(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホイノシトール４−リン酸アダプタータンパク質−２（ＦＡＰＰ２）に結合する化合物を同定する方法であって、表２に示される、ＦＡＰＰ２の基質結合ポケットを構成する少なくともアミノ酸の原子座標を使用して、ＦＡＰＰ２に結合する化合物をコンピューターで同定するステップを含む、方法。
【請求項２】
ホスホイノシトール４−リン酸アダプタータンパク質−２（ＦＡＰＰ２）に結合する化合物を同定する方法であって、
ａ）表３に示される、ＦＡＰＰ２の少なくともＧＬＴＰドメインについての原子座標のセットを提供するステップ、および
ｂ）前記座標を使用して、ＦＡＰＰ２に結合する化合物をコンピューターで同定するステップ
を含む、方法。
【請求項３】
前記化合物が、ＦＡＰＰ２の基質結合ポケットに結合する、またはＦＡＰＰ２の基質結合ポケットに隣接して結合する、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記化合物が、ＦＡＰＰ２のインヒビターである、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記化合物が、ＦＡＰＰ２の基質である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物が、好ましくはＧＬＴＰよりも、ＦＡＰＰ２に対して特異的である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記化合物が小分子である、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記コンピューターで同定するステップが、化合物のライブラリーから前記化合物を同定するステップまたはデータベースにおいて前記化合物を同定するステップを含む、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ＦＡＰＰ２ポリペプチドに対する、同定された前記化合物の結合を試験するステップをさらに含む、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
結合性化合物の前記試験が、前記ＦＡＰＰ２ポリペプチドの活性をモジュレートする前記結合性化合物の能力を試験するステップを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記結合性化合物を試験するステップが、前記結合性化合物が、
ａ）前記ＦＡＰＰ２ポリペプチドの移行活性をモジュレートするかどうか；
ｂ）前記ＦＡＰＰ２ポリペプチドの安定性をモジュレートするかどうか；および／または
ｃ）ＦＡＰＰ２ポリペプチドの細胞内輸送をモジュレートするかどうか、
を決定するための生物学的アッセイを使用して実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記結合性化合物が、ＦＡＰＰ２の前記移行活性もしくは前記安定性を減少させる、またはゴルジ中に存在するＦＡＰＰ２の量を低減させる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＦＡＰＰ２に結合する化合物を設計、選択および／または最適化する方法であって、
ａ）表２に示される、ＦＡＰＰ２の基質結合ポケットを構成する少なくともアミノ酸の原子座標のセットを提供するステップ、ならびに
ｂ）前記化合物と、前記原子座標から生成された３次元構造情報の全てまたは一部との間でのフィッティング操作を実施することによって、前記化合物をコンピューターで設計、選択および／または最適化するステップ
を含む、方法。
【請求項１４】
ＦＡＰＰ２に結合する化合物を設計、選択および／または最適化する方法であって、
ａ）表３に示される、ＦＡＰＰ２の少なくともＧＬＴＰドメインについての原子座標のセットを提供するステップ、ならびに
ｂ）前記化合物と、前記原子座標から生成された３次元構造情報の全てまたは一部との間でのフィッティング操作を実施することによって、前記化合物をコンピューターで設計、選択および／または最適化するステップ
を含む、方法。
【請求項１５】
コンピューターで同定するステップが、ＦＡＰＰ２に結合する結合性化合物をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで設計するステップを含む、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記結合性化合物が、公知の化合物から設計される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＦＡＰＰ２と会合する化合物の能力を評価するための方法であって、
ａ）表２に示される、ＦＡＰＰ２の基質結合ポケットを構成する少なくともアミノ酸の原子座標のセットを提供するステップ；
ｂ）前記化合物と、前記原子座標から生成された３次元構造情報の全てまたは一部との間でのフィッティング操作をコンピューターで実施するステップ；および
ｃ）前記フィッティング操作の結果を分析して、前記化合物とＦＡＰＰ２との間の会合を定量化するステップ
を含む、方法。
【請求項１８】
ＦＡＰＰ２と会合する化合物の能力を評価するための方法であって、
ａ）表３に示される、ＦＡＰＰ２の少なくともＧＬＴＰドメインについての原子座標のセットを提供するステップ、および
ｂ）前記化合物と、前記原子座標から生成された３次元構造情報の全てまたは一部との間でのフィッティング操作をコンピューターで実施するステップ；および
ｃ）前記フィッティング操作の結果を分析して、前記化合物とＦＡＰＰ２との間の会合を定量化するステップ
を含む、方法。
【請求項１９】
請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法を用いて、化合物を設計、選択および／または最適化するステップ、ならびに薬学的に許容される担体または希釈剤を用いて、得られた産物を製剤化するステップを含む、医薬組成物を製造する方法。
【請求項２０】
ＦＡＰＰ２のアミノ酸３０８〜５１９（配列番号１）に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列およびリゾチームＴ４Ｌのアミノ酸２〜１６４（配列番号２）に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドであって、前記融合ポリペプチドが、ＦＡＰＰ２の移行活性を有し、ＦＡＰＰ２のアミノ酸３０８〜５１９（配列番号１）に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する前記アミノ酸配列が、リンカーを介して、リゾチームＴ４Ｌのアミノ酸２〜１６４（配列番号２）に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する前記アミノ酸配列に連結されている、融合ポリペプチド。
【請求項２１】
前記リンカーが、スレオニン、セリン、プロリン、アスパラギン、およびグリシンを含む１つまたは複数のアミノ酸である、請求項２０に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２２】
前記リンカーが、１つまたは複数のグリシン残基を含む、請求項２０または２１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２３】
前記リンカーがグリシンからなる、請求項２０から２２のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２４】
ヒトＦＡＰＰ２の残基Ｄ３６０、Ｎ３６４、Ｗ４０７を含む、請求項２０から２３のいずれか一項に記載のポリペプチドであって、番号付けは配列番号４に従う、融合ポリペプチド。
【請求項２５】
前記融合ポリペプチドが、配列番号３の配列またはその断片を含み、前記断片が、配列番号３の配列と比較して最大１０アミノ酸の欠失を含む、請求項２０から２４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２６】
配列番号３の配列からなる、請求項２５に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２７】
請求項２０から２６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項２８】
請求項２７に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２９】
請求項２８に記載のベクターを含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト４−リン酸アダプタータンパク質（ｆｏｕｒ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｄａｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）２（ＦＡＰＰ２）糖脂質移行タンパク質（ＧＬＴＰ）様ドメインの高分解能結晶構造の提供、および創薬におけるこの構造の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ファブリー病（アンダーソン・ファブリー病と呼ばれる場合もある）は、哺乳動物リソソームにおけるスフィンゴ糖脂質の正常なプロセシングに必要な酵素であるα−ガラクトシダーゼＡ（α−Ｇａｌ  Ａ）が存在しないことを特徴とする稀なＸ連鎖障害である。α−Ｇａｌ  Ａの喪失は、心臓、腎臓、肝臓および血管内皮細胞内での、セラミドトリヘキソシド（ｃｅｒａｍｉｄｅ  ｔｒｉｈｅｘｏｓｉｄｅ）（ＣＴＨ）としても公知の中性グロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）の蓄積をもたらす。腎疾患および心疾患は、ファブリー患者における死亡率および罹患率の最も一般的な原因である［１、２］。ヘミ接合性雄性、ホモ接合性雌性および一部のヘテロ接合性雌性は、被角血管腫、肢端触覚異常（ａｃｒｏｐａｒａｔｈｅｓｉｓ）、脳卒中、心筋症、心筋梗塞（ｍｙｏｃａｒｄｉａｎ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ）および腎不全として臨床的に症状発現する進行性の臓器障害を経験する［１］。腎臓は、Ｇｂ３沈着からの損傷に対してひときわ感受性であり、糸球体の有足突起、血管内皮細胞および上皮細胞に局在化したスフィンゴ糖脂質のいくつかの公開された報告が存在する。アポトーシスによる有足突起の喪失は、糸球体硬化症をもたらし、腎臓機能を劇的に低減させる。罹患した個体は、疾患進行および症状の重症度の点で変動する。
【０００３】
歴史的に、ファブリー患者に対する処置選択肢は、腎臓および心血管合併症の症状の緩和に限定されていた［３］。より苛酷な処置、即ち、臓器移植［４、５］およびプラスマフェレーシス［６］の試みは、成功することが証明されなかった。現在、２種のガラクトシダーゼ薬物が、酵素補充療法（ＥＲＴ）を介したファブリー病の処置のために利用可能である：アガルシダーゼアルファ（Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標）、ＴＫＴ／Ｓｈｉｒｅ）およびアガルシダーゼベータ（Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）、Ｇｅｎｚｙｍｅ）。これらのタンパク質ベースの治療剤は、静脈内注射によって投与され（静脈内注射のために承認され）、Ｇｂ３蓄積のレベルを低減させるために、罹患臓器のリソソームへとガラクトシダーゼ活性を送達する。ファブリー病などのリソソーム蓄積症の処置のためのＥＲＴのためのさらなるアプローチが必要とされる。
【０００４】
ＥＲＴに対する代替的戦略は、基質低減療法（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）（ＳＲＴ）である。これは、患者における病理的基質（即ち、Ｇｂ３）の量を制限することに基づいて働く。ファブリー病の病理学は、Ｇｂ３を分解する患者の能力の低減および結果として生じる基質の蓄積の結果として生じ、ＳＲＴの目的は、存在するこの病理的物質の量を低減させることである。
【０００５】
Ｇｂ３は、他の複合スフィンゴ糖脂質と同様、ゴルジにおいてグルコシルセラミド（ＧｌｃＣｅｒ）から合成される。サイトゾル移行タンパク質ＦＡＰＰ２は、異なる細胞区画における異なるＧＳＬの下流の合成のための異なる経路へとＧｌｃＣｅｒを分配することにおいて重要な役割を有することが、最近示されている。ＦＡＰＰ２は、ＧｌｃＣｅｒをトランスゴルジネットワーク（ＴＧＮ）に直接送達することを担うことが示されている。ＴＧＮにおいて、Ｇｂ３を含むグロボスフィンゴ脂質およびアシアロスフィンゴ脂質が、ＧｌｃＣｅｒから合成される。他のＧｌｃＣｅｒは、ゴルジ嚢においてガングリオ系列のスフィンゴ脂質を作製するために、小胞経路を介してゴルジ嚢へと移動される。ＦＡＰＰ−２−／−マウスは、腎臓におけるＧｂ３の選択的減少を有することが、さらに示されている［７］。
【０００６】
Ｇｂ３の合成におけるＦＡＰＰ２の役割を考慮すると、ＦＡＰＰ２は、ファブリー病の処置のためのＳＲＴのための標的を提示する。ＳＲＴは、ゴーシェ病およびニーマン・ピック病Ｃ型などのリソソーム蓄積症のために提案されており、Ｚａｖｅｓｃａ（登録商標）（Ａｃｔｅｌｉｏｎ）は、ＥＲＴの標準的な処置を受けることができない軽度から中程度のゴーシェ病１型患者の処置のため、およびニーマン・ピック病Ｃ型を有する全ての年齢の疾患患者の神経学的症状の処置のために承認されている。しかし、ファブリー病のＳＲＴに適切なＦＡＰＰ２のインヒビターは、現在利用可能でない。
【０００７】
ヒト糖脂質移行タンパク質（ＧＬＴＰ）の結晶構造に基づいて、ヒトＦＡＰＰ２のＧＬＴＰドメインの構造はモデル化されているが［８］、ＦＡＰＰ２の糖脂質結合部分の高分解能結晶構造が、ＳＲＴに適切なＦＡＰＰ２インヒビターを開発するために必要とされている。特に、ＦＡＰＰ２は、ＧＬＴＰとは異なる脂質移行特異性を有することが公知であり、ＦＡＰＰ２は、ＧＬＴＰによって容易に移行されるある特定の糖脂質、例えば、負に荷電した糖脂質を移行させることができない。さらに、２つのタンパク質の構造には差異が存在し、これは、それらの異なるヘリックス内容、およびＦＡＰＰ２のＧＬＴＰドメインについての比較的低いＴｍに反映され、ＧＬＴＰについての５３℃と比較して、約４１℃のＴｍで熱的なアンフォールディングを示す［８］。
【０００８】
ＦＡＰＰ２に対して特異的なインヒビターを開発することは、特に目的とされ、ＦＡＰＰ２の構造を理解すること、ならびに他の関連の分子および無関係の分子とそれがどのように異なり得るかが、このプロセスにおいて重要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｔｈｕｒｂｅｒｇら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（２００２）６２（６）：１９３３〜１９４６
【非特許文献２】Ｔａｎａｋａら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ（２００５）６４（４）：２８１〜２８７
【非特許文献３】Ｄｅｓｎｉｃｋら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ（２００２）５７（１）：１〜８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
ＦＡＰＰ２のＧＬＴＰドメイン（ＦＡＰＰ２−Ｃ２１２）の高分解能結晶構造が生成された。この構造は、ＧｌｃＣｅｒの糖頭部基（ｈｅａｄｇｒｏｕｐ）と相互作用する残基（Ｄ３６０、Ｎ３６４、Ｗ４０７が含まれる）が、十分に精密化されており、つまり、セラミドのアシル／スフィンゴシン鎖と相互作用する他の（例えば、疎水性）残基であることを示している。高分解能構造は、ＦＡＰＰ２のインヒビターを設計するためおよび最適化するために使用され得る。原子レベルの構造情報は、本発明以前にはＦＡＰＰ２のＧＬＴＰドメインについては入手可能でなく、この情報は、ＦＡＰＰ２活性における構造−機能関係を理解するために重要であり、ＦＡＰＰ２の新規インヒビターの設計および試験を可能にする。
【００１１】
本発明の態様は、本発明者が、ＦＡＰＰ２のＧＬＴＰドメインを結晶化し、続いて３次元ポリペプチド構造を決定することに成功したことに基づく。ＦＡＰＰ２のＧＬＴＰドメインは、ヒトＦＡＰＰ２中のＣ末端２１２アミノ酸である（ヒトＦＡＰＰ２の番号付けを使用すると残基３０８〜５１９）。ＦＡＰＰ２のＧＬＴＰドメインは、比較的可撓性かつ不安定な分子（その低いＴｍによって明らかなとおり）であり、ほぼ４５℃であっても完全にアンフォールディングされるので、これを結晶化することが可能になったことは、特に驚くべきことである。ＦＡＰＰ２のＧＬＴＰドメインの結晶を生成するための以前の広範な試みは、成功しなかった。結晶化可能な融合タグとして、本発明者がリゾチームＴ４Ｌを選択した場合にのみ、結晶を生成することが可能であり、そこから、以下により詳細に定義される構造が生成された。
【００１２】
従って、第１の態様では、本発明は、Ｔ４Ｌに融合された、ＦＡＰＰ２のＧＬＴＰドメインを含むポリペプチドを提供する。コードする核酸分子およびベクターがさらに提供され、これらを含有する宿主細胞もまた提供される。
【００１３】
さらなる態様は、本発明のポリペプチドの結晶性形態である。
【００１４】
さらなる態様では、本発明は、本発明の結晶性形態を得る方法であって、本発明のポリペプチドを提供するステップ、およびこのポリペプチドを、それが沈殿し、結晶を形成するポリペプチド濃度へと濃縮するステップを含む方法を提供する。この方法から得ることができる結晶性形態もまた提供される。
【００１５】
ＦＡＰＰ２のＧＬＴＰドメインについて本明細書で提供される原子座標、およびそのサブセット、ならびに本明細書で提供される原子座標を使用して生成され得る３次元構造モデルは、ＦＡＰＰ２結合性化合物を同定、設計、選択および／または最適化するために使用され得る。かかる化合物は、ＦＡＰＰ２を阻害するために使用され得、従って、Ｇｂ３レベルを低減させ得る。
【００１６】
従って、本発明の態様は、ＦＡＰＰ２に結合する化合物を同定する方法に関する。この方法は、例えば表２に示される、ＦＡＰＰ２の基質結合ポケットを構成する少なくともアミノ酸の原子座標を使用して、または表３に示される、ＦＡＰＰ２の少なくともＧＬＴＰドメインについての原子座標を使用して、ＦＡＰＰ２に結合する化合物をコンピューターで同定するステップを含み得る。ＦＡＰＰ２ポリペプチドに結合する化合物は、座標を使用して、コンピューターで同定され得る。
【００１７】
さらなる態様では、本発明は、ＦＡＰＰ２に結合する化合物を設計、選択および／または最適化する方法であって、ａ）例えば表２に示される、ＦＡＰＰ２の基質結合ポケットを構成する少なくともアミノ酸の原子座標のセットを提供するステップ、ならびにｂ）化合物と、原子座標から生成された３次元構造情報の全てまたは一部との間でのフィッティング操作を実施することによって、その化合物をコンピューターで設計、選択および／または最適化するステップを含む方法を提供する。
【００１８】
さらなる態様では、本発明は、ＦＡＰＰ２に結合する化合物を設計、選択および／または最適化する方法であって、ａ）表３に示される、ＦＡＰＰ２の少なくともＧＬＴＰドメインについての原子座標のセットを提供するステップ、ならびにｂ）化合物と、原子座標から生成された３次元構造情報の全てまたは一部との間でのフィッティング操作を実施することによって、その化合物をコンピューターで設計、選択および／または最適化するステップを含む方法を提供する。
【００１９】
さらなる態様では、本発明は、ＦＡＰＰ２と会合する化合物の能力を評価するための方法であって、ａ）例えば表２に示される、ＦＡＰＰ２の基質結合ポケットを構成する少なくともアミノ酸の原子座標のセットを提供するステップ；ｂ）化合物と、原子座標から生成された３次元構造情報の全てまたは一部との間でのフィッティング操作をコンピューターで実施するステップ；およびｃ）このフィッティング操作の結果を分析して、化合物とＦＡＰＰ２との間の会合を定量化するステップを含む方法を提供する。
【００２０】
さらなる態様では、本発明は、ＦＡＰＰ２と会合する化合物の能力を評価するための方法であって、ａ）表３に示される、ＦＡＰＰ２の少なくともＧＬＴＰドメインについての原子座標のセットを提供するステップ、およびｂ）化合物と、原子座標から生成された３次元構造情報の全てまたは一部との間でのフィッティング操作をコンピューターで実施するステップ；およびｃ）このフィッティング操作の結果を分析して、化合物とＦＡＰＰ２との間の会合を定量化するステップを含む方法を提供する。
【００２１】
さらなる態様では、本発明は、ＦＡＰＰ２と会合する化合物の能力を評価するためにコンピューターを使用する方法であって、このコンピューターは、例えば表２に示される、ＦＡＰＰ２の基質結合ポケットを構成する少なくともアミノ酸の原子座標がコード化されたデータ記憶材料を含む機械可読データ記憶媒体、およびアミノ酸の構造の３次元グラフィカル表示を生成するための手段を含み、この方法は、ａ）化合物およびＦＡＰＰ２の基質結合ポケットの全てまたは一部の構造のグラフィカル３次元表示を使用して、第１の化合物を位置決めするステップ；ｂ）コンピューター手段を用いることによって、化合物とＦＡＰＰ２の基質結合ポケットとの間でのフィッティング操作を実施するステップ；およびｃ）このフィッティング操作の結果を分析して、化合物とＦＡＰＰ２の基質結合ポケットとの間の会合を定量化するステップを含む方法を提供する。
【００２２】
さらなる態様では、本発明は、ＦＡＰＰ２と会合する化合物の能力を評価するためにコンピューターを使用する方法であって、このコンピューターは、表３に示される、ＦＡＰＰ２の少なくともＧＬＴＰドメインについての原子座標がコード化されたデータ記憶材料を含む機械可読データ記憶媒体、およびその３次元グラフィカルを生成するための手段を含み、この方法は、ａ）化合物およびＦＡＰＰ２のＧＬＴＰドメインの全てまたは一部の構造のグラフィカル３次元表示を使用して、第１の化合物を位置決めするステップ；ｂ）コンピューター手段を用いることによって、化合物とＦＡＰＰ２のＧＬＴＰドメインとの間でのフィッティング操作を実施するステップ；およびｃ）このフィッティング操作の結果を分析して、化合物とＦＡＰＰ２のＧＬＴＰドメインとの間の会合を定量化するステップを含む方法を提供する。
【００２３】
さらなる態様では、本発明は、本発明のポリペプチドについての原子座標またはそのサブセットを含むコンピューター可読媒体、および本発明のコンピューター可読媒体を含むコンピューターを提供する。
【００２４】
本発明のポリペプチドを規定するＸ線結晶学的構造座標またはそのサブセットを含むメモリユニットと；このメモリユニットと電気通信したプロセッサーであって、ポリペプチドの少なくとも一部分を提示する３次元構造を有する分子モデルを生成するプロセッサーとを含むコンピューターシステムもまた、本発明の一部を形成する。
【００２５】
本発明のさらなる態様は、本発明の方法を用いて、化合物を設計、選択および／または最適化するステップ、同定された化合物を、医薬品としての投与のために改変するステップ、ならびに薬学的に許容される担体または希釈剤を用いて、得られた産物を製剤化するステップを含む、医薬組成物を製造する方法を提供する。
【００２６】
さらなる態様では、本発明は、ＦＡＰＰ２に結合する結合性化合物をモデル化することにおける、本発明の結晶性形態の構造またはその構造の一部分の使用、ならびにＦＡＰＰ２に結合する結合性化合物をモデル化することにおける、本発明の結晶性形態の原子座標またはその原子座標のサブセットの使用を提供する。
【００２７】
本発明の方法によって同定、設計、選択および／または最適化された化合物、ならびに医薬品としての投与のために任意選択で改変された化合物、ならびに／または医薬品として製剤化された化合物が、本発明のさらなる態様で提供される。かかる化合物は、例えば、ファブリー病の処置において、医薬として使用され得る。それを必要とする患者に、かかる化合物または医薬品の有効量を投与するステップを含む、ファブリー病を処置または予防する方法がさらに提供される。
【００２８】
ポリペプチド
ＦＡＰＰ２のＧＬＴＰドメインを結晶化することは以前には不可能であったが、それは少なくとも、これが、低い融解温度を有する非常に可撓性のペプチドだからである。ファージＴ４由来のリゾチーム配列のアミノ酸２〜１６４を、ＦＡＰＰ２のＧＬＴＰドメイン（ＦＡＰＰ２のアミノ酸３０８〜５１９）に融合させることによって、本発明者らは、驚くべきことに、結晶を生成することが可能だったことを見出した。生成された融合タンパク質の結晶は、各非対称単位中に、２分子の融合タンパク質を含有した。結晶格子中の隣接する分子由来のＴ４Ｌは、結晶化を促進したように見える広範な接触を行う（図１ＡおよびＢ）。従って、Ｔ４Ｌ配列の、ＦＡＰＰ２のＧＬＴＰドメインへの融合は、分析のためにこのポリペプチドの結晶が生成されるのを可能にするという点で、利点を有する。Ｔ４Ｌは、分子のＮ末端または中央のいずれかにおける、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）との融合物としてのみ、以前には使用されていた［９、１０、１１］。これらは、ＦＡＰＰ２のＧＬＴＰドメインとは非常に異なる性質のタンパク質である。
【００２９】
従って、本発明は、Ｔ４Ｌポリペプチドに融合された、ＦＡＰＰ２のＧＬＴＰドメインを含むポリペプチドを提供する。ＦＡＰＰ２のＧＬＴＰドメインは、Ｔ４Ｌポリペプチドに対してＣ末端側またはＮ末端側であり得る。ある特定の実施形態では、このＦＡＰＰ２はヒトＦＡＰＰ２である。ヒトＦＡＰＰ２についての全長配列は、配列番号４に示される。ＧＬＴＰドメインを構成する、ヒトＦＡＰＰ２のＣ末端２１２アミノ酸（ＦＡＰＰ２のアミノ酸３０８〜５１９）の配列は、配列番号１に示され、Ｔ４Ｌポリペプチドのアミノ酸２〜１６４の配列は、配列番号２に示される。
【００３０】
従って、ＦＡＰＰ２のアミノ酸３０８〜５１９（配列番号１）に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列およびリゾチームＴ４Ｌのアミノ酸２〜１６４（配列番号２）に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドは、本発明の一部を形成する。任意選択で、このポリペプチドは、配列番号３の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。
【００３１】
本発明のポリペプチドは、一実施形態では、残基Ｌ３４９、Ｄ３６０、Ｎ３６４、Ｋ３６７、Ｗ４０７Ｒ４１０、Ｆ４１４、Ｉ４２９、Ｙ４３７、Ｌ４４１、Ｈ４４５、Ｖ４４９、Ｆ４５３、Ａ４５６、Ｆ４６６、Ｌ４７０、Ｖ３４２、Ｌ３４６、Ｖ３５７、Ｌ３６１、Ｌ４３３、Ｖ４５２、Ｌ４８８、Ｙ４９１、Ｖ３４５、Ｎ３９９、Ｅ４０３、Ｒ３９８、Ｆ３１１およびＦ３１２を含み、さらなる実施形態では、配列番号３の配列またはその断片を含む。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号３の配列またはその断片からなる。配列番号３の配列からなるポリペプチドは、Ｔ４Ｌ−ＦＡＰＰ２−Ｃ２１２と呼ばれ得る。
【００３２】
より好ましいポリペプチドは、ＦＡＰＰ２のアミノ酸３０８〜５１９（配列番号１）および／もしくはリゾチームＴ４Ｌのアミノ酸２〜１６４（配列番号２）の配列と、それぞれ、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは９９．５％よりも高い同一性の百分率を有し、ならびに／または配列番号３のアミノ酸の配列と、それぞれ、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは９９．５％よりも高い同一性の百分率を有し得る。百分率同一性は、本明細書で言及する場合、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）によって特定されるデフォルトパラメーター［Ｂｌｏｓｕｍ  ６２マトリックス；ギャップオープンペナルティ＝１１およびギャップエクステンションペナルティ＝１］を使用して、ＢＬＡＳＴバージョン２．１．３を使用して決定される通りである。
【００３３】
かかるポリペプチドは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、１５、２０、２５、３０もしくは３５またはそれ超のアミノ酸の、あるいは最大でこの数のアミノ酸の、参照配列からのアミノ酸置換、挿入または欠失によって、参照配列とは異なる配列を含有し得る。かかる配列には、有害な様式でタンパク質の機能または活性に影響を与えることのない保存的アミノ酸置換を含有するタンパク質が含まれる。
【００３４】
挿入には、例えば、Ｔ４Ｌ配列とＦＡＰＰ２配列との間のリンカーが含まれ得る。リンカーにおいて使用され得るアミノ酸の適切な例には、スレオニン、セリン、プロリン、アスパラギン、グリシンが含まれる。好ましくは、このリンカーは、１つまたは複数のグリシン残基を含む。より好ましくは、このリンカーは、１つまたは複数のグリシン残基からなる（例えば、単一のグリシンである）。
【００３５】
従って、参照ポリペプチドの断片は、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸の欠失（例えば、Ｎ末端もしくはＣ末端からの、または内部の）を含有する。
【００３６】
本発明のポリペプチドはさらに、例えば、ペプチドの調製および／または精製において使用される、タグを含み得る。かかるタグは、当技術分野で周知であり、従って、ｈｉｓタグが含まれ得る。リンカーは、任意のタグとＴ４Ｌ配列またはＦＡＰＰ２配列との間にも存在し得る。
【００３７】
ある特定の実施形態では、本発明のポリペプチドをコードする核酸が提供される。ある特定の実施形態では、この核酸は、配列番号５に示される配列、またはその断片を含む。
【００３８】
本発明のポリペプチドにおける置換、付加および欠失は、本発明のコードする核酸分子に適切な変化を起こすことによって生成され得、そうして、本発明の核酸は、１つまたは複数のヌクレオチド置換、付加、欠失または重複を含み得る。
【００３９】
置換、付加および／または欠失バリアントを有するポリペプチドを作出する改変および変異は、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列内で行われ得る。
【００４０】
改変および変異には、欠失、点変異、トランケーション、アミノ酸置換をもたらす核酸変化、およびアミノ酸の付加をもたらす核酸変化が含まれる。
【００４１】
核酸改変は、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に関してサイレントであるが、特定の宿主における翻訳のために好ましいコドンを提供するバリアントを生成するために、行われ得る。原核生物系などの特定の非哺乳動物発現系における核酸の翻訳のために好ましいコドンは、当技術分野で周知である、例えば、［１２；１３；１４］。なお他の改変が、コード遺伝子の発現を増強または制御するために、非コード配列に対して行われ得る。
【００４２】
コードする核酸配列は、ベクター中に存在し得る。このベクターは、１つまたは複数の調節配列に作動可能に関連したコード配列を含み得る。コード配列および調節配列は、それらが、コード配列の発現または転写を調節配列の制御下に置くように、共有結合的に連結されている場合、「〜に作動可能に関連」されている。プロモーター領域は、そのプロモーター領域がコード配列の転写をモジュレートすることが可能である場合、コード配列に作動可能に関連されている。
【００４３】
遺伝子発現に必要とされる調節配列の性質は、種間または細胞型間で変動し得るが、これには、それぞれ、転写および翻訳の開始に関与する５’非転写配列および５’非翻訳配列、例えば、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などが一般に含まれ得る。５’非転写調節配列には、作動可能に関連した遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域が含まれ得る。プロモーターは、構成的または誘導性であり得る。調節配列には、エンハンサー配列または上流アクチベーター配列もまた含まれ得る。
【００４４】
調節配列に作動可能に関連したＤＮＡ配列は、例えば、異なる遺伝的環境間でのトランスポートのため、または宿主細胞における発現のために、制限およびベクター中へのライゲーションによって、挿入され得る。ベクターは、典型的には、ＤＮＡまたはＲＮＡから構成される。ベクターには、プラスミド、ウイルスベクター、コスミド、人工染色体およびファージミドが含まれるが、これらに限定されない。クローニングベクターは、宿主細胞において複製することが可能であり、ベクターがそこでカットされ得、その中に所望の核酸配列（例えば、オープンリーディングフレーム）が挿入され得る１つまたは複数のエンドヌクレアーゼ制限部位によってさらに特徴付けられるベクターである。ベクターは、ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞またはされていない細胞の同定における使用に適切な、１つまたは複数のマーカー配列を含有し得る。マーカーには、例えば、抗生物質または他の化合物に対する耐性または感受性のいずれかを増加または減少させるタンパク質をコードする遺伝子、その活性が当技術分野で公知の標準的なアッセイによって検出可能な酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはルシフェラーゼ）をコードする遺伝子、および形質転換またはトランスフェクトされた細胞、宿主、コロニーまたはプラークの表現型に目に見えて影響を与える遺伝子が含まれる。
【００４５】
原核生物系について、宿主と適合性の種由来の複製部位および制御配列を含有するプラスミドベクターが、使用され得る。好ましくは、このベクターは、宿主細胞において自律的に複製する能力を有する。有用な原核生物宿主には、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌が含まれる。原核生物細胞においてポリペプチドを発現させるために、その核酸配列（例えば、ｃＤＮＡ）を機能的原核生物プロモーターに作動可能に連結することが望ましい。かかるプロモーターは、構成的もしくは（例えば、誘導または抑制解除によって）調節可能のいずれかであり得る。
【００４６】
真核生物宿主には、例えば、酵母、真菌、昆虫細胞および哺乳動物細胞が含まれる。さらに、植物細胞もまた、宿主として利用可能であり、植物細胞と適合性の制御配列は、当技術分野で公知である。
【００４７】
広範な種々の転写および翻訳調節配列が、宿主の性質に依存して用いられ得る。転写および翻訳調節シグナルは、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスおよびシミアンウイルスなどのウイルス供給源から誘導され得る。例えば、アクチン、コラーゲンおよびミオシンなどの哺乳動物プロモーターが用いられ得る。抑制または活性化を可能にする転写開始調節シグナルは、遺伝子配列の発現が、例えば、温度における変化または化学的もしくは生物学的モジュレーティング分子の添加を介した抑制／開始など、調節シグナルによってモジュレートされ得るように、選択され得る。
【００４８】
所望の遺伝子配列を宿主細胞染色体中に組み込むことが可能なベクターが、用いられ得る。それらの染色体中に導入された核酸を安定に組み込んだ細胞は、発現ベクターを含有する宿主細胞の選択を可能にする１つまたは複数のマーカーを導入することによっても、選択され得る。選択可能なマーカー遺伝子配列は、発現される遺伝子配列に直接連結され得るか、または共トランスフェクション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）によって同じ細胞中に導入され得るかのいずれかである。さらなるエレメント、例えば、スプライスシグナル、転写プロモーター、エンハンサーおよび終結シグナルもまた、ｍＲＮＡの最適な合成のために必要とされ得る。
【００４９】
所望のベクターまたは所望の核酸配列が調製されると、このベクターまたは核酸配列は、種々の適切な手段のいずれか、例えば、形質転換、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿または直接的マイクロインジェクションによって、適切な宿主細胞中に導入される。ベクターの導入後、レシピエント細胞は、ベクター含有細胞の成長に関して選択する選択的培地中で成長する。クローニングされた遺伝子配列の発現は、組換えポリペプチドの産生を生じる。
【００５０】
結晶を調製すること
別の態様では、本発明は、例えば、本発明のポリペプチドを提供すること、およびこのポリペプチドを、それが沈殿し、結晶を形成するポリペプチド濃度へと濃縮することにより、本発明のポリペプチドを結晶化するための方法を提供する。
【００５１】
ある特定の実施形態では、本発明のポリペプチドを結晶化するための方法は、本発明の精製された組換えポリペプチドを結晶化するステップを含む。
【００５２】
広範な種々の結晶化条件が、本発明のポリペプチドの結晶を提供するために用いられ得、従って、広範な種々の結晶化条件が、本発明によって想定および包含される。全てのタンパク質は、例えば、タンパク質を含有する溶液を過飽和させること；ならびに／もしくはタンパク質を含有する溶液に、沈殿化剤もしくは結晶化剤、塩、金属および／または緩衝液を添加することなどの、独自のセットの条件下で結晶化する。
【００５３】
バッチ結晶化、蒸気拡散（例えば、シッティングドロップ（ｓｉｔｔｉｎｇ  ｄｒｏｐ）またはハンギングドロップ（ｈａｎｇｉｎｇ  ｄｒｏｐ）のいずれかによる）および微小透析が含まれるが、これらに限定されない、当業者に公知の任意の結晶化技術が、本発明の結晶を得るために用いられ得る。一部の場合には、シーディングが、Ｘ線品質結晶（ｘ−ｒａｙ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｒｙｓｔａｌ）を得るために必要とされ得る。従って、結晶の標準的なミクロおよび／またはマクロシーディングが使用され得る。ある特定の実施形態では、本発明の結晶は、ハンギングドロップ蒸気拡散法を使用して成長する。
【００５４】
本発明のポリペプチドの結晶は、結晶化に適切な任意の温度で成長し得る。例えば、結晶は、およそ０℃からおよそ３０℃までの範囲の温度で成長し得る。ある特定の実施形態では、本発明の結晶は、およそ０℃〜およそ１０℃の間の温度で成長する。ある特定の実施形態では、本発明の結晶は、およそ０℃〜およそ５℃の間の温度で成長する。他の実施形態では、本発明の結晶は、およそ５℃〜およそ１０℃、およそ１０℃〜およそ１５℃、およそ１５℃〜およそ２０℃、およそ２０℃〜およそ２５℃、およそ２５℃〜およそ３０℃の間の温度で成長する。
【００５５】
ある特定の実施形態では、本発明の結晶は、およそ１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃の温度または室温で成長する。
【００５６】
本発明の結晶は、典型的には、１種または複数の沈殿剤を含む結晶化溶液から成長する。ある特定の実施形態では、これらの沈殿剤は、ポリマー、ポリエーテル、アルコール、塩および／またはポリオーから選択され得る。ある特定の実施形態では、これらの沈殿剤は、モノメチルエーテル（ＭＥ）；ポリエチレングリコールＰＥＧ−４００；ＰＥＧ−１０００；ＰＥＧ−２０００；ＰＥＧ−３０００；ＰＥＧ−８０００；ＰＥＧ  ２０，０００；（（ＮＨ４）２ＳＯ４）；２−プロパノール；１，４−ブタンジオール；酒石酸Ｋ／Ｎａ；エタノール；ＮａＣｌ；クエン酸ナトリウム；ＮａＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４；エチレングリコール；ジオキサン；２−メチル−２，４−ペンタンジオール（ＭＰＤ）；ポリエチレンイミン；ｔｅｒｔ−ブタノール；および１，６−ヘキサンジオールからなる群より選択される。
【００５７】
ある特定の実施形態では、これらの結晶化条件は、１種または複数の塩をさらに含み得る。従って、ある特定の実施形態では、これらの結晶化条件は、ＭｇＣｌ２；Ｚｎ（ＯＡｃ）２、ＬｉＳＯ４、Ｃａ（ＯＡｃ）２、ＮａＣｌ；（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＣｄＣｌ２、ＣｏＣｌ２、ＭｇＳＯ４およびＮｉＣｌ２、好ましくはＭｇＣｌ２および／またはＮａＣｌからなる群より選択される１種または複数の塩をさらに含む。ある特定の実施形態では、これらの結晶化条件は、２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）；２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）；Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）；Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシル３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＳＰＯ）；４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）；３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）；２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール（Ｔｒｉｓ）；ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ｂｉｓ（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）；Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）；Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）；Ｎ−Ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）；Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）；ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ｔｒｉｓ（２−ｃａｒｂｏｘｙｌｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ）（ＴＣＥＰ）；アセトアミドグリシン；コラミン塩化物（ｃｈｏｌａｍｉｎｅ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）；グリシンアミド；ビシン；Ｎ−（２−ヒドロキシ−ｌ，ｌ−ｂｉｓ（ヒドロキシメチル）エチル）グリシン（トリシン）；イミダゾール；クエン酸ナトリウム；酢酸ナトリウム；カコジレート（ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ）；リン酸Ｎａ／Ｋ、および［１５］に記載される緩衝液からなる群より選択される１種または複数の緩衝液、好ましくはｔｒｉｓをさらに含む。本発明のポリペプチドを結晶化するために使用され得る沈殿剤には、硫酸リチウム；ＰＥＧ−４００；ＰＥＧ−５５０  ＭＭＥ；ＰＥＧ−２０００；ＰＥＧ−６０００；ＰＥＧ−８０００；ＰＥＧ  ２０，０００；および／または２−メチル−２，４−ペンタンジオール（ＭＰＤ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００５８】
ある特定の実施形態では、この結晶化溶液のｐＨは、約およそ４のｐＨ〜およそ９のｐＨの間である。ある特定の実施形態では、この結晶化溶液のｐＨは、約およそ６．５のｐＨ〜およそ９のｐＨの間である。ある特定の実施形態では、この結晶化溶液のｐＨは、およそ７．０である。ある特定の実施形態では、この結晶化溶液のｐＨは、タンパク質の等電点近傍である。
【００５９】
具体的な実施形態では、約６ｍｇ／ｍｌの濃度における本発明のポリペプチドが、ランダムマトリックス結晶化スクリーニングキットを用いるシッティングドロップ蒸気拡散法を使用する結晶化条件についてスクリーニングされる。かかるキットは、市販の、例えば、Ｑｉａｇｅｎ  ＪＣＳＧ−Ｉランダムマトリックス結晶化キットである。具体的な実施形態では、本発明のポリペプチドは、＃６条件（０．２Ｍ  ＭｇＣｌ２、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０、２．５Ｍ  ＮａＣｌ）下で結晶化される。他の実施形態では、これらの条件は、０．１〜０．３Ｍ  ＭｇＣｌ２、１．５〜３Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７である。およそ６〜２０ｍｇ／ｍｌのタンパク質が使用され得る。
【００６０】
ある特定の実施形態では、結晶は、例えば、データ収集の間に生じる結晶に対する放射線損傷を減弱させるために、液体窒素の温度において結晶を凍結させるための最適な低温条件（ｃｒｙｏ−ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）についてスクリーニングされる。ある特定の実施形態では、最適な低温条件についてのスクリーニングは、２０〜３５％ｖ／ｖのポリオール、例えば、グリセロール、エチレングリコールもしくは２−メチル−２，４−ペンタンジオール（ＭＰＤ）、または３５〜７０％ｗ／ｖの糖、例えば、スクロースもしくはキシリトールを含有する結晶化緩衝液において実施され得る。結晶は、低温緩衝液（ｃｒｙｏ−ｂｕｆｆｅｒ）中に約５〜１５分間浸漬され得る。具体的な実施形態では、条件＃６（０．２Ｍ  ＭｇＣｌ２、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０、２．５Ｍ  ＮａＣｌ）において成長させた本発明の結晶の凍結保護は、グリセロールおよびキシリトールを含有する低温緩衝液（０．２Ｍ  ＭｇＣｌ２、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０、２．５Ｍ  ＮａＣｌ、１０％グリセロールおよび５％キシリトール）中に結晶を浸漬させることによって達成される。
【００６１】
本発明の結晶は、ＦＡＰＰ２ポリペプチドのＧＬＴＰドメインに結合された結合性化合物もまた含み得る。ポリペプチドと結合性化合物との複合体は、結晶化の前、その後またはその間に形成され得る。ある特定の実施形態では、本発明の結晶、および結晶化条件は、結合性化合物をさらに含む。従って、ある特定の実施形態では、上記方法の結晶化溶液は、ＦＡＰＰ２  ＧＬＴＰドメインポリペプチド−結合性化合物複合体を提供するために、結合性化合物をさらに含む。ある特定の実施形態では、上記方法によって提供されるＦＡＰＰ２  ＧＬＴＰドメインポリペプチドは、ＦＡＰＰ２  ＧＬＴＰドメインポリペプチド−結合性化合物複合体を提供するために、結合性化合物の溶液中に浸漬される。
【００６２】
ある特定の実施形態では、結合性化合物は、ＦＡＰＰ２  ＧＬＴＰドメインポリペプチドの基質結合ポケット中で結合される。一部の実施形態では、このインヒビターは、可逆的インヒビターである。
【００６３】
他の実施形態では、この結合性化合物は、１つまたは複数のエキソサイト（ｅｘｏｃｉｔｅ）において、基質結合ポケットの外側に結合する。一部の実施形態では、この結合性化合物は、基質結合ポケット中で結合しようと１つまたは複数のエキソサイトにおいて結合しようと、結晶化および／またはＸ線回折のためにタンパク質を安定化することを補助する。
【００６４】
本発明のポリペプチドを提供するステップは、宿主細胞において適切なポリペプチドを発現させるステップを任意選択で含み得、このポリペプチドを精製するステップを任意選択でさらに含み得る。
【００６５】
発現されるポリペプチドは、本発明のポリペプチドが次いでタンパク質分解性切断などによってそれから誘導され得る、任意のポリペプチドである。従って、発現されるポリペプチドは、宿主細胞からのタンパク質の精製の間またはその後に引き続いて除去されるタグを含有し得る。このタグは、例えば、マトリックスへの結合を可能にすること、または宿主細胞からのポリペプチドの分泌を可能にすることによって、精製を促進するために使用され得る。
【００６６】
適切な精製方法の例には、Ｎｉカラムステップが含まれる。Ｎｉカラムは、例えばｈｉｓタグ中のヒスチジン残基に結合する。サイズ排除クロマトグラフィーステップ（ＳＥＣ）ステップもまた、例えば、異なるサイズのポリペプチドを分離するために、使用され得る。アニオン交換カラムが、さらに、またはあるいは、例えばＮｉカラムの後に使用され得る。これは、タンパク質の純度を増加させ得る。
【００６７】
ポリペプチドの結晶性形態
本発明は、本発明のポリペプチドの結晶性形態もまた提供する。ある特定の実施形態では、この結晶は、Ｔ４Ｌポリペプチドに融合された、ヒトＦＡＰＰ２のＧＬＴＰドメインの結晶である。ある特定の実施形態では、この結晶は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むまたはアミノ酸配列からなるポリペプチドの結晶である。
【００６８】
本発明の結晶は、種々の形態を取り得、その全てが、本発明によって企図される。ある特定の実施形態では、この結晶は、約５０〜１００×３０〜５０×２０〜３０μｍのサイズを有し得る。ある特定の実施形態では、この結晶は、図５に例示される光学的外観（ｏｐｔｉｃａｌ  ａｐｐｅａｒａｎｃｅ）を有し、および／またはこの結晶は、一部は明瞭な面を含まない、ロッド形状として成長し得る。本発明の結晶は、本明細書の他の場所で言及されるポリペプチド結晶化の方法によって得ることが可能であり得る。
【００６９】
本発明のポリペプチドの結晶性形態は、空間群Ｐ２１２１２で特徴付けられ得、ａ＝１００．０２Å、ｂ＝１３０．８７Å、ｃ＝８８．７３Å、α＝９０°、β＝９０°、γ＝９０°の＋／−５％、４％、３％、２％、１％の単位格子パラメーター、任意選択でａ＝１００．０２Å、ｂ＝１３０．８７Å、ｃ＝８８．７３Å、α＝９０°、β＝９０°、γ＝９０°の単位格子パラメーター、ａ＝１００．０２Å、ｂ＝１３０．８７Å、ｃ＝８８．７３Åの単位格子パラメーター、α＝９０°、β＝９０°、γ＝９０°の単位格子パラメーターを有し得る。このａ、ｂおよびｃ値は、さらなる小数位まで規定され得る（例えば、ａ＝１００．０２０、ｂ＝１３０．８７２、ｃ＝８８．７３３）。
【００７０】
用語「空間群」とは、結晶中の対称な要素の配置を指す。用語「単位格子」とは、基本的な並行６面体（ｐａｒａｌｌｅｌｉｐｉｐｅｄ）形状のブロックを指す。結晶の全体積は、かかるブロックの規則的なアセンブリによって構築され得る。
【００７１】
ＦＡＰＰ２のＧＬＴＰドメインの結晶構造
別の態様では、本発明は、本発明のポリペプチドについての３次元構造情報を提供する。他の態様では、本発明は、本発明のポリペプチドのアミノ酸のサブセットについての３次元構造情報を提供する。例えば、このサブセットは、ＦＡＰＰ２の基質結合ポケットを構成するアミノ酸、ＦＡＰＰ２の糖頭部基認識部位を構成するアミノ酸、および／またはＦＡＰＰ２のＧＬＴＰドメインを構成するアミノ酸であり得る。
【００７２】
ある特定の実施形態では、Ｘ線回折データ収集は、Ｘ線結晶学設備において実施され得る。１、２、３またはそれ超の回折データセットが、１つまたは複数の結晶から収集され得る。ある特定の実施形態では、本発明の結晶は、少なくともおよそ８オングストローム（Å）の分解能限界まで回折する。ある特定の実施形態では、この結晶は、少なくともおよそ６Å、４Åまたは３Åの分解能限界まで回折する。
【００７３】
ある特定の実施形態では、この結晶は、約３．９Åの、約３．２Åの、約２．９Åの、または約２．６Åの最大分解能まで、構造的座標の決定のためのＸ線を回折する。この結晶は、約２．０〜４．０Åの（例えば、約２．５Å〜約３．５Å、約２．０Å〜約３．０Åの、約２．５Å〜約３．０Åの、または約３．０Å〜約３．５Åの）最大分解能まで回折し得る。
【００７４】
回折データは、使用される機器およびデータを収集するために使用される結晶（複数可）の品質に全て依存する、種々の振動角、フレームの数および曝露時間を使用して収集され得る。当業者は、これらのパラメーターを最適化する方法を知っている［１６；１７］）。ある特定の実施形態では、回折データは、１°の振動で収集され得る。１°未満または１°超の振動などの他の振動が使用され得る。例えば、回折データは、０．１°、０．３°、０．５°、１°、１．５°、２°、３°、４°、５°もしくは１０°の振動、またはこれらの角度の間の任意の振動角で収集され得る。ある特定の実施形態では、１２０フレームが収集される。１２０よりも多いまたは少ないフレームが、収集され得る。例えば、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００もしくは５０００フレーム、またはこれらの数の間の任意の数のフレームが、収集され得る。ある特定の実施形態では、曝露は、１フレーム当たり１０分間である。例えば、１フレーム当たり５秒間、１０秒間、２０秒間、３０秒間、４０秒間、５０秒間、６０秒間、１２０秒間、１８０秒間、３分間、４分間、５分間、１５分間、２０分間、３０分間、またはこれらの時間の間の任意の曝露時間などの、他のフレーム曝露時間もまた使用され得る。データマージングおよびスケーリング（ｓｃａｌｉｎｇ）は、例えば、ＨＫＬ２０００ソフトウェアスイート（ＨＫＬ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ、ＶＡ）を使用して実施され得る。構造決定、モデル構築および精密化は、例えば、ＣＣＰ４ソフトウェアスイートの一部であるＭｏｌｒｅｐ、ｃｏｏｔおよびＲｅｆｍａｃなどのソフトウェアを使用して実施され得る。ＭｏｌＲｅｐは、自動分子置換のためのプログラムである（例えば、ＭｏｌＲｅｐ、バージョン１０．２．３５）。モデル構築のためのＰａｕｌ  Ｅｍｓｌｅｙ（ｗｗｗ．ｙｓｂｌ．ｙｏｒｋ．ａｃ．ｕｋ／〜ｅｍｓｌｅｙ）によるＣｏｏｔ  Ｇｒａｐｈｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅは、ｒｅｆｍａｃ５（Ｇｎｕ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｌｉｃｅｎｓｅ；ｒｅｆｍａｃ５、例えば、バージョン５．５．００７２またはバージョン５．５．０１０９）に対するインターフェースを含む。Ｇａｒｉｂ  Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖらによる高分子精密化プログラムは、ＣＣＰ４プログラムスイート（ｗｗｗ．ｃｃｐ４．ａｃ．ｕｋ、ＣＣＰ４、バージョン６．１．３）中に組み込まれる。構造的分析は、分子ビューアーソフトウェアＰＹＭＯＬ（ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ）を使用して実施され得る。ある特定の実施形態では、ポリペプチドのモデルは、プログラムＭｏｌｒｅｐを使用する分子置換法ならびに検索モデルとしてのＴ４Ｌ（ＰＤＢ  ＩＤ：３Ｇ３Ｖ）およびヒトＧＬＴＰ（ＰＤＢ  ＩＤ  １ＳＷＸ）について入手可能な構造情報によって取得され得る。例えば、初期位相は、検索モデルの座標から、ポリアラニンモデルを生じる側鎖の全てを除去して取得され得る。かかるモデルは、例えば、ｃｏｏｔおよびＲｅｆｍａｃなどのプログラムを使用して、さらなるモデル構築および精密化のために使用され得る。
【００７５】
用語「分子置換」とは、その原子座標が公知であるポリペプチド構造を配向させるまたは位置決めすることによって、その構造座標が公知ではない、ポリペプチド、または結合性化合物と複合体化したポリペプチドの３次元構造の予備モデルを生成することを含む方法を指す。位相がこのモデルから計算され、未知の結晶構造の観察された振幅と組み合わされて、およその構造を与える。次いで、この構造は、最終的な正確な構造を提供するために、精密化のいくつかの形態のいずれかに供される。当業者に公知の任意のプログラムが、分子置換によって構造を決定するために用いられ得る。適切な分子置換プログラムには、ＡＭＯＲＥ（１９９４年）［１８；１９］およびＣＮＳ（１９９８年）［２０］が含まれるが、これらに限定されない。
【００７６】
ある特定の実施形態では、本発明の結晶性ポリペプチドの原子座標またはそのサブセット（例えば、ＦＡＰＰ２の糖頭部基結合性残基、基質結合ポケットおよび／またはＧＬＴＰドメインについての）が提供される。結晶が３Åの分解能で回折する一実施形態では、このモデルは、２５．５％の最終Ｒ因子および３２．４％のＲｆｒｅｅまで精密化され得る。結晶が２．６Åの分解能で回折するさらなる実施形態では、このモデルは、２０．５％の最終Ｒ因子および２５．７％のＲｆｒｅｅまで精密化され得る。
【００７７】
ある特定の実施形態では、結晶性Ｔ４Ｌ−ＦＡＰＰ２−Ｃ２１２（配列番号３）の原子座標が提供される。配列番号３の残基３６〜２０７についてのパラメーターは、表１に示され、表中、これらは、融合タンパク質中のヒトＦＡＰＰ２の残基３０８以降に対するそれらの位置を反映するために、残基１３６〜３０７と称される。基質結合ポケット残基についてのパラメーターは、表２に示され、ＦＡＰＰ２のＧＬＴＰドメインについてのパラメーターは、表３に示される。表２および３中の残基番号付けは、全長ヒトＦＡＰＰ２における残基番号付けに従う（残基３０８以降は、全長ヒトＦＡＰＰ２においてこれらの残基のために使用される番号付けを用いて言及される（例えば、３０８はＩｌｅであり、３０９はＰｒｏであり、３１０はＴｈｒであり、３１１および３１２は両方ともＰｈｅである、など）。ヒトＦＡＰＰ２の残基３０８〜５１４についての原子座標は、表３中に提供される。分子Ａについての座標のみが提供される。
【００７８】
一実施形態では、３Åにおける結晶性Ｔ４Ｌ−ＦＡＰＰ２−Ｃ２１２は、Ｐ２１２１２の空間群、および、ａ＝９９．８Å、ｂ＝１３０．６Å、ｃ＝８８．６Å、α＝９０°、β＝９０°、γ＝９０°の＋／−５％、４％、３％、２％、１％の単位格子パラメーター、任意選択でａ＝９９．８Å、ｂ＝１３０．６Å、ｃ＝８８．６Å、α＝９０°、β＝９０°、γ＝９０°の単位格子パラメーターを有する。２．６Åにおける結晶性Ｔ４Ｌ−ＦＡＰＰ２−Ｃ２１２は、Ｐ２１２１２の空間群、およびａ＝１００．０２Å、ｂ＝１３０．８７Å、ｃ＝８８．７３Å、α＝９０°、β＝９０°、γ＝９０°の＋／−５％、４％、３％、２％、１％の単位格子パラメーター、任意選択でａ＝１００．０２Å、ｂ＝１３０．８７Å、ｃ＝８８．７３Å、α＝９０°、β＝９０°、γ＝９０°の単位格子パラメーターを有する（このａ、ｂおよびｃ値は、さらなる小数位まで規定され得る（例えば、ａ＝１００．０２０、ｂ＝１３０．８７２、ｃ＝８８．７３３）。
【００７９】
用語「原子座標」とは、結晶形態にあるタンパク質分子の原子（散乱中心）によるＸ線の単色ビームの回折によって取得されたパターンに関連する数学的方程式から導出される数学的座標を指す。回折データは、結晶の反復単位の電子密度マップを計算するために使用され得る。次いで、この電子密度マップは、結晶の単位格子内の個々の原子の位置を確立するために使用され得る。これらの座標は、コンピューター分析によっても取得され得る。
【００８０】
結晶性Ｔ４Ｌ−ＦＡＰＰ２−Ｃ２１２は、非対称単位中に、Ｍｏｌ−ＡおよびＭｏｌ−Ｂと呼ばれる２分子のＴ４Ｌ−ＦＡＰＰ２−Ｃ２１２を有する（図１）。結晶格子中の隣接する分子由来のＴ４Ｌは、結晶化を促進したように見える広範な接触を行う（図１）。分子Ａについての座標のみが表中に示される。
【００８１】
分析により、Ｄ３６０、Ｎ３６４、Ｗ４０７（糖頭部基結合性残基であると考えられる）を含む、グルコシルセラミド結合に関与するＦＡＰＰ２の残基、およびグルコシルセラミドを収容し、そのアシル／スフィンゴシン鎖と相互作用し得る他の（例えば、疎水性）残基が、電子密度マップにおいて十分に精密化されることが示される。ＰＤＢ  ＩＤ：３Ｓ０Ｋ由来のオレオイルアシル鎖（１８：１）を含有するグルコシルセラミドは、ＦＡＰＰ２構造のリガンド結合ポケット（図３、図中、アミノ酸残基は、配列番号４に従って番号付けされている）中にドッキングされ、対応する電子密度マップは、図４に示される。ドッキング後にエネルギー最小化は行わなかった。
【００８２】
ＦＡＰＰ２−Ｃ２１２構造は、８つのアルファヘリックスを有する一般的なＧＬＴＰ折り畳みを取る（図６）。Ｗ４０７は、ヘリックス−４中に位置する。糖頭部基は、このトリプトファンの上に積み重なり、Ｄ３６０およびＮ３６４とさらに接触する。ＦＡＰＰ２では、Ｅ４０３もまた、糖環（ｓｕｇａｒ  ｒｉｎｇ）とのさらなる相互作用を提供する糖結合ポケットに位置する。Ｅ４０３は、相同性モデル化に基づいて、糖結合ポケット中に位置し、負に荷電した糖頭部基を識別することができると、文献中に報告されている。しかし、本発明の構造では、これは、糖環結合を安定化できる残基として現れる。
【００８３】
Ｎ３９９と水素結合したＫ３６７およびＮ３９９周囲の突出したループは、ＦＡＰＰ２中の負に荷電した糖頭部基を識別することを担うようである（図７）。
【００８４】
セラミド結合性トンネルを形成する残基のほとんどは、ＦＡＰＰ２およびｈＧＬＴＰにおいて保存されているまたは類似しているのいずれかである。しかし、ｈＧＬＴＰ中には存在しない２つのフェニルアラニン、セラミド結合性トンネルの末端に位置するＦ３１１およびＦ３１２が存在する（図６および８、図８では、２４：１ガラクトシルＣｅｒが結合したｈＧＬＴＰ（ＰＤＢ  ＩＤ：２ＥＵＫ）が、ＦＡＰＰ２上に重ね合わされている）。これら２つのフェニルアラニンは、ＦＡＰＰ２に独自であり、ＦＡＰＰ２  ＧＬＴＰドメインのＮ末端に位置する。これら２つの残基は、疎水性トンネルの末端に存在し、ヘリックス１、７および８とも疎水性接触し、そうしてＧＬＴＰ折り畳みを安定化させる。さらに、これら２つのフェニルアラニン残基は、ＶＡＰ（小胞結合膜タンパク質関連タンパク質）と相互作用することが公知のＦＦＡＴ様モチーフの一部である。ＦＡＰＰ２のＦ３１１は、ヘリックス１とヘリックス２との間に位置するｈＧＬＴＰのＦ３３と同じ場所を占める。これら２つの残基は、セラミド放出において役割を果たし得る。ＦＡＰＰ２の移行活性の阻害は、これらを押しのける（ｄｉｓｐｌａｃｅ）ことによって達成され得る。
【００８５】
用語「結合ポケット」は、移行される分子（即ち、基質）がＦＡＰＰ２に結合する部位を指すために本明細書で使用される。結合ポケットの構造および化学的特性は、結合性化合物または基質の認識および結合を可能にする。この結合ポケットは、典型的には、分子の結合特異性（例えば、電荷、疎水性および／または立体障害）を担う残基を含む。３０残基が、セラミドドッキングモデルにおけるドッキングした基質の５Å以内にあると、本発明者によって同定されている（表４を参照のこと）。一実施形態では、この基質結合ポケットは、表４の残基を含む。これらの残基は、基質と接触する可能性を有する。
【００８６】
ある特定の実施形態では、この結合ポケットは、糖頭部基結合性残基を含むと定義され得る。
【００８７】
これらの糖頭部基結合性残基は、基質（例えば、ＧｌｃＣｅｒ）のグルコシル頭部基と接触する残基である。少なくとも残基Ｄ３６０、Ｎ３６４およびＷ４０７は、ｈＧＬＴＰに対する変異研究に基づいて、ＧｌｃＣｅｒのグルコシル頭部基と接触すると考えられる［２１］（図３もまた参照のこと）。これらの糖頭部基結合性残基は、ある特定の基質に対するＦＡＰＰ２の選択性に寄与し得る。例えば、ＦＡＰＰ２は、関連の分子ＧＬＴＰとは異なる基質選択性を示すことが示されている。ＦＡＰＰ２は、広く選択的なヒトＧＬＴＰと比較して、非荷電モノヘキソシルおよびジヘキソシルセラミドに対する優先傾向を示す［８］。ＦＡＰＰ２は、ＧｌｃＣｅｒならびに他の単純な中性グリコシルセラミド、例えば、ＧｌａＣｅｒおよびＬａｃＣｅｒを効率的に移行させることが示されているが、スルファチドなどの負に荷電した分子は移行させない。これらの糖頭部基結合性残基の原子座標は、表２中に含まれる。
【００８８】
これらの糖頭部基結合性残基に加えて、基質結合ポケットは、ＦＡＰＰ２が、ＧｌｃＣｅｒなどの基質の非糖部分、例えば、そのセラミド部分を収容することを可能にする残基もまた含み得る。疎水性残基を含む、基質またはセラミド（脂肪酸鎖）収容トンネルが存在する（表４を参照のこと）。疎水性であると規定され得るこのトンネルは、基質結合に依存する形状を有する（ヘリックス２、４、５および６は、脂肪酸鎖を収容するために、僅かに移動し得る）。セラミド収容トンネル中の２つの重要なフェニルアラニン残基Ｆ３１１およびＦ３１２の役割は、上で議論されている。セラミド収容トンネル中の残基には、表４で言及される他の疎水性残基に加えて、Ｌ４４１、Ｆ４５３、Ｙ４９１（例えば、［２１］中で同定されたとおり）が含まれる。
【００８９】
基質結合ポケット中の重要な残基の一部は、ｈＧＬＴＰ中のものと同一であり、他の残基は類似であるが、Ｖ３４５、Ｎ３９９、Ｅ４０３、Ｒ３９８、Ｆ３１１およびＦ３１２を含む少数がＦＡＰＰ２に独自であることが、表４から見て取れる。
【００９０】
本発明の構造は、ヒトＧＬＴＰと比較してヒトＦＡＰＰ２に独自である基質結合ポケットの残基として、Ｖ３４５、Ｎ３９９、Ｅ４０３、Ｒ３９８、Ｆ３１１およびＦ３１２を同定している。これらは、ヒトＧＬＴＰには存在しない場合があり（Ｒ３９８、Ｆ３１１およびＦ３１２の場合）、またはヒトＧＬＴＰ中の等価な残基とは異なり得る。Ｆ３１１およびＦ３１２の潜在的役割は、上で議論されている。Ｎ３９９、Ｅ４０３およびＲ３９８は、糖頭部基の近傍で見出される。
【００９１】
一実施形態では、取得された構造情報に基づいて作出されたモデルは、糖頭部基結合性残基についての位置情報を含有する。他の実施形態では、取得された構造情報に基づいて作出されたモデルは、さらに、またはあるいは、Ｌ４４１、Ｆ４５３、Ｙ４９１（および任意選択で、表４で言及される他の疎水性残基）を含む、セラミド収容トンネル中の残基についての位置情報を含有する。さらなる実施形態では、取得された構造情報に基づいて作出されたモデルは、さらに、またはあるいは、ヒトＦＡＰＰ２に独自として表４で言及される残基の位置情報を含有する。
【００９２】
表１〜３は、結晶性Ｔ４Ｌ−ＦＡＰＰ２−Ｃ２１２またはその部分についての原子座標を提供するが、本発明は、例えば、活性であるとして認識されるエリアにおいて特に、顕著な構造的相同性（例えば、顕著な構造的重複）を有するポリペプチドについてのその構造的改変もまた企図し、従って、本明細書で提供されるものと同じまたは類似の構造情報を提供することを、理解すべきである。顕著な構造的相同性とは、以下の基準のうち少なくとも１つを指す：（ｉ）結晶性Ｔ４Ｌ−ＦＡＰＰ２−Ｃ２１２もしくはそのＧＬＴＰドメインとの、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％の構造的相同性；または（ｉｉ）結晶性Ｔ４Ｌ−ＦＡＰＰ２−Ｃ２１２もしくはそのＧＬＴＰドメインの認識された結合ポケットとの、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％の構造的相同性。ある特定の実施形態では、顕著な構造的相同性は、Ｔ４Ｌ−ＦＡＰＰ２−Ｃ２１２またはそのＧＬＴＰドメインの一次アミノ酸配列との、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の構造的相同性もまた指し得る。さらに、Ｔ４Ｌ−ＦＡＰＰ２−Ｃ２１２の一次アミノ酸配列は、より大きいアミノ酸配列中にセグメントとして含まれる配列であり得るか、またはその断片（例えば、ＧＬＴＰドメイン）であり得る。一部の実施形態では、全長Ｔ４Ｌ−ＦＡＰＰ２−Ｃ２１２ポリペプチドの断片は、本明細書で提供される本発明の方法または系において提供または使用される。一部の実施形態では、断片は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５０〜７５、７５〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００アミノ酸の（または少なくともそれらの）配列を含む。一部の実施形態では、Ｔ４Ｌ−ＦＡＰＰ２−Ｃ２１２の断片は、全長Ｔ４Ｌ−ＦＡＰＰ２−Ｃ２１２配列、例えば、全長ヒトＴ４Ｌ−ＦＡＰＰ２−Ｃ２１２配列を含まない。一部の実施形態では、Ｔ４Ｌ−ＦＡＰＰ２−Ｃ２１２の断片は、ＦＡＰＰ２の移行活性を担う部分のうち全てまたは少なくとも一部を含む。一部の実施形態では、断片には、ＧｌｃＣｅｒのグルコシル頭部基と接触することが示されている残基（例えば、Ｄ３６０、Ｎ３６４、Ｗ４０７）を含有する断片が含まれる。本発明は、Ｔ４Ｌ−ＦＡＰＰ２−Ｃ２１２またはそのＧＬＴＰドメインの任意のおよび全てのかかるバリエーションおよび改変を企図し、これらは、本発明の方法および使用において使用され得る（例えば、ＦＡＰＰ２の３０８〜５１５、３０８〜５１４、３０８〜５１３、３０８〜５１２）。
【００９３】
表１は、Ｔ４Ｌ−ＦＡＰＰ２−Ｃ２１２についての原子座標のセットを提供し、表３は、そのＧＬＴＰドメインについての原子座標を提供する。
【００９４】
構造情報の使用
別の態様では、本発明は、方法および／または構造情報の使用、例えば、ファブリー病を処置する際に有用であり得る、ＦＡＰＰ２に対する結合性化合物を設計、同定および／またはスクリーニングするための方法を提供する。
【００９５】
ある特定の実施形態では、ＦＡＰＰ２と会合する化合物の能力を評価する方法などの、ＦＡＰＰ２に対する結合性化合物を同定、設計、選択および／または最適化するための方法が提供される。これらの結合性化合物は、ファブリー病の処置において有用であり得る。ファブリー病は、哺乳動物リソソームにおけるスフィンゴ糖脂質の正常なプロセシングに必要な酵素であるα−ガラクトシダーゼＡ（α−Ｇａｌ  Ａ）が存在しないことによって引き起こされるので、この酵素に対する基質の量を低減させることは、ファブリー病の処置において特に有用であり得る。ある特定の実施形態では、この結合性化合物は、例えばタンパク質フォールディングの間の酵素安定化に影響を与え得る。この化合物は、酵素の細胞内輸送の局面、または移行機能の局面、例えば、基質認識および／もしくは移行活性にも、影響を与え得る。
【００９６】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される３次元構造情報を使用した、ＦＡＰＰ２結合性化合物のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでの設計、同定、選択および／または最適化のための方法が提供される。ある特定の実施形態では、ＦＡＰＰ２活性のインヒビター、可逆的インヒビター、アクチベーターおよび／または安定剤を同定するために使用され得る方法が提供される。ある特定の実施形態では、ＦＡＰＰ２安定性をモジュレートする結合性化合物を同定するために使用され得る方法が提供される。ある特定の実施形態では、ＦＡＰＰ２の安定性、活性および／または細胞内輸送をモジュレートする結合性化合物を同定するために使用され得る方法が提供される。ある特定の実施形態では、ＦＡＰＰ２に結合する能力、ＦＡＰＰ２の安定性をモジュレートする能力、ＦＡＰＰ２の活性をモジュレートする能力、およびまたはＦＡＰＰ２の細胞内輸送をモジュレートする能力について、潜在的結合性化合物を試験するために使用され得る方法が提供される。ある特定の実施形態では、これらの方法には、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの方法が含まれる。
【００９７】
潜在的ＦＡＰＰ２結合性化合物の設計、同定、選択および／または最適化
本発明の１つの目的は、ＦＡＰＰ２に対する潜在的結合性化合物を設計、同定、選択および／または最適化するために、Ｔ４Ｌ−ＦＡＰＰ２−Ｃ２１２について提供された原子座標（表１および３）またはそのサブセット（例えば、ＦＡＰＰ２の基質結合ポケット残基について提供されたものおよび／またはＦＡＰＰ２のＧＬＴＰドメインについて提供されたもの）を使用することである。本明細書でＦＡＰＰ２が言及される全ての場合において、これは、好ましくは、ヒトＦＡＰＰ２である。この方法から得られた化合物は、ヒト被験体においてファブリー病を処置することができると、さらに同定され得る。他の場所で議論されるように、これらの方法は、糖頭部基結合性残基および／または基質結合ポケット中のさらなる残基である少なくともアミノ酸の原子座標を利用し得る。表３は、ヒトＦＡＰＰ２の残基３０８〜５１４についての原子座標を提供する。これらの方法は、ヒトＦＡＰＰ２の少なくともアミノ酸３０８〜５１４の、これらの原子座標を利用し得る。
【００９８】
従って、さらなる態様では、本発明は、ＦＡＰＰ２に結合する化合物を同定する方法であって、例えば表２に示される、ＦＡＰＰ２の少なくとも基質結合ポケットの原子座標を使用して、ＦＡＰＰ２に結合する化合物をコンピューターで同定するステップを含む方法を提供する。本発明はさらに、ＦＡＰＰ２に結合する化合物を同定する方法であって、ａ）表３に示される、ＦＡＰＰ２の少なくともＧＬＴＰドメインについての原子座標のセットを提供するステップ、およびｂ）この座標を使用して、ＦＡＰＰ２に結合する化合物をコンピューターで同定するステップを含む方法を提供する。
【００９９】
さらなる態様では、本発明は、ＦＡＰＰ２に結合する化合物を設計、選択および／または最適化する方法であって、ａ）例えば表２に示される、ＦＡＰＰ２の基質結合ポケットを構成する少なくともアミノ酸の原子座標のセットを提供するステップ、ならびにｂ）化合物と、原子座標から生成された３次元構造情報の全てまたは一部との間でのフィッティング操作を実施することによって、その化合物をコンピューターで設計、選択および／または最適化するステップを含む方法を提供する。本発明はさらに、ＦＡＰＰ２に結合する化合物を設計、選択および／または最適化する方法であって、ａ）表３に示される、ＦＡＰＰ２の少なくともＧＬＴＰドメインについての原子座標のセットを提供するステップ、ならびにｂ）化合物と、原子座標から生成された３次元構造情報の全てまたは一部との間でのフィッティング操作を実施することによって、その化合物をコンピューターで設計、選択および／または最適化するステップを含む方法を提供する。
【０１００】
さらなる態様では、本発明は、ＦＡＰＰ２と会合する化合物の能力を評価するための方法であって、ａ）例えば表２に示される、ＦＡＰＰ２の基質結合ポケットを構成する少なくともアミノ酸の原子座標のセットを提供するステップ；ｂ）化合物と、原子座標から生成された３次元構造情報の全てまたは一部との間でのフィッティング操作をコンピューターで実施するステップ；およびｃ）このフィッティング操作の結果を分析して、化合物とＦＡＰＰ２ポリペプチドとの間の会合を定量化するステップを含む方法を提供する。本発明はさらに、ＦＡＰＰ２と会合する化合物の能力を評価するための方法であって、ａ）表３に示される、ＦＡＰＰ２の少なくともＧＬＴＰドメインについての原子座標のセットを提供するステップ、およびｂ）化合物と、原子座標から生成された３次元構造情報の全てまたは一部との間でのフィッティング操作をコンピューターで実施するステップ；およびｃ）このフィッティング操作の結果を分析して、化合物とＦＡＰＰ２との間の会合を定量化するステップを含む方法を提供する。
【０１０１】
一実施形態では、本発明の方法は、ステップ（ｂ）の前に、この構造の３次元グラフィカル表示を生成するステップをさらに含む。
【０１０２】
さらなる態様では、本発明は、ＦＡＰＰ２と会合する化合物の能力を評価するためにコンピューターを使用する方法であって、このコンピューターは、例えば表２に示される、ＦＡＰＰ２の基質結合ポケットを構成する少なくともアミノ酸の原子座標がコード化されたデータ記憶材料を含む機械可読データ記憶媒体、およびアミノ酸の構造の３次元グラフィカル表示を生成するための手段を含み、この方法は、ａ）化合物およびＦＡＰＰ２の基質結合ポケットの全てまたは一部の構造のグラフィカル３次元表示を使用して、第１の化合物を位置決めするステップ；ｂ）コンピューター手段を用いることによって、化合物とＦＡＰＰ２の基質結合ポケットとの間でのフィッティング操作を実施するステップ；およびｃ）このフィッティング操作の結果を分析して、化合物とＦＡＰＰ２の基質結合ポケットとの間の会合を定量化するステップを含む方法を提供する。
【０１０３】
この方法はさらに、ＦＡＰＰ２と会合する化合物の能力を評価するためにコンピューターを使用する方法であって、このコンピューターは、表３に示される、ＦＡＰＰ２の少なくともＧＬＴＰドメインについての原子座標がコード化されたデータ記憶材料を含む機械可読データ記憶媒体、およびＦＡＰＰ２のＧＬＴＰドメインの構造の３次元グラフィカル表示を生成するための手段を含み、この方法は、ａ）化合物およびＦＡＰＰ２のＧＬＴＰドメインの全てまたは一部の構造のグラフィカル３次元表示を使用して、第１の化合物を位置決めするステップ；ｂ）コンピューター手段を用いることによって、化合物とＦＡＰＰ２のＧＬＴＰドメインとの間でのフィッティング操作を実施するステップ；およびｃ）このフィッティング操作の結果を分析して、化合物とＦＡＰＰ２のＧＬＴＰドメインとの間の会合を定量化するステップを含む方法を提供する。
【０１０４】
ＦＡＰＰ２と会合する化合物の能力を評価するためにコンピューターを使用する方法は、（ｄ）第２の化学的実体を用いて、ステップ（ａ）〜（ｃ）を反復するステップ；および（ｅ）第１または第２の化学的実体の定量化された会合に基づいて、ＦＡＰＰ２のＧＬＴＰドメインまたは基質結合ポケットと会合する第１または第２の化学的実体のうちの少なくとも１つを選択するステップをさらに含み得る。
【０１０５】
上記方法は、さらに、単独の、またはセラミド収容トンネル残基および／もしくはＦＡＰＰ２に独自であると規定される残基と合わせた、糖頭部基結合性残基の原子座標に基づいて、実施され得る。
【０１０６】
ＦＡＰＰ２に結合する結合性化合物をモデル化することにおける、本発明の結晶性形態の構造またはそのサブセットの使用、およびＦＡＰＰ２に結合する結合性化合物をモデル化することにおける、本発明の結晶性形態の原子座標またはそのサブセットの使用もまた、提供される。
【０１０７】
本発明の方法において使用され得る構造座標の有用なサブセットは、ａ）ＦＡＰＰ２の糖頭部基結合性残基、ｂ）ＦＡＰＰ２の基質結合ポケット残基、およびｃ）ＦＡＰＰ２のＧＬＴＰドメイン、を規定する構造座標を含む。
【０１０８】
本発明に従う潜在的結合性化合物は、ＦＡＰＰ２上のどの場所でも結合し得ることを理解すべきである。一実施形態では、本発明に従う潜在的結合性化合物は、ＦＡＰＰ２のＧＬＴＰドメイン上に結合し得る。この結合性化合物は、結合ポケットに、または結合ポケットとして同定されていない任意の他の部位に、例えば、結合ポケットに隣接する部位に、結合し得る。ある特定の実施形態では、本発明に従う潜在的結合性化合物は、ＦＡＰＰ２ポリペプチド（新生の、部分的にまたは完全に折り畳まれた）上の１つまたは複数の部位に特異的に結合し得る。
【０１０９】
多くの実施形態では、この結合性分子は、ＦＡＰＰ２の結合ポケットに結合する。多くの実施形態では、この結合性分子は、ＦＡＰＰ２の糖頭部基結合性残基、またはセラミド収容トンネル残基に結合する。分子またはその規定された部分「への結合（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ）」は、分子またはその規定された部分の全てまたは一部への結合を包含し、その結果、分子またはその規定された部分への結合に対する言及は、その分子または部分の各残基との相互作用が行われることを必要としない。
【０１１０】
これに沿って、結合性化合物が、本発明の方法を使用して同定される場合、結合性化合物の同定は、関連する分子もしくはその規定された部分、または規定された分子もしくはその部分の一部についての情報を使用し得る。従って、ＦＡＰＰ２のＧＬＴＰドメインの構造、ＦＡＰＰ２結合ポケットの構造、糖頭部基結合性残基の構造、またはこれらのいずれかの一部分についての情報を使用し得る。
【０１１１】
本明細書で使用する場合、「結合性化合物」とは、ＦＡＰＰ２に可逆的にまたは不可逆的に結合する化合物を指す。ある特定の実施形態では、この結合性化合物は、ＦＡＰＰ２の結合ポケット中で結合する。結合は、共有結合または非共有結合であり得る結合の形成を含み得る。非共有結合的結合は、例えば、水素結合、イオン結合または疎水性結合であり得る。
【０１１２】
結合性化合物は、ＦＡＰＰ２の活性に影響を与え得る。これは、その基質を移行させるＦＡＰＰ２の能力をモジュレートすることによって直接達成され得、これは、ＦＡＰＰ２のインヒビターであること（即ち、移行活性における阻害または低減を惹起すること）によって、またはＦＡＰＰ２のアクチベーターであること（即ち、移行活性における増加を惹起すること）によって、達成され得る。一部の場合には、この結合性化合物は、ＦＡＰＰ２の安定性に影響を与え得、これは次に、ＦＡＰＰ２の活性に対する影響を生じ得、この場合、この結合性分子は、ＦＡＰＰ２の安定剤または不安定化剤である（即ち、ＦＡＰＰ２の安定性における変化を惹起し得る）。他の場合には、この結合性分子は、ＦＡＰＰ２の細胞内輸送に影響を与え得る。ＦＡＰＰ２は、ゴルジにおいてその基質を取りあげ、従って、ゴルジにおいて局在化するＦＡＰＰ２の能力に影響する結合性分子（例えば、ＦＡＰＰ２がゴルジに局在化するのを防止する、またはＦＡＰＰ２がゴルジに局在化する能力を低減させる、またはＦＡＰＰ２がゴルジに局在化する能力を増加させる）もまた企図される。
【０１１３】
ある特定の実施形態では、この潜在的結合性化合物は、潜在的インヒビターまたはアクチベーター化合物である。ある特定の実施形態では、この潜在的結合性化合物は、潜在的ＦＡＰＰ２インヒビターまたはアクチベーター化合物である。ある特定の実施形態では、この潜在的インヒビターまたはアクチベーター化合物は、競合的、不競合的または非競合的なインヒビターまたはアクチベーター化合物である。ある特定の実施形態では、この潜在的インヒビターは、可逆的インヒビターである。当業者は、標準的な方程式を使用して動力学的データをコンピューターフィッティングさせることによって［２２］、またはＦＡＰＰ２の移行活性をモジュレートする潜在的インヒビターもしくはアクチベーターの能力を測定するアッセイを用いることによって、潜在的インヒビターまたはアクチベーターを、競合的、不競合的もしくは非競合的または可逆的なインヒビターまたはアクチベーターとして同定し得る。
【０１１４】
ＦＡＰＰ２は、ＧｌｃＣｅｒなどの糖脂質をシス−ゴルジからＴＧＮへと移行させるように少なくとも機能することが公知である。従って、ＦＡＰＰ２の活性には、その移行活性、即ち、その基質を一方の膜からもう一方の膜へと移行させることが含まれる。この移行活性は、例えば、一方の膜からもう一方の膜への基質移行をｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定することによって測定され得る。これらのアッセイには、一般に、ドナー小胞およびアクセプター小胞が関与し、標識された基質の移行が測定される。少なくとも２つの確立されたアッセイが存在する。一例では、基質移行は、基質が放射性標識される場合、アクセプター小胞の液体シンチレーションカウンティングによって測定される。別の一例では、糖脂質移行活性のリアルタイムモニタリングは、フェルスター共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を使用して実施され、このとき、ドナー膜における適切に標識された基質分子と標識された移行不能な分子との間のＦＲＥＴが決定される。適切に標識された基質分子の発光の回復は、移行を示す［２３、２４、２５、２６、２７］。
【０１１５】
ＦＡＰＰ２のインヒビターまたはアクチベーターは、一実施形態では、それぞれ、ＦＡＰＰ２活性の統計的に有意な減少または増加をもたらし得る。
【０１１６】
ＦＡＰＰ２のインヒビターは、ＦＡＰＰ２の触媒基質であり得る。かかる化合物は、ＦＡＰＰ２の天然の基質ＧｌｃＣｅｒのアナログ、または結合ポケットに結合する他の分子、例えば、ＧａｌＣｅｒもしくはＬａｃＣｅｒのアナログであり得る。かかるアナログは、それらにＦＡＰＰ２を阻害させる改変を有し得る。
【０１１７】
可能なインヒビターのさらなる例には、例えば、Ｗ４０７の上に積み重なり得、糖頭部基結合ポケットを満たし得る、親水性結合または水素結合形成性頭部基を有する分子；（２）セラミド収容トンネルに結合し得る疎水性分子；（３）セラミド収容トンネルの末端に（糖結合ポケットに対して反対の面に）位置するＦ３１１／Ｆ３１２を押しのけ得る小分子が含まれる。
【０１１８】
結合性化合物は、小分子であり得る。用語「小分子」は、本明細書で使用する場合、ポリマーではない低分子量有機化合物を記載することを意味する。小分子は、タンパク質、核酸または多糖などのバイオポリマーに、高いまたは低い親和性で結合し得、そのバイオポリマーの活性または機能をさらに変更し得る。小さい有機化合物の分子量は、一般に、約１５００Ｄａよりも小さくてもよい。小分子は、約１０００Ｄａよりも小さい、約８００Ｄａよりも小さい、または約５００Ｄａよりも小さくてもよい。小分子は、細胞膜を横切って迅速に拡散し得、経口バイオアベイラビリティーを有し得る。これらの化合物は、天然または合成であり得る。
【０１１９】
ＦＡＰＰ２に対して（例えば、ヒトＦＡＰＰ２に対して）特異的な結合性分子を同定することができることは、有用である。特異的とは、この結合性分子が、ＦＡＰＰ２への結合に対する優先傾向を有する（例えば、これが、１つもしくは複数の他の分子に結合しない、またはこれが、１つもしくは複数の他の分子への、例えば、少なくとも５分の１、１０分の１、２０分の１、５０分の１、１００分の１、２００分の１、５００分の１、１０００分の１に低減された親和性の、低減された結合を示す）ことを意味する。結合は、当技術分野で公知の方法に従って定量化され得る。
【０１２０】
好ましくは、この結合性分子は、ＧＬＴＰと比較して、ＦＡＰＰ２に対して特異的である（例えば、ヒトＧＬＴＰと比較して、ヒトＦＡＰＰ２に対して特異的である）。ヒトＦＡＰＰ２のＧＬＴＰドメインは、本発明者によって決定されたとおり、ヒトＧＬＴＰと構造が類似しているが同一ではなく、これら２つの分子間には重要な差異が存在する。本発明者によるＦＡＰＰ２の構造の同定は、必要とされる特異性を有する結合性分子を得ることができることを意味する。
【０１２１】
ヒトＧＬＴＰについての構造情報（例えば、ＰＤＢ  ＩＤ  １ＳＷＸ、ＰＤＢ  ＩＤ  ２ＥＵＫ、ＰＤＢ  ＩＤ  ４Ｈ２Ｚ）の利用可能性は、上記方法（ヒトＦＡＰＰ２のＧＬＴＰドメイン（またはその部分）の構造を使用する）に加えて、ヒトＦＡＰＰ２のＧＬＴＰドメイン（またはその部分）についての原子座標または構造情報を使用する上記ステップが、ヒトＧＬＴＰについての原子座標または構造情報を使用して実施される方法が、実施され得ることもまた意味する。これは、ヒトＦＡＰＰ２のＧＬＴＰドメイン（またはその部分）の構造を使用する方法と並行してまたはそれと順番に実施され得る。かかる方法は、ＦＡＰＰ２に結合する結合性分子がＧＬＴＰよりもＦＡＰＰ２に対して特異的であるかどうかを決定するためのさらなる方法である。
【０１２２】
同様に、本明細書で提供される情報は、（例えば、等しいまたは約等しい親和性で）ヒトＧＬＴＰおよびヒトＦＡＰＰ２の両方に結合する結合性化合物、またはヒトＦＡＰＰ２よりもヒトＧＬＴＰに対して特異的である結合性化合物を同定するために使用され得る。上で言及される方法は、ヒトＧＬＴＰおよびヒトＦＡＰＰ２の両方に結合する結合性化合物、またはヒトＦＡＰＰ２よりもヒトＧＬＴＰに対して特異的である結合性化合物を同時にまたは逐次的に同定するために、ＧＬＴＰについて利用可能な原子座標または構造情報、およびＦＡＰＰ２について本明細書で提供される等価な情報を使用して実施され得る。
【０１２３】
従って、例として、ＦＡＰＰ２に結合する化合物を同定、設計、選択、最適化および／または評価する、上で言及される方法は、この化合物がＧＬＴＰに結合するかどうかを決定するステップ、および／または化合物とＧＬＴＰの３次元構造情報の全てもしくは一部との間でのフィッティング操作を実施するステップを、さらに含み得る。
【０１２４】
ＦＡＰＰ２と会合する化合物の能力を評価するためにコンピューターを使用することに関する、上で言及される方法は、ＧＬＴＰの基質結合ポケット（または分子全体）を構成する少なくともアミノ酸の原子座標がコード化されるデータ記憶材料をさらに必要とし得、化合物とＧＬＴＰの基質結合ポケットとの間の会合を定量化するステップをさらに必要とし得る。
【０１２５】
上で言及される使用は、ＧＬＴＰの構造の使用をさらに取り込み得る。
【０１２６】
従って、かかる方法および使用は、ＦＡＰＰ２に（例えば、ＧＬＴＰよりも）特異的に結合する化合物またはＦＡＰＰ２およびＧＬＴＰに結合する化合物を同定、設計、選択、最適化および／または評価する方法であり得る。
【０１２７】
さらなる一例として、ＦＡＰＰ２よりもＧＬＴＰに特異的に結合する化合物を同定、設計、選択、最適化および／または評価する方法もまた、提供される。例えば、ＦＡＰＰ２よりもＧＬＴＰに特異的に結合する化合物を同定する方法は、（ｉ）例えば表２に示されるＦＡＰＰ２の少なくとも基質結合ポケットの原子座標、およびＧＬＴＰの少なくとも基質結合ポケットの原子座標、または（ｉｉ）表３に示されるＦＡＰＰ２の少なくともＧＬＴＰドメインについての原子座標、およびＧＬＴＰについての原子座標を使用して、ＦＡＰＰ２よりもＧＬＴＰに特異的に結合する化合物をコンピューターで同定するステップを含む。
【０１２８】
ＦＡＰＰ２よりもＧＬＴＰに特異的に結合する化合物を設計、選択および／または最適化する方法は、ａ）ｉ）例えば表２に示されるＦＡＰＰ２の基質結合ポケットを構成する少なくともアミノ酸、およびＧＬＴＰの基質結合ポケットを構成する少なくともアミノ酸、またはｉｉ）表３に示されるＦＡＰＰ２の少なくともＧＬＴＰドメイン、およびＧＬＴＰの、原子座標のセットを提供するステップ、ｂ）化合物と、原子座標から生成された３次元構造情報の全てまたは一部との間でのフィッティング操作を実施することによって、その化合物をコンピューターで設計、選択および／または最適化するステップを含み得る。
【０１２９】
一実施形態では、本発明の方法は、ステップ（ｂ）の前に、この構造の３次元グラフィカル表示を生成するステップをさらに含む。
【０１３０】
潜在的結合性化合物は、化合物のライブラリーから同定もしくは選択され得、またはデータベースから同定もしくは選択され得る。かかる場合には、同定は、既存の分子構造から行われ、潜在的結合性化合物は、例えば、既存の化合物の群より選択される。所望の特性または特徴を有するまたは示す１つまたは複数のメンバー、例えば、小分子または基質アナログが選択される。
【０１３１】
この潜在的結合性化合物は、一部の実施形態では、例えばｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで設計される。結合性化合物がｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで設計される場合、これは、公知の化合物に由来し得る。「設計」または「設計すること」とは、本明細書で使用する場合、例えば、小分子または基質アナログなどの化合物の、新規分子構造を提供することを意味する。
【０１３２】
潜在的結合性化合物の設計および同定（例えば、適切な化学的断片を選択することによる）において使用され得る適切なコンピュータープログラムには、ＧＲＩＤ［２８］、ＭＣＳＳ［２９］、ＡＵＴＯＤＯＣＫ［３０］；およびＤＯＣＫ［３１］が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３３】
個々の化学的実体または断片を接続する際に使用され得る適切なコンピュータープログラムには、ＣＡＶＥＡＴ（Ｂａｒｔｌｅｔｔ（１９８９年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ、Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｐｕｂ．、Ｒｏｙａｌ  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ７８巻：１８２〜１９６頁［３２］）；および３Ｄ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ、例えば、ＭＤＬ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣａｌｉｆによるＭＡＣＣＳ−３Ｄ）、ＨＯＯＫ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）および参考文献［３３］で概説されるものが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３４】
潜在的結合性化合物が段階的な様式（例えば、上記したように、一度に１つの断片または化学的実体）で構築または同定される方法に加えて、潜在的結合性化合物は、空の活性部位を使用して、または任意選択で、公知のインヒビター（複数可）、アクチベーター（複数可）もしくは安定剤（複数可）の一部の部分（複数可）を含めて、全体としてまたは「ｄｅ  ｎｏｖｏ」で、設計され得る。適切なコンピュータープログラムには、ＬＵＤＩ［３４］、ＬＥＧＥＮＤ［３５］；およびＬＥＡＰＦＲＯＧ（Ｔｒｉｐｏｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）が含まれるが、これらに限定されない。他の分子モデル化技術もまた、本発明に従って用いられ得る［３６、３７］。
【０１３５】
潜在的結合性化合物が、本明細書に記載される方法によって、設計、選択（ｓｅｌｅｃｔ）、同定、合成または選択（ｃｈｏｏｓｅ）されると、その化合物がＦＡＰＰ２（および／またはＧＬＴＰ）に結合する親和性が、コンピューターでの評価によって試験および最適化され得る。潜在的結合性化合物として設計または選択（ｓｅｌｅｃｔ）または合成または選択（ｃｈｏｏｓｅ）された化合物は、その結合した状態で、好ましくは、標的部位との反発的静電相互作用を欠くように、コンピューターでさらに最適化され得る。かかる非補完的（例えば、静電）相互作用には、反発的電荷−電荷、双極子−双極子および電荷−双極子相互作用が含まれる。具体的には、潜在的結合性化合物と、それがＦＡＰＰ２に結合する部位との間での全ての静電相互作用の合計は、ある特定の実施形態では、結合のエンタルピーに中性または好都合な寄与を行う。化合物の変形エネルギーおよび静電相互作用を評価するために使用され得る適切なコンピューターソフトウェアには、Ｍ．Ｊ．Ｆｒｉｓｃｈ、Ｇａｕｓｓｉａｎ，Ｉｎｃ．、（１９９２年）Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、Ｐａ．によるＧａｕｓｓｉａｎ  ９２、改訂Ｃ；Ｐ．Ａ．Ｋｏｌｌｍａｎ、（１９９４年）Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ａｔ  Ｓａｎ  ＦｒａｎｃｉｓｃｏによるＡＭＢＥＲ、バージョン４．０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．、（１９９４年）Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、Ｍａｓｓ．によるＱＵＡＮＴＡ／ＣＨＡＲＭＭ；およびＢｉｏｓｙｓｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、（１９９４年）Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣａｌｉｆによるＩｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ／Ｄｉｓｃｏｖｅｒが含まれるが、これらに限定されない。これらのプログラムは、例えば、Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓワークステーション、ＩＲＩＳ  ４Ｄ／３５またはＩＢＭ  ＲＩＳＣ／６０００ワークステーションモデル５５０を使用して、実装され得る。ハードウェアシステム、例えば、ＬＩＮＵＸオペレーティングシステムを備えたＩＢＭ  ｔｈｉｎｋｐａｄまたはＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）オペレーティングシステムを備えたＤＥＬＬ  ｌａｔｉｔｕｄｅ  Ｄ６３０が使用され得る。その速度および容量が継続的に改変される他のハードウェアシステムおよびソフトウェアパッケージが、当業者に公知である。
【０１３６】
ある特定の実施形態では、結合性化合物は、非補完的（例えば、静電）相互作用、例えば、反発的電荷−電荷、双極子−双極子および電荷−双極子相互作用を誘導するために、上記方法によって、特異的に設計および／または選択（ｓｅｌｅｃｔ）および／または合成および／または選択（ｃｈｏｏｓｅ）され得る。ある特定の実施形態では、潜在的結合性化合物と、それがＦＡＰＰ２に結合する部位との間での全ての静電相互作用の合計は、中性ではない、結合のエンタルピーへの寄与を行う。
【０１３７】
ある特定の実施形態では、上記方法は、潜在的結合性化合物を設計および／または選択（ｓｅｌｅｃｔ）する際に、適切なコンピュータープログラムを使用するステップを含む。
【０１３８】
さらに、ある特定の実施形態では、上記方法は、潜在的結合性化合物を合成および／または選択（ｃｈｏｏｓｅ）することと併せて、適切なコンピュータープログラムを使用するステップを含む。
【０１３９】
さらに、ある特定の実施形態では、上記方法はさらに、ＦＡＰＰ２（および／またはＧＬＴＰ）に結合する潜在的結合性化合物の能力を特徴付けるために、本明細書に記載されるように、適切なアッセイを使用するステップを含む。これは、化合物が結合する能力を直接試験するステップ、および／または化合物が（例えば、その移行活性、安定性、フォールディングおよび／または細胞内局在化に影響を与えることによって）ＦＡＰＰ２活性に対して影響を有するかどうかを決定するステップを含み得る。
【０１４０】
結合性化合物の結合特性を評価するために、熱量測定技術（例えば、等温滴定熱量測定（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  ｃａｌｏｍｅｔｒｙ）、示差走査熱量測定（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｃａｌｏｍｅｔｒｙ））またはＢｉａｃｏｒｅ（商標）などのアッセイが使用され得る。
【０１４１】
ある特定の実施形態では、上記方法は、潜在的結合性化合物がＦＡＰＰ２（および／またはＧＬＴＰ）の活性（例えば、移行活性）、安定性または細胞内輸送をモジュレートするかどうかを決定するステップをさらに含み得る。これは、生物学的アッセイを使用して実施され得る。
【０１４２】
潜在的結合性化合物がＦＡＰＰ２の移行活性をモジュレートするかどうかを決定することは、潜在的結合性化合物を基質（例えば、ＧｌｃＣｅｒ）の存在下でＦＡＰＰ２と接触させること、および基質移行の量を決定することを含み得る。これは、ＦＡＰＰ２移行活性に対する潜在的結合性化合物の影響を決定するために、潜在的結合性化合物の非存在下における基質移行の量と比較され得る。ＦＡＰＰ２に適切なアッセイは、当技術分野で公知であり、上で議論されている。
【０１４３】
潜在的結合性化合物がＦＡＰＰ２（および／またはＧＬＴＰ）の安定性をモジュレートするかどうかを決定することは、例えば、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、円偏光二色性（ＣＤ）スペクトル分析を含み得る。
【０１４４】
潜在的結合性化合物がＦＡＰＰ２（および／またはＧＬＴＰ）の細胞内輸送をモジュレートするかどうかを決定することは、細胞ベースのアッセイを含み得る。
【０１４５】
本発明の方法は、医薬品としての投与のために、この結合性化合物を改変するステップをさらに含み得る。この結合性化合物は、上で議論したように、ＦＡＰＰ２（および／またはＧＬＴＰ）に結合する、必要とされる能力を有し得るが、さらなる最適化からなおも利益を得る可能性がある。かかる場合には、この結合性化合物の化学構造は、化学的改変の出発点として使用される。かかる改変は、効力、選択性、薬物動態学的パラメーターまたは物理化学的特性（例えば、安定性、溶解度）を改善するために設計され得る。
【０１４６】
本発明の方法は、医薬品として、この結合性化合物、または改変された結合性化合物を製剤化するステップをさらに含み得る。これは、一般に、薬剤を薬学的に許容される担体と混合することを含む。用語「薬学的に許容される担体」には、本明細書で使用する場合、それ自体毒性効果を誘導することも、医薬組成物を受けている個体にとって有害な抗体の産生を引き起こすこともない、任意の薬剤が含まれる。薬学的に許容される担体は、液体、例えば、水、食塩水、グリセロール、エタノールまたは補助的物質、例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝化物質などを、さらに含有し得る。従って、用いられる薬学的担体は、投与の経路に依存して変動する。担体は、患者による摂取を補助するために、錠剤、丸剤、糖剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁物へと、医薬組成物が製剤化されるのを可能にし得る。薬学的に許容される担体の徹底的な議論は、［３８］において入手可能である。
【０１４７】
コンピューター可読媒体
本発明は、本発明のポリペプチドについての原子座標またはそのサブセットを含むコンピューター可読媒体を提供する。このコンピューター可読媒体は、ポリペプチドまたはその一部分の分子モデルをディスプレイするためのプログラミングをさらに含む。このコンピューター可読媒体は、結合性分子を同定するためのプログラミングをさらに含み得、これを助けるために、試験化合物の構造のデータベースをさらに含み得る。かかる試験化合物は、例えば、ＦＡＰＰ２の公知のインヒビターに基づき得、例えば、ＧｌｃＣｅｒのアナログであり得る。
【０１４８】
これらの原子座標は、表１〜３に示される。
【０１４９】
「コンピューター可読媒体」とは、コンピューターによって直接読み出しおよびアクセスされ得る任意の媒体を指す。かかる媒体には、以下が含まれるが、これらに限定されない：磁気記憶媒体、例えば、フロッピーディスク、ハードディスク記憶媒体および磁気テープ；光学記憶媒体、例えば、光学ディスクまたはＣＤ−ＲＯＭ；電気記憶媒体、例えば、ＲＡＭおよびＲＯＭ；ならびにこれらのカテゴリーのハイブリッド、例えば、磁気／光学記憶媒体。
【０１５０】
本発明のコンピューター可読媒体を含むコンピューターは、表１に示される、本発明のポリペプチドを規定するＸ線結晶学的構造座標またはそのサブセットを含むメモリユニットと；このメモリユニットと電気通信したプロセッサーであって、上記ポリペプチドの少なくとも一部分を提示する３次元構造を有する分子モデルを生成するプロセッサーとを含むコンピューターシステムとして提供される。
【０１５１】
「コンピューターシステム」とは、本発明の原子座標データを分析するために使用される、ハードウェア手段、ソフトウェア手段およびデータ記憶手段を指す。本発明のコンピューターベースのシステムの最小ハードウェア手段は、中央処理装置（ＣＰＵ）、入力手段、出力手段およびデータ記憶手段を含む。所望により、構造データを視覚化するために、モニターが提供される。このデータ記憶手段は、ＲＡＭまたは本発明のコンピューター可読媒体にアクセスするための手段であり得る。かかるシステムの例は、Ｕｎｉｘベース、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）を実行する、Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  ＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄおよびＳｕｎ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能なマイクロコンピューターワークステーションである。
【０１５２】
本発明の別の目的は、他のタンパク質の構造を解明するための方法を提供することである。本明細書に提供される構造的座標の全てまたは一部は、このプロセスを最初から試みるよりも迅速かつ効率的に、別の結晶化された分子の構造を決定するために使用され得る。これは、例えば、構造を解明するため、あるいは類似の機能のタンパク質ドメインを含む他のタンパク質、他の相同性ドメイン、または高い相同性もしくは同一性のアミノ酸配列を含むタンパク質の構造を部分的に解明するために、有用であり得る。かかるタンパク質構造は、表中に提供される構造情報の一部または全てを使用して、解明され得る。一部の実施形態では、分子置換法が、本発明によって提供される構造情報を使用してかかる構造を解明するために用いられ得る。
【０１５３】
化合物および医薬品
本発明の方法によって同定、設計、選択および／または最適化された化合物は、本発明のさらなる態様では、医薬品としての投与のために改変されたかかる化合物および／または医薬品として製剤化されたかかる化合物として、提供される。かかる化合物は、例えば、ファブリー病の処置において、医薬として使用され得る。それを必要とする患者において、かかる化合物または医薬品の有効量を投与するステップを含む、ファブリー病を処置または予防する方法が、さらに提供される。
【０１５４】
本発明のさらなる態様は、本発明の方法を用いて、化合物を設計、選択および／または最適化するステップ、同定された化合物を、医薬品としての投与のために改変するステップ、ならびに薬学的に許容される担体または希釈剤を用いて、得られた産物を製剤化するステップを含む、医薬組成物を製造する方法を提供する。
【０１５５】
任意の医薬品が、投与の任意の公知の経路によって送達され得る。この医薬品は、局所または全身送達され得る。これは、非経口経路（例えば、皮下、腹腔内、静脈内もしくは筋内のいずれかの注射によって、または組織の間質腔に送達される）によって、または病変中に、送達され得る。投与の他の形式には、経口および肺投与、坐剤、ならびに経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）または経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）適用、針、ならびに皮下注射器（ｈｙｐｏｓｐｒａｙ）が含まれる。
【０１５６】
この医薬品は、単独で、またはファブリー病を有する患者の処置において現在使用されている他の薬物の投与もまた含む処置レジメンの一部として、投与され得る。例えば、これは、酵素補充療法と組み合わせて、または疾患の臨床的な症状発現の処置と関連する処置、例えば、鎮痛薬、抗痙攣薬および非ステロイド性抗炎症薬物（ＮＳＡＩＤ）と組み合わせて、投与され得る。
【０１５７】
この薬剤は、他の薬物（複数可）と同時に、逐次的にまたは別々に、投与され得る。例えば、この薬剤は、他の薬物（複数可）の投与の前または後に投与され得る。
【０１５８】
数値ｘに関して、用語「約」とは、例えば、ｘ±１０％を意味する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
ホスホイノシトール４−リン酸アダプタータンパク質−２（ＦＡＰＰ２）に結合する化合物を同定する方法であって、表２に示される、ＦＡＰＰ２の基質結合ポケットを構成する少なくともアミノ酸の原子座標を使用して、ＦＡＰＰ２に結合する化合物をコンピューターで同定するステップを含む、方法。
（項目２）
ホスホイノシトール４−リン酸アダプタータンパク質−２（ＦＡＰＰ２）に結合する化合物を同定する方法であって、
ａ）表３に示される、ＦＡＰＰ２の少なくともＧＬＴＰドメインについての原子座標のセットを提供するステップ、および
ｂ）前記座標を使用して、ＦＡＰＰ２に結合する化合物をコンピューターで同定するステップ
を含む、方法。
（項目３）
前記化合物が、ＦＡＰＰ２の基質結合ポケットに結合する、またはＦＡＰＰ２の基質結合ポケットに隣接して結合する、項目１または項目２に記載の方法。
（項目４）
前記化合物が、ＦＡＰＰ２のインヒビターである、上述の項目のいずれかに記載の方法。
（項目５）
前記化合物が、ＦＡＰＰ２の基質である、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記化合物が、好ましくはＧＬＴＰよりも、ＦＡＰＰ２に対して特異的である、上述の項目のいずれかに記載の方法。
（項目７）
前記化合物が小分子である、上述の項目のいずれかに記載の方法。
（項目８）
前記コンピューターで同定するステップが、化合物のライブラリーから前記化合物を同定するステップまたはデータベースにおいて前記化合物を同定するステップを含む、上述の項目のいずれかに記載の方法。
（項目９）
ＦＡＰＰ２ポリペプチドに対する、同定された前記化合物の結合を試験するステップをさらに含む、上述の項目のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
結合性化合物の前記試験が、前記ＦＡＰＰ２ポリペプチドの活性をモジュレートする前記結合性化合物の能力を試験するステップを含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記結合性化合物を試験するステップが、前記結合性化合物が、
ａ）前記ＦＡＰＰ２ポリペプチドの移行活性をモジュレートするかどうか；
ｂ）前記ＦＡＰＰ２ポリペプチドの安定性をモジュレートするかどうか；および／または
ｃ）ＦＡＰＰ２ポリペプチドの細胞内輸送をモジュレートするかどうか、
を決定するための生物学的アッセイを使用して実施される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記結合性化合物が、ＦＡＰＰ２の前記移行活性もしくは前記安定性を減少させる、またはゴルジ中に存在するＦＡＰＰ２の量を低減させる、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
ＦＡＰＰ２に結合する化合物を設計、選択および／または最適化する方法であって、
ａ）表２に示される、ＦＡＰＰ２の基質結合ポケットを構成する少なくともアミノ酸の原子座標のセットを提供するステップ、ならびに
ｂ）前記化合物と、前記原子座標から生成された３次元構造情報の全てまたは一部との間でのフィッティング操作を実施することによって、前記化合物をコンピューターで設計、選択および／または最適化するステップ
を含む、方法。
（項目１４）
ＦＡＰＰ２に結合する化合物を設計、選択および／または最適化する方法であって、
ａ）表３に示される、ＦＡＰＰ２の少なくともＧＬＴＰドメインについての原子座標のセットを提供するステップ、ならびに
ｂ）前記化合物と、前記原子座標から生成された３次元構造情報の全てまたは一部との間でのフィッティング操作を実施することによって、前記化合物をコンピューターで設計、選択および／または最適化するステップ
を含む、方法。
（項目１５）
コンピューターで同定するステップが、ＦＡＰＰ２に結合する結合性化合物をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで設計するステップを含む、項目１３または１４に記載の方法。
（項目１６）
前記結合性化合物が、公知の化合物から設計される、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
ＦＡＰＰ２と会合する化合物の能力を評価するための方法であって、
ａ）表２に示される、ＦＡＰＰ２の基質結合ポケットを構成する少なくともアミノ酸の原子座標のセットを提供するステップ；
ｂ）前記化合物と、前記原子座標から生成された３次元構造情報の全てまたは一部との間でのフィッティング操作をコンピューターで実施するステップ；および
ｃ）前記フィッティング操作の結果を分析して、前記化合物とＦＡＰＰ２との間の会合を定量化するステップ
を含む、方法。
（項目１８）
ＦＡＰＰ２と会合する化合物の能力を評価するための方法であって、
ａ）表３に示される、ＦＡＰＰ２の少なくともＧＬＴＰドメインについての原子座標のセットを提供するステップ、および
ｂ）前記化合物と、前記原子座標から生成された３次元構造情報の全てまたは一部との間でのフィッティング操作をコンピューターで実施するステップ；および
ｃ）前記フィッティング操作の結果を分析して、前記化合物とＦＡＰＰ２との間の会合を定量化するステップ
を含む、方法。
（項目１９）
ＦＡＰＰ２と会合する化合物の能力を評価するためにコンピューターを使用する方法であって、前記コンピューターは、表２に示される、ＦＡＰＰ２の基質結合ポケットを構成する少なくともアミノ酸の原子座標がコード化されたデータ記憶材料を含む機械可読データ記憶媒体、および前記アミノ酸の構造の３次元グラフィカル表示を生成するための手段を含み、前記方法は、
ａ）前記化合物およびＦＡＰＰ２の基質結合ポケットの全てまたは一部の構造のグラフィカル３次元表示を使用して、第１の化合物を位置決めするステップ；
ｂ）コンピューター手段を用いることによって、前記化合物とＦＡＰＰ２の基質結合ポケット中心との間でのフィッティング操作を実施するステップ；および
ｃ）前記フィッティング操作の結果を分析して、前記化合物とＦＡＰＰ２の基質結合ポケットとの間の会合を定量化するステップ
を含む、方法。
（項目２０）
ＦＡＰＰ２と会合する化合物の能力を評価するためにコンピューターを使用する方法であって、前記コンピューターは、表３に示される、ＦＡＰＰ２の少なくともＧＬＴＰドメインについての原子座標がコード化されたデータ記憶材料を含む機械可読データ記憶媒体、およびＦＡＰＰ２のＧＬＴＰドメインの構造の３次元グラフィカル表示を生成するための手段を含み、前記方法は、
ａ）前記化合物およびＦＡＰＰ２の少なくともＧＬＴＰドメインの構造のグラフィカル３次元表示を使用して、第１の化合物を位置決めするステップ；
ｂ）コンピューター手段を用いることによって、前記化合物とＦＡＰＰ２のＧＬＴＰドメインとの間でのフィッティング操作を実施するステップ；および
ｃ）前記フィッティング操作の結果を分析して、前記化合物とＦＡＰＰ２のＧＬＴＰドメインとの間の会合を定量化するステップ
を含む、方法。
（項目２１）
前記化合物が、項目３から７のいずれか一項に定義された通りである、項目１３から２０のいずれかに記載の方法。
（項目２２）
医薬品としての投与のために、前記化合物を改変するステップをさらに含む、上述の項目のいずれかに記載の方法。
（項目２３）
医薬品として前記化合物を製剤化するステップをさらに含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
項目１から２０のいずれか一項に記載の方法を用いて、化合物を設計、選択および／または最適化するステップ、項目２１に定義された同定された化合物を改変するステップ、ならびに薬学的に許容される担体または希釈剤を用いて、得られた産物を製剤化するステップを含む、医薬組成物を製造する方法。
（項目２５）
ＦＡＰＰ２のアミノ酸３０８〜５１９（配列番号１）に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列およびリゾチームＴ４Ｌのアミノ酸２〜１６４（配列番号２）に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（項目２６）
ヒトＦＡＰＰ２の残基Ｄ３６０、Ｎ３６４、Ｗ４０７を含む、項目２５に記載のポリペプチドであって、番号付けは配列番号４に従う、ポリペプチド。
（項目２７）
配列番号３の配列またはその断片を含む、項目２５または２６に記載のポリペプチド。
（項目２８）
配列番号３の配列からなる、項目２７に記載のポリペプチド。
（項目２９）
項目２５から２８のいずれか一項に記載のポリペプチドの結晶性形態。
（項目３０）
前記結晶が、空間群Ｐ２１２１２で特徴付けられ、ａ＝１００．０２Å、ｂ＝１３０．８７Å、ｃ＝８８．７３Å、α＝９０°、β＝９０°、γ＝９０°の＋／−５％の単位格子パラメーターを有する、項目２９に記載の結晶性形態。
（項目３１）
前記結晶が、およそ２．０Åから４．０Åの間の分解能まで、構造座標の決定のためのＸ線を回折する、項目２９または３０に記載の結晶性形態。
（項目３２）
項目２９から３１のいずれか一項に記載の結晶性形態を得る方法であって、
項目２５から２８のいずれかに記載のポリペプチドを提供するステップ、および前記ポリペプチドを、それが沈殿し、結晶を形成するポリペプチド濃度へと濃縮するステップを含む、方法。
（項目３３）
前記提供するステップが、宿主細胞において前記ポリペプチドを発現させるステップ、および前記ポリペプチドを精製するステップを含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉ細胞である、項目３２に記載の方法。
（項目３５）
前記精製が、Ｎｉカラムステップおよび／またはＳＥＣカラムステップおよび／またはアニオン交換カラムステップを含む、項目３３または３４に記載の方法。
（項目３６）
項目３２から３５のいずれか一項に記載の方法を使用して得られた結晶。
（項目３７）
項目２５から２８のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
（項目３８）
項目３７に記載の核酸分子を含むベクター。
（項目３９）
項目３８に記載のベクターを含む宿主細胞。
（項目４０）
項目２５から２８のいずれか一項に記載のポリペプチドについての原子座標またはそのサブセットを含むコンピューター可読媒体。
（項目４１）
前記ポリペプチドの分子モデルをディスプレイするためのプログラミングをさらに含む、項目４０に記載のコンピューター可読媒体。
（項目４２）
前記ポリペプチドに結合する分子を同定するためのプログラミングをさらに含む、項目４０または４１に記載のコンピューター可読媒体。
（項目４３）
試験化合物の構造のデータベースをさらに含む、項目４２に記載のコンピューター可読媒体。
（項目４４）
前記原子座標が、表１、２または３に示される、項目４０から４３のいずれか一項に記載のコンピューター可読媒体。
（項目４５）
項目４０から４４のいずれかに記載のコンピューター可読媒体を含む、コンピューター。
（項目４６）
本発明のポリペプチドを規定するＸ線結晶学的構造座標またはそのサブセットを含むメモリユニットと；前記メモリユニットと電気通信したプロセッサーであって、前記ポリペプチドの少なくとも一部分を提示する３次元構造を有する分子モデルを生成するプロセッサーとを含むコンピューターシステム。
（項目４７）
ＦＡＰＰ２に結合する結合性化合物をモデル化することにおける、項目２９から３１のいずれか一項に記載の結晶性形態の構造またはそのサブセットの使用。
（項目４８）
ＦＡＰＰ２に結合する結合性化合物をモデル化することにおける、項目２９から３１のいずれか一項に記載の結晶性形態の原子座標またはそのサブセットの使用。
（項目４９）
前記サブセットが、ａ）ＦＡＰＰ２の糖頭部基残基を構成する残基、ｂ）ＦＡＰＰ２の基質結合ポケットを構成する残基、および／またはｃ）ＦＡＰＰ２のＧＬＴＰドメインを構成する残基を規定するＸ線構造座標を含む、項目４６から４８のいずれか一項に記載のコンピューターシステムまたは使用。
（項目５０）
項目１から２１のいずれか一項に記載の方法によって同定されるか、または項目２２から２４に記載の方法によって得られる化合物。
（項目５１）
医薬としての使用のための、項目１から２１のいずれか一項に記載の方法によって同定されるか、または項目２２から２４に記載の方法によって得られる化合物。
（項目５２）
ファブリー病の処置における使用のための、項目１から２１のいずれか一項に記載の方法によって同定されるか、または項目２２から２４に記載の方法によって得られる化合物。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】図１は、結晶学的ＡＵ中の２分子のＴ４Ｌ−ＦＡＰＰ２−Ｃ２１２（それぞれ、シアンおよび緑色の、Ｍｏｌ−ＡおよびＭｏｌ−Ｂ）を示す図である。
【０１６０】
【図２】図２は、Ｔ４Ｌ間の広範な相互作用を示す、結晶格子中の２つの隣接するＴ４Ｌ−ＦＡＰＰ２−Ｃ２１２分子を示す図である。
【０１６１】
【図３】図３は、１８：１グルコシルセラミド（ＧｌｃＣｅｒ、緑色の棒で示される）が、さらなるエネルギー最小化なしに、ＦＡＰＰ２−Ｃ２１２の構造中にドッキングされることを示す図である。ＧｌｃＣｅｒの座標は、ＰＤＢ  ＩＤ：３Ｓ０Ｋから取った。オレオイル鎖およびスフィンゴシン鎖にごく接近したＦＡＰＰ２の疎水性残基が、棒モデルで示される。グルコシル頭部基と接触する残基は、棒モデルで示され、標識されている。
【０１６２】
【図４】図４は、Ｗ４０７周囲の電子密度マップが、ドッキングされた１８：１  ＧｌｃＣｅｒ（図３を参照のこと）と共に示されることを示す図である。ドッキング後にエネルギー最小化は行わなかった。
【０１６３】
【図５】図５は、Ｔ４Ｌ−ＦＡＰＰ２−Ｃ２１２結晶を示す図である。
【０１６４】
【図６ａ】図６は、ＦＡＰＰ２−Ｃ２１２構造（Ｔ４Ｌは明確さのために除去されている）（ａ）と比較のためのｈＧＬＴＰ（ｂ）を示す図である。
【図６ｂ】図６は、ＦＡＰＰ２−Ｃ２１２構造（Ｔ４Ｌは明確さのために除去されている）（ａ）と比較のためのｈＧＬＴＰ（ｂ）を示す図である。
【０１６５】
【図７】図７は、糖頭部基結合：ＦＡＰＰ２−Ｃ２１２（ａｐｏ）対ｈＧＬＴＰ複合体（ＰＤＢ：４Ｈ２Ｚ）を示す図である。ＦＡＰＰ２は緑色で示され、ＧＬＴＰはシアンで示される。ｈＧＬＴＰに結合したモノスルホ−ガラクトシルセラミドは、ピンク色で示される。ＦＡＰＰ２における糖結合ポケットの近傍には、より多くの負の電荷が存在し、ＦＡＰＰ２では、Ｋ３６７が位置決めされ、Ｒ３９８周囲の正に荷電したループは、水素結合によって突出する。
【０１６６】
【図８】図８は、ＦＡＰＰ２およびＧＬＴＰ（ＰＤＢ  ＩＤ：２ＥＵＫ）中のＦＦＡＴ様モチーフを示す図である。ＦＦＡＴモチーフ（酸性トラック中の２つのＰｈｅ）は、ＶＡＰタンパク質（小胞結合膜タンパク質関連タンパク質）と相互作用する。ＦＡＰＰ２のＦ３１１およびｈＧＬＴＰのＦ３３は、同じ場所を占める（セラミド２４：１の尾部において）。ＦＡＰＰ２はシアンで示され、ｈＧＬＴＰは緑色で示される。ｈＧＬＴＰに結合した２４：１ガラクトシルセラミドは、橙色である。ＦＦＡＴ  ＦＡＰＰ２様モチーフは、潜在的に、ＧＬＴＰ折り畳みの安定性およびセラミド放出に関与する。
【発明を実施するための形態】
【０１６７】
（実施例）
（実施例１）
ＦＡＰＰ２−Ｃ２１２についての結晶化スクリーニング：
ＦＡＰＰ２のＣ末端２１２アミノ酸、ａａ３０８〜５１９（ＦＡＰＰ２−Ｃ２１２）を、ＳＵＭＯまたはＨｉｓ融合物として発現させ、融合タンパク質として、またはタグ除去されたＦＡＰＰ２−Ｃ２１２として精製した。これらのタンパク質を、結晶化研究のために、６〜１６ｍｇ／ｍｌに濃縮した。結晶化スクリーニングを、シッティングドロップ蒸気拡散法によって、Ｑｉａｇｅｎの市販の結晶化スクリーニングキット（ＪＣＳＧキットＩ〜ＩＶ）を使用して、精製されたＦＡＰＰ２−Ｃ２１２分子を用いて実施した。結晶化スクリーニングを、Ｃ８−セラミド、フロリジン、ジスルホまたはモノスルホガラクトシルセラミドを含む、ＦＡＰＰ２またはヒトＧＬＴＰタンパク質に結合することが公知の種々のリガンドと共にインキュベートしたＦＡＰＰ２−Ｃ２１２についても実施した。これらの結晶化試験は、見込みのある結晶化ヒットを１つも生じなかった。
【０１６８】
（実施例２）
ＦＡＰＰ２−Ｃ２１２リゾチーム融合：
ＦＡＰＰ２−Ｃ２１２を結晶化するための代替的戦略として、リゾチーム（Ｔ４Ｌ）を、結晶化可能な融合タグとして選択して、結晶化を促進した。
【０１６９】
Ｈｉｓ−Ｔ４Ｌ−ＦＡＰＰ２−Ｃ２１２（Ｔ４Ｌ−ＦＡＰＰ２−Ｃ２１２）を、ｐＲＳＥＴベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中にクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、ＮｉカラムおよびＳＥＣカラムプロセスによって精製した。精製されたタンパク質は、４７．２ｋＤａの分子量を有する。Ｔ４Ｌ−ＦＡＰＰ２−Ｃ２１２を、６ｍｇ／ｍｌに濃縮し、結晶化試験を、ＱｉａｇｅｎのＪＣＳＧ−Ｉランダムマトリックス結晶化キットを使用して実施した。全ての結晶化実験を、１６℃のインキュベーター中で、シッティングドロップ蒸気拡散法によって実施した。最初の結晶化ヒットが、３日後に、条件＃Ｃ６のＪＣＳＧキット−１において観察された。
【０１７０】
（実施例３）
Ｔ４Ｌ−ＦＡＰＰ２−Ｃ２１２についての結晶化最適化：
Ｔ４Ｌ−ＦＡＰＰ２−Ｃ２１２結晶を生じた結晶化条件（ＪＣＳＧ−＃Ｃ６）は、０．２Ｍ  ＭｇＣｌ２、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ＝７．０および２．５Ｍ  ＮａＣｌであった。結晶化のさらなる最適化を、タンパク質濃度を最大２０ｍｇ／ｍｌまで増加させ、結晶化溶液中のＭｇＣｌ２およびＮａＣｌ濃度をスクリーニングし、結晶化ドロップをマイクロシーディングすることによって、実施した。結晶核形成は、１８〜２４時間で見られ得、結晶は約１週間成長する。５０〜１００ミクロンサイズの結晶が、この結晶化条件下で再現性良く生成される。
【０１７１】
（実施例４）
回折データ収集：
Ｘ線回折データを、Ｃｕアノードを備えたＲｉｇａｋｕ  Ｘ線回折計を使用して、ＢＩＤＭＣ  Ｘ線回折コア設備において収集した。サイズが約５０〜１００ミクロンの結晶を、０．２Ｍ  ＭｇＣｌ２、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ＝７．０、２．５Ｍ  ＮａＣｌ、１０％グリセロールおよび５％キシリトールの低温緩衝液を使用して、液体窒素中でそれらを凍結させた後に、データ収集に使用した。約１２０フレームのＸ線回折データを、１°の振動および１０分の曝露で収集した。このＸ線回折データセットを処理し、ＢＩＤＭＣにおいてＨＫＬ２０００を使用してＰ２２２空間群にスケーリングした。３．０Å分解能のＸ線回折データセットを、最高の分解能シェル（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｈｅｌｌ）における９５％の完全性（ｃｏｍｐｌｅｔｅｎｅｓｓ）および＞１．５のＩ／シグマで、初期構造決定に使用した。引き続いて、２．６Å分解能におけるデータセットを使用した。
【０１７２】
（実施例５）
構造決定および精密化：
３．０Åでは、単位格子寸法は、ａ＝９９．８Å、ｂ＝１３０．６Å、ｃ＝８８．６Å、α＝９０°、β＝９０°、γ＝９０°である。２．６Åでは、単位格子寸法は、ａ＝１００．０２Å、ｂ＝１３０．８７Å、ｃ＝８８．７３Å、α＝９０°、β＝９０°、γ＝９０°である。分子置換（ＭＲ）を使用して、Ｔ４Ｌ−ＦＡＰＰ２−Ｃ２１２の構造を決定した。Ｔ４Ｌ構造（ＰＤＢ  ＩＤ：３Ｇ３Ｖ）およびｈＧＬＴＰ構造（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＳＷＸ）を、検索モデルとして使用した。ＭｏｌｒｅｐをＭＲに使用し、ｒｅｆｍａｃ５を精密化に使用し、ｃｏｏｔをモデル構築に使用した。
【０１７３】
Ｔ４ＬおよびＧＬＴＰの各々２分子が、Ｐ２１２１２の空間群の下で、分子置換法によって非対称単位（ＡＵ）中で同定された。さらなるモデル構築および精密化を、ｒｅｆｍａｃおよびｃｏｏｔを使用して反復して実施した。３Å構造を、Ｒ＝２５．５％およびＲｆｒｅｅ＝３２．４％まで精密化した。２．６Å構造は、２０．５％の最終Ｒ因子および２５．７％のＲｆｒｅｅまで精密化されている。
【０１７４】
（実施例６）
構造の簡単な説明：
非対称単位中には、Ｍｏｌ−ＡおよびＭｏｌ−Ｂと呼ばれる２分子のＴ４Ｌ−ＦＡＰＰ２−Ｃ２１２が存在する（図１）。結晶格子中の隣接する分子由来のＴ４Ｌは、結晶化を促進したように見える広範な接触を行う（図２）。電子密度マップにおいて、分子−ＡについてＦＡＰＰ２のａａ３０８〜５１４および分子−ＢについてＦＡＰＰ２の３０８〜５１５を、曖昧さ（ａｍｂｉｇｕｉｔｙ）なしに見ることができた。電子密度は、分子−ＡのＫ１９０、Ｉ３２２、Ｅ３２６、Ｓ３２８、Ｅ３３３およびＥ５０９ならびに分子−ＢのＫ１９０、Ｌ３２４、Ｌ３２５、Ｅ３２６、Ｋ３７７、Ｅ３７８およびＲ３９８の側鎖については、明確でない。
【０１７５】
Ｗ４０７、Ｈ４４５、Ｄ３６０が含まれる、セラミド結合に関与する残基、およびセラミドのアシル／スフィンゴシン鎖と相互作用する他の疎水性残基は、電子密度マップにおいて十分に精密化される。ＰＤＢ  ＩＤ：３Ｓ０Ｋ由来のオレオイルアシル鎖（１８：１）を含有するグルコシルセラミドを、本発明者らの現在のＦＡＰＰ２構造のリガンド結合ポケット中にドッキングさせ（図３）、対応する電子密度マップは図４に示される。ドッキング後にエネルギー最小化は行わなかった。
【０１７６】
図６は、ｈＧＬＴＰ（ＰＤＢ  ＩＤ  １ＳＷＸ）のものと比較した、ＦＡＰＰ２−Ｃ２１２構造を示す。ＦＡＰＰ−Ｃ２１２の糖頭部基結合性残基を、モノスルホ−ガラクトシルセラミドとのｈＧＬＴＰ複合体（ＰＤＢ  ＩＤ  ４Ｈ２Ｚ）のものと比較した。ＦＡＰＰ２における糖頭部基の近傍には、より多くの負の電荷が存在し、さらに、ＦＡＰＰ２では、Ｋ３６７が位置決めされ、Ｒ３９８周囲の正に荷電したループが、Ｋ３６７とＮ３９９との間の水素結合によって突出することが観察された（図７）。
【０１７７】
ｈＧＬＴＰプラス２４：１ガラクトシルセラミド（ＰＤＢ  ＩＤ  ２ＥＵＫ）の構造とＦＡＰＰ２−Ｃ２１２の構造との比較は、ＦＡＰＰ２中のＦＦＡＴモチーフが、ＧＬＴＰ折り畳みの安定性およびセラミド放出において重要である可能性が高いことを示している（図８）。Ｆ３１１は、ｈＧＬＴＰのＦ３３の位置を占有する（図８）。
【０１７８】
配列表のための配列：  
【化１】
0006770945.tif 000002
【化２】
0006770945.tif 000003
表
【表１−１】
0006770945.tif 000004
【表１−２】
0006770945.tif 000005
【表１−３】
0006770945.tif 000006
【表１−４】
0006770945.tif 000007
【表１−５】
0006770945.tif 000008
【表１−６】
0006770945.tif 000009
【表１−７】
0006770945.tif 000010
【表１−８】
0006770945.tif 000011
【表１−９】
0006770945.tif 000012
【表１−１０】
0006770945.tif 000013
【表１−１１】
0006770945.tif 000014
【表１−１２】
0006770945.tif 000015
【表１−１３】
0006770945.tif 000016
【表１−１４】
0006770945.tif 000017
【表１−１５】
0006770945.tif 000018
【表１−１６】
0006770945.tif 000019
【表１−１７】
0006770945.tif 000020
【表１−１８】
0006770945.tif 000021
【表１−１９】
0006770945.tif 000022
【表１−２０】
0006770945.tif 000023
【表１−２１】
0006770945.tif 000024
【表１−２２】
0006770945.tif 000025
【表１−２３】
0006770945.tif 000026
【表１−２４】
0006770945.tif 000027
【表１−２５】
0006770945.tif 000028
【表１−２６】
0006770945.tif 000029
【表１−２７】
0006770945.tif 000030
【表１−２８】
0006770945.tif 000031
【表２−１】
0006770945.tif 000032
【表２−２】
0006770945.tif 000033
【表２−３】
0006770945.tif 000034
【表２−４】
0006770945.tif 000035
【表２−５】
0006770945.tif 000036
【表２−６】
0006770945.tif 000037
【表３−１】
0006770945.tif 000038
【表３−２】
0006770945.tif 000039
【表３−３】
0006770945.tif 000040
【表３−４】
0006770945.tif 000041
【表３−５】
0006770945.tif 000042
【表３−６】
0006770945.tif 000043
【表３−７】
0006770945.tif 000044
【表３−８】
0006770945.tif 000045
【表３−９】
0006770945.tif 000046
【表３−１０】
0006770945.tif 000047
【表３−１１】
0006770945.tif 000048
【表３−１２】
0006770945.tif 000049
【表３−１３】
0006770945.tif 000050
【表３−１４】
0006770945.tif 000051
【表３−１５】
0006770945.tif 000052
【表３−１６】
0006770945.tif 000053
【表３−１７】
0006770945.tif 000054
【表３−１８】
0006770945.tif 000055
【表３−１９】
0006770945.tif 000056
【表３−２０】
0006770945.tif 000057
【表３−２１】
0006770945.tif 000058
【表３−２２】
0006770945.tif 000059
【表３−２３】
0006770945.tif 000060
【表３−２４】
0006770945.tif 000061
【表３−２５】
0006770945.tif 000062
【表３−２６】
0006770945.tif 000063
【表３−２７】
0006770945.tif 000064
【表４】
0006770945.tif 000065
【０１７９】
【化３】
0006770945.tif 000066
【化４】
0006770945.tif 000067
【図１】
0006770945.tif 000068
【図２】
0006770945.tif 000069
【図３】
0006770945.tif 000070
【図４】
0006770945.tif 000071
【図５】
0006770945.tif 000072
【図６ａ】
0006770945.tif 000073
【図６ｂ】
0006770945.tif 000074
【図７】
0006770945.tif 000075
【図８】
0006770945.tif 000076
【配列表】
0006770945000001.app