(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
鱸由来ペプチド抽出物であって、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号７のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号８のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号９のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１０のアミノ酸配列からなるペプチド及び配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチドを含む鱸由来ペプチド抽出物である傷口の癒合促進剤。
【請求項２】
鱸由来ペプチド抽出物であって、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号７のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号８のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号９のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１０のアミノ酸配列からなるペプチド及び配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチドを含む鱸由来ペプチド抽出物であるコラーゲン増殖促進剤。
【請求項３】
鱸由来ペプチド抽出物であって、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号７のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号８のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号９のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１０のアミノ酸配列からなるペプチド及び配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチドを含む鱸由来ペプチド抽出物である血管増殖促進剤。
【請求項４】
鱸由来ペプチド抽出物であって、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号７のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号８のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号９のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１０のアミノ酸配列からなるペプチド及び配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチドを含む鱸由来ペプチド抽出物である免疫細胞活性化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドに関し、特に傷口の癒合、コラーゲン増殖、血管新生、免疫細胞の活性化を促進し、また傷口の感染を減少させることに応用できるペプチドに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
一般に、けがをしたり手術を受けたりした後は、傷口の快復、気力の快復を問わず、いずれも長期の静養が必要となり、また適切な飲食を組み合わせることで最良の快復効果を得ることができる。早期の快復を望む場合によく見られるのは、例えば鱸（スズキ）のスープ等の鱸抽出物といった、傷口を早く癒合させることができる食品や栄養食品、薬を摂取することである。
【０００３】
２０１３年の台湾の鱸の漁獲量は約２６，０９４トン、生産総額は２１．８億元にのぼり、一般家庭やレストランにおいて直接食用にされるものを除いて、多くの鱸は加工製品にされるが、加工後に産出する副産物のうち、魚の皮と骨の割合は３０％にもなる。もしこれらをうまく活用できれば、台湾漁業の付加価値を高められるだけでなく、鱸の加工で出る副産物の処理という問題も効果的に解決することができる。
【発明の概要】
【０００４】
鱸抽出物における有効な成分を知るため、本発明はその中の有効なペプチド成分を確認し、傷口の癒合、コラーゲン増殖、血管新生、免疫細胞の活性化を促進し、また傷口の感染を減少させることができるペプチドを提供する。当該ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、及びその組み合わせのペプチドで構成されるグループから選択されたものを含む。
【０００５】
本発明の一実施例では、当該鱸抽出物は鱸の皮、鱗、骨、或いは肉から抽出される。
【０００６】
本発明の一実施例では、当該鱸抽出物は、ケラチナーゼ（Ｋｅｒａｔｉｎａｓｅ）、トリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ）、ブロメライン（Ｂｒｏｍｅｌａｉｎ）、パパイン（Ｐａｐａｉｎ）、ペプシン（Ｐｅｐｓｉｎ）、アルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）、ニュートラーゼ（Ｎｅｕｔｒａｓｅ）、プロタメックス（Ｐｒｏｔａｍｅｘ）及びフレーバーザイム（Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ）で構成されるグループから選択される酵素により抽出し、得たものである。
【０００７】
本発明の一態様では、傷口癒合促進の用途に用いるペプチドを提供し、当該ペプチドは上記のペプチドを含む。
【０００８】
本発明の別の態様では、上記のペプチドを含む傷口癒合促進剤を提供する。
【０００９】
本発明の一態様では、コラーゲン増殖促進の用途に用いるペプチドを提供し、当該ペプチドは上記のペプチドを含む。
【００１０】
本発明の別の態様では、上記のペプチドを含むコラーゲン増殖促進剤を提供する。
【００１１】
本発明の一態様では、血管増殖促進の用途に用いるペプチドを提供し、当該ペプチドは上記のペプチドを含む。
【００１２】
本発明の別の態様では、上記のペプチドを含む血管増殖促進剤を提供する。
【００１３】
本発明の一態様では、免疫細胞活性化の用途に用いるペプチドを提供し、当該ペプチドは上記のペプチドを含む。
【００１４】
本発明の別の態様では、上記のペプチドを含む免疫細胞活性化剤を提供する。
【００１５】
本発明の実施例のペプチドにより、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１  βの発現量を誘発することができるため、ウィルスや細菌に対抗し、傷口の感染を減少させ、また壊死組織を取り除き、傷口のデブリードメントを助け、傷口の修復を促進することができる。また、本発明の実施例のペプチドにより、ＩＬ−８及びＣＸＣＬ１２の発現を誘発することができるため、傷口により多くの免疫細胞が集まるよう促し、またより多くの免疫細胞を活性化することができる。さらに一方で、本発明の実施例のペプチドは、ＩＬ−１０の発現を抑えることができるため、繊維組織によるコラーゲン分泌を効果的に促進し、傷口の修復及び癒合を助けることができる。それとともに、本発明の実施例のペプチドにより、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１  βの発現を活性化させ、線維芽細胞と角質細胞をさらに活性化することができるため、血管新生を促進するという働きを有する。
【００１６】
本発明が提供するペプチドは上記の効果を有するため、本発明の一実施例では、本発明のペプチドを、例えば傷口の癒合促進剤、コラーゲン増殖促進剤、血管増殖促進剤又は免疫細胞活性化剤といった、関連効果の組成物又は試薬の調製にさらに応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、細胞の模擬傷口で炎症が起きた際に、本発明の実施例のペプチドが細胞ＩＬ−１  βのｍＲＮＡ発現に与えた影響の結果を示す図である。
【図２】図２は、細胞の模擬傷口で炎症が起きた際に、本発明の実施例のペプチドが細胞ＴＮＦ−αのｍＲＮＡ発現に与えた影響の結果を示す図である。
【図３】図３は、細胞の模擬傷口で炎症が起きた際に、本発明の実施例のペプチドが細胞ＩＬ−８のｍＲＮＡ発現に与えた影響の結果を示す図である。
【図４】図４は、細胞の模擬傷口で炎症が起きた際に、本発明の実施例のペプチドが細胞ＣＸＣＬ１２のｍＲＮＡ発現に与えた影響の結果を示す図である。
【図５】図５は、細胞の模擬傷口で炎症が起きた際に、本発明の実施例のペプチドが細胞ＩＬ−１０のｍＲＮＡ発現に与えた影響の結果を示す図である。
【図６】図６は、細胞の模擬傷口で炎症が起きた際に、本発明の実施例のペプチドが細胞ＩＬ−１  βのｍＲＮＡ発現に与えた影響の結果を示す図である。
【図７】図７は、細胞の模擬傷口で炎症が起きた際に、本発明の実施例のペプチドが細胞ＴＮＦ−αのｍＲＮＡ発現に与えた影響の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の実施例のペプチドは、まず鱸のサンプルを処理し、それを酸で処理した後に抽出を行い、抽出した混合物をさらに複合型酵素で加水分解し、加水分解で生成されたものをろ過し、純化すれば得られる。続いて、これらペプチドに対する配列決定及び関連の効果の試験について、以下でさらに詳細に説明する。
【００１９】
（実施例１  鱸抽出物の調製方法）
まず、鱸をスライスマシンで約２〜６ｃｍの大きさに切って原料とする。当該鱸の部位は皮、鱗、骨及び肉を含む。そして、２〜５倍の体積のＲＯ逆浸透水で原料を洗浄し、２〜３回繰り返し洗浄して血や不純物を取り除く。
【００２０】
その後、鱸と酸性液の比率１：５（ｗ／ｖ）で酸による処理を行う。酸の濃度と種類は１〜５％の塩酸、硫酸又は燐酸とする。鱸を１５〜２０℃で１０〜４８時間浸漬した後、２〜５倍の体積のＲＯ逆浸透水で、酸による処理を行った原料を洗浄し、２〜３回繰り返し洗浄して酸を除き、最後に炭酸カルシウムでｐＨ値を４〜８の間に調整する。
【００２１】
鱸のサンプルを準備した後、５５〜１００℃の熱水で１〜６時間抽出を行う。その後３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ろ過して滓を取り除く。さらに０．２〜１％の炭酸カルシウム又は石灰で不純物を取り除いて清澄化する。そして１〜１０μｍのろ過膜でろ過した後、イオン交換樹脂のカラム吸着によってろ過し、不純物と石灰を取り除いて、有効なペプチドをさらに分離、純化する。純化後の有効なペプチドを活性炭脱臭及び脱色処理して，５０〜６０℃で１０〜２０倍に減圧濃縮する。
【００２２】
続いて、複合型酵素を加えて４０〜６０℃で１〜５時間加水分解する。当該複合型酵素は、０．０１％〜０．１％のケラチナーゼ（Ｋｅｒａｔｉｎａｓｅ）及びブロメライン（Ｂｒｏｍｅｌａｉｎ）と、０．１〜５％のパパイン（Ｐａｐａｉｎ）、トリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ）及びペプシン（Ｐｅｐｓｉｎ）と、０．１〜５％のアルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）、ニュートラーゼ（Ｎｅｕｔｒａｓｅ）、プロタメックス（Ｐｒｏｔａｍｅｘ）及びフレーバーザイム（Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ）とを含む。加水分解完了後、８５〜９５℃で１０〜３０分間反応させて酵素を不活性化させた後、冷却する。冷却後、珪藻土及び活性炭でろ過し、ペプチド抽出液を清澄化及び脱臭し、その後もう一度ろ過して、ろ過後の生成物に超高温殺菌（Ｕｌｔｒａ−ｈｉｇｈ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ＵＨＴ）を行い、１３５〜１４０℃で３〜５秒殺菌する。最後に、０．２μｍのろ過膜でろ過して細かい不純物を取り除くと、本発明が必要とする複数種のペプチドを含む鱸の抽出物が得られる。
【００２３】
（実施例２  鱸の抽出物におけるペプチドの配列決定）
鱸の抽出物を適切に希釈した後、遠心分離（１３０００ｒｐｍ、２ｍｉｎ）によって２００μｌの上澄み液を吸い取り、Ｃ１８−ＺｉｐＴｉｐ（Ｍｉｌｌｐｏｒｅ）で脱塩濃縮し、サンプル溶解後１／２の体積を取り、以下の条件でＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行う。ＭＳ／ＭＳスペクトルは、Ｍａｓｃｏｔ解析プログラムを使ってデータベースを検索し、解析を行い、解析結果を得る。
【００２４】
反応条件 ：
質量分析計 ： LTQ XL (Thermo Scientific)
LCシステム ： Agilent 1200 Series
緩衝液A ： ddH2O / 0.1% formic acid
緩衝液B ： 100% ACN / 0.1% formic acid
分析カラム ： C18 reverse phase column
【００２５】
【表１】
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【００２６】
アミノ酸の配列を決定した後、そのうちの１１種のペプチドを確認する。そのアミノ酸の配列は表２に示すＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １〜１１である。
【００２７】
【表２】
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【００２８】
（実施例３  免疫細胞の遺伝子発現量の解析）
ヒトのＴＨＰ−１細胞（ヒト単球系細胞株）を６ウェルの細胞培養プレート（５＊１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）でそれぞれ培養し、且つそれをグループ分けして個別にリポ多糖（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，以下ＬＰＳという）処理を行う。処理方法は表３に示す通りである。
【００２９】
【表３】
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【００３０】
異なる反応物と時間とで処理した各グループの細胞を集めた後、ＲＮＡ単離キット（ＧｅｎｅＭａｒｋ  ＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ）で細胞中のＲＮＡを分離し、さらにｃＤＮＡ合成キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ）によってｃＤＮＡを合成する。その後、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応キット（ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ，  ＫＡＰＡ社）を使って目的の遺伝子を測定し、さらにＡＢＩ  Ｓｔｅｐ  ｏｎｅ  ソフトウエアにより遺伝子発現の解析を行って，遺伝子発現のレベルから鱸抽出物の免疫細胞に対する影響と効果を検討した。その結果を図１〜図７に示す。
【００３１】
まず図１を見ていただきたい。図１は、細胞の模擬傷口で炎症が起きた際に、本発明の実施例の鱸抽出物におけるペプチドが細胞ＩＬ−１  βのｍＲＮＡ発現に与えた影響の結果を示す図である。図１は以下のことを示している。すなわち、ＬＰＳ処理によってＴＨＰ−１細胞株のＩＬ−１  β発現量が上昇し、ＬＰＳ誘導が６時間という前提で、さらに１％及び２％の鱸ペプチドで３時間処理を行った場合のＩＬ−１  β発現量は、それぞれ対照グループ（ＬＰＳ＿６ｈｒ）の４．８倍及び７．９倍であり、ＬＰＳ誘導が９時間という前提で、さらに１％及び２％の鱸ペプチドで６時間処理を行った場合のＩＬ−１  β発現量は、それぞれ対照グループ（ＬＰＳ＿９ｈｒ）の４．３倍及び８．７倍であった。
【００３２】
図２を見ていただきたい。図２は、細胞の模擬傷口で炎症が起きた際に、本発明の実施例の鱸抽出物におけるペプチドが細胞ＴＮＦ−αのｍＲＮＡ発現に与えた影響の結果を示す図である。図２の結果は以下のことを示している。すなわち、ＬＰＳ処理によってＴＨＰ−１細胞株のＴＮＦ−α発現量が上昇し、ＬＰＳ誘導が６時間という前提で、さらに１％及び２％の鱸ペプチドで３時間処理を行った場合のＴＮＦ−α発現量は、それぞれ対照グループ（ＬＰＳ＿６ｈｒ）の３倍及び３．５倍であり、ＬＰＳ誘導が９時間という前提で、さらに１％及び２％の鱸ペプチドで６時間処理を行った場合のＴＮＦ−α発現量は、それぞれ対照グループ（ＬＰＳ＿９ｈｒ）の２．３倍及び４倍であった。そしてＴＮＦ−α及びＩＬ−１  βの誘発は傷口の修復に重要な役目を果たしており、その発現量の増加はウィルスや細菌に対抗し、傷口の感染を減少させ、さらに壊死組織を取り除き傷口のデブリードメントを助けることができる。
【００３３】
図３を見ていただきたい。図３は、細胞の模擬傷口で炎症が起きた際に、本発明の実施例の鱸抽出物におけるペプチドが細胞ＩＬ−８のｍＲＮＡ発現に与えた影響の結果を示す図である。図３の結果は以下のことを示している。すなわち、ＬＰＳ処理によってＴＨＰ−１細胞株のＩＬ−８発現量が上昇し、ＬＰＳ誘導が６時間という前提で、さらに１％及び２％の鱸ペプチドで３時間処理を行った場合のＩＬ−８発現量は、それぞれ対照グループ（ＬＰＳ＿６ｈｒ）の７．６倍及び６．３倍であり、ＬＰＳ誘導が９時間という前提で、さらに１％及び２％の鱸ペプチドで６時間処理を行った場合のＩＬ−８発現量は、それぞれ対照グループ（ＬＰＳ＿９ｈｒ）の４．７倍及び７．９倍であった。
【００３４】
図４を見ていただきたい。図４は、細胞の模擬傷口で炎症が起きた際に、本発明の実施例の鱸抽出物におけるペプチドが細胞ＣＸＣＬ１２のｍＲＮＡ発現に与えた影響の結果を示す図である。図４の結果は以下のことを示している。すなわち、ＬＰＳ処理によってＴＨＰ−１細胞株のＣＸＣＬ１２発現量が上昇し、ＬＰＳ誘導が６時間という前提で、さらに１％及び２％の鱸ペプチドで３時間処理を行った場合のＣＸＣＬ１２発現量は、それぞれ対照グループ（ＬＰＳ＿６ｈｒ）の１．９倍及び３倍であり、ＬＰＳ誘導が９時間という前提で、さらに１％及び２％の鱸ペプチドで６時間処理を行った場合のＣＸＣＬ１２発現量は、それぞれ対照グループ（ＬＰＳ＿９ｈｒ）の１．７倍及び３．２倍であった。ＩＬ−８及びＣＸＣＬ１２の発現量誘発は、免疫システムが傷口においてより多くの免疫細胞が集まるよう促し、また同時により多くの免疫細胞を活性化することができる。
【００３５】
図５を見ていただきたい。図５は、細胞の模擬傷口で炎症が起きた際に、本発明の実施例の鱸抽出物におけるペプチドが細胞ＩＬ−１０のｍＲＮＡ発現に与えた影響の結果を示す図である。図５の結果は以下のことを示している。すなわち、ＬＰＳ処理によってＴＨＰ−１細胞株のＩＬ−１０発現量が低下し、ＬＰＳ誘導が２７時間という前提で、さらに１％及び２％の鱸ペプチドで２４時間処理を行った場合のＩＬ−１０の発現量は、対照グループ（ＬＰＳ＿２７ｈｒ）に対してそれぞれ５４％及び３０％低下した。ＩＬ−１０発現を抑制することの効果は、繊維組織によるコラーゲン分泌を効果的に促進できる点であり、従って傷口の修復と癒合を助けることができる。
【００３６】
図６と図７を同時に見ていただきたい。この２つの図は、細胞の模擬傷口で炎症が起きた際に、本発明の実施例の鱸抽出物におけるペプチドが細胞ＩＬ−１  βのｍＲＮＡとＴＮＦ−αのｍＲＮＡ発現に与えた影響の結果をそれぞれ示す図である。図６の結果は以下のことを示している。すなわち、ＬＰＳ処理によってＴＨＰ−１細胞株のＩＬ−１  β発現量が上昇し、ＬＰＳ誘導が２７時間という前提で、さらに１％及び２％の鱸ペプチドで２４時間処理を行った場合のＩＬ−１  β発現量は、それぞれ対照グループ（ＬＰＳ＿２７ｈｒ）の３．３倍及び５．１倍である。図７の結果は以下のことを示している。すなわち、ＬＰＳ処理によってＴＨＰ−１細胞株のＴＮＦ−α発現量が上昇し、ＬＰＳ誘導が２７時間という前提で、さらに２％の鱸ペプチドで２４時間処理を行った場合のＴＮＦ−α発現量は対照グループ（ＬＰＳ＿２７ｈｒ）の２．３倍である。ＴＮＦ−αとＩＬ−１  βの発現量を活性化させ、また線維芽細胞と角質細胞を同時に活性化することができるため、血管新生を促進する効果を有する。
【００３７】
従って、前記の細胞の模擬傷口が炎症を起こした状態における、ＩＬ−１  β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−８、ＩＬ−１０及びＣＸＣＬ１２発現量の変化による影響から、以下のことがはっきりとわかる。すなわち、本発明が提供するペプチドは、傷口により多くの免疫細胞を集め、またより多くの免疫細胞を活性化することができ、ウィルスや細菌に対抗し、傷口の感染を減少させ、また壊死組織を取り除き、傷口のデブリードメントを助け、傷口の修復を促進する効果を有する。それとともに、繊維組織によるコラーゲン分泌を効果的に促進し、傷口の修復及び癒合を更に助けることができる。また、当該ペプチドにより、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１  βの発現を活性化することで、線維芽細胞と角質細胞をより活性化することができるため、血管新生を促進するという働きを有する。
【００３８】
本発明が提供するペプチドは上記の効果を有するため、本発明のペプチドをさらに利用して、例えば傷口癒合促進剤、コラーゲン増殖促進剤、血管増殖促進剤、免疫細胞活性化剤といった、関連効果の組成物又は試薬の調製に応用することができる。これら組成物又は試薬は、有効量の本発明のペプチド及び賦形剤又は担体等を含んでよく、従って当該組成物又は試薬の形式は、錠剤、カプセル、液体、ゲル、スラリー、懸濁液、散剤、貼り薬、ローション剤、スプレー剤、膜状物であってよく，特に限定されない。さらに、前記組成物又は試薬はその利用方法によって、飲食品に調製して保健関連の食品に応用したり、外部用品の補助として使用したりすることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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