(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
スチレン系モノマをモノマ単位として含有するポリマを含む多孔質ポリマ粒子と、
前記多孔質ポリマ粒子の表面に結合した、両イオン性のポリマである第１のグラフト鎖と、
前記第１のグラフト鎖に結合した、水酸基を有するポリマである第２のグラフト鎖とを備え、
前記水酸基を有するポリマが、デキストラン、アガロース、プルラン、アミロース及びキトサンからなる群から選ばれる少なくとも１種の多糖類であり、
前記第１のグラフト鎖のグラフト密度が０．１ｃｈａｉｎ／ｎｍ２以上であり、前記第２のグラフト鎖のグラフト密度が０．１ｃｈａｉｎ／ｎｍ２以下である分離材。
【請求項２】
前記第１のグラフト鎖が、下記の式（Ｉ）、（ＩＩ）、又は（ＩＩＩ）で表される両性イオン基を有する、請求項１に記載の分離材。
【化１】
0006729041.tif 000008
【請求項３】
当該分離材の細孔径分布におけるモード径が０．０５〜０．６μｍである、請求項１又は２に記載の分離材。
【請求項４】
前記分離材の粒径の変動係数が５〜１５％である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の分離材。
【請求項５】
前記第２のグラフト鎖が陽イオン交換基及び陰イオン交換基の少なくとも一方を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の分離材。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の分離材を備えるカラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は分離材及びカラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、タンパク質に代表される生体高分子を分離精製する場合、一般的には多孔質型の合成高分子を母体とするイオン交換体、親水性天然高分子の架橋ゲルを母体とするイオン交換体等が用いられている。多孔質の合成高分子を母体とするイオン交換体の場合、塩濃度による体積変化が小さく、カラムに充填してクロマトグラフィーで用いた場合、通液時の耐圧性が良いという傾向がある。しかし、このイオン交換体をタンパク質等の分離に用いた場合、疎水的相互作用に基づく不可逆吸着等の非特異吸着が起き、ピークの非対称化が発生する、あるいは、該疎水的相互作用でイオン交換体に吸着されたタンパク質が吸着されたまま回収できないという問題点がある。
【０００３】
一方、上記のデキストラン、アガロース等の多糖に代表される親水性天然高分子の架橋ゲルを母体とするイオン交換体の場合、タンパク質の非特異吸着がほとんどないという利点がある。ところが、このイオン交換体は、水溶液中で著しく膨潤し、溶液のイオン強度による体積変化、及び遊離酸形と負荷形との体積変化が大きく、機械的強度も十分ではないという欠点を有する。特に、架橋ゲルをクロマトグラフィーで使用する場合、通液時の圧力損失が大きく、通液によりゲルが圧密化するといった欠点がある。
【０００４】
親水性天然高分子の架橋ゲルが持つ欠点を克服するため、いわば“骨格”となる剛直な物質と組み合わせる試みがこれまでになされている。例えば特許文献１では、多孔性高分子の細孔内に天然高分子ゲル等のゲルを保持した複合体を、ペプチド合成の分野で用いることが記載されている。特許文献１では、このような複合体を用いることにより反応性物質の負荷係数を高め、高収率の合成ができることが発明の効果として挙げられている。また、特許文献１には、硬質な合成高分子物質でゲルが包囲されるため、カラムベッドの形態で使用しても容積変化がなく、カラムを通過するフロースルーの圧力が変化しないという効果が記載されている。
【０００５】
特許文献２及び特許文献３には、セライト等の無機多孔質体にデキストラン、セルロースといった多糖等のキセロゲルを保持させた分離材が開示されている。このゲルには収着性能を付加するためにジエチルアミノメチル（ＤＥＡＥ）基等が付与されており、ヘモグロビンの除去に使用されている。その効果として、カラムでの通液性の良さが記載されている。
【０００６】
特許文献４には、いわゆるマクロネットワーク構造のコポリマの細孔を、モノマから合成した架橋共重合体のゲルで埋めたハイブリッドコポリマのイオン交換体が開示されている。架橋共重合体ゲルは、架橋度が低い場合、圧力損失、体積変化等の問題があるが、ハイブリッドコポリマにすることで通液特性が改善され、圧力損失が少なくなること、また、イオン交換容量が向上し、リーク挙動が改善されることが記載されている。
【０００７】
有機合成ポリマ基体の細孔内に巨大網目構造を有する親水性天然高分子の架橋ゲルを充填した複合化分離材が提案されている（特許文献５、特許文献６参照）。
【０００８】
特許文献７ではメタクリル酸グリシジルとアクリル架橋モノマにより構成される多孔質粒子が合成されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第４９６５２８９号明細書
【特許文献２】米国特許第４３３５０１７号明細書
【特許文献３】米国特許第４３３６１６１号明細書
【特許文献４】米国特許第３９６６４８９号明細書
【特許文献５】特開平１−２５４２４７号公報
【特許文献６】米国特許第５１１４５７７号明細書
【特許文献７】特開２００９−２４４０６７号公報
【特許文献８】特開昭６０−１６９４２７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従来の分離材では、カラムとして用いたときの通液性に劣り、生体高分子の非特異吸着が多く、タンパク質吸着量が低いといった問題があり、これらの問題をいずれも十分なレベルで解決することは難しい。
【００１１】
そこで、本発明は、カラムとして用いたときの通液性に優れ、生体高分子の非特異吸着量が低減され、タンパク質吸着量が高い分離材、及び該分離材を備えるカラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、下記［１］〜［９］に記載の分離材及びカラムを提供する。
［１］スチレン系モノマをモノマ単位として含有するポリマを含む多孔質ポリマ粒子と、上記多孔質ポリマ粒子の表面に結合した、両イオン性のポリマである第１のグラフト鎖と、上記第１のグラフト鎖に結合した、水酸基を有するポリマである第２のグラフト鎖とを備える分離材。
［２］上記第１のグラフト鎖が、下記の式（Ｉ）、（ＩＩ）、又は（ＩＩＩ）で表される両性イオン基を有する、［１］に記載の分離材。
【化１】
0006729041.tif 000002
［３］上記水酸基を有するポリマが多糖類である、［１］又は［２］に記載の分離材。
［４］上記多糖類がデキストラン、アガロース、プルラン、アミロース及びキトサンからなる群から選ばれる少なくとも１種である、［３］に記載の分離材。
［５］当該分離材の細孔径分布におけるモード径が０．０５〜０．６μｍである、［１］〜［４］のいずれかに記載の分離材。
［６］上記分離材の粒径の変動係数が５〜１５％である、［１］〜［５］のいずれかに記載の分離材。
［７］上記第１のグラフト鎖のグラフト密度が０．１ｃｈａｉｎ／ｎｍ２以上であり、前記第２のグラフト鎖のグラフト密度が０．１ｃｈａｉｎ／ｎｍ２以下である、［１］〜［６］のいずれかに記載の分離材。
［８］上記第２のグラフト鎖が陽イオン交換基及び陰イオン交換基の少なくとも一方を有する、［１］〜［７］のいずれかに記載の分離材。
［９］［１］〜［８］のいずれかに記載の分離材を備えるカラム。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、カラムとして用いたときの通液性に優れ、生体高分子の非特異吸着量が低減され、タンパク質吸着量が高い分離材を提供することができる。また、本発明により該分離材を備えるカラムが提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明するが、本発明はこれらの実施形態に何ら限定されるものではない。なお、本明細書中、「多孔質ポリマ粒子の表面」とは、多孔質ポリマ粒子の外側の表面のみでなく、多孔質ポリマ粒子の内部における細孔の表面を含むものとする。また、本明細書中（メタ）アクリル酸とは、アクリル酸又はメタクリル酸を意味し、（メタ）アクリレート等の類似の表現においても同様である。
【００１５】
本実施形態に係る分離材は、スチレン系モノマをモノマ単位として含有するポリマを含む多孔質ポリマ粒子と、当該多孔質ポリマ粒子の表面に結合した、両イオン性のポリマである第１のグラフト鎖と、当該第１のグラフト鎖に結合した、水酸基を有するポリマである第２のグラフト鎖とを備える。
【００１６】
（多孔質ポリマ粒子）
本実施形態の多孔質ポリマ粒子は、１種以上のモノマに由来するモノマ単位を含有するポリマを含む多孔質粒子である。多孔質ポリマ粒子は、例えば、多孔質化剤を含むモノマを重合させて得られる粒子である。多孔質ポリマ粒子は、例えば、従来の懸濁重合等によって合成することができる。モノマは、特に限定されないが、スチレン系モノマ等のビニルモノマを使用することができる。すなわち、多孔質ポリマ粒子は、スチレン系モノマに由来するモノマ単位を含有していてよい。スチレン系モノマとは、スチレン骨格を有するモノマをいう。具体的なモノマとしては、以下のような多官能性モノマ及び単官能性モノマが挙げられる。
【００１７】
スチレン系の多官能性モノマとしては、例えば、ジビニルベンゼン、ジビニルビフェニル、ジビニルナフタレン、ジビニルフェナントレン等のジビニル化合物などが挙げられる。これらの多官能性モノマは、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合せて用いてもよい。上記の中でも耐久性、耐酸性及び耐アルカリ性の観点から、ジビニルベンゼンを使用することが好ましい。ジビニルベンゼンを含有するスチレン系モノマを用いることにより、得られる多孔質ポリマ粒子の弾性率を向上でき、カラム充填時、及び粒子取り扱い時の粒子破壊を抑制することができる。
【００１８】
モノマがジビニルベンゼンを含む場合、その量は、モノマ全質量に対して５０質量％以上であることが好ましく、６０質量％以上であることがより好ましく、７０質量％以上であることが更に好ましく、８０質量％以上であることがより更に好ましい。ジビニルベンゼンを５０質量％以上含むことにより、耐アルカリ性がより良好となるため好ましい。モノマ全質量に対するジビニルベンゼンの含有量の上限は１００質量％であってもよい。
【００１９】
スチレン系の単官能性モノマとしては、例えば、スチレン、ｏ−メチルスチレン、ｍ−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、α−メチルスチレン、ｏ−エチルスチレン、ｍ−エチルスチレン、ｐ−エチルスチレン、２，４−ジメチルスチレン、ｐ−ｎ−ブチルスチレン、ｐ−ｔ−ブチルスチレン、ｐ−ｎ−ヘキシルスチレン、ｐ−ｎ−オクチルスチレン、ｐ−ｎ−ノニルスチレン、ｐ−ｎ−デシルスチレン、ｐ−ｎ−ドデシルスチレン、ｐ−メトキシスチレン、ｐ−フェニルスチレン、ｐ−クロロスチレン、３，４−ジクロロスチレン等のスチレン及びその誘導体が挙げられる。カルボキシル基、アミノ基、水酸基、アルデヒド基等の官能基を有するスチレン誘導体も使用することができる。これらは１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合せて用いてもよい。上記の中でも耐酸性及び耐アルカリ性の観点から、スチレンを使用することが好ましい。
【００２０】
多孔質化剤としては、重合時に相分離を促し、粒子の多孔質化を促進する有機溶媒である脂肪族又は芳香族の炭化水素類、エステル類、ケトン類、エーテル類、アルコール類が挙げられる。具体的には、トルエン、キシレン、シクロヘキサン、オクタン、酢酸ブチル、フタル酸ジブチル、メチルエチルケトン、ジブチルエーテル、１−ヘキサノール、２−オクタノール、デカノール、ラウリルアルコール、シクロヘキサノール等が挙げられる。これらの多孔質化剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合せて用いてもよい。
【００２１】
上記多孔質化剤は、モノマ１００質量部に対して０〜３００質量部使用できる。多孔質化剤の量によって、多孔質ポリマ粒子の空孔率をコントロールできる。さらに、多孔質化剤の種類によって、多孔質ポリマ粒子の細孔の大きさ及び形状をコントロールすることができる。
【００２２】
重合反応の溶媒として使用する水を多孔質化剤とすることもできる。水を多孔質化剤とする場合は、モノマに油溶性界面活性剤を溶解させ、モノマの液滴が水を吸収することによって、粒子を多孔質化することが可能である。
【００２３】
多孔質化に使用される油溶性界面活性剤としては、例えば、分岐Ｃ１６〜Ｃ２４脂肪酸、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４脂肪酸のソルビタンモノエステル（例えば、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノミリステート又はヤシ脂肪酸から誘導されるソルビタンモノエステル）；分岐Ｃ１６〜Ｃ２４脂肪酸、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４脂肪酸のジグリセロールモノエステル（例えば、ジグリセロールモノオレエート（例えば、Ｃ１８：１脂肪酸のジグリセロールモノエステル）、ジグリセロールモノミリステート、ジグリセロールモノイソステアレート又はヤシ脂肪酸のジグリセロールモノエステル）；分岐Ｃ１６〜Ｃ２４アルコール（例えば、ゲルベアルコール）、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２アルコール又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４アルコール（例えば、ヤシ脂肪アルコール）のジグリセロールモノ脂肪族エーテル；及びこれらの混合物が挙げられる。
【００２４】
好ましい油溶性界面活性剤としては、ソルビタンモノラウレート（例えば、ＳＰＡＮ（登録商標）２０、好ましくは純度約４０％を超える、より好ましくは約５０％を超える、最も好ましくは約７０％を超えるソルビタンモノラウレート）；ソルビタンモノオレエート（例えば、ＳＰＡＮ（登録商標）８０、好ましくは純度約４０％、より好ましくは約５０％、最も好ましくは約７０％を超えるソルビタンモノオレエート）；ジグリセロールモノオレエート（例えば、純度約４０％を超える、より好ましくは約５０％を超える、最も好ましくは約７０％を超えるジグリセロールモノオレエート）、ジグリセロールモノイソステアレート（例えば、好ましくは純度約４０％を超える、より好ましくは約５０％を超える、最も好ましくは約７０％を超えるジグリセロールモノイソステアレート）、ジグリセロールモノミリステート（好ましくは純度約４０％を超える、より好ましくは約５０％を超える、最も好ましくは約７０％を超えるジグリセロールモノミリステート）、ジグリセロールのココイル（例えば、ラウリル、ミリストイル等）エーテル、又はこれらの混合物が挙げられる。
【００２５】
これらの油溶性界面活性剤は、モノマ１００質量部に対して５〜８０質量部の範囲で使用することが好ましい。油溶性界面活性剤の量が５質量部以上であると、水滴の安定性が十分となることから、大きな単一孔を形成しにくくなる。油溶性界面活性剤の量が８０質量部以下であると、重合後に多孔質ポリマ粒子が形状をより保持しやすくなる。
【００２６】
重合反応に用いられる水性媒体としては、水、水と水溶性溶媒（例えば、低級アルコール）との混合媒体等が挙げられる。水性媒体には、界面活性剤が含まれていてもよい。界面活性剤としては、アニオン系、カチオン系、ノニオン系及び両性イオン系の界面活性剤のうち、いずれも用いることができる。
【００２７】
アニオン系界面活性剤としては、例えば、オレイン酸ナトリウム、ヒマシ油カリ等の脂肪酸油、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム等のアルキル硫酸エステル塩、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等のアルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩、アルカンスルホン酸塩、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム等のジアルキルスルホコハク酸塩、アルケニルコハク酸塩（ジカリウム塩）、アルキルリン酸エステル塩、ナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム等のポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩などが挙げられる。
【００２８】
カチオン系界面活性剤としては、例えば、ラウリルアミンアセテート、ステアリルアミンアセテート等のアルキルアミン塩、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド等の第四級アンモニウム塩が挙げられる。
【００２９】
ノニオン系界面活性剤としては、例えば、ポリエチレングリコールアルキルエーテル類、ポリエチレングリコールアルキルアリールエーテル類、ポリエチレングリコールエステル類、ポリエチレングリコールソルビタンエステル類、ポリアルキレングリコールアルキルアミン又はアミド類等の炭化水素系ノニオン界面活性剤、シリコンのポリエチレンオキサイド付加物類、ポリプロピレンオキサイド付加物類等のポリエーテル変性シリコン系ノニオン界面活性剤、パーフルオロアルキルグリコール類等のフッ素系ノニオン界面活性剤が挙げられる。
【００３０】
両性イオン系界面活性剤としては、例えば、ラウリルジメチルアミンオキサイド等の炭化水素界面活性剤、リン酸エステル系界面活性剤及び亜リン酸エステル系界面活性剤が挙げられる。
【００３１】
界面活性剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。上記界面活性剤の中でも、モノマの重合時の分散安定性の観点から、アニオン系界面活性剤が好ましい。
【００３２】
必要に応じて添加される重合開始剤としては、例えば、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイル、オルソクロロ過酸化ベンゾイル、オルソメトキシ過酸化ベンゾイル、３，５，５−トリメチルヘキサノイルパーオキサイド、ｔｅｒｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキサノエート、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルパーオキサイド等の有機過酸化物；２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、１，１’−アゾビスシクロヘキサンカルボニトリル、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）等のアゾ系化合物が挙げられる。重合開始剤は、モノマ１００質量部に対して、０．１〜７．０質量部の範囲で使用することができる。
【００３３】
重合温度は、モノマ及び重合開始剤の種類に応じて、適宜選択することができる。重合温度は、２５〜１１０℃が好ましく、５０〜１００℃がより好ましい。
【００３４】
重合に際し、粒子の分散安定性を向上させるために、乳化液に高分子分散安定剤を添加してもよい。
【００３５】
高分子分散安定剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリカルボン酸、セルロース類（ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース等）、ポリビニルピロリドンが挙げられ、トリポリリン酸ナトリウム等の無機系水溶性高分子化合物も併用することができる。これらのうち、ポリビニルアルコール又はポリビニルピロリドンが好ましい。高分子分散安定剤を使用する場合、高分子分散安定剤の添加量は、モノマ１００質量部に対して１〜１０質量部が好ましい。
【００３６】
モノマが単独に乳化重合することを抑えるために、亜硝酸塩類、亜硫酸塩類、ハイドロキノン類、アスコルビン酸類、水溶性ビタミンＢ類、クエン酸、ポリフェノール類等の水溶性の重合禁止剤を用いてもよい。
【００３７】
多孔質ポリマ粒子の平均粒径は、好ましくは５００μｍ以下、より好ましくは３００μｍ以下、更に好ましくは１００μｍ以下である。また、多孔質ポリマ粒子の平均粒径は、好ましくは１０μｍ以上、より好ましくは３０μｍ以上であり、更に好ましくは５０μｍ以上である。多孔質ポリマ粒子の平均粒径が１０μｍ以上であると、カラム充填後のカラム圧の増加を抑制できる傾向がある。本実施形態の多孔質ポリマ粒子を備える分離材は、粉砕して得られる従来の分離材と比べて、クロマトグラフィーで使用した場合、流体力学的に、効率的に有利である。
【００３８】
多孔質ポリマ粒子及び分離材の粒径の変動係数（Ｃ．Ｖ．）は、通液性向上の観点から、５〜１５％であることが好ましく、５〜１０％であることがより好ましい。粒径のＣ．Ｖ．を低減する方法として、マイクロプロセスサーバー（日立製作所社製）等の乳化装置により単分散化することが挙げられる。
【００３９】
（第１のグラフト鎖）
本実施形態に係る分離材は、多孔質ポリマ粒子の表面に結合した第１のグラフト鎖を有する。第１のグラフト鎖は、両イオン性のポリマである。分離材が第１のグラフト鎖を備えることにより、生体高分子の非特異吸着を抑制することができ、ＣＩＰ（定置洗浄）工程の耐久性が改善される。薄膜でコーティングすることにより、カラム圧の向上を抑制することができる。
【００４０】
両イオン性のポリマは、両性イオン基を有するポリマであることが好ましい。両性イオン基は、例えば、ホスホベタイン基、カルボキシベタイン基、スルホベタイン基等であってよい。両性イオン基は、例えば、下記式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で表される両性イオン基であってよい。すなわち、第１のグラフト鎖は、下記式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で表される両性イオン基を有していてよい。
【００４１】
【化２】
0006729041.tif 000003
【００４２】
第１のグラフト鎖は、非特異吸着を防止するために、リビングラジカル重合である原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）を用いて、両性イオン基を有するポリマを多孔質ポリマ粒子表面からグラフトさせることによって形成することが望ましい。両性イオン基を有するポリマは、例えば、両性イオン基を有するモノマを含むモノマをラジカル重合することにより得られる。分離材がこのような第１のグラフト鎖を有することにより、大幅にタンパク質の非特異吸着を抑制することができる。
【００４３】
両性イオン基を有するモノマの例として、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、［２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル］ジメチル−（３−スルホプロピル）アンモニウムヒドロキシド、Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム−Ｎ−エチルカルボキシレート等が挙げられる。また上記両性イオン性官能基を有するモノマとして、（メタ）アクリルアミド化合物も用いることができる。
【００４４】
第１のグラフト鎖は、多孔質ポリマ粒子表面にグラフト開始基を導入後、形成させることができる。ＡＴＲＰ法におけるグラフト開始基（ＡＴＲＰ開始基）の導入方法は特に限定されないが、多孔質ポリマ粒子に二重結合が残存している場合は、臭酸、塩酸等を二重結合に反応させることでＡＴＲＰ開始基を導入することができる。また、多孔質ポリマ粒子表面に水酸基を有する場合には、２−ブロモプロピオニルブロミドを多孔質ポリマ粒子と反応させることにより簡便に開始基を導入することができる。また、簡便な方法として、２−ブロモプロピオニルブロミドにドーパミンを反応させた物質を使用して、多孔質ポリマ粒子表面に膜を形成することにより開始基を導入することもできる。
【００４５】
ＡＴＲＰ法の場合、触媒としては、特に限定されず、ＡＴＲＰ法において通常使用されるものの中から幅広く選択できる。触媒として、例えば、遷移金属錯体を用いることができる。遷移金属錯体は特に限定されず、幅広く選択できる。遷移金属錯体は、例えば、以下に例示する配位子群及び遷移金属群から、適宜配位子と遷移金属とを選び出し、互いに組み合わせて用いることができる。配位子としては、例えば、２，２’−ビピリジル、４，４’−ジメチル−２，２’−ジピリジル、４，４’−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２，２’−ジピリジル、４，４’−ジノニル−２，２’−ジピリジル、Ｎ−ブチル−２−ピリジルメタンイミン、Ｎ−オクチル−２−ピリジルメタンイミン、Ｎ−ドデシル−Ｎ−（２−ピリジル−メチレン）アミン、Ｎ−オクタデシル−Ｎ−（２−ピリジルメチレン）アミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−ペンタメチル−ジエチレントリアミン、トリス（２−ピリジルメチル）アミン、１，１，４，７，１０，１０−ヘキサメチルトリエチレン−テトラミン、トリス［２−（ジメチルアミノ）エチルアミン、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラ−デカン、１，４，８，１１−テトラメチル−１−４−８−１１−テトラアザシクロテトラデカン、及びＮ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラキス（２−ピリジルメチル）−エチレンジアミン等が挙げられる。
【００４６】
遷移金属としては、例えば、ＣｕＣｌ、ＣｕＣｌ２、ＣｕＢｒ、ＣｕＢｒ２、ＴｉＣｌ２、ＴｉＣｌ３、ＴｉＣｌ４、ＴｉＢｒ４、ＦｅＣｌ２、ＦｅＣｌ３、ＦｅＢｒ２、ＦｅＢｒ３、ＣｏＣｌ２、ＣＯＢｒ２、ＮｉＣｌ２、ＮｉＢｒ２、ＭｏＣｌ３、ＭｏＣｌ５及びＲｕＣｌ３等が挙げられる。遷移金属錯体として、一価、又は二価銅錯体を使用することが好ましい。二価銅錯体としては、特に限定されないが、ＣｕＢｒ２／トリス［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミン錯体等を使用することができる。
【００４７】
重合に溶媒を用いる場合は、特に限定されないが、フリーラジカル重合において使用されている溶媒であって、触媒がある程度均一に溶解できるものが好ましい。例えば、水、エーテル類、アミド類、ニトリル類及びアルコール類からなる群より選択される少なくとも１種の溶媒を用いることができる。エーテル類としては、特に限定されないが、例えば、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジフェニルエーテル、アニソール及びジメトキシベンゼン等が挙げられる。アミド類としては、特に限定されないが、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等が挙げられる。ニトリル類としては、特に限定されないが、例えば、アセトニトリル、プロピオニトリル、ベンゾニトリル等が挙げられる。アルコール類としては、特に限定されないが、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブチルアルコール、ｔ−ブチルアルコール、イソアミルアルコール等が挙げられる。
【００４８】
溶媒としては、特に、水、エーテル類、アミド類及びアルコール類からなる群より選択される少なくとも１種が好ましく、水、アニソール又はＤＭＦがより好ましい。
【００４９】
上記溶媒は、更にその他の溶媒と混合して用いることができる。その他の溶媒としては、特に限定されないが、例えば、芳香族炭化水素である溶媒、ハロゲン化炭化水素等が挙げられる。芳香族炭化水素としては、特に限定されないが、例えば、ベンゼン、トルエン等が挙げられる。ハロゲン化炭化水素としては、特に限定されないが、例えば、クロロベンゼン、塩化メチレン、クロロホルム、クロロベンゼン等が挙げられる。この場合、上記の溶媒の量は開始剤のモル量以上とすることが好ましい。
【００５０】
下記式（Ａ）より算出される第１のグラフト鎖のグラフト密度は０．１ｃｈａｉｎ／ｎｍ２以上であることが、タンパク質の非特異吸着を防止する観点から望ましい。第１のグラフト鎖のグラフト密度は、例えば１ｃｈａｉｎ／ｎｍ２以下とすることができる。第１のグラフト鎖のグラフト密度は、グラフト開始基の表面密度により調節することができる。
グラフト密度σ＝グラフト鎖量（ｇ／粒子ｇ）×アボガドロ数／（グラフト鎖の数平均分子量Ｍｎ×粒子比表面積（ｎｍ２／粒子ｇ））    ・・・式（Ａ）
【００５１】
第１のグラフト鎖の数平均分子量は、多孔質ポリマ粒子にグラフトさせたポリマをアルカリ等により加水分解し、溶液中のポリマの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフ（ＧＰＣ）で測定することにより算出することができる。グラフト鎖量は、熱重量分析、又は多孔質ポリマ粒子のグラフト鎖形成前後の密度測定（重量変化測定）によって算出することができる。
【００５２】
（第２のグラフト鎖）
本実施形態に係る分離材は、上述の第１のグラフト鎖に結合した第２のグラフト鎖を有する。第２のグラフト鎖は水酸基を有するポリマである。分離材は、第２のグラフト鎖を有することにより、タンパク質を多く吸着することができる。水酸基を有するポリマは水溶性であることが好ましい。グラフトするポリマは水酸基を有するものであれば特に限定はされないが、水酸基を多く有するものが好ましく、多糖類を使用することが好ましい。多糖類としては、例えば、デキストラン、アガロース、プルラン、アミロース及びキトサンからなる群から選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。多糖類は、重量平均分子量１万〜１００万程度のものが好ましい。
【００５３】
第２のグラフト鎖を形成させる方法としては、例えば、第１のグラフト鎖に、第２のグラフト鎖との反応性を有する官能基（例えば、エポキシ基、グリシジル基等）を導入した後、第１のグラフト鎖を備える多孔質ポリマ粒子の細孔内に、上記水酸基を有するポリマの溶液を含浸させ、多孔質ポリマ粒子表面で、水酸基を有するポリマと上記官能基とを反応させる方法が挙げられる。
【００５４】
水酸基を有するポリマを溶解させる溶媒としては、当該ポリマを溶解することのできるものであれば、何でも使用できるが、通常、水又はアルコール類が最も一般的である。溶媒に溶解させるポリマの濃度は、５〜２０（ｍｇ／ｍｌ）であることが好ましい。含浸は、例えば、上記水酸基を有するポリマ溶液に、上述の方法で形成された多孔質ポリマ粒子を加えて一定時間攪拌することによって行うことができる。攪拌時間は多孔質ポリマ粒子の表面状態によっても変わるが、１〜１２時間含浸すればポリマ濃度が多孔質ポリマ粒子の内部で外部濃度と平衡状態となる。含浸の後、反応触媒、加熱等により反応を開始させる。
【００５５】
第１のグラフト鎖を形成させた多孔質ポリマ粒子を分散又は懸濁させる媒体としては、具体的には例えば、水、アルコール等が挙げられる。反応終了後、粒子を濾別し、ついで水、メタノール、エタノール等の親水性有機溶媒で洗浄し、未反応の親水性高分子及び懸濁用媒体等を除去すれば、多孔質ポリマ粒子の表面に水酸基を有する第２のグラフト鎖が形成された分離材が得られる。第２のグラフト鎖の量は熱分解の重量減少、密度計等で測定することができる。
【００５６】
第２のグラフト鎖のグラフト密度は、０．１ｃｈａｉｎ／ｎｍ２以下とすることが好ましい。グラフト密度を上記値以下とすることにより、タンパク質を分子鎖間でも吸着することが可能となり、吸着量を向上させることができる。第２のグラフト鎖のグラフト密度は、例えば、０．００１ｃｈａｉｎ／ｎｍ２以上とすることができる。第２のグラフト鎖のグラフト密度は、グラフト時に使用する溶媒中のポリマ濃度、反応時間等により調節することができる。
【００５７】
ついで、得られた分離材は、粒子表面の水酸基を介してイオン交換基、リガンド（プロテインＡ）等を導入することにより、例えば、イオン交換精製、アフィニティ精製等に使用することができる。イオン交換基の導入方法として、例えば、ハロゲン化アルキル化合物を用いる方法が挙げられる。
【００５８】
ハロゲン化アルキル化合物としては、モノハロゲノカルボン酸及びそのナトリウム塩、ハロゲン化アルキル基を少なくとも１つ有する１級、２級又は３級アミン及びその塩酸塩、ハロゲン化アルキル基を有する４級アンモニウム及びその塩酸塩等が挙げられる。モノハロゲノカルボン酸としては、例えば、モノハロゲノ酢酸、モノハロゲノプロピオン酸等が挙げられる。ハロゲン化アルキル基を少なくとも１つ有する３級アミンとしては、例えば、ジエチルアミノエチルクロライド等が挙げられる。これらのハロゲン化アルキル化合物としては、臭化物又は塩化物であることが好ましい。ハロゲン化アルキル化合物の使用量としては、第２のグラフト鎖の量に対して０．２％以上であることが好ましく、イオン交換基を付与する分離材の全質量に対して０．２質量％以上であることが好ましい。
【００５９】
イオン交換基の導入には、反応を促進するために、有機溶媒を用いるのが有効である。有機溶媒としては、例えば、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、イソブタノール、１−ペンタノール、イソペンタノール等のアルコール類などが挙げられる。
【００６０】
通常、イオン交換基の導入は、分離材の表面に存在する水酸基を有するポリマに行われる。イオン交換基の導入は例えば、水酸基を有するポリマがグラフトされた湿潤状態の分離材をろ過等により水切りした後、所定濃度のアルカリ性水溶液に浸漬し、一定時間放置した後、水−有機溶媒混合系で、上記ハロゲン化アルキル化合物を添加し反応させることにより行うことができる。アルカリ性水溶液としては、水酸化ナトリウム水溶液等が挙げられる。この反応は温度４０〜９０℃で還流下、０．５〜１２時間行うことが好ましい。上記の反応で使用されるハロゲン化アルキル化合物の種類により、付与されるイオン交換基が決定される。
【００６１】
イオン交換基は、陽イオン交換基又は陰イオン交換基であってよい。陽イオン交換基は、弱酸性基又は強酸性基であってよい。陰イオン交換基は、弱塩基性基又は強塩基性基であってよい。
【００６２】
イオン交換基として弱酸性基であるカルボキシル基を導入する方法としては、上記ハロゲン化アルキル化合物として、モノハロゲノ酢酸、モノハロゲノプロピオン酸等のモノハロゲノカルボン酸又はそのナトリウム塩を反応させる方法が挙げられる。これらモノハロゲノカルボン酸又はそのナトリウム塩の使用量は、イオン交換基を導入する分離材の全質量に対して０．２質量％以上であることが好ましい。
【００６３】
イオン交換基として強酸性基であるスルホン酸基を導入する方法としては、分離材に対してエピクロロヒドリン等のグリシジル化合物を反応させ、更に亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム等の亜硫酸塩又は重亜硫酸塩の飽和水溶液に分離材を添加する方法が挙げられる。反応は、３０〜９０℃で１〜１０時間行われることが好ましい。
【００６４】
イオン交換基として弱塩基性基であるアミノ基を付与する方法としては、上記ハロゲン化アルキル化合物のうち、アルキル基のうちの少なくとも１つがハロゲン化アルキル基で置換されている、モノ−、ジ−又はトリ−アルキルアミン、モノ−アルキル−モノ−アルカノールアミン、ジ−アルキル−モノ−アルカノールアミン、モノ−アルキル−ジ−アルカノールアミン等を反応させる方法、又はアルカノール基のうちの少なくとも１つがハロゲン化アルカノール基で置換されている、モノ−、ジ−又はトリ−アルカノールアミン、モノ−アルキル−モノ−アルカノールアミン、ジ−アルキル−モノ−アルカノールアミン、モノ−アルキル−ジ−アルカノールアミン等を反応させる方法が挙げられる。これらのハロゲン化アルキル化合物の使用量としては、分離材の全質量に対して０．２質量％以上であることが好ましい。反応条件は、４０〜９０℃で、０．５〜１２時間であることが好ましい。
【００６５】
イオン交換基として強塩基性基の４級アンモニウム基を導入する方法としては、まず、３級アミノ基を導入し、該３級アミノ基にエピクロルヒドリン等のハロゲン化アルキル化合物を反応させ、４級アンモニウム基に変換させる方法が挙げられる。４級アンモニウム塩酸塩等の４級アミノハロゲナイドを分離材に反応させてもよい。
【００６６】
一方、イオン交換基を導入する他の方法としては、アルカリ性雲囲気下で、分離材に１，３−プロパンスルトンを反応させる方法も挙げられる。１，３−プロパンスルトンは分離材全質量に対して０．４質量％以上使用することが好ましい。反応は、０〜９０℃で０．５〜１２時間行われることが好ましい。
【００６７】
分離材は、細孔直径が０．０５〜０．６μｍである細孔、すなわちマクロポアーを有するものが好ましい。分離材は、細孔径分布におけるモード径が０．０５μｍ〜０．６μｍであることが好ましい。細孔径分布におけるモード径が０．０５μｍ以上であると、細孔に入ることができる物質が多いため好ましい。細孔径分布におけるモード径が０．６μｍ以下であると、比表面積が大きくなるため好ましい。細孔径は上述の多孔質化剤により調整可能である。
【００６８】
第１のグラフト鎖を備える多孔質ポリマ粒子、及び分離材は、比表面積が３０ｍ２／ｇ以上であることが好ましい。実用性を鑑みると、比表面積は３５ｍ２／ｇ以上であることがより好ましく、４０ｍ２／ｇ以上であることが更に好ましい。比表面積が３０ｍ２／ｇ以上であると、分離する物質の吸着量がより多くなる傾向にある。
【００６９】
分離材及び多孔質ポリマ粒子の細孔容積の割合は、それぞれ分離材及び多孔質ポリマ粒子の全体積（細孔容積を含む）に対して、３０％以上７０％以下であることが好ましい。細孔容積の割合は４０％以上７０％以下であることが更に好ましい。
【００７０】
本実施形態に係る分離材及び多孔質ポリマ粒子の平均細孔径、細孔径分布におけるモード径、比表面積及び空隙率（細孔容積）は、水銀圧入測定装置（オートポア：株式会社島津製作所製）にて測定した値であり、以下のようにして測定する。試料は約０．０５ｇを標準５ｍｌ粉体用セル（ステム容積０．４ｍｌ）に加え、初期圧２１ｋＰａ（約３ｐｓｉａ、細孔直径約６０μｍ相当）の条件で測定する。水銀パラメータは、装置デフォルトの水銀接触角１３０ｄｅｇｒｅｅｓ、水銀表面張力４８５ｄｙｎｅｓ／ｃｍに設定する。また、細孔径０．０５〜５μｍの範囲に限定してそれぞれの値を算出する。
【００７１】
本実施形態に係る分離材は、タンパク質等の生体高分子の分離に対する優れた分離能を保持しながら、疎水的相互作用による非特異吸着が低減されており、耐久性に優れる。本実施形態に係る分離材は、静電的相互作用、アフィニティ精製等による生体高分子の分離に用いるのに好適である。例えば、タンパク質を含む混合溶液の中に本実施形態に係る分離材を添加し、静電的相互作用によりタンパク質だけを分離材に吸着させた後、該分離材を溶液からろ別し、塩濃度の高い水溶液中に添加すれば、分離材に吸着しているタンパク質を容易に脱離、回収できる。また、本実施形態に係る分離材は、カラムクロマトグラフィーにおいての使用も可能である。すなわち、本実施形態のカラムは、本実施形態の分離材を備える。
【００７２】
本実施形態に係る分離材を用いて分離できる生体高分子としては、水溶性物質が好ましい。具体的には、血清アルブミン、免疫グロブリン等の血液タンパク質、生体中に存在する酵素などのタンパク質、バイオテクノロジーにより生産されるタンパク質生理活性物質、ＤＮＡ、生理活性をするペプチド等の生体高分子であり、好ましくは分子量が２００万以下、更に好ましくは５０万以下のものである。また、公知の方法に従い、タンパク質の等電点、イオン化状態等によって、分離材の性質、条件等を選ぶ必要がある。公知の方法としては、例えば、特許文献８等に記載の方法が挙げられる。
【００７３】
本実施形態における多孔質ポリマ粒子の表面に第１及び第２のグラフト鎖を形成した後、粒子表面、細孔内にイオン交換基、プロテインＡ等を導入することにより、タンパク質等の生体高分子の分離において、天然高分子からなる粒子、及び合成ポリマからなる粒子の持つそれぞれの利点をあわせ持った特性が示される。特に本実施形態に係る分離材の骨格となる多孔質ポリマ粒子は、上述の方法で得られるものであるため、耐久性、及び耐アルカリ性に優れる。また、本実施形態に係る分離材は、非特異吸着が起こりにくく、タンパク質の脱吸着がしやすい傾向にある。さらに、本実施形態に係る分離材は、同一流速下でのタンパク質等の吸着容量（動的吸着量）が大きい傾向にある。
【００７４】
本明細書における通液速度とは、φ７．８×３００ｍｍのステンレス又はガラス製のカラムに分離材を充填し、液を流した際の通液速度を指す。カラムクロマトグラフィーでタンパク質の分離を行う場合、カラムに通液されるタンパク質溶液等の溶液の通液速度としては、一般に４００ｃｍ／ｈ以下の範囲である。一方、本実施形態に係る分離材を使用した場合は、従来のタンパク質分離用の分離材よりも速い速度である８００ｃｍ／ｈ以上で使用しても、高吸着量を維持することができる。
【００７５】
本実施形態に係る分離材の平均粒径は、通常１０〜３００μｍであることが好ましい。分取用又は工業用のクロマトグラフィーでの使用には、カラム内圧の極端な増加を避けるために、５０〜１００μｍであることが好ましい。
【００７６】
さらに、本実施形態に係る分離材は、カラムクロマトグラフィーで使用した場合、使用する溶出液の性質に依らず、カラム内での体積変化が少ないため、操作性に優れる。
【００７７】
分離材及び多孔質ポリマ粒子の平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．値は、以下の測定法により求めることができる。
１）粒子を、水（界面活性剤等の分散剤を含む）に分散させ、１質量％の粒子を含む分散液を調製する。
２）粒度分布計（シスメックスフロー、株式会社シスメックス製）を用いて、上記分散液中の粒子約１万個の画像により平均粒径と粒径のＣ．Ｖ．を測定する。
【００７８】
なお、本実施形態では、イオン交換基を導入する形態の分離材について説明したが、イオン交換基を導入しなくても分離材として用いることができる。このような分離材は、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィーに利用することができる。
【実施例】
【００７９】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００８０】
（実施例１）
（多孔質ポリマ粒子１の合成）
５００ｍＬの三口フラスコに、モノマとして純度９６％のジビニルベンゼン（ＤＶＢ９６０）を１６ｇ、油溶性界面活性剤としてＳＰＡＮ８０を６ｇ、重合開始剤として過酸化ベンゾイル０．６４ｇを加えたものをモノマ相として用意した。ポリビニルアルコール（０．５質量％）水溶液を連続相として用意した。上記モノマ相と連続相を使用してマイクロプロセスサーバーを用いて乳化後、得られた乳化液をフラスコに移し、８０℃のウォーターバスで加熱しながら、攪拌機を用いて約８時間撹拌をした。得られた粒子をろ過後、アセトンで洗浄し、多孔質ポリマ粒子１を得た。得られた多孔質ポリマ粒子の粒径をフロー型粒径測定装置（ＦＰＩＡ−３０００、シスメックス株式会社製）で測定し、平均粒径（体積基準）及び粒径のＣ．Ｖ．値を算出した（表１）。
【００８１】
（第１のグラフト鎖の形成）
得られた多孔質ポリマ粒子１を１０ｇ、チオグリセロールを０．１ｍｍｏｌ、及びアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を１ｍｍｏｌ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１００ｍＬ中に添加し、１２時間、７０℃で攪拌した。得られた粒子をアセトンで洗浄した。洗浄した粒子１０ｇ、イソブチリルブロマイド１ｇ、ＤＭＦ５０ｇ、及びトリエチルアミン０．５ｇを３時間室温で攪拌した。得られた粒子をアセトンで洗浄し、Ｂｒ開始基が導入された粒子を得た。２−（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）を１３ｇ、２臭化銅を６７０ｍｇ、及びトリスジメチルアミノエチルアミンを３３５ｍｇ、５０体積％メタノール水溶液８０ｇ中に添加した溶液を用意し、上記Ｂｒ開始基が導入された粒子１０ｇを投入して、窒素バブリングを行った。その後、上記溶液に１１９０ｍｇのアスコルビン酸を溶解させたエタノール２００ｇを添加し、５時間重合させ、多孔質粒子ポリマに第１のグラフト鎖を形成させた。その後、アリルグリシジルエーテルを５ｇ添加し、第１のグラフト鎖の末端にグリシジル基を導入した。グリシジル基導入後の粒子をろ過し、エタノール及び水にて洗浄した。第１のグラフト鎖を備える多孔質ポリマ粒子の比表面積を、水銀圧入法にて測定した。また得られた粒子の、第１のグラフト鎖の形成前後の重量変化より、第１のグラフト鎖のグラフト量を算出した。
【００８２】
グラフト鎖の分子量は以下のようにして求めた。水酸化ナトリウム水溶液（３Ｎ）４ｇに、第１のグラフト鎖を形成した多孔質ポリマ粒子１ｇを分散し、２５℃で３時間撹拌してグラフト鎖のポリマを溶解させ、鎖状ポリマが溶解した上澄みを回収した。次に、この鎖状ポリマ溶液に、溶液のｐＨが７になるまで１Ｍの塩酸を加え中和した。得られた水溶液中のポリマの数平均分子量をＧＰＣにより算出した。第１のグラフト鎖の数平均分子量は４５００であった。測定した数平均分子量及びグラフト鎖量を使用し、式（Ａ）により第１のグラフト鎖のグラフト密度を算出した。
【００８３】
（第２のグラフト鎖の形成）
上記で得られた、第１のグラフト鎖を備える多孔質ポリマ粒子１０ｇを、デキストラン（重量平均分子量５０万）１０質量％水溶液１００ｍＬに投入し、１時間攪拌した。その後、上記水溶液に１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液１００ｍＬを加え、１８時間攪拌して重合を行い、第２のグラフト鎖を形成させ、分離材を得た。分離材に形成された第２のグラフト鎖の量を、第２のグラフト鎖を形成する前後の粒子の重量変化を測定することによって求めた。分離材の比表面積、及び細孔径分布におけるモード径を、水銀圧入法にて測定した。デキストランの重量平均分子量を数平均分子量とみなして、式（Ａ）により第２のグラフト鎖のグラフト密度を算出した。分離材の粒径をフロー型粒径測定装置（ＦＰＩＡ−３０００、シスメックス株式会社製）で測定し、平均粒径（体積基準）及び粒径のＣ．Ｖ．値を算出した（表２）。
【００８４】
（タンパク質の非特異吸着能評価）
得られた分離材０．５ｇを、ＢＳＡ（牛血清アルブミン）濃度０．５ＭかつＮａＣｌ濃度２０ｍｇ／ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）５０ｍＬに投入し、２４時間室温で攪拌した。その後、遠心分離で上澄みをとった後、分光光度計で上澄み液のＢＳＡ濃度を測定した。ＢＳＡの濃度は分光光度計により２８０ｎｍの吸光度から確認した。上澄み液のＢＳＡ濃度から、分離材に吸着したＢＳＡ量を算出した。吸着量が５ｍｇ以下を「○」、５〜１０ｍｇを「△」、１０ｍｇ以上を「×」とした。
【００８５】
（イオン交換基の導入）
得られた分離材分散液から、遠心分離により水を除去した後、分離材２０ｇを、ジエチルアミノエチルクロライド塩酸塩を所定量溶解させた水溶液１００ｍＬに分散させ、７０℃で１０分間攪拌した。その後、７０℃に加温したＮａＯＨ水溶液５Ｍ１００ｍＬを添加し、１時間反応させた。反応終了後、濾過、水／エタノール（体積比８／２）で２回洗浄し、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基をイオン交換基として有する分離材を得た。以降の評価には上記ＤＥＡＥ基を有する分離材を用いた。
【００８６】
＜カラム特性評価＞
得られた分離材をメタノールと混合して、濃度３０質量％のスラリーを調製した。このスラリーをφ７．８×３００ｍｍのステンレスカラムに１５分かけて充填した。
【００８７】
（通液性評価）
分離材を充填したカラムに流速を変えて水を流し、流速とカラム圧の関係を測定し、カラム圧０．３ＭＰａ時の流速を測定した。１０００ｃｍ／ｈ未満を「×」、１０００ｃｍ／ｈ以上１５００ｃｍ／ｈ未満を「△」、１５００ｃｍ／ｈ以上を「○」とした。
【００８８】
（動的吸着量）
動的吸着量は以下のようにして測定した。２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）をカラムに１０カラム容量流した。その後、ＵＶによりカラム出口でのＢＳＡ濃度を測定しながら、ＢＳＡ濃度２ｍｇ／ｍＬの２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−塩酸緩衝液を流し、分離材にＢＳＡを吸着させた。カラム入口と出口のＢＳＡ濃度が一致するまで液を流した。続いて５カラム容量分の０．５Ｍ  ＮａＣｌ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液を流し、分離材からＢＳＡを脱離させた。１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける動的吸着量は以下の式を用いて算出した。
ｑ１０＝ｃｆＦ（ｔ１０−ｔ０）／ＶＢ
ｑ１０：１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける動的吸着量（ｍｇ／ｍＬ  ｗｅｔ  ｒｅｓｉｎ）
ｃｆ：注入しているＢＳＡ濃度
Ｆ：流速（ｍＬ／ｍｉｎ）
ＶＢ：ベッド体積（ｍＬ）
ｔ１０：１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける時間
ｔ０：ＢＳＡ注入開始時間
【００８９】
（定置洗浄（ＣＩＰ）特性評価）
上記動的吸着量の評価と同様の方法でカラム中にて分離材にＢＳＡを吸着及び脱離させた後、カラムに更に０．５ＭのＮａＯＨ水溶液を３カラム容量分流して洗浄した。ＢＳＡの吸着、脱離、及びアルカリ洗浄のサイクルを１００回行い、１回目のサイクルにおけるＢＳＡ吸着量に対する、１００回目のサイクルにおけるＢＳＡ吸着量の減少率を記録した。ＢＳＡ吸着量の減少率が５％以内を◎、５％超１５％未満を「○」、１５％以上４０％未満を「△」、４０％以上を「×」とした。
【００９０】
（タンパク質溶出試験）
動的吸着量を評価したカラムから分離材を取り出し、０．５質量％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液１００ｇ中で攪拌し、残存吸着しているタンパク質を溶出し、吸光度２８０ｎｍを測定することにより、担体に残存していたタンパク質量を評価した。残存タンパク質量が５ｍｇ以下であるものを「○」、５ｍｇ超２０ｍｇ未満を「△」、２０ｍｇ以上を「×」とした。
【００９１】
（実施例２）
多孔質ポリマ粒子の合成においてＳＰＡＮ８０を７ｇ使用した以外は実施例１と同様にして多孔質ポリマ粒子を合成し（多孔質ポリマ粒子２）、実施例１と同様に分離材を作製して評価した。
【００９２】
（実施例３）
多孔質ポリマ粒子の合成においてＳＰＡＮ８０を８ｇ使用した以外は実施例１と同様にして多孔質ポリマ粒子を合成し（多孔質ポリマ粒子３）、実施例１と同様に分離材を作製して評価した。
【００９３】
（実施例４）
第１グラフト鎖のモノマとしてＭＰＣの代わりに［２−（メタクリロイルオキシ）エチル］ジメチル−（３−スルホプロピル）アンモニウムヒドロキシド（ＳＢＭＡ）を使用した以外は実施例１と同様にして分離材を作製し、評価した。
【００９４】
（実施例５）
第１グラフト鎖のモノマとしてＭＰＣの代わりにＮ−（メタ）アクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム−Ｎ−エチルカルボキシレート（ＣＢＭＡ）を使用した以外は実施例１と同様にして分離材を作製し、評価した。
【００９５】
（比較例１）
第２のグラフト鎖を形成しなかったこと以外は実施例１と同様にして分離材を作製し、評価した。
【００９６】
（比較例２）
第１のグラフト鎖のモノマとしてＭＰＣの代わりにヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）を用いた以外は実施例１と同様にして分離材を作製し、評価した。
【００９７】
（比較例３）
多孔質ポリマ粒子４として市販のアガロース粒子（Ｃａｐｔｏ  ＤＥＡＥ、ＧＥヘルスケア製）をそのまま使用して評価した。
【００９８】
（比較例４）
多孔質ポリマ粒子の合成においてモノマとして２，３−ジヒドロキシプロピルメタクリレート１１．２ｇ、エチレングリコールジメタクリレート４．８ｇ、ＳＰＡＮ８０を５ｇ使用した以外は、多孔質ポリマ粒子１と同様にして多孔質ポリマ粒子５を合成した。洗浄後の粒子４ｇをデキストラン（分子量１５万）１ｇ、水酸化ナトリウム０．６ｇ水素化ホウ素ナトリウム０．１５ｇを蒸留水に溶解させた溶液６ｇを加えて、多孔質ポリマ粒子の細孔内に含浸させた。得られたデキストラン溶液含浸重合体を、エチルセルロース１質量％トルエン溶液１Ｌに加えて攪拌し、分散、懸濁させた。得られた懸濁液中に、エピクロルヒドリン５ｍＬを加えて５０℃に昇温し、この温度で６時間攪拌して、粒子の細孔内に含浸されているデキストランを架橋反応させた。反応終了後、懸濁液をろ過して生成ゲル状物を液と分離し、トルエン、エタノール、及び蒸留水で順次洗浄し、分離材を得た。得られた分離材に、実施例１と同様にアミノ基を導入後、評価した。
【００９９】
【表１】
0006729041.tif 000004
【０１００】
【表２】
0006729041.tif 000005
【０１０１】
【表３】
0006729041.tif 000006
【０１０２】
【表４】
0006729041.tif 000007
【０１０３】
表３、４中の「＊」印の項目は、第２のグラフト鎖形成後に測定したものである。
【０１０４】
第１及び第２のグラフト鎖を多孔質ポリマ粒子表面に設けることにより、非特異吸着及び使用後のタンパク質吸着を抑え、かつ動的吸着量を大幅に向上させることができた。また、カラム圧０．３ＭＰａ時の線流速が良好な粒子を得ることができた。一方、多孔質ポリマ粒子の細孔に多糖類を含浸させて得た比較例４では、動的吸着量の大幅な向上は見られなかった。これは多糖類を含浸させて架橋させた場合、細孔が埋まってしまい、タンパク質の粒子内への拡散が困難になったためであると推定される。