(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非アルコール性脂肪肝炎モデルマウスを製造するための方法であって、下記工程（１）及び（２）を含む方法
（１）メラノコルチン４型受容体の発現を抑制したマウスに、高脂肪食を摂取させる工程、
（２）前記高脂肪食を４週間摂取させたマウスに、四塩化炭素を単回投与する工程。
【請求項２】
非アルコール性脂肪肝炎モデルマウスを製造するための方法であって、下記工程（１）及び（２）を含む方法
（１）メラノコルチン４型受容体の発現を抑制したマウスに、高脂肪食を摂取させる工程、
（２）前記高脂肪食を少なくとも１５日間かつ４週間以下の期間で摂取させたマウスに、０．１ｍＬ／ｋｇを超え、かつ０．４ｍＬ／ｋｇ以下となる量の四塩化炭素を単回投与する工程。
【請求項３】
非アルコール性脂肪肝炎を抑制する活性を有する化合物をスクリーニングするための方法であって、下記工程（１）〜（６）を含む方法
（１）メラノコルチン４型受容体の発現を抑制したマウスに、高脂肪食を摂取させる工程、
（２）前記高脂肪食を４週間摂取させたマウスに、四塩化炭素を単回投与する工程、
（３）前記四塩化炭素を投与したマウスに、被験物質を接触させる工程、
（４）前記被験物質を接触させたマウスにおいて、非アルコール性脂肪肝炎の程度を検出する工程、
（５）工程（２）において前記四塩化炭素を投与したマウスに、前記被験物質を接触させずに、非アルコール性脂肪肝炎の程度を検出する工程、
（６）工程（４）及び工程（５）において検出した非アルコール性脂肪肝炎の程度を比較し、工程（４）において検出した非アルコール性脂肪肝炎の程度が、工程（５）において検出した非アルコール性脂肪肝炎の程度よりも低い場合に、前記被験物質は非アルコール性脂肪肝炎を抑制する活性を有する化合物であると判定する工程。
【請求項４】
非アルコール性脂肪肝炎を抑制する活性を有する化合物をスクリーニングするための方法であって、下記工程（１）〜（６）を含む方法
（１）メラノコルチン４型受容体の発現を抑制したマウスに、高脂肪食を摂取させる工程、
（２）前記高脂肪食を少なくとも１５日間かつ４週間以下の期間で摂取させたマウスに、０．１ｍＬ／ｋｇを超え、かつ０．４ｍＬ／ｋｇ以下となる量の四塩化炭素を単回投与する工程、
（３）前記四塩化炭素を投与したマウスに、被験物質を接触させる工程、
（４）前記被験物質を接触させたマウスにおいて、非アルコール性脂肪肝炎の程度を検出する工程、
（５）工程（２）において前記四塩化炭素を投与したマウスに、前記被験物質を接触させずに、非アルコール性脂肪肝炎の程度を検出する工程、
（６）工程（４）及び工程（５）において検出した非アルコール性脂肪肝炎の程度を比較し、工程（４）において検出した非アルコール性脂肪肝炎の程度が、工程（５）において検出した非アルコール性脂肪肝炎の程度よりも低い場合に、前記被験物質は非アルコール性脂肪肝炎を抑制する活性を有する化合物であると判定する工程。
【請求項５】
前記四塩化炭素の単回投与量が０．０５〜０．４ｍＬ／ｋｇである、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項６】
前記高脂肪食が、脂肪をエネルギー比率にて４０％以上含む組成物である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非アルコール性脂肪肝炎モデル動物の製造方法に関する。また本発明は、当該製造方法を利用する、非アルコール性脂肪肝炎を抑制する活性を有する化合物をスクリーニングするための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、飲酒習慣がないにも関わらず、メタボリックシンドロームに合併して発症し、肝硬変症や肝細胞癌にしばしば進行する、非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ、以下「ＮＡＳＨ」とも称する）が注目されている。日本においてもＮＡＳＨ症例は１００万人を超えると推定されており、また欧米では既に、肝硬変症や肝細胞癌の大部分はＮＡＳＨに由来しているのが現状である。
【０００３】
このように、その患者数は近年急速に増加しており、さらに肝硬変症や肝細胞癌になるリスクも高いため、ＮＡＳＨは、有効な治療・予防方法の開発が強く望まれているアンメット・メディカルニーズの極めて高い疾患である。また、現状では、ＮＡＳＨの確定診断や重症度判定には肝生検が必須であることから、侵襲性の低い診断方法の開発も切望されている。しかしながら、ＮＡＳＨの詳細な病態は未だ不明な点が多いこともあり、有効な治療方法、予防方法及び診断方法のいずれも開発されていないのが現状である。
【０００４】
また通常、このような治療方法等の開発には、病態モデルが有用であり、ＮＡＳＨに関しても、多々そのモデル動物についての報告がされている。例えば、マウス又はラットに、高脂肪食を摂取させ、四塩化炭素（ＣＣｌ４）等の肝障害剤を投与することにより脂肪肝と肝障害とを惹起した例が、ＮＡＳＨモデル動物として報告されている（特許文献１、非特許文献１〜６）。
【０００５】
しかしながら、このようにして調製されたマウス等においては、ヒトＮＡＳＨの特徴である後述のｈＣＬＳが認められない等、ヒトＮＡＳＨの表現型を反映しているとは評価し難いものであった。さらに、これらのマウス等においては、脂肪肝等の病変の発症に至るまでに、四塩化炭素等を複数回投与する必要があるため、当該マウスを用いた薬効評価や病態発症メカニズムを解析する上で、当該薬剤による直接的な影響との区別がつきにくく、このような解析を行う上での障害となることが著しく懸念されている。また、病変の発症に至るまでに必要な高脂肪食の負荷期間は６〜１２週間であり、モデル動物の調製に多大な時間を要するものであった。
【０００６】
そこで、かかる状況を鑑みた本発明者らによって、中枢性のエネルギー代謝調節に働くメラノコルチン４型受容体（ＭＣ４Ｒ：ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ  ４  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を欠損するＭＣ４Ｒノックアウトマウスに、高脂肪食を負荷させることにより、脂肪肝からヒトＮＡＳＨに特徴的な肝組織像を示すＮＡＳＨモデル動物が確立されている（非特許文献７）。特に、本発明者らは、このマウスを用いて、肝線維化の起点となる、ＮＡＳＨ特徴的な組織学的構造（ｈｅｐａｔｉｃ  ｃｒｏｗｎ−ｌｉｋｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ：ｈＣＬＳ）を同定することに成功している。さらに、ｈＣＬＳが実際にヒトＮＡＳＨにおいて認められ、またその病変とも著しく相関するものであることも明らかにしている（非特許文献８）。このように、高脂肪食を負荷させたＭＣ４Ｒノックアウトマウスは、上述のマウス等と比較して、ヒトＮＡＳＨの病態に忠実である。しかしながら、その一方で、病変の発症に２０週をも要するため、ＮＡＳＨを対象とする薬効評価やメカニズム解析等を迅速かつ効率良く行うという点において、依然妨げとなっていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１４−２０９８４９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｋｕｂｏｔａ  Ｎ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２０１３年７月、４０巻、７号、４２２〜４３０ページ
【非特許文献２】Ｗａｎｇ  Ｘ．ら、Ｌｉｐｉｄｓ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｄｉｓ．、２０１１年１２月１４日、１０：２３４
【非特許文献３】Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ  Ｓ．ら、Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ．、２０１３年４月、５８巻、４号、７７８〜７８４ページ
【非特許文献４】Ｃｈｈｅｄａ  ＴＫ．ら、ＢＭＣ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、２０１４年５月１０日、１４：８９
【非特許文献５】Ｓｏｎｇ  ＨＹ．ら、Ｊ  Ｔｒａｄｉｔ  Ｃｈｉｎ  Ｍｅｄ．、２０１１年１２月、３１巻、４号、３２７〜３３３ページ
【非特許文献６】Ｚｈａｎｇ  Ｑ．ら、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、２００５年３月７日、１１巻、９号、１３９２〜１３９５ページ
【非特許文献７】Ｉｔｏｈ  Ｍ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．、２０１１年１１月、１７９巻、５号、２４５４〜２４６３ページ
【非特許文献８】Ｉｔｏｈ  Ｍ．ら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．、２０１３年１２月１１日、８（１２）：ｅ８２１６３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、ヒトの非アルコール性脂肪肝炎の表現型を忠実に反映したモデル動物を、短期間にて製造することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、メラノコルチン４型受容体を欠損するＭＣ４Ｒノックアウトマウスに、高脂肪食を少なくとも１５日間摂取させた上で、四塩化炭素を単回投与することによって、ヒトＮＡＳＨに特徴的な肝組織像を示すＮＡＳＨモデル動物を作製できることを見出した。しかも、ヒトＮＡＳＨの表現型を示すように至るまでには僅か５週間程度しか要さないため、２０週間程度を要する従前の方法に比べて、飛躍的にＮＡＳＨモデル動物の調製時間を短くすることに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、ＮＡＳＨモデル動物の製造方法に関し、また当該製造方法を利用する、ＮＡＳＨを抑制する活性を有する化合物をスクリーニングするための方法に関するものであり、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
＜１＞  非アルコール性脂肪肝炎モデルマウスを製造するための方法であって、下記工程（１）及び（２）を含む方法
（１）メラノコルチン４型受容体の発現を抑制したマウスに、高脂肪食を摂取させる工程、
（２）前記高脂肪食を少なくとも１５日間摂取させたマウスに、四塩化炭素を単回投与する工程。
＜２＞  非アルコール性脂肪肝炎を抑制する活性を有する化合物をスクリーニングするための方法であって、下記工程（１）〜（６）を含む方法
（１）メラノコルチン４型受容体の発現を抑制したマウスに、高脂肪食を摂取させる工程、
（２）前記高脂肪食を少なくとも１５日間摂取させたマウスに、四塩化炭素を単回投与する工程、
（３）前記四塩化炭素を投与したマウスに、被験物質を接触させる工程、
（４）前記被験物質を接触させたマウスにおいて、非アルコール性脂肪肝炎の程度を検出する工程、
（５）工程（２）において前記四塩化炭素を投与したマウスに、前記被験物質を接触させずに、非アルコール性脂肪肝炎の程度を検出する工程、
（６）工程（４）及び工程（５）において検出した非アルコール性脂肪肝炎の程度を比較し、工程（４）において検出した非アルコール性脂肪肝炎の程度が、工程（５）において検出した非アルコール性脂肪肝炎の程度よりも低い場合に、前記被験物質は非アルコール性脂肪肝炎を抑制する活性を有する化合物であると判定する工程。
＜３＞  前記高脂肪食が、脂肪をエネルギー比率にて４０％以上含む組成物である、＜１＞又は＜２＞に記載の方法。
＜４＞  前記四塩化炭素の単回投与量が０．０５〜０．４ｍＬ／ｋｇである、＜１＞〜＜３＞のいずれか一に記載の方法。
＜５＞  メラノコルチン４型受容体の発現が抑制されており、高脂肪食を少なくとも１５日間摂取させ、かつ四塩化炭素を単回投与することにより、非アルコール性脂肪肝炎が誘導されたマウス。
＜６＞  前記高脂肪食が、脂肪をエネルギー比率にて４０％以上含む組成物である、＜５＞に記載のマウス。
＜７＞  前記四塩化炭素の単回投与量が０．０５〜０．４ｍＬ／ｋｇである、＜５＞又は＜６＞に記載のマウス。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ヒトの非アルコール性脂肪肝炎の表現型を忠実に反映したモデル動物を、短期間にて製造することが可能となる。さらに、ＮＡＳＨを抑制する活性を有する化合物を、迅速かつ効率良くスクリーニングすることが可能となる。特に、本発明の方法においては、従前の方法とは異なり、ＮＡＳＨの表現型を発症・維持するために、四塩化炭素を複数回投与し続けることを要しないため、この薬剤による直接的な影響を受けることなく、前記スクリーニング等を行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】高脂肪食を４週間摂取させたＭＣ４Ｒノックアウトマウスに、０．１ｍＬ／ｋｇの四塩化炭素を単回投与し、その投与２日後の肝臓をＨＥ染色し、顕微鏡にて観察した結果を示す写真である。図中、右側のパネルは、当該四塩化炭素投与２日後の結果を示し、左側のパネルは、四塩化炭素の代わりに溶媒を投与して２日後の結果を示す。また、図中「ＣＶ」は中心静脈を示し、「ＰＶ」は門脈を示し、矢印で指し示している風船様の構造は、バルーニング変性している肝細胞である。
【図２】高脂肪食を４週間摂取させたＭＣ４Ｒノックアウトマウスに、０．１ｍＬ／ｋｇの四塩化炭素を単回投与し、その投与４日後の肝臓をＴＵＮＥＬ染色し、顕微鏡にて観察した結果を示す写真である。図中、右側のパネルは、当該四塩化炭素投与４日後の結果を示し、左側のパネルは、四塩化炭素の代わりに溶媒を投与して４日後の結果を示す。また、図中「ＣＶ」は中心静脈を示し、「ＰＶ」は門脈を示し、黒塗りの三角で示している細胞は、ＴＵＮＥＬ染色にて検出されたアポトーシス細胞である。さらに、図中矢印で指し示している箇所は、炎症細胞が浸潤しているところを示す。
【図３】高脂肪食を４週間摂取させたＭＣ４Ｒノックアウトマウスに、０．１ｍＬ／ｋｇの四塩化炭素又は溶媒を単回投与し、その投与２、４、７及び１０日後の肝臓をＴＵＮＥＬ染色した。そして、各肝臓の切片全面積中のＴＵＮＥＬ陽性細胞数を測定し、１ｍｍ２あたりの平均細胞数を算出した結果を示すグラフである。解析した数は各群４個体である。なお、群間差は分散分析により検定した。図中のアスタリスクは溶媒投与群に対してＰ値が０．０５以下であることを示す。また、溶媒を投与した結果については、その投与７日後のみを示すが、投与２〜１０日後の間にて変化が生じていないことは確認してある（溶媒投与群の結果に関しては、下記図５及び９においても同様である）。
【図４】高脂肪食を４週間摂取させたＭＣ４Ｒノックアウトマウスに、０．１ｍＬ／ｋｇの四塩化炭素を単回投与し、その投与７日後の肝臓にＦ４/８０に対する免疫染色を施し、顕微鏡にて観察した結果を示す写真である。図中、右側のパネルは、当該四塩化炭素投与７日後の結果を示し、左側のパネルは、四塩化炭素の代わりに溶媒を投与して７日後の結果を示す。また、図中「ＣＶ」は中心静脈を示し、「ＰＶ」は門脈を示し、矢印で指し示している箇所は、Ｆ４/８０陽性マクロファージが脂肪変性した肝細胞を取り囲み貪食・処理している組織像（ｈＣＬＳ）を示す。
【図５】高脂肪食を４週間摂取させたＭＣ４Ｒノックアウトマウスに、０．１ｍＬ／ｋｇの四塩化炭素又は溶媒を単回投与し、その投与２、４、７及び１０日後の肝臓にＦ４/８０に対する免疫染色を施した。そして、各肝臓の切片における全面積中のｈＣＬＳ（肝臓王冠様構造）数を測定し、１ｍｍ２あたりの平均数を算出した結果を示すグラフである。解析した数は各群４個体である。
【図６】高脂肪食を４週間摂取させたＭＣ４Ｒノックアウトマウスに、０．１ｍＬ／ｋｇの四塩化炭素を単回投与し、その投与７日後の肝臓にＦ４/８０及びＣＤ１１ｃに対する免疫染色を施し、顕微鏡にて観察した結果を示す写真である。図中、左側は、Ｆ４/８０陽性細胞を検出した結果を示し、右側は、ＣＤ１１ｃ陽性細胞を検出した結果を示す。なお、上部２パネルと、下部２パネルとは、肝臓切片中において検出した部位（細胞）が異なる。
【図７】高脂肪食を４週間摂取させたＭＣ４Ｒノックアウトマウスに、０．１ｍＬ／ｋｇの四塩化炭素を単回投与し、その投与１０日後の肝臓にＦ４/８０及びＣＤ１１ｃに対する免疫染色を施し、顕微鏡にて観察した結果を示す写真である。図中、左側は、Ｆ４/８０陽性細胞を検出した結果を示し、右側は、ＣＤ１１ｃ陽性細胞を検出した結果を示す。なお、上部２パネルと、下部２パネルとは、肝臓切片中において検出した部位（細胞）が異なる。
【図８】高脂肪食を４週間摂取させたＭＣ４Ｒノックアウトマウスに、０．１ｍＬ／ｋｇの四塩化炭素を単回投与し、その投与７日後の肝臓をシリウスレッド染色し、顕微鏡にて観察した結果を示す写真である。図中、右側のパネルは、当該四塩化炭素投与７日後の結果を示し、左側のパネルは、四塩化炭素の代わりに溶媒を投与して７日後の結果を示す。また、図中「ＣＶ」は中心静脈を示し、「ＰＶ」は門脈を示す。
【図９】高脂肪食を４週間摂取させたＭＣ４Ｒノックアウトマウスに、０．１ｍＬ／ｋｇの四塩化炭素又は溶媒を単回投与し、その投与２、４、７及び１０日後の肝臓をシリウスレッド染色した。そして、各肝臓の切片における全面積中のシリウスレッド陽性面積（線維化面積）を測定し、その割合を算出した結果を示すグラフである。解析した数は各群４個体である。
【図１０】高脂肪食を２週間摂取させたＭＣ４Ｒノックアウトマウスに、０．１ｍＬ／ｋｇの四塩化炭素を単回投与し、その投与７日後の肝臓にＦ４/８０に対する免疫染色を施し、またはシリウスレッド染色を施し、顕微鏡にて観察した結果を示す写真である。図中、右側のパネルは、当該四塩化炭素投与７日後の結果を示し、左側のパネルは、四塩化炭素の代わりに溶媒を投与して７日後の結果を示す。また、上側のパネルが、Ｆ４/８０に対する免疫染色の結果を示し、下側のパネルが、シリウスレッド染色の結果を示す。図中「ＣＶ」は中心静脈を示し、「ＰＶ」は門脈を示す。
【図１１】通常食又は高脂肪食を４週間摂取させた野生型マウスに、０．１ｍＬ／ｋｇの四塩化炭素を単回投与し、その投与７日後の肝臓にＦ４/８０に対する免疫染色を施し、またはシリウスレッド染色を施し、顕微鏡にて観察した結果を示す写真である。図中、左側のパネルは、通常食を摂取させた野生型マウスにおける結果を示し、右側のパネルは、高脂肪食を摂取させた野生型マウスにおける結果を示す。また、上側のパネルが、Ｆ４/８０に対する免疫染色の結果を示し、下側のパネルが、シリウスレッド染色の結果を示す。図中「ＣＶ」は中心静脈を示し、「ＰＶ」は門脈を示す。
【図１２】高脂肪食を４週間摂取させたＭＣ４Ｒノックアウトマウスに、０．０５、０．１、０．２、０．４ｍＬ／ｋｇの四塩化炭素又は溶媒を単回投与し、その投与１及び７日後に採取した血清に関し、アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）の濃度を測定した結果を示すグラフである。解析した数は各群５個体である。図中各群の結果において、左側のバーが投与１日後の結果を示し、右側のバーが投与７日後の結果を示す。
【図１３】高脂肪食を４週間摂取させたＭＣ４Ｒノックアウトマウスに、０．０５、０．１、０．２、０．４ｍＬ／ｋｇの四塩化炭素又は溶媒を単回投与し、その投与７日後の肝臓をシリウスレッド染色した。そして、各肝臓の切片における全面積中のシリウスレッド陽性面積（線維化面積）を測定し、その割合を算出した結果を示すグラフである。解析した数は各群５個体である（但し、四塩化炭素０．４ｍＬ／ｋｇ投与群に関しては、その投与２、３日後に２匹が死亡したため、解析した数は３個体である）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜ＮＡＳＨモデルマウスの製造方法＞
本発明の非アルコール性脂肪肝炎モデルマウスの製造するための方法は、下記工程（１）及び（２）を含む
（１）メラノコルチン４型受容体の発現を抑制したマウスに、高脂肪食を摂取させる工程、
（２）前記高脂肪食を少なくとも１５日間摂取させたマウスに、四塩化炭素を単回投与する工程。
【００１５】
非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）とは、肝細胞における脂肪蓄積、肝細胞風船様変性（バルーニング変性）、アポトーシスの増加、肝臓の中心静脈領域への炎症性細胞の浸潤、脂肪変性した肝細胞をマクロファージが取り囲み貪食・処理する現象（ｈＣＬＳ）、肝臓における過剰な細胞外基質の沈着を伴う肝臓の疾患を意味し、このような症状の進行後に至る肝硬変又は肝細胞癌も、本発明のＮＡＳＨに含まれ得る。また、かかる組織学的な変化のみならず、アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）、遊離脂肪酸及び中性脂肪のうちの少なくとも１のマーカーの血清中の濃度が高い状態にあることも、本発明のＮＡＳＨに含まれ得る。
【００１６】
本発明において「メラノコルチン４型受容体」とは、視床下部や脳幹部にて高発現し，エネルギー代謝調節等に関与するタンパク質（ＭＣ４Ｒ）を意味し、マウス由来の典型的には、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号：ＮＰ＿０５８６７３で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号：ＮＭ＿０１６９７７で特定されるヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列からなるタンパク質）が挙げられる。なお当然のことながら、上記典型例として挙げているアミノ酸配列からなるタンパク質自体に、本発明に係るＭＣ４Ｒは限定されず、自然界において生じ得るその変異体も含まれる。
【００１７】
本発明において「抑制」には、完全な抑制（阻害）及び部分的な抑制が含まれる。また、ＭＣ４Ｒの発現の抑制は、ＭＣ４Ｒ遺伝子の転写レベル、翻訳レベル、あるいは機能レベルのいずれかによって達成され、より具体的には、ＭＣ４Ｒ遺伝子の少なくとも一部を含むターゲティングベクターが相同組み換えによって導入されたＥＳ細胞等を用いる遺伝子ノックアウト、ＭＣ４Ｒ遺伝子に対するｓｈＲＮＡ、アンチセンス、リボザイム等を用いる遺伝子ノックダウン、受容体拮抗剤（アンタゴニスト）投与、放射線照射、化学変異原投与、トランスポゾン導入等によってＭＣ４Ｒ遺伝子にその発現を抑制する、遺伝子変異導入によって達成され得る。遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックダウン、遺伝子変異導入に用いられる、ターゲッティングベクターの構築、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス、リボザイム等の設計及び合成、マウスのＥＳ細胞、未受精卵、受精卵、始原生殖細胞等へのDNAの導入方法、受容体拮抗剤投与、放射線照射、化学変異原投与、トランスポゾン導入等は、当業者であれば従来公知の方法を適用して行うことができる。また、このようにしてＭＣ４Ｒの発現が抑制される「マウス」の種類としては特に制限はなく、系統種であってもよく、雑種であってもよい。また、系統種としては、例えば、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ３Ｈ、ＩＣＲ、ＢＡＬＢ／ｃが挙げられるが、好ましくはＣ５７ＢＬ／６である。
【００１８】
本発明において用いられる「ＭＣ４Ｒの発現を抑制したマウス」としては、前述の通り、ＭＣ４Ｒ遺伝子ノックアウトマウス、ＭＣ４Ｒ遺伝子ノックダウンマウス、ＭＣ４Ｒ遺伝子変異導入マウス等が挙げられるが、好ましくは、ＭＣ４Ｒ遺伝子ノックアウトマウスであり、より好ましくは、ＭＣ４Ｒ遺伝子ノックアウトＣ５７ＢＬ／６マウスである。
【００１９】
本発明において前述のマウスに摂取させる「高脂肪食」としては、脂肪をエネルギー比率にて２０％以上含む食餌であり、好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上（例えば、５０以上、６０％以上）含む食餌である。また、このような食餌のエネルギー量として、４００ｋｃａｌ／１００ｇ以上（例えば、５００ｋｃａｌ／１００ｇ以上）であることが好ましい。また、本発明に係る食餌に含まれる脂肪としては、特に制限されることなく、動物性脂肪、植物性脂肪を問わず、例えば、乳脂肪、牛脂、豚脂、コーン油、大豆油、菜種油が挙げられるが、本発明に係る食餌には、動物性脂肪（乳脂肪、牛脂、豚脂等）が含まれていることが好ましい。さらに、本発明に係る高脂肪食の脂肪以外の成分は、通常の食餌成分であればよく、タンパク質、炭水化物、ミネラル等を含んでいてもよく、より具体的には、スクロース、コレステロール等を含んでいてもよい。
【００２０】
また、このような高脂肪食の前記マウスへの摂取開始時期としては、特に制限はなく、通常５週齢からであり、好ましくは８週齢からである。さらに、摂取させるマウスの性としても特に制限はないが、好ましくは雄である。また、高脂肪食の前記マウスへの摂取方法としても、特に制限はないが、通常、水と共に不断に自由摂食させることで行われる。
【００２１】
そして、本発明においては、このようにして高脂肪食を少なくとも１５日間摂取させたマウスに、四塩化炭素が単回投与される。四塩化炭素の投与時期としては、前記高脂肪食を少なくとも１５日間摂取させた後であればよいが、好ましくは３週間の摂取後、より好ましくは４週間の摂取後である。また、四塩化炭素の投与量としては、高脂肪食を摂取させた前記マウスにおいて、ｈＣＬＳ形成等のＮＡＳＨ病変を生じさせる量であればよいが、通常０．０５ｍＬ／ｋｇ以上であり、好ましくは０．０５〜０．４ｍＬ／ｋｇであり、より好ましくは、０．１〜０．２ｍＬ／ｋｇである。投与量が前記下限未満であれば前記マウスにおいてＮＡＳＨ病変を生じさせにくい傾向にあり、前記上限を超えると投与されたマウスが死亡し易くなる傾向にある。四塩化炭素のマウスへの投与方法としては、特に制限はなく、腹腔内投与、静脈内投与、皮下投与、経口投与等が挙げられるが、好ましくは腹腔内投与である。また、投与される四塩化炭素は、その投与方法にもよるが、溶媒にて希釈されていてもよい。かかる溶媒としては特に制限はなく、例えば、植物油（例えば、オリーブ油、コーン油）等のオイルが好適に用いられる。
【００２２】
また、このようにして四塩化炭素が単回投与された後のマウスに摂取させ続ける食餌としては、特に制限はないが、本発明において、前述の高脂肪食を四塩化炭素投与後もマウスに摂取させ続けることが好ましい。
【００２３】
＜ＮＡＳＨを抑制する活性を有する化合物のスクリーニング方法＞
本発明においては、上述のＮＡＳＨモデルマウスの製造方法を利用した、ＮＡＳＨを抑制する活性を有する化合物のスクリーニング方法をも提供し得る。すなわち、本発明は、下記工程（１）〜（６）を含む、ＮＡＳＨを抑制する活性を有する化合物をスクリーニングするための方法も提供し得る。
（１）メラノコルチン４型受容体の発現を抑制したマウスに、高脂肪食を摂取させる工程、
（２）前記高脂肪食を少なくとも１５日間摂取させたマウスに、四塩化炭素を単回投与する工程、
（３）前記四塩化炭素を投与したマウスに、被験物質を接触させる工程、
（４）前記被験物質を接触させたマウスにおいて、非アルコール性脂肪肝炎の程度を検出する工程、
（５）工程（２）において前記四塩化炭素を投与したマウスに、前記被験物質を接触させずに、非アルコール性脂肪肝炎の程度を検出する工程、
（６）工程（４）及び工程（５）において検出した非アルコール性脂肪肝炎の程度を比較し、工程（４）において検出した非アルコール性脂肪肝炎の程度が、工程（５）において検出した非アルコール性脂肪肝炎の程度よりも低い場合に、前記被験物質は非アルコール性脂肪肝炎を抑制する活性を有する化合物であると判定する工程。
【００２４】
工程（１）及び（２）については、上述の通りである。そして、本発明のスクリーニング方法においては、このような工程を経て調製されたＮＡＳＨモデルマウスに、被験物質を接触させる。
【００２５】
被験物質のマウスへの接触開始時期としては、四塩化炭素の単回投与と同時に、または当該投与後であればよいが、四塩化炭素による直接的な影響がスクリーニングの結果に及ぼしにくいという観点から、好ましくは四塩化炭素の投与後である。例えば、ＮＡＳＨ病変において、特にｈＣＬＳ形成を抑制する活性を有する化合物をスクリーニングするという観点から、好ましくは四塩化炭素の投与１日後以降に、被験物質を接触させることが好ましく、ｈＣＬＳを起点として形成される肝線維化を抑制する活性を有する化合物をスクリーニングするという観点から、好ましくは四塩化炭素の投与２日後以降（例えば、３〜６日後）に、被験物質を接触させることが好ましい。
【００２６】
接触させる被験物質としては、特に制限はなく、例えば、合成低分子化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、ペプチドライブラリー、抗体、細菌放出物質、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）の抽出液及び培養上清、精製又は部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物又は動物由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーが挙げられる。
【００２７】
マウスへの被験化合物の「接触」は、通常、マウスに被験化合物を摂取させることによって行うが、この方法に限定されない。また、摂取は、経口投与又は非経口投与、より具体的には、腹腔内投与、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、皮内投与、気道内投与、直腸投与及び筋肉内投与、輸液による投与が挙げられる。接触させる被験化合物の濃度、回数及び期間としては、特に制限はなく、その種類や性質（溶解度、毒性等）によって適宜調整され得る。
【００２８】
前記被験物質を接触させたマウスにおける、「非アルコール性脂肪肝炎の程度の検出」としては、例えば、後述の実施例において示すように、当該マウスから採取した肝臓を対象とし、肝細胞における脂肪蓄積、肝細胞風船様変性（バルーニング変性）、アポトーシス細胞の増加、炎症性細胞の浸潤、脂肪変性した肝細胞をマクロファージが取り囲み貪食・処理する現象（ｈＣＬＳ）、過剰な細胞外基質の沈着の程度を、組織学的に観察することにより行うことができる。また、後述の実施例において示すように、ＡＬＴ、ＡＳＴ、遊離脂肪酸及び中性脂肪のうちの少なくとも１のマーカーの血清中の濃度を測定することによっても行うことができる。
【００２９】
そして、このようにして検出された非アルコール性脂肪肝炎の程度を、被験物質を接触させていない本発明に係るＮＡＳＨモデルマウスのそれと比較し、低くなっている場合には、前記被験物質は非アルコール性脂肪肝炎を抑制する活性を有する化合物であると判定することができる。
【００３０】
以上、本発明のＮＡＳＨモデルマウスの製造方法、ＮＡＳＨを抑制する活性を有する化合物のスクリーニング方法の好適な実施形態について説明したが、本発明に係るＮＡＳＨモデルマウスは、ＮＡＳＨのバイオマーカーのスクリーニングにも好適に用いられ得る。すなわち、本発明は、下記工程（１）〜（３）を含む、非アルコール性脂肪肝炎のバイオマーカーをスクリーニングするための方法も提供し得る。
（１）メラノコルチン４型受容体の発現を抑制したマウスに、高脂肪食を摂取させる工程、
（２）前記高脂肪食を少なくとも１５日間摂取させたマウスに、四塩化炭素を単回投与する工程、
（３）前記四塩化炭素を投与したマウスから試料を採取し、該試料における遺伝子転写産物、遺伝子翻訳産物、遺伝子修飾、タンパク質修飾又は代謝産物を検出し、対照におけるそれと比較し、変動する物質を同定する工程。
【００３１】
工程（１）及び（２）については、上述の通りである。そして、このような工程を経て調製されたＮＡＳＨモデルマウスから採取される試料としては特に制限はなく、例えば、肝臓の組織及び細胞、並びに血液、血漿、血清、尿等の体液が挙げられる。また、このような試料から調製される遺伝子転写産物、遺伝子翻訳産物、遺伝子修飾、タンパク質修飾及び代謝産物としても特に制限はなく、例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ等の遺伝子転写産物、タンパク質、その部分ペプチド等の遺伝子翻訳産物、ＤＮＡメチル化、ヒストンアセチル化、ヒストンメチル化等の遺伝子修飾、リン酸化、ＳＵＭＯ化、糖鎖修飾等のタンパク質修飾、糖、脂質、脂肪酸等の代謝産物が挙げられる。
【００３２】
また、このような物質の検出方法としても特に制限はなく、検出される物質の種類に合わせた公知の方法によって達成され得るが、網羅的な検出方法が好ましい。遺伝子転写産物や遺伝子修飾を対象とした網羅的な解析（トランスクリプトーム解析、エピゲノム解析等）は、例えば、市販されているＤＮＡマイクロアレイ、メチル化アレイ等を用いて行うことができる。遺伝子翻訳産物やタンパク質修飾を対象とした網羅的な解析（プロテオーム解析等）は、例えば、二次元ゲル電気泳動法とＴＯＦ−ＭＳを組み合わせた方法等を用いて行うことができる。また、例えば、代謝産物を対象とした網羅的な解析（メタボローム解析）は、ＮＭＲやキャピラリー電気泳動、ＬＣ−ＭＳ等を用いて行うことができる。
【００３３】
このようにして得られた検出結果を比較する「対照」としては特に制限はなく、例えば、野生型マウス、通常食を摂取させたメラノコルチン４型受容体発現抑制マウス、高脂肪食を少なくとも１５日間摂取させたマウス（四塩化炭素を単回投与する前のマウス）が挙げられる。
【００３４】
そして、ＮＡＳＨに関連して発現が変動する物質が同定されれば、ＮＡＳＨのバイオマーカーとして、侵襲性の少ないＮＡＳＨの診断法、ＮＡＳＨの早期診断法、ＮＡＳＨの確定診断法等において有用である。
【００３５】
また、以上の通り、本発明に係るＮＡＳＨモデルマウスは、ＮＡＳＨの治療方法、予防方法、診断方法の開発に大きく貢献し得る。したがって、本発明は当該マウスも提供するものである。すなわち、メラノコルチン４型受容体の発現が抑制されており、高脂肪食を少なくとも１５日間摂取させ、かつ四塩化炭素を単回投与することにより、非アルコール性脂肪肝炎が誘導されたマウスをも、本発明は提供する。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３７】
（マウス）
メラノコルチン４型受容体を欠損させたマウス（以下、「ＭＣ４Ｒノックアウトマウス」とも称する。遺伝的バックグランド：Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）は、テキサス大学メディカルセンター  Ｊｏｅｌ  Ｋ．Ｅｌｍｑｕｉｓｔより提供したものを使用した（Ｂａｌｔｈａｓａｒ  Ｎ．ら、Ｃｅｌｌ、２００５年１１月４日発行、１２３巻、３号、４９３〜５０５ページ  参照）。また、対照群として、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウスを、日本クレア株式会社より購入して用意した。
【００３８】
これらのマウスは、特に断りがない限り、温度、湿度及び照明時間（１２時間明暗サイクル）が制御された環境下、水及び標準食（日本クレア株式会社製、げっ歯類飼育繁殖用飼料：ＣＥ−２、３４３．１ｋｃａｌ／１００ｇ、脂肪をエネルギー比率にて１２．６％含む、）を不断に自由摂取させ、維持した。
【００３９】
（組織学的解析）
前記マウスから採取した肝臓は、中性緩衝ホルマリン溶液に浸漬して固定化し、パラフィン包埋に供し、切片を調製した。
【００４０】
そして、前記切片を用い、Ｓａｋａｉｄａ  Ｉ.ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２００４年、４０巻、１３０４〜１３１１ページ、及び、Ｔａｎａｋａ  Ｍ.ら、Ｅｎｄｏｃｒ  Ｊ、２０１０年、５７巻、６１〜７２ページに記載の方法に沿って、ＨＥ及びシリウスレッドにて染色した。さらに、各切片における全面積中のシリウスレッド陽性面積、すなわち線維化面積を測定し、その割合を算出した。
【００４１】
また、前記切片を用い、肝臓におけるアポトーシス細胞を、ＡｐｏｐＴａｇプラスペルオキシダーゼインサイチュアポトーシス検出キット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて、ＴＵＮＥＬ法により検出した。さらに、各切片における全面積中のＴＵＮＥＬ陽性細胞数を測定し、１ｍｍ２あたりの平均細胞数を算出した。
【００４２】
また、前記切片を用い、Ｆ４／８０陽性マクロファージを、Ｋｉｔａｇａｗａ  Ｋ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、２００４年、１６５巻、２３７〜２４６ページに記載の方法に沿って、ラット由来の抗マウスＦ４／８０抗体を用いた免疫染色により検出した。さらに、各切片における全面積中のｈＣＬＳ（肝臓王冠様構造）の数を測定し、１ｍｍ２あたりの平均数を算出した。
【００４３】
また、前記マウスから採取した肝臓から、凍結切片を調製し、前記抗Ｆ４／８０抗体及びアメリカンハムスター由来の抗マウスＣＤ１１ｃ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、カタログ番号：１４−０１１４）による抗原抗体反応に供した後、蛍光色素にて標識した前記一次抗体を認識する二次抗体と反応させ、蛍光免疫染色法により、Ｆ４／８０及びＣＤ１１ｃ陽性マクロファージを検出した。
【００４４】
（血液分析）
前記マウスから採取した血液に関し、Ｉｔｏｈ  Ｍ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、２０１１年、１７９巻、２４５４〜２４６３ページに記載の方法に沿って、アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）の濃度を測定した。
【００４５】
（実施例１）
ＭＣ４Ｒノックアウトマウス（雄、８週齢）に、高脂肪食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ社製、高脂肪飼料：Ｄ１２０７９Ｂ、４６８ｋｃａｌ／１００ｇ、脂肪をエネルギー比率にて４１％含む、スクロースを３４．０％含む、コレステロールを０．２％含む）を４週間摂取させた。次いで、０．１ｍＬ／ｋｇの四塩化炭素を腹腔内に単回投与した。なお、投与に際しては、四塩化炭素を溶媒（オリーブ油）にて４０倍に希釈したものを用いた。また、対照群として、溶媒のみを投与したマウスも用意した。そして、当該投与２、４、７又は１０日後に肝臓を採取し、上記の通り、パラフィン切片を調製し、ＨＥ染色、シリウスレッド染色、ＴＵＮＥＬ染色、Ｆ４／８０染色に供した。得られた結果を、ＨＥ染色に関しては図１に示し、ＴＵＮＥＬ染色に関しては図２及び３に示し、Ｆ４／８０染色に関しては図４及び５に示し、シリウスレッド染色に関しては図８及び９に示す。また、四塩化炭素投与７及び１０日後に採取した肝臓については、凍結切片も調製し、上記の通り、Ｆ４／８０及びＣＤ１１ｃの二重染色に供した。得られた結果を図６及び７に示す。
【００４６】
図１に示した結果から明らかな通り、四塩化炭素投与２日後には、ＮＡＳＨ特異的な病変の一つであるバルーニング変性が、肝臓の中心静脈域に検出された。さらに、図２〜４に示した結果から明らかな通り、四塩化炭素投与４日後にはアポトーシス細胞の増加が認められ、また中心静脈域への炎症性細胞の浸潤も検出された。さらに、投与７日後以降には、ｈＣＬＳ形成と肝細胞周囲性の線維化が検出された。なお、本実施例において検出されたｈＣＬＳは、本発明者らによって従前作製されたＮＡＳＨモデルマウスと同様に、ＣＤ１１ｃ陽性マクロファージにて構成されており、肝臓に散在するマクロファージとは異なることが確認された（図６及び７参照のこと）。
【００４７】
（比較例１）
高脂肪食の摂取期間を４週間から２週間に短縮した以外は、実施例１に記載の方法と同様の方法にてマウスを調製し、四塩化炭素投与７日後に肝臓を採取し、パラフィン切片を調製し、シリウスレッド染色及びＦ４／８０染色に供した。得られた結果を、図１０に示す。
【００４８】
図１０に示した結果から明らかな通り、２週間の高脂肪食負荷では、実施例１において検出されたようなＮＡＳＨ病変が認められなかった。
【００４９】
（比較例２）
ＭＣ４Ｒノックアウトマウスを野生型マウスとした以外は、実施例１に記載の方法と同様の方法にてマウスを調製し、四塩化炭素投与７日後に肝臓を採取し、パラフィン切片を調製し、シリウスレッド染色及びＦ４／８０染色に供した。得られた結果を、図１１に示す。
【００５０】
図１１に示した結果から明らかな通り、野生型マウスでは、４週間の高脂肪食負荷を与え、四塩化炭素を単回投与しても、実施例１において検出されたようなＮＡＳＨ病変を検出することはできなかった。
【００５１】
（実施例２〜４）
四塩化炭素の単回投与量を０．０５ｍＬ／ｋｇ、０．２ｍＬ／ｋｇ又は０．４ｍＬ／ｋｇ（実施例２〜４）とした以外は、実施例１同様にマウスを調製した。また、併せて投与量を０．１ｍＬ／ｋｇとするマウス（実施例１）も調製した。
【００５２】
そして、四塩化炭素投与してから１日後又は７日後に、尾静脈採血を行い、血清を調製し、ＡＬＴ測定を行った。また、四塩化炭素投与７日後に肝臓を採取し、パラフィン切片を調製し、シリウスレッド染色に供した。得られた結果を図１２及び１３に示す。
【００５３】
図１２及び１３に示した結果から明らかな通り、四塩化炭素投与１日後のＡＬＴ濃度、及び、当該投与７日後の肝線維化面積は、四塩化炭素の投与量依存的に増加した。なお、四塩化炭素  ０．４ｍＬ／ｋｇ投与群においては、５例中２例が投与してから２及び３日後に死亡した。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
以上説明したように、本発明によれば、肝臓の中心静脈領域におけるバルーニング変性、肝臓におけるアポトーシス細胞の増加、肝臓の中心静脈領域への炎症性細胞の浸潤、脂肪変性した肝細胞をマクロファージが取り囲み貪食・処理する現象（ｈＣＬＳ）、肝臓における過剰な細胞外基質の沈着といった、ヒトＮＡＳＨにおける病変を忠実に反映したモデルマウスを、たった５週間程度で製造することが可能となる。さらに、当該製造方法を利用することで、ＮＡＳＨを抑制する活性を有する化合物、並びにＮＡＳＨのバイオマーカーを、迅速かつ効率良くスクリーニングすることが可能となる。
【００５５】
したがって、本発明は、ＮＡＳＨの治療方法、予防方法及び診断方法の開発において、極めて有用である。
【図１】
0006670556.tif 000002
【図２】
0006670556.tif 000003
【図３】
0006670556.tif 000004
【図４】
0006670556.tif 000005
【図５】
0006670556.tif 000006
【図６】
0006670556.tif 000007
【図７】
0006670556.tif 000008
【図８】
0006670556.tif 000009
【図９】
0006670556.tif 000010
【図１０】
0006670556.tif 000011
【図１１】
0006670556.tif 000012
【図１２】
0006670556.tif 000013
【図１３】
0006670556.tif 000014