(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも部分的にフラグメント化されたゲノムDNAを含むサンプル中の高メチル化標的DNAの有無を検出する方法であって、
（a）前記DNA内の、5位の非メチル化されたシトシンをウラシルに又はグアニンとハイブリダイズしない別の塩基に変換する工程、
（b）メチル化非特異的プライマーオリゴヌクレオチド及びメチル化特異的に増幅をブロッキングする少なくとも1つのメチル化特異的ブロッカーを用いて、100塩基対（bp）未満の長さであり、プライマーが結合しないゲノムDNAの少なくとも3つのCpG部位を含む、前記変換された標的DNAの領域を増幅する工程であって、
工程（b）の少なくとも1つのプライマーオリゴヌクレオチドが、
（1）該標的DNAの少なくとも1つのCpG部位のシトシン塩基の位置においてメチル化非特異的な不一致若しくはスペーサーを含み、及び／又は
（2）該標的DNAの少なくとも1つのSNP部位においてSNP非特異的な不一致若しくはスペーサーを含み、及び
（c）工程（b）において増幅されたDNAの有無を検出する工程、
を含み、増幅されたDNAの有無がそれぞれサンプル中の高メチル化標的DNAの有無を反映する、方法。
【請求項２】
前記標的DNAが各プロモーター領域を含むゲノムヒトFOXL2、SHOX2、又はPTGER4のDNA及びその5 kbの上流及び下流内のDNAである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
請求項1又は2に記載のゲノムDNAを含むサンプル中の高メチル化標的DNAの有無を検出する方法を含む対象の癌の有無を検出する方法であって、
前記サンプルが前記癌を有する対象において癌細胞の腫瘍DNAを含む対象由来サンプルであり、
前記癌を有する患者の癌細胞において前記標的DNAが高メチル化され、
該サンプル中の高メチル化標的DNAの有無がそれぞれ該対象の癌の有無の指標である、方法。
【請求項４】
前記癌が肺癌又は結腸直腸癌である、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
別のプライマーオリゴヌクレオチドと合わせて、5位の非メチル化されたシトシンがウラシルに又はグアニンとハイブリダイズしない別の塩基に変換されているゲノムDNAの一本鎖からアンプリコンを作製するのに好適なメチル化非特異的プライマーオリゴヌクレオチドであって、
前記アンプリコンが100 bp未満の長さであり、プライマーが結合しないゲノムDNAの少なくとも3つのCpG部位を含み、
該少なくとも1つのプライマーオリゴヌクレオチドが、
（1）該標的DNAの少なくとも1つのCpG部位のシトシン塩基の位置においてメチル化非特異的な不一致若しくはスペーサーを含み、及び／又は
（2）該標的DNAの少なくとも1つのSNP部位においてSNP非特異的な不一致若しくはスペーサーを含む、
プライマーオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
ゲノムDNAを含むサンプル中の高メチル化標的DNAの有無を検出するためのキットであって、
（i）フォワードプライマーとリバースプライマーとからなるメチル化非特異的プライマーオリゴヌクレオチドの少なくとも1つの対であって、
前記プライマーの対は、5位の非メチル化されたシトシンがウラシルに又はグアニンとハイブリダイズしない別の塩基に変換されているゲノムDNAの一本鎖からアンプリコンを作製するのに適しており、
前記ゲノムDNAが少なくとも部分的にフラグメント化され、
前記アンプリコンが100 bp未満の長さであり、プライマーが結合しないゲノムDNAの少なくとも3つのCpG部位を含み、
少なくとも1つのプライマーオリゴヌクレオチドが、
（1）該標的DNAの少なくとも1つのCpG部位のシトシン塩基の位置においてメチル化非特異的な不一致若しくはスペーサーを含み、及び／又は
（2）該標的DNAの少なくとも1つのSNP部位においてSNP非特異的な不一致若しくはスペーサーを含み、及び
（ii）メチル化特異的に増幅をブロッキングすることができる少なくとも1つのメチル化特異的ブロッカー、
を含むキット。
【請求項７】
前記ゲノムDNAの一本鎖が各プロモーター領域を含むヒトFOXL2、SHOX2、又はPTGER4のDNA及びその5 kb上流及び下流内のDNAである、請求項5に記載のメチル化非特異的プライマーオリゴヌクレオチド又は請求項6に記載のキット。
【請求項８】
前記少なくとも1つの不一致又はスペーサーが前記プライマーオリゴヌクレオチドの3'末端の10個のヌクレオチド内にあり、及び／又は前記プライマーオリゴヌクレオチドの5'末端の5個のヌクレオチド内にはない、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも1つの不一致又はスペーサーが前記プライマーオリゴヌクレオチドの3'末端の10個のヌクレオチド内にあり、及び／又は前記プライマーオリゴヌクレオチドの5'末端の5個のヌクレオチド内にはない、請求項5又は7に記載のメチル化非特異的プライマーオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記少なくとも1つの不一致又はスペーサーが前記プライマーオリゴヌクレオチドの3'末端の10個のヌクレオチド内にあり、及び／又は前記プライマーオリゴヌクレオチドの5'末端の5個のヌクレオチド内にはない、請求項6に記載のキット。
【請求項１１】
対象の癌の有無を検出するための請求項5若しくは7に記載のメチル化非特異的プライマーオリゴヌクレオチド又は請求項6に記載のキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬理ゲノミクスの分野、特に高メチル化DNAの有無の検出に関する。マーカーDNAにおいてCpGメチル化を検出することは癌及び癌の亜型の診断に有用であり、本発明はそのための改良された方法を提供する。このような改良された方法は特に非メチル化マーカーDNAの高いバッググランドでメチル化マーカーDNAをより高い感度で検出することを可能にする。
【背景技術】
【０００２】
65年以上前に、Mandel及びMetaisは初めてヒトにおける細胞外核酸の存在を観察したことを記載し（非特許文献1）、40年以上後になって、血漿、血清、及び他の体液から単離された細胞非含有（cell-free：無細胞）核酸において、腫瘍関連の遺伝子変化を見つけることができることが明らかとなった（非特許文献2、非特許文献3）。これは、様々な形態の悪性腫瘍において観察されるエピジェネティックな変化を含む。哺乳動物の染色質の特質はDNAメチル化であり、CpGジヌクレオチドのコンテキストにおけるシトシンのメチル化は、発達の調節における役割の1つを担い、胚形成及び細胞分化等の基本的な生物学的過程において重要であることが知られている（非特許文献4、非特許文献5）。それゆえ、メチル化は、遺伝子転写を調節するだけでなく、ゲノム安定性、刷込み及びX染色体の不活性化を維持する役割も担う。癌遺伝子、及び腫瘍抑制遺伝子におけるエピジェネティックな変化は、癌の発症における鍵となる重要な変化である（非特許文献6）。DNAメチル化パターンは、癌細胞では大きく改変されることから、癌細胞と正常な組織とを識別するために使用することができる。それゆえ、DNAメチル化パターンを使用して、あらゆる種類の癌が診断されている。比較的最近の構想として、患者の体内の腫瘍量の1つの指標として、腫瘍から例えば血液に放出される血中遊離腫瘍DNAをメチル化解析に使用する。かなり感度が高く、またかなり特異的な方法を用いて腫瘍患者から細胞外核酸を単離し、特徴付けることができることが、「リキッドバイオプシー」という用語につながっている。その結果、医師はもはや、組織生検及び身体スキャンの単一の検査だけに左右されることはない。このようなリキッドバイオプシーにおいての、非メチル化非腫瘍DNAの高いバッググランドで少量のメチル化腫瘍DNAを検出することは、検出方法の感度における大きな課題である。メチル化特異的PCR（MSP）及び特にHeavyMethyl（商標）（HM）技術等の、バイサルファイト変換後のメチル化腫瘍DNAの選択的増幅に基づいた技術を用いて、非常に良好な結果が得られている（非特許文献7）。
【０００３】
癌の進行が遅い程、患者を治療する治療選択肢及び可能性が良好となる。したがって、出来る限り早期に癌を診断することが非常に望ましい。しかし、進行の遅い癌は、腫瘍の大きさが小さく、癌細胞が少ないことを意味し、血中遊離腫瘍DNAの放出が少ない。このことは、例えば、血漿中において6時間未満と細胞外核酸の半減期がかなり短いことにより更に困難となる（非特許文献7）。それゆえ、検出方法の感度が高い程、早期に癌を確実に診断し、又は完全に診断することができる。それに応じて、当該技術分野において、感度の高いDNAメチル化を検出する方法が必要とされる。
【０００４】
感度の高い検出において、HeavyMethyl（商標）つまりHM（プライマーは非特異的にメチル化と結合するが、特異的にメチル化をブロッキングするため、不必要な鋳型の作製が最小限であっても、その前の増幅サイクルにおいてブロッキングできていないと、再ブロッキングが行われる）は、MSP（特異的にメチル化をプライミングするため、完璧に一致する鋳型を導入し、ミスプライミングが生じた場合に、ひいてはこれを指数関数的に増幅させる）と比べたときに第1の選択肢と見なされる。このHMの利点は1つの不利な点にもなると考えられる、すなわちブロッカー用のCpG富化部分がCpGを含まないプライミング部位と並んでいることが必要であることは広く受け入れられている理論である。所与の標的DNAの好適な部位又は領域が限られていることから、これは分析する部位又は領域の選択肢をかなり限定するものである。
【０００５】
設計上の制約（constrictions）（望まないCpG部位、SNP等）のため、これまでのメチル化アッセイはHMでは最大150 bpの大きさのアンプリコンを使用していたが、本発明者らは一般に血中腫瘍DNA中のフラグメント化の対処にも適用可能であると考えた。本発明者らは、長年の経験及び結果の比較から、このような長さを用いた癌マーカーアッセイは、癌細胞（完全な大きさの高分子量のゲノム腫瘍DNA）を含有する標本に非常に有用であり、また標的が血中遊離DNA（このようなDNAが少なくとも部分的にフラグメント化されることが予想される）であるリキッドバイオプシー／体液に適用したときにも有用である（しかし、わずかに感度が低下する）ことを示していた。
【０００６】
本発明者らは現在、驚くべきことに、増幅産物のサイズの更なる減少が更に良好な増幅につながり（血中腫瘍DNAに認められるDNAフラグメント化と無関係でも）、非メチル化非腫瘍DNAの高いバックグランドの中で元の鋳型、すなわちメチル化腫瘍DNAが少ないときに特に有用であるかなり改良されたシグナルとなることを見つけている。他の懸念（例えば望まないCpG部位、SNP等）を覆す、一次設計の目的としてのアンプリコンのサイズの減少は、本発明者らの知るところでは行われていないが、これは小さいサイズは分析する部位又は領域の選択肢をかなり限定し、つまりHeavyMethyl（商標）を用いた感度の高い検出ではメチル化非特異的にしなければならない、プライマーが結合する（covered）CpG部位が存在することから、好適な部位又は領域がかなり少ないためである。また、SNP部位は、プライマーがSNPの特定のヌクレオチドに特異的である場合、感度がバイアスされるため、プライマーが結合するべきではない。
【０００７】
本発明者らはまた、驚くべきことにHM用のプライマーにおけるCpG部位（又はSNP部位）内の不一致（mismatches：ミスマッチ）の導入（CpG部位のシトシンの位置において、プライマーの第1の塩基とバイサルファイトDNAセンス鋳型の第2の塩基との、例えばC=C、T=C、C=T、又はT=Tの不一致、又はプライマーの第1の塩基とバイサルファイト合成リバース相補鎖の第2の塩基とのA=G、G=G、A=A、又はG=Aの不一致を導入することによる非特異的なメチル化）では、全体のプライマー結合エンタルピーを設計（例えば、伸長）によって調節するときだけでなく、不一致の位置がプライマーの中間位置に配置された場合でも誤ったブロッキング又は非特異的プライミングを導入しなかった（負の影響がほとんどないと予想される位置であるプライマーの5'末端の隣の位置に限定されない）ことを認めた。実際に、このような構築物が更に良好にブロッキングし得る証拠があった。本発明者らは、このブロッキングは、更に十分にアニーリングされるブロッキングされていないプライマーと比べ、ブロッキングされたプライマーの不安定性が更に高いことによるものであると考えている。
【０００８】
これらの発見に従い適応される癌を検出する方法は、最も有力な治療の時間枠の可能性を提供することにより癌患者の治癒の改善を可能にする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Mandel P, Metais P. Les acides nucleiques du plasma sanguin chezl'homme. C.R.Acad.Sci.Paris 142, 241-243. 1948
【非特許文献２】Fleischhacker M, Schmidt B. (2007) Circulating nucleic acids (CNAs)and cancer--a survey. Biochim Biophys Acta 1775: 181-232
【非特許文献３】Jung K, Fleischhacker M, Rabien A. (2010) Cell-free DNA in the bloodas a solid tumor biomarker-a critical appraisal of the literature. Clin ChimActa 411: 1611-1624
【非特許文献４】Smith ZD, Meissner A. (2013) DNA methylation: roles in mammaliandevelopment. Nat Rev Genet 14: 204-220;
【非特許文献５】Gibney ER, Nolan CM. (2010) Epigenetics and gene expression.Heredity (Edinb) 105: 4-13
【非特許文献６】Suva ML, Riggi N, Bernstein BE. (2013) Epigenetic reprogramming incancer. Science 339: 1567-1570
【非特許文献７】Cottrell et al., A real-time PCR assay for DNA-methylation usingmethylation-specific blockers. Nucleic acids Res. 2004 Jan 13;32(1):e10
【非特許文献８】Rago C, Huso DL, Diehl F, Karim B, Liu G, et al. (2007) Serialassessment of human tumor burdens in mice by the analysis of circulating DNA.Cancer Res 67: 9364-9370
【発明の概要】
【００１０】
第1の態様において、本発明は、ゲノムDNAを含むサンプルにおいて高メチル化された標的DNAの有無を検出する方法に関する。
【００１１】
その第1の基本的な実施の形態では、本発明は少なくとも部分的にフラグメント化されたゲノムDNAを含むサンプル中の高メチル化標的DNAの有無を検出する方法であって、
（a）DNA内の、5位の非メチル化されたシトシンをウラシルに又はグアニンとハイブリダイズしない別の塩基に変換する工程と、
（b）メチル化非特異的プライマーオリゴヌクレオチド及びメチル化特異的に増幅をブロッキングする少なくとも1つのメチル化特異的ブロッカーを用いて、100塩基対（bp）未満の長さであり、ゲノムDNAの少なくとも3つのCpG部位を含む、変換された標的DNAの領域を増幅する工程と、
（c）工程（b）において増幅されたDNAの有無を検出する工程と、
を含み、増幅されたDNAの有無がそれぞれサンプル中の高メチル化標的DNAの有無を反映する、方法に関する。
【００１２】
その第2の基本的な実施の形態では、本発明はゲノムDNAを含むサンプル中の高メチル化標的DNAの有無を検出する方法であって、
（a）DNA内の、5位の非メチル化されたシトシンをウラシルに又はグアニンとハイブリダイズしない別の塩基に変換する工程と、
（b）メチル化非特異的プライマーオリゴヌクレオチド及びメチル化特異的に増幅をブロッキングする少なくとも1つのメチル化特異的ブロッカーを用いて、変換された標的DNAの領域を増幅する工程であって、少なくとも1つのプライマーオリゴヌクレオチドが（1）CpG部位のシトシン塩基の位置においてメチル化非特異的な不一致若しくはスペーサーを含む少なくとも1つのCpG部位及び／又は（2）SNP非特異的な不一致若しくはスペーサーを含む少なくとも1つのSNP部位と結合する、工程と、
（c）工程（b）において増幅されたDNAの有無を検出する工程と、
を含み、増幅されたDNAの有無がそれぞれサンプル中の高メチル化標的DNAの有無を反映する、方法に関する。
【００１３】
第2の態様において、本発明は、第1の態様によるゲノムDNAを含むサンプル中の高メチル化標的DNAの有無を検出する方法を含む対象の癌の有無を検出する方法であって、
上記サンプルが上記癌を有する対象において癌細胞の腫瘍DNAを含む対象由来サンプルであり、
上記癌を有する患者の癌細胞において上記標的DNAが高メチル化され、
サンプル中の高メチル化標的DNAの有無がそれぞれ対象の癌の有無の指標である、方法に関する。
【００１４】
第3の態様において、本発明は、別のプライマーオリゴヌクレオチドと合わせて、5位の非メチル化されたシトシンがウラシルに又はグアニンとハイブリダイズしない別の塩基に変換されているゲノムDNAの一本鎖から増幅産物を作製するのに好適なメチル化非特異的プライマーオリゴヌクレオチドであって、少なくとも1つのプライマーオリゴヌクレオチドがCpG部位のシトシン塩基の位置においてメチル化非特異的な不一致又はスペーサーを含む少なくとも1つのCpG部位と結合する、プライマーオリゴヌクレオチドに関する。
【００１５】
第4の態様において、本発明は、第1の態様の方法を行うのに適したキットに関する。
【００１６】
その第1の基本的な実施の形態では、本発明は、
（i）フォワードプライマーとリバースプライマーとからなるメチル化非特異的プライマーオリゴヌクレオチドの少なくとも1つの対であって、上記プライマーの対は、5位の非メチル化されたシトシンがウラシルに又はグアニンとハイブリダイズしない別の塩基に変換されているゲノムDNAの一本鎖から増幅産物を作製するのに適しており、上記ゲノムDNAが少なくとも部分的にフラグメント化され、上記増幅産物が100 bp未満の長さであり、ゲノムDNAの少なくとも3つのCpG部位を含む、プライマーオリゴヌクレオチドの少なくとも1つの対と、
（ii）メチル化特異的に増幅をブロッキングすることができる少なくとも1つのメチル化特異的ブロッカーと、
を含むキットに関する。
【００１７】
その第2の基本的な実施の形態では、本発明は、
（i）フォワードプライマーとリバースプライマーとからなるメチル化非特異的プライマーオリゴヌクレオチドの少なくとも1つの対であって、上記プライマーの対は、5位の非メチル化されたシトシンがウラシルに又はグアニンとハイブリダイズしない別の塩基に変換されているゲノムDNAの一本鎖から増幅産物を作製するのに適しており、上記増幅産物はプライマーの結合部位間の領域にゲノムDNAの少なくとも3つのCpG部位を含み、少なくとも1つのプライマーオリゴヌクレオチドが（1）CpG部位のシトシン塩基の位置においてメチル化非特異的な不一致若しくはスペーサーを含む少なくとも1つのCpG部位及び／又は（2）SNP非特異的な不一致若しくはスペーサーを含む少なくとも1つのSNP部位と結合する、プライマーオリゴヌクレオチドの少なくとも1つの対と、
（ii）メチル化特異的に増幅をブロッキングすることができる少なくとも1つのメチル化特異的ブロッカーと、
を含むキットに関する。
【００１８】
第5の態様において、本発明は、対象の癌の有無を検出するための第3の態様のメチル化非特異的プライマーオリゴヌクレオチド又は第4の態様のキットの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】好ましい標的領域のマップを示す図である。A:SHOX2、B:PTGer4、C:FOXL2。配列番号を説明する表1を参照のこと。
【図２】アッセイ例を示す図である。基準配列及びアッセイDNA配列は、構築されたGRCh38ゲノムのセンス配向内にある。アッセイ及びそれらのエレメントを中間位置でゲノム基準配列とアライメントする（genomicは両方の鎖を示す）。それにより取消し線のない鎖は、アッセイの鋳型として関連するバイサルファイト変換鎖となる。取り消されたリバース相補ゲノム鎖はアッセイと関連しないが相補性のため図示する。ゲノム基準配列の上部及び下部に、2つの得られた配列を示す：増幅のための最初の鋳型であるバイサルファイト鎖（bis.）及び増幅により合成されるまで利用不可能なそのリバース相補鎖（synth）。これらの配列のどちらが上部又は下部になるかは、構築されたゲノムの配列配向に左右される。全てのDNA一本鎖配列は、それらの配向に従い両末端に3'及び5'がアノテーションされる。命名はIUPAC塩基を使用している：YはC又はTのいずれかを意味し（CpGコンテキストのシトシンのメチル化状態の未確認量に左右される）、RはG又はAのいずれかを意味する（メチル化状態が未確認のCpG位置のシトシンの塩基リバース相補鎖）。プライマー配列を、下線の配列により示す。ブロッカー及びプローブ等の他のオリゴマーをアッセイ配列及び基準配列とアライメントして示す−リバース配列が必要な場合（アッセイのリバース鎖に一致）、灰色の文字色を加えて示す。CpGコンテキストのシトシンである、間接的に又は直接問い合わせるプローブ又はブロッカーの鎖及び／又は任意の塩基に対面する対応物は、灰色のバックグランドの太字の文字（例えば、Y又はc）として示す。頭文字を様々なコンテキスト：全てのゲノム基準配列用、バイサルファイト鋳型に対する合成鎖であるリバース相補鎖の塩基用（プライマーを除く）、及びバイサルファイト産物のDNA-メチル化測定の関連位置用に使用する。CpGコンテキスト又はSNPのシトシンのいずれかである、プライマー領域の塩基は、考えられる全ての状態に対してプライマーに不一致を導入することでPCRへの影響が除外されるが、黒のバックグランドに白抜きで強調する（例えば、Y）。CpGコンテキストの外側にあるシトシン由来のバイサルファイト鋳型鎖のチミジン（PCRにおいて、初めにウラシルに脱アミノ化され、その後チミジンに置き換えられる）をイタリックで示す（例えば、t）。
【図３】技術的サンプル（technical samples）を用いたブロッカー及びプローブでかなり同一のCpGを結合及び評価する、1プライマーの中間位置に不一致を含まないFOXL2の90 bpと、1つのプライマーの中間位置にメチル化非特異的な不一致を含むFOXL2の68 bpのリアルタイムPCRアッセイの比較を示す図である。
【図４】50 pgのメチル化DNAをスパイクしていないマーカー及びスパイクしたマーカーにおける、血漿サンプルの陰性（メチル化FOXL2を含有しない）及びわずかに陽性（約50 pgのレベルのメチル化FOXL2を含有する）を用いたブロッカー及びプローブで、1プライマーの中間位置に不一致を含まないFOXL2の90 bpと、1つのプライマーの中間位置にメチル化非特異的な不一致を含むFOXL2の68 bpとのリアルタイムPCRアッセイの比較を示す図である。
【図５】技術的サンプル（左上部）、スパイクされていない血漿及び様々なレベルでスパイクされた血漿（右上部）、並びに肺癌患者及び健常患者由来の血漿サンプル（下部）を用いた、1つのプライマーの中間位置にメチル化非特異的な不一致を含むFOXL2の68 bpの性能を示す図である。技術的サンプル及びスパイクされた血漿におけるPCRを3連行った。下部の図は、1.3 HEXシグナルのサイクル閾値（Ct）のカットオフ値を示し、Ctを決定するために、その曲線を呼び出した。このカットオフ値で、癌患者のみを評価することができ、健常患者のシグナルは閾値を下回った。
【図６】リアルタイムPCRにより、健常個体由来の血漿対照と比べた肺癌患者由来の血漿サンプルのSHOX2メチル化を、基準物質としてACTBを用いた二連の反応において評価した。肺癌患者由来の59のサンプル及び92の健常対照を比較した。AUC算出値=0.871。マークした点は95 %感度対95 %の特異度の閾値である。
【図７】リアルタイムPCRにより、健常個体由来の血漿対照と比べた肺癌患者由来の血漿サンプルのSHOX2メチル化を、別のメチル化マーカー及び基準物質としてACTBを用いた3連の反応において評価した。肺癌患者由来の48のサンプル及び100の健常対照を比較した。AUC算出値=0.893（使用した他のメチル化（methylation）マーカーとは別に評価したSHOX2）。マークした点は、95 %感度対95 %特異度の閾値である。
【図８】リアルタイムPCRにより、多様な肺疾患を有する血漿対照と比べた肺癌患者由来の血漿のSHOX2メチル化を、別のメチル化マーカー及び基準物質としてACTBを用いた3連の反応において示す図である。肺癌患者由来の50の血漿サンプル及び良性の肺疾患の個体由来の50の血漿対照を比較した。AUC算出値=0.834（使用した他のメチル化マーカーとは別に評価したSHOX2）。マークした点は95 %感度対95 %特異度の閾値である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明を下記に詳細に説明する前に、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル及び試薬は変更することができるため、本発明がこれらに限定されないことを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は特定の実施形態を説明することを目的とするものに過ぎず、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも理解されたい。他に定義のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００２１】
好ましくは、本明細書で使用される用語は、"A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPACRecommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Koelbl, H. eds. (1995),Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland)に記載のように定義される。
【００２２】
いくつかの文献が本明細書の文章全体を通して引用される。本明細書に引用される各々の文献（特許、特許出願、科学出版物、製造者の仕様書、使用説明書等の全てを含む）は、上記又は下記を問わず、その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする。本明細書中のいずれの記載も、本発明が先行発明のためにかかる開示に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるものではない。
【００２３】
下記で本発明の要素を記載する。これらの要素は特定の実施形態とともに挙げられているが、更なる実施形態を作成するのに、これらの要素をどのような方法及びどのような数でも組み合わせることができることを理解されたい。多様に記載された実施例及び好ましい実施形態は、本発明を例示的に記載された実施形態のみに限定するものとは解釈されない。本明細書は例示的に記載された実施形態と、あらゆる数の開示された及び／又は好ましい要素とを組み合わせた実施形態を支持及び包含するものであると理解されたい。さらに文脈上他に指定のない限り、本出願において記載された全ての要素のあらゆる並び替え（permutations）及び組合せが本出願の明細書により開示されていると見なされる。
【００２４】
本明細書及び添付の特許請求の範囲の全体を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む」という語は（the word "comprise", and variations such as"comprises" and "comprising"）、提示の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を含むが、任意の他の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を除外しないことを意味するものと理解される。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、数量を特定していない単数形（thesingular forms "a", "an", and "the"）は、文脈上他に明確に示されていない限り、複数の指示対象を含む。
【００２５】
本発明の態様及びその特定の実施形態
本発明は、発明の概要に記載のいくつかの態様に関する。これらの態様は、下記に記載の代替の実施形態及び好ましい実施形態を含む。
【００２６】
第1の態様において、本発明は、ゲノムDNAを含むサンプルにおいて高メチル化された標的DNAの有無を検出する方法に関する。
【００２７】
第1の態様の第1の基本的な実施形態において、本発明は、少なくとも部分的にフラグメント化されたゲノムDNAを含むサンプル中の高メチル化標的DNAの有無を検出する方法であって、
（a）DNA内の、5位の非メチル化されたシトシンをウラシルに又はグアニンとハイブリダイズしない別の塩基に変換する工程と、
（b）メチル化非特異的プライマーオリゴヌクレオチド及びメチル化特異的に増幅をブロッキングする少なくとも1つのメチル化特異的ブロッカーを用いて、100塩基対（bp）未満の長さであり、プライマーが結合しないゲノムDNAの少なくとも3つのCpG部位を含む、変換された標的DNAの領域を増幅する工程と、
（c）工程（b）において増幅されたDNAの有無を検出する工程と、
を含み、増幅されたDNAの有無がそれぞれサンプル中の高メチル化標的DNAの有無を反映する、方法に関する。
【００２８】
好ましくは、工程（b）の少なくとも1つのプライマーオリゴヌクレオチドは、（1）CpG部位のシトシン塩基の位置においてメチル化非特異的な不一致若しくはスペーサーを含む少なくとも1つのCpG部位、及び／又は（2）SNP非特異的な不一致若しくはスペーサーを含む少なくとも1つのSNP部位と結合する。
【００２９】
第1の態様の第2の基本的な実施形態において、本発明は、ゲノムDNAを含むサンプル中の高メチル化標的DNAの有無を検出するための方法であって、
（a）DNA内の、5位の非メチル化されたシトシンをウラシルに又はグアニンとハイブリダイズしない別の塩基に変換する工程と、
（b）メチル化非特異的プライマーオリゴヌクレオチド及びメチル化特異的に増幅をブロッキングする少なくとも1つのメチル化特異的ブロッカーを用いて、変換された標的DNAの領域を増幅する工程であって、上記領域はプライマーが結合しないゲノムDNAの少なくとも3つのCpG部位を含み、少なくとも1つのプライマーオリゴヌクレオチドは（1）CpG部位のシトシン塩基の位置においてメチル化非特異的な不一致若しくはスペーサーを含む少なくとも1つのCpG部位、及び／又は（2）SNP非特異的な不一致若しくはスペーサーを含む少なくとも1つのSNP部位と結合する、工程と、
（c）工程（b）において増幅されたDNAの有無を検出する工程と、
を含み、増幅されたDNAの有無がそれぞれサンプル中の高メチル化標的DNAの有無を反映する、方法に関する。
【００３０】
好ましくは、上記領域は100塩基対（bp）未満の長さである。
【００３１】
以下に、第1の態様の第1及び第2の基本的な実施形態の両方の好ましい実施形態を説明する。
【００３２】
好ましい実施形態において、上記領域は、100 bp、99 bp、98 bp、97 bp、96 bp、94 bp、93 bp、92 bp、91 bp、90 bp、89 bp、88 bp、87 bp、86 bp、85 bp、84 bp、83 bp、82 bp、81 bp、80 bp、79 bp、78 bp、77 bp、76 bp、75 bp、74 bp、73 bp、72 bp、71 bp、70 bp、69 bp、68 bp、67 bp、66 bp、65 bp、64 bp、63 bp、62 bp、61 bp、又は60 bp未満の長さ、好ましくは97 bp、92 bp、84 bp、73 bp、72 bp、69 bp、又は67 bp未満の長さである。領域の好ましい範囲は、50 bp〜99 bp、より好ましくは60bp〜99 pb、最も好ましくは60 bp若しくは66 bp〜96 bp、60 bp若しくは66 bp〜91 bp、60 bp若しくは66 bp〜83 bp、60 bp若しくは66 bp〜72 bp、60 bp若しくは66 bp〜71 bp又は60 bp若しくは66 bp〜68 bpである。特に（及び他のマーカーの一般的な長さとは別に）、領域はSHOX2に対して92 bp未満の長さ、PTGER4に対して97 bp、84 bp若しくは67 bp未満の長さ、及び／又はFOXL2に対して73 bp、72 bp、若しくは69 bp未満の長さ（対応して適用する、すなわち50 bp、好ましくは60 bp若しくは66 bp〜91 bp（SHOX2）、96 bp、83 bp、若しくは66 bp（PTGER4）、又は72 bp、71 bp若しくは68 bp（FOXL）の範囲）である。上記の長さのそれぞれの場合、上記領域は、好ましくはプライマーが結合しない、ゲノムDNAの少なくとも3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、又は15個のCpG 部位を含む。好ましくはこれらのCpG部位の少なくとも3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、又は15個（必ずしも全ての、特にスペーサー又はメチル化非特異的な不一致により結合されるCpG部位ではない）は、作製及び／又は検出可能なアンプリコンの高メチル化標的DNAではメチル化されなければならない。
【００３３】
好ましい実施形態において、1プライマー当たりの不一致及びスペーサーの総数（CpG部位及びSNP部位の両方に関連の不一致及びスペーサーを含む）は、1、2、又は3、より好ましくは1又は2、最も好ましくは1である。プライマーの一方のみ又はプライマーの両方が不一致を含むことが想定される。両方のプライマーが不一致を含む場合、一方のプライマーの不一致の数は、もう一方のプライマーの不一致の数とは独立したものである。
【００３４】
好ましい実施形態において、少なくとも1つの不一致又はスペーサー、好ましくは全ての不一致及びスペーサーは、プライマーオリゴヌクレオチドの3'末端の10個のヌクレオチド内にあり、及び／又はプライマーオリゴヌクレオチドの5'末端の5個のヌクレオチド内にはない。むしろ、少なくとも1つの不一致又はスペーサー、好ましくは全ての不一致及びスペーサーは、プライマーオリゴヌクレオチドの中間位置の3つ目又は3'末端の3つ目にあることが好ましい。
【００３５】
好ましい実施形態において、工程（b）では、上記領域のCpG部位、好ましくはブロッカーが結合するCpG部位がメチル化されない場合、メチル化特異的に増幅をブロッキングする少なくとも1つのメチル化特異的ブロッカーが標的DNAの領域の増幅をブロッキングする。したがって、高メチル化標的DNAのみが増幅される。
【００３６】
好ましい実施形態において、工程（c）では、工程（b）において増幅されたDNAの有無を、プローブ、好ましくはプローブオリゴヌクレオチドを用いて検出する。
【００３７】
好ましい実施形態において、メチル化非特異的な不一致は、CpG部位のシトシン塩基の位置（C又は変換及び続く増幅によりU/Tである）において、工程（a）から得られたDNAに対して一致するA若しくはGの代わりにそれぞれT若しくはC、又は工程（a）から得られたDNAから第1の増幅サイクルにおいて直接作製された鎖に対して一致するC若しくはTの代わりにそれぞれA若しくはGである。
【００３８】
好ましい実施形態において、上記標的DNAは、それぞれのプロモーター領域を含むゲノムヒトSHOX2、PTGER4又はFOXL2のDNA並びにその5 kb、4 kb、3 kb、2 kb又は1 kb上流及び下流内のDNAである。好ましくは、上記標的DNAはゲノムヒトSHOX2、PTGER4、又はFOXL2のDNAである。SHOX2において、標的DNAは、配列番号101による配列、より好ましくは配列番号106による配列、更により好ましくは配列番号111による配列、最も好ましくは配列番号116による配列を有することが好ましい。PTGER4において、標的DNAは、好ましくは配列番号51による配列、より好ましくは配列番号56による配列、更により好ましくは配列番号61による配列、更により好ましくは配列番号66、配列番号71、配列番号76、又は配列番号81の1つによる配列、最も好ましくは配列番号86、配列番号91、又は配列番号96の1つによる配列を有する。FOXL2において、標的DNAは、好ましくは配列番号1による配列、より好ましくは配列番号6又は配列番号11による配列、更により好ましくは配列番号16、配列番号21、配列番号26、又は配列番号31の1つによる配列、最も好ましくは配列番号36、配列番号41、又は配列番号46の1つによる配列を有する。（変換前の全て；SHOX2、PTGER4、及びFOXL2におけるこの（this）好ましい標的領域の関係を示すマップを図Xに示す）。
【００３９】
第2の態様において、本発明は、第1の態様によるゲノムDNAを含むサンプル中の高メチル化標的DNAの有無を検出する方法を含む対象の癌の有無を検出する方法であって、
上記サンプルが上記癌を有する対象において癌細胞の腫瘍DNAを含む対象由来サンプルであり、
上記癌を有する患者の癌細胞において上記標的DNAが高メチル化され、
サンプル中の高メチル化標的DNAの有無がそれぞれ対象の癌の有無の指標である、方法に関する。
【００４０】
好ましい実施形態において、癌は、以下に明記の群から選択される癌である（定義に関する章を参照されたい）。好ましくは、癌は、SHOX2、PTGER4及び／又はFOXL2関連領域が高メチル化された癌細胞を含む癌である。より好ましくは、癌は肺癌又は結腸直腸癌であり、最も好ましくは、癌は肺癌である。より詳細には、癌は好ましくはSHOX2、PTGER4、若しくはFOXL2における肺癌、又はPTGER4若しくはFOXL2、より好ましくはFOXL2における結腸直腸癌である。それぞれの場合、癌は、上記に明記の肺癌及び結腸直腸癌の任意の亜型であってよい。より好ましい実施形態において、肺癌又は結腸直腸癌の病期は任意のIII期までである。より好ましくは、癌は、肺癌において0期、IA期、IB期、IIA期、若しくはIIB期（好ましくは0期、IA期、及び／又はIB期の1つ又は複数）又は結腸直腸癌において0期、I期、IIA期、IIB期、若しくはIIC期（好ましくは0期及び／又はIA期の1つ又は複数）である。
【００４１】
好ましい実施形態において、癌の存在を示すものを、画像検査（例えば、PET、CT、MRI、X線、又は超音波）、内視鏡検査、及び／又は組織生検の顕微鏡評価を用いて確認する。
【００４２】
第2の態様に関して、本発明はまた、癌を有する対象に癌治療を勧めるための方法であって、第2の態様に従い対象の癌の有無を検出し、癌の存在が検出される場合、対象に癌治療を勧めることを含む、方法に関する。
【００４３】
第2の態様に関して、本発明はまた、癌を有する対象を治療する方法であって、第2の態様に従い対象内の癌の存在を検出し、上記に明記されるように1種又は複数種の癌治療を用いて対象を治療することを含む、方法に関する。
【００４４】
第2の態様に関して、本発明はまた、癌を有する疑いのある対象を治療する方法であって、第2の態様に従い対象内の癌の有無を検出し、癌の存在が検出される場合、上記に従いそれぞれ対象に勧め又は治療することを含む、方法に関する。
【００４５】
第3の態様において、本発明は、別のプライマーオリゴヌクレオチドと合わせて、5位の非メチル化されたシトシンがウラシルに又はグアニンとハイブリダイズしない別の塩基に変換されているゲノムDNAの一本鎖からアンプリコンを作製するのに好適なメチル化非特異的プライマーオリゴヌクレオチドであって、該少なくとも1つのプライマーオリゴヌクレオチドが（1）該CpG部位のシトシン塩基の位置においてメチル化非特異的な不一致若しくはスペーサーを含む少なくとも1つのCpG部位及び／又は（2）SNP非特異的な不一致若しくはスペーサーを含む少なくとも1つのSNP部位と結合する、プライマーオリゴヌクレオチドに関する。
【００４６】
好ましくは、プライマーオリゴヌクレオチドは15ヌクレオチド長〜30ヌクレオチド長、より好ましくは19ヌクレオチド長〜25ヌクレオチド長である。
【００４７】
好ましい実施形態において、ゲノムDNAの上記一本鎖は、それぞれのプロモーター領域を含むヒトSHOX2、PTGER4、又はFOXL2のDNA並びにその5 kb、4 kb、3 kb、2 kb、又は1 kb上流及び下流内のDNA（本明細書ではヒトSHOX2、PTGER4、又はFOXL2関連領域とも呼ばれる）である。好ましくは、該一本鎖はゲノムヒトSHOX2、PTGER4、又はFOXL2のDNA由来である。SHOX2において、ゲノムDNAの一本鎖は、好ましくは配列番号101による配列、より好ましくは配列番号106による配列、更により好ましくは配列番号111による配列、最も好ましくは配列番号116による配列（変換前）、又はそれぞれ、それらに相補的なリバース配列を有する。PTGER4において、標的DNAは好ましくは配列番号51による配列、より好ましくは配列番号56による配列、更により好ましくは配列番号61による配列、更により好ましくは配列番号66、配列番号71、配列番号76、若しくは配列番号81の1つによる配列、最も好ましくは配列番号86、配列番号91、若しくは配列番号96の1つによる配列（変換前）又は、それぞれ、それらに相補的なリバース配列を有する。FOXL2において、標的DNAは、好ましくは配列番号1による配列、より好ましくは配列番号6若しくは配列番号11による配列、更により好ましくは配列番号16、配列番号21、配列番号26、若しくは配列番号31の1つによる配列、最も好ましくは、配列番号36、配列番号41、若しくは配列番号46の1つによる配列又は、それぞれ、それらに相補的なリバース配列を有する（全て変換前；SHOX2、PTGER4、及びFOXL2のこの好ましい標的領域の関係を示すマップは図Xに示す）。
【００４８】
好ましい実施形態において、プライマーオリゴヌクレオチドは、
（a）配列番号102、配列番号103、配列番号104、若しくは配列番号105、
（b）配列番号52、配列番号53、配列番号54、若しくは配列番号55、又は、
（c）配列番号2、配列番号3、配列番号4、若しくは配列番号5、
による配列の15ヌクレオチド長〜30ヌクレオチド長のセグメントに実質的に同一の配列を有し、
この場合、実質的に同一の配列は、ゲノムDNAにおけるCpG部位のシトシン塩基の位置において少なくとも1つのメチル化非特異的な不一致又はスペーサーを含む（すなわち、それぞれの配列番号は変換されていないDNAに由来するものであり、表1を参照されたい）。
【００４９】
（a）において、プライマーオリゴヌクレオチドは配列番号（107、108、109、又は110）による配列、より好ましくは配列番号（112、113、114、又は115）による配列、最も好ましくは配列番号（117、118、119、又は120）による配列の15ヌクレオチド長〜30ヌクレオチド長のセグメントに実質的に同一である配列を有する。（b）において、プライマーオリゴヌクレオチドは、配列番号（57、58、59、又は60）による配列、より好ましくは配列番号（62、63、64、又は65）による配列、更により好ましくは配列番号（67、68、69、若しくは70）、配列番号（72、73、74、若しくは75）、配列番号（77、78、79、若しくは80）又は配列番号（82、83、84、若しくは85）による配列、最も好ましくは配列番号（87、88、89、若しくは90）、配列番号（92、93、94、若しくは95）、又は配列番号（97、98、99、若しくは100）による配列の15ヌクレオチド長〜30ヌクレオチド長のセグメントに実質的に同一な配列を有する。（c）において、プライマーオリゴヌクレオチドは、配列番号（7、8、9、若しくは10）又は配列番号（12、23、24、若しくは15）による配列、より好ましくは配列番号（17、18、19、20）、配列番号（22、23、24、若しくは25）、配列番号（27、28、29、若しくは30）又は配列番号（32、33、24、若しくは35）の1つによる配列、最も好ましくは配列番号（37、38、39、若しくは40）、配列番号（42、43、44、若しくは45）又は配列番号（47、48、49、若しくは50）の1つによる配列の15ヌクレオチド長〜30ヌクレオチド長のセグメントに実質的に同一である配列を有する（SHOX2、PTGER4、及びFOXL2のこの好ましい標的領域の関係を示すマップを図Xに示す）。
【００５０】
好ましくは、不一致は配列番号2、5、7、10、12、15、17、20、22、25、27、30、32、35、37、40、42、45、47、50、52、55、57、60、62、65、67、70、72、75、77、80、82、85、87、90、92、95、97、100、102、105、107、110、112、115、117、若しくは120における1つのCをA若しくはGで置換することによるもの、又は配列番号3、4、8、9、13、14、18、19、23、24、28、29、33、34、38、39、43、44、48、49、53、54、58、59、63、64、68、69、73、74、78、79、83、84、88、89、93、94、98、99、103、104、108、109、113、114、118、若しくは119における1つのGをT若しくはCで置換することによるもののいずれかである。
【００５１】
セグメントは19ヌクレオチド長〜25ヌクレオチド長が好ましい。
【００５２】
好ましい実施形態において、不一致及びスペーサーの総数（CpG部位及びSNPの両方に関連の不一致及びスペーサーを含む）は、1、2、又は3、より好ましくは1又は2、最も好ましくは1である。
【００５３】
好ましい実施形態において、少なくとも1つの不一致又はスペーサー、好ましくは全ての不一致及びスペーサーは、プライマーオリゴヌクレオチドの3'末端の10個のヌクレオチド内にあり、及び／又は5'末端の5個のヌクレオチド内にはない。むしろ、少なくとも1つの不一致又はスペーサー、好ましくは全ての不一致及びスペーサーは、プライマーオリゴヌクレオチドの中間位置の3つ目又は3'末端の3つ目にあることが好ましい。
【００５４】
特に好ましい実施形態において、プライマーオリゴヌクレオチドは、配列番号121若しくは122若しくはその変異体（（a）において）、配列番号140、141、144、145、148、若しくは149若しくはその変異体（（b）において））、又は配列番号126、127、130、131、135若しくは136若しくはその変異体（（c）において））による配列を有する。これに関する変異体は最大10ヌクレオチド、9ヌクレオチド、8ヌクレオチド、7ヌクレオチド、6ヌクレオチド、5ヌクレオチド、4ヌクレオチド、3ヌクレオチド、2ヌクレオチド、若しくは1ヌクレオチド、好ましくは最大5ヌクレオチド、より好ましくは最大（up to）3ヌクレオチド上流若しくは下流（それぞれの標的配列に対する）に移動し、及び／又は最大10ヌクレオチド、9ヌクレオチド、8ヌクレオチド、7ヌクレオチド、6ヌクレオチド、5ヌクレオチド、4ヌクレオチド、3ヌクレオチド、2ヌクレオチド、若しくは1ヌクレオチド、好ましくは最大5ヌクレオチド、より好ましくは最大3ヌクレオチド長い若しくは短い（それぞれの標的配列において、すなわち、それぞれの標的配列になおアニーリング中の）配列である。
【００５５】
第4の態様において、本発明は、第1の態様の方法を行うのに適したキットに関する。
【００５６】
第4の態様の第1の基本的な実施形態は、本発明は、
（i）フォワードプライマーとリバースプライマーとからなるメチル化非特異的プライマーオリゴヌクレオチドの少なくとも1つの対であって、上記プライマーの対は、5位の非メチル化されたシトシンがウラシルに又はグアニンとハイブリダイズしない別の塩基に変換されているゲノムDNAの一本鎖からアンプリコンを作製するのに適しており、上記ゲノムDNAが少なくとも部分的にフラグメント化され、上記アンプリコンが100 bp未満の長さであり、プライマーが結合しないゲノムDNAの少なくとも3つのCpG部位を含む、プライマーオリゴヌクレオチドの少なくとも1つの対と、
（ii）メチル化特異的に増幅をブロッキングすることができる少なくとも1つのメチル化特異的ブロッカーと、
を含むキットに関する。
【００５７】
好ましくは、少なくとも1つのプライマーオリゴヌクレオチドは、（1）CpG部位のシトシン塩基の位置においてメチル化非特異的な不一致若しくはスペーサーを含む少なくとも1つのCpG部位、及び／又は（2）SNP非特異的な不一致若しくはスペーサーを含む少なくとも1つのSNP部位と結合する。
【００５８】
第4の態様の第1の基本的な実施形態の好ましい実施形態において、キットは以下を含む。
（i）以下の（a）〜（c）の1つ又は複数：
（a）配列番号102による配列の15ヌクレオチド長〜30ヌクレオチド長のセグメントに同一若しくは実質的に同一である配列を含むフォワードプライマーオリゴヌクレオチドと、配列番号103による配列の15ヌクレオチド長〜30ヌクレオチド長のセグメントに同一若しくは実質的に同一である配列を含むリバースプライマーオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対A；及び／又は配列番号104による配列の15ヌクレオチド長〜30ヌクレオチド長のセグメントに同一若しくは実質的に同一である配列を含むフォワードプライマーオリゴヌクレオチドと、配列番号105による配列の15ヌクレオチド長〜30ヌクレオチド長のセグメントに同一若しくは実質的に同一である配列を含むリバースプライマーオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対B、
（b）配列番号52による配列の15ヌクレオチド長〜30ヌクレオチド長のセグメントに同一若しくは実質的に同一である配列を含むフォワードプライマーオリゴヌクレオチドと、配列番号53による配列の15ヌクレオチド長〜30ヌクレオチド長のセグメントに同一若しくは実質的に同一である配列を含むリバースプライマーオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対A；及び／又は配列番号54による配列の15ヌクレオチド長〜30ヌクレオチド長のセグメントに同一若しくは実質的に同一である配列を含むフォワードプライマーオリゴヌクレオチドと、配列番号55による配列の15ヌクレオチド長〜30ヌクレオチド長のセグメントに同一若しくは実質的に同一である配列を含むリバースプライマーオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対B、及び／又は、
（c）配列番号2による配列の15ヌクレオチド長〜30ヌクレオチド長のセグメントに同一若しくは実質的に同一である配列を含むフォワードプライマーオリゴヌクレオチドと、配列番号3による配列の15ヌクレオチド長〜30ヌクレオチド長のセグメントに同一若しくは実質的に同一である配列を含むリバースプライマーオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対A；及び／又は配列番号4による配列の15ヌクレオチド長〜30ヌクレオチド長のセグメントに同一若しくは実質的に同一である配列を含むフォワードプライマーオリゴヌクレオチドと、配列番号5による配列の15ヌクレオチド長〜30ヌクレオチド長のセグメントに同一若しくは実質的に同一である配列を含むリバースプライマーオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対B、
（この場合、実質的に同一な配列は、少なくとも1つのメチル化非特異的な不一致又はスペーサーを含み、フォワードプライマーA又はリバースプライマーBの少なくとも1つのメチル化非特異的な不一致は、CをA又はGで置換することによるものであり、フォワードプライマーB又はリバースプライマーAにおいて、該不一致は、GをT又はCで置換することによるものであり、メチル化非特異的スペーサーは、フォワードプライマーA又はリバースプライマーBのCに代わるスペーサー、及びフォワードプライマーB又はリバースプライマーAのGに代わるスペーサーであり、また、
各場合、（a）配列番号101、（b）配列番号51、及び（c）配列番号1による鋳型DNAを含むプライマー対A又はBを使用して作製可能なアンプリコンが100塩基対（bp）未満の長さである）、
（ii）以下の（a）〜（c）の1つ又は複数のそれぞれ：
（a）少なくとも1つのブロッカーオリゴヌクレオチドが配列番号102による配列のセグメントと同一の配列を有し、上記セグメントにおいて全てのCがTで置換され、若しくは少なくとも1つのブロッカーオリゴヌクレオチドが配列番号103による配列のセグメントと同一の配列を有し、上記セグメントにおいて全てのGがAで置換される、プライマー対Aのための20ヌクレオチド長〜40ヌクレオチド長を含む少なくとも1つのブロッカーオリゴヌクレオチド、若しくは少なくとも1つのブロッカーオリゴヌクレオチドが配列番号104による配列のセグメントと同一の配列を有し、上記のセグメントにおいて全てのGがAで置換され、若しくは少なくとも1つのブロッカーオリゴヌクレオチドが配列番号105による配列のセグメントと同一の配列を有し、上記のセグメントにおいて全てのCがTで置換される、プライマー対Bのための20ヌクレオチド長〜40ヌクレオチド長を含む少なくとも1つのブロッカーオリゴヌクレオチド、
（b）少なくとも1つのブロッカーオリゴヌクレオチドが配列番号52による配列のセグメントと同一の配列を有し、上記セグメントにおいて全てのCがTで置換され、若しくは少なくとも1つのブロッカーオリゴヌクレオチドが配列番号53による配列のセグメントと同一の配列を有し、上記セグメントにおいて全てのGがAで置換される、プライマー対Aのための20ヌクレオチド長〜40ヌクレオチド長を含む少なくとも1つのブロッカーオリゴヌクレオチド、若しくは少なくとも1つのブロッカーオリゴヌクレオチドが配列番号54による配列のセグメントと同一の配列を有し、上記セグメントにおいて全てのGがAで置換され、若しくは少なくとも1つのブロッカーオリゴヌクレオチドが配列番号55による配列のセグメントと同一の配列を有し、上記セグメントにおいて全てのCがTで置換される、プライマー対Bのための20ヌクレオチド長〜40ヌクレオチド長を含む少なくとも1つのブロッカーオリゴヌクレオチド、及び／又は、
（c）少なくとも1つのブロッカーオリゴヌクレオチドが配列番号2による配列のセグメントと同一の配列を有し、上記セグメントにおいて全てのCがTで置換され、若しくは少なくとも1つのブロッカーオリゴヌクレオチドが配列番号3による配列のセグメントと同一の配列を有し、上記セグメントにおいて全てのGがAで置換される、プライマー対Aのための20ヌクレオチド長〜40ヌクレオチド長を含む少なくとも1つのブロッカーオリゴヌクレオチド、若しくは少なくとも1つのブロッカーオリゴヌクレオチドが配列番号4による配列のセグメントと同一の配列を有し、上記セグメントにおいて全てのGがAで置換され、若しくは少なくとも1つのブロッカーオリゴヌクレオチドが配列番号5による配列のセグメントと同一の配列を有し、上記セグメントにおいて全てのCがTで置換される、プライマー対Bのための20ヌクレオチド長〜40ヌクレオチド長を含む少なくとも1つのブロッカーオリゴヌクレオチド、
（この場合、ブロッカーオリゴヌクレオチドの上記セグメントのいずれかが、少なくとも部分的に、プライマー対A又はBのフォワードプライマー又はリバースプライマーの5'末端の5'→3'方向の下流にあり、プライマー配列（上記ブロッカーオリゴヌクレオチド置換と関連なく）と重複し又は重複せず（好ましくは重複し）、非重複セグメントは、プライマー対の向かい合うプライマーのリバース相補配列と重複せず、又は実質的に重複しない（上記ブロッカーオリゴヌクレオチド置換と関連なく）（「実質的に重複しない」は、最大5ヌクレオチド、4ヌクレオチド、3ヌクレオチド、2ヌクレオチド、又は1ヌクレオチドと重複し得ることを意味するが、この重複が上記の向かい合うプライマー用の鋳型として作用するには、すなわち、向かい合うプライマーがブロッカーに結合し、ポリメラーゼがプライマーを伸長するのに十分な大きさではない））、並びに場合により、
（iii）以下（a）〜（c）の1つ又は複数のそれぞれ：
（a）配列番号102若しくは103による配列の10ヌクレオチド長〜25ヌクレオチド長のセグメントに同一である配列を含むプローブオリゴヌクレオチドA、及び／又は配列番号104若しくは105による配列の10ヌクレオチド長〜25ヌクレオチド長のセグメントに同一である配列を含むプローブオリゴヌクレオチドB、
（b）配列番号52若しくは53による配列の10ヌクレオチド長〜25ヌクレオチド長のセグメントに同一である配列を含むプローブオリゴヌクレオチドA、及び／又は配列番号54若しくは55による配列の10ヌクレオチド長〜25ヌクレオチド長のセグメントに同一である配列を含むプローブオリゴヌクレオチドB、及び／又は、
（c）配列番号2若しくは3による配列の10ヌクレオチド長〜25ヌクレオチド長のセグメントに同一である配列を含むプローブオリゴヌクレオチドA、及び／又は配列番号4若しくは5による配列の10ヌクレオチド長〜25ヌクレオチド長のセグメントに同一である配列を含むプローブオリゴヌクレオチドB、
（この場合、プローブオリゴヌクレオチドはメチル化特異的であり、（i）に従い作製可能なアンプリコンの一本鎖にアニーリングし、上記プライマーオリゴヌクレオチドはどれもアニーリングしない）。
【００５９】
好ましくは、少なくとも1つのプライマーオリゴヌクレオチド、より好ましくはプライマー対A及び／又はBのそれぞれの少なくとも1つのプライマーオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つのメチル化非特異的な不一致又はスペーサーを含む。
【００６０】
第4の態様の第2の基本的な実施形態では、本発明は、
（i）フォワードプライマーとリバースプライマーとからなるメチル化非特異的プライマーオリゴヌクレオチドの少なくとも1つの対であって、上記プライマーの対は、5位の非メチル化されたシトシンがウラシルに又はグアニンとハイブリダイズしない別の塩基に変換されているゲノムDNAの一本鎖からアンプリコンを作製するのに適しており、上記アンプリコンはプライマーが結合しないゲノムDNAの少なくとも3つのCpG部位を含み、少なくとも1つのプライマーオリゴヌクレオチドが（1）CpG部位のシトシン塩基の位置においてメチル化非特異的な不一致若しくはスペーサーを含む少なくとも1つのCpG部位及び／又は（2）SNP非特異的な不一致若しくはスペーサーを含む少なくとも1つのSNP部位と結合する、プライマーオリゴヌクレオチドの少なくとも1つの対と、
（ii）メチル化特異的に増幅をブロッキングすることができる少なくとも1つのメチル化特異的ブロッカーと、
を含むキットに関する。
【００６１】
好ましくは、上記アンプリコンは100 bp未満の長さである。
【００６２】
第4の態様の第2の基本的な実施形態の好ましい実施形態において、キットは以下を含む。
（i）以下の（a）〜（c）の1つ又は複数：
（a）配列番号102による配列の15ヌクレオチド長〜30ヌクレオチド長のセグメントに実質的に同一である配列を含むフォワードプライマーオリゴヌクレオチドと、配列番号103による配列の15ヌクレオチド長〜30ヌクレオチド長のセグメントに実質的に同一である配列を含むリバースプライマーオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対A；及び／又は配列番号104による配列の15ヌクレオチド長〜30ヌクレオチド長のセグメントに実質的に同一である配列を含むフォワードプライマーオリゴヌクレオチドと、配列番号105による配列の15ヌクレオチド長〜30ヌクレオチド長のセグメントに実質的に同一である配列を含むリバースプライマーオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対B、
（b）配列番号52による配列の15ヌクレオチド長〜30ヌクレオチド長のセグメントに実質的に同一である配列を含むフォワードプライマーオリゴヌクレオチドと、配列番号53による配列の15ヌクレオチド長〜30ヌクレオチド長のセグメントに実質的に同一である配列を含むリバースプライマーオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対A；及び／又は配列番号54による配列の15ヌクレオチド長〜30ヌクレオチド長のセグメントに実質的に同一である配列を含むフォワードプライマーオリゴヌクレオチドと、配列番号55による配列の15ヌクレオチド長〜30ヌクレオチド長のセグメントに実質的に同一である配列を含むリバースプライマーオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対B、及び／又は、
（c）配列番号2による配列の15ヌクレオチド長〜30ヌクレオチド長のセグメントに実質的に同一である配列を含むフォワードプライマーオリゴヌクレオチドと、配列番号3による配列の15ヌクレオチド長〜30ヌクレオチド長のセグメントに実質的に同一である配列を含むリバースプライマーオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対A；及び／又は配列番号4による配列の15ヌクレオチド長〜30ヌクレオチド長のセグメントに実質的に同一である配列を含むフォワードプライマーオリゴヌクレオチドと、配列番号5による配列の15ヌクレオチド長〜30ヌクレオチド長のセグメントに実質的に同一である配列を含むリバースプライマーオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対B、
（この場合、実質的に同一な配列は、少なくとも1つのメチル化非特異的な不一致又はスペーサーを含み、フォワードプライマーA又はリバースプライマーBの少なくとも1つのメチル化非特異的な不一致は、CをA又はGで置換することによるものであり、フォワードプライマーB又はリバースプライマーAにおいて、該不一致は、GをT又はCで置換することによるものであり、メチル化非特異的スペーサーは、フォワードプライマーA又はリバースプライマーBのCに代わるスペーサー、及びフォワードプライマーB又はリバースプライマーAのGに代わるスペーサーである）、
（ii）以下の（a）〜（c）の1つ又は複数のそれぞれ：
（a）少なくとも1つのブロッカーオリゴヌクレオチドが配列番号102による配列のセグメントと同一の配列を有し、上記セグメントにおいて全てのCがTで置換され、若しくは少なくとも1つのブロッカーオリゴヌクレオチドが配列番号103による配列のセグメントと同一の配列を有し、上記セグメントにおいて全てのGがAで置換される、プライマー対Aのための20ヌクレオチド長〜40ヌクレオチド長を含む少なくとも1つのブロッカーオリゴヌクレオチド、若しくは少なくとも1つのブロッカーオリゴヌクレオチドが配列番号104による配列のセグメントと同一の配列を有し、上記のセグメントにおいて全てのGがAで置換され、若しくは少なくとも1つのブロッカーオリゴヌクレオチドが配列番号105による配列のセグメントと同一の配列を有し、上記のセグメントにおいて全てのCがTで置換される、プライマー対Bのための20ヌクレオチド長〜40ヌクレオチド長を含む少なくとも1つのブロッカーオリゴヌクレオチド、
（b）少なくとも1つのブロッカーオリゴヌクレオチドが配列番号52による配列のセグメントと同一の配列を有し、上記セグメントにおいて全てのCがTで置換され、若しくは少なくとも1つのブロッカーオリゴヌクレオチドが配列番号53による配列のセグメントと同一の配列を有し、上記セグメントにおいて全てのGがAで置換される、プライマー対Aのための20ヌクレオチド長〜40ヌクレオチド長を含む少なくとも1つのブロッカーオリゴヌクレオチド、若しくは少なくとも1つのブロッカーオリゴヌクレオチドが配列番号54による配列のセグメントと同一の配列を有し、上記セグメントにおいて全てのGがAで置換され、若しくは少なくとも1つのブロッカーオリゴヌクレオチドが配列番号55による配列のセグメントと同一の配列を有し、上記セグメントにおいて全てのCがTで置換される、プライマー対Bのための20ヌクレオチド長〜40ヌクレオチド長を含む少なくとも1つのブロッカーオリゴヌクレオチド、及び／又は、
（c）少なくとも1つのブロッカーオリゴヌクレオチドが配列番号2による配列のセグメントと同一の配列を有し、上記セグメントにおいて全てのCがTで置換され、若しくは少なくとも1つのブロッカーオリゴヌクレオチドが配列番号3による配列のセグメントと同一の配列を有し、上記セグメントにおいて全てのGがAで置換される、プライマー対Aのための20ヌクレオチド長〜40ヌクレオチド長を含む少なくとも1つのブロッカーオリゴヌクレオチド、若しくは少なくとも1つのブロッカーオリゴヌクレオチドが配列番号4による配列のセグメントと同一の配列を有し、上記セグメントにおいて全てのGがAで置換され、若しくは少なくとも1つのブロッカーオリゴヌクレオチドが配列番号5による配列のセグメントと同一の配列を有し、上記セグメントにおいて全てのCがTで置換される、プライマー対Bのための20ヌクレオチド長〜40ヌクレオチド長を含む少なくとも1つのブロッカーオリゴヌクレオチド、
（この場合、ブロッカーオリゴヌクレオチドの上記セグメントのいずれかが、少なくとも部分的に、プライマー対A又はBのフォワードプライマー又はリバースプライマーの5'末端の5'→3'方向の下流にあり、プライマー配列（上記ブロッカーオリゴヌクレオチド置換と関連なく）と重複し又は重複せず（好ましくは重複し）、非重複セグメントは、プライマー対の向かい合うプライマーのリバース相補配列と重複せず、又は実質的に重複しない（上記ブロッカーオリゴヌクレオチド置換と関連なく）（「実質的に重複しない」は、最大5ヌクレオチド、4ヌクレオチド、3ヌクレオチド、2ヌクレオチド、又は1ヌクレオチドと重複し得ることを意味するが、この重複が上記の向かい合うプライマー用の鋳型として作用するには、すなわち、向かい合うプライマーがブロッカーに結合し、ポリメラーゼがプライマーを伸長するのに十分な大きさではない））、並びに場合により、
（iii）以下（a）〜（c）の1つ又は複数のそれぞれ：
（a）配列番号102若しくは103による配列の10ヌクレオチド長〜25ヌクレオチド長のセグメントに同一である配列を含むプローブオリゴヌクレオチドA、及び／又は配列番号104若しくは105による配列の10ヌクレオチド長〜25ヌクレオチド長のセグメントに同一である配列を含むプローブオリゴヌクレオチドB、
（b）配列番号52若しくは53による配列の10ヌクレオチド長〜25ヌクレオチド長のセグメントに同一である配列を含むプローブオリゴヌクレオチドA、及び／又は配列番号54若しくは55による配列の10ヌクレオチド長〜25ヌクレオチド長のセグメントに同一である配列を含むプローブオリゴヌクレオチドB、及び／又は、
（c）配列番号2若しくは3による配列の10ヌクレオチド長〜25ヌクレオチド長のセグメントに同一である配列を含むプローブオリゴヌクレオチドA、及び／又は配列番号4若しくは5による配列の10ヌクレオチド長〜25ヌクレオチド長のセグメントに同一である配列を含むプローブオリゴヌクレオチドB、
（この場合、プローブオリゴヌクレオチドはメチル化特異的であり、（i）に従い作製可能なアンプリコンの一本鎖にアニーリングし、上記プライマーオリゴヌクレオチドはどれもアニーリングしない）。
【００６３】
好ましくは、各場合、（a）配列番号101、（b）配列番号51、及び（c）配列番号1による鋳型DNAを含むプライマー対A又はBを用いて作製可能なアンプリコンは100塩基対（bp）未満の長さである。
【００６４】
以下に、第1の態様の第1及び第2の両方の基本的な実施形態の好ましい実施形態を説明する。
【００６５】
好ましい実施形態において、ゲノムDNAの上記一本鎖は、各プロモーター領域を含むヒトSHOX2、PTGER4、又はFOXL2のDNA並びにその5 kb、4 kb、3 kb、2 kb、又は1 kb上流及び下流内のDNAのものである。該一本鎖は、ゲノムヒトSHOX2、PTGER4、又はFOXL2のDNA由来であることが好ましい。SHOX2において、ゲノムDNAの一本鎖は、好ましくは配列番号101による配列、より好ましくは配列番号106による配列、更により好ましくは配列番号111による配列、最も好ましくは配列番号116による配列、又はそれぞれ、それらに相補的なリバース配列を有する。PTGER4において、ゲノムDNAの一本鎖は、好ましくは配列番号51による配列、より好ましくは配列番号56による配列、更により好ましくは配列番号61による配列、更により好ましくは配列番号66、71、76、若しくは81の1つによる配列、最も好ましくは配列番号86、91、若しくは96の1つによる配列、又はそれぞれ、それらに相補的なリバース配列を有する。FOXL2において、ゲノムDNAの一本鎖は、好ましくは配列番号1による配列、より好ましくは配列番号6若しくは配列番号11による配列、更により好ましくは配列番号16、21、26、若しくは31の1つによる配列、最も好ましくは配列番号36、41、若しくは46の1つによる配列、又はそれぞれ、それらに相補的なリバース配列を有する（全て変換前；SHOX2、PTGER4、及びFOXL2のこの好ましい標的領域の関係を示すマップを図Xに示す）。
【００６６】
好ましい実施形態において、上記アンプリコンは、100 bp、99 bp、98 bp、97 bp、96 bp、94 bp、93 bp、92 bp、91 bp、90 bp、89 bp、88 bp、87 bp、86 bp、85 bp、84 bp、83 bp、82 bp、81 bp、80 bp、79 bp、78 bp、77 bp、76 bp、75 bp、74 bp、73 bp、72 bp、71 bp、70 bp、69 bp、68 bp、67 bp、66 bp、65 bp、64 bp、63 bp、62 bp、61 bp、又は60 bp未満の長さ、好ましくは97 bp、92 bp、84 bp、73 bp、72 bp、69 bp、又は67 bp未満の長さである。領域の好ましい範囲は、50 bp〜99 bp、より好ましくは60bp〜99 bp、最も好ましくは60 bp若しくは66 bp〜96 bp、60 bp若しくは66 bp〜91 bp、60 bp若しくは66 bp〜83 bp、60 bp若しくは66 bp〜72 bp、60 bp若しくは66 bp〜71 bp、又は60 bp若しくは66 bp〜68 bpである。特に（他のマーカーの一般的な長さとは別に）、領域はSHOX2において92 bp未満の長さであり、PTGER4において97 bp、84bp又は67 bp未満の長さであり、及び／又はFOXL2において73 bp、72 bp又は69 bp未満の長さである（対応して適用される範囲、すなわち、50 bp、好ましくは60 bp若しくは66 bp〜91 bp（SHOX2）、96 bp、83 bp若しくは66 bpまで（PTGER4）、又は72 bp、71 bp若しくは68 bpまで（FOXL））。上記の長さのそれぞれにおいて、上記のアンプリコンは、好ましくはプライマーが結合しない、ゲノムDNAの少なくとも3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、又は15個のCpG部位を含む。好ましくは、これらのCpG部位の少なくとも3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、又は15個（必ずしも全ての、特にスペーサー又はメチル化非特異的な不一致が結合するCpG部位ではない）は、作製されるアンプリコンの高メチル化された標的DNAではメチル化されなければならない。
【００６７】
好ましい実施形態において、1プライマー当たりの不一致及びスペーサーの総数（CpG部位及びSNPの両方に関連の不一致及びスペーサーを含む）は、1、2、又は3、より好ましくは1又は2、最も好ましくは1である。プライマーの一方のみ又はプライマーの両方は不一致を含むことが想定される。両方のプライマーが不一致を含む場合、一方のプライマーの不一致の数は、もう一方のプライマーの不一致の数とは独立したものである。
【００６８】
好ましい実施形態において、少なくとも1つの不一致又はスペーサー、好ましくは全ての不一致及びスペーサーは、3'末端の10個のヌクレオチド内にあり、及び／又は（and/or）プライマーオリゴヌクレオチドの5'末端の5個のヌクレオチド内にはない。むしろ、少なくとも1つの不一致又はスペーサー、好ましくは全ての不一致及びスペーサーは、プライマーオリゴヌクレオチドの中間位置の3番目又は3'末端の3番目にあることが好ましい。
【００６９】
好ましい実施形態において、キットは、（iii）少なくとも1つのメチル化特異的プローブ、好ましくはプローブオリゴヌクレオチドを更に含む。
【００７０】
（i）、（ii）、及び（iii）の（a）において、セグメントは好ましくは配列番号（それぞれ107、108、109、又は110）による配列、より好ましくは配列番号（それぞれ112、113、114、又は115）それぞれによる配列、最も好ましくは配列番号（それぞれ117、118、119、又は120）による配列のものである。
【００７１】
（i）、（ii）、及び（iii）の（b）において、セグメントは好ましくは配列番号（それぞれ57、58、59、又は60）による配列、より好ましくは配列番号（それぞれ62、63、64、又は65）による配列、更により好ましくは配列番号（それぞれ67、68、69、若しくは70）、配列番号（それぞれ72、73、74、若しくは75）、配列番号（それぞれ77、78、79、若しくは80）又は配列番号（それぞれ82、83、84、若しくは85）の1つによる配列、最も好ましくは配列番号（それぞれ87、88、89、若しくは90）、配列番号（それぞれ92、93、94、若しくは95）又は配列番号（それぞれ97、98、99、若しくは100）の1つによる配列である。
【００７２】
（i）、（ii）、及び（iii）の（c）において、セグメントは好ましくは配列番号（それぞれ7、8、9、若しくは10）又は配列番号（それぞれ12、23、24、若しくは15）による配列、より好ましくは配列番号（それぞれ17、18、19、20）、配列番号（それぞれ22、23、24、若しくは25）、配列番号（それぞれ27、28、29、若しくは30）又は配列番号（それぞれ32、33、24、若しくは35）の1つによる配列、最も好ましくは配列番号（それぞれ37、38、39、若しくは40）、配列番号（それぞれ42、43、44、若しくは45）又は配列番号（それぞれ47、48、49、若しくは50）の1つによる配列（SHOX2、PTGER4、及びFOXL2のこの好ましい標的領域の関係を示すマップを図Xに示す）。
【００７３】
好ましい実施形態において、キットは、非メチル化されたシトシンをウラシルに、又はハイブリダイゼーション特性においてシトシンと類似性のない検出可能な別の塩基に変換することが可能な試薬、及び／又はPCR反応を行うための緩衝剤、ヌクレオチド、及び／又はポリメラーゼ等の試薬を更に含む。
【００７４】
特に好ましい実施形態において、キットは以下を含む。
（SHOX2標的用）配列番号121による配列又はその変異体を含むフォワードプライマー、配列番号122による配列又はその変異体を含むリバースプライマー、配列番号123及び124から選択される配列及びそれらの変異体を含む1つ又は2つのブロッカー、並びに場合により、配列番号122による配列、そのリバース相補鎖、又はそのいずれか1つの変異体を含むプローブ、
（FOXL2標的用）配列番号126による配列又はその変異体を含むフォワードプライマー、配列番号127による配列又はその変異体を含むリバースプライマー、配列番号128による配列又はその変異体を含むブロッカー、並びに場合により、配列番号129による配列、そのリバース相補鎖、又はそのいずれか1つの変異体を含むプローブ、
（FOXL2標的用）配列番号130による配列又はその変異体を含むフォワードプライマー、配列番号131による配列又はその変異体を含むリバースプライマー、配列番号132及び133から選択される配列及びその変異体を含む1つ又は2つのブロッカー、並びに場合により配列番号134による配列、そのリバース相補鎖、又はいずれかの1つの変異体を含むプローブ、
（FOXL2標的用）配列番号135による配列又はその変異体を含むフォワードプライマー、配列番号136による配列又はその変異体を含むリバースプライマー、配列番号137及び138から選択される配列及びその変異体を含む1つ又は2つのブロッカー、並びに場合により配列番号139による配列、そのリバース相補鎖、又はそのいずれか1つの変異体を含むプローブ、
（PTGER4標的用）配列番号140による配列又はその変異体を含むフォワードプライマー、配列番号141による配列又はその変異体を含むリバースプライマー、配列番号142による配列又はその変異体を含むブロッカー、並びに場合により配列番号143による配列、そのリバース相補鎖、又はいずれか1つの変異体を含むプローブ、
（PTGER4標的用）配列番号144による配列又はその変異体を含むフォワードプライマー、配列番号145による配列又はその変異体を含むリバースプライマー、配列番号146による配列又はその変異体を含むブロッカー、並びに場合により配列番号147による配列、そのリバース相補鎖、又はいずれか1つの変異体を含むプローブ、及び／又は、
（PTGER4標的用）配列番号148による配列又はその変異体を含むフォワードプライマー、配列番号149による配列又はその変異体を含むリバースプライマー、配列番号150による配列又はその変異体を含むブロッカー、並びに場合により配列番号151による配列、そのリバース相補鎖、又はいずれか1つの変異体を含むプローブ。
【００７５】
これに関する変異体は、最大10ヌクレオチド、9ヌクレオチド、8ヌクレオチド、7ヌクレオチド、6ヌクレオチド、5ヌクレオチド、4ヌクレオチド、3ヌクレオチド、2ヌクレオチド、若しくは1ヌクレオチド、好ましくは最大5ヌクレオチド、より好ましくは最大3ヌクレオチド上流若しくは下流に（それぞれの標的配列に対して）移動し、及び／又は最大10ヌクレオチド、9ヌクレオチド、8ヌクレオチド、7ヌクレオチド、6ヌクレオチド、5ヌクレオチド、4ヌクレオチド、3ヌクレオチド、2ヌクレオチド、若しくは1ヌクレオチド、好ましくは最大5ヌクレオチド、より好ましくは最大3ヌクレオチドの長い若しくは短い（それぞれの標的配列において、すなわち、それぞれの標的配列になおアニーリング中の）ものである。
【００７６】
第5の態様において、本発明は、対象の癌の有無を検出するための第3の態様のメチル化非特異的プライマーオリゴヌクレオチド又は第4の態様のキットに関する。
【００７７】
特に、本発明の第1又は第2の態様の方法に使用される。
【００７８】
本発明の定義及び更なる実施形態
本明細書では種々の用語及び語句が使用され、これらは以下に定義されるような特定の意味を有する。好ましい意味は、本明細書に記載の本発明の態様の好ましい実施形態として解釈される。それゆえ、これら及び以下に記載の更なる実施形態を本発明の態様の任意の実施形態、特に上記の発明の態様の任意の好ましい実施形態と組み合わせることができる。
【００７９】
本明細書において使用される場合、「検出する」という用語は、高メチル化標的DNAの有無を少なくとも定性的に分析することを指す。高メチル化は、標的DNAの1個以上、2個以上、3個以上、4個以上、5個以上、6個以上、10個以上、15個以上、又は30個以上のCpG部位にて決定することが好ましい。通常、癌において分析されるCpG部位は、隣接するDNAのCpG部位もメチル化されるといった共メチル化され、隣接するDNAのCpG部位を加えて又は代わりに分析することができる。「少なくとも定性的に」は、含まれているのであれば、高メチル化標的DNAの定量的決定も行うことができることを意味する。このような「量を決定すること」は、本明細書に記載のように行われることができる。一般に、定量化は、例えば、サンプル1 mL当たりのpg又は1 mL当たりのng、サンプル1 mL当たりのコピー数、PCRサイクル数等において絶対的なものであってよく、又は例えば対照サンプルより10倍高い、又は基準対照のメチル化の割合というように相対的なものであってよい。サンプル中の高メチル化標的DNAの量を決定することは、サンプル中の総DNA量に対して正規化することを含むことができる。試験サンプル中の全DNAの量に対して正規化することは、好ましくは高メチル化標的DNAの量と、基準部位のゲノムDNAの量との比を算出することを含む。基準部位は、任意のゲノム部位であってよく、遺伝子である必要はない。例としては、短鎖のDNA反復配列を含む部位である。基準遺伝子の場合、遺伝子はハウスキーピング遺伝子であることが好ましい。
【００８０】
ハウスキーピング遺伝子は、基本的な細胞機能の維持に関与し、又はそれに必要とされる、恒常的に発現する遺伝子であり、正常及び病理生理学的状態下における生体の全ての細胞に発現するため、ゲノムが染色体の不安定性及び欠失により部分的に影響される場合であっても利用可能である予測される。ヒトのみにおいて、2000を超えるハウスキーピング遺伝子があり（引用することにより本明細書の一部をなす、Changet al., PLoS ONE 6(7): e22859. doi:10.1371/journal.pone.0022859を参照されたい）、これらを全て本発明において使用することができる。非限定的な例は、ヒト酸性リボゾームタンパク質（HuPO）、β-アクチン（BA）、シクロフィリン（CYC）、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）、β2-ミクログロブリン（B2M）、β-グルクロニダーゼ（GUS）、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）、転写因子IID TATA結合タンパク質（TBP）、トランスフェリン受容体（TfR）、伸長因子-1-α（EF-1-α）、転移リンパ節51（MLN51）、及びユビキチン結合酵素（UbcH5B）である。
【００８１】
サンプル中の高メチル化標的DNAの量は、実質的に完全なメチル化ゲノムDNAを含む基準サンプルの高メチル化標的DNAの量に対する高メチル化標的DNAの割合である。高メチル化標的DNAの割合を決定することは、基準サンプルの同じ標的の高メチル化DNAの量を決定すること、好ましくは基準部位のメチル化非特異的な測定を用いた全メチル化DNAのサンプル間の正規化、及び試験サンプル由来の比を基準サンプル由来の対応する比で除算することを含むことが好ましい。割合を、百分率として、又は以下に定義した除算の結果に100を乗算することによるPMRとして表すことができる。
【００８２】
代替的に、特に高メチル化標的DNAの量をリアルタイムPCRにより決定する場合、標的及び基準部位の、好ましくは対象のサンプル及び基準（ref）サンプル由来のハウスキーピング遺伝子（hkg）（少なくとも標的遺伝子座でのメチル化）のサイクル閾値（Ct）を用いて以下のように算出することができる：量=100×x-（（Cttarget-Cthkg）-（Cttargetref-Cthkgref））、式中、xは推定PCR効率であり、1〜3が好ましく、2がより好ましい。
【００８３】
「基準サンプル」という用語は、既知のDNA濃度及び既知の標的メチル化状態の対照DNAを含むサンプルを指す。対照DNAは人工的にメチル化された、好ましくは実質的に完全にメチル化されたヒトDNAが好ましいが必然ではない。好ましい実施形態において、人工的なメチル化は、DNAメチルトランスフェラーゼを用いることにより実現される。DNA自体は、例えば細胞株DNA、プラスミドDNA、人工DNA、又はそれらの組合せ／混合物であってよい。
【００８４】
標的遺伝子座でのメチル化DNAは、1つ又は複数の細胞株由来の細胞株DNA、好ましくは十分に特徴付けられたもの、及びゲノム標的メチル化状態が既知のもの、及び／又は実質的に完全にメチル化されていることが知られているものが好ましい。実質的に完全にメチル化されたゲノムDNAはDNA、特にメチル化された全て又は実質的に全てのCpG部位を有するゲノムDNAが好ましい。これにおいて「実質的に全て」は、少なくとも95 %、96 %、97 %、98 %、99 %、99.5 %、又は99.9 %を意味する。好ましい実施形態において、全て又は実質的に全てのCpG部位のメチル化は、全て又は実質的に全てのCpG部位のメチル化となるように、CpGメチルトランスフェラーゼを用いてDNAを処理することにより実現される。
【００８５】
高メチル化標的DNAの量をPMR値として表すことが好ましい。「PMR」、つまり「メチル化基準物質の割合」、又は「完全メチル化基準物質の割合」という用語は、メチル化の程度を説明し、通常、遺伝子と基準物質との比を、遺伝子と完全なメチル化基準物質との比（例えばCpGメチルトランスフェラーゼ、正常な非メチル化基準物質のSssI処理等により得られる）で除算し、100を乗算することにより算出される。PMRの決定は、引用することにより本明細書の一部をなすOgino et al.（JMD May 2006, Vol. 8, No. 2）において詳述されている。代替的にPMRを、shox2及び基準部位の、例えば患者サンプル及び基準（ref）サンプル（標的遺伝子座でのメチル化）由来のハウスキーピング遺伝子（hkg）のリアルタイムPCRサイクル閾値（Ct）を用いる□□Ct法を用いて以下のように算出することができる：□□Ct=（（Cttarget-Cthkg）-（Cttargetref-Cthkgref））;PMR=100×x-□□Ct、式中、xは推定PCR効率である。一般に、PCR効率は1〜3であることが推測され、2又はほぼ2であることが好ましい。PMRは少なくとも3回、より好ましくは4回〜8回、最も好ましくは6回の実験反復又は平行実験に対するPMR中央値が好ましい。
【００８６】
本明細書において使用される場合、「高メチル化」という用語は、「メチル化」又は「DNAメチル化」に関連し、メチル基をシトシン又はアデニンDNAヌクレオチドに付加することを含む生化学プロセスを指す。シトシンの5位、特にプロモーター領域のDNAメチル化は、遺伝子発現を減少させる作用がある可能性があり、試験した全ての脊椎動物に見つかっている。成体の非配偶子細胞において、DNAメチル化は通例、CpG部位において生じる。本明細書において使用される場合、「CpG部位」又は「CpGジヌクレオチド」という用語は、シトシンヌクレオチドが、塩基の直鎖状の配列の長さに沿って、配列内のグアニンヌクレオチドに隣接して存在するDNA領域を指す。「CpG」は「C-リン酸-G」の省略形であり、すなわち、シトシン及びグアニンがたった1つのリン酸により分離し、リン酸がDNA内の任意の2つのヌクレオシドを結合させる。「CpG」の表記を使用して、この直鎖状の配列とシトシン及びグアニンのCG塩基対合とを区別する。CpGジヌクレオチドのシトシンをメチル化して、5-メチルシトシンを形成することができる。「CpG部位」又は「ゲノムDNAのCpG部位」は、DNAの前の（非メチル化）CpG部位の部位に対しても使用され、この場合、CpG部位の非メチル化Cを本明細書に記載のように別のものに（例えば、バイサルファイトによりウラシルに）変換させた。本出願は、各関連DNA領域のゲノム配列及び各変換鎖のバイサルファイト変換配列を提供する。参照されるCpG部位は常に、変換した配列が変換によりこれらのCpG部位を既に含有していない場合であってもゲノム配列のCpG部位である。「高メチル化」という用語は、異常なメチル化パターン又は状態（すなわち、1つ又は複数のヌクレオチドのメチル化の有無）を指し、この場合、1つ又は複数のヌクレオチド、好ましくはCpG部位（複数の場合もある）のC（複数の場合もある）は、患者に治療を要する癌、好ましくは任意の癌に罹患していない又は罹患したことのない患者又は対象（健常対照）の非癌細胞由来の同じゲノムDNAと比べてメチル化されている。これは特に、健常対照DNAサンプル内の対応するCpGジヌクレオチドにて見つかる5-mCytの量に対する試験DNAサンプルのDNA配列内の1つ又は複数のCpGジヌクレオチドの5-mCytの存在の増加を指す。メチル化状態／パターンとしての高メチル化を1つ又は複数のCpG部位にて決定することができる。2つ以上のCpG部位を使用する場合、高メチル化を、各部位にて個別に又は合わせたCpG部位の平均として決定することができる。代替的に、全ての評価されたCpG部位は、高メチル化の要件を満たすようにメチル化されなければならない。
【００８７】
本明細書において使用される場合、「標的DNA」という用語は、特定の染色体の位置のゲノムヌクレオチド配列を指す。本発明において、標的DNAは通例、疾患の状態において高メチル化されると知られている遺伝子マーカーである（例えば、癌細胞対非癌細胞）。遺伝子マーカーは、ゲノムDNAのコード領域又は非コード領域であってよい。
【００８８】
本明細書において使用される場合、「標的DNAの領域」という用語は、分析される標的DNAの一部を指す。一般に、この領域は、少なくとも50塩基対、60塩基対、70塩基対、80塩基対、90塩基対、100塩基対、150塩基対、若しくは200塩基対若しくは300塩基対（bp）の長さであり、及び／又は500 bp、600 bp、700 bp、800 bp、900 bp、若しくは1000bpより短い（本明細書において定義される、例えば「100 bp未満の長さ」によって更に限定されない限り）。特に、該領域は、ゲノムDNAの少なくとも3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、又は15個のCpG部位を含む領域である。これらの部位は、領域の増幅に使用されるプライマーが結合しないことが好ましい。好ましくは、これらのCpG部位の少なくとも3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、又は15個（必ずしも全ての、特に、スペーサー又は例えばプライマーのメチル化非特異的な不一致が結合するCpG部位ではない）は、高メチル化標的DNAにおいてメチル化される。
【００８９】
本発明の1つの標的DNAは、SHOX2と関連したゲノムDNAである。本明細書において使用される場合、「SHOX2」という用語は、shox2（short stature homeobox 2、ヒトNCBI遺伝子ID6474、ゲノム位置3q25.32）遺伝子を指し、またhomeoboxタンパク質Og12X又は対合関連homeoboxタンパク質SHOTと表される。SHOX2は、DNA結合ドメインを表す60アミノ酸残基モチーフを含有するタンパク質をコードする遺伝子のhomeoboxファミリーのメンバーである。homeoboxタンパク質は、無脊椎動物及び脊椎動物種の両方におけるパターン形成に関与する転写制御因子として広く特徴付けられている。ヒトSHOX2と関連するゲノムDNA配列（構築されたGRCh38ゲノムの3番染色体の158090954〜158111503位）を本明細書において提供する（表1を参照されたい）。
【００９０】
本発明の別の標的DNAは、PTGER4と関連するゲノムDNAである。本明細書において使用される場合、「PTGER4」という用語は、ptger4（プロスタグランジンE受容体4、ヒトNCBI遺伝子ID5734、ゲノム位置5p13.1）遺伝子を指し、また指定のEP4又はEP4Rと表される。PTGER4はG-タンパク質結合受容体ファミリーのメンバーであり、プロスタグランジンE2（PGE2）として同定される4つの受容体の1つである。この受容体は、T-細胞因子シグナル伝達を活性化させることができ、初期増殖応答1タンパク質（EGR1）のPGE2誘導性発現を介在し、シクロオキシゲナーゼ-2 mRNAのレベル及び安定性を調節し、グリコーゲン合成酵素キナーゼ-3のリン酸化を導くことが示されている。マウスのノックアウト研究では、この受容体が新生児の循環系適応、骨粗しょう症、及び皮膚免疫応答の開始に関与する可能性があることが示唆されている。ヒトPTGER4と関連するゲノムDNA配列（構築されたGRCh38ゲノムの5番染色体の40674498〜40698735位）を本明細書において提供する（配列番号51）。
【００９１】
本発明の別の標的DNAは、FOXL2と関連するゲノムDNAである。本明細書において使用される場合、「FOXL2」という用語は、foxl2（forkheadboxタンパク質L2、ヒトNCBI遺伝子ID668、ゲノム位置3q23）遺伝子を指し、またBPES、PFRK、POF3、BPES、又はPINTOと表される。FOXL2は、forkhead DNA結合ドメインを含有するforkhead転写因子であり、発達及び性決定に関与する。遺伝子内の突然変異は、瞼裂縮小症候群及び早発卵巣不全3の原因である。ヒトFOXL2と関連するゲノムDNA配列（構築されたGRCh38ゲノムの3番染色体の138939224〜138952140位）を本明細書において提供する（配列番号1）。
【００９２】
本明細書において使用される場合、「サンプル」という用語は、対象から得られた生物学的材料を指し、全ての染色体由来のゲノムDNA、好ましくは全ゲノムを包含するゲノムDNAを含む。サンプルは、対象に癌がある場合、癌の細胞又は癌細胞由来の遊離ゲノムDNA（標的DNAを含む）、好ましくは癌細胞由来の血中ゲノムDNAを含む。サンプルは、任意の好適な組織又は生体液、例えば血液、唾液、血漿、血清、尿、脳脊髄液（CSF）、糞便、頬内スワブ又は頬内咽頭部スワブ、手術標本、生検から得られた標本、又はパラフィンで包埋した組織サンプルから得ることができる。対象からサンプルを得るための方法は、当業者によく知られている。サンプルは、腫瘍生検又は液体サンプルが好ましい。液体サンプルは、血液、血清、血漿、又は尿が好ましい。癌が肺癌である場合、サンプルは気管支洗浄、気管支肺胞洗浄、気管支擦過若しくは気管支摩耗を含む気管支鏡検査法、又は痰若しくは唾液から得られる材料を含むことも想定される。通例、標的DNAを含むサンプル、特に癌細胞由来の細胞外標的DNAにおいて、癌細胞由来の標的DNAと異なり高メチル化されていない非癌細胞由来の標的DNAもある。通常、非癌細胞由来の上記標的DNAは、有病細胞由来の量の少なくとも10倍、少なくとも100倍、少なくとも1000倍、又は少なくとも10000倍を超える。一般にサンプルに含まれるゲノムDNAは、少なくとも部分的にフラグメント化される。「少なくとも部分的にフラグメント化」とは、少なくとも細胞外DNA、特に少なくとも癌細胞由来の細胞外標的DNAをフラグメント化することを意味する。「フラグメント化されたゲノムDNA」という用語は、細胞、特に癌細胞のゲノムのDNAの小片（長いDNAをより短い長さの個別のフラグメントに一部生理学的、化学的及び／又は生物学的に分解した結果である）を指す。特に、「フラグメント化」は、ゲノムDNA、好ましくは標的DNAの少なくとも一部を1500 bp、1300 bp、1100bp、1000 bp、900 bp、800 bp、700 bp、600 bp、500 bp、400 bp、300 bp、200 bp、又は100 bpより短いフラグメントにフラグメント化することを意味する。これに関する「少なくとも一部」は、少なくとも5 %、10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、又は75 %を意味する。
【００９３】
本明細書において使用される場合「ゲノムDNA」という用語は、染色体のDNAを指し、コーディングDNAと区別するために使用される。それゆえゲノムDNAは、遺伝子に属するエクソン、イントロン、及び制御配列、特にプロモーターを含む。
【００９４】
本明細書において使用される場合、「DNA内の、5位の非メチル化されたシトシンをウラシルに、又はグアニンとハイブリダイズしない別の塩基に変換する」という語句は、非メチル化されたシトシン塩基の全て又は実質的に全てが、ウラシル塩基又は塩基対の挙動において、シトシンに類似しない別の塩基に変換されるが、5-メチルシトシン塩基は変化しないままであるように、DNAを化学的に処理するプロセスを指す。DNAサンプル内の非メチル化であり、メチル化されないシトシン塩基の変換は、変換剤を用いて行われる。本明細書において使用される場合、「変換剤」という用語は、非メチル化されたシトシンをウラシルに又はハイブリダイゼーション特性においてシトシンに類似しない検出可能な別の塩基に変換することが可能な試薬に関する。変換剤は、二亜硫酸塩又は重亜硫酸塩等のバイサルファイトが好ましい。反応は、標準的な手法（Frommer et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:1827-31、Olek, 1996, Nucleic Acids Res 24:5064-6;欧州特許第1394172号）に従い行われる。酵素による、例えばメチル化特異的シチジンデアミナーゼの使用による変換を行うことも可能である。最も好ましくは、変換剤は、バイサルファイトナトリウム又はバイサルファイト塩である。
【００９５】
本明細書において使用される場合、「増幅する」又は「アンプリコンを作製する」という用語は、標的核酸及びその相補配列、又は特にその領域のコピー数の増加を指す。増幅は、当該技術分野において既知の任意の方法を使用することにより行うことができる。核酸の増幅には、増幅プロセス中に多数のサイクルを必要とする方法又は単一の温度にて行われる方法がある。サイクル法は、熱サイクルを必要とする方法により例示される。熱サイクルを必要とする方法には、当該技術分野に既知のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）がある。PCRは、熱変性により二本鎖のDNAを一本鎖のDNAに変性し、プライマーを一本鎖のDNAにアニーリングし、プライマーから相補鎖を合成することを含む。等温増幅は、単一の温度にて行われ、又は増幅プロセスの主な態様が単一の温度にて行われる増幅である。PCRプロセスでは、反応産物を加熱し、別のプライマーが鋳型に結合することができるように2つの鎖を分離する。逆に、等温法は、二本鎖を2つの鎖に分離し、鋳型を再コピーするための鎖置換ポリメラーゼ（stranddisplacing polymerase）によるものである。等温法は、プライマー置換して反復する鋳型のコピーを開始することによる方法及び単一のプライマー分子の継続した再利用又は新しい合成を行うことによる方法に分類することができる。プライマー置換による方法には、ヘリカーゼ依存性増幅（HDA）、エキソヌクレアーゼ依存性増幅、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（RPA）、及びループ介在性増幅（LAMP）がある。単一プライマー分子の継続した再利用又は新しい合成による方法には、鎖置換増幅（SDA）又は核酸増幅（NASBA及びTMA）がある。
【００９６】
増幅は、メチル化特異的PCR（すなわち、アンプリコンを1つ又は複数のCpG部位が変換されるか又はされないかに左右して作製される）により、メチル化非特異的であるが、バイサルファイト変換DNAに特異的なプライマー（すなわち、少なくとも1つの変換されたCと結合することにより変換されたDNAにのみにハイブリダイズされる）を用いて行うことが好ましい。メチル化特異性は、メチル化特異的ブロッカーオリゴヌクレオチドを用い、これが変換された又は変換されていないCpG部位に特異的にハイブリダイズしてから、PCR重合を終了させることで得られる。最も好ましい実施形態において、増幅の工程は、リアルタイムPCR、特にHeavyMethyl（商標）又はHeavyMethyl（商標）-MethyLight（商標）を含む。
【００９７】
本明細書において使用される場合、HeavyMethyl（商標）という用語は、メチル化特異的ブロッキングプローブ（本明細書において、ブロッカーとも呼ばれる）がCpG位置間に結合し、又は標的DNA若しくはその領域のメチル化特異的選択的増幅を可能にする増幅プライマーが結合する、アッセイを指す。
【００９８】
「MethyLight（商標）」という用語は、PCR工程後に更に操作を必要としない蛍光ベースのリアルタイムPCR法を利用するハイスループット定量的メチル化アッセイである（Eads et al.,Cancer Res. 59:2302-2306, 1999、引用することにより本明細書の一部をなす）。要するに、MethyLight（商標）プロセスはゲノムDNAの混合サンプルから始め、このサンプルが例えば、標準的な手法に従って、重亜硫酸ナトリウム反応中にメチル化依存的な配列差異がある混合プールに変換される（バイサルファイトプロセスによって、非メチル化シトシン残基がウラシルに変換される）。それから、蛍光ベースのPCRを「偏向（biased：バイアス）」（既知のCpGジヌクレオチドと重複するPCRプライマーによる）反応中に行う。配列識別（discrimination）は、増幅プロセスのレベルと蛍光検出プロセスのレベルとの両方で行うことができる。MethyLight（商標）アッセイは、ゲノムDNAサンプルにおけるメチル化パターンに関する定量的検査として使用してもよく、配列識別はプローブハイブリダイゼーションのレベルで起こる。この定量的なバージョンでは、PCR反応によって、特定の推定メチル化部位と重複する蛍光プローブの存在下でメチル化特異的な増幅が与えられる。プライマーもプローブも全くCpGジヌクレオチドに重ならない反応によって、DNAの導入量に対する不偏制御が与えられる。「HeavyMethyl（商標）MethyLight（商標）」アッセイという用語は、MethyLight（商標）アッセイを、増幅プライマー間のCpG位置をカバーするメチル化特異的な遮断プローブと組み合わせたMethyLight（商標）アッセイの変法である、HeavyMethyl（商標）MethyLight（商標）アッセイを表す。
【００９９】
オリゴヌクレオチドにおいて使用する場合、「アニーリング」という用語は、オリゴヌクレオチドがサンプルDNAのワトソン−クリック塩基対合の列に沿って少なくとも実質的に相補的な配列に結合し、適度な、又はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において二本鎖構造を形成するとして理解されるものである。アニーリングは単一のヌクレオチド又は塩基において使用される場合、ワトソン−クリック塩基対合、例えばC-G、A-T、及びA-Uによる結合を指す。「実質的に相補的」とは、オリゴヌクレオチドが鋳型の正確な配列を反映する必要はなく、本明細書に定義の不一致及び／又はスペーサーを含むことができることを意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、68℃、5×SSC／5×デンハルト液／1.0 %SDSにてハイブリダイズし、室温にてで0.2×SSC/0.1 %SDSで洗浄することを含み、又はその当該技術分野において認識される等価物（例えば、ハイブリダイゼーションは、60℃、2.5×SSC緩衝液にて行った後、37℃、低濃度の緩衝液による数回の洗浄工程を行い、安定した状態）を含む。適度な条件は、42℃で3×SSCでの洗浄、又はその当該技術分野において認識されている等価物を含む。プローブと標的核酸との特性（identity）の最適レベルが得られるよう塩濃度及び温度のパラメーターを変更することができる。このような条件に関するガイドラインは、当該技術分野において、例えばSambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Press, N.Y.;及びAusubel et al. (eds.),1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N.Y.) atUnit 2.10により利用可能である。
【０１００】
本明細書において使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、5個〜50個のリボヌクレオチド又は好ましくはデオキシリボヌクレオチドの直鎖オリゴマーを指す。オリゴヌクレオチドは一本鎖のDNAフラグメントの構造を有することが好ましい。
【０１０１】
本明細書において使用される場合、「プライマーオリゴヌクレオチド」という用語は、コピーされることが求められる核酸配列に実質的な相補的な一本鎖オリゴヌクレオチド配列（鋳型）を指し、プライマー伸長産物の合成のための開始点として作用する。「実質的に相補的」とは、プライマーオリゴヌクレオチドが、鋳型の正確な配列を反映する必要がなく、（例えば、PCRサイクルの）選択されたアニーリング及び伸長条件下において、アニーリング及び伸長のための開始点として作用することができる限り、本明細書において定義される不一致及び／又はスペーサーを含むことができることを意味する。プライマーオリゴヌクレオチドは、10ヌクレオチド長〜40ヌクレオチド長、より好ましくは15ヌクレオチド長〜30ヌクレオチド長、最も好ましくは19ヌクレオチド長〜25ヌクレオチド長であることが好ましい。
【０１０２】
本明細書において使用される場合、「ブロッカー」という用語は、DNAの一本鎖にメチル化特異的に（すなわち、変換されたメチル化若しくは好ましくは変換された非メチル化DNA、又はそれに由来する増幅されたDNAのいずれかに特異的である）結合し、それに結合することにより、例えば結合するプライマーを阻止することにより、又は結合するプライマー伸長を阻止することによりDNAの増幅を阻止する分子を指す。ブロッカーの非限定例には（Non-limiting examples for blockers）、配列及び／又はメチル化特異的抗体（ブロッキング、例えばプライマー結合又はポリメラーゼ）、特にブロッカーオリゴヌクレオチドがある。
【０１０３】
「ブロッカーオリゴヌクレオチド」は、ブロッカーオリゴヌクレオチドの上流に位置するプライマーの伸長を阻止するブロッカーであり得る。ブロッカーオリゴヌクレオチドはポリメラーゼの5'末端のヌクレアーゼ活性に耐性のある骨格を有するヌクレオシド／ヌクレオチドを含む。これは、例えば、ペプチド核酸（PNA）、ロックド核酸（LNA）、モルフォリノ、グリコール核酸（GNA）、トレオース核酸（TNA）、架橋核酸（BNA）、N3'-P5'ホスホロアミデート（NP）オリゴマー、マイナーグルーブバインダー結合型オリゴヌクレオチド（MGB結合型オリゴヌクレオチド）、ホスホロチオエート（PS）オリゴマー、CrC4アルキルホスホネートオリゴマー、ホスホロアミデート、β-ホスホジエステルオリゴヌクレオチド、a-ホスホジエステルオリゴヌクレオチド、又はその組合せを含むことにより得ることができる。代替的に、ブロッカーオリゴヌクレオチドはプライマーオリゴヌクレオチドの結合部位と重複するDNAの一本鎖に結合部位を含む非伸長型オリゴヌクレオチドであってよい。ブロッカーが結合されると、プライマーは結合することができないため、アンプリコンは作製されない。ブロッカーが結合されないと、プライマー結合部位は結合可能であり、アンプリコンが作製される。このような重複するブロッカーにおいて、ブロッカーの親和性は、DNAに対するプライマーの親和性より高いことが好ましい。ブロッカーオリゴヌクレオチドは通例、15ヌクレオチド長〜50ヌクレオチド長、好ましくは20ヌクレオチド長〜40ヌクレオチド長、より好ましくは25ヌクレオチド長〜35ヌクレオチド長である。「少なくとも1つのブロッカー」は、1個、2個、3個、4個、又は5個の数のブロッカー、より詳細には、1個〜2個、又は1個〜3個のブロッカーを指す。また、ブロッカーオリゴヌクレオチドそのものは、伸長できない3'末端のためプライマー（すなわち、ポリメラーゼにより伸長することができない）として作用することができない。
【０１０４】
本明細書において使用される場合、「プローブオリゴヌクレオチド」又は「プローブ」という用語は、通常、プライマーオリゴヌクレオチドのいずれかが結合する場所ではない（すなわち、プライマーオリゴヌクレオチドがアニーリングする配列セグメントと重複する1つの鎖の配列セグメントではない）、アンプリコンの1つの鎖にアニーリングすることで、アンプリコンを検出するために使用されるオリゴヌクレオチドを指す。好ましくは、不一致を含まずにアニールし、言い換えれば、アンプリコンの1つの鎖に相補的であることが好ましい。プローブオリゴヌクレオチドは、好ましくは5ヌクレオチド長〜40ヌクレオチド長、より好ましくは10ヌクレオチド長〜25ヌクレオチド長、最も好ましくは25ヌクレオチド長〜20ヌクレオチド長である。通常、プローブは、アンプリコンの検出を可能にする少なくとも1つの検出可能な標識に結合、好ましくは共有結合する。本明細書において使用される場合、「検出可能な標識」という用語は、任意の特定の制限を示すものではない。検出可能な標識は、放射性標識、発光性標識、蛍光染料、酵素活性を有する化合物、磁性標識、抗原、及び検出可能な標識に高い結合親和性を有する化合物からなる群から選択することができる。例えば、プローブに結合する蛍光染料は、検出標識として、例えばリアルタイムPCRにおいて作用することができる。好適な放射性マーカーは、P-32、S-35、1-125、及びH-3であり、好適な発光性マーカーは、化学発光性化合物、好ましくはルミノールであり、好適な蛍光マーカーは、好ましくはダンシルクロリド、フルオレセイン-5-イソチオシアネート、及び4-フルオロ-7-ニトロベンズ-2-アザ-1,3ジアゾール、特に6-カルボキシフルオレスセイン（FAM）、6-ヘキサクロロフルオレスセイン（HEX）、5（6）-カルボキシテトラメチルローダミン（TAMRA）、5（6）-カルボキシ-X-ローダミン（ROX）、シアニン-5-フルオロフォア（Cy5）、及びそれらの誘導体であり、好適な酵素マーカーは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、a-ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、又はビオチンである。
【０１０５】
オリゴヌクレオチドにおいて本明細書において使用される場合、「CpG部位と結合する」という用語は、CpG部位のC（すなわち、バイサルファイトにより変換された配列を指すときに該当するゲノムDNAのCpG部位）の変換前又は変換後にこのCpG部位を含むDNA領域へのオリゴヌクレオチドアニーリングを指す。アニーリングは、CpG部位（又はCが変換された場合、その前のCpG部位）において、以下に記載のようにメチル化特異的又はメチル化非特異的であってよい。
【０１０６】
本明細書において使用される場合、「メチル化特異的」という用語は、一般にCpGメチル化の有無に左右されることを指す。
【０１０７】
オリゴヌクレオチドにおいて、本明細書において使用される場合、「メチル化特異的」という用語は、少なくとも1つのCpG部位のCが変換前に非メチル化され、又はメチル化されるか、すなわちCが変換されていたか、若しくは変換されていないかに応じて、少なくとも1つのCpG部位のCの位置において不一致を含むことなく、オリゴヌクレオチドがDNAの一本鎖にアニールされるか、されないか（5位の非メチル化されたシトシンがウラシルに又はグアニンとハイブリダイズしない別の塩基に変換され、また変換前に少なくとも1つのCpG部位を含む）を意味する。メチル化特異性は、正（オリゴヌクレオチドは、Cが変換されない場合に上記の不一致を含まずにアニールされる）又は負（オリゴヌクレオチドは、Cが変換される場合に上記の不一致を含まずにアニールされる）のいずれかであってよい。オリゴヌクレオチドの特異性に反して、そのアニーリングを阻止するために、変換前に少なくとも2個、3個、4個、5個、又は6個、好ましくは3個〜6個のCpG部位と結合することが好ましい。
【０１０８】
本明細書において使用される場合、「メチル化非特異的」という用語は、一般にCpGメチル化の有無に依存しないことを指す。
【０１０９】
オリゴヌクレオチドにおいて、本明細書において使用される場合、「メチル化非特異的」という用語は、少なくとも1つのCpG部位のCが変換前に非メチル化又はメチル化であること、すなわち、Cが変換されているか又はされていないかに関係なく、オリゴヌクレオチドがDNAの一本鎖にアニールされる（5位の非メチル化されたシトシンがウラシルに又はグアニンとハイブリダイズしない別の塩基に変換されており、変換前に少なくとも1つのCpG部位を含んでもよく、又は含まなくてもよい）ことを意味する。或る例では、オリゴヌクレオチドがアニールする、DNAの一本鎖の領域は、任意のCpG部位を含まない（変換前及び変換後）だけで、オリゴヌクレオチドはメチル化非特異的である。別の例では、オリゴヌクレオチドがアニールするDNAの一本鎖の領域は、アニーリングが、少なくとも1つのCpG部位のCが変換前に非メチル化又はメチル化であるか、すなわちCが変換されているか、又はされていないかに左右されないように、変換前及び変換後のCpG部位（複数の場合もある）のCの位置において、1つ〜3つ、すなわち1つ、2つ、又は3つの不一致及び／又はスペーサー、好ましくは1つの不一致又はスペーサーを含む。不一致及び／又はスペーサーに関わらずアニーリングを可能にするため、オリゴヌクレオチドの10個のヌクレオチド当たり2つ以上の不一致を含まないことが好ましい（他に切り捨てがない場合、小数第1位が5以上の場合は四捨五入する）。
【０１１０】
本明細書において使用される場合、「不一致」という用語は、DNAの塩基対の不一致、より詳細には、正常な塩基対合の相互作用を形成することができない塩基対（すなわち、「A」と「T」若しくは「U」又は「G」と「C」以外）を指す。
【０１１１】
本明細書において使用される場合、「SNP部位」という用語は、「SNP」の部位、すなわち、或る個体集団内で変化する（好ましくはヒト）ゲノムにおける特定の位置の単一のヌクレオチド多型を指す。本出願のゲノムDNAのSNPは、当該技術分野において知られており、NCBIのdbSNP等のオンラインデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp）において見つけることができる。
【０１１２】
本明細書において使用される場合、「SNP非特異的な不一致」という用語は、ヌクレオチドと、同じ集団の別の個体のゲノムの同じ位置に見つかるヌクレオチドに対応するものとを置換しないヌクレオチド置換による不一致を指す。
【０１１３】
本明細書において使用される場合、「スペーサー」という用語は、2個のヌクレオチドをつなげるとき、その2個のヌクレオチド間の距離が約1個のヌクレオチド分の距離（すなわち、3つ目のヌクレオチドでつながっている場合、2個のヌクレオチド分離れている距離）に増加させる非ヌクレオチドスペーサー分子を指す。スペーサーの非限定的な例は、イノシン、d-ウラシル、ハロゲン化塩基、アミノ-dT、C3、C12、スペーサー9、スペーサー18、及びdスペーサー）である。
【０１１４】
本明細書において使用される場合、「反映する」という用語は、「の結果である」又は「示す」を意味すると理解するものとする。
【０１１５】
本明細書において使用される場合、「対象の癌の有無を検出する方法」という語句は、対象の癌診断、すなわち対象が癌を有するか又はそうでないかを決定することを指す。当業者であれば理解されるように、このような評価は通常、正確であることが好ましいが、100 %の患者において正確というわけではない。しかし、この用語は、対象の統計的に有意な部分において、正確に示すことができることが求められる。一部が統計的に有意であるかは、当業者であれば、いくつかの既知の統計的評価ツール、例えば信頼区間の決定、p値の決定、Studentのt検定、マン−ホイットニーの検定等を用いて容易に決定することができる。Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons,New York 1983に詳述されている。好ましい信頼区間は、少なくとも50 %、少なくとも60 %、少なくとも70 %、少なくとも80%、少なくとも90 %、少なくとも95 %である。p値は0.05、0.01、又は0.005であることが好ましい。
【０１１６】
本明細書において使用される場合、「癌」という用語は、体内の他の部分に浸潤又は拡散する可能性のある異常な細胞の増殖を含む大きな疾患群を指す。この細胞は、新生物又は腫瘍の部分集合を形成する。新生物又は腫瘍は、無秩序に増殖し、多くの場合塊又は小塊を形成するが、散在し得る細胞の一群である。好ましくは、「癌」という用語は、以下の特徴の1つ又は複数により定義される：
増殖シグナル伝達の自給自足性、
抗増殖シグナルに対する不感受性、
アポトーシスの回避、
無限の複製能の可能性、
血管新生の誘導及び持続、及び／又は、
転移及び組織浸潤の活性化。
【０１１７】
本発明において、癌は、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳／CNS腫瘍、乳癌、原発不明癌、キャッスルマン病、子宮頸癌、結腸／直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍ファミリー、眼癌、胆嚢癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（GIST）、妊娠性絨毛疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓癌、咽頭癌及び下咽頭癌、白血病、肝癌、肺癌、リンパ腫、皮膚リンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、副鼻腔癌及び鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫−成人軟部癌、皮膚癌、小腸癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンストレームマクログロブリン血症、及びウィルムス腫瘍からなる群から選択されることが好ましい。
【０１１８】
「結腸直腸癌」という用語は広義の意味で用いられ、（1）大腸及び／又は直腸の上皮細胞に生じる癌の全ての段階及び全ての形態、及び／又は（2）大腸及び／又は直腸の内膜に罹患する癌の全ての段階及び全ての形態を指す。結腸直腸癌には、それぞれが結腸（結腸癌）又は直腸（直腸癌）に由来する、腺癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、原発性直腸結腸リンパ腫、平滑筋肉腫、黒色腫又は扁平上皮癌がある。結腸直腸癌の分類に用いられる病期システムにおいて、結腸及び直腸を1つの臓器として治療する。
【０１１９】
本明細書において使用される場合、「病期0の結腸直腸癌」という用語は、最も早期の段階である癌を指す。該癌は、結腸又は直腸の内部層（粘膜）を透過して増殖していないものである。この段階は、上皮内癌又は粘膜内癌としても知られている。病期0は、TNM分類のTisN0M0に該当する。
【０１２０】
本明細書において使用される場合、「病期Iの結腸直腸癌」という用語は、粘膜筋板から粘膜下への増殖を有する癌（T1）を指し、又は固有筋層に増殖していることもある（T2）。該癌は周辺のリンパ節又は遠位の部位に拡散していない。病期Iは、TNM分類のT1-T2N0M0に該当する。
【０１２１】
本明細書において使用される場合、「病期IIAの結腸直腸癌」という用語は、結腸又は直腸の最外層に増殖しているが、最外層を透過していない癌を指す（T3）。該癌は、周辺の臓器に到達していない。該癌は、周辺のリンパ節又は遠位の部位にまだ拡散していない。病期IIAはTNM分類のT3N0M0に該当する。
【０１２２】
本明細書において使用される場合、「病期IIBの結腸直腸癌」という用語は、結腸又は直腸の壁を透過し増殖するが、他の周辺の組織又は臓器に増殖していない癌を指す（T4a）。該癌は、周辺のリンパ節又は遠位の部位にまだ拡散していない。病期IIBはTNM分類のT4aN0M0に該当する。
【０１２３】
本明細書において使用される場合、「病期IICの結腸直腸癌」という用語は、結腸又は直腸の壁を透過し増殖し、他の周辺の組織若しくは臓器に接着し、又は他の周辺の組織若しくは臓器に増殖している癌を指す（T4b）。該癌は、周辺のリンパ節又は遠位の部位にまだ拡散していない。病期IICはTNM分類のT4bN0M0に該当する。
【０１２４】
本明細書において使用される場合、「病期IIIAの結腸直腸癌」という用語は、以下の1つを指す：（i）癌が粘膜から粘膜下に増殖しており（T1）、固有筋層にも増殖する可能性がある（T2）。該癌は、1つ〜3つの周辺のリンパ節に拡散し（N1a/N1b）、又はリンパ節付近の脂肪領域に拡散しているが、リンパ節自体には拡散していない（N1c）。該癌は遠位の部位に拡散していない。これはTNM分類のT1-T2N1M0に該当する。（ii）該癌が粘膜から粘膜下に増殖している（T1）。該癌が4つ〜6つの周辺のリンパ節に拡散している（N2a）。該癌は遠位の部位に拡散していない。これはTNM分類のT1N2aM0に該当する。
【０１２５】
本明細書において使用される場合、「病期IIIBの結腸直腸癌」という用語は、以下の1つを指す：（i）該癌が結腸又は直腸の最外層に（T3）又は臓側腹膜に増殖している（T4a）が周辺の臓器には到達していない。該癌は、1つ〜3つの周辺のリンパ節（N1a/N1b）又はリンパ節付近の脂肪領域に拡散しているが、リンパ節自体には拡散していない（N1c）。該癌は遠位の部位に拡散していない。これはTNM分類のT3-T4aN1M0に該当する。（ii）該癌は固有筋層（T2）、又は結腸若しくは直腸の最外層（T3）に増殖している。該癌は4つ〜6つの周辺のリンパ節に増殖している（N2a）。該癌は遠位の部位に拡散していない。これはTNM分類のT2-T3N2aM0に該当する。（iii）該癌は粘膜から粘膜下に増殖しており（T1）、又は該癌は固有筋層にも増殖している可能性がある（T2）。該癌は7つ以上の周辺のリンパ節に拡散している（N2b）。該癌は遠位の部位に拡散していない。これはTNM分類のT1-T2N2bM0に該当する。
【０１２６】
本明細書において使用される場合、「病期IIICの結腸直腸癌」という用語は、以下の1つを指す：（i）該癌は結腸又は直腸の壁（臓側腹膜を含む）を透過し増殖するが、周辺の臓器には到達していない（T4a）。該癌は4つ〜6つの周辺のリンパ節に拡散している（N2a）。該癌は遠位の部位に拡散していない。これはTNM分類のT4aN2aM0に該当する。（ii）該癌は結腸若しくは直腸の最外層に（T3）又は臓側腹膜を透過し増殖している（T4a）が、周辺の臓器に達していない。該癌は7つ以上の周辺のリンパ節に拡散している（N2b）。該癌は遠位の部位に拡散していない。これはTNM分類のT3-T4aN2bM0に該当する。（iii）該癌は結腸又は直腸の壁を透過し増殖しており、他の周辺の組織若しくは臓器に接着し、又は他の周辺の組織若しくは臓器に増殖している（T4b）。該癌は少なくとも1つの周辺のリンパ節又はリンパ節付近の脂肪領域に拡散している（N1又はN2）。該癌は遠位の部位に拡散していない。これはTNM分類のT4bN1-N2M0に該当する。
【０１２７】
本明細書において使用される場合、「病期IVAの結腸直腸癌」という用語は、結腸又は直腸の壁を透過し増殖しており、又は増殖しておらず、かつ周辺のリンパ節に拡散し、又は拡散していない癌を指す。該癌は1つの遠位の臓器（例えば肝臓又は肺）又は一連のリンパ節に拡散している（M1a）。これはTNM分類のanyTanyNM1aに該当する。
【０１２８】
本明細書において使用される場合、「病期IVAの結腸直腸癌」という用語は、結腸又は直腸の壁を透過し増殖しており、又は増殖しておらず、かつ周辺のリンパ節に拡散しており、又は拡散していない癌を指す。該癌は2つ以上の遠位の臓器（例えば肝臓又は肺）若しくは一連のリンパ節に拡散しており、又は該癌は腹膜（腹腔の内膜）の遠位の部分に拡散している（M1b）。これはTNM分類のanyTanyNM1bに該当する。
【０１２９】
「肺癌」という用語は、小細胞肺癌（SCLC）及び非小細胞肺癌（NSCLC）を含む。
【０１３０】
本明細書において使用される場合、「SCLC」又は「小細胞肺癌」という用語は未分化新生物を指し、好ましくは原始様細胞又は胚様細胞（primitive- or embryonic-appearing cells）から構成される。その名称が示唆するように、小細胞癌の細胞は、正常細胞より小さく、任意の細胞質の隙間はほとんどない。
【０１３１】
本明細書において使用される場合、「NSCLC」又は「非小細胞肺癌」は、予後及び管理がほぼ同じであることから、一緒に分類される異種疾患の一群を指し、世界保健機関／国際肺癌学会の組織学的分類（Travis WD et al. Histological typing of lung and pleural tumors. 3rded. Berlin: Springer-Verlag, 1999）に従い以下を含む：
（i）扁平上皮癌（SCC）は、NSCLCの30 %〜40 %を占め、大きい呼吸管において発症するが、ゆっくり増殖することから、これらの腫瘍の大きさにより診断が異なることを意味する。
（ii）腺癌は、NSCLCの最も一般的な亜型であり、NSCLCの50 %〜60 %を占め、肺のガス交換表面付近から発症し、また治療に対して様々な反応を有し得る、亜型である細気管支肺胞上皮癌を含む。
（iii）大細胞癌は、肺の表面付近に増殖する急速増殖型である。最初は除外診断となり、検査を更に行ってから、通常、扁平上皮癌又は腺癌に再分類される。
（iv）腺扁平細胞癌は、2種類の細胞：扁平上皮細胞（或る特定の臓器の内膜にある薄く、扁平な細胞）と腺様細胞とを含有する癌の1種である。
（v）多形性の、肉腫様の、又は肉腫性の要素を含む癌。これは組織学的異種性並びに上皮細胞及び間葉細胞の分化における連続形態（continuum）を反映する珍しい腫瘍の一群である。
（vi）カルチノイド腫瘍はゆっくり増殖する神経内分泌肺腫瘍であり、神経系によりもたらされた刺激に応答してホルモンを放出することができる細胞に発症する。
（vii）唾液腺型の癌は、肺の大きな気道の内部に局在する唾液腺細胞に発症する。
（viii）未分類の癌には、上記の肺癌分類のいずれにも適合しない癌である。
【０１３２】
NSCLCは、扁平上皮癌、腺癌、大細胞（未分化）癌、腺扁平細胞癌、及び肉腫様癌であり得る。
【０１３３】
SCLC又はNSCLCは、病期0、病期IA、病期IB、病期IIa、病期IIb、病期IIIa、病期IIIb、又は病期IVのNSCLCであってよい。
【０１３４】
本明細書において使用される場合、「病期0のNSCLC」という用語は、空気が通過する内膜にある細胞の上部層にのみ存在する腫瘍を指す。該腫瘍は、他の肺組織の深部に浸潤しておらず、リンパ節又は遠位の部位に拡散していない。病期0はTNM分類の病期TisN0M0に該当する。
【０１３５】
本明細書において使用される場合、「病期IのNSCLC」又は「病期IのSCLC」という用語は、肺に存在するが、胸部のリンパ節又は胸部の外側の他の位置に認められていない腫瘍を指す。病期Iの（N）SCLCは、通常、腫瘍の大きさ又は肺の外側に沿った内膜である胸膜の関与に基づき病期IA及び病期IBに更に分けられる。病期IAでは、腫瘍は3センチメートル（cm）以下の大きさであり、周辺の組織への浸潤は認められた場合でもかなり少ない。該癌はリンパ節又は任意の遠位の部位に拡散していない。病期IBでは、該腫瘍は3 cmより大きく、肺周囲の胸膜の内膜に浸潤しており、又は肺の一部を破壊している。該癌はリンパ節又は任意の遠位の部位に拡散していない。病期IAはTNM分類の病期T1N0M0に該当する。病期IBはTNM分類のT2M0N0に該当する。
【０１３６】
本明細書において使用される場合、「病期IIのNSCLC」又は「病期IのSCLC」という用語は、胸部内のリンパ節に関与して発症しているか、又はより広範囲の胸部構造及び組織を浸潤しているかのいずれかの癌を指す。しかし、胸部の関与部位を透過しての拡散は認めることができず、該癌はなお局所疾患であるとみなされる。病期IIは病期IIA及び病期IIBに更に分けられる。病期IIAは3 cm以下であり、周辺の組織への浸潤は認められた場合でもかなり少ない腫瘍を指す。胸部の同じ側にある1つ又は複数のリンパ節が関与するが、遠位の部位に拡散していない。病期IIBは2つの状態：3 cmより大きく、周辺の組織に一部の浸潤を含み、胸部の同じ側にある1つ又は複数のリンパ節の関与を含む腫瘍；又はリンパ節の関与はないが、肺の外側の胸部構造を浸潤するか、又は竜骨から2 cm以内（気管又は空気を肺に運ぶ管が分かれ、右肺及び左肺に到達する点）に局在するかのいずれかにある癌に分類される。病期IIAはTNM分類のT1N1M0又はT2N1M0に該当する。病期IIBはTNM分類によるT3N0M0に該当する。
【０１３７】
本明細書において使用される場合、「病期IIIのNSCLC」又は「病期IのSCLC」という用語は、病期IIに比べより広範囲に胸部の組織に浸潤しており、及び／又は該癌が縦隔のリンパ節に拡散している腫瘍を指す。しかし、体内の他の部分への拡散（転移）は、検出することはできない。病期IIIは病期IIIA及び病期IIIBに分けられる。病期IIIAは、任意の隣接する臓器に浸潤せず、腫瘍から離れた1つ又は複数のリンパ節を含むが、胸部の外側にない単一の腫瘍又は腫瘤を指す。病期IIIBは胸部の2つ以上の領域に拡散しているが、胸部の外側にない癌を指す。病期IIIAは、TNM分類によるT1N2M0、T2N2M0、T3N1M0、T3N2M0、T4N0M0、又はT4N1M0に該当する。病期IIIBはTNM分類によるT1N3M0、T2N3M0、T3N3M0、T4N2M0、又はT4N3M0に該当する。
【０１３８】
本明細書において使用される場合、「病期IVのNSCLC」又は「病期IのSCLC」という用語は肝臓、脳、又は他の臓器を含み得る体内の様々な部位に拡散又は転移している癌を指す。病期IVはM1を含む任意のT又は任意のNに該当する。
【０１３９】
TNM分類は悪性癌のための病期システムである。本明細書において使用される場合、「TNM分類」という用語は、Sobin et al.（International Union AgainstCancer (UICC), TNM Classification of Malignant tumors, 6th ed. NewYork; Springer, 2002, pp. 191-203）（TNM6）及びAJCC Cancer Staging Manual 6th edition; Chapter 19; Lung - originalpages 167-177に定義されるTNM病期の分類の第6版を参照し、これらにより、腫瘍をいくつかの因子、すなわち以下のように腫瘍に対してT、リンパ節に対してN、転移に対してMによって分類する：
T:原発腫瘍は評価することができない、又は痰若しくは気管支洗浄液に悪性細胞が存在することにより証明されるが画像又は気管支鏡検査法により視覚化されない：
T0：原発腫瘍の証拠がないもの、
Tis：上皮内癌、
T1：最大寸法で3 cm以下であり、肺又は臓側胸膜に囲まれ、葉気管支より近位に浸潤した、気管支鏡による証拠のない腫瘍（例えば、主要な気管支内ではない）、
T2：3 cm超であるが7 cm以下の腫瘍又は以下の特徴のいずれかを含む腫瘍（5 cm以下の場合、これらの特徴を含むT2腫瘍はT2aに分類される）：主要な気管支、つまり竜骨から2 cm以上遠位を含み；臓側胸膜（PL1又はPL2）に浸潤し；門領域に拡張するが、肺全体に関与しない無気肺又は閉塞性肺炎と関連し、
T3：7 cm超又は以下のいずれかに直接浸潤する腫瘍：頭頂胸膜（PL3）、胸部壁（上肺溝腫瘍を含む）、横隔膜、横隔神経、縦隔胸膜、頭頂心膜；又は竜骨から2cm未満の遠位にあるが、竜骨は含まない主要な気管支の腫瘍；又は肺全体の関連無気肺若しくは閉塞性肺炎若しくは同じ葉内の個別の腫瘍瘤（複数の場合もある）、及び、
T4：以下のいずれかに浸潤する任意の大きさの腫瘍：縦隔、心臓、大血管、気管、反回神経、食道、椎体、竜骨、様々な同側葉にある個別の腫瘍瘤（複数の場合もある）。
N（所属リンパ節）：
NX：所属リンパ節を評価することができない
N0：所属リンパ節転移がない
N1：直接の拡大による関与を含む、同側気管支周囲及び／又は同側門リンパ節及び肺内リンパ節の転移
N2：同側縦隔及び／又は竜骨下リンパ節（複数の場合もある）の転移
N3：対側縦隔、対側門、同側若しくは対側斜角筋、又は鎖骨上リンパ節（複数の場合もある）の転移
M：遠位の転移
M0：遠位の転移がない
M1：遠位の転移
【０１４０】
本明細書において使用される場合、「癌細胞」という用語は、発達中の一連の特徴的な機能的能力、特に以下の1つ又は複数を獲得する細胞を指す：アポトーシスを回避する能力、増殖シグナルの自給自足性、抗増殖シグナルに対する不感受性、組織浸潤／転移、顕著な増殖能、及び／又は血管新生の持続。この用語は、前悪性及び悪性癌細胞の両方を包含することを意味する。
【０１４１】
本明細書において使用される場合、「腫瘍DNA」又は「癌細胞の腫瘍DNA」は、単に癌細胞のDNAを指す。該用語は、癌細胞のDNAを本明細書において言及される他のDNAとより明確に区別するために使用されるに過ぎない。したがって、不明確さを生じない限り、「癌細胞のDNA」という用語を代わりに使用することができる。
【０１４２】
本明細書において使用される場合、「対象」という用語は、個体、例えばヒト、非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー及び他の類人猿及びサル種）；家畜、例えば鳥類、魚類、畜牛、ヒツジ、ブタ、ヤギ、及びウマ；愛玩動物、例えばイヌ及びネコ；マウス、ラット、及びモルモット等の齧歯動物を含む実験動物を指す。該用語は特定の年齢又は性別を示すものではない。特定の意味において、対象は哺乳類である。好ましい意味において、対象はヒトである。
【０１４３】
本明細書において使用される場合、「指標となる」又は「示す」という用語は、示されたものを識別又は明記することを指す。当業者であれば理解されるように、このような評価は通常、正確であることが好ましいが、100 %の患者において正確というわけではない。しかし、この用語は、対象の統計的に有意な部分において、正確に示すことができることが求められる。一部が統計的に有意であるかは、当業者であれば、いくつかの既知の統計的評価ツール、例えば信頼区間の決定、p値の決定、Studentのt検定、マン−ホイットニーの検定等を用いて容易に決定することができる。Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons,New York 1983に詳述されている。好ましい信頼区間は、少なくとも50 %、少なくとも60 %、少なくとも70 %、少なくとも80%、少なくとも90 %、少なくとも95 %である。p値は0.05、0.01、又は0.005であることが好ましい。
【０１４４】
本明細書において使用される場合、「アンプリコンを作製する」という用語は、二本鎖又は一本鎖DNAの鋳型の定義された領域を、通例ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて増幅することを指す。「アンプリコン」は、上記の定義された領域によるDNAの二本鎖フラグメントである。
【０１４５】
本明細書において使用される場合、「プライマー対」という用語は、2つのオリゴヌクレオチド、すなわち二本鎖核酸分子において、（少なくとも実質的に）同一である各鎖の相補鎖にアニーリングするように各鎖それぞれに（少なくとも実質的に）同一である配列を有するフォワードプライマー及びリバースプライマーを指す。「フォワードプライマー」という用語は、二本鎖核酸分子のフォワード鎖（ゲノム基準配列の方向により定義される）に（少なくとも実質的に）同一であるプライマーを指し、「リバースプライマー」という用語は、二本鎖核酸分子のフォワード鎖のリバース相補鎖に（少なくとも実質的に）同一であるプライマーを指す。フォワードプライマーとリバースプライマーとがそれぞれの鋳型にアニーリングする部位間の距離は、プライマーを作製することができると推定されるアンプリコンの長さに左右される。通例、本発明において、その距離は50 bp〜1000 bpである。本明細書において好ましいアンプリコンの大きさを明記する。一対のプライマーを用いて増幅される一本鎖DNAの鋳型の場合、プライマーの一方のみが最初の増幅サイクルにおいて一本鎖にアニーリングする。次いで、もう一方のプライマーが新たに作製された相補鎖に結合し、そうして増幅の成果物が二本鎖のDNAフラグメントとなる。「5位の非メチル化されたシトシンがウラシルに又はグアニンとハイブリダイズしない別の塩基に変換されている、ゲノムDNAの一本鎖からアンプリコンを作製するのに適したプライマー対」という語句は、非メチル化されたシトシンからウラシルへと塩基を変化させ、ウラシルがアデニンと塩基対合するため、アンプリコンにおいてチミンに置き換わることが考慮されたプライマーを指す。
【０１４６】
癌おいて、本明細書において使用される場合、「治療」又は「治療すること」は治療的処置を指し、この場合、目的は癌の進行を抑えることである。有益な又は所望の臨床結果は、好ましくは検出可能な、症状の緩和（release of symptoms）、罹患期間の短縮、病的状態の安定化（具体的には悪化しない）、疾患の進行の遅延、病的状態の改善及び／又は寛解（部分的及び全体の両方）を含むが、それらに限定されない。治療の成功は、必ずしも治癒を意味しないが、治療を適用しない場合の予測生存率に比べ、生存率の延長を意味することもある。好ましい実施形態において、該治療は第一選択治療であり、すなわち癌はこれまでに治療されていなかったものである。癌治療には、治療の投薬計画が含まれる。
【０１４７】
本明細書において使用される場合、「治療の投薬計画」という用語は、疾患並びに利用可能な手法及び投薬の観点から患者をどのように治療するかと指す。癌治療の投薬計画の非限定的な例は、化学療法、外科手術及び／又は放射線治療又はそれらの組合せである。癌の早期検出法である、本発明は、特に外科手術、具体的には治癒切除を可能にする。特に「治療の投薬計画」という用語は、以下に定義の1つ又は複数の抗癌剤の投与又は療法を指す。治療の投薬計画の変更は、必ずしも薬剤又は療法の変更を意味するものではなく、同じ薬剤又は療法の用量の変更を意味することもある。本明細書において使用される場合、「抗癌剤又は抗癌療法」という用語は、抗増殖性、抗発癌性及び／又は制癌性の特性のある、化学的、物理的、又は生物学的な作用物質又は療法又は外科手術（それらの組合せを含む）を指す。
【０１４８】
化学的抗癌剤又は抗癌療法は、アルキル化剤、代謝抵抗物質、植物アルカロイド、及びテルペノイド、及びトポイソメラーゼ阻害剤からなる群から選択することができる。アルキル化剤は白金系化合物であることが好ましい。1つの実施形態において、白金系化合物は、シスプラチン、オキサリプラチン、エプタプラチン、ロバプラチン、ネダプラチン、カルボプラチン、イプロプラチン、テトラプラチン、ロバプラチン、DCP、PLD-147、JM118、JM216、JM335、及びサトラプラチンからなる群から選択される。
【０１４９】
物理的抗癌剤又は抗癌療法は、放射線療法（例えば、治癒的放射線治療、アジュバント放射線治療、姑息的放射線治療、遠隔放射線治療、小線源治療、又は代謝性放射線治療）、光線療法（例えば、ヘマトポルフィリン（hematoporphyrin）又はフォトフリンIIを用いる）、及びハイパーサーミアからなる群から選択することができる。
【０１５０】
外科手術は、治癒切除、姑息的外科手術、予防的外科手術、又は細胞切除術であってよい。通例として、外科手術は、切除、例えば嚢内切除、辺縁切除、広範囲切除、又は根治切除（Baron及びValin（Rec. Med. Vet, Special Canc. 1990;11(166):999-1007）に記載）を含む。
【０１５１】
生物学的抗癌剤又は抗癌療法は、抗体（例えば、癌細胞を破壊する免疫応答を刺激する抗体、例えばリツキシマブ（rituximab）若しくはアレムツズマブ、「自家」細胞を攻撃する免疫細胞を阻止する抑制シグナルを免疫細胞の受容体に結合することによって免疫応答を刺激する抗体、例えばイピリムマブ、腫瘍増殖に必要なタンパク質の作用を干渉する抗体、例えばベバシズマブ、セツキシマブ、若しくはパニツムマブ、又は薬剤、好ましくは毒素等の細胞致死物質、化学療法剤若しくは放射性分子に抱合される抗体、例えばY-イブリツモマブチウキセタン、I-トシツモマブ若しくはado-トラスツズマブエムタンシン）、サイトカイン（例えば、インターフェロン又はインターロイキン、例えばINF-α及びIL-2）、ワクチン（例えば、癌関連抗原を含むワクチン、例えばシプリューセル-T）、腫瘍溶解性ウイルス（例えば、天然腫瘍溶解性ウイルス、例えばレオウイルス、ニューカッスル病ウイルス、若しくはムンプスウイルス、又は遺伝子操作されたウイルス、例えば麻疹ウイルス、アデノウイルス、ワクチニアウイルス、若しくはヘルペスウイルス、EGFR若しくはHER-2等の癌関連抗原を担持する細胞を優先的に標的とするウイルス）、遺伝子治療剤（例えば、改変腫瘍抑制因子に置き換えたDNA若しくはRNA、癌遺伝子発現を遮断するDNA若しくはRNA、患者の免疫系を改善するDNA若しくはRNA、癌細胞の化学療法、放射線治療若しくは他の治療に対する感受性を高めるDNA若しくはRNA、細胞の自殺を誘導するDNA若しくはRNA、又は抗血管新生作用をもたらすDNA若しくはRNA）、及び養子T細胞（例えば、抗腫瘍活性において選択された、患者から採取された腫瘍浸潤T細胞又は癌関連抗原を認識するよう遺伝子操作された患者から採取したT細胞）からなる群から選択することができる。
【０１５２】
1つの実施形態において、1つ又は複数の抗癌薬は、酢酸アビラテロン、ABVD、ABVE、ABVE-PC、AC、AC-T、ADE、Ado-トラスツズマブエムタンシン、アファチニブマレイン酸塩、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アミノレブリン酸、アナストロゾール、アプレピタント、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼエルウィニアクリサンテミ、アキシチニブ、アザシチジン、BEACOPP、ベリノスタット、ベンダムスチン塩酸塩、BEP、ベバシズマブ、ベキサロテン、ビカルタミド、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ボスチニブ、ブレンツキシマブベドチン、ブスルファン、カバジタキセル、カボザンチニブ-S-リンゴ酸塩、CAF、カペシタビン、CAPOX、カルボプラチン、カルボプラチン-タキソール、カルフィルゾミブ、カルムスチン、カルムスチンインプラント、セリチニブ、セツキシマブ、クロラムブシル、クロラムブシル-プレドニゾン、CHOP、シスプラチン、クロファラビン、CMF、COPP、COPP-ABV、クリゾチニブ、CVP、シクロホスファミド、シタラビン、シタラビン、リポソーム製剤、ダブラフェニブ、ダカルバジン、ダクチオマイシン、ダサチニブ、ダウノルビシン塩酸塩、デシタビン、デガレリクス、デニロイキンジフチトクス、デノスマブ、塩酸デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン塩酸塩、ドキソルビシン塩酸塩リポソーム、エルトロンボパグオラミン、エンザルタミド、エピルビシン塩酸塩、EPOCH、エリブリンメシル酸塩、エルロチニブ塩酸塩、エトポシドリン酸塩、エベロリムス、エキセメスタン、FEC、フィルグラスチム、リン酸フルダラビン、フルオロウラシル、FU-LV、フルベストラント、ゲフィチニブ、ゲムシタビン塩酸塩、ゲムシタビン-シスプラチン、ゲムシタビン-オキサリプラチン、ゲムツズマブオゾガマイシン、グルカルピダーゼ、ゴセレリン酢酸塩、HPV二価ワクチン、組換えHPV四価ワクチン、Hyper-CVAD、イブリツモマブチウキセタン、イブルチニブ、ICE、イデラリシブ、イホスファミド、イマチニブ、メシレート、イミキモド、ヨード131トシツモマブ及びトシツモマブ、イピリムマブ、イリノテカン塩酸塩、イキサベピロン、トシル酸ラパチニブ、レナリドミド、レトロゾール、ロイコボリンカルシウム、酢酸リュープロリド、リポソーマルシタラビン、ロムスチン、塩酸メクロレタミン、酢酸メゲストロール、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシンC、ミトキサントロン塩酸塩、MOPP、ネララビン、ニロチニブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、オマセタキシンメペスクシネート、OEPA、OFF、OPPA、オキサリプラチン、パクリタキセル、パクリタキセルアルブミン安定化ナノ粒子製剤、PAD、パリフェルミン、パロノセトロン塩酸塩、パミドロネート二ナトリウム、パニツムマブ、パゾパニブ塩酸塩、ペグアスパラガーゼ、ペグインターフェロンα-2b、ペムブロリズマブ、ペメトレキセド二ナトリウム、ペルツズマブ、プレリキサフォル、ポマリドミド、ポナチニブ塩酸塩、プララトレキサート、プレドニゾン、プロカルバジン塩酸塩、ラジウム223二塩化物、ラロキシフェン塩酸塩、ラムシルマブ、ラスブリカーゼ、R-CHOP、R-CVP、組換えHPV二価ワクチン、組換えHPV四価ワクチン、組換えインターフェロンα-2b、レゴラフェニブ、リツキシマブ、ロミデプシン、ロミプロスチム、ルキソリチニブリン酸塩、シル���キシマブ、シプリューセル-T、トシル酸ソラフェニブ、STANFORD V、リンゴ酸スニチニブ、TAC、タルク、タモキシフェンクエン酸塩、テモゾロミド、テムシロリムス、サリドマイド、トポテカン塩酸塩、トレミフェン、トシツモマブ及びI 131ヨードトシツモマブ、TPF、トラメチニブ、トラスツズマブ、バンデタニブ、VAMP、VeIP、ベムラフェニブ、ビンブラスチン硫酸塩、ビンクリスチン硫酸塩、ビンクリスチン硫酸塩リポソーム、ビノレルビン酒石酸塩、ビスモデギブ、ボリノスタット、XELOX、Ziv-アフリベルセプト、並びにゾレドロン酸からなる群から選択される。
【０１５３】
本出願において参照した配列番号
本出願は配列番号1〜配列番号151を参照している。これらの配列番号の概説及び説明を以下の表1に挙げる：
【０１５４】
表1：明細書の配列番号のr.c.はリバース相補鎖を意味し、CからT又はGからAはCpGコンテキスト外のシトシンのウラシルへのバイサルファイト変換により変換され、続く増幅においてチミジンに置き換えられたことを意味する。bis1はバイサルファイト変換されたフォワード鎖（各ゲノムDNAの配列番号に記載の通り）及びbis2はフォワード鎖のバイサルファイト変換されたリバース相補鎖（各ゲノムDNAの配列番号のリバース相補鎖）を指し、これにより、例えば構築されたゲノム（HCGR38）から得られる場合、該鎖の方向がゲノム基準配列の方向により定義される。配列のマッピングにおいて、図2を参照されたい。
【表１−１】
0006731942.tif 000002
【表１−２】
0006731942.tif 000003
【表１−３】
0006731942.tif 000004
【０１５５】
本発明は、以下の実施例によって説明されるが、これらは単なる例示に過ぎず、本発明の範囲を限定するものではないと解釈されるものとする。
【実施例】
【０１５６】
実施例1
サンプル作製：
アッセイの評価に使用される技術的サンプルを、アッセイ領域（ヒトゲノムDNA：男性、Promega GmbH）において非メチル化であることが知られている、バイサルファイト処理したPBL（末梢血液DNA）のDNAと、メチル化DNA（汎用メチル化DNAである、DNA-メチルトランスフェラーゼで処理したDNA、Merck Chemicals GmbH）との混合物として合計10 ng/mlを作製した。非メチル化DNAに対する第2の技術的基準対照として、ゲノムワイドにランダム増幅されたDNA（Phi）を用いた。ゲノムDNA対照は、未処理のPBL DNAであった。技術的対照用に使用又は混合した他の全てのDNAを、製造業者のプロトコルに従い、EpiTect Bisulfiteキット（Qiagen GmbH）でバイサルファイト処理した後、希釈混合した。技術的サンプルにおいて、ゲノムDNAは、血中腫瘍のDNAとは対照的にフラグメント化／分解されなかった。
【０１５７】
血漿対照を、健常（非癌）患者からの3.5 ml容量の血漿（血漿、規定EDTA、Cliniqa Co.）にメチル化DNA（汎用メチル化DNAであるDNA-メチルトランスフェラーゼ処理したDNA、Merck Chemicals GmbH）をスパイクすることにより作製した。患者の血漿サンプルは、癌試験において残った肺癌患者及び健常（非癌）患者の3 ml〜3.5 mlであった。血漿中の（inplasma）肺癌DNAはフラグメント化／分解した。
【０１５８】
サンプル／DNAプロセッシング：
技術的サンプル／DNA混合物をそのまま使用した。血漿サンプルを、Epi proColon 2.0キット（Epigenomics AG）の使用説明書（IFU）に規定される事前解析ワークフローと同様にプロセッシングした。
【０１５９】
PCR反応において、血漿サンプルの約1 mlの血漿の技術的サンプル又はプロセッシングした等価物におけるそれぞれの反応のどちらにも10 ngの全DNAを用いた。本出願のアッセイ用に設計された、関連オリゴマーを含有するPCRミックスを除き、LightCycler 480（Roche Applied Sciences）によるリアルタイムPCRを、Epi proColon 2.0 PCRキット（Epigenomics AG）のPCRプロトコルに従い行った。
【０１６０】
本実施例では、ブロッカー及びプローブを用いて同一のCpGと結合し、また評価対象のFOXL2に対する2つのアッセイを比較する：1.プライマーの中間位置に不一致を含まない、既に確立されている90 bp長のHMアッセイ（FOXL2-長鎖）、このアッセイは、上記の大きさ及び特徴において種々のアッセイ代替物から選ばれており、多くの実験でプライマー／ブロッカー／プローブの配列に関して最適化されているものである。2.1つのプライマーの中間位置にメチル化非特異的な不一致を含む、新たな68 bp長のHMアッセイ（FOXL2-短鎖）。このアッセイはプライマー／ブロッカー／プローブの配列に関してまだ最適化されていないものである。
【０１６１】
結果：
アッセイを技術的サンプル（図1）及びスパイクした血漿サンプル（図2）において比較した。両方の比較では驚くべきことに、短鎖のアッセイが、最適化されておらず、またプライマーの1つのちょうど中間位置に不一致を有していたけれども、長鎖のアッセイより良好である明らかな証拠が得られた。これは驚くべきことに、短縮が感度をかなり改善しただけでなく、その作用が血中腫瘍DNAの特質であるDNAフラグメント化に左右されなかったことによるものであった（技術的サンプルでは、DNAはフラグメント化されなかった）。
【０１６２】
短鎖のアッセイの結果を、技術的サンプル及びスパイクした血漿サンプルにおける独立した実験で立証した（図3、上部）。測定可能なメチル化DNA量として、1PCR当たり10 pgのメチル化DNA（技術的サンプル）又は1PCR当たり12 pgのメチル化DNA（スパイクした血漿サンプル）程の少ないものが繰り返し示され、これは約4分子の鋳型に等しい（6 pgのDNAはおよそ1つの細胞の2倍体ゲノムの質量である）。
【０１６３】
患者の血漿材料の量が限られていることで、2つのアッセイの直接比較を行うことができず、技術的に良好に行われた短鎖のアッセイに用い、癌患者の血漿中のFOXL2メチル化を検出するための有用性を立証したに過ぎなかった（図3、下部）。
【０１６４】
実施例2
サンプル作製及びプロセッシング：
肺癌患者、良性の肺疾患患者、及び健常対照由来の血漿サンプルを、Epi proColon 2.0キット（Epigenomics AG）の使用説明書（IFU）に規定されるように採取した。つまり、EDTA用に、血漿を2つの遠心分離工程により作製した。プロセッシングまで、血漿サンプルを-70℃で保存した。肺癌例において、血液採取は、任意の癌のための特定の処置の前に行われた。対象は全て、年齢範囲が近いものであった。
【０１６５】
血漿サンプルを、Epi proColon 2.0キット（Epigenomics AG）の使用説明書（IFU）に規定される事前解析ワークフローと同様にプロセッシングした。プロセッシングした等価物の約1 mlの血漿を合計30 μlの容量用いてPCR反応を技術的反復として2連又は3連行った。AppliedBiosystems 7500 Fast Dx（Applied Biosystems）によるリアルタイムPCRを、Epi proColon 2.0 PCRキット（Epigenomics AG）のPCRプロトコルに従い行った。検討したマーカーのメチル化状態に加え、ACTBレベルを、基準物質として並行して測定した。検討したサンプルは全て、ACTB値に対する解析において有効であると定義された。データ解析及びROC解析において、技術的反復の最小Ct値を用いた。
【０１６６】
試験1：第1の試験において、基準物質としてACTBを用いた2連の反応において、肺癌例と健常対照とを比較することによりSHOX2メチル化を評価した。PCR反応は、鋳型としてEpi proColon elution製の12 μlのバイサルファイト処理したDNAを合計30 μlの容量用いて技術的反複として2連行われた。肺癌例由来の59のサンプルを検討した。26例を肺扁平上皮癌、22例を腺癌、5例をSCLC、3例をNSCLC以外、2例を腺扁平上皮癌、及び1例を大細胞癌と診断した。疾患の証拠のない個体由来の92の血漿サンプルを対照としてプロセッシングした。
【０１６７】
試験2：第2の試験において、基準物質として別のメチル化マーカー及びACTBを用いた3連の反応において、肺癌例と健常対照とを比較することによりSHOX2メチル化を評価した。PCR反応は、鋳型としてEpi proColon elution製の12 μlのバイサルファイト処理したDNAを合計30μlの容量用いて技術的反復として4連行われた。肺癌例由来の48のサンプルを検討した。26例を肺扁平上皮癌、20例を腺癌、1例をNSCLC以外、1例を大細胞癌と診断した。疾患の証拠のない個体由来の100の血漿サンプルを対照としてプロセッシングした。
【０１６８】
試験3：第3の試験において、癌以外の肺疾患におけるSHOX2メチル化状態を検討し、肺癌患者におけるSHOX2メチル化と比較した。基準物質として別のメチル化マーカー及びACTBを用いた3連の反応においてSHOX2メチル化を評価した。PCR反応は、鋳型としてEpi proColon elution製の15 μlのバイサルファイト処理したDNAを合計30 μlの容量用いて技術的反復として3連行われた。本試験では、試験I及び試験IIで用いられた肺癌患者由来の一部の検討済みの50の血漿サンプルを50の対照と比較した。これらの対照を異なる肺疾患：18例を慢性閉塞性肺疾患（COPD）、10例を肺炎、5例を喘息、5例を気管支拡張症、及び12例を他の肺疾患、例えば単包包虫感染又は骨軟骨腫症と診断した。
【０１６９】
結果：
これまでの試験における血漿中のSHOX2メチル化の検出では、288名の肺癌患者と189名の対照とを比較したROCプロットにおいて0.78の曲線下面積値の臨床成績が得られた（Kneip et al., Journal of Thoracic Oncology, Volume 6, Number 8,August 2011）。その試験では、124 bp長のアンプリコンのSHOX2アッセイを用いて、肺癌患者と健常対象とを識別していた。本明細書に記載のようにアッセイの改変により、プライマー中の不一致を可能にする改変オリゴヌクレオチドを使用し、より短い91 bp長のアンプリコンを得た（図2、SHOX2も参照されたい）。Kneip et al.のアッセイ及び本明細書に記載のアッセイは、同じCpG部位のメチル化を検出する。この本発明者のアッセイの改変では、予期せぬSHOX2の検出の改善及び良好な臨床成績が得られた。これを3つの個別の試験により例証している。
【０１７０】
試験Iは、基準遺伝子としてACTBを用いた2連の反応においてプライマー不一致（図2）を含む本発明者の新たな91 bpのSHOX2アッセイを用いた。この試験では、肺癌患者由来の59の血漿サンプルと対照として健常個体由来の92の血漿サンプルとの比較により、ROC曲線解析における0.871のAUCの改善が得られた（図6）。
【０１７１】
第2の試験では、SHOX2メチル化のレベルを、プライマー不一致を含む同じく91 bpのSHOX2アッセイを用いて、肺癌患者由来の48の血漿サンプルと、対照として健常個体由来の100の血漿サンプルとを比較することにより検討した。試験Iとは対照的に、SHOX2をACTBに加え、更なるメチル化マーカーを測定した3連の反応において測定した。アッセイの複雑性の増大にも関わらず、臨床成績はなお、ROCプロットにおいて0.893のAUCによる証拠として改善されている（図7）。
【０１７２】
第3の試験において、血漿中に認められたSHOX2メチル化が肺癌に特徴的であり、又は癌以外の他の肺癌疾患に相関し得るかを検討した。それゆえ、試験I及び試験IIの肺癌患者由来の一部の50の血漿サンプルを再度測定し、良性の肺疾患患者由来の50の血漿サンプルと比較した。再度、プライマーの不一致を含む同じく91 bpのSHOX2アッセイを用いた。ROC解析により、0.834のAUCが得られ（図8）、本明細書に記載のより短鎖の改変アッセイを用いたSHOX2メチル化の検出を用いて、健常対照だけでなく、良性の肺疾患患者も識別することができることを示した。
【０１７３】
要約すると、3つ全ての試験により、図2に示すプライマー不一致を含む本発明者の91 bpのSHOX2アッセイは驚くべきことに、両方のアッセイは同じCpG部位によるものであるが、不一致を含まない長鎖のアッセイより優れた臨床評価であることを示した。
【符号の説明】
【０１７４】
図1A
SHOX2 sequencesby IDs  配列番号別のSHOX2配列
SEQ IDs  配列番号
base position inchromosome 3  3番染色体における塩基位置
図1B
PTGER4 sequencesby IDs  配列番号別のPGER4配列
SEQ IDs  配列番号
base position inchromosome 5  5番染色体における塩基位置
図1C
FOXL2 sequencesby IDs  配列番号別のFOXL2配列
SEQ IDs  配列番号
base position inchromosome 3  3番染色体における塩基位置
図2
FOXL2 assay basedon the genomic reference SEQ ID NO: 46  ゲノム基準配列番号46に対するFOXL2アッセイ
SEQ ID NO  配列番号
blocker  ブロッカー
reverse  リバース
probe  プローブ
PTGER4 assaybased on the genomic reference SEQ ID NO: 91  ゲノム基準配列番号91に対するPTGER4アッセイ
SHOX2 assay basedon the genomic reference SEQ ID NO: 116  ゲノム基準配列番号116に対するSHOX2アッセイ
図3
FOXL-2 long  FOXL-2長鎖
FOXL-2 short  FOXL-2短鎖
0 pg mDNA in 10ng total DNA  10 ngの全DNA中の0 pgのmDNA
10 pg mDNA in 10ng total DNA  10 ngの全DNA中の10 pgのmDNA
100 pg mDNA in 10ng total DNA  10 ngの全DNA中の100 pgのmDNA
5000 pg mDNA in10 ng total DNA  10 ngの全DNA中の5000 pgのmDNA
cycle  サイクル
図4
FOXL2 long  FOXL2長鎖
FOXL2 short  FOXL2短鎖
50 pg mDNA inplasma  血漿中の50 pgのmDNA
50 pg mDNA inpos. plasma  陽性血漿中の50 pgのmDNA
plasma  血漿
pos. plasma  陽性血漿
図5
Foxl2 shorttechnical  Foxl2短鎖技術的サンプル
Foxl2 short onplasma  血漿のFoxl2短鎖
0 pg mDNA spikedin plasma  血漿にスパイクした0 pgのmDNA
12 pg mDNA spikedin plasma  血漿にスパイクした12 pgのmDNA
50 pg mDNA spikedin plasma  血漿にスパイクした50 pgのmDNA
100 pg mDNAspiked in plasma  血漿にスパイクした100 pgのmDNA
cycle  サイクル
healty  健常者
lung cancer  肺癌
図6
Sensitivity  感度
Cases  症例
Controls  対照
Specifity  特異度
図7
Sensitivity  感度
Cases  症例
Controls  対照
Specifity  特異度
図8
Sensitivity  感度
Cases  症例
Controls  対照
Specifity  特異度
【図１−Ａ】
0006731942.tif 000005
【図１−Ｂ】
0006731942.tif 000006
【図１−Ｃ】
0006731942.tif 000007
【図２】
0006731942.tif 000008
【図３】
0006731942.tif 000009
【図４】
0006731942.tif 000010
【図５−１】
0006731942.tif 000011
【図５−２】
0006731942.tif 000012
【図６】
0006731942.tif 000013
【図７】
0006731942.tif 000014
【図８】
0006731942.tif 000015
【配列表】
0006731942000001.app