(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における特定の細菌を検出する方法であって、対象からの検体に含まれる、
該細菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原と、
該細菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原とは異なる抗原と、
を同時に測定する工程を含み、
該測定が、該抗原及び該異なる抗原各々に対する複数の抗体を用いたイムノアッセイであって、
該抗原と該異なる抗原の少なくとも一方が検出された場合に該細菌が検出されたと判断する、
検出方法。
【請求項２】
該イムノアッセイが同一の捕捉部位でなされる、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
該異なる抗原が多糖抗原又はリポ多糖抗原である、請求項１又は２に記載の検出方法。
【請求項４】
該測定が
リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原の異なる部位と結合する少なくとも２種類の抗体と、
多糖抗原又はリポ多糖抗原の異なる部位と結合する少なくとも２種類の抗体と、
を用いたサンドイッチイムノアッセイである、請求項１に記載の検出方法。
【請求項５】
該リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原と結合する抗体がモノクローナル抗体であり、
該多糖抗原又はリポ多糖抗原と結合する抗体がポリクローナル抗体である、請求項３に記載の検出方法。
【請求項６】
該イムノアッセイがイムノクロマトグラフィー法、又はＥＬＩＳＡ法である、請求項１から５のいずれかに記載の検出方法。
【請求項７】
該細菌がレジオネラ菌である、請求項１から６のいずれかに記載の検出方法。
【請求項８】
該検体が尿検体である、請求項１から７のいずれかに記載の検出方法。
【請求項９】
対象における特定の細菌を検出するための検出キットであって、対象からの検体に含まれる、
該細菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原と、
該細菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原とは異なる抗原と、
を同時に測定するための手段を備え、
該測定が、該抗原及び該異なる抗原各々に対する複数の抗体を用いたイムノアッセイであって、
該測定するための手段が、該抗原と該異なる抗原の少なくとも一方が検出された場合に該細菌が検出されたと判断するための手段を備える、
該細菌の検出キット。
【請求項１０】
該測定するための手段が、イムノアッセイが同一の捕捉部位でなされるための手段を備える、請求項９に記載の検出キット。
【請求項１１】
該異なる抗原が多糖抗原又はリポ多糖抗原である、請求項９又は１０に記載の検出キット。
【請求項１２】
該測定するための手段が、
リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原の異なる部位と結合する少なくとも２種類の抗体と、
多糖抗原又はリポ多糖抗原の異なる部位と結合する少なくとも２種類の抗体と、
を含む、請求項９に記載の検出キット。
【請求項１３】
該リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原と結合する抗体がモノクローナル抗体であり、
該多糖抗原又はリポ多糖抗原と結合する抗体がポリクローナル抗体である、請求項１１に記載の検出キット。
【請求項１４】
該測定するための手段がイムノクロマトグラフィー法、又はＥＬＩＳＡ法である、請求項９から１３のいずれかに記載の検出キット。
【請求項１５】
該細菌がレジオネラ菌である、請求項９から１４のいずれかに記載の検出キット
【請求項１６】
該検体が尿検体である、請求項９から１５のいずれかに記載の検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中の特定の細菌を検出する方法に関する。本発明の方法は、細菌による感染症の診断の分野等で有用である。
【背景技術】
【０００２】
微生物感染症の診断は、通常、感染部位などでの原因菌の検出、又は、血清、もしくは体液中の原因菌に対する抗体の検出結果に基づいて判断される。特に、この診断のためには、原因菌の検出が患者への迅速な治療を可能にする意味で重要である。
【０００３】
感染症原因菌の検出には、原因菌の分離培養を経てその生化学的性状をもとに該原因菌の同定を行う培養法、原因菌に特異的な遺伝子をもとにＰＣＲ法などにより増幅し検出する遺伝子法、原因菌の表面抗原マーカー等と抗体との特異的反応を利用して原因菌検出を行う免疫法に大別できる。しかしながら、培養法、及び遺伝子法は検出結果を得るまでに時間がかかるので、短時間にしかも高感度に原因菌を検出し、迅速かつ適切な患者への治療につながる点で免疫法による検査結果が診断するための利用価値が高い。従来免疫法による感染症原因菌の検出には、菌種によって様々なマーカー抗原と抗体の組み合わせが使われている。
【０００４】
特許文献１は、種特異的であり、かつ同一種内のすべての血清型を検出できる微生物検出用抗体とその作製法、微生物検出方法及び微生物検出用試薬キットを提案する。特許文献１では、各種の微生物について細胞内のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原に対する抗体を作製し、対象微生物に特異的に反応する抗体を選択する。この抗体を用いて微生物を検出している。
【０００５】
近年では、種々の感染症の原因菌のうち、レジオネラ菌の免疫法による検出も試みられている。レジオネラ菌検出用の抗体としては、例えば、特許文献２に報告されているものがある。特許文献２では、本質的にタンパク質非含有のO-糖質抗原又はO-多糖質抗原をレジオネラ菌の種、又は種の血清群から分離してクロマトグラフィーカラムに結合し、これを使用してレジオネラ菌のひとつの血清型に対する粗抗体の精製を行っている。このようにして得られる抗原特異的抗体は、レジオネラ症、ポンティアック熱及びその他のレジオネラ菌が起因した疾患の検出のため、ならびに環境試料中のレジオネラ菌の検出のための免疫化学的アッセイ法において使用されることが記載されている。
【０００６】
特許文献３は、レジオネラ菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原と反応する抗体を用いて、患者の下気道検体、尿又は血液における該抗原を検出することを含む、レジオネラ菌に起因する病態を検査する方法を提供する。この方法は、レジオネラ菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原に対する抗体を使用して、肺組織破砕液中の同抗原を検出したところ、肺内の生菌数の増減に伴い速やかにその抗原濃度が変化すること及び、その濃度変化が尿中の抗原濃度にも反映されるという実験事実に基づき完成されたものであり、患者の増悪度を反映できる偽陽性の少ない検査方法である旨が述べられている。
【０００７】
検出対象を、２つ以上の抗体を用いて検出することも試みられている。特許文献４は、特定の細菌に由来する２つ以上の異なる検体の特徴に対して抗原特異性を有する２つ以上の抗体を含む、免疫クロマトグラフィーデバイスを提案する。特許文献４は、この方法によれば、病原菌の検体（例えば、細胞外関連成分及び／又は細胞内部分からの細胞マーカー）の特徴に対するシグナルが強化されるため、そのような病原菌の試料を分析する従来の技術と比較して有利であると述べている。しかしながら細胞外関連成分と細胞内部分からの細胞マーカーとを、それぞれ選択することを明記するものではない。
【０００８】
細菌を検出対象としたものではないが、特許文献５は、複数の異なる測定対象物質と、前記複数の異なる測定対象物質の各々と特異的に結合し、共通する標識物質で標識した複数の異なる標識抗体とを用い、前記標識物質量を測定することにより前記複数の測定対象物質の濃度の総和を測定することを特徴とする免疫測定方法を提供する。特許文献５は、この方法は、ダイオキシン類やＰＣＢ類等のように、塩素化量の異なる異性体からなる混合物を測定対象物質とする場合において、ダイオキシン類やＰＣＢ類の総濃度を一括して測定できる方法であると述べられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開ＷＯ００／０６６０３号公報（特許第５２１９０７５号）
【特許文献２】特表２００２−５２３０３０号公報
【特許文献３】特開２０１３−０６１３０４号公報
【特許文献４】特表２０１０−５１０５２４号公報
【特許文献５】特開２００８−１７０３７７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
特許文献１のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原を検出する方法は、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２がすべての細菌細胞に存在し、しかもそのアミノ酸配列が細菌間である程度の相違することから、各種の細菌を特異的に検出することが可能である。そのため広く活用されており、さらなる検出精度の向上が望まれる。好ましくは、感染からの経過時間にかかわらず、精度の高い細菌の検出を行うことである。
一方、本発明者らの検討によると、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２は、細胞の増殖が盛んな時期には細菌の量が少なくても検出のためには十分な量で発現しているが、その後は細菌の量が多いにもかかわらず、減少することが分かった。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、より精度の高い細菌検出を行うために、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原のみを検出する系では、感染時期によっては細菌が検出できない懸念があることに着目した。そして、これまで細菌の検出のために単独で利用されてきたリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原に加えて、同じ細菌由来の他の抗原を検出することを同時に行えば、検出精度の向上が期待できると考えた。特に、細胞の表面に存在し、そのため菌体の増殖に応じて存在量が増加すると考えられるものを抗原として、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原とともに細菌の検出において利用すれば、感染からの経過時間にかかわらず、精度の高い細菌の検出を行うことができると考えた。
【００１２】
そして各種免疫実験を用いて鋭意研究を重ねた結果、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原と、それとは異なる抗原の代表的なものとして、細胞の細胞壁外膜の構成成分の一つである多糖抗原又はリポ多糖抗原とを、同時に検出することを、種々の症例由来の試料に対して試みた。その結果、２種の抗原の検出対象とすることにより、従来法では抗原の検出が難しい症例の試料においても感染を特定することができ、また当該感染症には罹患していない対象由来の試料については正しく陰性と判定できることを見出し、本発明を完成した。
【００１３】
発明は、以下を提供する。
［１］対象における特定の細菌を検出する方法であって、対象からの検体に含まれる、
該細菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原と、
該細菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原とは異なる抗原と、
を同時に測定する工程を含む、
検出方法。
［２］該異なる抗原が細胞表面抗原である、１に記載の検出方法。
［３］該細胞表面抗原が多糖抗原又はリポ多糖抗原である、２に記載の検出方法。
［４］該測定が、該抗原に対する抗体を用いたイムノアッセイである、１から３のいずれかに記載の検出方法。
［５］該測定が
リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原の異なる部位と結合する少なくとも２種類の抗体と、
多糖抗原又はリポ多糖抗原の異なる部位と結合する少なくとも２種類の抗体と、
を用いたサンドイッチイムノアッセイである、４に記載の検出方法。
［６］該リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原と結合する抗体がモノクローナル抗体であり、
該多糖抗原又はリポ多糖抗原と結合する抗体がポリクローナル抗体である、４又は５に記載の検出方法。
［７］該イムノアッセイがイムノクロマトグラフィー法である、４から６のいずれかに記載の検出方法。
［８］該細菌がレジオネラ菌である、１から７のいずれかに記載の検出方法。
［９］該検体が尿検体である、１から８のいずれかに記載の検出方法。
［１０］対象における特定の細菌を検出するための検出キットであって、対象からの検体に含まれる
該細菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原と、
該細菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原とは異なる抗原と、
を同時に測定するための手段を備えた、該細菌の検出キット。
［１１］該異なる抗原が、細胞表面抗原である１０に記載の検出キット。
［１２］該細胞表面抗原が多糖抗原又はリポ多糖抗原である、１１に記載の検出キット。
［１３］該測定するための手段が該抗原に対する抗体を含む、１０から１２のいずれかに記載の検出キット。
［１４］該測定するための手段が、
リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原の異なる部位と結合する少なくとも２種類の抗体と、
多糖抗原又はリポ多糖抗原の異なる部位と結合する少なくとも２種類の抗体と、
を含む、１３に記載の検出キット。
［１５］該リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原と結合する抗体がモノクローナル抗体であり、
該多糖抗原又はリポ多糖抗原と結合する抗体がポリクローナル抗体である、１３又は１４に記載の検出キット。
［１６］該測定するための手段がイムノクロマトグラフィー法である、１３から１５のいずれかに記載の検出キット。
［１７］該細菌がレジオネラ菌である、１０から１６のいずれかに記載の検出キット
［１８］該検体が尿検体である、１０から１７のいずれかに記載の検出キット。
【００１４】
本発明はまた、以下を提供する。
［１］対象における特定の細菌を検出する方法であって、
該検出方法はイムノクロマトグラフィー装置を用い、
該装置は、細菌の有無を判定する一つの判定部上に、対象からの検体に含まれる、該細菌の少なくとも２種類の抗原と各々結合する少なくとも２種類の抗体が固定されている、
検出方法。
［２］該抗体の少なくとも一つが細胞内抗原に結合する抗体である、１に記載の検出方法。
［３］該細胞内抗原がリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原である、２に記載の検出方法。
［４］該抗体の少なくとも一つが細胞表面抗原に結合する抗体である、１から３のいずれかに記載の検出方法。
［５］該細胞表面抗原が多糖抗原又はリポ多糖抗原である、４に記載の検出方法。
［６］該装置が
リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原の異なる部位と結合する少なくとも２種類の抗体と、
多糖抗原又はリポ多糖抗原の異なる部位と結合する少なくとも２種類の抗体と、
を備え、
該固定された少なくとも２種類の抗体が、
該リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原の異なる部位と結合する少なくとも２種類の抗体のいずれかと、
該多糖抗原又はリポ多糖抗原の異なる部位と結合する少なくとも２種類の抗体のいずれかと、
を含む、１から５のいずれかに記載の検出方法。
［７］該リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原と結合する抗体がモノクローナル抗体であり、
該多糖抗原又はリポ多糖抗原と結合する抗体がポリクローナル抗体である、６に記載の検出方法。
［８］該判定部に固定される、
該リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原の異なる部位と結合する少なくとも２種類の抗体のいずれかと、
該多糖抗原又はリポ多糖抗原の異なる部位と結合する少なくとも２種類の抗体のいずれかと、
の濃度の総和が０．１ｍｇ／ｍｌ以上５ｍｇ／ｍｌ以下である、６又は７に記載の検出方法。
［９］該判定部に固定される、
該リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原の異なる部位と結合する少なくとも２種類の抗体のいずれかと、
該多糖抗原又はリポ多糖抗原の異なる部位と結合する少なくとも２種類の抗体のいずれかと、
の濃度の比率が１：４から４：１の範囲である、６から８のいずれかに記載の検出方法。
［１０］該装置が、
該リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原の異なる部位と結合する少なくとも２種類の抗体のいずれかであって、標識化された抗体と、
該多糖抗原又はリポ多糖抗原の異なる部位と結合する少なくとも２種類の抗体のいずれかであって、標識化された抗体と、
を更に備える、６から９のいずれかに記載の検出方法。
［１１］該標識化に用いられた標識が同一の標識である、１０に記載の検出方法。
［１２］該標識が着色粒子である、１１に記載の検出方法。
［１３］該着色粒子が金属コロイド粒子である、１２に記載の検出方法。
［１４］該リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原の異なる部位と結合する少なくとも２種類の抗体のいずれかと、
該多糖抗原又はリポ多糖抗原の異なる部位と結合する少なくとも２種類の抗体のいずれかと、
が異なる着色粒子上に固定化されている、１２又は１３に記載の検出方法。
［１５］該リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原の異なる部位と結合する少なくとも２種類の抗体のいずれかが固定化された着色粒子と、
該多糖抗原又はリポ多糖抗原の異なる部位と結合する少なくとも２種類の抗体のいずれかが固定化された着色粒子と
の濃度の比率が１：９から９：１の範囲である、１４に記載の検出方法。
［１６］該リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原の異なる部位と結合する少なくとも２種類の抗体のいずれかと、
該多糖抗原又はリポ多糖抗原の異なる部位と結合する少なくとも２種類の抗体のいずれかと、
が同一の着色粒子上に固定化されている、１２又は１３に記載の検出方法。
［１７］該同一の着色粒子上に固定化される、
該リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原の異なる部位と結合する少なくとも２種類の抗体のいずれかと、
該多糖抗原又はリポ多糖抗原の異なる部位と結合する少なくとも２種類の抗体のいずれかと、
の濃度の比率が１：９から９：１の範囲である、１６に記載の検出方法。
［１８］該検体を予め接触させるための、
ｐＨ５．５以上ｐＨ８．５以下とするための緩衝液と、
非イオン性界面活性剤と、
タンパク質又は糖の少なくとも一方と、
を含む反応液を更に用いる、１から１７のいずれかに記載に検出方法。
［１９］該非イオン性界面活性剤が、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、及びＴｒｉｔｏｎＸ１００からなる群より選ばれるいずれかである、１８に記載の検出方法。
［２０］該細菌がレジオネラ菌である、１から１９のいずれかに記載の検出方法。
［２１］該検体が尿検体である、１から２０のいずれかに記載の検出方法。
［２２］対象における特定の細菌の検出キットであって、
該検出キットはイムノクロマトグラフィー装置を含み、
該装置は、細菌の有無を判定する同一の判定部上に、該細菌の少なくとも２種類の抗原と各々結合する少なくとも２種類の抗体が固定されている、検出キット。
［２３］該抗体の少なくとも一つが細胞内抗原に結合する抗体である、２２に記載の検出キット。
［２４］該細胞内抗原がリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原である、２３に記載の検出キット。
［２５］該抗体の少なくとも一つが細胞表面抗原に結合する抗体である、２２から２４のいずれかに記載の検出キット。
［２６］該細胞表面抗原が多糖抗原又はリポ多糖抗原である、２５に記載の検出キット。
［２７］該装置が
リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原の異なる部位と結合する少なくとも２種類の抗体と、
多糖抗原又はリポ多糖抗原の異なる部位と結合する少なくとも２種類の抗体と、
を備え、
該固定された抗体が該抗原の異なる部位と結合する少なくとも２種類の抗体のいずれかである、２２から２６のいずれかに記載の検出キット。
［２８］該リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原と結合する抗体がモノクローナル抗体であり、
該多糖抗原又はリポ多糖抗原と結合する抗体がポリクローナル抗体である、２７に記載の検出キット。
［２９］該判定部に固定される、
該リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原の異なる部位と結合する少なくとも２種類の抗体のいずれかと、
該多糖抗原又はリポ多糖抗原の異なる部位と結合する少なくとも２種類の抗体のいずれかと、
の濃度の総和が０．１ｍｇ／ｍｌ以上５ｍｇ／ｍｌ以下である、２７又は２８に記載の検出キット。
［３０］該判定部に固定される、
該リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原の異なる部位と結合する少なくとも２種類の抗体のいずれかと、
該多糖抗原又はリポ多糖抗原の異なる部位と結合する少なくとも２種類の抗体のいずれかと、
の濃度の比率が１：４から４：１の範囲である、２７から２９のいずれかに記載の検出キット。
［３１］該装置が
該リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原の異なる部位と結合する少なくとも２種類の抗体のいずれかであって、標識化された抗体と、
該多糖抗原又はリポ多糖抗原の異なる部位と結合する少なくとも２種類の抗体のいずれかであって、標識化された抗体と、
を更に備える、２７から３０のいずれかに記載の検出キット。
［３２］該標識化に用いられた標識が同一の標識である、３１に記載の検出キット。
［３３］該標識が着色粒子である、３２に記載の検出キット。
［３４］該着色粒子が金属コロイド粒子である、３３に記載の検出キット。
［３５］該リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原の異なる部位と結合する少なくとも２種類の抗体のいずれかと、
該多糖抗原又はリポ多糖抗原の異なる部位と結合する少なくとも２種類の抗体のいずれかと
が異なる着色粒子上に固定化されている、３３又は３４に記載の検出キット。
［３６］該リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原の異なる部位と結合する少なくとも２種類の抗体のいずれかが固定化された着色粒子と、
該多糖抗原又はリポ多糖抗原の異なる部位と結合する少なくとも２種類の抗体のいずれかが固定化された着色粒子と、
の濃度の比率が１：９から９：１の範囲である、３５に記載の検出キット。
［３７］該リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原の異なる部位と結合する少なくとも２種類の抗体のいずれかと、
該多糖抗原又はリポ多糖抗原の異なる部位と結合する少なくとも２種類の抗体のいずれかと、
が同一の着色粒子上に固定化されている、３３又は３４のいずれかに記載の検出キット。
［３８］該同一の着色粒子上に固定化される、
リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原の異なる部位と結合する少なくとも２種類の抗体のいずれかと、
該多糖抗原又はリポ多糖抗原の異なる部位と結合する少なくとも２種類の抗体のいずれかと、
の濃度の比率が１：９から９：１の範囲である、３７に記載の検出キット。
［３９］該検体を予め接触させるための、
ｐＨ５．５以上ｐＨ８．５以下とするための緩衝液と、
非イオン性界面活性剤と、
タンパク質又は糖の少なくとも一方と、
を含む反応液を更に含む、２２から３８のいずれかに記載の検出キット。
［４０］該非イオン性界面活性剤が、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、及びＴｒｉｔｏｎＸ１００からなる群より選ばれるいずれかである、３９に記載の検出キット。
［４１］該細菌がレジオネラ菌である、２２から４０のいずれかに記載の検出キット。
［４２］該検体が尿検体である、２２から４１のいずれかに記載の検出キット。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の方法によれば、目的の細菌を、精度よく検出することができる。
特に細胞表面抗原を用いる態様によれば、細菌感染からの経過時間にかかわらず、細菌を検出できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】レジオネラ菌の増殖と、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の発現量及びリポ多糖（ＬＰＳ）量との関係を示すグラフである。
【図２】イムノクロマトグラフィー装置の一例を示す断面模式図である。１は基材、２は標識抗体含浸部材、３はクロマト展開用膜担体、４は吸収用部材、５は試料添加用部材、６は捕捉部位（判定部）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明について更に詳細に説明する。
＜２種の抗原の検出＞
本発明の方法は、対象における特定の細菌を検出する方法であって、検体に含まれる２種類の抗原を同時に検出することを特徴とする。２種類の抗原は、より詳細には、細胞内に存在する抗原と、それとは異なる抗原との２種類である。抗原の検出には、抗体が用いられることが好ましい。また本発明は、対象における特定の細菌を検出する方法であって、該検査方法は免疫クロマト法を利用したキットを用い、該キットは、細菌の有無を判定する一つの判定部上に、特定の細菌に含まれる二種類以上の抗原と各々反応する二種類以上の抗体が固定されている検出方法に関する。キットに使用される抗体の少なくとも一つは、細胞内抗原に反応する抗体であることが好ましく、また少なくとも一つは、細胞表面抗原に反応する抗体であることが好ましい。対象は、ヒト又は非ヒト動物を含み、また特定の細菌に感染したヒト又は非ヒト動物、その疑い若しくはリスクのあるヒト又は非ヒト動物、及び健常なヒト又は非ヒト動物を含む。
【００１８】
本発明において「特定の細菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原と、それとは異なる抗原とを同時に測定する」というときは、一回の測定で、特定の同一の細菌が有するリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原と、それとは異なる抗原を検出することをいう。同一の細菌が複数存在していても構わない。そして、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原と、それとは異なる抗原を測定する場所は、同じであることが好ましく、同じ場所で測定することで相互を補完することが可能となり、測定精度を向上することができる。また、「測定する」とは、抗原の存在の有無又はその量を分析することをいう。したがって、測定の結果、抗原が検出されなかった場合も、検出された場合と同様、本発明の方法の実施に該当する。
【００１９】
本発明で用いる抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の何れでもよいが好ましくはリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原と結合する抗体がモノクローナル抗体であり、多糖抗原又はリポ多糖抗原と結合する抗体がポリクローナル抗体であることが望ましい。
【００２０】
［細胞内抗原の検出：リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原の検出］
本発明では、２種以上の抗原が検出される。本発明において検出される２種以上の抗原の少なくとも一つは、細胞内抗原であることが好ましく、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原であることがより好ましい。
リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原に対する抗体は、国際公開第００／０６６０３号公報（前掲特許文献１）に記載の方法で作製することができる。抗体は、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の全長タンパク質あるいはその部分ペプチドを抗原として用いて作製することができるが、全長タンパク質を抗原として作製することが好ましい。この部分ペプチドあるいは全長タンパク質をそのまま、又はキャリアタンパク質と架橋した後必要に応じてアジュバントとともに動物へ接種せしめ、その血清を回収することでリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２を認識する抗体（ポリクローナル抗体）を含む抗血清を得ることができる。また抗血清より抗体を精製して使用することもできる。接種する動物としてはヒツジ、ウマ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット等であり、特にポリクローナル抗体作製にはヒツジ、ウサギなどが好ましい。また、抗体としてはハイブリドーマ細胞を作製する公知の方法により取得したモノクローナル抗体を適用することがより好ましいが、この場合はマウスが好ましい。当該モノクローナル抗体として、特定の細菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２と反応し、特定の細菌とは異なる種に属する細菌、又は異なる属に属する細菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２とは反応しないモノクローナル抗体をスクリーニングすることにより、当該細菌による感染症にかかっているかどうかの診断に役立てることが可能となる。
【００２１】
本発明の好ましい態様の一つにおいては、レジオネラ菌が検出される。この態様においては、用いられる抗体は、レジオネラ菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原と種特異的又は属選択的に反応する抗体である。ここで、「種に特異的」とは、レジオネラ属に属するある特定の種の細菌（たとえばレジオネラ・ニューモフィラの全血清型）とのみ反応し、レジオネラ属以外の他の属に属する細菌、並びにレジオネラ属に属する上記特定の種以外の種の細菌とは反応しないことを意味する。また、「属に選択的」とは、レジオネラ属に属する一部又はすべての細菌とのみ反応し、レジオネラ属以外の他の属に属する細菌とは反応しないことを意味する。
【００２２】
本態様で用いる抗体は、レジオネラ菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の全長あるいはその部分ペプチドを抗原として用いて作製することができる。レジオネラ・ニューモフィラのリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２のアミノ酸配列は公知であり、例えば、特開２００４−２０１６０５号公報の配列番号２に記載されている。
【００２３】
本態様で用いるレジオネラ菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原に対する抗体は、以下のａ）又はｂ）記載の方法、あるいはその他の類似の方法によって取得することができるが、これらの方法に限定されるものではない。
【００２４】
ａ）レジオネラ菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２のアミノ酸配列（およびコードする遺伝子配列）は公知であるため、他のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２のアミノ酸配列（およびコードする遺伝子配列）が公知な微生物における該タンパク質のアミノ酸配列との類似性が少ない領域についてアミノ酸数５個から３０個ほどのペプチド断片を合成し、それを免疫原としてポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体を作製することにより目的の抗体を取得することができる。
【００２５】
ｂ）また、既知の該遺伝子の両端部位におけるＤＮＡ配列をプローブとしたＰＣＲ手法による遺伝子増幅、相同部分配列を鋳型プローブとしたハイブリダイゼーション法など通常の遺伝子操作手法を用いることにより該遺伝子の全長配列を取得することができる。その後、他のタンパク質遺伝子とのフュージョン遺伝子などを構築し、大腸菌等を宿主として公知の遺伝子導入手法により宿主内に該当フュージョン遺伝子を挿入し大量に発現させた後にフュージョンタンパク質として用いたタンパク質に対する抗体アフィニティーカラム法などにより発現タンパク質を精製することにより目的とするタンパク質抗原を取得することができる。
【００２６】
この場合、レジオネラ菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の全長タンパク質が抗原となるため、異なる微生物間で保存されているアミノ酸部分に対する抗体を取得しても本発明の目的に合致しない。従って、本法によって取得した抗原に対しては公知の手法によりモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得し、レジオネラ菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２とのみ反応する抗体を産生するクローンを選択することにより目的の抗体を取得することができる。
【００２７】
抗原となるリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の精製度が不足している場合は、公知の精製手法であるイオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過などの手法により精製した後、特開２００４−２０１６０５号公報に記載のすでに作製した抗体によるウェスタンブロットなどの方法によりレジオネラ菌リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の溶出画分を同定しさらに精製度の高いタンパク質を得ることができる。得られた精製レジオネラ菌リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原を基にして公知の方法によりハイブリドーマあるいはポリクローナル抗体を取得し、同様に目的の微生物に特異的に反応するハイブリドーマあるいはポリクローナル抗体を選択することにより目的の抗体を取得することができる。
【００２８】
［細胞内抗原とは異なる抗原］
本発明において検出される２種類以上の抗原のうち少なくとも一つは細胞内抗原とは異なる抗原であり、好ましくはリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原とは異なる抗原である。本発明者らの検討によると、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原は、細胞の増殖が盛んな時期には細菌の量が少なくても検出のためには十分な量で発現しているが、その後は細菌の量が多いにもかかわらず、減少することが分かっている。このような現象は、多くの細菌に共通すると考えられる。リボソームタンパク質は、すべての細菌に存在し、細胞の成長、増殖、代謝に大きくかかわっている。機能自体はどの菌も同じと考え、同じ現象が共通すると考えられるからである。したがって、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原とは異なる抗原としては、特に限定されないが、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原の発現量が低下する時期を補完するとの観点からは、細胞の増殖とともに増加することが明らかである、細胞表面抗原であることが好ましい。細胞表面抗原とは、細菌細胞の表面、すなわち細菌の細胞膜を構成する成分であって、抗原となり得るものをいう。
【００２９】
細胞表面抗原としては、抗原となり得るものであれば特に限定されない。細胞表面に多く存在し、抗体が入手しやすく、検出が容易であるとの観点からは、好ましい例の一つは、多糖類である。多糖類としては、リポ多糖、莢膜多糖、菌体外多糖などが挙げられる。検出対象となる菌がグラム陰性菌である場合、細胞表面抗原の特に好ましい例は、リポ多糖（ＬＰＳ）である。
【００３０】
細胞表面抗原を検出するための抗体の製造方法は、当業者にはよく知られている。市販されているものを利用してもよい。
【００３１】
本発明によって検出される特定の細菌の例として、レジオネラ菌、肺炎球菌、クラミジア菌、マイコプラズマ菌等が挙げられる。特に好ましい例は、レジオネラ菌である。
【００３２】
本発明において、特定の細菌は、検体に含まれる特定の細菌由来の抗原として検出される。検体の例として、尿、咽頭ぬぐい、下気道、血液、鼻腔吸引液、及び鼻咽頭ぬぐい等が挙げられる。特に好ましい例は、尿である。
【００３３】
＜装置、キット＞
本発明の方法は、イムノクロマトグラフィー法（「免疫クロマトグラフィー法」、「免疫クロマト法」、又は「イムノクロマト法」ということもある。）を利用した装置又はキットを用いる。キットは、イムノクロマトグラフィー装置を含み、イムノクロマトグラフィー装置は、細菌の有無を判定するための判定部を有し、判定部上には、好ましくは細菌に含まれる２種類以上の抗原と各々反応する２種類以上の抗体が固定される。キット又はイムノクロマトグラフィー装置は、それぞれの抗原に対して、固定化された抗体とは異なる部位と結合する抗体を用いるサンドイッチアッセイ（「サンドイッチイムノアッセイ」ということもある。）を利用したものでもよい。
【００３４】
より詳細には、２種類以上の抗原は、判定部に固定化された抗体とは異なる部位と結合する抗体と、判定部に固定化された抗体を用いて、サンドイッチアッセイ法により検出することができる。あるいは２種類以上の抗原は、標識された抗原と、判定部上に固定化された抗体とは異なる部位と結合する抗体を用いて競合法にて検出してもよい。但し、本発明においては、検出感度が高く、陽性で抗体検出ラインが出現するサンドイッチアッセイ法が好ましい。
【００３５】
図２に、イムノクロマトグラフィー装置の例の、断面模式図を示した。１は基材、２は標識抗体含浸部材、３はクロマト展開用膜担体、４は吸収用部材、５は試料添加用部材を示す。６は細菌に含まれる２種類以上の抗原と各々反応する２種類以上の抗体が固定された判定部であり、ここに抗原が捕捉されることから、補足部位ということもある。
【００３６】
標識抗体含浸部材には、好ましくは、２種類以上の、検出対象となる抗原に対する抗体であって固定化された抗体とは異なる部位と結合する抗体、又は２種類以上の標識された抗原が保持されている。ここに、固定化された抗体とは異なる部位と結合する抗体が保持されている場合には、サンドイッチアッセイ法により抗原を検出することができる。また、ここに標識された抗原が保持されている場合には、競合法により特定物質を検出することができる。本発明においては、検出感度が高く、陽性で抗体検出ラインが出現するサンドイッチアッセイ法の方が好ましいことから、ここには、固定化された抗体とは異なる部位と結合する抗体が保持されていることが好ましい。
【００３７】
固定化された抗体とは異なる部位と結合する抗体を保持させる場合には、それぞれの抗原に対し、判定部に固定化される抗体と、固定化された抗体とは異なる部位と結合する抗体の、２種類の抗体を用いる。サンドイッチアッセイ法により抗原を検出することができるように、２種類の抗体は、一つの抗原に同時に結合できることができる抗体であり、一方の抗体のエピトープは、他方の抗体が認識する抗原のエピトープとは異なることが好ましい。
【００３８】
本発明において、検出可能な信号を得るために、標識抗体含浸部材に保持される固定化された抗体とは異なる部位と結合する、２種類以上の抗体又は抗原は標識される。２種類以上の抗体又は抗原それぞれ別の標識により標識化することもでき、また同じ標識により標識化することもできる。検出が容易であり、かつ目視での判定が容易であるとの観点からは、同じ標識を用いることが好ましい。
【００３９】
標識としては、着色粒子、酵素、ラジオアイソトープなどが挙げられるが、特殊な設備不要で目視によって検出可能な着色粒子を使用することが好ましい。着色粒子としては、金や白金などの金属微粒子（金コロイド粒子、白金コロイド粒子ということもある。）、非金属粒子、ラテックス粒子などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。着色粒子は、試験片の空隙内を通って下流に輸送されることができるサイズであればいかなるサイズでもよいが、直径が１ｎｍから１０μｍが好ましい。より好ましくは、５ｎｍから１μｍであり、さらに好ましくは１０ｎｍから１００ｎｍである。
【００４０】
［判定部に固定化される抗体の濃度比］
判定部には、２種類以上の抗原に各々反応する２種類以上の抗体が固定化される。２種類の抗原を利用する態様において、判定部に固定化される２種類の抗体の濃度比は、目的の細菌の検出を意図した精度で行うことができる限り特に限定されないが、例えば、１：５〜５：１とすることができる。目視で十分な判定ができるとの観点からは、１：４〜４：１とすることが好ましく、１：３〜３：１とすることがさらに好ましい。判定部に固定化される抗体の量は、目的の細菌の検出を意図した精度で行うことができる限り特に限定されないが、抗体の総和の濃度として０．１ｍｇ／ｍｌ以上、好ましくは０．２ｍｇ／ｍｌ以上、より好ましくは０．５ｍｇ／ｍｌ以上である抗体溶液を、1μＬ／ｃｍでライン状に塗布し、これを乾燥することにより、適切な量が固定化された判定部を得ることができる。溶液の抗体濃度の上限値は特に限定されないが、下限値がいずれの場合であっても５．０ｍｇ／ｍｌ以下とすることができ、４．０ｍｇ／ｍｌ以下とすることが好ましく、３．０ｍｇ／ｍｌ以下とすることがより好ましい。本発明において、装置に固定化される抗体の濃度又は装置に固定化された抗体の濃度は、特に記載した場合を除き、装置へ抗体を固定化する際に用いる抗体含有液における抗体の濃度で代替される。
【００４１】
［金コロイドへの固定化方法（別々固定、同一固定）］
イムノクロマト装置の好ましい態様の一つは、２種類の抗原各々に対する固定化された抗体とは異なる部位と結合する２種類の抗体を、金属コロイド粒子、好ましくは金コロイド粒子に固定化して用いるものである。この態様においては、２種類の抗体は、各々異なる金コロイド粒子に固定化してもよく、同一の金コロイド粒子に固定化してもよい。なお、本発明、本発明の実施態様、又は本発明の実施例を、金コロイド粒子を用いた場合を例に説明することがあるが、その説明は金コロイド粒子以外の金属コロイド粒子（例えば、白金コロイド粒子、パラジウムコロイド粒子、銀コロイド粒子、銅コロイド粒子、ニッケルコロイド粒子、インジウムコロイド粒子等）を用いた場合にもあてはまる。
【００４２】
［金コロイドの混合比（別々固定の場合）］
異なる金コロイド粒子に固定化する場合、各々を固定化した２種類の金コロイド粒子を混合して用いることができる。混合比は、目的の細菌の検出を意図した精度で行うことができる限り特に限定されないが、本発明者らの検討によると、混合した金コロイド標識抗体液の一方が一定の濃度以上含まれていないと、その金コロイド標識抗体が補足する抗原との複合体が少なく、検出部位のラインが目視で認識し難く、また混合した金コロイド標識抗体液の一方が一定の濃度を超えると、検出部位に捕捉される量が飽和し、さらには流れを妨げる原因になりうる。そのため、混合比は、１：１９〜１９：１とすることが好ましい。目視で十分な判定ができるとの観点からは、１：９〜９：１とすることが好ましく、１：３〜３：１とすることがさらに好ましい。
【００４３】
［金コロイドに結合される抗体の濃度比］
同一の金コロイド粒子に固定化する場合、固定化する際の抗体の濃度比は、目的の細菌の検出を意図した精度で行うことができる限り特に限定されないが、本発明者らの検討によると、一方の抗体の濃度が一定以下であると、その抗体に対する反応性が著しく低くなり、目的の効果が発揮し難く、また抗体濃度を一定以上としてもそれ以上金コロイド粒子に抗体が結合しなくなる。そのため、濃度比は、１：１９〜１９：１とすることがこのましい。目視で十分な判定ができるとの観点からは、１：９〜９：１とすることが好ましく、１：３〜３：１とすることがさらに好ましい。本発明において、金属コロイドに固定化される抗体の濃度又は装置に固定化された抗体の濃度は、特に記載した場合を除き、金属コロイドへ抗体を固定化する際に用いる抗体含有液における抗体の濃度で代替される。
【００４４】
［装置の製造、材料］
イムノクロマト装置は、公知の方法にて市販の材料を用いて作製することができる。装置の基材（図２の例では１）としては、入手のしやすさや安定性、安全性、成形性及び滅菌性に優れるという点でポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン等の合成高分子、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、酢酸セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸塩等の天然高分子自体ならびにそれを架橋した構造体や改質した構造体、ヒドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料、ステンレス、チタン、アルミニウム等の金属を用いることができる。中でも合成高分子や天然高分子誘導体が好ましい。また基材の形状としては平板、メッシュ、織布、不織布、スポンジ状構造体、３次元成型体（ブロック状）等で用いることができる。
【００４５】
標識抗体含浸部材（図２の例では２）に使用する材料は、イムノクロマトグラフィーを行えるものであれば特に限定されないが、好ましくは、セルロース誘導体等の繊維マトリックス、濾紙、ガラス繊維、布、綿等である。
【００４６】
判定部（図２の例では６）を含むクロマト展開用膜担体（図２の例では３）に使用する材料は、イムノクロマトグラフィーを行えるものであれば特に限定されないが、好ましくは、ニトロセルロース、混合ニトロセルロースエステル、ポリビニリデンフロライド、ナイロン等である。
【００４７】
本発明において、クロマト展開用膜担体の判定部への抗体の固定化においては、膜担体表面に抗体分子が直接結合していてもよいし、又は活性基を介して結合していてもよい。膜担体から抗体分子又は活性基が膜担体表面に固定化された状態であれば、いずれの結合状態であってもよい。結合状態としては、共有結合、イオン結合、ファンデルワールス結合、水素結合又は疎水結合の単独又はこれら複数の合力があげられる。特に抗体溶液と膜担体表面との単純な接触による物理的な吸着法は、簡便で本発明に特に好適に用いられる。また抗体の吸着後に膜担体表面を洗浄や乾燥させること、あるいは膜担体表面に抗体溶液を塗布後に水分を蒸発せしめて膜担体表面に抗体を固定化する方法も、本発明に極めて好適に使用することができる。
【００４８】
［その他］
本発明のキットには、免疫クロマト装置以外に、検体を希釈する溶液、及び／又は細菌を溶解して細胞内成分および／または細胞表面成分を抽出するための溶液を必要に応じて含めてもよい。本発明者らの検討によると、患者由来の検体中には様々な共存物質が存在し、それらがイムノクロマト検出系において、試験液の流れや反応性に影響を及ぼしうる。そのため、共存物質の影響を低減させ、イムノクロマトの展開速度を一定に保ち、かつ偽陽性や反応阻害が起こらないようにするとの観点からは、検体を希釈するための液には、タンパク質及び糖類のうち少なくとも一方が添加されていることが好ましく、非イオン性界面活性剤がさらに含まれていることがより好ましい。
【００４９】
タンパク質としては、目的の細菌の検出を意図した精度で行うことができる限り特に限定されないが、入手が容易であるとの観点からは、アルブミン、カゼイン等が好ましい。また糖類としては、目的の細菌の検出を意図した精度で行うことができる限り特に限定されず、糖類全般を用いることができるが、入手が容易であるとの観点からは、グルコース、フルクトースのような単糖類、スクロース、オリゴ糖あるいはデキストランのような多糖類等が好ましい。タンパク質及び糖類は、一種を用いてもよく、２種以上を用いてもよい。これらの濃度は、当業者であれば適宜設計できる。
【００５０】
非イオン性界面活性剤としては、目的の細菌の検出を意図した精度で行うことができる限り特に限定されないが、エステルエーテル型、エステル型、エーテル型のいずれも好適に用いることができると考えられ、より具体的にはポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、脂肪酸ソルビタンエステル、アルキルポリグルコシド、脂肪酸ジエタノールアミド、アルキルモノグリセリルエーテル、ポリソルベート類（脂肪酸ソルビタンエステルにエチレンオキシドが数十分子縮合したもの）などがあげられるが、特に限定されない。特に好ましい例の一つは、ポリソルベート類、より特定すると、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノパルミテート（Ｔｗｅｅｎ４０）、ポリオキシエチレン(60)ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン(65)ソルビタントリステアレート、及びポリオキシエチレン(80)ソルビタンモノオレエート等、ならびにポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、より特定するとポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎＸ１００）等である。非イオン性界面活性剤は、一種用いてもよく、２種以上用いてもよい。
【００５１】
非イオン性界面活性剤の濃度（複数の非イオン性界面活性剤を用いる場合は、非イオン性界面活性剤総量としての濃度を指す。）は、例えばイムノクロマト法を用いる場合は展開液の流れが確保される限り、特に限定されないが、いずれの場合であっても、下限は、検体と混合した場合の終濃度が０．０３％以上となるようにすることができ、好ましくは０．０５％以上であり、より好ましくは０．０７５％以上であり、さらに好ましくは０．１％以上であり、特に好ましくは０．３％以上である。また非イオン性界面活性剤の濃度の上限値は、溶菌による反応や抗原抗体反応を著しく阻害しない程度であればよく、いずれの場合であっても、１０％以下とすることができ、好ましくは７．５％以下であり、より好ましくは５％以下であり、さらに好ましくは３％以下であり、特に好ましくは２％以下である。
【００５２】
検体のｐＨは、免疫反応の反応性に影響を与える要因となりうる。そのため検体を希釈するための液は、ｐＨが５．５以上であり、かつ８．５以下となるように緩衝されていることが好ましい。特に患者の尿が検体となる場合においては、尿検体は健康な人でもｐＨが５から９と幅広いため、検出性能を維持するためにも、このような緩衝作用のある検体希釈液がキットに含まれることが好ましい。緩衝作用を持たせるためには、検体の希釈液は、各種グッドバッファーなどの緩衝液を含むことが好ましい。
【００５３】
また、本発明の検査キットには、検体を採取するための綿棒やスポイト又は容器、希釈溶液と検体を混合するための容器、検体溶液を基材に添加するためのスポイト状又は他の形状の容器などを必要に応じて含めてもよいが、これらは必ずしも含めなくてもよい。
【００５４】
本発明を以下の実施例に基づいて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００５５】
＜製造例１＞
以下の実施例では、レジオネラ菌リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原に対する抗体として、特許文献３に記載の方法で取得した抗体を使用した。これらの抗体の取得方法を以下に記載する。
【００５６】
（１）レジオネラ・ニューモフィラリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗体を産生するハイブリドーマの取得
特開２００４−２０１６０５号公報の実施例３に記載のプラスミドｐＧＥＸ−Ｌｅｇ１６．リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２を含有する大腸菌ＤＨ５α形質転換体を用いて、同報実施例記載の方法に従い抗レジオネラ・ニューモフィラリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗体を産生するハイブリドーマを取得するための免疫源としてのＬｅｇｉｏｎｅｌｌａリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２タンパク質精製物を調整した。さらに当該リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２を用い、特開２００４−２０１６０５号公報の実施例４に記載の方法に従い、レジオネラリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体を産生するハイブリドーマを取得した。
【００５７】
（２）レジオネラ・ニューモフィラリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗体を産生するハイブリドーマを用いた抗体生産と酵素標識
上記（１）にて取得したハイブリドーマを定法に従い培養、精製しモノクローナル抗体をそれぞれ回収した。具体的には各ハイブリドーマを種細胞増殖用培地としてウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％添加したＴＩＬ  ＭｅｄｉａＩ培地（ＩＢＬ社製）５ｍｌで１〜２×１０5個／ｍｌ程度となるように希釈し、５％ＣＯ2、３７℃、２５ｃｍ2培養フラスコ中で２−３日培養した。５〜１０×１０5個／ｍｌ程度に増殖した細胞を、さらに７５ｃｍ2培養フラスコ中にて同様に増殖させた後、１〜２×１０5個／ｍｌ程度となるように同様のＦＢＳ入り培地で希釈しローラーボトル中へ２５０ｍｌに継代した。５％ＣＯ2、３７℃で２−３日培養した後、さらに２５０ｍｌのＦＢＳ入り清培地を追加して２−３日間培養を継続した。５〜１０×１０5個／ｍｌ程度にまで増殖させた後、すべての細胞を回収し、同量の無血清培養用培地（ＡＳＦ０１０４Ｎ  味の素社製）に置換した。  ４〜７日間培養したのち培養液を回収して２５００ｒｐｍ、１０分の遠心により目的とする抗体を含む培養上清を取得した。  培養上清は、ポアサイズ０．４５μｍで無菌濾過し、０．１％のアジ化ソーダ添加後４℃で保存した。取得した培養上清を０．０５ｍｏｌｅ／ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７）で５倍希釈後Ｈｉｔｒａｐ−ｐｒｏｔｅｉｎＧカラム（GEヘルスケアジャパン社製、５ｍｌ）に吸着させ、リン酸緩衝液で５ベッドボリューム分洗浄後ｐＨ２．５の０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液で溶出し、フラクションを回収して各ハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体を得た。
【００５８】
＜実施例１＞
レジオネラ・ニューモフィラ血清型１菌増殖実験：レジオネラ・ニューモフィラ血清型１菌の増殖と、レジオネラ菌リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原又はレジオネラ・ニューモフィラ血清型１ ＬＰＳ抗原の発現量測定
本実験におけるレジオネラ菌はATCC33152株を使用した。
レジオネラ菌を、BCYE寒天培地で37℃、4日間培養した後、単一コロニーを3mlのBYE培地に添加し、攪拌しながら37℃で一晩培養した菌を、再び新しいBYE培地3mlに添加し、攪拌しながら37℃で培養した。
【００５９】
この培養液を一定時間おきに抽出し、菌濃度と、レジオネラ菌リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原とレジオネラ・ニューモフィラ血清型１ ＬＰＳ濃度をそれぞれ測定した。抽出した菌培養液は、それぞれ遠心分離して上清を除き、菌ペレットに1%TritonX-100／生理食塩水溶液を加え、室温で1晩溶菌したものを各菌液サンプルとして、それぞれの抗原濃度を測定する免疫測定法を実施した。
【００６０】
レジオネラ菌リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原、及びレジオネラ・ニューモフィラ血清型１ ＬＰＳの測定方法（ELISA）
ELISA用プレートにリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗体１を添加して１晩吸着させた。抗体液を捨てて洗浄し、BSAを含むBufferでブロッキングしたのち、各菌液サンプルを段階希釈して添加し反応させた。反応後サンプル液を捨てて洗浄した後、HRP標識したリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗体２を添加して反応させた。反応後標識抗体液を捨てて十分洗浄した後、基質を添加して発色させて吸光度を測定した。
同様にＬＰＳについても、ＬＰＳ抗体を使用して測定した。
【００６１】
図１に示すように、培養時間とともに菌が増殖し、ある一定のところで増殖が停止する。レジオネラ・ニューモフィラ血清型１ ＬＰＳ抗原は菌の濃度と並行して増えていくのに対し、レジオネラ菌リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原は菌の増殖期に高い発現を示す様子をみることができた。
【００６２】
これにより、菌量が多い時はもちろんのこと、菌が少なくレジオネラ・ニューモフィラ血清型１ ＬＰＳ抗原の検出が難しい場合でも、増殖段階ではレジオネラ菌リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原が高濃度で存在するため、本発明の検出方法である2種類の抗原を同時に測定することによって、どの増殖時期であっても安定して菌の検出が可能であることが証明された。
【００６３】
＜実施例２＞
レジオネラ・ニューモフィラ血清型1 ＬＰＳ抗原＋レジオネラ菌リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原同時検出系キットの実験−１：臨床尿検体を用いた評価
レジオネラ症の患者尿を、レジオネラ・ニューモフィラ血清型１ ＬＰＳ抗原検出イムノクロマトキット、レジオネラ菌リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原検出イムノクロマトキットと、レジオネラ・ニューモフィラ血清型1 ＬＰＳ抗原＋レジオネラ菌リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原同時検出系のイムノクロマトキットにて比較・評価した。
【００６４】
試験時に採取される患者検体は、患者の状態や感染からの経過時間によって、検体中に含まれる各抗原量が異なることが想定される。
実際、表１にあるように、レジオネラ症患者の尿検体（患者検体No.1からNo.4）では、レジオネラ・ニューモフィラ血清型１ ＬＰＳ抗原検出系又はレジオネラ菌リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原検出系、それぞれ単独系では検出が難しい症例も存在した。しかしながら、レジオネラ・ニューモフィラ血清型１ ＬＰＳ抗原とレジオネラ菌リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原を両方同時に検出する本発明の方法では、いずれの症例も検出でき、どのような症例でも検出しうる可能性が証明された。また、レジオネラ症ではない患者の尿検体（患者検体No.５）では、当然ながら本発明の方法でも陰性と判定された。
【００６５】
【表１】
0006770805.tif 000002
【００６６】
＜実施例３＞
レジオネラ・ニューモフィラ血清型１ ＬＰＳ抗原＋レジオネラ菌リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原同時検出系キットの実験−２：判定部に固定する2種類の抗体の濃度比を決定するための実験
判定部に固定するレジオネラ・ニューモフィラ血清型１ ＬＰＳ抗体とレジオネラ菌リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗体の濃度比を決定するため、各濃度比で抗体を固定したイムノクロマトキットを作製して、レジオネラ・ニューモフィラ血清型１ ＬＰＳ抗原又はレジオネラ菌リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原との反応性を確認した。
【００６７】
１）レジオネラ・ニューモフィラ血清型1 ＬＰＳ抗原＋レジオネラ菌リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原を同時検出するイムノクロマトキットの構成
レジオネラ・ニューモフィラ血清型1 ＬＰＳ抗原＋レジオネラ菌リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原を同時検出するイムノクロマトキットの構成方法を以下に示す。
【００６８】
（a）金コロイド標識抗体液の調整
金コロイド溶液（粒径60nm）に1/10量の0.1M感作Bufferとレジオネラ菌リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗体を加えて混合し、室温で30分間静置して抗体を金コロイド粒子表面に結合させた後、金コロイド溶液における最終濃度が0.5%となるようにカゼインナトリウム5%水溶液を加えてブロッキングし、金コロイド標識抗リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗体液を調製した。
同様に金コロイド標識抗レジオネラ・ニューモフィラ血清型1 ＬＰＳ抗体液を調製した。
これにより、各金コロイド標識抗体液を得た。
【００６９】
（b）レジオネラ・ニューモフィラ血清型1 ＬＰＳ抗原＋レジオネラ菌リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原同時検出用イムノクロマトキットの作製
（b-1）レジオネラ菌リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原又はレジオネラ・ニューモフィラ血清型１ ＬＰＳ抗原と、各金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位（判定部）
幅25mm、長さ300mmのニトロセルロース膜をクロマトグラフ媒体のクロマト展開用膜担体3として用意した。レジオネラ菌リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗体とレジオネラ・ニューモフィラ血清型１ ＬＰＳ抗体が、それぞれ2.25mg/ml+0.25mg/ml、2.0mg/ml+0.5mg/ml、1.5mg/ml+1.0mg/ml、1.0mg/ml+1.5mg/ml、0.5mg/ml+2.0mg/ml、0.25mg/ml+2.25mg/mlで含有されてなる溶液を、このクロマト展開用膜担体3におけるクロマト展開開始点側の末端から10mmの位置に1μL/cmでライン状に塗布して、これを50℃で乾燥し、その後、0.5％カゼイン溶液に浸し、次いで0.2％スクロース溶液に浸し、一晩室温で乾燥させた。レジオネラ菌リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原又はレジオネラ・ニューモフィラ血清型１ ＬＰＳ抗原と、各金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位6とした。
【００７０】
（b-2）金コロイド標識抗体含浸部材
(a)の金コロイド標識抗体液を、一定の濃度に調製したものを、10mm×300mmの帯状のグラスファイバーパッドに2mLを含浸せしめ、これを乾燥させて金コロイド標識抗体含浸部材2とした。
2種類の金コロイド標識抗体液は、別々のグラスファイバーパッドに含侵することにより、2種類の金コロイド標識抗体含侵部材を得た。
【００７１】
（b−3）イムノクロマトキットの作製
上記クロマト展開用膜担体3、上記金コロイド標識抗体含浸部材2の他に、試料添加用部材5として綿布と、吸収用部材4として濾紙を用意した。そして、これらの部材を基材１に貼り合せた後、5mm幅に切断し、図２と同様のイムノクロマトキットを作製した。
2種類の金コロイド標識抗体含侵部材は、レジオネラ・ニューモフィラ血清型1 ＬＰＳ抗原の反応性を見るためには金コロイド標識レジオネラ・ニューモフィラ血清型1 ＬＰＳ抗体含侵部材を、レジオネラ菌リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原の反応性を見るためには金コロイド標識レジオネラ菌リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗体含侵部材を使ってイムノクロマトキットを作製した。
【００７２】
２）試験
作製したイムノクロマトキットの評価には、レジオネラ菌ATCC33152株を培養して得た菌抗原液を使用して実施した。
すなわち、レジオネラ菌を、BCYE寒天培地で37℃、4日間培養した後、単一コロニーを3mlのBYE培地に添加し、攪拌しながら37℃で一晩培養した菌を、再び新しいBYE培地3mlに添加し、攪拌しながら37℃で培養した。この培養液を遠心分離して上清を除き、菌ペレットにOD600nmの濁度が1になるように1%TritonX-100／生理食塩水溶液を加え、室温で1晩溶菌したものを菌抗原原液とした。さらにこの菌抗原原液を生理食塩水で適宜希釈後、1.5倍希釈となるように0.5%の界面活性剤を含む添加液に加えたものを試験液として供した。
【００７３】
この試験液120ulを、１）で得られたイムノクロマトキットの試料添加用部材5にマイクロピペットで滴下してクロマト展開し、室温で15分放置後、上記捕捉部位6で捕捉された抗原と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉の有無を、赤紫色ラインが目視で確認できるかどうかで判定した。
【００７４】
表２は、イムノクロマトキットの検出部位に固定した2種類の抗体は、それぞれがある一定のレベル以上の濃度を固定されていないと、その抗体が補足する抗原と金コロイド標識抗体の複合体をとらえるのが難しくなることを示している。
これにより、検出部位に固定する2種類の抗体の濃度比は１：４から４：１の比率が望ましいことが証明された。
【００７５】
【表２】
0006770805.tif 000003
【００７６】
＜実施例４＞
レジオネラ・ニューモフィラ血清型１ ＬＰＳ抗原＋レジオネラ菌リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原同時検出系キットの実験−３：２種類の金コロイド標識抗体液の混合比を決定するための実験
レジオネラ・ニューモフィラ血清型１ ＬＰＳ抗原＋レジオネラ菌リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原同時検出系キットに組み込む金コロイド標識抗体含浸部材として、グラスファイバーパッドに含侵させる２種類の金コロイドの濃度比を変えて作製し、レジオネラ・ニューモフィラ血清型１ ＬＰＳ抗原又はレジオネラ菌リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原との反応性を確認した。
【００７７】
１）レジオネラ・ニューモフィラ血清型1 ＬＰＳ抗原＋レジオネラ菌リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原を同時検出するイムノクロマトキットの構成
レジオネラ・ニューモフィラ血清型1 ＬＰＳ抗原＋レジオネラ菌リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原を同時検出するイムノクロマトキットの構成方法を以下に示す。
【００７８】
（a）金コロイド標識抗体液の調整
（a-1）１種類の抗体が結合した金コロイドの作製
金コロイド溶液（粒径60nm）に1/10量の0.1M感作Bufferとレジオネラ菌リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗体を加えて混合し、室温で30分間静置して抗体を金コロイド粒子表面に結合させた後、金コロイド溶液における最終濃度が0.5%となるようにカゼインナトリウム5%水溶液を加えてブロッキングし、金コロイド標識抗リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗体溶液を調製した。
同様に金コロイド標識抗レジオネラ・ニューモフィラ血清型1 ＬＰＳ抗体溶液を調製した。
これにより、各金コロイド標識抗体液を得た。
【００７９】
（a-2）２種類の抗体が同時に結合した（抗体混合結合系）金コロイドの作製
金コロイド溶液（粒径60nm）に1/10量の0.1M感作Bufferと、レジオネラ菌リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗体及びレジオネラ・ニューモフィラ血清型1 ＬＰＳ抗体を加えて混合し、室温で30分間静置して2種類の抗体を金コロイド粒子表面に結合させた。この時、金コロイド溶液に混合するレジオネラ菌リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗体とレジオネラ・ニューモフィラ血清型1 ＬＰＳ抗体は、10ug/ml+190ug/ml, 20ug/ml+180ug/ml, 50ug/ml+150ug/ml, 100ug/ml+100ug/ml, 150ug/ml+50ug/ml, 180ug/ml+20ug/ml, 190ug/ml+10ug/mlで混合したものをそれぞれ使用した。その後、金コロイド溶液における最終濃度が0.5%となるようにカゼインナトリウム5%水溶液を加えてブロッキングし、抗体混合結合系の金コロイド標識抗体液を調製した。
【００８０】
（b）レジオネラ・ニューモフィラ血清型1 ＬＰＳ抗原＋レジオネラ菌リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原同時検出用イムノクロマトキットの作製
（b-1）レジオネラ菌リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原又はレジオネラ・ニューモフィラ血清型１ ＬＰＳ抗原と、各金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位、すなわち判定部
幅25mm、長さ300mmのニトロセルロース膜をクロマトグラフ媒体のクロマト展開用膜担体3として用意した。レジオネラ菌リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗体とレジオネラ・ニューモフィラ血清型１ ＬＰＳ抗体が、1.5mg/ml+1.0mg/mlで含有されてなる溶液を、このクロマト展開用膜担体3におけるクロマト展開開始点側の末端から10mmの位置に1μL/cmでライン状に塗布して、これを50℃で乾燥し、その後、0.5％カゼイン溶液に浸し、次いで0.2％スクロース溶液に浸し、一晩室温で乾燥させた。レジオネラ菌リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原又はレジオネラ・ニューモフィラ血清型１ ＬＰＳ抗原と、各金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位6とした。
【００８１】
（b-2）金コロイド標識抗体含浸部材
(a-1)の２種類の金コロイド標識抗体液を、OD450nmの値を指標にして、１９：１から１：１９の濃度比で混合したものを、10mm×300mmの帯状のグラスファイバーパットに2mLを含浸せしめ、これを乾燥させて金コロイド標識抗体含浸部材2とした。
【００８２】
(a-2)の抗体混合結合系の各金コロイド標識抗体液を、OD450nmの値を指標にしてそれぞれ同じ濃度に調製し、10mm×300mmの帯状のグラスファイバーパットに2mLを含浸せしめ、これを乾燥させて抗体混合結合系の各金コロイド標識抗体含浸部材2とした。
【００８３】
（b−3）イムノクロマトキットの作製
上記クロマト展開用膜担体3、上記金コロイド標識抗体含浸部材2の他に、試料添加用部材5として綿布と、吸収用部材4として濾紙を用意した。そして、これらの部材を基材１に貼り合せた後、5mm幅に切断し、図２と同様のイムノクロマトキットを作製した。
【００８４】
２）試験
作製したイムノクロマトキットの評価は、遺伝子組み換えによって作製したリコンビナントのレジオネラ菌リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原（リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原）と、レジオネラ菌ATCC33152株より抽出精製したＬＰＳ抗原（精製ＬＰＳ抗原）を使用して実施した。
すなわち、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原又は精製ＬＰＳ抗原を生理食塩水で希釈後、それぞれ1.5倍希釈となるように0.5%の界面活性剤を含む添加液に加えたものを各試験液として供した。
【００８５】
この試験液120ulを、１）で得られたイムノクロマトキットの試料添加用部材5にマイクロピペットで滴下してクロマト展開し、室温で15分放置後、上記捕捉部位6で捕捉された抗原と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉の有無を、赤紫色ラインが目視で確認できるかどうかで判定を行った。
【００８６】
表３は、金コロイド標識抗体液を（a-1）の方法で作製したイムノクロマトキットにおいて、混合した金コロイド標識抗体液の一方が一定の濃度以上含まれていないと、その金コロイド標識抗体が補足する抗原との複合体が少なく、検出部位のラインが目視で認識し難いことを示している。
また、混合した金コロイド標識抗体液の一方が一定の濃度を超えると、イムノクロマトキットの検出部位に捕捉される量が飽和し、さらには流れを妨げる原因になりうることも確認された。
これにより、2種類の金コロイド標識抗体液の混合比は１：９から９：１の比率が望ましいことが証明された。
【００８７】
【表３】
0006770805.tif 000004
【００８８】
さらに、（a-2）の抗体混合系作製方法による金コロイド標識抗体を使ったキットを同様に試験したところ、金コロイドに結合するレジオネラ菌リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗体とレジオネラ・ニューモフィラ血清型1 ＬＰＳ抗体の濃度が10ug/ml+190ug/ml又は190ug/ml+10ug/mlの時、前者はレジオネラ菌リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原との反応性が、また後者はレジオネラ・ニューモフィラ血清型１ ＬＰＳ抗原との反応性が著しく低くなり、本発明の効果が発揮できないことが判明した。加えて、抗体濃度がある一定以上濃くなるとそれ以上金コロイドに抗体が結合しなくなるため効率が悪い。
したがって、抗体混合系の金コロイド標識抗体液を作製する場合、結合する抗体の濃度比は１：９から９：１の範囲で有効である。
【００８９】
＜実施例５＞
レジオネラ・ニューモフィラ血清型１ ＬＰＳ抗原＋レジオネラ菌リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原同時検出系キットの実験−４：検体に添加する反応液
レジオネラ・ニューモフィラ血清型1 ＬＰＳ抗原＋レジオネラ菌リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原同時検出用イムノクロマトキットで、レジオネラ・ニューモフィラ血清型１ ＬＰＳ抗原とレジオネラ菌リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原を同時に検出する本発明において、２種類の抗原を同一の判定部上で効果的に、すなわちどちらの反応系もお互いを阻害することなく検出できることが必須であり、検体に添加する反応液は、同じ組成でお互いの抗原抗体反応を最大限発揮できる組成であることが、極めて重要である。
さらには、患者検体に存在する各抗原を検出できることが求められるため、患者検体のpHや共存物質の影響を考え、反応液のpHやその他の添加物質について、最適な条件を確認した。
【００９０】
本発明の検出系で２種類の抗原が検出できる反応液のpH範囲を調べたところ、表４に示したように、pH5.5未満又はpH8.5を超える場合は極度に検出性能が下がることが証明された。これにより、反応液はpH5.5からpH8.5の範囲内に入っていることが望ましい。
【００９１】
【表４】
0006770805.tif 000005
【００９２】
さらに、患者検体中には様々な共存物質が存在し、それらがイムノクロマト検出系において、試験液の流れや反応性に影響を及ぼしうる。そこで共存物質の影響を低減させるために、イムノクロマトの展開速度を一定に保ち、かつ、偽陽性や反応阻害が起こらないような添加物質を調査したところ、表５に示す通り、反応液中にある種のたんぱく質又は糖類のどちらか一方が添加され、かつ非イオン性界面活性剤が含まれているときに、最も良好な結果が得られた。
【００９３】
【表５】
0006770805.tif 000006
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明は、レジオネラ菌等による細菌感染症の診断において利用することができる。
【図１】
0006770805.tif 000007
【図２】
0006770805.tif 000008