(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）多能性幹細胞からニューロン細胞系列又は筋細胞系列に誘導され、フィブロネクチンでコーティングされた支持体上の、ＦＧＦファミリーのタンパク質のメンバー及びＥＧＦを含む培地中で維持された細胞を提供する工程と、
ｂ）ニューロンを得るためにラミニンでコーティングされた支持体か、筋管若しくは筋管とニューロンとの混合物を得るためにフィブロネクチンでコーティングされた支持体かのいずれかの上で、ＦＧＦファミリーのタンパク質のいかなるメンバーもＥＧＦも含まない培地中で、前記誘導された細胞を培養する工程と
を含み、
胚様体を生成する工程を含まない、
ニューロン又は筋管を生成するための方法。
【請求項２】
多能性幹細胞からニューロン細胞系列に誘導される細胞が、以下：
ｉ．  ＦＧＦファミリーのタンパク質のメンバー、ＥＧＦ及びＤＭＳＯを含む培地中で多能性幹細胞を培養する工程；次に
ｉｉ．  ＦＧＦファミリーのタンパク質のメンバー及びＥＧＦを含み、ＤＭＳＯを含まない培地中で前記細胞を培養する工程；並びに次に
ｉｉｉ．  フィブロネクチンでコーティングされた支持体上の、ＦＧＦファミリーのタンパク質のメンバー及びＥＧＦを含み、ＤＭＳＯを含まない培地中で前記細胞を培養する工程
を用いて入手可能である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記多能性幹細胞が、人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）又はＥＳ細胞である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記ｉＰＳＣが、胎児、小児又は成体の対象由来である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記ｉＰＳＣが、胎児、小児又は成体の初代線維芽細胞由来である、請求項３又は４記載の方法。
【請求項６】
培養する工程ｉ）の持続時間が、８から２４時間の間、特に持続時間１６時間である、請求項２記載の方法。
【請求項７】
培養する工程ｉｉ）の持続時間が、４から２０日の間、特に１５日である、請求項２又は６記載の方法。
【請求項８】
工程ｉｉｉ）の持続時間が、少なくとも１０日である、請求項２、６、及び７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が、工程ａ）と工程ｂ）との間に凍結又は増殖されていてもよい、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
工程ａ）で誘導された細胞が、ニューロンを得るために工程ｂ）のラミニンでコーティングされた支持体上にそれらをプレーティングする前に酵素的又は機械的に破壊される、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
工程ａ）で誘導された細胞が、ニューロンと筋管との混合物を得るために工程ｂ）のフィブロネクチンでコーティングされた支持体上にそれらをプレーティングする前に剥がされる、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
工程ａ）で誘導された細胞が、筋管を得るために工程ｂ）のフィブロネクチンでコーティングされた支持体上にそれらをプレーティングする前に機械的に破壊される、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
工程ｂ）の持続時間が、少なくとも３日である、請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
工程ｂ）の後に、ドーパミン作動性ニューロンなどの特殊なニューロンへのニューロンの終末分化のさらなる工程を含む、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
ドーパミン作動性ニューロンが、工程ｂ）の後に得られた細胞を、ＦＧＦ８及びＳＨＨを含有する培地中で、特に持続時間４８時間、培養することによって得られる、請求項１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、人工多能性幹細胞を含めた多能性幹細胞からニューロン細胞及び筋細胞を産生するための方法に関する。
【０００２】
発明の背景
多能性幹細胞は、身体のほぼあらゆる細胞に分化する潜在性を有し、自己再生することができる。最近になって、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の利用可能性は、培養状態でのその無限の増殖能と、任意の異なるヒト細胞型へのその分化能とともに、我々の疾患の病因の理解を改善するために、そして細胞療法又は組織生産を含めた新しい治療法を計画及び試験するためにも、潜在的に貴重な材料源を提供した。実際にごく最近まで、ヒト疾患に特異的な多能性細胞は、５〜６日後の胚の内部細胞塊から得られた既存のヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の遺伝的改変か、着床前遺伝子診断により検出可能な単一遺伝子疾患を有する胚からの新しいｈＥＳＣの産生かによってのみ作製することができた。これらの方法は、非常に限定的であり、わずかな疾患だけがこの方法で研究されている。したがって、最近の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の開発は、いくつかのヒトの疾患の理解及びモデル化に新たな将来性をもたらした。
【０００３】
一部の分化系列コミットメント（lineage commitment）についてはプロトコールが確立されているが、場合によっては、工程の費用を減らし、十分に特徴付けられた分化型細胞を大量に得るために実験の開発が依然として求められ、又は最適化される必要がある。例えば、多能性幹細胞から真のニューロン細胞への分化を誘導する方法を有する必要がある。そのようなニューロンは、数ある中で、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、及びハンチントン病などの中枢神経疾患の処置のための、又は細胞モデルとしての貴重なツールである。ｉＰＳＣなどの多能性幹細胞から神経派生細胞を誘導するための方法は、当技術分野において公知である（例えば、Yan et al., Stem Cells Transl Med. 2013;2:862-870から）が、まだ満足なものではない。したがって、依然、多能性細胞をニューロン細胞に分化させるための効率的な方法の必要性がある。
【０００４】
そのうえ、これは筋細胞の提供にも当てはまり、これまでのところ、神経筋障害のモデル化は、ｈｉＰＳＣ又はｈＥＳＣから成熟骨格筋細胞への分化のための効率的なプロトコールが不在であることによって妨げられている。実際、骨格筋細胞がマウスＥＳ細胞又はｉＰＳＣ細胞から派生できることを多数の研究が示したものの、特に胚様体形成の間に沿軸中胚葉分化が不十分なせいで、限られた数の研究だけがヒトＥＳ及びｉＰＳＣからの筋細胞の効率的な派生を報告している（Darabi et al., Cell stem cell. 2012;10(5):610-9; Tedesco et al., Sci Transl Med. 2012;4(140):140ra89; Barberi et al., Nature medicine. 2007;13(5):642-8; Awaya et al., PLoS One. 2012;7(12):e51638; Darabi et al., Stem Cells. 2011;29(5):777-90）。それにもかかわらず、そのような細胞は、筋ジストロフィーだけでなく世界中の数百万人を冒す加齢、悪液質、萎縮症若しくは筋肉減弱症に関連する筋肉消耗などの非遺伝障害を含めた広範囲の筋肉の病状のモデル化のために、又は薬理学的処置若しくは細胞ベースの再生医療などの新しい治療法を試験するためにも、同様に有用であり得る。それは、多能性細胞から再生医療用の細胞を産生するための満足できる方法がまだ得られていないからである。
【０００５】
発明の概要
本発明者らは、本明細書において、多能性細胞からニューロン細胞及び筋管への分化のための新規で効率的な方法を記載する。有利なことには、該方法は、たとえフィーダー細胞層上に成長した多能性細胞にも代替的に適用できるとしても、フィーダー細胞層を必要としない。そのうえ、他の公表されたプロトコールに比べて、本発明の方法は、ニューロン又は筋細胞生成のための胚様体形成も、ニューロン生成のためのニューロンのロゼット（原始神経上皮細胞）又はニューロスフェア形成も必要としないが、これらは細胞集団の純度を改変し得る（Hitoshi et al., Genes Dev. 2004;18:1806-1811; Liu et al., Nat Protoc. 2013;8:1670-1679; Lie et al., Methods Mol Biol. 2012;873:237-246）。本発明の方法は、細胞恒常性を撹乱し得る薬物添加（Li et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2011;108:8299-8304; Menendez et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2011;108:19240-19245; Yan et al., Stem Cells Transl Med. 2013;2:862-870; Chambers et al., Nat Biotechnol. 2009;27:275-280; Surmacz et al., Stem Cells. 2012;30:1875-1884）も、利用可能な分化済み細胞の量を制限する細胞選別又は異所性導入遺伝子発現（Darabi et al., Cell stem cell. 2012;10(5):610-9; Tedesco et al., Sci Transl Med. 2012;4(140):140ra89; Barberi et al., Nature medicine. 2007;13(5):642-8; Awaya et al., PLoS One. 2012;7(12):e51638; Darabi et al., Stem Cells. 2011;29(5):777-90）も必要としない。そのうえ、本発明の方法は、最初の分化段階でサイトカインを２種だけ使用する必要があり、大量のニューロン前駆細胞及び筋前駆細胞を１０〜１５日で生じ、その細胞を維持し、定期的に増殖させ、又はさらに分化させることができる。以前に公表されたプロトコールによると、ＦＧＦが、細胞を未分化状態で維持するために使用された（US 2005/153445）、又は神経前駆細胞を成長させるために最初に使用されたが、次に、細胞分化を誘導するためにとりわけこの因子を抑制するように提唱されている（US 2002/090723）。しかし、以前のプロトコールは、ＥＧＦが多能性細胞をニューロン細胞系列に誘導及び成長させるための重要な因子であり得、ＥＧＦをＦＧＦと一緒に培地から抑制することがこれらの細胞をニューロン又は筋管にさらに分化させることに有利であると示唆していない。そのうえ、当業者ならば、細胞をＥＧＦ中で培養し、次にこの因子を培地から取り除くことよりもむしろ、Yanら、2013（前記）によって提供されるようにＢＤＮＦ及びＧＤＮＦを使用することによってそのようなプロトコールが改善されると予期するであろう。
【０００６】
したがって、本発明は：
ａ）多能性幹細胞からニューロン細胞系列又は筋細胞系列に誘導された細胞であって、フィブロネクチンでコーティングされた支持体上の、ＦＧＦファミリータンパク質のメンバー及びＥＧＦを含む培地中で維持された細胞を提供する段階；並びに
ｂ）ニューロンを得るためにラミニンでコーティングされた支持体上、又は筋管若しくは筋管とニューロンとの混合物を得るためにフィブロネクチンでコーティングされた支持体上のいずれかで、ＦＧＦファミリータンパク質のいかなるメンバーもＥＧＦも欠如する培地中で、誘導された細胞を培養する段階
を含む、ニューロン又は筋管を産生するための方法を提供する。
【０００７】
一実施態様では、段階ｂ）で使用されるニューロン細胞系列又は筋細胞系列の細胞は：
ｉ．  ｂＦＧＦ、ＥＧＦ及びＤＭＳＯを含有する培地中で多能性幹細胞を培養する段階；次に
ｉｉ．  ｂＦＧＦ及びＥＧＦを含有し、ＤＭＳＯを欠如する培地中で細胞を培養する段階；並びに次に
ｉｉｉ．  フィブロネクチンでコーティングされた支持体上で、ｂＦＧＦ及びＥＧＦを含有し、ＤＭＳＯを欠如する培地中で細胞を培養する段階
によって入手可能である。
【０００８】
本発明は、また、上記と同義の段階ｉ〜ｉｉｉに従って入手可能なニューロン細胞系列又は筋細胞系列の細胞（あるいはニューロン前駆細胞又は筋前駆細胞とも呼ばれる）に関する。
【０００９】
別の実施態様では、培養する段階ｉ）の持続時間は、８から２４時間の間であり、持続時間は、特に１６時間である。さらなる一実施態様では、培養する段階ｉｉ）の持続時間は、所望の細胞系列の少なくとも９０％の富化に達するために４から２０日の間、特に１０から２０日の間であり、持続時間は、より詳細には１５日である。別の実施態様では、段階ｉｉｉ）の持続時間は、少なくとも５日、より詳細には少なくとも１０日である。さらなる一実施態様によると、段階ｂ）の持続時間は、少なくとも３日である。
【００１０】
有利なことには、細胞は、段階ａ）とｂ）との間に凍結又は増殖され得る。
【００１１】
別の実施態様では、ドーパミン作動性ニューロンなどの特殊ニューロンへの終末分化のさらなる段階は、段階ｂ）の後に実行される。特に、ドーパミン作動性ニューロンは、ＦＧＦ８及びＳＨＨを含有する培地中で、細胞を例えば４８時間の持続時間培養することによって得られ得る。ＧＡＢＡ作動性ニューロンの生成に向けた分化は、ＳＨＨの存在下で得られる場合があり、グルタミン酸作動性ニューロンの生成に向けた分化は、レチノイン酸の存在下で得られる場合があり、運動ニューロンの生成に向けた分化は、ＳＡＧ（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄアゴニスト）、レチノイン酸及びＣＨＩＲ９９０２１（６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（５−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］−３−ピリジンカルボニトリル）の存在下で得られ得る。
【００１２】
本発明の方法は、簡単で頑健な条件を使用して、大集団のニューロン及び筋管を産生することを可能にする。そのような細胞は、正常な脳又は筋肉の発生及び機能のみならず、神経疾患、神経精神疾患、神経筋疾患又は筋疾患の細胞モデルにおける薬理学的、毒物学的又は遺伝的スクリーニングアッセイ法などの様々な適用に、並びにそのような疾患のニューロン又は筋代替療法に、採用され得る。
【００１３】
本発明のこれら及びさらなる態様並びに好ましい実施態様は、以下の部分に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ニューロンを生成するための本発明による方法の代表的な一実施態様を示す図である。１〜１５日目；ｈｉＰＳＣからヒトニューロン幹細胞（ｈＮＳＣ）への分化。ｈｉＰＳＣを増殖させ、ｍＴｅＳＲ中でマトリゲルコーティングしたプレート上に培養した成熟ｈｉＰＳＣを、２３Ｇ針を使用して機械的に破壊して３０〜５０個の小塊にし、マトリゲルコーティングした３５mm培養ディッシュ上の２０ng/ml ｂＦＧＦ、２０ng/ml ＥＧＦを添加した（ＤＭ＋）分化培地（ＤＭ）中に播種する。２％(v/v) ＤＭＳＯを用いて、１６時間で最適の結果が得られた。一晩インキュベーション後に、培地をＤＭ＋と交換する。分化した細胞は、ｈｉＰＳＣコロニー周囲に単層として徐々に出現し、毎日培地を交換してその細胞を最大１５日間維持及び増殖させることができる。１０〜１５日分化させた後、集密度９０〜１００％の細胞をディスパーゼ（Dispase）で解離させる。ｈＮＳＣの小塊を、フィブロネクチンをコーティングした３５mm培養ディッシュ上に播種し、播種後数分以内で細胞の90%が接着する。ｈＮＳＣをアキュターゼ（Accutase）又は細胞スクレーパーで分割し、３５mm培養ディッシュ１枚あたり細胞１×１０５個の密度で再播種した後、数回の継代の間維持し、増殖させることができる。最終分化のために、２３Ｇ針で細胞を機械的に分離し、ｂＦＧＦ及びＥＧＦなしのＤＭ中でラミニンコーティングした６ウェルプレート上に播種する。培地を毎日交換する。播種後５〜７日でニューロンが発生する。ドーパミン作動性ニューロンへの最終分化の一例は、ＦＧＦ８及びＳＨＨなどの特異的サイトカインの添加後に提示される。
【図２】筋管を生成するための本発明による方法の代表的な一実施態様を示す図である。１〜１５日目；ｈｉＰＳＣからヒト筋前駆細胞への分化。ｈｉＰＳＣを増殖させ、ｍＴｅＳＲ中でマトリゲルコーティングしたプレート上に培養した成熟ｈｉＰＳＣを、２３Ｇ針を使用して機械的に破壊して３０〜５０個の小塊にし、マトリゲルコーティングした３５mm培養ディッシュ上の２０ng/ml ｂＦＧＦ、２０ng/ml ＥＧＦを添加した（ＤＭ＋）分化培地（ＤＭ）中に播種する。２％(v/v) ＤＭＳＯの存在下、１６時間のインキュベーションで最適の分化が得られた。この一晩インキュベーション後に、培地をＤＭ＋と交換する。分化した細胞は、大きな集合体を形成し、その集合体を機械的に分離及び解離することができる。フィブロネクチンコーティングした３５mm培養ディッシュ上に細胞の小塊を播種し、播種後数分以内に細胞の９０％が接着する。これらの筋前駆細胞を数回の継代の間維持し、増殖させることができる。最終分化のために、２３Ｇ針で細胞を機械的に分離し、ｂＦＧＦ及びＥＧＦなしのＤＭ中でフィブロネクチンコーティングした６ウェルプレート上に播種する。培地を毎日交換する。播種後５〜７日で筋細胞が発生し、１０〜１５日で融合して伸長した多核性筋管を形成し始める。
【図３】ニューロン及び筋管を生成するための本発明による方法の代表的な一実施態様を表す図である。１〜１５日目；ｍＴｅＳＲ中でマトリゲルコーティングしたプレート上に成熟ｈｉＰＳＣを増殖させ、２３Ｇ針を使用して機械的に破壊して３０〜５０個の小塊にする。分化のために、マトリゲルコーティングした３５mm培養ディッシュ上の、２０ng/ml ｂＦＧＦ、２０ng/ml ＥＧＦ（ＤＭ＋）及び２％(v/v) ＤＭＳＯを添加した分化培地（ＤＭ）中に細胞を１６時間播種する。一晩インキュベーション後、培地をＤＭ＋と交換する。分化した細胞は、ｈｉＰＳＣコロニーの周囲に単層として徐々に出現し、毎日培地を交換してその細胞を最大１５日間維持及び増殖させることができる。１０〜１５日後に、細胞は集密度９０〜１００％に達する。最終分化及びニューロンと筋細胞との共培養のために、単層又は懸濁状態で成長した細胞集合体のいずれかとして成長した細胞を、例えば細胞スクレーパー又は２３Ｇ針を使用して剥がし、収集し、機械的に解離させ、ｂＦＧＦ及びＥＧＦなしのＤＭ中でフィブロネクチンコーティングした６ウェルプレート上に一定分量を播種する。培地を毎日交換する。
【図４−１】ｈｉＰＳＣの特徴付け。本発明者らの研究室で、２つの異なる初代線維芽細胞系にＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２及びｃ−ＭＹＣを発現している多シストロン性ベクター（OKSMベクター、Millipore）をレンチウイルス感染させることにより、ヒト人工多能性細胞を独立して樹立した。Ｃ３は市販のヒト包皮線維芽細胞系（Millipore）由来であった。Ｃ５クローンは、Coriellから得られた初代線維芽細胞（Ref AG08498）由来であった。提示したデータは、クローンＣ３及びＣ５から得られたものであるが、他のクローンも試験した（データは示さず）。これらのｈｉＰＳＣは、ヒトＥＳ様形態を示し、フローサイトメトリー分析（Ａ、上欄）及び免疫蛍光（Ａ、下欄）又は定量ＲＴ  ＰＣＲ（Ｂ）により決定されたＳＯＸ２、ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧ幹細胞マーカーを発現するが、いかなる核型欠損も示さなかった（Ｃ）。加えて、これらの細胞は、懸濁状態で成長させたときに分化して胚様体を形成することが可能である（データは示さず）。
【図４−２】ｈｉＰＳＣの特徴付け。本発明者らの研究室で、２つの異なる初代線維芽細胞系にＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２及びｃ−ＭＹＣを発現している多シストロン性ベクター（OKSMベクター、Millipore）をレンチウイルス感染させることにより、ヒト人工多能性細胞を独立して樹立した。Ｃ３は市販のヒト包皮線維芽細胞系（Millipore）由来であった。Ｃ５クローンは、Coriellから得られた初代線維芽細胞（Ref AG08498）由来であった。提示したデータは、クローンＣ３及びＣ５から得られたものであるが、他のクローンも試験した（データは示さず）。これらのｈｉＰＳＣは、ヒトＥＳ様形態を示し、フローサイトメトリー分析（Ａ、上欄）及び免疫蛍光（Ａ、下欄）又は定量ＲＴ  ＰＣＲ（Ｂ）により決定されたＳＯＸ２、ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧ幹細胞マーカーを発現するが、いかなる核型欠損も示さなかった（Ｃ）。加えて、これらの細胞は、懸濁状態で成長させたときに分化して胚様体を形成することが可能である（データは示さず）。
【図４−３】ｈｉＰＳＣの特徴付け。本発明者らの研究室で、２つの異なる初代線維芽細胞系にＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２及びｃ−ＭＹＣを発現している多シストロン性ベクター（OKSMベクター、Millipore）をレンチウイルス感染させることにより、ヒト人工多能性細胞を独立して樹立した。Ｃ３は市販のヒト包皮線維芽細胞系（Millipore）由来であった。Ｃ５クローンは、Coriellから得られた初代線維芽細胞（Ref AG08498）由来であった。提示したデータは、クローンＣ３及びＣ５から得られたものであるが、他のクローンも試験した（データは示さず）。これらのｈｉＰＳＣは、ヒトＥＳ様形態を示し、フローサイトメトリー分析（Ａ、上欄）及び免疫蛍光（Ａ、下欄）又は定量ＲＴ  ＰＣＲ（Ｂ）により決定されたＳＯＸ２、ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧ幹細胞マーカーを発現するが、いかなる核型欠損も示さなかった（Ｃ）。加えて、これらの細胞は、懸濁状態で成長させたときに分化して胚様体を形成することが可能である（データは示さず）。
【図４−４】ｈｉＰＳＣの特徴付け。本発明者らの研究室で、２つの異なる初代線維芽細胞系にＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２及びｃ−ＭＹＣを発現している多シストロン性ベクター（OKSMベクター、Millipore）をレンチウイルス感染させることにより、ヒト人工多能性細胞を独立して樹立した。Ｃ３は市販のヒト包皮線維芽細胞系（Millipore）由来であった。Ｃ５クローンは、Coriellから得られた初代線維芽細胞（Ref AG08498）由来であった。提示したデータは、クローンＣ３及びＣ５から得られたものであるが、他のクローンも試験した（データは示さず）。これらのｈｉＰＳＣは、ヒトＥＳ様形態を示し、フローサイトメトリー分析（Ａ、上欄）及び免疫蛍光（Ａ、下欄）又は定量ＲＴ  ＰＣＲ（Ｂ）により決定されたＳＯＸ２、ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧ幹細胞マーカーを発現するが、いかなる核型欠損も示さなかった（Ｃ）。加えて、これらの細胞は、懸濁状態で成長させたときに分化して胚様体を形成することが可能である（データは示さず）。
【図５】ニューロン前駆細胞の生成及び増殖のための手順。分化過程の誘導後、コロニーを１０から１５日目の間にピックアップし、フィブロネクチン上の合成培地中で培養する。この段階で、ニューロン前駆細胞に発現される異なるマーカーを用いたフローサイトメトリー分析によって示されるように、分化能を失わずに細胞を凍結することもできる。初回又は６回目の継代後にＦＡＣＳを行った。２種のクローン（Ｃ３及びＣ５を図示する）から得られた代表的な結果。アイソタイプ特異的対照抗体を対照として使用した。
【図６】ｈｉＰＳＣからニューロン前駆細胞への分化。Ａ．機械的破壊（ｃ）前のｍＴｅＳＲにおけるマトリゲルコーティングしたプレート上に成長した小型未熟（ａ）及び成熟（ｂ）ｈｉＰＳＣコロニーの明視野像。Ｂ．細胞塊を、２３Ｇ針を使用して機械的に破壊した後に、マトリゲル上に播種し、分化培地中で成長させた。左、誘導後４８時間（ａ）；４日（ｂ）又は１５日（ｃ）のニューロン分化の明視野像。（ｄ）誘導４８時間後に、ニューロンマーカーであるネスチン（緑）を発現している分化した細胞は、ＯＣＴ４陽性ｈｉＰＳＣコロニー（赤）から移動する。（ｅ）、誘導４日後のネスチンを発現しているニューロン前駆細胞（緑）及びＯＣＴ４を発現しているｈｉＰＳＣ。１５日後（ｆ）に、ＯＣＴ４の発現はほとんど検出不能であり、ネスチン陽性ニューロン前駆細胞は、集密度９０〜１００％に達する。
【図７】ニューロンマーカーの発現。Ａ．クローン３及び５からのｈｉＰＳＣ（それぞれｈｉＰＳ−Ｃ３及びｈｉＰＳ−Ｃ５）並びに誘導２０日後のニューロン前駆細胞（ＰＮＣ３及びＰＮＣ５）におけるニューロン前駆細胞マーカーの発現を、定量ＲＴ−ＰＣＲ（ＰＡＸ６）によって決定した。Ｂ．クローン３及び５からのｈｉＰＳＣ（それぞれｈｉＰＳ−Ｃ３及びｈｉＰＳ−Ｃ５）、誘導３０日後のニューロン前駆細胞（ＰＮＣ３及びＰＮＣ５）又はラミニンコーティングしたディッシュ上にニューロン前駆細胞を播種した１５日後の成熟ニューロン（ＮＣ３及びＮＣ５）における成熟ニューロンのＣｈＡＴ（コリンアセチルトランスフェラーゼ）マーカーの発現をＲＴ−ＱＰＣＲによって決定した。Ｃ．ＳＨＨ及びＦＧＦ８の存在下で誘導した１５日後に、ドーパミン作動性ニューロンにおけるドーパミン作動性ニューロンのマーカーＤＤＣ（ＤＯＰＡデカルボキシラーゼをコードする）の発現を評価した。
【図８】成熟ニューロンの生成。Ａ．異なるニューロン成熟段階の図解。ニューロン前駆細胞は、固相コーティングされたプレート上で集密度９０〜１００％に増殖することができる（（ａ）倍率×５；（ｂ）倍率×１０）、又はより低い密度で解離及び播種（（ｃ）倍率×５；（ｄ）倍率×１０）して、さらなる分化に供することができる（（ｅ）倍率×５；（ｆ）倍率×１０）。Ｂ．ＮＢ中であるが、ｂＦＧＦ及びＥＧＦなしにラミニン上でニューロン前駆細胞を播種した２日後の免疫蛍光染色。大部分の細胞はネスチンを発現し（ａ）；細胞をＤＡＰＩで対比染色した（ｂ）；（ｃ）重ね合わせ。Ｃ．２０〜３０日で、ｈｉＰＳＣ由来成熟ニューロンは、βＩＩＩチューブリン（欄ａ、ｂ）及び成熟ニューロンのマーカーＮｅｕＮ（ｂ）を発現する。記載のようにＳＨＨ及びＦＧＦ８の添加によりドーパミン作動性分化が誘導された。誘導の１５日後に、ドーパミン作動性ニューロンの生成及び機能性をチロシンヒドロキシラーゼに対する抗体を用いた免疫蛍光染色により標定した（ｃ）。
【図９】筋原性進行は、一過性間葉状態の通過を必要とする。欄Ａに、異なる骨格筋分化段階を図示する。（１）細胞集合体；（２）細胞集合体の機械的破壊後に得られた小塊；（３）間葉前駆細胞の単層形成（×１０）；（４）×２０。Ｂ．ＣＤ１０５及びＣＤ７３間葉系幹細胞マーカー並びに筋細胞への分化コミットメントのマーカーであるＣＤ５６に対する抗体を用いたフローサイトメトリーによって間葉前駆細胞を特徴付けた。ベースラインを決定するために非誘導ｈｉＰＳＣを使用した。Ｃ．ＣＤ７３及びＣＤ１０５陽性の間葉系幹細胞並びにＣＤ５６陽性分化コミットメント筋細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって決定した。アイソタイプを使用して蛍光バックグラウンドを決定し、個別の蛍光色素について補正を決定した。前方散乱（ＦＳＣ−Ａ）。
【図１０】ｈｉＰＳＣ由来筋細胞の特徴付け。Ａ．初期分化段階で単離された間葉系幹細胞が筋細胞系列にすでにコミットメントされているか、それともまだ間葉分化のためにコンピテントであるかどうかを判定するために、本発明者らは、これらの細胞が、ＢＭＰ２の存在下、懸濁状態で成長させたときにアグリカン及びコラーゲンＸを発現しているマイクロペレットを形成する能力を試験した。Ｂ．ＰＡＸ３、ＰＡＸ７、ＭＵＲＦ１、ＭＹＯＤ又はミオゲニン（ＭＧＮ）などの骨格筋形成の間に発現する遺伝子の発現を、クラスＩＩミオシン重鎖遺伝子（ＭＹＨ２、ＭＹＨ３、ＭＹＨ７、ＭＹＨ８）、サルコグリカン（ＳＣＧ）及びデスミン（ＤＳＭ）の発現と共にＲＴ−ＰＣＲによって監視した。
【図１１】Ｚ線様サルコメア構築を有する伸長多核性筋線維の形成。Ａ．筋線維の形成を示している代表的な位相差顕微鏡像（１〜３；倍率×１０；４、×２０）。Ｂ．ｈｉＰＳＣ由来筋細胞の免疫化学（１）ＭＹＯＤ；（２）デスミン。Ｃ．（１）ＭＦ２０；（２）ＭＦ２０陽性線維における白点線により範囲を決められるＭＹＯＤ陽性核。Ｄ．後期分化段階で実施されるｈｉＰＳＣ由来のミオシン重鎖陽性多核性線維におけるサルコメア構築の図解（写真１、白矢印は横紋を示す）。写真２では、核をＭＹＯＤで染色し、筋管をサルコメア性ミオシン重鎖に対する抗体（ＭＦ２０）で染色する。
【図１２】ニューロン又は骨格筋の最終分化は、ＦＧＦ及びＥＧＦの存在により妨害される。ニューロン細胞系列（Ａ）又は筋細胞系列（Ｃ）に向けた最終分化を、ＥＧＦ（２０ng/ml）及びｂＦＧＦ（２０ng/ml）の存在下で試験した。ニューロン分化のためにラミニン（Ａ）又は骨格筋のためにフィブロネクチン（Ｃ）上に播種後、細胞を２０〜３０日間維持した。細胞形態、成熟ニューロン（Ｂ）又は多核性筋管（Ｄ）における富化を、２種のサイトカインが取り除かれた条件（それぞれ欄Ｆ及びＨ）と比較した。
【図１３】対照及びｈｉＰＳＣ由来骨格筋前駆細胞の長期生着及び再生能。分化の２０日目にｈｉＰＳＣ由来筋前駆細胞５×１０５個を注射されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのＴＡ断面の代表的な免疫染色。ａ〜ｂ．生着の３０日後に、ヒト核抗原マーカーを使用することにより生着した細胞を同定した。ヒト及びマウスの筋肉の両方を染色するデスミンで線維を対比染色した。核をＤＡＰＩで対比染色した。ｃ．ｄ．ヒトスペクトリンについて陽性染色された対照又はｈｉＰＳＣ由来細胞を注射された筋肉。ヒト筋肉及びマウスの筋肉の両方を染色するデスミンで線維を染色し、核をＤＡＰＩで対比染色した。ｅ．抗体がヒト細胞に特異的であったことを検証するために、未注射のＴＡをデスミンに対する抗体（上欄）また抗ヒト核抗原に対する抗体（下欄）で染色した。
【図１４】ｈｉＰＳＣ由来運動ニューロンの存在下で、伸長した多核性筋線維はＺ線サルコメア構造及び神経筋接合部を形成する。ａ．フィブロネクチンコーティングしたプレート上でニューロン前駆細胞及び筋前駆細胞の共分化のために使用された手順の図示。ニューロン前駆細胞及び筋前駆細胞をフィブロネクチン上に２：１の比で播種し、マイトジェンなし分化培地中で培養し、２０〜３０日間維持した。ｂ．異なる細胞集団の明視野像、左、ニューロンに囲まれた、配向した筋線維（矢印で示す）；中央、高倍率；右、後期分化段階で起こったサルコメア構築の図解（矢印は横紋を示す）。ｃ．筋肉−ニューロン共培養で得られた運動ニューロンの免疫染色の代表的な画像。ＨＢ９又はｂ−チューブリンの染色及び重ね合わせ。ｄ．Ｚ線様構造を形成している多核性線維におけるミオシン重鎖及びＭＹＯＤの発現。横紋を矢印で示す。核をＤＡＰＩで対比染色する。ｅ．筋管をＭＦ２０で染色する。アセチルコリン受容体のクラスター形成は、Alexa Fluor 555とカップリングしたαブンガロトキシンで染色後の筋管表面で倍率６３倍で視認可能である。核をＤＡＰＩで対比染色する。
【図１５−１】ＦＳＨＤ１又はＦＳＨＤ２患者由来のｈｉＰＳＣの特徴付け。初代皮膚線維芽細胞に、ＫＬＦ４、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びｃ−ＭＹＣをコードするレンチウイルス（多シストロン性ＳＴＥＭＣＣＡ−ＯＫＳＭベクター、Millipore）を感染させた後に、ヒトｉＰＳＣを産生させた。２つの対照クローン（Ｃ３及びＣ５）は、以前に記載されたものである（Badja et al., 2014, Stem Cells Transl Med）。古典的手順を使用してＦＳＨＤ患者由来の３つのクローンを完全に特徴付けた（Marti et al., 2013), Nature Protocols 8, 223-253）。これらのｈｉＰＳＣは、核型欠損を全く示さなかった（ａ）。ｂ．Ｎａｎｏｇ及びＯＣＴ４幹細胞マーカーについての免疫染色。ｃ．異なるクローンにおけるＮａｎｏｇ、ＯＣＴ４及びＳＯＸ２のリアルタイムＰＣＲによる逆転写及び定量。ヒストグラムは、Ｈ９  ｈＥＳＣに比べた発現の平均変化倍率を示す。３６Ｂ４標準遺伝子に対して値を規準化する。エラーバーは、３つの独立した反応からのＳＤを表す。ｄ．これらの細胞は、懸濁状態で成長したときに分化して胚様体を形成することが可能であり、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ免疫不全マウスに皮下注射後に奇形腫を形成する。注射の１〜２ヶ月後に、奇形腫を収集し、パラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン包埋し、ヘマトキシリン−エオシンで染色する。神経外胚葉層（ＮＥ）、中胚葉（Ｍ）又は内胚葉（Ｅ）由来の組織を含む代表的な組織切片を示す。
【図１５−２】ＦＳＨＤ１又はＦＳＨＤ２患者由来のｈｉＰＳＣの特徴付け。初代皮膚線維芽細胞に、ＫＬＦ４、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びｃ−ＭＹＣをコードするレンチウイルス（多シストロン性ＳＴＥＭＣＣＡ−ＯＫＳＭベクター、Millipore）を感染させた後に、ヒトｉＰＳＣを産生させた。２つの対照クローン（Ｃ３及びＣ５）は、以前に記載されたものである（Badja et al., 2014, Stem Cells Transl Med）。古典的手順を使用してＦＳＨＤ患者由来の３つのクローンを完全に特徴付けた（Marti et al., 2013), Nature Protocols 8, 223-253）。これらのｈｉＰＳＣは、核型欠損を全く示さなかった（ａ）。ｂ．Ｎａｎｏｇ及びＯＣＴ４幹細胞マーカーについての免疫染色。ｃ．異なるクローンにおけるＮａｎｏｇ、ＯＣＴ４及びＳＯＸ２のリアルタイムＰＣＲによる逆転写及び定量。ヒストグラムは、Ｈ９  ｈＥＳＣに比べた発現の平均変化倍率を示す。３６Ｂ４標準遺伝子に対して値を規準化する。エラーバーは、３つの独立した反応からのＳＤを表す。ｄ．これらの細胞は、懸濁状態で成長したときに分化して胚様体を形成することが可能であり、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ免疫不全マウスに皮下注射後に奇形腫を形成する。注射の１〜２ヶ月後に、奇形腫を収集し、パラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン包埋し、ヘマトキシリン−エオシンで染色する。神経外胚葉層（ＮＥ）、中胚葉（Ｍ）又は内胚葉（Ｅ）由来の組織を含む代表的な組織切片を示す。
【図１６−１】ヒト人工多能性幹細胞からの筋形成分化。ａ．段階１、０〜１５日目；ｈｉＰＳＣからヒト筋前駆細胞への分化。マトリゲルコーティングしたプレート上のｍＴｅＳＲ中で培養した成熟ｈｉＰＳＣを、２３Ｇ針を使用して機械的に破壊し、３０〜５０個の小塊にし、マトリゲルでコーティングした３５mm培養ディッシュ上の、２０ng/ml ｂＦＧＦ、２０ng/ml ＥＧＦを添加した分化培地（ＤＭ）中に播種する。２％(v/v) ＤＭＳＯの存在下、１６時間のインキュベーションで最適な分化が得られた。この一晩のインキュベーション後に、培地をＤＭ＋と交換する。分化した細胞は、大きな集合体を形成し、その集合体を機械的に解離させ、再播種することができる。フィブロネクチンコーティングした３５mm培養ディッシュ上に播種された細胞の小塊は、数分以内に接着する。１０〜１５日後に、これらの筋前駆細胞をさらなる継代の間維持し、増殖させる、又は能力の損失なしに凍結解凍することができる。最終分化（段階２）のために、２３Ｇ針で細胞を機械的に分離し、フィブロネクチンでコーティングした６ウェルプレート上の、ｂＦＧＦ及びＥＧＦを欠如する同じ培地中に播種する。培地を２〜３日毎に交換する。播種後５〜１０日で筋細胞が発生し、３０〜４５日で融合して伸長した多核性筋管を形成し始める。ｂ．骨格筋分化の異なる段階の図解。（１）成熟ｈｉＰＳＣコロニー；（２）細胞塊周囲での筋前駆細胞の移動；（３）間葉前駆細胞の単層形成（×１０）；（４）多核性線維の終末分化及び形成。ｃ．間葉前駆細胞を、ＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５間葉マーカー並びに筋細胞分化コミットメントのマーカーであるＣＤ５６に対する抗体を用いたフローサイトメトリーによって特徴付けた。アイソタイプを使用して、蛍光のバックグラウンドを決定し、ベースライン（黒線）を設定し、各個別の蛍光色素について補正を決定した。（ｘ軸、蛍光強度（Ａ．Ｕ）；ｙ軸、細胞数）。パーセンテージは、異なる試料中の各マーカーＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５が陽性の間葉系幹細胞の割合、又は分化コミットメントしたＣＤ５６陽性筋細胞のパーセンテージを表す。ＣＴ（対照３）、ＦＳＨＤ患者（ＦＳＨＤ１−２ＵＲ）及び２人のＦＳＨＤ２患者（ＦＳＨＤ２−Ｇ及びＦＳＨＤ２−Ｐ）からの細胞。
【図１６−２】ヒト人工多能性幹細胞からの筋形成分化。ａ．段階１、０〜１５日目；ｈｉＰＳＣからヒト筋前駆細胞への分化。マトリゲルコーティングしたプレート上のｍＴｅＳＲ中で培養した成熟ｈｉＰＳＣを、２３Ｇ針を使用して機械的に破壊し、３０〜５０個の小塊にし、マトリゲルでコーティングした３５mm培養ディッシュ上の、２０ng/ml ｂＦＧＦ、２０ng/ml ＥＧＦを添加した分化培地（ＤＭ）中に播種する。２％(v/v) ＤＭＳＯの存在下、１６時間のインキュベーションで最適な分化が得られた。この一晩のインキュベーション後に、培地をＤＭ＋と交換する。分化した細胞は、大きな集合体を形成し、その集合体を機械的に解離させ、再播種することができる。フィブロネクチンコーティングした３５mm培養ディッシュ上に播種された細胞の小塊は、数分以内に接着する。１０〜１５日後に、これらの筋前駆細胞をさらなる継代の間維持し、増殖させる、又は能力の損失なしに凍結解凍することができる。最終分化（段階２）のために、２３Ｇ針で細胞を機械的に分離し、フィブロネクチンでコーティングした６ウェルプレート上の、ｂＦＧＦ及びＥＧＦを欠如する同じ培地中に播種する。培地を２〜３日毎に交換する。播種後５〜１０日で筋細胞が発生し、３０〜４５日で融合して伸長した多核性筋管を形成し始める。ｂ．骨格筋分化の異なる段階の図解。（１）成熟ｈｉＰＳＣコロニー；（２）細胞塊周囲での筋前駆細胞の移動；（３）間葉前駆細胞の単層形成（×１０）；（４）多核性線維の終末分化及び形成。ｃ．間葉前駆細胞を、ＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５間葉マーカー並びに筋細胞分化コミットメントのマーカーであるＣＤ５６に対する抗体を用いたフローサイトメトリーによって特徴付けた。アイソタイプを使用して、蛍光のバックグラウンドを決定し、ベースライン（黒線）を設定し、各個別の蛍光色素について補正を決定した。（ｘ軸、蛍光強度（Ａ．Ｕ）；ｙ軸、細胞数）。パーセンテージは、異なる試料中の各マーカーＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５が陽性の間葉系幹細胞の割合、又は分化コミットメントしたＣＤ５６陽性筋細胞のパーセンテージを表す。ＣＴ（対照３）、ＦＳＨＤ患者（ＦＳＨＤ１−２ＵＲ）及び２人のＦＳＨＤ２患者（ＦＳＨＤ２−Ｇ及びＦＳＨＤ２−Ｐ）からの細胞。
【００１５】
発明の詳細な説明
とりわけ、本発明に関する一般的な方法について、例えば「Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.」(Sambrook et al., 1989)、Animal Cell Culture（R. I. Freshney, ed., 1987)）、Methods in Enzymologyのシリーズ（Academic Press）、Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells（J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987）;「Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Ed.」（F. M. Ausubel et al., eds., 1987 & 1995）；Recombinant DNA Methodology II（R. Wu ed., Academic Press 1995）を含めた周知の教科書が参照される。
【００１６】
細胞培養及び培地の使用における一般的な技法は、とりわけ、Large Scale Mammalian Cell Culture（Hu et al. 1997. Curr Opin Biotechnol 8: 148）；Serum-free Media（K. Kitano. 1991. Biotechnology 17: 73）；又はLarge Scale Mammalian Cell Culture（Curr Opin Biotechnol 2: 375, 1991）に概略が述べられている。
【００１７】
本発明の実施に有用な一般的な技法のさらなる詳述のために、実務家は、細胞生物学、組織培養、及び発生学における標準的な教科書及び総説を参照することができる。とりわけ、「Teratocarcinomas and embryonic stem cells: A practical approach」(E. J. Robertson, ed., IRL Press Ltd. 1987);「Guide to Techniques in Mouse Development」（P. M. Wasserman et al. eds., Academic Press 1993)；「Embryonic Stem Cells: Methods and Protocols」（Kursad Turksen, ed., Humana Press, Totowa N.J., 2001）;「Embryonic Stem Cell Differentiation in Vitro」（M. V. Wiles, Meth. Enzymol. 225: 900, 1993）;「Properties and uses of Embryonic Stem Cells: Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy」（P. D. Rathjen et al., al., 1993）が含まれる。幹細胞の分化は、例えば、Robertson. 1997. Meth Cell Biol 75: 173; Roach and McNeish. 2002. Methods Mol Biol 185: 1-16；及びPedersen. 1998. Reprod Fertil Dev 10: 31に総説されている。
【００１８】
ニューロン及び筋細胞を培養するために適用される任意の培地が、多能性幹細胞分化のための本発明の実施における基礎培地として使用され得る。例えば、基礎培地は、ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法必須培地）、ＮＰＢＭ（ニューロン前駆細胞基礎培地）又は液体neurobasal-A培地であり得る。成長及び分化を誘導するために使用される本明細書記載の特定の因子以外に、さらなる成分が基礎培地中に含まれ得る。実例となる成分には、Ｎ２サプリメント、Ｂ２７サプリメント、インスリン、トランスフェリン、セレン及びグルタミンが含まれる。特定の実施態様に無血清及び／又は無抗生物質培地がより適している場合があるものの、基礎培地に、さらに、血清（例えばＦＣＳ）及び／又は抗生物質を添加してもよい。
【００１９】
本発明によると、多能性幹細胞は、ニューロン又は筋管に分化する。本明細書に使用される用語「多能性幹細胞」は、限りなく自己複製する能力を有し、適切な条件で多数の細胞型、特に３つの胚性胚葉の全て、すなわち中胚葉、内胚葉、及び外胚葉由来の細胞型を生じることができる細胞を意味する。用語「多能性幹細胞」には、哺乳類、特にヒトの、胚性幹細胞（ＥＳＣ）又は人工多能性幹細胞などの多能性幹細胞が含まれる。本発明の実施に使用される多能性幹細胞は、特に、技術の現状において以前に記載されたように得られたヒトｉＰＳＣである。実務家は、特に、Takahashi and Yamanaka; induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors; Cell 2006; 126: 663-676又はPark et al.; Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors; Nature 2008; 451: 141-146を参照することができる。本発明の実施に有用なｉＰＳＣは、哺乳類、特にヒト対象由来であり得る。ｉＰＳＣを得るために使用される細胞は、任意の発生段階で得られる場合があり、特に胎児起源であり、又は若齢（例えば小児）若しくは成体対象から得られた細胞由来である。当業者に周知のように、ｉＰＳＣは、また、任意の起源組織由来であり得る。例えばｉＰＳＣは、血液、皮膚、筋肉、臍帯などから得られる場合がある。特別な一実施態様では、ｉＰＳＣは、初代皮膚線維芽細胞、特にヒト初代皮膚線維芽細胞から産生される。さらなる特別な一実施態様では、細胞源、特に初代皮膚線維芽細胞は、哺乳類、特に成体ヒトからのものである。別の特別な実施態様では、ヒトｉＰＳＣは、細胞源、特に初代皮膚線維芽細胞から、これらの細胞に山中４因子ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２及びｃ−ＭＹＣ（ＯＫＳＭ）をコードするレンチウイルスを感染させた後に産生される。MilliporeからのＳＴＥＭＣＣＡ−ＯＫＳＭ多シストロン性ベクターなどの、ｉＰＳＣの産生に有用な市販のキットが入手可能である。もちろん、例えばセンダイウイルスを使用することによる、ｉＰＳＣを産生するための他の方法が、当業者に公知である。ｉＰＳＣの生成に関する追加的な詳細が、実施例に提供される。多能性幹細胞、特にｉＰＳＣは、分化段階に使用される培地と異なる培地中で培養され得る。例えば、ｉＰＳＣは、ｍＴｅＳＲ中で、適応した支持体上、例えばマトリゲル又は任意の他の適切なコーティングでコーティングされたディッシュの上で培養及び維持される。本発明の実施において、ｉＰＳＣは、正常な個体から、又は発育障害、精神遅滞症候群、神経変性疾患、神経筋病状などを含めた任意の構成的疾患を有する個体から産生され得る。
【００２０】
次に、多能性幹細胞は、ニューロン前駆細胞又は筋前駆細胞に誘導される。この段階は、最初に、ｉ）ＦＧＦファミリータンパク質のメンバー、例えばｂＦＧＦ、ｉｉ）ＥＧＦ及びｉｉｉ）ＤＭＳＯを含有する培地中でそれらを培養することによって実施される。特別な一実施態様では、ＥＧＦ及びＦＧＦファミリータンパク質のメンバーは、濃度１〜１００ng/mL、特に１０〜２０ng/mLで培地中に添加される。そのうえ、ＤＭＳＯは、培地中に濃度０．５％〜５％（体積：体積）、特に濃度２％（ｖ：ｖ）で存在する。この段階は、８から２４時間の間を含む持続時間にわたり実行される。次に、培地は、ＦＧＦファミリータンパク質のメンバー（例えばｂＦＧＦ）及びＥＧＦを含有するが、ＤＭＳＯを欠如する培地と交換される。ＦＧＦファミリータンパク質のメンバー及びＥＧＦを含むがＤＭＳＯを欠如する培地中での培養は、４から２０日の間、例えば１０から２０日の間、特に１２から１８日の間、より詳細には１４から１６日の間に含まれる持続時間にわたり行われる場合があり、持続時間は特に１５日である。実務家は、特に、細胞が細胞培養支持体上に約８０〜１００％の集密度、特に約８０〜９０％の集密度になるまでの間、細胞を培養する。この誘導段階（ＤＭＳＯを含有する培地又は不含の培地のいずれかにおける）は、多能性幹細胞の培養に適合した支持体上で実行され得る。例えば、培養は、フィーダー依存性又はフィーダーなしであり得る。フィーダー依存性培養の場合、支持体に不活性胚性マウス線維芽細胞層がコーティングされる。フィーダーなしの培養の場合、コーティングは、マトリゲル又はビトロネクチンを用いたコーティングなどのコーティングが支持体上に提供され得る。特別な一実施態様では、ニューロン前駆細胞又は筋前駆細胞の誘導は、フィーダーなしの培養条件で、特にマトリゲル又はビトロネクチンで、より詳細にはマトリゲルでコーティングされた支持体上で実施される。
【００２１】
次の段階において、誘導されたニューロン前駆細胞及び／又は筋前駆細胞は、フィブロネクチンでコーティングされたディッシュ（又はプレート若しくは支持体、これらの用語は互換的に使用される）に移植され、その上でこれらの細胞は、ＦＧＦファミリータンパク質のメンバー（例えばｂＦＧＦ）及びＥＧＦを含有する培地中で培養される。この段階は、ニューロン前駆細胞及び／又は筋前駆細胞（又はその他の名称の前駆細胞）を増殖可能にする。２つの細胞型は、それらの形態に基づき識別することができる。ニューロン細胞は、単層として成長し、一方で筋細胞は集合体として成長する。あるいは、それらの細胞型は、ニューロン前駆細胞についてＰＡＸ６、ＳＯＸ１若しくはネスチン、又は筋前駆細胞についてＣＤ５６などの細胞特異的マーカーの発現によって識別され得る。誘導されたニューロン前駆細胞及び／又は筋前駆細胞は、フィブロネクチンでコーティングされた支持体への移植前に、まず、酵素又は機械的破壊を実行することにより解離され得る。特別な一実施態様では、筋前駆細胞集合体が収集されて、培養支持体上に単層として成長するニューロン前駆細胞からそれらが分離される。次に、筋前駆細胞は、さらに、特に針、特に２３Ｇ針などの無菌用具を用いた破壊によって機械的に分離され得る。ニューロン前駆細胞は、また、酵素的破壊などの適切な手段により培養支持体から分離され得る。酵素的破壊は、特に、ディスパーゼ、トリプシン若しくはアキュターゼ（STREMPRO）その他当技術分野において公知の酵素を使用して実行され得る。フィブロネクチンでコーティングされた支持体上でのこの培養段階で、細胞は、数回の継代の間に増殖され、少なくとも１０日間、又は少なくとも２０日間、又は少なくとも３０日間、又は少なくとも４５日間、又はそれを超えて維持され得る。それらは、また、例えば適応した培地中で、例えばCryoStem Freezing Medium（STEMGENT）又は任意の他の適切な培地中で、−８０℃、−１５０℃、又は液体窒素中の−１９６℃でさえ凍結され得る。細胞は、また、本発明の方法の段階ｂ）によりニューロン又は筋肉分化のために直接使用され得る。
【００２２】
本発明の方法の段階ｂ）は、増殖したニューロン前駆細胞及び筋前駆細胞をニューロン又は筋管に分化させるために実行される。ニューロン前駆細胞及び筋前駆細胞は、まず、成長して高集密度になり、例えばトリプシン又はアキュターゼ（STEMPRO）などの酵素を使用して当技術分野において公知の任意の手段により、又は機械的破壊により、例えば２３Ｇ針などの無菌用具を用いて細胞層を破壊することにより分離され得る。次に、細胞は、所望の細胞系列に応じて選択されるコーティングでコーティングされたディッシュに播種される。播種は、ディッシュの１０％、特に２０％以上を覆うことが可能な密度で実施され得る。例えば、細胞は、培養ディッシュの２０〜２５％の密度で播種され得る。ニューロンが所望の場合、細胞は、酵素又は機械的破壊のいずれかの後にラミニンコーティングディッシュに播種される。筋管が所望の場合、前駆細胞（特に上記の筋前駆細胞集合体）は、機械的に破壊され（針、特に２３Ｇ針などを用いる）、次にフィブロネクチンでコーティングされたディッシュ上に播種される。ニューロンと筋管との混合物が所望の場合、前駆細胞は、単層として成長した細胞及び懸濁状態で成長した細胞（すなわち筋前駆細胞の集合体）の剥離及び収集及び希釈の後に、フィブロネクチンでコーティングされたディッシュ上に播種される。この段階で、培地、例えば以前の段階で使用されたものと同じ基礎培地であるが、ＦＧＦファミリータンパク質のメンバー（例えばｂＦＧＦ）及びＥＧＦを欠如する培地に、細胞が播種及び培養される。段階ｂ）は、少なくとも３日間実行され、細胞は、定期的に培地を交換して、例えば１又は２日毎に、好ましくは毎日交換して、この培地中に１ヶ月以上維持され得る。特殊なニューロンが求められる場合、段階ｂ）により得られたニューロンは、さらに、適切な培養条件を用いて分化され得る。例えば、ドーパミン作動性ニューロンは、段階ｂ）で得られたニューロンの培地中に５０〜２００ng/mL ＦＧＦ８及び１０〜２０ng/mL ＳＨＨを添加することによって得られ得る。ドーパミン作動性ニューロンは、この培地中で２〜５日処理後に得られる。段階ｂ）のＳＨＨの存在下で得られたニューロンを培養することによってＧＡＢＡ作動性ニューロンなどの他の特殊なニューロンが得られ、又はレチノイン酸の存在下でそれらを培養することによってグルタミン酸作動性ニューロンが得られ、又はＳＡＧ（Smoothenedアゴニスト）、レチノイン酸及びＣＨＩＲ９９０２１の存在下でそれらを培養することによって運動ニューロンが得られ得る。運動ニューロンを得るための代替的な一実施態様では、上記のニューロン前駆細胞及び筋前駆細胞は、両方とも、最終的に運動ニューロン及び筋線維の生成に至る共培養のために同じ支持体上に播種される。
【００２３】
特別な一実施態様では、本発明は、骨格筋細胞及び運動ニューロンの共培養及び共分化に関する。この実施態様の特別な一変形では、ニューロン前駆細胞及び筋前駆細胞は、適切な比で、例えば２：１の比（ニューロン前駆細胞：筋前駆細胞）で、フィブロネクチンでコーティングされたプレート上に播種され、いずれのＦＧＦファミリータンパク質のメンバーも含まず、ＥＧＦを欠如する分化培地中に２０〜３０日間維持される。以下の実験の部に示されるように、ニューロン前駆細胞の存在下で、多核性筋線維は、徐々に、光学顕微鏡法により明確に視認可能で自然に単収縮するＺ線構造を有する高レベルのサルコメア構造に達し、一方で、運動ニューロン特異的ＨＢ９転写因子についての染色によって示されるように、ニューロンは運動ニューロンに分化する。全体的に見て、これは、ＦＧＦファミリータンパク質のいかなるメンバーもＥＧＦもなしに、又はＳＡＧ、レチノイン酸及びＣＨＩＲ９９０２１などの上記のような因子を使用する化学誘導なしに、ニューロン前駆細胞及び筋前駆細胞の共培養が、運動ニューロンの分化を誘導することを示唆している。加えて、運動ニューロンの存在は、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）陽性筋管の表面でのαブンガロトキシン陽性クラスターの形成ととともに、多能性幹細胞由来多核性筋線維の成熟（Ｚ線）及び機能性（収縮）に寄与する。
【００２４】
本発明は、また、上記方法に従って調製されたニューロン及び筋管に関する。本発明は、また、上記のように得られたニューロン又は筋管を含む、神経学的状態及び筋肉状態を処置するために有用な組成物に関する。本発明の細胞は、それを必要とする患者に直接使用及び移植され得、又はそれらは、まず、ニューロン組織若しくは筋肉組織中のタンパク質若しくはＲＮＡを発現若しくは修正（発現の増加若しくは減少）するために遺伝的に改変され得る。細胞移植は、当技術分野において公知の方法を使用して達成することができる。ｉＰＳＣを得るために体細胞が使用された、それを必要とする患者が、例えば、遺伝的欠陥によって媒介される疾患又は状態を有する場合、これらの細胞を遺伝的に改変することは、有用であり得、又は所要でさえあり得る。この欠陥の修正が、本発明により提供され得る。
【００２５】
本発明のニューロン及び筋管を使用して処置され得る代表的な疾患には、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病のような神経変性障害、例えばレット症候群、脆弱Ｘ症候群のような神経発達障害、例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィー、ベッカー型ミオパチー、ディスフェリノパチー（dysperlinopathy）、カルパイノパチー（calpainopathy）のような神経筋疾患が含まれる。
【００２６】
本発明は、また、神経学的又は筋肉状態を処置するための潜在的候補として被験薬剤を同定するための方法を提供する。該方法は、特に、アルツハイマー病、パーキンソン病のようなニューロン症状又は筋肉症状、例えばレット症候群、脆弱Ｘ症候群のような神経発達障害、例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィー、ベッカー型ミオパチー、ディスフェリノパチー及びカルパイノパチーのような神経筋疾患、特に顔面肩甲上腕型ジストロフィー、を有する個体に由来する、上記方法に従って得られたニューロン若しくは筋管、又は上に定義されたように得られたニューロン前駆細胞若しくは筋前駆細胞を提供する段階、並びに神経細胞又は筋管に対する被験化合物の効果を試験する段階を含む。例えば、神経細胞がドーパミン作動性神経細胞ならば、試験される効果は、特異的ドーパミン取込みを含めたドーパミン作動性特徴に関する。
【００２７】
本発明の方法により得られるような筋前駆細胞（すなわち上記と同義の段階ｉ、ｉｉ及びｉｉｉを適用することにより得られる）は、哺乳類に注射後にインビボで筋肉組織を再生可能であることが、本明細書においてさらに示される。したがって、一態様では、本発明は、筋肉の再生を必要とする対象において筋肉を再生するための方法であって、上に定義されたような筋前駆細胞の有効量を対象に投与する段階を含む方法に関する。本発明の筋前駆細胞を使用して処置され得る代表的な疾患には、例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィー、ベッカー型ミオパチー、ディスフェリノパチー、カルパイノパチーのような神経筋疾患が含まれる。さらなる特別な一実施態様では、筋前駆細胞は、処置されるべき対象又は異なるドナーに由来する多能性幹細胞から得られる。特に、筋前駆細胞は、処置されるべき対象に由来する多能性幹細胞であって、患者に筋肉損傷を引き起こしている任意の遺伝的欠損を修正するために遺伝子操作された多能性幹細胞から導き出される。
【００２８】
実施例
実験手順
ヒト線維芽細胞のｈｉＰＳＣへの再プログラミング
初代皮膚線維芽細胞に山中４因子ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２及びｃ−ＭＹＣ（ＯＫＳＭ）をコードするレンチウイルス（ＳＴＥＭＣＣＡ−ＯＫＳＭ多シストロン性ベクター、Millipore）を感染多重度（ＭＯＩ）５〜２０で感染させた後、ヒトｉＰＳＣが産生された。
【００２９】
６ウェルプレートで感染を行った後、細胞をＤＭＥＭ高グルコース、１０％ ＳＶＦ培地中で５〜６日間成長させる。標準条件を使用してトリプシンで剥離した後、フィーダーとして使用したマイトマイシンＣ処理マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を有する１００mmディッシュ上で成長させる。５０mM β−メルカプトエタノールを０．１％、ＭＥＭ可欠アミノ酸１００（Life Technologies, ref 11140035）を１％、ＫＳＲ（ノックアウト代用血清培地、Life Technologies, ref 10820028）を２０％、ペニシリン-ストレプトマイシンを１％、２００mM Ｌ−グルタミン（Life Technologies, ref 25030024）を１％、及び終濃度１０ng/mlの塩基性ＦＧＦを添加したｈＥＳ培地（ＫＯ ＤＭＥＭ（Life Technologies, ref 10829018）中で細胞を成長させる。ｈｉＰＳＣクローンの出現まで培地を毎日交換する。感染の約４〜６週間後に、ＥＳ細胞様形態に基づきクローンをピックアップする。ピックアップされたクローンを成長させ、マトリゲル（BD Biosciences, cat, No. 354277）でコーティングされた３５mmディッシュ上のmTeSR（商標）１培地（Stemcell technologies, cat, No. 05850）上のコロニーとして増殖させる。この方法により産生されたｈｉＰＳＣクローンを、古典的な手順を使用して完全に特徴付けた（Marti et al., Nat Protoc. 2013 Feb;8(2):223-53）。多能性マーカー（ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２）の発現を、定量ＲＴ−ＰＣＲ、ＦＡＣＳ分析及び免疫蛍光染色によって決定した。核型分析によりゲノムの完全性を分析した。内胚葉、中胚葉及び外胚葉起源の細胞にある胚様体の形成によってインビトロで、並びに免疫不全マウスに注射後の奇形腫形成によってインビボで、分化能を分析した。
【００３０】
ニューロン分化（図１）。
ニューロン前駆細胞の誘導：３５mmマトリゲルコーティングプレート（プレート１枚あたりｈｉＰＳＣ約２×１０６個）上のｍＴｅＳＲ（商標）１培地中で成長した成熟ｈｉＰＳＣコロニーに分化を行った。１日目に、ｍＴｅＳＲ（商標）１培地を、２％ ＤＭＳＯ（Sigma-Aldrich, cat, No. D2438）を添加した分化培地＋（ＤＭ＋）に８〜２４時間交換した。ＤＭ＋は、液体Neurobasal（登録商標）−Ａ培地（１×）、（Life Technologies, cat, No. 10888-022）、１×〜２× Ｎ２サプリメント（Life Technologies, cat, No.17502-048）；１×〜２× Ｂ２７サプリメント（Life Technologies, cat, No. 0080085-SA）；１×〜２× インスリン−トランスフェリン−セレン−Ａ（ITS-A, Life Technologies, cat, No. 51300-045）；安定グルタミン（PAA, cat, No. M11-006）；２０ng/ml ｂＦＧＦ（PeproTech, cat, No. 100-18B）及び２０ng/ml ＥＧＦ（PeproTech, cat, No. AF-100-15）からなる。次に、培地をＤＭＳＯなしのＤＭ＋に交換し、３５mmマトリゲルコーティングディッシュ上で１〜２日ごとに培地を交換して、細胞を集密になるまで１０〜１５日間成長させた。
【００３１】
前駆細胞の増殖：１０〜１５日後に、アキュターゼを用いて酵素的に、又はスクレーパーを用いて機械的にのいずれかで破壊した細胞を、さらなる分化のために６０mmフィブロネクチンコーティングプレート（R&D Systems, cat, No. 1918-FN-02M）上に移植する。この段階で、細胞をCryoStem凍結培地（STEMGENT, cat, No. 01-0013-50）中に入れて−８０℃で凍結させることもできる。６０mmプレート上で成長したニューロン前駆細胞は、２５〜３０日目に高度に集密になる。この段階で、細胞を機械的に、又はアキュターゼ処理（STEMPRO, cat, No. A11105-01）により解離させ、所要の細胞数に応じて３５又は６０mmディッシュ上のいずれかに数回継代するために増殖させ、又は上記のように凍結させることができる。
【００３２】
最終分化：最終分化を誘導するために、Ｇ２３針を使用して機械的に小塊として破壊することにより、高度に集密なニューロン前駆細胞を分離し、３５〜６０mmラミニンコーティングディッシュ上のＤＭ−（ＦＧＦ及びＥＧＦなしのＤＭ＋）中に播種する。ラミニン上に播種後３〜７日で、ニューロンが塊から成長し、相互に結合を形成し始める。培地を２日毎に取り替え、ニューロンを培養状態で少なくとも１ヶ月間維持することができる。より高い比率（６０〜９０％）のドーパミン作動性ニューロンが、１００ng/ml ＦＧＦ８及び１０ng/ml ＳＨＨを用いた２〜５日の処理後に得られる。
【００３３】
ニューロンの生理学的性質を決定するために、ニューロンをＲＴ−ＱＰＣＲ及びＩＦ試験によって特徴付けた。
【００３４】
骨格筋細胞の分化（図２）：
骨格筋前駆細胞の誘導：３５mmマトリゲルコーティングプレート（プレート１枚あたりｈｉＰＳＣ約２×１０６個）上でｍＴｅＳＲ（商標）１培地中に成長した成熟ｈｉＰＳＣコロニーを分化させた。１日目に、ｍＴｅＳＲ（商標）１培地を、２％ＤＭＳＯ（Sigma-Aldrich, cat, No. D2438）を添加した分化培地＋（ＤＭ＋）に８〜２４時間交換した。ＤＭ＋は：液体Neurobasal（登録商標）Ａ培地（１×）、（Life Technologies, cat, No. 10888-022）、１×〜２× Ｎ２サプリメント（Life Technologies, cat, No.17502-048）；１×〜２× Ｂ２７サプリメント（Life Technologies, cat, No. 0080085-SA）；１×〜２× インスリン−トランスフェリン−セレン−Ａ（ITS-A, Life Technologies, cat, No. 51300-045）；安定グルタミン（PAA, cat, No. M11-006)；１０ng/ml〜２０ng/ml ｂＦＧＦ（PeproTech, cat, No. 100-18B）及び１０ng/ml〜２０ng/ml ＥＧＦ（PeproTech, cat, No. AF-100-15）からなる。次に、培地をＤＭＳＯなしのＤＭ＋に交換し、培地を１〜２日毎に交換して細胞を３５mmマトリゲルコーティングディッシュ上で集密になるまで１０〜１５日間成長させた。
【００３５】
前駆細胞の増殖：１０〜１５日後に、筋前駆細胞は大きな集合体を形成し、それを機械的に単離し、さらなる分化のために６０mmフィブロネクチンコーティングプレート（R&D Systems, cat, No. 1918-FN-02M）上に移植することができる。この段階で、細胞を解離させ、CryoStem凍結培地（STEMGENT, cat, No. 01-0013-50）に入れて−８０℃で凍結することができる。播種後、本発明者らは、球形からＮＣＡＭ筋原性マーカー（ＣＤ５６）陽性の紡錘様細胞への細胞形態の急速な変化を観察する。１０〜２０日目に骨格筋前駆細胞を３５〜６０mmフィブロネクチンコーティングプレート上で成長させ、２５〜３０日目に、高度に集密になる。骨格筋前駆細胞を分割し、必要な細胞数に応じて、３５又は６０mmディッシュのいずれかのＤＭ＋中で数回継代する間増殖させ、又は上記のように凍結することができる。集密状態の３５mmディッシュは、３から４×１０５個の間の前駆細胞を含む。
【００３６】
最終分化：分化培地中でｈｉＰＳＣの分化を誘導した４０〜５０日後に、前駆細胞は筋芽細胞様形態を取り始め、並列して配向し、融合して多核性収縮骨格筋細胞を形成する。フィブロネクチン上に播種後２５〜３０日で自然収縮が観察される。培地を１〜２日毎に取り替える。骨格筋細胞をＲＴ−ｑＰＣＲ、フローサイトメトリー及び免疫蛍光染色（ＩＦ）によって特徴付ける。
【００３７】
ニューロン細胞及び骨格筋細胞の共培養（図３）：
ニューロン前駆細胞及び骨格筋前駆細胞の誘導：３５mmマトリゲルコーティングプレート上のｍＴｅＳＲ（商標）１培地中で成長した成熟ｈｉＰＳＣのコロニー（プレート１枚あたりｈｉＰＳＣ約２×１０６個）に分化を行った。１日目に、ｍＴｅＳＲ（商標）１培地を２％ ＤＭＳＯ（Sigma-Aldrich, cat, No. D2438）を添加した分化培地＋（ＤＭ＋）と８〜２４時間交換した。ＤＭ＋は：液体Neurobasal（登録商標）Ａ培地（１×）、（Life Technologies, cat, No. 10888-022）、１×〜２× Ｎ２サプリメント（Life Technologies, cat, No.17502-048）；１×〜２× Ｂ２７サプリメント（Life Technologies, cat, No. 0080085-SA）；１×〜２× インスリン−トランスフェリン−セレン−Ａ（ITS-A, Life Technologies, cat, No. 51300-045）；安定グルタミン（PAA, cat, No. M11-006）；１０ng/ml〜２０ng/ml ｂＦＧＦ（PeproTech, cat, No. 100-18B）及び１０ng/ml〜２０ng/ml ＥＧＦ（PeproTech, cat, No. AF-100-15）からなる。次に、培地をＤＭＳＯなしのＤＭ＋と交換し、１〜２日毎に培地を交換しながら細胞を３５mmマトリゲルコーティングディッシュ上で１０〜１５日間、集密になるまで成長させた。
【００３８】
誘導の１０〜２０日後に、筋前駆細胞の機械的破壊又はニューロン前駆細胞の酵素的破壊後に、６０mmフィブロネクチンコーティングプレート上にニューロン前駆細胞及び骨格筋前駆細胞を維持し、集密になるまで２５〜３０日目まで増殖させることができる。筋細胞及びニューロン細胞のために使用される分化培地が同じであるので、成熟多核性骨格筋細胞及びニューロンの共培養が可能である。増殖後、ニューロン前駆細胞及び筋細胞前駆細胞を分割し、必要な細胞数に応じて３５又は６０mmディッシュのいずれかで数回継代する間さらに増殖させることができる。あるいは、骨格筋前駆細胞及びニューロン前駆細胞を１２ウェルのフィブロネクチンコーティングディッシュ上に播種し、完全に分化するまでＤＭ−を補給することができる。成熟ニューロン及び多核性筋管の共培養が、誘導の４０〜５０日後に得られる。培地を１〜２日毎に取り替える。
【００３９】
ポリ−Ｄ−リシン、フィブロネクチン、ラミニンを用いたコーティング：
ニューロン前駆細胞及び筋前駆細胞への分化、それらの増殖を支援し、最終的に成熟機能性細胞へのそれらの分化を誘導するためにフィブロネクチン（R&D Systems, cat, No. 1918-FN-02M）及びラミニン（Invitrogen, cat, No. 23017-015）を使用する。
【００４０】
製造業者が推奨するように１mg/ml ポリ−Ｄ−リシン、フィブロネクチン及びラミニンの希釈液を調製し、少量の分注（６ウェルプレート又は１２ウェルプレートディッシュ１枚をコーティングするために６０μl）として−２０℃で数ヶ月間保存する。コーティングのために６０μl分注を氷上で解凍し、ＤＰＢＳ １×（終濃度１０ug/ml）６ml中に希釈する。次に、６ウェルプレートのウェル１個あたり希釈したポリ−Ｄ−リシン １ml（１２ウェルプレートのウェル１個あたり０．５ml）を添加し、３７℃で１時間インキュベートする。プレートを１×ＤＰＢＳ中で３回リンスし、次にフィブロネクチン又はラミニンでコーティングする（プレートは４℃で１週間保存できる）。使用前に、プレートを３７℃で３０分間予備インキュベートし、１×ＤＰＢＳで１回リンスする。
【００４１】
マトリゲルコーティング：ｈｉＰＳＣの維持及び分化の両方のためにマトリゲル（BD Biosciences, cat, No. 354277）コーティングディッシュを使用する。５mlマトリゲルバイアルを４℃で解凍し、製造業者が推奨するように一定分量を調製し、−２０℃で保存する。一定分量の１つをＸ−ＶＩＶＯ １０（Lonza, cat, No. BE04-380Q）１２ml中に希釈し、３５mmディッシュ（３５mmディッシュ１枚あたり１ml）１２枚をコーティングするために使用する。一定分量を氷上で１〜２時間解凍する。１０ml冷ピペットを使用して、氷上の１５ml冷尖形チューブ中の新鮮Ｘ−ＶＩＶＯ １０培地１２ｍｌでマトリゲルを再懸濁する。３５mmディッシュ１枚あたりマトリゲル懸濁液１mlを使用する。マトリゲルコーティングディッシュを４℃で２週間保存することができる。使用前に、コーティングプレートを室温で１〜２時間放置する。
【００４２】
免疫蛍光
誘導の１５日後に、細胞を機械的に破壊しラミニンコーティング２ウェルLabTek Permanoxチャンバースライド（Thermo Scientific, cat, No. 177429）に移植する。細胞を４％パラホルムアルデヒド中で２０分間固定し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ １×−０．１％トリトン中で２０分間透過処理し、ＰＢＳで洗浄し、次に０．５％ ＢＳＡを含有するブロッキング緩衝液に入れて室温で３０分間インキュベートする。一次抗体とのインキュベーションは、４℃で一晩又は室温で２時間行った。インキュベーション後に、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、０．５％ ＢＳＡの存在下でAlexa fluorコンジュゲート型二次抗体（抗マウスAlexa Fluor 483（１／２００）又は抗ウサギAlexa Fluor 555（１／１０００））と共に１時間インキュベートした。核をＤＡＰＩで対比染色した。Axio Imager.Z2（Carl Zeiss Microscopy）を使用して画像を取得した。以下の一次抗体を使用した：マウス抗ネスチン（希釈１：５００、Millipore, MAB5326）；ウサギ抗ＮｅｕＮ（希釈１：１００、Millipore, ABN78）、ウサギ抗チロシンヒドロキシラーゼ（希釈１：１００、Millipore, AB152）、ウサギ抗ＯＣＴ４（希釈１：１００、Abcam, ab19857）、ウサギ抗ＭｙｏＤ（希釈１：１００、Santa Cruz, SC304）；ウサギ抗デスミン（希釈１：１００、Abcam, Ab15200）、マウス抗ＭＦ２０（希釈１：１００）。抗マウスAlexa Fluor 483（希釈１：２００、Ozyme 4408S）又は抗ウサギAlexa Fluor 555（希釈１：１０００、Ozyme; 4413S）のいずれかを使用することによって視覚化を行った。
【００４３】
フローサイトメトリー分析。
アキュターゼを用いて細胞を３７℃で１０分間処理し、Ｎ−培地でリンスする。細胞を計数し、１０００rpmで５分間遠沈した。
【００４４】
各条件について、細胞１×１０５個を４％パラホルムアルデヒド中で２０分間固定した。細胞を１０００rpmで５分間遠沈し、０．５％ ＢＳＡでリンスし、０．２％トリトンで２０分間処理し、０．５％ ＢＳＡで２０分間ブロッキングし、その後異なる抗体（０．５％ ＢＳＡ １００μl中に抗体５μl）を添加した。試料を３０分間インキュベートした。次に、試料を遠沈し、リンスし、ACCURI C6フローサイトメーターを使用して分析した。生きた細胞の選択及び細胞集合体又は破片の除去のために側方散乱（ＳＳＣ−Ａ）に対する前方散乱（ＦＳＣ−Ａ）に基づき細胞を分析した。蛍光集団の分析は生きた細胞に限定した。未染色の細胞及びアイソタイプ対照を使用して、蛍光バックグラウンドを決定し、個別の蛍光色素について補正を決定した。抗体を、BD Biosciences（抗ＳＯＸ１、ref 561549；抗ＰＡＸ６、ref 562249、抗ネスチン、ref 561230、抗ＣＤ１０５−ＦＩＴＣ、ref 561443；抗ＣＤ５６−ＰＥ、ref 555516及び抗７３−ＰＥ、ref 561014）から購入した。
【００４５】
定量及び半定量ＲＴ−ＰＣＲ並びにプライマー。
Trizol（Invitrogen, Cat. No. 15596-026）を使用して全ＲＮAを抽出した。Superscript IIキット及びオリゴｄＴを製造業者（Life Technologies）の説明書に従って使用して、全ＲＮＡ １μgの逆転写を４２℃で５０分間行い、続いて７０℃で１５分間不活性化した。Primer Blast及びPrimer 3を使用してプライマーを設計した。ＳＹＢＲグリーンマスターミックスを使用してLightCycler 480（Roche）でリアルタイムＰＣＲ増幅を行った。標準化プロトコールを使用して全てのＰＣＲを行い、Lightcycler 480ソフトウェアバージョン１．５．０．３９（Roche）を用いてデータを解析した。標準曲線を使用する絶対定量及びＲＰＬ１９標準遺伝子の発現に対する規準化により変化率を決定した：ＲＰＬ１９−Ｆ、ＡＴＣ  ＧＡＴ  ＣＧＣ  ＣＡＣ  ＡＴＧ  ＴＡＴ  ＣＡ（配列番号：１）；ＲＰＬ１９−Ｒ，Ｒ：ＧＣＧ  ＴＧＣ  ＴＴＣ  ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＣＴＴ  ＡＧ（配列番号：２）。
【００４６】
ニューロン前駆細胞に関するプライマーは：ＰＡＸ６−Ｆ、ＣＣＧ  ＧＴＣ  ＡＡＧ  ＡＡＡ  ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＡＣＣ  ＡＧＡ（配列番号：３）；ＰＡＸ６−Ｒ、ＣＣＡ  ＴＴＧ  ＣＴＡ  ＴＴＣ  ＴＴＣ  ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＴＴＧ（配列番号：４）。ＳＯＸ２−Ｆ、ＴＣＡ  ＧＧＡ  ＧＴＴ  ＧＴＣ  ＡＡＧ  ＧＣＡ  ＧＡＧ  ＡＡＧ（配列番号：５）；ＳＯＸ２−Ｒ、ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＧＡＴ  ＧＡＴ  ＴＧＴ  ＴＡＴ  ＴＡＴ（配列番号：６）である。
【００４７】
成熟ニューロンに関するプライマーは：ＣｈＡＴ−Ｆ、ＡＡＣ  ＣＧＧ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＡＣ（配列番号：７）；ＣｈＡＴ−Ｒ、ＴＴＧ  ＴＡＧ  ＣＡＧ  ＧＣＡ  ＣＣＡ  ＴＡＣ  ＣＣ（配列番号：８）。ＤＤＣ−Ｆ、ＴＧＴ  ＧＧＡ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＴＣＴ  ＧＧＧ  ＧＣ（配列番号：９）；ＤＤＣ−Ｒ、ＣＧＡ  ＧＡＡ  ＣＡＧ  ＡＴＧ  ＧＣＡ  ＡＡＧ  ＣＧ（配列番号：１０）である。
【００４８】
間葉分化に関するプライマーは：アグリカン−Ｆ、ＣＴＧ  ＣＴＴ  ＣＣＧ−ＡＧＧ  ＣＡＴ  ＴＴＣ  ＡＧ（配列番号：１１）；アグリカン−Ｒ、ＣＴＴ  ＧＧＧ  ＴＣＡ  ＣＧＡ  ＴＣＣ  ＡＣＴ  ＣＣ（配列番号：１２）。ＣＯＬ１０Ａ１−Ｆ、ＧＧＴ  ＡＴＡ  ＧＣＡ  ＧＴＡ  ＡＧＡ  ＧＧＡ  ＧＡＧ  ＣＡ（配列番号：１３）；ＣＯＬ１０Ａ１−Ｒ、ＡＧＧ  ＡＣＴ  ＴＣＣ  ＧＴＡ  ＧＣＣ  ＴＧＧ  ＴＴＴ（配列番号：１４）である。
【００４９】
筋肉分化に関するプライマーは：ＰＡＸ３−Ｆ、ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＧＣＡ  ＴＧＧ  ＡＴＴ  ＴＴＣ  Ｃ（配列番号：１５）；ＰＡＸ３−Ｒ、ＴＴＧ  ＴＣＡ  ＧＧＡ  ＧＴＣ  ＣＣＡ  ＴＴＡ  ＣＣＴ（配列番号：１６）。ＰＡＸ７−Ｆ、ＣＣＡ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＣＴＣ  ＣＡＧ  ＣＴＡ  ＣＴＣ（配列番号：１７）；ＰＡＸ７−Ｒ、ＧＧＧ  ＴＴＧ  ＣＣＣ  ＡＡＧ  ＡＴＧ  ＣＴＣ（配列番号：１８）。ＭＹＯＤ−Ｆ、ＴＧＣ  ＧＣＡ  ＡＣＧ  ＣＣＡ  ＴＣＣ  ＧＣＴ  Ａ（配列番号：１９）；ＭＹＯＤ−Ｒ、ＧＧＧ  ＣＣＧ  ＣＴＧ  ＴＡＧ  ＴＣＣ  ＡＴＣ  ＡＴＧ  Ｃ（配列番号：２０）。ＭＵＲＦ１−Ｆ、ＣＴＴ  ＧＡＣ  ＴＧＣ  ＣＡＡ  ＧＣＡ  ＡＣＴ  ＣＡ（配列番号：２１）；ＭＵＲＦ１−Ｒ、ＣＡＡ  ＡＧＣ  ＣＣＴ  ＧＣＴ  ＣＴＧ  ＴＣＴ  ＴＣ（配列番号：２２）。ＭＹＨ２−Ｆ、ＧＧＡ  ＧＣＴ  ＧＧＴ  ＧＧＡＧＧＧ  ＧＣＣ  ＡＡ（配列番号：２３）；ＭＹＨ２−Ｒ、ＴＧＣ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＧＣＡ  ＣＣＡ  ＧＧＡ  ＧＴＴ  Ｔ（配列番号：２４）。ＭＹＨ３−Ｆ、ＧＣＴ  ＴＧＴ  ＧＧＧ  ＣＧＧ  ＡＧＧ  ＴＣＴ  ＧＧ（配列番号：２５）；ＭＹＨ３−Ｒ、ＡＧＧ  ＧＣＴ  ＧＧＴ  ＴＣＴ  ＧＡＧ  ＣＣＴ  ＣＧＡ  Ｔ（配列番号：２６）。ＭＹＨ７−Ｆ、ＧＧＣ  ＡＣＧ  ＡＡＧ  ＧＧＣ  ＴＴＧ  ＡＡＴ  ＧＡＧ  ＧＡＧ（配列番号：２７）；ＭＹＨ７−Ｒ、ＡＴＧ  ＧＧＧ  ＣＴＴ  ＴＧＣ  ＴＧＧ  ＣＡＣ  ＣＴ（配列番号：２８）。ＭＹＨ８−Ｆ、ＴＣＣ  ＡＣＣ  ＡＡＧ  ＡＡＣ  ＣＣＡ  ＧＡＧ  ＡＧＴ  ＧＧ（配列番号：２９）；ＭＹＨ８−Ｒ、ＴＧＧ  ＧＣＣ  ＴＣＡ  ＡＴＣ  ＣＧＣ  ＴＣＣ  ＴＴ（配列番号：３０）。ＳＣＧＣ−Ｆ、ＣＧＡ  ＣＣＣ  ＧＴＴ  ＴＣＡ  ＡＧＡ  ＣＣＴ  ＴＡ（配列番号：３１）；ＳＣＧＣ−Ｒ、ＣＣＴ  ＣＡＡ  ＴＴＴ  ＴＣＣ  ＣＡＧ  ＣＧＴ  ＧＡ（配列番号：３２）。ＤＳＭ−Ｆ、ＣＣＧ  ＣＣＡ  ＴＣＴ  ＧＣＧ  ＣＧＡ  ＧＴＡ  ＣＣ（配列番号：３３）；ＤＳＭ−Ｒ、ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＧＧＧ  ＣＴＧ  ＧＴＴ  ＴＣＴ  ＣＧＧ  Ａ（配列番号：３４）。ＭＧＮ−Ｆ、ＧＣＣ  ＴＣＣ  ＴＧＣ  ＡＧＴ  ＣＣＡ  ＧＡＧ  Ｔ（配列番号：３５）；ＭＧＮ−Ｒ、ＡＧＴ  ＧＣＡ  ＧＧＴ  ＴＧＴ  ＧＧＧ  ＣＡＴ  ＣＴ（配列番号：３６）である。
【００５０】
ＧＵＳＢ−Ｆ、ＣＴＣ  ＡＴＴ  ＴＧＧ  ＡＡＴ  ＴＴＴ  ＧＣＣ  ＧＡＴ  Ｔ（配列番号：３７）；ＧＵＳＢ−Ｒ、ＣＣＧ  ＡＧＴ  ＧＡＡ  ＧＡＴ  ＣＣＣ  ＣＴＴ  ＴＴＴ  Ａ（配列番号：３８）を内部標準として使用した。
【００５１】
結果
本発明者らは、ヒト多能性細胞（図４）からニューロン（図１）への分化を誘導するために簡単な手順を開発した。第１段階は、合成培地中に入れてマトリゲルコーティングプレート上で前駆細胞を予備分化及び増殖させることを要する。第２段階は、成熟ニューロン（図１）への最終分化のためにフィブロネクチン上の次にラミニンコーティングディッシュ上に播種することを要する。あるいは、特定の因子の存在下で特殊なニューロンの生成を達成することができる。
【００５２】
ＤＭＳＯの存在下で誘導後、ｈｉＰＳ細胞の形態は徐々に改変される（図６Ａ、Ｂ）。異なる時点での免疫蛍光染色により、扁平な紡錘様細胞におけるＯＣＴ４多能性マーカーの徐々に進行する喪失及びネスチン神経幹細胞マーカーを発現する神経上皮表現型の獲得が確認され、これは、早くも誘導４日後でのニューロン細胞系列に向けたスイッチを示している（Yang et al., Cell Stem Cell. 2011;9:517-525）（図６Ｂ）。多能性マーカーの発現は、１５日後にほぼ検出不能になる（図６Ｂ）。注目すべきことに、ラミニン上に播種後、継代１及び６回目にネスチン、ＰＡＸ６又はＳＯＸ１を発現している細胞が高い割合である（図５及び７）が、ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ又はＳＯＸ１７中胚葉及び内胚葉マーカーの発現が不在であることによって示されるように、これらのニューロン前駆細胞は、自己再生し、それらの潜在力を維持し、数週間増殖することができる。そのうえ、この前駆細胞集団を能力の喪失なしに凍結及び解凍することができる。この戦略は高度に再現性があり、異なる健康ヒトドナーの皮膚線維芽細胞由来の異なるｈｉＰＳＣクローンで類似の収率が得られた（図４）。
【００５３】
ニューロン細胞系列の誘導後、ネスチン陽性細胞（図８Ｂ）は、フィブロネクチンコーティングプレート上の分化培地中で維持及び増殖されるか、ｂＦＧＦ及びＥＧＦの除去後、追加的な因子を添加せずにラミニンコーティングプレート上で成熟ニューロンに分化さる場合がある。次に、有糸分裂後ニューロンの２つのマーカーであるβＩＩＩ−チューブリン及びＮｅｕＮの染色（図８Ｃ）並びにＣｈＡＴ（コリンアセチルトランスフェラーゼ）（図７Ｂ）によって特徴付けられる最終分化は、ラミニン上に播種した５〜７日後に達成される。このプロトコールが特殊ニューロンの生成を可能にするかどうかを判定するために、本発明者らは、ＦＧＦ８及びＳＨＨで成熟ニューロンを４８時間誘導することによって、ドーパミン作動性系列に向けた分化も試験した（Carpenter et al., Methods Mol Biol. 2006;331:153-167）（図８Ｃ）。誘導後１５日で、本発明者らは、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ；図８Ｃ）及びＤＤＣ（図７Ｃ）を発現している機能的ドーパミン作動性ニューロンの高い富化を得た。
【００５４】
全体的に見て、これらのデータは、ラミニン上に播種後に、ニューロン前駆細胞が成熟ニューロンに分化し、このニューロンをパッチクランプ記録によって示される膜特性の喪失なしに最大３５日間維持できることを示している。加えて、これらの細胞は、特定のサイトカインの存在下でドーパミン作動性ニューロンなどの特殊ニューロンに向けて分化することができる。
【００５５】
ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣを自己再生することは、任意の細胞型に分化する潜在性を有することで、特に再生医療用の生体物質の貴重な供給源となる。しかし、多くの場合に、先端医療におけるこれらの細胞の使用は、分化工程の効率及び規模が低いことにより妨げられる。
【００５６】
本発明者らは、本明細書においてｈｉＰＳＣからニューロン細胞への分化のための新規で効率的なプロトコールを記載した。本発明者らのプロトコールは、フィーダー細胞層を要さない。そのうえ、他の公表されたプロトコールに比べて、本発明者らの手順は、細胞集団の純度を改変することがあり得る胚様体に続くロゼット（原始神経上皮細胞）及びニューロスフェア形成も（Hitoshi et al., Genes Dev. 2004;18:1806-1811; Liu et al., Nat Protoc. 2013;8:1670-1679; Lie et al., Methods Mol Biol. 2012;873:237-246）、細胞ホメオスタシスを撹乱し得る薬物添加も（Li et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2011;108:8299-8304; Menendez et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2011;108:19240-19245; Yan et al., Stem Cells Transl Med. 2013;2:862-870; Chambers et al., Nat Biotechnol. 2009;27:275-280; Surmacz et al., Stem Cells. 2012;30:1875-1884）、利用可能な分化した細胞量を限定する細胞選別も必要としない。そのうえ、本発明者らのプロトコールは、最初の分化段階でサイトカインを２種だけ添加することを要し、１０〜１５日で大量のニューロン前駆細胞をもたらし、その細胞を維持して定期的に増殖させる、又はさらに分化させることができる。
【００５７】
これらのニューロン細胞は、Ｎａ＋及びＫ＋電位作動性チャネルと一緒になって異なるニューロンマーカーを発現し、活動電位を産生及び伝搬することが可能である。そのうえ、これらの細胞は、中枢神経系における主な抑制性シナプス駆動を担うＣｌ−選択的ＧＡＢＡ受容体などの、異なる種類の受容体作動性チャネルを発現した。
【００５８】
ますます多くの報告が、ｈｉＰＳＣに基づく構成的障害モデルを記載し、これらの種々の疾患の病理機序を理解するための新天地を開いているが、創薬及び潜在的な細胞療法におけるそれらの使用も可能にしている。本発明者らの方法は、ドーパミン作動性ニューロンを含めた大量の成熟ニューロンを生成するために使用できる。したがって、本発明者らの戦略は、ニューロンの分化経路、シナプス及びシナプス後応答を研究するための、又は薬理学的処置を試験するための貴重なツールを提供し、神経発達疾患及び神経変性疾患を含めた多数の病状を理解するための新天地を開いている。
【００５９】
同時に、本発明者らは、適切なコーティングの逐次使用及びサイトカインの添加又は除去に基づき、ヒト多能性細胞の骨格筋分化を誘導するための２段階手順を開発した。第１段階は、合成培地中での前駆細胞の予備分化及び増殖を要する（図２）。約１０〜１５日で、大きな細胞集合体が懸濁液中に形成する。これらの細胞集合体は、機械的に分離及び解離させることができる。第２段階は、フィブロネクチンコーティングディッシュ上へのこれらの細胞塊の播種及び細胞単層の形成を要する（図２）。フィブロネクチンコーティングプレート上に規定の因子の存在下で成熟多核性筋管への最終分化が誘導される。本発明者らのプロトコールは、フィーダー細胞層を要さず、成熟単核性骨格筋細胞の高い富化をもたらす。予備分化した細胞をクローン増幅し、数週間維持し、又は効力若しくは自己再生の喪失なしに凍結及び解凍することができる（図２）。これらの細胞を、損傷した筋肉の再生のために使用することができる。フィブロネクチン上に播種後、本発明者らは、球形から、細胞集合体から移動する紡錘様細胞への細胞形態の急速な変化を観察する（図９Ａ）。それらの筋形成能及び集団の均一性を決定するために、集合体から得られた細胞に関して、ＣＤ１０５（エンドグリン）及びＣＤ７３（５’ヌクレオチダーゼ）などの間葉系幹細胞マーカー並びにＮＣＡＭ（ＣＤ５６）筋原性マーカーの発現を、２つの異なるクローンへのフローサイトメトリーによって分析した（図９Ｂ、Ｃ）。２週間分化させた後に、８５から９８％の間の細胞が２種の間葉系幹細胞マーカーＣＤ１０５及びＣＤ７３を発現し、一方で６０〜９５％の細胞は、筋原性系列に分化コミットメントされている。細胞集合体を分離後、本発明者らは、ＣＤ７３＋／ＣＤ１０５＋が他の間葉由来系列に向けて分化し得るかどうかも試験した。したがって、トリプシン消化により細胞を解離させ、ＢＭＰ２の存在下、軟骨形成培地中で細胞５×１０５個を３週間維持した。３週間後に、本発明者らは、軟骨中に見られる主要プロテオグリカンであるアグリカン及び軟骨細胞によって発現されるコラーゲンＸを発現している微小ペレットの形成を観察した（図１０Ａ）。あるいは、本発明者らは、コラーゲンなどの他の固相コーティングプレート上への播種が筋肉分化を促進し得るが、さらなる分化を観察しなかったかどうかも試験した。
【００６０】
筋肉形成プログラムは、衛星細胞の活性化、筋芽細胞の増殖又は多核性筋管への最終分化に関与するＰＡＸ３／７、ＭＹＯＤ、ＭＹＦ５、ミオゲニン又はＭＲＦ４などの異なる骨格筋特異的転写因子の逐次発現によって活性化する。したがって、１５日培養後に、本発明者らは、いくつかの筋肉特異的マーカーのパネルの発現を定量ＲＴ−ＰＣＲによって測定し（図１０Ｂ）、ｈｉＰＳＣ由来筋細胞の発現パターンを胎児筋肉と比較した。前駆細胞では、本発明者らは、ＭＹＯＤ又はミオゲニンと一緒にＰＡＸ３及びＰＡＸ７及びＭＵＲＦ１の発現を検出することができた。したがって、特定の筋原性マーカーの発現レベルが２つのクローンの間で変動するものの、それらは、種々の筋肉特異的遺伝子の発現と共に転写レベルで共通の遺伝子発現プロファイルを分かち合う。
【００６１】
最終分化のために、ＥＧＦ及びｂＦＧＦの不在下でフィブロネクチンコーティングプレート上に成長した筋前駆細胞を機械的に分離し、フィブロネクチンコーティングディッシュ上に播種し、この培地中で２〜３週間維持することができる（図２；１１Ａ）。徐々に、本発明者らは、融合してＭＹＯＤ（図１１Ｂ、左欄）及びデスミン（図１１Ｂ、右欄）を発現する多核性筋管を形成する伸長多核性細胞の出現を観察した。本発明者らは、成熟線維の存在を示すＺ線様構造（図１１Ｄ、左欄、位相差顕微鏡法；右欄、ＭＦ２０染色）と共に、多核性線維（図１１Ｃ、右欄）において、終末筋肉分化のマーカーであるミオシン重鎖（図１１Ｃ、左及び右欄）の発現も観察した。ニューロン前駆細胞の存在下で、多核性筋線維は、Ｚ線構造を有する高レベルのサルコメア構築及び自然単収縮に徐々に到達し（図１４ｄ）、一方でニューロンは、運動ニューロン特異的ＨＢ９転写因子についての染色によって示されるように、運動ニューロンに分化する（図１４ｃ）。運動ニューロンの存在は、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）陽性筋管の表面でのαブンガロトキシン陽性クラスターの形成と一緒になって、ｈｉＰＳＣ由来多核性筋線維の成熟（Ｚ線）及び機能性（収縮）に寄与する（図１４ｅ、ｆ）。
【００６２】
多種多様な終末分化組織におけるｈｉＰＳＣの分化のために多数のプロトコールが利用可能であるが、ｈｉＰＳＣＳ若しくはｈＥＳＣから骨格系列への分化は困難なままであり、又はウイルストランスダクション若しくは時間及び労働集約的な多段階培養及び細胞選別後に筋肉特異的転写因子の過剰発現を要する。
【００６３】
健康なヒトドナー皮膚線維芽細胞由来の２つの異なる系統のヒトｉＰＳＣを使用して、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２及びｃ−ＭＹＣ再プログラミング因子を用いたレトロウイルストランスダクションにより、本発明者らは、筋肉収縮細胞への分化のための迅速で効率的なプロトコールを開発した。それによって、適切なコーティング上で化学的に規定された条件で培養したときに、薬物添加も誘導も筋原性マーカーの誘導発現もなしに、ヒトｈｉＰＳＣから成熟筋細胞を効率的に産生することができる。このプロトコールの主な利点の一つは、追加的な操作も化学的誘導もなしに大量の筋原性前駆細胞を産生できる可能性である。そのうえ、培養の初期条件が筋細胞とニューロンとの間で同じであることは、この戦略がこれらの２種の細胞の共培養にも使用できることに注目する価値がある。この戦略は、少なくとも４０種の異なる障害を含む筋ジストロフィーだけでなく、世界中の数百万人を冒す加齢、悪液質、萎縮症又は筋肉減弱症に関連する筋肉消耗などの非遺伝障害を含めた、筋肉の多数の病状をモデル化するための新天地を開くものである。加えて、本明細書記載の方法によって導き出された細胞は、薬物スクリーニング又は薬物若しくは細胞に基づく治療法のモニタリングのための貴重な資源である。
【００６４】
ＥＧＦ及びｂＦＧＦが細胞運命を改変するかどうかを判定するために、ニューロン細胞系列又は筋細胞系列に向けた最終分化を、適切な表面、すなわちニューロン分化についてはラミニン（図１２Ａ）、骨格筋分化についてはフィブロネクチン（図１２Ｃ）の上に播種後、両方のサイトカインの存在下で試験し、サイトカインを除外した条件と比較した（それぞれ図１２Ｅ及び図１２Ｇ）。播種後、２種のサイトカイン（それぞれ終濃度２０ng/ml）の存在下で前駆細胞を２０〜３０日間維持した。本発明者らは、白い矢印によって示される、限られた数の成熟ニューロン（図１２Ｂ）又は伸長多核性筋管（図１２Ｄ）だけを観察したが、それは、２種のサイトカインの除去が、成熟ニューロン（図１２Ｅ）又は多核性筋管（図１２Ｈ）への最終分化及び濃縮のために必要とされることを示唆している。
【００６５】
骨格筋を変化させる遺伝性又は後天性の疾患は、世界中の数百万人が罹患している。本発明の方法が神経筋障害のモデル化のために使用され得るかどうかを判定するために、本発明者らは、顔面肩甲上腕型ジストロフィー（ＦＳＨＤ１ Ａ、ＯＭＩＭ １５８９００）を患う患者からのｈｉＰＳＣにも本発明者らの条件を適用した（図１５）。この神経筋障害は、下肢に進行する顔、肩、肩甲及び下肢帯の筋肉の非対称性で進行性の筋肉脆弱化によって特徴付けられる。大部分の場合（９５％）、ＦＳＨＤは、遠位４ｑ３５ローカスでのＤ４Ｚ４マイクロサテライトエレメントのアレイ短縮と連鎖している（Sarfarazi et al., 1992, Am J Hum Genet 51, 396-403; Wijmenga et al., 1992, Nat Genet 2, 26-30）が、残りの５％の患者のうち（ＦＳＨＤ２）、２〜３％はＳＭＣＨＤ１遺伝子に突然変異を有する（Lemmers et al., 2012, Nature Genetics 44, 1370-1374）。
【００６６】
ＦＳＨＤ患者由来のヒトｉＰＳＣを、ＦＧＦ及びＥＧＦを欠如する培地中に入れてフィブロネクチンでコーティングされた支持体上で筋前駆細胞を培養する段階を含む、本発明者らの筋分化プロトコールに供した。骨格筋への分化コミットメントを、２つのサブテロメア４ｑ３５アレル（ＦＳＨＤ１−２ＵＲ）の１つに２ユニットのＤ４Ｚ４リピートを有する重症患者及びＳＭＣＨＤ１遺伝子にヘテロ接合性突然変異（ＦＳＨＤ２−Ｇ及びＦＳＨＤ２−Ｐ、図１５）を有し、ＦＳＨＤでしばしば観察されるエピジェネティック改変であるＤ４Ｚ４アレイの低メチル化を示している２人のＦＳＨＤ２患者由来のｈｉＰＳＣで試験した（Gaillard et al., 2014, Neurology）。これらのｈｉＰＳＣは、ヒトＥＳ様形態及び特徴を示し、核型欠損を全く示さなかった（図１５）。
【００６７】
本発明者らは、異なるＦＳＨＤ由来クローン及び対照についてＥＧＦ及びＦＧＦ２を添加した分化培地中で２週間後に、匹敵するレベルのＣＤ５６陽性前駆細胞（＞９４％）を得た。これらの結果は、健康なドナー又は神経筋障害を患う患者からの細胞についてこのプロトコールが効率的に機能することを示している（図１６）。
【００６８】
骨格筋前駆細胞の移植は、再生医療において、特に筋ジストロフィーの処置において可能な戦略として見なされている。本発明者らのｈｉＰＳＣ由来筋前駆細胞が筋肉を産生する能力を評価するために、対照及びＦＳＨＤ１ ｈｉＰＳＣ由来筋前駆細胞（すなわち、ＦＧＦ２、ＥＧＦ及びＤＭＳＯ含有培地中で培養された細胞）を凍結損傷の４８時間後に７週齢ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの前脛骨筋（ＴＡ）の単一部位に注射した。注射の１〜３ヶ月後に動物を屠殺し、生着したｈｉＰＳＣ由来筋線維の存在を、ヒト核又はヒトスペクトリンに特異的な抗体を使用した横断切片への免疫蛍光により分析した（図１３ａ、ｂ）。対照又はＦＳＨＤ１由来細胞由来の筋原性前駆細胞の移植は、抗ヒト核（それぞれ図１３ａ、１３ｂ）及び抗ヒトスペクトリン（それぞれ図１３ｃ、１３ｄ）に対する反応性を示した。対照的に、注射されていないマウスは、ヒト抗原に対して検出可能な染色を示さなかった（図１３ｅ）。顕著には、通常、注射後１〜３ヶ月後で奇形腫を形成するｈｉＰＳｃと比べて、長続きする生着（３ヶ月）は、注射部位での奇形腫の不在を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【配列表】
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