(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物におけるアシネトバクター・バウマニ株によって引き起こされた感染の予防処置に適したワクチン組成物であって、
ａ．内因性ＬＰＳをコードする１つ又は種々の細胞核酸分子の部分的な又は完全な不活性化を特徴とするリポ多糖（ＬＰＳ）生合成遺伝子を欠損するアシネトバクター・バウマニ株及び／又は、
ｂ．上記のａ）項に記載のリポ多糖（ＬＰＳ）を欠損するアシネトバクター・バウマニ株由来の外膜小胞（ＯＭＶ）、
を含む、ワクチン組成物であって、
前記リポ多糖（ＬＰＳ）を欠損するアシネトバクター・バウマニ株がｌｐｘＡ、ｌｐｘＢ、ｌｐｘＣ、ｌｐｘＤ、ｌｐｘＫ、ｌｐｘＬ及びｌｐｘＭからなる群より選択される遺伝子の部分的な又は完全な不活性化を特徴とする、ワクチン組成物。
【請求項２】
前記リポ多糖（ＬＰＳ）を欠損するアシネトバクター・バウマニ株がｌｐｘＡ、ｌｐｘＢ及びｌｐｘＣからなる群より選択される遺伝子の部分的な又は完全な不活性化を特徴とする、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
前記ワクチンが、
ａ．配列番号２７のアミノ酸配列を有するポリペプチド（推定鉄シデロホア受容体（Ａ．バウマニ  ＡＴＣＣ  １７９７８；アクセッション番号ＹＰ＿００１０８４６８４））若しくはその生物学的に活性なフラグメント（フラグメントは、配列番号１〜配列番号１１からなる群又はそのいずれかの組合せから選択されるか、若しくは配列番号１〜配列番号１１の配列のいずれかと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドである）及び／又は、
ｂ．配列番号２８のアミノ酸配列を有するポリペプチド（推定ヒドロキサム酸型鉄シデロホア受容体（Ａ．バウマニ  ＡＴＣＣ  １７９７８；アクセッション番号ＹＰ＿００１０８４６９６））若しくはその生物学的に活性なフラグメント（フラグメントは、配列番号１２〜配列番号２３からなる群又はそのいずれかの組合せから選択されるか、若しくは該アミノ酸の配列番号１２〜配列番号２３と少なくとも８５％の同一性を有する配列を有するポリペプチドである）、
からなる群より選択される組換えポリペプチドを更に含む、請求項１又は２に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
Ａ．バウマニの精製外膜タンパク質を更に含み、該精製外膜タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９からなる群又はそのいずれかの組合せから選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
配列番号２４若しくは配列番号２５の組換え融合ポリペプチド又は配列番号２６の核酸分子によりコードされる前記組換え融合ポリペプチドを更に含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
リポ多糖（ＬＰＳ）を欠損するアシネトバクター・バウマニ株を含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載のワクチン組成物であって、前記アシネトバクター・バウマニ株が請求項３〜５のいずれか一項に記載のアミノ酸配列のいずれかをコードすることが可能な核酸分子を含み、又は該ヌクレオチド配列により形質転換され、形質導入され、若しくはトランスフェクトされ、それにより該菌株が該アミノ酸配列の外因性の発現を生じることが可能となっている、請求項１〜５のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
前記リポ多糖（ＬＰＳ）を欠損するアシネトバクター・バウマニ株を不活性化させる、請求項１〜６のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
前記リポ多糖（ＬＰＳ）を欠損するアシネトバクター・バウマニ株がＡＴＣＣ株  １９６０６由来である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
哺乳動物、好ましくはヒトにおけるＡ．バウマニによって引き起こされた感染の予防処置のために用いられる、請求項１〜８のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
請求項１又は２に記載のリポ多糖（ＬＰＳ）を欠損するアシネトバクター・バウマニ株を含有する医薬。
【請求項１１】
リポ多糖（ＬＰＳ）を欠損するアシネトバクター・バウマニ株及び／又は該菌株由来の外膜小胞（ＯＭＶ）の、該菌株及び／又はＯＭＶに結合することが可能な抗体又はそのフラグメントを作製するための使用（ただし、ヒトを用いて抗体又はそのフラグメントを作製するための使用を除く）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して、薬理学及び免疫学の分野、特に哺乳動物におけるアシネトバクター・バウマニ（Acinetobacter baumannii）株によって引き起こされた感染の予防処置に好適なワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
多剤耐性のＡ．バウマニによって引き起こされた感染の臨床上の重要性が増していく中で、この病原菌によって引き起こされた感染の予防及び治療のための新規のアプローチを開発することは当然必要なこととなっている。これに関し、或る特定の患者集団への予防接種が、この病原菌によって引き起こされる罹病率及び死亡率の減少に寄与することができた。不活性化させた細菌全細胞をベースとしたグラム陰性菌ワクチンは免疫原性が高く、多くの細菌種に対して防御免疫を生じることが示されている。しかし、これらのワクチンにリポ多糖が含まれることによる高濃度のエンドトキシンがヒトにおけるワクチン使用を困難にさせている。
【０００３】
アシネトバクター・バウマニは、病院環境において臨床的に問題となるグラム陰性球杆菌である。この微生物は、土壌及び水源環境にかなり分布し（非特許文献１）、院内病原菌として様々な種類の感染、例えばとりわけ肺炎、菌血症、髄膜炎並びに皮膚組織及び軟組織の感染を引き起こす恐れがある（非特許文献２）。この病原菌は通例、人工呼吸器を挿管している患者及び火傷の傷害を被った患者に感染する（非特許文献３）。しかし、市中肺炎の場合（非特許文献４、非特許文献５）、並びにベトナム、イラク、クウェート及びアフガニスタンの戦争関連の外傷を受けた軍人の場合にも隔離される（非特許文献６、非特許文献７）。Ａ．バウマニによる感染に関連した大まかな死亡率は、院内感染では３５％〜７０％である（非特許文献８）。Ａ．バウマニの抗生物質に対する耐性を獲得する能力により、多剤耐性株の数はここ数年劇的に増加している（非特許文献９、非特許文献１０）。これらの耐性の高い菌株の出現が、Ａ．バウマニによって引き起こされた感染の臨床的管理を複雑にしている。これに関し、Ａ．バウマニに対するワクチンの開発は、この病原菌によって引き起こされる罹病率及び死亡率を減少させる可能性がある（非特許文献１１）。
【０００４】
Ａ．バウマニについて記載されている実験的なワクチンは、単一の精製抗原からなるワクチンと多重成分ワクチンとの大きく２つのグループに分類することができる。最初のグループのうち、外膜タンパク質ＯｍｐＡ（非特許文献１２）、バイオフィルム関連タンパク質Ｂａｐ（非特許文献１３）、膜輸送体Ａｔａ（非特許文献１４）及び表面多糖類のポリ−Ｎ−アセチル−β−（１−６）グルコサミン（非特許文献１５）は、それらの特異的免疫応答を誘起する能力により良好な候補物質として記載されている。しかし、能動免疫が付与された後の生存率を試験する実験では、ＯｍｐＡが部分的な防御をもたらし、またＢａｐの発現はバイオフィルムを形成しない菌株では明確に示されなかったことを例証するに過ぎなかった。多重成分ワクチンを使用するアプローチには、外膜複合体（非特許文献１６）、外膜小胞（outer membrane vesicles；非特許文献１７）及び不活性型全細胞（非特許文献１８）がある。ＡＴＣＣ  １９６０６株及び臨床分離株を用いたマウスモデルにおいて、これらのワクチンはそれぞれ強い免疫応答を誘導し、感染に対して高度の防御を誘起することができる。しかし、これらの期待のできる結果にも関わらず、ヒトにおけるこれらのワクチンの使用は、これらの製剤にリポ多糖（ＬＰＳ）が多く含まれることによる、これらのワクチン中のエンドトキシン濃度の高さを考慮すると困難となる。
【０００５】
ＬＰＳは、Ｏ抗原、コア多糖及びＬＰＳのエンドトキシン活性に関与する脂質Ａにより形成される。大腸菌を使用した最初の研究では、ＬＰＳの産生が細菌の生存能力に不可欠であることが例証された（非特許文献１９）。しかし、続く研究において、或る特定の細菌種、例えばナイセリア・メニンギティディス（Neisseria meningitidis：髄膜炎菌）及びモラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）は、ＬＰＳ生合成に関与する酵素をコードする遺伝子が突然変異した後でも生存可能であり、完全にＬＰＳを欠失する菌株が得られた（非特許文献２０、非特許文献２１）。最近の研究では、Ａ．バウマニがＬＰＳ生合成に関与する遺伝子ｌｐｘＡ、ｌｐｘＣ及びｌｐｘＤの突然変異により、抗生物質であるコリスチンに対する耐性を獲得し（非特許文献２２）、ＬＰＳを完全に欠損する菌株を生じ得ることが例証された。この結果は、Ａ．バウマニがＬＰＳの非存在下においても生存可能であり、これらの菌株をベースとしたワクチンの開発の実現性が高いことを示した。
【０００６】
外膜小胞（ＯＭＶ）は、多数のグラム陰性菌から分泌される、細菌外膜由来の小胞である（非特許文献２３）。ＯＭＶは、およそ２０ｎｍ〜２００ｎｍの球状の小胞であり、外膜タンパク質、ペリプラズムタンパク質及びＬＰＳから構成される（非特許文献２４、非特許文献２５）。分泌されたＯＭＶは、クオラムセンシングの検出、病原性因子の輸送及び遺伝子の移送に関与し、細菌の発症機序の役割を果たすことが示されている。また、ＯＭＶは、脂質ラフトとの融合を介して宿主細胞の内部にタンパク質を送達することができることが例証され、ＯＭＶを使用して細菌産物を長い距離にわたり輸送することができることが示唆された（非特許文献２６）。Kwonらによる最近の研究では、Ａ．バウマニの臨床分離株がｉｎ  ｖｉｔｒｏで成長中にＯＭＶを分泌することが例証された（非特許文献２７）。ＯＭＶのプロテオーム解析では、ＯＭＶが多数の病原性因子及び免疫調節タンパク質を含有することが例証され、Ａ．バウマニの発症機序の重要な役割を果たすことが示唆された。
【０００７】
ＯＭＶをベースとしたワクチンは、ナイセリア・メニンギティディス、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）及びビブリオ・コレラ（Vibrio cholerae：コレラ菌）を含む種々のグラム陰性菌に対して開発されている（非特許文献２８、非特許文献２９、非特許文献３０）。ＯＭＶによる免疫付与は、感染の動物モデルにおいて、多数の細菌抗原に対する抗体及び防御免疫をもたらす能力を誘導することが示されている。さらに、Ｎ．メニンギティディス血清群Ｂから単離されたＯＭＶは、ヒトにおいて安全であり、免疫原性を示し、ニュージーランドの髄膜炎菌性髄膜炎の流行の制御に使用された（非特許文献３１）。
【０００８】
Ａ．バウマニによって引き起こされた感染は多くの場合、単一のクローンによって引き起こされた流行から起きる。このため、ＯＭＶをベースとしたワクチンは、原因となるクローンからＯＭＶが単離された場合に更に効果的である。細菌培養液からのＯＭＶの精製は迅速かつ簡易であり、培養上清の濾過及びＯＭＶの濃縮を必要とするに過ぎない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Baumann, P. 1968. J. Bacteriol. 96, 39-42
【非特許文献２】Garcia-Quintanilla et al., 2013. Curr. Pharm. Biotechnol.印刷中
【非特許文献３】Munoz-Price y Weinstein. 2008. N. Engl. J. Med. 358, 1271-1281
【非特許文献４】Ho et al., 2009. Chest. 136, 1119-1127
【非特許文献５】Ong et al., 2009. Respirology 14, 1200-1205
【非特許文献６】Jones et al., 2006. Lancet Infect. Dis. 6, 317-318
【非特許文献７】Tong, 1972. JAMA 219, 1044-1047
【非特許文献８】Vila y Pachon, 2008. Expert Opin. Pharmacother. 9, 587-599
【非特許文献９】Tasbakan et al., 2009. Mikrobiyol Bul. 43, 61-70
【非特許文献１０】Valencia et al., 2009. Infect. Control Hosp. Epidemiol. 30: 257-263
【非特許文献１１】Pachon y McConnell, 2014. Vaccine,印刷中
【非特許文献１２】Luo et al., 2012. PLoS One 7, e29446
【非特許文献１３】Fattahian et al., 2011. Microb. Pathog. 51, 402-406
【非特許文献１４】Bentancor et al., 2012. Infect. Immun. 80, 3381-3388
【非特許文献１５】Bentancor et al., 2012. Infect Immun 80, 651-656
【非特許文献１６】McConnell et al., 2011. Infect. Immun. 79, 518-526
【非特許文献１７】McConnell et al., 2011. Vaccine 29, 5705-5710
【非特許文献１８】McConnell y Pachon, 2010. Vaccine 29: 1-5
【非特許文献１９】Raetz, 1990. Annu. Rev Biochem. 59, 129-170
【非特許文献２０】Peng et al., 2005. Infect. Immun. 73, 7569-7577
【非特許文献２１】Steeghs et al., 1999. Infect. Immun. 67, 4988-4993
【非特許文献２２】Moffatt et al., 2010. Antimicrob. Agents Chemother. 54, 4971-4977
【非特許文献２３】Kulp et al., 2010. Annu. Rev. Microbiol. 64, 163-184
【非特許文献２４】Kuehn et al., 2005. Genes Dev. 19, 2645-2655
【非特許文献２５】Mashburn et al., 2005. Nature. 437, 422-425
【非特許文献２６】Kesty et al., 2004. Embo J. 23, 4538-4549
【非特許文献２７】Kwon et al., 2009. FEMS Microbiol. Lett. 297, 150-156
【非特許文献２８】Bjune et al., 1991. NIPH Ann. 14, 125-130
【非特許文献２９】Keenan et al., 2003. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 36, 199-205
【非特許文献３０】Bishop et al., 2012. J. Infect. Dis. 205, 412-21
【非特許文献３１】Nokleby et al., 2007. Vaccine. 25, 3080-84
【発明の概要】
【００１０】
態様Ａ：本発明のこの態様は、哺乳動物におけるアシネトバクター・バウマニ株によって引き起こされた感染の予防処置（感染前）に好適な医薬組成物、好ましくはワクチン組成物であって、
ａ．内因性ＬＰＳをコードする１つ又は種々の細胞核酸分子の部分的又は完全な不活性化を特徴とする、リポ多糖（ＬＰＳ）を欠損するアシネトバクター・バウマニ株全細胞及び／又は、
ｂ．上記ａ）項に記載のリポ多糖（ＬＰＳ）を欠損するアシネトバクター・バウマニ株由来の外膜小胞（ＯＭＶ）、
を含む、組成物を指す。
【００１１】
本発明のこの態様の好ましい実施の形態において、リポ多糖（ＬＰＳ）を欠損するアシネトバクター・バウマニ株はｌｐｘＡ、ｌｐｘＢ及び／又はｌｐｘＣからなる群より選択される遺伝子の部分的な又は完全な不活性化を特徴とする。
【００１２】
本発明のこの態様の、又はその好ましい実施の形態のいずれかの別の好ましい実施の形態において、医薬組成物、好ましくはワクチン組成物は、以下からなる群より選択される、好ましくは組換え体である、ポリペプチドを更に含む。
ａ．配列番号２７のアミノ酸配列（推定鉄シデロホア受容体（Ａ．バウマニ  ＡＴＣＣ  １７９７８；アクセッション番号ＹＰ＿００１０８４６８４））若しくはそのフラグメント（フラグメントという用語は本明細書において、配列番号１〜配列番号１１からなる群より選択される生物学的に活性なフラグメント若しくはそれらのいずれかの組合せとして理解される）若しくは配列番号１〜配列番号１１のいずれかと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列及び／又は、
ｂ．配列番号２８のアミノ酸配列（推定ヒドロキサム酸型鉄シデロホア受容体（Ａ．バウマニ  ＡＴＣＣ  １７９７８；アクセッション番号ＹＰ＿００１０８４６９６））若しくはそのフラグメント（フラグメントという用語は本明細書において、配列番号１２〜配列番号２３からなる群より選択される生物学的に活性なフラグメント若しくはそれらのいずれかの組合せとして理解される）若しくは配列番号１２〜配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有する配列。
【００１３】
本発明のこの態様の、又はその好ましい実施の形態のいずれかの別の好ましい実施の形態において、医薬組成物、好ましくはワクチン組成物が、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９からなる群又はそれらのいずれかの組合せから選択される、Ａ．バウマニの精製外膜タンパク質配列を更に含む。
【００１４】
本発明のこの態様の、又はその好ましい実施の形態のいずれかの更に別の好ましい実施の形態において、医薬組成物、好ましくはワクチン組成物が、配列番号２４及び／又は配列番号２５の組換え融合ポリペプチド配列及び／又は配列番号２６のヌクレオチド配列をコードするアミノ酸配列を更に含む。
【００１５】
本発明のこの態様の、又はその好ましい実施の形態のいずれかの更に別の好ましい実施の形態において、リポ多糖（ＬＰＳ）を欠損するアシネトバクター・バウマニ株が上述の項のいずれか一項に記載のアミノ酸配列のいずれかをコードすることが可能なヌクレオチド配列を含み、又は該ヌクレオチド配列により形質転換され、形質導入され、若しくはトランスフェクトされ、それにより該菌株が該アミノ酸配列のいずれかの外因性の発現を生じることが可能となる。
【００１６】
本発明のこの態様の、又はその好ましい実施の形態のいずれかの更に別の好ましい実施の形態において、上述の項のいずれか一項に記載のアミノ酸配列のいずれかをコードすることが可能であり、該アミノ酸配列を発現することが可能なヌクレオチド配列を含む、ウイルスベクター等のベクター、プラスミド又は発現カセットを更に含む。
【００１７】
本発明のこの態様の、又はその好ましい実施の形態のいずれかの更に別の好ましい実施の形態において、リポ多糖（ＬＰＳ）を欠損するアシネトバクター・バウマニ株を不活性化させる。好ましくは、上記菌株又は細胞がＡＴＣＣ株  １９６０６由来である。
【００１８】
態様Ｂ：本発明のこの態様は、哺乳動物、好ましくはヒトにおけるＡ．バウマニによって引き起こされた感染の予防処置に使用するため又は能動免疫の付与のための本発明の態様Ａ又はその好ましい実施の形態のいずれかの医薬組成物、好ましくはワクチン組成物を指す。
【００１９】
態様Ｃ：本発明のこの態様は、好ましくは、リポ多糖（ＬＰＳ）を欠損するアシネトバクター・バウマニ株及び／又はアシネトバクター・バウマニ株由来の外膜小胞（ＯＭＶ）に親和性又は結合親和性を有する、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｖｈｈ、ナノボディ（nanobody）及びジアボディ（diabody）からなる群より選択される、抗体（モノクローナル又はポリクローナル）又はそのフラグメントを含むワクチン組成物を指す。好ましい実施の形態において、上記の抗体又はそのフラグメントはリポ多糖（ＬＰＳ）を欠損するアシネトバクター・バウマニ株及び／又はアシネトバクター・バウマニ株由来の外膜小胞（ＯＭＶ）に特異的に結合する。
【００２０】
「親和性」又は「結合親和性」のＫＤは多くの場合、平衡会合定数（ｋａ）及び平衡解離定数（ｋｄ）を測定し、ｋａに対するｋｄの商を算出することにより決定される（ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）。
【００２１】
「特異的に結合する」という用語は、１０−６Ｍ以下の親和性のＫＤ（一価型親和性）で、抗体がＬＰＳ欠損株又はＬＰＳ欠損株由来のＯＭＶに結合することを意味する。抗体は、他の関連のない分子に比べ標的抗原に対する親和性がかなり大きくなり得る。抗体はまたホモログに比べ、標的抗原に対する親和性がかなり大きく、例えば標的抗原に対する相対的な親和性は少なくとも１．５倍、２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍、１０６倍大きい。このような親和性は、従来の技法を用いて、例えば平衡透析により、放射性標識した標的抗原を用いた放射性免疫アッセイにより、又は当業者に既知の別の方法により容易に決定することができる。親和性データを例えば［Kaufman RJ, Sharp PA. （1982） Amplification and expression of sequences cotransfected with a modular dihydrofolate reductase complementary dna gene. J Mol Biol.159:601-621］に記載の方法により分析することができる。
【００２２】
「抗体」という用語は、最も広い意味で用いられ、完全に一体化された（assembled）抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗原に結合することができる抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ’（ａｂ）２、Ｆｖ、一本鎖抗体、ジアボディ）、ラクダ抗体（camelbodies）及び所望の生物学的活性を示す上記を含む組換えペプチドを含む。
【００２３】
本明細書における抗体／免疫グロブリンの「機能的フラグメント」又は「抗原結合抗体フラグメント」は抗原結合領域を保持する抗体／免疫グロブリンのフラグメント（例えば、ＩｇＧの可変領域）として定義される。抗体の「抗原結合領域」は通例、抗体の１つ又は複数の超可変領域（複数の場合もある）、すなわちＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２及び／又はＣＤＲ−３領域に見つかるが、可変「フレームワーク」領域も例えばＣＤＲにおける足場を提供することにより抗原結合の重要な役割を果たすことができる。
【００２４】
「超可変」領域という用語は、抗原結合に関与する、抗体又は機能的フラグメントの可変ドメインＶＨ及びＶＬのアミノ酸残基を指す。
【００２５】
抗体フラグメントの非限定的な例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体フラグメント、ジアボディ、トリアボディ（triabodies）、テトラボディ（tetrabodies）、ミニボディ（minibodies）、直鎖抗体［Johnson G , Wu TT. （2000） Kabat database and its applications: 30 years after the first variability plot. Nucleic Acids Res. 28:214-218］、キレート化組換え抗体、トリボディ（tribodies）若しくはバイボディ（bibodies）、イントラボディ（intrabodies）、ナノボディ、小モジュール型免疫製剤（ＳＭＩＰ）、抗原結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ化抗体、ＶＨＨ含有抗体、又はその突然変異タンパク質若しくは誘導体、及び所望の生物学的活性を保持する、特異的抗原と結合するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部、例えばＣＤＲ配列を含有するポリペプチド並びに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体［Chothia C, Lesk AM. （1987） Canonical structures for the hypervariable reions of immunoglobulins. J Mol Biol. 196:901-917; Zapata G, Ridgway JB, Mordenti J, Osaka G, Wong WL, Bennett GL, Carter P. （1995） Engineering linear F（ab'）2 fragments for efficient production in Escherichia coli and enhanced antiproliferative activity. Protein Eng. 8:1057-1062］が挙げられる。
【００２６】
本発明の態様Ｃの好ましい実施の形態において、医薬組成物又はワクチン組成物は、哺乳動物に本発明の第１の態様に記載のワクチン組成物を免疫付与した後に得られ、又は得ることが可能である。
【００２７】
態様Ｄ：本発明のこの態様は、哺乳動物、好ましくはヒトにおけるＡ．バウマニによって引き起こされた感染の治療的処置（感染後）において又は受動免疫の付与において使用される、本発明の態様Ｃに記載のワクチン組成物を指す。
【００２８】
態様Ｅ：本発明のこの態様は、本発明の態様Ａに記載のアミノ酸配列のいずれかをコードすることが可能なヌクレオチド配列により形質転換され、形質導入され、又はトランスフェクトされ、それにより上記アミノ酸配列のいずれかの外因性の発現を生じることができる、リポ多糖（ＬＰＳ）を欠損するアシネトバクター・バウマニ株を指す。好ましくは、上記Ａ．バウマニの欠損株は医薬として使用される。
【００２９】
態様Ｆ：本発明のこの態様は、好ましくはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｖｈｈ、ナノボディ及びジアボディからなる群より選択される抗体又はそのフラグメントを作製する方法であって、
ａ．好ましくは抗体ライブラリから抗体又はそのフラグメントを選択することと、
ｂ．リポ多糖（ＬＰＳ）を欠損するアシネトバクター・バウマニ株及び／又は該菌株由来の外膜小胞（ＯＭＶ）を抗原性標的として使用することと、
ｃ．親和性若しくは結合親和性を有し、又は該菌株及び／又はＯＭＶに特異的に結合することが可能であるこれらの抗体又はそれらのフラグメントを選択することと、
ｄ．上記の工程ｃ）において同定されたこれらの抗体又はそれらのフラグメントを作製することと、
を含む、方法を指す。
【００３０】
なお、Ａ．バウマニの血清型特異的なばらつきは、ＬＰＳ構成要素のエピトープの多様性による。上記の態様Ｆに詳述されている方法に従いＬＰＳ構成要素を除去することで、細菌表面のあまり変異しないエピトープに対する抗体に成長する抗体に注目した。Ａ．バウマニ株又はＡ．バウマニ分類において使用される全てのＡ．バウマニ国際流行クローンに属する個々の分離株の中で、このようなエピトープが保存される。したがってこの方法は、宿主感染に関与する菌株（複数の場合もある）由来とは独立したＡ．バウマニ感染に対する万能な治療のためのツールを提供する。
【００３１】
態様Ｇ：本発明のこの態様は、本発明の態様Ｆの方法により作製され、得られ又は得ることが可能な抗体又はそのフラグメントを指す。
【００３２】
態様Ｈ：本発明のこの態様は、アシネトバクター・バウマニ株及び／又はＯＭＶに親和性若しくは結合親和性を有し、又は特異的に結合することが可能な抗体又はそのフラグメントの作製に、リポ多糖（ＬＰＳ）を欠損するアシネトバクター・バウマニ株及び／又は該アシネトバクター・バウマニ由来の外膜小胞（ＯＭＶ）を使用することを指す。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ＩＢ０１０の安定性及びエンドトキシン含量を示す図である。（Ａ）ＡＴＣＣ  １９６０６及びＩＢ０１０の３つの独立した培養液からゲノムＤＮＡを抽出し、ｌｐｘＤ遺伝子に特異的なプライマーを用いて増幅した。およそ１０００Ｋｂに対応するバンドは、無傷のｌｐｘＤ遺伝子に対応し、この場合速く移動するバンドは４６２ヌクレオチドが欠失したｌｐｘＤ遺伝子に対応する。（Ｂ）ＡＴＣＣ  １９６０６及びＩＢ０１０のエンドトキシン濃度をカブトガニ血球抽出アッセイ（Limulus Amebocyte Assay）により決定した。縦棒は３つの独立した培養液の中央値を表し、エラーバーは平均値の標準誤差を表す。ＥＵ；エンドトキシン単位。
【図２】ＩＢ０１０の免疫付与に対する抗体応答を示すグラフである。血清サンプルは、ＡＴＣＣ  １９６０６をワクチン投与したマウス、ＩＢ０１０をワクチン投与したマウス及び対照マウスからワクチン投与前（０日目）並びに第１の免疫付与後７日目及び２１日目に採取され、総ＩｇＧ（Ａ）及びＩｇＭ（Ｂ）に特異的な抗原濃度をＥＬＩＳＡによって測定した（ｎ＝８マウス／群）。ＩｇＧ１（Ｃ）及びＩｇＧ２ｃ（Ｄ）の濃度を２１日目に測定し、ＡＴＣＣ  １９６０６をワクチン投与したマウス、ＩＢ０１０をワクチン投与したマウス及び対照マウスの血清をＥＬＩＳＡによって測定した。全てのパネルにおいて、箱髭プロットはそれぞれの四分位範囲を表し、横線は中央値を表す。＊は同じ時点の対照マウスの濃度と比較ｐ＜０．０５、＃は同じ実験群の７日目のサンプルと比較ｐ＜０．０５。†はＡＴＣＣ  １９６０６をワクチン投与したマウスの２１日目のサンプルと比較ｐ＜０．０５。
【図３】組織の細菌量に対するワクチン投与の効果を示すグラフである。免疫付与したマウス及び対照マウスを２．０×１０６ｃｆｕ（３００×ＬＤ５０）のＡＴＣＣ  １９６０６株に感染させ、脾臓細菌量を感染の１２時間後に決定した（ｎ＝８マウス／群）。データ点は個々のマウスの細菌量を表し、横線は各群のマウスの中央値を表す。＊は対照マウスと比較ｐ＜０．０５。
【図４】感染後の炎症性サイトカイン濃度に対するワクチン投与の効果を示すグラフである。免疫付与したマウス及び対照マウスを２．０×１０６ｃｆｕ（３００×ＬＤ５０）のＡＴＣＣ  １９６０６株に感染させ、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α及びＩＬ−６の血清濃度を決定した（ｎ＝８マウス／群）。データ点は個々のマウスのサイトカイン濃度を表し、横線は各群のマウスの中央値を表す。＊は対照マウスと比較ｐ＜０．０５、＃はＡＴＣＣ  １９６０６をワクチン投与したマウスと比較ｐ＜０．０５。
【図５】播種性Ａ．バウマニ感染のマウスモデルの生存率に対するワクチン投与の効果を示すグラフである。ワクチン投与したマウス及び対照マウスを２．２５×１０６ｃｆｕ（３４０．９×ＬＤ５０）のＡＴＣＣ  １９６０６株（Ａ）又は１．０５×１０６ｃｆｕ（２．１８×ＬＤ５０）のＡ．バウマニ臨床単離株Ａｂ−１５４（Ｂ）に感染させ、生存率をその後７日間にわたりモニタリングした（ｎ＝８マウス／群）。＊は対照マウスと比較ｐ＜０．０５。
【図６】ＬＰＳを含まないＡ．バウマニのＯＭＶのタンパク質プロファイルを示す図である。２４時間、４８時間及び７２時間の培養後のＯＭＶ作製におけるＡＴＣＣ  １９６０６株及びＩＢ０１０株。ＯＭＶを精製後、タンパク質の量を、ブラッドフォード法を用いて定量化し、１０ｍｃｇのタンパク質をクマシー染色した１０％ポリアクリルアミドゲルにおいて視覚化した。
【図７】ＯＭＶのタンパク質プロファイルにおける鉄キレート剤の２，２−ビピリジルの作用を示す図である。ＡＴＣＣ  １９６０６株及びＩＢ０１０株を使用して、２４時間の培養後のＯＭＶのタンパク質プロファイルに対する２，２−ビピリジル（ＢＩＰ）の作用を分析した。ＡＴＣＣ  １９６０６株の場合、２００ｍｃＭの濃度を使用する一方で、ＩＢ０１０の場合、１００ｍｃＭ及び１５０ｍｃＭを使用した。ＯＭＶを精製後、タンパク質の量を、ブラッドフォード法を用いて定量化し、１０ｍｃｇのタンパク質をクマシー染色した１０％ポリアクリルアミドゲルにおいて視覚化した。
【図８】ＯＭＶの作製に対する鉄キレート剤の２，２−ビピリジルの作用を示す図である。ＡＴＣＣ  １９６０６株及びＩＢ０１０株を使用して、２４時間の培養後のＯＭＶの作製に対する２，２−ビピリジル（ＢＩＰ）の作用を分析した。図において、ＢＩＰで処理した後のＯＭＶの総タンパク質含量を示し、ブラッドフォード法を用いて濃度を測定した。
【図９】ＯＭＶを視覚化した図である。ＡＴＣＣ  １９６０６から精製したＯＭＶを１．６％のグルタルアルデヒドを用いて固定し、四酸化オスミウム及び鉛及びウランで染色し、電子顕微鏡法により視覚化した。
【図１０】精製ＯＭＶを視覚化した図である。ＩＢ０１０から精製したＯＭＶを１．６％のグルタルアルデヒドを用いて固定し、四酸化オスミウム及び鉛及びウランで染色し、電子顕微鏡法により視覚化した。
【図１１】ＬＰＳを含まないＯＭＶのタンパク質プロファイルを示す図である。ＩＢ０１０株及び１６７Ｒ株を使用してＯＭＶを作製し、各サンプルのタンパク質の量を定量化した。１０ｍｃｇのタンパク質をクマシー染色した１０％ポリアクリルアミドゲルにおいて視覚化した。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明は、感染病原菌によって引き起こされた感染に対して防御することができる、アシネトバクター・バウマニ（Ａ．バウマニ）のＬＰＳを欠損する全細胞及び／又は外膜小胞からなる組成物及びワクチンを指す。
【００３５】
本発明の著者らは、接種時にＡ．バウマニ由来のＬＰＳを欠損するＡ．バウマニ及び／又は外膜小胞の不活性化細胞を免疫付与し、これにより後のこの細菌感染に対しての防御がもたらされることを例証し、Ａ．バウマニによって引き起こされた感染に対する予防ワクチンとしてこれらの細胞又は菌株の利用性を例証する。
【００３６】
本発明の第１の態様は、ＬＰＳを欠損するアシネトバクター細胞又は菌株（以後、本発明の細胞又は菌株）を指す。
【００３７】
アシネトバクター種は、オキシダーゼ陰性であり、顕微鏡下において対になって現れる、絶対好気性の非発酵及び非運動性細菌である。アシネトバクター株は、自然界に広く分布しており、土壌に重要なものであり、土壌の無機化に寄与している。
【００３８】
本発明における「不活性化細胞」は、複製能はないが、免疫原性能を保存する細胞であると理解される。本発明の細胞は、接種する前に不活性化され、宿主内での複製を防止するため、投与により生じる干渉を防止する。本発明の細胞の不活性化は、現行の技術水準において既知の多様な方法、例えば吸着、加熱、紫外線光、イオン化放射、超音波、フェノール、ホルモール、ホルムアルデヒド、クリスタルバイオレット、グリセルアルデヒド、エチレンオキシド、プロピオラクトン、エチレンアミン、ブロモエチレンアミン又はホルマリンを用いるがこれらに限定されずに行うことができる。好ましい実施形態において、本発明の細胞を、ホルマリンを用いて不活性化する。別の好ましい実施形態において、本発明の細胞は、アシネトバクター・バウマニ種由来であり、ホルマリンを用いて不活性化される。
【００３９】
本発明のこの態様の好ましい実施形態において、ＬＰＳ欠損は、ＬＰＳサブユニットに対する内因性遺伝子、特にＬＰＳのｌｐｘＡ、ｌｐｘＢ及び／又はｌｐｘＣをコードする核酸の１つ又は種々の細胞分子の部分的又は完全な不活性化により実現することができる。
【００４０】
本発明の別の好ましい実施形態において、ＬＰＳを欠損するアシネトバクターの細胞又は菌株は、ＬＰＳの生合成に関与する遺伝子をコードする核酸配列における１つ若しくは種々のヌクレオチドの欠失、及び／又はＬＰＳ発現を制御する配列における１つ若しくは種々のヌクレオチドの挿入により得られる。欠失及び／又は挿入は、相同組換えによる作製、トランスポゾンの挿入又は現行の技術水準において既知の他の適切な方法であってよい。
【００４１】
本発明の好ましい実施形態において、配列を、例えば遺伝子ｌｐｘＡ、ｌｐｘＢ、ｌｐｘＣ、ｌｐｘＤ、ｌｐｘＫ、ｌｐｘＬ及び／又はｌｐｘＭ若しくはこれらの組合せのいずれかを含有する自殺ベクターの構築により又は選別用のマーカー遺伝子を用いて干渉し、ベクターを用いて標的細胞を形質変換し、ＬＰＳ発現に陰性となる陽性細胞をスクリーニングすることにより不活性化する。
【００４２】
本発明の別の好ましい実施形態において、本発明の細胞又は菌株は、好ましくはＡ．バウマニ細胞であり、特に弱毒化させたＡ．バウマニ細胞又は他のアシネトバクター；アシネトバクター・バイリイ（Acinetobacter baylyi）、アシネトバクター・ベイジェリンキイ（A. beijerinckii）、アシネトバクター・ブレジニエ（A. bereziniae）、アシネトバクター・ボイシエリ（A. boissieri）、アシネトバクター・ボーヴェティイ（A. bouvetii）、アシネトバクター・ブリソウイイ（A. brisouii）、アシネトバクター・カルコアセティカス（A. calcoaceticus）、アシネトバクター・ゲルネリ（A.gerneri）、アシネトバクター・ギロイア（A. guillouiae）、アシネトバクター・グリモンティイ（A. grimontii）、アシネトバクター・ギレンバーギイ（A. gyllenbergii）、アシネトバクター・へモリティカス（A. haemolyticus）、アシネトバクター・インディカス（A. indicus）、アシネトバクター・ジョンソニイ（A. johnsonii）、アシネトバクター・ジュニイ（A. junii）、アシネトバクター・ルオフィイ（A. lwoffii）、アシネトバクター・ネクタリス（A. nectaris）、アシネトバクター・ノソコミアリス（A. nosocomialis）、アシネトバクター・パルブス（A. parvus）、アシネトバクター・ピティイ（A. pittii）、アシネトバクター・プヤンゲンシス（A. puyangensis）、アシネトバクター・ラジオレシステンス（A. radioresistens）、アシネトバクター・ルディス（A. rudis）、アシネトバクター・シンドレリ（A. schindleri）、アシネトバクター・ソリ（A. soli）、アシネトバクター・タンドイ（A. tandoii）、アシネトバクター・テジェランバーギエ（A. tjernbergiae）、アシネトバクター・トウネリ（A. towneri）、アシネトバクター・アーシンギイ（A. ursingii）又はアシネトバクター・ベネチアナス（A. venetianus）である。
【００４３】
本明細書において、アシネトバクターは、細菌界プロテオバクテリア門ガンマプロテオバクテリア網シュードモナス目モラクセラ科を指すと理解される。
【００４４】
本発明の「アシネトバクター・バウマニの細胞又は菌株」は、細菌ドメインプロテオバクテリア門ガンマプロテオバクテリア網シュードモナス目モラクセラ科アシネトバクター属アシネトバクター・バウマニ種に属するこのような細胞と理解される。
【００４５】
「リポ多糖（ＬＰＳ）又はリポオリゴ糖」は種々のグラム陰性菌の外膜に見られる構成要素と理解される。ＬＰＳという用語は、その発見の歴史により「エンドトキシン」と同じ意味で頻繁に使用されている。ＬＰＳは多糖鎖及びそれ以外をエンドトキシン活性に関与する脂質Ａとして知られる脂質からなる。多糖鎖は細菌の違いにより異なり、血清型を決定する。エンドトキシンはおよそ１０ｋＤａの大きさのものであるが、最大１０００ｋＤａの大きな凝集体を形成することができる。ヒトでは、ＬＰＳに対する抗体を産生することが可能であるが、一般にこれらの抗体は特異的血清型の細菌に対して防御することができるに過ぎない。エンドトキシンは、ナイセリア・メニンギティディス及びアシネトバクター・バウマニ等のグラム陰性菌によって引き起こされた感染の臨床徴候の多くに関与する。
【００４６】
本発明の組成物
本発明の第２の態様は、
ａ）本発明の細胞又は菌株と、
ｂ）場合によりヌクレオチド及び／又はアミノ酸の配列又はポリペプチドと、
を含む組成物（以下、本発明の組成物）を指す。
【００４７】
本発明のこの態様の更に好ましい実施形態において、核酸及び／又はアミノ酸の配列又はポリペプチドは組換え体である。
【００４８】
更に好ましい実施形態において、ポリペプチドは、
Ｉ）配列番号２７のペプチド配列（推定鉄シデロホア受容体（Ａ．バウマニ  ＡＴＣＣ  １７９７８；アクセッション番号  ＹＰ＿００１０８４６８４））若しくはそのフラグメント（フラグメントは生物学的に活性なフラグメントであり、好ましくは配列番号１〜配列番号１１からなる群又はそれらの組合せのいずれかから選択される）若しくは配列番号１〜配列番号１１のペプチド配列と少なくとも８５％の配列同一性を有する配列及び／又は、
ＩＩ）配列番号２８のペプチド配列（推定ヒドロキサム酸型鉄シデロホア受容体（Ａ．バウマニ  ＡＴＣＣ  １７９７８；アクセッション番号ＹＰ＿００１０８４６９６））若しくはそのフラグメント（フラグメントは生物学的に活性なフラグメントであり、好ましくは配列番号１２〜配列番号２３からなる群又はそれらの組合せのいずれかから選択される）若しくは配列番号１２〜配列番号２３のペプチド配列と少なくとも８５％の配列同一性を有する配列から選択される。
【００４９】
更に好ましい実施形態において、本発明の組成物は、配列番号２８のアミノ酸配列及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む。
【００５０】
別の好ましい実施形態において、本発明の組成物は、配列番号１〜配列番号２３からなる以下の群の少なくとも２つ、好ましくは３つ、より好ましくは４つのアミノ酸配列又は配列番号１〜配列番号２３の配列と少なくとも８５％の同一性を有するこれらのアミノ酸配列の変異体からなる融合タンパク質を含む。
【００５１】
別の好ましい実施形態において、融合タンパク質は、配列番号２４のアミノ酸配列又は配列番号２５のアミノ酸配列を含む。
【００５２】
別の好ましい実施形態において、本発明の組成物は、本発明に記載のアミノ酸配列を転写することが可能なヌクレオチド配列（以下、本発明のヌクレオチド配列）を含む。ヌクレオチド配列は配列番号２６がより好ましい。
【００５３】
以前に記載されたフラグメントは、少なくとも１つのアミノ酸によってアミノ酸配列が異なる。最も好ましい変形例は、配列番号１〜配列番号２５に示されたポリペプチドのいずれかと少なくとも８５％以上の（９０％、９３％以上、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上を含む）配列同一性を有するものである。より好ましくは、本発明は、配列番号１〜配列番号２５のポリペプチドのいずれかにおいて少なくとも１つ（少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ）の突然変異を特徴とする配列変異体を指す。説明部分で記載したように、本発明によれば、突然変異は、挿入（複数の場合もある）、欠失（複数の場合もある）及び置換（複数の場合もある）、好ましくは置換（複数の場合もある）により選択された任意の突然変異を指すことができる。
【００５４】
別の好ましい実施形態において、本発明の組成物は、本発明のヌクレオチド配列を含む、発現ベクター（以下、本発明の発現ベクター）を含む。
【００５５】
別の好ましい実施形態において、本発明の組成物はまた、ＬＰＳを欠損する外膜小胞（以下、本発明の外膜小胞）を含む。
【００５６】
別の好ましい実施形態において、本発明の組成物はまた、アミノ酸配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、及び（y）配列番号８９のアミノ酸配列又はそれらの組合せのいずれかを含むＡ．バウマニの膜から精製したタンパク質の少なくとも１つを含む。
【００５７】
より好ましくは、Ａ．バウマニの外膜のタンパク質の少なくとも１つは以下を含むプロセスにより得られる。
ａ．ミューラーヒントン培養液１リットルにＡ．バウマニ  ＡＴＣＣ  １９６０６のコロニーを植菌し、
ｂ．６００ｎｍの光学密度が０．６になるまで培養液をインキュベーションし、
ｃ．ｐＨ７．２の１０ｍＭリン酸緩衝液３０ｍｌを用いて細菌細胞を洗浄し、
ｄ．６０００×ｇにて１０分間遠心分離し、
ｅ．ｐＨ７．２の１０ｍＭリン酸緩衝液１０ｍｌに細菌ペレットを再懸濁させ、超音波処理を１分間に５回行うことにより溶解させ、
ｆ．６０００×ｇにて５分間遠心分離することにより溶解しなかった細胞を破棄し、
ｇ．４℃、２００００×ｇにて１時間上清を遠心分離し、
ｈ．ｐＨ７．２の１０ｍＭリン酸緩衝液に５ｍｌの２％Ｎ−ラウロイルサルコシンを３７℃にて３０分間溶解させることにより外膜のタンパク質を破棄し、
ｉ．４℃、２００００×ｇにて１時間遠心分離することにより（外膜タンパク質を含有する）不溶性の画分を析出し、
ｊ．ペレットをｐＨ６．８の６２．５ｍＭトリス−ＨＣｌ  ２ｍｌで１回洗浄し、４℃にて１時間遠心分離し、
ｋ．ペレットを５％ＳＤＳ溶液に再懸濁させ、メタノール／クロロホルムで沈殿させ、
ｌ．滅菌済みＰＢＳにペレットを再懸濁させる。
【００５８】
本発明の別の好ましい実施形態において、本発明の組成物は医薬組成物であり、より好ましくは許容される医薬ビヒクルも含み、更に好ましくは別の活性成分も含む。
【００５９】
別の好ましい実施形態において、本発明の組成物はアジュバントも含む。別の好ましい実施形態において、本発明の組成物はワクチンである。
【００６０】
本発明において、「ワクチン」という用語は、疾患に対して免疫応答を誘導するために使用される抗原性製剤を指す。ワクチンは抗原から作製されるが、抗原が宿主内に入ると、抗体の産生を介して免疫応答を誘起し、一時的又は永久的な免疫を生じる免疫記憶が作られる。なお、本明細書において使用される「ワクチン」という用語はまた、アシネトバクター株、特にＡ．バウマニ株によって引き起こされた感染の治療的処置又は受動免疫の付与に好適な抗体又はそのフラグメント由来の製剤として理解することができる。
【００６１】
ヌクレオチド配列及び発現ベクター
本発明の第３の態様は、配列番号１〜２５、２７若しくは２８のいずれか又はそれらのいずれかの組合せをコードするヌクレオチド配列（以下、本発明の第２のヌクレオチド配列）を指す。本発明の上記の第２のヌクレオチド配列はまた、配列番号２６の核酸配列を含む。
【００６２】
本発明の第４の態様は、本発明の第２のヌクレオチド配列を含む発現ベクター（以下、本発明の発現ベクター）を指す。
【００６３】
この態様の好ましい実施形態において、本発明の細胞は本発明の発現ベクターを含む。
【００６４】
核酸を組換えベクターに配置することができる。好ましくは、組換えベクターは原核ベクターであり、原核細胞のゲノムで複製され、及び／又は原核細胞のゲノムに組み込まれるための要素を含有するベクターである。好ましくは、組換えベクターは、発現制御配列に操作可能に結合する本発明の核酸分子を含有する。制御配列は、アシネトバクター、特にＡ．バウマニの活性発現を制御する配列が好ましい。ベクターは、染色体に組み込まれるのに十分な染色体外ベクターであってよい。このようなベクターの例は、例えばSambrook et al.（上掲）において当業者に知られている。
【００６５】
本発明の外膜小胞
本発明の第５の態様は、ＬＰＳを欠損する外膜小胞を指す。この態様の好ましい実施形態において、外膜小胞は本発明の細胞又は菌株から得られる。
【００６６】
本発明の細胞、小胞及び組成物の使用
第６の態様は、医薬として使用する本発明の組成物、又は代替法として、医薬の製造への本発明の組成物の使用を指す。
【００６７】
本明細書において使用される「医薬」又は「医薬組成物」という用語は、ヒト又は動物における疾患の予防、緩和、治療又は治癒のために使用される任意の物質に言及したものである。本発明の内容は本発明の組成物を含む組成物を指す。この本発明の組成物は、治療有効量のアシネトバクター属及び／又はアシネトバクター属の外膜小胞の不活性化細胞を含み、本細胞がアシネトバクター属の微生物に対して投与されると、生体において免疫応答を誘導することが可能である。それゆえ「医薬」又は「医薬組成物」という用語はワクチンとして知られている。
【００６８】
治療有効量を得るための投与量は、例えば哺乳動物の年齢、体重、性別、耐性等の種々の因子に左右される。本明細書において使用される「治療有効量」は、所望の効果が得られるアシネトバクター属及び／又は外膜小胞の不活性細胞の量を指し、一般に所望する治療効果により決定される。
【００６９】
本発明の第７の態様は、哺乳動物におけるＡ．バウマニによって引き起こされた感染の予防、改善若しくは治療のための本発明の組成物を指し、又は代替的に、哺乳動物におけるＡ．バウマニによって引き起こされた感染の予防、改善若しくは治療のための医薬の作製のための本発明の組成物の使用を指す。
【００７０】
「アシネトバクター属の微生物により生じる疾患」とは病因の原因物質がアシネトバクター属由来であるか、又はその代謝産物のいずれかであるこのような疾患と理解される。アシネトバクター属は、菌血症、髄膜炎、尿路感染、皮膚及び軟組織の感染、手術部位感染並びに肺炎であるが、それらに限定されない多様な病状を生じる。これらのことから、より好ましい形態の１つである、アシネトバクター属の微生物により生じる疾患は菌血症、髄膜炎、尿路感染、皮膚及び軟組織の感染、手術部位感染並びに肺炎からなる群より選択される。
【００７１】
本発明の医薬及び組成物を単独又はアシネトバクター属由来の微生物により生じた疾患の治療のための他の医薬若しくは組成物と組み合わせて使用することができる。
【００７２】
本発明の医薬及び組成物の両方は、薬学的に許容されるビヒクル又は賦形剤も含むことができる。
【００７３】
本発明の医薬及び組成物を、単独又はアシネトバクター属の微生物により生じた疾患の治療若しくは予防のための他の医薬若しくは組成物と組み合わせてのいずれかにおいて使用することができる。
【００７４】
「賦形剤」という用語は、本発明の医薬の組成物の要素の吸収、上記要素の安定化、より口当たりの良い稠度又は風味をもたらすように医薬の調製を活性化又は補助することに役立つ物質を指す。賦形剤は、本段落に記載の他の種類の賦形剤を除外することなく、例えばデンプン、糖、セルロース、甘味剤、着色剤の場合、大気及び／又は湿度から隔離する等の医薬を保護する機能、ピル、カプセル又は提示の他の任意の形態を充填する機能、例えば第二リン酸カルシウムの場合、構成要素の溶解及び腸への吸収を促進する機能等と合わせて賦形剤の成分を維持することができる。
【００７５】
同じく賦形剤としてのビヒクルは、医薬において本発明の構成要素のいずれかを所望の容量又は重量に希釈するのに使用する物質である。薬学的に許容されるビヒクルは、不活性物質又は本発明の要素のいずれかと類似の作用のものである。ビヒクルの機能は、他の要素の組込みを促進し、良好な投薬及び投与を可能にし、医薬に稠度及び形態を与えることである。提示の形態が液体であるとき、薬学的に許容されるビヒクルは希釈液である。
【００７６】
本発明の組成物において使用することができるアジュバント及び薬学的に許容されるビヒクルは、当業者に知られているこのようなビヒクルである。
【００７７】
本明細書において、「アジュバント」という用語は、抗原性の活性を含まず、かつそれ自体に抗原性の活性がない任意の作用剤を指し、免疫系を刺激し、ワクチンに対する応答を増大させるよう使用することができる。多くのアジュバントがあり、例えばリン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、サイトカイン、スクアリン、フロイントの不完全及び完全アジュバントであるが、それらに限定されない。本発明のこの態様の好ましい形態において、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、サイトカイン、スクアリン、フロイントの不完全及び完全アジュバントからなる群のアジュバントを選択する。本発明のこの態様の更に好ましい形態において、アジュバントはリン酸アルミニウムである。
【００７８】
本明細書において使用される「活性成分」、「活性物質」又は「薬学的に活性な物質」若しくは「薬学的に活性な成分」という用語は、薬理学的な活性若しく疾患の診断、治癒、緩和、治療若しくは予防において様々なその他の効果をもたらす可能性があり、又はヒト若しくは動物の体内の構造若しくは機能に影響を与える任意の構成要素を指す。これらの用語には、薬剤の製造における化学的変化を促進し、特異的活性又は効果をもたらす同様の形態及び改変形態で存在するこのような構成要素を含む。
【００７９】
本発明の第８の態様は、哺乳動物におけるＡ．バウマニによって引き起こされた感染に対して防御するための本発明の組成物、又は代替的に、哺乳動物におけるＡ．バウマニによって引き起こされた感染に対して防御する医薬の製造への本発明の組成物の使用を指す。
【００８０】
本発明の別の態様は、本発明の融合タンパク質若しくはペプチド又は本発明の第１若しくは第２の態様の組成物又は１回若しくは数回、例えば２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回若しくは１０回以上投与することができる本発明の医薬組成物を指す。用量当たりの活性成分の量に対して特に制限はない。
【００８１】
本発明の更なる態様は、配列番号２７若しくは配列番号２８に結合することが可能な抗体若しくはそのフラグメント又は第２の態様に記載の融合タンパク質若しくは本発明の融合タンパク質からなる組成物を指し、好ましくは、上記組成物は医薬組成物、好ましくはワクチンであり、上記医薬組成物をＡ．バウマニによって引き起こされた感染の治療又は予防に使用する。
【００８２】
本発明の第９の態様は、本発明の第１若しくは第２の態様の組成物又は本発明の融合タンパク質を用いた哺乳動物の免疫付与により得ることが可能な抗体若しくはその活性フラグメントを指し、好ましくは上記抗体又は活性フラグメントがＡ．バウマニによって引き起こされた感染の療法として、特に治療に使用される医薬組成物を構成する。
【００８３】
本発明につながるアシネトバクター細胞を作製する方法
本発明の第１０の態様は、上記のＡ．バウマニの細胞を作製する方法を指す。
【００８４】
アシネトバクター
この態様によれば、本方法は（ｉ）ＬＰＳを欠損する細菌細胞、特にアシネトバクターの細胞を準備する工程と、（ｉｉ）上記細菌細胞に組換え核酸分子を挿入する工程と（上記核酸分子は（ａ）哺乳動物において免疫応答を生じることが可能な、ポリペプチドの少なくとも１つのドメインと、（ｂ）ファゴリソソームを除くドメインとからなる融合ペプチドをコードする）、（ｉｉｉ）適切な条件下において工程（ｉｉ）により得られた細胞を培養する工程とからなる。上記核酸を発現することが可能な細胞を得ることが好ましい。細胞はＡ．バウマニの細胞であることがより好ましい。
【００８５】
更なる態様によれば、本方法は、（ｉ）ＬＰＳを欠損する細菌細胞、特にアシネトバクター細胞を準備し、（ｉｉ）組換え核酸分子を上記細菌に挿入し（上記核酸分子はファゴリソソームを除くペプチド又はポリペプチドをコードする）、（ｉｉｉ）適切な条件下において工程（ｉｉ）により得られた細胞を培養する工程からなる。
【００８６】
所望の場合、本発明の方法は、少なくとも１つの組換え核酸分子を細菌細胞に挿入することからなる（上記分子は哺乳動物における免疫応答を生じることが可能なペプチド又はポリペプチドをコードする）。
【００８７】
本発明における「感染」は、アシネトバクター属、好ましくはアシネトバクター・バウマニの任意の微生物による任意の宿主組織への侵入又はコロニー形成により生じた病状であると理解される。
【００８８】
本発明の「軟組織」は生体の非骨組織全てであると理解される。
【００８９】
本発明において理解される「予防」という用語は、アシネトバクター属の細胞又はアシネトバクター属の任意の派生株（derivative）若しくは代謝産物が原因となる損傷の出現を回避することからなる。
【００９０】
本明細書における「抗原」という用語は、抗体の形成を誘導することができる分子（一般にタンパク質又は多糖）を指す。抗原として作用することができる多くの様々な種類の分子、例えばタンパク質、ペプチド、多糖、稀にではあるが、核酸等の他の分子がある。
【００９１】
「耐性」という用語は、薬剤に対して細菌が発達させた何らかの防御の機構を指す。細菌が獲得し、次世代に伝わる耐性の機構が最も重要であり、主に抗生物質を不活性化させる酵素の産生、標的への薬剤の到達を遅らせる修飾物の出現及び／又はその標的自体の変化からなる。１つの細菌株は１つ又は多くの抗生物質に対する種々の耐性機構を発達させることができ、同様に多様な細菌種からの個別の機構により抗生物質を不活性化することができる。
【００９２】
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は同じ意味で使用され、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方の任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。
【００９３】
「アミノ酸配列」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は同じ意味で使用され、化学的又は生化学的に修飾することができる任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指す。
【００９４】
特許請求の範囲の記載の中で、「含む（comprising）」の単語及びその活用例は、他の技術的特徴、追加物、構成要素又は工程を除外することを意図しない。現行の技術水準にある当業者において、本発明の他の目的、利点及び特徴は、本発明の説明及び実施の章にて明らかとなる。以下の実施例及び図面は説明として提供され、本発明を限定することを意図しない。
【実施例】
【００９５】
実施例１
倫理に関する陳述
動物の使用を含む全ての実験は、ビルゲンデルロシオ（Virgen del Rocio）大学病院の倫理及び実験に対する委員会により承認された（評価コード：２０１３ＰＩ／２９６）。全ての実験において、苦痛を最小限にする努力がなされ、実験中瀕死と見られる全ての動物を、チオペンタールを用いて速やかに安楽死させた。
【００９６】
細菌株。Ａ．バウマニ  ＡＴＣＣ  １９６０６は、抗生物質感受性参考株である。ＡＴＣＣ  １９６０６のＬＰＳ欠損誘導株は、以前に記載されたように、１０ｍｇ／ｌのコリスチンを含有するミューラーヒントン寒天にＡＴＣＣ  １９６０６の一晩培養させたものをプレーティングすることにより得られた（Clinical Laboratory Standards Institute 2013）。ＬＰＳ生合成に関与する遺伝子の突然変異を含む菌株を、３７℃にて一晩成長させた後に出現するコリスチン耐性突然変異体のｌｐｘＡ、ｌｐｘＣ及びｌｐｘＤ遺伝子をシークエンシングすることにより同定した。ｌｐｘＤ遺伝子が大量に欠失している菌株を同定し、ＩＢ０１０と命名した。コリスチンに対する耐性を、臨床検査標準協会ガイドライン（Clinical Laboratory Standard Institute guidelines）［２３］に従った培養液の微量希釈により確定した。ＬＰＳが含有していないことを、製造業者の説明書に従いＱＣＬ−１０００カブトガニ血球抽出アッセイ（Lonza）を用いて各菌株の３つの独立した培養液のエンドトキシン濃度を測定することにより確定した。Ａｂ−１５４株は、既に特徴付けられているＡ．バウマニ臨床分離株である（Gautom, 1997. J. Clin. Microbiol. 35, 2977-2980）。
【００９７】
ワクチン製剤及びマウス免疫付与。ＩＷＣワクチン（ＬＰＳ含有及びＬＰＳ欠損の両方）を以前に記載された方法（Moffatt et al., 2010. Antimicrob. Agents Chemother. 54, 4971-4977）に基づき作製した。つまり、ＡＴＣＣ  １９６０６株及びＩＢ０１０株をミューラーヒントン培養液において０．８のＯＤ６００に成長させた。ＩＢ０１０の場合、１０μｇ／ｍｌのコリスチンを培養液に添加した。ＩＢ０１０の成長中に生じる野生型の復帰変異がないことを確認するために、ＡＴＣＣ  １９６０６及びＩＢ０１０の３つの独立した培養液を成長させ、ＱＩＡｍｐ  ＤＮＡミニキット（Qiagen）を用いて各培養液からゲノムＤＮＡを単離した。ｌｐｘＤ特異的プライマー５’ＧＣＴＡＡＴＴＧＧＴＧＡＡＧＧＴＡＧＴＣ３’及び５’ＧＡＣＧＡＡＴＣＧＴＴＴＧＡＡＴＣＴＧＣ３’を使用して、成長後にＩＢ０１０のｌｐｘＤの欠失が存在することを確認するために、培養液のゲノムＤＮＡを増幅させた。
【００９８】
ワクチン製剤において、細菌をリン酸緩衝生理食塩水で十分に洗浄した後、室温で撹拌しながら０．５Ｍホルマリンにおいて１８時間不活性化させた。細菌の完全な不活性化は、血液寒天にプレーティングすることによって確認された。不活性化細胞の濃度を１×１０１０細胞／ｍｌに調整し、これをアルミニウム系アジュバントのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ  ２％（ｗ／ｖ）（InvivoGen）と１：１（ｖ／ｖ）で混合させた。ワクチン投与は、６〜８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに０日及び１４日目にそれぞれの大腿四頭筋に１００μｌのワクチンを筋肉内注射することによって行われた。対照のマウスにリン酸緩衝生理食塩水及びアジュバントの混合物を同様に注射した。
【００９９】
Ａ．バウマニ感染のマウスモデル。我々のグループが以前に開発し、Ａ．バウマニに対するワクチン評価に使用している敗血症のマウスモデルを使用して、ワクチンの有効性を特徴付けた（Batson et al., 1950. J. Exp. Med. 91, 219-229; Rodriguez-Hernandez et al., 2000. J. Antimicrob. Chemother. 45, 493-501）。このモデルは、接種物質を腹腔内点滴注入後に播種性感染を生じ、通例２４時間〜４８時間以内に死亡する。接種物質の作製において、Ａ．バウマニ株をミューラーヒントン培養液中において３７℃にて１８時間成長させ、以前に記載されたように、生理食塩水内での適切な濃度に調整した（Moffatt et al., 2010. Antimicrob. Agents Chemother. 54, 4971-4977; Martin et al., 1998. J. Immunol. Methods 212, 187-192）。接種物質の細菌濃度を血液寒天にプレーティングすることによって決定した。マウスに、０．５ｍｌの細菌懸濁液を２１日目（第２の免疫付与の１週間後）に腹腔内注射することにより感染させ、７日間の生存率をモニタリングした。
【０１００】
脾臓の細菌量及び血清サイトカイン濃度。感染後の細菌量を、感染の１２時間後にワクチンを投与したマウス及び対照マウスにおいて決定した。マウスをチオペンタールの過剰投与により安楽死させ、後眼窩静脈洞から血液サンプルを採取後に、脾臓を無菌状態で摘出し、計量し、２ｍｌの生理食塩水でホモジナイズした。細菌を定量化するため、連続ｌｏｇ希釈液を血液寒天プレートにプレーティングした。マウスのインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）及びインターロイキン−６（ＩＬ−６）の血清レベルをＢＤ  ＯｐｔＥＩＡマウスキット（BD Biosciences）を用いて感染の１２時間後に決定した。
【０１０１】
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）。間接的酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）において、９６ウェルプレートを、５×１０７細菌／ウェルを含むリン酸緩衝生理食塩水で４℃にて一晩インキュベーションすることによりコーティングした。以前に記載されているように［２８］、０日目、７日目及び２１日目に採取した血清を用いてＥＬＩＳＡを行った。マウスに免疫付与するために使用した菌株に対する抗体価を測定し、分光光度の読取りがバックグランド用ウェル（血清を含有しないウェル）を上回る少なくとも０．１単位である場合、希釈液として定義した。
【０１０２】
統計分析。抗体価、細菌量及びサイトカイン濃度をクラスカル−ワリスのＨ検定を用いて比較し、独立したサンプルに対してはマン−ホイットニーのＵ検定及び従属サンプルに対してはフリードマン及びウィルコクソンの検定を行った。適宜、ボンフェローニ補正を適用した。生存率のデータをｌｏｇ−ｒａｎｋ検定を用いて比較した。全ての統計は、ＳＰＳＳバージョン１５．０ソフトウェア（SPSS Inc.）を用いて行われ、ｐ≦０．０５の値を有意と見なした。
【０１０３】
結果
ワクチン開発用のＬＰＳ欠損株の選択。１０μｇ／ｍｌのコリスチンの存在下においてのＡＴＣＣ  １９６０６の成長は、ｌｐｘＡ、ｌｐｘＣ及びｌｐｘＤ遺伝子内に突然変異を有するコリスチン耐性誘導株を数多く生じた（データは示さず）。これらの菌株の１つであるＩＢ０１０は、ｌｐｘＤ遺伝子内に４６２ヌクレオチド（ヌクレオチド１０４〜５６５）の大量の欠失を含んでおり、更にワクチン試験において使用するために選択された。この菌株が大量の欠失を含むことから、この菌株はＬＰＳ生合成遺伝子における単一のヌクレオチドが変化し又は欠失が少量である菌株よりも成長中の野生型への復帰変異の可能性は少ないと推論した。培養液の微量希釈実験により、最小発育阻止濃度は、ＡＴＣＣ  １９６０６株では０．２５μｇ／ｍｌ以下であり、ＩＢ０１０では１２８μｇ／ｍｌ超であることが示され、以前に記載された結果と同様、ｌｐｘＤの突然変異はコリスチンに対する耐性を生じ得ることが示された（Moffatt et al., 2010. Antimicrob. Agents Chemother. 54, 4971-4977）。成長中のＩＢ０１０を確実に遺伝的に安定させるため、ＡＴＣＣ  １９６０６及びＩＢ０１０の３つの独立した培養液由来のゲノムＤＮＡを、ｌｐｘＤ特異的プライマーを用いて増幅し、欠失が存在することを確認した。図１Ａに示すように、４６２ヌクレオチドの欠失を含有する、ＩＢ０１０の突然変異型ｌｐｘＤ遺伝子に対応するバンドが、全てのＩＢ０１０培養液を増幅後に存在し、復帰変異が生じていないことが示された。ＬＰＳの表現型の消失及びエンドトキシン濃度の減少がＡＴＣＣ  １９６０６及びＩＢ０１０のカブトガニ血球抽出アッセイによって特徴づけられ、ｌｐｘＤ遺伝子の突然変異により、１０６個の細胞当たり１ＥＵを超えるまでにエンドトキシン濃度が劇的に減少したことが例証された（図１Ｂ）。
【０１０４】
ＬＰＳ欠損ＩＷＣワクチンに対する抗体応答。ＡＴＣＣ  １９６０６及びＩＢ０１０のホルマリン処置により、生存する細菌が消失し、完全な細菌不活性化を示した。不活性化させたＩＢ０１０の免疫付与により生じた抗体応答を定量化するために、間接的ＥＬＩＳＡを、陰性対照マウス（ＰＢＳ及びアジュバントで免疫付与）及び１×１０９個の不活性化させたＩＢ０１０細胞をワクチン投与したマウスから採取した血清を用いて行われた。我々は１×１０９個の不活性化させたＡＴＣＣ  １９６０６細胞が堅固な免疫応答を誘導し、実験的感染に対する防御免疫を生じることを以前に示していることから（非特許文献１８）、陽性対照として、１群のマウスにこの細胞を免疫付与した。図２Ａに示すように、不活性化させたＩＢ０１０による免疫付与は、単回筋肉内投与の７日後に全てのマウスにおいて抗原特異的な総ＩｇＧの検出可能濃度を誘起し、これらの抗体濃度は２回目のワクチン投与でブーストしたときに有意に増加した（ｐ＝０．０３、ウィルコクソン検定）。不活性化させたＩＢ０１０ワクチンを２回投与したマウスの総ＩｇＧ価は、不活性化させた野生型細胞を含有するワクチンを投与したマウスの総ＩｇＧ価と同様であった（ｐ＝０．７２６、マン−ホイットニーのＵ検定）。対照マウスは、どの時点においても抗原特異的ＩｇＧは検出されなかった。対照的に、ＩｇＭ濃度は、単回投与後の不活性化させたＩＢ０１０ワクチンを免疫付与したマウスと不活性化させた野生型細胞を投与したマウスとの間では同様であった（ｐ＝０．１８６、マン−ホイットニーのＵ検定）が、２回目の免疫付与の７日後、ＩＢ０１０をワクチン投与したマウスの抗原特異的ＩｇＭは検出されず、一方、不活性化させた野生型細胞を免疫付与したマウス全てにおいてＩｇＭ濃度は検出可能であった（図２Ｂ）。
【０１０５】
Ｃ５７ＢＬ／６における、ＩｇＧのサブタイプであるＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａのホモログであるＩｇＧ２ｃの濃度（Martin et al., 1998. J. Immunol. Methods 212: 187-192）を２１日目の血清において決定した（図２Ｃ及び図２Ｄ）。不活性化させたワクチンを投与した両群のマウスのＩｇＧ１及びＩｇＧ２ｃ濃度は対照マウスに比べ有意であった（ｐ＜０．００１；マン−ホイットニーのＵ検定）。興味深いことに、ＩｇＧ１価は、ＡＴＣＣ  １９６０６をワクチン投与したマウスに比べ、ＩＢ０１０をワクチン投与したマウスにおいて有意に高いものとなった（ｐ＝０．００３；マン−ホイットニーのＵ検定）が、一方ＩｇＧ２ｃ価は両群間において同様なものであった。これらの結果は、Ｔｈ１及びＴｈ２の応答がともに不活性化させたＡＴＣＣ  １９６０６ワクチンに対してこれまで示されたものと同様に不活性化させたＩＢ０１０ワクチンにより誘起されることを示している（非特許文献１８）。
【０１０６】
感染後の細菌量に対するワクチン投与の効果。感染後の組織の細菌量に対するワクチン投与の効果を特徴付けるため、Ａ.バウマニによる感染を予防するワクチンの特徴付けのために我々のグループが以前に開発したマウスモデルを使用した（非特許文献１６、非特許文献１７、非特許文献１８）。このモデルは、感染の１時間後には遠位の器官で細菌が検出されるといった迅速な播種感染を生じる［１６］。ワクチン投与したマウス及び対照マウスを２．０×１０６ｃｆｕ（３００×ＬＤ５０）のＡＴＣＣ  １９６０６株に感染させ、感染の１２時間後に、脾臓の細菌量を決定した（図３）。ＩＢ０１０のワクチン投与により、脾臓の細菌数が対照マウスに比べおよそ１０００倍減少した（ｐ＜０．０５；マン−ホイットニーのＵ検定）。脾臓の細菌量は、ＩＢ０１０をワクチン投与したマウスと、不活性化させたＡＴＣＣ  １９６０６細胞で免疫付与したマウスとに大きな違いをなかった。
【０１０７】
感染後の血清サイトカイン濃度に対するワクチン投与の効果及び生存率。サイトカイン濃度に対する不活性化させたＬＰＳ欠損ワクチンでの免疫付与の効果を特徴付けるため、血清を感染の１２時間後にワクチン投与したマウス及び対照マウスから採取し、ＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αの濃度を決定した（図４）。３つのサイトカイン全ての濃度は、対照マウスに比べ、ワクチン投与したマウスの両群において有意に低いものとなり（ＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αにおいてｐ＝０．００３；マン−ホイットニーのＵ検定）、ワクチン投与したマウスは、敗血症性ショックの発症に伴う炎症性サイトカインを放出していなかったことを示唆した。
【０１０８】
ワクチンの有効性を、２回目の免疫付与の７日後に免疫付与したマウス及び対照マウスを２．２５×１０６ｃｆｕ（３４０．９×ＬＤ５０）のＡＴＣＣ  １９６０６株に感染させることにより試験し、生存率を７日間にわたりモニタリングした（図５）。ＩＢ０１０ワクチンをワクチン投与された全てのマウスは、抗原投与から防御されたが、対照マウスは全て４８時間以内に死亡した（Ｐ＜０．００１；ｌｏｇ−ｒａｎｋ検定）。予測していたように、ＡＴＣＣ  １９６０６株で免疫付与した全てのマウスは、以前に報告された結果と同様に抗原投与下において生存していた（非特許文献１６、非特許文献１７、非特許文献１８）。ＩＢ０１０のワクチン投与が関連のない菌株を用いた異種の抗原投与に対して防御することができるのかを決定するため、免疫付与したマウス及び対照マウスに、予め特徴付けられたＡ．バウマニ臨床分離株Ａｂ−１５４を１．０５×１０６ｃｆｕ（２．１８×ＬＤ５０）感染させた［２９］。またしても、免疫付与した全てのマウスが抗原投与下において生存したが、対照マウスは、４８時間以内に感染して死亡し（ｐ＜０．００１；ｌｏｇ−ｒａｎｋ検定）、ＩＢ０１０での免疫付与が、異種の菌株を用いた抗原投与に対して干渉効果をもたらすことができることを示した。
【０１０９】
結論として、これらの結果は、ＬＰＳを消失する細菌全細胞をベースとしたＡ．バウマニによって引き起こされる感染の予防のためのワクチンの開発に関して重要な情報をもたらす。これらの結果はまた、ＬＰＳを消失する菌株をベースとした他の細菌種のためのワクチンの開発の可能性に対する見解をもたらすことができる。
【０１１０】
実施例２
この実施例は、ＬＰＳを含まない上記の突然変異体の培養液から精製されたＯＭＶをベースとしたＡ．バウマニに対するワクチンの開発に関する。
【０１１１】
この目的を実行するため、ＬＰＳを含まないＡＴＣＣ  １９６０６Ｔ株及びその突然変異体のＩＢ０１０を実験室においてＡＴＣＣ  １９６０６Ｔ株から作製し、ｌｐｘＤ遺伝子の１０３位〜５６５位の４６２ヌクレオチドの欠失が含まれた。
【０１１２】
上記の菌株のＯＭＶの精製を実現する上で、以下のプロトコルを使用した。
菌株をコリスチン１０ｍｃｇ／ｍｌを含む血液寒天又はＭＨＢＩＩプレートに置き換え、３７℃にて一晩成長させる。
液体培養を使用してＡＴＣＣ  １９６０６又はＩＢ０１０を成長させる。これらを１８０ｒｐｍ、３７℃にて一晩通気させ培養する。
翌日、５０ｍｌ又は１００ｍｌの培養液又はＭＨＢ  １Ｌを作製し、３７℃にて一晩通気（１８０ｒｐｍ）させながらインキュベーションする。
インキュベーション後、細胞を４℃にて３０分間、４０００ｒｐｍで遠心分離する。
次に、上清を０．２２ミクロンのフィルターにて濾過する。
その後、ＯＭＶを４℃にて９０分間、３００００ｒｐｍの超遠心分離により沈殿させる。
【０１１３】
最後に、ペレットをＰＢＳに再懸濁させ、生菌を含まないことをプレーティングにより確認する。ＯＭＶを−８０℃にて保存する。
（プロトコルは非特許文献１７より採用）
【０１１４】
これまでのプロトコルを用いて、ＯＭＶの様々な精製が行われている。
２４時間、４８時間及び７２時間の培養後にＯＭＶを作製するための、ＡＴＣＣ  １９６０６株及びＩＢ０１０株のＯＭＶの精製。ＯＭＶを精製後に、タンパク質の量を、ブラッドフォード法を用いて定量化し、１０ｍｃｇのタンパク質をクマシー染色した１０％ポリアクリルアミドゲルにおいて視覚化した。
さらに、精製は、キレート剤の含有が鉄代謝に関連するタンパク質、例えばシデロホア受容体の発現の増加を生じるかを検証する目的で、鉄キレート剤であるＢｉｐを含有及び非含有のＡＴＣＣ  １９６０６株及びＩＢ０１０株由来のＯＭＶを用いて行われている。この場合、ＯＭＶは、タンパク質の定量化用及びアクリルアミドゲルのクマシー染色用及び電子顕微鏡法によるＯＭＶ視覚化用に精製された。
【０１１５】
最後に、ＯＭＶを、ｌｐｘＣ遺伝子にＩＳＡｂａ１を挿入したＡ．バウマニＡｂ−１６７の臨床分離株のＬＰＳ突然変異体から精製した。タンパク質をクマシー染色したアクリルアミドゲルにおいて定量化し、視覚化した。また、タンパク質をブラッドフォード法及び２Ｄ  Ｑｕａｎｔキットにより定量化した。
【０１１６】
実施例３．外膜タンパク質の精製
Ａ．バウマニ  ＡＴＣＣ  １９６０６を１リットルのミューラーヒントン培養液において６００ｎｍ（ＯＤ６００）の光学密度が０．６になるまで成長させ、ペレット化した細菌をｐＨ７．２の１０ｍＭリン酸緩衝液１０ｍｌに再懸濁させ、超音波処理により溶解させた。溶解しなかった細胞を４０００×ｇにて５分間遠心分離することにより除去し、上清を２００００＿ｇにて１時間遠心分離し、細胞外皮をペレット化した。内膜を、５ｍｌの２％Ｎ−ラウロイルサルコシンを用いて３７℃にて３０分間インキュベーションすることによって選択的に溶解させた。不溶性の画分を２００００＿ｇにて１時間遠心分離することによりペレット化した後、ｐＨ６．８の６２．５ｍＭトリス−Ｃｌ  ２ｍｌを用いて洗浄した。
【０１１７】
エンドトキシンを、タンパク質を５％ＳＤＳに再懸濁させ、４℃にて１０分間インキュベーションする冷却洗浄剤洗浄工程を用いて調製物から抽出した。続いてＳＤＳ及びエンドトキシンを、メタノール−クロロホルムに沈殿させることにより取り出し、ＰＢＳに再懸濁させた。
【０１１８】
アジュバントの追加
５００ｍｃｇ／ｍｌの濃度の精製タンパク質をリン酸アルミニウムアジュバントと１：１の比で混合した。
【０１１９】
箇条
１．ＬＰＳを欠損するアシネトバクター細胞。
２．内因性ＬＰＳ生合成遺伝子をコードする核酸の１つ又は種々の部分的な又は完全な不活性化により得られる、項１に記載のアシネトバクター細胞。
３．遺伝子がｌｐｘＡ、ｌｐｘＢ及び／又はｌｐｘＣ、又はそれらのいずれかの組合せから選択される、項２に記載のアシネトバクター細胞。
４．遺伝子のコード配列における１つ又は種々のヌクレオチドの欠失及び／又は挿入により得られる、項１〜項３のいずれか一項に記載のアシネトバクター細胞。
５．細胞は、弱毒化させたアシネトバクター細胞である、項１〜項４のいずれか一項に記載のアシネトバクター細胞。
６．ａ）項１又は項２に記載の細胞と、
ｂ）核酸分子及び／又はポリペプチドと、
を含む組成物。
７．核酸分子が組換え体であり、ポリペプチドが組換え体である、項１〜項６に記載の組成物。
８．ポリペプチドは、
ａ）配列番号２７のペプチド配列（推定鉄シデロホア受容体（Ａ．バウマニ  ＡＴＣＣ  １７９７８；アクセッション番号ＹＰ＿００１０８４６８４））若しくはそのフラグメント（フラグメントは生物学的に活性なフラグメントであり、好ましくは配列番号１〜配列番号１１からなる群又はその組合せのいずれかから選択される）若しくは配列番号１〜配列番号１１のペプチド配列と少なくとも８５％の配列同一性を有する配列及び／又は、
ｂ）配列番号２８のペプチド配列（推定ヒドロキサム酸型鉄シデロホア受容体（Ａ．バウマニ  ＡＴＣＣ  １７９７８；アクセッション番号ＹＰ＿００１０８４６９６））若しくはそのフラグメント（フラグメントは生物学的に活性なフラグメントであり、好ましくは配列番号１２〜配列番号２３からなる群又はその組合せのいずれかから選択される）若しくは配列番号１２〜配列番号２３のペプチド配列と少なくとも８５％の配列同一性を有する配列、
から選択される、項６又は項７に記載の組成物。
９．配列番号２８のアミノ酸配列及び配列番号２７のアミノ酸配列を更に含む、項６〜項８のいずれか一項に記載の組成物。
１０．配列番号１〜配列番号２３の群より少なくとも２つ、好ましくは３つ、より好ましくは４つのアミノ酸配列又は配列番号１〜配列番号２３と少なくとも８５％の配列同一性を有するこれらの配列の変異体を含む融合タンパク質を更に含む、項６〜項９のいずれか一項に記載の組成物。
１１．融合タンパク質が配列番号２４のアミノ酸配列又は配列番号２５のアミノ酸配列を更に含む、項１０に記載の組成物。
１２．項８〜項１１のいずれか一項に記載のアミノ酸配列を転写することが可能なヌクレオチド配列を含む、項６〜項１１のいずれか一項に記載の組成物。
１３．ヌクレオチド配列が配列番号２６である、項１２に記載の組成物。
１４．項１２又は項１３に記載のヌクレオチド配列を含む発現ベクターを更に含む、項６〜項１３のいずれか一項に記載の組成物。
１５．ＬＰＳを欠損する外膜小胞又は項１〜項５のいずれか一項に記載の細胞を更に含む、項６〜項１４のいずれか一項に記載の組成物。
１６．配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９のアミノ酸配列又はそれらの組合せを含む、Ａ．バウマニの精製外膜タンパク質の少なくとも１つを更に含む、項６〜項１４のいずれか一項に記載の組成物。
１７．ＬＰＳを欠損する外膜小胞。
１８．項１〜項５のいずれか一項に記載の細胞から得られた、項１７に記載の外膜小胞。
１９．細胞又は外膜小胞が、項８〜項１１のいずれか一項若しくは項１６に記載の、及び／又は項１２若しくは項１３に記載のヌクレオチド又は核酸を含むアミノ酸配列を産生するように設計されている、項６〜項１５のいずれか一項に記載の組成物。
２０．項１０又は項１１に記載のいずれかの融合タンパク質を転写することが可能なヌクレオチド配列。
２１．項１２又は項１３に記載のヌクレオチド又は核酸を含む発現ベクター。
２２．医薬組成物である項７〜項１６及び項１９のいずれか一項に記載の組成物。
２３．薬学的に許容されるビヒクルを更に含む、項２２に記載の組成物。
２４．別の活性成分を更に含む、項２２又は項２３に記載の組成物。
２５．アジュバントを更に含む、項２２〜項２４のいずれか一項に記載の組成物。
２６．組成物がワクチンである、項７〜項１６、項１９〜項２２及び項２５のいずれか一項に記載の組成物。
２７．医薬として用いられる項７〜項１６、項１９〜項２２及び項２５のいずれか一項に記載の組成物。
２８．哺乳動物におけるＡ．バウマニによって引き起こされた感染の予防、改善又は治療のための項７〜項１６、項１９〜項２２及び項２５のいずれか一項に記載の組成物。
２９．哺乳動物におけるＡ．バウマニによって引き起こされた感染に対して防御するための項７〜項１６、項１９〜項２２及び項２５のいずれか一項に記載の組成物。
３０．哺乳動物に項７〜項１６、項１９〜項２２及び項２５のいずれか一項に記載の組成物を免疫付与することにより得られる抗体又はその活性フラグメント。
３１．組成物が医薬組成物であり、Ａ．バウマニによって引き起こされた感染の療法、特に治療又は予防のために用いられる、項３０に記載の抗体又はそのフラグメント。
【０１２０】
追加の箇条
１．内因性ＬＰＳ生合成遺伝子をコードする１つ又は種々の細胞核酸分子の部分的な又は完全な不活性化により得られるＬＰＳを欠損するアシネトバクター細胞。
２．遺伝子がｌｐｘＡ、ｌｐｘＢ及び／又はｌｐｘＣ、又はそれらの組合せのいずれかから選択される、項１に記載のアシネトバクター細胞。
３．ａ）項１又は項２に記載の細胞と、
ｂ）組換え核酸分子及び／又は組換えポリペプチドと、
を含む組成物。
４．ポリペプチドは、
ｃ）配列番号２７のペプチド配列（推定鉄シデロホア受容体（Ａ．バウマニ  ＡＴＣＣ  １７９７８；アクセッション番号ＹＰ＿００１０８４６８４））若しくはそのフラグメント（フラグメントは生物学的に活性なフラグメントであり、好ましくは配列番号１〜配列番号１１からなる群又はその組合せのいずれかから選択される）若しくは配列番号１〜配列番号１１のペプチド配列と少なくとも８５％の配列同一性を有する配列及び／又は、
ｄ）配列番号２８のペプチド配列（推定ヒドロキサム酸型鉄シデロホア受容体（Ａ．バウマニ  ＡＴＣＣ  １７９７８；アクセッション番号ＹＰ＿００１０８４６９６））若しくはそのフラグメント（フラグメントは生物学的に活性なフラグメントであり、好ましくは配列番号１２〜配列番号２３からなる群又はその組合せのいずれかから選択される）若しくは配列番号１２〜配列番号２３のペプチド配列と少なくとも８５％の配列同一性を有する配列、
から選択される、項３に記載の組成物。
５．項４に記載のアミノ酸配列を転写することが可能なヌクレオチド配列、好ましくは配列番号２６を含む、項３又は項４に記載の組成物。
６．ＬＰＳを欠損する外膜小胞又は項１又は項２に記載の細胞を更に含む、項３〜項５のいずれか一項に記載の組成物。
７．配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９のＡ．バウマニの外膜から精製されるタンパク質の少なくとも１つを更に含む、項３〜項６のいずれか一項に記載の組成物。
８．ＬＰＳを欠損する外膜小胞。
９．項１又は項２に記載の細胞から得られた、項８に記載の外膜小胞。
１０．細胞又は外膜小胞が、項４又は項７に記載の、及び／又は項５の核酸配列を含むポリペプチド配列を産生するように設計されている、項３〜項７のいずれか一項に記載の組成物。
１１．組成物が医薬組成物である、項３〜項７及び項１０のいずれか一項に記載の組成物。
１２．医薬として用いられる項３〜項７、項１０及び項１１のいずれか一項に記載の組成物。
１３．哺乳動物におけるＡ．バウマニによって引き起こされた感染の予防、改善又は治療のために用いられる項３〜項７、項１０及び項１１のいずれか一項に記載の組成物。
１４．哺乳動物に項３〜項７、項１０及び項１１のいずれか一項に記載の組成物を免疫付与することにより得られる抗体又はその活性フラグメント。
１５．組成物が医薬組成物であり、Ａ．バウマニによって引き起こされた感染の療法、特に治療又は予防のために用いられる、項１４に記載の抗体又はその活性フラグメント。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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