(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１'−アセトキシチャビコールアセテート（1’-Acetoxychavicol acetate）を含有する、ケトン食療法が制限される対象のための、ケトン体産生促進剤。
【請求項２】
脳神経疾患予防又は治療用である、請求項１に記載のケトン体産生促進剤。
【請求項３】
脳神経疾患が、ケトン食療法の有効性が認められる脳神経疾患である、請求項２に記載のケトン体産生促進剤。
【請求項４】
脳神経疾患が、認知症、パーキンソン病、及びてんかんからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項２に記載のケトン体産生促進剤。
【請求項５】
ダイエット用、学習能力向上用、又は短期記憶もしくは長期記憶向上用である、請求項１に記載のケトン体産生促進剤。
【請求項６】
１'−アセトキシチャビコールアセテート（1’-Acetoxychavicol acetate）を含有する、てんかん予防又は治療用である、ケトン体産生促進剤。
【請求項７】
糖尿病患者のための、請求項１〜６のいずれかに記載のケトン体産生促進剤。
【請求項８】
経口剤である、請求項１〜７のいずれかに記載のケトン体産生促進剤。
【請求項９】
医薬、食品添加剤、又は食品である、請求項１〜８のいずれかに記載のケトン体産生促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、1’-Acetoxychavicol acetate（ＡＣＡ）を含有するケトン体産生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
1’-Acetoxychavicol acetate（ＡＣＡ）は、東南アジア原産の植物性食物であるナンキョウ（タイショウガ）に含有する主要機能成分である。ＡＣＡは様々な効果を奏することが知られている（例えば特許文献１、２、及び３）。
【０００３】
脳のエネルギー源はグルコースであるが、高齢化に伴って、神経細胞へのグルコースの取込みは低下する。その低下が著しい場合には、神経細胞はエネルギー不足となり、機能低下を生じ、さらに細胞死が誘導される。その結果、認知症などの脳神経疾患を発症する。一方、この細胞死は、グルコースの代替エネルギー源であるケトン体を補充することによって防ぐことができる。そのため、脳神経疾患に対する食事療法として、ケトン食療法が注目されている。さらに、ケトン食療法は、てんかん（特に難治性てんかん）の治療方法として効果的であることも知られている。ケトン食とは高脂質、低糖質（糖・炭水化物）食であり、脂質代謝を亢進させることによって脂質からケトン体（具体的にはアセト酢酸及びヒドロキシ酪酸）産生を増加させる。しかしながら、ケトン食は、栄養学的に理想とされる食事バランスと大きく異なること、また、脂質含量が多いため、副作用として、嘔吐、下痢、便秘を好発することが知られている。近年、中鎖脂肪酸からは長鎖脂肪酸よりも多くのケトン体が産生されるため、ケトン食の糖質制限を緩和できることから、中鎖脂肪酸の利用が勧められているが、糖尿病患者ではケトアシドーシスをおこすこともあるため、いずれの場合も医師や栄養士の指導の下で行う必要がある。
【０００４】
また、近年の健康志向の高まりを受け、特に先進国ではダイエットの需要が高まっている。ケトン食は、脂肪からケトン体が産生されることを亢進するため、効率よく脂肪を減少させることから、ダイエットの手法としても注目されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2006-151860号公報
【特許文献２】特開2013-193993号公報
【特許文献３】特開2014-156423号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、従来に比べてより簡便に行うことができ、且つ上述したようなリスクを軽減したケトン食を可能とする、ケトン体産生促進方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、1’-Acetoxychavicol acetate（１’−アセトキシチャビコールアセテート：ＡＣＡ）がケトン体産生促進効果を有することを見いだし、さらに改良を重ねて本発明を完成させるに至った。
【０００８】
本発明は例えば以下の項に記載のケトン体産生促進剤を包含する。
項１．
1’-Acetoxychavicol acetate（ＡＣＡ）を含有するケトン体産生促進剤。
項２．
脳神経疾患予防又は治療用である、項１に記載のケトン体産生促進剤。
項３．
脳神経疾患が、ケトン食療法の有効性が認められる脳神経疾患である、項２に記載のケトン体産生促進剤。
項４．
脳神経疾患が、認知症、パーキンソン病、及びてんかんからなる群より選択される少なくとも１種である、項２に記載のケトン体産生促進剤。
項５．
ダイエット用、学習能力向上用、又は短期記憶もしくは長期記憶向上用である、項１に記載のケトン体産生促進剤。
項６．
経口剤である、項１〜５のいずれかに記載のケトン体産生促進剤。
項７．
医薬、食品添加剤、又は食品である、項１〜６のいずれかに記載のケトン体産生促進剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のケトン体産生促進剤を用いることで、現状に比べてより簡便に行うことができ、且つ上述したようなリスク（例えば、嘔吐、下痢、便秘、ケトアシドーシスなど）を軽減したケトン食を実現することができる。これにより、より効率的な脳神経疾患の治療を行うことができる。また、糖尿病患者にケトン食療法を施す場合にも、ケトアシドーシスが起こる虞を低減できる。リスクが低減されていることから、ケトン食をダイエットに用いることも容易となる。さらには、本発明のケトン体産生促進剤は、学習能力向上効果、短期記憶もしくは長期記憶向上効果も期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例で行った実験のスケジュールを示す。
【図２】Ｙ字迷路試験に用いたＹ字迷路の写真を示す。
【図３】Ｙ字迷路試験において、各マウス群の示した交替行動率をまとめたグラフをを示す。＊はｐ＜０．０５を示す。
【図４】モーリス水迷路試験に用いた実験器具を示す。左側に水を張ったプール（足場及びスタート位置１、２、３、及び４の位置を記載した）の写真を示す。右側に、スタート位置１、２、３、及び４に設置した目印を示す。
【図５】モーリス水迷路試験の訓練セッションで用いたプールの概要を示す。
【図６】モーリス水迷路試験のプローブテストで用いたプールの概要を示す。
【図７】訓練セッションにおける、足場到達時間を各群ごとにまとめたグラフを示す。○はSAMR1 コントロール食群を、●はSAMP8 コントロール食群を、▲はSAMP8 0.02% ACA含有食群を、それぞれ示す。また、▲における、＊はｐ＜０．０５を、＊＊はｐ＜０．０１を、＊＊＊はｐ＜０．００１を、それぞれ示す（比較対象はいずれもSAMP8 コントロール食群）。
【図８】プローブテストにおける、足場が存在した地点に進入した回数を各群ごとにまとめたグラフを示す。＊＊はｐ＜０．０１（比較対象はSAMR1 コントロール食群）を、†はｐ＜０．０５（比較対象はSAMP8 コントロール食群）を、それぞれ示す。
【図９】ＧＣ−ＭＳによりマウス血清中のケトン体（ヒドロキシ酪酸）の量を検討した結果を、内部標準と比較した相対値により示す。
【図１０】各群のマウスの海馬組織をヘマトキシリン-エオジン染色し、海馬組織の神経細胞における形態変化を観察した結果を示す。ａ及びｄはSAMR1 コントロール食群を、ｂ及びｅはSAMP8 コントロール食群を、ｃ及びｆはSAMP8 0.02% ACA含有食群を、それぞれ示す。ａ、ｂ、ｃは倍率４．２倍、ｄ、ｅ、ｆは倍率１０倍での観察像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明について、さらに詳細に説明する。
【００１２】
1’-Acetoxychavicol acetate（「ＡＣＡ」と略記する）は、以下の構造を有する化合物である。
【００１３】
【化１】
0006708435.tif 000002
【００１４】
ＡＣＡは、例えば、東南アジア原産で、現地では食用として用いられる植物である、ナンキョウ（タイショウガ）の根茎に含まれることが知られている。本発明において用いるＡＣＡは、例えばナンキョウなどの植物から抽出して得たものであってもよいし、化学合成により得られたものであってもよく、特に限定されない。抽出方法や化学合成方法としては、公知の方法を用いることができる。
【００１５】
また、ＡＣＡは、上記構造式からも解るように、不斉炭素原子を１つ有している。上記構造式では不斉炭素原子は＊印で示されている。このため、ＡＣＡには２種の光学異性体（（Ｓ）−ＡＣＡ及び（Ｒ）−ＡＣＡ）が存在する。本発明に用いるＡＣＡは、Ｓ体及びＲ体の何れであってもよいし、これらの混合物であってもよい。混合物である場合の混合割合も特に限定されず、例えばモル比でＳ：Ｒが９：１〜１：９程度が例示される。また例えば、５：５の混合物であるラセミ体を用いることもできる。なお、天然には（つまりナンキョウ抽出物中には）Ｓ体として存在している。
【００１６】
本発明のケトン体産生促進剤は、ＡＣＡを含むことにより、ケトン体の産生を促進させる効果を奏する。本発明のケトン体産生促進剤は、ＡＣＡそのものであってもよく、ＡＣＡと他の成分とが配合されたものであってもよい。本発明のケトン体産生促進剤に、ＡＣＡに加えて他の成分が含まれる場合は、当該ケトン体産生促進剤はケトン体産生促進組成物ということもできる。このような他の成分は、本発明の効果を損なわない限り特に限定はされず、後述のように、本発明のケトン体産生促進剤が用いられる分野に応じて適宜設定することができる。
【００１７】
本発明のケトン体産生促進剤のＡＣＡの含有割合は、本発明の効果を損なわない限り特に制限されず、例えば０．００５〜１００質量％、好ましくは０．０１〜９９質量％程度が例示できる。また、本発明のケトン体産生促進剤の適用量は、本発明の効果が得られる量であれば特に制限されず、ケトン体産生促進剤の形態等によって適宜設定され得る。例えば、含有されるＡＣＡが成人一日あたり１〜３０００ｍｇ、好ましくは１０〜５００ｍｇとなる量が例示できる。なお、１日１回又は複数回（好ましくは２〜３回）に分けて投与することができる。適用対象はヒトが好ましいが、ヒト以外の非ヒト哺乳動物であってもよい。適用対象が非ヒト哺乳動物の場合も、当該ヒトの投与又は摂取量を参考として適宜設定することができる。また、本発明のケトン体産生促進剤の生体への適用方法も、本発明の効果を損なわない限り特に制限されないが、経口又は経血管（経静脈又は経動脈）で適用することが好ましい。つまり、経口投与又は経血管投与が好ましい。よって、本発明のケトン体産生促進剤の形態としては、経口剤又は経血管剤（例えば点滴剤又は注射剤）が好ましい。
【００１８】
本発明のケトン体産生促進剤は、例えば医薬品用途、食品添加剤用途、又は食品用途に好ましく用いることができる。
【００１９】
本発明のケトン体産生促進剤を医薬品用途で用いる場合であって、且つＡＣＡ及び他の成分が含まれる場合は、当該ケトン体産生促進剤はケトン体産生促進医薬組成物ともいえる。この場合、他の成分としては、薬学的に許容される基剤、担体、及び／又は添加剤（例えば溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等）等が例示できる。また、当該ケトン体産生促進剤の形態も特に制限されず、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤等が例示できる。これらの形態の医薬製剤は、必要に応じて当該他の成分とＡＣＡを組み合わせて常法により調製することができる。
【００２０】
本発明のケトン体産生促進剤を食品添加剤用途で用いる場合であって、且つＡＣＡ及び他の成分が含まれる場合は、当該ケトン体産生促進剤はケトン体産生促進食品添加剤又はケトン体産生促進食品添加組成物ともいえる。この場合、他の成分としては、食品衛生学上許容される基剤、担体、添加剤や、その他食品添加剤として利用され得る成分・材料が例示できる。また、当該ケトン体産生促進剤の形態も特に制限されず、例えば液状、粉末状、フレーク状、顆粒状、ペースト状のものが挙げられる。より具体的には、調味料（醤油、ソース、ケチャップ、ドレッシング等）、フレーク（ふりかけ）、焼き肉のたれ、スパイス、ルーペースト（カレールーペースト等）等が例示できる。このような食品添加剤は、必要に応じて当該他の成分とＡＣＡを組み合わせて常法により調製することができる。
【００２１】
本発明のケトン体産生促進剤を食品用途で用いる場合であって、且つＡＣＡ及び他の成分が含まれる場合は、当該ケトン体産生促進剤はケトン体産生促進食品組成物ともいえる。この場合、他の成分としては、食品衛生学上許容される基剤、担体、添加剤や、その他食品として利用され得る成分・材料が例示できる。また、当該ケトン体産生促進剤の形態も特に制限されず、例えば加工食品、飲料、健康食品（栄養機能食品、特定保健用食品等）、サプリメント、病者用食品（病院食、病人食又は介護食等）等が例示できる。これらは常法により調製することができる。特に、健康食品（栄養機能食品、特定保健用食品等）、又はサプリメントとして、ケトン体産生促進食品組成物を調製する場合は、継続的な摂取が行いやすいように、例えば顆粒、カプセル、錠剤（チュアブル剤等を含む）、飲料（ドリンク剤）等の形態で調製することが好ましく、なかでもカプセル、タブレット、錠剤、ドリンク剤の形態が摂取の簡便さの点からは好ましいが、特にこれらに限定されるものではない。
【００２２】
本発明のケトン体産生促進剤は、脳神経疾患の予防又は治療に有用である。特に、副作用のリスクが低いことから、ケトン食療法に好適に用いることができる。脳神経疾患としては、例えば認知症、パーキンソン病、てんかんが例示される。なお、ここでの認知症には、アルツハイマー病型認知症も含まれる。βアミロイドの蓄積が原因とされる脳神経疾患（特にβアミロイドの蓄積が原因とされるアルツハイマー病型認知症）は本発明のケトン体産生促進剤の使用対象疾患からは除外されてもよいが、特に事情がなければ除外されない。また、特に制限はされないが、本発明のケトン体産生促進剤の使用対象疾患である脳神経疾患は、グルコース取込み能低下により脳神経変性又は脳神経死が起こることに起因する脳神経疾患であることが好ましい。てんかんは、大脳ニューロンの過剰な放電から由来する反復性の発作（てんかん発作）を主徴とする脳神経疾患ではあるが、脳神経細胞のグルコース取込み能低下が指摘され、ケトン食療法の有効性も広く認められており、本発明のケトン体産生促進剤の好ましい使用対象疾患である。ケトン食療法の有効性が認められる脳神経疾患も、本発明のケトン体産生促進剤の使用対象疾患である脳神経疾患に好ましく包含される。
【００２３】
また、本発明のケトン体産生促進剤は、脂質代謝を亢進させることによって脂質からケトン体産生を増加させると考えられるため、効率よく脂肪を減少させることができ、よってダイエットにも有用である。特に、本発明のケトン体産生促進剤が食品添加剤用途又は食品用途で用いられる場合、特にダイエット用として好ましく用いることができる。
【００２４】
またさらに、本発明のケトン体産生促進剤は、学習能力の向上や、短期記憶もしくは長期記憶向上にも有用である。特に、老化により低下した学習能力、又は短期記憶もしくは長期記憶を向上させるために有用である。よって、本発明のケトン体産生促進剤は、学習能力向上用、又は短期記憶もしくは長期記憶向上用としても好ましく用いることができる。老化によりこれらの能力が低下した対象に対して特に有効であり、この場合の用途は、老化に伴う学習能力低下抑制用、あるいは老化に伴う短期記憶もしくは長期記憶低下抑制用ということもできる。
【００２５】
なお、糖尿病患者にケトン食療法を施すとケトアシドーシスを起こすおそれがあることから、糖尿病患者も本発明のケトン体産生促進剤の使用対象として好ましい。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。
【００２７】
老化促進モデルマウスを用いて、ＡＣＡを摂取することによりケトン体産生が促進されるかを、血清プロファイルを解析することにより検討した。また、Y-maze test（Ｙ字迷路試験）及びWater maze test（モーリス水迷路試験）により、短期記憶能力並びに学習能力及び長期記憶能力についても検討した。
【００２８】
ＡＣＡの調製
4-Hydroxybenzaldehyde (Wako, 12.5 g, 102.4 mmol), triethylamine (Wako, 15.5g, 1.5eq) 及び4-dimethylaminopyridine (Wako, 500mg, 0.04eq) を乾燥ジクロロメタン３００ｍＬに溶解し、０℃で撹拌しながら、tert-butyldimethylsilyl chloride (TCI, 18.5g, 1.2eq) を少しずつ加えた。室温で３時間撹拌した後、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（展開溶媒：Hexane:EtOAc =20:1）にて精製を行い、化合物１を得た(21.5g, 87%)。当該工程スキームを次に示す。
【００２９】
【化２】
0006708435.tif 000003
【００３０】
次に、化合物１ (20 g, 84.6 mmol) を乾燥ＴＨＦ３００ｍＬに溶解し、窒素気流下、０℃でvinylmagnesium bromide (TCI, 1 mol/L in THF, 102 mL, 1.2 eq) を滴下した。室温で３時間撹拌後、０．５Ｍ  ＨＣｌ水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（展開溶媒：Hexane:EtOAc =8:1）にて精製を行い、化合物２を得た(17.1 g, 76.4%)。当該工程スキームを次に示す。
【００３１】
【化３】
0006708435.tif 000004
【００３２】
さらに、化合物２(12g, 45.4mmol)を乾燥ＴＨＦ（２００ｍＬ）に溶解し、tetra-n-butylammonium Fluoride (TCI, 1 mol/L in THF, 54.5 mL, 1.2 eq)を０℃で滴下した。０℃で１時間撹拌後、飽和食塩水を加え、エーテル及びジクロロメタンで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮した後、ピリジン３００ｍＬに溶解し、無水酢酸（18.5 g, 4 eq）を加えて室温で一晩撹拌した。ピリジンを減圧留去した後、クロロホルムに溶解し、１Ｍ  ＨＣｌ水溶液で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（展開溶媒：Hexane:EtOAc =4:1）にて精製を行った。ヘキサンを加えて結晶化させた後、ヘキサンにより再結晶を行い、ラセミＡＣＡ（ラセミ混合物）を得た（7.01 g, 65.9%, mp. 68℃）。当該工程スキームを次に示す。
【００３３】
【化４】
0006708435.tif 000005
【００３４】
また、ラセミＡＣＡのスペクトル解析結果を次に示す。
HRMS (FAB, direct) calcd for C13H14O4,
[M]+234.0892; found, 234.0916.
1H NMR (400 MHz, CDCl3); d 2.10 (s, 3 H), 2.29 (s, 3 H), 5.25 (d, 1 H, J = 10.5 Hz), 5.30 (d, 1 H, J = 17.1 Hz), 5.98 (ddd, 1 H, J = 5.9, 10.5, 17.1 Hz), 6.26 (d, 1 H, J = 5.9 Hz), 7.08 (d, 2 H, J = 8.5 Hz), 7.37 (d, 2 H, J = 8.5 Hz).
【００３５】
以下の検討において飼料に混ぜたＡＣＡは、上記のようにして得られたラセミＡＣＡである。 
【００３６】
使用動物および飼育条件
８週齢の老化促進モデルマウスＳＡＭＰ８  （ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ｐｒｏｎｅ  ８）  およびその対照マウスである正常老化マウスＳＡＭＲ１  （ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ／１）を日本エスエルシー株式会社より購入し、２週間の予備飼育の後、２５週間、ＳＡＭＲ１  コントロール食群  （ｎ＝８）、ＳＡＭＰ８  コントロール食群  （ｎ＝１２）、ＳＡＭＰ８  ０．０２％  ＡＣＡ含有食群（ｎ  ＝１２）の３群に分けて飼育した。２２〜２４週にかけてＹ字迷路試験を、２４週目にモーリス水迷路試験を行った。また、２５週目に血清を採取し、血清中のケトン体（ヒドロキシ酪酸）量を調べるとともに、各マウスの海馬組織の細胞傷害の程度をヘマトキシリン−エオジン染色によって評価した。この実験スケジュールを図１に示す。また、用いた飼料（コントロール食及び０．０２％  ＡＣＡ含有食）の組成を以下の表１に示す。
【００３７】
なお、飼育期間中の各マウスの体重変化および総摂食量ついて、飼料組成間による違いは認められなかった。
【００３８】
【表１】
0006708435.tif 000006
【００３９】
短期記憶能力の測定  （Ｙ字迷路試験）
短期記憶能力をＹ字迷路試験によって評価した。マウスは探索行動を有しており、未知の経路を進む習性を持っている。Ｙ字迷路はこの習性を利用した方法である。そのため、短期の記憶が正常であれば、３つの異なるアームを順番に進入する（交替行動）ことが期待される。ＹＭ−４０Ｍ  （アーム長４０ｃｍ×アーム幅３ｃｍ（底面）、１２ｃｍ（上部）×高さ１５ｃｍ；株式会社ブレインサイエンス・イデア）の中央にマウスを置き、３分間、装置に対して馴化させた後５分間マウスの行動を観察した。５分間の試験時間に進入したアーム順序を測定し、全順序のうち、交替行動が成立した割合を計測した。なお、１回目と２回目のアーム進入順序が異なることは明らかであり、３回目の進入アーム選択の際、交替行動が成立するかしないかの２通りのため、交替行動率５０％を短期記憶能力の有無の指標とすることができる。
【００４０】
マウスの行動をＷｅｂカメラ  ＨＤ  Ｐｒｏ  Ｗｅｂｃａｍ  Ｃ９１０（Ｌｏｇｉｃｏｏｌ）を用いて撮影し、行動のトラッキングおよび解析に、ＡＮＹ−ｍａｚｅ  ｖｉｄｅｏ  ｔｒａｃｋｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．９６（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ  Ｃｏ．）を使用した。
【００４１】
用いたＹ字迷路（ＹＭ−４０Ｍ）の写真を図２に示す。また、各マウス群の交替行動率をまとめたグラフを図３に示す。図３より、マウスの短期記憶能力はＳＡＭＲ１において、正常であることが示唆された。一方で、ＳＡＭＰ８コントロール食群において交替行動率が５０％以下であることからＳＡＭＰ８コントロール食群において正常な短期記憶能力を失っていることが示唆された。ＳＡＭＰ８ＡＣＡ食群の短期記憶能力はＳＡＭＰ８コントロール食群と比較して有意に改善されており、ＳＡＭＲ１と同程度の短期記憶能力であった。
【００４２】
学習能力および長期記憶能力の測定  （モーリス水迷路試験）
学習能力および長期記憶能力をモーリス水迷路によって評価した。モーリス水迷路は２つのセッション、すなわち、足場の位置を記憶させる期間（訓練セッション）と足場を取り除いたときのマウスの行動を観察する期間（プローブテスト）に分けられる。ＷＭ−１２Ｍ（内径１２０ｃｍ×高さ４５ｃｍ；株式会社ブレインサイエンス・メディア）  の任意の場所に足場を設置し、足場＋１  ｃｍとなるように水を入れた。さらに市販の墨汁を加え、足場の存在を隠した。次に円形のプールの四方（４ヶ所）にスタート地点を設置した。そして、マウス自身の位置、および足場の位置を認識させるために、それぞれのスタート位置に色、形の異なる４種類の目印を設置した。当該実験器具の概要を図４に示す。なお、足場の位置は試験期間終了時まで移動させず、水温は２５℃±２℃となるようにした。
【００４３】
＜訓練セッション＞
訓練セッションでは、足場の位置を記憶させることによってマウスの学習能力を知ることができる。１日４回スタート地点から足場までの到達時間を測定した。なお４試行それぞれの試行におけるスタート地点は異なるスタート地点とした。（図５参照）
試験開始９０秒後までにマウスが足場に到達しない場合、マウスを足場に乗せ、３０秒間待機させた。また試験時間中に足場に到達した場合、足場に３０秒間待機させた。
【００４４】
＜プローブテスト＞
プローブテストでは訓練セッションにおいて使用した足場を取り除き、６０秒間の試験時間中に移動したマウスの軌跡を記録することによって長期記憶能力を知ることができる。記憶の保持力は試験時間中に、円形のプールを４分割したうち、足場が存在していた地点に進入した回数を指標とした。（図６参照）
なお、訓練セッションは連続９日間行い、プローブテストは訓練セッション終了日の次の日（１０日目）に行った。
【００４５】
図７に、訓練セッションにおける、足場到達時間を各群ごとにまとめたグラフを示す。訓練セッションにおいて、３日目、４日目、５日目においてＳＡＭＰ８ＡＣＡ食群の学習能力はＳＡＭＰ８コントロール食群と比較して有意に足場までの到達時間が短縮された。この結果から、ＳＡＭＰ８ＡＣＡ食群はＳＡＭＰ８コントロール食群と比較して、早期に、有意に学習能力の低下が抑制されたことが示唆された。
【００４６】
また、図８に、プローブテストにおける、足場が存在した地点に進入した回数を各群ごとにまとめたグラフを示す。ＳＡＭＲ１  コントロール食群とＳＡＭＰ８  ０．０２％  ＡＣＡ含有食群における足場地点への進入回数は同水準で、ＳＡＭＰ８コントロール食群の足場地点への進入回数は有意に低下していた。このことから、０．０２％ＡＣＡ含有食の摂食により有意に記憶の忘却が抑制されることが示唆された。
【００４７】
血清中のケトン体量の検討
各マウスから採取した血清を用い、Ｔａｍａｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｖｅｔ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ．  ２０１４  Ｎｏｖ；７６（１１）：１５１３−８）に記載の方法に準じて、ＧＣ−ＭＳにより血清中のケトン体量を調べた。なお、内部標準として２−イソプロピルリンゴ酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた。２５μＬの血清と５μＬの１ｍｇ／ｍＬの２−イソプロピルリンゴ酸を混合し、さらにこれに９００μＬの７０％エタノールを加えてＧＣ−ＭＳ解析に供した。ＧＣ−ＭＳ解析には、ＧＣＭＳ−ＱＰ２０１０（島津製作所）及びＤＢ−５カラム（長さ：３０ｍ、フィルム：１．００μｍ、内径：０．２５ｍｍ）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。フローレートは２４．５ｍＬ／ｍｉｎとした。ＧＣカラム温度については、１００℃から３００℃まで４℃／ｍｉｎで上昇するようプログラムした。イオンソース温度は２３０℃とした。Ｓｈｉｍａｚｕ  ＧＣＭＳソリューションソフトウェアｖｅｒ．２．７１を用いてデータを収集・解析した。なお、ケトン体（ヒドロキシ酪酸）は、ＮＩＳＴライブラリー（ＮＩＳＴ０８）を用いて同定した。検出されたヒドロキシ酪酸ピーク面積を内部標準ピーク面積で割り、相対値を算出した。データを平均値±標準偏差で表し、有意差の有無は一元配置分散分析  （ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）の後、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｍｅｒの方法によって評価された。
【００４８】
結果を図９に示す。ＳＡＭＰ８  ０．０２％  ＡＣＡ含有食群のみ、ケトン体の産生が亢進していることが分かった。このことから、ＡＣＡがケトン体産生促進効果を奏することが示唆された。
【００４９】
海馬神経細胞の病理組織学的解析
マウス海馬組織中の神経細胞における形態変化をヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）染色によって観察した。結果を図１０に示す。ＳＡＭＰ８コントロール食群の海馬組織には核や細胞の形状変化が観察され細胞傷害が認められた。一方、ＳＡＭＰ８  ０．０２％  ＡＣＡ含有食群の海馬組織にはＳＡＭＲ１  コントロール食群の海馬組織と同様に正常な細胞の形状が観察されたことから、ＡＣＡの摂食により海馬組織の細胞傷害が抑制されたことが示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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