(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
質量分析を利用して糖鎖の構造を解析する方法であって、
a)分子内に負電荷を安定的に存在させ得る部位を少なくとも一つ有する酸性のラベル化剤を用い、還元を伴うことなく解析対象の糖鎖をラベル化してサンプルを調製するサンプル調製ステップと、
b)前記サンプルに対して負イオンモードで、ラベル化糖鎖のプロトン脱離イオンをプリカーサイオンとするＭＳ／ＭＳ分析を行う分析実行ステップと、
c)前記ＭＳ／ＭＳ分析の結果から、糖鎖の分枝構造を反映したＤイオン又はＥイオンの少なくとも一方を含むプロダクトイオンを検出することにより糖鎖の構造を推定する推定ステップと、
を有することを特徴とする糖鎖解析方法。
【請求項２】
請求項１に記載の糖鎖解析方法であって、
前記ラベル化剤は分子内に負電荷を安定的に存在させる部位を一つ有するものであることを特徴とする糖鎖解析方法。
【請求項３】
請求項１に記載の糖鎖解析方法であって、
前記ラベル化剤にあって負電荷を安定的に存在させる部位はカルボキシ基であることを特徴とする糖鎖解析方法。
【請求項４】
請求項１に記載の糖鎖解析方法であって、
前記ラベル化剤はアミノ基、ヒドラジド基、アミノオキシ基、又はそれに相当する塩基性官能基を有し、糖鎖の還元末端と結合することを特徴とする糖鎖解析方法。
【請求項５】
請求項１に記載の糖鎖解析方法であって、
前記ラベル化剤は糖鎖中のグリコシルアミン構造のアミノ基と反応することを特徴とする糖鎖解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、質量分析を利用して糖鎖の構造を解析する方法に関し、特に、分枝構造（樹状構造ともいう）を有する糖鎖の構造解析に有用な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体を構成するタンパク質の半分以上は糖鎖修飾を受けていると言われており、糖鎖修飾はタンパク質の構造や機能の調節に重要な役割を果たしている。また、近年の研究により、細胞表面上で発現した糖鎖は、細胞間相互作用やシグナル伝達、発生・分化、さらには受精、ガン転移など、様々な生体内現象に関与することが分かってきている。
タンパク質を修飾している糖鎖は単糖が直鎖状に連なった構造であることは少なく、多くの場合、分枝構造を有している。こうした分枝構造を有する糖鎖の構造は非常に多様性に富んでおり、その構造がタンパク質の機能に大きな影響を及ぼしている。そのため、糖鎖の構造解析は、生理学、生命科学、医学等、様々な分野において重要である。【０００３】
近年、糖鎖の構造解析には、質量分析、特にタンデム質量分析、多段階質量分析（ＭＳn）などと呼ばれる、イオンに対する解離操作を伴った質量分析が広く利用されている。質量分析を用いた糖鎖構造解析は、一般に、正イオンモードの下で取得されたマススペクトル（本明細書では、ＭＳ／ＭＳ分析で得られたＭＳ／ＭＳスペクトル等もマススペクトルということがある）に基づいて行われる。但し、正イオン化された糖鎖を衝突誘起解離（ＣＩＤ）法によって解離させると、単糖間のグリコシル結合で解離が生じることが多く、分枝構造の情報は得られにくい。そのため、そうした手法は糖鎖を構成する単糖を推定するには有用であるものの、分枝構造を有する糖鎖の構造解析にはあまり適さない。【０００４】
これに対し、あまり一般的ではないものの、負イオンモードの下で取得されたマススペクトルに基づく糖鎖構造解析も試みられている。
負イオン化された糖鎖をＣＩＤにより解離させると、分枝構造を反映する解離が特異的に生じ易いことが知られている。例えばＮ型糖鎖では、二本の枝のうちの１−６アームの構造情報を反映するＤイオンや１−３アームの構造情報を反映するＥイオンがそれぞれ生じ易く、これらイオンを検出することによって分枝構造の推定が可能である。しかも、これらプロダクトイオンは単純な一次開裂によって生じると考えられており、複雑な二次開裂や三次開裂によって生じるイオンに比べて、元の分子の構造情報がそのままプロダクトイオンに反映され易いという特性がある。そのため、例えば或る特定のプロダクトイオンがマススペクトル上で観測された場合に、元の分子の部分構造が一意に定まる診断的な解析が行えるという利点がある。こうしたことから、負イオンモードでの質量分析は、分枝構造を有する糖鎖の構造解析に有利であるといえる。【０００５】
しかしながら、そもそも糖鎖は負イオン化されにくいという問題がある。単糖の一つであるシアル酸はカルボキシル基を持つため、負電荷に帯電し易い。そのため、シアル酸を含む酸性糖鎖は比較的負イオンになり易いものの、実際の測定ではシアル酸の損失を防止するためにシアル酸部分の負電荷を中和するように前処理で誘導体化が行われることも多い。そのため、一般には、糖鎖にシアル酸が含まれる場合であっても、実質的に脱プロトン化する官能基を有さない中性糖鎖を負イオン化する必要がある。【０００６】
中性糖鎖を負イオン化する一つの方法として、糖鎖分子にアニオンを付加させることで負イオン化する方法が開発されている。例えば特許文献１、非特許文献１には、実質的に中性である糖鎖をマトリクス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法で負イオン化するために、特殊な液体マトリクスにアニオンを添加して測定用のサンプルを調製する方法が開示されている。液体マトリクスは、例えばアミンのイオンとｐ−クマル酸等の酸性基含有有機物質のイオンとから成るイオン性液体であり、アニオンはテトラフルオロホウ酸などである。しかしながら、こうした方法では、使用できるマトリクスの種類がかなり制約を受けることになり、ＭＡＬＤＩ用の一般的な、つまりは安価で入手が容易であるマトリクスを利用することができない。また、このような特殊なマトリクスは、質量分析装置の種類によっては適さない場合がある。例えば、液体マトリクスは通常のマトリクス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）においてマトリクス自身の厚みやその他の影響によって分解能の低下をもたらす場合がある。そのため、後述するイオントラップをＴＯＦＭＳの前段に設けた質量分析装置で使用されるほうが好ましい。また、糖鎖の種類によっては、添加するアニオンの種類が同じであってもプロダクトイオンが全く得られない場合もあるため、アニオンの選択も難しい。さらにまた、糖鎖に付加したアニオンとその糖鎖との間で共有結合を形成してしまい、そのために構造解析に有用である診断的なプロダクトイオンが得られない場合がある、といった問題もある。【０００７】
ところで、糖鎖の構造解析は糖タンパク質や糖ペプチド等から糖鎖を切り出した状態のままで行われることもあるが、糖鎖の還元末端をラベル化（標識化）した状態で行われることも多い。よく知られているのは、蛍光標識のためのラベル化である。ラベル化剤の中には負電荷に帯電し易い部分を有するものもあり、そうしたラベル化剤で糖鎖をラベル化すれば糖鎖の負イオン化は容易になる。これは、中性糖鎖、シアリル糖鎖、修飾シアリル糖鎖などの糖鎖の種類に依らず適用が可能であり、効率良く糖鎖を負イオン化することができる。【０００８】
しかしながら、非特許文献２の報告によれば、負に帯電し易いラベル化剤で以てラベル化された糖鎖を負イオンモードでＭＳ／ＭＳ分析することで得られるＭＳ／ＭＳスペクトルは、期待されるような特異的なものではなく、単糖間のグリコシル結合が切断された、いわゆるｙ系列と呼ばれる複数のプロダクトイオンが観測されるのみである。該文献では、負に帯電し易いラベル化剤で糖鎖の還元末端をラベル化して負イオンモードでＭＳ／ＭＳ分析しても、糖鎖の構造解析に重要な分枝構造を反映したプロダクトイオンは得られないと結論付けられている。【０００９】
こうしたことから、負イオンモードの質量分析による糖鎖構造解析を行うには、糖鎖をラベル化するかしないかに拘わらず、上述したように、アニオンを付加した特殊なマトリクスを用いてＭＡＬＤＩ用サンプルを調製し、特殊な質量分析装置で測定する方法を採らざるを得ない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０１３−２０５２２１号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】西風（T. Nishikaze）、ほか３名、「センシティブ・アナリシス・オブ・ニュートラル・Ｎ−グリカンズ・ユージング・アニオン-ドープド・リキッド・マトリクス・G3CA・バイ・ネガティブ-イオン・マトリクス-アシステッド・レーザ・デソープション/イオナイゼイション・マス・スペクトロメトリ（Sensitive Analysis of Neutral N-Glycans using Anion-Doped Liquid Matrix G3CA by Negative-Ion Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry）」、アナリティカル・ケミストリ（Anal. Chem.）、2012年、Vol.84、No.12、pp. 6097-6103
【非特許文献２】ハーベイ（D. J. Harvey）、「コリジョン-インデュースド・フラグメンテイション・オブ・ネガティブ・イオンズ・フロム・Ｎ-リンクド・グリカンズ・デリバタイズド・ウィズ・2-アミノベンゾイック・アシッド（Collision-induced fragmentation of negative ions from N-linked glycans derivatized with 2-aminobenzoic acid）」、ジャーナル・オブ・マス・スペクトロメトリ（Journal of Mass Spectrometry）、2005年、Vol.40、pp.642-653
【非特許文献３】西風（T. Nishikaze）、ほか３名、「ストラクチャー・アナリシズ・オブ・Ｎ-グルカンズ・バイ・ザ・グルカン-ラベリング・メソッド・ユージング・3-アミノキノリン-ベースド・リキッド・マトリクス・イン・ネガティブ-イオン・マルディ-マス（Structural analysis of N-glycans by the glycan-labeling method using 3-aminoquinoline-based liquid matrix in negative-ion MALDI-MS）」、アナリティカル・ケミストリ（Anal. Chem.）、2012年、Vol.84、No.12、pp.6097-6103
【非特許文献４】チェン（Chen ST.）、ほか１名、「リンケージ・アンド・ブランチ・アナリシス・オブ・ハイ-マンノース・オリゴサッカライズ・ユージング・クロスド-リング・ラベリング・オブ・8-アミノピリン-1,3,6-トリスルフォネート・アンド・P-アミノベンゾイック・エチル・エステル・アンド・ネガティブ・イオン・トラップ・マス・スペクトロメトリ（Linkage and Branch Analysis of High-Mannose Oligosaccharides Using Closed-Ring Labeling of 8-Aminopyrene-1,3,6-Trisulfonate and P-Aminobenzoic Ethyl Ester and Negative Ion Trap Mass Spectrometry）」、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ソサイエティ・フォー・マス・スペクトロメトリ（Journal of The American Society for Mass Spectrometry）、2012年8月、Vol.23、Issue 8、pp.1408-1418
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上述したように従来の糖鎖解析方法では、解析対象である糖鎖を確実に負イオン化してその分枝構造情報を反映したＭＳ／ＭＳスペクトルを取得するために、入手が容易な一般的なマトリクスでなく高価である特殊なマトリクスを用いる等、サンプル調製のための前処理にコストが掛かり煩雑であるという課題があった。さらに、使用できる質量分析装置の種類が限定される場合があり、汎用的な手法ではなかった。【００１３】
本発明はこうした課題に鑑みて成されたものであり、その目的とするところは、質量分析を用いて糖鎖構造解析を行う際に、低コストの簡便な前処理によって糖鎖を確実に負イオン化し、糖鎖の分枝構造情報を反映したＭＳ／ＭＳスペクトルを取得することができる糖鎖解析方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
一般に、糖鎖をラベル化する際には還元アミノ化（又は還元的アミノ化）と呼ばれる方法がよく用いられる。これは糖鎖の還元末端とアミノ基を有するラベル化剤を反応させたあとに還元剤により還元反応を生じさせ、それによってラベル化体を安定化させる方法である。例えば上記非特許文献２で用いられているラベル化法も還元アミノ化法である。【００１５】
これまで、本発明者は、塩基性又は中性のラベル化剤を用いてラベル化した糖鎖について特許文献１、非特許文献１に記載の手法で負イオンモードによる糖鎖構造解析を試み、その結果を非特許文献３等で報告した。本発明者は、その実験の中で、安定なラベル化生成物を得るための還元過程の有無が、糖鎖構造解析に有用なＭＳ／ＭＳスペクトルが得られるか否かに影響を及ぼすことを確認した。そして、ラベル化の有無やラベル化の種類とはほぼ無関係に、診断的なプロダクトイオン情報を得るうえでは還元を行わないことが好ましいとの結論に達した。こうした現象は、ラベル化後に還元を行うことによって糖鎖の根元（還元末端側）のＮ-アセチルグルコサミン残基が完全に開環してしまう結果、ＣＩＤ時における環内での電子移動が困難になり、二次開裂、三次開裂が促進されてしまうことによるものと推察される。【００１６】
また、非特許文献４には、還元を伴わないラベル化法を糖鎖に適用した実験例が報告されている。ここでは、中性の４−アミノ安息香酸エチルエステル（ＡＢＥＥ）をラベル化剤として還元を伴わないラベル化（該文献では「closed-ring labeling」と呼ばれている）を行い負イオンモードでＭＳ／ＭＳ分析を行うことで、非誘導化糖鎖と同等のマススペクトルが得られるとされている。一方で、酸性の８−アミノピレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＡＰＴＳ）をラベル化剤とし還元を伴わないラベル化を行う実験もなされているが、中性のラベル化剤を使用した場合とは異なり、特異的なプロダクトイオンは観測できなかったとされている。即ち、この報告では、分枝構造を解析するうえで有用な情報を取得するという観点において、中性のラベル化剤を用いた場合には還元を行わないことの効果があるものの、酸性のラベル化剤を用いた場合には還元を行わないことの効果がないとの結論が導かれている。【００１７】
しかしながら、本発明者は、塩基性や中性のラベル化剤を用いた場合の結果から鑑みて、負に帯電し易いラベル化剤、即ち酸性のラベル化剤でラベル化した場合にも還元の有無が開裂の態様に影響を及ぼすのではないかとの推測に基づいて実験等による検討を鋭意行った。その結果、負に帯電し易い酸性のラベル化剤を用いて糖鎖をラベル化した後に還元を行わずに負イオンモードの質量分析を行うことで、効率良く脱プロトン化体を得ることができることを見いだした。また、さらにその脱プロトン化体をターゲットとするＣＩＤを含むＭＳ／ＭＳ分析を行うことで、分枝構造特異的なプロダクトイオンを観測可能であることも見いだし、本発明をするに至った。【００１８】
即ち、上記課題を解決するために成された本発明は、質量分析を利用して糖鎖の構造を解析する方法であって、
a)分子内に負電荷を安定的に存在させ得る部位を少なくとも一つ有する酸性のラベル化剤を用い、還元を伴うことなく解析対象の糖鎖をラベル化してサンプルを調製するサンプル調製ステップと、
b)前記サンプルに対して負イオンモードで、ラベル化糖鎖のプロトン脱離イオンをプリカーサイオンとするＭＳ／ＭＳ分析を行う分析実行ステップと、
c)前記ＭＳ／ＭＳ分析の結果から、糖鎖の分枝構造を反映したＤイオン又はＥイオンの少なくとも一方を含むプロダクトイオンを検出することにより糖鎖の構造を推定する推定ステップと、
を有することを特徴としている。
【００１９】
本発明に係る糖鎖解析方法において、還元を伴わないラベル化を行う手法として典型的には次の二つのいずれかの手法を採ることができる。
（１）上述したように糖鎖をラベル化する際に利用される一般的な手法は還元アミノ化であり、その際には、ラベル化剤と還元剤とが併用される。一般に、糖鎖のフリーである還元末端にラベル化剤に由来する物質が結合すると、そのあと、還元剤の作用によって、結合部分付近の一部構造が還元され、安定したラベル化体が形成される。この場合には、還元剤を用いないことによって還元を伴わないラベル化を行うことができる。【００２０】
（２）タンパク質のラベル化にしばしば用いられるラベル化剤として、アミノ基に結合するＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル類があるが、近年、これを用いた糖鎖のラベル化剤も市販されている。こうしたラベル化剤は還元アミノ化によるラベル化剤と異なり、もともとラベル化の際に還元を行う必要がない。こうしたＮＨＳエステル類のラベル化剤でも負電荷を安定的に存在させ得る部位を少なくとも一つ有するものであれば、本発明に係る糖鎖解析方法に利用することができる。この場合には、上述したようにラベル化自体が還元を伴わないラベル化である。【００２１】
本発明に係る糖鎖解析方法において、サンプル調製ステップでは、還元されていない糖鎖のラベル化体を試料として含むサンプルを調製する。例えばＭＡＬＤＩ質量分析装置を用いた質量分析を行う場合には、マトリクスとして液体マトリクスを用い、その液体マトリクスを構成する酸性基含有有機物質としてラベル化剤にもなる物質を用いる。これにより、ＭＡＬＤＩ質量分析用のサンプルを調製する作業の一環として、還元を伴わない糖鎖のラベル化を行うことができ、作業工程が簡略化できる。分析実行ステップでは、調製された上記サンプルを適宜の質量分析装置を用いてＭＳ／ＭＳ分析する。それによって得られたＭＳ／ＭＳスペクトルには、糖鎖の分枝構造を反映した、例えばＤイオン、Ｅイオンなどがプロダクトイオンとして観測される。こうしたプロダクトイオンの情報を利用することで、分枝構造を有する糖鎖の構造を推定することが可能となる。【００２２】
本発明に係る糖鎖解析方法において、ラベル化剤において負電荷を安定的に存在させ得る部位とは、一般に、カルボキシル基、リン酸基、硫酸基などの負に帯電し易い性質を有する官能基である。例えばカルボキシル基を１個有する典型的なラベル化剤としては、２−アミノ安息香酸（２ＡＡ）、５−アミノサリチル酸（５ＡＳＡ）などがある。また、硫酸基を有する化合物でラベル化剤として利用可能なものとしては、２−アミノベンゼンスルホン酸（2-Aminobenzenesulfonic Acid）や２−アミノ−１−ナフタレンスルホン酸（2-Amino-1-naphthalenesulfonic Acid）などがあり、リン酸基を有する化合物でラベル化剤として利用可能なものとしては、４−アミノベンジルホスホン酸（4-Aminobenzylphosphonic acid）などがある。【００２３】
一方、上述したＮＨＳエステル類でカルボキシル基を１個有するラベル化剤としては、いずれも米国シグマ-アルドリッチ（SIGMA-ARDRICH）社製である「79636 Sigma Atto 590 NHSエステル」（分子式：Ｃ41Ｈ42ＣｌＮ3Ｏ11)、「72464 Sigma Atto 565 NHSエステル」（分子式：Ｃ35Ｈ34ＣｌＮ3Ｏ11）、「F9551 Sigma-Aldrich」（フルオロセイン ５−カルボキシメチルチオプロパン酸ＮＨＳエステル）などがある。また、同じＮＨＳエステル類で硫酸基を１個有するラベル化剤としては、「73494 Sigma Dy-560 NHSエステル」（分子式：Ｃ37Ｎ44Ｎ4Ｏ10Ｓ2）、「55536 Sigma Fluorescent Red Mega 480 NHSエステル」（分子式：Ｃ30Ｈ33Ｎ3Ｏ9Ｓ）などがある。【００２４】
一般に知られている糖鎖のラベル化剤には、分子内に負電荷を安定的に存在させる部位が一つであるものもあれば複数有しているものもある。例えば上記非特許文献４で報告されている実験に利用されたＡＰＴＳは硫酸基を三つ有しており強酸性である。こうした従来からの知見によれば、負電荷を安定的に存在させる部位が分子内に複数存在する場合、分枝構造を反映するプロダクトイオンが観測されない可能性がある。そこで、本発明に係る糖鎖解析方法において好ましくは、前記ラベル化剤として、分子内に負電荷を安定的に存在させる部位を一つのみ有するものを用いるとよい。【００２５】
またラベル化剤としては、アミノ基、ヒドラジド基、アミノオキシ基、又はそれに相当する塩基性官能基を有し、糖鎖の還元末端と結合するものとするとよい。また、別の種類のラベル化剤としては、糖鎖中のグリコシルアミン構造のアミノ基と反応するものとするとよい。上述した２ＡＡ、５ＡＳＡなどはこうした条件を満たす化合物である。【００２７】
なお、本発明に係る糖鎖解析方法において解析対象である糖鎖は、例えば糖タンパク質や糖ペプチドに含まれる糖鎖、即ち、タンパク質やペプチドなどを修飾している糖鎖である。こうした糖鎖の構造を解析する場合には、通常、糖タンパク質、糖ペプチドなどから糖鎖を切り出す（分離する）前処理ステップが必要であり、そうして得られた糖鎖に対してラベル化が行われる。【００２８】
また本発明に係る糖鎖解析方法において、質量分析は典型的にはＭＡＬＤＩ法によるイオン化を行うＭＡＬＤＩ質量分析であるが、脱プロトン化体であるイオンを生成可能なイオン化法であれば、イオン化法はＭＡＬＤＩ法に限らない。他の有用なイオン化法としては、具体的には例えばエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法などが挙げられる。ＥＳＩ法の場合には１価の脱プロトン化体以外の多価イオンも生成するため、それら（多価脱プロトン化体）をプリカーサイオンとしてＭＳ／ＭＳ分析を行ってもよい。また、もちろん、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）とそうした質量分析装置とを連結したＬＣ−ＭＳシステムを用い、カラムで成分分離を行いながら質量分析を行ってもよい。
【発明の効果】
【００２９】
本発明に係る糖鎖解析方法によれば、煩雑でコストの掛かる前処理でなく一般的な前処理によりサンプル調製を行いながら、分枝構造を有する糖鎖を確実に負イオン化し、その分枝構造情報を反映したＭＳ／ＭＳスペクトルを取得することができる。具体的には例えば、ＭＡＬＤＩ質量分析を行う際には、一般的な、つまりは安価で入手が容易であるＭＡＬＤＩ質量分析用のマトリスクを用いてサンプルを調製すればよい。それにより、比較的簡便に且つ低コストで、分枝構造を有する糖鎖の構造を推定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の一実施例である糖鎖解析方法における解析手順の概略フローチャート。
【図２】２ＡＡのラベル化体（還元あり）である２分枝型糖鎖を負イオンモードでＭＳ／ＭＳ分析することによって得られたＭＳ／ＭＳスペクトルの一例を示す図。
【図３】２ＡＡのラベル化体（還元なし）である２分枝型糖鎖を負イオンモードでＭＳ／ＭＳ分析することによって得られたＭＳ／ＭＳスペクトルの一例を示す図。
【図４】アニオンを添加した特殊な液体マトリクスを用いて調製したサンプルを負イオンモードでＭＳ／ＭＳ分析することによって得られたＭＳ／ＭＳスペクトルの一例を示す図。
【図５】５ＡＳＡのラベル化体（還元なし）である２分枝型糖鎖を負イオンモードでＭＳ／ＭＳ分析することによって得られたＭＳ／ＭＳスペクトルの一例を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
まず、本発明の一実施例である糖鎖解析方法における解析手順について、図１を参照して説明する。図１はこの解析手順の概略フローチャートである。ここでは、質量分析装置としてＭＡＬＤＩ質量分析装置を用い、タンパク質を修飾している糖鎖の構造を解析する場合を例に挙げる。
【００３２】
まず、解析対象である糖鎖を含む糖タンパク質から既知の手法により糖鎖を切り出し、さらに切り出した糖鎖を精製して試料を調製する（ステップＳ１）。
【００３３】
次に、解析対象である糖鎖を、負に帯電し易い部位を含む適宜の化合物をラベル化剤として用いてラベル化する。負に帯電し易い部位とは、典型的には、例えばカルボキシル基、リン酸基、硫酸基など、負に帯電し易い、つまりはプロトンが脱離し易い官能基である。ここで重要なことは、還元を伴わないラベル化を行うことである（ステップＳ２）。
【００３４】
一般に知られている糖鎖のラベル化剤は還元アミノ化によるラベル化を行うものが多いが、そうしたラベル化剤は還元剤とセットで使用される。即ち、糖鎖とラベル化剤とを反応させることで、糖鎖のフリーの還元末端にラベル化剤由来の化合物に結合させる。引き続き、還元剤の作用により糖鎖に結合した化合物の一部が還元され、安定したラベル化糖鎖が形成される。これに対し、本実施例の糖鎖解析方法において、ラベル化剤として還元アミノ化によるラベル化を行うものを使用する場合には、還元剤を用いずに還元反応を起こさないようにすればよい。
上述した２ＡＡや５ＡＳＡは一つのカルボキシル基とアミノ基を含み、糖鎖の開環状である還元末端に結合するラベル化剤であり、上記のような還元剤を用いないラベル化に好適である。
【００３５】
一方、タンパク質のラベル化剤として知られているＮＨＳエステルはアミノ基に結合する化合物であるから、糖鎖中のグリコシルアミンのアミノ基にも結合し得る。即ち、ＰＮＧａｓe Ｆ等の酵素で糖タンパク質から遊離させた直後の糖鎖（グリコシルアミン構造を有する糖鎖）のラベル化剤としてＮＨＳエステル類を利用することができる。ＮＨＳエステル類のラベル化剤には種々のものがあるが、その中には上述した負に帯電し易い官能基を含むものもあり、それらも糖鎖を負イオン化するためのラベル化剤として利用することができる。ＮＨＳエステル類を用いたラベル化は上述した還元アミノ化によるラベル化とは反応のメカニズムが相違し、還元を行う必要がない。そのため、ＮＨＳエステル類を用いて糖鎖をラベル化する場合には、それ自体が還元を伴わないラベル化である。
【００３６】
上述した「79636 Sigma Atto 590 NHSエステル」、「72464 Sigma Atto 565 NHSエステル」、「F9551 Sigma-Aldrich」などはカルボキシル基を１個有し、「73494 Sigma Dy-560 NHSエステル」、「55536 Sigma Fluorescent Red Mega 480 NHSエステル」などは硫酸基を１個有しており、上記のような還元を伴わないラベル化に好適である。
【００３７】
次に、上記のように還元を伴わないラベル化によって形成された糖鎖のラベル化体を試料とし、適宜のマトリクスを用いてＭＡＬＤＩ質量分析用のサンプルを調製する（ステップＳ３）。なお、後述するように、サンプル調製に液体マトリクスを用い、その液体マトリクスを構成する酸性基含有有機物質としてステップＳ２で挙げたラベル化剤を利用可能である場合には、還元を伴わないラベル化とＭＡＬＤＩ質量分析用サンプルの調製とを実質的に並行して又は連続的に行うことができる。
【００３８】
そして、ステップＳ３で調製されたサンプルについて、ＭＡＬＤＩイオン源を搭載しＭＳ／ＭＳ分析が可能である質量分析装置を用い、負イオンモードでＭＳ／ＭＳ分析を実行する（ステップＳ４）。ＭＳ／ＭＳ分析ではラベル化糖鎖のプロトン脱離イオンをプリカーサイオンとすればよい。
【００３９】
上記のようにラベル化された糖鎖に対して得られるＭＳ／ＭＳスペクトルには、糖鎖の分枝構造を反映したプロダクトイオン、例えばＤイオンやＥイオン由来のピークが明瞭に現れる。また、糖鎖の還元末端側にＮ-アセチルグルコサミンが存在する場合、そのＮ-アセチルグルコサミン残基が環開裂することによるイオン由来のピークも現れる。そこで、こうした分枝構造を反映したプロダクトイオンを検出し、そのプロダクトイオンの質量電荷比などに基づいて糖鎖の構造を推定する（ステップＳ５）。
【００４０】
以上のようにして本実施例の糖鎖解析方法では、分枝構造を有する糖鎖の構造を的確に推定することができる。
【実施例】
【００４１】
以下、上記実施例の糖鎖解析方法の手順に従った実験例と、これと対比するために行った従来の糖鎖解析方法の手順に従った比較例とについて具体的に説明する。【００４２】
［比較例１］
試料としては、英国ラドガー（Ludger）社製であるＮＡ２型の２ＡＡ化標準糖鎖（2-AA labeled NA2 glycan）を用いた。これは、下記化学式に記載の二分枝構造であるＮＡ２型の標準糖鎖の還元末端に２ＡＡが結合した構造を有し、ラベル化後に還元処理が行われている。【００４３】
【化１】
0006766880.tif 000002
【００４４】
上記２ＡＡ化標準糖鎖を濃度が１pmol/uLになるように超純水に溶解し、その溶液を１uL採取してＭＡＬＤＩ用サンプルプレート（米国ハドソン・サーフェス・テクノロジー（Hudson Surface Technology）社製のμFocus MALDI plate）上に滴下した。そして、濃度５０％のアセトニトリル（ＡＣＮ＝Acetonitrile）にマトリクスとして濃度５mg/mLである２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）を溶解したものを０．５uL採取し、サンプルプレート上の上記試料に重層して風乾させることで測定用サンプルを調製した。この測定用サンプルについて、質量分析装置を用い、負イオンモードでＭＳ／ＭＳ分析を行った。質量分析装置としては、ＭＡＬＤＩイオン源、３次元イオントラップ、及び飛行時間型質量分析計を備えたＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦＭＳ、具体的には島津製作所／クレイトス（Kratos）社製のAXIMA-Resonance（登録商標）を用いた。【００４５】
上記分析によって取得されたＭＳ／ＭＳスペクトルを図２に示す。これは、m/z１７６０．７に検出された１価のプロトン脱離（［Ｍ−Ｈ］-）イオンをプリカーサイオンとしてＭＳ／ＭＳ分析を実施した結果である。図２から分かるように、検出されているピークの多くは単糖間のグリコシル結合の切断によって生じたものであり、糖鎖の非還元末端（図２中に記載の糖鎖構造の左端）から順に単糖残基が脱離したｙ系列のイオンピークである。ここでは、ＤイオンやＥイオンなど、分枝構造特異的なプロダクトイオン由来のピークやＧｌｃＮＡｃの環開裂由来のピークは殆ど又は全く検出されていない。それ故に、このＭＳ／ＭＳスペクトルからは糖鎖を構成する単糖の推定は可能であるものの、糖鎖の分枝構造の解析を行うことは非常に困難である。【００４６】
［本実施例の糖鎖解析方法に従った実験例１］
試料として、米国シグマ-アルドリッチ（SIGMA-ARDRICH）社製であるラベル化されていないＮＡ２型の標準糖鎖を用いた。この糖鎖の化学式は比較例１で示したものと同じである。この標準糖鎖を、ラベル化剤でもある酸性基含有有機物質として２ＡＡを含む液体マトリクスに溶解し、加温することにより糖鎖と２ＡＡとの反応を促進させて糖鎖のラベル化体を形成した。より具体的に述べると、１Ｍ濃度の２ＡＡ溶液４５μLにテトラメチルグアニジン（ＴＭＧ＝1,1,3,3,-Tetramethylguanidine）原液５μLを加えて溶解させ、これを５μL採取して５０％ＡＣＮ４５μLで希釈したものをマトリクス溶液（液体マトリクス）として用いた。このマトリクス溶液０．５uLとサンプル溶液１uLをＭＡＬＤＩ用サンプルプレート（上記ハドソン・サーフェス・テクノロジー社製μFocus MALDI plate）上で混合し、そのままプレートごとヒートブロック上で７５℃の温度で９０分間加温した。２ＡＡをラベル化剤としたラベル化によって糖鎖の還元末端に２ＡＡが結合するものの、還元剤が使用されないので還元は行われない。【００４７】
こうして調製した測定用サンプルを、上記比較例１と同様に、ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦＭＳを用い負イオンモードでＭＳ／ＭＳ分析を行った。この分析により得られたＭＳ／ＭＳスペクトルを図３に示す。これは、m/z１７５８．７に検出されたプロトン脱離（［Ｍ−Ｈ］-）イオンをプリカーサイオンとしてＭＳ／ＭＳ分析を実施した結果である。なお、ここでは上述したようにラベル化後に還元を行っていないのでプリカーサイオンの質量電荷比は比較例１よりも２Da低いが、実質的には比較例１とプリカーサイオンは同じである。【００４８】
図３から分かるように、図２に示した比較例１のＭＳ／ＭＳスペクトルとは異なり、分枝構造の情報を含むＤイオンやＥイオン由来のピークが明瞭に観測されている。また、m/z＝１２００以上の高質量電荷比領域に観測されるピークは、糖鎖の還元末端側に位置するＧｌｃＮＡｃ残基の環開裂（Ａシリーズ）によるＡイオンであり、プリカーサイオンとこれらピークとの質量差からフコース（fucose）の位置の推定が可能である。これら各イオンの質量電荷比に基づいて、分枝構造を含む糖鎖全体の構造推定が容易に行える。【００４９】
このように、２ＡＡによるラベル化のように糖鎖構造中に負電荷が局在している場合であってもＤイオンやＥイオン、Ａイオンなどの非還元末端側の部分構造を含むプロダクトイオンが得られることは、従来の知見からは全く予想外のことであるといえる。
なお、非還元２ＡＡラベル化体を得るための化学反応はサンプルプレート上でなくチューブ等の容器内で行ってもよい。また、一般のラベル化でもよく行われるように、質量分析の実行前に過剰な試薬（ラベル化剤）などを除去する精製工程を設けてもよい。【００５０】
［比較例２］
特許文献１に記載の従来技術の方法に則って、ラベル化されていないＮＡ２型糖鎖の硝酸付加体イオン（［Ｍ＋ＮＯ3］-）をＭＳ／ＭＳ分析した。具体的には、測定用サンプルを調製するために、マトリクスとしてＧ3ＣＡ（1,1,3,3-tetramethylguanidine p-クマル酸塩）、マトリクス添加剤として硝酸アンモニウムを用いた。それにより得られたＭＳ／ＭＳスペクトルを図４に示す。これは、m/z１７０２．６に検出された硝酸付加（［Ｍ＋ＮＯ3］-）イオンをプリカーサイオンとしてＭＳ／ＭＳ分析を実施した結果である。このときに得られるＭＳ／ＭＳスペクトルは図３に示した実験例１で得られたＭＳ／ＭＳスペクトルにかなり近く、分枝構造特異的なプロダクトイオンが観測されていることが分かる。言い換えれば、上記実施例の糖鎖解析方法では、この比較例２のような特殊なマトリクスを用いることなく糖鎖の分枝構造情報を含むＭＳ／ＭＳスペクトルを得ることができると言うことができる。【００５１】
［実験例２］
糖鎖をラベル化するために２ＡＡの代わりに５−アミノサリチル酸（５ＡＳＡ）を使用するほかは、上記実験例１と全く同様の手順に従って測定用サンプルを調製し、負イオンモードでＭＳ／ＭＳ分析を行った。それにより得られたＭＳ／ＭＳスペクトルを図５に示す。これは、m/z１７７４．７に検出されたプロトン脱離（［Ｍ−Ｈ］-）イオンをプリカーサイオンとしてＭＳ／ＭＳ分析を実施した結果である。
実験例１とほぼ同じパターンのピーク、即ち、実験例１によるＭＳ／ＭＳスペクトルと同じ質量電荷比にＤイオン、Ｅイオン、ＧｌｃＮＡｃ残基の環開裂によるＡイオン由来のピークが観測されている。このことから、本発明に係る糖鎖解析方法では、糖鎖が同じであれば、ラベル化剤の化学構造に依らず、同じ分枝構造情報を反映したＭＳ／ＭＳスペクトルが得られることが分かる。【００５２】
上記実験例２で得られた知見は糖鎖の構造解析において都合がよい。即ち、異なるラベル化剤でラベル化されたサンプルに対するＭＳ／ＭＳスペクトルのパターンがほぼ同一であれば、それらは同じ糖鎖であると結論付けることができる。そのため、例えば或るラベル化剤を用いて様々な糖鎖に対して取得したＭＳ／ＭＳスペクトルをデータベース化しておきさえすれば、別のラベル化剤を用いて調製した未知の糖鎖に対して得られたＭＳ／ＭＳスペクトルを上記データベースに照合することでその未知の糖鎖を同定することが可能となる。このように、糖鎖の同定を行う際に使用可能なラベル化剤の制約が緩くなれば、分析者は手元にある適宜のラベル化剤を使用してサンプルを調製すればよくなる。【００５３】
なお、上記実施例は本発明の一例にすぎず、本発明の趣旨の範囲で適宜変形、修正、追加等を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。
例えば、上記実験例で用いたラベル化剤に限らず、そのほかのカルボキシル基、リン酸基、硫酸基などを有するラベル化剤、例えば、２−アミノベンゼンスルホン酸、２−アミノ−１−ナフタレンスルホン酸、４−アミノベンジルホスホン酸などを非還元で用いてもよい。また、上記で例示した「79636 Sigma Atto 590 NHSエステル」、「72464 Sigma Atto 565 NHSエステル」、「F9551 Sigma-Aldrich」、「73494 Sigma Dy-560 NHSエステル」、「55536 Sigma Fluorescent Red Mega 480 NHSエステル」などのＮＨＳエステル類を用いてもよい。【００５４】
また、上記実施例はＭＡＬＤＩ質量分析装置を用いて質量分析を行うことを前提としていたが、本発明に係る糖鎖解析方法は、脱プロトン化体（多価の脱プロトン化体）をプリカーサイオンとしてＭＳ／ＭＳ分析を行う他のイオン化法による質量分析装置を用いた質量分析に適用可能である。即ち、いわゆるソフトなイオン化法により負イオン化が可能なイオン化法、例えばＥＳＩ法などを用いた質量分析に適用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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