(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞凝集塊促進細胞培養インサートであって、
細胞培養デバイスの貯留容器に挿入できるように寸法決めされた本体であって、第１の開放端部、開口部を画成する第２の端部、及び前記第１の開放端部から前記第２の端部に延びる、傾斜を成す1つ以上の側壁を有する本体と、
前記第２の端部の前記開口部の上に配置された多孔質膜と、
を備え、
前記多孔質膜が微小井戸のアレイを備えているとともに、微小井戸内に細胞凝集塊を形成するよう構成されており、
前記微小井戸が、上部開口、側壁、および弓型表面を有する多孔質膜底部を備え、
前記多孔質膜底部の少なくとも一部が、前記弓型表面の中または前記弓型表面の上において細胞に対し非接着性であることを特徴とするインサート。
【請求項２】
前記第２の端部の前記開口部が、１００μｍ〜１０００μｍの範囲の直径寸法を有することを特徴とする、請求項１記載の細胞培養インサート。
【請求項３】
前記本体の前記１つ以上の側壁の少なくとも一部が、細胞非接着性であることを特徴とする、請求項１又は２記載の細胞培養インサート。
【請求項４】
前記微小井戸のアレイの内の１つの微小井戸の一部が、少なくとも部分的に細胞凝集塊閉じ込め容積を画成することを特徴とする、請求項１〜３いずれか１項記載の細胞培養インサート。 
【請求項５】
前記細胞凝集塊閉じ込め容積の深さが、１００μｍ〜５００μｍの範囲であることを特徴とする、請求項４記載の細胞培養インサート。
【請求項６】
貯留容器を更に備え、第１の細胞培養インサートが、該インサートの前記第２の端部を前記貯留容器の底部の上方に保持して、前記貯留容器の内部に配置されるように構成されて成ることを特徴とする、請求項１〜５いずれか１項記載の細胞培養インサート。
【請求項７】
前記第１のインサートが、前記貯留容器の前記内部に配置されたとき、前記第１のインサートの内部が、前記第１のインサートの前記第２の端部の前記開口部の上に配置された、前記多孔質膜を介してのみ、前記貯留容器の前記内部と流体連通することを特徴とする、請求項６記載の細胞培養インサート。
【請求項８】
第１の開放端部、開口部を画成する第２の端部、及び前記第１の開放端部から前記第２の端部に延びる１つ以上の側壁を有する、第２のインサートを更に備え、
前記第２のインサートが、該インサートの前記第２の端部を前記第１のインサートの前記第２の端部の上方に保持して、前記第１のインサートの前記内部に配置されるように構成されて成ることを特徴とする、請求項６又は７記載の細胞培養インサート。
【請求項９】
前記第２のインサートが、前記第１のインサートの前記内部に配置されたとき、前記第２のインサートの内部が、前記第２のインサートの前記第２の端部の前記開口部の上に配置された、前記多孔質膜を介してのみ、前記第１のインサートの前記内部と流体連通することを特徴とする、請求項８記載の細胞培養インサート。
【請求項１０】
前記貯留容器の少なくとも一部が、ガス透過性であることを特徴とする、請求項６〜９いずれか１項記載の細胞培養インサート。
【請求項１１】
細胞凝集塊を培養する方法であって、
請求項１〜５いずれか１項記載の細胞凝集塊促進細胞培養インサートを、貯留容器内に配置するステップであって、前記貯留容器が底部を有し、前記インサートが、該インサートの前記第２の端部が前記貯留容器の上方に位置するように、前記貯留容器の内部に配置される、ステップと、
前記インサートに細胞を導入するステップと、
細胞培養培地を導入するステップと、
前記インサート内の前記細胞培養培地内において細胞を培養して、前記細胞凝集塊を形成するステップと、
を備えたことを特徴とする方法。
【請求項１２】
細胞凝集塊を培養する方法であって、
請求項８又は９記載の第１のインサート又は第２のインサート、あるいはその両方に細胞を導入するステップと、
細胞培養培地を導入するステップと、
前記インサート内の前記細胞培養培地内において細胞を培養して、前記細胞凝集塊を形成するステップと、
を備えたことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【関連技術の相互参照】
【０００１】
本出願は、その内容に依拠し、参照により全内容が本明細書に組み込まれたものとする、２０１４年１０月２９日出願の米国仮特許出願第６２／０６９９９６号の米国特許法第１１９条に基づく優先権を主張するものである。
【技術分野】
【０００２】
本開示はセルを培養するための装置、システム、及び方法に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
本開示は、概して、細胞を培養する際に用いられ、細胞凝集塊の形成を促進する細胞培養インサート、及びこのような細胞凝集塊促進細胞培養インサートの使用方法に関するものである。細胞凝集塊は、二次元（２Ｄ）の細胞培養システムにおいて、単層として培養された細胞と比較して、より生体内に近い機能を細胞に与えることができる三次元（３Ｄ）の細胞集団である。肝細胞等、特定の細胞種にとって、細胞凝集塊は、２Ｄで培養した同等物と比較して、より優れた生体内に似た機能性を達成し保持することができる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示の様々な実施の形態に従って、細胞を培養する際に用いられ、細胞凝集塊の形成を促進する細胞培養インサート、及びかかる細胞凝集塊促進細胞培養インサートの使用方法について説明する。一部の実施の形態において、本明細書に記載の細胞培養インサートを別の細胞培養インサートに入れ子にするか、又は別の細胞培養インサートを本明細書に記載の細胞培養インサートに入れ子にすることができる。
【０００５】
様々な実施の形態において、本開示は、本体及び多孔質膜を有する細胞培養インサートを記述している。本体は第１の開放端部、第２の端部であって、１００μｍ〜１０００μｍの範囲（例えば、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、及びそれらの間のすべての値及び範囲、例えば、２００〜５００、２００〜７００、４００〜６００等）の直径寸法を有する開口部を画成する第２の端部、及び第１の開放端部から第２の開放端部に延びる1つ以上の側壁を有している。1つ以上の側壁、又はその一部が（例えば、第1又は第２の端部に対し、垂直から５度より大きく、例えば、＞１０°、＞２０°、＞３０°、＞４０°、＞５０°等）傾斜を成している。側壁は、傾斜を成している場合、第２の端部の直径が、第１の開放端部の直径より小さくなるように傾斜していることが好ましい。多孔質膜が第２の端部の開口部の上に配置されている。
【０００６】
様々な実施の形態において、本開示は、本体及び多孔質膜を有する細胞培養インサートを記述している。本体は第１の開放端部、開口部を画成する第２の端部、及び第１の開放端部から第２の端部に延びる1つ以上の側壁を有している。1つ以上の側壁、又はその一部が傾斜を成している。多孔質膜は、第２の端部の開口部の上に配置され、細胞非接着性である。
【０００７】
様々な実施の形態において、本開示は、細胞培養デバイスの貯留容器に少なくとも部分的に挿入されるように構成された、透過性支持デバイスを記述している。透過性支持デバイスは、テーパー形状、及び第１の透過性支持体によって少なくとも部分的に画成された底部を有する第１の井戸を備えている。
【０００８】
様々な実施の形態において、本開示は、細胞培養インサートを記述している。インサートは、第１の開放端部、第２の端部、及び第１の開放端部から第２の端部に延びる１つ以上の側壁を有する本体を含んでいる。第２の端部は、底部に多孔質膜を有する井戸を画成する微小井戸のアレイを有する基板を備え、井戸を画成する微小井戸のアレイを有する基板の少なくとも一部が傾斜を成している。
【０００９】
様々な実施の形態において、本開示は、テーパー形状、及び第１の透過性支持体によって少なくとも部分的に画成された底部を有する第１の井戸、及び第１の井戸の下方に底部を有する貯留容器を備えた、入れ子式透過性支持デバイスを記述している。実施の形態において、貯留容器は、ガス透過性材料で構成されるか、微小井戸のアレイを有するか、又はその両方である。
【００１０】
様々な実施の形態において、本開示は、第１の井戸、第２の井戸、及び第３の井戸を備えた、入れ子式透過性支持デバイスを記述している。第１の井戸は底部を有し、底部の少なくとも一部が、第１の多孔質膜によって形成されている。第２の井戸は底部を有し、底部の少なくとも一部が、第２の多孔質膜によって形成されている。第１又は第２の透過性支持体の一部は弓形形状を成すことができる。第２の井戸及び第２の透過性支持体は、第１の井戸及び第１の透過性支持体の下方に位置している。第３の井戸は、第２の井戸及び第２の透過性支持体の下方に位置する、液体非透過性、ガス透過性の底部を有している。
【００１１】
別の実施の形態において、本開示は、第１の井戸、第２の井戸、及び第３の井戸を備えた、入れ子式透過性支持デバイスを記述している。第１の井戸は、底部が多孔質膜である微小井戸のアレイを形成した基板を有している。第２の井戸は、底部が多孔質膜である微小井戸のアレイを形成した基板を有している。第３の井戸は、底部が液体非透過性、ガス透過性支持体である、微小井戸のアレイを形成した基板を有している。多孔質膜の底部を有し、微小井戸のアレイ基板を備えた第２の井戸は、第１の多孔質膜の底部を有し、微小井戸のアレイ基板を備えた第１の井戸の下方、かつ液体非透過性、ガス透過性底部を有し、微小井戸のアレイ基板を備えた第３の井戸の上方に位置している。
【００１２】
本開示の主題の更なる特徴及び効果は、これに続く詳細な説明に述べてあり、当業者はその記述から、一部は容易に明らかであり、これに続く詳細な説明、特許請求の範囲、及び添付図面を含め、本明細書に記載の方法を実施することによって認識できるであろう。
【００１３】
前述の概要説明及び以下の詳細な説明は、本発明の主題の実施の形態を示すものであって、特許請求した本発明の主題の性質及び特徴を理解するための概要、及び枠組みの提供を意図したものであることを理解されたい。添付図面は、本発明の主題の更なる理解が得られることを意図して添付したもので、本明細書に組み込まれ、その一部を構成するものである。図面は、本開示の主題の様々な実施の形態を示すもので、その説明と併せ、本開示の主題の原理及び作用の説明に役立つものである。更に、図面及び詳細な説明は、単なる例示に過ぎず、いかなる方法によっても、特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
本開示の具体的な実施の形態の以下の詳細な説明は、同様の構造は同様の参照番号で示す、以下の図面と併せて読むことによって、最も良く理解することができる。
【図１Ａ】細胞を培養して細胞凝集塊を形成することができる、細胞培養インサートの実施の形態の概略図。
【図１Ｂ】細胞を培養して細胞凝集塊を形成することができる、細胞培養インサートの実施の形態の概略図。
【図１Ｃ】細胞を培養して細胞凝集塊を形成することができる、細胞培養インサートの実施の形態の概略図。
【図２Ａ】細胞を培養して細胞凝集塊を形成することができる、一部分の細胞培養インサートの実施の形態の概略図。
【図２Ｂ】細胞を培養して細胞凝集塊を形成することができる、一部分の細胞培養インサートの実施の形態の概略図。
【図３Ａ】細胞を培養して、１つ以上の細胞凝集塊を形成することができる、細胞培養インサートの実施の形態の概略図（側面図）。
【図３Ｂ】細胞培養インサートの第２の端部に、微小井戸のアレイを有する基板の１つの実施の形態を示す図。
【図３Ｃ】細胞を培養して、１つ以上の細胞凝集塊を形成することができる、細胞培養インサートの第２の端部の概略図（上面図）。
【図３Ｄ】細胞を培養して、１つ以上の細胞凝集塊を形成することができる、細胞培養インサートの第２の端部を形成する、底部が多孔質膜を有する基板上の微小井戸のアレイの概略図（拡大側面図）。
【図４Ａ】細胞を培養して、１つ以上の細胞凝集塊を形成することができる、入れ子式細胞培養インサートの一部の実施の形態の概略図。
【図４Ｂ】細胞を培養して、１つ以上の細胞凝集塊を形成することができる、入れ子式細胞培養インサートの一部の実施の形態の概略図。
【図５Ａ】細胞を培養して、井戸の底部を形成する任意又はすべての細胞培養基板上に、１つ以上の細胞凝集塊を形成することができる、入れ子式細胞培養インサートの一部の実施の形態の概略図。
【図５Ｂ】細胞を培養して、井戸の底部を形成する任意又はすべての細胞培養基板上に、１つ以上の細胞凝集塊を形成することができる、入れ子式細胞培養インサートの一部の実施の形態の概略図。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
一部の実施の形態を添付図面に示す、本開示の主題の様々な実施の形態について以下詳細に説明する。図面全体を通し、同一又は同様の部品には、同じ参照番号を用いている。しかし、参照番号を用いて所与の図における構成要素を示すことによって、同じ番号で示す、別の図における構成要素を、限定することを意図するものではないことが理解されよう。更に、異なる参照番号を用いて構成要素を示すことによって、異なる番号を付した構成要素が、別の番号を付した構成要素と同一又は類似することができないことを示すことを意図したものではない。
【００１６】
本開示は、取り分け、細胞凝集塊促進細胞培養インサート及び細胞凝集塊促進細胞培養インサートの使用方法を記述するものである。一部の実施の形態において、細胞凝集塊促進細胞培養インサートは、細胞培養装置に収容される。一部の実施の形態において、細胞凝集塊促進細胞培養インサートは、別の細胞培養インサート又は別の細胞凝集塊促進細胞培養インサート内に配置することができる。一部の実施の形態において、細胞凝集塊促進細胞培養インサートは、別の細胞培養インサート又は別の細胞凝集塊促進細胞培養インサートを収容することができる。様々な実施の形態において、細胞凝集塊促進細胞培養インサートの使用方法が、新規化学物質（ＮＣＥ）又は新規生物由来物質（ＮＢＥ）を試験するための実験を行うステップを含んでいる。
【００１７】
入れ子式透過性支持デバイスを含む、細胞培養デバイス又は装置は、細胞凝集塊促進細胞培養インサートを有するように構成することができる。かかる細胞培養デバイス又は装置の例には、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）透過性支持体（コーニング社）、及びＭＩＬＬＩＣＥＬＬ（登録商標）細胞培養インサート（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）、並びに本明細書の開示と矛盾しない範囲において、参照により、その全内容が本明細書に組み込まれたものとする、米国特許第８，１６３，５３７号明細書に記載の細胞培養物品及び方法が含まれる。
【００１８】
ここで、図１Ａ〜Ｃを参照すると、細胞培養装置５００の実施の形態の概略側面図が示されている。装置５００は、1つ以上の側壁１１０を有する細胞凝集塊促進細胞培養インサート１００であって、側壁を細胞非接着性として、インサート１００内の細胞を互いに結合させて細胞凝集塊２００を形成させるインサートを備えている。実施の形態において、インサートは、マルチ井戸細胞培養プレートの貯留容器又は井戸１５０の内部に収まる。一部の実施の形態において、1つ以上の側壁１１０を超低結合材料でコーティングして、側壁を細胞非接着性にすることができる。非接着性材料の例には、過フッ素化ポリマー、オレフィン、同様のポリマー、又はそれらの混合物が含まれる。別の例には、アガロース、ポリアクリルアミド等の非イオン性ヒドロゲル、ポリエチレンオキシド等のポリエーテル、ポリビニルアルコール等のポリオール又は同様の材料、あるいはそれらの混合物が含まれる。
【００１９】
細胞凝集塊促進細胞培養インサート１００の１つ以上の側壁１１０が、傾斜を成す部分１１５を含んでいる。一部の実施の形態において、１つ以上の側壁は、その長さ全体に沿って傾斜させることができる。別の実施の形態において、１つ以上の側壁は、一部分のみが傾斜を成している。
【００２０】
細胞凝集塊促進細胞培養インサート１００の１つ以上の側壁１１０及び他の構成要素は、任意の適切な材料で構成することができる。細胞又は培養培地と接触することが意図される物質は、細胞及び培地と適合性があることが好ましい。一般的には、細胞培養構成要素はポリマー材料で構成される。適切なポリマー材料の例には、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリスチレン共重合体、フッ素ポリマー、ポリエステル、ポリアミド、ポリスチレンブタジエン共重合体、完全水素化されたスチレンポリマー、ポリカーボネートＰＤＭＳ共重合体、及びポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、ポリプロピレン共重合体、環状オレフィン共重合体等のポリオレフィンが含まれる。
【００２１】
細胞凝集塊促進細胞培養インサート１００は、第１の開放端部１０１及び開口部を画成する第２の端部１０２を有する本体を含んでいる。第２の端部の開口部を多孔質膜１２０で覆うことができる。一部の実施の形態において、多孔質膜１２０を、細胞接着性にすることができる。別の実施の形態において、多孔質膜１２０又はその一部を、細胞２００に対し非接着性にすることができる。
【００２２】
ここで、図２Ａ及び図２Ｂを参照すると、細胞凝集塊促進細胞培養インサート１００の本体の第２の端部の開口部は、様々な形状を有することができる。一部の実施の形態において、開口部は円又は楕円を形成する。別の実施の形態において、開口部は矩形又はその他の四角形を画成する。一部の実施の形態において、第２の端部の開口部は、１００μｍ〜１０００μｍの範囲である、直径、幅、方形又は矩形の対角線等の直径寸法ｄ１を有している。具体的には、第２の端部の開口部は、１００μｍ、１５０μｍ、２００μｍ、２５０μｍ、３００μｍ、３５０μｍ、４００μｍ、４５０μｍ、５００μｍ、５５０μｍ、６００μｍ、６５０μｍ、７００μｍ、７５０μｍ、８００μｍ、８５０μｍ、９００μｍ、又は１０００μｍ、及び１００μｍ〜１０００μｍの範囲に含まれる、任意の寸法の直径寸法ｄ１を有することができる。
【００２３】
多孔質膜１２０は様々な形状を有することができる。一部の実施の形態において、多孔質膜１２０は、細胞凝集塊促進細胞培養インサート１００の本体の第２の端部の開口部を完全に覆っている。一部の実施の形態において、多孔質膜は弓形形状又は湾曲形状を有することができる。一部の実施の形態において、細胞凝集塊促進細胞培養インサートの本体の第２の端部が、底部を形成する多孔質膜を有する微小井戸アレイから成っている。
【００２４】
多孔質膜は、トラックエッチ膜、又は織布若しくは不織多孔質材料を含み、これに限定されない、様々な種類の材料から構成することができる。多孔質膜を処理又はコーティングすることによって、細胞に対し、膜をより接着性又はより非接着性にすることができる。処理は、プラズマ放電、コロナ放電、ガスプラズマ放電、イオン衝撃、電離放射線、及び高強度ＵＶ光を含む、当技術分野で公知の任意の数の方法によって施すことができる。コーティングは、印刷、スプレー、凝縮、放射エネルギー、イオン化技術、又は浸漬を含む、当技術分野で公知の任意の方法によって施すことができる。次に、コーティングは共有又は非共有結合部位のいずれかを提供することができる。かかる部位を用いて、細胞培養成分（例えば、増殖又は接着を促進するタンパク質）の部分を付着させることができる。更に、コーティングを用いて細胞の付着を強化することもできる（例えば、ポリリジン）。これに代えて、前述の細胞非接着性コーティングを用いて、細胞の結合を防止又は抑制することができる。
【００２５】
実施の形態において、多孔質膜は、微小井戸のアレイを有する基板であってよい。
【００２６】
一部の実施の形態において、細胞が形成した細胞凝集塊２００によって、細胞凝集塊促進細胞培養インサートの多孔質膜１２０が閉塞される。（例えば、図１Ａ参照）。一部の態様において、この閉塞によって、タンパク質、小分子及び／又は培地の通路が、細胞凝集塊を周回するのが防止される。
【００２７】
例えば、非接着性側壁、幾何学形状、及び重力の組み合わせによって、インサート内で培養される細胞の増殖が限定される、閉じ込め容積を画成することができる。実施の形態において、この組み合わせによって、インサート内で培養された細胞による細胞凝集塊の形成を促進することができる。第２の端部に近接する１つ以上の側壁の一部、及び第２の開口部の幅又は対角線によって、閉じ込め容積を画成することができる。一部の実施の形態において、第２の端部に近接する１つ以上の側壁の一部ｄ２が、５００μｍ、４５０μｍ、４００μｍ、３５０μｍ、３００μｍ、２５０μｍ、２００μｍ、１５０μｍ、１００μｍ、又はこの間の任意の長さである。一部の実施の形態において、閉じ込め容積は、微小井戸アレイ基板の井戸と第２の開口部の底部を形成する多孔質膜とによって画成される。この場合、第２の開口部が、閉じ込め容積を含む微小井戸アレイ基板の井戸で第１の開口部のサイズに近似し、５００μｍ、４５０μｍ、４００μｍ、３５０μｍ、３００μｍ、２５０μｍ、２００μｍ、１５０μｍ、１００μｍ、又はこの間の任意の長さの直径ｄ１を有する。
【００２８】
図１Ｃに戻り、一部の実施の形態において、細胞凝集塊促進細胞培養インサートは、第１の開放端部の周囲に延びるレッジ１３０を更に備えることができ、レッジ１３０は、細胞凝集塊促進細胞培養インサート１００が、貯留容器１５０の内部に配置されたとき、インサートを支持する大きさに形成されている。一部の実施の形態において、貯留容器１５０の少なくとも一部がガス透過性である。
【００２９】
図１Ａに示すように、細胞凝集塊２００は、一部が多孔質膜１２０を含むことができる、細胞凝集塊促進細胞培養インサート１００において増殖することができる。多孔質膜１２０及び下部側壁１１０の一方又は両方を、細胞非接着性にすることができる。側壁１１０の傾斜によって、播種した細胞２００の多孔性膜１２０上への凝集が助長される。重力、超低結合材料、細胞培養インサートの側壁の幾何学形状、及び多孔質膜の弓形形状のうちの１つ以上によって、細胞凝集塊の形成を促進することができる。更に、実施の形態において、多孔質膜は、細胞凝集塊を形成するように構成及び配置された、微小井戸のアレイを含むことができる。
【００３０】
図１Ｂに示すように、細胞凝集塊は、一部が多孔質膜１２０である、細胞凝集塊促進細胞培養インサート１００において増殖することができる。多孔質膜１２０及び下部側壁１１０を、細胞非接着性にすることができる。側壁１１０の傾斜によって、播種した細胞２００の多孔性膜１２０上への凝集が助長される。重力、超低結合材料、細胞培養インサートの側壁の幾何学形状、及び多孔質膜１２０周囲の細胞閉じ込め容積のうちの１つ以上によって、細胞凝集塊の形成を促進することができる。細胞凝集塊の大きさは、閉じ込め容積によって限定することができる。実施の形態において、インサートの第２の端部は、細胞凝集塊の形成を促進する閉じ込め容積である、細胞凝集塊閉じ込め容積をもたらす形状を有することができる。
【００３１】
図３Ａに示すように、一部の実施の形態において、細胞凝集塊促進細胞培養インサート１０５は、第１の開放端部１０１、第２の端部１０２、及び第１の開放端部から第２の端部に延びる１つ以上の側壁１１０を有することができる。一部の実施の形態において、側壁は傾斜を成している。１つの態様において、細胞凝集塊促進細胞培養インサート１０５は、各々が側壁４１０を有することができる、多数の細胞凝集塊促進井戸４００を含んでいる。一部の実施の形態において、細胞凝集塊促進細胞培養インサート１０５は、細胞非接着性の１つ以上の側壁１１０を有することができる。
【００３２】
一部の実施の形態において、微小井戸のアレイを有する基板は、六方最密充填井戸構造から成っている。六角形の井戸４００を示す、微小井戸４１０のアレイを有する、かかる基板の実施の形態の画像を図３Ｂに示す。図３Ｃは、微小井戸４１０のアレイを有する基板の、実施の形態のトップダウンビューを示す概略図である。一部の好ましい実施の形態において、各々の井戸４００内で培養された細胞は、１つの細胞凝集塊２００を形成する。
【００３３】
図３Ｄに示すように、一部の実施の形態において、細胞凝集塊促進細胞培養インサート１０５の井戸４００は、上部開口部及び底部、又は低点若しくは表面を画成する内面を有している。上部開口部において、井戸は、１００μｍ〜１０００μｍの範囲の直径、幅、方形又は矩形の対角線等の直径寸法ｄ３を有している。具体的には、井戸は１００μｍ、１５０μｍ、２００μｍ、２５０μｍ、３００μｍ、３５０μｍ、４００μｍ、４５０μｍ、５００μｍ、５５０μｍ、６００μｍ、６５０μｍ、７００μｍ、７５０μｍ、８００μｍ、８５０μｍ、９００μｍ、又は１０００μｍ、及び１００μｍ〜１０００μｍの範囲に含まれる、任意の寸法の直径寸法ｄ３を有することができる。一部の実施の形態において、井戸４００の深さｄ４は、１０００μｍ、５００μｍ、４５０μｍ、４００μｍ、３５０μｍ、３００μｍ、２５０μｍ、２００μｍ、１５０μｍ、１００μｍ、又は１００μｍ〜１０００μｍの範囲に含まれる任意の大きさである。
【００３４】
一部の実施の形態において、微小井戸のアレイを有し、多孔質支持体が微小井戸４１０の底部を形成する基板が、細胞凝集塊促進細胞培養インサート１０５を覆っている。一部の実施の形態において、微小井戸４１０のアレイを有する基板の少なくとも一部が、細胞非接着性である。一部の実施の形態において、微小井戸４１０のアレイを有する基板の少なくとも一部が、細胞接着性である。一部の実施の形態において、微小井戸４１０のアレイを有する基板の一部が多孔質である。更に別の実施の形態において、井戸４００を形成する微小井戸４１０のアレイを有する基板が、開口部を有している。一部の実施の形態において、微小井戸４１０のアレイを有する基板の一部は、多孔質膜４２０に接着、貼り付け、又は並置することができる。１つの実施の形態において、細胞凝集塊促進細胞培養インサート１０５の第２の端部が、多孔質膜４２０によって覆われ、多孔質膜によって、微小井戸４１０を有する基板が画成される。
【００３５】
一部の実施の形態において、細胞凝集塊促進細胞培養インサート１０５の井戸４００を形成する、微小井戸４１０のアレイを有する基板の少なくとも一部が傾斜を成している。一部の実施の形態において、井戸４００を形成する、微小井戸４１０のアレイを有する基板を、井戸の全深さに沿って傾斜させることができる。
【００３６】
本明細書に記載の構造化底面は、任意の適切な方法で形成することができる。例えば、基板を鋳造、射出成形、又はエンボス加工して、微小井戸４１０のアレイを有する基板を形成することができる。多孔質材料又はガス透過性材料を鋳造、射出成形、又はエンボス加工して、微小井戸のアレイを有する基板を形成することができる。
【００３７】
ここで、図４Ａ−Ｂを参照すると、一部の実施の形態において、入れ子式透過性支持デバイス６００に、細胞凝集塊促進細胞培養インサート１００を用いることができる。一部の実施の形態において、細胞凝集塊促進細胞培養インサート１００を別の細胞培養インサート若しくはデバイス、又は細胞凝集塊促進細胞培養インサートの内部に配置することができる。１つの態様において、２つ、３つ、又は４つ以上の細胞凝集塊促進細胞培養インサート１００を入れ子にすることができる。別の態様において、細胞凝集塊促進細胞培養インサート１００は、別の細胞培養インサートの内部に配置され、又は別の細胞培養インサートを内部に配置することができる。一部の実施の形態において、細胞凝集塊促進細胞培養インサートは、第１の開放端部の周囲に延びるレッジを更に有することができ、レッジは、細胞凝集塊促進細胞培養インサートが、貯留容器の内部又は別の細胞培養インサートの内部に配置されたとき、インサートを支持するように寸法決めされている。細胞培養の分野の当業者であれば、細胞凝集塊促進細胞培養インサートと別の細胞培養インサートとを任意に組み合わせた構成が可能であることを認識するであろう。各々の細胞培養インサートは、多孔質膜１２０を有するか、又はガス透過性にすることができる。１つの実施の形態において、一番下の細胞培養インサート又は貯留容器はガス透過性であり、上部の細胞インサートは、多孔質膜１２０を有している。
【００３８】
例えば、図４Ａに示すように、入れ子式デバイスは、上部の細胞凝集塊促進細胞培養インサート１００及び中間の細胞凝集塊促進細胞培養インサート１０１を有することができる。上部の細胞凝集塊促進細胞培養インサート１００及び中間の細胞凝集塊促進細胞培養インサート１０１は、底部に多孔質膜１２０を有することができる。実施の形態において、多孔質膜は微小井戸のアレイを有する基板である。入れ子式デバイスは、透過性支持体を有さない細胞凝集塊促進細胞培養貯留容器１０２を更に含むことができる。一部の実施の形態において、細胞凝集塊促進細胞培養貯留容器１０２は、ガス透過性材料で構成又はガス透過性材料の一部を含むことができる。実施の形態において、ガス透過性材料は、微小井戸のアレイを有する基板である。
【００３９】
図４Ｂの実施の形態に示すように、中間の細胞培養インサート１０１のみが細胞凝集塊促進細胞培養インサートであり得るが、一番上の細胞培養インサート３００及び中間の細胞凝集塊促進細胞培養インサート１０１の両方が、多孔質膜１２０を有している。一番下のデバイスは貯留容器１５１であってよい。１つの実施の形態において、貯留容器１５１はガス透過性である。
【００４０】
図５Ａに示すように、中間の細胞培養インサートは、多数の細胞凝集塊促進多孔質井戸４００を含む、細胞凝集塊促進細胞培養インサート１０５であり得る。一番上の細胞培養インサート３００は、多孔質膜１２０を有することができる。細胞凝集塊促進細胞培養インサート１０５は貯留容器１５１に挿入又は入れ子にすることができる。１つの実施の形態において、貯留容器１５１はガス透過性である。多数の細胞凝集塊促進井戸４００を含む、細胞凝集塊促進細胞培養インサート１０５を使用することによって、（図４Ａ及びＢ等に示す）２Ｄの細胞シートを培養する平底のインサートで、より密な入れ子が可能になり、信号増幅及び細胞処理速度に必要な、より多くの細胞凝集塊が提供され、試験システムにおけるボトルネックが防止される。図５Ｂは、液体非透過性、ガス透過性の底部を有する細胞凝集塊促進貯留容器１５１内に、多孔質膜底部１２０を有する、第１の細胞凝集塊促進細胞培養インサート１０５、及び第２の細胞凝集塊促進細胞培養インサート１０６を有する装置の実施の形態を示す図である。より大きな信号増幅をもたらすことに加えて、細胞凝集塊のより生理学的な機能性によって、動物実験の代替により近づけることができる。当業者には理解されるであろうが、各々が多孔質膜を有するか又は有さず、細胞凝集塊促進のための微小井戸のアレイを有するか又は有さない基板を有し、ガス透過性又は非透過性である細胞培養支持体を、所望の細胞培養環境に応じて、任意に組み合わせることができる。
【００４１】
一部の実施の形態において、細胞凝集塊促進細胞培養インサートを、ＮＣＥとして知られる化合物又は分子が、所望の生物活性を有する否かを判定する方法に用いることができる。かかる方法は、例えば、米国特許第８，１６３，５３７号明細書に記載されている。多くの場合、これ等の方法は、ＮＣＥの吸収、分布、代謝、排泄、及び毒性（ＡＤＭＥ−Ｔｏｘ）の検査、並びに、薬物動態パラメータを含む、標的治療指標に対するＮＣＥの有効性レベルの判定が伴う。１つの種類の評価は、「第１パス効果」を調査することである。この評価は、ＮＣＥが消化管を通して吸収され、次いで肝臓による代謝後における、ＮＣＥのバイオアベイラビリティの実験的判定を含んでいる。一般に、「第１パス効果」の評価では、２つの個別の体外アッセイを行い、データを組み合わせて腸透過性及び肝臓代謝を判定する必要がある。必要に応じ、追加の調査を行って、標的選択性、有効性、及び用量を決定することができる（Ｌａｕ他、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ、Ｖｏｌ． ３２、 Ｎｏ. ９、 ｐｐ. ９３７−９４２、２００４）。
【００４２】
ＮＣＥの腸内吸収を調査するために今日使用されている周知の方法は、一般にＴｒａｎｓｗｅｌｌ（商標）の商品名で販売され、コーニング社によって製造されたもの等の透過性支持体上で行われるＣａｃｏ ２細胞ベースのアッセイとして知られている（「Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）：Ｓｎａｐｗｅｌｌ（商標）及び  Ｎｅｔｗｅｌｌ（商標）インサートを含む−使用説明書」コーニング社、２００７年９月）。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ透過性支持体は、Ｃａｃｏ ２細胞分極の発現を促進し、より生体内に似た試験状態を創出するように設計されている。Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの研究者らは、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ透過性支持体を受容するＴｒａｎｓｗｅｌｌ受容体プレートに、栄養培地内の肝細胞を付加することによって、Ｃａｃｏ ２細胞ベースのアッセイの有用性を拡大した。このように、研究者らはＮＣＥの経口バイオアベイラビリティをより正確に予測することができた。しかし、３時間の培養期間中における、これ等の条件下での肝細胞の生存率は、僅か５０〜７０％であり、本方法の可能性が制限されていた（Ｌａｕ他、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ、Ｖｏｌ.３２、Ｎｏ．９、ｐｐ．９３７−９４２、２００４）。東京大学の別の研究者グループは、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ受容体プレートの内表面に増殖する単層のＨｅｐ Ｇ２細胞と共に、透過性支持体上にＣａｃｏ ２細胞を培養した。一部のアッセイには有用であるが、Ｈｅｐ Ｇ２細胞は、体内肝細胞を代表する機能を維持しなかった（Ｃｈｏｉ他、 Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ、ｖｏｌ. １８、ページ３９３−４０２、２００４）。
【００４３】
第１パスアッセイ等の薬物相互作用研究に関する、米国食品医薬品局の現行のガイダンスによれば、種特異的応答のために、新鮮又は凍結保存されたヒト肝細胞を用いた体外アッセイを推奨している（米国保健福祉省、他 「医薬品相互作用研究 − 研究、設計、データ分析、及び投薬と表示のための含意」、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２００６年９月）。しかし、ポリスチレン上で組織培養処理された、標準的な細胞培養条件において、初代肝細胞が急速に分化機能を失うことは周知である。正常分化肝細胞機能の喪失により、生体内に似た状態が低下し、従って、ＡＤＭＥ−Ｔｏｘにおける実験データの妥当性、及び体外アッセイにおける薬物動態も低下する。
【００４４】
本明細書に記載の方法の一部の実施の形態において、Ｃａｃｏ ２細胞ベースのアッセイに使用される、肝細胞又はＨｅｐ Ｇ２細胞が、細胞凝集塊促進細胞培養インサート内で培養される。
【００４５】
一部の実施の形態において、本開示は入れ子式透過性支持デバイス、及び入れ子式透過性支デバイスを用いて、新しい治療化合物、ＮＢＥ、又はＮＣＥを試験するために、様々な実験を行う方法に関連している。
【００４６】
一部の実施の形態において、細胞凝集塊促進細胞培養インサートを用いて、システムに似た通信情報を評価することができる。一部の実施の形態において、細胞凝集塊促進細胞培養インサートを用いて、垂直方向の一連のヒト臓器を表す細胞モデルを創出することができる。
【００４７】
１つに態様において、入れ子式透過性支持デバイスを用いて、消化管からの吸収及び肝臓による代謝後の、ＮＣＥ又はＮＢＥのバイオアベイラビリティを判定するための第１パスアッセイが形成される。
【００４８】
１つの実施の形態において、入れ子式透過性支持デバイス６００を用いて、第１パスアッセイを実施して、消化管を通した吸収及び肝臓による代謝後の、ＮＣＥのバイオアベイラビリティを判定することができる。別の実施形態において、入れ子式透過性支持デバイス６００を用いて、第１パスアッセイを実施して、消化管を通した吸収及び肝臓による代謝後の、ＮＢＥのバイオアベイラビリティを判定することができる。
【００４９】
例えば、図５Ａに示す実施の形態を用いる研究者は、増殖貯留容器内に培地を配置した後、増殖貯留容器内に上部インサート３００を配置することができる。次に、上部インサート３００は、培地内のある量のＣａｃｏ ２細胞で満たされる。上部インサート３００と増殖貯留容器は、上部インサート３００の透過性支持体を横断して、Ｃａｃｏ ２細胞の融合性単層が形成されるまで連通している。Ｃａｃｏ ２細胞が、上部インサート３００の透過性支持体を横断して形成されるのに、通常約１ヶ月を要する。経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）試験を実施することによって、Ｃａｃｏ ２細胞を電子的に試験し、Ｃａｃｏ ２細胞相互の密着接着の度合いを判定することができ、この試験では、上部インサート３００にプローブが挿入された後、プローブによってパルスが開始され、パルスが透過性支持体下方の増殖貯留容器に位置する別のプローブによって検出される。実行可能な別の試験において、Ｃａｃｏ ２細胞の単層の間隙を通過することができる、黄燐イエローと呼ばれる色素が用いられる。上部インサート３００に導入された後、増殖貯留容器に現れる黄燐イエローが多ければ多いほど、Ｃａｃｏ ２細胞単層の成熟度（又は融合性）が低い。このような試験を実施して、Ｃａｃｏ ２の細胞培養が期待通りに機能していることを確認することができる。
【００５０】
並行して、研究者は、別の増殖貯留容器に培地を配置した後、この増殖貯留容器内に中間インサート１０５を配置することができる。次に、中間インサート１０５は、培地内のある量の肝細胞で満たされる。中間インサート１０５と増殖貯留容器は、第２の透過性支持体を横断して、肝細胞の細胞凝集塊が形成されるまで連通している。肝細胞が適切に機能していることを確認するための試験を行うこともできる。これに代えて、上部インサート３００及び中間インサート１０５を貯留容器１５１内に配置して、Ｃａｃｏ ２細胞及び肝細胞を増殖させることができる。
【００５１】
Ｃａｃｏ ２細胞及び肝細胞が培養された後、上部インサート３００及び中間インサート１０５が、それぞれの増殖貯留容器から引上げ除去される。中間インサート１０５は、培地を含む貯留容器１５１に配置される（入れ子にされる）。次に、一部の培地が、中間インサート１０５内に位置する肝細胞の層の上方に配置される。次に、上部インサート３００が、中間インサート１０５内に配置される（入れ子にされる）。ＮＣＥ／ＮＢＥ及び培地が、上部インサート３００の内部に位置するＣａｃｏ ２細胞層の上方に分注される。培養期間が終了した後、上部インサート３００を除去し、中間インサート１０５内の培地を試験して（即ち、ＬＳ／ＭＳ）、ＮＣＥ／ＮＢＥが腸上皮（Ｃａｃｏ ２細胞）を通過したか否かを判定することができる。ＮＣＥ／ＮＢＥが、Ｃａｃｏ ２細胞を実際に通過した場合、中間インサート１０５を除去し、貯留容器１５１内の培地を試験して（即ち、ＬＳ／ＭＳ）、ＮＣＥのバイオアベイラビリティ及び／又はＮＣＥ／ＮＢＥが、肝臓（肝細胞）によってどのように代謝され、代謝産物が形成されるかをチェックすることができる。また、肝細胞は、ＮＣＥ／ＮＢＥが、適用投薬量において、毒性であるか否かを示すことができる。貯留容器１５１の底部に標的細胞（又は分子）が存在する場合、これ等を検査して（即ち、ＬＳ／ＭＳ）、微視的に、又はインサート３００及び１０５を引き抜くことによって、Ｃａｃｏ ２細胞及び肝細胞と肝細胞とを分離した、アッセイを用いることによって、薬物効果を判定することができる。これに代えて、例えば、米国特許第８，１６３，５３７号明細書に記載されているように、質問システムを用いて貯留容器１５１の底部の標的細胞（又は分子）を検査して、機能および生存率を評価することができる。このようなアッセイによって、１）ＮＣＥ／ＮＢＥが腸上皮を通過できるか否か、２）肝臓がＮＣＥ／ＮＢＥを代謝するか、又はＮＣＥ／ＮＢＥによって損傷を受けるか否か、及び３）標的細胞に対する未処理又は肝臓代謝されたＮＣＥ／ＮＢＥの効果を理解することができる。
【００５２】
別の実施の形態において、入れ子式透過性支持デバイス１００を用いて、消化管を通過しない代わりに吸入によって体内に入り、Ｃａｃｏ ２細胞が、鼻粘膜細胞、気管支細胞、又は肺上皮細胞等に置換される、ＮＣＥを試験することができる。研究者は、実際には、入れ子式透過性支持デバイス６００において使用される、実際の細胞を選択するのが一般的であろう。
【００５３】
一部の実施の形態において、特に、第２の端部に多数の井戸を備えた実施の形態、又は入れ子式支持体を用いた実施の形態において、多数の細胞凝集塊を増殖させることができる。一部の実施の形態において、細胞凝集塊はすべて同じである。別の実施の形態において、２つ以上の異なる種類の細胞凝集塊が用いられる（例えば、器官の多細胞機能をシミュレート又は再構成するための共培養系）。細胞の画像化又は細胞によって生成された信号の検出を行う場合、所望に応じ、複数の細胞からの応答を同時に分析するか、又は個々の細胞若しくは細胞群からの結果をプールすることができる。
【００５４】
細胞凝集塊等の三次元に培養された細胞は、単層として二次元に培養された同等物と比較して、より生体内様の機能性を示すことができる。二次元細胞培養システムにおいて、細胞は培養される基板に付着することができる。しかし、細胞凝集塊等、三次元で細胞を増殖させると、細胞は基板に付着する代わりに相互作用する。三次元で培養した細胞は、細胞間通信及び細胞外マトリックスの発展の観点から、より生体内の組織に似ている。従って、細胞凝集塊によって、細胞移動、分化、生存、及び増殖に関する優れたモデルが提供され、研究、診断、薬効、薬理学、及び毒性試験に関するより良いシステムが提供される。
【００５５】
一部の実施の形態において、内部で培養される細胞が細胞凝集塊を形成するように、デバイスが構成されている。例えば、細胞を増殖させる井戸を細胞非接着性にして、井戸内の細胞を互いに結合させて球体を形成することができる。細胞凝集塊は、井戸の幾何学形状によって限定される寸法限界まで拡張する。一部の実施の形態において、超低結合材料のコーティングによって、井戸が細胞非接着性にされる。
【００５６】
非接着性材料の例には、過フッ素化ポリマー、オレフィン、同様のポリマー、又はそれらの混合物が含まれる。別の例には、アガロース、ポリアクリルアミド等の非イオン性ヒドロゲル、ポリエチレンオキシド等のポリエーテル、ポリビニルアルコール等のポリオール又は同様の材料、あるいはそれらの混合物が含まれる。例えば、非接着性井戸、井戸の幾何学形状（大きさ及び形状）及び／又は重力の組み合わせによって、井戸内で培養される細胞が、細胞凝集塊に自己組織化するように誘導される。一部の細胞凝集塊は、単層で増殖した細胞と比較して、より生体内様の応答を示す分化した細胞機能を維持する。間葉系間質細胞等の他の細胞種は、細胞凝集塊として培養された場合、その多能性が保持される。
【００５７】
一部の実施の形態において、本明細書に記載のシステム、デバイス、及び方法は、１つ以上の細胞を含んでいる。一部の実施の形態において、細胞は凍結保存されている。一部の実施の形態において、細胞は三次元培養である。かかる実施の形態の一部において、システム、デバイス、及び方法は１つ以上の細胞凝集塊を含んでいる。一部の実施の形態において、細胞の１つ以上が活発に分裂する。一部の実施の形態において、システム、デバイス、及び方法は、（例えば、栄養素（例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸）、エネルギー（例えば、炭水化物）、必須金属及びミネラル（例えば、カルシウム、マグネシウム、鉄、リン酸塩、硫酸塩）、緩衝剤（例えば、リン酸塩 、酢酸塩）、ｐＨ変化の指標（例えば、フェノールレッド、ブロモクレゾールパープル）、選択剤（例えば、化学薬品、抗菌剤）等を含む）培養培地を含んでいる。一部の実施の形態において、１つ以上の試験化合物（例えば、薬物）が、システム、デバイス、及び方法に含まれている。
【００５８】
多種多様な細胞種を培養することができる。一部の実施の形態において、細胞凝集塊は１つの種類の細胞を含んでいる。一部の実施の形態において、細胞凝集塊は複数種類の細胞を含んでいる。複数の細胞凝集塊を増殖させる一部の実施の形態において、各々の細胞凝集塊は同じ種類であり、別の実施の形態において、２つ以上の異なる種類の細胞凝集塊が増殖される。細胞凝集塊に増殖される細胞は、自然細胞又は変異細胞（例えば、１つ以上の非自然的遺伝子変異を含む細胞）であってよい。一部の実施の形態において、細胞は体細胞である。一部の実施の形態において、細胞は、任意の所望の分化状態（例えば、多能能、複能性、運命決定、不死化等）の幹細胞又は前駆細胞（例えば、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞）である。一部の実施の形態において、細胞は、疾患細胞又は疾患モデル細胞である。例えば、一部の実施の形態において、細胞凝集塊は、１つ以上の種類の癌細胞又は過剰増殖状態に誘導され得る細胞（例えば、形質転換細胞）を含んでいる。細胞は、副腎、膀胱、血管、骨、骨髄、脳、軟骨、頚部、角膜、子宮内膜、食道、胃腸、免疫系（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、白血球、マクロファージ、及び樹状細胞）、肝臓、肺、リンパ管、筋肉（例えば、心筋）、神経、卵巣、膵臓（例えば、膵島細胞）、下垂体、前立腺、腎臓、唾液、皮膚、腱、精巣、及び甲状腺を含み、これに限定されない、所望の任意の種類の組織又は器官からの、又は由来する細胞であってよい。一部の実施の形態において、細胞は哺乳動物の細胞（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ニワトリ、ヤギ、ウマ等）である。
【００５９】
培養された細胞は、研究、診断、薬物スクリーニング及び試験、治療、並びに産業用途に幅広く使用される。
【００６０】
一部の実施の形態において、細胞はタンパク質又はウイルスの製造に用いられる。多数の細胞凝集塊を並行して培養するシステム、デバイス、及び方法は、タンパク質の製造に特に有効である。三次元培養によって、細胞密度の増加、及び細胞増殖表面積１平方センチメートル当たり、より高いタンパク質収量が得られる。ワクチン製造用の任意の所望のタンパク質又はウイルスを細胞内で増殖させ、所望に応じて、単離又は精製して使用することができる。一部の実施の形態において、タンパク質は細胞に対し天然タンパク質である。一部の実施の形態において、タンパク質は細胞に対し、変性タンパク質である。一部の実施の形態において、タンパク質は組換えにより発現される。タンパク質は、変性プロモーターを用いて過剰発現させることが好ましい。一部の実施の形態において、精製又は検出タグは、その精製及び／又は検出を容易にする、関心タンパク質に対する融合パートナーとして発現される。一部の実施の形態において、精製後に融合パートナーを分離させるために、切断可能リンカーで融合が発現される。
【００６１】
一部の実施の形態において、タンパク質は治療的タンパク質である。かかるタンパク質には、不完全若しくは異常（例えば、インスリン）タンパク質を置換するタンパク質及びペプチド、既存の経路（例えば、阻害剤又はアゴニスト）を増強するタンパク質及びペプチド、新規な機能若しくは活性を提供するタンパク質及びペプチド、分子若しくは生命体に干渉するタンパク質及びペプチド、又は他の化合物若しくはタンパク質（例えば、放射性核種、細胞傷害性薬物、エフェクタータンパク質等）を送達するタンパク質及びペプチドが含まれるが、これに限定されるものではない。一部の実施の形態において、タンパク質は、任意の種類（例えば、ヒト化、二重特異性、多重特異性等）の抗体（例えば、モノクローナル抗体）等の免疫グロブリンである。治療的タンパク質の種類には、抗体ベースの薬物、Ｆｃ融合タンパク質、抗凝固剤、抗原、血液因子、骨形成タンパク質、遺伝子操作されたタンパク質足場、酵素、成長因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、及び血栓溶解薬が含まれるが、これに限定されるものではない。治療的タンパク質を用いて、癌、免疫障害、代謝障害、遺伝的障害、感染症、並びに他の疾患及び状態を予防又は治療することができる。
【００６２】
一部の実施の形態において、タンパク質は診断的タンパク質である。診断的タンパク質には、抗体、親和性結合パートナー（例えば、受容体結合リガンド）、阻害剤、アンタゴニスト等が含まれるが、これに限定されるものではない。一部の実施の形態において、診断タンパク質は、検出可能な部分（例えば、蛍光部分、発光部分（例えば、ルシフェラーゼ）、比色部分等）で発現するか、又は検出可能な部分である。
【００６３】
一部の実施の形態において、タンパク質は工業的タンパク質である。工業的タンパク質には、食品成分、工業用酵素、農業用タンパク質、分析用酵素等が含まれるが、これに限定されるものではない。
【００６４】
一部の実施の形態において、細胞は、薬物発見、特性決定、有効性試験、及び毒性試験に用いられる。かかる試験には、薬理効果評価、発癌性評価、医用造影剤特性評価、半減期評価、放射線安全性評価、遺伝毒性試験、免疫毒性試験、生殖及び発生試験、薬物相互作用評価、線量評価、吸着評価、処分評価、代謝評価、除去試験等が含まれるが、これに限定されるものではない。特定の細胞種を特定の試験に用いることができる（例えば、肝臓毒性には肝細胞、腎毒性には腎近位尿細管上皮細胞、血管毒性には血管内皮細胞、神経毒性にはニューロン及びグリア細胞、心臓毒性には心筋細胞、横紋筋融解には骨格筋細胞等）。処理細胞は、膜の完全性、細胞代謝物含量、ミトコンドリア機能、リソソーム機能、アポトーシス、遺伝子変化、遺伝子発現の相違等を含み、これに限定されない任意の数の所望のパラメータについて評価することができる。
【００６５】
一部の実施の形態において、細胞培養デバイスは、より大きなシステムの構成要素である。一部の実施の形態において、システムは複数（例えば、２、３、４、５、----、１０、----、２０、----、３０、----、５０、----、１００、----、１０００等）のかかる細胞培養デバイスを備えている。一部の実施の形態において、システムは、培養デバイスを最適な培養条件（例えば、温度、雰囲気、湿度等）に維持するためのインキュベータを備えている。一部の実施の形態において、システムは細胞を画像化、又は分析するための検出器を備えている。かかる検出器には、蛍光計、照度計、カメラ、顕微鏡、プレートリーダ（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＥＮＶＩＳＩＯＮ  プレートリーダ、ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＶＩＥＷＬＵＸ  プレートリーダ等）、細胞分析装置（ＧＥ ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２０００及び２２００、ＴＨＥＲＭＯ／ＣＥＬＬＯＭＩＣＳ ＣＥＬＬＮＳＩＧＨＴ  ハイコンテンツスクリーニングプラットフォーム等）、及び共焦点画像化システム（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＯＰＥＲＡＰＨＥＮＩＸ  ハイスループットコンテンツスクリーニングシステム、ＧＥ ＩＮＣＥＬＬ  ６０００  セルイメージングシステム等）が含まれるが、これに限定されるものではない。一部の実施の形態において、システムは、培養細胞に対し、培養培地又は他の成分を供給、再供給、及び循環させるための潅流システム又は他の構成要素を備えている。一部の実施の形態において、システムは、培養デバイスの取扱い、使用、及び／又は分析を自動化するためのロボット構成要素（例えば、ピペット、アーム、プレート移動装置等）を備えている。
【００６６】
インサート、方法、及びアセンブリの多くの態様が、本明細書に開示されている。一部の選択された態様の概要を以下に示す。第１の態様において、細胞培養インサートは（ｉ）第１の開放端部、１００μｍ〜１０００μｍの範囲の直径寸法を有する開口部を画成する、第２の端部、及び第１の開放端部から第２の端部に延びる、傾斜を成す１つ以上の側壁を有する本体、及び（ｉｉ）第２の端部の開口部の上に配置された、多孔質膜を備えている。
【００６７】
第２の態様は、１つ以上の側壁の少なくとも一部が、細胞非接着性である、第１の態様に記載の細胞培養インサートである。
【００６８】
第３の態様は、多孔質膜の少なくとも一部が、細胞非接着性である、第１又は第２の態様に記載の細胞培養インサートである。
【００６９】
第４の態様は、多孔質膜の少なくとも一部が、細胞接着性である、第１〜第３の態様のいずれかに記載の細胞培養インサートである。
【００７０】
第５の態様は、第２の端部に近接する１つ以上の側壁の一部が、少なくとも部分的に細胞閉じ込め容積を画成する、第１〜第４の態様のいずれかに記載の細胞培養インサートである。
【００７１】
第６の態様は、細胞閉じ込め容積の深さが、１００μｍ〜１０００μｍの範囲である、第５の態様に記載の細胞培養インサートである。
【００７２】
第７の態様は、インサート内で培養された細胞が、細胞凝集塊を形成するように構成された、第１〜第６の態様のいずれかに記載の細胞培養インサートである。
【００７３】
第８の態様は、細胞凝集塊を培養するための方法であって、（ｉ）第７の態様に記載の細胞培養インサートを、底部を有する貯留容器内に配置するステップであって、インサートの本体の第２の端部が、貯留容器の底部の上方に位置するように、インサートが貯留容器に配置される、ステップと、（ｉｉ）細胞をインサートに導入するステップと、（ｉｉｉ）細胞培養培地をインサートに導入するステップと、（ｉｖ）インサートの細胞培養培地において細胞を培養して、細胞凝集塊を形成するステップとを備えている。
【００７４】
第９の態様は、細胞培養アセンブリであって、（ｉ）内部を画成し、底部を有する貯留容器と、（ｉｉ）本体の第２の端部が、貯留容器の底部の上方に位置して、貯留容器の内部に配置されるように構成された、第１〜第７の態様のいずれかに記載の第１の細胞培養インサートであって、本体が内部を画成する、インサートとを備えたアセンブリである。
【００７５】
第１０の態様は、第１のインサートが、貯留容器の内部に配置されたとき、第１のインサートの内部が、第１のインサートの本体の第２の端部の開口部の上に配置された、多孔質膜を介してのみ、貯留容器の内部と流体連通する、第９の態様に記載の細胞培養アセンブリである。
【００７６】
第１１の態様は、内部を画成する本体を有する第２のインサートであって、本体が第１の開放端部、開口部を画成する第２の端部、及び第１の開放端部から第２の端部に延びる１つ以上の側壁を有し、第２のインサートの本体の第２の端部が、第１のインサートの本体の第２の端部の上方に位置して、第１のインサートの内部に配置されるように構成された、第２のインサートを更に備えた、第９の態様又は第１０の態様に記載の細胞培養アセンブリである。
【００７７】
第１２の態様は、第２のインサートが、第１のインサートの内部に配置されたとき、第２のインサートの内部が、第２のインサートの本体の第２の端部の開口部の上に配置された、多孔質膜を介してのみ、第１のインサートの内部と流体連通する、第１１の態様に記載の細胞培養アセンブリである。
【００７８】
第１３の態様は、（ｉ）第１２の態様に記載の細胞培養アセンブリの貯留容器の内部に、標的細胞及び細胞培養培地を導入して、貯留容器の底部において、標的細胞を増殖させるステップと、（ｉｉ）第１２の態様に記載の第１の細胞培養インサートを貯留容器の内部に配置するステップと、（ｉｉｉ）複数の第１の種類の細胞及び細胞培養培地を第１の細胞培養インサートの内部に配置して、第１のインサートの多孔質膜の近傍において、第１の種類の細胞を、細胞凝集塊として、増殖させるステップと、（ｉｖ）第１２の態様に記載の第２の細胞培養インサートを第１のインサートの内部に配置するステップと、（ｖ）複数の第２の種類の細胞及び細胞培養培地を第２の細胞培養インサートの内部に配置して、第２のインサートの多孔質膜の近傍において、第２の種類の細胞を、細胞凝集塊として、増殖させるステップとを備えた方法である。
【００７９】
第１４の態様は、第２のインサートの内部から、第１のインサートの内部に移動する化合物又はその代謝誘導体が、第２の種類の細胞を通過するように、第２の種類の細胞が第２のインサートの多孔質膜を覆う、第１３の態様に記載の方法である。
【００８０】
第１５の態様は、第１のインサートの内部から、貯留容器の内部に移動する化合物又はその代謝誘導体が、第１の種類の細胞を通過するように、第１の種類の細胞が第１のインサートの多孔質膜に付着する、第１４の態様に記載の方法である。
【００８１】
第１６の態様は、（ｉ）試験化合物を第２のインサートに導入するステップ、及び（ｉｉ）試験化合物又はその代謝誘導体が、標的細胞に与える効果を特定するステップを更に備えた、第１５の態様に記載の方法である。
【００８２】
第１７の態様は、第１の種類の細胞が、肝細胞である、第１３〜第１６の態様のいずれかに記載の方法である。
【００８３】
第１８の態様は、第２の種類の細胞が、Ｃａｃｏ ２細胞である、第１３〜第１７の態様のいずれかに記載の方法である。
【００８４】
第１９の態様は、細胞培養インサートであって、（ｉ）第１の開放端部、開口部を画成する第２の端部、及び第１の開放端部から第２の端部に延びる、傾斜を成す１つ以上の側壁を有する本体と、（ｉｉ）第２の端部の開口部の上に配置された多孔質膜であって、細胞非接着性である膜とを備えたインサートである。
【００８５】
第２０の態様は、細胞培養デバイスの貯留容器に、少なくとも部分的に挿入されるように構成された、透過性支持デバイスであって、テーパー形状、及び第１の透過性支持体によって少なくとも部分的に画成された底部を有する第１の井戸を備えたデバイスである。
【００８６】
第２１の態様は、井戸が、井戸内で培養された細胞が、細胞凝集塊を形成するように構成された、第２０の態様に記載の透過性支持デバイスである。
【００８７】
第２２の態様は、第１の井戸の少なくとも一部が、超低結合材料でコーティングされた、第２０又は第２１の態様に記載の透過性支持デバイスである。
【００８８】
第２３の態様は、透過性支持体の少なくとも一部が、第１の井戸内で培養された細胞が付着するように構成された、第２０〜第２２の態様のいずれかに記載の透過性支持デバイスである。
【００８９】
第２４の態様は、第１の井戸の少なくとも一部が、弓形形状を含む、第２０〜第２３の態様のいずれかに記載の透過性支持デバイスである。
【００９０】
第２５の態様は、第１の井戸の少なくとも一部が、円錐形状を含む、第２０〜第２４の態様のいずれかに記載の透過性支持デバイスである。
【００９１】
第２６の態様は、井戸の一部が閉じ込め容積を画成する、第２０〜第２５の態様のいずれかに記載の透過性支持デバイスである。
【００９２】
第２７の態様は、閉じ込め容積の直径寸法が、２００μｍ〜５００μｍの範囲である、第２６の態様に記載の透過性支持デバイスである。
【００９３】
第２８の態様は、閉じ込め容積の深さが、１００μｍ〜５００μｍの範囲である、第２６又は第２７の態様に記載の透過性支持デバイスである。
【００９４】
第２９の態様は、第１の井戸が、底部を有する第２の井戸を受け入れるよう構成及び寸法決めされ、第２の井戸が第１の井戸の上方に位置する、第２０〜第２８の態様のいずれかに記載の透過性支持デバイスである。
【００９５】
第３０の態様は、（ｉ）テーパー形状、及び第１の透過性支持体によって少なくとも部分的に画成された底部を有する第１の井戸、及び（ｉｉ）第１の井戸の下方に位置する底部を有する貯留容器を備えた、入れ子式透過性支持デバイスである。
【００９６】
第３１の態様は、井戸が、井戸内で培養された細胞が、細胞凝集塊を形成するように構成された、第３０の態様に記載の入れ子式透過性支持デバイスである。
【００９７】
第３２の態様は、第１の井戸の少なくとも一部が、超低結合材料でコーティングされた、第３０又は第３１の態様に記載の入れ子式透過性支持デバイスである。
【００９８】
第３３の態様は、透過性支持体の少なくとも一部が、第１の井戸内で培養された細胞が付着するように構成された、第２９〜第３２の態様のいずれかに記載の入れ子式透過性支持デバイスである。
【００９９】
第３４の態様は、第１の井戸の少なくとも一部が、弓形形状を含む、第３０〜第３３の態様のいずれかに記載の入れ子式透過性支持デバイスである。
【０１００】
第３５の態様は、第１の井戸の少なくとも一部が、円錐形状を含む、第３０〜第３４の態様のいずれかに記載の入れ子式透過性支持デバイスである。
【０１０１】
第３６の態様は、井戸の一部が、閉じ込め容積を画成する、第３０〜第３５の態様のいずれかに記載の入れ子式透過性支持デバイスである。
【０１０２】
第３７の態様は、閉じ込め容積の直径寸法が、１００μｍ〜１０００μｍの範囲、例えば、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、又は１０００μｍ等であり、前述のすべての間の範囲を含む、第３６の態様に記載の入れ子式透過性支持デバイスである。
【０１０３】
第３８の態様は、閉じ込め容積の深さが、１００μｍ〜１０００μｍの範囲、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、又は１０００μｍ等であり、前述のすべての間の範囲を含む、第３６又は第３７の態様に記載の入れ子式透過性支持デバイスである。
【０１０４】
第３９の態様は、第２の透過性支持体によって、少なくとも部分的に画成された底部を有する第２の井戸を更に備え、第１の井戸及び第１の透過性支持体が、第２の井戸及び第２の透過性支持体の下方に位置する、第３０〜第３８の態様のいずれかに記載の入れ子式透過性支持デバイスである。
【０１０５】
第４０の態様は、第２の井戸が、テーパー形状を含む、第３９の態様に記載の入れ子式透過性支持デバイスである。
【０１０６】
第４１の態様は、貯留容器の底部が、ガス透過性材料を含む、第３０〜第４０の態様のいずれかに記載の入れ子式透過性支持デバイスである。
【０１０７】
第４２の態様は、入れ子式透過性支持デバイスであって、（ｉ）底部を有する第１の井戸であって、底部の少なくとも一部が第１の透過性支持体によって形成された、第１の井戸、（ｉｉ）底部を有する第２の井戸であって、底部が弓形形状を含み、底部の少なくとも一部が、第２の透過性支持体によって形成され、第２の井戸及び第２の透過性支持体が、第１の井戸及び第１の透過性支持体の下方に位置する、第２の井戸、及び（ｉｉｉ）第２の井戸及び第２の透過性支持体の下方に位置する底部を有する第３の井戸を備えたデバイスである。
【０１０８】
第４３の態様は、第２の井戸の少なくとも一部が、超低結合材料でコーティングされた、第４２の態様に記載の入れ子式透過性支持デバイスである。
【０１０９】
第４４の態様は、細胞培養インサートであって、第１の開放端部、第２の端部、及び第１の開放端部から第２の端部に延びる1つ以上の側壁を備え、第２の端部が、井戸を画成する微小井戸のアレイを有する基板を含み、井戸を画成する微小井戸のアレイを有する基板の少なくとも一部が傾斜を成す、インサートである。
【０１１０】
第４５の態様は、側壁が傾斜を成す、第４４の態様に記載の細胞培養インサートである。
【０１１１】
第４６の態様は、側壁が細胞非接着性である、第４４又は第４５の態様に記載の細胞培養インサートである。
【０１１２】
第４７の態様は、微小井戸のアレイを有する基板の少なくとも一部が、細胞非接着性である、第４４〜第４６の態様のいずれかに記載の細胞培養インサートである。
【０１１３】
第４８の態様は、井戸が、上部開口部を画成する内面を有し、上部開口部において、１００μｍ〜１０００μｍの範囲の直径寸法を有する、第４４〜第４７の態様のいずれかに記載の細胞培養インサートである。
【０１１４】
第４９の態様は、井戸が１００μｍ〜１０００μｍの範囲の深さを有する、第４４〜第４８の態様のいずれかに記載の細胞培養インサートである。
【０１１５】
第５０の態様は、微小井戸のアレイを有する基板の少なくとも一部が、細胞非接着性である、第４４〜第４９の態様のいずれかに記載の細胞培養インサートである。
【０１１６】
第５１の態様は、微小井戸のアレイを有する基板の少なくとも一部が、細胞接着性である、第４４〜第４９の態様のいずれかに記載の細胞培養インサートである。
【０１１７】
第５２の態様は、微小井戸のアレイを有する基板の少なくとも一部が、多孔質である、第４４〜第５１の態様のいずれかに記載の細胞培養インサートである。
【０１１８】
第５３の態様は、微小井戸のアレイを有する基板が開口部を備えた、第４４〜第５２の態様のいずれかに記載の細胞培養インサートである。
【０１１９】
第５４の態様は、微小井戸のアレイを有する基板が、多孔質膜に接着、固定、又は並置された、第４４〜第５３の態様のいずれかに記載の細胞培養インサートである。
【０１２０】
第５５の態様は、第２の端部が多孔質膜によって覆われた、第４４〜第５４の態様のいずれかに記載の細胞培養インサートである。
【０１２１】
第５６の態様は、微小井戸のアレイを有する基板が、傾斜面を備えた、第４４〜第５５の態様のいずれかに記載の細胞培養インサートである。
【０１２２】
第５７の態様は、微小井戸のアレイを有する基板が、六角形構造体のアレイを備えた、第４４〜第５６の態様のいずれかに記載の細胞培養インサートである。
【０１２３】
第５８の態様は、細胞培養アセンブリであって、（ｉ）内部を画成し、底部を有する貯留容器、及び（ｉｉ）本体の第２の端部が貯留容器の底部の上方に位置して、貯留容器の内部に配置されるように構成された、第４４〜第５７の態様のいずれかに記載の第１の細胞培養インサートであって、本体が内部を画成するインサートを備えたアセンブリである。
【０１２４】
第５９の態様は、第１のインサートが、貯留容器の内部に配置されたとき、第１のインサートの内部が、第１のインサートの本体の第２の端部の開口部の上に配置された、多孔質膜を介してのみ、貯留容器の内部と流体連通する、第５８の態様に記載の細胞培養アセンブリである。
【０１２５】
第６０の態様は、内部を画成する本体を有する第２のインサートであって、本体が第１の開放端部、開口部を画成する第２の端部、及び第１の開放端部から第２の端部に延びる１つ以上の側壁を有し、第２のインサートの本体の第２の端部が、第１のインサートの本体の第２の端部の上方に位置して、第１のインサートの内部に配置されるように構成された第２のインサートを更に備えた、第５８又は第５９の態様に記載の細胞培養アセンブリである。
【０１２６】
第６１の態様は、第２のインサートが第１のインサートの内部に配置されたとき、第２のインサートの内部が、第２のインサートの本体の第２の端部の開口部の上に配置された、多孔質膜を介してのみ、第１のインサートの内部と流体連通する、第６０の態様に記載の細胞培養アセンブリである。
【０１２７】
第６２の態様は、細胞培養インサートであって、細胞培養デバイスの貯留容器に挿入できるように寸法決めされた本体であって、第１の開放端部、多孔質膜を有する第２の端部、及び第１の開放端部から第２の端部に延びる1つ以上の側壁を有する、本体を備え、1つ以上の側壁が傾斜を成し、第２の端部が、細胞凝集塊の増殖に適するように寸法決めされた、複数の微小井戸を画成する上面を有する、インサートである。
【０１２８】
第６３の態様は、微小井戸の各々が、１００μｍ〜１０００μｍの直径を有する、第６２の態様に記載の細胞培養インサートである。
【０１２９】
別に明記しない限り、本明細書に記載のすべての方法は、そのステップを特定の順序で実施する必要があると解釈されることを意図するものでは全くない。従って、方法クレームにおいて、そのステップが従うべき順序が実際に記載されていない場合、又は特許請求の範囲若しくは明細書において、ステップが特定の順序に限定されると特に明記されていない場合、特定の順序が推定されることを意図するものでは全くない。任意の１つのクレームに記載された、１つ若しくは複数の特徴又は態様は、別の任意の１つ若しくは複数のクレームに記載された特徴又は態様と組み合わせるか、あるいは置換することができる。
【０１３０】
本明細書における記述は、構成要素が特定の方法で機能するように「構成」又は「適合」されていることを意味することにも留意されたい。この点において、そのような構成要素は、特定の特性又は機能を特定のやり方で具体化するように「構成」又は「適合」されており、そのような記述は、意図した使用の記述ではなく、構造的記述である。より具体的には、本明細書において、構成要素が「構成」又は「適合」されている方法について言及した場合、構成要素の既存の物理的状態を示すものであって、構成要素の構造的特性の明確な記述として解釈されるべきものである。
【０１３１】
移行句「備える（含む）」を用いて、特定の実施の形態の様々な特徴、要素、又はステップを開示することができるが、移行句「から成る」又は「実質的に成る」を用いて記述可能なものを含む、代替実施の形態が暗示されていることを理解されたい。従って、例えば、本体及び多孔質膜を備えた細胞培養インサートに対する、暗示された代替実施の形態には、本体及び多孔質膜から成る細胞培養インサートの実施の形態、及び本体及び多孔質膜から実質的に成る細胞培養インサートの実施の形態が含まれる。
【０１３２】
本開示の精神および範囲から逸脱することなく、本発明的技術に対して様々な改良及び変形が可能であることは、当業者には明らかであろう。当業者は、本発明的技術の精神及び実体を組み込んだ本開示に対する改良、組み合わせ、部分的組み合わせ、及び変形を思い付くことが可能であるため、本発明的技術は、添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲のすべてを包含するものと解釈されるべきである。
【０１３３】
本出願の開示と、参照により、本明細書中に援用される任意の文献の開示内容との間に矛盾が存在する場合、本出願の開示が適用されるものとする。前述の詳細な説明及び実施例は、理解を明確にすることだけを目的として示したものである。そこから不要な制限が理解されるべきではない。当業者に自明の変形が、特許請求の範囲に規定される実施の形態に包含されるため、実施の形態は、図示及び説明した厳密な詳細に限定されるものではない。
【０１３４】
別に明記しない限り、明細書及び特許請求の範囲に用いられている構成要素、分子量等を示す全ての数値は、あらゆる場合において、「約」という用語によって修飾されていると理解されたい。従って、別段反対の意味が明記されていない限り、本明細書及び特許請求の範囲に記載の数値パラメータは、得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。少なくとも、均等論を請求項の範囲に限定しようとするものではないが、各々の数値パラメータは、少なくとも、報告された有効桁数及び通常の丸め技法を適用することによって解釈されるべきである。
【０１３５】
数値範囲及びパラメータが近似値であることに拘わらず、具体的実施例に記載の数値はできるだけ正確に報告されている。しかし、全ての数値は、本質的に、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的に生じる範囲を含んでいる。
【０１３６】
「上端」、「底部」、「左」、「右」、「上部」、「下部」、「上方」、「下方」、並びにその他の方向及び向き等、本明細書において言及する方向は、図を明確にするために用いているものであって、実際のデバイス若しくはシステム、又はデバイス若しくはシステムの使用を限定するものではない。本明細書に記載のデバイス、物品、又はシステムの多くは、多数の方向及び向きに使用することができる。細胞培養装置に関連して、本明細書に用いられている方向記述子は、多くの場合、装置が、装置内の細胞を培養するために配向されたときの方向を意味する。
【０１３７】
「好ましい」及び「好ましくは」という用語は、特定の状況下において、特定の利益をもたらすことができる実施の形態を意味する。しかし、同じ又は他の状況下において、他の実施の形態も好ましい。更に、１つ以上の好ましい実施の形態の記述は、他の実施の形態が有用でないことを暗示しているものではなく、他の実施の形態を排除することを意図するものではない。
【０１３８】
本明細書において、「有する（ｈａｖｅ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「備えている（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等は、制限のない包括的な意味で用いているものであって、一般に「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）が、これに限定されない」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）が、これに限定されない」、又は「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）が、これに限定されない」ことを意味する。
【０１３９】
「任意の」又は「必要に応じて」はそれに続いて記述された事象、状況、又は構成要素が、存在し得ること又は存在し得ないことを意味し、その記述には、事象、状況、又は構成要素が存在する場合及び存在しない場合が含まれる。
【０１４０】
別に明記しない限り、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、及び「少なくとも１つ」は交換可能に使用され、１つ又は複数を意味する。
【０１４１】
また、本明細書において、端点による数値範囲の記述は、その範囲内に包含されるすべての数を含む（例えば、１〜５は１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５等を含む）。本明細書において、範囲は「約」１つの特定の値から及び／又は「約」別の特定の値までのように表現することができる。かかる範囲が示された場合、その例は１つの特定の値から及び／又は別の特定の値を含む。同様に先行する「約」の使用によって、値が近似値として示された場合、特定の値が別の態様を形成することが理解されるであろう。範囲の各々の端点は、他方の端点との関連においても、他方の端点とは独立しても有意であることが理解されるであろう。
【０１４２】
離散的なステップを含む本明細書に開示の全ての方法において、ステップは任意の実行可能な順序で実行することができる。更に、必要に応じて、２つ以上のステップの任意の組み合わせを同時に実行することができる。
【０１４３】
幾つかの略語が本明細書に用いられている。これ等の略語の一部のリスト及びその意味を以下に示す。
ＡＤＭＥ−Ｔｏｘ−Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ、 Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ、 Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、 Ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ、 ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ（吸収、分布、代謝、排泄、及び毒性）
ＮＢＥ− Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｔｉｔｙ（新規生物由来物質）
ＮＣＥ− Ｎｅｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｔｉｔｙ（新規化学物質）
ＴＥＥＲ−Ｔｒａｎｓ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（経上皮電気抵抗）
すべての見出しは、読者の便宜を図るためのものであり、別に明記しない限り、見出しに続くテキストの意味を限定するために使用されるべきものではない。
【０１４４】
以下、本発明の好ましい実施形態を項分け記載する。
【０１４５】
実施形態１  
細胞培養インサートであって、
細胞培養デバイスの貯留容器に挿入できるように寸法決めされた本体であって、第１の開放端部、開口部を画成する第２の端部、及び前記第１の開放端部から前記第２の端部に延びる、傾斜を成す1つ以上の側壁を有する本体と、
前記第２の端部の前記開口部の上に配置された多孔質膜と、
を備えたインサート。
【０１４６】
実施形態２
前記第２の端部の前記開口部が、１００μｍ〜１０００μｍの範囲の直径寸法を有する、実施形態１記載の細胞培養インサート。
【０１４７】
実施形態３
前記第２の端部の前記開口部が、２００μｍ〜７５０μｍの範囲の直径寸法を有する、実施形態２記載の細胞培養インサート。
【０１４８】
実施形態４
前記多孔質膜が、微小井戸のアレイを備えた、実施形態１〜３いずれかに記載の細胞培養インサート。
【０１４９】
実施形態５
前記１つ以上の側壁の少なくとも一部が、細胞非接着性である、実施形態１記載の細胞培養インサート。
【０１５０】
実施形態６
前記多孔質膜の少なくとも一部が、細胞非接着性である、実施形態１〜５いずれかに記載の細胞培養インサート。
【０１５１】
実施形態７
前記多孔質膜の少なくとも一部が、細胞接着性である、実施形態１〜６いずれかに記載の細胞培養インサート。
【０１５２】
実施形態８
前記第２の端部に近接する前記１つ以上の側壁の一部が、少なくとも部分的に細胞凝集塊閉じ込め容積を画成する、実施形態１〜７いずれかに記載の細胞培養インサート。
【０１５３】
実施形態９
前記閉じ込め容積の深さが、１００μｍ〜５００μｍの範囲である、実施形態８記載の細胞培養インサート。
【０１５４】
実施形態１０
前記インサート内で培養された細胞による、細胞凝集塊の形成を促進するように構成された、実施形態１〜９いずれかに記載の細胞培養インサート。
【０１５５】
実施形態１１
細胞培養アセンブリであって、
内部を画成し、底部を有する貯留容器と、
実施形態１〜１０いずれかに記載の第１の細胞培養インサートであって、前記本体の前記第２の端部を前記貯留容器の前記底部の上方に保持するように、前記貯留容器の内部に配置されるように構成され、前記本体が内部を画成する、インサートと、
を備えた、細胞培養アセンブリ。
【０１５６】
実施形態１２
前記第１のインサートが、前記貯留容器の前記内部に配置されたとき、前記第１のインサートの前記内部が、前記第１のインサートの前記本体の、前記第２の端部の前記開口部の上に配置された、前記多孔質膜を介してのみ、前記貯留容器の内部と流体連通する、実施形態１１記載の細胞培養アセンブリ。
【０１５７】
実施形態１３
内部を画成する本体を有する第２のインサートであって、前記本体が、第１の開放端部、開口部を画成する第２の端部、及び前記第１の開放端部から前記第２の端部に延びる１つ以上の側壁を有し、前記第２のインサートの前記本体の前記第２の端部を前記第１のインサートの前記本体の前記第２の端部の上方に保持するように、前記第１のインサートの内部に配置されるように構成された、第２のインサートを更に備えた、実施形態１１又は１２記載の細胞培養アセンブリ。
【０１５８】
実施形態１４
前記第２のインサートが、前記第１のインサートの前記内部に配置されたとき、前記第２のインサートの前記内部が、前記第２のインサートの前記本体の、前記第２の端部の前記開口部の上に配置された、多孔質膜を介してのみ、前記第１のインサートの前記内部と流体連通する、実施形態１３記載の細胞培養アセンブリ。
【０１５９】
実施形態１５
実施形態１１〜１４のいずれかに記載の細胞培養アセンブリの貯留容器の内部に、標的細胞及び細胞培養培地を導入して、前記貯留容器の前記底部において、前記標的細胞を増殖させるステップと、
第１の細胞培養インサートを前記貯留容器の前記内部に配置するステップと、
複数の第１の種類の細胞及び細胞培養培地を前記第１の細胞培養インサートの内部に配置して、前記第１のインサートの前記多孔質膜の近傍において、前記第１の種類の細胞を、細胞凝集塊として、増殖させるステップと、
第２の細胞培養インサートを前記第１のインサートの前記内部に配置するステップと、
複数の第２の種類の細胞及び細胞培養培地を前記第２の細胞培養インサートの内部に配置して、前記第２のインサートの前記多孔質膜の近傍において、前記第２の種類の細胞を、細胞凝集塊として、増殖させるステップと、
を備えた方法。
【０１６０】
実施形態１６
前記第２のインサートの前記内部から、前記第１のインサートの前記内部に移動する化合物又はその代謝誘導体が、第２の種類の細胞を通過するように、前記第２の種類の細胞が、前記第２のインサートの前記多孔質膜を覆う、実施形態１５記載の方法。
【０１６１】
実施形態１７
前記第１のインサートの前記内部から、前記貯留容器の前記内部に移動する化合物又はその代謝誘導体が、前記第１の種類の細胞を通過するように、前記第１の種類の細胞が、前記第１のインサートの前記多孔質膜に付着する、実施形態１５記載の方法。
【０１６２】
実施形態１８
試験化合物を前記第２のインサートの前記内部に導入するステップ、及び
前記試験化合物又はその代謝誘導体が、前記標的細胞に与える効果を特定するステップ
を更に備えた、実施形態１５〜１７いずれかに記載の方法。
【０１６３】
実施形態１９
前記第１の種類の細胞が肝細胞である、実施形態１５〜１８いずれかに記載の方法。
【０１６４】
実施形態２０
前記第２の種類の細胞が、Ｃａｃｏ ２細胞である、実施形態１５〜１８いずれかに記載の方法。
【０１６５】
実施形態２1
細胞培養インサートであって、
第１の開放端部、開口部を画成する第２の端部、及び前記第１の開放端部から前記第２の端部に延びる、傾斜を成す１つ以上の側壁を有する本体と、
前記第２の端部の前記開口部の上に配置された多孔質膜であって、細胞非接着性であり、微小井戸のアレイを備えた膜と、
を備えたインサート。
【０１６６】
実施形態２２
前記微小井戸のアレイの微小井戸の少なくとも一部が、超低結合材料でコーティングされた、実施形態２１記載の細胞培養インサート。
【０１６７】
実施形態２３
前記透過性支持体の少なくとも一部が、前記微小井戸のアレイ内で培養された細胞に付着するように構成された、実施形態２１又は２２記載の細胞培養インサート。
【０１６８】
実施形態２４
微小井戸の少なくとも一部が、弓形形状を含む、実施形態２１〜２３いずれかに記載の細胞培養インサート。
【０１６９】
実施形態２５
前記微小井戸の少なくとも一部が、円錐形状を含む、実施形態２１〜２４いずれかに記載の細胞培養インサート。
【０１７０】
実施形態２６
前記微小井戸の一部が、閉じ込め容積を画成する、実施形態２１〜２５いずれかに記載の細胞培養インサート。
【０１７１】
実施形態２７
前記閉じ込め容積の直径寸法が、２００μｍ〜５００μｍの範囲である、実施形態２６記載の細胞培養インサート。
【０１７２】
実施形態２８
細胞培養インサートであって、
第１の開放端部、第２の端部、及び前記第１の開放端部から前記第２の端部に延びる１つ以上の側壁を有する本体を備え、
前記第２の端部が、微小井戸のアレイを有する基板を備えた、インサート。
【０１７３】
実施形態２９
前記側壁が傾斜を成す、実施形態２８記載の細胞培養インサート。
【０１７４】
実施形態３０
前記側壁が、細胞非接着性である、実施形態２８又は２９記載の細胞培養インサート。
【０１７５】
実施形態３１
微小井戸のアレイを有する前記基板の少なくとも一部が、細胞非接着性である、実施形態２８〜３０いずれかに記載の細胞培養インサート。
【０１７６】
実施形態３２
前記井戸が、上部開口部を画成する内面を有すると共に、前記上部開口部において、１００μｍ〜１０００μｍの範囲の直径寸法を有する、実施形態２８〜３１いずれかに記載の細胞培養インサート。
【０１７７】
実施形態３３
前記井戸が、１００μｍ〜５００μｍの範囲の深さを有する、実施形態２８〜３２いずれかに記載の細胞培養インサート。
【０１７８】
実施形態３４
微小井戸のアレイを有する前記基板の少なくとも一部が、細胞非接着性である、実施形態２８〜３３いずれかに記載の細胞培養インサート。
【０１７９】
実施形態３５
微小井戸のアレイを有する前記基板の少なくとも一部が、細胞接着性である、実施形態２８〜３４いずれかに記載の細胞培養インサート。
【０１８０】
実施形態３６
微小井戸のアレイを有する前記基板の少なくとも一部が、多孔質である、実施形態２８〜３５いずれかに記載の細胞培養インサート。
【０１８１】
実施形態３７
微小井戸のアレイを有する前記基板の少なくとも一部が、開口部を備えた、実施形態２８〜３６いずれかに記載の細胞培養インサート。
【０１８２】
実施形態３８
微小井戸のアレイを有する前記基板が、多孔質膜に接着、固定、又は並置された、実施形態２８〜３７いずれかに記載の細胞培養インサート。
【０１８３】
実施形態３９
前記第２の端部が、多孔質膜で覆われた、実施形態２８〜３８いずれかに記載の細胞培養インサート。
【０１８４】
実施形態４０
微小井戸のアレイを有する前記基板が、傾斜面を備えた、実施形態２８〜３９いずれかに記載の細胞培養インサート。
【０１８５】
実施形態４１
微小井戸のアレイを有する前記基板が、六角形構造体のアレイを備えた、実施形態２８〜４０いずれかに記載の細胞培養インサート。
【符号の説明】
【０１８６】
１００、１０５、１０６  細胞凝集塊促進細胞培養インサート
１０１                  第１の開放端部
１０２                  第２の端部
１１０、４１０          側壁
１１５                  傾斜部分
１２０                  多孔質膜
１５０、１５１          貯留容器
１３０                  レッジ
２００                  細胞凝集塊
３００                  細胞培養インサート
４００                  細胞凝集塊促進井戸
５００                  細胞培養装置
６００                  入れ子式透過性支持デバイス
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
0006731916.tif 000008
【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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