(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホルマリン固定組織の生体試料中のＴＵＢＢ３タンパク質のレベルを測定するための方法であって、質量分析を使用して前記生体試料から調製されたタンパク質消化物中のＴＵＢＢ３タンパク質断片ペプチドの量を検出及び定量化すること、並びに前記試料中のＴＵＢＢ３タンパク質のレベルを算出することを含み、前記ＴＵＢＢ３断片ペプチドが配列番号１０３のペプチドであり、
前記量が、相対量または絶対量である、前記方法。
【請求項２】
ＴＵＢＢ３タンパク質断片ペプチドの量を検出及び定量化する前に、前記タンパク質消化物を分画するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生体試料の前記タンパク質消化物が、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）プロトコルによって調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質消化物が、プロテアーゼ消化物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記質量分析が、タンデム質量分析、イオントラップ質量分析、三連四重極質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析、ＭＡＬＤＩ質量分析、及び／または飛行時間型質量分析を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記生体試料が、血液試料、尿試料、血清試料、腹水試料、喀痰試料、リンパ液、唾液試料、細胞、または固形組織である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＴＵＢＢ３タンパク質断片ペプチドを定量化することをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＴＵＢＢ３タンパク質断片ペプチドを定量化することが、１つの生体試料中の配列番号１０３に示されるＴＵＢＢ３タンパク質の約８〜約４５個のアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むＴＵＢＢ３タンパク質断片ペプチドの量を、異なる別個の生体試料中の同一ＴＵＢＢ３タンパク質断片ペプチドの量と比較することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＴＵＢＢ３タンパク質断片ペプチドを定量化することが、生体試料中のＴＵＢＢ３タンパク質断片ペプチドの量を、既知量の添加内部標準ペプチドとの比較によって決定することを含み、前記生体試料中のＴＵＢＢ３タンパク質断片ペプチドが同一のアミノ酸配列を有する内部標準ペプチドと比較される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記内部標準ペプチドが、同位体標識ペプチドである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法を実行するための製品を含む、ＴＵＢＢ３タンパク質の存在、および患者または対象における肺癌を含む癌との関連性を示すためのキット。
【請求項１２】
前記関連性が、ＴＵＢＢ３タンパク質断片ペプチドの量、または前記ＴＵＢＢ３タンパク質の量の前記検出及び定量化の結果を、肺癌を含む前記癌の診断上の病期／グレード／状態と相関させることである、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記キットが、他のタンパク質または他のタンパク質由来のペプチドの量の検出及び定量化を実行するための製品をさらに含む、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
配列番号１０３のペプチド及び／またはそれに対する抗体を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１４年７月１日に出願された仮出願第６２／０１９，８３０号に対する優先権を主張し、該仮出願の内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
緒言
癌は、増殖及び分割する細胞を殺傷し、様々な方法で機能する治療剤集で処置される。一般的な化学療法剤集は、独立してまたは併用されてのいずれかで、数十年にわたって使用されており、この一般的な薬剤集は、臨床腫瘍学実践において従来及び通常の癌処置となっている。これらの従来の化学療法薬は、大半の癌細胞の主な特性の１つである迅速な分割を行うすべての細胞を殺傷することにより作用する。そのような薬剤には、ＤＮＡを直接損傷するアルキル化剤、微小管形成を阻止するタキサン、ＤＮＡ及びＲＮＡ複製を妨害する代謝拮抗薬、ＤＮＡ複製に関与する酵素を妨害するアントラサイクリン（抗腫瘍抗生物質）、ＤＮＡ複製を阻止するトポイソメラーゼ阻害薬、酵素が細胞増殖に必要なタンパク質を作成することを阻止する天然産物に由来するアルカロイド及び他の化合物、ＤＮＡの架橋を引き起こしてＤＮＡ修復及び／またはＤＮＡ合成を阻害するプラチナ製剤が挙げられる。これらの群の化学療法剤は、元々、癌細胞の増殖を阻害するというそれらの基礎機能に基づいて開発され、それらの標的化作用様式の事前知識はほとんどなかった。それらが、既知のタンパク質を特異的に標的し、直接阻害するように開発されていなかったため、これらの薬剤は、歴史的に「標的化」癌治療剤とみなされていない。しかしながら、それらの開発以来、これらの群の薬剤のそれぞれの生化学機能が十分に理解されるようになり、それぞれが特定のタンパク質、酵素、または核酸に「標的化」効果を有することが見出されている。これらの化学療法剤の「標的」も、十分に理解され、ゆえに所与の癌に対する最も効果的な化学療法剤を、その癌の中のこれらの特定の「標的」の存在の有無に基づいて選択することができる。これらの薬剤がそれらの標的に効果を有し得るかどうかを予測することができる特定のバイオマーカーが存在する。この実施形態は、患者由来の生体試料において直接的に化学療法のこれらのバイオマーカーの存在の有無についてアッセイするための特定の方法を記載する。
【０００３】
癌療法に対する標的化手法は、１つ以上の特定の標的タンパク質が、どの治療剤（1つまたは複数）が癌を処置して癌の増殖を阻害するために使用されるべきかの指標を与えるとき、最も有利である。この実施形態は、癌療法に対する処置決定の改善のために、直接的に癌患者からの患者由来の生体試料において化学療法のどのタンパク質指標が発現、過剰発現されるか、または発現されないかを定量的に決定することに関して有用である１つ以上のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイにおいて使用するためのペプチド及びペプチド配列を提供する。
【発明の概要】
【０００４】
以下のタンパク質、すなわちＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及びＴＯＰＯ２Ａの部分列に由来する特定のペプチドを提供する。ＥＮＴ１は、受動拡散型ヌクレオシド輸送体１タンパク質としても知られており、本明細書ではＥＮＴ１と称することとする。ＥＲＣＣ１は、ＤＮＡ除去修復タンパク質ＥＲＣＣ−１としても知られており、本明細書ではＥＲＣＣ１と称することとする。ＦＯＬＲ１は、葉酸受容体アルファとしても知られており、本明細書ではＦＯＬＲ１と称することとする。ＲＲＭ１は、リボヌクレオシド二リン酸レダクターゼ大サブユニットとしても知られており、本明細書ではＲＲＭ１と称することとする。ＴＵＢＢ３は、チューブリンベータ−３鎖タンパク質としても知られており、本明細書ではＴＵＢＢ３と称することとする。ＴＯＰＯ１は、ＤＮＡトポイソメラーゼ１としても知られており、本明細書ではＴＯＰＯ１と称することとする。ＴＯＰＯ２Ａは、ＤＮＡトポイソメラーゼ２アルファとしても知られており、本明細書ではＴＯＰＯ２Ａと称することとする。
【０００５】
タンパク質由来の各ペプチドに対するペプチド配列及び断片化／遷移イオンは、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）アッセイ（複数可）とも称することができ、以下本明細書では、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ（複数可）と称する、質量分析ベースの選択反応モニタリング（ＳＲＭ）アッセイ（複数可）において特に有用である。ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及びＴＯＰＯ２Ａタンパク質、ならびにそれらのタンパク質のイソ型の定量的ＳＲＭ／ＭＲＭ分析のためのペプチドの使用を記載する。
【０００６】
１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つまたは６つのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ（複数可）を使用して、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質由来の特定のペプチドの１つ以上の存在を検出し、その相対または絶対定量的レベルを測定することができ、それゆえ、生体試料から得られる所与のタンパク質調製物中のそれらのタンパク質のそれぞれの総量を、質量分析によって測定する手段を提供することができる。それらのタンパク質由来の利用可能な全ペプチドのすべてもしくは一部は、単一のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイで同時に分析することができるか、または個別のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの任意の組み合わせで分析することができる。これらのペプチドはそれぞれ、生体試料から得られる所与のタンパク質調製物中の対応するタンパク質のそれぞれの総量を、質量分析によって測定する可能性のある手段を提供する。
【０００７】
より具体的には、本明細書に記載されるＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ（複数可）は、ホルマリン固定癌患者組織（例えば、切除腫瘍及び生検）などの患者組織試料から得られた細胞から調製される複合タンパク質溶解物試料中のこれらのペプチドを直接測定することができる。ホルマリン固定組織からタンパク質試料を調製する方法は、米国特許第７，４７３，５３２号に記載されており、その内容はそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。該特許に記載される方法は、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．（メリーランド州ロックビル）から入手可能であるＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ試薬及びプロトコルを用いて好都合に行われてよい。
【０００８】
癌患者から外科的に摘出された組織のホルムアルデヒド／ホルマリン固定は、病理学的実践において認められた慣例である。結果として、ホルムアルデヒド／ホルマリン固定パラフィン包埋組織が、最も広範に入手できるこれらの患者由来の組織形態である。ホルムアルデヒド／ホルマリン固定は、典型的に、本明細書でホルマリンと称するホルムアルデヒドの水溶液を用いる。「１００％」のホルマリンは、ホルムアルデヒドの飽和水溶液（約４０体積％または３７質量％のホルムアルデヒド）から構成され、酸化を、及び重合の程度を制限するために、少量の安定剤、通常、メタノールを含む。組織を保存する最も一般的な方法は、１０％の中性緩衝ホルマリンと一般に呼ばれるホルムアルデヒド水溶液中に全組織を長時間（８時間〜４８時間）浸漬し、続いて、室温での長期貯蔵のために、固定した全組織をパラフィンワックス中に包埋することである。したがって、ホルマリン固定癌組織を分析するための分子分析方法が、癌患者組織の分析において、最も受け入れられ、頻繁に活用される方法であろう。
【０００９】
ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ（複数可）からの結果を、組織（生体試料）が収集及び保存された患者または対象の特定の組織試料（例えば、癌組織試料）中の、これらのタンパク質のいずれかまたはすべての正確かつ精密な定量的レベルを、これらのタンパク質の可能性のあるイソ型の正確かつ精密な定量的レベルに加えて、相関させるために使用することができる。これは、癌に関する診断情報を提供するだけでなく、医師または他の医療従事者が、患者または対象のための適切な治療を決定することも可能にする。罹患組織中または別の患者／対象試料中のタンパク質発現のレベルに関する診断上及び治療上での重要な情報を提供するそのようなアッセイは、コンパニオン診断アッセイと呼ばれる。例えば、そのようなアッセイは、癌の病期、程度、または組織学を診断し、癌細胞の増殖を止めるのに最も効果的な治療剤を決定し、患者または対象が応答する可能性が最も高い治療剤の決定を導くように設計することができる。より具体的には、患者からの癌細胞中のＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質のうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上の検出及び／または定量化は、どの処置レジメン（1つまたは複数）に従うべきかを示すことができるタンパク質を提供し得る。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書に記載されるアッセイは、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質を含むタンパク質由来の特定の非修飾ペプチドの相対もしくは絶対レベルを定量化または測定し、それらのタンパク質由来の特定の修飾ペプチドの相対または絶対レベルも測定することもできる。修飾の例としては、ペプチド上に存在するリン酸化アミノ酸残基及びグリコシル化アミノ酸残基が挙げられる。タンパク質及びタンパク質イソ型の相対定量的レベルは、ＳＲＭ／ＭＲＭ法により、例えば、ＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積（例えば、特徴的ピーク面積または積分断片イオン強度）を比較することによって、決定することができる。個別のＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａペプチドの相対レベルは、異なる試料（例えば、対照試料及び患者の組織または対象の組織から調製された試料）中で決定することができる。あるいは、各ペプチドがそれ自体の特異的なＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピークを有する場合、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａ特徴的ペプチドのうちの１つ以上に対して複数のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積を比較することが可能である。ピーク面積を比較することによって、１つの生体試料中、または１つ以上の追加または異なる生体試料中のＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質、ならびに可能性のあるタンパク質イソ型含有量の相対レベルを決定することが可能である。このようにして、それらのタンパク質由来の特定のペプチド（１つまたは複数）の相対量、及びそれゆえ、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質、ならびにそれらの可能性のあるイソ型の相対量を、同じ実験条件下で複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上）の生体試料にわたって決定することができる。加えて、相対定量化を、単一の試料中のＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質由来の所与のペプチド（１つまたは複数）に対して、ＳＲＭ／ＭＲＭ法により、そのペプチドの特徴的ピーク面積を、生体試料からの同じタンパク質調製物中の異なるタンパク質（１つまたは複数）由来の別の異なるペプチド（１つまたは複数）の特徴的ピーク面積と比較することによって決定することができる。そのような方法を使用して、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質由来の特定のペプチドの量、及びそれゆえ、対応するタンパク質のそれぞれ、及びそれらの可能性のあるイソ型の量を、同じ試料中または異なる試料中で互いに比較して決定することができる。個別のペプチド（１つまたは複数）の相対定量化は、試料中または試料間の別のペプチド（１つまたは複数）の量と比較して行われ得るため、生体試料中のタンパク質の体積に対する絶対重量、または重量に対する絶対重量にかかわらず、（例えば、互いに比較してピーク面積を決定することによって）存在するペプチドの相対量を決定することが可能である。ゆえに、生体試料からのタンパク質調製物中のＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａペプチドの量を使用して、様々な試料中及び試料間のそれらのタンパク質の量を決定してよい。異なる試料間の個別の特徴的ピーク面積に関する相対定量化データは、一般的に、試料ごとに分析されるタンパク質の量に正規化される（例えば、試料の総タンパク質濃度及び分析される体積が試料の正規化に使用される）。相対定量化を、単一の試料中及び／または多くの試料にわたる、複数のタンパク質ならびにＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質（複数可）由来の多くのペプチドにわたって同時に実施して、相対タンパク質量、他のペプチド／タンパク質に対する１つのペプチド／タンパク質についてのさらなる洞察を得ることができる。
【００１１】
ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質の絶対定量的レベルは、例えば、ＳＲＭ／ＭＲＭ法によって決定され、それによって、１つの生体試料中のＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質由来の個別のペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積が、既知量の試料中に「スパイクされた」１つ以上の既知量の内部標準物（例えば、同位体標識標準物）のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積と比較される。一実施形態では、内部標準物は、１つ以上の重同位体で標識された１つ以上のアミノ酸残基を含有する、全く同一のＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａペプチドの合成バージョンである。そのような同位体標識内部標準物は、質量分析によって分析されるときに、天然のＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａペプチド特徴的ピークとは異なるかつ別個であり、コンパレータピークとして使用することができる予測可能及び一貫したＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積が生成されるように合成される。ゆえに、内部標準物が、既知量の生体試料からのタンパク質またはペプチド調製物中に既知量でスパイクされ、質量分析によって分析されるとき、天然ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積を、内部標準ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積と比較することができる。この数値比較により、生体試料からの最初のタンパク質調製物中に存在する天然ペプチドの絶対モル濃度及び／または絶対重量のいずれかの算出が可能となり、そこから対応するタンパク質の濃度または重量が決定され得る。断片ペプチドに対する絶対定量化データは、典型的に、試料ごとに分析されるタンパク質の量に従って表示される。絶対定量化は、多くのペプチドにわたって実施することができ、それが、同時に単一の試料中及び／または複数の試料にわたる複数のタンパク質（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ等）の定量決定を可能にして、個別の生体試料及び／または個別の試料のコホート全体における絶対タンパク質量についての洞察を得ることができる。一実施形態では、タンパク質の定量化は、Ｇｙｇｉらよって米国特許第７，５０１，２８６号に記載されるようにペプチド標準物を使用して行ってよい。
【００１２】
本明細書で用いる時、定量化する、定量化、測定する、測定という用語は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、標準物質（例えば、内部標準物）などの分析物の相対または絶対レベルを決定することを意味する。本明細書に記載されるアッセイ方法は、例えば、ホルマリン固定組織などの患者由来または対象由来の組織を採用する際に、癌の病期の決定を助けるものとして使用することができる。また、本明細書に記載されるＳＲＭ／ＭＲＭアッセイも、その患者または対象の処置における使用に際してどの治療剤が最も有利であり得るかの決定を助けるものとして使用することができる。
【００１３】
本明細書に記載される癌に関連するタンパク質のレベルを検査するために、腫瘍の一部もしくは全体の外科的摘出または疑わしい疾患の有無を決定するために行われる生検法のいずれかを通して、患者または対象から摘出された癌性組織または癌性である疑いのある組織に対して分析を行うことができる。組織の試料を分析して、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質（複数可）のうちの１つ以上が患者の組織または対象の組織中に存在するかどうか、及びそれらのタンパク質のどの形態が存在するかを決定する。さらには、それらのタンパク質のうちの１つ以上の発現レベルを決定し、健常組織中に見出される「正常」または基準レベルと比較することができる。健常組織中に見出されるタンパク質の正常または基準レベルは、例えば、癌を有さない１つ以上の個体の関連組織に由来してよい。あるいは、正常または基準レベルは、癌に罹患していない関連組織（例えば、同じ器官の部分）の分析によって、癌を有する個体に対して得られてよい。
【００１４】
タンパク質またはペプチドのレベルもしくは量は、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイにより決定されるタンパク質またはペプチドのモル、質量、もしくは重量で表される量として定義することができる。このレベルもしくは量は、分析される溶解物中のタンパク質または別の構成成分の総レベルもしくは量に正規化され得るか（例えば、マイクロモル／タンパク質のマイクログラム、またはマイクログラム／タンパク質のマイクログラムで表される）、またさらには１重量基準当たりでＤＮＡの量に正規化され得る（例えば、マイクロモルまたはマイクログラム／ＤＮＡのマイクログラム）。加えて、タンパク質またはペプチドのレベルもしくは量は、例えば、マイクロモルまたはナノグラム／マイクロリットルで表される、体積基準で決定されてよい。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイによって決定されるタンパク質またはペプチドのレベルもしくは量を、分析される細胞の数に正規化することもできる。ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質、ならびにこれらのタンパク質のイソ型に関する情報を使用して、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／もしくはＴＯＰＯ２Ａタンパク質、ならびにそれらのイソ型、または断片ペプチドのレベルを、正常組織中で観察されるレベルと相関させるかまたは比較することにより、癌の組織学的病期またはグレードの決定を助けることができる。一旦癌の組織学的病期及び／もしくはグレード、ならびに／またはＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質発現特性が決定されると、その情報は、例えば、アッセイされたタンパク質（複数可）（例えば、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａ）の異常発現を特徴とする癌組織を特異的に処置するために開発された（化学的及び生物学的）治療剤の一覧と照合させることができる。特定の個体からのＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質アッセイからの情報を、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質（複数可）を発現している細胞／組織を特異的に標的とする治療剤の一覧と照合することは、癌を処置するための個別化医療手法を表す。本明細書に記載されるアッセイ方法は、診断及び処置決定のための源として患者または対象自身の組織からのタンパク質の分析を用いることにより個別化医療手法の基盤を形成する。
【００１５】
ペプチド生成
原理的には、既知の特異性の任意のタンパク質分解プロセスによって調製される、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質に由来する任意の予測されるペプチドが、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質の存在量を決定するための代理レポーターとして使用されてよい。一実施形態では、試料は、既知の特異性のプロテアーゼ（１つまたは複数）（例えば、トリプシン及び／またはエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃのうちの１つ以上）で消化される。タンパク質分解処理から生じる１つ以上のペプチドを代理レポーターとして使用して、質量分析ベースのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイなどの好適なアッセイにおいて、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質のうちの１つ以上の存在量を決定することができる。同様に、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質中で修飾されることが知られている部位にアミノ酸残基を含有する、任意の予測されるペプチド配列を使用して、試料中のＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質の修飾の程度をアッセイしてもよい。
【００１６】
ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａ断片ペプチドは、米国特許第７，４７３，５３２号に提供されるＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）プロトコルの使用を含む様々な方法によって生成されてよい。Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）プロトコル及び試薬は、組織／生体試料中のタンパク質のタンパク質分解性消化により、ホルマリン固定パラフィン包埋組織から質量分光分析に適したペプチド試料を作製することができる。Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）プロトコルでは、組織／生体は、緩衝液中で、高温で長期間（例えば、約８０℃〜約１００℃で、約１０分間〜約４時間の期間にわたって）維持されて、タンパク質架橋を逆転または解放する。採用される緩衝液は、中性緩衝液（例えば、トリスベース緩衝液、または洗剤含有緩衝液）であり、有利には、質量分析の妨げとならない緩衝液である。次に、組織／生体試料を、前記生体試料の組織及び細胞構造を破壊し、前記試料を液化するのに十分な時間（例えば、約３７℃〜約６５℃の温度で約３０分〜約２４時間の期間）にわたって、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、及びエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃを含むが、これらに限定されない１つ以上のプロテアーゼで処理する。加熱及びタンパク質分解の結果物は、液体で、可溶性で、希釈可能な生物分子溶解物である。一組の実施形態では、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、及びエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃから選択される２つ以上のプロテアーゼを、生体試料のタンパク質分解処理に採用する。
【００１７】
ペプチド分離及びアッセイ
一旦溶解物が調製されると、試料中のペプチドは、それらの分析及び測定（定量化）を促進する様々な技術に供されてよい。分析を質量分析により行う場合、分析を促進するために、１つ以上のクロマトグラフ法を採用してよい。
【００１８】
一実施形態では、ペプチドは、質量分析装置による分析の前に、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）によって分離される。例えば、ペプチドを、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｏ  ９０Å  Ｃ１２、４μｍ樹脂（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、カリフォルニア州トーランス）で１２ｃｍのベッド長さに自己充填したＰｉｃｏＦｒｉｔ（１００μｍ  ＩＤ／１０μｍ先端ＩＤ、Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）カラムを用いて、ｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ、マサチューセッツ州ミルフォード）またはＥＡＳＹ−ｎＬＣ  ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カリフォルニア州サンノゼ）上で分離することができる。ペプチドを、８００ｎＬ／分の流速で、０．１％ギ酸を含有する１％〜５０％アセトニトリルの１２分のクロマトグラフィー勾配にわたって溶出することができる。液体クロマトグラフィーによって一旦分離されると、溶出されたペプチドは、分析のために質量分析計内へと導かれる。一実施形態では、質量分析計は、ナノスプレー源を備える。
【００１９】
別の実施形態では、ペプチドは、親和性技術、例えば、免疫学ベースの精製（例えば、免疫親和性クロマトグラフィー）、イオン選択培地におけるクロマトグラフィー、またはペプチドが修飾されている場合は、炭水化物修飾ペプチドの分離のためのレクチンなどの適切な媒体を使用した分離などによって分離されてよい。さらに別の実施形態では、質量分光分析の前にペプチドの免疫学的分離を採用するＳＩＳＣＡＰＡ法が採用される。ＳＩＳＣＡＰＡ技術は、例えば、米国特許第７，６３２，６８６号に記載されている。さらに他の実施形態では、レクチン親和性法（例えば、親和性精製及び／またはクロマトグラフィーを使用して、質量分析による分析の前に溶解物からペプチドを分離してよい。レクチンベースの方法を含む、ペプチド群の分離のための方法は、例えば、Ｇｅｎｇら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ，７５２：２９３−３０６（２００１）に記載されている。免疫親和性クロマトグラフィー技術、レクチン親和性技術、ならびに親和性分離及び／またはクロマトグラフィーの他の形態（例えば、逆相、サイズベースの分離、イオン交換）は、質量分析によるペプチドの分析を促進するために任意の好適な組み合わせで用いてよい。
【００２０】
驚くべきことに、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質由来の多くの可能性のあるペプチド配列は、質量分析ベースのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイでの使用に不適切であるかまたは効果がないことが見出されたが、理由は明らかになっていない。具体的には、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質由来の多くのトリプシンペプチドが、ホルマリン固定、パラフィン包埋組織由来のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物中で、効率的に検出または全く検出され得なかったことが見出された。ＭＲＭ／ＳＲＭアッセイに最も好適なペプチドを予測することができなかったため、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質のための信頼できる及び正確なＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するために、実際のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物中の修飾及び非修飾ペプチドを実験的に同定する必要があった。いかなる理論にも束縛されることを望まないが、いくつかのペプチドは、うまくイオン化しないか、または他のタンパク質とは異なる断片を生成せず、ペプチドはまた分離（例えば、液体クロマトグラフィー）中にうまく分解できないか、またはガラスもしくはプラスチック製品に付着する可能性があるため、例えば、質量分析によって検出することが困難である可能性があると考えられている。したがって、ホルマリン固定組織試料から調製されたＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物（例えば、表１及び２中のペプチド）中に検出することができる、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質由来のそれらのペプチドは、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイをＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイにおいて採用することができるペプチドである。一実施形態では、単一の試料中のＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質の断片の同時調製に採用されるプロテアーゼは、トリプシンであるだろう。
【００２１】
本明細書に記載される様々な実施形態（例えば、表１及び／または２）に見出されるＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａペプチドは、ホルマリン固定癌組織から得た細胞から調製された複合Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物中の全タンパク質のトリプシン消化により、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質に由来した。別段の指定がなければ、それぞれの例で、プロテアーゼはトリプシンであった。次いで、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物を質量分析によって分析して、質量分析によって検出及び分析されるＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質由来のペプチドを決定した。質量分光分析用の特定の好ましいサブセットのペプチドの同定は、次の項目、すなわち１）タンパク質由来のどのペプチド（１つまたは複数）がＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物の質量分析においてイオン化するかの実験的決定、及び２）Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物を調製するのに使用されるプロトコル及び実験条件を生き残るペプチドの能力に基づく。この後者の特性は、ペプチドのアミノ酸配列のみならず、試料調製の間に修飾された形態で生き残るペプチド内の修飾アミノ酸残基の能力までも及ぶものである。
【００２２】
ホルマリン（ホルムアルデヒド）固定組織から直接得た細胞からのタンパク質溶解物を、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）試薬及びプロトコルを用いて調製し、これは、組織の顕微解剖を介して試料管に細胞を収集し、続いて、細胞をＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）緩衝液中で長期間加熱することを伴う。一旦ホルマリン誘導性架橋がマイナスの影響を受けると、組織／細胞は、例えばプロテアーゼトリプシンを含むがこれらに限定されないプロテアーゼを使用して、予測可能な様式で完全に消化される。各タンパク質溶解物は、プロテアーゼを用いたインタクトなポリペプチドの消化により一群のペプチドへと変化する。各Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物を（例えば、イオントラップ質量分析により）分析して複数のペプチドの包括的プロテオミック調査を実施した。この場合、各タンパク質溶解物中に存在する全細胞性タンパク質から質量分析により同定され得る可能な限り多くのペプチドを同定するものとして、データを提示した。単一の複合タンパク質／ペプチド溶解物からできる限り多くのペプチドを同定するためのイオントラップ質量分析計または包括的プロファイリングを実施することができる別の形態の質量分析計が、分析に典型的に用いられる。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを、ＭＡＬＤＩ、イオントラップ、または三連四重極を含む任意の種類の質量分析計で開発及び実行することができるが、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ用の最も都合のよい装置プラットフォームは、三連四重極装置プラットフォームであると考えられることが多い。
【００２３】
採用された条件下で、単一の溶解物の単一ＭＳ分析にて一旦可能な限り多くのペプチドが同定されると、ペプチドの一覧が照合され、その溶解物中で検出されたタンパク質を判定するために使用した。そのプロセスは、複数のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物に対して繰り返され、ペプチドの非常に長い一覧を単一のデータセットに並べた。その種類のデータセットは、（プロテアーゼ消化後に）分析されたその種類の生体試料中で、具体的には生体試料のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物中で検出されることができ、ゆえに、例えば、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質などの特定のタンパク質に対するペプチドを含むペプチドを表すと見なすことができる。
【００２４】
一実施形態では、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａトリプシンペプチドは、ＥＮＴ１（例えば、ＮＣＢＩ受託番号Ｑ９９８０８、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７）、ＥＲＣＣ１（例えば、ＮＣＢＩ受託番号Ｐ０７９９２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６）、ＦＯＬＲ１（例えば、ＮＣＢＩ受託番号Ｐ１５３２８、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０）、ＲＲＭ１（例えば、ＮＣＢＩ受託番号Ｐ２３９２１、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７）、ＴＯＰＯ１（例えば、ＮＣＢＩ受託番号Ｐ１１３８７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８）、ＴＯＰＯ２Ａ（例えば、ＮＣＢＩ受託番号Ｐ１１３８８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１）及び／またはＴＵＢＢ３（例えば、ＮＣＢＩ受託番号Ｑ１３５０９、配列番号１０２、配列番号１０３）の絶対または相対量の決定において有用であると同定され、そのそれぞれが表１に列記される。これらのペプチドのそれぞれは、ホルマリン固定、パラフィン包埋組織から調製されるＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物における質量分析によって検出された。ゆえに、表１中のペプチドのそれぞれ、またはそれらのペプチドの任意の組み合わせ（例えば、表１に列挙されるこれらのペプチドのうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、または７つ以上、８つ以上、９つ以上、または１０以上）は、直接的にホルマリン固定患者または対象組織中を含む、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質の定量的ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイにおける使用のための候補である。
【００２５】
【表１】
0006670288.tif 000002
0006670288.tif 000003
0006670288.tif 000004
【００２６】
表１に列記されるＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａペプチドは、前立腺、結腸、及び乳房を含む異なるヒト器官の複数の異なるホルマリン固定組織の複数のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物から検出されたものを含む。これらのペプチドのそれぞれは、ホルマリン固定組織中のＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質の定量的ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイに有用であると見なされる。これらの実験のさらなるデータ分析は、いずれの特定の器官部位に由来するいずれの特定のペプチドに対しても、選択性は観察されなかったことを示した。このため、これらのペプチドのそれぞれは、任意の生体試料または体内の任意の器官部位に由来する任意のホルマリン固定組織からのＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物でのＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを実施するに好適であると考えられる。
【００２７】
別の実施形態では、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、（例えば、表１中に列記されるペプチドから）ＴＯＰＯ２Ａ及びＴＯＰＯ１のそれぞれに対して１つまたは２つのペプチドを採用する。別の実施形態では、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、（例えば、表１中に列記されるペプチドから）ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１及び／またはＴＵＢＢ３のそれぞれに対して１つまたは２つのペプチドを採用する。
【００２８】
他の実施形態では、ＥＮＴ１及びＥＲＣＣ１タンパク質の一方または両方をアッセイし、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質のうちの１つ、２つ、３つ、もしくは４つを、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ（複数可）を使用してアッセイする。そのような実施形態の一例では、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１タンパク質の一方もしくは両方に対する少なくとも１つのペプチドまたは少なくとも２つのペプチドを、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイによってアッセイし（例えば、表１中に列記されるＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１ペプチド）、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａのうちのいずれか１つ、２つ、３つ、または４つに対する少なくとも１つのペプチドまたは少なくとも２つのペプチドをアッセイする（例えば、表１中に列記されるペプチド）。そのような実施形態の別の例では、ＥＮＴ及びＲＲＭ１タンパク質のうちの一方もしくは両方に対する少なくとも１つまたは少なくとも２つのペプチドを、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイによってアッセイし（例えば、表１中に列記されるペプチド）、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａのうちのいずれかに対する少なくとも１つまたは少なくとも２つのペプチドをアッセイする（例えば、表１中に列記されるペプチド）。同位体標識されているが、それ以外はこれらの実施形態のうちのいずれかに記載されるペプチドのうちの１つ以上と同一であるペプチドを含む組成物が、本明細書に提供され、それらの調製使用、具体的には質量分析標準物質としての使用が以下に記載される。
【００２９】
一実施形態では、表１中の１つ以上のペプチド、またはこれらのペプチドの任意の組み合わせ（例えば、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上）が、免疫学的方法（例えば、ウエスタンブロット法またはＥＬＩＳＡ）を含むが、これらに限定されない質量分析に依存しない方法によりアッセイされる。一実施形態では、アッセイは、ホルマリン固定組織を用いて実施される。ペプチド（複数可）（絶対的または相対的）の量に向けられた情報がどのように得られるかにかかわらず、この情報は、患者もしくは対象の癌の存在を示す（診断する）こと、癌の病期／グレード／状態を決定すること、予後を提示すること、または患者もしくは対象のための治療もしくは処置レジメンを決定することを含む、本明細書に記載される方法のいずれかにおいて採用してよい。
【００３０】
他の実施形態では、免疫学的方法（例えば、ウエスタンブロット法またはＥＬＩＳＡ）を含むが、これらに限定されない質量分析に依存しない方法により、ＥＮＴ１及びＥＲＣＣ１タンパク質の一方または両方をアッセイし、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質のうちの１つ、２つ、３つ、または４つをアッセイする。そのような実施形態の一例では、ＥＮＴ１及びＥＲＣＣ１タンパク質の一方または両方に対する少なくとも１つまたは少なくとも２つのペプチドをアッセイし（例えば、表１中に列記されるＥＮＴ１及びＥＲＣＣ１ペプチド）、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、または４つに対する少なくとも１つまたは少なくとも２つのペプチドをアッセイする（例えば、表１中に列記されるペプチド）。そのような実施形態の別の例では、ＦＯＬＲ１及びＲＲＭ１タンパク質の一方または両方に対する少なくとも１つまたは少なくとも２つのペプチドを（例えば、表１中に列記されるＦＯＬＲ１及びＲＲＭ１ペプチド）、及び、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及びＴＯＰＯ２Ａタンパク質のいずれかに対する少なくとも１つまたは少なくとも２つのペプチドをアッセイする（例えば、表１中に列記されるペプチド）。
【００３１】
ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを実施する際の重要な考慮すべきことは、ペプチドの分析に採用してよい装置の種類である。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、ＭＡＬＤＩ、イオントラップ、または三連四重極を含む任意の種類の質量分析計において開発及び実行することができるが、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ用の現在最も都合のよい装置プラットフォームは、三連四重極装置プラットフォームであると考えられることが多い。その種類の質量分析計が、細胞内に含まれる全タンパク質からの何十万から何百万の個別のペプチドからなり得る極めて複雑化したタンパク質溶解物内で単一の単離標的ペプチドを分析するための最も好適な装置であると考えられ得る。
【００３２】
ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質由来の各ペプチドに対するＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを最も効率よく実施するためには、分析においてペプチド配列に加えて情報を利用することが望ましい。そのさらなる情報は、アッセイが効率的に行われ得るように、特定の標的化ペプチド（複数可）の、正しい、焦点を当てた分析を行うように、質量分析計（例えば、三連四重極質量分析計）を指示し、それに命令を与える際に用いてよい。
【００３３】
一般に、標的ペプチド、ならびに特定のＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａペプチドに関するさらなる情報は、各ペプチドのモノアイソトピック質量、その前駆物質電荷状態、前駆物質ｍ／ｚ値、ｍ／ｚ遷移イオン、及び各遷移イオンのイオン型のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上を含んでよい。ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質に対するＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するために使用してよいさらなるペプチド情報を、表１中の一覧からの１２（１２）個のＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａペプチドについて表２中に示す。表２に示されるペプチドについて記載されるこのさらなる情報は、準備され、獲得され、及び他のプロテアーゼまたはプロテアーゼの組み合わせ（例えば、トリプシン及び／またはＬｙｓ  Ｃ）の作用によって産生されるものを含む、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質由来の任意の他のペプチドの分析に適用されてよい。
【００３４】
【表２】
0006670288.tif 000005
0006670288.tif 000006
0006670288.tif 000007
【００３５】
いくつかの実施形態では、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質のアッセイに好適なペプチド（例えば、表１に記載され、配列番号１〜１０３として示されるペプチド）は、切断されるとサブペプチドを産生し得るペプチド配列の内部にさらなるタンパク質分解部位を含有してよい。そのようなサブペプチドは、所望のプロテアーゼのタンパク質分解切断部位に対して同定されたペプチドの配列を評価することにより認識可能である。一実施形態では、トリプシンペプチドは、トリプシンによるさらなる切断の際にサブペプチドをもたらすことができる追加の内部トリプシン切断部位を含んでよい。
【００３６】
別の実施形態では、トリプシンペプチドは、トリプシン、ＧｌｕＣ、ＡｓｐＮ、キモトリプシン、及び／またはＬｙｓ  Ｃのうちのいずれか１つ、２つ、またはそれ以上による切断の際にサブペプチドの形成をもたらすことができる、トリプシンＧｌｕＣ、ＡｓｐＮ、キモトリプシン、及び／またはＬｙｓ  Ｃを含むが、これらに限定されないプロテアーゼのための内部部位を含有してよい。別の実施形態では、Ｌｙｓ  Ｃペプチドは、ＧｌｕＣ、ＡｓｐＮ、キモトリプシン、及び／またはトリプシンのうちのいずれか１つ、２つ、またはそれ以上による切断の際にサブペプチドの形成をもたらすことができる、ＧｌｕＣ、ＡｓｐＮ、キモトリプシン、及び／またはトリプシンなどの他のプロテアーゼのための内部部位を含有してよい。そのようなサブペプチド、及び具体的には、配列番号１〜１０３に記載されるペプチドのうちのいずれか１つ以上のトリプシン、ＧｌｕＣ、ＡｓｐＮ、キモトリプシン、及び／またはＬｙｓＣ切断断片が、記載され、本開示の範囲内であることが理解される。
【００３７】
本明細書に記載される実施形態は、表１及び２中のペプチドのうちの１つ以上を含む組成物を含み、同位体標識されているが、それ以外は表１及び２中に見いだされるペプチドのうちの１つ以上と同一であるペプチドを任意で含んでよい。いくつかの実施形態では、組成物は、表１及び２中のペプチドのうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、または１０３（１０３）すべてを含む。そのような組成物は、アミノ酸配列が、同位体標識されているが、それ以外は表１及び表２中に見出されるペプチドのうちの１つ以上と同一であるペプチドを含む、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を任意で含んでよい。表１及び２中のペプチドのうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ以上を含む、同位体標識された合成もしくは天然のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質が採用される場合、プロテアーゼ処理は、同位体標識されているが、それ以外は表１及び２中のペプチドと同一であるペプチドを解放する。
【００３８】
そのような同位体標識された生物学的または生合成ペプチドは、同位体標識されたアミノ酸を使用して、例えば、プログラムされた細胞溶解物中または組織培養物中で調製されてよい。同位体標識ペプチドのそれぞれは、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈ、またはそれらの組み合わせからなる群より独立して選択される１つ以上の同位体で標識されてよい。ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質由来のペプチドを含む組成物は、同位体標識されていてもいなくても、そのタンパク質由来のペプチドのすべて（例えば、トリプシンペプチドの完全なセット）を含有する必要はない。いくつかの実施形態では、組成物は、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質から組み合わせたすべてのペプチド、特に、表１及び表２中に表示されているペプチドのすべてを含有するわけではない。ペプチドを含有する組成物は、乾燥もしくは凍結乾燥した材料、液体（例えば、水性）溶液もしくは懸濁液、アレイ、またはブロットの形態であってよい。
【００３９】
一実施形態では、特定のＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａペプチドに関するさらなる情報は、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質のＬｙｓ  Ｃタンパク質分解から生じるペプチドに対する、各ペプチドのモノアイソトピック質量、その前駆物質電荷状態、前駆物質ｍ／ｚ値、ｍ／ｚ遷移イオン、及び各遷移イオンのイオン型のうちの１つ以上、２つ以上、または３つ以上を含む。
【００４０】
別の実施形態では、特定のＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａペプチドに関するさらなる情報は、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質のトリプシンタンパク質分解から生じるペプチドに対する、各ペプチドのモノアイソトピック質量、その前駆物質電荷状態、前駆物質ｍ／ｚ値、ｍ／ｚ遷移イオン、及び各遷移イオンのイオン型のうちの１つ以上、２つ以上、または３つ以上を含む。
【００４１】
さらに別の実施形態では、特定のＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａペプチドに関するさらなる情報は、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質のトリプシン及び／またはＬｙｓ  Ｃタンパク質分解から生じるペプチドに対する、各ペプチドのモノアイソトピック質量、その前駆物質電荷状態、前駆物質ｍ／ｚ値、ｍ／ｚ遷移イオン、及び各遷移イオンのイオン型のうちの１つ以上、２つ以上、または３つ以上を含む。一実施形態では、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質のそれぞれ由来の単一のトリプシン及び／またはＬｙｓ  Ｃタンパク質分解ペプチドは、関連するさらなる情報とともに、診断決定に採用される。
【００４２】
ある特定の実施形態
本発明のある特定の実施形態を以下に記載する。
【００４３】
１．生体試料中のＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質のレベルを測定するための方法であって、質量分析を使用して前記生体試料から調製されたタンパク質消化物中の１つ以上の修飾及び／または非修飾ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質断片ペプチドの量を検出及び／または定量化すること、並びに前記試料中の修飾または非修飾ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質のレベルを算出することを含み、前記量が相対量または絶対量である、前記方法。
【００４４】
２．１つ以上の修飾または非修飾ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質断片ペプチドの量を検出及び／または定量化する前に、前記タンパク質消化物を分画するステップをさらに含む、実施形態１に記載の方法。
【００４５】
３．前記分画ステップが、ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、または逆相高速液体クロマトグラフィーからなる群より選択される、実施形態２に記載の方法。
【００４６】
４．前記生体試料の前記タンパク質消化物が、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）プロトコルによって調製される、実施形態１〜３のいずれかに記載の方法。
【００４７】
５．前記タンパク質消化物が、プロテアーゼ消化物を含む、実施形態１〜３のいずれかに記載の方法。
【００４８】
６．前記タンパク質消化物が、トリプシン及び／またはｌｙｓ  Ｃ消化物を含む、実施形態５に記載の方法。
【００４９】
７．前記質量分析が、タンデム質量分析、イオントラップ質量分析、三連四重極質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析、ＭＡＬＤＩ質量分析、及び／または飛行時間型質量分析を含む、実施形態１〜６のいずれかに記載の方法。
【００５０】
８．使用される質量分析のモードが、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、及び／または複数選択反応モニタリング（ｍＳＲＭ）、またはそれらの任意の組み合わせである、実施形態７に記載の方法。
【００５１】
９．該ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質断片ペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、及び配列番号１０３として記載されるアミノ酸配列を含む、実施形態１〜８のいずれかに記載の方法。
【００５２】
１０．該生体試料が、血液試料、尿試料、血清試料、腹水試料、喀痰試料、リンパ液、唾液試料、細胞、または固形組織である、実施形態１〜９のいずれかに記載の方法。
【００５３】
１１．該生体試料がホルマリン固定組織である、実施形態１〜１０のいずれかに記載の方法。
【００５４】
１２．該生体試料がパラフィン包埋組織である、実施形態１〜１１のいずれかに記載の方法。
【００５５】
１３．該生体試料が腫瘍から得られる組織である、実施形態１〜１２のいずれかに記載の方法。
【００５６】
１４．該腫瘍が原発腫瘍である、実施形態１３に記載の方法。
【００５７】
１５．該腫瘍が二次腫瘍である、実施形態１３に記載の方法。
【００５８】
１６．修飾及び／または非修飾ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質断片ペプチドを定量化することをさらに含む、実施形態１〜１５のいずれかに記載の方法。
【００５９】
１７（ａ）．ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質断片ペプチドを定量化することが、１つの生体試料中のＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質の約８〜約４５個のアミノ酸残基のアミノ酸配列を含む１つ以上のＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質断片ペプチドの量を、異なる別個の試料または生体試料中の同一のＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質断片ペプチドの量と比較することを含む、実施形態１〜１６のいずれかに記載の方法。
【００６０】
１７（ｂ）．ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質断片ペプチドを定量化することが、１つの生体試料中の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、及び配列番号１０３に示されるＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質の約８〜約４５個のアミノ酸残基のアミノ酸配列を含む１つ以上のＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質断片ペプチドの量を、異なる別個の生体試料中の同一のＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質断片ペプチドの量と比較することを含む、実施形態１〜１６のいずれかに記載の方法。
【００６１】
１８．１つ以上のＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質断片ペプチドを定量化することが、生体試料中のＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質断片ペプチドのそれぞれの量を、既知量の添加内部標準ペプチドへの比較によって決定することを含み、該生体試料中のＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質断片ペプチドがそれぞれ、同一のアミノ酸配列を有する添加内部標準ペプチドと比較される、実施形態１７（ａ）または１７（ｂ）に記載の方法。
【００６２】
１９．該内部標準ペプチドが、同位体標識ペプチドである、実施形態１８に記載の方法。
【００６３】
２０．該同位体標識内部標準ペプチドが、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈ、またはそれらの組み合わせから選択される１つ以上の重安定同位体を含む、実施形態１９に記載の方法。
【００６４】
２１．該タンパク質消化物中の１つ以上の修飾または非修飾ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質断片ペプチドの量を検出及び／または定量化することが、修飾及び／または非修飾ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質の存在、ならびに患者または対象における癌との関連性を示す、実施形態１〜２０のいずれかに記載の方法。
【００６５】
２２．１つ以上の修飾及び／または非修飾ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質断片ペプチドの量、または前記ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質の量の前記検出及び／または定量化の結果を、該癌の診断上の病期／グレード／状態と相関させることをさらに含む、実施形態２１に記載の方法。
【００６６】
２３．１つ以上の修飾または非修飾ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質断片ペプチドの量、または前記ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質の量の前記検出及び／または定量化の結果を、該癌の診断上の病期／グレード／状態と相関させることが、他のタンパク質または他のタンパク質由来のペプチドの量を検出及び／または定量化することと多重形式で組み合わされて、該癌の診断上の病期／グレード／状態に関するさらなる情報を提供する、実施形態２２に記載の方法。
【００６７】
２４．前記生体試料が得られた患者または対象のために、１つ以上のＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質断片ペプチドの有無もしくは量、またはＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質の量に基づいて、処置を選択することをさらに含む、実施形態１〜２３のいずれかに記載の方法。
【００６８】
２５．前記生体試料を得られた患者または対象に、治療有効量の治療剤を投与することをさらに含み、該治療剤及び／または投与される該治療剤の量が、１つ以上の修飾または非修飾ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質断片ペプチドの量、またはＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質の量に基づく、実施形態１〜２４のいずれかに記載の方法。
【００６９】
２６．該処置または該治療剤が、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質を発現する癌細胞に指向される、実施形態２４及び２５に記載の方法。
【００７０】
２７．該生体試料が、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）プロトコル及び試薬を採用して１つ以上の修飾または非修飾ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質断片ペプチドの量を定量化するために処理されているホルマリン固定腫瘍組織である、実施形態１〜２７のいずれかに記載の方法。
【００７１】
２８．前記１つ以上の修飾または非修飾ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質断片ペプチドが、表１中のペプチドのうちの１つ以上である、実施形態１〜２８のいずれかに記載の方法。
【００７２】
２９．表１中のペプチドのうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、もしくは１０以上、及び／またはそれらに対する抗体を含む組成物。
【００７３】
３０．表２のペプチドのうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、もしくは１０以上、またはそれらに対する抗体を含む、実施形態３０に記載の組成物。
【００７４】
例示的なＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ方法
以下に記載される方法は、１）ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質についての質量分析ベースのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイのために使用することができるＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質由来の候補ペプチドを同定し、２）ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質由来の標的ペプチドのための個別のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ（１つまたは複数）を開発し、３）定量アッセイを癌診断及び／または最適治療の選択に適用するために使用された。
【００７５】
１．ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質のためのＳＲＭ／ＭＲＭ候補断片ペプチドの同定：
ａ．プロテアーゼ（１つまた複数）（トリプシンを含んでも含まなくてもよい）を使用して、ホルマリン固定生体試料からＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）タンパク質溶解物を調製して、タンパク質を消化する
ｂ．イオントラップタンデム質量分析計で、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物中の全タンパク質断片を分析し、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質由来の全断片ペプチドを同定し、この場合、個別の断片ペプチドは、リン酸化またはグリコシル化などのいかなるペプチド修飾も含有しない
ｃ．イオントラップタンデム質量分析計で、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物中の全タンパク質断片を分析し、例えば、リン酸化またはグリコシル化残基などのペプチド修飾を有するＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質由来の全断片ペプチドを同定する
ｄ．完全長ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質全体から特定の消化方法により生成された全ペプチドは、潜在的に測定可能であるが、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの開発に使用される好ましいペプチドは、ホルマリン固定生体試料から調製された複合Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）タンパク質溶解物中で直接的に質量分析により同定されるものである
ｅ．患者または対象組織中で特異的に修飾され（リン酸化、グリコシル化等）、イオン化し、ゆえに、ホルマリン固定生体試料からのＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物を分析するときに、質量分析計において検出することができるペプチドは、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質のペプチド修飾をアッセイするための候補ペプチドとして同定される。
２．ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質由来の断片ペプチドのための質量分析アッセイ
ａ．Ｌｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物中で同定された個別の断片ペプチドのための三連四重極質量分析計でのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質由来のペプチドに適用する
ｉ．ゲル電気泳動法、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動法、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、または逆相高速液体クロマトグラフィーが含まれるが、これらに限定されない、最適なクロマトグラフィー条件のための断片ペプチドに対する最適保持時間を決定する
ｉｉ．各ペプチドに対するＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するために、ペプチドのモノアイソトピック質量、各ペプチドに対する前駆物質電荷状態、各ペプチドに対する前駆物質ｍ／ｚ値、各ペプチドに対するｍ／ｚ遷移イオン、及び各断片ペプチドに対する各遷移イオンのイオン型を決定する。
ｉｉｉ．次いで、（ｉ）及び（ｉｉ）からの情報を用いて、三連四重極質量分析計でＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを行うことができ、この場合、各ペプチドは、三連四重極質量分析計で行われるときに固有のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを的確に規定する特徴的及び固有のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピークを有する。
ｂ．ＳＲＭ／ＭＲＭ質量分析の分析から固有のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積の関数として、検出されるＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質の断片ペプチドの量が、特定のタンパク質溶解物中のＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質の相対及び絶対量の両方を示すことができるように、ＳＲＭ／ＭＲＭ分析を行う。
ｉ．相対的定量化は、以下により達成され得る：
１．１つのホルマリン固定生体試料からのＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物中で検出された所与のＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２ＡペプチドからのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積を、少なくとも第２、第３、第４、またはそれを超えるホルマリン固定生体試料からの少なくとも第２、第３、第４、またはそれを超えるＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物中の同一のＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａ断片ペプチドの同一のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積と比較することにより、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質の存在の増加または減少を決定すること
２．１つのホルマリン固定生体試料からのＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物中で検出された所与のＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２ＡペプチドからのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積を、異なる別個の生物学的源由来の他の試料中の他のタンパク質由来の断片ペプチドから発生したＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積と比較することにより、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質の存在の増加または減少を決定し、この場合、ペプチド断片に対する２つの試料間のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積の比較は、各試料中で分析されたタンパク質の量に正規化される。
３．ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質の変化するレベルを、様々な細胞条件下でのそれらの発現レベルを変化させない他のタンパク質のレベルに正規化するために、所与のＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２ＡペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積を、ホルマリン固定生体試料からの同一のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物中の異なるタンパク質に由来する他の断片ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積と比較することにより、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質の存在の増加または減少を決定すること。
４．これらのアッセイは、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質の非修飾断片ペプチド、ならびに修飾断片ペプチドの両方に適用することができ、この場合、修飾は、限定されないが、リン酸化及び／またはグリコシル化を含み、修飾ペプチドの相対レベルは、非修飾ペプチドの相対量を決定するのと同一の様式で決定される。
ｉｉ．所与のペプチドの絶対定量化は、個別の生体試料中のＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質由来の所与の断片ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積を、生体試料からのタンパク質溶解物中にスパイクされた内部断片ペプチド標準物のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積と比較することにより、達成され得る
１．内部標準物は、調べられているＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質由来の断片ペプチドの標識された合成バージョンである。この標準物は、既知量で試料中にスパイクされ、ＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積は、生体試料中の内部断片ペプチド標準物及び天然断片ペプチドの両方に対し、別々に決定することができ、その後、両方のピーク面積を比較することができる
２．これは、非修飾断片ペプチド及び修飾断片ペプチドに適用することができ、この場合、修飾は、限定されないが、リン酸化及び／またはグリコシル化を含み、修飾ペプチドの絶対レベルは、非修飾ペプチドの絶対的量を決定するのと同一の様式で決定することができる。
３．癌診断及び処置への断片ペプチド定量化の適用
ａ．ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質の断片ペプチドレベルの相対及び／または絶対定量化を行い、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質発現の、患者または対象の腫瘍組織における癌の病期／グレード／状態に対する、以前に決定され、ならびに癌の分野で十分に理解されている、関連性が確認されることを実証する
ｂ．ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質の断片ペプチドレベルの相対及び／または絶対定量化を行い、異なる処置戦略からの臨床転帰との相関を実証し、この場合、この相関は、この分野ですでに実証されているか、または患者もしくは対象のコホート、及びそれらの患者もしくは対象からの組織にわたる相関研究を通して将来実証することができる。一旦以前に確立された相関関係、または将来得られる相関関係のいずれかがこのアッセイにより確認されると、本アッセイ方法を使用して、最適な処置戦略を決定することができる。
【００７６】
内部標準物は、調べられているＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質由来の断片ペプチドの標識された合成バージョン（またはタンパク質分解の際に放出される断片ペプチドの標識された合成バージョンを含むタンパク質もしくはポリペプチド）である。この標準物は、既知量で試料中にスパイクされ、ＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積は、生体試料中の内部断片ペプチド標準物及び天然断片ペプチドの両方に対し、別々に決定することができ、その後、両方のピーク面積を比較することができる。これは、非修飾断片ペプチド及び修飾断片ペプチドに適用することができ、この場合、修飾は、限定されないが、リン酸化及び／またはグリコシル化を含み、修飾ペプチドの絶対レベルは、非修飾ペプチドの絶対的レベルを決定するのと同一の様式で決定することができる。
【００７７】
特定のペプチドに関する特異的及び固有の特徴は、イオントラップ及び三連四重極質量分析計の両方でのすべてのペプチドの分析により発生した。その情報には、ペプチドのモノアイソトピック質量、その前駆物質電荷状態、前駆物質ｍ／ｚ値、前駆物質の遷移ｍ／ｚ値、及び同定された遷移のそれぞれのイオン型が含まれる。その情報は、ホルマリン固定試料／組織からのＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解物中で直接的に各及びすべての候補ＳＲＭ／ＭＲＭペプチドについて実験的に決定されなければならない；なぜなら、興味深いことに、タンパク質由来のすべてのペプチドを、本明細書に記載のＳＲＭ／ＭＲＭを用いてそのような溶解物中で検出することができるわけではないからであり、このことは、検出されないペプチドは、ホルマリン固定試料／組織からのＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ溶解物中で直接的にペプチド／タンパク質を定量化することにおいて使用するためのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するための候補ペプチドとは考えることができないことを示している。
【００７８】
特定のペプチドのためのある特定のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを三連四重極質量分析計で行う。ある特定のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイにより分析される実験試料は、例えば、ホルマリン固定されパラフィン包埋されている組織から調製されるＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅタンパク質溶解物である。そのようなアッセイからのデータは、ホルマリン固定試料中のこのペプチドに対する固有のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピークの存在を示す。
【００７９】
このペプチドに特異的な遷移イオン特徴を使用して、ホルマリン固定生体試料中の特定のペプチドを定量的に測定する。これらのデータは、このペプチドの絶対量を分析されるタンパク質溶解物の１マイクログラムあたりのペプチドのモル量の関数として示す。
【００８０】
ホルマリン固定患者由来または対象由来の組織の分析に基づいた組織中のＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質レベルの評価は、それぞれの具体的な患者または対象に関する診断、予後、及び治療に関連する情報を提供することができる。生体試料中のＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質のレベルを測定するための方法であって、質量分析を使用して、前記生体試料から調製されたタンパク質消化物中の１つ以上の修飾または非修飾ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質断片ペプチドの量を検出及び／または定量化すること、及び前記試料中の修飾または非修飾ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質のレベルを算出することを含み、前記レベルが、相対レベルまたは絶対レベルである、前記方法を本明細書に記載する。関連する実施形態では、１つ以上のＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質断片ペプチドを定量化することは、既知量の添加内部標準ペプチドとの比較により、生体試料中のＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質断片ペプチドのそれぞれの量を決定することを含み、該生体試料中のＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質断片ペプチドはそれぞれ、同一のアミノ酸配列を有する内部標準ペプチドと比較される。いくつかの実施形態では、内部標準物は、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈ、またはそれらの組み合わせから選択される１つ以上の重安定同位体を含む、同位体標識内部標準ペプチドである。
【００８１】
本明細書に記載される生体試料中のＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質（または、そのサロゲートとしての断片ペプチド）のレベルを測定するための方法は、患者または対象における癌の診断上の指標として使用してよい。一実施形態では、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質のレベルの測定からの結果を採用して、組織中に見出されるＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質のレベルを、正常及び／または癌性もしくは前癌性組織中に見出されるＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質のレベルと相関させること（例えば、比較すること）により、癌の診断上の病期／グレード／状態を決定してよい。
【００８２】
ホルマリン固定患者組織中の特定のタンパク質のレベルを検出するために使用されている唯一の現行方法は、免疫組織化学（ＩＨＣ）である。この方法は、患者腫瘍組織試料からの単一の組織切片で１回につき１つのタンパク質のみを分析する。このため、複数のタンパク質を分析するためには、複数の組織切片を調べなければならず、それには多くの時間及び労力がかかる。ＩＨＣは、抗体を使用して標的タンパク質の存在を検出し、タンパク質への抗体の非特異的結合の可能性があるために、いかなるＩＨＣ実験においても信号バックグラウンドの大きな生来の可能性がある。加えて、ＩＨＣは、良くても半定量的でしかない。これらの問題に起因して、ＩＨＣは、複数のタンパク質の客観的な定量的分析を同時に提供することができない。本実施形態は、患者組織試料の単一の切片を利用して、１００％アッセイ特異性を伴って、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質の客観的定量化を同時に提供することができ、多くの時間及び費用を節約しながら、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質の発現に関するより一層価値のあるデータを提供する。
【００８３】
この多重ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ−１Ｒ、及びｃＭｅｔなどの薬物標的タンパク質を含む、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質以外の他のさらなるタンパク質の同時分析も含むことができる。これは、さらなるタンパク質の分析が、さらなる薬物のどれが特定の癌の処置に有用であり得るかということも示すので、価値がある。さらなる例となる薬物標的タンパク質の分析に基づいたさらなる薬物の例としては、ＥＧＦＲ受容体を標的とするアービタックス、ＩＧＦ−１Ｒを標的とするフィギツムマブ、及びｃ−Ｍｅｔ及び血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ−２）を標的とするフォレチニブ（Ｆｏｒｅｔｉｎｉｂ）が挙げられる。
【００８４】
核酸及びタンパク質の両方を同一のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）生体分子の調製物から分析することができるので、タンパク質が分析される際の同一の試料中の核酸から、疾患の診断及び薬物処置決定に関するさらなる情報を生成することが可能である。例えば、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質が、ある特定の細胞により増加したレベルで発現される場合、ＳＲＭによりアッセイされるとき、データは細胞の状態に関する情報を提供することができ、無秩序な増殖、潜在的な薬剤抵抗性及び癌の発生に対するそれらの可能性を得ることができる。同時に、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／もしくはＴＯＰＯ２Ａ遺伝子ならびに／またはそれらがコードする核酸及びタンパク質の状態に関する情報（例えば、ｍＲＮＡ分子及びそれらの発現レベルまたはスプライス変異体）を、同一のＬｉｑｕｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ（商標）生体分子の調製物中に存在する核酸から得ることができ、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質のＳＲＭ分析と同時に評価することができる。ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａからでなく、同じ生体分子の調製物中に存在する任意の遺伝子及び／または核酸は、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／またはＴＯＰＯ２Ａタンパク質のＳＲＭ分析と同時に評価することができる。一実施形態では、ＥＮＴ１、ＥＲＣＣ１、ＦＯＬＲ１、ＲＲＭ１、ＴＵＢＢ３、ＴＯＰＯ１、及び／もしくはＴＯＰＯ２Ａタンパク質、ならびに／または１つ、２つ、２つ、３つ、４つ以上のさらなるタンパク質に関する情報は、それらのタンパク質をコードする核酸を検査することによって分析され得る。これらの核酸を、例えば、シークエンシング法、ポリメラーゼ連鎖反応法、制限断片多型分析、欠失の同定、挿入、及び／または単一塩基対多型、遷移、塩基転換、もしくはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない、突然変異体の存在の決定のうちの１つ以上、２つ以上、または３つ以上により、調査することができる。
【００８５】
上記説明ならびに方法及び組成物の例示的な実施形態は、本開示の範囲を例示するものである。しかしながら、当業者には明らかであろう変形のため、本開示は、上に記載される特定の実施形態に限定されることを意図するものではない。
【配列表】
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