(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サルコシン単位を有する親水性ブロックと、乳酸単位を有する疎水性ブロックとを有する両親媒性ブロックポリマーＡ１、
乳酸単位を有する疎水性ポリマーＡ２、
脂肪酸トリグリセリド、及び
脂溶性薬剤
を含み、
前記疎水性ポリマーＡ２、前記脂肪酸トリグリセリド、及び、前記脂溶性薬剤は、前記両親媒性ブロックポリマーＡ１が形成する疎水性コア内に存在している、分子集合体。
【請求項２】
前記親水性ブロックに含まれるサルコシン単位は２〜３００個である、請求項１に記載の分子集合体。
【請求項３】
前記疎水性ブロックに含まれる乳酸単位は５〜４００個である、請求項１又は２に記載の分子集合体。
【請求項４】
前記疎水性ポリマーＡ２に含まれる乳酸単位は１０個以上である、請求項１〜３のいずれかに記載の分子集合体。
【請求項５】
前記脂肪酸トリグリセリドは、グリセリンと炭素数４〜２４の飽和脂肪酸とのトリエステルである、請求項１〜４のいずれかに記載の分子集合体。
【請求項６】
前記脂溶性薬剤は、炭素数４〜２４の飽和又は不飽和の脂肪族鎖を分子内に有するものである、請求項１〜５のいずれかに記載の分子集合体。
【請求項７】
前記疎水性ポリマーＡ２は、前記両親媒性ブロックポリマーＡ１に対するモル比Ａ２／Ａ１として、０．１／１〜１０／１の範囲で含まれる、請求項１〜６のいずれかに記載の分子集合体。
【請求項８】
前記脂肪酸トリグリセリドは、前記両親媒性ブロックポリマーＡ１に対して、５〜２００重量％の範囲で含まれる、請求項１〜７のいずれかに記載の分子集合体。
【請求項９】
前記脂溶性薬剤は、前記両親媒性ブロックポリマーＡ１に対して、１〜５０重量％の範囲で含まれる、請求項１〜８のいずれかに記載の分子集合体。
【請求項１０】
粒子径が１０〜１０００ｎｍである、請求項１〜９のいずれかに記載の分子集合体。
【請求項１１】
前記脂溶性薬剤は、２つの炭素数８〜２４の飽和又は不飽和の高級脂肪酸残基と、２つのアンミンとが白金に配位した錯体である、請求項１〜１０のいずれかに記載の分子集合体。
【請求項１２】
前記分子集合体は、以下の工程：
容器中に、前記両親媒性ブロックポリマーＡ１、前記疎水性ポリマーＡ２、前記脂肪酸トリグリセリド、及び前記脂溶性薬剤を有機溶媒中に含む溶液を用意する工程、
前記溶液から前記有機溶媒を除去し、前記容器の内壁に、前記両親媒性ブロックポリマーＡ１、前記疎水性ポリマーＡ２、前記脂肪酸トリグリセリド、及び前記脂溶性薬剤を含むフィルムを得る工程、及び
前記容器中に水又は水溶液を加え、前記フィルムを粒子状の分子集合体に変換して分子集合体の分散液を得る工程、
を含む調製方法によって得られたものである、請求項１〜１１のいずれかに記載の分子集合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノメディシン及び薬剤搬送システム（ＤＤＳ）の分野に属する。本発明は、両親媒性ブロックポリマーを用いた薬剤内包分子集合体に関する。本発明の薬剤内包分子集合体はナノレベルの粒子径を有し、各種薬剤物質搬送用ナノキャリアとして用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
近年ナノテクノロジーへの関心が高まっており、ナノテクノロジーは、生体試料中の物質の検出、in vivo でのイメージングにおいて注目を浴びている。特に医薬の分野においては、リン脂質からなるナノ粒子であるリポソームなどが、薬剤搬送システム（ドラッグデリバリーシステム；ＤＤＳ）における担体として用いられている。【０００３】
例えば、特開平４−１６９５３１号公報、特開平４−１６９５３２号には、飽和又は不飽和高級脂肪酸残基を有する脂溶性白金錯体を有効成分として含有するリポソーム製剤が開示されている。【０００４】
一方、より生体適合性が高いペプチド性のナノ粒子も知られている。例えば、特開２００８−０２４８１６号公報及び米国特許出願公開ＵＳ２００８／００１９９０８には、疎水性ブロックとしてポリグルタミン酸メチルエステルを有する両親媒性ブロックポリマーを用いた、ペプチドタイプのナノ粒子が開示されている。この公報には、当該ナノ粒子ががん組織へ集積することを観察したことが示されている。【０００５】
また、Chemistry Letters, vol.36, no.10, 2007, p.1220-1221には、ポリ乳酸鎖とポリサルコシン鎖から構成される両親媒性ブロックポリマーを合成し、当該両親媒性ブロックポリマーの自己集合によって、ＤＤＳにおけるナノキャリアとしての利用可能性を有する粒径２０〜２００ｎｍの分子集合体を調製したことが示されている。【０００６】
国際公開第２００９／１４８１２１号公報（米国特許出願公開ＵＳ２０１１／０１０４０５６）及びバイオマテリアルズ（Biomaterials）、２００９年、第３０巻、ｐ．５１５６−５１６０に、疎水性ブロックがポリ乳酸鎖、親水性ブロックがポリサルコシン鎖である直鎖型の両親媒性ブロックポリマーが、水溶液中において自己組織化し、高分子ミセル（ラクトソーム）を形成することが開示されている。ラクトソームの粒子径については、段落［０１２７］に１０ｎｍ〜５００ｎｍが開示されているが、実際には、段落［０２５１］に３０ｎｍ〜１３０ｎｍが開示されているのみである。ラクトソームは、高い血中滞留性を有するほか、それまでに既に開発されていた高分子ミセルと比べて肝臓への集積量が著しく減少することが分かっている。このラクトソームは、血中に滞留している粒子径が数十〜数百ｎｍのナノ粒子が癌疾に溜まりやすいという性質［Enhanced Permeation and Retention effect（ＥＰＲ効果）］を利用することによって、癌疾部位を標的とした分子イメージング又は薬剤搬送用のナノキャリアとして適用可能である。【０００７】
がん組織は正常組織よりも細胞の増殖が速く、細胞の増殖に必要な酸素やエネルギーを獲得するために、がん組織中に新生血管を誘導する。この新生血管はもろいため、ある程度大きな分子も当該血管外に漏れ出すことが知られている。さらに、がん組織では物質の排泄機構が未発達であるため、当該血管から漏れ出た分子がある程度がん組織中に滞留する。この現象がＥＰＲ効果として知られているものである。【０００８】
国際公開第２０１２／１７６８８５号公報（米国特許出願公開ＵＳ２０１４／０１２７１３２）には、サルコシンを含む分岐した親水性ブロックと、ポリ乳酸を有する疎水性ブロックとを有する分岐型の両親媒性ブロックポリマーが、水溶液中において自己組織化し、粒径が１０〜５０ｎｍの高分子ミセル（ラクトソーム）を形成することが開示されている。【０００９】
国際公開第２０１２／０２６３１６号公報（米国特許出願公開ＵＳ２０１３／０１４９２５２）、及び国際公開第２０１２／１１８１３６号公報（米国特許出願公開ＵＳ２０１３／０３３６８９６）には、蛍光色素を内包させたラクトソームナノ粒子からなるスイッチング型蛍光ナノ粒子プローブ及びそれを用いた蛍光分子イメージング法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開平４−１６９５３１号公報
【特許文献２】特開平４−１６９５３２号公報
【特許文献３】特開２００８−０２４８１６号公報
【特許文献４】米国特許出願公開ＵＳ２００８／００１９９０８
【特許文献５】ＷＯ２００９／１４８１２１号公報
【特許文献６】米国特許出願公開ＵＳ２０１１／０１０４０５６
【特許文献７】ＷＯ２０１２／１７６８８５号公報
【特許文献８】米国特許出願公開ＵＳ２０１４／０１２７１３２
【特許文献９】ＷＯ２０１２／０２６３１６号公報
【特許文献１０】米国特許出願公開ＵＳ２０１３／０１４９２５２
【特許文献１１】ＷＯ２０１２／１１８１３６号公報
【特許文献１２】米国特許出願公開ＵＳ２０１３／０３３６８９６
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】ケミストリ・レターズ (Chemistry Letters)、２００７年、第３６巻、第１０号、ｐ．１２２０−１２２１
【非特許文献２】バイオマテリアルズ（Biomaterials）、２００９年、第３０巻、ｐ．５１５６−５１６０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記各公報に開示された高分子ミセル（ラクトソーム）ナノ粒子の疎水性コアは、ポリ乳酸で構成されており、疎水性コアに任意の脂溶性薬剤を効率よく内包させることは困難である。【００１３】
本発明の目的は、脂溶性薬剤を効率よく内包できる分子集合体（例えば、高分子ミセルナノ粒子）を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、鋭意研究を行った結果、ポリサルコシン／ポリ乳酸系の両親媒性ブロックポリマーと、ポリ乳酸系の疎水性ポリマーと、さらに脂肪酸トリグリセリドとを用いることにより、脂溶性薬剤を効率よく内包した分子集合体が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１５】
本発明は、以下の発明を含む。
（１）  サルコシン単位を有する親水性ブロックと、乳酸単位を有する疎水性ブロックとを有する両親媒性ブロックポリマーＡ１、
乳酸単位を有する疎水性ポリマーＡ２、
脂肪酸トリグリセリド、及び
脂溶性薬剤
を含む分子集合体。【００１６】
（２）  前記親水性ブロックに含まれるサルコシン単位は２〜３００個である、上記（１）に記載の分子集合体。【００１７】
（３）  前記疎水性ブロックに含まれる乳酸単位は５〜４００個である、上記（１）又は（２）に記載の分子集合体。【００１８】
（４）  前記疎水性ポリマーＡ２に含まれる乳酸単位は１０個以上である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の分子集合体。【００１９】
（５）  前記脂肪酸トリグリセリドは、グリセリンと炭素数４〜２４の飽和脂肪酸とのトリエステルである、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の分子集合体。【００２０】
（６）  前記脂溶性薬剤は、炭素数４〜２４の飽和又は不飽和の脂肪族鎖を分子内に有するものである、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の分子集合体。【００２１】
（７）  前記疎水性ポリマーＡ２は、前記両親媒性ブロックポリマーＡ１に対するモル比Ａ２／Ａ１として、０．１／１〜１０／１の範囲で含まれる、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の分子集合体。【００２２】
（８）  前記脂肪酸トリグリセリドは、前記両親媒性ブロックポリマーＡ１に対して、５〜２００重量％の範囲で含まれる、上記（１）〜（７）のいずれかに記載の分子集合体。【００２３】
（９）  前記脂溶性薬剤は、前記両親媒性ブロックポリマーＡ１に対して、１〜５０重量％の範囲で含まれる、上記（１）〜（８）のいずれかに記載の分子集合体。【００２４】
（１０）  粒子径が１０〜１０００ｎｍである、上記（１）〜（９）のいずれかに記載の分子集合体。【００２５】
（１１）  前記分子集合体は、以下の工程：
容器中に、前記両親媒性ブロックポリマーＡ１、前記疎水性ポリマーＡ２、前記脂肪酸トリグリセリド、及び前記脂溶性薬剤を有機溶媒中に含む溶液を用意する工程、
前記溶液から前記有機溶媒を除去し、前記容器の内壁に、前記両親媒性ブロックポリマーＡ１、前記疎水性ポリマーＡ２、前記脂肪酸トリグリセリド、及び前記脂溶性薬剤を含むフィルムを得る工程、及び
前記容器中に水又は水溶液を加え、前記フィルムを粒子状の分子集合体に変換して分子集合体の分散液を得る工程、
を含む調製方法によって得られたものである、上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の分子集合体。【００２６】
サルコシン単位を有する親水性ブロックと、乳酸単位を有する疎水性ブロックとを有する両親媒性ブロックポリマーＡ１、
乳酸単位を有する疎水性ポリマーＡ２、
脂肪酸トリグリセリド、及び
有効成分としての脂溶性薬剤
を含むミセル製剤。
【発明の効果】
【００２７】
本発明の分子集合体は、ポリサルコシン／ポリ乳酸系の両親媒性ブロックポリマー、ポリ乳酸系の疎水性ポリマー、脂肪酸トリグリセリド、及び脂溶性薬剤を含む。脂肪酸トリグリセリドを用いることにより、高分子ミセル（ラクトソーム）ナノ粒子のポリ乳酸で構成されている疎水性コアに脂溶性薬剤を効率よく内包させることができる。本発明によれば、有効成分としての脂溶性薬剤を含むミセル製剤が提供される。従来、脂溶性薬剤は血液中で自己凝集する性質があり、そのため、肝臓への集積性はあるが、他の腫瘍疾患部位には搬送されにくい。本発明により、ラクトソームナノ粒子内に脂溶性薬剤を効率よく内包させ、血液中に安定して分散させることが可能となったたので、ラクトソームナノ粒子が腫瘍患部に溜まりやすいという性質［Enhanced Permeability and Retention effect（ＥＰＲ効果）］を利用することによって、腫瘍患部を標的とした薬剤搬送が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、実験例２において、ＯＤＯ添加量に対する散乱強度比［（ミセル由来の散乱強度）／（ミリプラチン凝集体由来の散乱強度）］を示すグラフである。
【図２】図２〜５は、実験例５において、ミリプラチン内包ラクトソームのアルブミン存在下でのＰＢＳ溶液についての３７℃での経時によるＨＰＬＣ＆ＩＣＰ−ＭＳ測定チャートであり、図２は、０時間でのＨＰＬＣ＆ＩＣＰ−ＭＳ測定チャートである。横軸は、ＨＰＬＣのリテンションタイム（分）、縦軸は、Detector Response であり、195Ｐｔ（ＩＣＰ−ＭＳ）の相対強度及び２２０ｎｍでの吸光度の相対強度を表す。
【図３】図３は、２４時間でのＨＰＬＣ＆ＩＣＰ−ＭＳ測定チャートである。
【図４】図４は、１２０時間でのＨＰＬＣ＆ＩＣＰ−ＭＳ測定チャートである。
【図５】図５は、１９２時間でのＨＰＬＣ＆ＩＣＰ−ＭＳ測定チャートである。
【図６】図６は、実験例５において、ミリプラチン内包ラクトソームのアルブミン存在下でのＰＢＳ溶液についての３７℃での経時によるＩＣＰ−ＭＳ測定での195Ｐｔのピーク面積変化を示すグラフである。横軸は、経時時間（時間）、縦軸は、195Ｐｔの相対的ピーク面積を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明の分子集合体（ラクトソーム；Lactosome）は、サルコシン単位を有する親水性ブロックと、乳酸単位を有する疎水性ブロックとを有する両親媒性ブロックポリマーＡ１、乳酸単位を有する疎水性ポリマーＡ２、脂肪酸トリグリセリド、及び脂溶性薬剤を含むナノ粒子である。両親媒性ブロックポリマー分子の凝集により、或いは自己集合的な配向会合により分子集合体が形成され、分子集合体に前記脂溶性薬剤が内包されている。ナノ粒子とは、サイズがナノオーダーの粒子であり、ミセル、ベシクル等の分子集合体が含まれる。以下に説明する。
【００３０】
［１．両親媒性ブロックポリマーＡ１］
両親媒性ブロックポリマーＡ１は、サルコシン単位を有する親水性ブロックと、乳酸単位を有する疎水性ブロックとを有する。両親媒性ブロックポリマーは、直鎖型又は分岐型のいずれであってもよい。親水性ブロックと疎水性ブロックとは、リンカー部を介して結合している。
【００３１】
［１−１．親水性ブロック］
本発明において、親水性ブロック鎖が有する「親水性」という物性の具体的な程度としては、特に限定されるものではないが、少なくとも、親水性ブロック鎖の全体が、後述の乳酸単位を有する疎水性ブロック鎖に対して相対的に親水性が強い性質をいう。或いは、親水性ブロック鎖が疎水性ブロック鎖とコポリマーを形成することによって、コポリマー分子全体として両親媒性を実現することが可能となる程度の親水性をいう。さらに或いは、両親媒性ブロックポリマーが溶媒中で自己組織化して、自己集合体、特に粒子状の自己集合体を形成することが可能となる程度の親水性をいう。
【００３２】
本発明において、両親媒性ブロックポリマーは、親水性ブロックにおいて直鎖構造を有していてもよいし、分岐した構造を有していてもよい。親水性ブロックが分岐構造をとる場合には、親水性ブロックを構成する複数の分岐それぞれにサルコシンが含まれる。
【００３３】
親水性ブロックにおいて、構成単位の種類及び比率は、ブロック全体が上述したような親水性となるように、当業者によって適宜決定されるものである。例えば、前記親水性ブロックに含まれるサルコシン単位の合計は２〜３００個である。具体的には、親水性ブロックが直鎖型の場合、サルコシン単位の合計は、例えば、１０〜３００、２０〜２００、又は２０〜１００程度でありうる。構成単位数が上記範囲を超えると、分子集合体を形成した場合に、形成された分子集合体の安定性を欠く傾向にある。上記範囲を下回ると、両親媒性ブロックポリマーとしての体をなさないか、又は、分子集合体の形成自体が困難となる傾向にある。
【００３４】
親水性ブロックが分岐型の場合、親水性ブロックを構成する複数の分岐全てに含まれるサルコシン単位の合計は、例えば、２〜２００、２〜１００、又は２〜１０個でありうる。あるいは、親水性ブロックを構成する複数の分岐全てに含まれるサルコシン単位の合計は、例えば、３０〜２００、又は５０〜１００個でありうる。１つの分岐当たりのサルコシン単位数の平均は、例えば、１〜６０、１〜３０、１〜１０、又は１〜６でありうる。すなわち、親水性ブロックを構成する各分岐それぞれは、サルコシン又はポリサルコシン鎖を含んで構成されることができる。構成単位数が上記範囲を超えると、分子集合体を形成した場合に、形成された分子集合体の安定性を欠く傾向にある。上記範囲を下回ると、両親媒性ブロックポリマーとしての体をなさないか、又は、分子集合体の形成自体が困難となる傾向にある。
【００３５】
分岐型の場合、親水性ブロックにおける分岐は２以上であればよいが、分子集合体を形成する際に粒子形状のミセルを効率的に得る観点から、好ましくは３以上である。親水性ブロックにおける分岐の数の上限は特に限定されるものではないが、例えば２７である。特に、本発明においては、親水性ブロックの分岐の数が３であることが好ましい。分岐構造は、当業者が適宜設計できる。
【００３６】
サルコシン（すなわちＮ−メチルグリシン）は水溶性が高く、また、サルコシンのポリマーはＮ置換アミドを有することから通常のアミド基に比べてシス−トランス異性化が可能であり、さらに、Ｃα炭素まわりの立体障害が少ないことから、高い柔軟性を有するものである。このような構造を構成ブロックとして用いることは、当該ブロックに高い親水性の基本特性、又は、高い親水性と高い柔軟性とを併せ持つ基本特性が備わる点で非常に有用である。
【００３７】
さらに、親水性ブロックは、末端（すなわちリンカー部と反対側の末端）に親水性基（例えば水酸基に代表される）を有していることが好ましい。
【００３８】
なお、ポリサルコシン鎖においては、全てのサルコシン単位が連続していてもよいし、非連続であってもかまわないが、当該分岐鎖全体として上述の基本特性を損なわないように分子設計されたものであることが好ましい。
【００３９】
親水性ブロック鎖がサルコシン単位以外の他の構成単位を有する場合、そのような構成単位としては特に限定されないが、アミノ酸（親水性アミノ酸及びその他のアミノ酸を含む）とすることができる。なお、本明細書において「アミノ酸」は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、及びそれらの修飾及び／又は化学的変更による誘導体を含む概念で用いる。さらに、本明細書において、アミノ酸は、α−、β−、γ−アミノ酸を含む。好ましくは、αアミノ酸である。例えば、セリン、スレオニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００４０】
また、両親媒性ブロックポリマーＡ１は糖鎖やポリエーテルなどのさらなる基を有してよい。この場合は、両親媒性ブロックポリマーＡ１の親水性ブロックが糖鎖やポリエーテルなどを有するように分子設計されることが好ましい。
【００４１】
［１−２．疎水性ブロック］
本発明において、疎水性ブロックが有する「疎水性」という物性の具体的な程度としては、特に限定されるものではないが、少なくとも、疎水性ブロックが、上記の親水性ブロックの全体に対して相対的に疎水性が強い領域であり、当該親水性ブロックとコポリマーを形成することによって、コポリマー分子全体として両親媒性を実現することが可能となる程度の疎水性を有していれば良い。或いは、当該両親媒性ブロックポリマーが溶媒中で自己組織化して、自己集合体、好ましくは粒子状の自己集合体を形成することが可能となる程度の疎水性を有していれば良い。
【００４２】
１本の両親媒性ブロックポリマー中に存在する疎水性ブロックは分岐していなくともよいし、分岐していてもよい。しかしながら、分子集合体がミセル構造の場合を考慮すると、疎水性ブロックは分岐していない方が、疎水性コア部に対して、親水性分岐型シェル部の稠密度が増すので、より小さい粒径の安定したコア／シェル型ミセルを形成し易いと考えられる。
【００４３】
本発明において、疎水性ブロックは乳酸単位を含むものである。疎水性ブロックにおいて構成単位の種類及び比率は、ブロック全体が上述したような疎水性となるように、当業者によって適宜決定されるものである。例えば、前記疎水性ブロックに含まれる乳酸単位の数は５〜４００個である。具体的には、例えば疎水性ブロックが分岐していない場合、乳酸単位の数は、例えば５〜１００個、１５〜６０個、又は２５〜４５個でありうる。疎水性ブロックが分岐している場合は、疎水性ブロックを構成する複数の分岐全てに含まれる乳酸単位の数の合計が、例えば１０〜４００個、好ましくは２０〜２００個でありうる。この場合、１つの分岐当たりの乳酸単位数の平均は、例えば、５〜１００個、好ましくは１０〜１００個である。
【００４４】
構成単位数が上記範囲を上回ると、分子集合体を形成した場合に、当該形成された分子集合体の安定性を欠く傾向にある。構成単位数が上記範囲を下回ると、分子集合体の形成自体が困難となる傾向にある。
【００４５】
疎水性ブロックが分岐する場合、分岐の数は特に限定されないが、分子集合体を形成する際に粒子形状のミセルを効率的に得る観点から、例えば、親水性ブロックにおける分岐数以下とすることができる。
【００４６】
ポリ乳酸は、以下の基本特性を有する。
ポリ乳酸は、優れた生体適合性及び安定性を有するものである。このため、このようなポリ乳酸を構成ブロックとした両親媒性物質から得られる分子集合体は、生体、特に人体への応用性という点で非常に有用である。
また、ポリ乳酸は、優れた生分解性を有することから代謝が早く、生体内においてがん組織以外の組織への集積性が低い。このため、このようなポリ乳酸を構成ブロックとした両親媒性物質から得られる分子集合体は、がん組織への特異的な集積性という点で非常に有用である。
そして、ポリ乳酸は、低沸点溶媒への溶解性に優れるものであることから、このようなポリ乳酸を構成ブロックとした両親媒性物質から分子集合体を得る際に、有害な高沸点溶媒の使用を回避することが可能である。このため、このような分子集合体は、生体への安全性という点で非常に有用である。
【００４７】
なお、疎水性ブロックを構成するポリ乳酸鎖（ＰＬＡ）においては、全ての乳酸単位が連続していてもよいし、非連続であってもかまわないが、疎水性ブロック全体として上述の基本特性を損なわないように分子設計されたものであることが好ましい。
【００４８】
疎水性ブロックを構成するポリ乳酸鎖（ＰＬＡ）は、Ｌ−乳酸単位から構成されているポリＬ−乳酸鎖（ＰＬＬＡ）か、又は、Ｄ−乳酸単位から構成されているポリＤ−乳酸鎖（ＰＤＬＡ）のいずれであってもよい。また、Ｌ−乳酸単位とＤ−乳酸単位との両者から構成されていてもよい。この場合において、Ｌ−乳酸単位とＤ−乳酸単位とは、交互配列、ブロック配列、又はランダム配列のいずれであってもよい。
【００４９】
疎水性ブロック鎖が乳酸単位以外の他の構成単位を有する場合、そのような構成単位の種類・比率は、ブロック鎖全体が上述したような疎水性であることを満たせば特に限定されるものではないが、所望の諸特性を有するように分子設計されたものであることが好ましい。
【００５０】
疎水性ブロック鎖において、乳酸単位以外の構成単位を有する場合、そのような構成単位は、乳酸以外のヒドロキシ酸及びアミノ酸（疎水性アミノ酸及びその他のアミノ酸を含む）からなる群から選択することができる。ヒドロキシ酸としては、特に限定されないが、グリコール酸、ヒドロキシイソ酪酸などが挙げられる。疎水性アミノ酸は、その多くが、脂肪族側鎖、芳香族側鎖などを有する。天然アミノ酸では、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、チロシン、及びトリプトファンなどが挙げられる。非天然アミノ酸では、特に限定されないが、グルタミン酸メチルエステル、グルタミン酸ベンジルエステル、アスパラギン酸メチルエステル、アスパラギン酸エチルエステル、アスパラギン酸ベンジルエステルなどのアミノ酸誘導体が挙げられる。
【００５１】
［１−３．両親媒性ブロックポリマーＡ１の構造］
両親媒性ブロックポリマーＡ１が直鎖型又は分岐型のいずれの場合にも、親水性ブロックと疎水性ブロックとを連結するリンカー部位の構造は、化学的に許容可能な構造であれば特に限定されるものではない。両親媒性ブロックポリマーＡ１の構造及び合成については、ＷＯ２００９／１４８１２１号公報（直鎖型）、及びＷＯ２０１２／１７６８８５号公報（分岐型）を参照して、当業者が適宜分子設計できる。
【００５２】
分岐構造の場合、例えば、親水性ブロック側の分枝の数が２である場合は、ポリ乳酸鎖を含む分子鎖のリンカー部位にある１つのＮ原子から、ポリサルコシン鎖を含む２本の分子鎖が分岐しうる。言い換えれば、ポリ乳酸鎖に直接的又は間接的に結合しているＮ原子が、直接的又は間接的に２本のポリサルコシン鎖に結合していることができる。
【００５３】
また例えば、親水性ブロック側の分枝の数が３である場合は、ポリ乳酸鎖を含む分子鎖のリンカー部位にある１つのＣ原子から、ポリサルコシン鎖を含む３本の分子鎖が分岐しうる。言い換えれば、ポリ乳酸鎖に直接的又は間接的に結合しているＣ原子が、直接的又は間接的に３本のポリサルコシン鎖に結合していることができる。リンカー部位にある１つのＰ原子やＳｉ原子から分岐している場合や、両親媒性ブロックポリマー分子全体が四級アンモニウム分子を形成している場合も同様である。
【００５４】
親水性ブロック側の分枝の数が３を超える場合は、分枝がさらなる分岐構造を有するように分子設計されることができる。
【００５５】
疎水性ブロック側も分岐している場合についても、上記と同様の観点で分子設計されることができる。
【００５６】
下記式（I）に、親水性ブロック側の分岐の数が３、疎水性ブロック側の分岐なしである場合の分岐型両親媒性ブロックポリマーの好ましい構造を示す。
【００５７】
【化１】
0006775591.tif 000002
【００５８】
式（I）中、ｎ１、ｎ２及びｎ３は、それらの合計が３〜２００となる数、ｍは５〜１００の数を表し、Ｒは、水素原子又は有機基を表す。有機基の炭素数は、１〜２０でありうる。具体的には、アルキル基やアルキルカルボニル基などが挙げられる。
【００５９】
下記式（II）に、親水性ブロック側の分岐の数が３、疎水性ブロック側の分岐の数が２である場合の分岐型両親媒性ブロックポリマーの好ましい構造を示す。
【００６０】
【化２】
0006775591.tif 000003
【００６１】
式（II）中、ｎ１、ｎ２及びｎ３、並びにＲは、式（I）における場合と同じである。ｍ１及びｍ２は、それらの合計が１０〜４００となる数を表す。
【００６２】
［１−４．両親媒性ブロックポリマーＡ１の合成］
本発明において、両親媒性ブロックポリマーＡ１の合成法としては、特に限定されるものではなく、公知のペプチド合成法、ポリエステル合成法、及び／又はデプシペプチド合成法を用いることができる。
【００６３】
ペプチド合成は、例えば、アミンなどの塩基を開始剤として、Ｎ−カルボキシアミノ酸無水物(アミノ酸ＮＣＡ)を開環重合することなどによって行うことができる。
【００６４】
ポリエステル合成は、例えば、アミンなどの塩基や金属錯体などを開始剤として、ラクチドを開環重合することなどによって行うことができる。ラクチドとしては、ブロック鎖の所望の光学純度を考慮して、当業者が適宜決定することができる。例えば、Ｌ−ラクチド、Ｄ−ラクチド、ＤＬ−ラクチド及びメソラクチドから適宜選択し、ブロック鎖の所望の光学純度に応じて当業者が適宜使用量を決定することができる。
【００６５】
デプシペプチド合成は、例えば、疎水性ブロックとしてポリ乳酸を先に合成し、その後、親水性ブロックとなるポリペプチド鎖を伸張する方法と、親水性ブロックとなるポリペプチド鎖を先に合成し、その後、疎水性ブロックとなるポリ乳酸を伸張する方法とが挙げられる。
【００６６】
本発明の分子集合体において、ポリ乳酸の鎖長を調整することができる。両親媒性ブロックポリマーＡ１の合成の際には、ポリ乳酸の鎖長をより自由に制御するという観点から、疎水性ブロックであるポリ乳酸を先に合成し、その後、親水性ブロック鎖となるポリペプチド鎖を伸張する方法を行う方が好ましい。また、両親媒性ブロックポリマーＡ１における疎水性ブロック鎖としてのポリ乳酸は、親水性ブロック鎖としてのポリサルコシンに比べ重合度の制御をより容易に且つ正確に行うことができる。
【００６７】
両親媒性ブロックポリマーＡ１の合成についても、ＷＯ２００９／１４８１２１号公報（直鎖型）、及びＷＯ２０１２／１７６８８５号公報（分岐型）を参照することができる。
【００６８】
［２．疎水性ポリマーＡ２］
疎水性ポリマーＡ２は、乳酸単位を有する疎水性ポリマーである。疎水性ポリマーＡ２は、例えば１０個以上の乳酸単位を有し、好ましくは１５個以上の乳酸単位を有する。ここで、疎水性ポリマーＡ２が有する「疎水性」という物性の具体的な程度としては特に限定されるものではないが、少なくとも、上記の両親媒性ポリマーＡ１の親水性ブロックに対して、相対的に疎水性が強い。
【００６９】
疎水性ポリマーＡ２においては、１０個以上の乳酸単位が主たる構成成分であることが好ましい。しかしながら、乳酸単位以外の他の構成単位を有することも許容する。当該乳酸単位はそのすべてが連続していてもよいし、非連続であってもよい。
【００７０】
疎水性ポリマーＡ２の構成単位や鎖長は、基本的に、両親媒性ブロックポリマーＡ１における疎水性ブロック鎖の分子設計における場合と同様の観点で決定することができる。このようにすることによって、分子集合体において、疎水性ポリマーＡ２と、両親媒性ブロックポリマーＡ１の疎水性ブロック鎖との親和性に優れるという効果も得られる。疎水性ポリマーＡ２は、両親媒性ブロックポリマーＡ１からなる分子集合体ミセルの疎水性コア部に主に存在していると考えられる。
【００７１】
疎水性ポリマーＡ２を構成するポリ乳酸鎖（ＰＬＡ）は、Ｌ−乳酸単位から構成されているポリＬ−乳酸鎖（ＰＬＬＡ）か、又は、Ｄ−乳酸単位から構成されているポリＤ−乳酸鎖（ＰＤＬＡ）のいずれであってもよい。また、Ｌ−乳酸単位とＤ−乳酸単位との両者から構成されていてもよい。この場合において、Ｌ−乳酸単位とＤ−乳酸単位とは、交互配列、ブロック配列、又はランダム配列のいずれであってもよい。前記疎水性ポリマーＡ２を構成するポリ乳酸鎖（ＰＬＡ）が、Ｌ−乳酸単位とＤ−乳酸単位との両者から構成されていると、非晶性ポリマーとなりやすい。非晶性ポリマーとは、JIS K7121にて融点が観測されない高分子をいう。
【００７２】
疎水性ポリマーＡ２が、乳酸単位以外の他の構成単位を有する場合は、当該他の構成単位は、疎水性ポリマーＡ２が全体として上記定義された「疎水性」の範疇を越える影響を与えない程度で含まれる。従って、当該他の構成単位は乳酸単位より親水性であっても疎水性であってもかまわない。他の構成単位の種類・比率は、疎水性ポリマーＡ２全体が上述したような疎水性となるように、当業者によって適宜決定される。当該他の構成単位の例としては、上記１−２において乳酸単位以外の構成単位として挙げたものが含まれる。
【００７３】
疎水性ポリマーＡ２の構成単位数の上限としては、特に限定されないが、例えば、両親媒性ブロックポリマーＡ１における疎水性ブロックの２倍の長さを超えないものとする。具体的には、例えば前記ポリマーＡ１の疎水性ブロックが分岐していない場合、前記ポリマーＡ１の疎水性ブロックにおける乳酸単位の数が、例えば５〜１００個、１５〜６０個、又は２５〜４５個であると、該乳酸単位の数に対応して、疎水性ポリマーＡ２の構成単位数の上限としては、１０〜２００個、３０〜１２０個、又は５０〜９０個程度とすることができる。前記ポリマーＡ１の疎水性ブロックが分岐している場合は、前記ポリマーＡ１の疎水性ブロックにおける１つの分岐当たりの乳酸単位数の平均が、例えば、５〜１００個、好ましくは１０〜１００個であると、該乳酸単位の数に対応して、疎水性ポリマーＡ２の構成単位数の上限としては、１０〜２００個、２０〜２００個程度とすることができる。ただし、前記疎水性ポリマーＡ２を構成するポリ乳酸鎖（ＰＬＡ）が非晶性ポリマーの場合には、両親媒性ブロックポリマーＡ１における疎水性ブロックの５倍の長さを超えて、さらに長鎖のものであってもよい。疎水性ポリマーＡ２の構成単位数によって、形成された分子集合体の安定性、分子集合体の疎水コア体積及び粒子径を調整することができる。
【００７４】
疎水性ポリマーＡ２の合成は、当業者に知られた重合法により行うことができる。例えば、ポリ乳酸の合成は、ＷＯ２００９／１４８１２１号公報（［０２３５］〜［０２４３］）を参照して、ラクチドの開環重合により行うとよい。あるいは、乳酸からの直接重合により行ってもよい。
【００７５】
前記疎水性ポリマーＡ２は、特に限定されないが、前記両親媒性ブロックポリマーＡ１に対するモル比Ａ２／Ａ１として、例えば、０．１／１〜１０／１の範囲で含まれる。前記疎水性ポリマーＡ２の配合量によって、分子集合体の疎水コア体積及び粒子径を調整することができる。上記範囲よりも疎水性ポリマーＡ２の割合が上回ると、分子集合体自体がその形状を保ちにくくなる傾向にある。また、上記範囲よりも疎水性ポリマーＡ２の割合が下回ると、疎水性ポリマーＡ２を混合することによる効果（すなわち、疎水コア体積増大効果及び粒子径制御効果）が得られにくくなる傾向にある。好ましいモル比Ａ２／Ａ１は、０．５／１〜２．５／１の範囲である。
【００７６】
上記の範囲を満たす量で両親媒性ブロックポリマーＡ１と疎水性ポリマーＡ２とを用いることによって、例えば１０〜１０００ｎｍ、１０〜５００ｎｍ、好ましくは１０〜２００ｎｍ、より好ましくは２０〜１００ｎｍの粒子径を有する分子集合体を調製することができる。ここで「粒子径」とは、粒子分布で最も出現頻度の高い粒径、すなわち中心粒径をいう。本発明の分子集合体ナノ粒子の大きさを測定するための方法は特に限定されるものではなく、当業者によって適宜選択されるものである。例えば、透過型電子顕微鏡（Transmission Electron Microscope;ＴＥＭ）又は原子間力顕微鏡（Atomic Force Microscope;ＡＦＭ）による観察法や、静的光散乱法、動的光散乱（Dynamic Light Scattering;ＤＬＳ）法などが挙げられる。ＤＬＳ法においては、溶液中でブラウン運動している粒子の移動拡散係数を測定する。本明細書の実施例においては、動的光散乱法を用いている。
【００７７】
［３．脂肪酸トリグリセリド］
脂肪酸トリグリセリドは、グリセリンと脂肪酸とのトリエステルである。脂肪酸トリグリセリドは、その脂肪酸の炭素数により、短鎖脂肪酸トリグリセリド（ＳＣＴ：Short-chain triglyceride）（一般的に脂肪酸の炭素数５以下のもの）、中鎖脂肪酸トリグリセリド（ＭＣＴ：Medium-chain triglyceride）（一般的に脂肪酸の炭素数６以上１２以下のもの）、及び長鎖脂肪酸トリグリセリド（ＬＣＴ：Long-chain triglyceride）（一般的に脂肪酸の炭素数１３以上のもの）に分類されることがある。
【００７８】
短鎖脂肪酸トリグリセリドにおける短鎖脂肪酸としては、炭素数２〜５の飽和脂肪酸が挙げられ、より具体的には、酢酸（Ｃ2 ）、プロピオン酸（Ｃ3 ）、酪酸（Ｃ4 ）、イソ酪酸（Ｃ4 ）、吉草酸（Ｃ5 ）、イソ吉草酸（Ｃ5 ）が挙げられる。
【００７９】
中鎖脂肪酸トリグリセリドにおける中鎖脂肪酸としては、炭素数６〜１２の飽和脂肪酸が挙げられ、より具体的には、カプロン酸（Ｃ6 ）、エナント酸（Ｃ7 ）、カプリル酸（Ｃ8 ）、ペラルゴン酸（Ｃ9 ）、カプリン酸（Ｃ10）、ウンデシル酸（Ｃ11）、ラウリン酸（Ｃ12）が挙げられる。
【００８０】
長鎖脂肪酸トリグリセリドにおける長鎖脂肪酸としては、炭素数１３以上の飽和脂肪酸が挙げられ、より具体的には、ペンタデシル酸（Ｃ15）、パルミチン酸（Ｃ16）、マルガリン酸（Ｃ17）、ステアリン酸（Ｃ18）、アラキジン酸（Ｃ20）、ベヘン酸（Ｃ22）、リグノセリン酸（Ｃ24）等が挙げられる。
【００８１】
本発明において、前記脂肪酸トリグリセリドとして、グリセリンと炭素数４〜２４程度の飽和脂肪酸とのトリエステルを用いるとよく、グリセリンと炭素数６〜２０程度の飽和脂肪酸とのトリエステルを用いることが好ましく、グリセリンと炭素数８〜２０程度の飽和脂肪酸とのトリエステルを用いることがさらに好ましい。さらに、炭素数８〜１２の中鎖脂肪酸トリグリセリドを用いることがより好ましい。
前記トリグリセリド分子において、３つのエステルが同じ中鎖脂肪酸とのエステルであってもよいし、異なる中鎖脂肪酸とのエステルであってもよい。これらはいずれも液状油である。前記中鎖脂肪酸トリグリセリドは、市販のものを入手することができる。例えば、（カプリル酸／カプリン酸）トリグリセリドとして、Ｏ．Ｄ．Ｏ［（カプリル酸／カプリン酸）＝７５／２５］、スコレー６４Ｇ［（カプリル酸／カプリン酸）＝６０／４０］、スコレーＭＣ［（カプリル酸／カプリン酸）＝８５／１５］、スコレー８［カプリル酸＝９５％以上］（以上、日清オイリオグループ製）；  ココナードＭＬ［（カプリル酸／カプリン酸／ラウリン酸）トリグリセリド］、ココナードＭＴ［（カプリル酸／カプリン酸）トリグリセリド］、ココナードＲＫ［（カプリル酸）トリグリセリド］（以上、花王ケミカル製）等が挙げられる。
【００８２】
前記脂肪酸トリグリセリド、特に中鎖脂肪酸トリグリセリドは、疎水性ポリマーＡ２とも相溶性がよく、両親媒性ブロックポリマーＡ１からなる分子集合体ミセルの疎水性コア部に主に存在していると考えられる。前記脂肪酸トリグリセリド、特に中鎖脂肪酸トリグリセリドを配合することによって、脂溶性薬剤を分子集合体ミセルの疎水性コア部に効率よく内包することができる。
【００８３】
前記脂肪酸トリグリセリドは、特に限定されないが、前記両親媒性ブロックポリマーＡ１に対して、例えば、５〜２００重量％の範囲で含まれる。前記脂肪酸トリグリセリドの配合量によって、脂溶性薬剤の内包量を調整することができる。上記５〜２００重量％程度の前記中鎖脂肪酸トリグリセリドの量で、脂溶性薬剤の内包に効果が得られやすい。一方、前記中鎖脂肪酸トリグリセリドの量が、上記範囲を上回ると、分子集合体ミセルの疎水性コア部の体積空間が少なくなり、脂溶性薬剤の内包効果が低下する傾向にある。好ましい前記中鎖脂肪酸トリグリセリドの量は、前記両親媒性ブロックポリマーＡ１に対して、５〜１００重量％の範囲であり、より好ましくは１０〜５０重量％の範囲である。
【００８４】
［４．脂溶性薬剤］
脂溶性薬剤は、炭素数４〜２４の飽和又は不飽和の脂肪族鎖を分子内に有する薬剤である。炭素数４〜２４の脂肪族鎖としては、飽和又は不飽和の低級又は高級脂肪族炭化水素基、飽和又は不飽和の低級又は高級脂肪酸残基等が挙げられる。
【００８５】
飽和又は不飽和の低級脂肪族炭化水素基としては、炭素数４〜７の炭化水素基が挙げられ、例えば、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、２−エチルヘキシル基、ヘプチル基等のアルキル基；ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基、ヘプテニル基等のアルケニル基が例示される。
【００８６】
飽和又は不飽和の高級脂肪族炭化水素基としては、炭素数８〜２４の炭化水素基が挙げられ、例えば、オクチル基、ノニル基、デシル基、ドデシル基、テトラデシル基、ヘキサデシル基、オクタデシル基等のアルキル基；デセニル基、ドデセニル基、テトラデセニル基、ヘキサデセニル基、オクタデセニル基等のアルケニル基が例示される。
【００８７】
飽和又は不飽和の高級脂肪酸残基としては、炭素数８〜２４の脂肪酸残基が挙げられ、例えば、オクチル酸（Ｃ8）、ノニル酸（Ｃ9）カプリン酸（Ｃ10）、ウンデシル酸（Ｃ11）、ラウリン酸（Ｃ12）、ミリスチン酸（Ｃ14）、パルミチン酸（Ｃ16）、ステアリン酸（Ｃ18）、アラキジン酸（Ｃ20）、ベヘン酸（Ｃ22）、リグノセリン酸（Ｃ24）等の飽和脂肪酸残基；パルミトレイン酸（Ｃ16）、オレイン酸（Ｃ18）、リノール酸（Ｃ18）、リノレン酸（Ｃ18）、アラキドン酸（Ｃ20）等の不飽和脂肪酸残基が例示される。脂肪酸残基には、脂肪酸の形態（−ＣＯＯＨ）、脂肪酸の塩の形態（−ＣＯＯ- ）、金属との錯体を構成している脂肪酸の形態、脂肪酸誘導体の形態（エステル化）等が含まれる。
【００８８】
本発明においては、脂溶性薬剤は、炭素数４〜２０程度の飽和又は不飽和の脂肪族鎖（上記した脂肪族炭化水素基、又は脂肪酸残基）を分子内に有するものが好ましい。
【００８９】
脂溶性薬剤は、分子内に１つの上記脂肪族鎖を有していてもよく、又は２つ以上の上記脂肪族鎖を有していてもよい。また、脂溶性薬剤は、白金、亜鉛、鉄、銅等の金属を含む錯体であってもよい。
【００９０】
例えば、脂溶性薬剤として、２つの上記飽和又は不飽和の高級脂肪酸残基と、２つの（有機基で置換された又は無置換の）アンミンとが白金に配位した錯体が挙げられる。具体的には、２つのミリスチン酸（Ｃ14）残基と、ジアミノシクロヘキサンとが白金に配位した錯体であるミリプラチン（Miriplatin)［ミリプラ（登録商標）、(SP-4-2)-[(1R,2R)-cyclohexane-1,2-diamine-N,N'] bis (tetradecanoato-O) platinum］が挙げられる。ミリプラチンは、白金系制癌剤である。
【００９１】
ミリプラチンは、原薬粒子同士の凝集性があるため（「新規肝細胞癌治療剤  ミリプラチンの研究開発」、住友化学、２０１１−Ｉ、３９−４６頁）、分子集合体ミセルを形成させる操作においてミリプラチンが凝集して系外に排除される現象が観察される。このことから、ミリプラチンのような脂溶性薬剤は、両親媒性ブロックポリマーＡ１からなる分子集合体ミセルの疎水性コア部に効率よく内包させることは難しい。本発明において、中鎖脂肪酸トリグリセリドを配合することによって、脂溶性薬剤を分子集合体ミセルの疎水性コア部に効率よく内包することができる。
【００９２】
前記脂溶性薬剤は、特に限定されないが、前記両親媒性ブロックポリマーＡ１に対して、例えば、１〜５０重量％の範囲で、好ましくは１〜３０重量％の範囲で、場合によっては１〜１０重量％の範囲で効率よく含まれ得る。
【００９３】
［５．分子集合体の作成］
分子集合体（ラクトソーム）の作成法は特に限定されず、所望する分子集合体の大きさ、特性、担持させる機能性構造の種類、性質、含有量などに応じて、当業者が適宜選択することができる。必要に応じ、下記のように分子集合体を形成した後に、得られた分子集合体に対して、公知の方法によって表面修飾を行っても良い。なお、粒子が形成されたことの確認は、電子顕微鏡観察等によって行うと良い。
【００９４】
［５−１．フィルム法］
本発明における両親媒性ブロックポリマーＡ１、疎水性ポリマーＡ２、中鎖脂肪酸トリグリセリド、及び脂溶性薬剤は、低沸点溶媒への溶解性を有するため、この方法を用いた分子集合体の調製が可能である。
【００９５】
フィルム法は、次の工程を含む。すなわち、容器（例えばガラス容器）中に、両親媒性ブロックポリマーＡ１、疎水性ポリマーＡ２、脂肪酸トリグリセリド及び脂溶性薬剤を有機溶媒中に含む溶液を用意する工程；前記溶液から前記有機溶媒を除去し、前記容器の内壁に両親媒性ブロックポリマーＡ１、疎水性ポリマーＡ２、脂肪酸トリグリセリド及び脂溶性薬剤を含むフィルムを得る工程；及び、前記容器中に水又は水溶液を加え、必要に応じて超音波処理を行い、前記フィルムを粒子状の分子集合体（脂溶性薬剤を内包する）に変換して分子集合体の分散液を得る工程、を含む。さらに、フィルム法は、前記の分子集合体の分散液を凍結乾燥処理に供する工程を含んでも良い。
【００９６】
また、両親媒性ブロックポリマーＡ１、疎水性ポリマーＡ２、脂肪酸トリグリセリド及び脂溶性薬剤を有機溶媒中に含む溶液は、当業者によって適宜調製される。例えば、用いるべきポリマーＡ１、Ａ２、脂肪酸トリグリセリド及び脂溶性薬剤の全てを一度に混合することによって調製されてもよいし、用いるべきポリマーＡ１、Ａ２、脂肪酸トリグリセリド及び脂溶性薬剤のうちの一部（例えば、ポリマーＡ１）をあらかじめフィルムの状態で用意し、その後、用いるべき成分のうち他の成分（例えば、ポリマーＡ２、脂肪酸トリグリセリド及び脂溶性薬剤）を含む溶液を加えることによって調製されてもよい。あらかじめ用意される一部のポリマーのフィルムの形成法は、後述する方法（すなわちポリマーＡ１、Ａ２、脂肪酸トリグリセリド及び脂溶性薬剤を含むフィルムの形成法）に準じて行うことができる。
【００９７】
フィルム法に用いる有機溶媒としては、低沸点溶媒を用いることが好ましい。本発明における低沸点溶媒とは、１気圧における沸点が１００℃以下、好ましくは９０℃以下のものをいう。具体的には、クロロホルム、ジエチルエーテル、アセトニトリル、２−プロパノール、エタノール、アセトン、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、ヘキサンなどが挙げられる。
【００９８】
ポリマーＡ１、Ａ２、脂肪酸トリグリセリド及び脂溶性薬剤の溶解にこのような低沸点溶媒を使用することによって、溶媒の除去が非常に簡単になる。溶媒の除去の方法としては特に限定されることなく、使用する有機溶媒の沸点などに応じ、当業者が適宜決定すればよい。例えば、減圧下における溶媒除去を行ってもよいし、自然乾燥による溶媒除去を行ってもよい。
【００９９】
有機溶媒が除去された後は、容器内壁に両親媒性ブロックポリマーＡ１、疎水性ポリマーＡ２、脂肪酸トリグリセリド及び脂溶性薬剤を含むフィルムが形成される。このフィルムが張り付いた容器中に、水又は水溶液を加える。水又は水溶液としては特に限定されることなく、生化学的、薬学的に許容することができるものを当業者が適宜選択すればよい。例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、緩衝液などが挙げられる。
【０１００】
水又は水溶液が加えられた後、２０〜９０℃、１〜６０分の条件下で加温処理を行い、フィルムが容器内壁から剥がれる過程で分子集合体を形成する。処理終了時には、分子集合体（脂溶性薬剤を内包する）が前記の水又は水溶液中に分散された分散液が容器中に調製される。その際、必要に応じて超音波処理を行ってもよい。
【０１０１】
この分散液は、直接生体に投与されることが可能である。すなわち、無溶媒の分子集合体そのものの状態で保存される必要性がない。このため、例えば、半減期の短い薬剤を用いるＰＥＴ（ポジトロン放出断層撮影）用分子プローブへの応用が非常に有用である。
【０１０２】
また、得られた分散液を凍結乾燥処理に供する場合、その方法としては公知の方法を特に限定されることなく用いることができる。たとえば、上記のようにして得られた分子集合体の分散液を液体窒素などによって凍結させ、減圧下で昇華させることによって行うことができる。これにより、分子集合体の凍結乾燥処理物が得られる。すなわち、分子集合体を凍結乾燥処理物として保存することが可能になる。必要に応じ、この凍結乾燥物に水又は水溶液を加えて、分子集合体の分散液を得ることによって、分子集合体を使用に供することができる。水又は水溶液としては特に限定されることなく、生化学的、薬学的に許容することができるものを当業者が適宜選択すればよい。例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、緩衝液などが挙げられる。
【０１０３】
ここで、凍結乾燥処理前の分散液中には、両親媒性ブロックポリマーＡ１、疎水性ポリマーＡ２、脂肪酸トリグリセリド及び脂溶性薬剤から形成された本発明の分子集合体以外にも、そのような分子集合体を形成しなかった両親媒性ブロックポリマーＡ１、疎水性ポリマーＡ２、脂肪酸トリグリセリド及び脂溶性薬剤が各々それ自体として残存しうる。このような分散液を凍結乾燥処理に供すると、溶媒が濃縮される過程で、本発明の分子集合体を形成せず残存していた両親媒性ブロックポリマーＡ１、疎水性ポリマーＡ２、脂肪酸トリグリセリド及び脂溶性薬剤から、さらに分子集合体を形成することが可能になる。従って、本発明の分子集合体の調製を効率的に行うことが可能になる。
【０１０４】
［５−２．インジェクション法］
インジェクション法は、次の工程を含む。すなわち、容器（例えば試験管など）中に、両親媒性ブロックポリマーＡ１、疎水性ポリマーＡ２、脂肪酸トリグリセリド及び脂溶性薬剤を有機溶媒中に含む溶液を用意する工程；前記の溶液を水又は水溶液に分散させる工程；及び有機溶媒を除去する工程を含む。さらに、インジェクション法においては、有機溶媒を除去する工程の前に、適宜精製処理工程を行ってもよい。
【０１０５】
インジェクション法に用いる有機溶媒としては、例えばトリフルオロエタノール、エタノール、２−プロパノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどが用いられる。
水又は水溶液としては、注射用蒸留水、生理食塩水、緩衝液などが用いられる。
精製処理としては、例えばゲルろ過クロマトグラフィー、フィルタリング、超遠心などの処理を行うことができる。
【０１０６】
このようにして得られた分子集合体を生体内へ投与する場合であって、有機溶媒に生体に有害なものを用いた場合は、この有機溶媒の除去を厳密に行う必要がある。
【０１０７】
分子集合体をベシクルとして調製する場合において、内包型のものを調製する場合は、注射用蒸留水、生理食塩水、緩衝液などの水系溶媒に、内包すべき物質を溶解又は懸濁させ、このようにして得られた水溶液又は懸濁液に、両親媒性ブロックポリマーＡ１、疎水性ポリマーＡ２、脂肪酸トリグリセリド及び脂溶性薬剤を上記有機溶媒に溶解させて得られた溶液を分散させるとよい。
【０１０８】
［６．薬剤搬送システム］
本発明の分子集合体を生体内に投与することにより、薬剤搬送を行うことができる。
本発明における薬剤搬送方法において、投与ターゲットとしては特に限定されない。特に、本発明の分子集合体は、がん部への特異的集積性に優れたものである。本発明の分子集合体は、ＥＰＲ (enhanced permeability and retention) 効果によりがん組織へ集積するため、その集積性はがんの種類によらない。従って、本発明の分子集合体の投与ターゲットとしてはがんであることが好ましい。投与ターゲットとなりうるがんは多岐に亘る。例えば、肝臓がん、すい臓がん、肺がん、子宮頸がん、乳がん、大腸がんなどが挙げられる。
【０１０９】
また、本発明の分子集合体のがん部への集積性は、腎排泄と肝臓などの細網内皮系への集積が回避される粒子径制御を達成できる分子集合体の設計と、細網内皮系に対しステルス性を与えるための粒子表面制御を達成できる両親媒性ポリマーの分子設計によるところが大きい。
【実施例】
【０１１０】
以下に本発明をより詳細に説明するために実施例を示すが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。【０１１１】
［両親媒性ブロックポリマーＡ１］
両親媒性ブロックポリマーＡ１の合成は、ＷＯ２００９／１４８１２１号公報、ＷＯ２０１２／１７６８８５号公報に記載の方法を参照して行うことができる。【０１１２】
（PSar70-PLLA30）
以下の化学式に示すように、まず、Ｌ−ラクチド（化合物１）とＮ−カルボベンゾキシ−１，２−ジアミノエタン塩酸塩（化合物２）とを用いて、アミノ化ポリＬ−乳酸（a-PLLA）（平均重合度３０）を合成した。【０１１３】
【化３】
0006775591.tif 000004
【０１１４】
次に、サルコシン−ＮＣＡ(Sar-NCA)とアミノ化ポリＬ−乳酸(a-PLLA)とを、グリコール酸、Ｏ−（ベンゾトリアゾル−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（HATU）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（DIEA）を用いて反応させ、サルコシン単位７０個からなる親水性ブロックとＬ−乳酸単位３０個からなる疎水性ブロックとを有する直鎖型両親媒性ブロックポリマー（PSar70-PLLA30）を合成した。【０１１５】
【化４】
0006775591.tif 000005
【０１１６】
［疎水性ポリマーＡ２］
疎水性ポリマーＡ２の合成については、例えば、ＷＯ２００９／１４８１２１号公報（［０２３５］〜［０２４３］）を参照することができる。【０１１７】
（Z-PLLA30）
Ｌ−ラクチド（化合物１）とＮ−カルボベンゾキシ−１，２−ジアミノエタン塩酸塩（化合物２）とを用いて、Z-PLLAと表されるポリＬ−乳酸（平均重合度３０，重量平均分子量ＭＷ＝２，３５６）を合成した。Z-PLLA中のＬ−乳酸単位の数:３０。【０１１８】
【化５】
0006775591.tif 000006
【０１１９】
［ミリプラチン］
Ｃ34Ｈ68Ｎ2 Ｏ4 Ｐｔ  （分子量：７６３．９９）
【化６】
0006775591.tif 000007
【０１２０】
［実験例１：ミリプラチン内包ラクトソームの調製１：中鎖脂肪酸トリグリセリド添加の有無］
ガラス試験管中で、PSar70-PLLA30 ２ｍｇに対して、Z-PLLA30を１００ｍｏｌ％（PSar70-PLLA30のモル数を基準として）、ミリプラチン（大日本住友製薬製）を５ｗｔ％（０．１ｍｇ）、及びＯＤＯ［（カプリル酸／カプリン酸）トリグリセリド］（日清オイリオグループ製）を３０ｗｔ％（０．６ｍｇ）添加して、クロロホルム約０．５ｍＬに溶解し、溶媒を減圧下留去し、試験管の内壁にフィルム化を行った。得られたフィルムに対して、超純水２ｍＬを加えて、８５℃、２０分間の加温処理を行い、粒子化を行った。得られた粒子含有液を０．２μｍのフィルター処理して、ミリプラチン内包ラクトソーム含有液（サンプル４）を得た。【０１２１】
比較用として、ＯＤＯを添加しなかった以外は、上記操作と同様にして、粒子化を行い、フィルター処理を行い、ミリプラチン内包ラクトソーム含有液（サンプル１）を得た。【０１２２】
上記サンプル１（ＯＤＯ添加なし）と、サンプル４（ＯＤＯ  ３０ｗｔ％添加あり）とについて、ラクトソーム粒子径及びミリプラチンの内包量を測定した。結果を表１に示す。【０１２３】
ラクトソーム粒子径は、動的散乱法（DLS：Dynamic Light Scattering）を用いて測定した。測定には、動的光散乱測定装置（Malvern Instruments 社製、Zetasizer Nano）を用いた。【０１２４】
ラクトソームに対するミリプラチンの内包量は、ミリプラチンに含まれる 195ＰｔをＩＣＰ−ＭＳ測定することにより定量した。【０１２５】
【表１】
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【０１２６】
表１に示すように、ＯＤＯ  ３０ｗｔ％添加ありの場合（サンプル４）のミリプラチンのラクトソームに対する内包量は３．７１ｗｔ％であり、ＯＤＯ添加なしの場合（サンプル１）と比較してミリプラチンの内包量が約２．４倍に増加した。また、ＯＤＯ添加によって、粒子径が５７．８ｎｍから８２．４ｎｍへと大きくなった【０１２７】
［実験例２：ミリプラチン内包ラクトソームの調製２：中鎖脂肪酸トリグリセリド添加量の評価］
ラクトソームに対するＯＤＯの至適添加量を評価するため、両親媒性ポリマーに対するＯＤＯ添加量を０〜６０ｗｔ％の範囲で変化させてミリプラチンの内包を行った。（Z-PLLA30量１００ｍｏｌ％、ミリプラチン量５ｗｔ％）【０１２８】
すなわち、PSar70-PLLA30 に対するＯＤＯ添加量を０ｗｔ％（サンプル１：実験例１の比較用サンプル１と同じ）、５ｗｔ％（サンプル２）、１５ｗｔ％（サンプル３）、３０ｗｔ％（サンプル４：実験例１のサンプル４と同じ）、４０ｗｔ％（サンプル５）、５０ｗｔ％（サンプル６）、又は６０ｗｔ％（サンプル７）とした以外は、上記実験例１の操作と同様にして、粒子化を行い、フィルター処理を行い、各ミリプラチン内包ラクトソーム含有液（サンプル１〜７）を得た。
【０１２９】
各サンプル１〜７について、ミセル由来の散乱強度と、ミリプラチンの凝集体由来の散乱強度とを動的散乱法（Malvern Instruments 社製、Zetasizer Nano）により測定した。そして、
散乱強度比＝（ミセル由来の散乱強度）／（ミリプラチン凝集体由来の散乱強度）
を求めたところ、次の結果が得られた。【０１３０】
ＯＤＯ添加量      散乱強度比  
サンプル１      ０ｗｔ％        ０．６０
サンプル２      ５ｗｔ％        ０．４８
サンプル３    １５ｗｔ％        １．１０
サンプル４    ３０ｗｔ％        ２．２５
サンプル５    ４０ｗｔ％        １．６０
サンプル６    ５０ｗｔ％        ０．７５
サンプル７    ６０ｗｔ％        ０．６０【０１３１】
図１は、ＯＤＯ添加量（ｗｔ％）に対する上記散乱強度比のグラフである。これらの結果、ＯＤＯ添加量３０ｗｔ％の時にミセル由来の散乱強度が最大となることが分かった。これは、次のように考えられる。ＯＤＯ添加量が少ない場合には、ＯＤＯ添加の効果が弱く、その結果、ミリプラチンが十分にラクトソームに内包されずミリプラチンの凝集体が生成した。一方、ＯＤＯ添加量が多い場合には、ラクトソームに内包されなかったＯＤＯ由来の凝集体が生成し、その結果、ミリプラチンが十分にラクトソームに内包されずミリプラチンの凝集体が生成したたためと考えられる。PSar70-PLLA30 に対するＯＤＯ添加量は、１５〜４５ｗｔ％程度が好ましいと考えられる。【０１３２】
［実験例３：ミリプラチン内包ラクトソームの調製３：ポリ乳酸添加の評価］
この実験例では、以下のように、両親媒性ポリマーに対してポリ乳酸を添加した場合（両親媒性ポリマーのモル数を基準として５０ｍｏｌ％、又は１００ｍｏｌ％）とポリ乳酸を添加しない場合（０ｍｏｌ％）において、ミリプラチンの混合量を両親媒性ポリマー量に対して１０ｗｔ％、５ｗｔ％、又は２ｗｔ％と変えて内包実験を行った。（中鎖脂肪酸トリグリセリド添加なし）【０１３３】
ガラス試験管中で、PSar70-PLLA30 ２ｍｇに対して、Z-PLLA30を０ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％、又は１００ｍｏｌ％として、それぞれの場合において、ミリプラチン（大日本住友製薬製）を１０ｗｔ％（０．２ｍｇ）、５ｗｔ％（０．１ｍｇ）、又は２ｗｔ％（０．０４ｍｇ）添加して、クロロホルム約０．５ｍＬに溶解し、溶媒を減圧下留去し、試験管の内壁にフィルム化を行った。得られたフィルムに対して、超純水２ｍＬを加えて、超音波処理（２８ｋＨｚ、６０℃、１０分間）を行い、粒子化を行った。得られた粒子含有液を０．２μｍのフィルター処理した。【０１３４】
ミリプラチンを１０ｗｔ％添加した場合は、いずれのポリ乳酸Z-PLLA30のモル量の場合にも、フィルターの目詰まりが起こった。そのため、以降の検討は行わなかった。【０１３５】
ミリプラチン添加量５ｗｔ％、又は２ｗｔ％の場合のフィルター処理後のミリプラチン内包粒子含有液について、実験例１と同様にして、動的散乱法により粒子径を測定した。ミリプラチン添加量５ｗｔ％の場合には、ポリ乳酸Z-PLLA30の添加量が０ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％、１００ｍｏｌ％と多くなるに従い、粒子径が４３．２ｎｍ、５２．３ｎｍ、７６．４ｎｍと大きくなる傾向を示した。それに対して、ミリプラチン添加量２ｗｔ％の場合には、２成分の粒子径が観測され、３００ｎｍ程度の粒子が検出された。【０１３６】
次に、ミリプラチン添加量５ｗｔ％、又は２ｗｔ％の場合のフィルター処理後のミリプラチン内包粒子含有液を凍結乾燥した。凍結乾燥されたミリプラチン内包ラクトソーム粒子をクロロホルム約０．５ｍＬに溶解し、ゲルろ過を行い、ＨＰＬＣによりミリプラチン内包量（両親媒性ポリマーに対するｗｔ％）を定量した。ミリプラチン添加量が５ｗｔ％の場合は、ポリ乳酸Z-PLLA30を添加しないとミリプラチンは全く内包されず、ポリ乳酸の添加量が５０ｍｏｌ％、１００ｍｏｌ％と多くなるに従い、内包量も１．２ｗｔ％、２．０ｗｔ％と多くなる傾向を示した。それに対して、ミリプラチン添加量が２ｗｔ％の場合は、ミリプラチン内包量のポリ乳酸添加量への依存性は見られなかった。
【０１３７】
これらの結果、最もミリプラチン内包量が高かった組成は、両親媒性ポリマーに対してポリ乳酸を１００ｍｏｌ％添加し、ミリプラチンを５ｗｔ％添加した場合であり、ラクトソーム粒子内にミリプラチンは両親媒性ポリマーに対して２ｗｔ％内包された。またこの場合、ミリプラチンの仕込み量に対する収率は４０％であった。【０１３８】
以上の結果を、表２のエントリー１〜６として示す。【０１３９】
［実験例４：ミリプラチン内包ラクトソームの調製４：添加剤の検討］
この実験例では、以下のように、ミリプラチンを内包させるための添加剤についての検討を行った。【０１４０】
ミリプラチン内包ラクトソームに対する添加剤として、注射溶剤としてよく使用されているＮＩＫＫＯＬ  ＩＰＭ−１００(ミリスチン酸イソプロピル、日光ケミカルズ製)、ＮＩＫＫＯＬ  ＤＥＳ−ＳＰ(セバシン酸ジエチル、日光ケミカルズ製)、又は中鎖脂肪酸トリグリセリド（Ｏ．Ｄ．Ｏ、日清オイリオグループ製）を用いた。【０１４１】
ガラス試験管中で、PSar70-PLLA30 ２ｍｇに対して、Z-PLLA30を０ｍｏｌ％又は１００ｍｏｌ％（PSar70-PLLA30のモル数を基準として）、ミリプラチン（大日本住友製薬製）を５ｗｔ％（０．１ｍｇ）、及び添加剤として、ＮＩＫＫＯＬ  ＩＰＭ−１００、ＮＩＫＫＯＬ  ＤＥＳ−ＳＰ、又はＯＤＯを５、１５、３０ｗｔ％となるように添加して、クロロホルム約０．５ｍＬに溶解し、溶媒を減圧下留去し、試験管の内壁にフィルム化を行った。得られたフィルムに対して、超純水２ｍＬを加えて、８５℃、２０分間の加温処理を行い、粒子化を行い、粒子含有液を得た。また、Z-PLLA30を１００ｍｏｌ％、ミリプラチン（大日本住友製薬製）を５ｗｔ％（０．１ｍｇ）、及び添加剤として、ＯＤＯを４０、５０、６０ｗｔ％となるように添加した場合についても同様に粒子化を行った。【０１４２】
各場合について、フィルムの状態ではＯＤＯ＋Z-PLLA30を添加したものの透明度が最も高かった。【０１４３】
得られた各粒子含有液について０．２μｍのフィルター処理を行った結果、全量フィルターを通過したものは、ＩＰＭ−１００  ５ｗｔ％（エントリー７）、ＤＥＳ−ＳＰ  ５ｗｔ％（エントリー８）、ＯＤＯ  ３０ｗｔ％＋Z-PLLA30（エントリー９）の３種類であり、他の粒子含有液についてはフィルターが目詰まりした。さらに、粒子が単一成分であったのはＯＤＯ  ３０ｗｔ％＋Z-PLLA30（エントリー９）のみであった。ＯＤＯ  ４０ｗｔ％＋Z-PLLA30（エントリー１０）では、フィルターが目詰まりしたが、さらにＯＤＯ添加量を５０ｗｔ％以上に増やした場合は、粒子含有液はフィルターを通過しなくなった。ＯＤＯ  ３０ｗｔ％＋Z-PLLA30（エントリー９）の粒子径は８２．４ｎｍであり、ＯＤＯを添加しない場合の５７．８ｎｍ（表１のサンプル１）と比較して粒子径が大きくなった。この結果は、両親媒性ポリマーがＯＤＯとミリプラチンの微小な凝集体を分散させる乳化剤として作用したためと推定された。【０１４４】
以上のミリプラチン内包結果を、表２のエントリー７〜１０として示す。粒子化の溶媒としては、いずれも超純水を用いた。【０１４５】
【表２】
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【０１４６】
［実験例５：：ミリプラチン内包ラクトソームの安定性評価］
実験例４のエントリー９で作製したミリプラチン内包ラクトソーム含有液（PSar70-PLLA30 に対して、Z-PLLA30１００ｍｏｌ％、ミリプラチン５ｗｔ％、及びＯＤＯ３０ｗｔ％から作製されたもの）の凍結乾燥品をリン酸緩衝生理食塩水ＰＢＳ(Phosphate buffered saline) に溶解し、ウシ血清アルブミンＢＳＡ(Bovine serum albumin)を添加した場合と添加しない場合で、ミリプラチンのラクトソーム内包安定性をＨＰＬＣ＆ＩＣＰ−ＭＳにより、以下のように評価した。【０１４７】
実験例４のエントリー９で作製したミリプラチン内包ラクトソーム含有液の凍結乾燥品を、５ｍｇ／ｍｌとなるようにPBSに溶解したミリプラチン内包ラクトソーム溶液０．２ｍｌに、１０ｍｇ／ｍｌのBSA溶液を０．５ｍｌとPBS溶液０．３ｍｌを添加した。その後、３７℃にて１９２時間までのミリプラチンのラクトソーム内包安定性をＨＰＬＣ＆ＩＣＰ−ＭＳにより測定した。【０１４８】
図２〜５は、ミリプラチン内包ラクトソームのアルブミン存在下でのＰＢＳ溶液についての３７℃での経時によるＨＰＬＣ＆ＩＣＰ−ＭＳ測定チャートであり、図２は０時間での、図３は２４時間での、図４は１２０時間での、及び図５は１９２時間でのＨＰＬＣ＆ＩＣＰ−ＭＳ測定チャートである。横軸は、ＨＰＬＣのリテンションタイム（分）、縦軸は、195Ｐｔ（ＩＣＰ−ＭＳ）の相対強度及び２２０ｎｍでの吸光度の相対強度を表す。【０１４９】
図６は、同ミリプラチン内包ラクトソームのアルブミン存在下でのＰＢＳ溶液についての３７℃での経時によるＩＣＰ−ＭＳ測定での195Ｐｔのピーク面積変化を示すグラフである。横軸は、経時時間（時間）、縦軸は、195Ｐｔの相対的ピーク面積を表す。【０１５０】
ＨＰＬＣ及びＩＣＰ−ＭＳの測定結果から、ミリプラチン内包ラクトソームは大きい粒子と小さい粒子の混合物であり、ミリプラチンは大きい粒子内に保持されていることが分かった。２２０ｎｍでの吸光度のグラフにおいて、リテンションタイム約５．５分のピークが大きい粒子に相当し、リテンションタイム約６．２分のピークが小さい粒子に相当する。また、リテンションタイム約１０．５分のピーク等は、ラクトソーム粒子よりも低分子量画分（図６における低分子量画分１、及び低分子量画分２）に相当するピークである。なお、リテンションタイム約８分のピークはアルブミンのピークである。ラクトソーム（約５．５分、約６．２分）の２２０ｎｍでの吸光度ピーク面積は０時間を基準として、１９２時間（８日）後で約６０％維持しており、安定であった。【０１５１】
一方、ラクトソーム画分中の白金量は１９２時間（８日）後でも約９０％残存しており、放出された白金錯体はアルブミン画分に検出された（図６）。また、図２〜５のＨＰＬＣ結果から、経時によりラクトソームの粒子径の小さい画分の方が粒子径の大きい画分よりも大きく減少し、ラクトソームのピーク形状の変化が認められた。これらの結果からアルブミン存在下でミリプラチン内包ラクトソーム（粒子径の大きいラクトソーム）の安定性が高くなることが分かった。【０１５２】
アルブミン非存在下の場合についても同様にして、３７℃で１９２時間経過までミリプラチン内包ラクトソームの安定性を評価した結果、ラクトソームのピーク面積は経時的に減少し１９２時間（８日）後では約２０％しか残存しておらず、低分子量画分が経時的に増加した。ラクトソーム画分中の白金量はラクトソームのピーク面積よりもより速やかな減少を示した。このように、アルブミン非存在下においては、ミリプラチン内包ラクトソームの安定性は、アルブミン存在下におけるよりも劣っていた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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