(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞と結合可能な第一の分子が刺激分解性リンカーを介して固定化された第一の領域と、
前記細胞と特異的に結合可能な結合部並びに識別部及び標識部が刺激分解性リンカーを介して連結された第二の分子と、特異的に結合可能な分子が固定化された第二の領域と、
前記標識部を検出可能な検出領域と、を含む細胞分析用チップを用いる細胞の分析方法であり、
以下の工程：
（Ａ）細胞と結合可能でありかつ刺激分解性リンカーを介してウェルに固定化されている第一の分子で、細胞を捕捉する工程、
（Ｂ）細胞の細胞表面分子に、該細胞と特異的に結合可能な結合部並びに核酸断片を含む識別部及び標識部が刺激分解性リンカーを介して連結された第二の分子を、結合させる工程、
（Ｃ）第二の分子の結合部と、前記識別部及び標識部とを切り離す工程、
（Ｄ）切り離された識別部及び標識部のうち、前記核酸断片を含む識別部を、ウェルに固定化されている識別部認識分子に特異的に結合させる工程、
（Ｅ）前記識別部認識分子に結合した前記識別部及び標識部のうち、前記核酸断片を含む標識部を検出する工程、及び
（Ｆ）前記工程（Ｅ）で得られた標識部の検出結果から、第二の分子と特異的に結合した細胞表面分子を特定及び／又は定量する工程、
を含む、細胞の分析方法。
【請求項２】
更に以下の工程：
（Ｇ）細胞からの細胞分泌物を特定及び／若しくは定量する工程、並びに／又は
（Ｈ）細胞から核酸を取得して解析する工程
を含む、請求項１に記載の細胞の分析方法。
【請求項３】
前記工程（Ａ）において捕捉される細胞が、単一細胞又は同一種類の複数細胞である、請求項１又は２に記載の細胞の分析方法。
【請求項４】
前記第一の分子は、オレイル基、抗体、アプタマー又は分子認識ポリマーを含む分子である、請求項１から３のいずれか一項に記載の細胞の分析方法。
【請求項５】
前記第二の分子は、抗体、アプタマー又は分子認識ポリマーを含む分子である、請求項１から４のいずれか一項に記載の細胞の分析方法。
【請求項６】
前記刺激分解性リンカーは光分解性リンカーである、請求項１から５のいずれか一項に記載の細胞の分析方法。
【請求項７】
更に、以下の工程：
（Ｉ）前記細胞を回収する工程を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の細胞の分析方法。
【請求項８】
前記第一の分子及び／又は前記第二の分子は、刺激分解性リンカーを介してウェルに固定化されており、
前記回収工程では、前記刺激分解性リンカーを分解して前記細胞を回収する、請求項７に記載の細胞の分析方法。
【請求項９】
前記識別部認識分子は、前記識別部に含まれる核酸断片と相補的な核酸断片を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の細胞の分析方法。
【請求項１０】
前記識別部認識分子は、ウェルに固定化されている位置と対応付けられた情報を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の細胞の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の分析方法、細胞分析用チップ、細胞分析用試薬、細胞分析用チップ及び細胞分析用装置に関する。詳細には、本発明は特に、単一細胞の分析方法、単一細胞分析用チップ、単一細胞分析用試薬、単一細胞分析用キット及び単一細胞分析用装置にも関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の単一細胞（シングルセル）解析は、フローサイトメトリーのような少数の特定遺伝子をターゲットにした解析や、Mass Cytometry技術を用いたプロテイン解析に留まっていた。
【０００３】
前記フローサイトメトリーは、蛍光色素が結合した抗体と細胞表面抗原とを特異的に結合させた細胞を、一つずつ高速で流しながら、レーザー等で蛍光色素を励起してその蛍光を測定する手法である。
しかし、複数のレーザーを用いることで、マルチカラー検出が可能だが、蛍光色素間の漏れ込み補正が複雑（蛍光波長のオーバーラップ）等により、同時測定可能なカラー数は11カラーまでしか報告されていなかった。また複数レーザーの搭載により装置が高額になるという問題もあった。
【０００４】
前記Mass Cytometryは、金属同位体で標識した抗体を細胞に結合させた後、その細胞を一つずつ流しながら破壊してTOF-MSで金属同位体を検出する手法である。
しかし、この手法を用いることで、35種の細胞表面抗原を測定可能だが、測定時に細胞を破壊してしまう。そのため、その細胞に対して中身情報（DNA、RNAなど）を得ることはできなかった。また培養等の他の工程に回すことはできなかった。
【０００５】
最近、前記手法とは別に、Massachusetts General Hospitalのグループが、細胞表面抗原の網羅的な解析を行なった。該解析では、NanoStringのnCounter装置と光分解性リンカーが用いられている（非特許文献１）。
しかし、この手法においては、表面抗原を網羅的に測定してはいるが、細胞の中身情報を得ることはできていなかった。また、表面抗原と結合した蛍光バーコード標識抗体を光分解性リンカーで分離後、それを別なプレートに移して測定する必要があり、多数の細胞の測定には向いていなかった。
【０００６】
また、前記手法で用い得る光分解性リンカーとして、例えば、O-ニトロベンジル化合物に基づくもの、ニトロベラトリル化合物に基づくもの（特許文献１）や、パラヒドロキシフェナシル基、7-ニトロインドリン基、2-(2-ニトロフェニル)エチル基、（クマリン-4-イル）メチル基等（特許文献２）が挙げられていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2005-511058号公報
【特許文献２】特開2014-73092号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】A. V. Ullal1, et al., “Cancer Cell Profiling by Barcoding Allows Multiplexed Protein Analysis in Fine-Needle Aspirates”, Science Translational Medicine, 2014, Vol. 6, Issue 219, pp. 219ra9
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本技術は、前述のフローサイトメトリーやMass Cytometryの問題点等に鑑み、細胞を破壊することなく解析し、かつ該細胞の中身情報も得て、その細胞を網羅的に解析することを主目的とする。網羅的解析には、例えば、単一細胞又は複数細胞における、細胞表面分子、細胞分泌物、細胞内分子等の情報を得ることが含まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち、本技術は、以下の工程：
（Ａ）細胞と結合可能な第一の分子で細胞を捕捉する工程、
（Ｂ）細胞の細胞表面分子に、該細胞表面分子と特異的に結合可能な結合部、識別部及び標識部が連結された第二の分子を結合させる工程、
（Ｃ）第二の分子の結合部と、識別部及び標識部とを切り離す工程、
（Ｄ）切り離された識別部及び標識部のうち、識別部を、識別部認識分子に特異的に結合させる工程、及び
（Ｅ）識別部認識分子に結合した識別部及び標識部のうち、標識部を検出する工程
を含む、細胞の分析方法を提供する。
また、本技術は、
（Ｆ）前記工程（Ｅ）で得られた標識部の検出結果から、第二の分子と特異的に結合した細胞表面分子を特定及び／又は定量する工程
を含むことができる。
また、本技術は、更に以下の工程：
（Ｇ）細胞からの細胞分泌物を特定及び／若しくは定量する工程、並びに／又は
（Ｈ）細胞から核酸を取得して解析する工程
を含めることができる。
前記第一の分子は、オレイル基、抗体、アプタマー又は分子認識ポリマーを含む分子とすることができる。
また、前記第二の分子は、抗体、アプタマー又は分子認識ポリマーを含む分子とすることができる。
更に、前記第一の分子及び／又は前記第二の分子は、刺激分解性リンカーを介してウェルに固定化することができる。
前記刺激分解性リンカーには、光分解性リンカーを用いることができる。
また、前記識別部は、核酸断片を含むようにすることができる。
また、前記識別部認識分子は、前記識別部に含まれる核酸断片と相補的な核酸断片を含めることができる。
前記識別部認識分子は、ウェルに固定化され、ウェルに固定化されている位置と対応付けられた情報を有することができる。
【００１１】
また、本技術は、細胞と結合可能な第一の分子が固定化された第一の領域と、
前記細胞と特異的に結合可能な結合部、識別部及び標識部が連結された第二の分子と特異的に結合可能な分子が固定化された第二の領域と、
前記標識部を検出可能な検出領域と、
を含む、細胞分析用チップを提供することができる。
また、本技術の細胞分析用チップは、前記第一の領域、第二の領域及び検出領域からなる群から選択される領域を含むウェルと、
前記ウェル間を連結する流路と、
前記流路に設置されているバルブと、
を含むことができる。
更に、前記識別部認識分子及び／又は細胞分泌物認識分子は、複数の種類の分子を含めてもよい。
前記複数の種類の分子は、前記領域に固定化されている位置と対応付けられた情報を有することができる。
【００１２】
更に、本技術は、細胞表面分子、細胞内分子及び細胞分泌物からなる群から選択される分子に特異的に結合可能な結合部と標識部とを含む分子を含有する、細胞分析用試薬を提供する。
【００１３】
また更に、本技術は、細胞と結合可能な第一の分子が固定化された第一の領域と、
前記細胞と特異的に結合可能な結合部、識別部及び標識部が連結された第二の分子と特異的に結合可能な分子が固定化された第二の領域と、
前記標識部を検出可能な検出領域と、
を含む細胞分析用チップと、
細胞表面分子、細胞内分子及び細胞分泌物からなる群から選択される分子に特異的に結合可能な結合部と標識部とを含む分子を含有する試薬、前記標識部を検出する試薬、並びに細胞分泌を刺激する物質を含有する試薬からなる群から選択される試薬と
を含む、細胞分析用キットを提供する。
【００１４】
更にまた、本技術は、前記細胞分析用チップを挿入する挿入部と、
前記細胞分析用チップの流体の移動を制御する流体制御部と、
前記細胞分析用チップの第一の領域に光を照射する光照射部と、
前記細胞分析用チップの検出領域で標識部を検出する検出部と、
を含む、細胞分析装置を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本技術によれば、細胞を非破壊のまま、多数の細胞表面分子を同時に検出することが可能である。
また、細胞における細胞表面分子、細胞内分子、細胞分泌物等の測定結果を、統合して分析することができる。
なお、ここに記載された効果は必ずしも限定されるものではなく、本開示中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】メトキシニトロベンジルの光吸収パターンを示す図である。
【図２】本技術に係る、単一細胞と第一の分子、第二の分子との結合を模式的に示す図である。
【図３】本技術に係る、ウェルに異なる特異的結合分子をスポットした様子を模式的に示す図である。
【図４】本技術に係る、ウェルの形状を示す縦断面図である。
【図５】本技術に係る、第一〜第三の空間に属するウェルの縦断面図である。
【図６】本技術に係る、ウェルの下からの光照射による細胞の解放を模式的に示す図である。
【図７】本技術に係る、捕捉された細胞のスポットをイメージした図面代用写真である。
【図８】本技術に係る、細胞分析用装置の構成を示すブロック図である。
【図９】本技術に係る、第一の空間を用いた細胞分析用チップの概略を示す図である。
【図１０】本技術に係る、第一の空間を用いた細胞の分析方法のフローを示す図である。
【図１１】本技術に係る、第一の空間を用いた細胞の分析方法のフローを示す図である。
【図１２】本技術に係る、第一及び第二の空間を用いた細胞分析用チップの概略を示す図である。
【図１３】本技術に係る、第一及び第二の空間を用いた細胞の分析方法のフローを示す図である。
【図１４】本技術に係る、第一及び第二の空間を用いた細胞の分析方法のフローを示す図である。
【図１５】本技術に係る、第一及び第二の空間を用いた細胞の分析方法のフローを示す図である。
【図１６】本技術に係る、第一及び第二の空間を用いた細胞の分析方法のフローを示す図である。
【図１７】本技術に係る、第一及び第二の空間を用いた細胞の分析方法のフローを示す図である。
【図１８】本技術に係る、第一及び第二の空間を用いた細胞の分析方法のフローを示す図である。
【図１９】本技術に係る、第一〜第三の空間を用いた細胞分析用チップの概略を示す図である。
【図２０】本技術に係る、第一〜第三の空間を用いた細胞の分析方法のフローを示す図である。
【図２１】本技術に係る、第一〜第三の空間を用いた細胞分析用チップの概略を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本技術を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。説明は以下の順序で行う。
１．細胞の分析方法
（１）工程（Ａ）
（２）工程（Ｂ）
（３）工程（Ｃ）
（４）工程（Ｄ）
（５）工程（Ｅ）
（６）工程（Ｆ）
（７）工程（Ｇ）
（８）工程（Ｈ）
（９）細胞から得られたデータの統合
２．細胞分析用チップ
３．細胞分析用試薬
４．細胞分析用キット
５．細胞分析用装置
６．実施態様
（１）実施態様１
（２）実施態様２
（３）実施態様３
（４）実施態様４
（５）実施態様５
（６）実施態様６
（７）実施態様７
（８）実施態様８
【００１８】
１．細胞の分析方法
本技術は、以下の工程：
（Ａ）細胞と結合可能な第一の分子で細胞を捕捉する工程、
（Ｂ）細胞の細胞表面分子に、該細胞表面分子と特異的に結合可能な結合部、識別部及び標識部が連結された第二の分子を結合させる工程、
（Ｃ）第二の分子の結合部と、識別部及び標識部とを切り離す工程、
（Ｄ）切り離された識別部及び標識部のうち、識別部を、識別部認識分子に特異的に結合させる工程、及び
（Ｅ）識別部認識分子に結合した識別部及び標識部のうち、標識部を検出する工程、
を含む。
また、工程（Ｆ）として、前記工程（Ｅ）で得られた標識部の検出結果から、第二の分子と特異的に結合した細胞表面分子を特定及び／又は定量する工程
を含めてもよい。
更に、本技術は、以下の工程：
（Ｇ）細胞からの細胞分泌物を特定及び／若しくは定量する工程、並びに／又は
（Ｈ）細胞から核酸を取得して解析する工程
を含めてもよい。
上記工程を行う順番は、工程（Ａ）〜（Ｈ）の順に限定されることなく、変更することができる。例えば、細胞表面分子に第二の分子を結合した後、細胞を捕捉することもできる。この場合、工程（Ｂ）、工程（Ａ）の順で行えばよい。
あるいは、細胞分泌物を測定してから細胞表面分子を測定する場合、工程（Ａ）、工程（Ｇ）、工程（Ｂ）の順で行えばよい。
【００１９】
（１）工程（Ａ）
工程（Ａ）では、細胞と結合可能な第一の分子で細胞を捕捉することを行う。
捕捉する細胞の種類は特に限定されず、動物細胞、植物細胞、菌類等、あらゆる細胞が対象となる。例えば、動物細胞の場合、血液中の細胞、生体組織から採取した細胞、培養細胞等が挙げられる。また、接着性細胞、非接着性細胞のいずれでもよい。
本技術では、例えば、１個の細胞が１個のウェル内に捕捉される、いわゆるシングルセルトラップを行う。従って、細胞が細胞塊を形成している場合は、既知の細胞分散法、例えばトリプシン処理等で細胞を単一細胞に分散させ、細胞浮遊液にすることが好ましい。
あるいは、同一種類の複数個の細胞を同時に捕捉してもよい。
【００２０】
細胞を捕捉する第一の分子は、ウェル（第一の空間）に固定化される。ウェルは特に限定されず、例えば、平底、V底又はU底等、板状、ビーズ状、膜状、網状等のウェルを用いることができる。本技術では、後述の流路をウェル間に形成する場合を考慮し、凹部を有する形状が好ましい。
【００２１】
1個のウェル内には、1個の細胞を捕捉してもよいし、同一種類の複数の細胞を捕捉してもよい。
1個のウェル内に1個の細胞を捕捉する場合、前記第一の分子を、捕捉する1個の細胞と同等かそれ以下の直径サイズになるように、ウェルに固定化することが好ましい。細胞のサイズによらず、細胞を1個ずつ捕捉することができる。
また、ウェルの大きさや、後述の流路の幅を調整し、細胞がフローサイトメトリーのように1個ずつ流れ、ウェルに1個ずつ捕捉されるようにすることもできる。フローサイトメトリーで用いられるシース液を用いずに、例えばバッファーや洗浄液等で細胞を流すことができる。
【００２２】
ウェルは、複数あってもよい。例えば、ウェル同士が一列に並んでいる場合は、ウェル間を流路でつなぐ。片端のウェル方向から細胞浮遊液を流し、1つのウェルに細胞を1個捕捉し、捕捉されなかった細胞は該ウェルから次のウェルに流すことができる。細胞を各ウェルで捕捉した後、流路に備えられたバルブ等で隔離してもよい。
あるいは、ウェルの凹部に、セルソーターで細胞1個を投入することもできる。
【００２３】
前記第一の分子の構造は、細胞と結合可能な部位を含む。細胞と結合可能な部位として、例えば、オレイル基、抗体、アプタマー、分子認識ポリマーを用いることができる。
【００２４】
オレイル基は、疎水性であり、浮遊する細胞表面と接着する。オレイル基に、例えばPEG等のスペーサーを付与し、その末端にNHS基（N-ヒドロキシスクシンイミド基）を含めて、第一の分子としてもよい。該第一の分子は、例えばコラーゲン等でコーティングしたウェルに固定化することができる。
抗体の場合、捕捉したい細胞に存在する細胞表面分子を抗原とする抗体を用いることができる。抗体は、ウェルに共有結合的に固定化することができる。
アプタマーの場合、捕捉したい細胞に存在する表面分子と特異的に結合する核酸分子やペプチドを用いることができる。
分子認識ポリマーの場合、目的の細胞表面分子に似た物理化学特性を持つ化合物の存在下でも、高い選択性で目的の細胞表面分子を捕捉することができる。
【００２５】
前記第一の分子は、前記細胞と結合可能な部位と固定化されたウェルとの間に、刺激分解性リンカーを介する構造にすることができる。
リンカーを介しておくと、細胞表面分子や細胞分泌物等の各種測定後に細胞を回収したい場合、効率よく回収することができる。回収後は、細胞が生きたままであるので、培養することや、細胞を破壊して細胞内分子の測定・分析等を行うことができる。
【００２６】
刺激分解性リンカーは、特定の外部からの刺激で分解する接続分子である。例えば、特定の波長の光で分解されるリンカー、酵素で分解されるリンカー、温度で分解されるリンカー等がある。
本技術で用いる刺激分解性リンカーは特に限定されないが、細胞の破壊や影響を与えないようにする点で、光分解性リンカーを用いることが好ましい。
【００２７】
光分解性リンカーとは、特定の波長によって分解される構造を持つ分子であり、分解される波長は、その分子の吸収波長とほぼ一致する。
例えば、光分解性リンカーに用いられるメトキシノトロベンジル基の場合、図１に示す実線（before irradiation）のような吸収パターンを示す。346nmでの吸収を1とすると、364nmでは0.89、406nmでは0.15、487nmでは0.007の吸収を示す。すなわち、365nmの光源を用いれば、光分解性リンカーの分解効率がよく、488nmの光源ではほぼ分解されないという性質を有する。
【００２８】
その他の光分解性リンカーとして、例えば、以下のものを挙げることができる：ニトロベンジル基（特開2010-260831号公報）、パラヒドロキシフェナシル基（テトラヘドロンレターズ、1962年、1巻、1頁）、7-ニトロインドリン基（ジャーナルオブアメリカンケミカルソサイエティーズ、1976年、98巻、843頁）、2-(2-ニトロフェニル)エチル基（テトラヘドロン、1997年、53巻、4247頁）及び（クマリン-4-イル）メチル基（ジャーナルオブアメリカンケミカルソサイエティーズ、1984年、106巻、6860頁）等。
【００２９】
光分解性リンカーに照射する光の波長は、各光分解性リンカーに対応する波長であればよい。例えば330〜450nm付近の波長である。また、細胞にダメージを与えない、例えば、30mW/cm^2,100sec.→3J/cm^2で照射することが好ましい。特に300nm以下の波長は、細胞にダメージを与える可能性があるので使用しないことが好ましい。
UVによる細胞毒性に関しては、細胞の種類にもよるが、500J/cm^2でDNAにダメージが生じて細胞成長を阻害すると言われている（Callegari, A. J. & Kelly, T. J. Shedding light on the DNA damage checkpoint. Cell Cycle 6, 660-6 (2007)）。また、42J/cm^2では細胞毒性が生じない、という報告もある（Masato T, et al, Optical cell separation from three-dimensional environment in photodegradable hydrogels for pure culture techniques, Scientific Reports 4, Article number. 4793(2014)）。
【００３０】
（２）工程（Ｂ）
工程（Ｂ）では、細胞の細胞表面分子に、該細胞表面分子と特異的に結合可能な結合部、識別部及び標識部が連結された第二の分子を結合させることを行う。
【００３１】
前記工程（Ａ）で捕捉された細胞には、種々の細胞表面分子が存在する。細胞表面分子は、糖鎖、タンパク質、脂質等である。具体的な細胞表面分子として、例えばCD抗原、細胞接着分子の各種ファミリー、細胞表面受容体等が挙げられる。
【００３２】
前記第二の分子は、前記細胞表面分子と特異的に結合可能な結合部、識別部及び標識部を含む。
細胞表面分子と特異的に結合可能な結合部には、例えば抗体全体、抗体の可変領域部分や、アプタマー、分子認識ポリマーを用いることができる。
細胞表面分子と第二の分子との結合反応や、前記工程（Ａ）の第一の分子への結合反応等は、特に限定されないが、ウェル全体を、例えば4℃に冷却してもよいし、動物の体温に近い約37℃に加温して、一定時間反応を行うことができる。
【００３３】
識別部は、前記結合部に連結されている。識別部には、例えば、種々のタンパク質やペプチド、核酸（DNA鎖、RNA鎖）断片等を用いることができる。本技術では、特に限定さないが、好ましくは核酸断片が用いられる。核酸断片の大きさは、特に限定されないが、例えば3〜100個の核酸で構成されるDNA断片である。
DNA断片であれば、核酸のA、T、G、Cの組み合わせ次第で、多種の配列を作成することができるので好ましい。
細胞表面分子（抗原）と結合する抗体は350種程度あると言われており、オリゴレベルの長さ（約20塩基以下）のDNA配列で標識を作製すれば、そのすべての抗体に対するDNA配列が作製可能である。
【００３４】
標識部は、前記結合部に連結された識別部に連結されている。標識部に用いる標識は、既知のものでよく、例えば、蛍光分子、RI標識、ハプテン、アフィニティータグ、酵素、金属等が挙げられる。
標識部に蛍光分子を用いた場合、1色でよいが、2色以上でもよい。金属を用いた場合は、TOF-MSで検出可能である。
【００３５】
また、蛍光標識等に限定されず、拡散せずにその場で発光または発色するなどして光学的に検出できる手法を用いてもよい。例えば、ルテニウム錯体を標識として用いて、基板表面に電極を配置すれば、電気化学発光が可能である。
更に、horseradish peroxidase（HRP）やルシフェラーゼを識別部に結合して、化学発光基質（ルミノール、ルシゲニン、アダマンチルジオキタセン誘導体等）や生物発光基質（ルシフェリン、バクテリアルルシフェラーゼ、セレンテラジン等）を添加し、その発光強度を検出することも可能である。
電気化学発光、化学発光、生物発光はシグナルを増幅できるので高感度な検出が可能となる。
また、SYBR Green Ｉなどのインターカレーターを用いて検出しても良い。
【００３６】
なお、前記結合部と、識別部及び標識部との間には、刺激分解性リンカーを介することができ、刺激分解性リンカーとして、例えば前述した光分解性リンカーを用いることができる。
また、光分解性リンカーの種類が異なれば光分解に適した波長が異なることを利用してもよい。例えば、異なる細胞表面分子に結合する第二の分子には、異なる波長で分解されるリンカーを用いておく。そして、その光分解性リンカーに適した波長の光を照射すれば、標的の細胞表面分子に結合した第二の分子から、リンカーから所望の種類の識別部及び標識部を有する部分を遊離することができる。
【００３７】
図２に、第一の空間のウェル２６に固定化された第一の分子２１に単一細胞２２が捕捉され、捕捉された単一細胞の細胞表面分子２３に第二の分子２４が結合した、模式図を示す。第一の分子２１及び第二の分子２４に刺激分解性リンカー２５が含まれ、第二の分子の認識部及び／又は標識部として金属２７又は核酸断片２８が用いられている例である。  また、従来の典型的な蛍光標識物２９を用いた例も示す。
【００３８】
（３）工程（Ｃ）
工程（Ｃ）では、第二の分子の結合部と、識別部及び標識部とを切り離すことを行う。
切り離しは、前記刺激分解性リンカーを刺激して行う。光分解性リンカーの場合、光の照射範囲に第二の分子の光分解性リンカーが含まれるよう、捕捉された細胞のウェルを照射すればよい。
光照射で分解された第二の分子は、結合部と、識別部及び標識部とに分離する。結合部は捕捉された細胞の細胞表面分子に結合したままである。一方、切り離されて遊離した識別部及び標識部は、溶液ごと流すか、バッファー液等で流して、次のウェル（第二の空間等）に移動させることができる。
【００３９】
（４）工程（Ｄ）
工程（Ｄ）では、遊離した識別部及び標識部のうち、識別部を、識別部認識分子に特異的に結合させることを行う。
識別部認識分子は、第二の分子に用いた識別部に対応する認識分子を含める。例えば、第二の分子の識別部がタンパク質、ペプチドの場合、識別部認識分子に抗体が用いられる。また、第二の分子の識別部が核酸断片の場合、その核酸断片に相補的な核酸配列を有する断片が用いられる。
【００４０】
識別部認識分子は、前記第一の分子が固定化されたウェル（第一の空間）に固定化してもよいし、それとは別のウェル（第二の空間等）に固定化してもよい。また、1つのウェルに複数の種類の識別部認識分子を固定化することができる。識別部認識分子は、種類ごとにアレイ状に固定化してもよい。例えば、識別部認識分子として核酸配列を有する断片を用いた場合、DNAチップのような形態にすることができる。
【００４１】
また、1つのウェルを、例えば細胞表面分子測定用の分子を固定化する領域（第一の領域）と細胞内分子測定用の分子を固定化する領域（第二の領域）に分けて固定化してもよい。固定化するスポットの位置さえ重ならなければ、固定化した分子とスポット位置とを対応づけた情報で区別可能である。
【００４２】
一例を図３に示す。ウェル３１の左側に、細胞表面分子測定用の識別部認識分子３２のスポット３４が縦3列、横6列に並んでいる。右側に、細胞内分子測定用の識別部認識分子３３のスポット３４が縦3列、横6列に並んでいる。350種類の分子を測定する場合は、350スポット用意し、それぞれに異なる分子を固定化しておく。スポットサイズは、細胞の表面積以上あればよい。
【００４３】
また、ウェルの形状は特に限定されず、固定化する分子等に応じて選択すればよい。例えば、ウェルの平面に分子を固定化してもよいし（図４上段）、ウェルの凸部に固定化してもよく（図４中段）、ウェルの凹部に固定化してもよい（図４下段）。
【００４４】
このようにウェルに固定化された細胞表面分子測定用の識別部認識分子には、前記工程（Ｃ）で切り離された識別部及び標識部のうち、識別部が特異的に結合する。
例えば、識別部が核酸断片の場合、その核酸断片に相補的な配列を有する識別部認識分子（DNA鎖等）が固定化されているスポットに結合する。
識別部がタンパク質、ペプチドの場合、そのタンパク質、ペプチドを抗原として認識する識別部認識分子（抗体）が固定化されているスポットに結合する。
【００４５】
（５）工程（Ｅ）
工程（Ｅ）では、工程（Ｄ）で識別部認識分子に特異的に結合した識別部及び標識部のうち、標識部を検出することを行う。
標識部は、上述のように、蛍光分子、RI標識、ハプテン、アフィニティータグ、酵素又は金属等の標識分子を含む。標識部の検出は、用いられている標識分子に対応した検出方法で検出される。例えば、標識部に蛍光分子を用いている場合、励起波長の光を蛍光分子に照射すればよい。
標識部が、RI標識、ハプテン、アフィニティータグ又は酵素、金属であれば、それぞれ、放射線、検出用抗体、TOF-MS等で定性及び／又は定量すればよい。
【００４６】
なお、識別部と標識部に用いる分子の組み合わせは、本技術において特に限定されない。識別部として、タンパク質、ペプチド又は核酸断片等と、標識部として、蛍光分子、RI標識、ハプテン、アフィニティータグ、酵素又は金属等とを自由に組み合わせることができる。
本技術では、例えば、識別部として核酸断片、標識部として蛍光分子を好ましく組み合わせることができる。
【００４７】
（６）工程（Ｆ）
工程（Ｆ）では、前記工程（Ｅ）で得られた標識部の検出結果から、第二の分子と特異的に結合した細胞表面分子を特定及び／又は定量することを行う。
前述したように、認識部に例えば核酸断片を用いた場合、A、T、G、Cを組み合わせれば、現在存在すると言われている細胞表面分子約350種類を優に超える種類の核酸断片を用意できる。
前述したように、350種類超の核酸断片と相補的な核酸断片が、種類ごとに、異なるウェルのスポットに固定化されていれば、核酸断片の種類とスポットの位置とが結びつけられ、位置情報として把握される。
そして、どのスポットがどの程度の蛍光を発しているかで、細胞表面分子の種類と発現量がわかる。位置情報に展開することで、350種超の細胞表面分子の網羅的な測定が可能である。
【００４８】
特に、ウェルの形状が平面の場合は、反応した基質が拡散するので、スポット位置が近い場合は、スポット場所が特定できないことが考えられる。その場合は、スポット部を凹部とする等、拡散が抑制できる形状にすればよい。
【００４９】
なお、識別認識分子に未結合な、第二の分子から遊離された識別部及び標識部は、除去してバックグラウンドノイズを下げて高感度測定することが好ましい。従って、ウェルに固定化された識別認識分子と一定時間の反応後は、未結合の、第二の分子から遊離された識別部及び標識部を除去するために、洗浄液等を流すことが好ましい。
【００５０】
（７）工程（Ｇ）
工程（Ｇ）では、細胞からの細胞分泌物を特定及び／又は定量することを行う。
捕捉された細胞は、工程（Ａ）〜（Ｆ）を経ても生きている。よって、捕捉されたまま、細胞分泌物がウェル中で分泌され得る。あるいは、捕捉された細胞を解放して、別の容器に入れ、細胞分泌物を分泌させてもよい。
細胞分泌物は、本技術において特に限定されず、あらゆる細胞分泌物が対象となり得る。細胞分泌物として、例えば、インシュリン、セクレチン等の各種ホルモン、ペプシノゲン等の各種酵素、サイトカインやケモカイン、パーフォリンやグランザイム、エクソソーム等が挙げられる。
【００５１】
ここで、細胞分泌物を分泌させる際、細胞を刺激してもよい。細胞に、物理的刺激、化学的刺激等を与えることができる。免疫細胞の場合は、腫瘍細胞と会合させてもよい。
例えば、細胞に細胞分泌刺激物質を適用すればよい。細胞分泌刺激物質は、細胞の種類や分泌物の種類等によって異なるが、例えば、糖、アミノ酸、脂肪、酸・アルカリ（pH調整剤）が挙げられる。
【００５２】
細胞分泌物の特定及び／又は定量は、一般的に用いられる方法で行うことができる。例えば、特定の細胞分泌物を抗原とする抗体に標識を付しておき、抗原抗体反応後、標識の検出及び／又は強度測定をすることができる。
【００５３】
あるいは、第一の分子が固定されているウェル（第一の空間）と隣り合うウェル（第三の空間）に、細胞分泌物と特異的に結合する抗体、アプタマー、分子認識ポリマー等を特定の場所に固定化しておく。固定化した抗体等と細胞から分泌された細胞分泌物が結合した後、標識された分子（抗体、アプタマー、分子認識ポリマー等）を投入し、サンドイッチイムノアッセイ等を行うことができる。このときの反応は、例えば、前述の電気化学発光、化学発光、生物発光などが利用可能である。
【００５４】
なお、捕捉された細胞を解放して、細胞分泌や、後述する細胞の核酸解析、その他の細胞に関する分析を行う場合、前述したように、細胞を捕捉する第一の分子を、刺激分解性リンカーを介して固定化する構造にしておくことが好ましい。細胞を解放する際、刺激分解性リンカーに刺激を与えれば容易に細胞を回収できる。
【００５５】
（８）工程（Ｈ）
工程（Ｈ）では、細胞から核酸を取得して解析することを行う。
細胞は、工程（Ａ）〜（Ｇ）を経てもなお生きているので、該細胞を破壊して核酸を取得し解析することができる。
核酸の取得及び解析は、一般的に用いられる方法で行うことができる。例えば、核酸を抽出、精製、増幅（PCR法等）し、核酸配列を決定する方法で行うことができる。
また、抽出後に予備増幅までを行い、それらを回収して、次世代シーケンサー等で核酸配列を決定することができる。
【００５６】
（９）細胞から得られたデータの統合
前記工程（Ｆ）では、細胞に存在する細胞表面分子の特定及び／又は定量のデータが得られる。該データと、当該細胞に関する他のデータを統合すれば、同じ生細胞での分析が可能となる。
【００５７】
例えば、前記工程（Ｇ）では、細胞からの分泌物の特定及び／又は定量のデータが得られる。工程（Ｆ）で得られたデータと工程（Ｇ）で得られたデータとを統合すれば、生細胞の細胞表面分子と細胞分泌物の関係を分析できる。
【００５８】
また、前記工程（Ｈ）では、細胞の核酸のデータを取得することができる。工程（Ｆ）で得られたデータと工程（Ｈ）で得られたデータとを統合すれば、生細胞で発現している細胞表面分子と遺伝子との関係を分析できる。
【００５９】
更に、前記工程（Ｆ）、工程（Ｇ）、工程（Ｈ）で得られたデータを統合してもよい。これにより、生細胞における、細胞表面分子と細胞分泌物と遺伝子との関係を明らかにすることができる。
【００６０】
本技術によれば、以上の工程で、細胞を非破壊のまま、その細胞表面分子（抗原等）を網羅的に測定でき、かつ、刺激等により細胞が分泌した分子も網羅的に測定が可能である。第二の空間、第三の空間における測定結果を照合すると、細胞表面情報と細胞分泌情報（細胞応答情報）が、いわゆるシングルセルのレベルで確実に統合可能である。
【００６１】
２．細胞分析用チップ
本技術の細胞分析用チップによれば、細胞浮遊液から細胞を捕捉して各種測定まで、チップ内ですべて実現できる。
【００６２】
本技術の細胞分析用チップには、第一の領域、第二の領域及び検出領域が含まれる。
第一の領域には、細胞と結合可能な第一の分子が固定化されている。
第二の領域には、細胞と特異的に結合可能な結合部、識別部及び標識部が連結された第二の分子と特異的に結合可能な分子が固定化されている。
検出領域には、前記標識部が検出可能なように、例えば、前記識別部を特異的に結合する分子が固定化されている。
【００６３】
第一の領域、第二の領域及び検出領域は、１つのウェルに存在してもよいし、それぞれ別のウェルに存在してもよいし、複数の領域が１つのウェルに存在し且つその他の領域が他のウェルに存在してもよい。
ウェル間は流路で連結され、該流路にはバルブが設置されていてもよい。
【００６４】
例えば、本技術の細胞分析用チップは、第一の空間に属する複数のウェルを含み、第一の空間の各ウェルは流路で連結されている。各ウェルが一列に配置されている場合、流路で一列に連結される。細胞浮遊液等のサンプル、試薬、洗浄液等は、各ウェルに入れてもよいが、流路で連結されているため、片端のウェルに入れてもう一方の端のウェルの方向へ流すこともできる。例えば、数十cm/s以下の低速、低圧で流すことができる。
【００６５】
前記流路には、バルブが設置されている。バルブは、開閉できる構造になっており、例えば、各ウェルでサンプルと試薬とを反応させるときは閉じ、他のウェルにサンプルや試薬を流すときは開けることができる。
【００６６】
第一の空間に属するウェルには、1つのウェルに対して1個の細胞が捕捉されるように、第一の分子が固定化されている。例えば、捕捉する1つの細胞と同等かそれ以下の直径サイズになるように、ウェルに固定化すればよい。
また、第一の分子は、好ましくは刺激分解性リンカーを介してウェルに固定化される。
【００６７】
細胞分析用チップは、更に、他の空間に属するウェルを含んでもよい。例えば、第一の空間と同一プレート上に、第二の空間、第三の空間等に属するウェルを含んでもよい。これにより、細胞表面分子、細胞内分子、細胞分泌物等が同一プレートで測定可能となる。また、複数のウェルがあることで、細胞への刺激印加等、生物学的な特定の条件を与えることなどが可能で、かつ経時的に細胞を測定、解析することが可能となる。
【００６８】
例えば、第二の空間に属するウェルは、第一の空間に属するウェルと同様に、各ウェルが一列に配置され、流路で一列に連結することができる。第三の空間等も同様である。
第一の空間に属するウェルと第二の空間に属するウェルとが平行に二列に並んで配置された場合、第一の空間に属するウェルと、その隣に配置された第二の空間に属するウェルとを流路で連結することができる。該流路には、バルブを設置することができる。
また、第二の空間のウェルには、例えば、前述の識別部認識分子を固定化しておくことができる。
【００６９】
このような構造の分析用チップを用いるときは、まず、第一の空間に固定化された第一の分子に、細胞を捕捉させる。次に、細胞の細胞表面分子と特異的に結合可能な結合部を含む第二の分子を反応させる。この間、第一の空間のウェルと第二の空間のウェルの間の流路のバルブは閉じておく。
【００７０】
第一の空間のウェルに捕捉された細胞の細胞表面分子と結合した第二の分子に対して、刺激を与え、刺激分解性リンカーを分解して、第二の分子の識別部及び標識部を遊離する。  
次に、遊離した識別部及び標識部を、第二の空間のウェルに移動させるため、第一の空間のウェルと第二の空間のウェルとの間の流路のバルブを開く。第一の空間のウェルにある、識別部及び標識部を含む液が、第二の空間のウェルに流れ込む。液が流れ込んだ後、バルブを閉じる。
第二の空間のウェルでは、第二の分子から遊離した識別部及び標識部の識別部分と、第二の空間のウェルに固定化された識別部認識分子との反応を行う。
【００７１】
第二の空間の他、更に第三の空間に属するウェルを配置する場合、例えば、第一の空間に属するウェルを中央に縦一列に配置し、その右側に縦一列に第二の空間に属するウェルを配置し、第一の空間に属するウェルの左側に縦一列に第三の空間に属するウェルを配置することができる。
【００７２】
第三の空間に属するウェル間もまた、流路で連結し、バルブを設置することができる。また、第三の空間に属するウェルと、その右隣の第一の空間に属するウェルとを、流路で連結し、バルブを設置することができる。
【００７３】
第一の空間に属するウェルでは、捕捉された細胞を溶解して、核酸の抽出、精製、予備増幅、増幅等を行うことができる。
ここで、図５に、第一、第二、第三の空間に属するウェルの断面図を示す。図５において、左側が第三の空間、中央が第一の空間、右側が第二の空間とする。また、図５の（ａ）は、細胞を第一の空間に属するウェルに流入させ（図５の（ａ）の(1)）、単一細胞が捕捉されてかつ単一細胞の細胞表面分子に第二の分子が結合したところを示す。このとき、第一の空間に属するウェルから第二の空間に属するウェルを連結する流路のバルブは閉じている。第一の空間に属するウェルから第三の空間に属するウェルを連結する流路のバルブも閉じている。
【００７４】
図５の（ｂ）では、中央の第一の空間に属するウェルにおいて、第二の分子の刺激分解性リンカーが分解し、識別部及び標識部が遊離する。第一の空間に属するウェルから、右側の第二の空間に属するウェルへの流路のバルブが開けられ、遊離した識別部及び標識部が第二の空間に属するウェルに流入（図５の（ｂ）の(2)）する。第二の空間に属するウェルには、識別部認識分子が固定化されており、識別部標識分子と特異的に結合する識別部が結合し、測定を行う。
【００７５】
図５の（ｃ）では、中央の第一の空間に属するウェルに捕捉されていた単一細胞を溶解し、細胞内分子（例えば核酸）の抽出等を行う。左側の第三の空間に属するウェルへの流路のバルブが開けられ、核酸が第三の空間に属するウェルに流入（図５の（ｃ）の(3)）する。第三の空間に属するウェルには、細胞内分子認識分子が固定化されており、核酸と特異的に結合し、測定を行う。
また、細胞を溶解しなければ、in situ hybridization、in situ PCR、in situ Sequencing等を行ってもよい。細胞膜透過処理後、細胞内分子を染色して観察してもよい。
【００７６】
あるいは、第一の空間に属するウェルで核酸の抽出等を行わずに、第一の分子に刺激を与えて刺激分解性リンカーを分解し、細胞を解放してもよい。解放した細胞は、流路を通って第三の空間に属するウェルで他の分析や培養等を行うことができる。解放した細胞は、第四の空間や他の容器等に移してもよい。
【００７７】
第一、第二、第三等の空間に属するウェルには、前述の第一の分子や識別部認識分子である第二の分子の他に、任意の分子を固定化することができる。例えば、細胞分泌物を認識する分子、細胞の細胞内分子を認識する抗体、細胞の核酸の配列と相補的な配列を有する分子等である。
例えば、細胞表面分子と細胞内分子の情報を測定したい場合は、前述の図３に示したように、第二の空間に属するウェルに、細胞表面分子と結合した核酸断片と相補的な配列を有する核酸断片を固定化し、第三の空間に属するウェルに、細胞内分子と特異的に結合する分子または相補的に結合する分子を固定化しておけばよい。
【００７８】
別のパターンとして、第一、第二又は第三等の空間のウェルを複数の領域にわけて、各領域に別の分子を固定化することができる。
例えば、第一の空間のウェル1つにおいて、第一の領域と第二の領域とに分け、第一の領域には、表面分子と結合可能な第一の分子が固定化され、第二の領域には、細胞表面分子と特異的に結合可能な結合部、識別部及び標識部が連結された第二の分子並びに／又は細胞からの細胞分泌物と特異的に結合可能な分子が固定化される。
【００７９】
また、更なるパターンとして、第二の空間に属するウェルにおいて、第二の分子に含まれる識別部に相補的な核酸断片を第一領域に、細胞内分子と特異的に結合する核酸断片を第二領域に固定化し、第三の空間に属するウェル全体に、細胞分泌物と特異的に結合する分子を固定化してもよい。
【００８０】
この場合、まず、第二の分子に含まれる識別部に相補的な核酸断片を、刺激分解性リンカーに刺激を与えることにより遊離させ、第二の空間に属するウェルに送る。続いて、第一の空間に属するウェルに捕捉されている細胞を刺激する等して分泌された細胞分泌物を、第三の空間に属するウェルに送る。その後、第一の空間に属するウェルで細胞を溶解し、細胞内分子を第二の空間に属するウェルへ送る。一定時間の反応が終了したら、未結合分子を除去するため、第二の空間に属するウェルを、バルブを開けて洗浄し、次に第三の空間に属するウェルを、バルブを開けて洗浄する。その後は、反応基質を追加するなどして発光位置と量を測定する。細胞内DNAやmRNAを測定する場合、予備増幅が必要であれば第一の空間に属するウェルで行う。その後、第二の空間に属するウェルへ移動させればよい。
【００８１】
また、第一の空間に属するウェルで予備増幅後に溶液を回収して、シーケンサー等の他の装置で測定することも可能である。また、第一の空間に属するウェルで細胞を溶解しない場合は、細胞を捕捉している第一の分子の刺激分解性リンカーを分解して、細胞を回収してもよい。
【００８２】
刺激分解性リンカーには、前述のように、光分解性のものを用いることができる。この場合、第一の分子の光分解性リンカーには、細胞表面分子と結合する第二の分子に用いた光分解性リンカーが分解する波長とは異なる波長で分解するリンカーを用いることができる。例えば、第二の分子に用いる光分解性リンカーは365nmで分解され、第一の分子に用いる光分解性リンカーは700nmで分解される。
【００８３】
光分解性リンカーを分解するには、第一の空間に属するウェルの下から、特定の波長の光が照射できるようにする。時間短縮をする場合、各ウェルの下に光源を配置しておくのがよい。ただし、これに限定されず、走査してもよい。一定範囲を照射可能な光源であれば、そこに微小な範囲の開閉が可能なシャッターを配置してもよい。また、Digital Micro Deviceを用いて特定エリアのみを照射しても良い。
【００８４】
図６に、第一の空間に属するウェルの下から光を照射して、光分解性リンカーを分解して細胞を解放する模式図を示す。
図６の（ａ）は、第一の空間に属するウェルに第一の分子が固定化されたところを示す。第一の分子には、光分解性リンカーが含まれる。図６の（ｂ）は、第一の空間に属するウェルに細胞を流入させ、細胞が第一の分子に捕捉され、第二の分子が細胞表面分子と特異的に結合したところを示す。図６の（ｃ）は、第一の空間に属するウェルの下から光６１を照射した部分について、光分解性リンカーが分解されて捕捉されていた細胞が解放されたところを示す。光照射は、例えば、1J/cm2（100mW/cm2の場合、10s）で行えばよい。
光照射のタイミングを変えれば、第一の分子、第二の分子の光分解性リンカーを、時間差を持って分解できるので、解放もまた時間差を付けることができる。
【００８５】
図７には、固定化された第一の分子に細胞が捕捉されているイメージ図を示す。本技術によれば、高密度に細胞を単層で捕捉できる。従って、一つのウェルに同一種の複数細胞を捕捉し、細胞表面分子、細胞外分泌物質、細胞内分子の検出および観察を実施してもよい。
なお、同一種の複数細胞には、同じcell lineからの培養細胞や、フローサイトメトリーにより同一とみなされた細胞集団（フローサイトメトリーにより同じゲート領域に表示される細胞群）等が該当する。
【００８６】
更に、第二、第三の空間に属するウェルにおいては、ウェルの下に、ある程度の面積を一括で撮影できるCMOSなどを配置してもよく、第二、第三の空間に属するウェルを走査して撮影することができる。また、感度が欲しい場合は、露光時間を長くすればよい。複数の検出対象分子を一括で検出でき、イメージング解析も可能になる。装置としては、例えば、IN Cell Analyzer 6000（GE Healthcare）のsCOMSが挙げられる。これによれば、96ウェルプレートの1ウェル（約0.33cm2）を1回で撮影できる。96ウェルプレート全体（約31.68cm2）であれば約4分で撮影できる。
【００８７】
３．細胞分析用試薬
本技術の試薬は、前記細胞の分析方法に用いられる試薬であって、細胞表面分子、細胞内分子及び細胞分泌物からなる群から選択される分子に特異的に結合可能な結合部と標識部とを含む分子を含有する。例えば、前記第二の分子を含有する試薬、細胞分泌物と特異的に結合し標識された分子を含有する試薬、細胞内分子と特異的に結合し標識された分子を含有する試薬等が挙げられる。試薬に含有される分子は、1試薬中、1種類含有してもよいし、複数種類含有してもよい。
【００８８】
４．細胞分析用キット
本技術の細胞分析用キットは、前記細胞分析用チップと、前記細胞分析用試薬、標識部を検出する試薬及び細胞分泌を刺激する物質を含有する試薬からなる群から選択される試薬を少なくとも1つあるいは任意に組み合わせて、含めることができる。
【００８９】
５．細胞分析用装置
図８に、本技術で用いられる細胞分析用装置の一例を示す。
該装置には、挿入部８４、流体制御部８１、光照射部８３、検出部８５、記憶部８６、処理部８２を含む。
挿入部８４は、前記細胞分析用チップを細胞分析用装置に挿入し、セットする機能を有する。
流体制御部８１は、細胞を含む液、細胞分泌物を含む液、試薬、洗浄液等をウェル導入する機能、これらの液を、流路を介して他のウェルに送流する機能、不要な液を排出する機能等を有する。
光照射部８３は、前述の細胞分析用チップのウェルに固定化された第一の分子や、第二の分子に含まれる光分解性リンカーを分解するのに適切な波長の光を、ウェルに照射する光源を含む。
検出部８５は、前記細胞分析用チップに導入され捕捉された細胞や、細胞分泌物、細胞表面分子等を、標識の測定等により、検出及び／又は定量する機能を有する。
記憶部８６には、前記挿入部８４、流体制御部８１、光照射部８３、検出部８５の動作が記憶され、更に、検出部等で得られたデータを記憶させることができる。
処理部８２は、前記記憶部８６の記憶に基づき、各部と相互にシークエンス処理を行い、挿入部８４、流体制御部８１、光照射部８３、検出部８５の動作を実行する。
【００９０】
該装置の動作の一例は、以下のとおりである。
まず、本技術に用いられる装置に、前記細胞分析用チップが挿入部８４により搭載される。次に、処理部８２により流体制御部８１が作動し、第一の空間の端のウェルに細胞を含む液を導入する。次に、流体制御部８１は、ウェル間の流路に設置されたバルブを開き、細胞を含む液を送流する。各ウェルに固定化された第一の分子により細胞1個を捕捉させ、捕捉されなかった細胞を、洗浄液等を送流することで除去する。
【００９１】
前記第一の空間の端のウェルに、細胞表面分子と特異的に結合する第二の分子を含む液を導入するよう、流体制御部８１が作動し、該第二の分子を含む液が、流路を介して下流側のウェルに送流される。第一の分子に捕捉された細胞には第二の分子が結合し、結合しなかった第二の分子を、流体制御部８１により、洗浄液等を送流することで除去する。
【００９２】
細胞表面分子と特異的に結合した第二の分子に、光照射部８３から光を照射し、第二の分子の光分解性リンカーを切断し、第二の分子の認識部及び標識部を分離する。光照射の位置やタイミング、波長、強度、時間等は、記憶部８６にプログラムとして記憶され、処理部８２を介して光照射部８３を駆動することにより行う。
【００９３】
次に、流体制御部８１を作動させて、第一の空間のウェルと第二の空間のウェルとの間に設置されたバルブを開き、分離された認識部及び標識部を含む液を、第一の空間のウェルから第二の空間のウェルに送流する。
【００９４】
第二の空間のウェルには、認識部と特異的に結合する分子が固定化されており、送流された認識部及び標識部の認識部分が、固定化された分子と結合する。流体制御部８１を作動させ、洗浄液等を第二の空間の端のウェルに導入し、第二の空間のウェルで結合しなかった認識部及び標識部を、流路を介して除去する。
【００９５】
第二の空間のウェルに結合した認識部及び標識部の標識部分を、検出部８５により検出及び／又は定量する。ここで得られたデータは、記憶部８６に蓄積されるようにしてもよい。
検出方法は、標識が蛍光標識であれば、標識に適した波長の光を照射して検出する等、公知の方法を用いることができる。この時の光照射も光照射部８３が行うようにすることができる。
【００９６】
一方、第一の空間のウェルに捕捉された細胞について、更に細胞分泌物を検出及び／又は定量してもよい。細胞分泌物のデータは、記憶部８６に蓄積されるようにしてもよい。  あるいは、第一の分子に光照射部８３からの光を照射して、細胞を解放してもよい。解放された細胞は、例えば、細胞内分子の測定に用いたり、培養に用いることができる。
【００９７】
６．実施態様
以下、本技術の実施態様について、図面を参照しながら具体的に説明する。
（１）実施態様１
第一の空間のみを用いる場合を説明する。この場合では、例えば、細胞分泌物の測定、細胞表面分子の測定、細胞内mRNAの予備増幅又は細胞回収を行うことができ、細胞の状態を知ることができる。
【００９８】
図９に、細胞分析用チップの概略を示す。
図９において、ウェルＷ１〜Ｗ４が縦に４つ並んでいる。各ウェルには、特定の細胞表面分子と結合する抗体が光分解性リンカーを介して固定化されている（第一の分子の固定化）。また、その他の細胞表面分子と結合する抗体及び細胞分泌物と結合する抗体が各ウェルに固定化されている。各ウェルは流路１６で連結され、かつバルブ３〜５が各ウェル間に設置されている。
なお、ウェルＷ１は、細胞や洗浄液等の投入口としてもよく、捕捉された細胞を測定用コントロール等としてもよい。
【００９９】
図１０に、細胞分析用チップを細胞分析用装置に挿入した後の実施態様１のフローを示す。図９及び図１０、図８を参照しながら説明する。
まず、細胞の細胞表面分子に、該細胞表面分子と特異的に結合可能な結合部、識別部及び標識部が連結された第二の分子を結合して、細胞表面を標識する（Ｓ９７１）。第二の分子には、光分解性リンカーが含まれる。種々の細胞表面分子に各々対応する標識を結合させることで、後に、その標識の有無と強度を測定することによって、細胞表面分子の種類とその存在量等を明らかにすることができる。
【０１００】
次に、記憶部８６に基づく記憶に基づいて、処理部８２により流体制御部８１を作動させて、前記第二の分子で標識された細胞を含む液を、ウェルＷ１に投入する。このとき、標識された細胞が図９の矢印方向からウェルＷ２〜Ｗ４に順に流れるように、バルブ３〜４を開けておく。細胞がウェルＷ１〜Ｗ４に流れる間に、ウェルに固定化された、細胞と結合可能な前記第一の分子で、細胞１個を捕捉する（Ｓ９７２）。捕捉されなかった細胞は、流体制御部８１によりＷ４方向の下流に流して除去する（Ｓ９７３）。このとき、細胞を流すために洗浄液等を用いてもよい。
【０１０１】
次に、流体制御部８１によりバルブ３〜５を閉じて、光照射部８３による、細胞表面標識の分離、すなわち第二の分子の結合部と識別部及び標識部とを切り離して分離する（Ｓ９８２）。分離された識別部及び標識部は、ウェルＷ１〜Ｗ４の各底面で捕獲され、標識部の検出・測定を検出部８５にて行う（Ｓ９８３）。測定により、どのような細胞表面分子がどの程度、1個の細胞に存在するかを明らかにすることができる。測定結果は、記憶部８６にデータとして蓄積することができる。
【０１０２】
一方、細胞外に分泌された細胞分泌物は、各ウェルの底面に固定化された抗体等で捕獲し、検出部８５にて特定及び／又は定量する（Ｓ９８４）。これにより、どのような細胞分泌物がどの程度、1個の細胞から分泌されたかを明らかにすることができる。測定結果は、記憶部８６にデータとして蓄積することができる。
【０１０３】
その後、細胞から核酸を取得して解析する。細胞内分子のDNA、mRNAを予備増幅する場合は、バルブ３〜５を閉じたまま、細胞溶解及びMulti Displacement Amplification法等による予備増幅を行い（Ｓ９８０）、溶液を回収する。回収した溶液は、DNA、mRNAの分析等に用いることができる。
【０１０４】
なお、図１０のＳ９７１〜Ｓ９８４と同様の工程（Ｓ１０７１〜Ｓ１０８４）を行ったのち、細胞を回収することもできる。光照射により第一の分子の光分解性リンカーを分解し、細胞を遊離して回収する（Ｓ１０８１）。回収した細胞は、培養等に用いることができる。
【０１０５】
（２）実施態様２
第一及び第二の空間を用いる場合を説明する。この場合では、例えば、細胞分泌物の測定、細胞表面分子の測定、細胞内mRNAの予備増幅又は細胞回収を行うことができる。第二の空間では、細胞外に分泌された細胞分泌物及び細胞表面分子標識の測定を行うことができる。
また、細胞分泌刺激等による環境制御も可能であり、細胞の状態変動を測定することもできる。
【０１０６】
図１２に、細胞分析用チップの概略を示す。
第一の空間１１に、ウェルＷ１〜Ｗ４が縦に4つ並ぶ。ウェルＷ１〜Ｗ４には、細胞表面分子と結合する抗体が光分解性リンカーを介して固定化されている。
第一の空間１１の右側の第二の空間１２に、ウェルＷ５〜Ｗ８が縦に4つ並ぶ。ウェルＷ５〜Ｗ８には、細胞分泌物と結合する抗体及び識別部認識分子が固定化されている。
ウェルＷ１〜４とウェルＷ５〜Ｗ８は、それぞれ縦の流路で連結されている。また、第一の空間と第二の空間のウェルも上端のウェルＷ１とＷ５を除いて流路１６で横に連結されている。流路にはそれぞれバルブ１、３、４、５が設置されている。
【０１０７】
なお、ウェルＷ１とＷ５は連結してもかまわないが、ウェルＷ１をＷ５と連結しないことにより、ウェルＷ１を細胞や洗浄液等の投入口として用いることもでき、あるいは、ウェル１に捕捉された細胞を測定用コントロール等として用いることができる。
【０１０８】
図１３に、細胞分析用チップを細胞分析用装置に挿入した後の実施態様２のフローを示す。図１２及び図１３、図８を参照しながら説明する。
まず、記憶部８６に基づく記憶に基づいて、処理部８２により流体制御部８１を作動させて、バルブ１を閉じ、バルブ３〜５を開け、第一の空間１１の上端のウェルＷ１に細胞を含む液を投入して、ウェルＷ１からウェルＷ４に流す。流れる間に、細胞と結合可能な前記固定化された第一の分子で細胞1個を各ウェルに捕捉する（Ｓ１２７２）。
未結合の細胞は、ウェルＷ４方向の下流に流して除去する（Ｓ１２７３）。細胞を流すために、洗浄液等を用いてもよい。
【０１０９】
次に、捕捉された細胞の環境を制御する（Ｓ１２７４）。例えば、流体制御部８１により、細胞分泌を刺激する細胞分泌刺激物質の投与を行う。刺激物質により細胞分泌を活発にすることができる。このとき、バルブ３〜５を開いて同じ刺激物質を投与してもよいし、バルブ３〜５を閉じてウェル毎に別の刺激物質を投与してもよい。
【０１１０】
バルブ１のみ開き、細胞外に分泌された細胞分泌物を含む液を、流体制御部８１により第二の空間のウェルに移動させる（Ｓ１２７５）。ウェルＷ２の細胞分泌物はウェルＷ６に、ウェルＷ３のものはウェルＷ７に、ウェルＷ４のものはウェルＷ８に移動する。移動後、バルブ１を閉じる。
細胞分泌物は第二の空間のウェルの底面に固定化された抗体等で捕獲され、検出部８５で測定を行う（Ｓ１２７６）。測定により、どのような細胞分泌物がどの程度、1個の細胞から分泌されたかを明らかにすることができる。測定結果は、記憶部８６にデータとして蓄積することができる。
【０１１１】
次に、バルブ１を閉じ、第一の空間１１のウェルに捕捉されたままの細胞の細胞表面分子へ、第二の分子等で標識を付与する（Ｓ１２７７）。バルブ３〜５を開けると、第二の分子を含む液をＷ１からＷ４方向に流すことができる。又は、全てのバルブを閉じて、Ｗ１〜Ｗ４の各ウェルに第二の分子を添加してもよい。
次に、全てのバルブを閉じたまま、ウェルＷ１〜Ｗ４に光照射部８３から光を照射して、第二の分子の光分解性リンカーを分解し、識別部及び標識部を切り離して分離する（Ｓ１２７８）。
【０１１２】
バルブ１のみ開き、分離した識別部及び標識部を含む液を、第二の空間のウェルに移動させる（Ｓ１２７９）。その後バルブ１を閉じる。第二の空間のウェルの底面には、前述のように識別部認識分子が固定化されており、識別部を識別部認識分子に特異的に結合させ、標識部を検出、測定する（Ｓ１２７９）。測定により、どのような細胞表面分子がどの程度、1個の細胞に存在するかを特定及び／又は定量することができる。測定結果は、記憶部８６にデータとして蓄積することができる。
【０１１３】
（３）実施態様３
実施態様２とは異なる、第一及び第二の空間を用いる場合を説明する。この場合では、例えば、細胞分泌物の測定、細胞表面分子の測定、細胞内mRNAの予備増幅又は細胞回収を行うことができる。
例えば、第一の空間のウェルでは細胞分泌物を測定し、第二の空間のウェルでは細胞表面分子の標識測定を行うことができる。
また、細胞分泌刺激等による環境制御も可能であり、細胞の状態変動を測定することもできる。
【０１１４】
図１４に、細胞分析用チップを細胞分析用装置に挿入した後の実施態様３の工程のフローを示す。各空間のウェルの配置、流路、バルブの構造は、実施態様２で用いるチップ（図１２）と同様である。ウェルＷ１〜Ｗ４に細胞表面分子と結合する第一の分子及び細胞分泌物と結合する抗体が固定化され、ウェルＷ５〜Ｗ８には、識別部認識分子が固定化されている。
以下、図１４及び図１２、図８を参照して説明する。
【０１１５】
まず、記憶部８６に基づく記憶に基づいて、処理部８２により流体制御部８１を作動させ、バルブ１を閉じ、バルブ３〜５を開き、第一の空間１１のウェルＷ１に細胞を含む液を投入して、ウェルＷ１からウェルＷ４の方向に流す。各ウェルで細胞を1個ずつ、第一の分子で捕捉する（Ｓ１３７２）。未結合の細胞は、洗浄液を流す等により除去する（Ｓ１３７３）。
【０１１６】
次に、捕捉された細胞の環境を制御する（Ｓ１３７４）。例えば、細胞分泌を刺激する細胞分泌刺激物質の投与を流体制御部８１により行う。刺激物質により細胞分泌を活発にすることができる。このとき、バルブ３〜５を開いて同じ刺激物質を投与してもよいし、バルブ３〜５を閉じてウェル毎に別の刺激物質を投与してもよい。
細胞外に分泌された細胞分泌物は、第一の空間のウェル底面に固定化された抗体等で捕獲し、検出部８５で測定する（Ｓ１３８４）。これにより、どのような細胞分泌物がどの程度、1個の細胞から分泌されたか、特定及び／又は定量することができる。測定結果は、記憶部８６にデータとして蓄積することができる。
【０１１７】
また、第一の空間のウェルに捕捉された細胞の細胞表面分子に、第二の分子を結合させる（Ｓ１３７７）。特定の種類あるいは種々の細胞表面分子を標識することができる。
このとき、流体制御部８１を作動させ、バルブ１は閉じ、バルブ３〜５を開いて、ウェルＷ１からウェルＷ４方向に第二の分子を含む液を流してもよいし、全てのバルブを閉じて、ウェルＷ１〜Ｗ４のそれぞれに第二の分子を含む液を添加してもよい。
【０１１８】
次に、光照射部８３でウェルＷ１〜Ｗ４に光照射し、第二の分子の光分解性リンカーを分解し、識別部及び標識部を切り離して分離させる（Ｓ１３７８）。このとき、バルブは全て閉じている。
【０１１９】
バルブ３〜５は閉じたまま、バルブ１を開き、分離した識別部及び標識部が含まれる液を、第一の空間１１のウェルＷ２〜Ｗ４から第二の空間１２のウェルＷ６〜Ｗ８へ移動させる（Ｓ１３７９）。その後、バルブ１を閉じる。
第二の空間のウェルの底面には、前述のように識別部認識分子が固定化されており、分離した識別部及び標識部を捕獲し、検出部８５で測定を行う（Ｓ１３７９）。測定により、どのような細胞表面分子がどの程度、1個の細胞に存在するかを特定及び／又は定量することができる。測定結果は、記憶部８６にデータとして蓄積することができる。
【０１２０】
その後、細胞から核酸を取得して解析する。細胞内分子のDNA、mRNAを予備増幅する場合は、全てのバルブを閉じたまま、細胞溶解及びMulti Displacement Amplification法等による予備増幅を行い（Ｓ１３８０）、溶液を回収する。回収した溶液は、DNA、mRNAの分析等に用いることができる。
【０１２１】
なお、図１４のＳ１３７２〜Ｓ１３７９と同様の工程（Ｓ１４７２〜１４７９）を行ったのち、細胞を回収することもできる。光照射により第一の分子の光分解性リンカーを分解し、細胞を遊離して回収する（Ｓ１４８１）。回収した細胞は、培養等に用いることができる。
【０１２２】
（４）実施態様４
実施態様２及び３とは異なる、第一及び第二の空間を用いる場合を説明する。この場合では、例えば、細胞分泌物の測定、細胞表面分子の測定、細胞内mRNAの予備増幅又は細胞回収を行うことができる。
例えば、第二の空間のウェルでは細胞分泌物及び細胞表面分子標識の測定を行い、第一の空間のウェルで細胞内分子のDNA、mRNAの測定を行うことができる。
また、細胞分泌刺激等による環境制御も可能であり、細胞の状態変動を測定することもできる。
【０１２３】
図１６に、細胞分析用チップを細胞分析用装置に挿入した後の実施態様４の工程のフローを示す。各空間のウェルの配置、流路、バルブの構造は、実施態様２で用いるチップ（図１２）と同様である。ウェルＷ１〜Ｗ４には、細胞表面分子と結合する第一の分子が固定化されている。ウェルＷ５〜Ｗ８には、細胞分泌物と結合する抗体及び識別部認識分子が固定化されている。
【０１２４】
まず、記憶部８６に基づく記憶に基づいて、処理部８２により流体制御部８１を作動させ、バルブ１を閉じ、バルブ３〜５を開き、第一の空間１１のウェルＷ１に細胞を含む液を投入して、ウェルＷ４方向に流し、各ウェルで細胞を1個ずつ、第一の分子で捕捉する（Ｓ１５７２）。
未結合の細胞は、洗浄液等を流して除去する（Ｓ１５７３）。
【０１２５】
次に、捕捉された細胞の環境を制御する（Ｓ１５７４）。例えば、細胞分泌を刺激する細胞分泌刺激物質の投与を流体制御部８１により行う。刺激物質により細胞分泌を活発にすることができる。このとき、バルブ３〜５を開いて同じ刺激物質を投与してもよいし、バルブ３〜５を閉じてウェル毎に別の刺激物質を投与してもよい。
バルブ３〜５を閉じ、バルブ１を開けて、細胞外に分泌された細胞分泌物を、第二の空間のウェルに移動させる（Ｓ１５７５）。その後、全てのバルブを閉じる。
第二の空間１２のウェル底面には、前述のように、細胞分泌物と特異的に結合する抗体が固定化されており、移動した細胞分泌物を捕獲し、検出部８５で測定を行う（Ｓ１５７６）。測定により、どのような細胞分泌物がどの程度、1個の細胞から分泌されたかを特定及び／又は定量することができる。測定結果は、記憶部８６にデータとして蓄積することができる。
【０１２６】
次に、第一の空間１１のウェルに捕捉されている細胞の細胞表面分子に、第二の分子を結合させる（Ｓ１５７７）。特定の種類又は種々の細胞表面分子を標識することができる。
このとき、流体制御部８１を作動させ、バルブ１は閉じ、バルブ３〜５を開いて、ウェルＷ１からウェルＷ４方向に第二の分子を含む液を流してもよいし、全てのバルブを閉じて、ウェルＷ１〜Ｗ４のそれぞれに第二の分子を含む液を添加してもよい。
【０１２７】
次に、全てのバルブを閉じ、ウェルＷ１〜Ｗ４を光照射して、第二の分子から、識別部及び標識部を切り離して分離する（Ｓ１５７８）。
バルブ１を開き、分離した識別部及び標識部を第二の空間のウェルに移動させる（Ｓ１５７９）。その後バルブ１を閉じる。
移動した識別部及び標識部は、第二の空間のウェル底面に固定化された識別部認識部位で捕獲し、検出部８５で測定を行う（Ｓ１５７９）。測定により、どのような細胞表面分子がどの程度、1個の細胞に存在するかを特定及び／又は定量することができる。測定結果は、記憶部８６にデータとして蓄積することができる。
【０１２８】
その後、細胞から核酸を取得して解析する。細胞内分子のDNA、mRNAを予備増幅する場合は、全てのバルブを閉じたまま、細胞溶解及びMulti Displacement Amplification法等による予備増幅を行い（Ｓ１５８０）、溶液を回収する。回収した溶液は、DNA、mRNAの分析等に用いることができる。
【０１２９】
なお、図１６のＳ１５７２〜Ｓ１５７９と同様の工程（Ｓ１６７２〜Ｓ１６７９）を行ったのち、細胞を回収することもできる。光照射部８３を作動させ、第一の分子の光分解性リンカーを分解し、細胞を遊離して回収する（Ｓ１６８１）。回収した細胞は、培養等に用いることができる。
【０１３０】
（５）実施態様５
実施態様２〜４とは異なる、第一及び第二の空間を用いる場合を説明する。この場合では、例えば、細胞分泌物の測定、細胞表面分子の測定、細胞内mRNAの予備増幅又は細胞回収を行うことができる。
例えば、第二の空間のウェルでは細胞分泌物及び細胞表面分子標識の測定を行い、第一の空間のウェルで細胞内分子のタンパク質等の測定を行うことができる。
また、細胞分泌刺激等による環境制御も可能であり、細胞の状態変動を測定することもできる。
【０１３１】
図１８に、細胞分析用チップを細胞分析用装置に挿入した後の実施態様５のフローを示す。各空間のウェルの配置、流路、バルブは、実施態様２で用いるチップ（図１２）と同様であるが、ウェルＷ１〜Ｗ４には、細胞表面分子と結合する第一の分子が固定化されており、ウェルＷ５〜Ｗ８には、細胞分泌物と特異的に結合する抗体及び識別部認識分子が固定化されている。
【０１３２】
まず、記憶部８６に基づく記憶に基づいて、処理部８２により流体制御部８１を作動させ、バルブ１を閉じ、バルブ３〜５を開いて、第一の空間のウェルＷ１に細胞を含む液を投入し、各ウェルで細胞1個を第一の分子で捕捉する（Ｓ１７７２）。これにより、解析対象の細胞をウェルに保持することができる。
未結合の細胞は、洗浄液を流す等により除去する（Ｓ１７７３）。
次に、捕捉された細胞の環境を制御する（Ｓ１７７４）。例えば、細胞分泌を刺激する細胞分泌刺激物質の投与を流体制御部８１により行う。刺激物質により細胞分泌を活発にすることができる。このとき、バルブ３〜５を開いて同じ刺激物質を投与してもよいし、バルブ３〜５を閉じてウェル毎に別の刺激物質を投与してもよい。
【０１３３】
バルブ３〜５を閉じ、バルブ１を開いて、細胞外に分泌された細胞分泌物を、第二の空間１２のウェルに移動させる（Ｓ１７７５）。その後、バルブ１を閉じる。
第二の空間１２のウェル底面には、前述のように、細胞分泌物と特異的に結合する抗体が固定化されており、移動した細胞分泌物を捕獲し、検出部８５で測定を行う（Ｓ１７７６）。測定により、どのような細胞分泌物がどの程度、1個の細胞から分泌されたか特定及び／又は定量することができる。測定結果は、記憶部８６にデータとして蓄積することができる。
【０１３４】
次に、第一の空間１１のウェルに捕捉されている細胞の細胞表面分子に、第二の分子を結合させる（Ｓ１７７７）。特定の種類又は種々の細胞表面分子を標識することができる。このとき、流体制御部８１により、バルブ１は閉じ、バルブ３〜５を開いて、ウェルＷ１からウェルＷ４方向に第二の分子を含む液を流してもよいし、全てのバルブを閉じて、ウェルＷ１〜Ｗ４のそれぞれに第二の分子を含む液を添加してもよい。
全てのバルブを閉じ、ウェルＷ１〜Ｗ４に光照射部８３から光を照射し、第二の分子の識別部及び標識部を切り離して分離する（Ｓ１７７８）。
【０１３５】
バルブ１のみ開いて、分離した識別部及び標識部を第二の空間のウェルに移動させる（Ｓ１７７９）。その後バルブ１を閉じる。
移動した識別部及び標識部は、第二の空間のウェル底面に固定化された識別部認識部位で捕獲され、検出部８５で測定を行う（Ｓ１７７９）。これにより、どのような細胞表面分子がどの程度、1個の細胞に存在するかを特定及び／又は定量することができる。測定結果は、記憶部８６にデータとして蓄積することができる。
【０１３６】
その後、全てのバルブを閉じたまま、細胞について細胞膜透過処理後、細胞内染色（FISH等）し（Ｓ１７８５）、細胞内イメージング測定を行う（Ｓ１７８６）。得られた画像と上記細胞分泌物と上記細胞表面分子の測定結果を合わせて細胞を解析することができる。
【０１３７】
（６）実施態様６
第一、第二及び第三の空間を用いる場合を説明する。この場合では、例えば、細胞分泌物の測定、細胞表面分子の測定、細胞内mRNAの予備増幅又は細胞回収を行うことができる。第一の空間では、細胞分泌物の測定を行い、第二の空間では、細胞表面分子標識の測定を行い、第三の空間では、細胞外に分泌された細胞分泌物及び細胞表面分子標識の測定を行うことができる。
また、細胞分泌刺激等による環境制御も可能であり、細胞の状態変動を測定することもできる。
【０１３８】
図１９に、細胞分析用チップの概略を示す。
中央に第一の空間１１のウェルＷ１〜Ｗ４が縦に4つ並び、右側に第二の空間１２のウェルＷ５〜Ｗ８、左側に第三の空間１３のウェルＷ９〜Ｗ１２が縦に4つ並ぶ。各空間の各ウェルは、流路１６で縦に連結されている。また、第一の空間と第二の空間のウェル、第一の空間と第三の空間のウェルも、上端のウェル（Ｗ１、Ｗ５、Ｗ９）を除いて流路１６で横に連結される。流路１６には、バルブ１、２、３、４、５が設置されている。
ウェルＷ１〜Ｗ４には第一の分子及び細胞分泌物に対する抗体が固定化され、ウェルＷ５〜Ｗ８には識別部認識分子が固定化されている。
なお、ウェルＷ１、Ｗ５、Ｗ９は、細胞や洗浄液、試薬等の投入口としてもよいし、捕捉された細胞や固定化された抗体等の測定用コントロール等としてもよい。
【０１３９】
図２０に、細胞分析用チップを細胞分析用装置に挿入した後の実施態様６のフローを示す。図１９及び図２０、図８を参照して以下説明する。
まず、記憶部８６に基づく記憶に基づいて、処理部８２により流体制御部８１を作動し、バルブ１及び２を閉じ、バルブ３〜５を開いて、第一の空間のウェルＷ１に細胞を含む液を投入し、ウェルＷ１からウェルＷ４の方向へ流す。流す間に、ウェルＷ１〜Ｗ４の各ウェルで細胞1個を第一の分子で捕捉する（Ｓ１９７２）。これにより、解析対象の細胞をウェルに保持することができる。
未結合の細胞は、洗浄液を流す等により除去する（Ｓ１９７３）。
【０１４０】
次に、捕捉された細胞の環境を制御する。例えば、細胞分泌を刺激する細胞分泌刺激物質の投与を流体制御部８１により行う（Ｓ１９７４）。刺激物質により細胞分泌を活発にすることができる。このとき、バルブ３〜５を開いて同じ刺激物質を投与してもよいし、バルブ３〜５を閉じてウェル毎に別の刺激物質を投与してもよい。
【０１４１】
全てのバルブを閉じ、細胞外に分泌された細胞分泌物を、第一の空間のウェル底面に固定化された抗体で捕獲し、検出部８５で測定を行う（Ｓ１９８４）。測定により、どのような細胞分泌物がどの程度、1個の細胞から分泌されたかを特定及び／又は定量することができる。測定結果は、記憶部８６にデータとして蓄積することができる。
【０１４２】
次に、捕捉されている細胞の細胞表面分子に、第二の分子を結合させる（Ｓ１９７７）。特定の種類又は種々の細胞表面分子を標識することができる。このとき、バルブ１は閉じ、バルブ３〜５を開いて、ウェルＷ１からウェルＷ４方向に第二の分子を含む液を流してもよいし、全てのバルブを閉じて、ウェルＷ１〜Ｗ４のそれぞれに第二の分子を含む液を添加してもよい。
全てのバルブを閉じ、ウェルＷ１〜Ｗ４に光照射部８３により光を照射し、第二の分子の光分解性リンカーを分解して、識別部及び標識部を切り離して分離する（Ｓ１９７８）。
【０１４３】
バルブ１を開き、分離した識別部及び標識部を含む液を、第二の空間１２の各ウェルに移動させる。その後バルブ１を閉じる。
移動した識別部及び標識部は、第二の空間１２のウェル底面に固定化された識別部認識分子と識別部とが結合して捕獲され、検出部８５で測定を行う（Ｓ１９８７）。測定により、どのような細胞表面分子がどの程度、1個の細胞に存在するかを特定及び／又は定量することができる。測定結果は、記憶部８６にデータとして蓄積することができる。
【０１４４】
次に、全てのバルブを閉じ、第一の空間１１のウェルＷ１〜Ｗ４に捕捉されている細胞を、光照射部８３により光を照射することで、第一の分子の光分解性リンカーを分解して遊離する（Ｓ１９８８）。
バルブ２のみ開き、遊離した細胞を、第三の空間１３の各ウェルＷ８〜Ｗ１２に移動させる（Ｓ１９８９）。その後バルブ２を閉じる。
第三の空間１３のウェルで、細胞を溶解する（Ｓ１９８９）。溶解は、溶液の添加や超音波破砕等で行うことができる。
ここで、全てのバルブを閉じたまま、必要であれば、Multi Displacement Amplification法等でDNA、mRNA等を予備増幅する。
増幅されたDNA、mRNAを含む溶液を回収し（Ｓ１９９０）、PCRやNGS(次世代シーケンサー)等で解析する。
【０１４５】
（７）実施態様７
実施態様６とは異なる、第一、第二及び第三の空間を用いる場合を説明する。図２１に、細胞分析用チップの概略を示す。
【０１４６】
図２１を参照すると、中央に第一の空間１１のウェルＷ２〜Ｗ４が縦に3つ並び、右側に第二の空間１２のウェルＷ５〜Ｗ８、左側に第三の空間１３のウェルＷ９〜Ｗ１２が縦に4つ並ぶ。第二及び第三の空間のウェルは、流路１６で縦に連結され、第一の空間と第二の空間のウェル、第一の空間と第三の空間のウェルは上端のウェルを除いて流路１６で横に連結される。流路にはそれぞれバルブ１、２、３、４、５が設置されている。
ウェルＷ２〜Ｗ４には細胞表面分子と結合する第一の分子が固定化され、ウェルＷ５〜Ｗ８には識別部認識分子が固定化され、ウェルＷ９〜Ｗ１２には細胞分泌物に特異的に結合する抗体が固定化されている。
なお、ウェルＷ５、Ｗ９は、洗浄液、試薬等の投入口としてもよいし、試薬や固定化された抗体等の測定用コントロール等としてもよい。
【０１４７】
まず、流体制御部８１を作動させ、全てのバルブを閉じ、第一の空間１１のウェルＷ２、Ｗ３、Ｗ４に細胞を含む液を投入し、ウェルに固定化されている第一の分子で細胞1個を捕捉する。これにより、解析対象の細胞をウェルに保持することができる。
そこに、抗体と光分解性リンカーと標識された核酸断片とで構成される第二の分子を投入し、細胞の細胞表面分子と結合させる。これにより、第一分子、細胞、第二分子のサンドイッチが形成される。
次に、ウェルＷ２〜Ｗ４に光照射部８３により光照射し、第二の分子の標識された核酸断片（識別部及び標識部）を分離する。
【０１４８】
バルブ１のみ開き、分離された標識された核酸断片を、第二の空間のウェルＷ６〜Ｗ８へ移動させ、ウェルＷ６〜Ｗ８に固定化された相補的核酸断片（識別部認識部位）と特異的に結合させる。
未結合の標識された核酸断片は、バルブ３、４、５を開いて洗浄液等で流して除去した後、シグナル増幅し、検出部８５で測定を行う。測定により、どのような細胞表面分子がどの程度、1個の細胞に存在するかを特定及び／又は定量することができる。測定結果は、記憶部８６にデータとして蓄積することができる。
【０１４９】
更に細胞分泌物を測定する場合は、細胞が捕捉された第一の空間１１のウェルＷ２〜Ｗ４に細胞分泌刺激物質を流体制御部８１により投入する。刺激物質により細胞分泌を活発にすることができる。
細胞分泌物が分泌されたら、バルブ２のみ開き、分泌物を第三の空間１３のウェルＷ１０〜Ｗ１２に移動させ、ウェルに固定化された細胞分泌物に特異的に結合する抗体と結合させる。未結合の分泌物を、バルブ３、４、５を開いて除去する。
全てのバルブを閉じ、シグナル増幅して、検出部８５で測定を行う。測定により、どのような細胞分泌物がどの程度、1個の細胞から分泌されたかを特定及び／又は定量することができる。測定結果は、記憶部８６にデータとして蓄積することができる。
【０１５０】
（８）実施態様８
実施態様６、７とは異なる、第一、第二及び第三の空間を用いる場合を説明する。各空間のウェルの配置、流路、バルブは、実施態様６で用いるチップ（図１９）と同様である。第一の空間１１のウェルには第一の分子、第二の空間１２のウェルには識別部認識分子、第三の空間１３のウェルには細胞分泌物と特異的に結合する抗体が固定化されている。
【０１５１】
まず、記憶部８６に基づく記憶に基づいて、処理部８２により流体制御部８１を作動させ、バルブ１及び２を閉じ、バルブ３〜５を開き、第一の空間１１のウェルＷ１に細胞を含む液を投入し、ウェルＷ１からウェルＷ４に液を流す間に、各ウェルに細胞1個を第一の分子で捕捉する。これにより、解析対象の細胞をウェルに保持することができる。
そこに、抗体と光分解性リンカーと標識された核酸断片とで構成される第二の分子を流体制御部８１により投入し、細胞の細胞表面分子と結合させる。これにより、第一の分子、細胞、第二の分子のサンドイッチが形成される。
未結合の第二の分子は、洗浄液等で流して除去する。
【０１５２】
全てのバルブを閉じ、第一の空間１１のウェルＷ１〜Ｗ４に光照射し、第二の分子の標識された核酸断片を分離する。バルブ１のみ開き、分離した標識された核酸断片を、第一の空間１１のウェルＷ２〜Ｗ４から第二の空間１２のウェルＷ６〜Ｗ８に移動させる。
バルブ１を閉じ、移動した標識された核酸断片は、第二の空間１２のウェルに固定化された相補的核酸断片と特異的結合させる。これにより、二重鎖の核酸断片が形成される。その後、バルブ３〜５を開いて、未結合の標識された核酸断片を洗浄液等で流して除去する。
全てのバルブを閉じて、シグナル増幅した後、第二の空間１２の各ウェルの測定を検出部８５で行う。測定により、どのような細胞表面分子がどの程度、1個の細胞に存在するかを特定及び／又は定量することができる。測定結果は、記憶部８６にデータとして蓄積することができる。
【０１５３】
更に、細胞分泌物を測定する場合、流体制御部８１により、全てのバルブを閉じるか、バルブ１及び２を閉じかつバルブ３〜５を開いて、捕捉された細胞がある第一の空間１１のウェルに細胞分泌刺激物質を投入する。刺激物質により細胞分泌を活発にすることができる。
次に、バルブ１及び３〜５を閉じ、バルブ２を開いて、細胞外へ分泌された細胞分泌物を第三の空間１３のウェルＷ１０〜Ｗ１２に移動させる。そして、第三の空間のウェルに固定化されている細胞分泌物と特異的に結合する抗体と結合させる。未結合の細胞分泌物は、バルブ１、２を閉じ、バルブ３〜５を開いて洗浄液等を流して除去する。その後、全てのバルブを閉じ、シグナル増幅して検出部８５で測定を行う。測定により、どのような細胞分泌物がどの程度、1個の細胞から分泌されたかを特定及び／又は定量することができる。測定結果は、記憶部８６にデータとして蓄積することができる。
【０１５４】
また更に、細胞から核酸を取得して解析することができる。細胞内分子（DNA、mRNA）を増幅する場合は、全てのバルブを閉じ、第一の空間に捕捉されている細胞を溶解する。溶解は、溶解液の投入や超音波破砕等で行うことができる。
次にMulti Displacement Amplification法等で予備増幅し、その液を回収してPCRやNGS等で解析を行う。
【０１５５】
これとは別に細胞を回収する場合、全てのバルブを閉じ、第一の空間１１の各ウェルに光を照射する。回収された細胞は、培養等に用いられる。
【０１５６】
なお、本技術は、以下のような構成も採ることができる。
［１］以下の工程：
（Ａ）細胞と結合可能な第一の分子で細胞を捕捉する工程、
（Ｂ）細胞の細胞表面分子に、該細胞表面分子と特異的に結合可能な結合部、識別部及び標識部が連結された第二の分子を結合させる工程、
（Ｃ）第二の分子の結合部と、識別部及び標識部とを切り離す工程、
（Ｄ）切り離された識別部及び標識部のうち、識別部を、識別部認識分子に特異的に結合させる工程、及び
（Ｅ）識別部認識分子に結合した識別部及び標識部のうち、標識部を検出する工程、
を含む、細胞の分析方法。
［２］以下の工程：
（Ｆ）前記工程（Ｅ）で得られた標識部の検出結果から、第二の分子と特異的に結合した細胞表面分子を特定及び／又は定量する工程
を含む、［１］に記載の細胞の分析方法。
［３］更に以下の工程：
（Ｇ）細胞からの細胞分泌物を特定及び／若しくは定量する工程、並びに／又は
（Ｈ）細胞から核酸を取得して解析する工程
を含む、［１］又は［２］に記載の単一細胞の分析方法。
［４］前記工程（Ａ）において捕捉される細胞が、単一細胞又は同一種類の複数細胞である、［１］〜［３］のいずれかに記載の細胞の分析方法。
［５］前記第一の分子は、オレイル基、抗体、アプタマー又は分子認識ポリマーを含む分子である、請求項［１］〜［４］のいずれかに記載の細胞の分析方法。
［６］前記第二の分子は、抗体、アプタマー又は分子認識ポリマーを含む分子である、［１］〜［５］のいずれかに記載の細胞の分析方法。
［７］前記第一の分子及び／又は前記第二の分子は、刺激分解性リンカーを介してウェルに固定化されている、［１］〜［６］のいずれかに記載の細胞の分析方法。
［８］前記刺激分解性リンカーは光分解性リンカーである、［７］に記載の細胞の分析方法。
［９］前記識別部は核酸断片を含む、［１］〜［８］のいずれかに記載の細胞の分析方法。
［１０］前記識別部認識分子は、前記識別部に含まれる核酸断片と相補的な核酸断片を含む、［９］に記載の細胞の分析方法。
［１１］前記識別部認識分子はウェルに固定化されている、［１］〜［１０］のいずれかに記載の細胞の分析方法。
［１２］前記識別部認識分子は、ウェルに固定化されている位置と対応付けられた情報を有する、［１１］に記載の細胞の分析方法。
［１３］細胞と結合可能な第一の分子が固定化された第一の領域と、
前記細胞と特異的に結合可能な結合部、識別部及び標識部が連結された第二の分子と特異的に結合可能な分子が固定化された第二の領域と、
前記標識部を検出可能な検出領域と、
を含む細胞分析用チップ。
［１４］前記第一の領域、第二の領域及び検出領域からなる群から選択される領域を含むウェルと、
前記ウェル間を連結する流路と、
前記流路に設置されているバルブと、
を含む、［１３］に記載の細胞分析用チップ。
［１５］前記第一の領域、第二の領域及び検出領域からなる群から選択される領域を含むウェルに、識別部認識分子及び／又は細胞分泌物認識分子が固定化されている、［１４］に記載の細胞分析用チップ。
［１６］前記識別部認識分子及び／又は細胞分泌物認識分子は、複数の種類の分子を含む、［１５］に記載の細胞分析用チップ。
［１７］前記複数の種類の分子は、前記領域に固定化されている位置と対応付けられた情報を有する、［１６］に記載の細胞分析用チップ。
［１８］細胞表面分子、細胞内分子及び細胞分泌物からなる群から選択される分子に特異的に結合可能な結合部と標識部とを含む分子を含有する細胞分析用試薬。
［１９］細胞と結合可能な第一の分子が固定化された第一の領域と、
前記細胞と特異的に結合可能な結合部、識別部及び標識部が連結された第二の分子と特異的に結合可能な分子が固定化された第二の領域と、
前記標識部を検出可能な検出領域と、
を含む細胞分析用チップと、
細胞表面分子、細胞内分子及び細胞分泌物からなる群から選択される分子に特異的に結合可能な結合部と標識部とを含む分子を含有する試薬、前記標識部を検出する試薬、並びに細胞分泌を刺激する物質を含有する試薬からなる群から選択される試薬と
を含む、細胞分析用キット。
［２０］前記［１３］に記載の細胞分析用チップを挿入する挿入部と、
前記細胞分析用チップの流体の移動を制御する流体制御部と、
前記細胞分析用チップの第一の領域に光を照射する光照射部と、
前記細胞分析用チップの検出領域で標識部を検出する検出部と、
を含む、細胞分析用装置。
【符号の説明】
【０１５７】
１〜５            バルブ
１１              第一の空間
１２              第二の空間
１３              第三の空間
１６              流路
２１              第一の分子
２２              細胞
２３              細胞表面分子
２４              第二の分子
２５              刺激分解性リンカー
２６、３１        ウェル
２７              金属
２８              核酸断片
２９              蛍光標識物
３２              細胞表面分子測定用の識別部認識分子
３３              細胞内分子測定用の識別部認識分子
３４              スポット
６１              光
８１              流体制御部
８２              処理部
８３              光照射部
８４              挿入部
８５              検出部  
８６              記憶部
８７              細胞用分析装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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