(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．線維芽細胞培地Ｍ１中で線維芽細胞を培養する工程；
ｂ．コラーゲンを含むマトリクスに、工程ａで得られた線維芽細胞を播種する工程；ｃ．コラーゲンを含む前記マトリクスに播種された線維芽細胞を、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩又はそれらの誘導体を含む線維芽細胞培地Ｍ２中で培養し、前記マトリクス及び前記培養された線維芽細胞に代用真皮を形成させる工程；
ｄ．メラニン形成細胞を、メラニン形成細胞培地Ｍ３中で培養する工程；
ｅ．角化細胞を、角化細胞培地Ｍ４中で培養する工程；
ｆ．工程ｄで得られたメラニン形成細胞と工程ｅで得られた角化細胞とを混合する工程 
；
ｇ．工程ｃで得られた前記代用真皮を、工程ｆで得られた前記混合物とともに、９から１９の（角化細胞＋メラニン形成細胞）／線維芽細胞比で播種する 工程；
ｈ．工程ｇで播種された前記代用真皮を、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩又はそれらの誘導体を含む皮膚培地Ｍ５中で培養し、それによって代用皮膚を形成する工程
を含む、代用皮膚を作製するための方法。 
【請求項２】
前記培地Ｍ５が、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩又はそれらの誘導体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ｆのメラニン形成細胞と角化細胞との前記混合が、１／２０から１／１５のメラニン形成細胞／角化細胞比で行われる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
工程ｂの前記播種が、コラーゲンを含む前記マトリクスの表面積に対して２００００から５００００線維芽細胞／ｃｍ２の密度で行われる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程ｃが、アスコルビン酸及びアスコルビン酸塩を含まない線維芽細胞培地Ｍ２１の存在下、１８から２８時間にわたる第一の培養工程ｃ’、及び
アスコルビン酸、アスコルビン酸塩又はそれらの誘導体を含む線維芽細胞培地Ｍ２２の存在下、少なくとも２日間にわたる第二の培養工程ｃ’’を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
工程ｈが：
−  ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩、アスコルビン酸及びアスコルビン酸塩を含まない培地Ｍ５１の存在下、６から２４時間にわたる第一の培養工程ｈ’、
−  ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩又はそれらの誘導体を含む培地Ｍ５２の存在下、少なくとも２日間にわたる第二の培養工程ｈ’’、並びに
−  ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩又はそれらの誘導体、及びアスコルビン酸、アスコルビン酸塩又はそれらの誘導体を含む培地Ｍ５３中、少なくとも２日間にわたる第三の培養工程ｈ’’’
を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載の方法を実行することによって得られた代用皮膚。
【請求項８】
前記線維芽細胞が、個体に関して、前記代用皮膚の前記個体への移植という観点から自家性である、請求項７に記載の代用皮膚。
【請求項９】
前記線維芽細胞、前記メラニン形成細胞、及び前記角化細胞が、個体に関して自家性である、請求項８に記載の代用皮膚。
【請求項１０】
請求項１から８のいずれか一項に記載の方法の工程ｃで得ることができる代用真皮。
【請求項１１】
請求項８若しくは９に記載の代用皮膚、又は請求項１０に記載の代用真皮から構成される移植片。
【請求項１２】
皮膚障害及び／又は皮膚物質の喪失を治療するための手段としての使用のための請求項１１に記載の移植片。
【請求項１３】
前記皮膚障害及び／又は皮膚物質の喪失が、熱傷、治癒欠陥、慢性創傷、色素異常、血管腫、及び皮膚癌を含む群より選択される、請求項１２に記載の使用のための移植片。
【請求項１４】
線維芽細胞培地Ｍ１、コラーゲンを含むマトリクス、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩又はそれらの誘導体を含む線維芽細胞培地Ｍ２、メラニン形成細胞培地Ｍ３、角化細胞培地Ｍ４、及び皮膚培地Ｍ５を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法を実行するためのキット。
【請求項１５】
前記培地Ｍ１からＭ５が、独立して、臨床グレードの培地である、請求項１４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、代用皮膚を作製するための方法、その方法を実行することによって得ることができる動物の代用皮膚、好ましくは、哺乳類及び／又はヒトの代用皮膚、並びにその方法を実行するためのキットに関する。
【０００２】
本発明はまた、代用皮膚から成る移植片、並びに皮膚障害及び／又は皮膚物質の喪失を治療するための手段としてのその使用にも関する。
【０００３】
本発明は、特に、薬理学、医療、及び臨床の分野で用いられ得る。
【０００４】
以下の記述において、角括弧（［］）内の参照番号は、テキストの最後に提示する参考文献のリストを参照することを意味する。
【背景技術】
【０００５】
皮膚は、非常に特定の層構造を含む非常に複雑な器官である。それは、以下の３つの主要部分：
−  最も薄く、表皮と称される表層部分、
−  より厚い中間部分で、表皮が付着されている真皮、及び
−  より深い層の皮下組織
を含む。
【０００６】
それは特に、外部媒体と、多くの哺乳類、特にヒトの内部媒体との間のバリアを提供する。この「バリア」機能のおかげで、皮膚は、生物にとっての保護を自然に提供し、一方同時に、前記生物と外部環境との間の繋がりも提供する。皮膚は、何らかの攻撃に対する最初の防御器官も成す。
【０００７】
皮膚は、多くの攻撃を受けるものであり、それらは、例えば、癌の原因となる炎症反応／細胞改変を引き起こし得るＵＶ線に伴う攻撃、熱傷、乱切など、例えば鈍器によるものなどの物理的攻撃、洗剤を例とする化学製品に例えば伴う化学的攻撃であり得る。このような様々な攻撃は、特に、皮膚の構造を改変すること、その色を変化させること、及び／又は皮膚創傷の外観を引き起こすことを起こし得る皮膚障害を誘発し得る。
【０００８】
実際、ヒドロキノンなどの化学製品及び／又は分子が、高い用量で用いられた場合、強い色素脱失を誘発し得ること、瘢痕、ストレッチマーク、糖尿病、高血圧症、皮膚癌、又は全身合併症を例とする重篤な病態、腎障害、体毛の発達を引き起こし得ること、並びに顎鬚の成長及び体臭の乱れを引き起こし得ることが知られている。脱色が所望される効果を超えて進み過ぎると、これらの結果は、不可逆的となり得る。この場合、主要なソリューションは、依然として、正常な外観に「戻す」試みとしての皮膚移植である。
【０００９】
他の要素が皮膚の変化の原因となる場合もあり、例えば、遺伝的秩序（genetic order）のパラメータ、並びに／又は全身内分泌及び／若しくは自己免疫障害に伴うパラメータである。それらは、特に、白斑、メラニン増加症、無色性色素失調症、又は母斑などの色素異常を引き起こす病態であり得る。そのような障害を治療するための方法の１つは、皮膚移植及び／又は色素細胞の組み込み（implementation）を含む。しかし、このような方法は、適用される皮膚及び／又は色素細胞の安定性に多くの場合関連する相対効果を有する。
【００１０】
皮膚は、例えば鈍器などの外部要素によって損傷される場合もあり、ある程度深い創傷が引き起こされ得る。皮膚は、非常に強い再生及び治癒能力を有しており、それによって、ほとんどの場合、ある程度の長期間にわたる治癒が可能となる。治癒時間及び／又は能力は、特に、創傷の深さ／程度、及びさらには個体の生理的状態に依存し得る。実際、深い創傷の場合、それらは、病原体に対する「開かれた扉」となる可能性があり、モニタリングの増加が、及び／又は例えば縫合糸を用いることによる、若しくは特に皮膚の再生を可能とする目的で、特に様々な損傷部分を修復する目的で、その上に皮膚移植片を適用することによる創傷を閉じるための介入の必要性が求められる。
【００１１】
先行技術には、特に皮膚再生に好ましい環境の形成を一時的に可能とする人工代用真皮が存在する。これらの代用物によって形成される構造及び環境は、多くの場合、真皮のそれに近い。しかし、これらの代用物は、医療デバイスであり、本質的に合成物であり、高価である。
【００１２】
先行技術にはまた、個体からの皮膚サンプルから得られた細胞、特に角化細胞を培養するためのシステムも存在し、それは、数週間の後、慢性創傷又は熱傷を例とする創傷に、その治癒を促進する目的で堆積／噴霧することができる培養物を形成する。
【００１３】
しかし、これらの方法及び代用物は、それ自体、線維芽細胞、角化細胞、及びメラニン形成細胞などの皮膚の主要構成細胞を含む代用皮膚を構成するものではない。特に、これらの代用物は、メラニン形成細胞を含んでおらず、したがって、色素沈着された及び／又は色素沈着可能である代用皮膚を得ることはできない。さらに、これらの代用物は、例えば、色素異常の治療、例えば、外科手術、完全な皮膚の喪失まで起こり得る著しい皮膚の喪失を例えば引き起こす事故に起因する深い創傷の治療に用いることはできない。
【００１４】
さらに、利用可能な代用真皮を得るための方法は、「遅い」方法であり、この方法では、例えば、深い熱傷などの特定の創傷の治療に適合する時間で代用物を得ることはできない。
【００１５】
そして、市販の代用皮膚の大部分は、構造的な意味でも、及び疫学的な意味でも、脆弱な製品である。したがって、これらの製品は、特にその取扱い時における製品のいかなる断裂も回避するために、小サイズである場合が多い。
【００１６】
先行技術にはまた、例えば米国特許第５７５５８１４号の文書に記載のように、特に、細胞の培養、特に線維芽細胞及び／又はメラニン形成細胞と角化細胞との混合物の培養を含む代用皮膚を作製するためのシステム／方法も存在する。しかし、これらのシステム／方法では、生体内の皮膚と同一の構造を有する代用物を得ることはできない。加えて、これらの方法によって得られた代用物は、角質層中におけるケラチンの成熟異常に相当する皮膚の分化異常である不全角化を呈し、したがって、皮膚障害及び／又は皮膚物質の喪失の治療にこれらを用いることはできない。そして、代用皮膚を作製するための公知のシステム／方法は、特に、ウシ脳下垂体抽出物を例とする臨床使用に不適合である化合物を含む媒体を用いる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
したがって、代用物のコスト及び作製時間を低減するために、先行技術のこれらの欠陥、欠点、及び障害を克服する代用皮膚を作製するための方法、特に、皮膚の主要な構成細胞、特に線維芽細胞、角化細胞、及びメラニン形成細胞を含む代用皮膚を得ることを可能とする方法を見出すことが実際に求められている。
【００１８】
また、再現可能であり、信頼性の高い皮膚モデルの作製を可能とする方法を見出すことも、先行技術において実際に求められている。
【００１９】
また、皮膚障害及び／又は皮膚物質の喪失の治療に用いることができる新規な代用皮膚を見出すことも実際に求められている。
【００２０】
また、容易に取り扱うことができ、その取扱い時に断裂の高リスクを呈さない新規な代用皮膚を見出すことも実際に求められている。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明の目的は、具体的には、以下の：
ａ．線維芽細胞培地Ｍ１中で線維芽細胞を培養する工程；
ｂ．コラーゲンを含むマトリクスに、工程ａで得られた線維芽細胞を播種する工程；
ｃ．コラーゲンを含むマトリクスに播種された線維芽細胞を、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩又はそれらの誘導体を含む線維芽細胞培地Ｍ２中で培養し、マトリクス及び培養された線維芽細胞に代用真皮を形成させる工程；
ｄ．メラニン形成細胞を、メラニン形成細胞培地Ｍ３中で培養する工程；
ｅ．角化細胞を、角化細胞培地Ｍ４中で培養する工程；
ｆ．工程ｄで得られたメラニン形成細胞と工程ｅで得られた角化細胞とを混合する工程；
ｇ．工程ｃで得られた代用真皮を、工程ｆで得られた混合物とともに播種する工程；
ｈ．工程ｇで播種された代用真皮を、皮膚培地Ｍ５中で培養して、代用皮膚を形成する工程
を含む、代用皮膚を作製するための方法を提供することによって、この必要性を満たすことである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明において、「含む（comprise）」の用語は、一方では、「含む（include）」、「含有する」、又は「包含する」を、他方では、「から構成される」又は「から成る」を同等に意味し得る。
【００２３】
本発明において、本発明の方法に従って得られた代用真皮は、生体内の真皮の特徴を再現する完全な組織であり、すなわち、タンパク質型の高分子、特にコラーゲン線維、グリコサミノグリカン線維、タンパク質、及び機能性線維芽細胞を含む。
【００２４】
本発明において、本発明の方法に従って得られた代用皮膚は、生体内の皮膚の特徴を再現する完全な組織であり、すなわち、組織学的に正常である基底層、有棘層、顆粒層、及び角質層を再現する角化細胞、並びに基底メラニン形成細胞を含み、機能性線維芽細胞を含有する代用真皮と機能性基底層を介して接触している角化多重層表皮（keratinized pluristratified epithelium）を含む。
【００２５】
有利には、本発明に従う方法により、代用物の細胞によって分泌されるタンパク質混合物から特に成り、それによって、生体内の皮膚の特徴を再現する真皮−表皮接合部を形成する基底層を含む代用皮膚を得ることができる。
【００２６】
本発明では、本発明の方法で用いることができる線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び角化細胞は、当業者に公知のあらゆる線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び角化細胞であってよい。それらは、例えば、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、２５  ｒｕｅ  ｄｕ
Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、Ｆ−７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５のＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇ
ａｎｉｓｍｅ［フランス国立微生物カルチャーコレクション］（ＣＮＣＭ）由来のものを例とする細胞バンクから入手した線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び／又は角化細胞であってよい。それらはまた、市販の線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び／又は角化細胞であってもよく、例えば、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ＣｅｌｌｎＴｅｃ社、又はＰｒｏｍｏｃｅｌｌ社から販売されている細胞である。それらはまた、動物、好ましくは、哺乳類から、及び／又はヒトから予め単離された生物サンプルから単離された線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び／又は角化細胞であってもよい。線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び／又は角化細胞は、１つの生検組織又は複数の生検組織から独立して単離された線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び／又は角化細胞であってよい。線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び／又は角化細胞は、前記患者への前記代用皮膚の移植片の目的で、個体、好ましくは、哺乳類及び／又はヒトからの１つの生検組織又は複数の生検組織から独立して単離されてよい。それらは、独立して、個体に対して自家性又は異種性である線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び／又は角化細胞であってよい。
【００２７】
本発明において、有利には、線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び角化細胞で表される３つの細胞型のうちの少なくとも２つの細胞型が、個体に対して自家性である。
【００２８】
１つの特定の実施形態では、線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び角化細胞が、有利には、個体に対して自家性の細胞である。
【００２９】
線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び／又は角化細胞は、例えば、コーカサス人種、アジア人種、若しくはアフリカ人種の皮膚由来、様々な解剖学的部位、例えばヒトの背中、顔、胸部、手の甲、手のひら由来の１つの生検組織又は複数の生検組織から独立して単離されてよい。
【００３０】
それらは、独立して、加齢シミ（日光黒子（actinic lentigo））、肝斑、白斑、母斑、又はメラノーマを例とする１若しくは複数の皮膚病態を有する好ましくはヒトからの皮膚生検組織から独立して単離された線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び／又は角化細胞であってよい。
【００３１】
それらはまた、例えば、レトロウィルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）によって独立して遺伝子改変された線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び／又は角化細胞であってもよい。それらは、例えば、独立して、少なくとも１つのタンパク質、例えば、ＶＩＩ型コラーゲン、ケラチン５、１４、カタラーゼ、及びＳＩＲＴ６から選択されるタンパク質を過剰発現し、並びに／又は少なくとも１つのタンパク質、例えば、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）若しくは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）技術を介して、例えば、ＶＩＩ型コラーゲン、ＨＩＦ１、又はＣＣＮ３を過小発現する線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び／又は角化細胞であってよい。それらは、例えば、Pendaries V et al., JID 2012［１］；Petek LM et al. Mol ther 2010［２］に記載のように独立して遺伝子改変された線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び／又は角化細胞であってよい。それらは、例えば、独立して遺伝子改変されていても、又はされていなくてもよい線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び／又は角化細胞であってよく、例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−４０４８の参照番号で識別されるＫｅｒ−ＣＴ細胞、又はＡＴＣＣ  ＣＲＬ−４００５の参照番号で識別されるＴｅｌＣＯＦＳ０２ＭＡ細胞である。
【００３２】
それらはまた、ＨａＣａＴ角化細胞株又はＷＳ１線維芽細胞株を例とする細胞株由来の線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び／又は角化細胞であってよい。
【００３３】
好ましくは、用いることができる線維芽細胞は、照射処理３Ｔ３線維芽細胞を含まない。
【００３４】
それらはまた、成体幹細胞から、例えば前記成体幹細胞を維持することによって誘導された多能性幹細胞から、並びに／又は例えばＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ４、若しくはｃ−Ｍｙｃ遺伝子の導入、及び続いてのレチノイン酸及び／若しくはＢＭＰ−４を例とする因子カクテルによる細胞株への分化を介して誘導された多能性幹細胞から独立して得られた線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び／又は角化細胞であってもよい。それらはまた、アルギニン末端ポリアミドアミンナノ粒子を例とするナノ粒子の使用に基づく非ウィルス技術によって誘導された成体幹細胞及び／又は多能性幹細胞であってもよい。当業者であれば、自身の一般的知識により、方法及び／又は細胞を選択することができる。それらは、例えば、Kogut et al. Methods Mol Biol 2014［３］、Ohta et al., Methods Mol
Biol, 2013［４］、及び／又はRevilla et al., J Tissue Eng Regen Med, 2015［５］に記載される方法によって得られた線維芽細胞、メラニン形成細胞、及び／又は角化細胞であってよい。
【００３５】
本発明において、「線維芽細胞培地Ｍ１」の用語は、線維芽細胞の培養に適する当業者に公知のいかなる培地をも意味することを意図している。それは、例えば、市販の培地であってよく、例えば、アミノ酸、ビタミン、無機塩、及び糖（例えば、グルコース、の混合物を特に含むＧｉｂｃｏ社から販売されているダルベッコ改変イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）、又はＣｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社から販売されているＦｉｂｒｏｌｉｆｅ培地であってよい。
【００３６】
【表１−１】
0006729880.tif 000002
【表１−２】
0006729880.tif 000003
【００３７】
本発明において、培地Ｍ１は、添加剤、特に、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）も含んでよい。
【００３８】
本発明において、培地Ｍ１は、例えば、培地の総重量に対して、５重量％から１５重量％、７．５から１２．５重量％、１０重量％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含んでよい。
【００３９】
本発明において、培地Ｍ１は、少なくとも１つの抗真菌性化合物及び／又は抗菌性化合物を含んでよい。これは、例えば、当業者に公知の、及び／又は市販されているいかなる抗真菌性化合物及び／又は抗菌性化合物であってもよい。それは、例えば、アンホテリシンＢ、ケトコナゾール、及びこれらの混合物を含む群より選択される少なくとも１つの抗真菌性化合物であってよい。それは、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、シプロフロキサシン、及びこれらの混合物を含む群より選択される少なくとも１つの抗菌性化合物であってよい。
【００４０】
本発明において、培地Ｍ１は、培地の総重量に対して、０．１重量％から１０重量％、０．５重量％から５重量％、１重量％の抗真菌剤を含んでよい。
【００４１】
本発明において、培地Ｍ１は、培地の総重量に対して、０．１重量％から１０重量％、０．５重量％から５重量％、１重量％の抗生物質を含んでよい。
【００４２】
本発明において、培地Ｍ１及び／又はその構成成分のすべては、臨床グレードのものであってよい。
【００４３】
「臨床グレード」の用語は、本発明において、構成成分又は培地が、ある分野における臨床的な使用に適するとして該当機関から認可されたものであることを意味する。有利には、本発明において、培地が臨床グレードである場合、それは、ウシ脳下垂体抽出物を含まない。
【００４４】
本発明において、線維芽細胞培養工程ａは、３０から４０℃、３５から３９℃を含む、又は３７℃に等しい温度で行われてよい。
【００４５】
本発明において、工程ａの線維芽細胞培養時間は、５から２１日間、５から１５日間、又は８から１５日間を含んでよい。
【００４６】
本発明において、工程ａの線維芽細胞培養時間は、５％から１０％のＣＯ２を含む制御雰囲気下、例えば、少なくとも５％のＣＯ２を含む雰囲気下で行われてよい。
【００４７】
本発明によると、線維芽細胞培養工程ａは、３０から４０℃、３２から４０℃、又は３７℃に等しい温度、及び少なくとも５％のＣＯ２を含む制御雰囲気下のインキュベーター中で行われてよい。
【００４８】
本発明によると、線維芽細胞培養工程ａは、当業者に公知である適切ないかなる培養容器中で行われてもよい。それは、ペトリ皿、又は容量が２５から７５ｃｍ２、２５、７５、若しくは１７５ｃｍ２である培養フラスコであってもよい。
【００４９】
本発明によると、工程ａに従う培養によって得られた線維芽細胞は、培養容器中、コンフルエントである細胞の層を形成してよい。例えば、線維芽細胞は、７０％から１００％コンフルエントであってよく、好ましくは、１００％コンフルエントである。
【００５０】
本発明によると、工程ａに従う培養が、所望に応じてコンフルエントであってもよい細胞の層に相当する場合、方法はさらに：
−  培地を除去し、細胞を溶液でリンスし、リンス溶液を除去する工程ａ’、
−  トリプシン処理によって細胞を剥離する工程ａ’’、及び
−  沈澱又は遠心分離を行う工程ａ’’’、
も含んでよい。
【００５１】
本発明によると、工程ａ’において、培地の除去は、当業者に公知である適切ないかなる方法で行われてもよい。それは、例えば、培地を吸引すること、又は培地を除去するために容器を逆さまにすることであってもよい。
【００５２】
本発明によると、工程ａ’において、細胞のリンスは、当業者に公知である適切ないかなる方法で行われてもよく、例えば、リンス溶液中での細胞の浸漬、散布、又はインキュベーションによる。
【００５３】
本発明において、「リンス溶液」の用語は、当業者に公知である細胞をリンスするためのいかなる溶液をも意味することを意図している。それは、例えば、７．２から７．４を含むｐＨのＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩溶液）緩衝溶液であってよい。
【００５４】
【表２】
0006729880.tif 000004
【００５５】
それは、市販の緩衝溶液であってもよく、例えば、それぞれ、Ｇｉｂｃｏ社、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社、又はＬｏｎｚａ社から販売されているリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）又はハンクス平衡溶液であってもよい。
【００５６】
本発明によると、工程ａ’において、リンス溶液の除去は、当業者に公知である適切ないかなる方法で行われてもよい。それは、例えば、リンス溶液を吸引すること、又はリンス溶液を除去するために容器を逆さまにすることであってもよい。
【００５７】
本発明によると、トリプシン処理工程ａ’’は、トリプシンを含む緩衝溶液（ＢＳ）に細胞を浸漬し、続いて、酵素反応を停止するために、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加することによって行われてよい。
【００５８】
本発明によると、緩衝溶液（ＢＳ）は、トリプシン処理法に用いることができる当業者に公知であるいかなる緩衝溶液であってもよい。それは、例えば、それぞれＧｉｂｃｏ社、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社、又はＬｏｎｚａ社から販売されているリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）又はハンクス平衡溶液であってもよい。
【００５９】
本発明によると、緩衝溶液（ＢＳ）に添加されるトリプシンの量は、総重量に対して０．０１重量％から０．０５重量％であってよい。
【００６０】
本発明によると、緩衝溶液（ＢＳ）にＦＣＳを添加する前のトリプシンを含む緩衝溶液中でのインキュベーション時間は、２から１０分間であってよい。
【００６１】
本発明によると、緩衝溶液（ＢＳ）に添加されるＦＣＳの量は、総体積に対して５体積％から２０体積％を含んでよい。
【００６２】
本発明によると、沈澱工程ａ’’’は、当業者に公知であるいかなる方法で行われても
よい。それは、例えば、沈降、又は８００から１４００回転毎分、例えば１２００回転毎分に等しい速度での遠心分離であってよい。
【００６３】
本発明によると、遠心分離工程ａ’’’は、４から１０分間、例えば５分間に等しい時間にわたって行われてよい。
【００６４】
本発明によると、沈澱工程ａ’’’は、当業者に公知であるいかなる装置で行われてもよい。それは、例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社又はＪｏｕａｎ社から販売されている回転式遠心分離機であってもよい。
【００６５】
本発明において、「コラーゲンを含むマトリクス」の用語は、細胞を播種することができる当業者に公知であるコラーゲンを含むいずれのマトリクスをも意味することを意図している。それは、例えば、Bell et al., 1979［６］に記載されるように、好ましくは線維芽細胞のいかなる優先的な組織化も起こさない、弛緩状態の（non-taut）Ｉ型コラーゲンゲルに相当するコラーゲンのマトリクスであってよい。それは、例えば、２５から５００ｃｍ２の表面積であるＩ型コラーゲンが好ましいコラーゲンの密度／濃度を有するマトリクスであってよい。それは、例えば、市販のコラーゲンを含むマトリクスであってよく、例えば、それは、Ｉｎｔｅｇｒａ社から販売されているコラーゲンを含むマトリクスであってもよい。
【００６６】
有利には、コラーゲンを含むマトリクスは、真皮再生マトリクス（dermal regeneration matrix）であってよい。真皮再生マトリクスは、特に、それぞれＩｎｔｅｇｒａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社及びＭｅｄＳｋｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｄｒ．  Ｓｕｗｅｌａｃｋ  ＡＧ社からＩｎｔｅｇｒａ（登録商標）及びＭａｔｒｉｄｅｒｍ（登録商標）の商品名で販売されているマトリックスから選択されてよい。有利には、及びコラーゲンを含む他のマトリックスとは対照的に、上記で述べたものなどの真皮再生マトリクスは、既にモデル化されており、それによって、皮膚同等物の構築が促進される。
【００６７】
１つの実施形態では、コラーゲンを含むマトリクスは、架橋されたコラーゲン、及び少なくとも１つのグリコサミノグリカン、例えばコンドロイチン−６−硫酸を含むマトリクスであってよい。それは、例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社から販売されているＩｎｔｅｇｒａマトリクス（登録商標）及び／又はBoyce ST et al., 1988［７］の文書に記載される方法に従って得られたマトリクスであってもよい。
【００６８】
別の実施形態では、コラーゲンを含むマトリクスは、未変性構造コラーゲン及びエラスチンの線維を含むマトリクスであってもよい。「未変性構造コラーゲンの線維」の用語は、特に、化学的に架橋されていない線維を意味することを意図している。マトリクスは、例えば、ＭｅｄＳｋｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｄｒ．  Ｓｕｗｅｌａｃｋ  ＡＧ社から販売されているＭａｔｒｉｄｅｒｍマトリクス、及び／又はHafemann et al., Burns 1999［８］の文書に記載の方法に従って得られたマトリクスであってもよい。
【００６９】
本発明において、コラーゲンを含むマトリクスの厚さは、線維芽細胞を播種する前は、１．０から３．０ｍｍ（両端値を含む）であってよい。１つの特定の実施形態では、コラーゲンを含むマトリクスの厚さは、線維芽細胞を播種する前は、厳密に１．０ｍｍ超であってよい。
【００７０】
本発明において、工程ｂの播種は、当業者に公知であるいかなる方法で行われてもよい。それは、例えば、線維芽細胞を含む培地のマトリクス上への散布による、マトリクス上で細胞をサブ培養することによる堆積による、細胞を懸濁状態で含む培地の注ぎ入れによ
る、又は例えばWonhye Lee et al. “Multi-layered culture of human skin fibroblasts and keratinocytes through three-dimensional freeform fabrication.” Biomaterials, 2009, March; 30(8):1587-95［７］に記載のような３Ｄプリンティングによる適用であってもよい。
【００７１】
本発明において、工程ａが、工程ａ’’を含む場合、本発明の方法は、播種工程ｂの前に、遠心分離した細胞の培地Ｍ１中での再懸濁の工程ｂ１を含んでよい。
【００７２】
本発明において、コラーゲンを含むマトリクスの工程ｂの播種は、コラーゲンを含むマトリクスの表面積に対して、２００００から５００００線維芽細胞／ｃｍ２、好ましくは、３００００線維芽細胞／ｃｍ２の密度で行われてよい。１つの特定の実施形態では、線維芽細胞密度は、コラーゲンを含むマトリクスに対して、厳密に５００００線維芽細胞／ｃｍ２未満であってよい。
【００７３】
本発明において、線維芽細胞培地Ｍ２は、線維芽細胞の培養に適する当業者に公知であるいかなる培地であってもよい。それは、例えば、市販の培地であってもよく、例えば、アミノ酸、ビタミン、無機塩、糖、例えばグルコースの混合物を特に含むダルベッコ改変イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）であってもよい。
【００７４】
本発明において、培地Ｍ１はまた、添加剤、特に、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含んでもよい。
【００７５】
本発明において、培地Ｍ２は、培地の総重量に対して、５から１５重量％、７．５重量％から１２．５重量％、又は１０重量％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含んでもよい。
【００７６】
本発明において、培地Ｍ２は、少なくとも１つの抗真菌性化合物及び／又は抗菌性化合物を含んでよい。それは、例えば、当業者に公知である及び／又は市販されているいかなる抗真菌性化合物及び／又は抗菌性化合物であってもよい。それは、例えば、アンホテリシンＢ、ケトコナゾール、又はこれらの混合物を含む群より選択される少なくとも１つの抗真菌性化合物であってもよい。それは、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、シプロフロキサシン、及びこれらの混合物を含む群より選択される少なくとも１つの抗菌性化合物であってもよい。
【００７７】
本発明において、培地Ｍ２は、培地の総重量に対して、０．１重量％から１０重量％、０．５重量％から５重量％、又は１重量％の抗真菌剤を含んでよい。
【００７８】
本発明において、培地Ｍ２は、培地の総重量に対して、０．１重量％から１０重量％、０．５重量％から５重量％、又は１重量％に等しい量の抗生物質を含んでよい。
【００７９】
本発明において、培地Ｍ２はまた、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩又はそれらの誘導体を含んでもよい。例えば、培地Ｍ２は、２０から６０ｍｇ・ｍＬ−１、例えば、３０から５５ｍｇ・ｍＬ−１、又は５０ｍｇ・ｍＬ−１に等しい濃度で、アスコルビン酸又はアスコルビン酸塩を含んでよい。
【００８０】
本発明において、「誘導体」の用語は、当業者に公知であるカルボン酸又はカルボキシレートのいかなる誘導体も示す。例えば、この用語は、対応する酸のエステル又は無水物などの誘導体を含み得る。
【００８１】
有利には、アスコルビン酸により、特に、線維芽細胞によるコラーゲン合成を刺激することによって、コラーゲンを含むマトリクスのリモデリングを促進することが可能となる
。
【００８２】
本発明において、培地Ｍ２及び／又はその構成成分のすべては、臨床グレードのものであってよい。
【００８３】
本発明において、線維芽細胞培養工程ｃは、３０から４０℃、３５から３９℃を含む、又は３７℃に等しい温度で行われてよい。
【００８４】
本発明において、工程ｃの線維芽細胞培養時間は、５から１２日間、又は７から１０日間であってよい。
【００８５】
本発明において、線維芽細胞培養工程ｃは、少なくとも５％のＣＯ２を含む制御雰囲気下で行われてよい。
【００８６】
本発明において、コラーゲンを含むマトリクスに播種された線維芽細胞の培養工程ｃは：
−  アスコルビン酸及びアスコルビン酸塩を含まない線維芽細胞培地Ｍ２１の存在下、１８から２８日間にわたる第一の培養工程ｃ’、及び
−  アスコルビン酸、アスコルビン酸塩又はそれらの誘導体を含む線維芽細胞培地Ｍ２２の存在下、少なくとも２日間にわたる第二の培養工程ｃ’’
を含んでよい。
【００８７】
この実施形態において、線維芽細胞培地Ｍ２１は、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩及びそれらの誘導体を含まない上記で定める通りの培地Ｍ２に相当する。本発明において、培地Ｍ２１及び／又はその構成成分のすべては、臨床グレードのものであってよい。
【００８８】
この実施形態において、線維芽細胞培地Ｍ２２は、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩又はそれらの誘導体を含む上記で定める通りの培地Ｍ２に相当する。本発明において、培地Ｍ２２及び／又はその構成成分のすべては、臨床グレードのものであってよい。
【００８９】
本発明において、培養工程ｃ’は、３０から４５℃、３５から３９℃を含む、又は３７℃に等しい温度で行われてよい。
【００９０】
本発明において、工程ｃ’の培養時間は、１９から２７時間、例えば２４時間であってよい。
【００９１】
本発明において、培養工程ｃ’’は、３０から４０℃、３５から３９℃を含む、又は３７℃に等しい温度で行われてよい。
【００９２】
本発明において、工程ｃ’’の培養時間は、５から１２日間、又は７日間に等しくてよい。
【００９３】
本発明者らはまた、有利には、工程ｃで得られたマトリクス及び培養線維芽細胞が、代用真皮に相当する構造を形成することも実証した。
【００９４】
有利には、本発明者らはまた、培養工程ｃ’が、接着及び線維芽細胞によるマトリクスのコロニー形成の工程に相当し、工程ｃ’’が、有利には、代用真皮を形成するための線維芽細胞を含むマトリクスのリモデリングを可能とすることも実証した。特に、それぞれ培地Ｍ２１及びＭ２２を用いることによる連続する工程ｃ’及びｃ’’により、有利には、線維芽細胞が増殖せず、コラーゲンを含むマトリクスにコロニー形成する代用真皮の形
成が可能となり、同時に、有利には、線維芽細胞自体によるコラーゲン産生も可能となり、したがって、真皮のリモデリングが可能となる。
【００９５】
言い換えると、工程ｃ後に得られた製品は、有利には、代用真皮として用いることができる。特に、この製品は、線維芽細胞が誘導され得る真皮のすべての物理化学的特性を含む。
【００９６】
本発明によると、メラニン形成細胞培養工程ｄは、当業者に公知である適切ないかなる培養容器中で行われてもよい。それは、ペトリ皿、又は容量が２５から７５ｃｍ２、２５、７５、若しくは１７５ｃｍ２である培養フラスコであってもよい。
【００９７】
本発明において、メラニン形成細胞培地Ｍ３は、メラニン形成細胞の培養に適する当業者に公知であるいかなる培地であってもよい。それは、例えば、市販の培地であってよく、例えば、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社から「Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｍ２」の参照名で販売されている市販の培地、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社から販売されている「ＭＢＭ」、以下の表３に示されるように、アミノ酸、ビタミン、無機塩、糖、例えばグルコースの混合物を特に含むＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から販売されているＭＣＤＢ１５３培地であってよい。
【００９８】
【表３−１】
0006729880.tif 000005
【表３−２】
0006729880.tif 000006
【００９９】
それはまた、改変された市販の培地であってもよく、例えば、チロシン、メチオニン、又はこれらの混合物を例とするアミノ酸、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）を例とするさらなる無機塩をさらに含むＭＣＤＢ１５３培地であってもよい。
【０１００】
本発明において、培地Ｍ３はさらに、ウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ）、インスリン、ペニシリン−ストレプトマイシン（ＰＳ）、ヒドロコルチゾン、ウマ血清、ウシ血清、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＳＣＦ、又はこれらのいずれかの混合物から選択される少なくとも１つの添加剤も含んでよい。
【０１０１】
本発明において、培地Ｍ３は、培地の総重量に対して、０．１重量％から１０重量％、０．５から５重量％、又は１重量％のペニシリン−ストレプトマイシン（ＰＳ）を含んでよい。
【０１０２】
本発明において、培地Ｍ３は、１．２５から１．６０μＭ、１．４０から１．５５μＭ、又は１．４５μＭのヒドロコルチゾン濃度を含んでよい。
【０１０３】
本発明において、培地Ｍ３は、１００から１６０μｇ・ｍＬ−１、１１０から１５０μ
ｇ・ｍＬ−１、又は１４０μｇ・ｍＬ−１に等しいウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ）濃度を含んでよい。
【０１０４】
本発明において、培地Ｍ３は、１５から２５μｇ・ｍＬ−１、又は２０μｇ・ｍＬ−１に等しいインスリン濃度を含んでよい。
【０１０５】
本発明において、培地Ｍ３は、０．０１から０．２μｇ・ｍＬ−１、０．０１から０．１μｇ・ｍＬ−１、又は０．０１μｇ・ｍＬ−１に等しいＧＭ−ＣＳＦ濃度を含んでよい。
【０１０６】
本発明において、培地Ｍ３は、０．００４から０．２μｇ・ｍＬ−１、０．０１から０．１５μｇ・ｍＬ−１、又は０．０５μｇ・ｍＬ−１に等しいＳＣＦ濃度を含んでよい。
【０１０７】
本発明において、培地Ｍ３は、０．１から１０ｎｇ・ｍＬ−１、０．５から５ｎｇ・ｍＬ−１、０．８から２ｎｇ・ｍＬ−１、又は１ｎｇ・ｍＬ−１に等しいｂＦＧＦ濃度を含んでよい。
【０１０８】
本発明において、培地Ｍ３は、培地の総重量に対して、１重量％から５重量％、２重量％から４重量％、若しくは３重量％のウマ又はウシ血清を含んでよい。
【０１０９】
本発明において、培地Ｍ３及び／又はその構成成分のすべては、臨床グレードのものであってよい。
【０１１０】
本発明において、メラニン形成細胞培養工程ｄは、３０から４０℃、例えば３７℃に等しい温度を例とする周囲温度で行われてよい。
【０１１１】
本発明において、工程ｄの培養時間は、１５から２８日間であってよい。
【０１１２】
本発明において、工程ｄのメラニン形成細胞培養は、少なくとも５％のＣＯ２を含む制御雰囲気下で行われてよい。
【０１１３】
本発明によると、工程ｄに従う培養によって得られたメラニン形成細胞は、培養容器中、コンフルエントである細胞層を形成してよい。例えば、メラニン形成細胞は、５０％から１００％コンフルエントの細胞層を形成してよい。
【０１１４】
本発明によると、工程ｄに従う培養が、所望に応じてコンフルエントであってもよい細胞層に相当する場合、方法はさらに：
−  培地を除去し、細胞を溶液でリンスし、リンス溶液を除去する工程ｄ’、
−  トリプシン処理によって細胞を剥離する工程ｄ’’、及び
−  沈澱工程ｄ’’’、
も含んでよい。
【０１１５】
本発明において、工程ｄ’では、培地の除去は、当業者に公知である適切ないかなる方法で行われてもよい。それは、例えば、培地を吸引すること、又は培地を除去するために容器を逆さまにすることであってもよい。
【０１１６】
本発明において、工程ｄ’では、細胞のリンスは、当業者に公知であるいかなる方法で行われてもよく、例えば、リンス溶液中での細胞の散布又は浸漬であってもよい。
【０１１７】
本発明において、「メラニン形成細胞リンス溶液」の用語は、当業者に公知であるいか
なるメラニン形成細胞リンス溶液をも意味することを意図している。それは、例えば、上記の表２に記載の溶液を例とするＨＢＳＳ緩衝溶液、又は７．２から７．４を含むｐＨのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）であってもよい。それはまた、市販の緩衝溶液であってもよく、例えば、それぞれ、Ｇｉｂｃｏ社、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社、又はＬｏｎｚａ社から販売されているリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）又はハンクス平衡溶液であってもよい。
【０１１８】
本発明において、工程ｄ’では、リンス溶液の除去は、当業者に公知である適切ないかなる方法で行われてもよい。それは、例えば、リンス溶液を吸引すること、又はリンス溶液を除去するために容器を逆さまにすることであってもよい。
【０１１９】
本発明によると、トリプシン処理工程ｄ’’は、トリプシンを含む緩衝溶液（ＢＳ）に細胞を浸漬し、続いて、酵素反応を停止するために、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加することによって行われてよい。
【０１２０】
本発明によると、緩衝溶液（ＢＳ）は、上記で定める通りの緩衝溶液であってよい。
【０１２１】
本発明によると、緩衝溶液（ＢＳ）に添加されるトリプシンの量は、総重量に対して、０．０１重量％から０．０５重量％であってよい。
【０１２２】
本発明によると、ＦＣＳを緩衝溶液に添加する前のトリプシンインキュベーション時間は、２から５分間であってよい。
【０１２３】
本発明において、溶液（ＢＳ）に添加されるＦＣＳの量は、総体積に対して５体積％から２０体積％を含んでよい。
【０１２４】
本発明によると、沈澱工程ｄ’’’は、沈降によって、遠心分離によって、当業者に公知であるいかなる方法で行われてもよい。それは、例えば、８００から１２００回転毎分の速度での遠心分離であってもよい。
【０１２５】
本発明によると、遠心分離工程ｄ’’’は、５から１０分間にわたって行われてよい。
【０１２６】
本発明において、遠心分離工程ｄ’’’は、当業者に公知であるいかなる装置で行われてもよい。それは、例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社又はＪｏｕａｎ社から販売されている回転式遠心分離機であってもよい。
【０１２７】
本発明において、遠心分離工程ｄ’’’により、細胞を培地から分離するために、細胞を沈降させることができる。当業者であれば、一般的知識により、培地中の細胞を沈降させることができる公知のいずれかの技術を用いて遠心分離工程ｄ’’’を適合／改変させる方法を認識しているであろう。
【０１２８】
本発明によると、角化細胞培養工程ｅは、当業者に公知である適切ないかなる培養容器中で行われてもよい。それは、ペトリ皿、又は容量が２５から７５ｃｍ２、２５、７５、若しくは１２５ｃｍ２である培養フラスコであってもよい。
【０１２９】
本発明において、角化細胞培地Ｍ４は、角化細胞の培養に適する当業者に公知であるいかなる培地であってもよい。それは、例えば、市販の培地であってよく、例えば、Ｌｉｆｅ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から販売されているＫＳＦＭ培地、Ｌｏｎｚａ社若しくはＰｒｏｖｉｔｒｏ社から販売されているＫＧＭ、アミノ酸、ビタミン、無機塩、糖、例えばグルコースの混合物を特に含むＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から販売されているＭＣＤ
Ｂ１５３培地であってよい。それはまた、改変された市販の培地であってもよく、例えば、０．１００から０．１１０Ｍ／ｌ、例えば０．１０４Ｍ／ｌの塩化ナトリウム濃度、２から３×１０−２Ｍ／ｌ、例えば２．２９×１０−２Ｍ／ｌのＨｅｐｅｓ濃度、１．１０×１０−２Ｍ／ｌから１．２５×１０−２Ｍ／ｌ、例えば１．１９×１０−２Ｍ／ｌの炭酸水素ナトリウム濃度を含み、並びに未改変ＭＣＤＢ１５３培地の濃度の２倍であるアルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、及びコリンの濃度を含むＭＣＤＢ１５３培地であってもよい。
【０１３０】
本発明において、培地Ｍ４は、増殖因子、例えば上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ）、インスリン、ペニシリン−ストレプトマイシン（ＰＳ）、ヒドロコルチゾン、又はこれらのいずれかの混合物から選択される添加剤も含んでよい。有利には、培地Ｍ４は、臨床グレードの添加剤を含んでよい。それらは、例えば、増殖因子、例えば上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン、ペニシリン−ストレプトマイシン（ＰＳ）、ヒドロコルチゾン、又はこれらのいずれかの混合物から選択される添加剤であってよい。
【０１３１】
本発明において、培地Ｍ４は、例えば、培地の総重量に対して、０．５重量％から５重量％、０．７５から３重量％、又は１重量％のペニシリン−ストレプトマイシン（ＰＳ）を含んでよい。
【０１３２】
本発明において、培地Ｍ４は、１．２５から１．６０μＭ、１．４０から１．５５μＭ、又は１．４５μＭのヒドロコルチゾン濃度を含んでよい。
【０１３３】
本発明において、培地Ｍ４は、５０から９０μｇ・ｍＬ−１、６０から８０μｇ・ｍＬ−１、又は７０μｇ・ｍＬ−１のウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ）濃度を含んでよい。
【０１３４】
本発明において、培地Ｍ４は、３から８μｇ・ｍＬ−１、例えば５μｇ・ｍＬ−１に等しいインスリン濃度を含んでよい。
【０１３５】
本発明において、培地Ｍ４は、５から１５ｎｇ・ｍＬ−１、６．５から１３ｎｇ・ｍＬ−１、又は１０ｎｇ・ｍＬ−１に等しい上皮増殖因子（ＥＧＦ）濃度を含んでよい。
【０１３６】
本発明において、培地Ｍ４及び／又はその構成成分のすべては、臨床グレードのものであってよい。
【０１３７】
本発明において、角化細胞培養工程ｅは、２５から３９℃、例えば３７℃に等しい温度で行われてよい。
【０１３８】
本発明において、工程ｅの培養時間は、１５から２８日間を含んでよい。
【０１３９】
本発明において、工程ｅの角化細胞培養は、少なくとも５％のＣＯ２を含む制御雰囲気下で行われてよい。
【０１４０】
本発明によると、工程ｅに従う培養によって得られた角化細胞は、培養容器中にて細胞の単層を形成し得る。それは、例えば、培養容器中、コンフルエントに近い、例えば、５０％から８０％コンフルエントである細胞の単層であってよい。
【０１４１】
本発明によると、工程ｅに従う培養が、コンフルエントに近い、好ましくは、５０％から８０％コンフルエントである細胞の単層に相当する場合、方法はさらに：
−  培地を除去し、細胞を溶液でリンスし、リンス溶液を除去する工程ｅ’、
−  トリプシン処理によって細胞を剥離する工程ｅ’’、及び
−  遠心分離工程ｅ’’’、
も含んでよい。
【０１４２】
本発明において、工程ｅ’では、培地の除去は、当業者に公知である適切ないかなる方法で行われてもよい。それは、例えば、培地を吸引すること、又は培地を除去するために容器を逆さまにすることであってもよい。
【０１４３】
本発明において、工程ｅ’では、細胞のリンスは、当業者に公知であるいかなる方法で行われてもよく、例えば、角化細胞リンス溶液中での細胞の浸漬、散布、又はインキュベーションによる方法であってもよい。
【０１４４】
本発明において、「角化細胞リンス溶液」の用語は、当業者に公知であるいかなる角化細胞リンス溶液をも意味することを意図している。それは、例えば、７．２から７．４を含むｐＨのＰＢＳ緩衝溶液又は例えば上記の表２に記載のようなＨＢＳＳ緩衝溶液であってよい。それはまた、市販の緩衝溶液であってもよく、例えば、それぞれ、Ｇｉｂｃｏ社、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社、又はＬｏｎｚａ社から販売されているリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）又はハンクス平衡溶液であってよい。
【０１４５】
本発明において、工程ｅ’では、角化細胞リンス溶液の除去は、当業者に公知である適切ないかなる方法で行われてもよい。それは、例えば、角化細胞リンス溶液を吸引すること、又は角化細胞リンス溶液を除去するために容器を逆さまにすることであってもよい。
【０１４６】
本発明によると、トリプシン処理工程ｅ’’は、トリプシンを含む溶液（Ｓ）に細胞を浸漬し、続いて、酵素反応を停止するために、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加することによって行われてよい。
【０１４７】
本発明によると、溶液（Ｓ）に添加されるトリプシンの量は、溶液の総重量に対して、０．０１重量％から０．０５重量％を含んでよい。
【０１４８】
本発明によると、ＦＣＳを培地に添加する前のトリプシンインキュベーション時間は、５から１０分間を含んでよい。
【０１４９】
本発明において、溶液（Ｓ）に添加されるＦＣＳの量は、溶液の総重量に対して５重量％から２０重量％を含んでよい。
【０１５０】
本発明によると、遠心分離工程ｅ’’’は、当業者に公知であるいかなる方法で行われてもよい。それは、例えば、８００から１２００回転毎分の速度での遠心分離であってもよい。
【０１５１】
本発明によると、遠心分離工程ｅ’’’は、５から１０分間にわたって行われてよい。
【０１５２】
本発明において、遠心分離工程ｅ’’’は、当業者に公知であるいかなる装置を用いて行われてもよい。それは、例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社又はＪｏｕａｎ社から販売されている回転式遠心分離機であってもよい。
【０１５３】
本発明において、工程ｄで得られたメラニン形成細胞を工程ｅで得られた角化細胞と混合する工程ｆは、当業者に公知である適切ないかなる方法で行われてもよい。それは、例えば、培地中、撹拌下での細胞の混合であってもよい。
【０１５４】
本発明において、工程ｆのメラニン形成細胞と角化細胞との混合は、１／２０から１／１５、又は１／１９に等しい数基準でのメラニン形成細胞／角化細胞比で行われてよい。
【０１５５】
有利には、本発明者らは、驚くべきことに、メラニン形成細胞と角化細胞との混合を、１／２０から１／１５、好ましくは１／１９に等しいメラニン形成細胞／角化細胞比で行った場合、得られる代用皮膚が、生体内の皮膚と同一の構造的／生物学的特性を有することを実証した。
【０１５６】
１つの好ましい実施形態では、工程ｆのメラニン形成細胞と角化細胞との混合は、１／２０から１／１５、又は１／１９に等しい数基準でのメラニン形成細胞／角化細胞比で行われ、コラーゲンを含むマトリクスは、上記で定める通りの真皮再生マトリクスである。
【０１５７】
本発明において、工程ｇの代用真皮への播種は、当業者に公知であるいかなる方法で行われてもよい。それは、例えば、工程ｆで得られたメラニン形成細胞と角化細胞との混合物を含む培地の散布による、代用真皮上で細胞をサブ培養することでの堆積による、工程ｆで得られたメラニン形成細胞と角化細胞との混合物細胞を含む培地の滴下による、又は例えばWonhye Lee et al. “Multi-layered culture of human skin fibroblasts and keratinocytes through three-dimensional freeform fabrication.” Biomaterials, 2009, Mar; 30(8):1587-95［９］に記載のような３Ｄプリンティングによる適用であってもよい。
【０１５８】
本発明において、工程ｇの代用真皮への播種は、有利には、９から１９の（角化細胞＋メラニン形成細胞）／線維芽細胞比で行われてよい。本発明者らは、実際、驚くべきことに、工程ｇの播種を９から１９の（角化細胞＋メラニン形成細胞）／線維芽細胞比で行った場合、得られる代用皮膚が、正常皮膚と同一の構造的／生物学的特性を有することを実証した。
【０１５９】
１つの好ましい実施形態では、工程ｇの代用真皮への播種は、９から１９の（角化細胞＋メラニン形成細胞）／線維芽細胞比で行われ、コラーゲンを含むマトリクスは、上記で定める通りの真皮再生マトリクスである。
【０１６０】
本発明において、「皮膚培地Ｍ５」の用語は、皮膚の培養に適する当業者に公知であるいかなる培地をも意味することを意図している。それは、例えば、市販の培地であってよく、例えば、改変グリーン培地（modified Green medium）であってよく、すなわち、２／３のダルベッコ／フォークト改変イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）；１／３のハムＦ１２培地を含み、及び１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含んでおり、これは、アミノ酸、ビタミン、無機塩、糖、例えばグルコースの混合物を特に含むＧｉｂｃｏ社から販売されている注文生産の混合物である。それはまた、改変グリーン培地、すなわち、コレラ毒素及びトリヨードチロニン（triodothyronine）を含まないグリーン培地、又は１０％のＦＣＳを含むイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）とＭＣＤＢ１５３培地との混合物、又は１０％のＦＣＳを含むＩＭＤＭ／ｄｅｒｍａｌｉｆｅ角化細胞培地であってよく、それぞれ、Ｇｉｂｃｏ社、Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社、及びＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから販売されている。
【０１６１】
本発明において、培地Ｍ５は、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩若しくはそれらの誘導体、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩若しくはそれらの誘導体、又はこれらの混合物から選択される添加剤もさらに含んでよい。
【０１６２】
本発明において、培地Ｍ５は、例えば、４０から６０ｍｇ・Ｌ−１、４５から５５ｍｇ・Ｌ−１、又は５０ｍｇ・Ｌ−１のヒアルロン酸塩又はヒアルロン酸を含んでよい。
【０１６３】
有利には、培地Ｍ５が、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩及び／又はそれらの誘導体を含む場合、それは、ウシ脳下垂体抽出物を含まない。
【０１６４】
本発明において、培地Ｍ５は、例えば、４０から６０ｍｇ・Ｌ−１、４５から５５ｍｇ・Ｌ−１、又は５０ｍｇ・Ｌ−１のアスコルビン酸又はアスコルビン酸塩を含んでよい。
【０１６５】
本発明において、皮膚培養工程ｈは、２５から４０℃を含む、例えば３７℃に等しい温度で行われてよい。
【０１６６】
本発明において、工程ｈの皮膚培養時間は、６から２１日間、例えば８から１５日間であってよい。
【０１６７】
本発明において、工程ｈの皮膚培養は、少なくとも５％のＣＯ２を含む制御雰囲気下で行われてよい。
【０１６８】
本発明によると、工程ｈの皮膚培養は、２５から４０℃を含む、例えば３７℃に等しい温度、及び少なくとも５％のＣＯ２を含む制御雰囲気下で行われてよい。
【０１６９】
本発明において、培地Ｍ５及び／又はその各構成成分は、臨床グレードのものであってよい。
【０１７０】
本発明において、工程ｈは：
−  ヒアルロン酸及びヒアルロン酸塩を、又はアスコルビン酸及びアスコルビン酸塩を含まない培地Ｍ５１の存在下、少なくとも６時間、好ましくは、６から２４時間にわたる第一の培養工程ｈ’、
−  ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩又はそれらの誘導体を含む培地Ｍ５２の存在下、０から７日間、好ましくは、少なくとも２日間にわたる第二の培養工程ｈ’’、並びに
−  ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩又はそれらの誘導体、及びアスコルビン酸、アスコルビン酸塩又はそれらの誘導体を含む培地Ｍ５３中、少なくとも２日間にわたる第三の培養工程ｈ’’’
を含んでよい。
【０１７１】
代用皮膚培地Ｍ５１は、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩及びそれらの誘導体を含まない上記で定める通りの培地Ｍ５に相当する。
【０１７２】
本発明において、培地Ｍ５１及び／又はその各構成成分は、臨床グレードのものであってよい。
【０１７３】
代用皮膚培地Ｍ５２は、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩又はそれらの誘導体を含み、同時に、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩及びそれらの誘導体を含まない上記で定める通りの培地Ｍ５に相当する。
【０１７４】
本発明において、培地Ｍ５２及び／又はその各構成成分は、臨床グレードのものであってよい。
【０１７５】
代用皮膚培地Ｍ５３は、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩又はそれらの誘導体を含み、及びアスコルビン酸、アスコルビン酸塩又はそれらの誘導体を含む上記で定める通りの培地Ｍ５に相当する。
【０１７６】
本発明において、培地Ｍ５３は、臨床グレードの培地であってよい。
【０１７７】
本発明において、培養工程ｈ’は、工程ｇで得られた播種された代用真皮を、培地Ｍ５１中に堆積されることによって行われてよい。
【０１７８】
本発明において、培養工程ｈ’は、２５から４０℃を含む、例えば３７℃に等しい温度で行われてよい。
【０１７９】
本発明において、培養工程ｈ’の継続時間は、６から２４時間、例えば８から２４時間、又は１２から１８時間であってよい。
【０１８０】
本発明において、皮膚培養工程ｈ’は、少なくとも５％のＣＯ２を含む制御雰囲気下で行われてよい。
【０１８１】
有利には、本発明者らは、工程ｈ’により、メラニン形成細胞及び角化細胞の代用真皮上での接着を促進することが可能となることを実証した。
【０１８２】
本発明において、培養工程ｈ’’は、工程ｈ’で得られた播種された代用真皮を、培地Ｍ５２中に堆積されることによって、又は工程ｈ’で得られた播種された代用真皮を、培地Ｍ５２中に浸漬若しくは液浸（submersion）することで行われてよい。
【０１８３】
本発明において、培養工程ｈ’’は、２５から４０℃を含む、例えば３７℃に等しい温度で行われてよい。
【０１８４】
本発明において、培養工程ｈ’’の継続時間は、０から７日間、好ましくは、２から７日間を含んでよい。
【０１８５】
本発明において、皮膚培養工程ｈ’’は、少なくとも５％のＣＯ２を含む制御雰囲気下で行われてよい。
【０１８６】
本発明において、培養工程ｈ’’’は、工程ｈ’’で得られた播種された代用真皮の培地Ｍ５２での堆積、工程ｈ’’で得られた播種された代用真皮の培地Ｍ５２への浸漬、又は工程ｈ’’で得られた播種された代用真皮の、前記代用物が気液界面まで前記培地中に浸漬されるか若しくは前記培地の液面からちょうど出るように浸漬される浸漬によって行われてよい。
【０１８７】
本発明において、「前記培地の液面からちょうど出る」の用語は、培地中への代用物の浸漬が、その上部を浸漬することなくその高さ全体にわたって代用物を覆うように行われることを意味することを意図している。
【０１８８】
本発明において、培養工程ｈ’’’は、２５から４０℃を含む、例えば３７℃に等しい温度で行われてよい。
【０１８９】
本発明において、培養工程ｈ’’’の継続時間は、２から７日間、好ましくは、７日間を含んでよい。
【０１９０】
本発明において、皮膚培養工程ｈ’’’は、少なくとも５％のＣＯ２を含む制御雰囲気下で行われてよい。
【０１９１】
有利には、本発明者らは、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩又はそれらの誘導体、及びア
スコルビン酸、アスコルビン酸塩又はそれらの誘導体を含む培地Ｍ５３中に、工程ｈ’’で得られた播種された代用真皮を浸漬させることにより、真皮−表皮接合部の形成を促進することが可能となり、したがって、播種された代用真皮の細胞のより良好な極性化が得られることを実証した。
【０１９２】
有利には、本発明者らはまた、工程ｈ’’で得られた播種された代用真皮を培地の気液界面まで、又は培地の液面からちょうど出るように、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩又はそれらの誘導体、及びアスコルビン酸、アスコルビン酸塩又はそれらの誘導体を含む培地Ｍ５３中に浸漬させることにより、表皮の分化が可能となり、したがって、代用皮膚又は同等物上での角質層の形成が促進されることも実証した。
【０１９３】
有利には、本発明者らはまた、工程ｈ’’で得られた播種された代用真皮を培地の気液界面まで、又は培地の液面からちょうど出るように、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩又はそれらの誘導体、及びアスコルビン酸、アスコルビン酸塩又はそれらの誘導体を含む培地Ｍ５３中に浸漬させることにより、基底層の細胞の高い増殖能、並びに生体内の皮膚で見られる勾配に類似する表皮の分化の増加に伴う増殖能の減少勾配を維持することが可能となることも実証した。
【０１９４】
有利には、本発明者らはまた、培地Ｍ５がヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩又はそれらの誘導体を含む場合、このことにより、驚くべきことに、代用皮膚又は同等物の品質を改善することが可能となることも実証した。
【０１９５】
有利には、本発明者らは、この方法により、有利には、その構成層のすべてを含む代用皮膚又は同等物を得ることが可能となることを実証した。したがって、本発明の方法に従って得られる代用皮膚は、先行技術で知られる代用皮膚とは対照的に、天然の皮膚に類似の特性を有する。
【０１９６】
有利には、本発明者らはまた、この方法により、先行技術で知られているよりも非常に大きいサイズの代用真皮及び／又は代用皮膚を得ることが可能となることも実証した。特に、この方法により、有利には、１から２５ｃｍ２、例えば、５から２５ｃｍ２の表面積を有する代用真皮及び／又は代用皮膚を得ることが可能となる。
【０１９７】
本発明者らはまた、有利には、この方法により、最小増幅能（minimum amplification capacity）が６である代用真皮若しくは同等物、及び／又は皮膚同等物若しくは代用物を得ることが可能となることも実証した。
【０１９８】
加えて、本発明者らはまた、有利には、本発明に従う方法により、その取扱い時に代用物のいかなる断裂／物理的変化をも回避することが有利には可能となる粘弾性を伴って取扱うことができる代用真皮及び／又は代用皮膚を得ることが可能となることも実証した。
【０１９９】
加えて、本発明の方法による代用真皮及び／又は代用皮膚の作製時間は、典型的には、３０日間未満であり、したがって、特に熱傷の治療における要件に適合している。
【０２００】
上記で定める通りの方法を実行することによって得ることができる代用皮膚も、本発明の主題である。
【０２０１】
有利には、本発明者らは、代用皮膚が、表皮メラニン沈着ユニット（epidermal melanization unit）を形成する基底層のレベルにメラニン形成細胞を含むことを実証した。
【０２０２】
有利には、本発明の方法によって得ることができる代用皮膚は、有利には、メラニン形
成細胞の存在によって、構成的な色素沈着を呈する。
【０２０３】
有利には、代用皮膚は、先行技術で知られるよりも非常に大きいサイズであり、それによって、特に、広範な創傷がある場合、単一の、又は先行技術と比較してより少ない数の代用皮膚の適用が可能となる。また、適用されるべき代用皮膚の数の減少により、有利には、治療コストを削減し、同時に前記治療を加速させることも可能となる。
【０２０４】
方法の工程ｃで得ることができる代用真皮も、本発明の主題である。
【０２０５】
有利には、代用真皮は、新たに形成された（neoformed）ＩＶ型コラーゲンを含んでよい。
【０２０６】
有利には、代用真皮は、線維芽細胞が分布しているＩ型コラーゲンを含む少なくとも１つのマトリクスを含む。それはまた、特にＩＶ型コラーゲンであるコラーゲン、ラミニン、又はグリコサミノグリカンなどの分子を例とするその他の細胞外マトリクス構成成分も含有してよい。
【０２０７】
有利には、代用真皮は、先行技術で知られるよりも非常に大きいサイズであり、それによって、特に、広範な創傷がある場合、単一の、又は先行技術と比較してより少ない数の代用物の適用が可能となる。また、適用されるべき代用物の数の減少により、有利には、例えば治療されるべき表面全体を覆う単一のデバイスの提供によって、治療コストを削減し、同時に治療を加速させることも可能となる。
【０２０８】
本発明者らはまた、本発明に従う代用真皮及び／又は代用皮膚を、有利には、物質の喪失を補うために用いることができること、したがって、本発明に従う代用真皮及び／又は代用皮膚を、有利には、移植片として用いることができることも実証した。
【０２０９】
しがたって、上記で定める通りの代用皮膚又は上記で定める通りの代用真皮から構成される移植片も本発明の主題である。
【０２１０】
本発明において、本発明に従う移植片は、皮膚障害及び／又は皮膚物質の喪失を治療するための手段として用いることができる。特に、本発明に従う移植片は、熱傷、外傷又は慢性創傷に伴う治癒欠陥、色素異常、血管腫、及び皮膚癌を含む群より選択される皮膚障害及び／又は皮膚物質の喪失を治療するための手段として用いることができる。
【０２１１】
したがって、本発明に従う代用皮膚又は代用真皮の移植又は植え込みを含む皮膚の病気を治療するための方法も本発明の主題である。
【０２１２】
本発明において、代用皮膚の植え込みは、当業者に公知であるいかなる方法で行われてもよい。それは、例えば、治療されるべき領域への代用物の直接適用であってよく、例えば、Pena, and al. Use of Autologous Skin Equivalents With Artificial Dermal Matrix (Integra) in Donor Site Coverage in Radial Forearm Free Flaps: Preliminary Cases J Oral and Maxillofacial Surgery, 70:10 10, 2012［１０］に記載の方法に従う。
【０２１３】
本発明において、代用皮膚の移植は、当業者に公知であるいかなる方法で行われてもよい。それは、例えば、除去されるべき皮膚／真皮の領域の特定及び除去の第一の工程、及びそれに続く、除去された状態の領域への代用物の組み込みの第二の工程を含む方法であってよい。それはまた、E. Dantzer, F. Braye Reconstructive surgery using an artificial dermis (Integra): results with 39 grafts. Br J Plast Surg, 54:8 8, 2001［１１］の文書に記載の方法であってもよい。
【０２１４】
治療方法において、「皮膚の病気」の用語は、熱傷、外傷又は慢性創傷に伴う治癒欠陥、色素異常、血管腫、及び皮膚癌を意味することを意図している。
【０２１５】
したがって、治療方法により、病変及び／又は損傷及び／又は病態皮膚を、健全な代用皮膚で置き換えることができる。
【０２１６】
治療方法は、例えば、色素性母斑、巨大色素性母斑、メラノーマ、血管腫、又はエクリン汗孔腫のアブレーション後の代用皮膚の移植を含んでよい。
【０２１７】
治療方法はまた、熱傷、及び／又は深い損傷、及び／又は慢性創傷例えば、糖尿病性創傷に、代用皮膚を植え込み及び／又は適用することも含んでよい。
【０２１８】
有利には、本発明者らは、驚くべきことに、培地Ｍ５がヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩又はそれらの誘導体を含む本発明の方法に従って代用皮膚又は同等物が得られた場合における、特に皮膚障害の治療の過程での組織修復の加速を実証した。
【０２１９】
また、線維芽細胞培地Ｍ１、コラーゲンを含むマトリクス、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩又はそれらの誘導体を含むマトリクス中の線維芽細胞の培養のための培地Ｍ２、メラニン形成細胞培地Ｍ３、角化細胞培地Ｍ４、及び皮膚培地Ｍ５を含む、本発明に従う方法を実行するためのキットも本発明の主題である。
【０２２０】
また、線維芽細胞培地Ｍ１、コラーゲンを含むマトリクス、コラーゲンを含むマトリクス中の線維芽細胞の培養のための培地Ｍ２１、Ｍ２２、メラニン形成細胞培地Ｍ３、角化細胞培地Ｍ４、皮膚培地Ｍ５１、及び／又は皮膚培地Ｍ５２、及び／又は皮膚培地Ｍ５３を含む、本発明に従う方法を実行するためのキットも本発明の主題である。
【０２２１】
培地Ｍ１、Ｍ２、Ｍ２１、Ｍ２２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ５１、Ｍ５２、及びＭ５３は、上記で定める通りである。
【０２２２】
−  個体の健常領域から皮膚サンプルを採取する工程
−  線維芽細胞、角化細胞、及び採取したサンプルからの線維芽細胞を用いて、本発明に従って代用皮膚を作製する工程、及び
−  得られた代用物を個体に移植する工程
を含む皮膚移植法も本発明の主題である。
【０２２３】
その他の利点は、当業者であれば、説明のために与えられ、添付の図面によって示される以下の例を読むことで、さらに明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２２４】
【図１】図１は、代用皮膚／同等物を得るための工程の図を示す。
【図２】図２は、皮膚（図２Ａ）、及び播種する細胞の比を変化させて本発明の方法に従って得られた代用皮膚（図２Ｂ及び２Ｃ）の光学顕微鏡写真を示す。
【図３】図３Ａは、工程ｃで得られた代用真皮の、線維芽細胞を染色した後の光学顕微鏡による写真である。図３Ｂは、小サイズ、すなわち０．５ｃｍ２の得られた代用皮膚の写真である。図３Ｃは、中サイズ、すなわち２５ｃｍ２の得られた代用皮膚の写真である。
【図４】図４は、コラーゲンを含むマトリクスの移植後の（Ａ列）、又は工程ｃで得られた代用真皮の移植後の（Ｂ列）写真を示し、移植の日（１段目）、移植の１４日後（２段目）、又は移植の２４日後（３段目）である。
【図５】図５は、移植の２４時間後、ヘマトキシリン・エオシン染色後の移植片から採取したサンプルの光学顕微鏡写真を示す。
【図６】図６は（図６ＡからＤ）、１３．３の（角化細胞＋メラニン形成細胞）／線維芽細胞播種細胞比による方法に従って得られた皮膚同等物の光学顕微鏡写真（図６Ａ及びＢ）；基底位置（basal position）のメラニン形成細胞の免疫組織化学的標識（図６Ｃ、明色領域）、並びにＩＶ型コラーゲン（図６Ｄ（２））及びｐ６３増殖マーカー（図６Ｄ（１））を標識した基底層の生成を示す。図６Ｅ及び６Ｆは、基底位置のメラニン形成細胞の免疫組織化学的標識後（図６Ｅ、明色領域）、ＩＶ型コラーゲンの標識後（図６Ｆ（２））、及びｐ６３増殖マーカーの標識後（図６Ｆ（１））の皮膚の光学顕微鏡写真を示す。
【実施例】
【０２２５】
例１：代用皮膚の作製の例
本例において、用いた細胞は、過去に患者に対して行った乳房形成術から採取した皮膚生検組織から得た。
【０２２６】
生検組織の採取は、形成外科医が行い、生検組織は、生理食塩水を含有する滅菌チューブに入れた。
【０２２７】
細胞は、以下のようにして生検組織から単離した。
【０２２８】
１．表皮細胞単離
ａ．生検組織を滅菌ＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩溶液）でリンスする。
ｂ．生物学技術者が外科用メスを用いて脂肪組織を除去する。
ｃ．３７℃まで予備加熱したトリプシン−ＥＤＴＡと共に、３から２４時間インキュベートする。
ｄ．照射処理ＦＣＳ（トリプシン阻害剤）で中和する。
ｅ．表皮を除去し、高増殖（ｐ６３陽性）細胞が見られる基底層を外科用メスでこすり取る。
ｆ．ろ過、１２００回転毎分での遠心分離、並びに、以下の表４に示す化合物を含むが、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、及び塩化コリンの濃度を２倍とし、ＮａＣｌ濃度を０．１０４Ｍ／ｌに低下させ、Ｈｅｐｅｓを２．２９×１０−２Ｍ／ｌに低下させ、及びＮａＨＣＯ３を１．１９×１０−２Ｍ／ｌに低下させ、培地のｐＨを７．４に調節し、及び角化細胞のための抗生物質（ペニシリン及びストレプトマイシン１％）を含む改変＊ＭＣＤＢ１５３培地中への１ｃｍ２あたり１０００００細胞でのペレットの播種を行う。
【０２２９】
メラニン形成細胞については、ろ過、１２００回転毎分での遠心分離、並びに、以下の表４に示す化合物を含み、さらに５．８８ｇの炭酸水素ナトリウム／５ｌ、０．２７２ｇのチロシン／５ｌ、及び０．１５７ｇのＬ−メチオニン／５ｌを含み、培地のｐＨを７．４に調節した改変＊ＭＣＤＢ１５３培地中への１ｃｍ２あたり１０００００細胞でのペレットの播種を行う。
【０２３０】
【表４−１】
0006729880.tif 000007
【表４−２】
0006729880.tif 000008
【０２３１】
ｇ．３日ごとに培地を交換しながら、３７℃、５％  ＣＯ２で１週間インキュベートする。
ｈ．およそ１週間後、差別的トリプシン処理（differential trypsinization）＝０．０２５％  トリプシン及び０．０．１Ｍ  ＥＤＴＡでのトリプシン処理（メラニン形成細胞を剥離するために１〜２分間、角化細胞を剥離するために１０分間）を行う。メラニン形成細胞が先に剥離するために、培養物を精製することができる。
照射処理ＦＣＳでの中和、１２００回転毎分での遠心分離、及び同じ媒体での増幅のためのペレットの播種を行う。
ｉ．３日ごとに培地を交換しながら、３７℃、５％  ＣＯ２で１週間インキュベートする。
【０２３２】
２．線維芽細胞の単離
ａ．真皮部分をＨＢＳＳでリンスする。
ｂ．１％  コラゲナーゼと共に、３７℃で、真皮の種類に応じて最大３時間にわたって真皮をインキュベートする。
ｃ．照射処理ＦＣＳで中和する。
ｄ．４０μｍの細胞ふるいでのろ過、ＧＲ  ２０２２遠心分離機による１２００回転毎
分での５分間の遠心分離、並びに１０％  照射処理ＦＣＳ、及び１％でペニシリン及びストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中への２４時間の１ｃｍ２あたり１０００００細胞でのペレットの播種を行う。
ｅ．Ｊｏｕａｎ  ＩＧ  １５０インキュベーター中、３日ごとに培地を交換しながら、３７℃、５％  ＣＯ２で１週間インキュベートする。
【０２３３】
３．代用皮膚の作製
ａ．０．０２５％  トリプシン及び０．０．１Ｍ  ＥＤＴＡで１０分間線維芽細胞をトリプシン処理し、続いて照射処理ＦＣＳで中和し、ＧＲ  ２０２２遠心分離機により１２００回転毎分で５分間遠心分離し、予めハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で３回リンスした滅菌コラーゲン由来の真皮マトリクス、すなわち、Ｉｎｔｅｇｒａ  ｍａｔｒｉｘ（登録商標）上の１０％  ＦＣＳを含むＤＭＥＭに、注文生産のステンレス鋼インキュベーターチャンバー中、１ｃｍ２あたり３００００線維芽細胞の割合で播種する。
ｂ．３７℃、５％  ＣＯ２での２４時間の培養後、インキュベーションチャンバーをマトリクスから取り除いた。
ｃ．播種したマトリクスを、１０％の照射処理ＦＣＳ、並びに１％でペニシリン及びストレプトマイシン、並びに５０ｍｇ／ｍＬ  アスコルビン酸を含むＤＭＥＭ中、３日ごとに培地を交換しながら、３７℃、５％  ＣＯ２で１週間インキュベートした。
ｄ．角化細胞及びメラニン形成細胞のトリプシン処理を、０．０２５％  トリプシン及び０．０．１Ｍ  ＥＤＴＡで、メラニン形成細胞培養皿からのメラニン形成細胞の剥離のために１から２分間、角化細胞培養皿からの角化細胞の剥離のために１０分間行う。照射処理ＦＣＳでの中和、及び遠心分離、及びインキュベーションチャンバー中での、１９角化細胞あたり１メラニン形成細胞を含有する混合物の１ｃｍ２あたり４０００００細胞での播種を行う。
ｅ．２４時間接着させる。
ｆ．改変グリーン培地：５０ｍｇ／ｍｌでヒアルロン酸を含むＤＭＥＭ／ハムＦ１２／１０％  ＦＣＳで７日間液浸させる。
ｇ．改変グリーン培地：１０％  ＦＣＳ、５０ｍｇ／ｍｌでのヒアルロン酸及び５０ｍｇ／ｍｌ  アスコルビン酸、並びに抗生物質、すなわち１％  ペニシリン−ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／ハムＦ１２で７日間界面培養する。
【０２３４】
図１は、代用皮膚を得るための工程の図を示す。
【０２３５】
本例において、得られた２つの代用皮膚は、１３．３の（角化細胞＋メラニン形成細胞）／線維芽細胞比を有していた。１３．３の比の場合、線維芽細胞、及び角化細胞／メラニン形成細胞混合物の堆積工程の過程において、播種した細胞の量は、それぞれ、線維芽細胞は１５０００、メラニン形成細胞は１００００、角化細胞は１９００００であった。
【０２３６】
代用物が得られると、それを、４％  ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、次に４μｍのセクションを切り出し、続いて皮膚の様々な層の標識のために、ヘマトキシリン・エオシン染色を行った。光学顕微鏡での観察を×４０の倍率で行った。顕微鏡をＣＣＤカメラ（ニコン、ソフトウェア  ＮＩＳ  ｅｌｅｍｅｎｔ  Ｂｒ）と連結させたため、観察結果の写真を撮影した。図２Ｂは、（角化細胞＋メラニン形成細胞）／線維芽細胞比を１３．３とした場合の方法に従って得られた代用皮膚の光学顕微鏡写真を示す。図２Ｃは、（角化細胞＋メラニン形成細胞）／線維芽細胞比を６．７とした場合の方法に従って得られた代用皮膚の光学顕微鏡写真を示し、図２Ａは、正常皮膚生検組織の光学顕微鏡写真を示す。図６Ａ及び６Ｂも、（角化細胞＋メラニン形成細胞）／線維芽細胞比を１３．３とした場合の方法に従って得られた皮膚同等物の光学顕微鏡写真を示す。
【０２３７】
さらに、（角化細胞＋メラニン形成細胞）／線維芽細胞比を１３．３とした場合の方法
に従って得られた代用物、及び生体内皮膚の免疫組織化学的標識を、代用物中でのメラニン形成細胞の存在、特にＩＶ型コラーゲンを含む基底層の生成（図６Ｄ（２））、基底層中における細胞の増殖能（図６Ｄ（１））、及びメラニン形成細胞の存在（図６Ｃ）を識別する目的で、Salducci, M., Andre, N., Guere, C., Martin, M., Fitoussi, R., Vie,
K., and Cario-Andre, M. (2014). Factors secreted by irradiated aged fibroblasts
induce solar lentigo in pigmented reconstructed epidermis. Pigment Cell Melanoma Res. 27, 502-504［１２］又はSimon, D., Daubos, A., Pain, C., Fitoussi, R., Vie, K., Taieb, A., de Benetti, L., and Cario-Andre, M. (2013). Exposure to acute electromagnetic radiation of mobile phone exposure range alters transiently skin homeostasis of a model of pigmented reconstructed epidermis. Int. J. Cosmet. Sci. 35, 27-34［１３］に記載の方法に従って行った。図６Ｅ及び６Ｆは、基底位置のメラニン形成細胞の免疫組織化学的標識後（図６Ｅ、明色領域）、ＩＶ型コラーゲンの標識後（図６Ｆ（２））、及びｐ６３増殖マーカーの標識後（図６Ｆ（１））の生体内皮膚の光学顕微鏡写真を示す。図６Ｃ及び６Ｄにおいて、生体内皮膚の場合のように（図６Ｅ及び６Ｆ）存在する細胞が高増殖性であるレベルにＩＶ型コラーゲンが存在することによって実証されるように、本発明に従う代用皮膚がメラニン形成細胞及び基底層を含むことが明白に見られる。
【０２３８】
これらの写真に示されるように、方法によって得られる代用物は、生体内皮膚と同一の構造を有している。
【０２３９】
例２：本発明に従う代用真皮のマウスへの移植
本例において、用いた代用皮膚は、乳房形成術から得た細胞を１３．３の（角化細胞＋メラニン形成細胞）／線維芽細胞比で用いて例１に記載のようにして得た代用物であった。用いたマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂからのｓｗｉｗｗ  ｎｕ／ｎｕヌードマウスであった。
【０２４０】
本例において、移植は、１０体のマウスに対して並行して行った。
【０２４１】
真皮及び表皮を除去するために、マウスの切開を、外科用メスを用い、５ｃｍ２の領域に対して行い、乱切した領域を生理食塩水で洗浄した。乱切した領域に、それを覆うために予め作製しておいた代用皮膚を適用し（図４Ａ、１段目）、次に、移植した領域を、マウスの皮膚と共に縫合して閉じた（図４Ｂ、１段目）。
【０２４２】
マウスを、専用の動物ハウスに、移植片の生着に必要な時間にわたってはカゴ１つあたり１体、その後は適切なサイズのカゴにカゴ１つあたり５体で飼育した。
【０２４３】
２週間後、マウスから皮膚の皮弁を取り除くことによって移植片がどの程度生着したかについての観察を行った（図４Ａ、２段目）。言い換えると、縫合したマウス皮膚から縫合糸を取り除き、前記皮膚を取り除き、移植した代用真皮を露出させて目視観察を行った（図４Ｂ、２段目）。
【０２４４】
３週間後に、移植片がどの程度生着したかについての目視観察を行った（図４Ｂ及びＢ、３段目）。
【０２４５】
図４に示されるように、有利には、代用真皮を、特に、副作用を誘発することのない移植片として適用することができることが明らかに見られる。
【０２４６】
加えて、適用後３週間での代用真皮の構造状態を調べるために、代用物を外科用メスで切除することでサンプルを採取した。代用物を４％  ホルマリンで固定し、パラフィンに
包埋し、次に４μｍのセクションを切り出し、続いて皮膚の様々な層の標識のために、ヘマトキシリン・エオシン染色を行った。光学顕微鏡での観察を×４０の倍率で行った。顕微鏡をＣＣＤカメラ（ニコン、ソフトウェア  ＮＩＳ  ｅｌｅｍｅｎｔ  Ｂｒ）と連結させたため、観察結果の写真を撮影した。
【０２４７】
図５は、移植した代用物の光学顕微鏡写真を示す。特に、図５Ａは、それほど多く存在せず、コラーゲンの再組織化を開始していないマウス線維芽細胞によってコロニー形成された代用物を示す。図５Ｂは、移植前にヒト線維芽細胞でコロニー形成された代用物を示す。数多くの線維芽細胞及びマトリクスの再組織化が、特にコラーゲンの厚い束の存在する表層領域に見られる。したがって、本例は、細胞のすべてが存在することによって、容易に一体化可能であり、経時で劣化せず、移植後に成熟を示し、それはマトリクス中の線維芽細胞下で加速される代用物を得ることが可能となることを明らかに実証するものである。
【０２４８】
参考文献のリスト
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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