(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホルマリン固定組織の生体試料中のＧＴＰアーゼＫＲａｓタンパク質（ＫＲａｓ）のレベルを測定する方法であって、質量分析法を用いて前記生体試料から調製したタンパク質消化物中のＫＲａｓフラグメントペプチドを検出し、及びその量を定量化すること、及び前記試料中のＫＲａｓタンパク質の前記レベルを計算することを含み、ここで、前記ＫＲａｓフラグメントペプチドは配列番号１のペプチドであり、
前記レベルが相対的レベルまたは絶対的レベルであり、
使用される質量分析法のモードが、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、及び／または多重選択反応モニタリング（ｍＳＲＭ）である、前記方法。
【請求項２】
前記ＫＲａｓフラグメントペプチドを検出し及び定量化する前に、前記タンパク質消化物を分画するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分画ステップが、液体クロマトグラフィ、ナノ逆相液体クロマトグラフィ、高性能液体クロマトグラフィまたは、逆相高性能液体クロマトグラフィからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質消化物が、プロテアーゼ消化物を含む、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質消化物が、トリプシン消化物を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記質量分析法が、タンデム質量分析法、イオントラップ質量分析法、三連四重極質量分析法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法、ＭＡＬＤＩ質量分析法、及び／または飛行時間形質量分析法を含む、請求項１〜３および５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記組織がパラフィン包埋組織である、請求項１〜３および５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記組織が腫瘍から得られる、請求項１〜３および５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＫＲａｓフラグメントペプチドを定量化することが、１つの生体試料中のＫＲａｓフラグメントペプチドの量と、異なる別個の生体試料中の同じＫＲａｓフラグメントペプチドの量とを比較することを含む、請求項１〜３および５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＫＲａｓフラグメントペプチドを定量化することが、公知の量の追加された内部標準ペプチドとの比較によって生体試料中の前記ＫＲａｓフラグメントペプチドの前記量を決定することを含み、前記生体試料中のＫＲａｓフラグメントペプチドが、同じアミノ酸配列を有する内部標準ペプチドと比較される、請求項１〜３および５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記内部標準ペプチドが、同位体標識したペプチドである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記同位体標識した内部標準ペプチドが、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈまたはそれらの組合せから選択された１つ以上の安定した重同位体を含む、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に援用されている、２０１４年７月１１日出願の仮特許出願第６２／０２３，６８３号に対する優先権を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＧＴＰアーゼＫＲａｓタンパク質（Ｋ−Ｒａｓ−２、Ｋｉ−Ｒａｓ及びｃ−Ｋ−Ｒａｓとも呼ばれ、本明細書中では「ＫＲａｓ」と呼ぶ）の部分配列から誘導された特異的ペプチドが提供される。各ペプチドについてのペプチド配列及びフラグメンテーション／遷移イオンは多重反応モニタリング（ＭＲＭ）アッセイと呼ぶこともでき、かつ本明細書中ではＳＲＭ／ＭＲＭと呼ばれる質量分析法に基づく選択反応モニタリング（ＳＲＭ）アッセイにおいて特に有用である。ＫＲａｓタンパク質のＳＲＭ／ＭＲＭ定量分析のためのペプチドの使用について記述される。
【０００３】
このＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、ＫＲａｓタンパク質由来の特異的ペプチドの１つ以上の相対的または絶対的定量レベルを測定するために使用可能であり、したがって、生体試料から得た所与のタンパク質調製物中のＫＲａｓタンパク質の量を測定する質量分析方法を提供する。
【０００４】
より具体的には、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、ホルマリン固定された癌患者の組織などの患者の組織試料から入手した細胞から調製された複合タンパク質溶解物試料中で直接これらのペプチドを測定することができる。内容全体が参照として本明細書に援用されている米国特許第７，４７３，５３２号に、ホルマリン固定組織からタンパク質試料を調製する方法が記載されている。米国特許第７，４７３，５３２号に記載の方法は、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手可能なＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ試薬及びプロトコルを用いて適切に実施され得る。
【０００５】
癌患者組織由来の最も広く有利に利用可能な組織形態は、ホルマリン固定され、パラフィン包埋された組織である。外科的に取出された組織のホルムアルデヒド／ホルマリン固定は、世界中で群を抜いて最も一般的な癌組織試料保存方法であり、標準的な病理学実践のための一般に認められた慣習である。ホルムアルデヒド水溶液がホルマリンと呼ばれる。「１００％」ホルマリンは、酸化及び重合度を制限するため通常はメタノールである少量の安定剤を伴う水中のホルムアルデヒド飽和溶液（約４０体積％または３７質量％）からなる。組織を保存する最も一般的な方法は、一般的に１０％中性緩衝ホルマリンとも呼ばれるホルムアルデヒド水溶液中に長時間（８時間ないし４８時間）にわたり全組織を浸漬させ、その後固定した全組織を室温で長時間保管するためにパラフィンろう内に包埋することである。したがって、ホルマリン固定された癌組織を分析するための分子分析方法が、癌患者の組織分析のための最も一般に認められ頻繁に利用されている方法である。
【０００６】
ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイに由来する結果を用いて、組織（生体試料）が採取され保存された患者または被験者の特定組織試料（例えば癌組織）試料内部のＫＲａｓタンパク質の正確かつ厳密な定量的レベルを相関することができる。これにより、癌についての診断及び予後情報が得られるばかりでなく、医師または他の医療専門家も、患者のための適切な療法をより正確に決定することができるようになる。罹患組織または他の患者試料中のタンパク質発現レベルに関する診断上、予後上及び治療上重要な情報を提供するこのようなアッセイは、コンパニオン診断アッセイと呼ばれる。例えば、このようなアッセイは、癌の病期または程度を診断し、患者が応答する確率が最も高い治療薬を決定するために設計され得る。
【発明の概要】
【０００７】
本明細書中に記載のアッセイは、ＫＲａｓタンパク質由来の特異的未修飾ペプチドの相対的または絶対的レベルを測定し、同様に、ＫＲａｓタンパク質由来の特異的修飾ペプチドの絶対的または相対的レベルも測定することができる。修飾の例としては、ペプチド上に存在し得るリン酸化アミノ酸残基及びグリコシル化アミノ酸残基が含まれる。
【０００８】
ＫＲａｓタンパク質の相対的定量レベルは、例えば、異なる試料中の個別のＫＲａｓペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積（例えばシグネチャーピーク面積または累積フラグメントイオン強度）を比較することによって、ＳＲＭ／ＭＲＭ方法により決定可能である。代替的には、多重ＫＲａｓシグネチャーペプチドのための多数のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積を比較して（ここで各ペプチドは独自の特異的ＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピークを有する）、１つの生体試料中の相対的ＫＲａｓタンパク質含有量を決定し、それを１つ以上の追加のまたは異なる生体試料中のＫＲａｓタンパク質含有量と比較することが可能である。このようにして、ＫＲａｓタンパク質由来の特定のペプチド（単複）の量、ひいてはＫＲａｓタンパク質の量が、同じ実験条件下で、２つ以上の生体試料にわたり、同じＫＲａｓペプチド（単複）との関係において決定される。さらに、ＳＲＭ／ＭＲＭ方法によりそのペプチドについてのシグネチャーピーク面積と、生体試料からの同じタンパク質調製物の内部の異なるタンパク質（単複）に由来する別の異なるペプチド（単複）についてのシグネチャーピーク面積とを比較することによって、単一の試料内部のＫＲａｓタンパク質からの所与のペプチド（単複）について、相対的定量を決定することができる。このようにして、ＫＲａｓタンパク質由来の特定のペプチドの量、ひいては、ＫＲａｓタンパク質の量が、同じ試料の内部で互いとの関係において決定される。これらのアプローチは、試料間及び試料内部で別のペプチド（単複）の量に対するＫＲａｓタンパク質由来の個別のペプチド（単複）の定量を可能にし、ここでシグネチャーピーク面積によって決定される量は、生体試料からのタンパク質調製物中のＫＲａｓペプチドの絶対的重量対体積または重量対重量の量の如何に関わらず、互いに相対的である。異なる試料間の個別のシグネチャーピーク面積についての相対的な定量データは、１試料あたりの分析されたタンパク質の量に対して正規化され得る。単一の試料中及び／または多くの試料にわたって、多数のタンパク質及びＫＲａｓタンパク質からの多くのペプチドにわたり、同時に相対的定量を行なって、他のペプチド／タンパク質との関係における１つのペプチド／タンパク質の相対的タンパク質量への見識を得ることができる。
【０００９】
ＫＲａｓタンパク質の絶対的定量レベルは、例えば、ＳＲＭ／ＭＲＭ方法により決定可能であり、これによって、１つの生体試料中のＫＲａｓタンパク質由来の個別のペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積が、スパイクされた内部標準のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピークと比較される。一実施形態において、内部標準は、１つ以上の重同位体で標識された１つ以上のアミノ酸残基を含む全く同一のＫＲａｓペプチドの合成版である。このような同位体標識内部標準は、質量分析法によって分析された場合に、天然ＫＲａｓペプチドシグネチャーピークとは異なり別個でありしたがってコンパレータピークとして使用可能である予測可能で一貫したＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピークを生成するような形で合成可能である。こうして、内部標準が公知の量で生体試料由来のタンパク質調製物中にスパイクされ質量分析法によって分析された場合、天然ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積は、内部標準ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積と比較され、この数値的比較は、生体試料由来の原初のタンパク質調製物中に存在する天然ペプチドの絶対モル濃度及び／または絶対重量のいずれかを標示する。フラグメントペプチドについての絶対的定量データが、１試料あたりの分析されたタンパク質量に応じて表示される。絶対的定量を、単一の試料中で同時に多くのペプチドひいてはタンパク質にわたり及び／または多くの標本にわたり行って、個別の生体試料中及び個別の試料中のコホート全体の中の絶対的タンパク質量への見識を得ることができる。
【００１０】
ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ方法は、例えばホルマリン固定した組織などの患者由来組織内で直接癌の病期診断及び／または患者診断を補助するため、ならびにその患者を治療する上で使用するためにどの治療薬が最も有利と考えられるかを決定するのを補助するために使用可能である。例えば部分的腫瘍または全腫瘍の治療的摘出のための外科手術を通してか、または疑わしい疾病の有無を決定するために行なわれる生検方法を通して患者から摘出された癌組織は、その患者組織内に特異的タンパク質（単複）が存在するか否か、及びどのタンパク質形態が存在するかを決定するために分析される。その上、１つのタンパク質または多数のタンパク質の発現レベルを決定し、健常組織内に見出される「正常」または基準レベルと比較することができる。健常組織内に見出されるタンパク質の正常または基準レベルは、例えば、癌を有していない１つ以上の個体の関連組織から誘導され得る。代替的には、癌を有する個体のための正常または基準レベルは、癌を患っていない関連組織の分析によって得ることができる。
【００１１】
タンパク質レベル（例えばＫＲａｓレベル）のアッセイは同様に、癌の病期を診断するためにも使用可能であり、ＫＲａｓレベルを利用することによって、癌の診断を受けた患者または被験者についての予後情報を提供できる。個別のＫＲａｓペプチドのレベルは、分析されたタンパク質溶解物の総量あたりのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイにより決定されたペプチドのモル量として定義される。したがって、ＫＲａｓタンパク質（またはＫＲａｓタンパク質のフラグメントペプチド）のレベルを正常組織内で観察したレベルと相関することによって、癌の病期または悪性度及び／または患者の予後を決定するのを補助するためにＫＲａｓに関する情報を使用することができる。癌の病期及び／または悪性度及び／またはＫＲａｓタンパク質発現特性がひとたび決定された時点で、その情報を、アッセイされたタンパク質（単複）（例えばＫＲａｓ）の異常な発現によって特徴づけられる癌組織を特異的に治療するために開発された治療薬（化学的及び生物学的）のリストに整合させることができる。ＫＲａｓタンパク質アッセイからの情報を、例えばＫＲａｓタンパク質またはこのタンパク質を発現する細胞／組織を特異的に標的にする治療薬のリストに整合させることで、疾病の治療に対する個別化医療と呼ばれているものが定義される。本明細書中に記載のアッセイ方法は、診断及び治療上の決定の源として患者自身の組織由来のタンパク質の分析を使用することによる個別化医療のアプローチの根拠を成すものである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】部分Ａ〜Ｃは、三連四重極質量分析計上で行ったＫＲａｓペプチドの定量を伴う、ホルマリン固定生体試料由来のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解物上で行なわれたＫＲａｓタンパク質由来の単一ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの一実施例を示す。ホルマリン中で固定された生体試料中のこのペプチドをどのように測定するかについての特定的特性が示されている。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
原則として、例えば公知の特異性をもつプロテアーゼ（例えばトリプシン）で消化することにより調製されたＫＲａｓタンパク質に由来する予測されたあらゆるペプチドを代理レポータして用いて、質量分析法ベースのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを使用して試料中のＫＲａｓタンパク質の存在量を決定することができる。同様にして、ＫＲａｓタンパク質内で潜在的に修飾されるものとして公知である部位においてアミノ酸残基を含むあらゆる予測ペプチド配列も同様に、試料中のＫＲａｓタンパク質の修飾の程度をアッセイするために使用可能であると考えられる。
【００１４】
ＫＲａｓフラグメントペプチドは、米国特許第７，４７３，５３２号中で提供されているＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅプロトコルを使用することを含む、さまざまな方法によって生成され得る。Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅプロトコル及び試薬は、組織／生体試料中のタンパク質のタンパク質分解消化により、ホルマリン固定パラフィン包埋組織から、質量分析法による分析に好適なペプチド試料を生成することができる。Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅプロトコルにおいて、組織／生体試料は、タンパク質架橋を逆転または解除するために、長時間にわたり（例えば約１０分から約４時間、約８０℃から約１００℃まで）緩衝液中で加熱される。利用される緩衝液は、中性緩衝液（例えばトリス系緩衝液、または洗浄剤を含む緩衝液）である。熱処理の後、組織／生体試料は、生体試料の組織及び細胞構造を分断させ試料を液化するのに充分な時間（例えば、３７℃〜６５℃の温度で３０分から２４時間の期間）、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン及びエンドプロテイナーゼＬｙｓ‐Ｃを含む（ただしこれらに限定されない）１つ以上のプロテアーゼで処理される。加熱及びタンパク質分解の結果は、液体で可溶かつ低濃度の生体分子溶解物である。
【００１５】
意外にも、ＫＲａｓタンパク質由来の多くの潜在的ペプチド配列が、直ちに明らかでない理由のために、質量分析法に基づくＳＲＭ／ＭＲＭアッセイにおける使用にとって好適でないかまたは有効でないことが発見されている。このことは特に、ホルマリン固定組織由来のペプチドについて言えることである。ＭＲＭ／ＳＲＭアッセイのために最も好適なペプチドを予測することは不可能であったことから、ＫＲａｓタンパク質用の信頼性の高い正確なＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するためには、実際のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解物中の修飾または未修飾ペプチドを実験的に同定することが必要であった。いかなる理論による束縛も望まないものの、一部のペプチドは、例えば、他のタンパク質と別個でないフラグメントを充分にイオン化または産生しないことから質量分析法による検出が困難であり得る、と考えられている。ペプチドは同様に、分離中（例えば液体クロマトグラフィ）に充分分割できない場合もあり、あるいはガラスまたはプラスチックウェアに接着する場合もある。
【００１６】
本開示のさまざまな実施形態（例えば表１及び２）に見られるＫＲａｓペプチドは、ホルマリン固定された癌組織から入手した細胞から調製された複合Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解物の内部の全てのタンパク質のプロテアーゼ消化により、ＫＲａｓタンパク質から誘導されたものである。別段の指摘の無いかぎり、各実施例において、プロテアーゼはトリプシンであった。Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解物は、このとき、質量分析法により検出され分析されるＫＲａｓタンパク質由来のペプチドを決定するために、質量分析法によって分析された。質量分析法による分析のための特定の好ましいペプチドサブセットの同定は、１）１つのタンパク質由来のどのペプチド（単複）がＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解物の質量分析法による分析においてイオン化するかの実験に基づく決定、及び２）Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解物を調製する上で使用されるプロトコル及び実験条件に生き延びるペプチドの能力、に基づくものである。この後者の特性は、ペプチドのアミノ酸配列のみならず、試料調製中に修飾形態で生き延びるペプチド内部の修飾アミノ酸残基の能力にも広がっている。
【００１７】
ホルマリン（ホルムアルデヒド）固定組織から直接入手した細胞からのタンパク質溶解物は、組織の顕微解剖を介して試料管内に細胞を採取することとそれに続いて長時間にわたりＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ緩衝液内で細胞を加熱することを必要とするＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ試薬及びプロトコルを使用して、調製された。ホルマリンで誘発された架橋にひとたびマイナスの影響が及んだならば、組織／細胞は次に、例えばトリプシンなどのプロテアーゼを用いて、予測可能な形で完全に消化されるが、他のプロテアーゼを使用することもできる。各タンパク質溶解物は、プロテアーゼを用いた無欠のポリペプチドの消化によってペプチド収集物へと変化する。各々のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解物は、ペプチドの多数の包括的プロテオーム調査を行なうために（例えばイオントラップ質量分析法により）分析され、ここで、データは、各々のタンパク質溶解物中に存在する全ての細胞タンパク質から質量分析法により同定され得るかぎりの数のペプチドの同定として提示された。
【００１８】
単一の複合タンパク質／ペプチド溶解物からの可能なかぎり多くのペプチドの同定のために包括的プロファイリングを行なうことのできるイオントラップ質量分析計または別の形態の質量分析計が利用される。しかしながら、ペプチドの包括的プロファイリングを行なうには、イオントラップ質量分析計を使用することが有利であり得る。ＭＡＬＤＩ、イオントラップまたは三連四重極を含めた任意のタイプの質量分析計上でＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発し実施することができるものの、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイのためには三連四重極型計器プラットフォームを使用することが有利である。このタイプの質量分析計は、１つの細胞内に含まれている全てのタンパク質由来の数十万ないし数百万もの個別のペプチドで構成され得る非常に複合度の高いタンパク質溶解物の内部で単一の単離された標的ペプチドを分析するための好適な計器である。
【００１９】
利用された条件下の単一の溶解物の単一のＭＳ分析内でひとたび可能なかぎり多くのペプチドが同定されたならば、次にペプチドリストが照合され、その溶解物中で検出されたタンパク質を決定するために使用された。そのプロセスは、多数のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解物について反復され、非常に大きなペプチドリストが単一のデータセットの形に照合された。このタイプのデータセットは、（プロテアーゼ消化の後に）分析された生体試料タイプの中、具体的には生体試料のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解物中で検出され得るペプチドを代表するものとみなされることができ、こうして、例えばＫＲａｓタンパク質などの特定のタンパク質のためのペプチドを含む。
【００２０】
一実施形態において、絶対量または相対量のＫＲａｓタンパク質の投与において有用であるものとして同定されたＫＲａｓトリプシンペプチドは、各々が表１に列挙されている、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７のペプチドを１つ以上、２つ以上、３つ以上または４つ以上含む。これらのペプチドの各々は、ホルマリン固定、パラフィン包埋組織から調製されたＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解物中で質量分析法により検出された。したがって、各ペプチドは、直接内部にホルマリン固定患者組織を含む、ヒト生体試料中のＫＲａｓタンパク質についての定量ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発する上で使用するための一候補である。
【００２１】
【表１】
0006670290.tif 000002
【００２２】
表１に列挙されているＫＲａｓトリプシンペプチドは、前立腺、結腸及び胸部を含めた異なる人体臓器の多数の異なるホルマリン固定組織の多数のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解物から検出されたものを含む。これらのペプチドの各々は、ホルマリン固定組織内のＫＲａｓタンパク質の定量ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイにとって有用であるとみなされている。これらの実験のさらなるデータ分析は、いずれの特定の臓器部位に由来するいずれの特異的ペプチドについても、選好性は全くないことを示した。したがって、これらのペプチドは、任意の生体試料由来または体内の任意の臓器部位由来の任意のホルマリン固定組織からのＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解物についてＫＲａｓタンパク質のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを行なうために使用され得る。
【００２３】
ＫＲａｓタンパク質由来の各ペプチドについてＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを最も効率良く実施するためには、分析においてペプチド配列に加えて情報を利用することが望ましい。この追加情報は、アッセイを有効に行なうことができるように、特定の標的ペプチド（単複）の適正な集中分析を行なうように質量分析計（例えば三連四重極質量分析計）を管理指示する上で使用し得る。
【００２４】
標的ペプチド全般及び特定のＫＲａｓペプチドについての追加情報は、ペプチドのモノアイソトピック質量、その前駆体荷電状態、前駆体ｍ／ｚ値、ｍ／ｚ遷移イオン及び各遷移イオンのイオンタイプを含み得る。表２は、表１内のリストからのＫＲａｓペプチドのうちの１つについてのＫＲａｓタンパク質のためのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するのに使用され得る追加のペプチド情報を示す。表２内の例により示された１つのＫＲａｓペプチドについて説明された類似の追加情報を作製し、獲得しかつ表１に含まれている他のペプチドに適用することができる。
【００２５】
【表２】
0006670290.tif 000003
【００２６】
以下で説明する方法は、１）ＫＲａｓタンパク質についての質量分析法を用いたＳＲＭ／ＭＲＭアッセイのために使用可能であるＫＲａｓタンパク質からの候補ペプチドを同定するため、２）相関する目的でＫＲａｓタンパク質由来の標的ペプチドについて個別のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ（単複）を開発するため、及び３）癌診断及び／または最適な療法の選択に対し、定量アッセイを適用するために使用された。
【００２７】
アッセイ方法
１．  ＫＲａｓタンパク質のためのＳＲＭ／ＭＲＭ候補フラグメントペプチドの同定
ａ．  タンパク質を消化するため、（トリプシンを含んでいても含まなくともよい）プロテアーゼ（単複）を用いて、ホルマリン固定生体試料からＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解物を調製する。
ｂ．  イオントラップタンデム質量分析計上でＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解物中の全てのタンパク質フラグメントを分析し、個別のフラグメントペプチドがリン酸化反応またはグリコシル化などのいかなるペプチド修飾も含んでいないＫＲａｓタンパク質由来の全てのフラグメントペプチドを同定する。
ｃ．  イオントラップタンデム質量分析計上でＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解物中の全てのタンパク質フラグメントを分析し、例えばリン酸化またはグリコシル化残基などのペプチド修飾を担持するＫＲａｓタンパク質由来の全てのフラグメントペプチドを同定する。
ｄ．  完全長ＫＲａｓタンパク質全体から特定の消化方法によって生成された全てのペプチドは潜在的に測定可能であるが、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの開発のために使用される好ましいペプチドは、ホルマリン固定生体試料から調製された複合Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅタンパク質溶解物中で直接質量分析法によって同定されるものである。
ｅ．  患者組織内の特異的に修飾され（リン酸化、グリコシル化など）、ホルマリン固定生体試料からのＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解物を分析する場合に質量分析計中でイオン化し、ひいては検出されるペプチドは、ＫＲａｓタンパク質のペプチド修飾をアッセイするための候補ペプチドとして同定される。
【００２８】
２．  ＫＲａｓタンパク質由来のフラグメントペプチドのための質量分析法アッセイ
ａ．  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解物中で同定された個別のフラグメントペプチドのための三連四重極質量分析計上でのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイが、ＫＲａｓタンパク質由来のペプチドに適用される。
ｉ．  ゲル電気泳動法、液体クロマトグラフィ、キャピラリー電気泳動法、ナノ逆相液体クロマトグラフィ、高性能液体クロマトグラフィ、または逆相高性能液体クロマトグラフィを含む（ただしこれらに限定されない）最適なクロマトグラフィ条件のための、フラグメントペプチドの最適保持時間を決定する。
ｉｉ．  各ペプチドのためのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発する目的で、ペプチドのモノアイソトピック質量、各ペプチドについての前駆体荷電状態、各ペプチドについての前駆体ｍ／ｚ、各ペプチドについてのｍ／ｚ遷移イオン、及び各フラグメントペプチドについての各遷移イオンのイオンタイプを決定する。
ｉｉｉ．  次に、（ｉ）及び（ｉｉ）に由来する情報を用いて、三連四重極質量分析計上でＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを行なうことができるが、各ペプチドは三連四重極質量分析計上で行なわれる通りの固有のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを厳密に定義する１つの特徴的な固有のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピークを有している。
ｂ．  ＳＲＭ／ＭＲＭ質量分析法による分析からの固有のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積の一関数として検出されているＫＲａｓタンパク質のフラグメントペプチドの量が、特定のタンパク質溶解物中のタンパク質の相対量及び絶対量の両方を表わすことができるような形で、ＳＲＭ／ＭＲＭ分析を行なう。
ｉ．  相対的定量は、以下のことによって達成し得る：
１．  １つのホルマリン固定生体試料由来のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解物中で検出された所与のＫＲａｓペプチドからのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積と、少なくとも第２、第３、第４またはそれ以上のホルマリン固定生体試料由来の少なくとも第２、第３、第４またはそれ以上のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解物中の同じＫＲａｓフラグメントペプチドの同じＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積とを比較することによって、ＫＲａｓタンパク質の存在の増加または減少を決定する。
２．  １つのホルマリン固定生体試料由来のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解物中で検出された所与のＫＲａｓペプチドからのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積と、異なる別個の生体供給源から誘導された他の試料中の他のタンパク質由来のフラグメントペプチドから開発されたＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積とを比較することにより、ＫＲａｓタンパク質の存在の増加または減少を決定する。ここで１つのペプチドフラグメントについての２つの試料の間のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積の比較は、各試料中で分析されたタンパク質の量に対して正規化される。
３．  さまざまな細胞条件下でその発現レベルを変化させない他のタンパク質のレベルに対しＫＲａｓタンパク質の変化するレベルを正規化するために、所与のＫＲａｓペプチドについてのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積と、ホルマリン固定生体試料由来の同じＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解物中の異なるタンパク質から誘導された他のフラグメントペプチドからのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積とを比較することによって、ＫＲａｓタンパク質の存在の増加または減少を決定する。
４．  これらのアッセイは、ＫＲａｓタンパク質の未修飾フラグメントペプチド及び修飾フラグメントペプチドの両方に適用でき、ここで修飾には、非限定的に、リン酸化反応及び／またはグリコシル化が含まれ、ここで修飾ペプチドの相対的レベルは、未修飾ペプチドの相対量を決定する場合と同じ形で決定される。
ｉｉ.  所与のペプチドの絶対的定量は、個別の生体試料中のＫＲａｓタンパク質由来の所与のフラグメントペプチドについてのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積と、生体試料からタンパク質溶解物中にスパイクされた内部フラグメントペプチド標準のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積とを比較することにより達成され得る。
１．  内部標準は、調査中のＫＲａｓタンパク質由来のフラグメントペプチドの標識された合成版である。この標準は、公知の量で試料中にスパイクされ、ＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積は、生体試料中の天然フラグメントペプチドと内部フラグメントペプチド標準の両方について別個に決定されて、それに続いて両方のピーク面積が比較され得る。
２．  これは、未修飾フラグメントペプチドと修飾フラグメントペプチドに対して適用され得、ここで修飾には、非限定的に、リン酸化反応及び／またはグリコシル化が含まれ、ここで、修飾ペプチドの絶対レベルは、未修飾ペプチドの絶対レベルの決定と同じ形で決定可能である。
【００２９】
３．  癌診断及び治療に対してフラグメントペプチドの定量を応用する
ａ．  ＫＲａｓタンパク質のフラグメントペプチドレベルの相対的及び／または絶対的定量を行ない、癌の分野では充分に理解されている通り、患者の腫瘍組織内の癌の病期／悪性度／状態に対するＫＲａｓタンパク質発現の予め決定された関連性が確認されることを実証する。
ｂ．  ＫＲａｓタンパク質のフラグメントペプチドレベルの相対的及び／または絶対的定量を行ない、異なる処理戦略からの臨床的成果との相関関係を実証する。ここで、この相関関係は、該分野においてすでに実証されたものであるか、または患者コホートにわたる相関研究を通して将来実証され得るものである。以前に、立証された相関関係または将来に誘導される相関関係のいずれかがひとたびこのアッセイによって確認された時点で、最適な治療戦略を決定するために、このアッセイ方法を使用することができる。
【００３０】
図１は、ホルマリン固定生体試料由来のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解物について行なわれた単一のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの一例を示す。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、三連四重極質量分析計上でのＫＲａｓタンパク質の定量を目的とする単一のペプチド用として開発された。このＫＲａｓペプチド（配列ＳＦＥＤＩＨＨＹＲ）についての特異的かつ固有の特性は、イオントラップ及び三連四重極質量分析計の両方の上での全てのＫＲａｓペプチドの分析によって開発されたものであり、図１Ａ中に示されている。この情報には、ペプチドのモノアイソトピック質量、その前駆体荷電状態前駆体ｍ／ｚ値、前駆体の遷移ｍ／ｚ値及び同定された遷移の各々のイオンタイプが含まれる。この情報は、ホルマリン固定された試料／タンパク質由来のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解物中で直接、各々全ての候補ＳＲＭ／ＭＲＭペプチドについて実験により決定されなければならない。これは、興味深いことに、ＫＲａｓタンパク質由来の全てのペプチドを、本明細書中に記載の通りのＳＲＭ／ＭＲＭを用いてこのような溶解物中で検出できるわけではないことが理由であり、このことは、検出されなかったＫＲａｓペプチドを、ホルマリン固定試料／タンパク質由来のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解物中で直接ペプチド／タンパク質を定量する上で使用するためのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発する目的の候補ペプチドとみなすことはできない、ということを表わしている。
【００３１】
図１Ｂに示されている通り、この特定のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを、三連四重極質量分析計上で行なった。この実験における実験用試料は、組織代用として作用するようにホルマリン固定されパラフィン包埋された細胞系統から調製されたＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅタンパク質であった。このアッセイからのデータは、ホルマリン固定試料中のこのＫＲａｓペプチドのための固有のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピークの存在を標示する。
【００３２】
図１Ｃは、ホルマリン固定された生体試料中の上述のペプチドを定量的に測定するためにこのペプチドのための特異的遷移イオン特性が使用されることを示している。これらのデータは、分析されたタンパク質溶解物１マイクログラムあたりのペプチドのモル量の一関数としてこのＫＲａｓペプチドの絶対量を標示する。ホルマリン固定された患者由来のタンパク質の分析に基づいたタンパク質内のＫＲａｓタンパク質レベルの査定は、各々の特定の患者についての診断、予後及び治療関連情報を提供することができる。一実施形態において、本開示は、生体試料中のＧＴＰアーゼＫＲａｓタンパク質のレベルを測定する方法において、質量分析法を用いて該生体試料から調製したタンパク質消化物中の１つ以上の修飾または未修飾ＫＲａｓフラグメントペプチドを検出しその量を定量化すること、及び該試料中の修飾または未修飾ＫＲａｓタンパク質のレベルを計算することを含む方法であって、ここでレベルが相対的レベルまたは絶対的レベルである、方法について説明している。関連する実施形態においては、１つ以上のＫＲａｓフラグメントペプチドを定量化することが、公知の量の追加された内部標準ペプチドとの比較によって生体試料中のＫＲａｓフラグメントペプチドの各々の量を決定することを含み、生体試料中のＫＲａｓフラグメントペプチドの各々が、同じアミノ酸配列を有する内部標準ペプチドと比較される。一部の実施形態において、同位体標識した内部標準ペプチドが、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈまたはそれらの組合せから選択された１つ以上の安定した重同位体を含む。
【００３３】
本明細書中に記載された生体試料中のＫＲａｓタンパク質（またはその代用物としてのフラグメントペプチド）のレベルを測定する方法は、患者または被験者の体内の癌の診断及び／または予後の指標として使用され得る。一実施形態において、ＫＲａｓタンパク質のレベルの測定からの結果は、タンパク質内で見出されたＫＲａｓタンパク質のレベルと、正常な及び／または癌状態または前癌状態のタンパク質とを相関（例えば比較）することによって、癌の診断病期／悪性度／状態及び／または予後状態を決定するために利用され得る。
【００３４】
核酸及びタンパク質の両方共が同じＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）生体分子調製物から分析可能であることから、タンパク質が分析されたものと同じ試料中の核酸から疾病診断及び薬剤治療の決定についての追加情報を生成することが可能である。例えば、一部の細胞によりＫＲａｓタンパク質が増大したレベルで発現される場合、ＳＲＭによりアッセイされた時点でデータは、細胞の状態についての情報を提供することができ、これらの細胞の無制御な成長の可能性、薬剤耐性の可能性及び癌の発達を得ることができる。同時に、ＫＲａｓ遺伝子及び／またはそれらがコードする核酸及びタンパク質の状態（例えば、ｍＲＮＡ分子及びそれらの発現レベルまたはスプライス変異）についての情報を、同じＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）生体分子調製物中に存在する核酸から得ることができ、これをＫＲａｓタンパク質のＳＲＭ分析と同時に査定することができる。ＫＲａｓ由来でなく同じ生体分子調製物中に存在するあらゆる遺伝子及び／または核酸を、ＫＲａｓタンパク質のＳＲＭ分析と同時に査定することができる。一実施形態において、ＫＲａｓタンパク質及び／または１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上の追加のタンパク質に関する情報は、これらのタンパク質をコードする核酸を検査することによって査定され得る。これらの核酸は、例えば、シークエンシング方法、ポリメラーゼ連鎖反応方法、制限酵素断片長多型分析、欠失、挿入の同定、及び／または非限定的に単一塩基対多型、遷移、トランス版またはそれらの組合せを含む変異の決定のうちの１つ以上、２つ以上または３つ以上により検査可能である。
【００３５】
本発明の１つの態様によれば、以下が提供される。
（１）生体試料中のＧＴＰアーゼＫＲａｓタンパク質（ＫＲａｓ）のレベルを測定する方法であって、質量分析法を用いて前記生体試料から調製したタンパク質消化物中の１つ以上の修飾または未修飾ＫＲａｓフラグメントペプチドを検出し、および／またはその量を定量化すること、及び前記試料中の修飾または未修飾ＫＲａｓタンパク質の前記レベルを計算することを含み、
前記レベルが相対的レベルまたは絶対的レベルである、前記方法。
（２）１つ以上の修飾または未修飾ＫＲａｓフラグメントペプチドを検出し及び／または定量化する前に、前記タンパク質消化物を分画するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
（３）前記分画ステップが、ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィ、キャピラリー電気泳動法、ナノ逆相液体クロマトグラフィ、高性能液体クロマトグラフィまたは、逆相高性能液体クロマトグラフィからなる群から選択される、（２）に記載の方法。
（４）前記生体試料の前記タンパク質消化物が、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅプロトコルによって調製される、（１）ないし（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記タンパク質消化物が、プロテアーゼ消化物を含む、（１）ないし（３）のいずれかに記載の方法。
（６）前記タンパク質消化物が、トリプシン消化物を含む、（５）に記載の方法。
（７）前記質量分析法が、タンデム質量分析法、イオントラップ質量分析法、三連四重極質量分析法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法、ＭＡＬＤＩ質量分析法、及び／または飛行時間形質量分析法を含む、（１）ないし（６）のいずれかに記載の方法。
（８）使用される質量分析法のモードが、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、及び／または多重選択反応モニタリング（ｍＳＲＭ）である、（７）に記載の方法。
（９）前記ＫＲａｓフラグメントが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７として明記されたアミノ酸配列を含む、（１）ないし（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）前記生体試料が、血液試料、尿試料、血清試料、腹水試料、喀痰試料、リンパ液、唾液試料、細胞または固体組織である、（１）ないし（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）前記組織がホルマリン固定組織である、（１０）に記載の方法。
（１２）前記組織がパラフィン包埋組織である、（１０）または（１１）に記載の方法。
（１３）前記組織が腫瘍から得られる、（１０）に記載の方法。
（１４）前記腫瘍が原発性腫瘍である、（１３）に記載の方法。
（１５）前記腫瘍が続発性腫瘍である、（１３）に記載の方法。
（１６）修飾または未修飾ＫＲａｓフラグメントペプチドを定量化することをさらに含む、（１）ないし（１５）のいずれかに記載の方法。
（１７）前記ＫＲａｓフラグメントペプチドを定量化することが、１つの生体試料中で配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７に示されている通りのＫＲａｓの約８個ないし約４５個のアミノ酸残基のアミノ酸配列を含む１つ以上のＫＲａｓフラグメントペプチドの量と、異なる別個の生体試料中の同じＫＲａｓフラグメントペプチドの量とを比較することを含む、（１６）に記載の方法。
（１８）１つ以上のＫＲａｓフラグメントペプチドを定量化することが、公知の量の追加された内部標準ペプチドとの比較によって生体試料中の前記ＫＲａｓフラグメントペプチドの各々の前記量を決定することを含み、前記生体試料中のＫＲａｓフラグメントペプチドの各々が、同じアミノ酸配列を有する内部標準ペプチドと比較される、（１７）に記載の方法。
（１９）前記内部標準ペプチドが、同位体標識したペプチドである、（１８）に記載の方法。
（２０）前記同位体標識した内部標準ペプチドが、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈまたはそれらの組合せから選択された１つ以上の安定した重同位体を含む、（１９）に記載の方法。
（２１）前記タンパク質消化物中の１つ以上の修飾または未修飾ＫＲａｓフラグメントペプチドを検出し及び／または定量化することが、修飾または未修飾ＫＲａｓタンパク質の存在及び被験者の癌との関連性を標示する、（１）ないし（２０）のいずれかに記載の方法。
（２２）前記１つ以上の修飾または未修飾ＫＲａｓフラグメントペプチドを検出及び／または定量化することの結果、または前記ＫＲａｓタンパク質のレベルを、前記癌の診断病期／悪性度／状態と相関することをさらに含む、（２１）に記載の方法。
（２３）前記１つ以上の修飾または未修飾ＫＲａｓフラグメントペプチドを検出及び／または定量化することの結果、または前記ＫＲａｓタンパク質のレベルを、前記癌の診断病期／悪性度／状態と相関させることが、多重フォーマットで他のタンパク質または他のタンパク質由来のペプチドを検出及び／または定量化して前記癌の診断病期／悪性度／状態についての追加情報を提供することと組合わされる、（２２）に記載の方法。
（２４）前記生体試料が得られた被験者のために、１つ以上のＫＲａｓフラグメントペプチドの存在、不在または量、またはＫＲａｓタンパク質のレベルに基づいて、１つの治療を選択することをさらに含む、（１）ないし（２３）のいずれかに記載の方法。
（２５）前記生体試料が得られた被験者に対して治療上有効な量の治療薬を投与することをさらに含み、前記治療薬及び／または投与される前記治療薬の量が、１つ以上の修飾または未修飾ＫＲａｓフラグメントペプチドの量またはＫＲａｓタンパク質のレベルに基づくものである、（１）ないし（２４）のいずれかに記載の方法。
（２６）治療薬が前記ＫＲａｓタンパク質を結合させ及び／またはその生体活性を阻害する、２４）又は（２５）に記載の方法。
（２７）前記治療薬が、ＫＲａｓ発現癌細胞を特異的に標的とするレオリシンまたは他の薬剤から選択される、２６）２６）に記載の方法。
（２８）前記生体試料が、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅプロトコル及び試薬を用いて１つ以上の修飾または未修飾ＫＲａｓフラグメントペプチドの前記量を定量化するために処理されたホルマリン固定腫瘍組織である、（１）ないし（２７）のいずれかに記載の方法。
（２９）前記ＫＲａｓフラグメントペプチドが、配列番号1として記載の前記アミノ酸配列を有する、（９）に記載の方法。
【図１】
0006670290.tif 000004
【配列表】
0006670290000001.app