(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２６６に示されるアミノ酸配列を含んでなる、９〜３０アミノ酸長のペプチド、またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項２】
ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子に結合する能力を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
配列番号２６６に示されるアミノ酸配列からなる、請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドが、修飾されおよび／または非ペプチド結合を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５】
配列番号２６６に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有するＨＬＡリガンドと反応性のＴ細胞受容体。
【請求項６】
前記ＨＬＡリガンドのアミノ酸配列が、配列番号２６６に示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項５に記載のＴ細胞受容体。
【請求項７】
前記ＨＬＡリガンドのアミノ酸配列が、配列番号２６６に示されるアミノ酸配列からなる、請求項５または６に記載のＴ細胞受容体。
【請求項８】
（ａ）配列番号２６６に示されるアミノ酸配列を含んでなる９〜３０アミノ酸長のペプチド；および
（ｂ）ＨＬＡ−ＤＲ抗原関連不変鎖（Ｉｉ）のＮ末端アミノ酸１〜８０
を含んでなる、融合タンパク質。
【請求項９】
（ａ）請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド；
（ｂ）請求項５〜７のいずれか一項に記載のＴ細胞受容体；または
（ｃ）請求項８に記載の融合タンパク質
をエンコードする核酸。
【請求項１０】
ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせである、請求項に９記載の核酸。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の核酸を含んでなる、発現ベクター。
【請求項１２】
請求項９または１０に記載の核酸、または請求項１１に記載の発現ベクターを含んでなる、宿主細胞。
【請求項１３】
樹状細胞または抗原提示細胞である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド、請求項５〜７のいずれか一項に記載のＴ細胞受容体、または請求項８に記載の融合タンパク質を製造する方法であって、請求項１２に記載の宿主細胞を培養するステップと、前記宿主細胞および／またはその培養液から前記ペプチド、前記Ｔ細胞受容体、または前記融合タンパク質を単離するステップとを含んでなる、方法。
【請求項１５】
ＣＴＬを適切な抗原提示細胞の表面に発現される抗原負荷ヒトクラスＩ  ＭＨＣ分子に、前記ＣＴＬが抗原特異的様式で活性化するのに十分な時間にわたり、生体外で接触させるステップを含んでなり、前記抗原が請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドである、活性化細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を製造するためのインビトロ法。
【請求項１６】
前記抗原が、十分な量の前記抗原を抗原提示細胞に接触させることで、適切な抗原提示細胞の表面に発現されるクラスＩ  ＭＨＣ分子上に負荷される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗原提示細胞が、請求項１〜４のいずれか一項に記載の前記ペプチドを発現する能力がある発現ベクターを含んでなる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法によって製造される、活性化細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）。
【請求項１９】
患者において標的がん細胞を死滅させるための、請求項１８に記載の活性化細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を含む標的がん細胞の死滅剤。
【請求項２０】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド、請求項５〜７のいずれか一項に記載のＴ細胞受容体、請求項８に記載の融合タンパク質、請求項９または１０に記載の核酸、請求項１１に記載の発現ベクター、請求項１３または１４に記載の宿主細胞、または請求項１８に記載の活性化細胞傷害性Ｔリンパ球を含む薬剤。
【請求項２１】
前記薬剤がワクチンである、請求項２０に記載の薬剤。
【請求項２２】
前記薬剤ががんに対して有効である、請求項２０または２１に記載の薬剤。
【請求項２３】
前記がんが、急性骨髄性白血病および／または慢性リンパ管白血病である、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項２４】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドからなる群から選択される少なくとも１つの活性成分、請求項５〜７のいずれか一項に記載のＴ細胞受容体、請求項８に記載の融合タンパク質、請求項９または１０に記載の核酸、請求項１１に記載の発現ベクター、請求項１３または１４に記載の宿主細胞、および請求項１８に記載の活性化細胞毒性Ｔリンパ球、および薬学的に許容可能な担体を含んでなる、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫療法で使用するためのペプチド、核酸、および細胞に関する。特に、本発明は、がんの免疫療法に関する。本発明は、単独で、またはその他の腫瘍関連ペプチドとの組み合わせで抗腫瘍免疫応答を刺激する、ワクチン組成物の活性医薬品成分の役割を果たす腫瘍関連細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）ペプチドエピトープにさらに関する。本発明は、抗腫瘍免疫応答を引き起こすためのワクチン組成物で使用され得る、ヒト腫瘍細胞のＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩ分子に由来する、いくつかの新規ペプチド配列と、それらの変異型とに関する。
【背景技術】
【０００２】
急性骨髄性白血病または急性非リンパ球性白血病（ＡＮＬＬ）としてもまた知られている急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、骨髄に蓄積して正常な血液細胞の産生を妨げる異常な白血球細胞の迅速な増殖によって特徴付けられる、骨髄性系血液細胞のがんである。ＡＭＬは、成人を冒す最も一般的な急性白血病であり、その発生率は加齢に伴って増大する。ＡＭＬは比較的稀な疾患であるが、米国におけるがん死亡のおよそ１．２％を構成し、その発生率は、人口の高齢化に伴って増大することが予測される。
【０００３】
ＡＭＬの症状は、赤血球、血小板、および正常な白血球細胞の減少を引き起こす、白血病細胞による正常な骨髄の置換によって引き起こされる。これらの症状としては、疲労、息切れ、容易な挫傷と出血、および感染症リスクの増大が挙げられる。いくつかのリスク因子および染色体の異常が同定されているが、特定の原因は明らかでない。急性白血病としてＡＭＬは迅速に進行し、未治療の場合、典型的に数週間または数ヶ月間以内に致死性となる。
【０００４】
ＡＭＬは、いくつかの亜型を有する；治療および予後は、亜型間で異なる。５年後生存率は、亜型によって１５〜７０％で変動し、再発率は３３〜７８％で変動する。ＡＭＬは、最初に、寛解誘導を目的とする化学療法で治療され；患者には、続いて追加的な化学療法、または造血幹細胞移植が施されても良い。
【０００５】
米国特許公開第２００５／０２６１１９０Ａ１号明細書は、Ｈｓｃ７０／Ｈｓｐ７０、ユビキチン化タンパク質またはバロシン含有タンパク質に結合する、Ｆａｓ随伴因子１のポリペプチドフラグメントを開示する。フラグメントのいくつかは、本明細書で開示されるような配列番号５を含む。
【０００６】
同様に、韓国特許第１００６９２４１６号明細書は、血管新生および細胞増殖に対して抑制効果を有する、ＦＡＦ−１（Ｆａｓ随伴因子１）のフラグメントを開示する。したがって、それは、例えば、腫瘍転移抑制剤などの抗がん剤として提案されている。腫瘍転移に対する抑制効果を有する画分は、ＦＡＦ１の２９０〜３４５アミノ酸から構成される。
【０００７】
Ｈａｓｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ  ｌｉｇａｎｄｏｍｅ  ｏｆ  Ｂ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２０１３  Ｊｕｌ；１２（７）：１８２９−４３）は、多数の特定の免疫学的問題を解決するための出発点として、Ｂ細胞のＨＬＡリガンドームを構成する１４，５００個のペプチドリガンドの同定および相対定量化を開示する。
【０００８】
Ｋｏｗａｌｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｔｈｅ  ＨＬＡ  Ｌｉｇａｎｄｏｍｅ  Ｏｆ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  Ｌｅｕｋｅｍｉ  −Ｔｏｗａｒｄｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｓｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｂｌｏｏｄ  ２０１３；１２２（２１）：４１２３）は、２５人のＣＬＬ患者および３５人の健常対照のＨＬＡクラスＩペプチドームを分析する方法を記載する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記にもかかわらず、重篤な副作用をもたらすこともある過剰な化学療法剤またはその他の薬剤を使用しないことで、患者の福利を改善する、血液がんなどのがん、特に急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および異なる表現型のその他の血液がんのための新しい効果的かつ安全な治療の選択肢に対する必要性が、なおもある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、非侵襲様式で患者の免疫系を刺激して抗腫瘍剤として作用する、ペプチドを利用する。
【００１１】
本発明の第１の態様では、本発明は、配列番号１〜配列番号３２５、配列番号３２６〜配列番号４４７または配列番号４４８〜配列番号６０５またはそれらの変異配列の群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるペプチドに関し、それは、配列番号１〜配列番号３２５または配列番号４４８〜配列番号６０５と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％相同的であり（好ましくは少なくとも８０％または少なくとも９０％同一であり）、その中で前記変異体は、前記ペプチドまたはその薬学的に許容可能な塩と交差反応するＴ細胞を誘導し、その中で前記ペプチドは、基礎となる完全長ポリペプチドでない。
【００１２】
本発明は、配列番号１〜配列番号３２５、配列番号３２６〜配列番号４４７または配列番号４４８〜配列番号６０５の群から選択される配列を含んでなる本発明のペプチド、または配列番号１〜配列番号３２５または配列番号４４８〜配列番号６０５と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％相同的な（好ましくは少なくとも８０％または少なくとも９０％同一の）それらの変異体にさらに関し、前記ペプチドまたはそれらの変異体は、配列番号１〜配列番号３２５では、８〜１００、好ましくは８〜３０、最も好ましくは８〜１４アミノ酸、配列番号４４８〜配列番号６０５では、１２〜１００、好ましくは１２〜３０、最も好ましくは１２〜１８アミノ酸の全長を有する。
【００１３】
以下の表は、本発明によるペプチド、それらの各配列番号、およびそれらのペプチドの予期される起源タンパク質を示す。表１の全てのペプチドは、ＨＬＡ  Ａ  ＨＬＡＢまたはＨＬＡ  Ｃ対立遺伝子に結合し、表２のペプチドは、ＡＭＬ関連抗原に由来すると同定され、表３のペプチドはＨＬＡ−ＤＲ（ＭＨＣクラスＩＩ）対立遺伝子に結合する。表３のクラスＩＩペプチドは、それぞれの基礎となるポリペプチドの過剰発現または過剰提示を伴う、ＡＭＬ、慢性リンパ管白血病（ＣＬＬ）、およびその他の血液悪性腫瘍の診断および／または治療においてさらに有用である。
【００１４】
したがって、本発明は、特に、配列番号４４８〜配列番号６０５に記載の配列を含んでなる本発明のペプチド、または配列番号４４８〜配列番号６０５と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％相同的な（好ましくは少なくとも８０％または少なくとも９０％同一の）それらの変異型に関し、前記ペプチドまたはそれらの変異型は、１２〜１００、好ましくは１２〜３０、最も好ましくは１２〜１８アミノ酸の全長を有する。本発明は、特に、配列番号４４８〜配列番号６０５に記載の配列からなる、本発明のペプチドに関する。
【００１５】
【表１−１】
0006659582.tif 000002
【表１−２】
0006659582.tif 000003
【表１−３】
0006659582.tif 000004
【表１−４】
0006659582.tif 000005
【表１−５】
0006659582.tif 000006
【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
0006659582.tif 000009
【表１−９】
0006659582.tif 000010
【表１−１０】
0006659582.tif 000011
【表１−１１】
0006659582.tif 000012
【００１６】
表は、ＡＭＬ患者（ｎ＝１５）における表示頻度が≧２０％であるＨＬＡクラスＩリガンドーム由来腫瘍関連抗原（ＬｉＴＡＡ）と、それぞれのＨＬＡ拘束性でアノテートされた表示ＨＬＡリガンド（ＬｉＴＡＰ）とを示す。略称：ｒｅｐ．、表示；ｎ．ａ．、未特定
【００１７】
【表２−１】
0006659582.tif 000013
【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
0006659582.tif 000017
【００１８】
表は、起源サンプルでアノテートされた、確立されたＡＭＬ関連抗原に由来する提示ＨＬＡリガンド、異なる組織（１５個のＡＭＬサンプル、３０個のＰＢＭＣサンプル、５個のＢＭＮＣサンプル）中の表現頻度、および対応するＨＬＡ拘束性を示す。略称：ｒｅｐ．、表示；ｎ．ａ．、未特定。
【００１９】
以下の表３のペプチドは、血液悪性腫瘍、ＡＭＬおよび／または慢性リンパ管白血病（ＣＬＬ）細胞の、好ましくはＡＭＬの診断および／または治療においてさらに有用である。
【００２０】
【表３−１】
0006659582.tif 000018
【表３−２】
0006659582.tif 000019
【表３−３】
0006659582.tif 000020
【表３−４】
0006659582.tif 000021
【表３−５】
0006659582.tif 000022
【００２１】
表は、ＡＭＬ患者（ｎ＝１２）における表示頻度が＞２０％であるＨＬＡクラスＩＩリガンドーム由来腫瘍関連抗原（ＬｉＴＡＡ）と、表示ＨＬＡリガンド（ＬｉＴＡＰ）とを示す。略称：ｒｅｐ．、表示。
【００２２】
以下の表４のペプチドは、ＡＭＬおよび／またはＣＬＬの、好ましくはＡＭＬの診断および／または治療の双方において有用である。
【００２３】
【表４】
0006659582.tif 000023
【００２４】
したがって、特に好ましいのは、本発明によって、配列番号４４８、５２０、４７１、４７２、４３９、３５３、５２２、３１８、１７８、６８、２０１、４７４、３８１、３２３、４６、２４１、４５０、３５７、４９１、４９２、４９３、４９４、４４１、４４２、４９８、４９５、３５４、４５、３８２、４４５、４４３、２０２、１７９、２９６、３８３、５２５、３２５、および１８０からなる群から選択される、少なくとも１つのペプチドと、本明細書に記載されるようなＡＭＬおよび／またはＣＬＬの治療におけるその使用である。
【００２５】
本発明は、例えば、ＣＬＬなどのＡＭＬ以外の増殖性疾患の治療で利用するための本発明によるペプチドにさらに関する。それでもなお、以下の表５に示されるように、本発明によるペプチドの多くはまた、その他の適応症でも使用され得る。
【００２６】
【表５−１】
0006659582.tif 000024
【表５−２】
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【表５−３】
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【表５−４】
0006659582.tif 000027
【表５−５】
0006659582.tif 000028
【表５−６】
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【表５−７】
0006659582.tif 000030
【表５−８】
0006659582.tif 000031
【表５−９】
0006659582.tif 000032
【表５−１０】
0006659582.tif 000033
【表５−１１】
0006659582.tif 000034
【表５−１２】
0006659582.tif 000035
【表５−１３】
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【００２７】
したがって、本発明の別の態様は、以下の群から選択される増殖性疾患の治療、好ましくは併用治療のための本発明によるペプチドの使用に関する。
非定型脂肪腫；
脳腫瘍、そして腎オンコサイトーマおよびリンパ節悪性黒色腫から選択される増殖性疾患；神経膠芽腫、そして骨非骨化性線維腫、髄膜腫、乳がん、子宮内膜腺がん、大網平滑筋肉腫、耳下腺多形性腺腫、皮膚扁平上皮がん、甲状腺腺結節性過形成、および子宮頸部扁平上皮がんから選択される増殖性疾患；
乳小葉がん；
乳管内がん；
結腸または直腸がん、そして腺がん、副腎皮質がん、乳粘液がん、腺がん、子宮内膜ミュラー管混合腫瘍、線維腫症、腎がん、肝臓限局性結節性過形成、肝細胞がん、肺小細胞がん、肺扁平上皮がん、乳がん、リンパ節非ホジキンリンパ腫、転移性腎細胞がん、子宮筋層平滑筋腫、卵巣奇形腫、卵巣莢膜腫−線維腫、副甲状腺腫、前立腺良性結節性過形成、直腸腺がん、脾臓慢性骨髄性白血病、脾臓髄外造血、胃腺がん、滑膜肉腫、精巣セミノーマ、胸線胸腺腫、および子宮頸部扁平上皮がんから選択される増殖性疾患；
結腸腺腫；
子宮内膜腺がん；
食道腺がん；
腎血管筋脂肪腫；
腎明細胞がん、そして骨非骨化性線維腫、脳髄膜腫、結腸腺がん、結腸腺腫、結腸非ホジキンリンパ腫から選択される増殖性疾患；
腎明細胞がん、そして子宮内膜腺がん、腎血管筋脂肪腫、多発性嚢胞腎、腎移行上皮がん、脂肪腫非ホジキンリンパ腫、卵巣腺がん、耳下腺多形性腺腫、前立腺がん、脾臓非ホジキンリンパ腫、胃消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、滑膜肉腫、および甲状腺結節性過形成から選択される増殖性疾患；
腎臓、腎細胞がん；例えば非明細胞型；
脂肪肉腫；
肝限局性結節性過形成；
肝臓、肝細胞がん、そして副腎皮質腺腫、乳がん、腺様嚢胞がん、結腸腺がん、肝限局性結節性過形成、肝細胞がん、肺腺がん、膵臓腺がん、耳下腺多形性腺腫、小腸消化管間質腫瘍、甲状腺結節性過形成、線維腫症、腎血管筋脂肪腫、腎細胞がん、肝限局性結節性過形成、肺大細胞がん、子宮筋層平滑筋腫、および子宮頸部扁平上皮がんから選択される増殖性疾患；肺腺がん；
肺非小細胞肺がん、そして骨非骨化性線維腫、腎がん、肝細胞がん、肺腺がん、肺神経内分泌がん、大網、腺がん、シュワン細胞腫、脾臓慢性骨髄性白血病、脾臓髄外造血、胃腺がん、精巣セミノーマ、胸腺腫、および子宮頸部扁平上皮がんから選択される増殖性疾患；
リンパ節浸潤性乳がん；
リンパ節非ホジキンリンパ腫；
悪性線維性組織球腫；
転移性浸潤性乳がん；
転移性腎細胞がん；
大網腺がん；
明細胞型卵巣腺がん；
卵巣顆粒膜細胞腫瘍；
膵臓腺がん、そして骨巨細胞腫、骨肉腫、乳がん、軟骨肉腫、筋肉内脂肪腫、脂肪腫、肺腺がん、リンパ節ホジキン病、子宮筋層、平滑筋腫、卵巣粘液性嚢胞腺がん、胃腺がん、および胸腺腫から選択される増殖性疾患；
副甲状腺腫；
前立腺がん；
直腸腺がん；
小腸消化管間質腫瘍；
脾臓慢性骨髄性白血病；
脾臓髄外造血；
扁平上皮がん；
胃腺がん、そして、脳髄膜腫、転移性肝臓カルチノイド腫瘍、前立腺がん、および脾臓慢性骨髄性白血病から選択される増殖性疾患；
胃分化型腺がん、そして結腸腺がん、結腸非ホジキンリンパ腫、子宮内膜腺がん、腎ウィルムス腫瘍、肺腺がん、肺小細胞がん、リンパ節非ホジキンリンパ腫、悪性線維性組織球腫、転移性浸潤性乳小葉がん、副甲状腺腫、直腸腺がん、胃腺がん、精巣セミノーマ、および子宮子宮頸部扁平上皮がんから選択される増殖性疾患；
胃腺がん、そして肺腺がん、転移性腎細胞がん、子宮筋層平滑筋腫、非ホジキンリンパ腫、菌状息肉腫、卵巣腺がん、膵臓腺がん、および白血球細胞慢性リンパ球性白血病から選択される増殖性疾患；
胃子宮内膜、腺がん；
転移性胃がん、そして腺がん、骨非骨化性線維腫、乳がん、十二指腸腺がん、肝腺腫、肺大細胞がん、肺神経内分泌がん、肺扁平上皮がん、リンパ節非ホジキンリンパ腫、卵巣顆粒膜細胞腫瘍、卵巣ミュラー管混合腫瘍、膵臓腺がん、前立腺結節性過形成、直腸腺がん、および基底細胞がんから選択される増殖性疾患；
甲状腺結節性過形成；
および子宮頸部扁平上皮がん。
【００２８】
ＡＣＢＤ６は、そのＮ末端にアシルＣｏＡ結合領域、そのＣ末端に２つのアンキリンモチーフを保有する、モジュラータンパク質をコードする。ＡＣＢＤ６発現は、血液および血管発達における機能がある、組織および前駆細胞に限定される。ＡＣＢＤ６は、骨髄、脾臓、胎盤、臍帯血、循環ＣＤ３４＋前駆細胞臓、および胎盤由来胚性様幹細胞内で検出される（Ｓｏｕｐｅｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【００２９】
ＢＲＡＰは、ＢＲＣＡ１およびその他のタンパク質の核局在化シグナルに結合するその能力によって同定される、ＢＲＣＡ１関連タンパク質をコードする。それは細胞質内タンパク質であり、核局在化シグナルがあるタンパク質を細胞質内に保持することで、核標的化を制御してもよい（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。ＢＲＡＰは、白血病関連抗原とされている（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
【００３０】
ＣＤＣＡ７Ｌは、発がん遺伝子ｃ−Ｍｙｃと相互作用してその形質転換活性を増強する、タンパク質細胞分裂周期関連７様をコードする。（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。ＣＤＣＡ７Ｌは、肝細胞がんにおいて大きく上方制御され、ＣＤＣＡ７Ｌの異所性過剰発現は、肝細胞がん細胞増殖とコロニー形成を促進する（Ｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【００３１】
ＣＨＴＦ１８はタンパク質をコードし、それはＣＨＴＦ８およびＤＣＣ１と共に、（細胞周期のＳ期においてＤＮＡにＰＣＮＡをロードする）代替複製因子Ｃ複合体の構成要素である（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。ＣＨＴＦ１８は、複製因子Ｃ複合体の別の遺伝子と共に、カエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）における体細胞増殖を低下させる、合成致死性遺伝子相互作用を誘導し得る。この事実のために、ＣＨＴＦ１８は、抗がん剤標的候補として同定された（ＭｃＬｅｌｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ＥＳＣＯ１およびＣＨＴＦ１８中の体細胞変異の同時出現は、非類内膜子宮内膜腫瘍において統計学的に有意であった（Ｐｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【００３２】
ＫＩＦ１５は、有糸分裂紡錘体の構築および安定化に関与するタンパク質である、キネシンファミリーメンバー１５をコードする（Ｖａｎｎｅｓｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。乳がんでは、抗ＫＩＦ１５抗体が乳がん患者から単離され得るので、ＫＩＦ１５が過剰発現されて免疫原性であることが示される（Ｓｃａｎｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。さらに、ＫＩＦ１５は、肺腺がんに関与するようである（Ｂｉｄｋｈｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【００３３】
ＮＯＰ１４は、ｐｒｅ−１８ｓ  ｒＲＮＡプロセッシングと小型リボソームサブユニット構築で役割を果たす、タンパク質をコードする（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。ＮＯＰ１４遺伝子の変異および異常な発現が、膵臓がんで検出されている。膵臓がん細胞中では、ＮＯＰ１４の過剰発現は、遊走、増殖、およびコロニー形成を促進する（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２ｂ；Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２ａ）。卵巣がん患者の全血サンプル中のＮＯＰ１４発現の下方制御は、予後不良と相関する（Ｉｓａｋｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【００３４】
ＮＵＤＣＤ１は、１つの既知のならびに卵巣がん関連抗原６６（ＯＶＡ６６）を含有する、ＮｕｄＣ領域をコードする（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。ヒトがん細胞中では、ＮＵＤＣＤ１は、Ｉ型インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）シグナル伝達経路を制御することで、腫瘍形成に影響を及ぼす（Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４ａ）。ＮＵＤＣＤ１は、マウス胚線維芽細胞細胞系であるＮＩＨ３Ｔ３の発がん性形質転換を誘導する（Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４ｂ）。
【００３５】
ＰＲＩＭ１は、小型の４９ｋＤａプライマーゼサブユニットであるタンパク質をコードする。プライマーゼおよびＤＮＡポリメラーゼαは、真核細胞内のＤＮＡ複製のための２つの重要な酵素成分である（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。ＰＲＩＭ１は、２２個の小児骨肉腫サンプルの４１％で増幅されることが分かった。ＰＲＩＭ１は、コア１２ｑ１３アンプリコン遺伝子ＣＤＫ４、ＳＡＳ、およびＯＳ９と共に同時増幅され、それらに非常に近く物理的にマッピングされた（Ｙｏｔｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。子宮頸がん中におけるＳＩＸ１発現の上方制御は、ＰＲＩＭ１をはじめとするＤＮＡ複製の開始に関連する、複数遺伝子の上方制御をもたらす（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【００３６】
ＱＴＲＴＤ１は、７−デアザグアノシンクエオシンの合成によるｔＲＮＡ修飾において重要な役割を果たす、ｔＲＮＡ−グアニントランスグリコシラーゼのサブユニットをコードする。コードされるタンパク質は、クエオシン５一リン酸再利用経路における役割を有してもよい（ＲｅｆＳｅｑ、２００２）。
【００３７】
ＳＤＡＤ１は、ｒＲＮＡプロセッシングに関与するかもしれない、十分に特徴付けられていないタンパク質をコードする。ＳＤＡＤ１遺伝子中の単一ヌクレオチド多形性は、季節性アレルギー性鼻炎に関連することが示された（Ｂａｂｂｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。
【００３８】
ＴＡＲＢＰ１は、転写伸長中に、ＨＩＶ−１  ＴＡＲからＲＮＡポリメラーゼＩＩを遊離させるかもしれない、二本鎖ＲＮＡ結合タンパク質である、ＴＡＲ（ＨＩＶ−１）ＲＮＡ結合タンパク質１をコードする（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。ＴＡＲＢＰ１発現は、皮膚の基底細胞がんおよび扁平上皮がんで、有意に上方制御されることが示された（Ｓａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【００３９】
ＶＣＰＩＰ１（ＶＣＩＰ１３５としてもまた知られている）およびｐ４７は、ゴルジ体およびＥＲアセンブリー中で機能することが示されている（Ｕｃｈｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。ＶＣＰＩＰ１は、乳がん中で下方制御される（Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。ＶＣＰＩＰ１は、脱ユビキチン化酵素の１つであり、卵巣腫瘍ファミリー（ＯＴＵ）の一員である（Ｅｎｅｓａ  ａｎｄ  Ｅｖａｎｓ，２０１４）。
【００４０】
ＺＮＦ１３１は、エストロゲン受容体αのリプレッサーの機能を果たすかもしれない、十分に特徴付けられていない転写調節因子である、亜鉛フィンガータンパク質１３１をコードする（Ｏｈ  ａｎｄ  Ｃｈｕｎｇ，２０１２）。
【００４１】
本発明は、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩの分子に結合する能力を有する、本発明によるペプチドにさらに関する。
【００４２】
本発明は、本発明によるペプチドにさらに関し、前記ペプチドは、（それぞれ）配列番号１〜配列番号３２５、配列番号３２６〜配列番号４４７または配列番号４４８〜配列番号６０５に記載のアミノ酸配列からなり、またはそれから本質的になる。
【００４３】
示されるようなアミノ酸配列から本質的になるペプチドは、非修飾ペプチドと比較して、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩ分子に結合する能力が実質的に変化したり悪影響を受けることなく交換される、１つまたは２つの非アンカーアミノ酸を有し得る（アンカーモチーフについては下記を参照されたい）。アミノ酸配列から本質的になる別のペプチド中では、１つまたは２つのアミノ酸が、非修飾ペプチドと比較して、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩ分子に結合する能力が実質的に変化したり悪影響を受けることなく、それらの保存的交換パートナーと交換される（本明細書の以下もまた参照されたい）。
【００４４】
本発明は、本発明によるペプチドにさらに関し、前記ペプチドは、修飾されおよび／または非ペプチド結合を含む。
【００４５】
本発明は、本発明によるペプチドにさらに関し、前記ペプチドは、特にＨＬＡ−ＤＲ抗原関連不変鎖（Ｉｉ）のＮ末端アミノ酸に融合した、または例えば樹状細胞に対して特異的な抗体などの抗体に（またはその配列中に）融合した、融合タンパク質の一部である。
【００４６】
本発明は、本発明によるペプチドをエンコードする核酸にさらに関する。
【００４７】
本発明は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせである、本発明による核酸にさらに関する。
【００４８】
本発明は、本発明による核酸を発現する能力がある、発現ベクターにさらに関する。
【００４９】
本発明は、医療で使用するための本発明によるペプチド、本発明による核酸、または本発明による発現ベクターにさらに関する。
【００５０】
本発明は、本発明による抗体、およびそれらを生成する方法にさらに関する。
【００５１】
本発明は、本発明によるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、特に可溶性ＴＣＲ（ｓＴＣＲ）、およびそれらを生成する方法にさらに関する。
【００５２】
本発明は、前述のような本発明による核酸または発現ベクターを含んでなる、宿主細胞にさらに関する。
【００５３】
本発明は、抗原提示細胞である、本発明による宿主細胞にさらに関する。
【００５４】
本発明は、抗原提示細胞が樹状細胞である、本発明による宿主細胞にさらに関する。
【００５５】
本発明は、本発明による宿主細胞を培養するステップと、宿主細胞またはその培養液からペプチドを単離するステップとを含んでなる、本発明によるペプチドを製造する方法にさらに関する。
【００５６】
本発明は、ＣＴＬを適切な抗原提示細胞の表面に発現される抗原負荷ヒトクラスＩまたはＩＩ  ＭＨＣ分子に、前記ＣＴＬを抗原特異的様式で活性化するのに十分な時間にわたり、生体外で接触させるステップを含んでなる、活性化細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を製造するためのインビトロ法にさらに関し、前記抗原は本発明による任意のペプチドである。
【００５７】
本発明は、十分な量の抗原を抗原提示細胞に接触させることで、適切な抗原提示細胞の表面に発現されるクラスＩまたはＩＩＭＨＣ分子上に、抗原が負荷される、本発明による方法にさらに関する。
【００５８】
本発明は、抗原提示細胞が、配列番号１〜配列番号３２５、配列番号３２６〜配列番号４４７または配列番号４４８〜配列番号６０５、または前記変異アミノ酸配列を含有する、前記ペプチドを発現する能力がある、発現ベクターを含んでなる、本発明による方法にさらに関する。
【００５９】
本発明は、本発明による方法によって製造される活性化細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）にさらに関し、それは、本発明によるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する細胞を選択的に認識する。
【００６０】
本発明は、本発明による細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の有効数を患者に投与するステップを含んでなる、患者において、本発明による任意のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する標的細胞を死滅させる方法にさらに関する。
【００６１】
本発明は、記載される任意のペプチド、本発明による核酸、本発明による発現ベクター、本発明による細胞、または本発明による活性化細胞傷害性Ｔリンパ球の薬剤としての、または薬剤の製造における、使用にさらに関する。
【００６２】
本発明は、前記薬剤がワクチンである、本発明による使用にさらに関する。
【００６３】
本発明は、薬剤ががんに対して有効である、本発明による使用にさらに関する。
【００６４】
本発明は、前記がん細胞が、血液悪性腫瘍細胞、ＡＭＬまたは慢性リンパ管白血病（ＣＬＬ）細胞である、本発明による使用にさらに関する。
【００６５】
本発明は、血液悪性腫瘍、ＡＭＬまたは慢性リンパ管白血病（ＣＬＬ）細胞、好ましくはＡＭＬの診断および／または予後診断で使用され得る、本発明によるペプチドをベースとした特定のマーカータンパク質および生物マーカーにさらに関する。
【００６６】
さらに本発明は、がん治療のためのこれらの新規標的の使用に関する。
【００６７】
さらに、本発明は、予備選別された腫瘍関連ペプチドの貯蔵庫（データベース）を使用して、個々の患者のための個別化抗がんワクチンを製造する方法に関する。
【００６８】
免疫応答の刺激は、宿主免疫系によって外来性として認識された抗原の存在に依存する。腫瘍関連抗原の存在の発見は、宿主の免疫系を利用して腫瘍成長に介入する可能性を高めた。免疫系の体液性および細胞性アームの双方を活用する様々な機構が、がん免疫療法のために目下探求されている。
【００６９】
細胞性免疫応答の特定の要素は、腫瘍細胞を特異的に認識して破壊する能力がある。腫瘍浸潤性細胞集団から、または末梢血からの細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の単離は、がんに対する自然免疫防御において、このような細胞が重要な役割を果たすことを示唆する。特に、細胞質ゾル内に位置するタンパク質または欠陥リボソーム産物（ＤＲＩＰＳ）に由来する、通常は８〜１０のアミノ酸残基の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）保有ペプチドのクラスＩ分子を認識するＣＤ８陽性Ｔ細胞が、この応答において重要な役割を果たす。ヒトのＭＨＣ分子はまた、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とも称される。
【００７０】
ＭＨＣ分子には、２つのクラスがある：核を有するほとんどの細胞に見られる、ＭＨＣクラスＩ分子。ＭＨＣ分子は、それぞれ、重鎖と、β−２−ミクログロブリン（ＭＨＣクラスＩ受容体）またはαおよびβ鎖（ＭＨＣクラスＩＩ受容体）とから、構成される。それらの三次元立体構造の結果として結合溝が生じ、それはペプチドとの非共有結合相互作用のために使用される。ＭＨＣクラスＩは、大部分が内在性タンパク質である、ＤＲＩＰおよびより大型のペプチドのタンパク質分解的切断から得られる、ペプチドを提示する。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に優勢に見られ、エンドサイトーシス過程でＡＰＣに取り込まれて引き続きプロセシングされる、外来性または膜貫通タンパク質のペプチドを主に提示する。ペプチドおよびＭＨＣクラスＩ分子複合体が、適切なＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）を有するＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔリンパ球によって認識される一方で、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子の複合体は、適切なＴＣＲを有するＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞によって認識される。その結果、ＴＣＲ、ペプチド、およびＭＨＣは、化学量論的に１：１：１の量で存在することが良く知られている。
【００７１】
ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞は、ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞による、効果的な応答の誘導と維持に重要な役割を果たす。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に由来するＣＤ４陽性Ｔ細胞エピトープの同定は、抗腫瘍免疫応答を始動させる医薬品の開発に非常に重要である；Ｇｎｊａｔｉｃ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ＮＹ−ＥＳＯ−１  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００３  Ｊｕｌ  ２２；１００（１５）：８８６２−７）。腫瘍部位では、Ｔヘルパー細胞は、ＣＴＬ親和性サイトカイン環境を支持し（Ｍｏｒｔａｒａ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．ＣＩＩＴＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｒｙ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ａ  Ｔｈ１  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，ｔｕｍｏｒ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｍｅｍｏｒｙ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００６  Ｊｕｎ  １；１２（１１  Ｐｔ  １）：３４３５−４３）、例えば、ＣＴＬ、ＮＫ細胞、マクロファージ、顆粒球などのエフェクター細胞を誘引する（Ｈｗａｎｇ  ＭＬ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｇｎａｔｅ  ｍｅｍｏｒｙ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｔｈｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ，ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ，ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｔｕｍｏｒ  ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７  Ｎｏｖ  １；１７９（９）：５８２９−３８）。
【００７２】
炎症不在下では、ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現は、免疫系細胞、特に、例えば、単球、単球由来細胞、マクロファージ、樹状細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）に主に限定される。がん患者では、腫瘍細胞がＭＨＣクラスＩＩ分子を発現することが、驚くことに発見された（Ｄｅｎｇｊｅｌ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ  ａｂｕｎｄａｎｃｅ  ｏｆ  ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００６  Ｊｕｌ  １５；１２（１４  Ｐｔ  １）：４１６３−７０）。
【００７３】
例えば、マウスなどの哺乳類動物モデルでは、ＣＴＬエフェクター細胞（すなわち、ＣＤ８陽性Ｔリンパ球）不在下であっても、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）の分泌による血管新生阻害を通じた腫瘍発現阻の阻害には、ＣＤ４陽性Ｔ細胞だけで十分であることが示された。
【００７４】
さらに、ＨＬＡクラスＩＩ分子によって提示される腫瘍関連抗原からのペプチドを認識するＣＤ４陽性Ｔ細胞が、抗体（Ａｂ）応答の誘導を通じて、腫瘍の進行を抑制し得ることが示された。
【００７５】
ＨＬＡクラスＩ分子に結合する腫瘍関連ペプチドとは対照的に、これまでに、少数の瘍関連抗原（ＴＡＡ）のクラスＩＩリガンドのみが記載されている。
【００７６】
ＨＬＡクラスＩＩ分子の構成的発現は、通常、免疫系細胞に限定されるので、原発性腫瘍からクラスＩＩペプチドを直接単離する実現性が、可能であるとは考えられなかった。しかしＤｅｎｇｊｅｌ  ｅｔ  ａｌ．は、腫瘍からいくつかのＭＨＣクラスＩＩエピトープを直接同定することに成功した（国際特許出願パンフレット２００７／０２８５７４、欧州特許第１７６００８８Ｂ１号明細書；（Ｄｅｎｇｊｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【００７７】
腫瘍特異的細胞傷害性Ｔリンパ球によって認識される抗原、すなわちそれらのエピトープは、酵素、受容体、転写因子などの全てのタンパク質クラスに由来する分子であり得て、それはそれぞれの腫瘍細胞で発現され、同一起源の非改変細胞と比較して上方制御される。
【００７８】
ＣＤ８およびＣＤ４依存性の双方のタイプの応答は、抗腫瘍効果と共同して相乗的に寄与するので、ＣＤ８＋ＣＴＬ（リガンド：ＭＨＣクラスＩ分子＋ペプチドエピトープ）、またはＣＤ４陽性Ｔヘルパー細胞（リガンド：ＭＨＣクラスＩＩ分子＋ペプチドエピトープ）のどちらかによって認識される、腫瘍関連抗原の同定および特性解析は、腫瘍ワクチンの開発に重要である。
【００７９】
本発明はまた、２つの新しい非常に有用なＭＨＣクラスＩＩペプチド（配列番号４４８〜配列番号６０５に記載される）にも関する。これらのペプチドは、特に、ペプチドがそれぞれ由来する抗原を過剰発現および／または過剰提示する、ＡＭＬおよびその他のがんの診断および／または治療において有用である。
【００８０】
本発明はまた、配列番号４４８〜配列番号６０５に記載される、本発明のＭＨＣクラスＩＩペプチドのいわゆる鎖長変異型にも関する。
【００８１】
鎖長変異型は、通常Ｎおよび／またはＣ末端が延長され（１〜５個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸）、またはＮおよび／またはＣ末端が短縮された（１〜５個のアミノ酸）ペプチドであり、それは依然としてＭＨＣに結合して、本明細書に記載されるような細胞性免疫応答を引き起こし得る。現状技術で公知のように、クラスＩＩタンパク質に対するペプチド結合はサイズに制約がなく、１１〜３０のアミノ酸長で変動し得る。ＭＨＣクラスＩＩ分子中のペプチド結合溝は両端が開いており、相対的により長いペプチドの結合を可能にする。「コア」の９残基長断片がペプチド認識に最も寄与するが、側面に位置する領域もまた、クラスＩＩ対立遺伝子に対するペプチドの特異性にとって重要である（例えば、Ｍｅｙｄａｎ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ  ａｌｌｅｌｅｓ  ｂｙ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｍｏｔｉｆ  ｍｉｎｉｎｇ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１３；１４  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１３を参照されたい）。当業者は、（例えば、上述されるような）利用できる多数のソフトウェアツールを使用して結合モチーフを同定でき、ひいては鎖長変異型を生成するために、表３に記載のＭＨＣクラスＩＩペプチドを伸長および／または欠失させる可能性を同定できるあろう。
【００８２】
ペプチドが細胞性免疫応答を引き起こす（誘発する）ためには、それはＭＨＣ分子と結合しなくてはならない。この過程は、ＭＨＣ分子の対立遺伝子と、ペプチドのアミノ酸配列の特定の多形性とに依存する。ＭＨＣクラスＩ結合ペプチドは、通常は、８〜１２アミノ酸残基長であり、通常は、それらの配列中に、ＭＨＣ分子の対応する結合溝と相互作用する２つの保存残基（「アンカー」）を含有する。このようにして、各ＭＨＣ対立遺伝子は、どのペプチドが結合溝と特異的に結合し得るかを決定する、「結合モチーフ」を有する。
【００８３】
ＭＨＣクラスＩ依存免疫反応では、ペプチドは腫瘍細胞によって発現される特定のＭＨＣクラスＩ分子に結合できるのみならず、それらはまた、特有のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞によって認識されなくてはならない。
【００８４】
腫瘍特異的細胞傷害性Ｔリンパ球によって認識される抗原、すなわちそれらのエピトープは、酵素、受容体、転写因子などの全てのタンパク質クラスに由来する分子であり得て、それはそれぞれの腫瘍細胞で発現されて、同一起源の非改変細胞と比較して、上方制御される。
【００８５】
腫瘍関連抗原の現行の分類は、次の主要群を含んでなる：
ａ）がん精巣抗原：Ｔ細胞によって認識され得る、これまでに同定された最初の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）はこのクラスに属し、最初はがん精巣（ＣＴ）抗原と称されたが、それは、そのメンバーが組織学的に異なるヒト腫瘍で発現し、正常組織では、精巣の精母細胞／精原細胞のみに存在し、時として胎盤に存在するためであった。精巣の細胞は、クラスＩおよびＩＩ  ＨＬＡ分子を発現しないので、これらの抗原は正常組織のＴ細胞によって認識され得ず、したがって免疫学的に腫瘍特異的と見なされる。ＣＴ抗原の周知の例は、ＭＡＧＥファミリーメンバーまたはＮＹ−ＥＳＯ−１である。
ｂ）分化抗原：これらのＴＡＡは、腫瘍と、それから腫瘍が生じる正常組織との間で共有され；大多数は、メラノーマおよび正常なメラノサイトに見られる。これらのメラノサイト系関連タンパク質の多くはメラニン生合成に関与し、したがって腫瘍特異的でないが、それでもなおがん免疫療法のために広く利用されている。例としては、黒色腫に対するチロシナーゼおよびＭｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、または前立腺がんに対するＰＳＡが挙げられるが、これに限定されるものではない。
ｃ）過剰発現されるＴＡＡ：広範に発現されるＴＡＡをエンコードする遺伝子は、組織学的に異なるタイプの腫瘍で、ならびに多数の正常組織で、概してより低い発現レベルで検出されている。正常組織によってプロセシングされ、潜在的に提示されるエピトープの多くは、Ｔ細胞認識閾値レベルに満たない可能性がある一方で、腫瘍細胞におけるそれらの過剰発現は、先に確立された免疫寛容を破壊することで抗がん応答を引き起こし得る。このクラスのＴＡＡの顕著な例は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、サバイビン、テロメラーゼまたはＷＴ１である。
ｄ）腫瘍特異的抗原：これらのユニークなＴＡＡは、正常な遺伝子（β−カテニン、ＣＤＫ４など）の変異から生じる。これらの分子変化のいくつかは、腫瘍性形質転換および／または進行に関連する。腫瘍特異的抗原は、通常、正常組織に対する自己免疫反応のリスクなしに、強力な免疫応答を誘導できる。他方、これらのＴＡＡは、ほとんどの場合、その上でそれらが同定されたまさにその腫瘍のみと関係があり、通常は、多くの個々の腫瘍間で共有されない。
ｅ）異常な翻訳後修飾から生じるＴＡＡ：このようなＴＡＡは、腫瘍中で特異的でなく過剰発現もされないタンパク質から生じてもよいが、それでもなお、主に腫瘍中で活性の翻訳後プロセスによって、腫瘍関連抗原になる。このクラスの例は、腫瘍でＭＵＣ１のような新規エピトープをもたらす改変グリコシル化パターンから、または腫瘍特異的であってもなくてもよい分解中のタンパク質スプライシング事象から生じる。
ｆ）腫瘍ウイルスタンパク質：これらのＴＡＡは、発がん過程で重要な役割を果たしてもよいウイルスタンパク質であり、それらは外来性である（ヒト由来でない）ため、Ｔ細胞応答を誘起し得る。このようなタンパク質の例は、子宮頸がんで発現される、ヒト乳頭腫１６型ウイルスタンパク質Ｅ６およびＥ７である。
【００８６】
タンパク質が、細胞傷害性Ｔリンパ球によって腫瘍特異的または腫瘍関連抗原として認識され、治療で利用されるためには、特定の必要条件が満たされなくてはならない。抗原は、主に腫瘍細胞によって発現されるべきであり、健常組織によって発現されずまたは比較的少量発現され、または別の好ましい実施形態では、ペプチドは、健常組織と比較して、腫瘍細胞によって過剰提示されるべきである。それぞれの抗原は、ある種の腫瘍に存在するだけでなく、高い密度（すなわち、細胞あたりの各ペプチドのコピー数）で存在することも、さらに望ましい。腫瘍特異的および腫瘍関連抗原は、例えば、細胞周期制御またはアポトーシス抑制における機能が原因で、正常細胞から腫瘍細胞への形質転換に直接関与するタンパク質に、由来することが多い。さらに、形質転換を直接引き起こすタンパク質の下流標的が、上方制御されてもよく、したがって間接的に腫瘍関連であってもよい。このような間接的腫瘍関連抗原もまた、ワクチン接種アプローチの標的であってもよい。（Ｓｉｎｇｈ−Ｊａｓｕｊａ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｔｕｂｉｎｇｅｎ  ａｐｐｒｏａｃｈ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ＨＬＡ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００４  Ｍａｒ；５３（３）：１８７−９５）。どちらの場合も、腫瘍関連抗原に由来するペプチド（「免疫原性ペプチド」）は、生体外または生体内でＴ細胞応答をもたらすべきであるので、抗原のアミノ酸配列中にエピトープが存在することが必須である。
【００８７】
基本的に、ＭＨＣ分子に結合できるあらゆるペプチドが、Ｔ細胞エピトープとして機能してもよい。生体外または生体内Ｔ細胞応答誘導のための必要条件は、対応するＴＣＲがあるＴ細胞の存在、およびこの特定エピトープに対する免疫寛容の不在である。
【００８８】
したがって、ＴＡＡは腫瘍ワクチン開発のための出発点である。ＴＡＡを同定して特性決定する方法は、患者または健常者から単離され得るＣＴＬの使用に基づき、または方法は、腫瘍および正常組織間の差次的転写プロファイル、または差次的ペプチド発現パターンの生成に基づく。
【００８９】
しかし、腫瘍組織またはヒト腫瘍細胞系で過剰発現され、またはこのような組織または細胞系で選択的に発現される遺伝子の同定は、免疫療法においてこれらの遺伝子から転写される抗原の使用に関する、正確な情報を提供しない。これは、これらの抗原のエピトープの個々の亜集団のみが、このような用途に適するためであり、その理由は、対応するＴＣＲがあるＴ細胞が存在しなくてはならず、この特定のエピトープに対する免疫寛容が不在または最小でなくてはならないからである。したがって本発明の非常に好ましい実施形態では、それに対する機能性および／または増殖性Ｔ細胞がある、過剰にまたは選択的に提示されるペプチドのみを選択することが、重要である。このような機能性Ｔ細胞は、特異的抗原による刺激時にクローン増殖し得て、エフェクター機能を果たすことができるＴ細胞（「エフェクターＴ細胞」）と定義される。
【００９０】
本発明によるＴＣＲおよび抗体の場合、基礎となるペプチドの免疫原性は二次的である。本発明によるＴＣＲおよび抗体では、提示が決定的要素である。
【００９１】
Ｔヘルパー細胞は、抗腫瘍免疫において、ＣＴＬのエフェクター機能を統合する上で重要な役割を果たす。ＴＨ１型のＴヘルパー細胞応答を始動するＴヘルパー細胞エピトープは、ＣＤ８陽性キラーＴ細胞のエフェクター機能を支持し、それは、細胞表面に腫瘍関連ペプチド／ＭＨＣ複合体を提示する腫瘍細胞に向けられた、細胞傷害機能を含む。このようにして腫瘍関連Ｔヘルパー細胞ペプチドエピトープは、単独で、またはその他の腫瘍関連ペプチドとの組み合わせで、抗腫瘍免疫応答を刺激するワクチン組成物の活性医薬品成分の役割を果たし得る。
【００９２】
追加的ながんに対する使用は、以下の本発明によるペプチドのより詳細な説明で開示される。
【発明を実施するための形態】
【００９３】
本明細書の用法では、別段の記載がない限り、全ての用語は下述のとおり定義される。
【００９４】
「ペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカルボニル基の間のペプチド結合によって互いに連結する、一連のアミノ酸残基を命名するために本明細書で使用される。ペプチドは好ましくは９アミノ酸長であるが、８アミノ酸長程度に短く、１０、１１、１２、１３または１４アミノ酸程度に長くあり得て、ＭＨＣクラスＩＩペプチドの場合、それらは１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸長であり得る。
【００９５】
さらに「ペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカルボニル基の間のペプチド結合によって互いに連結する、一連のアミノ酸残基の塩を含むものとする。好ましくは、塩は、例えば、塩化物または酢酸塩（トリフルオロ酢酸塩）などのペプチドの薬学的に許容可能な塩である。
【００９６】
「ペプチド」という用語は、「オリゴペプチド」を含むものとする。「オリゴペプチドペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカルボニル基の間のペプチド結合によって互いに連結する、一連のアミノ酸残基を命名するために本明細書で使用される。オリゴペプチドの長さは、その中で正しいエピトープまたはエピトープが保持されれば、本発明にとって重要でない。オリゴペプチドは、典型的に、長さが約３０アミノ酸残基未満で、約１５アミノ酸残基を上回る。
【００９７】
「本発明のペプチド」という用語は、上で定義されるような、配列番号１〜配列番号３２５、配列番号３２６〜配列番号４４７または配列番号４４８〜配列番号６０５に記載のペプチドからなり、またはそれを含んでなるペプチドを含むものとする。
【００９８】
「ポリペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカルボニル基の間のペプチド結合によって互いに連結する、一続きのアミノ酸残基を指す。正しいエピトープが保持されれば、ポリペプチドの長さは本発明にとって重要でない。ペプチドまたはオリゴペプチドという用語とは対照的に、ポリペプチドという用語は、約３０を超えるアミノ酸残基を含有する分子を指すことが意図される。
【００９９】
このような分子をコードする、ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質またはポリヌクレオチドは、免疫応答を誘導する能力があれば「免疫原性」である（したがって本発明内の「免疫原」である）。本発明では、免疫原性は、より具体的には、Ｔ細胞応答を誘導する能力と定義される。したがって「免疫原」は、免疫応答を誘導する能力がある分子であり、本発明では、Ｔ細胞応答を誘導する能力がある分子である。別の態様では、免疫原は、それに対する特異的抗体またはＴＣＲを生じさせるために使用される、ペプチド、ペプチドとＭＨＣの複合体、オリゴペプチド、および／またはタンパク質であり得る。
【０１００】
クラスＩ  Ｔ細胞「エピトープ」は、クラスＩ  ＭＨＣ受容体に結合する短いペプチドを要して、三成分複合体（ＭＨＣクラスＩα鎖、β−２−ミクログロブリン、およびペプチド）を形成し、それは、適切な親和性でＭＨＣ／ペプチド複合体に結合する適合Ｔ細胞受容体を保有するＴ細胞によって、認識され得る。ＭＨＣクラスＩ分子へのペプチド結合は、典型的に８〜１４アミノ酸長であり、最も典型的には９アミノ酸長である。
【０１０１】
ヒトにおいては、ＭＨＣクラスＩ分子（ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ともまた称されるヒトのＭＨＣ分子）をコードする、３つの異なる遺伝子座、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃがある。ＨＬＡ−Ａ＊０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２、およびＨＬＡ−Ｂ＊０７は、これらの遺伝子座から発現され得る、異なるＭＨＣクラスＩ対立遺伝子の例である。
【０１０２】
表６：ＨＬＡ＊Ａ０２および最も頻度の高いＨＬＡ−ＤＲ血清型の発現頻度Ｆ。頻度は、ハーディ・ワインベルグ式Ｆ＝１−（１−Ｇｆ）２を用いて、Ｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｒｉ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．ＨＬＡ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ：ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｄｏｎｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｄｏｎｏｒ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．１９９７  Ｏｃｔ  １５；６４（７）：１０１７−２７）から適応された、米国人母集団におけるハプロタイプ頻度Ｇｆから推定される。連鎖不均衡のために、Ａ＊０２と特定のＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子との組み合わせは、それらの単一頻度から予測されるよりも豊富であり、または低頻度であるかもしれない。詳細については、Ｃｈａｎｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓ．Ｊ．Ｃｈａｎｏｃｋ，ｅｔ  ａｌ（２００４）ＨＬＡ−Ａ，−Ｂ，−Ｃｗ，−ＤＱＡ１  ａｎｄ  ＤＲＢ１  ｉｎ  ａｎ  Ａｆｒｉｃａｎ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＵＳＡ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６５：１２２３−１２３５）を参照されたい。
【０１０３】
【表６】
0006659582.tif 000037
【０１０４】
したがって治療および診断目的では、いくつかの異なるＨＬＡクラスＩＩ受容体と適切な親和性で結合するペプチドが、非常に望ましい。いくつかの異なるＨＬＡクラスＩＩ分子に対するペプチド結合は、乱交雑バインダーと称される。
【０１０５】
本明細書の用法では、ＤＮＡ配列への言及は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡの双方を含む。したがって、特異的配列は、文脈上明らかに別の意味が示唆されない限り、このような配列の一本鎖ＤＮＡ、このような配列とその補体との二本鎖（二本鎖ＤＮＡ）、およびこのような配列の補体を指す。「コード領域」という用語は、その天然ゲノム環境内で、遺伝子の発現産物を天然にまたは普通にコードする遺伝子の部分、すなわち、遺伝子の天然発現産物を生体内でコードする領域を指す。
【０１０６】
コード領域は、非変異型（「正常」）、変異型または改変遺伝子に由来し得て、またはＤＮＡ合成技術の当業者に周知の方法を使用して実験室で完全に合成された、ＤＮＡ配列または遺伝子に由来しさえする。
【０１０７】
「ヌクレオチド配列」という用語は、デオキシリボヌクレオチドのヘテロ重合体を指す。
【０１０８】
特定のペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、天然起源であってもよく、またはそれらは合成的に構築されてもよい。一般に、本発明のペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質をエンコードするＤＮＡ断片は、ｃＤＮＡフラグメントと短いオリゴヌクレオチドリンカーから構築され、または一連のオリゴヌクレオチドから構築されて、微生物またはウイルスオペロンに由来する調節因子を含んでなる、組換え転写単位で発現できる合成遺伝子を提供する。
【０１０９】
本明細書の用法では、「ペプチドをコードする（またはエンコードする）ヌクレオチド」という用語は、それによって配列が発現される生体系と適合性の人工（人造）開始および停止コドンを含むペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を指す。
【０１１０】
「発現産物」という用語は、遺伝子の、そして遺伝コード縮重に起因する同等物をコードし、したがって同一アミノ酸をコードする任意の核酸配列の、天然翻訳産物であるポリペプチドまたはタンパク質を意味する。
【０１１１】
コード配列に言及する場合、「フラグメント」という用語は、その発現産物が、完全コード領域の発現産物と本質的に同一の生物学的機能または活性を保つ、完全未満のコード領域を含んでなるＤＮＡの部分を意味する。
【０１１２】
「ＤＮＡ断片」という用語は、別々のフラグメントの形態の、またはより大型のＤＮＡコンストラクトの構成要素としての、ＤＮＡポリマーを指し、それは、実質的に純粋な、すなわち、混入内在性物質を含まない形態で、例えばクローニングベクターを使用する標準生化学的方法によって、断片およびその構成ヌクレオチド配列を同定、操作、および回収できるようにする量または濃度で、少なくとも１回単離されたＤＮＡに由来する。このような断片は、読み取り枠の形態で提供され、それは、典型的に真核生物遺伝子内に存在する内部非翻訳配列またはイントロンによって、中断されていない。非翻訳ＤＮＡ配列は、読み取り枠下流に存在してもよく、それはそこでコード領域の操作または発現を妨げない。
【０１１３】
「プライマー」という用語は、短い核酸配列を意味し、それはＤＮＡの１本鎖と対合し得て、ＤＮＡポリメラーゼがそこでデオキシリボヌクレオチド鎖合成を開始する、遊離３’−ＯＨ末端を提供する。
【０１１４】
「プロモーター」という用語は、転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼ結合に関与する、ＤＮＡの領域を意味する。
【０１１５】
「単離」という用語は、物質が、その元の環境（例えばそれが天然起源であれば、天然環境）から取り出されることを意味する。例えば、生きている動物中に存在する天然ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然システムで共存する物質の一部または全部から分離された同一ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり得て、および／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であり得るが、このようなベクターまたは組成物がその天然環境の一部でないと言う意味では、なおも単離されている。
【０１１６】
本発明によって開示されるポリヌクレオチド、および組換えまたは免疫原性ポリペプチドは、「精製」形態であってもよい。「精製」という用語は、完全に純粋である必要はなく；むしろ、それは相対的定義であることが意図されて、これらの用語が当業者によって理解されるように、高度に精製された調製物、または部分的にのみ精製された調製物を含み得る。例えば、ｃＤＮＡライブラリーから単離された個々のクローンは、電気泳動的に均一に、従来法で精製されている。少なくとも１桁、好ましくは２または３桁、より好ましくは４または５桁への出発原料または天然物質の精製が、明示的に検討される。さらに、重量基準で、好ましくは９９．９９９％、または少なくとも９９．９９％または９９．９％；さらに望ましくは９９％以上の純度を有する、特許請求されるポリペプチドが、明示的に検討される。
【０１１７】
本発明によって開示される核酸およびポリペプチド発現産物、ならびにこのような核酸および／またはこのようなポリペプチドを含有する発現ベクターは、「富化形態」であってもよい。本明細書の用法では、「富化」という用語は、（例えば）その天然濃度の少なくとも約２、５、１０、１００、または１０００倍の物質濃度を意味し、有利には重量基準で０．０１％、好ましくは重量基準で少なくとも約０．１％である。重量基準で約０．５％、１％、５％、１０％、および２０％の富化調製物もまた、検討される。本発明を構成する、配列、コンストラクト、ベクター、クローン、およびその他の物質は、有利には、富化または単離形態であり得る。
【０１１８】
「活性フラグメント」という用語は、単独で、または任意選択的に適切なアジュバントと共に、例えば、ウサギまたはマウスなどのそしてまたヒトを含む哺乳類などの動物に投与されると、免疫応答を生じるフラグメント（すなわち免疫原性を有する）を意味し、このような免疫応答は、ヒトなどのレシピエント動物におけるＴ細胞応答を刺激する形態を取る。代案としては、「活性フラグメント」はまた、生体外でＴ細胞応答を誘導するために使用されてもよい。
【０１１９】
本明細書の用法では、ポリペプチドとの関連で使用される場合、「部分」、「断片」、および「フラグメント」という用語は、アミノ酸残基などの連続する残基の配列を指し、その配列は、より大型の配列のサブセットを形成する。例えば、ポリペプチドが、トリプシンまたはキモトリプシンなどの一般的エンドペプチダーゼのいずれかによって処理されれば、このような処理から得られるオリゴペプチドは、出発ポリペプチドの部分、断片またはフラグメントに相当するであろう。ポリヌクレオチドに関して使用される場合、これらの用語は、いずれかのエンドヌクレアーゼによる前記ポリヌクレオチドの処理によって生じる生成物を指す。
【０１２０】
本発明によると、配列に言及する場合、「同一性百分率」または「パーセント同一」という用語は、比較される配列（「比較配列」）と、記載されまたは特許請求される配列（「参照配列」）とのアライメント後に、配列が、特許請求されまたは記載される配列と比較されることを意味する。次に同一性百分率は、次式に従って判定される：
同一性百分率＝１００［１−（Ｃ／Ｒ）］
式中、Ｃは、参照配列と比較される配列との間のアライメント長にわたる、参照配列と比較配列の間の差異の数であり、
（ｉ）比較配列中に対応する整列塩基またはアミノ酸を有しない参照配列中の各塩基またはアミノ酸、および
（ｉｉ）参照配列中の各ギャップ、および
（ｉｉｉ）比較配列中の整列塩基またはアミノ酸と異なる参照配列中の各整列塩基またはアミノ酸が、差異を構成して、
（ｉｉｉｉ）アライメントは、整合配列の１位から開始しなくてはならず；
Ｒは、比較配列とのアライメント長にわたる参照配列中の塩基またはアミノ酸の数であり、参照配列中に生じるあらゆるギャップも塩基またはアミノ酸として数えられる。
【０１２１】
比較配列とそれに対して同一性百分率が上のように計算される参照配列との間に、特定の最小同一性百分率とほぼ同一のまたはそれ以上のアライメントが存在すれば、その中に上記のように計算された同一性百分率が特定の同一性百分率未満であるアライメントが存在したとしても、比較配列は、参照配列との特定の最小同一性百分率を有する。
【０１２２】
本明細書で開示される元の（未修飾）ペプチドは、特に明記されない場合は、ペプチド鎖内の異なる、おそらくは選択的な部位における、１つまたは複数の残基の置換によって修飾され得る。好ましくはこれらの置換は、アミノ酸鎖の末端に位置する。このような置換は保存的性質であってもよく、例えば、疎水性アミノ酸が別の疎水性アミノ酸によって置換されるなど、構造および特徴の類似したアミノ酸によってアミノ酸が置換される。さらにより保存的な置換は、ロイシンのイソロイシンによる置換などの同一または類似サイズおよび化学的性質のアミノ酸の置換である。天然起源相同タンパク質ファミリーの配列多様性の研究では、特定のアミノ酸置換は、他よりも耐容されることが多く、これらは、元のアミノ酸とその置換物の間のサイズ、電荷、極性、および疎水性の類似性との相関を示すことが多く、これが「保存的置換」の定義の基礎である。
【０１２３】
保存的置換は、本明細書では、以下の５つのグループの１つの中の交換として定義される：グループ１−小型脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）；グループ２−極性の負に帯電した残基およびそれらのアミド（Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ）；グループ３−極性の正に帯電した残基（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）；グループ４−大型脂肪族非極性残基（Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ）；およびグループ５−大型芳香族残基（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）。
【０１２４】
より保存的でない置換は、アラニンのイソロイシン残基による置換などの類似した特徴を有するがサイズがいくらか異なる別のアミノ酸による置換を伴うかもしれない。高度に非保存的な置換は、酸性アミノ酸による極性アミノ酸の置換、または塩基性でさえあるアミノ酸の置換を伴うかもしれない。しかし化学効果は完全に予測可能でなく、遊離基置換は単純な化学的原理からは予測できない偶然の効果をもたらす可能性があるので、このような「過激な」置換でも、潜在的に無効であるとして却下し得ない。
【０１２５】
もちろんこのような置換には、通常のＬ−アミノ酸以外の構造体が関与してもよい。したがってＤ−アミノ酸が、本発明の抗原性ペプチドに通常見られるＬ−アミノ酸を置換するかもしれず、依然として本明細書の開示に包含される。さらに非標準Ｒ基（すなわち、天然タンパク質の通常の２０個のアミノ酸に見られるもの以外のＲ基）を保持するアミノ酸もまた置換目的で使用されて、本発明による免疫原および免疫原性ポリペプチドが生成されてもよい。
【０１２６】
２つ以上の位置における置換が、以下に定義されるように実質的に同等またはそれ以上の抗原活性のあるペプチドをもたらすことが発見された場合、これらの置換の組み合わせを試験して、置換の組み合わせが、ペプチドの抗原性に相加または相乗効果をもたらすかどうかが判定される。最大で、ペプチド内の４つ以下の位置が同時に置換される。
【０１２７】
本発明のペプチドは、最大４個のアミノ酸で伸長させ得て、すなわち４：０〜０：４の間のあらゆる組み合わせで、どちらかの末端に１、２、３または４個のアミノ酸が付加され得る。
【０１２８】
本発明による伸長の組み合わせは、以下の表７に示される。
【０１２９】
【表７】
0006659582.tif 000038
【０１３０】
伸長のためのアミノ酸は、元のタンパク質配列のペプチドまたは任意のその他のアミノ酸であり得る。伸長を利用して、ペプチドの安定性または溶解度を高め得る。
【０１３１】
「Ｔ細胞応答」という用語は、生体外または生体内でペプチドによって誘導される、エフェクター機能の特異的増殖および活性化を意味する。ＭＨＣクラスＩ拘束性ＣＴＬでは、エフェクター機能は、ペプチドパルス、ペプチド前駆体パルスまたは天然ペプチド提示標的細胞の溶解；好ましくはペプチドによって誘導されるインターフェロン−γ、ＴＮＦ−α、またはＩＬ−２であるサイトカインの分泌；好ましくはペプチドによって誘導されるグランザイムまたはパーフォリンであるエフェクター分子の分泌；または脱顆粒であってもよい。
【０１３２】
好ましくは、本発明によるペプチドに特異的なＣＴＬを置換ペプチドについて試験する場合、置換ペプチドが背景に対して最大溶解増大の半分を達成するペプチド濃度は、約１ｍＭ以下、好ましくは約１μＭ以下、より好ましくは約１ｎＭ以下、さらにより好ましくは約１００ｐＭ以下、最も好ましくは約１０ｐＭ以下である。置換ペプチドが、２人以上、少なくとも２人、より好ましくは３人の個人からのＣＴＬによって認識されることもまた好ましい。
【０１３３】
したがって本発明のエピトープは、天然起源腫瘍関連または腫瘍特異的エピトープと同一であってもよく、またはそれらが実質的に同一の抗原活性を有しさえすれば、４つ以下の残基が参照ペプチドと異なるエピトープを含んでもよい。
【０１３４】
免疫応答の刺激は、宿主免疫系によって外来性として認識された抗原の存在に依存する。腫瘍関連抗原の存在の発見は、今や、宿主の免疫系を用いて、腫瘍成長に介入する可能性を高めた。免疫系の体液性および細胞性アームの双方を活用する様々な機構が、がん免疫療法のために目下探索されている。
【０１３５】
細胞性免疫応答の特定の要素は、腫瘍細胞を特異的に認識して破壊する能力がある。腫瘍浸潤性細胞集団から、または末梢血からの細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の単離は、がんに対する自然免疫防御において、このような細胞が重要な役割を果たすことを示唆する。特に、ＣＤ８陽性Ｔ細胞がこの応答において重要な役割を果たし、それらは、細胞質ゾル内に位置するタンパク質または欠陥リボソーム産物（ＤＲＩＰＳ）に由来する、通常は８〜１２残基の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）保有ペプチドのクラスＩ分子を認識する。ヒトのＭＨＣ分子はまた、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とも称される。
【０１３６】
ＭＨＣクラスＩ分子は、主に内在性の細胞質または核タンパク質、ＤＲＩＰＳ、およびより大型のペプチドのタンパク質分解的切断から得られる、ペプチドを提示する、核を有する大多数の細胞上にある。しかし、エンドソームコンパートメントまたは外来性起源に由来するペプチドもまた、ＭＨＣクラスＩ分子上に頻繁に見られる。この非古典的様式のクラスＩ提示は、文献中で交差提示と称される。
【０１３７】
ＣＤ８およびＣＤ４依存性のどちらのタイプの応答も、共同して相乗的に抗腫瘍効果に寄与するので、ＣＤ８陽性ＣＴＬ（ＭＨＣクラスＩ分子）またはＣＤ４陽性ＣＴＬ（ＭＨＣクラスＩＩ分子）のどちらかによって認識される腫瘍関連抗原の同定および特性解析は、腫瘍ワクチンの開発において重要である。したがってどちらかのクラスのＭＨＣ複合体へのペプチド結合を含有するペプチド組成物を提供することが、本発明の目的である。
【０１３８】
がん治療に関連する重篤な副作用および費用を考慮すると、より良い予後診断法および診断法がぜひとも必要である。したがって、がん全般、特に肺がんのための生物マーカーに相当する、その他の要素を同定する必要性がある。さらに、がん全般、特にＡＭＬの治療法で使用され得る要素を同定する必要性がある。
【０１３９】
本発明は、本発明のペプチドを過剰にまたは排他的に提示する、がん／腫瘍、好ましくは肺がん、なおもより好ましくはＡＭＬおよびその他のがん（表５を参照されたい）を治療するのに有用なペプチドを提供する。これらのペプチドは、原発性ヒトＡＭＬサンプル上で、ＨＬＡ分子によって天然に提示されることが、質量分析法によって示された。
【０１４０】
ペプチドがそれに由来する起源遺伝子／タンパク質（「完全長タンパク質」または「基礎タンパク質」とも称される）は、正常組織と比較して、腫瘍組織で高度に過剰発現されることが示され（ＡＭＬについては、実施例１および図２を参照されたい）、起源遺伝子との高度な腫瘍関連性が実証された。さらに、ペプチドそれ自体も腫瘍組織上では強力に過剰提示されたが、正常組織では過剰提示されなかった（実施例１および図３を参照されたい）。
【０１４１】
ＨＬＡ結合ペプチドは、免疫系、具体的にはＴリンパ球／Ｔ細胞によって認識され得る。Ｔ細胞は、例えば誘導ペプチドを提示する肺がん細胞などの認識されたＨＬＡ／ペプチド複合体を提示する細胞を破壊し得る。
【０１４２】
本発明のペプチドは、Ｔ細胞応答を刺激する能力がありおよび／または過剰提示されることが示されおり、したがって本発明に従って、抗体および／またはＴＣＲ、特にｓＴＣＲを生成するために使用され得る（実施例１および図４を参照されたい）。さらに、ペプチドは、それぞれのＭＨＣと複合体化した場合、抗体および／またはＴＣＲ、特に本発明によるＴＣＲ生成のためにも使用され得る。それぞれの方法は当業者に良く知られており、それぞれの参考文献にもまた見られる。したがって本発明のペプチドは、それによって腫瘍細胞を破壊し得る、患者における免疫応答を生じさせるのに有用である。患者における免疫応答は、理想的には免疫原性を増強する薬剤（すなわちアジュバント）との組み合わせで、記載されるペプチド、または適切な前駆体（例えば、伸長ペプチド、タンパク質、またはこれらのペプチドをコードする核酸）を患者に直接投与することで、誘導され得る。本発明の標的ペプチドは、正常組織上では同等のコピー数で提示されないので、このような治療的ワクチン接種から起こる免疫応答は、腫瘍細胞に対して高度に特異的であることが予測され得て、患者の正常細胞に対する望まれない自己免疫反応のリスクを防止する。
【０１４３】
医薬組成物は、遊離形態または薬学的に許容可能な塩の形態のどちらかのペプチドを含んでなる（上記もまた参照されたい）。本明細書の用法では、「薬学的に許容可能な塩」は、開示されたペプチドの誘導体を指し、ペプチドは、薬剤の酸性または塩基性塩を生成することで修飾される。例えば、酸性塩は、適切な酸との反応を伴って、遊離塩基（典型的にその中で中性形態の薬剤が中性ＮＨ２基を有する）から調製される。酸性塩を調製するための適切な酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などの有機酸、ならびに例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸リン酸などの無機酸の双方が挙げられる。逆に、ペプチド上に存在してもよい酸部分の塩基性塩の調製物は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、トリメチルアミンなどの薬学的に許容可能な塩基を用いて調製される。
【０１４４】
特に好ましい一実施形態では、医薬組成物は、酢酸（酢酸塩）、トリフルオロ酢酸または塩酸（塩化物）の塩として、ペプチドを含んでなる。
【０１４５】
がんを治療するために有用であるのに加えて、本発明のペプチドは、診断薬としてもまた有用である。ペプチドは肺がん細胞から生成され、これらのペプチドは正常組織には存在せずまたはより低レベルで存在すると判定されたので、これらのペプチドを使用してがんの存在が診断され得る。
【０１４６】
特許請求されるペプチドの組織生検上の存在は、がん診断において病理学者を補佐し得る。抗体、質量分析法または当該技術分野で既知のその他の方法による特定のペプチドの検出は、組織が悪性であり、または炎症を起こしており、または一般的に病的であることを病理学者に伝え得る。ペプチド基の存在は、病的組織の分類または下位分類を可能にし得る。
【０１４７】
患部組織検体上のペプチドの検出は、特にＴリンパ球が作用機序に関与することが知られておりまたは予測される場合に、免疫系が関与する治療法の利点を判定できるようにする。ＭＨＣ発現の喪失は、それによって感染悪性細胞が免疫監視を逃れる、十分に説明された機序である。したがってペプチドの存在は、この機序が、分析した細胞によって活用されていないことを示す。
【０１４８】
本発明のペプチドは、ペプチドまたはＭＨＣ分子と複合体化したペプチドに対する、Ｔ細胞応答または抗体応答などのこれらのペプチドに対するリンパ球応答を分析するのに、使用されるかもしれない。これらのリンパ球応答は、さらなる治療ステップを決定するための予後マーカーとして使用され得る。これらの応答はまた、例えば、タンパク質、核酸、自己材料のワクチン接種や、リンパ球の養子免疫伝達などの異なる手段によるリンパ球応答の誘導を目指す、免疫療法アプローチにおける代理マーカーとして使用され得る。遺伝子治療の設定では、副作用の評価において、ペプチドに対するリンパ球応答が考慮され得る。リンパ球応答のモニタリングはまた、例えば移植片対宿主病および宿主対移植片病の検出など、移植治療の経過観察検査のための有益な手段かもしれない。
【０１４９】
本発明のペプチドを使用して、ＭＨＣ／ペプチド複合体に対する特異的抗体が生成され開発され得る。これらは、毒素または放射性物質を患部組織に標的化する治療法のために、使用され得る。これらの抗体の別の用途は、ＰＥＴなどのイメージング目的の放射性核種の患部組織への標的化であり得る。この用途は、小規模な転移の検出、または病的組織のサイズと正確な位置確認の判定を助け得る。
【０１５０】
したがってＨＬＡ拘束性抗原と複合体化したヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩと特異的に結合する、組換え抗体を製造する方法を提供することが、本発明のさらなる態様であり、方法は、前記ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩを発現する細胞を含んでなる、遺伝子操作された非ヒト哺乳類を前記ＨＬＡ拘束性抗原と複合体化した可溶性形態のＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子によって免疫化するステップと；前記非ヒト哺乳類の抗体産生細胞から、ｍＲＮＡ分子を単離するステップと；前記ｍＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質分子を提示するファージディスプレイライブラリーを作成するステップと；前記ファージディスプレイライブラリーから少なくとも１つのファージを単離するステップとを含んでなり、前記少なくとも１つのファージは、前記ＨＬＡ拘束性抗原と複合体化した前記ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩと特異的に結合する、前記抗体を提示する。
【０１５１】
ＨＬＡ拘束性抗原と複合体化したヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩと特異的に結合する抗体を提供することも、本発明のさらなる態様であり、その中で抗体は、好ましくは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体および／またはキメラ抗体である。
【０１５２】
本発明のさらに別の態様は、ＨＬＡ拘束性抗原と複合体化したヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩと特異的に結合する、前記抗体を製造する方法に関し、方法は、前記ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩを発現する細胞を含んでなる、遺伝子操作された非ヒト哺乳類を前記ＨＬＡ拘束性抗原と複合体化した可溶性形態のＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子によって免疫化するステップと；前記非ヒト哺乳類の抗体産生細胞からｍＲＮＡ分子を単離するステップと；前記ｍＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質分子を提示するファージディスプレイライブラリーを作成するステップと；前記ファージディスプレイライブラリーから少なくとも１つのファージを単離するステップとを含んでなり、前記少なくとも１つのファージは、前記ＨＬＡ拘束性抗原と複合化した前記ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩと特異的に結合可能な前記抗体を提示する。このような抗体および一本鎖クラスＩ主要組織適合性複合体を生成するそれぞれの方法、ならびにこれらの抗体を生成するためのその他のツールは、本発明の目的で、全てその内容全体が参照によって明示的に援用される、国際公開第第０３／０６８２０１号パンフレット、国際公開第２００４／０８４７９８号パンフレット、国際公開第０１／７２７６８号パンフレット、国際公開第０３／０７０７５２号パンフレット、およびＣｏｈｅｎ  ＣＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ＭＨＣ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ，ｐｅｐｔｉｄｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ，Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ：ｎｅｗ  ｔｏｏｌｓ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＴＣＲ−ｐｅｐｔｉｄｅ−ＭＨＣ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．２００３  Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；１６（５）：３２４−３２．；Ｄｅｎｋｂｅｒｇ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ａｎｄ  ＡＰＣｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｗｉｔｈ  ＴＣＲ−ｌｉｋｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔｏｗａｒｄ  ａ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３  Ｓｅｐ  １；１７１（５）：２１９７−２０７；およびＣｏｈｅｎ  ＣＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ：ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ，ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｖｉｒａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ＭＨＣ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３  Ａｐｒ  １５；１７０（８）：４３４９−６１で開示される。
【０１５３】
好ましくは、抗体は、２０ナノモル濃度未満、好ましくは１０ナノモル濃度未満の結合親和性で複合体に結合し、それは本発明の文脈で「特異的」と見なされる。
【０１５４】
特異的ペプチドＭＨＣ複合体を認識する可溶性Ｔ細胞受容体を製造する方法を提供することもまた、本発明のさらなる態様である。このような可溶性Ｔ細胞受容体は、特異的Ｔ細胞クローンから生成され得て、それらの親和性は、相補性決定領域を標的とする変異誘発によって増大され得る。Ｔ細胞受容体の選択目的で、ファージディスプレイが使用され得る（米国特許第２０１０／０１１３３００号明細書、Ｌｉｄｄｙ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ＴＣＲ−ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｋｉｌｌｉｎｇ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２０１２  Ｊｕｎ；１８（６）：９８０−９８７）。ファージディスプレイにおいて、および薬剤としての実用において、Ｔ細胞受容体を安定化する目的で、例えば非天然ジスルフィド結合、その他の共有結合（一本鎖Ｔ細胞受容体）、または二量体化ドメインによって、αおよびβ鎖を連結させ得る（Ｂｏｕｌｔｅｒ  ＪＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｔａｂｌｅ，ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｆｏｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  ２００３  Ｓｅｐ；１６（９）：７０７−７１１．；Ｃａｒｄ  ＫＦ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＩＬ−２  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｔａｉｎｓ  ＭＨＣ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ＩＬ−２  ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２００４  Ａｐｒ；５３（４）：３４５−３５７；およびＷｉｌｌｃｏｘ  ＢＥ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ａｌｐｈａｂｅｔａ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ  ｓｕｉｔａｂｌｅ  ｆｏｒ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １９９９  Ｎｏｖ；８（１１）：２４１８−２４２３を参照されたい）。Ｔ細胞受容体は、標的細胞上で特定機能を発揮させるために、毒素、薬剤、サイトカイン（米国特許第２０１３／０１１５１９１号明細書を参照されたい）、抗ＣＤ０１１５１９１ドメインのようなエフェクター細胞漸増ドメインなどに、連結させ得る。さらにそれは、養子免疫伝達のために使用されるＴ細胞内で発現され得る。
【０１５５】
さらなる情報は、国際公開第２００４／０３３６８５Ａ１号パンフレットおよび国際公開第２００４／０７４３２２Ａ１号パンフレットにある。ＴＣＲの組み合わせは、国際公開第２０１２／０５６４０７Ａ１号パンフレットに記載される。さらなる生成方法は、国際公開第２０１３／０５７５８６Ａ１号パンフレットで開示される。
【０１５６】
さらに、それらは、生検サンプルに基づく病理学者のがん診断を確認するために使用され得る。
【０１５７】
過剰提示ペプチドを選択するために、中央値サンプル提示ならびに反復試験変動を示す、提示プロファイルが計算される。プロファイルは、関心のある腫瘍実体のサンプルを正常なサンプルのベースラインに並置させる。次に、線形混合効果モデルのｐ値を計算し（Ｊ．Ｐｉｎｈｅｉｒｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｎｌｍｅ  Ｐａｃｋａｇｅ：Ｌｉｎｅａｒ  ａｎｄ  Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｍｉｘｅｄ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  Ｍｏｄｅｌｓ．２００７）、誤検出率によって複数試験について補正するすることで（Ｙ．Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ  ａｎｄ  Ｙ．Ｈｏｃｈｂｅｒｇ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｆａｌｓｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒａｔｅ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｐｏｗｅｒｆｕｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ．Ｓｅｒｉｅｓ  Ｂ（Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌ），Ｖｏｌ．５７（Ｎｏ．１）：２８９−３００，１９９５）、これらの各プロファイルが過剰提示スコアに統合され得る。
【０１５８】
質量分析法によるＨＬＡリガンドの同定と相対的定量化のために、衝撃凍結サンプルからのＨＬＡ分子が精製され、ＨＬＡ関連ペプチドが単離された。単離ペプチドが分離され、オンラインナノエレクトロスプレーイオン化（ｎａｎｏＥＳＩ）液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）実験によって、配列が同定された。得られたペプチド配列は、ＡＭＬサンプルから記録された天然ＴＵＭＡＰの断片化パターンを同一配列の対応する合成参照ペプチドの断片化パターンと比較することで、確認された。ペプチドは、原発性腫瘍のＨＬＡ分子のリガンドとして直接同定されたので、これらの結果は、ＡＭＬ患者から入手された原発性腫瘍組織上における、同定されたペプチドの天然プロセッシングおよび提示の直接的証拠を提供する。
【０１５９】
発見パイプラインＸＰＲＥＳＩＤＥＮＴ（登録商標）ｖ２．１（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第２０１３−００９６０１６号明細書を参照されたい）は、いくつかの異なる非がん性組織および臓器と比較した、がん組織上のＨＬＡ拘束性ペプチドレベルの直接的相対定量化に基づく、妥当な過剰提示ペプチドワクチン候補の同定と選択を可能にする。これは、独自仕様のデータ解析パイプラインによる獲得ＬＣ−ＭＳデータ処理、配列同定のためのアルゴリズム組み合わせ、スペクトルクラスタリング、イオン計数、滞留時間アライメント、電荷状態のデコンボリューションと正規化を使用した、無標識示差定量化の開発によって達成された。
【０１６０】
各ペプチドおよびサンプルの誤差推定値を含む、提示レベルが確立された。腫瘍組織上で排他的に提示されるペプチド、および腫瘍内で過剰提示されるペプチドが、非がん性の組織および臓器との比較で同定された。
【０１６１】
本発明の文脈では、５０回の衝撃凍結ＡＭＬ腫瘍組織サンプルからのＨＬＡペプチド複合体が精製されて、ＨＬＡ関連ペプチドが単離され、ＬＣ−ＭＳによって分析された（実施例を参照されたい）。本出願に含まれる全てのＴＵＭＡＰは、このアプローチによって原発性ＡＭＬ腫瘍サンプル上で同定され、原発性ＡＭＬ上におけるそれらの提示が確認された。
【０１６２】
ＡＭＬ腫瘍および正常組織上で同定されたＴＵＭＡＰは、無標識ＬＣ−ＭＳデータのイオン計数を使用して定量化された。方法は、ペプチドのＬＣ−ＭＳシグナル面積が、サンプル中のその豊富さに相関すると仮定する。様々なＬＣ−ＭＳ実験におけるペプチドの全ての定量的シグナルは、中心傾向に基づいて正規化され、サンプルあたりで平均化されて、提示プロファイルと称される棒グラフにマージされた。提示プロファイルは、タンパク質データベース検索、スペクトルクラスタリング、電荷状態デコンボリューション（除電）、および滞留時間アライメントおよび正規化のような、異なる解析法を統合する。
【０１６３】
したがって本発明は、配列番号１〜配列番号３２５、配列番号３２６〜配列番号４４７または配列番号４４８〜配列番号６０５からなる群から選択される配列を含んでなるペプチド、または配列番号１〜配列番号３２５、配列番号３２６〜配列番号４４７または配列番号４４８〜配列番号６０５と少なくとも９０％相同的な（好ましくは同一の）それらの変異体、または前記ペプチドと交差反応するＴ細胞を誘導するそれらの変異体に関し、前記ペプチドは完全長ポリペプチドでない。
【０１６４】
本発明は、配列番号１〜配列番号３２５、配列番号３２６〜配列番号４４７または配列番号４４８〜配列番号６０５からなる群から選択される配列を含んでなるペプチド、または配列番号１〜配列番号３２５、配列番号３２６〜配列番号４４７または配列番号４４８〜配列番号６０５と少なくとも９０％相同的な（好ましくは同一の）それらの変異体にさらに関し、前記ペプチドまたは変異型は、８〜１００、好ましくは８〜３０、最も好ましくは８〜１４アミノ酸の全長を有する。
【０１６５】
本発明は、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩの分子に結合する能力を有する、本発明によるペプチドにさらに関する。
【０１６６】
本発明は、配列番号１〜配列番号３２５、配列番号３２６〜配列番号４４７または配列番号４４８〜配列番号６０５に記載のアミノ酸配列からなり、またはそれから本質的になる、本発明によるペプチドにさらに関する。
【０１６７】
本発明は、ペプチドが（化学的に）修飾されおよび／または非ペプチド結合を含む、本発明によるペプチドにさらに関する。
【０１６８】
本発明は、本発明によるペプチドにさらに関し、ペプチドは、融合タンパク質の一部であり、特にＨＬＡ−ＤＲ抗原関連不変鎖（Ｉｉ）のＮ末端アミノ酸を含んでなり、またはペプチドは、例えば樹状細胞特異的抗体などの抗体に（またその中に）融合する。
【０１６９】
本発明は、本発明によるペプチドをエンコードする核酸にさらに関するが、ただしペプチドは完全ヒトタンパク質でない。
【０１７０】
本発明は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせである、本発明による核酸にさらに関する。
【０１７１】
本発明は、本発明による核酸を発現する能力がある発現ベクターにさらに関する。
【０１７２】
本発明は、医療で使用するための本発明によるペプチド、本発明による核酸、または本発明による発現ベクターにさらに関する。
【０１７３】
本発明は、本発明による核酸または本発明による発現ベクターを含んでなる、宿主細胞にさらに関する。
【０１７４】
本発明は、抗原提示細胞である、本発明による宿主細胞にさらに関する。
【０１７５】
本発明は、抗原提示細胞が樹状細胞である、本発明による宿主細胞にさらに関する。
【０１７６】
本発明は、本発明によるペプチドを製造する方法にさらに関し、方法は、記載される宿主細胞を培養するステップと、宿主細胞またはその培養液からペプチドを単離するステップとを含んでなる。
【０１７７】
本発明は、活性化細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を製造するためのインビトロ法にさらに関し、方法は、ＣＴＬを適切な抗原細胞の表面に発現される抗原負荷ヒトクラスＩまたはＩＩ  ＭＨＣ分子に、前記ＣＴＬを抗原特異的様式で活性化するのに十分な時間にわたり、生体外で接触させるステップを含んでなり、前記抗原は本発明による任意のペプチドである。
【０１７８】
本発明は、十分な量の抗原を抗原提示細胞に接触させることで、前記抗原が、適切な抗原提示細胞の表面に発現されるクラスＩまたはＩＩＭＨＣ分子上に負荷される、記載される方法にさらに関する。
【０１７９】
本発明は、抗原提示細胞が、配列番号１〜配列番号３２５、配列番号３２６〜配列番号４４７または配列番号４４８〜配列番号６０５を含有する前記ペプチドを発現する能力がある、発現ベクター、または前記変異アミノ酸配列を含んでなる、本発明による方法にさらに関する。
【０１８０】
本発明は、記載されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する細胞を選択的に認識する、本発明による方法によって製造される、活性化細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）にさらに関する。
【０１８１】
本発明は、患者において標的細胞を死滅させる方法にさらに関し、その標的細胞は、本発明による任意のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現し、方法は、本発明による有効数の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を患者に投与するステップを含んでなる。
【０１８２】
本発明は、薬剤としての、または薬剤の製造における、本発明による任意のペプチド、本発明による核酸、本発明による発現ベクター、本発明による細胞、または本発明による活性化細胞傷害性Ｔリンパ球の使用にさらに関する。
【０１８３】
本発明は、薬剤がワクチンである、本発明による使用にさらに関する。
【０１８４】
本発明は、薬剤ががんに対して有効である、本発明による使用にさらに関する。
【０１８５】
本発明は、前記がん細胞がＡＭＬ細胞またはその他の非固形腫瘍細胞である、本発明による使用にさらに関する。
【０１８６】
本発明は、肺がんの予後診断で使用され得る、特定のマーカータンパク質および生物マーカーにさらに関する。
【０１８７】
さらに、本発明は、がん治療のための本発明によって記載されるような新規標的の使用に関する。
【０１８８】
「抗体（単数）」または「抗体（複数）」という用語は、本明細書では広義に使用され、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の双方を含む。本発明によれば、「抗体」という用語には、所望の特性（例えば、肺がんマーカーポリペプチドの特異的結合、増大したレベルで肺がんマーカー遺伝子を発現する肺がん細胞への毒素送達、および／または肺がんマーカーポリペプチドの活性阻害）のいずれかを示しさえすれば、未変性または「完全」免疫グロブリン分子に加えて、これらの免疫グロブリン分子のフラグメントまたはポリマー、および免疫グロブリン分子のヒト化バージョンもまた含まれる。
【０１８９】
可能ならいつでも、本発明の抗体は、商業的供給元から購入されてもよい。また本発明の抗体は、周知の方法を使用して生成されてもよい。当業者は、本発明の抗体を生成するために、完全長肺がんマーカーポリペプチドまたはそのフラグメントのどちらを使用してもよいことを理解するであろう。本発明の抗体を生成するために使用されるポリペプチドは、天然起源から部分的にまたは完全に精製されてもよく、または組換えＤＮＡ技術を使用して製造されてもよい。
【０１９０】
例えば、配列番号１〜配列番号３２５、配列番号３２６〜配列番号４４７または配列番号４４８〜配列番号６０５ポリペプチドに記載のペプチド、またはその変異体またはフラグメントなどの本発明によるペプチドをコードするｃＤＮＡは、原核細胞（例えば、細菌）または真核細胞（例えば、酵母、昆虫、または哺乳類細胞）内で発現され得て、その後、組換えタンパク質を精製して、本発明による抗体を生成するために使用される肺がんマーカーポリペプチドと特異的に結合する、モノクローナルまたはポリクローナル抗体製剤を生成するために使用され得る。
【０１９１】
当業者は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体の２つ以上の異なるセットの生成が、その目的の用途（例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学的検査、生体内イメージング、免疫毒素療法）に必要な特異性および親和性がある抗体を得る可能性を最大化することを理解するであろう。抗体は、それに対して抗体が使用される目的に従って、既知の方法によってそれらの所望の活性について試験される（例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学的検査、免疫療法など；抗体の生成および試験のさらなるガイダンスについては、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｎｅｗ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  ２０１３を参照されたい）。例えば、抗体は、ホルマリン固定肺がんまたは冷凍組織切片のＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロット、免疫組織化学染色中で試験されてもよい。それらの最初の生体外特性解析後、治療または生体内診断用途を意図した抗体が、既知の臨床試験法によって試験される。
【０１９２】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書の用法では、実質的に均質な抗体集団から入手される抗体を指し；すなわち、母集団を構成する個々の抗体は、微量で存在してもよい可能な自然発生的変異を除き同一である。本明細書では、「モノクローナル抗体」は、「キメラ」抗体を明確に含み、その中では、それらが所望の拮抗活性を示しさえすれば、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来しまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同的である一方で、鎖の残部は、別の種に由来しまたは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中、ならびにこのような抗体のフラグメント中の対応する配列と同一または相同的である（その内容全体を本明細書に援用する、米国特許第４，８１６，５６７号明細書）。
【０１９３】
本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法を使用して調製されてもよい。ハイブリドーマ法では、マウスまたはその他の適切な宿主動物が典型的に免疫剤によって免疫化され、免疫剤と特異的に結合する抗体を産生するまたは産生できるリンパ球を生じる。代案としては、リンパ球は、生体外で免疫化されてもよい。
【０１９４】
モノクローナル抗体はまた、米国特許第，８１６，５６７号明細書に記載されるものなどの組換えＤＮＡ法によって生成されてもよい。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して、容易に単離および配列決定され得る（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合できる、オリゴヌクレオチドプローブを使用することで）。
【０１９５】
インビトロ法もまた、一価の抗体を調製するのに適する。抗体フラグメント、特にＦａｂフラグメントを生成するための抗体の消化は、当該技術分野で既知の通例の技術を使用して達成され得る。例えば、消化は、パパインを使用して実施され得る。パパイン消化の例は、国際公開第９４／２９３４８号パンフレットおよび米国特許第４，３４２，５６６号明細書に記載される。抗体のパパイン消化は、それぞれ単一抗原結合部位があるＦａｂフラグメントと称される２つの同一の抗原結合フラグメントと、残りのＦｃフラグメントとを典型的に生成する。ペプシン処理は、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントおよびｐＦｃ’フラグメントをもたらす。
【０１９６】
抗体フラグメントは、その他の配列に付着するかどうかに関わりなく、フラグメントの活性が非修飾抗体または抗体フラグメントと比較して顕著に変化せずまたは損なわれないという条件で、特定領域または特定アミノ酸残基の挿入、欠失、置換、またはその他の選択された修飾もまた含み得る。これらの修飾は、ジスルフィド結合能力のあるアミノ酸の除去／付加、そのバイオ寿命増大、その分泌特性改変などのいくつかの追加的な特性を提供し得る。いずれの場合も、抗体フラグメントは、結合活性、結合領域における結合調節などの生理活性特性を有しなくてはならない。抗体の機能性または活性領域は、タンパク質の特定領域の変異誘発と、それに続く発現および発現ポリペプチドの試験によって、同定されてもよい。このような方法は、当該技術分野の熟練した実務家には容易に分かり、抗体フラグメントをエンコードする核酸の部位特異的変異誘発を含み得る。
【０１９７】
本発明の抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体をさらに含んでなってもよい。非ヒト（例えばマウス）抗体などのヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはその他の抗原結合部分配列など）である。ヒト化抗体としては、その中でレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する、マウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト生物種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置換される、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が挙げられる。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体または移入ＣＤＲまたはフレームワーク配列のどちらにも見られない、残基を含んでなってもよい。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つおよび典型的に２つの可変領域の実質的に全てを含んでなり、その中では、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン共通配列のものである。ヒト化抗体は、至適には、典型的にヒト免疫グロブリン定常領域である、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部もまた含んでなる。
【０１９８】
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該技術分野で周知である。通常、ヒト化抗体は、非ヒト起源から導入された、１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「移入」残基と称されることが多く、それは典型的に「移入」可変領域から得られる。ヒト化は、齧歯類ＣＤＲ（複数）またはＣＤＲ（単数）配列を対応するヒト抗体配列によって置換することで、基本的に実施され得る。したがって、このような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）であり、その中では、実質的に非損傷ヒト可変領域未満が、非ヒト生物種からの対応する配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は典型的にヒト抗体であり、その中では、いくつかのＣＤＲ残基と、おそらくはいくつかのＦＲ残基とが、齧歯類抗体中の類似部位からの残基によって置換されている。
【０１９９】
免疫化に際して、内在性免疫グロブリン生成不在下でヒト抗体の完全レパートリーを生成できる遺伝子組換え動物（例えばマウス）を用い得る。例えば、キメラおよび生殖細胞系変異マウスにおける、抗体重鎖連結領域遺伝子のホモ接合型欠失が、内在性抗体生成の完全阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖細胞系変異マウスにおけるヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの転写は、抗原チャレンジに際して、ヒト抗体の生成をもたらす。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリー中でも生成され得る。
【０２００】
本発明の抗体は、好ましくは薬学的に許容できる担体中で対象に投与される。典型的に、適当量の薬理的に許容可能な塩が製剤中で使用されて製剤を等張にする。薬理的に許容可能な担体の例としては、生理食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液が挙げられる。溶液のｐＨは、好ましくは約５〜約８、より好ましくは約７〜約７．５である。さらなる担体としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックス徐放性製剤が挙げられ、そのマトリックスは、例えば、フィルム、リポソームまたは微粒子などの造形品の形態である。当業者には、例えば、投与される抗体の投与経路および濃度次第で、特定の担体がより好ましくあってもよいことが明らかであろう。
【０２０１】
抗体は、注射（例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内）によって、またはその有効形態での血流への送達を確実にする、輸液などのその他の方法によって、対象、患者、または細胞に投与され得る。抗体はまた、腫瘍内または腫瘍周囲経路によって投与されて、局所性ならびに全身性の治療効果を発揮してもよい。局所注射または静脈注射が好ましい。
【０２０２】
抗体を投与するための有効投与量およびスケジュールは、経験的に判定されてもよく、このような測定の実施は、当該技術分野の技術範囲内である。当業者では、投与すべき抗体用量が、例えば、抗体を投与される対象、投与経路、使用される特定の抗体型、および投与されるその他の薬剤次第で変動することを理解するであろう。単独使用される抗体の典型的な１日量は、上述の要素次第で、１日あたり約１（μｇ／ｋｇ〜最大１００ｍｇ／ｋｇ体重またはそれ以上の範囲に及ぶかもしれない。肺がんを治療するための抗体投与に続いて、治療用抗体の効力は、熟練した実務家に良く知られている様々な方法で評価され得る。例えば、標準腫瘍イメージング技術を使用して、治療を受ける対象の肺がんのサイズ、数、および／または分布がモニターされてもよい。抗体投与不在下で起こる疾患経過と比較して、腫瘍成長を停止させ、腫瘍収縮をもたらし、および／または新規腫瘍の発症を予防する、治療的に投与された抗体は、肺がん治療のための有効な抗体である。
【０２０３】
本発明の表２および５で言及されるペプチド（特にＡＭＬに関連するもの）、ひいてはそれらの基礎となるポリペプチドは、ＡＭＬで高度に発現されて、正常細胞内ではかなり低いレベルから極めて低いレベルで発現されるので、ＡＢＣＡ１３および／またはＭＭＰ１２発現またはポリペプチド活性の阻害が、好ましくは、ＡＭＬを治療または予防するための治療ストラテジーに組み込まれてもよい。
【０２０４】
アンチセンス療法の原理は、（転写または翻訳を介した）遺伝子発現の配列特異的抑制が、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡと相補的アンチセンス種の間の細胞内部ハイブリダイゼーションによって達成されてもよいという仮説に基づく。このようなハイブリッド核酸二本鎖の形成は、標的腫瘍抗原エンコードゲノムＤＮＡの転写、または標的腫瘍抗原ｍＲＮＡのプロセッシング／輸送／翻訳および／または安定性を妨害する。
【０２０５】
アンチセンス核酸は、多様なアプローチによって送達され得る。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスＲＮＡは、腫瘍細胞への取り込みを可能にする形態で、（例えば静脈注射によって）対象に直接投与され得る。代案としては、アンチセンスＲＮＡ（またはＲＮＡフラグメント）をコードする、ウイルスまたはプラスミドベクターが、生体内で細胞に導入され得る。アンチセンス効果はまた、センス配列によって誘導され得る；しかし表現型の変化の程度は、極めて変わりやすい。効果的なアンチセンス療法によって誘導される表現型変化は、例えば、標的ｍＲＮＡレベル、標的タンパク質レベル、および／または標的タンパク質活性レベルの変化によって評価される。
【０２０６】
特定の実施例では、アンチセンス遺伝子治療による肺腫瘍マーカー機能の阻害は、アンチセンス肺腫瘍マーカーＲＮＡの対象への直接投与によって達成されてもよい。アンチセンス腫瘍マーカーＲＮＡは、任意の標準的な技術によって生成され単離されてもよいが、高効率プロモーター（例えばＴ７プロモーター）の制御下にあるアンチセンス腫瘍マーカーｃＤＮＡを使用した生体外転写によって、最も容易に生成される。アンチセンス腫瘍マーカーＲＮＡの細胞への投与は、下に記載される直接的な核酸投与法のいずれかによって実施され得る。
【０２０７】
遺伝子治療を使用して、ＡＢＣＡ１３およびＭＭＰ１２機能を阻害する代案のストラテジーは、抗ＡＢＣＡ１３、抗ＭＭＰ１２抗体、または抗ＡＢＣＡ１３、抗ＭＭＰ１２抗体の一部の細胞内発現を伴う。例えば、ＡＢＣＡ１３、ＭＭＰ１２ポリペプチドと特異的に結合してその生物学的活性を阻害するモノクローナル抗体をエンコードする遺伝子（または遺伝子フラグメント）は、核酸発現ベクター内で、特定の（例えば組織または腫瘍特異的）遺伝子制御配列の転写制御下に置かれる。次にベクターは、肺がん細胞またはその他の細胞に取り込まれるように対象に投与され、次に細胞は、抗ＡＢＣＡ１３、抗ＭＭＰ１２抗体を分泌し、それによってＡＢＣＡ１３、ＭＭＰ１２ポリペプチドの生物学的活性を妨げる。好ましくは、ＡＢＣＡ１３、ＭＭＰ１２ポリペプチドは、ＡＭＬがん細胞の細胞外表面に存在する。
【０２０８】
対象細胞への外来性ＤＮＡ投与と取り込み（すなわち、遺伝子変換または形質移入）を含む上述の方法では、本発明の核酸は裸のＤＮＡの形態であり得て、または核酸はＡＭＬ腫瘍マーカータンパク質発現を阻害するために、核酸を細胞に送達するベクター内にあり得る。ベクターは、アデノウイルスベクター（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｌａｖａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）などの市販製品であり得る。細胞への核酸またはベクターの送達は、多様な機構を介し得る。一実施例として、送達は、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＧＩＢＣＯ−２５  ＢＲＬ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、およびＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．ＵＳ）などの市販のリポソーム調製物、ならびに当該技術分野で標準的な手順に従って開発されたその他のリポソームを使用して、リポソームを介し得る。さらに、本発明の核酸またはベクターは、その技術がＧｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳ．）から入手できる電気穿孔によって、ならびにＳＯＮＯＰＯＲＡＴＩＯＮ装置（ＩｍａＲｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｔｕｃｓｏｎ，Ａｒｉｚｏｎａ，ＵＳ）の手段によって、生体内に送達され得る。
【０２０９】
一実施例として、ベクター送達は、組換えレトロウイルスゲノムをパッケージし得るレトロウイルスベクター系などのウイルス系を介し得る。次に組換えレトロウイルスを使用して感染させ、それによって感染細胞に、ＡＢＣＡ１３および／またはＭＭＰ１２の発現を阻害するアンチセンス核酸を送達し得る。改変核酸を哺乳類細胞に導入する正確な方法は、もちろん、レトロウイルスベクターの使用に限定されない。アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス性（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、偽型レトロウイルスベクターの使用をはじめとするその他の技術が、この手順のために一般的に利用可能である。リポソーム送達および受容体媒介およびその他のエンドサイトーシス機構などの物理的形質導入技術もまた、使用され得る。本発明は、これらのまたはその他の一般に使用される遺伝子導入方法のいずれかと併用され得る。
【０２１０】
抗体はまた、生体内診断アッセイのために使用されてもよい。通常、抗体は、免疫シンチグラフィーを使用して腫瘍が位置確認され得るように、放射性ヌクレオチド（１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、３Ｈ、３２Ｐまたは３５Ｓなど）で標識される。一実施形態では、抗体またはそれらのフラグメントは、２つ以上のＡＢＣＡ１３およびＭＭＰ１２標的の細胞外ドメインに結合し、親和性値（Ｋｄ）は、１×１０μＭ未満である。
【０２１１】
診断用の抗体は、様々なイメージング法による検出に適するプローブで標識されてもよい。プローブの検出方法としては、蛍光、光学、共焦点、および電子顕微鏡検査；磁気共鳴画像法および分光法；蛍光透視法、コンピュータ断層撮影、および陽電子放射型断層撮影法が挙げられるが、これに限定されるものではない。適切なプローブとしては、フルオレセイン、ローダミン、エオシン、およびその他のフルオロフォア、放射性同位体、金、ガドリニウムおよびその他のランタニド、常磁性鉄、フッ素１８およびその他の陽電子放出放射性核種が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに、プローブは二官能価または多官能価であってもよく、列挙される方法の１つ以上によって検出可能である。これらの抗体は、前記プローブで直接または間接的に標識されてもよい。プローブの共有結合、プローブの抗体への組み込み、およびプローブの結合のためのキレート化合物の共有結合をはじめとする、プローブの抗体への付着が、特に十分に技術分野で良く認識されている。免疫組織化学的検査では、疾患組織サンプルは、新鮮または冷凍であってもよく、またはパラフィン包埋されてホルマリンなどの保存料で固定されてもよい。サンプルを含有する固定または包埋切片を標識一次抗体および二次抗体と接触させ、抗体を使用して、原位置発現するＡＢＣＡ１３および／またはＭＭＰ１２タンパク質が検出される。
【０２１２】
本発明は、配列番号１〜配列番号３２５、配列番号３２６〜配列番号４４７または配列番号４４８〜配列番号６０５からなる群から選択される配列を含んでなるペプチド、または配列番号１〜配列番号３２５、配列番号３２６〜配列番号４４７または配列番号４４８〜配列番号６０５と９０％相同的なそれらの変異体、または前記ペプチドと交差反応するＴ細胞を誘導するそれらの変異体を提供する。
【０２１３】
本発明のペプチドは、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩおよび／またはクラスＩＩの分子に結合する能力を有する。
【０２１４】
本発明では、「相同的」という用語は、２つのアミノ酸配列、すなわちペプチドまたはポリペプチド配列の配列間の同一性の程度（上の同一性百分率を参照されたい）を指す。前述の「相同性」は、比較される配列にわたり、最適条件下でアライメントされた２つの配列を比較することで判定される。このような配列相同性は、例えばＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを使用してアライメントを作成することで計算され得る。一般に利用できる配列解析ソフトウェア、より具体的には、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ、ＧＥＮＥＴＹＸまたはその他の分析ツールが、公共データベースによって提供される。
【０２１５】
当業者は、特定のペプチドの変異型によって誘導されるＴ細胞が、ペプチドそれ自体と交差反応できるかどうかを評価できるであろう（Ｆｏｎｇ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．Ａｌｔｅｒｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｆｌｔ３  ｌｉｇａｎｄ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００１  Ｊｕｌ  １７；９８（１５）：８８０９−１４；Ｚａｒｅｍｂａ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ａｇｏｎｉｓｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９７  Ｏｃｔ  １５；５７（２０）：４５７０−７；Ｃｏｌｏｍｂｅｔｔｉ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  ｍｅｌａｎ−Ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ｓｅｌｆ  ｍｅｌａｎ−Ａ／ＨＬＡ−Ａ２  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６  Ｊｕｎ  １；１７６（１１）：６５６０−７；Ａｐｐａｙ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｍｅｌａｎ−Ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６  Ｊｕｌ；３６（７）：１８０５−１４）。
【０２１６】
所与のアミノ酸配列の「変異型」によって、本発明者らは、ペプチドが、配列番号１〜配列番号３２５、配列番号３２６〜配列番号４４７または配列番号４４８〜配列番号６０５からなる所与のアミノ酸配列からなるペプチドと実質的に同様に、ＨＬＡ分子となおも結合できるように、（例えば、それらを別の天然アミノ酸残基の側鎖で、またはその他の側鎖で、置換することにより）例えば、アミノ酸の１つまたは２つの残基の側鎖が改変されることを意味する。例えばペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊０２または−ＤＲなどの適切なＭＨＣ分子の結合溝と相互作用して結合する能力を改善せずとも、少なくとも維持するように修飾されてもよく、このようにしてそれは、活性化ＣＴＬのＴＣＲに結合する能力を改善せずとも、少なくとも維持する。
【０２１７】
これらのＣＴＬは、引き続いて細胞と交差反応して、本発明の態様で定義される同族ペプチドの天然アミノ酸配列を含有するポリペプチドを発現する細胞を殺滅し得る。学術文献（Ｇｏｄｋｉｎ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．  Ｕｓｅ  ｏｆ  ｅｌｕｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａ  ｔｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｔｈｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ａｌｌｅｌｅ  ＨＬＡ−ＤＱ８（ＤＱ  ３．２）．Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７  Ｊｕｎ；９（６）：９０５−１１）、およびデータベース（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ：ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  ＭＨＣ  ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｏｔｉｆｓ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．１９９９  Ｎｏｖ；５０（３−４）：２１３−９）から演繹され得るように、ＨＬＡ結合ペプチドの特定の位置は、典型的に、アンカー残基であり、結合溝を構成するポリペプチド鎖の極性、電気物理的、疎水性、および空間特性によって画定されるＨＬＡ受容体の結合モチーフと適合する、コア配列を形成する。したがって当業者は、既知のアンカー残基を維持することで、配列番号１〜配列番号３２５、配列番号３２６〜配列番号４４７または配列番号４４８〜配列番号６０５に記載されるアミノ酸配列を修飾でき、このような変異型が、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子に結合する能力を維持するかどうかを判定できる。本発明の変異体は、活性化ＣＴＬのＴＣＲに結合する能力を維持し、それは引き続いて、本発明によるペプチドの天然アミノ酸配列を含有するポリペプチドを発現する細胞と交差反応して、殺滅する。
【０２１８】
Ｔ細胞受容体との相互作用に実質的に寄与しないアミノ酸残基は、その組み込みが、Ｔ細胞反応性に実質的に影響を及ぼさず、関連ＭＨＣとの結合を排除しない、別のアミノ酸での置換によって修飾され得る。したがって与えられた但し書きを除いて、本発明のペプチドは、与えられたようなアミノ酸配列またはそれらの部分または変異体を含む、任意のペプチド（本発明者らは、その用語にオリゴペプチドまたはポリペプチドを含める）であってもよい。
【０２１９】
より長いペプチドもまた、適切であってもよい。ＭＨＣクラスＩエピトープは、通常は８〜１１アミノ酸長であるが、実際のエピトープを含むより長いペプチドまたはタンパク質から、ペプチドプロセッシングによって生成することも可能である。実際のエピトープ側面に位置する残基は、プロセッシング中に実際のエピトープを曝露させるのに必要なタンパク質分解切断に、実質的に影響を及ぼさない残基であることが好ましい。
【０２２０】
したがって、本発明は、ＭＨＣクラスＩエピトープのペプチドおよび変異型もまた提供し、ペプチドまたは変異型は、８〜１００、好ましくは８〜３０、最も好ましくは８〜１４、すなわち８、９、１０、１１、１２、１３、１４アミノ酸の全長を有し、クラスＩＩ結合ペプチドの場合、長さはまた、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２３アミノ酸であり得る。
【０２２１】
もちろん本発明によるペプチドまたは変異体は、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩの分子に結合する能力を有する。ペプチドまたは変異体のＭＨＣ複合体への結合は、当該技術分野で既知の方法によって試験されてもよい。
【０２２２】
本発明の特に好ましい実施形態では、ペプチドは、配列番号１〜配列番号３２５、配列番号３２６〜配列番号４４７または配列番号４４８〜配列番号６０５に記載のアミノ酸配列からなり、またはそれから本質的になる。
【０２２３】
「から本質的になる」は、本発明によるペプチドが、配列番号１〜配列番号３２５、配列番号３２６〜配列番号４４７または配列番号４４８〜配列番号６０５のいずれかに記載の配列またはそれらの変異体に加えて、ＭＨＣ分子エピトープのためのエピトープとして機能するペプチドの一部を必ずしも構成しない、追加的なＮおよび／またはＣ末端に位置するアミノ酸のひと配列を含有することをを意味するものとする。
【０２２４】
それでもなお、これらの配列は、本発明によるペプチドの細胞への効率的な導入を提供する上で重要であり得る。本発明の一実施形態では、ペプチドは、例えば、ＮＣＢＩ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ００４９７に由来する、ＨＬＡ−ＤＲ抗原関連不変鎖の８０個のＮ末端アミノ酸を含んでなる、融合タンパク質である（ｐ３３、以下の「Ｉｉ」）。その他の融合物中では、本発明のペプチドは、本明細書に記載されるような抗体、またはその機能的部分に、特に抗体の配列中に、前記抗体によって特異的に標的化されるように融合され得て、または例えば樹状細胞に対して特異的な抗体に、またはその中に融合され得る。
【０２２５】
さらにペプチドまたは変異型は、より強力な免疫応答を引き起こすために、安定性および／またはＭＨＣ分子への結合を改善するようにさらに修飾されてもよい。ペプチド配列のこのような最適化方法は当該技術分野で周知であり、例えば、逆ペプチド結合または非ペプチド結合の導入が挙げられる。
【０２２６】
逆ペプチド結合中では、アミノ酸残基はペプチド（−ＣＯ−ＮＨ−）結合によって連結せず、ペプチド結合が逆転する。このようなレトロ−インベルソペプチド模倣剤は、例えば、参照により本明細書に援用される、Ｍｅｚｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９，３２３０−３２３７に記載されるものなどの当該技術分野で既知の方法を使用して作成されてもよい。このアプローチは、側鎖の方向でなく、主鎖に関与する変化を含有する、擬ペプチドを作成することを伴う。Ｍｅｚｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）は、ＭＨＣ結合およびＴヘルパー細胞応答のために、これらの擬ペプチドが有用であることを示す。ＣＯ−ＮＨペプチド結合の代わりにＮＨ−ＣＯ結合を含有するレトロ−インバースペプチドは、タンパク質分解に対してはるかにより高い耐性がある。
【０２２７】
非ペプチド結合は、例えば、−ＣＨ２−ＮＨ、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＳＯ−である。米国特許第４，８９７，４４５号明細書は、標準手順によって合成されるポリペプチドと、ＮａＣＮＢＨ３の存在下でアミノアルデヒドとアミノ酸を反応させることで合成される非ペプチド結合とが関与する、ポリペプチド鎖中で非ペプチド結合（−ＣＨ２−ＮＨ）を固相合成する方法を提供する。
【０２２８】
上述の配列を含んでなるペプチドは、それらのアミノおよび／またはカルボキシ末端に存在する追加的な化学基と共に合成されて、ペプチドの安定性、生物学的利用能、および／または親和性が向上されてもよい。例えば、カルボベンゾキシル、ダンシル、またはｔ−ブチルオキシカルボニル基などの疎水性基が、ペプチドのアミノ末端に付加されてもよい。同様に、アセチル基または９−フルオレニルメトキシカルボニル基が、ペプチドのアミノ末端に配置されてもよい。さらに、疎水性基、ｔ−ブチルオキシカルボニル、またはアミド基が、ペプチドのカルボキシ末端に付加されてもよい。
【０２２９】
さらに、本発明のペプチドは、それらの立体配置を改変させるように合成されてもよい。例えば、通常のＬ異性体でなく、ペプチドのアミノ酸残基の１つまたは複数のＤ異性体が使用されてもよい。なおもさらに、本発明のペプチドのアミノ酸残基の少なくとも１つは、良く知られている非天然起源アミノ酸残基の１つで置換されてもよい。これらのような改変は、本発明のペプチドの安定性、生物学的利用能および／または結合作用の増大に役立ってもよい。
【０２３０】
同様に、本発明のペプチドまたは変異体は、ペプチド合成の前または後のどちらかに、特異的アミノ酸を反応させることで、化学的に修飾されてもよい。このような修飾の例は、当該技術分野で周知であり、例えば、参照により本明細書に援用される、Ｒ．Ｌｕｎｄｂｌａｄ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，３ｒｄ  ｅｄ．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，２００５に要約される。アミノ酸の化学修飾としては、これに限定されるものではないが、アシル化、アミド化、リジンのピリドキシル化、還元アルキル化、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によるアミノ基のトリニトロベンジル化、カルボキシル基のアミド修飾およびシステインのシステイン酸への酸化の実施によるスルフヒドリル修飾、水銀誘導体形成、その他のチオール化合物との混合ジスルフィド形成、マレイミドとの反応、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化、およびアルカリ性ｐＨでのシアネートによるカルバモイル化による修飾が挙げられるが、これに限定されるものではない。この点において、当業者は、タンパク質の化学修飾に関するより詳細な手順について、Ｃｈａｐｔｅｒ  １５  ｏｆ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｅｄｓ．Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  ＮＹ  １９９５−２０００）を参照されたい。
【０２３１】
簡単に述べると、例えばタンパク質中のアルギニル残基の修飾は、付加体を形成するためのフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、および１，２−シクロヘキサンジオンなどの隣接するジカルボニル化合物の反応に基づくことが多い。別の例は、メチルグリオキサールとアルギニン残基の反応である。システインは、リジンおよびヒスチジンなどのその他の求核性部位の同時修飾なしに、修飾され得る。その結果、多数の試薬がシステイン修飾のために利用可能である。Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈなどの会社のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ）が、特定の試薬に関する情報を提供する。
【０２３２】
タンパク質中のジスルフィド結合の選択的還元もまた、一般的である。ジスルフィド結合は、生物医薬品の加熱処理中に形成されて酸化され得る。
【０２３３】
ウッドワード試薬Ｋを使用して、特定のグルタミン酸残基を修飾してもよい。Ｎ−（３−（ジメチルアミノ）プロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドを使用して、リジン残基とグルタミン酸残基の間に分子内架橋が形成され得る。
【０２３４】
例えばジエチルピロ炭酸は、タンパク質中のヒスチジル残基修飾のための試薬である。ヒスチジンはまた、４−ヒドロキシ−２−ノネナールを使用して修飾され得る。
【０２３５】
リジン残基およびその他のα−アミノ基の反応物は、例えば、ペプチドの表面への結合またはタンパク質／ペプチド架橋で有用である。リジンはポリ（エチレン）グリコールの付着部位であり、タンパク質のグリコシル化の主要な修飾部位である。
【０２３６】
タンパク質中のメチオニン残基は、例えば、ヨードアセトアミド、ブロモエチルアミン、およびクロラミンＴによって修飾され得る。
【０２３７】
テトラニトロメタンおよびＮ−アセチルイミダゾールを使用して、チロシル残基が修飾され得る。ジチロシンの形成を通じた架橋は、過酸化水素／銅イオンによって達成され得る。
【０２３８】
トリプトファンの修飾に関する最近の研究では、Ｎ−ブロモサクシニミド、臭化２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルまたは３−ブロモ−３−メチル−２−（２−ニトロフェニルメルカプト）−３Ｈ−インドール（ＢＰＮＳ−スカトール）が使用された。
【０２３９】
ＰＥＧによる治療用タンパク質およびペプチドの成功裏の修飾が、循環半減期の延長と関係することが多い一方で、タンパク質と、グルタルアルデヒド、ポリエチレングリコールジアクリレート、およびホルムアルデヒドとの架橋は、ハイドロゲル調製のために使用される。免疫療法のためのアレルゲンの化学修飾は、カリウムシアネートを用いるカルバミル化によって達成されることが多い。
【０２４０】
ペプチド、または修飾されまたは非ペプチド結合を含むペプチド変異体は、本発明の好ましい実施形態である。通常、ペプチドおよび変異体（少なくともアミノ酸残基の間にペプチド結合を含有するもの）は、Ｌｕｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｕｎｄｅｒ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ−ｆｌｏｗ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．Ｍａｙ  １９８１；７８（５）：２７９１−２７９５）およびその中の参考文献で開示されるようなＦｍｏｃ−ポリアミド型固相ペプチド合成で合成されてもよい。一時的なＮ−アミノ基保護は、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基によってもたらされる。この高度に塩基不安定性の保護基の反復切断は、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジンを使用して実施される。側鎖官能基は、それらのブチルエーテル（セリン、スレオニン、およびチロシンの場合）、ブチルエステル（グルタミン酸およびアスパラギン酸の場合）、ブチルオキシカルボニル誘導体（リジンおよびヒスチジンの場合）、トリチル誘導体（システインの場合）、および４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル誘導体（アルギニンの場合）として保護されてもよい。グルタミンまたはアスパラギンがＣ末端残基である場合、側鎖アミド官能基を保護するために、４，４’−ジメトキシベンズヒドリル基が活用される。固相担体は、ジメチルアクリルアミド（主鎖−単量体）、ビスアクリロイルエチレンジアミン（架橋剤）、およびアクリロイルサルコシンメチルエステル（機能化因子）の３つの単量体から構成される、ポリジメチル−アクリルアミドポリマーをベースとする。使用されるペプチドと樹脂との切断可能な結合剤は、酸不安定性４−ヒドロキシメチル−フェノキシ酢酸誘導体である。逆転Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシル−カルボジイミド／ヒドロキシベンゾトリアゾール媒介性共役手順を使用して付加されるアスパラギンおよびグルタミンを除き、全てのアミノ酸誘導体は、それらのあらかじめ形成された対称的な無水物誘導体として添加される。全ての共役および脱保護反応は、ニンヒドリン、トリニトロベンゼンスルホン酸またはイソチン試験手順を使用してモニターされる。合成完了時に、ペプチドは樹脂担体から切断され、同時に、５０％スカベンジャー混合物を含有する９５％トリフルオロ酢酸処理によって側鎖保護基が除去される。一般に使用されるスカベンジャーとしては、エタンジチオール、フェノール、アニソール、および水が挙げられ、厳密な選択は、合成されるペプチドの構成アミノ酸に左右される。また、ペプチド合成のための固相および溶液相法の組み合わせも可能である（例えば、Ｂｒｕｃｋｄｏｒｆｅｒ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｆｒｏｍ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｍｉｌｌｉｇｒａｍ  ａｍｏｕｎｔｓ  ｆｏｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｔｏ  ｍｕｌｔｉ−ｔｏｎｓ  ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｕｔｕｒｅ．Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００４  Ｆｅｂ；５（１）：２９−４３．Ｒｅｖｉｅｗ、およびその中で引用される参考文献を参照されたい）。
【０２４１】
トリフルオロ酢酸は真空蒸発によって除去され、引き続くジエチルエーテルとの磨砕から、粗製ペプチドが得られる。存在する任意のスカベンジャーは、単純な抽出処置によって除去され、それは水相の凍結乾燥時に、スカベンジャーを含まない粗製ペプチドを与える。ペプチド合成のための試薬は、一般に、例えばＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（ＵＫ）Ｌｔｄ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ  ＮＧ７  ２ＱＪ，ＵＫから入手できる。
【０２４２】
精製は、再結晶化、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、および（通常は）例えばアセトニトリル／水勾配分離を使用する逆相高速液体クロマトグラフィーなどの技術の任意の１つまたは組み合わせによって、実施されてもよい。
【０２４３】
ペプチドの分析は、薄層クロマトグラフィー、電気泳動法、特にキャピラリー電気泳動法、固相抽出（ＣＳＰＥ）、逆相高速液体クロマトグラフィー、酸加水分解後のアミノ酸分析を使用して、高速原子衝撃（ＦＡＢ）質量分光分析によって、ならびにＭＡＬＤＩおよびＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ質量分光分析によって、実施されてもよい。
【０２４４】
本発明のさらなる態様は、本発明のペプチドまたはペプチド変異体をエンコードする核酸（例えばポリヌクレオチド）を提供する。ポリヌクレオチドは、それがペプチドをコードしさえすれば、例えば、単鎖および／または二本鎖のいずれかのＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせであってもよく、または例えばホスホロチオエート主鎖があるポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドの未変性または安定化形態であってもよく、それはイントロンを含有してもまたはしなくてもよい。もちろん、天然起源ペプチド結合によって連結する天然アミノ酸残基を含有するペプチドのみが、ポリヌクレオチドによってエンコード可能である。本発明のなおもさらなる態様は、本発明によるポリペプチドを発現する能力がある、発現ベクターを提供する。
【０２４５】
例えば、相補的付着端を通じて、ポリヌクレオチド、特にＤＮＡをベクターに連結する、多様な方法が開発されている。例えば、ベクターＤＮＡに挿入されるＤＮＡ断片に、相補的ホモポリマー配列が付加され得る。次に、相補的ホモポリマー尾部間の水素結合によってベクターとＤＮＡ断片が連結されて、組換えＤＮＡ分子が形成する。
【０２４６】
１つまたは複数の制限酵素認識部位を含有する合成リンカーは、ＤＮＡ断片をベクターに連結する代替え法を提供する。多様な制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する合成リンカーは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＮ，ＵＳＡ．をはじめとするいくつかの供給元から、商業的に入手できる。
【０２４７】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを修飾する望ましい方法は、Ｓａｉｋｉ  ＲＫ，ｅｔ  ａｌ．（Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ａｎｅｍｉａ  ａｎｄ  ｂｅｔａ−ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ  ｗｉｔｈ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｏｂｅｓ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．１９８８  Ｓｅｐ  １；３１９（９）：５３７−４１）で開示されるようなポリメラーゼ連鎖反応を用いる。この方法は、例えば適切な制限酵素認識部位を改変することで、ＤＮＡを適切なベクターに導入するために使用されてもよく、またはそれは、当該技術分野で既知のその他の有用な様式でＤＮＡを修飾するために使用されてもよい。ウイルスベクターを使用するのであれば、ポックスウイルスまたはアデノウイルスベクターが好ましい。
【０２４８】
次にＤＮＡ（またはレトロウイルスベクターの場合はＲＮＡ）を適切な宿主中で発現させて、本発明のペプチドまたは変異体を含んでなるポリペプチドが生成されてもよい。このようにして、本明細書に含まれる教示を考慮して適切に修正された既知の技術に従って、本発明のペプチドまたは変異体をコードするＤＮＡを使用して、発現ベクターを構築してもよく、次にそれを使用して、本発明のポリペプチドの発現および生成のために、適切な宿主細胞に形質転換する。このような技術としては、米国特許第４，４４０，８５９号明細書、米国特許第４，５３０，９０１号明細書、米国特許第４，５８２，８００号明細書、米国特許第４，６７７，０６３号明細書、米国特許第４，６７８，７５１号明細書、米国特許第４，７０４，３６２号明細書、米国特許第４，７１０，４６３号明細書、米国特許第４，７５７，００６号明細書、米国特許第４，７６６，０７５号明細書、および米国特許第４，８１０，６４８号明細書で開示されるものが挙げられる。
【０２４９】
本発明の化合物を構成するポリペプチドをエンコードするＤＮＡ（またはレトロウイルスベクターの場合はＲＮＡ）は、適切な宿主への導入のために、多種多様なその他のＤＮＡ配列に連結されてもよい。コンパニオンＤＮＡは、宿主の性質、ＤＮＡの宿主への導入様式、およびエピソームの維持または組み込みが所望されるかどうかに左右される。
【０２５０】
一般に、ＤＮＡは、発現のための適切な方向および正しい読み枠で、プラスミドなどの発現ベクター中に挿入される。必要ならば、ＤＮＡは、所望の宿主によって認識される、適切な転写および翻訳制御調節ヌクレオチド配列に連結されてもよいが、このような調節は、一般に発現ベクター内で利用できる。次に、標準的な技術を通じて、ベクターが宿主に導入される。一般に、全ての宿主が、ベクターによって形質転換されるわけではない。したがって、形質転換された宿主細胞を選択することが必要になる。一選択技術は、抗生物質耐性などの形質転換細胞内で選択可能な形質をコードする、任意の必要な制御要素があるＤＮＡ配列を発現ベクター内に組み込むことを伴う。
【０２５１】
代案としては、このような選択可能な形質の遺伝子は、所望の宿主細胞を同時形質転換するために使用される、別のベクター上にあり得る。
【０２５２】
次に、本明細書で開示される教示を考慮して、当業者に知られている適切な条件下で十分な時間にわたり、本発明の組換えＤＮＡによって形質転換された宿主細胞を培養してポリペプチドの発現を可能にし、次に、それを回収し得る。
【０２５３】
細菌（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、酵母（例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌（例えばアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））、植物細胞、動物細胞、および昆虫細胞をはじめとする多数の発現系が知られている。好ましくは、細胞系は、ＡＴＣＣ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手できるＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞であり得る。
【０２５４】
構成的発現のための典型的な哺乳類細胞ベクタープラスミドは、適切なポリＡ尾部と、ネオマイシンなどの耐性マーカーとがある、ＣＭＶまたはＳＶ４０プロモーターを含んでなる。一例は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡから入手できるｐＳＶＬである。誘導性哺乳類発現ベクターの一例であるｐＭＳＧもまた、Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手できる。有用な酵母プラスミドベクターは、ｐＲＳ４０３−４０６およびｐＲＳ４１３−４１６であり、通常、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ  ９２０３７，ＵＳＡから入手できる。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、およびｐＲＳ４０６は、酵母組み込みプラスミド（ＹＩｐｓ）であり、酵母選択マーカーＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、およびＵＲＡ３が組み込まれている。プラスミドｐＲＳ４１３−４１６は、酵母セントロメアプラスミド（Ｙｃｐｓ）である。ＣＭＶプロモーターベースのベクター（例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）は、一過性または安定性発現、細胞質内発現または分泌、およびＦＲＡＧ、３ｘＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃまたはＭＡＴの様々な組み合わせでのＮ末端またはＣ末端標識付けを提供する。これらの融合タンパク質は、組換えタンパク質を検出、精製、および分析できるようにする。二重標識融合物は、検出に融通性を与える。
【０２５５】
強力なヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター調節領域は、ＣＯＳ細胞内で構成タンパク質発現レベルを１ｍｇ／Ｌ程度の高さに上昇させる。効力がより低い細胞系では、タンパク質レベルは典型的に、約０．１ｍｇ／Ｌである。ＳＶ４０複製起点の存在は、ＳＶ４０複製許容ＣＯＳ細胞内で、高レベルのＤＮＡ複製をもたらす。例えば、ＣＭＶベクターは、細菌細胞内のｐＭＢ１（ｐＢＲ３２２の誘導体）複製起点、細菌内のアンピシリン耐性選択のためのｂ−ラクタマーゼ遺伝、ｈＧＨポリＡ、およびｆ１起点を含有し得る。プレプロトリプシンリーダー（ＰＰＴ）配列を含有するベクターは、抗ＦＲＡＧ抗体、樹脂、およびプレートを使用した精製のために、培養液中へのＦＲＡＧ融合タンパク質分泌を誘導し得る。多様な宿主細胞で使用するためのその他のベクターおよび発現系が、当該技術分野で周知である。
【０２５６】
別の実施形態では、本発明の２つ以上のペプチドまたはペプチド変異型がコードされ、したがって順次発現される（「数珠玉構造」コンストラクトに類似する）。その際に、ペプチドまたはペプチド変異型は、例えばＬＬＬＬＬＬなどの一続きのリンカーアミノ酸によって、共に連結または融合してもよく、またはそれらの間の任意の追加的なペプチドなしに連結してもよい。
【０２５７】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドベクターコンストラクトで形質転換された宿主細胞にも関する。宿主細胞は、原核または真核生物のどちらかであり得る。細菌細胞は、いくつかの状況では、好ましい原核宿主細胞であってもよく、典型的には、例えばＢｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡから入手できる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５株、および米国微生物系統保存機関（ＡＴＣＣ）Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡから入手できるＲＲ１（ＡＴＣＣ番号３１３４３）などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株である。好ましい真核宿主細胞としては、酵母、昆虫および哺乳類細胞、好ましくはマウス、ラット、サルまたはヒト線維芽および結腸細胞系に由来するものなどの脊椎動物細胞が挙げられる。酵母宿主細胞としては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ  ９２０３７，ＵＳＡから一般に入手できる、ＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５００、およびＹＰＨ５０１が挙げられる。好ましい哺乳類宿主細胞としては、ＡＴＣＣからＣＣＬ６１として入手できるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＡＴＣＣからＣＲＬ１６５８として入手できるＮＩＨ  Ｓｗｉｓｓマウス胚細胞ＮＩＨ／３Ｔ３、ＡＴＣＣからＣＲＬ１６５０として入手できるサル腎臓由来ＣＯＳ−１細胞、およびヒト胎児由来腎臓細胞である２９３細胞が挙げられる。好ましい昆虫細胞は、バキュロウイルス発現ベクターで形質移入され得るＳｆ９細胞である。発現のための適切な宿主細胞の選択に関する概説は、例えば、Ｐａｕｌｉｎａ  Ｂａｌｂａｓ  ａｎｄ  Ａｒｇｅｌｉａ  Ｌｏｒｅｎｃｅ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｒｅｖｉｅｗｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，”Ｐａｒｔ  Ｏｎｅ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＩＳＢＮ  ９７８−１−５８８２９−２６２−９による教科書、および当業者に知られているその他の文献にある。
【０２５８】
本発明のＤＮＡコンストラクトによる適切な細胞宿主の形質転換は、使用されるベクターのタイプに典型的に左右される周知の方法によって達成される。原核宿主細胞の形質転換に関しては、例えば、Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９，２１１０，ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．を参照されたい。酵母細胞の形質転換は、Ｓｈｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．に記載される。Ｂｅｇｇｓ（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ  ２７５，１０４−１０９の方法もまた有用である。脊椎動物細胞に関しては、例えば、リン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ−デキストランまたはリポソーム製剤などのこのような細胞を形質移入するのに有用な試薬が、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ｏｒ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ  ２０８７７，ＵＳＡ．から入手できる。電気穿孔もまた、細胞を形質転換および／または形質移入するのに有用であり、酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞、および脊椎動物細胞を形質転換する技術分野で周知である。
【０２５９】
成功裏に形質転換された細胞、すなわち本発明のＤＮＡコンストラクトを含有する細胞は、ＰＣＲなどの周知の技術によって同定され得る。代案としては、上清タンパク質の存在は、抗体を使用して検出され得る。
【０２６０】
例えば、細菌、酵母、および昆虫細胞などの本発明の特定の宿主細胞は、本発明のペプチドの調製において有用であることが理解されるであろう。しかしその他の宿主細胞が、特定の治療法において有用であってもよい。例えば、樹状細胞などの抗原提示細胞は、それらが適切なＭＨＣ分子内に負荷されてもよいように、本発明のペプチドを発現するために有用に使用されてもよい。したがって、本発明は、本発明による核酸または発現ベクターを含んでなる宿主細胞を提供する。
【０２６１】
好ましい実施形態では、宿主細胞は、抗原提示細胞、特に樹状細胞または抗原提示細胞である。前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）を含有する組換え融合タンパク質がロードされたＡＰＣは、無症候性または微小症候性転移性ＨＲＰＣを治療するために、２０１０年４月２０日に、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって認可された（シプロイセル−Ｔ）（Ｓｍａｌｌ  ＥＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｈａｓｅ  ＩＩＩ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ−Ｔ（ＡＰＣ８０１５）ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ，ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２００６  Ｊｕｌ  １；２４（１９）：３０８９−９４。Ｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｐｕｌｓｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ（ｐｒｏｖｅｎｇｅ）ｐｌｕｓ  ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｒｏｌｏｇｉｃ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ａｆｔｅｒ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｌｏｃａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ．２００６  Ｊｕｌ  １；１０７（１）：６７−７４）。
【０２６２】
次に、本発明のさらなる態様は、ペプチドまたはその変異型を製造する方法を提供し、方法は、宿主細胞を培養するステップと、宿主細胞またはその培養液からペプチドを単離するステップとを含んでなる。
【０２６３】
別の実施形態では、本発明のペプチド、核酸または発現ベクターは、医療で使用される。例えば、ペプチドまたはその変異体は、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射、皮内（ｉ．ｄ．）注射、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射、筋肉内（ｉ．ｍ．）注射のために調合されてもよい。ペプチド注射の好ましい方法としては、ｓ．ｃ．、ｉ．ｄ．、ｉ．ｐ．、ｉ．ｍ．、およびｉ．ｖ．が挙げられる。ＤＮＡ注射の好ましい方法としては、ｉ．ｄ．、ｉ．ｍ．、ｓ．ｃ．、ｉ．ｐ．、およびｉ．ｖ．が挙げられる。例えば、５０μｇ〜１．５ｍｇ、好ましくは１２５μｇ〜５００μｇのペプチドまたはＤＮＡの用量が投与されてもよく、それぞれのペプチドまたはＤＮＡに左右される。この範囲の用量は、以前の治験で成功裏に使用された（Ｗａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １８，１２５４−１２６１（２０１２））。
【０２６４】
本発明の別の態様は、活性化Ｔ細胞を製造するためのインビトロ法を含み、方法は、生体外Ｔ細胞を適切な抗原提示細胞の表面に発現される抗原負荷ヒトＭＨＣ分子に、Ｔ細胞を抗原特異的様式で活性化するのに十分な時間にわたり接触させるステップを含んでなり、抗原は本発明によるペプチドである。好ましくは、抗原提示細胞と共に、十分な量の抗原が使用される。
【０２６５】
好ましくは、哺乳類細胞は、ＴＡＰペプチド輸送体のレベルまたは機能が皆無でありまたは低下している。ＴＡＰペプチド輸送体が欠如している適切な細胞としては、Ｔ２、ＲＭＡ−Ｓ、およびショウジョウバエ細胞が挙げられる。ＴＡＰは、抗原処理に関連する輸送体である。
【０２６６】
ヒトペプチド負荷欠乏細胞系Ｔ２は、カタログ番号ＣＲＬ１９９２の下に、米国微生物系統保存機関、１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  ２０８５２，ＵＳＡから入手でき；ショウジョウバエ細胞系Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ系統２は、カタログ番号ＣＲＬ１９８６３の下にＡＴＣＣから入手でき；マウスＲＭＡ−Ｓ細胞系は、Ｋａｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ  １９８５（Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ，Ｈ．−Ｇ．，およびＫ．Ｋａｒｒｅ．１９８５．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６２：１７４５）に記載される。
【０２６７】
好ましくは、宿主細胞は、形質移入前に、ＭＨＣクラスＩ分子を実質的に発現しない。刺激因子細胞が、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ３のいずれかなどのＴ細胞のための共刺激シグナルを提供する上で、重要な分子を発現することもまた好ましい。多数のＭＨＣクラスＩ分子および共刺激因子分子の核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬデータベースから公的に入手可能である。
【０２６８】
ＭＨＣクラスＩエピトープが抗原として使用される場合、Ｔ細胞はＣＤ８陽性ＣＴＬである。
【０２６９】
抗原提示細胞が形質移入されて、このようなエピトープを発現する場合、好ましくは細胞は、本明細書に記載されるような配列番号１〜配列番号３２５、配列番号３２６〜配列番号４４７または配列番号４４８〜配列番号６０５またはその変異アミノ酸配列を含有するペプチドを発現する能力がある、発現ベクターを含んでなる。
【０２７０】
生体外でＣＴＬを生成するために、その他のいくつかの方法が使用されてもよい。例えば、自己由来腫瘍浸潤性リンパ球が、ＣＴＬを生成するために使用され得る。Ｐｌｅｂａｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５  Ｊｕｎ；２５（６）：１７８３−７）は、ＣＴＬの調製において自己由来末梢血リンパ球（ＰＬＢ）を利用した。さらに、樹状細胞をペプチドまたはポリペプチドでパルス処理する、または組換えウイルスで感染させることによる、自己由来ＣＴＬの生成も可能である。Ｂ細胞もまた、自己由来ＣＴＬの生成で使用され得る。さらに、ペプチドまたはポリペプチドでパルス処理された、または組換えウイルスで感染されたマクロファージが、自己ＣＴＬの調製で使用されてもよい。Ｓ．Ｗａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００３（Ｃｕｔｔｉｎｇ  ｅｄｇｅ：ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ａｖｉｄｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ８  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｏｎ  ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ  ＭＨＣ／ａｎｔｉ−ＣＤ２８−ｃｏａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３  Ｎｏｖ  １５；１７１（１０）：４９７４−８）は、これも選択されたペプチドに対するＴ細胞を生成するための適切な方法である、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を使用した、Ｔ細胞の生体外プライミングを記載する。本発明では、ビオチン：ストレプトアビジン生化学によって、あらかじめ形成されたＭＨＣ：ペプチド複合体を表面ポリスチレン粒子（ミクロビーズ）に共役することで、ａＡＰＣが生成される。このシステムは、ａＡＰＣ上のＭＨＣ密度の正確な調節を可能にし、それは、血液サンプルから高効率で、高または低結合活性の抗原特異的Ｔ細胞応答を選択的に引き起こすことを可能にする。ＭＨＣ：ペプチド複合体の他に、ａＡＰＣは、それらの表面に共役する、抗ＣＤ２８抗体のような共刺激活性があるその他のタンパク質を保有すべきである。さらにこのようなａＡＰＣベースのシステムは、例えばサイトカイン様インターロイキン１２などの適切な可溶性因子の付加を要することが多い。
【０２７１】
Ｔ細胞の調製では、同種異系細胞もまた使用されてもよく、方法は、参照によって本明細書に援用される、国際公開第９７／２６３２８号パンフレットで詳述される。例えば、ショウジョウバエ細胞およびＴ２細胞に加えて、その他の細胞を使用して、ＣＨＯ細胞、バキュロウイルス感染昆虫細胞、細菌、酵母、ワクシニア感染標的細胞などの抗原が提示されてもよい。さらに植物ウイルスが使用されてもよく（例えば、Ｐｏｒｔａ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｏｗｐｅａ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ａｓ  ａ  ｈｉｇｈ−ｙｉｅｌｄｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１９９４  Ａｕｇ  １；２０２（２）：９４９−５５を参照されたい）、外来性ペプチド提示のための高収率系としてのササゲモザイクウイルスの開発が記載される。
【０２７２】
本発明のペプチドに向けられた活性化Ｔ細胞は、治療法において有用である。したがって、本発明のさらなる態様は、前述の本発明の方法によって入手できる活性化Ｔ細胞を提供する。
【０２７３】
上記方法によって生成される活性化Ｔ細胞は、配列番号１〜配列番号３２５、配列番号３２６〜配列番号４４７または配列番号４４８〜配列番号６０５のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する細胞を選択的に認識する。
【０２７４】
好ましくは、Ｔ細胞は、そのＴＣＲを介して、ＨＬＡ／ペプチド複合体と相互作用（例えば結合）することで、細胞を認識する。Ｔ細胞は、その標的細胞が、本発明のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する患者において、標的細胞を死滅させる方法で有用であり、患者には有効数の活性化Ｔ細胞が投与される。患者に投与されるＴ細胞は、患者に由来して上述のように活性化されてもよい（すなわちそれらは自己Ｔ細胞である）。代案としては、Ｔ細胞は、患者でなく別の個人に由来する。もちろん、個人が健常人であれば、それが好ましい。「健常人」によって、本発明者らは、個人が概して健康良好であり、好ましくは有能な免疫系を有して、より好ましくは容易に検査され検出され得る任意の疾患に罹患していないことを意味する。
【０２７５】
生体内では、本発明によるＣＤ８陽性Ｔ細胞の標的細胞は、腫瘍細胞（これは時にＭＨＣクラスＩＩを発現する）および／または腫瘍（腫瘍細胞）周囲の間質細胞であり得る（これも時にＭＨＣクラスＩＩを発現する；（Ｄｅｎｇｊｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００６））。
【０２７６】
本発明のＴ細胞は、治療用組成物の活性成分として使用されてもよい。したがって、本発明は、その標的細胞が、本発明のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する患者において、標的細胞を死滅させる方法もまた提供し、方法は、上で定義されるようなＴ細胞の有効数を患者に投与するステップを含んでなる。
【０２７７】
「異常発現」によって、本発明者らは、正常な発現レベルと比較して、ポリペプチドが過剰発現されること、または腫瘍がそれに由来する組織では遺伝子がサイレントであるが、腫瘍ではそれが発現されることもまた意味する。「過剰発現」によって、本発明者らは、ポリペプチドが、正常組織に存在するレベルの少なくとも１．２倍のレベル；好ましくは正常組織に存在するレベルの少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍または１０倍のレベルで存在することを意味する。
【０２７８】
Ｔ細胞は、例えば、上に記載されるものなどの当該技術分野で既知の方法によって得られてもよい。
【０２７９】
このいわゆるＴ細胞養子免疫伝達のためのプロトコルは、当該技術分野で周知である。概説は、Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．Ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ：ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｏｎ  ｓｕｃｃｅｓｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６  Ｍａｙ；６（５）：３８３−９３．Ｒｅｖｉｅｗ．およびＭｏｒｇａｎ  ＲＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ａｆｔｅｒ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００６  Ｏｃｔ  ６；３１４（５７９６）：１２６−９）にある。
【０２８０】
本発明の任意の分子、すなわちペプチド、核酸、抗体、発現ベクター、細胞、活性化ＣＴＬ、Ｔ細胞受容体またはそれをエンコードする核酸は、免疫応答を逃れる細胞によって特徴付けられる、障害の治療に有用である。したがって本発明の任意の分子は、薬剤として、または薬剤の製造において使用されてもよい。分子は、単独で、または本発明のその他の分子または既知の分子との組み合わせで、使用されてもよい。
【０２８１】
好ましくは、本発明の薬剤はワクチンである。それは、直接患者に、罹患臓器に、または全身的に、ｉ．ｄ．、ｉ．ｍ．、ｓ．ｃ．、ｉ．ｐ．、およびｉ．ｖ．投与され、または生体外で患者またはヒト細胞系に由来する細胞に適用されて、それが引き続いて患者に投与され、または生体外で使用されて患者に由来する免疫細胞の亜集団が選択され、次にそれが患者に再投与されてもよい。核酸が、生体外で細胞に投与される場合、インターロイキン２などの免疫刺激サイトカインを同時発現させるように、細胞を形質移入することが有用であってもよい。ペプチドは、実質的に純粋であり、または免疫刺激アジュバント（下記参照）と組み合わされ、または免疫賦活性サイトカインとの組み合わせで使用され、または例えばリポソームなどの適切な送達系によって投与されてもよい。ペプチドはまた、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）またはマンナンなどの適切な担体に共役されてもよい（国際公開第９５／１８１４５号パンフレット、およびＬｏｎｇｅｎｅｃｋｅｒ，１９９３を参照されたい）。ペプチドはまた、標識されてもよく、融合タンパク質であってもよく、またはハイブリッド分子であってもよい。その配列が本発明に記載されるペプチドは、ＣＤ４またはＣＤ８  Ｔ細胞を刺激することが予測される。しかし、ＣＤ８ＣＴＬの刺激は、ＣＤ４Ｔヘルパー細胞によって提供される援助の存在下で、より効率的である。したがって、ＣＤ８ＣＴＬを刺激するＭＨＣクラスＩエピトープでは、ハイブリッド分子の融合パートナーまたはセクションは、適切にはＣＤ４陽性Ｔ細胞を刺激するエピトープを提供する。ＣＤ４およびＣＤ８刺激エピトープは、当該技術分野で周知であり、本発明で同定されたものが含まれる。
【０２８２】
一態様では、ワクチンは、配列番号１〜配列番号６０５に記載されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドと少なくとも１つの追加的なペプチド、好ましくは２〜５０、より好ましくは２〜２５、なおもより好ましくは２〜２０、最も好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８個のペプチドとを含んでなる。ペプチドは、１つまたは複数の特異的ＴＡＡから誘導されてもよく、ＭＨＣクラスＩ分子に結合してもよい。
【０２８３】
別の態様では、ワクチンは、配列番号１〜配列番号３２５、配列番号３２６〜配列番号４４７または配列番号４４８〜配列番号６０５に記載されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドと少なくとも１つの追加的なペプチド、好ましくは２〜５０、より好ましくは２〜２５、なおもより好ましくは２〜２０、最も好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８個のペプチドとを含んでなる。ペプチドは、１つまたは複数の特異的ＴＡＡから誘導されてもよく、ＭＨＣクラスＩ分子に結合してもよい。
【０２８４】
ポリヌクレオチドは、実質的に純粋であり、または適切なベクターまたは送達系に含有されてもよい。核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせであってもよい。このような核酸をデザインして導入する方法は、当該技術分野で周知である。概説は、例えば、（Ｐａｓｃｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５  Ｈｕｍａｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．２００５  Ａｕｇ；６２（１５）：１７５５−６２）によって提供される。ポリヌクレオチドワクチンは調製が容易であるが、免疫応答誘導におけるこれらのベクターの作用機序は、完全には分かっていない。適切なベクターおよび送達系としては、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルスまたは２つ以上のウイルスの構成要素を含有するハイブリッドベースのシステムなどのウイルスＤＮＡおよび／またはＲＮＡが挙げられる。非ウイルス送達系としては、カチオン性脂質およびカチオン性ポリマーが挙げられ、ＤＮＡ送達技術分野で周知である。「遺伝子銃」などを介した、物理的送達もまた使用されてもよい。核酸によってコードされるペプチド（単数）またはペプチド（複数）は、例えば、上述のように、それぞれの逆ＣＤＲのＴ細胞を刺激する、エピトープとの融合タンパク質であってもよい。
【０２８５】
本発明の薬剤は、１つまたは複数のアジュバントもまた含んでもよい。アジュバントは、抗原に対する免疫応答（例えば、ＣＴＬおよびヘルパーＴ（ＴＨ）細胞によって媒介される免疫応答）を非特異的に促進または増強する物質であり、したがって本発明の薬剤で有用であると考えられる。適切なアジュバントとしては、１０１８  ＩＳＳ、アルミニウム塩、ＡＭＰＬＩＶＡＸ（登録商標）、ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ−８７０、８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ｄＳＬＩＭ、フラジェリンまたはフラジェリンに由来するＴＬＲ５リガンド、ＦＬＴ３リガンド、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イミキモド（ＡＬＤＡＲＡ（登録商標））、レシキモド、ＩｍｕＦａｃｔ  ＩＭＰ３２１、ＩＬ−２やＩＬ−１３やＩＬ−２１などのインターロイキン、インターフェロンαまたはβまたはそのペグ化誘導体、ＩＳパッチ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＩＳＣＯＭｓ、ＪｕｖＩｍｍｕｎｅ（登録商標）、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＡＬＰ２、ＭＦ５９、モノホスホリルリピドＡ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＭＳ  １３１２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ２０６、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１、油中水型および水中油型エマルション、ＯＫ−４３２、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７−ＭＰ−ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＯｓｐＡ、ＰｅｐＴｅｌ（登録商標）ベクター系、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）［ＰＬＧ］ベースおよびデキストラン微粒子、ｔａｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ  ＳＲＬ１７２、Ｖｉｒｏｓｏｍｅｓおよびその他のウイルス様粒子、ＹＦ−１７Ｄ、ＶＥＧＦ  ｔｒａｐ、Ｒ８４８、β−グルカン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、サポニンに由来するＡｑｕｉｌａ’ｓ  ＱＳ２１  ｓｔｉｍｕｌｏｎ、マイコバクテリア抽出物および合成細菌細胞壁模倣物、およびＲｉｂｉ’ｓ  ＤｅｔｏｘまたはＱｕｉｌまたはＳｕｐｅｒｆｏｓなどのその他の独自仕様のアジュバントが挙げられるが、これに限定されるものではない。フロイントまたはＧＭ−ＣＳＦなどのアジュバントが好ましい。樹状細胞およびそれらの調製物に対して特異的な、いくつかの免疫学的アジュバント（例えばＭＦ５９）が、以前記載されている（Ａｌｌｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｋｒｕｍｍｅｌ，１９９５  Ｔｈｅ  Ｙｉｎ  ａｎｄ  Ｙａｎｇ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９５  Ｎｏｖ  １０；２７０（５２３８）：９３２−３．Ｒｅｖｉｅｗ）。サイトカインもまた、使用されてもよい。数種のサイトカインは、樹状細胞のリンパ組織（例えばＴＮＦ−）への移動に影響を与えること、Ｔリンパ球（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、およびＩＬ−４）のための効率的な抗原提示細胞への樹状細胞の成熟を加速すること（その内容全体を参照によって本明細書に具体的に援用する米国特許第５，８４９，５８９号明細書）、および免疫増強剤（例えば、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２３、ＩＬ−７、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β）として作用することと、直接関連づけられている（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ，１９９６  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａ���  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１９９６  Ｏｃｔ；２（１０）：１０９６−１０３）。
【０２８６】
ＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチドもまた、ワクチン環境においてアジュバント効果を促進することが報告されている。理論により拘束されることなく、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、主にＴＬＲ９であるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を通じた、内在的（非適応性）免疫系の活性化によって作用する。ＣｐＧ誘発性ＴＬＲ９活性化は、ペプチドまたはタンパク質抗原、生または死滅ウイルス、樹状細胞ワクチン、自己細胞ワクチン、そして予防的および治療的ワクチンの双方における多糖コンジュゲートをはじめとする、多種多様な抗原に対する、抗原特異的体液性および細胞性応答を増強する。より重要なことには、それは樹状細胞の成熟と分化を促進し、ＣＤ４  Ｔ細胞援助の不在下であってさえも、ＴＨ１細胞の活性化促進と、強力な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）生成をもたらす。ＴＬＲ９刺激によって誘導されるＴＨ１バイアスは、常態ではＴＨ２バイアスを促進するミョウバンまたは不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）などのワクチンアジュバント存在下であってさえも維持される。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、その他のアジュバントと調合されまたは同時投与された際に、または微粒子、ナノ粒子、脂質エマルションなどの配合物、または類似配合物中で、なおもより高いアジュバント活性を示し、それは、抗原が比較的弱い場合、強力な応答を誘導するために特に必要である。それらは免疫応答もまた加速し、いくつかの実験では、ＣｐＧなしのワクチン総量と同等の抗体応答で、抗原用量のほぼ２桁分の低減を可能にする（Ｋｒｉｅｇ，２００６）。米国特許第６，４０６，７０５Ｂ１号明細書は、抗原特異的免疫応答を誘導するためのＣｐＧオリゴヌクレオチド、非核酸アジュバント、および抗原の併用を記載する。ＣｐＧ  ＴＬＲ９拮抗薬は、Ｍｏｌｏｇｅｎ（Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）製のｄＳＬＩＭ（二重ステムループ免疫修飾物質）であり、それは本発明の医薬組成物の好ましい構成要素である。ＲＮＡ結合ＴＬＲ７、ＴＬＲ８および／またはＴＬＲ９などのその他のＴＬＲ結合分子もまた、使用されてもよい。
【０２８７】
有用なアジュバントのその他の例としては、化学修飾ＣｐＧ（例えば、ＣｐＲ、Ｉｄｅｒａ）；ポリ（Ｉ：Ｃ）などのｄｓＲＮＡアナログおよびそれらの誘導体（例えばＡｍｐｌｉＧｅｎ（登録商標）、Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）、ポリ（ＩＣＬＣ）、ポリ（ＩＣ−Ｒ）、ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）、非ＣｐＧ細菌ＤＮＡまたはＲＮＡ；ならびにシクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ（登録商標）、セレブレックス、ＮＣＸ−４０１６、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、ソラフェニブ、テモゾロマイド、テムシロリムス、ＸＬ−９９９、ＣＰ−５４７６３２、パゾパニブ、ＶＥＧＦＴｒａｐ、ＺＤ２１７１、ＡＺＤ２１７１、抗ＣＴＬＡ４などの免疫活性小型分子および抗体；免疫系の重要な構造体を標的にするその他の抗体（例えば、抗ＣＤ４０、抗ＴＧＦβ、抗ＴＮＦα受容体）；ＳＣ５８１７５が挙げられるが、これに限定されるものではなく、これらは治療的におよび／またはアジュバントとして作用してもよい。本発明の文脈で有用なアジュバントおよび添加剤の量と濃度は、過度の実験を実施することなく、当業者によって容易に判定され得る。
【０２８８】
好ましいアジュバントは、イミキモド、レシキモド、ＧＭ−ＣＳＦ、シクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ、インターフェロンα、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび誘導体、ポリ（Ｉ：Ｃ）および誘導体、ＲＮＡ、シルデナフィル、およびＰＬＧまたはビロソーム微粒子配合物である。
【０２８９】
本発明による医薬組成物の好ましい実施形態では、アジュバントは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、サルグラモスチム）、シクロホスファミド、イミキモド、レシキモド、およびインターフェロンαなどのコロニー刺激因子からなる群から選択される。
【０２９０】
本発明による医薬組成物の好ましい実施形態では、アジュバントは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、サルグラモスチム）、シクロホスファミド、イミキモド、およびレシキモドなどのコロニー刺激因子からなる群から選択される。
【０２９１】
本発明による医薬組成物の好ましい実施形態では、アジュバントは、シクロホスファミド、イミキモドまたはレシキモドである。
【０２９２】
なおもより好ましいアジュバントは、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＭＳ  １３１２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ２０６、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１、ポリＩＣＬＣ（Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標））、および抗ＣＤ４０  ｍＡＢまたはそれらの組み合わせである。
【０２９３】
この組成物は、皮下、皮内、筋肉内などの非経口投与、または経口投与のために使用される。このためには、ペプチドおよび任意選択的にその他の分子が、薬学的に許容可能な好ましくは水性の担体に溶解され、または懸濁される。さらに組成物は、緩衝液、結合剤、ブラスチング剤、希釈剤、風味、潤滑剤などの賦形剤を含有し得る。ペプチドはまた、サイトカインなどの免疫刺激物質と共に投与され得る。このような組成物で使用され得る賦形剤の詳細な一覧は、例えば、Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ  Ｅｄ．，２０００，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｐｒｅｓｓから得られる。組成物は、腺腫様またはがん性疾患の防止、予防法および／または治療法のために使用され得る。代表的配合物は、例えば、欧州特許第２１１３２５３号明細書にある。
【０２９４】
それでもなお、本発明のペプチドの数と物理化学的特性次第で、１２〜１８ヶ月を超えて安定している、ペプチドの特定の組み合わせ、特に２０を超えるペプチドとの組み合わせのための配合を提供するために、さらなる研究が必要である。
【０２９５】
本発明は、がん、特にＡＭＬ、慢性リンパ管白血病（ＣＬＬ）およびその他の血液悪性腫瘍を治療するのに有用な薬剤を提供する。
【０２９６】
本発明は、
（ａ）溶液中のまたは凍結乾燥形態の上述の医薬組成物を含有する容器；
（ｂ）任意選択的に、凍結乾燥製剤のための希釈剤または再構成溶液を含有する第２の容器；および
（ｃ）任意選択的に、（ｉ）溶液の使用、または（ｉｉ）凍結乾燥製剤の再構成および／または使用のための取扱説明書
を含んでなるキットをさらに目的とする。
【０２９７】
キットは、（ｉｉｉ）緩衝液、（ｉｖ）希釈剤、（Ｖ）濾過、（ｖｉ）針、または（Ｖ）シリンジの１つまたは複数をさらに含んでなってもよい。容器は、好ましくは、ボトル、バイアル、シリンジまたは試験管であり；それは、多回使用容器であってもよい。医薬組成物は、好ましくは凍結乾燥される。
【０２９８】
本発明のキットは、好ましくは、適切な容器内の本発明の凍結乾燥製剤と、その再構成および／または使用のための取扱説明書とを含んでなる。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル（例えば二重チャンバーバイアル）、シリンジ（二重チャンバーシリンジなど）、および試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの多様な材料から形成されてもよい。好ましくは、キットおよび／または容器は、容器上にあるまたは容器に付随する、取扱説明を含み、それは再構成および／または使用上の指示を示す。例えば、ラベルは、凍結乾燥製剤が、上述されるようなペプチド濃度に再構成されることを表示してもよい。ラベルは、製剤が皮下投与のために有用であり、または皮下投与用であることをさらに表示してもよい。
【０２９９】
製剤を収容する容器は、多回使用バイアルであってもよく、それは再構成製剤の反復投与（例えば２〜６回の投与）を可能にする。キットは、適切な希釈剤（例えば、炭酸水素ナトリウム溶液）を含んでなる、第２の容器をさらに含んでなってもよい。
【０３００】
希釈剤と凍結乾燥製剤の混合時に、再構成製剤中の最終ペプチド濃度は、好ましくは少なくとも０．１５ｍｇ／ｍＬ／ペプチド（＝７５μｇ）であり、好ましくは３ｍｇ／ｍＬ／ペプチド（＝１５００μｇ）以下である。キットは、その他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および取扱説明が掲載されるパッケージインサートをはじめとする、商業的および使用者観点から望ましい、その他の材料をさらに含んでもよい。
【０３０１】
本発明のキットは、その他の構成要素（例えば、その他の化合物またはこれらのその他の化合物の医薬組成物）が添加されたまたは添加されていない、本発明による医薬組成物製剤を含有する単回容器を有してもよく、または各構成要素のための別個の容器を有してもよい。
【０３０２】
好ましくは、本発明のキットは、第２の化合物（アジュバント（例えばＧＭ−ＣＳＦ）、化学療法剤、天然物、ホルモンまたは拮抗薬、抗血管新生因子または阻害剤、アポトーシス誘発剤またはキレート剤など）またはその医薬組成物の同時投与と合わせて使用するためにパッケージされた、本発明の製剤を含む。キットの構成要素は、あらかじめ混合されてもよく、または各構成要素は、患者への投与前に別個の異なる容器内にあってもよい。キットの構成要素は、１つまたは複数の液体溶液、好ましくは水溶液、より好ましくは無菌水溶液中で、提供されてもよい。またキットの構成要素は、固体として提供されてもよく、それは、好ましくは別の異なる容器内に提供される、適切な溶媒の添加によって液体に変換されてもよい。
【０３０３】
治療用キットの容器は、バイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または固体または液体を封入するその他のあらゆる手段であってもよい。通常、２つ以上の構成要素がある場合、キットは、第２のバイアルまたは別の容器を含有して、別々の投薬を可能にする。キットは、薬学的に許容可能な液体のための別の容器もまた、含有してもよい。好ましくは、治療用キットは、装置（例えば、１本または複数の針、シリンジ、点眼器、ピペットなど）を含有して、本キットの構成要素である本発明の作用物質の投与を可能にする。
【０３０４】
本製剤は、経口（腸内）、経鼻、眼、皮下、皮内、筋肉内、静脈内または経皮などの任意の許容できる手段によるペプチド投与に適するものである。好ましくは、投与はｓ．ｃ．であり、最も好ましくはｉ．ｄである。投与は、輸液ポンプによってもよい。
【０３０５】
本発明のペプチドはＡＭＬに関連する腫瘍組織から単離されたので、本発明の薬剤は、好ましくはＡＭＬを治療するために使用される。好ましい実施形態では、ＡＢＣＡ１３およびＭＭＰ１２から誘導される本発明のペプチドは、ＡＭＬから単離され、本発明の薬剤は、好ましくは、これらのポリペプチドのＡＭＬ過剰発現を治療するために使用される。
【０３０６】
本発明は、予備スクリーニングＴＵＭＡＰの貯蔵庫（データベース）から選択される少なくとも１つのペプチドを含んでなる、医薬組成物を製造するステップを含んでなる、個々の患者のための個別化医薬品を製造する方法をさらに含み、医薬組成物で使用される少なくとも１つのペプチドは、個々の患者における適切さについて選択される。好ましくは、医薬組成物はワクチンである。方法はまた、ＴＣＲ単離などの下流用途のためのＴ細胞クローンを生成するように適応させ得る。
【０３０７】
「個別化医薬品」は、能動的個別化がんワクチンおよび自己由来患者組織を使用する養子細胞療法をはじめとする、個々の患者の治療のためにのみ使用される、１人の患者個人のために特に調整された治療法を意味するものとする。
【０３０８】
本明細書の用法では、「貯蔵庫」という用語は、例えば、データベースまたは実際の貯蔵単位形態である、特定の腫瘍型における免疫原性および過剰提示について予備スクリーニングされた一群のペプチドを指すものとする。「貯蔵庫」という用語は、ワクチンに含まれる特定のペプチドが、予備製造されて物理的設備内で貯蔵されることを暗示することは意図されないが、その可能性も検討される。ペプチドは、製造される各個別化ワクチンのために新規に製造されてもよく、または予備製造されて貯蔵されてもよいことが明示的に検討される。
【０３０９】
貯蔵庫（例えば、データベースまたは実際の貯蔵単位の形態）は、分析されたいく人かのＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃ陽性ＡＭＬ患者腫瘍組織内で高度に過剰発現される、腫瘍関連ペプチドから構成される（表１〜３を参照されたい）。それは、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩペプチドを含有する。いくつかのＧＢＭ組織から採取された腫瘍関連ペプチドに加えて、貯蔵庫は、ＨＬＡ−Ａ＊０２およびＨＬＡ−Ａ＊２４標識ペプチドを含有してもよい。これらのペプチドは、ＴＵＭＡＰＳによって誘導されるＴ細胞免疫の規模を定量様式で比較できるようにし、したがって抗腫瘍応答を引き起こすワクチンの能力について、重要な結論が導かれるようにする。第２に、それは、患者において、「自己」抗原に由来するＴＵＭＡＰに対するいかなるワクチン誘導Ｔ細胞応答も観察されない症例において、「非自己」抗原に由来する重要な陽性対照ペプチドとして機能する。第３に、それは、患者集団の免疫能力状態に関する結論が導かれるようにしてもよい。
【０３１０】
貯蔵庫（例えば、データベースまたは実際の貯蔵単位の形態）のためのＨＬＡクラスＩおよびＩＩ  ＴＵＭＡＰは、遺伝子発現解析、質量分析法、およびＴ細胞免疫学を組み合わせた、統合ゲノム機能解析アプローチを使用することで同定される。アプローチは、高い割合の腫瘍上に真に存在するが、正常組織では皆無または最小限にのみ発現されるＴＵＭＡＰだけが、さらなる分析のために選択されることを保証する。ペプチド選択のために、患者からのＡＭＬサンプルおよび健常ドナーからの血液が、段階的アプローチで分析された：
１．悪性物質からのＨＬＡリガンドが、質量分析法によって同定された。
２．マイクロアレイによるゲノム規模メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）発現解析を使用して、一連の正常器官および組織と比較して悪性組織（ＡＭＬ）中の遺伝子過剰発現が同定された。
３．同定されたＨＬＡリガンドは、遺伝子発現データと比較された。ステップ２で検出された、選択的にまたは過剰に発現された遺伝子によってコードされるペプチドは、多重ペプチドワクチンのための適切なＴＵＭＡＰ候補と見なされた。
４．同定されたペプチドのＴＵＭＡＰとしての妥当性を支持する追加的な証拠を同定するために、文献調査が実施された。
５．ｍＲＮＡレベルでの過剰発現の関連性は、ステップ３からの選択されたＴＵＭＡＰの腫瘍組織上における再検出と、健常組織における検出の欠如（またはまれな）検出によって確認された。
６．選択されたペプチドによる生体内Ｔ細胞応答の誘導が可能かどうかを評価するために、健常ドナーならびにＡＭＬ患者からのヒトＴ細胞を使用して、生体外免疫原性アッセイが実施された。
【０３１１】
一態様では、ペプチドを貯蔵庫に含める前に、免疫原性について予備スクリーニングする。制限を意図しない一例として、貯蔵庫に包含されるペプチドの免疫原性は、ペプチド／ＭＨＣ複合体および抗ＣＤ２８抗体がロードされた人工抗原提示細胞による、健常ドナーからのＣＤ８＋Ｔ細胞の反復刺激を通じた、生体外Ｔ細胞プライミングを含んでなる方法によって判定される。
【０３１２】
この方法は、稀ながんに、そして稀な発現プロファイルがある患者にとって、好ましい。一定組成がある多重ペプチド混合物とは対照的に、現在開発されている貯蔵庫は、腫瘍中の抗原の実際の発現とワクチンとの顕著により高いマッチングを可能にする。多標的アプローチでは、各患者のために、選択された単一のまたは組み合わされた数種の「既製」ペプチドが利用される。理論上は、例えば５０個の抗原性ペプチドのライブラリーからの５つの異なる抗原性ペプチドの選択に基づくアプローチだけで、およそ１７００万個の可能な医薬品（ＤＰ）組成物がもたらされる。
【０３１３】
一態様では、ペプチドは、以下のような本発明による方法に基づく、個々の患者のためのそれらの適切さに基づいて、ワクチンへの包含のために選択される。
【０３１４】
患者の腫瘍材料および血液サンプルから、ＨＬＡ表現型、トランスクリプトミクスおよびペプチドミクスデータを収集し、貯蔵庫および患者に固有の（すなわち変異）ＴＵＭＡＰを含有する、各患者に対して最も適切なペプチドを同定する。患者腫瘍中で選択的にまたは過剰発現されて、可能な場合、患者の個々のＰＢＭＣと共に試験されると、強力な生体外免疫原性を示すペプチドが、選択される。
【０３１５】
好ましくは、ワクチンに含まれるペプチドは、（ａ）個々の患者からの腫瘍サンプルによって提示される腫瘍関連ペプチド（ＴＵＭＡＰ）を同定するステップと；（ｂ）（ａ）で同定されたペプチドを上述のペプチド貯蔵庫と比較するステップと；（ｃ）患者において同定された腫瘍関連ペプチドと関連がある、貯蔵庫（データベース）からの少なくとも１つのペプチドを選択するステップとを含んでなる方法によって同定される。例えば、腫瘍サンプルによって提示されるＴＵＭＡＰは、（ａ１）腫瘍サンプルからの発現データを腫瘍サンプルの組織型に相当する正常組織サンプルからの発現データと比較して、腫瘍サンプル中で過剰発現または異常発現されるタンパク質を同定するステップと；（ａ２）発現データを腫瘍サンプル中のＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子と結合するＭＨＣリガンドの配列と相関させて、腫瘍によって過剰発現または異常発現されるタンパク質に由来するＭＨＣリガンドを同定するステップとによって同定される。好ましくは、ＭＨＣリガンドの配列は、腫瘍サンプルから単離されたＭＨＣ分子から結合ペプチドを溶出させて、溶出したリガンドを配列決定することで同定される。好ましくは、腫瘍サンプルおよび正常組織は、同一患者から得られる。
【０３１６】
貯蔵庫モデルを使用してペプチドを選択するのに加えて、またはその代案として、ＴＵＭＡＰを患者において新規に同定し、次に、ワクチンに含めてもよい。一実施例として、候補ＴＵＭＡＰは、（ａ１）腫瘍サンプルからの発現データを、腫瘍サンプルの組織型に対応する正常組織のサンプルからの発現データと比較して、腫瘍サンプル中で過剰発現または異常発現されるタンパク質を特定する；そして（ａ２）発現データを腫瘍サンプル中のＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子と結合するＭＨＣリガンドの配列と相関させて、腫瘍によって過剰発現または異常発現されるタンパク質に由来するＭＨＣリガンドを同定することで、患者において同定されてもよい。別の実施例として、個々の患者からの正常な対応組織と比較して、腫瘍サンプルに固有の変異を含有するタンパク質が同定されてもよく、特異的に変異を標的とするＴＵＭＡＰが同定され得る。例えば、腫瘍のゲノム、および対応する正常組織のゲノムは、全ゲノム配列決定によって配列決定され得る。遺伝子のタンパク質コード領域中の非同義の変異を発見するために、ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡが腫瘍組織から抽出され、正常な非変異ゲノム生殖細胞系ＤＮＡが末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から抽出される。適用されるＮＧＳアプローチは、タンパク質コード領域の再配列決定（エクソーム再配列決定）に限定される。この目的で、供給業者が提供する標的富化キットを使用して、ヒトサンプルからのエクソンＤＮＡが捕捉され、例えばＨｉＳｅｑ２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）による配列決定がそれに続く。それに加えて、遺伝子発現の直接定量化のため、そして変異遺伝子が患者の腫瘍で発現されることの妥当性評価のために、腫瘍ｍＲＮＡが配列決定される。結果として得られる数百万の配列読み取りは、ソフトウェアアルゴリズムを通じて処理される。出力一覧は、変異および遺伝子発現を含有する。ＰＢＭＣ由来生殖細胞系の多様性と比較することで、腫瘍特異的体細胞突然変異を判定して、優先順位をつける。次に、新規に同定されたペプチドは、貯蔵庫（データベース）について上述した免疫原性について試験され、適切な免疫原性を保持する候補ＴＵＭＡＰが、ワクチンへの包含のために選択されてもよい。
【０３１７】
例示的な一実施形態では、ワクチンに包含されるペプチドは、（ａ）上述の方法（方法）によって、個々の患者からの腫瘍サンプルによって提示される腫瘍関連ペプチド（ＴＵＭＡＰ）を同定するステップと；ｂ）対応する正常組織との比較で、ａ）で同定されたペプチドを免疫原性および腫瘍中の過剰提示について予備選別されたペプチドの貯蔵庫（データベース）と比較するステップと；（ｃ）患者において同定された腫瘍関連ペプチドと関連がある、貯蔵庫（データベース）からの少なくとも１つのペプチドを選択するステップと（ｄ）任意選択的に、（ａ）で新規に同定された少なくとも１つのペプチドを選択して、その免疫原を確認するステップとによって同定される。
【０３１８】
例示的な一実施形態では、ワクチンに包含されるペプチドは、（ａ）個々の患者からの腫瘍サンプルによって提示される腫瘍関連ペプチド（ＴＵＭＡＰ）を同定するステップと；（ｂ）（ａ）で新規に同定された少なくとも１つのペプチド選択して、その免疫原性を確認するステップとによって同定される。
【０３１９】
ひとたびペプチドが選択されたら、ワクチンが製造される。
【０３２０】
ワクチンは、好ましくは、３３％ＤＭＳＯに溶解された個々のペプチドからなる液体製剤である。
【０３２１】
製品に包含される各ペプチドは、ＤＭＳＯに溶解される。単一ペプチド溶液の濃度は、製品に包含されるペプチドの数に応じて選択されなくてはならない。単一ペプチドのＤＭＳＯ溶液が等量で混合されて、ペプチドあたり約２．５ｍｇ／ｍｌの濃度で、製品に包含される全てのペプチドを含有する溶液が得られる。次に混合溶液は、注射用水で１：３に希釈されて、３３％ＤＭＳＯ中でペプチドあたり０．８２６ｍｇ／ｍｌの濃度が得られる。希釈溶液は、０．２２μｍの無菌フィルターを通して濾過される。最終バルク溶液が得られる。
【０３２２】
最終バルク溶液はバイアルに充填されて、使用時まで−２０℃で保存される。１本のバイアルは、０．５７８ｍｇの各ペプチドを含有する７００μＬの溶液を含有する。それらの５００μＬ（ペプチドあたりおよそ４００μｇ）が、皮内注射のために装入される。
【０３２３】
ここでそれらの好ましい実施形態を記載する添付図を参照して、以下の実施例で本発明を説明するが、制限は意図されない。本発明の目的で、本明細書で引用される全ての参考文献は、その内容全体を参照によって援用する。
【図面の簡単な説明】
【０３２４】
【図１】原発性ＡＭＬサンプルおよび健常ドナーＨＳＣのＨＬＡの表面発現を示す。定量化は、ＱＩＦＩＫＩＴ（Ｄａｋｏ）を使用して生体外で実施された。（ａ）自己由来ＣＤ１５＋正常単球と比較した、ＨＬＡクラスＩ（Ｗ６／３２ｍＡｂ）発現ＣＤ３４＋ＡＭＬ芽球。（ｂ）自己由来ＣＤ１５＋正常単球と比較した、ＨＬＡ−ＤＲ（Ｌ２４３ｍＡｂ）発現ＣＤ３４＋ＡＭＬ芽球。（ｃ）ＨＬＡクラスＩ（Ｗ６／３２ｍＡｂ）発現ＣＤ３４＋ＡＭＬ芽球（ｎ＝５）、および健常ドナーに由来するＣＤ３４＋ＣＤ３８−造血幹細胞（ｎ＝５）。（ｄ）ＨＬＡ−ＤＲ（Ｌ２４３ｍＡｂ）発現ＣＤ３４＋ＡＭＬ芽球（ｎ＝５）、および健常ドナーから誘導されたＣＤ３４＋ＣＤ３８−造血幹細胞（ｎ＝５）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、不対ｔ検定。略称：ＵＰＮ、画一患者番号
【図２】原発性ＡＭＬサンプルからのＨＬＡリガンド数および起源タンパク質の同定を示す。固有ＩＤ（ペプチド配列および対応する起源タンパク質）は、原発性ＡＭＬサンプル中のＨＬＡクラスＩ（Ｗ６／３２ｍＡｂ、ｎ＝１５）およびＨＬＡクラスＩＩ（Ｔｕ３９ｍＡｂ、ｎ＝１２）のＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって同定される。サンプルあたりの固有リガンド同定が、≧５００（ＨＬＡクラスＩ）および≧１００（ＨＬＡクラスＩＩ）の閾値を満たすサンプルのみが、この試験に包まれた。略称：ＩＤ、同定；ＵＰＮ、画一患者番号
【図３】ＡＭＬ（ｎ＝１５）、ＰＢＭＣ（ｎ＝３０）、およびＢＭＮＣ（ｎ＝５）のＨＬＡクラスＩリガンドーム／起源プロテオームの特性決定に基づく、ペプチドワクチン標的の同定を示す。（ａ）ＡＭＬ、ＰＢＭＣ、およびＢＭＮＣのＨＬＡクラスＩリガンド起源タンパク質の重なり。（ｂ）ＡＭＬ、ＰＢＭＣ、およびＢＭＮＣ中のＨＬＡ拘束性表示頻度に基づく、ＨＬＡクラスＩリガンド起源タンパク質の比較プロファイリング。それぞれの起源タンパク質（ｘ軸）のＨＬＡ拘束性提示について陽性である患者／ドナーの絶対数が、ｙ軸に表示される。破線は、それぞれの各コホートの１００％表示を示す。左側のボックスは、頻度＞２０％で、ＡＭＬ限定的表示を示す起源タンパク質のサブセットを強調表示する（ＬｉＴＡＡ：リガンドーム由来腫瘍関連抗原）。（ｃ）既報のＨＬＡクラスＩリガンドーム中のＡＭＬ関連抗原の表示分析。バーは、ＡＭＬ、ＰＢＭＣ、およびＢＭＮＣ中のＨＬＡクラスＩリガンドによる、それぞれの抗原の相対的表示を示す。（ｄ）ＦＬＴ３−ＷＴ（ｎ＝７）ＡＭＬ  ＨＬＡクラスＩリガンドームと対比された、ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異型（ｎ＝８）のサブセット特定的分析。ＦＬＴ３−ＩＴＤおよびＦＬＴ３−ＷＴ  ＡＭＬに関するＡＭＬ限定的起源タンパク質（（ｂ）で定義されるような）の重複分析。（ｅ）ＦＬＴ３−ＩＴＤおよびＦＬＴ３−ＷＴＡＭ中のＬＨＬＡ拘束性表示頻度に基づく、ＡＭＬ限定的ＨＬＡクラスＩリガンド起源タンパク質の比較プロファイリング。中央のボックスは、本明細書で定義されるＬｉＴＡＡの９１．３％を含む、共有起源タンパク質のサブセットを強調表示する。
【図４−１】ＨＬＡクラスＩ  ＡＭＬ−ＬｉＴＡＰの機能特性解析を示す。（ａ）２つの異なるＡ＊０３拘束性ＡＭＬ  ＬｉＴＡＰ（リガンドーム由来腫瘍関連ペプチド）貯留（ＰＩ１およびＰＩ２）による刺激後における、ＡＭＬ患者ＰＢＭＣのＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイ。ＰＨＡは陽性対照の役割を果たし、ＨＩＶＧＡＧ１８〜〜２６Ａ＊０３ペプチドによる刺激は、陰性対照の役割を果たした。ＰＩ１およびＰＩ２では、有意なＩＦＮ−γ産生が観察された。（ｂ）ＰＩ１ａｎｄＰＩ２刺激ＡＭＬ患者ＰＢＭＣ（（ａ）と同一）のＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの細胞内染色。ＰＭＡ／イオノマイシンは陽性対照の役割を果たし、ＨＩＶＧＡＧ１８〜２６Ａ＊０３ペプチドは陰性対照の役割を果たした。（ｃ）Ａ＊０３拘束性ＡＭＬ  ＬｉＴＡＰ貯留ＰＩ１およびＰＩ２による刺激後における、健常ドナーＰＢＭＣの検証ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、有意なＩＦＮ−γ産生がないことを明らかにした。
【図４−２】同上
【図４−３】同上
【図４−４】同上
【図４−５】同上
【図４−６】同上
【図５−１】ＡＭＬ  ＨＬＡクラスＩＩリガンドームの特性決定に基づく、相加的／相乗的ペプチドワクチン標的の同定を示す。（ａ）ＡＭＬ（ｎ＝１２）、ＰＢＭＣ（ｎ＝１３）、およびＢＭＮＣ（ｎ＝２）のＨＬＡクラスＩＩリガンド起源プロテオームの重複分析。（ｂ）ＡＭＬ、ＰＢＭＣ、およびＢＭＮＣ中のＨＬＡ拘束性表示頻度に基づく、ＨＬＡクラスＩＩリガンド起源タンパク質の比較プロファイリング。それぞれの起源タンパク質（ｘ軸）のＨＬＡ拘束性提示について陽性である患者／ドナーの絶対数が、ｙ軸に表示される。破線は、それぞれの各コホートの１００％表示を示す。左側のボックスは、頻度＞２０％で、ＡＭＬ限定的表示を示す起源タンパク質のサブセットを強調表示する。（ｃ）ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩ  ＡＭＬ限定的起源タンパク質の重複分析。（ｄ）４３の共通ＡＭＬ限定的起源タンパク質の内、３つのサブセットが、ＨＬＡクラスＩＩペプチドに包埋される、完全なＨＬＡクラスＩリガンドを含有することが同定された。包埋配列は太字で示される。（ｅ）異なるＨＬＡクラスＩＩＡＭＬ  ＬｉＴＡＰ（ＰＩＩ１、ＰＩＩＩ２、およびＰＩＩＩ３）による刺激後における、ＡＭＬ患者ＰＢＭＣのＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイ。ＰＨＡは陽性対照の役割を果たし、ＦＬＮＡ１６６９〜１６８３ＨＬＡ−ＤＲペプチドによる刺激は陰性対照の役割を果たした。ＰＩＩ１、ＰＩＩＩ２、およびＰＩＩＩ３では、ＩＦＮ−γ産生の有意な増大が、複数患者で観察された。略称：ＵＰＮ、画一患者番号
【図５−２】同上
【図５−３】同上
【図６】ＦＬＴ３−ＷＴ（ｎ＝７）サブセットと対比して、ＦＬＴ３−ＩＴＤ（ｎ＝８）中のＨＬＡクラスＩリガンドーム内部不均一性を評価するための実験の結果を示す。本発明者らは、半定量的類似性インデクシングを実施した。異なるＨＬＡタイプのリガンドームを比較できるように、本発明者らはＨＬＡリガンド起源タンパク質のレベルの分析を実施した。半定量的情報は、表示ＨＬＡリガンドのスペクトルカウント（ＰＳＭ）を分析することで導かれた。ユークリッド距離は、サンプル対の類似性／相違性の測定値として分析され、低い値は高類似性、高い値は高相違性を示唆する。ユークリッド距離は、社内で作成したＰｙｔｈｏｎスクリプト（Ｐｙｔｈｏｎ  ｖ３．３．３、Ｐｙｔｈｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）を使用して、各サブセット中の可能な各サンプルペアについて計算された。手短に述べると、各サンプルペア中の全ＰＳＭカウントが、それぞれのより高いカウントサンプルに対して正規化された。起源タンパク質一覧を合わせ、それぞれの起源タンパク質に相当するＰＳＭカウントの差の絶対値を合計して、ユークリッド距離が得られた。＊＊＊Ｐ＜０．００１、不対ｔ検定。
【実施例】
【０３２５】
実施例１
細胞表面に提示される腫瘍関連ペプチドの同定および定量化
組織サンプル
患者の腫瘍サンプルは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙによって提供された。全ての患者の告知に基づく同意書が与えられた。組織サンプルは、外科手術直後に液体窒素中で衝撃凍結され、ＴＵＭＡＰの単離まで−８０℃で保存された。リガンドーム分析では、治療前の診断時または再発時における、ＡＭＬ患者からのＰＢＭＣ（＞８０％の血中ＡＭＬ  ＢＬＡＳＴカウント）、ならびに健常ドナーのＰＢＭＣおよびＢＭＮＣが、密度勾配遠心分離によって単離された。
【０３２６】
組織サンプルからのＨＬＡペプチドの単離
ＨＬＡクラスＩおよびＩＩ分子は、以前記載されたような標準イムノアフィニティー精製を用いて単離された。手短に述べると、スナップ凍結細胞ペレットが、１×プロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ，Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含有する、１０  ｍＭの  ＣＨＡＰＳ／ＰＢＳ（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ／Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）中で溶解された。ＨＬＡ分子は、それぞれＣＮＢｒ活性化セファロースに共有結合する、汎ＨＬＡクラスＩ特異的ｍＡｂ  Ｗ６／３２および汎ＨＬＡクラスＩＩ特異的ｍＡｂ  Ｔｕ３９を使用して、シングルステップで精製された（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃｈａｌｆｏｎｔ  Ｓｔ  Ｇｉｌｅｓ，ＵＫ）。ＨＬＡ：ペプチド複合体は、０．２％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、Ｍｅｒｃｋ，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）の反復添加によって溶出された。溶出画分Ｅ１〜Ｅ８は貯留され、遠心分離濾過ユニット（Ａｍｉｃｏｎ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して、限外濾過によって遊離ＨＬＡリガンドが単離された。ＨＬＡリガンドは、ＺｉｐＴｉｐ  Ｃ１８ピペット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）先端を使用して、濾液から抽出されて脱塩された。抽出されたペプチドは、３５μｌの８０％アセトニトリル（ＡＣＮ、Ｍｅｒｃｋ）／０．２％ＴＦＡ中で溶出され、完全に乾燥するまで遠心分離され、２５μｌの１％ＡＣＮ／０．０５％ＴＦＡに再懸濁された。サンプルは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析まで−２０℃で保存された。
【０３２７】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるＨＬＡリガンド分析
ペプチドサンプルは、逆相液体クロマトグラフィー（ｎａｎｏＵＨＰＬＣ，ＵｌｔｉＭａｔｅ  ３０００  ＲＳＬＣｎａｎｏ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）によって分離され、引き続いてオンライン接続されたＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬハイブリッド質量分光計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｈｅｒ）中で分析された。サンプルは、５回の技術的反復試験中で分析された。５μｌ（サンプルの２０％に相当する）のサンプル容積が、７５μｍ×２ｃｍ捕捉カラム（Ａｃｃｌａｉｍ  ＰｅｐＭａｐ  ＲＳＬＣ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に、４μｌ／分で５．７５分間にわたり注入された。引き続いてペプチド分離が、５０μｍ×５０ｃｍ分離カラム（Ａｃｃｌａｉｍ  ＰｅｐＭａｐ  ＲＳＬＣ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）上で、２．４から３２．０％に及ぶＡＣＮ勾配を適用して、５０℃および１７５ｎｌ／分の流速で１４０分間にわたり実施された。溶出ペプチドは、ナノスプレーイオン化によってイオン化され、調査スキャンで最も豊富な５つの前駆イオンのフラグメントスペクトルを生成する、トップ５ＣＩＤ（衝突誘起解離）法を実装する質量分光計内で分析された。分解能は、６０，００に設定された。ＨＬＡクラスＩリガンドでは、質量範囲は４００〜６５０ｍ／ｚに限定され、電荷状態２および３が断片化を許された。ＨＬＡクラスＩＩでは、３００〜１，５００ｍ／ｚの質量範囲が分析されて、電荷状態≧２が断片化を許された。
【０３２８】
代表的過剰提示ペプチドの提示プロファイルは、図３に示される。
【０３２９】
ペプチド特異的Ｔ細胞の増幅
ＡＭＬ患者および健常ボランティアからのＰＢＭＣが、１０％貯留ヒト型血清（ＰＨＳ、社内製造）、１００ｍＭのβ−メルカプトエタノール（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＥ）が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養された。ＣＤ８＋Ｔ細胞刺激では、ＰＢＭＣが解凍されて、１μｇ／ｍｌペプチドでパルス処理された。ペプチドパルス処理ＰＢＭＣ（５〜６×１０６細胞／ｍｌ）は、３７℃および５％ＣＯ２で１２日間培養された。０日目および１日目に、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）および５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７（Ｐｒｏｍｏｋｉｎｅ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が、培養液に追加された。３、５、７、および９日目に、２ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）が培養液に追加された。ペプチド刺激ＰＢＭＣは、１２日目にＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって、１３日目に細胞内サイトカイン染色によって、それぞれ機能解析された。ＣＤ４＋Ｔ細胞刺激では、培養は、次の２つの修正を加えて、ＣＤ８＋Ｔ細胞について記載されたようにして実施された：パルス処理は１０μｇ／ｍｌのＨＬＡクラスＩＩペプチドを用いて実施され、ＩＬ−４およびＩＬ−７は添加されなかった。
【０３３０】
ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、以前記載されたようにして実施された（Ｗｉｄｅｎｍｅｙｅｒ  Ｍ，Ｇｒｉｅｓｅｍａｎｎ  Ｈ，Ｓｔｅｖａｎｏｖｉｃ  Ｓ，Ｆｅｙｅｒａｂｅｎｄ  Ｓ，Ｋｌｅｉｎ  Ｒ，Ａｔｔｉｇ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ  ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｒｏｂｕｓｔ  ＣＤ４＋  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒｉｔｙ  ｏｆ  ｖａｃｃｉｎａｔｅｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１２  Ｊｕｌ  １；１３１（１）：１４０−９）。手短に述べると、９６ウェルニトロセルロースプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）が、１ｍｇ／ｍｌのＩＦＮ−γｍＡｂ（Ｍａｂｔｅｃｈ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ，ＵＳＡ）で被覆され、４℃で一晩培養された。プレートは、１０％ＰＨＳによって３７℃で２時間ブロックされた。５×１０５個の細胞／ウェルの予備刺激ＰＢＭＣが、１μｇ／ｍｌ（ＨＬＡクラスＩ）または２．５μｇ／ｍｌ（ＨＬＡクラスＩＩ）ペプチドでパルス処理されて、２４〜２６時間培養された。読み取りは、製造会社の使用説明書に従って実施された。スポットは、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ  Ｓ５分析器（ＣＴＬ，Ｓｈａｋｅｒ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＯＨ，ＵＳＡ）を使用して計数された。＞１５スポット／ウェルカウントされ、ウェルあたりの平均スポットカウントが、陰性対照ウェルの平均スポット数よりも少なくとも３倍高ければ、Ｔ細胞応答は陽性と見なされた（がんイムノガイディングプログラム（ＣＩＰ）ガイドラインに準拠する）。
【０３３１】
細胞内ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α染色
ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の発生頻度および機能性が、細胞内ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α染色によって分析された。ＰＢＭＣは、１μｇ／ｍｌの個々のペプチドでパルス処理されて、１０μｇ／ｍｌのＢｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）および１０μｇ／ｍｌのＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（ＢＤ）の存在下で６〜８時間培養された。細胞は、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（ＢＤ）、ＣＤ８−ＰＥＣｙ７（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＣＤ４−ＡＰＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＴＮＦ−α−ＰＥ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、およびＩＦＮ−γ−ＦＩＴＣ（ＢＤ）を使用して標識された。サンプルは、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ上で分析された。
【０３３２】
ＨＬＡ表面発現の定量化
健康な単球との比較を可能にするために、免疫表現型検査が定義するようにＣＤ１５−ＡＭＬ芽球と少なくとも５％の正常なＣＤ１５＋単球とを含有する、追加的な患者サンプル中で、ＨＬＡ表面発現の定量化が実施された。ＨＬＡ表面発現は、ＱＩＦＩＫＩＴ（登録商標）定量的フローサイトメトリーアッセイキット（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して、製造会社の使用説明書に従って分析された。手短に述べると、各三つ組み試験サンプルが、汎ＨＬＡクラスＩ特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ｗ６／３２、ＨＬＡ−ＤＲ特異的ｍＡｂＬ２４３（どちらも社内で作成）またはＩｇＧアイソタイプ対照（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）で、それぞれ染色された。ＦＩＴＣ−コンジュゲートウサギ抗マウスＦ（ａｂ’）２フラグメント（Ｄａｋｏ）による二次染色が、引き続いてＰＢＭＣ、ＢＭＮＣならびにＱＩＦＩＫＩＴ（登録商標）定量化ビーズ上で実施された。表面マーカー染色が、直接標識ＣＤ３４（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）、ＣＤ１５（ＢＤ）、ＣＤ４５（ＢＤ）、およびＣＤ３８（ＢＤ）を用いて実施された。ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ細胞分析器（ＢＤ）上のフローサイトメトリー分析の直前に、７ＡＡＤ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）が生存マーカーとして添加された。
【０３３３】
結果
原発性ＡＭＬサンプルは、自己由来良性白血球と比較してＨＬＡ発現の損失または下方制御を示さない
対応する良性白血球と比較したＡＭＬ芽球上のＨＬＡ発現レベルが、判定された。この目的を達成するために、ＣＤ１５−ＡＭＬがある５人の患者と、５人の健康なＢＭＮＣドナーのパネルにおいて、ＨＬＡ表面レベルがフローサイトメトリーによって定量化された。ＡＭＬ芽球はＣＤ３４＋としてゲートされ、ＣＤ４５ｍｅｄ生存細胞およびそれらのＨＬＡ発現が、自己由来ＣＤ１５＋正常顆粒球および単球と比された。ＨＬＡレベルは不均一であり、全ＨＬＡクラスＩ分子カウントは、ＡＭＬ芽球上の４５，１８９〜２６１，６４７分子／細胞から、ＣＤ１５＋細胞上の７５，３４４〜２３９，４９６分子／細胞に及ぶことが分かった。３つ組みの患者個別分析におけるＨＬＡ表面発現は、３／５の患者で軽微ながらも有意な過剰発現を明らかにした（不対ｔ検定、Ｐ≦０．００１）。ＨＬＡ−ＤＲ発現は、ＡＭＬ芽球上で１，４７６〜４５，１５０分子／細胞、ＣＤ１５＋細胞で上で０〜３，２５２の範囲であり、全ての分析された患者においてＡＭＬ芽球上で有意により高かった（Ｐ≦０．００１）。対照のために、５人の健常ＢＭＮＣドナーの造血幹細胞（ＨＳＣ、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−）上で、ＨＬＡ表面分子カウントが分析された。正常な単球と比較した、ＡＭＬ上の  ＨＬＡ表面発現の包括的統計解析は、平均ＨＬＡクラスＩおよびＩＩ発現に有意差がないことを明らかにした。正常なＨＳＣ（２４８，５８７±３５，３５１分子／細胞）上の平均ＨＬＡクラスＩカウントは、ＡＭＬ芽球（１１６，４４５±３７，８５５分子／細胞、Ｐ＝０．０３４、図１ｃ）よりも有意に高いことが分かった。正常なＨＳＣ（３８，３７３±５，１５９分子／細胞）上の平均ＨＬＡクラスＩＩカウントは、ＡＭＬ芽球（１７，１０３±７，６０４分子／細胞、Ｐ＝０．０５３）と比較して有意に高いレベルを示した。
【０３３４】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、無数の天然に提示されるＨＬＡクラスＩおよびＩＩリガンドを同定する
１５人のＡＭＬ患者（表１）のＨＬＡクラスＩリガンドームをマッピングすることで、６，１０４個の起源タンパク質に相当する合計１３，２３８個の異なるペプチドが同定された。患者あたりの同定された（がん）固有のペプチド数は、５６３〜２，７３３個（平均１，２９９個のペプチド）の範囲であった。健常コホート（３０人のＰＢＭＣドナー、５ＢＭＮＣ人のドナー）では、合計１７，９４０個の固有ペプチドが同定された（ＰＢＭＣ上では１７，３２２ペプチド／７，２０７起源タンパク；ＢＭＮＣ上では１，７３８ペプチド／１，３８４起源タンパク質、補足）。１２人のＡＭＬ患者におけるＨＬＡクラスＩＩリガンドームの分析は、８８５個の起源タンパク質に相当する、合計２，８１６個の固有ペプチド（１０４〜７５３個のペプチド／患者の範囲、平均３３２個のペプチド）をもたらした。ＨＬＡクラスＩＩ健常対照コホート（１３人のＰＢＭＣ、２人のＢＭＮＣドナー）は、２，２０２個の異なるペプチドをもたらした（ＰＢＭＣ上では２，０４６個のペプチド／７５６個の起源タンパク質、ＢＭＮＣ上では３１７個のペプチド／１６４個の起源タンパク質）。ＨＬＡクラスＩ（スピアマンＲ＝０．２７、Ｐ＝０．３３）、またはＨＬＡクラスＩＩ（Ｒ＝０．３１、Ｐ＝０．３３）のどちらについても、分析された細胞数とペプチド同定数の間に相関は見られなかった。
【０３３５】
ＨＬＡクラスＩリガンドームの比較プロファイリングは多数のＡＭＬ関連抗原を示す
ペプチドワクチン接種の新規標的をＡＭＬ中で同定するために、ＡＭＬ、ＰＢＭＣｍおよびＢＭＮＣコホートのＨＬＡリガンド起源タンパク質が、比較されマッピングされた。ＨＬＡ起源タンパク質の重複分析は、１，４３５個のタンパク質（マッピングされたＡＭＬ起源プロテオームの３．６％）が、ＡＭＬ患者のＨＬＡリガンドームで排他的に表示されることを明らかにした。ＡＭＬは、そのＨＬＡ起源タンパク質の７５．５％（４，５８８個のタンパク質）をＰＢＭＣと共有し、１９．３％（１，１７３個のタンパク質）をＢＭＮＣと共有することが分かった。ＢＭＮＣのＨＬＡリガンド起源タンパク質は、ＰＢＭＣの起源プロテオームの８９．９％（１，１７３個のタンパク質）との重複を示した。この無数の可能な標的から、本発明者らは、汎用ワクチン設計のために最も妥当で幅広く適用できる候補を選択することを目指した。したがって、本発明者らは、本発明者らのプラットフォーム上で抗原を選択するための最重要基準として、ＡＭＬリガンドーム中のＡＭＬの排他的かつ高頻度の表示を定義した。これらの基準に従ったＨＬＡリガンド起源タンパク質の格付けは、≧２０％のＡＭＬリガンドームで排他的に表示される、１３２個のタンパク質（ＡＭＬ起源プロテオームの２．２％）のサブセットを同定した。これらの２つの基準によって定義されるＬｉＴＡＡ（リガンドーム由来腫瘍関連抗原）中に、本発明者らは、患者リガンドームの８／１５（５３．３％）で検出されて、６つの異なるＨＬＡリガンド（ＡＥＱＦＲＬＥＱＩ（配列番号１）（Ｂ＊４４）、ＦＴＡＥＦＳＳＲＹ（配列番号２）（Ａ＊０３）、ＨＨＤＥＳＶＬＴＮＶＦ（配列番号３）（Ｂ＊３８：０１）、ＲＥＱＤＥＡＹＲＬ（配列番号４）（Ｂ＊４４：２５）、ＲＰＶＭＰＳＲＱＩ（配列番号５）（Ｂ＊０７）、ＶＱＲＥＹＮＬＮＦ（配列番号６）（Ｂ＊１５）によって表示される、ＦＡＳ随伴因子１（ＦＡＦ１）を最上位として同定した。≧３３％のＡＭＬリガンドームにおける表示を示した最上位の１５個のＬｉＴＡＡの概要は、表２に示される。要約すると、最上位の１３２個の最も頻度の高いＬｉＴＡＡのみが、幅広く適用できるＡＭＬ特異的ペプチドワクチンの開発に適する２５を超える異なるＨＬＡ拘束性がある、３４１個の異なる天然に提示されるＨＬＡリガンド（ＬｉＴＡＰ、リガンドーム由来腫瘍関連ペプチド）のパネルを提供する。さらに、１，７２７個の異なるＨＬＡリガンドによって表示される、＜２０％の表示頻度があるさらなる１，３８９個のＡＭＬ限定的起源タンパク質が、より個別化されたワクチン設計アプローチのリポジトリの役割を果たしてもよい。
【０３３６】
確立されたＡＭＬ関連抗原に由来する天然に提示されるＨＬＡクラスＩリガンドの同定
二次データマイニングアプローチは、天然に提示されるＨＬＡリガンドのデータセット中における、（Ａｎｇｕｉｌｌｅ  Ｓ，Ｖａｎ  Ｔｅｎｄｅｌｏｏ  ＶＦ，Ｂｅｒｎｅｍａｎ  ＺＮ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２０１２  Ｏｃｔ；２６（１０）：２１８６−９６で概説されるような）確立されたＡＭＬ関連抗原の同定および格付けに焦点を合わせた。これらの既報の抗原の２９個を表示する、１２２個の異なるＨＬＡリガンドが同定された。著しいことに、これらの抗原の＞８０％（２４／２９）は、良性ＰＢＭＣおよび／またはＢＭＮＣ上でもまた表示され、したがってＡＭＬ特異的でないことが発見された。
【０３３７】
ＨＬＡ提示に関するＡＭＬ排他性は、ＦＬＴ３（ＳＥＬＫＭＭＴＱＬ、Ｂ＊４０）（配列番号３３８）、ＰＡＳＤ１（ＬＬＧＨＬＰＡＥＩ、Ｃ＊０１０２）（配列番号４４７）、ＨＯＸＡ９（ＤＡＡＤＥＬＳＶＧＲＹ、Ａ＊２６：０１）（配列番号４３７）、ＡＵＲＫＡ（ＲＥＶＥＩＱＳＨＬ、Ｂ＊４９：０１）（配列番号４００）、およびＣＣＮＡ１（ＬＥＡＤＰＦＬＫＹ、Ｂ＊１８：０１（配列番号４０２）；ＥＰＰＡＶＬＬＬ、Ｂ＊５１：０１（配列番号４０１））で見られた。ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）では、合計１９の異なるＨＬＡリガンドが同定され、６／１５（４０％）のＡＭＬ、および０／３０のＰＢＭＣリガンドームにおける表示が検出された。しかし、正常なＢＭＮＣの分析は、３／５（６０％）のリガンドームにおける表示を明らかにして、標的同定のために、ＰＢＭＣおよびＢＭＮＣの双方を用いることの妥当性を強調した。要約すると、本発明者らの分析は、確立されたＡＭＬ関連抗原の大部分が、腫瘍限定的ＨＬＡ拘束性表示の要求事項を満たさないことを明らかにした。
【０３３８】
ＦＬＴ３−ＷＴ  ＡＭＬ  ＨＬＡクラスＩリガンドームと対比したＦＬＴ３−ＩＴＤ変異型のサブセット特定的分析は有意なリガンドーム相違性にもかかわらず共通ＬｉＴＡＡを同定する
異なるＡＭＬサブセットにわたる、本発明者らの新規標的の適用性を評価するために、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３遺伝子内縦列重複（ＦＬＴ３−ＩＴＤ、ｎ＝８）およびＦＬＴ３野性型（ＦＬＴ３−ＷＴ、ｎ＝７）患者サブセット中における、ＬｉＴＡＡの表示が特性決定された。ＨＬＡクラスＩリガンドームの類似性インデクシングは、ＦＬＴ３−ＷＴサブセットが、ＦＬＴ３−ＴＩＤサブセット（平均１６８７．０±１５６．５、ｎ＝２１、Ｐ＜０．０００１、図６）よりも有意に低い、内部不均一性（平均９１６．２±７０．６、ｎ＝２１）を提示することを明らかにした。ＡＭＬ限定的ＨＬＡ起源タンパク質（ＦＬＴ３−ＷＴ：７４８個のタンパク質、ＦＬＴ３−ＩＴＤ：９２６個のタンパク質）の重複分析は、それぞれ３２．０％（ＦＬＴ３−ＷＴ／ＦＬＴ３−ＩＴＤ）および２５．６％（ＦＬＴ３−ＩＴＤ／ＦＬＴ３−ＷＴ）の重複を明らかにした（図３ｄ）。注目すべきことに、高位のＬｉＴＡＡの４２／４６（９１．３％）は、双方のサブセットで表示されることが分かった（図３Ｅ）。ＦＬＴ３−ＩＴＤサブセット中で排他的に同定された、３つのＨＬＡリガンド起源タンパク質ＳＫＰ１（５／８）、Ｃ１６ｏｒｆ１３（５／８）、およびＥＲＬＩＮ１（４／８）は、表示頻度が≧５０％に達した。ＦＬＴ３−ＷＴ特異的ＬｉＴＡＡ  ＭＵＬ１は、ＦＬＴ３−ＷＴリガンドームの４／７（５７．１％）で表示される。総合すると、これらのデータは、高度に頻繁なサブセット特異的標的のごく一部を指摘する一方で、標的選択するための考案されたＨＬＡリガンドームのコホート構成分析ストラテジーを支持する。
【０３３９】
ＬｉＴＡＰの機能特性解析はＡＭＬ関連免疫反応性を示す
本発明者らのＨＬＡ−Ａ＊０３ＬｉＴＡＰの免疫原性および特異性を評価するために、本発明者らは、次に、１２日間免疫復活ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施した。６人のＡＭＬ患者ならびに８人の健常人から得られたＰＢＭＣが、最高位のＨＬＡ−Ａ＊０３ＬｉＴＡＰの異なる貯留（ＰＩ１およびＰＩ２）で刺激された。２／６のＡＭＬサンプルでは、用いられたペプチド貯留の双方について、有意なＩＦＮ−γ分泌が観察された（図４ａ）。これらの知見を立証するために、１２日間刺激前ＰＢＭＣ（図４ｂ）を使用して、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αのための細胞内サイトカイン染色およびフローサイトメトリーが実施された。ＰＩ１およびＰＩ２特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、ＩＦＮ−γ（ＰＩ１：１．６％、ＰＩ２：１．７％のＣＤ８＋Ｔ細胞）およびＴＮＦ−α（ＰＩ１：２．６％、ＰＩ２：２．４％のＣＤ８＋Ｔ細胞）分泌によって機能的に特徴付けられることが確認された。ＰＩ１およびＰＩ２で刺激されたＡ＊０３陽性健常ドナーＰＢＭＣを使用した検証ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、有意なＩＦＮ−γ分泌がないことを示した（０／８、図４ｃ）。これらの最初の特性決定は、本明細書で定義されるＬｉＴＡＰが、ＡＭＬ特異的Ｔ細胞エピトープとして潜在的に機能することを示す。
【０３４０】
ＨＬＡクラスＩＩリガンドーム分析は相加的標的を提供して潜在的に相乗的な包埋リガンドを特定する
ＨＬＡクラスＩＩ起源プロテオームの重複分析は、１，０７９個の異なるＨＬＡリガンドによって表示される３９６個のタンパク質（４４．７％）が、ＡＭＬのＨＬＡリガンドーム中で排他的に表示されることを同定した。ＡＭＬは、それぞれＰＢＭＣおよびＢＭＮＣと、その起源プロテオームの５３．３％（４７２個のタンパク質）および１５．１％（１３４個のタンパク質）を共有することが分かった。ＢＭＮＣは、ＰＢＭＣとの８８．２％（１２７個のタンパク質）の起源プロテオーム重複を示した。ＨＬＡクラスＩについて上述されるような比較ＨＬＡ起源プロテオームプロファイリングを実施することで、本発明者らは、≧２０％の表示頻度がある３６個のＬｉＴＡＡ（１５２個の異なるＨＬＡクラスＩＩリガンドによって表示される）を同定できた。最高位クラスＩＩ  ＬｉＴＡＡ（Ａ１ＢＧ）は６／１２（５０％）の患者で同定されて、５個の異なるリガンドによって表示される。ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩリガンドームの双方で提示されるＬｉＴＡＡを同定するために、本発明者らは、引き続いて、それぞれのＡＭＬ限定的起源プロテオームを比較した。これは、４３個の共通起源タンパク質（それぞれ３．０％／１０．４％のＨＬＡクラスＩ／ＨＬＡクラスＩＩ起源プロテオーム）のみのパネルを明らかにした。それぞれのクラスＩ対クラスＩＩリガンドマッピングは、完全な包埋ＨＬＡクラスＩリガンドを含有する、３つのＨＬＡクラスＩＩペプチドを同定した。
【０３４１】
ＨＬＡクラスＩＩ  ＬｉＴＡＰを機能的に特性決定するために、本発明者らは、１２日間免疫復活ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施した。最高位のＬｉＴＡＰの３／７では、ＡＭＬ患者においてＩＦＮ−γの有意な分泌が検出された。Ｔ細胞応答は、ペプチドＰＩＩ１（ＣＬＳＴＮ１８３６〜８５２）では４／１５（２６．７％）、ＰＩＩ２（ＬＡＢ５Ａ１２３〜１３８）では３／１５（２０．０％）、およびＰＩＩ３（ＭＢＬ２１９１〜２０６）では２／１５（１３．３％）のＡＭＬ患者で検出された。図５Ｅは、ＡＭＬ患者におけるペプチドＰＩＩ１、ＰＩＩ２、およびＰＩＩ３に対する、特異的Ｔ細胞の頻度の一例を示す。ＰＩＩ１、ＰＩＩ２、およびＰＩＩ３で刺激された健常ドナーＰＢＭＣを使用した検証ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、有意なＩＦＮ−γ分泌がないことを示した（０／８）。したがって、本明細書で定義されるＡＭＬ特異的ＨＬＡクラスＩＩエピトープは、ＨＬＡクラスＩペプチドワクチンを補完する可能性を有する。
【０３４２】
実施例２
本発明のペプチドをコードする遺伝子発現プロファイリング
ＭＨＣ分子によって腫瘍細胞の表面に提示されるとＡＭＬ中で同定された全てのペプチドが、免疫療法に適するとは限らないが、それはこれらのペプチドの大多数が、多数の細胞型によって発現される正常な細胞タンパク質に由来するためである。これらのペプチドのごく少数のみが腫瘍関連であり、それらが由来する腫瘍を高特異性で認識するＴ細胞を誘導できると思われる。このようなペプチドを同定し、ワクチン接種によって誘導される自己免疫リスクを最小化するために、本発明者らは、大多数の正常組織と比較して腫瘍細胞上で過剰発現される、タンパク質に由来するペプチドに焦点を合わせた。
【０３４３】
理想的なペプチドは、腫瘍に固有でその他のいかなる組織にも存在しないタンパク質に由来する。理想的なものと同様の発現プロファイルがある遺伝子に由来するペプチドを同定するために、同定されたペプチドをそれらが由来するタンパク質と遺伝子にそれぞれ割り当て、これらの遺伝子の発現プロファイルが作成された。
【０３４４】
ＲＮＡ源および調製
外科的に除去された組織標本は、告知に基づく同意書を各患者から得た後に、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙによって提供された（実施例１を参照されたい）。腫瘍組織標本は、外科手術直後に液体窒素中でスナップ凍結され、その後、液体窒素下で乳鉢と乳棒によって均質化された。全ＲＮＡは、ＴＲＩ試薬（Ａｍｂｉｏｎ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してこれらのサンプルから調製され、ＲＮｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）による精製がそれに続き；どちらの方法も製造業者のプロトコルに従って実施された。
【０３４５】
健常ヒト組織からの全ＲＮＡは、商業的に入手された（Ａｍｂｉｏｎ，Ｈｕｎｔｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；ＢｉｏＣｈａｉｎ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）。数人（２〜１２３人）の個人からのＲＮＡは、各個人からのＲＮＡが等しく重み付けされるように混合された。
【０３４６】
全てのＲＮＡサンプルの品質および量は、ＲＮＡ  ６０００  Ｐｉｃｏ  ＬａｂＣｈｉｐキット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で評価された。
【０３４７】
マイクロアレイ実験
全ての腫瘍および正常組織ＲＮＡサンプルの遺伝子発現解析は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ（ＨＧ）Ｕ１３３ＡまたはＨＧ−Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０オリゴヌクレオチドマイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって実施された。全てのステップは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマニュアルに従って実施された。簡単に述べると、マニュアルに記載されるようにして、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＲＴＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびオリゴｄＴ−Ｔ７プライマー（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、二本鎖ｃＤＮＡが５〜８μｇの全ＲＮＡから合成された。生体外転写は、Ｕ１３３ＡアレイのためのＢｉｏＡｒｒａｙ  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  ＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＥＮＺＯ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ，ＵＳＡ）、またはＵ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０のためのＧｅｎｅＣｈｉｐ  ＩＶＴ標識キット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）によって実施され、ｃＲＮＡ断片化、ハイブリダイゼーション、およびストレプトアビジン−フィコエリトリンとビオチン化抗ストレプトアビジン抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）による染色がそれに続いた。画像は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２５００Ａ  ＧｅｎｅＡｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ｕ１３３Ａ）またはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｇｅｎｅ−Ｃｈｉｐ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００（Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０）でスキャンされ、全てのパラメータについてデフォルト設定を使用して、ＧＣＯＳソフトウェア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）によってデータ解析された。正規化のために、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘによって提供される１００個のハウスキーピング遺伝子が使用された。相対的発現値は、ソフトウェアによって与えられるシグナルｌｏｇ比から計算され、正常な腎臓サンプルが自由裁量で１．０に設定された。
【０３４８】
ＡＭＬ中で高度に過剰発現されまたは排他的に発現される本発明の起源遺伝子の代表的発現プロファイルは、図３に示される。
【０３４９】
実施例３
ＡＭＬ  ＭＨＣクラスＩ提示ペプチドの生体外免疫原性
本発明のＴＵＭＡＰの免疫原性に関する情報を得るために、本発明者らは、ペプチド／ＭＨＣ複合体および抗ＣＤ２８抗体を負荷した人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）によるＣＤ８＋Ｔ細胞の反復刺激に基づく、生体外Ｔ細胞プライミングアッセイを用いて調査を実施した。このようにして、本発明者らは、これまでに本発明の９個のＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性ＴＵＭＡＰの免疫原性を示し得て、これらのペプチドが、それに対するＣＤ８＋前駆Ｔ細胞がヒトに存在する、Ｔ細胞エピトープであることを実証した。
【０３５０】
ＣＤ８＋Ｔ細胞の生体外プライミング
ペプチドＭＨＣ複合体（ｐＭＨＣ）および抗ＣＤ２８抗体を負荷した、人工抗原提示細胞による生体外刺激を実施するために、本発明者らは、最初に、告知に基づく同意後に、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから得られた健常ドナーのＣＤ８ミクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ−Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した正の選択を通じて、新鮮ＨＬＡ−Ａ＊０２白血球除去生成物からＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。
【０３５１】
単離ＣＤ８＋リンパ球またはＰＢＭＣは、１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清（ＰＡＮ−Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｉｄｅｎｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＣＣ  Ｐｒｏ，Ｏｂｅｒｄｏｒｌａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、２０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｃａｍｂｒｅｘ）を添加した、ＲＰＭＩ−Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からなるＴ細胞培地（ＴＣＭ）中で、使用時まで培養された。２．５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７（Ｐｒｏｍｏ  Ｃｅｌｌ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａ，Ｎｕｒｎｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）もまた、この段階でＴＣＭに添加された。
【０３５２】
ｐＭＨＣ／抗ＣＤ２８被覆ビーズの生成、Ｔ細胞刺激、および読み取りは、高度に定義された生体外システム内で、刺激条件あたり４種の異なるｐＭＨＣ分子と、読み取り条件あたり８種の異なるｐＭＨＣ分子を使用して実施された。
【０３５３】
ａＡＰＣ負荷およびサイトメトリー読み取りのために使用された全てのｐＭＨＣ複合体は、わずかな修正を加えて（Ｒｏｄｅｎｋｏ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＵＶ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｌｉｇａｎｄ  ｅｘｃｈａｎｇｅ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２００６；１（３）：１１２０−３２）、ＵＶ誘発ＭＨＣリガンド交換から誘導された。交換によって得られるｐＭＨＣ単量体の量を判定するために、本発明者らは、Ｒｏｄｅｎｋｏ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．，２００６に記載のストレプトアビジンベースのサンドイッチＥＬＩＳＡを実施した。精製共刺激マウスＩｇＧ２ａ抗ヒト型ＣＤ２８  Ａｂ  ９．３（Ｊｕｎｇ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｒｅｓｔｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９８７  Ｊｕｌ；８４（１３）：４６１１−５）が、製造業者（Ｐｅｒｂｉｏ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって推奨されるように、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドビオチンを使用して化学的にビオチン化された。使用されたビーズは、直径５．６μｍのストレプトアビジン被覆ポリスチレン粒子（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ）であった。
【０３５４】
陽性および陰性対照刺激のために使用されたｐＭＨＣは、それぞれ、Ａ＊０２０１／ＭＬＡ−００１（修飾Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１に由来するペプチドＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号６０６））、およびＡ＊０２０１／ＤＤＸ５−００１（ＤＤＸ５に由来するＹＬＬＰＡＩＶＨＩ（配列番号６０７））であった。
【０３５５】
４×１２．５ｎｇの異なるビオチンｐＭＨＣ存在下で、８００，０００個のビーズ／２００μｌが９６ウェルプレート内で被覆され、洗浄されて、引き続いて２００μｌの容量中で６００ｎｇのビオチン抗ＣＤ２８が添加された。５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）を添加した２００μｌのＴＣＭ中で、１×１０６のＣＤ８＋Ｔ細胞を２×１０５の洗浄被覆ビーズと、３７℃で３〜４日間にわたり同時インキュベートすることで、９６ウェルプレート内で刺激が開始された。次に８０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加した新鮮ＴＣＭで培地の半分を交換し、３７℃で３〜４日間にわたり培養が継続された。この刺激サイクルが、合計３回実施された。条件あたり８個の異なるｐＭＨＣ分子を使用したｐＭＨＣ多量体読み取りでは、５つの異なる蛍光色素との共役を包含するわずかな修正を加えて、以前記載されたような二次元コンビナトリアルコーディングアプローチ（Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２  Ｐａｒａｌｌｅｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｂｙ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｏｆ  ＭＨＣ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２０１２  Ａｐｒ  １２；７（５）：８９１−９０２）が使用された。最後に、Ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ近赤外染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＣＤ８−ＦＩＴＣ抗体クローンＳＫ１（ＢＤ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、および蛍光性ｐＭＨＣ多量体による細胞の染色によって多量体解析が実施された。解析では、適切なレーザーおよびフィルターを装着したＢＤ  ＬＳＲＩＩ  ＳＯＲＰ血球計数器が使用された。ペプチド特異的細胞は、全ＣＤ８＋細胞の百分率として計算された。多量体解析の評価は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）を使用して実施された。特異的多量体＋ＣＤ８＋リンパ球の生体外初回刺激は、陰性対照刺激と比較することで検出された。１人の健常ドナーの少なくとも１つの評価可能生体外刺激ウェルが、生体外刺激後に、特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞系を含有することが認められれば、所与の抗原の免疫原性が検出された（すなわちこのウェルは、ＣＤ８＋Ｔ細胞内に少なくとも１％の特異的多量体＋を含有し、特異的多量体＋細胞の百分率は、陰性対照刺激の中央値の少なくとも１０倍であった）。
【０３５６】
ＡＭＬペプチドの生体外免疫原性
試験されたＨＬＡクラスＩペプチドでは、ペプチド特異的Ｔ細胞系の生成によって、生体外免疫原性が実証され得る。本発明の２種のペプチドのＴＵＭＡＰ特異的多量体染色後の代表的フローサイトメトリー結果が、対応する陰性対照と共に図４に示される。
【０３５７】
実施例４
ペプチドの合成
全てのペプチドは、Ｆｍｏｃストラテジーを使用する、標準的な十分に確立された固相ペプチド合成を使用して合成された。分取ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製後、イオン交換法を実施して、生理学的適合性カウンターイオン（例えばトリフルオロ酢酸、酢酸、アンモニウムまたは塩化物）が組み込まれた。
【０３５８】
個々のペプチドのアイデンティティーおよび純度は、質量分析法および分析用ＲＰ−ＨＰＬＣによって判定された。ペプチドは、イオン交換法後に、純度が９０％〜９９．７％の白色から灰白色凍結乾燥物として得られた。
【０３５９】
全てのＴＵＭＡＰは、好ましくはトリフルオロ酢酸塩または酢酸塩として投与され、その他の適切な塩形態もまた可能である。実施例３の測定では、ペプチドのトリフルオロ酢酸塩が使用された。
【０３６０】
実施例５
ＭＨＣ結合アッセイ−ＭＨＣクラスＩ
本発明によるＴ細胞ベースの治療法のための候補ペプチドは、それらのＭＨＣ結合能力（親和性）についてさらに試験された。個々のペプチドＭＨＣ複合体は、分析された関心のあるペプチドで交換することによって生成された。ペプチド受容性ＭＨＣ分子を効果的に結合して安定化し得るペプチド候補のみが、ＭＨＣ複合体の分離を防止する。交換反応の収率を判定するために、安定化ＭＨＣ複合体の軽鎖（β２ｍ）の検出に基づくＥＬＩＳＡが実施された。アッセイは、概して、Ｒｏｄｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｒｏｄｅｎｋｏ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．１（２００６）：１１２０−１１３２）に記載されるようにして実施された。
【０３６１】
９６ウェルＭＡＸＩＳｏｒｐプレート（ＮＵＮＣ）をＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌストレプトアビジンにより室温で一晩被覆して４回洗浄し、ブロック緩衝液を含有する２％ＢＳＡ中で３７℃で１時間ブロックした。再度折りたたまれたＨＬＡ−Ａ＊０２０１／ＭのＬＡ−００１単量体が、１５〜５００ｎｇ／ｍｌの範囲をカバーする標準物質の役割を果たした。ＵＶ交換反応のペプチド−ＭＨＣ単量体は、ブロック緩衝液中で１００倍に希釈された。サンプルを３７℃で１時間インキュベートして４回洗浄し、２μｇ／ｍｌのＨＲＰ共役結合抗β２ｍと共に３７℃で１時間インキュベートし、再度洗浄してＴＭＢ溶液で検出し、ＮＨ２ＳＯ４で停止させた。吸光は、４５０ｎｍで測定された。抗体またはそれらのフラグメント、および／またはＴ細胞受容体またはそれらのフラグメントの生成および製造のためには、高い交換収率（好ましくは５０％よりも高い、最も好ましくは高い７５％よりも）を示す候補ペプチドが、ＭＨＣ分子に対する十分な結合活性を示してＭＨＣ複合体の分離を防止することから、一般に好ましい。
【０３６２】
試験されたペプチドのＭＨＣクラスＩ結合スコアは、＜２０％＝＋；２０％−４９％＝＋＋；５０％−７５％＝＋＋＋；＞＝７５％＝＋＋＋＋であった。
【０３６３】
【表８】
0006659582.tif 000039
【０３６４】
実施例６
ＭＨＣ結合アッセイ−ＭＨＣクラスＩＩ
ＨＬＡクラスＩＩタンパク質は、多数のハプロタイプによってコードされる、３つの主要なアイソタイプＨＬＡ−ＤＲ、−ＤＰ、−ＤＱに分類される。様々なαおよびβ鎖の組み合わせは、任意の母集団に見られるＨＬＡクラスＩＩタンパク質の多様性を増大させる。したがって、選択されたＨＬＡクラスＩＩ  ＴＵＭＡＰは、かなりの割合の患者で、効果的なＴ細胞応答に寄与するために、数種の異なるＨＬＡ−ＤＲ分子に結合しなくてはならない（すなわち乱交雑結合能力を示す）。
【０３６５】
様々なＨＬＡ−ＤＲハプロタイプに対するＧＡＬＮＴ７−００１およびＥＲＧＩＣ１−００１の乱交雑結合と、形成された複合体の安定性は、生体外結合アッセイで評価された。
【０３６６】
試験されたペプチドは、次のとおりであった。
【０３６７】
【表９】
0006659582.tif 000040
【０３６８】
１１の調査されたＨＬＡ−ＤＲハプロタイプは、ＨＬＡ−Ａ＊０２−およびＨＬＡ−Ａ＊２４−陽性北米集団における、それらの頻度によって選択される。データは、米国骨髄バンクに登録した１３５万人のＨＬＡ型ボランティアの分析から導かれる（Ｍｏｒｉ  Ｍ，Ｂｅａｔｔｙ  ＰＧ，Ｇｒａｖｅｓ  Ｍ，Ｂｏｕｃｈｅｒ  ＫＭ，Ｍｉｌｆｏｒｄ  ＥＬ（１９９７）．ＨＬＡ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ：ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｄｏｎｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｄｏｎｏｒ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６４，１０１７−１０２７）。分析された母集団は、次の民族に細分化された：白人米国人（Ｎ＝９９７，１９３）、アフリカ系米国人（Ｎ＝１１０，０５７）、アジア系米国人（Ｎ＝８１，１３９）、ラテン系米国人（Ｎ＝１００，１２８）、および北米先住民（Ｎ＝１９，２０３）。
【０３６９】
使用されたＭＨＣペプチド結合アッセイは、各候補ペプチドが選択されたＨＬＡクラスＩＩハプロタイプに結合し、ＨＬＡペプチド複合体を安定化する能力を判定した。このためには、候補ペプチドが、特定のＨＬＡクラスＩＩタンパク質を用いて生体外で構築される。
【０３７０】
特定のＨＬＡ分子に対する候補ペプチドの結合能力は、各ＨＬＡハプロタイプに対する既知の非常に強力な結合特性（陽性対照）がある対照ペプチドと比較される。実験的標準誤差は、３つ組みの陽性対照の結合実験に由来する。
【０３７１】
特定のＨＬＡ分子に対するペプチドの親和性に加えて、形成されるＨＬＡペプチド複合体の永続的安定性は、免疫応答発生に重要である。この理由から、形成されたＨＬＡペプチド複合体の存在が、３７℃で２４時間の培養後に測定される。形成されたＭＨＣ−ペプチド複合体の安定性は、２４時間目の結合スコアと、再折りたたみ直後（したがって０時間目）に得られる結合スコアとのパーセント比として計算される。
【０３７２】
ＲＥＶＥＡＬ（登録商標）ＭＨＣ−ペプチド結合アッセイにおけるＧＡＬＮＴ７−００１およびＥＲＧＩＣ１−００１の分析は、双方のペプチドが様々なＨＬＡハプロタイプに結合することを示した。どちらのペプチドも、調査された７つのＨＬＡハプロタイプ（ＨＬＡ−ＤＲ１、−ＤＲ２、−ＤＲ４、−ＤＲ５、および−ＤＲ７）中の５つと、複合体を形成することが示された。検出された結合スコアは、陽性対照に対して０．０２〜約７８．５％の範囲内であり、非結合ペプチドのスコアを明らかに超えていた。ＧＡＬＮＴ７−００１は、調査された７つのＨＬＡハプロタイプ（ＨＬＡ−ＤＲ１、−ＤＲ２、−ＤＲ４、−ＤＲ７）中の４つで、乱交雑性の強力な結合を示した（すなわち、１５％を超える結合スコア、サービス提供者の体験に基づく値は、強力な結合を反映すると見なされる）。ＥＲＧＩＣ−００１では、調査された２つのＨＬＡハプロタイプの結合スコアが、およそ１５％以上であった（ＨＬＡ−ＤＲ４、−ＤＲ５）。どちらのペプチドも、ＨＬＡ−ＤＲ３およびＨＬＡ−ＤＲ６には結合しなかった。
【０３７３】
形成されたＨＬＡ−ＧＡＬＮＴ７−００１およびＨＬＡ−ＥＲＧＩＣ１−００１複合体の安定性分析は、調査された７つのＨＬＡ−ペプチド複合体中の４つが、３７℃で２４時間後に安定していたことを明らかにした（ＨＬＡ−ＤＲ１、−ＤＲ４、−ＤＲ５、−ＤＲ７）。
【０３７４】
生体外結合アッセイを使用した、最も頻度の高いＨＬＡ−ＤＲハプロタイプに対する、ＧＡＬＮＴ７−００１およびＥＲＧＩＣ１−００１の結合能力の分析は、双方のペプチドについて、乱交雑結合能力を明らかにした。どちらのペプチドも、調査された７つのＨＬＡ−ＤＲハプロタイプ中の５つと、複合体を形成する。したがって、分析は、少なくとも４つのＥＲＧＩＣ１−００１および少なくとも２つのＨＬＡ−ＤＲハプロタイプに対する、ＧＡＬＮＴ７−００１のかなりの結合能力を示した。さらに、調査された各ペプチドで、形成された５つのＨＬＡペプチド複合体の中の４つは、少なくとも２４時間安定していた。したがって、分析は、双方のペプチドが、かなりの割合の患者において、Ｔ細胞応答の有効性に寄与するはずであることを示した。
【０３７５】
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【図１】
0006659582.tif 000041
【図２】
0006659582.tif 000042
【図３】
0006659582.tif 000043
【図４−１】
0006659582.tif 000044
【図４−２】
0006659582.tif 000045
【図４−３】
0006659582.tif 000046
【図４−４】
0006659582.tif 000047
【図４−５】
0006659582.tif 000048
【図４−６】
0006659582.tif 000049
【図５−１】
0006659582.tif 000050
【図５−２】
0006659582.tif 000051
【図５−３】
0006659582.tif 000052
【図６】
0006659582.tif 000053
【配列表】
0006659582000001.app