(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３０、３２、４０、４２、４８、５１、または５３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
治療に有効な量の配列番号３０、３２、４０、４２、４８、５１、または５３に記載のアミノ酸配列からなる１つまたは複数のペプチドと、任意の薬学的に許容される賦形剤と、を含む、医薬組成物。
【請求項３】
請求項２に記載の医薬組成物の製造方法であって、
治療に有効な量の配列番号３０、３２、４０、４２、４８、５１、または５３に記載のアミノ酸配列からなる１つまたは複数のペプチドと、薬学的に許容される賦形剤とを組み合わせることを含む、製造方法。
【請求項４】
治療に用いられる、配列番号３０、３２、４０、４２、４８、５１、または５３に記載のアミノ酸配列からなる１つまたは複数のペプチド。
【請求項５】
神経変性障害の治療、改善または予防に用いられる、配列番号３０、３２、４０、４２、４８、５１、または５３に記載のアミノ酸配列からなる１つまたは複数のペプチド。
【請求項６】
治療される前記神経変性障害が「グローバル」ニューロン（‘Ｇｌｏｂａｌ’  ｎｅｕｒｏｎｓ）の損傷または死によって特徴づけられる、請求項５に記載の１つまたは複数のペプチド。
【請求項７】
前記神経変性障害が、アルツハイマー病；パーキンソン病；ハンチントン病；運動ニューロン病；脊髄小脳変性症１型、２型、および３型；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；統合失調症；レビー小体型認知症；および前頭側頭型認知症からなる群から選択される、請求項５または６に記載の１つまたは複数のペプチド。
【請求項８】
治療される前記神経変性障害がアルツハイマー病；パーキンソン病；ハンチントン病；または運動ニューロン病である、請求項５〜７のいずれか１項に記載の１つまたは複数のペプチド。
【請求項９】
治療される前記神経変性障害がアルツハイマー病である、請求項５〜８のいずれか１項に記載の１つまたは複数のペプチド。
【請求項１０】
２以上のペプチドが、前記神経変性障害の治療において組み合わせて使用される、請求項５〜９のいずれか１項に記載の１つまたは複数のペプチド。
【請求項１１】
Ｔ３０毒性に対して保護的な１つまたは複数のペプチドが、Ａβ毒性に対して保護的な１つまたは複数のペプチドと組み合わせて使用される、請求項１０に記載の１つまたは複数のペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経変性障害に関し、そして特に新規のペプチド、組成物、療法、およびそのような症状（例えば、アルツハイマー病）の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病は、主として６５歳を超える年齢の男女が患い、当該疾患を有すると診断される可能性は実質的に年齢とともに増大する。６５歳を超える成人の割合は今後４０年で世界的に増大し、アルツハイマー病の発生は２倍を超えると予測されており、２０１０年の２１００万人から２０５０年には５３００万人に上ると言われている（ｗｗｗ．ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓｒｅｓｅａｒｃｈｕｋ．ｏｒｇおよびｗｗｗ．ａｌｚ．ｏｒｇの統計より）。このアルツハイマー病の患者数の予測される指数関数的な増大は、未遭遇の医療需要の主要な領域を表しているだけではなく、現在完全に有効な疾患の治療方法がないがゆえ、重要な治療および診断の市場機会を提供する。
【０００３】
アルツハイマー病に特異的に対抗する新薬はなかったが、より一般的な神経変性障害についてもここ１０年間なかった。理由は現時点において、薬学的に標的にできる根底にある脳のメカニズムが未だ特定されていないためである。神経変性の過程の代表的な説明は‘アミロイド仮説’であり、神経細胞の死を、死後の（ｐｏｓｔ−ｍｏｒｔｅｍ）アルツハイマー脳の特徴である、有害なアミロイドの付着に結び付けられる細胞膜の破壊であるとし、アミロイド前駆体タンパクの異常開裂の結果であるとしている。しかしながら、この‘アミロイド仮説’は、頻繁にみられるアルツハイマー病とパーキンソン病の共病理や、全脳細胞のアミロイドの偏在にもかかわらず変性に弱い細胞の特徴的な選択性、認知症モデル動物のアミロイドの付着の欠如、認知欠如が見られなくとも特定の脳の領域でのアミロイドの発生はしていることの説明にはならない。過去２０年の薬学的標的としてのアミロイド形成の認知度にもかかわらず、この理論に基づいた治療の効果は未だ認められていない。より見込みのある可能性としては、一度脳変性過程が進行すると、より非特異的な二次的かつ増悪的な効果としてアミロイドが付加的に生成するというものである。
【０００４】
神経変性の主な機構を特定する１つの糸口は、結局、様々な神経細胞群が本来脆弱である可能性である。さらに、多様な細胞サブグループにアルツハイマー病、パーキンソン病および運動ニューロン疾患は互いに隣接しており、脳幹から前脳に至る連続的な‘ハブ’を形成する傾向があり、そのすべてが上位の大脳中心にむけて上側と外側へ放射拡散する。このゆえに、伝達物質の不均質性にもかかわらず、これらの神経細胞群は、小脳、視床、皮質など、脳の他の大部分のよりよく知られた局所的な回路の細胞と区別するために、グローバルニューロン（‘Ｇｌｏｂａｌ’  ｎｅｕｒｏｎｓ）と総称されている。これらの選択的に脆弱なグローバルニューロンは、異なる用語（等樹状コア、‘ｉｓｏｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｏｒｅ’）を用いてではあるものの、神経変性に重要であることが数十年前には特定されていた。
【０００５】
グローバルニューロンのサブグループは、脳卒中で損傷した時でさえ、脳における他の部位の対応物はそうならないのに対してこれらの細胞だけが次第に死んでいくのはなぜか、という困難で未回答の問題を説明できるかもしれない共通の特徴を有している。すなわち、グローバルニューロンのサブグループは、成長を助長してこれを持続させる物質（すなわち‘栄養因子’）に対する特異的な感受性を伴って、成人期中およびその間の頑強な可塑性を保持しているのである。成長中の脳において、栄養因子はカルシウム流入を刺激することにより作用し、細胞内でのイベントのカスケードを引き起こし、やがては選択的な分化と成長をもたらす。しかしながら、より高い用量または長期間の暴露において、カルシウム流入の維持は神経細胞に対して有毒になり得る。最も重要なこととして、カルシウムの流入が栄養または有毒の効果を引き起こすか否かを決定する他の因子は年齢である。神経細胞が成熟するにつれて、かつては栄養レベルであった細胞間カルシウムが致命的になるのである。
【０００６】
本発明者らは以前に、神経変性過程は実際には異常に活性化された発生の過程であることを提唱した。この仮説の裏付けとして、脳幹の‘ハブ（ｈｕｂ）’となる神経細胞の肥大が実際にアルツハイマー脳において報告されている（Ｂｏｗｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．  ７：７２３−３０）。もし広範囲においてこのハブが損傷している場合、頻繁に見受けられるが未だかつて説明されていないアルツハイマー病とパーキンソン病の共病理の症例で生ずるように複数の神経変性疾患が現れる。興味深いことに、グローバルニューロンの脆弱なハブのすべての神経細胞は、伝達物質の不均質性にもかかわらず、すべてが馴染みのある酵素であるアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）を含んでいる。ノルアドレナリン作動性青斑核、ドーパミン作動性黒質またはセロトニン作動性縫線核のような細胞のサブグループは、通常の基質であるアセチルコリンを含有しないため、ＡＣｈＥはその通常の機能を果たすことができない神経細胞に存在しているということになる。その正常な酵素的役割からのさらに予期せぬ逸脱は、ＡＣｈＥが、おそらくそれ自体が何らかの種類の細胞間メッセンジャーとして、グローバルニューロンから実際に放出されるということである。一般に、ＡＣｈＥは現在、神経組織および非神経組織の双方の多種多様な状況において栄養活性を持ったシグナル伝達分子として広くよく知られている。
【０００７】
本発明者らは以前、ＡＣｈＥがそれ自身の酵素作用とは独立して、栄養剤として作用し、神経細胞へのカルシウム流入を実際に引き起こすことを示した。ゆえに、グローバルニューロン内では、ＡＣｈＥは、量、有効期間および最も顕著には年齢に依存して、栄養−毒性軸に沿って分布する、２つの非古典的作用を有している可能性がある。もし、通常の神経細胞が成人期に、脳卒中のように損傷した場合、他が機能的に補償する。対照的に、グローバルニューロンは栄養源を呼び出すことで応答し、再生を試みる。しかし、それに続くカルシウムの流入は、より老年の、成熟した細胞にとって致命的であることから、結果として生じる損傷は、さらに補償を試みることによって神経変性を特徴付ける悪循環を引き起こす。
【０００８】
アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）は、様々な形態の異なる発達段階で発現しており、これらはすべて同一の酵素活性を有するが、全く異なる分子組成を有する。‘テイルド（ｔａｉｌｅｄ）’（Ｔ−ＡＣｈＥ）はシナプスにおいて発現しており、本発明者らは以前に、Ｃ−末端から切断されうる２本のペプチドを同定しており、これらの一方は“Ｔ１４”と称され、他方は“Ｔ３０”として知られ、これらのいずれもβ−アミロイドの相当する領域に対して強い配列相同性を有する。ＡＣｈＥ  Ｃ−末端ペプチド“Ｔ１４”は、非加水分解作用の範囲に関与するＡＣｈＥ分子の特徴的な部分であると同定されている。合成１４アミノ酸ペプチド類似体（すなわち、“Ｔ１４”）、および続いてそれが含まれて大きく、より安定で、より高活性なアミノ酸配列（すなわち、“Ｔ３０”）は、‘非コリン作動性’ＡＣｈＥに相当する作用を示し、Ｔ３０配列の内部における不活性残基（すなわち“Ｔ１５”）は効果がなかった。
【０００９】
Ｔ１４およびＴ３０の急性的な作用は、（ｉ）数ミリ秒から数時間の時間軸で脳スライスの神経細胞へのカルシウム流入を調節する；（ｉｉ）ＰＣ１２細胞およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの神経細胞の器官型培養物における細胞生存率を低下させる；（ｉｉｉ）神経細胞およびＰＣ１２細胞からの‘補償的な’カルシウム誘導性ＡＣｈＥ放出を調節する；（ｉｖ）卵母細胞および脳スライスの神経細胞でカルシウム電流を活性化する；（ｖ）アミロイドと毒性作用において相乗的に作用する；および（ｖｉ）アミロイド前駆体タンパク質産生およびアミロイドβ（Ａβ）ペプチド放出に関与する、というものである。Ｔ１４およびＴ３０の慢性的な作用は、（ｉ）神経細胞の成長抑制；（ｉｉ）アポトーシスの誘発；（ｉｉｉ）ＡＣｈＥ放出の増大；（ｉｖ）α７ニコチン性受容体への結合と調節；（ｖ）２４時間にわたって細胞表面でのα７受容体発現を増進し、それによってさらなる毒性のためのフィードフォワード機構を提供する、というものである。
【００１０】
Ｔ１４およびＴ３０は、毒性の誘導においてβ−アミロイドより選択的であり、毒性を悪化させるアミロイドと相乗的に作用することから、Ｔ１４またはＴ３０の毒性作用を遮断する薬剤は、アミロイドのより選択的でないその後の毒性作用をも低減すると仮定されてきた。本発明者らは以前、Ｔ１４およびＴ３０ペプチドがα７ニコチン性受容体のアロステリック部位に結合して栄養−毒性作用のスペクトルを誘導することを示した。この受容体は、脳の発達の重要な期間においてＡＣｈＥと共発現するとともに、成人の脳内においてもほぼ類似した分布を示し、脳内での最も強力なカルシウムイオノフォアの１つである。コリン（食事に由来する）が代替の一次的なリガンドとして作用することができるため、α７ニコチン性受容体はコリン作動性伝達とは独立して機能することもできる。さらに、この受容体はすでに現在の療法のガランタミン（レミニール（ＲＴＭ））の標的の１つとしてアルツハイマー病に関与するとされており、同時にアミロイドの作用にも結び付けられている。
【００１１】
しかしながら、ガランタミンの有効性は限定的であることが判明しており、同時に他のα７ニコチン性アセチルコリン受容体拮抗剤が未だ臨床試験中である。ガランタミンはＡＣｈＥを阻害するのと同様に他の受容体に対して非特異的な作用を示すだけでなく、α７ニコチン性受容体に対してより高い親和性を有する（すなわち、約５ｎＭ）Ｔ３０およびＴ１４と比較すると、α７ニコチン性受容体に対する親和性は低い（すなわち、１０μＭしかない）。したがって、アルツハイマー病の脳において、Ｔ３０ペプチドの内因性等価物がすでにそれぞれの受容体部位を占めている場合、ガランタミンは不可避的な副作用を伴う非生理学的な高用量で投与する必要があり、さらに重要なことにその有効性も疑わしい。
【００１２】
本発明者らは以前、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）のＣ−末端に由来するアミノ酸配列を含む環状ペプチドが、ＡＣｈＥおよび／またはその末端ペプチドの非古典的な作用（すなわち、酵素活性とは独立したＡＣｈＥの作用）をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて選択的に阻害し、そしてそれゆえ、神経変性障害の治療に使用されうることを示した。たとえば、図２および図３に示される“ＮＢＰ１４”と称される環状ペプチドは、ＡＣｈＥペプチドおよびアミロイドベータの作用と拮抗するα７ニコチン性受容体のアロステリック調節剤として作用することから、特に活性であることが示されている。この環状ペプチドは直鎖状のＴ１４、Ｔ３０およびβ−アミロイドの毒性から細胞を保護し、直鎖状のＴ１４およびＴ３０の毒性によって誘導されたＡＣｈＥの補償的な放出を遮断することが示された。さらに、環状のＮＢＰ１４は単体で供与されると、ラット脳スライス中のＣａ２＋濃度に有意な作用を示さないが、β−アミロイドの作用を遮断することも観察された。
【００１３】
しかしながら、環状のＮＢＰ１４によって示された活性にもかかわらず、その大きさに起因して、血液脳関門の通過能力についていくらかの懸念がある。したがって、アルツハイマー病およびパーキンソン病のような神経変性障害の治療のための改善された医薬を提供することについての要望は継続して存在している。
【発明の概要】
【００１４】
実施例で議論しているように、本発明者らはアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）のＣ−末端由来の小さな直鎖状ペプチド（すなわち、４〜１４アミノ酸長）またはその環状の変異体に注意を向けることで以前の研究を構築した。本発明者らはペプチドアレイを調製し、神経変性障害の治療に有用である活性な直鎖状ペプチドを分類し、これを有用でない不活性なペプチドと分別することが驚くべきことに可能であることを見出した。これらの活性および不活性のペプチドは、Ｔ３０またはアミロイドに対する神経保護の有効性に基づいて分類され、これは細胞損失の減少および付随するＡＣｈＥの補償放出、すなわち、直鎖状ペプチドの存在下で培養されたＰＣ１２細胞から放出されたアセチルコリンエステラーゼの、当該ペプチドの非存在下でのＰＣ１２細胞のそれと比較した百分率を計算し、この値を当該ペプチドの存在下でのＰＣ１２細胞の生存率（百分率）で除することによって決定された値係数により評価した。
【００１５】
したがって、本発明の第１の形態によれば、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）のＣ末端、その環化変異体、またはその短小化体由来の５〜８個のアミノ酸の配列を含み、またはこれからなり、１．０〜１．１の係数値ｘを有するペプチド、その誘導体または類似体が提供される。ここで、ｘ＝％ＡＣｈＥ放出／％ＰＣ１２細胞生存率であり、「％ＡＣｈＥ放出」は、Ｔ３０（配列番号１５６）またはＡβ（配列番号１５８）から選択される毒性ペプチドと前記ペプチド、その誘導体または類似体の存在下で培養されたＰＣ１２細胞調製物から放出されたアセチルコリンエステラーゼの、前記ペプチド、その誘導体または類似体の不存在下で培養されたＰＣ１２細胞調製物（すなわち、コントロール）から放出されたアセチルコリンエステラーゼと比較した百分率であり、「％ＰＣ１２細胞生存率」は、Ｔ３０（配列番号１５６）またはＡβ（配列番号１５８）から選択される毒性ペプチドと前記ペプチド、その誘導体または類似体の存在下で培養されたＰＣ１２細胞調製物の生存率の、前記ペプチド、その誘導体または類似体の不存在下で培養されたＰＣ１２細胞調製物（すなわち、コントロール）の生存率と比較した百分率である。
【００１６】
実施例に記載されているように、本発明者らは、驚くべきことに、Ｔ３０およびＡβの毒性に対するペプチドの保護的な有効性を示す係数値（Ｘ）に基づき、活性なペプチドを不活性なペプチドから分別することが可能であることを示した。コントロールの値（すなわち、ペプチドの不存在下）は１．０である。この係数値は２つの生物学的パラメータの関係であり、ｘ＝１．０〜１．１は毒性を示さない（すなわち、保護的である）ことを意味し、ｘ＞１．１は毒性を意味する。Ｔ３０についての値はｘ＝１６９．４５／７４．３０９＝２．２８であり、およびアミロイドベータ（Ａβ）についての値はｘ＝１２４．１９／８７．４２＝１．４２である。
【００１７】
表１および表２は、Ｔ３０およびＡβの毒性に対するＡＣｈＥ活性およびＰＣ１２細胞生存率における直鎖状ペプチドの効果を示したものである。示されているように、いくつかのペプチドは保護的であるが、毒性を予防しないものもある。本発明のペプチドが対応する受容体部位をすでに占めているＴ３０ペプチドの内因性等価物に競り勝つということは予測できなかったことである。したがって、第１の形態のペプチドは、以前に確立されていた直鎖状Ｔ３０（およびＴ１４）ペプチドそしてさらにβ−アミロイド（Ａβ）の毒性作用を防止する。より大きなサイズの化合物は末梢から脳へのアクセスを獲得する（すなわち、血液脳関門を通過する）可能性が低いと考えられるため、活性ペプチドは５〜８アミノ酸の長さであるという点がさらなる条件である。したがって、この２つの条件（すなわち、アミノ酸長および神経保護活性）を用いることで、構造および機能によって神経保護直鎖状ペプチドの単離が可能となる。このように、本発明者らはｉｎ  ｖｉｖｏでのその有効性を確信しており、本発明のペプチドは、さらなる細胞喪失から安定化させる点において、神経変性障害の治療に著しい有用性を有すると考えている。
【００１８】
第２の形態においては、治療または診断に用いられる、第１の形態に係る１以上のペプチド、その誘導体または類似体が提供される。
【００１９】
第３の形態においては、神経変性障害の治療、改善または予防に用いられる、第１の形態に係る１以上のペプチド、その誘導体または類似体が提供される。
【００２０】
第４の形態においては、被験体の神経変性障害を治療、改善または予防する方法が提供され、前記方法は、そのような処置を必要とする被験体に、有効量の１以上の第１の形態に係るペプチド、その誘導体または類似体を投与することを含む。
【００２１】
治療される前記神経変性障害は、好ましくは‘グローバル’ニューロンの損傷または死によって特徴づけられているものである。たとえば、前記神経変性障害は、アルツハイマー病；パーキンソン病；ハンチントン病；運動ニューロン病；脊髄小脳変性症１型、２型、および３型；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；統合失調症；レビー小体型認知症；および前頭側頭型認知症から選択されうる。
【００２２】
好ましくは、治療される前記神経変性障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病または運動ニューロン病である。最も好ましくは、第１の形態に係るペプチド、その誘導体または類似体で治療される前記神経変性障害が、アルツハイマー病である。
【００２３】
“その誘導体または類似体”との語は、その中のアミノ酸残基が類似の側鎖またはペプチド骨格の特性を有する残基（天然アミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ酸模倣体のいずれであるかにかかわらず）で置換されたペプチドを意味しうる。さらに、前記ペプチドの末端は、アセチル基またはアミド基と類似の性質をもつＮ−末端保護基またはＣ−末端保護基で保護されていてもよい。
【００２４】
本発明のペプチドの誘導体および類似体は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるペプチドの半減期を増大させるものを含みうる。たとえば、本発明の前記ペプチドの誘導体または類似体は、ペプチドのペプトイド誘導体およびレトロペプトイド誘導体、ペプチドのペプチド−ペプトイドハイブリッド誘導体およびＤ−アミノ酸誘導体を含みうる。
【００２５】
ペプトイド（すなわち、ポリＮ−置換グリシン）は、ペプチド模倣体の部類に属し、側鎖がアミノ酸にあるようなα−炭素ではなく、ペプチド骨格の窒素原子に付加している。
本発明の前記ペプチドのペプトイド誘導体は、ペプチドの構造の知識から容易に設計できる。レトロペプトイド（すべてのアミノ酸がペプトイド残基で逆順に置換されている）も本発明における適切な誘導体である。レトロペプトイドは、ペプチドまたは１つのペプトイド残基を含むペプトイド−ペプチドハイブリッドと比較して、リガンド結合溝において反対方向に結合することが期待される。その結果、ペプトイド残基の側鎖は元のペプチドの側鎖と同じ方向を向くことができる。
【００２６】
“由来の”は、ＡＣｈＥのＣ−末端およびその一部分、またはその環化変異体、たとえばＮＢＰ−１４に存在する、すなわちこれを形成するアミノ酸配列の誘導体または改変体であるアミノ酸配列を意味しうる。
【００２７】
“短小化体”は、ＡＣｈＥ由来のペプチドからアミノ酸の除去によって大きさを小さくしたものを意味しうる。前記アミノ酸の除去は残基をペプチドのＣ−末端またはＮ−末端から除くことによって、または１以上のアミノ酸をペプチドの内部から除くことによって達成されうる。
【００２８】
１つの実施形態において、第１の形態のペプチド、その誘導体または類似体は、環状であるかまたは環化されていてもよい。しかしながら、最も好ましくは、前記ペプチド、その誘導体または類似体は環状ではなく、環化されてもいないものである。好ましくは、前記ペプチド、その誘導体または類似体は直鎖状である。好ましくは、前記ペプチド、その誘導体または類似体は精製され、および／または単離されたもの、すなわち、天然に見いだされないものである。好ましくは、前記ペプチド、その誘導体または類似体が少なくとも９５％の純度を有し、または少なくとも９９％の純度を有するもの、すなわち不純物を含まないものである。
【００２９】
アセチルコリンエステラーゼはアセチルコリンを加水分解するセリンプロテアーゼであり、当業者にはよく知られている。脳内に見られるアセチルコリンエステラーゼの主な形態はテイルドアセチルコリンエステラーゼ（“ｔａｉｌｅｄ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ”、Ｔ−ＡＣｈＥ）として知られている。本発明が主に神経変性障害の治療に関連することを考慮すると、前記ペプチド、その誘導体または類似体は、テイルドアセチルコリンエステラーゼ（Ｔ−ＡＣｈＥ）のＣ−末端に由来するアミノ酸配列、またはその環状変異体もしくは短小化体を含むか、これからなることが好ましい。
【００３０】
ヒトのテイルドアセチルコリンエステラーゼ（Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ：ＡＡＡ６８１５１．１）の１つの実施形態のタンパク質配列は、６１４アミノ酸の長さであり、以下のように配列番号１５７として本明細書に提供される：
【００３１】
【化１】
0006708646.tif 000002
【００３２】
配列番号１５７の最初の３１アミノ酸残基はタンパク質の放出時に除去され、それによって５８３アミノ酸配列が残ることが理解されるであろう。したがって、前記ペプチド、その誘導体または類似体は、アセチルコリンエステラーゼのＣ末端に由来するアミノ酸配列、またはその環状変異体もしくは短小化体を含むことが好ましく、この際、前記アセチルコリンエステラーゼは、実質的に配列番号１５７に示されるアミノ酸配列またはその機能的変異体もしくは断片を含む。好ましくは、Ｎ末端の３１個のアミノ酸は除外される。
【００３３】
好ましくは、前記ペプチド、その誘導体または類似体は、アセチルコリンエステラーゼのＣ−末端またはその環化変異体もしくは短小化体を形成する末尾３００、２００、１００または５０アミノ酸由来のアミノ酸配列を含むか、またはこれからなり、この際最も好ましくは、前記アセチルコリンエステラーゼが実質的に配列番号１５７に示されるアミノ酸配列を含む。前記ペプチド、その誘導体または類似体は、好ましくは、アセチルコリンエステラーゼのＣ末端またはその環化変異体もしくは短小化体を形成する末尾４０または３０アミノ酸由来のアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる。
【００３４】
実施例に記載し、そして図７に図示したように、本発明者らは、それによって活性のあるペプチドを同定するための一連の条件を考案した。活性ペプチドを確立するのに用いられる第１の条件は、ＡＣｈＥ活性およびＰＣ１２細胞の生存率の尺度である係数値（ｘ）が１．０から１．１であることであった。用いられる他の条件は、前記活性ペプチドは長さが５〜８アミノ酸であることであったが、これはより大きなサイズの化合物は末梢から脳へのアクセスを獲得する（すなわち、血液脳関門を通過する）可能性が低いと考えられるためである。
【００３５】
活性ペプチドを同定するのに用いられる他の条件は、前記ペプチドのα７ニコチン性受容体のアロステリック部位に対する理論的結合値に基づくものであった。前記理論的結合値は、ＴｒｏｔｔおよびＯｌｓｏｎによって公表されたアルゴリズム（Ｏ．  Ｔｒｏｔｔ，Ａ．Ｊ．  Ｏｌｓｏｎ，ＡｕｔｏＤｏｃｋ  Ｖｉｎａ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｐｅｅｄ  ａｎｄ  ａｃｃｕｒａｃｙ  ｏｆ  ｄｏｃｋｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｅｗ  ｓｃｏｒｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｔｈｒｅａｄｉｎｇ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１  （２０１０）  ４５５−４６１を参照）によって計算できる。したがって、好ましくは前記ペプチド、その誘導体または類似体はα７ニコチン性受容体のアロステリック部位に対して−７．０ｋｃａｌ・ｍｏｌ−１未満、より好ましくは−７．１ｋｃａｌ・ｍｏｌ−１未満、最も好ましくは−７．８ｋｃａｌ・ｍｏｌ−１未満の理論的結合親和性を有する。
【００３６】
活性ペプチドを同定するのに用いた最後の条件は、前記ペプチドによって生じるＰＣ１２細胞へのカルシウムの流入量である。前記カルシウムの流入値は方法の項に記載したようにして計算できる。前記カルシウム値は、Ｔ３０またはＡβを単独で、または前記小さなペプチドの共存下で投与したときの実験の結果に相当する。これらの実験におけるコントロール値は、アセチルコリン単独で誘起されたカルシウム流入に基づく。好ましくは、前記ペプチド、その誘導体または類似体は１２０未満のカルシウム流入値を有し、より好ましくは９７〜１２０の値を有する。
【００３７】
好ましくは、前記ペプチド、その誘導体または類似体は、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）のＣ−末端またはその環化変異体に由来する５〜８アミノ酸の配列からなる。
【００３８】
したがって、特に好ましくは、前記ペプチド、その誘導体または類似体は、（ｉ）５〜８アミノ酸の長さである；（ｉｉ）１．０〜１．１の計数値ｘを有する；（ｉｉ）α７ニコチン性受容体のアロステリック部位へのペプチドの理論的結合値が−７．０未満である；そして、１２０未満のカルシウム流入値を有する。
【００３９】
最も好ましくは，前記ペプチド、その誘導体または類似体は、（ｉ）５〜８アミノ酸の長さである；（ｉｉ）１．０〜１．１の係数値ｘを有する；（ｉｉ）α７ニコチン性受容体のアロステリック部位へのペプチドの理論的結合値が−７．１未満である、または−７．８０未満である；そして、９７〜１２０のカルシウム流入値を有する。
【００４０】
有利に、そして好ましくは、本発明の前記ペプチド、その誘導体または類似体は、Ｔ３０ペプチドおよび／またはＡβの毒性作用に対して保護的である。より好ましくは、本発明の前記ペプチド、その誘導体または類似体は、Ｔ３０ペプチドおよびＡβの毒性作用に対して保護的である。毒性のパラメータはアセチルコリンエステラーゼの増加と細胞生存率の減少、カルシウム流入の増大およびα７ニコチン性受容体への理論的親和性の低下として定量される。これらのパラメータの変化によって前記ペプチドの保護的な効果を評価するのである。
【００４１】
本発明の前記ペプチド、その誘導体または類似体の分子量は、好ましくは、１０００Ｄａ未満であり、より好ましくは９００Ｄａ未満である。
【００４２】
好ましくは、前記ペプチド、その誘導体または類似体は、５個および８個のアミノ酸残基、または５個および７個のアミノ酸、または６個および８個のアミノ酸を含むか、またはこれからなる。
【００４３】
１つの好ましい実施形態において、前記ペプチド、その誘導体または類似体は、６個のアミノ酸を含むか、またはこれからなる。好ましくは、前記ペプチド、その誘導体または類似体は、実質的に配列番号３０、３２、４０または４２に記載されているアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる。
【００４４】
配列番号３０（すなわち“ＮＢＰ−６０１”）のアミノ酸配列は：ＨＷＫＡＥＦである。配列番号３２（すなわち“ＮＢＰ−６０３”）のアミノ酸配列は：ＫＡＥＦＨＲである。配列番号４０（すなわち“ＮＢＰ−６１１”）のアミノ酸配列は：ＳＹＭＶＨＷである。配列番号４２（すなわち“ＮＢＰ−６１３”）のアミノ酸配列は：ＭＶＨＷＫＡである。
【００４５】
好ましくは、配列番号４０はＡβの毒性作用に対して保護的である。好ましくは、配列番号３０、３２および４２はＴ３０の毒性作用に対して保護的である。
【００４６】
他の好ましい実施形態において、前記ペプチド、その誘導体または類似体は、７個のアミノ酸を含むか、またはこれからなる。好ましくは、前記ペプチド、その誘導体または類似体は、実質的に配列番号４８、５１または５３に記載されているアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる。
【００４７】
配列番号４８（すなわち“ＮＢＰ−７０５”）のアミノ酸配列は：ＥＦＨＲＷＳＳである。配列番号５１（すなわち“ＮＢＰ−７０８”）のアミノ酸配列は：ＲＷＳＳＹＭＶである。配列番号５３（すなわち“ＮＢＰ−７１０”）のアミノ酸配列は：ＳＳＹＭＶＨＷである。
【００４８】
好ましくは、配列番号５３はＡβの毒性作用に対して保護的である。好ましくは、配列番号４８および５１はＴ３０の毒性作用に対して保護的である。
【００４９】
他の好ましい実施形態において、前記ペプチド、その誘導体または類似体は、８個のアミノ酸を含むか、またはこれからなる。好ましくは、前記ペプチド、その誘導体または類似体は、実質的に配列番号６１に記載されているアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる。
【００５０】
配列番号６１（すなわち“ＮＢＰ−８０４”）のアミノ酸配列は：ＡＥＦＨＲＷＳＳである。
【００５１】
好ましくは、配列番号６１はＴ３０の毒性作用に対して保護的である。
【００５２】
図３に示されるように、ＮＰＢ−６０１、６０３および８０４はすべて、末端のアラニンとリシンとで環化した環状ＮＢＰ−１４（配列番号１）に由来するものであることがわかる。ＮＰＢ−６０１、６０３および８０４はすべて直鎖状ペプチドであり、互いに連結したアラニンおよびリシンのアミノ酸（すなわち、ＮＢＰ−１４がライゲーションしている場所を規定するアミノ酸）を含んでいる。
【００５３】
Ａβは現在、アルツハイマー病のような神経変性障害を引き起こす毒性についてより一般的に受け容れられている機構であろう。したがって、Ａβ毒性に対して保護的である本発明の任意のペプチド、その誘導体または類似体が好ましく、ゆえに、これらは神経変性障害の治療に特に有用である。しかしながら、本発明者らの以前の研究では、Ａβ毒性ではなく、Ｔ３０毒性が実際にはより確からしい神経変性障害の要因であることが示唆されている。したがって、Ｔ３０毒性に対して保護的である本発明の任意のペプチド、その誘導体または類似体が最も好ましく、そして神経変性障害の治療に特に有用である。
【００５４】
本発明者らは、前記好ましい直鎖状ペプチドについて、ＰＣ１２におけるＴ３０およびアミロイドに対する用量依存性応答実験を行った（実施例６）。本発明者らはさらに、基底前脳で誘発された応答に対するＴ３０の効果を試験し、環状ＮＢＰ１４または第１の形態のより短い直鎖状変異体のいずれかがＴ３０誘発性変化を反転することができるか否かを試験した。実施例６および７は、ＮＢＰ６０１、ＮＢＰ６０３およびＮＢＰ６１３がＴ３０の作用から保護することを示した。したがって、これらのペプチドが最も好ましい。
【００５５】
第５の形態においては、実質的に配列番号３０、３２、４０、４２、４８、５１、５３または６１に記載されるアミノ酸配列からなるペプチド、その誘導体または類似体が提供される。
【００５６】
第６の形態においては、治療または診断に用いられる、第５の形態に係る１以上のペプチド、その誘導体または類似体が提供される。
【００５７】
第７の形態においては、神経変性障害の治療、改善または予防に用いられる、第５の形態に係る１以上のペプチド、その誘導体または類似体が提供される。
【００５８】
第８の形態においては、被験体の神経変性障害を治療、改善または予防する方法が提供され、前記方法は、そのような処置を必要とする被験体に、有効量の１以上の第５の形態に係るペプチド、その誘導体または類似体を投与することを含む。
【００５９】
好ましい実施形態においては、単一のペプチド、その誘導体または類似体が神経変性障害の治療に用いられする。しかしながら、結果に基づいて、別の実施形態においては、２以上のペプチド、その誘導体または類似体が神経変性障害の治療に用いられる、すなわち、併用療法に用いられる。たとえば、Ａβ毒性に対して保護的であることが示された複数のペプチドが用いられてもよい。あるいは、好ましくは、Ｔ３０毒性に対して保護的であることが示された複数のペプチドが用いられてもよい。
【００６０】
しかしながら、好ましい実施形態においては、Ｔ３０毒性に対して保護的である１以上のペプチドを、Ａβ毒性に対して保護的である以上のペプチドと併用する、すなわち、２つのペプチド（表１に示されるＴ３０毒性に対して保護的であるペプチドから１つ、および表２に示されるＡβ毒性に対して保護的であるペプチドから１つ）を投与する。たとえば、ＮＢＰ−６０１（配列番号３０）はＮＢＰ−７１０（配列番号５３）と同時投与でき、またはＮＢＰ−８０４（配列番号６１）はＮＢＰ−６１１（配列番号４０）と同時投与できる、などのことである。
【００６１】
本発明に係るペプチドは、アルツハイマー病のような神経変性障害の治療、改善または予防の単独療法（すなわち、１以上の第１の形態のペプチド、その誘導体または類似体の使用）に用いられうる薬剤として用いることができると理解されるであろう。あるいは、本発明に係る前記ペプチドは、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤のようなアルツハイマー病を治療、改善または予防する既知の療法の補助薬として、またはこれと組み合わせて用いることができる。
【００６２】
本発明に係る前記ペプチドは、特に、組成物が用いられる用法に応じて多数の異なる形態を有する組成物に組み合わせることができる。ゆえに、たとえば、組成物は粉末、錠剤、カプセル、溶液、軟膏、クリーム、ゲル、ハイドロゲル、エアロゾル、スプレー、ミセル溶液、経皮貼布、リポソーム分散液または処置を必要とするヒトまたは動物に投与することができる他の任意の適切な形態でありうる。本発明に係る薬剤の賦形剤は、それが与えられる被験体によって十分に忍容されるものでなければならず、血液脳関門を越えてペプチドの送達を可能にするものであることが好ましいと理解されるであろう。
【００６３】
脳障害のいかなる治療の効果も、治療候補のペプチドの血液脳関門（ＢＢＢ）透過性に依存することは理解されるであろう。しかしながら、アルツハイマー病の間において、血液脳関門（ＢＢＢ）における透過性が向上することは広く知られており、これにより本発明のペプチドが中枢神経系へ（実際には理想的には、それが必要とされる退化部位、すなわち、ＢＢＢが損傷された部位に）到達することが可能となる。
【００６４】
本発明のペプチドがＢＢＢを透過するようにするためには、以下のような２つの主な戦略が用いられうる：（１）脳を特異的に標的とし、活性化合物を送達するためのトランスポーターとしてのナノ粒子の使用。この方法は、ペプチド、タンパク質、および抗癌剤を脳に送達するために首尾よく使用されてきた；（２）カーゴペプチド（ｃａｒｇｏ  ｐｅｐｔｉｄｅ）の使用。ＢＢＢを横切って特異的に輸送されるこのようなペプチドの添加は、本発明のペプチドの容易な移動を可能にする。
【００６５】
本発明によるポリペプチドを含む医薬は、多くの方法で使用することができる。たとえば、経口投与が必要とされうる場合、ポリペプチドは、たとえば、錠剤、カプセルまたは液体の形態で経口的に摂取され得る組成物内に含まれうる。ペプチドを投与するための別の選択肢は、鼻内噴霧を用いることであり、これは鼻内噴霧によるペプチド投与が、経口または静脈内投与方法よりも迅速かつ効率的に脳に到達するためである（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｍｏｒｙｚｉｎｅ．ｃｏｍ／２０１０／０７／２６／ｎｏｓｅ−ｓｐｒａｙｓ−ｃｒｏｓｓ−ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ−ｂａｒｒｉｅｒ−ｆａｓｔｅｒ−ａｎｄ−ｓａｆｅｒ／を参照）。したがって、本発明のポリペプチドを含む組成物は吸入で投与してもよい（たとえば、鼻腔内）。組成物は局所使用のために処方してもよい。たとえば，クリームまたは軟膏が皮膚に、たとえば、脳の近く、が挙げられる。
【００６６】
本発明のポリペプチドは徐放または遅延放出デバイスに組み入れてもよい。そのようなデバイスは、たとえば、皮下に挿入され、薬剤が数週間または数か月にわたって放出される。前記デバイスは、たとえば頭のように、治療部の最も近くに配置される。そのようなデバイスは、通常は繰り返しの投与（たとえば，少なくとも日々の注射）を必要とする長期の治療において本発明のポリペプチドを使用することが必要となったときに特に有利となる。
【００６７】
好ましい実施形態において、本発明の薬剤は血流中または直接治療が必要な個所への被験体への注射によって行うことができる。たとえば、薬剤は脳の近くに注射できる。注射は静脈内（ボーラスまたは輸液）、皮下（ボーラスまたは輸液）、皮内（ボーラスまたは輸液）が可能である。
【００６８】
前記ポリペプチドの必要量は、投与様式、ポリペプチドの物理化学的特性、およびそれが単独療法としてまたは併用療法において使用されているかどうかに依存して、生物学的活性および生物学的利用能によって評価されることが理解されるであろう。投与の頻度も、治療される被験体のポリペプチドの半減期によって影響される。最適な投与用量は当業者によって評価され、使用されている特定のポリペプチド、医薬組成物の濃度、投与方式、神経変性疾患の進行度合いによって異なる。特定の治療される被験体に依存する、年齢、体重、性別、食事、投与時間を含む追加の要素によって用量の調節が必要になる。
【００６９】
一般に、本発明のポリペプチドの神経変性疾患の治療、改善および予防に使用される日用量は、体重あたり０．００１μｇ／ｋｇおよび体重あたり１００ｍｇ／ｋｇの間であり、どのポリペプチドが使用されるかに依存する。より好ましくは、体重あたり０．０１μｇ／ｋｇおよび体重あたり１ｍｇ／ｋｇの間であり、最も好ましくは、体重あたり０．１μｇ／ｋｇおよび体重あたり０．１μｇ／ｋｇの間である。
【００７０】
前記ポリペプチドは神経変性疾患の発病前または病中、発病後に投与してもよい。日々の投与は単回投与（１回の日毎の注射または点鼻内噴霧の吸入）で行ってもよい。あるいは、前記ポリペプチドは日中に２回以上の投与を必要としてもよい。たとえば、ポリペプチドは２回（または治療する神経変性疾患の重症度に応じてそれより多数）０．０７μｇと７００ｍｇの間（すなわち、想定される体重は７０ｋｇ）、日毎に投与してもよい。治療される患者は第１の投薬を起床時に、第２の投与を夕方に（２回投与用法の場合）または、３もしくは４時間おきに投薬できる。あるいは、適切な量の本発明のポリペプチドを、繰り返し投与する必要することなく、徐放デバイスを用いることができる。
【００７１】
本発明のポリペプチドの特定の製剤および的確な投薬レジメン（たとえば、薬剤および投与の頻度）を形成するために、製薬業界で通常使用されるもの（たとえば、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験、臨床試験など）のような既知の手順を用いることができる。本発明者らは、本発明のポリペプチドの使用に基づく抗神経変性疾患組成物を初めて示唆した者であると考えている。
【００７２】
したがって、本発明の第５の形態では、治療上有効量の第１の形態のペプチド、その誘導体または類似体と、任意に薬学的に許容される賦形剤と、を含む医薬組成物が提供される。
【００７３】
前記医薬組成物は、好ましくは抗神経変性疾患組成物（すなわち、被験体におけるアルツハイマー病などの神経変性障害の治療上の改善、予防または治療に用いられる医薬製剤）である。
【００７４】
本発明はさらに第６の形態として、治療上有効量の第１の形態のペプチド、その誘導体または類似体と、薬学的に許容される賦形剤とを組み合わせることを含む、第５の形態に係る医薬組成物の製造方法を提供する。
【００７５】
前記ペプチド，その誘導体または類似体は、好ましくは、ＮＢＰ−６０１（配列番号３０）、ＮＢＰ−６０３（配列番号３２）、ＮＢＰ−６１３（配列番号４２）、ＮＢＰ−７０５（配列番号４８）、ＮＢＰ−７０８（配列番号５１）、ＮＢＰ−８０４（配列番号６１）、ＮＢＰ−６１１（配列番号４０）またはＮＢＰ−７１０（配列番号５３）である。
【００７６】
“被験体”は脊椎動物、哺乳類または家畜であってもよい。したがって、本発明の薬剤はどんな哺乳類、たとえば家畜（たとえばウマ）、ペットの治療に用いられてもよいし、他の獣医学的用途に用いられてもよい。しかしながら、最も好ましくは、被験体はヒトである。
【００７７】
“治療上有効量”のペプチドは被験体に投与するにあたって、神経変性障害の症状の治療に必要な量、または望ましい効果を生むのに必要な有効成分の量のことである。
【００７８】
たとえば、治療に有効な量使用されるペプチドは約０．００１ｍｇから約８００ｍｇであってもよく、好ましくは約０．０１ｍｇから約５００ｍｇである。ペプチドの用量は好ましくは約０．１ｍｇから約１００ｍｇの用量である。
【００７９】
本明細書で言及する“薬学的に許容される賦形剤”は、医薬組成物を製剤化するのに有用であることが当業者に知られている既知の化合物または既知の化合物の組み合わせである。
【００８０】
１つの実施形態において、薬学的に許容される賦形剤は固体であってもよく、組成物は粉末または錠剤の形態であってもよい。薬学的に許容される賦形剤は、香料、滑沢剤、可溶化剤、懸濁化剤、色素、充填剤、流動促進剤、圧縮助剤、不活性結合剤、甘味料、保存料、コート剤または錠剤崩壊剤としても作用し得る１種類以上の物質を含んでもよい。賦形剤はカプセル化素材であってもよい。散剤においては、賦形剤は本発明によって微細に分割された活性剤と混合された細かく分割された固体である。錠剤において、有効成分は、適切な割合で必要な圧縮特性を有する賦形剤と混合され、所望の形状および大きさに圧縮されてもよい。散剤と錠剤は９９％まで有効成分を含んでもよい。適切な固体の賦形剤は、たとえば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖類、乳糖、デキストリン、でん粉、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリドン、低融点ワックス、イオン交換樹脂を含む。他の実施形態において、前記薬学的賦形剤はゲルであり、前記組成物はクリームまたはその類似体である。
【００８１】
しかしながら、薬学的賦形剤は液体であってもよく、その医薬組成物は溶液の形態である。液体賦形剤は溶液、分散液、エマルジョン、シロップ、エリキシルおよび加圧組成物の製造に使用される。本発明による有効成分は、水、有機溶媒、両方の混合物または薬学的に許容される油脂のような薬学的に許容される液体賦形剤に溶解または分散することができる。液体賦形剤は、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、保存料、甘味料、香料、分散剤、増粘剤、色素、粘度調整剤、安定剤または浸透圧調整剤のような他の適切な薬学的添加物を含むことができる。適切な経口または非経口投与の液体賦形剤は水（一部上記のような添加物、たとえば、セルロース誘導体、好ましくはカルボキシメチルセルロース溶液を含む）、アルコール（１価アルコールおよび多価アルコール、たとえば、グリコール）およびその誘導体、および油（分画ヤシ油およびラッカセイ油）を含む。非経口投与において、賦形剤はオレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルのような油基材エステルであってもよい。無菌液体賦形剤は非経口投与の無菌液形態の組成物に有用である。加圧組成物の前記液体賦形剤はハロゲン化炭化水素または他の薬学的に許容される高圧ガスであってもよい。
【００８２】
無菌の溶液または分散液である液体の医薬組成物は、たとえば、筋肉内、髄腔内、硬膜外、腹腔内、静脈内および特に皮下注射に用いることができる。ポリペプチドは、投与時に無菌水、食塩水、または他の適切な無菌の注射可能な媒体に溶解または分散することが可能な、無菌の固形組成物として製造できる。
【００８３】
本発明のポリペプチドとその組成物は、他の溶質または分散剤（たとえば、十分な食塩水またはグルコースは溶液を等張にできる）、胆汁酸塩、アカシア、ゼラチン、ソルビタンモノオレート、ポリソルベート８０（ソルビトールのオレイン酸エステルとその無水物がエチレンオキシドで共重合されている）およびその類似物を含む、無菌溶液または分散液の形態で経口投与できる。本発明で使用されるポリペプチドは、液体または固体のいずれかの形態で経口投与できる。経口投与に適切な組成物は、ピル、カプセル、顆粒、錠剤、散剤のような固体形状、および溶液、シロップ、エリキシル、分散液のような液体形状を含む。非経口投与で有用な形態は、無菌溶液、エマルジョン、分散液を含む。
【００８４】
本発明は、本明細書に記載の任意の配列のアミノ酸配列または核酸配列を実質的に含む任意の核酸もしくはペプチドまたはその変異体、誘導体もしくは類似体（機能的変異体または機能的断片など）を意味することまで拡張されることも理解されるであろう。“実質的に前記アミノ酸／核酸／ペプチド配列”、“機能的変異体”および“機能的断片”は、本明細書で言及される前記アミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列と少なくとも４０％の配列の同一性を有する配列であり、たとえば、配列番号１〜１５７で表される配列と４０％同一、などである。
【００８５】
参照される配列のいずれかとの配列の同一性が６５％を超える、より好ましくは７０％を超える、さらにより好ましくは７５％を超える、さらにより好ましくは８０％を超えるアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列もまた考慮される。好ましくは、前記アミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列が参照される配列のいずれかと少なくとも８５％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一、さらにより好ましくは少なくとも９２％同一、さらにより好ましくは少なくとも９５％同一、さらにより好ましくは少なくとも９７％同一、さらにより好ましくは少なくとも９８％同一、最も好ましくは本明細書に記載の配列のいずれかと少なくとも９９％同一である。
【００８６】
当業者であれば２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性百分率の計算方法を理解できるであろう。２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性百分率を計算するためには、２つの配列のアライメントをまず準備する必要があり、次いで配列同一性値を計算する。２つの配列の同一性百分率は、（ｉ）たとえば、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（異なるプログラムで実施される）、または３Ｄ比較からの構造的整列のような配列を整列させるために使用される方法；および（ｉｉ）たとえば、ローカル−グローバルアラインメント比較、ペアスコアマトリックスの使用（たとえば、ＢＬＯＳＵＭ６２、ＰＡＭ２５０、Ｇｏｎｎｅｔなど）、およびギャップペナルティ（ｇａｐ−ｐｅｎａｌｔｙ）といったアライメントメソッドで使用されるパラメータ、たとえば、機能的な形態と定数、によって異なる値を示しうる。
【００８７】
アライメントさせたのち、２つの配列同一性百分率を計算する方法は幾通りもある。たとえば、１つは同一性の数を以下で除しうる：（ｉ）最も短い配列長；（ｉｉ）アライメントの長さ；（ｉｉｉ）配列の平均長；（ｉｖ）ギャップなし位置（ｎｏｎ−ｇａｐ  ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）の数；または（ｉｖ）オーバーハングを除く等価ポジションの数。さらに、同一性百分率は強く長さ依存であると理解されよう。したがって、対の配列が短くなるにつれ、配列同一性が高くなることは偶然に起こり得ると予想される。
【００８８】
よって、タンパク質またはＤＮＡ配列の正確な整列は複雑なプロセスであると理解されよう。一般的なマルチプルアラインメントプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ  （Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２２，  ４６７３−４６８０；  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２４，  ４８７６−４８８２）は、本発明に従ってタンパク質またはＤＮＡの複数のアライメントを生成するための好ましい方法である。ＣｌｕｓｔａｌＷに適切なパラメータは以下のようになる：ＤＮＡアライメントは：Ｇａｐ  Ｏｐｅｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝１５．０，Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝６．６６，およびＭａｔｒｉｘ＝Ｉｄｅｎｔｉｔｙ。タンパクアライメントは：Ｇａｐ  Ｏｐｅｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝１０．０，Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．２，およびＭａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ。ＤＮＡおよびタンパクアライメント：ＥＮＤＧＡＰ＝−１，およびＧＡＰＤＩＳＴ＝４。当業者は、これらおよび他のパラメータを最適配列アライメントにおいて変更する必要があることに注意しなくてはならない。
【００８９】
好ましくは、２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性百分率の計算は、そのような配列から（Ｎ／Ｔ）＊１００によって計算でき、Ｎは配列が同一の残基を共有する位置の数であり、Ｔはギャップを含むがオーバーハングを含まない比較された位置の総数である。したがって、最も好ましくは、２つの配列間の同一性百分率を計算する方法は、（ｉ）配列アライメントをＣｌｕｓｔａｌＷプログラムに、たとえば、上記で示した適切なパラメータセットを用いて準備し；および（ｉｉ）ＮおよびＴの値を以下の式
配列同一性＝（Ｎ／Ｔ）＊１００に代入することを含む。
【００９０】
類似の配列を同定するための別の方法は、当業者に公知であろう。たとえば、実質的に類似のヌクレオチド配列は、ストリンジェントな条件下でＤＮＡ配列またはそれらの相補体にハイブリダイズする配列によってコードされる。ストリンジェントな条件において、ヌクレオチドが、フィルタ結合ＤＮＡまたはＲＮＡが約４５℃の３ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）でハイブリダイズし、次いで最低１回２０〜６５℃の０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄されることを意味する。あるいは、実質的に類似のポリペプチドは、少なくとも１、しかし、５、１０、２０、５０または１００未満のアミノ酸が本明細書に記載される配列とは異なっていてもよい。
【００９１】
遺伝子コードの縮重のために、それによってコードされるタンパク質の配列に実質的に影響を及ぼすことなく、本明細書に記載された任意の核酸配列を変異または変化させることができ、これによりその機能的変異体を得ることができることは明らかである。適切なヌクレオチド変異体は、配列内の同じアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって変化した配列を有するものであり、したがってサイレントな変化を生じる。他の適切な変異体は、相同なヌクレオチド配列を有するが、置換するアミノ酸と同様の生物物理学的特性の側鎖を有するアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって変化する配列の全部または一部を含むものであり、保守的な変化を生ずる。小さい非極性の疎水的なアミノ酸は、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、およびメチオニンを含む。大きく非極性の疎水的なアミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンを含む。極性の中性のアミノ酸はセリン、スレオニン、システイン、アスパラギンおよびグルタミンを含む。正に帯電した（塩基性の）アミノ酸は、リシン、アルギニンおよびヒスチジンを含む。負に帯電した（酸性の）アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。したがって、アミノ酸が類似の生体物理特性を有するアミノ酸と置換されていてもよく、当業の技術者はそれらのアミノ酸をコードするヌクレオチドの配列を知っているであろう。
【００９２】
更なる形態では、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）のＣ末端に由来する５〜８個のアミノ酸の配列またはその短小化体を含むペプチド、その誘導体または類似体が提供され、ここで前記ペプチド、誘導体または類似体は、１．０から１．１の係数値ｘを有するものである。
【００９３】
この際、ｘ＝％ＡＣｈＥ放出／％ＰＣ１２細胞生存率であり、
「％ＡＣｈＥ放出」は、Ｔ３０（配列番号１５６）またはＡβ（配列番号１５８）から選択される毒性ペプチドと前記ペプチド、その誘導体または類似体の存在下で培養されたＰＣ１２細胞調製物から放出されたアセチルコリンエステラーゼの、前記ペプチド、その誘導体または類似体の不存在下で培養されたＰＣ１２細胞調製物から放出されたアセチルコリンエステラーゼと比較した百分率であり、「％ＰＣ１２細胞生存率」は、Ｔ３０（配列番号１５６）またはＡβ（配列番号１５８）から選択される毒性ペプチドと前記ペプチド、その誘導体または類似体の存在下で培養されたＰＣ１２細胞調製物の生存率の、前記ペプチド、その誘導体または類似体の不存在下で培養されたＰＣ１２細胞調製物の生存率と比較した百分率である。
【００９４】
本明細書に記載されるすべての特徴（付随する請求の範囲，要約書および図面を含む）は、および／または開示された方法や工程のすべての段階を含み、明示的に除外される特徴および／または段階を除いて、上記様態のいずれかと組み合わせることができる。
【００９５】
本発明をよりよく理解し、同様の実施形態がどのように実施されるかを示すために、ここで例として以下に説明する添付図面を参照する：
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】図１（ａ）は、環状ポリペプチドＮＢＰ−１４（本明細書では配列番号１で示される）のα７ニコチン性受容体への結合を示す。図１（ｂ）は、環状ＮＢＰ−１４の３次元構造の拡大図を示す。
【図２】図２は、環化部位を形成する末端のアラニン（Ａ）およびリシン（Ｋ）残基を有するＮＢＰ−１４の配列を示す。
【図３】図３は、末端のアラニン（Ａ）およびリシン（Ｋ）残基が互いに結合している環状ＮＢＰ−１４ペプチドを示す。
【図４ａ】図４ａは、本発明の直鎖状ペプチドの多様な実施形態を示す。ペプチドは，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３または１４個のアミノ酸を有するペプチドのそれぞれのグループに分けられる。
【図４ｂ】図４ｂは、本発明の直鎖状ペプチドの多様な実施形態を示す。ペプチドは，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３または１４個のアミノ酸を有するペプチドのそれぞれのグループに分けられる。
【図４ｃ】図４ｃは、本発明の直鎖状ペプチドの多様な実施形態を示す。ペプチドは，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３または１４個のアミノ酸を有するペプチドのそれぞれのグループに分けられる。
【図４ｄ】図４ｄは、本発明の直鎖状ペプチドの多様な実施形態を示す。ペプチドは，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３または１４個のアミノ酸を有するペプチドのそれぞれのグループに分けられる。
【図４ｅ】図４ｅは、本発明の直鎖状ペプチドの多様な実施形態を示す。ペプチドは，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３または１４個のアミノ酸を有するペプチドのそれぞれのグループに分けられる。
【図４ｆ】図４ｆは、本発明の直鎖状ペプチドの多様な実施形態を示す。ペプチドは，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３または１４個のアミノ酸を有するペプチドのそれぞれのグループに分けられる。
【図４ｇ】図４ｇは、本発明の直鎖状ペプチドの多様な実施形態を示す。ペプチドは，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３または１４個のアミノ酸を有するペプチドのそれぞれのグループに分けられる。
【図４ｈ】図４ｈは、本発明の直鎖状ペプチドの多様な実施形態を示す。ペプチドは，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３または１４個のアミノ酸を有するペプチドのそれぞれのグループに分けられる。
【図４ｉ】図４ｉは、本発明の直鎖状ペプチドの多様な実施形態を示す。ペプチドは，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３または１４個のアミノ酸を有するペプチドのそれぞれのグループに分けられる。
【図４ｊ】図４ｊは、本発明の直鎖状ペプチドの多様な実施形態を示す。ペプチドは，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３または１４個のアミノ酸を有するペプチドのそれぞれのグループに分けられる。
【図４ｋ】図４ｋは、本発明の直鎖状ペプチドの多様な実施形態を示す。ペプチドは，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３または１４個のアミノ酸を有するペプチドのそれぞれのグループに分けられる。
【図５】図５は、α７ニコチン性受容体の標的部位を有する本発明の直鎖状ペプチドのさまざまな実施形態を構成するペプチドの理論的親和性のグラフ表示である。
【図６】図６は、アセチルコリンエステラーゼの放出、カルシウムイオンの流入および細胞の生存率の間の関係を示すデータおよび対応するグラフを示す。図６ａは、アセチルコリンエステラーゼの放出とカルシウムイオンの流入との関係（相関は０．２１０である）を示し、図６ｂは、カルシウムイオンの流入と細胞の生存率との関係（相関は０．０２６である）を示し、図６ｃは、アセチルコリンエステラーゼの放出と細胞の生存率との関係（相関は−０．５５０である）を示す。
【図７】図７は、本発明による活性ペプチドの同定に使用される４つのフィルタまたは条件を示すフローチャートである。条件１は、ＰＣ１２細胞からのＡＣｈＥ放出とＰＣ１２生存率との相関に関する；条件２は、条件１の適用後に残るペプチドの理論的結合親和性に関する；条件３は、条件２の適用後に残るペプチドによって引き起こされるＰＣ１２細胞におけるカルシウムイオンの流入に関する；そして条件４は、ペプチドサイズに関し、すなわち基準３を適用した後に残る８アミノ酸以上のペプチドを除外することに関する。
【図８】図８は、Ｔ３０に対するＮＢＰ−６０１またはＮＢＰ−６０３の直鎖状変異体のカルシウム増強作用の用量依存的な作用を示すグラフである。
【図９】図９は、Ｔ３０に対するＮＢＰ−６１３の直鎖状変異体のカルシウム増強作用の用量依存的な作用を示すグラフである。
【図１０】図１０は、対角複合帯（内側中隔核（ＭＳ）、対角帯の垂直脚（ＶＤＢ）、対角帯の水平脚（ＨＤＢ））；基底前脳の一部を構成する脳の小領域を含む冠状のラットの脳スライスの写真（上パネル）および対応する模式図（下パネル）である。赤星印は、電位感受性色素イメージング（ＶＳＤＩ）および電気生理学的実験時の刺激のおおよその位置を示す。
【図１１】図１１は、灌流条件におけるベースライン（青線）、Ｔ３０（２μＭ，緑線）およびＴ３０＆ＮＢＰ１４（４μＭ，赤線）における、関心のある領域（ＲＯＩ）内で放出された蛍光の量（ｄＦ／Ｆ０）を示すＶＳＤＩ平均時系列である。基底前脳における応答プロファイルは、第１相が最初のピーク応答（最初の刺激から０〜１５ｍｓ）、第２相がピーク応答の後（最初の刺激から１５〜２５ｍｓ）の短時間の静止、第３相が反動のように見え、フェーズ２直後（刺激から２５ｍｓ＋）から長時間の（再起）活動である、３相の応答を示す。データは最初の刺激から０ｍｓと２８０ｍｓとの間の蛍光発光の総和（Σ）によって求めた。
【図１２】図１２は、生データ（ｎ＝１４）を編集したグラフを示し、このグラフの左上のパネルはベースライン（青色）、Ｔ３０（緑色）、およびＴ３０＆ＮＢＰ１４（赤色）の最大ピーク振幅（第１相）の個々のデータポイントを示し；左下のパネルはベースライン（青色）、Ｔ３０（緑色）、およびＴ３０＆ＮＢＰ１４（赤色）の個々のデータポイントの蛍光応答（ΣｄＦ／Ｆ０）の合算を示す。同じデータの実験固有の傾向を最大ピーク振幅ついて（右上図）と蛍光の合算（右下図）について示した。上図のＹ軸の単位：記録された蛍光、ｄＦ／Ｆ０；下図：記録された蛍光（刺激後０→２８０ｍｓ）の合算（ΣｄＦ／Ｆ０）である。
【図１３】図１３は、生データ群（図１２の下パネルに示す）の長時間活性の合算した個々の値から、Ｔ３０による全体的な基底前脳神経細胞ネットワーク活性の低下の誘導（上パネル）、およびＴ３０によるネットワーク活性の増加の誘導（下パネル）の実験例を示す。両者において、ネットワーク活性はベースライン水準から少なくとも５０％の応答（上昇／低下）の差異を示した。両者において、Ｔ３０とＮＢＰ１４の共灌流（第３の条件）は常にＴ３０の灌流によって誘起された変異をベースライン活性レベルに戻した。
【図１４】図１４は、Ｔ３０の灌流によって誘起された変化（Ｔ３０応答−ベースライン応答；ｙ軸）に対し、ベースライン応答中に放出された蛍光の合計の個々のデータ点（ｘ軸）をプロットしたグラフである。相関はベースライン応答水準が高くなるにつれ、Ｔ３０によって誘起される差異が大きくなる形で見られ；ｐ＝０．００７である。
【図１５】図１５は、ＮＢＰ１４の灌流への追加によって誘起された変化（Ｔ３０＆ＮＢＰ１４応答−Ｔ３０応答；ｙ軸）に対し、Ｔ３０灌流中に放出された蛍光の合計の個々のデータ点（Ｔ３０応答−ベースライン応答；ｘ軸）をプロットしたグラフである。相関はＴ３０によって誘起された差異が大きくなるにつれ、ＮＢＰ１４の追加によって誘起される差異が大きくなる形で見られ；ｐ＝０．０１５であり、ＮＢＰ１４がＴ３０の作用に対して有効な阻害剤であることを示している。
【図１６】図１６は、灌流条件におけるベースライン（青線）、Ｔ３０（２μＭ、緑線）およびＴ３０（２μＭ）＆ＮＢＰ−６０３（４μＭ、赤線）における、関心のある領域（ＲＯＩ）内で放出された蛍光の量（ｄＦ／Ｆ０）を示すＶＳＤＩ平均時系列である。データは最初の刺激から０ｍｓと２８０ｍｓとの間の蛍光発光の総和（Σ）によって求めた。
【図１７】図１７は、生データ（ｎ＝５）を編集したグラフを示し、このグラフの左上のパネルはベースライン（青色）、Ｔ３０（緑色）およびＴ３０＆ＮＢＰ６０３（赤色）の最大ピーク振幅（第１相）の個々のデータポイントを示し；左下のパネルは個々のデータポイントの蛍光応答（ΣｄＦ／Ｆ０）の合算を示す。同じデータの実験固有の傾向を最大ピーク振幅について（右上パネル）と蛍光の合算（右下パネル）について示した。上図のＹ軸の単位：記録された蛍光、ｄＦ／Ｆ０；下図：記録された蛍光（刺激後０→２８０ｍｓ）の合算（ΣｄＦ／Ｆ０）である
【図１８】図１８は、Ｔ３０の灌流によって誘起された変化（Ｔ３０応答−ベースライン応答；ｙ軸）に対し、ベースライン応答中に放出された蛍光の合計の個々のデータ点（ｘ軸）をプロットしたグラフである。データ点数が少なく高い多様性が中で見られ、（上で見られたような）下降傾向が見られ；ｐ＝０．０５である。
【図１９】図１９は、ＮＢＰ−６０３の灌流への追加によって誘起された変化（Ｔ３０＆ＮＢＰ−６０３応答−Ｔ３０応答；ｙ軸）に対し、Ｔ３０灌流中に放出された蛍光の合計の個々のデータ点（Ｔ３０応答−ベースライン応答；ｘ軸）をプロットしたグラフである。相関はＴ３０によって誘起された差異が大きくなるにつれ、ＮＢＰ−６０３の追加によって誘起される差異が大きくなる形で見られ；ｐ＝０．０２４である。
【図２０】図２０は、直鎖状ポリペプチドＮＢＰ−６０１（本明細書に記載の配列番号３０で示される）がα７ニコチン性受容体（α７−ｎＡＣｈＲ）に結合している結合の様子を示す。
【図２１】図２１は、環状ＮＢＰ−１４の化学構造を示す。
【００９７】
［実施例］
材料および方法
ＰＣ１２細胞の培養
ＰＣ１２細胞は、副腎髄質由来のクローニングされた褐色細胞腫細胞株である（Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｔｉｓｃｈｌｅｒ，１９７６，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ７３：２４２４−２４２８；  Ｍｉｚｒａｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８７：６１６１−６１６５）。クロム親和性細胞は神経堤に由来するが、接近可能な末梢器官（副腎髄質）の中心に位置するため、脳に‘窓’を提供すると記載されている（Ｂｏｒｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２，  Ｍｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  １７：３５４−３５８）。これらの細胞は、神経変性の依然として未知の一次過程を研究するための強力ではあるが、新規なｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルであり、なぜこのプロジェクトに有用であるかの理由は以下のとおりである：アルツハイマー病患者の副腎髄質は、たとえば、数多くのレビー小体様封入体、神経原線維変化および対になった、らせん状フィラメントであるＣＮＳに見られるものを連想させる様々な病理学的特徴ならびにアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の発現を示す（Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ  １６８：５７−６０）。さらに、ＡｐｐｌｅｙａｒｄおよびＭａｃｄｏｎａｌｄらは、（１９９１，  Ｌａｎｃｅｔ  ３３８：  １０８５−１０８６）おそらく血漿中への分泌が増強されたため、ＡＤ患者で上昇している、ＡＤの副腎からの可溶性（すなわち，放出可能な）形態のＡＣｈＥのみを選択的に低減することを示した（Ａｔａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃｉ  ７０：  １−１２；  Ｂｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，  Ｂｒａｉｎ  １３１：  １０９−１１９）。
【００９８】
野生型のＰＣ１２細胞はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス，ミズーリ州）から提供された。ＰＣ１２細胞の培養または調製は、コラーゲンコート（２μｇ／ｃｍ２）された１００ｍｍディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ製）上に常法により播種し、最小必須培地（ＭＥＭ）に熱不活化１０％ウマ血清（ＨＳ）と５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、そして１：４００ペニシリン／ストレプトマイシン溶液を加えた培地で維持した。細胞は５％ＣＯ２の加湿された雰囲気で３７℃に維持され、培地は２日ごとに交換した。分割のため、細胞はピペットと培地を用いてディッシュから取り出し、新たな培養皿の上にこれらの一部を再播種した。細胞は１２〜２５の継代の間のものを用いた。
【００９９】
β−アミロイドの調製
β−アミロイド（１−４２）繊維は提供者（アブカム，英国ケンブリッジ））の記載に従って調製した。１ｍｇのβ−アミロイド（１−４２）を１ｍＬの１００％  １，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＰＩＰ）に溶解させた。この溶液を室温で１ｈインキュベートした。次に、溶液を１０分間、超音波そして次いで高速真空乾燥機（サーモフィッシャーサイエンティフィック，ラフバラ，英国）で乾燥させ、そして−８０℃で保管した。実験には、サンプルは１００％ＤＭＳＯに溶解させ、２ｈ室温でインキュベートし、繊維の形成を確実にした。
【０１００】
細胞生存率アッセイ
Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（ＣＣＫ−８）は従来使用されていたＳＲＢ法を改良して使用した。高水溶性のテトラゾリウム塩ＷＳＴ−８を利用することにより、ＣＣＫ−８を電子キャリアの存在下で還元すると水溶性ホルマザン色素を生成する。ＷＳＴ−８は細胞内のデヒドロゲナーゼで還元され、細胞培地に可溶な黄色の生成物（ホルマザン）を与える。細胞内のデヒドロゲナーゼの活性で生成したホルマザン色素の量は生細胞数に正比例している。ＰＣ１２細胞は９６ウェルプレートの実験の前日に２００μＬの完全増殖培地中に播種した。Ｔ３０もしくはＡβ単独、またはＮＢＰ−１４と共にもしくはより小さなペプチドが追加され、１時間インキュベータでインキュベートした。次いで、１００μＬの増殖培地を抜き取り、１０μＬのＣＣＫ−８を加えた。プレートは２時間インキュベータでインキュベートし、吸光プレートリーダーに入れた。吸光度は４５０ｎｍで測定する必要がある。
【０１０１】
アセチルコリンエステラーゼ活性アッセイ
ＡＣｈＥ活性はＡＣｈＥ活性の結果であるチオール基の存在を測定するＥｌｌｍａｎ試薬を用いて測定した。細胞は細胞活性アッセイ実験の前日に播種した。Ｔ３０もしくはＡβ（５μＭ）単独、またはＮＢＰ−１４と共にもしくはより小さなペプチド（０．５μＭ）で処理した。処理後、各処理の上澄み（灌流液）を集め、２５μＬの各条件を新しい平底９６ウェルプレートに添加し、次いで１７５μＬのＥｌｌｍａｎ試薬（Ａ液：ＫＨ２ＰＯ４  １３９ｍＭおよびＫ２ＨＰＯ４  ７９．６６ｍＭ、ｐＨ７．０；Ｂ液（基質）：ヨウ化アセチルコリン  １１．５ｍＭ；Ｃ液（試薬）：５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）８ｍＭとＮａＨＣＯ３  １５ｍＭ）を加えた。前記Ｅｌｌｍａｎ試薬は３３（Ａ）：３（Ｂ）：４（Ｃ）の比の３液の混合で調製した。吸光度測定は一定間隔（３，１０，３０および６０分）で実験を通して４０５ｎｍで測定した。
【０１０２】
カルシウム蛍光法
ＰＣ１２細胞を実験の前日に９６ウェルプレートの２００μＬの完全増殖培地中に播種する。実験当日に、Ｆｌｕｏ−８溶液（アブカム）を（提供者のプロトコールに基づいて）調製する。次いで、１００μＬの増殖培地を取り除き、１００μＬのＦｌｕｏ−８溶液を加える。Ｔ３０またはＡβをＮＢＰ−１４または小さいペプチドとを加えた共存下で処理し、３０分間インキュベータ中で、そして３０分室温でインキュベートする。
【０１０３】
１時間後，プレートは蛍光プレートリーダー（フルオスター）に入れる。蛍光を読み取る前に、アセチルコリン（ＡＣｈ）１００μＭを調製し、フルオスターの注入器に入れる。各ウェルにつき、読み取りは基準の蛍光の測定の後にアセチルコリンを注入し、誘起されるカルシウムのニコチン性受容体からの取り込みについて行う。次いで、前記ペプチドの効果を評価する。
【０１０４】
ＶＳＤＩ方法論：
脳スライスの調製およびｅｘ  ｖｉｖｏ記録
冠状ラット脳スライスを（Ｂａｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）に記載された手順に従って調製したが、今回は前脳基底部を含んでいた（ブレグマ（Ｐａｘｉｎｏｓ  ａｎｄ  Ｗａｔｓｏｎ，１９９８）から＋０．７０および−０．２６ミリメートル（ｍｍ））。次いで、以前に記載されたように（Ｂａｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．７３Ｃ：１０−１８）、電圧感受性色素を用いた光学イメージングを行った。
【０１０５】
データ解析と統計
ＶＳＤＩデータは４×４ｍｍの２次元像で記録し、１００×１００ピクセルに相当する−各ピクセルは４０×４０マイクロメートル（μｍ）であり、そこから重要なデータを抽出した。ＶＳＤＩデータは実験を通してまとめていないが、実際は別々の周期で１５分の長さで記録した。刺激の間の刺激間間隔（ＩＳＩ）は２８秒で、したがって、すべての録画期間は３２の連続する刺激から構成される。全３２の刺激から構成される前記のデータは、その後、各実験条件につき１つのファイルに平均化され、ＭａｔＬａｂ用に特別に作られたＶＳＤＩデータ解析ツールボックス（Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ９：ｅ１０８６８６）を用いて解析した。要するに、このツールボックスは、すべてのスライスと実験条件にわたって同じＲＯＩからデータを抽出して合成するために、各スライスに適用可能な決まった関心領域（ＲＯＩ）ジオメトリの選択を可能にしている。ＲＯＩは、内側中隔核（ＭＳ）、対角帯の垂直脚（ＶＤＢ）および対角帯の水平脚（ＨＤＢ）を包含するスライスの中隔領域の軟膜表面に沿って選択した。ＲＯＩから取得したＶＳＤＩデータは、次いで、単独の平均時系列でプロットした。（図１１）しかしながら、ＶＳＤＩデータを定量するために、曲線下面積を刺激時点（ｔ＝０）から２８０ｍｓ後まで計算した（蛍光のわずかな変化を合算した、図１１〜２２）；この定量化方法は中間および長時間応答のすべての成分を考慮に入れている。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６（ｖ６．０５；  ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、すべての統計的試験（別段の記載がない限り、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ））を実施した。すべての統計的試験では、ｐ＜０．０５を有意と見なし、データは平均±標準誤差として表した。
【０１０６】
薬剤と試薬
ＭＥＭ、培地血清、抗体、コラーゲン、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８および緩衝液試薬はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス，ミズーリ州）から提供された。Ｔ３０、ＡＣｈＥペプチドおよび環状Ｔ１４はジェノスフェア・バイオテクノロジーズ（フランス）によって合成された。アミロイドベータおよびＦｌｕｏ−８はアブカム（ケンブリッジ，英国）より提供された。小さなペプチドはルーチンのペプチド合成法で合成した。ペプチドのストックは蒸留水で希釈した。
【０１０７】
データ解析
それぞれの異なる技法において、統計解析は率の平均値または１２以上の実験から行った。ＧｒａｐｈＰＡＤ  Ｉｎｓｔａｔ（ＧｒａｐｈＰＡＤソフトウェア、サンディエゴ、カルフォルニア）を用いて、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびＴｕｋｅｙの事後検定により、複数の治療群と同じ対照間の比較を行った。これらのテストでは、すべての治療の手段を他のすべての治療の手段と比較する；すなわち，すべてのペアワイズ比較のセットに同時に適用し、２つの平均の差が許容すると予想される標準誤差よりも大きい場所を特定する。統計的有意性はＰ値＜０．０５で得られた。ＧｒａｐｈＰＡＤ  Ｐｒｉｓｍ  ６（ＧｒａｐｈＰＡＤソフトウェア、サンディエゴ、カルフォルニア）を用いてグラフをプロットした。
【０１０８】
実施例１：環状Ｔ１４（すなわち，ＮＢＰ１４）
‘テイルド’アセチルコリンエステラーゼ（Ｔ−ＡＣｈＥ）はシナプスで発現され、本発明者らは以前、２つのペプチドがそのＣ−末端より切断でき、１つは“Ｔ１４”（１４アミノ酸長）と称され、他方は“Ｔ３０”（３０アミノ酸長）として知られ、双方が強い配列相同性を有している。
【０１０９】
直鎖状のペプチドＴ１４のアミノ酸配列は、
【０１１０】
【化２】
0006708646.tif 000003
【０１１１】
である。
【０１１２】
直鎖状のペプチドＴ３０のアミノ酸配列は、
【０１１３】
【化３】
0006708646.tif 000004
【０１１４】
である。
【０１１５】
前記ＡＣｈＥ  Ｃ−末端ペプチド“Ｔ１４”はＡＣｈＥ分子の突出した部位で、その非加水分解作用の範囲を担っている。合成１４アミノ酸ペプチド類似体（すなわち“Ｔ１４”）、および後にそれが組み込まれたより大きく、より安定で、より有力なアミノ酸配列（すなわち，“Ｔ３０”）は、‘非コリン作動性の’ＡＣｈＥの作用として報告されている作用と同等の作用を示す。
【０１１６】
はじめに図１ａおよび２０を参照すると、α７ニコチン性受容体のアロステリック部位への１４アミノ酸長の環状のＴ１４ペプチド（すなわち，ＮＢＰ−１４）の結合が示されており、このことから直鎖状ペプチドのＴ１４がＴ３０の結合と競合し、β−アミロイドと拮抗する。前記環状ペプチドＮＢＰ−１４はアミノ酸配列Ｔ１４，すなわち，ＡＥＦＨＲＷＳＳＹＭＶＨＷＫ  ［配列番号１］に基づくが，末端のアラニン（Ａ）とリシン（Ｋ）残基で環化している。図１ｂは環状ＮＢＰ−１４がα７ニコチン性受容体の結合ポケットに位置する３次元構造の拡大図である。
【０１１７】
図２を参照すると、ＮＢＰ−１４配列の末端のアラニン（Ａ）とリシン（Ｋ）残基が環を形成していることが示されており、図３には末端のアラニンとリシン残基が互いに結合している環状ＮＢＰ−１４ペプチドを示す。環化は種々の異なる手段で達成されうる。たとえば、ジェノスフェア・バイオテクノロジー（フランス）は直鎖状ペプチドをＮ−末端からＣ−末端ラクタムに変換することでＴ１４の環化を行った。環状ＮＢＰ１４の生成のためのＴ１４の環化は両端、すなわち、ＨＷＫ−ＡＥＦをまとめる。
【０１１８】
本発明者らは以前、環状ＮＢＰ−１４および／またはその末端ペプチドがｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＡＣｈＥの非古典的作用（すなわち，ＡＣｈＥの酵素活性とは独立した作用）を選択的に阻害し、神経変性障害の治療に用いられることを示した。ＮＢＰ１４はα７ニコチン性受容体の真の拮抗剤として振る舞い、直鎖状Ｔ１４、Ｔ３０、β−アミロイドの毒性からの細胞の保護を示した。また、ＮＢＰ１４は直鎖状Ｔ１４およびＴ３０の毒性によって誘起されたＡＣｈＥの補償的放出も阻害した。さらに、単独投与において環状ＮＢＰ１４はラット脳片のＣａ２＋濃度に何ら影響を与えないが、β−アミロイドの作用を阻害した。
【０１１９】
実施例２：ＮＢＰ１４から誘導される直鎖状ペプチドのアレイの調製
前記実施例１で議論されたＮＢＰ１４の驚くべき結果に基づいて、本発明者はＮＢＰ１４の配列に基づいた直鎖状ペプチド（４〜１４アミノ酸長）、各直鎖ペプチド配列はＮＢＰ１４の配列に沿った任意のアミノ酸位置で開始または終了する、ペプチドのアレイを調製した。前記直鎖状ペプチドのアレイを、図４ａ〜４ｋにまたがった大きな表に示す（配列番号２〜１５５として特定）。
【０１２０】
前記図４ａの表には、４アミノ酸長の１４個のペプチド（配列番号２〜１５）を掲載している。各直鎖状ペプチドは、たとえばＮＢＰ−４０１（４アミノ酸による最初のペプチド）、ＮＢＰ−４０２（４アミノ酸による２番目のペプチド）などのようになっている。前記図４ｂの表には、５アミノ酸長の１４個のペプチド（配列番号１６〜２９）を掲載している。各直鎖状ペプチドは、たとえばＮＢＰ−５０１（５アミノ酸による最初のペプチド）、ＮＢＰ−５０２（５アミノ酸による２番目のペプチド）などのようになっている。前記図４ｃの表には、６アミノ酸長の１４個のペプチド（配列番号３０〜４３）を掲載しており、前記図４ｄの表は、７アミノ酸長の１４個のペプチド（配列番号４４〜５７）を掲載しており、前記図４ｅの表は、８アミノ酸長の１４個のペプチド（配列番号５８〜７１）を掲載しており、前記図４ｆの表は、９アミノ酸長の１４個のペプチド（配列番号７２〜８５）を掲載しており、前記図４ｇの表は、１０アミノ酸長の１４個のペプチド（配列番号８６〜９９）を掲載しており、前記図４ｈの表は、１１アミノ酸長の１４個のペプチド（配列番号１００〜１１３）を掲載しており、前記図４ｉの表は、１２アミノ酸長の１４個のペプチド（配列番号１１４〜１２７）を掲載しており、前記図４ｊの表は、１３アミノ酸長の１４個のペプチド（配列番号１２８〜１４１）を掲載しており、前記図４ｋの表は、１４アミノ酸長の１４個のペプチド（配列番号１４２〜１５５）を掲載している。
【０１２１】
各直鎖状のペプチドは合成され，活性を以下のように解析した。
【０１２２】
実施例３：ＮＢＰ−１４から誘導された小さな直鎖状ペプチドのＴ３０またはＡβの毒性と細胞生存率への効果
ＮＢＰ−１４から誘導された小さな直鎖状ペプチド（配列番号２〜１５５）について、前記毒性Ｔ３０直鎖状ペプチド（配列番号１５６）および野生型アミロイドベータ（１−４２）（Ａβ）（配列番号１５８）に対する３つのｉｎ  ｖｉｔｒｏの系、すなわち、（ｉ）ＰＣ１２細胞から放出されたＡＣｈＥ、（ｉｉｉ）ＰＣ１２細胞の生存率および（ｉｉｉ）ＰＣ１２細胞へのカルシウムの流入の３つの系で解析した。
【０１２３】
β−アミロイドの一部のアミノ酸配列を本明細書では配列番号１５８として示し、以下のとおりである：
【０１２４】
【化４】
0006708646.tif 000005
【０１２５】
各直鎖状ペプチドのＴ３０および／またはＡβに対する保護的なまたは毒性的な作用は、図７に要約したように、一連の４つのフィルタまたは条件に基づいて決定した：
１．ＡＣｈＥ放出に対するＰＣ１２細胞生存率（有意な負の相関がある）；
２．Ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏにおけるα７ニコチン性受容体のアロステリック部位への結合；
３．ＰＣ１２細胞へのカルシウムの流入；および
４．ペプチドの大きさ。
【０１２６】
フィルタ１：ＡＣｈＥ放出に対するＰＣ１２細胞生存率
はじめに、その相関のため、本発明者らは、Ｔ３０および／またはＡβに対する各直鎖状ペプチドの保護的なまたは毒性的な作用を示す“係数値（ｖａｌｕｅ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ（Ｘ）”を得るため、以下の式を用いてアッセイ（ｉ）および（ｉｉ）を組み合わせた。本発明者らは係数値（Ｘ）を以下のように求めた：
係数値（Ｘ）＝（％ＡＣｈＥ放出）／（％細胞生存率）
ここで、「％ＡＣｈＥ放出」は、Ｔ３０（配列番号１５６）またはＡβ（配列番号１５８）から選択される毒性ペプチドと前記ペプチド、その誘導体または類似体の存在下で培養されたＰＣ１２細胞調製物から放出されたアセチルコリンエステラーゼの、前記ペプチド、その誘導体または類似体の不存在下で培養されたＰＣ１２細胞調製物から放出されたアセチルコリンエステラーゼ（すなわち、コントロール）と比較した百分率であり、
「％ＰＣ１２細胞生存率」は、Ｔ３０（配列番号１５６）またはＡβ（配列番号１５８）から選択される毒性ペプチドと前記ペプチド、その誘導体または類似体の存在下で培養されたＰＣ１２細胞調製物の生存率の、前記ペプチド、その誘導体または類似体の不存在下で培養されたＰＣ１２細胞調製物の生存率（すなわち、コントロール）と比較した百分率である。
【０１２７】
以下に記載したとおり，本発明者らは，驚くべきことに，Ｔ３０やＡβ毒性に対して保護的な効果を示す係数値（Ｘ）に基づいて，活性なペプチドが不活性なペプチドと分別可能なことを示した。
【０１２８】
前記コントロール（すなわち、いずれのペプチドも含まれない）は値１を有する。前記方法の項に記載したように、前記コントロールの値は処理していない細胞から、前記毒性値はＴ３０またはＡβで処理した細胞から、前記保護値はＮＢＰ−１４とＴ３０またはＡβとの共存下で処理した細胞から求めた。Ｔ３０についての値は，ｘ＝１６９．４５／７４．３０９＝２．２８、そしてアミロイドベータ（Ａβ）についてはｘ＝１２４．１９／８７．４２＝１．４２である。
【０１２９】
したがって、係数値（Ｘ）が１．０未満であるか１．１を超えると毒性を示し、係数値が１．０〜１．１のペプチドは活性、ゆえに保護的である。表１および表２は、Ｔ３０およびＡβの毒性（濃度５μＭ）に対するＡＣｈＥの活性およびＰＣ１２細胞の生存率への直鎖状ペプチド（濃度０．５μＭ）の効果を示す。“値”列は各ペプチドの保護的な効果を示している。
【０１３０】
本発明者らは，灌流液中のＡＣｈＥ活性およびＰＣ１２細胞生存率の２つのパラメータが，Ｐ＜０．０５レベルで有意な−０．５５（ｎ＝１０）の相関係数と非常に密接に関連していることを示した（図６ｃ参照）。この細胞活性に対するＡＣｈＥ放出の最初の法則は、Ｔ３０（表１に示したｎ＝２３のペプチド）またはＡβ（表２に示したｎ＝３２のペプチド）のいずれかに対して保護的なペプチドの、５５個の好結果のペプチドをもたらした。
【０１３１】
【表１】
0006708646.tif 000006
【０１３２】
【表２】
0006708646.tif 000007
【０１３３】
フィルタ２  Ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏにおける結合
本発明者らは、α７ニコチン性受容体のアロステリック部位に対するｉｎ  ｓｉｌｉｃｏにおける理論的結合親和性を試験し、前記値についても表１および表２に示した。
【０１３４】
前記ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ解析はＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙで開示されたＡｕｔｏｄｏｃｋ  Ｖｉｎａソフトウェアを利用して行った（Ｏ．  Ｔｒｏｔｔ，  Ａ．  Ｊ．  Ｏｌｓｏｎ  ＡｕｔｏＤｏｃｋ  Ｖｉｎａ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｐｅｅｄ  ａｎｄ  ａｃｃｕｒａｃｙ  ｏｆ  ｄｏｃｋｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｅｗ  ｓｃｏｒｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｔｈｒｅａｄｉｎｇ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１  （２０１０）  ４５５−４６１）。前記解析は著者らの推奨する方法で行った。前記結果解析と比較は、受容体に結合したアミノ酸と、アミノ酸間の距離とを手動で比較することにより行った。
【０１３５】
本発明者らは、−７．０より小さい理論的結合親和性は、前記ペプチドとα７ニコチン性受容体のアロステリック部位との高い親和性と相関することを見出した。したがって、活性なペプチドの総数はフィルタ１に基づく５５個から、続くフィルタ２によって２８個まで減少した。
【０１３６】
フィルタ３  カルシウムの流入
本発明者らはさらに、細胞生存率および上記で議論した３番目のパラメータ（ｉｉｉ）すなわち、ＰＣ１２細胞へのカルシウム流入との関係を調査した。しかしながら、図６ｂに示すように、非常に異なる時間スケールを有するこれらのパラメータは相関しておらず、０．０２６（ｎ＝１０）の相関係数しか持たないことが分かった。本発明者らはまた、ＡＣｈＥ活性とＰＣ１２細胞へのカルシウム流入との関係を調べた。しかしながら、これらのパラメータは、図６ａに示すように、相関係数が０．２１（ｎ＝１０）しかなく、異なる時間スケールにわたるこのパラメータも相関していないことが分かった。
【０１３７】
したがって、本発明者らは、ＡＣｈＥの放出は、最終的な細胞死に起因する直接的な‘補償’であり、非特異的に引き起こされるカルシウムの直接的な侵入に起因するものではなく，より遅い細胞内カスケードに起因する可能性が高いと仮定している。
【０１３８】
フィルタ２で絞り込まれた２８ペプチドのカルシウム流入の値も表１および表２に示した。本発明者らはカルシウム流入値が９７から１２０が活性のペプチドと相関することを見出した。したがって、活性なペプチドの総数は、フィルタ２の２８個から、続くフィルタ３によって１２個にまで絞り込まれた。
【０１３９】
フィルタ４  ペプチドの大きさ
最後に、本発明者らは８アミノ酸より大きい（理論分子量が９００Ｄａより大きい）ペプチドは神経変性障害を治療する現実的で有力な候補化合物を提示しないと考えている。
よって、これらの大きなペプチドを除外した。したがって、活性なペプチドの総数はフィルタ３の１２個から、続くフィルタ４によって８個にまで絞り込まれた。
【０１４０】
結論
このように、全４つのフィルタを考慮すると、Ｔ３０に対する神経保護剤の候補の数は６つのペプチド（すなわち、ＮＢＰ−６０１、６０３、６１３、７０５、７０８および８０４）であり、そして、Ａβに対する薬剤の数は２つのペプチドのみ（すなわち、ＮＢＰ−６１１および７１０）となった。表１および表２において、緑の値は保護的または活性なペプチドに相当し、赤は毒性または不活性なペプチドに相当することを示す。よって、フィルタの複合的な利用は、構造と同様に機構や機能によって、神経保護的な直鎖状ペプチドの単離を可能にする。このように、本発明者らはｉｎ  ｖｉｖｏにおける効果を確信している。
【０１４１】
実施例４：直鎖状ペプチドを用いた複合療法
本発明者らは、環状ＮＢＰ−１４由来の直鎖状ペプチドの小さなサブセットがＴ３０毒性に対して驚くべき保護的な活性を示し、ペプチドの別のサブセットがＡβに対して保護的であることを明らかに示した。Ａβは、現在，アルツハイマー病のような神経変性障害を引き起こすためのより一般的に受け容れられている毒性の機構であることが理解されよう。したがって、ペプチドＮＢＰ−６１１および７１０の１つまたは複数が、神経変性障害の治療に特に有用である。
【０１４２】
しかしながら、本発明者の以前の研究において、実際にはＡβ毒性ではなくＴ３０の毒性がそのような疾患の原因である可能性が高いことを示唆している。したがって、ペプチドＮＢＰ−６０１、６０３、６１３、７０５、７０８および８０４の１つまたは複数が神経変性障害の治療に特に有用である。
【０１４３】
ある実施形態において、本発明者らは２つのペプチドを選択する（１つを表１に示したＴ３０に対して保護的な群から選択し、もう１つを表２に示したＡβに対して保護的な群から選択する）ことが有利であると考えている。たとえば、ＮＢＰ−６０１はＮＢＰ−６１１と共投与でき、またはＮＢＰ−７０５はＮＢＰ−７１０と共投与できる、などである。
【０１４４】
実施例５：結合活性解析
図５および図２０には、α７ニコチン性受容体の標的部位の枠で示されたように、本発明の直鎖状ペプチドの様々な実施形態を作り出す前記ペプチドの理論的結合親和性を図示した。
【０１４５】
実施例６：好ましいペプチドのＰＣ１２細胞のＴ３０およびアミロイドに対する応答の用量依存性
環状ＮＢＰ−１４の選択された小さな直鎖状変異体を用いて、Ｔ３０に対する用量依存性試験を行い、その結果を図８および図９に示した。これらの試験は、実施例７で議論された脳スライスで得られた結果を裏付けている。
【０１４６】
実施例７：Ｔ３０に対する脳スライス実験における好ましいペプチド（およびＮＢＰ−１４コントロール）の解析
図１０は、内側中隔、垂直対角帯および水平対角線帯を含む基底前脳の位置を示す。ＶＳＤＩ実験の目的は、３０Ｖの電気刺激を用いて基底前脳で誘発された応答を特徴づけること、およびこれらの応答が高濃度のＴ３０（２μＭ；図１１）の添加によってどのように最初に調節されるかを見ることであった。
【０１４７】
誘発された反応は、Ｔ３０によって調節されることが実際に観察されたが、多数が阻害を示し、いくつかの応答は活性が増加した（図１２）。全ての場合において、灌流液へのＮＢＰ１４の添加は、Ｔ３０によって誘起されたあらゆる種類の変化を有意に反転させることが見出された（図１３，１４および１５）。
【０１４８】
さらに、ＮＢＰ１４変異体ＮＢＰ−６０３（図１６）について、ＮＢＰ１４と同じ正確な実験方法で試験した。変異体ＮＢＰ−６０３は、Ｔ３０によって誘起される変化を反転させる際にいくらかの有意な効果を有することが見出された（図１７および図１９）。
【図１】
0006708646.tif 000008
【図２】
0006708646.tif 000009
【図３】
0006708646.tif 000010
【図４ａ】
0006708646.tif 000011
【図４ｂ】
0006708646.tif 000012
【図４ｃ】
0006708646.tif 000013
【図４ｄ】
0006708646.tif 000014
【図４ｅ】
0006708646.tif 000015
【図４ｆ】
0006708646.tif 000016
【図４ｇ】
0006708646.tif 000017
【図４ｈ】
0006708646.tif 000018
【図４ｉ】
0006708646.tif 000019
【図４ｊ】
0006708646.tif 000020
【図４ｋ】
0006708646.tif 000021
【図５】
0006708646.tif 000022
【図６】
0006708646.tif 000023
【図７】
0006708646.tif 000024
【図８】
0006708646.tif 000025
【図９】
0006708646.tif 000026
【図１０】
0006708646.tif 000027
【図１１】
0006708646.tif 000028
【図１２】
0006708646.tif 000029
【図１３】
0006708646.tif 000030
【図１４】
0006708646.tif 000031
【図１５】
0006708646.tif 000032
【図１６】
0006708646.tif 000033
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
0006708646.tif 000036
【図２０】
0006708646.tif 000037
【図２１】
0006708646.tif 000038
【配列表】
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