(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞を培養し、胚様体を形成する胚様体形成工程と、
前記胚様体を培養し、中胚葉を誘導する中胚葉誘導工程と、
前記中胚葉誘導後の胚様体をエストラジオール、エストロン及びエストリオールからなる群より選択される一種以上の存在下で培養し、心筋細胞を誘導する心筋細胞誘導工程と、
前記心筋細胞誘導後の胚様体を解離する胚様体解離工程とを含み、
前記胚様体解離工程が、前記中胚葉誘導工程開始から４０日目までの間に行われることを特徴とする心筋細胞の製造方法。
【請求項２】
胚様体解離工程が、中胚葉誘導工程開始１６日目から３０日目までの間に行われる請求項１に記載の心筋細胞の製造方法。
【請求項３】
胚様体解離工程における、胚様体とタンパク質分解酵素とを連続して接触させる時間が１分間〜３０分間である請求項１から２のいずれかに記載の心筋細胞の製造方法。
【請求項４】
胚様体解離工程を複数回行う請求項１から３のいずれかに記載の心筋細胞の製造方法。
【請求項５】
胚様体解離工程後の心筋細胞を培養し、成熟化させる心筋細胞成熟化工程を含む請求項１から４のいずれかに記載の心筋細胞の製造方法。
【請求項６】
非心筋細胞の成長を抑制する非心筋細胞成長抑制工程を含む請求項５に記載の心筋細胞の製造方法。
【請求項７】
非心筋細胞成長抑制工程が、心筋細胞誘導工程と胚様体解離工程との間、及び胚様体解離工程と心筋細胞成熟化工程との間の少なくともいずれかで行われる請求項６に記載の心筋細胞の製造方法。
【請求項８】
心筋細胞が、肥大型心筋症、心肥大、及びヌーナン症候群の少なくともいずれかに対する予防乃至治療薬のスクリーニング方法、並びに心室型心筋細胞の製造の少なくともいずれかに用いられる請求項１から７のいずれかに記載の心筋細胞の製造方法。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかに記載の心筋細胞の製造方法により製造された心筋細胞に蛍光ＲＮＡプローブを導入する蛍光ＲＮＡプローブ導入工程と、
前記蛍光ＲＮＡプローブに由来する蛍光を発する細胞を分取する分取工程とを含むことを特徴とする心室型心筋細胞の製造方法。
【請求項１０】
蛍光ＲＮＡプローブの標的遺伝子が、ＭＹＬ２遺伝子、ＩＲＸ４遺伝子、ＭＹＬ３遺伝子、及びＲＰＬ３Ｌ遺伝子の少なくともいずれかである請求項９に記載の心室型心筋細胞の製造方法。
【請求項１１】
蛍光ＲＮＡプローブの標的遺伝子が、ＭＹＬ２遺伝子である請求項９から１０のいずれかに記載の心室型心筋細胞の製造方法。
【請求項１２】
肥大型心筋症、心肥大、及びヌーナン症候群の少なくともいずれかに対する予防乃至治療薬のスクリーニング方法であって、
請求項１〜８のいずれかに記載の製造方法により製造された心筋細胞、及び請求項９〜１１のいずれかに記載の製造方法により製造された心室型心筋細胞の少なくともいずれかを用いることを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項１３】
心筋細胞、及び心室型心筋細胞の少なくともいずれかに被験物質を投与する被験物質投与工程と、
前記被験物質を投与された心筋細胞、及び前記心室型心筋細胞の少なくともいずれかを測定する測定工程と、
前記測定工程の結果を指標として、前記被験物質の肥大型心筋症、心肥大、及びヌーナン症候群の少なくともいずれかに対する予防乃至治療効果を判定する判定工程とを含む請求項１２に記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
前記判定工程が、心室型心筋細胞の面積、及び心室型心筋細胞の細胞骨格異常の少なくともいずれかを指標とする請求項１３に記載のスクリーニング方法。
【請求項１５】
請求項１から８のいずれかに記載の心筋細胞の製造方法により製造された心筋細胞を用い、
免疫染色により、心室型心筋細胞と、心房型心筋細胞とを区別する工程を含む請求項１２から１４のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項１６】
測定工程が、細胞質染色化合物により心筋細胞を染色し、前記心筋細胞の面積を測定する処理と、アクチン繊維染色化合物により心筋細胞を染色し、前記アクチン繊維染色化合物による染色強度を測定する処理とを含む請求項１３から１５のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心筋細胞の製造方法、心室型心筋細胞及びその製造方法、並びに肥大型心筋症、心肥大、及びヌーナン症候群の少なくともいずれかに対する予防乃至治療薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、多能性幹細胞の１つである人工多能性幹細胞（以下、「ｉＰＳ細胞」と称することがある）の研究が進められている。例えば、ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導した心筋細胞は、再生医療、創薬研究、薬物安全性試験などの様々な用途への応用が期待されている。
【０００３】
再生医療では、例えば、自己のｉＰＳ細胞やバンキングされたｉＰＳ細胞から分化誘導された心筋細胞を心臓に移植することにより、失われた心臓の機能を回復させることが期待されている。また、創薬研究では、例えば、健常者のｉＰＳ細胞や難病患者から作製された疾患特異的ｉＰＳ細胞から分化誘導された心筋細胞を解析やスクリーニングに利用し、循環器疾患や難病に対する新薬を開発することが期待されている。また、薬物安全性試験では、開発中もしくは開発された薬の心毒性のスクリーニングのために心筋細胞を用いたりすることが期待されている。
【０００４】
これまでに、心筋細胞を製造する方法として、胚様体形成法でサイトカインを用いて心筋細胞を分化誘導する方法（例えば、非特許文献１参照）、接着培養でサイトカインを使わずに心筋細胞を分化誘導する方法（例えば、非特許文献２参照）、接着培養と、浮遊培養とを併用し、サイトカインを使わずに心筋細胞を分化誘導する方法（例えば、非特許文献３参照）などが提案されている。
しかしながら、これらの提案で製造される心筋細胞は、再生医療、創薬研究、薬物安全性試験などの様々な用途への応用を考えると、品質的に十分とは言えないという問題がある。
【０００５】
そのため、大きく明瞭なプラトー相を有する活動電位を示し、また、大きなピークカリウム電流、ピークカルシウム電流、及びピークナトリウム電流を安定して示す高品質な心筋細胞が求められているのが現状である。
【０００６】
また、上記提案の技術で製造される心筋細胞には、多くの非心筋細胞が混入してしまうという問題や、心筋細胞の非均質性という問題もある。
前記心筋細胞の非均質性とは、異なる性質を有するペースメーカー型心筋細胞、心房型心筋細胞、心室型心筋細胞が混在していることを言う。
前記非心筋細胞の混入や、心筋細胞の非均質性によって、例えば、前記心筋細胞を再生医療に利用した際には、不整脈源性や発がん性が問題となり、創薬研究や薬物安全性試験に利用した際には不正確な結果が得られてしまう可能性があるという問題がある。
【０００７】
そのため、非心筋細胞の混入や、心筋細胞の非均質性を低減することができる心筋細胞の製造方法も求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｙａｎｇ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．、  Ｈｕｍａｎ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｖｅｌｏｐ  ｆｒｏｍ  ａ  ＫＤＲ＋  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ−ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．、  Ｎａｔｕｒｅ．、  ２００８  Ｍａｙ  ２２；４５３（７１９４）：５２４−８
【非特許文献２】Ｌｉａｎ  Ｘ，  ｅｔ  ａｌ．、  Ｒｏｂｕｓｔ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．、  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．、  ２０１２  Ｊｕｌｙ  ３；１０９（２７）：Ｅ１８４８−５７
【非特許文献３】Ｍｉｎａｍｉ  Ｉ，  ｅｔ  ａｌ．、  Ａ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｔｈａｔ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｃａｒｄｉａｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｕｎｄｅｒ  ｄｅｆｉｎｅｄ，  ｃｙｔｏｋｉｎｅ−  ａｎｄ  ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．、  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．、  ２０１２  Ｎｏｖ  ２９；２（５）：１４４８−６０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、高品質な心筋細胞を製造することが可能な心筋細胞の製造方法、非心筋細胞の混入や、心筋細胞の非均質性が低減されており、高品質である心室型心筋細胞及びその製造方法、並びに心筋細胞及び心室型心筋細胞の少なくともいずれかを用いた肥大型心筋症、心肥大、及びヌーナン症候群の少なくともいずれかに対する予防乃至治療薬のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  多能性幹細胞を培養し、胚様体を形成する胚様体形成工程と、
前記胚様体を培養し、中胚葉を誘導する中胚葉誘導工程と、
前記中胚葉誘導後の胚様体を培養し、心筋細胞を誘導する心筋細胞誘導工程と、
前記心筋細胞誘導後の胚様体を解離する胚様体解離工程とを含み、
前記胚様体解離工程が、前記中胚葉誘導工程開始から４０日目までの間に行われることを特徴とする心筋細胞の製造方法である。
＜２＞  前記＜１＞に記載の心筋細胞の製造方法により製造された心筋細胞に蛍光ＲＮＡプローブを導入する蛍光ＲＮＡプローブ導入工程と、
前記蛍光ＲＮＡプローブに由来する蛍光を発する細胞を分取する分取工程とを含むことを特徴とする心室型心筋細胞の製造方法である。
＜３＞  活動電位振幅が１４０ｍＶ以上であり、３００ｐＡ以上のピークカリウム電流、１ｎＡ以上のピークカルシウム電流、及び６．５ｎＡ以上のピークナトリウム電流を示すことを特徴とする心室型心筋細胞である。
＜４＞  肥大型心筋症、心肥大、及びヌーナン症候群の少なくともいずれかに対する予防乃至治療薬のスクリーニング方法であって、
心筋細胞、及び心室型心筋細胞の少なくともいずれかを用いることを特徴とするスクリーニング方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、高品質な心筋細胞を製造することが可能な心筋細胞の製造方法、非心筋細胞の混入や、心筋細胞の非均質性が低減されており、高品質である心室型心筋細胞及びその製造方法、並びに心筋細胞及び心室型心筋細胞の少なくともいずれかを用いた肥大型心筋症、心肥大、及びヌーナン症候群の少なくともいずれかに対する予防乃至治療薬のスクリーニング方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、製造例２において、蛍光ＲＮＡプローブを導入しなかった場合の結果を示す図である。
【図２】図２は、製造例２において、蛍光ＲＮＡプローブとしてＳＦ１０２を導入した場合の結果を示す図である。
【図３】図３は、製造例２において、蛍光ＲＮＡプローブとしてＭＹＬ２−１を導入した場合の結果を示す図である。
【図４】図４は、製造例２において、蛍光ＲＮＡプローブとしてＭＹＬ２−２を導入した場合の結果を示す図である。
【図５】図５は、製造例２において、蛍光ＲＮＡプローブとしてＭＹＬ３−１を導入した場合の結果を示す図である。
【図６】図６は、製造例２において、蛍光ＲＮＡプローブとしてＭＹＬ３−２を導入した場合の結果を示す図である。
【図７】図７は、製造例２において、蛍光ＲＮＡプローブとしてＩＲＸ４−１を導入した場合の結果を示す図である。
【図８】図８は、製造例２において、蛍光ＲＮＡプローブとしてＩＲＸ４−２を導入した場合の結果を示す図である。
【図９】図９は、製造例２において、蛍光ＲＮＡプローブとしてＲＰＬ３Ｌ−１を導入した場合の結果を示す図である。
【図１０】図１０は、製造例２において、蛍光ＲＮＡプローブとしてＲＰＬ３Ｌ−２を導入した場合の結果を示す図である。
【図１１】図１１は、試験例１において、ＦＡＣＳでソーティングを行った結果を示す図である。
【図１２】図１２は、試験例１において、ＦＡＣＳでソーティングを行った結果を示す図である。
【図１３】図１３は、試験例２における遺伝子の発現量を解析した結果を示す図である。
【図１４】図１４は、試験例３におけるＭＹＬ２陽性分画の細胞の活動電位の代表的な一例を示す図である。
【図１５】図１５は、試験例３におけるＭＹＬ２陰性分画の細胞の活動電位の代表的な一例を示す図である。
【図１６】図１６は、試験例５における遺伝子の発現量を解析した結果を示す図である。
【図１７】図１７は、試験例７において、本発明の方法により精製した心室型心筋細胞のナトリウム電流を解析した結果を示す図である。
【図１８】図１８は、試験例７において、市販のｉＣｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓのナトリウム電流を解析した結果を示す図である。
【図１９】図１９は、試験例７において、市販のＲｅｐｒｏＣａｒｄｉｏのナトリウム電流を解析した結果を示す図である。
【図２０】図２０は、試験例７において、本発明の方法により精製した心室型心筋細胞のカリウム電流を解析した結果を示す図である。
【図２１】図２１は、試験例７において、市販のｉＣｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓのカリウム電流を解析した結果を示す図である。
【図２２】図２２は、試験例７において、市販のＲｅｐｒｏＣａｒｄｉｏのカリウム電流を解析した結果を示す図である。
【図２３】図２３は、試験例７において、本発明の方法により精製した心室型心筋細胞のカルシウム電流を解析した結果を示す図である。
【図２４】図２４は、試験例７において、市販のｉＣｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓのカルシウム電流を解析した結果を示す図である。
【図２５】図２５は、試験例７において、市販のＲｅｐｒｏＣａｒｄｉｏのカルシウム電流を解析した結果を示す図である。
【図２６】図２６は、試験例８における健常者由来ｉＰＳ細胞を用いて製造された心筋細胞を免疫染色した代表的な一例を示す図である。
【図２７】図２７は、試験例８におけるにおける肥大型心筋症患者由来ｉＰＳ細胞を用いて製造された心筋細胞を免疫染色した代表的な一例を示す図である。
【図２８】図２８は、試験例８のハイコンテンツ解析機器による細胞面積を解析した結果を示す図である。
【図２９】図２９は、試験例８のハイコンテンツ解析機器による細胞の真円率を解析した結果を示す図である。
【図３０】図３０は、試験例８のハイコンテンツ解析機器による核の面積を解析した結果を示す図である。
【図３１】図３１は、試験例８のハイコンテンツ解析機器による核の真円率を解析した結果を示す図である。
【図３２】図３２は、試験例８のハイコンテンツ解析機器によるファロイジン染色強度を解析した結果を示す図である。
【図３３】図３３は、試験例８のハイコンテンツ解析機器付属のテクスチャ解析の項目の“Ｈｏｌｅ”を解析した結果を示す図である。
【図３４】図３４は、試験例８のハイコンテンツ解析機器付属のテクスチャ解析の項目の“Ｅｄｇｅ”を解析した結果を示す図である。
【図３５】図３５は、試験例８のハイコンテンツ解析機器付属のテクスチャ解析の項目の“Ｒｉｄｇｅ”を解析した結果を示す図である。
【図３６】図３６は、試験例８のハイコンテンツ解析機器付属のテクスチャ解析の項目の“Ｖａｌｌｅｙ”を解析した結果を示す図である。
【図３７】図３７は、試験例８のハイコンテンツ解析機器付属のテクスチャ解析の項目の“Ｂｒｉｇｈｔ”を解析した結果を示す図である。
【図３８】図３８は、試験例８のハイコンテンツ解析機器付属のテクスチャ解析の項目の“Ｄａｒｋ”を解析した結果を示す図である。
【図３９】図３９は、試験例８のハイコンテンツ解析機器付属のテクスチャ解析の項目の“Ｓａｄｄｌｅ”を解析した結果を示す図である。
【図４０】図４０は、試験例８のハイコンテンツ解析機器付属のテクスチャ解析の項目の“Ｓｐｏｔ”を解析した結果を示す図である。
【図４１】図４１は、試験例９のハイコンテンツ解析機器による細胞面積を解析した結果を示す図である。
【図４２】図４２は、試験例９のハイコンテンツ解析機器による核の面積を解析した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（心筋細胞の製造方法）
本発明の心筋細胞の製造方法は、胚様体形成工程と、中胚葉誘導工程と、心筋細胞誘導工程と、胚様体解離工程とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【００１４】
＜胚様体形成工程＞
前記胚様体形成工程は、多能性幹細胞を培養し、胚様体を形成する工程である。
【００１５】
＜＜多能性幹細胞＞＞
前記多能性幹細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞などが挙げられる。これらの中でも、ｉＰＳ細胞が好ましい。
前記多能性幹細胞の種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００１６】
前記多能性幹細胞の調製方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、後述するフィーダー細胞培養工程により未分化状態で維持されている多能性幹細胞を解離したものを前記胚様体形成工程に用いることができる。
【００１７】
＜＜培地＞＞
前記胚様体形成工程における培地（以下、「胚様体形成工程用培地」、「胚様体形成工程用培養液」と称することがある）としては、胚様体を形成することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００１８】
前記胚様体形成工程用培地の具体例としては、多能性幹細胞を未分化状態で維持可能な培地にＹ２７６３２を最終濃度５μＭ〜１０μＭで添加した培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にＢＭＰ４などのサイトカインを添加した培地などが挙げられる。
前記多能性幹細胞を未分化状態で維持可能な培地の具体例としては、ＲｅｐｒｏＦＦ（リプロセル社製）、ＲｅｐｒｏＦＦ２（リプロセル社製）、ＲｅｐｒｏＸＦ（リプロセル社製）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｍＴｅＳＲ１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＴｅＳＲ２（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）などが挙げられる。
前記胚様体形成工程用培地は、Ｙａｎｇ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．、  Ｎａｔｕｒｅ．、  ２００８  Ｍａｙ  ２２；４５３（７１９４）：５２４−８、Ｌｉａｎ  Ｘ，  ｅｔ  ａｌ．、  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．、  ２０１２  Ｊｕｌｙ  ３；１０９（２７）：Ｅ１８４８−５７、Ｍｉｎａｍｉ  Ｉ，  ｅｔ  ａｌ．、  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．、  ２０１２  Ｎｏｖ  ２９；２（５）：１４４８−６０などを参照して調製することができる。
【００１９】
また、前記多能性幹細胞を未分化状態で維持可能な培地としては、下記多能性幹細胞を未分化状態で維持可能な培地−１、多能性幹細胞を未分化状態で維持可能な培地−２を用いることもできる。
【００２０】
−多能性幹細胞を未分化状態で維持可能な培地−１−
基礎培地として、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ナカライテスク株式会社製）を用い、前記基礎培地に、下記表１−１及び表１−２に記載の成分を添加した培地（以下、「第１の分化誘導培地」と称することがある）。
【００２１】
【表１−１】
0006670494.tif 000002
【００２２】
【表１−２】
0006670494.tif 000003
【００２３】
−多能性幹細胞を未分化状態で維持可能な培地−２−
基礎培地として、イスコフ改変ダルベッコ培地（以下、「ＩＭＤＭ」と称することがある）を用い、前記基礎培地に、下記表２−１及び表２−２に記載の成分を添加した培地（以下、「一液式分化誘導培地」と称することがある）。
【００２４】
【表２−１】
0006670494.tif 000004
【００２５】
【表２−２】
0006670494.tif 000005
【００２６】
前記胚様体形成工程用培地の中でも、前記多能性幹細胞を未分化状態で維持可能な培地−１にＹ２７６３２を最終濃度５μＭ〜１０μＭで添加した培地、前記多能性幹細胞を未分化状態で維持可能な培地−２にＹ２７６３２を最終濃度５μＭ〜１０μＭで添加した培地が好ましい。
【００２７】
＜＜培養＞＞
前記胚様体形成工程における培養は、浮遊培養が好ましい。
前記浮遊培養の方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、接着加工を行っていない培養皿や低接着加工を行った培養皿を用い、前記多能性幹細胞を培養する方法やスピナーフラスコを用い、前記多能性幹細胞を培養する方法が挙げられる。
前記接着加工を行っていない培養皿、低接着加工を行った培養皿、及びスピナーフラスコは、市販品を用いることができる。
【００２８】
−期間−
前記胚様体形成工程の期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、２４時間〜４８時間などが挙げられる。
【００２９】
−培養条件−
前記胚様体形成工程における培養条件としては、特に制限はなく、公知の培養条件を適宜選択することができる。
前記培養は、低酸素条件で行ってもよいし、大気条件で行ってもよいが、分化効率に優れる点で、低酸素条件が好ましい。
低酸素条件とは、常酸素濃度（２１％）を下回る酸素濃度条件をいう。
前記低酸素条件における酸素濃度としては、２１％未満であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．１％以上２１％未満が好ましく、１％以上１０％以下がより好ましく、４％以上６％以下が特に好ましい。
【００３０】
＜中胚葉誘導工程＞
前記中胚葉誘導工程は、前記胚様体を培養し、中胚葉を誘導する工程である。
【００３１】
＜＜培地＞＞
前記中胚葉誘導工程における培地（以下、「中胚葉誘導工程用培地」、「中胚葉誘導工程用培養液」と称することがある）としては、中胚葉を誘導することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｙａｎｇ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．、  Ｎａｔｕｒｅ．、  ２００８  Ｍａｙ  ２２；４５３（７１９４）：５２４−８に記載の培地、Ｌｉａｎ  Ｘ，  ｅｔ  ａｌ．、  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．、  ２０１２  Ｊｕｌｙ  ３；１０９（２７）：Ｅ１８４８−５７に記載の培地、Ｍｉｎａｍｉ  Ｉ，  ｅｔ  ａｌ．、  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．、  ２０１２  Ｎｏｖ  ２９；２（５）：１４４８−６０に記載の培地などが挙げられる。
【００３２】
前記中胚葉誘導工程用培地の具体例としては、下記第２の分化誘導培地、前記一液式分化誘導培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）などの培地に、Ｗｎｔシグナル活性化物質、Ａｃｔｉｖｉｎ  ＡやＢＭＰ４などのサイトカインを添加した培地などが挙げられる。これらの中でも、下記第２の分化誘導培地にＷｎｔシグナル活性化物質を添加した培地、前記一液式分化誘導培地にＷｎｔシグナル活性化物質を添加した培地が好ましい。
【００３３】
前記Ｗｎｔシグナル活性化物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｗｎｔタンパク質、ＣＨＩＲ９９０２１等の化合物などが挙げられる。これらの中でも、ＣＨＩＲ９９０２１が好ましい。前記Ｗｎｔシグナル活性化物質は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記中胚葉誘導工程用培地におけるＣＨＩＲ９９０２１の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２μＭ〜６μＭが好ましく、３μＭ〜５μＭがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００３４】
−第２の分化誘導培地−
基礎培地として、ＩＭＤＭ（ナカライテスク株式会社製）を用い、前記基礎培地に、下記表３に記載の成分を添加した培地。
【００３５】
【表３】
0006670494.tif 000006
【００３６】
＜＜培養＞＞
前記中胚葉誘導工程における培養は、浮遊培養が好ましい。
前記浮遊培養の方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、上記胚様体形成工程の培養の項目に記載した方法と同様のものが挙げられる。
【００３７】
−期間−
前記中胚葉誘導工程の期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、４８時間〜７２時間などが挙げられる。
【００３８】
−時期−
前記中胚葉誘導工程を行う時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記胚様体形成工程開始１日目〜３日目、前記胚様体形成工程開始１日目〜４日目、前記胚様体形成工程開始２日目〜４日目などが挙げられる。前記時期は、前記胚様体形成工程開始日を０日目として数える。
【００３９】
−培養条件−
前記中胚葉誘導工程における培養条件としては、特に制限はなく、公知の培養条件を適宜選択することができ、例えば、上記胚様体形成工程の培養条件の項目に記載したものと同様とすることができる。
【００４０】
＜心筋細胞誘導工程＞
前記心筋細胞誘導工程は、前記中胚葉誘導後の胚様体を培養し、心筋細胞を誘導する工程である。
前記心筋細胞誘導工程は、単回の心筋細胞誘導処理からなる態様であってもよいし、複数回の心筋細胞誘導処理からなる態様であってもよいが、複数回の心筋細胞誘導処理からなる態様が好ましい。
前記心筋細胞誘導処理の回数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、３回が好ましい。
前記心筋細胞誘導工程は、洗浄処理を含んでもよい。
【００４１】
−期間−
前記心筋細胞誘導工程の期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、４日間〜２５日間などが挙げられる。これらの中でも、１０日間〜２５日間が好ましい。
通常、心筋細胞誘導工程を４日間程度行うことで心筋細胞が分化誘導され、胚様体が拍動する様子が観察される。心筋細胞誘導工程を１０日間〜２５日間程度行うことで十分に心筋細胞を誘導することができる。
【００４２】
−時期−
前記心筋細胞誘導工程の時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記胚様体形成工程開始３日目〜２０日目、前記胚様体形成工程開始４日目〜２０日目などが挙げられる。前記時期は、前記胚様体形成工程開始日を０日目として数える。
【００４３】
＜＜第１の心筋細胞誘導処理＞＞
前記第１の心筋細胞誘導処理は、前記中胚葉誘導後の胚様体を第１の心筋細胞誘導処理用培地（以下、「第１の心筋細胞誘導処理用培養液」と称することがある）で培養する処理である。
【００４４】
−培地−
前記第１の心筋細胞誘導処理用培地としては、心筋細胞を誘導することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｙａｎｇ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．、  Ｎａｔｕｒｅ．、  ２００８  Ｍａｙ  ２２；４５３（７１９４）：５２４−８に記載の培地、Ｌｉａｎ  Ｘ，  ｅｔ  ａｌ．、  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．、  ２０１２  Ｊｕｌｙ  ３；１０９（２７）：Ｅ１８４８−５７に記載の培地、Ｍｉｎａｍｉ  Ｉ，  ｅｔ  ａｌ．、  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．、  ２０１２  Ｎｏｖ  ２９；２（５）：１４４８−６０に記載の培地などが挙げられる。
【００４５】
前記第１の心筋細胞誘導処理用培地の具体例としては、前記第２の分化誘導培地、前記一液式分化誘導培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）などの培地に、Ｗｎｔシグナル抑制物質、ＴＧＦ−βシグナル抑制物質、エストロゲン様作用を有する物質、又はサイトカインを添加した培地などが挙げられる。
これらの中でも、前記第２の分化誘導培地にＷｎｔシグナル抑制物質、ＴＧＦ−βシグナル抑制物質、及びエストロゲン様作用物質を添加した培地、前記一液式分化誘導培地にＷｎｔシグナル抑制物質、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤、及びエストロゲン様作用物質を添加した培地が好ましい。
【００４６】
前記Ｗｎｔシグナル抑制物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｄｋｋ−１やＦｒｉｚｚｌｅｄ８−Ｆｃ等のリコンビナントタンパク質、ＩＷＰ２、ＩＷＲ１、ＸＡＶ９３９、ＫＹ０２１１１等の化合物などが挙げられる。これらの中でも、ＩＷＰ２が、低濃度から優れた分化誘導効率を発揮する点で、好ましい。前記Ｗｎｔシグナル抑制物質は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記第１の心筋細胞誘導処理用培地におけるＩＷＰ２の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１μＭ〜１０μＭが好ましく、２μＭ〜９μＭがより好ましく、４μＭ〜７μＭが特に好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００４７】
前記ＴＧＦ−βシグナル阻害剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＳＢ４３１５４２、ＳＢ５０５１２４、Ａ−８３−０１などが挙げられる。これらの中でも、ＳＢ４３１５４２が、分化誘導効率に優れる点で、好ましい。前記ＴＧＦ−βシグナル阻害剤は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記第１の心筋細胞誘導処理用培地におけるＳＢ４３１５４２の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１μＭ〜１０μＭが好ましく、２μＭ〜９μＭがより好ましく、３μＭ〜８μＭが特に好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００４８】
前記エストロゲン様作用物質とは、エストロゲン作用を示すホルモン、低分子化合物をいう。
前記エストロゲン様作用物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エストラジオール、エストロン、エストリオール、ゲニステインなどが挙げられる。これらの中でも、エストラジオールが、分化誘導効率に優れる点で、好ましい。前記エストロゲン様作用を有する物質は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記第１の心筋細胞誘導処理用培地におけるエストロゲン様作用物質の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１ｎＭ〜１０，０００ｎＭが好ましく、１０ｎＭ〜１，０００ｎＭがより好ましい。前記好ましい範囲内であると、より心筋細胞への分化誘導効率に優れる点で、有利である。
【００４９】
前記サイトカインとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦなどが挙げられる。前記サイトカインは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記第１の心筋細胞誘導処理用培地におけるサイトカインの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬなどが挙げられる。
【００５０】
−培養−
前記第１の心筋細胞誘導処理における培養は、浮遊培養が好ましい。
前記浮遊培養の方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、上記胚様体形成工程の培養の項目に記載した方法と同様のものが挙げられる。
【００５１】
−−期間−−
前記第１の心筋細胞誘導処理の期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、４８時間〜７２時間などが挙げられる。
【００５２】
−−時期−−
前記第１の心筋細胞誘導処理を行う時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、胚様体形成工程開始３日目〜６日目、胚様体形成工程開始３日目〜５日目、胚様体形成工程開始４日目〜６日目などが挙げられる。前記時期は、前記胚様体形成工程開始日を０日目として数える。
【００５３】
−−培養条件−−
前記第１の心筋細胞誘導処理における培養条件としては、特に制限はなく、公知の培養条件を適宜選択することができ、例えば、上記胚様体形成工程の培養条件の項目に記載したものと同様とすることができる。
【００５４】
＜＜第２の心筋細胞誘導処理＞＞
前記第２の心筋細胞誘導処理は、前記第１の心筋細胞誘導処理後の胚様体を第２の心筋細胞誘導処理用培地（以下、「第２の心筋細胞誘導処理用培養液」と称することがある）で培養する処理である。
【００５５】
−培地−
前記第２の心筋細胞誘導処理用培地としては、心筋細胞を誘導することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｙａｎｇ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．、  Ｎａｔｕｒｅ．、  ２００８  Ｍａｙ  ２２；４５３（７１９４）：５２４−８に記載の培地、Ｌｉａｎ  Ｘ，  ｅｔ  ａｌ．、  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．、  ２０１２  Ｊｕｌｙ  ３；１０９（２７）：Ｅ１８４８−５７に記載の培地、Ｍｉｎａｍｉ  Ｉ，  ｅｔ  ａｌ．、  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．、  ２０１２  Ｎｏｖ  ２９；２（５）：１４４８−６０に記載の培地などが挙げられる。
【００５６】
前記第２の心筋細胞誘導処理用培地の具体例としては、前記第２の分化誘導培地、前記一液式分化誘導培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）などの培地に、Ｗｎｔシグナル抑制物質、ＴＧＦ−βシグナル抑制物質、エストロゲン様作用を有する物質、又はサイトカインを添加した培地などが挙げられる。
これらの中でも、前記第２の分化誘導培地にＷｎｔシグナル抑制物質、及びエストロゲン様作用物質を添加した培地、前記一液式分化誘導培地にＷｎｔシグナル抑制物質、及びエストロゲン様作用物質を添加した培地が好ましい。
【００５７】
前記Ｗｎｔシグナル抑制物質、及びその含有量は、上記第１の心筋細胞誘導処理用培地の項目に記載したものと同様である。
【００５８】
前記ＴＧＦ−βシグナル抑制物質、及びその含有量は、上記第１の心筋細胞誘導処理用培地の項目に記載したものと同様である。
【００５９】
前記エストロゲン様作用物質、及びその含有量は、上記第１の心筋細胞誘導処理用培地の項目に記載したものと同様である。
【００６０】
前記サイトカイン、及びその含有量は、上記第１の心筋細胞誘導処理用培地の項目に記載したものと同様である。
【００６１】
−培養−
前記第２の心筋細胞誘導処理における培養は、浮遊培養が好ましい。
前記浮遊培養の方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、上記胚様体形成工程の培養の項目に記載した方法と同様のものが挙げられる。
【００６２】
−−期間−−
前記第２の心筋細胞誘導処理の期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、４８時間〜７２時間などが挙げられる。
【００６３】
−−時期−−
前記第２の心筋細胞誘導処理を行う時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、胚様体形成工程開始６日目〜８日目、胚様体形成工程開始５日目〜８日目などが挙げられる。前記時期は、前記胚様体形成工程開始日を０日目として数える。
【００６４】
−−培養条件−−
前記第２の心筋細胞誘導処理における培養条件としては、特に制限はなく、公知の培養条件を適宜選択することができ、例えば、上記胚様体形成工程の培養条件の項目に記載したものと同様とすることができる。
【００６５】
＜＜第３の心筋細胞誘導処理＞＞
前記第３の心筋細胞誘導処理は、前記第２の心筋細胞誘導処理後の胚様体を第３の心筋細胞誘導処理用培地（以下、「第３の心筋細胞誘導処理用培養液」と称することがある）で培養する処理である。
【００６６】
−培地−
前記第３の心筋細胞誘導処理用培地としては、心筋細胞を誘導することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｙａｎｇ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．、  Ｎａｔｕｒｅ．、  ２００８  Ｍａｙ  ２２；４５３（７１９４）：５２４−８に記載の培地、Ｌｉａｎ  Ｘ，  ｅｔ  ａｌ．、  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．、  ２０１２  Ｊｕｌｙ  ３；１０９（２７）：Ｅ１８４８−５７に記載の培地、Ｍｉｎａｍｉ  Ｉ，  ｅｔ  ａｌ．、  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．、  ２０１２  Ｎｏｖ  ２９；２（５）：１４４８−６０に記載の培地などが挙げられる。
【００６７】
前記第３の心筋細胞誘導処理用培地の具体例としては、前記第２の分化誘導培地、前記一液式分化誘導培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）などの培地に、Ｗｎｔシグナル抑制物質、ＴＧＦ−βシグナル抑制物質、エストロゲン様作用を有する物質、又はサイトカインを添加した培地などが挙げられる。
これらの中でも、前記第２の分化誘導培地にエストロゲン様作用物質を添加した培地、前記一液式分化誘導培地にエストロゲン様作用物質を添加した培地が好ましい。
【００６８】
前記Ｗｎｔシグナル抑制物質、及びその含有量は、上記第１の心筋細胞誘導処理用培地の項目に記載したものと同様である。
【００６９】
前記ＴＧＦ−βシグナル抑制物質、及びその含有量は、上記第１の心筋細胞誘導処理用培地の項目に記載したものと同様である。
【００７０】
前記エストロゲン様作用物質、及びその含有量は、上記第１の心筋細胞誘導処理用培地の項目に記載したものと同様である。
【００７１】
前記サイトカイン、及びその含有量は、上記第１の心筋細胞誘導処理用培地の項目に記載したものと同様である。
【００７２】
−培養−
前記第３の心筋細胞誘導処理における培養は、浮遊培養が好ましい。
前記浮遊培養の方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、上記胚様体形成工程の培養の項目に記載した方法と同様のものが挙げられる。
【００７３】
−−期間−−
前記第３の心筋細胞誘導処理の期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、４日間〜２０日間などが挙げられる。これらの中でも、８日間〜１２日間が好ましい。
【００７４】
−−時期−−
前記第３の心筋細胞誘導処理を行う時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、胚様体形成工程開始８日目〜２０日目などが挙げられる。前記時期は、前記胚様体形成工程開始日を０日目として数える。
【００７５】
−−培養条件−−
前記第３の心筋細胞誘導処理における培養条件としては、特に制限はなく、公知の培養条件を適宜選択することができ、例えば、上記胚様体形成工程の培養条件の項目に記載したものと同様とすることができる。
【００７６】
＜＜洗浄処理＞＞
前記洗浄処理は、前記第１の心筋細胞誘導処理、前記第２の心筋細胞誘導処理、及び前記第３の心筋細胞誘導処理の少なくともいずれかの後に、前記胚様体を洗浄する処理であり、後述する洗浄工程と同様にして行うことができる。
【００７７】
＜胚様体解離工程＞
前記胚様体解離工程は、前記心筋細胞誘導後の胚様体を解離する工程である。
【００７８】
−時期−
前記胚様体解離工程を行う時期としては、前記中胚葉誘導工程開始から４０日目までの間であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記中胚葉誘導工程開始１６日目から３０日目までの間が好ましい。前記胚様体解離工程を前記中胚葉誘導工程開始から４０日目までの間に行うことにより、細胞に対して強い障害を与えることなく、胚様体を解離させることができる。前記時期は、前記中胚葉誘導工程開始日を０日目として数える。
【００７９】
−解離方法−
前記胚様体を解離する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、前記胚様体にタンパク質分解酵素を接触させて解離する方法などが挙げられる。
【００８０】
−−接触時間−−
前記胚様体と前記タンパク質分解酵素とを連続して接触させる時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１分間〜３０分間が好ましい。前記好ましい範囲内であると、胚様体がタンパク質分解酵素に連続して長時間曝露されることで起こる細胞死を防ぐことができ、効率良く細胞を回収することができる。
【００８１】
−−回数−−
前記胚様体解離工程の回数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、複数回が好ましい。
【００８２】
前記胚様体を解離する方法の好ましい態様は、以下の通りである。
（１）  胚様体が、ピペットや回収チューブの容器内面に接着しないように、ピペットや回収チューブの容器内面に、タンパク質成分を０．１質量％〜１質量％含む緩衝液を接触させる。
（２）  前記胚様体を回収チューブに回収し、沈殿させた後に上清を除去する。次いで、緩衝液を加え、再度沈殿させた後に上清を除去する作業を２回繰り返す。
（３）  タンパク質分解酵素、及び核酸分解酵素を含む解離溶液を加え、３７℃で５分間保持した後にピペッティングを行い、更に３７℃で５分間保持する。
（４）  ピペッティングを行った後に、核酸分解酵素、及び１０質量％〜２０質量％の血清を含むタンパク質分解反応停止液を加え、３７℃で５分間保持する。これにより、タンパク質分解反応を停止させるとともに、細胞が破壊されることで溶液中に漏出したゲノムＤＮＡを分解する。
（５）  上清中に含まれる解離した細胞を回収する。
（６）  前記（４）で沈殿していた残渣に緩衝液を加え、再度沈殿させた後に上清を除去する。
（７）  タンパク質分解酵素、及び核酸分解酵素を含む解離溶液を加え、３７℃で５分間保持した後にピペッティングを行い、更に３７℃で５分間保持する。
（８）  ピペッティングを行った後に、核酸分解酵素、及び１０質量％〜２０質量％の血清を含むタンパク質分解反応停止液を加え、３７℃で５分間保持する。これにより、タンパク質分解反応を停止させるとともに、細胞が破壊されることで溶液中に漏出したゲノムＤＮＡを分解する。
（９）  上清中に含まれる解離した細胞を回収する。
（１０）  前記（６）〜（９）の作業を残渣がなくなるまで繰り返し行う。
（１１）  前記（５）及び（９）で解離した細胞を全てまとめ、４０μｍのフィルタに通すことで細胞の凝集体を除去した後、遠心して細胞を回収する。
【００８３】
前記タンパク質成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、血清、牛血清アルブミンなどが挙げられる。
前記緩衝液としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳなどが挙げられる。
前記タンパク質分解酵素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トリプシンなどが挙げられる。
前記核酸分解酵素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｄｎａｓｅ  Ｉなどが挙げられる。
【００８４】
前記胚様体解離工程は、前記解離処理を行った後の細胞を培養する処理を含むことが好ましい。
前記解離処理を行った後の細胞を培養する処理における培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＭＥＭに、血清を添加した培地などが挙げられる。前記血清の含有量としては、例えば、２０質量％などが挙げられる。
【００８５】
前記解離処理を行った後の細胞を培養する処理における培養は、接着培養が好ましい。
前記接着培養の方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
【００８６】
前記解離処理を行った後の細胞を培養する処理の期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１日間〜３日間などが挙げられる。
【００８７】
前記解離処理を行った後の細胞を培養する処理を行う時期としては、前記中胚葉誘導工程開始から４０日目までの間であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記解離処理を行った後、前記中胚葉誘導工程開始から３０日目までの間が好ましい。前記時期は、前記中胚葉誘導工程開始日を０日目として数える。
【００８８】
前記解離処理を行った後の細胞を培養する処理における培養条件としては、特に制限はなく、公知の培養条件を適宜選択することができ、例えば、上記胚様体形成工程の培養条件の項目に記載したものと同様とすることができる。
【００８９】
前記接着培養における細胞の播種密度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２．５×１０４細胞／ｃｍ２〜２×１０５細胞／ｃｍ２が好ましく、８×１０４細胞／ｃｍ２〜１．２×１０５細胞／ｃｍ２がより好ましい。
【００９０】
前記解離処理を行った後の細胞を培養する処理における培養容器としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、接着培養を行うための培養容器をゼラチンでコーティングしたものが好ましい。
【００９１】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フィーダー細胞培養工程、洗浄工程、心筋細胞成熟化工程、非心筋細胞成長抑制工程などが挙げられる。これらの中でも、心筋細胞成熟化工程、非心筋細胞成長抑制工程を含むことが好ましい。
【００９２】
＜＜フィーダー細胞培養工程＞＞
前記フィーダー細胞培養工程は、多能性幹細胞と、フィーダー細胞とを共に培養し、多能性幹細胞を未分化な状態で維持する工程である。
前記フィーダー細胞としては、特に制限はなく、公知のものを適宜選択することができる。
前記フィーダー細胞培養工程の培養条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００９３】
＜＜洗浄工程＞＞
前記洗浄工程は、上述した胚様体形成工程、中胚葉誘導工程、及び心筋細胞誘導工程の少なくともいずれかの後に、前記胚様体を洗浄する工程である。
前記洗浄の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培養後の胚様体を培養液ごと容器に回収し、静置して前記胚様体を沈殿させた後、上清を除去し、次いで、培養液又は緩衝液を加え、再度静置して前記胚様体を沈殿させた後、上清を除去する方法などが挙げられる。
前記洗浄の回数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、複数回行うことが好ましい。
【００９４】
＜＜非心筋細胞成長抑制工程＞＞
前記非心筋細胞成長抑制工程は、非心筋細胞の成長を抑制する工程である。
前記非心筋細胞成長抑制工程を行う時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記心筋細胞誘導工程と前記胚様体解離工程との間（以下、「第１の非心筋細胞成長抑制工程」、又は「非心筋細胞成長抑制工程−１」と称することがある）、及び前記胚様体解離工程と前記心筋細胞成熟化工程との間（以下、「第２の非心筋細胞成長抑制工程」、又は「非心筋細胞成長抑制工程−２」と称することがある）の少なくともいずれかで行うことが好ましい。
【００９５】
−第１の非心筋細胞成長抑制工程−
前記第１の非心筋細胞成長抑制工程は、前記心筋細胞誘導工程後の胚様体を第１の非心筋細胞成長抑制工程用培地（以下、「第１の非心筋細胞成長抑制工程用培養液」と称することがある）で培養する工程である。
【００９６】
−−培地−−
第１の非心筋細胞成長抑制工程用培地としては、非心筋細胞の成長を抑制することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、グルコースを含まない培養液に乳酸を添加した培地などが挙げられる。前記培地を用いることにより、非心筋細胞の増殖を抑制し胚様体中に含まれる心筋細胞の割合を高めることができる。
前記グルコースを含まない培養液に乳酸を添加した培地は、例えば、国際公開第２００７／０８８８７４号、Ｔｏｈｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ２０１３などの記載を参照して調製することができる。
具体的には、ＤＭＥＭに、牛血清アルブミンと、Ｌ−乳酸とを添加した培地などが挙げられる。前記牛血清アルブミンの含有量としては、例えば、５，０００ｍｇ／Ｌなどが挙げられる。前記Ｌ−乳酸の含有量としては、例えば、３６０ｍｇ／Ｌなどが挙げられる。
【００９７】
−−培養−−
前記第１の非心筋細胞成長抑制工程における培養は、浮遊培養が好ましい。
前記浮遊培養の方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、上記胚様体形成工程の培養の項目に記載した方法と同様のものが挙げられる。
【００９８】
−−−期間−−−
前記第１の非心筋細胞成長抑制工程の期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、６日間〜１０日間などが挙げられる。
【００９９】
−−−時期−−−
前記第１の非心筋細胞成長抑制工程を行う時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、胚様体形成工程開始２０日目〜２８日目などが挙げられる。前記時期は、前記胚様体形成工程開始日を０日目として数える。
【０１００】
−−−培養条件−−−
前記第１の非心筋細胞成長抑制工程における培養条件としては、特に制限はなく、公知の培養条件を適宜選択することができ、例えば、上記胚様体形成工程の培養条件の項目に記載したものと同様とすることができる。
【０１０１】
前記第１の非心筋細胞成長抑制工程における培養容器としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、血清又は牛血清アルブミンなどのタンパク質成分を０．１質量％〜１質量％程度含むＰＢＳやＨＢＳＳなどの緩衝液を予め容器内面に接触させる処理をすることが好ましい。前記グルコースを含まない培養液に乳酸を添加した培地はタンパク質成分をほとんど含んでおらず、培養中の胚様体がピペットや回収チューブなどのプラスチック製容器内面に接着しやすくなっているが、前記処理により、プラスチック製容器内面に胚様体が接着することを防ぎ、本工程におけるロスを軽減することができる。
【０１０２】
−第２の非心筋細胞成長抑制工程−
前記第２の非心筋細胞成長抑制工程は、前記胚様体解離工程後の細胞を第２の非心筋細胞成長抑制工程用培地（以下、「第２の非心筋細胞成長抑制工程用培養液」と称することがある）で培養する工程である。
【０１０３】
−−培地−−
第２の非心筋細胞成長抑制工程用培地としては、非心筋細胞の成長を抑制することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記第１の非心筋細胞成長抑制工程の培地の項目に記載したものと同様のものが挙げられる。
【０１０４】
−−培養−−
前記第２の非心筋細胞成長抑制工程における培養は、接着培養が好ましい。
前記接着培養の方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
【０１０５】
−−−期間−−−
前記第２の非心筋細胞成長抑制工程の期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、３日間〜７日間などが挙げられる。前記胚様体解離工程後の心筋細胞は、グルコースを含まない培地による培養に対する感受性が多様であることから、前記第１の非心筋細胞成長抑制工程よりも短期間であることが好ましい。
【０１０６】
−−−時期−−−
前記第２の非心筋細胞成長抑制工程を行う時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記胚様体解離工程後の心筋細胞が接着した後、胚様体形成工程開始３０日目〜３５日目などが挙げられる。前記時期は、前記胚様体形成工程開始日を０日目として数える。
【０１０７】
−−−培養条件−−−
前記第２の非心筋細胞成長抑制工程における培養条件としては、特に制限はなく、公知の培養条件を適宜選択することができ、例えば、上記胚様体形成工程の培養条件の項目に記載したものと同様とすることができる。
【０１０８】
前記接着培養における細胞の播種密度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２．５×１０４細胞／ｃｍ２〜２×１０５細胞／ｃｍ２が好ましく、８×１０４細胞／ｃｍ２〜１．２×１０５細胞／ｃｍ２がより好ましい。
【０１０９】
前記第２の非心筋細胞成長抑制工程における培養容器としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、接着培養を行うための培養容器をゼラチンでコーティングしたものが好ましい。
【０１１０】
＜＜心筋細胞成熟化工程＞＞
前記心筋細胞成熟化工程は、前記胚様体解離工程後の心筋細胞を培養し、成熟化させる工程である。
【０１１１】
−培地−
前記心筋細胞成熟化工程に用いる培地（以下、「心筋細胞成熟化工程用培地」、「心筋細胞成熟化工程用培養液」と称することがある）としては、心筋細胞を成熟化させることができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＭＥＭ培地に、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（Ｂｉｏｗｅｓｔ社製）、Ｎｅｗｂｏｒｎ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）、Ｂｏｖｉｎｅ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）、又はＡｄｕｌｔ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）を１質量％〜２０質量％含有させた培養液などが挙げられる。
【０１１２】
−−培養−−
前記心筋細胞成熟化工程における培養は、接着培養が好ましい。
前記接着培養の方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
【０１１３】
−−期間−−
前記心筋細胞成熟化工程の期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、５日間〜１０日間などが挙げられる。
【０１１４】
−−時期−−
前記心筋細胞成熟化工程を行う時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、胚様体形成工程開始３５日目〜４２日目などが挙げられる。前記時期は、前記胚様体形成工程開始日を０日目として数える。
【０１１５】
−−培養条件−−
前記心筋細胞成熟化工程における培養条件としては、特に制限はなく、公知の培養条件を適宜選択することができ、例えば、上記胚様体形成工程の培養条件の項目に記載したものと同様とすることができる。
【０１１６】
前記接着培養における細胞の播種密度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２．５×１０４細胞／ｃｍ２〜２×１０５細胞／ｃｍ２が好ましく、８×１０４細胞／ｃｍ２〜１．２×１０５細胞／ｃｍ２がより好ましい。
【０１１７】
前記心筋細胞成熟化工程における培養容器としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【０１１８】
前記心筋細胞成熟化工程を行うことにより、心筋細胞の成熟を促すことができる。心筋細胞が成熟することで、例えば、心室型心筋細胞では心室型心筋細胞特異的な遺伝子をより高発現するようになり、心室型心筋細胞特異的遺伝子を標識する技術を応用した心室型心筋細胞の単離が容易になる。また、心筋細胞を成熟させることで、生後心臓で起こる心筋細胞の変化（細胞面積の増大、分裂能の喪失、カルシウムハンドリング関連遺伝子の発現増加など）を再現することができ、再生医療や薬物スクリーニングにより適した高品質の心筋細胞を得ることができる。
【０１１９】
上記方法により、多能性幹細胞から心筋細胞が得られたことを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、心筋細胞に特異的な遺伝子の発現を免疫染色により確認する方法、心筋細胞に特異的な遺伝子の発現をＰＣＲ法により確認する方法などが挙げられる。
また、得られた心筋細胞が高品質であるか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、パッチクランプ法などが挙げられる。
具体的には、活動電位振幅が１４０ｍＶ以上である大きく明瞭なプラトー相を有する活動電位、３００ｐＡ以上の大きなピークカリウム電流、１ｎＡ以上の大きなピークカルシウム電流、及び６．５ｎＡ以上の大きなピークナトリウム電流が確認された場合には、高品質な心筋細胞が得られたと判断することができる。
【０１２０】
本発明の心筋細胞の製造方法により製造される心筋細胞は、後述する本発明の心室型心筋細胞の製造方法の材料、スクリーニング方法の材料などとして、好適に用いることができる。
【０１２１】
（心室型心筋細胞及びその製造方法）
本発明の心室型心筋細胞は、本発明の心室型心筋細胞の製造方法により、好適に製造することができる。
以下、本発明の心室型心筋細胞の製造方法の説明と併せて、本発明の心室型心筋細胞についても説明する。
【０１２２】
＜心室型心筋細胞の製造方法＞
本発明の心室型心筋細胞の製造方法は、蛍光ＲＮＡプローブ導入工程と、分取工程とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【０１２３】
＜＜蛍光ＲＮＡプローブ導入工程＞＞
前記蛍光ＲＮＡプローブ導入工程は、本発明の心筋細胞の製造方法により製造された心筋細胞に蛍光ＲＮＡプローブを導入する工程である。
【０１２４】
−心筋細胞−
前記心筋細胞は、多能性幹細胞から分化誘導された心筋細胞であり、ペースメーカー型心筋細胞、心房型心筋細胞、心室型心筋細胞などが混在した細胞集団である。
【０１２５】
−蛍光ＲＮＡプローブ−
前記蛍光ＲＮＡプローブは、前記心筋細胞内の標的遺伝子の検出に用いられる。
前記心筋細胞内の標的遺伝子の有無を検出することにより、心室型心筋細胞を特異的に検出することが可能となる。
前記蛍光ＲＮＡプローブは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【０１２６】
前記標的遺伝子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＭＹＬ２遺伝子、ＩＲＸ４遺伝子、ＭＹＬ３遺伝子、及びＲＰＬ３Ｌ遺伝子の少なくともいずれかが好ましく、心室型心筋細胞をより特異的に検出することができる点で、ＭＹＬ２遺伝子がより好ましい。
前記標的遺伝子は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【０１２７】
前記標的遺伝子における標的配列としては、標的遺伝子を検出することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記各標的遺伝子における全てのアイソフォームを網羅することができる配列であることが好ましい。
前記標的配列の長さとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２０ｍｅｒ〜３０ｍｅｒが好ましい。
前記標的配列は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【０１２８】
−ＭＹＬ２遺伝子−
前記ＭＹＬ２遺伝子は、正式名称がＭｙｏｓｉｎ  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｈａｉｎ  ２，Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ，Ｃａｒｄｉａｃ，Ｓｌｏｗであり、その塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）などの公共データベースを通じて容易に入手することができる。例えば、ヒトＭＹＬ２遺伝子の塩基配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０００４３２．３で入手することができる。
前記ＭＹＬ２遺伝子を検出するための標的配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、配列番号：１で表される配列、配列番号：２で表される配列が好ましく、配列番号：１で表される配列がより好ましい。
−−ＭＹＬ２遺伝子を検出するための標的配列−−
５’−ｃａｔｇｇｃａｃｃｔａａｇａａａｇｃａａａｇａａｇａｇ−３’（配列番号：１）
５’−ｃａｔｃａｃｃｃａｃｇｇａｇａａｇａｇａａｇｇａｃｔａ−３’（配列番号：２）
【０１２９】
−ＩＲＸ４遺伝子−
前記ＩＲＸ４遺伝子は、正式名称がＩｒｏｑｕｏｉｓ  Ｈｏｍｅｏｂｏｘ  ４であり、その塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）などの公共データベースを通じて容易に入手することができる。例えば、ヒトＩＲＸ４遺伝子の塩基配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０１６３５８．２で入手することができる。
前記ＩＲＸ４遺伝子を検出するための標的配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、配列番号：３で表される配列、配列番号：４で表される配列が好ましい。
−−ＩＲＸ４遺伝子を検出するための標的配列−−
５’−ｃｔａｔｇｇｃａａｃｔａｃｇｔｇａｃｃｔａｃｇｇｃｔｃ−３’（配列番号：３）
５’−ａｇａｇｃｔｃｃａａｇａａｃｇｃａｇａｇｃｃｃｇｔｇｇ−３’（配列番号：４）
【０１３０】
−ＭＹＬ３遺伝子−
前記ＭＹＬ３遺伝子は、正式名称がＭｙｏｓｉｎ  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｈａｉｎ  ３，Ａｌｋａｌｉ；  Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ，Ｓｋｅｌｅｔａｌ，Ｓｌｏｗであり、その塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）などの公共データベースを通じて容易に入手することができる。例えば、ヒトＭＹＬ３遺伝子の塩基配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０００２５８．２で入手することができる。
前記ＭＹＬ３遺伝子を検出するための標的配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、配列番号：５で表される配列、配列番号：６で表される配列が好ましい。
−−ＭＹＬ３遺伝子を検出するための標的配列−−
５’−ｃｔａａｇｇａｇｇｔｃｇａｇｔｔｔｇａｔｇｃｔｔｃｃａ−３’（配列番号：５）
５’−ｃａｇｃｔａａａｃｃｔｃｇｔｇｃｃｃａｇｇａａｇｃｃｃ−３’（配列番号：６）
【０１３１】
−ＲＰＬ３Ｌ遺伝子−
前記ＲＰＬ３Ｌ遺伝子は、正式名称がＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ３−Ｌｉｋｅであり、その塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）などの公共データベースを通じて容易に入手することができる。例えば、ヒトＲＰＬ３Ｌ遺伝子の塩基配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００５０６１．２で入手することができる。
前記ＲＰＬ３Ｌ遺伝子を検出するための標的配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、配列番号：７で表される配列、配列番号：８で表される配列が好ましい。
−−ＲＰＬ３Ｌ遺伝子を検出するための標的配列−−
５’−ｔｇｃａｇａａｃａｃｃｔｃａｇｔｇａｔｇａｇｔｇｃｃｇ−３’（配列番号：７）
５’−ａｔｔａｃｇｃｔｇａｇａａａｇｔｃｃｃｔｃｃｔｇｇｔｇ−３’（配列番号：８）
【０１３２】
前記蛍光ＲＮＡプローブの構成としては、特に制限はなく、公知の構成を適宜選択することができ、例えば、金ナノ粒子に蛍光標識された二本鎖オリゴヌクレオチドを結合させた構成や、直鎖状のオリゴデオキシヌクレオチドを直接蛍光標識したもの、ヘアピン状のオリゴヌクレオチドを蛍光標識したもの（モレキュラービーコンなど）などが挙げられる。
前記金ナノ粒子に蛍光標識された二本鎖オリゴヌクレオチドを結合させた構成の蛍光ＲＮＡプローブは、一方の鎖が蛍光色素分子を有し（以下、「レポーター鎖」と称することがある）、他方の鎖（以下、「捕捉鎖」と称することがある）が金ナノ粒子に結合している。二本鎖オリゴヌクレオチドを形成している状態では、前記レポーター鎖の蛍光色素分子は、前記金ナノ粒子により消光している。一方、前記蛍光ＲＮＡプローブが標的遺伝子（以下、「標的ＲＮＡ」と称することがある）に近付くと、前記標的ＲＮＡが前記捕捉鎖に結合し、前記レポーター鎖が放出され、蛍光が発する。前記蛍光を検出することで、前記心筋細胞内における標的遺伝子の発現の有無を確認することができ、後述の分取工程で、心室型心筋細胞を分取することが可能となる。
前記金ナノ粒子に蛍光標識された二本鎖オリゴヌクレオチドを結合させた構成の蛍光ＲＮＡプローブは、例えば、ＳｍａｒｔＦｌａｒｅ（商標）  ＲＮＡ検出プローブ（メルク株式会社製）を用いることができる。
【０１３３】
前記蛍光色素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記蛍光色素の中でも、Ｃｙ５が、汎用のセルソーターで検出可能な点で、好ましい。
【０１３４】
−導入−
前記心筋細胞は、前記蛍光ＲＮＡプローブを導入する２日程度前に、８×１０４細胞／ｃｍ２〜１．２×１０５細胞／ｃｍ２の播種密度で播き、接着培養をすることが好ましい。
前記接着培養における培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記心筋細胞成熟化工程の培地の項目に記載したものと同様のものが挙げられる。
【０１３５】
前記心筋細胞に前記蛍光ＲＮＡプローブを導入する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＳｍａｒｔＦｌａｒｅ（商標）  ＲＮＡ検出プローブ（メルク株式会社）の推奨プロトコルに沿って導入することができる。
前記蛍光ＲＮＡプローブの導入には、細胞毒性の観点から、リポフェクタミンＬＴＸ  Ｐｌｕｓ（インビトロジェン社製）を使用しないことが好ましい。
【０１３６】
＜＜分取工程＞＞
前記分取工程は、前記蛍光ＲＮＡプローブに由来する蛍光を発する細胞（以下、「蛍光標識された細胞」と称することがある）を分取する工程である。
前記分取工程により、心室型心筋細胞が単離、精製される。
【０１３７】
前記蛍光を発する細胞を分取する手段としては、特に制限はなく、公知の手段を適宜選択することができ、例えば、自動細胞解析分離装置（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ（ＦＡＣＳ））などが挙げられる。
【０１３８】
前記分取工程を行う時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記蛍光ＲＮＡプローブの導入の１日間後が好ましい。
【０１３９】
＜＜その他の工程＞＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【０１４０】
＜心室型心筋細胞＞
上記方法により、心室型心筋細胞が得られたことを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、心室型心筋細胞に特異的な遺伝子の発現を免疫染色により確認する方法、心室型心筋細胞に特異的な遺伝子の発現をＰＣＲ法により確認する方法、パッチクランプ法などで心室型心筋細胞特有の活動電位を確認する方法などが挙げられる。
また、得られた心室型心筋細胞が高品質であるか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、パッチクランプ法などが挙げられる。
具体的には、活動電位振幅が１４０ｍＶ以上である大きく明瞭なプラトー相を有する活動電位、３００ｐＡ以上の大きなピークカリウム電流、１ｎＡ以上の大きなピークカルシウム電流、及び６．５ｎＡ以上の大きなピークナトリウム電流が確認された場合には、高品質な心室型心筋細胞が得られたと判断することができる。
【０１４１】
本発明の心室型心筋細胞は、活動電位振幅が１４０ｍＶ以上であり、３００ｐＡ以上のピークカリウム電流、１ｎＡ以上のピークカルシウム電流、及び６．５ｎＡ以上のピークナトリウム電流を示す。
【０１４２】
本発明の心室型心筋細胞の製造方法によれば、ペースメーカー型心筋細胞、心房型心筋細胞、心室型心筋細胞などが混在した細胞集団から、心室型心筋細胞を生きたまま分取することができる。前記心室型心筋細胞は、重症心不全などの再生医療の対象となる疾患に対し、より特異性が高いため、再生医療の実現へ向けて非常に有用である。また、心室筋型心筋細胞のみをスクリーニングに用いることで、心不全、心筋症、ヌーナン症候群などの心室筋型心筋細胞が異常を呈する疾患に対してより有用な新規薬剤を開発することが可能となる。
【０１４３】
（スクリーニング方法）
本発明のスクリーニング方法は、肥大型心筋症、心肥大、及びヌーナン症候群の少なくともいずれかに対する予防乃至治療薬のスクリーニング方法である。
【０１４４】
前記スクリーニング方法に用いる細胞としては、心筋細胞、及び心室型心筋細胞の少なくともいずれかであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記心筋細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、本発明の心筋細胞の製造方法により製造された心筋細胞が好ましい。
前記心室型心筋細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、本発明の心室型心筋細胞が好ましい。
【０１４５】
前記スクリーニングの方法としては、心筋細胞、及び心室型心筋細胞の少なくともいずれかを用いる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、被験物質投与工程と、測定工程と、判定工程とを含む方法が好ましい。
前記心筋細胞を用いる場合には、心室型心筋細胞と、心房型心筋細胞とを区別する工程を更に含むことが好ましい。
【０１４６】
＜被験物質投与工程＞
前記被験物質投与工程は、前記心筋細胞、及び前記心室型心筋細胞の少なくともいずれかに被験物質を投与する工程である。
前記心筋細胞、及び前記心室型心筋細胞は、健常者由来の細胞であってもよいし、肥大型心筋症患者由来の細胞であってもよいし、心肥大患者由来の細胞であってもよし、ヌーナン症候群患者由来の細胞であってもよい。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【０１４７】
−被験物質−
前記被験物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化合物、該化合物の誘導体、タンパク質、核酸分子などが挙げられる。
前記被験物質の投与量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【０１４８】
−培養−
前記被験物質を投与される前記心筋細胞、及び前記心室型心筋細胞の少なくともいずれかの培養方法としては、特に制限はなく、後述する測定工程で用いる方法に応じて適宜選択することができる。
例えば、パッチクランプ法を用いる場合には、前記心筋細胞、及び前記心室型心筋細胞の少なくともいずれかを低密度で播種することで単細胞の状態で培養する必要があり、播種密度としては、５００細胞／ｃｍ２〜１０，０００細胞／ｃｍ２が好ましい。
例えば、ハイコンテンツ解析機器を用いて測定する場合には、前記心筋細胞、及び前記心室型心筋細胞の少なくともいずれかを培養容器の底面積を５０％〜８０％程度覆う状態で培養する必要があり、播種密度としては、１５，０００細胞／ｃｍ２〜６０，０００細胞／ｃｍ２が好ましく、１５，０００細胞／ｃｍ２〜３５，０００細胞／ｃｍ２がより好ましい。
例えば、カルシウムイメージングや細胞の動きの解析を行う場合には、前記心筋細胞、及び前記心室型心筋細胞の少なくともいずれかを高密度に播種することでシート状に培養する必要があり、播種密度としては、１×１０５細胞／ｃｍ２〜２×１０５細胞／ｃｍ２が好ましい。
前記播種密度が好ましい範囲外であると、評価を適切に行うことが困難となることがある。
前記培養における培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＭＥＭに、血清を添加した培地などが挙げられる。前記血清の含有量としては、例えば、５質量％〜１０質量％などが挙げられる。
前記培養の方法、条件としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
【０１４９】
＜測定工程＞
前記測定工程は、前記被験物質を投与された心筋細胞、及び前記心室型心筋細胞の少なくともいずれかを測定する工程である。
【０１５０】
−方法−
前記測定方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、パッチクランプ法を用いて電気生理学的特性を測定する方法、マイクロプレートリーダーを用いてカルシウムイオンや膜電位の変化を測定する方法、ハイコンテンツ解析機器を用いて細胞の形態、タンパク質の発現、タンパク質の修飾を測定する方法、細胞イメージングシステムを用いて細胞の動きを観察する方法などが挙げられる。
前記測定方法を行う手段としては、特に制限はなく、公知の手段を適宜選択することができる。
【０１５１】
例えば、前記ハイコンテンツ解析機器を用いる場合、前記測定工程は、細胞質染色化合物により心筋細胞を染色し、前記心筋細胞の面積を測定する処理と、アクチン繊維染色化合物により心筋細胞を染色し、前記アクチン繊維染色化合物の染色強度を測定する処理とを含むことが好ましい。また、必要に応じて、核染色化合物により、心筋細胞を染色し、前記心筋細胞の核の面積を測定する処理を含んでもよい。
【０１５２】
前記細胞質染色化合物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＨＣＳ  ＣｅｌｌＭａｓｋＴＭ  Ｂｌｕｅ（インビトロジェン社製）などが挙げられる。
前記細胞質染色化合物を用いることにより、アクチン繊維染色化合物による染色や後述する心室型心筋細胞と、心房型心筋細胞とを区別する工程における免疫染色において、細胞の端まで染色されなかったり、均一に染まらなかったりすることによる細胞の定義付けが困難であるという問題を解消することができる。
【０１５３】
前記アクチン繊維染色化合物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ファロイジンなどが挙げられる。前記アクチン繊維染色化合物により、細胞骨格を染色することができる。
【０１５４】
前記核染色化合物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヘキストなどが挙げられる。
【０１５５】
＜判定工程＞
前記判定工程は、前記測定工程の結果を指標として、前記被験物質の肥大型心筋症、心肥大、及びヌーナン症候群の少なくともいずれかに対する予防乃至治療効果を判定する工程である。
【０１５６】
−判定−
前記判定の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
例えば、ハイコンテンツ解析機器を測定方法として利用した場合、被験物質を投与した肥大型心筋症、心肥大、又はヌーナン症候群患者由来の心筋細胞又は心室型心筋細胞の細胞面積、細胞の真円率、核の面積、核の真円率、アクチン繊維染色化合物による染色強度、テクスチャ解析の各種パラメータが、健常者由来の心筋細胞又は心室型心筋細胞と同様となった場合には、前記被験物質は、肥大型心筋症、心肥大、又はヌーナン症候群に対する治療効果を有すると判定することができる。
前記テクスチャ解析の各種パラメータとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ハイコンテンツ解析機器としてＯｐｅｒｅｔｔａ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いた場合には、“Ｈｏｌｅ”、“Ｅｄｇｅ”、“Ｒｉｄｇｅ”、“Ｖａｌｌｅｙ”、“Ｂｒｉｇｈｔ”、“Ｄａｒｋ”、“Ｓａｄｄｌｅ”、“Ｓｐｏｔ”などが挙げられる。
【０１５７】
前記評価工程は、心室型心筋細胞の面積、及び心室型心筋細胞の細胞骨格異常の少なくともいずれかを指標とすることが好ましい。
前記心室型心筋細胞の面積を指標とすることにより、心室型心筋細胞の肥大の程度を評価することができる。
前記細胞骨格異常は、前記アクチン繊維染色化合物による染色強度、前記テクスチャ解析の各種パラメータに基づいて評価することができる。
【０１５８】
＜心室型心筋細胞と、心房型心筋細胞とを区別する工程＞
前記心室型心筋細胞と、心房型心筋細胞とを区別する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、免疫染色が好ましい。
心室型心筋細胞特異的に発現する遺伝子を免疫染色することにより、心室型心筋細胞であるか否かを判別することができる。また、併せて、心房型心筋細胞特異的に発現する遺伝子についても免疫染色してもよい。
前記心室型心筋細胞と、心房型心筋細胞とを区別する工程を行う時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
後述する試験例６に示されるように、心室型心筋細胞と、心房型心筋細胞とでは、細胞面積が異なる。そのため、心室型心筋細胞と、心房型心筋細胞とを区別することにより、前記判定工程でより適切な判定をすることができる。
【０１５９】
本発明のスクリーニング方法によれば、肥大型心筋症、心肥大、及びヌーナン症候群の少なくともいずれかに対する予防乃至治療薬を効率良くスクリーニングすることが可能となる。
【実施例】
【０１６０】
以下に製造例等を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの製造例等に何ら限定されるものではない。
【０１６１】
（製造例１：心筋細胞の製造）
＜胚様体形成工程＞
多能性幹細胞として、国立大学法人  東京大学医学部付属病院にて樹立したヒトｉＰＳ細胞を用いた。
常法に則って未分化状態で維持されている前記ヒトｉＰＳ細胞をコロニー状に解離し、下記培地（以下、「胚様体形成工程用培養液」と称することがある）に懸濁した後、低接着加工を行った培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ超低接着加工表面（コーニング社製））で浮遊培養（培養条件：３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２）を開始し（０日目）、１日間培養することで、前記ヒトｉＰＳ細胞の凝集体（胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ  Ｂｏｄｙ：ＥＢ）を形成させた。
−胚様体形成工程用培養液−
基礎培地として、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ナカライテスク株式会社製）を用い、前記基礎培地に、下記表４−１及び表４−２に記載の成分を添加したもの（第１の分化誘導培地）に、更に、Ｙ２７６３２（シグマ社製、５μＭ）を添加した培地を胚様体形成工程用培養液とした。
【０１６２】
【表４−１】
0006670494.tif 000007
【０１６３】
【表４−２】
0006670494.tif 000008
【０１６４】
＜洗浄工程＞
前記胚様体を培養液ごと遠心管に回収し、静置して前記胚様体を沈殿させた後、上清を除去した。次いで、イスコフ改変ダルベッコ培地（以下、「ＩＭＤＭ」と称することがある）（ナカライテスク株式会社製）を加え、再度静置して前記胚様体を沈殿させた後、上清を除去した。この作業を２回繰り返し行った。
【０１６５】
＜中胚葉誘導工程＞
前記洗浄工程後、下記培地（以下、「中胚葉誘導工程用培養液」と称することがある）を加え、前記培養皿で、浮遊培養を再開した（胚様体形成工程開始１日目〜３日目）。
−中胚葉誘導工程用培養液−
基礎培地として、ＩＭＤＭ（ナカライテスク株式会社製）を用い、前記基礎培地に、下記表５に記載の成分を添加したもの（第２の分化誘導培地）に、更に、ＣＨＩＲ９９０２１（ミリポア社製、４μＭ）を添加した培地を中胚葉誘導工程用培養液とした。
【０１６６】
【表５】
0006670494.tif 000009
【０１６７】
＜洗浄工程＞
前記中胚葉誘導後の胚様体を培養液ごと遠心管に回収し、静置して前記胚様体を沈殿させた後、上清を除去した。次いで、ＩＭＤＭを加え、再度静置して前記胚様体を沈殿させた後、上清を除去した。この作業を２回繰り返し行った。
【０１６８】
＜心筋細胞誘導工程＞
＜＜第１の心筋細胞誘導処理＞＞
前記洗浄工程後、下記培地（以下、「第１の心筋細胞誘導処理用培養液」と称することがある）を加え、前記培養皿で、浮遊培養を再開した（胚様体形成工程開始３日目〜６日目）。
−第１の心筋細胞誘導処理用培養液−
前記中胚葉誘導工程用培養液において調製した第２の分化誘導培地に、ＩＷＰ２（シグマ社製、５μＭ）、ＳＢ４３１５４２（シグマ社製、５μＭ）、及びエストラジオール（シグマ社製、１００ｎＭ）を添加した培地を第１の心筋細胞誘導処理用培養液とした。
【０１６９】
＜＜洗浄処理＞＞
前記第１の心筋細胞誘導処理後の胚様体を培養液ごと遠心管に回収し、静置して前記胚様体を沈殿させた後、上清を除去した。次いで、ＩＭＤＭを加え、再度静置して前記胚様体を沈殿させた後、上清を除去した。この作業を２回繰り返し行った。
【０１７０】
＜＜第２の心筋細胞誘導処理＞＞
前記洗浄工程後、下記培地（以下、「第２の心筋細胞誘導処理用培養液」と称することがある）を加え、前記培養皿で、浮遊培養を再開した（胚様体形成工程開始６日目〜８日目）。
−第２の心筋細胞誘導処理用培養液−
前記中胚葉誘導工程用培養液において調製した第２の分化誘導培地に、ＩＷＰ２（シグマ社製、５μＭ）、及びエストラジオール（シグマ社製、１００ｎＭ）を添加した培地を第２の心筋細胞誘導処理用培養液とした。
【０１７１】
＜＜洗浄処理＞＞
前記第２の心筋細胞誘導処理後の胚様体を培養液ごと遠心管に回収し、静置して前記胚様体を沈殿させた後、上清を除去した。次いで、ＩＭＤＭを加え、再度静置して前記胚様体を沈殿させた後、上清を除去した。この作業を２回繰り返し行った。
【０１７２】
＜＜第３の心筋細胞誘導処理＞＞
前記洗浄工程後、下記培地（以下、「第３の心筋細胞誘導処理用培養液」と称することがある）を加え、前記培養皿で、浮遊培養を再開した（胚様体形成工程開始８日目〜２０日目）。
−第３の心筋細胞誘導処理用培養液−
前記中胚葉誘導工程用培養液において調製した第２の分化誘導培地に、エストラジオール（シグマ社製、１００ｎＭ）を添加した培地を第２の心筋細胞誘導処理用培養液とした。
【０１７３】
＜＜洗浄処理＞＞
前記第３の心筋細胞誘導処理後の胚様体を培養液ごと遠心管に回収し、静置して前記胚様体を沈殿させた後、上清を除去した。次いで、ＩＭＤＭを加え、再度静置して前記胚様体を沈殿させた後、上清を除去した。この作業を２回繰り返し行った。
【０１７４】
＜非心筋細胞成長抑制工程−１＞
前記洗浄処理後、下記培地（以下、「非心筋細胞成長抑制用培養液」と称することがある）を加え、前記培養皿で、浮遊培養を再開した（胚様体形成工程開始２０日目〜２８日目）。
−非心筋細胞成長抑制用培養液−
基礎培地として、ＤＭＥＭ（グルコース不含、ナカライテスク株式会社製）を用い、前記基礎培地に、牛血清アルブミン（シグマ社製）を５，０００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−乳酸（和光純薬工業株式会社製）を３６０ｍｇ／Ｌ添加した培地を非心筋細胞成長抑制用培養液とした。
【０１７５】
＜胚様体解離工程＞
前記非心筋細胞成長抑制用培養液で培養した後の胚様体を以下のようにして、解離した（胚様体形成工程開始２８日目、中胚葉誘導工程開始２７日目）。
【０１７６】
（１）  胚様体が、ピペットや回収チューブの容器内面に接着しないように、ピペットや回収チューブの容器内面に、血清（Ｂｉｏｗｅｓｔ社製）を１質量％含むＰＢＳを接触させた。
（２）  前記胚様体を回収チューブに回収し、沈殿させた後に上清を除去した。次いで、ＰＢＳを加え、再度沈殿させた後に上清を除去する作業を２回繰り返した。
（３）  下記組成の解離溶液を３ｍＬ加え、３７℃で５分間保持した後にピペッティングを行い、更に３７℃で５分間保持した。
−解離溶液−
２．５ｍｇ／Ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ／１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＤＴＡ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ナカライテスク株式会社製）に、ＤＮａｓｅ  Ｉ（ミリポア社製）を２０ｍｇ／Ｌ添加した溶液を解離溶液として利用した。
（４）  ピペッティングを行った後に、下記組成のタンパク質分解反応停止液を３ｍＬ加え、３７℃で５分間保持し、タンパク質分解反応を停止させるとともに、細胞が破壊されることで溶液中に漏出したゲノムＤＮＡを分解した。
−タンパク質分解反応停止液−
ＤＭＥＭ（ナカライテスク株式会社製）に、血清（Ｂｉｏｗｅｓｔ社製）を２０質量％、及びＤＮａｓｅ  Ｉ（ミリポア社製）を２０ｍｇ／Ｌ添加した溶液をタンパク質分解反応停止液として用いた。
（５）  上清に含まれる解離した細胞を別のチューブに回収した。
（６）  前記（４）で沈殿していた残渣にＰＢＳを加え、再度沈殿させた後に上清を除去した。
（７）  前記（３）と同様の作業を行った。
（８）  前記（４）と同様の作業を行った。
（９）  前記（５）と同様の作業を行った。
（１０）  前記（６）〜（９）の作業を残渣がなくなるまで繰り返し行った。
（１１）  前記（５）、及び（９）で別のチューブに回収した細胞をまとめて４０μｍのフィルタ（ＢＤ社製（３５２３４０））に通し、解離した細胞から細胞の凝集体を除去した。前記フィルタを通した後の細胞を遠心して上清を除去した。
【０１７７】
前記（１１）で上清を除去した後にペレットとなって沈殿している細胞を、培地（ＤＭＥＭ（ナカライテスク株式会社製）に血清（Ｂｉｏｗｅｓｔ社製）を２０質量％加えた培養液）に懸濁し、播種密度１００，０００細胞／ｃｍ２となるようにゼラチンコートを行った培養皿（グライナー社製）に播き、接着培養を行った（培養条件：３７℃、５％ＣＯ２、胚様体形成工程開始２８日目〜３０日目）。
なお、前記ゼラチンコートは、ＰＢＳにゼラチン（シグマ社製）を０．１質量％加えた溶液を培養皿の表面に３０分間以上接触させた後、該溶液を除去することで可能である。
【０１７８】
＜非心筋細胞成長抑制工程−２＞
前記胚様体解離工程後、培地を前記非心筋細胞成長抑制工程−１における非心筋細胞成長抑制用培養液に変更し、培養を継続した（培養条件：３７℃、５％ＣＯ２、胚様体形成工程開始３０日目〜３５日目）。
【０１７９】
＜心筋細胞成熟化工程＞
前記非心筋細胞成長抑制工程後、培地を下記心筋細胞成熟化工程用培養液に変更し、培養を継続した（培養条件：３７℃、５％ＣＯ２、胚様体形成工程開始３５日目〜４２日目）。以上の工程により、心筋細胞を製造した。
−心筋細胞成熟化工程用培養液−
基礎培地として、ＤＭＥＭ（ナカライテスク株式会社製）を用い、前記基礎培地に、Ｂｏｖｉｎｅ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）を５質量％添加した培地を心筋細胞成熟化工程用培養液とした。
【０１８０】
（製造例２：心室型心筋細胞の製造）
前記製造例１で得られた心筋細胞を用い、以下のようにして、心室型心筋細胞を製造（以下、「精製」と称することがある）した。
【０１８１】
＜蛍光ＲＮＡプローブ導入工程＞
蛍光ＲＮＡプローブを導入する２日前に、前記製造例１で得られた心筋細胞を、播種密度１００，０００細胞／ｃｍ２となるようにゼラチンコートを行った培養皿（グライナー社製）に播き、接着培養を行った（培養条件：３７℃、５％ＣＯ２）。なお、培地は、前記製造例１の心筋細胞成熟化工程における心筋細胞成熟化工程用培養液を用いた。
【０１８２】
前記接着培養開始２日目に、ＳｍａｒｔＦｌａｒｅＴＭ  ＲＮＡ検出プローブ（ミリポア社製、標的配列は下記蛍光ＲＮＡプローブの項目参照）を含む溶液（以下、「ＳｍａｒｔＦｌａｒｅ溶液」と称することがある）を培養液１ｍＬあたり１μＬ添加し、培養を継続した。
なお、レポーター鎖の蛍光色素分子には、Ｃｙ５を用いた。
【０１８３】
−蛍光ＲＮＡプローブ（「ＲＮＡ蛍光標識プローブ」と称することもある）−
（１）標的遺伝子がＭＹＬ２遺伝子であり、標的配列が下記配列番号：１で表されるプローブ（以下、「ＭＹＬ２−１」と称することがある）
５’−ｃａｔｇｇｃａｃｃｔａａｇａａａｇｃａａａｇａａｇａｇ−３’（配列番号：１）
前記配列番号：１で表される配列は、ＭＹＬ２遺伝子の７１番目〜９７番目の領域である。
（２）標的遺伝子がＭＹＬ２遺伝子であり、標的配列が下記配列番号：２で表されるプローブ（以下、「ＭＹＬ２−２」と称することがある）
５’−ｃａｔｃａｃｃｃａｃｇｇａｇａａｇａｇａａｇｇａｃｔａ−３’（配列番号：２）
前記配列番号：２で表される配列は、ＭＹＬ２遺伝子の５４５番目〜５７１番目の領域である。
（３）標的遺伝子がＩＲＸ４遺伝子であり、標的配列が下記配列番号：３で表されるプローブ（以下、「ＩＲＸ４−１」と称することがある）
５’−ｃｔａｔｇｇｃａａｃｔａｃｇｔｇａｃｃｔａｃｇｇｃｔｃ−３’（配列番号：３）
前記配列番号：３で表される配列は、ＩＲＸ４遺伝子の３６５番目〜３９１番目の領域である。
（４）標的遺伝子がＩＲＸ４遺伝子であり、標的配列が下記配列番号：４で表されるプローブ（以下、「ＩＲＸ４−２」と称することがある）
５’−ａｇａｇｃｔｃｃａａｇａａｃｇｃａｇａｇｃｃｃｇｔｇｇ−３’（配列番号：４）
前記配列番号：４で表される配列は、ＩＲＸ４遺伝子の８３８番目〜８６４番目の領域である。
（５）標的遺伝子がＭＹＬ３遺伝子であり、標的配列が下記配列番号：５で表されるプローブ（以下、「ＭＹＬ３−１」と称することがある）
５’−ｃｔａａｇｇａｇｇｔｃｇａｇｔｔｔｇａｔｇｃｔｔｃｃａ−３’（配列番号：５）
前記配列番号：５で表される配列は、ＭＹＬ３遺伝子の１８８番目〜２１４番目の領域である。
（６）標的遺伝子がＭＹＬ３遺伝子であり、標的配列が下記配列番号：６で表されるプローブ（以下、「ＭＹＬ３−２」と称することがある）
５’−ｃａｇｃｔａａａｃｃｔｃｇｔｇｃｃｃａｇｇａａｇｃｃｃ−３’（配列番号：６）
前記配列番号：６で表される配列は、ＭＹＬ３遺伝子の６７５番目〜７０１番目の領域である。
（７）標的遺伝子がＲＰＬ３Ｌ遺伝子であり、標的配列が下記配列番号：７で表されるプローブ（以下、「ＲＰＬ３Ｌ−１」と称することがある）
５’−ｔｇｃａｇａａｃａｃｃｔｃａｇｔｇａｔｇａｇｔｇｃｃｇ−３’（配列番号：７）
前記配列番号：７で表される配列は、ＲＰＬ３Ｌ遺伝子の３６５番目〜３９１番目の領域である。
（８）標的遺伝子がＲＰＬ３Ｌ遺伝子であり、標的配列が下記配列番号：８で表されるプローブ（以下、「ＲＰＬ３Ｌ−２」と称することがある）
５’−ａｔｔａｃｇｃｔｇａｇａａａｇｔｃｃｃｔｃｃｔｇｇｔｇ−３’（配列番号：８）
前記配列番号：８で表される配列は、ＲＰＬ３Ｌ遺伝子の１０２８番目〜１０５４番目の領域である。
（９）ネガティブコントロール（スクランブルオリゴを標識したもの、以下、「ＳＦ１０２」と称することがある）
【０１８４】
＜分取工程＞
前記蛍光ＲＮＡプローブを導入して１日間経過後に、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を用いて細胞を剥離し、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳＡｒｉａＴＭＩＩＩ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）でソーティングを行った。結果を図１〜図１０に示す。
【０１８５】
図１〜図１０の結果から、蛍光ＲＮＡプローブとしてＭＹＬ２−１を導入した場合に右方シフトが最も強いことが示された。
【０１８６】
（試験例１：心室型心筋細胞の評価−１）
蛍光ＲＮＡプローブとしてＭＹＬ２−１を用い、製造例２と同様にして、心室型心筋細胞を精製した。ＦＡＣＳでソーティングを行った結果を図１１及び図１２に示す。
図１２中、Ｐ１は、ＭＹＬ２−１陽性分画（ＭＹＬ２−１によって標識された蛍光強度が上位１０％の分画）を示し、Ｐ２は、ＭＹＬ２−１陰性分画（ＭＹＬ２−１によって標識された蛍光強度が下位１０％の分画）を示す。
【０１８７】
−免疫染色−
ＦＡＣＳでソーティングを行う前の細胞群（以下、「未ソート」と称することがある）、ＭＹＬ２−１によって標識された蛍光強度が上位１０％の細胞群（以下、「ＭＹＬ２陽性分画」と称することがある）、及びＭＹＬ２−１によって標識された蛍光強度が下位１０％の細胞群（以下、「ＭＹＬ２陰性分画」と称することがある）について、播種密度３０，０００細胞／ｃｍ２となるようにゼラチンコートを行った９６穴プレート（ＣｅｌｌＣａｒｒｉｅｒ−９６、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）に播き、接着培養を開始した（培養条件：３７℃、５％ＣＯ２）。なお、培地は、ＤＭＥＭ（ナカライテスク株式会社製）に血清（Ｂｉｏｗｅｓｔ社製）を１０質量％加えた培養液を用いた。２日間後、培地を除去した後にＰＢＳで洗浄し、４質量％パラホルムアルデヒドを常温で１０分間作用させることで固定作業を行った。
【０１８８】
心室型ミオシン軽鎖、及び心房型ミオシン軽鎖に対する抗体を用いて固定した細胞の免疫染色を以下のようにして行い、ハイコンテンツ解析機器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製、Ｏｐｅｒｅｔｔａ）を用いて解析した。
前記固定後の細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（シグマ社製）を０．１質量％含むＰＢＳを常温で５分間作用させることで透徹作業を行った。
透徹後の細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、正常ヤギ血清（シグマ社製）を５質量％含むＰＢＳを常温で６０分間作用させることでブロッキング作業を行った。
ブロッキング後の細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、正常ヤギ血清（シグマ社製）を５質量％含むＰＢＳに、心室型ミオシン軽鎖に対するウサギポリクローナル抗体（カタログ番号１０９０６−１−ＡＰ、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社製）及び心房型ミオシン軽鎖に対するマウスモノクローナル抗体（カタログ番号３１１０１１、Ｓｙｎａｐｔｉｃｓ社製）を１：２００で希釈することで作製した一次抗体溶液を４℃で一晩作用させた。
一次抗体溶液を作用させた細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、正常ヤギ血清（シグマ社製）を５質量％含むＰＢＳに、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８で蛍光標識したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６で蛍光標識したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１：５００で希釈することで作製した二次抗体溶液を常温で１時間作用させた。
二次抗体を作用させた細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、正常ヤギ血清（シグマ社製）を５質量％含むＰＢＳに、ヘキスト３３３４２（１０ｍｇ／ｍＬ、インビトロジェン社製）を１：１０，０００で、ＤＭＳＯに溶解したＨＣＳ  ＣｅｌｌＭａｓｋＴＭ  Ｂｌｕｅ（インビトロジェン社製）を１：５，０００で、メタノールに溶解したＣＦＴＭ６４７で蛍光標識したファロイジン（Ｂｉｏｔｉｕｍ社製）を１：４０で希釈することで作製したカウンターステイン溶液を室温で３０分間作用させた。
カウンターステインした細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、４質量％パラホルムアルデヒドを常温で１０分間作用させることで後固定作業を行った。
【０１８９】
前記免疫染色の結果、未ソートでは、心室筋（ＭＹＬ２遺伝子単独陽性）細胞の割合が６４．１％、心房筋（ＭＹＬ７遺伝子単独陽性）細胞の割合が１３．７％、その他の割合が２２．２％であった。ＭＹＬ２陽性分画では、心室型心筋細胞の割合が９４．３％、心房型心筋細胞の割合が３．２％、その他の割合が２．６％であった。ＭＹＬ２陰性分画では、心室型心筋細胞の割合が４４．３％、心房型心筋細胞の割合が２４．６％、その他の割合が３１．０％であった。
したがって、本発明の心室型心筋細胞の製造方法により、心室型心筋細胞を精製できることが確認された。
【０１９０】
（試験例２：心室型心筋細胞の評価−２）
前記試験例１で得られたＭＹＬ２陽性分画、及びＭＹＬ２陰性分画の各細胞における心室型心筋細胞特異的遺伝子（ＭＹＬ２遺伝子、ＭＹＬ３遺伝子、ＩＲＸ４遺伝子）、及びカルシウムハンドリングに関わる遺伝子（ＰＬＮ遺伝子、ＲＹＲ２遺伝子、ＡＴＰ２Ａ２遺伝子、ＣＡＳＱ１遺伝子）の発現量をリアルタイムＰＣＲ法で解析した。結果を図１３に示す。
【０１９１】
−遺伝子の発現量の測定−
細胞からＲＮＡ抽出試薬（Ｔｒｉｚｏｌ、インビトロジェン社製）を用いてＲＮＡを抽出し、キット（Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてゲノムＤＮＡを除去した後に逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを作成した。リアルタイムＰＣＲはユニバーサルプローブ及びＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０  ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて行った。リアルタイムＰＣＲに用いたプライマーの配列及びユニバーサルプローブの番号は、以下のとおりである。
−−ＭＹＬ２遺伝子を定量するためのプライマー配列及びプローブの番号−−
フォワード  ：  ５’−ｇｃａｇｇｃｇｇａｇａｇｇｔｔｔｔｃ−３’（配列番号：９）
リバース  ：  ５’−ａｇｔｔｇｃｃａｇｔｃａｃｇｔｃａｇｇ−３’（配列番号：１０）
プローブ番号  ：  ６３番
−−ＭＹＬ３遺伝子を定量するためのプライマー配列及びプローブの番号−−
フォワード  ：  ５’−ｇｇｃａｇａａｇｔｇｃｔｃｃｇｔｇｔ−３’（配列番号：１１）
リバース  ：  ５’−ａｇｔｃｃａｔｃａｔｃｔｔｇｇｔａｔｔｇａｇｃ−３’（配列番号：１２）
プローブ番号  ：  ６０番
−−ＩＲＸ４遺伝子を定量するためのプライマー配列及びプローブの番号−−
フォワード  ：  ５’−ａｇａｇｃｔｃｃａａｇａａｃｇｃａｇａｇ−３’（配列番号：１３）
リバース  ：  ５’−ｔｃｇａａｇｔｃｇｔｃｃａａｇｔｃａｃｔａａ−３’（配列番号：１４）
プローブ番号  ：  １７番
−−ＰＬＮ遺伝子を定量するためのプライマー配列及びプローブの番号−−
フォワード  ：  ５’−ｔｔｃａｃａｔｔｇａｇｔａｇｇｃａｇａｇｇａ−３’（配列番号：１５）
リバース  ：  ５’−ｃａｔｇａａｔａｔｔｃｔｔｔｃｃｃｃｃａｃｔ−３’（配列番号：１６）
プローブ番号  ：  ６９番
−−ＲＹＲ２遺伝子を定量するためのプライマー配列及びプローブの番号−−
フォワード  ：  ５’−ｇｃｇｇａｔｃｃａｇｔａａａａｃａｃｔｔｇ−３’（配列番号：１７）
リバース  ：  ５’−ｔｃｃｃｃａｔｇｔｇｇａｔａｇｔｇｔｃａｔ−３’（配列番号：１８）
プローブ番号  ：  ６３番
−−ＡＴＰ２Ａ２遺伝子を定量するためのプライマー配列及びプローブの番号−−
フォワード  ：  ５’−ｇｇｔｃａａｇａａｇｃｔｔａａｇｇａｇａｇａｔｇ−３’（配列番号：１９）
リバース  ：  ５’−ｔｃａｃａａｇｔｔｃｃａｇｃａａｇｇｔｔｔ−３’（配列番号：２０）
プローブ番号  ：  ４１番
−−ＣＡＳＱ１遺伝子を定量するためのプライマー配列及びプローブの番号−−
フォワード  ：  ５’−ｇｃｔｇｔｇｇｃｃａａｇａａａｃｔａｇｇ−３’（配列番号：２１）
リバース  ：  ５’−ｃａａｔｇａｃｔｔｃａｔｃｔｃｃｃｔｔｇａａ−３’（配列番号：２２）
プローブ番号  ：  ５６番
【０１９２】
図１３中、横軸は、遺伝子を示し、各遺伝子の項目における左側は、ＭＹＬ２陰性分画の細胞における遺伝子の発現を解析した結果を示し、右側は、ＭＹＬ２陽性分画の細胞における遺伝子の発現を解析した結果を示す。
図１３の結果から、ＭＹＬ２陽性分画では、心室型心筋細胞特異的遺伝子及びカルシウムハンドリングに関わる遺伝子の発現が高くなっていた。カルシウムハンドリングに関わる遺伝子が多いほうが成熟した心室型心筋細胞であり、応用に適しているとされることから、本発明の製造方法で得られた心室型心筋細胞は、優れたものであることが示された。
【０１９３】
（試験例３：心室型心筋細胞の評価−３）
前記試験例１で得られたＭＹＬ２陽性分画、及びＭＹＬ２陰性分画の各細胞について、パッチクランプを用いた電気生理学的解析を行った。結果を図１４及び図１５に示す。
【０１９４】
−活動電位の測定−
前記細胞を、ゼラチンをコートしたカバーグラス上に播種し、５日間〜１０日間培養した後、自発的に拍動している単細胞をホールセル状態にし、電流固定下（０ｐＡ）で自発性の活動電位を測定した。細胞外液の組成は、ＮａＣｌ  １５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＫＣｌ  ４ｍｍｏｌ／Ｌ、ＣａＣｌ２  １．２ｍｍｏｌ／Ｌ、ＭｇＣｌ２  １ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｄ（＋）−グルコース  １０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＨＥＰＥＳ  １０ｍｍｏｌ／Ｌ（ＮａＯＨを用いてｐＨ７．４に調整）のものを用いた。電極内液の組成は、ＫＣｌ  １４０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＭｇＣｌ２  １ｍｍｏｌ／Ｌ、ＥＧＴＡ  ５ｍｍｏｌ／Ｌ、ＭｇＡＴＰ  ５ｍｍｏｌ／Ｌ、ＨＥＰＥＳ  １０ｍｍｏｌ／Ｌ（ＫＯＨを用いてｐＨ７．２に調整）のものを用いた。
【０１９５】
図１４は、ＭＹＬ２陽性分画の細胞の活動電位の代表的な一例を示し、図１５は、ＭＹＬ２陰性分画の細胞の活動電位の代表的な一例を示す。
ＭＹＬ２陽性分画では、全ての細胞で活動電位が観察され、また、心室筋様活動電位が観察された細胞の割合は９２％であった（１２細胞中１１細胞）。一方、ＭＹＬ２陰性分画では、活動電位が観察された細胞の割合は５０％であり、そのうち、心室筋様活動電位が観察された細胞の割合は３３％であった（６細胞中２細胞）。
したがって、電気生理学的解析の結果からも本発明の製造方法で得られた心室型心筋細胞は、優れたものであることが示された。
【０１９６】
（試験例４：心室型心筋細胞の精製時期の検討−１）
心筋細胞として、（１）前記製造例１の胚様体解離工程後の心筋細胞、（２）前記製造例１の非心筋細胞成長抑制工程−２後の心筋細胞、又は（３）前記製造例１の心筋細胞成熟化工程後の心筋細胞を用い、蛍光ＲＮＡプローブとして、ＭＹＬ２−１を用いた以外は、前記製造例２と同様にして、ＦＡＣＳでソーティングを行った。
【０１９７】
ＦＡＣＳにより分取したＭＹＬ２陽性分画について、前記試験例１と同様にして免疫染色を行った。
【０１９８】
前記免疫染色の結果、（１）前記製造例１の胚様体解離工程後の心筋細胞を用いた場合では、心室型心筋細胞の割合が７０％、心房型心筋細胞の割合が１３％、その他の割合が１７％であり、（２）前記製造例１の非心筋細胞成長抑制工程−２後の心筋細胞を用いた場合では、心室型心筋細胞の割合が８４％、心房型心筋細胞の割合が４．９％、その他の割合が１１％であり、（３）前記製造例１の心筋細胞成熟化工程後の心筋細胞を用いた場合では、心室型心筋細胞の割合が９４％、心房型心筋細胞の割合が３．２％、その他の割合が２．６％であった。
したがって、心室型心筋細胞の精製効率は、心筋細胞成熟化工程を行うことによって上昇することが示された。
【０１９９】
（試験例５：心室型心筋細胞の精製時期の検討−２）
前記試験例４で得られた各ＭＹＬ２陽性分画の細胞における心室型心筋細胞特異的遺伝子（ＭＹＬ２遺伝子、ＭＹＬ３遺伝子、ＩＲＸ４遺伝子）、及びカルシウムハンドリングに関わる遺伝子（ＰＬＮ遺伝子、ＲＹＲ２遺伝子、ＡＴＰ２Ａ２遺伝子、ＣＡＳＱ１遺伝子）の発現量を、前記試験例２と同様にして測定した。結果を図１６に示す。
【０２００】
図１６中、横軸は、遺伝子を示し、各遺伝子の項目における左側は、（１）前記製造例１の胚様体解離工程後の心筋細胞を用いた場合のＭＹＬ２陽性分画の細胞における遺伝子の発現を解析した結果を示し、中央は、（２）前記製造例１の非心筋細胞成長抑制工程−２後の心筋細胞を用いた場合のＭＹＬ２陽性分画の細胞における遺伝子の発現を解析した結果を示し、右側は、（３）前記製造例１の心筋細胞成熟化工程後の心筋細胞を用いた場合のＭＹＬ２陽性分画の細胞における遺伝子の発現を解析した結果を示す。
図１６の結果から、心室型心筋細胞特異的遺伝子及びカルシウムハンドリングに関わる遺伝子の発現は、心筋細胞成熟化工程を行うことによって上昇することが示された。
【０２０１】
（試験例６：心室型心筋細胞の精製時期の検討−３）
前記試験例４の免疫染色の結果を用い、心室型心筋細胞及び心房型心筋細胞の面積を測定した。結果を表６−１から表６−３に示す。
【０２０２】
【表６−１】
0006670494.tif 000010
【０２０３】
【表６−２】
0006670494.tif 000011
【０２０４】
【表６−３】
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【０２０５】
表６−１から表６−３の結果から、胚様体解離工程後、非心筋細胞成長抑制工程−２後、心筋細胞成熟工程後の順に、細胞面積が増大し、ばらつきが減少した。
したがって、心筋細胞成熟化工程を行うことが好ましいことが示された。
【０２０６】
（試験例７：心室型心筋細胞の評価−４）
前記試験例１で得られたＭＹＬ２陽性分画の細胞、市販の心筋細胞である、ｉＣｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）、及びＲｅｐｒｏＣａｒｄｉｏ（株式会社リプロセル製）について、パッチクランプを用いた電気生理学的解析を行った。
【０２０７】
−イオンチャネル電流の測定−
前記細胞を、ゼラチンをコートしたカバーグラス上に播種し、５日間〜１０日間培養した後、自発的に拍動している単細胞をホールセル状態にし、電位固定下で観察した。細胞外液の組成は、ＮａＣｌ  １５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＫＣｌ  ４ｍｍｏｌ／Ｌ、ＣａＣｌ２  １．２ｍｍｏｌ／Ｌ、ＭｇＣｌ２  １ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｄ（＋）−グルコース  １０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＨＥＰＥＳ  １０ｍｍｏｌ／Ｌ（ＮａＯＨを用いてｐＨ７．４に調整）のものを用いた。電極内液の組成は、ＫＣｌ  １４０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＭｇＣｌ２  １ｍｍｏｌ／Ｌ、ＥＧＴＡ  ５ｍｍｏｌ／Ｌ、ＭｇＡＴＰ  ５ｍｍｏｌ／Ｌ、ＨＥＰＥＳ  １０ｍｍｏｌ／Ｌ（ＫＯＨを用いてｐＨ７．２に調整）のものを用いた。
イオンチャネル電流を測定する際の電位プロトコルは以下を用いた。
・  ナトリウム電流  ：  保持電位−９０ｍＶから−２０ｍＶまで２０ミリ秒の脱分極刺激を１秒間隔で与えた。
・  カルシウム電流  ：  保持電位−４０ｍＶから−０ｍＶまで１００ミリ秒の脱分極刺激を１０秒間隔で与えた。
・  カリウム電流  ：  保持電位−９０ｍＶから−４０ｍＶまで５０ミリ秒の脱分極の後、２０ｍＶ、２秒の脱分極、更に−４０ｍＶ、０．５秒に再分極させる刺激を１５秒間隔で与えた。
【０２０８】
結果を図１７から図２５に示す。
図１７は、試験例１で得られたＭＹＬ２陽性分画の細胞のナトリウム電流を解析した結果を示し、図１８は、市販のｉＣｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓのナトリウム電流を解析した結果を示し、図１９は、市販のＲｅｐｒｏＣａｒｄｉｏのナトリウム電流を解析した結果を示す。
図２０は、試験例１で得られたＭＹＬ２陽性分画の細胞のカリウム電流を解析した結果を示し、図２１は、市販のｉＣｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓのカリウム電流を解析した結果を示し、図２２は、市販のＲｅｐｒｏＣａｒｄｉｏのカリウム電流を解析した結果を示す。
図２３は、試験例１で得られたＭＹＬ２陽性分画の細胞のカルシウム電流を解析した結果を示し、図２４は、市販のｉＣｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓのカルシウム電流を解析した結果を示すし、図２５は、市販のＲｅｐｒｏＣａｒｄｉｏのカルシウム電流を解析した結果を示す。
【０２０９】
図１７から図２５の結果から、本発明の製造方法で得られた心室型心筋細胞は、６．５ｎＡ以上の大きなピークナトリウム電流、３００ｐＡ以上の大きなピークカリウム電流、及び１ｎＡ以上の大きなピークカルシウム電流を安定して示しており、市販品と比較して、非常に優れたものであることが示された。
【０２１０】
（試験例８：心室型心筋細胞の比較）
多能性幹細胞として、国立大学法人  東京大学医学部付属病院にて樹立した、健常者由来ｉＰＳ細胞、ヌーナン症候群患者由来ｉＰＳ細胞、又は肥大型心筋症患者由来ｉＰＳ細胞を用いた以外は、前記製造例１と同様にして、心筋細胞を製造した。
【０２１１】
前記心筋細胞を、１５，０００細胞／ｃｍ２で９６穴プレートに播種した。培地は、ＤＭＥＭ（ナカライテスク株式会社製）に血清（Ｂｉｏｗｅｓｔ社製）を１０質量％加えた培養液を用いた。
免疫染色により、ＭＹＬ２遺伝子（心室型ミオシン軽鎖）を発現している細胞、ＭＹＬ７遺伝子（心房型ミオシン軽鎖）を発現している細胞、細胞の核及び細胞質を染色し、ハイコンテンツ解析機器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製、Ｏｐｅｒｅｔｔａ）を用いて観察、解析した。
前記免疫染色は、以下のようにして行った。
播種２日間後、培地を除去した後にＰＢＳで洗浄し、４質量％パラホルムアルデヒドを常温で１０分間作用させることで固定作業を行った。
固定後の細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（シグマ社製）を０．１質量％含むＰＢＳを常温で５分間作用させることで透徹作業を行った。
透徹後の細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、正常ヤギ血清（シグマ社製）を５質量％含むＰＢＳを常温で６０分間作用させることでブロッキング作業を行った。
ブロッキング後の細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、正常ヤギ血清（シグマ社製）を５質量％含むＰＢＳに、心室型ミオシン軽鎖に対するウサギポリクローナル抗体（カタログ番号１０９０６−１−ＡＰ、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社製）及び心房型ミオシン軽鎖に対するマウスモノクローナル抗体（カタログ番号３１１０１１、Ｓｙｎａｐｔｉｃｓ社製）を１：２００で希釈することで作製した一次抗体溶液を４℃で一晩作用させた。
一次抗体溶液を作用させた細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、正常ヤギ血清（シグマ社製）を５質量％含むＰＢＳに、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８で蛍光標識したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６で蛍光標識したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１：５００で希釈することで作製した二次抗体溶液を常温で１時間作用させた。
二次抗体を作用させた細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、正常ヤギ血清（シグマ社製）を５質量％含むＰＢＳにヘキスト３３３４２（１０ｍｇ／ｍＬ、インビトロジェン社製）を１：１０，０００で、ＤＭＳＯに溶解したＨＣＳ  ＣｅｌｌＭａｓｋＴＭ  Ｂｌｕｅ（インビトロジェン社製）を１：５，０００で、メタノールに溶解したＣＦＴＭ６４７で蛍光標識したファロイジン（Ｂｉｏｔｉｕｍ社製）を１：４０で希釈することで作製したカウンターステイン溶液を室温で３０分間作用させた。
カウンターステインした細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、４質量％パラホルムアルデヒドを常温で１０分間作用させることで後固定作業を行った。
【０２１２】
健常者由来ｉＰＳ細胞を用いて製造された心筋細胞を免疫染色した代表的な一例を図２６に示し、肥大型心筋症患者由来ｉＰＳ細胞を用いて製造された心筋細胞を免疫染色した代表的な一例を図２７に示す。
【０２１３】
また、ハイコンテンツ解析機器による解析の結果を図２８〜図４０に示す。なお、図２８〜図４０中、「健常者」は健常者由来ｉＰＳ細胞を用いて製造された心筋細胞中の心室型心筋細胞の結果を示し、「ヌーナン症候群」はヌーナン症候群患者由来ｉＰＳ細胞を用いて製造された心筋細胞中の心室型心筋細胞の結果を示し、「肥大型心筋症」は肥大型心筋症患者由来ｉＰＳ細胞を用いて製造された心筋細胞中の心室型心筋細胞の結果を示す。
【０２１４】
細胞面積は、図２８に示されるように、健常者由来ｉＰＳ細胞を用いて製造された心室型心筋細胞と比べて、ヌーナン症候群患者由来ｉＰＳ細胞を用いて製造された心室型心筋細胞及び肥大型心筋症患者由来ｉＰＳ細胞を用いて製造された心室型心筋細胞のほうが大きくなっていた。
【０２１５】
細胞の真円率は、図２９に示されるように、健常者由来ｉＰＳ細胞を用いて製造された心室型心筋細胞と比べて、肥大型心筋症患者由来ｉＰＳ細胞を用いて製造された心室型心筋細胞のほうが小さくなっていた。
【０２１６】
核の面積は、図３０に示されるように、健常者由来ｉＰＳ細胞を用いて製造された心室型心筋細胞と比べて、肥大型心筋症患者由来ｉＰＳ細胞を用いて製造された心室型心筋細胞のほうが大きくなっていた。
【０２１７】
核の真円率は、図３１に示されるように、健常者由来ｉＰＳ細胞を用いて製造された心室型心筋細胞と比べて、肥大型心筋症患者由来ｉＰＳ細胞を用いて製造された心室型心筋細胞のほうが小さくなっていた。
【０２１８】
ファロイジン染色強度は、図３２に示されるように、健常者由来ｉＰＳ細胞を用いて製造された心室型心筋細胞と比べて、ヌーナン症候群患者由来ｉＰＳ細胞を用いて製造された心室型心筋細胞のほうが小さくなっていた。
【０２１９】
ファロイジン染色像についてのハイコンテンツ解析機器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製、Ｏｐｅｒｅｔｔａ）付属のテクスチャ解析の項目のうち、“Ｈｏｌｅ（図３３）”、“Ｅｄｇｅ（図３４）”、“Ｒｉｄｇｅ（図３５）”、“Ｖａｌｌｅｙ（図３６）”、“Ｂｒｉｇｈｔ（図３７）”、及び“Ｄａｒｋ（図３８）”は、健常者由来ｉＰＳ細胞を用いて製造された心室型心筋細胞と比べて、ヌーナン症候群患者由来ｉＰＳ細胞を用いて製造された心室型心筋細胞及び肥大型心筋症患者由来ｉＰＳ細胞を用いて製造された心室型心筋細胞のほうが小さくなっていた。また、ファロイジン染色像についてのハイコンテンツ解析機器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製、Ｏｐｅｒｅｔｔａ）付属のテクスチャ解析の項目のうち、“Ｓａｄｄｌｅ（図３９）”、及び“Ｓｐｏｔ（図４０）”は、健常者由来ｉＰＳ細胞を用いて製造された心室型心筋細胞と比べて、肥大型心筋症患者由来ｉＰＳ細胞を用いて製造された心室型心筋細胞のほうが小さくなっていた。
【０２２０】
以上のように、本発明の製造方法によると、健常者由来と、ヌーナン症候群患者由来と、肥大型心筋症患者由来とで大きさなどが異なる心室型心筋細胞となることが明らかとなった。
したがって、本発明の方法により得られる心筋細胞、及び心室型心筋細胞は、ヌーナン症候群、肥大型心筋症、及び心肥大の少なくともいずれかに対する予防乃至治療薬のスクリーニング方法に応用できる可能性が示された。
【０２２１】
（試験例９：スクリーニング系の確認）
多能性幹細胞として、国立大学法人  東京大学医学部付属病院にて樹立した、肥大型心筋症患者由来ｉＰＳ細胞を用いた以外は、前記製造例１と同様にして、心筋細胞を製造した。
【０２２２】
前記心筋細胞を、１５，０００細胞／ｃｍ２で９６穴プレートに播種した。培地は、ＤＭＥＭ（ナカライテスク株式会社製）に血清（Ｂｉｏｗｅｓｔ社製）を１０質量％加えた培養液を用いた。
播種の４８時間後に、培地をＤＭＥＭ（ナカライテスク株式会社製）に血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）を５質量％加えた培養液に交換したうえで、心肥大抑制効果が報告されている薬剤であるラパマイシン、ニフェジピン、カルベジロールを最終濃度１０μＭで添加した。また、前記薬剤に代えて、ＤＭＳＯを添加したものをコントロールとした。
【０２２３】
前記薬剤の添加の４８時間後に、前記試験例８と同様にして、免疫染色により、ＭＹＬ２遺伝子（心室型ミオシン軽鎖）を発現している細胞、ＭＹＬ７遺伝子（心房型ミオシン軽鎖）を発現している細胞、細胞の核及び細胞質を染色し、ハイコンテンツ解析機器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製、Ｏｐｅｒｅｔｔａ）を用いて観察、解析した。
【０２２４】
ハイコンテンツ解析機器により、心室筋型心筋細胞について解析した結果を図４１〜図４２に示す。
カルベジロールを添加した場合は、図４１〜図４２に示されるように、細胞面積及び核面積の両方が、コントロールに比べて減少していた。
ラパマイシンを添加した場合、及びニフェジピンを添加した場合は、図４２に示されるように、核面積がコントロールに比べて減少していた。
したがって、本発明の製造方法により製造された心筋細胞、及び本発明の心室型心筋細胞の少なくともいずれかを用いることにより、心肥大に対して予防乃至治療効果を有する化合物を適切に検出できることが確認された。
【０２２５】
本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
＜１＞  多能性幹細胞を培養し、胚様体を形成する胚様体形成工程と、
前記胚様体を培養し、中胚葉を誘導する中胚葉誘導工程と、
前記中胚葉誘導後の胚様体を培養し、心筋細胞を誘導する心筋細胞誘導工程と、
前記心筋細胞誘導後の胚様体を解離する胚様体解離工程とを含み、
前記胚様体解離工程が、前記中胚葉誘導工程開始から４０日目までの間に行われることを特徴とする心筋細胞の製造方法である。
＜２＞  胚様体解離工程が、中胚葉誘導工程開始１６日目から３０日目までの間に行われる前記＜１＞に記載の心筋細胞の製造方法である。
＜３＞  胚様体解離工程における、胚様体とタンパク質分解酵素とを連続して接触させる時間が１分間〜３０分間である前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の心筋細胞の製造方法である。
＜４＞  胚様体解離工程を複数回行う前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の心筋細胞の製造方法である。
＜５＞  胚様体解離工程後の心筋細胞を培養し、成熟化させる心筋細胞成熟化工程を含む前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の心筋細胞の製造方法である。
＜６＞  非心筋細胞の成長を抑制する非心筋細胞成長抑制工程を含む前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の心筋細胞の製造方法である。
＜７＞  非心筋細胞成長抑制工程が、心筋細胞誘導工程と胚様体解離工程との間、及び胚様体解離工程と心筋細胞成熟化工程との間の少なくともいずれかで行われる前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の心筋細胞の製造方法である。
＜８＞  心筋細胞が、肥大型心筋症、心肥大、及びヌーナン症候群の少なくともいずれかに対する予防乃至治療薬のスクリーニング方法、並びに心室型心筋細胞の製造の少なくともいずれかに用いられる前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の心筋細胞の製造方法である。
＜９＞  前記＜１＞から＜８＞のいずれかに記載の心筋細胞の製造方法により製造された心筋細胞に蛍光ＲＮＡプローブを導入する蛍光ＲＮＡプローブ導入工程と、
前記蛍光ＲＮＡプローブに由来する蛍光を発する細胞を分取する分取工程とを含むことを特徴とする心室型心筋細胞の製造方法である。
＜１０＞  蛍光ＲＮＡプローブの標的遺伝子が、ＭＹＬ２遺伝子、ＩＲＸ４遺伝子、ＭＹＬ３遺伝子、及びＲＰＬ３Ｌ遺伝子の少なくともいずれかである前記＜９＞に記載の心室型心筋細胞の製造方法である。
＜１１＞  蛍光ＲＮＡプローブの標的遺伝子が、ＭＹＬ２遺伝子である前記＜９＞から＜１０＞のいずれかに記載の心室型心筋細胞の製造方法である。
＜１２＞  活動電位振幅が１４０ｍＶ以上であり、３００ｐＡ以上のピークカリウム電流、１ｎＡ以上のピークカルシウム電流、及び６．５ｎＡ以上のピークナトリウム電流を示すことを特徴とする心室型心筋細胞である。
＜１３＞  前記＜９＞から＜１１＞のいずれかに記載の心室型心筋細胞の製造方法により製造されたものである前記＜１２＞に記載の心室型心筋細胞である。
＜１４＞  肥大型心筋症、心肥大、及びヌーナン症候群の少なくともいずれかに対する予防乃至治療薬のスクリーニング方法であって、
心筋細胞、及び心室型心筋細胞の少なくともいずれかを用いることを特徴とするスクリーニング方法である。
＜１５＞  心筋細胞が、前記＜１＞から＜８＞のいずれかに記載の心筋細胞の製造方法により製造された心筋細胞であり、心室型心筋細胞が、前記＜１２＞から＜１３＞のいずれかに記載の心室型心筋細胞である前記＜１４＞に記載のスクリーニング方法である。
＜１６＞  心筋細胞、及び心室型心筋細胞の少なくともいずれかに被験物質を投与する被験物質投与工程と、
前記被験物質を投与された心筋細胞、及び前記心室型心筋細胞の少なくともいずれかを測定する測定工程と、
前記測定工程の結果を指標として、前記被験物質の肥大型心筋症、心肥大、及びヌーナン症候群の少なくともいずれかに対する予防乃至治療効果を判定する判定工程とを含む前記＜１４＞から＜１５＞のいずれかに記載のスクリーニング方法である。
＜１７＞  前記＜１＞から＜８＞のいずれかに記載の心筋細胞の製造方法により製造された心筋細胞を用い、
免疫染色により、心室型心筋細胞と、心房型心筋細胞とを区別する工程を含む前記＜１５＞から＜１６＞のいずれかに記載のスクリーニング方法である。
＜１８＞  測定工程が、細胞質染色化合物により心筋細胞を染色し、前記心筋細胞の面積を測定する処理と、アクチン繊維染色化合物により心筋細胞を染色し、前記アクチン繊維染色化合物による染色強度を測定する処理とを含む前記＜１６＞から＜１７＞のいずれかに記載のスクリーニング方法である。
＜１９＞  評価工程が、心室型心筋細胞の面積、及び心室型心筋細胞の細胞骨格異常の少なくともいずれかを指標とする前記＜１６＞から＜１８＞のいずれかに記載のスクリーニング方法である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【配列表】
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