(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料（７６）中の複数の点状物体の確率論的局在化のための光学顕微鏡法であって、
物体空間に配置された試料（７６）は、その光軸（Ｏ）に沿って予め設定される軸方向広がり（ｔ）を有する焦点深度領域（７８）を物体空間に有する結像光学系（７０）によって検出器（１４、５６）に結像され；及び
試料（７６）中に含まれる点状物体は、試料（７６）の結像によって検出器（１４、５６）に形成される第１試料像が評価されることによって、焦点深度領域（７８）の内部において局在化され；
光軸（Ｏ）の方向における個々の点状物体の局在化のために、第１試料像の点状物体を表すライトスポット（３８、４０、４２、４４、６０）の特性パラメータ（ｄ）が求められ、及び、この特性パラメータ（ｄ）に対し、予め設定される割当情報に依存して、点状物体に関係付けられる軸方向のｚ位置が割り当て設定され；
その内部において点状物体が局在化される焦点深度領域（７８）は、物体空間において試料（７６）に対し相対的に光軸（Ｏ）に沿って焦点深度領域（７８）の軸方向広がり（ｔ）より小さい予め設定される軸方向調整ストロークだけシフトされ；
軸方向にシフトされた焦点深度領域（７８）で、試料（７６）は結像光学系（７０）によって新たに検出器に結像されて、少なくとも１つの第２試料像が形成され；
第２試料像において、点状物体のｚ位置は、予め設定される軸方向調整ストロークに依存して求められ；
点状物体の第１試料像において求められたｚ位置は、同じ点状物体の第２試料像において求められたｚ位置と対比され；及び
この対比に依存して修正情報が生成され、該修正情報に基づいて、前記割当情報に依存して求められた点状物体のｚ位置が修正される
光学顕微鏡法。
【請求項２】
焦点深度領域（７８）の内部において光軸（Ｏ）に沿って、焦点深度領域（７８）に対し相対的に位置固定的な少なくとも１つのｚ基準位置（ｚｓ）が規定され；
軸方向にシフトされた焦点深度領域（７８）で検出器に形成される少なくとも１つの第２試料像からの、軸方向にシフトされた焦点深度領域においてｚ基準位置（ｚｓ）に配置されている点状物体を表す複数のライトスポット（３８、４０、４２、４４、６０）の少なくとも１つは、基準ライトスポットとして規定され；
基準ライトスポットによって表される点状物体のｚ位置は、物体空間において、焦点深度領域（７８）の軸方向調整ストロークとｚ基準位置とに依存して決定され；
第１試料像からの、第２試料像の基準ライトスポットのものと同じ点状物体を表す複数のライトスポット（３８、４０、４２、４４、６０）の１つは、対照ライトスポットとして特定され；及び
対照ライトスポットによって表される点状物体のｚ位置の、基準ライトスポットによって表される同じ点状物体のｚ位置に対するずれに依存して修正情報が生成され、該修正情報に基づいて、割当情報に依存して求められる点状物体のｚ位置が修正される、
請求項１に記載の光学顕微鏡法。
【請求項３】
焦点深度領域（７８）は複数のステップで軸方向にシフトされ、これらのステップの各々において個々の基準ライトスポットと対応する対照ライトスポットとに基づいて修正情報が生成され、割当情報に依存して求められる点状物体のｚ位置は段階的に生成される修正情報に基づいて修正される
請求項２に記載の光学顕微鏡法。
【請求項４】
前記ステップの各々において、割当情報に依存して個々の対照ライトスポットに対して求められるｚ位置は、対応する基準ライトスポットに対して求められるｚ位置によって置換され、この置換によって、修正関数が修正情報として生成される
請求項３に記載の光学顕微鏡法。
【請求項５】
焦点深度領域（７８）の段階的シフトによって対照ライトスポット及び基準ライトスポットの何れも利用することができない修正関数の中間値は、内挿法によって求められる
請求項４に記載の光学顕微鏡法。
【請求項６】
焦点深度領域（７８）の段階的シフトによって求められる点状物体のｚ位置は、全体局在化像に重ね合わせられる
請求項３〜５の何れかに記載の光学顕微鏡法。
【請求項７】
対照ライトスポットによって形成される対照ライトスポットの対照構造は、その明るさを考慮して特定される
請求項２〜６の何れかに記載の光学顕微鏡法。
【請求項８】
個々の軸方向調整ストロークの和は、焦点深度領域（７８）の軸方向広がり（ｔ）に実質的に等しい
請求項３〜７の何れかに記載の光学顕微鏡法。
【請求項９】
軸方向調整ストロークは、センサ（８４）によって検出される
請求項１〜８の何れかに記載の光学顕微鏡法。
【請求項１０】
焦点深度領域（７８）は、試料（７６）が結像光学系（７０）に対し相対的に又は結像光学系（７０）が試料（７６）に対し相対的に光軸（Ｏ）に沿ってシフトされることによって、物体空間において試料（７６）に対し相対的に光軸（Ｏ）に沿って軸方向調整ストロークだけシフトされる
請求項１〜９の何れかに記載の光学顕微鏡法。
【請求項１１】
較正用点状物体が焦点深度領域（７８）の内部において光軸（Ｏ）に沿って運動され、かつ、検出器に生成される較正像の較正用点状物体を表すライトスポット（３８、４０、４２、４４、６０）の特性パラメータ（ｄ）が較正用点状物体のｚ位置に依存して検出されることによって、割当情報が得られる
請求項１〜１０の何れかに記載の光学顕微鏡法。
【請求項１２】
検出器として２つの検出チャンネルを有する装置が使用され、該２つの検出チャンネルのうち、第１検出チャンネルは第１焦点面（３２）に光学的に共役な位置にある第１像面（３０）を有し、他方、第２検出チャンネルは第１像面（３０）に対し光軸（Ｏ）に沿ってシフトされた第２像面（３４）を有し、該第２像面（３４）は第１焦点面（３２）に対し光軸（Ｏ）に沿ってシフトされた第２焦点面（３６）に対し光学的に共役な位置にある
請求項１〜１１の何れかに記載の光学顕微鏡法。
【請求項１３】
検出器に前置されるシリンダレンズであって、ライトスポット（３８、４０、４２、４４、６０）に割り当てられた点状物体が焦点深度領域に存在する焦点面の一方の側から他方の側に光軸（Ｏ）に沿って運動されるとき、検出器に生成されるライトスポットの認識可能な形状変化をもたらすシリンダレンズを使用する
請求項１〜１１の何れかに記載の光学顕微鏡法。
【請求項１４】
特性パラメータとして、個々の点状物体を検出器に表すライトスポット（３８、４０、４２、４４、６０）の形状及び／又は広がりが使用される
請求項１〜１３の何れかに記載の光学顕微鏡法。
【請求項１５】
試料中の複数の点状物体の確率論的局在化のための光学顕微鏡装置であって、
その光軸（Ｏ）に沿った予め設定される軸方向広がり（ｔ）を有する焦点深度領域（７８）を物体空間に有する結像光学系（７０）；
物体空間に配置された試料（７６）が結像光学系（７０）によって結像される検出器；及び
結像光学系（７０）が検出器に形成する第１試料像を評価することによって、試料（７６）に含まれる点状物体を焦点深度領域（７８）の内部において局在化する制御ユニット（８０）
を含み、
制御ユニット（８０）は、光軸（Ｏ）の方向における個々の点状物体の局在化のために、第１試料像の点状物体を表すライトスポット（３８、４０、４２、４４、６０）の特性パラメータ（ｄ）を求め、及び、この特性パラメータ（ｄ）に対し、予め設定される割当情報に依存して、点状物体に関係付けられる軸方向のｚ位置を割り当て設定し；
制御ユニット（８０）によって制御される調整ユニット（８２）は、その内部において点状物体が局在化される焦点深度領域（７８）を、物体空間において試料（７６）に対し相対的に光軸（Ｏ）に沿って焦点深度領域（７８）の軸方向広がり（ｔ）より小さい予め設定される軸方向調整ストロークだけシフトし；
結像光学系（７０）は、試料（７６）を、軸方向にシフトされた焦点深度領域（７８）で新たに検出器に結像して、第２試料像を形成し；
制御ユニット（８０）は、第２試料像において、点状物体のｚ位置を、予め設定される軸方向の調整ストロークに依存して求め；
制御ユニット（８０）は、点状物体の第１試料像において求められたｚ位置と、同じ点状物体の第２試料像において求められたｚ位置とを対比し；及び
制御ユニット（８０）は、この対比に依存して修正情報を生成し、該修正情報に基づいて、割当情報に依存して求められた点状物体のｚ位置を修正する、
光学顕微鏡装置。
【請求項１６】
制御ユニット（８０）は、焦点深度領域（７８）の内部において光軸（Ｏ）に沿って、少なくとも１つの位置固定的なｚ基準位置（ｚｓ）を規定し；
制御ユニット（８０）は、軸方向にシフトされた焦点深度領域（７８）で検出器に形成される少なくとも１つの第２試料像からの、軸方向にシフトされた焦点深度領域においてｚ基準位置（ｚｓ）に配置されている点状物体を表す複数のライトスポット（３８、４０、４２、４４、６０）の少なくとも１つを、基準ライトスポットとして規定し；
制御ユニット（８０）は、基準ライトスポットによって表される点状物体のｚ位置を、物体空間において、焦点深度領域（７８）の軸方向調整ストロークとｚ基準位置とに依存して決定し；
制御ユニット（８０）は、第１試料像からの、第２試料像の基準ライトスポットのものと同じ点状物体を表す複数のライトスポット（３８、４０、４２、４４、６０）の１つを、対照ライトスポットとして特定し；及び
制御ユニット（８０）は、対照ライトスポットによって表される点状物体のｚ位置の、基準ライトスポットによって表される同じ点状物体のｚ位置に対するずれに依存して修正情報を生成し、該修正情報に基づいて、割当情報に依存して求められる点状物体のｚ位置を修正する、
請求項１５に記載の光学顕微鏡装置。
【請求項１７】
焦点深度領域（７８）の軸方向調整ストロークを検出するためのセンサ（８４）を含む
請求項１５又は１６に記載の光学顕微鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の点状物体の局在化（局部的位置決め：Lokalisierung）のための光学顕微鏡法に関し、とりわけ、物体空間に配置された試料が、その光軸に沿って予め設定される軸方向の広がり（長さ：Ausdehnung）を有する焦点深度領域を物体空間に有する結像光学系によって検出器に結像され；及び、試料中に含まれる点状物体が、試料の結像によって検出器に形成される第１試料像が評価されることによって、焦点深度領域の内部において局在化され；光軸の方向における個々の点状物体の局在化のために、第１試料像の点状物体を表すライトスポットの特性パラメータが求められ、及び、この特性パラメータに対し、予め設定される割当情報に依存して、点状物体に関係付けられる軸方向のｚ位置が割り当てられる光学顕微鏡法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、個々のマーカーの、とりわけ蛍光分子の逐次的確率論的局在化に基づいて、伝統的光学顕微鏡の回折に起因する分解能限界より小さい試料構造を表すことができる光学顕微鏡結像法が開発された。そのような方法は、例えば、WO 2006/127692 A2；DE 10 2006 021 317 B3；WO 2007/128434 A1；US 2009/0134342 A1；DE 10 2008 024 568 A1；WO 2008/091296 A2；“Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM)”，Nature Methods 3，793-796 (2006)，M. J. Rust，M. Bates，X. Zhuang；“Resolution of Lambda/10 in fluorescence microscopy using fast single molecule photo-switching”，Geisler C. et al，Appl. Phys. A，88，223-226 （2007）に記載されている。顕微鏡法のこれらの新たな部門は、局在化顕微鏡法とも称される。その応用方法は、文献において、例えば、（Ｆ）ＰＡＬＭ（（蛍光）光活性化局在顕微鏡法：(Fluorescence) Photoactivation Localization Microscopy）、ＰＡＬＭＩＲＡ（独立走行取得型ＰＡＬＭ：ＰＡＬＭ with Independently Running Acquisition）、ＧＳＤ（ＩＭ）（基底状態欠乏（個別分子リターン）顕微鏡法：Ground State Depletion (Individual Molecule Return) Microscopy）又は（Ｆ）ＳＴＯＲＭ（（蛍光）確率論的光学再構成顕微鏡法：(Fluorescence) Stochastic Optical Reconstruction Microscopy）という名称で知られている。
【０００３】
これらの新たな方法は、２つの識別可能な状態即ち「明」状態と「暗」状態を有する点状物体、所謂マーカーを有する結像されるべき（被結像）試料構造が提供されるという点において共通する。例えば蛍光発色物質（染料）がマーカーとして使用される場合、明状態は蛍光発光可能状態であり、暗状態は蛍光発光不能状態である。
【０００４】
好ましい使用例では、例えば WO 2008/091296 A2 及び WO 2006/127692 A2 に記載されているように、光スイッチ可能又は光活性化可能な蛍光分子が使用される。或いは、例えば DE 10 2006 021 317 B3 に記載されているように、標準蛍光分子の固有の（inhaerent）暗状態を使用することができる。
【０００５】
結像光学系の伝統的（ないし古典的：klassisch）分解能限界より大きい分解能で試料構造を結像するために、小部分量のマーカーが繰り返し明状態に移行される。その際、最も単純な場合では、この活性部分量を形成するマーカーの密度は、隣り合うマーカー間の平均距離が明状態、従って光学顕微鏡により結像可能な状態、において結像光学系の分解能限界より大きいように、選択されることができる。活性部分量を形成するマーカーは、空間的（立体的）分解光検出器に、例えばＣＣＤカメラに、個々の点状のマーカーから、その寸法が光学系の分解能限界によって規定されるライトスポットの形で光分布が検出されるよう、結像される。
【０００６】
この方法では、多数の生データ個別画像が撮像されるが、これらには、夫々、他の活性部分量が結像されている。そして、１つの画像評価プロセスでは、個々の生データ個別画像において、明状態において存在する点状のマーカーを表す光分布の重心位置が定められる。そして、生データ個別画像（複数）から求められた光分布（複数）の重心位置（複数）は、全体画像データセットの形で１つの全体表示に編集される。この全体表示によって生成される高解像度（分解能）全体画像はマーカーの分布を反映ないし再現している。
【０００７】
被結像試料構造の代表的（典型的）な再生のためには、十分に多くのマーカー信号が検出されなければならない。しかしながら、夫々の活性部分量におけるマーカーの数は、２つのマーカーが明状態において相互間で有しなければならない最小の平均距離によって制限されるため、試料構造を完全に結像（描出）するためには、非常に多くの生データ個別画像を撮像しなければならない。典型的には、生データ個別画像の数は１０，０００〜１００，０００の範囲にある。
【０００８】
物体面（以下においてはｘｙ面とも称する）におけるマーカーの上述の横方向の位置決定に加え、軸方向（以下においてはｚ方向とも称する）における位置決定も実行される。ここで、軸方向は、結像光学系の光軸の方向、即ち光の主伝播方向を意味する。
【０００９】
三次元の局在化は、Kao et. al., 1994, Biophysical Journal, 67、Holtzer et. al., 2007, Applied Physics Letters, 90 及び Toprak et al., 2007, Nano Letters, 7(7) に記載されているような所謂「パーティクル・トラッキング（Particle-Tracking）」実験から知られている。これらは、個別分子の上述のスイッチ（明暗切替：Schalten）及び局在化に基づく画像生成法においても既に使用されている。これについては、Huang et al, 2008, Science, 319 及び Juette et al., 2008, Nature Methods が参照される。関連技術としては、更に、Pavani et al., 2009, PNAS, 106 が参照される。
【００１０】
ｚ方向における点状物体の局在化は、原理的に、カメラの検出面において検出されるライトスポットの変化（この変化は点状物体が検出面に光学的に共役な焦点面ないしフォーカス（合焦）面から外れる際に視認可能になる）を評価することによって実行される。なお、以下においては、点状物体（Punktobjekt）とは、その寸法が結像光学系の、とりわけ検出用対物レンズの回折により定まる分解能限界より小さい物体を意味するものとする。この場合、検出用対物レンズは、そのような物体を３次元の合焦光分布の形で像空間に結像する。合焦光分布は、カメラの検出面に、所謂“Point-Spread-Function”即ち点像分布関数又は略してＰＳＦによって特徴付けられるライトスポットを形成する。ここで、点状物体が焦点を通るｚ方向に即ち焦点面に対し直角方向に動くと、ＰＳＦの寸法及び形状は変化する。検出されたライトスポットに対応する検出信号をＰＳＦの寸法及び形状に関して分析すると、それにより、物体の実際のｚ位置を逆推論（逆算：Rueckschluesse）することにより求めることができる。
【００１１】
点状物体が焦点面から過度に大きく離れて位置する場合、カメラの検出面に生成されるライトスポットは、その対応する測定信号が通常の測定雑音に埋もれて最早識別できないほどにぼやけている。即ち（逆にいえば）、物体空間のｚ方向にフォーカス（合焦）面ないし焦点面を中心としてその周りに所定の領域があり、この領域の内部にある点状物体は、点状物体の局在化のためにｚ方向において評価できるほどにまだ十分に鮮明なライトスポットを検出面に生成する。焦点面を含むｚ方向のこの領域は、以下においては、「焦点深度領域（Schaerfentiefenbereich）」と称するものとする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】WO 2006/127692 A2
【特許文献２】DE 10 2006 021 317 B3
【特許文献３】WO 2007/128434 A1
【特許文献４】US 2009/0134342 A1
【特許文献５】DE 10 2008 024 568 A1
【特許文献６】WO 2008/091296 A2
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】M. J. Rust, M. Bates, X. Zhuang, "Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM)"，Nature Methods 3, 793-796 (2006)
【非特許文献２】Geisler C. et al, "Resolution of Lambda/10 in fluorescence microscopy using fast single molecule photo-switching", Appl. Phys. A, 88, 223-226 (2007)
【非特許文献３】Kao et. al., "Tracking of Single Fluorescent Particles in Three Dimensions: Use of Cylindrical Optics to Encode Particle Position", 1994, Biophysical Journal, 67
【非特許文献４】Holtzer et. al., "Nanometric three-dimensional tracking of individual quantum dots in cells", 2007, Applied Physics Letters, 90
【非特許文献５】Toprak et al., "Three-Dimensional Particle Tracking via Bifocal Imaging", 2007, Nano Letters, 7(7)
【非特許文献６】Huang et al., "Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy", 2008, Science, 319
【非特許文献７】Juette et al., "Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples", 2008, Nature Methods
【非特許文献８】Pavani et al., "Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function", 2009, PNAS, 106
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
しかしながら、３次元の局在化には、点状物体に由来するＰＳＦは検出面に関し対称的であるという根本的な問題がある。このことは、点状物体が焦点面から外れたときＰＳＦは変化し、そのため、焦点面に対する点状物体の距離を決定することはできるが、これに対し、ＰＳＦの変化は焦点面の両側に対して対称的であるため、焦点深度領域内の点状物体は焦点面のどちら側にあるかを決定することができないことを意味する。
【００１５】
上記の問題に対処しようとする種々の方法が知られている。例えば、当業界において「非点収差法（Astigmatismusverfahren）」（上記文献Kao et. al.、Holtzer et. al. 及び Huang et al. 参照）、「二重平面法（Bi-Plane-Verfahren）」（上記文献 Toprak et al. 及び Juette et al. 参照）及び「ダブルへリックス法（Doppelhelixverfahren）」（上記文献 Pavani et al. 参照）と呼ばれている方法がある。これらの方法は、ｚ方向における点状物体の局在化のために、検出器に生成されるライトスポットが特性パラメータを決定するために分析され、この特性パラメータは点状物体のｚ位置に割り当てられるという点で共通する。この割り当ては、特性パラメータと点状物体のｚ位置を関係付ける予め決定される割当情報に基づいて実行される。特性パラメータとしては、例えば、非点収差法の場合のように、ライトスポットの形状を特徴付けるパラメータや、二重平面法の場合のように、２つのライトスポット（これらは同じライトスポットに由来し、かつ、それらの対応する焦点面が物体空間においてｚ方向に互いにずらされている検出面に生成される）の広がり（長さ）を互いに関係付けるパラメータが考慮される。
【００１６】
問題は、本来的な光学顕微鏡による測定に先立って決定され、測定で求められる特性パラメータと点状物体の軸方向ｚ位置との間で割り当てを可能にする割当情報が、ｚ位置の正確な決定が不可能である程に不正確であることがしばしばあるという点にある。即ち、割当情報は、試料の光学的性質の変化に依存する。光学的性質が僅かに変化するだけで、局在化顕微鏡法に必要とされる高性能（高倍率）の光学系の場合、結像誤差、例えば、球面収差が生じる。その結果、ライトスポットによって与えられるＰＳＦの形状が変化し、そのため、新たな光学的条件にとって、例えば較正曲線の形で求められた割当情報は最早正しくない。この場合、検出器において検出されるライトスポットに、誤ったｚ位置が割り当てられる。
【００１７】
最終的な測定対象である生物学的試料に、上述の較正曲線の作成を可能にする、例えば蛍光放射性小球のような、較正用要素を導入することは、利用者にとってしばしば困難である。このことは、色収差による誤差を回避するために、これらの較正用要素が種々の色で蛍光発光することが望まれる場合にとりわけ当てはまる。それゆえ、較正を即ち割当情報の決定を専用の較正用試料を用いて実行する実用上好ましいバリエーションがある。しかしながら、この場合、不正確な（誤りのある）較正の問題はとりわけ大きな影響を及ぼす。というのは、較正用試料の光学的性質は本来の測定試料の光学的性質と完全に同一であることはあり得ないからである。カバーガラスの厚みの僅かな違いや試料の包埋媒体の僅かな違いがあるだけで、較正曲線の形状にはっきりとしたずれ（差異）が生じ得る。
【００１８】
測定されるべき試料に実験上の多大な手間をかけて較正用試料を直接配した場合であっても、そのように求められた較正曲線は不正確であり得る。そのため、例えば、僅かに温度が変化するだけでも、典型的な液浸オイルはその屈折率が変化し、そのため、またもや、結像に球面収差が生じるに至る。そのため、同一の試料であっても、較正用試料の撮像の時点と本来的測定の時点との間で較正曲線に変化が生じ得る。更に、較正用試料として使用されるある寸法の蛍光発光小球の信号は、点状物体を形成する個別分子の信号と常に相違し、そのため、またもや、不正確な較正曲線が得られる。
【００１９】
実用上、これらの問題は、点状物体のｚ位置の正確な絶対的決定をしばしば不可能にする。かくして、ｚ位置における相対差を求めることは、従って、更には隣り合う構造を高分解能で区別することは、全く可能ではある。しかしながら、場合によりあり得る隣り合う構造が互いに対し正確にどの程度離れているかを明言（Aussage）することは困難である。この場合に重要なことは、分解能即ちごく近くに隣り合って位置する構造を区別する能力と絶対的位置決定とを区別することである。そのため、従来使用されていた例えば較正曲線の形の割当情報は通常は所望の分解能を可能にするが、点状物体の絶対的ｚ位置を正確に決定することはできない。この事態は、光学的収差に起因するｚ方向における３次元画像の少なからぬ（通常は非線形的な）歪みとして説明することも可能である。現代の生物学においてはまさに、これは重大な問題である。例えば、タンパク質の正確な形状及び配置（構造）はその機能に重大な影響を与える。構造に関する情報を得るためには、３つの空間方向のすべてにおいて正確かつ絶対的な測定を必要とする。ｚ方向における局在化のための従来の不十分な較正手段は、十分な信頼性を提供できない。
【００２０】
それゆえ、本発明の課題は、冒頭に掲げた態様の点状物体の局在化のための光学顕微鏡法を、点状物体を従来よりも正確にｚ方向において局在化できるように、更に発展させることである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
上記の課題を解決するために本発明は請求項１に応じ以下を提供する：その内部において点状物体が局在化される焦点深度領域は、物体空間において試料に対し相対的に光軸に沿って、焦点深度領域の軸方向広がり（長さ：Ausdehnung）より小さい予め設定される軸方向調整ストロークだけシフトされ；軸方向にシフトされた焦点深度領域で、試料は結像光学系によって新たに検出器に結像されて、少なくとも１つの第２試料像が形成され；第２試料像において、点状物体のｚ位置は、予め設定される軸方向調整ストロークに依存して求められ；点状物体の第１試料像において求められたｚ位置は、同じ点状物体の第２試料像において求められたｚ位置と対比され；及びこの対比に依存して修正情報が生成され、該修正情報に基づいて、前記割当情報に依存して求められた点状物体のｚ位置が修正される。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
既に冒頭で述べたように、本発明における焦点深度領域とは、物体空間におけるフォーカス（合焦）面ないし焦点面を中心としたその周りのｚ方向における所定の領域であって、その内部にある点状物体が、当該点状物体の局在化のためにｚ方向において評価できるほどにまだ十分に鮮明なライトスポットを検出器に生成するものと理解されるべきものである。この場合、この最大限に可能な焦点深度領域を完全に使用することは不可欠ではない。従って、所望の局在化精度に依存して焦点深度領域を意図的に短縮し、以って、相当に不鮮明ではあるがそれ自体はまだ評価可能なライトスポットを評価から除外することも有用であり得る。
【００２３】
本発明に応じた解決策は、例えば光学的エラーによる誤った（不正確な）割当情報（これは例えば記憶された較正関数の形で与えられる）を測定中に修正することを提供する。このために、光軸に沿ったその軸方向の広がりないし長さが既知である結像光学系の焦点深度領域は、焦点深度領域の軸方向広がり（長さ）より小さい軸方向調整ストロークだけ試料に対し相対的にシフトされる。換言すれば、このシフトは、物体空間において元の（本来の）焦点深度領域とシフトされた焦点深度領域の間に、光軸に沿ったある程度の重なり（重畳）が存在するように実行される。
【００２４】
即ち、この重なりは、その分だけ焦点深度領域が光軸に沿って動かされる軸方向調整ストロークが焦点深度領域の軸方向の広がり（長さ）より小さいことによって達成される。従って、この調整ストローク（距離）は、例えば焦点深度領域の軸方向広がり（長さ）の５〜９０％、１０〜８０％、１５〜７０％、２０〜６０％又は２５〜５０％の範囲にある。なお、この値の範囲は単なる例として理解すべきであることは言うまでもない。
【００２５】
焦点深度領域の軸方向広がり（長さ）より小さい軸方向調整ストロークだけの焦点深度領域の本発明に応じたシフトは、考慮される２つの焦点深度領域即ち元の（本来の）焦点深度領域とシフトされた焦点深度領域は光軸に沿って重なりを有するものとして理解することができる。これが意味することは、本発明は、個々の段階において焦点深度領域が焦点深度領域の広がり（長さ）より大きい調整ストロークだけシフトされる焦点深度領域の一連の段階的シフトをもカバーする（その保護範囲内に含む）ことである（但し、該一連の段階的シフト全体の結果、考慮される焦点深度領域の間に上述の軸方向の重なりが実現されている場合に限る）。
【００２６】
その分だけ焦点深度領域が１又は複数のステップ（段階）で物体空間においてシフトされる軸方向調整ストロークが焦点深度領域の軸方向広がり（長さ）より小さいという状態は、ｚ方向における焦点深度領域のシフトがｚ方向における結像光学系の分解精度（分解能：Aufloesungsgenauigkeit）を上回る精度で実行されることを意味する。これは、例えば、結像光学系又は試料の何れかをｚ方向にシフトするピエゾアクチュエータによって達成することができる。同様に、焦点深度領域をシフトするために好適な光学要素、例えば可変形（デフォーマブル）レンズ、可変形（デフォーマブル）若しくはスライド可能（verfahrbar）ミラー又は空間的光変調器を使用することも可能である。
【００２７】
本発明に応じた修正は、焦点深度領域を越える３次元の顕微鏡結像を可能にするが、これは、従来はｚ方向における画像の歪みのために容易にはできなかったことである。尤も、１つの画像の撮像後、結像をｚ方向に焦点深度領域の軸方向長さに相当する分だけ正確に移動し、次いで、更なる画像を撮像し、最後に、これらの２つの画像をｚ方向において組み合わせる（結合する）ことは、原理的には従来法でも考えられ得る。この場合、それから得られるのは、ｚ方向に２つの焦点深度領域を越えて延在する全体画像であろう。しかしながら、この方法は、従来にはなかった精度でのｚ方向における点状物体（複数）の局在化を必要とする。本発明の方法によって達成される精度によって初めて、ｚ方向における複数の画像の組み合わせ（結合）が、これらの画像間における誤った重ね合わせ又は隙間を生じることなく、可能になる。
【００２８】
それによって点状物体のｚ位置が修正される修正情報が、修正規則（Korrekturvorschrift）の形で提供される場合（なお、本発明に応じて修正されるｚ位置は、この修正規則によって、元の（誤りのある）割当情報によって求められる点状物体のｚ位置に割り当てられる）、場合によっては、上述の場合に、ｚ方向に相前後する複数の焦点深度領域の各々に対し１つの専用の（固有の：eigen）修正規則が求められ、点状物体の局在化のために当該焦点深度領域において使用される。
【００２９】
本発明の方法は、とりわけ、較正曲線が試料ないし試料を通る光路の光学的性質の変化によって変化される場合に有利に使用することができる。そのため、試料の複数の異なった領域に対し異なる較正を適用することができる。その一例は、水（液体）媒体に配された（包埋された）試料である。試料における結像の焦点面が深くなればなるほど、光は、液浸オイルやガラスのような他の光学材料と異なる屈折率を有する水を一層長く横断しなければならない。このため、光学的結像従って較正曲線も焦点深度領域のｚ位置に依存して変化する。
【００３０】
第１試料像ないし第２試料像は夫々、本発明に応じ、例えば冒頭で説明した１又は複数の生データ個別画像によって実現されるような画像データセットとして理解することができる。
【００３１】
有利には、焦点深度領域の内部において光軸に沿って、焦点深度領域に対し相対的に位置固定的な少なくとも１つのｚ基準位置が規定される。軸方向にシフトされた焦点深度領域で検出器に形成される少なくとも１つの第２試料像からの、軸方向にシフトされた焦点深度領域においてｚ基準位置に配置されている点状物体を表す複数のライトスポットの少なくとも１つは、基準ライトスポットとして規定される。基準ライトスポットによって表される点状物体のｚ位置は、物体空間において、焦点深度領域の軸方向調整ストロークとｚ基準位置とに依存して決定される。第１試料像からの、第２試料像の基準ライトスポットのものと同じ点状物体を表す複数のライトスポットの１つは、対照ライトスポットとして特定（同定）される。対照ライトスポットによって表される点状物体のｚ位置の、基準ライトスポットによって表される同じ点状物体のｚ位置に対するずれに依存して修正情報が生成され、該修正情報に基づいて、割当情報に依存して求められる点状物体のｚ位置が修正される。
【００３２】
従って、焦点深度領域の内部には、焦点深度領域に対し相対的に位置固定的な（定置的な）少なくとも１つのｚ基準位置が規定される。この位置固定的とは、ｚ基準位置が謂わば焦点深度領域と一緒に物体空間において動かされることを意味する。ｚ基準位置としては、例えば、焦点深度領域の物体空間における軸方向上方又は軸方向下方の境界が規定される。焦点深度領域の中央の焦点面が存在するｚ位置もｚ基準位置として好適である。更に、焦点深度領域の内部においてただ一つのｚ基準位置だけではなく、複数のｚ基準位置を規定することも可能である。なお、ｚ基準位置は、物体空間におけるその位置は既知であり、従って、ｚ基準位置に存在する点状物体のｚ位置を誤りなく（正確に）決定することを可能にする。
【００３３】
従って、この実施形態は、実際の測定中に例えば所定の時間間隔で誤りのある（不正確な）較正を修正可能にする基準測定を試料において実行するために、光学的結像エラーから影響を受けることなく可能な焦点深度領域の正確なシフトの使用を提供する。この修正を基礎付けることは、ｚ基準位置が既知であるので、軸方向にシフトされた焦点深度領域で撮像された試料像において、該シフトされた焦点深度領域の内部のｚ基準位置に存在する点状物体を誤りなく（正確に）決定する（特定する）ことができることである。この正確なｚ位置を知ることにより、焦点深度領域のシフトの前に撮像された試料像においてこの試料像で求められた点状物体のｚ位置を修正するために使用することができる修正情報を本発明に応じて生成することができる。焦点深度領域の漸次的シフトによって修正情報が次第に完全なものにされると、誤りのある較正によって引き起こされる全体画像の歪みをこのようにして修正することができる。
【００３４】
有利には、焦点深度領域は、複数のステップで（多段階的に）軸方向にシフトされる。この場合、これらのステップの各々において、修正情報は、その都度の基準ライトスポットとその都度の対照ライトスポットとに基づいて生成される。割当情報に依存して求められた点状物体のｚ位置は、最終的に、段階的に生成される修正情報に基づいて修正される。焦点深度領域のステップ的（段階的）シフトによって、元の（本来の）即ちシフトされていない焦点深度領域は謂わばｚ基準位置で走査される。ｚ基準位置は各ステップにおいて既知であるため、元の（本来の）焦点深度領域の内部において、その都度シフトされるｚ基準位置と一致するｚ位置をもって特定（同定）される点状物体が正確に局在化されることができる。そして、これらの正確に決定されたｚ位置に基づき、修正情報を用いることによって、元の焦点深度領域の内部におけるこれらの位置の間にあるｚ位置も求めることができる。
【００３５】
有利には、各ステップにおいて、割当情報に依存して個々の対照ライトスポットに対して求められるｚ位置は、対応する基準ライトスポットに対して求められるｚ位置によって置換され、この置換によって、修正情報を形成する修正関数が生成される。この場合、この修正関数は、有利には、第１試料像が撮像された焦点深度領域全体をカバーする。
【００３６】
とりわけ有利な一実施形態では、焦点深度領域の段階的シフトによって対照ライトスポット及び基準ライトスポットの何れも利用することができない修正関数の中間値は、内挿法によって求められる。この場合、ｚ基準位置のシフトによって正確に求められるｚ位置は、それに基づいて内挿法例えば単純スプライン補間法（内挿法）を実行することができる支持部位（Stuetzstellen）を構成する。かくして、例えば、典型的な較正エラーを考慮する適切なモデル関数が選択され、所望の修正関数を得るために、このモデル関数が、上述の支持部位において適合化される。
【００３７】
有利には、焦点深度領域の段階的シフトによって求められる点状物体のｚ位置は、全体局在化像（Gesamtlokalisierungsbild）に重ね合わせられる。これにより、（第２）試料像は、元の（第１）試料像において求められたｚ位置のために使用されるだけではなく、元の焦点深度領域よりも大きい領域に亘ってｚ方向に延在する全体局在化像の構築のためにも使用される。
【００３８】
有利には、その分だけ焦点深度領域が物体空間においてシフトされる軸方向調整ストロークは、センサによって検出される。かくして、点状物体の求められたｚ位置の修正に関与する軸方向調整ストロークは、常に正確に既知であることが保証される。試料に対する相対的な焦点深度領域のシフトは、試料を結像光学系に対し相対的に又は結像光学系を試料に対し相対的に光軸に沿って動かすことによって実行することができる。しかしながら、本発明はこれに限定されない。従って、例えば、焦点深度領域を物体空間において結像光学系の光軸に沿ってシフトするために、可変形レンズ、可変形ミラー、空間的光変調器等を使用することも可能である。
【００３９】
特別な一実施形態では、検出器に前置されるシリンダレンズが使用される。このシリンダレンズは、ライトスポットに割り当てられた点状物体が焦点深度領域にある焦点面の一方の側から他方の側に光軸に沿って動かされるとき、検出器に生成されるライトスポットの識別（区別）可能な形状変化を引き起こす。この場合、ライトスポットの形状変化は、ｚ方向における局在化のための特性パラメータとして使用することができる。
【００４０】
ここで、「ライトスポットの形状」という概念は、本発明においては、個別ライトスポットの形状に関係するだけではなく、例えば冒頭で説明したダブルへリックス法に見られるような複数のライトスポットから構成される全体の形状も含むものであると理解することができることを指摘する。この場合、例えば、謂わば互いに対し相対的に回転運動を同様に行う２つのライトスポットが考慮される。
【００４１】
有利には、対照（比較）ライトスポットによって形成される対照ライトスポットの対照構造は、その明るさを考慮して、即ち、この構造に寄与する個別スポットの総数を考慮して、特定（同定）される。この実施形態は、とりわけ、シフトされた焦点深度領域について求められたｚ位置が割当情報に基づいて予め決定されたｚ位置の修正のために使用されるだけではなく、全体局在化像の生成のためにも考慮される場合に有利である。この更なる構成によって、全体局在化像における妨害的な明るさの相違（むら）が回避される。
【００４２】
割当情報は、例えば、較正用点状物体が焦点深度領域の内部において光軸に沿って運動され、かつ、検出器に生成される較正像の較正用点状物体を表すライトスポットの特性パラメータが較正用点状物体のｚ位置に依存して検出される（求められる）ことによって、得ることができる。特性パラメータとしては、例えば、検出器におけるライトスポットの形状及び／又は広がり（長さ）が考慮される。
【００４３】
本発明の方法を実施するために、請求項１４に応じ、試料中の点状物体の局在化のための光学顕微鏡装置が提供される。
【００４４】
ここに、本発明の好ましい実施の形態を示す。
（形態１）上記の課題を解決するために、本発明の第１の視点により、試料中の複数の点状物体の確率論的局在化のための光学顕微鏡法が提供される。この光学顕微鏡法において、
物体空間に配置された試料は、その光軸に沿って予め設定される軸方向広がりを有する焦点深度領域を物体空間に有する結像光学系によって検出器に結像され；及び
試料中に含まれる点状物体は、試料の結像によって検出器に形成される第１試料像が評価されることによって、焦点深度領域の内部において局在化され；
光軸の方向における個々の点状物体の局在化のために、第１試料像の点状物体を表すライトスポットの特性パラメータが求められ、及び、この特性パラメータに対し、予め設定される割当情報に依存して、点状物体に関係付けられる軸方向のｚ位置が割り当て設定され；
その内部において点状物体が局在化される焦点深度領域は、物体空間において試料に対し相対的に光軸に沿って焦点深度領域の軸方向広がりより小さい予め設定される軸方向調整ストロークだけシフトされ；
軸方向にシフトされた焦点深度領域で、試料は結像光学系によって新たに検出器に結像されて、少なくとも１つの第２試料像が形成され；
第２試料像において、点状物体のｚ位置は、予め設定される軸方向調整ストロークに依存して求められ；
点状物体の第１試料像において求められたｚ位置は、同じ点状物体の第２試料像において求められたｚ位置と対比され；及び
この対比に依存して修正情報が生成され、該修正情報に基づいて、前記割当情報に依存して求められた点状物体のｚ位置が修正される（第１基本構成）。
（形態２）上記の光学顕微鏡法において、焦点深度領域の内部において光軸に沿って、焦点深度領域に対し相対的に位置固定的な少なくとも１つのｚ基準位置が規定され；
軸方向にシフトされた焦点深度領域で検出器に形成される少なくとも１つの第２試料像からの、軸方向にシフトされた焦点深度領域においてｚ基準位置に配置されている点状物体を表す複数のライトスポットの少なくとも１つは、基準ライトスポットとして規定され；
基準ライトスポットによって表される点状物体のｚ位置は、物体空間において、焦点深度領域の軸方向調整ストロークとｚ基準位置とに依存して決定され；
第１試料像からの、第２試料像の基準ライトスポットのものと同じ点状物体を表す複数のライトスポットの１つは、対照ライトスポットとして特定され；及び
対照ライトスポットによって表される点状物体のｚ位置の、基準ライトスポットによって表される同じ点状物体のｚ位置に対するずれに依存して修正情報が生成され、該修正情報に基づいて、割当情報に依存して求められる点状物体のｚ位置が修正されることが好ましい。
（形態３）上記の光学顕微鏡法において、焦点深度領域は複数のステップで軸方向にシフトされ、これらのステップの各々において個々の基準ライトスポットと対応する対照ライトスポットとに基づいて修正情報が生成され、割当情報に依存して求められる点状物体のｚ位置は段階的に生成される修正情報に基づいて修正されることが好ましい。
（形態４）上記の光学顕微鏡法において、前記ステップの各々において、割当情報に依存して個々の対照ライトスポットに対して求められるｚ位置は、対応する基準ライトスポットに対して求められるｚ位置によって置換され、この置換によって、修正関数が修正情報として生成されることが好ましい。
（形態５）上記の光学顕微鏡法において、焦点深度領域の段階的シフトによって対照ライトスポット及び基準ライトスポットの何れも利用することができない修正関数の中間値は、内挿法によって求められることが好ましい。
（形態６）上記の光学顕微鏡法において、焦点深度領域の段階的シフトによって求められる点状物体のｚ位置は、全体局在化像に重ね合わせられることが好ましい。
（形態７）上記の光学顕微鏡法において、対照ライトスポットによって形成される対照ライトスポットの対照構造は、その明るさを考慮して特定されることが好ましい。
（形態８）上記の光学顕微鏡法において、個々の、有利には同じ長さの軸方向調整ストロークの和は、焦点深度領域の軸方向広がりに実質的に等しいことが好ましい。
（形態９）上記の光学顕微鏡法において、軸方向調整ストロークは、センサによって検出されることが好ましい。
（形態１０）上記の光学顕微鏡法において、焦点深度領域は、試料が結像光学系に対し相対的に又は結像光学系が試料に対し相対的に光軸に沿ってシフトされることによって、物体空間において試料に対し相対的に光軸に沿って軸方向調整ストロークだけシフトされることが好ましい。
（形態１１）上記の光学顕微鏡法において、較正用点状物体が焦点深度領域の内部において光軸に沿って運動され、かつ、検出器に生成される較正像の較正用点状物体を表すライトスポットの特性パラメータが較正用点状物体のｚ位置に依存して検出されることによって、割当情報が得られるが好ましい。
（形態１２）上記の光学顕微鏡法において、検出器として２つの検出チャンネルを有する装置が使用され、該２つの検出チャンネルのうち、第１検出チャンネルは第１焦点面に光学的に共役な位置にある第１像面を有し、他方、第２検出チャンネルは第１像面に対し光軸に沿ってシフトされた第２像面を有し、該第２像面は第１焦点面に対し光軸に沿ってシフトされた第２焦点面に対し光学的に共役な位置にあることが好ましい。
（形態１３）上記の光学顕微鏡法において、検出器に前置されるシリンダレンズであって、ライトスポットに割り当てられた点状物体が焦点深度領域に存在する焦点面の一方の側から他方の側に光軸に沿って運動されるとき、検出器に生成されるライトスポットの認識可能な形状変化をもたらすシリンダレンズを使用することが好ましい。
（形態１４）上記の光学顕微鏡法において、特性パラメータとして、個々の点状物体を検出器に表すライトスポットの形状及び／又は広がりが使用されることが好ましい。
（形態１５）上記の課題を解決するために、本発明の第２の視点により、試料中の複数の点状物体の確率論的局在化のための光学顕微鏡装置が提供される。この光学顕微鏡装置は、
その光軸に沿った予め設定される軸方向広がりを有する焦点深度領域を物体空間に有する結像光学系；
物体空間に配置された試料が結像光学系によって結像される検出器；及び
結像光学系が検出器に形成する第１試料像を評価することによって、試料に含まれる点状物体を焦点深度領域の内部において局在化する制御ユニット
を含み、
制御ユニットは、光軸の方向における個々の点状物体の局在化のために、第１試料像の点状物体を表すライトスポットの特性パラメータを求め、及び、この特性パラメータに対し、予め設定される割当情報に依存して、点状物体に関係付けられる軸方向のｚ位置を割り当て設定し；
制御ユニットによって制御される調整ユニットは、その内部において点状物体が局在化される焦点深度領域を、物体空間において試料に対し相対的に光軸に沿って焦点深度領域の軸方向広がりより小さい予め設定される軸方向調整ストロークだけシフトし；
結像光学系は、試料を、軸方向にシフトされた焦点深度領域で新たに検出器に結像して、第２試料像を形成し；
制御ユニットは、第２試料像において、点状物体のｚ位置を、予め設定される軸方向の調整ストロークに依存して求め；
制御ユニットは、点状物体の第１試料像において求められたｚ位置と、同じ点状物体の第２試料像において求められたｚ位置とを対比し；及び
制御ユニットは、この対比に依存して修正情報を生成し、該修正情報に基づいて、割当情報に依存して求められた点状物体のｚ位置を修正する（第２基本構成）。
（形態１６）上記の光学顕微鏡装置において、制御ユニットは、焦点深度領域の内部において光軸に沿って、少なくとも１つの位置固定的なｚ基準位置を規定し；
制御ユニットは、軸方向にシフトされた焦点深度領域で検出器に形成される少なくとも１つの第２試料像からの、軸方向にシフトされた焦点深度領域においてｚ基準位置に配置されている点状物体を表す複数のライトスポットの少なくとも１つを、基準ライトスポットとして規定し；
制御ユニットは、基準ライトスポットによって表される点状物体のｚ位置を、物体空間において、焦点深度領域の軸方向調整ストロークとｚ基準位置とに依存して決定し；
制御ユニットは、第１試料像からの、第２試料像の基準ライトスポットのものと同じ点状物体を表す複数のライトスポットの１つを、対照ライトスポットとして特定し；及び
制御ユニットは、対照ライトスポットによって表される点状物体のｚ位置の、基準ライトスポットによって表される同じ点状物体のｚ位置に対するずれに依存して修正情報を生成し、該修正情報に基づいて、割当情報に依存して求められる点状物体のｚ位置を修正することが好ましい。
（形態１７）上記の光学顕微鏡装置において、焦点深度領域の軸方向調整ストロークを検出するためのセンサを含むことが好ましい。
以下に、本発明の実施例を図面を参照して詳細に説明する。なお、特許請求の範囲に付した図面参照符号は専ら発明の理解を助けるためのものであり、本発明を図示の態様に限定することは意図しない。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ｚ方向における点状物体の局在化のための本発明の一実施例を示す模式図。
【図２】ｚ方向における点状物体の局在化のための本発明の他の一実施例を示す模式図。
【図３】焦点面に対する相対的な点状物体のｚ位置に対し検出面において検出されるライトスポットの形状を割り当てた割当規則（Zuordnungsvorschrift）の一例。
【図４】本発明に応じて使用される焦点深度領域の一例を示す模式図。
【図５】エラーのある割当情報によって引き起こされるｚ方向における試料像の歪み（Verzerrung）の一例を示す模式図。
【図６】焦点深度領域の本発明に応じたシフトによって点状物体のｚ位置が修正される様子の一例を示す模式図。
【図７】図６に応じた方法によって生成される修正関数の一例を例示的に示すグラフ。
【実施例】
【００４６】
最初に、図１〜図３を参照して、ｚ方向において点状物体（複数）の局在化を可能にする特性パラメータを異なる方法で求める２つの実施例を説明する。
【００４７】
図１は、結像光学系としての対物レンズ１２と検出面１４とを有する光学顕微鏡装置１０の一例を示す。図１の装置は２つの別個の検出チャンネルを有する。これらの検出チャンネルのうち、図１の紙面左側にあるチャンネルは実質的に対物レンズ１２と第１鏡胴レンズ１６とによって規定され、他方、図１の紙面右側にあるチャンネルは対物レンズ１２と第２鏡胴レンズ１８によって形成される。点状物体２０から放出される光は、ビームスプリッタ２２と偏向ミラー２４、２６及び２８とを介して同じ割合（割当分）でこれらの検出チャンネルの両方に導かれる。
【００４８】
これら２つの検出チャンネルはその焦点（合焦）位置が（互いに対し）僅かに相違する。このことは、第１検出チャンネルは第１焦点面３２に対し光学的に共役な（位置にある）第１像面３０を有するのに対し、他方の（第２）検出チャンネルは第１像面３０に対し対物レンズ１２の光軸Ｏに平行な方向に即ちｚ方向にずらされた第２像面３４を有し、該第２像面３４は第１焦点面３２に対し同様にｚ方向にずらされた第２焦点面３６に対し光学的に共役である（共役な位置にある）ことを意味する。
【００４９】
局在化されるべき点状物体２０が一方の検出チャンネルの焦点面にある場合、該物体２０は対物レンズ１２によって該検出チャンネルにおいて鮮明に結像されるのに対し、他方の検出チャンネルにおいては不鮮明に結像される。該物体２０は、これら２つの焦点面３２及び３６の間にある場合、これら２つの検出チャンネルにおいて不鮮明に結像される。
【００５０】
図１には、焦点面３２及び３６に対する相対的な点状物体２０のｚ位置に依存して検出面１４に生成されるライトスポット３８、４０、４２及び４４によって上述の状態が示されている。従って、ライトスポット３８、４０、４２、４４は、図１には、ｘｙ面についての平面図で示されている。ライトスポット３８、４０、４２、４４は、夫々、検出面１４において対物レンズ１２によって生成される合焦（フォーカス）光分布（Fokuslichtverteilung）から生じるＰＳＦによって特徴付けられる。
【００５１】
点状物体２０が第１焦点面３２にある場合、図示左側の検出チャンネルの検出面１４には比較的小さいライトスポット３８が、図示右側の検出チャンネルの検出面１４にはそれに比べて大きいライトスポット４２が生じる。これに対し、点状物体２０が（第２）焦点面３６にある場合、図示左側の検出チャンネルの検出面１４には大きいライトスポット４０が、図示右側の検出チャンネルの検出面１４には小さいライトスポット４４が生じる。
【００５２】
検出面１４に生成されるライトスポット３８、４０、４２、４４からは、焦点面３２及び３６に対する相対的な点状物体２０のｚ位置のための尺度である特性パラメータを導き出すことができる。例えば、特性パラメータとして、図示左側の検出チャンネルに生成されるライトスポット３８又は４０の延びないし長さ（ないし広がり：Ausdehnung）は、図示右側の検出チャンネルに生成されるライトスポット４２又は４４の延びないし長さに関係付けられることができる。
【００５３】
図２は、点状物体のｚ位置を求めることを可能にする上述の特性パラメータが他の方法で得られる（把握される）一例を示す。図２は、部分図ａ）において、まず、点状物体２０が対物レンズ５０と鏡胴レンズ５２とから構成される結像光学系５４を介して検出面５６に結像される従来の構造を示す。この場合、点状物体２０は、検出面５６に対し光学的に共役な（位置にある）面である焦点面５８に存在しているはずである。
【００５４】
結像光学系５４は、点状物体２０から出射する光を、検出面５６に投射する３次元の合焦光分布に成形する。検出面５６は、ｚ方向に対し直角に延在する平坦な交面（Schnitt）を合焦光分布によって示すライトスポット６０を検出する。この状態をより良好に表すために、図２において、ライトスポット６０は、検出面５６についての平面図で即ちｘｙ面に示されている。
【００５５】
点状物体２０が焦点面５８に存在する図２の部分図ａ）に示された例において、検出面５６におけるライトスポット６０は円形（真円）形状、即ち、ｘｚ面及びｙｚ面に関し鏡像対称的な形状を有する。
【００５６】
図２は、部分図ｂ）において、対物レンズ５０及び鏡胴レンズ５２に加えてシリンダレンズ６２を備えた本発明に応じて変容された一例を示す。シリンダレンズ６２は、ｘ方向及びｙ方向において夫々異なる屈折率（力）を有し、従って、ｘ方向及びｙ方向に対し異なる合焦位置（Fokuslagen）を有する。これに応じて、検出面５６におけるライトスポット６０はｘ方向及びｙ方向に変形して十字状になっている。点状物体２０は、部分図ｂ）において今や相違する２つの焦点面の中央に正確に位置するが、この中央位置もまた図面参照符号５８で示されている。尤も、十字状ライトスポット６０は上述の意味で対称状態を維持している。
【００５７】
図２は、部分図ｃ）において、点状物体２０が焦点面５８の上方に位置する一例を示す。焦点面５８からのこのずれにより、検出面５６におけるライトスポット６０は非対称的に変形されて楕円状になっている。この場合、ライトスポット６０の楕円形状は、点状物体２０が焦点面５８から離隔するほど一層明確に現れる。
【００５８】
図２は、部分図ｄ）において、点状物体２０が焦点面５８の下方に位置する一例を示す。この場合も、検出面５６におけるライトスポット６０は楕円状に変形（長径化）されるが、その変形（長径化）方向は部分図ｃ）におけるライトスポット６０の変形方向とは異なる。このため、ライトスポット６０の形状に基づいて、点状物体２０が焦点面５８の上方又は下方の何れに位置するかを見分けることができる。図２の記載から分かるように、焦点面５８に対する相対的な点状物体２０のｚ位置は、検出面５６におけるライトスポット６０の形状及び延びないし長さ（Ausdehnung）に基づいて決定することができる。これは、この実施例では、例えば図３に示されている割当規則（Zuordnungsvorschrift）に基づいて実行される。そのような割当規則は較正測定によって得ることができる。この較正測定においては、較正用点状物体がｚ方向において焦点面５８の一方の側から他方の側に運動し、その際、ライトスポットの形状がその都度既知のｚ位置に対して決定される。かくして、その後の測定において、測定されたライトスポットを正しいｚ位置に割り当てることを可能にする割当規則が得られる。実用上は、このために、特別の較正用試料、例えば、較正用点状物体として蛍光発光性小球体又は照明光を散乱するナノパーティクルを有する試料が使用される。
【００５９】
図３は、上記の実施例に応じて作成した割当規則の一例である。ここでは、符号ｓｘで示されたｘ方向におけるライトスポットの延びないし長さと符号ｓｙで示されたｙ方向におけるライトスポットＰＳＦの延びないし長さとの差が特性パラメータｄとして定義されている。かくして、本来の撮像において、測定されたライトスポットの各々に対し１つのｚ位置を決定することを可能にする割当規則ｄ（ｚ）が得られる。次いで、この位置は、ｘｙ位置と共に記憶され、高解像度化された３次元画像の生成に利用される。
【００６０】
点状物体のｚ位置を求めることを可能にする割当規則の決定は上述の実施例に限定されない。従って、例えば、冒頭に記載したダブルへリックス法（Doppelhelixverfahren）もそのような割当規則を生成するために好適である。
【００６１】
更に、図３に示した形態の関数で表された割当規則も単に例示的な実施例として示したに過ぎないことを指摘する。従って、例えば、測定されたＰＳＦと予め記憶又は計算されたＰＳＦの間の相関関係（関係付け）の形で画像対比を行うことも同様に可能である。そして、測定されたＰＳＦと最も類似している記憶又は計算されたＰＳＦのｚ位置は、正しいｚ位置とみなされる。測定されたＰＳＦがその形状に関し記憶又は計算されたＰＳＦと同一でない場合、それ（該測定されたＰＳＦ）には、例えば内挿法によって、該測定されたＰＳＦに最も類似する複数の記憶又は計算されたＰＳＦのｚ位置の間にあるｚ位置を割り当てることができる。
【００６２】
以下に、図４〜図７に関連して、上述の形態の割当規則に基づく点状物体の局在化の修正を可能にする態様を例示的に説明する。
【００６３】
図４は、本発明の顕微鏡装置の一実施例を極めて模式的に示す。図４では、本発明に応じた修正方法の説明に役立つ構成要素のみが示されている。とりわけ、図４では、検出器については図示を省略している。
【００６４】
図４の装置構成では、対物レンズ７０は、カバーガラス７２に配された試料７６を液浸媒体７８を介して検出器に結像する。対物レンズ７０は、対物レンズ７０の光軸Ｏに沿って即ちｚ方向に軸方向の延在の延び（長さ）ｔを有する焦点深度領域７８を有する。焦点深度領域７８は、焦点深度領域７８の内部にある点状物体（複数）が対物レンズ７０によって検出器に、例えば図３に示した形態を有する割当規則を考慮してｚ方向における局在化を可能にするために十分に鮮明なライトスポットとして結像されるように定められる。従って、物体空間内部における焦点深度領域７８の位置及び延び（長さ）は予め定められておりかつ既知である。
【００６５】
図４の装置は、更に、当該装置の運転全体を制御する制御ユニット８０を有する。とりわけ、制御ユニット８０は、点状物体の局在化のために必要な計算及び評価を行う計算手段を有する。制御ユニット８０は、更に、焦点深度領域７８を所定の（定義された）態様で光軸に沿ってシフトするために対物レンズ７０を光軸Ｏに沿って運動させることができるピエゾアクチュエータ８２を制御する。制御ユニット８０に接続されたセンサ８４は、対物レンズ７０従って焦点深度領域７８が物体空間の内部においてシフトされるその調整ストローク（距離）を検出する。
【００６６】
試料７６は、焦点深度領域７８において互いに異なるｚ位置に配置されている種々の構造９０、９２、９４、９６及び９８を含む。構造９０、９２、９４、９６及び９８には、局在化されるべき点状物体（複数）を形成するマーカーが付されている。撮像の間、構造９０、９２、９４、９６及び９８にあるマーカーは個別にライトスポットとして検出器に結像され、これらのライトスポットはその位置及び形状について制御ユニット８０によって評価される。このようにして、ｚ方向において高解像度化された画像が生成される。
【００６７】
図５は、不正確な割当規則がｚ方向において画像を歪ませる様子を明確に表す図である。そのため、図５の左側の部分には、構造９０、９２、９４、９６及び９８が配置されている焦点深度領域７８を有する物体空間が記載されており、他方、図５の右側部分には、像空間におけるこれらの構造の像が記載されている。物体空間のｚ位置に対応する像空間の内部におけるｚ位置は、記号「’」が付記されている。
【００６８】
図５に示した例では、不正確な（誤りのある）割当規則は、ｚ’方向において画像を押し潰して（圧縮して）いる。
【００６９】
図６には、不正確な割当規則によって引き起こされる画像のこの潰れ（Stauchung）が、焦点深度領域７８を多段階的にｚ方向にシフトすることによって、順次的に是正される様子が示されている。この場合、図６の部分図ａ）は、図５に示された状態に対応する。
【００７０】
次に、焦点深度領域７８において、焦点深度領域７８に対し相対的に位置固定的な、即ち、物体空間において焦点深度領域７８と一緒にシフトされる、ｚ基準位置が定義される。この実施例では、符号ｚｓで表された焦点深度領域の下側の境界がｚ基準位置として定められる。このｚ基準位置は既知であるので（なぜなら、制御ユニット８０の制御信号とこの信号によって達成されるｚ位置の間の関係が分かるため、焦点深度領域７８のｚ方向シフトの大きさも分かるから）、試料の内部におけるｚ基準位置にある構造のｚ位置は正確かつ誤り（誤差）なしで検出する（求める）ことができる。焦点深度領域７８はまだシフトされていない図６の部分図ａ）では、ｚ基準位置は構造９０（の位置）に相当する。
【００７１】
試料が検出器に結像され、次いで、焦点深度領域７８がそのｚ基準位置と一緒にｚｓ＝ｚ１の位置にシフトされると、図６の部分図ｂ）に示した状態が生じる。この場合、構造９２が焦点深度領域７８のｚ基準位置にある。ｚ基準位置に配置されている構造９２に含まれている点状物体について、ｚ位置を正確に決定することができる。ｚ基準位置に配置された点状物体（複数）によって検出器に生成されるライトスポット（複数）は、以下では、基準ライトスポット（複数）というものとする。これらの基準ライトスポットに基づいて、シフトされた焦点深度領域７８で撮像された第２試料像の基準ライトスポット（複数）に対応するライトスポット（複数）が、予め撮像された第１試料像（図６の部分図ａ）において特定（同定）される。第１試料像に含まれているこれらのライトスポットは、以下では、対照ライトスポットというものとする。
【００７２】
図６の部分図ａ）とｂ）の対比により示されるように、第１試料像において、構造９２に含まれている点状物体のｚ位置は、不正確な割当規則のために、誤って（不正確に）、即ち、過小の値ｚｘ’で求められている。この誤った値は、第２試料像において正しく求められた値によって置換され、かくして修正されることができる。この正しい値はｚ１＝ｚ１’として既知である。
【００７３】
図７に示されているように、構造９２の正しい位置ｚ１を誤った位置ｚｘ’即ち構造９２について部分図ａ）の第１試料像内に見出された位置に対してグラフにプロットすることができる。
【００７４】
ここで、焦点深度領域７８の軸方向の延び（長さ）ｔより小さい定義された（所定の）調整ストローク（距離）だけ、焦点深度領域７８を更にシフトする。この例では、第２のシフトステップにおいて予め与えられる調整距離もまた値Ｄｚに等しく、そのため、ｚ基準位置は位置ｚ２にシフトされる。ここで再び、試料像が撮像され、ｚ基準位置に即ち焦点深度領域７８の下側境界に配置されている構造が再び考慮される。図６の部分図ｃ）によると、この構造は、この場合、構造９４であるが、この構造９４の点状物体は検出器に関連する基準ライトスポットを生成する。この基準ライトスポットに基づいて、再び、第１試料像（図６の部分図ａ）において関連する対照ライトスポットが特定（同定）される、即ち、第１試料像において構造９４が見つけ出される。第１試料像では、構造９４には、ｚ位置ｚ＋’が割り当てられている。図７のグラフでは、この位置ｚ＋’に対し正しい位置ｚ２がプロットされている。
【００７５】
図６の部分図ａ）に示されているように元の（本来の）焦点深度領域の全体がカバー（ないし処理）されるまで、図６の部分図ｄ）及びｅ）に示したように、適切な数のステップ（段階）で、上述の方法が行われる（上述の方法でシフトが行われる）。（即ち、まず、ステップ１において、焦点深度領域７８内の全体について撮像する（第１試料像）。次に、ステップ２において、焦点深度領域７８の下側境界が位置ｚ１に位置するよう焦点深度領域７８を既知のストローク（距離）だけシフトし、第２試料像を生成する。位置ｚ１’における第２試料像の構造、即ちｚ基準位置を構成する焦点深度領域７８の下側境界にある構造９２（ｘ）、を記憶しかつその正しい位置ｚ１も記憶する。次に、ステップ１からの試料像に対し、記憶した構造９２（ｘ）と対比しつつサーチを実行する。このサーチは同じ構造９２（ｘ）が第１試料像に位置するｚ位置が発見されるまで実行する。この場合、このｚ位置はｚｘ’であり、これも記憶される。図７に示したグラフでは、構造９２（ｘ）の正しい位置ｚ１が同じ構造の誤った位置ｚｘ’に対してプロットされている。次に、ステップ３において、焦点深度領域７８の下側境界が位置ｚ２に位置するよう焦点深度領域７８を既知のストローク（距離）だけシフトし、第３試料像を生成する。位置ｚ２’における第３試料像の構造、即ちｚ基準位置を構成する焦点深度領域７８の下側境界にある構造９４（＋）、を記憶しかつその正しい位置ｚ２も記憶する。次に、ステップ１からの試料像に対し、記憶した構造９４（＋）と対比しつつサーチを実行する。このサーチは同じ構造９４（＋）が第１試料像に位置するｚ位置が発見されるまで実行する。この場合、このｚ位置はｚ＋’であり、これも記憶される。図７に示したグラフでは、構造９４（＋）の正しい位置ｚ２が同じ構造の誤った位置ｚ＋’に対してプロットされている。同様の処理が構造９６（＃）及び９８（＊）に対しても実行され、その結果、正しい値ｚ３及びｚ４が第１試料像の対応する構造の誤った位置ｚ＃’及びｚ＊’に対してプロットされる。かくして、第１試料像に示された複数の構造の誤った位置の、対応する構造の正しいｚ位置に対するマッピングが生成される。これらの構造の間にある構造の正しい位置については、図７に破線で示したように、補間法ないし内挿法によって求めることができる。図７に示したこのマッピングは、オリジナルの第１試料像内の構造のｚ位置を修正するために使用可能な修正関数を表す。）
【００７６】
第１試料像において再び見つけ出されたすべての構造について、図７のグラフに基づいて、正しい位置を縦軸において読み取ることができる。記載された測定点（複数）に基づき、典型的な校正誤差（Kalibrierfehler）を考慮した適切なモデル関数を用いて、修正規則（Korrekturvorschrift）を得ることができる。選択的に、修正規則を得るために、単純スプライン補間法又はその他の態様の補間法（内挿法）を使用することもできる。図７に記号ｃ（ｚ’）で表されたこの修正規則（即ち修正関数）は、第１試料像（図６の部分図ａ）を修正するために使用することができる。かくして、第１試料像において求められるすべての位置ｚ’について、修正規則ｃ（ｚ’）から、夫々正しいｚ位置が得られる。
【００７７】
上述の方法は単なる例示に過ぎないと理解すべきであることを指摘する。従って、上述のものと異なるアルゴリズムも使用できることは明らかである。とりわけ、実際の応用において好都合なのは、図４〜図７に示した例の場合のように、焦点深度領域の内部においてただ一つの位置固定のｚ基準位置を定めることだけではない。従って、焦点深度領域の他の部位（複数）において更なるｚ基準位置（複数）を定義する（定める）こともできる。
【００７８】
更に、第１試料像に対する第ｎ像のずれを考慮することだけではなく、第ｍ像からの構造に対する第ｎ像からの構造の位置ずれも求めること（なお、ｎとｍは１以上の自然数である）も可能である。これによって、より多くの測定点が生じるため、より正確な修正規則を得ることができる。更に、第ｍ像に同様に存在する構造と比べた第ｎ像の歪みを直接的に決定する画像処理アルゴリズムも使用することができる。本質的であることは、焦点深度領域の高精度のシフトによって、点状物体の局在化のために好都合に使用される観察される構造のｚ位置に関する追加の情報が得られることだけである。
【００７９】
更に、修正規則がその都度完全な試料領域に適用されることができない場合、物体空間及び像空間の内部においてｚないしｚ’の値領域即ち焦点深度領域及び対応する像領域は柔軟に（フレキシブルに）適合化されることができる。
【００８０】
更に、シフトされた焦点深度領域で得られた位置情報を第１試料像において求められるｚ位置の修正のために使用するだけではなく、この位置情報を画像生成自体に入れ込む（使用する：einfliessen）ことも可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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