(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における炎症性疾患を治療及び／又は予防するための医薬組成物であって、
９，１５Ｓ−ジヒドロキシ−１１−オキソ−５Ｚ，１３Ｅ−プロスタジエン酸，１−グリセリルエステルを含み、
前記炎症性疾患が、２型糖尿病、インスリン抵抗性及び肥満からなる群から選択される、医薬組成物。
【請求項２】
前記炎症性疾患が、２型糖尿病である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
肥満の対象における２型糖尿病の発症を予防するか、又は遅延させる、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
対象においてインスリン分泌を調節する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
膵臓細胞、腸内分泌細胞、上皮細胞、肝臓細胞、脂肪細胞及び神経細胞からなる群から選択される細胞に作用する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記細胞が膵β細胞である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記膵β細胞により産生されるインスリンの量を増加させる、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
膵β細胞のアポトーシスを防止又は低減する、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記細胞がＬ細胞である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記細胞がアストロサイト又はニューロンである、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
肝臓及び／又は脂肪組織における炎症を低減させる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症性疾患の治療及び／又は予防に関する。特に、本発明は、酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルの使用及びこのような治療のために酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルを利用する方法に関する。更に、本発明は、炎症性疾患を発症する対象のリスクを、対象由来のサンプル中の酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルの量に基づき、決定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症は、病原体、損傷した細胞及び／又は刺激物等の有害な刺激に対する組織の複雑な生物学的応答である。一般に、炎症は、有害な刺激を除去し、組織の治癒プロセスを開始しようとする、生物の防御作用である。しかし、炎症の調節が不適切な場合、対象の年齢に関係なく、いくつかの病気を引き起こし得る。
【０００３】
加齢は、多くの場合、体液性免疫不全の増加に付随した細胞性免疫応答の顕著な低下、例えば、ワクチンに対する応答の低下等の免疫系の調節異常に関連する。更に、加齢は、低悪性度の炎症の状態に関連することも多い。特に、多くの高齢の対象は、罹患率及び死亡率に寄与する感染性及び非感染性疾患のリスクが高い。
【０００４】
望ましくない炎症は、適切な投薬により治療することができる。しかし、投薬により、望ましくない副作用が生じる可能性があるため、多くの場合、医療関係者の監視を必要とする。
【０００５】
２型糖尿病（Type 2 diabetesmellitus、ＴＩＩＤ）は、糖尿病の最も多い形態であり、慢性高血糖、インスリン抵抗性及び通常、食後高血糖に反応してインスリンを分泌する膵β細胞の相対的な機能不全を特徴とする。２型糖尿病は、遺伝的、環境的及び習慣リスク因子に関連する。
【０００６】
ＴＩＩＤに罹患し、生きる人々は、様々な型の短期及び長期両方の合併症にかかりやすい。短期合併症は、低血糖糖尿病性ケトアシドーシス（hypoglycaemia diabetic ketoacidosis、ＤＫＡ）及び高浸透圧性高血糖状態（hyperosmolar hyperglycaemic state、ＨＨＳ）を含む。長期合併症は、網膜症、心疾患、腎症及び神経障害を含む。このような合併症により、早期死亡になることがある。
【０００７】
罹患率及び死亡率のこの増加傾向は、疾患の有病率、疾患の潜行性発症及び認知の遅れのため、ＴＩＩＤ患者において見られる。ＴＩＩＤの世界的な発生率は、２０１１年に３億６６００万人で、２０３０年までに５億５２００万人まで上昇すると推定されている（Ｇｌｏｂａｌ  ｂｕｒｄｅｎ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ．Ｄｉａｂｅｔｉｃ  ａｔｌａｓ  ｆｉｆｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  ２０１１，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｄｆ．ｏｒｇ／ｄｉａｂｅｔｅｓａｔｌａｓにて入手可能（２０１１年１２月１８日にアクセス））。
【０００８】
多数の生活因子が、ＴＩＩＤの発症に関連することが知られている。これらの因子は、身体不活動、座りがちな生活、喫煙及びアルコールの摂取を含む。特に、肥満は、ＴＩＩＤの症例の約５５％に寄与することが分かっており（Ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ  ａｎｄ  Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  Ｗｅｅｋｌｙ  Ｒｅｐｏｒｔ；５３（４５）：１０６６−１０６８）、強い遺伝性関連もある。しかし、肥満者がすべてＴＩＩＤを発症するわけではないことが認識されている。
【０００９】
ＴＩＩＤは、インスリン抵抗性、インスリン産生の低下及び最終的な膵β細胞不全によってもたらされるインスリン非感受性を特徴とする。これにより、肝臓、筋細胞及び脂肪細胞へのグルコース輸送が減少する。この機能不全の結果、空腹時に上昇するグルカゴン及び肝臓のグルコースの量は、食事によって抑制されない。インスリンの不適当な量及びインスリン抵抗性の上昇により、高血糖を生じる。ＴＩＩＤの重要な特徴は、膵β細胞が栄養及び栄養因子を感知できず、機能不全となるため、β細胞質量及びインスリン分泌の量を増加させることにより特異的に作用する治療に無反応になることである。
【００１０】
現在のＴＩＩＤの治療は、β細胞消失を防ぎかつインスリン分泌を刺激するために、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ１）受容体作動薬の連日注射を含む。しかし、ＧＬＰ１を使用すると、膵臓及び心臓血管の合併症のリスクがある。スルホニルウレア等の従来の経口薬により、患者が生命に関わる低血糖を更に起こしやすくなる。また、糖尿病前症又はハイリスクの個体の予防的治療もなく、ＴＩＩＤを発症するリスクが高い個体を特定するための方法もない。
【００１１】
したがって、炎症状態及び障害を治療及び／又は予防するために使用することができる、代替化合物及び組成物が求められている。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステル量が炎症性疾患に関連するという判定に基づく。更に、本発明は、酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルが炎症性疾患に直接関連する細胞において生理学的応答に影響し得ることを示した。
【００１３】
第１の態様において、本発明は、対象における炎症性疾患の治療及び／又は予防に使用するための酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルを用意する。
【００１４】
酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルは、酸素化アラキドニルグリセロールエステルであってもよい。酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルは、プロスタグランジングリセロールエステルであってもよい。酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルは、プロスタテトラエン酸グリセロールエステルであってもよい。
【００１５】
プロスタテトラエン酸グリセロールエステルは、以下の群：１１−オキソ−５Ｚ，９，１２Ｅ，１４Ｅ−プロスタテトラエン酸−１グリセロールエステル；９，１５Ｓ−ジヒドロキシ−１１−オキソ−５Ｚ，１３Ｅ−プロスタジエン酸，１−グリセリルエステル；１１−オキソ−５Ｚ，９，１２Ｅ，４Ｅ−プロスタテトラエン酸−２−グリセロールエステル；１１−オキソ−１５Ｓ−ヒドロキシ−５Ｚ，９Ｚ，１３Ｅ−プロスタトリエン酸−１グリセロールエステル；及び９，１５Ｓ−ジヒドロキシ−１１−オキソ−５Ｚ，１３Ｅ−プロスタジエン酸，２−グリセリルエステルから選択し得る。
【００１６】
プロスタテトラエン酸グリセロールエステルは、１１−オキソ−５Ｚ，９，１２Ｅ，１４Ｅ−プロスタテトラエン酸−１グリセロールエステル、９，１５Ｓ−ジヒドロキシ−１１−オキソ−５Ｚ，１３Ｅ−プロスタジエン酸，１−グリセリルエステル又は１１−オキソ−５Ｚ，９，１２Ｅ，１４Ｅ−プロスタテトラエン酸−２−グリセロールエステルであってもよい。
【００１７】
第２の態様において、本発明は、対象における炎症性疾患の治療及び／又は予防に使用するための、本発明の第１の態様で定義された１種以上の酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルを含む組成物を用意する。
【００１８】
炎症性疾患は、以下の群：２型糖尿病、インスリン抵抗性、肥満及び代謝性疾患から選択され得る。
【００１９】
本発明の第１又は第２の態様による使用するための酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステル又は組成物は、肥満の対象における２型糖尿病の発症を予防するか、又は遅延させるためであってもよい。
【００２０】
本発明の第１又は第２の態様による使用するための酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステル又は組成物は、対象においてインスリン分泌を調節するためであってもよい。
【００２１】
酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルは、以下の群：膵臓細胞、腸内分泌細胞、上皮細胞、肝臓細胞、脂肪細胞又は神経細胞から選択される細胞に作用し得る。
【００２２】
細胞は、膵β細胞であってもよい。酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルは、膵β細胞によって産生されるインスリンの量を増加させ得る。酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルは、膵β細胞のアポトーシスを防止又は低減し得る。
【００２３】
細胞は、腸内分泌Ｌ細胞であってもよい。
【００２４】
細胞は、アストロサイト又はニューロンであってもよい。
【００２５】
酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルは、肝臓及び／又は脂肪組織における炎症を低減し得る。
【００２６】
第３の態様において、本発明は、インビボで本発明の第１の態様で定義された少なくとも１種の酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルの産生を誘導するか、又は増加させるための方法を提供する。
【００２７】
酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルの量は、肝臓細胞、白色脂肪組織又は膵β細胞において増加し得る。
【００２８】
この方法は、次の工程を含み得る：
（ａ）対象に、以下の群：アラキドニルグリセロール（ＡＧ）、ジアシルグリセロール（１，２−ＤＡＧ）及び／又はトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）から選択される前駆物質を投与すること、
（ｂ）対象において、以下の群：ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）、ジアシルグリセロールリパーゼ（ＤＡＧＬ）、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ）、Ｎ−アシルホスファチジルエタノールアミン特異的ホスホリパーゼＤ（ＮＡＴＥ−ＰＬＤ）、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）、プロスタグランジンＦシンターゼ（ＰＧＦＳ）、プロスタグランジンＥシンターゼ（プロスタグランジングリセロールエステルＳ）、プロスタグランジンＩシンターゼ（ＰＧＩＳ）、プロスタグランジンＤシンターゼ（ＰＧＤＳ）及び／又はトロンボキサンＡ（２）シンターゼ（ＴＸＡＳ）から選択される酵素の発現又は活性を誘導するか、又は増加させること。
【００２９】
第４の態様において、本発明は、対象における炎症性疾患を治療及び／又は予防するための方法であって、本発明の第１の態様で定義された酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルを対象に投与すること又は本発明の第３の態様による方法により、インビボで本発明の第１の態様で定義された少なくとも１種の酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルの産生を誘導するか、又は増加させること、を含む、方法を提供する。
【００３０】
炎症性疾患は、以下の群：２型糖尿病、インスリン抵抗性、肥満及び代謝性疾患から選択され得る。
【００３１】
炎症性疾患は、２型糖尿病であってもよい。
【００３２】
本発明の第４の態様による方法は、肥満の対象における２型糖尿病の発症を予防するか、又は遅延させるためであってもよい。
【００３３】
この方法は、対象においてインスリン分泌を調節するためであってもよい。
【００３４】
第５の態様において、炎症性疾患を発症するリスクを有する対象を特定するための方法であって、
【００３５】
（ａ）対象由来のサンプル中の少なくとも１種の酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステル量を決定することと、
【００３６】
（ｂ）サンプル中の酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステル（１種又は複数種類）の量を基準値と比較することと、を含み、
【００３７】
基準値と比較して、サンプル中の低量の酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステル（１種又は複数種類）により、炎症性疾患を発症するリスクが示される、方法を提供する。
【００３８】
炎症性疾患を発症するリスクを有する対象を特定するための方法は、続いて、食事介入を適用し、酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルを増加し得る。
【００３９】
酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルは、酸素化アラキドニルグリセロールエステルであってもよい。酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルは、プロスタグランジングリセロールエステルであってもよい。酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルは、プロスタテトラエン酸グリセロールエステルであってもよい。
【００４０】
プロスタテトラエン酸グリセロールエステルは、以下の群：
１１−オキソ−５Ｚ，９，１２Ｅ，１４Ｅ−プロスタテトラエン酸−１グリセロールエステル；
９，１５Ｓ−ジヒドロキシ−１１−オキソ−５Ｚ，１３Ｅ−プロスタジエン酸，１−グリセリルエステル；
１１−オキソ−５Ｚ，９，１２Ｅ，４Ｅ−プロスタテトラエン酸−２−グリセロールエステル；
１１−オキソ−１５Ｓ−ヒドロキシ−５Ｚ，９Ｚ，１３Ｅ−プロスタトリエン酸−１−グリセロールエステル；又は
９，１５Ｓ−ジヒドロキシ−１１−オキソ−５Ｚ，１３Ｅ−プロスタジエン酸，２−グリセリルエステルから選択され得る。
【００４１】
サンプルは、血清、血漿、尿検体又は脂肪組織バイオプシーサンプルであってもよい。
【００４２】
炎症性疾患は、以下の群：２型糖尿病、インスリン抵抗性、肥満及び代謝性疾患から選択され得る。
【００４３】
一実施形態において、対象は肥満であり、この方法を使用して、対象が２型糖尿病を発症する可能性を予測する。
【００４４】
第６の態様において、本発明は、
ｉ）細胞における炎症性サイトカインシグナル伝達の調節又は
ｉｉ）細胞のアポトーシスからの保護に使用するための、本発明の第１の態様で定義された酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルを用意する。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】エタノール中における活性化された白色脂肪組織（white adipose tissue、ＷＡＴ）から単離された生理活性脂質フラクションのストック及び各種希釈物の濃度。グルコース刺激インスリン分泌に対する生理活性脂質の相乗効果。ＭＩＮ６細胞を、２ｍＭグルコースにおいて２時間の飢餓後、脂質フラクション（１：５０希釈）又はビヒクル（エタノール２％）とともに２０ｍＭグルコースで３０分間刺激する。各生理活性脂質フラクションの濃度を以下に示す。分泌したインスリンをＥＬＩＳＡ法により測定した。
【図２】生理活性脂質フラクションの用量応答及び膵β細胞生存。ＭＩＮ６細胞（７０〜８０％コンフルエント）を、完全ＤＭＥＭ培地において、単離した生理活性脂質の各種希釈物（１：１０００〜１：２０希釈）（第２、明るいほうの棒）又はエタノールの対応する希釈物、すなわちビヒクル対照（第１、暗いほうの棒）で４８時間処理した。付着した細胞をトリプシン処理し、計数した。各種希釈物の濃度を図１に示す。
【図３】β細胞フラクションに対する生理活性脂質の長期間の効果。（Ａ）ＭＩＮ６細胞を、生理学的範囲（１：１０００希釈）に近い濃度の生理活性脂質で７２時間処理した。処理の最後に、ＧＳＩＳを測定することにより、β細胞フラクションを評価した。（Ｂ）生理活性フラクション３及び５を、健康なドナー由来の初代ヒト膵島において７２時間試験した。生理活性脂質フラクション５は、ヒト膵島β細胞の能力を倍増させ、グルコース刺激に応答してインスリンを分泌することにより、β細胞機能を実質的に向上させた。
【図４】生理活性脂質によるグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）の急性的な増幅。ＭＩＮ６細胞において、飢餓条件下（２ｍＭグルコース）又は２０ｍＭグルコース若しくは２０ｍＭグルコース＋１：１００希釈での生理活性脂質を用いて１５分間刺激した後、インスリン分泌を測定した。インスリン分泌をＥＬＩＳＡ法により測定した。
【図５】生理活性脂質フラクション５を更に５つのサブフラクション（５−，５．１、５．２、５．３及び５．４）に分けた。ＧＳＩＳを実施する前に、ＭＩＮ６細胞を１：１０００の希釈の濃縮生理活性脂質サブフラクションで７２時間処理した。
【図６】β細胞を、生理活性脂質フラクション（１：１００希釈）の存在下又は非存在下で、炎症性サイトカインカクテル（５０Ｕ／ｍＬ  ＩＬ１β、１００Ｕ／ｍＬ  ＴＮＦα及び１００Ｕ／ｍＬ  ＩＮＦγ）で４８時間処理した。処理後、（Ａ）ＮＦｋＢシグナル伝達経路（ＩＫＫａ／ｂリン酸化）及びアポトーシス（切断型カスパーゼ３）をウエスタンブロットで評価し、（Ｂ）カスパーゼ８活性をＣａｓｐａｓｅ  Ｇｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞抽出物において測定した。
【図７】ＷＴ  Ｗｉｓｔａｒラット又はＧａｔａ  Ｋａｋｉｚａｋｉ（ＧＫ）ラットから単離した膵島細胞を、生理活性脂質フラクションで７２時間処理した。β細胞機能を測定するために、次に、膵島細胞を栄養素カクテル（２０ｍＭグルコース、１×アミノ酸及び０．１μＭ  Ｅｘ−４）で１時間刺激し、インスリン分泌をＥＬＩＳＡ法で評価した。
【図８】腸内分泌Ｌ細胞株（ＮＣＩ−Ｈ７１６）の急性刺激を、生理活性脂質フラクションの存在下又は非存在下で、低（２ｍＭ）及び高（２０ｍＭ）グルコースで試験した。その効果を、ＧＬＰ１分泌を測定することにより、評価した。
【図９】腸内分泌Ｌ細胞機能における生理活性脂質の長期間の効果を、グルコース刺激後、ＧＬＰ１分泌を評価する前に、生理活性脂質でＮＣＩ−Ｈ７１６細胞株を７２時間前処理することにより、判定した。
【図１０】生理活性脂質フラクションで７２時間処理した後のＭＩＮ６細胞における細胞のストレス遺伝子の調節。
【図１１】生理活性脂質の同定のためのワークフロー。
【図１２Ａ】純粋な合成フラクション５．４及び５．３と単離したフラクション５．４の機能効果の比較。生理活性脂質で短期（１時間）及び長期（７２時間）処理後、インスリン分泌を評価した。ヒト膵島細胞。
【図１２Ｂ】純粋な合成フラクション５．４及び５．３と単離したフラクション５．４の機能効果の比較。生理活性脂質で短期（１時間）及び長期（７２時間）処理後、インスリン分泌を評価した。若いラットの初代膵島細胞。
【図１２Ｃ】純粋な合成フラクション５．４及び５．３と単離したフラクション５．４の機能効果の比較。生理活性脂質で短期（１時間）及び長期（７２時間）処理後、インスリン分泌を評価した。ＩＮＳ１Ｅｐ８１及びＩＮＳＥ  ｐ９６。
【図１３】生理活性脂質でのグルコース刺激インスリン分泌。マウス膵島細胞（Ａ）又はＩｎｓ１Ｅ細胞（Ｂ）において、５０ｐＭでの７２時間の処理後、フラクション５．３から特定された生理活性脂質プロスタグランジンＤ２グリセロールエステル（ＰＧＤ２Ｇ）は、インスリン分泌を増加させた。ＰＧＤ２Ｇ処理後、グルコース刺激インスリン放出を、ＫＲＢ溶液における低グルコース（２ｍＭ）及び高グルコース（２０ｍＭ）条件で測定した。インスリン放出は、Ｉｎｓ１Ｅ細胞及びマウス膵島におけるインスリンの全量からの放出として表現される。
【図１４】総タンパク質量に正規化された生理活性脂質でのインスリン分泌。フラクション５．３から特定されたプロスタグランジンＤ２グリセロールエステル（ＰＧＤ２Ｇ）が、グルコースでの刺激下で、インスリン分泌を急性的に刺激した。グルコース刺激インスリン放出を、各種濃度（４７０ｐＭ、２．３ｎＭ、２３０ｎＭ）の生理活性脂質の存在下で低グルコース（２ｍＭ）及び高グルコース（２０ｍＭ）において測定した。生理活性脂質は、特に２．５ｎＭ〜２５０ｎＭの濃度でグルコース刺激インスリン放出を向上させた。結果を、総タンパク質量に正規化したインスリン放出として示す。
【図１５】生理活性脂質でのヒト膵島におけるβ細胞機能及びインクレチン応答の向上。生理活性脂質、すなわち５０ｐＭでフラクション５．３から特定されたプロスタグランジンＤ２グリセロールエステル（ＰＧＤ２Ｇ）は、７２時間の処理後、（Ａ）痩せた２型糖尿病患者及び（Ｂ）糖尿病でない肥満のドナー由来のヒト膵島におけるβ細胞機能及びインクレチン応答を向上させた。グルコース刺激インスリン放出を、低グルコース（２ｍＭ）、高グルコース（２ｍＭ）及び高グルコース（２０ｍＭ）＋０．１μＭエキセンディン４において測定した。
【図１６】サイトカイン誘発性機能不全後のグルコース刺激インスリン放出の向上。フラクション５．３から特定された生理活性脂質プロスタグランジンＤ２グリセロールエステル（ＰＧＤ２Ｇ）ＰＧＤ２Ｇは、ヒト膵島をサイトカイン誘発性機能不全から保護した。（Ａ）糖尿病でない痩せたドナー、（Ｂ）２型糖尿病の痩せたドナー及び（Ｃ）２型糖尿病の肥満のドナー由来のヒト膵島を、５０ｐＭの生理活性脂質で７２時間処理した。直近の４８時間の間に、サイトカインミックスを添加した（ＩＬ１β１０ｎｇ／ｍＬ、ＴＮＦα２５ｎｇ／ｍＬ及びＩＮＦγ１０ｎｇ／ｍＬ）。グルコース刺激インスリン放出を、低グルコース（２ｍＭ）及び高グルコース（２０ｍＭ）条件で測定した。生理活性脂質は、サイトカイン誘発性機能不全後、グルコース刺激インスリン放出を向上させることができた。
【図１７】生理活性脂質によるＧＬＰ−１分泌の増加。フラクション５．３から特定された生理活性脂質プロスタグランジンＤ２グリセロールエステル（ＰＧＤ２Ｇ）は、ＧＬＰ１分泌を増加させた。ＧＬＰ−１分泌分析は、０．２３ｎＭ〜２．３ｎＭの各種濃度の生理活性脂質の存在下で、ヒトＨ７１６細胞を用いて行った。プロスタグランジンＤ２グリセロールエステルは、Ｈ７１６細胞におけるＧＬＰ１分泌（総タンパク質量に正規化したＧＬＰ１放出として表現した）を著しく向上させた。
【図１８】フラクション５．４から特定された生理活性脂質１５−デオキシ−Δ１２，１４−ＰＧＪ２−２−Ｇ及びフラクション５．３から特定されたプロスタグランジンＤ２グリセロールエステル（ＰＧＤ２Ｇ）は、インスリン分泌を増加させた。インスリン分泌分析を、糖尿病でない痩せたドナー由来のヒト膵島を用いて低グルコース（２ｍＭ）及び高グルコース（２０ｍＭ）条件で行った。フラクション５．４から特定された生理活性脂質１５−デオキシ−Δ１２，１４−ＰＧＪ２−２−Ｇ（２５０ｐＭ）は、白色脂肪組織（ＷＡＴ）フラクション（１／１００希釈）が存在する場合及び存在しない場合の両方でインスリン分泌を増加させた。フラクション５．３から特定された生理活性脂質プロスタグランジンＤ２グリセロールエステル（ＰＧＤ２Ｇ）も、対照組織と比較して、インスリン分泌を増加させた。  両生理活性脂質は、グルコース刺激インスリン放出を急速に向上させた。結果は、膵島１０個あたりの分泌インスリンをｎｇで表現する。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
一態様において、本発明は、対象における炎症性疾患の治療及び／又は予防に使用するための酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルを用意する。
【００４７】
酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステル
酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルは、本明細書において「生理活性脂質」ということもある。
【００４８】
酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルは、少なくとも１つの酸素化脂肪酸部位又はその誘導体にエステル結合で結合したグリセロールを含む生理活性脂質を示す。酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルは、グリセロール部位の任意の炭素にエステル結合で結合した、１つ、２つ若しくは３つの酸素化脂肪酸部位又はその誘導体を含み得る。
【００４９】
例えば、酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルは、以下の構造を有し得る。
【化１】
0006646671.tif 000002
【００５０】
式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３のうちの少なくとも１つは、エステル結合で炭素に結合した酸素化脂肪酸である。
【００５１】
「脂肪酸部位」は、長鎖脂肪族末端を有するカルボン酸を示す。脂肪酸部位は、炭素数が４〜２８でもよい。脂肪酸部位は、飽和又は不飽和であってもよい。短鎖脂肪酸は、炭素数が６未満であり、中鎖脂肪酸は、炭素数が６〜１２であり、長鎖脂肪酸は炭素数が１３〜２１であり、超長鎖脂肪酸は、炭素数が２２を超える。
【００５２】
脂肪酸は、長鎖脂肪酸又は超長鎖脂肪酸でもよい。
【００５３】
脂肪酸としては、アラキドン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、サピエン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、リノール酸及びエイコサペンタエン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
「酸素化」は、脂肪酸部位が、脂肪酸鎖内に少なくとも１つの酸素化官能基を含むことを意味する。すなわち、酸素化は、グリセロール部位に結合するエステル基に加えて、少なくとも１つの酸素化官能基を含む。
【００５５】
例えば、酸素化官能基は、水酸基、エポキシ基、メトキシ基又はオキソ官能基であってもよい。ある実施形態において、酸素化官能基は、水酸基である。
【００５６】
「その誘導体」は、酸素化脂肪酸部位から形成することができる任意の分子を示す。例えば、その誘導体は、酸素化アラキドニル、プロスタグランジン又はプロスタテトラエン酸部位を示し得る。
【００５７】
酸素化アラキドニルグリセロールエステル
酸素化アラキドニルグリセロールエステルは、少なくとも１つの酸素化アラキドン酸部位がグリセロール部位にエステル結合で結合しているグリセロールエステルを示す。
【００５８】
酸素化アラキドニルグリセロールエステルは、グリセロール部位にエステル結合で結合した１つ、２つ又は３つのアラキドン酸基を含み得る。酸素化アラキドニルグリセロールエステルは、グリセロール部位にエステル結合で結合した単一のアラキドン酸基を含み得る。単一のアラキドン酸基は、グリセロール部位のＣ１、Ｃ２又はＣ３にエステル結合で結合し得る。
【００５９】
プロスタグランジングリセロールエステル
プロスタグランジングリセロールエステルは、少なくとも１つのプロスタグランジン部位がグリセロール部位にエステル結合で結合しているグリセロールエステルを示す。
【００６０】
プロスタグランジングリセロールエステルは、主に２−アラキドニルグリセロールのシクロオキシゲナーゼによる酸素化により生成され、プロスタグランジンＤ／Ｅシンターゼ等のその他の特異的な酵素もまた、特異的なプロスタグランジングリセロールの合成に関わる。プロスタグランジンは、脂肪酸アシルから酵素により誘導され、５−炭素環を含む、２０個の炭素原子を含む。
【００６１】
プロスタグランジンとしては、プロスタグランジンＡ２（ＰＧＡ２）、ＰＧＢ２、ＰＧＣ２、ＰＧＤ２、ＰＧＥ２（ＰＧＥ２）、ＰＧＦ２α及びＰＧＧ２が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
プロスタグランジングリセロールエステルは、グリセロール部位にエステル結合で結合した１つ、２つ又は３つのプロスタグランジン部位を含み得る。プロスタグランジングリセロールエステルは、グリセロール部位にエステル結合で結合した単一のプロスタグランジン基を含み得る。単一のプロスタグランジン基は、グリセロール部位のＣ１、Ｃ２又はＣ３にエステル結合で結合し得る。
【００６３】
プロスタテトラエン酸グリセロールエステル
プロスタテトラエン酸グリセロールエステルは、少なくとも１つのプロスタテトラエン酸部位がグリセロール部位にエステル結合で結合しているグリセロールエステルを示す。
【００６４】
プロスタテトラエン酸グリセロールエステルは、主に２−アラキドニルグリセロールのシクロオキシゲナーゼによる酸素化により生成される。
【００６５】
本発明にかかる使用のためのプロスタテトラエン酸グリセロールエステルは、以下の群：１１−オキソ−５Ｚ，９，１２Ｅ，１４Ｅ−プロスタテトラエン酸−１グリセロールエステル；９，１５Ｓ−ジヒドロキシ−１１−オキソ−５Ｚ，１３Ｅ−プロスタジエン酸，１−グリセリルエステル；１１−オキソ−５Ｚ，９，１２Ｅ，４Ｅ−プロスタテトラエン酸−２−グリセロールエステル；１１−オキソ−１５Ｓ−ヒドロキシ−５Ｚ，９Ｚ，１３Ｅ−プロスタトリエン酸−１−グリセロールエステル；及び９，１５Ｓ−ジヒドロキシ−１１−オキソ−５Ｚ，１３Ｅ−プロスタジエン酸，２−グリセリルエステルから選択され得る。
【００６６】
プロスタテトラエン酸グリセロールエステルは、１１−オキソ−５Ｚ，９，１２Ｅ，１４Ｅ−プロスタテトラエン酸−１グリセロールエステル、９，１５Ｓ−ジヒドロキシ−１１−オキソ−５Ｚ，１３Ｅ−プロスタジエン酸，１−グリセリルエステル又は１１−オキソ−５Ｚ，９，１２Ｅ，１４Ｅ−プロスタテトラエン酸−２−グリセロールエステルであってもよい。
【００６７】
組成物
一態様において、本発明は、本明細書に記載しているように、１種以上の酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルを含む組成物に関する。
【００６８】
組成物は、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種又は少なくとも５種の酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルを含み得る。
【００６９】
組成物は、以下の群：１１−オキソ−５Ｚ，９，１２Ｅ，１４Ｅ−プロスタテトラエン酸−１グリセロールエステル；９，１５Ｓ−ジヒドロキシ−１１−オキソ−５Ｚ，１３Ｅ−プロスタジエン酸，１−グリセリルエステル；１１−オキソ−５Ｚ，９，１２Ｅ，４Ｅ−プロスタテトラエン酸−２−グリセロールエステル；１１−オキソ−１５Ｓ−ヒドロキシ−５Ｚ，９Ｚ，１３Ｅ−プロスタトリエン酸−１−グリセロールエステル；及び９，１５Ｓ−ジヒドロキシ−１１−オキソ−５Ｚ，１３Ｅ−プロスタジエン酸，２−グリセリルエステルから選択される１種以上のプロスタテトラエン酸グリセロールエステルを含み得る。
【００７０】
医薬組成物
本発明にかかる使用のための酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステル又は組成物は、医薬組成物として用意され得る。
【００７１】
医薬組成物は、薬理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤又は補助剤とともに、本明細書に定義された１種以上の酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルを含み得る。医薬担体、賦形剤又は希釈剤の選択は、意図した投与経路及び標準の薬務に関して、選ぶことができる。医薬組成物は、担体、賦形剤又は希釈剤として（又はそれに加え）、任意の好適な（１つ又は複数の）結合剤、潤滑剤、懸濁化剤、コーティング剤、可溶化剤及びその他キャリア剤を含み得る。
【００７２】
投与
酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルの投与は、有効成分を生物学的に利用可能にする任意の経路を使用して、行うことができる。例えば、酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルは、経口及び非経口経路、腹腔内に、静脈内に、皮下に、経皮的に、筋肉内に、局所送達を経て、例えば、カテーテル又はステントを用いて投与することができる。
【００７３】
治療及び／又は予防
本発明は、対象における炎症性疾患の治療及び／又は予防に使用するための酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルを用意する。
【００７４】
炎症性疾患の予防のための使用は、酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルの予防的使用に関する。ここで、酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルは、疾患の原因を防ぐか、若しくは減退させるか、又は疾患に関連した少なくとも１つの症状の発症を減らすか、若しくは防ぐために、炎症性疾患にまだ罹患していない及び／又は疾患のいずれの症状も出ていないに対象投与され得る。対象は、炎症性疾患に関する疾病素質を有し得るか、又は炎症性疾患を発症するリスクがあると考えられる。
【００７５】
炎症性疾患の治療のための使用は、酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルの治療的使用に関する。ここで、酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルは、疾患に関連した少なくとも１つの症状を緩和、低減若しくは改善するために又は炎症性疾患の進行を遅らせるか、低減させるか、若しくは阻止するために、既存の疾患又は症状を有する対象に投与され得る。
【００７６】
対象
対象は、ヒト又は動物の対象であってもよい。対象は、哺乳類の対象であってもよい。一実施形態において、対象は哺乳類、好ましくはヒトである。対象は代替的に、例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ又はブタを含む非ヒトの哺乳類であってもよい。一実施形態において、対象は、イヌ又はネコ等のコンパニオンアニマルである。
【００７７】
対象は、本明細書に記載しているように、炎症性疾患を有し得る。「炎症性疾患を有する」は、対象が病態に関連した少なくとも１つの症状を有することを示す。
【００７８】
対象は、本明細書に記載しているように、炎症性疾患のリスクを有し得る。「炎症性疾患のリスク」は、対象が炎症性疾患にまだ罹患していない及び／又は疾患のいずれの症状も出ていないことを示す。対象は、炎症性疾患に関する疾病素質を有し得るか、又は炎症性疾患を発症するリスクがあると考えられる。
【００７９】
炎症性疾患
一態様において、本発明は、炎症性疾患の治療及び／又は予防に使用するための酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルを用意する。典型的な炎症性疾患は、当業者に既知であり、心血管疾患、癌、関節炎、自己免疫性関連状態、肥満、代謝性疾患、インスリン抵抗性及び２型糖尿病を含む疾患を含むが、これらに限定されない。
【００８０】
炎症は、病原体、損傷した細胞及び／又は刺激物等の有害な刺激に対する組織の複雑な生物学的応答である。一般に、炎症は、有害な刺激を除去し、組織の治癒プロセスを開始しようとする、生物の防御作用である。しかし、炎症の調節が不適切な場合、対象の年齢に関係なく、いくつかの病気を引き起こし得る。
【００８１】
炎症性疾患は、加齢に関連し得る。
【００８２】
加齢は、多くの場合、体液性免疫不全の増加に付随した細胞性免疫応答の顕著な低下、例えば、ワクチンに対する応答の低下等の免疫系の調節異常に関連する。更に、加齢は、低悪性度の炎症の状態と関連することも多い。特に、多くの高齢の対象は、罹患率及び死亡率に寄与する感染性及び非感染性疾患のリスクが高い。
【００８３】
肥満
肥満は、白色脂肪組織（ＷＡＴ）の過度の蓄積によって生じる。肥満は、重度の代謝性障害（メタボリックシンドローム、ＭＳ）に関連し、豊かな社会における健康管理システムの重要な問題の１つを表す。
【００８４】
「ボディマス指数」すなわち「ＢＭＩ」は、体重のキログラム値を身長のメートル値の二乗で除算した比率を意味する。「過体重」は、２５〜３０のＢＭＩを有する成人のヒトに対して定義される。「肥満」とは、動物、特にヒト及び他の哺乳類の脂肪組織に蓄えられた自然エネルギーが、一定の健康状態又は死亡率の増加に関係する点まで増加した状態である。「肥満の」とは、３０を超えるＢＭＩを有する成人のヒトに対して定義される。
【００８５】
ＷＡＴは、多数のシグナルを発生し、このシグナルには、隣接細胞に影響するだけでなく，他の周辺組織及び脳を標的にする、サイトカイン、ホルモン、成長因子、補体因子及び基質タンパク質を含む。自然免疫系の活性化を含む全身性炎症プロセスは、脂肪組織拡張及び低酸素により引き起こされる。
【００８６】
したがって、肥満は、脂肪細胞の代謝に影響を及ぼし得るＷＡＴの慢性低悪性度炎症に関連する。慢性炎症は、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−α及びＣ反応性タンパク質を含むが、これらに限定されない、様々な炎症マーカーに関連する。
【００８７】
肥満関連慢性低悪性度炎症は、肥満誘発性インスリン抵抗性の重要な原因であり、２型糖尿病（ＴＩＩＤ）の発症のリスク因子である。肥満はＴＩＩＤの主要なリスク因子の１つであるが、肥満の対象がすべて糖尿病性があるわけではない。肥満関連慢性低悪性度炎症は、肥満誘発性インスリン抵抗性の重要な原因としても認められている。
【００８８】
したがって、対象は、インスリン抵抗性及び／又はＴＩＩＤを発症するリスクがある肥満の対象であってもよい。
【００８９】
インスリン抵抗性
インスリン抵抗性は、標的細胞又は全器官が曝露したインスリン濃度に対する応答性の低下として定義され得る。この定義は、一般にインスリン媒介グルコース処理に対する感受性の欠陥を示すために使用される。
【００９０】
インスリンは、細胞のエネルギー供給及び多量栄養素のバランスを調節し、摂食状態のタンパク同化プロセスを指示する重要なホルモンである。インスリンは、筋肉及び脂肪組織等のインスリン依存性組織へのグルコースの細胞内輸送に必須である。生理学的に全身レベルで、インスリンの作用は、他のホルモンの相互作用に影響を受ける。インスリンは、摂食状態において代謝プロセスを進める優勢なホルモンであるが、成長ホルモン及びインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）と協調して作用する。他の刺激のうち、インスリン誘発性低血糖を予防するインスリンに応答して、成長ホルモンが分泌される。他のインスリン拮抗ホルモンは、グルカゴン、グルココルチコイド及びカテコールアミンを含む。これらのホルモンは、空腹状態において代謝プロセスを進める。
【００９１】
インスリンシグナル伝達において受容体後の欠陥により、インスリン抵抗性は細胞レベルで顕著である。潜在的な機序は、インスリン受容体、ＩＲＳタンパク質若しくはＰＩＰ−３キナーゼのチロシンリン酸化のダウンレギュレーション、不全状態若しくは遺伝子多型を含むか、又はＧＬＵＴ４機能の異常性を伴い得る（Ｗｈｅａｔｃｒｏｆｔ  ｅｔ  ａｌ；Ｄｉａｂｅｔ  Ｍｅｄ．２００３；２０：２５５−６８を参照）。
【００９２】
インスリン抵抗性は、ボディマス指数、ウェスト周り、特にウェスト対ヒップの比の増加と関連している。これらは、肥満の増加、特に内臓脂肪組織の量の増加を反映する。内臓脂肪組織は、腸の周りの腹腔内脂肪を示し、肝臓脂肪と関連する。内臓脂肪組織は、皮下脂肪とは異なる代謝性を有する。内臓脂肪組織は、遊離脂肪酸アシルの代謝回転に関して、より代謝的に活性である。遊離脂肪酸アシルの流量が増加すると、細胞レベルのインスリン抵抗性が促進され、肝臓のＶＬＤＬ産生が増加する。
【００９３】
脂肪組織は、炎症促進性活性を有するサイトカイン、例えば、ＴＮＦα、インターロイキン及びＰＡＩー１を含む、インスリン抵抗性に関連した多数のサイトカインを産生する。
【００９４】
肥満において見られるインスリン抵抗性は、筋肉及び肝臓の組織におけるトリグリセリド蓄積を促進する脂肪細胞由来遊離脂肪酸アシルが増加しながら、主として筋肉及び肝臓に影響を与えると考えられる。これにより、脂肪細胞はインスリン抵抗性を有しやすい。遊離脂肪酸アシルの流量は、内臓脂肪組織から、更には遺伝学的に媒介された脂肪細胞インスリン抵抗性を有する個体において、より大きい。肥満を増加させる作用においては個体差が存在するが、インスリン抵抗性になりやすい個体におけるインスリン抵抗性は、体重増加により悪化し、体重減少により改善する。
【００９５】
したがって、インスリン抵抗性は、肥満誘発性インスリン抵抗性であり得る。
【００９６】
対象は、ＴＩＩＤを発症するリスクがあるインスリン抵抗性を有する対象であってもよい。
【００９７】
２型糖尿病（ＴＩＩＤ）
ＴＩＩＤは、世界的に有病率が上昇している慢性代謝性障害である。世界のいくつかの国では、影響を受ける人の数が加齢母集団の増加により、次の１０年で倍増すると予測される。
【００９８】
ＴＩＩＤは、インスリン抵抗性、インスリン産生の低下及び最終的な膵β細胞不全によってもたらされるインスリン非感受性を特徴とする。これにより、肝臓、筋細胞及び脂肪細胞へのグルコース輸送が減少する。高血糖に関連した脂肪の破壊が増加する。
【００９９】
この機能不全の結果、空腹時に上昇するグルカゴン及び肝臓のグルコースの量が、食事によって抑制されない。インスリンの不適当な量及びインスリン抵抗性の上昇により、高血糖を生じる。
【０１００】
ＴＩＩＤの人々は、糖尿病性ケトアシドーシス（ＤＫＡ）、高浸透圧性高血糖状態（ＨＨＳ）、網膜症、心疾患、腎症及び神経障害を含む、様々な型の短期及び長期両方の合併症にかかりやすい。このような合併症により、早期死亡になることがある。
【０１０１】
本発明者らは、驚くべきことに、酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルが膵β細胞からのインスリン分泌を増加させ、膵β細胞におけるアポトーシスの量を低減させることができることを示した。
【０１０２】
したがって、一態様において、本発明は、対象におけるインスリン分泌の調節に使用するための酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルを用意する。インスリン分泌の調節は、対象におけるインスリン分泌の量の増加を示し得る。例えば、酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルは、均等な未処置の対照におけるインスリン分泌の量と比較して、１．５倍、２倍、５倍又は１０倍までインスリン分泌の量を増加させることができる。
【０１０３】
ＴＩＩＤの重要な特性は、膵β細胞が機能不全となり、グルコース刺激に非感受となるため、インスリン分泌の量を増加させることにより特異的に作用する治療に無反応になることである。本明細書に記載している使用するための酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルは、一般的炎症の調節、ミトコンドリアの機能及びアポトーシスを含む広範な機能を介して作用する。したがって、本酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルは、インスリン分泌の刺激に加え、ＴＩＩＤにおけるインスリン抵抗性の発症に寄与することが知られている機序及び経路を積極的に調節するため、ＴＩＩＤの治療として有利である。
【０１０４】
上述したとおり、肥満は、ＴＩＩＤの発症にとって主要なリスク因子であるが、肥満患者がすべてＴＩＩＤを発症するわけではない。
【０１０５】
したがって、一態様において、本発明は、肥満の対象におけるＴＩＩＤの発症の予防又は遅延に使用するための酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルを用意する。
【０１０６】
代謝性疾患
代謝性疾患又は障害は、代謝機能の変調又は障害を特徴とする状態である。代謝性障害は、高血糖、糖尿病前症、糖尿病（１型及び２型）、肥満、インスリン抵抗性及びメタボリックシンドロームを含むが、これらに限定されない。
【０１０７】
リポジストロフィー
本発明の酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルは、リポジストロフィーの治療及び／又は予防のために使用することができる。リポジストロフィーは、体の脂肪組織の異常又は変性状態を特徴とする医学的状態である。特に、リポジストロフィーは、人がインスリン注射を同じ箇所に繰り返し行う場合に皮膚に形成される塊又は小さなへこみになることがある。
【０１０８】
リポジストロフィーの副作用の１つが、注射による投薬の拒絶反応、投薬の吸収の遅れ又は出血を引き起こし得る損傷であり、ひいては投薬を拒否するようになる。これらのシナリオのいずれにおいても、糖尿病のためのインスリン等の投薬の適量を正確に計測することができず、かつ投薬が適用される疾患の治療が損なわれ、それにより医学的状態が悪化する。
【０１０９】
細胞
本発明にかかる使用のための酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルは、以下の群：膵臓細胞、腸内分泌細胞、上皮細胞、肝臓細胞、脂肪細胞又は神経細胞から選択される細胞に作用し得る。
【０１１０】
本発明で使用される、用語「に作用する」は、細胞の生理学的活性の変化を引き起こすことを意味する。
【０１１１】
例えば、酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルは、インスリン、グルカゴン様ペプチド−１（glucagon-like peptide-1、ＧＬＰ１）及び／又は胃抑制ポリペプチド（gastricinhibitory polypeptide、ＧＩＰ）等のホルモンの細胞による分泌を刺激し得る。酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルは、細胞のアポトーシス、特に酸化又は炎症性ストレスに関連したアポトーシスを防止し得る。酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルは、細胞のインスリン分泌能を支援し得る。
【０１１２】
細胞は、酸化及び／又は炎症性ストレスに対して感受性があってもよい。
【０１１３】
細胞は、脂質代謝の調節に関与し得る。
【０１１４】
腸内分泌細胞は、胃腸管及び膵臓の特殊な内分泌細胞である。腸内分泌細胞は、各種の刺激胃腸管ホルモン又はペプチドに応答して、ホルモンを産生し、このホルモンを全身作用の目的で血流に放出するか、局所的なメッセンジャーとして拡散するか、又は腸管の神経系に透過して、神経応答を活性化する。
【０１１５】
膵臓は、血中を循環するインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン及び膵ポリペプチドを含む、いくつかの重要なホルモンを産生する内分泌腺である。ランゲルハンス島は、内分泌腺（すなわち、ホルモン産生）細胞を含む膵臓の領域である。ランゲルハンス島で産生されたホルモンは、以下の（少なくとも）５種類の細胞により直接血流に分泌される。
【０１１６】
グルカゴンを産生するα細胞（全膵島細胞の１５〜２０％）
【０１１７】
インスリン及びアミリンを産生するβ細胞（６５〜８０％）
【０１１８】
ソマトスタチンを産生するδ細胞（３〜１０％）
【０１１９】
膵ポリペプチドを産生するＰＰ細胞（γ細胞）（３〜５％）
【０１２０】
グレリンを産生するε細胞（＜１％）
【０１２１】
本発明にかかる使用のための酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルは、膵β細胞に作用し得る。膵β細胞は、膵臓のインスリンを産生する細胞であり、ランゲルハンス島にて最も多い細胞である。
【０１２２】
内分泌細胞は、ホルモン類を分泌する。例えば、内分泌細胞は、腸、胃又は膵臓の内分泌細胞である。
【０１２３】
腸管内分泌細胞は、一緒にクラスター化せず、腸管の至るところで単一細胞として広がっている。分泌されるホルモン類は、ソマトスタチン、モチリン、コレシストキニン、ニューロテンシン、血管作動性腸管ペプチド及びエンテログルカゴンを含む。
【０１２４】
本発明にかかる使用のための酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルは、Ｋ細胞又はＬ細胞に作用し得る。Ｋ細胞は、胃抑制ペプチド、すなわちインクレチンを分泌する。Ｌ細胞は、インクレチンともいうグルカゴン様ペプチド−１及びグルカゴン様ペプチド−２を分泌する。
【０１２５】
腸クロム親和細胞は、セロトニン及びヒスタミンを分泌する内分泌細胞である。
【０１２６】
胃の内分泌細胞は、胃腺、ほとんどの場合は胃腺の基底部に見られる。Ｇ細胞はガストリンを分泌し、迷走神経の節後線維は、副交感神経刺激時にガストリン放出ペプチドを放出し、分泌を刺激することができる。
【０１２７】
胃内分泌細胞より産生される他のホルモン類は、コレシストキニン、ソマトスタチン、血管作動性腸管ペプチド、サブスタンスＰ、α−エンドルフィン及びγ−エンドルフィンを含む。
【０１２８】
上皮細胞は、胃及び泌尿器等の体腔の内側及び外側の内層を覆う。いくつかの上皮細胞、例えば、腸の内層に見られる上皮細胞は、原形質膜の頂端側に位置する能動輸送系を使用し、ろ過された物質の輸送において支援を行う。例えば、腸の内側を覆う上皮細胞の原形質膜のある領域内に位置するグルコース−Ｎａ＋シンポートは、細胞に、細胞の原形質膜を通過するＮａ＋濃度勾配を作ることができ、これにより、腸の管腔からグルコースを取り込むために必要なエネルギーを提供する。グルコースは、次に下層結合組織に放出され、濃度勾配を低いほうへ促進拡散により血液供給に輸送される。
【０１２９】
細胞は、肝細胞等の肝臓細胞であってもよい。肝臓は、炭水化物から脂肪酸アシルを形成し、脂肪酸アシル及びグリセロールからトリグリセリドを合成するように、糖質代謝に関連する。肝細胞は、リポタンパク質（ＶＬＤＬ、ＨＤＬ）を構築し、運搬するアポタンパク質も合成する。また、肝臓は、糖新生、つまり、アラニン、グリセロール及びオキサロ酢酸塩等の前駆物質からの炭水化物の形成にとって、主要な体内の部位である。
【０１３０】
肝臓は、体循環から多くの脂質を受け取り、カイロミクロンレムナントを代謝するように、脂質代謝にも関連する。肝臓は、酢酸塩からコレステロールも合成し、更に胆汁塩も合成する。
【０１３１】
脂肪細胞は、脂肪としてのエネルギーの貯蔵において特定化された脂肪組織を主として構成する細胞である。脂肪組織には、白色脂肪組織（ＷＡＴ）及び褐色脂肪組織（brown adipose tissue、ＢＡＴ）の２種類があり、それぞれ白色脂肪及び褐色脂肪としても知られ、２種類の脂肪細胞を含む。肥満は、脂肪細胞の大きさの増大（肥大）及び小さい程度での細胞増殖（過形成）による脂肪量の膨張を特徴とする。肥満者の脂肪細胞において、グリセロール、ホルモン及び炎症促進性サイトカイン等の代謝モジュレーターの生成が増加し、インスリン抵抗性が発症する。
【０１３２】
脂肪細胞における脂肪の生成は、不飽和脂肪酸アシルの合成、グルコースの取り込みを促進し、脂質生成を刺激する遺伝子の転写を活性化するインスリンにより強く刺激を受ける。
【０１３３】
細胞は、ニューロン又はアストロサイト等の神経細胞であってもよい。アストロサイトは、脳及び脊髄における星状膠細胞である。アストロサイトは、ヒトの脳で最も多い細胞である。アストロサイトは、血液脳関門を形成する内皮細胞の生化学的補助、神経組織への栄養の提供、細胞外イオンバランスの維持並びに外傷性損傷の後の脳及び脊髄の修復及び瘢痕プロセスにおける役割を含む、多くの機能を実行する。
【０１３４】
方法
更に、本発明は、インビボで本発明の第１の態様で定義された少なくとも１種の酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルの産生を誘導するか、又は増加させるための方法に関する。
【０１３５】
本方法は、本発明の第１の態様で定義された少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、複数の種類もの酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルの産生を誘導するか、又は増加させ得る。
【０１３６】
本方法は、対象の肝臓及び／又は白色脂肪組織における酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルの量を増加させ得る。増加という用語は、例えば、本方法が行われる前の酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルの量と比較して、１．５倍、２倍、５倍又は１０倍までの増加を示し得る。酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルは、本方法が実施される前に対象の肝臓及び／又は白色脂肪組織に存在しない場合もある。
【０１３７】
本方法は、次の工程を含み得る。
ａ）アラキドニルグリセロール（ＡＧ）、ジアシルグリセロール（１，２−ＤＡＧ）及び／若しくはトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）から選択される前駆物質を対象に投与すること並びに／又は
（ｂ）対象において、以下の群：ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）、ジアシルグリセロールリパーゼ（ＤＡＧＬ）、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ）、Ｎ−アシルホスファチジルエタノールアミン特異的ホスホリパーゼＤ（ＮＡＴＥ−ＰＬＤ）、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）、プロスタグランジンＦシンターゼ（ＰＧＦＳ）、プロスタグランジンＥシンターゼ（ＰＧＥＳ）、プロスタグランジンＩシンターゼ（ＰＧＩＳ）、プロスタグランジンＤシンターゼ（ＰＧＤＳ）及び／又はトロンボキサンＡ（２）シンターゼ（ＴＸＡＳ）から選択される酵素の発現又は活性を誘導するか、又は増加させること。
【０１３８】
上述した酵素の発現は、遺伝子治療、免疫応答の刺激、免疫細胞の局所浸潤又は脂質プール及び／若しくは脂質ラフトにおける変性により、増加し得る。
【０１３９】
前駆物質の投与は、有効成分を生物学的に利用可能にする様々な経路のいずれかを使用して、行い得る。例えば、前駆物質は、経口及び非経口経路、腹腔内に、静脈内に、皮下に、経皮的に、筋肉内に、局所送達を経て、投与することができる。
【０１４０】
本発明は、炎症性疾患の治療及び／又は予防に使用するための酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステル前駆物質も提供する。
【０１４１】
治療方法
本発明は、対象における炎症性疾患を治療及び／又は予防するための方法であって、本発明の第１の態様で定義された少なくとも１種の酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルを対象に投与すること、又は上述の方法により、インビボで第１の態様で定義された少なくとも１種の酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルの産生を誘導するか、又は増加させること、を含む、方法に更に関する。
【０１４２】
炎症性疾患は、本明細書で定義された任意の疾患であってよい。
【０１４３】
診断方法
更なる態様において、本発明は、対象における炎症性疾患を診断するか、又は炎症性疾患を発症するリスクを有する対象を特定するための方法であって、
（ａ）対象由来のサンプル中の、少なくとも１種の酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルの量を決定することと、
（ｂ）サンプル中の酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステル（１種又は複数種類）の量を基準値と比較することと、を含み、
基準値と比較して、サンプル中の低量の酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステル（１種又は複数種類）により、炎症性疾患又は炎症性疾患を発症するリスクが示される、方法に関する。
【０１４４】
少なくとも１種の酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルの量の決定
サンプル中の酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルの量は、任意の好適な方法によって測定又は決定することができる。例えば、質量分析法（mass spectroscopy、ＭＳ）を使用してもよい。代替実施形態において、他の分光法、クロマトグラフ法、標識技術又は定量化学的な方法を使用してもよい。サンプル中の酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステル量は、質量分析法、特に液体クロマトグラフィータンデム型質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって測定することができる。
【０１４５】
酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルは、液体クロマトグラフィー（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を使用して、決定することができる。例えば、酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルの量を、Ｍｅｓｏｏｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｌｅｕｋｅｍｉａ（２０１４）２８，１３８１〜１３８７）に記載のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法を使用して、決定することができる。
【０１４６】
サンプル中の酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルの量及び基準値を通常、同じ分析方法を使用して、決定することができる。
【０１４７】
サンプル
本方法は、対象から得られるサンプル中の少なくとも１種の酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルの量を決定する工程を含む。したがって、本方法は、通常、ヒト又は動物の身体の外側で、例えば、試験を行う対象から事前に得た体液サンプルに対して行われる。サンプルは、血液から得られてもよく、すなわち、サンプルは、全血又は血液フラクションを含んでもよい。サンプルは、血漿又は血清を含んでもよい。
【０１４８】
血液サンプルを採取し、かつ血液フラクションを分離する技術は当該技術分野において既知である。例えば、静脈血サンプルは、針を使用して患者から採取され、プラスチックチューブ内に堆積されてもよい。採取チューブは、例えば、スプレーコーティングしたシリカ、及び血清分離のためのポリマーゲルを含んでもよい。血清は、室温において、１３００ＲＣＦで１０分間遠心分離によって分離され、−８０℃で小さなプラスチックチューブに保存されてもよい。
【０１４９】
サンプルは、血清、血漿、尿検体又は脂肪組織バイオプシーサンプルであってもよい。
【０１５０】
基準値との比較
本方法は、試験サンプル中の少なくとも１種の酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルの量を１つ以上の基準値又は対照値と比較する工程を更に含み得る。通常、本方法において決定された各個体の酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルに対する特定の基準値が使用される。基準値は、酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルの通常量、すなわち、対照の対象の同じ種類のサンプル（例えば、血清又は血漿）中の酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルの量であってもよい。対照の対象は、例えば、普通の健常者又は糖尿病ではない肥満の対象であってもよい。基準値は、例えば、対象の対照集団、例えば、５、１０、１００又は１０００以上の対照の対象（この対象は、試験対象と年齢及び／又は性別が同じ又は同じでなくてもよい）における、酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルの平均量又は中央値量に基づいてもよい。
【０１５１】
対象の酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルバイオマーカー値と対応する基準値との差の程度は、どの対象がある種の介入から最も利益を得るかを決定するのにも有用である。
【０１５２】
試験サンプルにおける酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルの量は、例えば、基準値に比べ少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％又は少なくとも１００％減少し得る。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、基準値は同対象から先に得られた値である。これにより、以前の生活又は酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルバイオマーカー量に関する処理前と比較して、対象の現在の生活の作用の直接比較又は治療戦略が可能になり、改良を直接評価することができる。
【０１５４】
基準値を、試験サンプル中の酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステル量の決定に対応する方法を使用して、例えば、対照の対象から得た１つ以上のサンプルを使用して、決定することができる。例えば、いくつかの実施形態において、対照サンプルにおける酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステル量を、試験サンプルに対する並行分析において決定することができる。あるいは、いくつかの実施形態において、特定の種類のサンプル（例えば、血清又は血漿）中の個々の酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステル種の量に関する基準値を、例えば、公表された研究から先に入手することもできる。したがって、いくつかの実施形態において、基準値は先に決定してもよいし、又は得られた各試験サンプルに関する対照サンプルについて対応する測定を実施することなく、計算若しくは推測してもよい。
【０１５５】
炎症性疾患
炎症性疾患は、本明細書で定義された任意の炎症性疾患であってよい。一実施形態において、本方法を使用して、肥満の対象がＴＩＩＤを発症する可能性を予測することができる。前述のように、肥満はインスリン抵抗性及び場合により、ＴＩＩＤの発症の主要なリスク因子であるが、肥満の患者がすべてインスリン抵抗性及びＴＩＩＤを発症するわけではない。本発明者らは、驚くべきことに、酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルの減少量の量がインスリン抵抗性及びＴＩＩＤに関連すると結論付けた。したがって、本方法の一実施形態において、肥満の対象由来のサンプル中の酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルの量が、基準値に比べ、例えば、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％又は少なくとも１００％減少すると、肥満対象はＴＩＩＤを発症する可能性の上昇が予測され得る。
【０１５６】
本方法は、本明細書に定義された方法により少なくとも１種の酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルの産生を誘導又は増加することにより、炎症性疾患を有する又は炎症性疾患のリスクがあると本方法により決定された対象を治療する工程を更に含み得る。
【０１５７】
本発明は、
ｉ）細胞における炎症性サイトカインシグナル伝達の調節又は
ｉｉ）細胞のアポトーシスからの保護に使用するための、本発明の第１の態様で定義された酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルも用意する。
【０１５８】
炎症性サイトカインシグナル伝達
炎症は、多様な炎症性サイトカインにより媒介され、炎症性サイトカインは、２つの群：急性炎症に関与するもの及び慢性炎症応答の原因となるものに分けることができる。例えば、組織損傷に応対した炎症は、急性期における、血流の増加、並びに体液、白血球及びサイトカイン等の炎症性メディエーターの蓄積とともに血管透過性を特徴とする。亜急性／慢性期（以下、慢性期という）において、例えば、組織損傷の部位に存在する病原体（１種又は複数種類）に特異的な体液性及び細胞免疫応答の発現を特徴とする。急性及び慢性炎症性の両プロセス時、種々の可溶性因子が、細胞の接着分子の発現の増加及び化学誘引により、白血球動員に関連する。これらの可溶性メディエーターの多くは、常在細胞（例えば、線維芽細胞、内皮細胞、組織マクロファージ及びマスト細胞）及び新たに動員された炎症性細胞（例えば、単核、リンパ球、好中球及び好酸球）の活性化を調節し、これらのメディエーターには、炎症性プロセスへの全身性応答をするものもある。いくつかのサイトカインは、急性炎症性反応の媒介において重要な役割を果たす、すなわち、ＩＬ−１、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＩＬ−８、その他ケモカイン、ＧＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦである。慢性炎症性プロセスを媒介することが知られているサイトカインは、液性炎症に関するサイトカイン、例えば、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３及びトランスフォーミング増殖因子ｂ（ＴＧＦ−Ｂ）と、細胞炎症に寄与するサイトカイン、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ−γ誘導因子（ＩＧＩＦ）、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α及びＴＮＦ−βとに分けることができる。
【０１５９】
酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルは、細胞内の炎症性サイトカインシグナル伝達を調節し得る。特に、酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルは、ＩＬ−１β、ＴＮＦα及び／又はＩＦＮγ等の炎症性サイトカインへの細胞の応答を調節し得る。
【０１６０】
酸素化脂肪酸アシルグリセロールエステルは、細胞の炎症性応答によって活性化したＮＦｋＢシグナル伝達経路を下方制御し得る。
【０１６１】
アポトーシス
細胞は、熱、放射線、栄養欠乏、ウイルス感染又は低酸素等のストレスに応答して、細胞内アポトーシスシグナル伝達を開始する。細胞死の実際のプロセスが発生する前に、アポトーシスシグナルが、調節タンパク質にアポトーシス経路を開始させなければならない。このプロセスの２つの主要な調節方法としては、ミトコンドリア機能性を標的にすること又はＴＮＦ経路若しくはＦａｓ経路を介しシグナルを直接伝達することが確認されていた。
【０１６２】
小胞体ストレス、酸化ストレス及び炎症は、糖尿病におけるβ細胞不全の主要な原因である。本発明者らは、本発明の生理活性脂質が、炎症性サイトカインカクテルで処理した（実施例４）β細胞におけるアポトーシスシグナルを低減させることを示した。細胞炎症反応によって活性化したＮＦｋＢシグナル伝達経路を低減させることにより、生理活性脂質はアポトーシスからβ細胞を保護した。
【０１６３】
実施例により本発明を更に説明するが、これらの実施例は、当業者が本発明を実施するのに役立てるために提供することを意味するものであり、本発明の範囲を限定することを決して意図するものではない。
【実施例】
【０１６４】
実施例１  生理活性脂質フラクションを用いたＭＩＮ６細胞の急性刺激
ＭＩＮ６細胞を、完全ＤＭＥＭ培地に７０〜８０％コンフルエントで培養した。グルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）に対する生理活性脂質フラクションの急性作用を測定するために、低グルコース培地（Ｋｒｅｂｓ  Ｒｉｎｇｅｒ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｈｅｐｅｓ、すなわちＫＲＢＨ＋２ｍＭグルコース）において２時間細胞を飢餓させた後、生理活性脂質フラクション（ＫＲＢＨ１：５０希釈  ２０ｍＭ  Ｇｌｃ）の存在下で２０ｍＭグルコースを用いて３０分間刺激した。ＧＳＩＳに対する生理活性脂質の作用を、対照のグルコース＋ビヒクル（２％エタノール）と比較した。インスリン分泌を、インスリンＥＬＩＳＡキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ）を使用して測定した。
【０１６５】
これらのデータから、ＧＳＩＳに対する生理活性脂質の相乗効果があることが分かる（図１）。
【０１６６】
実施例２  β細胞機能及び生存に対する脂質フラクションでの長期処理の効果
生理活性脂質での長期処理がβ細胞機能及び生存に影響するか否かを判定するために、生理活性脂質の濃度を増加させ（１：１０００〜１：２０希釈）、ＭＩＮ６β細胞株をＤＭＥＭ培地中で４８時間処理した（表１参照）。長期処理の実験において、前処理の最後に生理活性脂質を培地から除去し、グルコース刺激後、細胞の機能を評価した。１００％に正規化したビヒクル処理細胞のベースラインと比較して、細胞数を計数することにより、細胞生存及び増殖を評価した。
【表１】
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【０１６７】
生理活性脂質の最高濃度では、フラクション１及び５のみが細胞生存において効果を示す（図２）。
【０１６８】
β細胞機能に対する生理活性脂質の長期間の効果を判定するために、ＭＩＮ６細胞を、生理学的範囲（１：１０００希釈）に近い濃度の生理活性脂質で７２時間処理した。処理の最後に、ＧＳＩＳを測定することにより、β細胞機能を評価した（図３（Ａ））。生理活性脂質フラクション５は、ＭＩＮ６細胞の能力を倍増させて、グルコース刺激に応答してインスリンを分泌することにより、β細胞機能を実質的に向上させた。
【０１６９】
フラクション３及び５を、健康なドナー由来の初代ヒト膵島において更に試験した。フラクション５は、以前から健康な膵島からのグルコース刺激に応答するインスリン分泌を著しく増加させた（図３（Ｂ））。
【０１７０】
実施例３  β細胞機能に対する生理活性脂質の効果の更なる判定
脂質フラクション５由来の純粋な生理活性脂質種の単離は、液体クロマトグラフィーを用いた更なる分割法により行った。５個のサブフラクションを単離し、試験し、サブフラクションがグルコースの存在下でインスリン分泌を急性的に刺激するかを判定した。
【０１７１】
ＭＩＮ６細胞において、飢餓条件下（２ｍＭグルコース）又は２０ｍＭグルコース若しくは２０ｍＭグルコース＋１：１００希釈での生理活性脂質で１５分間刺激した後、インスリン分泌を測定した。インスリン分泌をＥＬＩＳＡ法により測定した。
【０１７２】
フラクション５は、グルコースの存在下でインスリン分泌を相乗的に増加させたが、サブフラクション５．３は、インスリン分泌をグルコースのみの場合よりも約３倍増加させた（図４）。
【０１７３】
長期処理の効果を判定するために、ＧＳＩＳの実施前に、ＭＩＮ６細胞を１：１０００の希釈の濃縮生理活性脂質サブフラクションで７２時間処理した（図５）。サブフラクションはすべてβ細胞機能を実質的に向上させた。しかし、サブフラクション５．４は、β細胞機能のより強力なモジュレーターである。
【０１７４】
実施例４  生理活性脂質の細胞保護作用
小胞体ストレス、酸化ストレス及び炎症は、糖尿病におけるβ細胞不全の主要な原因である。単離された生理活性脂質フラクションがβ細胞死において役割を果たすかを判定するために、生理活性脂質フラクション（１：１００希釈）の存在下又は非存在下で、β細胞を炎症性サイトカインカクテル（５０Ｕ／ｍＬ  ＩＬ１β、１００Ｕ／ｍＬ  ＴＮＦα及び１００Ｕ／ｍＬ  ＩＮＦγ）で４８時間処理した。処理後、カスパーゼ８活性（アポトーシスの早期マーカー）を粗細胞抽出物から測定した。フラクション３及び５は共に、アポトーシスシグナルを低減させ、フラクション３及び５は共に、細胞保護性を有することを示す（図６（Ａ））。
【０１７５】
サブフラクション５．３及び５．４の細胞保護性について、前述するように、サイトカイン処理後、ＭＩＮ６細胞におけるフラクション１、３及び５と比較して、更に評価した。フラクション５及びサブフラクション５．４は共に、細胞の炎症応答によって活性化したＮＦｋＢシグナル伝達経路を低減させることにより、切断型カスパーゼ３（アポトーシス）を顕著に低減させた（図６（Ｂ））。
【０１７６】
実施例５  β細胞不全における生理活性脂質の生理学的関連性
ヒト２型糖尿病に非常に類似した２型糖尿病モデルである、ＧＫ（Ｇａｔａ  Ｋａｋｉｚａｋｉ）ラットから単離した初代膵島の機能に対する生理活性脂質サブフラクション５．４の効果を更に検討した。成体のＧＫラットは、顕著な炎症、膵島細胞線維化及びβ細胞機能の低下を特徴とする。生理活性脂質フラクション５．４がＧＫラットにおける膵島不全の支援を行うかを判定するために、膵島機能の評価前、２０ｍＭグルコース、１×アミノ酸及び０．１μＭＥｘ−４からなる分泌促進物質カクテルである、ＧＬＰ１アイソフォームで１時間刺激した後、単離した膵島をビヒクル又は５．４フラクションで７２時間処理した。
【０１７７】
これらのデータは、フラクション５．４がＧＫラットのインスリン分泌能を、対照である正常なＷｉｓｔａｒラットに相当する量まで支援することができることを示す（図７）。
【０１７８】
実施例６  グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ１）の腸内分泌細胞分泌における生理活性脂質の役割
腸内分泌Ｌ細胞株（ＮＣＩ−Ｈ７１６）を、生理活性脂質フラクションの存在下又は非存在下で、低（２ｍＭ）及び高（２０ｍＭ）濃度のグルコースで急性的に刺激した。これらのデータは、フラクション４が刺激性のグルコースとの最も有意な相乗作用を提供し、ＧＬＰ１分泌を増加することを示す（図８）。
【０１７９】
腸内分泌Ｌ細胞機能における生理活性脂質の長期間の効果を判定するために、ＮＣＩ−Ｈ７１６細胞株を生理活性脂質で７２時間処理した。フラクション５の前処理は、２０ｍＭグルコースで刺激した後、ＧＬＰ１分泌を実質的に増加させた（図９）。
【０１８０】
実施例７  生理活性脂質の細胞のストレス遺伝子の調節
生理活性脂質フラクションは、炎症及び小胞体ストレスに関連した細胞のストレス遺伝子の発現を低減させることができる（図１０）。特に、フラクション５が最も作用した。
【０１８１】
実施例８  生理活性脂質の同定
Ｍａｓｏｏｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｌｅｕｋｅｍｉａ（２０１４）２８，１３８１〜１３８７）に記載されているように、クロマトグラフィー分析を行った。エイコサノイド及び関連代謝物をＣ１８逆相（ＲＰ）ＬＣカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ、３μｍ粒子、１５０×２ｍｍ）で分離し、脂肪酸アシルエタノールアミド／グリセロールエステルを、（ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＫｉｎｅｔｅｘ−ＸＢ−Ｃ１８、２．６μｍ粒子、１００×２ｍｍ）で勾配（Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウム＋０．１％ギ酸；Ｂ：ＡＣＮ：Ｈ２Ｏ：ギ酸（９０：１０：０．１）＋１０ｍＭ酢酸アンモニウムを使用して、０．５ｍＬ／分で分離した。３５％のＢからなる開始条件を２分間維持した。勾配を、１分かけて５５％のＢまで増加し、その後、７分かけて９５％のＢまで増加し、２分間維持し、最終的に２分間初期条件に戻し、平衡化した。
【０１８２】
質量分析法による分析を、ＬＴＱＥｌｉｔｅリニアイオントラップ（Elite Ilinear ion trap、ＬＩＴ）オービトラップを使用して、行った。イオンスプレー電圧を４０００Ｖに調整した。フルスキャンモード６００００及びＭＳ／ＭＳモード１５０００の分解能を使用した。自動データ処理については、＊．ｍｚＸＭＬファイル規格を開くために、データ取得ファイルを変換し、オープンソースバイオコンダクターパッケージＸＣＭＳ（バージョン１．２２．１）２及び自社開発のアディショナルＲパッケージを使用して、分析を行った。質量中心のピーク上でピーク検出を行い、内部質量標準及び共通の未処置脂質を使用して、サンプル依存の質量再補正を行った。質量許容誤差５ｐｐｍとした全サンプルにわたって、ピークをグループ化した。最大質量偏差３ｐｐｍの自社開発の手法に基づく階層型相関を使用して、ピークのデアイソトーピングを行った。
【０１８３】
この方法を使用して同定された代表的な生理活性脂質は、
９α，１５Ｓ−ジヒドロキシ−１１−オキソ−５Ｚ，１３Ｅ−プロスタジエン酸１−グリセリルエステル又は９α，１５Ｓ−ジヒドロキシ−１１−オキソ−プロスタ−５Ｚ，１３Ｅ−ジエン−１−酸１−グリセリルエステル若しくはプロスタグランジンＤ２グリセロールエステル（フラクション５．３由来）、
１１−オキソ−５Ｚ，９，１２Ｅ，４Ｅ−プロスタテトラエン酸−２−グリセロールエステル又は１１−オキソ−プロスタ−５Ｚ，９，１２Ｅ，１４Ｅ−テトラエン−１−酸、２−グリセロールエステル若しくは１５−デオキシ−Δ１２，１４−ＰＧＪ２−２−グリセロールエステル（フラクション５．４由来）であった。
【０１８４】
次に、精製生理活性脂質を、その後のインビトロでの試験に使用した。
【０１８５】
実施例９  純粋な合成フラクション５．４及び５．３と単離したフラクション５．４の機能効果の比較
生理活性脂質及びグルコースで短期処理（１時間）又は長期処理（１６又は７２時間、１：５００希釈）後、ラット及びヒトの初代膵島において、インスリン分泌を測定した（図１２Ａ、図１２Ｂ、図１２Ｃ）。
【０１８６】
フラクション５．４ＷＡＴを脂肪／脳組織から精製した。フラクション５．４及び５．３は、純粋な合成フラクション（１０μｇ／μＬストック）である。生理活性脂質の濃度は、２０ｐｇ／μＬであった。対照はエタノールであった。図１２Ａ、図１２Ｂ、図１２Ｃに示されるように、合成化合物は、フラクション５．３／５．４と類似の化学的及び生物学的な効果を有することが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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