(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
PDL-1分子であって、前記PDL-1分子のアミノ酸配列は、配列番号5〜8、14、19〜31および33から選ばれる一つであり、前記PDL-1分子とPD-1分子の親和力は、野生型PDL-1分子とPD-1分子との親和力の少なくとも5倍であることを特徴とする、前記PDL-1分子。
【請求項２】
請求項1に記載のPDL-1分子を含むことを特徴とする、融合タンパク質。
【請求項３】
前記融合タンパク質が、さらにhIgG4Fcを含むことを特徴とする、請求項2に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
多価のPDL-1複合体であって、少なくとも2つのPDL-1分子を含み、かつそのうちの少なくとも1つのPDL-1分子が、請求項1に記載のPDL-1分子であるか、あるいは、少なくとも1つの請求項2または3に記載の融合タンパク質を含むことを特徴とする、前記複合体。
【請求項５】
2価のPDL-1複合体、3価のPDL-1複合体または4価のPDL-1複合体であることを特徴とする、請求項4に記載の多価のPDL-1複合体。
【請求項６】
請求項1に記載のPDL-1分子、請求項2または3に記載の融合タンパク質、あるいは、請求項4または5に記載の多価のPDL-1複合体をコードする核酸配列またはその相補配列を含むことを特徴とする、核酸分子。
【請求項７】
請求項6に記載の核酸分子を含むことを特徴とする、ベクター。
【請求項８】
請求項7に記載のベクターを含むか、あるいは染色体に外来の請求項6に記載の核酸分子が組み込まれていることを特徴とする、宿主細胞。
【請求項９】
薬学的に許容される担体と、請求項1に記載のPDL-1分子、または請求項2または3に記載の融合タンパク質、または請求項4または5に記載のPDL-1複合体とを含むことを特徴とする、薬物組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、さらにImmTACおよび/またはHATacを含むことを特徴とする、請求項9に記載の薬物組成物。
【請求項１１】
腫瘍を治療するための、請求項9または10に記載の薬物組成物。
【請求項１２】
請求項1に記載のPDL-1分子、または請求項2または3に記載の融合タンパク質、請求項4または5に記載のPDL-1複合体の使用であって、腫瘍を治療する薬物の製造に使用されることを特徴とする、前記使用。
【請求項１３】
請求項1に記載のPDL-1を製造する方法であって、
（i）請求項8に記載の宿主細胞を培養することによって、請求項1に記載のPDL-1分子を発現する工程と、
（ii）前記のPDL-1分子を単離または精製する工程と、
を含むことを特徴とする、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物技術の分野に関し、より具体的に、プログラム細胞死受容体（Programmed Death-1、PD-1）分子に対して高親和力を有する可溶性プログラム細胞死受容体リガンド（Programmed Death Ligand-1、PDL-1）分子、および当該分子の製造方法と使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
PD-1は活性化したT細胞およびB細胞で発現される免疫抑制性受容体である。PDL-1はPD-1のリガンドで、B7ファミリーに属し、IgVおよびIgC様領域、膜貫通領域および細胞質領域の尾部を有し、PDL-1はリンパ球における受容体PD-1と相互作用し、免疫応答の負調節において重要な役目を果たす。多くの腫瘍細胞系および腫瘍細胞はPDL-1分子を高発現し（Konishi Jら， Clin.Cancer Res.，2004，10(15): 5094−5100）、それがリンパ球の表面におけるPD-1分子と結合すると、生体の抗腫瘍免疫応答を弱める（Radziewicz Hら，J Virol，2007，81（6): 2545−2553）ことで、腫瘍の免疫逃避の発生につながる。研究では、子宮頸癌および肝臓癌において、半分近くの腫瘍浸潤CD8+ T細胞はPD-1分子を発現し、それが腫瘍細胞によって発現されるPDL-1と結合すると、CTL細胞の消耗およびアポトーシスにつながる（Dong Hら,J Mol Med (Berl)，2003，81(5):281−287;Karim Rら，Clin Cancer Res,2009，15(20):6341−6347; Zhao Qら,Eur J Immunol,2011,41(8):2314−2322)。
【０００３】
上記免疫逃避の課題に対し、リンパ球の表面におけるPD1と腫瘍細胞の表面におけるPDL-1の相互作用を遮断すると、リンパ球の免疫性を向上させることができるため、免疫系による腫瘍細胞の除去に有利である。この課題に対し、大量の研究が行われた。浸潤性膵癌のネズミモデルにおいて、T.Nomiら(Clin.Cancer Res.13：2151-2157(2007))はPD-1とPDL-1の相互作用に対する遮断の治療効果を証明した。当業者は、リンパ球の殺傷能力を向上させる有効な手段を見つけるために、PD-1とPDL-1の相互作用の研究に取り込んでいる。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の目的は、PD-1分子に対して高親和力を有するPDL-1分子を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、上記高親和力のPDL-1分子の製造方法と使用を提供することである。
【０００５】
本発明の第一の側面では、配列番号1で示されるアミノ酸配列に突然変異を含有してなるPDL-1分子を提供する。
もう一つの好適な例において、前記PDL-1分子のアミノ酸配列は配列番号1で示されるアミノ配列に基づき、かつ配列番号1で示されるアミノ配列に対して1個または複数個のアミノ酸残基の突然変異またはアミノ酸残基の挿入を行うことによって前記PDL-1分子を得る。
もう一つの好適な例において、前記PDL-1分子のアミノ酸配列は配列番号1で示されるアミノ配列と少なくとも90％（好ましくは少なくとも92％、より好ましくは少なくとも94％）の配列相同性を有する。
【０００６】
もう一つの好適な例において、前記PDL-1分子とPD-1分子の親和力は野生型PDL-1分子とPD-1分子の親和力の少なくとも2倍、好ましくは少なくとも5倍、より好ましくは少なくとも10倍、最も好ましくは少なくとも50倍である。
もう一つの好適な例において、前記PDL-1分子とPD-1分子の親和力は野生型PDL-1分子とPD-1分子の親和力の少なくとも100倍、好ましくは少なくとも200倍、より好ましくは少なくとも500倍である。
【０００７】
もう一つの好適な例において、前記PDL-1分子における突然変異のアミノ酸残基の部位は1〜3、35〜50、および/または95〜105番目のアミノ酸残基のうちの1個または複数個で、ここで、アミノ酸残基の番号に配列番号1で示される番号が使用される。
もう一つの好適な例において、前記PDL-1分子における突然変異のアミノ酸残基の部位は1、36〜40、47〜48および/または95〜101番目のアミノ酸残基のうちの1個または複数個で、ここで、アミノ酸残基の番号に配列番号1で示される番号が使用される。
【０００８】
もう一つの好適な例において、突然変異のアミノ酸残基の部位の数はnで、ここで、1≦n≦15、好ましくは3≦n≦11、より好ましくは4≦n≦10で、たとえばnは5、6、7、8、9、10でもよい。もう一つの好適な例において、前記PDL-1分子における突然変異のアミノ酸残基の部位は1F、36I、38Y、40E、47I、48Q、95R、97M、99S、101Gのうちの1個または複数個を含むか、あるいは102Gの後ろに1個または複数個のアミノ酸の挿入があり、ここで、アミノ酸残基の番号に配列番号1で示される番号が使用される。
【０００９】
もう一つの好適な例において、前記PDL-1分子における突然変異のアミノ酸残基の部位は36I、38Y、および40Eを含み、ここで、アミノ酸残基の番号に配列番号1で示される番号が使用される。
もう一つの好適な例において、前記PDL-1分子における突然変異のアミノ酸残基の部位はさらに40E、および47Iを含み、ここで、アミノ酸残基の番号に配列番号1で示される番号が使用される。
【００１０】
もう一つの好適な例において、前記PDL-1分子における突然変異のアミノ酸残基の部位はさらに95R、および97Mを含み、ここで、アミノ酸残基の番号に配列番号1で示される番号が使用される。
もう一つの好適な例において、突然変異したPDL-1分子は1W；36Q、36E、36Tまたは36N；38F、38N、38Hまたは38A；40M、40F、40L、40Wまたは40Y；47L、47V、47F、47S、47Y、47Pまたは47A；48S；95T、95Vまたは95L；97L；99Gまたは99A；101D、101K、101Eまたは101H；102Gの後ろに挿入されたアミノ酸Gからなる群から選ばれる1個または複数個を含み、ここで、アミノ酸残基の番号に配列番号1で示される番号が使用される。
【００１１】
もう一つの好適な例において、前記PDL-1分子は、
36Q、38H、および40F、あるいは
36E、38H、および40F、あるいは
36Q、38F、および40M、あるいは
36Q、38F、および40M
を含み、ここで、アミノ酸残基の番号に配列番号1で示される番号が使用される。
もう一つの好適な例において、前記PDL-1分子はさらに48Sを含み、ここで、アミノ酸残基の番号に配列番号1で示される番号が使用される。
【００１２】
もう一つの好適な例において、前記PDL-1分子はさらに
47V、および48S、あるいは
47F、および48S
を含み、ここで、アミノ酸残基の番号に配列番号1で示される番号が使用される。
もう一つの好適な例において、前記PDL-1分子はさらに97Lを含み、ここで、アミノ酸残基の番号に配列番号1で示される番号が使用される。
もう一つの好適な例において、前記PDL-1分子はさらに
95T、97L、99G、および101K、あるいは
95V、97L、99A、および101K
を含み、ここで、アミノ酸残基の番号に配列番号1で示される番号が使用される。
【００１３】
もう一つの好適な例において、前記PDL-1分子のアミノ酸配列は配列番号5〜34から選ばれる一つである。
もう一つの好適な例において、前記PDL-1分子は可溶性のものである。
もう一つの好適な例において、前記PDL-1分子のC末端またはN末端に抱合体が結合している。
もう一つの好適な例において、前記PDL-1分子に結合した抱合体はT細胞受容体で、好ましくは、前記T細胞受容体は高親和性のT細胞受容体である。
【００１４】
本発明の第二の側面では、本発明の第一の側面に記載のPDL-1分子を含む融合タンパク質を提供する。
もう一つの好適な例において、前記融合タンパク質はさらにhIgG4Fcを含む。
本発明の第三の側面では、多価のPDL-1複合体であって、少なくとも2つのPDL-1分子を含み、かつそのうちの少なくとも1つのPDL-1分子は本発明の第一の側面に記載のPDL-1分子であるか、あるいは少なくとも1つの本発明の第二の側面に記載の融合タンパク質を含む複合体を提供する。
【００１５】
本発明の第四の側面では、本発明の第一の側面に記載のPDL-1分子、本発明の第二の側面に記載の融合タンパク質、あるいは本発明の第三の側面に記載の多価のPDL-1複合体をコードする核酸配列またはその相補配列を含む核酸分子を提供する。
本発明の第五の側面では、本発明の第四の側面に記載の核酸分子を含むベクターを提供する。
本発明の第六の側面では、本発明の第五の側面に記載のベクターを含有するか、あるいは染色体に外来の本発明の第四の側面に記載の核酸分子が組み込まれた宿主細胞を提供する。
【００１６】
本発明の第七の側面では、薬学的に許容される担体と、本発明の第一の側面に記載のPDL-1分子、または本発明の第二の側面に記載の融合タンパク質、または本発明の第三の側面に記載のPDL-1複合体とを含有する薬物組成物を提供する。
もう一つの好適な例において、前記薬物組成物はさらにImmTACおよび/またはHATacを含む。
本発明の第八の側面では、疾患を治療する方法であって、治療が必要な対象に本発明の第一の側面に記載のPDL-1分子、本発明の第二の側面に記載の融合タンパク質、または本発明の第三の側面に記載のPDL-1複合体、または本発明の第七の側面に記載の薬物組成物を施用することを含む方法を提供する。
もう一つの好適な例において、前記疾患は腫瘍である。
【００１７】
本発明の第九の側面では、腫瘍を治療する薬物の製造における、本発明の第一の側面に記載のPDL-1分子、本発明の第二の側面に記載の融合タンパク質、または本発明の第三の側面に記載のPDL-1複合体の使用を提供する。
本発明の第十では、本発明の第一に記載のPDL-1を製造する方法であって、
（i） 本発明の第六に記載の宿主細胞を培養することによって、本発明の第一の側面に記載のPDL-1分子を発現させる工程と、
（ii） 前記のPDL-1分子を単離または精製する工程と、
を含む方法を提供する。
【００１８】
もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴および下記（たとえば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組合せ、新しい、または好適な技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図1aと図1bは、それぞれ野生型PDL-1分子の細胞外のアミノ酸配列とヌクレオチド配列である。
【図２】図2は、野生型PDL-1タンパク質の精製後のSDS-PAGEゲルの写真である。
【図３】図3aと図3bは、それぞれ本発明の実施例2で再生、精製されたPD-1のアミノ酸配列とヌクレオチド配列である。
【図４】図4は、野生型PDL-1分子とPD-1分子の結合のBIAcoreのグラフである。
【図５−１】図5は、本発明の高親和性PDL-1分子のアミノ酸配列で、突然変異または挿入のアミノ酸残基は下線で表される。
【図５−２】図5は、本発明の高親和性PDL-1分子のアミノ酸配列で、突然変異または挿入のアミノ酸残基は下線で表される。
【図５−３】図5は、本発明の高親和性PDL-1分子のアミノ酸配列で、突然変異または挿入のアミノ酸残基は下線で表される。
【図５−４】図5は、本発明の高親和性PDL-1分子のアミノ酸配列で、突然変異または挿入のアミノ酸残基は下線で表される。
【図５−５】図5は、本発明の高親和性PDL-1分子のアミノ酸配列で、突然変異または挿入のアミノ酸残基は下線で表される。
【図５−６】図5は、本発明の高親和性PDL-1分子のアミノ酸配列で、突然変異または挿入のアミノ酸残基は下線で表される。
【００２０】
【図６】図6aと図6bは、それぞれImmTAC(1G4)のα鎖とβ鎖のアミノ酸配列である。
【図７】図7は、本発明の高親和力PDL-1分子が顕著にImmTAC(1G4)によるPBMCの腫瘍細胞に対する殺傷を向上させることを示す。
【図８】図8aは、hIgG4Fc分子のアミノ酸配列である。図8bは、hIgG4Fc分子のヌクレオチド配列である。
【図９】図9は、野生型PDL1-hIgG4Fc融合タンパク質の精製後のSDS-PAGEゲルの写真である。
【図１０−１】図10aは、本発明の高親和力PDL1-hIgG4Fc融合タンパク質が顕著にImmTAC(1G4)によるPBMCの腫瘍細胞Mel624に対する殺傷を向上させることを示す。図10bは、本発明の高親和力PDL1-hIgG4Fc融合タンパク質が顕著にImmTAC(1G4)によるPBMCの腫瘍細胞NCI-H1299に対する殺傷を向上させることを示す。
【図１０−２】図10cは、本発明の高親和力PDL1-hIgG4Fc融合タンパク質が顕著にImmTAC(1G4)によるPBMCの腫瘍細胞IM9に対する殺傷を向上させることを示す。図10dは、本発明の高親和力PDL1-hIgG4Fc融合タンパク質が顕著にImmTAC(1G4)によるPBMCの腫瘍細胞MDA-MB-231に対する殺傷を向上させることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
具体的な実施形態
本発明者は幅広く深く研究したところ、意外にPD-1分子に対して高親和力を有する可溶性PDL-1分子が有効にリンパ球の殺傷能力を向上させることを見出した。そのため、本発明はPD-1に対する親和力が野生型PDL-1分子のPD-1に対する親和力の少なくとも2倍である可溶性の高親和力PDL-1分子を提供する。
具体的に、本発明に係るPDL-1分子は配列番号1で示されるアミノ酸配列に突然変異を含有する。より具体的に、前記PDL-1分子のアミノ酸配列は配列番号1で示されるアミノ配列と少なくとも90％の配列相同性を有する。
【００２２】
本発明を説明する前、方法および条件は変更することができるため、本発明は記載される具体的な方法および実験条件に限定されないと理解される。また、本明細書で用いられる用語は具体的な実施形態の説明だけを目的とし、かつその意図は限定性のものではなく、本発明の範囲は添付の請求の範囲だけに限定されると理解される。
別途に定義しない限り、本明細書で用いられるすべての技術と科学の用語はいずれも本発明が属する分野の当業者が通常理解する意味と同様である。
本発明の実施またはテストにおいて本発明における記載と類似または等価の任意の方法と材料を使用することができるが、本明細書で好適な方法と材料が挙げられた。
【００２３】
用語
野生型PDL-1分子：本発明に係る野生型PDL-1分子とは、野生型PDL-1分子の細胞外領域で、そのアミノ酸配列とヌクレオチド配列はそれぞれ図1aと図1bに示す。
PBMC：末梢血単核球（PBMC）は円形の細胞核を有する血球で、たとえばリンパ球や単核球が挙げられる。これらの血球は免疫系の感染に抵抗して侵入者に適応する要素である。リンパ球類はT細胞（CD4とCD8陽性は約75％）、B細胞およびNK細胞（合計約25％）からなる。
高親和性T細胞受容体：そのリガンドとの親和力が相応する野生型T細胞受容体とそのリガンドの親和力の少なくとも2倍であるT細胞受容体をいう。
【００２４】
腫瘍：病理学的分類や侵入の段階にかかわらず、すべての種類の癌細胞増殖または発癌過程、転移性組織または悪性転化細胞、組織または器官を含む。腫瘍の実施例は固形腫瘍、軟部組織腫瘍や転移性病巣を含むが、これらに限定されない。固形腫瘍の実施例は様々な器官・系の悪性腫瘍、たとえば肉腫、肺扁平上皮癌や癌を含む。たとえば、感染した前立腺、肺、乳房、リンパ、胃腸（たとえば結腸）、および尿生殖路（たとえば腎臓、上皮細胞）、咽頭が挙げられる。肺扁平上皮癌は悪性腫瘍、たとえば大半の結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、小腸癌や食道癌を含む。上記癌の転移性病巣は同様に本発明の方法および組成物で治療および予防することができる。
【００２５】
薬用担体：賦形剤または安定化剤とも呼ばれ、使用量および濃度はそれに露出する細胞や個体に毒性がない。通常、生理的に許容される担体はpH緩衝の水溶液である。生理的に許容される担体の例はリン酸塩、クエン酸塩やほかの有機酸のような緩衝剤、アスコルビン酸を含む酸化防止剤、低分子量(約10個の残基未満)ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンや免疫グロブリンのようなタンパク質、ポリビニルピロリドンのような親水性重合体、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンやリシンのようなアミノ酸、ブドウ糖、マンノースやデキストリンを含む単糖、二糖やほかの糖類、EDTAのような錯化剤、マンニトールやソルビトールのような糖アルコール、ナトリウムのような塩形成対イオン、および/またはTWEENTM、ポリエチレングリコール(PEG)やPLURONICSTMのようなノニオン性界面活性剤を含む。
【００２６】
発明の詳述
PD-1は活性化したT細胞およびB細胞で発現される免疫抑制性受容体である。PDL-1はPD-1のリガンドで、B7ファミリーに属し、IgVおよびIgC様領域、膜貫通領域および細胞質領域の尾部を有し、PDL-1はリンパ球における受容体PD-1と相互作用し、免疫応答の負調節において重要な役目を果たす。本発明者は幅広く深く研究したところ、意外にPD-1分子に対して高親和力を有する可溶性PDL-1分子が有効にリンパ球の殺傷能力を向上させることを見出した。そのため、本発明はPD-1に対する親和力が野生型PDL-1分子のPD-1に対する親和力の少なくとも2倍である可溶性の高親和力PDL-1分子を提供する。
【００２７】
任意の適切な方法によって上記PDL-1分子とPD-1の結合親和力（解離平衡定数KDに反比例する）および結合半減期（T1/2で表される）を測定することができる。もちろん、親和力が倍になると、KDが半減する。T1/2の計算はIn2を解離速度（Koff）で割ることによる。そのため、Koffが倍になると、T1/2が半減する。好ましくは同じ試験プロトコールによって結合親和力または結合半減期を数回、たとえば3回またはそれ以上検出し、結果の平均値を取る。好適な実施形態において、本発明の実施例における表面プラスモン共鳴（BIAcore）法によってこれらの検出を行う。
【００２８】
当該方法によって検出された本発明における野生型PDL-1分子のPD-1分子に対する解離平衡定数KDは2.462E-05Mで、そのBIAcore結合グラフを図4に示す。親和力が倍になると、KDが半減するため、検出された高親和力PDL-1分子のPD-1分子に対する解離平衡定数KDが1.231 E-05Mである場合、当該高親和力PDL-1分子のPD-1分子に対する親和力が野生型PDL-1分子のPD-1に対する親和力の2倍であることが示される。当業者に熟知のKD値の単位間の換算関係は、1M=1000μM、1μM=1000nM、1nM=1000pMである。
【００２９】
本発明の一つの好適な例において、本発明の好適な親和力を測定する手段によって測定される本発明のPDL-1分子とPD-1分子の親和力は野生型PDL-1分子とPD-1分子の親和力の少なくとも2倍、好ましくは少なくとも5倍、より好ましくは少なくとも10倍、最も好ましくは少なくとも50倍である。
【００３０】
もう一つの好適な例において、前記PDL-1分子とPD-1分子の親和力は野生型PDL-1分子とPD-1分子の親和力の少なくとも100倍、好ましくは少なくとも200倍、より好ましくは少なくとも500倍である。
【００３１】
具体的に、本発明の高親和力PDL-1分子とPD-1の親和力はKD≦1.231E-05M、好ましくは、1.0E-06M≦KD≦1.0 E-05M、より好ましくは、1.0E-07M≦KD≦1.0 E-06M、最も好ましくは、1.0E-08M≦KD≦1.0 E-07Mである。
【００３２】
本発明の高親和力PDL-1分子は配列番号1で示されるアミノ酸配列に1個または複数個の突然変異を含有する。具体的に、前記PDL-1分子のアミノ酸配列は配列番号1で示されるアミノ配列と少なくとも90％（好ましくは少なくとも92％、より好ましくは少なくとも94％、たとえば95％、96％、97％、98％、99％）の配列相同性を有する。
【００３３】
より具体的に、本発明の高親和力PDL-1分子における突然変異のアミノ酸残基の部位は1F、36I、38Y、40E、47I、48Q、95R、97M、99S、101Gのうちの1個または複数個を含むか、あるいは102Gの後ろに1個または複数個のアミノ酸の挿入があり、ここで、アミノ酸残基の番号に配列番号1で示される番号が使用される。
【００３４】
もう一つの好適な例において、突然変異したPDL-1分子は1W；36Q、36E、36Tまたは36N；38F、38N、38Hまたは38A；40M、40F、40L、40Wまたは40Y；47L、47V、47F、47S、47Y、47Pまたは47A；48S；95T、95Vまたは95L；97L；99Gまたは99A；101D、101K、101Eまたは101H；102Gの後ろに挿入されたアミノ酸Gからなる群から選ばれる1個または複数個を含み、ここで、アミノ酸残基の番号に配列番号1で示される番号が使用される。
【００３５】
もう一つの好適な例において、前記PDL-1分子のアミノ酸配列は配列番号5〜34から選ばれる一つである。
可溶性の高親和力PDL-1分子を得るために、本発明で使用される野生型PDL-1分子は膜貫通領域を含まない。そのため、本発明の一つの好適な例において、前記PDL-1分子は可溶性のものである。
【００３６】
任意の適切な方法で突然変異をさせてもよく、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によるもの、制限酵素によるクローンまたはライゲーション非依存的なクローン化（LIC）方法を含むが、これらに限定されない。多くの標準の分子生物学教材ではこれらの方法が詳記されている。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の誘導および制限酵素によるクローンの詳細は、SambrookおよびRussell, (2001) 「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」（Molecular Cloning-A Laboratory Manual）(第三版)CSHL出版社を参照する。LIC方法の詳細な情報はRashtchian,(1995)Curr Opin Biotechnol 6(1):30-6を参照する。
【００３７】
本発明の高親和力PDL-1分子を生成する方法は、文献(Liら, (2005)Nature Biotech 23(3):349-354)に記載されるように、このようなPDL-1分子をディスプレイするファージ顆粒の多様性ライブラリーかPD-1に対して高親和性を有するPDL-1を選別する方法でもよいが、これに限定されない。
もちろん、本発明の野生型PDL-1を発現する遺伝子または少し修飾された本発明の野生型PDL-1を発現する遺伝子はいずれも鋳型鎖の調製のために使用することができる。その後、当該鋳型鎖をコードするDNAに本発明の高親和力PDL-1の生成に必要な変更を導入する。
【００３８】
本発明のPDL-1は、多価複合体の様態で提供することもできる。本発明の多価PDL-1は2つ、3つ、4つまたはそれ以上の本発明のPDL-1分子が互いに結合してなる多量体を含み、本発明の実施例5に記載されるように、IgG FC断片で二量体を調製してもよく、あるいはp53の四量体ドメインで四量体を生成させてもよく、あるいは複数の本発明のPDL-1がもう一つの分子と結合してなる複合体でもよい。
本発明の高親和力PDL-1分子は単独で使用してもよく、抱合体と共役またはほかの様態で結合してもよく、好ましくは共役の様態で結合してもよい。好ましくは、前記抱合体はT細胞受容体で、より好ましくは、前記T細胞受容体は高親和性のT細胞受容体である。
【００３９】
本発明の高親和力PDL-1分子はほかの分子と併用し、有効な協同作用を果たすこともできる。好ましくは、前記ほかの分子はImmTACまたはHATacである。2種類の分子はいずれもT細胞の標的を改めることによって、標的細胞を殺傷する作用を果たすことができる。前記ImmTAC分子はαβ定常領域の間に人工的鎖間ジスルフィド結合を含有する可溶性二本鎖TCR分子と抗CD3抗体の融合分子で、具体的に文献(Joanne Oates， Bent K. Jakobsen.（ImmTACs）Novel bi-specific agents for targeted cancer thrapy. OncoImmunology2:2,e22891, February2013)を参照する。前記HATac分子は高親和性T細胞活性化コア（High Affinity T-cell activation core）で、その一つの形態は疎水コアが突然変異したα鎖とβ鎖の可変ドメインが連結してなる可溶性一本鎖TCR分子と抗CD3抗体の融合分子でもよいが、前記可溶性一本鎖TCR分子の詳細は特許文献WO2014/206304を参照する。
【００４０】
また、本発明は、本発明のPDL-1をコードする核酸分子に関する。本発明の核酸分子は、DNA形態でもRNA形態でもよい。DNAは、コード鎖でも非コード鎖でもよい。たとえば、本発明TCRをコードする核酸配列は本発明の図面で示される核酸配列と同様のものでもよく、縮重変異体でもよい。例を挙げて「縮重変異体」の意味を説明すると、本明細書で用いられるように、「縮重変異体」とは本発明において配列番号1を有するタンパク質配列をコードするが、配列番号2の配列と違う核酸配列をいう。
【００４１】
本発明の核酸分子の全長配列あるいはその断片は、通常、PCR増幅法、組換え法または人工合成の方法で得られるが、これらに限定されない。現在、本発明のPDL-1（またはその断片、あるいはその誘導体）をコードするDNA配列は完全に化学合成で獲得することがすでに可能である。さらに、このDNA配列を本分野で周知の各種の既知のDNA分子（或いはベクターなど）や細胞に導入してもよい。
【００４２】
本発明は、本発明の核酸分子を含むベクター、および本発明のベクターまはたコード配列で遺伝子工学によって生成する宿主細胞にも関する。
また、本発明は、薬学的に許容される担体と、本発明のPDL-1、または本発明のPDL-1複合体とを含有する薬物組成物を提供する。
また、本発明は、疾患を治療する方法であって、治療が必要な対象に本発明のPDL-1、または本発明のPDL-1複合体、または本発明の薬物組成物を施用することを含む方法を提供するが、特に、本発明のPDL-1分子はほかの分子と併用し、好ましくは、ほかの分子はImmTACまたはHATacである。
【００４３】
もちろん、ここで、アミノ酸の名称は、世界中に汎用の一文字のアルファベットの表示を使用し、その相応するアミノ酸の名称の三文字のアルファベットの略称はそれぞれAla (A)、Arg (R)、Asn (N)、Asp (D)、Cys (C)、Gln (Q)、Glu (E)、Gly (G)、His (H)、Ile (I)、Leu (L)、Lys (K)、Met (M)、Phe (F)、Pro (P)、Ser (S)、Thr (T)、Trp (W)、Tyr (Y)、Val (V)である。本分野において、機能が近い、または類似のアミノ酸で置換する場合、通常、蛋白質の機能を変えることがない。C末端および/またはN末端への1つまたは2つ以上のアミノ酸の付加も、通常、蛋白質の構造と機能を変えることはない。
【００４４】
本発明は、さらに、本発明のPDL-1を少し修飾したPDL-1分子を含む。 修飾（通常は一次構造が変わらない）形態は、本発明のPDL-1の化学的に誘導された形態、たとえばアセチル化またはカルボキシ化を含む。修飾は、さらに、グリコシル化、たとえば本発明のPDL-1の合成および加工でまたはさらなる加工の工程でグリコシル化修飾を行ってなるPDL-1分子も含む。このような修飾は、PDL-1をグルコシル化する酵素（たとえば哺乳動物のグリコシル化酵素または脱グリコシル化酵素）に露出させることによって完成する。修飾形態は、さらにリン酸化アミノ酸残基（例えばリン酸チロシン、リン酸セリン、リン酸トレオニン）を有する配列を含む。さらに、修飾によって抗タンパク質加水分解性を向上させたPDL-1または溶解性を改善したPDL-1を含む。
【００４５】
本発明のPDL-1またはPDL-1複合体は、薬学的に許容される担体とともに薬物組成物で提供することができる。本発明のPDL-1またはPDL-1複合体は、通常、無菌薬物組成物の一部として提供され、前記組成物は、通常、薬学的に許容される担体を含む。この薬物組成物は、任意の適切な様態でもよい（患者への投与に必要な方法によって決まる）。単位剤形で提供してもよいが、通常、密封の容器に入って提供され、キットの一部として提供してもよい。このようなキットは、取り扱い説明書を含むが、必ず必要なものではない。複数の前記単位剤形を含んでもよい。また、本発明のPDL-1は、単独で使用してもよく、ほかの治療剤と結合または抱合して併用してもよい（たとえば同一の薬物組成物に配合される）。
【００４６】
薬物組成物は、さらに、薬学的に許容される担体を含有してもよい。用語の「薬学的に許容される担体」とは、治療剤の投与のために使用される担体である。当該用語は、自身がその組成物を受ける個体に有害な抗体を誘導せず、且つ投与後過剰な毒性がないという条件を満足するような薬剤担体を指す。これらの担体は、本分野の技術者に熟知である。「レミントンの医薬科学」（Remington's Pharmaceutical Sciences（Mack Pub. Co.，N.J. 1991年））において、薬学的に允許される賦形剤に関する十分な検討が見つけられる。このような担体は、食塩水、緩衝液、ブドウ糖、水、グリセリン、エタノール、佐剤、及びその組合せを含むが、これらに限定されない。
【００４７】
治療性組成物において、薬学的に許容される担体は液体、例えば水、塩水、グリセリンやエタノールを含んでもよい。さらに、これらの担体には、補助的な物質、例えば湿潤剤或いは乳化剤、pH緩衝物質等が存在してもよい。通常、治療性組成物は注射剤、例えば液体溶液または懸濁液に調製してもよく、注射直前に溶液または懸濁液に配合することに適する液体ビヒクルの固体形態に調製してもよい。本発明の組成物にすれば、通常の経路で給与することができ、眼内、筋肉内、静脈内、皮下、皮内、あるいは局部給与を含むが、これらに限られない。好ましくは胃腸外で、皮下、筋肉内または静脈内を含む。予防・治療する対象は、動物、特にヒトでよい。
【００４８】
本発明の薬物組成物が実際に治療に使用される場合、使用の状況に合わせて様々な異なる剤形の薬物組成物としてもよい。好ましくは、注射剤、経口投与剤などが挙げられる。これらの薬物組成物は、通常の方法によって混合、希釈または溶解で配合することができ、かつ適切な薬物添加剤、たとえば賦形剤、崩壊剤、バインダー、潤滑剤、希釈剤、緩衝剤、等張化剤（isotonicities）、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤や溶解助剤などを添加することもあり、またこの配合過程は剤形に合わせて通常の方法で行うことができる。
【００４９】
また、本発明の薬物組成物は、徐放剤の様態で投与することもできる。たとえば、本発明のPDL-1は、徐放重合体を担体とするピルまたはマイクロカプセルに配合し、さらにこのピルまたはマイクロカプセルを手術で治療される組織に移植することができる。徐放重合体の例として、エチレン-酢酸ビニル共重合体、ポリヒドロメタクリレート（polyhydrometaacrylate）、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、乳酸重合体、乳酸-グリコール酸共重合体などが挙げられ、好ましくは生分解可能な重合体、たとえば乳酸重合体および乳酸-グリコール酸共重合体が挙げられる。
【００５０】
本発明の薬物組成物が実際に治療に使用される場合、活性成分としての本発明のPDL-1またはPDL-1複合体その薬学的に許容される塩の投与量は、治療される患者それぞれの体重、年齢、性別、症状の程度によって合理的に決定することができるが、最終的に合理的な投与量は医師によって決められる。
【００５１】
本発明の主な利点は以下の通りである。
（1） 本発明は、PD-1に対して高親和力を有するPDL-1分子を得た。
（2） 本発明の高親和力PDL-1分子は有効にリンパ球の殺傷能力を向上させることができる。
以下の具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。下記実施例で具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、たとえばSambrookおよびRussellら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」（Molecular Cloning-A Laboratory Manual）（第三版）(2001) に記載の条件などの通常の条件に、あるいは、メーカーのお薦めの条件に従う。特に断らない限り、％と部は、重量で計算される。以下、実施例で使用された実験材料および試薬は、特に説明しない限り、いずれも市販品として得られる。
【００５２】
実施例1  野生型PDL-1の発現、再生および精製
野生型PDL-1の細胞外アミノ酸配列およびヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号1および2で、図1aおよび図1bに示すように、野生型PDL-1の細胞外配列を含む標的遺伝子をNcoIおよびNotIで二重酵素切断し、NcoIおよびNotIで二重酵素切断されたpET28aベクターに連結させた。連結物をE.coli DH5αに形質転換させ、カナマイシン含有LBプレートを塗布し、37℃で逆さまで一晩培養し、陽性クローンを取ってPCR選別を行い、陽性組換え体に対して配列決定を行い、配列が正確と確認されたら組換えプラスミドを抽出してE.coli BL21(DE3)に形質転換させ、発現に使用した。
【００５３】
上記組換えプラスミドpET28a-PDL-1を含有するBL21(DE 3)集落を全部カナマイシン含有LB培地に接種し、37℃でOD600が0.6〜0.8になるまで培養し、最終濃度が0.5 mMになるようにIPTGを入れ、37℃で続いて4 h培養した。5000 rpmで15 min遠心して細胞沈殿物を収集し、BugbusterMaster Mix(Merck)で細胞沈殿物を分解させ、6000 rpmで15 min遠心して封入体を収集し、さらにBugbuster(Merck)で洗浄することによって細胞破片および膜成分を除去し、6000 rpmで15 min遠心し、封入体を収集した。封入体を緩衝液（50mM Tris-HCl、200mM NaCl、2mM EDTA、6 M グアニジン塩酸塩、pH 8.0）に溶解させ、高速遠心で不溶物を除去し、上清液をBCA法によって定量した後分けて収納し、-80℃で保存して使用に備えた。
【００５４】
7mgの溶解したPDL-1封入体タンパク質に、2 mLの緩衝液（50mM Tris-HCl、200mM NaCl、2mM EDTA、6 M グアニジン塩酸塩、pH 8.0）を入れ、さらに最終濃度が10 mMになるようにDTTを入れ、37℃で30 min処理した。注射器で100 mLの再生緩衝液（50 mM HEPES、pH 7.5、500 mM L-アルギニン、9 mM グルタチオン、1 mM グルタチオンジスルフィド、24mM NaCl、1 mM KCl）に上記処理後のPDL-1を滴下し、4℃で30 min撹拌した後、再生液を分画分子量が3.5 kDaのセルロース膜透析袋に入れ、透析袋を2Lの冷やしておいた水に置き、4℃でゆっくり一晩撹拌した。24時間後、透析液を2Lの冷やしておいた緩衝液（10 mMTris-HCl pH 8.0）に置換し、4℃で続いて24 h透析した後、透析液を新鮮な同様の緩衝液に換えて続いて24時間透析し、サンプルを0.45 μmのろ膜でろ過し、真空脱気後アニオン交換カラム(HiTrap Q HP、GE Healthcare)を通させ、10 mMTris-HCl pH 8.0で調製された0〜1M NaClの直線勾配溶離液でタンパク質を精製し、収集された溶離画分に対してSDS-PAGE分析を行い、そのSDS-PAGEゲルの写真を図2に示す。PDL-1画分を濃縮した後、さらにゲルろ過カラム(Superdex 75 10/300、GE Healthcare)で精製し、目的画分に対してもSDS-PAGE分析を行った。
【００５５】
BIAcore分析に使用される溶出画分はさらにゲルろ過法でその純度を測定した。条件は、クロマトグラフィカラムAgilent Bio SEC-3(300 A、φ7.8×300 mm)で、移動相が150 mMリン酸塩緩衝液で、流速0.5 mL/min、カラム温度25℃、紫外検出波長214 nmであった。
【００５６】
実施例2  結合の特徴付け
BIAcore分析
BIAcore T200リアルタイム分析システムによって野生型PDL-1分子と PD-1の結合活性を検出した。抗ストレプトアビジンの抗体（GenScript）をカップリング緩衝液(10 mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH 4.77)に入れた後、抗体に予めEDCおよびNHSで活性化させたCM5チップを通させ、抗体をチップの表面に固定化させ、最後にエタノールアミンの塩酸溶液で未反応の活性化表面をブロッキングし、カップリング過程を完成させ、カップリングレベルは約15,000 RUであった。
【００５７】
低濃度のストレプトアビジンに抗体で被覆されたチップの表面を通させた後、ビオチン化されたPD-1に検出チャンネルを通させ、もう一つのチャンネルを参照チャンネルとし、さらに0.05 mMのビオチンに10 μL/minの流速でチップを2 min通させ、ストレプトアビジンの残った結合部位をブロッキングした。シングルサイクル動態学分析方法によってその親和力を測定し、PDL-1をHEPES-EP緩衝液（10 mM HEPES,、150 mMNaCl、3 mM EDTA、0.005％ P20、pH 7.4）をいくつかの異なる濃度に希釈し、30 μL/minの流速で、順にチップの表面を通させ、毎回の仕込みの結合時間は120 sで、最後の一回の仕込みが終わったら600 s溶離させた。毎回の測定終了後、pH 1.75の10 mMGly-HClでチップを再生した。BIAcore Evaluationソフトによって動態学のパラメーターを計算した。
本実施例で使用されたPD-1のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列はそれぞれ図3aおよび3bに示すように、その発現、再生および精製の過程は実施例1における野生型PDL-1の発現、再生および精製の過程と同様である。そのビオチン化の過程は以下の通りである。
【００５８】
a．ビオチン化
Millipore限外ろ過チューブで精製されたPD-1分子を濃縮し、同時に緩衝液を10 mM Tris pH 8.0に置き換えた後、ビオチン化試薬として0.05 M Bicine pH 8.3、10 mM ATP、10 mM MgOAc、50 μM D-Biotin、100 μg/ml BirA酵素（GST-BirA）を入れ、室温で混合物を一晩インキュベートし、SDS-PAGEによって完全にビオチン化したか検出した。
【００５９】
b．ビオチン化された複合体の精製
Millipore限外ろ過チューブでビオチン化標識されたPD-1分子を1 mlに濃縮し、ゲルろ過クロマトグラフィーによってビオチン化されたPD-1を精製し、Akta精製装置（GE社）を使用し、ろ過されたPBSでHiPrepTM 16/60 S200 HRカラム（GE社）を予め平衡化し、1 mlの濃縮されたビオチン化PD-1分子をかけた後、PBSで1 ml/minの流速で溶離させた。ビオチン化されたPD-1分子は約10mlにおいて単峰として溶離して現れた。タンパク質を含有する成分を合併し、Millipore限外ろ過チューブで濃縮し、BCA法（Thermo）によってタンパク質濃度を測定し、ビオチン化されたPD-1分子を分けて-80 ℃で保存した。
本実施例の上記過程で検出された野生型PDL-1分子とPD-1分子の結合親和力のKD値は2.462E-05Mで、そのBIAcore結合グラフを図4に示す。
【００６０】
実施例3  高親和力PDL-1分子の生成
実施例1に記載の野生型PDL-1の細胞外配列を鋳型鎖とし、Liら((2005)Nature Biotech 23(3):349-354)によって開示されたファージディスプレイおよび選別の方法に従い、高親和力PDL-1の選別を行った。数回の選別後のファージライブラリーはいずれもPD-1と強い結合シグナルを持ち、中から単一のクローンを取り、配列分析を行った。
実施例1に記載の方法によって本発明の高親和性PDL-1分子を発現、再生および精製し、そして実施例2に記載の方法によってそのPD-1分子との親和力を測定した。本発明で得られた高親和力PDL-1分子とPD-1分子の親和力は野生型PDL-1分子とPD-1分子の親和力の少なくとも2倍で、そのアミノ酸配列は図5に示し、そのPD-1分子との親和力数値は下記表2に示す。
【００６１】
【表１】
0006650515.tif 000002
【００６２】
実施例4  高親和力PDL-1分子のPBMC（末梢血単核球）の腫瘍細胞株（A375）に対する殺傷効果への影響
本実施例では非放射性細胞毒性試験によって殺傷作用を検証した。当該試験は51Cr放出細胞毒性試験の比色代替試験で、定量的に細胞分解後放出される乳酸脱水素酵素（LDH）を測定するものである。30-分間カップリングの酵素試験によって培養上清液における放出されたLDHを検出し、それによってテトラゾリド（INT）が赤色のホルマザン産物に転換される。形成する色の量は分解細胞の数に比例する。標準96ウェルプレートリーダーによって490 nmの吸光度のデーターを収集した。
【００６３】
使用された材料は以下の通りである。CytoTox96非放射性細胞毒性試験(プロメガ社)(G1780)、基質混合物、試験緩衝液、分解溶液および停止溶液が含まれる。試験培地:10％ FBS(熱不活性のもの、Gibco社、カタログ番号10108-165)、VIVO-15 (Lonza)、カタログ番号: 04-418 ) 。Nuncマイクロウェル丸底96ウェル組織培養プレート(ヌンク社(Nunc)、カタログ番号163320)。Nunc-免疫プレートMaxisorb(ヌンク社、カタログ番号442404)。
【００６４】
本実施例で使用された標的細胞はA375細胞である（ATCCから購入、製品番号CRL-1619）。試験培地において標的細胞を調製した。標的細胞の濃度を2×10^5個細胞/mLに調整することによって、2×10^4個細胞/ウェル、100μlにした。
【００６５】
本実施例で使用されたエフェクター細胞(PBMC細胞)は健常者の新鮮な白膜から単離され、細胞は1×10^6個細胞/mlで試験培地に再懸濁させることによって、1x10^5個細胞/ウェル、100μlにした。
【００６６】
試験において、ImmTACの最終濃度は10^-9Mで、ImmTACの保存濃度は13X10^-6Mで、13000倍希釈し、そのまま調製できたエフェクター細胞に入れた。異なる高親和力PDL1の最終濃度は30ug/mlであった。本実施例で使用されたImmTACのα鎖およびβ鎖のアミノ酸配列はそれぞれ図6aおよび6bに示す通りである。
【００６７】
以下の順で試験の各成分をプレートに入れた。100μlの標的細胞(上記のように調製された)を各ウェルに入れた。100μlのエフェクター細胞(上記のように調製された)を各ウェルに入れた。異なる高親和力PDL1を各ウェルに入れた。
【００６８】
エフェクター細胞自発放出、200μlエフェクター細胞のみ、標的細胞自発放出、200μl標的細胞のみ、標的細胞最大放出、200μl標的細胞のみといったいくつかの対照を下記のように調製した。すべてのウェルは同じものに3つずつ調製し、最終濃度は200μlであった。250×gでプレートを4分間遠心した後、37℃で24時間インキュベートした。20μlの分解溶液を標的細胞最大放出対照ウェルに入れ、45分間後上清液を収集した。250×gでプレートを4分間遠心する。試験プレートの各ウェルの50μl清液を平底96ウェルNuncVlnxisorbプレートの相応するウェルに移した。試験緩衝液(12m1)で基質混合物を戻した。その後、50μlの戻された基質混合物をプレートの各ウェルに入れた。プレートにアルミ箔を被り、室温で30分間インキュベートした。50μlの停止溶液をプレートの各ウェルに入れて反応を停止された。停止溶液を入れた後、1時間内でELISAプレートリーダーによって490nmの吸光度を記録した。
【００６９】
結果の計算:実験、標的細胞自発放出の吸光度値から背景の平均吸光度値を引き、標的細胞最大放出対照で得られた吸光度値から体積校正対照の平均吸光度値を引いた。前の2つの工程で得られた校正値は、％細胞毒性=100×(実験-標的細胞自発-エフェクター細胞自発)/(標的細胞最大-標的細胞自発)という式によって細胞毒性百分率を計算した。
【００７０】
実験結果は図7に示すように、図7で「PBMC+A375+1G4+PDL1」と下に表示されるカラム図においてPDL1は野生型PDL-1分子である。図における分解率の向上または低下は「PBMC+A375+1G4」のカラム図に対するものである。具体的な計算方法は、|(「PBMC+A375+1G4+PDL-1分子」-「PBMC+A375+1G4」)|/ 「PBMC+A375+1G4」である。当該結果から、本発明の高親和力PDL-1分子の一部は顕著にPBMCの腫瘍細胞に対する殺傷作用を向上させることが示された。
【００７１】
実施例5  高親和力PDL1二量体タンパク質の構築、発現および精製
ヒト免疫グロブリン結晶性フラグメント（human immunoglobulin fragment crystallizable、hIgG4Fc）で高親和力PDL1分子の二量体を構築した。具体的に、高親和力PDL-1の細胞外ヌクレオチド配列の3’末端とhIgG4Fcヌクレオチド配列の5’末端をオーバーラップPCRを連結し、融合タンパク質の核酸配列およびアミノ酸配列を得たが、 hIgG4Fcのアミノ酸配列および核酸配列はそれぞれ配列番号37および38で、図8aおよび図8bに示す。融合タンパク質配列を持つ標的遺伝子をEcoRIおよびNotIで二重酵素切断し、EcoRIおよびNotIで二重酵素切断されたpcDNA3.1(+)ベクターに連結した。連結物をTOP10に形質転換させ、アンピシリン含有LBプレートを塗布し、37℃で逆さまで一晩培養し、陽性クローンを取ってPCR選別を行い、陽性組換え体に対して配列決定を行い、配列が正確と確認されたら組換えプラスミドを抽出して293T細胞に一過性導入し、発現に使用した。野生型PDL1分子の二量体の構築方法は上記と同様で、野生型PDL1分子の二量体は本発明における発現手段はPDL1-hIgG4である。高親和力PDL1分子の二量体は本発明における発現手段は高親和力PDL1分子番号-hIgG4、たとえばL2D7-hIgG4である。
【００７２】
1X10^7個の293T細胞（ATCCから購入、製品番号CRL-11268）を10cm細胞培養シャーレに接種し、12h後PBSで1回洗浄し、そしてopti-MEM培地に置換した。Lipo2000:組換えプラスミド(1ug/ul)=2:1の比率でそれぞれopti-MEMに入れ、室温で5min静置し、lipo2000を含むopti-MEMを1滴ずつ組換えプラスミドを含むopti-MEMに入れ、混合し、室温で20min静置し、opti-MEM培地が置換された293T細胞に入れ、4h後freestyle（商標） 293培地に置換し、5％ CO2 37℃のインキュベーターで3d培養した。
【００７３】
培養上清を収集し、0.45 μmのろ膜でろ過し、アニオン交換カラム(HiTrap Q HP、GE Healthcare)を通させ、20 mMTris-HCl pH 7.0で調製された0〜1M NaClの直線勾配溶離液でタンパク質を精製し、収集された溶離画分に対してSDS-PAGE分析を行い、PDL1-hIgG4Fcを例とし、そのSDS-PAGEゲルの写真を図9に示す。画分を濃縮した後、さらにゲルろ過カラム(Superdex 200 10/300、GE Healthcare)で精製し、目的画分に対してもSDS-PAGE分析を行った。
【００７４】
使用された材料は以下の通りである。10cm細胞培養シャーレ(greiner、カタログ番号：627160)、opti-MEM培地(gibco。カタログ番号：31985-070)、Lipo2000、freestyle（商標） 293培地(gibco、カタログ番号：12338-018)、PureLinkTM HiPure Plasmid Maxiprep Kit(invitrogen、カタログ番号：K2100-06)。
【００７５】
実施例6  高親和力PDL1-hIgG4Fc融合タンパク質のPBMC（末梢血単核球）の腫瘍細胞株に対する殺傷効果への影響
本実施例では非放射性細胞毒性試験によって殺傷作用を検証した。当該試験は51Cr放出細胞毒性試験の比色代替試験で、定量的に細胞分解後放出される乳酸脱水素酵素（LDH）を測定するものである。30-分間カップリングの酵素試験によって培養上清液における放出されたLDHを検出し、それによってテトラゾリド（INT）が赤色のホルマザン産物に転換される。形成する色の量は分解細胞の数に比例する。標準96ウェルプレートリーダーによって490 nmの吸光度のデーターを収集した。
【００７６】
使用された材料は以下の通りである。CytoTox96非放射性細胞毒性試験(プロメガ社)(G1780)、基質混合物、試験緩衝液、分解溶液および停止溶液が含まれる。試験培地:10％ FBS(熱不活性のもの、Gibco社、カタログ番号10108-165)、VIVO-15 (Lonza)、カタログ番号: 04-418 ) 。Nuncマイクロウェル丸底96ウェル組織培養プレート(ヌンク社(Nunc)、カタログ番号163320)。Nunc-免疫プレートMaxisorb(ヌンク社、カタログ番号442404)。
【００７７】
本実施例で使用された標的細胞はMel624細胞（Cassian Yee実験室から寄贈）、NCI-H1299細胞（ATCCから購入、製品番号CRL-5803）、IM9細胞（ATCCから購入、製品番号CRL-159）、MDA-MB-231細胞（ATCCから購入、製品番号CRM-HTB-26）。試験培地において標的細胞を調製した。標的細胞の濃度を2×10^5個細胞/mLに調整することによって、2×10^4個細胞/ウェル、100μlにした。
【００７８】
本実施例で使用されたエフェクター細胞(PBMC細胞)は健常者の新鮮な白膜から単離され、細胞は1×10^6個細胞/mlで試験培地に再懸濁させることによって、1x10^5個細胞/ウェル、100μlにした。
【００７９】
試験において、ImmTACの最終濃度は10^-9Mで、ImmTACの保存濃度は5X10^-6Mで、5000倍希釈し、そのまま調製できたエフェクター細胞に入れた。異なる高親和力PDL1-hIgG4Fc融合タンパク質の最終濃度は20ug/mlであった。本実施例で使用されたImmTAC（1G4）のα鎖およびβ鎖のアミノ酸配列はそれぞれ図6aおよび6bに示す通りである。
【００８０】
以下の順で試験の各成分をプレートに入れた。100μlの標的細胞(上記のように調製された)を各ウェルに入れた。100μlのエフェクター細胞(上記のように調製された)を各ウェルに入れた。異なる高親和力PDL1-hIgG4Fc融合タンパク質を各ウェルに入れた。
【００８１】
エフェクター細胞自発放出、200μlエフェクター細胞のみ、標的細胞自発放出、200μl標的細胞のみ、標的細胞最大放出、200μl標的細胞のみといったいくつかの対照を下記のように調製した。すべてのウェルは同じものに3つずつ調製し、最終濃度は200μlであった。250×gでプレートを4分間遠心した後、37℃で20時間インキュベートした。20μlの分解溶液を標的細胞最大放出対照ウェルに入れ、45分間後上清液を収集した。250×gでプレートを4分間遠心する。試験プレートの各ウェルの50μl清液を平底96ウェルNuncVlnxisorbプレートの相応するウェルに移した。試験緩衝液(12m1)で基質混合物を戻した。その後、50μlの戻された基質混合物をプレートの各ウェルに入れた。プレートにアルミ箔を被り、室温で30分間インキュベートした。50μlの停止溶液をプレートの各ウェルに入れて反応を停止された。停止溶液を入れた後、1時間内でELISAプレートリーダーによって490nmの吸光度を記録した。
【００８２】
結果の計算:実験、標的細胞自発放出の吸光度値から背景の平均吸光度値を引き、標的細胞最大放出対照で得られた吸光度値から体積校正対照の平均吸光度値を引いた。前の2つの工程で得られた校正値は、％細胞毒性=100×(実験-標的細胞自発-エフェクター細胞自発)/(標的細胞最大-標的細胞自発)という式によって細胞毒性百分率を計算した。
実験結果は図10a、図10b、図10cおよび図10dに示す。
【００８３】
図10aで「PBMC+Mel624+1G4+PDL1-hlgG4」と下に表示されるカラム図においてPDL1-hlgG4は野生型PDL-1融合分子である。図における分解率の向上または低下は「PBMC+Mel624+1G4」のカラム図に対するものである。具体的な計算方法は、|(「PBMC+Mel624+1G4+高親和力PDL1-hlgG4分子」-「PBMC+Mel624+1G4+PDL1-hlgG4分子」)|/ 「PBMC+Mel624+1G4+PDL1-hlgG4分子」である。当該結果から、本発明の高親和力PDL-1融合分子の一部は顕著にPBMCの腫瘍細胞Mel624に対する殺傷作用を向上させることが示された。
【００８４】
図10bで「PBMC+NCI-H1299+1G4+PDL1-hlgG4」と下に表示されるカラム図においてPDL1-hlgG4は野生型PDL-1融合分子である。図における分解率の向上または低下は「PBMC+NCI-H1299+1G4」のカラム図に対するものである。具体的な計算方法は、|(「PBMC+NCI-H1299+1G4+高親和力PDL1-hlgG4分子」-「PBMC+NCI-H1299+1G4+PDL1-hlgG4分子」)|/ 「PBMC+NCI-H1299+1G4+PDL1-hlgG4分子」である。当該結果から、本発明の高親和力PDL-1融合分子の一部は顕著にPBMCの腫瘍細胞NCI-H1299に対する殺傷作用を向上させることが示された。
【００８５】
図10cで「PBMC+IM9+1G4+PDL1-hlgG4」と下に表示されるカラム図においてPDL1-hlgG4は野生型PDL-1融合分子である。図における分解率の向上または低下は「PBMC+IM9+1G4+PDL1-hlgG4」のカラム図に対するものである。具体的な計算方法は、|(「PBMC+IM9+1G4+高親和力PDL1-hlgG4分子」-「PBMC+IM9+1G4+PDL1-hlgG4分子」)|/ 「PBMC+IM9+1G4+PDL1-hlgG4分子」である。当該結果から、本発明の高親和力PDL-1融合分子の一部は顕著にPBMCの腫瘍細胞IM9に対する殺傷作用を向上させることが示された。
【００８６】
図10dで「PBMC+MDA-MB-231+1G4+PDL1-hlgG4」と下に表示されるカラム図においてPDL1-hlgG4は野生型PDL-1融合分子である。図における分解率の向上または低下は「PBMC+MDA-MB-231+1G4+PDL1-hlgG4」のカラム図に対するものである。具体的な計算方法は、|(「PBMC+MDA-MB-231+1G4+高親和力PDL1-hlgG4分子」-「PBMC+MDA-MB-231+1G4+PDL1-hlgG4分子」)|/ 「PBMC+MDA-MB-231+1G4+PDL1-hlgG4分子」である。当該結果から、本発明の高親和力PDL-1融合分子の一部は顕著にPBMCの腫瘍細胞MDA-MB-231に対する殺傷作用を向上させることが示された。
【００８７】
実験結果は図10a、10b、10cおよび10dに示すように、当該結果から、本発明の高親和力PDL1-hIgG4Fc融合タンパク質が顕著にImmTAC(1G4)によるPBMCの腫瘍細胞に対する殺傷を向上させることが示される。
【００８８】
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、当業者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の様態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【配列表】
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