(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性、またはＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有するタンパク質を含有する、治療または治療剤のヒト対象への利益を向上させるための医薬組成物であって、
（ａ）前記タンパク質は、前記ヒト対象に投与され、およびその後、
（ｂ）前記治療または前記治療剤が前記対象に投与され、
−  前記治療が臓器移植であり、または前記治療剤が抗体であり、
−  投与される前記タンパク質の量が、０．０１〜１ｍｇ/ｋｇ  ＢＷであり、且つ、前記対象の血清に存在する実質的に全部のＩｇＧ分子によるＦｃ受容体結合を排除するのに十分であり、
−  前記タンパク質の投与と前記治療または治療剤の投与が、少なくとも１時間、多くとも6時間である時間区間によって隔てられている、
医薬組成物。
【請求項２】
（ｉ）ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有する前記タンパク質が、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）などのストレプトコッカス属細菌由来のＩｇＧシステインプロテアーゼであり、任意選択で、前記タンパク質がＩｄｅＳまたはＭＡＣ２であり、あるいは
（ｉｉ）ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有する前記タンパク質が、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、腺疫菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）、もしくはストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）などのストレプトコッカス属細菌由来、またはヒツジ偽結核菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、大便連鎖球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、もしくはエリザベトキンギア・メニンゴセプティカ（Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｋｉｎｇｉａ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃａ）由来のＩｇＧエンドグリコシダーゼであり、任意選択で、前記タンパク質がＥｎｄｏＳ、ＣＰ４０、ＥｎｄｏＥ、またはＥｎｄｏＦ２である、
請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
（ｉ）ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有する前記タンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列、またはＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有するその断片もしくは変種を含み、またはそれからなるタンパク質であり、あるいは
（ｉｉ）ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有する前記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列、またはＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有するその断片もしくは変種を含み、またはそれからなるタンパク質である、
請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記時間区間が、１〜２時間、１〜３時間、１〜４時間、１〜５時間、１〜６時間、２〜３時間、２〜４時間、２〜５時間、２〜６時間、３〜４時間、３〜５時間、３〜６時間、４〜５時間、４〜６時間、または５〜６時間である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記治療剤が、癌または別の疾患の処置のために投与される抗体であり、任意選択で、前記癌が、前立腺癌、乳癌、膀胱癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、腎臓（腎細胞）癌、食道癌、甲状腺癌、リンパ腫、皮膚癌、黒色腫、または白血病である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記治療剤が、アバゴボマブ（Ａｂａｇｏｖｏｍａｂ）、アブシキシマブ（Ａｂｃｉｘｉｍａｂ）、アクトクスマブ（Ａｃｔｏｘｕｍａｂ）、アダリムマブ（Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）、アデカツムマブ（Ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂ）、アフェリモマブ（Ａｆｅｌｉｍｏｍａｂ）、アフツズマブ（Ａｆｕｔｕｚｕｍａｂ）、アラシズマブペゴール（Ａｌａｃｉｚｕｍａｂ  ｐｅｇｏｌ）、ＡＬＤ５１８、アレムツズマブ（Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、アリロクマブ（Ａｌｉｒｏｃｕｍａｂ）、アルツモマブペンテト酸（Ａｌｔｕｍｏｍａｂ  ｐｅｎｔｅｔａｔｅ）、アマツキシマブ（Ａｍａｔｕｘｉｍａｂ）、アナツモマブマフェナトクス（Ａｎａｔｕｍｏｍａｂ  ｍａｆｅｎａｔｏｘ）、アンルキンズマブ（Ａｎｒｕｋｉｎｚｕｍａｂ）、アポリズマブ（Ａｐｏｌｉｚｕｍａｂ）、アルシツモマブ（Ａｒｃｉｔｕｍｏｍａｂ）、アセリズマブ（Ａｓｅｌｉｚｕｍａｂ）、アチヌマブ（Ａｔｉｎｕｍａｂ）、アツリズマブ（Ａｔｌｉｚｕｍａｂ）（＝トシリズマブ）、アトロリムマブ（Ａｔｏｒｏｌｉｍｕｍａｂ）、バピネウズマブ（Ｂａｐｉｎｅｕｚｕｍａｂ）、バシリキシマブ（Ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ）、バビツキシマブ（Ｂａｖｉｔｕｘｉｍａｂ）、ベクツモマブ（Ｂｅｃｔｕｍｏｍａｂ）、ベリムマブ（Ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）、ベンラリズマブ（Ｂｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂ）、ベルチリムマブ（Ｂｅｒｔｉｌｉｍｕｍａｂ）、ベシレソマブ（Ｂｅｓｉｌｅｓｏｍａｂ）、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、ベズロトクスマブ（Ｂｅｚｌｏｔｏｘｕｍａｂ）、ビシロマブ（Ｂｉｃｉｒｏｍａｂ）、ビマグルマブ（Ｂｉｍａｇｒｕｍａｂ）、ビバツズマブメルタンシン（Ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ  ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）、ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）、ブロソズマブ（Ｂｌｏｓｏｚｕｍａｂ）、ブレンツキシマブベドチン（Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ  ｖｅｄｏｔｉｎ）、ブリアキヌマブ（Ｂｒｉａｋｉｎｕｍａｂ）、ブロダルマブ（Ｂｒｏｄａｌｕｍａｂ）、カナキヌマブ（Ｃａｎａｋｉｎｕｍａｂ）、カンツズマブメルタンシン（Ｃａｎｔｕｚｕｍａｂ  ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）、カンツズマブラブタンシン（Ｃａｎｔｕｚｕｍａｂ  ｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）、カプラシズマブ（Ｃａｐｌａｃｉｚｕｍａｂ）、カプロマブペンデチド（Ｃａｐｒｏｍａｂ  ｐｅｎｄｅｔｉｄｅ）、カルルマブ（Ｃａｒｌｕｍａｂ）、カツマキソマブ（Ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ）、ＣＣ４９、セデリズマブ（Ｃｅｄｅｌｉｚｕｍａｂ）、セルトリズマブペゴール（Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ  ｐｅｇｏｌ）、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、Ｃｈ．１４．１８、シタツズマブボガトクス（Ｃｉｔａｔｕｚｕｍａｂ  ｂｏｇａｔｏｘ）、シクスツムマブ（Ｃｉｘｕｔｕｍｕｍａｂ）、クラザキズマブ（Ｃｌａｚａｋｉｚｕｍａｂ）、クレノリキシマブ（Ｃｌｅｎｏｌｉｘｉｍａｂ）、クリバツズマブテトラキセタン（Ｃｌｉｖａｔｕｚｕｍａｂ  ｔｅｔｒａｘｅｔａｎ）、コナツムマブ（Ｃｏｎａｔｕｍｕｍａｂ）、コンシズマブ（Ｃｏｎｃｉｚｕｍａｂ）、クレネズマブ（Ｃｒｅｎｅｚｕｍａｂ）、ＣＲ６２６１、ダセツズマブ（Ｄａｃｅｔｕｚｕｍａｂ）、ダクリズマブ（Ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ）、ダロツズマブ（Ｄ��ｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、ダラツムマブ（Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ）、デムシズマブ（Ｄｅｍｃｉｚｕｍａｂ）、デノスマブ（Ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）、デツモマブ（Ｄｅｔｕｍｏｍａｂ）、ドルリモマブアリトクス（Ｄｏｒｌｉｍｏｍａｂ  ａｒｉｔｏｘ）、ドロジツマブ（Ｄｒｏｚｉｔｕｍａｂ）、デュリゴツマブ（Ｄｕｌｉｇｏｔｕｍａｂ）、デュピルマブ（Ｄｕｐｉｌｕｍａｂ）、デュシギツマブ（Ｄｕｓｉｇｉｔｕｍａｂ）、エクロメキシマブ（Ｅｃｒｏｍｅｘｉｍａｂ）、エクリズマブ（Ｅｃｕｌｉｚｕｍａｂ）、エドバコマブ（Ｅｄｏｂａｃｏｍａｂ）、エドレコロマブ（Ｅｄｒｅｃｏｌｏｍａｂ）、エファリズマブ（Ｅｆａｌｉｚｕｍａｂ）、エフングマブ（Ｅｆｕｎｇｕｍａｂ）、エロツズマブ（Ｅｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、エルシリモマブ（Ｅｌｓｉｌｉｍｏｍａｂ）、エナバツズマブ（Ｅｎａｖａｔｕｚｕｍａｂ）、エンリモマブペゴール（Ｅｎｌｉｍｏｍａｂ  ｐｅｇｏｌ）、エノキズマブ（Ｅｎｏｋｉｚｕｍａｂ）、エノチクマブ（Ｅｎｏｔｉｃｕｍａｂ）、エンシツキシマブ（Ｅｎｓｉｔｕｘｉｍａｂ）、エピツモマブシツキセタン（Ｅｐｉｔｕｍｏｍａｂ  ｃｉｔｕｘｅｔａｎ）、エプラツズマブ（Ｅｐｒａｔｕｚｕｍａｂ）、エルリズマブ（Ｅｒｌｉｚｕｍａｂ）、エルツマキソマブ（Ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）、エタラシズマブ（Ｅｔａｒａｃｉｚｕｍａｂ）、エトロリズマブ（Ｅｔｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、エボロクマブ（Ｅｖｏｌｏｃｕｍａｂ）、エキスビビルマブ（Ｅｘｂｉｖｉｒｕｍａｂ）、ファノレソマブ（Ｆａｎｏｌｅｓｏｍａｂ）、ファラリモマブ（Ｆａｒａｌｉｍｏｍａｂ）、ファルレツズマブ（Ｆａｒｌｅｔｕｚｕｍａｂ）、ファシヌマブ（Ｆａｓｉｎｕｍａｂ）、ＦＢＴＡ０５、フェルビズマブ（Ｆｅｌｖｉｚｕｍａｂ）、フェザキヌマブ（Ｆｅｚａｋｉｎｕｍａｂ）、フィクラツズマブ（Ｆｉｃｌａｔｕｚｕｍａｂ）、フィギツムマブ（Ｆｉｇｉｔｕｍｕｍａｂ）、フランボツマブ（Ｆｌａｎｖｏｔｕｍａｂ）、フォントリズマブ（Ｆｏｎｔｏｌｉｚｕｍａｂ）、フォラルマブ（Ｆｏｒａｌｕｍａｂ）、フォラビルマブ（Ｆｏｒａｖｉｒｕｍａｂ）、フレソリムマブ（Ｆｒｅｓｏｌｉｍｕｍａｂ）、フルラヌマブ（Ｆｕｌｒａｎｕｍａｂ）、フツキシマブ（Ｆｕｔｕｘｉｍａｂ）、ガリキシマブ（Ｇａｌｉｘｉｍａｂ）、ガニツマブ（Ｇａｎｉｔｕｍａｂ）、ガンテネルマブ（Ｇａｎｔｅｎｅｒｕｍａｂ）、ガビリモマブ（Ｇａｖｉｌｉｍｏｍａｂ）、ゲムツズマブオゾガマイシン（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ  ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、ゲボキズマブ（Ｇｅｖｏｋｉｚｕｍａｂ）、ギレンツキシマブ（Ｇｉｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）、グレムバツムマブベドチン（Ｇｌｅｍｂａｔｕｍｕｍａｂ  ｖｅｄｏｔｉｎ）、ゴリムマブ（Ｇｏｌｉｍｕｍａｂ）、ゴミリキシマブ（Ｇｏｍｉｌｉｘｉｍａｂ）、ＧＳ６６２４、イバリズマブ（Ｉｂａｌｉｚｕｍａｂ）、イブリツモマブチウキセタン（Ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ  ｔｉｕｘｅｔａｎ）、イクルクマブ（Ｉｃｒｕｃｕｍａｂ）、イゴボマブ（Ｉｇｏｖｏｍａｂ）、イムシロマブ（Ｉｍｃｉｒｏｍａｂ）、イムガツズマブ（Ｉｍｇａｔｕｚｕｍａｂ）、インクラクマブ（Ｉｎｃｌａｃｕｍａｂ）、インダツキシマブラブタンシン（Ｉｎｄａｔ��ｘｉｍａｂ  ｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）、インフリキシマブ（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、インテツムマブ（Ｉｎｔｅｔｕｍｕｍａｂ）、イノリモマブ（Ｉｎｏｌｉｍｏｍａｂ）、イノツズマブオゾガマイシン（Ｉｎｏｔｕｚｕｍａｂ  ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、イラツムマブ（Ｉｒａｔｕｍｕｍａｂ）、イトリズマブ（Ｉｔｏｌｉｚｕｍａｂ）、イキセキズマブ（Ｉｘｅｋｉｚｕｍａｂ）、ケリキシマブ（Ｋｅｌｉｘｉｍａｂ）、ラベツズマブ（Ｌａｂｅｔｕｚｕｍａｂ）、ラムパリズマブ（Ｌａｍｐａｌｉｚｕｍａｂ）、レブリキズマブ（Ｌｅｂｒｉｋｉｚｕｍａｂ）、レマレソマブ（Ｌｅｍａｌｅｓｏｍａｂ）、レルデリムマブ（Ｌｅｒｄｅｌｉｍｕｍａｂ）、レキサツムマブ（Ｌｅｘａｔｕｍｕｍａｂ）、リビビルマブ（Ｌｉｂｉｖｉｒｕｍａｂ）、リゲリズマブ（Ｌｉｇｅｌｉｚｕｍａｂ）、リンツズマブ（Ｌｉｎｔｕｚｕｍａｂ）、リリルマブ（Ｌｉｒｉｌｕｍａｂ）、ロデルシズマブ（Ｌｏｄｅｌｃｉｚｕｍａｂ）、ロルボツズマブメルタンシン（Ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ  ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）、ルカツムマブ（Ｌｕｃａｔｕｍｕｍａｂ）、ルミリキシマブ、マパツムマブ（Ｍａｐａｔｕｍｕｍａｂ）、マスリモマブ（Ｍａｓｌｉｍｏｍａｂ）、マブリリムマブ（Ｍａｖｒｉｌｉｍｕｍａｂ）、マツズマブ（Ｍａｔｕｚｕｍａｂ）、メポリズマブ（Ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ）、メテリムマブ（Ｍｅｔｅｌｉｍｕｍａｂ）、ミラツズマブ（Ｍｉｌａｔｕｚｕｍａｂ）、ミンレツモマブ（Ｍｉｎｒｅｔｕｍｏｍａｂ）、ミツモマブ（Ｍｉｔｕｍｏｍａｂ）、モガムリズマブ（Ｍｏｇａｍｕｌｉｚｕｍａｂ）、モロリムマブ（Ｍｏｒｏｌｉｍｕｍａｂ）、モタビズマブ（Ｍｏｔａｖｉｚｕｍａｂ）、モキセツモマブパスドトクス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂ  ｐａｓｕｄｏｔｏｘ）、ムロモナブ−ＣＤ３（Ｍｕｒｏｍｏｎａｂ−ＣＤ３）、ナコロマブタフェナトクス（Ｎａｃｏｌｏｍａｂ  ｔａｆｅｎａｔｏｘ）、ナミルマブ（Ｎａｍｉｌｕｍａｂ）、ナプツモマブエスタフェナトクス（Ｎａｐｔｕｍｏｍａｂ  ｅｓｔａｆｅｎａｔｏｘ）、ナルナツマブ（Ｎａｒｎａｔｕｍａｂ）、ナタリズマブ（Ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ）、ネバクマブ（Ｎｅｂａｃｕｍａｂ）、ネシツムマブ（Ｎｅｃｉｔｕｍｕｍａｂ）、ネレリモマブ（Ｎｅｒｅｌｉｍｏｍａｂ）、ネスバクマブ（Ｎｅｓｖａｃｕｍａｂ）、ニモツズマブ（Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ）、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ノフェツモマブメルペンタン（Ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂ  ｍｅｒｐｅｎｔａｎ）、オカラツズマブ（Ｏｃａｒａｔｕｚｕｍａｂ）、オクレリズマブ（Ｏｃｒｅｌｉｚｕｍａｂ）、オデュリモマブ（Ｏｄｕｌｉｍｏｍａｂ）、オファツムマブ（Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）、オララツマブ（Ｏｌａｒａｔｕｍａｂ）、オロキズマブ（Ｏｌｏｋｉｚｕｍａｂ）、オマリズマブ（Ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ）、オナルツズマブ（Ｏｎａｒｔｕｚｕｍａｂ）、オポルツズマブモナトクス（Ｏｐｏｒｔｕｚｕｍａｂ  ｍｏｎａｔｏｘ）、オレゴボマブ（Ｏｒｅｇｏｖｏｍａｂ）、オルチクマブ（Ｏｒｔｉｃｕｍａｂ）、オテリキシズマブ、オキセルマブ（Ｏｘｅｌｕｍａｂ）、オザネズマブ（Ｏｚａｎｅｚｕｍａｂ）、オゾラリズ���ブ（Ｏｚｏｒａｌｉｚｕｍａｂ）、パギバキシマブ（Ｐａｇｉｂａｘｉｍａｂ）、パリビズマブ（Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ）、パニツムマブ（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、パノバクマブ（Ｐａｎｏｂａｃｕｍａｂ）、パルサツズマブ（Ｐａｒｓａｔｕｚｕｍａｂ）、パスコリズマブ（Ｐａｓｃｏｌｉｚｕｍａｂ）、パテクリズマブ（Ｐａｔｅｃｌｉｚｕｍａｂ）、パトリツマブ（Ｐａｔｒｉｔｕｍａｂ）、ペムツモマブ（Ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）、ペラキズマブ（Ｐｅｒａｋｉｚｕｍａｂ）、ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、ペキセリズマブ（Ｐｅｘｅｌｉｚｕｍａｂ）、ピジリズマブ（Ｐｉｄｉｌｉｚｕｍａｂ）、ピナツズマブベドチン（Ｐｉｎａｔｕｚｕｍａｂ  ｖｅｄｏｔｉｎ）、ピンツモマブ（Ｐｉｎｔｕｍｏｍａｂ）、プラクルマブ（Ｐｌａｃｕｌｕｍａｂ）、ポラツズマブベドチン（Ｐｏｌａｔｕｚｕｍａｂ  ｖｅｄｏｔｉｎ）、ポネズマブ（Ｐｏｎｅｚｕｍａｂ）、プリリキシマブ（Ｐｒｉｌｉｘｉｍａｂ）、プリトキサキシマブ（Ｐｒｉｔｏｘａｘｉｍａｂ）、プリツムマブ（Ｐｒｉｔｕｍｕｍａｂ）、ＰＲＯ１４０、クイリズマブ（Ｑｕｉｌｉｚｕｍａｂ）、ラコツモマブ（Ｒａｃｏｔｕｍｏｍａｂ）、ラドレツマブ（Ｒａｄｒｅｔｕｍａｂ）、ラフィビルマブ（Ｒａｆｉｖｉｒｕｍａｂ）、ラムシルマブ（Ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）、ラニビズマブ（Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）、ラキシバクマブ（Ｒａｘｉｂａｃｕｍａｂ）、レガビルマブ（Ｒｅｇａｖｉｒｕｍａｂ）、レスリズマブ（Ｒｅｓｌｉｚｕｍａｂ）、リロツムマブ（Ｒｉｌｏｔｕｍｕｍａｂ）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、ロバツムマブ（Ｒｏｂａｔｕｍｕｍａｂ）、ロレデュマブ（Ｒｏｌｅｄｕｍａｂ）、ロモソズマブ（Ｒｏｍｏｓｏｚｕｍａｂ）、ロンタリズマブ（Ｒｏｎｔａｌｉｚｕｍａｂ）、ロベリズマブ（Ｒｏｖｅｌｉｚｕｍａｂ）、ルプリズマブ（Ｒｕｐｌｉｚｕｍａｂ）、サマリズマブ（Ｓａｍａｌｉｚｕｍａｂ）、サリルマブ（Ｓａｒｉｌｕｍａｂ）、サツモマブペンデチド（Ｓａｔｕｍｏｍａｂ  ｐｅｎｄｅｔｉｄｅ）、セクキヌマブ（Ｓｅｃｕｋｉｎｕｍａｂ）、セリバンツマブ（Ｓｅｒｉｂａｎｔｕｍａｂ）、セトキサキシマブ（Ｓｅｔｏｘａｘｉｍａｂ）、セビルマブ（Ｓｅｖｉｒｕｍａｂ）、シブロツズマブ（Ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）、シファリムマブ（Ｓｉｆａｌｉｍｕｍａｂ）、シルツキシマブ（Ｓｉｌｔｕｘｉｍａ
ｂ）、シムツズマブ（Ｓｉｍｔｕｚｕｍａｂ）、シプリズマブ（Ｓｉｐｌｉｚｕｍａｂ）、シルクマブ（Ｓｉｒｕｋｕｍａｂ）、ソラネズマブ（Ｓｏｌａｎｅｚｕｍａｂ）、ソリトマブ（Ｓｏｌｉｔｏｍａｂ）、ソネプシズマブ（Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ）、ソンツズマブ（Ｓｏｎｔｕｚｕｍａｂ）、スタムルマブ（Ｓｔａｍｕｌｕｍａｂ）、スレソマブ（Ｓｕｌｅｓｏｍａｂ）、スビズマブ（Ｓｕｖｉｚｕｍａｂ）、タバルマブ（Ｔａｂａｌｕｍａｂ）、タカツズマブテトラキセタン（Ｔａｃａｔｕｚｕｍａｂ  ｔｅｔｒａｘｅｔａｎ）、タドシズマブ（Ｔａｄｏｃｉｚｕｍａｂ）、タリズマブ（Ｔａｌｉｚｕｍａｂ）、タネズマブ（Ｔａｎｅｚｕｍａｂ）、タプリツモマブパプトクス（Ｔａｐｌｉｔｕｍｏｍａｂ  ｐａｐｔｏｘ）、テフィバズマブ（Ｔｅｆｉｂａｚｕｍａｂ）、テリモマブアリトクス（Ｔｅｌｉｍｏｍａｂ  ａｒｉｔｏｘ）、テナツモマブ（Ｔｅｎａｔｕｍｏｍａｂ）、テネリキシマブ（Ｔｅｎｅｌｉｘｉｍａｂ）、テプリズマブ（Ｔｅｐｌｉｚｕｍａｂ）、テプロツムマブ（Ｔｅｐｒｏｔｕｍｕｍａｂ）、ＴＧＮ１４１２、チシリムマブ（Ｔｉｃｉｌｉｍｕｍａｂ）（＝トレメリムマブ（ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ））、チルドラキズマブ（Ｔｉｌｄｒａｋｉｚｕｍａｂ）、チガツズマブ（Ｔｉｇａｔｕｚｕｍａｂ）、ＴＮＸ−６５０、トシリズマブ（Ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）（＝アツリズマブ（ａｔｌｉｚｕｍａｂ））、トラリズマブ（Ｔｏｒａｌｉｚｕｍａｂ）、トシツモマブ（Ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）、トラロキヌマブ（Ｔｒａｌｏｋｉｎｕｍａｂ）、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、ＴＲＢＳ０７、トレガリズマブ（Ｔｒｅｇａｌｉｚｕｍａｂ）、トレメリムマブ（Ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）、ツコツズマブセルモロイキン（Ｔｕｃｏｔｕｚｕｍａｂ  ｃｅｌｍｏｌｅｕｋｉｎ）、ツビルマブ（Ｔｕｖｉｒｕｍａｂ）、ウブリツキシマブ（Ｕｂｌｉｔｕｘｉｍａｂ）、ウレルマブ（Ｕｒｅｌｕｍａｂ）、ウルトキサズマブ（Ｕｒｔｏｘａｚｕｍａｂ）、ウステキヌマブ（Ｕｓｔｅｋｉｎｕｍａｂ）、バパリキシマブ（Ｖａｐａｌｉｘｉｍａｂ）、バテリズマブ（Ｖａｔｅｌｉｚｕｍａｂ）、ベドリズマブ（Ｖｅｄｏｌｉｚｕｍａｂ）、ベルツズマブ（Ｖｅｌｔｕｚｕｍａｂ）、ベパリモマブ（Ｖｅｐａｌｉｍｏｍａｂ）、ベセンクマブ（Ｖｅｓｅｎｃｕｍａｂ）、ビシリズマブ（Ｖｉｓｉｌｉｚｕｍａｂ）、ボロシキシマブ（Ｖｏｌｏｃｉｘｉｍａｂ）、ボルセツズマブマフォドチン（Ｖｏｒｓｅｔｕｚｕｍａｂ  ｍａｆｏｄｏｔｉｎ）、ボツムマブ（Ｖｏｔｕｍｕｍａｂ）、ザルツムマブ（Ｚａｌｕｔｕｍｕｍａｂ）、ザノリムマブ（Ｚａｎｏｌｉｍｕｍａｂ）、ザツキシマブ（Ｚａｔｕｘｉｍａｂ）、ジラリムマブ（Ｚｉｒａｌｉｍｕｍａｂ）、またはゾリモマブアリトクス（Ｚｏｌｉｍｏｍａｂ  ａｒｉｔｏｘ）である抗体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記治療が、臓器移植であり、任意選択で、前記臓器が腎臓、肝臓、心臓、膵臓、肺、または小腸である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
移植時または移植直前に、患者におけるＴ細胞および／またはＢ細胞の抑制の誘導が行われる、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記抑制の誘導が、ムロモナブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）抗体、リンパ球免疫グロブリン、抗胸腺細胞グロブリン調製物（ＡＴＧＡＭ）、またはリツキシマブのうちの少なくとも１つの有効量を患者に投与することを意味する、請求項８に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療または治療剤の対象への利益を向上させるための方法に関する。方法は、（ａ）対象において血清ＩｇＧ分子のＦｃ受容体結合を低下させる作用物質を対象に投与するステップ、および（ｂ）その後、前記治療または前記治療剤を対象に投与するステップを含む。本発明はまた、対象において病原性自己抗体の効果を低下させるための方法であって、（ａ）対象において血清ＩｇＧ分子のＦｃ受容体結合を低下させる作用物質を対象に投与するステップ、および任意選択で、（ｂ）その後、内因性自己抗体を除去する処置を対象に施すステップを含む方法に関する。本発明はまた、本発明の方法を実行するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、免疫系の構成要素であり、他の免疫系要素を身体内の特定の標的に動員する。抗体は、Ｆａｂドメインの特異性を通して標的抗原に特異的である。抗体は、抗体断片結晶化可能（Ｆｃ）ドメインの、免疫細胞の表面上に発現したＦｃ受容体（ＦｃＲ）との相互作用を通して免疫系の他の要素を動員する。哺乳類血清における優勢な抗体は、通常、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）クラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４である。これらの抗体は、ヒトＦｃＲ：ＦｃγＲＩ、ＲγＩＩａ、ＲγＩＩｂ、ＲγＩＩＩａ、およびＦｃγＲｎ、ならびに補体Ｆｃ受容体Ｃ１ｑを結合する。ＩｇＧ分子による細胞免疫系の動員の効力は、ＦｃのＦｃＲへの親和性により影響される。抗体のＦｃドメインとＦｃＲとの相互作用は、治療剤として投与される抗体の作用、およびまた、抗体媒介性移植拒絶反応を含む様々な自己免疫状態において病原的役割を果たす抗体の作用の両方にとって重要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明者らは、驚くべきことに、患者の血清における全部の、または実質的に全部のＩｇＧ分子によるＦｃ受容体結合を完全に、迅速に、一時的に、かつ安全に、排除する作用物質を用いることが可能であることを示した。これは、治療抗体が投与される場合、Ｆｃ受容体との結合において内因性ＩｇＧと競合する必要がないため、それの効力が増強するはずの、限定された長さの時間帯を生み出す。したがって、一実施形態において、方法は、治療抗体によって処置される疾患を処置するために用いられ得る。
【０００４】
この限定された長さの時間帯はまた、こうしなかったならば患者の血清に存在する抗ドナーＩｇＧ抗体の作用のせいで無効なはずの、臓器移植などの治療を施すために用いられ得る。したがって、一実施形態において、方法は、臓器移植の前に患者を脱感作するために用いられ得る。
【０００５】
したがって、本発明は、治療または治療剤の対象への利益を向上させるための方法であって、（ａ）対象において血清ＩｇＧ分子のＦｃ受容体結合を低下させる作用物質を対象に投与するステップ、および（ｂ）その後、前記治療または前記治療剤を対象に投与するステップを含み、
−  投与される前記作用物質の量が、対象の血清に存在する全部の、または実質的に全部のＩｇＧ分子によるＦｃ受容体結合を排除するのに十分であり、
−  ステップ（ａ）と（ｂ）が、対象の血清に存在する実質的に全部のＩｇＧ分子によるＦｃ受容体結合が排除されるのに十分である時間区間によって隔てられている、
方法を提供する。前記区間は、典型的には、少なくとも３０分間で、かつ多くても２１日間であり得る。
【０００６】
本発明はまた、対象において抗体の効果を除去するために、または低下させるために用いられ得る。これは、ギラン・バレー症候群またはグッドパスチャー症候群などの病原性自己抗体により全体的に、または部分的に媒介される自己免疫疾患を患っている患者において特に有用であり得る。したがって、本発明はまた、対象において抗体の効果を除去し、または低下させるための方法であって、（ａ）対象において血清ＩｇＧ分子のＦｃ受容体結合を低下させる作用物質を対象に投与するステップ、および任意選択で、（ｂ）その後、内因性自己抗体を除去する処置を対象に施すステップを含み、
−  ステップ（ａ）と（ｂ）が、少なくとも２週間の時間区間によって隔てられ、
−  内因性自己抗体を除去する前記処置が、プラスマフェレーシスもしくは免疫吸着であり、またはＦｃＲｎ受容体による血清中の抗体のリサイクリングを阻止し、それにより抗体半減期を低下させる作用物質（例えば、抗ＦｃＲｎ抗体）の投与である、
方法に関する。本発明はまた、
（ｉ）ＩｇＧのＦ（ａｂ’）２部分と特異的に結合する第１の作用物質と試料をインキュベートするステップ、
（ｉｉ）ＩｇＧのＦｃ部分と特異的に結合する第２の作用物質と試料をインキュベートするステップ、
（ｉｉｉ）両方の作用物質の存在を判定することにより試料中の無傷ＩｇＧの濃度を決定するステップ
を含む、個体から採取された試料において無傷ＩｇＧの量を評価するための方法を提供する。本発明はまた、本発明の方法を実行するためのキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ＩｄｅＳによるＩｇＧ切断の概略図である。アイソタイプを問わず、無傷ヒトＩｇＧはＩｄｅＳにより２ステップで切断される。１番目のステップは、１つの無傷重鎖を有する単一切断化ＩｇＧ（ｓｃＩｇＧ）を生じる。２番目のステップは、１つのＦ（ａｂ’）２断片と、非共有結合性相互作用によって一緒に保持された、１つのホモ二量体Ｆｃ断片からなる完全に切断された生成物を生じる。
【図２】蛋白尿が実施例１のヒト試験を通して安全性評価としてモニターされたことを示す図である。Ｍｕｌｔｉｓｔｉｘ（Ｓｉｅｍｅｎｓ）が病院で日常的に用いられ、ＩｇＧ切断に相関する一過性蛋白尿が、いく人かの対象において検出された。Ａ）プラセボを与えられた対象（ｎ＝９）、Ｂ）０．２４ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ  ＩｄｅＳの単一用量を与えられた対象（ｎ＝４）。
【図３】血清におけるＩｄｅＳの薬物動態を示す図である。血清中のＩｄｅＳ濃度を、ＩｄｅＳに由来する４つのペプチドに基づいてＬＣ−ＭＳ／ＭＳ方法により検出した。Ａ）ＩｄｅＳの用量レベル（０．０１、０．０４、０．１２、および０．２４ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ）に対する、注入の終了の１分前における血清中ＩｄｅＳ濃度の比較（対数スケール：円は個々の濃度を表す）。分析物：ペプチドＬＦＥＹＦＫ（ｎ＝２０）。Ｂ）０．１２ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ  ＩｄｅＳまたは０．２４ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ  ＩｄｅＳの注入から２４時間後までの時間プロフィールに対する４つのペプチド（ＡＦＰＹＬＳＴＫ、ＡＩＹＶＴＤＳＤＳＮＡＳＩＧＭＫ、ＧＧＩＦＤＡＶＦＴＲ、およびＬＦＥＹＦＫ）の平均値の血清中濃度の比較（ｎ＝８）。
【図４】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる定性的薬力学分析がＩｇＧの迅速な分解を示したことを示す図である。投薬前、投薬から１４分後、２０分後、１時間後、２時間後、６時間後、および２４時間後におけるタンパク質バンドパターンを示す、Ａ）０．１２ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ  ＩｄｅＳおよびＢ）０．２４ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ  ＩｄｅＳを投薬された対象由来の血清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。Ｃ）投薬前、投薬から２時間後、２４時間後、７日後、１４日後、２１日後、２８日後、および３５日後における０．２４ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ群における１人の対象由来の血清におけるＩｇＧ回復。各図における右側の矢印は、ヒトＩｇＧ、ｓｃＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｃの混合物を含有するＩｇＧマーカーにおける異なるバンドを示す。各図における左側の線は、ｋＤ標準の分子量を示す。ゲルは、０．１２ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ  ＩｄｅＳ用量群および０．２４ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ  ＩｄｅＳ用量群における代表的な対象を示す。
【図５】ＥＬＩＳＡによる定量的薬力学分析はＩｇＧの迅速な分解を示したことを示す図である。０．２４ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ  ＩｄｅＳを投薬された個々の対象由来の血清中ＩｇＧレベルを、（無傷ＩｇＧとｓｃＩｇＧの両方を検出する）確証済みＥＬＩＳＡ方法を用いて決定した。ＩｇＧの初期の迅速な分解、およびＩｇＧの回復の両方を追跡することができるように、ｘ軸を２つに分けている。１番目の部分は、時間単位での時間（０〜２４時間）を示し、２番目は、日単位での時間（７〜６４日）を示す。
【図６】ヒト血清におけるＩｄｅＳのインビトロ滴定を示す図である。健康な対象由来のヒト血清試料をＩｄｅＳの基質として用い、ＥＬＩＳＡにより滴定した（ｎ＝２０；誤差バー、平均±ＳＥＭ）。最高の用量群、０．２４ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ  ＩｄｅＳは、インビトロでのおよそ６ｍｇ／Ｌ  ＩｄｅＳに対応し、０．１２ｍｇ／ｋｇ  ＢＷはインビトロでの３ｍｇ／Ｌ  ＩｄｅＳ、０．０４ｍｇ／ｋｇ  ＢＷはインビトロでの１ｍｇ／Ｌ  ＩｄｅＳ、０．０１ｍｇ／ｋｇ  ＢＷはインビトロでの０．２ｍｇ／Ｌ  ＩｄｅＳに対応する。結果は、各対象についての出発値と比較したパーセントの残存ＩｇＧとしてｙ軸に示されている。ｍｇ／ＬでのＩｄｅＳ用量がｘ軸上にある。
【図７】抗原特異的薬力学を示す図である。０．２４ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ群（ｎ＝４）由来のヒト血清試料を、抗原（ジフテリア、破傷風、百日咳、ポリオ、およびヘモフィルス（Haemophilus）インフルエンザｂ型）の混合物に対するＩｇＧの存在について検討した。結果は、各対象についての出発値と比較したパーセントの残存ＩｇＧとしてｙ軸に示されている。ＩｇＧの初期の迅速な分解、およびＩｇＧの回復の両方を追跡することができるように、ｘ軸を２つに分けている。１番目の部分は、時間単位での時間（０〜２４時間）を示し、２番目は、日単位での時間（７〜６４日）を示す。
【図８】ＩｄｅＳを投薬された対象由来の血清が食作用能力障害を示したことを示す図である。ヒト血清におけるＩｇＧのオプソニン化能力を、少なくとも１個の貪食された蛍光ビーズを有するエフェクター細胞のパーセントとして測定した。Ａ）０．２４ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ  ＩｄｅＳで処置された対象対プラセボで処置された対象の投薬前および投薬から２４時間後。各個体についての投薬前食作用レベルは、１００％に設定され、バックグランドは、血清の非存在下でのビーズの自発性取り込みであり、ＩｄｅＳ群においてｎ＝４、プラセボ群においてｎ＝２である。Ｂ）血清における食作用潜在能力の動態は、異なる時点（投薬前、２時間、６時間、２４時間、４８時間、４日、７日、および１４日）での、０．２４ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ群における１人の代表的な対象について示されている。ＩｇＧの非存在下でのビーズの自発性取り込みは、白抜きの四角形として示されている。ｐ値は、マン・ホイットニーを用いて計算された（＊＊＊＝Ｐ＜０．０１）。
【図９】抗ＩｄｅＳ抗体を、試験前および試験の間中、追跡したことを示す図である。ヒト血清試料を、Ｐｈａｄｉａ（登録商標）２５０装置においてＩｄｅＳ特異的ＣＡＰ−ＦＥＩＡ（ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ）アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて分析した。ＩｇＧについてのカットオフ（ＬＬＯＱ）は２ｍｇ／Ｌであった。Ａ）１３０人のヒトドナー由来の試料（参照）を、この試験においてスクリーニングされた７８人の健康なヒト男性対象（スクリーニング）と比較した。強調された線は、参照群（６．１ｍｇ／Ｌ）およびスクリーニング群（１０．６ｍｇ／Ｌ）についての中央値を示す。Ｂ）０．１２ｍｇ／ｋｇ群および０．２４ｍｇ／ｋｇ群についての平均として示された抗ＩｄｅＳ  ＩｇＧの動態（ｎ＝８；誤差バー、平均±ＳＥＭ）。１４日目より前、対象のいずれにおいても抗ＩｄｅＳ  ＩｇＧの増加は見られない。Ｃ）１４日目、およびＤ）１８２日目における別個の群について示された抗ＩｄｅＳ  ＩｇＧレベル。線は、各群についての中央値レベルを示す。ｐ値は、クラスカル・ワリス、一元配置ＡＮＯＶＡ、およびダンの多重比較を用いて計算された（＊＝Ｐ＜０．０５および＊＊＝Ｐ＜０．０２）。
【図１０】２０人の試験されたドナー（健康なボランティアおよびステージ５ＣＫＤ患者）由来の血清におけるＩｄｅＳの効力を示す図である。様々な濃度のＩｄｅＳでのヒト血清の処置後の残存ＩｇＧを、ＥＬＩＳＡを用いて決定した。図は、ｍｇ／ｍｌでの残存ＩｇＧがＩｄｅＳ用量（ｇ／Ｌ）に対してプロットされている、個々のヒト血清のシグモイド用量反応曲線を示す。計算されたＭＡＢＥＬ（０．００３１ｇ／Ｌ）およびＭＥＤ（０．０２５ｇ／Ｌ）がグラフに示されている（紺青色の線）。選択された患者血清Ｐ０２、Ｐ０４、Ｐ０７、Ｐ０８およびＰ０９は、異なる色で強調されている。
【図１１−１】感作された患者Ｎｏ．Ｐ０２由来の血清におけるＩｄｅＳの抗ＨＬＡ  ＩｇＧへの効力を示す図である。グラフは、偽（青色）およびＩｄｅＳ（赤色）処置後の（上部グラフ）ＭＨＣクラス−Ｉ（Ａ、Ｂ、およびＣ）および（下部グラフ）ＭＨＣクラス−ＩＩ（ＤＰ、ＤＱ、およびＤＲ）についての個々の抗原に対するＭＦＩ（生）を示す。ＭＦＩ：平均蛍光強度。
【図１１−２】感作された患者Ｎｏ．Ｐ０２由来の血清におけるＩｄｅＳの抗ＨＬＡ  ＩｇＧへの効力を示す図である（図１１−１の続き）。
【図１２−１】感作された患者Ｐ０４についての図１１に相当する図である。
【図１２−２】感作された患者Ｐ０４についての図１１に相当する図である（図１２−１の続き）。
【図１３−１】感作された患者Ｐ０７についての図１１に相当する図である。
【図１３−２】感作された患者Ｐ０７についての図１１に相当する図である（図１３−１の続き）。
【図１４−１】感作された患者Ｐ０８についての図１１に相当する図である。
【図１４−２】感作された患者Ｐ０８についての図１１に相当する図である（図１４−１の続き）。
【図１５−１】感作された患者Ｐ０９についての図１１に相当する図である。
【図１５−２】感作された患者Ｐ０９についての図１１に相当する図である（図１５−１の続き）。
【図１６】ＩｄｅＳまたはプラセボの投薬前（黒色）、投薬から２４時間後（赤色）、投薬から４８時間後（緑色）、および投薬から９６時間後（青色）に収集された対象５０３および５０４由来の血清（１０μｌ非ＤＴＴ処置）で染色されたＢａｌｂ／ｃ脾臓細胞（ゲートＰ１）を示す図である。結合を、ヒトＦＣγに対する二次試薬を用いて検出した。ＩｄｅＳグラフについて、投薬前のプロットは、３つ全ての投薬後のプロットの右側にある。したがって、９６時間において維持されている、２４時間におけるマウス脾臓細胞と結合する血清の能力の低下がある。
【図１７】０．２４ｍｇ／ｋｇ  ＢＷのＩｄｅＳを投薬された健康な対象（５０４）由来の血清とＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓細胞との間での異種間クロスマッチを示す図である。血清試料を、投薬前、および投薬後の示された時点で収集した。血清を、ＩｇＭを不活性化するためにＤＴＴで処置した。生細胞（緑色／明るい）と死細胞（赤色／鈍い）を示すＴｅｒａｓａｋｉウェルのオーバーレイ写真。ＰＢＳのみ（無血清）で処置された脾臓細胞を、自発性細胞死についての対照として用いた。
【図１８】ＩｇＧのＡｓｎ−２９７（Ｋａｂａｔナンバリング）におけるＮ結合型グリカンのＥｎｄｏＳによる切断の概略図を示す。
【図１９】ＩｄｅＳで処置された対象（＃１０１）由来の血清においてＩｇＧレベルを測定するための２つの方法（比濁法およびＰＤ−ＥＬＩＳＡ）の比較を示す図である。ＩｄｅＳの投薬後の様々な時点で血清を収集し、病院での標準ｐ−ＩｇＧ比濁法試験を用いて、および無傷ＩｇＧと、ＩｄｅＳのＩｇＧの切断により生成されたＦ（ａｂ’）２断片とを区別するために本発明者らによって開発されたＰＤ−ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、測定した。ＵＬＮ＝健康なヒト対象におけるＩｇＧについての正常値の上限、およびＬＬＮ＝健康なヒト対象におけるＩｇＧについての正常値の下限。
【図２０】ＩｄｅＳがＢ細胞上のＩｇＧ型を切断するが、ＩｇＭ型のＢＣＲを切断しないことを示す図である。Ａ：示された量のＩｄｅＳでの処置後のＩｇＧ型（Ｎｕ−ＤＵＬ−１）およびＩｇＭ型（Ｄａｕｄｉ）のＢＣＲ発現細胞における抗Ｆａｂシグナルのフローサイトメトリー分析。ｙ軸は、ＦＬ４での平均蛍光強度を示す。Ｂ：様々な量のＩｄｅＳでの処置後のＮｕ−ＤＵＬ−１細胞の表面上における抗Ｆａｂおよび抗Ｆｃのフローサイトメトリー分析。
【図２１】ＩｄｅＳが、可溶性ＩｇＧと類似した効力でＩｇＧ型のＢＣＲを切断することを示す図である。Ａ：ヘパリン処置された末梢血を、ＰＢＳまたは様々な量のＩｄｅＳで処置した。インキュベーション時間後、血漿を単離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。無傷ＩｇＧ、ｓｃＩｇＧ、およびＦ（ａｂ’）２断片は、右側に示されている。Ｂ：同じＰＢＳまたはＩｄｅＳ処置血液から精製されたＰＢＭＣを、ＣＤ１９＋および抗Ｆｃまたは抗Ｆａｂについて二重染色した。
【図２２】ＩｄｅＳが、メモリーＢ細胞上の表面ＩｇＧを切断することを示す図である。Ａ：＞９０％ＣＤ１９＋細胞を結果として生じた、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐを用いるＢ細胞のネガティブセレクション。Ｂ：ＣＤ１９＋／ＣＤ２７＋細胞由来の表面ＩｇＧのＦ（ａｂ’）２部分はＩｄｅＳにより効率的に切断される。細胞膜アンカー型Ｆｃエピトープの量はＩｄｅＳ処置後、変化しない。
【図２３−１】ＩｄｅＳ処置後の細胞の回復を示す図である。Ａ：様々な量のＩｄｅＳでの処置後のＮｕ−ＤＵＬ−１細胞の表面における抗Ｆａｂのフローサイトメトリー分析。ＩｄｅＳを除去し、細胞を培養し、１時間後および２４時間後、分析した。Ｂ：Ｎｕ−ＤＵＬ−１細胞を様々な量のＩｄｅＳまたは抗増殖性対照物質（サイトカラシンＤおよびピューロマイシン）で処置し、ＢｒｄＵの６時間のパルス時間の前に、２４時間、培養した。Ｃ：Ｎｕ−ＤＵＬ−１細胞をＰＢＳまたは３０μｇ／ｍｌ  ＩｄｅＳで２４時間処置し、その後、細胞内ヒドロゲナーゼ活性に基づいた生存率アッセイ（ＣＣＫ−８）を読み出しとして用いた。
【図２３−２】ＩｄｅＳ処置後の細胞の回復を示す図である（図２３−１の続き）。
【図２４−１】エキソビボでＩｄｅＳ処置されたＰＢＭＣにおけるＩｇＧ型ＢＣＲ発現の回復を示す図である。Ａ：ＰＢＳまたはＩｄｅＳ処置（３０μｇ／ｍｌ）直後、および１６時間のＩｄｅＳを含まない培養後のＣＤ１９＋細胞における抗Ｆａｂシグナルのフローサイトメトリー分析。二重陽性細胞はＲ２において見出される。Ｂ：ＰＢＳまたはＩｄｅＳ処置（３０μｇ／ｍｌ）直後、および１６時間の培養後のＣＤ１９＋細胞における抗Ｆｃシグナルのフローサイトメトリー分析。二重陽性細胞はＲ２において見出され、ゲートＰ３における細胞に占めるパーセンテージとして表されている。
【図２４−２】エキソビボでＩｄｅＳ処置されたＰＢＭＣにおけるＩｇＧ型ＢＣＲ発現の回復を示す図である（図２４−１の続き）。
【図２５】濃縮されたＢ細胞（ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ、＞９０％ＣＤ１９＋細胞）におけるＩｇＧ型のＢＣＲの回復を示す図である。Ａ：ＰＢＳまたはＩｄｅＳ処置（３０μｇ／ｍｌ）直後、および処置後の示された時点での濃縮されたＢ細胞における抗Ｆａｂシグナルのフローサイトメトリー分析。Ｂ：ＰＢＳまたはＩｄｅＳ処置（３０μｇ／ｍｌ）直後、および処置後の様々な時点での濃縮されたＢ細胞における抗Ｆｃシグナルのフローサイトメトリー分析。
【図２６】ＩｄｅＳがＢ細胞の生存率に影響しないことを示す図である。＞９０％ＣＤ１９＋細胞を含有する、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ濃縮化Ｂ細胞を、ＰＢＳまたはＩｄｅＳ（３０μｇ／ｍｌ）処置後、数日間、培養し続け、生存率を、比色ＣＣＫ−８アッセイを用いて測定した。
【図２７】ＩｄｅＳ処置がＢＣＲシグナル伝達を阻害することを示す図である。Ｎｕ−ＤＵＬ−１細胞を、Ｆ（ａｂ’）２特異的抗体を用いる架橋の前に、ＰＢＳまたはＩｄｅＳ（３０μｇ／ｍｌ）で処置した。Ａ：ＥＲＫ１／２リン酸化を、フローサイトメトリーにおいて、リン酸特異的抗体を用いて、刺激後の様々な時点で追跡した。Ｂ：ＰＬＣ−γ２リン酸化を、フローサイトメトリーにおいて、リン酸特異的抗体を用いて、刺激後の様々な時点で追跡した。
【図２８−１】ＩｄｅＳが、ＩｇＧ産生細胞のＢ細胞成熟を特異的に遮断することを示す図である。ＰＢＭＣをＩｄｅＳで処置し、メモリーＢ細胞を活性化し、かつそれらをＩｇ産生細胞へと分化させるために、組換えＩＬ２およびＲ８４８で刺激した。ＥＬＩＳＰＯＴフィルタープレートを、ＩｇＧ産生細胞の数について評価した。Ａ：フィルタープレートに、５００００個または１０００００個の細胞を蒔き、０日目において、ＩｄｅＳ有り／無しおよびｒＩＬ２／Ｒ８４８有り／無しで処置した。１つの設定において、Ｒ８４８およびＩＬ２での刺激の３日目に、ＩｄｅＳを加えた。Ｂ：３０μｇ／ｍｌ  ＩｄｅＳの存在下または非存在下でのｒＩＬ２／Ｒ８４８での９６時間の刺激後のＩｇＡ産生細胞、ＩｇＭ産生細胞、およびＩｇＧ産生細胞の数。Ｃ：０．３〜３０μｇ／ｍｌ  ＩｄｅＳの存在下または非存在下でのｒＩＬ２／Ｒ８４８での７２時間の刺激後のＩｇＧ産生細胞の数。Ｄ：０．３〜３０μｇ／ｍｌ  ＩｄｅＳで１時間、細胞を前処置し、その後、ＩｄｅＳを除去し、細胞をｒＩＬ２／Ｒ８４８での７２時間の刺激に曝した後の、ＩｇＧ産生細胞の数。
【図２８−２】ＩｄｅＳが、ＩｇＧ産生細胞のＢ細胞成熟を特異的に遮断することを示す図である（図２８−１の続き）。
【図２８−３】ＩｄｅＳが、ＩｇＧ産生細胞のＢ細胞成熟を特異的に遮断することを示す図である（図２８−１の続き）。
【図２９−１】０．２４ｍｇ／ｋｇ  ＢＷのＩｄｅＳの単回のｉ．ｖ．投薬後の健康なヒト対象における、ＩｄｅＳ処置後の様々な時点でのＣＤ１９＋／ＩｇＧ＋細胞のフローサイトメトリー分析を示す図である。精製されたＰＢＭＣを、前方散乱（Ｐ１）を用いてゲーティングし、Ｂ細胞（ＣＤ１９＋）をＰ１においてＭ１としてモニターした。上部パネルは、投薬前、および投薬から９６時間後までのＣＤ１９（ＦＬ２）およびＩｇＧのＦｃ部分（ＦＬ４）について二重陽性細胞を示す。下部パネルは、投薬前、および投薬から９６時間後までのＣＤ１９（ＦＬ２）およびＩｇＧのＦａｂ部分（ＦＬ４）について二重陽性細胞を示す。
【図２９−２】０．２４ｍｇ／ｋｇ  ＢＷのＩｄｅＳの単回のｉ．ｖ．投薬後の健康なヒト対象における、ＩｄｅＳ処置後の様々な時点でのＣＤ１９＋／ＩｇＧ＋細胞のフローサイトメトリー分析を示す図である（図２９−１の続き）。
【図３０】ＩｄｅＳが、ヒトにおいてインビボで、ＩｇＧ型のＢＣＲを切断することを示す図である。健康なヒト対象に、０．２４ｍｇ／ｋｇ  ＢＷのＩｄｅＳを投薬し、投薬後の様々な時点でＰＢＭＣを収集した。ＣＤ１９およびＦ（ａｂ’）２について二重陽性細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーを用いて分析した。投薬後の時間がｘ軸に、ＭＦＩ×細胞頻度がｙ軸に示されている。
【図３１】ＩｄｅＳ処置細胞（上方）およびＰＢＳ処置細胞（下方）の抗体架橋後の４８時間のアッセイ時間中のＢ細胞生存率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
開示された方法の異なる適用は、当技術分野における特定のニーズに合わせられ得ることは理解されるべきである。本明細書で用いられる用語は、本発明の特定の実施形態を記載することのみを目的としており、限定することを意図されないこともまた、理解されるべきである。
【０００９】
加えて、この明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる場合、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」、および「その（the）」は、内容が明らかに別なふうに規定していない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「１つの肺（a lung）」への言及は、「（複数の）肺（lungs）」を含み、「１つの抗原（an antigen）」への言及は、２つ以上のそのような抗原を含み、「１つの対象（a subject）」への言及は、２つ以上のそのような対象を含むなどである。
【００１０】
用語「患者」および「対象」は、交換可能に用いられ、典型的には、ヒトを指す。
【００１１】
本明細書で用いられる場合、「血清ＩｇＧ分子とのＦｃ受容体結合を低下させる作用物質」とは、任意の適切な機構によりこの効果を達成する作用物質を意味する。様々な作用物質が、ＩｇＧ分子のＦｃ受容体相互作用を低下させることが知られている。これらの作用物質は、細菌起源のタンパク質である場合が多く、様々な異なる様式で作用し得る。
【００１２】
例えば、そのようなタンパク質は、抗原結合ドメインとＦｃ相互作用ドメインがお互いに分離されるようにＩｇＧを切断するＩｇＧシステインプロテアーゼであり得る。そのような場合、血清中の無傷ＩｇＧ分子の量が低下するため、血清ＩｇＧ分子のＦｃ受容体相互作用は低下する。
【００１３】
別の例として、そのようなタンパク質は、ＩｇＧのＦｃ相互作用ドメイン上のグリカン構造、特に位置Ａｓｎ−２９７（Ｋａｂａｔナンバリング）におけるＮ結合型二分岐グリカンを切断するＩｇＧエンドグリコシダーゼであり得る。このグリカン構造は、Ｆｃ受容体結合において重要な役割をもつ。したがって、それが、タンパク質により全体的に、または部分的に除去された場合、これは、さもなければ無傷であるＩｇＧ分子によるＦｃ受容体結合の低下をもたらすだろう。そのような場合、結合の低下は、好ましくは、ＩｇＧ：ＦｃγＲ相互作用についての平衡結合定数の少なくとも２倍の増加を結果として生じる。好ましくは、その作用物質は、ＩｇＧ：ＦｃγＲ相互作用についての平衡結合定数を、少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも４倍、または少なくとも５倍、または少なくとも６倍、または少なくとも７倍、または少なくとも８倍、増加させる。より好ましくは、その作用物質は、ＩｇＧ：ＦｃγＲ相互作用についての平衡結合定数を、少なくとも８倍、増加させる。平衡結合定数の増加は、ＩｇＧとＦｃγＲの間（例えば、ＩｇＧとＦｃγＲＩＩＡとの間）の結合の減少を表す。
【００１４】
本明細書で用いられる場合、用語「血清ＩｇＧ分子」は、本発明の方法が実行される前にヒト組織中に存在する任意のγ免疫グロブリン（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）分子を指す。そのようなＩｇＧ分子は、個体のＢ細胞から内因的に産生されている場合もあるし、本発明の方法が実行される前に対象へ投与されている外因性γ免疫グロブリンである場合もある。
【００１５】
本明細書で用いられる場合、用語「Ｆｃ受容体」は、細胞上に存在するＦｃγ免疫グロブリン受容体（ＦｃγＲ）を指す。ヒトにおいて、ＦｃγＲは、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）、およびＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）を含む受容体のファミリーの１つ、一部、または全部を指す。本明細書で用いられる場合、ＦｃγＲという用語は、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）、およびＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）の天然に存在する多型を含む。
【００１６】
上記下記にかかわらず、本明細書で引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、全体として本明細書に参照により組み入れられている。
【００１７】
治療または治療剤の利益を向上させるための方法
本発明は、治療または治療剤の対象への利益を向上させるための方法を提供する。方法は、本明細書でステップ（ａ）および（ｂ）と呼ばれる２つのステップを含む。
【００１８】
ステップ（ａ）は、対象において血清ＩｇＧ分子のＦｃ受容体結合を低下させる作用物質を対象に投与することを含む。投与される作用物質の量は、好ましくは、対象の血清に存在する全部の、または実質的に全部のＩｇＧ分子によるＦｃ受容体結合を排除するのに十分である。
【００１９】
ステップ（ｂ）は、その後、前記治療または治療剤を対象に投与することを含む。
【００２０】
ステップ（ａ）と（ｂ）は、好ましくは対象の血清に存在する全部の、または実質的に全部のＩｇＧ分子によるＦｃ受容体結合が排除されるのに十分である時間区間によって隔てられている。前記区間は、典型的には、少なくとも３０分間で、かつ多くても２１日間であり得る。
【００２１】
本発明はまた、治療または治療剤の対象への利益を向上させるための方法に用いられる、対象において血清ＩｇＧ分子のＦｃ受容体結合を低下させる作用物質であって、方法が、（ａ）対象の血清に存在する全部の、または実質的に全部のＩｇＧ分子によるＦｃ受容体結合を排除するのに十分な量の作用物質を対象に投与するステップ、および（ｂ）その後、前記治療または前記治療剤を対象に投与するステップを含み、ステップ（ａ）と（ｂ）が、対象の血清に存在する実質的に全部のＩｇＧ分子によるＦｃ受容体結合が排除されるのに十分である時間区間によって隔てられている、作用物質を提供する。前記区間は、典型的には、少なくとも３０分間で、かつ多くても２１日間であり得る。
【００２２】
本発明はまた、治療または治療剤の対象への利益を向上させるための薬物の製造における、対象において血清ＩｇＧ分子のＦｃ受容体結合を低下させる作用物質の使用であって、前記向上させることが、（ａ）対象の血清に存在する全部の、または実質的に全部のＩｇＧ分子によるＦｃ受容体結合を排除するのに十分な量の作用物質を対象に投与するステップ、および（ｂ）その後、前記治療または前記治療剤を対象に投与するステップを含み、ステップ（ａ）と（ｂ）が、対象の血清に存在する実質的に全部のＩｇＧ分子によるＦｃ受容体結合が排除されるのに十分である時間区間によって隔てられている、使用を提供する。前記区間は、典型的には、少なくとも３０分間で、かつ多くても２１日間であり得る。
【００２３】
ステップ（ａ）と（ｂ）のタイミングおよび順序
ステップ（ａ）はステップ（ｂ）の前に行われ、ステップ（ａ）と（ｂ）が、対象の血清に存在する全部の、または実質的に全部のＩｇＧ分子によるＦｃ受容体結合が排除されるのに十分である時間区間によって隔てられている。「実質的に全部の」とは、典型的には、血清ＩｇＧによるＦｃ受容体結合が、ステップ（ａ）の前に存在したレベルの５％未満へ低下することを意味する。例えば、ステップ（ａ）で投与される作用物質がプロテアーゼ（例えば、ＩｄｅＳ）である場合には、区間は、任意の適切なアッセイによって測定される場合に、作用物質が、対象において血清ＩｇＧの少なくとも９５％を切断するのに必要とされる時間であるだろう。前記区間は、典型的には、少なくとも３０分間で、かつ多くても２１日間であり得る。
【００２４】
ステップ（ａ）と（ｂ）の間の時間区間の下限は、ステップ（ａ）において投与される作用物質が、対象の血清に存在する実質的に全部のＩｇＧ分子によるＦｃ受容体結合を排除するのにかかる時間によって決定される。これは、任意選択で、個体から採取された血清試料を試験し、任意の適切なアッセイを適用することにより決定され得る。いくつかの例示的な適切なアッセイは、実施例に記載されている。
【００２５】
そのようなアッセイは、例えば、ＥＬＩＳＡにおいて、１つまたは複数のＦｃ受容体と結合することができる、血清試料中のＩｇＧ分子の存在について直接的に試験し得る。あるいは、そのようなアッセイは、ステップ（ａ）において投与される作用物質でのＩｇＧの処置から生じると予想される１つまたは複数の反応生成物の存在について試験し得るという点で、間接的であり得る。例えば、その作用物質が、ＩｇＧタンパク質を切断する酵素である場合、血清試料は、無傷ＩｇＧ分子、または切断から生じる断片の存在についてアッセイされ得る。これは、分子量に基づいたその分子および断片を分離すること、例えば、質量分析法もしくはＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、またはその分子もしくは断片の特異的検出、例えば、ＥＬＩＳＡによるなどの任意の適切な方法により達成され得る。あるいは、ＩｇＧは、対象由来の血清を、ＦｃγＲを発現する細胞と混合し、蛍光色素コンジュゲート型抗ヒトＩｇＧを用いるフローサイトメトリーによりＩｇＧ結合をモニターすることにより検出され得る。
【００２６】
臨床設定における血清試料などの試料においてＩｇＧの量を評価するための通常の方法は、スピード、使用の容易さ、および正確さという理由でネフェロメトリーおよび比濁法に頼っている。ネフェロメトリーおよび比濁法の両方において、光源が、透明な容器内の液体試料を通って投射される。比濁法は、光の強度の減少を測定し、ネフェロメトリーは、光が試料を通過する時の光の散乱を測定し、それは、溶液中の免疫グロブリンの濃度に比例する。両方の原理は、試料中の抗原と反応して、抗原／抗体複合体を形成する（凝集）、加えられる抗ＩｇＧ抗体に基づいている。ＰＥＧの添加は、その反応を、終了点まで迅速に進行させ、感度を増加させ、過剰抗原を含有する試料が偽陰性結果を生じるリスクを低下させる。ＩｇＧ分析の場合、ＩｇＧのＦ（ａｂ’）２部分は、抗ＩｇＧ抗体により架橋され、凝集反応を引き起こす。しかしながら、存在するＩｇＧの一部または全部が無傷ではない可能性がある場合、そのような方法は、適切であり得ない。例えば、ＩｇＧシステインプロテアーゼ（例えば、ＩｄｅＳ）が、例えば本発明の方法において、試料を採取される対象に投与されている場合、またはそのようなプロテアーゼが試料に投与されている場合には、Ｆ（ａｂ’）２断片およびＦｃ断片などの切断断片が存在するだろう。これは、Ｆ（ａｂ’）２断片が試料中にまだ存在している限り、通常のネフェロメトリー方法および比濁法の凝集反応に影響しない。無傷ＩｇＧと比較してＦ（ａｂ’）２断片のより短い半減期により、凝集は、時間と共に減少するだろうが、試料に存在する無傷ＩｇＧの量と比例しない。したがって、ＩｇＧシステインプロテアーゼ（例えば、ＩｄｅＳ）の存在により影響される試料は、通常の方法によって評価することができない。本発明者らは、ＩｇＧシステインプロテアーゼ（例えば、ＩｄｅＳ）の存在によって影響される試料に適合し、（非限定的に）本発明の他の方法と組み合わせた使用を含む、任意の臨床設定において用いられ得る、ＩｇＧ濃度についての新しいアッセイを開発した。
【００２７】
前記方法は、無傷ＩｇＧと、ＩｄｅＳによって生成されたＦ（ａｂ’）２断片とを区別することができる。これは、異なる断片を検出する抗体、すなわち、抗Ｆａｂ抗体および抗Ｆｃ抗体を使用することにより達成された。アッセイに用いられる抗体は、試料に影響するＩｇＧシステインプロテアーゼ（典型的には、ＩｄｅＳ）についての基質であってはならない。これは、アッセイ試薬が、試料に存在する可能性がある任意の活性プロテアーゼにより影響されることを回避する。これは、様々な種由来のＩｇＧを試験することにより、または抗体全体の代わりに抗体断片（すなわち、Ｆａｂ断片またはＦ（ａｂ’）２断片）を用いることにより、達成することができる。典型的には、抗Ｆ（ａｂ’）２物質が捕獲試薬として試料とインキュベートされる。捕獲試薬は、典型的には、例えば、アッセイプレートのウェルに固定化される。その後、結合したＩｇＧが、検出試薬としての抗Ｆｃ物質とのインキュベーションにより検出される。したがって、ネフェロメトリー方法および比濁法とは違って、Ｆａｂ部分とＦｃ部分の両方を有するＩｇＧのみが検出されるだろう。検出試薬は、典型的には、蛍光色素、または発色基質と反応する酵素などの検出を促進するための部分に直接的または間接的にコンジュゲートされ得る。捕獲試薬および検出試薬は、ＩｇＧのＦａｂ部分またはＦｃ部分を特異的に認識する任意の他の分子であり得、逆の順序で用いることができ、すなわち、抗Ｆｃを用いて捕獲し、かつ抗Ｆａｂを用いて検出する。アッセイは、通常のＥＬＩＳＡまたはＭｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ形式などの任意の適切な形式で行われ得る。
【００２８】
ＩｇＧシステインプロテアーゼがＩｄｅＳである場合などのいくつかの場合において、試料は、１つの重鎖だけが切断され、かつＦ（ａｂ’）２が他方の無傷重鎖に付着したままであるｓｃＩｇＧなどの中間体断片を含み得る。そのような場合、ｓｃＩｇＧ断片は、無傷ＩｇＧとしてアッセイにより誤って同定され得る。したがって、方法は、試料に存在する断片のサイズを評価する補完的なステップを含み得る。ヒンジ領域より下の重鎖間にジスルフィド架橋はないため、ｓｃＩｇＧ断片における重鎖のＦｃ部分は、変性条件下で、およそ２０〜２５ｋＤａタンパク質として、無傷重鎖から分離するだろう。様々な断片サイズは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどの任意の適切な方法を用いて検出および定量化することができる。任意選択の補完的なステップを含む方法の特定の実施形態は、実施例１に記載されている（効力評価を参照）。方法は、臨床設定においてＩｄｅＳの効力を評価するために特に有用である。
【００２９】
ステップ（ａ）の作用物質が、ＩｇＧ上のグリカン部分を切断する酵素である場合、血清試料は、正常グリカンかもしくは切り詰め型グリカンのいずれかを有するＩｇＧ分子の存在について、または切断から生じるグリカン断片についてアッセイされ得る。これは、分子量に基づいたその分子および／または断片を分離すること、例えば、質量分析法もしくはＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、またはその分子もしくは断片の特異的検出、例えば、ＥＬＩＳＡによるなどの任意の適切な方法により達成され得る。
【００３０】
ステップ（ａ）と（ｂ）の間の時間区間の下限は、少なくとも３０分間、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、または少なくとも６時間から選択され得る。もし、対象の血清に存在する実質的に全部のＩｇＧ分子によるＦｃ受容体結合がより早い時点で排除されていることが決定されたならば、下限は、上記のどれよりも短くあり得る。
【００３１】
ステップ（ａ）と（ｂ）の間の時間区間の上限は、下限とは無関係に選択され得、ＩｇＧの内因性産生が、方法を実行する前に対象の血清に存在したＩｇＧ分子と置き換わり始め、または完全に置き換わるのにかかる時間によって決定され得る。これは、個体から採取された血清試料を試験し、下限に関して上で記載されたものなどの任意の適切なアッセイを適用することにより決定され得る。新しく合成されたＩｇＧは、典型的には、血清において、３〜４日以内に再出現し始め、約３週間（２１日間）までに全部の置き換えが完了する。
【００３２】
ステップ（ａ）と（ｂ）の間の時間区間の上限は、下限とは無関係に選択され得、多くても２１日間、多くても１８日間、多くても１４日間、多くても１３日間、多くても１２日間、多くても１１日間、多くても１０日間、多くても９日間、多くても８日間、多くても７日間、多くても６日間、多くても５日間、多くても４日間、多くても３日間、多くても２日間、多くても２４時間、多くても１８時間、多くても１２時間、多くても１０時間、多くても８時間、多くても７時間、多くても６時間、多くても５時間、多くても４時間、多くても３時間、多くても２時間、または多くても１時間から選択され得る。
【００３３】
好ましくは、ステップ（ａ）と（ｂ）の間の時間区間は、ステップ（ａ）と（ｂ）が同じ日に、または処置センターへの同じ訪問時中に実行され得るように、多くても２４時間、より好ましくは多くても１２時間、最も好ましくは多くても６時間である。これは、特に処置センターへのアクセスが限定され得る場合、非常に有利である。したがって、ステップ（ａ）と（ｂ）の間の時間区間は、ステップ（ａ）において投与される作用物質が、対象の血清に存在する実質的に全部のＩｇＧ分子によるＦｃ受容体結合を排除するのに十分長くあるべきであるが、多くても約６時間である。したがって、ステップ（ａ）と（ｂ）の間の区間は、好ましくは、３０分間〜１時間、３０分間〜２時間、３０分間〜３時間、３０分間〜４時間、３０分間〜５時間、３０分間〜６時間、１〜２時間、１〜３時間、１〜４時間、１〜５時間、１〜６時間、２〜３時間、２〜４時間、２〜５時間、２〜６時間、３〜４時間、３〜５時間、３〜６時間、４〜５時間、４〜６時間、または５〜６時間である。
【００３４】
ステップ（ａ）
ステップ（ａ）において、対象において血清ＩｇＧ分子のＦｃ受容体結合を低下させる作用物質の有効量が、対象に投与される。「有効量」とは、作用物質のその量が、対象の血清に存在する実質的に全部のＩｇＧ分子によるＦｃ受容体結合を排除するのに十分であることを意味する。
【００３５】
作用物質
典型的には、作用物質は、典型的には細菌起源の、タンパク質である。作用物質は、好ましくは免疫グロブリン分子のヒンジ領域において切断する、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有するタンパク質であり得る。そのようなタンパク質の例はＩｄｅＳ（化膿性連鎖球菌の免疫グロブリンＧ分解性酵素（Immunoglobulin G-degrading enzyme of S. pyogenes））である。ＩｄｅＳは、独特の特異性度を有する連鎖球菌プロテアーゼである；それは、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体を切断するが、（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭを含む）他の基質を切断しない。ＩｄｅＳは、ヒトＩｇＧを、ヒンジ領域のＣＯＯＨ末端の限定された部位で、Ｆ（ａｂ’）２断片とＦｃ断片へと切断する（図１参照）。ＩｄｅＳの成熟配列は配列番号１として提供されている。作用物質は、配列番号１のアミノ酸配列を含み、もしくはそれからなるタンパク質であり得、または別の細菌由来のそれのホモログであり得る。
【００３６】
あるいは、作用物質は、配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一性を有する任意のアミノ酸配列を含み、またはそれからなり、かつＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有するＩｄｅＳタンパク質の変種であり得る。好ましい変種は、タンパク質ＭＡＣ２であり、その完全配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦＣ６７９０７．１として入手可能である。シグナル配列を含まないＭＡＣ２の配列は配列番号３として提供されている。作用物質は、配列番号３のアミノ酸配列を含み、もしくはそれからなるタンパク質であり得、または別の細菌由来のそれのホモログであり得る。
【００３７】
ＩｄｅＳタンパク質の変種は、その変種がＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有するとの条件で、配列番号１のアミノ酸配列に対して１個、２個、３個、４個、５個、１０個、２０個、３０個、またはそれ以上までのアミノ酸置換、挿入、または欠失が生じているアミノ酸配列を含み得、またはそれからなり得る。前記アミノ酸置換は好ましくは保存的である。保存的置換は、アミノ酸を、類似した化学構造、類似した化学的性質、または類似した側鎖体積の他のアミノ酸と置き換える。導入されるアミノ酸は、それらが置き換わるアミノ酸と類似した極性、親水性、疎水性、塩基性度、酸性度、中性度、または電荷を有し得る。あるいは、保存的置換は、既存の芳香族または脂肪族アミノ酸の代わりに芳香族または脂肪族である別のアミノ酸を導入し得る。保存的アミノ酸変化は当技術分野においてよく知られており、下記の表１に定義されているように、２０個の主なアミノ酸の性質に従って選択され得る。アミノ酸が類似した極性を有する場合、これは、表２におけるアミノ酸側鎖についてのハイドロパシー尺度を参照することにより、決定することができる。
【００３８】
【表１】
0006708641.tif 000002
【００３９】
【表２】
0006708641.tif 000003
【００４０】
あるいは、作用物質は、配列番号１または配列番号３の断片を含み、またはそれからなり、かつＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有するタンパク質であって、好ましくは、前記断片が１００〜３００、１５０〜３００、または２００〜３００アミノ酸長である、タンパク質であり得る。その断片は、配列番号１または配列番号３のアミノ酸配列の１個または複数個のアミノ酸残基の欠失により作製され得る。１個、２個、３個、４個、５個、１０個、２０個、３０個、４０個、もしくは５０個までの残基、またはそれ以上が欠失してもよい。欠失した残基はお互いに連続していてもよい。
【００４１】
作用物質は、好ましくはＩｇＧのＦｃ領域においてＡｓｎ−２９７（Ｋａｂａｔナンバリング）でのグリカン部分を切断する、ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有するタンパク質であり得る。そのようなタンパク質の例は、ＥｎｄｏＳ（化膿性連鎖球菌のエンドグリコシダーゼ（Endoglycosidase of S. pyogenes））である。ＥｎｄｏＳは、正常にグリコシル化されたＩｇＧのアスパラギン連結型グリカンのβ−１，４−ジ−Ｎ−アセチルキトビオースのコアを加水分解する（図１８参照）。ＥｎｄｏＳの成熟配列は配列番号２として提供されている。作用物質は、配列番号２のアミノ酸配列を含み、もしくはそれからなるタンパク質であり得、あるいは腺疫菌（Streptococcus equi）もしくはストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Streptococcus zooepidemicus）、またはヒツジ偽結核菌（Corynebacterium pseudotuberculosis）、大便連鎖球菌（Enterococcus faecalis）、もしくはエリザベトキンギア・メニンゴセプティカ（Elizabethkingia meningoseptica）などの別の細菌由来のそれのホモログであり得る。作用物質は、ＣＰ４０、ＥｎｄｏＥ、またはＥｎｄｏＦ２であり得る。
【００４２】
あるいは、作用物質は、配列番号２と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一性を有する任意のアミノ酸配列を含み、またはそれからなり、かつＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有するＥｎｄｏＳタンパク質の変種であり得る。ＥｎｄｏＳタンパク質の変種は、その変種がＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有するとの条件で、配列番号２のアミノ酸配列に対して１個、２個、３個、４個、５個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、またはそれ以上までのアミノ酸置換、挿入、または欠失が生じているアミノ酸配列を含み得、またはそれからなり得る。前記アミノ酸置換は、好ましくは、保存的である。保存的置換は、配列番号１に関して上記で定義されている通りである。
【００４３】
あるいは、作用物質は、配列番号２の断片を含み、またはそれからなり、かつＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有するタンパク質であって、好ましくは、前記断片が４００〜９５０、５００〜９５０、６００〜９５０、７００〜９５０、または８００〜９５０アミノ酸長である、タンパク質であり得る。好ましい断片は、連鎖球菌のシステインプロテアーゼＳｐｅＢによる切断によって生じたＥｎｄｏＳの酵素活性のあるα−ドメインに対応する、配列番号２のアミノ酸１〜４０９からなる。その断片は、配列番号１のアミノ酸配列の１個または複数個のアミノ酸残基の欠失により作製され得る。１個、２個、３個、４個、５個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、もしくは５５０個までの残基、またはそれ以上が欠失してもよい。欠失した残基は他のと連続していてもよい。
【００４４】
配列番号２の任意の断片または変種は、好ましくは、配列番号２の残基１９１〜１９９、すなわち、配列番号１のＬｅｕ−１９１、Ａｓｐ−１９２、Ｇｌｙ−１９３、Ｌｅｕ−１９４、Ａｓｐ−１９５、Ｖａｌ−１９６、Ａｓｐ−１９７、Ｖａｌ−１９８、およびＧｌｕ−１９９を含む。これらのアミノ酸は、グルタミン酸で終了する、完全なキチナーゼファミリー１８活性部位を構成する。キチナーゼの活性部位におけるグルタミン酸は、酵素活性に必須である。それゆえに、最も好ましくは、配列番号２の変種は、配列番号２のＧｌｕ−１９９を含有する。配列番号２の変種は、その変種が配列番号２のＧｌｕ−１９９を含有するとの条件で、１つまたは複数の保存的置換を有する、配列番号２の残基１９１〜１９９を含有し得る。
【００４５】
投与および用量
ステップ（ａ）において、作用物質は、好ましくは、点滴静注により投与されるが、例えば、皮内、皮下、経皮、筋肉内、動脈内、腹腔内、関節内、骨内、または他の適切な投与経路を含む任意の適切な経路により投与されてもよい。投与される前記作用物質の量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ〜２ｍｇ／ｋｇ  ＢＷの間、０．０４〜２ｍｇ／ｋｇ  ＢＷの間、０．１２ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ〜２ｍｇ／ｋｇ  ＢＷの間、好ましくは０．２４ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇ  ＢＷの間、最も好ましくは１ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇ  ＢＷの間であり得る。作用物質は、実質的に単離された形で存在し得る。それは、意図された使用に干渉しないだろう（下記で論じられているような）担体または希釈剤と混合されてもよく、それでも実質的に単離されたと見なされ得る。それはまた、実質的に精製された形をとり得、その場合、それは、一般的に、調製物において、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、９８％、または９９％のそのタンパク質を含む。
【００４６】
製剤および組成物
作用物質は、好ましくは、１つまたは複数の薬学的に許容される担体または希釈剤、および任意選択で、１つまたは複数の他の治療用成分と共に投与される。担体は、製剤の他の成分と適合性であり、かつそのレシピエントに有害ではないという意味で「許容され」なければならない。典型的には、注射用担体および最終製剤は無菌で、かつ発熱物質を含まない。
【００４７】
適切な組成物の製剤化は、全てが当業者に容易に利用できる標準薬学的製剤化学および方法論を用いて実行することができる。例えば、作用物質は、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤または媒体と組み合わせることができる。湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などの補助的な物質が、賦形剤または媒体中に存在してもよい。これらの賦形剤、媒体、および補助的な物質は、一般的に、その組成物を受ける個体において免疫応答を誘導せず、かつ不当な毒性無しに投与され得る薬剤である。薬学的に許容される賦形剤としては、水、食塩水、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、グリセロール、チオグリセロール、およびエタノールなどの液体が挙げられるが、それらに限定されない。薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩、および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩もまたそれに含めることができる。薬学的に許容される賦形剤、媒体、および補助的な物質の徹底的な議論は、Remington’s Pharmaceutical Sciences（Mack Pub. Co., N.J. 1991）で入手することができる。
【００４８】
そのような組成物は、ボーラス投与または連続投与に適した形で調製され、パッケージングされ、または販売され得る。注射用組成物は、アンプル中、または保存剤を含有する複数回用量容器中などの単位剤形で調製され、パッケージングされ、または販売され得る。組成物としては、懸濁液、溶液、油性または水性媒体中の乳濁液、ペースト、および植え込み型の徐放性または生分解性製剤が挙げられるが、それらに限定されない。そのような組成物は、非限定的に、懸濁剤、安定剤、または分散剤を含む１つまたは複数の追加の成分をさらに含んでもよい。非経口投与用の組成物の一実施形態において、活性成分は、復元される組成物の非経口投与前に適切な媒体（例えば、発熱物質を含まない滅菌水）での復元のための乾燥した形（例えば、粉末または顆粒）で提供される。組成物は、無菌の注射可能な水性または油性懸濁液または溶液の形で調製され、パッケージングされ、または販売され得る。この懸濁液または溶液は、公知の技術に従って製剤化され得、活性成分に加えて、本明細書に記載された分散剤、湿潤剤、または懸濁剤などの追加の成分を含み得る。そのような無菌注射用製剤は、例えば、水または１，３−ブタンジオールなどの無毒の非経口的に許容される希釈剤または溶媒を用いて調製され得る。他の許容される希釈剤および溶媒としては、リンゲル液、等張性塩化ナトリウム溶液、および合成モノグリセリドまたはジグリセリドなどの固定油が挙げられるが、それらに限定されない。
【００４９】
有用である他の非経口で投与可能な組成物としては、活性成分を、微結晶の形で、リポソーム調製物中に、または生分解性ポリマー系の構成要素として含むものが挙げられる。徐放性または植え込みのための組成物は、乳濁液、イオン交換樹脂、難溶性ポリマー、または難溶性塩などの薬学的に許容されるポリマー性または疎水性材料を含み得る。
【００５０】
ステップ（ｂ）
ステップ（ｂ）において、治療または治療剤が対象に投与される。治療または治療剤は、典型的には、ステップ（ａ）が最初に行われなかったならば、用いられたであろう場合と正確に同じ様式で投与または実施される。
【００５１】
治療剤
一実施形態において、治療剤は、癌または別の疾患の処置のために投与される抗体である。治療剤は、静注用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）であり得る。この実施形態の関連において、方法は、代わりとして、対象における癌または別の疾患の処置のための方法として記載され得、その方法は、（ａ）対象において血清ＩｇＧ分子のＦｃ受容体結合を低下させる作用物質を対象に投与するステップ、および（ｂ）その後、前記癌または前記他の疾患についての処置である治療的有効量の抗体を対象に投与するステップを含み、
−  投与される前記作用物質の量が、対象の血清に存在する実質的に全部のＩｇＧ分子によるＦｃ受容体結合を排除するのに十分であり、
−  ステップ（ａ）と（ｂ）が、少なくとも２時間で、かつ多くても２１日間の時間区間によって隔てられている。
【００５２】
本発明はまた、癌または別の疾患の処置のためのそのような方法に用いられる作用物質を提供する。本発明はまた、そのような方法による癌または別の疾患の処置のための薬物の製造における作用物質の使用を提供する。
【００５３】
癌は、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄球性白血病、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、虫垂癌、星細胞腫、小児小脳または小児大脳、基底細胞癌、肝外胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、脳幹グリオーマ、脳癌、脳腫瘍；小脳星細胞腫、脳腫瘍；大脳星細胞腫／悪性グリオーマ、脳腫瘍；上衣腫、脳腫瘍；髄芽腫、脳腫瘍；テント上原始神経外胚葉性腫瘍、脳腫瘍；視覚路および視床下部グリオーマ、乳癌、気管支アデノーマ／カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、カルチノイド腫瘍；消化管、原発不明の癌腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性グリオーマ、子宮頚癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、ユーイングファミリー腫瘍におけるユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍；小児性、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌；眼球内黒色腫、眼癌；網膜芽細胞腫、胆嚢癌、胃（gastric (stomach)）癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍；頭蓋外、性腺外、または卵巣、妊娠性トロホブラスト腫瘍、脳幹のグリオーマ、グリオーマ、小児性大脳星細胞腫、グリオーマ；小児性視覚路および視床下部、胃カルチノイド、有毛細胞白血病、頭頚部癌、心臓癌、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部および視覚路グリオーマ、眼球内黒色腫、島細胞癌（膵内分泌部）、カポジ肉腫、腎臓癌（腎細胞癌）、咽頭癌、白血病、白血病；急性リンパ芽球性（急性リンパ性白血病とも呼ばれる）、白血病；急性骨髄球性（急性骨髄性白血病とも呼ばれる）、白血病；慢性リンパ性（慢性リンパ性白血病とも呼ばれる）、白血病；慢性骨髄芽球性（慢性骨髄性白血病とも呼ばれる）、白血病；有毛細胞、口唇および口腔癌、脂肪肉腫、肝臓癌（原発性）、肺癌；非小細胞、肺癌；小細胞、リンパ腫、リンパ腫；ＡＩＤＳ関連、リンパ腫；バーキット、リンパ腫；皮膚Ｔ細胞、リンパ腫；ホジキン、リンパ腫；非ホジキン（ホジキンリンパ腫を除く全てのリンパ腫の古い分類）、リンパ腫；原発性中枢神経系、マクログロブリン血症、ワルデンシュトレーム、骨の悪性線維性組織球腫／骨肉腫、髄芽腫、黒色腫、黒色腫；眼内（眼）、メルケル細胞癌、中皮腫；成人悪性、中皮腫；原発不明を含む転移性扁平上皮頚部癌、口腔癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、骨髄性白血病；慢性、骨髄球性白血病；成人急性、骨髄球性白血病；小児急性、骨髄腫；多発性（骨髄の癌）、骨髄増殖性疾患、鼻腔および副鼻腔の癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌、卵巣上皮癌（表層上皮・間質性腫瘍）、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、膵臓癌、島細胞、副鼻腔および鼻腔の癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体星細胞腫、松果体胚腫、松果体芽腫およびテント上原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体アデノーマ、形質細胞腫／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前���腺癌、直腸癌、腎細胞癌（腎臓癌）；腎盂および尿管、移行上皮癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫；ユーイングファミリー腫瘍；カポジ肉腫、肉腫；軟組織、肉腫；子宮、セザリー症候群、皮膚癌（非黒色腫性）、皮膚癌（黒色腫）、皮膚癌腫；メルケル細胞、小細胞肺癌、小腸癌、軟組織肉腫、扁平上皮細胞癌、原発不明を含む扁平上皮頚部癌；転移性、胃癌、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫；皮膚性（菌状息肉腫およびセザリー症候群を参照）、精巣癌、咽頭癌、胸腺腫、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺癌、甲状腺癌、腎盂および尿管の移行上皮癌、トロホブラスト腫瘍、尿管および腎盂移行上皮癌、尿道癌、子宮癌；子宮内膜、子宮肉腫、腟癌、視覚路および視床下部のグリオーマ、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ならびにウィルムス腫瘍（腎臓癌）であり得る。
【００５４】
癌は、好ましくは、前立腺癌、乳癌、膀胱癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、腎臓（腎細胞）癌、食道癌、甲状腺癌、皮膚癌、リンパ腫、黒色腫、または白血病である。
【００５５】
ステップ（ｂ）において投与される抗体は、好ましくは、上記の癌型の１つまたは複数に関連した腫瘍抗原に特異的である。本方法に用いられる抗体について対象となる標的としては、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１０５、ＣＤ１３８、ＣＤ１７４、ＣＤ２０５、ＣＤ２２７、ＣＤ３２６、ＣＤ３４０、ＭＵＣ１６、ＧＰＮＭＢ、ＰＳＭＡ、Ｃｒｉｐｔｏ、ＥＤ−Ｂ、ＴＭＥＦＦ２、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＢ２、ＦＡＰ、ａｖインテグリン、メゾテリン、ＥＧＦＲ、ＴＡＧ−７２、ＧＤ２、ＣＡ１Ｘ、５Ｔ４、α４β７インテグリン、Ｈｅｒ２が挙げられる。他の標的は、インターロイキンＩＬ−Ｉ〜ＩＬ−１３、腫瘍壊死因子αおよびβ、インターフェロンα、β、およびγ、腫瘍増殖因子β（ＴＧＦ−β）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、ならびに顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）などのサイトカインである。Human Cytokines: Handbook for Basic & Clinical Research（Aggrawal et al. eds., Blackwell Scientific, Boston, MA 1991）を参照。他の標的は、アデニルシクラーゼ、グアニルシクラーゼ、およびホスホリパーゼＣなどのホルモン、酵素、ならびに細胞内および細胞間メッセンジャーである。対象となる他の標的は、ＣＤ２０およびＣＤ３３などの白血球抗原である。薬物もまた、対象となる標的であり得る。標的分子は、ヒト、哺乳類、または細菌の分子であり得る。他の標的は、ウイルスと細菌の両方の微生物病原体、および腫瘍に由来するタンパク質、糖タンパク質、および糖などの抗原である。さらに他の標的は、米国特許第４，３６６，２４１号明細書に記載されている。
【００５６】
「別の疾患」とは、抗体の投与により処置可能である任意の他の疾患を意味する。他の疾患は、悪性腹水であり得、その場合、その疾患についての処置である抗体は、典型的には、カツマキソマブ、またはカツマキソマブと同じ標的と結合する抗体である。
【００５７】
癌の処置であろうと別の疾患の処置であろうと、抗体に、細胞傷害性部分、または検出可能な標識を直接的に、または間接的に付着させてもよい。抗体は、当技術分野において知られた様々な方法の１つまたは複数を用いて１つまたは複数の投与経路を介して投与され得る。投与の経路および／または様式は、所望の結果によって異なるだろう。抗体についての好ましい投与経路としては、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄、または、例えば注射もしくは注入による、他の非経口投与経路が挙げられる。本明細書で用いられる場合、句「非経口投与」は、経腸的および局所的投与以外の、通常注射による、投与様式を意味する。あるいは、抗体は、局所、上皮、または粘膜の投与経路などの、非経口ではない経路を介して投与することができる。局部投与もまた好ましく、それには、腫瘍周囲、腫瘍近傍、腫瘍内、病変内、病変周囲、腔内注入、膀胱内（intravesicle）投与、および吸入が挙げられる。
【００５８】
抗体の適切な用量は、熟練した医師によって決定され得る。抗体の実際の用量レベルは、患者に毒性であることなく、特定の患者、組成物、および投与様式について所望の治療応答を達成するのに有効である活性成分の量を得るように変動され得る。選択される用量レベルは、用いられる特定の抗体の活性、投与経路、投与の時間、抗体の排泄速度、処置の期間、用いられる特定の組成物と組み合わせて用いられる他の薬物、化合物、および／または材料、処置されている患者の年齢、性別、体重、状態、全体的な健康、および以前の病歴、ならびに医学分野においてよく知られた同様の因子を含む様々な薬物動態学的因子に依存するだろう。
【００５９】
抗体の適切な用量は、例えば、処置されることになっている患者の体重１ｋｇあたり約０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲であり得る。例えば、適切な用量は、１日あたり約１μｇ／ｋｇ体重から１０ｍｇ／ｋｇ体重まで、または１日あたり約１０μｇ／ｋｇ体重から約５ｍｇ／ｋｇ体重までであり得る。
【００６０】
投与計画は、最適の所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調整され得る。例えば、ステップ（ａ）と（ｂ）の間の必要とされる区間を超えないとの条件で、単回ボーラスが投与され得、または、本方法のステップ（ｂ）が、時間をかけて投与されるいくつかの分割された用量を含み得、または用量が、治療状況の緊急事態により示された場合、比例的に低下もしくは増加し得る。投与の容易さおよび用量の均一性のために単位剤形で非経口組成物を製剤化することは特に有利である。本明細書で用いられる場合、単位剤形は、処置されることになっている対象についての単位の用量として適した物理的に別々の単位を指し、各単位が、必要とされる薬学的担体と共同して所望の治療効果を生じるように計算された活性化合物の所定量を含有する。
【００６１】
ステップ（ｂ）の抗体は、化学療法または放射線療法と組み合わせて投与され得る。方法は、ステップ（ｂ）の抗体と共に、単一の組成物において、または併用治療の部分として別個の組成物において投与され得る、追加の抗癌抗体または他の治療剤の投与をさらに含み得る。例えば、ステップ（ｂ）の抗体は、他の作用物質の前に、後に、またはそれと同時に投与され得る。
【００６２】
抗体は、アバゴボマブ（Abagovomab）、アブシキシマブ(Abciximab)、アクトクスマブ（Actoxumab）、アダリムマブ(Adalimumab)、アデカツムマブ(Adecatumumab)、アフェリモマブ(Afelimomab)、アフツズマブ(Afutuzumab)、アラシズマブペゴール（Alacizumab pegol）、ＡＬＤ５１８、アレムツズマブ(Alemtuzumab)、アリロクマブ（Alirocumab）、アルツモマブペンテト酸（Altumomab pentetate）、アマツキシマブ(Amatuximab)、アナツモマブマフェナトクス（Anatumomab mafenatox）、アンルキンズマブ（Anrukinzumab）、アポリズマブ(Apolizumab)、アルシツモマブ(Arcitumomab)、アセリズマブ（Aselizumab）、アチヌマブ（Atinumab）、アツリズマブ（Atlizumab）（＝トシリズマブ）、アトロリムマブ（Atorolimumab）、バピネウズマブ（Bapineuzumab）、バシリキシマブ(Basiliximab)、バビツキシマブ(Bavituximab)、ベクツモマブ（Bectumomab）、ベリムマブ(Belimumab)、ベンラリズマブ（Benralizumab）、ベルチリムマブ（Bertilimumab）、ベシレソマブ(Besilesomab)、ベバシズマブ(Bevacizumab)、ベズロトクスマブ(Bezlotoxumab)、ビシロマブ（Biciromab）、ビマグルマブ（Bimagrumab）、ビバツズマブメルタンシン（Bivatuzumab mertansine）、ブリナツモマブ（Blinatumomab）、ブロソズマブ（Blosozumab）、ブレンツキシマブベドチン(Brentuximab vedotin)、ブリアキヌマブ(Briakinumab)、ブロダルマブ(Brodalumab)、カナキヌマブ(Canakinumab)、カンツズマブメルタンシン(Cantuzumab mertansine)、カンツズマブラブタンシン（Cantuzumab ravtansine）、カプラシズマブ（Caplacizumab）、カプロマブペンデチド(Capromab pendetide)、カルルマブ(Carlumab)、カツマキソマブ(Catumaxomab)、ＣＣ４９、セデリズマブ(Cedelizumab)、セルトリズマブペゴール(Certolizumab pegol)、セツキシマブ(Cetuximab)、Ｃｈ．１４．１８、シタツズマブボガトクス（Citatuzumab bogatox）、シクスツムマブ(Cixutumumab)、クラザキズマブ（Clazakizumab）、クレノリキシマブ(Clenoliximab)、クリバツズマブテトラキセタン(Clivatuzumab tetraxetan)、コナツムマブ（Conatumumab）、コンシズマブ（Concizumab）、クレネズマブ（Crenezumab）、ＣＲ６２６１、ダセツズマブ(Dacetuzumab)、ダクリズマブ(Daclizumab)、ダロツズマブ(Dalotuzumab)、ダラツムマブ(Daratumumab)、デムシズマブ（Demcizumab）、デノスマブ(Denosumab)、デツモマブ(Detumomab)、ドルリモマブアリトクス（Dorlimomab aritox）、ドロジツマブ（Drozitumab）、デュリゴツマブ（Duligotumab）、デュピルマブ(Dupilumab)、デュシギツマブ（Dusigitumab）、エクロメキシマブ（Ecromeximab）、エクリズマブ(Eculizumab)、エドバコマブ（Edobacomab）、エドレコロマブ(Edrecolomab)、エファリズマブ(Efalizumab)、エフングマブ（Efungumab）、エロツズマブ(Elotuzumab)、エルシリモマブ（Elsilimomab）、エナバツズマブ（Enavatuzumab）、エンリモマブペゴール（Enlimomab pegol）、エノキズマブ（Enokizumab）、エノチクマブ（Enoticumab）、エンシツキシマブ（Ensituximab）、エピツモマブシツキセタン（Epitumomab cituxetan）、エプラツズマブ（Epratuzumab）、エルリズマブ（Erlizumab）、エルツマキソマブ（Ertumaxomab）、エタラシズマブ（Etaracizumab）、エトロリズマブ（Etrolizumab）、エボロクマブ(Evolocumab)、エキスビビルマブ（Exbivirumab）、ファノレソマブ（Fanolesomab）、ファラリモマブ（Faralimomab）、ファルレツズマブ（Farletuzumab）、ファシヌマブ（Fasinumab）、ＦＢＴＡ０５、フェルビズマブ（Felvizumab）、フェザキヌマブ（Fezakinumab）、フィクラツズマブ（Ficlatuzumab）、フィギツムマブ(Figitumumab)、フランボツマブ（Flanvotumab）、フォントリズマブ（Fontolizumab）、フォラルマブ（Foralumab）、フォラビルマブ（Foravirumab）、フレソリムマブ（Fresolimumab）、フルラヌマブ（Fulranumab）、フツキシマブ（Futuximab）、ガリキシマブ(Galiximab)、ガニツマブ（Ganitumab）、ガンテネルマブ（Gantenerumab）、ガビリモマブ（Gavilimomab）、ゲムツズマブオゾガマイシン(Gemtuzumab ozogamicin)、ゲボキズマブ(Gevokizumab)、ギレンツキシマブ(Girentuximab)、グレムバツムマブベドチン（Glembatumumab vedotin）、ゴリムマブ(Golimumab)、ゴミリキシマブ(Gomiliximab)、ＧＳ６６２４、イバリズマブ（Ibalizumab）、イブリツモマブチウキセタン(Ibritumomab tiuxetan)、イクルクマブ（Icrucumab）、イゴボマブ（Igovomab）、イムシロマブ（Imciromab）、イムガツズマブ（Imgatuzumab）、インクラクマブ（Inclacumab）、インダツキシマブラブタンシン（Indatuximab ravtansine）、インフリキシマブ(Infliximab)、インテツムマブ(Intetumumab)、イノリモマブ（Inolimomab）、イノツズマブオゾガマイシン(Inotuzumab ozogamicin)、イピリムマブ(Ipilimumab)、イラツムマブ（Iratumumab）、イトリズマブ(Itolizumab)、イキセキズマブ（Ixekizumab）、ケリキシマブ(Keliximab)、ラベツズマブ(Labetuzumab)、ラムパリズマブ（Lampalizumab）、レブリキズマブ（Lebrikizumab）、レマレソマブ（Lemalesomab）、レルデリムマブ（Lerdelimumab）、レキサツムマブ（Lexatumumab）、リビビルマブ（Libivirumab）、リゲリズマブ（Ligelizumab）、リンツズマブ(Lintuzumab)、リリルマブ（Lirilumab）、ロデルシズマブ（Lodelcizumab）、ロルボツズマブメルタンシン（Lorvotuzumab mertansine）、ルカツムマブ（Lucatumumab）、ルミリキシマブ、マパツムマブ（Mapatumumab）、マスリモマブ（Maslimomab）、マブリリムマブ（Mavrilimumab）、マツズマブ(Matuzumab)、メポリズマブ(Mepolizumab)、メテリムマブ（Metelimumab）、ミラツズマブ(Milatuzumab)、ミンレツモマブ（Minretumomab）、ミツモマブ（Mitumomab）、モガムリズマブ(Mogamulizumab)、モロリムマブ（Morolimumab）、モタビズマブ(Motavizumab)、モキセツモマブパスドトクス（Moxetumomab pasudotox）、ムロモナブ−ＣＤ３(Muromonab-CD3)、ナコロマブタフェナトクス（Nacolomab tafenatox）、ナミルマブ（Namilumab）、ナプツモマブエスタフェナトクス(Naptumomab estafenatox)、ナルナツマブ（Narnatumab）、ナタリズマブ(Natalizumab)、ネバクマブ(Nebacumab)、ネシツムマブ(Necitumumab)、ネレリモマブ(Nerelimomab)、ネスバクマブ（Nesvacumab）、ニモツズマブ(Nimotuzumab)、ニボルマブ(Nivolumab)、ノフェツモマブメルペンタン（Nofetumomab merpentan）、オビヌツズマブ(Obinutuzumab)、オカラツズマブ（Ocaratuzumab）、オクレリズマブ(Ocrelizumab)、オデュリモマブ（Odulimomab）、オファツムマブ(Ofatumumab)、オララツマブ（Olaratumab）、オロキズマブ（Olokizumab）、オマリズマブ(Omalizumab)、オナルツズマブ（Onartuzumab）、オポルツズマブモナトクス（Oportuzumab monatox）、オレゴボマブ(Oregovomab)、オルチクマブ（Orticumab）、オテリキシズマブ、オキセルマブ（Oxelumab）、オザネズマブ（Ozanezumab）、オゾラリズマブ（Ozoralizumab）、パギバキシマブ(Pagibaximab)、パリビズマブ(Palivizumab)、パニツムマブ(Panitumumab)、パノバクマブ（Panobacumab）、パルサツズマブ（Parsatuzumab）、パスコリズマブ（Pascolizumab）、パテクリズマブ（Pateclizumab）、パトリツマブ（Patritumab）、ペムツモマブ（Pemtumomab）、ペラキズマブ（Perakizumab）、ペルツズマブ(Pertuzumab)、ペキセリズ��ブ（Pexelizumab）、ピジリズマブ（Pidilizumab）、ピナツズマブベドチン（Pinatuzumab vedotin）、ピンツモマブ（Pintumomab）、プラクルマブ（Placulumab）、ポラツズマブベドチン（Polatuzumab vedotin）、ポネズマブ(Ponezumab)、プリリキシマブ（Priliximab）、プリトキサキシマブ（Pritoxaximab）、プリツムマブ(Pritumumab)、ＰＲＯ１４０、クイリズマブ（Quilizumab）、ラコツモマブ（Racotumomab）、ラドレツマブ（Radretumab）、ラフィビルマブ（Rafivirumab）、ラムシルマブ(Ramucirumab)、ラニビズマブ(Ranibizumab)、ラキシバクマブ(Raxibacumab)、レガビルマブ(Regavirumab)、レスリズマブ(Reslizumab)、リロツムマブ(Rilotumumab)、リツキシマブ(Rituximab)、ロバツムマブ（Robatumumab）、ロレデュマブ（Roledumab）、ロモソズマブ(Romosozumab)、ロンタリズマブ（Rontalizumab）、ロベリズマブ（Rovelizumab）、ルプリズマブ（Ruplizumab）、サマリズマブ（Samalizumab）、サリルマブ（Sarilumab）、サツモマブペンデチド（Satumomab pendetide）、セクキヌマブ(Secukinumab)、セリバンツマブ（Seribantumab）、セトキサキシマブ（Setoxaximab）、セビルマブ（Sevirumab）、シブロツズマブ（Sibrotuzumab）、シファリムマブ（Sifalimumab）、シルツキシマブ(Siltuximab)、シムツズマブ（Simtuzumab）、シプリズマブ(Siplizumab)、シルクマブ（Sirukumab）、ソラネズマブ(Solanezumab)、ソリトマブ（Solitomab）、ソネプシズマブ（Sonepcizumab）、ソンツズマブ（Sontuzumab）、スタムルマブ（Stamulumab）、スレソマブ（Sulesomab）、スビズマブ（Suvizumab）、タバルマブ（Tabalumab）、タカツズマブテトラキセタン（Tacatuzumab tetraxetan）、タドシズマブ（Tadocizumab）、タリズマブ(Talizumab)、タネズマブ(Tanezumab)、タプリツモマブパプトクス（Taplitumomab paptox）、テフィバズマブ（Tefibazumab）、テリモマブアリトクス（Telimomab aritox）、テナツモマブ（Tenatumomab）、テネリキシマブ（Teneliximab）、テプリズマブ(Teplizumab)、テプロツムマブ（Teprotumumab）、ＴＧＮ１４１２、チシリムマブ（Ticilimumab）（＝トレメリムマブ(tremelimumab)）、チルドラキズマブ（Tildrakizumab）、チガツズマブ（Tigatuzumab）、ＴＮＸ−６５０、トシリズマブ(Tocilizumab)（＝アツリズマブ(atlizumab)）、トラリズマブ（Toralizumab）、トシツモマブ(Tositumomab)、トラロキヌマブ（Tralokinumab）、トラスツズマブ(Trastuzumab)、ＴＲＢＳ０７、トレガリズマブ（Tregalizumab）、トレメリムマブ(Tremelimumab)、ツコツズマブセルモロイキン（Tucotuzumab celmoleukin）、ツビルマブ（Tuvirumab）、ウブリツキシマブ（Ublituximab）、ウレルマブ（Urelumab）、ウルトキサズマブ(Urtoxazumab)、ウステキヌマブ(Ustekinumab)、バパリキシマブ（Vapaliximab）、バテリズマブ（Vatelizumab）、ベドリズマブ(Vedolizumab)、ベルツズマブ(Veltuzumab)、ベパリモマブ（Vepalimomab）、ベセンクマブ（Vesencumab）、ビシリズマブ(Visilizumab)、ボロシキシマブ(Volociximab)、ボルセツズマブマフォドチン（Vorsetuzumab mafodotin）、ボツムマブ（Votumumab）、ザルツムマブ(Zalutumumab)、ザノリムマブ(Zanolimumab)、ザツキシマブ（Zatuximab）、ジラリムマブ（Ziralimumab）、またはゾリモマブアリトクス（Zolimomab aritox）であり得る。
【００６３】
好ましい抗体には、ナタリズマブ、ベドリズマブ、ベリムマブ、アタシセプト、アレファセプト、オテリキシズマブ、テプリズマブ、リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、エプラツズマブ、アレムツズマブ、アバタセプト、エクリズマブ、オマリズマブ、カナキヌマブ、メプリズマブ（Meplizumab）、レスリズマブ、トシリズマブ、ウステキヌマブ、ブリアキヌマブ、エタネルセプト、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴール、ゴリムマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、イブリツモマブチウキセタン、トスチツモマブ（Tostitumomab）、セツキシマブ、ベバシズマブ、パニツムマブ、デノスマブ、イピリムマブ、およびブレンツキシマブベドチンが挙げられる。
【００６４】
治療
別の実施形態において、治療は臓器移植である。臓器は、腎臓、肝臓、心臓、膵臓、肺、または小腸から選択され得る。
【００６５】
処置されることになっている対象は、好ましくは、感作されている、または高度に感作されている可能性がある。「感作された」とは、対象が、ヒト主要組織適合（ＭＨＣ）抗原（ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とも呼ばれる）に対する抗体を発生していることを意味する。抗ＨＬＡ抗体は、同種異系的に感作されたＢ細胞に由来し、通常、輸血、以前の移植、または妊娠により、以前、感作されている患者に存在する（Jordan et al., 2003）。
【００６６】
可能性のある移植レシピエントが感作されているかどうかは、任意の適切な方法により決定され得る。例えば、パネル反応性抗体（ＰＲＡ）試験が、レシピエントが感作されているかどうかを決定するために用いられ得る。３０％より高いＰＲＡスコアは、典型的には、その患者が「免疫学的リスクが高い」または「感作されている」ことを意味するように解釈される。あるいは、クロスマッチ試験が行われ、その試験において、可能性のある移植ドナーの血液の試料が、意図されるレシピエントのそれと混合される。陽性のクロスマッチは、そのレシピエントが、ドナー試料に対して反応する抗体を有することを意味し、そのレシピエントが感作されており、移植が起こるべきではないことを示す。クロスマッチ試験は、典型的には、移植直前に最終チェックとして行われる。
【００６７】
可能性のあるドナーのＭＨＣ抗原に対する高力価抗体（すなわち、ドナー特異的抗体（ＤＳＡ））の存在は、急性抗体媒介性拒絶反応のリスクがあるため、移植に対する直接的禁忌である。要するに、ドナーＭＨＣ抗原に対する感作が、適切なドナーの同定を妨げる。陽性のクロスマッチ試験は、移植に対する明白な障壁である。腎臓移植を待つ患者のおよそ３分の１が感作されており、多くも１５％が高度に感作されているため、このことは、移植を待つ患者の蓄積をもたらす。米国において、２００１〜２００２年における腎臓移植についての順番待ちリストでの期間の中央値は、パネル反応性抗体（ＰＲＡ）スコア０〜９％をもつ者について１３２９日間、ＰＲＡ１０〜７９％をもつ者について１９２０日間、およびＰＲＡ８０％以上をもつ者について３６４９日間であった（ＯＰＴＮ−データベース、２０１１）。
【００６８】
ＤＳＡ障壁を克服するための１つの認められたストラテジーは、血漿交換または免疫吸着を、しばしば例えばγグロブリン静注（ＩＶＩＧ）またはリツキシマブと組み合わせて、適用し、ＤＳＡのレベルを、移植を考慮することができるレベルまで低下させることである（Jordan et al., 2004；Montgomery et al., 2000；Vo et al., 2008a；Vo et al., 2008b）。しかしながら、血漿交換、免疫吸着、およびＩＶＩＧ処置は、非効率的であること、および、それらが長期間に渡る処置の繰り返しを含むため、厳しい計画を必要とすることの欠点を有する。死亡したドナー由来の臓器が利用可能になった時、それは数時間以内に移植されなければならないが、これは、長引く冷虚血時間は、腎臓移植において、移植片機能の遅延および同種移植片喪失についての最も重要なリスク因子の１つであるからである（Ojo et al., 1997）。
【００６９】
対照的に、本発明の方法は、可能性のある移植レシピエントにおいてＤＳＡの迅速で、一時的で、かつ安全な除去を可能にする。移植直前に作用物質を投与することは、高度に感作された患者を効果的に脱感作する能力があり、それにより、移植を可能にし、かつ急性抗体媒介性拒絶反応を回避する。移植前の単一用量の作用物質は、ドナー特異的ＩｇＧ抗体を有する何千人という患者の移植を可能にするだろう。
【００７０】
この実施形態の関連において、方法は代わりとして、対象における臓器不全の処置のための方法として記載され得、その方法は、（ａ）対象において血清ＩｇＧ分子のＦｃ受容体結合を低下させる作用物質を対象に投与するステップ、および（ｂ）その後、交換臓器を対象へ移植するステップを含み、
−  投与される前記作用物質の量が、対象の血清に存在する実質的に全部のＩｇＧ分子によるＦｃ受容体結合を排除するのに十分であり、
−  ステップ（ａ）と（ｂ）が、少なくとも２時間で、かつ多くても２１日間の時間区間によって隔てられている。
【００７１】
この実施形態は、対象において移植された臓器の拒絶反応、特に急性抗体媒介性移植拒絶反応を防止するための方法として記載され得、その方法は、臓器の移植の少なくとも２時間前で、かつ多くても２１日前に、対象において血清ＩｇＧ分子のＦｃ受容体結合を低下させる作用物質を対象に投与するステップであって、投与される前記作用物質の量が、対象の血清に存在する実質的に全部のＩｇＧ分子によるＦｃ受容体結合を排除するのに十分である、ステップを含む。作用物質の投与とその後の移植は、上記で提示された方法の代替の言葉遣いでのステップ（ａ）と（ｂ）の間の時間区間と等価である時間区間によって隔てられている。したがって、上記のステップ（ａ）と（ｂ）の間の時間区間についての様々な上限および下限がこの時間区間に等しく適用される。この実施形態において、時間区間が、その方法がただ１回の通院の間で行われることを可能にするのに十分短いことは、特に好ましい。したがって、好ましい区間は、１〜６時間または１〜１２時間である。
【００７２】
本発明はまた、臓器不全を処置し、または移植拒絶反応、特に急性抗体媒介性移植拒絶反応を防止するそのような方法における作用物質の使用を提供する。本発明はまた、そのような方法による臓器不全の処置または移植拒絶反応の防止のための薬物の製造における作用物質の使用を提供する。
【００７３】
この実施形態において、本発明の方法は、移植時または移植直前に行われるステップを追加として含み得、そのステップは、患者におけるＴ細胞および／またはＢ細胞の抑制の誘導を含む。前記抑制の誘導は、典型的には、Ｔ細胞を死滅させ、もしくは阻害する有効量の作用物質を投与すること、および／またはＢ細胞を死滅させ、もしくは阻害する有効量の作用物質を投与することを含む。Ｔ細胞を死滅させ、または阻害する作用物質には、ムロモナブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）抗体、およびリンパ球免疫グロブリン、抗胸腺細胞グロブリン調製物（ＡＴＧＡＭ）が挙げられる。リツキシマブは、Ｂ細胞を死滅させ、または阻害することが知られている。
【００７４】
対象において抗体を除去し、または抗体の効果を低下させるための方法
本発明はまた、対象において抗体を除去し、または抗体の効果を低下させるための方法を提供する。方法によって影響されることになる抗体は、典型的には、病原性自己抗体である。方法は、ステップ（ａ）と呼ばれる第１のステップ、およびステップ（ｂ）と呼ばれる任意選択の第２のステップを含む。
【００７５】
ステップ（ａ）は、対象において血清ＩｇＧ分子のＦｃ受容体結合を低下させる作用物質を対象に投与することを含む。投与される作用物質の量は、好ましくは、対象の血清に存在する実質的に全部のＩｇＧ分子によるＦｃ受容体結合を排除するのに十分である。
【００７６】
行われる場合、ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）の後に、内因性抗体を除去する処置を対象に施すことを含み、内因性抗体を除去する前記処置がプラスマフェレーシスもしくは免疫吸着であり、またはＦｃＲｎ受容体による血清中の抗体のリサイクリングを阻止し、それにより半減期を低下させる作用物質（例えば、抗ＦｃＲｎ抗体）の投与であり、ステップ（ａ）と（ｂ）が少なくとも２週間の時間区間によって隔てられている。
【００７７】
方法はさらに、ステップ（ａ）を繰り返すことを含み得る。ステップ（ａ）は、好ましくは、患者が低レベルの抗作用物質抗体応答を有する場合に繰り返されるだけである。患者の血清中の抗作用物質ＩｇＧ分子の量は、作用物質特異的ＣＡＰ  ＦＥＩＡ（ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ）試験などの任意の適切な方法により決定され得る。ステップ（ａ）の繰り返しは、ＣＡＰ  ＦＥＩＡの結果が、臨床医によって決定される閾値より下である場合に行われるだけである。典型的には、過剰な抗作用物質応答の発生を回避するために、ステップ（ａ）は、せいぜい６カ月ごとに１回、繰り返されるべきである。
【００７８】
本方法により影響されるのは、典型的には、自己抗体により全体的に、または一部、媒介される自己免疫疾患において標的とされる自己抗原に特異的な病原性自己抗体であり得る。
【００７９】
【表３−１】
0006708641.tif 000004
【００８０】
【表３−２】
0006708641.tif 000005
【００８１】
【表３−３】
0006708641.tif 000006
【００８２】
この実施形態において、方法は代わりとして、対象における自己免疫疾患の処置のための方法として記載され得、その方法は、（ａ）対象において血清ＩｇＧ分子のＦｃ受容体結合を低下させる作用物質を対象に投与するステップ、および任意選択で（ｂ）その後、前記癌または自己免疫疾患についての処置である治療的有効量の抗体を対象に投与するステップを含み、投与される前記作用物質の量が、対象の血清に存在する実質的に全部のＩｇＧ分子によるＦｃ受容体結合を排除するのに十分であり、およびステップ（ａ）と（ｂ）が、少なくとも２時間で、かつ多くても２１日間の時間区間によって隔てられている。本発明はまた、自己免疫疾患の処置のためのそのような方法に用いられる作用物質を提供する。本発明はまた、そのような方法による自己免疫疾患の処置のための薬物の製造における作用物質の使用を提供する。
【００８３】
自己免疫疾患は、好ましくは、自己抗体により全体的に、または一部、媒介される慢性自己免疫疾患である。自己免疫疾患は、表３に列挙された疾患の１つであり得る。
【００８４】
任意選択の追加の方法ステップ
本発明の方法において、ステップ（ａ）において投与される作用物質は、典型的には、血清ＩｇＧ分子にのみ作用するわけではない。本発明者らはまた、その作用物質が、Ｂ細胞受容体複合体（ＢＣＲ）の部分として存在する膜結合型ＩｇＧ分子にも作用し得るという驚くべき発見をしている。
【００８５】
ＢＣＲは、１つのリガンド結合部分および１つのシグナル伝達部分を含有する。リガンド結合部分は、膜貫通型ドメインを有する抗体からなり、シグナル伝達部分は、Ｉｇ−α／Ｉｇ−β（ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂ）と呼ばれるヘテロ二量体からなる。ＣＤ７９タンパク質は、細胞膜にまたがり、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を有する細胞質側末端を有する。受容体のライゲーションにより、ＩＴＡＭは、ＳＲＣファミリーキナーゼＬＹＮによりリン酸化され、脾臓チロシンキナーゼ（ＳＹＫ）をその受容体に動員する。ＳＹＫの活性化は、シグナロソームと名付けられた細胞膜関連シグナル伝達複合体の形成をもたらし、その複合体は、ホスホリパーゼ−Ｃγ２（ＰＬＣγ２）、ホスホイノシタイド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、Ｂｒｕｔｏｎチロシンキナーゼ（ＢＴＫ）、ＶＡＶ１、およびアダプター分子などのシグナル伝達分子を集合させる。ＢＣＲシグナル伝達カスケードにおける２つの基本的な、集中的に研究された中間体ＰＬＣγ２およびＰＩ３Ｋは、重要な第２のメッセンジャーを生成し、それらは、次に、ＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）および細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ１／２；ＭＡＰＫ３および１として知られる）を活性化する。Ｂ細胞運命決定、すなわち、増殖、生存、分化、および細胞死は、これらのシグナル伝達事象間でのバランスによって密接に制御される。Ｂ細胞発生中、ナイーブの成熟Ｂ細胞は、骨髄を出て、高親和性長命形質細胞、および抗原刺激により活性化された時に激しく応答する状態にあるメモリーＢ細胞になる前に、胚中心における体細胞超変異およびクラススイッチを受ける。メモリーＢ細胞は、抗原に対してＢＣＲとの結合を通して応答し、循環中のかなりの割合のメモリーＢ細胞は、ＩｇＧ型のＢＣＲを有する。
【００８６】
したがって、本発明の方法のステップ（ａ）において投与される作用物質はまた、メモリーＢ細胞のＢＣＲのＩｇＧ部分に作用し得、リガンド結合によるこれらの細胞の正常な活性化を阻害し得る。結果として、個体におけるメモリーＢ細胞の活性化が低下する区間が生じる。この区間は、典型的には、ステップ（ａ）の完了から約１２時間後に終わるが、より長い場合がある。区間の終わりに、無傷の膜結合型ＩｇＧ（および、それにしたがって、正常なＢＣＲ）のレベルは、典型的には、影響された細胞における膜代謝回転の結果として、回復している。続いて、その後、さらなる区間があり、その終わりに、新しく合成されたＩｇＧが血清中に再出現し始める。この区間は、典型的には、ステップ（ａ）の完了から約３〜４日後に終わる。
【００８７】
したがって、本発明の方法のステップ（ａ）において投与される作用物質のメモリーＢ細胞への作用は、本発明のいずれの方法においても任意選択の追加のステップを含める機会を与える。ステップ（ａ１）と呼ばれるこのステップは、本発明の方法において、ステップ（ａ）の後で、かつステップ（ｂ）が存在する場合には、ステップ（ｂ）の前に行われる。その後、ステップ（ｂ）は、典型的には、ステップ（ａ１）の後、可能または実行可能になるとすぐに行われるだろう。ステップ（ａ１）は、（ｉ）ステップ（ａ）の後であるが、対象における細胞表面上の無傷の膜結合型ＩｇＧのレベルの回復前の区間において、または（ｉｉ）（ｉ）の後であるが、対象の血清において新しく合成されたＩｇＧが再出現し始める前の区間において、行われ得る。無傷の膜結合型ＩｇＧのレベルの回復、または血清ＩｇＧの再出現は、任意の適切な方法により決定され得る。例示的な方法は、実施例において記載されている。
【００８８】
（ｉ）の区間は、典型的には、ステップ（ａ）から約１２時間後、１６時間後、または２４時間後に終わる。したがって、ステップ（ａ１）が区間（ｉ）において行われる場合には、それは、ステップ（ａ）から１時間後までに、２時間後までに、３時間後までに、４時間目後までに、５時間後までに、６時間後までに、７時間後までに、８時間後までに、９時間後までに、１０時間後までに、１１時間後までに、１２時間後までに、１６時間後までに、または２４時間後までに、好ましくはステップ（ａ）から１〜２時間後までに、行われ得る。
【００８９】
（ｉｉ）の区間は、（ｉ）の区間の終了時点から始まり、典型的には、ステップ（ａ）から３日後または４日後に終わる。したがって、（ｉｉ）の区間は、したがって、典型的には、多くても、ステップ（ａ）から１２時間後から４日（９６時間）後までである。それゆえに、ステップ（ａ１）が区間（ｉｉ）において行われる場合には、それは、ステップ（ａ１）の１２時間後から９６時間後の間に行われ、ステップ（ａ）から１２時間後から２４時間後の間、１２時間後から４８時間後の間、または１２時間後から７２時間後の間に行われ得る。対象の便宜のために、ステップ（ａ１）を区間（ｉｉ）内でできる限り早く行うことが一般的に好ましい。したがって、ステップ（ａ）から１２時間後から２４時間後の間にステップ（ａ１）を行うことが好ましい。
【００９０】
ステップ（ａ１）が区間（ｉ）において行われる場合には、それは、典型的には、ステップ（ａ）の作用物質のＢ細胞への作用から生じるＩｇＧまたはＩｇＧ断片上に存在するエピトープを特異的に標的にする作用物質の投与を含む。例えば、ステップ（ａ１）は、膜結合型Ｆｃ断片（ＩｄｅＳの作用により生じたものなど）と特異的に結合する作用物質、またはグリコシル化が変化した膜結合型ＩｇＧ（ＥｎｄｏＳの作用により生じたものなど）と特異的に結合する作用物質の投与を含み得る。エピトープは、ステップ（ａ）の作用物質の作用により新しく生成される場合もあるし、またはステップ（ａ）の作用物質の作用から生じるＩｇＧもしくはＩｇＧ断片により保持されるとの条件で、無傷ＩｇＧにすでに存在するエピトープの場合もある。言い換えれば、本発明はまた、追加のステップ（ａ１）が、ステップ（ａ）の後で、かつステップ（ｂ）が存在する場合にはステップ（ｂ）の前に行われる方法であって、ステップ（ａ１）が、ステップ（ａ）において投与された作用物質の、ＢＣＲ複合体中の膜結合型ＩｇＧへの作用によって生じたエピトープと特異的に結合する作用物質を対象に投与するステップを含み、前記投与するステップが、ステップ（ａ）の後であるが、ＢＣＲ複合体中の無傷の膜結合型ＩｇＧのレベルが、ステップ（ａ）の前に存在したのと同じレベルに回復している状況の前の区間で行われる、方法を提供し得る。それは、上記のような区間（ｉ）である。エピトープは、例えば、膜結合型Ｆｃ断片（ＩｄｅＳの作用により生じたものなど）であり得る。前記方法のステップ（ａ１）において投与される作用物質は、抗体などの、そのエピトープと特異的に結合する任意の作用物質であり得る。作用物質の結合は、典型的には、標的が存在する細胞の活性化低下および／または死を結果として生じるだろう。前記細胞は、典型的には、メモリーＢ細胞である。作用物質は、任意選択で、細胞毒（適切な例としては、表４に列挙されたものが挙げられる）、放射性同位元素、または前記細胞の前記活性化低下もしくは死を促進するための他の部分にコンジュゲートされ得る。したがって、この実施形態において、ステップ（ａ１）における作用物質の投与は、典型的には、ステップ（ａ）の作用物質の作用により変化しているＩｇＧ分子をディスプレイするメモリーＢ細胞の死を結果として生じる。したがって、ステップ（ａ１）の包含は、例えば、血清ＩｇＧ分子の欠如を長引かせ、または維持することにより、本発明の方法の有益な効果を増加させ得る。
【００９１】
【表４】
0006708641.tif 000007
【００９２】
ステップ（ａ１）が区間（ｉｉ）において行われる場合には、それは、典型的には、無傷の膜結合型ＩｇＧを特異的に標的にする作用物質の投与を含む。前記作用物質は、ＢＣＲ複合体における膜結合型ＩｇＧのレベルが回復しているメモリーＢ細胞に影響するだけだろう。この区間内において、無傷ＩｇＧの全ての他の型（例えば、循環ＩｇＧ、またはエフェクター細胞と細胞膜におけるＦｃ受容体により結合したＩｇＧ）は、ステップ（ａ）において投与された作用物質の作用により除去されているだろうし、結果として生じた断片は排除されているだろう。したがって、ステップ（ａ１）において投与される作用物質は、無傷ＢＣＲを回復している全てのメモリーＢ細胞を標的にするために用いられ得る。あるいは、作用物質は、特定の抗原に特異的であるメモリーＢ細胞のＢＣＲの特異的Ｆａｂ領域を標的にするために用いられ得、すなわち、ステップ（ａ１）において投与される作用物質は抗イディオタイプであり得る。例えば、ステップ（ａ１）において投与される作用物質は、移植レシピエントにおいてドナー特異的抗体のＦａｂ領域、または表３に列挙されているような障害を患っている患者などの自己免疫患者における自己免疫抗原に特異的な抗体のＦａｂ領域を標的にするために用いられ得る。
【００９３】
言い換えれば、本発明はまた、追加のステップ（ａ１）が、ステップ（ａ）の後で、かつステップ（ｂ）が存在する場合にはステップ（ｂ）の前に行われる方法であって、ステップ（ａ１）が、無傷の膜結合型ＩｇＧのエピトープと特異的に結合する作用物質を対象に投与するステップを含み、前記投与するステップが、ＢＣＲ複合体における無傷の膜結合型ＩｇＧのレベルが、ステップ（ａ）の前に存在したレベルと類似した、実質的に同じ、または同じレベルまで戻っているが、新しく合成されたＩｇＧがまだ血清中に再出現していない、ステップ（ａ）の後の区間において行われる、方法を提供し得る。それは、上記のような区間（ｉｉ）である。前記方法のステップ（ａ１）において投与される作用物質は、抗体などの、そのエピトープと特異的に結合する任意の作用物質であり得る。作用物質の結合は、典型的には、標的が存在する細胞の活性化低下および／または死を結果として生じるだろう。作用物質は、任意選択で、細胞毒（適切な例として、表４に列挙されたものが挙げられる）、放射性同位元素、または前記細胞の前記活性化低下もしくは死を促進するための他の部分にコンジュゲートされ得る。この実施形態において、ステップ（ａ１）における作用物質の投与は、無傷の膜結合型ＩｇＧ分子をディスプレイする全てのメモリーＢ細胞の死を結果として生じ得る。あるいは、それは、膜結合型ＩｇＧ分子の特定の特異性をディスプレイするメモリーＢ細胞のみの死を結果として生じ得る。いずれにしても、ステップ（ａ１）の包含は、例えば、全ての血清ＩｇＧ分子の欠如を長引かせ、もしくは維持すること、または特定の標的に特異的な血清ＩｇＧ分子の特定のサブセットの欠如を長引かせ、もしくは維持することにより、本発明の方法の有益な効果を増加させ得る。後者は、本発明の方法が適用される対象の血清において、新しく合成されるＩｇＧ集団からＩｇＧ分子の望ましくないサブセットの選択的除去を可能にする点において、特に有利であり得る。
【００９４】
キット
本発明はまた、本発明の方法に用いるのに適したキットを提供し、そのキットは、対象において血清ＩｇＧ分子のＦｃ受容体結合を低下させる、ある量の作用物質を含有し、その量は、対象の血清に存在する全部の、または実質的に全部のＩｇＧ分子によるＦｃ受容体結合を排除するのに十分である。
【００９５】
本発明のキットは、追加として、上記で述べられた実施形態のいずれかが実行されることを可能にする１つまたは複数の他の試薬または装置を含み得る。そのような試薬または装置は、以下のうちの１つまたは複数を含む：治療的有効量の、抗体である治療剤、適切なバッファー（水溶液）、点滴静注として作用物質を対象に投与するための手段（針を含む容器または装置など）。試薬は、液体試料がその試薬を再懸濁させるように、乾燥状態でキット中に存在してもよい。キットはまた、任意選択で、キットが本発明の方法に用いられることを可能にするための使用説明書、またはその方法がどの患者に用いられ得るかに関する詳細を含んでもよい。
【００９６】
以下の実施例は本発明を例証する。
【実施例１】
【００９７】
前臨床試験
ＧＭＰ製造されたＩｄｅＳの、ニュージーランドホワイトウサギにおける毒性学および薬理学を調べるために設計されたＧＬＰに準拠した前臨床研究は、ＩｄｅＳが、ＩｄｅＳ投与で５分以内にＩｇＧの完全な血漿プールを切断し、処置の１日後、残存ＩｇＧが１％未満であることを実証した。ＩｇＧレベルは、ＩｄｅＳ処置から２４〜４８時間後、それの最低レベルに達し、次いで、その後の日々において、徐々に増加した。正常なＩｇＧレベルは、単回のＩｄｅＳ投与からおよそ３週間後、回復した。最終産物、すなわち、Ｆ（ａｂ’）２断片およびＦｃ断片は、無傷ＩｇＧと比較して有意により短い半減期を有し、ＩｄｅＳの単回投与の翌日、低レベルが検出できるのみであった。ＩｄｅＳは、ウサギにおいて、迅速に分布し、用量比例的な薬物動態、およびおよそ１時間の血漿中半減期をもつ多相性排出を示した。反復投与毒性学試験に基づいて、ＩｄｅＳについての無毒性量（ＮＯＡＥＬ）を、２ｍｇ／ｋｇ体重（ＢＷ）に設定した。データ未呈示。
【００９８】
上記のインビトロおよびインビボ実験におけるＩｄｅＳの効果は、劇的であり、健康なヒトボランティアにおけるさらなる研究のための基礎を提供した。
【００９９】
ヒト試験
材料および方法
試験デザイン
Ｌｕｎｄ、ＳｗｅｄｅｎのＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ＨｏｓｐｉｔａｌのＰｈａｓｅ  Ｏｎｅユニットにおいて行われた、健康な男性対象における二重盲検無作為化単一施設試験（ＥｕｄｒａＣＴ番号：２０１２−０００９６９−２１）であった。プロトコールは、募集の前に地域倫理委員会によって承認され、全対象は、試験のための諸手順を行う前に署名されたインフォームドコンセントを提出した。主目的は、単一の漸増用量の静脈内投与後のＩｄｅＳの安全性および耐容性を評価することであった。副次的目的は、健康なヒト対象においてＩｄｅＳ効力（すなわち、血清ＩｇＧの低下）、薬物動態、および免疫原性を評価することであった。
【０１００】
ＧＭＰ製造ＩｄｅＳ（Ｈａｎｓａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＡＢ、Ｓｗｅｄｅｎ）の希釈輸液を、０．２μｍフィルターを含む注入セットを有する注入シリンジ（Ｂ．Ｂｒａｕｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において病院の薬局によるリン酸緩衝等張性食塩水中に調製した。０．０１０ｍｇ／ｋｇ  ＢＷの選択された初回用量は、前臨床で決定された推定最小薬理作用量（ＭＡＢＥＬ）の１０分の１であり、動物毒性学において決定された無毒性量（ＮＯＡＥＬ）の２００分の１であった。試験デザインは、集中的な安全性モニタリングを用いて用量の段階的増大を可能にした。
【０１０１】
組み入れ基準を満たすために、対象は、スクリーニング健康診断により健康であり、１８〜４５歳であり、カニューレ挿入のための適切な静脈を有し、１９〜３０ｋｇ／ｍ２の間の肥満度指数（ＢＭＩ）、および体重５０〜１００ｋｇでなければならない。試験から除外される対象は、非限定的に免疫グロブリンＡ欠損症を含む任意の臨床的意義のある免疫不全を有する（またはその病歴を有する）者、抗ＩｄｅＳ  ＩｇＧのレベルの上昇（＞１５ｍｇ／Ｌ）があった者、スクリーニング中、血清Ｂ型肝炎表面抗原、Ｃ型肝炎抗体、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、進行中の結核、進行中の梅毒、活動性単純ヘルペス、または帯状疱疹感染の検査で陽性と出た者であった。
【０１０２】
各対象は、臨床試験ユニットで３日間の入院期間をもち、ＩｄｅＳまたはプラセボ（リン酸緩衝食塩水）に無作為化され、入院した次の朝、投薬された。各用量群における２人の対象は、第１日目に投薬され（１人はＩｄｅＳ、１人はプラセボ）、群における次の対象は１週間後、投薬された。各コホートに従って、データモニタリング委員会が安全性データを評価し、次の用量レベルを決定した。１つの用量レベルでの最後の投薬から次の用量レベルの開始までの時間は、少なくとも１４日間であった。注入は、各群において最初の２人の対象については３０分間の間、その群におけるその後の対象については１５分間の間、与えられた。入院期間の間、集中的な安全性モニタリング、ならびに安全性、薬物動態、効力、および抗薬物抗体についての連続的な血液試料採取を実施した。対象は４日目に退院し、６４日目の試験の終了まで、健康診断および血液試料採取を含む、少なくとも８回の中間の追跡調査来院があった。
【０１０３】
試験に参加した全対象を、細菌感染に対する予防として抗生物質（βラクタムに対して過敏性ではない場合には、Ｓｐｅｋｔｒａｍｏｘ）で処置した。予防処置は、投薬日に開始し、血漿ＩｇＧレベルが４．５ｇ／Ｌより高くなるまで続いた。他の併用薬物療法または治療は、治験研究者によって処方され、かつ対象の安全性および福祉のために必要とみなされることがない限り、投薬後最初の２８日間の間、パラセタモールを除いて許可されなかった。
【０１０４】
安全性評価
有害事象（ＡＥ）を、入院の時点から、追跡期間を含む試験期間を通じて、収集した。記述、開始／停止時間、共通毒性基準グレード（ＣＴＣＡＥによる）、重症度、因果関係（ありそうにない、可能性あり、またはほぼ確実）、とられた措置、中断、および結果を含むＡＥについての全情報を、記録した。バイタルサイン、体温、心拍数、および仰臥位血圧を、入院期間中に定期的に、および全てのその後の来院時点に記録した。加えて、対象を、注入の間、およびその後の２４時間、５リード遠隔測定ＥＣＧでモニターした。臨床化学、血液学、血液凝固、安全性バイオマーカー（ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＴＮＦα）、および血漿ＩｇＧについての安全性試料を、Ｌａｂｍｅｄｉｃｉｎ  Ｓｋａｎｅ、Ｓｗｅｄｅｎにおいて日常的方法を用いて分析した。尿検査（Ｕ−グルコース、Ｕ−ヘモグロビン、およびＵ−タンパク質）を、Ｍｕｌｔｉｓｔｉｘ（Ｓｉｅｍｅｎｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて評価した。
【０１０５】
効力、薬物動態、および抗ＩｄｅＳ抗体評価のための血清試料
効力試験を意図された血液試料を、ＩｄｅＳによるさらなるタンパク質分解切断を防止するために２ｍＭヨード酢酸を含有する改変型ＣＡＴ血清ＢＤバキュテナー（ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）において収集した。血液試料採取を以下の時点に実施した：投薬前、注入の終了の１分前（１４分または２９分）、注入の終了から５分後（２０分または３５分）、および注入の終了から４５分後（１時間または１時間１５分）。加えて、試料を、注入の開始から２時間後、６時間後、２４時間後、４８時間後、および７２時間後、ならびに注入後７日目、１４日目、２１日目、２８日目、および６４日目に収集した。薬物動態試験を意図された血液試料を、以下の時点に標準型の血清ＢＤバキュテナーにおいて収集した：投薬前、注入の終了の１分前、注入の終了から５分後、注入の終了から４５分後、ならびに投薬から２時間後、６時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、および１４４時間後。抗ＩｄｅＳ抗体分析を意図された血液試料を、１日目（投薬前）、２日目（２４時間）、３日目（４８時間）、４日目（７２時間）、７日目（１週間）、１４日目（２週間）、２１日目（３週間）、２８日目（４週間）、および６４日目（２カ月）に標準型の血清ＢＤバキュテナーにおいて収集した。試験プロトコール以外に、対象は、１８２日目（６カ月）および３６５日目（１年）に任意選択の血清試料を求められた。全ての試料を、分析まで−６０℃未満で保存した。
【０１０６】
効力評価
ＩｇＧのＩｄｅＳ切断およびプロセシングを、異なる方法で調べた；酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて、血清中のＩｇＧおよびＩｇＧ断片を決定し、Ｆａｂ含有断片およびＦｃ含有断片の動態を調べた。その定量アッセイは、ＩｄｅＳ切断生成物、すなわち、Ｆ（ａｂ’）２とＦｃと単一切断化ＩｇＧ（ｓｃＩｇＧ）（重鎖の１つが切断されている）とを完全に区別することができた。Ｃｏｖａｎｃｅ  Ｌｔｄ、ＵＫにより開発および実施されたＥＬＩＳＡは、無傷ＩｇＧおよびｓｃＩｇＧを測定した。Ｆａｂ−ＥＬＩＳＡは、全てのＦａｂ含有ＩｇＧ断片、すなわち、無傷ＩｇＧ、ｓｃＩｇＧ、およびＦ（ａｂ’）２を測定し、Ｆｃ−ＥＬＩＳＡは、全てのＦｃ含有断片、すなわち、無傷ＩｇＧ、ｓｃＩｇＧ、および遊離Ｆｃを測定した。
【０１０７】
Ｃｏｖａｎｃｅ  Ｌｔｄ、ＵＫにより実施されたアッセイは公式に確証された。簡単に述べれば、血清試料をＥＬＩＳＡによって分析し、そのＥＬＩＳＡにおいて、ＩｇＧを、捕獲抗体、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２（＃１０９−００６−０９７、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．、ＰＡ、ＵＳＡ）と結合させた。定量化ヒト血清タンパク質キャリブレータ（ＩｇＧ）（Ｘ０９０８、Ｄａｋｏ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を、標準物質および品質試料の調製のために用いた。結合型ＩｇＧを、ペルオキシダーゼコンジュゲート型Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的（＃１０９−０３６−０９８、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ）、および発色基質（ＴＭＢ）をその後、添加することにより検出した。定量の下限は、５ｎｇ／ｍＬ（１００％血清中）であった。血清分析を、Ｃｏｖａｎｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｈａｒｒｏｇａｔｅ、ＵＫ）で実施した。
【０１０８】
Ｆｃ−ＥＬＩＳＡは、捕獲抗体としてヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃγ断片特異的）Ｆ（ａｂ’）２断片（＃１０９−００６−０９８  Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．、ＰＡ、ＵＳＡ）、および検出抗体としてビオチンコンジュゲート型ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃγ断片特異的）Ｆ（ａｂ’）２断片（＃１０９  ０６６  ０９８  Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いた。Ｆａｂ−ＥＬＩＳＡにおいて、捕獲抗体としてアフィニティー精製マウス抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２断片特異的抗体（＃２０９−００５−０９７  Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．、ＰＡ、ＵＳＡ）、および検出抗体としてビオチン化ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ＩｇＧ−ＣＨ１（＃７１０．３１２０．１００  ＢＡＣ  Ｂ．Ｖ．、Ｎａａｒｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いた。ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（ＳＡ−ＨＲＰ）（＃２１１２６  Ｐｉｅｒｃｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を二次検出のために用いた。キャリブレータおよびＱＣ試料（ＵＬＯＱ、ＬＬＯＱ、Ｈ−ＯＣ、Ｍ−ＱＣ、およびＬ−ＱＣ）を、ヒト静注用γグロブリンＩＶＩｇ（Ｏｃｔａｇａｍ（登録商標））から調製した。全ての希釈を、ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ中で実施し、Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）平底９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ  Ａ／Ｓ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで洗浄した。血清試料およびＱＣ試料を３連で分析した。ＴＭＢ  ＯｎｅコンポーネントＨＲＰマイクロウェル基質（ＴＭＢＷ−１０００−０１、ＢｉｏＦｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、ＭＤ、ＵＳＡ）を発色基質として用い、酵素反応を、０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４の添加により停止させた。吸光度を、λ＝４５０ｎｍでＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ  ＥＸ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．）（ソフトウェア：Ａｓｃｅｎｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ．２．６）において測定した。
【０１０９】
Ｆａｂ−ＥＬＩＳＡと、血清ＩｇＧの通常の比濁法分析の比較は、図１９に示されている。示されているように、比濁法アッセイは、Ｆ（ａｂ’）２と無傷ＩｇＧとを区別することができないため、ＩｄｅＳ処置後、時間と共の、無傷ＩｇＧのレベルの小さい変化を検出するだけである。対照的に、Ｆａｂ−ＥＬＩＳＡは、同じ時間において、ＩｇＧレベルのほぼ完全な除去および回復を示している。
【０１１０】
ＥＬＩＳＡからの定量データをさらに評価するために、血清試料をまた、定性的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を用いて分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、製造会社の使用説明書（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）に従って実施した。簡単に述べれば、０．２５μｌの血清を、４〜２０％Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ（商標）プレキャストゲル（ＢｉｏＲａｄ）上、２００Ｖで４０分間、非還元条件下、分離した。ＳｅｅＢｌｕｅ  ＭＷ標準物質（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ならびに社内で調製されたヒトＩｇＧ、ｓｃＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｃの混合物をマーカーとして用いた。ゲルを、製造会社の使用説明書に従って、ＧｅｌＣｏｄｅ  Ｂｌｕｅ染色試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ、ＵＳＡ）で染色し、ゲルをスキャンした。
【０１１１】
薬物動態評価
４つのＩｄｅＳ由来ペプチド、すなわち、ＡＦＰＹＬＳＴＫ、ＡＩＹＶＴＤＳＤＳＮＡＳＩＧＭＫ、ＧＧＩＦＤＡＶＦＴＲ、およびＬＦＥＹＦＫを、血清試料において検定済ＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイによりアッセイした（Karlsson et al. 2012）。試料を、以前に記載されているように（Karlsson et al. 2012）、ＭＳ分析用に調製した。選択反応モニタリング（ＳＲＭ）測定を、Ｒｅｐｒｏｓｉｌ−ＰＵＲ  Ｃ１８（Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）およびＥａｓｙ−ｎＬＣ  ＩＩシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共にパッキングされた、ＰｉｃｏＣｈｉｐカラムを備えたＴＳＱ  Ｖａｎｔａｇｅ三連四重極質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ、ＵＳＡ）において実施した。生データを、ＳＲＭ分析ソフトウェアＳｋｙｌｉｎｅ（MacLean et al. 2010）で処理および分析し、その結果を手作業で確証および検査した。注射体積は、１２．５ｎｌの血清（すなわち、１μｇの総タンパク質）に相当する１μｌであった。線形回帰曲線をフィッティングさせるために、ＩｄｅＳスパイク血清由来の非正規化ペプチド総ピーク領域を用いた（無標識型タンパク質定量）。未知のヒト試料における個々のペプチドの濃度を、線形回帰から内挿した。市販の、６つのウシタンパク質由来トリプシンペプチドの等モル混合物（６  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｔｒｙｐｔｉｃ  Ｄｉｇｅｓｔ  Ｅｑｕａｌ  Ｍｏｌａｒ  Ｍｉｘ、Ｍｉｃｈｒｏｍ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）を、ＱＣ試料として用い、４〜６個の分析試料ごとに流した（Teleman et al. 2012）。
【０１１２】
時間に対する血清中濃度のデータを、Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）バージョン６．３、ビルド６．２．０．４９５（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ（登録商標）、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡ）におけるノンコンパートメント分析（ＮＣＡ）により分析した。試料採取時間および投薬の名目上と実際との間の大きな偏差（＞２０％）は観察されなかったため、名目上の試料採取時間および投薬を、ＮＣＡ計算に用いた。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイは確証されておらず、公式の最低検出限界（ＬＬＯＱ）は定義されていない。ＰＫ計算のためのカットオフを、全ての４つのペプチドおよび個体について投薬から２４時間後に設定した。
【０１１３】
抗ＩｄｅＳ  ＩｇＧ評価
抗ＩｄｅＳ特異的ＩｇＧの定量のためのＣＡＰ−ＦＥＩＡ（ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ）試験は、Ｕｐｐｓａｌａ、ＳｗｅｄｅｎのＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｈａｄｉａ（登録商標））によって開発された。最初の試験により、３対数測定範囲（3-logaritmic measuring range）がその試験を用いて可能であることが示され、ＩｇＧ  ＩｄｅＳ特異的ＣＡＰ−ＦＥＩＡアッセイについての検出限界（ＬＯＤ）が、示唆された低いアッセイカットオフ（すなわち、２．０ｍｇ／Ｌ）の７分の１であることが示された。臨床試料の分析を、Ｐｈａｄｉａ（登録商標）２５０装置において、Ｐｈａｄｉａ（登録商標）２５０ユーザーマニュアルに従って、その試験を１回の反復を以て用い、実施した。試験は、研究用途のみを意図された。
【０１１４】
抗原特異的効力
研究グレードのＥＬＩＳＡアッセイは、試験の終了時点において抗原特異的効力を検討するためにＨａｎｓａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＡＢで開発された。第１相試験に含まれた健康な対象における自己抗原の不足のために、スウェーデンの小児期予防接種スケジュールに含まれたワクチンに対する対象ＩｇＧ応答を代わりとして利用した。簡単に述べれば、ＤＴａＰ−ＩＰＶ／／ＰＲＰ〜Ｔワクチン（Ｐｅｎｔａｖａｃ（登録商標）／Ｐｅｎｔａｘｉｍ（登録商標）−Ｓａｎｏｆｉ  Ｐａｓｔｅｕｒ）を、ＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）を４℃でコーティングする前に、ＰＢＳ中に１００倍希釈した。正常なヒトＩｇＧ（ＩＶＩｇ、Ｏｃｔａｇａｍ（登録商標））をキャリブレータとして、ヤギ抗ヒトＦｃ特異的ビオチン−ＳＰコンジュゲート型Ｆ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＃１０９−０６６−０９８）を検出抗体として利用した。さらに、ＳＡ−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ  ＃２１１２６）を用い、シグナルをＴＭＢ  ＯｎｅコンポーネントＨＲＰマイクロウェル基質（ＢｉｏＦＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＃ＴＭＢＷ−１０００−０１）で発色させ、０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で停止させ、４５０ｎｍにおいて読み取った。
【０１１５】
機能のインビトロアッセイ
食作用アッセイは、（Ackerman et al., 2011）から改変して開発された。蛍光ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎビーズ（＃Ｆ８７７６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を、０．１ｍｇ／ｍｌのビオチン化抗ＩｇＧ  ＣＨ１（ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ、＃７１０．３１２０．１００  ＢＡＣ  Ｂ．Ｖ．、Ｎａａｒｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で一晩、コーティングした。ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ試薬は、ＣＨ１ドメインを有するヒト重鎖ＩｇＧに特異的、すなわち、無傷ＩｇＧ、ｓｃＩｇＧ、およびＦ（ａｂ’）２断片に特異的であるが、ＩｇＭはこのタンパク質により捕獲されない。コーティング化ビーズを洗浄し、試験対象由来の１：１００希釈された血清と混合し、３７℃で２時間、インキュベートして、血清中のＩｇＧをコーティング化ビーズと結合させた。対照を、コーティング化ビーズを希釈バッファー（０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）と混合することにより調製した。全ての試料を２連で調製した。インキュベーション後、ＩｇＧ負荷ビーズを洗浄し、７５０００個のＴＨＰ−１細胞／試料と混合し、ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で１．５〜３時間、インキュベートした。インキュベーション後、試料を、氷冷２％リン酸緩衝ホルマリン中に固定し、ＴＨＰ−１細胞における蛍光取り込みを、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーターを用いてモニターした。
【０１１６】
統計解析
平均値、中央値、標準偏差、および基本的な統計解析を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて実施した。
【０１１７】
結果
試験の説明
スウェーデン規制倫理当局からの承認後、ＩｄｅＳの単一の漸増用量での男性、無作為化二重盲検試験において、まず第Ｉ相を行った。目的は、静脈内投与後の健康なヒト対象におけるＩｄｅＳの安全性、効力、薬物動態、および免疫原性を評価することであった。
【０１１８】
合計２９人の健康な対象が含まれ、４つの用量群に分けられた。各用量群における対象は無作為化され、ＩｄｅＳかまたはプラセボのいずれかを受けた。注入は、静脈内に、各群における最初の２人の対象については３０分間にわたって、その後の対象については１５分にわたって与えられた。初回用量は０．０１ｍｇ／ｋｇ  ＢＷであり（ＮＩｄｅＳ：８およびＮプラセボ：４）、データモニタリング委員会による評価後、用量は、段階的に０．０４ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ（ＮＩｄｅＳ：４およびＮプラセボ：２）、０．１２ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ（ＮＩｄｅＳ：４およびＮプラセボ：１）、最後に０．２４ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ（ＮＩｄｅＳ：４およびＮプラセボ：２）へ増加された。対象を、投薬後６４日目までモニターし、第１週の間はより集中的にモニターした。全対象は、男性の白色人種で、２３（範囲：２０〜４１）歳の年齢中央値、２３（範囲：２０〜３０）ｋｇ／ｍ２のＢＭＩ中央値を有する体重中央値７６（範囲：５９〜１００）ｋｇであり、群間の個体群統計学における統計学的有意差はなかった。
【０１１９】
安全性の評価
合計７７個の有害事象（ＡＥ）が、２９人の対象のうちの２４人において観察され、３９個のＡＥ（１４人の対象中）を関連（すなわち、可能性あり、またはほぼ確実）として分類した（表１．１）。これらの３９個のＡＥの中で、３５個は、１の共通毒性基準グレードを有した。４個のＡＥがグレード２であり、これらは全て、ほぼ確実な注入反応を経験した１人の対象（５０６）からだった。症状は、アンチヒスタミン（２ｍｇ  Ｔａｖｅｇｙｌ  ｉ．ｖ．）およびコルチコステロイド（８ｍｇ  Ｂｅｔａｐｒｅｄ  ｉ．ｖ．）での処置後１５分以内に消散し、ＩｄｅＳ注入は中断されなかった。ＡＥのいずれも重篤として報告されず、どの用量規制毒性基準にも合わず、または試験薬の中止をもたらすことはなかった。
【０１２０】
７７個のＡＥの中で、最もよく報告されているものは、上咽頭炎、頭痛、および疲労であった。上咽頭炎は、ＩｄｅＳにおいて２０人の対象のうち１０人について報告され、プラセボにおいて９人の対象のうち６人について報告された。７人の対象は、９回、頭痛を報告し（全て、ＩｄｅＳにおいて）、６人の対象（ＩｄｅＳにおける５人、プラセボにおける１人）は、疲労の７回の発生を報告した。
【０１２１】
血液学、臨床化学、または血液凝固における臨床的に有意な変化は同定されなかった。しかしながら、一過性蛋白尿が、２４〜４８時間後、ＩｇＧの有意な切断を結果として生じるＩｄｅＳ用量を投与された対象において観察された（図２）。このピークはおそらく、ＩｇＧ切断生成物の循環からのクリアランスを反映したと思われる。ＩｄｅＳはＩｇＧ抗体を分解するため、試験対象の感染リスクが増加するだろうという当初の懸念があり、対象を、試験への組み入れの前に、遺伝性免疫グロブリン障害、例えば、ＩｇＡ欠損についてスクリーニングした。さらに、血漿ＩｇＧの低下による感染リスクの増加で、試験対象が細菌性病原体（例えば、肺炎連鎖球菌）の無症状の保菌者であり得ることの懸念が高まった。したがって、血清ＩｇＧレベルが４．５ｇ／Ｌより高くへ戻るまで、対象は抗生物質予防法を受けた。全ての試験対象が抗生物質処置に組み入れられ、感染率の増加の兆しはなかった。
【０１２２】
【表５】
0006708641.tif 000008
【０１２３】
ＩｄｅＳの薬物動態
血清中のＩｄｅＳ濃度を、ＩｄｅＳに由来する４つのペプチドに基づいたＬＣ−ＭＳ／ＭＳ方法により測定し、時間に対する血清中濃度のデータをノンコンパートメント分析により分析した。薬物動態学的パラメータを、投薬から２４時間後まで計算した。これは、その残存濃度が、この方法の推定定量範囲の近く、またはそれより低かったためである。
【０１２４】
２９人の対象のうち、９人がプラセボを受け、２０人がＩｄｅＳを用量群０．０１ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ、０．０４ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ、０．１２ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ、および０．２４ｍｇ／ｋｇ  ＢＷにおいて受けた。分析されたペプチドのいずれも、投薬前試料、または９人のプラセボ対象由来の試料において検出することはできなかった。しかしながら、ＩｄｅＳを与えられた２０人の対象由来の試料においてＩｄｅＳを検出することができ、それにより投薬が確認された。ＩｄｅＳの濃度は、用量と共に増加し、注入終了の１分前の血清中濃度の増加は、用量に比例した（図３Ａ）。
【０１２５】
０．１２ｍｇ／ｋｇ  ＢＷおよび０．２４ｍｇ／ｋｇ  ＢＷで投薬された対象において、合計１０個の血液試料／対象を、投薬から１週間後まで収集した。ＩｄｅＳの血清中濃度は、曝露量の大部分が投薬後最初の２４時間の間に排出される多相性排出曲線として描くことができた。投薬後最初の６時間の間において、平均ｔ１／２は、０．１２ｍｇ／ｋｇ  ＢＷで４．１（±２．６）時間、および０．２４ｍｇ／ｋｇ  ＢＷで４．９（±２．８）時間であった。Ｃｍａｘは、０．１２  ｍｇ／ｋｇ  ＢＷで５．０（±２．５）ｍｇ／Ｌおよび０．２４ｍｇ／ｋｇ  ＢＷで８．３（±３．７）ｍｇ／Ｌであった（図３Ｂ）。
【０１２６】
ＩｄｅＳの効力および薬力学
ＩｄｅＳによるＩｇＧ切断の効力および薬力学を、対象由来の血清試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびＥＬＩＳＡによって評価した。ＩｄｅＳは、ＩｇＧを２ステップで切断する（Ryan et al., 2008；Vindebro et al., 2013）。１番目の反応は、２つの重鎖の１つをまだ無傷にしたまま、単一切断化ＩｇＧ（ｓｃＩｇＧ）を生じる、２つの重鎖の１つの非常に迅速かつ効率的な切断である。ｓｃＩｇＧは、ＩｄｅＳについての感受性はより低いが、まだ機能し得る基質であり、この２番目の切断が、Ｆ（ａｂ’）２断片およびＦｃ断片を生じる。
【０１２７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、ＩｄｅＳが、０．１２ｍｇ／ｋｇ  ＢＷまたは０．２４ｍｇ／ｋｇ  ＢＷで投薬された全ての８人の対象において、６時間以内に完全、または完全に近い効果を生じる、すなわち、ＩｇＧプールがＦ（ａｂ’）２断片およびＦｃ断片へ変換されることが明らかにされた（図４ＡおよびＢ）。効果は、著しく迅速であり、ＩｇＧプールは、投薬中（投与開始から１４分後、すなわち、完全投薬の１分前）にすでにｓｃＩｇＧへ変換され、最大効果は、全対象において投薬から２〜６時間後に達成された。新しく合成された無傷ＩｇＧは、投薬から２週間後、血清中に検出可能であり、３週間後、無傷ＩｇＧのレベルはさらに増加しており、血清において主なＩｇＧ画分を構成していた（図４Ｃ）。
【０１２８】
血清におけるＦａｂ含有断片およびＦｃ含有断片の動力学を、１つのＦａｂ特異的ＥＬＩＳＡ方法および１つのＦｃ特異的ＥＬＩＳＡ方法を用いて分析した。ＥＬＩＳＡは、異なるＩｇＧ検体、すなわち、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、ｓｃＩｇＧ、および無傷ＩｇＧを完全には区別しなかった。Ｆａｂ−ＥＬＩＳＡは、全てのＦａｂ含有ＩｇＧ断片、すなわち、無傷ＩｇＧ、ｓｃＩｇＧ、およびＦ（ａｂ’）２を測定し、Ｆｃ−ＥＬＩＳＡは、全てのＦｃ含有断片、すなわち、無傷ＩｇＧ、ｓｃＩｇＧ、および遊離Ｆｃを測定した。
【０１２９】
Ｆ（ａｂ’）２断片およびＦｃ断片は、投薬から１日後から７日後の間に最低レベルに達し、その後、無傷ＩｇＧの合成により、全対象においてそのレベルは増加した（データ未呈示）。Ｆｃ断片の排出は、Ｆ（ａｂ’）２断片の排出より若干速く、投薬から１日後すでに、プラトーレベルに達した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出されたヒトＩｇＧのＦ（ａｂ’）２およびＦｃへの迅速な切断はＥＬＩＳＡによって確認され（図５）、投薬から２〜６時間後、５％未満の残存シグナルで低いプラトーレベルに達することが示された。このシグナルは主にｓｃＩｇＧから生じていると結論付けられた。ヒト対象におけるＩｇＧの分解は、２０人の健康なヒト対象由来の血清試料においてＩｇＧを切断するのに必要とされる、以前に滴定されたＩｄｅＳ濃度とよく相関した（図６）。
【０１３０】
ＩｄｅＳおよび抗原特異的ＩｇＧ抗体
スウェーデンの人口の大部分は、ＤＴａＰ−ＩＰＶ／／ＰＲＰ〜Ｔ（Ｐｅｎｔａｖａｃ（登録商標））ワクチン（ジフテリア、破傷風、百日咳、ポリオ、およびヘモフィルス（Haemophilus）ｂ型）の抗原成分に対するＩｇＧ抗体を有する。そのワクチンは、スウェーデン小児期予防接種スケジュールの一環であり、たいていの個体は、このワクチンまたは類似したワクチンの反復注射を受けている。これを予備的研究に利用し、その予備的研究において、これらの抗原に対する既存のＩｇＧを測定した。その結果により、抗原特異的ＩｇＧへのＩｄｅＳの効果が、各個体における総ＩｇＧへの効果と同じパターンを示すことが示された。加えて、これらの抗原特異的ＩｇＧ抗体の再出現は、総ＩｇＧの再出現と類似した（図７）。
【０１３１】
ＩｄｅＳ処置および食作用活性
ＩｄｅＳの投薬後の残存ＩｇＧの機能活性を評価するために、対象由来の血清を、食作用アッセイにおいて試験した。投薬前、およびＩｄｅＳ投薬後の様々な時点に収集された血清試料由来のＩｇＧを、蛍光ビーズ上に捕獲し、洗浄し、エフェクター細胞と混合し、食作用を、少なくとも１個の貪食されたビーズを有するエフェクター細胞のパーセントとして測定した。アッセイにおけるバックグランドとして、血清を含まないビーズを用いて、エフェクター細胞による空ビーズの自発性取り込みをモニターした。食作用アッセイにより、０．２４ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ  ＩｄｅＳを投薬された全対象が、投薬から２４時間後、バックグランドの食作用レベルに達することが示された（図８Ａ）。０．２４ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ  ＩｄｅＳで処置された対象由来の血清における残存ＩｇＧまたはＩｇＧ断片は、２時間目の試料採取時点においてすでに有意に減少した食作用能力を有すること、および食作用能力が７日間、低下したままであることがさらに示された（図８Ｂ）。
【０１３２】
ＩｄｅＳおよび免疫原性
以前の研究により、その集団のかなりの割合が、ＩｄｅＳに対するあらかじめ形成されたＩｇＧ抗体を有することが示されている（Akesson et al., 2004）。あらかじめ形成されたＩｄｅＳ抗体を有する個体はＩｄｅＳに対する過敏症／注入様反応のリスクが増加していると推定することができた。それゆえに、ＩｄｅＳ特異的抗体の定量的測定のための特異的なインビトロ検査を開発した。検査は、ＣＡＰフルオロ酵素イムノアッセイ（ＣＡＰ−ＦＥＩＡ／ＩｍｍｕｎｏＣａｐ）であり、それを、組み入れ前に試験対象をスクリーニングするために用いた。ＩｇＧ抗体力価の上昇（＞１５ｍｇ／Ｌ）があった対象はこの試験から排除した。試験開始前に、１３０人のヒト対象の参照群をその検査でスクリーニングした。結果は図９Ａ（最初の列）に示されている。１３０人のうちの１０人は、カットオフより低い（＜２ｍｇ／Ｌ）ＩｄｅＳ特異的ＩｇＧを有した。抗ＩｄｅＳ  ＩｇＧの中央値レベルは、６．１ｍｇ／Ｌ（範囲＜２〜７８ｍｇ／Ｌ；ｎ＝１３０）であり、１５ｍｇ／Ｌにおいて８０％パーセンタイルであった。この試験においてスクリーニングされた７８人の健康なヒト男性対象は全て、処置前、ＩｄｅＳに対する検出可能なＩｇＧを有した。結果は、図９Ａの２列目に示されている。抗ＩｄｅＳ  ＩｇＧの中央値レベルは、１０．６ｍｇ／Ｌ（範囲２．１〜９０．８ｍｇ／Ｌ）であった。検査された個体の２８％が、１５ｍｇ／Ｌを超える抗ＩｄｅＳ  ＩｇＧ力価を有し、試験から除外された。
【０１３３】
試験対象の大部分は、抗ＩｄｅＳ  ＩｇＧの増加を以て応答した。応答は、投薬から１週間後、検出できなかったが、投薬から２週間後、ピークレベル近くに達しており、その後、ゆっくり減少した（図９Ｂ）。抗ＩｄｅＳ  ＩｇＧの投薬前レベルの中央値（全対象）は、５．３ｍｇ／Ｌ（範囲：２．０〜１０．６ｍｇ／Ｌ）であり、１４日目において、ＩｄｅＳを投薬された全対象のレベルの中央値は、１０４ｍｇ／Ｌ（範囲：３．１〜１７４４ｍｇ／Ｌ）であった。投薬から２カ月後、抗ＩｄｅＳ  ＩｇＧのレベルは、個体の大半において減少し始め、ＩｄｅＳを投薬された全対象の抗ＩｄｅＳ  ＩｇＧレベルの中央値は、８７．８ｍｇ／Ｌ（範囲：１０．５〜７６４ｍｇ／Ｌ）であった。抗ＩｄｅＳ  ＩｇＧ応答の大きさの個体差が大きかったが、明らかに、０．０１ｍｇ／ｋｇまたは０．０４ｍｇ／ｋｇを受けた対象と比較して、０．１２ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ  ＩｄｅＳまたは０．２４ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ  ＩｄｅＳを受けた対象の中でより強い応答があった（図９Ｃ）。１８２日目において、ＩｄｅＳを投薬された２０人の個体のうちの１９人は、以前に分析された対象の正常範囲（範囲＜２〜９０．８ｍｇ／Ｌ；Ｎ＝２０８）内であった（図９Ｄ）。１８２日目において、１人の対象のみが、正常範囲よりわずかに上の抗ＩｄｅＳ  ＩｇＧレベル（１０１ｍｇ／Ｌ）をなおも有した。この対象は０．０１ｍｇ／ｋｇ用量群にあり、３６５日目において、抗ＩｄｅＳ  ＩｇＧレベルは、この対象について正常範囲内であった（４０．５ｍｇ／Ｌ）。抗ＩｄｅＳ  ＩｇＧ応答は、ストレプトキナーゼおよびスタフィロキナーゼなどの細菌起源の他のタンパク質薬物について報告された応答と、動態および大きさにおいて非常に類似していると結論付けることができる。
【０１３４】
考察
この画期的医薬品の臨床試験は、ＩｄｅＳが、投与からたった数分後、血漿ＩｇＧを単一切断化ＩｇＧ（ｓｃＩｇＧ）へ変換することを示す。ｓｃＩｇＧは、Ｆｃγ受容体との結合の低下およびＦｃ媒介性細胞傷害性の低下で、エフェクター機能が損なわれていることが実証されている（Brezski et al., 2009）。本試験に組み入れられた健康な対象における病原性自己抗体の欠如にもかかわらず、正常ＩｇＧを、バイオマーカーとしてモニターすることができ、ＩｄｅＳは、試験された用量範囲内でＩｇＧ切断における強い効力を示した。総ＩｇＧへの完全な、または完全に近い効果、すなわち、Ｆ（ａｂ’）２断片およびＦｃ断片への変換は、０．１２ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ  ＩｄｅＳまたは０．２４ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ  ＩｄｅＳを投薬された全対象において見られ、試験薬は好ましい安全性プロフィールを示した。投与からたった６時間後、血液においてほんの低濃度のＩｇＧ（＜５％）を検出することができ、ＩｇＧは、新しく合成されたＩｇＧが血漿に再び存在するまで、１週間より長い間、持続的に低いままであった。これらの結果は、例えば、１回の血漿体積交換が、ＩｇＧの最初のレベルのおよそ３５％への低下を結果として生じ、血漿交換から２４時間後、ＩｇＧレベルが、主に脈管性間隙へのリンパ排液により、６０％へ上昇しているという、血漿交換を用いて一般的に得られる結果に匹敵し得た（Ismail et al., 2001）。
【０１３５】
ＩｄｅＳが細菌タンパク質であることの結果として、およびたいていのヒトは、化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）と以前に接触したことがあるため、全対象は、抗ＩｄｅＳ  ＩｇＧ抗体をあらかじめ形成しており、予想通り反応し、ＩｄｅＳ注入から２〜３週間後、ピークに達するというＩｇＧ応答を示した。抗薬物応答の振幅は、個体間で実質的に異なったが、用量反応パターンが観察された。投薬から６カ月〜１２カ月後、全対象は、正常範囲内の抗ＩｄｅＳ抗体レベル（すなわち、＜２〜９１ｍｇ／Ｌ）まで戻り、潜在的中和抗体および安全面を考慮すれば、ＩｄｅＳ処置は６〜１２カ月後、繰り返すことができると予測された。この臨床試験と並行して開発されたＩｄｅＳ特異的ＣＡＰ  ＦＥＩＡ試験は、反復投薬を考慮する場合、臨床医をガイドするための価値あるツールであり得た。
【０１３６】
総血漿ＩｇＧに加えて、本試験は、スウェーデン小児期予防接種スケジュール内のジフテリア、破傷風、百日咳、ポリオ、およびヘモフィルス（haemophilus）ｂ型に対するワクチンとして利用された特定のバイオマーカーへのＩｄｅＳ効果を調べた。結果は、総ＩｇＧへのＩｄｅＳ効力に関して、抗原特異性に大きな差はないこと、および全対象は、全ＩｇＧプールが戻った時点でそれらの抗原特異的ＩｇＧを完全に回復していることを示した。
【０１３７】
試験はまた、Ｆｃγ受容体との相互作用が主要な役割を果たすことが予想される、食作用アッセイにおいてＩｇＧをＩｄｅＳで切断する機能的関連性も評価した。このアッセイは、ＩｄｅＳの投与から数時間後すでに、残存するＩｇＧ／ＩｇＧ断片の食作用効果が、全ての試験対象において有意に低下し、効果は７日後も残存することを示した。その結果は、ＩｄｅＳが、ヒトにおいてインビボでＦｃ媒介性エフェクター機能を不活性化する能力を有することを示している。
【０１３８】
本明細書に提示されたデータをまとめると、単一用量のＩｄｅＳが、ヒトにおいてＩｇＧを安全に、迅速に、かつ効率的に不活性化すること、およびその効果は数週間、残存することを実証している。単独での、および／または他のＢ細胞減弱薬物（例えば、リツキシマブまたはボルテゾミブ）と組み合わせたＩｄｅＳが、ＩｇＧ自己抗体が病態に寄与している多くの状態についての非常に魅力的な治療アプローチである。ＩｄｅＳの免疫原性は、おそらく長期間処置を妨げるが、１年に１回または２回の反復処置は、おそらく可能だろう。しかしながら、他の薬物、または免疫吸着もしくは血漿交換などのテクノロジーと組み合わせてＩｄｅＳの高い効力を利用する賢明な治療アプローチを適用することにより、病原性抗体の低い血漿中レベルを長期の時間枠の間、維持することは可能であるはずである。
【０１３９】
ＩｄｅＳによるＩｇＧの除去は、一時的であり、それの最善の使用は、抗体媒介性移植拒絶反応などの単相性経過をたどる状態についてであり得ることを示唆する。これは現在、ＩｄｅＳに関する第ＩＩ相試験において研究中である。
【０１４０】
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【実施例２】
【０１４１】
序論
ドナー特異的抗体（ＤＳＡ）の存在下での移植は、急性同種移植片損失と共に超急性抗体媒介性拒絶反応を結果として生じるリスクを負う。実施例１における試験は、ＩｄｅＳが、０．２４ｍｇ／ｋｇ  ＢＷまで安全で、かつ耐容性がよいことを実証している。この用量において、ＩｄｅＳは、血漿ＩｇＧのプールを、注入開始後１４分以内に完全に切断した。無傷ＩｇＧのレベルは、それの最初のレベルの５％未満へ低下した。そのデータは、単一用量のＩｄｅＳが、血漿ＩｇＧ低下の効率および速度に関してプラスマフェレーシスおよび免疫吸着の両方より優れていることを明らかに示した。
【０１４２】
したがって、移植直前の感作された腎臓患者のＩｄｅＳ処置は、ＩｇＧをＦ（ａｂ’）２断片およびＦｃ断片へ迅速かつ効率的に切断し、それにより、細胞傷害性ＤＳＡの血清中レベルを、生体ドナーおよび死亡したドナー（ＬＤおよびＤＤ）移植が可能であるレベルへ低下させるはずである。移植時点でまだ循環中のドナー特異的Ｆ（ａｂ’）２断片はまた、例えば、低親和性ＩｇＭまたは残留ＩｇＧの移植片への結合を阻止し得、それにより、臓器を拒絶反応からさらに保護する。この試験の目的は、臨床的に意義のある用量のＩｄｅＳでの処置が、感作された患者由来の血清を用いて、陽性のクロスマッチ試験を陰性へ変えることができるかどうかを調べること、ならびに総ＩｇＧのレベルの低下と、ＨＬＡクラスＩおよびＩＩに特異的なＩｇＧの低下の間の相関を調べることであった。
【０１４３】
材料および方法
血清試料
調べられる患者は、ステージ５  ＣＫＤと診断されており、腎臓移植の順番待ちリストに挙がっていた。患者は全て、感作されており、抗ＨＬＡについて陽性であった。患者は、Ｍａｌｍｏ、ＳｗｅｄｅｎのＳｋａｎｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ＨｏｓｐｉｔａｌのＤｅｐｔ．  ｏｆ  Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ＵｎｉｔのＨ．Ｅｋｂｅｒｇ教授およびＤｅｐｔ．  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｓｕｒｇｅｒｙ、Ｕｐｐｓａｌａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｕｐｐｓａｌａ、ＳｗｅｄｅｎのＧ．Ｔｕｆｖｅｓｏｎ教授によって採用された。患者は、書面での患者情報を受け、試験のための諸手順が開始される前にインフォームドコンセントに署名した。血清を、病院手順に従って、１０ｍｌの静脈血から単離した。秘密の保全を保証するために、治験責任研究者は、血清試料に識別番号（ＰＸＸ）を割り当てることにより、患者のアイデンティティを、調べる科学者に利用できないようにした。試料を、バンキングのためにＵｐｐｓａｌａのＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ＨｏｓｐｉｔａｌのＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎへ送り、その後、各血清の一部を、ＩｄｅＳ関連分析のためにＬｕｎｄのＨａｎｓａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＡＢへ送った。
【０１４４】
患者由来の血清におけるＩｄｅＳ切断
５人の患者（Ｐ０２、Ｐ０４、Ｐ０７、Ｐ０８、およびＰ０９）由来の血清（１００μｌ）を、ＩｄｅＳ（バッチＢＸ１００１８６５；９．９ｇ／ｌ）で処置した。６ｇ／ｌのＩｄｅＳストックをＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ中に調製した。１００μＬの血清を、血清ｐＨを生理的レベル（ｐＨ７．４）に調整するために、１２μＬ  ０．１Ｍ  ＨＣｌに加え、その後、２．４μｌのＩｄｅＳストック（６ｇ／ｌ）を、１１５μｌ中１２５μｇ／ｍｌ  ＩｄｅＳの最終濃度に達するように加えた。全ての調製は氷上で行った。切断を、３７℃で（Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ；Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）２時間、実施し、さらなる分析まで、フリーザー（−２０℃）内に試料を置くことにより停止させた。各患者由来の対照試料は、ＩｄｅＳに取って代わる希釈バッファー（ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ）で同様に偽処置された。
【０１４５】
ヒトＩｇＧの定量
血清試料を、総ＩｇＧ濃度の決定のために、Ｌｕｎｄ、ＳｗｅｄｅｎのＳｋａｎｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ＨｏｓｐｉｔａｌのＤｅｐｔ．  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙに送った。ＩｄｅＳで処置されたヒト血清試料を、Ｈａｎｓａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＡＢによって開発されたＥＬＩＳＡアッセイを用いて無傷ＩｇＧについて分析した。ＭａｘｉＳｏｒｐ９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、１００ｎｇ／ウェルのＦ（ａｂ’）２断片特異的なＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒト（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＃１０９−００６−０９７）で、炭酸バッファー（ｐＨ９．６）中、一晩、＋４〜８℃でコーティングした。プレートを、ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）で洗浄し、ＰＢＳ＋２％ＢＳＡで、室温で１時間、ブロッキングした。キャリブレータおよび試料を、ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ（希釈バッファー）中に希釈した。洗浄後、希釈されたキャリブレータ（Ｍ−１、健康なボランティア由来の血清；濃度１１．２ｇ／ｌ）および血清試料を、プレート上に加え、室温で１時間、静置してインキュベートした。プレートを再び、洗浄し、希釈バッファー中に１：２００００希釈された５０μｌ  Ｆｃγ断片特異的なビオチン−ＳＰ−ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＃１０９−０６６−０９８）を加え、３０分間、インキュベートした。もう１回洗浄後、希釈バッファー中に１：４００００希釈された５０μｌのＳＡ−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ  ＃２１１２６）を加え、３０分間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、反応を、ＴＭＢ（ＢｉｏＦＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＃ＴＭＢＷ−１０００−０１）で発色させ、０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で停止させ、λ＝４５０ｎｍで読み取った。キャリブレータは、分析された範囲内に４パラメータのロジスティックフィット（ｙ＝ｂ＋（ａ−ｂ）／（１＋ｘｃ）＾ｄ）で曲線を形成し、標準曲線のＩＣ５０値にできる限り近いＯＤ値を生じる試料希釈度を好ましくは、定量に用いた。
【０１４６】
ＩｄｅＳ効力および免疫原性評価
ＩｄｅＳ効力についてのＥＬＩＳＡアッセイを、ＩｄｅＳ特異的抗体応答についてのＣＡＰ  ＦＥＩＡ（ＩｍｍｕｎｏＣａｐ）アッセイであったように、実施例１におけるように、行った。結果は、実施例１で報告された結果に対して比較するためだけに用い、示されていない。
【０１４７】
補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）および単一抗原ビーズ（ＳＡＢ）分析（Ｌｕｍｉｎｅｘ）
ＩｄｅＳおよびプラセボで処置された血清を、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ抗原のパネルに対するＳＡＢ分析（ＬＡＢＳｃｒｅｅｎ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ、Ｏｎｅ  Ｌａｍｂｄａ）を用いて、抗ＨＬＡ  ＩｇＧ抗体について分析した。血清をまた、２３人のドナー由来のＴ細胞およびＢ細胞に関する補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）スクリーン試験において試験し、反応性についてスコア化した。Ｔ細胞およびＢ細胞を、それぞれ、ＣＤ８磁気ビーズおよびＭＨＣクラスＩＩ磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ）を用いて濃縮した。ＳＡＢおよびＣＤＣ分析は、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｒｕｄｂｅｃｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｕｐｐｓａｌａ、ＳｗｅｄｅｎのＭａｔｓ  Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎ博士によって、臨床設定における確証済み方法を用いて行われた。ＣＤＣ反応を、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ手順（Fuller et al., 1982）に従ってスコア化した。
【０１４８】
補体依存性リンパ球毒性クロスマッチ（ＣＤＣ−ＣＸＭ）試験
脾細胞を、Ｂａｌｂ／ｃマウスからＦｉｃｏｌｌ分離により調製した。細胞をＰＢＳ（×２）中で洗浄し、０．１％熱不活性化ＢＳＡを含むＤＭＥＭ：Ｆ１２（Ｄｉｆｃｏ）中、２×１０６個の細胞／ｍｌに再懸濁した。血清試料を、ＩｇＭを不活性化するために、４５μｌ血清を５μｌ  ５０ｍＭ  ＤＴＴと混合し、３７℃で３０〜４５分間、インキュベートすることにより、ＤＴＴで処置した。ＣＸＭ試験は、１μｌ細胞懸濁液（すなわち、２０００個の細胞）および１μｌの試料（すなわち、血清または対照）を６０ウェルＴｅｒａｓａｋｉプレート（Ｎｕｎｃ）に加えることにより実施した。室温での３０分間のインキュベーション後、Ｂａｂｙ  Ｒａｂｂｉｔ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（５μｌ）（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）を加え、その混合物を、室温で６０分間、さらにインキュベートした。ＦｌｕｏｒｏＱｕｅｎｃｈ  ＡＯ／ＥＢ  Ｓｔａｉｎ  Ｑｕｅｎｃｈ（５μｌ）（Ｏｎｅ  Ｌａｍｂｄａ  ｉｎｃ．）を各ウェルに加え、その混合物を室温で１５分間、インキュベートした。細胞傷害性をスコア化し（スコア１〜８）、蛍光顕微鏡法で記録した。
【０１４９】
データ処理
グラフを、Ｍａｃ  ＯＳ  Ｘ用ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン５．０ｄ、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡ、ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍを用いて作成した。
【０１５０】
結果および考察
患者血清のＩｄｅＳ処置
血清を、腎臓移植を待つステージ５  ＣＫＤを有する、１２人の感作された患者から収集した。ＩｄｅＳ処置の効力を決定するために、各血清においてＩｄｅＳを用量滴定し、最大効果に達するのに必要とされるＩｄｅＳの最小濃度において個体差があったが、ＩｄｅＳは、試験された濃度範囲内で全患者血清においてＩｇＧを効果的に切断すると結論付けることができた（図１０）。患者血清における総ＩｇＧレベルを分析し、正常範囲内にあることを見出した（中央値：９．３ｇ／Ｌ；範囲６．５〜１６．２ｇ／Ｌ）。さらに、抗ＩｄｅＳレベルを、ＩｄｅＳ−ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ分析を用いて決定したところ、全ての１２個の血清は、低レベル（中央値：４．５ｍｇ／Ｌ；範囲＜２〜１４．８ｍｇ／Ｌ）の抗ＩｄｅＳ  ＩｇＧを含有していた（ＨＭｅｄ  Ｄｏｃ．Ｎｏ：２０１２−０４１）。個々の抗ＩｄｅＳレベルまたは総ＩｇＧのレベルとＩｄｅＳ効力との間に明らかな相関はなかった。５個の代表的な血清、すなわち、Ｐ０２、Ｐ０４、Ｐ０７、Ｐ０８、およびＰ０９を、抗ＨＬＡ抗体のさらなる分析のために選択した。
【０１５１】
血清を、ＩｄｅＳまたはプラセボ（ＰＢＳ）で、３７℃で２時間、処置し、記載されたＥＬＩＳＡを用いて、残存ＩｇＧについて分析した。比較として、ＩｄｅＳ処置試料と並行して、本発明者らは、プロテインＡセファロースでの徹底的な免疫吸着を実施し、残存ＩｇＧを分析した。結果は、ＩｄｅＳ処置が、ＩｇＧのレベルを７．５〜１５．９ｇ／Ｌから０．１７〜０．４ｇ／Ｌへ低下させた（表２．１）。免疫吸着は、概してあまり効果がなく、０．１８〜１．５ｇ／Ｌ残存ＩｇＧであった。
【０１５２】
【表６】
0006708641.tif 000009
【０１５３】
これらの結果は、例えば、プラスマフェレーシスを用いて、一般的に得られる結果と比較するべきである。プラスマフェレーシスにおいては、１回の血漿体積交換が、ＩｇＧの最初のレベルのおよそ３５％への低下を結果として生じ、血漿交換から２４時間後、ＩｇＧレベルが、主に脈管性間隙へのリンパ排液により、６０％へ上昇している（Ismail et al., 2001）。５サイクルまで繰り返されたプラスマフェレーシスでさえも、手順の終了時点での１０％から次の手順前の２０〜２５％の間の変動するＩｇＧレベルを結果として生じる。実施例１に記載された前臨床試験は、ウサギにおけるＩｄｅＳの単回静脈内注射が、無傷ＩｇＧの最初のレベルの２〜３％への迅速な（１時間以内）低下を結果として生じること、およびＩｇＧレベルが、処置後数日間、低いままであることを実証した。同様の結果は、実施例１に記載された第Ｉ相臨床試験において健康なヒト対象にＩｄｅＳを投与した後に得られた。血漿ＩｇＧのプールは、０．２４ｍｇ／ｋｇ  ＢＷのＩｄｅＳの投与中（注入開始から１４分後）にすでにｓｃＩｇＧへ完全に変換され、プールＩｇＧへの投薬から２時間後、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｃへさらに変換されていた。データは、最初のレベルの５％未満（それの大部分はｓｃＩｇＧからなる）に対応するレベルが、投薬から２〜６時間後の間にすでに達し得ること、およびレベルが徐々に増加し始めるまでに数日間かかることを示した。
【０１５４】
ＣＤＣ分析
患者Ｐ０２、Ｐ０４、Ｐ０７、Ｐ０８、およびＰ０９由来のＩｄｅＳおよびプラセボで処置された血清を、選択され、かつ十分特徴付けられたドナー由来のＴ細胞（すなわち、ＣＤ８＋について濃縮された細胞）およびＢ細胞（すなわち、ＭＨＣクラスＩＩ＋について濃縮された細胞）のパネルに対する血清スクリーンＣＤＣ試験に供した。表２．２および２．３に提示された結果（下記の個々の患者の結果の概要もまた参照）は、ＩｄｅＳ処置が、ドナー特異的ＩｇＧを含有する血清により媒介される補体依存性細胞傷害性を完全に抑止する能力を有することを明らかに実証した。主に抗ＭＨＣクラスＩ抗体を扱うＴ細胞試験において、ＩｄｅＳ処置が、患者Ｐ０２、Ｐ０４、Ｐ０７、およびＰ０９を完全に脱感作することができ、患者Ｐ０８について感作のグレードを有意に向上させることができた（表２．２）。抗ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ抗体を扱うＢ細胞試験において、ＩｄｅＳ処置は、全患者について感作のグレードを向上させた（表２．３）。ＩｄｅＳ処置が、可能性のあるドナーに対するＣＤＣ反応性を明らかに低下させ、それにより、全ての試験された患者について適切なドナーを見出す機会を増加させると結論付けることができた。ＩｄｅＳ処置が、陽性の移植前クロスマッチを陰性へ変え、それにより、感作された患者を移植可能にする能力を有することもまた、本明細書に提示されたデータから明らかであった。
【０１５５】
抗ＨＬＡ分析
感作された患者由来の血清における、Ｉｄｅｓ処置後の総ＩｇＧの低下が、抗ＨＬＡ抗体のレベルの低下に反映されることを検証するために、ＩｄｅＳまたはプラセボで処置された試料をＳＡＢ分析に供した。アレイは、９７個のＭＨＣクラスＩ（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃ）および９１個のＭＨＣクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ−ＤＲ）抗原を含むＭＨＣの１８８個の対立遺伝子多型を含んだ。結果は、ＩｄｅＳ処置が、感作された患者由来の血清において抗ＨＬＡ  ＩｇＧのレベルを低下させ得ることを確認し、全ての試験された患者由来の血清の、クラスＩおよびクラスＩＩの個々のＭＨＣ分子に対する反応性が、ＩｄｅＳ処置後、有意に低下したと結論付けることができた（図１１〜１５ならびに別表ＩおよびＩＩ）。感作された患者の移植を考慮する場合、ＭＦＩ（生）における閾値＞１０００（時々、＞２０００）が、特定のＨＬＡ抗原に対する有意な反応性についてのカットオフとして用いられることが非常に多い。ＩｄｅＳ処置は、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩの両方において、全ての試験された患者におけるこれらの閾値より上のＨＬＡ抗原の数を明らかに減少させることができた（表２．４および２．５；別表Ｉ〜ＩＩ）。
【０１５６】
ＩｄｅＳ処置は陽性のＣＸＭを陰性へ変える能力を有する
［Ｇａｌ  α−１，３−Ｇａｌ］構造に対する天然に存在する抗体（抗Ｇａｌ抗体）は、非ヒト組織のヒト超急性拒絶反応（ＨＡＲ）の主要なエフェクターである。たいていの哺乳動物とは違って、ヒトは、機能性α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）遺伝子を欠き、推定的にはＧａｌＴ＋腸内細菌に応答して、大量の抗Ｇａｌ抗体を産生する（Ding et al., 2008、およびPierson 2009）。本目的は、実施例１の第Ｉ相試験からの臨床血清試料を用いて、ＩｄｅＳの効果を分析するために非霊長類に対する霊長類の抗Ｇａｌ反応性を仮性マーカーとして利用することができるかどうかを調べることであった。
【０１５７】
ＩｇＧのレベルを、０．２４ｍｇ／ｋｇ  ＩｄｅＳの健康なヒト対象への投薬前および後に収集された連続的血清試料において、確証済みＰＤ−ＥＬＩＳＡを用いて測定した（表２．６）。データは、ＩｄｅＳの投薬から２時間後のＩｇＧのおよそ１０分の１への減少、および投薬から２４時間後のおよそ２０分の１への減少があることを実証した。ＰＤ−ＥＬＩＳＡは、無傷の完全に機能するＩｇＧと、Ｆｃエフェクター機能が減衰したｓｃＩｇＧとを区別しない。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ｓｃＩｇＧが、これらの血清中の残存ＩｇＧの支配的な割合を占めることを示しており、完全に機能するＩｇＧのレベルが、ＩｄｅＳ処置から数分後すでに低いことを示唆した（実施例１参照）。
【０１５８】
【表７】
0006708641.tif 000010
【０１５９】
【表８】
0006708641.tif 000011
【０１６０】
【表９】
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【０１６１】
【表１０】
0006708641.tif 000013
【０１６２】
【表１１】
0006708641.tif 000014
【０１６３】
ヒト血清試料が、マウス抗原を結合するＩｇＧ（例えば、抗ｇａｌ）を含有するかどうかを調べるために、マウス脾臓細胞を、健康なヒト対象における０．２４ｍｇ／ｋｇ  ＩｄｅＳの投薬前、および投薬後の様々な時点において収集された無希釈の連続的血清試料で、ＦＡＣＳ分析のために染色した。ＩｇＧの細胞との結合を、ｈＦｃγ特異的試薬を用いて検出した。データは、総ＩｇＧの実証された低下と一致して、処置から９６時間後まで持続した、ＩｄｅＳ処置から２４時間後の明らかなシフトを実証した（図１６における代表的なグラフ）。切断生成物、すなわち、Ｆ（ａｂ’）２断片およびＦｃγ断片は、循環からの迅速な排出を示し、ＩｄｅＳ処置から１〜２日後、低いプラトーレベルに達する（実施例１参照）。結果的に、標的抗原との結合における、残存する可能性がある無傷ＩｇＧとＦ（ａｂ’）２断片との競合は、このアッセイにおいてわずかであることが予想された。第Ｉ相試験において収集された投薬前試料が、マウス細胞を結合するＩｇＧを含有すること、およびＩｄｅＳ処置がこの反応性を低下させることが結論付けられた。
【０１６４】
ヒト血清が、補体結合ＩｇＧおよびＩｇＭに起因する、Ｇａｌ抗原に対する反応性を含有することは、実証されている（Pierson, 2009）。これは、ヒト血清が、補体依存性クロスマッチ試験（ＣＤＣ−ＣＸＭ）（Ｔｅｒａｓａｋｉ試験）においてマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）由来の脾臓細胞に対して強く反応したことを実証することにより確認された（データ未呈示）。ＩｄｅＳは、ＩｇＧに対して非常に特異的であるため、試験される血清に存在するＩｇＭを不活性化するために全試料をＤＴＴ処置した。０．２４ｍｇ／ｋｇ  ＢＷを投薬された３人の健康な対象（５０４、５０５、および５０６）由来の投薬前、投薬から２時間後、および投薬から２４時間後に収集された連続的血清試料を、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来の脾臓細胞に対するＣＤＣ−ＣＸＭにおいて試験した。全ての投薬前試料は、強く反応したが（スコア８）、ＩｄｅＳ処置から２時間後および２４時間後に収集された試料は、完全に陰性（スコア１）であった（表２．７および図１７）。
【０１６５】
【表１２】
0006708641.tif 000015
【０１６６】
ＩｄｅＳ処置は、マウス細胞表面標的を結合する能力を有する特定のＩｇＧの血清中レベルを低下させ得ること、およびこの効果が、ＩｄｅＳ処置後数日間、持続することが結論付けられた。ＩｇＧがＩｄｅＳ処置後の最初の日（複数可）の内にすでに回復するということはなかったという事実は、ＩｄｅＳが血漿ＩｇＧだけでなく、血管系の外に、すなわち、間質液中に位置するＩｇＧもまた切断することを明らかに示していた。さらに、０．２４ｍｇ／ｋｇ  ＩｄｅＳで処置された対象由来のＩｄｅＳ処置から２時間後および２４時間後に収集された血清は、マウス標的細胞に対する補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を媒介できず、ＩｄｅＳが、陽性のＣＭＸ結果を陰性結果に変え得ることを明らかに示している。
【０１６７】
個々の患者の結果の概要
患者Ｐ０２
患者Ｐ０２由来の血清は、４人のドナー由来のＴ細胞に対してＣＤＣ反応性を示し、ＩｄｅＳ処置が、この反応性を完全に中和することができた（スコア：１）（表２．２）。加えて、処置前の血清は、２３人のＢ細胞ドナーのうちの１６人に対して反応し、処置後、（低下した）反応性が、２人のドナーのみに対して残存したが（表２．３）、残りは陰性であった（スコア：１）。ＳＡＢ分析により、ＩｄｅＳ処置前、患者血清が、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃ抗原、ならびにＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ−ＤＲ抗原に対する反応性（すなわち、ＭＦＩ＞１０００）を有することが実証された（表２．４および２．５；図１１）。ＩｄｅＳ処置が、全抗原に対する反応性を低下させ、ごく少数（すなわち、２個のＨＬＡ−ＤＲ抗原）がＭＦＩ：１０００超の反応性を有した（ＭＦＩ：２０００超のものはなかった）（表２．４および２．５；図１１）。総体的結論は、ＩｄｅＳが、患者Ｐ０２由来の血清を完全に近く脱感作できるということである。
【０１６８】
患者Ｐ０４
患者Ｐ０４由来の血清は、Ｔ細胞ＣＤＣ試験において５人のドナーに対して反応し、ＩｄｅＳ処置が、この反応性を完全に中和することができた（すなわち、スコア：１）（表２．２）。ＭＨＣクラスＩ  ＳＡＢ分析は、主にＨＬＡ−Ｂ抗原に対する強い反応性を実証しただけでなく、いくつかのＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｃ抗原に対する反応性も実証した（表２．４；図１２）。ＩｄｅＳ処置後、低下したが、有意な反応性が、いくつかのＨＬＡ−Ｂ抗原に対して残存した。注目に値すべきことには、ドナーＰＣ：１７は、遺伝子型ＨＬＡ−Ｂ＊３５：０１を有し、Ｐ０４血清は、ＣＤＣアッセイにおいて、このドナーに対して強く反応した（表２．３）。また、ＳＡＢアッセイにおいて、その血清は、ＨＬＡ−Ｂ＊３５：０１抗原に対して強く反応した（ＭＦＩ：２１４６３）（別表−Ｉ）。しかしながら、ＩｄｅＳ処置は、ＳＡＢアッセイにおけるＨＬＡ−Ｂ＊３５：０１抗原に対する反応性がまだ最高のうちの１つであった（ＭＦＩ：２５１７）とはいえ、ＰＣ：１７ドナーに対する反応性を完全に中和した（スコア８から１へ）。
【０１６９】
Ｂ細胞ＣＤＣ試験において、その血清は、試験された２３人のドナーのうちの８人に対して強く反応し（すなわち、スコア：８）、ＩｄｅＳ処置が、これらのドナーの全部に対する反応性を低下させた（表３）。患者Ｐ０４由来の血清は、ＳＡＢアッセイにおいて、ＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＲ抗原に対して陽性であった（表２．５；図１２）。しかしながら、ＩｄｅＳ処置は非常に効果的であり、処置後、試験されたＨＬＡ−ＤＲ抗原のうちの２個だけが有意な反応性を有した。総体的結論は、ＩｄｅＳ処置が、患者Ｐ０４由来の血清において抗ＨＬＡ反応性を低下させるのに非常に効果的であるということである。
【０１７０】
患者Ｐ０７
患者Ｐ０７由来の血清は、ＣＤＣ試験において広い反応性を有し、Ｔ細胞ＣＤＣ試験において２３人の試験されたドナーのうちの１５人に対して強い反応性（すなわち、ＣＤＣスコア：８）を示した。ＩｄｅＳ処置は、これらの１５人のドナーの全部に対する反応性を完全に中和した（すなわち、スコア：１）（表２．２）。ＭＨＣクラスＩ  ＳＡＢ分析により、試験されたＨＬＡ−Ｂ抗原の３４個に対する強い反応性が実証され、ＨＬＡ−ＡまたはＨＬＡ−Ｃ抗原に対する反応性は実証されなかった（表２．５；図１３および別表−Ｉ）。ＩｄｅＳ処置後、ＭＨＣクラスＩ抗原は有意なシグナルを生じず、すなわち、測定されたＭＦＩは全て、１０００未満であった。
【０１７１】
Ｂ細胞ＣＤＣ試験において、その血清は、試験された２３人のドナーのうちの１６人に対して強く反応し（すなわち、ＣＤＣスコア：８）、１つの例外（ドナーＰＣ：１９）を除いて、それらは、Ｔ細胞ＣＤＣにおいて強い陽性であったのと同じドナーであった（表２．２および２．３）。これは、Ｂ細胞がクラスＩ陽性およびクラスＩＩ陽性の両方であるため、反応性の大部分が、ＭＨＣクラスＩ反応性に起因し得ることを示している。興味深いことに、ＩｄｅＳは、試験されたドナーの大部分に対するスコアを低下させたが、ＩｄｅＳは、対応するＴ細胞ＣＤＣにおいてほど効果的ではなかった。ＩｄｅＳが、Ｔ細胞ＣＤＣにおいてスコアを完全に中和したが、Ｂ細胞ＣＤＣにおいて効果を生じなかった２人のドナー（ＰＣ：２０およびＰＣ：２１）があった。これについての可能な説明は、例えば、クラスＩＩ抗原に対して非常に高い力価であること、またはこの患者が、クラスＩＩ抗原に対するＩｇＭ抗体の有意な力価を有することであり得る。しかしながら、ＳＡＢ分析は、その患者が、ＨＬＡ−ＤＰまたはＨＬＡ−ＤＱに対する抗体を有しないことを明らかに実証している（表２．５；図１３および別表−ＩＩ）。その患者は、試験されたＨＬＡ−ＤＲ抗原の１３個に対して低〜中間（すなわち、ＭＦＩ  １２００〜６５００）の反応性を有し、この反応性は、ＩｄｅＳ処置により完全に中和されている（ＭＦＩ＜１６０）。結果的に、Ｂ細胞試験における残存反応性をクラスＩＩ抗原に対する高力価によって説明することは困難である。ＩｄｅＳ処置がＴ細胞ＣＤＣにおいて完全な効果を生じたが、Ｂ細胞ＣＤＣにおいて効果を生じなかった２人のドナー（ＰＣ：２０およびＰＣ：２１）は、以下のＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子を有する；ＰＣ：２０−ＤＲＢ１＊１１：０１、ＤＢＲ３＊０２：０２、およびＰＣ：２１−ＤＲＢ１＊０１：０１、ＤＢＲ１＊１６：０１：０１、ＤＲＢ５＊０２０２。これらの抗原の全ては、ＳＡＢアレイに存在している。患者Ｐ０７由来の血清は、ＤＲＢ１＊１１：０１に対して中間の反応性（ＭＦＩ：４５５２）で、およびＤＢＲ３＊０２：０２に対して弱く（ＭＦＩ：１２０３）、反応するが、ＩｄｅＳ処置後、シグナルは、どちらの抗原についても１００未満である。その血清は、ＩｄｅＳ処置前も後もＤＲＢ１＊０１：０１、ＤＲＢ１＊１６：０１：０１、またはＤＲＢ５＊０２０２に対する反応性をもたない。結論は、ＭＨＣクラスＩＩ抗原に対するＩｇＧが、これらのドナーを用いるＢ細胞ＣＤＣにおける効果の欠如を説明することができないということであり、ＩｇＭが関与し得ると推測することは魅力的である。総体的結論は、ＩｄｅＳが、患者Ｐ０７由来の血清において抗ＨＬＡ抗体のレベルを低下させるのに非常に効果的であるということである。
【０１７２】
患者Ｐ０８
患者Ｐ０８由来の血清は、Ｔ細胞ＣＤＣ試験およびＢ細胞ＣＤＣ試験において全ての試験されたドナーに対して反応性が高い（表２．２および２．３）。Ｔ細胞試験において、ＩｄｅＳが反応性を完全に中和することができる１４人のドナー、およびＩｄｅＳが測定可能な効果を生じない６人のドナーがある。Ｂ細胞試験において、ＩｄｅＳが反応性を完全に中和することができる５人のドナーがあり、その同じドナーを用いるＴ細胞試験においてもＩｄｅＳが完全な活性を有するため、この反応性を、単にＭＨＣクラスＩ反応性であるということに帰することは魅力的である。ＩｄｅＳがＴ細胞試験もＢ細胞試験もいずれにおいても効果を生じず、またはＩｄｅＳがこれらの試験において部分的のみ効果を生じるいくつかのドナーがある。しかしながら、ＩｄｅＳがＴ細胞試験において完全な効果を生じ、かつＢ細胞試験において測定可能な効果を生じない３人のドナー（ＰＣ：１４、ＰＣ：１６、およびＰＣ：２０）もまたある。
【０１７３】
ＳＡＢ分析により、患者Ｐ０８が、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃ、ならびにＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ−ＤＲに対する抗体を有することが明らかに実証されている。ＩｄｅＳ処置前、その血清は、試験された血清の中で、最も広い反応性を有する（表２．４および２．５；図１４）。加えて、ＳＡＢ分析は、その患者が、試験された患者の中で、最も高い力価の抗ＨＬＡ抗体を有することを示している（図１５、ならびに別表ＩおよびＩＩ）。その反応性が、処置後、むしろ高い割合のＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＲ抗原に対してまだ有意である（すなわち、ＭＦＩ＞１０００）とはいえ、ＩｄｅＳが、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ抗体のレベルを明らかに低下させることができる。残存する総ＩｇＧ（０．４ｇ／Ｌ）を測定した場合、ＩｄｅＳがＰ０８血清において最も効果が低いことは注目すべきことであり、これは、残存抗ＨＬＡ抗体のレベルに必然的に反映されている。
【０１７４】
患者Ｐ０９
患者Ｐ０９由来の血清は、７人のドナー由来のＴ細胞に対して強いＣＤＣ反応性（すなわち、ＣＤＣスコア：８）を有し、ＩｄｅＳ処置は、この反応性を完全に中和することができた（表２．２）。加えて、その血清は、２３人のＢ細胞ドナーのうちの２２人に対して反応し、処置後、６人のドナーに対して、（低下した）反応性が残存した（表２．３）。ＳＡＢ分析により、ＩｄｅＳ処置前、その患者血清が、主にＨＬＡ−Ａ抗原に対して、ならびにＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＲ抗原に対して反応性を有する（すなわち、ＭＦＩ＞１０００）ことが実証された（表２．４および２．５；図１５）。ＩｄｅＳは、全抗原に対する反応性を低下させ、処置後、ごく少数のＨＬＡ−ＤＱ抗原のみが、ＭＦＩ：１０００超の反応性を有した。総体的結論は、ＩｄｅＳが、患者Ｐ０９由来の血清を完全に近く脱感作できるということである。
【０１７５】
結論
ステージ５  ＣＫＤを患っている感作された患者由来の血清の、臨床的に意義のある用量のＩｄｅＳを用いた処置は、総ＩｇＧのレベルを迅速かつ実質的に低下させることができた。さらに、この活性は、これらの患者由来の血清における特定の、および／または広範な反応性の抗ＨＬＡ  ＩｇＧのレベルの低下に直接、反映された。ＳＡＢ分析により、ＩｄｅＳ処置が、全ての分析された患者由来の血清において陽性と判定された全てのＭＨＣ抗原に対するＩｇＧ抗体のレベルを低下させることが明らかに実証された。大部分の場合、ＩｄｅＳ処置後の個々のＭＨＣ抗原に対する反応性は、臨界ＭＦＩより下、すなわち、１０００未満であった。仮定上のドナー由来のＴ細胞およびＢ細胞に対するＣＤＣ−ＣＸＭにおいて、ＩｄｅＳは、全ての試験された患者血清試料における反応性を低下させることができ、陽性のクロスマッチを陰性へ変える能力を有した。さらに、０．２４ｍｇ／ｋｇ  ＩｄｅＳでの処置前に健康な対象から収集された血清は、マウス標的細胞に対するＣＤＣ−ＣＸＭにおいて強く反応したが、ＩｄｅＳ処置から２時間後および２４時間後に収集された血清は陰性であり、そのことは、ＩｄｅＳ処置が、陽性のＣＸＭを陰性へ変える能力を有することをさらに証明している。まとめると、本明細書に提示されたデータは、移植直前のＩｄｅＳ処置が、高度に感作された患者を脱感作する可能性を有し、それにより、移植を可能にし、かつ急性抗体媒介性拒絶反応を回避することを明らかに示している。
【０１７６】
実施例２  −  別表Ｉ  −  ＭＦＩ生データ−ＭＨＣクラスＩ抗原
【０１７７】
【表１３】
0006708641.tif 000016
【０１７８】
【表１４】
0006708641.tif 000017
【０１７９】
【表１５】
0006708641.tif 000018
【０１８０】
実施例２  −  別表ＩＩ  −  ＭＦＩ生データ−ＭＨＣクラスＩＩ抗原
【０１８１】
【表１６】
0006708641.tif 000019
【０１８２】
【表１７】
0006708641.tif 000020
【０１８３】
【表１８】
0006708641.tif 000021
【０１８４】
参照文献
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【実施例３】
【０１８５】
序論
実施例１および２に実証されているように、ＩｄｅＳは、ヒト対象への静脈内投与後、全ての血漿ＩｇＧを迅速に切断する。以下のインビトロおよびエキソビボのデータは、ＩｄｅＳが、前に示されているように可溶性ＩｇＧを切断するだけでなく、表面ＩｇＧ陽性Ｂ細胞からＢ細胞受容体複合体のＦ（ａｂ’）２部分もまた切り取ることを示している。ＩｄｅＳを通してのＢＣＲの切り詰めは、Ｒ８４８およびＩＬ−２活性化ＣＤ２７陽性メモリーＢ細胞からの分泌型ＩｇＧの誘導に強い阻害効果を生じるが、表面ＩｇＭ陽性ＢＣＲ細胞のＩｇＭ分泌は、ＩｄｅＳでの処置によって低下しない。これは、ドナー特異的抗体を有する患者のＩｄｅＳでの処置が、前記抗体を除去するだけでなく、ドナー特異的メモリーＢ細胞もまた、ドナー抗原に（少なくとも最初は）応答できなくすることを示唆している。したがって、メモリーＢ細胞のいかなる最初の活性化も、より多くのドナー特異的抗体を産生することができる形質細胞の生成もまた影響される。
【０１８６】
材料および方法
表面免疫グロブリンについての細胞株のスクリーニング
異なるヒトＢ細胞リンパ腫細胞株、すなわち、Ｕ−２９４０（ＡＣＣ６３４）、ＮＵ−ＤＵＬ−１（ＡＣＣ５７９）、Ｒａｊｉ（ＣＣＬ−８６）、およびＤａｕｄｉ（ＣＣＬ−２１３）を、膜結合型ＩｇＧまたはＩｇＭの存在についてスクリーニングした。簡単に述べれば、細胞を、１０％ＦＣＳおよびＰＥＳＴを追加したＲＰＭＩ１６４０において、３７℃で、５％ＣＯ２中、培養した。細胞を、氷上での５分間の酸洗浄（０．１ＭグリシンｐＨ２．７、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）前に、ＰＢＳまたは様々な濃度のＩｄｅＳで、３７℃で３０分間、処置した。酸洗浄は、膜貫通型分子を無傷のままにしながら、ＦｃγＲに存在し、または抗原に結合した抗体を除去する（Gilden et al., 1978、Jennings et al., 2011）。細胞を、Ｆ（ａｂ’）２部分（＃１０９−０６６−０９７、Ｊａｃｋｓｏｎ、全ての免疫グロブリンサブクラスに存在する軽鎖と交差反応する）およびＩｇＧのＦｃ部分（＃１０９−０６６−０９８、Ｊａｃｋｓｏｎ、ＩｇＧ重鎖に特異的）、またはＩｇＭ（ＧＭ−８０Ａ、ＩＣＬ）に特異的なビオチン化抗体で染色した。Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーターを用いてＦＬ４で細胞をモニターするために、ストレプトアビジン−ＡＰＣ（＃０１６−１３０−０８４、Ｊａｃｋｓｏｎ）を用いた。
【０１８７】
細胞増殖および生存率アッセイ
増殖を、ＢｒｄＵ取り込みによって測定した。細胞を、ＰＢＳまたは様々な濃度のＩｄｅＳで処置し、９６ウェルプレートに５×１０４個の細胞／ウェルを蒔き、２４時間、培養した。ＢｒｄＵを細胞に加え、製造会社の推奨（細胞増殖ＥＬＩＳＡ、ＢｒｄＵ比色、Ｒｏｃｈｅ  ＃１１  ６４７  ２２９  ００１）に従って増殖を測定する前に、６時間、インキュベートした。サイトカラシンＤ（Ｃ２６１８、Ｓｉｇｍａ）およびピューロマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、抗増殖対照として様々な濃度で用いた。
【０１８８】
高感度の比色アッセイ（ＣＣＫ−８）を用いて、細胞生存率を測定した。細胞をＰＢＳまたは３０μｇ／ｍｌ  ＩｄｅＳで処置し、９６ウェルプレートに２×１０４個の細胞／ウェルを蒔き、２４時間、培養した。ＣＣＫ−８（ＣＣＫ−８細胞カウンティングキット８、同仁化学研究所、日本）を加え、４５０ｎｍでの吸光度を様々な時点で追跡した。Ｎｕ−ＤＵＬ−１に関する実験において、それらをＰＢＳまたは３０μｇ／ｍｌ  ＩｄｅＳで処置し、様々な量の細胞を、９６ウェルプレートに蒔き、ＣＣＫ−８の添加前に２４時間、培養した。濃縮されたＢ細胞に関する実験において、末梢血を、３０μｇ／ｍｌのＩｄｅＳまたはＰＢＳを追加したヘパリンチューブに収集し、３７℃、５％ＣＯ２で３０分間、インキュベートした。２５０μｌ  ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（登録商標）ヒトＢ細胞濃縮カクテル（＃０７９０５、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を５ｍｌ血液に加え、よく混合し、室温で２０分間、インキュベートした。試料を、密度勾配分離（Ｆｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅＰＬＵＳ）の前に、２％ＦＣＳを追加したＰＢＳの等量で希釈した。収集されたＢ細胞をカウントし、１０％ＦＣＳおよびＰＥＳＴを追加したＲＰＭＩ１６４０中、２０×１０４個の細胞／ｍｌに調整した。２×１０４個の細胞／ｍｌを、９６ウェルプレートに３連で蒔き、ＣＣＫ−８の添加前に２４時間、培養した。
【０１８９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる血漿におけるＩｄｅＳ効力の検討
ＰＢＳまたは様々な量のＩｄｅＳで処置されたヘパリン血の密度勾配分離中に収集された血漿を用いて、可溶性ＩｇＧへのＩｄｅＳ効力を検証した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、製造会社の使用説明書（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）に従って実施した。簡単に述べれば、１μｌの血漿を、４〜２０％Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ（商標）プレキャストゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で、非還元条件下、２００Ｖで４０分間、分離させた。ゲルを、ＧｅｌＣｏｄｅ  Ｂｌｕｅ染色試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ、ＵＳＡ）で、製造会社の使用説明書に従って染色し、ゲルをスキャンした。
【０１９０】
切断されたＢＣＲの回復
Ｎｕ−ＤＵＬ−１細胞を、ＰＢＳまたは様々な量のＩｄｅＳで、３７℃で１時間、処置し、その後、少しの残存するＩｄｅＳも除去するために徹底的な洗浄を行った。細胞を、９６ウェルプレートにおいて１０％ＦＣＳおよびＰＥＳＴを追加したＲＰＭＩ１６４０中に蒔いた。１つのプレートをすぐに、無傷ＩｇＧのフローサイトメトリー分析に用い、もう１つは、分析前に２４時間、培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。細胞を、Ｆ（ａｂ’）２部分に特異的なビオチン化抗体（＃１０９−０６６−０９７、Ｊａｃｋｓｏｎ）、続いてストレプトアビジン−ＡＰＣ（＃０１６−１３０−０８４、Ｊａｃｋｓｏｎ）で染色し、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーターを用いてＦＬ４でモニターした。
【０１９１】
末梢血を、健康なボランティアからヘパリンチューブ（ＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ、＃３６７８７６）に収集し、密度勾配分離（Ｆｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅＰＬＵＳ）を用いてＰＢＭＣを単離する前に、３０μｇ／ｍｌ  ＩｄｅＳかまたはＰＢＳのいずれかで３７℃で１時間、処置した。ＰＢＭＣ界面を収集し、ＰＢＳ中で洗浄し、培地（１０％ＦＣＳおよびＰＥＳＴを追加したＲＰＭＩ１６４０）中に再懸濁した。ＰＢＭＣをカウントし、２×１０６個の細胞／ｍｌに調整し、試料を取り出し、ＰＦＡ中に固定し、０．１％ＢＳＡを追加したＰＢＳ中で洗浄し、フローサイトメトリー分析まで４℃で保存した。残りの細胞を培養し、試料を取り出し、示された時点でＰＦＡ固定した。ＩｇＧのＦ（ａｂ’）２部分の検出のために、ビオチン化抗ＣＨ１−ＩｇＧ（＃７１０．３２０２．１００、ＢＡＣ）を用い、ＩｇＧのＦｃ部分の検出のために、ヤギ抗ヒトＦｃ特異的Ｆ（ａｂ’）２断片（＃１０９−０６６−０９８、Ｊａｃｋｓｏｎ）を用いた。細胞をさらに、ＰＥコンジュゲート型抗ＣＤ１９（＃ＩＰ−３０５−Ｔ１００、ＥｘＢｉｏ）およびストレプトアビジン−ＡＰＣ（＃０１６−１３０−０８４、Ｊａｃｋｓｏｎ）で二重染色した。リンパ球集団を、前方散乱を用いてゲーティングし、二重陽性細胞を、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーターを用いてＦＬ２およびＦＬ４でモニターした。
【０１９２】
細胞内リン酸特異的フローサイトメトリー（ＢＣＲシグナル伝達）
Ｎｕ−ＤＵＬ−１細胞を、シグナル伝達実験の開始前に、バックグランドリン酸化を最小限にするために、無血清培地中で一晩、培養した。次の日、ＰＢＳまたは３０μｇ／ｍｌ  ＩｄｅＳを加え、細胞を３０分間、培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。１×１０６個の細胞を取り出し、ＰＦＡ中に５分間、固定し、続いて氷上で７０％エタノール中、１０分間、透過処置した。細胞を、０．１％ＢＳＡを追加したＰＢＳ中で洗浄し、分析まで４℃で保存した（ゼロ試料）。ゼロ試料の収集後、残りの細胞のＢＣＲを、１０μｇ／ｍｌヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２特異的Ｆ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＃１０９−００６−０９７）の添加により架橋し、細胞試料を様々な時点で収集し、固定し、透過処置した。固定された細胞を、フローサイトメトリー分析のために、ＡＰＣコンジュゲート型リン酸特異的ＥＲＫ１／２（＃１７−９１０９−４２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＰＥコンジュゲート型リン酸特異的ＰＬＣ−γ２（＃５５８４９０、ＢＤ）を用いて染色した。細胞を、ＡｃｃｕｒｉサイトメーターＣ６を用いてＦＬ２およびＦＬ４でモニターした。
【０１９３】
メモリーＢ細胞の分化
ＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ、＃３６７８７６）に収集し、密度勾配分離（Ｆｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅＰＬＵＳ）を用いてＰＢＭＣを単離した。ＰＢＭＣ界面を収集し、ＰＢＳ中で洗浄し、培地（１０％ＦＣＳおよびＰＥＳＴを追加したＲＰＭＩ１６４０）中に再懸濁した。ＰＢＭＣを２×１０６個の細胞／ｍｌに調整し、ＩｄｅＳ（最終濃度０．３μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、および３０μｇ／ｍｌ）かまたはＰＢＳのいずれかと共に蒔いた。細胞を、Ｒ８４８とｒＩＬ−２の混合物で、製造会社の推奨（ＭａｂＴｅｃｈ）に従って刺激し、７２〜９６時間、培養した。短時間処置を意図された細胞を、ＰＢＳまたはＩｄｅＳを追加したチューブに残し、ＰＢＳでの３×１２ｍｌおよび培地中での１×１２ｍｌの洗浄前に、３７℃で１時間、インキュベートした。上記のようにこれらの細胞を蒔いてＲ８４８／ｒＩＬ−２で処置した。
【０１９４】
ＥＬＩＳｐｏｔフィルタープレートを、７０％エタノールであらかじめ湿らせ、滅菌水で洗浄し、捕獲抗体（ＩｇＧ産生細胞をモニターするためのＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳ  Ｍａｂｔｅｃｈキット＃３８５０−２ＨＷ−Ｐｌｕｓ、ＩｇＭ産生細胞をモニターするためのＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳ  Ｍａｂｔｅｃｈキット＃３８４５−２ＨＷ−Ｐｌｕｓ、およびＩｇＡ産生細胞をモニターするためのＥＬＩＳｐｏｔＢＡＳＩＣ  Ｍａｂｔｅｃｈキット＃３８６０−２Ｈ）と４℃で一晩、インキュベートした。ＥＬＩＳｐｏｔフィルタープレートを洗浄し、細胞を蒔く前に、培地で少なくとも３０分間、ブロッキングした。
【０１９５】
細胞を１５ｍｌチューブに移し、徹底的に洗浄し、カウントし、０．５×１０６個の細胞／ｍｌに調整し、２倍希釈を調製し、その後、細胞を、調製されたＥＬＩＳｐｏｔフィルタープレートに蒔いて、２４時間培養した。ＥＬＩＳｐｏｔプレートを洗浄し、総ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡ分析用の（その名前を付けられたキットに含まれる）ビオチン化検出抗体を、室温で２時間、インキュベートした。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰと室温で１時間、インキュベートし、その後、それらを洗浄し、ＴＭＢのすぐに使える溶液とインキュベートし、明瞭なスポットが現れるまで発色させた。プレートを水道水で洗浄し、暗闇中、乾燥させた。フィルターを写真で記録し、スポットを手作業でカウントした。
【０１９６】
Ｂ細胞の濃縮およびフローサイトメトリー
Ｂ細胞の濃縮のために、末梢血を、３０μｇ／ｍｌのＩｄｅＳまたはＰＢＳを追加したヘパリンチューブに収集し、３７℃、５％ＣＯ２で３０分間、インキュベートした。２５０μｌ  ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（登録商標）ヒトＢ細胞濃縮カクテル（＃０７９０５、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を５ｍｌ血液に加え、よく混合し、室温で２０分間、インキュベートした。試料を、密度勾配分離（Ｆｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅＰＬＵＳ）の前に、２％ＦＣＳを追加したＰＢＳの等量で希釈した。収集されたＢ細胞をカウントし、フローサイトメトリー染色のためにＶ字型９６ウェルプレート中に蒔く前に、２％ＦＣＳを追加したＰＢＳ中に１５×１０４個の細胞／ｍｌに調整した。プレートを１５００ｒｐｍで３分間、遠心分離し、上清をはじき飛ばした。ＩｇＧのＦ（ａｂ’）２部分の検出のために、１０μｇ／ｍｌビオチン化抗ＣＨ１−ＩｇＧ（＃７１０．３２０２．１００、ＢＡＣ）を用い、ＩｇＧのＦｃ部分の検出のために、０．５μｇ／ｍｌヤギ抗ヒトＦｃ特異的Ｆ（ａｂ’）２断片（＃１０９−０６６−０９８、Ｊａｃｋｓｏｎ）を用いた。細胞をさらに、ＰＥコンジュゲート型抗ＣＤ１９（＃ＩＰ−３０５−Ｔ１００、ＥｘＢｉｏ）かまたはＰＥコンジュゲート型抗ＣＤ２７（＃５５５４４１、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）のいずれか、続いてストレプトアビジン−ＡＰＣ（（＃０１６−１３０−０８４、Ｊａｃｋｓｏｎ）で二重染色した。細胞を、ＡｃｃｕｒｉサイトメーターＣ６を用いてＦＬ２およびＦＬ４でモニターした。
【０１９７】
ヒト臨床試験において初めて、ＩｄｅＳがＩｇＧ型のＢＣＲを切断する
単一の漸増用量のＩｄｅＳに関する第Ｉ相、二重盲検無作為化試験を、スウェーデンの規制倫理当局からの承認（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ０１８０２６９７）後、Ｐｈａｓｅ  １  Ｕｎｉｔ、Ｌｕｎｄにおいて行った。全対象は、試験のための諸手順が開始される前に書面のインフォームドコンセントに署名した。試験の予備的部分として、ＣＤ１９＋細胞上のＩｇＧ型のＢＣＲの完全性を、０．１２ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ  ＩｄｅＳまたは０．２４ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ  ＩｄｅＳでの静脈内処置後の様々な時点でモニターした。末梢血をヘパリンチューブに収集し、密度勾配分離（Ｆｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅＰＬＵＳ）を用いて収集から２時間以内にＰＢＭＣを単離した。ＰＢＭＣ界面を収集し、ＰＢＳ中で洗浄し、氷上で３０分間、ＰＦＡ中に固定した。細胞を洗浄し、全時点を収集するまで、０．５％ＢＳＡを追加したＰＢＳ中で保存した。細胞を、ＩｇＧのＦ（ａｂ’）２部分の検出のために、１０μｇ／ｍｌビオチン化抗ＣＨ１−ＩｇＧ（＃７１０．３２０２．１００、ＢＡＣ）で染色した。ＩｇＧのＦｃ部分の検出のために、０．５μｇ／ｍｌヤギ抗ヒトＦｃ特異的Ｆ（ａｂ’）２断片（＃１０９−０６６−０９８、Ｊａｃｋｓｏｎ）を用いた。細胞をさらに、ＰＥコンジュゲート型抗ＣＤ１９（＃２１２７０１９４、Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ）およびストレプトアビジン−ＡＰＣ（＃０１６−１３０−０８４、Ｊａｃｋｓｏｎ）で二重染色した。各個体についての投薬前試料においてリンパ球集団をゲーティングし、その後、このゲートを、対象の全時点について用いた。ＣＤ１９＋細胞を、ＦＬ２でモニターし、Ｆ（ａｂ’）２／ＦｃシグナルをＦＬ４でモニターした。ＣＤ１９＋細胞をＭ１（ＦＬ２）でモニターし、これらの細胞をさらに、抗Ｆｃおよび抗Ｆａｂ染色（ＦＬ４）でのシグナルの存在についてモニターした。各試料において、右上（ＵＲ）における細胞数および平均蛍光強度（ＭＦＩ）を収集した。さらに、二重陽性細胞の頻度を、以下の式を用いて計算した：
【０１９８】
【数１】
0006708641.tif 000022
この式は、ＵＲにおいて少ない細胞数しか存在しない場合にＭＦＩの差を認識することができるように用いられた。
【０１９９】
結果
ＩｄｅＳは、可溶性ＩｇＧと同様の効力でＩｇＧ型のＢＣＲを切断する
４つの異なるＢリンパ腫細胞株を、膜貫通ＩｇＧまたはＩｇＭの存在について、膜貫通ドメインを介して膜に付着していないＩｇＧまたはＩｇＭを除去するための酸洗浄ステップを含むフローサイトメトリーアプローチを用いてスクリーニングした（Gilden et al., 1978、Jennings et al., 2011）。細胞株上のＩｇＧ型またはＩｇＭ型のＢＣＲの存在を検証した後、Ｎｕ−ＤＵＬ−１（ＩｇＧ型のＢＣＲ）およびＤａｕｄｉ（ＩｇＭ型のＢＣＲ）を、さらなる分析のためのモデルとして選択した。Ｆａｂ断片特異的Ｆ（ａｂ’）２抗体は、ＩｇＧとＩｇＭの両方に存在する軽鎖と交差反応するため、その抗体を用いて、ＢＣＲのＦａｂ部分の存在を検出した。Ｆｃ部分の存在を検出するために、ＩｇＧのＦｃ部分に対する抗体を用いた。無傷の膜結合型ＩｇＧは、４μｇ／ｍｌより高いＩｄｅＳ濃度において細胞表面上に検出することができなかった。ＩｇＭ型のＢＣＲを有するＤａｕｄｉ細胞は、高濃度のＩｄｅＳにおいてさえ、影響されなかった（図２０Ａ）。Ｎｕ−ＤＵＬ−１細胞を、様々な濃度のＩｄｅＳで処置し、ＦＡＣＳ染色前に、３７℃で３０分間、インキュベートした。ＩｄｅＳは、切断されたＦｃ部分を膜に付着した状態にしながら、ＢＣＲに存在するＩｇＧのＦ（ａｂ’）２部分を効率的に除去することが示された（図２０Ｂ）。
【０２００】
本発明者らは次に、健康なボランティアから精製されたＰＢＭＣ上のＢＣＲ切断の検討にかかった。Ｆａｂ特異的抗体のＩｇＭ上の軽鎖との交差反応性のために、抗ＩｇＧ−ＣＨ１ドメイン特異的ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ断片を、異型遺伝子性ＰＢＭＣ集団を染色するために用いた。ヘパリンチューブに収集された血液を、様々な濃度のＩｄｅＳで３０分間（３７℃）、処置した。ＩｄｅＳ処置後、ＰＢＭＣを密度勾配分離し、血漿とＰＢＭＣの両方を収集した。血漿を、可溶性ＩｇＧ上のＩｄｅＳ効力を確認するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図２１Ａ）。ｓｃＩｇＧは、０．９μｇ／ｍｌ  ＩｄｅＳですでに生成され、完全切断は９μｇ／ｍｌで達成された。
【０２０１】
ＣＤ１９はＢ細胞系譜についての顕著な特徴であるため、ＰＢＭＣを、Ｂ細胞上の無傷ＩｇＧ−ＢＣＲの存在をモニターするために、抗ＣＤ１９、および抗Ｆａｂまたは抗Ｆｃで二重染色した。フローサイトメトリーにより、ＩｄｅＳが、膜内にＦｃ部分を残しながら、ＣＤ１９＋細胞からＩｇＧのＦ（ａｂ’）２部分を除去し得ることが示された（図２１Ｂ）。ＢＣＲに存在する単一切断化膜結合型ＩｇＧはまだ膜に付着しているため、ｓｃＩｇＧ生成物が存在し、かつ膜に付着している限り、その効果は、フローサイトメトリーによって完全には見ることができない。完全な効果は、９μｇ／ｍｌ  ＩｄｅＳにおいて、膜結合型ＩｇＧ上で達せられた。したがって、これらの結果は、遊離ＩｇＧへのＩｄｅＳ効力と、対応してＢ細胞受容体中に存在する膜結合型ＩｇＧへのＩｄｅＳ効力との間に直接的な相関があることを初めて、示している。
【０２０２】
メモリーサブセットのＢ細胞へのＩｄｅＳの効果をさらに定義するために、ＣＤ１９＋／ＣＤ２７＋メモリーＢ細胞への効果を調べた。ＣＤ１９＋Ｂ細胞は、総ＰＢＭＣ集団の数パーセントを構成するだけである。それゆえに、ＣＤ１９＋Ｂ細胞を、ネガティブセレクション（ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ）を用いて濃縮し、＞９０％ＣＤ１９＋細胞を生じた（図２２Ａ）。この集団のおよそ１０％は、ＩｄｅＳ処置前、表面ＩｇＧとＣＤ２７の二重陽性に染まった（図２２Ｂ）。ＩｄｅＳ処置後、ＣＤ１９＋／ＣＤ２７＋細胞の１％未満が、細胞表面ＩｇＧの陽性に染まった（図２２Ｂ）。したがって、これらのデータは、クラススイッチしたメモリーＢ細胞、すなわち、ＣＤ１９＋／ＣＤ２７＋／表面ＩｇＧ＋細胞上のＢＣＲがＩｄｅＳによって効率的に切断されることを、初めて示している。
【０２０３】
切断されたＢＣＲは、細胞株とＰＢＭＣの両方において迅速に再生し、細胞生存率に効果を生じない
ＩｇＧ型のＢＣＲの膜代謝回転を調べるために、Ｎｕ−ＤＵＬ−１細胞を様々な濃度のＩｄｅＳで処置し、ＩｄｅＳを除去するために洗浄し、培養した。処置から１時間後および２４時間後、細胞の一部を取り出し、フローサイトメトリーによって膜結合型ＩｇＧについて分析した。処置から１時間後、＞４μｇ／ｍｌのＩｄｅＳ濃度において検出可能なＩｇＧはなかったが、処置から２４時間後、Ｆａｂ特異的シグナルが最初のレベルに戻り、膜結合型ＩｇＧが回復していることを実証した（図２３Ａ）。Ｎｕ−ＤＵＬ−１細胞をまた、ＢｒｄＵ取り込みを用いて増殖能について分析し、ＩｄｅＳ処置を２４時間にわたって継続した場合でさえも、ＩｇＧ型のＢＣＲを切断した後の増殖に差はなかった（図２３Ｂ）。抗増殖能が知られている物質（ピューロマイシンおよびサイトカラシンＤ）は、その細胞に強い抗増殖効果を生じた。Ｎｕ−ＤＵＬ−１細胞の生存率もまた、高用量のＩｄｅＳ（３０μｇ／ｍｌ）で２４時間、細胞を処置することにより調べ、生存率を、ＣＣＫ−８アッセイを用いて分析し、ＩｄｅＳ処置後、細胞生存率への効果はなかった（図２３Ｃ）。
【０２０４】
ＩｇＧ型のＢＣＲが、高増殖性リンパ腫細胞株において２４時間以内に再生されるという所見は、増殖性細胞における膜代謝回転が通常、非常に高いため、予想することができた。初代細胞上のＩｇＧ型のＢＣＲの代謝回転をさらに調べるために、健康なボランティア由来のＰＢＭＣを同様の処置に供した。血液をヘパリンチューブに収集し、高用量（３０μｇ／ｍｌ）のＩｄｅＳで処置した。血液の処置後、ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌにおいて分離した。培養前に全ＩｄｅＳを除去するために、ＰＢＭＣを大量のバッファーで洗浄した。様々な時点で細胞の一部を取り出し、固定し、Ｂ細胞系譜について抗ＣＤ１９で染色し、ＩｇＧ−ＢＣＲをモニターするために抗Ｆａｂまたは抗Ｆｃでさらに染色した。ＩｇＧ型のＢＣＲは、正常なヒトＣＤ１９＋細胞上でも迅速に再生し、切断後１６時間以内にすでに、完全ＭＦＩにまだ達していないとはいえ、抗Ｆａｂ陽性細胞の数が、処置前のレベルまで戻った。これは、ＰＢＭＣのＩｄｅＳ処置から１６時間後、細胞が、全てのＩｇＧ−ＢＣＲがまだ置き換わっていないとはいえ、表面上に無傷ＩｇＧ−ＢＣＲを再び有することを示している（図２４Ａ）。抗Ｆｃシグナルはその処置によって影響されず、ＩｄｅＳ処置がＩｇＧ型のＢＣＲからＦ（ａｂ’）２を脱落させることを実証している（図２４Ｂ）。Ｂ細胞は、総ＰＢＭＣ集団の数パーセントを占めるのみであるため、本発明者らはまた、Ｂ細胞濃縮キット（ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ）を用い、＞９０％ＣＤ１９＋細胞を生じた。Ｆ（ａｂ’）２特異的試薬とＦｃ特異的試薬の両方を用いて、ＣＤ１９濃縮化細胞集団のおよそ２０％が、ＩｇＧの陽性に染まった（図２５）。細胞表面回復実験を、これらの精製された細胞を用いて繰り返し、ＩｄｅＳ処置が、膜結合型ＩｇＧのＦ（ａｂ’）２部分を効率的に除去して、Ｆｃ部分を無傷のままにした（図２５Ａおよび２５Ｂ）。再び、代謝回転は迅速であり、処置から１６時間後すでに、細胞表面ＩｇＧが回復していた（図２５Ａ）。無傷ＢＣＲ有りまたは無しでの初代ヒトＢ細胞の生存を評価するために、細胞生存率を、ＣＣＫ−８アッセイを用いて数日間、追跡した。ＩｄｅＳ処置によりＣＤ１９濃縮化細胞からＩｇＧ型のＢＣＲを一時的に除去した場合、細胞生存率への有意な効果はなかった（図２６）。
【０２０５】
ＩｄｅＳ処置はＢＣＲシグナル伝達を阻害する
ＢＣＲシグナル伝達は、Ｂリンパ球の活性化、生存、および分化において重要である。ＢＣＲ結合後の最初の事象は、ＬｙｎおよびＳｙｋの活性化であり、それはその後、ＰＬＣ−γ２およびＥＲＫ１／２の活性化へとさらに伝播される。記載された実験により、ＩｄｅＳがＩｇＧ型のＢＣＲを切断し得ることが明らかに示されており、それは、ＢＣＲシグナル伝達に関して重要な意味をもつはずである。これを検証するために、ＰＬＣ−γ２およびＥＲＫ１／２リン酸化を、ＢＣＲシグナル伝達カスケードの下流の指標としてモニターした。Ｆ（ａｂ’）２特異的抗体を用いてＮｕ−ＤＵＬ−１細胞上のＢＣＲを架橋させる一連の実験において、その細胞が、ＩｄｅＳ処置後、ＢＣＲを通してシグナル伝達することができないことが示された（図２７Ａおよび２７Ｂ）。ＩｄｅＳ処置後、ＰＬＣ−γ２もＥＲＫ１／２も、Ｆ（ａｂ’）２特異的抗体を用いて試みられたＢＣＲライゲーションに応答してリン酸化されることはなかった。偽処置された細胞は正常に応答した。これらのデータは、切断されたＩｇＧ型のＢＣＲを有する、ＩｄｅＳ処置された細胞は、抗原刺激に応答できないことを実証している。
【０２０６】
ＩｄｅＳはＢ細胞成熟を遮断する
ＩｄｅＳが、細胞株または初代Ｂ細胞の生存率に影響しないが、それらを抗原に応答できなくさせるという所見により、本発明者らは、初代メモリーＢ細胞の機能性をさらに探求することに決めた。したがって、ＰＢＭＣを収集し、ＩｄｅＳで処置し、メモリーＢ細胞を活性化し、それらをＩｇ産生細胞へ分化させるために組換えＩＬ２およびＲ８４８で刺激した（Jahnmatz et al., 2013）。７２〜９６時間後、ＩｄｅＳを除去するために、細胞を徹底的に洗浄し、Ｉｇ産生細胞の頻度について分析した。追加の対照として、ＩＬ２／Ｒ８４８培養の３日目にもＩｄｅＳを加えた。この時点において、ＩＬ２／Ｒ８４８分化したＢ細胞のＩｇＧの分泌を停止させることはできない。この対照はまた、シグナルの喪失が、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの抗体に干渉するＩｄｅＳのキャリーオーバー効果によるのではないことを示している（図２８Ａ）。たいていの実験において、ＩｄｅＳは、刺激期間（９６時間）中ずっと存在し、結果は、ＩｄｅＳ処置がメモリーＢ細胞分化およびＩｇＧ産生細胞の数を阻害したが、それは、ＩｇＭ産生細胞またはＩｇＡ産生細胞の成熟に効果を生じないことを示した（図２８Ａおよび２８Ｂ）。０．３μｇ／ｍｌから３０μｇ／ｍｌまでの全ての試験されたＩｄｅＳ濃度においてＢ細胞分化への有意な効果があった（図２８Ｃ）。ＩＬ２およびＲ８４８での刺激前にＩｄｅＳを洗い流す第２セットの実験もまた、ＩｇＧ産生細胞の数の有意な低下を結果として生じ（図２８Ｄ）、ＩｇＧ−ＢＣＲの抗原結合部分の最初の除去が、Ｉｇ産生細胞へのメモリーＢ細胞活性化を阻害することにおける重要なステップであることを示している。
【０２０７】
ヒトにおいてインビボで、ＩｄｅＳはＩｇＧ型のＢＣＲを切断する
ＩｄｅＳは最近、健康なヒト対象が単一の漸増ｉ．ｖ．用量を与えられるヒト試験において初めて試験されている（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ０１８０２６９７）（提出された原稿）。４人の対象に与えられた最高の試験用量は、０．２４ｍｇ／ｋｇ  ＢＷであった。その治験の予備的部分は、ＩｄｅＳ投与後、様々な時点において循環ＣＤ１９＋リンパ球上のＩｇＧ型のＢＣＲの完全性を分析することであった。投与前、投与から２時間後、２４時間後、４８時間後、および９６時間後、末梢血を収集し、ＰＢＭＣを精製した。細胞を、さらなる細胞代謝を防ぐためにすぐに固定し、対象からの全ての時点が分析できるまで保存した。ＰＢＭＣを、ＣＤ１９、およびＦ（ａｂ’）２断片またはＦｃ断片、それぞれについて二重染色し、フローサイトメトリーを用いて分析した。この方法は、細胞表面上にＦ（ａｂ’）２（すなわち、無傷のＩｇＧ型のＢＣＲ）およびＦｃを有する細胞の頻度および平均蛍光強度を測定することができる。しかしながら、その方法は、無傷ＢＣＲと単一切断化ＢＣＲとを区別しない。結果は、Ｆ（ａｂ’）２の陽性に染まったＣＤ１９＋細胞の数が、ＩｄｅＳ（０．２４ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ  ＩｄｅＳ）での処置から２時間後すでに低下し、一方、Ｆｃの陽性に染まった細胞の数は低下しなかったことを実証した（図２９）。これは明らかに、ＩｄｅＳがインビボで、ＣＤ１９＋細胞上の表面ＩｇＧを切断したことを実証している。４人の対象、加えて２人のプラセボからのデータは、ヒトにおいてＩｄｅＳがＩｇＧ型のＢＣＲを効率的に切断したこと、および表面ＩｇＧが陽性であるＣＤ１９＋細胞の頻度が、処置以降の日々にわたって徐々に回復したことを実証している（図３０）。
【０２０８】
考察
本明細書に提示されたデータは明らかに、ＩｄｅＳがＩｇＧ型のＢＣＲを切断し、受容体ライゲーションに応答したＢＣＲシグナル伝達を完全に阻害することを示している。したがって、ＩｄｅＳ切断されたＩｇＧ型のＢＣＲを有するＢ細胞は、抗原結合ができなくなり、その結果として、受容体ライゲーションの下流での主要な細胞事象、すなわち、内部移行、プロセシング、およびＭＨＣクラスＩＩ分子上での提示の喪失を生じる。Ｂ細胞は、非常に強力な抗原提示細胞であり（Lanzavecchia 1990、Avalos & Plough 2015）、特異的なＢＣＲ媒介性エンドサイトーシス後、ＨＬＡ上に抗原を高効率で提示することができ、それゆえに、ＩｄｅＳ切断によるＢＣＲの抗原結合断片の喪失は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞への抗原提示に影響を与える可能性が高い。
【０２０９】
ＩｇＧ型のＢＣＲの切断は、細胞株においても健康なヒト対象から精製されたＢ細胞においても細胞生存率に影響を与えない（図２３、２４、および２６）。しかしながら、細胞は、インビトロよりインビボでより若干ゆっくりと、処置から回復するように思われる（図３０）。ヒト第Ｉ相試験からの分析に利用できる細胞の量が非常に限定されているため、他のＢ細胞マーカーは、この予備的試験において追跡することができなかった。したがって、Ｂ細胞の任意の特定の亜集団の運命に関して結論を引き出すことはできない。その証拠は、本発明者らがインビトロで観察しているように、膜代謝回転による、切断された細胞上のＩｇＧ型のＢＣＲの回復と一致しているが、インビボで見られた回復のわずかな遅れは、単なる膜代謝回転よりむしろ、新しいＢ細胞の成熟によることを排除することはできない。
【０２１０】
本明細書に提示された結果は、ＩｄｅＳがポリクローナル刺激（ＩＬ２およびＲ８４８）での活性化前に用いられる場合には、ＩｄｅＳがＩｇＧ抗体分泌細胞の発生を遮断するが、ＩｇＡまたはＩｇＭ抗体分泌細胞の発生を遮断しないことを示している。しかしながら、ＩｄｅＳが後で用いられる場合には、それは遮断効果を生じない。培養中のＰＢＭＣのインビトロ刺激により、ＢＣＲと結合した抗原は内部移行し、ＭＨＣＩＩ分子上にロードされ、Ｂ細胞増殖および分化を誘導するＴ細胞へ提示される（Tangye & Tralington 2009）。抗原刺激の非存在下において、すなわち、ＩｇＧ−ＢＣＲがＩｄｅＳによって切断される場合のように、Ｂ細胞は、二次シグナルを得て増殖することはないだろう。
【０２１１】
さらに、これは、抗原の非存在下においてさえも刺激に応答すること、すなわち、持続性シグナルを維持することにおける、ＩｇＧ−ＢＣＲ複合体についての重要な役割を示している。ＢＣＲのＣＤ７９ｂの細胞外領域における単一のアミノ酸突然変異が、無ガンマグロブリン血症を結果として生じることが発表されている（Dobbs et al., 2007）。この所見は、ＢＣＲの細胞外部分におけるタンパク質間の相互作用が、細胞活性化に重要であることを示しており、本発明者らは、ＣＤ７９ａ／ｂとＩｇＧの間の相互作用が、外部刺激に応答した適切なシグナロソームの生成に重要であると推測する。この理論についてのさらなる裏付けは、非溶解性抗体を用いてＣＤ７９ｂ細胞外ドメインを標的にする刊行物によってもたらされる（Hardy et al., 2014）。彼らは、インビトロとインビボの両方において、ＣＤ７９ｂとの結合が、結果として、Ｂ細胞アネルギー、およびＩｇＧ産生細胞の喪失を生じることを見出した。本発明者らは、ＩｇＧのＦ（ａｂ’）２部分の切断によりＢＣＲを解体することが、結果として、適切な細胞内タンパク質集合および機能性シグナロソームの生成の喪失により、抗原依存性活性化に対する無応答性を生じると提案する。
【０２１２】
ＩｄｅＳは現在、腎臓移植についての順番待ちリストの高度に感作された患者の脱感作のために開発されている。これらの患者は、たいていのドナーに対して抗体を発生しており、適合ドナーを見出す機会がほとんどない。移植前にＩｄｅＳを用いてドナー特異的抗体（ＤＳＡ）を除去することにより、患者は、処置前の陽性のクロスマッチにもかかわらず、移植に適格となることができる。ＩｄｅＳ処置の追加の効果は、結合能力を保持した遊離Ｆ（ａｂ’）２断片のＤＳＡからの即時の生成である。これらのＦ（ａｂ’）２断片は、移植片におけるエピトープを結合して封鎖し得、Ｆ（ａｂ’）２断片は、補体結合（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、および抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）などのＦｃ媒介性機能を喪失しているため、Ｆ（ａｂ’）２断片は、ＩｇＭ、および新しく形成されるＩｇＧ  ＤＳＡを遮断し、それにより、移植片の追加の保護を与える能力を有し得る。本明細書に提示された結果は、ＩｄｅＳがまた、ＣＤ２７＋陽性メモリーＢ細胞上のＩｇＧ型のＢＣＲを切断し、それらを、抗原刺激へ応答できなくすることを示している。したがって、ＩｄｅＳによってＤＳＡを除去するだけでなく、さらに、ＤＳＡ特異的メモリーＢ細胞は、最初は、ドナー抗原に応答する能力をもたない。これは、メモリーＢ細胞の最初の活性化、および長命形質細胞の生成がＩｄｅＳ処置によって影響されている可能性が高いため、移植片生存の結果に長期間の効果を潜在的に生じる可能性がある。
【０２１３】
参照文献
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【実施例４】
【０２１４】
以下の試験を、ＩｄｅＳで処置されているＢ細胞のＢＣＲを標的にすることが可能かどうかを決定するために行った。
【０２１５】
材料および方法
簡単に述べれば、Ｒ１０培地（ＲＰＭＩ１６４０、ＰＥＳＴ、および１０％ＦＣＳ）における８００００個／ウェルから１２５０個／ウェルまでの細胞（Ｎｕ−ＤＵＬ−１、ＩｇＧ型のＢＣＲを有するＢ細胞リンパ腫；ＤＳＭＺからのＡＣＣ５７９）の２段階希釈物を、９６ウェル平底ポリスチレンプレートに２連で蒔き、生細胞についてのキャリブレータとして用いた。２００００個の細胞／ウェルをプレートに蒔き、３０μｇ／ｍｌ  ＩｄｅＳ有りまたは無しで、ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で１時間、インキュベートした。抗Ｆａｂ、抗Ｆｃ、または対照を、試験ウェルに、１０μｇ／ｍｌの最終濃度まで加え、プレートを、ＣＯ２インキュベーター内、３７℃でインキュベートした。最初のプレートを３時間後、２番目を２４時間後、３番目を４８時間後、取り出した。インキュベーターからプレートを取り出した後、ＣＣＫ−８試薬（ＣＣＫ−８細胞カウンティングキットから；同仁化学研究所、日本）を加え、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（分光光度計）において４５０ｎｍでプレートを読み取る前に１時間、インキュベーションを継続した。ＣＣＫ−８アッセイは、細胞増殖アッセイおよび細胞傷害性アッセイにおける細胞生存率の決定のための高感度の比色アッセイを可能にする。用いられた抗Ｆａｂ剤は、Ｆ（ａｂ’）２特異的ヤギＦ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＃１０９−００６−０９７、１．３ｍｇ／ｍｌ）であった。用いられた抗Ｆｃ剤は、Ｆｃ特異的ヤギＦ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＃１０９−００６−０９８、１．３ｍｇ／ｍｌ）であった。対照は、マウスγグロブリン（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＃０１５−０００−００２、１１．４ｍｇ／ｍｌ）であった。対照は、試験された抗Ｆａｂおよび抗Ｆｃと同じ製造会社製であるように選択され、マウスＩｇＧがＩｄｅＳによって切断されないという理由による。
【０２１６】
結果および結論
【０２１７】
【表１９】
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【０２１８】
結果は、ＩｇＧ型のＢＣＲを発現する標的細胞（この場合、Ｂ細胞リンパ腫細胞株）上のＢＣＲの架橋が、Ｆ（ａｂ’）２部分またはＦｃ部分のいずれかに対する抗体を用いても、細胞死を誘導することを示している。しかしながら、標的としてＢＣＲを直接的に用いることは、ＩｄｅＳ処置前にヒトにおいて、循環中の正常なＩｇＧレベル（約１０ｍｇ／ｍＬ）の存在により、不可能である。しかしながら、ＩｄｅＳでの前処置は、標的細胞上のＦｃ断片を治療介入にまだ利用可能にしたまま、循環中に残る抗体レベルを減少させることができる。ＩｄｅＳ切断後のＦｃ断片を標的にすることは、ＩｄｅＳ処置された細胞において、偽処置された細胞においてと少なくとも同じくらい効率的である。治療介入は、ＩｄｅＳ切断の結果としてＢＣＲにおいて生じているエピトープを標的にする抗体を用いて、または（本明細書に示されているような）Ｆｃ上の共通のエピトープを標的にすることによってでも、達成することができる。治療抗体は、好ましくは、ＩｄｅＳによって切断されず、かつ高度のＦｃエフェクター機能、すなわち、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、およびＡＤＣＰを有する抗体である。その抗体はまた、細胞傷害性薬剤、すなわち、放射性同位元素または毒素と連結することも可能である。
【０２１９】
循環中のＩｇＧの回復と比較して、膜結合型ＢＣＲ上の無傷ＩｇＧのかなり速い回復に
よりもう一つの可能性が提供される。これは、標的として、Ｆｃ部分だけでなく、Ｆ（ａ
ｂ’）２部分を用いることを可能にする。メモリーＢ細胞上のＩｇＧ−ＢＣＲの回復は、
特定の望ましくない特異性（すなわち、抗ＨＬＡまたは抗インスリン）を有するメモリー
Ｂ細胞を特異的に標的にするために（毒素または放射性同位元素に連結した）抗原を用い
る可能性をもたらす。
また、本発明は以下を提供する。
＜１＞  治療または治療剤の対象への利益を向上させるための方法であって、（ａ）前記対象において血清ＩｇＧ分子のＦｃ受容体結合を低下させる作用物質を前記対象に投与するステップ、および（ｂ）その後、前記治療または前記治療剤を前記対象に投与するステップを含み、
−  前記治療が臓器移植であり、または前記治療剤が抗体であり、
−  投与される前記作用物質の量が、前記対象の血清に存在する実質的に全部のＩｇＧ分子によるＦｃ受容体結合を排除するのに十分であり、
−  ステップ（ａ）と（ｂ）が、前記対象の前記血清に存在する実質的に全部のＩｇＧ分子によるＦｃ受容体結合が排除されるのに十分である時間区間によって隔てられている、
方法。
＜２＞前記作用物質が以下から選択される、＜１＞に記載の方法：
（ｉ）ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有するタンパク質、または
（ｉｉ）ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有するタンパク質。
＜３＞（ｉ）ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有する前記タンパク質が、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）などのストレプトコッカス属細菌由来のＩｇＧシステインプロテアーゼであり、任意選択で、前記タンパク質がＩｄｅＳまたはＭＡＣ２であり、あるいは
（ｉｉ）ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有する前記タンパク質が、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、腺疫菌（Streptococcus equi）、もしくはストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Streptococcus zooepidemicus）などのストレプトコッカス属細菌由来、またはヒツジ偽結核菌（Corynebacterium pseudotuberculosis）、大便連鎖球菌（Enterococcus faecalis）、もしくはエリザベトキンギア・メニンゴセプティカ（Elizabethkingia meningoseptica）由来のＩｇＧエンドグリコシダーゼであり、任意選択で、前記タンパク質がＥｎｄｏＳ、ＣＰ４０、ＥｎｄｏＥ、またはＥｎｄｏＦ２である、
＜２＞に記載の方法。
＜４＞（ｉ）ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有する前記タンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列、またはＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有するその断片もしくは変種を含み、またはそれからなるタンパク質であり、あるいは
（ｉｉ）ＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有する前記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列、またはＩｇＧエンドグリコシダーゼ活性を有するその断片もしくは変種を含み、またはそれからなるタンパク質である、
＜２＞に記載の方法。
＜５＞前記作用物質が、点滴静注により投与され、および／または投与される前記作用物質の前記量が、０．０１ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ〜２ｍｇ／ｋｇ  ＢＷの間、０．０４ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ〜２ｍｇ／ｋｇ  ＢＷの間、０．１２ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ〜２ｍｇ／ｋｇ  ＢＷの間、０．２４ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ〜２ｍｇ／ｋｇ  ＢＷの間、もしくは１ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ〜２ｍｇ／ｋｇ  ＢＷの間である、＜１＞〜＜４＞のいずれか一項に記載の方法。
＜６＞−  ステップ（ａ）と（ｂ）の間の前記時間区間の下限が、少なくとも３０分間、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、または少なくとも６時間から選択され、
−  ステップ（ａ）と（ｂ）の間の前記時間区間の上限が、多くても２１日間、多くても１８日間、多くても１４日間、多くても１３日間、多くても１２日間、多くても１１日間、多くても１０日間、多くても９日間、多くても８日間、多くても７日間、多くても６日間、多くても５日間、多くても４日間、多くても３日間、多くても２日間、多くても２４時間、多くても１８時間、多くても１２時間、多くても１０時間、多くても８時間、多くても７時間、または多くても６時間から、独立的に選択される、
＜１＞〜＜５＞のいずれか一項に記載の方法。
＜７＞ステップ（ａ）と（ｂ）の間の前記時間区間が、３０分間〜１時間、３０分間〜２時間、３０分間〜３時間、３０分間〜４時間、３０分間〜５時間、３０分間〜６時間、１〜２時間、１〜３時間、１〜４時間、１〜５時間、１〜６時間、２〜３時間、２〜４時間、２〜５時間、２〜６時間、３〜４時間、３〜５時間、３〜６時間、４〜５時間、４〜６時間、または５〜６時間である、＜１＞〜＜６＞のいずれか一項に記載の方法。
＜８＞前記治療剤が、癌または別の疾患の処置のために投与される抗体であり、任意選択で、前記癌が、前立腺癌、乳癌、膀胱癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、腎臓（腎細胞）癌、食道癌、甲状腺癌、リンパ腫、皮膚癌、黒色腫、または白血病である、＜１＞〜＜７＞のいずれか一項に記載の方法。
＜９＞前記治療が、アバゴボマブ（Abagovomab）、アブシキシマブ(Abciximab)、アクトクスマブ（Actoxumab）、アダリムマブ(Adalimumab)、アデカツムマブ(Adecatumumab)、アフェリモマブ(Afelimomab)、アフツズマブ(Afutuzumab)、アラシズマブペゴール（Alacizumab pegol）、ＡＬＤ５１８、アレムツズマブ(Alemtuzumab)、アリロクマブ（Alirocumab）、アルツモマブペンテト酸（Altumomab pentetate）、アマツキシマブ(Amatuximab)、アナツモマブマフェナトクス（Anatumomab mafenatox）、アンルキンズマブ（Anrukinzumab）、アポリズマブ(Apolizumab)、アルシツモマブ(Arcitumomab)、アセリズマブ（Aselizumab）、アチヌマブ（Atinumab）、アツリズマブ（Atlizumab）（＝トシリズマブ）、アトロリムマブ（Atorolimumab）、バピネウズマブ（Bapineuzumab）、バシリキシマブ(Basiliximab)、バビツキシマブ(Bavituximab)、ベクツモマブ（Bectumomab）、ベリムマブ(Belimumab)、ベンラリズマブ（Benralizumab）、ベルチリムマブ（Bertilimumab）、ベシレソマブ(Besilesomab)、ベバシズマブ(Bevacizumab)、ベズロトクスマブ(Bezlotoxumab)、ビシロマブ（Biciromab）、ビマグルマブ（Bimagrumab）、ビバツズマブメルタンシン（Bivatuzumab mertansine）、ブリナツモマブ（Blinatumomab）、ブロソズマブ（Blosozumab）、ブレンツキシマブベドチン(Brentuximab vedotin)、ブリアキヌマブ(Briakinumab)、ブロダルマブ(Brodalumab)、カナキヌマブ(Canakinumab)、カンツズマブメルタンシン(Cantuzumab mertansine)、カンツズマブラブタンシン（Cantuzumab ravtansine）、カプラシズマブ（Caplacizumab）、カプロマブペンデチド(Capromab pendetide)、カルルマブ(Carlumab)、カツマキソマブ(Catumaxomab)、ＣＣ４９、セデリズマブ(Cedelizumab)、セルトリズマブペゴール(Certolizumab pegol)、セツキシマブ(Cetuximab)、Ｃｈ．１４．１８、シタツズマブボガトクス（Citatuzumab bogatox）、シクスツムマブ(Cixutumumab)、クラザキズマブ（Clazakizumab）、クレノリキシマブ(Clenoliximab)、クリバツズマブテトラキセタン(Clivatuzumab tetraxetan)、コナツムマブ（Conatumumab）、コンシズマブ（Concizumab）、クレネズマブ（Crenezumab）、ＣＲ６２６１、ダセツズマブ(Dacetuzumab)、ダクリズマブ(Daclizumab)、ダロツズマブ(Dalotuzumab)、ダラツムマブ(Daratumumab)、デムシズマブ（Demcizumab）、デノスマブ(Denosumab)、デツモマブ(Detumomab)、ドルリモマブアリトクス（Dorlimomab aritox）、ドロジツマブ（Drozitumab）、デュリゴツマブ（Duligotumab）、デュピルマブ(Dupilumab)、デュシギツマブ（Dusigitumab）、エクロメキシマブ（Ecromeximab）、エクリズマブ(Eculizumab)、エドバコマブ（Edobacomab）、エドレコロマブ(Edrecolomab)、エファリズマブ(Efalizumab)、エフングマブ（Efungumab）、エロツズマブ(Elotuzumab)、エルシリモマブ（Elsilimomab）、エナバツズマブ（Enavatuzumab）、エンリモマブペゴール（Enlimomab pegol）、エノキズマブ（Enokizumab）、エノチクマブ（Enoticumab）、エンシツキシマブ（Ensituximab）、エピツモマブシツキセタン（Epitumomab cituxetan）、エプラツズマブ（Epratuzumab）、エルリズマブ（Erlizumab）、エルツマキソマブ（Ertumaxomab）、エタラシズマブ（Etaracizumab）、エトロリズマブ（Etrolizumab）、エボロクマブ(Evolocumab)、エキスビビルマブ（Exbivirumab）、ファノレソマブ（Fanolesomab）、ファラリモマブ（Faralimomab）、ファルレツズマブ（Farletuzumab）、ファシヌマブ（Fasinumab）、ＦＢＴＡ０５、フェルビズマブ（Felvizumab）、フェザキヌマブ（Fezakinumab）、フィクラツズマブ（Ficlatuzumab）、フィギツムマブ(Figitumumab)、フランボツマブ（Flanvotumab）、フォントリズマブ（Fontolizumab）、フォラルマブ（Foralumab）、フォラビルマブ（Foravirumab）、フレソリムマブ（Fresolimumab）、フルラヌマブ（Fulranumab）、フツキシマブ（Futuximab）、ガリキシマブ(Galiximab)、ガニツマブ（Ganitumab）、ガンテネルマブ（Gantenerumab）、ガビリモマブ（Gavilimomab）、ゲムツズマブオゾガマイシン(Gemtuzumab ozogamicin)、ゲボキズマブ(Gevokizumab)、ギレンツキシマブ(Girentuximab)、グレムバツムマブベドチン（Glembatumumab vedotin）、ゴリムマブ(Golimumab)、ゴミリキシマブ(Gomiliximab)、ＧＳ６６２４、イバリズマブ（Ibalizumab）、イブリツモマブチウキセタン(Ibritumomab tiuxetan)、イクルクマブ（Icrucumab）、イゴボマブ（Igovomab）、イムシロマブ（Imciromab）、イムガツズマブ（Imgatuzumab）、インクラクマブ（Inclacumab）、インダツキシマブラブタンシン（Indatuximab ravtansine）、インフリキシマブ(Infliximab)、インテツムマブ(Intetumumab)、イノリモマブ（Inolimomab）、イノツズマブオゾガマイシン(Inotuzumab ozogamicin)、イピリムマブ(Ipilimumab)、イラツムマブ（Iratumumab）、イトリズマブ(Itolizumab)、イキセキズマブ（Ixekizumab）、ケリキシマブ(Keliximab)、ラベツズマブ(Labetuzumab)、ラムパリズマブ（Lampalizumab）、レブリキズマブ（Lebrikizumab）、レマレソマブ（Lemalesomab）、レルデリムマブ（Lerdelimumab）、レキサツムマブ（Lexatumumab）、リビビルマブ（Libivirumab）、リゲリズマブ（Ligelizumab）、リンツズマブ(Lintuzumab)、リリルマブ（Lirilumab）、ロデルシズマブ（Lodelcizumab）、ロルボツズマブメルタンシン（Lorvotuzumab mertansine）、ルカツムマブ（Lucatumumab）、ルミリキシマブ、マパツムマブ（Mapatumumab）、マスリモマブ（Maslimomab）、マブリリムマブ（Mavrilimumab）、マツズマブ(Matuzumab)、メポリズマブ(Mepolizumab)、メテリムマブ（Metelimumab）、ミラツズマブ(Milatuzumab)、ミンレツモマブ（Minretumomab）、ミツモマブ（Mitumomab）、モガムリズマブ(Mogamulizumab)、モロリムマブ（Morolimumab）、モタビズマブ(Motavizumab)、モキセツモマブパスドトクス（Moxetumomab pasudotox）、ムロモナブ−ＣＤ３(Muromonab-CD3)、ナコロマブタフェナトクス（Nacolomab tafenatox）、ナミルマブ（Namilumab）、ナプツモマブエスタフェナトクス(Naptumomab estafenatox)、ナルナツマブ（Narnatumab）、ナタリズマブ(Natalizumab)、ネバクマブ(Nebacumab)、ネシツムマブ(Necitumumab)、ネレリモマブ(Nerelimomab)、ネスバクマブ（Nesvacumab）、ニモツズマブ(Nimotuzumab)、ニボルマブ(Nivolumab)、ノフェツモマブメルペンタン（Nofetumomab merpentan）、オビヌツズマブ(Obinutuzumab)、オカラツズマブ（Ocaratuzumab）、オクレリズマブ(Ocrelizumab)、オデュリモマブ（Odulimomab）、オファツムマブ(Ofatumumab)、オララツマブ（Olaratumab）、オロキズマブ（Olokizumab）、オマリズマブ(Omalizumab)、オナルツズマブ（Onartuzumab）、オポルツズマブモナトクス（Oportuzumab monatox）、オレゴボマブ(Oregovomab)、オルチクマブ（Orticumab）、オテリキシズマブ、オキセルマブ（Oxelumab）、オザネズマブ（Ozanezumab）、オゾラリズマブ（Ozoralizumab）、パギバキシマブ(Pagibaximab)、パリビズマブ(Palivizumab)、パニツムマブ(Panitumumab)、パノバクマブ（Panobacumab）、パルサツズマブ（Parsatuzumab）、パスコリズマブ（Pascolizumab）、パテクリズマブ（Pateclizumab）、パトリツマブ（Patritumab）、ペムツモマブ（Pemtumomab）、ペラキズマブ（Perakizumab）、ペルツズマブ(Pertuzumab)、��キセリズマブ（Pexelizumab）、ピジリズマブ（Pidilizumab）、ピナツズマブベドチン（Pinatuzumab vedotin）、ピンツモマブ（Pintumomab）、プラクルマブ（Placulumab）、ポラツズマブベドチン（Polatuzumab vedotin）、ポネズマブ(Ponezumab)、プリリキシマブ（Priliximab）、プリトキサキシマブ（Pritoxaximab）、プリツムマブ(Pritumumab)、ＰＲＯ１４０、クイリズマブ（Quilizumab）、ラコツモマブ（Racotumomab）、ラドレツマブ（Radretumab）、ラフィビルマブ（Rafivirumab）、ラムシルマブ(Ramucirumab)、ラニビズマブ(Ranibizumab)、ラキシバクマブ(Raxibacumab)、レガビルマブ(Regavirumab)、レスリズマブ(Reslizumab)、リロツムマブ(Rilotumumab)、リツキシマブ(Rituximab)、ロバツムマブ（Robatumumab）、ロレデュマブ（Roledumab）、ロモソズマブ(Romosozumab)、ロンタリズマブ（Rontalizumab）、ロベリズマブ（Rovelizumab）、ルプリズマブ（Ruplizumab）、サマリズマブ（Samalizumab）、サリルマブ（Sarilumab）、サツモマブペンデチド（Satumomab pendetide）、セクキヌマブ(Secukinumab)、セリバンツマブ（Seribantumab）、セトキサキシマブ（Setoxaximab）、セビルマブ（Sevirumab）、シブロツズマブ（Sibrotuzumab）、シファリムマブ（Sifalimumab）、シルツキシマブ(Siltuximab)、シムツズマブ（Simtuzumab）、シプリズマブ(Siplizumab)、シルクマブ（Sirukumab）、ソラネズマブ(Solanezumab)、ソリトマブ（Solitomab）、ソネプシズマブ（Sonepcizumab）、ソンツズマブ（Sontuzumab）、スタムルマブ（Stamulumab）、スレソマブ（Sulesomab）、スビズマブ（Suvizumab）、タバルマブ（Tabalumab）、タカツズマブテトラキセタン（Tacatuzumab tetraxetan）、タドシズマブ（Tadocizumab）、タリズマブ(Talizumab)、タネズマブ(Tanezumab)、タプリツモマブパプトクス（Taplitumomab paptox）、テフィバズマブ（Tefibazumab）、テリモマブアリトクス（Telimomab aritox）、テナツモマブ（Tenatumomab）、テネリキシマブ（Teneliximab）、テプリズマブ(Teplizumab)、テプロツムマブ（Teprotumumab）、ＴＧＮ１４１２、チシリムマブ（Ticilimumab）（＝トレメリムマブ(tremelimumab)）、チルドラキズマブ（Tildrakizumab）、チガツズマブ（Tigatuzumab）、ＴＮＸ−６５０、トシリズマブ(Tocilizumab)（＝アツリズマブ(atlizumab)）、トラリズマブ（Toralizumab）、トシツモマブ(Tositumomab)、トラロキヌマブ（Tralokinumab）、トラスツズマブ(Trastuzumab)、ＴＲＢＳ０７、トレガリズマブ（Tregalizumab）、トレメリムマブ(Tremelimumab)、ツコツズマブセルモロイキン（Tucotuzumab celmoleukin）、ツビルマブ（Tuvirumab）、ウブリツキシマブ（Ublituximab）、ウレルマブ（Urelumab）、ウルトキサズマブ(Urtoxazumab)、ウステキヌマブ(Ustekinumab)、バパリキシマブ（Vapaliximab）、バテリズマブ（Vatelizumab）、ベドリズマブ(Vedolizumab)、ベルツズマブ(Veltuzumab)、ベパリモマブ（Vepalimomab）、ベセンクマブ（Vesencumab）、ビシリズマブ(Visilizumab)、ボロシキシマブ(Volociximab)、ボルセツズマブマフォドチン（Vorsetuzumab mafodotin）、ボツムマブ（Votumumab）、ザルツムマブ(Zalutumumab)、ザノリムマブ(Zanolimumab)、ザツキシマブ（Zatuximab）、ジラリムマブ（Ziralimumab）、またはゾリモマブアリトクス（Zolimomab aritox）である抗体である、＜１＞〜＜７＞のいずれか一項に記載の方法。
＜１０＞前記治療が、臓器移植であり、任意選択で、前記臓器が腎臓、肝臓、心臓、膵臓、肺、または小腸である、＜１＞〜＜７＞のいずれか一項に記載の方法。
＜１１＞前記方法が、移植時または移植直前に行われるステップも含み、前記ステップが患者におけるＴ細胞および／またはＢ細胞の抑制の誘導を含む、＜１０＞に記載の方法。
＜１２＞前記抑制の誘導が、ムロモナブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）抗体、リンパ球免疫グロブリン、抗胸腺細胞グロブリン調製物（ＡＴＧＡＭ）、またはリツキシマブのうちの少なくとも１つの有効量を投与することを含む、＜１１＞に記載の方法。
＜１３＞対象において抗体を除去し、および／または抗体の効果を低下させるための方法であって、（ａ）前記対象において血清ＩｇＧ分子のＦｃ受容体結合を低下させる作用物質を前記対象に投与するステップ、および任意選択で（ｂ）その後、内因性自己抗体を除去する処置を前記対象に施すステップを含み、内因性自己抗体を除去する前記処置が、プラスマフェレーシスもしくは免疫吸着であり、またはＦｃＲｎ受容体による血清中の抗体のリサイクリングを阻止し、それにより半減期を低下させる作用物質の投与であり、ステップ（ａ）と（ｂ）が、少なくとも１週間の時間区間によって隔てられている、方法。
＜１４＞ステップ（ａ）をせいぜい６カ月ごとに１回、繰り返すことを含み、任意選択で、前記作用物質が、＜２＞〜＜４＞のいずれか一項に定義されている通りである、＜１３＞に記載の方法。
＜１５＞追加のステップ（ａ１）が、ステップ（ａ）の後で、かつステップ（ｂ）が存在する場合にはステップ（ｂ）の前に行われ、ステップ（ａ１）が以下のいずれかを含む、＜１＞〜＜１４＞のいずれか一項に記載の方法：
（ｉ）ステップ（ａ）において投与された前記作用物質の膜結合型ＩｇＧへの作用によって生じたエピトープと特異的に結合する作用物質を前記対象に投与するステップであって、ステップ（ａ）の後であるが、ＢＣＲ複合体中の無傷の膜結合型ＩｇＧのレベルが、ステップ（ａ）の前に存在したのと類似したレベルまで戻っている状態の前の区間で行われる、ステップ；または
（ｉｉ）無傷の膜結合型ＩｇＧのエピトープと特異的に結合する作用物質を前記対象に投与するステップであって、ＢＣＲ複合体における無傷の膜結合型ＩｇＧのレベルが、ステップ（ａ）の前に存在していたレベルと類似したレベルまで戻っているが、新しく合成されたＩｇＧがまだ血清中に再出現していない、ステップ（ａ）の後の区間で行われる、ステップ。
＜１６＞ステップ（ａ１）の前記作用物質が、ステップ（ａ）の完了から１２時間後までに（ｉ）に従って投与され、またはステップ（ａ１）の前記作用物質が、ステップ（ａ）の完了から１２時間後から４日後の間に（ｉｉ）に従って投与される、＜１５＞に記載の方法。
＜１７＞ステップ（ａ）が、任意選択で＜３＞または＜４＞に定義されているような、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有する作用物質を投与することを含み、
−  ステップ（ａ１）の前記作用物質が、（ｉ）に従って投与され、かつステップ（ａ）の前記作用物質による膜結合型ＩｇＧの切断から生じる膜結合型Ｆｃ断片と特異的に結合する作用物質であり、または
−  ステップ（ａ１）の前記作用物質が、（ｉｉ）に従って投与され、かつ無傷の膜結合型ＩｇＧのエピトープと特異的に結合する作用物質であり、任意選択で、前記作用物質が抗イディオタイプである、
＜１５＞または＜１６＞に記載の方法。
＜１８＞ステップ（ａ１）の前記作用物質が、任意選択で細胞毒にコンジュゲートした抗体である、＜１５＞〜＜１７＞のいずれか一項に記載の方法。
＜１９＞以下のステップを含む、個体から採取された試料において無傷ＩｇＧの量を評価するための方法：
（ｉ）ＩｇＧのＦ（ａｂ’）２部分と特異的に結合する第１の作用物質と前記試料をインキュベートするステップ、
（ｉｉ）ＩｇＧのＦｃ部分と特異的に結合する第２の作用物質と前記試料をインキュベートするステップ、
（ｉｉｉ）両方の作用物質の存在を判定することにより、前記試料における無傷ＩｇＧの濃度を決定するステップ。
＜２０＞前記第１の作用物質がＩｇＧのＦｃ部分と結合し、かつ前記第２の作用物質がＩｇＧのＦ（ａｂ’）２部分と結合し、または逆である、＜１９＞に記載の方法。
＜２１＞前記第１の作用物質が表面上に固定化され、かつ前記第２の作用物質が溶液中に遊離している、＜１９＞または＜２０＞に記載の方法。
＜２２＞前記個体または前記試料が、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有する作用物質で処置されており、任意選択で、前記作用物質がＩｇＧシステインプロテアーゼであり、前記プロテアーゼが任意選択で＜３＞または＜４＞に定義されている通りである、＜１９＞〜＜２１＞のいずれか一項に記載の方法。
＜２３＞ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有する作用物質の効力を評価することを目的として行われる、＜１９＞〜＜２２＞のいずれか一項に記載の方法。
【配列表フリーテキスト】
【０２２０】
配列番号１は、化膿性連鎖球菌（S.pyogenes）の成熟免疫グロブリンＧ分解性酵素（ＩｄｅＳ）のアミノ酸配列を示す。このタンパク質は、時々、ＭＡＣ１と呼ばれる。分泌シグナルを含むＭＡＣ１の完全配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＷＰ＿０１０９２２１６０．１として入手可能である。
配列番号２は、成熟エンドグリコシダーゼＳ（ＥｎｄｏＳ）のアミノ酸配列を示す。分泌シグナルを含む完全配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＫ００８５０．１で入手可能である。
配列番号３は、ＩｄｅＳの変種、成熟ＭＡＣ２のアミノ酸配列を示す。分泌シグナルを含むＭＡＣ２の完全配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦＣ６７９０７．１として入手可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２８−３】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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