(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の生理学的サンプル上で蛍光検出アッセイを実行するアッセイユニット（１）であって、
マイクロ流体システム（２０）を備えたマイクロ流体チップであり、該マイクロ流体チップ上に配置された１つ以上のマイクロ流体チャネル（３０）を介して生理学的サンプル又は被験物質溶液（１１０）を搬送することができるマイクロ流体チップと、
前記マイクロ流体チップ上に配置された２つ以上の方形導波路構造（６２、６６、６７、６３）を備えたフォトニックシステム（６０）であり、近赤外、可視、又は近紫外域の励起光（６４、６５）を導波することができるフォトニックシステム（６０）と
を備え、
前記１つ以上のマイクロ流体チャネル及び前記２つ以上の導波路構造が、検出部位（２６）において互いに交差しており、特定のマイクロ流体チャネル及び特定の導波路構造が互いに交差するアッセイ領域（３２）において、前記導波路構造（６６、６７）のコア（１０４）の１つ以上の側方表面（１０５、１０５’）が、前記導波路構造内を導かれた光のエバネセント場が前記マイクロ流体チャネルの内側容積部の特定部分と重なるように、前記マイクロ流体チャネルの内側容積部に対して少なくとも部分的に対向した、アッセイユニット（１）。
【請求項２】
前記アッセイ領域（３２）において、前記導波路コア（１０４）の前記表面（１０５、１０５’）に１つ以上の捕獲スポット（２７）が配置されており、前記捕獲スポットが、前記導波路コアの前記表面（１０５、１０５’）に固定されたアッセイの捕捉分子（１１２）の被膜を含む、請求項１に記載のアッセイユニット。
【請求項３】
前記アッセイ領域（３２）において、前記導波路構造（６６、６７）の前記コア層（１０４）が基板層（１０２）上に配置され、前記基板層の反対側に位置する前記コア（１０４）の上側表面（１０５）のみが前記マイクロ流体チャネル（３０）の内側容積部に対向するように、前記コア層がクラッド層（１０６）に埋め込まれている、請求項１又は２に記載のアッセイユニット。
【請求項４】
前記アッセイ領域（３２）において、前記導波路構造（６６、６７）の前記コア層（１０４）が基板層（１０２）上に配置され、前記基板層の反対側に位置する前記コア（１０４）の上側表面（１０５）と２つの側方表面（１０５’）との両者が前記マイクロ流体チャネル（３０）の内側容積部に対向するように、前記コア層は少なくとも部分的にクラッド層（１０６）に埋め込まれていない、請求項１又は２に記載のアッセイユニット。
【請求項５】
前記導波路構造（６６）が、単一の導波路又は一束の導波路を含み、前記導波路が、単一モード導波路又は多モード導波路である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアッセイユニット。
【請求項６】
前記２つ以上の方形導波路構造（６２、６６、６７、６３）に光線を取り込む１つ以上の結合要素（７４）並びに／又は前記２つ以上の方形導波路構造（６２、６６、６３）から光線を取り出す１つ以上の結合要素（７５）を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のアッセイユニット。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のアッセイユニット（１）上で実行された免疫学的検定の結果を読み出すリーダユニット（２）であって、
アッセイユニットを解放可能に搭載するホルダと、
励起光線（６４）を発生する１つ又は複数の光源（７２）と、
前記ホルダに搭載されたアッセイユニットにより放出された蛍光発光（６８）を測定することができる検出ユニット（８０）と
を備える、リーダユニット（２）。
【請求項８】
前記検出ユニット（８０）が、前記ホルダに搭載されたアッセイユニット（１）の前記蛍光発光（６８）の２次元デジタル画像を取得することができる、請求項７に記載のリーダユニット。
【請求項９】
前記検出ユニット（８０）が、電荷結合素子チップ等のデジタル画像検出チップを備える、請求項７又は８に記載のリーダユニット。
【請求項１０】
前記ホルダに搭載されたアッセイユニット（１）の結合要素（７４）に向かって励起光線（６４）を導く光学要素を備える、請求項７〜９のいずれか一項に記載のリーダユニット。
【請求項１１】
前記ホルダに搭載されたアッセイユニット（１）の導波路（６３）から取り出された励起光（６５）の振幅を測定する検出要素（７６）を備える、請求項７〜１０のいずれか一項に記載のリーダユニット。
【請求項１２】
蛍光検出免疫学的検定を実行する診断装置（３）であって、請求項１〜６のいずれか一項に記載の１つ又は複数のアッセイユニット（１、１’）と、請求項７〜１１のいずれか一項に記載のリーダユニット（２）とを備える、診断装置（３）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、独立請求項の前文に係る、蛍光検出アッセイを実行するアッセイユニット、このようなアッセイユニットの結果を読み出すリーダユニット、並びにこのようなアッセイユニット及びリーダユニットを備えた診断装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
多種多様な生化学的被験物質に関して、例えば体液等の生理学的サンプルの分析が行われる場合がある。正確な医療診断は、健康状態及び疾病の識別、監視、予後診断、並びにコンパニオン診断等の診療の重要な一部である。医療診断システムの使用には、専用医療検査室及びいわゆるポイントオブケア（ＰｏＣ）検査という２つの主要な環境がある。
【０００３】
本明細書の説明における用語「生理学的サンプル」は、血液、尿、便、若しくは組織等、患者から得られる生物学的物質又はこのような生物学的物質に基づいてその後の分析用に作成されるサンプルであるすべての物質を含むものとする。
【０００４】
医療検査室において用いられるような検査室診断装置は一般的に、多種多様な分析能力を提供する。検査室診断装置は、高感度、正確、及び柔軟であり、高いスループットを提供する。ただし、高価であり、その操作には、十分な訓練を受けた人員が必要となる不都合もある。このため、このような診断装置は主に、最も効率的に利用可能な病院検査室及び集中型の医療検査室で用いられる。ただし、このような装置には、患者からの生理学的サンプルが必要であるため、分析を行う予定の医療検査室に上記サンプルを運んで、然るべく取り扱い及び保管を行う必要がある。結果として、分析の結果が利用可能となるのは、数時間後或いは数日後のみである。
【０００５】
益々多くの診断検査が患者の近くのポイントオブケアで、例えば、医療機関、病院の緊急治療室、救急車、患者側、自宅、又は屋外において、行われている。ポイントオブケア診断装置は、携行可能であり、分析結果が迅速に（数分以内に）得られる場合が多い。装置の使用は一般的に、はるかに容易であるため、特殊な訓練を受けていない医療従事者或いは患者自身によって診断検査を実行可能である。ポイントオブケア診断に用いられる装置は、少量のサンプルを分析し、低コストであり、使用が容易である。また、装置へのサンプルの導入後すぐに結果が得られる。ポイントオブケア診断検査は、身体の生化学的状態のスナップを提供する。病院及び診療所においては、医師により、臨床検査室分析器の代替又は補完として用いられる。また、病院外、自宅、又は屋外でも用いられる。
【０００６】
現行のポイントオブケア診断装置は、唯一の情報源として依拠するのに十分正確又は高感度ではない場合が多い。このため、臨床検査室においては、診断検査のやり直しが必要な場合が多い。これにより、１つの課題として、臨床検査室と同等の代替物を提供するのに十分高感度且つ正確なポイントオブケア診断装置を開発することが挙げられる。
【０００７】
近年、例えばＬ．Ｇｅｒｖａｉｓ、Ｅ．Ｄｅｌａｍａｒｃｈｅ、「Ｔｏｗａｒｄ  Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  Ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ−ｄｒｉｖｅｎ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  ａｎｄ  ＰＤＭＳ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ」、Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ  ９、ｎｏ．２３（２００９）：３３３０．ｄｏｉ：１０．１０３９／ｂ９０６５２３ｇ及びＬ．Ｇｅｒｖａｉｓ、Ｎ．ｄｅ  Ｒｏｏｉｊ、Ｅ．Ｄｅｌａｍａｒｃｈｅ、「Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  Ｃｈｉｐｓ  ｆｏｒ  Ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−Ｃａｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ」、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２３、Ｎｏ．２４（Ｊｕｎｅ  ２４，２０１１）：Ｈ１５１−Ｈ１７６．ｄｏｉ：１０．１００２／ａｄｍａ．２０１１００４６４という２つの論文に開示の通り、ポイントオブケア診断用の新世代マイクロ流体チップが開発されている。
【０００８】
血液１滴分（２０マイクロリットル未満）の単純な追加の後、ごく少量の統合試薬（数ピコリットル）を用いることにより、マイクロ流体チップは、高感度（ピコモル）且つ正確（１０％未満の変動係数）に数十の異なるタンパク質を多重検出することができる。これらのマイクロ流体チップは、強力ではあるものの、シリコンでの製造には依然として高価であり、光信号の取得及び定量化のための高価な高性能蛍光顕微鏡を必要としている。
【０００９】
蛍光は、生化学的検出に用いられる主要な変換技術のうちの１つであり、多様な被験物質、特に、ウイルス、タンパク質、核酸、小分子、及びイオンの検出に利用可能である。基底エネルギー状態にある蛍光分子（フルオロフォア）は、一定の励起波長の光子を吸収する。励起状態の低エネルギーレベルへの内部緩和の後は、光子が自然に放出されて、蛍光放射となる。
【００１０】
分析を目的として、測定可能な蛍光発光は、被験物質の存在に依存する必要がある。そして、２つの重要な手法が存在する。
【００１１】
一手法においては、適当に作成されたフルオロフォア（いわゆる蛍光マーカ）が被験物質に結合される。被験物質及び解放フルオロフォアの分離後は、検出された蛍光放射の量によって、被験物質の量を決定することができる。免疫学的検定の典型例において、第１のステップでは、蛍光マーカがタンパク質被験物質に対して選択的に結合される。蛍光マーカは、フルオロフォアを抗体に共有結合させて作成したものである。そして、フルオロフォア抗体錯体は、タンパク質被験物質に特異的に結合する。第２のステップにおいては、表面又は固相に固定された対応する抗体に対して、検出対象の特定の被験物質が選択的に結合される。その結果、検出対象の被験物質についても、フルオロフォアと一体的に固相に固定される。
【００１２】
特に、表面蛍光免疫学的検定は、製薬及び診断会社の主力商品である。マイクロアレイスライドは、何十万もの捕獲スポットを含むとともに、大規模多重タンパク質及び核酸アッセイの実行に利用可能である。蛍光検出は、非常に高感度であり、表面上の単分子を正確に検出可能である。このようなタンパク質及び核酸マイクロアレイスライド並びにマイクロアレイ光学リーダを統合した検査室ベースの強力なシステムは、Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、ｂｉｏ−Ｒａｄ、及びＡｒｒａｙｉｔ等の製造業者により販売されている。
【００１３】
小分子及びイオンの検出に用いられる別の手法において、被験物質は、フルオロフォアと相互作用することにより、その蛍光挙動に影響を及ぼす。得られる蛍光を被験物質のない予想蛍光と比較することにより、存在する被験物質の量を決定することができる。例えば、被験物質は、光子が放出される放射経路よりもフルオロフォア内の非放射緩和経路が好適となり、所与の励起パワーに対して得られる蛍光放射が低減されるように（いわゆる蛍光消光）、フルオロフォアと相互作用するようにしてもよい。
【００１４】
両方法に従って、ウイルス及びタンパク質等の被験物質を検出することができる。蛍光ラベルを用いたウイルスタイタリングには、ＶｉｒｏＣｙｔによる装置「ウイルスカウンタ２１００（Ｖｉｒｕｓ  Ｃｏｕｎｔｅｒ  ２１００）」を利用可能である。ウイルスには、核酸及びウイルスの膜タンパク質それぞれに特異的な２つの異なる蛍光染料が付着する。そして、ウイルスカウンタは、両方の蛍光出力が存在する事象をカウントする。これらのイベントをカウントするとともに流量と組み合わせることによって、ウイルス粒子の体積濃度を決定する。Ｍ．Ｍ．Ｆｅｒｒｉｓら（「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｖｉｒｕｓ  Ｃｏｕｎｔｅｒ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ」、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１７１（２０１１）、１１１．）は、ウイルスカウンタ２１００を用いて約１０６ｖｐ／ｍＬを上回るバキュロウイルスサンプルを定量化することにより、ウイルスタイタリングに関する現行の代表的な基準であるプラークアッセイと同等の信頼性のウイルス検出が得られることを報告している。
【００１５】
競合蛍光アッセイにおいて、サンプルからの非標識被験物質は、固相上の抗原部位に関してサンプルに追加された蛍光標識被験物質と競合する。Ｂ．Ｇｕｉｒｇｉｓら（「Ｇｏｌｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−ｂａｓｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｍａｌａｒｉａ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」、Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．４０２（２００２）、１０１９．）は、血液サンプル中のマラリア抗原を検出する競合蛍光免疫学的検定を開発した。
【００１６】
蛍光標識は、分子診断にも用いられ、ＤＮＡ又はＲＮＡ中の特定の配列を検出する。例えば、Ｒａｎｄｏｘは、家族性高コレステロール血症を検出するための「ＦＨアレイ（ＦＨ−Ａｒｒａｙ）」と称する装置を販売しており、嚢胞性線維症は、ＩｌｌｕｍｉｎａのＭｉＳｅｑＤｘプラットフォーム上で検出可能である。
【００１７】
蛍光免疫学的検定は、ホルモン、抗生物質残留物、又はフタル酸エステル等の小分子の検出にも用いられる。Ｓ．Ｊ．Ｚｏｈａら（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４（１９９８）、２０４５）は、蛍光免疫学的検定を利用して、甲状腺刺激ホルモンＴＳＨを検出した。Ｍ．Ｓｕｎら（Ｓｔｅｒｏｉｄｓ  ７５（２０１０）、４００）は、蛍光免疫学的検定を利用して、エストラジオールを検出した。Ｉｎｄｅｘｘ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓは、蛍光免疫学的検定であるＰａｒａｌｌｕｘを開発して、ミルク中の抗生物質残留物を検出した。Ｌ．Ｏｋｅｒｍａｎら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ＡＯＡＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、８６（２００３）、２３６）は、Ｐａｒａｌｌｕｘ免疫学的検定を利用して、牛及び豚の腎臓中の異なる抗生物質残留物を同時に検出した。水中のフタル酸ジシクロヘキシルを決定するため、Ｍ．Ｚｈａｎｇ、Ｙ．Ｓｈｅｎｇ（Ｊ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃ．２０（２０１０）、１１６７）は、競合蛍光免疫学的検定を開発して、グルコースを検出した。Ｈ．Ｓｈｉｂａｔａら（ＰＮＡＳ  １０７（２０１０）、１７８９４）は、グルコース認識部位、蛍光部位、スペーサ、及び重合部位で構成された蛍光単量体を合成した。蛍光強度を観察することによって、高感度範囲における血中のグルコース濃度の変動を良好にトレースすることができた。Ｔｅｒｕｍｏ  ＣａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒによるＣＤＩブラッドパラメータモニタリングシステム（ＣＤＩ  ＢｌｏｏｄＰａｒａｍｅｔｅｒＭｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）は、蛍光検出技術を用いて、ｐＨ、ｐＣＯ２、ｐＯ２、Ｋ＋、酸素飽和（ｓＯ２）等の血液ガスを検出することができる。
【００１８】
高感度蛍光検出システムは、その多くの便益にも関わらず、いくつかの制約を有する。通例、大型且つ複雑な光学縦列を備え、通常はレーザ走査共焦点顕微鏡法を採用する大型の光学リーダシステムが必要となる。また、上記システムの多くは、流体制御が非常に制限されているため、訓練を受けたピペット操作人員、ピペット操作ロボット、又は能動ポンピングが必要である。さらに、表面上及び大型反応槽中の生化学的反応は、拡散距離が長いため、輸送制限形態で動作することになる。これらの組み合わされた制限は、高感度蛍光検出がポイントオブケア診断において一般的ではないことを意味する。
【００１９】
その他の主要な課題のうちの１つとして、性能の低下なく信号を読み出す器具類の小型化が挙げられる。高性能光学顕微鏡に相当するものを、小型化によって、手持ち装置にする必要がある。
【００２０】
一手法としては、流体的、光学的、及び生化学的構造をチップ上に直接集積させる。機能的要素の近接及び（検査室機器と比較して）小型の距離により、高性能を維持しつつ、電力をはるかに効率的に使用可能である。
【００２１】
良好なアッセイの重要な一態様として、信号対雑音比（Ｓ／Ｎ）がある。これは、本開示の特定の枠組みにおいて、蛍光の不在化で同じセンサにより記録された信号の量に対する蛍光発光の存在下で記録された信号の量に対応する。大きなＳ／Ｎを表示するシステムは、負の検出事象よりも高い確実性の正の検出事象を区別することができる。また、検出された被験物質を定量化できるようにするには、大きなＳ／Ｎが必要である。この場合、検出可能な最低濃度すなわち検出限界は、信号対雑音比の関数である。同様に、アッセイの感度すなわちアッセイが区別可能な２つの濃度間の最小差は、Ｓ／Ｎに直接依存する。
【００２２】
標準的な蛍光アッセイにおいては、励起光が自由伝搬ビームを用いて与えられ、大きな領域を露光する。この方法には、主に３つの欠点がある。第１に、励起ビームは通例、１つ又は複数の検出部位よりもはるかに大きな領域を網羅する。これは、例えばチップ全体での励起の良好な均一性を確保するのに必要である。その結果、通例は励起パワーの大部分が未使用のままとなるため、フルオロフォアに対する励起の局所的なパワー密度が人為的に低減する、又はその結果所要励起パワーの総量が増大する。第２に、フルオロフォアにより吸収されなかった光は、検出システム内で依然として自由に伝搬する。これにより、全体的な信号対雑音比を低下させる大量の不要光が生じる。許容範囲のＳ／Ｎを実現するには、非常に高い品質のフィルタを使用することが必要となる可能性があるため、システムの総コストが増大する。第３に、検出領域外に励起光が存在すると、寄生蛍光発光の生成によって、Ｓ／Ｎに有害となる可能性がある。この寄生蛍光は、チップを構成する材料による発光（自己蛍光と称する場合が多い）又は検査対象のサンプル中の他の化合物からの発光が考えられる。後者は、全血又は血漿等の生理学的サンプルにおける蛍光アッセイの場合、非常に一般的である。
【００２３】
蛍光検出免疫学的検定の場合、良好なアッセイは、高蛍光マーカ密度の領域と低蛍光マーカ密度の領域とを効率的に識別する能力に依拠する。この能力には、（ｉ）蛍光マーカの効率的な励起、（ｉｉ）弱い蛍光発光信号からの励起光の完全な分離、（ｉｉｉ）自由開放マーカからの結合マーカの明確な隔離、そして最後に（ｉｖ）蛍光マーカの蛍光発光の高感度検出を必要とする。
【００２４】
上記要求に対処する一手法として、エバネセント波励起が用いられており、多様な検出システムが開発されている。エバネセント波は、導波路及びキャビティ等の光を強く閉じ込める構造において生成可能であり、このような構造の表面近傍にて、蛍光マーカを選択的に励起させることができる。以下では、導波路構造におけるエバネセント波の自然原理について、より詳しく説明する。
【００２５】
導波路は、光を閉じ込めるとともに、１つ又は２つの次元でのみ光を伝搬させる構造である。平面集積光学の範囲においては、スラブ導波路（１次元）及び方形導波路（２次元）という２種類の導波路を識別可能である。
【００２６】
スラブ導波路は、低屈折率材料の２層間に位置決めされた高屈折率材料の層から成る。高屈折率層に入射した光は、当該層により規定された平面内で自由に伝搬可能であるが、外側では自由に伝搬可能ではない（１次元閉じ込め）。この構成において、集束ビームの入射による導波の強度は、入射点と測定点との間の距離が長くなるにつれて、２次的に低下する。
【００２７】
方形導波路は、４つの辺を低屈折率の１つ又は複数の媒体で囲まれた高屈折率の方形断面を有する線形構造から成る。この構成において、導波路構造に入射した光は、高屈折率領域に沿って自由に伝搬可能であるが、各辺の低屈折率媒体側への退出は阻止される。これは、２次元閉じ込めに相当する。この種の構造は、延長距離にわたって光強度を大幅に変更することなく、光を容易に伝搬可能である。
【００２８】
強く閉じ込められた導波の近くのエバネセント波の存在は、平面導波路の例を検討することによって理解可能である。マクスウェル方程式に従って、ベクトルヘルムホルツ方程式を立証する伝搬電磁波は、電界成分に関して、以下のように記述することができる。
【数１】
0006659173.tif 000002
ここで、Ｅ（ｒ）はベクトル電界を表し、ｋは伝搬波ベクトルである。関連する磁界Ｈ（ｒ）についても、同じ式を記述可能である。したがって、ベクトル界（Ｅｘ、Ｅｙ、Ｅｚ、Ｈｘ、Ｈｙ、Ｈｚ）の各成分は、スカラーヘルムホルツ方程式を立証する必要があり、ψ（ｒ）は、上記電磁界成分のいずれかである。
【数２】
0006659173.tif 000003
【００２９】
ここで、非対称導波路の最も一般的な場合を検討する。これは、基板層（下層）、最も屈折率が高いコア層（中間層）、及びクラッド層（上層）という屈折率が異なる３つの層で構成されている。アッセイ装置の場合、クラッド層としては、可視域での屈折率ｎが１．３３〜１．３６の唾液、尿、血液、又は血漿等の生理学的媒体も可能である。比較として、コア及びクラッド層は、ガラス（可視域での屈折率ｎは通常１．４５〜１．９）、窒化ケイ素（ｎは約２）若しくは窒化ガリウム（ｎは約２．３８）等の半導体、又はより好都合なこととして、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、若しくはポリスチレン等のポリマーで構成可能である。上記ポリマーの屈折率ｎは通常、１．４５〜１．６のオーダが可能である。
【００３０】
なお、上述のすべての材料及び屈折率値は、スペクトルの可視域での動作に関して与えている。また、検査媒体は、複素屈折率の形態ｎ＝η＋ｉκ（κ≠０）でモデル化可能な特定の波長での吸収を表示することも可能であることに留意するものとする。
【００３１】
Ａ．Ｎｅｙｅｒ、Ｔ．Ｋｎｏｃｈｅ、Ｌ．Ｍｕｌｌｅｒ、「Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｏｗ  Ｌｏｓｓ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｗａｖｅｇｕｉｄｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  Ｍｏｕｌｄｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２９、ｎｏ．４（１９９３）：３９９−４０１及びＫ．Ｂ．Ｍｏｇｅｎｓｅｎ、Ｊ．Ｅｌ−Ａｌｉ、Ａ．Ｗｏｌｆｆ、Ｊ．Ｐ．Ｋｕｔｔｅｒ、「Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｗａｖｅｇｕｉｄｅｓ  ｆｏｒ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｏｐｔｉｃｓ  ４２、ｎｏ．１９（２００３）：４０７２−４０７９という２つの論文には、ポリマー系の導波路を具備した光学装置の２つの例が開示されている。
【００３２】
材料の選定とは無関係に、光学問題は、３つの層それぞれにおいてスカラーホルムヘルツ方程式を立証する電界（各磁界）分布の把握から成る。この問題は、２つの分極すなわち横電界（ＴＥ）及び横磁界（ＴＭ）に基づいて電磁波集合を分解することにより簡単化するのが一般的である。層状媒体のｚに沿って伝搬するＴＥ波の場合（ただし、ｘはスタック方向であり、ｙは無限に不変と考えられる）のみを考慮すると、上記問題は、以下のように書き直せる。
【数３】
0006659173.tif 000004
屈折率プロファイルは、以下の通りである。
【数４】
0006659173.tif 000005
βは、導波方向に沿った伝搬波数であり、ｄは、コア層の厚さである。
【００３３】
したがって、上式は、連立方程式の形態で書き直すことができ、それぞれ、考慮する層内で有効であって、各界面でのＥｙ（ｘ）及びその２次導関数の連続関係を立証する。連立方程式は、以下のように記述することができる。
【数５】
0006659173.tif 000006
ここで、
【数６】
0006659173.tif 000007
【００３４】
連立方程式は、奇数又は偶数の解を有し得る。偶数の場合のみを考慮すると、基本モードの場合と同様に、解は以下となる。
【数７】
0006659173.tif 000008
φＳは、位相シフトである。ここから、導波モードの電界の一部が空間的に、減衰定数
【数８】
0006659173.tif 000009
でそれぞれ基板及びクラッドに延入していることが分かる。これら２つの指数関数的に減衰するテールは、導波モードのエバネセントテールと称し、例えば界面近くに位置付けられたフルオロフォア等の吸収分子の励起に利用可能である。減衰定数は主に、相対屈折率及び導波路の非対称度の他、励起波長によって決まる。
【００３５】
フルオロフォアの励起にエバネセント波を用いる既存のシステムにおいて、エバネセント波は、導光構造の界面における入射波の内部全反射によって生じる。
【００３６】
導光構造は一般的に、光ファイバに基づくか否か又は平面状であるか否かに従って識別される。同様に、エバネセント波励起構造は、光ファイバ又は平面構造に基づいて開発されている。
【００３７】
例えば国際公開第９６／２９５８９号及び欧州特許出願公開第０１２８７２３号に記載のシステムは、光ファイバベース又は光ファイバ状の免疫学的検定用構造に相当する。光ロッド又はファイバの外側表面は、生化学的捕捉分子で被覆されている。そして、この官能化された表面に対して、検査対象の溶液を接触させる。標的及び捕捉分子は、生化学的反応によって互いに結合する。構造内の導波の形成によって、表面の直近に位置付けられた蛍光標識標的−捕捉錯体の局所的な励起が可能となる。溶液内に離れて位置付けられた蛍光標識標的分子及び解放蛍光ラベルは、励起が行われないため、寄生背景放射を生じない。同様に、表面上に位置付けられた蛍光標識標的−捕捉錯体のみが蛍光を導波構造中に再結合可能である。そして、後者は、光学フィルタによって励起光から隔離可能であり、光検出器を用いて測定される。
【００３８】
アッセイにおける蛍光のエバネセント励起用の平面構造の使用は、大きな注目を集めてきた。これらの構造は通例、低屈折率の１つ又は複数の基板層上に堆積された高屈折率の１つ又は複数の薄層で構成されている。導波層は、厚さが励起波長と同程度であるものの、横寸法は通例、はるかに大きい。
【００３９】
高い集積度並びに簡単な作製及び組み立てプロセスは、光ファイバに対する平面装置の大きな便益である。この原理に基づいて、多様なシステムが開発されている。米国特許第５３４４７８４号において、構造は、透明な誘電体基板と、基板より屈折率が低いバッファ層と、バッファ層上に堆積された誘電体薄膜の形態の導波層とを備える。上記導波層は、基板よりも屈折率が高い。そして、導波層上には、試薬の層が堆積され、検査対象の液体に対向する。適当な波長の励起光線は、背面から透明な基板を通過し、励起放射が全反射するように選定された一定の角度で基板とバッファ層との間の界面に衝突することで、エバネセント場がバッファ層に進入する。エバネセント結合の結果として、励起放射が高屈折率導波層内を伝搬する。そして、マーカのエバネセント励起により、蛍光標識分子又は粒子の表面への結合が明らかとなる。表面に結合されたフルオロフォアは、エバネセント場によって励起され、蛍光放射を発する。蛍光発光の一部は、システムを介して再結合し、背面の基板層を離れる狭円錐状の蛍光を生じることにより、背面で検出される。
【００４０】
国際公開第２００６／１３５３０６号は、導波層の上方に位置付けられた微細構造のパターンをさらに備えた類似のシステムを開示している。
【００４１】
米国特許出願公開第２０１１／０１２０２６号では、ガスケットにより分離された２つの対向導波層の組み合わせが用いられている。検査対象の溶液は、２つの導波層間に導入されるため、相互作用面積が効果的に増大する。
【００４２】
別の手法では、２次元導波路を用いることにより、被験物質の閉じ込め領域として機能するマイクロメートルスケール又はサブミクロンスケール構造へと励起波を案内する。この場合、導波構造は、垂直方向及び水平方向の両者において、励起波長と同等の寸法を有する。この構成の効果として、励起光は、反応部位近くのシステムに導入する必要がないものの、一定距離で構造内に結合した後、ほとんど減衰することなく反応領域へと導波可能である。
【００４３】
米国特許出願公開第２００２／１１０８３９号は、一連の２次元導波路の上側クラッドに微小井戸が集積されたシステムを記載している。上側クラッドは、誘電材料で構成されている。被験物質が位置付けられる井戸の底部は、導波モードのエバネセントテールと接触しているため、導波路コアに結合された蛍光マーカを励起可能である。
【００４４】
米国特許出願公開第２００８／１５２２８１号に記載の検出システムにおいても、同様の手法が取られている。１つ又は複数の井戸がマスク層に作製されている。これらの井戸それぞれの底部は、１つ又は複数の導波路のコアと接触している。
【００４５】
このようなシステムの別の効率的な実装については、Ｍ．Ｊ．Ｌｅｖｅｎｅ、「Ｚｅｒｏ−Ｍｏｄｅ  Ｗａｖｅｇｕｉｄｅｓ  ｆｏｒ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｔ  Ｈｉｇｈ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９，ｎｏ．５６０７（Ｊａｎｕａｒｙ  ３１，２００３）：６８２−６８６という論文に見られる。この研究においては、サブ波長の開口が金属層に作成され、金属−クラッド構造のゼロモード導波路を形成している。この構成により、蛍光発光の増強及び単一のフルオロフォアに至る低蛍光レベルの撮像が可能となる。
【００４６】
さらに別の手法においては、一連のマイクロ流体チャネルと併せて一連の励起波長を用いることによりアッセイを行うことができる。このようなシステムの実証については、Ｆ．Ｓ．Ｌｉｇｌｅｒ、Ｃｈ．Ｒｏｗｅ  Ｔａｉｔｔ、Ｌ．Ｃ．Ｓｈｒｉｖｅｒ−Ｌａｋｅ、Ｋ．Ｅ．Ｓａｐｓｆｏｒｄ、Ｙ．Ｓｈｕｂｉｎ、Ｊ．Ｐ．Ｇｏｌｄｅｎ、「Ａｒｒａｙ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｏｘｉｎｓ」、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７７，ｎｏ．３（Ｏｃｔｏｂｅｒ  １，２００３）：４６９−４７７という論文に見られる。上述の微小井戸の手法と比較して、このようなシステムには、作製及び実装が簡単という利点があり、使い捨ての装置を見越して魅力的である。また、この手法には、生化学的反応速度論の観点で明確な利点がある。それにも関わらず、このようなシステムには、主に２つの欠点がある。第１に、マイクロ流体装置には、然るべきフィルタリング機能がないため、前処理された生体液を使用する必要であり、検査室外での装置の使用が除外される。第２に、マイクロ流体層は、洗浄及び蛍光スポットの撮像に先立って剥がす必要がある。これらの作業によって、この方法をポイントオブケア装置に適用できなくなる。
【００４７】
論文「Ｐｌａｓｔｉｃ  ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ  ｆｏｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｌａｓｅｒｓ」（Ｃｈ．Ｖａｎｎａｈｍｅら、Ｏｐｔｉｃｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ８１７９，２０１１）には、蛍光に基づくアッセイを実現するためのラボオンチッププラットフォームが開示されている。マイクロ流体チップは、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）で構成されており、分析対象の流体を搬送するマイクロ流体チャネルと、当該マイクロ流体チャネルと交差する一連の導波路とを備える。励起放射を生じる集積有機半導体レーザは、分布ブラッグ格子（ＤＢＧ）上への有機染料（ＤＣＭ）のドープによりレーザ状態を形成した有機半導体（Ａｌｑ３）の堆積により得られた光学利得領域として実現されている。レーザは外部励起され、放出された励起光が導波路に結合する。光は、導波路及びマイクロ流体チャネルの交点にある相互作用領域に導かれ、懸濁被験物質又は溶液中の被験物質の蛍光を励起する。結果としての蛍光発光信号は、ＣＣＤ（電荷結合素子）カメラ及び分光計で検出される。
【００４８】
開示のマイクロ流体チップにおいては、高度のフォトニック集積（２次レーザ源、格子、及び導波路）によって、チップ作製が高レベルに複雑化するため、実際のポイントオブケアシナリオでのこのようなマイクロ流体チップの使用に好ましくない。まず、ＰＭＭＡにおけるＤＢＧのインプリンティングは、大規模に一貫して実行するのが複雑な故障耐性に著しく劣ったプロセスである。第２に、フォトニック回路の作成には、２つの高精度位置合わせステップが必要である。一方のステップは、ＰＭＭＡの深紫外線曝露によるＤＢＧと整列した導波路のパターン化から成る。他方のステップは、マスク掩蔽によるＤＢＧへの有機半導体及び染料の局所堆積である。最後に、導波路間測定結果の整合性は、チップ上の独立した集積レーザそれぞれの特性に大きく依存する可能性が高い。後者は、作製、環境、及び作業条件に対して高い感度を示すため、低い測定精度を予想する必要がある。
【００４９】
論文「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃａｌｌｙ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ａｌｌ−ｐｏｌｙｍｅｒ  ｃｈｉｐｓ」（Ｍ．Ｓｃｈｅｌｂら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｏｐｔｉｃｓ  １５（４）、０４１５１７、２０１０）には、別のラボオンチップシステムが開示されており、ＰＭＭＡ基板のエッチング及びパターン化によって、垂直に交差するマイクロ流体チャネル及び１つ又は複数の導波路の組み合わせを作成している。マイクロ流体チャネルと導波路との交点には、多様な蛍光標識種（リン脂質及び細胞）が堆積されている。励起光は、ガラスファイバによって平面導波路に取り込まれる。チャネルと導波路との交点においては、励起光が導波路の端面から取り出され、チャネル側壁に対向して、固定された蛍光ラベルを励起する。そして、光学顕微鏡により蛍光が検出される。
【００５０】
開示のシステムにおいて、励起光の結合は、導波路の端面に接着された光ファイバにより実現される。これは、使い捨てチップに基づくポイントオブケアシナリオにこのようなシステムを使用する可能性を無視している。また、円形の光ファイバと方形導波路との間のモード結合は、可能ではあるものと、高効率とするには設計に細心の注意を払う必要がある。文献には、この態様に関する情報が提示されていない。
【００５１】
２番目に大きな欠点は、マイクロ流体チャネルによる導波路の分裂に起因する。導光は、導波路から退出して自由空間を伝搬するように強制される。これらの状況においては、大量の励起光がマイクロ流体チップの側壁から現れた後、最終的な撮像システムによって収集されることが予想され、寄生散乱により信号対雑音比が大幅に低下する。
【００５２】
米国特許第６４３８２７９号は、リッジ型導波路構造及びマイクロ流体チャネルを備えたアッセイチップ並びにこのような装置を作製する方法を開示している。励起光は、第１の導波路をマイクロ流体チャネルまで導かれ、そこで導波路構造から離れてマイクロ流体チャネルに進入し、幅１μｍ以下で深さ０．１２５〜１μｍの相互作用容積部内に存在するサンプルを本質的に照射することによって、上記容積部内に存在するフルオロフォアを励起する。相互作用容積部を通過した後、励起光は、サンプル体積の照射に用いられた第１の導波路と異なり、当該第１の導波路の反対に位置付けられた第２の導波路によって再度収集される。放出された蛍光は、外部の光検出システムによって検出される。
【００５３】
第１の導波路は、相互作用容積部にて終端するため、例えば界面における回折及び反射並びにサンプル体積中の散乱によって、励起光が失われる。可能な限り多くの光を効率的に収集及び再結合するには、第２の導波路の幅を広げることが必要である。結果として、マイクロ流体チャネル後の第２の導波路中に存在する励起光の量は、大幅に低下する。光の損失は、不均一なサンプル液中の光の散乱によっても生じるため、マイクロ流体チャネルの結果的な減衰効果は再現不可能であり、その他の励起光は本質的に、別の定量的測定に利用できなくなる。
【００５４】
開示のシステムに要する寸法及び材料は、射出成型等の現行のプラスチックでの大量生産法に適していない。シリコン、二酸化ケイ素、及びフォトレジスト材料を通常用いる、フォトリソグラフィ及び反応性イオンエッチング技術が必要である。さらに、幅１μｍ以下で深さ０．１２５μｍ〜１μｍの相互作用容積部は、上記装置の代表的な被験物質マトリクスである全血中の細胞成分よりも小さい。ただし、サンプルとしての全血の場合、フィルタリングによって必ずしもすべての細胞成分が除去されるわけではないため、相互作用容積部を詰まらせる機会が多い。また、このように寸法が小さなチャネルは、流体サンプルに対する抵抗が高い。上記方法を受動マイクロ流体システムに実装するのは、非常に難しい。このため、開示のシステムでは、流体が電気泳動的に搬送される。
【００５５】
論文「Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  Ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  −  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ  ｏｎ  Ｐｌａｎａｒ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｗａｖｅｇｕｉｄｅｓ」（Ｏ．Ｈｏｆｍａｎｎら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７４、５２４３、２００２）には、実験装置が開示されており、蛍光に基づく免疫学的検定が起こり得る速度に対する閉じ込め流の影響を調べることができる。実験装置は、窒化ケイ素（ＳｉＮ）及び酸化ケイ素（ＳｉＯ２）で構成された半導体導波層と、光導波路上に配置されたポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）マイクロ流体フローセルとで構成されている。フローセルは、２つの入口を有し、一方は分析対象の溶液の注入に用いられ、第２の入口は、被験物質の相互作用断面の免疫反応領域との調整を可能とする溶液の注入に用いられる。蛍光の励起及び検出は、平面導波層を介して行われ、固定されたフルオロフォアの励起には、導波励起光のエバネセント部が用いられる。励起光は、格子によって取り込まれ、同じ格子を用いて蛍光発光が取り出される。蛍光信号の記録には、点検出器が用いられる。
【００５６】
開示の構成には、多くの不都合がある。まず、スラブ導波路／１次元導波層の使用は、励起効率全体に悪影響があり、横方向閉じ込めがないことから、効率が数桁劣っている可能性がある。このため、開示の構成は、特に、スラブ導波路を介しても検出が行われ、利用可能な光信号がさらに少なくなることから、励起光入射とアッセイ部位との間の距離が長い場合は、不適当で、適正に機能しないことが予想される。
【００５７】
第２に、ＳｉＮ及びＳｉＯ２等の材料の使用では、廉価な使い捨て装置を実現できない。第３に、開示の測定方式では、導波層に対する取り込み及び取り出しが行われる蛍光発光を測定する。この手法は、放出される蛍光の総量に関して非常に非効率的であるのみならず、空間識別を一切提供しない。したがって、この手法では、反応領域外の領域から不要な信号が生じる可能性がある。また、このようなシステムを多重用途に使用することができない。任意の異なるアッセイ領域は、その蛍光信号を同じ導波層に取り込み、特定の信号部分を互いに識別することができないためである。
【００５８】
以上の検出方法は、検出方式が局所的な有効屈折率の変化に基づく同種の平面導波構造を用いた方法から区別する必要があることを強調する。このようなシステムの一例は、米国特許第６３９５５５８号に開示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００５９】
本発明の全体的な目的は、上述及び他の問題に関して技術水準を向上させるアッセイユニット及びこのようなアッセイユニットを備えた診断装置を提供することである。
【００６０】
特に、本発明に係るアッセイユニット及び診断装置は、高感度且つ高精度な蛍光検出アッセイ検査の実行及び励起パワーの効率的な利用が可能であるものとする。
【００６１】
本発明に係るアッセイユニット及び診断装置は、透過又は反射に基づく蛍光検出システムよりも高い信号対雑音比を提供するものとする。
【００６２】
本発明に係るアッセイユニット及び診断装置は、広い領域に分布した多様なプローブ／アッセイ領域に均一なエバネセント波励起場を与えるものとする。
【００６３】
異なるアッセイ領域の蛍光信号は、明確に識別できるものとする。
【００６４】
アッセイの結果は、最先端のものよりも複雑ではない光検出システムを用いてアクセスできるものとする。
【００６５】
本発明に係るアッセイユニットは、可能な限り少ない製造ステップにより、低コストで生産可能であるものとするのが好都合である。
【００６６】
生理学的サンプルとの接触又は使用後の別様の汚染に至る本発明に係る診断システムのすべての要素は、一般的には使用後に廃棄することになるアッセイユニットの一部であるものとするのが好都合である。
【００６７】
本発明に係るアッセイユニットは、前処理なく生理液を処理可能であるものとするのが好都合である。
【００６８】
上記及び他の目的は、独立請求項に係るアッセイユニット、リーダユニット、及び診断装置によって実質的に実現される。別の有利な実施形態については、従属請求項及び本明細書から得られる。
【課題を解決するための手段】
【００６９】
本発明は、添付の特許請求の範囲に記載の特徴のうちの１つ若しくは複数並びに／又は以下の特徴及びその組み合わせのうちの１つ若しくは複数を含んでいてもよい。
【００７０】
本発明に係る、１つ又は複数の生理学的サンプル上で蛍光検出アッセイを実行するアッセイユニットは、配置された１つ又は複数のマイクロ流体チャネルを介して生理学的サンプル又は被験物質溶液を搬送することができる、マイクロ流体システムを備えたマイクロ流体チップと、近赤外、可視、又は近紫外域の励起光を導波することができる、チップ上に配置された２つ以上の方形導波路構造を備えたフォトニックシステムと、を備える。１つ又は複数のマイクロ流体チャネル及び２つ以上の導波路構造は、検出部位において互いに交差している。特定のマイクロ流体チャネル及び特定の導波路構造が互いに交差するアッセイ領域において、導波路構造のコアの１つ又は複数の側方表面は、導波路構造内を導かれた光のエバネセント場がマイクロ流体チャネルの内側容積部の特定部分と重なるように、マイクロ流体チャネルの内側容積部に対して少なくとも部分的に対向している。
【００７１】
本発明の説明において、方形導波路構造／２次元導波路は、低屈折率の媒体により囲まれた一定の屈折率の本質的に方形の断面を有する本質的に直線状の任意の構造を含むことによって、導波路構造に取り込まれた光が直線状構造寸法に沿って自由に伝搬可能である一方、その他２つの寸法に閉じ込められることを意図している。これには、例えば台形断面の直線状導波路構造も含む。
【００７２】
エバネセント場を用いることにより、励起光がマイクロ流体チャネルと交差する場合のように、励起光パワーを導波路で大幅に失うことなく、マイクロ流体チャネルの重畳領域に存在するフルオロフォアを励起可能である。これにより、本質的に均一な励起光場を有するとともに導波路構造を１つだけ有し、サンプル体積中の散乱又は界面における反射等に起因する損失のない、２つ以上のマイクロ流体チャネルを後で提供可能となる。
【００７３】
本発明に係るアッセイユニットの有利な一実施形態においては、導波路コアの表面に１つ又は複数の捕獲スポットが位置付けられ、捕獲スポットが、上記コア表面に固定されたアッセイの捕捉分子の被膜を含む。
【００７４】
例えば、捕獲スポットは、免疫学的検定の捕獲抗体を含んでいてもよい。
【００７５】
１つのチップ（「光流体チップ」と称し得る）上でアッセイ検査のフルオロフォアを励起するのに必要なマイクロ流体システム及びフォトニックシステムの両者を統合することにより、チップ上への微細構造の作製に既知の技術を用いて、このようなアッセイユニットをコスト効率良く生産可能である。得られるアッセイユニットは、使用後に廃棄する必要があるが、廉価な部品のみを含む。
【００７６】
本発明に係る上記のようなアッセイユニットの有利な一実施形態においては、アッセイ領域において、導波路構造のコア層が基板層上に配置され、基板層の反対のコアの上側表面のみがマイクロ流体チャネルの内側容積部に対向するように、クラッド層に埋め込まれている。
【００７７】
本発明に係る上記のようなアッセイユニットの有利な別の実施形態においては、アッセイ領域において、導波路構造のコア層が基板層上に配置され、基板層の反対のコアの上側表面及び２つの側方表面の両者がマイクロ流体チャネルの内側容積部に対向するように、少なくとも部分的にクラッド層に埋め込まれていない。
【００７８】
導波路構造は、単一の導波路又は一束の導波路を含み、上記導波路が、単一モード導波路又は多モード導波路であるのが好都合である。
【００７９】
本発明に係るアッセイユニットは、１つ若しくは複数の導波路に光線を取り込む１つ若しくは複数の結合要素並びに／又は１つ若しくは複数の導波路から光線を取り出す１つ若しくは複数の結合要素を有するのが好都合である。
【００８０】
本発明に係る、上述の本発明に係るアッセイユニット上で実行された免疫学的検定の結果を読み出すリーダユニットは、アッセイユニットを解放可能に搭載するホルダと、励起光線を発生する１つ又は複数の光源と、ホルダに搭載されたアッセイユニットにより放出された蛍光発光を測定することができる検出ユニットと、を備える。
【００８１】
上記のようなリーダユニットの有利な一実施形態において、検出ユニットは、ホルダに搭載されたアッセイユニットの蛍光発光の２次元デジタル画像を取得できる。
【００８２】
本発明に係るリーダユニットにおいて、検出ユニットは、ＣＣＤ（電荷結合素子）チップ等のデジタル画像検出チップを備えるのが好都合である。
【００８３】
本発明に係るリーダユニットの特に有利な一実施形態は、ホルダに搭載されたアッセイユニットの結合要素に向かって励起光線を案内する光学要素を備える。
【００８４】
本発明に係るリーダユニットは、ホルダに搭載されたアッセイユニットの導波路から取り出された励起光の振幅を測定する検出要素を備え得る。
【００８５】
上記のような特徴にはそれぞれ、例えば異なる導波路構造により励起されたアッセイ領域の蛍光信号が定量的に比較可能であるという利点又は異なる導波路構造の減衰特性に対する製造プロセスの影響を補正可能であるという利点がある。
【００８６】
本発明に係る、蛍光検出免疫学的検定を実行する診断装置は、上述の本発明に係る１つ又は複数のアッセイユニットと、上述の本発明に係るリーダユニットと、を備える。
【００８７】
以下、本発明のより深い理解を容易にするため、添付の図面を参照する。これらの参照は、本発明を制限するものと解釈すべきではなく、ほんの一例に過ぎないものである。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】コンピュータシステムと接続された本発明に係る診断装置の模式図である。
【図２】マイクロ流体システム及びフォトニックシステムを備えた本発明に係るアッセイユニットの一実施形態の模式図である。
【図３】本発明に係るアッセイユニットのフォトニックシステムを含む、本発明に係る診断装置の光学系の模式側面図である。
【図４】多数の導波路及びマイクロ流体チャネルの交差点における捕獲スポットのマトリクスを含む、本発明に係るアッセイユニットの模式上面図である。
【図５】マイクロ流体チャネルの軸に沿った捕獲スポットにおける導波路構造の考え得る形状を通る模式断面図であって、（ａ）被験物質溶液が捕獲スポットを通過していない状態を示すとともに、（ｂ）被験物質溶液が捕獲スポットに存在する状態であって、電界振幅を示している。
【図６】導波路構造の軸に沿った検出部位における導波路構造の２つの変形例としての考え得る形状を通る模式断面図である。
【図７】捕獲スポットにおける導波路構造及びマイクロ流体構造の斜視図である。
【図８】マイクロ流体チャネルの軸に沿った捕獲スポットにおける導波路構造の別の考え得る形状を通る模式断面図であって、（ａ）被験物質溶液が捕獲スポットを通過していない状態を示すとともに、（ｂ）被験物質溶液が捕獲スポットに存在する状態を示している。
【図９】突出形状での捕獲スポットにおける導波路コアの模式図であって、（ａ）側面図及び（ｂ）上面図である。
【図１０】捕獲スポットにおける導波路構造及びマイクロ流体チャネルの４つの有利な形状の模式図である。
【図１１】検出部位の検出マトリクスの詳細を示した模式図であって、（ａ）導波路構造が埋め込まれた状態を示すとともに、（ｂ）導波路構造が突出した状態を示している。
【図１２】本発明に係るアッセイユニットにおける導波路アレイの２つの有利な励起光強度分布構成の模式図である。
【図１３】導波路を用いた光キャビティの励起用の２つの有利な構成の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００８９】
以下に提供する例は、本発明の改良された例示であるが、本発明を本明細書に開示の特徴に限定するのには適していない。以下、同一又は少なくとも機能の観点で同一の構成要素には、同一又は少なくとも同等の参照番号を付している。
【００９０】
蛍光検出アッセイ検査の一例として蛍光検出免疫学的検定を用いることにより、本発明を説明する。ただし、当業者には明らかなことだが、本発明は、フルオロフォアが永久的又は分析プロセスのある段階で表面に固定されるその他任意の蛍光検出アッセイ技術によっても実現可能である。このため、マイクロ流体チップ上の蛍光検出免疫学的検定に関して説明する実施形態は、ほんの一例を表すに過ぎず、本発明をこの特定種類のアッセイに限定するものではない。
【００９１】
図１には、本発明に係る診断装置３の例示的な一実施形態を模式的に示す。診断装置３は、使い捨てのマイクロ流体チップ１の形態であり、蛍光アッセイ検査を実行する本発明に係るアッセイユニット１と、診断検査の蛍光アッセイの結果をアッセイユニット１から読み出し得る再利用可能なリーダユニット２とを備える。２つの別の使い捨てアッセイユニット１’は、後々使用できる状態となっている。
【００９２】
図示のリーダユニット２の例示的な実施形態は、アッセイユニットを解放可能に搭載可能なスロットをケーシングの側壁に備える。図中、アッセイユニット１は、スロットに挿入された状態を示している。ただし、当業者であれば、リーダユニット及びアッセイユニットを解放可能な様態で動作可能に結合できる他の可能性を認識するであろう。
【００９３】
リーダユニット２は、一般的なデータリンク５（例えば、ＵＳＢ接続又はＷＬＡＮ接続）を介して一般的なコンピュータシステム４と接続されている。所与の例に示すコンピュータシステム４は、標準的なコンピュータ装置すなわちディスプレイ及びキーボードを備えたデスクトップコンピュータである。ただし、コンピュータシステムは、例えばモバイルコンピュータ、タブレット装置、スマートフォン等、携帯型のコンピュータ装置であってもよい。
【００９４】
使い捨てのアッセイユニット１は、１回使用の蛍光アッセイ要素を備える。また、サンプル物質と接触するため、使用により汚染されるその他すべての部品を備えるのが好都合である。再利用可能なリーダユニット２は、２回以上使用可能なすべての部品、特に、励起及び検出システムの高価な光学及び電子部品の他、検出、評価、及び装置制御に必要な電子部品を備えるのが好都合である。
【００９５】
本発明の特定の実施形態に応じて、コンピュータシステム４は、リーダユニットからの測定データの取得及び上記データの評価、評価データの診断結果としてのユーザへの提示、並びに／又は動作命令のリーダユニットへの送信等に用いられるようになっていてもよい。ただし、このような機能の一部又は全部をリーダユニットに集約することも可能であり、後者の場合は、独立型の診断装置として使用することも可能である。
【００９６】
本発明に係る使い捨てのアッセイユニット１は、その２つの主要な機能的構成要素としてマイクロ流体システム２０及びフォトニックシステム６０を備えたマイクロ流体チップとして実現されるのが好都合である。
【００９７】
図２には、本発明に係るアッセイユニット１の有利な一実施形態を模式的に示しており、マイクロ流体システム２０及びフォトニックシステム８０の機能的模式図である。
【００９８】
マイクロ流体システム２０は、下流方向に、注入パッド２２、サンプル作成部２４、検出部位２６、及び毛細管ポンプ２８を備える。異なる部分は、診断検査手続き中に被験物質溶液が進行可能である狭い流体チャネル３０によって流体的に接続されている。注入パッド２２においては、診断検査を実行する流体サンプルがシステムに導入される。サンプル作成部２４においては、後で分析するサンプルが作成される。サンプル作成部は、サンプル及び実行する分析検査の種類に応じて、フィルタ、溶解、及び培養室等の特徴を含み得る。培養室においては、例えば被験物質分子の蛍光マーカとの結合反応等、必要な予備化学反応が起こる。検出部位２６においては、固定された捕捉抗体と被験物質溶液が相互作用し、結果としての蛍光信号が測定される。毛細管ポンプ２８は、診断検査手順に従い、流体経路に沿って、サンプル流体又は被験物質溶液をそれぞれ搬送する。
【００９９】
アッセイユニットのフォトニックシステム６０は、励起光線６４を１つ又は複数の入力導波路６２に取り込む１つ又は複数の結合要素７４を備える。上記導波路６２は、励起光６４を検出部位２６側へと案内し、励起光のエバネセントテールが導波路表面近くの蛍光マーカを励起することによって、放出された蛍光が検出される。これについては、以下により詳しく説明する。
【０１００】
フォトニックシステムの導波路は、本質的に垂直な角度で検出部位２６と交差する。そして、出力導波路６３は、その他の光を分離して他の結合要素７５へと案内し、ここで光がフォトニックシステムから取り出される。
【０１０１】
図３では、本発明に係る診断装置３の光学系７０を模式側面図で示す。光学系は、一方において、使い捨てアッセイユニット１のフォトニックシステム６０の他、リーダユニット２の一部として有利に実現されるとともに再利用可能な光学要素を具備する。
【０１０２】
光学系７０は、励起光源７２を備える。光源は、例えばレーザダイオード、発光ダイオード（ＬＥＤ）、スーパールミネセントダイオード等として実現可能であり、フルオロフォアの励起に必要な励起光６４を発生する。
【０１０３】
レーザダイオードを使用することには、特に横方向及び縦方向の両者において単一モードである場合、主に２つの利点がある。得られる非常に狭い線幅によれば、線幅が広い光源の場合よりも、励起及び放出のスペクトル領域の分離が容易となる。第２に、レーザは、大きな光学的拡張の利益を享受するため、効率的に光を導波路に取り込むのに理想的で適している。
【０１０４】
単一の光源ですべての導波路に供給する代わりに、例えばダイオードアレイ等の多数の光源を使用可能である。光源７０は、本発明に係る診断装置３の再利用可能なリーダユニット２の一部として実現されるのが好都合である。ただし、使い捨てのアッセイユニット１の一部として実現されていてもよい。
【０１０５】
光学系は、光源７２により放出された励起光線６４を平面導波路６２に取り込んで光を検出部位２６側へと導く傾向にある結合要素７４をさらに備える。結合要素７４は、フォトニックシステム６０の一部として使い捨てのアッセイユニット／マイクロ流体チップ１に含むことも可能であるし、再利用可能なリーダユニット２に含まれる外部要素として設けることも可能である。
【０１０６】
結合要素７４は、例えば励起光線６４を導波路入力面に集束させるレンズとして、図示のように光線６４をエバネセント的に導波路６２に取り込むプリズムとして、又は格子結合器若しくはマイクロミラー等の垂直結合器として実現可能である。光を面から導波路に取り込むレンズは、レーザモードと導波モードとが良好にモード整合していることを前提として、高い効率性という利点がある。それでもなお、この構成は、位置合わせ不整合の影響を受ける。プリズム結合器は、機械的に安定しているものの、導波路のコアから非常に短い距離（通常、１００ｎｍ以下のオーダ）でプリズムを配置して効率化する必要がある。格子結合器は、導波路のコア上に直接又はコア近傍に格子が作製されるため、レンズ又はプリズム等の如何なる外部要素等も不要となることが利点である。格子結合器は、寸法は小さいものの、断熱テーパとの併用によって、光源位置合わせに関する機械公差を緩和することができる（Ｄ．Ｔａｉｌｌａｅｒｔら、「Ａｎ  Ｏｕｔ−ｏｆ−Ｐｌａｎｅ  Ｇｒａｔｉｎｇ  Ｃｏｕｐｌｅｒ  ｆｏｒ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｂｕｔｔ−Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｐｌａｎａｒ  Ｗａｖｅｇｕｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｍｏｄｅ  Ｆｉｂｅｒｓ」、ＩＥＥＥ  Ｊ．Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、Ｖｏｌ．３８、Ｎｏ．７、Ｊｕｌｙ  ２００２参照）。
【０１０７】
別の変形例において、光学系７０は、１つ又は複数のＹ分岐又はスプリッタ（図示せず）を具備することにより、単一の導波路に取り込まれた励起光を一連の後続の分配導波路に正確に分配する。これらの分配導波路はそれぞれ、励起光を取り込み部位から検出部位へと搬送する。
【０１０８】
検出部位２６は、導波路又はキャビティ等のフォトニック構造から成る。導波路は、伝搬方向に対して垂直な方向に、数マイクロメートル以下のオーダの寸法で、数ミリメートルに達し得る距離にわたって、大量の光パワーを閉じ込めることができるため、蛍光励起には非常に有利な構造である。強閉じ込め型導波路の界面におけるエバネセントテールは、フルオロフォア等の隣接分子によって吸収可能であり、蛍光発光を再放出可能であり、この蛍光発光が後で検出される。
【０１０９】
光学的なマイクロ又はナノキャビティは、光を一時的に閉じ込めることができる。キャビティを導波路と組み合わせて使用することにより、導波路単独の場合に対して付加的な利点を与える。キャビティモードと共振した所与の量の電磁エネルギーは、一定の時間にわたって、キャビティ内に格納されたままとなる。この時間は、その線質係数（Ｑ）によって与えられる。キャビティの線質係数が大きくなると、キャビティ内のエネルギーが減衰するのに要する時間が長くなる。この現象は、キャビティに格納された光が標準的な伝搬波よりも吸収分子（フルオロフォア等）とその近傍で長時間にわたり相互作用可能であるため、蛍光励起に使用できて都合が良い。これは、所与の導波路入力パワーに対して、蛍光信号の大幅な増大に直結する。
【０１１０】
光学的なマイクロ又はナノキャビティには、主に２つの種類がある。第１の種類は、ウィスパリングギャラリモード（ＷＧＭ）共振器に対応し、マイクロリング、マイクロトロイド、及びマイクロスフェアを具備する。第２の種類は、ミラーアンドフォトニックバンドギャップ（ＰＢＧ）共振器に対応するとともに、ファブリペロー（ＦＰ）キャビティ、分布ブラッグ共振器（ＤＢＲ）、及びフォトニック結晶（ＰｈＣ）キャビティを具備しており、それぞれ、多様な構成で実装可能である。
【０１１１】
検出部位には、１つ又は複数のアッセイスポット３２が設けられており、特定の被験物質タンパク質の捕捉抗体が導波路構造の表面に固定され、被験物質溶液と接触する。免疫学的検定に対する肯定応答の場合、上流の培養室２４で蛍光標識済みの標的抗原／被験物質タンパク質は、導波路構造の表面近くの固定された抗体により捕捉され、フルオロフォアが表面上に凝集する。導波路構造に閉じ込められた励起光の電磁界のエバネセントテールは、凝集した蛍光マーカを励起し、これが後に蛍光６８を放出する。
【０１１２】
蛍光マーカの蛍光発光６８は、アッセイ領域３２のマトリクスの上方に配置された検出ユニット８０によって検出される。考え得る一実施形態において、検出ユニット８０は、ＣＣＤカメラシステムとして実現可能である。このような実施形態によれば、多数のアッセイ領域３２の蛍光発光信号の並列検出が可能である。検出ユニット８０は、再利用可能なリーダユニット２の一部として実現されるのが好都合である。
【０１１３】
また、この代替又は追加として、検出ユニットは、アッセイ領域３２の反対側の導波路構造に設けることができる。
【０１１４】
光学系の詳細設計に応じて、別の光学要素を設けることにより、検出器の感度を最適化するようにしてもよい。例えば、検出に先立って励起迷光を除去する帯域フィルタを適用可能である。
【０１１５】
励起光のその他の部分６５は、検出部位から分離して別の導波路６３を導かれる。そして、不要な励起光は、第１の結合要素７４に類似する別の結合要素７５を介して、導波路６３及びフォトニックシステム６０から取り出される。その後、例えば集束レンズ及びフォトダイオード等の適当な検出要素７６によって、光振幅を検出可能である。得られた信号は、例えば感度及び精度の向上のため、個々の使い捨てアッセイユニット１、１’の具体的な減衰値を考慮する基準として使用することも可能である。
【０１１６】
別の手法においては、不要な励起光が反射してフォトニックシステム６０に戻り、その結果、散乱等に起因する検出部位の不要な背景雑音が生じることのないように、その他の光線６５が吸収される。
【０１１７】
図４は、本発明に係るアッセイユニット１の検出部位２６を示した模式上面図である。左側では、４つの同じ導波路６２が励起光６４を取り込み構造（図示せず）から中央の検出部位２６側へと案内している。検出部位の通過後、出力導波路６３は、その他の光６５を分離して、右側の取り出し構造（図示せず）側へと導く。
【０１１８】
検出部位２６において、導波路は、上流の培養室（図示せず）から検出部位２６を通って下流の排出部位等へと被験物質溶液２５を搬送する４つのマイクロ流体チャネル３０と交差している。マイクロ流体チャネル３０が導波路構造６６と交差する場所であるアッセイ領域３２において、フルオロフォアマーキング被験物質溶液は、導波路構造の表面に固定された捕捉抗体と接触する。あるアッセイ領域３２の特定の抗体に対応する蛍光標識抗原が被験物質溶液中に存在する場合、被験物質−フルオロフォア錯体は、表面に凝集し、導波路構造において、励起光波のエバネセントテールにより励起可能である。このような導波路構造の考え得る実施形態については、以下に説明する。
【０１１９】
考え方に応じて、異なる標的タンパク質用の固定捕捉抗体をＮ個の異なるアッセイ領域それぞれに提供することは、大抵可能であり、Ｎ個のタンパク質の並列多重免疫学的検定検出が可能となる。或いは、Ｎ個未満のタンパク質が対象ではあるものの、より高い信頼性で冗長検査及びコントロールを提供するようにしてもよい。
【０１２０】
図５には、検出部位における導波路構造６６の考え得る有利な形状を模式的に示している。導波路構造は、基板層１０２、屈折率が基板１０２よりも高いコア層１０４、及び屈折率がコア層１０４よりも低いクラッド層１０６で構成されている。コア層の上側表面１０５は、検査媒体１１０（通常、血漿等の生理溶液）と直接接触する。図５（ａ）に示すように、上記上側表面には、固定捕捉抗体１１２が設けられ、捕獲スポット２７を構成している。捕捉抗体１１２は特異的に、特定の抗原すなわち検出すべきタンパク質分子１１４と結合する。その結果、捕獲スポット２７は、このようなタンパク質に対してのみ、選択的に感度を有する。
【０１２１】
媒体１１０中の上記特定抗原１１４の存在下において、抗原−抗体錯体１１７は、表面１０５上に形成される。図５（ｂ）に示すように、豊富に存在する蛍光マーカ１１６と錯体１１８を形成済みの抗原１１４は、コア層の表面１０５に固定された捕捉抗体１１２と結合する。
【０１２２】
図５（ｂ）の右側の模式的な曲線は、表面に垂直な軸に沿った励起光の第１の導波モードの電界分布を表している。電界の大部分は導波路コア１０４内に位置付けられているが、２つのエバネセントテールは、導波路コアの各側に１つずつ、コアの外側に存在する。基板層１０２と検査媒体１１０との間の屈折率プロファイルの不均衡のため、より大きなエバネセントテールが基板に位置付けられる一方、検査媒体１１０に位置付けられるエバネセントテールは小さい。このため、励起光は本質的に、コア層表面のごく近傍の被験物質溶液１１０内にのみ存在しており、表面に近いフルオロフォア１１６のみが励起光子を吸収して、後で蛍光光子を放出することができる。被験物質溶液内の未反応蛍光マーカ１１６は、励起されないため、信号背景が低下して信号対雑音比が高くなる。
【０１２３】
図５（ｂ）の寸法は、完全に模式的である旨、述べておかなければならない。抗体のサイズは、約１０ｎｍであり、導波路及び電界の寸法は、数マイクロメートルの範囲である。
【０１２４】
コア表面１０５の隣接領域に捕捉抗体が設けられていたとしても、有害ではない。捕捉抗体被膜の作製に際しては、導波路コア表面と隣接クラッド層表面とを識別しないのが製造上容易となり得る。クラッド層上の抗体に付着したフルオロフォアは、励起場がないことから、単に励起されないだけである。
【０１２５】
図６（ａ）は、導波路コア１０４の軸に沿った断面視において、本発明に係る診断装置１の検出部位２６上の導波路６６構造及びマイクロ流体チャネル３０構造の考え得る構成を模式的に示している。フォトニック構造及びマイクロ流体構造の両者がチップの基板層１０２上に実装されている。図５の例と同様に、コア層１０４は、周囲のクラッド層（不可視）に埋め込まれている。マイクロ流体チャネル３０は、コア層１０４の上方で延びたクラッド層１０６中に位置付けられている。基板クラッド層１０６の上には、スーパーストレート層１０８が堆積され、マイクロ流体チャネル３０のカバーを構成している。
【０１２６】
捕獲スポット２７においては、マイクロ流体チャネル３０が１つ又は複数の導波路コア１０４と交差している。この部位では、導波路コア１０４の表面１０５が開放され、捕捉抗体１１２が設けられている。検出スポット上のフルオロフォアの蛍光発光を光学的に検出する必要があるため、スーパーストレート層１０８及び／又は基板層１０２は、可視域において透明となるように選定されている。
【０１２７】
図６（ｂ）に示すように、第２の考え得る構成においては、フォトニック構造が基板１０２上に実装され、図５の例と同様に、導波路コア１０４がクラッド層（不可視）に埋め込まれている。一方、マイクロ流体構造３０は、スーパーストレート層１０８の中にある。
【０１２８】
上記図示の通り複雑な構造を作製するため、基板１０２上には、異なる材料の層を堆積可能である。或いは、２つの要素を別個に作製し、最終的に互いに重ね合わせることによって、完全なチップ構造を形成することができる。例えば、クラッド層及び埋め込み導波路コア１０４を基板上に堆積させ、マイクロチャネル３０を備えたスーパーストレートカバー１０８を作製し、カバー１０８を基板部に搭載することによって、図６（ｂ）に示す構造を製造可能である。
【０１２９】
アッセイ領域３２で交差している導波路構造６６及びマイクロ流体チャネル３０の構造をさらに説明するため、図７は、図６（ｂ）に類似する構造の切り出し詳細を斜視で示している。チップ基板層１０２の上には、導波路コア１０４が堆積され、クラッド層１０６に埋め込まれている。クラッド／コア層１０６／１０４の上には、スーパーストレート層１０８が堆積され、その内部にマイクロ流体チャネル３０が位置付けられている。チャネル３０が導波路コア１０４と交差する場所では、コアの表面１０５（暗灰色領域）の他、隣接クラッド層の表面（明灰色領域）が開放されている。開放コア表面１０５の少なくとも一部には、固定捕捉抗体の層が設けられ（図示せず）、捕獲スポット２７を構成しており、ここには、フルオロフォアマーキング被験物質タンパク質が後で付着可能である。
【０１３０】
動作時、マイクロ流体チャネルには、被験物質溶液が充填されるため、コア層１０４及びクラッド層の表面を覆うことになる。励起光は、コア層１０４中を導かれる。励起光場のエバネセントテールは、コア表面１０５のごく近傍の領域と重なる。そして、当該領域に存在するフルオロフォアが励起され、蛍光放射を放出する。蛍光放射の一部は、透明なスーパーストレート層１０８を通過するため、外側で観測７８可能である。
【０１３１】
図８には、捕獲スポット２７における導波路構造６６の別の形状を模式的に示している。この例では、埋め込みクラッド層を使用しない。その結果、コア層１０４が基板層１０２から突出している。コア層は、側方表面１０５’及び上側表面１０５の両者が検査溶液１１０に接触する。捕捉抗体１１２は、コア層のアクセス可能なすべての表面に固定されているため、総相互作用面積ひいては利用可能な蛍光信号及び信号対雑音比が大きくなる。
【０１３２】
図５〜図７に示すような埋め込み導波路コア形状の場合は、アッセイ領域３２において、導波路コア１０４が直接、上側表面がスーパーストレート層１０８又はクラッド層１０６により覆われた部分から被験物質溶液と接触する部分へと変化する。
【０１３３】
図８に示すような突出導波路コア形状においては、基板層、クラッド層、及びスーパーストレート層にコアが埋め込まれた埋め込み形状から、コアの３つの表面が開放されて被験物質溶液と接触する捕獲スポットでの突出形状まで、断熱変化を与えるのが好都合である。
【０１３４】
図９には、上記のように有利な形状の考え得る一実施形態を示している。導波路コア１０４は、基板１０２上に堆積され、両側面でクラッド層１０６に埋め込まれている。導波路構造は、透明なスーパーストレート層１０８によって覆われ、その中にマイクロ流体チャネル３０が形成されている。マイクロ流体チャネル及び導波路６２は、垂直な角度で交差している。アッセイ領域３２において、導波層１０４がマイクロ流体チャネル３０の左側の側壁３１から離れると、コア１０４がまず、クラッド層１０６において横方向に埋め込まれる。その後は、中央部１０７において導波路コア１０４の上側表面１０５及び２つの側方表面１０５’の両者が開放されるまで、クラッド層は高さが低くなり、テーパ状構造を形成する。右側では、導波路コア１０４及びクラッド層１０６が右側の側壁３１’に達するまで、クラッド層の高さが再び大きくなり、テーパ状構造を形成する。この完全埋め込み状況と露出状況との間の段階的な変化により、反射、導波励起光の損失等の有害な光学的影響が抑えられる。
【０１３５】
図８と同様に、導波路コアの表面１０５、１０５’には、被験物質タンパク質とフルオロフォアとの錯体を捕捉する固定捕捉抗体（図示せず）が設けられている。
【０１３６】
上記説明の通り、アッセイ領域３２においては、導波路の界面のごく近傍で導波励起場の一部のみが検査媒体と重なる。検出可能なフルオロフォアの実際の量を規定する接触面積の他、捕獲スポット２７のサイズ及び分布についても、適切な蛍光信号を発生するための重要な因子である。
【０１３７】
図１０には、本発明に係るアッセイユニットにおいて異なるタンパク質分子の捕獲スポットを実現するための４つの異なる手法を示しており、タンパク質スポットのサイズと導波路の幅との比が異なっている。
【０１３８】
図１０（ａ）は、図７に類似する導波路構造６６及び捕獲スポット２７の考え得る一実施形態の上面図であって、カバーとなるスーパーストレート層が除去された状態を示している。単一の横多モード導波路６６は、クラッド層１０６に埋め込まれた導波路コア１０４を備える。導波路コア１０４は、可視又は近紫外域における励起波長に関して、同等に幅広である（例えば、コア１０４の幅が５０マイクロメートルである）。導波路６６とマイクロ流体チャネル３０との交差点には、単一の大きな捕獲スポット２７が存在する。捕獲スポットは、サイズが導波路幅と同等であり、導波路コア１０４の表面１０５上に設けられた固定捕捉抗体の被膜を含む。多モード導波路６６の励起光は、導波路コアの表面１０５に存在するフルオロフォアを励起する。
【０１３９】
図１０（ｂ）に示すような別の実施形態においては、より小さな捕獲スポット２７（例えば、幅が５マイクロメートル）のマトリクスが導波路コアの表面１０５上に配置されている。多モード導波路６６の寸法は、図１０（ａ）の上記実施形態と同様である。捕獲スポット２７はすべて、同じ被験物質タンパク質に対して感度を有する。その結果は、大きな蛍光発光スポットではなく、小さな蛍光発光ドットのマトリクスである。
【０１４０】
図１０（ｃ）に示すようなさらに別の実施形態においては、５本一束の単一モード導波路６６がマイクロ流体チャネル３０と交差している。導波路コアの幅は、数マイクロメートルである。図１０（ａ）と同様に、導波路コアの表面１０５及びクラッド層１０６表面の隣接領域には、大きな捕獲スポット２７が存在する。導波路コアの表面上のフルオロフォアのみが励起されることになる。
【０１４１】
図１０（ｄ）に示すようなさらに別の実施形態においては、図１０（ｃ）に類似する５本の単一モード導波路６６がマイクロ流体チャネル３０と交差している。導波路コアの表面１０５上には、図１０（ｂ）に類似する小さな捕獲スポット２７のマトリクスが配置されている。導波路６６の寸法は、図１０（ａ）の上記実施形態と同様である。捕獲スポット２７はすべて、同じ被験物質タンパク質に対して感度を有する。その結果は、大きな蛍光発光スポットではなく、小さな蛍光発光ドットのマトリクスである。
【０１４２】
特定のアッセイ領域３２の全蛍光発光の積分は、検出部位２７の画像の評価に際して実行されるのが好都合である。この目的のため、アッセイ領域３２の異なる捕獲スポット２７の分解を検出ユニットで行う必要はない。
【０１４３】
図１１（ａ）には、本発明に係るアッセイユニットの有利な一実施形態の検出部位２６のアッセイ領域３２の部分集合の詳細を模式的に示しているが、導波路構造の形状は図１０（ｃ）に類似している。この図は、スーパーストレート層（図示せず）の上方に配置された検出システムの図に類似している。図示の詳細においては、３つの単一モード導波路から成る２つの導波路束６７が３つのマイクロ流体チャネル３０と交差している。導波路コア１０４は、クラッド層１０６に埋め込まれている。導波路束６７とマイクロ流体チャネルとの交差領域３２には、大きな捕獲スポット２７が配置されている。
【０１４４】
各捕獲スポット２７は、異なる被験物質タンパク質に対して感度を有する。したがって、検出ユニットにより得られた検出部位における蛍光発光のデジタル写真を分析する評価システムでは、捕獲スポット２７の領域における全信号を測定して積分することにより、特定の捕獲スポットにおける特定の被験物質の存在を判定できるようになる。異なる列及び行の捕獲スポット間の距離は、様々なパラメータを考慮に入れて選定されている。特に、最小距離は、検出システムの分解能に関して選定されており、これは、異なるアッセイ領域３２の信号の他、フォトニックシステムにおける隣接アッセイ領域間の考え得るクロストークを明確に識別できなければならない。
【０１４５】
図１１（ｂ）には、埋め込みコアと図９に類似する突出コアとの間の遷移を用いて、突出導波路構造を備えた上述の実施形態の変形例を示している。これにより、マイクロ流体チャネル中の各導波路コア周りの鋸歯構造は、クラッド材料のテーパに対応しており、導波モードを埋め込み構成から突出構成へと断熱変換するのに用いられる。クラッド境界１０６’は、隣接するマイクロ流体チャネル３０間のクロストークを防止する。
【０１４６】
導波路それぞれに取り込まれる励起光パワーの良好な均一性は、異なる捕獲スポットの蛍光信号間の同等な関係を得るため、本発明に係るアッセイユニットで実行するマトリクス免疫学的検定検査の重要な態様である。図１２は、２つの有利な配光方式を示している。
【０１４７】
図１２（ａ）に示すような第１の手法においては、２つの束６６がそれぞれ４つの導波路を有しており、各導波路は、左側の取り込み部位７４から右側の検出部位２６、２６’、最終的には取り出し部位（図示せず）まで、互いに完全に独立している。励起光は、導波路それぞれに対して別個に入射し、各導波路に類似の励起強度を与える要素は、マイクロ流体チップの外側に位置付けられており、再利用可能なリーダユニット上に位置付けられているのが好都合である。異なる導波路に跨る均一な光強度は、例えば共通の励起光源の光を異なる導波路の結合要素に分配する可動ミラーを備えた線形照射装置により実現可能である。
【０１４８】
図１２（ｂ）に示すような第２の手法においては、Ｙ分岐／導波路スプリッタ６１によって、共通の入力導波路６２ａが後続の導波路６２、６２’へと逐次分割されている。このように、検出部位それぞれに均一な励起パワーが供給されている。励起光を等しく分配する手段は、使い捨てのアッセイユニット上に位置付けられている。
【０１４９】
図１３は、導波路コア（１０４）からの光を光キャビティ（９０）に取り込む２つの構成を示している。光キャビティ９０に取り込まれた電磁界は、キャビティ内に一時的に格納され、捕獲スポット（２７）上の隣接フルオロフォアをエバネセント的に励起するのに用いられる。
【０１５０】
図１３（ａ）に示すような有利な一実施形態においては、伝搬モードのエバネセントテールがキャビティの共振モードを励起可能となるように、光キャビティ（９０）が導波路コア（１０４）の脇に位置付けられている。共振モードは、捕獲スポット（２７）のフルオロフォアにより吸収可能なエバネセント成分をそれ自体が有する。励起されたフルオロフォアは、それぞれの基底状態に戻る際に蛍光を発する。導波路を伝わる励起光の波長は、電磁エネルギーがキャビティモードに結合して自由に近傍のフルオロフォアを励起するように、導波路の帯域幅以内であるとともに、キャビティの共振波長に同調している必要がある。
【０１５１】
このような実施形態の一変形例においては、導波路がリッジ型導波路から成り、キャビティは、ウィスパリングギャラリモードに対応するマイクロリングキャビティから成る。この構成の利点は、標準的なリソグラフィ法で容易に作製可能なことである。マイクロリング共振器は、線質係数が非常に大きな光学モードに耐えることができ、光−質相互作用の強度が増してフルオロフォアの励起が強化される。別の有利な変形例においては、導波路がフォトニック結晶Ｗ１導波路から成り、キャビティは、フォトニック結晶Ｌ３キャビティから成り得る。
【０１５２】
図１３（ｂ）に示すような別の有利な実施形態において、光キャビティ（９０）は、２つの整列した導波路コア（１０４、１０４’）間に位置決めされている。この構成においては、励起波長がキャビティの共振波長に同調している限り、入力導波路（６２、１０４）に導かれた光がキャビティ（９０）及び第２の出力導波路（６３）に結合する。
【０１５３】
本明細書の全体を通して、様々な文献を引用したが、それぞれの開示内容をすべて本明細書に援用する。
【０１５４】
本発明の範囲は、本明細書に記載の特定の実施形態によって制限されないものとする。実際、当業者には、上記説明及び添付の図面により、本明細書の記載に加えて、本発明の種々改良が明らかとなるであろう。したがって、このような改良は、添付の特許請求の範囲に含まれるものである。
【符号の説明】
【０１５５】
１、１’  アッセイユニット
２  リーダユニット
３  診断装置
４  コンピュータシステム
５  データリンク
２０  マイクロ流体システム
２２  注入パッド
２４  サンプル作成部
２５  被験物質溶液
２６、２６’  検出部位
２７  捕獲スポット
２８  毛細管ポンプ
３０  マイクロ流体チャネル
３１、３１’  チャネルの側壁
３２  アッセイ領域
６０  フォトニックシステム、フォトニック層
６１  導波路スプリッタ
６２、６２’  入力導波路
６２ａ  入力導波路
６３  出力導波路
６４  励起光線、励起光
６５  その他の励起光
６６  検出領域の導波路構造
６７  導波路束
６８  蛍光発光
７０  光学系
７２  光源
７４  結合要素
７５  結合要素
７６  基準信号検出要素
７８  観測者
８０  検出ユニット
９０  光キャビティ
１０２  基板層
１０４、１０４’  コア層
１０５、１０５’  コア層の表面
１０６、１０６’  クラッド層
１０７  中央部
１０８  スーパーストレート層
１１０  被験物質溶液
１１２  固定捕捉抗体／捕捉分子
１１４  抗原／被験物質分子
１１６  フルオロフォア、蛍光マーカ
１１７  捕捉抗体−抗原錯体
１１８  抗原−蛍光マーカ錯体
１１９  捕捉抗体−抗原−蛍光マーカ錯体
【図１】
0006659173.tif 000010
【図２】
0006659173.tif 000011
【図３】
0006659173.tif 000012
【図４】
0006659173.tif 000013
【図５（ａ）】
0006659173.tif 000014
【図５（ｂ）】
0006659173.tif 000015
【図６（ａ）】
0006659173.tif 000016
【図６（ｂ）】
0006659173.tif 000017
【図７】
0006659173.tif 000018
【図８（ａ）】
0006659173.tif 000019
【図８（ｂ）】
0006659173.tif 000020
【図９（ａ）】
0006659173.tif 000021
【図９（ｂ）】
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【図１０（ａ）】
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【図１０（ｂ）】
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【図１０（ｃ）】
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【図１０（ｄ）】
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【図１１（ａ）】
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【図１１（ｂ）】
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【図１２（ａ）】
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【図１２（ｂ）】
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【図１３（ａ）】
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【図１３（ｂ）】
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