(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣＤ３εおよびヒトＲＯＲ１の細胞外ドメインに特異的に結合する二特異性抗体であって、
ａ）ヒトＲＯＲ１の細胞外ドメインに特異的に結合する第１のＦａｂであって、前記第１のＦａｂが第１の軽鎖および第１の重鎖を含み、前記第１の軽鎖が可変ドメインＶＬおよび定常ドメインＣＬを含み、前記第１の重鎖が可変ドメインＶＨおよび定常ドメインＣＨ１を含む、第１のＦａｂと；
ｂ）ヒトＣＤ３εに特異的に結合する第２のＦａｂであって、前記第２のＦａｂが第２の軽鎖および第２の重鎖を含み、前記第２の軽鎖が、可変ドメインＶＨおよび定常ドメインＣＬを含むクロスオーバー軽鎖であり、前記第２の重鎖が、可変ドメインＶＬおよび定常ドメインＣＨ１を含むクロスオーバー重鎖である、第２のＦａｂとを含み；
前記第１の軽鎖の前記定常ドメインＣＬ内で、１２３位におけるアミノ酸および１２４位におけるアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）、前記第１の重鎖の前記定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により独立に置換されている（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）、
二特異性抗体。
【請求項２】
ヒトＣＤ３εおよびヒトＲＯＲ１の細胞外ドメインに特異的に結合する二特異性抗体であって、
ａ）ヒトＲＯＲ１の細胞外ドメインに特異的に結合する第１のＦａｂであって、前記第１のＦａｂが第１の軽鎖および第１の重鎖を含み、前記第１の軽鎖が可変ドメインＶＬおよび定常ドメインＣＬを含み、前記第１の重鎖が可変ドメインＶＨおよび定常ドメインＣＨ１を含む、第１のＦａｂと；
ｂ）ヒトＣＤ３εに特異的に結合する第２のＦａｂであって、前記第２のＦａｂが第２の軽鎖および第２の重鎖を含み、前記第２の軽鎖が、可変ドメインＶＨおよび定常ドメインＣＬを含むクロスオーバー軽鎖であり、前記第２の重鎖が、可変ドメインＶＬおよび定常ドメインＣＨ１を含むクロスオーバー重鎖である、第２のＦａｂとを含み；
前記第２の軽鎖の前記定常ドメインＣＬ内で、１２３位におけるアミノ酸および１２４位におけるアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）、前記第２の重鎖の前記定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により独立に置換されている（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）、
二特異性抗体。
【請求項３】
さらに第３のＦａｂを含み、前記第３のＦａｂが前記第１のＦａｂと同一である、請求項１または請求項２に記載の二特異性抗体。
【請求項４】
（ａ）前記第２の軽鎖の前記可変ドメインＶＨが、配列番号２３、２４および２５の重鎖ＣＤＲを、それぞれ、抗ＣＤ３ε抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含み、前記第２の重鎖の前記可変ドメインＶＬが、配列番号２６、２７および２８の軽鎖ＣＤＲを、それぞれ、抗ＣＤ３ε抗体の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含み、任意選択で、前記可変ドメインが、配列番号２１および２２に示される配列を有するか；または
（ｂ）前記第２の軽鎖の前記可変ドメインＶＨが、配列番号１２、１３および１４の重鎖ＣＤＲを、それぞれ、抗ＣＤ３ε抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含み、前記第２の重鎖の前記可変ドメインＶＬが、配列番号１５、１６および１７の軽鎖ＣＤＲを、それぞれ、抗ＣＤ３ε抗体の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含み、任意選択で、前記可変ドメインが、配列番号１０および１１に示される配列を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
【請求項５】
前記１２４位におけるアミノ酸がＫであり、前記１４７位におけるアミノ酸がＥであり、前記２１３位におけるアミノ酸がＥであり、そして前記１２３位におけるアミノ酸がＲである、請求項１から４のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
【請求項６】
前記二特異性抗体であって、さらにヒトＩｇＧ１  Ｆｃパートを含み、（ｉ）ＦｃのＰｒｏ３２９がグリシンもしくはアルギニンにより置換され、ならびに／または（ｉｉ）Ｌｅｕ２３４がアラニンにより置換され、Ｌｅｕ２３５がアラニンにより置換される、請求項１から５のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
【請求項７】
構築物ＲＯＲ１  Ｆａｂ−Ｆｃ−ＣＤ３  Ｆａｂ−ＲＯＲ１  Ｆａｂであることを特徴とする、請求項３から６のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項に記載の二特異性抗体を調製するための方法であって、
ａ）宿主細胞を、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含むベクターで形質転換するステップと、
ｂ）前記宿主細胞を、前記抗体の合成を可能とする条件下で培養するステップと、
ｃ）前記抗体を、前記培養から回収するステップと
を含む方法。
【請求項９】
請求項１から７のいずれか一項に記載の二特異性抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１から７のいずれか一項に記載の二特異性抗体および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１１】
医薬としての使用のための、請求項１から７のいずれか一項に記載の二特異性抗体を含む組成物、または請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
ＲＯＲ１陽性血液悪性腫瘍、ＲＯＲ１陽性固形腫瘍または形質細胞障害の処置における医薬としての使用のための請求項１１に記載の組成物または医薬組成物であって、前記ＲＯＲ１陽性血液悪性腫瘍が、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞系系統の慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）（Ｂ−ＣＬＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、および腫瘍細胞の表面上にＲＯＲ１を有する他の血液悪性腫瘍からなる群から選択され、前記ＲＯＲ１陽性固形腫瘍が、乳がん、肺がん、卵巣がん、胃がんおよび膵がんからなる群から選択され、任意選択で、前記形質細胞障害が、多発性骨髄腫またはＲＯＲ１を発現する他のＢ細胞障害から選択される、請求項１１に記載の組成物または医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＤ３εおよびＲＯＲ１に対する新規の二特異性抗体、それらの製造および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ＲＯＲ１（同義語：チロシン−プロテインキナーゼ膜貫通受容体ＲＯＲ１、ＥＣ＝２．７．１０．１、神経栄養チロシンキナーゼ、受容体関連１、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｑ０１９７３）はチロシン−プロテインキナーゼ受容体である。この受容体は、Masiakowski  P、Carroll  R.D.、J.  Biol.  Chem.  ２６７巻：２６１８１〜２６１９０頁（１９９２年）「A  novel  family  of  cell  surface  receptors  with  tyrosine  kinase-like  domain」において記載されている。ＷＯ９２１８１４９およびＷＯ９５２７０６０では、Ｒｔｋ−２としてＲＯＲ−１、およびＲＯＲ−１に対する抗体について言及されている。ＷＯ２００２０８７６１８では、がんの増殖および分化を、増殖因子受容体を選択的に阻害することによって制御する方法について言及されている。このような受容体は、Ｒｏｒ１またはＲｏｒ２でありうる。ＷＯ２００５１００６０５では、乳がんに対する治療標的としてのＲＯＲ１、ならびに、ＲＯＲ１、ＲＯＲ１の細胞外領域（Ｍ１〜Ｖ４０６）およびＲＯＲ１断片Ｑ７３〜Ｖ１３９、Ｅ１６５〜Ｉ２９９、Ｋ３１２〜Ｃ３９１に特異的に結合する抗ＲＯＲ１抗体について言及されている。ＷＯ２００７０５１０７７は、抗ＲＯＲ１抗体およびリンパ腫細胞検出におけるその使用に関する。ＷＯ２００８１０３８４９でも抗ＲＯＲ１抗体について言及されている。Rabbani  H.ら、Blood（ASH  Annual  Meeting  Abstracts）２０１０年１１６巻：要約９１６）には、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）の処置のための抗ＲＯＲ１抗体の使用が開示されている。Ｒａｂｂａｎｉは、抗ＲＯＲ１である、細胞外ドメインに対する抗体、ＣＲＤ領域（Ｗｎｔタンパク質のリガンド結合性部位）に対する抗体およびクリングルドメインに対する抗体を使用した。Daneshmanesh  AHら、Int.  J.  Cancer、１２３巻（２００８年）１１９０〜１１９５頁は、細胞外ドメイン断片ＷＮＩＳＳＥＬＮＫＤＳＹＬＴＬ（配列番号１８）に結合する抗ＲＯＲ１抗体および細胞内ドメイン断片ＫＳＱＫＰＹＫＩＤＳＫＱＡＳ（配列番号２０）に結合する抗ＲＯＲ１抗体に関する。ＣＬＬの処置のための、このような抗体の使用に関しても言及されている。
【０００３】
ＷＯ２０１１１５９８４７は、リンパ腫または腺癌のようなＲＯＲ１がんの処置のための、生物活性分子とのコンジュゲートとしての抗ＲＯＲ１抗体に関する。ＷＯ２００８０７６８６８、ＷＯ２００８１０３８４９、ＷＯ２０１００８０６９、ＷＯ２０１０１２４１８８、ＷＯ２０１１０７９９０２、ＷＯ２０１１０５４００７、ＷＯ２０１１１５９８４７、ＷＯ２０１２０７６０６６、ＷＯ２０１２０７６７２７、ＷＯ２０１２０４５０８５、およびＷＯ２０１２０９７３１３もＲＯＲ１結合性分子または抗ＲＯＲ１抗体に関する。ＷＯ２０１２０７５１５８は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号２の配列、および可変重鎖ドメイン（ＶＨ）として配列番号６の配列、およびそれぞれのＣＤＲとして配列番号３、４、５、７、８、９の配列を含む抗ＲＯＲ１抗体に関する。この抗体は、さらに、ＭＡＢ１とも称される。ＷＯ２０１２０９７３１は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号４５の配列および可変重鎖ドメイン（ＶＨ）として配列番号４２の配列を含む抗ＲＯＲ１抗体に関する。この抗体は、さらに、ＭＡＢ２とも称される。ＷＯ２０１２０７５１５８は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号４６の配列および可変重鎖ドメイン（ＶＨ）として配列番号４３の配列を含む抗ＲＯＲ１抗体に関する。この抗体は、さらに、ＭＡＢ３とも称される。ＷＯ２０１２０７５１５８は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号４７の配列および可変重鎖ドメイン（ＶＨ）として配列番号４４の配列を含む抗ＲＯＲ１抗体に関する。この抗体は、さらに、ＭＡＢ４とも称される。
【０００４】
ＷＯ２００５０４０４１３は、ＲＯＲ１を含めた受容体チロシンキナーゼ活性の阻害剤を同定および／または検証するためのスクリーニング方法を対象とする。
【０００５】
ＷＯ２００８０３６４４９、ＷＯ２０１１０１４６５９およびＷＯ２０１１０５０２６２では、１つの標的がＲＯＲ１でありうる二特異性抗体について言及されている。ＷＯ２００７１４６９６８では、エフェクター機能を有する多価単鎖結合性タンパク質について言及されており、ＲＯＲ１およびＣＤ３が可能性のある標的として言及されている。ＷＯ２０１１０５４００７は、ＲＯＲ１の細胞外ドメインに結合するアフィニティー試薬を投与する、がんの処置方法を対象とする。ＣＤ３との二特異性抗体も言及されている。ＷＯ２０１４０３１１７４では、ＲＯＲ１の２つの異なるエピトープに特異的な二特異性抗体について言及されている。好ましい抗体Ｄ１０は、ＭＤＡ  ＭＢ  ２３１上皮乳腺癌において、３７℃で強力に内部化する。YangおよびBaskar  PLos  ONE  ６巻（２０１１年）ｅ２１０１８頁では、ＷＯ２０１２０７５１５８と同じく、抗ＲＯＲ１抗体Ｒ１２についても言及されている。Rebagay  R.ら、Frontiers  in  Oncology（２０１２年）７巻、論文番号３４、１〜８頁では、ＲＯＲが、医薬の標的であり、また、細胞傷害作用薬剤を、細胞表面上に標的を発現する細胞中に送達するための手段であることが言及されている。Rebagayは、ＢｉＴＥなどの二特異性抗体についても言及している。Rebagayによると、強力な内部化は、武装抗体、すなわち抗体薬物コンジュゲートに有利である。D.  Mezzanzanica  Dら、Int.  Journal  of  Cancer、４１巻（１９８８年）６０９〜６１５頁では、ＭＯｖ１８（ヒト卵巣癌細胞に特異的な、あまり内部化しない葉酸受容体アルファ抗体）および抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３またはＴＲ６６）からなる二特異性抗体によってＣＴＬを再ターゲティングすることによる治療的手法が調査されている。Hudecek  Mら、Blood、１１６巻（２０１０年）、４５３２〜４５４１頁では、ＲＯＲ１がＢ細胞性慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）およびマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）により発現されることが言及されている。このような細胞は、マウス抗ＲＯＲ１抗体２Ａ２由来のｓｃＦｖをトランスフェクトし発現させた活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞によってターゲティングされうる。このような細胞は、Ｂ細胞悪性腫瘍の処置に有用である。Baskar  S.ら、mAbs  ４：３巻（２０１２年）３４９〜３６１頁は、ＰＥ３８毒素とコンジュゲートしたｓｃＦｖ  ２Ａ２抗ＲＯＲ１を含む免疫毒素ＢＴ−１を用いて悪性Ｂ細胞をターゲティングすることに関する。この免疫毒素は、部分的に内部化し、アポトーシスを誘導する。
【０００６】
Ｔリンパ球のＴＣＲ／ＣＤ３複合体は、ガンマ（γ）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ゼータ（ζ）、およびイータ（η）と標識されるＣＤ３の不変サブユニットと共に、細胞表面において共発現する、ＴＣＲアルファ（α）／ベータ（β）ヘテロ二量体またはＴＣＲガンマ（γ）／デルタ（δ）ヘテロ二量体からなる。ヒトＣＤ３εは、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０７７６６（ＣＤ３Ｅ＿ＨＵＭＡＮ）下に記載されている。最先端技術において記載されている抗ＣＤ３ε抗体は、ＳＰ３４（Ｙａｎｇ  ＳＪ、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８６年）、１３７巻：１０９７〜１１００頁）である。ＳＰ３４は、霊長動物ＣＤ３およびヒトＣＤ３のいずれとも反応する。ＳＰ３４は、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎＴＭ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）から入手可能である。最先端技術において記載されている、さらなる抗ＣＤ３抗体は、ＵＣＨＴ−１（ＷＯ２００００４１４７４を参照されたい）である。最先端技術において記載されている、さらなる抗ＣＤ３抗体は、ＢＣ−３（Ｆｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；ＧｖＨＤについてのフェーズＩ／ＩＩ試験において使用された；Ａｎａｓｅｔｔｉ  Ｃら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、５４巻：８４４頁（１９９２年））である。
【０００７】
最近では、例えば、ＩｇＧ抗体フォーマットと単鎖ドメインとの、例えば、融合によって、多種多様な組換え二特異性抗体フォーマットが開発されている（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ＲＥ、ｍＡｂｓ、４巻：２号（２０１２年）、１〜１６頁を参照されたい）。可変ドメインＶＬおよびＶＨまたは定常ドメインＣＬおよびＣＨ１を、互いに置きかえた二特異性抗体については、ＷＯ２００９０８０２５１およびＷＯ２００９０８０２５２において記載されている。
【０００８】
誤対合副生成物の問題を回避する手法であって、「ＫＩＨ（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）」として公知である手法は、接触界面を修飾するように、突然変異を、ＣＨ３ドメインへと導入することにより、２つの異なる抗体重鎖の対合を強いることを目的とする。１つの鎖上では、かさ高いアミノ酸を、短い側鎖を伴うアミノ酸で置きかえ、「ホール」を創出した。逆に、大型の側鎖を伴うアミノ酸を、他のＣＨ３ドメインへと導入して、「ノブ」を創出した。これらの２つの重鎖（および両方の重鎖に対して適切でなければならない２つの同一な軽鎖）を共発現させることにより、ホモ二量体の形成（「ホール−ホール」または「ノブ−ノブ」）と対比して高収率の、ヘテロ二量体の形成（「ノブ−ホール」）が観察された（Ｒｉｄｇｗａｙ  ＪＢ、Ｐｒｅｓｔａ  ＬＧ、Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ；およびＷＯ１９９６０２７０１１）。ファージディスプレイ手法と、ヘテロ二量体を安定化させるジスルフィド架橋の導入とを使用して、２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面をリモデリングすることにより、ヘテロ二量体の百分率を、さらに増大させうる（Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ＡＭら、Ｎａｔｕｒｅ、Ｂｉｏｔｅｃｈ、１６巻（１９９８年）、６７７〜６８１頁；Ａｔｗｅｌｌ  Ｓ、Ｒｉｄｇｗａｙ  ＪＢ、Ｗｅｌｌｓ  ＪＡ、Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ．、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２７０巻（１９９７年）、２６〜３５頁）。ＫＩＨ（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）技術のための新たな手法については、例えば、ＥＰ１８７０４５９Ａ１において記載されている。このフォーマットは、非常に魅力的であると考えられるが、現在のところ、臨床に向けた進展について記載するデータは、入手可能でない。この戦略の１つの重大な制約は、誤対合および不活性分子の形成を防止するのに、２つの親抗体の軽鎖が、同一でなければならないことである。こうして、この技法は、これらの抗体の重鎖および／または同一な軽鎖を最適化しなければならないので、第１および第２の標的に対する２つの抗体から出発して、２つの標的に対する組換え二特異性抗体を容易に開発するのには適切でない。Ｘｉｅ，Ｚ.ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２８６巻（２００５年）、９５〜１０１頁は、ｓｃＦｖを、ＫＩＨ（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）技術と組み合わせて、ＦＣパートに使用する、二特異性抗体のフォーマットに言及している。ＷＯ２０１２１１６９２７およびＷＯ２０１０１４５７９２は、ＣＨ１とＣＬドメインとを交換することについて言及している。ＷＯ２００９０８０２５４は、二特異性抗体を作製するためのＫＩＨ（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）構築物について言及している。ＷＯ２００６０９３７９４は、ヘテロ二量体のタンパク質結合性組成物に関する。ＷＯ１９９９３７７９１は、多目的の抗体誘導体について記載している。Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６０巻（１９９８年）、２８０２〜２８０８頁は、可変領域ドメイン交換の、ＩｇＧの機能的特性に対する影響に言及している。
【０００９】
ＷＯ２０１３０２３６２は、ヘテロ二量体化されたポリペプチドに関する。ＷＯ２０１３１２７３３は、ヘテロ二量体のＦｃ領域を含むポリペプチドに関する。ＷＯ２０１２１３１５５５は、操作されたヘテロ二量体の免疫グロブリンに関する。ＥＰ２６４７７０７は、操作されたヘテロ二量体の免疫グロブリンに関する。ＷＯ２００９０８０２５１、ＷＯ２００９０８０２５２、ＷＯ２００９０８０２５３、ＷＯ２００９０８０２５４、およびＳｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．ら、ＰＮＡＳ、１０８巻（２０１１年）、１１１８７〜１１９１頁は、ドメインのクロスオーバーを伴う、二特異性の二価ＩｇＧ抗体に関する。軽鎖の誤対合を防止するように、１つの結合内にＶＨ／ＶＬの置きかえ／交換を伴う多特異性抗体（ＣｒｏｓｓＭａｂＶＨ−ＶＬ）であって、ＷＯ２００９０８０２５２（Ｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．ら、ＰＮＡＳ、１０８巻（２０１１年）、１１１８７〜１１９１頁もまた参照されたい）において記載されている多特異性抗体は、第１の抗原に対する軽鎖の、第２の抗原に対する誤った重鎖とのミスマッチにより引き起こされる副生成物を明らかに低減する（このようなドメイン交換を伴わない手法と比較して）。しかし、それらの調製物は、完全に副産物非含有というわけではない。主要な副産物は、ベンス−ジョーンズ型相互作用に基づく（Ｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．ら、PNAS、１０８巻（２０１１年）、１１１８７〜１１９１頁）。
【００１０】
したがって、ＶＨ／ＶＬの交換を伴う、ＣＤ３εおよびＲＯＲ１に対する二特異性抗体であって、高収率で作製することが可能であり、容易に精製されうる抗体が必要とされている。
【００１１】
卵巣がんは、米国における婦人科がんによる死亡の主な原因であり、また、女性において、最も一般的ながんの第７位であり、最も一般的ながんによる死亡の原因の第８位である。２０１４年に米国において予測される卵巣がんの新規症例は、推定２１，９８０件であり、卵巣がんに関連する死亡は、１４，２７０件である。世界的には、ほぼ２２５，０００名の女性が卵巣がんと診断され、１４０，０００名超がこの疾患により死亡すると思われる（Cancer  Facts  &  Figures  2014；http://www.cancer.org）。卵巣がんの発生率は年齢と共に上昇し、８０代で有病率が最も高い。卵巣がんと診断される女性の約半分が６３歳またはそれ超である。卵巣がんは、通常、予後が比較的不良である。限局性の段階で診断された場合には５年生存率が９２％であるが、この段階で検出されるのは全症例の１５％に過ぎない。大多数の症例（６１％）は、疾患が既に転移した後に診断される。遠隔転移の診断を受けた女性については、５年生存率は２７％である。過去２０年にわたる外科手術および化学療法の進歩にも拘らず、卵巣がんの患者における全生存の改善に関してはわずかな進展しか得られていない。進行卵巣がんを有する大多数の女性は第一選択の化学療法に応答するが、ほとんどの応答は長続きしない。患者の８０％超に、第一選択の処置後に疾患が再発し、５０％超が、診断されてから５年以内に再発疾患により死亡する（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒｒｅｓｅａｒｃｈ．ｏｒｇ）。標的療法は、薬物または他の物質を使用してがん細胞を同定および攻撃するが、正常細胞にはほとんど損傷を与えない、より新しい型のがん治療である。卵巣がんにおいて最も研究されている標的療法薬はベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））である。ベバシズマブは、進行卵巣がんの成長を縮小するまたは遅くすることが研究において示されている。ベバシズマブが、化学療法と共にもたらされた場合により一層良好に働くかどうかを検討するための試験では、腫瘍の縮小（または腫瘍の成長の阻止）については良好な結果が示されているが、女性の寿命を延ばすことへの補助は未だ示されていない（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｏｒｇ／ｃａｎｃｅｒ／ｏｖａｒｉａｎｃａｎｃｅｒ）。ＷＯ２００７１４６９５７は、ＲＯＲ１拮抗剤を用いて腫瘍の成長を阻害することに関する。このような薬剤は、例えば、ＲＯＲ１に対する抗体でありえ、腫瘍細胞系を用いたスクリーニングによって同定することができる。そのようにスクリーニングされた腫瘍細胞系卵巣がん細胞系は、言及されている。ＵＳ８２１２００９は、対象におけるＲＯＲ１関連がんを処置するための方法に関する。ＲＯＲ１関連がんはまた、とりわけ、卵巣がんである。ＷＯ２０１１０５４００７は、卵巣がんを治療するための方法であって、ＲＯＲ１に対する抗体を投与するステップを含む方法に関する。したがって、卵巣がんの処置のための、ＲＯＲ１に基づく薬剤が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第９２／１８１４９号
【特許文献２】国際公開第９５／２７０６０号
【特許文献３】国際公開第２００２／０８７６１８号
【特許文献４】国際公開第２００５／１００６０５号
【特許文献５】国際公開第２０１１／１５９８４７号
【特許文献６】国際公開第２００８／０７６８６８号
【特許文献７】国際公開第２００８／１０３８４９号
【特許文献８】国際公開第２０１０／０８０６９号
【特許文献９】国際公開第２０１０／１２４１８８号
【特許文献１０】国際公開第２０１１／０７９９０２号
【特許文献１１】国際公開第２０１１／０５４００７号
【特許文献１２】国際公開第２０１２／０７６０６６号
【特許文献１３】国際公開第２０１２／０７６７２７号
【特許文献１４】国際公開第２０１２／０４５０８５号
【特許文献１５】国際公開第２０１２／０９７３１３号
【特許文献１６】国際公開第２０１２／０７５１５８号
【特許文献１７】国際公開第２０１２／０９７３１号
【特許文献１８】国際公開第２００５／０４０４１３号
【特許文献１９】国際公開第２００８／０３６４４９号
【特許文献２０】国際公開第２０１１／０１４６５９号
【特許文献２１】国際公開第２０１１／０５０２６２号
【特許文献２２】国際公開第２００７／１４６９６８号
【特許文献２３】国際公開第２０１４／０３１１７４号
【特許文献２４】国際公開第２０００／０４１４７４号
【特許文献２５】国際公開第２００９／０８０２５１号
【特許文献２６】国際公開第２００９／０８０２５２号
【特許文献２７】国際公開第１９９６／０２７０１１号
【特許文献２８】国際公開第２０１２／１１６９２７号
【特許文献２９】国際公開第２０１０／１４５７９２号
【特許文献３０】国際公開第２００９／０８０２５４号
【特許文献３１】国際公開第２００６／０９３７９４号
【特許文献３２】国際公開第１９９９／３７７９１号
【特許文献３３】国際公開第２０１３／０２３６２号
【特許文献３４】国際公開第２０１３１２７３３号
【特許文献３５】国際公開第２０１２１３１５５５号
【特許文献３６】欧州特許出願公開第２６４７７０７号明細書
【特許文献３７】国際公開第２００９／０８０２５３号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｉ  Ｐ、Ｃａｒｒｏｌｌ  Ｒ．Ｄ．、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６７巻：２６１８１〜２６１９０頁（１９９２年）「Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎ」
【非特許文献２】Ｒａｂｂａｎｉ  Ｈ．ら、Ｂｌｏｏｄ（ＡＳＨ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ）２０１０年１１６巻：要約９１６
【非特許文献３】Ｄａｎｅｓｈｍａｎｅｓｈ  ＡＨら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ、１２３巻（２００８年）１１９０〜１１９５頁
【非特許文献４】ＹａｎｇおよびＢａｓｋａｒ  ＰＬｏｓ  ＯＮＥ  ６巻（２０１１年）ｅ２１０１８頁
【非特許文献５】Ｒｅｂａｇａｙ  Ｒ．ら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（２０１２年）７巻、論文番号３４、１〜８頁
【非特許文献６】Ｄ．  Ｍｅｚｚａｎｚａｎｉｃａ  Ｄら、Ｉｎｔ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、４１巻（１９８８年）６０９〜６１５頁
【非特許文献７】Ｈｕｄｅｃｅｋ  Ｍら、Ｂｌｏｏｄ、１１６巻（２０１０年）、４５３２〜４５４１頁
【非特許文献８】Ｂａｓｋａｒ  Ｓ．ら、ｍＡｂｓ  ４：３巻（２０１２年）３４９〜３６１頁
【非特許文献９】Ｙａｎｇ  ＳＪ、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８６年）、１３７巻：１０９７〜１１００頁
【非特許文献１０】Ａｎａｓｅｔｔｉ  Ｃら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、５４巻：８４４頁（１９９２年）
【非特許文献１１】Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ＲＥ、ｍＡｂｓ、４巻：２号（２０１２年）、１〜１６頁
【非特許文献１２】Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ＡＭら、Ｎａｔｕｒｅ、Ｂｉｏｔｅｃｈ、１６巻（１９９８年）、６７７〜６８１頁
【非特許文献１３】Ａｔｗｅｌｌ  Ｓ、Ｒｉｄｇｗａｙ  ＪＢ、Ｗｅｌｌｓ  ＪＡ、Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ．、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２７０巻（１９９７年）、２６〜３５頁
【非特許文献１４】Ｘｉｅ，Ｚ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２８６巻（２００５年）、９５〜１０１頁
【非特許文献１５】Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６０巻（１９９８年）、２８０２〜２８０８頁
【非特許文献１６】Ｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．ら、ＰＮＡＳ、１０８巻（２０１１年）、１１１８７〜１１９１頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の要旨）
本発明は、２つの標的、ヒトＣＤ３ε（さらにまた、「ＣＤ３」とも称する）およびヒトＲＯＲ１の細胞外ドメイン（さらにまた、「ＲＯＲ１」とも称する）に特異的に結合する二特異性抗体に関する。
【００１５】
本発明は、ＣＤ３およびＲＯＲ１に特異的に結合する、二価または三価の二特異性抗体であって、軽鎖およびそれぞれの重鎖内の可変ドメインＶＬおよびＶＨが、互いに置きかえられており、定常ドメインＣＬを含むことを特徴とし、１２４位におけるアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）、それぞれの定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）により独立に置換されている（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）二特異性抗体に関する。抗体は、ＣＤ３への結合について一価であることが好ましい。定常ドメインＣＬ内の１２４位におけるアミノ酸の置きかえに加えて、１２３位におけるアミノ酸も、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されていることが好ましい。抗体は、ＣＤ３への結合について一価であり、アミノ酸１２４がＫであり、アミノ酸１４７がＥであり、アミノ酸２１３がＥであり、アミノ酸１２３がＲまたはＫであることが好ましい。アミノ酸１２３は、Ｒであることが好ましい。
【００１６】
本発明は、ＣＤ３およびＲＯＲ１に特異的に結合する二特異性抗体であって、
ａ）ＲＯＲ１に特異的に結合する第１の抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖と；
ｂ）ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖であって、第２の抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖内の可変ドメインＶＬおよびＶＨが、互いに置きかえられている、第２の軽鎖および第２の重鎖とを含み；
ｃ）ａ）第１の軽鎖の定常ドメインＣＬ内で、１２４位におけるアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）、ａ）第１の重鎖の定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により独立に置換されている（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）（例えば、図１Ａ、１Ｃ、１Ｆ、１Ｈ、１Ｊを参照されたい）こと
を特徴とする二特異性抗体に関する。
【００１７】
前出の最後の段落で記載した、前記二特異性抗体は、前記二特異性抗体がさらに、前記第１の抗体のＦａｂ断片（さらにまた、「ＲＯＲ１−Ｆａｂ」とも称する）も含み、前記ＲＯＲ１−Ｆａｂの定常ドメインＣＬ内で、１２４位におけるアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）、前記ＲＯＲ１−Ｆａｂの定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により独立に置換されている（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）こと（例えば、図１Ｃ、１Ｆを参照されたい）もさらに特徴とすることが好ましい。
【００１８】
本発明はさらに、ＣＤ３およびＲＯＲ１に特異的に結合する二特異性抗体であって、
ａ）ＲＯＲ１に特異的に結合する第１の抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖と；
ｂ）ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖であって、第２の抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖内の可変ドメインＶＬおよびＶＨが、互いに置きかえられている、第２の軽鎖および第２の重鎖とを含み；
ｃ）ｂ）第２の軽鎖の定常ドメインＣＬ内で、１２４位におけるアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）、ｂ）第２の重鎖の定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により独立に置換されている（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）（例えば、図１Ｂ、１Ｄ、１Ｇ、１Ｉ、１Ｋを参照されたい）こと
を特徴とする二特異性抗体にも関する。
【００１９】
前出の最後の段落で記載した、前記二特異性抗体は、前記二特異性抗体がさらに、前記第１の抗体の第２のＦａｂ断片（「ＲＯＲ１−Ｆａｂ」）を含むこと（例えば、図１Ｄ、１Ｇを参照されたい）もさらに特徴とすることが好ましい。
【００２０】
アミノ酸の番号付けは、定常ドメインＣＬおよびＣＨについてはＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従い、その他についてはＫａｂａｔに従う（下記を参照されたい）。
【００２１】
第１または第２の軽鎖の定常ドメインＣＬ内の１２４位におけるアミノ酸の置きかえに加えて、１２３位におけるアミノ酸も、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されていることが好ましい。
【００２２】
定常ドメインＣＬ内で、１２４位におけるアミノ酸は、リシン（Ｋ）置換されており、定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）により置換されていることが好ましい。さらに、定常ドメインＣＬ内で、１２３位におけるアミノ酸は、アルギニン（Ｒ）により置換されていることが好ましい。
【００２３】
定常ドメインＣＬ内で、１２４位におけるアミノ酸がリシン（Ｋ）により置換されており、定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）により置換されていることが好ましい。さらに、定常ドメインＣＬ内で、１２３位におけるアミノ酸がリシン（Ｋ）により置換されていることが好ましい。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態では、本発明に従う抗体は、ＣＤ３に特異的に結合する抗体の１つのＦａｂ断片（さらにまた、「ＣＤ３−Ｆａｂ」とも称する）と、ＲＯＲ１に特異的に結合する抗体の１つのＦａｂ断片（さらにまた、「ＲＯＲ１−Ｆａｂ」とも称する）と、Ｆｃパートとからなり、ＣＤ３−ＦａｂおよびＲＯＲ１−Ｆａｂが、それらのＣ末端を介して、前記Ｆｃパートのヒンジ領域へと連結されている。ＣＤ３−ＦａｂまたはＲＯＲ１−Ｆａｂのいずれかは、アミノ酸置換を含み、ＣＤ３−Ｆａｂは、クロスオーバーを含む（図１Ａおよび１Ｂ）。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態では、本発明に従う抗体は、ＣＤ３−ＦａｂおよびＲＯＲ１−Ｆａｂが、それらのＣ末端を介して、Ｆｃパートのヒンジ領域へと連結されている１つのＣＤ３−Ｆａｂと、１つのＲＯＲ１−Ｆａｂと、前記Ｆｃパートと、そのＣ末端によりＣＤ３−ＦａｂのＮ末端へと連結された第２のＲＯＲ１−Ｆａｂとからなる。ＣＤ３−Ｆａｂは、クロスオーバーを含み、ＣＤ３−Ｆａｂまたは両方のＲＯＲ１−Ｆａｂのいずれかは、アミノ酸置換を含む（図１Ｃ、１Ｄ、１Ｆ，１Ｇ）。ＲＯＲ１−Ｆａｂ−Ｆｃ−ＣＤ３−Ｆａｂ−ＲＯＲ１−Ｆａｂを含む二特異性抗体であって、両方のＲＯＲ１−Ｆａｂが、アミノ酸置換を含み、ＣＤ３−Ｆａｂが、ＶＬ／ＶＨクロスオーバーを含む（図１Ｃ）二特異性抗体がとりわけ好ましい。ＲＯＲ１−Ｆａｂ−Ｆｃ−ＣＤ３−Ｆａｂ−ＲＯＲ１−Ｆａｂからなり、両方のＲＯＲ１−Ｆａｂが、アミノ酸置換Ｑ１２４Ｋ、Ｅ１２３Ｒ、Ｋ１４７ＥおよびＫ２１３Ｅを含み、ＣＤ３−Ｆａｂが、ＶＬ／ＶＨクロスオーバーを含む二特異性抗体がとりわけ好ましい。ＲＯＲ１−Ｆａｂ−Ｆｃ−ＣＤ３−Ｆａｂ−ＲＯＲ１−Ｆａｂからなり、両方のＲＯＲ１−Ｆａｂが、アミノ酸置換Ｑ１２４Ｋ、Ｅ１２３Ｒ、Ｋ１４７ＥおよびＫ２１３Ｅを含み、ＣＤ３−Ｆａｂが、ＶＬ／ＶＨクロスオーバーを含む二特異性抗体がとりわけ好ましい。両方のＲＯＲ１−Ｆａｂが、ＣＤＲとして抗体ＭＡＢ１のＣＤＲ、またはＶＨ／ＶＬとして、ＭＡＢ１のＶＨ／ＶＬを含むことが、とりわけ好ましい。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態では、本発明に従う抗体は、２つのＲＯＲ１−Ｆａｂと、Ｆｃパートとからなり、ＲＯＲ１−Ｆａｂが、それらのＣ末端を介して、前記Ｆｃパートのヒンジ領域およびそのＣ末端により１つのＲＯＲ１−ＦａｂのＮ末端へと連結されたＣＤ３−Ｆａｂへと連結されている。ＣＤ３−Ｆａｂは、クロスオーバーを含み、ＣＤ３−Ｆａｂまたは両方のＲＯＲ１−Ｆａｂは、アミノ酸置換を含む（図１Ｆおよび１Ｇ）。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態では、本発明に従う抗体は、そのＣ末端を介して前記Ｆｃパートのヒンジ領域へと連結された１つのＣＤ３−Ｆａｂと、そのＣ末端によりＣＤ３−ＦａｂのＮ末端へと連結されたＲＯＲ１−Ｆａｂとからなる。ＣＤ３−Ｆａｂは、クロスオーバーを含み、ＣＤ３−ＦａｂまたはＲＯＲ１−Ｆａｂのいずれかは、アミノ酸置換を含む（図１Ｈおよび１Ｉ）。
【００２８】
本発明の好ましい実施形態では、本発明に従う抗体は、そのＣ末端を介して前記Ｆｃパートのヒンジ領域へと連結された１つのＲＯＲ１−Ｆａｂと、そのＣ末端によりＲＯＲ１−ＦａｂのＮ末端へと連結されたＣＤ３−Ｆａｂとからなる。ＣＤ３−Ｆａｂは、クロスオーバーを含み、ＣＤ３−ＦａｂまたはＲＯＲ１−Ｆａｂのいずれかは、アミノ酸置換を含む（図１Ｊおよび１Ｋ）。
【００２９】
本発明のさらなる実施形態では、本発明に従う二特異性抗体は、
ａ）構築物ＲＯＲ１  Ｆａｂ−Ｆｃ−ＣＤ３  Ｆａｂ−ＲＯＲ１  Ｆａｂの二特異性抗体であり、
ｂ）抗ＣＤ３抗体のＦａｂ断片内に、ＶＬ／ＶＨクロスオーバーを含み、
ｃ）ヒトＩｇＧ１  Ｆｃパートを含み、
ｄ）Ｆｃパート内に、Ｐｒｏ３２９のグリシンによる置換およびＬｅｕ２３４のアラニンによる置換およびＬｅｕ２３５のアラニンによる置換を含み、ならびに、
ｅ）両方のＲＯＲ１  Ｆａｂの定常ドメインＣＬ内で、１２４位におけるアミノ酸がリシン（Ｋ）により置換されており、１２３位におけるアミノ酸がアルギニン（Ｒ）により置換されており、定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）により置換されている。
【００３０】
Ｆａｂ断片は、最先端技術に従う、適切なリンカーの使用により、一緒に化学的に連結される。適切なリンカーは、例えば、ＵＳ２０１４０２４２０７９に記載される。（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ１）２リンカー（配列番号１９）を使用することが好ましい（Ｄｅｓｐｌａｎｃｑ  ＤＫら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ.、１９９４年８月、７巻（８号）：１０２７〜３３頁；およびMack  M.ら、PNAS、１９９５年７月１８日、９２巻、１５号、７０２１〜７０２５頁）。２つのＦａｂ断片の間の連結は、重鎖の間で実施する。したがって、第１のＦａｂ断片のＣＨ１のＣ末端を、第２のＦａｂ断片のＶＨのＮ末端（クロスオーバーなし）、またはＶＬ（クロスオーバー）へと連結する。Ｆａｂ断片とＦｃパートとの間の連結は、本発明に従い、ＣＨ１とＣＨ２との間の連結として実施する。
【００３１】
ＲＯＲ１に特異的に結合する、抗体の第１および第２のＦａｂ断片は、同じ抗体に由来することが好ましく、ＣＤＲ配列、可変ドメイン配列ＶＨおよびＶＬ、ならびに／または定常ドメイン配列ＣＨ１およびＣＬが同一であることが好ましい。ＲＯＲ１に特異的に結合する、抗体の第１および第２のＦａｂ断片のアミノ酸配列は、同一であることが好ましい。ＲＯＲ１抗体は、抗体ＭＡＢ１のＣＤＲ配列を含む抗体、抗体ＭＡＢ１のＶＨおよびＶＬ配列を含む抗体、または抗体ＭＡＢ１のＶＨ、ＶＬ、ＣＨ１、およびＣＬ配列を含む抗体であることが好ましい。
【００３２】
二特異性抗体は、Ｆａｂ断片およびＦｃパートとして、抗ＣＤ３抗体の１つを超えないＦａｂ断片、抗ＲＯＲ１抗体の２つを超えないＦａｂ断片、および１つを超えないＦｃパート、好ましくは、ヒトＦｃパートを含むことが好ましい。抗ＲＯＲ１抗体の第２のＦａｂ断片は、そのＣ末端を介して、抗ＣＤ３抗体のＦａｂ断片のＮ末端、またはＦｃパートのヒンジ領域のいずれかへと連結されていることが好ましい。連結は、ＲＯＲ１−ＦａｂのＣＨ１とＣＤ３−ＦａｂのＶＬとの間で実施する（ＶＬ／ＶＨクロスオーバー）ことが好ましい。
【００３３】
ヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体部分、好ましくは、Ｆａｂ断片は、配列番号１２、１３、および１４の重鎖ＣＤＲを、それぞれ、抗ＣＤ３ε抗体（ＣＤＲ  ＭＡＢ  ＣＤ３  Ｈ２Ｃ）の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＨと、配列番号１５、１６、および１７の軽鎖ＣＤＲを、それぞれ、抗ＣＤ３ε抗体（ＣＤＲ  ＭＡＢ  ＣＤ３  Ｈ２Ｃ）の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＬとを含むことを特徴とすることが好ましい。ヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体部分は、可変ドメインが、配列番号１０および１１（ＶＨＶＬ  ＭＡＢ  ＣＤ３  Ｈ２Ｃ）の可変ドメインであることを特徴とすることが好ましい。
【００３４】
ヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体部分、好ましくは、Ｆａｂ断片は、配列番号２３、２４、および２５の重鎖ＣＤＲを、それぞれ、抗ＣＤ３ε抗体（ＣＤＲ  ＭＡＢ  ＣＤ３  ＣＨ２５２７）の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＨと、配列番号２６、２７、および２８の軽鎖ＣＤＲを、それぞれ、抗ＣＤ３ε抗体（ＣＤＲ  ＭＡＢ  ＣＤ３  ＣＨ２５２７）の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＬとを含むことを特徴とすることが好ましい。ヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体部分は、可変ドメインが、配列番号２１および２２（ＶＨＶＬ  ＭＡＢ  ＣＤ３）の可変ドメインであることを特徴とすることが好ましい。
【００３５】
ヒトＲＯＲ１に特異的に結合する、抗体部分、好ましくは、Ｆａｂ断片は、重鎖ＣＤＲ、配列番号７のＣＤＲ１Ｈ、配列番号８のＣＤＲ２Ｈ、配列番号９のＣＤＲ３Ｈを含む可変ドメインＶＨを含むことと、軽鎖ＣＤＲ、配列番号３のＣＤＲ１Ｌ、配列番号４のＣＤＲ２Ｌ、配列番号５のＣＤＲ３Ｌを含む可変ドメインＶＬを含むこととを特徴とする（ＣＤＲ  ＭＡＢ１）ことが好ましい。
【００３６】
ヒトＲＯＲ１に特異的に結合する抗体部分、好ましくは、Ｆａｂ断片は、配列番号６のＶＨと配列番号２のＶＬとを含むことを特徴とする（ＶＨＶＬ  ＭＡＢ１）ことが好ましい。
【００３７】
本発明は、ヒトＲＯＲ１の細胞外ドメインおよびヒトＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体であって、ポリペプチド配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、および配列番号４０の重鎖および軽鎖のセットを含むことを特徴とする二特異性抗体に関する。
【００３８】
本発明は、ヒトＲＯＲ１の細胞外ドメインおよびヒトＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体であって、ポリペプチド配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、および配列番号４１の重鎖および軽鎖のセットを含むことを特徴とする二特異性抗体に関する。
【００３９】
本発明はさらに、それぞれの重鎖および軽鎖セットをコードする核酸セットにも関する。
【００４０】
ＩｇＧ１サブクラスの定常重領域ＣＨ２／ＣＨ３を含む本発明に従う二特異性抗体は、ＦｃＲおよびＣ１ｑへの結合を回避し、ＡＤＣＣ／ＣＤＣを最小化するように、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）を含むことを特徴とすることが好ましい。利点は、本発明のこのような抗体が、Ｔ細胞をリダイレクションし／活性化させる強力な機構により、その腫瘍細胞殺滅の有効性を純粋に媒介することである。補体系およびＦｃＲを発現するエフェクター細胞に対する効果などのさらなる作用機構は、回避され、副作用の危険性は、低下する。
【００４１】
本発明は、（好ましくは、配列番号３７の）（Ｎ末端からＣ末端へ）ＶＨ（ＲＯＲ１）−ＣＨ１（ＲＯＲ１）−ＶＬ（ＣＤ３）−ＣＨ１（ＣＤ３）−ＣＨ２−ＣＨ３からなる本発明に従う抗体の重鎖のほか、それぞれのコード核酸も含むことが好ましい。これらのポリペプチドおよびそれぞれの核酸は、本発明に従う二特異性抗体を作製するために有用である。
【００４２】
本発明に従う二特異性抗体のＣＤＲの外部におけるアミノ酸（ａａ）交換（「電荷変異体」とさらに言及される）は、ＲＯＲ１への結合などの生物学的特性を変化させずに、作製／精製の大幅な改善をもたらす。本発明に従うアミノ酸交換（電荷変異体）を導入することにより、軽鎖ＬＣの誤対合および作製時における副産物の形成が有意に低減され、したがって、精製が容易になる。
【００４３】
本発明は、２つの標的、ヒトＣＤ３ε、およびヒトＲＯＲ１の細胞外ドメインに特異的に結合する、内部化しない二特異性抗体に関する。本発明に従う二特異性抗体は、初代Ｂ−ＣＬＬ細胞において、１ｎＭの濃度で、３７℃で２時間の間に内部化しないことを特徴とすることが好ましい。本発明に従う二特異性抗体は、細胞ベースのアッセイにおいて、ＲＯＲ１陽性初代Ｂ−ＣＬＬ細胞を使用し、１ｎＭの抗体濃度で使用した場合、３７℃で２時間の間に内部化しないことを特徴とすることが好ましく、内部化しないとは、０時間において測定される、フローサイトメトリーにより検出される二特異性抗体の、ＲＯＲ１陽性初代Ｂ−ＣＬＬ細胞への結合時における平均蛍光強度（ＭＦＩ）が、３７℃で２時間のインキュベーション後の再測定のときに、５０％を超えて低減しない、好ましくは３０％を超えて低減しないことを意味する。
【００４４】
本発明に従う二特異性抗体は、二価抗体であり、ＲＯＲ１に特異的に結合する一価抗ＲＯＲ１抗体と、ＣＤ３に特異的に結合する一価抗体とを含むことを特徴とすることが好ましい。二価抗体は、０時間において測定される、フローサイトメトリーにより検出されるＲＯＲ１陽性細胞への結合の際におけるその前記平均蛍光強度（ＭＦＩ）が、３７℃で２時間のインキュベーション後の再測定のときに、内部化によって５０％を超えて低減しない、好ましくは３０％を超えて低減しないものであれば、好ましい。本発明に従う二特異性抗体は、二価抗体であり、ＲＯＲ１に特異的に結合する一価抗ＲＯＲ１抗体と、ＣＤ３に特異的に結合する一価抗体とを含むことを特徴とすることが好ましい。ＣＤ３に特異的に結合する一価抗体は、Ｆａｂ断片、好ましくは、ＣＤ３  ｃｒｏｓｓＦａｂであることが好ましい。このような二価抗体は、０時間において測定される、フローサイトメトリーにより検出されるＲＯＲ１陽性細胞への結合の際におけるその前記平均蛍光強度（ＭＦＩ）が、３７℃で２時間のインキュベーション後の再測定のときに、内部化によって５０％を超えて低減しない、好ましくは３０％を超えて低減しないものであれば、好ましい。本発明に従う二特異性抗体は、三価抗体であり、ＲＯＲ１に特異的に結合する二価抗ＲＯＲ１抗体と、ＣＤ３に特異的に結合する一価抗体とを含むことを特徴とすることが好ましい。ＣＤ３に特異的に結合する一価抗体は、Ｆａｂ断片または好ましくは、ＣＤ３  ｃｒｏｓｓＦａｂであることが好ましい。三価抗体は、０時間において測定される、フローサイトメトリーにより検出されるＲＯＲ１陽性細胞への結合の際におけるその前記平均蛍光強度（ＭＦＩ）が、３７℃で２時間のインキュベーション後の再測定のときに、内部化によって５０％を超えて低減しない、好ましくは３０％を超えて低減しないものであれば、好ましい。
【００４５】
本発明に従う二特異性抗体は、前記細胞ベースのアッセイにおいて、３７℃で２４時間の間、内部化しないことが好ましい。
【００４６】
本発明に従う二特異性抗体は、前記細胞ベースのアッセイにおいて、０．１ｐＭ〜２００ｎＭの間の濃度で使用した場合、内部化しないことが好ましい。
【００４７】
本発明のさらなる実施形態は、表面プラズモン共鳴を使用してＫｄ値により決定される、ＲＯＲ１とＣＤ３のアフィニティー比が５０００：１〜５：１である、本発明に従う抗体である。このような抗体は、悪性細胞への結合がＴ細胞よりも強力であるので、好都合である。Ｋｄ値は、ＣＤ３抗体については約１００ｎＭであり、ＲＯＲ１抗体については約５０ｐＭ〜５０ｎＭであることが好ましい。
【００４８】
Ｂ−ＣＬＬ細胞は、本発明に従って、細胞１×１０６個／ｍＬ（ＣＬＬ患者由来の初代ＰＢＭＣ）、または細胞１×１０６個／ｍＬ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１５５）、または細胞１×１０６個／ｍＬ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−３００４）の細胞濃度で使用することが好ましい。
【００４９】
ＣＤ３に特異的に結合する抗体部分は、ヒト化されていることを特徴とすることが好ましい。本発明に従うＣＤ３  Ｍａｂは、抗体Ｈ２Ｃ（ＷＯ２００８１１９５６７において記載されている）および／もしくは抗体ＣＨ２５２７（ＷＯ２０１３０２６８３９において記載されている）と同じＣＤ３εのエピトープに結合するか、または好ましくは抗体Ｈ２ＣもしくはＣＨ２５２７であることが好ましい。
【００５０】
ＲＯＲ１に特異的に結合する抗体部分は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、それぞれの可変軽鎖ＣＤＲとして配列番号３、４、５のＣＤＲを含み、可変重鎖ドメイン（ＶＨ）が、それぞれの可変重鎖ＣＤＲとして配列番号７、８、９のＣＤＲを含むことを特徴とすることが好ましい。ＲＯＲ１に特異的に結合する抗体部分は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号２の配列と少なくとも９０％同一である配列、および可変重鎖ドメイン（ＶＨ）として配列番号６の配列と少なくとも９０％同一である配列を含むことを特徴とすることが好ましい。ＲＯＲ１に特異的に結合する抗体部分は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号２の配列、および可変重鎖ドメイン（ＶＨ）として配列番号６の配列を含むことを特徴とすることが好ましい。ＲＯＲ１に特異的に結合する抗体部分は、ヒト化されていることを特徴とすることが好ましい。本発明に従うＲＯＲ１  Ｍａｂは、上で記載したＭａｂと同じＲＯＲ１のエピトープに結合することが好ましい。
【００５１】
本発明のさらなる実施形態は、本発明に従う二特異性抗体を調製するための方法であって、宿主細胞を、それぞれの抗体または断片をコードする核酸分子を含む１つまたは複数のベクターで形質転換するステップと、宿主細胞を、前記抗体分子の合成を可能とする条件下で培養するステップと、前記抗体分子を、前記培養物から回収するステップとを含む方法である。
【００５２】
本発明に従う二特異性抗体を調製するための方法は、
ａ）宿主細胞を、ポリペプチド、配列番号３７、３８、３９、および４０の重鎖および軽鎖のセット、または配列番号３７、３８、３９、および４１のセットをコードする核酸分子を含む１つまたは複数のベクターで形質転換するステップと、
ｂ）宿主細胞を、前記抗体分子の合成を可能とする条件下で培養するステップと、
ｃ）前記抗体分子を、前記培養物から回収するステップと
を含むことが好ましい。
【００５３】
本発明のさらなる実施形態は、本発明に従う抗体をコードする核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞である。
【００５４】
本発明のさらなる実施形態は、第１の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含むベクターと、第２の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含むベクターとを含む宿主細胞であって、可変ドメインＶＬおよびＶＨが互いに置きかえられている宿主細胞である。
【００５５】
本発明のさらなる好ましい実施形態は、本発明に従う抗体および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。
【００５６】
本発明のさらなる好ましい実施形態は、医薬としての使用のための、本発明に従う抗体を含む医薬組成物である。本発明のさらなる好ましい実施形態は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）および濾胞性リンパ腫（ＦＬ）を含むＲＯＲ１陽性血液悪性腫瘍の処置における医薬としての使用のための、本発明に従う抗体または本発明に従う抗体を含む医薬組成物である。ＲＯＲ１は、これらの種々の血液がんの細胞表面上に有意にかつ均一に発現する。本発明のさらなる実施形態は、ＲＯＲ１を発現する白血病および非ホジキンリンパ腫の処置における医薬としての使用のための、本発明に従う抗体または本発明に従う抗体を含む医薬組成物である。本発明の好ましい実施形態は、Ｂ細胞系系統の慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）（Ｂ−ＣＬＬ）の処置における医薬としての使用のための、本発明に従う抗体または本発明に従う抗体を含む医薬組成物である。Ｂ−ＣＬＬは、Ｂリンパ球に発達する単一の骨髄細胞のＤＮＡに対する後天性突然変異から生じる。骨髄細胞が白血病性の変化を受けると、骨髄細胞は多数の細胞に増加し、ＣＬＬ細胞は正常細胞よりも良好に成長および生存するので、経時的に正常細胞が押し出される。この結果、骨髄においてＣＬＬ細胞が制御されずに成長し、それにより、血液中のＣＬＬ細胞の数の増加が導かれる。ＣＬＬの症状は、通常、経時的に発生し、一部の患者では無症候性であり、血液検査の結果が異常（例えば、白血球の増加）なだけである。症状があるＣＬＬ患者では、疲労、息切れ、貧血、体重減少、食欲減退、リンパ節および脾臓の肥大、ならびに低免疫グロブリンレベルおよび好中球数の減少に起因する再発性感染が生じる（Leukemia  &  Lymphoma  Society、２００９年）。本発明のさらなる好ましい実施形態は、多発性骨髄腫の処置における医薬としての使用のための、本発明に従う抗体または本発明に従う抗体を含む医薬組成物である。本発明のさらなる実施形態は、多発性骨髄腫ＭＭのような形質細胞障害、またはＲＯＲ１を発現する他のＢ細胞障害の処置における医薬としての使用のための、本発明に従う抗体または本発明に従う抗体を含む医薬組成物である。ＭＭは、骨髄コンパートメント内の、異常な形質細胞の、単クローナル性の拡大および蓄積により特徴付けられるＢ細胞悪性腫瘍である。ＭＭはまた、同じＩｇＧ遺伝子再配列および体細胞超変異を伴う、循環クローン性Ｂ細胞も伴う。ＭＭは、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）と呼ばれる、無症状性の前悪性状態であって、骨髄形質細胞の低レベルおよび単クローン性タンパク質により特徴付けられる前悪性状態から起こる。ＭＭ細胞は、低速度で増殖する。ＭＭは、複数の構造的染色体変化（例えば、不均衡型転座）の進行性の発生から生じる。ＭＭは、悪性形質細胞と、骨髄微小環境（例えば、正常な骨髄間質細胞）との交互的な相互作用を伴う。活動性のＭＭの臨床徴候は、単クローン性の抗体スパイク、形質細胞の過密な骨髄、溶解性骨病変、および破骨細胞の過剰刺激から生じる骨破壊（Dimopulos  &  Terpos、Ann  Oncol  ２０１０年；２１巻、増刊７：ｖｉｉ１４３〜１５０頁）を含む。本発明のさらなる実施形態は、ヒト乳がん（Zhang  S、PLoS  One  ２０１２年；７巻（３号）：ｅ３１１２７頁）および肺がん（Yamaguchi  T、Cancer  Cell  ２０１２年：２１巻（３号）：３４８頁）などのＲＯＲ１陽性固形腫瘍の処置における医薬としての使用のための、本発明に従う抗体または本発明に従う抗体を含む医薬組成物である。
【００５７】
本発明のさらなる実施形態は、このような処置のための、本発明に従う抗体または本発明に従う医薬組成物の使用である。
【００５８】
本発明のさらなる実施形態は、卵巣がん、肺がん、乳がん、胃がん、および／または膵がんからなる群から選択される疾患の処置のための、本発明に従う抗体または本発明に従う医薬組成物の使用である。本発明のさらなる実施形態は、卵巣がん、肺がん、乳がん、胃がん、および／または膵がんの処置における使用のための、本発明に従う抗体または本発明に従う医薬組成物である。
【００５９】
本発明のさらなる実施形態は、卵巣がんの処置のための、本発明に従う抗体または本発明に従う医薬組成物の使用である。本発明のさらなる実施形態は、卵巣がんの処置における使用のための、本発明に従う抗体または本発明に従う医薬組成物である。本発明のさらなる実施形態は、がん患者に、治療有効量の、本発明に従う抗体を投与するステップを含む、処置の方法である。本発明のさらなる実施形態は、がんが、卵巣がん、肺がん、乳がん、胃がん、および／または膵がんおよび血液悪性腫瘍からなる群から選択される、このような方法である。本発明のさらなる実施形態は、抗体の前、抗体の後、または抗体と同時に化学療法または放射線を施す、このような方法である。本発明のさらなる実施形態は、このような疾患を有する患者に、本発明に従う抗体を投与するステップを含む、処置の方法である。本発明のさらなる実施形態は、卵巣がんを有する患者に、本発明に従う抗体を投与するステップを含む、処置の方法である。本発明のさらなる実施形態は、がん、好ましくは、卵巣がんを処置するための医薬としての、本発明に従う抗体の使用である。本発明のさらなる実施形態は、がん、好ましくは、卵巣がんを処置するための医薬の製造における、本発明に従う抗体の使用である。
【００６０】
本発明に従う抗体または医薬組成物は、週１回または週２回、好ましくは、皮下投与によって（例えば、好ましくは、週１回または週２回、０．１〜１０ｍｇ／ｍ２の用量範囲で）投与することが好ましい。本発明に従う抗体は、細胞傷害作用活性が優れているので、Ｔ細胞二特異性ではない（すなわち、１つのアーム上のＣＤ３に結合しない）従来の単一特異性抗体または従来の二特異性抗体と比較して、より小さな大きさの臨床的用量範囲で投与することができる。本発明に従う抗体に関して、皮下投与が臨床状況において好ましいことが想定される（例えば、週１回または週２回、０．１〜１０ｍｇ／ｍ２の用量範囲で）。本発明に従う抗体は、週に少なくとも１回または２回の投与を可能にする、およそ数日の半減期で消失する。本発明に従う抗体の別の利点は、分子量（すなわち、およそ１５０〜２００ｋＤａ）が腎臓での濾過のサイズ限界（５０〜７０ｋＤａ）よりも大きいことである。この分子量は、長い消失半減期を可能とし、週１回または週２回の皮下投与を可能とする。
【００６１】
本発明に従う抗体は、１ｍｇ／ｋｇ体重（ＢＷ）の用量で、週２回または週に１回、静脈内（ｉ．ｖ．）、または皮下（ｓ．ｃ.）、または腹腔内（ｉ．ｐ．）投与され、好ましくは、０．５ｍｇ／ｋｇ  ＢＷで、週２回または週に１回、ｉ．ｖ.またはｉ．ｐ．またはｓ．ｃ．投与され、好ましくは、０．１ｍｇ／ｋｇ  ＢＷで、週２回または週に１回、ｉ．ｖ.またはｉ．ｐ．またはｓ．ｃ．投与され、好ましくは、０．０５ｍｇ／ｋｇ  ＢＷで、週２回または週に１回、ｉ．ｖ.またはｉ．ｐ．またはｓ．ｃ．投与され、好ましくは、０．０１ｍｇ／ｋｇ  ＢＷで、週２回または週に１回、ｉ．ｖ．またはｉ．ｐ．またはｓ．ｃ．投与され、好ましくは、５μｇ／ｋｇ  ＢＷで、週２回または週に１回、ｉ．ｖ.またはｉ．ｐ．またはｓ．ｃ．投与され、ＲＯＲ１発現腫瘍細胞系（例えば、ＣＬＬ、ＭＭ、ＭＣＬ細胞系）を用いた異種移植モデルにおいて、７０％を超え、好ましくは８５％を超え、好ましくは１００％に近い腫瘍成長の阻害を示すことにより特徴付けられることが好ましい。
【００６２】
本発明に従う抗体は、マウス、好ましくは、カニクイザルにおける消失半減期であって、１２時間より長い、好ましくは、３日間またはそれより長い消失半減期により特徴付けられることが好ましい。
【００６３】
腫瘍細胞上の標的およびＣＤ３に結合し、分子フォーマット（ｓｃＦｖ）２を有する二特異性抗体は、消失半減期が、１〜４時間と非常に短い。（ｓｃＦｖ）２二特異性ＣＤ１９×ＣＤ３抗体ブリナツモマブを用いた臨床試験では、この化合物は、患者が携行するポンプを介して、数週間および数カ月間にわたり投与しなければならなかった（Toppら、J  Clin  Oncol  ２０１１年：２９巻（１８号）：２４９３〜８頁）。週２回または週に１回のｉｖまたはｓｃ投与と比較して、ポンプを介して投与される処置は、患者にとってはるかに不都合であり、また、はるかに危険でもある（例えば、ポンプの不具合、カテーテルに関する問題）。
【００６４】
本発明に従う抗体は、ＲＯＲ１陽性細胞系（例えば、ＲＰＭＩ８２２６細胞、Ｒｅｃ−１細胞、Ｊｅｋｏ細胞）への結合についてのＥＣ５０値であって、３０ｎＭまたはそれを下回る、好ましくは、１５ｎＭおよびそれを下回るＥＣ５０値を示すことを特徴とすることが好ましい。
【００６５】
本発明に従う抗体は、ヒトＴ細胞の存在下における、ＲＯＲ１発現腫瘍細胞（例えば、ＲＰＭＩ８２２６細胞、Ｒｅｃ−１細胞、Ｊｅｋｏ細胞）のリダイレクトされた殺滅を、１０ｎＭ未満、好ましくは、１ｎＭ、好ましくは、０．０５ｎＭ、好ましくは、０．０２ｎＭ、好ましくは、０．００２ｎＭおよびそれを下回るＥＣ５０で誘導するその能力を特徴とすることにより特徴付けられることが好ましい。
【００６６】
二特異性抗体の安定性は、実際的な条件および臨床適用の影響を受ける可能性がある。近年における抗体操作の改善にも拘らず、一部の組換えタンパク質および分子フォーマット（例えば、ｓｃＦＶ断片）は、ストレス条件下で、他の組換えタンパク質および分子フォーマットより容易に変性し、凝集物を形成する傾向がある（WornおよびPluckthun.  J  Mol  Biol  ２００１年：３０５巻、９８９〜１０１０頁）。本発明に従う抗体は、標準的な製剤緩衝液中、３７℃で、好ましくは、４０℃で、１０日間、好ましくは、最長２週間、好ましくは、最長４週間、保存された前記抗体が、高分子量（ＨＭＷ）分子種および／または低分子量（ＬＭＷ）分子種および／または単量体含量の、同じ製剤緩衝液中、−８０℃で同じ保存期間保存された前記抗体と比較して、１０％を超える変化（Δ）、好ましくは、５％を超える変化（Δ）を結果としてもたらさないことを特徴とすることが好ましい。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
ヒトＣＤ３εおよびヒトＲＯＲ１の細胞外ドメインである、２つの標的に特異的に結合する、二価または三価の二特異性抗体であって、軽鎖およびそれぞれの重鎖内の可変ドメインＶＬおよびＶＨが、互いに置きかえられており、定常ドメインＣＬを含むことを特徴とし、１２４位におけるアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（Ｋａｂａｔに従う番号付け）、それぞれの定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）により独立に置換されている（Ｋａｂａｔに従う番号付け）二特異性抗体。
（項目２）
ヒトＣＤ３εおよびヒトＲＯＲ１の細胞外ドメインである、２つの標的に特異的に結合する二特異性抗体であって、
ａ）ヒトＲＯＲ１の細胞外ドメインに特異的に結合する第１の抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖と；
ｂ）ＣＤ３εに特異的に結合する第２の抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖であって、前記第２の抗体の前記第２の軽鎖および第２の重鎖内の可変ドメインＶＬおよびＶＨが、互いに置きかえられている、第２の軽鎖および第２の重鎖とを含み；
ｃ）ａ）前記第１の軽鎖の定常ドメインＣＬ内で、１２４位におけるアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（Ｋａｂａｔに従う番号付け）、ａ）前記第１の重鎖の定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により独立に置換されている（Ｋａｂａｔに従う番号付け）こと
を特徴とする二特異性抗体。
（項目３）
ヒトＣＤ３εおよびヒトＲＯＲ１の細胞外ドメインである、２つの標的に特異的に結合する二特異性抗体であって、
ａ）ヒトＲＯＲ１の細胞外ドメインに特異的に結合する第１の抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖と；
ｂ）ヒトＣＤ３εに特異的に結合する第２の抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖であって、前記第２の抗体の前記第２の軽鎖および第２の重鎖内の可変ドメインＶＬおよびＶＨが、互いに置きかえられている、第２の軽鎖および第２の重鎖とを含み；
ｃ）ｂ）下にある前記第２の軽鎖の定常ドメインＣＬ内で、１２４位におけるアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（Ｋａｂａｔに従う番号付け）、ｂ）下にある前記第２の重鎖の定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により独立に置換されている（Ｋａｂａｔに従う番号付け）こと
を特徴とする二特異性抗体。
（項目４）
さらに、前記第１の抗体のＦａｂ断片（さらにまた、「ＲＯＲ１−Ｆａｂ」とも称する）も含み、前記ＲＯＲ１−Ｆａｂの定常ドメインＣＬ内で、１２４位におけるアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（Ｋａｂａｔに従う番号付け）、前記ＲＯＲ１−Ｆａｂの定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により独立に置換されている（Ｋａｂａｔに従う番号付け）こと
を特徴とする、項目２に記載の二特異性抗体。
（項目５）
さらに、前記第１の抗体の第２のＦａｂ断片（「ＲＯＲ１−Ｆａｂ」）を含むことを特徴とする、項目３に記載の二特異性抗体。
（項目６）
ヒトＣＤ３εに特異的に結合する抗体の１つのＦａｂ断片（さらにまた、「ＣＤ３−Ｆａｂ」とも称する）と、ヒトＲＯＲ１の細胞外ドメインに特異的に結合する抗体の１つのＦａｂ断片（さらにまた、「ＲＯＲ１−Ｆａｂ」とも称する）と、Ｆｃパートとからなり、前記ＣＤ３−Ｆａｂおよび前記ＲＯＲ１−Ｆａｂが、それらのＣ末端を介して、前記Ｆｃパートのヒンジ領域へと連結されており、前記ＣＤ３−Ｆａｂまたは前記ＲＯＲ１−Ｆａｂのいずれかが、アミノ酸置換を含み、前記ＣＤ３−Ｆａｂが、クロスオーバーを含むことを特徴とする、項目１のいずれかに記載の二特異性抗体。
（項目７）
前記ＣＤ３−Ｆａｂおよび前記ＲＯＲ１−Ｆａｂが、それらのＣ末端を介して、前記Ｆｃパートのヒンジ領域へと連結されている、１つのＣＤ３−Ｆａｂと、１つのＲＯＲ１−Ｆａｂと、Ｆｃパートと、そのＣ末端により前記ＣＤ３−ＦａｂのＮ末端へと連結された第２のＲＯＲ１−Ｆａｂとからなり、前記ＣＤ３−Ｆａｂが、クロスオーバーを含み、前記ＣＤ３−Ｆａｂまたは両方のＲＯＲ１−Ｆａｂのいずれかが、アミノ酸置換を含むことを特徴とする、項目６に記載の二特異性抗体。
（項目８）
ＲＯＲ１−Ｆａｂ−Ｆｃ−ＣＤ３−Ｆａｂ−ＲＯＲ１−Ｆａｂからなり、両方のＲＯＲ１−Ｆａｂが、アミノ酸置換を含み、前記ＣＤ３−Ｆａｂが、ＶＬ／ＶＨクロスオーバーを含むことを特徴とする、項目７に記載の二特異性抗体。
（項目９）
それらのＣ末端を介して、前記Ｆｃパートのヒンジ領域へと連結されている２つのＲＯＲ１−Ｆａｂと、Ｆｃパートと、そのＣ末端により１つのＲＯＲ１−ＦａｂのＮ末端へと連結されているＣＤ３−Ｆａｂとからなり、前記ＣＤ３−Ｆａｂが、クロスオーバーを含み、前記ＣＤ３−Ｆａｂまたは両方のＲＯＲ１−Ｆａｂのいずれかが、アミノ酸置換を含むことを特徴とする、項目１に記載の二特異性抗体。
（項目１０）
そのＣ末端を介して、前記Ｆｃパートのヒンジ領域へと連結された、１つのＣＤ３−Ｆａｂと、そのＣ末端により、前記ＣＤ３−ＦａｂのＮ末端へと連結されたＲＯＲ１−Ｆａｂとからなり、前記ＣＤ３−Ｆａｂまたは前記ＲＯＲ１−Ｆａｂのいずれかが、アミノ酸置換を含むことを特徴とする、項目１から５のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
（項目１１）
そのＣ末端を介して、前記Ｆｃパートのヒンジ領域へと連結された、１つのＲＯＲ１−Ｆａｂと、そのＣ末端により、前記ＲＯＲ１−ＦａｂのＮ末端へと連結されたＣＤ３−Ｆａｂとからなり、前記ＣＤ３−Ｆａｂまたは前記ＲＯＲ１−Ｆａｂのいずれかが、アミノ酸置換を含むことを特徴とする、項目１から６のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
（項目１２）
抗ＲＯＲ１抗体ＭＡＢ１のＣＤＲ配列を含むことを特徴とする、項目１から１１のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
（項目１３）
抗ＲＯＲ１抗体ＭＡＢ１のＶＨおよびＶＬ配列を含むか、または抗ＲＯＲ１抗体ＭＡＢ１のＶＨ、ＶＬ、ＣＨ１、およびＣＬ配列を含む抗体であることを特徴とする、項目１から１２のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
（項目１４）
ヒトＣＤ３εに特異的に結合する抗体部分、好ましくは、前記Ｆａｂ断片が、
ａ）配列番号１２、１３および１４の重鎖ＣＤＲを、それぞれ、前記抗ＣＤ３ε抗体（ＣＤＲ  ＭＡＢ  ＣＤ３  Ｈ２Ｃ）の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＨと、配列番号１５、１６および１７の軽鎖ＣＤＲを、それぞれ、前記抗ＣＤ３ε抗体（ＣＤＲ  ＭＡＢ  ＣＤ３  Ｈ２Ｃ）の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＬとを含むか、または、
ｂ）配列番号２３、２４および２５の重鎖ＣＤＲを、それぞれ、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＨを含み、前記可変ドメインＶＬが、配列番号２６、２７および２８の軽鎖ＣＤＲを、それぞれ、前記抗ＣＤ３ε抗体（ＣＤＲ  ＭＡＢ  ＣＤ３  ＣＨ２５２７）の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＬにより置きかえられていることを特徴とすることを特徴とする、項目１から１３のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
（項目１５）
ヒトＣＤ３εに特異的に結合する前記抗体部分が、
ａ）前記可変ドメインが、配列番号１０および１１（ＶＨＶＬ  ＭＡＢ  ＣＤ３  Ｈ２Ｃ）の可変ドメインであるか、または、
ｂ）前記可変ドメインが、配列番号２１および２２（ＶＨＶＬ  ＭＡＢ  ＣＤ３  ＣＨ２５２７）の可変ドメインであることを特徴とすることを特徴とする、項目１から１４のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
（項目１６）
ヒトＲＯＲ１に特異的に結合する前記Ｆａｂ断片が、重鎖ＣＤＲ、配列番号７のＣＤＲ１Ｈ、配列番号８のＣＤＲ２Ｈ、配列番号９のＣＤＲ３Ｈを含む可変ドメインＶＨを含むことと、軽鎖ＣＤＲ、配列番号３のＣＤＲ１Ｌ、配列番号４のＣＤＲ２Ｌ、配列番号５のＣＤＲ３Ｌを含む可変ドメインＶＬを含むこととを特徴とする（ＣＤＲ  ＭＡＢ１）ことを特徴とする、項目１から１５のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
（項目１７）
ヒトＲＯＲ１に特異的に結合する前記Ｆａｂ断片が、配列番号１０のＶＨと配列番号１１のＶＬとを含むことを特徴とする（ＶＨＶＬ  ＭＡＢ１）ことを特徴とする、項目１から１６のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
（項目１８）
前記定常ドメインＣＬ内の１２４位における前記アミノ酸の置きかえに加えて、１２３位におけるアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されていることを特徴とする、項目１から１７のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
（項目１９）
アミノ酸１２４がＫであり、アミノ酸１４７がＥであり、アミノ酸２１３がＥであり、およびアミノ酸１２３がカッパ軽鎖についてはＲであり、ラムダ軽鎖についてはＫであることを特徴とする、項目１から１８のいずれか一項に記載の二特異性抗体。
（項目２０）
ヒトＣＤ３ε、およびヒトＲＯＲ１の細胞外ドメインに特異的に結合する二特異性抗体であって、ポリペプチド、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、および配列番号４０からなる群、または、ポリペプチド、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、および配列番号４１からなる群から選択される、重鎖および軽鎖のセットを含むことを特徴とする二特異性抗体。
（項目２１）
ヒトＣＤ３εに特異的に結合する前記抗体部分内で、
ａ）配列番号１２、１３および１４の重鎖ＣＤＲを、それぞれ、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＨにより、前記可変ドメインＶＨが置きかえられ、配列番号１５、１６および１７の軽鎖ＣＤＲを、それぞれ、前記抗ＣＤ３ε抗体の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＬにより、前記可変ドメインＶＬが置きかえられること、または、
ｂ）配列番号２３、２４および２５の重鎖ＣＤＲを、それぞれ、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＨにより、前記可変ドメインＶＨが置きかえられ、配列番号２６、２７および２８の軽鎖ＣＤＲを、それぞれ、前記抗ＣＤ３ε抗体の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＬにより、前記可変ドメインＶＬが置きかえられることを特徴とする、項目２０に記載の抗体。
（項目２２）
一方の重鎖のＣＨ３ドメインおよび他方の重鎖のＣＨ３ドメインの各々が、抗体のＣＨ３ドメインの間の、元の界面を含む界面において向かい合い、前記界面が、前記二特異性抗体の形成を促進するように変更されていることを特徴とし、前記変更が、
ａ）前記二特異性抗体内の前記他方の重鎖のＣＨ３ドメインの前記元の界面と向かい合う、一方の重鎖のＣＨ３ドメインの前記元の界面内で、アミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、一方の重鎖のＣＨ３ドメインの前記界面内に、前記他方の重鎖のＣＨ３ドメインの前記界面内の空洞にはまる突起が作出されるように、一方の重鎖のＣＨ３ドメインが変更されていることと、
ｂ）前記二特異性抗体内の前記第１のＣＨ３ドメインの前記元の界面と向かい合う、前記第２のＣＨ３ドメインの前記元の界面内で、アミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、前記第２のＣＨ３ドメインの前記界面内に、前記第１のＣＨ３ドメインの前記界面内の突起がはまる空洞が作出されるように、前記他方の重鎖のＣＨ３ドメインが変更されていることと
を特徴とする、項目１から２１のいずれか一項に記載の抗体。
（項目２３）
ヒトＩｇＧ１  Ｆｃパート内に、Ｐｒｏ３２９のグリシンもしくはアルギニンによるアミノ酸置換、ならびに／またはＬｅｕ２３４のアラニンによる置換およびＬｅｕ２３５のアラニンによる置換を含むことを特徴とする、項目１から２２のいずれか一項に記載の抗体。
（項目２４）
構築物ＲＯＲ１  Ｆａｂ−Ｆｃ−ＣＤ３  Ｆａｂ−ＲＯＲ１  Ｆａｂであり、前記抗ＣＤ３ε抗体のＦａｂ断片内にＶＬ／ＶＨクロスオーバーを含むこと、ならびに、前記ヒトＩｇＧ１  Ｆｃパート内に、Ｐｒｏ３２９のグリシンによるアミノ酸置換、Ｌｅｕ２３４のアラニンによるアミノ酸置換およびＬｅｕ２３５のアラニンによるアミノ酸置換を含むことを特徴とする、項目２３に記載の抗体。
（項目２５）
ａ）構築物ＲＯＲ１  Ｆａｂ−Ｆｃ−ＣＤ３  Ｆａｂ−ＲＯＲ１  Ｆａｂの抗体であること、
ｂ）前記抗ＣＤ３ε抗体のＦａｂ断片内にＶＬ／ＶＨクロスオーバーを含むこと、
ｃ）ヒトＩｇＧ１  Ｆｃパートを含むこと、
ｄ）前記Ｆｃパート内に、Ｐｒｏ３２９のグリシンによる置換およびＬｅｕ２３４のアラニンによる置換およびＬｅｕ２３５のアラニンによる置換を含むこと、ならびに、
ｅ）両方のＲＯＲ１  Ｆａｂの定常ドメインＣＬ内で、１２４位におけるアミノ酸がリシン（Ｋ）により置換されており、１２３位におけるアミノ酸がカッパ軽鎖についてはアルギニン（Ｒ）により置換されており、ラムダ軽鎖についてはリシン（Ｋ）により置換されており、前記定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）により置換されていることを特徴とする、項目１から２２のいずれか一項に記載の抗体。
（項目２６）
初代Ｂ−ＣＬＬ細胞において、１ｎＭの濃度で、３７℃で２時間の間に内部化しないことを特徴とする、項目１から２５のいずれか一項に記載の抗体。
（項目２７）
前記二特異性抗体が、細胞ベースのアッセイにおいて、ＲＯＲ１陽性初代Ｂ−ＣＬＬ細胞を使用し、１ｎＭの抗体濃度で使用した場合、３７℃で２時間の間に内部化しないことを特徴とし、内部化しないとは、０時間において測定される、フローサイトメトリーにより検出される前記二特異性抗体のＲＯＲ１陽性初代Ｂ−ＣＬＬ細胞への結合の際における平均蛍光強度（ＭＦＩ）が、３７℃で２時間のインキュベーション後の再測定のときに、５０％を超えて低減しないか、好ましくは３０％を超えて低減しないことを意味する、項目１から２６のいずれか一項に記載の抗体。
（項目２８）
項目１から２７のいずれか一項に記載の二特異性抗体を調製するための方法であって、
ａ）宿主細胞を、項目１から２７のいずれか一項に記載の抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含むベクターで形質転換するステップと、
ｂ）前記宿主細胞を、前記抗体分子の合成を可能とする条件下で培養するステップと、
ｃ）前記抗体分子を、前記培養物から回収するステップと
を含む方法。
（項目２９）
項目１から２７のいずれか一項に記載の抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞。
（項目３０）
項目１から２７のいずれか一項に記載の抗体および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
（項目３１）
医薬としての使用のための、項目１から２７のいずれか一項に記載の抗体、または項目３０に記載の医薬組成物。
（項目３２）
慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、および潜在的に、腫瘍細胞の表面上にＲＯＲ１を有する他の血液悪性腫瘍を含むＲＯＲ１陽性血液悪性腫瘍の処置における医薬としての使用のため、ならびに乳がんおよび肺がんなどのＲＯＲ１陽性固形腫瘍の処置のための、項目１から２７のいずれか一項に記載の抗体、または項目３０に記載の医薬組成物。
（項目３３）
多発性骨髄腫の処置における医薬としての使用のための、項目１から２７のいずれか一項に記載の抗体、または項目３０に記載の医薬組成物。
（項目３４）
Ｂ細胞系系統の慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）（Ｂ−ＣＬＬ）の処置のため、および多発性骨髄腫ＭＭのような形質細胞障害、またはＲＯＲ１を発現する他のＢ細胞障害の処置における医薬としての使用のための、項目１から２７のいずれか一項に記載の抗体、または項目３０に記載の医薬組成物。
（項目３５）
卵巣がん、肺がん、乳がん、胃がん、および膵がんからなる群から選択される疾患の処置における医薬としての使用のための、項目１から２７のいずれか一項に記載の抗体、または項目３０に記載の医薬組成物。
（項目３６）
卵巣がんの処置における医薬としての使用のための、項目１から２７のいずれか一項に記載の抗体、または項目３０に記載の医薬組成物。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
特記事項：以下の図面の説明において、Ｍａｂ２を、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体における抗ＲＯＲ１抗体としておよび／または抗ＲＯＲ１  Ｆａｂとして使用したことが言及されていなければ、Ｍａｂ１が、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体における抗ＲＯＲ１抗体としておよび／または抗ＲＯＲ１  Ｆａｂとして使用されている。
【００６８】
【図１Ａ−Ｂ】図１Ａ−Ｋ。Ｆａｂ断片（ＣＤ３およびＲＯＲ１に対して特異的である）を含む、以下のように指定される好ましい二特異性抗体：（１Ａ、１Ｂ）Ｆａｂ  ＲＯＲ１−Ｆｃ−Ｆａｂ  ＣＤ３；（１Ｃ、１Ｄ）Ｆａｂ  ＲＯＲ１−Ｆｃ−Ｆａｂ  ＣＤ３−Ｆａｂ  ＲＯＲ１；（１Ｆ、１Ｇ）Ｆａｂ  ＲＯＲ１−Ｆｃ−Ｆａｂ  ＲＯＲ１−Ｆａｂ  ＣＤ３；（１Ｈ、１Ｉ）Ｆｃ−Ｆａｂ  ＣＤ３−Ｆａｂ  ＲＯＲ１；（１Ｊ、１Ｋ）Ｆｃ−Ｆａｂ  ＲＯＲ１−Ｆａｂ  ＣＤ３。Ｆａｂ  ＣＤ３は、ＬＣ誤対合および副産物を低減するように、ＶＨ−ＶＬクロスオーバーを含むことが好ましい。Ｆａｂ  ＣＤ３およびＦａｂ  ＲＯＲ１は、可撓性のリンカーにより、互いに連結される。
【図１Ｃ−Ｇ】図１Ａ−Ｋ。Ｆａｂ断片（ＣＤ３およびＲＯＲ１に対して特異的である）を含む、以下のように指定される好ましい二特異性抗体：（１Ａ、１Ｂ）Ｆａｂ  ＲＯＲ１−Ｆｃ−Ｆａｂ  ＣＤ３；（１Ｃ、１Ｄ）Ｆａｂ  ＲＯＲ１−Ｆｃ−Ｆａｂ  ＣＤ３−Ｆａｂ  ＲＯＲ１；（１Ｆ、１Ｇ）Ｆａｂ  ＲＯＲ１−Ｆｃ−Ｆａｂ  ＲＯＲ１−Ｆａｂ  ＣＤ３；（１Ｈ、１Ｉ）Ｆｃ−Ｆａｂ  ＣＤ３−Ｆａｂ  ＲＯＲ１；（１Ｊ、１Ｋ）Ｆｃ−Ｆａｂ  ＲＯＲ１−Ｆａｂ  ＣＤ３。Ｆａｂ  ＣＤ３は、ＬＣ誤対合および副産物を低減するように、ＶＨ−ＶＬクロスオーバーを含むことが好ましい。Ｆａｂ  ＣＤ３およびＦａｂ  ＲＯＲ１は、可撓性のリンカーにより、互いに連結される。
【図１Ｈ−Ｋ】図１Ａ−Ｋ。Ｆａｂ断片（ＣＤ３およびＲＯＲ１に対して特異的である）を含む、以下のように指定される好ましい二特異性抗体：（１Ａ、１Ｂ）Ｆａｂ  ＲＯＲ１−Ｆｃ−Ｆａｂ  ＣＤ３；（１Ｃ、１Ｄ）Ｆａｂ  ＲＯＲ１−Ｆｃ−Ｆａｂ  ＣＤ３−Ｆａｂ  ＲＯＲ１；（１Ｆ、１Ｇ）Ｆａｂ  ＲＯＲ１−Ｆｃ−Ｆａｂ  ＲＯＲ１−Ｆａｂ  ＣＤ３；（１Ｈ、１Ｉ）Ｆｃ−Ｆａｂ  ＣＤ３−Ｆａｂ  ＲＯＲ１；（１Ｊ、１Ｋ）Ｆｃ−Ｆａｂ  ＲＯＲ１−Ｆａｂ  ＣＤ３。Ｆａｂ  ＣＤ３は、ＬＣ誤対合および副産物を低減するように、ＶＨ−ＶＬクロスオーバーを含むことが好ましい。Ｆａｂ  ＣＤ３およびＦａｂ  ＲＯＲ１は、可撓性のリンカーにより、互いに連結される。
【００６９】
【図２】（Ａ）初代ＣＬＬ細胞および（Ｂ）ＲＰＭＩ８２２６  ＭＭ細胞およびＲｅｃ−１  ＭＣＬ細胞の表面上の、Ａｌｅｘａ４８８で標識された抗ＲＯＲ１  ＩｇＧ抗体またはＡｌｅｘａ６４７で標識された抗ヒトＦｃ抗体を使用する、ＲＯＲ１細胞の検出。ベースラインと比較したＭＦＩシグナルの上昇を示すグラフ。
【００７０】
【図３】ＲＯＲ１陽性ＲＰＭＩ８２２６細胞上の、抗ＲＯＲ１  ＩｇＧ１抗体の結合（Ａ）およびＲＯＲ１陰性ＭＫＮ４５細胞への非結合（Ｂ）。抗ＲＯＲ１抗体濃度（０．１４〜１００ｎＭ）の関数としてプロットされた、抗ＲＯＲ１  ＩｇＧについての平均蛍光強度。
【００７１】
【図３−１】図３−１は、電荷変異体を伴わない８３Ａ１０−ＴＣＢの作製および精製を、電荷変異体を伴う８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖと対比して示す図である。８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体および８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体のための、異なる精製法の後における、ＣＥ−ＳＤＳ（非還元）による、最終タンパク質調製物についてのグラフ。８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体へと適用された、プロテインＡ（ＰＡ）アフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ除外クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による精製ステップ（Ａ）。（Ｂ）（Ａ）における最終タンパク質調製物へと適用された、さらなる精製ステップ：カチオン交換クロマトグラフィー（ｃＩＥＸ）ステップおよび最終的なサイズ除外クロマトグラフィー（ｒｅ−ＳＥＣ）ステップ。（Ｃ）ＰＡ＋ｃＩＥＸ＋ＳＥＣ精製ステップの後における、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体。８３Ａ１０−ＴＣＢ分子および８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ分子のいずれも、参考として援用されるＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０６７８４１の図２ａに記載されている分子フォーマットの分子である。
【００７２】
【図３−２ＡＢ】図３−２は、一対一の比較研究：電荷変異体を伴わない８３Ａ１０−ＴＣＢの作製を、電荷変異体を伴う８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖと対比して示す図である。８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体および８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体の特性（例えば、純度、収率、単量体含量）を、並行して測定し、各精製ステップ：１）ＰＡアフィニティークロマトグラフィーだけ（Ａ、Ｂ）、２）ＰＡアフィニティークロマトグラフィー、次いで、ＳＥＣ（Ｃ、Ｄ）、ならびに３）ＰＡアフィニティークロマトグラフィー、次いで、ＳＥＣ、次いで、ｃＩＥＸおよびｒｅ−ＳＥＣ（Ｅ、Ｆ）の後で比較した。８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体および８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体のための、それぞれの精製法の後における、ＣＥ−ＳＤＳ（非還元）による、最終タンパク質溶液についてのグラフ。（Ａ）８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体へと適用されたＰＡアフィニティークロマトグラフィーによる精製ステップ。（Ｂ）８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体へと適用されたＰＡアフィニティークロマトグラフィーによる精製ステップ。（Ｃ）８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体へと適用された、ＰＡアフィニティークロマトグラフィー＋ＳＥＣ精製ステップ。（Ｄ）８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体へと適用された、ＰＡアフィニティークロマトグラフィー＋ＳＥＣ精製ステップ。（Ｅ）８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体へと適用された、ＰＡアフィニティークロマトグラフィー±ＳＥＣ＋ｃＩＥＸ＋ＳＥＣ精製ステップ。（Ｆ）８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体へと適用された、ＰＡアフィニティークロマトグラフィー±ＳＥＣ＋ｃＩＥＸ＋ＳＥＣ精製ステップ。純度、収率、単量体含量を測定した。液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）により検出された、適正な分子の百分率。
【図３−２ＣＤ】図３−２は、一対一の比較研究：電荷変異体を伴わない８３Ａ１０−ＴＣＢの作製を、電荷変異体を伴う８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖと対比して示す図である。８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体および８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体の特性（例えば、純度、収率、単量体含量）を、並行して測定し、各精製ステップ：１）ＰＡアフィニティークロマトグラフィーだけ（Ａ、Ｂ）、２）ＰＡアフィニティークロマトグラフィー、次いで、ＳＥＣ（Ｃ、Ｄ）、ならびに３）ＰＡアフィニティークロマトグラフィー、次いで、ＳＥＣ、次いで、ｃＩＥＸおよびｒｅ−ＳＥＣ（Ｅ、Ｆ）の後で比較した。８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体および８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体のための、それぞれの精製法の後における、ＣＥ−ＳＤＳ（非還元）による、最終タンパク質溶液についてのグラフ。（Ａ）８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体へと適用されたＰＡアフィニティークロマトグラフィーによる精製ステップ。（Ｂ）８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体へと適用されたＰＡアフィニティークロマトグラフィーによる精製ステップ。（Ｃ）８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体へと適用された、ＰＡアフィニティークロマトグラフィー＋ＳＥＣ精製ステップ。（Ｄ）８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体へと適用された、ＰＡアフィニティークロマトグラフィー＋ＳＥＣ精製ステップ。（Ｅ）８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体へと適用された、ＰＡアフィニティークロマトグラフィー±ＳＥＣ＋ｃＩＥＸ＋ＳＥＣ精製ステップ。（Ｆ）８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体へと適用された、ＰＡアフィニティークロマトグラフィー±ＳＥＣ＋ｃＩＥＸ＋ＳＥＣ精製ステップ。純度、収率、単量体含量を測定した。液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）により検出された、適正な分子の百分率。
【図３−２ＥＦ】図３−２は、一対一の比較研究：電荷変異体を伴わない８３Ａ１０−ＴＣＢの作製を、電荷変異体を伴う８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖと対比して示す図である。８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体および８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体の特性（例えば、純度、収率、単量体含量）を、並行して測定し、各精製ステップ：１）ＰＡアフィニティークロマトグラフィーだけ（Ａ、Ｂ）、２）ＰＡアフィニティークロマトグラフィー、次いで、ＳＥＣ（Ｃ、Ｄ）、ならびに３）ＰＡアフィニティークロマトグラフィー、次いで、ＳＥＣ、次いで、ｃＩＥＸおよびｒｅ−ＳＥＣ（Ｅ、Ｆ）の後で比較した。８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体および８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体のための、それぞれの精製法の後における、ＣＥ−ＳＤＳ（非還元）による、最終タンパク質溶液についてのグラフ。（Ａ）８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体へと適用されたＰＡアフィニティークロマトグラフィーによる精製ステップ。（Ｂ）８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体へと適用されたＰＡアフィニティークロマトグラフィーによる精製ステップ。（Ｃ）８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体へと適用された、ＰＡアフィニティークロマトグラフィー＋ＳＥＣ精製ステップ。（Ｄ）８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体へと適用された、ＰＡアフィニティークロマトグラフィー＋ＳＥＣ精製ステップ。（Ｅ）８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体へと適用された、ＰＡアフィニティークロマトグラフィー±ＳＥＣ＋ｃＩＥＸ＋ＳＥＣ精製ステップ。（Ｆ）８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体へと適用された、ＰＡアフィニティークロマトグラフィー±ＳＥＣ＋ｃＩＥＸ＋ＳＥＣ精製ステップ。純度、収率、単量体含量を測定した。液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）により検出された、適正な分子の百分率。
【００７３】
【図３−３】抗体濃度の関数として、蛍光強度シグナル中央値の増大によって測定される、ＲＯＲ１  ＩｇＧ（ＲＯＲ１  Ｍａｂ２、白抜き記号）および抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体（ＲＯＲ１  Ｍａｂ２−ＴＣＢｃｖ、塗りつぶし記号）の、卵巣がん細胞系ＳＫ−ＯＶ−３（Ａ）およびＰＡ−１（Ｂ）への結合。ＳＫ−ＯＶ−３卵巣がん細胞系およびＰＡ−１卵巣がん細胞系の両方で試験した、ＣＤ３だけに結合し、ＲＯＲ１に結合しない対照ＴＣＢでは、シグナルは観察されなかった（ＡおよびＢ；塗りつぶし丸）。
【００７４】
【図３−４】抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体の、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞への結合。Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞においてＲＯＲ１  Ｍａｂ２−ＴＣＢｃｖ（四角）および対照ＴＣＢ（丸）の濃度依存的結合が観察され、これにより、どちらのＴＣＢ抗体もＴ細胞上のＣＤ３に結合することが確認される。
【００７５】
【図４Ａ】図４。標識された抗ヒトＦｃ二次抗体を使用するＦＡＣＳによって検出される（間接的な検出）、３７℃で２時間のインキュベーション後の、ＲＯＲ１陽性初代Ｂ−ＣＬＬ細胞上の（Ａ、Ｂ）１ｎＭの濃度の抗ＲＯＲ１  ＩｇＧ１抗体および（Ａ、Ｃ）抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ２＋１抗体の内部化率（％）。（Ａ、Ｂ）抗ＲＯＲ１  ＩｇＧ抗体（１ｎＭ）は、初代Ｂ−ＣＬＬ細胞において、約１２．５％内部化した。（Ａ、Ｃ）抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ２＋１抗体（１ｎＭ）は、初代Ｂ−ＣＬＬ細胞において、同じ実験条件で、ＦＡＣＳ（間接的な検出）によって測定される通り、２７．１％の内部化率を示した。内部化は、０時間、ベースラインにおけるＭＦＩ値に基づいて計算し、以前に記載された式を使用して計算した。
【図４ＢＣ】図４。標識された抗ヒトＦｃ二次抗体を使用するＦＡＣＳによって検出される（間接的な検出）、３７℃で２時間のインキュベーション後の、ＲＯＲ１陽性初代Ｂ−ＣＬＬ細胞上の（Ａ、Ｂ）１ｎＭの濃度の抗ＲＯＲ１  ＩｇＧ１抗体および（Ａ、Ｃ）抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ２＋１抗体の内部化率（％）。（Ａ、Ｂ）抗ＲＯＲ１  ＩｇＧ抗体（１ｎＭ）は、初代Ｂ−ＣＬＬ細胞において、約１２．５％内部化した。（Ａ、Ｃ）抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ２＋１抗体（１ｎＭ）は、初代Ｂ−ＣＬＬ細胞において、同じ実験条件で、ＦＡＣＳ（間接的な検出）によって測定される通り、２７．１％の内部化率を示した。内部化は、０時間、ベースラインにおけるＭＦＩ値に基づいて計算し、以前に記載された式を使用して計算した。
【００７６】
【図５】標識された抗ヒトＦｃ二次抗体を使用するＦＡＣＳによって検出される（間接的な検出）、フェニルアルシンオキシド（ＰＡＯ）の存在下または非存在下、３７℃で２時間のインキュベーション後の、初代Ｂ−ＣＬＬ細胞上の抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ１＋１抗体（１ｎＭ）の内部化率（％）。ＰＡＯを伴わない３７℃で２時間のインキュベーション後には、初代Ｂ−ＣＬＬ細胞において、ＭＦＩシグナルの９１％の低減が観察された。しかし、Ｂ−ＣＬＬ細胞をＰＡＯ（３μＭ）の存在下でインキュベートした場合にも、ＭＦＩシグナルの９０％の消失がなお観察され、これにより、ＭＦＩシグナルの損失が、抗体の内部化に起因するものではなく、おそらく解離に起因するものであることが示される。
【００７７】
【図６】２つの独立の実験において測定された、３７℃で２時間のインキュベーション後の、ＲＰＭＩ８２２６  ＭＭ細胞における、ＴＣＢ２＋１抗体および抗ＲＯＲ１  ＩｇＧ抗体（１ｎＭ）の内部化率。結果は、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ２＋１のＲＰＭＩ細胞における内部化率が１５％未満であることを実証する。
【００７８】
【図７】Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞上の抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体の結合。抗体濃度（３〜５００ｎＭ）の関数としてプロットされた、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体についての平均蛍光強度；Ｊｕｒｋａｔ細胞上の抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ１＋１抗体および抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ２＋１抗体。抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ１＋１抗体および抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ２＋１抗体のＪｕｒｋａｔ細胞に対するＥＣ５０値および最大結合は未到達だった。ＤＰ４７アイソタイプ対照抗体または抗ＲＯＲ１  ＩｇＧ抗体はＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞に結合しなかった。
【００７９】
【図８】ＲＯＲ１陽性ＲＰＭＩ８２２６細胞上の抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体の結合。抗体濃度（０．１３６〜１３．６ｎＭ）の関数としてプロットされた平均蛍光強度。
【００８０】
【図９Ａ】図９。ＲＯＲ１陽性（Ａ）Ｒｅｃ−１細胞および（Ｂ）ＲＰＭＩ８２２６細胞の存在下での、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体によるＴ細胞の活性化マーカーの上方調節。抗体濃度（０．０１ｐＭ〜１００ｎＭ）の関数としてプロットされた平均蛍光強度。（Ａ）ＣＤ８  Ｔ細胞に対してゲーティングした場合の後期活性化マーカーＣＤ２５の平均蛍光強度の濃度依存的な増大がＲｅｃ−１細胞において観察された。ＲＯＲ１陽性Ｒｅｃ−１細胞の存在下での、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ１＋１抗体によるＣＤ８  Ｔ細胞の有意な濃度依存的活性化。１００ｐＭの抗体で最大シグナルに到達した。非結合性ＴＣＢ構築物を使用することによる、ＲＯＲ１陽性標的細胞への結合を伴わないＴ細胞上のＣＤ３への結合でのＣＤ８  Ｔ細胞の非特異的な活性化は最小であった。ＣＤ８  Ｔ細胞の活性化は、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ２＋１抗体を用いた場合に、ＣＤ２５平均蛍光強度の、かすかであるが注目すべき増大によって示される通り、弱かった。しかし、非特異的なＴ細胞の活性化を除外することはできなかった。（Ｂ）ＲＯＲ１陽性ＲＰＭＩ８２２６  ＭＭ細胞の存在下で抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ１＋１抗体および抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ２＋１抗体によって媒介される、ＣＤ８  Ｔ細胞上のＣＤ２５の濃度依存的な上方調節。被験ＴＣＢ抗体の最高濃度（１００ｐＭ）において、非結合性ＴＣＢ構築物を用いて示される通り、ＣＤ８  Ｔ細胞の非特異的な活性化は見られなかった。
【図９Ｂ】図９。ＲＯＲ１陽性（Ａ）Ｒｅｃ−１細胞および（Ｂ）ＲＰＭＩ８２２６細胞の存在下での、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体によるＴ細胞の活性化マーカーの上方調節。抗体濃度（０．０１ｐＭ〜１００ｎＭ）の関数としてプロットされた平均蛍光強度。（Ａ）ＣＤ８  Ｔ細胞に対してゲーティングした場合の後期活性化マーカーＣＤ２５の平均蛍光強度の濃度依存的な増大がＲｅｃ−１細胞において観察された。ＲＯＲ１陽性Ｒｅｃ−１細胞の存在下での、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ１＋１抗体によるＣＤ８  Ｔ細胞の有意な濃度依存的活性化。１００ｐＭの抗体で最大シグナルに到達した。非結合性ＴＣＢ構築物を使用することによる、ＲＯＲ１陽性標的細胞への結合を伴わないＴ細胞上のＣＤ３への結合でのＣＤ８  Ｔ細胞の非特異的な活性化は最小であった。ＣＤ８  Ｔ細胞の活性化は、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ２＋１抗体を用いた場合に、ＣＤ２５平均蛍光強度の、かすかであるが注目すべき増大によって示される通り、弱かった。しかし、非特異的なＴ細胞の活性化を除外することはできなかった。（Ｂ）ＲＯＲ１陽性ＲＰＭＩ８２２６  ＭＭ細胞の存在下で抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ１＋１抗体および抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ２＋１抗体によって媒介される、ＣＤ８  Ｔ細胞上のＣＤ２５の濃度依存的な上方調節。被験ＴＣＢ抗体の最高濃度（１００ｐＭ）において、非結合性ＴＣＢ構築物を用いて示される通り、ＣＤ８  Ｔ細胞の非特異的な活性化は見られなかった。
【００８１】
【図９−１】卵巣がん標的細胞の存在下での、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体によるＴ細胞の活性化マーカーの上方調節。活性化マーカーの発現を、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団に対してゲーティングした場合の蛍光強度中央値を測定することにより決定した。ＲＯＲ１  Ｍａｂ２−ＴＣＢｃｖ（四角）は、ＲＯＲ１の発現が低度なＳＫ−ＯＶ−３標的細胞の存在下で、ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ａ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｂ）において観察された、ＣＤ６９早期活性化マーカーの濃度依存的な増大を誘導したのに対し、対照ＴＣＢ（三角形）は、Ｔ細胞の活性化を少しも誘導しなかった。臨床的に関与性の濃度である１ｎＭのＲＯＲ１  Ｍａｂ２−ＴＣＢｃｖにおいて、４８時間のインキュベーション後、最大４０％の活性化ＣＤ４  Ｔ細胞および２５％の活性化ＣＤ８  Ｔ細胞が既に存在していた。
【００８２】
【図１０】抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体によって活性化されたＣＤ８  Ｔ細胞による、リダイレクトされたＴ細胞によるＲＯＲ１陽性ＲＰＭＩ８２２６  ＭＭ標的細胞の殺滅。抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体によって誘導される標的細胞の特異的な細胞傷害作用（腫瘍溶解）をＬＤＨ放出によって測定した。（Ａ）実験１（１４時間の時点）：３：１のＥ：Ｔ比、すなわち、ＣＤ８  Ｔ細胞、３に対してＲＰＭＩ８２２６標的細胞、１を用いた実験条件で、被験最低濃度である０．０１ｐＭの抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ１＋１抗体では３０％の腫瘍溶解が既に観察され、３０ｎＭの抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体で最大３７．５％の腫瘍溶解に達した。ＬＤＨ放出により検出された、３０ｎＭにおいて観察された３７．５％の腫瘍溶解は、３０ｎＭの非結合性ＴＣＢ１＋１（すなわち、エフェクター細胞には結合するが標的細胞には結合しない）での非特異的な標的細胞溶解は１７％に過ぎなかったので、標的細胞の非特異的な殺滅だけに帰することはできなかった。抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ２＋１抗体については、被験最低濃度である０．２ｆＭにおいて３０％の最大の標的細胞溶解が既に観察され、最大１０ｎＭとして増大する濃度で濃度依存的な応答は見られなかった。３０ｎＭの非結合性ＴＣＢ２＋１では腫瘍溶解が３０％近くであった。（Ｂ）実験２（２０時間の時点）：１００ｐＭの濃度の抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ１＋１およびＴＣＢ２＋１抗体では３０〜４０％の標的細胞溶解が観察されたのに対し、非結合性ＴＣＢ対照は、同じ濃度において腫瘍溶解を少しも誘導しなかった。
【００８３】
【図１１】異なるエフェクター細胞対腫瘍細胞（Ｅ：Ｔ）比での、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体によって活性化されたＰＢＭＣ由来のＴ細胞による、リダイレクトされたＴ細胞によるＲＯＲ１陽性ＲＰＭＩ８２２６  ＭＭ標的細胞の殺滅。抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体によって誘導される標的細胞の特異的な細胞傷害作用（腫瘍溶解）をＬＤＨ放出によって測定した。（Ａ）Ｅ：Ｔ比＝ＰＢＭＣ、１０：ＲＰＭＩ８２２６  ＭＭ細胞、１（２４時間の時点）：最大１００ｎＭとして増大する濃度で、濃度依存的な応答が見られた。１０：１のＥ：Ｔ比、すなわち、ＰＢＭＣ、１０に対してＲＰＭＩ８２２６標的細胞、１を用いた実験条件において、１００ｎＭの濃度の抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ１＋１抗体および抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ２＋１抗体で最大平均２５％の腫瘍溶解が観察された。ＬＤＨ放出により検出された、１００ｎＭで観察された２５％の腫瘍溶解は、１００ｎＭの非結合性ＴＣＢ２＋１（すなわち、エフェクター細胞には結合するが標的細胞には結合しない）での非特異的な標的細胞溶解は９％に過ぎなかったので、標的細胞の非特異的な殺滅だけに帰することはできなかった。（Ｂ）Ｅ：Ｔ比＝ＰＢＭＣ、２５：ＲＰＭＩ８２２６  ＭＭ細胞、１（２４時間の時点）：最大２ｎＭとして増大する濃度の抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ１＋１で、濃度依存的な腫瘍溶解が見られた。２ｎＭの濃度の抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ１＋１で最大平均３０％の腫瘍溶解が既に観察されたが、１００ｎＭの濃度で、応答がより大きくなることはかったので、腫瘍溶解はプラトーに到達したものと思われる。
【００８４】
【図１２ＡＢ】図１２。異なるレベルの、表面ＲＯＲ１：発現が高度なＰＡ−１（Ａ）、発現が中程度なＣＯＬＯ−７０４（Ｂ）およびＯＶＣＡＲ−５（Ｃ）、および発現が低度なＳＫ−ＯＶ−３（Ｄ）を用いた、リダイレクトされたＴ細胞によるＲＯＲ１陽性卵巣がん標的細胞の殺滅。ＰＢＭＣ、１０：標的細胞、１のエフェクター細胞対腫瘍細胞（Ｅ：Ｔ）比。抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体によって誘導される標的細胞の特異的な細胞傷害作用（腫瘍溶解）をＬＤＨ放出によって測定した（４８時間培養）。０．５ｐＭから５０ｎＭまでの増大する濃度で、濃度依存的な応答が見られた。ＲＯＲ１  Ｍａｂ２−ＴＣＢｃｖ（四角）は、ＲＯＲ１の発現が高度なＰＡ−１卵巣がん細胞（Ａ）、ＲＯＲ１の発現が中程度なＣＯＬＯ−７０４卵巣がん細胞（Ｂ）およびＯＶＣＡＲ−５卵巣がん細胞（Ｃ）、ならびにＲＯＲ１の発現が低度なＳＫ−ＯＶ−３卵巣がん細胞（Ｄ）の腫瘍細胞溶解の濃度依存的な増大を誘導した。対照的に、ＣＤ３だけに結合する対照ＴＣＢ（Ａ、Ｂ、Ｃ；丸）は、臨床的に関与性の濃度（すなわち、最大１０ｎＭ）において腫瘍細胞溶解を誘導しなかった。代表的な実験を示す（ｎ＝１〜５）。
【図１２ＣＤ】図１２。異なるレベルの、表面ＲＯＲ１：発現が高度なＰＡ−１（Ａ）、発現が中程度なＣＯＬＯ−７０４（Ｂ）およびＯＶＣＡＲ−５（Ｃ）、および発現が低度なＳＫ−ＯＶ−３（Ｄ）を用いた、リダイレクトされたＴ細胞によるＲＯＲ１陽性卵巣がん標的細胞の殺滅。ＰＢＭＣ、１０：標的細胞、１のエフェクター細胞対腫瘍細胞（Ｅ：Ｔ）比。抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体によって誘導される標的細胞の特異的な細胞傷害作用（腫瘍溶解）をＬＤＨ放出によって測定した（４８時間培養）。０．５ｐＭから５０ｎＭまでの増大する濃度で、濃度依存的な応答が見られた。ＲＯＲ１  Ｍａｂ２−ＴＣＢｃｖ（四角）は、ＲＯＲ１の発現が高度なＰＡ−１卵巣がん細胞（Ａ）、ＲＯＲ１の発現が中程度なＣＯＬＯ−７０４卵巣がん細胞（Ｂ）およびＯＶＣＡＲ−５卵巣がん細胞（Ｃ）、ならびにＲＯＲ１の発現が低度なＳＫ−ＯＶ−３卵巣がん細胞（Ｄ）の腫瘍細胞溶解の濃度依存的な増大を誘導した。対照的に、ＣＤ３だけに結合する対照ＴＣＢ（Ａ、Ｂ、Ｃ；丸）は、臨床的に関与性の濃度（すなわち、最大１０ｎＭ）において腫瘍細胞溶解を誘導しなかった。代表的な実験を示す（ｎ＝１〜５）。
【発明を実施するための形態】
【００８５】
（発明の詳細な説明）
本発明者らは、ＶＨ／ＶＬの交換を伴う、ＣＤ３εおよびＲＯＲ１に対する二特異性抗体は、ＣＤ３εまたはＲＯＲ１に対する抗体部分の軽鎖ＣＬ内で、１２４位におけるアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）、それぞれの定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）により独立に置換されている（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）場合、高収率で作製され、容易に精製されうることを見出した。
【００８６】
ＶＨ／ＶＬの交換は、ＣＤ３結合性部分内でなされることが好ましい。二特異性抗体は、ＣＤ３への結合について一価であることが好ましい。上で記載したアミノ酸置換は、ＲＯＲ１結合性部分内またはＣＤ３結合性部分内のいずれかでなされうる。したがって、本発明のある特定の実施形態では、ＣＤ３結合性部分は、ＶＨ／ＶＬの交換およびアミノ酸置換を含みうる。この場合、ＲＯＲ１結合性部分は、アミノ酸１２４、１４７、２１３、または１２３において、ＶＨ／ＶＬの交換も、アミノ酸置換も含まない。二特異性抗体は、ＣＤ３への結合について一価であり、ＲＯＲ１への結合について二価であることが好ましい。したがって、記載される通り、二特異性抗体は、第１のＲＯＲ１結合性部分と同一である、第２のＲＯＲ１結合性部分を含みうる。したがって、第１のＲＯＲ１結合性部分が、アミノ酸置換を含めば、第２のＲＯＲ１結合性部分も、同じ置換を含み、第１のＲＯＲ１結合性部分が、アミノ酸置換を含まなければ、第２のＲＯＲ１結合性部分もまた、置換を含まない。アミノ酸１２４は、Ｋであり、アミノ酸１４７は、Ｅであり、アミノ酸２１３は、Ｅであり、アミノ酸１２３は、Ｒであることが好ましい。ＣＤ３結合性部分およびＲＯＲ１結合性部分（または、そうである場合、ＲＯＲ１結合性部分の両方）は、Ｆａｂ断片であり、それによって、２つのＲＯＲ１結合性部分が存在する場合、１つのＲＯＲ１部分は、ＣＨ１／ＶＬ（ＲＯＲ１結合性部分のＣ末端（ＣＨ１）からクロスオーバーのＣＤ３結合性部分のＮ末端（ＶＬ）へ）、またはＣＨ１／ＶＨ（クロスオーバーのＣＤ３結合性部分のＣ末端（ＣＨ１）からＲＯＲ１結合性部分のＮ末端（ＶＨ）へ）を介して、ＣＤ３結合性部分へと化学的に連結されることが好ましい。二特異性抗体は、Ｆｃパートを含む場合も、Ｆｃパートを含まない場合もある。
【００８７】
本明細書で使用される「ＲＯＲ１」という用語は、チロシン−プロテインキナーゼ受容体である、ヒトＲＯＲ１（同義語：チロシン−プロテインキナーゼ膜貫通受容体ＲＯＲ１、ＥＣ＝２．７．１０．１、神経栄養チロシンキナーゼ、受容体関連１、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｑ０１９７３）に関する。ＲＯＲ１の細胞外ドメインは、ＵｎｉＰｒｏｔに従い、アミノ酸３０〜４０６からなる。本明細書で使用される「ＲＯＲ１に対する抗体、抗ＲＯＲ１抗体またはＲＯＲ１  Ｍａｂ」という用語は、ヒトＲＯＲ１に特異的に結合する抗体に関する。この抗体は、ＲＯＲ１の細胞外ドメイン（配列番号１のアミノ酸Ｍ１〜Ｖ４０６）に特異的に結合する。この抗体は、Ｉｇ様Ｃ２型ドメイン（配列番号１のアミノ酸Ｑ７３〜Ｖ１３９）、ｆｒｉｚｚｌｅｄドメイン（配列番号１のアミノ酸Ｅ１６５〜Ｉ２９９）、またはクリングルドメイン（配列番号１のアミノ酸Ｋ３１２〜Ｃ３９１）である、細胞外ドメインの断片に特異的に結合する。これらの断片は、ＷＯ２００５１００６０５において言及されている。この抗体は、ＲＯＲ１の細胞外ドメイン断片ＷＮＩＳＳＥＬＮＫＤＳＹＬＴＬ（配列番号１８）に特異的に結合することがさらに好ましい。この断片は、Daneshmanesh  AHら、Int.  J.  Cancer、１２３巻（２００８年）１１９０〜１１９５頁において言及されている。本発明に従う例示的な抗ＲＯＲ１抗体は、Ｍａｂ２（ＷＯ２０１２０９７３１、Ｍａｂ  ４Ａ５）およびＭａｂ１、Ｍａｂ３およびＭａｂ４（ＷＯ２０１２０７５１５８、Ｍａｂ  Ｒ１２、Ｙ３１およびＲ１１）である。指定のない場合、ＲＯＲ１  ＩｇＧまたはＴＣＢ抗体はＭａｂ１を指す。
【００８８】
本明細書で使用される「ＣＤ３εまたはＣＤ３」という用語は、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０７７６６（ＣＤ３Ｅ＿ＨＵＭＡＮ）下に記載されているヒトＣＤ３εに関する。「ＣＤ３に対する抗体、抗ＣＤ３抗体」という用語は、ＣＤ３εに結合する抗体に関する。抗体は、配列番号１２、１３、および１４の重鎖ＣＤＲを、それぞれ、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＨと、配列番号１５、１６、および１７の軽鎖ＣＤＲを、それぞれ、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＬとを含むことが好ましい。抗体は、配列番号１０（ＶＨ）および配列番号１１（ＶＬ）の可変ドメインを含むことが好ましい。抗体は、配列番号２３、２４および２５の重鎖ＣＤＲを、それぞれ、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＨと、配列番号２６、２７および２８の軽鎖ＣＤＲを、それぞれ、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＬとを含むことが好ましい。抗体は、配列番号２１（ＶＨ）および配列番号２２（ＶＬ）の可変ドメインを含むことが好ましい。配列番号１０および１１および２１および２２に示されている抗ＣＤ３抗体は、ＳＰ３４に由来し、抗体ＳＰ３４としてのエピトープ結合に関して同様の配列および同じ特性を有する。
【００８９】
「ＣＤ３またはＲＯＲ１に特異的に結合すること」とは、抗体が、ＣＤ３またはＲＯＲ１のターゲティングにおいて治療剤として有用であるように、ＣＤ３またはＲＯＲ１（標的）に、十分なアフィニティーで結合することが可能な抗体を指す。一部の実施形態では、抗ＣＤ３またはＲＯＲ１抗体が、無関係なＣＤ３以外またはＲＯＲ１以外のタンパク質に結合する程度は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、またはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により測定される場合、抗体のＣＤ３またはＲＯＲ１への結合の約１０分の１、好ましくは、１００分の１未満である。ＣＤ３またはＲＯＲ１に結合する抗体の解離定数（Ｋｄ）は、１０−８Ｍまたはそれ未満、好ましくは、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、好ましくは、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍであることが好ましい。本発明に従う二特異性抗体は、異なる種に由来するＲＯＲ１の間で保存されているＲＯＲ１のエピトープおよび／または異なる種に由来するＣＤ３の間、好ましくは、ヒトおよびカニクイザルの間で保存されているＣＤ３のエピトープに結合することが好ましい。「ＣＤ３およびＲＯＲ１に特異的に結合する二特異性抗体」または「本発明に従う抗体」とは、両方の標的への結合についてのそれぞれの定義を指す。ＲＯＲ１（またはＣＤ３またはＲＯＲ１およびＣＤ３）に特異的に結合する抗体は、他のヒト抗原に結合しない。したがって、ＥＬＩＳＡでは、このような無関係な標的についてのＯＤ値は、特異的なアッセイの検出限界のＯＤ値と等しいかもしくはそれ未満、好ましくは、１．５ｐＭと等しいかもしくはそれ未満、またはＲＯＲ１をプレートに結合させていないか、もしくはＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトしていない対照試料のＯＤ値と等しいかもしくはそれ未満である。
【００９０】
本発明に従う抗体は、プレートに結合させたＲＯＲ１を使用する、ヒトＲＯＲ１への結合についてのＥＬＩＳＡにより解析する。このアッセイでは、好ましくは、１．５ｎＭの量のプレートに結合させたＲＯＲ１と、好ましくは、１ｐＭ〜２００ｎＭの範囲の濃度の抗ＲＯＲ１抗体を使用する。そのＲＯＲ１結合が、ＲＯＲ１をプレートに結合させていないか、または本発明に従うＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトしていない対照試料のＯＤ値よりも少なくとも２０％高い本発明に従う抗体は、「ＥＬＩＳＡアッセイにおいてヒトＲＯＲ１に結合する」抗体である。本発明に従う例示的な抗体は、ポリペプチド、配列番号３７、３８、３９、および４０の重鎖および軽鎖のセットにより特徴付けられる。本発明に従う別の例示的な抗体は、ポリペプチド、配列番号３７、３８、３９、および４１の重鎖および軽鎖のセットにより特徴付けられる。
【００９１】
本明細書で使用される「内部化しない、本発明に従う抗体」という用語は、細胞ベースのアッセイにおいて、ＲＯＲ１陽性Ｂ−ＣＬＬ細胞を使用して、および１ｎＭの抗体濃度で使用した場合、３７℃で２時間の間に内部化しないことを特徴とするＭＦＩ低減特性を有する、本発明に従う二特異性抗体を意味し、内部化しないとは、０時間において測定される、フローサイトメトリーにより検出されるＲＯＲ１陽性細胞への結合の際における平均蛍光強度（ＭＦＩ）が、３７℃で２時間のインキュベーション後の再測定のときに、内部化によって５０％を超えて低減せず、好ましくは３０％を超えて低減しないことを意味する。本発明に従う二特異性抗体は、ＲＯＲ１陽性Ｂ−ＣＬＬ細胞において内部化しない、したがって、前記抗ＲＯＲ１抗体のＲＯＲ１陽性Ｂ−ＣＬＬ細胞への結合は、本明細書に記載の細胞ベースのアッセイにおいて、前記抗体を３７℃で２時間インキュベートしたした場合に、５０％を超えて低減せず、好ましくは、３０％を超えて低減しない。
【００９２】
本発明に従う二特異性抗体はまた、細胞ベースのアッセイにおいて、ＲＯＲ１陽性Ｂ−ＣＬＬ細胞を使用して、および１ｎＭの抗体濃度で、３７℃で２時間の間に、フローサイトメトリーにより測定される、３７℃で０時間から２時間までの内部化による平均蛍光強度の低減（ΔＭＦＩ）が、同じ濃度および実験条件における、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号２の配列および可変重鎖ドメイン（ＶＨ）として配列番号６の配列を含むヒトＩｇＧ１カッパ（κ）型の抗ＲＯＲ１二価抗体のΔＭＦＩの、１２０％〜０％の間、好ましくは、１００％〜０％であることも好ましい。
【００９３】
抗ＲＯＲ１抗体を含むＴ細胞二特異性抗体を使用する治療では、上で定義した通り、腫瘍細胞とＴ細胞の間の安定な免疫シナプスおよび有効なＴ細胞媒介性のリダイレクトされた細胞傷害作用を容易にするために、抗体は内部化しないことが好ましい。
【００９４】
本明細書で使用される、「前記抗ＲＯＲ１抗体のＲＯＲ１陽性細胞への内部化」を反映する「平均蛍光強度の低減」（ΔＭＦＩ）、または「ＭＦＩ低減」という用語は、式ΔＭＦＩ＝１００−１００×［（ＭＦＩ実験値−ＭＦＩバックグラウンド）／（ＭＦＩ最大−ＭＦＩバックグラウンド）］を使用することにより、各ＲＯＲ１抗体について、非特異的なヒトＩｇＧ対照（ＭＦＩバックグラウンド）および氷上で維持されたＲＯＲ１抗体（ＭＦＩ最大）と比較して計算されるＭＦＩ低減の百分率を指す。ＭＦＩ実験値は、３７℃で２時間のインキュベーション後の前記ＲＯＲ１抗体で測定されるＭＦＩである。１０μＭのエンドサイトーシス阻害剤フェニルアルシンオキシドによって少なくとも７５％遮断および反転されるＭＦＩ低減は、例えば、抗体内部化によって引き起こされるのに対し、フェニルアルシンオキシドにより遮断されないＭＦＩ低減は、抗体解離によって引き起こされる。内部化する抗ＲＯＲ１抗体は最先端技術において公知である（Baskarら、Clin.  Cancer  Res.、１４巻（２号）：３９６〜４０４頁（２００８年））。
【００９５】
本発明に従う二特異性抗体は、３μＭのフェニルアルシンオキシド（ＰＡＯ）の存在下で２時間の時点のＭＦＩ値の、ＰＡＯの非存在下における２時間の時点のＭＦＩ値と比較した増大が、３０％を超えない、好ましくは、２０％を超えない、好ましくは、１０％を超えない、さらには、０時間におけるＭＦＩ値の検出レベルを超えないことを特徴とすることが好ましい。
【００９６】
本明細書で使用される「標的」という用語は、ＲＯＲ１またはＣＤ３のいずれかを意味する。「第１の標的および第２の標的」という用語は、第１の標的としてのＣＤ３、および第２の標的としてのＲＯＲ１を意味するか、または、第１の標的としてのＲＯＲ１、および第２の標的としてのＣＤ３を意味する。
【００９７】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、モノクローナル抗体を指す。抗体は、「軽鎖」（ＬＣ）および「重鎖」（ＨＣ）の２つの対（本明細書では、このような軽鎖（ＬＣ）／重鎖対を、ＬＣ／ＨＣと略記する）からなる。このような抗体の軽鎖および重鎖は、いくつかのドメインからなるポリペプチドである。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書では、ＨＣＶＲまたはＶＨと略記する）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、重鎖定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３（抗体クラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧ）、任意選択で重鎖定常ドメインＣＨ４（抗体クラス：ＩｇＥおよびＩｇＭ）を含む。各軽鎖は、軽鎖可変ドメインＶＬおよび軽鎖定常ドメインＣＬを含む。可変ドメインＶＨおよびＶＬは、相補性決定領域（ＣＤＲ）と名付けられる超可変領域であって、フレームワーク領域（ＦＲ）と名付けられる、より保存的な領域を散在させた、超可変領域へとさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端から、カルボキシ末端へと、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で並べられる、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。重鎖および軽鎖の「定常ドメイン」は、抗体の、標的への結合に直接は関与しないが、多様なエフェクター機能を呈示する。
【００９８】
本明細書で使用される「抗体の軽鎖」とは、Ｎ末端からＣ末端の方向で、ＶＬ−ＣＬと略記される、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含むポリペプチドである。本明細書で使用される「クロスオーバー軽鎖（ＶＨ−ＣＬ）」とは、ＶＬドメインを、それぞれのＶＨドメインで置きかえた軽鎖である。本明細書で使用される「抗体の重鎖」とは、Ｎ末端からＣ末端の方向で、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）を含むポリペプチドである。本明細書で使用される「クロスオーバー重鎖（ＶＬ−ＣＨ１）」とは、ＶＨドメインを、それぞれのＶＬドメインで置きかえた重鎖である。
【００９９】
ヘテロ二量体化を強化する、ＣＨ３修飾のためのいくつかの手法であって、例えば、ＷＯ９６／２７０１１、ＷＯ９８／０５０４３１、ＥＰ１８７０４５９、ＷＯ２００７／１１０２０５、ＷＯ２００７／１４７９０１、ＷＯ２００９／０８９００４、ＷＯ２０１０／１２９３０４、ＷＯ２０１１／９０７５４、ＷＯ２０１１／１４３５４５、ＷＯ２０１２０５８７６８、ＷＯ２０１３１５７９５４、ＷＯ２０１３０９６２９１において十分に記載されている手法が存在する。このような手法のいずれにおいても、第１のＣＨ３ドメインおよび第２のＣＨ３ドメインの両方を、各ＣＨ３ドメイン（またはそれを含む重鎖）がもはや、それ自身とホモ二量体化することができず、操作された相補的な他のＣＨ３ドメインとヘテロ二量体化することを強いられるように（第１のＣＨ３ドメインと、第２のＣＨ３ドメインとが、ヘテロ二量体化し、２つの第１のＣＨ３ドメインまたは２つの第２のＣＨ３ドメインの間でホモ二量体が形成されないように）相補的な形で操作することが典型的である。重鎖のヘテロ二量体化を改善するためのこれらの異なる手法は、本発明に従う抗体内で、重鎖−軽鎖修飾（１つの結合性アーム内のＶＨおよびＶＬの交換／置きかえ、ならびにＣＨ１／ＣＬ界面内の、逆の電荷を伴う帯電アミノ酸による置換の導入）と組み合わせた異なる代替法であって、軽鎖の誤対合、例えば、ベンス−ジョーンズ型副産物を低減する代替法として想定されている。
【０１００】
本発明の好ましい一実施形態では、アミノ酸置換または電荷変異体とは、軽鎖の誤対合を低減する、本発明に従う抗体内の１２３位および１２４位における定常ドメインＣＬおよび／または１４７位および２１３位における定常ドメインＣＨ１に適用される。
【０１０１】
本発明の好ましい一実施形態では（本発明に従う抗体が、重鎖内にＣＨ３ドメインを含む場合には）、本発明に従う前記多特異性抗体のＣＨ３ドメインは、例えば、ＷＯ９６／０２７０１１、Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、９巻（１９９６年）、６１７〜６２１頁；およびＭｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６巻（１９９８年）、６７７〜６８１頁；ＷＯ９８／０５０４３１において、いくつかの例と共に、詳細に記載されている、「ＫＩＨ（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）」技術により変更することができる。この方法では、これらの２つのＣＨ３ドメインを含有する両方の重鎖のヘテロ二量体化を増大させるように、２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面を変更する。２つのＣＨ３ドメイン（２つの重鎖の）の各々を「ノブ」としうる一方で、他は「ホール」となる。
【０１０２】
こうして、本発明の一実施形態では、本発明に従う前記抗体は（各重鎖内にＣＨ３ドメインを含み）、ａ）抗体の第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインおよびｂ）抗体の第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインの各々が、抗体のＣＨ３ドメインの間の、元の界面を含む界面において向かい合い、前記界面が、本発明に従う抗体の形成を促進するように変更されていることもさらに特徴とし、前記変更は、
ｉ）本発明に従う抗体内の他方の重鎖のＣＨ３ドメインの元の界面と向かい合う、一方の重鎖のＣＨ３ドメインの元の界面内で、アミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、一方の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内に、他方の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内の空洞にはまる突起が作出されるように、一方の重鎖のＣＨ３ドメインが変更されていることと、
ｉｉ）本発明に従う抗体内の第１のＣＨ３ドメインの元の界面と向かい合う、第２のＣＨ３ドメインの元の界面内で、アミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、第２のＣＨ３ドメインの界面内に、第１のＣＨ３ドメインの界面内の突起がはまる空洞が作出されるように、他方の重鎖のＣＨ３ドメインが変更されていることと
を特徴とする。
【０１０３】
より大きい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）からなる群から選択されることが好ましい。
【０１０４】
本発明の一態様では、両方のＣＨ３ドメインは、両方のＣＨ３ドメインの間でジスルフィド架橋が形成されうるように、各ＣＨ３ドメインの対応する位置におけるアミノ酸としてのシステイン（Ｃ）の導入により、さらに変更されている。
【０１０５】
ヘテロ二量体化を強化する、ＣＨ３修飾のための他の技法も、本発明の代替法として想定されており、例えば、ＷＯ９６／２７０１１、ＷＯ９８／０５０４３１、ＥＰ１８７０４５９、ＷＯ２００７／１１０２０５、ＷＯ２００７／１４７９０１、ＷＯ２００９／０８９００４、ＷＯ２０１０／１２９３０４、ＷＯ２０１１／９０７５４、ＷＯ２０１１／１４３５４５、ＷＯ２０１２／０５８７６８、ＷＯ２０１３／１５７９５４、ＷＯ２０１３／１５７９５３、ＷＯ２０１３／０９６２９１において記載されている。
【０１０６】
一実施形態では、本発明に従う抗体は、ＩｇＧ２アイソタイプの抗体であり、ＷＯ２０１０／１２９３０４において記載されているヘテロ二量体化法を、代替的に使用することができる。
【０１０７】
「抗体」という用語は、例えば、それらの特徴的な特性が保持されている限りにおいて、マウス抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および遺伝子操作抗体（変異体または突然変異体の抗体）を含む。とりわけ、組換えヒト抗体またはヒト化抗体としての、ヒト抗体またはヒト化抗体が、とりわけ、好ましい。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一のアミノ酸組成を有する抗体分子の調製物を指す。
【０１０８】
二特異性抗体に関して本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、二特異性抗体が、ＣＤ３およびＲＯＲ１結合剤として、言及されているような結合剤だけを含むことを意味する。したがって、ＲＯＲ１に特異的に結合する一価抗ＲＯＲ１抗体と、ＣＤ３に特異的に結合する一価抗体とを含む本発明に従う二特異性抗体は、ＣＤ３およびＲＯＲ１結合に関しては、ＣＤ３に対する結合力価は１だけであり、ＲＯＲ１に対する力価は１だけであり、したがって、二価である。ＲＯＲ１に特異的に結合する二価抗ＲＯＲ１抗体と、ＣＤ３に特異的に結合する一価抗体とを含む本発明に従う二特異性抗体は、ＲＯＲ１結合に関しては結合力価が２であり、ＣＤ３結合に関しては力価が１であり、したがって、三価である。ＣＤ３に特異的に結合する一価抗体は、そのＣ末端において、ＲＯＲ１に特異的に結合する抗体の１つの可変鎖のＮ末端と共有結合していることが好ましい。
【０１０９】
本明細書で使用される「抗体のＦａｂ断片」とは、抗原に結合する抗体の断片である。抗体のＦａｂ断片は、２つのドメイン対からなる。野生型抗体では、抗体のＦａｂ断片は、重鎖（ＣＨ１、およびＶＨ）および軽鎖（ＣＬおよびＶＬ）の各々の１つの定常ドメインおよび１つの可変ドメインから構成される。本発明に従えば、このようなドメイン対はまた、クロスオーバーのために、ＶＨ−ＣＬおよびＶＬ−ＣＨ１でもありうる。野生型抗体では、かつ、本発明に従えば、Ｆａｂ断片の重鎖および軽鎖のドメイン対のドメインは、化学的に一緒に連結されてはおらず、したがって、ｓｃＦｖ（単鎖可変断片）ではない。本発明に従う「クロスオーバー」とは、好ましくは、１つのＦａｂドメイン内で、ＶＬとＶＨとが、互いに置きかえられていることを意味する。「Ｆａｂ断片」という用語は、Ｆａｂ’断片のようなヒンジ領域の一部または全部も包含する。本明細書で使用される場合、「Ｆ（ａｂ）２断片」とは、Ｆｃパートを有することが好ましい、二価の単一特異性抗体断片を指す。
【０１１０】
本明細書で使用される「アミノ酸置換または電荷変異体」という用語は、定常ドメインＣＬ内で、１２４位におけるアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）、それぞれの定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）により独立に置換されており、好ましくは、さらに、定常ドメインＣＬ内で、１２３位におけるアミノ酸も、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により、好ましくは、アルギニン（Ｒ）により独立に置換されているという点で、本発明に従うアミノ酸置換を意味する。
【０１１１】
アミノ酸置換の好ましい組合せは、Ｑ１２４Ｋ、Ｅ１２３Ｒ、Ｋ１４７Ｅ、およびＫ２１３Ｅ（例えば、Ｅ１２３Ｒとは、１２３位におけるグルタミン酸（Ｅ）が、アルギニン（Ｒ）で置きかえられていることを意味する）である。Ｆ（ａｂ）２断片は、ヒンジ領域内で、Ｃ末端においてジスルフィド結合によって連結されていることが好ましく、通常、このような「Ｆ（ａｂ）２断片」は、Ｆ（ａｂ’）２断片である。アミノ酸置換の好ましい組合せは、Ｅ１２４Ｋ、Ｅ１２３Ｋ、Ｋ１４７ＥおよびＫ２１３Ｅである（例えば：Ｅ１２３Ｋは、１２３位のグルタミン酸（Ｅ）がリシン（Ｋ）により置きかえられていることを意味する）。Ｆ（ａｂ）２断片は、ヒンジ領域内で、Ｃ末端においてジスルフィド結合によって連結されていることが好ましく、通常、このような「Ｆ（ａｂ）２断片」は、Ｆ（ａｂ’）２断片である。本発明に従う抗体の定常ドメインＣＨ１／ＣＬ内の、逆の電荷を伴う帯電アミノ酸による置換の導入は、軽鎖の誤対合を低減する。
【０１１２】
本発明中で使用される「ＲＯＲ１  Ｆａｂ」という用語は、ＲＯＲ１に特異的に結合する抗体のＦａｂ断片を指す。抗ＲＯＲ１抗体Ｆａｂ断片（ＲＯＲ１  Ｆａｂ）内の可変領域または定常領域のいずれかの交換に起因して、このようなＲＯＲ１  Ｆａｂは、「ＲＯＲ１  ｃｒｏｓｓＦａｂ」または「クロスオーバーＲＯＲ１  Ｆａｂ断片」と称される。本発明に従って、ＲＯＲ１  Ｆａｂは、ＲＯＲ１  ｃｒｏｓｓＦａｂではない。「接続されている」とは、Ｆａｂ断片が、ペプチド結合により、直接、または１つもしくは複数のペプチドリンカーを介してのいずれかで連結されていることが好ましいことを意味する。本発明中で使用される「ＣＤ３  Ｆａｂ」という用語は、ＣＤ３に特異的に結合する抗体のＦａｂ断片を指す。ＣＤ３  Ｆａｂは、そのＮ末端において、ＲＯＲ１  ＦａｂのＣ末端に連結されている。ＣＤ３  Ｆａｂ内の可変領域または定常領域のいずれかの交換に起因して、このようなＣＤ３  Ｆａｂは、「ＣＤ３  ｃｒｏｓｓＦａｂ」または「クロスオーバーＣＤ３  Ｆａｂ断片」と称される。本発明に従って、ＣＤ３  Ｆａｂは、ｃｒｏｓｓＦａｂであることが好ましい。
【０１１３】
本発明中で使用される「ペプチドリンカー」という用語は、合成起源のものであることが好ましいアミノ酸配列を有するペプチドを指す。本発明に従うこれらのペプチドリンカーを使用して、Ｆａｂ断片のうちの１つを他のＦａｂ断片のＣ末端またはＮ末端に接続して本発明に従う多特異性抗体を形成する。前記ペプチドリンカーは、少なくとも５アミノ酸の長さ、好ましくは、５〜１００アミノ酸の長さ、より好ましくは、１０〜５０アミノ酸の長さのアミノ酸配列を有するペプチドであることが好ましい。一実施形態では、前記ペプチドリンカーは（ＧｘＳ）ｎまたは（ＧｘＳ）ｎＧｍであり、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリンであり（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５または６、およびｍ＝０、１、２または３）または（ｘ＝４、ｎ＝２、３、４または５およびｍ＝０、１、２または３）、好ましくは、ｘ＝４およびｎ＝２または３、より好ましくは、ｘ＝４、ｎ＝２である。さらに、リンカーは、免疫グロブリンヒンジ領域（その一部）を含みうる。一実施形態では、前記ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２（配列番号１９）である。
【０１１４】
ギリシャ文字：α、δ、ε、γ、およびμで示される、５種類の哺乳動物抗体重鎖が存在する（Ｊａｎｅｗａｙ  ＣＡ，Ｊｒら（２００１年）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、５版、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）。存在する重鎖の種類は、抗体のクラスを規定し、これらの鎖は、それぞれ、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＧ抗体、およびＩｇＭ抗体において見出される（Ｒｈｏａｄｅｓ  ＲＡ、Ｐｆｌａｎｚｅｒ  ＲＧ（２００２年）、Ｈｕｍａｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、４版、Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ）。別個の重鎖は、サイズおよび組成が異なり、αおよびγが、約４５０アミノ酸を含有するのに対し、μおよびεは、約５５０アミノ酸を有する。各重鎖は、２つの領域である、定常領域および可変領域を有する。定常領域は、同じアイソタイプの全ての抗体では、同一であるが、異なるアイソタイプの抗体では異なる。重鎖γ、α、およびδは、３つの定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３（一列の）と、可撓性を付加するためのヒンジ領域とから構成される定常領域を有し（Ｗｏｏｆ  Ｊ、Ｂｕｒｔｏｎ  Ｄ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、４巻（２００４年）、８９〜９９頁）、重鎖μおよびεは、４つの定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４から構成される定常領域を有する（Ｊａｎｅｗａｙ  ＣＡ，Ｊｒら（２００１年）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、５版、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）。重鎖の可変領域は、異なるＢ細胞により産生される抗体内では異なるが、単一のＢ細胞またはＢ細胞クローンにより産生される全ての抗体では同じである。各重鎖の可変領域は、約１１０アミノ酸の長さであり、単一の抗体ドメインから構成される。哺乳動物では、ラムダ（λ）およびカッパ（κ）と呼ばれる、２種類の軽鎖しか存在しない。軽鎖は、２つの連続ドメイン：１つの定常ドメインＣＬと、１つの可変ドメインＶＬとを有する。軽鎖のおおよその長さは、２１１〜２１７アミノ酸である。
【０１１５】
Ｆｃパートを含む本発明に従う二特異性抗体は、任意のクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ、好ましくは、ＩｇＧまたはＩｇＥ）、またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２、好ましくは、ＩｇＧ１）の抗体であることが可能であり、これによって、本発明に従う二特異性二価抗体が由来する両方の抗体は、同じサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４など、好ましくは、ＩｇＧ１）、好ましくは、同じアロタイプ（例えば、白色人種）のＦｃパートを有する。
【０１１６】
「抗体のＦｃパート」とは、当業者に周知であり、パパインによる抗体の切断に基づき規定される用語である。Ｆｃパートを含む本発明に従う抗体は、Ｆｃパートとして、好ましくは、ヒト由来のＦｃパート、好ましくは、ヒト定常領域の他の全てのパートも含有する。抗体のＦｃパートは、補体の活性化、Ｃ１ｑへの結合、Ｃ３の活性化、およびＦｃ受容体への結合に直接関与する。抗体の、補体系に対する影響は、ある特定の条件に依存するが、Ｃ１ｑへの結合は、Ｆｃパート内の、規定された結合性部位により引き起こされる。このような結合性部位は、最先端技術において公知であり、例えば、Ｌｕｋａｓ，ＴＪ．ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ.、１２７巻（１９８１年）、２５５５〜２５６０頁；Ｂｒｕｎｈｏｕｓｅ，Ｒ．、およびＣｅｂｒａ，Ｊ．Ｊ．、ＭｏＩ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６巻（１９７９年）、９０７〜９１７頁；Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２８８巻（１９８０年）、３３８〜３４４頁；Ｔｈｏｍｍｅｓｅｎ，Ｊ．Ｅ．ら、ＭｏＩ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３７巻（２０００年）、９９５〜１００４頁；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ，Ｅ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６４巻（２０００年）、４１７８〜４１８４頁；Ｈｅｚａｒｅｈ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７５巻（２００１年）、１２１６１〜１２１６８頁；Ｍｏｒｇａｎ，Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、８６巻（１９９５年）、３１９〜３２４頁；ならびにＥＰ０３０７４３４により記載されている。このような結合性部位は、例えば、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、およびＰ３２９（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け（下記を参照されたい））である。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３の抗体が通例、補体の活性化、Ｃ１ｑへの結合、Ｃ３の活性化を示すのに対し、ＩｇＧ４は、補体系を活性化させず、Ｃ１ｑに結合せず、Ｃ３を活性化させない。Ｆｃパートは、ヒトＦｃパートであることが好ましい。Ｆｃパートは、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃパートであることが好ましい。本発明に従う抗体は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃパート内に、Ｐｒｏ３２９の、グリシンもしくはアルギニンによるアミノ酸置換、ならびに／または置換Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ、好ましくは、Ｐｒｏ３２９のグリシンによる置換、ならびに置換Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含むことが好ましい。
【０１１７】
ＩｇＧ１サブクラスの定常重領域ＣＨ２／ＣＨ３を含む本発明に従う二特異性抗体は、ＦｃＲおよびＣ１ｑ結合を回避し、ＡＤＣＣ／ＣＤＣを最小化するように、変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）を含むことを特徴とすることが好ましい。利点は、本発明のこのような抗体が、Ｔ細胞をリダイレクションし／活性化させる強力な機構により、その腫瘍細胞殺滅の有効性を純粋に媒介することである。補体系およびＦｃＲを発現するエフェクター細胞に対する効果などのさらなる作用機構は、回避され、副作用の危険性は、低下する。
【０１１８】
本発明に従う抗体は、Ｆｃパートとして、野生型ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＦｃ変異体であって、位置Ｐｒｏ３２９におけるアミノ酸置換と、少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換とを含み、残基が、ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従い、番号付けされ、前記抗体が、野生型ＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む抗体と比較して、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩに対するアフィニティーの低減を呈示し、前記抗体により誘導されるＡＤＣＣが、野生型ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む抗体により誘導されるＡＤＣＣの少なくとも２０％まで低減されるＦｃ変異体を含むことが好ましい。具体的な実施形態では、本発明に従う抗体内の野生型ヒトＦｃ領域のＰｒｏ３２９を、グリシンもしくはアルギニン、またはＦｃのプロリン３２９と、ＦｃγＲＩＩＩのトリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｅ）残基Ｔｒｐ８７およびＴｉｐ１１０との間で形成される、Ｆｃ／Ｆｃγ受容体界面内のプロリンサンドイッチ（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、４０６巻、２６７〜２７３頁（２０００年７月２０日））を破壊するのに十分な程度に大型のアミノ酸残基で置換する。本発明のさらなる態様では、Ｆｃ変異体内の、少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ、またはＰ３３１Ｓであり、さらに別の実施形態では、前記少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域のＬ２３４Ａ（ロイシン２３４が、アラニンにより置換されていることを示す）およびＬ２３５Ａ、またはヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域のＳ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅである。このようなＦｃ変異体については、ＷＯ２０１２１３０８３１において、詳細に記載されている。
【０１１９】
本発明に従う抗体の定常重鎖は、ヒトＩｇＧ１型のものであることが好ましく、定常軽鎖は、ヒトカッパ（κ）型のものであることが好ましい。
【０１２０】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一のアミノ酸組成を有する抗体分子の調製物を指す。
【０１２１】
「キメラ抗体」という用語は、１つの供給源または種に由来する可変領域、すなわち、結合性領域と、異なる供給源または種に由来する定常領域の少なくとも一部とを含む抗体であって、通例、組換えＤＮＡ技法により調製される抗体を指す。マウス可変領域と、ヒト定常領域とを含むキメラ抗体が好ましい。本発明により包含される、「キメラ抗体」の他の好ましい形態は、本発明に従う特性であって、とりわけ、Ｃ１ｑへの結合および／またはＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合に関する特性を作出するように、定常領域を、元の抗体の定常領域から修飾するか、または変化させた形態である。このようなキメラ抗体はまた、「クラススイッチ抗体」とも称する。キメラ抗体とは、免疫グロブリンの可変領域をコードするＤＮＡセグメントと免疫グロブリンの定常領域をコードするＤＮＡセグメントとを含む、発現した免疫グロブリン遺伝子の産物である。キメラ抗体を作製するための方法は、当技術分野で周知の従来の組換えＤＮＡおよび遺伝子トランスフェクション技法を伴う。例えばＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１巻（１９８４年）、６８５１〜６８５５頁；米国特許第５，２０２，２３８号、および同第５，２０４，２４４号を参照されたい。
【０１２２】
「ヒト化抗体」という用語は、フレームワークまたは「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が、親免疫グロブリンのＣＤＲと比較して特異性が異なる、免疫グロブリンのＣＤＲを含むように修飾された抗体を指す。好ましい実施形態では、マウスＣＤＲを、ヒト抗体のフレームワーク領域へとグラフトして、「ヒト化抗体」を調製する。例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻（１９８８年）、３２３〜３２７頁；およびＮｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３１４巻（１９８５年）、２６８〜２７０頁を参照されたい。特に好ましいＣＤＲは、キメラ抗体について上で言及した標的を認識する配列を表すＣＤＲに対応する。本発明により包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、本発明に従う特性であって、とりわけ、Ｃ１ｑへの結合および／またはＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合に関する特性を作出するように、定常領域を、元の抗体の定常領域から、さらに修飾するか、または変化させた形態である。
【０１２３】
本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことを意図する。最先端技術では、ヒト抗体が周知である（ｖａｎ  Ｄｉｊｋ，Ｍ．Ａ．およびｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｊ．Ｇ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、５巻（２００１年）、３６８〜３７４頁）。ヒト抗体はまた、免疫化すると、内因性免疫グロブリン産生の非存在下において、ヒト抗体の完全なレパートリーまたはセレクションを産生することが可能な、トランスジェニック動物（例えば、マウス）によって作製することもできる。ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子アレイの、このような生殖細胞系列突然変異マウスへの移入は、標的による感作時における、ヒト抗体の産生を結果としてもたらす（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻（１９９３年）、２５５１〜２５５５頁；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２巻（１９９３年）、２５５〜２５８頁；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ら、Ｙｅａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ.、７巻（１９９３年）、３３〜４０頁を参照されたい）。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリー（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．およびＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．、Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ.、２２７巻（１９９２年）、３８１〜３８８頁；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ.、２２２巻（１９９１年）、５８１〜５９７頁）で作製することもできる。ＣｏｌｅらおよびＢｏｅｒｎｅｒらによる技法はまた、ヒトモノクローナル抗体の調製にも利用可能である（Coleら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７頁（１９８５年）；およびＢｏｅｒｎｅｒ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７巻（１９９１年）、８６〜９５頁）。本発明に従うキメラ抗体およびヒト化抗体について既に言及した通り、本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語はまた、本発明に従う特性であって、とりわけ、Ｃ１ｑへの結合および／またはＦｃＲへの結合に関する特性を作出するように、例えば、「クラススイッチング」、すなわち、Ｆｃパートの変化または突然変異（例えば、ＩｇＧ１からＩｇＧ４への突然変異、および／またはＩｇＧ１／ＩｇＧ４突然変異）により、定常領域において修飾される抗体も含む。
【０１２４】
本明細書で使用される「組換えヒト抗体」という用語は、ＮＳＯ細胞もしくはＣＨＯ細胞などの宿主細胞、またはヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体、あるいは宿主細胞へとトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現させた抗体など、組換え手段により調製するか、発現させるか、創出するか、または単離した、全てのヒト抗体を含むことを意図する。このような組換えヒト抗体は、可変領域および定常領域を、再配列された形態で有する。本発明に従う組換えヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける体細胞超変異に供されている。こうして、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列のＶＨおよびＶＬ配列に由来し、これらと類縁であるが、ｉｎ  ｖｉｖｏのヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内で、天然には存在しえない配列である。
【０１２５】
本明細書で使用される「可変ドメイン」（軽鎖（ＶＬ）の可変ドメイン、重鎖（ＶＨ）の可変領域）は、抗体の、標的への結合に直接関与する、軽鎖および重鎖の対の各々を示す。可変ヒト軽鎖および重鎖のドメインは、同じ一般的構造を有し、各ドメインは、その配列が、広く保存され、３つの「超可変領域」（または相補性決定領域、ＣＤＲ）により接続されている、４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。フレームワーク領域は、βシートコンフォメーションを取り、ＣＤＲは、βシート構造を接続するループを形成しうる。各鎖内のＣＤＲは、フレームワーク領域により、それらの三次元構造に保たれ、他の鎖に由来するＣＤＲと一緒に、標的結合性部位を形成する。抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３領域は、本発明に従う抗体の結合特異性／アフィニティーにおいて、特に重要な役割を果たし、したがって、本発明のさらなる目的を提供する。
【０１２６】
本明細書で使用される場合の「超可変領域」または「抗体の標的結合性部分」という用語は、標的への結合の一因となる、抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」に由来するアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」領域または「ＦＲ」領域とは、本明細書で規定される超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。したがって、抗体の軽鎖および重鎖は、Ｎ末端からＣ末端へと、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む。各鎖上のＣＤＲは、このようなフレームワークアミノ酸により隔てられている。とりわけ、重鎖のＣＤＲ３は、標的への結合に最も寄与する領域である。ＣＤＲ領域およびＦＲ領域は、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１年）による標準的な規定に従い、決定する。
【０１２７】
本明細書で使用される「標的」または「標的分子」という用語は互換的に使用され、ヒトＲＯＲ１およびヒトＣＤ３εを指す。
【０１２８】
「エピトープ」という用語は、抗体への特異的結合が可能な、任意のポリペプチド決定基を含む。ある特定の実施形態では、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニルなど、化学的に活性な表面分子の群を含み、ある特定の実施形態では、特異的な三次元構造特徴および／または特異的な電荷特徴を有しうる。エピトープとは、抗体が結合する、標的の領域である。
【０１２９】
一般に、第１の標的に特異的に結合する前記抗体の軽鎖および重鎖をコードする２つのベクターと、第２の標的に特異的に結合する前記抗体の軽鎖および重鎖をコードするさらなる２つのベクターが存在する。２つのベクターのうちの一方は、それぞれの軽鎖をコードし、２つのベクターの他方は、それぞれの重鎖をコードする。しかし、本発明に従う二特異性抗体を調製するための代替法では、第１の標的に特異的に結合する抗体の重鎖および軽鎖をコードするただ１つの第１のベクターおよび第２の標的に特異的に結合する抗体の重鎖および軽鎖をコードするただ１つの第２のベクターを宿主細胞の形質転換に使用することができる。
【０１３０】
本明細書で使用される「核酸または核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むことを意図する。核酸分子は、一本鎖でも二本鎖でもよいが、二本鎖ＤＮＡであることが好ましい。
【０１３１】
本明細書で使用される「細胞」、「細胞系」、および「細胞培養物」という表現は、互換的に使用され、全てのこのような呼称は、子孫細胞を含む。こうして、「形質転換体」および「形質転換細胞」という語は、初代対象細胞、およびこれに由来する培養物であって、継代数に関わらない培養物を含む。また、全ての子孫細胞は、意図的なまたは偶発的な突然変異のために、ＤＮＡ含量が正確に同一でない可能性があることも理解される。元の形質転換細胞内でスクリーニングされたのと同じ機能または生物学的活性を有する、変異体の子孫細胞も含まれる。顕著に異なる呼称が意図される場合、文脈から明らかであろう。
【０１３２】
本明細書で使用される「形質転換」という用語は、ベクター／核酸の、宿主細胞への移入のプロセスを指す。透過しにくい細胞壁バリアを伴わない細胞を宿主細胞として使用する場合、トランスフェクションは、例えば、ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ  ｄｅｒ  Ｅｈ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２巻（１９７８年）、５４６頁以降により記載されている、リン酸カルシウム沈殿法により実行する。しかし、また、核注射によるまたはプロトプラスト融合によるなど、ＤＮＡを細胞へと導入するための他の方法も使用することができる。原核細胞または実質的な細胞壁の構築を含有する細胞を使用する場合、例えば、トランスフェクションの１つの方法は、Ｃｏｈｅｎ  ＳＮら、ＰＮＡＳ、１９７２年、６９巻（８号）：２１１０〜２１１４頁により記載されている通り、塩化カルシウムを使用するカルシウム処理である。
【０１３３】
最先端技術では、形質転換を使用する、抗体の組換え産生が周知であり、例えば、Ｍａｋｒｉｄｅｓ，Ｓ．Ｃ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ.、１７巻（１９９９年）、１８３〜２０２頁；Ｇｅｉｓｓｅ，Ｓ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ.、８巻（１９９６年）、２７１〜２８２頁；Ｋａｕｆｍａｎ，ＲＪ．、ＭｏＩ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.、１６巻（２０００年）、１５１〜１６１頁；Ｗｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ｇ．ら、Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ、４８巻（１９９８年）、８７０〜８８０頁による総説論文；ならびにＵＳ６３３１４１５およびＵＳ４８１６５６７において記載されている。
【０１３４】
本明細書で使用される「発現」とは、核酸をｍＲＮＡへと転写するプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡ（転写物ともまた称する）を、その後、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質へと翻訳するプロセスを指す。転写物と、コードされたポリペプチドとを、遺伝子産物と総称する。ポリヌクレオチドが、ゲノムＤＮＡに由来する場合、真核細胞内の発現は、ｍＲＮＡのスプライシングを含みうる。
【０１３５】
「ベクター」とは、核酸分子、特に、自己複製型核酸分子であって、挿入された核酸分子を、宿主細胞内および／または宿主細胞間に移入する核酸分子である。用語は、主にＤＮＡまたはＲＮＡの、細胞への挿入（例えば、染色体の組込み）のために機能するベクター、主にＤＮＡまたはＲＮＡの複製のために機能するベクターの複製、ならびにＤＮＡまたはＲＮＡの転写および／または翻訳のために機能する発現ベクターを含む。また、記載される機能のうちの１つを超える機能を提供するベクターも含まれる。
【０１３６】
「発現ベクター」とは、適切な宿主細胞へと導入されると、ポリペプチドへと転写および翻訳されるポリヌクレオチドである。「発現系」とは通例、所望の発現産物をもたらすように機能しうる発現ベクターを含む、適切な宿主細胞を指す。
【０１３７】
本発明に従う二特異性抗体は、組換え手段により作製することが好ましい。このような方法は、最先端技術において広く公知であり、原核細胞内および真核細胞内のタンパク質の発現であって、その後における抗体ポリペプチドの単離と、通例、薬学的に許容される純度までの精製とを伴う発現を含む。タンパク質を発現させるためには、標準的な方法により、軽鎖および重鎖またはこれらの断片をコードする核酸を、発現ベクターへと挿入する。発現は、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、酵母、またはＥ．ｃｏｌｉ細胞のような適切な原核または真核宿主細胞内で実施し、抗体は、細胞（上清または溶解の後における細胞）から回収する。二特異性抗体は、全細胞で、細胞溶解物中、または部分的に精製もしくは実質的に純粋形態で存在しうる。精製は、アルカリ／ＳＤＳ処理、カラムクロマトグラフィー、および当技術分野で周知の他の技法を含む標準的な技法により、他の細胞構成要素または他の夾雑物、例えば、他の細胞核酸またはタンパク質、を消失させるために実施する。Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７年）を参照されたい。
【０１３８】
ＮＳ０細胞内の発現は、例えば、Ｂａｒｎｅｓ，Ｌ．Ｍ．ら、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３２巻（２０００年）、１０９〜１２３頁；およびＢａｒｎｅｓ，Ｌ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ.、７３巻（２００１年）、２６１〜２７０頁により記載されている。一過性発現は、例えば、Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，Ｙ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、３０巻（２００２年）、Ｅ９頁により記載されている。可変ドメインのクローニングは、Ｏｒｌａｎｄｉ，Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６巻（１９８９年）、３８３３〜３８３７頁；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９巻（１９９２年）、４２８５〜４２８９頁；およびＮｏｒｄｅｒｈａｕｇ，Ｌ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０４巻（１９９７年）、７７〜８７頁により記載されている。好ましい一過性発現系（ＨＥＫ２９３）は、Ｓｃｈｌａｅｇｅｒ，Ｅ．−Ｊ．およびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｋ．、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３０巻（１９９９年）、７１〜８３頁；ならびにＳｃｈｌａｅｇｅｒ，Ｅ．−Ｊ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９４巻（１９９６年）、１９１〜１９９頁により記載されている。
【０１３９】
原核細胞に適する制御配列は、例えば、プロモーター、任意選択で、オペレーター配列およびリボソーム結合性部位を含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、およびポリアデニル化シグナルを活用することが公知である。
【０１４０】
核酸は、別の核酸配列との機能的関係に置かれた場合、「作動可能に連結」されている。例えば、プレ配列もしくは分泌リーダーのためのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参与するプレタンパク質として発現する場合、ポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に連結されているか；プロモーターもしくはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されているか；またはリボソーム結合性部位は、翻訳を容易とするように位置づけられている場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結された」とは、連結されているＤＮＡ配列が連続であり、分泌リーダーの場合、リーディングフレーム内で連続であることを意味する。しかし、エンハンサーは、連続でなくともよい。連結は、好都合な制限部位におけるライゲーションにより達成される。このような部位が存在しない場合は、従来の慣行に従い、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用する。
【０１４１】
二特異性抗体は、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなど、従来の免疫グロブリン精製手順により、培養培地から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡまたはＲＮＡは、従来の手順を使用して、たやすく単離され、シークエンシングされる。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡおよびＲＮＡの供給源として用いることができる。単離されたら、ＤＮＡを、発現ベクターへと挿入することができ、次いで、宿主細胞内で組換えモノクローナル抗体の合成を得るように、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞であって、トランスフェクトしなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞へとトランスフェクトする。
【０１４２】
二特異性抗体のアミノ酸配列の変異体（または突然変異体）は、適切なヌクレオチド変化を、抗体ＤＮＡへと導入することにより、またはヌクレオチドの合成により調製する。このような修飾は、実施しうるが、例えば、上で記載した通り、非常に限定的な範囲内に限られる。例えば、修飾は、ＩｇＧアイソタイプおよび標的への結合など、上述の抗体特徴を変更しないが、組換え作製の収率、タンパク質の安定性を改善する、または精製を容易とすることが可能である。
【０１４３】
Ｔ細胞二特異性（ＴＣＢ）結合剤は、細胞の殺滅（例えば、ピコモル未満の範囲または低ピコモル範囲の、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞殺滅アッセイにおけるＥＣ５０；Dreierら、Int  J  Cancer、２００２年）において、非常に高度な、濃度／腫瘍細胞受容体占有度依存的効力を有するが、Ｔ細胞二特異性結合剤（ＴＣＢ）は、従来の単一特異性抗体よりはるかに低用量で施されている。例えば、ブリナツモマブ（ＣＤ１９×ＣＤ３）は、急性リンパ性白血病の処置のための、５〜１５μｇ／ｍ２／日（すなわち、わずか、０．０３５〜０．１０５ｍｇ／ｍ２／週）、または非ホジキンリンパ腫の処置のための、６０μｇ／ｍ２／日の連続静脈内投与で施され、これらの投与時における血清濃度は、０．５〜４ｎｇ／ｍｌの範囲である（Klingerら、Blood、２０１２年、Toppら、J  Clin  Oncol、２０１１年、Goebelerら、Ann  Oncol、２０１１年）。ブリナツモマブの消失半減期は非常に短いので、臨床投与は、患者の体に携行するポンプを介した持続注入による。本発明の抗体の消失半減期はより長いので、本発明に従う抗体では、皮下投与が可能であり、臨床状況において好ましいことが想定される（週１回または週２回、０．１〜１０ｍｇ／ｍ２の用量範囲が好ましく、さらにより低い用量が好ましい）。これらの低濃度／用量／受容体占有度であってもなお、ＴＣＢは、無視できない有害事象を引き起こしうる（Klingerら、Blood、２０１２年）。本発明の抗体の薬物動態的特性の改善は、有害事象を潜在的に低減する１つの尺度である。
【０１４４】
原理上は、ＣＤ３およびＲＯＲ１に対する二特異性抗体を最先端技術において公知の全てのフォーマットで作製することが可能である。最近では、例えば、ＩｇＧ抗体フォーマットと単鎖ドメインとの、例えば、融合によって、多種多様な組換え二特異性抗体フォーマットが開発されている（例えば、Kontermann  RE、mAbs、４巻：２号（２０１２年）、１〜１６頁を参照されたい）。可変ドメインＶＬおよびＶＨまたは定常ドメインＣＬおよびＣＨ１を、互いに置きかえた二特異性抗体については、ＷＯ２００９０８０２５１およびＷＯ２００９０８０２５２において記載されている。抗体フォーマットならびに二特異性抗体および多特異性抗体のフォーマットはまた、ペップボディ（ｐｅｐｂｏｄｙ）（ＷＯ２００２４４２１５）、新規抗原受容体（「ＮＡＲ」）（ＷＯ２００３０１４１６１）、ダイアボディ−ダイアボディ二量体「ＴａｎｄＡｂ」（ＷＯ２００３０４８２０９）、ポリアルキレンオキシド改変ｓｃＦｖ（ＵＳ７１５０８７２）、ヒト化ウサギ抗体（ＷＯ２００５０１６９５０）、合成免疫グロブリンドメイン（ＷＯ２００６０７２６２０）、共有結合性ダイアボディ（ＷＯ２００６１１３６６５）、フレキシボディ（ｆｌｅｘｉｂｏｄｙ）（ＷＯ２００３０２５０１８）、ドメイン抗体、ｄＡｂ（ＷＯ２００４０５８８２２）、ワクシボディ（ｖａｃｃｉｂｏｄｙ）、（ＷＯ２００４０７６４８９）、新世界霊長類フレームワークを有する抗体（ＷＯ２００７０１９６２０）、切断可能なリンカーを用いた抗体−薬物コンジュゲート（ＷＯ２００９１１７５３１）、ヒンジ領域が除去されたＩｇＧ４抗体（ＷＯ２０１００６３７８５）、ＩｇＧ４様ＣＨ３ドメインを有する二特異性抗体（ＷＯ２００８１１９３５３）、ラクダ科動物抗体（ＵＳ６８３８２５４）、ナノボディ（ＵＳ７６５５７５９）、ＣＡＴダイアボディ（ＵＳ５８３７２４２）、標的抗原およびＣＤ３を対象とする二特異性ｓｃＦｖ２（ＵＳ７２３５６４１）、ｓＩｇＡ  Ｐ１抗体（ＵＳ６３０３３４１）、ミニボディ（ＵＳ５８３７８２１）、ＩｇＮＡＲ（ＵＳ２００９１４８４３８）、ヒンジおよびＦｃ領域が改変された抗体（ＵＳ２００８２２７９５８、ＵＳ２００８０１８１８９０）、三官能性抗体（ＵＳ５２７３７４３）、トリオマブ（ＵＳ６５５１５９２）、トロイボディ（ｔｒｏｙｂｏｄｙ）（ＵＳ６２９４６５４）である。
【０１４５】
本発明に従う抗体は、週１回または週２回、ｓ．ｃ.投与することができる。
【０１４６】
本発明に従う二特異性三価抗体は、効力に対する利点、有効性および安全性に対する予測可能性を有する。
【０１４７】
ＲＯＲ１に対して二価性を有し、ＣＤ３に対して一価性を有する、本発明に従う抗体は、悪性細胞上の腫瘍標的ＲＯＲ１への結合に、循環中のＴ細胞上のＣＤ３εへの結合よりも有利であり、ＣＤ３シンクを回避し、したがって、腫瘍における薬物曝露が増大する。
【０１４８】
以下の例、配列表、および図は、本発明の理解の一助とするために提示するものであり、本発明の真の範囲は、付属の特許請求の範囲で記される。本発明の精神から逸脱することなく、記される手順に改変を施しうることが理解される。
【０１４９】
配列表
【化１】
0006708635.tif 000002
【化２】
0006708635.tif 000003
【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
0006708635.tif 000009
【０１５０】
以下の、本発明に従うＦｃ含有抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢを作製するためには、上で記載した表で言及した、それぞれの構築物／配列番号が必要とされる：
ＲＯＲ１−ＴＣＢ  （２＋１）：３７、３８、３９、４０×２または３７、３８、３９、４１×２
ＲＯＲ１−ＴＣＢ  （１＋１）：３６、３７、３９、４０または３６、３７、３９、４１
Ｍａｂ２  ＲＯＲ１−ＴＣＢ  （２＋１）：３９、５４、５５、５６×２
Ｍａｂ３  ＲＯＲ１−ＴＣＢ  （２＋１）：３９、５７、５８、５９×２
Ｍａｂ４  ＲＯＲ１−ＴＣＢ  （２＋１）：３９、６０、６１、６２×２
【０１５１】
以下では、本発明の具体的な実施形態を列挙する。
実施形態１．  ヒトＣＤ３ε（さらにまた、「ＣＤ３」とも称する）およびヒトＲＯＲ１（さらにまた、「ＲＯＲ１」とも称する）の細胞外ドメインである、２つの標的に特異的に結合する、二価または三価の二特異性抗体であって、軽鎖およびそれぞれの重鎖内の可変ドメインＶＬおよびＶＨが、互いに置きかえられており、定常ドメインＣＬを含むことを特徴とし、１２４位におけるアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）、それぞれの定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）により独立に置換されている（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）二特異性抗体。
【０１５２】
実施形態２．  ヒトＣＤ３εおよびヒトＲＯＲ１の細胞外ドメインである、２つの標的に特異的に結合する二特異性抗体であって、
ａ）ＲＯＲ１に特異的に結合する第１の抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖と；
ｂ）ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖であって、前記第２の抗体の前記第２の軽鎖および第２の重鎖内の可変ドメインＶＬおよびＶＨが、互いに置きかえられている、第２の軽鎖および第２の重鎖とを含み；
ｃ）ａ）前記第１の軽鎖の定常ドメインＣＬ内で、１２４位におけるアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）、ａ）前記第１の重鎖の定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により独立に置換されている（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）こと
を特徴とする二特異性抗体。
【０１５３】
実施形態３．  ヒトＣＤ３εおよびヒトＲＯＲ１の細胞外ドメインである、２つの標的に特異的に結合する二特異性抗体であって、
ａ）ヒトＲＯＲ１に特異的に結合する第１の抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖と；
ｂ）ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖であって、前記第２の抗体の前記第２の軽鎖および第２の重鎖内の可変ドメインＶＬおよびＶＨが、互いに置きかえられている、第２の軽鎖および第２の重鎖とを含み；
ｃ）ｂ）下にある前記第２の軽鎖の定常ドメインＣＬ内で、１２４位におけるアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）、ｂ）下にある前記第２の重鎖の定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により独立に置換されている（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）こと
を特徴とする二特異性抗体。
【０１５４】
実施形態４．  さらに、前記第１の抗体のＦａｂ断片（さらにまた、「ＲＯＲ１−Ｆａｂ」とも称する）も含み、前記ＲＯＲ１−Ｆａｂの定常ドメインＣＬ内で、１２４位におけるアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されており（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）、前記ＲＯＲ１−Ｆａｂの定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）により独立に置換されている（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従う番号付け）こと
を特徴とする、実施形態２に従う二特異性抗体。
【０１５５】
実施形態５．  さらに、前記第１の抗体の第２のＦａｂ断片（「ＲＯＲ１−Ｆａｂ」）を含むことを特徴とする、実施形態３に従う二特異性抗体。
【０１５６】
実施形態６．  ＣＤ３εに特異的に結合する抗体の１つのＦａｂ断片（さらにまた、「ＣＤ３−Ｆａｂ」とも称する）と、ＲＯＲ１に特異的に結合する抗体の１つのＦａｂ断片（さらにまた、「ＲＯＲ１−Ｆａｂ」とも称する）と、Ｆｃパートとからなり、前記ＣＤ３−Ｆａｂおよび前記ＲＯＲ１−Ｆａｂが、それらのＣ末端を介して、前記Ｆｃパートのヒンジ領域へと連結されており、前記ＣＤ３−Ｆａｂまたは前記ＲＯＲ１−Ｆａｂのいずれかが、アミノ酸置換を含み、前記ＣＤ３−Ｆａｂが、クロスオーバーを含むことを特徴とする、実施形態１のいずれかに従う二特異性抗体。
【０１５７】
実施形態７．  前記ＣＤ３−Ｆａｂおよび前記ＲＯＲ１−Ｆａｂが、それらのＣ末端を介して、前記Ｆｃパートのヒンジ領域へと連結されている、１つのＣＤ３−Ｆａｂと、１つのＲＯＲ１−Ｆａｂと、Ｆｃパートと、そのＣ末端により前記ＣＤ３−ＦａｂのＮ末端へと連結された第２のＲＯＲ１−Ｆａｂとからなり、前記ＣＤ３−Ｆａｂが、クロスオーバーを含み、前記ＣＤ３−Ｆａｂまたは両方のＲＯＲ１−Ｆａｂのいずれかが、アミノ酸置換を含む（図１Ｃおよび１Ｄ）ことを特徴とする、実施形態６に従う二特異性抗体。
【０１５８】
実施形態８．  ＲＯＲ１−Ｆａｂ−Ｆｃ−ＣＤ３−Ｆａｂ−ＲＯＲ１−Ｆａｂからなり、両方のＲＯＲ１−Ｆａｂが、アミノ酸置換を含み、前記ＣＤ３−Ｆａｂが、ＶＬ／ＶＨクロスオーバーを含むことを特徴とする、実施形態７に従う二特異性抗体。
【０１５９】
実施形態９．  それらのＣ末端を介して、前記Ｆｃパートのヒンジ領域へと連結されている２つのＲＯＲ１−Ｆａｂと、Ｆｃパートと、そのＣ末端により１つのＲＯＲ１−ＦａｂのＮ末端へと連結されているＣＤ３−Ｆａｂとからなり、前記ＣＤ３−Ｆａｂが、クロスオーバーを含み、前記ＣＤ３−Ｆａｂまたは両方のＲＯＲ１−Ｆａｂのいずれかが、アミノ酸置換を含む（図１Ｆおよび１Ｇ）ことを特徴とする、実施形態１に従う二特異性抗体。
【０１６０】
実施形態１０．  そのＣ末端を介して、前記Ｆｃパートのヒンジ領域へと連結された、１つのＣＤ３−Ｆａｂと、そのＣ末端により、前記ＣＤ３−ＦａｂのＮ末端へと連結されたＲＯＲ１−Ｆａｂとからなり、前記ＣＤ３−Ｆａｂまたは前記ＲＯＲ１−Ｆａｂのいずれかが、アミノ酸置換を含む（図１Ｈおよび１Ｉ）ことを特徴とする、実施形態１から５のいずれか一つに従う二特異性抗体。
【０１６１】
実施形態１１．  そのＣ末端を介して、前記Ｆｃパートのヒンジ領域へと連結された、１つのＲＯＲ１−Ｆａｂと、そのＣ末端により、前記ＲＯＲ１−ＦａｂのＮ末端へと連結されたＣＤ３−Ｆａｂとからなり、前記ＣＤ３−Ｆａｂまたは前記ＲＯＲ１−Ｆａｂのいずれかが、アミノ酸置換を含む（図１Ｊおよび１Ｋ）ことを特徴とする、実施形態１から６のいずれか一つに従う二特異性抗体。
【０１６２】
実施形態１２．  抗ＲＯＲ１抗体ＭＡＢ１のＣＤＲ配列を含むことを特徴とする、実施形態１から１１のいずれか一つに従う二特異性抗体。
【０１６３】
実施形態１３．  抗ＲＯＲ１抗体ＭＡＢ１のＶＨおよびＶＬ配列を含むか、または抗ＲＯＲ１抗体ＭＡＢ１のＶＨ、ＶＬ、ＣＨ１、およびＣＬ配列を含む抗体であることを特徴とする、実施形態１から１２のいずれか一つに従う二特異性抗体。
【０１６４】
実施形態１４．  ヒトＣＤ３εに特異的に結合する抗体部分、好ましくは、前記Ｆａｂ断片が、
ａ）配列番号１２、１３および１４の重鎖ＣＤＲを、それぞれ、前記抗ＣＤ３ε抗体（ＣＤＲ  ＭＡＢ  ＣＤ３  Ｈ２Ｃ）の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＨと、配列番号１５、１６および１７の軽鎖ＣＤＲを、それぞれ、前記抗ＣＤ３ε抗体（ＣＤＲ  ＭＡＢ  ＣＤ３  Ｈ２Ｃ）の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＬとを含むか、または、
ｂ）配列番号２３、２４および２５の重鎖ＣＤＲを、それぞれ、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＨを含み、前記可変ドメインＶＬが、配列番号２６、２７および２８の軽鎖ＣＤＲを、それぞれ、前記抗ＣＤ３ε抗体（ＣＤＲ  ＭＡＢ  ＣＤ３  ＣＨ２５２７）の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＬにより置きかえられていることを特徴とすることを特徴とする、実施形態１から１３のいずれか一つに従う二特異性抗体。
【０１６５】
実施形態１５．  ヒトＣＤ３εに特異的に結合する前記抗体部分が、前記可変ドメインが、
ａ）配列番号１０および１１（ＶＨＶＬ  ＭＡＢ  ＣＤ３  Ｈ２Ｃ）、または、
ｂ）配列番号２１および２２（ＶＨＶＬ  ＭＡＢ  ＣＤ３  ＣＨ２５２７）
の可変ドメインであることを特徴とすることを特徴とする、実施形態１から１４のいずれか一つに従う二特異性抗体。
【０１６６】
実施形態１６．  ヒトＲＯＲ１に特異的に結合する前記Ｆａｂ断片が、重鎖ＣＤＲ、配列番号７のＣＤＲ１Ｈ、配列番号８のＣＤＲ２Ｈ、配列番号９のＣＤＲ３Ｈを含む可変ドメインＶＨを含むことと、軽鎖ＣＤＲ、配列番号３のＣＤＲ１Ｌ、配列番号４のＣＤＲ２Ｌ、配列番号５のＣＤＲ３Ｌを含む可変ドメインＶＬを含むこととを特徴とする（ＣＤＲ  ＭＡＢ１）ことを特徴とする、実施形態１から１５のいずれか一つに従う二特異性抗体。
【０１６７】
実施形態１７．  ヒトＲＯＲ１に特異的に結合する前記Ｆａｂ断片が、配列番号１０のＶＨと配列番号１１のＶＬとを含むことを特徴とする（ＶＨＶＬ  ＭＡＢ１）ことを特徴とする、実施形態１から１６のいずれか一つに従う二特異性抗体。
【０１６８】
実施形態１８．  前記定常ドメインＣＬ内の１２４位における前記アミノ酸の置きかえに加えて、１２３位におけるアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）により独立に置換されていることを特徴とする、実施形態１から１７のいずれか一つに従う二特異性抗体。
【０１６９】
実施形態１９．アミノ酸１２４がＫであり、アミノ酸１４７がＥであり、アミノ酸２１３がＥであり、およびアミノ酸１２３がＲであるかまたはアミノ酸１２４がＫであり、アミノ酸１４７がＥであり、アミノ酸２１３がＫである、および、アミノ酸１２３がＫであり、好ましくはアミノ酸１２３がＲであることを特徴とする、実施形態１から１８のいずれか１つに従う二特異性抗体。
【０１７０】
実施形態２０．  ヒトＲＯＲ１の細胞外ドメインおよびヒトＣＤ３εに特異的に結合する二特異性抗体であって、ポリペプチド、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、および配列番号４０からなる群、または、ポリペプチド、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、および配列番号４１からなる群から選択される、重鎖および軽鎖のセットを含むことを特徴とする二特異性抗体。
【０１７１】
実施形態２１．  ヒトＣＤ３εに特異的に結合する前記抗体部分内で、
ａ）配列番号１２、１３および１４の重鎖ＣＤＲを、それぞれ、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＨにより、前記可変ドメインＶＨが置きかえられ、配列番号１５、１６および１７の軽鎖ＣＤＲを、それぞれ、前記抗ＣＤ３ε抗体の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＬにより、前記可変ドメインＶＬが置きかえられること、または、
ｂ）配列番号２３、２４および２５の重鎖ＣＤＲを、それぞれ、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＨにより、前記可変ドメインＶＨが置きかえられ、配列番号２６、２７および２８の軽鎖ＣＤＲを、それぞれ、前記抗ＣＤ３ε抗体の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として含む可変ドメインＶＬにより、前記可変ドメインＶＬが置きかえられることを特徴とする、実施形態２０に従う抗体。
【０１７２】
実施形態２２．  一方の重鎖のＣＨ３ドメインおよび他方の重鎖のＣＨ３ドメインの各々が、抗体のＣＨ３ドメインの間の、元の界面を含む界面において向かい合い、前記界面が、前記二特異性抗体の形成を促進するように変更されていることを特徴とし、前記変更が、
ａ）前記二特異性抗体内の前記他方の重鎖のＣＨ３ドメインの前記元の界面と向かい合う、一方の重鎖のＣＨ３ドメインの前記元の界面内で、アミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、一方の重鎖のＣＨ３ドメインの前記界面内に、前記他方の重鎖のＣＨ３ドメインの前記界面内の空洞にはまる突起が作出されるように、一方の重鎖のＣＨ３ドメインが変更されていることと、
ｂ）前記二特異性抗体内の前記第１のＣＨ３ドメインの前記元の界面と向かい合う、前記第２のＣＨ３ドメインの前記元の界面内で、アミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置きかえられ、これにより、前記第２のＣＨ３ドメインの前記界面内に、前記第１のＣＨ３ドメインの前記界面内の突起がはまる空洞が作出されるように、前記他方の重鎖のＣＨ３ドメインが変更されていることと
を特徴とする、実施形態１から２１のいずれか一項に従う抗体。
【０１７３】
実施形態２３．  ヒトＩｇＧ１  Ｆｃパート内に、Ｐｒｏ３２９のグリシンもしくはアルギニンによるアミノ酸置換、ならびに／またはＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａのアラニンによる置換を含むことを特徴とする、実施形態１から２２のいずれか一つに従う抗体。
【０１７４】
実施形態２４．  構築物ＲＯＲ１  Ｆａｂ−Ｆｃ−ＣＤ３  Ｆａｂ−ＲＯＲ１  Ｆａｂであり、前記抗ＣＤ３ε抗体のＦａｂ断片内にＶＬ／ＶＨクロスオーバーを含むこと、ならびに、前記ヒトＩｇＧ１  Ｆｃパート内に、Ｐｒｏ３２９のグリシンによるアミノ酸置換、Ｌｅｕ２３４のアラニンによるアミノ酸置換およびＬｅｕ２３５のアラニンによるアミノ酸置換を含むことを特徴とする、実施形態２３に従う抗体。
【０１７５】
実施形態２５．  ａ）構築物ＲＯＲ１  Ｆａｂ−Ｆｃ−ＣＤ３  Ｆａｂ−ＲＯＲ１  Ｆａｂの抗体であること、
ｂ）前記抗ＣＤ３抗体のＦａｂ断片内にＶＬ／ＶＨクロスオーバーを含むこと、
ｃ）ヒトＩｇＧ１  Ｆｃパートを含むこと、
ｄ）前記Ｆｃパート内に、Ｐｒｏ３２９のグリシンによる置換およびＬｅｕ２３４のアラニンによる置換およびＬｅｕ２３５のアラニンによる置換を含むこと、ならびに、
ｅ）両方のＲＯＲ１  Ｆａｂの定常ドメインＣＬ内で、１２４位におけるアミノ酸がリシン（Ｋ）により置換されており、１２３位におけるアミノ酸がアルギニン（Ｒ）により置換されており、前記定常ドメインＣＨ１内で、１４７位におけるアミノ酸および２１３位におけるアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）により置換されていることを特徴とする、実施形態１から２２のいずれか一つに従う抗体。
【０１７６】
実施形態２６．  ヒトＣＤ３εおよびヒトＲＯＲ１の細胞外ドメインである、前記２つの標的に特異的に結合することを特徴とし、初代Ｂ−ＣＬＬ細胞において、１ｎＭの濃度で、３７℃で２時間の間に内部化しないことを特徴とする、実施形態１から２５のいずれか一つに従う抗体。
【０１７７】
実施形態２７．  ヒトＣＤ３εおよびヒトＲＯＲ１の細胞外ドメインである、前記２つの標的に特異的に結合することを特徴とし、前記二特異性抗体が、細胞ベースのアッセイにおいて、ＲＯＲ１陽性初代Ｂ−ＣＬＬ細胞を使用し、１ｎＭの抗体濃度で使用した場合、３７℃で２時間の間に内部化しないことを特徴とし、内部化しないとは、０時間において測定される、フローサイトメトリーにより検出される前記二特異性抗体のＲＯＲ１陽性初代Ｂ−ＣＬＬ細胞への結合の際における平均蛍光強度（ＭＦＩ）が、３７℃で２時間のインキュベーション後の再測定のときに、５０％を超えて低減しないか、好ましくは３０％を超えて低減しないことを意味する、実施形態１から２６のいずれか一つに従う抗体。
【０１７８】
実施形態２８．マウスにおける、好ましくは、カニクイザルにおける消失半減期であって、１２時間より長い、好ましくは、３日間またはそれより長い消失半減期を特徴とする、実施形態１から２７に従う抗体。
【０１７９】
実施形態２９．ＲＯＲ１陽性細胞系（例えば、ＲＰＭＩ８２２６細胞、Ｒｅｃ−１細胞、Ｊｅｋｏ細胞）への結合についてのＥＣ５０値であって、３０ｎＭまたはそれを下回る、好ましくは、１５ｎＭおよびそれを下回るＥＣ５０値を示すことを特徴とする、実施形態１から２８に従う抗体。
【０１８０】
実施形態３０．ヒトＴ細胞の存在下における、ＲＯＲ１発現腫瘍細胞（例えば、ＲＰＭＩ８２２６細胞、Ｒｅｃ−１細胞、Ｊｅｋｏ細胞；ＰＡ−１、ＣＯＬＯ−７０４、ＯＶＣＡＲ−５、ＳＫ−ＯＶ−３のような卵巣がん細胞系））のリダイレクトされた殺滅を、１０ｎＭ未満、好ましくは、１ｎＭ、好ましくは、０．０５ｎＭ、好ましくは、０．０２ｎＭ、好ましくは、０．００２ｎＭおよびそれを下回るＥＣ５０で誘導するその能力を特徴とする、実施形態１から２９に従う抗体。
【０１８１】
実施形態３１．標準的な製剤緩衝液中、３７℃で、好ましくは、４０℃で、１０日間、好ましくは、最長２週間、好ましくは、最長４週間保存された前記抗体が、高分子量（ＨＭＷ）分子種および／または低分子量（ＬＭＷ）分子種および／または単量体含量の、同じ製剤緩衝液中、−８０℃で同じ保存期間保存された前記抗体と比較して、１０％を超える変化（Δ）、好ましくは、５％を超える変化（Δ）を結果としてもたらさないことを特徴とする、実施形態１から３０に従う抗体。
【０１８２】
実施形態３２．  実施形態１から３１のいずれか一つに従う二特異性抗体を調製するための方法であって、
ａ）宿主細胞を、実施形態１から３１のいずれか一つに従う抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含むベクターで形質転換するステップと、
ｂ）前記宿主細胞を、前記抗体分子の合成を可能とする条件下で培養するステップと、
ｃ）前記抗体分子を、前記培養物から回収するステップと
を含む方法。
【０１８３】
実施形態３３．  実施形態１から３１のいずれか一つに従う抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞。
【０１８４】
実施形態３４．  実施形態１から３０のいずれか一つに従う抗体および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【０１８５】
実施形態３５．  医薬としての使用のための、実施形態１から３１のいずれか一つに従う抗体、または実施形態３４に従う医薬組成物。
【０１８６】
実施形態３６．  慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）を含むＲＯＲ１陽性血液悪性腫瘍の処置における医薬としての使用のため、ならびに卵巣がん、乳がんおよび肺がんなどのＲＯＲ１陽性固形腫瘍の処置のための、実施形態１から３１のいずれか一つに従う抗体、または実施形態３４に従う医薬組成物。
【０１８７】
実施形態３７．  多発性骨髄腫の処置における医薬としての使用のための、実施形態１から３１のいずれか一つに従う抗体、または実施形態３４に従う医薬組成物。
【０１８８】
実施形態３８．  Ｂ細胞系系統の慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）（Ｂ−ＣＬＬ）の処置のため、および多発性骨髄腫ＭＭのような形質細胞障害、またはＲＯＲ１を発現する他のＢ細胞障害の処置における医薬としての使用のための、実施形態１から３１のいずれか一つに従う抗体、または実施形態３４に従う医薬組成物。
【０１８９】
実施形態３９．  卵巣がん、肺がん、乳がん、胃がん、および膵がんからなる群から選択される疾患の処置における医薬としての使用のための、実施形態１から３１のいずれか一つに従う抗体、または実施形態３４に従う医薬組成物。
【０１９０】
実施形態４０．  卵巣がんの処置における医薬としての使用のための、実施形態１から３１のいずれか一つに従う抗体、または実施形態３４に従う医薬組成物。
【０１９１】
材料および一般的方法
ヒト免疫グロブリンの軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Kabat,  E.  Aら、Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest、５版、Public  Health  Service、National  Institutes  of  Health、Bethesda、MD（１９９１年）において示されている。抗体鎖のアミノ酸は、ＥＵ番号付け（Edelman,  G.Mら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ６３巻（１９６９年）７８〜８５頁；Kabat,  E.Aら、Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest、５版、Public  Health  Service、National  Institutes  of  Health、Bethesda、MD（１９９１年））に従い番号付けされ、言及されている。
【０１９２】
組換えＤＮＡ技法
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９年において記載されている、標準的方法を使用して、ＤＮＡを取り扱った。分子生物学的試薬は、製造元の指示書に従い使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ，  Ｅ．Ａ．ら、（１９９１年）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、ＮＩＨ刊行物番号９１−３２４２において与えられている。抗体鎖のアミノ酸は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、（１９９１年）に従い番号付けされ、言及された。
【０１９３】
遺伝子の合成
ａ）所望の遺伝子セグメントは、化学合成により制作されたオリゴヌクレオチドから調製した。単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位に挟まれた、６００〜１８００ｂｐ長の遺伝子セグメントを、ＰＣＲ増幅を含む、オリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーションによりアセンブルし、その後、指し示される制限部位、例えば、Ｋｐｎｌ／ＳａｄまたはＡｓｃｌ／Ｐａｃｌを介して、ｐＰＣＲＳｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ベースのｐＧＡ４クローニングベクターへとクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列は、ＤＮＡシークエンシングにより確認した。遺伝子合成断片は、Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で提供されている仕様に従い、注文した。ｂ）要請される場合、所望の遺伝子セグメントは、適切な鋳型を使用するＰＣＲにより作出するか、またはＧｅｎｅａｒｔ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、自動式遺伝子合成により、合成オリゴヌクレオチドおよびＰＣＲ産物から合成した。単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位に挟まれた遺伝子セグメントは、標準的な発現ベクターまたはさらなる解析のためのシークエンシングベクターへとクローニングした。プラスミドＤＮＡは、市販されているプラスミド精製キットを使用して、形質転換された細菌から精製した。プラスミド濃度は、ＵＶ分光法により決定した。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列は、ＤＮＡシークエンシングにより確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクターへのサブクローニングを可能とする、適切な制限部位によりデザインした。要請される場合、タンパク質コード遺伝子は、タンパク質を、真核細胞内の分泌へとターゲティングする、リーダーペプチドをコードする５’末端のＤＮＡ配列によりデザインした。
【０１９４】
ＤＮＡの配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖シークエンシングにより決定する。
【０１９５】
ＤＮＡおよびタンパク質の配列解析ならびに配列データの管理
Ｃｌｏｎｅ  Ｍａｎａｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＆  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）ソフトウェアパッケージバーション９．２を、配列のマッピング、解析、注釈づけ、および例示のために使用した。
【０１９６】
発現ベクター
ａ）下で記載される抗体鎖を含む融合遺伝子は、ＰＣＲおよび／または遺伝子合成により作出し、対応する核酸セグメントの接続であって、例えば、それぞれのベクター内で固有の制限部位を使用する接続によって、公知の組換え方法および技法によりアセンブルした。サブクローニングされた核酸配列は、ＤＮＡシークエンシングにより検証した。一過性トランスフェクションのためには、形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ培養物（Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ  ＡＸ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）からのプラスミド調製により、より大量のプラスミドを調製する。
ｂ）抗ＲＯＲ１抗体の発現ベクターを作出するために、重鎖および軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、哺乳動物細胞系内の発現に最適化された、それぞれの汎用レシピエント発現ベクターへとあらかじめ挿入された、ヒトＩｇＧ１定常重鎖またはｈｕｍ  ＩｇＧ１定常軽鎖のいずれかとインフレームでサブクローニングした。抗体の発現は、ＣＭＶエンハンサーおよびＭＰＳＶプロモーターに続いて、５’ＵＴＲ、イントロン、およびＩｇカッパＭＡＲエレメントを含むキメラＭＰＳＶプロモーターにより駆動する。転写は、ＣＤＳの３’末端における合成ポリＡシグナル配列により終結させる。全てのベクターは、タンパク質を、真核細胞内の分泌へとターゲティングする、リーダーペプチドをコードする５’末端のＤＮＡ配列を保有する。加えて、各ベクターは、ＥＢＶ  ＥＢＮＡ発現細胞内のエピソームのプラスミド複製のためのＥＢＶ  ＯｒｉＰ配列も含有する。
ｃ）ＲＯＲ１×ＣＤ３二特異性抗体ベクターを作出するために、ＩｇＧ１由来の二特異性分子は、少なくとも、２つの顕著に異なる抗原性決定基ＣＤ３およびＲＯＲ１に特異的に結合することが可能な、２つの抗原結合性部分からなる。抗原結合性部分とは、各々が、可変領域および定常領域を含む、重鎖および軽鎖から構成されるＦａｂ断片である。Ｆａｂ断片のうちの少なくとも１つは、ＶＨとＶＬとを交換した、「Ｃｒｏｓｓｆａｂ」断片であった。Ｆａｂ断片内のＶＨとＶＬとの交換により、特異性の異なるＦａｂ断片が、同一のドメインの並びを有さないことを確保する。二特異性分子のデザインは、ＣＤ３について一価であり、ＲＯＲ１について二価であり、この場合、１つのＦａｂ断片を、内側のＣｒｏｓｓＦａｂ（２＋１）のＮ末端へと融合させた。二特異性分子は、分子の半減期が長くなるように、Ｆｃパートを含有した。構築物の概略表示を、図１に与え、構築物の好ましい配列を、配列番号３９〜５２に示す。分子は、懸濁液中で成長するＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞に、哺乳動物用発現ベクターを、ポリマーベースの共トランスフェクトをすることにより作製した。２＋１  ＣｒｏｓｓＦａｂ−ＩｇＧ構築物を調製するために、細胞に、対応する発現ベクターを、１：２：１：１の比（「Ｆｃ（ノブ）ベクター」：「軽鎖ベクター」：「軽鎖  ＣｒｏｓｓＦａｂベクター」：「重鎖−ＣｒｏｓｓＦａｂベクター」）でトランスフェクトした。
【０１９７】
細胞培養技法
Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０００年）、Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ，Ｊ．Ｓ．、Ｄａｓｓｏ，Ｍ．、Ｈａｒｆｏｒｄ，Ｊ．Ｂ．、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｊ．、およびＹａｍａｄａ，Ｋ．Ｍ．（編）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．において記載されている、標準的な細胞培養技法を使用する。
【０１９８】
ＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ系）内の一過性発現
二特異性抗体は、ポリマーを使用して、懸濁液中で培養される、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞内の、それぞれの哺乳動物用発現ベクターの一過性共トランスフェクションにより発現させた。トランスフェクションの１日前に、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を、６ｍＭのＬ−グルタミンを補充した、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ培地中に、生細胞１５０万個／ｍＬで播種した。最終的な産生容量１ｍＬ当たり、生細胞２００万個を遠心分離した（２１０×ｇで５分間）。上清を吸引し、細胞を、１００μＬのＣＤ  ＣＨＯ培地中に再懸濁させた。最終的な産生容量１ｍＬ当たりのＤＮＡは、１μｇのＤＮＡ（重鎖：修飾重鎖：軽鎖：修飾軽鎖の比＝１：１：２：１）を、１００μＬのＣＤ  ＣＨＯ培地中で混合することにより調製した。０．２７μＬのポリマー溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を添加した後で、混合物を、１５秒間ボルテックスし、室温で１０分間放置した。１０分後、再懸濁させた細胞およびＤＮＡ／ポリマー混合物をまとめ、次いで、適切な容器へと移し、これを、振とうデバイス（３７℃、５％のＣＯ２）内に置いた。３時間のインキュベーション時間後に、６ｍＭのＬ−グルタミン、１．２５ｍＭのバルプロ酸、および１２．５％のＰｅｐｓｏｙ（５０ｇ／Ｌ）を補充した、８００μＬのＥｘ−Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄｉｕｍを、最終的な産生容量１ｍＬ当たり添加した。２４時間後、７０μＬのフィード溶液を、最終的な産生容量１ｍＬ当たり添加した。７日後、または細胞の生存率が、７０％と等しいかまたはそれ未満となったところで、遠心分離および滅菌濾過により、細胞を、上清から分離した。抗体は、アフィニティーステップ、ならびにカチオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ除外クロマトグラフィーである、１つまたは２つの仕上げステップにより精製した。要請される場合は、さらなる仕上げステップも使用した。組換え抗ＢＣＭＡヒト抗体および二特異性抗体は、懸濁液中で、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞に、哺乳動物用発現ベクターを、ポリマーベースの共トランスフェクトをすることにより作製した。細胞には、フォーマットに応じて、２つまたは４つのベクターをトランスフェクトした。ヒトＩｇＧ１では、一方のプラスミドにより、重鎖をコードし、他方のプラスミドにより、軽鎖をコードした。二特異性抗体では、４つのプラスミドを共トランスフェクトした。これらのうちの２つにより、２つの異なる重鎖をコードし、他の２つにより、２つの異なる軽鎖をコードした。トランスフェクションの１日前に、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を、６ｍＭのＬ−グルタミンを補充した、Ｆ１７  Ｍｅｄｉｕｍ中に、生細胞１５０万個／ｍＬで播種した。
【０１９９】
タンパク質の決定
抗体濃度の決定は、０．１％の抗体溶液の吸光度についての理論値を使用する、２８０ｎｍにおける吸光度の測定により行った。この値は、アミノ酸配列に基づくものであり、ＧＰＭＡＷソフトウェア（Ｌｉｇｈｔｈｏｕｓｅ  ｄａｔａ）により計算した。
【０２００】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造元の指示書に従い使用する。特に、１０％または４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ−ＴＲＩＳ  Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４）およびＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ（還元ゲル、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔランニングバッファー添加剤を伴う）、またはＭＯＰＳ（非還元ゲル）ランニングバッファーを使用する。
【０２０１】
タンパク質の精製
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによる精製
アフィニティーステップのために、上清を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５  ６ＣＶで平衡化させたプロテインＡカラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＦＦ、５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。同じ緩衝液による洗浄ステップの後で、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１００ｍＭのグリシン、ｐＨ３．０による段階的溶出によって、抗体を、カラムから溶出させた。所望の抗体を伴う画分を、０．５Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０（１：１０）で速やかに中和し、プールし、遠心分離により濃縮した。濃縮物は、滅菌濾過し、さらにカチオン交換クロマトグラフィーおよび／またはサイズ除外クロマトグラフィーに掛けた。
【０２０２】
カチオン交換クロマトグラフィーによる精製
カチオン交換クロマトグラフィーステップのために、濃縮されたタンパク質を、アフィニティーステップのために使用した溶出緩衝液で、１：１０に希釈し、カチオン交換カラム（Ｐｏｒｏｓ  ５０  ＨＳ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）へとロードした。それぞれ、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２０ｍＭのトリス、ｐＨ５．０、および２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２０ｍＭのトリス、１００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ５．０である、平衡緩衝液および洗浄緩衝液による、２回の洗浄ステップの後で、タンパク質を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２０ｍＭのトリス、１００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ８．５を使用する勾配により溶出させた。所望の抗体を含有する画分は、プールし、遠心分離により濃縮し、滅菌濾過し、さらにサイズ除外ステップに掛けた。
【０２０３】
解析用サイズ除外クロマトグラフィーによる精製
サイズ除外ステップのために、濃縮されたタンパク質を、製剤緩衝液としての、Ｔｗｅｅｎ２０を伴うかまたは伴わない、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０と共に、ＸＫ１６／６０  ＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入した。単量体を含有する画分は、プールし、遠心分離により濃縮し、滅菌バイアルへと滅菌濾過した。
【０２０４】
純度および単量体含量の測定
最終タンパク質調製物の純度および単量体含量は、２５ｍＭのリン酸カリウム、１２５ｍＭの塩化ナトリウム、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウム、ｐＨ６．７による緩衝液中で、ＣＥ−ＳＤＳ（Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））およびＨＰＬＣ（ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ解析用サイズ除外カラム（Ｔｏｓｏｈ））のそれぞれにより決定した。
【０２０５】
ＬＣ−ＭＳ解析による分子量の確認
脱グリコシル化
分子の均質の調製を確認するために、最終タンパク質溶液を、ＬＣ−ＭＳ解析により解析した。炭水化物により導入される異質性を除去するために、構築物を、ＰＮＧａｓｅＦ（ＰｒｏＺｙｍｅ）で処理する。したがって、２Ｍのトリス２μｌを、濃度を０．５ｍｇ／ｍｌとする２０μｇのタンパク質へと添加することにより、タンパク質溶液のｐＨを、ｐＨ７．０へと調整した。０．８μｇのＰＮＧａｓｅＦを、添加し、３７℃で１２時間インキュベートした。
【０２０６】
ＬＣ−ＭＳ解析−オンライン検出
ＬＣ−ＭＳ法は、ＴＯＦ  ６４４１質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ）へとカップリングさせた、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ  １２００上で実施した。クロマトグラフィーによる分離は、Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ  Ｐｏｌｙｓｔｅｒｅｎｅカラム；ＲＰ１０００−８（粒子サイズを８μｍとする、４．６×２５０ｍｍ；カタログ番号７１９５１０）上で実施した。溶離液Ａは、水中に５％のアセトニトリル、および０．０５％（ｖ／ｖ）のギ酸であり、溶離液Ｂは、９５％のアセトニトリル、５％の水、および０．０５％のギ酸であった。流量は、１ｍｌ／分であり、分離は、４０℃で実施し、前に記載した処理により、６μｇ（１５μｌ）のタンパク質試料を得た（表７）。
【０２０７】
【表７】
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【０２０８】
最初の４分間の間、質量分析計を塩汚染から保護するように、溶出液を、廃棄物へと方向づけた。ＥＳＩ源は、乾燥ガス流量を１２ｌ／分とし、温度を３５０℃とし、噴霧器圧力を６０ｐｓｉとして動作させた。ＭＳスペクトルは、陽イオンモードにおいて、３８０Ｖのフラグメンター電圧および７００〜３２００ｍ／ｚの質量範囲を使用して取得した。ＭＳデータは、計器ソフトウェアにより、４〜１７分間にわたり取得した。
【０２０９】
ＰＢＭＣからの初代ヒト汎Ｔ細胞の単離
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離により、地域の血液バンク、または健常ヒトドナーに由来する採取したての血液から得られる、富化されたリンパ球調製物（軟膜）から調製した。略述すると、血液を、滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ、Ｈ８８８９）にわたり、注意深く層化させた。４５０×ｇ、室温で３０分間遠心分離の後（ブレーキをオフに切り替える）、ＰＢＭＣを含有する相間部の上方の血漿部分を廃棄した。ＰＢＭＣを、新しい５０ｍｌ  Ｆａｌｃｏｎチューブへと移し、チューブを、ＰＢＳで、５０ｍｌの総容量まで満たした。混合物を、４００×ｇ、室温で１０分間遠心分離した（ブレーキをオンに切り替える）。上清を廃棄し、ＰＢＭＣペレットを、滅菌ＰＢＳで２回洗浄した（３５０×ｇ、４℃で１０分間の遠心分離ステップ）。結果として得られるＰＢＭＣ集団を、自動的にカウントし（ＶｉＣｅｌｌ）、アッセイ開始まで、インキュベーター内、３７℃、５％のＣＯ２、１０％のＦＣＳ、および１％のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｋ０３０２）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で保存した。
【０２１０】
ＰＢＭＣからのＴ細胞の富化は、製造元の指示書に従い、Ｐａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ型番１３０−０９１−１５６）を使用して実施した。略述すると、細胞ペレットを、細胞１０００万個当たり４０μｌの低温緩衝液（滅菌濾過された、０．５％のＢＳＡ、２ｍＭのＥＤＴＡを伴うＰＢＳ）中で希釈し、細胞１０００万個当たり１０μｌのビオチン−抗体カクテルと共に、４℃で１０分間インキュベートした。細胞１０００万個当たり３０μｌの低温緩衝液および２０μｌの抗ビオチン磁気ビーズを添加し、混合物を、４℃でさらに１５分間インキュベートした。現行容量の１０〜２０倍容量を添加することにより、細胞を洗浄し、その後、３００×ｇで１０分間遠心分離ステップにかけた。最大１億個の細胞を、５００μｌの緩衝液中に再懸濁させた。標識されていないヒト汎Ｔ細胞の磁気による分離は、製造元の指示書に従い、ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ型番１３０−０４２−４０１）を使用して実施した。結果として得られるＴ細胞集団を、自動的にカウントし（ＶｉＣｅｌｌ）、アッセイ開始まで、インキュベーター内、３７℃、５％のＣＯ２、ＡＩＭ−Ｖ培地中で保存した（２４時間より長くない）。
【０２１１】
ＰＢＭＣからの初代ヒトナイーブＴ細胞の単離
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離により、地域の血液バンク、または健常ヒトドナーに由来する採取したての血液から得られる、富化されたリンパ球調製物（軟膜）から調製した。ＰＢＭＣからのＴ細胞の富化は、製造元の指示書に従い、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ（型番１３０−０９３−２４４）製のＮａｉｖｅ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して実施したが、ＣＤ８＋Ｔ細胞の最後の単離ステップは省略した（初代ヒト汎Ｔ細胞の単離についての記載もまた参照されたい）。
【０２１２】
特記事項：二特異性抗体の特性を示す実験は全て、非ＣＶ二特異性抗体を用いて実施した。しかし、本発明者らの知見によれば、本発明に従うＣＶ二特異性抗体についての結果も同じであるかまたは実質的に類似するものである。
【実施例】
【０２１３】
特記事項：以下の実施例の説明において、Ｍａｂ２を、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体における抗ＲＯＲ１抗体としておよび／または抗ＲＯＲ１  Ｆａｂとして使用したことが言及されていなければ、Ｍａｂ１が、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体における抗ＲＯＲ１抗体として、および／または抗ＲＯＲ１  Ｆａｂとして使用されている。
【０２１４】
（実施例１）
抗ＲＯＲ１抗体の作出
配列番号２〜９のＲＯＲ１抗体（ＭＡＢ１）のＶＨおよびＶＬ領域のタンパク質配列は、ＷＯ２０１２／０７５１５８において記載されている。略述すると、上で記載した配列をコードするオリゴヌクレオチドをＰＣＲによって繋ぎ合わせて、それぞれ抗ＲＯＲ１抗体のＶＨおよびＶＬ配列をコードするｃＤＮＡを合成する。
【０２１５】
抗ＲＯＲ１抗体の発現ベクターを作出するために、重鎖および軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、哺乳動物細胞系内の発現に最適化された、それぞれの汎用レシピエント発現ベクターにあらかじめ挿入されたヒトＩｇＧ１定常重鎖またはｈｕｍ  ＩｇＧ１定常軽鎖のいずれかとインフレームでサブクローニングした。抗体の発現は、ＣＭＶエンハンサーおよびＭＰＳＶプロモーターに続いて、５’ＵＴＲ、イントロン、およびＩｇカッパＭＡＲエレメントを含むキメラＭＰＳＶプロモーターにより駆動した。転写は、ＣＤＳの３’末端における合成ポリＡシグナル配列により終結させた。全てのベクターは、タンパク質を、真核細胞において分泌にターゲティングするリーダーペプチドをコードする５’末端のＤＮＡ配列を保有する。加えて、各ベクターは、ＥＢＶ  ＥＢＮＡ発現細胞内での、エピソームとしてのプラスミド複製のためのＥＢＶ  ＯｒｉＰ配列も含有する。
【０２１６】
ＲＯＲ１抗体を、懸濁液中で培養したＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞において、それぞれの哺乳動物用発現ベクターを、一過性のポリマーベースの共トランスフェクションによって発現させた。トランスフェクションの１日前に、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を、６ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＥｘ−Ｃｅｌｌ培地中に、生細胞１５０万個／ｍＬで播種した。最終的な産生容量１ｍＬ当たり、生細胞２００万個を遠心分離した（２１０×ｇで５分間）。上清を吸引し、細胞を、１００μＬのＣＤ  ＣＨＯ培地中に再懸濁させた。最終的な産生容量１ｍＬ当たりのＤＮＡは、１μｇのＤＮＡ（重鎖：軽鎖の比＝１：１）を、１００μＬのＣＤ  ＣＨＯ培地中で混合することにより調製した。０．２７μＬのポリマー溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を添加した後で、混合物を、１５秒間ボルテックスし、室温で１０分間放置した。１０分後、再懸濁させた細胞およびＤＮＡ／ポリマー混合物をまとめ、次いで、適切な容器に移し、これを、振とうデバイス（３７℃、５％のＣＯ２）内に置いた。３時間のインキュベーション時間後に、６ｍＭのＬ−グルタミン、１．２５ｍＭのバルプロ酸および１２．５％のＰｅｐｓｏｙ（５０ｇ／Ｌ）を補充した、８００μＬのＥｘ−Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄｉｕｍを、最終的な産生容量１ｍＬ当たり添加した。２４時間後、７０μＬのフィード溶液を、最終的な産生容量１ｍＬ当たり添加した。７日後、または細胞生存率が、７０％と等しいか、またはそれ未満となったところで、遠心分離および滅菌濾過により、細胞を、上清から分離した。抗体は、アフィニティーステップ、ならびにカチオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ除外クロマトグラフィーである、１つまたは２つの仕上げステップにより精製した。要請される場合は、さらなる仕上げステップを使用した。ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞に、哺乳動物用発現ベクターをポリマーベース共トランスフェクトすることにより、懸濁液中で組換え抗ＲＯＲ１ヒト抗体を生成した。細胞に２つのベクターをトランスフェクトした。ヒトＩｇＧ１については、一方のプラスミドが重鎖をコードするものであり、他方のプラスミドが軽鎖をコードするものであった。トランスフェクションの１日前に、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を、６ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＦ１７  Ｍｅｄｉｕｍ中に、生細胞１５０万個／ｍＬで播種した。
【０２１７】
（実施例２）
ＲＯＲ１をそれらの表面において発現するヒトＢ−ＣＬＬ細胞系、または初代Ｂ−ＣＬＬ細胞、多発性骨髄腫細胞系、またはマントル細胞リンパ腫細胞系
ａ）採取したてのヒト初代Ｂ−ＣＬＬ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ５＋）をＣＬＬ患者の血液から単離した。地域の倫理審査委員会によるガイドラインおよびヘルシンキ宣言に従い、説明同意文書の署名を得た後で、ＣＬＬ患者から、血液を収集する。低温保存されたヒト初代Ｂ−ＣＬＬ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ５＋）は、Ａｌｌｃｅｌｌｓ（Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ、ＵＳＡ）から入手した。患者由来の初代Ｂ−ＣＬＬ細胞は、合法的に得られたものであり、以下の倫理的要件に応じるものであった：（ｉ）ＣＬＬと診断された患者からの試料の取得が、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｒｅｖｉｅｗｉｎｇ  Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ）、またはＨｕｍａｎ  Ｓｕｂｊｅｃｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認されていること；（ｉｉ）患者から、Ａｌｌｃｅｌｌｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｐｒｏｇｒａｍへの参加の前に署名および証人署名された説明同意文書の署名フォームを得ること；（ｉｉｉ）上で記載した疾患と診断された患者全員が、プログラムに対する彼らの責務に対して正当な補償を受けること、およびその補償がＩＲＢまたはＨｕｍａｎ  Ｓｕｂｊｅｃｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認されたものであること；（ｉｖ）患者全員が、提供した試料が任意の研究適用に使用される可能性があり、研究適用から生じるあらゆる権利を放棄することを承知していること。初代Ｂ−ＣＬＬ細胞を、１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ中で成長させた。初代ＣＤ１９＋ＣＤ５＋Ｂ−ＣＬＬ細胞上のＲＯＲ１の発現を、蛍光色素コンジュゲート抗ヒトＲＯＲ１抗体を使用するフローサイトメトリーにより確認した（実施例３を参照されたい）。
ｂ）ヒトＢリンパ球多発性骨髄腫細胞系ＲＰＭＩ８２２６は、ＡＴＣＣから入手した（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１５５）。ＲＰＭＩ８２２６骨髄腫細胞をＤＭＥＭ、１０％のＦＣＳ、１％のグルタミン中で培養した。ＲＰＭＩ８２２６細胞系におけるＲＯＲ１の発現を、蛍光色素コンジュゲート抗ヒトＲＯＲ１抗体を使用するフローサイトメトリーにより確認した（実施例３を参照されたい）。
ｃ）ヒトマントル細胞リンパ腫（Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫）Ｒｅｃ−１細胞系は、ＡＴＣＣから入手した（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−３００４）。Ｒｅｃ−１細胞をＤＭＥＭ、１０％のＦＣＳ、１％のグルタミン中で培養した。Ｒｅｃ−１細胞系におけるＲＯＲ１の発現を、蛍光色素コンジュゲート抗ヒトＲＯＲ１抗体を使用するフローサイトメトリーにより確認した（実施例３を参照されたい）。
【０２１８】
（実施例２．１）
細胞表面におけるＲＯＲ１の発現のレベルが異なるヒト卵巣がん細胞系
ａ）卵巣奇形癌に由来するヒト卵巣がん細胞系ＰＡ−１は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；カタログ番号ＣＲＬ−１５７２）から入手した。ＰＡ−１細胞系を、１０％ウシ胎仔血清（熱不活化）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、および１５００ｍｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウムを補充したＥａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）（ＡＴＣＣ、カタログ番号３０−２００３）中で培養した。フローサイトメトリーにより測定される通り、ＰＡ−１細胞系におけるＲＯＲ１の発現は高度であることが確認された（実施例３．１を参照されたい）。
ｂ）卵巣腺癌に由来するヒト卵巣がん細胞系ＣＯＬＯ−７０４は、Ｌｅｉｂｎｉｚ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＤＳＭＺ−Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＤＳＭＺ；カタログ番号ＡＣＣ１９８）から入手した。ＣＯＬＯ−７０４細胞系を９０％のＲＰＭＩ１６４０および１０％の熱不活化ウシ胎仔血清中で培養した。フローサイトメトリーにより測定される通り、ＣＯＬＯ−７０４細胞系におけるＲＯＲ１の発現は中程度であることが確認された（実施例３．１を参照されたい）。
ｃ）卵巣明細胞癌に由来するヒト卵巣がん細胞系ＥＳ−２は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；カタログ番号ＣＲＬ−１９７８）から入手した。ＥＳ−２細胞系を、ＡＴＣＣにより配合されたＭｃＣｏｙ’ｓ  ５ａ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ（カタログ番号３０−２００７）および１０％ウシ胎仔血清中で培養した。フローサイトメトリーにより測定される通り、ＥＳ−１細胞系におけるＲＯＲ１の発現は陰性であることが確認された（実施例３．１を参照されたい）。
ｄ）卵巣癌に由来するヒト卵巣がん細胞系ＳＫ−ＯＶ−３は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；カタログ番号ＨＴＢ−７７）から入手した。ＳＫ−ＯＶ−３細胞系を、ＡＴＣＣにより配合されたＭｃＣｏｙ’ｓ  ５ａ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ（カタログ番号３０−２００７）および１０％ウシ胎仔血清中で培養した。フローサイトメトリーにより測定される通り、ＳＫ−ＯＶ−３細胞系におけるＲＯＲ１の発現は低度であることが確認された（実施例３．１を参照されたい）。
ｅ）卵巣腺癌に由来するヒト卵巣がん細胞系ＯＶＣＡＲ−５は、ＵＳ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＮＣＩ−６０ヒトがん細胞系パネルから入手した。ＯＶＣＡＲ−５細胞系を９０％のＲＰＭＩ１６４０および１０％の熱不活化ウシ胎仔血清中で培養した。フローサイトメトリーにより測定される通り、ＯＶＣＡＲ−５細胞系におけるＲＯＲ１の発現は中程度であることが確認された（実施例３．１を参照されたい）。
【０２１９】
（実施例３）
初代Ｂ−ＣＬＬ細胞、ＲＰＭＩ８２２６骨髄腫細胞またはＲｅｃ−１  ＭＣＬ細胞上に発現したＲＯＲ１への結合（フローサイトメトリー）
ａ）初代ＣＤ１９＋ＣＤ５＋ＣＬＬ細胞上のＲＯＲ１の発現を、フローサイトメトリーにより評価した。略述すると、細胞を採取し、洗浄し、生存率についてカウントし、９６ウェル丸底プレートのウェル当たり細胞５００００個で再懸濁させ、１０μｇ／ｍｌの、Ａｌｅｘａ４８８で標識された抗ヒトＲＯＲ１抗体と共に、４℃で３０分間インキュベートした（内部化を防止するように）。インキュベーション時間の終了時に、細胞を遠心分離し（３５０×ｇで５分間）、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１００ｕｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアを作動させるＣａｎｔｏＩＩデバイス上で解析した。図２Ａは、抗ＲＯＲ１抗体の初代Ｂ−ＣＬＬ細胞への結合時の蛍光強度中央値の増大を示し、これにより、ＲＯＲ１が初代ＣＬＬ細胞上に発現することが示される。
ｂ）次いで、Ｂリンパ球骨髄腫ＲＰＭＩ８２２６細胞系におけるＲＯＲ１の発現を、上で記載した方法を使用してフローサイトメトリーにより評価した。図３は、増大する濃度の抗ＲＯＲ１抗体がＲＰＭＩ８２２６細胞に結合する際には蛍光強度中央値が増大するが（Ａ）、ＲＯＲ１陰性ＭＫＮ４５細胞（ヒト胃腺癌細胞系、ＤＳＭＺ  ＡＣＣ４０９）に結合する際には蛍光強度中央値が増大しない（Ｂ）ことを示す。表１は、抗ＲＯＲ１抗体の、ＲＯＲ１陽性ＲＰＭＩ８２２６細胞系への結合についてのＥＣ５０を示す。
【０２２０】
【表１】
0006708635.tif 000011
ｃ）ＭＣＬ  Ｒｅｃ−１細胞系におけるＲＯＲ１の発現についても、上で記載した方法を使用してフローサイトメトリーにより試験した。図２Ｂは、抗ＲＯＲ１抗体のＲｅｃ−１  ＭＣＬ細胞への結合する際の蛍光強度中央値の増大を示す。
【０２２１】
（実施例３．１）
ＲＯＲ１  ＩｇＧ抗体の、ＲＯＲ１陽性ヒト卵巣がん細胞系への結合（フローサイトメトリーにより検出される）
ａ）ＰＡ−１、ＣＯＬＯ−７０４、ＥＳ−２、ＳＫ−ＯＶ−３、およびＯＶＣＡＲ−５を含めたヒト卵巣がん細胞系におけるＲＯＲ１の発現レベルを、フローサイトメトリーにより測定した。略述すると、細胞を採取し、洗浄し、生存率についてカウントし、９６ウェル丸底プレートのウェル当たり細胞５０，０００個で再懸濁させ、Ａｌｅｘａ４８８で標識された抗ヒトＲＯＲ１抗体と共に４℃で３０分間インキュベートした。全てのＲＯＲ１およびアイソタイプ対照抗体を滴定し、０．０１〜１００ｎＭ（０．００１５〜１５μｇ／ｍＬ）の間の最終濃度範囲で解析した。標識されていない抗体を使用した試料については、細胞を遠心分離し（３５０×ｇで５分間）、１２０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ  Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で洗浄し、再懸濁させ、蛍光色素コンジュゲートＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７コンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  Ｆｃ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ；＃１０９−６０６−００８）と共に、４℃でさらに３０分間インキュベートした。インキュベーション時間の終了時に、細胞を遠心分離し（３５０×ｇで５分間）、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１００ｕｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアを作動させるＣａｎｔｏＩＩデバイス上で解析した。次いで、ＲＯＲ１の発現を蛍光強度中央値（ＭＦＩ）として定量化し、ＭＦＩをＲＯＲ１抗体濃度の関数として示すグラフをプロットした。次いで、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用してＥＣ５０値を測定した。表２は、Ｍａｂ１およびＭａｂ２抗ＲＯＲ１抗体の、ＲＯＲ１陽性ＳＫ−ＯＶ−３卵巣がん細胞系およびＰＡ−１卵巣がん細胞系への結合についてのＥＣ５０を示す。Ｍａｂ１およびＭａｂ２抗ＲＯＲ１抗体はどちらも、ＰＡ−１細胞系（高レベルのＲＯＲ１を発現することが後で見出された）に、ＳＫ−ＯＶ−３（低レベルのＲＯＲ１を発現することが後で見出された）に対するよりも大きな効力で結合する。ＲＯＲ１  Ｍａｂ１およびＲＯＲ１  Ｍａｂ２のＳＫ−ＯＶ−３への結合について計算されるＥＣ５０は外挿による推定値であり、実際よりも高く、または低く見積もられている可能性がある。図３−３は、ＳＫ−ＯＶ−３細胞（Ａ、白抜きの四角）およびＰＡ−１細胞（Ｂ、白抜きの三角形）におけるＭＦＩの増大をＲＯＲ１  Ｍａｂ２  ＩｇＧの濃度の関数として示す。最大強度は、１０μｇ／ｍＬの抗体濃度で、ＰＡ−１細胞において、ＳＫ−ＯＶ−３細胞に対しておよそ３倍に達することができた。
【０２２２】
【表２】
0006708635.tif 000012
ｂ）ヒト卵巣がん細胞ＰＡ−１、ＣＯＬＯ−７０４、ＥＳ−２、ＳＫ−ＯＶ−３、およびＯＶＣＡＲ−５の細胞表面上の、ＲＯＲ１抗原のコピー数を決定するために、Ｑｉｆｉｋｉｔ（Ｄａｋｏ、＃Ｋ００７８）法を使用した。卵巣腫瘍細胞をＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し（１００μｌ／ウェル；３５０×ｇで５分間）、細胞１００万個／ｍｌに調整した。５０μｌ（＝細胞５０万個）の細胞懸濁液を、示されている通り、９６丸底ウェルプレートの各ウェルに移した。次いで、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、０．１％のＢＳＡ）中で、２５μｇ／ｍｌの最終濃度まで（または飽和濃度に）希釈された、５０μｌのマウス抗ヒトＲＯＲ１  ＩｇＧ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃３５７８０２）、またはマウスＩｇＧ２ａアイソタイプ対照抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃４０１５０１）を添加し、暗所内、４℃で３０分間、染色を実施した。次に、１００μｌのＳｅｔ−ｕｐ  ＢｅａｄｓまたはＣａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｂｅａｄｓを、別々のウェルに添加し、細胞ならびにビーズを、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞およびビーズを、Ｑｉｆｉｋｉｔにより提供されている、フルオレセインコンジュゲート抗マウス二次抗体（飽和濃度の）を含有する、２５μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させた。細胞およびビーズを、暗所内、４℃で４５分間染色した。細胞を１回洗浄し、全ての試料を、１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。試料を、マルチカラーフローサイトメーターおよびインストールされたソフトウェア（例えば、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアを作動させるＣａｎｔｏＩＩデバイス）上で解析した。
【０２２３】
表２．１に示される通り、ＲＯＲ１抗原のコピー数／結合性部位を５つのヒト卵巣がん細胞系（ＥＳ−２、ＳＫ−ＯＶ−３、ＯＶＣＡＲ−５、ＣＯＬＯ−７０４およびＰＡ−１）において測定し、発現のレベルは異なった。ＥＳ−２細胞は、ヒトＲＯＲ１の抗原コピーを少しも発現しなかったのに対し、Ｓ−ＫＯＶ−３細胞は、低レベルのヒトＲＯＲ１、ＯＶＣＡＲ−５を発現し、ＣＯＬＯ−７０４細胞は、中程度のレベルのヒトＲＯＲ１を発現し、ＰＡ−１細胞は、高レベルのヒトＲＯＲ１を発現した。これらのＲＯＲ１の発現の結果を踏まえて、ＲＯＲ１の発現レベルが高度、中程度および／または低度であるヒト卵巣がん細胞系を選択し、実施例１０において、リダイレクトされたＴ細胞による細胞傷害作用アッセイにおいて腫瘍標的細胞として使用した。
【０２２４】
【表２．１】
0006708635.tif 000013
【０２２５】
（実施例４）
ＣＬＬ患者由来の初代ＰＢＭＣまたはＲＰＭＩ８２２６  ＭＭ細胞における抗ＲＯＲ１抗体の内部化（フローサイトメトリー）
抗ＲＯＲ１抗体を内部化アッセイにおいてさらに試験した。略述すると、ヒトＲＯＲ１を発現する初代Ｂ−ＣＬＬ標的細胞を、Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ緩衝液により採取し、ＶｉＣｅｌｌを使用して細胞生存率を決定した後に、洗浄し、１０％のＦＣＳを補充したＲＰＭＩ中に、１×１０６個（１×１０６個／ｍＬ）の、非処置ＣＬＬ患者に由来するＰＢＭＣまたは細胞１×１０６個／ｍＬのＲＰＭＩ８２２６細胞の濃度で再懸濁させた。細胞懸濁液を、各被験ＩｇＧ／ＴＣＢおよび各濃度について１５ｍｌ  Ｆａｌｃｏｎチューブに移した。Ａｌｅｘａ４８８とコンジュゲートした、希釈された抗ＲＯＲ１  ＩｇＧまたは抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ（ＲＰＭＩ＋１０％のＦＣＳ中１ｎＭまで希釈）０．５ｍｌをチューブに添加し、低温室内、シェーカーで３０分間インキュベートした。インキュベートし、細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄して結合していない抗体を除去した後、細胞を氷上で放置したか、または９６ウェルＦＡＣＳプレート中のあらかじめ加温した培地中に移し（細胞０．１×１０６個）、内部化を容易にするために、３７℃で１５分間、３０分間、１時間、２時間、および２４時間インキュベートした。さらに、細胞の試料をまた、内部化を阻害するために、３μＭのフェニルアルシンオキシド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下、３７℃で２時間および／または２４時間インキュベートした。その後、細胞を冷ＰＢＳで１回洗浄し、Ａｌｅｘａ６４７で標識された抗ヒトＦｃ二次抗体（Ｆ（ａｂ）２）と共に、４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで３回の最終的な洗浄後、細胞を４００×ｇで４分間遠心分離し、ヨウ化プロピジウム（１：４０００）（Ｓｉｇｍａ）を伴うかまたは伴わないＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。抗ＲＯＲ１  ＩｇＧおよび抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢについての細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＦｌｏｗＪｏ解析用ソフトウェアを使用して測定した。
【０２２６】
ＭＦＩ低減は、抗体内部化、抗体解離またはその両方の組合せを表しうる。ＭＦＩ低減の百分率は、式ΔＭＦＩ＝１００−１００×［（ＭＦＩ実験値−ＭＦＩバックグラウンド）／（ＭＦＩ最大−ＭＦＩバックグラウンド）］を使用することにより、各ＲＯＲ１抗体について、非特異的なヒトＩｇＧ対照（ＭＦＩバックグラウンド）および氷上で維持されたＲＯＲ１抗体（ＭＦＩ最大）と比較して計算する。エンドサイトーシス阻害剤フェニルアルシンオキシドにより遮断されるＭＦＩ低減は抗体内部化を示すのに対し、フェニルアルシンオキシドにより遮断されないＭＦＩ低減は、抗体解離を反映する。内部化する抗ＲＯＲ１抗体は最先端技術において公知である（Baskarら、Clin.  Cancer  Res.、１４巻（２号）：３９６〜４０４頁（２００８年））。
【０２２７】
Ｔ細胞二特異性などの抗体ベースの治療については、腫瘍細胞とＴ細胞の間の安定な免疫シナプスおよび有効なＴ細胞媒介性のリダイレクトされた細胞傷害作用を容易にするために、腫瘍標的に特異的な抗体または抗体断片が、内部化しないか、または内部化が緩徐であるか、または内部化がわずかであることが重要である。したがって、内部化しないか、または内部化が緩徐であるか、または内部化がわずかである抗ＲＯＲ１抗体を、以下の次のステップ（実施例５）、すなわち、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体の産生のために選択する。
【０２２８】
初代ＣＬＬ細胞およびＲＰＭＩ８２２６細胞における抗ＲＯＲ１  ＩｇＧ抗体の内部化値を図４および６ならびに表４および６にさらにまとめる。
【０２２９】
（実施例５）
抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体の作出
（実施例５．１）
抗ＣＤ３抗体の作出
以下のＶＨおよびＶＬ領域のタンパク質配列を使用して、ヒトおよびカニクイザル交差反応性ＣＤ３ε抗体を作出した。
【０２３０】
ＣＨ２５２７＿ＶＨ（配列番号２１）：
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＴＹＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＲＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＣＨ２５２７＿ＶＬ（配列番号２２）
ＱＡＶＶＴＱＥＰＳＬＴＶＳＰＧＧＴＶＴＬＴＣＧＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱＥＫＰＧＱＡＦＲＧＬＩＧＧＴＮＫＲＡＰＧＴＰＡＲＦＳＧＳＬＬＧＧＫＡＡＬＴＬＳＧＡＱＰＥＤＥＡＥＹＹＣＡＬＷＹＳＮＬＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
【０２３１】
略述すると、上で記載した配列をコードするオリゴヌクレオチドをＰＣＲにより繋ぎ合わせて、それぞれ抗ＣＤ３抗体のＶＨおよびＶＬ配列をコードするｃＤＮＡを合成した。
【０２３２】
抗ＣＤ３抗体ＣＨ２５２７（配列番号２１〜２８）を使用して、以下の実施例において使用するＴ細胞二特異性抗体を作出した。
【０２３３】
（実施例５．２）
抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性１＋１フォーマット（すなわち、ＲＯＲ１に対して一価であり、ＣＤ３に対して一価である、１アーム二特異性（Ｆａｂ）ｘ（Ｆａｂ）抗体）の作出
ａ）本発明に従う抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体は、週に少なくとも１回または２回の投与を可能にする、約１〜１２日間の消失半減期という利点を有し得る。
【０２３４】
１＋１の１アームフォーマット（すなわち、ＲＯＲ１に対して一価であり、ＣＤ３に対して一価である、二特異性（Ｆａｂ）×（Ｆａｂ）抗体）の抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体を、実施例１で作出された抗ＲＯＲ１抗体を用いて作製した。実施例１に記載されている、対応する抗ＲＯＲ１  ＩｇＧ１抗体の完全Ｆａｂ（重鎖ＶＨドメインおよび重鎖ＣＨ１ドメインに加えた、軽鎖ＶＬドメインおよび軽鎖ＣＬドメイン）をコードするｃＤＮＡ、ならびに実施例５．１に記載されている抗ＣＤ３  ＶＨおよび抗ＣＤ３  ＶＬのｃＤＮＡを、出発材料として使用した。各二特異性抗体には、対応する抗ＲＯＲ１抗体の重鎖および軽鎖、ならびに上で記載した抗ＣＤ３抗体の重鎖および軽鎖を含む、４つのタンパク質鎖が関与した。
【０２３５】
ｂ）ＲＯＲ１×ＣＤ３二特異性抗体ベクターを作出するために、ＩｇＧ１由来の二特異性分子は、少なくとも、２つの顕著に異なる抗原性決定基ＣＤ３およびＲＯＲ１に特異的に結合することが可能な、２つの抗原結合性部分を含む。抗原結合性部分は、各々が、可変領域および定常領域を含む、重鎖および軽鎖から構成されるＦａｂ断片である。Ｆａｂ断片のうちの少なくとも１つは、Ｆａｂ重鎖とＦａｂ軽鎖の定常ドメインを交換した、「Ｃｒｏｓｓｆａｂ」断片である。Ｆａｂ断片内の重鎖定常ドメインと軽鎖定常ドメインとの交換により、特異性の異なるＦａｂ断片が、同一のドメインの並びを有さず、結果として、軽鎖を相互交換しないことを確保する。二特異性分子のデザインは、両方の抗原性決定基に対して一価（１＋１）でありうるか、またはＣＤ３に対して一価、ＲＯＲ１に対して二価でありえ、この場合、１つのＦａｂ断片を内側のＣｒｏｓｓＦａｂのＮ末端と融合する（２＋１）。構築物の概略表示を図１に示す。構築物の配列を配列番号２〜３６に示す。これらの分子は、懸濁液中で成長するＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞に、哺乳動物用発現ベクターをポリマーベース共トランスフェクトすることによって作製する。１＋１  ＣｒｏｓｓＦａｂ−ＩｇＧ構築物を調製するために、細胞に、対応する発現ベクターを、１：１：１：１の比（「Ｆｃ（ノブ）ベクター」：「軽鎖ベクター」：「軽鎖ＣｒｏｓｓＦａｂベクター」：「重鎖−ＣｒｏｓｓＦａｂベクター」）でトランスフェクトする。
【０２３６】
（実施例５．３）
抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性２＋１フォーマット（すなわち、ＲＯＲ１に対して二価であり、ＣＤ３に対して一価である、二特異性（Ｆａｂ）２×（Ｆａｂ）抗体）の作出
ａ）２＋１フォーマットによる抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体、すなわち、ＲＯＲ１に対して二価であり、ＣＤ３に対して一価である、二特異性（Ｆａｂ）２×（Ｆａｂ）抗体は、腫瘍標的ＲＯＲ１に優先的に結合し、ＣＤ３抗体シンクを回避し、したがって、腫瘍に焦点を当てた薬物曝露の確率がより高いので、効力に対する利点、有効性および安全性に対する予測可能性を有し得る。
【０２３７】
２＋１フォーマットの抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体（すなわち、ＲＯＲ１に対して二価であり、ＣＤ３に対して一価である、二特異性（Ｆａｂ）２×（Ｆａｂ）抗体を、実施例１において作出した抗ＲＯＲ１抗体を用いて作製する。実施例１に記載されている、対応する抗ＲＯＲ１  ＩｇＧ１抗体の完全Ｆａｂ（重鎖ＶＨドメインおよび重鎖ＣＨ１ドメインに加えた、軽鎖ＶＬドメインおよび軽鎖ＣＬドメイン）をコードするｃＤＮＡ、ならびに実施例５．１に記載されている抗ＣＤ３  ＶＨおよび抗ＣＤ３  ＶＬのｃＤＮＡを、出発材料として使用した。各二特異性抗体には、対応する抗ＲＯＲ１抗体の重鎖および軽鎖、ならびに上で記載した抗ＣＤ３抗体の重鎖および軽鎖を含む、４つのタンパク質鎖が含まれる。
【０２３８】
ｂ）ＲＯＲ１×ＣＤ３二特異性抗体ベクターを作出するために、ＩｇＧ１由来の二特異性分子は、少なくとも、２つの顕著に異なる抗原性決定基ＣＤ３およびＲＯＲ１に特異的に結合することが可能な、２つの抗原結合性部分からなる。抗原結合性部分は、各々が、可変領域および定常領域を含む、重鎖および軽鎖を含むＦａｂ断片である。Ｆａｂ断片のうちの少なくとも１つは、Ｆａｂ重鎖と、Ｆａｂ軽鎖の定常ドメインを交換した、「Ｃｒｏｓｓｆａｂ」断片である。Ｆａｂ断片内の重鎖定常ドメインと軽鎖定常ドメインとの交換により、特異性の異なるＦａｂ断片が、同一のドメインの並びを有さず、結果として、軽鎖を相互交換しないことを確保する。二特異性分子のデザインは、両方の抗原性決定基に対して一価（１＋１）でありうるか、またはＣＤ３に対して一価、ＲＯＲ１に対して二価でありえ、この場合、１つのＦａｂ断片を内側のＣｒｏｓｓＦａｂのＮ末端と融合する（２＋１）。構築物の概略表示を図１に示す；構築物の配列を配列番号１〜６２に示す。これらの分子は、懸濁液中で成長するＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞に、哺乳動物用発現ベクターをポリマーベース共トランスフェクトすることによって作製する。２＋１  ＣｒｏｓｓＦａｂ−ＩｇＧ構築物を調製するために、細胞に、対応する発現ベクターを、１：２：１：１の比（「Ｆｃ（ノブ）ベクター」：「軽鎖ベクター」：「軽鎖ＣｒｏｓｓＦａｂベクター」：「重鎖−ＣｒｏｓｓＦａｂベクター」）でトランスフェクトする。
【０２３９】
（実施例５．４）
電荷変異体を伴うかまたは伴わない、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体の作製および精製
二特異性抗体を作製するために、二特異性抗体を、懸濁液中で培養される、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞内の、それぞれの哺乳動物用発現ベクターの一過性のポリマーベースの共トランスフェクションにより発現させる。トランスフェクションの１日前に、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を、６ｍＭのＬ−グルタミンを補充した、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ培地中に、生細胞１５０万個で／ｍＬで播種する。最終的な産生容量１ｍＬ当たり、生細胞２００万個を遠心分離する（２１０×ｇで５分間）。上清を吸引し、細胞を、１００μＬのＣＤ  ＣＨＯ培地中に再懸濁させる。最終的な産生容量１ｍＬ当たりのＤＮＡは、１μｇのＤＮＡ（重鎖：修飾重鎖：軽鎖：修飾軽鎖の比＝１：１：２：１）を、１００μＬのＣＤ  ＣＨＯ培地中で混合することにより調製する。０．２７μＬのポリマー溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を添加した後で、混合物を、１５秒間ボルテックスし、室温で１０分間放置する。１０分後、再懸濁させた細胞およびＤＮＡ／ポリマー混合物をまとめ、次いで、適切な容器へと移し、これを、振とうデバイス（３７℃、５％のＣＯ２）内に置く。３時間のインキュベーション時間後に、６ｍＭのＬ−グルタミン、１．２５ｍＭのバルプロ酸、および１２．５％のＰｅｐｓｏｙ（５０ｇ／Ｌ）を補充した、８００μＬのＥｘ−Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄｉｕｍを、最終的な産生容量１ｍＬ当たり添加する。２４時間後、７０μＬのフィード溶液を、最終的な産生容量１ｍＬ当たり添加する。７日後、または細胞の生存率が、７０％と等しいかまたはそれ未満となったところで、遠心分離および滅菌濾過により、細胞を、上清から分離する。抗体は、アフィニティーステップ、ならびにカチオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ除外クロマトグラフィーである、１つまたは２つの仕上げステップにより精製する。要請される場合は、さらなる仕上げステップも使用する。
【０２４０】
アフィニティーステップのために、上清を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５  ６ＣＶで平衡化させたプロテインＡカラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＦＦ、５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードする。同じ緩衝液による洗浄ステップの後で、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１００ｍＭのグリシン、ｐＨ３．０による段階的溶出によって、抗体を、カラムから溶出させる。所望の抗体を伴う画分を、０．５Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０（１：１０）で速やかに中和し、プールし、遠心分離により濃縮する。濃縮物は、滅菌濾過し、さらにカチオン交換クロマトグラフィーおよび／またはサイズ除外クロマトグラフィーに掛ける。
【０２４１】
カチオン交換クロマトグラフィーステップのために、濃縮されたタンパク質を、アフィニティーステップのために使用した溶出緩衝液で、１：１０に希釈し、カチオン交換カラム（Ｐｏｒｏｓ  ５０  ＨＳ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）へとロードする。それぞれ、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２０ｍＭのトリス、ｐＨ５．０、および２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２０ｍＭのトリス、１００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ５．０である、平衡緩衝液および洗浄緩衝液による、２回の洗浄ステップの後で、タンパク質を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２０ｍＭのトリス、１００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ８．５を使用する勾配により溶出させる。所望の抗体を含有する画分は、プールし、遠心分離により濃縮し、滅菌濾過し、さらにサイズ除外ステップに掛ける。
【０２４２】
サイズ除外ステップのために、濃縮されたタンパク質を、製剤緩衝液としての、Ｔｗｅｅｎ２０を伴うかまたは伴わない、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０と共に、ＸＫ１６／６０  ＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入する。単量体を含有する画分は、プールし、遠心分離により濃縮し、滅菌バイアルへと滅菌濾過する。
【０２４３】
抗体濃度の決定は、０．１％の抗体溶液の吸光度についての理論値を使用する、２８０ｎｍにおける吸光度の測定により行う。この値は、アミノ酸配列に基づくものであり、ＧＰＭＡＷソフトウェア（Ｌｉｇｈｔｈｏｕｓｅ  ｄａｔａ）により計算する。
【０２４４】
最終タンパク質調製物の純度および単量体含量は、２５ｍＭのリン酸カリウム、１２５ｍＭの塩化ナトリウム、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウム、ｐＨ６．７による緩衝液中で、ＣＥ−ＳＤＳ（Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））およびＨＰＬＣ（ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ解析用サイズ除外カラム（Ｔｏｓｏｈ））のそれぞれにより決定する。
【０２４５】
最終タンパク質調製物の分子量を検証し、最終タンパク質溶液中の分子が均質になるように調製されたことを確認するために、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を使用する。脱グリコシル化ステップをまず実施する。炭水化物により導入される異質性を除去するために、構築物を、ＰＮＧａｓｅＦ（ＰｒｏＺｙｍｅ）で処理する。したがって、２Ｍのトリス２μｌを、濃度を０．５ｍｇ／ｍｌとする２０μｇのタンパク質へと添加することにより、タンパク質溶液のｐＨを、ｐＨ７．０へと調整する。０．８μｇのＰＮＧａｓｅＦを、添加し、３７℃で１２時間インキュベートする。次いで、ＬＣ−ＭＳオンライン検出を実施する。ＬＣ−ＭＳ法は、ＴＯＦ  ６４４１質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ）へとカップリングさせた、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ  １２００上で実施する。クロマトグラフィーによる分離は、Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ  Ｐｏｌｙｓｔｅｒｅｎｅカラム；ＲＰ１０００−８（粒子サイズを８μｍとする、４．６×２５０ｍｍ；カタログ番号７１９５１０）上で実施する。溶離液Ａは、水中に５％のアセトニトリル、および０．０５％（ｖ／ｖ）のギ酸であり、溶離液Ｂは、９５％のアセトニトリル、５％の水、および０．０５％のギ酸である。流量は、１ｍｌ／分であった。分離は、４０℃で実施し、前に記載した処理により、６μｇ（１５μｌ）のタンパク質試料を得る（表８）。
【表８】
0006708635.tif 000014
【０２４６】
最初の４分間の間、質量分析計を塩汚染から保護するように、溶出液を、廃棄物へと方向づける。ＥＳＩ源は、乾燥ガス流量を１２ｌ／分とし、温度を３５０℃とし、噴霧器圧力を６０ｐｓｉとして動作させた。ＭＳスペクトルは、陽イオンモードにおいて、３８０Ｖのフラグメンター電圧および７００〜３２００ｍ／ｚの質量範囲を使用して取得する。ＭＳデータは、計器ソフトウェアにより、４〜１７分間にわたり取得する。
【０２４７】
次いで、電荷変異体を伴わないＲＯＲ１×ＣＤ３−ＴＣＢの作製／精製プロファイルを、ＲＯＲ１×ＣＤ３−ＴＣＢｃｖ（電荷変異体を伴う）抗体と比較する、一対一の作製試行を行って、Ｔ細胞二特異性抗体に適用されるＣＬ−ＣＨ１電荷修飾の利点をさらに査定した。
【０２４８】
表８−１は、プロテインＡ（ＰＡ）アフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ除外クロマトグラフィー（ＳＥＣ）精製を含めた、標準的な、最適化されていない精製方法に従う、電荷変異体を伴うＲＯＲ１×ＣＤ３−ＴＣＢの３つの分子の有利な作製／精製プロファイルを示す。
【０２４９】
【表８−１】
0006708635.tif 000015
【０２５０】
図３−１は、電荷変異体を伴うかまたは伴わない別のＴＣＢ分子、すなわち８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体および８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体のための、異なる精製法の後における、ＣＥ−ＳＤＳ（非還元）による、最終タンパク質調製物についてのグラフを描示する。８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体へと適用された、プロテインＡ（ＰＡ）アフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ除外クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による精製ステップが結果としてもたらす単量体含量（Ａ）の純度は、３０％未満および８２．８％であった。カチオン交換クロマトグラフィー（ｃＩＥＸ）ステップおよび最終的なサイズ除外クロマトグラフィー（ｒｅ−ＳＥＣ）ステップを含むさらなる精製ステップを、（Ａ）における最終タンパク質調製物へと適用したところ、純度は、９３．４％へと増大したが、単量体含量は同じにとどまり、収率は、０．４２ｍｇ／Ｌへと有意に低減された。しかし、特異的電荷修飾を、８３Ａ１０抗ＢＣＭＡ  Ｆａｂ  ＣＬ−ＣＨ１へと適用したところ、つまり、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体では、ＰＡ＋ｃＩＥＸ＋ＳＥＣ精製ステップを適用した場合であってもなお、９５．３％の純度、１００％の単量体含量、および最大３．３ｍｇ／Ｌの収率により実証される通り、さらなるｒｅ−ＳＥＣ精製ステップを含むにも拘らず、作製／精製プロファイルが、７．９分の１の収率および１７．２％低量の単量体含量を示す（Ｂ）と比較して、ＴＣＢ分子の優れた作製／精製プロファイルを既に観察することができた（Ｃ）。
【０２５１】
次いで、８３Ａ１０−ＴＣＢの作製／精製プロファイルを、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体と対比して比較する、一対一の作製試行を行って、抗体へと適用されるＣＬ−ＣＨ１電荷修飾の利点をさらに査定した。８３Ａ１０−ＴＣＢ分子および８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ分子のいずれも、ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０６７８４１の図２ａに記載されている分子フォーマットの分子である。図３−２に描示される通り、８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体および８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体の特性を、並行して測定し、各精製ステップ：１）ＰＡアフィニティークロマトグラフィーだけ（Ａ、Ｂ）、２）ＰＡアフィニティークロマトグラフィー、次いで、ＳＥＣ（Ｃ、Ｄ）、ならびに３）ＰＡアフィニティークロマトグラフィー、次いで、ＳＥＣ、次いで、ｃＩＥＸおよびｒｅ−ＳＥＣ（Ｅ、Ｆ）の後で比較した。８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体および８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体のための、それぞれの精製法の後における、ＣＥ−ＳＤＳ（非還元）による、最終タンパク質溶液についてのグラフを、図３−２に顕示する。図３−２Ａおよび３−２Ｂにおいて示される通り、電荷変異体をＴＣＢ抗体へと適用することによる改善は、ＰＡアフィニティークロマトグラフィーだけによる精製の後で既に観察された。この一対一研究では、８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体へと適用した、ＰＡアフィニティークロマトグラフィーによる精製ステップは、６１．３％の純度、２６．２ｍｇ／Ｌの収率、および６３．７％の単量体含量を結果としてもたらした（３−２Ａ）。比較として、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体を、ＰＡアフィニティークロマトグラフィーで精製したところ、より良好な８１．０％の純度、より良好な５１．５ｍｇ／Ｌの収率、および６８．２％の単量体含量により、全ての特性が改善された（３−２Ｂ）。さらなるＳＥＣ精製ステップを、図３−２Ａおよび３−２Ｂで見られるように最終タンパク質調製物へと適用したところ、純度および単量体含量が、それぞれ、最大９１．０％および８３．９％と改善されたが、収率は１０．３ｍｇ／Ｌであった８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ（３−２Ｄ）と比較して、８３Ａ１０−ＴＣＢは、６９．５％の純度、１４．１ｍｇ／Ｌの収率、および７４．７％の単量体含量（３−２Ｃ）と向上した。この特定の実験では、収率こそ、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖが、８３Ａ１０−ＴＣＢよりわずかに少なかった（すなわち、２７％少なかった）ものの、適正な分子の百分率では、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖが、８３Ａ１０−ＴＣＢよりはるかに良好であり、ＬＣ−ＭＳにより測定される通り、それぞれ、４０〜６０％と対比した９０％であった。第３の一対一比較では、図３−２Ｃおよび３−２Ｄからの、８３Ａ１０−ＴＣＢおよび８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖの最終タンパク質調製物を、ＰＡアフィニティークロマトグラフィーによる精製ステップだけの後における、別の精製バッチ（同じ作製）からの最終タンパク質調製物、それぞれ約１Ｌ（等容量）と共にプールした。次いで、プールされたタンパク質調製物を、ｃＩＥＸおよびＳＥＣによる精製法により、さらに精製した。図３−２Ｅおよび３−２Ｆに描示される通り、電荷変異体を伴わないＴＣＢ抗体と比較した場合の、電荷変異体を伴うＴＣＢ抗体の作製／精製プロファイルの改善が一貫して観察された。いくつかのステップによる精製法（すなわち、ＰＡ±ＳＥＣ＋ｃＩＥＸ＋ＳＥＣ）を使用して、８３Ａ１０−ＴＣＢ抗体を精製した後において、達せられた純度は、４３．１％に過ぎず、９８．３％の単量体含量は達成されたが、収率は損なわれ、０．４３ｍｇ／Ｌへと低減された。ＬＣ−ＭＳにより測定される適正な分子の百分率は、やはり低値であり、６０〜７０％であった。最後に、最終タンパク質調製物の品質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける使用に許容可能なものではなかった。これとは全く対照的に、同じ複数の精製ステップを、同順で８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体へと適用したところ、９６．２％の純度および９８．９％の単量体含量が達せられたほか、ＬＣ−ＭＳにより測定される適正な分子も９５％であった。しかし、ここでもまた、収率は、ｃＩＥＸ精製ステップの後で、０．６４ｍｇ／Ｌへと大幅に低減された。結果は、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖ抗体に関して、より良好な純度、より高い単量体含量、より高い百分率の適正な分子、およびより良好な収率は、２つの標準的な精製ステップ、すなわち、ＰＡアフィニティークロマトグラフィーおよびＳＥＣの後で初めて達成されうるが（図３−２Ｄ）、８３Ａ１０−ＴＣＢでは、さらなる精製ステップを適用してもなお、このような特性を達成することができなかった（図３−２Ｅ）ことを示す。
【０２５２】
表８−２は、ＰＡ精製ステップの後における、８３Ａ１０−ＴＣＢの、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖと比較した特性についてまとめる。表８−３は、ＰＡ精製ステップおよびＳＥＣ精製ステップの後における、８３Ａ１０−ＴＣＢの、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖと比較した特性についてまとめる。表８−４は、ＰＡおよびＳＥＣに加え、ＰＡ単独、次いで、ｃＩＥＸおよびｒｅ−ＳＥＣの精製ステップの後における、８３Ａ１０−ＴＣＢの、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖと比較した特性についてまとめる。表８−２〜８−４では、太字の値は、８３Ａ１０−ＴＣＢと、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖとの間で比較した場合の優れた特性を強調する。代表的ではい可能性がある１つ（すなわち、収率および量のそれぞれ；表８−３を参照されたい）を例外として、３つの一対一比較実験から得られる全ての作製／精製パラメータおよび値は、８３Ａ１０−ＴＣＢと比較して、８３Ａ１０−ＴＣＢｃｖが優れていた。全体的な結果により、作製／精製特徴における利点は、ＣＬ−ＣＨ１電荷修飾を、ＴＣＢ抗体へと適用することにより達成できたこと、および開発可能特性が非常に良好な、既に高品質のタンパク質調製物を達成するのに要請される精製ステップは、２つ（すなわち、ＰＡアフィニティークロマトグラフィーおよびＳＥＣ）だけであったことが明らかに実証される。
【０２５３】
【表８−２】
0006708635.tif 000016
【０２５４】
【表８−３】
0006708635.tif 000017
【０２５５】
【表８−４】
0006708635.tif 000018
【０２５６】
（実施例６）
抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体の、ＲＯＲ１陽性Ｂ−ＣＬＬ細胞または骨髄腫細胞またはＴ細胞上のＣＤ３への結合（フローサイトメトリー）
【０２５７】
ａ）実施例５において作出した抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体を、初代Ｂ−ＣＬＬ細胞上に発現するヒトＲＯＲ１またはヒト白血病性Ｔ細胞Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１５２）上に発現するヒトＣＤ３へのそれらの結合特性についてもフローサイトメトリーにより解析した。Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞を１０％のウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ中で培養した。略述すると、培養細胞を採取し、カウントし、ＶｉＣｅｌｌを使用して、細胞生存率を査定した。次いで、生細胞を、０．１％のＢＳＡを含有するＦＡＣＳ  Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、１ｍｌ当たりの細胞２×１０６個に調整した。この細胞懸濁液１００μｌを、丸底９６ウェルプレートに、ウェルごとに、さらにアリコート分割した。細胞を含有するウェルに、３０μｌの、Ａｌｅｘａ４８８で標識された抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体または対応するＩｇＧ対照を添加して、３ｎＭ〜５００ｎＭまたは０．１ｐＭ〜２００ｎＭの最終濃度を得た。抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体と対照ＩｇＧは同じモル濃度で使用した。４℃で３０分間のインキュベーションの後、細胞を遠心分離し（３５０×ｇで５分間）、１５０μｌ／ウェルの、ＢＳＡを含有するＦＡＣＳ  Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で２回洗浄し、次いで、ウェル１つ当たり１００ｕｌのＢＤ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、型番５５４６５５）を使用して、４℃で２０分間細胞を固定し、１２０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩを使用して解析した。抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体の、Ｂ−ＣＬＬ細胞およびＴ細胞への結合を査定し、平均蛍光強度を、ＲＯＲ１を発現するＢ−ＣＬＬ細胞またはＣＤ３を発現するＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞のいずれかをゲーティングして決定し、ヒストグラムまたはドットプロットにプロットした。図７は、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体の、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞への結合についての平均蛍光強度であり、抗体濃度の関数としてプロットされた平均蛍光強度を示す。抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ１＋１抗体および抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ２＋１抗体のＪｕｒｋａｔ細胞に対するＥＣ５０値および最大結合は未到達だった。興味深いことに、ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ１＋１抗体は、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞に、ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ２＋１抗体よりも効率的に結合する。ＤＰ４７アイソタイプ対照抗体または抗ＲＯＲ１  ＩｇＧ抗体はＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞に結合しなかった。
【０２５８】
ｂ）抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体を、フローサイトメトリーにより、ＲＯＲ１を発現する骨髄腫ＲＰＭＩ８２２６細胞上のヒトＲＯＲ１への結合について解析した。略述すると、培養細胞を採取し、カウントし、ＶｉＣｅｌｌを使用して、細胞生存率を査定した。次いで、生細胞を、ＢＳＡを含有するＦＡＣＳ  Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、１ｍｌ当たりの細胞２×１０６個に調整した。この細胞懸濁液１００μｌを、丸底９６ウェルプレートに、ウェルごとに、さらにアリコート分割し、３０μｌの、Ａｌｅｘａ４８８で標識された抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体または対応するＩｇＧ対照と共に、４℃で３０分間インキュベートした。全ての抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体（およびアイソタイプ対照）を滴定し、０．１３６〜１３．６ｎＭの間の最終濃度範囲で解析した。標識されていない抗体を使用した試料については、細胞を遠心分離し（３５０×ｇで５分間）、１２０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ  Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で洗浄し、再懸濁させ、蛍光色素コンジュゲートＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７コンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  Ｆｃ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ；１０９−６０６−００８）と共に、４℃でさらに３０分間インキュベートした。次いで、細胞を、Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で２回洗浄し、ウェル１つ当たり１００ｕｌのＢＤ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、型番５５４６５５）を使用して、４℃で２０分間固定し、１２０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩを使用して解析した。図８は、抗体濃度：抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ１＋１抗体および抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ２＋１抗体の関数としてプロットされた、ＲＰＭＩ８２２６細胞における抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体についての平均蛍光強度を示す。抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ１＋１抗体および抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ２＋１抗体の、ＲＰＭＩ８２２６細胞への結合についてのＥＣ５０値（最大結合の５０％に達するのに要請される抗体の濃度を示す）を、表３にまとめる。ＦＡＣＳにより検出される通り、ＲＯＲ１に対して二価である抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ２＋１抗体は、ＲＯＲ１陽性ＲＰＭＩ８２２６骨髄腫細胞に、ＲＯＲ１に対して一価である抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ１＋１抗体よりもわずかに良好に結合すると思われる（図８）。蛍光色素コンジュゲート抗ヒトＦｃ二次抗体を使用するフローサイトメトリーにより検出される通り、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体はまた、初代Ｂ−ＣＬＬ細胞に結合することも示された（図２Ａ）。
【０２５９】
【表３】
0006708635.tif 000019
【０２６０】
（実施例６．１）
抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体の、卵巣がん細胞およびＴ細胞への結合（フローサイトメトリーにより測定される）
実施例５において作出した抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体を、フローサイトメトリーにより、ヒト卵巣がん細胞系ＰＡ−１およびＳＫ−ＯＶ−３ならびにヒト白血病性Ｔ細胞Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１５２）上に発現するヒトＣＤ３へのそれらの結合について解析した。Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞を、１０％のウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。略述すると、培養細胞を採取し、カウントし、ＶｉＣｅｌｌを使用して細胞生存率を査定する。次いで、生細胞を、０．１％のＢＳＡを含有するＦＡＣＳ  Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、１ｍｌ当たりの細胞２×１０６個に調整した。この細胞懸濁液１００μｌを、丸底９６ウェルプレートに、ウェルごとに、さらにアリコート分割した。細胞を含有するウェルに、３０μｌの、Ａｌｅｘａ４８８で標識された抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体または対応するＩｇＧ対照を添加して、１ｎＭ〜５００ｎＭ（Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞）、または０．１ｎＭ〜１００ｎＭ（ヒト卵巣がん細胞）の最終濃度を得た。抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体と対照ＩｇＧは同じモル濃度で使用した。４℃で３０分間のインキュベーションの後、細胞を遠心分離し（３５０×ｇで５分間）、１５０μｌ／ウェルの、ＢＳＡを含有するＦＡＣＳ  Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で２回洗浄し、次いで、細胞を、ウェル１つ当たり１００ｕｌのＢＤ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、型番５５４６５５）を使用して、４℃で２０分間固定し、１２０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩを使用して解析した。抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体の、ヒト卵巣がん細胞およびＴ細胞への結合を査定し、蛍光強度中央値を、ヒト卵巣がん細胞またはＣＤ３を発現するＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞のいずれかをゲーティングして決定し、ヒストグラムおよびドットプロットにプロットした。標識されていない抗体を使用した試料については、細胞を遠心分離し（３５０×ｇで５分間）、１２０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ  Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で洗浄し、再懸濁させ、蛍光色素コンジュゲートＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７コンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  Ｆｃ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ；１０９−６０６−００８）と共に、４℃でさらに３０分間インキュベートした。次いで、細胞を、Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で２回洗浄し、ウェル１つ当たり１００ｕｌのＢＤ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、型番５５４６５５）を使用して、４℃で２０分間固定し、１２０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩを使用して解析した。抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体についての蛍光強度中央値を抗体濃度の関数としてプロットした。抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３抗体のヒト卵巣がん細胞への結合についてのＥＣ５０値（最大結合の５０％に達するのに要請される抗体の濃度を示す）を、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して測定した。図３−３に示される通り、抗体濃度の関数として、蛍光強度シグナル中央値の増大によって測定される通り、ＲＯＲ１  Ｍａｂ２  ＩｇＧおよびＲＯＲ１  Ｍａｂ２−ＴＣＢｃｖの、ＳＫ−ＯＶ−３卵巣がん細胞系（Ａ）およびＰＡ−１ヒト卵巣がん細胞系（Ｂ）における濃度依存的結合が見られた。このような陽性シグナルは、ＣＤ３だけに結合し、ＲＯＲ１に結合しない対照ＴＣＢをＳＫ−ＯＶ−３卵巣がん細胞系およびＰＡ−１卵巣がん細胞系の両方で試験した場合には観察されなかった（ＡおよびＢ；塗りつぶし丸）。図３−４に示される通り、ＲＯＲ１  Ｍａｂ２−ＴＣＢｃｖおよび対照ＴＣＢの、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞における濃度依存的結合が見られ、これにより、両方のＴＣＢ抗体が、Ｔ細胞上のＣＤ３に結合することが確認される。
【０２６１】
（実施例７）
ＥＨＥＢ  Ｂ−ＣＬＬ細胞系、またはＣＬＬ患者由来の初代ＰＢＭＣまたはＲＰＭＩ８２２６  ＭＭ細胞における、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体の内部化（フローサイトメトリー）。
【０２６２】
上のステップ（実施例５）において選択した抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体を、内部化アッセイにおいてさらに試験した。略述すると、低温保存されたヒトＲＯＲ１を発現する初代Ｂ−ＣＬＬ標的細胞を解凍し、Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ緩衝液により採取し、ＶｉＣｅｌｌを使用して細胞生存率を決定した後に、洗浄し、１０％のＦＣＳを補充したＲＰＭＩ中に、１×１０６個（１×１０６個／ｍＬ）の低温保存した非処置ＣＬＬ患者に由来するＰＢＭＣ、または細胞２×１０６個／ｍＬのＥＨＥＢ  Ｂ−ＣＬＬ細胞系、または、１×１０６個／ｍＬのＲＰＭＩ８２２６細胞の濃度で再懸濁させた。細胞懸濁液を、各被験ＩｇＧ／ＴＣＢおよび各濃度について１５ｍｌ  Ｆａｌｃｏｎチューブに移した。Ａｌｅｘａ４８８とコンジュゲートした、希釈された抗ＲＯＲ１  ＩｇＧまたは抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ（ＲＰＭＩ＋１０％のＦＣＳ中１ｎＭまで希釈）を、０．５ｍｌをチューブに添加し、低温室内、シェーカーで３０分間インキュベートした。インキュベートし、細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄して結合していない抗体を除去した後、細胞を氷上に放置したか、または９６ウェルＦＡＣＳプレート中のあらかじめ加温した培地中に移し（細胞０．１×１０６個）、内部化を容易にするために、３７℃で１５分間、３０分間、１時間、２時間、および２４時間インキュベートした。さらに、細胞試料を、内部化を阻害するために、３μＭのフェニルアルシンオキシド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下、３７℃で２時間および／または２４時間インキュベートした。その後、細胞を冷ＰＢＳで１回洗浄し、Ａｌｅｘａ６４７で標識された抗ヒトＦｃ二次抗体（Ｆ（ａｂ）２）と共に、４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで３回の最終的な洗浄後、細胞を、４００×ｇで４分間遠心分離し、ヨウ化プロピジウム（１：４０００）（Ｓｉｇｍａ）を伴うかまたは伴わないＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。抗ＲＯＲ１  ＩｇＧおよび抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢについての細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＦｌｏｗＪｏ解析用ソフトウェアを使用して測定した。
【０２６３】
本明細書で使用される、「前記抗ＲＯＲ１抗体のＲＯＲ１陽性細胞への内部化」を反映する「平均蛍光強度の低減」（ΔＭＦＩ）、または「ＭＦＩ低減」という用語は、式ΔＭＦＩ＝１００−１００×［（ＭＦＩ実験値−ＭＦＩバックグラウンド）／（ＭＦＩ最大−ＭＦＩバックグラウンド）］を使用することにより、各ＲＯＲ１抗体について、非特異的なヒトＩｇＧ対照（ＭＦＩバックグラウンド）および氷上で維持されたＲＯＲ１抗体（ＭＦＩ最大）と比較して計算されるＭＦＩ低減の百分率を指す。ＭＦＩ実験値は、３７℃で２時間のインキュベーション後の前記ＲＯＲ１抗体で測定されるＭＦＩである。ＭＦＩ低減は、抗体内部化、抗体解離またはその両方の組合せを表しうる。エンドサイトーシス阻害剤フェニルアルシンオキシドにより遮断されるＭＦＩ低減は抗体内部化を示すのに対し、フェニルアルシンオキシドにより遮断されないＭＦＩ低減は、抗体解離を反映する。内部化する抗ＲＯＲ１抗体は最先端技術において公知である（Baskarら、Clin.  Cancer  Res.、１４巻（２号）：３９６〜４０４頁（２００８年））。
【０２６４】
一部の試験では、次いで、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞抗体の内部化率を、抗ＲＯＲ１二価ＩｇＧ抗体の内部化率と比較した。
【０２６５】
Ｔ細胞二特異性などの抗体ベースの治療については、腫瘍細胞とＴ細胞の間の安定な免疫シナプスおよび有効なＴ細胞媒介性のリダイレクトされた細胞傷害作用およびＴ細胞の活性化を容易にするために、腫瘍標的に特異的な抗体または抗体断片が内部化しないか、または内部化が緩徐であるか、または内部化がわずかであることが重要である。
【０２６６】
図４Ａおよび４Ｂに示され、表４にまとめられる通り、ＦＡＣＳ（蛍光色素コンジュゲート二次抗体の間接的な検出）によって測定される通り、抗ＲＯＲ１  ＩｇＧ抗体（１ｎＭ）は、初代Ｂ−ＣＬＬ細胞において、３７℃で２時間のインキュベーション後、約１２．５％内部化したのに対し、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ２＋１抗体（１ｎＭ）は、初代Ｂ−ＣＬＬ細胞において、同じ実験条件で、２７．１％の内部化率を示した（図４Ａおよび４Ｃ）。内部化は、０時間で、ベースラインにおけるＭＦＩ値に基づいて計算し、以前に記載された式を使用して計算した。結果は、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ２＋１が、Ｂ−ＣＬＬ細胞において３０％未満の内部化率を有することを示す。
【０２６７】
図５は、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ１＋１抗体（１ｎＭ）の、初代Ｂ−ＣＬＬ細胞における、フェニルアルシンオキシド（ＰＡＯ）の存在下または非存在下、３７℃で２時間のインキュベーション後の、内部化率を示す。ＭＦＩシグナルの低減は、抗体の内部化および／または解離に起因する可能性があるので、ＭＦＩシグナルの低減が、内部化によって引き起こされるか否かを、エンドサイトーシス阻害剤を使用して内部化を遮断することによって検証することが重要である。これは、細胞に対する結合活性が二価抗体よりも低い一価抗体に関して特に重要である。図５に示される通り、初代Ｂ−ＣＬＬ細胞において、ＰＡＯを伴わない３７℃で２時間のインキュベーション後に、ＭＦＩシグナルの９１％の低減が見られた。しかし、Ｂ−ＣＬＬ細胞をＰＡＯ（３μＭ）の存在下でインキュベートした場合にも、ＭＦＩシグナルの９０％の消失がなお観察され、これにより、ＭＦＩシグナルの低減が、抗体の内部化に起因するものではなく、おそらく解離に起因するものであることが示される（表５）。次いで、内部化率を０％まで計算することができた。結果は、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ１＋１がＢ−ＣＬＬ細胞において内部化しないことを実証し、これは、ＴＣＢ抗体についての好ましい特徴である。
【０２６８】
図６および表６に、２つの独立の実験において測定された、３７℃で２時間のインキュベーション後の、ＲＰＭＩ８２２６  ＭＭ細胞上の、ＴＣＢ２＋１抗体および抗ＲＯＲ１  ＩｇＧ抗体（１ｎＭ）の内部化率をまとめる。結果は、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ２＋１のＲＰＭＩ細胞上の内部化率が１５％未満であることを実証する。
【０２６９】
【表４】
0006708635.tif 000020
【０２７０】
【表５】
0006708635.tif 000021
【０２７１】
【表６】
0006708635.tif 000022
【０２７２】
（実施例８）
抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体との会合時のＴ細胞の活性化（フローサイトメトリー）
ａ）ヒトＲＯＲ１陽性細胞の存在下または非存在下における、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上の、早期活性化マーカーＣＤ６９、または後期活性化マーカーＣＤ２５の表面発現を査定することにより、実施例５において作出した抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体を、フローサイトメトリーにより、Ｔ細胞の活性化を誘導するそれらの潜在性についても解析した。略述すると、ＲＯＲ１陽性細胞を、Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ緩衝液により採取し、カウントし、細胞生存率を、ＶｉＣｅｌｌを使用して検証した。生存Ｂ−ＣＬＬ細胞を、１０％のＦＣＳを補充したＲＰＭＩ中、１ｍｌ当たりの細胞０．２×１０６個に調整し、この細胞懸濁液１００μｌを、丸底９６ウェルプレートに、ウェルごとに、ピペットにより移した。５０μｌのＴ細胞二特異性構築物を、ＲＯＲ１陽性細胞を含有するウェルに添加して、０．０１ｆＭ〜１００ｐＭまたは０．０１ｐＭ〜１００ｎＭの最終濃度を得た。９６ウェルプレートを、取りおき、さらに操作するまで３７℃、５％のＣＯ２で維持した。
【０２７３】
ＰＢＭＣを、クエン酸ナトリウムを伴うＣｅｌｌ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎチューブ（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＣＰＴチューブ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、密度勾配遠心分離を使用して、採取したての血液から単離した。次いで、全ヒトＴ細胞を、Ｐａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用し、製造元の指示書に従い単離した。一部の試験では、ＣＤ８  Ｔ細胞クローンをエフェクターとして使用した。ＮＬＶ（ＨＬＡ−Ａ２によって認識されるＣＭＶ特異的ペプチド）に特異的なＣＤ８  Ｔ細胞を、ＨＬＡ−Ａ２＋健常ドナーのＰＢＭＣから、ＣＤ８抗体およびＮＬＶペプチドと複合体を形成したＨＬＡ−Ａ２に特異的な四量体を使用して精製し、細胞分取機により分取した。精製された細胞を、４００ＩＵのＩＬ２を伴う培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｌ−グルタミン）中、ＮＬＶペプチドをパルスした健常ドナーのＰＢＭＣおよびＨＬＡ−Ａ２＋ＬＣＬ（リンパ芽球様細胞）から得られた、照射したフィーダー調製物上で増大させた。ＮＬＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞クローンを、４００ＩＵのＩＬ２を伴う同じ培地中で維持し、フィーダー調製物で定期的に再活性化した。次いで、ヒト全Ｔ細胞またはＣＤ８  Ｔ細胞クローン（エフェクター）を、１０％のＦＣＳを補充したＲＰＭＩ中、１ｍｌ当たりの細胞２×１０６個に調整した。この細胞懸濁液５０μｌを、既にＲＯＲ１陽性の標的細胞を含有するアッセイプレートのウェルごとに添加して、最終Ｅ：Ｔ比、３：１（エフェクターとしてＣＤ８  Ｔ細胞）、または１０：１（エフェクターとしてＰＢＭＣ）を得た。Ｔ細胞二特異性構築物が、ＲＯＲ１のみ陽性の腫瘍標的細胞の存在下で、Ｔ細胞を活性化することが可能であるかを決定するために、０．０１ｆＭ〜１００ｐＭまたは０．０１ｐＭ〜１００ｎＭの範囲の最終濃度の、それぞれの二特異性分子を含有し、エフェクター細胞を伴うが、ＲＯＲ１陽性腫瘍標的細胞は伴わないウェルも含めた。５％のＣＯ２、３７℃で、６〜２４時間（エフェクターとしてＣＤ８  Ｔ細胞クローン）、または２４〜４８時間（エフェクターとしてＰＢＭＣ）のインキュベーション後、細胞を、遠心分離により（３５０×ｇで５分間）ペレット化し、１５０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ  Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で２回洗浄した。ヒトＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ６９またはＣＤ２５に対する、選択された蛍光色素コンジュゲート抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によるエフェクター細胞の表面染色を、光から保護して、ＦＡＣＳ  Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、製造元のプロトコールに従って、４℃で３０分間実施した。細胞を、１５０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ  Ｓｔａｉｎ緩衝液で２回洗浄し、次いで、ウェル１つ当たり１００ｕｌのＢＤ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、型番５５４６５５）を使用して、４℃で２０分間固定し、１２０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩを使用して解析した。ＣＤ６９活性化マーカーまたはＣＤ２５活性化マーカーの発現を、ヒストグラムまたはドットプロットに示される通り、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ���胞集団をゲーティングした場合の平均蛍光強度を測定することにより決定した。
【０２７４】
図９Ａは、ＣＤ８  Ｔ細胞をゲーティングした場合の後期活性化マーカーＣＤ２５の平均蛍光強度の濃度依存的な増大を示す。結果は、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ１＋１抗体が、ＲＯＲ１陽性Ｒｅｃ−１細胞の存在下でＣＤ８  Ｔ細胞の有意な濃度依存的活性化を誘導し、１００ｐＭの抗体で最大シグナルに到達したことを示す。非結合性ＴＣＢ構築物によって得られる、ＲＯＲ１陽性標的細胞への結合を伴わないＴ細胞上のＣＤ３への結合でのＣＤ８  Ｔ細胞の非特異的な活性化は最小であった。ＣＤ８  Ｔ細胞の活性化は、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ２＋１抗体を用いると著しいものではなかったが、ＣＤ２５平均蛍光強度の、かすかであるが注目すべき増大が見られた。しかし、非特異的な活性化を除外することはできなかった。
【０２７５】
図９Ｂは、ＲＯＲ１陽性ＲＰＭＩ８２２６  ＭＭ細胞の存在下で、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ１＋１抗体および抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ２＋１抗体によって媒介される、ＣＤ８  Ｔ細胞上のＣＤ２５の濃度依存的な上方調節を示す。被験ＴＣＢ抗体の最高濃度（１００ｐＭ）において、非結合性ＴＣＢ構築物との比較において示される通り、ＣＤ８  Ｔ細胞の非特異的な活性化は見られなかった。
【０２７６】
（実施例８．１）
卵巣がん細胞の存在下での、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体との会合時のＴ細胞の活性化（フローサイトメトリー）
実施例５において作出した抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体を、ＲＯＲ１陽性ヒト卵巣がん細胞系ＰＡ−１および／またはＳＫ−ＯＶ−３の存在下における、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上の、早期活性化マーカーＣＤ６９および／または後期活性化マーカーＣＤ２５の表面発現を査定することにより、フローサイトメトリーにより、Ｔ細胞の活性化を誘導するそれらの潜在性についても解析した。略述すると、ヒト卵巣がん標的細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡにより採取し、洗浄し、平底９６ウェルプレートを使用して、細胞２５，０００個／ウェルの密度でプレーティングした。細胞を、一晩放置して接着させた。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離により、健常ヒトドナーから得られる、富化されたリンパ球調製物（軟膜）から調製した。採取したての血液を、滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ、＃Ｈ８８８９）上に、層状に載せた。遠心分離の後（室温、４５０×ｇで３０分間）、ＰＢＭＣを含有する相間部の上方の血漿を廃棄し、ＰＢＭＣを、新しいｆａｌｃｏｎチューブに移し、その後、５０ｍｌのＰＢＳを満たした。混合物を遠心分離し（室温、４００×ｇで１０分間）、上清を廃棄し、ＰＢＭＣペレットを滅菌ＰＢＳで２回洗浄した（３５０×ｇで１０分間の遠心分離ステップ）。結果として得られるＰＢＭＣ集団を、自動的にカウントし（ＶｉＣｅｌｌ）、さらなる使用まで（２４時間を超えない）、細胞系の供給元（実施例２．１を参照されたい）に従い、それぞれの培養培地中、細胞インキュベーター内、５％のＣＯ２、３７℃で保存した。抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体によって誘導されるＴ細胞の活性化を調査するために、ヒト卵巣がん細胞を示されている濃度の二特異性抗体に曝露した（０．１ｐＭ〜２００ｎＭの範囲、三連で）。次いで、ＰＢＭＣを、ヒト卵巣がん標的細胞に、最終的なエフェクターと標的との比（Ｅ：Ｔ比）、１０：１で添加した。５％のＣＯ２、３７℃で２４〜４８時間のインキュベーション後に、Ｔ細胞の活性化を評価した。インキュベーション期間後、細胞を、遠心分離により（３５０×ｇで５分間）ウェルから収集し、ペレット化し、１５０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ  Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で２回洗浄した。ヒトＣＤ４（マウスＩｇＧ１、Ｋ；クローンＲＰＡ−Ｔ４）、ＣＤ８（マウスＩｇＧ１、Ｋ；クローンＨＩＴ８ａ；ＢＤ型番５５５６３５）、ＣＤ６９（マウスＩｇＧ１；クローンＬ７８；ＢＤ型番３４０５６０）およびＣＤ２５（マウスＩｇＧ１、Ｋ；クローンＭ−Ａ２５１；ＢＤ型番５５５４３４）に対する、選択された蛍光色素コンジュゲート抗体によるエフェクター細胞の表面染色を、光から保護して、ＦＡＣＳ  Ｓｔａｉｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、製造元のプロトコールに従って、４℃で３０分間実施した。細胞を、１５０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ  Ｓｔａｉｎ緩衝液で２回洗浄し、次いで、ウェル１つ当たり１００ｕｌのＢＤ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、型番５５４６５５）を使用して、４℃で２０分間固定し、１２０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩを使用して解析した。ＣＤ６９活性化マーカーまたはＣＤ２５活性化マーカーの発現を、ヒストグラムまたはドットプロットに示される通り、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団をゲーティングした場合の蛍光強度中央値を測定することにより決定した。図９．１に示される通り、ＲＯＲ１  Ｍａｂ２−ＴＣＢｃｖ（四角）は、ＲＯＲ１の発現が低度なＳＫ−ＯＶ−３標的細胞の存在下で、ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ａ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｂ）において観察された、ＣＤ６９早期活性化マーカーの濃度依存的な増大を誘導したのに対し、対照ＴＣＢ（三角形）は、Ｔ細胞の活性化を少しも誘導しなかった。臨床的に関与性の濃度である１ｎＭのＲＯＲ１  Ｍａｂ２−ＴＣＢｃｖにおいて、４８時間のインキュベーション後、最大４０％の活性化ＣＤ４  Ｔ細胞および２５％の活性化ＣＤ８  Ｔ細胞が既に存在していた。
【０２７７】
（実施例９）
抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体の、Ｔ細胞上のＣＤ３への架橋結合時、および多発性骨髄腫細胞上のＲＯＲ１への架橋結合時の、リダイレクトされたＴ細胞による、多発性骨髄腫細胞に対する細胞傷害作用（ＬＤＨ放出アッセイ）
実施例５において作出した抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体を、抗原結合性部分の、細胞上のＲＯＲ１への結合を介する、構築物の架橋結合時に、ＲＯＲ１を発現する多発性骨髄腫細胞内でＴ細胞媒介性アポトーシスを誘導するそれらの潜在性についても解析した。略述すると、ヒトＲＯＲ１を発現するＲＰＭＩ−８２２６多発性骨髄腫標的細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１５５から入手可能である）を、Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ緩衝液により採取し、洗浄し、１０％のＦＣＳを補充したＲＰＭＩ中に再懸濁させた。ウェル１つ当たりの細胞約３０，０００個を、丸底９６ウェルプレート内にプレーティングし、構築物のそれぞれの希釈液を、所望の最終濃度、０．０１ｆＭ〜１００ｐＭまたは０．２ｎＭ〜３０ｎＭの最終濃度になるように添加した（三連で）。適切な比較のために、全てのＴ細胞二特異性構築物および対照を、同じモル濃度に調整した。ヒト全Ｔ細胞またはＣＤ８  Ｔ細胞クローン（エフェクター）をウェルに添加して、３：１の最終Ｅ：Ｔ比を得た。ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用した場合には、１０：１の最終Ｅ：Ｔ比を使用した。ＰＨＡ−Ｌ（Ｓｉｇｍａ）を、ヒトＴ細胞の活性化についての陽性対照として、１μｇ／ｍｌの濃度で使用した。陰性対照群は、エフェクター細胞だけ、または標的細胞だけで表した。標準化のために、ＲＰＭＩ−８２２６多発性骨髄腫標的細胞の最大溶解（＝１００％）を、最終濃度１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を伴い、細胞死を誘導する、標的細胞のインキュベーションにより決定した。最小溶解（＝０％）を、エフェクター細胞だけを伴い、すなわち、Ｔ細胞二特異性抗体を伴わずに共インキュベートされた標的細胞により表した。次いで、５％のＣＯ２、３７℃で、６〜２４時間のインキュベーション（エフェクターとしてＣＤ８  Ｔ細胞クローン）、または２４〜４８時間のインキュベーション（エフェクターとしてＰＢＭＣ）の後、製造元の指示書に従い、ＬＤＨ検出キット（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）により、アポトーシス性／壊死性ＲＯＲ１陽性標的細胞から上清へのＬＤＨ放出を測定した。ＬＤＨ放出の百分率を、濃度反応曲線において、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体の濃度に対してプロットした。ＩＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して測定し、最大ＬＤＨ放出の５０％を結果としてもたらすＴ細胞二特異性抗体の濃度として決定した。
【０２７８】
図１０は、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体によって活性化されたＣＤ８  Ｔ細胞による、リダイレクトされたＴ細胞によるＲＯＲ１陽性ＲＰＭＩ８２２６  ＭＭ標的細胞の殺滅を示す。抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体によって誘導される標的細胞の特異的な細胞傷害作用（腫瘍溶解）をＬＤＨ放出によって測定した。（Ａ）実験１（１４時間の時点）：抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ１＋１抗体では、非常にわずかな、腫瘍溶解応答の濃度依存的な増大が観察された。臨床的に関与性の３：１のＥ：Ｔ比、すなわち、ＣＤ８  Ｔ細胞３に対してＲＰＭＩ８２２６標的細胞１を反映する実験条件において、被験最低濃度である０．０１ｐＭの抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ１＋１抗体では３０％の腫瘍溶解が既に観察され、３０ｎＭの抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体で最大３７．５％の腫瘍溶解に達した。ＥＣ５０は、計算することができなかった。ＬＤＨ放出により検出された、３０ｎＭにおいて観察された３７．５％の腫瘍溶解は、３０ｎＭの非結合性ＴＣＢ１＋１（すなわち、エフェクター細胞には結合するが標的細胞には結合しない）での非特異的な標的細胞溶解は１７％に過ぎなかったので、標的細胞の非特異的な殺滅だけに帰することはできなかった。抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ２＋１抗体については、被験最低濃度である０．２ｆＭにおいて３０％の最大の標的細胞溶解が既に観察され、最大１０ｎＭとして増大する濃度で濃度依存的な応答は見られなかった。しかし、３０ｎＭの濃度の非結合性ＴＣＢ  ２＋１では、細胞溶解は既に３０％近くであった。（Ｂ）実験２（２０時間の時点）：ＲＯＲ１陽性ＲＰＭＩ８２２６において試験を繰り返し、２０時間のインキュベーション後に、ＬＤＨ放出の測定を評価した。１００ｐＭの濃度の抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ１＋１およびＴＣＢ２＋１抗体では３０〜４０％の標的細胞溶解が観察されたのに対し、１００ｐＭの非結合性ＴＣＢ対照は、腫瘍溶解を少しも誘導しなかった。結果は、ＣＤ８  Ｔ細胞上のＣＤ２５マーカーの上方調節によって測定されるＴ細胞の活性化の増大を裏付ける（図９Ｂ）。
【０２７９】
図１１は、異なるエフェクター細胞対腫瘍細胞（Ｅ：Ｔ）比での、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体によって活性化されたＰＢＭＣ由来のＴ細胞による、リダイレクトされたＴ細胞によるＲＯＲ１陽性ＲＰＭＩ８２２６  ＭＭ標的細胞の殺滅を示す。抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ抗体によって誘導される標的細胞の特異的な細胞傷害作用（腫瘍溶解）をＬＤＨ放出によって測定した。（Ａ）Ｅ：Ｔ比＝ＰＢＭＣ、１０：ＲＰＭＩ８２２６  ＭＭ細胞、１（２４時間の時点）：最大１００ｎＭとして増大する濃度で、濃度依存的な応答が見られた。１０：１のＥ：Ｔ比、すなわち、ＰＢＭＣ、１０に対してＲＰＭＩ８２２６標的細胞、１を用いた実験条件において、１００ｎＭの濃度の抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ１＋１抗体および抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ２＋１抗体で最大平均２５％の腫瘍溶解が観察された。ＬＤＨ放出により検出された、１００ｎＭで観察された２５％の腫瘍溶解は、１００ｎＭの非結合性ＴＣＢ２＋１（すなわち、エフェクター細胞には結合するが標的細胞には結合しない）での非特異的な標的細胞溶解は９％に過ぎなかったので、標的細胞の非特異的な殺滅だけに帰することはできなかった。（Ｂ）Ｅ：Ｔ比＝ＰＢＭＣ、２５：ＲＰＭＩ８２２６  ＭＭ細胞、１（２４時間の時点）：最大２ｎＭとして増大する濃度の抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ１＋１で、濃度依存的な腫瘍溶解が見られた。２ｎＭの濃度の抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ１＋１で最大平均３０％の腫瘍溶解が既に観察されたが、１００ｎＭの濃度で、応答がより大きくなることはなかったので、腫瘍溶解はプラトーに到達したものと思われる。
【０２８０】
ＲＯＲ１陽性血液がん細胞（ＣＬＬ、ＭＭ、およびＭＣＬ）による全体的なｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける結果は、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ１＋１および抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  ＴＣＢ２＋１分子が、１）ＲＯＲ１陽性標的細胞に結合し、２）ＣＤ３陽性Ｔ細胞に結合し、３）標的細胞およびＴ細胞への同時結合時にＴ細胞の活性化を媒介し、ならびに、４）Ｔ細胞上のＣＤ２５の上方調節を裏付けることに、リダイレクトされたＴ細胞による、ＲＯＲ１陽性標的細胞に対する細胞傷害作用を濃度依存的に誘導するので、これらの分子が、Ｔ細胞二特異性抗体のように作用することを明白に示す。
【０２８１】
（実施例１０）
ヒト卵巣がん細胞の細胞溶解（ＬＤＨ放出アッセイ）
実施例５において作出した抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体を、ヒト卵巣がん細胞におけるＴ細胞媒介性細胞傷害作用の誘導について解析した。ヒト卵巣がん細胞系ＰＡ−１、ＣＯＬＯ−７０４、ＳＫ−ＯＶ−３およびＯＶＣＡＲ−５。略述すると、ヒト卵巣がん標的細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡにより採取し、洗浄し、平底９６ウェルプレートを使用して、細胞２５，０００個／ウェルの密度でプレーティングした。細胞を一晩放置して接着させた。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離により、健常ヒトドナーから得られる、富化されたリンパ球調製物（軟膜）から調製した。採取したての血液を、滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ、＃Ｈ８８８９）上に、層状に載せた。遠心分離の後（室温、４５０×ｇで３０分間）、ＰＢＭＣを含有する相間部の上方の血漿を廃棄し、ＰＢＭＣを、新しいｆａｌｃｏｎチューブに移し、その後、５０ｍｌのＰＢＳを満たした。混合物を遠心分離し（室温、４００×ｇで１０分間）、上清を廃棄し、ＰＢＭＣペレットを滅菌ＰＢＳで２回洗浄した（３５０×ｇで１０分間の遠心分離ステップ）。結果として得られるＰＢＭＣ集団を、自動的にカウントし（ＶｉＣｅｌｌ）、さらなる使用まで（２４時間を超えない）、細胞系の供給元（実施例２．１を参照されたい）の示唆に従い、それぞれの培養培地中、細胞インキュベーター内、５％のＣＯ２、３７℃で保存した。殺滅アッセイのために、ＴＣＢ抗体を、示されている濃度で添加した（０．１ｐＭ〜２００ｎＭの範囲、三連で）。ＰＢＭＣを、ヒト卵巣がん標的細胞に最終的なエフェクターと標的との比（Ｅ：Ｔ比）、１０：１で添加した。５％のＣＯ２、３７℃で２４〜４８時間のインキュベーション後、アポトーシス性／壊死性細胞により細胞の上清中に放出されるＬＤＨの定量化（ＬＤＨ検出キット、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、＃１１  ６４４  ７９３  ００１）により、製造元の指示書に従い、標的細胞による殺滅を評価した。標的細胞の最大溶解（＝１００％）を、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を伴う、標的細胞のインキュベーションにより実現した。最小溶解（＝０％）は、エフェクター細胞を伴い、二特異性構築物を伴わずに共インキュベートされた標的細胞を指す。ＬＤＨ放出の百分率を、濃度反応曲線において、抗ＲＯＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二特異性抗体の濃度に対してプロットした。ＥＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して測定し、最大ＬＤＨ放出の５０％を結果としてもたらすＴ細胞二特異性抗体の濃度として決定した。図１２に示される通り、ＲＯＲ１  Ｍａｂ２−ＴＣＢｃｖ（四角）は、ＲＯＲ１の発現が高度なＰＡ−１卵巣がん細胞（Ａ）、ＲＯＲ１の発現が中程度なＣＯＬＯ−７０４（Ｂ）およびＯＶＣＡＲ−５（Ｃ）卵巣がん細胞およびＲＯＲ１の発現が低度なＳＫ−ＯＶ−３卵巣がん細胞（Ｄ）の腫瘍細胞溶解の濃度依存的な増大を誘導した。対照的に、ＣＤ３だけに結合する対照ＴＣＢ（Ａ、Ｂ、Ｃ；丸）は、臨床的に関与性の濃度（すなわち、最大１０ｎＭ）において腫瘍細胞溶解を誘導しなかった。代表的な実験を示す。
【０２８２】
【表９】
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【図１Ａ−Ｂ】
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【図１Ｃ−Ｇ】
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【図１Ｈ−Ｋ】
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【図２】
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【図３】
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【図３−１】
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【図３−２ＡＢ】
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【図３−２ＣＤ】
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【図３−２ＥＦ】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４Ａ】
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【図４ＢＣ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２ＡＢ】
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【図１２ＣＤ】
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【配列表】
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