(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のＬ−核酸の３’末端に１つまたは複数のＬ−ヌクレオチドを付加する方法であって、前記方法が、変異酵素活性提示部分を含むタンパク質の存在下で第１のＬ−核酸と前記１つまたは複数のＬ−ヌクレオチドを反応させるステップを含み、前記酵素活性が、前記第１のＬ−核酸の３’末端に１つまたは複数のＬ―ヌクレオチドを付加することができ、
前記変異酵素活性提示部分が、アミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列のアミノ酸がＤ−アミノ酸であり、
前記変異酵素活性提示部分が、酵素活性提示部分の変異体であり、前記酵素活性提示部分が、配列番号１５に係るアミノ酸配列からなり、前記配列番号１５に係るアミノ酸配列のアミノ酸がＤ−アミノ酸であり、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、少なくとも１つのアミノ酸位置で配列番号１５に係るアミノ酸配列からなる酵素活性提示部分のアミノ酸配列と異なり、かつ／または、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１５に係るアミノ酸配列の切断型であり、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１５〜２２および５１のいずれかに係るアミノ酸配列と異なり、
（ｉ）  前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１５に係るアミノ酸配列の以下のアミノ酸位置またはそれに対応するアミノ酸位置：
ａ）アミノ酸位置７１、７６、もしくは６７のうちの少なくとも１つ、または、
ｂ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および７１、または、
ｃ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および３１、または、
ｄ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および７６、または、
ｅ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および６７、または、
ｆ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および８６、または、
ｇ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および９６、または、
ｈ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および８５、または、
ｉ）アミノ酸位置１５５および２０３および７１、または、
ｊ）アミノ酸位置１５５および２０３および８６、または、
ｋ）アミノ酸位置１５５および２０３および３１、または、
ｌ）アミノ酸位置１５５および２０３および７６、または、
ｍ）アミノ酸位置１５５および２０３および６７、または、
ｎ）アミノ酸位置１５５および２０３および９６、または、
ｏ）アミノ酸位置１５５および２０３および８５
で、配列番号１５に係るアミノ酸配列からなる酵素活性提示部分のアミノ酸配列と異なり、ならびに／または
（ｉｉ）  前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１５に係るアミノ酸配列の切断型であって、前記切断型が、配列番号１５に係るアミノ酸配列のｎ個のＣ末端のアミノ酸を欠いており、ｎが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、および１５を含む群から選択されるいずれかの整数である、
方法。
【請求項２】
ａ）〜ｏ）のうちのいずれか１つで、位置１５５、２０３、７１、６７、８５、および９６のアミノ酸が、システインにより置換されており、位置３１のアミノ酸が、セリンにより置換されており、位置７６のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置８６のアミノ酸が、グリシンまたはシステインにより置換されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｌ−ヌクレオチドおよび変異酵素活性提示部分を含むタンパク質の存在下で標的Ｌ−核酸を増幅する方法であって、前記変異酵素活性提示部分が、前記標的Ｌ−核酸を増幅することができ、
前記変異酵素活性提示部分がアミノ酸配列を含み、
前記アミノ酸配列のアミノ酸がＤ−アミノ酸であり、
前記変異酵素活性提示部分が、酵素活性提示部分の変異体であり、前記酵素活性提示部分が、配列番号１５に係るアミノ酸からなり、配列番号１５に係るアミノ酸配列のアミノ酸が、Ｄ−アミノ酸であり、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、少なくとも１つのアミノ酸位置で、配列番号１５に係るアミノ酸配列からなる酵素活性提示部分のアミノ酸配列と異なり、かつ／または、
前記変異酵素提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１５に係るアミノ酸配列の切断型であり、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１５〜２２および５１のいずれかに係るアミノ酸配列と異なり、
（ｉ）  前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１５に係るアミノ酸配列の以下のアミノ酸位置またはそれに対応するアミノ酸位置：
ａ）アミノ酸位置７１、７６、もしくは６７のうちの少なくとも１つ、または、
ｂ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および７１、または、
ｃ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および３１、または、
ｄ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および７６、または、
ｅ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および６７、または、
ｆ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および８６、または、
ｇ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および９６、または、
ｈ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および８５、または、
ｉ）アミノ酸位置１５５および２０３および７１、または、
ｊ）アミノ酸位置１５５および２０３および８６、または、
ｋ）アミノ酸位置１５５および２０３および３１、または、
ｌ）アミノ酸位置１５５および２０３および７６、または、
ｍ）アミノ酸位置１５５および２０３および６７、または、
ｎ）アミノ酸位置１５５および２０３および９６、または、
ｏ）アミノ酸位置１５５および２０３および８５
で、配列番号１５に係るアミノ酸配列からなる酵素活性提示部分のアミノ酸配列と異なり、ならびに／または
（ｉｉ）  前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１５に係るアミノ酸配列の切断型であって、前記切断型が、配列番号１５に係るアミノ酸配列のｎ個のＣ末端のアミノ酸を欠いており、ｎが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、および１５を含む群から選択されるいずれかの整数である、
方法。
【請求項４】
ａ）〜ｏ）のうちのいずれか１つで、位置１５５、２０３、７１、６７、８５、および９６のアミノ酸が、システインにより置換されており、位置３１のアミノ酸が、セリンにより置換されており、位置７６のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置８６のアミノ酸が、グリシンまたはシステインにより置換されている、
請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記変異酵素活性提示部分が、
（ｉ）  配列番号８９〜１２０のいずれか１つに係るアミノ酸配列、または
（ｉｉ）  配列番号１２１、１６１、２０１、２４１、および２８１のいずれか１つに係るアミノ酸配列、または
（ｉｉｉ）  配列番号１２２〜１６０、１６２〜２００、２０２〜２４０、２４２〜２８０、および２８２〜３３８のいずれか１つに係るアミノ酸配列、
を含む、
請求項１または３に記載の方法。
【請求項６】
第１のＬ−核酸の３’末端に１つまたは複数のＬ−ヌクレオチドを付加する方法であって、前記方法が、変異酵素活性提示部分を含むタンパク質の存在下で第１のＬ−核酸と前記１つまたは複数のＬ−ヌクレオチドを反応させるステップを含み、前記酵素活性が、前記第１のＬ−核酸の３’末端に１つまたは複数のＬ―ヌクレオチドを付加することができ、
前記変異酵素活性提示部分が、アミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列のアミノ酸がＤ−アミノ酸であり、
前記変異酵素活性提示部分が、酵素活性提示部分の変異体であり、前記酵素活性提示部分が、配列番号１５に係るアミノ酸配列からなり、前記配列番号１５に係るアミノ酸配列のアミノ酸がＤ−アミノ酸であり、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、少なくとも１つのアミノ酸位置で配列番号１５に係るアミノ酸配列からなる酵素活性提示部分のアミノ酸配列と異なり、かつ／または、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１５に係るアミノ酸配列の切断型であり、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１５〜２２および５１のいずれかに係るアミノ酸配列と異なり、
前記変異酵素活性提示部分が、配列番号３３９〜３４３のいずれか１つに係るアミノ酸配列を含むか、または
前記変異酵素活性提示部分が、少なくとも１つのアミノ酸位置で、配列番号１５に係るアミノ酸配列の変異型のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含み、配列番号１５に係るアミノ酸配列の変異型が配列番号３３９〜３４３のいずれか１つに係るアミノ酸配列であり、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号３３９〜３４３のいずれか１つに係るアミノ酸配列の以下の位置、またはそれに対応するアミノ酸位置：
ａ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは７１、または、
ｂ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは８６、または、
ｃ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは３１、または、
ｄ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは７６、または、
ｅ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは６７、または、
ｆ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは９６、または、
ｇ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは８５
で、配列番号３３９〜３４３のいずれか１つのアミノ酸配列と異なる、
方法。
【請求項７】
ａ）〜ｈ）のいずれか１つにおいて、位置１５５、２０３、７１、６７、８５、および９６のアミノ酸が、システインにより置換されており、位置３１のアミノ酸がセリンにより置換されており、位置７６のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置８６のアミノ酸がグリシンまたはシステインにより置換されている、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
Ｌ−ヌクレオチドおよび変異酵素活性提示部分を含むタンパク質の存在下で標的Ｌ−核酸を増幅する方法であって、前記変異酵素活性提示部分が、前記標的Ｌ−核酸を増幅することができ、
前記変異酵素活性提示部分がアミノ酸配列を含み、
前記アミノ酸配列のアミノ酸がＤ−アミノ酸であり、
前記変異酵素活性提示部分が、酵素活性提示部分の変異体であり、前記酵素活性提示部分が、配列番号１５に係るアミノ酸からなり、配列番号１５に係るアミノ酸配列のアミノ酸が、Ｄ−アミノ酸であり、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、少なくとも１つのアミノ酸位置で、配列番号１５に係るアミノ酸配列からなる酵素活性提示部分のアミノ酸配列と異なり、かつ／または、
前記変異酵素提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１５に係るアミノ酸配列の切断型であり、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１５〜２２および５１のいずれかに係るアミノ酸配列と異なり、
前記変異酵素活性提示部分が、配列番号３３９〜３４３のいずれか１つに係るアミノ酸配列を含むか、または
前記変異酵素活性提示部分が、少なくとも１つのアミノ酸位置で、配列番号１５に係るアミノ酸配列の変異型のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含み、配列番号１５に係るアミノ酸配列の変異型が配列番号３３９〜３４３のいずれか１つに係るアミノ酸配列であり、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号３３９〜３４３のいずれか１つに係るアミノ酸配列の以下の位置、またはそれに対応するアミノ酸位置：
ａ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは７１、または、
ｂ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは８６、または、
ｃ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは３１、または、
ｄ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは７６、または、
ｅ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは６７、または、
ｆ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは９６、または、
ｇ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは８５
で、配列番号３３９〜３４３のいずれか１つのアミノ酸配列と異なる、
方法。
【請求項９】
ａ）〜ｈ）のいずれか１つにおいて、位置１５５、２０３、７１、６７、８５、および９６のアミノ酸が、システインにより置換されており、位置３１のアミノ酸がセリンにより置換されており、位置７６のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置８６のアミノ酸がグリシンまたはシステインにより置換されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記変異酵素活性提示部分が、ポリメラーゼ活性提示部位である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項３、８及び９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
変異酵素活性提示部分を含むタンパク質であって、前記変異酵素活性提示部分がアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列のアミノ酸がＤ−アミノ酸であり、前記変異酵素活性が、第１のＬ−核酸の３’末端に１つまたは複数のＬ−ヌクレオチドを付加することができ、
前記変異酵素活性提示部分が、酵素活性提示部分の変異体であり、前記酵素活性提示部分が、配列番号１５に係るアミノ酸配列からなり、配列番号１５に係るアミノ酸配列のアミノ酸がＤ−アミノ酸であり、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、少なくとも１つのアミノ酸位置で、配列番号１５に係るアミノ酸配列からなる酵素活性提示部分のアミノ酸配列と異なり、かつ／または、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１５に係るアミノ酸配列の切断型であり、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１５〜２２、および５１のいずれかに係るアミノ酸配列と異なり、
（ｉ）  前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、以下の、配列番号１５に係るアミノ酸配列のアミノ酸位置、またはそれに対応するアミノ酸位置：
ａ）アミノ酸位置７１、７６もしくは６７のうちの少なくとも１つ、または、
ｂ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および７１、または、
ｃ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および３１、または、
ｄ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および７６、または、
ｅ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および６７、または、
ｆ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および８６、または、
ｇ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および９６、または、
ｈ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および８５、または、
ｉ）アミノ酸位置１５５および２０３および７１、または、
ｊ）アミノ酸位置１５５および２０３および８６、または、
ｋ）アミノ酸位置１５５および２０３および３１、または、
ｌ）アミノ酸位置１５５および２０３および７６、または、
ｍ）アミノ酸位置１５５および２０３および６７、または、
ｎ）アミノ酸位置１５５および２０３および９６、または、
ｏ）アミノ酸位置１５５および２０３および８５
で、配列番号１５に係るアミノ酸配列からなる酵素活性提示部分のアミノ酸配列と異なり、
ならびに／または
（ｉｉ）  前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１５に係るアミノ酸配列の切断型であって、前記切断型が、配列番号１５に係るアミノ酸配列のｎ個のＣ末端のアミノ酸を欠いており、ｎが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、および１５を含む群から選択されるいずれかの整数である、
タンパク質。
【請求項１３】
ａ）〜ｏ）のいずれか１つにおいて、位置１５５、２０３、７１、６７、８５、および９６のアミノ酸がシステインにより置換され、位置３１のアミノ酸がセリンにより置換されており、位置７６のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置８６のアミノ酸がグリシンまたはシステインにより置換されている、請求項１２に記載のタンパク質。
【請求項１４】
前記変異酵素活性提示部分が、
（ｉ）  配列番号８９〜１２０のいずれか１つに係るアミノ酸配列、または
（ｉｉ）  配列番号１２１、１６１、２０１、２４１、および２８１のいずれか１つに係るアミノ酸配列、または
（ｉｉｉ）  配列番号１２２〜１６０、１６２〜２００、２０２〜２４０、２４２〜２８０、および２８２〜３３８のいずれか１つに係るアミノ酸配列、
を含む、
請求項１２又は１３に記載のタンパク質。
【請求項１５】
変異酵素活性提示部分を含むタンパク質であって、前記変異酵素活性提示部分がアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列のアミノ酸がＤ−アミノ酸であり、前記変異酵素活性が、第１のＬ−核酸の３’末端に１つまたは複数のＬ−ヌクレオチドを付加することができ、
前記変異酵素活性提示部分が、酵素活性提示部分の変異体であり、前記酵素活性提示部分が、配列番号１５に係るアミノ酸配列からなり、配列番号１５に係るアミノ酸配列のアミノ酸がＤ−アミノ酸であり、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、少なくとも１つのアミノ酸位置で、配列番号１５に係るアミノ酸配列からなる酵素活性提示部分のアミノ酸配列と異なり、かつ／または、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１５に係るアミノ酸配列の切断型であり、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１５〜２２、および５１のいずれかに係るアミノ酸配列と異なり、
前記変異酵素活性提示部分が、配列番号３３９〜３４３のいずれか１つに係るアミノ酸配列を含むか、または
前記変異酵素活性提示部分が、少なくとも１つのアミノ酸位置で、配列番号１５に係るアミノ酸配列の変異型のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含み、配列番号１５に係るアミノ酸配列の変異型が配列番号３３９〜３４３のいずれか１つに係るアミノ酸配列であり、
前記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号３３９〜３４３のいずれか１つに係るアミノ酸配列の以下の位置、またはそれに対応するアミノ酸位置：
ａ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは７１、または、
ｂ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは８６、または、
ｃ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは３１、または、
ｄ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは７６、または、
ｅ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは６７、または、
ｆ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは９６、または、
ｇ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは８５
で、配列番号３３９〜３４３のいずれか１つのアミノ酸配列と異なる、
タンパク質。
【請求項１６】
ａ）〜ｈ）のいずれか１つにおいて、位置１５５、２０３、７１、６７、８５、および９６のアミノ酸が、システインにより置換されており、位置３１のアミノ酸がセリンにより置換されており、位置７６のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置８６のアミノ酸がグリシンまたはシステインにより置換されている、請求項１５に記載のタンパク質。
【請求項１７】
前記変異酵素活性提示部分が、ポリメラーゼ活性提示部位である、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１８】
野生型のポリメラーゼのポリメラーゼの変異体であり、
前記ポリメラーゼの変異体が、アミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列のアミノ酸がＤ−アミノ酸であり、
前記野生型のポリメラーゼが、配列番号１５に係るアミノ酸配列からなり、配列番号１５に係るアミノ酸配列のアミノ酸がＤ−アミノ酸であり、
前記ポリメラーゼの変異体のアミノ酸配列が、少なくとも１つのアミノ酸位置で、野生型のポリメラーゼのアミノ酸配列と異なり、かつ／または、
前記ポリメラーゼの変異体のアミノ酸配列が、配列番号１５に係るアミノ酸配列の切断型であり、
前記ポリメラーゼの変異体のアミノ酸配列が、配列番号１５〜２２、および５１のいずれかに係るアミノ酸配列と異なり、
前記ポリメラーゼの変異体のアミノ酸配列が、以下の、配列番号１５に係るアミノ酸配列のアミノ酸位置、またはそれに対応するアミノ酸位置：
ａ）アミノ酸位置７１、７６もしくは６７のうちの少なくとも１つ、または、
ｂ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および７１、または、
ｃ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および３１、または、
ｄ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および７６、または、
ｅ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および６７、または、
ｆ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および８６、または、
ｇ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および９６、または、
ｈ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および８５、または、
ｉ）アミノ酸位置１５５および２０３および７１、または、
ｊ）アミノ酸位置１５５および２０３および８６、または、
ｋ）アミノ酸位置１５５および２０３および３１、または、
ｌ）アミノ酸位置１５５および２０３および７６、または、
ｍ）アミノ酸位置１５５および２０３および６７、または、
ｎ）アミノ酸位置１５５および２０３および９６、または、
ｏ）アミノ酸位置１５５および２０３および８５
で、配列番号１５に係るアミノ酸配列からなる野生型のポリメラーゼのアミノ酸配列と異なり、
ならびに／または
（ｉｉ）前記ポリメラーゼの変異体のアミノ酸配列が、配列番号１５に係るアミノ酸配列の切断型であって、前記切断型が、配列番号１５に係るアミノ酸配列のｎ個のＣ末端のアミノ酸を欠いており、ｎが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、および１５を含む群から選択されるいずれかの整数である、
ポリメラーゼの変異体。
【請求項１９】
ａ）〜ｏ）のいずれか１つにおいて、位置１５５、２０３、７１、６７、８５、および９６のアミノ酸がシステインにより置換されており、位置３１のアミノ酸がセリンにより置換されており、位置７６のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置８６のアミノ酸がグリシンまたはシステインにより置換されている、請求項１８に記載のポリメラーゼの変異体。
【請求項２０】
前記ポリメラーゼの変異体が、
（ｉ）  配列番号８９〜１２０のいずれか１つに係るアミノ酸配列、または
（ｉｉ）  配列番号１２１、１６１、２０１、２４１、および２８１のいずれか１つに係るアミノ酸配列、または
（ｉｉｉ）  配列番号１２２〜１６０、１６２〜２００、２０２〜２４０、２４２〜２８０、および２８２〜３３８のいずれか１つに係るアミノ酸配列、
を含む、
請求項１８又は１９に記載のポリメラーゼ変異体。
【請求項２１】
野生型のポリメラーゼのポリメラーゼの変異体であり、
前記ポリメラーゼの変異体が、アミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列のアミノ酸がＤ−アミノ酸であり、
前記野生型のポリメラーゼが、配列番号１５に係るアミノ酸配列からなり、配列番号１５に係るアミノ酸配列のアミノ酸がＤ−アミノ酸であり、
前記ポリメラーゼの変異体のアミノ酸配列が、少なくとも１つのアミノ酸位置で、野生型のポリメラーゼのアミノ酸配列と異なり、かつ／または、
前記ポリメラーゼの変異体のアミノ酸配列が、配列番号１５に係るアミノ酸配列の切断型であり、
前記ポリメラーゼの変異体のアミノ酸配列が、配列番号１５〜２２、および５１のいずれかに係るアミノ酸配列と異なり、
前記ポリメラーゼの変異体が、配列番号３３９〜３４３のいずれか１つに係るアミノ酸配列を含むか、または
前記ポリメラーゼの変異体が、少なくとも１つのアミノ酸位置で、配列番号１５に係るアミノ酸配列の変異型のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含み、配列番号１５に係るアミノ酸配列の変異型が配列番号３３９〜３４３のいずれか１つに係るアミノ酸配列であり、
前記ポリメラーゼの変異体のアミノ酸配列が、配列番号３３９〜３４３のいずれか１つに係るアミノ酸配列の以下の位置、またはそれに対応するアミノ酸位置：
ａ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは７１、または、
ｂ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは８６、または、
ｃ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは３１、または、
ｄ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは７６、または、
ｅ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは６７、または、
ｆ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは９６、または、
ｇ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは８５
で、配列番号３３９〜３４３のいずれか１つのアミノ酸配列と異なる、
ポリメラーゼ変異体。
【請求項２２】
ａ）〜ｈ）のいずれか１つにおいて、位置１５５、２０３、７１、６７、８５、および９６のアミノ酸が、システインにより置換されており、位置３１のアミノ酸がセリンにより置換されており、位置７６のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置８６のアミノ酸がグリシンまたはシステインにより置換されている、請求項２１に記載のポリメラーゼ変異体。
【請求項２３】
Ｌ−核酸の３’末端に１つまたは複数のＬ−ヌクレオチドを付加する方法における変異酵素活性提示部分を含むタンパク質の使用であって、前記タンパク質が、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載のタンパク質である、使用。
【請求項２４】
Ｌ−ヌクレオチドの存在下で標的Ｌ−核酸を増幅する方法における変異酵素活性提示部分を含むタンパク質の使用であって、前記タンパク質が、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載のタンパク質である、使用。
【請求項２５】
Ｌ−核酸分子に結合する標的分子の同定のための方法であって、以下の、
（ａ）Ｌ−核酸分子の異種性の集合を作製するステップと、
（ｂ）前記標的分子と、ステップ（ａ）のＬ−核酸分子の異種性の集合を接触させるステップと、
（ｃ）前記標的分子により結合されていないＬ−核酸分子を分離するステップと、
（ｄ）前記標的分子により結合されたＬ−核酸分子を増殖するステップであって、前記増殖ステップがタンパク質を使用しており、前記タンパク質が、請求項１２〜１７のいずれか１つに記載のタンパク質である、ステップと
を含む、方法。
【請求項２６】
タンパク質を生成する方法であって、前記タンパク質がアミノ酸配列からなり、前記アミノ酸配列のアミノ酸がＤ―アミノ酸であり、
（ａ）前記タンパク質の２つ以上のフラグメントが化学的に合成されており、これにより前記フラグメントが全体で、前記タンパク質のアミノ酸配列を形成し、前記フラグメントが、固相ペプチド合成により合成されており、
（ｂ）ステップ（ａ）のフラグメントが、セグメントの縮合、天然の化学的なライゲーション、酵素的なライゲーション、またはその組み合わせにより互いに結合しており、
前記タンパク質が、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載のタンパク質である、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、第一のＬ−核酸の３’末端に１以上のＬ−ヌクレオチドを付加するための方法、標的Ｌ−核酸を増幅するための方法、酵素活性提示部分を含むタンパク質、アミノ酸がＤ−アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリメラーゼ、配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなる野生型ポリメラーゼのポリメラーゼ変異体、１以上のＬ−ヌクレオチドを付加するための方法における酵素活性提示部分を含むタンパク質の使用、標的Ｌ−核酸を増幅するための方法における酵素活性提示部分を含むタンパク質の使用、標的分子結合Ｌ−核酸分子の同定のための方法、タンパク質およびポリメラーゼをそれぞれ作製するための方法に関する。
【０００２】
より広い意味での遺伝子技術の使用は、医学および診断の分野において、ならびに基礎研究においてこの数十年にわたりなされた進歩に大いに貢献した。遺伝子技術によりもたらされる合成能力は、１つの化学合成を上回るものである。遺伝子技術および遺伝子工学によって、特に、原核および真核細胞の酵素機構を利用する事実上無制限量のＬ−ペプチドおよびＬ−タンパク質の産生が可能である。酵素およびポリメラーゼは特に、野生型であれ、またはこのような野生型の変異体であれ、理論的収率でないにせよ、化学合成によって達成可能である長さまでこのようなＤ−核酸の基本単位、すなわちＤ−ヌクレオチドを連結する、Ｄ−核酸の合成が可能である。
【０００３】
遺伝子技術において使用される酵素は、それぞれ、キラル特異性ゆえに、そのキラリティーがそれら自身のキラリティーに適合する基本単位および基質しか利用できない。キラリティーが逆である基本単位および基質は、それぞれ、酵素の活性に対する対象になり得ない。キラル相反性の原理のため、逆キラリティーの基本単位および基質それぞれのプロセシングには、酵素が逆キラリティーを有することも必要とされる。
【０００４】
このキラル相反性の原理は、例えば、シュピーゲルマーとしても知られ、このように呼ばれる標的結合Ｌ−核酸の作製において集中的に使用される。現在のところ、シュピーゲルマーは、Ｄ−ペプチドまたはＤ−タンパク質などの標的分子または標的構造の鏡像異性型に対するインビトロ選択のために第一段階でＤ−核酸ライブラリを使用する過程によって同定される。第二段階において、標的分子または標的構造の鏡像異性型に結合する、このように同定されたＤ−核酸を、対応するＬ−核酸として調製する。キラル相反性の原理の結果として、これらのＬ−核酸、すなわちシュピーゲルマーは、Ｌ−ペプチドまたはＬ−タンパク質などの真のまたは現実の標的分子に結合でき、選択過程に対して使用されるＤ−ペプチドまたはＤ−タンパク質などのその鏡像異性型には結合できない。好ましくは、このような真のまたは現実の標的分子または標的構造は、ヒトまたは動物体などの生体系で存在するような標的分子または標的構造である。このようなシュピーゲルマーの調製のための方法は、例えば「Ｔｈｅ  Ａｐｔａｍｅｒ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」（ｅｄｓ．Ｋｌｕｓｓｍａｎｎ，２００６）」に記載されている。
【０００５】
シュピーゲルマーを同定する過程をより容易するある方法は、真のまたは現実の標的分子または標的構造により示される鏡像異性型において標的分子または標的構造を用いてＬ−核酸ライブラリからＬ−核酸が直接選択されるように過程を再設計することであり得る。この過程の一部は、標的分子および標的構造それぞれに最初に結合するＬ−核酸の増幅なので、ポリメラーゼが、Ｌ−プライマーに少なくとも１つのヌクレオチドを付加することが必要である。現在まで、このようなことが可能なＬ−アミノ酸からなるポリメラーゼは知られていない。このため、Ｄ−アミノ酸からなるポリメラーゼおよび同様の酵素が必要とされている。遺伝子技術は、Ｄ−アミノ酸からなるこのような機能的に活性のあるポリメラーゼを提供できないので、化学合成が必要である。しかし、Ｄ−タンパク質またはＤ−ポリペプチドの合成は、比較的低分子に限定される。今までのところ合成された最大のＤ−タンパク質は、１０２個のＤ−アミノ酸からなる血管由来タンパク質血管内皮増殖因子（略称ＶＥＧＦ−Ａ）のＤ−タンパク質型であるが（Ｍａｎｄａｌら、２０１２）、ポリメラーゼは一般に３００個を超えるアミノ酸からなる。
【０００６】
したがって、本発明の根本となる問題は、プライマーなどのＬ−核酸への少なくとも１個のヌクレオチドの付加を可能にする方法の提供である。本発明の根本となるさらなる問題は、Ｌ−ヌクレオチドを利用する標的Ｌ−核酸を増幅するための方法の提供である。本発明の根本となるまたさらなる問題は、このような方法の実施を可能にする手段の提供である。
【０００７】
本発明の根本となるこれらおよび他の問題は、添付される独立した特許請求の範囲の対象により解決される。好ましい実施形態は、添付される独立した特許請求の範囲から導かれ得る。
【０００８】
具体的には、本発明の根本となるこれらおよび他の問題は、以下の実施形態によっても解決される。
【０００９】
実施形態１：第１のＬ−核酸の３’末端に１つまたは複数のＬ−ヌクレオチドを付加する方法であって、上記方法が、変異酵素活性提示部分を含むタンパク質の存在下で第１のＬ−核酸と上記１つまたは複数のＬ−ヌクレオチドを反応させるステップを含み、上記酵素活性が上記第１のＬ−核酸の３’末端に１つまたは複数のＬ−ヌクレオチドを付加することができ、
上記変異酵素活性提示部分が、アミノ酸配列を含み、上記アミノ酸配列のアミノ酸がＤ−アミノ酸であり、
上記変異酵素活性提示部分が、酵素活性提示部分の変異体であり、上記酵素活性提示部分が、配列番号１５に係るアミノ酸配列からなり、上記配列番号１５に係るアミノ酸配列のアミノ酸がＤ−アミノ酸であり、
上記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、少なくとも１つのアミノ酸位置、好ましくは３つのアミノ酸位置で配列番号１５に係るアミノ酸配列からなる酵素活性提示部分のアミノ酸配列と異なり、かつ／または
上記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１５に係るアミノ酸配列の切断型であり、
上記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１５〜２２および５１のいずれかに係るアミノ酸配列と異なる、
方法。
【００１０】
実施形態２：上記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、以下の、配列番号１５に係るアミノ酸配列のアミノ酸位置またはそれに対応するアミノ酸位置：
ａ）アミノ酸位置７１、７６、６７、もしくは８６のうちの少なくとも１つ、または
ｂ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および７１、または
ｃ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および３１、または
ｄ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および７６、または
ｅ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および６７、または、
ｆ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および８６、または、
ｇ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および９６、または、
ｈ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および８５、または、
ｉ）アミノ酸位置１５５および２０３および７１、または、
ｊ）アミノ酸位置１５５および２０３および８６、または、
ｋ）アミノ酸位置１５５および２０３および３１、または、
ｌ）アミノ酸位置１５５および２０３および７６、または、
ｍ）アミノ酸位置１５５および２０３および６７、または、
ｎ）アミノ酸位置１５５および２０３および８６、または、
ｏ）アミノ酸位置１５５および２０３および９６、または、
ｐ）アミノ酸位置１５５および２０３および８５
で、配列番号１５に係るアミノ酸配列からなる酵素活性提示部分のアミノ酸配列と異なり、
好ましくは、ａ）〜ｐ）のうちのいずれか１つで、位置１５５、２０３、７１、６７、８５、および９６のアミノ酸が、システインにより置換されており、位置３１のアミノ酸が、セリンにより置換されており、位置７６のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置８６のアミノ酸が、グリシンまたはシステインにより置換されている、
実施形態１に記載の方法。
【００１１】
実施形態３：上記変異酵素活性提示部分が、配列番号８９〜１２０のいずれか１つに係るアミノ酸配列、好ましくは、配列番号８９に係るアミノ酸配列、または配列番号９０に係るアミノ酸配列、または配列番号９４に係るアミノ酸配列、または配列番号９７に係るアミノ酸配列、より好ましくは、配列番号９４に係るアミノ酸配列、または配列番号９７に係るアミノ酸配列、最も好ましくは配列番号９４に係るアミノ酸配列を含む、実施形態２に記載の方法。
【００１２】
実施形態４：上記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１５に係るアミノ酸配列の切断型であって、上記切断型が、配列番号１５に係るアミノ酸配列のｎ個のＣ末端のアミノ酸を欠いており、ｎが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、および１５を含む群から選択されるいずれかの整数である、実施形態１に記載の方法。
【００１３】
実施形態５：上記変異酵素活性提示部分が、配列番号１２１、１６１、２０１、２４１、および２８１のいずれか１つに係るアミノ酸配列を含む、実施形態１および４のいずれか１つに記載の方法。
【００１４】
実施形態６：上記変異酵素活性提示部分が、少なくとも１つのアミノ酸位置、好ましくは３つのアミノ酸位置で、配列番号１５に係るアミノ酸配列の切断型のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含み、配列番号１５に係るアミノ酸配列の切断型が、配列番号１２１、１６１、２０１、２４１、および２８１のいずれか１つに係るアミノ酸配列である、請求項１および４のいずれか１項に記載の方法。
【００１５】
実施形態７：上記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１２１、１６１、２０１、２４１、および２８１のいずれか１つに係るアミノ酸配列の以下の位置、またはそれに対応するアミノ酸位置：
ａ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは７１、または、
ｂ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは８６、または、
ｃ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは３１、または、
ｄ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは７６、または、
ｅ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは６７、または、
ｆ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは８６、または、
ｇ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは９６、または、
ｈ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは８５
で、配列番号１２１、１６１、２０１、２４１、および２８１のいずれか１つのアミノ酸配列と異なり、
好ましくは、ａ）〜ｈ）のいずれか１つにおいて、位置１５５、２０３、７１、６７、８５、および９６のアミノ酸が、システインにより置換されており、位置３１のアミノ酸がセリンにより置換されており、位置７６のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置８６のアミノ酸がグリシンまたはシステインにより置換されており、
より好ましくは、上記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１２２〜１６０、１６２〜２００、２０２〜２４０、２４２〜２８０、および２８２〜３３８のいずれか１つに係るアミノ酸配列を含み、最も好ましくは、上記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１３５、１７４、２１４、２５４、２９４のいずれか１つに係るアミノ酸配列を含む、
実施形態６に記載の方法。
【００１６】
実施形態８：上記変異酵素活性提示部分が、配列番号３３９〜３４３のいずれか１つに係るアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の方法。
【００１７】
実施形態９：上記変異酵素活性提示部分が、少なくとも１つのアミノ酸位置、好ましくは３つのアミノ酸位置で、配列番号１５に係るアミノ酸配列の変異型と異なるアミノ酸配列を含み、配列番号１５に係るアミノ酸配列の変異型が、配列番号３３９〜３４３のいずれか１つに係るアミノ酸配列である、実施形態１に記載の方法。
【００１８】
実施形態１０：上記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号３３９〜３４３のいずれか１つに係るアミノ酸配列の以下の位置、またはそれに対応するアミノ酸位置：
ａ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３、および／もしくは７１、または、
ｂ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３、および／もしくは８６、または、
ｃ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３、および／もしくは３１、または、
ｄ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３、および／もしくは７６、または、
ｅ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３、および／もしくは６７、または、
ｆ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３、および／もしくは８６、または、
ｇ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３、および／もしくは９６、または、
ｈ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３、および／もしくは８５
で、配列番号３３９〜３４３のいずれか１つのアミノ酸配列と異なり、
好ましくは、ａ）〜ｈ）のいずれか１つにおいて、位置１５５、２０３、７１、６７、８５、および９６のアミノ酸が、システインにより置換されており、位置３１のアミノ酸がセリンにより置換されており、位置７６のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置８６のアミノ酸がグリシンまたはシステインにより置換されている、実施形態９に記載の方法。
【００１９】
実施形態１１：上記変異酵素活性提示部分が、ポリメラーゼ活性提示部位である、実施形態１および１０のいずれか１項に記載の方法。
【００２０】
実施形態１２：上記変異酵素活性がポリメラーゼ活性である、実施形態１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【００２１】
実施形態１３：上記ポリメラーゼ活性が、温度安定性ポリメラーゼ活性である、実施形態１２に記載の方法。
【００２２】
実施形態１４：上記ポリメラーゼ活性が、ＤＮＡポリメラーゼ活性である、実施形態１２〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【００２３】
実施形態１５：上記ＤＮＡポリメラーゼ活性が、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性である、実施形態１４に記載の方法。
【００２４】
実施形態１６：上記変異酵素活性提示部分が酵素である、実施形態１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【００２５】
実施形態１７：上記ポリメラーゼ活性提示部位が、ポリメラーゼである、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【００２６】
実施形態１８：上記反応ステップを、第１のＬ−核酸への少なくとも１つまたは複数のＬ―ヌクレオチドの付加を可能にし、好ましくは、５〜２０，０００個のＬ−ヌクレオチド、好ましくは１０〜２，０００個のＬ−ヌクレオチド、より好ましくは５０〜５００個のＬ−ヌクレオチド、最も好ましくは５０〜１００個のＬ−ヌクレオチドの付加を可能にする条件下で実行する、実施形態１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【００２７】
実施形態１９：上記第１のＬ−核酸への少なくとも１つまたは複数のＬ―ヌクレオチドの付加が、第１のＬ−核酸への少なくとも１つまたは複数のＬ−ヌクレオチドの共有結合であり、好ましくは、第１のＬ−核酸の３’ＯＨと少なくとも１つまたは複数のＬ−ヌクレオチドのうちの１つの５’リン酸塩との間に３’―５’ホスホジエステルを形成することによる、共有結合である、実施形態１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【００２８】
実施形態２０：上記第１のＬ−核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＤＮＡ、修飾ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせからなるプライマーである、実施形態１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【００２９】
実施形態２１：上記第１のＬ−核酸が、Ｌ−ヌクレオチドおよび任意に修飾からなる、実施形態１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【００３０】
実施形態２２：上記第１のＬ−核酸が、Ｌ−ヌクレオチドからなる、実施形態１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【００３１】
実施形態２３：上記反応が、第２のＬ−核酸をさらに含み、上記第１のＬ−核酸のうちの１つの分子が、上記第２のＬ−核酸のうち１つの分子に、好ましくはワトソンクリック塩基対を介してハイブリダイズされている、実施形態１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【００３２】
実施形態２４：上記ポリメラーゼ活性提示部位が、上記第２のＬ−核酸に相補的な第３のＬ−核酸を合成し、上記第３のＬ−核酸が、上記第１のＬ−核酸と、上記第１のＬ−核酸の３’末端に付加したＬ−ヌクレオチドとを含む、実施形態２３に記載の方法。
【００３３】
実施形態２５：Ｌ−ヌクレオチドおよび変異酵素活性提示部分を含むタンパク質の存在下で標的Ｌ−核酸を増幅する方法であって、上記変異酵素活性提示部分が、上記標的Ｌ−核酸を増幅することができ、上記変異酵素活性提示部分がアミノ酸配列を含み、
上記アミノ酸配列のアミノ酸がＤ−アミノ酸であり、
上記変異酵素活性提示部分が、酵素活性提示部分の変異体であり、上記酵素活性提示部分が、配列番号１５に係るアミノ酸からなり、配列番号１５に係るアミノ酸配列のアミノ酸が、Ｄ−アミノ酸であり、
上記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、少なくとも１つのアミノ酸位置、好ましくは３つのアミノ酸位置で、配列番号１５に係るアミノ酸配列からなる酵素活性提示部分のアミノ酸配列と異なり、かつ／または、
上記変異酵素提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１５に係るアミノ酸配列の切断型であり、
上記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１５〜２２および５１のいずれかに係るアミノ酸配列と異なる、
方法。
【００３４】
実施形態２６：上記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、以下の、配列番号１５に係るアミノ酸配列のアミノ酸位置、またはそれに対応するアミノ酸位置：
ａ）アミノ酸位置７１、７６、６７、もしくは８６のうちの少なくとも１つ、または、
ｂ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３、および７１、または、
ｃ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３、および３１、または、
ｄ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３、および７６、または、
ｅ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３、および６７、または、
ｆ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３、および８６、または、
ｇ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３、および９６、または、
ｈ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３、および８５、または、
ｉ）アミノ酸位置１５５および２０３、および７１、または、
ｊ）アミノ酸位置１５５および２０３、および８６、または、
ｋ）アミノ酸位置１５５および２０３、および３１、または、
ｌ）アミノ酸位置１５５および２０３、および７６、または、
ｍ）アミノ酸位置１５５および２０３、および６７、または、
ｎ）アミノ酸位置１５５および２０３、および８６、または、
ｏ）アミノ酸位置１５５および２０３、および９６、または、
ｐ）アミノ酸位置１５５および２０３、および８５
で、配列番号１５に係るアミノ酸配列からなる酵素活性提示部分のアミノ酸配列と異なり、
好ましくは、ａ）〜ｐ）のいずれか１つにおいて、位置１５５、２０３、７１、６７、８５、および９６のアミノ酸が、システインにより置換されており、位置３１のアミノ酸がセリンにより置換されており、位置７６のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置８６のアミノ酸がグリシンまたはシステインにより置換されている、
実施形態２５に記載の方法。
【００３５】
実施形態２７：上記変異酵素活性提示部分が、配列番号８９〜１２０のいずれか１つに係るアミノ酸配列、好ましくは、配列番号８９に係るアミノ酸配列、または配列番号９０に係るアミノ酸配列、または配列番号９４に係るアミノ酸配列、または配列番号９７に係るアミノ酸配列、より好ましくは配列番号９４に係るアミノ酸配列、または配列番号９７に係るアミノ酸配列、最も好ましくは配列番号９４に係るアミノ酸配列を含む、実施形態２６に記載の方法。
【００３６】
実施形態２８：上記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１５に係るアミノ酸配列の切断型であり、上記切断型が、配列番号１５に係るアミノ酸配列のｎ個のＣ末端のアミノ酸を欠いており、ｎが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、および１５を含む群から選択されるいずれかの整数である、実施形態２５に記載の方法。
【００３７】
実施形態２９：上記変異酵素活性提示部分が、配列番号１２１、１６１、２０１、２４１、および２８１のいずれか１つに係るアミノ酸配列を含む、実施形態２５および２８のいずれか１項に記載の方法。
【００３８】
実施形態３０：上記変異酵素活性提示部分が、少なくとも１つのアミノ酸位置、好ましくは３つのアミノ酸位置で、配列番号１５に係るアミノ酸配列の切断型のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含み、配列番号１５に係るアミノ酸配列の切断型が、配列番号１２１、１６１、２０１、２４１、および２８１のいずれか１つに係るアミノ酸配列である、実施形態２５および２８のいずれか１項に記載の方法。
【００３９】
実施形態３１：上記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、以下の、配列番号１２１、１６１、２０１、２４１、および２８１のいずれか１つに係るアミノ酸配列の位置、またはそれに対応するアミノ酸位置：
ａ）アミノ酸位置１５５、および／もしくは２０３、および／もしくは７１、または、
ｂ）アミノ酸位置１５５、および／もしくは２０３、および／もしくは８６、または、
ｃ）アミノ酸位置１５５、および／もしくは２０３、および／もしくは３１、または、
ｄ）アミノ酸位置１５５、および／もしくは２０３、および／もしくは７６、または、
ｅ）アミノ酸位置１５５、および／もしくは２０３、および／もしくは６７、または、
ｆ）アミノ酸位置１５５、および／もしくは２０３、および／もしくは８６、または、
ｇ）アミノ酸位置１５５、および／もしくは２０３、および／もしくは９６、または、
ｈ）アミノ酸位置１５５、および／もしくは２０３、および／もしくは８５
で、配列番号１２１、１６１、２０１、２４１、および２８１のいずれか１つのアミノ酸配列と異なり、
好ましくは、ａ）〜ｈ）のいずれか１つにおいて、位置１５５、２０３、７１、６７、８５、および９６のアミノ酸がシステインにより置換されており、位置３１のアミノ酸がセリンにより置換されており、位置７６のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置８６のアミノ酸がグリシンまたはシステインにより置換されており、
より好ましくは、上記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１２２〜１６０、１６２〜２００、２０２〜２４０、２４２〜２８０、および２８２〜３３８のいずれか１つに係るアミノ酸配列を含み、最も好ましくは、上記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１３５、１７４、２１４、２５４、２９４のいずれか１つに係るアミノ酸配列を含む、
実施形態３０に記載の方法。
【００４０】
実施形態３２：上記変異酵素活性提示部分が、配列番号３３９〜３４３のいずれか１つに係るアミノ酸配列を含む、実施形態２５に記載の方法。
【００４１】
実施形態３３：上記変異酵素活性提示部分が、少なくとも１つのアミノ酸位置、好ましくは３つのアミノ酸位置で、配列番号１５に係るアミノ酸配列の変異型と異なるアミノ酸配列を含み、配列番号１５に係るアミノ酸配列の変異型が、配列番号３３９〜３４３のいずれか１つに係るアミノ酸配列である、実施形態２５に記載の方法。
【００４２】
実施形態３４：上記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、以下の、配列番号３３９〜３４３のいずれか１つに係るアミノ酸配列の位置、またはそれに対応するアミノ酸位置：
ａ）アミノ酸位置１５５、および／もしくは２０３、および／もしくは７１、または、
ｂ）アミノ酸位置１５５、および／もしくは２０３、および／もしくは８６、または、
ｃ）アミノ酸位置１５５、および／もしくは２０３、および／もしくは３１、または、
ｄ）アミノ酸位置１５５、および／もしくは２０３、および／もしくは７６、または、
ｅ）アミノ酸位置１５５、および／もしくは２０３、および／もしくは６７、または、
ｆ）アミノ酸位置１５５、および／もしくは２０３、および／もしくは８６、または、
ｇ）アミノ酸位置１５５、および／もしくは２０３、および／もしくは９６、または、
ｈ）アミノ酸位置１５５、および／もしくは２０３、および／もしくは８５
で、配列番号３３９〜３４３のいずれか１つのアミノ酸配列と異なり、
好ましくは、ａ）〜ｈ）のいずれか１つにおいて、位置１５５、２０３、７１、６７、８５、および９６のアミノ酸がシステインにより置換されており、位置３１のアミノ酸がセリンにより置換されており、位置７６のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置８６のアミノ酸がグリシンまたはシステインにより置換されている、
実施形態３３に記載の方法。
【００４３】
実施形態３５：上記酵素活性提示部分がポリメラーゼ活性提示部位である、実施形態２５〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【００４４】
実施形態３６：上記酵素活性がポリメラーゼ活性である、実施形態２５〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【００４５】
実施形態３７：上記ポリメラーゼ活性が温度安定性ポリメラーゼ活性である、実施形態３６に記載の方法。
【００４６】
実施形態３８：上記ポリメラーゼ活性がＤＮＡポリメラーゼ活性である、実施形態３６〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【００４７】
実施形態３９：上記ＤＮＡポリメラーゼ活性がＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性である、実施形態３８に記載の方法。
【００４８】
実施形態４０：上記酵素活性提示部分が酵素である、実施形態２５〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【００４９】
実施形態４１：上記ポリメラーゼ活性提示部位がポリメラーゼである、実施形態３５〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【００５０】
実施形態４２：上記反応するステップを、上記標的Ｌ−核酸の増幅を可能にする条件下で実行する、実施形態２５〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【００５１】
実施形態４３：上記方法が、少なくとも１つのプライマー、好ましくは２つのプライマーを利用し、上記少なくとも１つのプライマーが、Ｌ−ヌクレオチドおよび任意に修飾からなる、実施形態２５〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【００５２】
実施形態４４：上記プライマーがＬ−ヌクレオチドからなる、実施形態４３に記載の方法。
【００５３】
実施形態４５：上記標的Ｌ−核酸が、Ｌ―ヌクレオチドからなる、実施形態２５〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【００５４】
実施形態４６：上記方法がポリメラーゼ連鎖反応である、実施形態２５〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【００５５】
実施形態４７：上記標的Ｌ−核酸が、Ｌ―ＤＮＡからなる、実施形態２５〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【００５６】
実施形態４８：上記標的Ｌ−核酸が、２０〜２０，０００個のＬ−ヌクレオチド、好ましくは３０〜２，０００個のＬ−ヌクレオチド、より好ましくは４０〜５００個のＬ−ヌクレオチド、最も好ましくは５０〜１００個のＬ−ヌクレオチドからなる、実施形態２５〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【００５７】
実施形態４９：変異酵素活性提示部分を含むタンパク質であって、上記変異酵素活性提示部分がアミノ酸配列を含み、上記アミノ酸配列のアミノ酸がＤ−アミノ酸であり、上記変異酵素活性が、第１のＬ−核酸の３’末端に１つまたは複数のＬ−ヌクレオチドを付加することができ、
上記変異酵素活性提示部分が、酵素活性提示部分の変異体であり、上記酵素活性提示部分が、配列番号１５に係るアミノ酸配列からなり、配列番号１５に係るアミノ酸配列のアミノ酸がＤ−アミノ酸であり、
上記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、少なくとも１つのアミノ酸位置、好ましくは３つのアミノ酸位置で、配列番号１５に係るアミノ酸配列からなる酵素活性提示部分のアミノ酸配列と異なり、かつ／または、
上記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１５に係るアミノ酸配列の切断型であり、
上記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１５〜２２、および５１のいずれかに係るアミノ酸配列と異なる、
タンパク質。
【００５８】
実施形態５０：上記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、以下の、配列番号１５に係るアミノ酸配列のアミノ酸位置、またはそれに対応するアミノ酸位置：
ａ）アミノ酸位置７１、７６、６７、もしくは８６のうちの少なくとも１つ、または、
ｂ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および７１、または、
ｃ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および３１、または、
ｄ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および７６、または、
ｅ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および６７、または、
ｆ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および８６、または、
ｇ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および９６、または、
ｈ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および８５、または、
ｉ）アミノ酸位置１５５および２０３および７１、または、
ｊ）アミノ酸位置１５５および２０３および８６、または、
ｋ）アミノ酸位置１５５および２０３および３１、または、
ｌ）アミノ酸位置１５５および２０３および７６、または、
ｍ）アミノ酸位置１５５および２０３および６７、または、
ｎ）アミノ酸位置１５５および２０３および８６、または、
ｏ）アミノ酸位置１５５および２０３および９６、または、
ｐ）アミノ酸位置１５５および２０３および８５
で、配列番号１５に係るアミノ酸配列からなる酵素活性提示部分のアミノ酸配列と異なり、
好ましくは、ａ）〜ｐ）のいずれか１つにおいて、位置１５５、２０３、７１、６７、８５、および９６のアミノ酸がシステインにより置換され、位置３１のアミノ酸がセリンにより置換されており、位置７６のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置８６のアミノ酸がグリシンまたはシステインにより置換されている、
実施形態４９に記載のタンパク質。
【００５９】
実施形態５１：上記変異酵素活性提示部分が、配列番号８９〜１２０のいずれか１つに係るアミノ酸配列、好ましくは、配列番号８９に係るアミノ酸配列、または配列番号９０に係るアミノ酸配列、または配列番号９４に係るアミノ酸配列、または配列番号９７に係るアミノ酸配列、より好ましくは、配列番号９４に係るアミノ酸配列、または配列番号９７に係るアミノ酸配列、最も好ましくは配列番号９４に係るアミノ酸配列を含む、実施形態５０に記載のタンパク質。
【００６０】
実施形態５２：上記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１５に係るアミノ酸配列の切断型であり、上記切断型が、配列番号１５に係るアミノ酸配列のｎ個のＣ末端のアミノ酸を欠いており、ｎが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、および１５を含む群から選択されるいずれかの整数である、請求項４９に記載のタンパク質。
【００６１】
実施形態５３：上記変異酵素活性提示部分が、配列番号１２１、１６１、２０１、２４１、および２８１のいずれか１つに係るアミノ酸配列を含む、実施形態４９および５２のいずれか１項に記載のタンパク質。
【００６２】
実施形態５４：上記変異酵素活性提示部分が、少なくとも１つのアミノ酸位置、好ましくは３つのアミノ酸位置で、配列番号１５に係るアミノ酸配列の切断型のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含み、配列番号１５に係るアミノ酸配列の切断型が、配列番号１２１、１６１、２０１、２４１、および２８１のいずれか１つに係るアミノ酸配列である、実施形態４９および５２のいずれか１項に記載のタンパク質。
【００６３】
実施形態５５：上記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、以下の、配列番号１２１、１６１、２０１、２４１、および２８１のいずれか１つに係るアミノ酸配列の位置、またはそれに対応するアミノ酸位置：
ａ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは７１、または、
ｂ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは８６、または、
ｃ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは３１、または、
ｄ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは７６、または、
ｅ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは６７、または、
ｆ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは８６、または、
ｇ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは９６、または、
ｈ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは８５
で、配列番号１２１、１６１、２０１、２４１、および２８１のいずれか１つのアミノ酸配列と異なり、
好ましくは、ａ）〜ｈ）のいずれか１つにおいて、位置１５５、２０３、７１、６７、８５、および９６のアミノ酸がシステインにより置換されており、位置３１のアミノ酸がセリンにより置換されており、位置７６のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置８６のアミノ酸がグリシンまたはシステインにより置換されており、
より好ましくは、タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号１２２〜１６０、１６２〜２００、２０２〜２４０、２４２〜２８０、および２８２〜３３８のいずれか１つに係るアミノ酸配列を含み、最も好ましくは、上記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１３５、１７４、２１４、２５４、２９４に係るいずれか１つのアミノ酸配列を含む、
実施形態５４に記載のタンパク質。
【００６４】
実施形態５６：上記変異酵素活性提示部分が、配列番号３３９〜３４３のいずれか１つに係るアミノ酸配列を含む、実施形態４９に記載のタンパク質。
【００６５】
実施形態５７：上記変異酵素活性提示部分が、少なくとも１つのアミノ酸位置、好ましくは３つのアミノ酸位置で、配列番号１５に係るアミノ酸配列の変異型と異なるアミノ酸配列を含み、配列番号１５に係るアミノ酸配列の変異型が、配列番号３３９〜３４３のいずれか１つに係るアミノ酸配列である、実施形態４９に記載のタンパク質。
【００６６】
実施形態５８：上記変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、以下の、配列番号３３９〜３４３のいずれか１つに係るアミノ酸配列の位置、またはそれに対応するアミノ酸位置：
ａ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは７１、または、
ｂ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは８６、または、
ｃ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは３１、または、
ｄ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは７６、または、
ｅ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは６７、または、
ｆ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは８６、または、
ｇ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは９６、または、
ｈ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは８５
で、配列番号３３９〜３４３のいずれか１つのアミノ酸配列と異なり、
好ましくは、ａ）〜ｈ）のいずれか１つにおいて、位置１５５、２０３、７１、６７、８５、および９６のアミノ酸がシステインにより置換されており、位置３１のアミノ酸がセリンにより置換されており、位置７６のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置８６のアミノ酸がグリシンまたはシステインにより置換されている、
実施形態５７に記載のタンパク質。
【００６７】
実施形態５９：上記変異酵素活性提示部分が、ポリメラーゼ活性提示部位である、実施形態４９〜５８のいずれかに記載のタンパク質。
【００６８】
実施形態６０：上記変異酵素活性がポリメラーゼ活性である、実施形態４９〜５９に記載のタンパク質。
【００６９】
実施形態６１：上記ポリメラーゼ活性が温度安定性ポリメラーゼ活性である、実施形態６０に記載のタンパク質。
【００７０】
実施形態６２：上記ポリメラーゼ活性がＤＮＡポリメラーゼ活性である、請求項６０〜６１のいずれか１項に記載のタンパク質。
【００７１】
実施形態６３：上記ＤＮＡポリメラーゼ活性がＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性である、実施形態６２に記載のタンパク質。
【００７２】
実施形態６４：上記変異酵素活性提示部分が酵素である、実施形態４９〜６３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【００７３】
実施形態６５：上記ポリメラーゼ活性提示部位がポリメラーゼである、実施形態５９〜６３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【００７４】
実施形態６６：野生型のポリメラーゼのポリメラーゼの変異体であり、上記ポリメラーゼの変異体が、アミノ酸配列を含み、好ましくは上記アミノ酸配列のアミノ酸がＤ−アミノ酸であり、
上記野生型のポリメラーゼが、配列番号１５に係るアミノ酸配列からなり、好ましくは配列番号１５に係るアミノ酸配列のアミノ酸がＤ−アミノ酸であり、
上記ポリメラーゼの変異体のアミノ酸配列が、少なくとも１つのアミノ酸位置、好ましくは３つのアミノ酸位置で、野生型のポリメラーゼのアミノ酸配列と異なり、かつ／または、
上記ポリメラーゼの変異体のアミノ酸配列が、配列番号１５に係るアミノ酸配列の切断型であり、
上記ポリメラーゼの変異体のアミノ酸配列が、配列番号１５〜２２、および５１のいずれかに係るアミノ酸配列と異なる、
ポリメラーゼの変異体。
【００７５】
実施形態６７：上記ポリメラーゼの変異体のアミノ酸配列が、以下の、配列番号１５に係るアミノ酸配列のアミノ酸位置、またはそれに対応するアミノ酸位置：
ａ）アミノ酸位置７１、７６、６７、もしくは８６のうちの少なくとも１つ、または、
ｂ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および７１、または、
ｃ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および３１、または、
ｄ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および７６、または、
ｅ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および６７、または、
ｆ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および８６、または、
ｇ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および９６、または、
ｈ）アミノ酸位置１５５もしくは２０３および８５、または、
ｉ）アミノ酸位置１５５および２０３および７１、または、
ｊ）アミノ酸位置１５５および２０３および８６、または、
ｋ）アミノ酸位置１５５および２０３および３１、または、
ｌ）アミノ酸位置１５５および２０３および７６、または、
ｍ）アミノ酸位置１５５および２０３および６７、または、
ｎ）アミノ酸位置１５５および２０３および８６、または、
ｏ）アミノ酸位置１５５および２０３および９６、または、
ｐ）アミノ酸位置１５５および２０３および８５
で、配列番号１５に係るアミノ酸配列からなる野生型のポリメラーゼのアミノ酸配列と異なり、
好ましくは、ａ）〜ｐ）のいずれか１つにおいて、位置１５５、２０３、７１、６７、８５、および９６のアミノ酸がシステインにより置換されており、位置３１のアミノ酸がセリンにより置換されており、位置７６のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置８６のアミノ酸がグリシンまたはシステインにより置換されている、
実施形態６６に記載のポリメラーゼの変異体。
【００７６】
実施形態６８：上記ポリメラーゼの変異体が、配列番号８９〜１２０のいずれか１つに係るアミノ酸配列、好ましくは、配列番号８９に係るアミノ酸配列、または配列番号９０に係るアミノ酸配列、または配列番号９４に係るアミノ酸配列、または配列番号９７に係るアミノ酸配列、より好ましくは、配列番号９４に係るアミノ酸配列、または配列番号９７に係るアミノ酸配列、最も好ましくは配列番号９４に係るアミノ酸配列を含む、実施形態６７に記載のポリメラーゼ変異体。
【００７７】
実施形態６９：上記ポリメラーゼの変異体のアミノ酸配列が、配列番号１５に係るアミノ酸配列の切断型であり、上記切断型が、配列番号１５に係るアミノ酸配列のｎ個のＣ末端のアミノ酸を欠いており、ｎが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、および１５を含む群から選択されるいずれかの整数である、実施形態６６に記載のポリメラーゼの変異体。
【００７８】
実施形態７０：上記ポリメラーゼの変異体が、配列番号１２１、１６１、２０１、２４１、および２８１のいずれか１つに係るアミノ酸配列を含む、実施形態６６および６９のいずれか１つに記載のポリメラーゼの変異体。
【００７９】
実施形態７１：上記ポリメラーゼの変異体が、少なくとも１つのアミノ酸位置、好ましくは３つのアミノ酸位置で配列番号１５に係るアミノ酸配列の切断型のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含み、配列番号１５に係るアミノ酸配列の切断型が、配列番号１２１、１６１、２０１、２４１、および２８１のいずれか１つに係るアミノ酸配列である、実施形態６６および６９のいずれか１つに記載のポリメラーゼの変異体。
【００８０】
実施形態７２：上記ポリメラーゼの変異体のアミノ酸配列が、以下の配列番号１２１、１６１、２０１、２４１、および２８１のいずれか１つに係るアミノ酸配列の位置、またはそれに対応するアミノ酸位置：
ａ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは７１、または、
ｂ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは８６、または、
ｃ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは３１、または、
ｄ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは７６、または、
ｅ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは６７、または、
ｆ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは８６、または、
ｇ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは９６、または、
ｈ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは８５
での配列番号１２１、１６１、２０１、２４１、および２８１のいずれか１つのアミノ酸配列と異なり、
好ましくは、ａ）〜ｈ）のいずれか１つにおいて、位置１５５、２０３、７１、６７、８５、および９６のアミノ酸が、システインにより置換されており、位置３１のアミノ酸が、セリンにより置換されており、位置７６のアミノ酸がグリシンまたはアラニンにより置換されており、位置８６のアミノ酸がグリシンまたはシステインにより置換されており、
より好ましくは、ポリメラーゼの変異体のアミノ酸配列が、配列番号１２２〜１６０、１６２〜２００、２０２〜２４０、２４２〜２８０、および２８２〜３３８のいずれか１つに係るアミノ酸配列を含み、最も好ましくは、上記ポリメラーゼの変異体のアミノ酸配列が、配列番号１３５、１７４、２１４、２５４、２９４のいずれか１つに係るアミノ酸配列を含む、
実施形態７１に記載のポリメラーゼの変異体
【００８１】
実施形態７３：上記ポリメラーゼの変異体が、配列番号３３９〜３４３のいずれか１つに係るアミノ酸配列を含む、実施形態６６に記載のポリメラーゼの変異体。
【００８２】
実施形態７４：上記ポリメラーゼの変異体が、少なくとも１つのアミノ酸位置、好ましくは３つのアミノ酸位置で、配列番号１５に係るアミノ酸配列の変異型と異なるアミノ酸配列を含み、配列番号１５に係るアミノ酸配列の変異型が、配列番号３３９〜３４３のいずれか１つに係るアミノ酸配列である、実施形態６６に記載のポリメラーゼの変異体。
【００８３】
実施形態７５：上記ポリメラーゼの変異体のアミノ酸配列が、以下の配列番号３３９〜３４３のいずれか１つに係るアミノ酸配列の位置、またはそれに対応するアミノ酸位置：
ａ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは７１、または、
ｂ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは８６、または、
ｃ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは３１、または、
ｄ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは７６、または、
ｅ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは６７、または、
ｆ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは８６、または、
ｇ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは９６、または、
ｈ）アミノ酸位置１５５および／もしくは２０３および／もしくは８５
で、配列番号３３９〜３４３のいずれか１つのアミノ酸配列と異なり、
好ましくは、ａ）〜ｈ）のいずれか１つにおいて、位置１５５、２０３、７１、６７、８５、および９６のアミノ酸が、システインにより置換されており、位置３１のアミノ酸が、セリンにより置換されており、位置７６のアミノ酸が、グリシンまたはアラニンにより置換されており、位置８６のアミノ酸が、グリシンまたはシステインにより置換されている、
実施形態７４に記載のポリメラーゼの変異体。
【００８４】
実施形態７６：上記ポリメラーゼの変異体のアミノ酸配列のアミノ酸が、Ｄ―アミノ酸である、請求項６６〜７５のいずれか１項に記載のポリメラーゼの変異体。
【００８５】
実施形態７７：上記ポリメラーゼの変異体のアミノ酸配列のアミノ酸が、Ｌ−アミノ酸である、実施形態６６〜７５のいずれか１項に記載のポリメラーゼの変異体。
【００８６】
実施形態７８：Ｌ−核酸の３’末端に１つまたは複数のＬ−ヌクレオチドを付加する方法における変異酵素活性提示部分を含むタンパク質の使用であって、上記タンパク質が、実施形態４９〜６５のいずれか１項に記載のタンパク質である、使用。
【００８７】
実施形態７９：Ｌ−ヌクレオチドの存在下で標的Ｌ−核酸を増幅する方法における変異酵素活性提示部分を含むタンパク質の使用であって、上記タンパク質が、実施形態４９〜６５のいずれか１項に記載のタンパク質である、使用。
【００８８】
実施形態８０：上記標的Ｌ−核酸を増幅する方法が、ポリメラーゼ連鎖反応である、実施形態７９に記載の使用。
【００８９】
実施形態８１：Ｌ−核酸分子に結合する標的分子の同定のための方法であって、以下の、
（ａ）Ｌ−核酸分子の異種性の集合を作製するステップと、
（ｂ）上記標的分子と、ステップ（ａ）のＬ−核酸分子の異種性の集合を接触させるステップと、
（ｃ）上記標的分子により結合されていないＬ−核酸分子を分離するステップと、
（ｄ）上記標的分子により結合されたＬ−核酸分子を増殖するステップであって、上記増殖ステップがタンパク質を使用しており、上記タンパク質が、実施形態４９〜６５のいずれか１つに記載のタンパク質である、ステップと
を含む、方法。
【００９０】
実施形態８２：
（ｅ）上記標的分子により結合されたＬ−核酸分子をシークエンシングするステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）においてシークエンシングしたＬ−核酸分子のヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列の核酸分子を合成するステップと
をさらに含む、実施形態８１に記載の方法。
【００９１】
実施形態８３：ステップ（ａ）のＬ−核酸分子の異種性の集合の核酸分子が、５’末端および３’末端で、プライマー結合部位、およびそれぞれ、ポリメラーゼ連鎖反応によりステップ（ｄ）で得たＬ−核酸分子の増幅を可能にするプライマー結合部位と相補的である配列を含み、上記ポリメラーゼ連鎖反応で使用したポリメラーゼが、実施形態４９〜６５のいずれか１つに記載のタンパク質であり、上記ポリメラーゼ連鎖反応で使用したプライマーが、Ｌ−ヌクレオチドからなり、上記ポリメラーゼ連鎖反応で使用したヌクレオチドが、Ｌ−ヌクレオチドである、実施形態８１〜８２のいずれか１項に記載の方法。
【００９２】
実施形態８４：ステップ（ｄ）の後に
（ｄａ）上記標的分子と上記増幅した核酸分子を接触させるステップ
が導入されており、
ステップ（ｂ）および任意にステップ（ｃ）および／または（ｄ）が、ステップ（ｅ）の前に実行されており、ステップ（ｄａ）、（ｂ）、（ｃ）、および任意に（ｄ）が、１回または数回実行されている、実施形態８１〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【００９３】
実施形態８５：Ｌ−核酸に結合する標的分子が、ＤＮＡである、実施形態８１〜８４のいずれか１項に記載の方法。
【００９４】
実施形態８６：Ｌ−核酸分子に結合する標的分子が、Ｌ−ヌクレオチドからなる、実施形態８１〜８５のいずれか１項に記載の方法。
【００９５】
実施形態８７：タンパク質を生成する方法であって、上記タンパク質がアミノ酸配列からなり、上記アミノ酸配列のアミノ酸がＤ―アミノ酸であり、
（ａ）上記タンパク質の２つ以上のフラグメントが化学的に合成されており、上記フラグメントが全体で、上記タンパク質のアミノ酸配列を形成し、好ましくは上記フラグメントが、固相ペプチド合成により合成されており、
（ｂ）ステップ（ａ）のフラグメントが、セグメントの縮合、天然の化学的なライゲーション、酵素的なライゲーション、またはその組み合わせにより互いに結合しており、
上記タンパク質が、実施形態４９〜６５のいずれか１項に記載のタンパク質である、
方法。
【００９６】
実施形態８８：上記酵素的なライゲーションで使用した酵素が、クロストリパインである、実施形態８７に記載のタンパク質を生成する方法。
【００９７】
発明者らは、驚くべきことに、機能的に活性のあるＤ−アミノ酸からなるタンパク質を化学的に合成することが可能であり、それによって、このようなタンパク質が一般的にはポリメラーゼにより示されるようなサイズを有するようになることを見出した。より具体的には、発明者らは、このようなＤ−タンパク質およびＤ−ポリメラーゼ、すなわちポリメラーゼとして活性のあるＤ−アミノ酸からなるポリメラーゼの合成を可能にする方法に気付いた。この驚くべき知見に基づき、Ｌ−核酸およびＬ−核酸分子の酵素性合成に必要とされるタンパク質および酵素活性が今や利用可能である。Ｌ−核酸およびＬ−核酸分子のこのような酵素性合成は、第一のＬ−核酸の３’末端に１以上のＬ−ヌクレオチドを付加するための方法および、Ｌ−核酸としてのＬ−ヌクレオチドの存在下で標的Ｌ−核酸を増幅するための、すなわち増幅産物がＬ−核酸である方法を含むが、これらに限定されない。
【００９８】
これらの方法および酵素活性は、利用するシュピーゲルマーを同定する代替的過程の一部であるので、シュピーゲルマーを同定するこのような代替的過程が現在、実現できる。
【００９９】
発明者らは、酵素活性が、第一のＬ−核酸の３’末端に１以上のＬ−ヌクレオチドを付加することができる酵素活性提示部分を含むタンパク質の存在下で、１以上のＬ−ヌクレオチドを第一のＬ−核酸と反応させる段階を含む、第一のＬ−核酸の３’末端に対して１以上のＬ−ヌクレオチドを付加するための方法を開発した。
【０１００】
好ましい実施形態において、酵素活性は、第一のＬ−核酸の３’末端に５から２０，０００個のＬ−ヌクレオチド、好ましくは１０から２，０００個のＬ−ヌクレオチド、より好ましくは５０から５００個のＬ−ヌクレオチド、最も好ましくは５０から１００個のＬ−ヌクレオチドを付加することができる。
【０１０１】
「付加する」という用語は、本明細書中で好ましく使用される場合、好ましくは第一のＬ−核酸の３’ＯＨと少なくとも１以上のＬ−ヌクレオチドの１つの５’リン酸との間に３’−５’ホスホジエステル結合を形成させることによる、本発明による、分子間の共有結合、Ｌ−核酸の共有結合およびＬ−核酸への少なくとも１以上のＬ−ヌクレオチドの共有結合である。本発明によると、Ｌ−核酸に付加されるＬ−ヌクレオチドは、Ｌ−ヌクレオチドにより延長されるＬ−核酸の３’末端を形成する。
【０１０２】
好ましい実施形態において、第一のＬ−核酸の３’末端に１以上のＬ−ヌクレオチドを付加するための方法は、第二のＬ−核酸を含み、ここで、好ましくはワトソン−クリック塩基対形成を通じて、第一のＬ−核酸の１つの分子が第二のＬ−核酸の１つの分子とハイブリッド形成する。より好ましい実施形態において、本方法によって、第二のＬ−核酸と相補的である第三のＬ−核酸の合成が可能となり、この第三のＬ−核酸は、第一のＬ−核酸と、第一のＬ−核酸の３’末端、すなわち第一のＬ−核酸に付加されるＬ−ヌクレオチドと、を含み、１以上のＬ−ヌクレオチドが第一のＬ−核酸の３’末端に付加され、その結果、第三のＬ−核酸が得られる。
【０１０３】
本発明による酵素活性提示部分を含むタンパク質は、酵素活性提示部分のみを有するタンパク質および酵素活性提示部分と他の残基または部分とを有するタンパク質を含み、ここでタンパク質の他の残基または部分には酵素活性がない。本発明によると、酵素活性提示部分のアミノ酸配列は、３００から９００個の間のアミノ酸、好ましくは３００から６００個の間のアミノ酸、より好ましくは３００から３６０個の間のアミノ酸、最も好ましくは３４０から３６０個のアミノ酸を含む。
【０１０４】
本発明による酵素活性提示部分を含むタンパク質は、好ましくはポリメラーゼ活性提示部分である。本発明によるポリメラーゼ活性提示部分を含むタンパク質は、ポリメラーゼ活性提示部分のみを有するポリメラーゼおよびポリメラーゼ活性提示部分と他の残基または部分とを有するポリメラーゼを含み、ここでポリメラーゼの他の残基または部分にはポリメラーゼ活性がない。本発明によると、ポリメラーゼ活性提示部分のアミノ酸配列は、３００から９００個の間のアミノ酸、好ましくは３００から６００個の間のアミノ酸、より好ましくは３００から３６０個の間のアミノ酸、最も好ましくは３４０から３６０個のアミノ酸を含む。
【０１０５】
本発明によるポリメラーゼ活性提示部分は、好ましくは温度安定性のポリメラーゼ活性提示部分、より好ましくは温度安定性のＤＮＡポリメラーゼ活性提示部分および最も好ましくは温度安定性のＤＮＡ依存性ＤＮＡ−ポリメラーゼ活性提示部分である。
【０１０６】
本発明によるポリメラーゼ活性提示部分は、好ましくは、ＤＮＡ−ポリメラーゼ活性提示部分、より好ましくはＤＮＡ依存性ＤＮＡ−ポリメラーゼ活性提示部分または温度安定性のＤＮＡ−ポリメラーゼ活性提示部分、最も好ましくは温度安定性のＤＮＡ依存性ＤＮＡ−ポリメラーゼ活性提示部分である。
【０１０７】
酵素活性という用語は、本明細書中で使用される場合、特異的な反応の触媒であり、好ましくは１以上のヌクレオチドを核酸の３’末端に付加すること、核酸および／またはポリメラーゼ活性のアンプリケーション（ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、より好ましくは１以上のＬ−ヌクレオチドをＬ−核酸の３’末端に付加すること、Ｌ−核酸のアンプリケーション（ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ）である。
【０１０８】
本発明によるポリメラーゼ活性という用語は、Ｌ−ヌクレオチドの重合および／またはＬ−核酸へのＬ−ヌクレオチドの重合の、酵素の性能であり、ここで好ましくはＬ−ヌクレオチドはＬ−ヌクレオシド三リン酸である。
【０１０９】
本発明によるポリメラーゼ活性は、好ましくは温度安定性のポリメラーゼ活性、より好ましくは温度安定性のＤＮＡポリメラーゼ活性および最も好ましくは温度安定性のＤＮＡ依存性ＤＮＡ−ポリメラーゼ活性である。
【０１１０】
本発明によるポリメラーゼ活性は、好ましくはＤＮＡ−ポリメラーゼ活性、より好ましくはＤＮＡ依存性ＤＮＡ−ポリメラーゼまたは温度安定性のＤＮＡ−ポリメラーゼ活性、最も好ましくは温度安定性のＤＮＡ依存性ＤＮＡ−ポリメラーゼ活性である。
【０１１１】
既知のポリメラーゼは、天然源由来であるかまたは天然源からのポリメラーゼの最適化もしくは突然変異誘導された変異体である。ポリメラーゼは、キラルな基本単位、すなわちＬ−アミノ酸からなる。結果的に、ポリメラーゼの構造は、本質的にキラルでもあり、その結果、立体特異的な基質認識が起こる。ゆえに、これらの酵素は、適正な、すなわち対応するキラル立体配置の基質分子のみを受容する。したがって、既知のポリメラーゼは、Ｄ−ヌクレオチドまたはＤ−ヌクレオシド三リン酸を重合させ、ここで、これらは、Ｄ−ヌクレオチドからなる相補的Ｄ−核酸鎖を合成するために、鋳型鎖として、Ｄ−ヌクレオチドからなるＤ−核酸を使用する。さらに、鋳型鎖に対して、ポリメラーゼは、場合によっては、鋳型鎖とハイブリッド形成し、Ｄ−ヌクレオチドからなるプライマーを使用する。天然の核酸は、Ｄ−ヌクレオチドから構成され、特にＬ−アミノ酸からなるタンパク質および酵素によって、処理、例えば増幅され得るので、それぞれＬ−アミノ酸からなるこのようなタンパク質および酵素によってＬ−核酸は認識されない。したがって、標的分子または標的構造に結合するＬ−核酸は、シュピーゲルマーとも呼ばれ、このような標的分子または標的構造の天然型を用いてインビトロ選択過程によって直接得ることができない。
【０１１２】
発明者らは、驚くべきことに、Ｌ−核酸鋳型鎖とハイブリッド形成するＬ−ヌクレオチドからなるプライマーにＬ−核酸ヌクレオチドを付加し得るポリメラーゼを作製することができることを見出した。さらに、発明者らは、驚くべきことに、好ましくはポリメラーゼ−連鎖反応（略称ＰＣＲ）として知られる過程においてＬ−核酸の増幅のために使用され得るポリメラーゼを作製することが可能であることを見出した。
【０１１３】
ポリメラーゼは、ヌクレオシド三リン酸を重合させる酵素である。ポリメラーゼは、鋳型核酸鎖に相補的である核酸鎖鎖を合成するために、鋳型核酸鎖を使用する。鋳型核酸鎖に加えて、ポリメラーゼは、場合によっては、鋳型核酸鎖に対して塩基相補性に基づきハイブリッド形成するプライマーを使用する。鋳型核酸鎖、プライマーおよびポリメラーゼにより合成される核酸鎖は、独立にＤＮＡまたはＲＮＡの何れかであり得る。ポリメラーゼは、本明細書中で好ましく使用される場合、ＤＮＡポルメラーゼ（ｐｏｌｍｅｒａｓｅ）およびＲＮＡ−ポリメラーゼ、好ましくはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば逆転写酵素など、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを含む。より好ましくは、ポリメラーゼは温度安定性のポリメラーゼである。ポリメラーゼは、対応するネイティブまたは野生型酵素で見出されるアミノ酸の全てを含有する必要はないが、ポリメラーゼが所望の触媒活性を遂行するのを可能にするのに十分であるもののみ必要である。ある実施形態において、ポリメラーゼ活性は、例えば、５’−３’重合化、５’−３’エキソヌクレアーゼおよび３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を含む触媒活性を含む群から選択される触媒活性である。
【０１１４】
本発明によるポリメラーゼは、Ｄ−アミノ酸からなり、Ｌ−ヌクレオチドまたはＬ−ヌクレオシド三リン酸を重合化し、この本発明によるポリメラーゼは、Ｌ−ヌクレオチドからなる相補的Ｌ−核酸鎖を合成するために、鋳型鎖としてＬ−ヌクレオチドからなるＬ−核酸を使用する。さらに、鋳型鎖に対して、本発明によるポリメラーゼは、場合によっては鋳型鎖とハイブリッド形成し、Ｌ−ヌクレオチドからなるプライマーを使用する。鋳型鎖、プライマーおよび合成核酸鎖は独立にＬ−ＤＮＡまたはＬ−ＲＮＡの何れかであり得る。本発明によるポリメラーゼは、Ｄ−アミノ酸からなるＤＮＡポルメラーゼ（ｐｏｌｍｅｒａｓｅ）およびＤ−アミノ酸からなるＲＮＡ−ポリメラーゼ、好ましくはＤ−アミノ酸からなるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄ−アミノ酸からなる逆転写酵素などのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄ−アミノ酸からなるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよびＤ−アミノ酸からなるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを含む。より好ましくは、本発明によるポリメラーゼは、Ｄ−アミノ酸からなる温度安定性のポリメラーゼである。本発明によるポリメラーゼは、ネイティブ酵素で見出されるアミノ酸の全てを含有する必要はないが、本発明によるポリメラーゼが所望の触媒活性を遂行するのを可能にするのに十分であるもののみ必要である。触媒活性としては、例えば、５’−３’重合化、５’−３’エキソヌクレアーゼおよび３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が挙げられる。
【０１１５】
Ｌ−アミノ酸のみからなるポリメラーゼは、好ましくは本明細書中で「全Ｌ−ポリメラーゼ」と呼ばれる。
【０１１６】
Ｄ−アミノ酸のみからなるポリメラーゼは、好ましくは本明細書中で「全−Ｄポリメラーゼ」と呼ばれる。
【０１１７】
好ましい実施形態において、本発明によるポリメラーゼは、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼＸ、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ポリメラーゼＸコアドメイン、ラットポリメラーゼβ、真核生物ポリメラーゼβ、クレノウ断片、クレノウエキソポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、シーケナーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ポリメラーゼλ、ポリメラーゼＤＰＯ４、好ましくは、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ属、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｉｓｌａｎｄｉｃｕｓ属、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｈｉｂａｔａｅ属、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｅｎｇｃｈｏｎｇｅｎｓｉｓ属、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ属、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ属、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕｔｕｒｂｏ（商標）ポリメラーゼ、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス・ゴルゴナリウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、Ｓａｃポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｐｏｃポリメラーゼ、Ｐａｂポリメラーゼ、Ｍｔｈポリメラーゼ、Ｐｈｏポリメラーゼ、ＥＳ４ポリメラーゼ、ＥＸ−Ｔａｑ（商標）ポリメラーゼ、ＬＡ−Ｔａｑ（商標）ポリメラーゼ、Ｅｘｐａｎｄ（商標）ポリメラーゼ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（商標）Ｔａｑポリメラーゼ、Ｈｉ−Ｆｉ（商標）ポリメラーゼ、Ｔｂｒポリメラーゼ、Ｔｆｌポリメラーゼ、Ｔｒｕポリメラーゼ、Ｔａｃポリメラーゼ、Ｔｎｅポリルネラーゼ（ｐｏｌｙｒｎｅｒａｓｅ）、Ｔｍａポリメラーゼ、Ｔｉｈポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａｑ（商標）、Ｓｔｏｆｆｅｌ断片、９°Ｎｍ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＩ（商標）、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（商標）ポリメラーゼ、Ｐａｑ５０００（商標）、Ｐｆｘ−５０（商標）、Ｐｒｏｏｆｓｔａｒｔ（商標）、ＦｉｄｅｌｉＴａｑ（商標）、エロンガーゼ（商標）およびそれらのそれぞれおよび何れかの変異体の群から選択される。
【０１１８】
より好ましい実施形態において、本発明によるポリメラーゼは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるアフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼＸである。別のより好ましい実施形態において、本発明によるポリメラーゼは、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼＸの変異体、最も好ましくは、配列番号２に記載のアミノ酸配列、配列番号３に記載のアミノ酸配列および配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の選択されるアミノ酸配列のアフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼＸの変異体である。
【０１１９】
より好ましい実施形態において、本発明によるポリメラーゼは、ポリメラーゼＤｐｏ４の変異体もしくは変異型、または切断型であり、ここでポリメラーゼＤｐｏ４が、配列番号１５に係るアミノ酸配列からなり、ポリメラーゼＤｐｏ４の変異体もしくは変異型、または切断型が、配列番号８９〜３４３のいずれかに係るアミノ酸配列を含み、好ましくは、配列番号１５に係るポリメラーゼＤｐｏ４のアミノ酸、および配列番号８９〜３４３のいずれかに係るポリメラーゼＤｐｏ４の変異体もしくは変異型または切断型がＤ−アミノ酸である。別のより好ましい実施形態において、本発明によるポリメラーゼは、ポリメラーゼＤｐｏ４の変異体、最も好ましくは配列番号１６に記載のアミノ酸配列、配列番号１７に記載のアミノ酸配列、配列番号１８に記載のアミノ酸配列、配列番号１９に記載のアミノ酸配列、配列番号２０に記載のアミノ酸配列、配列番号２１に記載のアミノ酸配列および配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の選択されるアミノ酸配列からなるポリメラーゼＤｐｏ４の変異体である。
【０１２０】
ポリメラーゼの変異体もしくは変異型または切断型は、１以上のアミノ酸位置でこのポリメラーゼのアミノ酸配列とは異なるポリメラーゼである。アミノ酸配列中のアミノ酸位置は、好ましくはポリメラーゼのＮ−末端およびＣ−末端に対するその位置および／またはそのアミノ酸の周囲のアミノ酸に対するその位置により決定され、
ａ）ポリメラーゼがＮ−末端で短縮される場合、アミノ酸位置は、ポリメラーゼのＣ−末端に対するその位置により、およびそのアミノ酸の周囲のアミノ酸に対して決定され、
ｂ）ポリメラーゼがＣ−末端で短縮される場合、アミノ酸位置は、ポリメラーゼのＮ−末端に対するその位置により、およびそのアミノ酸の周囲のアミノ酸に対して決定され、
ｂ）ポリメラーゼがＮ−末端およびＣ−末端で短縮される場合、アミノ酸位置は、そのアミノ酸の周囲のアミノ酸に対するその位置によって決定されるようになる。
【０１２１】
本発明の一実施形態では、変異酵素活性提示部分は、酵素活性提示部分の変異体または変異型または切断型であり、酵素活性提示部分が、配列番号１５に係るアミノ酸配列からなり、好ましくは、配列番号１５に係る酵素活性提示部分のアミノ酸がＤ―アミノ酸であり、変異酵素活性提示部分が、本明細書中に開示されるように変異しており、すなわち、配列番号１５の少なくとも１つのアミノ酸位置、好ましくは配列番号１５の３つのアミノ酸位置で変異している。好ましくは、変異酵素活性提示部分は、配列番号８９〜３４３のいずれか１つに係るアミノ酸配列を含み、より好ましくは、配列番号８９〜３４３のいずれか１つに係るアミノ酸配列のアミノ酸は、Ｄ―アミノ酸である。
【０１２２】
本発明のさらなる実施形態では、変異酵素活性提示部分は、本明細書中に開示されるように変異しており、すなわち、変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列が、配列番号１５に係るアミノ酸配列と比較して、配列番号１５の少なくとも１つのアミノ酸位置、好ましくは配列番号１５の３つのアミノ酸位置で変異しており、言い換えると、変異酵素活性提示部分に固有の変異は、変異酵素活性提示部分のアミノ酸配列の区画に属しており、上記変異を除き配列番号１５に係るアミノ酸配列であり、よって、アミノ酸配列において、変異酵素活性提示部分および酵素活性提示部分の両方に含まれている。このような実施形態に関連して、変異酵素活性提示部分は、配列番号１５に係るアミノ酸配列のＮ末端およびＣ末端のいずれかまたは両方に付着した１つまたは複数の追加的なアミノ酸を含んでもよい。
【０１２３】
温度安定性である本発明によるポリメラーゼは、温度上昇によって比較的影響を受けにくい。ある具体的な非限定例において、温度安定性であるポリメラーゼは、少なくとも５０℃、例えば、５０℃の温度、６０℃、７５℃、８０℃、８２℃、８５℃、８８℃、９０℃、９２℃、９５℃以上の温度により影響を受けない。
【０１２４】
Ｌ−ヌクレオシド三リン酸のポリメルセーション（ｐｏｌｙｍｅｒｓａｔｉｏｎ）の過程内で、本ポリメラーゼは、１個のヌクレオシド三リン酸を別のヌクレオシド三リン酸に付加し、好ましくはその結果、核酸とも呼ばれるオリゴヌクレオチドが得られる。好ましい実施形態において、本ポリメラーゼは、１個のヌクレオシド三リン酸のみを１個のヌクレオシド三リン酸にまたは、例えばヌクレオチドが連鎖停止剤ヌクレオチド、例えばジデオキシヌクレオチドである場合、核酸の末端ヌクレオチドに付加する。このような連鎖停止剤ヌクレオチドは、核酸の配列決定を行うために使用され、当業者により知られている。
【０１２５】
Ｌ−核酸、好ましくは標的Ｌ−核酸を増幅するために、Ｌ−ヌクレオシド三リン酸のポリメルセーション（ｐｏｌｙｍｅｒｓａｔｉｏｎ）の過程が使用され得る。
【０１２６】
増幅は、核酸、好ましくは標的Ｌ−核酸のコピー数を増加させる何らかの過程である。
【０１２７】
好ましい実施形態において、標的Ｌ−核酸は、２０から２０，０００個のＬ−ヌクレオチド、好ましくは３０から２，０００個のＬ−ヌクレオチド、より好ましくは４０から５００個のＬ−ヌクレオチド、最も好ましくは５０から１００個のＬ−ヌクレオチドからなる。
【０１２８】
増幅の例は、核酸鋳型に対するプライマーのハイブリッド形成を可能にする条件下で、核酸をプライマー対と接触させるものである。適切な条件下でプライマーに１以上のヌクレオシド三リン酸を付加することによってポリメラーゼによりプライマーを伸長させ、核酸鋳型から解離させ、次いで再アニーリングさせ、伸長させ、解離させて核酸分子のコピー数を増幅させる。インビトロ増幅の産物は、標準的技術を用いて、電気泳動、制限エンドヌクレアーゼ切断パターン、オリゴヌクレオチドハイブリッド形成またはライゲーションおよび／または核酸配列決定によって特徴を調べることができる。
【０１２９】
代替的なインビトロ増幅技術は当業者にとって公知であり、転写フリー等温性増幅、鎖置換増幅およびＮＡＳＢＡ（商標）ＲＮＡ転写フリー増幅を含む。
【０１３０】
増幅方法の一部は、核酸、好ましくは２本鎖核酸を融解させるための反応の加熱および冷却の反復のサイクルからなる温度サイクリングおよび核酸の酵素性複製に依存する。これらの温度サイクリング段階は、核酸融解と呼ばれる過程において高温で２本鎖核酸の２本の鎖を最初に物理的に分離させるために必要である。次に、より低い温度で、標的核酸を選択的に増幅させるためのポリメラーゼによる核酸合成において、各鎖が鋳型として使用される。ポリメラーゼとともに標的領域に相補的な配列を含有するプライマー（この後この方法を示す。）は、選択的および反復性の増幅を可能にする重要な構成要素である。温度サイクリング進行に基づく増幅方法として、作製される核酸はそれ自身、複製のための鋳型として使用され、核酸鋳型が指数関数的に増幅される連鎖反応を引き起こす。
【０１３１】
温度性の増幅による最も著名な増幅方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（略称ＰＣＲ）である。
【０１３２】
プライマーは、ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそれらの組み合わせ、好ましくは、長さが１０ヌクレオチド以上のＤＮＡオリゴヌクレオチドからなる短い核酸分子である。より好ましくは、より長いプライマーは、長さが約１５、２０または２５ヌクレオチド以上であり得る。核酸ハイブリッド形成によって相補的標的核酸鎖とプライマーをアニーリングさせ、プライマーと標的核酸鎖との間でハイブリッドを形成させることができ、次いで、ポリメラーゼプライマー対によって標的核酸鎖に沿って伸長させたプライマーを、例えばＰＣＲまたは当技術分野で公知の他の核酸増幅方法による核酸の増幅のために使用し得る。
【０１３３】
Ｄ−アミノ酸からなる本発明のポリメラーゼの使用によって、プライマーおよび相補的標的核酸鎖がＬ−ヌクレオチドからなるようにすることが必要となる。好ましくは少なくとも１つのプライマーは、Ｌ−ヌクレオチドおよび場合によっては修飾からなる。
【０１３４】
核酸プライマーおよびプローブを調製し、使用するための方法は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｓａｍｂｒｏｃｋら、１９８９）に記載されている。ＰＣＲプライマー対は、例えばプライマーなど、その目的を対象としたコンピュータプログラムを用いることにより、既知の配列由来となることがある。当業者にとって当然のことながら、特定のプローブまたはプライマーの特異性は、その長さに伴い向上する。
【０１３５】
そのため、本発明によるポリメラーゼはＤ−アミノ酸からなる、好ましくはＤ−アミノ酸のみからなる。Ｄ−アミノ酸からなる本発明によるポリメラーゼは、天然源から単離することができず、細菌、酵母、真菌、ウイルスまたは動物細胞を用いた組み換え発現により作製できず、化学的過程、好ましくはライゲーション法と組み合わせた固相ペプチド合成（略称ＳＰＰＳ）などによって作製しなければならない。
【０１３６】
固相ペプチド合成は、ペプチドまたはタンパク質断片の合成に対する最新の技術であり：不溶性であるが多孔性の小型の固形ビーズをペプチド鎖が構築され得る機能的単位（「リンカー」）で処理する。ペプチドは、無水フッ化水素またはトリフルオロ酢酸などの試薬によりビーズから切断されるまで、ビーズに共有結合したままである。したがって、ペプチドは固相上に「固定化」されており、ろ過過程中に保持され得、一方で、液相試薬および合成の副産物が除去される。ＳＰＰＳの全般的な原理は、カップリング−洗浄−脱保護−洗浄の１反復サイクルである。固相連結ペプチドの自由Ｎ末端アミンを１個のＮ−保護アミノ酸単位にカップリングさせる（下記参照）。次に、この単位を脱保護し、これにより、さらなるアミノ酸が連結され得る新しいＮ末端アミンが現れる。この技術の優位性は、一部には、関心のある伸長中のペプチドが全て不溶性樹脂に共有結合されたまま、過剰な試薬を除去する各反応後の洗浄サイクルを行うことができることにある。ＳＰＰＳの主要な使用形態は２種類、ＦｍｏｃおよびＢｏｃがある。アミノ酸単量体のＮ末端は、これらの２つの基の何れかにより保護され、脱保護されたアミノ酸鎖上に付加される。ＳＰＰＳは収率により限定され、一般的には７０個のアミノ酸の範囲のペプチドおよびタンパク質が合成の利用能の限界となっている。合成の困難性は配列にも依存する。２個のペプチドを一緒にカップリングするために、断片縮合、ネイティブ化学ライゲーションまたは酵素性ライゲーションなどのライゲーション法を用いることによって、より大きな合成オリゴペプチドおよびタンパク質が得られるようになり得る。しかし、今までに合成された最大のＤ−タンパク質は、１０２個のＤ−アミノ酸からなる血管由来タンパク質血管内皮増殖因子（略称ＶＥＧＦ−Ａ）のＤ−タンパク質型である（Ｍａｎｄａｌら、２０１２）。
断片縮合は、ペプチドのアミノ酸のその鎖が化学基で完全に保護されているペプチドを使用し、そのペプチドは溶液中でカップリングされる。
【０１３７】
ネイティブ化学ライゲーションは水溶液中で行われる。必要な非保護ペプチド−チオエステル基本単位の調製は難関である。ネイティブ化学ライゲーションにおいて、非保護ペプチド２のＮ末端システイン残基のチオレート基は、ｐＨ７．０、２０℃＜Ｔ＜３７℃の水性緩衝液中で第二の非保護ペプチド１のＣ末端チオエステルを攻撃する。この可逆的トランスチオエステル化段階は、化学選択的であり、位置選択的であり、チオエステル中間体３の形成につながる。この中間体は、分子内Ｓ，Ｎ−アシルシフトにより再編成し、その結果、ライゲーション部位でネイティブアミド（「ペプチド」）結合４が形成される。
【０１３８】
実施例で示されるように、驚くべきことに、発明者らは、ネイティブ化学ライゲーションに必要なＣ末端チオエステルが、酵素性ライゲーション条件下で安定であるので、ネイティブ化学ライゲーションおよび酵素性ライゲーションを組み合わせて使用し得ることを示すことができた。
【０１３９】
Ｄ−ペプチドの酵素性ライゲーションは、次の段階を含むプロテアーゼの使用により作用する：（ａ）独自にＤ−ペプチドであるアミノ構成要素の調製、（ｂ）脱離基を含み、独自にＤ−ペプチドであるカルボキシ構成要素の調製および（ｃ）独自にＤ−ポリペプチドを与えるための、脱離基の切断によりアミノ構成要素とカルボキシ構成要素との間でペプチド結合を形成させるためのプロテアーゼ存在下でのアミノ構成要素およびカルボキシ構成要素の反応（ＷＯ２００３０４７７４３参照）。好ましくはプロテアーゼはクロストリパインである。
【０１４０】
本発明のポリメラーゼはまた、本発明のポリメラーゼ、および特に本明細書中で開示される特定の配列と基本的に相同であるポリメラーゼも含む。実質的に相同である、という用語は、相同性が少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％および最も好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を超えるものなどと理解されたい。
【０１４１】
本発明のポリメラーゼ活性提示部分はまた、本発明のポリメラーゼ活性提示部分および特に本明細書中で開示される特定の配列と基本的に相同であるポリメラーゼ活性提示部分も含む。実質的に相同である、という用語は、相同性が少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％および最も好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を超えるものなどと理解されたい。
【０１４２】
本発明のポリメラーゼまたは本発明発明のポリメラーゼ活性提示部分に存在する相同アミノ酸の実際のパーセンテージは、ポリメラーゼまたはポリメラーゼ活性提示部分に存在するアミノ酸の総数に依存する。％修飾は、ポリメラーゼまたはポリメラーゼ活性提示部分に存在するアミノ酸の総数に基づき得る。
【０１４３】
２つのポリメラーゼまたは２つのポリメラーゼ活性提示部分間の相同性は、当業者にとって公知のように決定され得る。より具体的には、指定のプログラムパラメーターに基づき、参照配列に対する試験配列についてのパーセント配列相同性を計算するために配列比較アルゴリズムを使用し得る。試験配列は、好ましくは、相同であると言われるかまたは相同であるか否か、相同である場合は、異なるポリメラーゼまたはポリメラーゼ活性提示部分に対してどの程度相同であるかを試験しようとするポリメラーゼまたはポリメラーゼ活性提示部分であり、そのため、このような異なるポリメラーゼまたはポリメラーゼ活性提示部分は相同性参照配列とも呼ばれる。例えばＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのローカル相同性アルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１）によって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同性アラインメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０）によって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似度法に対する検索（Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８）によって、これらのアルゴリズムのコンピュータでの実行によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．における、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）または目視によって、比較のためのポリメラーゼのアミノ酸配列の最適アラインメントを行い得る。
【０１４４】
パーセント配列同一性を決定するために適切であるアルゴリズムの一例は、ベーシック・ローカル・アラインメント検索ツール（本明細書中で以後、「ＢＬＡＳＴ」）において使用されるアルゴリズムであり、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７）参照。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（本明細書中で以後「ＮＣＢＩ」）を通じて公開されている。ＮＣＢＩから入手可能なソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴＮ（ヌクレオチド配列用）およびＢＬＡＳＴＰ（アミノ酸配列用）を用いて配列同一性を決定する際に使用される初期設定パラメーターは、ＭｃＧｉｎｎｉｓら（ＭｃＧｉｎｎｉｓら、２００４）に記載されている。
【０１４５】
本発明のポリメラーゼはまた、本発明のポリメラーゼおよび特に本明細書中で開示される本発明の特定のポリメラーゼに対してある一定の同一性を有し、それらのアミノ酸配列によって定められるポリメラーゼも含む。より好ましくは、本発明はまた、本発明のポリメラーゼおよび特に本明細書中で開示され、それらのアミノ酸配列またはその一部により定められる本発明の特定のポリメラーゼ対して少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％および最も好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を超える同一性を有し、それらのアミノ酸配列またはそれらの一部により定められるポリメラーゼも含む。
【０１４６】
本発明のポリメラーゼ活性提示部分は、本発明のポリメラーゼ活性提示部分および特に本明細書中で開示され、それらのアミノ酸配列により定められる本発明の特定のポリメラーゼ活性提示部分に対してある一定の同一性を有するポリメラーゼ活性提示部分も含む。より好ましくは、本発明はまた、本発明のポリメラーゼ活性提示部分および特に本明細書中で開示され、それらのアミノ酸配列またはそれらの一部により定められる本発明の特定のポリメラーゼ活性提示部に対して、少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％および最も好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を超える同一性を有するポリメラーゼ活性提示部分も含む。
【０１４７】
本願に関連して、核酸分子および核酸という用語は、別段の断りが明確に示されない場合は交換可能に使用される。
【０１４８】
好ましく本明細書中で使用される場合、「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｉｃｄおよびｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）」は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、例えばデオキシリボ核酸（略称ＤＮＡ）およびリボ核酸（略称ＲＮＡ）などを指す。さらに「核酸」という用語は複数の核酸を含む。「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｉｃｄおよびｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）」という用語はまた、ヌクレオチド類似体、１本鎖（センスまたはアンチセンス）および２本鎖のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドからなるＲＮＡまたはＤＮＡの何れかの同等物、変異体および類似体を含むとも理解されたい。デオキシリボヌクレオチドには、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシンおよびデオキシチミジンが含まれる。リボヌクレオチドには、アデノシン、シチジン、グアノシンおよびウリジンが含まれる。「ポリヌクレオチド」としての核酸分子への言及は、１本鎖のまたは２本鎖の分子を含む、共有結合により連結される２以上のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を意味するためにその広義の意味で使用される。「オリゴヌクレオチド」という用語はまた、共有結合によって連結される２以上のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を意味するためにも本明細書中で使用されるが、本明細書中で定義されるように、オリゴヌクレオチドは、１００ヌクレオチド未満を含む。
【０１４９】
核酸は、核酸を形成する連続ヌクレオチド全てが互いに１以上の共有結合により連結または結合されることを特徴とする。より具体的には、このようなヌクレオチドのそれぞれは、２個の他のヌクレオチドに、好ましくはホスホジエステル結合または他の結合を通じて連結または結合され、一続きの連続ヌクレオチドを形成する。しかし、このような配置において、このような配置が直鎖状であり、環状配置でなく、したがって環状分子でなく直鎖状であるという前提下で、２つの末端ヌクレオチド、すなわち好ましくは５’末端および３’末端のヌクレオチドは、それぞれ１個のヌクレオチドにのみ連結される。
【０１５０】
本願の別の実施形態において、核酸は少なくとも２つの連続ヌクレオチド群を含み、それにより連続ヌクレオチドの各群内で、各ヌクレオチドが２個の他のヌクレオチドに、好ましくはホスホジエステル結合または他の結合を通じて連結または結合され、一続きの連続ヌクレオチドが形成される。しかし、このような配置において、２個の末端ヌクレオチド、すなわち好ましくは５’末端および３’末端のヌクレオチドは、それぞれ１個のヌクレオチドにのみ連結される。しかし、このような実施形態において、連続ヌクレオチドの２つの群は、共有結合を通じて互いに連結または結合されず、共有結合、好ましくはこの２つのヌクレオチドの一方の糖部分とこの２つのヌクレオチドまたはヌクレオシドの他のホスホール部分との間で形成される共有結合を通じて、一方の群の１ヌクレオチドおよび別のまたは他方の群の１ヌクレオチドを連結する。しかし、代替的な実施形態において、連続ヌクレオチドの２つの群は、共有結合、好ましくはこの２つのヌクレオチドの一方の糖部分とこの２つのヌクレオチドまたはヌクレオシドの他方のホスホール部分との間で形成される共有結合を通じて１つの群の１ヌクレオチドおよび別のまたは他の群の１ヌクレオチドを連結する共有結合を通じて互いに対して連結または結合される。好ましくは、連続ヌクレオチドの少なくとも２群は共有結合を通じて連結されることはない。別の好ましい実施形態において、ホスホジエステル結合とは異なる共有結合を通じて少なくとも２群が連結される。
【０１５１】
核酸という用語は、好ましくはＤ−核酸またはＬ−核酸の何れかも包含する。好ましくは、核酸はＬ−核酸である。さらに、核酸の１または数個の部分がＤ−核酸として存在し、核酸の少なくとも１または数個の部分がＬ−核酸であり得る。核酸の「一部分」という用語は、１ヌクレオチドのような小さいものを意味する。このような核酸は、一般に本明細書中でそれぞれＤ−およびＬ−核酸と呼ばれる。したがって、好ましい実施形態において、本発明による核酸は、Ｌ−ヌクレオチドからなり、少なくとも１つのＤ−ヌクレオチドを含む。好ましくは、このようなＤ−ヌクレオチドは、一続きの何れかおよび何れかの核酸の末端に連結される。
【０１５２】
Ｌ−核酸は、本明細書中で使用される場合、Ｌ−ヌクレオチドからなる、好ましくは完全にＬ−ヌクレオチドからなる核酸である。
【０１５３】
Ｄ−核酸は、本明細書中で使用される場合、Ｄ−ヌクレオチドからなる、好ましくは完全にＤ−ヌクレオチドからなる核酸である。
【０１５４】
また、別段の指示がない場合、何れのヌクレオチド配列も、本明細書中で５’→３’方向に示される。
【０１５５】
核酸が、Ｄ−ヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチドまたは、例えば無作為である両者の組み合わせまたは少なくとも１つのＬ−ヌクレオチドおよび少なくとも１つのＤ−核酸からなる一続きの定められた配列からなるか否かに関わりなく、核酸分子は、デスオキシリボヌクレオチド（ｄｅｓｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、リボヌクレオチドまたはそれらの組み合わせからなり得る。
【０１５６】
核酸が、Ｄ−ヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチド、これらの混合物、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはそれぞれおよび何らかのそれらの組み合わせであるか否かにかかわらず、核酸という用語は、本明細書中で好ましく使用される場合、１本鎖核酸および２本鎖核酸も包含し、それにより好ましくは本発明による方法に供される場合の核酸分子は１本鎖核酸である。
【０１５７】
核酸という用語は、本明細書中で好ましく使用される場合、修飾核酸も包含する。修飾核酸は、ヌクレオチド−修飾ＲＮＡまたはヌクレオチド−修飾ＤＮＡ分子であり得、それにより、ヌクレアーゼ耐性基、例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｈ（概説についてはＵｓｍａｎ  ＆  Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２参照）での修飾により安定性を促進するために、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子は個々のヌクレオチドにおいて大規模に修飾される。
【０１５８】
核酸という用語は、本明細書中で好ましく使用される場合、完全に閉じた核酸も包含する。核酸に対する、完全に閉じた、すなわち環状構造は、ヌクレオチド配列が本発明により決定されるべきである核酸が、好ましくは共有結合を通じて閉じている場合に認められ、それによって、より好ましくはこのような共有結合は、本明細書中で開示されるように、核酸分子配列の５’末端と３’末端との間で形成される。
【０１５９】
核酸という用語は、好ましく使用される場合、非核酸分子部分を含むあらゆる核酸分子も包含する。このような非核酸分子部分は、次でより詳細に概説するように、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、様々な基を含む群から選択され得る。したがって、核酸という用語は、少なくとも１つの核酸部分および、細胞など、生体系への核酸分子の送達を促進するために使用され得る少なくとも１つのさらなる部分を含む複合物および／または複合体も包含する。提供される複合物および複合体は、細胞膜を横切って治療化合物を移送し、薬物動態を変化させ、および／または本発明の核酸の局在性を調節することによって治療活性を付与し得る。これらの種類の複合物および複合体は、好ましくは、細胞膜を横切る、低分子、脂質、リン脂質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、抗体、毒素、負電荷ポリマーおよび他のポリマー、例えばタンパク質、ペプチド、ホルモン、炭水化物、ポリエチレングリコールまたはポリアミンを含むがこれらに限定されない分子の送達に適切である。一般に、記載される輸送体は、分解性リンカーありまたはなしで、個別にまたは多構成要素系の一部としての何れかで使用されるように設計される。これらの化合物は、血清の存在下または非存在下で、異なる組織由来の多くの細胞タイプへの核酸分子の送達および／または局在を向上させると予想される（米国特許第ＵＳ５，８５４，０３８号参照）。本明細書中に記載の分子の複合物は、生体分解性核酸リンカー分子など、生体分解性であるリンカーを介して生物学的活性分子に結合させ得る。
【０１６０】
配列を決定しようとする核酸に関する次の記述で詳述されるように、非核酸部分は、ＰＥＧ部分、すなわちポリ（エチレングリコール）部分またはＨＥＳ部分、すなわちヒドロキシエチルデンプン部分であり得る。
【０１６１】
直接的にまたはリンカーを通じて、の何れかで、非核酸部分および好ましくはＰＥＧおよび／またはＨＥＳ部分を核酸分子に結合させ得る。核酸分子が１以上の修飾、好ましくは１以上のＰＥＧおよび／またはＨＥＳ部分を含むことも本発明の範囲内である。実施形態において、個別のリンカー分子によって、複数のＰＥＧ部分またはＨＥＳ部分が核酸分子に結合される。本発明に関連して使用されるリンカーは、それ自身、直鎖状または分岐状の何れかであり得る。これらの種類のリンカーは、当業者にとって公知であり、特許出願ＷＯ２００５／０７４９９３およびＷＯ２００３／０３５６６５にさらに記載されている。
【０１６２】
好ましい実施形態において、リンカーは生体分解性リンカーである。生体分解性リンカーによって、とりわけ、動物の身体、核酸分子からの修飾物の放出ゆえに、好ましくはヒトの身体における、滞留時間に関して、核酸分子の特徴を改変することが可能となる。生体分解性リンカーの使用によって、核酸分子の滞留時間をより良好に制御できるようになり得る。このような生体分解性リンカーの好ましい実施形態は、国際特許出願ＷＯ２００６／０５２７９０、ＷＯ２００８／０３４１２２、ＷＯ２００４／０９２１９１およびＷＯ２００５／０９９７６８に記載のものなどであるがそれらに限定されない生体分解性リンカーであり、したがって、国際特許出願ＷＯ２００４／０９２１９１およびＷＯ２００５／０９９７６８において、リンカーは、本明細書中で記載のような１または２個の修飾物、核酸分子およびその間の生体分解性リンカーからなる、ポリマー性オリゴヌクレオチドプロドラッグの一部である。
【０１６３】
本明細書中で好ましく使用される場合、「ヌクレオチド」は、天然のＤＮＡヌクレオシド一−、二−および三リン酸：デオキシアデノシン一−、二−および三リン酸；デオキシグアノシン一−、二−および三リン酸；デオキシチミジン一−、二−および三リン酸；およびデオキシシチジン一−、二−および三リン酸を含むがこれらに限定されない。（本明細書中で、それぞれｄＡ、ｄＧ、ｄＴおよびｄＣまたはＡ、Ｇ、ＴおよびＣと呼ぶ。）。ヌクレオチドという用語はまた、天然のＲＮＡヌクレオシド一−、二−および三リン酸：アデノシン一−、二−および三リン酸；グアニン一−、二−および三リン酸；ウリジン一−、二−および三リン酸；シチジン一−、二−および三リン酸（本明細書中でそれぞれＡ、Ｇ、ＵおよびＣと呼ぶ。）も含み；核酸分子、すなわちＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子の単量体の単位である塩基−糖−リン酸の組み合わせを指す。しかし、言い換えると、「ヌクレオチド」という用語は、環状フラノシド型糖（ＲＮＡ中のｐ−Ｄ／Ｌ−リボースおよびＤＮＡ中のＰ−Ｄ／Ｌ−２’−デオキシリボース）を含有する何らかの化合物を指し、これは、５’位置でリン酸化されており、−グリコシルＣ１’−Ｎ結合を介してＣ−１’糖位置に連結されるプリンまたはピリミジン型塩基の何れかを有する。ヌクレオチドは、とりわけ修飾塩基（例えば５−メチルシトシン）および修飾糖基（例えば２’−Ｏ−メチルリボシル、２’−Ｏ−メトキシエチルリボシル、２’−フルオロリボシル、２’−アミノリボシルなど）による修飾ヌクレオチドを有するヌクレオチドを含むマス修飾ヌクレオチドを含め、天然または合成であり得る。
【０１６４】
「核酸塩基」という用語は、天然の核酸塩基アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）ならびに非天然の核酸塩基、例えばキサンチン、ジアミノプリン、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン、７−デアザキサンチン、７−デアザグアニン、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、Ｎ６，Ｎ６−エタノ−２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン、５〜（Ｃ３−Ｃ６）−アルキニル−シトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、シュードイソシトシン、２−ヒドロキシ−５−メチル−４−トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシンなど、およびＦｒｅｉｅｒ  ＆  Ａｌｔｍａｎｎ（Ｆｒｅｉｅｒ  ＆  Ａｌｔｍａｎｎ，１９９７）の刊行物における米国特許ＵＳ５，４３２，２７２号に記載の「非天然の」核酸塩基を包含する。したがって、「核酸塩基」という用語は、既知のプリンおよびピリミジン複素環だけでなく、複素環類似体およびその互変異性体も含む。
【０１６５】
１本鎖核酸が個別および安定な三次元構造を形成し得、抗体のような標的分子に特異的に結合し得ることは本発明の範囲内である。Ｄ−ヌクレオチドから構成されるこのような核酸分子はアプタマーと呼ばれる。アプタマーは、いくつかの標的分子、例えば低分子、タンパク質、核酸に対して、および細胞、組織および生物に対しても同定され得、特異的な標的分子のインビトロおよび／またはインビボ機能を阻害し得る。アプタマーは通常、インビトロ選択と呼ばれる標的に対する選択過程または指数関数的進化によるリガンドの系統的進化（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙＥｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ、略称ＳＥＬＥＸ）（Ｂｏｃｋら、１９９２；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ＆  Ｓｚｏｓｔａｋ，１９９０；Ｔｕｅｒｋ  ＆  Ｇｏｌｄ，１９９０）によって同定される。主に、ヌクレアーゼ分解および腎臓による身体からのクリアランスゆえに、非修飾アプタマーは血量から迅速に排除され、半減期は分単位から時間単位であるが、これはアプタマーが本質的に低分子量であるからである。それゆえに、アプタマーを治療に使用するためには、糖の２’位（例えばリボース）骨格でこれらが修飾されねばならない（Ｂｕｒｍｅｓｔｅｒら、２００６）。
【０１６６】
アプタマーの不安定性の主因である偏在ヌクレアーゼは、キラル基本単位、すなわちＬ−アミノ酸からなる。結果的に、ヌクレアーゼの構造は、本質的にキラルでもあり、その結果、立体特異的な基質認識が起こる。それゆえに、これらの酵素は、適正なキラル立体配置の基質分子のみを受容する。アプタマーおよび天然の核酸分子はＤ−ヌクレオチドから構成されるので、Ｌ−オリゴヌクレオチドは、酵素的認識および続く分解から逃れるはずである。残念ながら、同じ原理ゆえに、この場合では、このような鏡像核酸を増幅するための酵素活性が自然には得られなかった。したがって、ＳＥＬＥＸ過程を使用して、Ｌ−核酸アプタマーを直接得ることができない。とはいえ、立体化学の原理から、所望の機能的Ｌ−核酸アプタマーへと最終的につながる迂回路が明らかとなる。
【０１６７】
インビトロで選択された（Ｄ−）アプタマーがその天然の標的に結合する場合、このアプタマーの構造鏡像は、天然標的の鏡像と同じ特徴により結合する。ここで、両相互作用パートナーは、同じ（非天然）キラリティーを有する。生命体および殆どの生化学的化合物のホモキラリティーゆえに、このようなエナンチオ−ＲＮＡリガンドは、当然ではあるが、実際の使用には制限がある。一方で、（非天然）鏡像標的に対してＳＥＬＥＸ過程が行われる場合、この（非天然）標的を認識するアプタマーが得られる。このアプタマー−所望のＬ−アプタマーの対応する鏡像立体配置は、同様に天然標的を認識する。生体安定性核酸分子の生成のためのこの鏡像選択過程は、最初に１９９６年（Ｋｌｕｓｓｍａｎｎら、１９９６；Ｎｏｌｔｅら、１９９６）に公開され、これにより、ある標的分子に対する高い親和性および特異性だけでなく、同時に生体安定性も示す、機能性の鏡像核酸分子リガンドが生成される。１本鎖核酸分子が、「シュピーゲルマー」（ドイツ語の「Ｓｐｉｅｇｅｌ」鏡より）と呼ばれるこのようなリガンド−結合Ｌ−核酸であることは本発明の範囲内である（「Ｔｈｅ  Ａｐｔａｍｅｒ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」；ｅｄｓ．Ｋｌｕｓｓｍａｎｎ，２００６参照）。
【０１６８】
とりわけ、本発明による核酸は、好ましくは本発明による核酸の検出を可能にする修飾を含み得る。このような修飾は、好ましくは放射性、酵素性および蛍光標識を含む群から選択される。このような修飾はまた、それ自身、放射性、酵素性および蛍光標識を含む群から選択される修飾により修飾され得るＤ−ヌクレオチドからも選択される。
【０１６９】
本明細書中で使用される場合の、核酸、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質の様々な配列番号、化学的性質、その実際の配列および内部参照番号を次の表でまとめる。
表１（Ａ）本願において参照される配列
【表１】
0006670237.tif 000002
0006670237.tif 000003
0006670237.tif 000004
0006670237.tif 000005
0006670237.tif 000006
0006670237.tif 000007
0006670237.tif 000008
0006670237.tif 000009
0006670237.tif 000010
0006670237.tif 000011
0006670237.tif 000012
0006670237.tif 000013
0006670237.tif 000014
0006670237.tif 000015
0006670237.tif 000016
0006670237.tif 000017
0006670237.tif 000018
0006670237.tif 000019
0006670237.tif 000020
0006670237.tif 000021
0006670237.tif 000022
0006670237.tif 000023
0006670237.tif 000024
0006670237.tif 000025
0006670237.tif 000026
0006670237.tif 000027
0006670237.tif 000028
0006670237.tif 000029
0006670237.tif 000030
0006670237.tif 000031
0006670237.tif 000032
0006670237.tif 000033
0006670237.tif 000034
0006670237.tif 000035
0006670237.tif 000036
0006670237.tif 000037
0006670237.tif 000038
0006670237.tif 000039
0006670237.tif 000040
0006670237.tif 000041
0006670237.tif 000042
0006670237.tif 000043
0006670237.tif 000044
0006670237.tif 000045
0006670237.tif 000046
0006670237.tif 000047
0006670237.tif 000048
【０１７０】
上記のものは、それらが本発明と関連して使用された場合、分子の代表であることを理解されたい。添付の配列リストは、単にアミノ酸またはそのヌクレオチド配列を反映するだけのものであり、上記の表で示されるようなその分子のさらなる特性を何ら反映するものではない。
【０１７１】
本発明は、さらなる特性、実施形態および長所が汲み取られ得る、図面、実施例および配列表によりさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【０１７２】
【図１Ａ】図１Ａは、Ｌ−ポリメラーゼＸの活性試験のための１−ギャップＤ−ＤＮＡ鋳型の組成を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、Ｌ−ポリメラーゼＸの活性試験のための６−ギャップＤ−ＤＮＡ鋳型の組成を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、ＵＰＬＣ（Ａ）および質量分析（Ｂ）による、合成Ｄ−ポリペプチド生成物Ａｃ−ＭＬＴＬＩＱＧＫＫＩＶＮＨＬＲＳＲＬＡＦＥＹＮＧＱＬＩＫＩＬＳＫＮＩＶＡＶＧＳＬ−ＯＧｐ（１）の分析を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＵＰＬＣ（Ａ）および質量分析（Ｂ）による、合成Ｄ−ポリペプチド生成物Ａｃ−ＭＬＴＬＩＱＧＫＫＩＶＮＨＬＲＳＲＬＡＦＥＹＮＧＱＬＩＫＩＬＳＫＮＩＶＡＶＧＳＬ−ＯＧｐ（１）の分析を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、ＵＰＬＣ（Ａ）および質量分析（Ｂ）による、合成Ｄ−ポリペプチド生成物Ｈ−ＲＲＥＥＫＭＬＮＤＶＤＬＬＩＩＶＰＥＫＫＬＬＫＨＶＬＰＮＩＲＩＫＧＬＳＦＳＶＫＡ−ＳＭｅ（２）の分析を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＵＰＬＣ（Ａ）および質量分析（Ｂ）による、合成Ｄ−ポリペプチド生成物Ｈ−ＲＲＥＥＫＭＬＮＤＶＤＬＬＩＩＶＰＥＫＫＬＬＫＨＶＬＰＮＩＲＩＫＧＬＳＦＳＶＫＡ−ＳＭｅ（２）の分析を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、ＵＰＬＣ（Ａ）および質量分析（Ｂ）による、合成Ｄ−ポリペプチド生成物Ｈ−ＣＧＥＲＫＣＶＬＦＩＥＷＥＫＫＴＹＱＬＤＬＦＴＡＬＡＥＥＫＰＹＡＩＦＨＦＴＧＰＶＳＹＬＩＲＩＲＡＡＬＫＫＫＮＹＫＬＮＱＹＧＬＦＫＮＱＴＬＶＰＬＫＩＴＴＥＫＥＬＩＫＥＬＧＦＴＹＲＩＰＫＫＲＬ−ＯＨ（３）の分析を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＵＰＬＣ（Ａ）および質量分析（Ｂ）による、合成Ｄ−ポリペプチド生成物Ｈ−ＣＧＥＲＫＣＶＬＦＩＥＷＥＫＫＴＹＱＬＤＬＦＴＡＬＡＥＥＫＰＹＡＩＦＨＦＴＧＰＶＳＹＬＩＲＩＲＡＡＬＫＫＫＮＹＫＬＮＱＹＧＬＦＫＮＱＴＬＶＰＬＫＩＴＴＥＫＥＬＩＫＥＬＧＦＴＹＲＩＰＫＫＲＬ−ＯＨ（３）の分析を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、ＵＰＬＣ（Ａ）および質量分析（Ｂ）による、合成Ｄ−ポリペプチド生成物Ａｃ−ＭＬＴＬＩＱＧＫＫＩＶＮＨＬＲＳＲＬＡＦＥＹＮＧＱＬＩＫＩＬＳＫＮＩＶＡＶＧＳＬＲＲＥＥＫＭＬＮＤＶＤＬＬＩＩＶＰＥＫＫＬＬＫＨＶＬＰＮＩＲＩＫＧＬＳＦＳＶＫＡ−ＳＭｅ（４）の分析を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＵＰＬＣ（Ａ）および質量分析（Ｂ）による、合成Ｄ−ポリペプチド生成物Ａｃ−ＭＬＴＬＩＱＧＫＫＩＶＮＨＬＲＳＲＬＡＦＥＹＮＧＱＬＩＫＩＬＳＫＮＩＶＡＶＧＳＬＲＲＥＥＫＭＬＮＤＶＤＬＬＩＩＶＰＥＫＫＬＬＫＨＶＬＰＮＩＲＩＫＧＬＳＦＳＶＫＡ−ＳＭｅ（４）の分析を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）および質量分析（Ｂ）による、ネイティブ化学ライゲーションＤ−ポリペプチド生成物Ａｃ−ＭＬＴＬＩＱＧＫＫＩＶＮＨＬＲＳＲＬＡＦＥＹＮＧＱＬＩＫＩＬＳＫＮＩＶＡＶＧＳＬＲＲＥＥＫＭＬＮＤＶＤＬＬＩＩＶＰＥＫＫＬＬＫＨＶＬＰＮＩＲＩＫＧＬＳＦＳＶＫＡＣＧＥＲＫＣＶＬＦＩＥＷＥＫＫＴＹＱＬＤＬＦＴＡＬＡＥＥＫＰＹＡＩＦＨＦＴＧＰＶＳＹＬＩＲＩＲＡＡＬＫＫＫＮＹＫＬＮＱＹＧＬＦＫＮＱＴＬＶＰＬＫＩＴＴＥＫＥＬＩＫＥＬＧＦＴＹＲＩＰＫＫＲＬ−ＯＨ（５）の分析を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）および質量分析（Ｂ）による、ネイティブ化学ライゲーションＤ−ポリペプチド生成物Ａｃ−ＭＬＴＬＩＱＧＫＫＩＶＮＨＬＲＳＲＬＡＦＥＹＮＧＱＬＩＫＩＬＳＫＮＩＶＡＶＧＳＬＲＲＥＥＫＭＬＮＤＶＤＬＬＩＩＶＰＥＫＫＬＬＫＨＶＬＰＮＩＲＩＫＧＬＳＦＳＶＫＡＣＧＥＲＫＣＶＬＦＩＥＷＥＫＫＴＹＱＬＤＬＦＴＡＬＡＥＥＫＰＹＡＩＦＨＦＴＧＰＶＳＹＬＩＲＩＲＡＡＬＫＫＫＮＹＫＬＮＱＹＧＬＦＫＮＱＴＬＶＰＬＫＩＴＴＥＫＥＬＩＫＥＬＧＦＴＹＲＩＰＫＫＲＬ−ＯＨ（５）の分析を示す。
【図７】図７は、Ｄ−ポリメラーゼＸの活性試験のための１−ギャップＬ−ＤＮＡ鋳型の組成を示す。
【図８】図８は、１−ギャップ基質におけるＤ−ポリメラーゼＸのＬ−ＤＮＡ伸長活性アッセイのゲル電気泳動を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、Ｄ−ポリメラーゼＸの活性試験のための６−ギャップＬ−ＤＮＡ鋳型の組成を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、６−ギャップ基質におけるＤ−ポリメラーゼＸのＬ−ＤＮＡ伸長活性アッセイのゲル電気泳動を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、Ｌ−ポリメラーゼＸの活性アッセイのためのプライマー−鋳型複合Ｄ−ＤＮＡ基質を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、一定温度で行われたＬ−ポリメラーゼＸのＤ−ＤＮＡ伸長活性アッセイのゲル電気泳動を示す。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、温度サイクリング用いて行われたＬ−ポリメラーゼＸのＤ−ＤＮＡ伸長活性アッセイのゲル電気泳動を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）およびＬＣ−ＥＳＩ質量分析（Ｂ）による合成全−Ｌ−ポリメラーゼｄｐｏ４変異体Ａ１５５Ｃの分析を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）およびＬＣ−ＥＳＩ質量分析（Ｂ）による合成全−Ｌ−ポリメラーゼｄｐｏ４変異体Ａ１５５Ｃの分析を示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、Ｌ−ポリメラーゼｄｐｏ４変異体Ａ１５５Ｃ、Ｖ２０３Ｃ、Ｃ３１ＳおよびＡ１５５Ｃ／Ｖ２０３ＣのＤ−ＤＮＡ  ＰＣＲ活性アッセイのゲル電気泳動を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、組み換えおよび合成Ｌ−ポリメラーゼｄｐｏ４のＤ−ＤＮＡ  ＰＣＲ活性アッセイのゲル電気泳動を示す。
【図１２Ｃ】Ｌ―ポリメラーゼｄｐｏ４の変異体Ａ７１Ｃ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃ、Ｓ８６Ｃ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３ＣおよびＣ３１Ｓ／Ｓ８６Ｃ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３ＣのＤ−ＤＮＡ  ＰＣＲ活性アッセイのゲル電気泳動を示す。
【図１２Ｄ】Ｌ―ポリメラーゼｄｐｏ４の変異体Ｍ７６Ｇ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３ＣおよびＭ７６Ａ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３ＣのＤ−ＤＮＡ  ＰＣＲ活性アッセイのゲル電気泳動を示す。
【図１２Ｅ】Ｌ―ポリメラーゼｄｐｏ４の変異体Ｉ６７Ｃ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃ、Ｓ８６Ｇ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３ＣおよびＳ９６Ｃ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３ＣのＤ−ＤＮＡ  ＰＣＲ活性アッセイのゲル電気泳動を示す。
【図１２Ｆ】Ｌ―ポリメラーゼｄｐｏ４のＣ末端のトランケーション形態Δ３、Δ６、Δ９、Δ１２、およびΔ１５のＤ−ＤＮＡ  ＰＣＲ活性アッセイのゲル電気泳動を示す。
【図１３】図１３は、質量分析による合成Ｄ−ポリペプチド生成物Ｈ−ＲＴＦＰＨＧＩＳＫＥＴＡＹＳＥＳＶＫＬＬＱＫＩＬＥＥＤＥＲＫＩＲＲＩＧＶＲＦＳＫＦＩＥＡＩＧＬＤＫＦＦＤＴ−ＮＨ２（１）の分析を示す。
【図１４】図１４は、質量分析による合成Ｄ−ポリペプチド生成物Ｂｏｃ−ＶＤＴＬＳＩＥＦＤＫＬＫＧＭＩＧＥＡＫＡＫＹＬＩＳＬＡＲＤＥＹＮＥＰＩＲＴＲＶＲＫＳＩＧＲＩＶＴＭＫＲＮＳＲＮＬＥＥＩＫＰＹＬＦＲＡＩＥＥＳＹＹＫＬＤＫＲＩＰＫＡＩＨＶＶＡＶＴＥＤＬＤＩＶＳＲＧ−ＯＨ（２）の分析を示す。
【図１５】図１５は、質量分析による断片縮合Ｄ−ポリペプチド生成物Ｈ−ＶＤＴＬＳＩＥＦＤＫＬＫＧＭＩＧＥＡＫＡＫＹＬＩＳＬＡＲＤＥＹＮＥＰＩＲＴＲＶＲＫＳＩＧＲＩＶＴＭＫＲＮＳＲＮＬＥＥＩＫＰＹＬＦＲＡＩＥＥＳＹＹＫＬＤＫＲＩＰＫＡＩＨＶＶＡＶＴＥＤＬＤＩＶＳＲＧＲＴＦＰＨＧＩＳＫＥＴＡＹＳＥＳＶＫＬＬＱＫＩＬＥＥＤＥＲＫＩＲＲＩＧＶＲＦＳＫＦＩＥＡＩＧＬＤＫＦＦＤＴ−ＮＨ２（３）の分析を示す。
【図１６Ａ】図１６Ａは、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ａ）および質量分析（Ｂ）による合成Ｄ−ポリペプチド生成物Ｚ−ＣＤＭＡＫＰＮＧＩＫＶＩＤＤＥＥＶＫＲＬＩＲＥＬＤＩＡＤＶＰＧＩＧＮＩＴＡＥＫＬＫＫＬＧＩＮＫＬ−ベンジル−チオエステル（４）の分析を示す。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ａ）および質量分析（Ｂ）による合成Ｄ−ポリペプチド生成物Ｚ−ＣＤＭＡＫＰＮＧＩＫＶＩＤＤＥＥＶＫＲＬＩＲＥＬＤＩＡＤＶＰＧＩＧＮＩＴＡＥＫＬＫＫＬＧＩＮＫＬ−ベンジル−チオエステル（４）の分析を示す。
【図１７Ａ】図１７Ａは、ＵＰＬＣ（Ａ）および質量分析（Ｂ）による合成Ｄ−ポリペプチド生成物Ｈ−ＲＫＥＶＹＱＱＶＳＳＲＩＭＮＬＬＲＥＹＳＥＫＩＥＩＡＳＩＤＥＡＹＬＤＩＳＤＫＶＲＤＹＲＥＡＹＮＬＧＬＥＩＫＮＫＩＬＥＫＥＫＩＴＶＴＶＧＩＳＫＮＫＶＦＡＫＩＡ−ＳＭｅ（７）の分析を示す。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、ＵＰＬＣ（Ａ）および質量分析（Ｂ）による合成Ｄ−ポリペプチド生成物Ｈ−ＲＫＥＶＹＱＱＶＳＳＲＩＭＮＬＬＲＥＹＳＥＫＩＥＩＡＳＩＤＥＡＹＬＤＩＳＤＫＶＲＤＹＲＥＡＹＮＬＧＬＥＩＫＮＫＩＬＥＫＥＫＩＴＶＴＶＧＩＳＫＮＫＶＦＡＫＩＡ−ＳＭｅ（７）の分析を示す。
【図１８Ａ】図１８Ａは、ＵＰＬＣ（Ａ）および質量分析（Ｂ）による合成Ｄ−ポリペプチド生成物Ａｃ−ＭＩＶＬＦＶＤＦＤＹＦＹＡＱＶＥＥＶＬＮＰＳＬＫＧＫＰＶＶＶＣＶＦＳＧＲＦＥＤＳＧＡＶＡＴＡＮＹＥＡＲＫＦＧＶＫＡＧＩＰＩＶＥＡＫＫＩＬＰＮＡＶＹＬＰＭ−ＯＧｐ（６）の分析を示す。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、ＵＰＬＣ（Ａ）および質量分析（Ｂ）による合成Ｄ−ポリペプチド生成物Ａｃ−ＭＩＶＬＦＶＤＦＤＹＦＹＡＱＶＥＥＶＬＮＰＳＬＫＧＫＰＶＶＶＣＶＦＳＧＲＦＥＤＳＧＡＶＡＴＡＮＹＥＡＲＫＦＧＶＫＡＧＩＰＩＶＥＡＫＫＩＬＰＮＡＶＹＬＰＭ−ＯＧｐ（６）の分析を示す。
【図１９Ａ】図１９Ａ−Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）およびＥＳＩ質量分析（Ｂ）によるクロストリパインが介在するＤ−ポリペプチドライゲーション生成物Ａｃ−ＭＩＶＬＦＶＤＦＤＹＦＹＡＱＶＥＥＶＬＮＰＳＬＫＧＫＰＶＶＶＣＶＦＳＧＲＦＥＤＳＧＡＶＡＴＡＮＹＥＡＲＫＦＧＶＫＡＧＩＰＩＶＥＡＫＫＩＬＰＮＡＶＹＬＰＭＲＫＥＶＹＱＱＶＳＳＲＩＭＮＬＬＲＥＹＳＥＫＩＥＩＡＳＩＤＥＡＹＬＤＩＳＤＫＶＲＤＹＲＥＡＹＮＬＧＬＥＩＫＮＫＩＬＥＫＥＫＩＴＶＴＶＧＩＳＫＮＫＶＦＡＫＩＡ−ＳＭｅ（８）の分析を示す。
【図１９Ｂ】図１９Ａ−Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）およびＥＳＩ質量分析（Ｂ）によるクロストリパインが介在するＤ−ポリペプチドライゲーション生成物Ａｃ−ＭＩＶＬＦＶＤＦＤＹＦＹＡＱＶＥＥＶＬＮＰＳＬＫＧＫＰＶＶＶＣＶＦＳＧＲＦＥＤＳＧＡＶＡＴＡＮＹＥＡＲＫＦＧＶＫＡＧＩＰＩＶＥＡＫＫＩＬＰＮＡＶＹＬＰＭＲＫＥＶＹＱＱＶＳＳＲＩＭＮＬＬＲＥＹＳＥＫＩＥＩＡＳＩＤＥＡＹＬＤＩＳＤＫＶＲＤＹＲＥＡＹＮＬＧＬＥＩＫＮＫＩＬＥＫＥＫＩＴＶＴＶＧＩＳＫＮＫＶＦＡＫＩＡ−ＳＭｅ（８）の分析を示す。
【図２０Ａ】図２０Ａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）およびＬＣ−ＥＳＩ質量分析（Ｂ）による、全−Ｌ−ポリメラーゼｄｐｏ４断片１５５−３５２（Ｖ２０３Ｃ）のネイティブ化学ライゲーション生成物の分析を示す。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）およびＬＣ−ＥＳＩ質量分析（Ｂ）による、全−Ｌ−ポリメラーゼｄｐｏ４断片１５５−３５２（Ｖ２０３Ｃ）のネイティブ化学ライゲーション生成物の分析を示す。
【図２１】ＵＰＬＣによる合成されたＤ−ポリペプチド生成物Ｈ−ＣＶＹＬＰＭＲＫＥＶＹＱＱＶＳＳＲＩＭＮＬＬＲＥＹＳＥＫＩＥＩＡＳＩＤＥＡＹＬＤＩＳＤＫＶＲＤＹＲＥＡＹＮＬＧＬＥＩＫＮＫＩＬＥＫＥＫＩＴＶＴＶＧＩＳＫＮＫＶＦＡＫＩＡ−ＳＢｚｌ（９）の分析を示す。
【図２２】質量分析による合成されたＤ−ポリペプチド生成物Ｈ−ＣＶＹＬＰＭＲＫＥＶＹＱＱＶＳＳＲＩＭＮＬＬＲＥＹＳＥＫＩＥＩＡＳＩＤＥＡＹＬＤＩＳＤＫＶＲＤＹＲＥＡＹＮＬＧＬＥＩＫＮＫＩＬＥＫＥＫＩＴＶＴＶＧＩＳＫＮＫＶＦＡＫＩＡ−ＳＢｚｌ（９）の分析を示す。
【図２３】ＵＰＬＣによる合成されたＤ−ポリペプチド生成物Ａｃ−ＭＩＶＬＦＶＤＦＤＹＦＹＡＱＶＥＥＶＬＮＰＳＬＫＧＫＰＶＶＶＣＶＦＳＧＲＦＥＤＳＧＡＶＡＴＡＮＹＥＡＲＫＦＧＶＫＡＧＩＰＩＶＥＡＫＫＩＬＰＮ−ＳＢｚｌ（１１）の分析を示す。
【図２４】質量分析による合成されたＤ−ポリペプチド生成物Ａｃ−ＭＩＶＬＦＶＤＦＤＹＦＹＡＱＶＥＥＶＬＮＰＳＬＫＧＫＰＶＶＶＣＶＦＳＧＲＦＥＤＳＧＡＶＡＴＡＮＹＥＡＲＫＦＧＶＫＡＧＩＰＩＶＥＡＫＫＩＬＰＮ−ＳＢｚｌ（１１）の分析を示す。
【図２５Ａ】ＵＰＬＣ（Ａ）およびＥＳＩ−ＬＣ−ＭＳ（Ｂ）による合成されたＤ−ポリペプチド生成物Ｚ−ＣＤＭＡＫＰＮＧＩＫＶＩＤＤＥＥＶＫＲＬＩＲＥＬＤＩＡＤＶＰＧＩＧＮＩＴＡＥＫＬＫＫＬＧＩＮＫＬ−ベンジル−チオエステル（７）の分析を示す。
【図２５Ｂ】ＵＰＬＣ（Ａ）およびＥＳＩ−ＬＣ−ＭＳ（Ｂ）による合成されたＤ−ポリペプチド生成物Ｚ−ＣＤＭＡＫＰＮＧＩＫＶＩＤＤＥＥＶＫＲＬＩＲＥＬＤＩＡＤＶＰＧＩＧＮＩＴＡＥＫＬＫＫＬＧＩＮＫＬ−ベンジル−チオエステル（７）の分析を示す。
【図２６Ａ】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）およびＥＳＩ−ＬＣ−ＭＳ（Ｂ）によるすべてのＤ−ペプチドの天然の化学的なライゲーション生成物Ｈ−ＣＤＭＡＫＰＮＧＩＫＶＩＤＤＥＥＶＫＲＬＩＲＥＬＤＩＡＤＶＰＧＩＧＮＩＴＡＥＫＬＫＫＬＧＩＮＫＬＣＤＴＬＳＩＥＦＤＫＬＫＧＭＩＧＥＡＫＡＫＹＬＩＳＬＡＲＤＥＹＮＥＰＩＲＴＲＶＲＫＳＩＧＲＩＶＴＭＫＲＮＳＲＮＬＥＥＩＫＰＹＬＦＲＡＩＥＥＳＹＹＫＬＤＫＲＩＰＫＡＩＨＶＶＡＶＴＥＤＬＤＩＶＳＲＧＲＴＦＰＨＧＩＳＫＥＴＡＹＳＥＳＶＫＬＬＱＫＩＬＥＥＤＥＲＫＩＲＲＩＧ  ＶＲＦＳＫＦＩＥＡＩＧＬＤＫＦＦＤＴ−ＮＨ２（８）の分析を示す。
【図２６Ｂ】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）およびＥＳＩ−ＬＣ−ＭＳ（Ｂ）によるすべてのＤ−ペプチドの天然の化学的なライゲーション生成物Ｈ−ＣＤＭＡＫＰＮＧＩＫＶＩＤＤＥＥＶＫＲＬＩＲＥＬＤＩＡＤＶＰＧＩＧＮＩＴＡＥＫＬＫＫＬＧＩＮＫＬＣＤＴＬＳＩＥＦＤＫＬＫＧＭＩＧＥＡＫＡＫＹＬＩＳＬＡＲＤＥＹＮＥＰＩＲＴＲＶＲＫＳＩＧＲＩＶＴＭＫＲＮＳＲＮＬＥＥＩＫＰＹＬＦＲＡＩＥＥＳＹＹＫＬＤＫＲＩＰＫＡＩＨＶＶＡＶＴＥＤＬＤＩＶＳＲＧＲＴＦＰＨＧＩＳＫＥＴＡＹＳＥＳＶＫＬＬＱＫＩＬＥＥＤＥＲＫＩＲＲＩＧ  ＶＲＦＳＫＦＩＥＡＩＧＬＤＫＦＦＤＴ−ＮＨ２（８）の分析を示す。
【図２７Ａ】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）およびＥＳＩ−ＬＣ−ＭＳ（Ｂ）によるすべてのＤ−ペプチドの天然の化学的ライゲーション生成物Ａｃ−ＭＩＶＬＦＶＤＦＤＹＦＹＡＱＶＥＥＶＬＮＰＳＬＫＧＫＰＶＶＶＣＶＦＳＧＲＦＥＤＳＧＡＶＡＴＡＮＹＥＡＲＫＦＧＶＫＡＧＩＰＩＶＥＡＫＫＩＬＰＮＣＶＹＬＰＭＲＫＥＶＹＱＱＶＳＳＲＩＭＮＬＬＲＥＹＳＥＫＩＥＩＡＳＩＤＥＡＹＬＤＩＳＤＫＶＲＤＹＲＥＡＹＮＬＧＬＥＩＫＮＫＩＬＥＫＥＫＩＴＶＴＶＧＩＳＫＮＫＶＦＡＫＩＡ−ＳＢｚｌ（１１）の分析を示す。
【図２７Ｂ】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）およびＥＳＩ−ＬＣ−ＭＳ（Ｂ）によるすべてのＤ−ペプチドの天然の化学的ライゲーション生成物Ａｃ−ＭＩＶＬＦＶＤＦＤＹＦＹＡＱＶＥＥＶＬＮＰＳＬＫＧＫＰＶＶＶＣＶＦＳＧＲＦＥＤＳＧＡＶＡＴＡＮＹＥＡＲＫＦＧＶＫＡＧＩＰＩＶＥＡＫＫＩＬＰＮＣＶＹＬＰＭＲＫＥＶＹＱＱＶＳＳＲＩＭＮＬＬＲＥＹＳＥＫＩＥＩＡＳＩＤＥＡＹＬＤＩＳＤＫＶＲＤＹＲＥＡＹＮＬＧＬＥＩＫＮＫＩＬＥＫＥＫＩＴＶＴＶＧＩＳＫＮＫＶＦＡＫＩＡ−ＳＢｚｌ（１１）の分析を示す。
【図２８Ａ】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＡおよびＢ）およびＥＳＩ−ＬＣ−ＭＳ（Ｃ）によるすべてのＤ−ポリメラーゼのＤｐｏ４変異体Ａ７１Ｃ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃの天然の化学的なライゲーション生成物の分析を示す。
【図２８Ｂ】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＡおよびＢ）およびＥＳＩ−ＬＣ−ＭＳ（Ｃ）によるすべてのＤ−ポリメラーゼのＤｐｏ４変異体Ａ７１Ｃ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃの天然の化学的なライゲーション生成物の分析を示す。
【図２８Ｃ】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＡおよびＢ）およびＥＳＩ−ＬＣ−ＭＳ（Ｃ）によるすべてのＤ−ポリメラーゼのＤｐｏ４変異体Ａ７１Ｃ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃの天然の化学的なライゲーション生成物の分析を示す。
【図２９】ＵＰＬＣによる合成されたＤ−ポリペプチド生成物Ｈ−ＲＫＥＶＹＱＱＶＳＳＲＩＭＮＬＬＲＥＹＳＥＫＩＥＩＡＳＩＤＥＡＹＬＤＩＳＤＫＶＲＤＹＲＥＡＹＮＬＧＬＥＩＫＮＫＩＬＥＫＥＫＩＴＶＴＶＧＩＳＫＮＫＶＦＡＫＩＡ−ＳＢｚｌ（９）の分析を示す。
【図３０】質量分析による合成されたＤ−ポリペプチド生成物Ｈ−ＲＫＥＶＹＱＱＶＳＳＲＩＭＮＬＬＲＥＹＳＥＫＩＥＩＡＳＩＤＥＡＹＬＤＩＳＤＫＶＲＤＹＲＥＡＹＮＬＧＬＥＩＫＮＫＩＬＥＫＥＫＩＴＶＴＶＧＩＳＫＮＫＶＦＡＫＩＡ−ＳＢｚｌ（９）の分析を示す。
【図３１】ＵＰＬＣによる合成されたＤ―ポリペプチド生成物Ａｃ−ＭＩＶＬＦＶＤＦＤＹ  ＦＹＡＱＶＥＥＶＬＮＰ  ＳＬＫＧＫＰＶＶＶ  ＣＶＦＳＧＲＦＥＤＳ  ＧＡＶＡＴＡＮＹＥＡ  ＲＫＦＧＶＫＡＧＩＰ  ＩＶＥＡＫＫＩＬＰＮ  ＡＶＹＬＰＧ−ＯＧｐ（１０）の分析を示す。
【図３２】質量分析による合成されたＤ−ポリメラーゼ生成物Ａｃ−ＭＩＶＬＦＶＤＦＤＹ  ＦＹＡＱＶＥＥＶＬＮＰ  ＳＬＫＧＫＰＶＶＶ  ＣＶＦＳＧＲＦＥＤＳ  ＧＡＶＡＴＡＮＹＥＡ  ＲＫＦＧＶＫＡＧＩＰ  ＩＶＥＡＫＫＩＬＰＮ  ＡＶＹＬＰＧ−ＯＧｐ（１０）の分析を示す。
【図３３Ａ】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ａ）およびＥＳＩ−ＬＣ−ＭＳ（Ｂ）によるプロテアーゼにより触媒されたすべてのＤ−ライゲーション生成物Ａｃ−ＭＩＶＬＦＶＤＦＤＹＦＹＡＱＶＥＥＶＬＮＰＳＬＫＧＫＰＶＶＶＣＶＦＳＧＲＦＥＤＳＧＡＶＡＴＡＮＹＥＡＲＫＦＧＶＫＡＧＩＰＩＶＥＡＫＫＩＬＰＮＡＶＹＬＰＧＲＫＥＶＹＱＱＶＳＳＲＩＭＮＬＬＲＥＹＳＥＫＩＥＩＡＳＩＤＥＡＹＬＤＩＳＤＫＶＲＤＹＲＥＡＹＮＬＧＬＥＩＫＮＫＩＬＥＫＥＫＩＴＶＴＶＧＩＳＫＮＫＶＦＡＫＩＡ−ＳＢｚｌ（１１）の分析を示す。
【図３３Ｂ】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ａ）およびＥＳＩ−ＬＣ−ＭＳ（Ｂ）によるプロテアーゼにより触媒されたすべてのＤ−ライゲーション生成物Ａｃ−ＭＩＶＬＦＶＤＦＤＹＦＹＡＱＶＥＥＶＬＮＰＳＬＫＧＫＰＶＶＶＣＶＦＳＧＲＦＥＤＳＧＡＶＡＴＡＮＹＥＡＲＫＦＧＶＫＡＧＩＰＩＶＥＡＫＫＩＬＰＮＡＶＹＬＰＧＲＫＥＶＹＱＱＶＳＳＲＩＭＮＬＬＲＥＹＳＥＫＩＥＩＡＳＩＤＥＡＹＬＤＩＳＤＫＶＲＤＹＲＥＡＹＮＬＧＬＥＩＫＮＫＩＬＥＫＥＫＩＴＶＴＶＧＩＳＫＮＫＶＦＡＫＩＡ−ＳＢｚｌ（１１）の分析を示す。
【図３４】ＵＰＬＣプロファイル（ａ）および質量スペクトル（ｂ）による、合成された粗製のすべてのＤ―ペプチド  Ｈ−ＫＡＩＨＶＶＡＶＴ  ＥＤＬＤＩＶＳＲＧＲ  ＴＦＰＨＧＩＳＫＥＴ  ＡＹＳＥＳＶＫＬＬＱ  ＫＩＬＥＥＤＥＲＫＩ  ＲＲＩＧＶＲＦＳＫＦ  ＩＥＡＩＧＬＤＫＦＦ  ＤＴ−ＮＨ２（１）の分析を示す。
【図３５】ＵＰＬＣプロファイル（ａ）および質量スペクトル（ｂ）による、合成された粗製のすべてのＤ―ペプチドＨ−ＣＤＴＬＳＩＥＦ  ＤＫＬＫＧＭＩＧＥＡ  ＫＡＫＹＬＩＳＬＡＲ  ＤＥＹＮＥＰＩＲＴＲ  ＶＲＫＳＩＧＲＩＶＴ  ＭＫＲＮＳＲＮＬＥＥ  ＩＫＰＹＬＦＲＡＩＥ  ＥＳＹＹＫＬＤＫＲＩ  Ｐ−ＯＨ（３）の分析を示す。
【図３６】ＵＰＬＣプロファイル（ａ）および質量スペクトル（ｂ）による、フラグメントの縮合により合成されたＨ−ＣＤＴＬＳＩＥＦ  ＤＫＬＫＧＭＩＧＥＡ  ＫＡＫＹＬＩＳＬＡＲ  ＤＥＹＮＥＰＩＲＴＲ  ＶＲＫＳＩＧＲＩＶＴ  ＭＫＲＮＳＲＮＬＥＥ  ＩＫＰＹＬＦＲＡＩＥ  ＥＳＹＹＫＬＤＫＲＩ  ＰＫＡＩＨＶＶＡＶＴ  ＥＤＬＤＩＶＳＲＧＲ  ＴＦＰＨＧＩＳＫＥＴ  ＡＹＳＥＳＶＫＬＬＱ  ＫＩＬＥＥＤＥＲＫＩ  ＲＲＩＧＶＲＦＳＫＦ  ＩＥＡＩＧＬＤＫＦＦ  ＤＴ−ＮＨ２（５）の分析を示す。
【図３７】ＵＰＬＣプロファイル（ａ）および質量スペクトル（ｂ）による、合成および精製したすべてのＤ−ペプチドＨ−ＣＶＹＬＰＭＲＫＥＶ  ＹＱＱＶＳＳＲＩＭＮ  ＬＬＲＥＹＳＥＫＩＥ  ＩＡＳＩＤＥＡＹＬＤ  ＩＳＤＫＶＲＤＹＲＥ  ＡＹＮＬＧＬＥＩＫＮ  ＫＩＬＥＫＥＫＩＴＶ  ＴＶＧＩＳＫＮＫＶＦ  ＡＫＩＡ−ＮＨＮＨ２の分析を示す。
【０１７３】
（実施例）
実施例で使用される場合の略語
ＡＣＮ  アセトニトリル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，ドイツシュネルドルフ）
ＤＣＭ  ジクロロメタン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，ドイツシュネルドルフ）
ＤＩＰＥＡ  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，ドイツシュネルドルフ）
ＥＤＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，ドイツシュネルドルフ）
Ｆｍｏｃ  ９−フルオレニル−メトキシカルボニル−
ＨＡＴＵ  （２−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）（ＣｒｅｏＳａｌｕｓ，米国ケンタッキー州ルイビル）
ＨＦＩＰ  １，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロホスフェート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，ドイツシュネルドルフ）
ＨＰＬＣ  高速液体クロマトグラフィー（高圧液体クロマトグラフィーと呼ばれることもある。）
ＭｅＩｍ  メチルイミダゾール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，ドイツシュネルドルフ）
ＭｅＯＨメタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，ドイツシュネルドルフ）
ＭＳＮＴ  １−（メシチレン−２−スルホニル）−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ，ドイツダルムシュタット）
ＮＭＰ  Ｎ−メチル−ピロリドン（Ｉｒｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ，ドイツマルクトレドヴィッツ）
ＰｙＢＯＰ  （ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧＡＡ，ドイツダルムシュタット）
ＳＤＳ  ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，ドイツシュネルドルフ）
ＴＢＴＵ  Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ，ドイツダルムシュタット）
ｔＢｕ  （ｔｅｒｔ．−ブチル−）
ＴＦＡ  トリフルオロ酢酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，ドイツシュネルドルフ）
ＴＦＥ  １，１，１−トリフルオロエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，ドイツシュネルドルフ）
ＴＨＦ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，ドイツシュネルドルフ）
ＴＩＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，ドイツシュネルドルフ）
ＴＬＣ  薄層クロマトグラフィー
Ｔｒｉｓ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，ドイツシュネルドルフ）
ＵＰＬＣ  超高速液体クロマトグラフィー
【０１７４】
（実施例１）−ポリメラーゼＸの野生型および変異体の組み換え発現および精製
アフリカブタ熱ウイルス（略称ＡＳＦＶ）からのポリメラーゼＸは、１９９７年にＯｌｉｖｅｒｏｓらにより記載され、特徴が調べられた。ポリメラーゼＸの野生型遺伝子は、開始コドンおよび終止コドンを含む、僅か５２５塩基対のオープンリーディングフレーム（略称ＯＲＦ）を有する（Ｏｌｉｖｅｒｏｓら、１９９７）。コードされるタンパク質の長さは僅か１７４アミノ酸である。この例は、どのようにポリメラーゼＸならびにそれらの変異体がＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現され、Ｈｉｓ６−Ｔａｇを用いて精製されたかを説明する。
【０１７５】
１．１  発現コンストラクト
ＡＳＦＶのコドン使用はＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）と異なるので、ポリメラーゼＸに対するＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）−コドン最適化合成遺伝子をＧｅｎｅＡｒｔ  ＡＧ（ドイツレーゲンスブルク）から購入した。本合成遺伝子配列は、ｐＣＲ４−Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター（元の会社：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ドイツカールスルーエ）中で提供された。開始コドンおよび２つの終止コドンを含むコドン最適化オープンリーディングフレームは、次の配列：ＡＴＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＴＴＣＡＧＧＧＣＡＡＡＡＡＡＡＴＣＧＴＧＡＡＣＣＡＴＣＴＧＣＧＴＡＧＣＣＧＴＣＴＧＧＣＣＴＴＴＧＡＡＴＡＴＡＡＣＧＧＣＣＡＧＣＴＧＡＴＴＡＡＡＡＴＴＣＴＧＡＧＣＡＡＡＡＡＣＡＴＴＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＧＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＣＧＴＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＴＧＣＴＧＡＡＣＧＡＴＧＴＧＧＡＴＣＴＧＣＴＧＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＣＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＣＴＧＣＴＧＡＡＡＣＡＴＧＴＧＣＴＧＣＣＧＡＡＣＡＴＴＣＧＴＡＴＴＡＡＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＴＴＡＧＣＧＴＧＡＡＡＧＴＧＴＧＣＧＧＣＧＡＡＣＧＴＡＡＡＴＧＣＧＴＧＣＴＧＴＴＴＡＴＣＧＡＡＴＧＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＴＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＴＴＴＡＣＣＧＣＧＣＴＧＧＣＣＧＡＡＧＡＡＡＡＡＣＣＧＴＡＴＧＣＧＡＴＣＴＴＴＣＡＴＴＴＴＡＣＣＧＧＴＣＣＧＧＴＧＡＧＣＴＡＴＣＴＧＡＴＴＣＧＴＡＴＴＣＧＴＧＣＧＧＣＧＣＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＴＡＣＡＡＡＣＴＧＡＡＣＣＡＧＴＡＴＧＧＣＣＴＧＴＴＴＡＡＡＡＡＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＧＴＧＣＣＧＣＴＧＡＡＡＡＴＴＡＣＣＡＣＣＧＡＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＡＴＴＡＡＡＧＡＡＣＴＧＧＧＣＴＴＴＡＣＣＴＡＴＣＧＣＡＴＴＣＣＧＡＡＡＡＡＡＣＧＣＣＴＧＴＡＡＴＡＡを有した。
【０１７６】
全−ＬポリメラーゼＸとも呼ばれるポリメラーゼＸに対する発現コンストラクトを得るために、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩによってポリメラーゼＸの遺伝子をｐＣＲ４−Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯから切り出し、ｐＲＳＥＴ−Ａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ドイツカールスルーエ）中でサブクローニングした。付加したＨｉｓ６−ＴａｇをＮ−末端にサブクローニングし、この遺伝子をＴ７プロモーターの調節下に置いた。コンストラクトをｐＭＪ１４と名付け、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）での全−ＬポリメラーゼＸの発現のために使用した。ｐＭＪ１４から発現されたタンパク質ポリメラーゼＸは２１０個のアミノ酸の次の配列：ＭＲＧＳＨＨＨＨＨＨＧＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧＲＤＬＹＤＤＤＤＫＤＲＷＧＳＭＬＴＬＩＱＧＫＫＩＶＮＨＬＲＳＲＬＡＦＥＹＮＧＱＬＩＫＩＬＳＫＮＩＶＡＶＧＳＬＲＲＥＥＫＭＬＮＤＶＤＬＬＩＩＶＰＥＫＫＬＬＫＨＶＬＰＮＩＲＩＫＧＬＳＦＳＶＫＶＣＧＥＲＫＣＶＬＦＩＥＷＥＫＫＴＹＱＬＤＬＦＴＡＬＡＥＥＫＰＹＡＩＦＨＦＴＧＰＶＳＹＬＩＲＩＲＡＡＬＫＫＫＮＹＫＬＮＱＹＧＬＦＫＮＱＴＬＶＰＬＫＩＴＴＥＫＥＬＩＫＥＬＧＦＴＹＲＩＰＫＫＲＬを有した。
【０１７７】
最初の３６個のアミノ酸は、数個のスペーサーアミノ酸およびいくつかの他の配列タグを含むＨｉｓ６−Ｔａｇに相当した（Ｔ７遺伝子１０リーダー、抗発現エピトープ）。最後の１７４個のアミノ酸部分は、ＡＳＦＶで見られるようなポリメラーゼＸタンパク質配列と同一であった。
【０１７８】
製造者のプロトコールに従い、市販のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＧｍｂＨ，ドイツヴァルトブロン）を用いて、全−ＬポリメラーゼＸの変異体に対する発現コンストラクトを作製した。プラスミドｐＭＪ１４を鋳型とした。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅに必要なオリゴヌクレオチドは、ＮＯＸＸＯＮの施設で合成したか（ＱＣ１０＿ｕｐ、ＱＣ１０＿ｌｏｗ）、またはＰｕｒｉｍｅｘ（ドイツグレーベンシュタイン）から購入したか（ＱＣ２６＿ｕｐ、ＱＣ２６＿ｌｏｗ、ＱＣ２７＿ｕｐ、ＱＣ２７＿ｌｏｗ、ＱＣ３１＿ｕｐ、ＱＣ３１＿ｌｏｗ）の何れかであった。次の変異体発現コンストラクトを作製し、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）での全−Ｌポリメラーゼの変異体の発現のために使用した。
【表２】
0006670237.tif 000049
【０１７９】
１．２  Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるタンパク質発現
発現コンストラクトｐＭＪ１４を用いてＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）で全−Ｌ−ポリメラーゼＸを発現させた。ｐＭＪ１３０、ｐＭＪ３５６、ｐＭＪ３５７またはｐＭＪ４１２から全−Ｌ−ポリメラーゼＸの変異体を発現させた。発現のために、コンピーテントＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の「ＢＬ−２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ’」（Ｎｏｖａｇｅｎ／ＶＷＲ、ドイツドレスデン）において適切な発現コンストラクトを形質転換し、抗生物質アンピシリンを用いて維持した。６００ｎｍでの光学密度がおよそ０．６に到達するまで、２ＹＴ培地中で培養物を３７℃で増殖させた。次いで、０．４ｍＭの最終濃度まで、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（略称ＩＰＴＧ）を添加することによって、タンパク質発現を誘導した。３０℃で発現を４時間行った。遠心によって細胞を回収し、−８０℃で保存するか、またはすぐに処理した。
【０１８０】
１．３  タンパク質精製
「溶解および結合（ｌｙｓｅ  ａｎｄ  ｂｉｎｄ）緩衝液」（５０ｍＭ  Ｎａ−リン酸、ｐＨ７．５、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、４０ｍＭイミダゾール）中、新鮮または凍結Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を氷上で再懸濁し、「フレンチプレス」（Ｇ．Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，
ドイツシュヴェービッシュ・グミュント）細胞破壊装置を用いて溶解させた。「Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ」材料（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツヒルデン）を用いて４℃で精製を行った。溶出緩衝液（５０ｍＭ  Ｎａ−リン酸、ｐＨ７．５、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭイミダゾール）を用いて、段階溶出を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ドイツカールスルーエ）を用いて分画を分析し、プールし、必要に応じて「Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗ」材料（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ドイツフライブルク）を用いて「ＡＫＴＡ  ｐｕｒｉｆｉｅｒ」システム上で陰イオン−イオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製した。ＭＡＬＤＩ質量分析によってタンパク質同一性を確認し、的確な分画をプールし、濃縮し、再緩衝化した。２５ｍＭ  Ｎａ−リン酸、ｐＨ７．５、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０％グリセロールからなる緩衝液中で精製タンパク質を−２０℃で保存した。ウシ血清アルブミン（略称ＢＳＡ）標準物質を用いてＢＣＡ−タンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ドイツボン）によってタンパク質濃度を評価した。
【０１８１】
実施例２−ポリメラーゼＸおよびポリメラーゼＸの変異体の活性確認
オリゴヌクレオチドにより形成される様々なタイプの基質複合体を用いて、全−Ｌ−ポリメラーゼＸおよび全−Ｌ−ポリメラーゼＸの変異体（実施例１参照）に対する活性アッセイを行ったが、この基質およびオリゴヌクレオチドはＤ−ＤＮＡ−ヌクレオチドからなる。
【０１８２】
２．１  １−ヌクレオチドギャップを有する基質における活性アッセイ
１−ギャップ基質に対するオリゴヌクレオチドのリスト：
【表３】
0006670237.tif 000050
【０１８３】
３３個のヌクレオチドからなるＤＮＡオリゴヌクレオチドの鋳型鎖（下鎖（ｌｏｗｅｒ  ｓｔｒａｎｄ）とも呼ばれる。）をそれぞれ１５および１７個のヌクレオチドからなる２つの異なるＤＮＡオリゴヌクレオチドとアニーリングさせ、それぞれその５’−末端および３’末端で鋳型鎖とハイブリッド形成させ、その結果、上鎖（ｕｐｐｅｒ  ｓｔｒａｎｄ）において１つのヌクレオチドのギャップを生じさせることによって、基質複合体を作製した。この複合体は、ギャップ内の鋳型位置でＡ、Ｃ、ＧまたはＴの何れかを含有した。アニーリング前に、Ｇａｍｍａ−３２Ｐ−アデノシン−三リン酸（ＡＴＰ）およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いた標準的なキナーゼ反応によって、１５個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドＳＰ−１をその５’−末端で３２Ｐにより放射性標識した。６５℃で１０分間加熱し、ゆっくりと冷却することによって、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０中でアニーリングを行った。ＮＡＰ−カラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での精製によって、組み込まれなかったｇａｍｍａ−３２Ｐ−ＡＴＰを除去した。
【０１８４】
活性アッセイにおいて、全−Ｌ−ポリメラーゼＸおよびそれらの変異体をＤ−立体配置１−ギャップ基質複合体と合わせた（図１Ａ参照）。陰性対照として、各基質を全−Ｌ−ポリメラーゼＸおよびそれらの変異体およびＤ−デスオキシ−ヌクレオチド−三リン酸（ｄＮＴＰ’ｓ）なしでも温置した。１−ギャップ複合体内の鋳型塩基によって、アッセイ中に対応するＤ−ｄＮＴＰのみを添加した。典型的な６μＬアッセイは、５０ｎＭ基質複合体、１．７ｎｇ／μＬ Ｌ−全−Ｌ−ポリメラーゼＸまたはそれらの変異体、８μＭの１つのＤ−ｄＮＴＰおよび緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４％グリセロール、０．１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ７．５）を含有した。Ｒｏｖａｌａｂ（ドイツテルトー）からＤ−ｄＮＴＰを購入した。温置時間は、３７℃で３０分間であった。アッセイ体積全体を試料緩衝液／色素と混合し、変性配列決定ゲル上に載せ、４時間分離した。このゲルをＫｏｄａｋ  Ｋスクリーンに−８０℃で一晩曝露し、ＢｉｏＲａｄ  Ｆｘホスホイメージャーシステムを用いて読み取った。
【０１８５】
全−Ｌ−ポリメラーゼＸおよび変異体Ｉ１２４Ｇ、Ｖ８０ＡおよびＶ８０Ｇは、これらの条件下で活性があり、２本の上鎖（ｕｐｐｅｒ  ｓｔｒａｎｄ）ＤＮＡオリゴヌクレオチド間の１つのヌクレオチドギャップが充填された。
【０１８６】
２．２  ６−ヌクレオチドギャップを有する基質における活性アッセイ
６−ギャップ基質に対するオリゴヌクレオチドのリスト：
【表４】
0006670237.tif 000051
【０１８７】
３３個のヌクレオチドからなるＤＮＡオリゴヌクレオチドの鋳型鎖（下鎖（ｌｏｗｅｒ  ｓｔｒａｎｄ）と呼ばれる。）をそれぞれ１５および１２個のヌクレオチドからなる２つの異なるＤＮＡオリゴヌクレオチドとアニーリングさせ、それぞれその５’−末端および３’末端で鋳型鎖とハイブリッド形成させ、その結果、上鎖（ｕｐｐｅｒ  ｓｔｒａｎｄ）の６個のヌクレオチドのギャップを生じさせることによって、基質複合体を作製した。アニーリング前に、Ｇａｍｍａ−３２Ｐ−アデノシン−三リン酸（ＡＴＰ）およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いた標準的なキナーゼ反応によって、１５個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドＳＰ−１をその５’−末端で３２Ｐにより放射性標識した。６５℃で１０分間加熱し、ゆっくりと冷却することによって、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０中でアニーリングを行った。ＮＡＰ−カラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ドイツフライブルク）での精製によって、組み込まれなかったｇａｍｍａ−３２Ｐ−ＡＴＰを除去した。
【０１８８】
活性アッセイにおいて、全−Ｌ−ポリメラーゼＸおよびそれらの変異体をＤ−立体配置６−ギャップ基質複合体と合わせた（図１Ｂ）。陰性対照として、基質を全−Ｌ−ポリメラーゼＸまたはそれらの変異体およびデスオキシ−ヌクレオチド−三リン酸塩（D-ｄＮＴＰ’ｓ）なしでも温置した。典型的な６μＬアッセイは、５０ｎＭ基質複合体、１．３ｎｇ／μＬ以下の全−Ｌ−ポリメラーゼＸまたはそれらの変異体、８μＭの各Ｄ−ｄＮＴＰおよび緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４％グリセロール、０．１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ７．５）を含有した。Ｒｏｖａｌａｂ（ドイツテルトー）からＤ−ｄＮＴＰを購入した。典型的な温置時間は、３７℃で３０分間であった。アッセイ体積全体を試料緩衝液／色素と混合し、変性配列決定ゲル上に載せ、４時間分離した。このゲルをＫｏｄａｋ  Ｋスクリーンに−８０℃で一晩曝露し、ＢｉｏＲａｄ  Ｆｘホスホイメージャーシステムを用いて読み取った。
【０１８９】
全−Ｌ−ポリメラーゼＸおよび変異体（Ｃ８６Ｓを除く。）はこれらの条件下で活性があり、２本の上鎖（ｕｐｐｅｒ  ｓｔｒａｎｄ）ＤＮＡオリゴヌクレオチド間の６ヌクレオチドギャップが充填された。
【０１９０】
実施例３−Ｄ−アミノ酸からなるポリメラーゼＰｏｌＸの変異体の合成
【０１９１】
本実施例内で、全−ＤポリメラーゼＸ変異体Ｖ８０Ａの合成を記載する。全−ＤポリメラーゼＸ変異体Ｖ８０Ａのアミノ酸配列は、Ａｃ−ＭＬＴＬＩＱＧＫＫＩＶＮＨＬＲＳＲＬＡＦＥＹＮＧＱＬＩＫＩＬＳＫＮＩＶＡＶＧＳＬＲＲＥＥＫＭＬＮＤＶＤＬＬＩＩＶＰＥＫＫＬＬＫＨＶＬＰＮＩＲＩＫＧＬＳＦＳＶＫＡＣＧＥＲＫＣＶＬＦＩＥＷＥＫＫＴＹＱＬＤＬＦＴＡＬＡＥＥＫＰＹＡＩＦＨＦＴＧＰＶＳＹＬＩＲＩＲＡＡＬＫＫＫＮＹＫＬＮＱＹＧＬＦＫＮＱＴＬＶＰＬＫＩＴＴＥＫＥＬＩＫＥＬＧＦＴＹＲＩＰＫＫＲＬ−ＯＨであった。
【０１９２】
固相ペプチド合成Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ−ストラテジーの必須要件に従い（Ｅｒｉｃ  Ａｔｈｅｒｔｏｎら、１９８１）使用する全アミノ酸を保護する。使用される全アミノ酸がＤ−アミノ酸である（Ｂａｃｈｅｍ，スイスブーベンドルフ）。
【０１９３】
３．１  ＨＯ−Ｇｐ（Ｂｏｃ）２の合成
Ｓｅｋｉｚａｋｉら（Ｓｅｋｉｚａｋｉら、１９９６）と同様に、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−保護４−グアニジノフェノールを合成した。これに従い、４０ｍｍｏｌのＮ，Ｎ’−Ｂｉｓ−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｓ−メチルイソチオウレア（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，ドイツシュネルドルフ）および６０ｍｍｏｌの４−アミノフェノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，ドイツシュネルドルフ）を５００ｍＬ丸底フラスコ中、２５０ｍＬ  ＴＨＦ中で溶解させた。この後、溶液にアルゴンを１０分間吹き付け、ＣａＣｌ２チューブで密封しながら１２０時間撹拌し続けた。
【０１９４】
溶媒を蒸発させた後、氷冷メタノールを用いて残渣を沈殿させた。Ｐ４Ｏ１０上で沈殿物を真空下で乾燥させた。最後に、ＤＣＭとともにフラッシュクロマトグラフィーを用いて生成物を精製した。生成物含有分画を合わせ、溶媒を減圧下で蒸発させた。ＴＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、質量分析およびＮＭＲを分析のために使用した。実験により決定された質量は、３５１Ｄａの計算質量に対応する。
【０１９５】
３．２  Ｈ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＧｐ（Ｂｏｃ）２の合成
１ｍｍｏｌのＺ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ，スイスブーベンドルフ）、０．９ｅｑ．ＴＢＴＵおよび０．９ｅｑ．ＨＯ−Ｇｐ（Ｂｏｃ）２を１０ｍＬ  ＤＭＦ中で溶解させた。２ｅｑ．ＤＩＰＥＡの添加後、溶液を２時間撹拌した。溶媒を蒸発させた後、ＤＣＭを用いて粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーで精製した。Ｚ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＧｐ（Ｂｏｃ）２の純粋な分画を合わせ、溶媒を蒸発させた。
【０１９６】
Ｚ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＧｐ（Ｂｏｃ）２を１０ｍＬ  ＭｅＯＨ中で溶解させ、アルゴンを吹き付けた。２時間で、Ｐｄ／Ｃ触媒およびＨ２の添加によって、Ｎ末端Ｚ−基の加水分解性切断を達成した。Ｈ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＧｐ（Ｂｏｃ）２をろ別した後、ＭｅＯＨを減圧下で蒸発させた。逆相ＨＰＬＣおよび質量分析を用いて分析を行った。生成物に対する４６５Ｄａの正確な質量が見いだされ、計算質量と対応した。
【０１９７】
３．３  全−Ｄ−ペプチドＡｃＭＬＴＬＩＱＧＫＫＩＶＮＨＬＲＳＲＬＡＦＥＹＮＧＱＬＩＫＩＬＳＫＮＩＶＡＶＧＳＬ−ＯＧｐ（１）の合成
Ｂａｒｌｏｓら（Ｂａｒｌｏｓら、１９８９）により記載のように、０．１０ｍｍｏｌのＴｅｎｔａＧｅｌ−Ｒ−Ｔｒｉｔｙｌレジン（Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ，ドイツテュービンゲン）をＦｍｏｃ−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ，スイスブーベンドルフ）とともに載せた。したがって、０．１０ｍｍｏｌレジンを０．６ｍｍｏｌの塩化チオニルとともに、３０分間、２回温置し、その後ＤＣＭで洗浄した。この後、６ｍＬ  ＤＣＭ中で、０．６ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、２．４ｍｍｏｌ  ＤＩＰＥとともに９０分間レジンを温置した。その後、ＤＣＭ中の１０％ＭｅＯＨ（ｖ／ｖ）、１０％ＤＩＰＥＡ（ｖ／ｖ）の溶液を用いて、レジンを１０分間、３回ブロッキング処理し、ＤＣＭで洗浄した。ＦＡＳＴｍｏｃプロトコールとともにＡＢＩ４３３（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，米国フォスターシティ）を用いて、自動化合成を行った。ＮＭＰ中９ｅｑ．ＨＡＴＵおよび２０ｅｑ．ＤＩＰＥＡを用いて１０ｅｑ．アミノ酸を活性化した。カップリング時間は４５分間であり、ＮＭＰ中２０％（ｖ／ｖ）ピペリジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，ドイツシュネルドルフ）を用いてＦｍｏｃ−脱保護化を７分間、３回行った。
【０１９８】
２時間にわたり、１０ｍＬのＤＣＭ中３０％（ｖ／ｖ）ＨＦＩＰ中でぺプチジルレジンを２回温置することによって、完全保護化ペプチド酸の切断を達成した。ペプチドをろ別した後、溶媒を蒸発させ、氷冷ジエチルエーテルを用いて残渣を沈殿させた。沈殿ペプチドを単離し、乾燥させた。
【０１９９】
６ｍＬ  ＮＭＰ中で、０．０１ｍｍｏｌの完全保護化ペプチド、４ｅｑ．ＰｙＢＯＰおよび５ｅｑ．Ｈ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＧｐ（Ｂｏｃ）２を溶解させた。１０ｅｑ．ＤＩＰＥＡの添加後、混合物を４時間撹拌した。この後、溶媒を還元気化（ｒｅｄｕｃｅｄ  ｅｖａｐｏｒａｔｅｄ）させ、氷冷ジエチルエーテルによって残渣を沈殿させた。沈殿ペプチドエステルを乾燥させ、その後、２時間にわたり、ＴＦＡ中、２．５％ＥＤＴ、２．５％水、２．５％ＴＩＳを用いて保護基を切り離した。ＴＦＡの蒸発後、氷冷ジエチルエーテルを用いてペプチドを沈殿させた。ＡＣＮ／水勾配を用いて、Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，ドイツアシャッフェンブルク）上でペプチドエステルの逆相ＨＰＬＣ精製を行った。生成物を含有する分画を合わせ、凍結乾燥させた。
【０２００】
ＨＰＬＣ／ＵＰＬＣ（図２Ａ）および質量分析（図２Ｂ）によって最終生成物の特徴を調べた。４６５４，７Ｄａの生成物に対する測定質量は、４６５２，７Ｄａの理論質量と一致した。
【０２０１】
３．４  全−Ｄ−ペプチドＨ−ＲＲＥＥＫＬＮＤＶＤＬＬＩＩＶＰＥＫＫＬＬＫＨＶＬＰＮＩＲＩＫＧＬＳＦＳＶＫＡ−ＳＭｅ（２）の合成
６ｍＬ  ＮＭＰ中で４５分間にわたり、５ｅｑ．アミノ酸、ｅｑ．４．９ｅｑ．ＨＡＴＵおよび１０ｅｑ．ＤＩＰＥＡを用いて、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨを０．１０ｍｍｏｌのＴｅｎｔａＧｅｌ−Ｒ−ＮＨ２レジン（Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ，ドイツテュービンゲン）に充填した。その後に、レジンをＴＨＦで洗浄した。８０℃で２時間、ＴＨＦ中の４ｅｑ．Ｌａｗｅｓｓｏｎ試薬と温置することによって、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−Ψ［ＣＳ−ＮＨ］−Ｒ−ＴｅｎｔａＧｅｌへの変換を達成した。この後、レジンをＮＭＰで洗浄した。その後、既に記載のとおり（実施例１．３参照）、そのように調製したレジンを自動化ペプチド合成において使用した。この後、Ｓｈａｒｍａら（Ｓｈａｒｍａら、２０１１）に従い、ＤＭＦ中ヨウ化メチルと一晩温置することによって、対応するチオエステルを生成させた。レジンのろ過後、ペプチドチオエステルを含有する溶媒を蒸発させ、氷冷ジエチルエーテルを用いて残渣を沈殿させた。ＴＦＡ中２．５％ＥＤＴ、２．５％水、２．５％ＴＩＳを用いて２時間にわたり、側鎖保護基の切断を行った。ＴＦＡの蒸発後、氷冷ジエチルエーテルでペプチドを沈殿させた。ＡＣＮ／水勾配を用いて、Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，ドイツアシャッフェンブルク）上でペプチドチオエステルの逆相ＨＰＬＣ精製を行った。生成物を含有する分画を合わせ、凍結乾燥させた。
【０２０２】
ＨＰＬＣ／ＵＰＬＣ（図３Ａ）および質量分析（図３Ｂ）によって最終生成物の特徴を調べた。生成物に対して実験により決定された質量（４６８３，８Ｄａ）は、４６８１，７Ｄａの理論値と一致する。
【０２０３】
３．５  全−Ｄ−ペプチドＨ−ＣＧＥＲＫＣＶＬＦＩＥＷＥＫＫＴＹＱＬＤＬＦＴＡＬＡＥＥＫＰＹＡＩＦＨＦＴＧＰＶＳＹＬＩＲＩＲＡＡＬＫＫＫＮＹＫＬＮＱＹＧＬＦＫＮＱＴＬＶＰＬＫＩＴＴＥＫＥＬＩＫＥＬＧＦＴＹＲＩＰＫＫＲＬ−ＯＨ（３）の合成
ＤＣＭ中６ｅｑ．アミノ酸、６ｅｑ．ＭＳＮＴおよび４．５ｅｑ  ＭｅＩｍを用いて、０．１０ｍｍｏｌのＴｅｎｔａＧｅｌ−Ｒ−ＰＨＢレジン（Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ，ドイツテュービンゲン）にＦｍｏｃ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＨを充填した。ＦＡＳＴｍｏｃプロトコールとともにＡＢＩ４３３を用いて自動化合成を行った。ＮＭＰ中９ｅｑ．ＨＡＴＵおよび２０ｅｑ．ＤＩＰＥＡを用いて１０ｅｑ．アミノ酸を活性化した。カップリング時間は４５分間であり、ＮＭＰ中２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンを用いて７分間にわたりＦｍｏｃ−脱保護化を３回行った。４２アミノ酸後、ダブルカップリング段階を行った。ＴＦＡ中２．５％ＥＤＴ、２．５％水、２．５％ＴＩＳを用いて２時間にわたり、Ｎ末端Ｆｍｏｃ−保護化ペプチドの切断を達成した。ＴＦＡの蒸発後、氷冷ジエチルエーテルによりペプチドを沈殿させた。Ｃ１８カラム上でＡＣＮ／水勾配を用いて、粗製Ｎ末端保護化ペプチドの逆相ＨＰＬＣ精製を行った。生成物含有分画を合わせ、凍結乾燥させた。その後、Ｆｍｏｃ−保護化ペプチドを溶解させ、Ｎ末端Ｆｍｏｃ−基を切り離すために、ＤＭＦ中２０％ピペリン中で撹拌した。２０分後、溶媒を蒸発させ、氷冷ジエチルエーテルを用いて残渣を沈殿させた。その後に、ＡＣＮ／水勾配とともにＣ１８カラムにより逆相ＨＰＬＣを用いて、沈殿粗製ペプチドを精製した。生成物含有分画を合わせ、凍結乾燥させた。
【０２０４】
ＨＰＬＣ／ＵＰＬＣ（図４Ａ）および質量分析（図４Ｂ）によって最終生成物の特徴を調べた。生成物の決定質量（１１１８４，３Ｄａ）は、１１１７８，２Ｄａの理論質量と一致する。
【０２０５】
３．６  ペプチド２とのペプチド１のプロテアーゼ触媒ライゲーションによる、全−Ｄ−ペプチドＡｃ−ＭＬＴＬＩＱＧＫＫＩＶＮＨＬＲＳＲＬＡＦＥＹＮＧＱＬＩＫＩＬＳＫＮＩＶＡＶＧＳＬＲＲＥＥＫＭＬＮＤＶＤＬＬＩＩＶＰＥＫＫＬＬＫＨＶＬＰＮＩＲＩＫＧＬＳＦＳＶＫＡ−ＳＭｅ（４）の合成
２％ＴｒｉｔｏｎＸ１００（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，ドイツシュネルドルフ）を含有するリン酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ入り）中で、ペプチド１を０．２ｍＭに、ペプチド２を０．６ｍＭに溶解させた。２０μＭクロストリパイン（Ｅｎｄｏｐｒｏｔｅａｓｅ  Ａｒｇ−Ｃ，Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，米国ニュージャージー州レイクウッド）の添加後、反応混合物を３７℃で一晩振盪した。沈殿ペプチドを遠心し、Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ／ギ酸  ６０／４０／０．５中で溶解させ、３０分内の３０％から６０％の水中ＡＣＮの勾配でＲＰ−１８−カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，ドイツアシャッフェンブルク）を用いて、逆相ＨＰＬＣによって精製した。生成物含有分画を合わせ、凍結乾燥させた。
【０２０６】
逆相ＵＰＬＣ（図５Ａ）およびＥＳＩ−質量分析（図５Ｂ）によって最終ペプチドを分析した。理論分子量（Ｍｔｈｅｏｒ＝９１９９．３Ｄａ）は、実測分子量（Ｍｏｂｓ＝９１９９．４Ｄａ）と一致する。
【０２０７】
３．７  ペプチド３とのペプチド４のネイティブ化学ライゲーションによる全−ＤポリメラーゼＸ変異体Ｖ８０Ａの合成
【０２０８】
６ＭグアニジンＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，ドイツシュネルドルフ）、２００ｍＭメルカプトフェニル−酢酸（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，ドイツシュネルドルフ）および５ｍｍ  Ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，ドイツシュネルドルフ）を含有するＴＲＩＳ−緩衝液（ｐＨ８．６）中でペプチド３および４の両方を０．２Ｍ溶解させた。反応混合物を室温で７２時間振盪した。その後、３０分内で３０％から６０％の水中ＡＣＮの勾配でＲＰ−８−カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，ドイツアシャッフェンブルク）を用いて、逆相ＨＰＬＣによって混合物を精製した。ライゲーション生成物を含有した分画をプールし、乾燥させた。乾燥粉末を水中で溶解させ、溶出液としてのリン酸ナトリウム緩衝液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，ドイツシュネルドルフ）（５０ｍＭ、ｐＨ６．８、０．５％ＳＤＳ）とともにＳＥＣ３０００−カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，ドイツアシャッフェンブルク）を用いて、サイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。生成物含有分画を合わせ、凍結乾燥させた。
【０２０９】
最終生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図６Ａ）およびＥＳＩ−質量分析（図６Ｂ）により分析した。レーン７で１４．４ｋＤａと２１．５ｋＤａとの間で明確なバンドが見られ、このことから、純粋な全長ポリメラーゼが示唆された。理論分子量（Ｍｔｈｅｏｒ＝２０３４２Ｄａ）は、ＥＳＩ−ＭＳにより示されるような実測分子量（Ｍｏｂｓ＝２０３６１Ｄａ）と一致する。
【０２１０】
実施例４−Ｄ−アミノ酸からなる合成ポリメラーゼＸ変異体の活性確認
６Ｍグアニジウム塩酸塩中で実施例３による乾燥全−ＤポリメラーゼＸ変異体Ｖ８０Ａを溶解させ、３，５００分子量カットオフの市販の透析装置（Ｐｉｅｒｃｅ／ＰｅｒＢｉｏ，ドイツボン）中での段階的な透析によって４℃で再折り畳みを行った。最終緩衝液は、５０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５であった。プレキャストゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ドイツカールスルーエ）上で標準的な一連の既知のタンパク質濃度を用いてドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を行い、続いてＳＹＰＲＯ−ＲＥＤ染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ドイツカールスルーエ）およびＢｉｏＲａｄ  Ｆｘスキャナー機器上での密度バンド分析を行うことによってタンパク質濃度を推定した。
【０２１１】
２種類の異なる基質タイプを用いて、全−ＤポリメラーゼＸ変異体Ｖ８０Ａに対する活性アッセイを行った。
【０２１２】
４．１  １−ヌクレオチドギャップがある基質における活性アッセイ
３３マー下鎖（ｌｏｗｅｒ  ｓｔｒａｎｄ）ＤＮＡオリゴヌクレオチドを２本の１７マー上鎖（ｕｐｐｅｒ  ｓｔｒａｎｄ）ＤＮＡオリゴヌクレオチドとアニーリングさせ、その結果、上鎖（ｕｐｐｅｒ  ｓｔｒａｎｄ）で１ヌクレオチドギャップを生じさせることによって、基質を作製した。Ｌ−立体配置でオリゴヌクレオチドを合成した。アニーリング前に、Ｇａｍｍａ−３２Ｐ−アデノシン−三リン酸（Ｇａｍｍａ−３２Ｐ−ＡＴＰ）およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いた標準的キナーゼ反応によって、３２Ｐにより１７マーの上鎖（ｕｐｐｅｒ  ｓｔｒａｎｄ）オリゴヌクレオチドＭＪ＿１＿５８＿ＭＤをその５’−末端で放射性標識した。Ｌ−オリゴヌクレオチドＭＪ＿１＿５８＿ＭＤのキナーゼ反応を促進するために、オリゴヌクレオチド合成中に、２つのＤ−立体配置グアノシン塩基を５’末端に付加した。６５℃で１０分間加熱し、ゆっくりと冷却することによって、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０中でアニーリングを行った。ＮＡＰ−カラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ドイツフライブルク）上での精製によって、組み込まれなかったｇａｍｍａ−３２Ｐ−ＡＴＰを除去した。この複合体は、ギャップ内の鋳型位置でＡ、Ｃ、ＧまたはＴの何れかを含有した。基質複合体の仕組みについては、図７参照。
【０２１３】
活性アッセイにおいて、合成全−ＤポリメラーゼＸ変異体Ｖ８０ＡをＬ−立体配置１−ギャップ基質複合体と合わせた。陰性対照として、各基質を全−ＤポリメラーゼＸ変異体Ｖ８０ＡおよびＬ−デスオキシ−ヌクレオチド−三リン酸（ｄＮＴＰ’ｓ）なしでも温置した。１−ギャップ複合体内の鋳型塩基に依存して、アッセイ中に対応するＬ−ｄＮＴＰのみが付加された。典型的な６μＬアッセイは、５０ｎＭ基質複合体、１．７ｎｇ／μＬ全−ＤポリメラーゼＸ変異体Ｖ８０Ａ、８μＭの１つのＬ−ｄＮＴＰおよび緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４％グリセロール、０．１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ７．５）を含有した。Ｌ−ｄＮＴＰをＲａｓａｙａｎ，Ｉｎｃ．（米国カリフォルニア州エンシニータス）によるカスタム合成として購入した。温置時間は３７℃で３０分間であった。アッセイ体積全体を試料緩衝液／色素と混合し、変性配列決定ゲル上に載せ、４時間分離した。ゲルを−８０℃で一晩Ｋｏｄａｋ  Ｋスクリーンに曝露し、ＢｉｏＲａｄ  Ｆｘホスホイメージャーシステムを用いて読み取った。
【０２１４】
図８から見られ得るように、全−ＤポリメラーゼＸ変異体Ｖ８０Ａにより、Ｌ−ＤＮＡ１−ギャップ基質上で伸長生成物がもたらされ、したがって、合成タンパク質の活性を確認した。特筆すべきことに、Ｌ−基質およびＬ−ｄＮＴＰと組み合わせた全−ＤポリメラーゼＸ変異体Ｖ８０Ａのみが何らかの伸長生成物をもたらした。また、それらの鋳型塩基に対応するＬ−ｄＮＴＰを含有する試料のみが伸長生成物をもたらした。これは、Ａ−複合体上でのｄＴＴＰヌクレオチド、Ｃ−複合体でのｄＧＴＰヌクレオチド、Ｇ−複合体でのｄＣＴＰヌクレオチドおよびＴ−複合体でのｄＡＴＰヌクレオチドが何らかの伸長生成物を与えるために存在しなければならなかったことを意味する。
【０２１５】
４．２  ６−ヌクレオチドギャップがある基質における活性アッセイ
３３マー下鎖（ｌｏｗｅｒ  ｓｔｒａｎｄ）ＤＮＡオリゴヌクレオチドを２つの１７マーおよび１２−マー上鎖（ｕｐｐｅｒ  ｓｔｒａｎｄ）ＤＮＡオリゴヌクレオチドとアニーリングさせ、その結果上鎖（ｕｐｐｅｒ  ｓｔｒａｎｄ）において６ヌクレオチドのギャップを生じさせることによって、基質を作製した。Ｌ−立体配置でオリゴヌクレオチドを合成した。アニーリング前に、Ｇａｍｍａ−３２Ｐ−アデノシン−三リン酸（ＡＴＰ）およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いた標準的なキナーゼ反応によって、１７マー上鎖（ｕｐｐｅｒ  ｓｔｒａｎｄ）オリゴヌクレオチドＭＪ＿１＿５８＿ＭＤ（Ｌ−立体配置）をその５’−末端で３２Ｐにより放射性標識した。Ｌ−オリゴヌクレオチドＭＪ＿１＿５８＿ＭＤのキナーゼ反応を促進するために、オリゴヌクレオチド合成中に２つのＤ−立体配置グアノシン塩基を５’末端に付加した。６５℃で１０分間加熱し、ゆっくりと冷却することによって、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０中で、アニーリングを行った。ＮＡＰ−カラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ドイツフライブルク）上での精製によって、組み込まれなかったｇａｍｍａ−３２Ｐ−ＡＴＰを除去した。基質複合体の仕組みについては、図９Ａを参照。
【０２１６】
活性アッセイにおいて、合成全−ＤポリメラーゼＸ変異体Ｖ８０ＡをＬ−立体配置６−ギャップ基質複合体と合わせた。陰性対照として、基質を全−ＤポリメラーゼＸ変異体Ｖ８０Ａおよびデスオキシ−ヌクレオチド−三リン酸（Ｌ−ｄＮＴＰ）なしでも温置した。典型的な６μＬアッセイは、５０ｎＭ基質複合体、１．３ｎｇ／μＬ以下の全−ＤポリメラーゼＸ変異体Ｖ８０Ａ、８μＭの各Ｌ−ｄＮＴＰおよび緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４％グリセロール、０．１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ７．５）を含有した。Ｒａｓａｙａｎ，Ｉｎｃ．（米国カリフォルニア州エンシニータス）によるカスタム合成としてＬ−ｄＮＴＰを購入した。典型的な温置時間は３７℃で３０分間であったが、そのバッチの活性に依存して、より長時間、温置を行った。アッセイ体積全体を試料緩衝液／色素と混合し、変性配列決定ゲル上に載せ、４時間分離した。ゲルを−８０℃で一晩、Ｋｏｄａｋ  Ｋスクリーンに曝露し、ＢｉｏＲａｄ  Ｆｘホスホイメージャーシステムを用いて読み取った。
【０２１７】
図９Ｂから見られ得るように、合成全−ＤポリメラーゼＸ変異体Ｖ８０Ａにより、Ｌ−ＤＮＡ６−ギャップ基質上でＮ＋６伸長生成物がもたらされ、したがって、合成タンパク質の活性を確認した。しかし、Ｎ＋６伸長生成物の合成は、同じ６−ギャップ複合体上でのＮ＋１伸長生成物よりも明確ではなかった。また、６−ギャップを充填するために温置時間の延長が必要であった。特筆すべきことに、何らかの伸長生成物を与えたのは、Ｌ−基質＋Ｌ−ｄＮＴＰと合わせた全−ＤポリメラーゼＸ変異体Ｖ８０Ａのみであった。
【０２１８】
実施例５−ポリメラーゼＸおよびポリメラーゼＸの変異体によるＤＮＡ合成
アフリカブタ熱ウイルス（略称ＡＳＦＶ）からのポリメラーゼＸは、ギャップ修復機能がある非常に離散性の高い酵素として文献（Ｏｌｉｖｅｒｏｓ，１９９７）に記載されている。実施例２で示されるように、全−Ｌ−ポリメラーゼＸおよびそれらの変異体は、ギャップのある基質上でのそれぞれの開始後、非常に僅かなヌクレオチドのみの組み込みを触媒することが示された。ここで、発明者らは、全−Ｌ−ポリメラーゼＸおよび変異体を用いてより長いＤＮＡを合成することを可能にする方法を開示し、８３マー鎖の完全な重合化を示す。
【０２１９】
５．１  プライマー−鋳型基質
全−Ｌ−ポリメラーゼＸおよびそれらの変異体の活性を試験するために、プライマー−鋳型複合体を使用した。全−Ｌ−ポリメラーゼＸの変異体Ｖ８０ＧおよびＶ８０Ａを試験するためにも同じ複合体を使用した。
【０２２０】
ｇａｐのないプライマー−鋳型複合体に対するＤ−オリゴヌクレオチドのリスト：
【表５】
0006670237.tif 000052
【０２２１】
１９個のヌクレオチドからなるＤＮＡオリゴヌクレオチドと８３個のヌクレオチドからなる鋳型鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＭＪ＿１＿１＿ＤＤ）をアニーリングさせることによって、基質を作製した。ＮＯＸＸＯＮでオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチドＭＪ＿１＿３３＿ＤＤは、蛍光色素Ａｔｔｏ−５３２（ＡｔｔｏＴｅｃ，ドイツジーゲン）を有する。６５℃で１０分間加熱し、ゆっくりと冷却することによって、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０中でアニーリングを行った。プライマー−鋳型複合体を図１０Ａで示す。
【０２２２】
５．２  一定温度での反応
活性アッセイにおいて、全−Ｌ−ポリメラーゼＸまたは全−Ｌ−ポリメラーゼＸの変異体Ｖ８０ＧまたはＶ８０ＡをＤ−立体配置プライマー−鋳型複合体と合わせた。典型的な６μＬアッセイは、５０ｎＭ基質複合体、１．３ｎｇ／μＬ以下の全−Ｌ−ポリメラーゼＸまたは全−Ｌ−ポリメラーゼＸの変異体Ｖ８０ＧもしくはＶ８０Ａ、８μＭの各Ｄ−ｄＮＴＰおよび緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４％グリセロール、０．１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ７．５）を含有した。Ｒｏｖａｌａｂ（ドイツテルトー）からＤ−ｄＮＴＰを購入した。Ｐｏｌ−Ｘ試料に対して、温置時間は３７℃で３０分間であった。陰性対照として、基質を全−Ｌ−ポリメラーゼＸまたは全−Ｌ−ポリメラーゼＸの変異体Ｖ８０ＧもしくはＶ８０Ａなし、およびデスオキシ−ヌクレオチド−三リン酸（Ｄ−ｄＮＴＰ）なしでも温置した。製造者により供給されたＴａｑ緩衝液中０．０８３Ｕ／μＬの最終濃度でＴａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ドイツカールスルーエ）を用いて陽性対照を遂行した。Ｔａｑ試料を６０℃で３０分間温置した。アッセイ体積全体を試料緩衝液／色素と混合し、変性ゲル上で分離した。ゲルをＢｉｏＲａｄ  Ｆｘホスホイメージャーシステムを用いて読み取った。
【０２２３】
全−Ｌ−ポリメラーゼＸまたは変異体Ｖ８０ＧまたはＶ８０Ａ全−Ｌ−ポリメラーゼＸは、活性があったが、全長８３マー鋳型の重合化を完遂することはできなかった。Ｔａｑポリメラーゼ陽性対照は、８３マー鋳型の完全な重合化を示し、図１０Ｂを参照のこと。
【０２２４】
５．３  温度サイクリング条件下での反応
開始後の全−Ｌ−ポリメラーゼＸが僅か１個のヌクレオチドの組み込みを触媒し、次いでＤＮＡ基質上に留まりながら停止するという仮定のもと、発明者らは、全−Ｌ−ポリメラーゼＸが鋳型から解離し、鋳型に再会合できるように、加熱パルス（５０℃、２分間）を繰り返し行った。この温度サイクリング手順を繰り返して、発明者らは、全−Ｌ−ポリメラーゼＸを用いて、８３マーの完全な重合化を行うことができた。全−Ｌ−ポリメラーゼＸ試料に対する温度プロファイルを次のように行ったことを除き、一定温度に対して上に記載のように反応および対照を設定した：
５から２５サイクルの（２０℃で３０分間／／５０℃で２分間）
次いで２０℃で３０分間の最終段階。
【０２２５】
１５サイクルを超えてから、全−Ｌ−ポリメラーゼＸは、陽性対照と同様に、全長８３マー鋳型鎖を重合化することができたことが観察されたが、図１０Ｃを参照のこと。
【０２２６】
実施例６−Ｄ−アミノ酸からなる合成ポリメラーゼＸ変異体を用いたプライマー伸長
この実施例で開示される方法は、全−Ｄ立体配置ポリメラーゼを試験するためにＬ−立体配置基質を使用する。
【０２２７】
６．１  プライマー−鋳型基質
ギャップのないプライマー−鋳型複合体に対するＬ−オリゴヌクレオチドのリスト：
【表６】
0006670237.tif 000053
【０２２８】
１９マー上鎖（ｕｐｐｅｒ  ｓｔｒａｎｄ）ＤＮＡオリゴヌクレオチドと８３マー下鎖（ｌｏｗｅｒ  ｓｔｒａｎｄ）ＤＮＡオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって基質を作製する。Ｌ−立体配置で、社内施設のＮＯＸＸＯＮでオリゴヌクレオチドを合成する。アニーリング前に、Ｇａｍｍａ−３２Ｐ−アデノシン−三リン酸（ＡＴＰ）およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いた標準的なキナーゼ反応によって、２１マー上鎖（ｕｐｐｅｒ  ｓｔｒａｎｄ）オリゴヌクレオチドＭＪ＿１＿１０９＿ＭＤをその５’−末端で３２Ｐにより放射性標識する。Ｌ−オリゴヌクレオチドＭＪ＿１＿１０９＿ＭＤのキナーゼ反応を促進するために、オリゴヌクレオチド合成中、２個のＤ−立体配置グアノシン塩基を５’末端に付加する。６５℃で１０分間加熱し、ゆっくりと冷却することによって、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０中でアニーリングを行う。ＮＡＰ−カラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ドイツフライブルク）での精製によって、組み込まれないＧａｍｍａ−３２Ｐ−ＡＴＰを除去する。
【０２２９】
６．２  一定温度での反応
活性アッセイにおいて、合成全−ＤポリメラーゼＸ変異体Ｖ８０ＡをＬ−立体配置プライマー−鋳型複合体と合わせる。典型的な６μＬアッセイは、５０ｎＭ基質複合体、１．３ｎｇ／μＬ以下の全−ＤポリメラーゼＸ変異体、８μＭの各Ｌ−ｄＮＴＰおよび緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４％グリセロール、０．１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ７．５）を含有する。Ｌ−ｄＮＴＰをＲａｓａｙａｎ，Ｉｎｃ．（米国カリフォルニア州エンシニータス）から購入した。温置時間は３７℃で少なくとも３０分間である。陰性対照として、基質をまた、ポリメラーゼなし、およびデスオキシ−ヌクレオチド−三リン酸（Ｌ−ｄＮＴＰ）なしでも温置する。アッセイ体積全体を試料緩衝液／色素と混合し、変性ゲル上で分離する。ゲルはＢｉｏＲａｄ  Ｆｘホスホイメージャーシステムを用いて読み取る。
【０２３０】
全−ＬポリメラーゼＸの場合と同じように、合成全−ＤポリメラーゼＸ変異体Ｖ８０Ａは、この状態下で活性があるが、全８３個のヌクレオチド鋳型鎖を重合化できない。
【０２３１】
６．３  温度サイクリング条件下での反応
実施例５と同様に、全−ＤポリメラーゼＸ変異体Ｖ８０Ａによる８３マーＬ−基質の全長全重合化を可能にするために温度サイクリング手順を繰り返す。温度プロファイルを次のように行ったことを除き、一定温度に対して上で記載されるように反応および対照を設定する：
５から２５サイクルの（２０℃で３０分間／／５０℃で２分間）
次いで２０℃で３０分間の最終段階。
【０２３２】
温度サイクル伸長を用いる場合、全−ＬポリメラーゼＸの場合と同じように、全−ＤポリメラーゼＸ変異体Ｖ８０Ａが全８３マー鋳型鎖を重合化できることが観察される。
【０２３３】
実施例７−ポリメラーゼＤｐｏ４および全てＬ−アミノ酸からなるポリメラーゼＤｐｏ４の変異体の組み換え発現および精製
ポリメラーゼＤｐｏ４は元来、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）（略称Ｓｓｏ）（Ｂｏｕｄｓｏｃｑ，２００１）で発見された。この野生型遺伝子は、開始コドンおよび終止コドンを含む１，０５９塩基対のオープンリーディングフレーム（略称ＯＲＦ）を有する。コードされるタンパク質の長さは、３５２アミノ酸である。この例は、ポリメラーゼＤｐｏ４およびポリメラーゼＤｐｏ４の変異体がどのようにＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現されて、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇを用いて精製されたかを説明する。
【０２３４】
７．１  発現コンストラクト
Ｓｓｏのコドン使用はＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）とは異なるので、野生型ＳｓｏポリメラーゼＤｐｏ４に対するＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）−コドン最適化合成遺伝子をＧｅｎｅＡｒｔ  ＡＧ（ドイツレーゲンスブルク）から購入した。合成遺伝子配列は、ｐＥＮＴＲＹ−ＩＢＡ１０ベクター（元の会社：ＩＢＡ  ＧｍｂＨ，ドイツゲッティンゲン）において提供された。開始コドンを含むが終止コドンを含まないコドン最適化オープンリーディングフレームは、次の配列を有した：ＡＴＧＡＴＴＧＴＧＣＴＧＴＴＴＧＴＧＧＡＴＴＴＴＧＡＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＧＣＣＣＡＧＧＴＧＧＡＡＧＡＡＧＴＴＣＴＧＡＡＴＣＣＧＡＧＣＣＴＧＡＡＡＧＧＴＡＡＡＣＣＧＧＴＴＧＴＴＧＴＴＴＧＴＧＴＴＴＴＴＡＧＣＧＧＴＣＧＣＴＴＴＧＡＡＧＡＴＡＧＣＧＧＴＧＣＡＧＴＴＧＣＡＡＣＣＧＣＣＡＡＴＴＡＴＧＡＡＧＣＣＣＧＴＡＡＡＴＴＴＧＧＴＧＴＴＡＡＡＧＣＣＧＧＴＡＴＴＣＣＧＡＴＴＧＴＴＧＡＡＧＣＣＡＡＡＡＡＡＡＴＴＣＴＧＣＣＧＡＡＴＧＣＡＧＴＴＴＡＴＣＴＧＣＣＧＡＴＧＣＧＣＡＡＡＧＡＡＧＴＴＴＡＴＣＡＧＣＡＧＧＴＴＡＧＣＡＧＣＣＧＴＡＴＴＡＴＧＡＡＴＣＴＧＣＴＧＣＧＣＧＡＡＴＡＴＡＧＣＧＡＡＡＡＡＡＴＴＧＡＡＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＴＴＧＡＴＧＡＡＧＣＣＴＡＴＣＴＧＧＡＴＡＴＴＡＧＣＧＡＴＡＡＡＧＴＧＣＧＣＧＡＴＴＡＴＣＧＣＧＡＡＧＣＡＴＡＴＡＡＴＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＣＣＴＧＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＡＴＴＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＧＣＡＴＴＡＧＣＡＡＡＡＡＴＡＡＡＧＴＧＴＴＴＧＣＣＡＡＡＡＴＴＧＣＡＧＣＡＧＡＴＡＴＧＧＣＡＡＡＡＣＣＧＡＡＴＧＧＣＡＴＴＡＡＡＧＴＧＡＴＴＧＡＴＧＡＴＧＡＡＧＡＡＧＴＧＡＡＡＣＧＴＣＴＧＡＴＴＣＧＣＧＡＡＣＴＧＧＡＴＡＴＴＧＣＡＧＡＴＧＴＴＣＣＧＧＧＴＡＴＴＧＧＣＡＡＴＡＴＴＡＣＣＧＣＡＧＡＡＡＡＡＣＴＧＡＡＡＡＡＡＣＴＧＧＧＣＡＴＴＡＡＴＡＡＡＣＴＧＧＴＴＧＡＴＡＣＣＣＴＧＡＧＣＡＴＴＧＡＡＴＴＴＧＡＴＡＡＡＣＴＧＡＡＡＧＧＣＡＴＧＡＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＡＧＣＣＡＡＡＴＡＴＣＴＧＡＴＴＡＧＣＣＴＧＧＣＡＣＧＴＧＡＴＧＡＡＴＡＴＡＡＴＧＡＡＣＣＧＡＴＴＣＧＴＡＣＣＣＧＴＧＴＴＣＧＴＡＡＡＡＧＣＡＴＴＧＧＴＣＧＴＡＴＴＧＴＧＡＣＣＡＴＧＡＡＡＣＧＣＡＡＴＡＧＣＣＧＴＡＡＴＣＴＧＧＡＡＧＡＡＡＴＴＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＴＧＴＴＴＣＧＴＧＣＡＡＴＴＧＡＡＧＡＡＡＧＣＴＡＴＴＡＴＡＡＡＣＴＧＧＡＴＡＡＡＣＧＣＡＴＴＣＣＧＡＡＡＧＣＣＡＴＴＣＡＴＧＴＴＧＴＴＧＣＡＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＴＣＴＧＧＡＴＡＴＴＧＴＴＡＧＣＣＧＴＧＧＴＣＧＴＡＣＣＴＴＴＣＣＧＣＡＴＧＧＴＡＴＴＡＧＣＡＡＡＧＡＡＡＣＣＧＣＣＴＡＴＡＧＣＧＡＡＡＧＣＧＴＴＡＡＡＣＴＧＣＴＧＣＡＧＡＡＡＡＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡＡＧＡＴＧＡＡＣＧＴＡＡＡＡＴＴＣＧＴＣＧＴＡＴＴＧＧＴＧＴＧＣＧＣＴＴＴＡＧＣＡＡＡＴＴＴＡＴＴＧＡＡＧＣＣＡＴＴＧＧＣＣＴＧＧＡＴＡＡＡＴＴＴＴＴＴＧＡＴＡＣＣ。
【０２３５】
全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４とも呼ばれるポリメラーゼＤｐｏ４に対する発現コンストラクトを得るために、市販のＳｔａｒＧａｔｅクローニングキット（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ）を用いて、ｐＥＮＴＲＹ−ＩＢＡ１０からｐＡＳＧ−ＩＢＡ５ベクター（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ，ドイツゲッティンゲン）に遺伝子をサブクローニングした。サブクローニングによって、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ  ＩＩがＮ−末端に付加され、終止コドンがＣ−末端に付加され、遺伝子がｔｅｔプロモーターの制御下となった。本コンストラクトをｐＭＪ３４３と名付け、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）での全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４の発現のために使用した。ｐＭＪ３４３から発現された全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４は、３６８個のアミノ酸の次の配列を有した：ＭＡＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫＳＧＭＩＶＬＦＶＤＦＤＹＦＹＡＱＶＥＥＶＬＮＰＳＬＫＧＫＰＶＶＶＣＶＦＳＧＲＦＥＤＳＧＡＶＡＴＡＮＹＥＡＲＫＦＧＶＫＡＧＩＰＩＶＥＡＫＫＩＬＰＮＡＶＹＬＰＭＲＫＥＶＹＱＱＶＳＳＲＩＭＮＬＬＲＥＹＳＥＫＩＥＩＡＳＩＤＥＡＹＬＤＩＳＤＫＶＲＤＹＲＥＡＹＮＬＧＬＥＩＫＮＫＩＬＥＫＥＫＩＴＶＴＶＧＩＳＫＮＫＶＦＡＫＩＡＡＤＭＡＫＰＮＧＩＫＶＩＤＤＥＥＶＫＲＬＩＲＥＬＤＩＡＤＶＰＧＩＧＮＩＴＡＥＫＬＫＫＬＧＩＮＫＬＶＤＴＬＳＩＥＦＤＫＬＫＧＭＩＧＥＡＫＡＫＹＬＩＳＬＡＲＤＥＹＮＥＰＩＲＴＲＶＲＫＳＩＧＲＩＶＴＭＫＲＮＳＲＮＬＥＥＩＫＰＹＬＦＲＡＩＥＥＳＹＹＫＬＤＫＲＩＰＫＡＩＨＶＶＡＶＴＥＤＬＤＩＶＳＲＧＲＴＦＰＨＧＩＳＫＥＴＡＹＳＥＳＶＫＬＬＱＫＩＬＥＥＤＥＲＫＩＲＲＩＧＶＲＦＳＫＦＩＥＡＩＧＬＤＫＦＦＤＴＧＳ。
【０２３６】
最初の１４個のアミノ酸は、数個のスペーサーアミノ酸を含むＳｔｒｅｐ−Ｔａｇ  ＩＩに相当し、最後の２個のアミノ酸はスペーサーアミノ酸に相当し、中間部の３５２個のアミノ酸部分は、Ｓｓｏで見られるポリメラーゼＤｐｏ４配列と同一であった。
【０２３７】
製造者のプロトコールにしたがって、市販のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＧｍｂＨ，ドイツヴァルトブロン）を用いて、全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４の変異体に対する発現コンストラクトを作製した。ｐＭＪ３６１、ｐＭＪ３６２、ｐＭＪ３６３、ｐＭＪ５０２、ｐＭＪ５０３、およびｐＭＪ５０４を作製するためにプラスミドｐＭＪ３４３を鋳型とした。また、２つのステップでｐＭＪ３６５を作製するためにプラスミドｐＭＪ３４３を鋳型とした。次に、ｐＭＪ５０８、ｐＭＪ５０９、ｐＪＡ９５、ｐＪＡ９６、ｐＪＡ１００、ｐＪＡ１０３、およびｐＪＡ１０４を作製するためにプラスミドｐＭＪ３６５を鋳型とした。次に、ＰＭＪ５１１を作製するためにプラスミドｐＭＪ５０９を鋳型とした。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅに必要なオリゴヌクレオチドは、ＮＯＸＸＯＮで合成したか（ＱＣ＿３８＿ｕｐ、ＱＣ＿３８＿ｌｏｗ、ＱＣ＿３９＿ｕｐ、ＱＣ＿３９＿ｌｏｗ、ＱＣ＿４０＿ｕｐ、ＱＣ＿４０＿ｌｏｗ、ＱＣ＿４１＿ｕｐ、ＱＣ＿４１＿ｌｏｗ、ＱＣ＿ｄｐｏ４＿Ｍ７６Ｇ＿センス、ＱＣ＿ｄｐｏ４＿Ｍ７６Ｇ＿アンチセンス、ＱＣ＿ｄｐｏ４＿Ｍ７６Ａ＿センス、ＱＣ＿ｄｐｏ４＿Ｍ７６Ａアンチセンス、ＱＣ＿ｄｐｏ４＿Ｉ６７Ｃ＿センス、ＱＣ＿ｄｐｏ４＿Ｉ６７Ｃ＿アンチセンス、ＱＣ＿ｄｐｏ４＿Ｓ８６Ｇ＿センス、ＱＣ＿ｄｐｏ４＿Ｓ８６Ｇ＿アンチセンス）またはＰｕｒｉｍｅｘから購入した（ドイツグレーベンシュタイン）（ＱＣ＿２８＿ｕｐ、ＱＣ＿２８＿ｌｏｗ、ＱＣ＿２９＿ｕｐ、ＱＣ＿２９＿ｌｏｗ、ＱＣ＿３０＿ｕｐ、ＱＣ＿３０＿ｌｏｗ）。
【０２３８】
次の変異体発現コンストラクトを作製し、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）での全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４の変異体の発現のために使用した。
【表７】
0006670237.tif 000054
0006670237.tif 000055
【０２３９】
７．２  Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのタンパク質発現
発現コンストラクトｐＭＪ３４３を用いて、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）において全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４を発現させた。ｐＭＪ３６１、ｐＭＪ３６２、ｐＭＪ３６３、ｐＭＪ３６５、ｐＭＪ５０２、ｐＭＪ５０３、ｐＭＪ５０４、ｐＭＪ５０８、ｐＭＪ５０９、ｐＭＪ５１１、ｐＪＡ９５、ｐＪＡ９６、ｐＪＡ１００、ｐＪＡ１０３またはｐＪＡ１０４から、全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４の突然変異の変異体を発現させた。発現のために、「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ」（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ／Ｂｉｏｚｙｍ，ドイツヘッシシュ・オルデンドルフ）を用いて、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株「ＮＥＢ  ｅｘｐｒｅｓｓ」（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，ドイツフランクフルト・アム・マイン）において適切な発現コンストラクトを形質転換し、抗生物質アンピシリンを用いて維持した。誘導因子として２００ｎｇ／ｍＬアンヒドロテトラサイクリン（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ，ドイツゲッティンゲン）を用いて、培地「ＥｎＢａｓｅ  Ｆｌｏ」または「ＥｎＰｒｅｓｓｏ」（ＢｉｏＳｉｌｔａ，フィンランドオウル）中で３０℃にて４８時間、発現を行った。遠心によって細胞を回収し、−８０℃で保存するかまたはすぐに処理した。
【０２４０】
７．３  タンパク質精製
「緩衝液Ｗ」（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で新鮮または凍結Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を氷上で再懸濁し、「フレンチプレス」（Ｇ．Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，ドイツシュヴェービッシュ・グミュント）細胞破壊装置を用いて溶解させた。５ｍＬ  ＳｔｒｅｐＴｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ドイツフライブルク）を備えた「ＡＫＴＡ  ｅｘｐｒｅｓｓ」システム上で４℃で精製を行った。２．５ｍＭデスチオビオチン（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ，ドイツゲッティンゲン）を含む緩衝液Ｗを用いて段階溶出を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ドイツカールスルーエ）を用いて分画を分析し、プールし、必要に応じて、「Ｑ  ＨＰ」カラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ドイツフライブルク）を備えた「ＡＫＴＡ精製装置」システム上で陰イオン−イオン交換クロマトグラフィーでさらに精製した。ＬＣ−ＭＳ質量分析によってタンパク質同一性を確認し、的確な分画をプールし、濃縮し、１０，０００分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）のＶｉｖａＳｐｉｎ  １５Ｒ濃縮装置（ＶｉｖａＳｃｉｅｎｃｅｓ／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ドイツゲッティンゲン）を用いて再緩衝化した。１００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、５０％グリセロールからなる緩衝液中で、精製タンパク質を−２０℃で保存した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でウシ血清アルブミン（略称ＢＳＡ）標準物質を用い、ＳＹＰＲＯ  Ｒｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ドイツカールスルーエ）で染色して、ゲル密度測定によって、タンパク質濃度を推定した。
【０２４１】
実施例８−２つの断片からなる合成ポリメラーゼＤｐｏ４の産生
全−ＬポリメラーゼＤｐｏ４の長さは３５２アミノ酸である。全−ＬポリメラーゼＤｐｏ４を化学的に作製するために、固相ペプチド合成により合成され得るより短い断片から、このような合成全−ＬポリメラーゼＤｐｏ４を組み立てなければならず、このより短い断片は、ネイティブ化学ライゲーションなどのペプチドライゲーション法によってライゲーションしなければならなかった。この例は、合成全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４を得るためにネイティブ化学ライゲーションによって、Ｄｐｏ４のライゲーション断片１−１５４、１５５−３５２、１５５−２０２および２０３−３５２が、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）でどのように発現され、精製され、互いに対してライゲーションされているかを説明する。
【０２４２】
８．１  発現コンストラクト
実施例７で開示されるように、市販ソースから合成遺伝子コンストラクトとして全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４に対する遺伝子を得た（ＧｅｎｅＡｒｔ，ドイツレーゲンスブルク）。そのコドン最適化配列に基づいてこの実施例の全ての断片をクローニングした。全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４変異体Ａ１５５Ｃの断片１−１５４、１５５−３５２、１５５−２０２および２０３−３５２に対する次の発現コンストラクトを作製した：
【表８】
0006670237.tif 000056
【０２４３】
８．１．１  全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４変異体Ａ１５５Ｃの断片１−１５４−チオエステル−発現コンストラクトｐＭＪ３７０
このコンストラクトは、全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４変異体Ａ１５５Ｃの断片１−１５４、続いてＭｘｅ  ＧｙｒＡインテインを含有し、チオエステルおよびキチン−結合ドメイン（ＣＢＤ）を生成させるためにこれを使用した。２つのＰＣＲ生成物からコンストラクトを組み立てた。全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４変異体Ａ１５５Ｃの断片１−１５４を増幅するために鋳型としてのｐＭＪ３４３およびプライマーＭＪ＿１＿９０＿ＤＤ（５’−リン酸−ＡＧＣＧＧＣＴＣＴＴＣＧＡＴＧＡＴＴＧＴＧＣＴＧＴＴＴＧＴＧＧＡＴＴＴＴ−３’）およびＭＪ＿１＿９１＿ＤＤ（５’−リン酸−ＡＧＣＧＧＣＴＣＴＴＣＧＧＣＡＴＧＣＡＡＴＴＴＴＧＧＣＡＡＡＣＡＣＴＴＴ−３’）を用いて、ＰＣＲ生成物１を作製した。Ｍｘｅ  Ｇｙｒ  ＡインテインおよびＣＢＤを増幅するために鋳型としてのｐＴＷＩＮ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，ドイツフランクフルト・アム・マイン）およびプライマーＭＪ＿１＿７２＿ＤＤ（５’−リン酸−ＡＧＣＧＧＣＴＣＴＴＣＧＴＧＣＡＴＣＡＣＧＧＧＡＧＡＴ−３’）およびＭＪ＿１＿７３＿ＤＤ（５’−リン酸−ＡＧＣＧＧＣＴＣＴＴＣＧＣＣＣＴＴＧＡＡＧＣＴＧＣＣＡＣＡＡＧＧＣＡＧＧＡＡＣＧＴＴ−３’）を用いて、ＰＣＲ生成物２を作製した。プライマーＭＪ＿１＿９０＿ＤＤおよびＭＪ＿１＿９１＿ＤＤは、Ｐｕｒｉｍｅｘ（ドイツグレーベンシュタイン）由来であり、一方でプライマーＭＪ＿１＿７２＿ＤＤおよびＭＪ＿１＿７３＿ＤＤは、ＩＢＡ  ＧｍｂＨ（ドイツゲッティンゲン）由来であった。フラッシュゲル系（ＬＯＮＺＡ，スイスバーゼル）上で２つのＰＣＲ生成物をゲル精製し、ＳｔａｒＧａｔｅ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ＥＮＴＲＹクローニングキット（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ，ドイツゲッティンゲン）を用いてｐＥＮＴＲＹ−ＩＢＡ２０において一緒にクローニングし、その結果、ｐＭＪ３６６が得られた。ＳｔａｒＧａｔｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒクローニングキット（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ，ドイツゲッティンゲン）を用いたｐＡＳＧ−ＩＢＡｗｔ１（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ，ドイツゲッティンゲン）におけるｐＭＪ３６６からのサブクローニングによって、ｐＭＪ３７０が得られた。コンストラクトｐＭＪ３７０は、（インテイン切断／チオエステル産生後）１５４アミノ酸長の次のタンパク質配列とともに、全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４変異体Ａ１５５Ｃの断片１−１５４−チオエステルをコードする：ＭＩＶＬＦＶＤＦＤＹＦＹＡＱＶＥＥＶＬＮＰＳＬＫＧＫＰＶＶＶＣＶＦＳＧＲＦＥＤＳＧＡＶＡＴＡＮＹＥＡＲＫＦＧＶＫＡＧＩＰＩＶＥＡＫＫＩＬＰＮＡＶＹＬＰＭＲＫＥＶＹＱＱＶＳＳＲＩＭＮＬＬＲＥＹＳＥＫＩＥＩＡＳＩＤＥＡＹＬＤＩＳＤＫＶＲＤＹＲＥＡＹＮＬＧＬＥＩＫＮＫＩＬＥＫＥＫＩＴＶＴＶＧＩＳＫＮＫＶＦＡＫＩＡ−チオエステル。
【０２４４】
８．１．２  全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４変異体Ａ１５５Ｃの断片１５５−３５２−発現コンストラクトｐＭＪ３８４
このコンストラクトは、「Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ  ｅＸａｃｔ」タグと、それに続く全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４変異体Ａ１５５Ｃの断片１５５−３５２を含有する。「Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ  ｅＸａｃｔ」タグを精製およびタンパク質分解性切断のために使用した。２つのＰＣＲ生成物からコンストラクトを組み立てた。「Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ  ｅＸａｃｔ」タグを増幅するために鋳型としてのｐＰＡＬ７（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ドイツミュンヘン）およびプライマーＭＪ＿１＿９９＿ＤＤ（５’−リン酸−ＡＧＣＧＧＣＴＣＴＴＣＧＡＴＧＧＧＡＧＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＧＧＧＡＡ−３’）およびＭＪ＿１＿１００＿ＤＤ（５’−リン酸−ＡＧＣＧＧＣＴＣＴＴＣＧＧＣＡＣＡＡＡＧＣＴＴＴＧＡＡＧＡＧＣＴＴＧＴＣ−３’）を用いて、ＰＣＲ生成物１を作製した。Ａ１５５Ｃ突然変異を含有するｄｐｏ４断片１５５−３５２を増幅するために鋳型としてのｐＭＪ３６１およびプライマーＭＪ＿１＿９６＿ＤＤ（５’−リン酸−ＡＧＣＧＧＣＴＣＴＴＣＧＴＧＣＧＡＴＡＴＧＧＣＡＡＡＡＣＣＧＡＡＴＧＧＣＡＴＴＡＡＡ−３’）およびＭＪ＿１＿９７＿ＤＤ（５’−リン酸−ＡＧＣＧＧＣＴＣＴＴＣＧＣＣＣＴＴＡＧＧＴＡＴＣＡＡＡＡＡＡＴＴＴＡＴＣＣＡＧＧ−３’）を用いて、ＰＣＲ生成物２を作製した。プライマーＭＪ＿１＿９６＿ＤＤ、ＭＪ＿１＿９７＿ＤＤ、ＭＪ＿１＿９９＿ＤＤおよびＭＪ＿１＿１００＿ＤＤは全て、Ｐｕｒｉｍｅｘ（ドイツグレーベンシュタイン）由来であった。フラッシュゲルシステム（ＬＯＮＺＡ，スイスバーゼル）上で２つのＰＣＲ生成物をゲル精製し、ＳｔａｒＧａｔｅ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ＥＮＴＲＹクローニングキット（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ，ドイツゲッティンゲン）を用いてｐＥＮＴＲＹ−ＩＢＡ２０と一緒にクローニングし、ｐＭＪ３８２が得られた。ＳｔａｒＧａｔｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒクローニングキット（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ，ドイツゲッティンゲン）を用いたｐＡＳＧ−ＩＢＡ５（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ，ドイツゲッティンゲン）中のｐＭＪ３８２からのサブクローニングによって、ｐＭＪ３８４が得られた。コンストラクトｐＭＪ３８４は、（タンパク質分解性切断後）１９８アミノ酸長の次のタンパク質配列とともに突然変異Ａ１５５Ｃを含有する全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４の断片１５５−３５２をコードする：ＣＤＭＡＫＰＮＧＩＫＶＩＤＤＥＥＶＫＲＬＩＲＥＬＤＩＡＤＶＰＧＩＧＮＩＴＡＥＫＬＫＫＬＧＩＮＫＬＶＤＴＬＳＩＥＦＤＫＬＫＧＭＩＧＥＡＫＡＫＹＬＩＳＬＡＲＤＥＹＮＥＰＩＲＴＲＶＲＫＳＩＧＲＩＶＴＭＫＲＮＳＲＮＬＥＥＩＫＰＹＬＦＲＡＩＥＥＳＹＹＫＬＤＫＲＩＰＫＡＩＨＶＶＡＶＴＥＤＬＤＩＶＳＲＧＲＴＦＰＨＧＩＳＫＥＴＡＹＳＥＳＶＫＬＬＱＫＩＬＥＥＤＥＲＫＩＲＲＩＧＶＲＦＳＫＦＩＥＡＩＧＬＤＫＦＦＤＴ。
【０２４５】
８．１．３  全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４変異体Ａ１５５Ｃの断片２０３−３５２−発現コンストラクトｐＭＪ３８５
このコンストラクトは、「Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ  ｅＸａｃｔ」タグとそれに続く、突然変異Ｖ２０３Ｃを含有するｄｐｏ４断片２０３−３５２を含有する。「Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ  ｅＸａｃｔ」タグを精製およびタンパク質分解性切断のために使用した。２つのＰＣＲ生成物からコンストラクトを組み立てた。「Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ  ｅＸａｃｔ」タグを増幅するために鋳型としてのｐＰＡＬ７（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ドイツミュンヘン）およびプライマーＭＪ＿１＿９９＿ＤＤ（５’−リン酸−ＡＧＣＧＧＣＴＣＴＴＣＧＡＴＧＧＧＡＧＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＧＧＧＡＡ−３’）およびＭＪ＿１＿１００＿ＤＤ（５’−リン酸−ＡＧＣＧＧＣＴＣＴＴＣＧＧＣＡＣＡＡＡＧＣＴＴＴＧＡＡＧＡＧＣＴＴＧＴＣ−３’）を用いてＰＣＲ生成物１を作製した。Ｖ２０３Ｃ突然変異を含有するｄｐｏ４断片２０３−３５２を増幅するために鋳型としてのｐＭＪ３６２およびプライマーＭＪ＿１＿９８＿ＤＤ（５’−リン酸−ＡＧＣＧＧＣＴＣＴＴＣＧＴＧＴＧＡＴＡＣＣＣＴＧＡＧＣＡＴＴＧＡＡＴＴＴ−３’）およびＭＪ＿１＿９７＿ＤＤ（５’−リン酸−ＡＧＣＧＧＣＴＣＴＴＣＧＣＣＣＴＴＡＧＧＴＡＴＣＡＡＡＡＡＡＴＴＴＡＴＣＣＡＧＧ−３’）を用いてＰＣＲ生成物２を作製した。プライマーＭＪ＿１＿９７＿ＤＤ、ＭＪ＿１＿９８＿ＤＤ、ＭＪ＿１＿９９＿ＤＤおよびＭＪ＿１＿１００＿ＤＤは全てＰｕｒｉｍｅｘ（ドイツグレーベンシュタイン）由来であった。フラッシュゲルシステム（ＬＯＮＺＡ，スイスバーゼル）上で２つのＰＣＲ生成物をゲル精製し、ＳｔａｒＧａｔｅ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ＥＮＴＲＹクローニングキット（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ，ドイツゲッティンゲン）を用いてｐＥＮＴＲＹ−ＩＢＡ２０中で一緒にクローニングし、その結果、ｐＭＪ３８３が得られた。ＳｔａｒＧａｔｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒクローニングキット（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ，ドイツゲッティンゲン）を用いたｐＡＳＧ−ＩＢＡ５（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ，ドイツゲッティンゲン）中のｐＭＪ３８３からのサブクローニングによって、ｐＭＪ３８５が得られた。コンストラクトｐＭＪ３８５は、（タンパク質分解性切断後）１５０アミノ酸長の次のタンパク質配列とともにｄｐｏ４断片２０３−３５２  Ｖ２０３Ｃをコードする：ＣＤＴＬＳＩＥＦＤＫＬＫＧＭＩＧＥＡＫＡＫＹＬＩＳＬＡＲＤＥＹＮＥＰＩＲＴＲＶＲＫＳＩＧＲＩＶＴＭＫＲＮＳＲＮＬＥＥＩＫＰＹＬＦＲＡＩＥＥＳＹＹＫＬＤＫＲＩＰＫＡＩＨＶＶＡＶＴＥＤＬＤＩＶＳＲＧＲＴＦＰＨＧＩＳＫＥＴＡＹＳＥＳＶＫＬＬＱＫＩＬＥＥＤＥＲＫＩＲＲＩＧＶＲＦＳＫＦＩＥＡＩＧＬＤＫＦＦＤＴ。
【０２４６】
８．１．４．全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４の断片１５５−２０２−発現コンストラクトｐＭＪ３８８
このコンストラクトは、ｄｐｏ４断片１５５−２０２とそれに続く、チオエステルを生成させるために使用したＭｘｅ  ＧｙｒＡインテインおよびキチン−結合ドメイン（ＣＢＤ）を含有する。２つのＰＣＲ生成物からコンストラクトを組み立てた。ｄｐｏ４  １５５−２０２断片を増幅するために鋳型としてのｐＭＪ３４３およびプライマーＭＪ＿１＿１０１＿ＤＤ（５’−リン酸−ＡＧＣＧＧＣＴＣＴＴＣＧＡＴＧＧＣＡＧＡＴＡＴＧＧＣＡＡＡＡＣＣＧＡＡＴ−３’）およびＭＪ＿１＿１０２＿ＤＤ（５’−リン酸−ＡＧＣＧＧＣＴＣＴＴＣＧＧＣＡＣＡＧＴＴＴＡＴＴＡＡＴＧＣＣＣＡＧＴＴＴ−３’）を用いてＰＣＲ生成物１を構築した。Ｍｘｅ  Ｇｙｒ  ＡインテインおよびＣＢＤを増幅させるために鋳型としてのｐＴＷＩＮ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，ドイツフランクフルト・アム・マイン）およびプライマーＭＪ＿１＿７２＿ＤＤ（５’−リン酸−ＡＧＣＧＧＣＴＣＴＴＣＧＴＧＣＡＴＣＡＣＧＧＧＡＧＡＴ−３’）およびＭＪ＿１＿７３＿ＤＤ（５’−リン酸−ＡＧＣＧＧＣＴＣＴＴＣＧＣＣＣＴＴＧＡＡＧＣＴＧＣＣＡＣＡＡＧＧＣＡＧＧＡＡＣＧＴＴ−３’）を用いてＰＣＲ生成物２を作製した。プライマーＭＪ＿１＿１０１＿ＤＤおよびＭＪ＿１＿１０２＿ＤＤは、Ｐｕｒｉｍｅｘ（ドイツグレーベンシュタイン）由来であり、一方、プライマーＭＪ＿１＿７２＿ＤＤおよびＭＪ＿１＿７３＿ＤＤはＩＢＡ  ＧｍｂＨ（ドイツゲッティンゲン）由来であった。フラッシュゲルシステム（ＬＯＮＺＡ，スイスバーゼル）上で２つのＰＣＲ生成物をゲル精製し、ＳｔａｒＧａｔｅ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ＥＮＴＲＹクローニングキット（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ，ドイツゲッティンゲン）を用いてｐＥＮＴＲＹ−ＩＢＡ２０中で一緒にクローニングし、その結果、ｐＭＪ３８６が得られた。ＳｔａｒＧａｔｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒクローニングキット（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ，ドイツゲッティンゲン）を用いたｐＡＳＧ−ＩＢＡｗｔ１（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ，ドイツゲッティンゲン）中でのｐＭＪ３８６からのサブクローニングによって、ｐＭＪ３８８が得られた。コンストラクトｐＭＪ３８８は、ｄｐｏ４断片１５５−２０２とそれに続く（最初のメチオニンのＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）介在切断後およびインテイン切断／チオエステル産生後）４８アミノ酸長のタンパク質配列をコードする：ＡＤＭＡＫＰＮＧＩＫＶＩＤＤＥＥＶＫＲＬＩＲＥＬＤＩＡＤＶＰＧＩＧＮＩＴＡＥＫＬＫＫＬＧＩＮＫＬ−チオエステル。
【０２４７】
８．２  Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるタンパク質発現
発現のために、「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ」（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ／Ｂｉｏｚｙｍ，ドイツヘッシシュ・オルデンドルフ）を用いてＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株「ＮＥＢ  ＥＸＰＲＥＳＳ」（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，ドイツフランクフルト・アム・マイン）中で適切な発現コンストラクトを形質転換し、抗生物質アンピシリンを用いて維持した。誘導因子として２００ｎｇ／ｍＬアンヒドロテトラサイクリン（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ，ドイツゲッティンゲン）を用いて、一晩、周囲温度で培地「ＥｎＢａｓｅ  Ｆｌｏ」または「ＥｎＰｒｅｓｓｏ」（ＢｉｏＳｉｌｔａ，フィンランドオウル）中で発現を行った。遠心によって細胞を回収し、−８０℃で保存するかまたはすぐに処理した。
【０２４８】
８．３  Ｍｘｅ  Ｇｙｒ  Ａインテインを用いたコンストラクトｐＭＪ３７０およびｐＭＪ３８８からのチオエステルの精製および生成
「カラム緩衝液」（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．５、５００ｍＭ  ＮａＣｌ）中で新鮮または凍結Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を氷上で再懸濁し、「フレンチプレス」（Ｇ．Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，ドイツシュヴェービッシュ・グミュント）細胞破壊装置を用いて溶解させた。キチン結合ビーズを含有するカラム（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄｓ  Ｂｉｏｌａｂｓ，ドイツフランクフルト・アム・マイン）を備えた「ＡＫＴＡ  ｅｘｐｒｅｓｓ」システム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ドイツフライブルク）」上で４℃で精製を行った。細胞溶解液を適用し、ベースラインまでカラム緩衝液で洗浄した後、インテイン介在性タンパク質切断およびチオエステル形成を誘導するために、カラム緩衝液中の５０ｍＭ  ２−メルカプトエタンスルホネート（略称ＭＥＳＮＡ）とともにカラムを４℃で２０時間温置した。チオエステルを担う切断タンパク質をカラム緩衝液でカラムから洗い流し、濃縮し、５ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．５、２５０ｍＭ  ＮａＣｌからなる緩衝液中でＢｉｏＧｅｌ  Ｐ６０媒体材料（ＢｉｏＲａｄ，ドイツミュンヘン）を用いてゲルろ過に供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）標準物質を用い、ＳＹＰＲＯ  Ｒｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ドイツカールスルーエ）で染色して、ゲル密度測定によってタンパク質濃度を推定した。ＬＣ−ＭＳ質量分析によって、タンパク質の正体およびチオエステルの存在を確認した。
【０２４９】
８．４  「Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ  ｅＸａｃｔ」タグによるコンストラクトｐＭＪ３８４からの精製およびタンパク質分解性切断
次のとおり、ｐＭＪ３８４からの全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４変異体Ａ１５５Ｃの断片１５５−３５２の精製を行った：「緩衝液Ｗ」（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で新鮮または凍結Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を氷上で再懸濁し、「フレンチプレス」（Ｇ．Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，ドイツシュヴェービッシュ・グミュント）細胞破壊装置を用いて溶解させた。５ｍＬ  ＳｔｒｅｐＴｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ドイツフライブルク）を備えた「ＡＫＴＡ  ｅｘｐｒｅｓｓ」システム上で４℃で精製を行った。２．５ｍＭデスチオビオチン（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ，ドイツゲッティンゲン）を含む緩衝液Ｗを用いて段階溶出を行った。ＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ドイツフライブルク）を用いた「Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ  ｅＸａｃｔ溶出緩衝液」（０．１Ｍ  Ｎａ−リン酸、ｐＨ７．２、０．１Ｍ  ＮａＦ）中での緩衝液交換に、溶出タンパク質を供し、次いでゆっくりとＰｒｏｆｉｎｉｔｙ  ｅＸａｃｔカラムに注入した。試料を濃縮し、１ｍＭの最終濃度になるまでＴｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィン）（ＴＣＥＰ）を供給し、５ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．５、２５０ｍＭ  ＮａＣｌからなる緩衝液で展開されるＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５調製グレードカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ドイツフライブルク）を用いてゲルろ過に適用した。タンパク質を濃縮し、−８０℃で保存した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）標準物質を用い、ＳＹＰＲＯ  Ｒｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ドイツカールスルーエ）で染色して、ゲル密度測定によってタンパク質濃度を推定した。ＬＣ−ＭＳ質量分析によってタンパク質同一性を確認した。
【０２５０】
８．５  「Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ  ｅＸａｃｔ」タグによるコンストラクトｐＭＪ３８５からの精製およびタンパク質分解性切断
次のとおりｐＭＪ３８５からのｄｐｏ４断片２０３−３５２  Ｖ２０３Ｃの精製を行った：封入体を調製し、「ｉ−ＦＯＬＤタンパク質再折り畳み系」マニュアル（Ｎｏｖａｇｅｎ／Ｍｅｒｃｋ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ドイツダルムシュタット）に記載のとおり変性させた。Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５微細物質（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ドイツフライブルク）を用いて、可溶化タンパク質を「緩衝液Ｗ」（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）への緩衝液交換に供し、ＳｔｒｅｐＴｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ドイツフライブルク）を備えた「ＡＫＴＡ  ｅｘｐｒｅｓｓ」システム上で４℃で精製した。２．５ｍＭデスチオビオチン（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ，ドイツゲッティンゲン）を含む緩衝液Ｗで段階溶出を行った。０．１Ｍの最終濃度まで溶出タンパク質溶液にＮａＦを供給し、１ｍＭの最終濃度になるようにＴｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィン）（ＴＣＥＰ）を供給し、次いでＰｒｏｆｉｎｉｔｙ  ｅＸａｃｔカラム中にゆっくりと注入した。脱イオン化水でフロースルーを１：３希釈し、ＨＣｌを用いてｐＨを７．２に調整した。「緩衝液Ａ」（５０ｍＭ  Ｎａ−リン酸、ｐＨ７．２、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）中で平衡化したＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＨＰカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ドイツフライブルク）を用いて陽イオン交換−クロマトグラフィーによって試料をさらに精製した。１７％、２５％および１００％の「緩衝液Ｂ」（５０ｍＭ  Ｎａ−リン酸、ｐＨ７．２、１Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）を用いて段階溶出を行った。分画をプールし、濃縮し、脱イオン化水中で展開させるＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５調製グレードカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ドイツフライブルク）を用いてゲルろ過に適用した。液体窒素中でタンパク質を瞬間凍結し、凍結乾燥させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）標準物質を用い、ＳＹＰＲＯ  Ｒｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ドイツカールスルーエ）で染色して、ゲル密度測定によってタンパク質濃度を推定した。ＬＣ−ＭＳ質量分析によってタンパク質同一性を確認した。
【０２５１】
８．６  断片１−１５４−チオエステルおよび１５５−３５２のネイティブ化学ライゲーションによる合成全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４変異体Ａ１５５Ｃの合成
２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、１％チオフェノールおよび５ｍＭ  ＴＲＩＳ（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩を含有するＴＲＩＳ−緩衝液（ｐＨ８．６）中で全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４変異体Ａ１５５Ｃの断片１−１５４−チオエステルおよび１５５−３５２を５０μＭで溶解させた。反応混合物を室温により７２時間振盪した。その後、ライゲーションの成功をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１１Ａ）およびＬＣ−ＥＳＩ−質量分析（ＲＰ１８−カラム、２０分間の０．１％ＴＦＡ  ５−９５％での水中０．１％ＴＦＡによるＡＣＮ勾配、図１１Ｂ）により分析した。４１ｋＤａ前後でレーンにおいて明確なバンドが見出され、このことから、全長ポリメラーゼが示された。理論分子量（Ｍｔｈｅｏｒ＝４０２２３Ｄａ）は、ＥＳＩ−ＭＳにより示される場合の、実測分子量（Ｍｏｂｓ＝４０２６５Ｄａ）と一致する。
【０２５２】
８．７  断片１５５−２０２−チオエステルおよび２０３−３５２のネイティブ化学ライゲーションによる断片１５５−３５２の合成
２％ＳＤＳ、１％チオフェノールおよび５ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩を含有するＴＲＩＳ−緩衝液（ｐＨ８．６）中で、全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４の断片１５５−２０２−チオエステルおよび２０３−３５２  Ｖ２０３Ｃを０．２Ｍで溶解させた。室温によって反応混合物を７２時間振盪した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２０Ａ）およびＬＣ−ＥＳＩ−質量分析（ＲＰ１８−カラム、２０分間の０．１％ＴＦＡ  ５−９５％での水中０．１％ＴＦＡによるＡＣＮ勾配、図２０Ｂ）によって、ライゲーションの成功の分析を行った。レーン７で２１．５ｋＤａ前後で明確なバンドが見出され、これによりライゲーション生成物が示された。理論分子量（Ｍｔｈｅｏｒ＝２２７４９Ｄａ）は、ＥＳＩ−ＭＳによって示される場合の、実測分子量（Ｍｏｂｓ＝２２７６９Ｄａ）と一致する。
【０２５３】
実施例９−全てＬ−アミノ酸からなる、ポリメラーゼＤｐｏ４の切断型の組み換え発現および精製
ポリメラーゼＤｐｏ４は、初めにＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  Ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ（略語  Ｓｓｏ）で発見された（Ｂｏｕｄｓｏｃｑ，  ２００１）。野生型の遺伝子は、開始コドンおよび終始コドンを含む１，０５９の塩基対のオープンリーディングフレーム（略語：ＯＲＦ）を有する。コードされたタンパク質は、３５２個の長さのアミノ酸を有する。この実施例は、どのようにポリメラーゼＤｐｏ４の切断型がＥ．Ｃｏｌｉで発現されたか、およびＳｔｒｅｐ−Ｔａｇを使用して精製されたかを説明する。
【０２５４】
９．１発現構築物
Ｓｓｏのコドンの利用は、Ｅ．Ｃｏｌｉと異なるため、野生型ＳｓｏポリメラーゼＤｐｏ４用のＥ．Ｃｏｌｉ−コドン最適化合成遺伝子は、ＧｅｎｅＡｒｔ  ＡＧ（ドイツレーゲンスブルク）から購入した。また、Ｃ末端から３、６、または９個のアミノ酸を切断した切断型を、ＧｅｎｅＡｒｔによりカスタムメイドした。合成遺伝子の配列は、Ｎ末端にＳｔｒｅｐ−Ｔａｇを追加するｐＡＳＫ−ＩＢＡ５ｐｌｕｓベクター（ｏｒｉｇｉｎａｔｏｒ  ｃｏｍｐａｎｙ：  ＩＢＡ  ＧｍｂＨ，  ドイツゲッティンゲン）で提供されている。Ｃ末端で３つのアミノ酸が欠失したｄｐｏ４のトランケーション形態は、この一連のプラスミドから発現した最も長い変異体であり、クローン３．Ｃ１１（変異体Δ３）と命名されており、３６８個のアミノ酸である以下のアミノ酸を有した（Ｎ〜Ｃ末端が示された配列）：
ＭＡＳＷＳＨＰＱＦＥＫＧＡＥＴＡＶＰＮＳＩＶＬＦＶＤＦＤＹＦＹＡＱＶＥＥＶＬＮＰＳＬＫＧＫＰＶＶＶＣＶＦＳＧＲＦＥＤＳＧＡＶＡＴＡＮＹＥＡＲＫＦＧＶＫＡＧＩＰＩＶＥＡＫＫＩＬＰＮＡＶＹＬＰＭＲＫＥＶＹＱＱＶＳＳＲＩＭＮＬＬＲＥＹＳＥＫＩＥＩＡＳＩＤＥＡＹＬＤＩＳＤＫＶＲＤＹＲＥＡＹＮＬＧＬＥＩＫＮＫＩＬＥＫＥＫＩＴＶＴＶＧＩＳＫＮＫＶＦＡＫＩＡＡＤＭＡＫＰＮＧＩＫＶＩＤＤＥＥＶＫＲＬＩＲＥＬＤＩＡＤＶＰＧＩＧＮＩＴＡＥＫＬＫＫＬＧＩＮＫＬＶＤＴＬＳＩＥＦＤＫＬＫＧＭＩＧＥＡＫＡＫＹＬＩＳＬＡＲＤＥＹＮＥＰＩＲＴＲＶＲＫＳＩＧＲＩＶＴＭＫＲＮＳＲＮＬＥＥＩＫＰＹＬＦＲＡＩＥＥＳＹＹＫＬＤＫＲＩＰＫＡＩＨＶＶＡＶＴＥＤＬＤＩＶＳＲＧＲＴＦＰＨＧＩＳＫＥＴＡＹＳＥＳＶＫＬＬＱＫＩＬＥＥＤＥＲＫＩＲＲＩＧＶＲＦＳＫＦＩＥＡＩＧＬＤＫＦ。
【０２５５】
最初の２０個のアミノ酸は、数個のスペーサーアミノ酸を含むＳｔｒｅｐ−Ｔａｇ  ＩＩを表し、次に以下の配列は、スルホロブス・ソルファタリカスのＤｐｏ４のアミノ酸２−３４９を表す。この実施例で説明される他のトランケーション形態は、Ｎ末端に同一の配列を有するが、Ｃ末端のアミノ酸が少なかった。たとえば、クローン９．Ｃ３（変異体Δ６）は、６つのアミノ酸が欠失しており、クローン２．Ｆ１２（変異体Δ９）は、Ｃ末端から欠失した９つのアミノ酸を有した。Ｄｐｏ４のさらなるトランケーション形態用の発現構築物を、製造社のプロトコルにしたがって、市販のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＧｍｂＨ，  ドイツヴァルトブロン）を使用して作製した。クローン２．Ｆ１２（ｐＡＳＫ−ＩＢＡ５ｐｌｕｓで、Ｃ末端で欠失した９つのアミノ酸を含むｄｐｏ４）は、ｐＣＫ５８およびｐＣＫ５９を作製するために鋳型として使用したＱ。ｕｉｋＣｈａｎｇｅで必要とされるオリゴヌクレオチドは、ＮＯＸＸＯＮであった。
【０２５６】
以下の発現構築物を、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるポリメラーゼＤｐｏ４の切断型の発現のために作製し、使用した。
【表９】
0006670237.tif 000057
【０２５７】
９．２Ｅ．Ｃｏｌｉにおけるタンパク質発現
Ｄｐｏ４の切断型Δ３、Δ６、Δ１２、またはΔ１５を、ｐＡＳＫ−ＩＢ５ｐｌｕｓに基づく発現構築物を使用してＥ．ｃｏｌｉにおいて発現した。発現のために、適切な発現構築物を、“形質転換および保存用溶液（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）”（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ／Ｂｉｏｚｙｍ，  ドイツヘッシシュ・オルデンドルフ）を使用してＥ．ｃｏｌｉの株「ＮＥＢ  ｅｘｐｒｅｓｓ」（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  ドイツフランクフルト・アム・マイン）で形質転換し、抗菌性のアンピシリンを用いて維持した。インデューサーとして２００ｎｇ／ｍｌのアンヒドロテトラサイクリン（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ、ドイツゲッティンゲン）を使用して、３０℃で４８時間、培地“ＥｎＢａｓｅ  Ｆｌｏ”または“ＥｎＰｒｅｓｓｏ”（ＢｉｏＳｉｌｔａ，  フィンランドオウル）中で発現を行った。細胞を、延伸により収集して、−８０℃で保存するか、またはすぐに処理した。
【０２５８】
９．３タンパク質の精製
新鮮または凍結したＥ．ｃｏｌｉを、“Ｂｕｆｆｅｒ  Ｗ”（１００  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中、氷上で再懸濁し、“Ｆｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓ”（Ｇ．  Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，  ドイツシュヴェービッシュ・グミュント）細胞破砕機を使用して溶解した。５ｍｌのＳｔｒｅｐＴｒａｐ  ＨＰのカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  ドイツフライブルク）を備え付けた“ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓ”システムで精製を４℃で行った。段階溶出を、２．５ｍＭのデスチオビオチン（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ，  ドイツゲッティンゲン）を含むバッファーＷを用いて行った。画分を集め、ＨｉＰｒｅｐ＿２６／１０カラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  ドイツフライブルク）を使用して、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）でバッファー交換した。次にタンパク質の試料を、５ｍｌの陽イオン交換カラムＨｉＴｒａｐ＿ＳＰ＿ＨＰ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ドイツフライブルク）に添加し、最大１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）の勾配で溶出した。溶出したピークの画分を回収し、集め、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２００ｍＭ  ＫＣｌ、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡでバッファー交換した。すべての重要な画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分析した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ドイツカールスルーエ）。タンパク質の同一性を、ＬＣ−ＭＳ質量分析により確認した。最終的な試料を、１０，０００の分子量のカットオフ（ＭＷＣＯ）で、ＶｉｖａＳｐｉｎ  １５Ｒの濃縮装置を使用して濃縮し（ＶｉｖａＳｃｉｅｎｃｅｓ／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  ドイツゲッティンゲン）、１容量のグリセロールおよびＤＴＴを追加することにより、保存バッファーは、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、５０％のグリセロールからなるものであった。精製したタンパク質を−２０℃で保存した。タンパク質の濃度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにとって標準的なウシ血清アルブミン（略語ＢＳＡ）を使用し、ＳＹＰＲＯ  Ｒｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ドイツカールスルーエ）で染色したゲルデンシトメトリーにより評価した。
【０２５９】
実施例１０−ポリメラーゼＤｐｏ４およびＬ−アミノ酸からなるポリメラーゼＤｐｏ４の変異体の活性確認
この実施例は、全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４および実施例７による全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４の変異体に対する、および実施例８による合成全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４に対する、および実施例９によるＤｐｏ４の切断型に対するＰＣＲ活性試験を記載する。
【０２６０】
１０．１  ＰＣＲ活性アッセイのための鋳型
ＰＣＲ反応のための鋳型は、８３マー１本鎖Ｄ−ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＭＪ＿１＿１＿ＤＤ）であり、これにより第一の温度サイクルにおいて逆の鎖が生成する。その後、両鎖を指数関数的増幅のための鋳型とする。Ｄ−立体配置で、ＮＯＸＸＯＮにおいて、鋳型ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよびＤＮＡプライマーを合成する。
【０２６１】
ＰＣＲ活性アッセイに対するオリゴヌクレオチドのリスト：
【表１０】
0006670237.tif 000058
【０２６２】
１０．２  ＰＣＲ反応
１５μＬＰＣＲ反応は、各０．２ｍＭの４種類のＤ−ｄＮＴＰ、１０ｎＭ  ８３マーｓｓＤＮＡ（ＭＪ＿１＿１＿ＤＤ）鋳型、１μＭのフォワードおよびリバースプライマー、１ｘ  ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ８．８＠２５℃）および少なくとも０．６７ｎｇ／μＬの全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４または全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４の変異体または合成全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４を含有した。フォワードプライマーはＤＥ４．４０Ｔ７であり、リバースプライマーはＤＥ４．４０Ｒであり、１０２塩基対長のＰＣＲ生成物が得られる。Ｒｏｖａｌａｂ（ドイツテルトー）からＤ−ｄＮＴＰを購入した。全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４または全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４の変異体または合成全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４を省くことによって陰性対照を遂行した。市販の全−Ｌ−ｄｐｏ４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，ドイツフランクフルト・アム・マイン）を用いて陽性対照を遂行した。
【０２６３】
温度サイクリングプログラムは、１サイクル（８５℃、３分）、次に少なくとも７サイクル（８５℃、３０秒／５６℃、１分／６０℃、４分）、次いで４℃で保持から構成された。ＰＣＲ反応物の４μＬアリコートを試料ローディング緩衝液と混合し、ＴＢＥ−ＰＡＧＥまたはアガロースゲル（ＬＯＮＺＡ、ドイツケルン）上で分析した。とりわけ１００ｂｐバンドを含有するＤＮＡ標準物質ラダーをこのゲル上に適用した。
【０２６４】
１０．３活性確認
全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４、全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４の変異体Ａ１５５Ｃ、Ｖ２０３Ｃ、Ｃ３１Ｓ、Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃ、Ｓ８５Ｃ、Ｓ８６Ｃ、Ｓ９６Ｃ、Ａ７１Ｃ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃ、Ｓ８６Ｃ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃ、Ｃ３１Ｓ／Ｓ８６Ｃ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃ、Ｍ７６Ｇ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃ、Ｍ７６Ａ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃ、Ｉ６７Ｃ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃ、Ｓ８６Ｇ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃおよび全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４のＳ９６Ｃ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃ、およびＤｐｏ４のＣ末端での切断型Δ３、Δ６、Δ９、Δ１２、およびΔ１５を試験した。試験したポリメラーゼは全て、ＰＣＲ反応において鋳型鎖を増幅することができた。図１２Ａは、全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４の変異体Ａ１５５Ｃ、Ｖ２０３Ｃ、Ｃ３１Ｓ、Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃを用いて行ったＰＣＲ反応の分析を示し、、ＤＮＡ標準物質ラダーと比較した場合に約１００ｂｐの範囲となるバンドを示した。予想されたＰＣＲ生成物サイズは１０２塩基対であった。このバンドはポリメラーゼがない陰性対照では現れない。またこの１０２ｂｐバンドは、８３マー鋳型より高く移動する。図１２Ｂは、組み換え全−Ｌ−ポリメラーゼｄｐｏ４を用い、断片のライゲーションにより作製された合成全−Ｌ−ポリメラーゼｄｐｏ４を使用して行ったＰＣＲ反応の分析を示す。ゲルは、ＤＮＡ標準物質ラダーと比較した場合に約１００ｂｐの範囲となるバンドを示した。予想されたＰＣＲ生成物サイズは１０２塩基対であった。ポリメラーゼがない陰性対照においてこのバンドは非常に弱い。組み換え全−Ｌ−ポリメラーゼｄｐｏ４および合成全−Ｌ−ポリメラーゼｄｐｏ４は、比較可能な活性を示す。図１２Ｃは、組み換え全Ｌ−ポリメラーゼｄｐｏ４、および変異体７１Ｃ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃ、Ｓ８６Ｃ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３ＣおよびＣ３１Ｓ／Ｓ８６Ｃ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃを用いて実施したＰＣＲ反応の分析を示す。このゲルは、ＤＮＡの標準ラダーと比較して約１００ｂｐの範囲のバンドを示した。予測したＰＣＲ産物の大きさは１０２の塩基対であった。図１２Ｄは、組み換え全Ｌ−ポリメラーゼｄｐｏ４、および変異体Ｍ７６Ｇ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３ＣおよびＭ７６Ａ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃで実施したＰＣＲ反応の分析を示す。このゲルは、ＤＮＡ標準ラダーと比較して約１００ｂｐの範囲のバンドを示した。予測したＰＣＲ産物の大きさは１０２の塩基対であった。図１２Ｅは、変異体Ｉ６７Ｃ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃ、Ｓ８６Ｇ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３ＣおよびＳ９６Ｃ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃで実施したＰＣＲ反応の分析を示す。このゲルは、ＤＮＡ標準ラダーと比較して約１００ｂｐの範囲のバンドを示した。予測したＰＣＲ産物の大きさは１０２塩基対であった。図１２Ｆは、Ｄｐｏ４のＣ末端での切断型Δ３、Δ６、Δ９、Δ１２、およびΔ１５で実施したＰＣＲ反応の分析を示す。このゲルは、ＤＮＡ標準ラダーと比較した約１００ｂｐの範囲のバンドを示した。予測したＰＣＲ産物の大きさは１０２塩基対であった。
【０２６５】
実施例１１−Ｄ−アミノ酸からなるポリメラーゼＤｐｏ４の変異体の合成
本実施例中では、全−ＤポリメラーゼＤｐｏ変異体Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃの合成を記載する。全−ＤポリメラーゼＤｐｏ変異体Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃのアミノ酸配列は、Ａｃ−ＭＩＶＬＦＶＤＦＤＹＦＹＡＱＶＥＥＶＬＮＰＳＬＫＧＫＰＶＶＶＣＶＦＳＧＲＦＥＤＳＧＡＶＡＴＡＮＹＥＡＲＫＦＧＶＫＡＧＩＰＩＶＥＡＫＫＩＬＰＮＡＶＹＬＰＭＲＫＥＶＹＱＱＶＳＳＲＩＭＮＬＬＲＥＹＳＥＫＩＥＩＡＳＩＤＥＡＹＬＤＩＳＤＫＶＲＤＹＲＥＡＹＮＬＧＬＥＩＫＮＫＩＬＥＫＥＫＩＴＶＴＶＧＩＳＫＮＫＶＦＡＫＩＡＣＤＭＡＫＰＮＧＩＫＶＩＤＤＥＥＶＫＲＬＩＲＥＬＤＩＡＤＶＰＧＩＧＮＩＴＡＥＫＬＫＫＬＧＩＮＫＬＣＤＴＬＳＩＥＦＤＫＬＫＧＭＩＧＥＡＫＡＫＹＬＩＳＬＡＲＤＥＹＮＥＰＩＲＴＲＶＲＫＳＩＧＲＩＶＴＭＫＲＮＳＲＮＬＥＥＩＫＰＹＬＦＲＡＩＥＥＳＹＹＫＬＤＫＲＩＰＫＡＩＨＶＶＡＶＴＥＤＬＤＩＶＳＲＧＲＴＦＰＨＧＩＳＫＥＴＡＹＳＥＳＶＫＬＬＱＫＩＬＥＥＤＥＲＫＩＲＲＩＧＶＲＦＳＫＦＩＥＡＩＧＬＤＫＦＦＤＴ−ＯＨである。
【０２６６】
固相ペプチド合成Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ−ストラテジーの要件（Ｅｒｉｃ  Ａｔｈｅｒｔｏｎら、１９８１）に従い、使用する全アミノ酸を保護する。使用するアミノ酸は全てＤ−アミノ酸である（Ｂａｃｈｅｍ，スイスブーベンドルフ）。
【０２６７】
１１．１  Ｈ−Ｄ−Ｍｅｔ−ＯＧｐ（Ｂｏｃ）２の合成
１ｍｍｏｌのＺ−Ｄ−Ｍｅｔ−ＯＨ、０．９ｅｑ．ＴＢＴＵおよび０．９ｍｍｏｌ  ＨＯ−Ｇｐ（Ｂｏｃ）２を１０ｍＬ  ＤＭＦ中で溶解させた。２ｅｑ．ＤＩＰＥＡの添加後、溶液を２時間撹拌した。溶媒を蒸発させた後、ＤＣＭを用いてフラッシュクロマトグラフィーにより粗生成物を精製した。Ｚ−Ｄ−Ｍｅｔ−ＯＧｐ（Ｂｏｃ）２の純粋な分画を合わせ、溶媒を蒸発させた。
【０２６８】
Ｚ−Ｄ−Ｍｅｔ−ＯＧｐ（Ｂｏｃ）２を１０ｍＬ  ＭｅＯＨ中で溶解させ、アルゴンを吹き付けた。２時間のＰｄ／Ｃ触媒およびＨ２の添加によって、Ｎ末端Ｚ−基の加水分解性切断を達成した。ろ別後、Ｈ−Ｄ−Ｍｅｔ−ＯＧｐ（Ｂｏｃ）２ＭｅＯＨを減圧下で蒸発させた。逆相ＨＰＬＣおよび質量分析を用いて分析を行った。４８２Ｄａの計算質量は、４８３Ｄａの決定質量と一致する。
【０２６９】
１１．２  完全保護化全−Ｄ−ペプチドＨ−ＲＴＦＰＨＧＩＳＫＥＴＡＹＳＥＳＶＫＬＬＱＫＩＬＥＥＤＥＲＫＩＲＲＩＧＶＲＦＳＫＦＩＥＡＩＧＬＤＫＦＦＤＴ−ＮＨ２（１）の合成
６ｍＬ  ＮＭＰ中で４５分間、５ｅｑ．アミノ酸、ｅｑ．４．９ｅｑ．ＨＡＴＵおよび１０ｅｑ  ＤＩＰＥＡを用いて、Ｆｍｏｃ−脱保護後に、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨを０．１ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｓｉｅｂｅｒ  ｒｉｎｋ  アミドＮｏｖａＳｙｎＴＧレジンに充填した。
【０２７０】
ＦＡＳＴｍｏｃプロトコールによりＡＢＩ  ４３３を用いて自動化合成を行った。ＮＭＰ中で９ｅｑ．ＨＡＴＵおよび２０ｅｑ．ＤＩＰＥＡ用いて、１０ｅｑ．アミノ酸を活性化した。カップリング時間は４５分間であり、ＮＭＰ中２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンを用いて７分間にわたりＦｍｏｃ−脱保護化を３回行った。４２アミノ酸のカップリング後、ダブルカップリングを行った。
【０２７１】
２時間にわたり、１０ｍＬのＤＣＭ中１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ中でぺプチジルレジンを２回温置することによって、完全保護化ペプチド酸の切断を達成した。ペプチドをろ別した後、溶媒を蒸発させ、氷冷ジエチルエーテルを用いて残渣を沈殿させた。沈殿させたペプチドを単離し、乾燥させた。
【０２７２】
ＨＰＬＣおよび質量分析（図１３）によって最終生成物の特徴を調べた。生成物に対する計算質量（６２４４Ｄａ）は、測定質量（６２４９Ｄａ）と一致する。
【０２７３】
１１．３  完全保護化全−Ｄ−ペプチドＢｏｃ−ＶＤＴＬＳＩＥＦＤＫＬＫＧＭＩＧＥＡＫＡＫＹＬＩＳＬＡＲＤＥＹＮＥＰＩＲＴＲＶＲＫＳＩＧＲＩＶＴＭＫＲＮＳＲＮＬＥＥＩＫＰＹＬＦＲＡＩＥＥＳＹＹＫＬＤＫＲＩＰＫＡＩＨＶＶＡＶＴＥＤＬＤＩＶＳＲＧ−ＯＨ（２）の合成
Ｂａｒｌｏｓら（Ｂａｒｌｏｓら、１９８９）により記載されるように、０．１０ｍｍｏｌのＴｅｎｔａＧｅｌ−Ｒ−ＴｒｉｔｙｌレジンにＦｍｏｃ−Ｄ−Ｇｌｙ−ＯＨを充填した。したがって、０．６ｍｍｏｌの塩化チオニルとともに０．１０ｍｍｏｌレジンを３０分間、２回温置し、その後にＤＣＭで洗浄した。この後、６ｍＬＤＣＭ中の０．６ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、２．４ｍｍｏｌ  ＤＩＰＥＡとともにレジンを９０分間温置した。その後、ＤＣＭ中１０％ＭｅＯＨ（ｖ／ｖ）、１０％ＤＩＰＥＡ（ｖ／ｖ）の溶液を用いて、レジンを１０分間、３回ブロッキング処理し、ＤＣＭで洗浄した。ＦＡＳＴｍｏｃプロトコールによりＡＢＩ４３３を用いて自動化合成を行った。ＮＭＰ中９ｅｑ．ＨＡＴＵおよび２０ｅｑ．ＤＩＰＥＡを用いて１０ｅｑ．アミノ酸を活性化した。カップリング時間は４５分間であり、ＮＭＰ中２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンを用いてＦｍｏｃ−脱保護化を７分間、３回行った。３９アミノ酸のカップリング後、ダブルカップリングを行った。
【０２７４】
ＤＣＭ中の１０ｍＬ  ３０％（ｖ／ｖ）ＨＦＩＰ中でぺプチジルレジンを２時間、２回温置することによって、完全保護化ペプチド酸の切断を達成した。ペプチドをろ別した後、溶媒を蒸発させ、氷冷ジエチルエーテルを用いて残渣を沈殿させた。沈殿させたペプチドを単離し、乾燥させた。ＨＰＬＣおよび質量分析によって最終生成物の特徴を調べた（図１４）。実験により決定された生成物の質量（１１２８９Ｄａ）は理論値（１１２８６Ｄａ）のとおりであった。
【０２７５】
１１．４  ペプチド２とペプチド１の断片縮合による全−Ｄ−ペプチドＨ−ＶＤＴＬＳＩＥＦＤＫＬＫＧＭＩＧＥＡＫＡＫＹＬＩＳＬＡＲＤＥＹＮＥＰＩＲＴＲＶＲＫＳＩＧＲＩＶＴＭＫＲＮＳＲＮＬＥＥＩＫＰＹＬＦＲＡＩＥＥＳＹＹＫＬＤＫＲＩＰＫＡＩＨＶＶＡＶＴＥＤＬＤＩＶＳＲＧＲＴＦＰＨＧＩＳＫＥＴＡＹＳＥＳＶＫＬＬＱＫＩＬＥＥＤＥＲＫＩＲＲＩＧＶＲＦＳＫＦＩＥＡＩＧＬＤＫＦＦＤＴ−ＮＨ２（３）の合成
【０２７６】
ＤＣＭ中２５％（ｖ／ｖ）ＴＦＥ中で５μｍｏｌｅ（２）および１ｅｑ．（１）を溶解させた。５ｅｑ．ＰｙＢＯＰおよび１０ｅｑ．ＤＩＰＥＡの添加後、混合物を一晩撹拌した。溶媒を蒸発させた後、氷冷ジエチルエーテルを用いてペプチドを沈殿させ、ろ別した。
【０２７７】
２時間にわたり、ＴＦＡ中２．５％ＥＤＴ、２．５％水、２．５％ＴＩＳによってペプチドの側鎖保護基の切断を行った。ＴＦＡの蒸発後、氷冷ジエチルエーテルを用いてペプチドを沈殿させた。ＡＣＮ／水勾配を用いてＣ１８カラムにおいて、Ｎ末端Ｆｍｏｃ−保護化ペプチドの逆相ＨＰＬＣ精製を行った。生成物を含有する分画を合わせ、凍結乾燥させた。
【０２７８】
ＨＰＬＣおよび質量分析によって最終生成物の特徴を調べた（図１５）。実験により決定された質量（１７５３１Ｄａ）は理論分子質量（１７５１２Ｄａ）と一致する。
【０２７９】
１１．５  全−Ｄ−ペプチドＺ−ＣＤＭＡＫＰＮＧＩＫＶＩＤＤＥＥＶＫＲＬＩＲＥＬＤＩＡＤＶＰＧＩＧＮＩＴＡＥＫＬＫＫＬＧＩＮＫＬ−ベンジル−チオエステル（４）の合成
Ｂａｒｌｏｓら（Ｂａｒｌｏｓら、１９８９）に記載のように、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＨを０．１０ｍｍｏｌのＴｅｎｔａＧｅｌ−Ｒ−Ｔｒｉｔｙｌレジンに充填した。したがって、０．６ｍｍｏｌの塩化チオニルとともに０．１０ｍｍｏｌレジンを３０分間、２回温置し、その後にＤＣＭで洗浄した。この後、６ｍＬ  ＤＣＭ中の０．６ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＨ、２．４ｍｍｏｌ  ＤＩＰＥＡとともにレジンを９０分間温置した。その後、ＤＣＭ中１０％ＭｅＯＨ（ｖ／ｖ）、１０％ＤＩＰＥＡ（ｖ／ｖ）の溶液を用いて、レジンを１０分間、３回ブロッキング処理し、ＤＣＭで洗浄した。ＦＡＳＴｍｏｃプロトコールによりＡＢＩ４３３を用いて自動化合成を行った。ＮＭＰ中９ｅｑ．ＨＡＴＵおよび２０ｅｑ．ＤＩＰＥＡを用いて、１０ｅｑ．アミノ酸を活性化した。カップリング時間は４５分間であり、ＮＭＰ中２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンを用いてＦｍｏｃ−脱保護化を７分間、３回行った。
【０２８０】
２時間にわたり、１０ｍＬのＤＣＭ中３０％（ｖ／ｖ）ＨＦＩＰ中でぺプチジルレジンを２回温置することによって、完全保護化ペプチド酸の切断を達成した。ペプチドのろ別後、溶媒を蒸発させ、氷冷ジエチルエーテルを用いて残渣を沈殿させた。沈殿ペプチドを単離し、乾燥させた。
【０２８１】
ＤＭＦ中でＮ末端Ｚ−および完全に側鎖保護されたペプチド４を１ｍＭに溶解させた。５ｅｑ．ＰｙＢＯＰ、１０ｅｑ．ＤＩＰＥＡおよび３０ｅｑ．ベンジルメルカプタンの添加後、混合物を４時間撹拌した。次に、ＤＭＦを蒸発させ、ペプチドを沈殿させ、氷冷ジエチルエーテルで洗浄した。２時間にわたるＴＦＡ中２．５％ＥＤＴ、２．５％水、２．５％ＴＩＳでの処理により、側鎖保護基を除去した。ＴＦＡの蒸発後、ペプチドを沈殿させ、氷冷ジエチルエーテルで洗浄した。次に、逆相ＨＰＬＣによってペプチド−ベンジル−チオエステルを精製し、逆相ＨＰＬＣ（図１６Ａ）およびＥＳＩ−ＭＳ（図１６Ｂ）によって分析した。理論分子量（Ｍｔｈｅｏｒ＝５５２７Ｄａ）は、ＥＳＩ−ＭＳにより示されるように実測分子量（Ｍｏｂｓ＝５５３３Ｄａ）と一致する。
【０２８２】
１１．６  全−Ｄ−ペプチドＨ−ＲＫＥＶＹＱＱＶＳＳＲＩＭＮＬＬＲＥＹＳＥＫＩＥＩＡＳＩＤＥＡＹＬＤＩＳＤＫＶＲＤＹＲＥＡＹＮＬＧＬＥＩＫＮＫＩＬＥＫＥＫＩＴＶＴＶＧＩＳＫＮＫＶＦＡＫＩＡ−ＳＭｅ（７）の合成
６ｍＬ  ＮＭＰ中で、４５分間、５ｅｑ．アミノ酸、ｅｑ．４．９ｅｑ．ＨＡＴＵおよび１０ｅｑ．ＤＩＰＥＡを用いて、０．１０ｍｍｏｌのＴｅｎｔａＧｅｌ−Ｒ−ＮＨ２レジンにＦｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨを充填した。その後に、レジンをＴＨＦで洗浄した。２時間にわたり、８０℃でＴＨＦ中４ｅｑ．Ｌａｗｅｓｓｏｎ試薬との温置によって、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−Ψ［ＣＳ−ＮＨ］−Ｒ−ＴｅｎｔａＧｅｌへの変換を達成した。この後、レジンをＮＭＰで洗浄した。その後に、このように調製したレジンを既に記載のように自動化ペプチド合成において使用した（ＡＢＩ４３３、ＦＡＳＴｍｏｃプロトコール、ＮＭＰ中９ｅｑ．ＨＡＴＵおよび２０ｅｑ．ＤＩＰＥＡを用いて１０ｅｑ．アミノ酸を活性化し；カップリング時間は４５分間であり、ＮＭＰ中２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンによって７分間、Ｆｍｏｃ−脱保護化を３回行った。）。４４カップリングアミノ酸の後、ダブルカップリング段階を行った。
【０２８３】
この後、Ｓｈａｒｍａら（Ｓｈａｒｍａら、２０１１）に従い、ＤＭＦ中ヨウ化メチルと一晩温置することによって、対応するチオエステルを生成させた。レジンのろ過後、ペプチドチオエステル含有溶媒を蒸発させ、氷冷ジエチルエーテルを用いて残渣を沈殿させた。２時間にわたり、ＴＦＡ中２．５％ＥＤＴ、２．５％水、２．５％ＴＩＳを用いて、側鎖保護基の切断を行った。ＴＦＡの蒸発後、氷冷ジエチルエーテルによりペプチドを沈殿させた。ＡＣＮ／水勾配を用いて、Ｃ１８カラム上で、ペプチドチオエステルの逆相ＨＰＬＣ精製を行った。生成物を含有する分画を合わせ、凍結乾燥させた。
【０２８４】
ＨＰＬＣ（図１７Ａ）および質量分析（図１７Ｂ）によって、最終生成物の特徴を調べた。質量分析によって決定された生成物の分子量（９１５５Ｄａ）は、計算質量（９１５０Ｄａ）と一致した。
【０２８５】
１１．７  Ａｃ−ＭＩＶＬＦＶＤＦＤＹＦＹＡＱＶＥＥＶＬＮＰＳＬＫＧＫＰＶＶＶＣＶＦＳＧＲＦＥＤＳＧＡＶＡＴＡＮＹＥＡＲＫＦＧＶＫＡＧＩＰＩＶＥＡＫＫＩＬＰＮＡＶＹＬＰＭ−ＯＧｐ（６）の合成
０．１０ｍｍｏｌのＴｅｎｔａＧｅｌ−Ｒ−Ｔｒｉｔｙｌレジンに、Ｂａｒｌｏｓら（Ｂａｒｌｏｓら、１９８９）に記載のようにＦｍｏｃ−Ｄ−Ｐｒｏ−ＯＨを充填した。したがって、０．６ｍｍｏｌの塩化チオニルとともに３０分間、２回、０．１０ｍｍｏｌレジンを温置し、その後に、ＤＣＭで洗浄した。この後、６ｍＬ  ＤＣＭ中０．６ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｄ−Ｐｒｏ−ＯＨ、２．４ｍｍｏｌ  ＤＩＰＥＡとともに、レジンを９０分間温置した。その後、ＤＣＭ中１０％ＭｅＯＨ（ｖ／ｖ）、１０％ＤＩＰＥＡ（ｖ／ｖ）の溶液を用いて、レジンを１０分間、３回ブロッキング処理し、ＤＣＭで洗浄した。ＦＡＳＴｍｏｃプロトコールによってＡＢＩ４３３を用いて自動化合成を行った。ＮＭＰ中９ｅｑ．ＨＡＴＵおよび２０ｅｑ．ＤＩＰＥＡを用いて１０ｅｑ．アミノ酸を活性化した。カップリング時間は４５分間であり、ＮＭＰ中２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンによって、７分間、３回、Ｆｍｏｃ−脱保護化を行った。４６アミノ酸のカップリング後、ダブルカップリングを行った。ＤＭＦ中１０％（ｖ／ｖ）無水酢酸および１０％（ｖ／ｖ）ＤＩＰＥＡを用いてＮ−末端のアセチル化を１０分間、３回行った。
【０２８６】
２時間にわたり、１０ｍＬのＤＣＭ中３０％（ｖ／ｖ）ＨＦＩＰ中でぺプチジルレジンを２回温置することによって、完全保護化ペプチド酸の切断を達成した。ペプチドのろ別後、溶媒を蒸発させ、氷冷ジエチルエーテルを用いて残渣を沈殿させ。沈殿ペプチドを単離し、乾燥させた。
【０２８７】
０．０１ｍｍｏｌの完全保護化ペプチド、４ｅｑ．ＰｙＢＯＰおよび５ｅｑ．Ｈ−Ｄ−Ｍｅｔ−ＯＧｐ（Ｂｏｃ）２を６ｍＬ  ＮＭＰ中で溶解させた。１０ｅｑ．ＤＩＰＥＡの添加後、混合物を４時間撹拌した。この後、溶媒を還元気化（ｒｅｄｕｃｅｄ  ｅｖａｐｏｒａｔｅｄ）させ、氷冷ジエチルエーテルによって残渣を沈殿させた。沈殿ペプチドエステルを乾燥させ、その後、２時間にわたり、ＴＦＡ中２．５％ＥＤＴ、２．５％水、２．５％ＴＩＳを用いて保護基を切り出した。ＴＦＡの蒸発後、氷冷ジエチルエーテルによりペプチドを沈殿させた。ＡＣＮ／水勾配を用いて、Ｃ１８カラム上でペプチドエステルの逆相ＨＰＬＣ精製を行った。生成物を含有する分画を合わせ、凍結乾燥させた。
【０２８８】
ＨＰＬＣ（図１８Ａ）および質量分析（図１８Ｂ）によって最終生成物の特徴を調べた。実験により決定された質量（８５４７Ｄａ）は、理論分子量（８５４１Ｄａ）と一致する。
【０２８９】
１１．８  ペプチド３とペプチド４のネイティブ化学ライゲーションによる、全−Ｄ−ペプチド、Ｈ−ＣＤＭＡＫＰＮＧＩＫＶＩＤＤＥＥＶＫＲＬＩＲＥＬＤＩＡＤＶＰＧＩＧＮＩＴＡＥＫＬＫＫＬＧＩＮＫＬＣＤＴＬＳＩＥＦＤＫＬＫＧＭＩＧＥＡＫＡＫＹＬＩＳＬＡＲＤＥＹＮＥＰＩＲＴＲＶＲＫＳＩＧＲＩＶＴＭＫＲＮＳＲＮＬＥＥＩＫＰＹＬＦＲＡＩＥＥＳＹＹＫＬＤＫＲＩＰＫＡＩＨＶＶＡＶＴＥＤＬＤＩＶＳＲＧＲＴＦＰＨＧＩＳＫＥＴＡＹＳＥＳＶＫＬＬＱＫＩＬＥＥＤＥＲＫＩＲＲＩＧ  ＶＲＦＳＫＦＩＥＡＩＧＬＤＫＦＦＤＴ−ＯＨ（５）の合成
【０２９０】
２％ＳＤＳ、１％チオフェノールおよび５ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩を含有するトリス−緩衝液（ｐＨ８．６）中でペプチド３および４の両方を０．２Ｍに溶解させる。反応混合物を室温により７２時間振盪する。その後、逆相ＨＰＬＣによって混合物を精製する。Ｎ末端Ｚ−保護基の除去のために、２７０ｅｑ．ＴＦＡおよび５０ｅｑ．チオアニソールでペプチドを溶解させ、室温で６時間振盪した（Ｙｏｓｈｉａｋｉ  Ｋｉｓｏら、１９８０）。ＴＦＡの蒸発後、ペプチドを沈殿させ、氷冷ジエチルエーテルにより洗浄し、逆相ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，ドイツアシャッフェンブルク）によって再び精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、逆相ＵＰＬＣおよびＥＳＩ−質量分析によって、遊離ペプチド５の分析を行う。生成物の正確な質量が分かる。
【０２９１】
１１．９  全−Ｄ−ペプチドの合成
ペプチド７とのペプチド６のプロテアーゼ−触媒ライゲーションによる、全−Ｄ−ペプチド、Ａｃ−ＭＩＶＬＦＶＤＦＤＹＦＹＡＱＶＥＥＶＬＮＰＳＬＫＧＫＰＶＶＶＣＶＦＳＧＲＦＥＤＳＧＡＶＡＴＡＮＹＥＡＲＫＦＧＶＫＡＧＩＰＩＶＥＡＫＫＩＬＰＮＡＶＹＬＰＭＲＫＥＶＹＱＱＶＳＳＲＩＭＮＬＬＲＥＹＳＥＫＩＥＩＡＳＩＤＥＡＹＬＤＩＳＤＫＶＲＤＹＲＥＡＹＮＬＧＬＥＩＫＮＫＩＬＥＫＥＫＩＴＶＴＶＧＩＳＫＮＫＶＦＡＫＩＡ−ＳＭｅ（８）の合成
４Ｍ尿素を含有するリン酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ入り）中で、ペプチド６を０．２ｍＭに溶解させ、ペプチド７を０．６ｍＭに溶解させた。２０μＭクロストリパイン（エンドプロテアーゼＡｒｇ−Ｃ、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，米国ニュージャージー州レイクウッド）の添加後、反応混合物を３７℃で一晩振盪した。沈殿ペプチドを遠心し、Ｈ２0／ギ酸  ８０／２０中で溶解させ、３０分内で５％から９５％の水中ＡＣＮ勾配でＲＰ−１８−カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，ドイツアシャッフェンブルク）を用い、逆相ＨＰＬＣによって精製する。最終ペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１９Ａ）およびＥＳＩ−質量分析（図１９Ｂ）により分析した。レーン１で１４，４ｋＤａと２１．５ｋＤａとの間でバンドが見られ、ライゲーション生成物が示された。ライゲーション生成物の理論分子量（Ｍｔｈｅｏｒ＝１７４７６Ｄａ）は、ＥＳＩ−ＭＳにより示されるように実測分子量（Ｍｏｂｓ＝１７４８６Ｄａ）と一致する。
【０２９２】
１１．１０  ペプチド５とのペプチド８のネイティブ化学ライゲーションによる全−ＤポリメラーゼＤｐｏ変異体Ａ１１５Ｃ／Ｖ２０３Ｃの合成
２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、１％チオフェノールおよび５ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩を含有するトリス−緩衝液（ｐＨ８．６）中で、ペプチド５および８の両方を０．２Ｍに溶解させる。反応混合物を室温により７２時間振盪する。その後、逆相ＨＰＬＣにより混合物を精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、逆相ＵＰＬＣおよびＥＳＩ−質量分析により分析する。ライゲーション生成物の正確な質量が分かる。
【０２９３】
実施例１２−
Ｄ−アミノ酸からなるポリメラーゼＤｐｏ４の変異体Ａ７１Ｃ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃの合成
実施例の中で、全Ｄ−ポリメラーゼＤｐｏ変異体Ａ７１Ｃ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃの合成を説明する。全―ＤポリメラーゼＤｐｏ変異体Ａ７１Ｃ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃのアミノ酸配列は、Ａｃ−ＭＩＶＬＦＶＤＦＤＹＦＹＡＱＶＥＥＶＬＮＰＳＬＫＧＫＰＶＶＶＣＶＦＳＧＲＦＥＤＳＧＡＶＡＴＡＮＹＥＡＲＫＦＧＶＫＡＧＩＰＩＶＥＡＫＫＩＬＰＮＣＶＹＬＰＭＲＫＥＶＹＱＱＶＳＳＲＩＭＮＬＬＲＥＹＳＥＫＩＥＩＡＳＩＤＥＡＹＬＤＩＳＤＫＶＲＤＹＲＥＡＹＮＬＧＬＥＩＫＮＫＩＬＥＫＥＫＩＴＶＴＶＧＩＳＫＮＫＶＦＡＫＩＡＣＤＭＡＫＰＮＧＩＫＶＩＤＤＥＥＶＫＲＬＩＲＥＬＤＩＡＤＶＰＧＩＧＮＩＴＡＥＫＬＫＫＬＧＩＮＫＬＣＤＴＬＳＩＥＦＤＫＬＫＧＭＩＧＥＡＫＡＫＹＬＩＳＬＡＲＤＥＹＮＥＰＩＲＴＲＶＲＫＳＩＧＲＩＶＴＭＫＲＮＳＲＮＬＥＥＩＫＰＹＬＦＲＡＩＥＥＳＹＹＫＬＤＫＲＩＰＫＡＩＨＶＶＡＶＴＥＤＬＤＩＶＳＲＧＲＴＦＰＨＧＩＳＫＥＴＡＹＳＥＳＶＫＬＬＱＫＩＬＥＥＤＥＲＫＩＲＲＩＧＶＲＦＳＫＦＩＥＡＩＧＬＤＫＦＦＤＴ−ＮＨ２である。
【０２９４】
使用するすべてのアミノ酸は、Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ−ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ（固相ペプチド合成Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ戦略の必要条件）（Ｅｒｉｃ  Ａｔｈｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  １９８１）にしたがって保護されている。使用するすべてのアミノ酸は、Ｄ−アミノ酸である（Ｂａｃｈｅｍ，  スイスブーベンドルフ）。
【０２９５】
１２．１完全に保護された全Ｄ−ペプチドの合成
Ｈ−ＲＴＦＰＨＧＩＳＫＥＴＡＹＳＥＳＶＫＬＬＱＫＩＬＥＥＤＥＲＫＩＲＲＩＧＶＲＦＳＫＦＩＥＡＩＧＬＤＫＦＦＤＴ−ＮＨ２（１）
０．１ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｓｉｅｂｅｒ  ｒｉｎｋアミドＮｏｖａＳｙｎＴＧ樹脂を、５当量のアミノ酸、４．９当量のＨＡＴＵ、および１０当量のＤＩＰＥＡを使用してＦｍｏｃ−Ｄ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨを用いた、６ｍｌのＮＭＰ中で４５分間のＦｍｏｃの脱保護の後で充填した。
【０２９６】
自動化合成を、ＦＡＳＴｍｏｃプロトコルを用いるＡＢＩ  ４３３シンセサイザーを使用して行った。１０当量のアミノ酸を、ＮＭＰ中９当量のＨＡＴＵおよび２０当量のＤＩＰＥＡを使用して活性化した。カップリング時間は４５分であり、Ｆｍｏｃ脱保護を、ＮＭＰ中２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンで７分間、３回行った。ダブルカップリングを、４２個のアミノ酸のカップリングの後に行った。
【０２９７】
完全に保護したペプチドの酸の切断を、ＤＣＭ中１％（ｖ／ｖ）のＴＦＡ１０ｍｌで、ペプチジル樹脂を２時間インキュベートすることにより達成した。樹脂をろ過した後、溶媒を蒸発させ、ペプチドを、氷冷したジエチルエーテルを使用して沈殿した。最終的にペプチドを単離し、乾燥した。最終的な産物を、ＨＰＬＣおよび質量分析により特徴付けた（図１３）。産物で計算した質量（６２４４Ｄａ）は、測定した質量（６２４９Ｄａ）に対応する。
【０２９８】
１２．２  完全に保護した全ＤペプチドＢｏｃ−ＣＤＴＬＳＩＥＦ  ＤＫＬＫＧＭＩＧＥＡ  ＫＡＫＹＬＩＳＬＡＲ  ＤＥＹＮＥＰＩＲＴＲ  ＶＲＫＳＩＧＲＩＶＴ  ＭＫＲＮＳＲＮＬＥＥ  ＩＫＰＹＬＦＲＡＩＥ  ＥＳＹＹＫＬＤＫＲＩ  ＰＫＡＩＨＶＶＡＶＴ  ＥＤＬＤＩＶＳＲＧ−ＯＨ（３）の合成
０．１０ｍｍｏｌのＴｅｎｔａＧｅｌ−Ｒ−Ｔｒｉｔｙｌ樹脂を、Ｂａｒｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂａｒｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）に記載されるようにＦｍｏｃ−Ｄ−Ｇｌｙ−ＯＨで充填した。よって０．１０ｍｍｏｌの樹脂を、０．６ｍｍｏｌの塩化チオニルで３０分間２回インキュベートし、その後、ＤＣＭで洗浄した。この後、樹脂を、０．６ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、２．４ｍｍｏｌのＤＩＰＥＡを含む６ｍｌのＤＣＭで９０分インキュベートした。その後、この樹脂を、ＤＣＭ中１０％  ＭｅＯＨ（ｖ／ｖ）、１０％  ＤＩＰＥＡ（ｖ／ｖ）の溶液を使用して１０分間、３回ブロッキングし、ＤＣＭで洗浄した。自動化合成を、ＦＡＳＴｍｏｃプロトコルを用い、ＡＢＩ４３３を使用して行った。１０当量のアミノ酸を、ＮＭＰ中９当量のＨＡＴＵおよび２０当量のＤＩＰＥＡを使用して活性化した。カップリング時間は４５分であり、Ｆｍｏｃ脱保護を、ＮＭＰ中２０％（ｖ／ｖ）のピペリジンで７分間、３回行った。ダブルカップリングのステップを、３９のアミノ酸のカップリングの後に行った。
【０２９９】
合成したペプチドの同一性を、ＨＰＬＣおよび質量分析により、少量のペプチジル樹脂のＴＦＡ切断の後に特徴づけた（図１４）。実験的に決定した産物の質量（１１２８９Ｄａ）は、理論値（１１２８６Ｄａ）に従うものであった。
【０３００】
完全に保護したペプチドの酸の切断は、ＤＣＭ中１％（ｖ／ｖ）のＴＦＡ１０ｍｌ中で、ペプチジル樹脂を、２時間、２回、インキュベートすることにより達成した。樹脂をろ過した後、溶媒を蒸発させ、ペプチドを、氷冷したジエチルエーテルを使用して沈殿した。最終的にペプチドを単離し、乾燥した。
【０３０１】
１２．３  ペプチド３とペプチド１のフラグメント縮合による全Ｄ−ペプチド
Ｈ−ＣＤＴＬＳＩＥＦＤＫＬＫＧＭＩＧＥＡＫＡＫＹＬＩＳＬＡＲＤＥＹＮＥＰＩＲＴＲＶＲＫＳＩＧＲＩＶＴＭＫＲＮＳＲＮＬＥＥＩＫＰＹＬＦＲＡＩＥＥＳＹＹＫＬＤＫＲＩＰＫＡＩＨＶＶＡＶＴＥＤＬＤＩＶＳＲＧＲＴＦＰＨＧＩＳＫＥＴＡＹＳＥＳＶＫＬＬＱＫＩＬＥＥＤＥＲＫＩＲＲＩＧＶＲＦＳＫＦＩＥＡＩＧＬＤＫＦＦＤＴ−ＮＨ２（５）の合成
５マイクロモル濃度の（３）および１当量の（１）を、ＤＣＭ中２５％（ｖ／ｖ）のＴＦＥに溶解した。５当量のＰｙＢＯＰおよび１０当量のＤＩＰＥＡを添加した後、混合物を一晩撹拌した。溶媒を蒸発させた後、ペプチドを氷冷したジエチルエーテルを使用して沈殿し、ろ過した。
【０３０２】
ペプチドの側鎖の保護基の切断を、２．５％のＥＤＴ、２．５％の水、２．５％のＴＩＳを含むＴＦＡを用いて２時間行った。ＴＦＡを蒸発させた後、ペプチドを氷冷したジエチルエーテルを用いて沈殿させた。Ｎ末端をＦｍｏｃ保護したペプチドの逆相ＨＰＬＣ精製を、ＡＣＮ／水勾配を使用してＣ１８カラムで行った。産物を含む画分を、組み合わせ、凍結乾燥した。
【０３０３】
最終的な産物を、ＨＰＬＣおよび質量分析により特徴づけた（図１５）。実験的に決定した質量（１７５３１Ｄａ）は、理論的な分子質量（１７５１２Ｄａ）に対応する。
【０３０４】
１２．４  全Ｄ−ペプチド  Ｈ−ＣＶＹＬＰＭＲＫＥＶＹＱＱＶＳＳＲＩＭＮＬＬＲＥＹＳＥＫＩＥＩＡＳＩＤＥＡＹＬＤＩＳＤＫＶＲＤＹＲＥＡＹＮＬＧＬＥＩＫＮＫＩＬＥＫＥＫＩＴＶＴＶＧＩＳＫＮＫＶＦＡＫＩＡ−ＳＢｚｌ（９）の合成
０．１０ｍｍｏｌのＴｅｎｔａＧｅｌ−Ｒ−Ｔｒｉｔｙｌ樹脂を、Ｂａｒｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｂａｒｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）に記載するようにＦｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨで充填した。よって、０．１０ｍｍｏｌの樹脂を、０．６ｍｍｏｌの塩化チオニルで３０分間、２回インキュベートし、その後、ＤＣＭで洗浄した。この後、樹脂を、０．６ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ、２．４ｍｍｏｌのＤＩＰＥＡを含む６ｍｌのＤＣＭで、９０分間インキュベートした。その後、樹脂を、ＤＣＭ中１０％  ＭｅＯＨ（ｖ／ｖ）、１０％  ＤＩＰＥＡ（ｖ／ｖ）の溶液を使用して１０分間、３回ブロッキングし、ＤＣＭで洗浄した。自動化合成を、ＦＡＳＴｍｏｃのプロトコルを用い、ＡＢＩ４３３を使用して行った。１０当量のアミノ酸を、ＮＭＰ中９当量のＨＡＴＵおよび２０当量のＤＩＰＥＡを使用して活性化した。カップリング時間は４５分であり、Ｆｍｏｃ−脱保護を、ＮＭＰ中２０％（ｖ／ｖ）のピペリジンで７分間、３回行った。ダブルカップリングは、４４のアミノ酸のカップリングの後に行った。Ｎ末端のアセチル化を、ＤＭＦ中１０％（ｖ／ｖ）の無水酢酸および１０％（ｖ／ｖ）のＤＩＰＥＡで、１０分間、３回行った。
【０３０５】
完全に保護したペプチドの酸の切断を、ＤＣＭ中３０％（ｖ／ｖ）のＨＦＩＰ１０ｍｌ中で、ペプチジル樹脂を２時間、２回インキュベートすることにより、達成した。樹脂をろ過した後、溶媒を蒸発させ、残渣を氷冷したジエチルエーテルを使用して沈殿した。沈殿したペプチドを単離し、乾燥した。
【０３０６】
０．００５ｍｍｏｌの完全に保護したペプチド、５当量のＰｙＢＯＰおよび１００当量のベンジルメルカプタンを６ｍｌのＤＣＭに溶解した。１０当量のＤＩＰＥＡを添加した後、混合物を４時間撹拌した。この後、溶媒を還元し、蒸発させ、残渣を、氷冷したジエチルエーテルにより沈殿させた。沈殿させたペプチドのエステルを乾燥させ、その後、保護基を、ＴＦＡ中、２．５％のＥＤＴ、２．５％の水、２．５％のＴＩＳを使用して２時間切断させた。ＴＦＡを蒸発させた後、ペプチドを氷冷したジエチルエーテルで沈殿した。ペプチドエステルの逆相ＨＰＬＣ精製を、ＡＣＮ／水勾配を使用してＣ１８カラムで実施した。産物を独占的に含む画分を、組み合わせ、凍結乾燥した。
【０３０７】
最終的な産物をＵＰＬＣ（図２１）および質量分析（図２２）により特徴づけた。質量分析により決定した産物の分子質量（９９２６Ｄａ）は、計算した質量（９９２３Ｄａ）に従うものであった。
【０３０８】
１２．５  Ａｃ−ＭＩＶＬＦＶＤＦＤＹＦＹＡＱＶＥＥＶＬＮＰＳＬＫＧＫＰＶＶＶＣＶＦＳＧＲＦＥＤＳＧＡＶＡＴＡＮＹＥＡＲＫＦＧＶＫＡＧＩＰＩＶＥＡＫＫＩＬＰＮ−ＳＢｚｌ（１１）の合成
０．１０ｍｍｏｌのＴｅｎｔａＧｅｌ−Ｒ−Ｔｒｉｔｙｌ樹脂を、Ｂａｒｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂａｒｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）に記載されるようにＦｍｏｃ−Ｄ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨで充填した。よって、０．１０ｍｍｏｌの樹脂を、０．６ｍｍｏｌの塩化チオニルを用いて、３０分間、２回、インキュベートし、その後、ＤＣＭで洗浄した。この後、樹脂を、６ｍｌのＤＣＭ中０．６ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｄ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、２．４ｍｍｏｌのＤＩＰＥＡで９０分間インキュベートした。その後、樹脂を、ＤＣＭ中１０％のＭｅＯＨ（ｖ／ｖ）、１０％のＤＩＰＥＡ（ｖ／ｖ）の溶液を使用して、１０分間、３回ブロッキングし、ＤＣＭで洗浄した。自動化合成を、ＦＡＳＴｍｏｃプロトコルを用い、ＡＢＩ４３３を使用して行った。１０当量のアミノ酸を、ＮＭＰ中９当量のＨＡＴＵおよび２０当量のＤＩＰＥＡを使用して活性化した。カップリング時間は４５分であり、Ｆｍｏｃ脱保護を、ＮＭＰ中２０％（ｖ／ｖ）のピペリジンで、７分間、３回、行った。ダブルカップリングを、４０のアミノ酸のカップリングの後に行った。Ｎ末端のアセチル化を、ＤＭＦ中１０％（ｖ／ｖ）の無水酢酸および１０％（ｖ／ｖ）のＤＩＰＥＡを用いて１０分間、３回行った。
【０３０９】
完全に保護したペプチドの切断を、１０ｍｌの３０％（ｖ／ｖ）のＨＦＩＰを含むＤＣＭで、２時間、２回、ペプチジル樹脂をインキュベートすることにより達成した。ペプチドをろ過した後、溶媒を蒸発させ、残渣を氷冷したジエチルエーテルを使用して沈殿した。沈殿したペプチドを単離し、乾燥させた。
【０３１０】
０．００５ｍｍｏｌの完全に保護したペプチド、５当量のＰｙＢＯＰおよび１００当量のベンジルメルカプタンを、６ｍｌのＤＣＭに溶解した。１０当量のＤＩＰＥＡを添加した後、混合物を４時間撹拌した。この後、溶媒を、還元し、蒸発させ、残渣を氷冷したジエチルエーテルにより沈殿した。沈殿したペプチドのエステルを乾燥し、その後、保護基を、ＴＦＡ中２．５％のＥＤＴ、２．５％の水、２．５％のＴＩＳを使用して、２時間切断した。ＴＦＡを蒸発させた後、ペプチドを氷冷したジエチルエーテルで沈殿した。ペプチドエステルの逆相ＨＰＬＣ精製を、ＡＣＮ／水勾配を使用してＣ１８カラムで行った。産物を独占的に含む画分を、組み合わせ、凍結乾燥した。
【０３１１】
最終的な産物を、ＵＰＬＣ（図２３）および質量分析（図２４）により特徴づけた。質量分析により決定した産物の分子質量（７８４８Ｄａ）は、計算した質量（７８４５Ｄａ）に従うものであった。
【０３１２】
１２．６  全Ｄ−ペプチドＺ−ＣＤＭＡＫＰＮＧＩＫＶＩＤＤＥＥＶＫＲＬＩＲＥＬＤＩＡＤＶＰＧＩＧＮＩＴＡＥＫＬＫＫＬＧＩＮＫＬ−ベンジル−チオエステル（７）の合成
０．１０ｍｍｏｌのＴｅｎｔａＧｅｌ−Ｒ−Ｔｒｉｔｙｌ樹脂を、Ｂａｒｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ（Ｂａｒｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）に記載されるようにＦｍｏｃ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＨで充填した。よって、０．１０ｍｍｏｌの樹脂を、０．６ｍｍｏｌの塩化チオニルで３０分間、２回インキュベートし、その後、ＤＣＭで洗浄した。この後、樹脂を、０．６ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＨ、２．４ｍｍｏｌのＤＩＰＥＡを含む６ｍｌのＤＣＭで、９０分間インキュベートした。その後、樹脂を、ＤＣＭ中１０％のＭｅＯＨ（ｖ／ｖ）、１０％のＤＩＰＥＡ（ｖ／ｖ）の溶液を使用して１０分間、３回ブロッキングし、ＤＣＭで洗浄した。自動化合成を、ＦＡＳＴｍｏｃプロトコルを用い、ＡＢＩ４３３を使用して行った。１０当量のアミノ酸を、ＮＭＰ中９当量のＨＡＴＵおよび２０当量のＤＩＰＥＡを使用して活性化した。カップリング時間は４５分であり、Ｆｍｏｃ脱保護を、ＮＭＰ中２０％（ｖ／ｖ）のピペリジンで、７分間、３回行った。
【０３１３】
完全に保護したペプチドの酸の切断を、ＤＣＭ中３０％（ｖ／ｖ）のＨＦＩＰ１０ｍｌ中、ペプチジル樹脂を２時間、２回インキュベートすることにより達成した。ペプチドをろ過した後、溶媒を蒸発させ、残渣を氷冷したジエチルエーテルを使用して沈殿した。沈殿したペプチドを単離し、乾燥させた。
【０３１４】
Ｎ末端のＺ−および完全に側鎖保護したペプチド４を、ＤＭＦに１ｍＭで溶解した。５当量のＰｙＢＯＰ、１０当量のＤＩＰＥＡおよび３０当量のベンジルメルカプタンを添加した後、混合物を４時間撹拌した。次にＤＭＦを蒸発させ、ペプチドを沈殿し、氷冷したジエチルエーテルで洗浄した。側鎖保護基を、ＴＦＡ中２．５％のＥＤＴ、２．５％の水、２．５％のＴＩＳで２時間処理することにより除去した。ＴＦＡを蒸発した後、ペプチドを氷冷したジエチルエーテルで沈殿し、洗浄した。次に、ペプチド−ベンジル−チオエステルを、逆相ＨＰＬＣにより精製し、逆相ＵＰＬＣ（図２５Ａ）およびＥＳＩ−ＭＳ（図２５Ｂ）により分析した。理論的な分子量（Ｍｔｈｅｏｒ＝５５２７Ｄａ）は、ＥＳＩ−ＬＣ−ＭＳにより示されるように、観察した分子量（Ｍｏｂｓ＝５５３４Ｄａ）に対応する。
【０３１５】
１２．７．ペプチド５とペプチド７の天然の化学的なライゲーションによる全Ｄ―ペプチドＨ−ＣＤＭＡＫＰＮＧＩＫＶＩＤＤＥＥＶＫＲＬＩＲＥＬＤＩＡＤＶＰＧＩＧＮＩＴＡＥＫＬＫＫＬＧＩＮＫＬＣＤＴＬＳＩＥＦＤＫＬＫＧＭＩＧＥＡＫＡＫＹＬＩＳＬＡＲＤＥＹＮＥＰＩＲＴＲＶＲＫＳＩＧＲＩＶＴＭＫＲＮＳＲＮＬＥＥＩＫＰＹＬＦＲＡＩＥＥＳＹＹＫＬＤＫＲＩＰＫＡＩＨＶＶＡＶＴＥＤＬＤＩＶＳＲＧＲＴＦＰＨＧＩＳＫＥＴＡＹＳＥＳＶＫＬＬＱＫＩＬＥＥＤＥＲＫＩＲＲＩＧ  ＶＲＦＳＫＦＩＥＡＩＧＬＤＫＦＦＤＴ−ＮＨ２（８）の合成
【０３１６】
ペプチド５および７の両方を、０．２Ｍで、２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、１％のチオフェノール、および５ｍＭのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩を含むリン酸ナトリウムバッファー（１００ｍＭ、１００ｍＭのＮａＣｌを含む、ｐＨ８）に溶解した。反応混合物を室温で４８時間振盪した。その後、混合物を、３０％〜８０％の１：１のＡＣＮ／メタノールを含む水／１％のＴＦＡの勾配を使用してＲＰ−８カラム（Ｖｙｄａｃ  ２０８  ＴＰ，  Ｇｒａｃｅ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ  ＫＧ，  ドイツヴォルムス）で、逆相ＨＰＬＣにより３０分以内に精製した。産物を含む画分を集め、移動相として５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６）を使用してＹａｒｒａ  ３ｕ  ＳＥＣ−２０００カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，ドイツアシャッフェンブルク）で分子ふるいクロマトグラフィーによる第２の段階で精製した。ＨｉＴｒａｐ脱塩カラム５ｍｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＧｍｂＨ，ドイツミュンヘン）を使用して水／１％のギ酸中の塩を除去した後、ペプチド産物の画分を凍結乾燥した。Ｎ末端のＺ保護基の除去のために、ペプチドを２７０当量のＴＦＡおよび５０当量のチオアニソールに溶解し、室温で６時間振盪した（Ｙｏｓｈｉａｋｉ  Ｋｉｓｏｅｔ  ａｌ，  １９８０）。ＴＦＡを蒸発させた後、ペプチドを沈殿し、氷冷したジエチルエーテルにより洗浄した。遊離ペプチド８の分析を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２６Ａ）およびＥＳＩ−ＬＣ質量分析（図２６Ｂ）により行った。バンドを、ライゲーション産物を示すマーカーの２０ｋＤａのバンドと２５ｋＤａのバンドの間で見出した。ライゲーション産物の理論的な分子量（Ｍｔｈｅｏｒ＝２２７８１Ｄａ）は、ＥＳＩ−ＬＣ−ＭＳにより示されるように観察された分子量（Ｍｏｂｓ＝２２７９６Ｄａ）に対応する。
【０３１７】
１２．８  ペプチド９とペプチド１０の天然の化学的なライゲーションによる、全Ｄ−ペプチドＡｃ−ＭＩＶＬＦＶＤＦＤＹＦＹＡＱＶＥＥＶＬＮＰＳＬＫＧＫＰＶＶＶＣＶＦＳＧＲＦＥＤＳＧＡＶＡＴＡＮＹＥＡＲＫＦＧＶＫＡＧＩＰＩＶＥＡＫＫＩＬＰＮＣＶＹＬＰＭＲＫＥＶＹＱＱＶＳＳＲＩＭＮＬＬＲＥＹＳＥＫＩＥＩＡＳＩＤＥＡＹＬＤＩＳＤＫＶＲＤＹＲＥＡＹＮＬＧＬＥＩＫＮＫＩＬＥＫＥＫＩＴＶＴＶＧＩＳＫＮＫＶＦＡＫＩＡ−ＳＢｚｌ（１１）の合成
ペプチド１０およびペプチド９を、６Ｍのグアニジン―ＨＣｌ、５ｍＭのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩、および２％のチオフェノールを含むリン酸ナトリウムバッファー（１００ｍＭ、ｐＨ８、１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む）に、０．５Ｍで溶解した。反応混合物を室温で７２時間振盪した。その後、チオフェノール―沈殿物を遠心し、上清を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳＥＣ−３カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，  ドイツブリンゲン）および移動相として５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６）中６Ｍのグアニジンを使用した分子ふるいクロマトグラフィーにより精製した。次にペプチドを含む画分を、ＨｉＴｒａｐ脱塩カラム５ｍｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＧｍｂＨ，  ドイツミュンヘン）で水／１％のギ酸で脱塩した。凍結乾燥した後、画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２７Ａ）およびＥＳＩ−ＬＣ質量分析（図２７Ｂ）により分析した。バンドを、ライゲーション産物を示すマーカーの１５ｋＤａのバンド〜２０ｋＤａのバンドの間で、レーン３〜６で見出した。ライゲーション産物の理論的な分子量（Ｍｔｈｅｏｒ＝１７６４１Ｄａ）は、ＥＳＩ−ＬＣ−ＭＳにより示されるように観察された分子量（Ｍｏｂｓ＝１７６４１Ｄａ）に対応する。
【０３１８】
１２．９  ペプチド８とペプチド１１の天然の化学的なライゲーションによる、全―ＤポリメラーゼＤｐｏ４の変異体Ａ７１Ｃ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃの合成
ペプチド１１および８の両方を、５０μＭで、２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、１％のチオフェノール、および５ｍＭのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩を含むリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８、１００ｍＭのＮａＣｌを含む）に溶解した。反応混合物を室温で７２時間振盪した。その後、反応混合物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２８Ａ＋Ｂ）およびＥＳＩ−ＬＣ質量分析（図２８Ｃ）により分析した。バンドを、ライゲーション産物を示す天然のＬ−Ｄｐｏ４が多い抽出物において、マーカーの３７ｋＤａのバンド〜５０ｋＤａのバンドの間のクマシー染色したゲルのレーン３（Ａ）および銀染色したゲルの対応するレーン（Ｂ）で見出された。ライゲーション産物の理論的な分子量（Ｍｔｈｅｏｒ＝４０２９８Ｄａ）は、ＥＳＩ−ＭＳ（Ｃ）により示されるように観察した分子量（Ｍｏｂｓ＝４０９４５Ｄａ）に対応する。６４７ｋＤａより高い測定した質量は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００付加物により引き起こされ得る。  
【０３１９】
実施例１３：Ｄ−アミノ酸からなるポリメラーゼＤｐｏ４の変異体Ｍ７６Ｇ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃの合成
本実施例の中で、全ＤポリメラーゼＤｐｏの変異体Ｍ７６Ｇ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃの合成を説明する。全ＤポリメラーゼＤｐｏの変異体Ｍ７６Ｇ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃのアミノ酸配列は、Ａｃ−ＭＩＶＬＦＶＤＦＤＹＦＹＡＱＶＥＥＶＬＮＰＳＬＫＧＫＰＶＶＶＣＶＦＳＧＲＦＥＤＳＧＡＶＡＴＡＮＹＥＡＲＫＦＧＶＫＡＧＩＰＩＶＥＡＫＫＩＬＰＮＡＶＹＬＰＧＲＫＥＶＹＱＱＶＳＳＲＩＭＮＬＬＲＥＹＳＥＫＩＥＩＡＳＩＤＥＡＹＬＤＩＳＤＫＶＲＤＹＲＥＡＹＮＬＧＬＥＩＫＮＫＩＬＥＫＥＫＩＴＶＴＶＧＩＳＫＮＫＶＦＡＫＩＡＣＤＭＡＫＰＮＧＩＫＶＩＤＤＥＥＶＫＲＬＩＲＥＬＤＩＡＤＶＰＧＩＧＮＩＴＡＥＫＬＫＫＬＧＩＮＫＬＣＤＴＬＳＩＥＦＤＫＬＫＧＭＩＧＥＡＫＡＫＹＬＩＳＬＡＲＤＥＹＮＥＰＩＲＴＲＶＲＫＳＩＧＲＩＶＴＭＫＲＮＳＲＮＬＥＥＩＫＰＹＬＦＲＡＩＥＥＳＹＹＫＬＤＫＲＩＰＫＡＩＨＶＶＡＶＴＥＤＬＤＩＶＳＲＧＲＴＦＰＨＧＩＳＫＥＴＡＹＳＥＳＶＫＬＬＱＫＩＬＥＥＤＥＲＫＩＲＲＩＧＶＲＦＳＫＦＩＥＡＩＧＬＤＫＦＦＤＴ−ＮＨ２である。
【０３２０】
使用されるすべてのアミノ酸は、Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ−ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ（Ｅｒｉｃ  Ａｔｈｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  １９８１）にしたがって保護されている。使用するすべてのアミノ酸は、Ｄ―アミノ酸（Ｂａｃｈｅｍ，  スイスブーベンドルフ）である。
【０３２１】
１３．１  Ｈ−Ｇｌｙ−ＯＧｐ（Ｂｏｃ）２の合成
１ｍｍｏｌのＺ−Ｇｌｙ−ＯＨ、０．９当量のＴＢＴＵおよび０．９ｍｍｍｏｌのＨＯ−Ｇｐ（Ｂｏｃ）２を、１０ｍｌのＤＭＥに溶解した。０．２当量のＤＩＰＥＡを添加した後、溶液を２時間撹拌した。溶媒を蒸発させた後、未処置の産物を、ＤＣＭ：ＥＥ（９：１）を使用してフラッシュクロマトグラフィーで精製した。Ｚ−Ｇｌｙ−ＯＧｐ（Ｂｏｃ）２の精製した画分を組み合わせ、溶媒を蒸発させた。
【０３２２】
Ｚ−Ｇｌｙ−ＯＧｐ（Ｂｏｃ）２を、１０ｍｌのＭｅＯＨに溶解し、アルゴンを流した。Ｎ末端のＺ基の加水切断を、Ｐｄ／Ｃ触媒およびＨ２を２時間以内に添加することにより達成した。触媒をろ過したした後、溶媒を減圧下で蒸発させた。分析物を、逆相ＨＰＬＣおよび質量分析により行った。計算した質量（４０８Ｄａ）は、実験的に決定した質量（４０９Ｄａ）に従うものである。
【０３２３】
１３．２完全に保護した全ＤペプチドＨ−Ｒ  ＴＦＰＨＧＩＳＫＥＴ  ＡＹＳＥＳＶＫＬＬＱ  ＫＩＬＥＥＤＥＲＫＩ  ＲＲＩＧＶＲＦＳＫＦ  ＩＥＡＩＧＬＤＫＦＦ  ＤＴ−ＮＨ２（１）の合成
０．１ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｓｉｅｂｅｒ  ｒｉｎｋアミドＮｏｖａＳｙｎＴＧ樹脂を、６ｍｌのＮＭＰにおいて、５当量のアミノ酸、４．９当量のＨＡＴＵ、および１０当量のＤＩＰＥＡを４５分間、使用する、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨを用いたＦｍｏｃ脱保護の後充填した。
【０３２４】
自動化合成を、ＦＡＳＴｍｏｃプロトコルを用いて、ＡＢＩ４３３シンセサイザーを使用して行った。１０当量のアミノ酸を、ＮＭＰ中、９当量のＨＡＴＵおよび２０当量のＤＩＰＥＡを使用して活性化した。カップリング時間は４５分であり、Ｆｍｏｃ脱保護を、ＮＭＰ中２０％（ｖ／ｖ）のピペリジンを用いて、７分間、３回、行った。ダブルカップリングを、４２のアミノ酸のカップリングの後に行った。
【０３２５】
完全に保護したペプチドの酸の切断を、ＤＣＭ中１％（ｖ／ｖ）のＴＦＡ１０ｍｌで、２時間、２回、ペプチジル樹脂をインキュベートすることにより達成した。樹脂をろ過した後、溶媒を蒸発させ、ペプチドを、氷冷したジエチルエーテルを使用して沈殿した。最終的にペプチドを単離し、乾燥させた。
【０３２６】
最終的な産物を、ＨＰＬＣおよび質量分析により特徴づけた（図１３）。産物に関して計算した質量（６２４４Ｄａ）は、測定した質量（６２４９Ｄａ）に対応する。
【０３２７】
１３．３完全に保護した全ＤペプチドＢｏｃ−ＣＤＴＬＳＩＥＦ  ＤＫＬＫＧＭＩＧＥＡ  ＫＡＫＹＬＩＳＬＡＲ  ＤＥＹＮＥＰＩＲＴＲ  ＶＲＫＳＩＧＲＩＶＴ  ＭＫＲＮＳＲＮＬＥＥ  ＩＫＰＹＬＦＲＡＩＥ  ＥＳＹＹＫＬＤＫＲＩ  ＰＫＡＩＨＶＶＡＶＴ  ＥＤＬＤＩＶＳＲＧ−ＯＨ（３）の合成
０．１０ｍｍｏｌのＴｅｎｔａＧｅｌ−Ｒ−Ｔｒｉｔｙｌ樹脂を、Ｂａｒｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂａｒｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）に記載されるようにＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨで充填した。よって、０．１０ｍｍｏｌの樹脂を、０．６ｍｍｏｌの塩化チオニルで３０分間、２回、インキュベートし、その後、ＤＣＭで洗浄した。この後、樹脂を、６ｍｌのＤＣＭ中０．６ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、２．４ｍｍｏｌのＤＩＰＥＡで、９０分インキュベートした。その後、樹脂を、ＤＣＭ中１０％のＭｅＯＨ（ｖ／ｖ）、１０％のＤＩＰＥＡ（ｖ／ｖ）の溶液を使用して１０分間、３回、ブロッキングし、ＤＣＭで洗浄した。自動化合成を、ＦＡＳＴｍｏｃプロトコルでＡＢＩ４３３を使用して行った。１０当量のアミノ酸を、ＮＭＰ中９当量のＨＡＴＵおよび２０当量のＤＩＰＥＡを使用して活性化した。カップリング時間は４５分であり、Ｆｍｏｃ脱保護を、ＮＭＰ中２０％（ｖ／ｖ）のピぺリジンで７分間、３回行った。ダブルカップリングのステップを、３９のアミノ酸のカップリングの後行った。
【０３２８】
合成したペプチドの同一性を、少量のペプチジル樹脂のＴＦＡ切断の後、ＨＰＬＣおよび質量分析により特徴づけた（図１４）。産物の実験的に決定した質量（１１２８９Ｄａ）は、理論値（１１２８６Ｄａ）に従うものであった。
【０３２９】
完全に保護したペプチドの酸の切断を、ＤＣＭ中１％（ｖ／ｖ）のＴＦＡ１０ｍｌで、ペプチジル樹脂を２回、２時間インキュベートすることにより達成した。溶媒を蒸発させ、ペプチドを、氷冷したジエチルエーテルを使用して沈殿させた。最終的に、ペプチドを単離し、乾燥させた。
【０３３０】
１３．４  ペプチド３とペプチド１のフラグメント縮合による全Ｄ−ペプチドＨ−ＣＤＴＬＳＩＥＦＤＫＬＫＧＭＩＧＥＡＫＡＫＹＬＩＳＬＡＲＤＥＹＮＥＰＩＲＴＲＶＲＫＳＩＧＲＩＶＴＭＫＲＮＳＲＮＬＥＥＩＫＰＹＬＦＲＡＩＥＥＳＹＹＫＬＤＫＲＩＰＫＡＩＨＶＶＡＶＴＥＤＬＤＩＶＳＲＧＲＴＦＰＨＧＩＳＫＥＴＡＹＳＥＳＶＫＬＬＱＫＩＬＥＥＤＥＲＫＩＲＲＩＧＶＲＦＳＫＦＩＥＡＩＧＬＤＫＦＦＤＴ−ＮＨ２（５）の合成
５マイクロモル濃度の（３）および１当量の（１）を、ＤＣＭ中２５％（ｖ／ｖ）のＴＦＥに溶解した。５当量のＰｙＢＯＰおよび１０当量のＤＩＰＥＡを添加した後、混合物を一晩撹拌した。溶媒を蒸発させた後、ペプチドを氷冷したジエチルエーテルを使用して沈殿させ、ろ過した。
【０３３１】
ペプチドの側鎖保護基の切断を、ＴＦＡ中２．５％のＥＤＴ、２．５％の水、２．５％のＴＩＳを用いて２時間行った。ＴＦＡを蒸発させた後、ペプチドを氷冷したジエチルエーテルを使用して沈殿させ、Ｎ末端のＦｍｏｃ保護したペプチドの逆相ＨＰＬＣ精製を、ＡＣＮ／水勾配を使用してＣ１８カラムで行った。産物を含む画分を組み合わせ、凍結乾燥した。
【０３３２】
最終的な産物を、ＨＰＬＣおよび質量分析により特徴づけた（図１５）。実験的に決定した質量（１７５３１Ｄａ）は、理論的な分子質量（１７５１２Ｄａ）に対応する。
【０３３３】
１３．５  全ＤペプチドＨ−ＲＫＥＶＹＱＱＶＳＳＲＩＭＮＬＬＲＥＹＳＥＫＩＥＩＡＳＩＤＥＡＹＬＤＩＳＤＫＶＲＤＹＲＥＡＹＮＬＧＬＥＩＫＮＫＩＬＥＫＥＫＩＴＶＴＶＧＩＳＫＮＫＶＦＡＫＩＡ−ＳＢｚｌ（９）の合成
０．１ｍｍｏｌのＴｅｎｔａＧｅｌ−Ｒ−Ｔｒｉｔｙｌ樹脂を、Ｂａｒｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂａｒｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）に記載されるようにＦｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨで充填した。よって、０．１０ｍｍｏｌの樹脂を、０．６ｍｍｏｌの塩化チオニルで２回、３０分間インキュベートし、その後、ＤＣＭで洗浄した。この後、樹脂を、０．６ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ、２．４ｍｍｏｌのＤＩＰＥＡを含む６ｍｌのＤＣＭで９０分間インキュベートした。その後、樹脂を、ＤＣＭ中１０％のＭｅＯＨ（ｖ／ｖ）、１０％のＤＩＰＥＡ（ｖ／ｖ）の溶液を使用して１０分間、３回、ブロッキングし、ＤＣＭで洗浄した。自動化合成を、ＦＡＳＴｍｏｃプロトコルでＡＢＩ４３３を使用して行った。１０当量のアミノ酸を、ＮＭＰ中９当量ＨＡＴＵおよび２０当量のＤＩＰＥＡを使用して活性化した。カップリング時間は４５分であり、Ｆｍｏｃ脱保護は、ＮＭＰ中２０％（ｖ／ｖ）のピペリジンで７分間、３回、行った。ダブルカップリングを、４４のアミノ酸をカップリングした後行った。Ｎ末端のアセチル化を、ＤＭＦ中１０％（ｖ／ｖ）の無水酢酸および１０％（ｖ／ｖ）のＤＩＰＥＡを用いて、１０分間、３回行った。
【０３３４】
完全に保護したペプチドの酸の切断を、ＤＣＭ中３０％（ｖ／ｖ）のＨＦＩＰ１０ｍｌ中、ペプチジル樹脂を２時間、２回インキュベートすることにより達成した。樹脂をろ過した後、溶媒を蒸発させ、残渣を、氷冷したジエチルエーテルを使用して沈殿した。沈殿したペプチドを単離し、乾燥させた。
【０３３５】
０．００５ｍｍｏｌの完全に保護したペプチド、５当量のＰｙＢＯＰおよび１００当量のベンジルメルカプタンを、６ｍｌのＤＣＭに溶解した。１０当量のＤＩＰＥＡを添加した後、混合物を４時間撹拌した。この後、溶媒を、還元し、蒸発させ、残渣を氷冷したジエチルエーテルにより沈殿した。沈殿したペプチドエステルを乾燥させ、その後、保護基を、ＴＦＡ中２．５％のＥＤＴ、２．５％の水、２．５％のＴＩＳを使用して、２時間切断した。ＴＦＡを蒸発させた後、ペプチドを氷冷したジエチルエーテルで沈殿した。ペプチドエステルの逆相ＨＰＬＣの精製を、ＡＣＮ／水勾配を使用してＣ１８カラムで行った。産物を独占的に含む画分を凍結乾燥した。
【０３３６】
最終的な産物を、ＵＰＬＣ（図２９）および質量分析（図３０）により特徴づけた。質量分析により決定した産物の分子質量（９２１７Ｄａ）は、計算した質量（９２１７Ｄａ）に従うものであった。
【０３３７】
１３．６  Ａｃ−ＭＩＶＬＦＶＤＦＤＹ  ＦＹＡＱＶＥＥＶＬＮＰ  ＳＬＫＧＫＰＶＶＶ  ＣＶＦＳＧＲＦＥＤＳ  ＧＡＶＡＴＡＮＹＥＡ  ＲＫＦＧＶＫＡＧＩＰ  ＩＶＥＡＫＫＩＬＰＮ  ＡＶＹＬＰＧ−ＯＧｐ（１０）の合成
０．１０ｍｍｏｌのＴｅｎｔａＧｅｌ−Ｒ−Ｔｒｉｔｙｌ樹脂を、Ｂａｒｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂａｒｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）に記載されるようにＦｍｏｃ−Ｄ−Ｐｒｏ−ＯＨで充填した。よって、０．１０ｍｍｏｌの樹脂を、０．６ｍｍｏｌの塩化チオニルで３０分間、２回インキュベートし、その後ＤＣＭで洗浄した。この後、樹脂を、０．６ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｄ−Ｐｒｏ−ＯＨ、２．４ｍｍｏｌのＤＩＰＥＡを含む６ｍｌのＤＣＭで、９０分間インキュベートした。その後、樹脂を、ＤＣＭ中１０％のＭｅＯＨ（ｖ／ｖ）、１０％のＤＩＰＥＡ（ｖ／ｖ）の溶液を使用して１０分間、３回ブロッキングし、ＤＣＭで洗浄した。自動化合成を、ＦＡＳＴｍｏｃプロトコルでＡＢＩ４３３を使用して行った。１０当量のアミノ酸を、ＮＭＰ中９当量のＨＡＴＵおｙび２０当量のＤＩＰＥＡを使用して活性化した。カップリング時間は４５分であり、Ｆｍｏｃ脱保護を、ＮＭＰ中２０％（ｖ／ｖ）のピペリジンで、７分間、３回行った、ダブルカップリングを、４５のアミノ酸をカップリングした後行った。Ｎ末端のアセチル化を、ＤＭＦ中１０％（ｖ／ｖ）の無水酢酸および１０％（ｖ／ｖ）のＤＩＰＥＡを用いて、１０分間３回行った。
【０３３８】
完全に保護したペプチドの酸の切断を、ＤＣＭ中３０％（ｖ／ｖ）ＨＦＩＰ１０ｍｌ中、ペプチド樹脂を２時間、２回インキュベートすることにより達成した。ペプチドをろ過した後、溶媒を蒸発させ、残渣を氷冷したジエチルエーテルを使用して沈殿した。沈殿したペプチドを単離かつ乾燥させた。
【０３３９】
０．００５ｍｍｏｌの完全に保護したペプチド、５当量のＰｙＢＯＰおよび１０当量のＨ−Ｇｌｙ−ＯＧｐ（Ｂｏｃ）２を、６ｍｌのＤＣＭに溶解した。１０当量のＤＩＰＥＡを添加した後、混合物を４時間撹拌した。この後、溶媒を還元し、蒸発させ、残渣を氷冷したジエチルエーテルにより沈殿させた。沈殿したペプチドエステルを乾燥させ、その後、保護基を、ＴＦＡ中２．５％のＥＤＴ、２．５％の水、２．５％のＴＩＳを使用して、２時間切断した。ＴＦＡの蒸発の後、ペプチドを氷冷したジエチルエーテルで沈殿させた。ペプチドエステルの逆相ＨＰＬＣ精製を、ＡＣＮ／水勾配を使用してＣ１８カラムで行った。産物を含む画分を組み合わせ、凍結乾燥した。
【０３４０】
最終的な産物を、ＵＰＬＣ（図３１）および質量分析（図３２）により特徴づけた。質量分析により決定した産物の分子質量（８４８１Ｄａ）は、計算した質量（８４７３Ｄａ）に従うものであった。
【０３４１】
１３．７  全ＤペプチドＺ−ＣＤＭＡＫＰＮＧＩＫＶＩＤＤＥＥＶＫＲＬＩＲＥＬＤＩＡＤＶＰＧＩＧＮＩＴＡＥＫＬＫＫＬＧＩＮＫＬ−ベンジル―チオエステル（７）の合成
０．１０ｍｍｏｌのＴｅｎｔａＧｅｌ−Ｒ−Ｔｒｉｔｙｌ樹脂を、Ｂａｒｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂａｒｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）に記載されるようにＦｍｏｃ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＨで充填した。よって、０．１０ｍｍｏｌの樹脂を、０．６ｍｍｏｌの塩化チオニルで３０分間、２回インキュベートし、その後、ＤＣＭで洗浄した。この後、樹脂を、０．６ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＨ、２．４ｍｍｏｌのＤＩＰＥＡを含む６ｍｌのＤＣＭで、９０分間インキュベートした。その後、樹脂を、ＤＣＭ中１０％のＭｅＯＨ（ｖ／ｖ）、１０％のＤＩＰＥＡ（ｖ／ｖ）の溶液を使用して、１０分間３回ブロッキングし、ＤＣＭで洗浄した。自動化合成を、ＦＡＳＴｍｏｃプロトコルでＡＢＩ４３３を使用して行った。１０当量のアミノ酸を、ＮＭＰ中９当量のＨＡＴＵおよび２０当量のＤＩＰＥＡを使用して活性化した。カップリング時間は４５分間であり、Ｆｍｏｃ脱保護を、ＮＭＰ中２０％（ｖ／ｖ）のピペリジンで７分間、３回行った。
【０３４２】
完全に保護したペプチドの酸の切断を、ＤＣＭ中３０％（ｖ／ｖ）のＨＦＩＰ１０ｍｌで、ペプチジル樹脂を、２時間、２回インキュベートすることにより達成した。ペプチドをろ過した後、溶媒を蒸発させ、残渣を氷冷したジエチルエーテルを使用して沈殿した。沈殿したペプチドを単離し、乾燥させた。
【０３４３】
Ｎ末端のＺ−および完全に側鎖保護したペプチド４を、ＤＭＦに１ｍＭで溶解した。５当量のＰｙＢＯＰ、１０当量のＤＩＰＥＡ、および３０当量のベンジルメルカプタンを添加した後、混合物を４時間撹拌した。次にＤＭＦを蒸発させ、ペプチドを沈殿し、氷冷したジエチルエーテルで洗浄した。側鎖保護基を、ＴＦＡ中２．５％のＥＤＴ、２．５％の水、２．５％のＴＩＳで２時間処理することにより除去した。ＴＦＡを蒸発させた後、ペプチドを沈殿し、氷冷したジエチルエーテルで洗浄した。次に、ペプチド―ベンジルチオエステルを、逆相ＨＰＬＣにより精製し、逆相ＵＰＬＣにより（図２５Ａ）およびＥＳＩ−ＭＳ（図２５Ｂ）により分析した。理論的な分子量（Ｍｔｈｅｏｒ＝５５２７Ｄａ）は、ＥＳＩ−ＬＣ−ＭＳにより示されるように観察された分子量（Ｍｏｂｓ＝５５３４Ｄａ）に対応する。
【０３４４】
１３．８  ペプチド５とペプチド７の天然の化学的なライゲーションによる全ＤペプチドＨ−ＣＤＭＡＫＰＮＧＩＫＶＩＤＤＥＥＶＫＲＬＩＲＥＬＤＩＡＤＶＰＧＩＧＮＩＴＡＥＫＬＫＫＬＧＩＮＫＬＣＤＴＬＳＩＥＦＤＫＬＫＧＭＩＧＥＡＫＡＫＹＬＩＳＬＡＲＤＥＹＮＥＰＩＲＴＲＶＲＫＳＩＧＲＩＶＴＭＫＲＮＳＲＮＬＥＥＩＫＰＹＬＦＲＡＩＥＥＳＹＹＫＬＤＫＲＩＰＫＡＩＨＶＶＡＶＴＥＤＬＤＩＶＳＲＧＲＴＦＰＨＧＩＳＫＥＴＡＹＳＥＳＶＫＬＬＱＫＩＬＥＥＤＥＲＫＩＲＲＩＧ  ＶＲＦＳＫＦＩＥＡＩＧＬＤＫＦＦＤＴ−ＮＨ２（８）の合成
ペプチド５および７の両方を、２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、１％のチオフェノール、および５ｍＭのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩を含むリン酸ナトリウムバッファー（１００ｍＭ、１００ｍＭのＮａＣｌを含む、ｐＨ８）に０．２Ｍで溶解した。反応混合物を室温により４８時間で振盪した。その後、混合物を、３０分以内に、水／１％ＴＦＡ中３０％〜８０％のＡＣＮ／メタノール（１：１）の勾配を使用して、ＲＰ−８カラム（Ｖｙｄａｃ  ２０８  ＴＰ，  Ｇｒａｃｅ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ  ＫＧ，  ドイツヴォルムス）での逆相ＨＰＬＣにより精製した。産物を含む画分を集め、Ｙａｒｒａ  ３ｕ  ＳＥＣ−２０００−カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，  ドイツアシャッフェンブルク）で分子ふるいクロマトグラフィーによる第２の段階で精製した。Ｎ末端のＺ保護基の除去のために、ペプチドを、２７０当量のＴＦＡおよび５０当量のチオアニソールに溶解し、室温で６時間振盪した（Ｙｏｓｈｉａｋｉ  Ｋｉｓｏｅｔ  ａｌ，  １９８０）。ＴＦＡを蒸発させた後、ペプチドを沈殿させ、氷冷したジエチルエーテルにより洗浄した。遊離ペプチド８の分析を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２６Ａ）およびＥＳＩ−ＬＣ質量分析（図２６Ｂ）により行った。バンドが、ライゲーション産物を示すマーカーの２０ｋＤａのバンドおよび２５ｋＤａのバンドの間で見出された。ライゲーション産物の理論的な分子量（Ｍｔｈｅｏｒ＝２２７８１Ｄａ）は、ＥＳＩ−ＬＣ−ＭＳにより示されるように観察された分子量（Ｍｏｂｓ＝２２７９６Ｄａ）に対応する。
【０３４５】
ペプチド９とペプチド１０のプロテアーゼ触媒のライゲーションによる、全ＤペプチドのＡｃ−ＭＩＶＬＦＶＤＦＤＹＦＹＡＱＶＥＥＶＬＮＰＳＬＫＧＫＰＶＶＶＣＶＦＳＧＲＦＥＤＳＧＡＶＡＴＡＮＹＥＡＲＫＦＧＶＫＡＧＩＰＩＶＥＡＫＫＩＬＰＮＡＶＹＬＰＧＲＫＥＶＹＱＱＶＳＳＲＩＭＮＬＬＲＥＹＳＥＫＩＥＩＡＳＩＤＥＡＹＬＤＩＳＤＫＶＲＤＹＲＥＡＹＮＬＧＬＥＩＫＮＫＩＬＥＫＥＫＩＴＶＴＶＧＩＳＫＮＫＶＦＡＫＩＡ−ＳＢｚｌ（１１）の合成
４Ｍの尿素を含むリン酸ナトリウムバッファー（１００ｍＭ、ｐＨ８、１００ｍＭのＮａＣｌを含む）に、ペプチド１０を０、２Ｍで溶解し、ペプチド９を０．６ｍＭで溶解した。２０μＭのクロストリパイン（Ｅｎｄｏｐｒｏｔｅａｓｅ  Ａｒｇ−Ｃ，  Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  米国ニュージャージー州レイクウッド）を添加した後、反応混合物を３７℃で一晩振盪した。その後、６Ｍのグアニジン―ＨＣｌを添加し、混合物を、移動相として５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６）中の６Ｍのグアニジン―ＨＣｌを用い、ＡｇｉｌｅｎｔＳＥＣ−３カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，  ドイツブリンゲン）を使用して分子ふるいクロマトグラフィーにより精製した。その後、ペプチドを含む画分を、ＨｉＴｒａｐ脱塩カラム５ｍｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＧｍｂＨ，  ドイツミュンヘン）で、水／１％のギ酸で脱塩した。凍結乾燥した後、画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３３Ａ）およびＥＳＩ−ＬＣ質量分析（図３３Ｂ）により分析した。バンドは、リガンド産物を示す１５ｋＤａ〜２０ｋＤａのレーン３および４で見出された。ライゲーション産物の理論的な分子量（Ｍｔｈｅｏｒ＝１７６１２Ｄａ）は、ＥＳＩ−ＭＳにより示される観察された分子量（Ｍｏｂｓ＝１７６４１Ｄａ）に対応した。
【０３４６】
１３．１０  ペプチド８とペプチド１１の天然の化学的なライゲーションによる全ＤポリメラーゼＤｐｏ４の変異体Ｍ７６Ｇ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃの合成
ペプチド１１および８の両方を、２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、１％のチオフェノール、および５ｍＭのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩を含むＴＲＩＳバッファー（ｐＨ８．６）に０．２Ｍで溶解した。反応混合物を室温により７２時間振盪した。その後、混合物を逆相ＨＰＬＣにより精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび逆相ＵＰＬＣおよびＥＳＩ質量分析により分析した。ライゲーション産物の正確な質量を見出す。
【０３４７】
実施例１４  代替的な合成戦略によりＤ−アミノ酸からなるポリメラーゼＤｐｏ４の変異体Ａ７１Ｃ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃの合成
本実施例の中で、全ＤポリメラーゼＤｐｏの変異体  Ａ７１Ｃ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃの合成を説明する。全ＤポリメラーゼＤｐｏの変異体  Ａ７１Ｃ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃのアミノ酸配列は、Ａｃ−ＭＩＶＬＦＶＤＦＤＹＦＹＡＱＶＥＥＶＬＮＰＳＬＫＧＫＰＶＶＶＣＶＦＳＧＲＦＥＤＳＧＡＶＡＴＡＮＹＥＡＲＫＦＧＶＫＡＧＩＰＩＶＥＡＫＫＩＬＰＮＣＶＹＬＰＭＲＫＥＶＹＱＱＶＳＳＲＩＭＮＬＬＲＥＹＳＥＫＩＥＩＡＳＩＤＥＡＹＬＤＩＳＤＫＶＲＤＹＲＥＡＹＮＬＧＬＥＩＫＮＫＩＬＥＫＥＫＩＴＶＴＶＧＩＳＫＮＫＶＦＡＫＩＡＣＤＭＡＫＰＮＧＩＫＶＩＤＤＥＥＶＫＲＬＩＲＥＬＤＩＡＤＶＰＧＩＧＮＩＴＡＥＫＬＫＫＬＧＩＮＫＬＣＤＴＬＳＩＥＦＤＫＬＫＧＭＩＧＥＡＫＡＫＹＬＩＳＬＡＲＤＥＹＮＥＰＩＲＴＲＶＲＫＳＩＧＲＩＶＴＭＫＲＮＳＲＮＬＥＥＩＫＰＹＬＦＲＡＩＥＥＳＹＹＫＬＤＫＲＩＰＫＡＩＨＶＶＡＶＴＥＤＬＤＩＶＳＲＧＲＴＦＰＨＧＩＳＫＥＴＡＹＳＥＳＶＫＬＬＱＫＩＬＥＥＤＥＲＫＩＲＲＩＧＶＲＦＳＫＦＩＥＡＩＧＬＤＫＦＦＤＴ−ＮＨ２である。
【０３４８】
使用するすべてのアミノ酸は、固相ペプチド合成のＦｍｏｃ／ｔＢｕ−戦略の必要要件（Ｅｒｉｃ  Ａｔｈｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  １９８１）に従い保護されている。使用するすべてのアミノ酸はＤ−アミノ酸である（Ｂａｃｈｅｍ，  スイスブーベンドルフ）。
【０３４９】
１４．１．完全に保護した全ＤペプチドＨ−ＫＡＩＨＶＶＡＶＴＥＤＬＤＩＶＳＲＧＲＴＦＰＨＧＩＳＫＥＴＡＹＳＥＳＶＫＬＬＱＫＩＬＥＥＤＥＲＫＩＲＲＩＧＶＲＦＳＫＦＩＥＡＩＧＬＤＫＦＦＤＴ−ＮＨ２（１）の合成
０．１ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｓｉｅｂｅｒ  ｒｉｎｋアミドＮｏｖａＳｙｎＴＧ樹脂を、４５分間、６ｍｌのＮＭＰ中、５当量のアミノ酸、４．９当量のＨＡＴＵ、および１０当量のＤＩＰＥＡを使用する、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨでＦｍｏｃ脱保護の後に充填した。
【０３５０】
自動化合成を、ＦＡＳＴｍｏｃプロトコルでＡＢＩ４３３シンセサイザーを使用して行った。１０当量のアミノ酸を、ＮＭＰ中９当量のＨＡＴＵおよび２０当量のＤＩＰＥＡを使用して活性化した。カップリング時間は４５分であり、Ｆｍｏｃ脱保護を、ＮＭＰ中２０％のピペリジン（ｖ／ｖ）で７分間、３回、行った。ダブルカップリングを、４２のアミノ酸をカップリングした後行った。
【０３５１】
完全に保護したペプチドの酸の切断を、ＤＣＭ中１％のＴＦＡ（ｖ／ｖ）１０ｍｌで、ペプチジル樹脂を２時間、２回インキュベートすることにより達成した。樹脂をろ過した後、溶媒を蒸発させ、ペプチドを、氷冷したジエチルエーテルを使用して沈殿させた。最終的なペプチドを単離し、乾燥させた。
【０３５２】
最終的な産物を、ＨＰＬＣおよび質量分析により特徴づけた（図３４）。産物に関して計算した質量（８１４８Ｄａ）は、測定した質量（８１５６Ｄａ）に対応する。
【０３５３】
１４．２  完全に保護した全ＤペプチドＨ−ＣＤＴＬＳＩＥＦ  ＤＫＬＫＧＭＩＧＥＡ  ＫＡＫＹＬＩＳＬＡＲ  ＤＥＹＮＥＰＩＲＴＲ  ＶＲＫＳＩＧＲＩＶＴ  ＭＫＲＮＳＲＮＬＥＥ  ＩＫＰＹＬＦＲＡＩＥ  ＥＳＹＹＫＬＤＫＲＩ  Ｐ−ＯＨ（３）の合成
０．１０ｍｍｏｌのＴｅｎｔａＧｅｌ−Ｒ−Ｔｒｉｔｙｌ樹脂を、Ｂａｒｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂａｒｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）に記載されるようにＦｍｏｃ−Ｄ−Ｐｒｏ−ＯＨで充填した。よって、０．１０ｍｍｏｌの樹脂を、０．６ｍｍｏｌの塩化チオニルで３０分間インキュベートし、その後、ＤＣＭで洗浄した。この後、樹脂を、０．６ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｄ−Ｐｒｏ−ＯＨ、２．４ｍｍｏｌのＤＩＰＥＡを含む６ｍｌのＤＣＭで、９０分間インキュベートした。その後、樹脂を、ＤＣＭ中１０％のＭｅＯＨ（ｖ／ｖ）、１０％のＤＩＰＥＡ（ｖ／ｖ）の溶液を使用して１０分間、３回ブロッキングし、ＤＣＭで洗浄した。自動化合成を、ＦＡＳＴｍｏｃプロトコルを用い、ＡＢＩ４３３を使用して行った。１０当量のアミノ酸を、ＮＭＰ中９当量のＨＡＴＵおよび２０当量のＤＩＰＥＡを使用して活性化した。カップリング時間は４５分であり、Ｆｍｏｃ脱保護を、ＮＭＰ中２０％のピペリジン（ｖ／ｖ）で７分間、３回、行った。ダブルカップリングのステップを、４０のアミノ酸をカップリングした後行った。Ｎ末端のシステイン誘導体は、Ｂｏｃ−Ｄ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨであった。
【０３５４】
合成したペプチドの同一性を、ＨＰＬＣおよび質量分析により、少量のペプチジルのＴＦＡ切断の後に特徴づけた（図３５）。実験的に決定した産物の質量（９３９３Ｄａ）は、理論値（９３８２Ｄａ）に従うものであった。
【０３５５】
完全に保護したペプチドの酸の切断を、ＤＣＭ中１％のＴＦＡ（ｖ／ｖ）１０ｍｌ中で、ペプチジル樹脂を２時間、２回インキュベートすることにより達成した。樹脂をろ過した後、溶媒を蒸発させ、ペプチドを氷冷したジエチルエーテルを使用して沈殿した。最終的にペプチドを単離し、乾燥させた。
【０３５６】
１４．３  ペプチド３とペプチド１のフラグメント縮合による全―ＤペプチドＨ−ＣＤＴＬＳＩＥＦＤＫＬＫＧＭＩＧＥＡＫＡＫＹＬＩＳＬＡＲＤＥＹＮＥＰＩＲＴＲＶＲＫＳＩＧＲＩＶＴＭＫＲＮＳＲＮＬＥＥＩＫＰＹＬＦＲＡＩＥＥＳＹＹＫＬＤＫＲＩＰＫＡＩＨＶＶＡＶＴＥＤＬＤＩＶＳＲＧＲＴＦＰＨＧＩＳＫＥＴＡＹＳＥＳＶＫＬＬＱＫＩＬＥＥＤＥＲＫＩＲＲＩＧＶＲＦＳＫＦＩＥＡＩＧＬＤＫＦＦＤＴ−ＮＨ２（５）の合成
５マイクロモル濃度の（３）および１当量の（１）を、ＤＣＭ中２５％のＴＦＥ（ｖ／ｖ）に溶解した。５当量のＰｙＢＯＰおよび１０当量のＤＩＰＥＡを添加した後、混合物を一晩撹拌した。溶媒を蒸発させた後、ペプチドを氷冷したジエチルエーテルを使用して沈殿させ、ろ過した。
【０３５７】
ペプチドの側鎖保護基の切断を、ＴＦＡ中２．５％のＥＤＴ（ｖ／ｖ）、２．５％の水（ｖ／ｖ）、２．５％のＴＩＳ（ｖ／ｖ）で、２時間行った。ＴＦＡを蒸発させた後、ペプチドを氷冷したジエチルエーテルを使用して沈殿させた。Ｎ末端のＦｍｏｃ保護したペプチドの逆相ＨＰＬＣ精製を、ＡＣＮ／水勾配を使用してＣ１８カラムで行った。産物を含む画分を組み合わせ、凍結乾燥した。
【０３５８】
最終的な産物を、ＨＰＬＣおよび質量分析により特徴づけた（図３６）。実験的に決定した質量（１７５２９Ｄａ）は、理論的な分子量（１７５１２Ｄａ）に対応する。
【０３５９】
１４．２  全ＤペプチドＨ−ＣＶＹＬＰＭＲＫＥＶＹＱＱＶＳＳＲＩＭＮＬＬＲＥＹＳＥＫＩＥＩＡＳＩＤＥＡＹＬＤＩＳＤＫＶＲＤＹＲＥＡＹＮＬＧＬＥＩＫＮＫＩＬＥＫＥＫＩＴＶＴＶＧＩＳＫＮＫＶＦＡＫＩＡ−ＮＨＮＨ２（９）の合成
０．１０ｍｍｏｌのＴｅｎｔａＧｅｌ−Ｒ−Ｔｒｉｔｙｌ樹脂を、Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）に記載されるようにヒドラジドで充填した。よって、０．１０ｍｍｏｌの樹脂を、０．６ｍｍｏｌの塩化チオニルで３０分間、２回インキュベートし、その後、ＤＣＭ、およびＤＣＭ中５０％のＤＭＦ（ｖ／ｖ）で洗浄した。この後、樹脂を、ＤＭＦ中５％のＮＨ２ＮＨ２（ｖ／ｖ）で３０分間、２回インキュベートした。その後、樹脂を、ＤＣＭ中１０％のＭｅＯＨ（ｖ／ｖ）、１０％のＤＩＰＥＡ（ｖ／ｖ）の溶液を使用して１０分間、３回ブロッキングし、ＤＣＭで洗浄した。第１のアミノ酸のカップリングを、ＮＭＰに溶解した１ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ、０．９ｍｍｏｌのＨＡＴＵ、２ｍｍｏｌのＤＩＰＥＡで１時間樹脂をインキュベートすることにより達成した。自動化合成を、ＦＡＳＴｍｏｃプロトコルを用い、ＡＢＩ４３３を使用して行った。１０当量のアミノ酸を、ＮＭＰ中９当量のＨＡＴＵおよび２０当量のＤＩＰＥＡを使用して活性化した。カップリング時間は４５分であり、Ｆｍｏｃ脱保護を、ＮＭＰ中２０％のピペリジン（ｖ／ｖ）で７分間、３回行った。ダブルカップリングを、４３のアミノ酸のカップリングの後行った。
【０３６０】
樹脂からのペプチドヒドラジドの切断を、ＴＦＡ中２．５％のＥＤＴ（ｖ／ｖ）、２．５％の水（ｖ／ｖ）、２．５％のＴＩＳ（ｖ／ｖ）で、ペプチジル樹脂を２時間インキュベートすることにより達成した。ＴＦＡを蒸発させた後、ペプチドを氷冷したジエチルエーテルで沈殿した。ペプチドエステルの逆相ＨＰＬＣ精製を、ＡＣＮ／水勾配を使用してＣ１８カラムで行った。産物を独占的に含む画分を組み合わせ、凍結乾燥した。
【０３６１】
最終的な産物を、ＵＰＬＣ（図３７Ａ）および質量分析（図３７Ｂ）により特徴付けた。質量分析により決定した分子質量（９８４３Ｄａ）は、計算した質量（９８３０Ｄａ）に従うものであった。
【０３６２】
１４．５  Ａｃ−ＭＩＶＬＦＶＤＦＤＹＦＹＡＱＶＥＥＶＬＮＰＳＬＫＧＫＰＶＶＶＣＶＦＳＧＲＦＥＤＳＧＡＶＡＴＡＮＹＥＡＲＫＦＧＶＫＡＧＩＰＩＶＥＡＫＫＩＬＰＮ−ＳＢｚｌ（１１）の合成
０．１０ｍｍｏｌのＴｅｎｔａＧｅｌ−Ｒ−Ｔｒｉｔｙｌ樹脂を、Ｂａｒｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂａｒｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）に記載されるようにＦｍｏｃ−Ｄ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨで充填した。よって、０．１０ｍｍｏｌの樹脂を、０．６ｍｍｏｌの塩化チオニルで３０分間、２回インキュベートし、その後、ＤＣＭで洗浄した。この後、樹脂を、０．６ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｄ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、２．４ｍｍｏｌのＤＩＰＥＡを含む６ｍｌのＤＣＭで９０分間インキュベートした。その後、樹脂を、ＤＣＭ中１０％のＭｅＯＨ（ｖ／ｖ）、１０％のＤＩＰＥＡ（ｖ／ｖ）の溶液を使用して１０分間、３回ブロッキングし、ＤＣＭで洗浄した。自動化合成を、ＦＡＳＴｍｏｃプロトコルでＡＢＩ４３３を使用して行った。１０当量のアミノ酸を、ＮＭＰ中９当量のＨＡＴＵおよび２０当量のＤＩＰＥＡを使用して活性化した。カップリング時間は４５分間であり、Ｆｍｏｃ脱保護を、ＮＭＰ中２０％のピペリジン（ｖ／ｖ）で７分間、３回、行った。ダブルカップリングを、４０のアミノ酸のカップリングの後行った。Ｎ末端のアセチル化を、ＤＭＦ中１０％の無水酢酸（ｖ／ｖ）および１０％のＤＩＰＥＡ（ｖ／ｖ）で、１０分間、３回行った。
【０３６３】
完全に保護したペプチドの酸の切断を、ＤＣＭ中３０％のＨＦＩＰ（ｖ／ｖ）１０ｍｌで、ペプチド樹脂を２時間、２回インキュベートすることにより達成した。ペプチドをろ過した後、溶媒を蒸発させ、残渣を、氷冷したジエチルエーテルを使用して沈殿させた。沈殿したペプチドを単離し、乾燥させた。
【０３６４】
０．００５ｍｍｏｌの完全に保護したペプチド、５当量のＰｙＢＯＰおよび１００当量のベンジルメルカプタンを、６ｍｌのＤＣＭに溶解した。１０当量のＤＩＰＥＡを添加した後、混合物を４時間撹拌した。この後、溶媒を還元し、蒸発させ、残渣を氷冷したジエチルエーテルにより沈殿した。沈殿したペプチドエステルを乾燥させ、その後、保護基を、ＴＦＡ中２．５％のＥＤＴ（ｖ／ｖ）、２．５％の水（ｖ／ｖ）、２．５％のＴＩＳ（ｖ／ｖ）を使用して、２時間切断した。ＴＦＡを蒸発させた後、ペプチドを氷冷したジエチルエーテルを使用して沈殿した。ペプチドエステルの逆相ＨＰＬＣ精製を、ＡＣＮ／水勾配を使用してＣ１８カラムで行った。産物を独占的に含む画分を組み合わせ、凍結乾燥した。
【０３６５】
最終的な産物を、ＵＰＬＣ（図２３）および質量分析（図２４）により特徴づけた。質量分析により決定した産物の分子質量（７８４８Ｄａ）は、計算した質量（７８４５Ｄａ）に従うものであった。
【０３６６】
１４．６  全Ｄ−ペプチドリポ  ＣＤＭＡＫＰＮＧＩＫＶＩＤＤＥＥＶＫＲＬＩＲＥＬＤＩＡＤＶＰＧＩＧＮＩＴＡＥＫＬＫＫＬＧＩＮＫＬ−４−ａｃｅｔａｍｉｄｏｔｈｉｏｐｈｅｎｙｌｅｓｔｅｒ（７）の合成
０．１０ｍｍｏｌのＴｅｎｔａＧｅｌ−Ｒ−Ｔｒｉｔｙｌ樹脂を、Ｂａｒｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂａｒｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）に記載されるようにＦｍｏｃ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＨで充填した。よって、０．１０ｍｍｏｌの樹脂を、０．６ｍｍｏｌの塩化チオニルで２回、３０分間インキュベートし、その後、ＤＣＭで洗浄した。この後、樹脂を、０．６ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＨ、２．４ｍｍｏｌのＤＩＰＥＡを含む６ｍｌのＤＣＭで９０分間インキュベートした。その後、樹脂を、ＤＣＭ中１０％のＭｅＯＨ（ｖ／ｖ）、１０％のＤＩＰＥＡ（ｖ／ｖ）の溶液を使用して１０分間、３回ブロッキングし、ＤＣＭで洗浄した。自動化合成を、ＦＡＳＴｍｏｃプロトコルでＡＢＩ４３３を使用して行った。１０当量のアミノ酸を、ＮＭＰ中９当量のＨＡＴＵおよび２０当量のＤＩＰＥＡを使用して活性化した。カップリング時間は４５分であり、Ｆｍｏｃ脱保護を、ＮＭＰ中２０％（ｖ／ｖ）のピペリジンで７分間、３回行った。最終的なカップリングステップの後、Ｆｍｏｃ脱保護を実行した。リポタグを、Ｇａｒｃｉａ−Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉａ  （Ｇａｒｃｉａ−Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉａ，  Ｃ．  １９９５）にしたがって、一晩、ＮＭＰ中１０当量の４−ニトロフェニル−２−（オクタデシルスルホニル）エチルカルボナート、１０当量のＨＯＢｔ、および１０当量のＤＩＰＥＡで樹脂をインキュベートすることにより導入した。この後、樹脂を、ＮＭＰおよびＤＣＭで洗浄した。
【０３６７】
完全に保護したペプチドの酸の切断を、ＤＣＭ中３０％（ｖ／ｖ）のＨＦＩＰ１０ｍｌで２時間、２回ペプチジル樹脂をインキュベートすることにより達成した。ペプチドをろ過した後、溶媒を蒸発させ、残渣を氷冷したジエチルエーテルを使用して沈殿させた。沈殿したペプチドを単離し、乾燥した。
【０３６８】
０．０５ｍｍｏｌのＮ末端のリポおよび完全に側鎖保護したペプチド４を、ＤＣＭに溶解した。５当量のＰｙＢＯＰ、１０当量のＤＩＰＥＡ、および３０当量の４−アセトアミドチオフェノールを添加した後、混合物を４時間撹拌した。ＤＣＭを蒸発させ、ペプチドを沈殿させ、氷冷したジエチルエーテルで洗浄した。側鎖保護基を、ＴＦＡ中２．５％のＥＤＴ（ｖ／ｖ）、２．５％の水（ｖ／ｖ）、２．５％のＴＩＳ（ｖ／ｖ）での２時間処理することにより除去した。ＴＦＡを蒸発させた後、ペプチドを沈殿し、氷冷したジエチルエーテルで洗浄した。次に、ペプチド―４アセトアミドチオフェニルエステルを、逆相ＨＰＬＣにより精製し、逆相ＵＰＬＣおよび質量分析により分析した。理論的な分子量（Ｍｔｈｅｏｒ＝５８４４）は、ＥＳＩ−ＬＳ−ＭＳにより示されるように観察した分子量（Ｍｏｂｓ＝５８４７）に対応する。
【０３６９】
１４．７  ペプチド５とペプチド７の天然の化学的なライゲーションによる全ＤペプチドＨ−ＣＤＭＡＫＰＮＧＩＫＶＩＤＤＥＥＶＫＲＬＩＲＥＬＤＩＡＤＶＰＧＩＧＮＩＴＡＥＫＬＫＫＬＧＩＮＫＬＣＤＴＬＳＩＥＦＤＫＬＫＧＭＩＧＥＡＫＡＫＹＬＩＳＬＡＲＤＥＹＮＥＰＩＲＴＲＶＲＫＳＩＧＲＩＶＴＭＫＲＮＳＲＮＬＥＥＩＫＰＹＬＦＲＡＩＥＥＳＹＹＫＬＤＫＲＩＰＫＡＩＨＶＶＡＶＴＥＤＬＤＩＶＳＲＧＲＴＦＰＨＧＩＳＫＥＴＡＹＳＥＳＶＫＬＬＱＫＩＬＥＥＤＥＲＫＩＲＲＩＧ  ＶＲＦＳＫＦＩＥＡＩＧＬＤＫＦＦＤＴ−ＮＨ２（８）の合成
【０３７０】
ペプチド５および７の両方を、２００ｍＭのメルカプトフェニル酢酸および５０ｍＭのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩を含むリン酸ナトリウムバッファー（２００ｍＭ、６ＭのグアニジンＨＣｌ、ｐＨ８）で２ｍＭに溶解した。反応混合物を室温により２４時間振盪した。その後、混合物を、３０分以内に３０〜９５％のＡＣＮ（０．１％のＴＦＡ）の勾配を使用することによりＲＰ４カラム（Ｊｕｐｉｔｅｒ  ５μｍ，３００Å，  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，  ドイツアシャッフェンブルク）で逆相ＨＰＬＣにより精製した。産物を含む画分を組み合わせ、凍結乾燥した。リポタグの切断を、Ｇａｒｃｉａ−Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉａ（Ｇａｒｃｉａ−Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉａ，Ｃ．  １９９５）にしたがって、ＴＦＥ中１０％のＮＨ４ＯＨで、一晩、乾燥した産物をインキュベートすることにより達成した。最終的な産物の精製を、上述と同一のＨＰＬＣ条件を使用して実行した。ライゲーション産物の理論的な分子量（Ｍｔｈｅｏｒ＝２２７８１Ｄａ）は、ＥＳＩ−ＬＣ−ＭＳにより示されるように観察した分子量（Ｍｏｂｓ＝２２７９６Ｄａ）に対応する。
【０３７１】
１４．８  ペプチド９とペプチド１０の天然の化学的なライゲーションによる全ＤペプチドＡｃ−ＭＩＶＬＦＶＤＦＤＹＦＹＡＱＶＥＥＶＬＮＰＳＬＫＧＫＰＶＶＶＣＶＦＳＧＲＦＥＤＳＧＡＶＡＴＡＮＹＥＡＲＫＦＧＶＫＡＧＩＰＩＶＥＡＫＫＩＬＰＮＣＶＹＬＰＭＲＫＥＶＹＱＱＶＳＳＲＩＭＮＬＬＲＥＹＳＥＫＩＥＩＡＳＩＤＥＡＹＬＤＩＳＤＫＶＲＤＹＲＥＡＹＮＬＧＬＥＩＫＮＫＩＬＥＫＥＫＩＴＶＴＶＧＩＳＫＮＫＶＦＡＫＩＡ−ＮＨＮＨ２（１１）の合成
ペプチド１０およびペプチド９を、２００Ｍのメルカプトフェニル酢酸および５０ｍＭのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩を含むリン酸ナトリウムバッファー（２００ｍＭ、６ＭのグアニジンＨＣｌ、ｐＨ８）に２ｍＭで溶解した。反応混合物を室温で２４時間振盪した。ＨＰＬＣ精製を、３０分で、Ｃ４カラム（Ｊｕｐｉｔｅｒ  ５μｍ，３００Å，  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，  ドイツアシャッフェンブルク）および３０〜９５％のＡＣＮ（０．１％のＴＦＡ）の勾配を使用して実行した。画分を含む産物を組み合わせ、凍結乾燥した。ライゲーション産物の理論的な分子量（Ｍｔｈｅｏｒ＝１７６４１Ｄａ）は、ＥＳＩ−ＬＣ−ＭＳにより示されるように観察した分子量（Ｍｏｂｓ＝１７６４１Ｄａ）に対応する。
【０３７２】
１４．９  ペプチド８とペプチド１１の天然の化学的なライゲーションによる全ＤポリペプチドＤｐｏ４変異体Ａ７１Ｃ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃの合成
ペプチド１１のヒドラジドの官能性の酸化、チオエステルへの変換、および天然の化学的なライゲーションを、Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）により行った。ペプチド１１を、リン酸ナトリウムバッファー（２００ｍＭ、６ＭのグアニジンＨＣｌ、ｐＨ３）に２ｍＭで溶解し、−１５℃の氷冷槽に置いた。酸化を、ＮａＮＯ２を添加することにより行い、５０ｍＭの最終濃度を得た。１５分後、溶液を、２００Ｍのメルカプトフェニル酢酸および５０ｍＭのＴＣＥＰを含むリン酸ナトリウムバッファー（２００ｍＭ、６Ｍのグアニジン―ＨＣｌ、ｐＨ８）中、ペプチド８の２ｍＭの溶液と混合した。
【０３７３】
反応混合物を、室温により２４時間振盪した。その後、反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＥＳＩ−ＬＣ質量分析により分析した。
【０３７４】
実施例１５  Ｄ−アミノ酸からなる合成ポリメラーゼｄｐｏ４の活性確認
この実施例は、実施例１１、１２、１３、および１４による全−ＤポリメラーゼＤｐｏ４変異体Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃ、Ａ７１Ｃ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃ、およびＭ７６Ｇ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃに対するＰＣＲ活性試験を記載する。ここで、全―ＤポリメラーゼＤｐｏ４変異体Ａ７１Ｃ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃは、実施例１３または１４による合成およびライゲーションで産生できる。
驚くべきことに、合成全−ＤポリメラーゼＤｐｏ４変異体Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃ、Ａ７１Ｃ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃ、およびＭ７６Ｇ／Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃは、余分な再折り畳みを行うことなく活性であり、したがって、さらなる再折り畳み手順なく使用される。プレキャストゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ドイツカールスルーエ）上でのドデシル硫酸ナトリウム（略称ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（略称ＰＡＧＥ）により、標準的な一連の既知のタンパク質濃度を用い、その後ＳＹＰＲＯ−ＲＥＤ染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ドイツカールスルーエ）およびＢｉｏＲａｄ  Ｆｘスキャナー機器上での密度バンド分析を行うことによって、タンパク質濃度を推定する。
【０３７５】
１４．１  ＰＣＲ活性アッセイに対する鋳型
ＰＣＲ反応に対する鋳型は、８３マー１本鎖Ｌ−ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＭＪ＿１＿１０５＿ＬＤ）であり、そこから、第一の温度サイクルにおいて逆鎖が生成される。その後、両鎖を指数関数的増幅に対する鋳型とする。ＮＯＸＸＯＮにおいてＬ−立体配置で鋳型ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよびＤＮＡプライマーを合成する。
【０３７６】
ＰＣＲ活性アッセイに対するオリゴヌクレオチドのリスト：
【表１１】
0006670237.tif 000059
【０３７７】
１４．２  ＰＣＲ反応
１５μＬＰＣＲ反応は、各０．２ｍＭの４種類のＬ−ｄＮＴＰ、１０ｎＭ  ８３マーｓｓＤＮＡ（ＭＪ＿１＿１０５＿ＬＤ）鋳型、１μＭのフォワードおよびリバースプライマー、１ｘ  ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ８．８＠２５℃）および少なくとも０．６７ｎｇ／μＬの全−ＤポリメラーゼＤｐｏ４変異体Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃを含有する。フォワードプライマーは、ＭＪ＿ｏｌｉｇｏ＿１８７＿ＬＤであり、１０２ｂｐのＰＣＲ生成物が得られ、これは８３マー鋳型とは区別されるものである。リバースプライマーは、ＭＪ＿ｏｌｉｇｏ＿１８９＿ＬＤである。Ｌ−ｄＮＴＰは、Ｒａｓａｙａｎ，Ｉｎｃ．（米国カリフォルニア州エンシニータス）によるカスタム合成として購入する。
【０３７８】
全−ＤポリメラーゼＤｐｏ４変異体Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃを省くことによって陰性対照を遂行する。
【０３７９】
温度サイクリングプログラムは、１サイクル（８５℃、３分）、次いで少なくとも７サイクルの（８５℃、３０秒／５６℃、１分／６０℃、４分）、次いで４℃で保持からなる。ＰＣＲ反応物の４μＬアリコートを試料ローディング緩衝液と混合し、ＴＢＥゲル上で分析する。とりわけ１００ｂｐバンドを含有するＤＮＡ標準物質ラダーをこのゲルに適用する。
【０３８０】
１４．３  活性確認
全−ＤポリメラーゼＤｐｏ４変異体Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３ＣおよびＬ−ＤＮＡ基質およびＬ−ヌクレオチドを用いたＰＣＲ反応によって、ＤＮＡ標準物質ラダーと比較した場合に約１００ｂｐの範囲となるバンドが得られる。このバンドは、ポリメラーゼがない陰性対照では出現しない。また、この１０２ｂｐバンドは、８３マー鋳型より高く移動する。全−ＤポリメラーゼＤｐｏ４変異体Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３ＣはＬ−ＤＮＡ増幅の出現に依存するので、温度増幅過程での合成全−ＤポリメラーゼＤｐｏ４変異体Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃの活性が確認される。
【０３８１】
実施例１５−Ｄ−またはＬ−核酸の合成
標準的な環外アミン保護基とともに（ＤａｍｈａおよびＯｇｉｌｖｉｅ、１９９３）２’ＴＢＤＭＳ  ＤＮＡホスホラミダイト化学を用いて、ＡＢＩ３９４合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）による固相合成によって、Ｌ−ＤＮＡ核酸またはＤ−ＤＮＡ核酸を作製した。ＤＮＡ合成のために、Ｄ−およびＬ−立体配置のｄＡ（Ｎ−Ｂｚ）−、ｄＣ（Ｎ−Ａｃ）−、ｄＧ（Ｎ−ｉｂｕ）−およびｄＴを適用した。ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡから全ホスホルアミダイトを購入した。合成および脱保護後、ゲル電気泳動によってＬ−ＤＮＡ核酸またはＤ−ＤＮＡ核酸を精製した。
【０３８２】
参考文献
次のような、本明細書中で引用する書類の完全な文献データは、別段の断りがない場合、それによってその参考文献の開示が参照により本明細書中に組み込まれる。
【表１２】
0006670237.tif 000060
0006670237.tif 000061
0006670237.tif 000062
【０３８３】
本明細書、特許請求の範囲および／または図面中で開示される本発明の特徴は、両者とも個別に、および何らかのそれらの組み合わせで、その様々な形態で本発明を実現するための材料であり得る。
【図１Ａ】
0006670237.tif 000063
【図１Ｂ】
0006670237.tif 000064
【図２Ａ】
0006670237.tif 000065
【図２Ｂ】
0006670237.tif 000066
【図３Ａ】
0006670237.tif 000067
【図３Ｂ】
0006670237.tif 000068
【図４Ａ】
0006670237.tif 000069
【図４Ｂ】
0006670237.tif 000070
【図５Ａ】
0006670237.tif 000071
【図５Ｂ】
0006670237.tif 000072
【図６Ａ】
0006670237.tif 000073
【図６Ｂ】
0006670237.tif 000074
【図７】
0006670237.tif 000075
【図８】
0006670237.tif 000076
【図９Ａ】
0006670237.tif 000077
【図９Ｂ】
0006670237.tif 000078
【図１０Ａ】
0006670237.tif 000079
【図１０Ｂ】
0006670237.tif 000080
【図１０Ｃ】
0006670237.tif 000081
【図１１Ａ】
0006670237.tif 000082
【図１１Ｂ】
0006670237.tif 000083
【図１２Ａ】
0006670237.tif 000084
【図１２Ｂ】
0006670237.tif 000085
【図１２Ｃ】
0006670237.tif 000086
【図１２Ｄ】
0006670237.tif 000087
【図１２Ｅ】
0006670237.tif 000088
【図１２Ｆ】
0006670237.tif 000089
【図１３】
0006670237.tif 000090
【図１４】
0006670237.tif 000091
【図１５】
0006670237.tif 000092
【図１６Ａ】
0006670237.tif 000093
【図１６Ｂ】
0006670237.tif 000094
【図１７Ａ】
0006670237.tif 000095
【図１７Ｂ】
0006670237.tif 000096
【図１８Ａ】
0006670237.tif 000097
【図１８Ｂ】
0006670237.tif 000098
【図１９Ａ】
0006670237.tif 000099
【図１９Ｂ】
0006670237.tif 000100
【図２０Ａ】
0006670237.tif 000101
【図２０Ｂ】
0006670237.tif 000102
【図２１】
0006670237.tif 000103
【図２２】
0006670237.tif 000104
【図２３】
0006670237.tif 000105
【図２４】
0006670237.tif 000106
【図２５Ａ】
0006670237.tif 000107
【図２５Ｂ】
0006670237.tif 000108
【図２６Ａ】
0006670237.tif 000109
【図２６Ｂ】
0006670237.tif 000110
【図２７Ａ】
0006670237.tif 000111
【図２７Ｂ】
0006670237.tif 000112
【図２８Ａ】
0006670237.tif 000113
【図２８Ｂ】
0006670237.tif 000114
【図２８Ｃ】
0006670237.tif 000115
【図２９】
0006670237.tif 000116
【図３０】
0006670237.tif 000117
【図３１】
0006670237.tif 000118
【図３２】
0006670237.tif 000119
【図３３Ａ】
0006670237.tif 000120
【図３３Ｂ】
0006670237.tif 000121
【図３４】
0006670237.tif 000122
【図３５】
0006670237.tif 000123
【図３６】
0006670237.tif 000124
【図３７】
0006670237.tif 000125