によって表される（全ての残基は一文字のアミノ酸コードで付与される）。複数の突然変異はコロンで分けられる。
【０１３２】
一部の実施形態において、免疫グロブリンポリペプチドは、上記の表２に列挙される１つ以上のアミノ酸置換を含むＣＨ３ドメインを含む。一部の実施形態において、二重特異性抗体は、表２の左のカラムに列挙される１つ以上のアミノ酸置換を含むＣＨ３ドメインを含む第１の免疫グロブリンポリペプチドと、表２の右のカラムに列挙される１つ以上の対応するアミノ酸置換を含むＣＨ３ドメインを含む第２の免疫グロブリンポリペプチドとを含む。
【０１３３】
以上で考察したＤＮＡの突然変異に続いて、１つ以上の対応するノブまたはホール形成突然変異によって修飾された免疫グロブリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが発現され、当該技術分野で既知の標準的な組み換え技法及び細胞系を使用して精製され得る。例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、同第５，８０７，７０６号、同第５，８２１，３３３号、同第７，６４２，２２８号、同第７，６９５，９３６号、同第８，２１６，８０５号、米国公開第２０１３／００８９５５３号、及びＳｐｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１：７５３−７５８，２０１３を参照されたい。修飾された免疫グロブリンポリペプチドは、大腸菌等の原核宿主細胞を使用して生成されても良い。対応するノブ及びホールを保有する免疫グロブリンポリペプチドは、共培養において宿主細胞中で発現され、共にヘテロ多量体として精製されても良く、またはこれらは、単一の培養において発現され、別個に精製され、インビトロで組み立てられても良い。一部の実施形態において、細菌性宿主細胞の２つの株（一方はノブを伴う免疫グロブリンポリペプチドを発現し、もう一方はホールを伴う免疫グロブリンポリペプチドを発現している）が、当該技術分野で既知の標準的な細菌培養技法を使用して共培養される。一部の実施形態において、これら２つの株は、特定の比率、例えば、培養において等しい発現レベルを達成する比率で混合され得る。一部の実施形態において、２つの株は、５０：５０、６０：４０、または７０：３０の比率で混合されても良い。ポリペプチド発現後、細胞は共に溶解され得、タンパク質が抽出され得る。ホモ多量体種対ヘテロ多量体種の存在度の測定を可能にする当該技術分野で既知の標準的な技法としては、サイズ排除クロマトグラフィーを挙げることができる。一部の実施形態において、修飾された免疫グロブリンポリペプチドの各々は、標準的な組み換え技法を使用して別個に発現され、それらは、共にインビトロで組み立てられ得る。組み立ては、例えば、修飾された免疫グロブリンポリペプチドの各々を精製し、それらを等しい質量で共に混合してインキュベートし、ジスルフィドを還元し（例えば、ジチオスレイトールでの処理によって）、濃縮し、ポリペプチドを再酸化することによって達成され得る。形成された二重特異性抗体は、カチオン交換クロマトグラフィーを含む標準的な技法を使用して精製され、サイズ排除クロマトグラフィーを含む標準的な技法を使用して測定されても良い。これらの方法のより詳細な説明については、Ｓｐｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１：７５３−８，２０１３を参照されたい。一部の実施形態において、修飾された免疫グロブリンポリペプチドは、ＣＨＯ細胞において別個に発現され、上記の方法を使用してインビトロで組み立てられ得る。
【０１３４】
異なるアプローチに従い、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原組み合わせ部位）を免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合する。融合は、好ましくは、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。融合のうちの少なくとも１つにおいて存在する、軽鎖結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが典型的である。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び所望の場合には免疫グロブリン軽鎖を別個の発現ベクター中に挿入し、好適な宿主生物へと同時トランスフェクトする。これにより、構築物中で使用される３つのポリペプチド鎖の不均衡な比率により最適な収率が提供される実施形態において、３つのポリペプチド断片の相互の割合を調整する際に優れた柔軟性が提供される。しかしながら、等しい比率の少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現により高い収率がもたらされるとき、または比率が特別に有意でないときには、２つまたは３つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を１つの発現ベクター中に挿入することが可能である。
【０１３５】
このアプローチの一実施形態において、二重特異性抗体は、一方のアームに第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、もう一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性を提供する）とで構成される。二重特異性分子の半分のみに免疫グロブリン軽鎖が存在することにより容易な分離方法が提供されるため、この非対称構造により所望の二重特異性化合物が不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから容易に分離されることが分かった。このアプローチは、ＷＯ  ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体の産生の更なる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照されたい。
【０１３６】
ＷＯ９６／２７０１１に記載されている別のアプローチに従い、抗体分子の対間の界面を、組み換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の割合を最大化するように操作することができる。一方の界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の界面からの１つ以上の小型のアミノ酸側鎖を、より大型の側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換える。より大型の側鎖（複数可）と同一または類似のサイズの補償「空洞」を、大型のアミノ酸側鎖をより小型の側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置き換えることによって、第２の抗体分子の界面上に創出する。これにより、ホモ二量体等の他の不要な最終産物と比較してヘテロ二量体の収率を増加させる機序が提供される。
【０１３７】
二重特異性抗体は、架橋または「ヘテロ複合体」抗体を含む。例えば、ヘテロ複合体中の抗体の一方はアビジンに、もう一方はビオチンにカップリングすることができる。かかる抗体は、例えば、免疫細胞を不要な細胞に標的化すること（米国特許第４，６７６，９８０号）及びＨＩＶ感染の治療用であること（ＷＯ  ９１／００３６０、ＷＯ  ９２／２００３７３、及びＥＰ  ０３０８９）が提案されている。ヘテロ複合体抗体は、任意の簡便な架橋方法を使用して作製し得る。好適な架橋剤は、いくつかの架橋技法と共に、当該技術分野で周知であり、米国特許第４，６７６，９８０号に記載されている。
【０１３８】
抗体断片からの二重特異性抗体の産生技法も、文献中で説明されている。例えば、二重特異性抗体は、化学連結を使用して調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）は、インタクトな抗体をタンパク質分解的に切断して、Ｆ（ａｂ’）２断片を産生する手順を説明している。これらの断片をジチオール複合化剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して、隣接ジチオールを安定させ、分子間のジスルフィド形成を防止する。次に、産生されたＦａｂ’断片をチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換する。その後、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の一方を、メルカプトエチルアミンを用いた還元によってＦａｂ’−チオールに再変換し、当モル量のもう一方のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して、二重特異性抗体を形成する。生成された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための薬剤として使用することができる。
【０１３９】
近年の進歩により、化学カップリングして二重特異性抗体を形成することができるＦａｂ’−ＳＨ断片の大腸菌からの直接的回収が促進されている。Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５：２１７−２２５（１９９２）は、完全ヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の生成を説明している。各Ｆａｂ’断片を大腸菌から別個に分泌させ、それに対してインビトロでの指向性化学カップリングを行い、二重特異性抗体を形成した。
【０１４０】
二重特異性抗体断片を組み換え細胞培養物から直接的に作製及び単離するための種々の技法も説明されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを使用して生成されてきた。Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結させた。抗体ホモ二量体をヒンジ領域にて還元して、モノマーを形成した後、再酸化して、抗体ヘテロ二量体を形成した。この方法は、抗体ホモ二量体の生成にも利用することができる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）によって説明される「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体断片を作製するための代替的機序を提供している。これらの断片は、短すぎて同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にすることができないリンカーによって、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、一方の断片のＶＨ及びＶＬドメインを、別の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと対形成させ、それにより、２つの抗原結合部位を形成する。１本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用によって二重特異性抗体断片を作製するための別の方針も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい。
【０１４１】
二重特異性抗体断片を作製するための別の技法は、「二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー」またはＢｉＴＥ（登録商標）アプローチである（例えば、ＷＯ２００４／１０６３８１、ＷＯ２００５／０６１５４７、ＷＯ２００７／０４２２６１、及びＷＯ２００８／１１９５６７を参照されたい）。このアプローチは、単一ポリペプチド上に配列された２つの抗体可変ドメインを利用する。例えば、単一ポリペプチド鎖は、可変重鎖（ＶＨ）ドメイン及び可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを各々有する２つの１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片を含み、これらのドメインは、２つのドメイン間の分子内会合を許容するのに十分な長さのポリペプチドリンカーによって分離される。この単一のポリペプチドは、２つのｓｃＦｖ断片間のポリペプチドスペーサ配列を更に含む。各ｓｃＦｖは、異なるエピトープを認識し、これらのエピトープは、異なる細胞型に特異的であっても良く、その結果として、２つの異なる細胞型の細胞が、各ｓｃＦｖがその同族のエピトープとエンゲージするときに近接するかまたは係留される。このアプローチの１つの特定の実施形態は、免疫細胞によって発現される細胞表面抗原を認識するｓｃＦｖ、例えば、Ｔ細胞上のＣＤ３ポリペプチドを含み、これは、悪性または腫瘍細胞等の標的細胞によって発現される細胞表面抗原を認識する別のｓｃＦｖに連結する。
【０１４２】
これは単一ポリペプチドであるため、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、当該技術分野で既知の任意の原核細胞発現系を使用して発現され得る。しかしながら、特異的精製技法（例えば、ＥＰ１６９１８３３を参照されたい）が、モノマー二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを、モノマーの意図される活性以外の生物活性を有し得る他の多量体種から分離するために必要であり得る。１つの例示的な精製スキームでは、分泌ポリペプチドを含有する溶液に対してまず金属親和性クロマトグラフィーを行い、イミダゾール濃度の勾配を用いて溶出を行う。この溶出物を、アニオン交換クロマトグラフィーを使用して更に精製し、ポリペプチドを、塩化ナトリウム濃度の勾配を使用して溶出する。最後に、この溶出物に対してサイズ排除クロマトグラフィーを行い、モノマーを多量体種から分離する。
【０１４３】
原子価が２超である抗体が企図される。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Ｔｕｆｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【０１４４】
一部の実施形態において、２鎖タンパク質は、多重特性性抗体または二重特異性抗体の一部である。多重特性抗体または二重特異性抗体は、本開示の２つ以上の一価抗体を含有する。
【０１４５】
一部の実施形態において、二重特性抗体の第１の抗原結合ドメインは、１つ以上の重鎖定常ドメインを含み、この１つ以上の重鎖定常ドメインは、第１のＣＨ１（ＣＨ１１）ドメイン、第１のＣＨ２（ＣＨ２１）ドメイン、第１のＣＨ３（ＣＨ３１）ドメインから選択され、二重特性抗体の第２の抗原結合ドメインは、１つ以上の重鎖定常ドメインを含み、この１つ以上の重鎖定常ドメインは、第２のＣＨ１（ＣＨ１２）ドメイン、第２のＣＨ２（ＣＨ２２）ドメイン、及び第２のＣＨ３（ＣＨ３２）ドメインから選択される。一部の実施形態において、第１の抗原結合ドメインの１つ以上の重鎖定常ドメインのうちの少なくとも１つは、第２の抗原結合ドメインの別の重鎖定常ドメインと対形成される。一部の実施形態において、ＣＨ３１及びＣＨ３２ドメインは、各々、突起または空洞を含み、ＣＨ３１ドメインにおけるこの突起または空洞は、それぞれ、ＣＨ３２ドメインにおける空洞または突起中に位置付けることができる。一部の実施形態において、ＣＨ３１及びＣＨ３２ドメインは、該突起と該空洞との間の接合部にて接触する。ＣＨ３１及びＣＨ３２ドメインにおけるアミノ酸置換の例示的なセットが本明細書の表２に示される。一部の実施形態において、ＣＨ２１及びＣＨ２２ドメインは各々、突起または空洞を含み、ＣＨ２１ドメインにおけるこの突起または空洞は、それぞれ、ＣＨ２２ドメインにおける空洞または突起中に位置付けることができる。一部の実施形態において、ＣＨ２１及びＣＨ２２ドメインは、該突起と該空洞との間の接合部にて接触する。一部の実施形態において、ＩｇＧのＣＨ３１及び／またはＣＨ３２ドメインは、米国特許第８，２１６，８０５号の図５に示されているアミノ酸付番による３４７、３４９、３５０、３５１、３６６、３６８、３７０、３９２、３９４、３９５、３９８、３９９、４０５、４０７、及び４０９からなる群から選択される残基における１つ以上のアミノ酸置換を含有する。一部の実施形態において、突起は、アルギニン（Ｒ）残基、フェニルアラニン（Ｆ）残基、チロシン（Ｙ）残基、及びトリプトファン（Ｗ）残基からなる群から選択される１つ以上の導入された残基を含む。一部の実施形態において、空洞は、アラニン（Ａ）残基、セリン（Ｓ）残基、トレオニン（Ｔ）残基、及びバリン（Ｖ）残基からなる群から選択される１つ以上の導入された残基を含む。一部の実施形態において、ＣＨ３及び／またはＣＨ２ドメインは、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１サブタイプ、ＩｇＧ２サブタイプ、ＩｇＧ２Ａサブタイプ、ＩｇＧ２Ｂサブタイプ、ＩｇＧ３サブタイプ、またはＩｇＧ４サブタイプ）に由来する。一部の実施形態において、二重特異性抗体の一方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｙを含み、もう一方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｙ４０７Ｔを含む。一部の実施形態において、一方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、もう一方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｙ４０７Ａを含む。一部の実施形態において、一方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｆ４０５Ａを含み、もう一方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３９４Ｗを含む。一部の実施形態において、一方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｙ及びＦ４０５Ａを含み、もう一方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３９４Ｗ及びＹ４０７Ｔを含む。一部の実施形態において、一方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｗ及びＦ４０５Ｗを含み、もう一方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３９４Ｓ及びＹ４０７Ａを含む。一部の実施形態において、一方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｆ４０５Ｗ及びＹ４０７Ａを含み、もう一方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｗ及びＴ３９４Ｓを含む。一部の実施形態において、一方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｆ４０５Ｗを含み、もう一方のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３９４Ｓを含む。突然変異は、原型残基、続くＫａｂａｔ付番システムを使用した位置、その後の移入残基によって表される。米国特許第８，２１６，８０５号の図５における付番も参照されたい。
【０１４６】
（ｖｉｉ）単一ドメイン抗体
一部の実施形態において、本開示の抗体は単一ドメイン抗体である。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てもしくは一部分または軽鎖可変ドメインの全てもしくは一部分を含む、単一のポリペプチド鎖である。ある特定の実施形態において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ．、例えば、米国特許第６，２４８，５１６  Ｂ１号を参照されたい）。一実施形態において、単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てまたは一部分からなる。
【０１４７】
（ｖｉｉｉ）抗体変異形
一部の実施形態において、本明細書に記載される抗体のアミノ酸配列修飾（複数可）が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異形は、抗体をコードするヌクレオチド配列中に適切な変化を導入することによって、またはペプチド合成によって、調製されても良い。かかる修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列からの残基の欠失、及び／またはそこへの残基の挿入、及び／またはその中での残基の置換が含まれる。最終構築物に到達するように、欠失、挿入、及び置換を任意に組み合わせることができるが、但し、その最終構築物が、所望の特性を保有することを条件とする。アミノ酸の改変は、配列が作製されるときに対象の抗体アミノ酸配列中に導入され得る。
【０１４８】
（ｉｘ）置換、挿入、及び欠失変異形
ある特定の実施形態において、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異形が提供される。置換型突然変異生成に対する目的の部位には、ＨＶＲ及びＦＲが含まれる。保存的置換が、「保存的置換」の見出しの下に表１において示される。より実質的な変化は、表１において、「例示的な置換」の見出しの下に提供され、またアミノ酸側鎖クラスを参照して以下に更に記載される。アミノ酸置換が目的の抗体中に導入され、生成物が、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の低下、またはＡＤＣＣもしくはＣＤＣの改善についてスクリーニングされてもよい。
0006770966.tif 000005
【０１４９】
アミノ酸は、次の一般的な側鎖特性に従って分類されてもよい。
ａ．疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、
ｂ．中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、
ｃ．酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
ｄ．塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
ｅ．鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、
ｆ．芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１５０】
非保存的置換には、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴うことになる。
【０１５１】
置換型変異形の１つの種類は、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の１個以上の超可変領域残基を置換することを伴う。一般に、更なる試験のために選択される、結果として生じる変異形（複数可）は、親抗体と比較して、ある特定の生物学的特性の修飾（例えば、改善）（例えば、改善された親和性、低下した免疫原性）を有することになり、かつ／または親抗体のある特定の生物学的特性を実質的に保持することになる。例示的な置換型変異形は、例えば、本明細書に記載されるもの等のファージディスプレイベースの親和性成熟技法を使用して、好都合に生成され得る、親和性成熟抗体である。簡潔に述べると、１個以上のＨＶＲ残基を突然変異させ、変異形抗体をファージ上で提示させて、特定の生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。
【０１５２】
変化（例えば、置換）をＨＶＲにおいて行って、例えば、抗体親和性を改善してもよい。かかる変化は、ＨＶＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセス中に高頻度で突然変異を経るコドンによってコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９−１９６（２００８）を参照されたい）、及び／またはＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）において行われても良く、結果として生じる変異形ＶＨまたはＶＬが、結合親和性について試験される。二次ライブラリを構築し、そこから再選択することによる親和性成熟は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，（２００１）に記載されている。）親和性成熟のいくつかの実施形態において、多様性が、多様な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャフリング、またはオリゴヌクレオチド指定突然変異生成）のうちのいずれかによって、成熟のために選定された可変遺伝子中に導入される。次いで、二次ライブラリが作成される。次いで、ライブラリは、所望の親和性を有する任意の抗体変異形を特定するために、スクリーニングされる。多様性を導入するための別の方法は、数個のＨＶＲ残基（例えば、１回に４〜６個の残基）がランダム化される、ＨＶＲ指向性アプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング突然変異生成またはモデリングを使用して、具体的に特定されてもよい。特にＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３が、標的とされることが多い。
【０１５３】
ある特定の実施形態において、置換、挿入、または欠失は、かかる変化が、抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限り、１つ以上のＨＶＲ内で生じ得る。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的変化（例えば、本明細書に提供される保存的置換）が、ＨＶＲにおいて行われてもよい。かかる変化は、ＨＶＲ「ホットスポット」またはＳＤＲの外側のものであってもよい。上記の変異形ＶＨ及びＶＬ配列のある特定の実施形態において、各ＨＶＲは、不変であるか、または１つ以下、２つ以下、もしくは３つ以下のアミノ酸置換を含有するかのいずれかである。
【０１５４】
突然変異生成のための標的とされ得る抗体の残基または領域を特定するための有用な方法の１つは、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５に記載される「アラニンスキャニング変異生成」と呼ばれるものである。この方法において、標的残基（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕ等の荷電残基）のうちのある残基または基が特定され、中性または負荷電アミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）によって置き換えられて、抗体と抗原との相互作用が影響を受けるかどうかが決定される。更なる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の場所に導入されてもよい。代替的に、または追加的に、抗体と抗原との間の接触点を特定するための抗原−抗体複合体の結晶構造。かかる接触残基及び隣接する残基は、置換の候補として標的とされるか、または排除されてもよい。変異形をスクリーニングして、それらが所望の特性を含有するかどうかを決定してもよい。
【０１５５】
アミノ酸配列挿入には、１個の残基〜１００個以上の残基を含有するポリペプチドの範囲の長さである、アミノ末端融合及び／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一のまたは多数のアミノ酸残基の配列内（ｉｎｔｒａｓｅｑｕｅｎｃｅ）挿入が含まれる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入型変異形には、抗体の血清中半減期を増加させる酵素（例えば、ＡＤＥＰＴのための）またはポリペプチドに対する抗体のＮ末端もしくはＣ末端への融合が含まれる。
【０１５６】
（ｘ）Ｆｃ領域変異形
ある特定の実施形態において、１つ以上のアミノ酸修飾が、本明細書に提供される抗体のＦｃ領域に導入され、それによってＦｃ領域変異形を生成してもよい。Ｆｃ領域変異形は、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含む、ヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４Ｆｃ領域）を含んでもよい。
【０１５７】
ある特定の実施形態において、本開示は、全てではないが一部のエフェクター機能を保有し、それにより、インビボでの抗体の半減期が重要であるが、ある特定のエフェクター機能（例えば補体及びＡＤＣＣ等）が不必要または有害である用途の望ましい候補となる、抗体変異形を企図する。インビトロ及び／またはインビボの細胞傷害性アッセイを実行して、ＣＤＣ及び／またはＡＤＣＣ活性の低減／枯渇を確認することができる。例えば、抗体が確実に、ＦｃγＲ結合を欠く（したがって、ＡＤＣＣ活性を欠いている可能性が高い）がＦｃＲｎ結合能力を保持するように、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実行することができる。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞は、Ｆｃ（ＲＩＩＩのみを発現するが、一方で単球は、Ｆｃ（ＲＩ、Ｆｃ（ＲＩＩ及びＦｃ（ＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）の４６４ページの表３に要約される。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：７０５９−７０６３（１９８６）を参照されたい）、及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：１４９９−１５０２（１９８５）；５，８２１，３３７（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１−１３６１（１９８７）を参照されたい）に記載されている。代替的に、非放射性アッセイ法が用いられてもよい（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ、及びＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照されたい。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。代替的に、または追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されるもの等の動物モデルにおいて、評価されても良い。また、Ｃ１ｑ結合アッセイをまた行って、抗体がＣ１ｑに結合不可能であり、したがってＣＤＣ活性を欠いていることを確認してもよい。例えば、ＷＯ  ２００６／０２９８７９及びＷＯ  ２００５／１００４０２におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行っても良い（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）、Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０１：１０４５−１０５２（２００３）、及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ  １０３：２７３８−２７４３（２００４）を参照されたい）。ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期の判定も、当該技術分野で既知の方法を使用して行うことができる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９−１７６９（２００６）を参照されたい）。
【０１５８】
低減したエフェクター機能を有する抗体には、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９のうちの１つ以上の置換を有するものが含まれる（米国特許第第６，７３７，０５６号）。かかるＦｃ突然変異体には、アラニンへの残基２６５及び２９７の置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体（米国特許第７，３３２，５８１号）を含む、アミノ酸２６５位、２６９位、２７０位、２９７位、及び３２７位のうちの２つ以上における置換を有するＦｃ突然変異体が含まれる。
【０１５９】
ＦｃＲへ結合が改善されたまたは減少したある特定の抗体変異形が記載される。（例えば、米国特許第第６，７３７，０５６号、ＷＯ２００４／０５６３１２、及びＳｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）を参照されたい）。
【０１６０】
ある特定の実施形態において、抗体変異形は、ＡＤＣＣを向上させる１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８位、３３３位、及び／または３３４位（残基のＥＵ付番）における置換を有する、Ｆｃ領域を含む。例示的な実施形態において、本抗体は、次のアミノ酸置換、すなわちＳ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、及びＫ３３４Ａを、そのＦｃ領域に含む。
【０１６１】
一部の実施形態において、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ  ９９／５１６４２、及びＩｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）に記載されるように、Ｃ１ｑ結合及び／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の改変（すなわち、向上または減少のいずれか）をもたらす改変が、Ｆｃ領域において行われる。
【０１６２】
半減期が増加し、かつ新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合性が向上した抗体は、母体ＩｇＧの胎児への移入に関与する（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）、及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））。これは、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されている。それらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する、１つ以上の置換を内部に有するＦｃ領域を含む。かかるＦｃ変異形には、Ｆｃ領域残基２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、または４３４のうちの１つ以上における置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換（米国特許第７，３７１，８２６号）を有するものが含まれる。Ｆｃ領域変異形の他の例に関しては、Ｄｕｎｃａｎ  ＆  Ｗｉｎｔｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：７３８−４０（１９８８）、Ｕ．Ｓ．特許第５，６４８，２６０号、米国特許第５，６２４，８２１号、及びＷＯ  ９４／２９３５１も参照されたい。
【０１６３】
（ｘｉ）抗体誘導体
本開示の抗体は、当該技術分野で既知であり、容易に入手可能な、追加の非タンパク質性部分を含有するように、更に修飾され得る。ある特定の実施形態において、抗体の誘導体化に好適な部分は、水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレン（ｐｒｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）グリコールホモポリマー、プロリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中での安定性があるため、製造における利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量のものであってもよく、分岐していても非分岐であってもよい。抗体に結合したポリマーの数は、様々であってもよく、１つを超えるポリマーが結合される場合、それらは、同じ分子であっても、または異なる分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／または種類は、改善対象の抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が規定の条件下で療法において使用されるかどうか等を含むが、これらに限定されない考慮に基づいて決定することができる。
【０１６４】
（ｘｉｉ）ベクター、宿主細胞、及び組み換え方法
抗体はまた、組み換え法を使用して生成されても良い。抗抗原抗体の組み換え生成では、抗体をコードする核酸が単離され、更なるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために、複製可能なベクター中に挿入される。抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能である、オリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離されて配列決定され得る。多くのベクターが利用可能である。ベクター構成要素としては、概して、シグナル配列、複製源、１つ以上のマーカ遺伝子、エンハンサー要素、プロモータ、及び転写終結配列のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６５】
（ａ）シグナル配列構成要素
本開示の抗体は、直接的にのみではなく、異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても組み換え的に生成され得る。この異種ポリペプチドは、好ましくは、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端にて特異的切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドである。選択される異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識され処理されるもの（例えば、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。天然の抗体シグナル配列を認識し処理しない原核宿主細胞については、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または耐熱性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核性シグナル配列によって置換される。
【０１６６】
（ｂ）複製起点
発現ベクター及びクローニングベクターの両方は、ベクターが１つ以上の選択される宿主細胞において複製できるようにする核酸配列を含有する。一般に、クローニングベクターにおいて、この配列は、ベクターに宿主染色体ＤＮＡとは無関係に複製させるものであり、かつ複製または自己複製配列の起点を含むものである。かかる配列は、多様な原核宿主細胞についてよく知られている。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点が大部分のグラム陰性細菌に好適である。
【０１６７】
（ｃ）選択遺伝子構成要素
発現ベクター及びクローニングベクターは、選択可能なマーカとも称される選択遺伝子を含有しても良い。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えば、アンピリシン、ネオマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリンに対する耐性を与える、（ｂ）栄養要求性欠乏を補充する、あるいは（ｃ）複合培地から得ることができない必須の栄養素、例えば、桿菌のためのＤアラニンラセマーゼをコードする遺伝子を供給する、タンパク質をコードする。
【０１６８】
選択スキームの一例は、宿主細胞の成長を停止するための薬物を利用する。異種遺伝子による形質転換に成功した細胞は、薬物耐性を与え、それにより選択レジメンで生存するタンパク質を生成する。かかる優勢選択の例は、薬物である、ネオマイシン、ミコフェノール酸、及びハイグロマイシンを使用する。
【０１６９】
別の選択スキームは、遺伝子産物が特定の培養培地における成長に不可欠である遺伝子を除去する染色体欠失を有する原核宿主細胞を使用する。これらの例において、宿主細胞の染色体欠失を補う異種遺伝子による形質転換に成功した細胞は、特定の培養培地における成長時に生存することになる。このスキームにおいて有用な遺伝子の例としては、栄養要求性マーカ遺伝子、または宿主細胞を特定の培養培地において成長させるときに必須の栄養素を産生するために必要とされる他の遺伝子を挙げることができる。
【０１７０】
（ｄ）プロモータ構成要素
発現ベクター及びクローニングベクターは、概して、宿主生物によって認識されるプロモータを含有し、抗体をコードする核酸に動作可能に連結する。原核宿主との使用に好適なプロモータは、ｐｈｏＡプロモータ、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモータ系、アルカリホスファターゼプロモータ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモータ系、及びｔａｃプロモータ等のハイブリッドプロモータが挙げられる。しかしながら、他の既知である細菌性プロモータも好適である。細菌系における使用のためのプロモータはまた、抗体をコードしているＤＮＡに動作可能に連結するシャインダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含有することになる。
【０１７１】
（ｅ）翻訳開始領域構成要素
上記のように、翻訳開始領域（ＴＩＲ）は、原核宿主細胞における組換えタンパク質の翻訳に重要であることが知られている（例えば、Ｓｉｍｍｏｎｓ  ＬＣ  ａｎｄ  Ｙａｎｓｕｒａ  ＤＧ  １９９６  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：６２９、及びＶｉｍｂｅｒｇ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ．２００７  ＢＭＣ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８：１００を参照されたい）。ＴＩＲは、翻訳単位の翻訳の効率を決定し得る。ＴＩＲは、典型的には、開始コドン、シャインダルガーノ（ＳＤ）配列、及び翻訳エンハンサー等の翻訳単位特性を含む。ＴＩＲは、シグナルペプチドをコードする分泌シグナル配列を更に含んでも良い。配列及びＴＩＲの特性間の離間により翻訳開始効率が調節され得る。タンパク質生成におけるＴＩＲの使用の更なる説明については、例えば、米国特許第５，８４０，５２３号（Ｓｉｍｍｏｎｓら）を参照されたい。これらは、発現及び分泌を最適化するための翻訳開始領域（ＴＩＲ）及びシグナル配列を説明している。
【０１７２】
（ｆ）転写終結構成要素
原核宿主細胞において使用される発現ベクターはまた、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含有しても良い。原核細胞において、終結因子は、Ｒｈｏ依存性またはＲｈｏ独立終結因子を含んでも良い。原核宿主細胞において有用な終結因子の一例としては、λｔ０終結因子が挙げられるが、これに限定されない（Ｓｃｈｏｌｔｉｓｓｅｋ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：３１８５，１９８７）。
【０１７３】
ＩＩＩ．プロセス最適化
宿主細胞を培養してポリペプチドの２つの鎖を発現させることによって原核宿主細胞に２つの鎖を含有するポリペプチドを生成する方法が本明細書で提供され、この場合、発現時に、２つの鎖が折り畳まれ組み立てられて宿主細胞中に生物学的に活性のポリペプチドを形成し、宿主細胞は、成長温度及び成長撹拌速度を含む成長相、ならびに生成温度及び生成撹拌速度を含む生成相を含む条件下で、培養培地において培養され、成長温度は、生成温度を２〜１０℃上回り、成長撹拌速度は、生成撹拌速度を５０〜２５０ｒｐｍ上回る。ある特定の生成プロセス最適化により、本明細書に記載のデータが示すように２鎖タンパク質の収率が劇的に増加することは、本開示の驚くべき発見である。
【０１７４】
（ｇ）宿主細胞の選択及び形質転換
本開示のある特定の態様は、原核宿主細胞に関する。本明細書のベクターにおけるＤＮＡのクローニングまたは発現に好適な原核細胞としては、グラム陰性またはグラム陽性生物等の真正細菌、例えば、エシェリキア属等の腸内細菌科、例えば、大腸菌、エンテロバクター属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、例えば、サルモネラ・チフィムリウム、セラチア属、例えば、セラチア・マルセッセンス、及び赤痢菌属、ならびにバシラス・サブチリス及びバシラス・リケニフォルミス等のバシラス（例えば、１９８９年４月１２日出版のＤＤ  ２６６，７１０に開示されているバシラス・リケニフォルミス４１Ｐ）、１９８９）、緑膿菌及びストレプトミセス等のシュードモナス属が挙げられる。１つの好ましい大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）であるが、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）、及び大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７，３２５）等の他の株が好適である。これらの例は、限定的なものではなく例示的なものである。
【０１７５】
一部の実施形態において、原核宿主細胞は、グラム陰性細菌である。グラム陰性細菌は、グラム染色によって検出されるペプチドグリカン層を取り囲む外膜を含有する任意の細菌を指す。多くのグラム陰性細菌性宿主細胞が当該技術分野で既知である。例えば、グラム陰性細菌として、プロテオバクテリア、例えば、アルファプロテオバクテリア、ベータプロテオバクテリア、ガンマプロテオバクテリア、ゼータプロテオバクテリア、イプシロンプロテオバクテリア、デルタプロテオバクテリア、及びアシドバクテリア、シアノバクテリア、ならびにスピロヘータが挙げられるが、これらに限定されないことが知られている。周知のグラム陰性細菌としては、エシェリシア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ）、サルモネラ属、赤痢菌属、シュードモナス属、ヘリオバクター（Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒ）属、レジオネラ属、ナイセリア属、及びクレブシエラ属等の属に由来する種を挙げることができる。
【０１７６】
一部の実施形態において、本開示のグラム陰性細菌は大腸菌である。本明細書で使用される大腸菌は、大腸菌種に属する細菌の任意の株または単離物を指し得る。大腸菌は、自然発生株、または突然変異もしくは本明細書に記載のプラスミドによる形質転換等によって遺伝子修飾された株を含んでも良い。
【０１７７】
一部の実施形態において、本開示の大腸菌は、内因性プロテアーゼ活性を欠く株のものである。理論に束縛されることを意図するものではないが、内因性プロテアーゼ活性を欠く株は、一部の内因性プロテアーゼが組み換えによって発現された基質に対する活性を有するため、本開示のペリプラズムタンパク質等の組み換えタンパク質の生成の向上を可能にし得ると考えられる（１つのこのような例については、Ｂａｎｅｙｘ  Ｆ  ａｎｄ  Ｇｅｏｒｇｉｕ  Ｇ  １９９０  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２（１）：４９１を参照されたい）。内因性プロテアーゼ活性を欠く株は、内因性プロテアーゼをコードしている遺伝子が、突然変異、欠失、さもなければ不活性化している株を含んでも良い。かかる遺伝子の例としては、ｄｅｇＰ、ｐｒｃ、及びｏｍｐＴを挙げることができるが、これらに限定されない。様々な原核宿主細胞における突然変異の導入方法（例えば、内因性プロテアーゼ活性を欠く株を操作するため）は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｓｎｙｄｅｒ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．２０１３  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ４ｔｈ  ｅｄ．ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。
【０１７８】
完全長抗体、抗体融合タンパク質、及び抗体断片等の２鎖タンパク質は、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされない場合、例えば、治療用抗体が、単独で腫瘍細胞の破壊において効果を示す細胞傷害性薬剤（例えば、毒素）に複合される場合に、細菌において生成されても良い。完全長抗体は、循環中により優れた半減期を有する。大腸菌における生成は、より早く、より費用効率が高い。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号（Ｃａｒｔｅｒら）、米国特許第５，７８９，１９９号（Ｊｏｌｙら）、米国特許第５，８４０，５２３号（Ｓｉｍｍｏｎｓら）を参照されたい。これらは、発現及び分泌を最適化するための翻訳開始領域（ＴＩＲ）及びシグナル配列を説明している。また、Ｃｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３），ｐｐ．２４５−２５４も参照されたい。これは、大腸菌における抗体断片の発現を説明している。発現後、抗体は、可溶性画分において大腸菌細胞ペーストから単離されても良く、また、例えば、アイソタイプに応じてタンパク質ＡまたはＧカラムを介して精製されても良い。最終精製は、例えば、ＣＨＯ細胞において発現された抗体を精製するためのプロセスと同様に実行することができる。
【０１７９】
宿主細胞は、２鎖タンパク質生成のための上記の発現ベクターまたはクローニングベクターによって形質転換され、プロモータの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードしている遺伝子の増幅に適切なものとなるように修飾される従来の栄養素培地において培養される。
【０１８０】
（ｈ）宿主細胞の培養
本開示のある特定の態様は、成長相及び生成相を含む条件下での培養培地中の宿主細胞の培養に関する。これらの相の各々は、更に、宿主細胞が特定の相において成長する条件を指し得る。例えば、本明細書で使用される場合、成長相は、成長温度及び成長撹拌速度を含んでも良く、生成相は、生成温度及び生成撹拌速度を含んでも良い。
【０１８１】
成長相は、宿主細胞の培養物が指数関数的に成長している間の任意の時間を指し得る。本明細書で使用される成長温度は、宿主細胞の成長相にある本開示の宿主細胞を含有する培養培地の温度を指し得る。宿主細胞培養物の成長相は、当該技術分野で一般的に知られている方法、例えば、経時的に培養物の吸光度（例えば、約５５０ｎｍの波長、約６００ｎｍの波長、またはその間の波長にて）を測定し、指数成長相が停止する時間を決定することによって決定されても良い。宿主細胞がｐｈｏプロモータを有するベクターを含有する場合、成長相は、宿主細胞の培養物が指数的に成長し、培養培地中のリン酸塩の濃度が、ｐｈｏプロモータを媒介する遺伝子転写の誘導を防止するのに十分なものとなる任意の時間を指し得る。
【０１８２】
生成相は、宿主細胞の培養が産物を生成している任意の時間を指す。本明細書で使用される生成温度は、宿主細胞の生成相にある本開示の宿主細胞を含有する培養培地の温度を指し得る。宿主細胞が、産物の発現を駆動するｐｈｏプロモータを有するベクターを含有する場合、生成相は、培養培地中のリン酸塩の濃度がｐｈｏプロモータを媒介する産物の遺伝子転写を誘導するほど十分に低下する任意の時間を指し得る。
【０１８３】
一部の実施形態において、本開示の宿主細胞は、生成温度を２℃〜１０℃上回る成長温度にて培養される。一部の実施形態において、本開示の宿主細胞は、生成温度を２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、または１０℃上回る成長温度にて培養される。一部の実施形態において、成長温度は、以下のいずれかの量だけ、すなわち、約１０、９．５、９、８．５、８、７．５、７、６．５、６、５．５、５、４．５、４、３．５、３、または２．５未満（℃）生成温度を上回る。一部の実施形態において、成長温度は、以下のいずれかの量だけ、すなわち、約２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、または９．５超（℃）生成温度を上回る。つまり、成長温度は、上限が１０、９．５、９、８．５、８、７．５、７、６．５、６、５．５、５、４．５、４、３．５、３、または２．５であり、独立して選択される下限が２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、または９．５である量（℃）の範囲のいずれかだけ生成温度を上回り、この場合、下限は上限を下回る。
【０１８４】
一部の実施形態において、成長温度は、成長相において約３０℃〜約３４℃の範囲である。一部の実施形態において、成長温度は、成長相において約３０℃、約３０．５℃、約３１℃、約３１．５℃、約３２℃、約３２．５℃、約３３℃、約３３．５℃、または約３４℃である。一部の実施形態において、成長相における成長温度は、約３４、３３．５、３３、３２．５、３２、３１．５、３１、または３０．５の温度（℃）のうちのいずれかを下回る。一部の実施形態において、成長相における成長温度は、約３０、３０．５、３１、３１．５、３２、３２．５、３３、または３３．５の温度（℃）のうちのいずれかを上回る。つまり、成長相における成長温度は、上限が３４、３３．５、３３、３２．５、３２、３１．５、３１、または３０．５であり、独立して選択される下限が３０、３０．５、３１、３１．５、３２、３２．５、３３、または３３．５である温度（℃）の範囲のいずれかであり得、この場合、下限は上限を下回る。
【０１８５】
一部の実施形態において、生成温度は、生成相において約２５℃〜約２９℃の範囲である。一部の実施形態において、生成温度は、生成相において約２５℃、約２５．５℃、約２６℃、約２６．５℃、約２７℃、約２７．５℃、約２８℃、約２８．５℃、または約２９℃である。一部の実施形態において、生成相における生成温度は、約２９、２８．５、２８、２７．５、２７、２６．５、２６、または２５．５の温度（℃）のいずれかを下回る。一部の実施形態において、生成相における生成温度は、約２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、または２８．５の温度（℃）のいずれかを上回る。つまり、生成相における生成温度は、上限が２９、２８．５、２８、２７．５、２７、２６．５、２６、または２５．５であり、独立して選択される下限が２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、または２８．５である温度（℃）の範囲のいずれかであり得、この場合、下限は上限を下回る。
【０１８６】
撹拌速度は、細胞培養物が撹拌される（例えば、振盪によって）速度を指す。本明細書で使用される成長撹拌速度は、本開示の宿主細胞を含有する培養物が宿主細胞の成長相において撹拌される速度を指す。本明細書で使用される生成撹拌速度は、本開示の宿主細胞を含有する培養物が宿主細胞の生成相において撹拌される速度を指す。細胞培養物を撹拌して、細胞培養物の曝気を維持する。
【０１８７】
一部の実施形態において、本開示の宿主細胞は、生成撹拌速度を５０〜２５０ｒｐｍ上回る成長撹拌速度にて培養される。一部の実施形態において、本開示の宿主細胞は、生成撹拌速度を５０ｒｐｍ、７５ｒｐｍ、１００ｒｐｍ、１２５ｒｐｍ、１５０ｒｐｍ、１７５ｒｐｍ、２００ｒｐｍ、２２５ｒｐｍ、または２５０ｒｐｍ上回る成長撹拌速度にて培養される。一部の実施形態において、成長撹拌速度は、約２５０、２２５、２００、１７５、１５０、１２５、１００、または７５未満の速度（ｒｐｍ）のいずれかだけ生成撹拌速度を上回る。一部の実施形態において、成長撹拌速度は、約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、または２２５超の速度（ｒｐｍ）のいずれかだけ生成撹拌速度を下回る。つまり、成長撹拌速度は、上限が２５０、２２５、２００、１７５、１５０、１２５、１００、または７５であり、独立して選択される下限が５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、または２２５である速度（ｒｐｍ）の範囲のいずれかだけ生成撹拌速度を上回り、この場合、下限は上限を下回る。
【０１８８】
一部の実施形態において、成長撹拌速度は、成長相において約６００〜８００ｒｐｍの範囲である。一部の実施形態において、成長撹拌速度は、成長相において約６００ｒｐｍ、約６２５ｒｐｍ、約６５０ｒｐｍ、約６７５ｒｐｍ、約７００ｒｐｍ、約７２５ｒｐｍ、約７５０ｒｐｍ、約７７５ｒｐｍ、または約８００ｒｐｍである。一部の実施形態において、成長撹拌速度は、約８００、７７５、７５０、７２５、７００、６７５、６５０、または６２５未満の速度（ｒｐｍ）のいずれかである。一部の実施形態において、成長撹拌速度は、成長相において約６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、または７７５超の速度（ｒｐｍ）のいずれかである。つまり、成長相における成長撹拌速度は、上限が８００、７７５、７５０、７２５、７００、６７５、６５０、または６２５であり、独立して選択される下限が６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、または７７５である速度（ｒｐｍ）の範囲のいずれかであり、この場合は、下限は上限を下回る。
【０１８９】
一部の実施形態において、生成撹拌速度は、生成相において約３００〜５００ｒｐｍの範囲である。一部の実施形態において、生成相における生成撹拌速度は、約３００ｒｐｍ、約３２５ｒｐｍ、約３５０ｒｐｍ、約３７５ｒｐｍ、約４００ｒｐｍ、約４２５ｒｐｍ、約４５０ｒｐｍ、約４７５ｒｐｍ、または約５００ｒｐｍである。一部の実施形態において、生成相における生成撹拌速度は、約５００、４７５、４５０、４２５、４００、３７５、３５０、３２５未満の速度（ｒｐｍ）のいずれかである。一部の実施形態において、生成相における生成撹拌速度は、約３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、または４７５超の速度（ｒｐｍ）のいずれかである。つまり、生成相における生成撹拌速度は、上限が５００、４７５、４５０、４２５、４００、３７５、３５０、または３２５であり、独立して選択される下限が３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、または４７５である速度（ｒｐｍ）の範囲のいずれかであり、この場合、下限は上限を下回る。
【０１９０】
理論に束縛されることを意図するものではないが、酸素濃度が制限される場合、酸素移動速度（ＯＴＲ）は、細胞の酸素取り込み速度（ＯＵＲ）または代謝率と等しいと考えられる。撹拌速度を調整することによってＯＴＲの操作の操作を容易にし得、それによってＯＵＲを操作する。ＯＵＲ及びそのＯＴＲとの関係のより詳細な説明は、Ｏｃｈｏａ−Ｇａｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．２７：１５３，２００９において見出すことができる。細胞培養物のＯＵＲを測定するための技法は、当該技術分野で既知であり、質量分析計を使用して細胞培養物からのオフガスの組成物を監視することと、細胞培養物の酸素取り込み速度及び二酸化炭素発生速度を算出することと、を含むが、これに限定されない。
【０１９１】
一部の実施形態において、本開示の宿主細胞は、生成相にある宿主細胞中のピーク酸素取り込み速度を０．５〜２．５ｍｍｏｌ／Ｌ／分上回る成長相にある宿主細胞中の酸素取り込み速度を達成するために十分な成長撹拌速度にて培養される。本開示の発見は、生成相にある細胞培養の撹拌速度を、成長相と比較して、約２．５ｍｍｏｌ／Ｌ／分未満の宿主細胞中の酸素取り込み速度を達成するために十分な速度に減少させることが、本開示の２鎖ポリペプチド等の産物の生成を大幅に向上させることである。
【０１９２】
一部の実施形態において、本開示の宿主細胞は、生成相にある宿主細胞中のピーク酸素取り込み速度を０．５ｍｍｏｌ／Ｌ／分、１．０ｍｍｏｌ／Ｌ／分、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ／分、２．０ｍｍｏｌ／Ｌ／分、または２．５ｍｍｏｌ／Ｌ／分上回る成長相にある宿主細胞中の酸素取り込み速度を達成するために十分な成長撹拌速度にて培養される。一部の実施形態において、本開示の宿主細胞は、生成相にある宿主細胞中のピーク酸素取り込み速度を次の酸素取り込み速度（ｍｍｏｌ／Ｌ／分）のうちのいすれか、すなわち約２．５、２．０、１．５、または１．０未満上回る成長相にある宿主細胞中の酸素取り込み速度を達成するために十分な成長撹拌速度にて培養される。一部の実施形態において、本開示の宿主細胞は、生成相にある宿主細胞中のピーク酸素取り込み速度を次の酸素取り込み速度（ｍｍｏｌ／Ｌ／分）のいずれか、すなわち約０．５、１．０、１．５、２．０、または２．５超上回る成長相にある宿主細胞中の酸素取り込み速度を達成するために十分な成長撹拌速度にて培養される。つまり、本開示の宿主細胞は、生成相にある宿主細胞中のピーク酸素取り込み速度を、上限が２．５、２．０、１．５、または１．０であり、独立して選択される下限が０．５、１．０、１．５、２．０、または２．５である酸素取り込み速度（ｍｍｏｌ／Ｌ／分）の範囲（下限は上限を下回る）のいずれかだけ上回る成長相にある宿主細胞中の酸素取り込み速度を達成するために十分な成長攪拌速度にて培養される。
【０１９３】
一部の実施形態において、成長相にある宿主細胞のピーク酸素取り込み速度は、３．５ｍｍｏｌ／Ｌ／分〜４．５ｍｍｏｌ／Ｌ／分の範囲である。一部の実施形態において、成長相にある宿主細胞のピーク酸素取り込み速度は、３．５ｍｍｏｌ／Ｌ／分、３．７５ｍｍｏｌ／Ｌ／分、４．０ｍｍｏｌ／Ｌ／分、４．２５ｍｍｏｌ／Ｌ／分、または４．５ｍｍｏｌ／Ｌ／分である。一部の実施形態において、生成相にある宿主細胞の酸素取り込み速度は、１．０ｍｍｏｌ／Ｌ／分〜３．０ｍｍｏｌ／Ｌ／分の範囲である。一部の実施形態において、生成相にある宿主細胞の酸素取り込み速度は、１．０ｍｍｏｌ／Ｌ／分、１．２５ｍｍｏｌ／Ｌ／分、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ／分、１．７５ｍｍｏｌ／Ｌ／分、２．０ｍｍｏｌ／Ｌ／分、２．２５ｍｍｏｌ／Ｌ／分、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ／分、２．７５ｍｍｏｌ／Ｌ／分、または３．０ｍｍｏｌ／Ｌ／分である。
【０１９４】
一部の実施形態において、本開示の宿主細胞は、生成撹拌速度より約１０％〜約４０％（ｒｐｍ／ｒｐｍ）高い成長撹拌速度にて培養される。一部の実施形態において、宿主細胞は、下限が生成撹拌速度の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、または３５％（ｒｐｍ／ｒｐｍ）であり、独立して選択される上限が生成撹拌速度の４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、または１５％以下（ｒｐｍ／ｒｐｍ）である成長攪拌速度にて培養される。好ましい実施形態において、本開示の宿主細胞は、１０Ｌの発酵装置中で１バールの背圧及び２０Ｌ／分の曝気速度にて培養される。
【０１９５】
本開示の宿主細胞は、多様な媒体中で培養され得る。本明細書で使用される「培養培地」は、本開示の細菌の成長を支援する任意の組成物または培養液を指す。好適な培養培地は、液体または固体であり、任意の栄養素、塩、緩衝液、要素、ならびに細胞の成長及び生存を支援する他の化合物を含有しても良い。一般的な培養培地の栄養素は、窒素、炭素、アミノ酸、炭水化物、微量元素、ビタミン、及びミネラルの源を含み得る。これらの栄養素は、個々の成分として（定義された合成培地中等）または複合エキスの構成成分（例えば、酵母エキス）として添加されても良い。培養培地は、急速な成長を支援するために栄養素に富んでいても良く、あるいはより遅い成長を支援するために栄養素が最低限であっても良い。培養培地はまた、汚染生物の成長を阻害するかまたは汚染生物を殺滅するために使用される任意の薬剤（例えば、抗生物質）を含有しても良い。培養培地はまた、誘導プロモータまたは酵素の活性を制御するために使用される任意の化合物を含有しても良い（一例として、ＩＰＴＧを含めることで、ｌａｃオペロンまたは機能的に類似するプロモータによって制御される任意のポリヌクレオチドの発現を誘導しても良い）。好適な培養培地の多数の例は、当業者に周知であり、Ｍ９培地、Ｌｙｓｏｇｅｎｙ  Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）、ＮＺＹ培養液、ＳＯＢ培地、及びＹＴ培養液が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９６】
これらの培地のいずれも、必要に応じて、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩等）、緩衝液（ＨＥＰＥＳ等）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジン等）、抗生物質、抗真菌薬、微量元素（マイクロモル範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される）、グルコース、及び／または適切なエネルギー源を補充され得る。原核細胞培養培地中で見出される典型的な成分は、酵母エキス、塩（例えば、ＮａＣｌ）、トリプトン、緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）、グリセロール等を含む。任意の他の必要な補充物も、当業者に既知であり得る適切な濃度で含まれ得る。温度及びｐＨ等の培養条件は、発現のために選択される原核宿主細胞で既に使用したものであり、当業者には明らかとなる。
【０１９７】
（ｉ）生物学的に活性のポリペプチドの精製
本開示のある特定の態様は、宿主細胞から生物学的に活性のポリペプチドを回収することに関する。典型的には、本開示の生物学的に活性のポリペプチドを回収すること（「精製すること」または「精製」という用語が本明細書で互換的に使用されても良い）は、ポリペプチドを宿主細胞（または、ポリペプチドが培地中に排出される場合には細胞培養培地）から単離すること、ならびにポリペプチドを、他の関連する高分子、例えば、細胞残屑及び他のポリペプチドから精製することを伴う。多様なタンパク質を多様な宿主細胞内コンパートメントから精製するための多数の技法が当該技術分野で既知である（例えば、Ｅｖａｎｓ，Ｊｒ．，ＴＣ  ａｎｄ  Ｘｕ  ＭＱ（ｅｄｓ．）Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ（２０１１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ  ７０５，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。例示的な技法が以下に記載されるが、これらは、当業者の理解を助けるための例示のみを目的に含まれるものであり、決して限定するものではない。
【０１９８】
組み換え技法を使用するとき、分泌タンパク質等の２鎖タンパク質は、細胞内で精製されるか、細胞膜周辺腔で精製されるか、または培地中に直接排出され得る。分泌タンパク質が細胞内で精製される場合、第１のステップとして、宿主細胞または溶解断片である粒子状残屑が、例えば、遠心分離または限外濾過によって除去される。
【０１９９】
一部の実施形態において、分泌タンパク質は、宿主細胞のペリプラズムから回収される。Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２）は、大腸菌の細胞膜周辺腔に排出される分泌タンパク質を単離するための手順を説明している。簡潔に述べると、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分かけて解凍する。細胞残屑は、遠心分離によって除去することができる。分泌タンパク質が培地中に排出される場合、概して、かかる発現系からの上清を、まず、市販のタンパク質濃縮フィルタ、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して濃縮する。ＰＭＳＦ等のプロテアーゼ阻害剤を前述のステップのいずれかに含めてタンパク質分解を阻害しても良く、抗生物質を含めて、偶発的な汚染物質の成長を防止しても良い。
【０２００】
細胞から調製された分泌タンパク質組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及び親和性クロマトグラフィーを使用して精製することができるが、親和性クロマトグラフィーが典型的に好ましい精製ステップのうちの１つである。抗体に関して、タンパク質Ａの親和性リガンドとしての安定性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する。タンパク質Ａを使用して、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖に基づく抗体を精製することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。タンパク質Ｇは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨される（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。親和性リガンドが結合するマトリックスは、ほとんどの場合アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。制御された細孔ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼン等の機械的に安定したマトリックスにより、アガロースを用いて達成され得るものよりも流速を早くして処理時間を短くすることが可能となる。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。タンパク質精製のための他の技法、例えば、イオン交換カラムでの分別、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸等）でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿も、回収される抗体に応じて利用可能である。当業者であれば、分泌タンパク質等の他の２鎖タンパク質を回収するために、抗体回収に有用なこれらの技法の多くを容易に応用し得ることを認識するであろう。
【０２０１】
一般に、研究、試験、及び臨床における使用のために抗体を調製するための種々の方法論は、当該技術分野で確立されており、上述の方法論と一致し、かつ／または目的の特定の抗体に関して当業者によって適切だと考えられる通りである。
【実施例】
【０２０２】
本開示は、以下の実施例を参照することにより十分に理解されることになる。しかしながら、これらは、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に記載の実施例及び実施形態が例示のみを目的とするものであること、ならびにこれらを考慮した種々の修飾または変化が当業者に示唆され、これらが本出願の趣旨及び範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであることが理解される。
【０２０３】
略記：Ａｂ（抗体）、ｈＡｂ（半抗体）、ＨＣ（重鎖）、ＩｍｍＴＡＣ（免疫動員性抗癌モノクローナルＴ細胞受容体）、ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）、ＬＣ（軽鎖）、ＯＤ（吸光度）、ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）、ＯＴＲ（酸素移動速度）、ＯＵＲ（酸素取り込み速度）、Ｔｇ（成長温度）、Ｔｐ（生成温度）、ＴＩＲ（翻訳開始領域）、ｘＩＬ４（抗インターロイキン−４）、ｘＩＬ１３（抗インターロイキン−１３）、ｘＩＬ１７（抗インターロイキン−１７）、及びｘＩＬ３３（抗インターロイキン−３３）。
【０２０４】
実施例１：シャペロン及びオキシドレダクターゼレベルが半抗体生成力価に与える影響
組み換え技法を使用する異種分泌タンパク質の生成は、多くの治療用分子にとって重要である。多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）は、多くの重要な治療的使用、例えば、癌における免疫療法及び他の用途を有する異種分泌タンパク質の１つの非限定的な例である。治療的使用のための多特異性抗体の生成は、半抗体（ｈＡｂ）等のこれらの抗体の成分を産業規模で生成する能力を必要とする。この要求を満たすために、標準的な方法と比べて顕著に増加した生成をもたらす最適化された発現ベクター及び処理ステップが本明細書に記載される。重要なことに、シャペロンタンパク質ＦｋｐＡ、ＤｓｂＡ、及びＤｓｂＣと組み合わせたｈＡｂの重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）を共発現させるための単一プラスミドまたは適合性プラスミド系が、組み立てられたｈＡｂの生成を顕著に向上させることが分かった。この系を試験して、複数のｈＡｂの生成を改善することが分かったが、これは、多くの分泌タンパク質の生成に対するその幅広い有用性を示す。続く処理ステップの最適化（例えば、培養の異なる相における、撹拌速度、ｐＨ、ＦｋｐＡプロモータ、及び培養温度を含む）により、産物収率が更により顕著に増加した。
【０２０５】
物質及び方法
半抗体（ｈＡｂ）ベクター構築
ベクターを、ＥＰ１３５６０５２に記載されているものに類似した様式で構築した。具体的には、種々の発現ベクターをｈＡｂの発現のために作製した。各ベクターでは、発現カセットをＥｃｏＲＩ部位にて大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２のフレームワークにクローニングした（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４３：７７−９０，１９７８）。各発現カセットは、少なくとも次の構成要素を含有した。（１）転写の制御のためのｐｈｏＡプロモータ（Ｋｉｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９：５６７１−５６７８，１９８１）、（２）翻訳開始のための大腸菌ｔｒｐ由来のシャインダルガーノ配列、耐熱性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）シグナル配列、またはこれら両方の組み合わせ（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ５５：１８９−１９６，１９８７）、及び（３）転写を終了するためのλｔ０終結因子（Ｓｃｈｏｌｔｉｓｓｅｋ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：３１８５，１９８７）。追加的に、ＳＴＩＩシグナル配列またはそのシグナル配列のサイレントコドン変異形は、軽鎖または重鎖のコード配列に先行した。この配列は、ポリペプチドのペリプラズムへの分泌を導く（Ｐｉｃｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４２：２６９−２７５，１９８３、及びＳｉｍｍｏｎｓ  ａｎｄ  Ｙａｎｓｕｒａ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：６２９−６３４，１９９６）。
【０２０６】
別個のシストロンを有するベクターを、免疫グロブリン軽鎖遺伝子及び重鎖遺伝子の独立した発現を提供するように設計した。かかるベクターにおいて、各鎖のシストロン単位は、それ自体のＰｈｏＡプロモータの制御下にあり、λｔ０終結因子が後に続く。更に、各シストロンは、軽鎖及び重鎖の両方の発現を調節するためにＴＩＲ（翻訳開始領域）を組み込んだ（Ｓｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２６３：１３３−１４７，２００２）。例示的な実施形態において、発現カセットは、５’から３’にかけて、軽鎖のシストロンが後に続く第１のＰｈｏＡプロモータ（ＴＩＲ−Ｌ＋軽鎖）及び第１のλｔ０終結因子、ならびに重鎖のシストロンが後に続く第２のＰｈｏＡプロモータ（ＴＩＲ−Ｈ＋重鎖）及び第２のλｔ０終結因子を含有する。代替的に、発現カセットは、５’から３’にかけて、重鎖のためのシストロンが後に続く第１のＰｈｏＡプロモータ（ＴＩＲ−Ｈ＋重鎖）及び第１のλｔ０終結因子、ならびに軽鎖のためのシストロンが後に続く第２のＰｈｏＡプロモータ（ＴＩＲ−Ｌ＋軽鎖）及び第２のλｔ０終結因子を含有する。ＴＩＲ−Ｌ及びＴＩＲ−Ｈの両方は、ＳＴＩＩシグナル配列またはその変異形の中に含有される。
【０２０７】
ｘＩＬ１３及びｘＩＬ４  ＩｇＧ４  ｈＡｂ発現ベクターについて、１，１及び２，２のＴＩＲの組み合わせを評価した。ｘＩＬ１７及びｘＩＬ３３  ＩｇＧ４  ｈＡｂ発現ベクターについて、ＴＩＲ２，２を評価した。第１の数は軽鎖のＴＩＲ強度を表し、第２の数は重鎖のＴＩＲ強度を表す。ｘＩＬ１３、ｘＩＬ４、ｘＩＬ１７、及びｘＩＬ３３  ＩｇＧ４  ｈＡｂに加えて、他のＩｇＧ１アイソタイプｈＡｂベクターを構築して試験した。
【０２０８】
シャペロン発現プラスミド構築
ｘＩＬ１３、ｘＩＬ４、ｘＩＬ１７、及びｘＩＬ３３  ｈＡｂの最高力価を得るための上記のベクターと組み合わせるシャペロン発現を決定するために、共発現させるプラスミドを提供した。シャペロン活性を有するペプチジルプロイルシス−トランスイソメラーゼであるＦｋｐＡタンパク質を含む、いくつかのシャペロンを試験した。そのために、ＦｋｐＡのＯＲＦを含有する適合性プラスミド（ｐＡＣＹＣ、Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を、ＥＰ１３５６  ０５２に記載されているように構築した（例えば、実施例９〜１０、特に段落［０１４３］を参照されたい）。
【０２０９】
現在のプロセスのためのこの作業を更に詳述すると、ＦｋｐＡ適合性ベクターのセットを、ＦｋｐＡ共発現のレベルを調節するように同様に産生した。ＦｋｐＡレベルの調節を、前述のシグナルペプチドの最適化によって達成した（上記のＳｉｍｍｏｎｓ  ａｎｄ  Ｙａｎｓｕｒａ，１９９６）。簡潔に述べると、ＦｋｐＡ  ＯＲＦの５’末端は、ＦｋｐＡシグナルペプチド（天然または変異形）、またはＳＴＩＩシグナルペプチドのいずれかを含有した。全てのＦｋｐＡ変異形遺伝子構築物は、ｔａｃＩＩプロモータの制御下にあった。
【０２１０】
次に、これらのプラスミドを上記のｈＡｂ発現プラスミドと株６６Ｆ８に同時に形質転換した。宿主株６６Ｆ８の遺伝子型は、Ｗ３１１０  ΔｆｈｕＡ  ΔｐｈｏＡ  ｉｌｖＧ２０９６（Ｖａｌｒ）Δｐｒｃ  ｓｐｒ４３Ｈ１  ΔｄｅｇＰ  ΔｍａｎＡ  ｌａｃＩＱ  ΔｏｍｐＴ  ΔｍｅｎＥである。
【０２１１】
ｘＩＬ１３  ｈＡｂについて、半抗体のＬＣ及びＨＣならびにＦｋｐＡをコードするＴＩＲ１，１ならびにＴＩＲ２，２プラスミドを構築し、６６Ｆ８を形質転換するために使用した。これらのプラスミド構築物において、ＦｋｐＡの発現は、ＬＣのＯＲＦの上流にあるｐｈｏＡプロモータによって制御された。ｐＢＲ３２２プラスミドは、典型的には、細胞あたり約３０コピーで維持され（Ｂｏｌｉｖａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２：９５−１１３，１９７７）、ｐＡＣＹＣプラスミドは、典型的には、細胞あたり約１５コピーで維持される（Ｃｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３４：１１４１−１１５６，１９７８）。理論に束縛されることを意図するものではないが、ＦｋｐＡがＡｂ発現プラスミドへと移動するときにコピー数が増加すると、作製されるＦｋｐＡの量が増加し得ると考えられる。
【０２１２】
オキシドレダクターゼプラスミド構築
ＦｋｐＡの共発現について説明した適合性プラスミド系と同様に、適合性プラスミドを利用して、既に記載したＦｋｐＡ  ＴＩＲ変異形のうちの１つを組み込むｈＡｂ発現プラスミドと組み合わせた種々の既知のオキシドレダクターゼをスクリーニングした。この作業は、ｐｘＩＬ１３．２．２．ＦｋｐＡｃ１３として特定されたＴＩＲ２，２プラスミドを用いて行った。加えて、適合性プラスミドを利用して、ｘＩＬ４及び他のＩｇＧ１  ｈＡｂと組み合わせたＦｋｐＡ及びオキシドレダクターゼをスクリーニングした。
【０２１３】
元々のオキシドレダクターゼ適合性プラスミドの構築は、ＥＰ  １３５６０５２号に記載されている通りのものであった（例えば、実施例９を参照されたい）。オキシドレダクターゼのスクリーニングは、ｈＡｂ発現プラスミドｘＩＬ１３．２．２．ＦｋｐＡｃ１３を用いた適合性プラスミドＪＪ２４７からの発現を含んだ。ｘＩＬ１３  ｈＡｂの例において、オキシドレダクターゼ発現は、１ｍＭのＩＰＴＧを用いて誘導するか、またはオキシドレダクターゼレベルを調節するために誘導しないままにするかのいずれかであった。
【０２１４】
また、ｈＡｂのＬＣ及びＨＣならびにシャペロンＦｋｐＡ、ＤｓｂＡ、及びＤｓｂＣをコードする単一プラスミドを構築して、６６Ｆ８を形質転換するために使用した。ｘＩＬ１３  ｈＡｂの例において、ＦｋｐＡの発現を駆動するために使用したプロモータが異なる、２つのＴＩＲ２，２単一プラスミドを構築した。単一プラスミドＭＤ１５７は、ＦｋｐＡ発現のためのｐｈｏＡプロモータを含有し、プラスミドＫＡ０１は、ｔａｃＩＩプロモータを含有した。異なるプロモータを利用することで、ＦｋｐＡ発現の更なる調節が可能となった。ｘＩＬ１７  ｈＡｂの例において、ＴＩＲ２，２単一プラスミドを構築したが（ＭＤ３４１）、これは、ＦｋｐＡ発現のためのｐｈｏＡプロモータを利用するものであった。全ての単一プラスミド条件において、ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣの発現は、多シストロン性の様式でｔａｃＩＩプロモータの制御下にあった。ｘＩＬ４  ｈＡｂの例では、以下に記載される、またＣＢ１として特定される、適合性シャペロンプラスミドＡＨ８１４５のＯＲＦを組み込むＴＩＲ２，２単一プラスミドを構築した。
【０２１５】
上記の単一プラスミド系に加えて、トリプルシャペロン適合性プラスミド系も、ＩｇＧ１アイソタイプ及びＩｇＧ４アイソタイプ両方のいくつかのｈＡｂを用いて評価した。適合性プラスミド系において、既に記載したＦｋｐＡ  ＴＩＲ変異形のうちの１つを多シストロン性ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣ適合性プラスミド（ＪＪ２４７）にクローニングし、ＡＨ８１４５として特定する。
【０２１６】
発酵プロセス
大規模生成は、本質的にはＥＰ１３５６０５２に記載されている通りのものであった（例えば、実施例４及び段落［００９５］〜［００９６］を参照されたい）。１０リットルの発酵の各々では、０．５ｍＬの凍結保存培養物（１０〜１５％のＤＭＳＯを含む）を解凍して使用し、０．５ｍｌのテトラサイクリン溶液（５ｍｇ／ｍｌ）ならびに／または２ｍＬのカナマイシン溶液（５ｍｇ／ｍＬ）及び２．５ｍｌの１Ｍリン酸ナトリウム溶液を補充した５００ｍｌのＳｏｙ  ＬＢ培地を含む２Ｌの振盪フラスコに播種した。この種培養物を振盪しながら３０℃で約１６時間成長させた後、これを使用して１０リットルの発酵器に播種した。
【０２１７】
発酵器は、当初、１．１ｇのグルコース、１００ｍｌの１Ｍ硫酸マグネシウム、１０ｍｌの微量元素溶液（１リットルの最終体積中、１００ｍｌの塩酸、２７ｇの塩化第二鉄、８ｇの硫酸亜鉛七水和物、７ｇの塩化コバルト六水和物、７ｇのモリブデン酸ナトリウム二水和物、８ｇの硫酸銅五水和物、２ｇのホウ酸、５ｇの硫酸マンガン一水和物）、２０ｍｌのテトラサイクリン溶液（エタノール中５ｍｇ／ｍｌ）または２５０ｍＬのアンピリシン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）のいずれか、１袋のＨＣＤ塩（３７．５ｇの硫酸アンモニウム、１９．５ｇの第二リン酸カリウム、９．７５ｇの第一リン酸ナトリウム二水和物、７．５ｇのクエン酸ナトリウム二水和物、１１．３ｇの第一リン酸カリウム）、２００ｇのＢＬ４  Ｓｏｙ（ダイズタンパク質加水分解物）、及び１００グラムの酵母エキスを含む約７．０リットルの培地を含んだ。発酵を、まず２０毎分標準リットル（ｓｌｐｍ）の気流を用いて３０℃で行い、７．０±０．２のｐＨで制御した（しかし、場合によっては、時折この範囲を超える偏位が生じた）。発酵器の背圧を１バールゲージに維持し、撹拌速度をまずは６５０ｒｐｍに設定した。以下の実施例２で詳細に考察するように、撹拌速度も変化させて、発酵器における酸素移動速度を操作し、その結果、細胞呼吸速度を制御することができる。加えて、以下の実施例３で詳細に考察するように、成長相及び生成相中の温度を調整して、産物収率を最大化することができる。
【０２１８】
発酵器に振盪フラスコからの細胞を含有する培地を播種した後、濃縮グルコース溶液を発酵器に供給するためにコンピュータに基づくアルゴリズムを使用して、培養物を発酵器中で高細胞密度に成長させた。水酸化アンモニウム（５８％溶液）及び硫酸（２４％溶液）も、ｐＨを制御するために必要に応じて発酵器に供給した。場合によっては、発泡を制御するためにＬ−６１消泡剤も添加した。
【０２１９】
培養物が約４０ＯＤ５５０の細胞密度に到達したとき、追加の１００ｍｌの１Ｍ硫酸マグネシウムを発酵器に添加した。加えて、濃縮塩フィード（１２５０ｍｌの最終体積中、１２．５ｇの硫酸アンモニウム、３２．５ｇの第二リン酸カリウム、１６．２５ｇの第一リン酸ナトリウム二水和物、２．５ｇのクエン酸ナトリウム二水和物、１８．７５ｇの第一リン酸カリウム、１０ｍｌの２．７％塩化第二鉄、及び１０ｍｌの微量元素）を発酵器に添加し、培養物が約２０ＯＤ５５０に到達したときに２．５ｍｌ／分の速度で開始し、約１２５０ｍｌが発酵器に添加されるまで継続した。発酵を典型的には７０〜８０時間継続した。
【０２２０】
電気泳動、免疫ブロット、及びＨＰＬＣ分析のための試料調製
非還元性可溶性試料調製は、ＥＰ１３５６０５２に記載されているものと同様である（例えば、実施例４、特に段落［００９８］を参照されたい）。具体的には、非還元性可溶性試料を次のように調製した。発酵過程で採取した１ｍＬの凍結した全培養液試料を室温で解凍した。１００μＬの解凍した全培養液を５００μＬの抽出緩衝液に添加した。（抽出緩衝液：１０ｍＭのトリス、ｐＨ６．８、５ｍＭのＥＤＴＡ、新たに添加した０．２ｍｇ／ｍＬの鶏卵リゾチーム、及び新たに調製したヨード酢酸、最終濃度５〜１０ｍＭ）。抽出緩衝液を加えた全培養液試料を、氷上で５〜１０分間インキュベートした後、２×１０のパルスで超音波処理し、続いて４℃及び１４，０００ｒｐｍで１５〜２０分間遠心分離した。上清を可溶性画分として除去した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫ブロットによる分析では、可溶性画分を、還元剤なしで、２倍のＮｏｖｅｘ  Ｔｒｉｃｉｎｅ試料緩衝液中に１：１０で希釈した。１０μＬのこの調製物を、１０ウェルのＮｏｖｅｘ  １０％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＮｕＰａｇｅゲルに充填し、ＭＥＳ緩衝液を用いて１５０Ｖで電気泳動させた。その後、このゲルを使用して、免疫ブロットまたはクマシーブルーによる染色を行った。
【０２２１】
可溶性画分の試料に対して、ＬＣ−カッパ／ＲＰアッセイによる分析を行った。このアッセイは、第１のカラムがＩｇＧ成分を含有するカッパ軽鎖を捕捉する親和性カラムであり、第２のカラムが逆相カラムである、２次元ＨＰＬＣアッセイである。一体型ＨＰＬＣワークステーションをデュアルカラムモードに設定した。溶媒貯蔵部は、溶媒１Ａ、親和性添加緩衝液、溶媒１Ｂ、親和性溶出緩衝液、０．２％のＴＦＡ水、溶媒２Ａ、逆相水性緩衝液、０．１％のＴＦＡ水、溶媒２Ｂ、逆相有機溶出緩衝液、０．１％のＴＦＡの８０％のアセトニトリルであった。第１のカラムは、ＰＯＲＯＳ（登録商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＬＣカッパ親和性カラム（２．１×３０ｍｍ）であり、これは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入した。親和性カラムが関与する全ての手順は周囲温度で行った。
【０２２２】
第２のカラムは、ＰＯＲＯＳ（登録商標）Ｒ２  ２０μｍ逆相カラム（２．１×３０ｍｍ）であり、これは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入した。逆相カラム温度を８０℃に維持した。
【０２２３】
親和性カラムを添加緩衝液中で平衡化し、試料を２ｍｌ／分の流量で充填した。素通り画分は廃棄を対象とするものであった。試料を充填した後、親和性カラムを添加緩衝液（３ｍｌ）で洗浄して、非特異的に結合した成分を還元した。次に、バルブの切り替えによって、親和性カラムを逆相カラムに接続し、２ｍｌ／分の流量で溶出緩衝液（５ｍｌ）を用いて溶出し、親和性捕捉成分を逆相カラムに移動させた。この移動ステップの間、一体型ＵＶ検出器を親和性カラムの後、かつ逆相カラムの前に位置付け、それによって、逆相カラムへの充填物となる親和性カラムの溶出を監視した。逆相カラムからの溶出及び接続解除の後、親和性カラムを水（２ｍｌ）で洗浄し、続いて添加緩衝液（４ｍｌ）を用いて再度平衡化した。
【０２２４】
充填した逆相カラムを０．１％の水性ＴＦＡ（１．１ｍｌ）で洗浄した。流量を２ｍｌ／分に設定し、急勾配（０．２５分）を３５％の溶媒２Ｂ（０．１％のＴＦＡ／８０％のアセトニトリル）に、続いて浅い勾配を３分にわたって５０％の溶媒２Ｂに行った。溶出は、０．５分で１００％の溶媒２Ｂへの勾配によって完了し、１．５分間保持した。次に、逆相カラムを０．０５分で最初の状態に戻し、２分間保持して、再度平衡化した。カラム溶出を２８０及び２１４ｎｍで監視した。逆相カラムからの分離に基づいて統合ピーク面積と標準的な既知濃度のものとを比較することで、定量化を行った。
【０２２５】
発酵プロセス中に生成されたＬＣ及びＨＣの可溶量及び全量も定量化した。全ＲＰ−ＨＰＬＣ定量化を行うために、発酵培養液試料を、１００ｍＭのＤＬ−ジチオスレイトール（Ｓｉｇｍａカタログ番号４３８１６）の６ＭのグアニジンＨＣＬ、３６０ｍＭのＴＲＩＳ、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．６）で２００ｍＭで１０倍に希釈した。試料をボルテックスし、６０℃で２０分間インキュベートし、１３，０００ｒｐｍで１５分間、４℃で遠心分離した。可溶性画分を、０．２２ｕｍのフィルタを使用して濾過した後、ＨＰＬＣに注入した。使用したＨＰＬＣシステムは、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １２９０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙシステムであった。試料を、Ｚｏｒｂａｘ  ３００ＳＢ−Ｃ３  Ｒａｐｉｄ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ（４．６×１５０ｍｍ、３．５ミクロン）分析カラム（カタログ番号８６３９７３−９０９）に注入した。移動相Ａは、０．１％のトリフルオロ酢酸（Ｔｈｅｒｍｏカタログ番号２８９０１）のＳＱＨ２Ｏからなり、移動相Ｂは、０．０８％のトリフルオロ酢酸のＨＰＬＣグレードのアセトニトリル（Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌカタログ番号ＡＨ０１５−４）からなった。
【０２２６】
全可溶性ＲＰ−ＨＰＬＣ定量化を行うために、発酵培養液試料に、Ｐｒｏ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＤＰＳ−２０を用いて１０秒間の均質化（１０，０００ｒｐｍ）及び超音波処理（８８％の振幅）の両方を４回行った。次に、試料を、４℃及び１４，０００ｒｐｍで１５〜２０分間遠心分離した。上清を可溶性画分として除去し、上記のようにＲＰ−ＨＰＬＣで変性させ処理した。
【０２２７】
結果
ｈＡｂ力価に与えるＦｋｐＡ発現の影響
図１Ａに示すように、ｘＩＬ１３  ｈＡｂ  ＴＩＲ１，１ベクターから軽鎖及び重鎖サブユニットを生成すると、総量２．９ｇ／Ｌ及び１．２ｇ／Ｌの軽鎖及び重鎖がそれぞれ生成された。ＴＩＲ２，２については、生成された軽鎖及び重鎖の総量は、それぞれ、６．４ｇ／Ｌ及び４．１ｇ／Ｌであった。
【０２２８】
しかしながら、総サブユニット生成量は、顕著な可溶性サブユニット蓄積をもたらすものではなかった。ｘＩＬ１３  ＴＩＲ１，１  ｈＡｂプラスミドを使用した際の、生成された軽鎖及び重鎖の総可溶量は、それぞれ、０．２ｇ／Ｌ、及び０．１ｇ／Ｌ未満であった（図１Ｂ）。ＴＩＲ２，２  ｈＡｂについては、生成された軽鎖及び重鎖の総可溶量は、それぞれ、０．３ｇ／Ｌ及び０．３ｇ／Ｌであった（図１Ｃ）。ＴＩＲ１，１発酵のために生成した組み立てたｘＩＬ１３  ｈＡｂの力価はわずか０．１ｇ／Ｌであり、ＴＩＲ２，２発酵については、力価は０．２ｇ／Ｌ未満であった（図２）。これらの結果は、ｈＡｂ産物の折り畳み及び／または組み立ては顕著に非効率的であることを示唆する。したがって、シャペロンの共発現を有するＴＩＲ１，１及びＴＩＲ２，２プラスミドを使用することが力価に与える影響を評価する更なる作業を行った。
【０２２９】
シャペロンタンパク質のいくつかのクラスは、タンパク質の折り畳み及び組み立てを促進することが知られている（図３Ａ〜Ｂ）。目的の特定のシャペロンは、ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼ及びシャペロンとして機能することが知られているＦｋｐＡ、ならびにオキシドレダクターゼとして機能することが知られているＤｓｂＡ及びＤｓｂＣを含む。ＦｋｐＡ、ＤｓｂＡ、及びＤｓｂＣの発現がｈＡｂ生成に影響を与えたかどうかを試験するために実験を開始した。
【０２３０】
具体的には、ｈＡｂのＨＣ及びＬＣのＯＲＦをコードする別個のプラスミド（適合性プラスミド系）または同じプラスミド（単一プラスミド系）を使用してＦｋｐＡを発現させることの影響を検査した（図４Ａ〜Ｂ）。単一発現プラスミドの使用により、プラスミド保持を確実にするために複数の抗生物質または選択圧の他の手段を使用する必要性が排除される。ｘＩＬ１３  ｈＡｂに使用した単一プラスミド系において、ＦｋｐＡ発現を駆動するプロモータを、ＩＰＴＧ誘導性ｔａｃＩＩプロモータからｐｈｏＡプロモータに変更した。このため、培養におけるリン酸塩枯渇により、ＨＣ、ＬＣ、及びＦｋｐＡの発現がもたらされる。
【０２３１】
ＦｋｐＡシャペロン共発現のレベルの増加は、可溶性モノマー重鎖蓄積の量の増加、加えてＩｇＧ１アイソタイプｈＡｂ（ｘＶＥＧＦ）に対する組み立てられたｈＡｂの増加と相関した（図５Ａ）。この実験では、既に記載したＦｋｐＡ発現変異形のセットを、１ｍＭのＩＰＴＧの誘導でスクリーニングした。ＦｋｐＡ共発現がない場合、ｘＶＥＧＦ  ｈＡｂの力価は０．２ｇ／Ｌであり、ＦｋｐＡ共発現（ＦｋｐＡ（ｗｔ））が最高レベルである条件においては、ｈＡｂ力価は約０．４ｇ／Ｌであった（図５Ｂ）。
【０２３２】
ｘＩＬ１３  ｈＡｂの生成について、適合性プラスミド系（図４Ａに示すように、一方のプラスミドからのｘＩＬ１３のＨＣ及びＬＣの発現、ならびに別のプラスミドからのＦｋｐＡの発現）を、ＴＩＲ１，１またはＴＩＲ２，２抗体発現ベクターを使用して試験した。ＦｋｐＡの共発現を駆動するために１ｍＭのＩＰＴＧを用いて誘導した適合性プラスミド系については、ＴＩＲ１，１プラスミドに対する力価は０．２ｇ／Ｌであり、ＴＩＲ２，２プラスミドに対する力価は０．４ｇ／Ｌであった（図６Ａ、列３及び４）。これにより、ＦｋｐＡが内因レベルであるＴＩＲ１，１及びＴＩＲ２，２条件と比較して、力価が約２倍増加した（図６Ａ、列１及び２）。図６Ｂは、ミリ吸光単位（ｍＡｕ）での超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）及びウェスタンブロットによって測定した、内因性発現と比較した場合の適合性の系において誘導されたＦｋｐＡ発現の量を示す。
【０２３３】
図４Ｂに示すＦｋｐＡ発現及びｈＡｂ生成のための単一プラスミド系も試験した。ｘＩＬ１３  ｈＡｂについては、単一プラスミドＴＩＲ１，１及びＴＩＲ２，２に対する力価は、それぞれ、０．４ｇ／Ｌ及び０．７ｇ／Ｌであった（図６Ａ）。これは、適合性プラスミド系と比べて約２倍の力価の増加を表す。単一プラスミド系におけるＦｋｐＡの発現レベルも、誘導性の適合性プラスミド系よりも約２倍高かった（図６Ｂ）。ＦｋｐＡ発現のレベルの増加は、両方のＴＩＲ条件における可溶性モノマー重鎖蓄積の量の増加と相関した。
【０２３４】
第３のｈＡｂ（ｘＩＬ４  ＩｇＧ４）を、適合性プラスミド系からの誘導性ＦｋｐＡ共発現を用いてＴＩＲ１，１条件及びＴＩＲ２，２条件の両方によって試験した。この実験では、ＦｋｐＡ（ｗｔ）共発現は、両方のＴＩＲ条件において可溶性モノマー重鎖の量を増加させた（図７Ａ）が、生成されたｈＡｂの力価を増加させなかった（図７Ｂ）。
【０２３５】
第４のｈＡｂ（ｘＶＥＧＦＣ  ＩｇＧ１）を、適合性プラスミド系から誘導したＦｋｐＡ共発現を用いて試験した。この実験では、ＦｋｐＡ（ｗｔ）共発現は、可溶性モノマー重鎖の量を増加させ、力価を０．５ｇ／Ｌから０．８ｇ／Ｌに増加させた（図８Ａ）。クマシー染色によって測定したＦｋｐＡ発現の増加（図８Ｂ）は、可溶性モノマーＨＣ鎖蓄積の増加と相関した（図８Ｃ）。要約すると、これらの結果は、ＦｋｐＡ発現が可溶性モノマー重鎖の蓄積を向上させるが、組み立てられたｈＡｂの力価に与える影響は変化することを示唆する。このことは、更なる最適化が望ましいことを示す。
【０２３６】
ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣ発現がｈＡｂ力価に与える影響
ｘＩＬ１３  ｈＡｂ生成を、オキシドレダクターゼＤｓｂＡ及びＤｓｂＣの発現のために上記のｐｘＩＬ１３．２．２．ＦｋｐＡｃ１３（単一プラスミド）を適合性プラスミドと組み合わせることによって更に最適化した（図９）。ｐｘＩＬ１３．２．２．ＦｋｐＡｃ１３を伴うＤｓｂＡ及びＤｓｂＣの両方を発現しているプラスミド（ＪＪ２４７）は、ｈＡｂ力価を増加させた。図１０は、ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣのＩＰＴＧ誘導の存在下及び不在下での、経時的に生成されたｘＩＬ１３  ｈＡｂの力価を示す。ＪＪ２４７を伴うｐｘＩＬ１３．２．２．ＦｋｐＡｃ１３についての最高力価は、発酵開始から５２時間で達成された。この時点では、ＩＰＴＧのない条件（非誘導条件）で、ｘＩＬ１３力価は１．２±０．２ｇ／Ｌであり、ＩＰＴＧのある条件（誘導条件）では、ｘＩＬ１３力価は１．０±０．２ｇ／Ｌであった（図１０）。試験した両条件では、５２時間〜７２時間における力価の低下が顕著であったが、これは実施例２に記載する発酵プロセス中の酸素取り込み速度（ＯＵＲ）の低下及び浸透圧の上昇に起因するものであった。
【０２３７】
ＤｓｂＡ、ＤｓｂＣ、及びＦｋｐＡ（ＡＨ８１４５）を発現している適合性の系も、ｘＩＬ４  ＴＩＲ１，１及びＴＩＲ２，２  Ａｂ発現プラスミドを用いて評価した（図１１Ａ）。３つ全てのシャペロンの非誘導性共発現により、ＴＩＲ１，１及びＴＩＲ２，２力価がそれぞれ、０．８ｇ／Ｌ及び１．２ｇ／Ｌとなった（図１２、レーン５及び６）。これは、ＴＩＲ２，２条件では、力価が、前述のＦｋｐＡ適合性ＴＩＲ２，２条件と比較して、約６倍増加したことを表した（図１２、列３及び４）。
【０２３８】
適合性の非誘導性ＡＨ８１４５プラスミド系を、別のｈＡｂを用いて更に評価した。ＴＩＲ２，２系ベクターを使用してｘＶＥＧＦＣ  ＩｇＧ１  ｈＡｂを生成することで、非誘導性の適合性ＡＨ８１４５条件により、ＦｋｐＡ共発現のみの場合と比較して、力価が０．８ｇ／Ｌから１．０ｇ／Ｌに増加した（図１３）。ＴＩＲ１，１条件及びＴＩＲ２，２条件の両方の第５のｈＡｂ（ｘＶＥＧＦＡ  ＩｇＧ１）を、ＡＨ８１４５適合性プラスミドを用いて試験した。シャペロン共発現がない場合、ＴＩＲ１，１条件及びＴＩＲ２，２条件の両方での力価は約０．９ｇ／Ｌで類似していた（図１４、列１及び３）。非誘導性ＡＨ８１４５条件の適合性プラスミドの場合、ＴＩＲ１，１及びＴＩＲ２，２プラスミドの力価は、それぞれ、１．２ｇ／Ｌ及び１．７ｇ／Ｌであった（図１４、列２及び４）。
【０２３９】
ＡＨ８１４５のシャペロンＯＲＦを組み込むｘＩＬ４  ＴＩＲ２，２単一プラスミドの創出物を産生し（ＣＢ１）、これを図１１Ｂに示す。ＩＰＴＧを添加しないＣＢ１プラスミドは、適合性プラスミド系で観察された力価よりもわずかに高い力価を生成した（図１５）。この比較において報告されたｈＡｂ力価は、実施例２に記載のように最適化撹拌方針を利用した発酵から産生されたことに留意されたい。ウェスタンブロットによると、３つ全てのシャペロンのレベルはＣＢ１の場合にわずかに高かった（図１５）。理論に束縛されることを意図するものではないが、単一プラスミド系により、プラスミドコピー数がより高くなり、このため収率がより高くなり得る。
【０２４０】
ｘＩＬ１３単一プラスミド系ＭＤ１５７を、非誘導性の適合性ｐｘＩＬ１３．２．２．ＦｋｐＡｃ１３及びＪＪ２４７適合性プラスミド系と比較した（図１６）。ＭＤ１５７単一プラスミド条件は、適合性の系における１．９±０．０４ｇ／Ｌと比較して、２．１±０．３ｇ／Ｌの力価を生成した（図１７）。この比較において報告された力価は、実施例２に記載のように最適化撹拌戦略を利用した発酵から産生されたことに留意されたい。
【０２４１】
総合すると、これらの結果は、ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣとＦｋｐＡとの共発現により、これらの硬化を確認するための複数のｈＡｂ構築物を使用した、組み立てられたｈＡｂの生成が増加することを示す。
【０２４２】
実施例２：酸素取り込みが半抗体生成に与える影響
上記の結果は、ｈＡｂ  ＨＣ及びＬＣと、ＦｋｐＡ、ＤｓｂＡ、及びＤｓｂＣとの共発現によって達成されるｈＡｂ生成の改善を示す。しかしながら、このように生成が向上しても、力価は、プラトーであるか、または更には生成から５２時間後の時点では減少したことが分かった。したがって、ｈＡｂ生成を更に最適化するための追加の実験を開始した。
【０２４３】
既に記載したように、発酵を、まず２０毎分標準リットル（ｓｌｐｍ）の気流を用いて３０℃で行い、７．０±０．２のｐＨに制御した。発酵器の背圧を１バールゲージに維持し、撹拌速度をまずは６５０ｒｐｍに設定した。背圧の追加のバールゲージにより、２００％の初期の溶解酸素濃度（ｄＯ２）がもたらされた。ｄＯ２シグナルが典型的には産物培養から約２時間で開始レベルの２％未満に低下した後、濃縮グルコース溶液を供給し、グルコースが非限定的栄養素となるように、発酵過程にわたって継続して供給した。
【０２４４】
１２時間の時点で、培養物中の細胞密度は、ｄＯ２濃度をゼロパーセントに、またはゼロパーセント付近に維持するのに十分なものとなった。理論に束縛されることを意図するものではないが、酸素濃度が制限される場合、酸素移動速度（ＯＴＲ）は、細胞の酸素取り込み速度（ＯＵＲ）または代謝率と等しいと考えられる。ＯＴＲの操作は、撹拌速度を調整することによって促進され、培養物のＯＵＲに直接的な影響を与えた。質量分析計を使用することで、発酵からのオフガスの組成物を監視し、発酵における酸素取り込み及び二酸化炭素発生速度の算出が可能となった。
【０２４５】
図１８に示すように、上記のＪＪ２４７プラスミド系を有するｐｘＩＬ１３．２．２．ＦｋｐＡｃ１３において、誘導性及び非誘導性ＴＩＲ２，２培養物は１２時間の時点で４．２５ｍｍｏｌ／Ｌ／分のピークＯＵＲを有し、この後、ｄＯ２は限定されるようになった。これらの培養物を６５０ｒｐｍの一定速度での撹拌下で成長させた。図１９は、これらの培養の経時的な浸透圧を示す。総合すると、図１８〜１９は、５０時間後に、細胞培養物のＯＵＲが急激に低下し、浸透圧が上昇したことを示す。
【０２４６】
図２０は、これらの培養物において経時的に生成されたｘＩＬ１３  ｈＡｂ力価を示す。５２時間で１．２ｇ／Ｌ±０．２ｇ／Ｌであった力価が、７２時間で０．７±０．０４ｇ／Ｌまで低下したことが観察された。同様に、誘導性の条件において、５２時間で１．０±０．２ｇ／Ｌであった力価が、７２時間で０．５±０．０５ｇ／Ｌまで低下したことが観察された。興味深いことに、生成におけるこの低下は、これらの培養物中でのＯＵＲ低下及び浸透圧上昇と同時に生じた。
【０２４７】
力価の低下を軽減し、浸透圧の上昇を排除するために、２６時間での撹拌移行を非誘導性ＴＩＲ２，２条件で評価した。撹拌速度を、６５０ｒｐｍから標的のＯＵＲ設定値を達成するレベルに移行させた。約１．５、１．７５、２．０、及び２．５ｍｍｏｌ／Ｌ／分の４つの異なるＯＵＲ標的設定値を試験した。ＯＵＲ設定値が約１．５〜２．０ｍｍｏｌ／Ｌ／分である撹拌移行が、ＯＵＲの低下（図２１）及び浸透圧の上昇（図２２）が排除された。
【０２４８】
重要なことに、撹拌移行条件の全てにおいて、力価は、５４時間の時点で非移行条件におけるものよりも高かった（図２３）。約２．５ｍｍｏｌ／Ｌ／分の条件において、ＯＵＲは約６０時間で低下し（図２１）、浸透圧は７２時間で１２００ｍＯｓｍのピークに上昇した（図２２）が排除された。７２時間で、約２．５ｍｍｏｌ／Ｌ／分の条件の力価（０．７ｇ／Ｌ）は、非移行条件（０．６±０．１ｇ／Ｌ）と類似したレベルまで低下した。約２．０ｍｍｏｌ／Ｌ／分の条件での平均力価は、試験した４つの条件の中で最高（２．４±０．６ｇ／Ｌ）であったが、力価がわずかに変動し、ＯＵＲプロファイルがわずかに低下したとみなされた。約１．５ｍｍｏｌ／Ｌ／分の条件では、両方とも、２．１±０．３ｇ／Ｌの平均力価を再現したが、ここでも、発酵後期においてＯＵＲプロファイルがわずかに変動したとみなされた。約１．７５ｍｍｏｌ／Ｌ／分の条件は、両方とも、再現可能な力価（１．８±０．２ｇ／Ｌ）及び一貫したＯＵＲ傾向を有したため、これを好ましい設定値として選択した。
【０２４９】
これらの結果は、培養物の撹拌速度を移行させることで、観察されたＯＵＲの低下及び浸透圧の上昇が軽減されることを示す。また、重要なことは、これらの撹拌移行により、ｈＡｂ生成力価が、特に後期の生成時点で向上することがである。
【０２５０】
実施例３：温度が半抗体生成に与える影響
これまでの実施例はｈＡｂ生成の顕著な増大を示すが、生成プロセスを更により最適化するための追加の試験を開始した。このため、ｘＩＬ１３  ｈＡｂ生成では、実施例１で説明した高性能の単一プラスミド系及び実施例２で説明した約１．７５ｍｍｏｌ／Ｌ／分のＯＵＲ設定値を開始点として使用した。このプロセスを、以下に記載のように、顕著に優れた生成収率を得るために更により最適化した。
【０２５１】
本開示の好ましい実施形態の発酵プロセスは、成長相及び生成相の２つの異なる区分に分けられても良い。成長相では、大部分の栄養素が過剰であり、培養密度は急速に増加する。生成相では、リン酸塩が制限されるようになり、成長が停止し、目的の産物の発現が開始する。温度がｈＡｂ生成に与える影響を、これらの相の各々について試験した。
【０２５２】
温度実験と組み合わせて、第２の宿主を評価した。これらの実験では、ＭＤ１５７プラスミドを６７Ａ６生成宿主に形質転換した。６７Ａ６株の遺伝子型は、Ｗ３１１０  ΔｆｈｕＡ  ΔｐｈｏＡ  ｉｌｖＧ＋  Δｐｒｃ  ｓｐｒ４３Ｈ１  ΔｄｅｇＰ  ΔｍａｎＡ  ｌａｃＩＱ  ΔｏｍｐＴ  ΔｍｅｎＥ７４２  ｄｅｇＰＳ２１０Ａである。
【０２５３】
６７Ａ６株は、ｄｅｇＰ遺伝子のプロテアーゼ欠損対立遺伝子（ｈｔｒＡ及びｐｔｄとしても知られる）のノックインを含有し、これは、ＤｅｇＰをコードする。ＤｅｇＰ（プロテアーゼＤｏとしても知られる）は、高温での生存に必要なペリプラズムセリンプロテアーゼである。加えて、ＤｅｇＰは、分子シャペロンとしても作用する。アラニンのセリンへの置換は、ＤｅｇＰのタンパク質分解活性を排除するが、そのシャペロン機能には影響しない（Ｓｐｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，９７：３３９−３４７，１９９９）。
【０２５４】
温度最適化を、ｘＩＬ１３  ＴＩＲ２，２単一プラスミド系について成長相（Ｔｇ）及び生成相（Ｔｐ）の両方に行った。図２４は、３０℃または２８℃の一定Ｔｇ／Ｔｐで成長させた培養物の成長を示す。２８℃の一定Ｔｇ／Ｔｐにより、３０℃の一定Ｔｇ／Ｔｐと比較して、成長率が停滞した。図２５は、これらの温度で成長させた培養物のＯＵＲを示す。成長率と同様に、ＯＵＲは、３０℃と比較して、培養物を２８℃の一定Ｔｇ／Ｔｐで成長させる場合に停滞する。
【０２５５】
図２６に示すように、リン酸塩は、３０℃の一定Ｔｇ／Ｔｐを使用する場合に２２±２時間で枯渇した。Ｔｇ／Ｔｐを２８℃に移行させると、培養物の成長速度は上記のように抑制され、リン酸塩の枯渇は２６±２時間に移行した。
【０２５６】
図２７は、これらの培養物のｘＩＬ１３  ｈＡｂ生成を示す。各条件では、産物発現は、リン酸塩枯渇が生じた時点で開始した。一定の２８℃のＴｇ／Ｔｐ条件により、一定の３０℃のＴｇ／Ｔｐ条件での１．３±０．２ｇ／Ｌと比較して、２．５±０．２ｇ／Ｌの最終力価が達成された。
【０２５７】
生成相における時間量を増加させるために、温度移行方針を試験した。この実験では、成長相の温度を３０℃に設定し、２０時間の時点で温度を２８℃に移行させた。０〜２０時間の間の成長（図２８）、リン酸塩（図２９）、及びＯＵＲ（図３０）プロファイルは、Ｔｇ３０／Ｔｐ２８℃移行及び一定のＴｇ／Ｔｐ３０℃条件に対して同様であった。
【０２５８】
図３１に示されるように、Ｔｇ３０／Ｔｐ２８℃条件下で生成された３．１ｇ／Ｌの最終力価と一定のＴｇ／Ｔｐ２８℃条件下で生成された２．５ｇ／Ｌの最終力価とを比較すると、産物誘導時に温度を２８℃に移行させることにより、力価が更に０．６ｇ／Ｌ増加したことが示される。これらの結果は、より高温で培養物を成長させ、生成時に培養温度を低下させることにより、産物形成が顕著に増加し得ることを示す。
【０２５９】
一部要因実験計画（ＤｏＥ）を行って、６７Ａ６宿主株を利用するｘＩＬ１３  ｈＡｂのための最適な動作条件を決定した。ＤｏＥは、３つの動作パラメータ及びＦｋｐＡのレベルに焦点を当てた。
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【０２６０】
表３−１に示すように、動作パラメータは、Ｔｇ及びＴｐ、ならびにｐＨを含んだ。パターンは、特定のパラメータに対する動作範囲を指し、（−）は低値パラメータを指し、（＋）は、高値パラメータを指し、０００１及び０００２は中心点パラメータを指す。Ｔｇは３０〜３４℃の範囲であり、Ｔｐは２５〜２８℃の範囲であり、ｐＨは６．７〜７．０の範囲であった。生成されるＦｋｐＡの量を、使用したプロモータによって調節した。高レベルのＦｋｐＡがＭＤ１５７上のｐｈｏＡプロモータから産生され、低レベルのＦｋｐＡはＫＡ０１上の非誘導性ｔａｃプロモータから産生された。１０の実験を実行することで、一部要因分析を行った。
【０２６１】
図３２に示すように、これらの因子は、生成されたｘＩＬ１３  ｈＡｂの力価に顕著な影響を与えた。表３−１に記載するＤｏＥ実験に使用した条件によって生成されたｈＡｂの力価は、約１．５〜約４．５ｇ／Ｌの範囲であった。
【０２６２】
ｘＩＬ４単一プラスミド（ＣＢ１）を、ｘＩＬ１３のＤｏＥから特定した最適な発酵条件（Ｔｇ３４℃、Ｔｐ２８℃、ｐＨ７．０）で試験した。しかしながら、ＣＢ１条件においては、ＩＰＴＧ誘導のないｔａｃＩＩプロモータを使用してＦｋｐＡ発現を駆動した。ｘＩＬ１４  ｈＡｂ力価を、Ｔｇ／Ｔｐを３０℃で一定にして保持し、ｐＨを７．０に維持した発酵条件と比較した。ｘＩＬ４  ｈＡｂ力価は、ＩＰＴＧを添加しないこの新たなプロセス条件で、１．３ｇ／Ｌから３．１ｇ／Ｌに増加した（図３３）。
【０２６３】
一部要因ＤｏＥを行って、ｘＩＬ１７  ｈＡｂのための最適な動作条件を決定した。ＭＤ３４１単一プラスミドを、ｘＩＬ１３  ｈＡｂ単一プラスミド（ＭＤ１５７）のＬＣ及びＨＣのＯＲＦをｘＩＬ１７のＬＣ及びＨＣのＯＲＦで置き換えることによって構築した。抗体断片及びシャペロンの発現に使用したプロモータは、ｘＩＬ１３（ＭＤ１５７）プラスミドと同一であった。ＤｏＥは、３つの動作パラメータに焦点を当てた。
0006770966.tif 000007
【０２６４】
表３−２に示すように、動作パラメータは、Ｔｇ及びＴｐ、ならびにｐＨを含んだ。Ｔｇは３０〜３４℃の範囲であり、Ｔｐは２５〜３０℃の範囲であり、ｐＨは６．７〜７．３の範囲であった。図３４は、最も顕著な力価蓄積が、Ｔｐが２５℃である条件において達成されたことを示す。
【０２６５】
図３５は、まずシャペロンタンパク質の共発現を最適化し、次に処理ステップ（例えば、撹拌速度、Ｔｇ、及びＴｐ）を最適化することがｘＩＬ１３  ｈＡｂ力価の生成に与える影響を示す。例示的な実施形態において、分子の最適化（例えば、シャペロンタンパク質発現及びベクターの特徴）は、力価を約１６倍増加させた。この生成レベルは、プロセス（例えば、撹拌速度、Ｔｇ、及びＴｐ）の進行を介して、更に約３．５倍向上した。総合すると、これらの結果は、生成及び頑健性の顕著な増大が、シャペロン発現、ベクター系、撹拌速度、ｐＨ、及び成長／生成温度を含む可変要素を最適化することによって達成され得ることを示す。最終的に、Ｔｇが３４℃であり、Ｔｐが２５℃であり、ｐＨが６．７であり、かつＦｋｐＡのレベルがｐｈｏＡプロモータによって生成された条件では、ｘＩＬ１３  ｈＡｂ力価が最も高くなったと判定された。
【０２６６】
実施例４：宿主株が半抗体生成に与える影響
これまでの実施例はｈＡｂ生成の顕著な増大を示すが、宿主株６６Ｆ８と６７Ａ６との間のｈＡｂ生成における潜在的な差異を特性評価するための追加の試験を開始した。このため、ｈＡｂ生成では、実施例１で説明した高性能の単一プラスミド系、実施例２で説明したＯＵＲ移行、及び実施例３で説明した温度移行を、６６Ｆ８及び６７Ａ６の２つの大腸菌宿主株において評価した。６６Ｆ８株の遺伝子型は、Ｗ３１１０  ΔｆｈｕＡ  ΔｐｈｏＡ  ｉｌｖＧ＋  Δｐｒｃ  ｓｐｒ４３Ｈ１  ΔｄｅｇＰ  ΔｍａｎＡ  ｌａｃＩＱ  ΔｏｍｐＴ  ΔｍｅｎＥ７４２である。６７Ａ６株の遺伝子型は、Ｗ３１１０  ΔｆｈｕＡ  ΔｐｈｏＡ  ｉｌｖＧ＋  Δｐｒｃ  ｓｐｒ４３Ｈ１  ΔｄｅｇＰ  ΔｍａｎＡ  ｌａｃＩＱ  ΔｏｍｐＴ  ΔｍｅｎＥ７４２  ｄｅｇＰＳ２１０Ａである。
【０２６７】
ｘＩＬ１３  ｈＡｂを、６６Ｆ８宿主株及び６７Ａ６宿主株の両方において発現させた。発酵は、上記の温度及び撹拌速度の移行を用いる条件下で行った。６７Ａ６株の使用により、６６Ｆ８株（図３６Ｂ）と比較して、可溶性ｘＩＬ１３  ｈＡｂ力価が増加し（図３６Ａ）、かつＬＣ及びＨＣの両方の総サブユニット蓄積が増加した。
【０２６８】
ｘＩＬ４  ｈＡｂも、６６Ｆ８宿主株及び６７Ａ６宿主株の両方において発現させた。ｘＩＬ４  ｈＡｂ発酵を３０℃の一定温度で行うと、約１．５ｇ／Ｌの類似した力価が両方の株から得られた（図３７Ａ）。しかしながら、Ｔｇを３４℃から２５℃のＴｐに低下させた発酵条件下では、６７Ａ６株は平均３．０ｇ／Ｌを生成し、６６Ｆ８株は平均２．０ｇ／Ｌを生成した（図３７Ｂ）。加えて、６７Ａ６の発酵におけるＬＣ及びＨＣの両方の総サブユニット蓄積は、温度移行を用いる条件下での６６Ｆ８の発酵よりも大きかった（図３８Ａ及び図３８Ｂ）。
【０２６９】
したがって、ｘＩＬ１３  ｈＡｂ及びｘＩＬ４  ｈＡｂの両方は、６７Ａ６宿主株によって提供される力価利益、及び成長温度と比較して減少した生成温度の２つの例である。理論に束縛されることを意図するものではないが、組み換えタンパク質の蓄積は、ＤｅｇＰを欠く宿主細胞においてはプラトーであると考えられ、突然変異ＤｅｇＰＳ２１０Ａを有する宿主株においては、組み換えタンパク質は、発酵が終了するまで蓄積すると考えられた。
【０２７０】
実施例５：最適化した発現ベクター及び最適化した培養条件を使用するｘＩＬ３３の生成
ｘＩＬ３３  ｈＡｂ（ＭＤ５０１プラスミド）を、ｘＩＬ１３  ｈＡｂ単一プラスミド（ＭＤ１５７）のＬＣ及びＨＣのためのＯＲＦをｘＩＬ３３のＬＣ及びＨＣのＯＲＦで置き換えることによって構築した。抗体断片及びシャペロンの発現に使用したプロモータは、ｘＩＬ１３（ＭＤ１５７）プラスミドと同一であった（図３９）。単一発酵を、ｘＩＬ３３のＬＣ及びＨＣ（ＭＤ４８１）のＯＲＦのみを含有するｘＩＬ３３  ｈＡｂ発現ベクターを用いて行った。ＭＤ４８１プラスミドは、分子シャペロンＤｓｂＡ、ＤｓｂＣ、またはＦｋｐＡのＯＲＦを含有しなかった。発酵を、３０℃の一定温度、７．０のｐＨ、及び６５０ｒｐｍの撹拌速度で行った（図４０の規範事例）。次に、単一発酵を、ｘＩＬ３３のＬＣ及びＨＣのＯＲＦ、ならびに分子シャペロンＤｓｂＡ、ＤｓｂＣ、またはＦｋｐＡのＯＲＦを含有するｘＩＬ３３  ｈＡｂ発現ベクター（ＭＤ５０１）を用いて行った。ＭＤ４８１の発酵に対する条件と同じ動作条件をＭＤ５０１の発酵に使用した。単一プラスミド（ＭＤ５０１）の使用により、規範事例と比較して、ｘＩＬ３３  ｈＡｂ力価が約１０倍増加した。
【０２７１】
一部要因ＤｏＥを行って、ｘＩＬ３３  ｈＡｂ  ＭＤ５０１単一プラスミドの最適な培養条件を決定した。ＤｏＥは、６７Ａ６宿主における２つの中心点複製を含む１０の実験を伴う一部要因における４つのパラメータに焦点を当てた（表５−１）。撹拌速度及び温度移行は、１５０のＯＤ５５０で行った。
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【０２７２】
表５−１に示すように、Ｔｇは３０〜３４℃の範囲であり、Ｔｐは２５〜３０℃の範囲であり、ｐＨは６．７〜７．３の範囲であり、ＯＵＲ設定値は１．９〜２．８ｍｍｏｌＯ２／Ｌ／分の範囲であった。図４１は、中心点条件が力価に対する最も顕著な利益を提供し、達成された最高力価は４．０±０．０５ｇ／Ｌであり、これにより、最終的に規範事例（図４０の規範事例）の動作条件と比較して、ｈＡｂ力価が更に増加することを示す。最良の培養条件は、７．０のｐＨ、３２℃のＴｇ、２７．５℃のＴｐ（２時間の傾斜）、及び約２．３ｍｍｏｌ／Ｌ分の標的ＯＵＲ（２時間の撹拌速度勾配）を含んだ。
【０２７３】
実施例６：ＦｋｐＡ最適化
ＦｋｐＡの発現レベルを最適化するために、２つの追加のＦｋｐＡ  ＴＩＲ変異形を、ｘＩＬ１３、ｘＩＬ１７、及びｘＩＬ３３  ｈＡｂのための単一プラスミド（ＭＤ１５７、ＭＤ３４１、及びＭＤ５０１プラスミド）において試験した。ＦｋｐＡ  ＴＩＲ変異形を、内因性ＦｋｐＡシグナル配列との比較において説明したように特性評価した（図４２）。ＭＤ１５７、ＭＤ３４１、及びＭＤ５０１プラスミドは、３つのＴＩＲ強度と相関したＦｋｐＡｃ１３のＯＲＦを組み込んだ（図４３）。ＭＤ１５７、ＭＤ３４１、及びＭＤ５０１において、単一プラスミドＦｋｐＡｃ１３  ＯＲＦをＦｋｐＡ  ＴＩＲ１またはＴＩＲ２  ＯＲＦで置き換え、各ｈＡｂについて、既に特定した最適化した発酵条件において試験した。
【０２７４】
ＦｋｐＡ発現のレベルの増加は、ｘＩＬ１３  ｈＡｂ蓄積の増加と相関した（図４４）。ＦｋｐＡ  ＴＩＲ１及びＴＩＲ２条件により、それぞれ、０．５及び２．５ｇ／Ｌの最終ＦｋｐＡ量、ならびに１．５及び２．５ｇ／ＬのｘＩＬ１３  ｈＡｂ力価をもたらした。ＴＩＲ３条件により、４ｇ／ＬのＦｋｐＡ及び３．８ｇ／ＬのｈＡｂが生成された。ＦｋｐＡ発現のレベルも、生成相ＯＵＲプロファイルに影響した。全体として、ＦｋｐＡの滴定により、生成されたｈＡｂの量を約３倍増加させた。
【０２７５】
ｘＩＬ３３  ｈＡｂ発酵において、最も低い力価蓄積プロファイルは、実行終了時の力価が２．４ｇ／ＬであるＦｋｐＡ  ＴＩＲ１条件と相関した（図４５）。ｘＩＬ３３  ＴＩＲ２及びＴＩＲ３条件により、ＴＩＲ１条件と比較して、ｘＩＬ３３  ｈＡｂ力価の約２倍の増加した（図４５）。データは、ＦｋｐＡのレベルの増加がｈＡｂ生成に有益であることを示唆する。
【０２７６】
ｘＩＬ１７  ｈＡｂ発酵において、最も低い力価蓄積プロファイルは、実行終了時の力価が２．０ｇ／ＬであるＦｋｐＡ  ＴＩＲ１条件と相関した（図４６）。
【０２７７】
ｘＩＬ１３  ｈＡｂについて既に記載した最良の条件を使用して、２つの追加のＦｋｐＡ  ＴＩＲ変異形を試験した（ＴＩＲ２．３及びＴＩＲ６）。ＴＩＲ２．３力価プロファイルは、既に試験したＴＩＲ２条件よりも高いことを示したが、依然として対照ＴＩＲ３条件より低かった（図４７Ａ）。ＴＩＲ６条件は、ＴＩＲ２．３条件と同様の力価蓄積プロファイルをもたらしたが、ここでもＴＩＲ３対照より低かった。ウェスタンブロット分析によって決定したＦｋｐＡ蓄積は、ＴＩＲ変異形にわたるＦｋｐＡの滴定を示した（図４７Ｂ）。データは、ｈＡｂ生成と相関して最適な量のＦｋｐＡが発現することを示唆する。これは、ｘＩＬ１３  ｈＡｂ（ＭＤ１５７単一プラスミド）の場合、ＴＩＲ３となる。
【０２７８】
実施例７：酸素移動速度（ＯＴＲ）条件の影響
実施例３で特定したｘＩＬ１３  ｈＡｂの最良の条件を第２のＯＴＲ方針を用いてまた試験した。実験（Ｎ＝３）において、容器背圧（ＢＰ）及び散布速度を、それぞれ、１．０から０．３バールに、また２０から１３ＳＬＰＭに減少させた。背圧及び散布速度の減少に起因するＯＴＲの損失を回復するために、成長相及び生成相の撹拌速度を、６５０から８８０ｒｐｍに、また４７５から６５０ｒｐｍに増加させた。容器背圧、散布速度、及び撹拌速度の異なる組み合わせを使用して、前述の実施例で述べたものと同様のＯＴＲ条件を達成することができる。
【０２７９】
発酵を、発酵プロセス全体で一定のＢＰを用いて行った。改変したＯＴＲ条件では、背圧を０．３バール（Ｎ＝３）に維持し、対照条件では、背圧を１．０バール（Ｎ＝５）に維持した。発酵を、発酵プロセス全体で一定の気流を用いて行った。改変したＯＴＲ条件では、気流を１３ＳＬＰＭ（Ｎ＝３）に維持し、対照条件では、気流を２０ＳＬＰＭ（Ｎ＝５）に維持した。発酵では、改変したＯＴＲ及び対照条件の両方において、１５０ＯＤ５５０での撹拌移行が実施された。改変したＯＴＲ条件では、初期撹拌速度を８８０ｒｐｍに設定して６５０ｒｐｍに移行させ、対照条件では、初期撹拌速度を６５０ｒｐｍに設定して４７５ｒｐｍに移行させた。
撹拌速度の増加は、散布及び背圧の低下に起因するＯＴＲの低下を補償した。ＯＴＲ条件の改変により、対照条件と同様のピーク及び生成相ＯＵＲ（図４８Ａ）ならびに成長プロファイル（図４８Ｂ）がもたらされた。ＯＴＲ条件の改変により、対照条件と同様の蓄積プロファイル及びピーク力価（４．１±０．４ｇ／Ｌ）がもたらされた（図４９）。
【０２８０】
実施例８：ＩｍｍＴＡＣ生成の最適化
免疫動員性抗癌モノクローナルＴ細胞受容体（ＩｍｍＴＡＣ）は、様々な抗癌治療にとって潜在的に有用である本開示の２鎖ポリペプチドである（例えば、Ｏａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｊａｋｏｂｓｅｎ，ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ２：ｅ２２８９１，２０１３、及びＬｉｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１８：９０８−７，２０１２を参照されたい）。多特異性抗体と同様に、治療的使用のためにＩｍｍＴＡＣを生成することは、アルファ及びベータＴＣＲ鎖、ならびにそれに融合される任意のポリペプチド（例えば、ｓｃＦｖ等の抗ＣＤ３エフェクター）等の成分を産業規模で生成する能力を必要とする。この要求を満たすために、発現ベクター及び処理ステップが最適化され、標準的な方法と比べて顕著に増加した生成をもたらした。重要なことに、上述の実施例のように、ＦｋｐＡの発現、プロセス変化、ＴＩＲ最適化、及びＤｓｂＣ発現が、複数のＩｍｍＴＡＣの生成においてこれらの増加をもたらしたことが分かった。
【０２８１】
物質及び方法
ＩｍｍＴＡＣ発現ベクター（図５０Ａ）について、１，１、１，２、及び２，３のＴＩＲの組み合わせを評価した。ＩｍｍＴＡＣ生成に関して本明細書で使用されるとき、第１の数はアルファ鎖のＴＩＲ強度を表し、第２の数はベータ鎖のＴＩＲ強度を表す（図５０Ｂ）。
【０２８２】
プラスミドを遺伝子型Ｗ３１１０  ΔｆｈｕＡ  ΔｐｈｏＡ  ｉｌｖＧ２０９６  （Ｖａｌｒ）  Δｐｒｃ  ｓｐｒ４３Ｈ１  ΔｄｅｇＰ  ΔｍａｎＡ  ｌａｃＩＱΔｏｍｐＴ  ΔｍｅｎＥ  ｄｅｇｐＳ２１０Ａを有する宿主株６７Ａ６に形質転換した。
【０２８３】
最初の発酵は、一定の３０℃及びｐＨ７．０で行い、２４時間で４時間にわたる撹拌勾配を開始し、おおよそ１．７５ｍｍｏｌ／Ｌ／分のＯＵＲを標的とした。
【０２８４】
ＦｋｐＡのＯＲＦを含有する適合性プラスミド（ｐＡＣＹＣ、Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を、上記のように、また欧州特許第ＥＰ１３５６０５２  Ｂ１に記載されているように、構築した。ＦｋｐＡ遺伝子構築物は、ｔａｃＩＩプロモータの制御下にあった。
【０２８５】
元々のオキシドレダクターゼ適合性プラスミドの構築は、欧州特許第ＥＰ１３５６０５２  Ｂ１号に記載されている通りのものであった（例えば、実施例９を参照されたい）。オキシドレダクターゼのスクリーニングは、ＩｍｍＴＡＣ  ＴＩＲ１，１  ＦｋｐＡ単一プラスミドを用いた適合性プラスミドＪＪ１４１（ＤｓｂＣ）、ＪＪ１４２（ＤｓｂＡ）、及びＪＪ２４７（ＤｓｂＡ／Ｃ）からの発現を含んだ。オキシドレダクターゼの発現を駆動するために使用されたｔａｃプロモータは誘導されず、プロモータからの漏出性発現に依存した。
【０２８６】
ＩｍｍＴＡＣ力価をアッセイするために、可溶性画分の試料に対してタンパク質Ｌ／ＲＰアッセイによる分析を行った。このアッセイは、第１のカラムがＩｇＧ成分を含有する可変軽鎖を捕捉する親和性カラムであり、第２のカラムが逆相カラムである、２次元ＨＰＬＣアッセイである。一体型ＨＰＬＣワークステーションをデュアルカラムモードに設定した。溶媒貯蔵部は、溶媒１Ａ、親和性添加緩衝液、ＰＢＳ、溶媒１Ｂ、親和性溶出緩衝液、０．２％のＴＦＡ水、溶媒２Ａ、逆相水性緩衝液、０．１％のＴＦＡ水、溶媒２Ｂ、逆相有機溶出緩衝液、０．０８％のＴＦＡのアセトニトリルであった。親和性カラムは、インハウス充填カラムであり、これは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＣＡ，ＵＳＡ）から購入したＰＯＲＯＳ（登録商標）ＡＬ活性樹脂にカップリングした、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した精製タンパク質Ｌを利用した。親和性カラムが関与する全ての手順は周囲温度で行った。
【０２８７】
第２のカラムは、ＨＡＬＯ  Ｃ４タンパク質逆相カラム（２．１×２０ｍｍ）であり、これは、Ｍａｃ−Ｍｏｄ（ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。逆相カラム温度を８０℃に維持した。
【０２８８】
親和性カラムを添加緩衝液中で平衡化し、試料を２ｍｌ／分の流量で充填した。素通り画分は廃棄を対象とするものであった。試料を充填した後、親和性カラムを添加緩衝液で洗浄して、非特異的に結合した成分を還元した。次に、バルブの切り替えによって、親和性カラムを逆相カラムに接続し、２ｍｌ／分の流量で溶出緩衝液を用いて溶出し、親和性捕捉成分を逆相カラムに移動させた。この移動ステップの間、ＵＶ検出器を親和性カラムの後、かつ逆相カラムの前に位置付け、それによって、親和性カラムの溶出を監視した（これは、逆相カラムへの充填物となった）。
【０２８９】
溶出の後、続けて、添加緩衝液を用いて親和性カラムを再度平衡化した。
【０２９０】
充填した逆相カラムを０．１％の水性ＴＦＡで洗浄した。流量を２ｍｌ／分に設定し、溶媒２Ｂを５％〜３０％へと急に勾配させ（０．０８％のＴＦＡのＡＣＮ）、続いて３４％へと緩やかに勾配させた。溶出は、溶媒２Ｂを１００％に勾配させて再生成することによって完了した。次に、逆相カラムを最初の状態に戻し、再度平衡化した。カラム溶出を２８０及び２１４ｎｍで監視した。逆相カラムからの分離に基づいて統合ピーク面積と標準的な既知濃度のものとを比較することで、定量化を行った。このアッセイの定量限界（ＬＯＱ）は、０．０１２５ｇ／Ｌである。
【０２９１】
結果
最初の発酵は、ＴＩＲ１，１構築物を評価した（図５１）。条件は以下の通りであった。３０℃、ｐＨ７．０、及びおよそ１．７５ｍｍｏｌＯ２／Ｌ／分のＯＵＲ。発酵により、力価蓄積が１０ｍｇ／Ｌとなった。全アルファ及びベータサブユニット蓄積は、それぞれ５５０ｍｇ／Ｌ及び８００ｍｇ／Ｌであった（図５２）。
【０２９２】
ＩｍｍＴＡＣ力価に与えるシャペロン発現の影響を決定するために、プラスミドを、上記のベクターを使用してシャペロンの共発現に対して提供した。シャペロン活性を有するペプチジルプロイルシス−トランスイソメラーゼであるＦｋｐＡタンパク質を含む、いくつかの既知のシャペロンを、ＩｍｍＴＡＣ発現と組み合わせて試験した。
【０２９３】
次に、ＦｋｐＡ適合性プラスミドを上記のＴＩＲ１，１  ＩｍｍＴＡＣ１発現プラスミド（図５３）で株６７Ａ６に形質転換した。発酵条件は、図５１に示される上述の最初の発酵において使用されるものと同一であった。ＦｋｐＡ  ｔａｃプロモータを、培養が２００ＯＤ５５０に達したとき、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。抗アルファ及び抗ベータ可溶性ウェスタンブロットは、アルファ及びベータ可溶性サブユニットの両方の蓄積（可溶性が低下したブロット、図５４Ａ）、加えて組み立てられたＩｍｍＴＡＣの増加を示した。力価分析もまた、シャペロンがない条件と比較して、２０ｍｇ／Ｌの最終力価と共に、組み立てられたＩｍｍＴＡＣの２倍の増加を示した（図５４Ｂ）。
【０２９４】
発酵プロセス条件を、後続のＩｍｍＴＡＣの実験において変更した（図５５）。全ての後続の発酵では、撹拌勾配は、およそ２．５ｍｍｏｌＯ２／Ｌ／分の特定のＯＵＲ設定値を標的とした。加えて、温度移行を２４時間で行い、成長温度を３０℃から２５℃の生成温度まで低下させた。
【０２９５】
改変プロセス条件を、上記のＦｋｐＡの適合性の系を使用して試験し、２００ＯＤ５５０での１ｍＭのＩＰＴＧの添加を含んだ。改変プロセス条件の使用により、４０ｍｇ／Ｌの最終力価を有するこれまでのプロセス条件と比較して、力価が約２倍増加した（図５７）。
【０２９６】
ＩｍｍＴＡＣ  ＴＩＲ１，１、ＴＩＲ１，２、及びＴＩＲ２，３について、ＩｍｍＴＡＣのアルファ及びベータ鎖ならびにＦｋｐＡをコードするプラスミドを構築し、６７Ａ６を形質転換するために使用した（図５８）。これらのプラスミド構築物において、ＦｋｐＡ  ＯＲＦはアルファＯＲＦ及びｐｈｏＡプロモータ制御転写の上流であった。ｐＢＲ３２２プラスミドは、典型的には、細胞あたり約３０コピーで維持され（Ｂｏｌｉｖａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２：９５−１１３，１９７７）、ｐＡＣＹＣプラスミドは、典型的には、細胞あたり約１５コピーで維持される（Ｃｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３４：１１４１−１１５６，１９７８）。理論に束縛されることを意図するものではないが、ＦｋｐＡがＩｍｍＴＡＣ発現プラスミドへと移動するときのコピー数が増加すると、作製されるＦｋｐＡの量が増加し得ると考えられる。
【０２９７】
ＦｋｐＡ  ＯＲＦを組み込む３つのＩｍｍＴＡＣ  ＴＩＲ変異形単一プラスミドにより、力価が既に記載したＴＩＲ１，１適合性ＦｋｐＡの系よりも高くなった。ＴＩＲ１，２及びＴＩＲ２，３の条件により、力価は各々およそ５０ｍｇ／Ｌとなる（図５９Ａ）一方、ＴＩＲ１，１の条件により、力価は６５ｍｇ／Ｌとなった（図５９Ａ）。ＴＩＲ２，３の条件の全アルファ及びベータサブユニット蓄積は、それぞれ２．５ｇ／Ｌ及び５．５ｇ／Ｌであった（図５９Ｂ）。ＴＩＲ１，１の条件において、全アルファ及びベータサブユニット蓄積は、それぞれ１ｇ／Ｌ及び２．５ｇ／Ｌであった。ＴＩＲ１，２の条件において、アルファ及びベータサブユニット蓄積は、それぞれおよそ０．８ｇ／Ｌ及び３．２ｇ／Ｌであった（図５９Ｂ）。
【０２９８】
可溶性ＦｋｐＡ発現（ウェスタンブロットによってアッセイされた）についてＴＩＲ１，１単一プラスミドとＴＩＲ１，１適合性プラスミド系との比較して、単一プラスミド系により、生成されたＦｋｐＡの量が増加したことが示された（図６０Ａ）。可溶性ＦｋｐＡの増加により、これまでの適合性プラスミド系と比較して、力価が更に増加し、６５ｍｇ／Ｌの最終力価を達成した（図６０Ｂ）。
【０２９９】
ＦｋｐＡの共発現について説明した適合性プラスミド系と同様に、適合性プラスミドを利用して、既に記載したＦｋｐＡ  ＯＲＦを組み込むＴＩＲ１，１  ＩｍｍＴＡＣ１と組み合わせた種々の既知のオキシドレダクターゼをスクリーニングした（図６１）。ＤｓｂＡ単独及びＤｓｂＣと組み合わせたＤｓｂＡの共発現により、これまでのＦｋｐＡのみの条件と比較して、２０ｍｇ／ｍｌの力価の減少が同様にもたらされた。しかしながら、ＤｓｂＣ単独の共発現により、力価が８０ｍｇ／Ｌとなり、これは、組み立てられたＩｍｍＴＡＣ生成における１５〜２０ｍｇ／Ｌの増加に対応した（図６２）。ＤｓｂＣの共発現を有するＴＩＲ１，１単一プラスミドにおける集合した力価の増加は、これまでのＦｋｐＡ単一ＴＩＲ２，３の条件において見られる増加したサブユニット蓄積が、個々のサブユニットの折り畳み及び組み立てに更なる利益を提供し得、力価を更に増加させ得るという仮説を導いた。ＴＩＲ２，３  ＦｋｐＡ単一プラスミドを、ＤｓｂＣの適合性の系を用いて試験し（Ｎ＝４）、平均力価が１１０ｍｇ／Ｌとなった（図６３）。
【０３００】
重要なことに、アルファ及びベータサブユニットＴＩＲの最適化と、シャペロンＦｋｐＡ及びＤｓｂＣの共発現、ならびに上記の改善されたプロセス条件とを組み合わせたところ（図５５）、ＩｍｍＴＡＣ１力価が１０倍増加した（図６４）。ＩｍｍＴＡＣ１生成に対する最適化のステップは、ＦｋｐＡの共発現、プロセス変化（増加したＯＵＲ、より塩基性のｐＨ、温度移行）、ＦｋｐＡ及びＩｍｍＴＡＣ１を有する単一プラスミド系、漏出性ＤｓｂＣ発現、及びＴＩＲ強度の改善を含んだ。
【０３０１】
上述の最適化は、ＩｍｍＴＡＣ１を用いて評価した。第２の別個のＩｍｍＴＡＣ、ＩｍｍＴＡＣ２は、同じ最適化を用いて試験した。図６５Ａ（アルファ鎖ブロット）及び図６５Ｂ（ベータ鎖ブロット）に示すように、同じＩｍｍＴＡＣ  ＴＩＲ及びシャペロン条件は、組み立てられたＩｍｍＴＡＣ２に最大の利益を提供する。
【０３０２】
総合すると、これらの結果は、ＦｋｐＡとＤｓｂＣとの共発現、及び重要なプロセス改善により、これらの効果を確認するための複数のＩｍｍＴＡＣ構築物を使用した、組み立てられたＩｍｍＴＡＣの生成が増加することを示す。
配列
全てのポリペプチド配列は、別途記載のない限り、Ｎ末端からＣ末端へと表される。
全てのポリヌクレオチド配列は、別途記載のない限り、５’から３’へと表される。
ＦｋｐＡ  ＴＩＲ１
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ＦｋｐＡ  ＴＩＲ２
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ＦｋｐＡ  ＴＩＲ３  （ｃ１３）
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ＦｋｐＡシグナルペプチド
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８Ａ】
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【図４８Ｂ】
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【図４９】
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【図５０Ａ】
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【図５０Ｂ】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６Ａ】
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【図５６Ｂ】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９Ａ】
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【図５９Ｂ】
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【図６０Ａ】
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【図６０Ｂ】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５Ａ】
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【図６５Ｂ】
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【配列表】
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