(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属又はアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物に由来するカタラーゼを共存させることを特徴とする、サルコシンオキシダーゼを保存する方法（但し、サルコシンオキシダーゼ及び／又はカタラーゼを、脱水縮合剤を用いて多数個のカルボキシル基を有する多糖類又は多数個のカルボキシル基を有するポリアミノ酸に結合させたものを用いて共存させる場合を除く）。
【請求項２】
クレアチニン又はクレアチン測定試薬においてサルコシンオキシダーゼを保存する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
検体中の測定対象物質を酵素反応させて過酸化水素を発生させ、これをペルオキシダーゼの存在下で発色剤と反応させて比色定量する方法を利用する測定法のための生体成分測定試薬であって、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属又はアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物由来のカタラーゼとサルコシンオキシダーゼとを含み、かつ、前記カタラーゼと前記サルコシンオキシダーゼとが共存する、生体成分測定試薬（但し、サルコシンオキシダーゼ及び／又はカタラーゼを、脱水縮合剤を用いて多数個のカルボキシル基を有する多糖類又は多数個のカルボキシル基を有するポリアミノ酸に結合させたものを用いて共存させる場合を除く）。
【請求項４】
測定対象がクレアチンまたはクレアチニンである、請求項３に記載の生体成分測定試薬。
【請求項５】
請求項３または４に記載の生体成分測定試薬を用いて、生体成分を測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サルコシンオキシダーゼを安定化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血清、尿などの生体試料中のクレアチン、クレアチニンの測定は、腎疾患の指標を与えるものとして臨床的意義が高い。それらの測定には、酸化酵素−ペルオキシダーゼ−酸化還元発色試薬系による生体成分測定法の１種である、サルコシンオキシダーゼ−ペルオキシダーゼ法などの酵素比色法が最もよく用いられている。この方法は、測定対象成分から過酸化水素を生成させ、この過酸化水素を定量することにより測定対象成分の試料中濃度を測定する方法である。
【０００３】
酵素比色系に使用されるサルコシンオキシダーゼ（ＥＣ．１．５．３．１）は、下記反応を触媒する酵素であり、これまで、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）  ｓｐ．、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）  ｓｐ．、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）  ｓｐ．などの微生物から抽出されている。
反応：サルコシン＋Ｏ２＋Ｈ２Ｏ→グリシン＋ホルムアルデヒド＋Ｈ２Ｏ２
【０００４】
一方、最近、簡便性などの理由から無調整液状試薬（以下、単に「液状試薬」とも言う。）が、広く臨床検査に使用されている。このような現状において、試薬中に添加される酵素の安定性は、測定の正確さ、精密さに影響を与えるものとして、重要視されている。
【０００５】
サルコシンオキシダーゼの安定化方法としては、サルコシンオキシダーゼ含有溶液に糖類、アミノ酸類およびキレート剤からなる群から選ばれた少なくとも１種の安定化剤を添加する方法（特許文献１）、グルコン酸またはその塩をサルコシンオキシダーゼ含有溶液に添加する方法（特許文献２）、さらに、水溶性多糖類に共有結合したクレアチニンアミジノヒドロラーゼを試薬の１成分とする方法（特許文献３）が知られている。しかし、溶液状態で長期間（少なくとも上限１０℃以下にて保存した場合、６ケ月以上）の安定性を確保するのに、十分なものとは言えないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特公昭５７−４８９５６
【特許文献２】特開昭５７−３６９８５
【特許文献３】特開昭６１−２４９３８９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、前記サルコシンオキシダーゼ−ペルオキシダーゼ法を用いたクレアチンまたはクレアチニン測定液状試薬における長期間の安定性をさらに向上させるために検討を重ねてきた。その結果、測定感度が低下する場合、その原因の１つとして、サルコシンオキシダーゼの活性が低下していることを見出した。本発明者らは、さらにその原因を究明したところ、溶液中で共存するカタラーゼによりサルコシンオキシダーゼの活性が低下し感度を低下させる場合があることがわかった。
【０００８】
前記サルコシンオキシダーゼ−ペルオキシダーゼ法においては、測定対象成分以外の物質から生成される過酸化水素が測定値の誤差要因となるため、測定対象成分以外の物質から生成された過酸化水素を、カタラーゼを作用させて水と酸素に分解する方法によって消去する方法（消去系）が、一般的に用いられている。このような消去系は、例えば、クレアチニン測定試薬ではクレアチンとサルコシンを消去するために、また、クレアチン測定用試薬では目的成分以外のサルコシンを消去するために、それぞれ使用されている。
【０００９】
すなわち、本発明の目的は、クレアチンまたはクレアチニン測定の液状試薬として用いるサルコシンオキシダーゼのカタラーゼ共存下における液状での長期安定化をはかることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記現状に鑑み、鋭意検討した結果、カタラーゼとして微生物由来のカタラーゼを用いることにより、サルコシンオキシダーゼの溶液中の安定性が向上することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１１】
従来から、カタラーゼを利用する測定系において用いられるカタラーゼとしては、ウシ由来のカタラーゼが一般的に用いられている。本発明者らは、まず、ウシ由来のカタラーゼが溶液中でサルコシンオキシダーゼと共存する場合、サルコシンオキシダーゼの活性を低下させ、測定感度を低下させる場合があることを見出した。そして、前記ウシ由来のカタラーゼのかわりに微生物由来のカタラーゼを用いた場合、サルコシンオキシダーゼの溶液中での活性低下が抑制され、前記測定系おける測定感度低下が抑制されるという驚くべき知見を得た。本発明は、この新知見に基づくものである。
【００１２】
すなわち、本発明は以下の通りである。
項１．
酸化酵素−ペルオキシダーゼ−酸化還元発色試薬系による生体成分測定方法において、測定対象成分以外の成分に由来する過酸化水素をカタラーゼで分解し、次いで、測定対象成分に由来する過酸化水素を定量することにより前記測定対象成分を定量するに際し、前記カタラーゼとして微生物由来のカタラーゼを用いることを特徴とする、カタラーゼ共存下におけるサルコシンオキシダーゼの安定化方法。
項２．
前記カタラーゼが、ポドスポラ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ）属、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）属、プレウロタス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）属、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ボトリオチニア（Ｂｏｔｒｙｏｔｉｎｉａ）属、クラビセプス（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、アジェロミセス（Ａｊｅｌｌｏｍｙｃｅｓ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、メソリゾビウム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、ノゼマ（Ｎｏｓｅｍａ）属、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属およびアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属からなる群より選択される少なくとも１種の微生物に由来するものである、項１に記載の方法。
項３．
前記カタラーゼが、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、又はアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）の微生物に由来するものである、項２に記載の方法。
項４．
前記測定対象成分が、クレアチニン又はクレアチンである、項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
項５．
酸化酵素−ペルオキシダーゼ−酸化還元発色試薬系による生体成分測定試薬であって、微生物由来のカタラーゼとサルコシンオキシダーゼとを含み、かつ、前記カタラーゼと前記サルコシンオキシダーゼとが共存する、生体成分測定試薬。
項６．
測定対象がクレアチンまたはクレアチニンである、項５に記載の生体成分測定試薬。
項７．
項５または６に記載の生体成分測定試薬を用いて、生体成分を測定する方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明では、カタラーゼを含むサルコシンオキシダーゼの溶液において微生物由来のカタラーゼを共存させることにより、１０℃保存で１９ヶ月後のサルコシンオキシダーゼの残存活性が約８７％以上であるサルコシンオキシダーゼ溶液が得られる。従来から用いられているウシ由来のカタラーゼに比べ、微生物由来のカタラーゼがサルコシンオキシダーゼの溶液中での活性低下に対する影響を受けにくいことを意味する。また、クレアチン測定液状試薬としても、１０℃で１９ヶ月保存後の標準液測定感度は、ほとんど低下がみられず良好な安定性を示す。したがって、本発明により、溶液状態で長期間（少なくとも上限１０℃以下にて保存した場合、１９ケ月以上）の安定なサルコシンオキシダーゼ溶液ならびに該溶液を含むクレアチン測定液状試薬ならびにクレアチニン測定液状試薬が得られる。
本発明によれば、カタラーゼとサルコシンオキシダーゼとを含む酸化酵素−ペルオキシダーゼ−酸化還元発色試薬系による生体成分測定において、長期間安定して確度高く測定することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の実施形態の一つは、酸化酵素−ペルオキシダーゼ−酸化還元発色試薬系による生体成分測定方法において、測定対象成分以外の成分に由来する過酸化水素をカタラーゼで分解（このことを「消去」とも表現する。）し、次いで、測定対象成分に由来する過酸化水素を定量することにより前記測定対象成分を定量するに際し、前記カタラーゼとして微生物由来のカタラーゼを用いることを特徴とする、カタラーゼ共存下におけるサルコシンオキシダーゼの安定化方法である。
【００１５】
「酸化酵素−ペルオキシダーゼ−酸化還元発色試薬系」による生体成分測定方法とは、検体中の測定対象物質を酵素反応させて過酸化水素を発生させ、これをペルオキシダーゼの存在下で発色剤と反応させて比色定量する方法を利用する測定法である。このような生体成分測定方法は既に当該技術分野において確立されている。よって、その知見を本発明に適用して、各種試料中の生体成分の量または濃度を測定することができ、その態様は特に制限されない。例えば、尿酸（ＵＡ）、クレアチニン（ＣＲＥ）、クレアチン（ＣＲ）、トリグリセライド（ＴＧ）、コレステロール（ＣＨＯ）などを測定対象とする生体成分測定方法がある。
【００１６】
本発明のサルコシンオキシダーゼの安定化方法は、前記「酸化酵素−ペルオキシダーゼ−酸化還元発色試薬系」による測定系に、さらにサルコシンオキシダーゼを含むことを必要条件の１つとする（サルコシンオキシダーゼ−ペルオキシダーゼ法）。そのような測定法が適用できる測定対象としては、ＣＲＥまたはＣＲが挙げられる。
ＣＲＥ測定方法は以下の通りである。まず、ＣＲＥを基質とするクレアチニンアミジノヒドロラーゼの反応で生じたクレアチンを、さらにクレアチンアミドヒドロラーゼと反応させてサルコシンを生じさせる。次に、サルコシンをサルコシンオキシダーゼを用いて過酸化水素を生じさせる。さらに、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼ−発色剤系により定量することによりＣＲＥ濃度を測定する。
ＣＲ測定は、ＣＲを基質とするクレアチンアミドヒドロラーゼの反応で生じたサルコシンをサルコシンオキシダーゼを用いて過酸化水素を生じさせ、さらに、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼ−発色剤系により定量することによりＣＲ濃度を測定する。
上記のように、測定対象に直接作用する酸化酵素として好適なものがないときは、いわゆる共役反応を適宜設計することにより、ペルオキシダーゼ−発色剤系による濃度測定を可能にすることができる。
【００１７】
ところで、これらの方法では、血清などの試料中に共存する妨害物質、例えばアスコルビン酸、ビリルビンなどの生体内還元物質の影響を受けやすい問題点が知られていたが、それぞれの妨害物質に応じて、いわゆる消去系など種々の対策が検討され、克服されてきた。例えば、アスコルビン酸に対しては、試料にアスコルビン酸オキシダーゼを作用させることにより消去できる。また、ビリルビンに対しては、試料にビリルビンオキシダーゼを作用させることにより消去できる。
【００１８】
さらに、数段階の共役反応を設計した場合は、反応中間体が試料に含まれることにより正誤差を発生するので、これらについても消去系が検討されている。代表的な方法は、測定対象物質に直接作用する酵素以外の酵素を試料に作用させて過酸化水素を生じさせ、反応中間体をカタラーゼで消去した後、測定対象物質に直接作用する酵素を反応系に追加して過酸化水素を発生させ、これをペルオキシダーゼの存在下で発色剤と反応させると同時に、カタラーゼの作用を事実上停止させて比色定量する方法である。
例えば、ＣＲＥ測定の場合は、クレアチニンアミジノヒドロラーゼ以外の酵素（クレアチンアミドヒドロラーゼおよびサルコシンオキシダーゼ）を試料に作用させて、反応中間体（クレアチンなど）に起因して発生した過酸化水素をカタラーゼで消去した後、クレアチニンアミジノヒドロラーゼを反応系に追加して、測定対象であるＣＲＥに起因して発生した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下で発色剤と反応させて比色定量する（このとき、同時に、カタラーゼの作用を実質的に停止させる。）。
【００１９】
本発明のサルコシンオキシダーゼの安定化方法では、上記で説明した「酸化酵素−ペルオキシダーゼ−酸化還元発色試薬系」による測定系に、サルコシンオキシダーゼのほかに、さらに微生物カタラーゼを含むことを必要条件とする。
【００２０】
本発明の方法に用いられる上記カタラーゼの由来微生物は特に限定されない。例えばカビ、細菌および一部の古細菌由来のものが挙げられる。そのような微生物として、ポドスポラ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ）属、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）属、プレウロタス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）属、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ボトリオチニア（Ｂｏｔｒｙｏｔｉｎｉａ）属、クラビセプス（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、アジェロミセス（Ａｊｅｌｌｏｍｙｃｅｓ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、メソリゾビウム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、ノゼマ（Ｎｏｓｅｍａ）属、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属およびアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属からなる群より選択される少なくとも１種の微生物に由来するものが挙げられる。
【００２１】
より具体的には、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ  ａｎｓｅｒｉｎａ，  Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒｏｓｓａ，  Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｆｕｌｖｕｍ，  Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｎｉｄｕｌａｎｓ，  Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｏｓｔｒｅａｔｕｓ，  Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ，  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ，  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ，  Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ，  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ，  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ，  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ，  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ，  Ｂｏｔｒｙｏｔｉｎｉａ  ｆｕｃｋｅｌｉａｎａ，  Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ  ｐｕｒｐｕｒｅａ，  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ，  Ａｊｅｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ，  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ，  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ，  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ，  Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ，  Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ，  Ｎｏｓｅｍａ  ｌｏｃｕｓｔａｅ，  Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚａｅ，  Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ等を例示することができる。細菌などは複数種のカタラーゼを生産することが知られている。
【００２２】
なかでも、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、又はアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）の微生物に由来するものが好ましい。
【００２３】
本発明の方法に用いられるカタラーゼは、１種類のカタラーゼのみを用いてもよいし、２種類以上のカタラーゼを混合して用いてもよい。また、カタラーゼを２種類以上用いる場合には、同一種類の微生物由来のカタラーゼであっても、異なる種類の微生物由来のカタラーゼであってもよい。
【００２４】
これらの微生物由来カタラーゼは種々市販されており、市販品を好ましく用いることができる。また、当業者に周知の常法により、微生物を培養し、該培養物から精製することにより得ることもできる。
【００２５】
本発明の別の実施形態の一つは、酸化酵素−ペルオキシダーゼ−酸化還元発色試薬系による生体成分測定試薬であって、微生物由来のカタラーゼとサルコシンオキシダーゼとを含み、かつ、前記カタラーゼと前記サルコシンオキシダーゼとが共存する、生体成分測定試薬である。好ましい測定対象としては、クレアチンまたはクレアチニンが例示される。また、前記の生体成分測定試薬を用いて生体成分を測定する方法も、また、本発明の実施形態の一つである。
【００２６】
本発明の生体成分測定試薬は、以下の（１）〜（４）を少なくとも含み、かつ、微生物由来のカタラーゼとサルコシンオキシダーゼとが同一組成物中に共存している。
（１）微生物由来のカタラーゼ
（２）サルコシンオキシダーゼ
（３）ペルオキシダーゼ
（４）酸化還元発色試薬
【００２７】
前記試薬は、汎用の自動分析機（例えば、日立７１７０形自動分析機）に適用できるよう構成された試薬（またはキット）であることが好ましい。そのような形態として、例えば、凍結乾燥などの手段により製造された乾燥製剤と溶解液の組み合わせで構成された試薬（またはキット）が挙げられる。好ましくは液状試薬であり、例えば試薬を２つに分包した液状試薬（以下、２試薬系の液状試薬とも記載する。）である。この方法では、試料にまず１種類目の試薬（以下、第一試薬またはＲ１とも記載する。）を添加して一定時間反応させ、次いで２種類目の試薬（以下、第二試薬またはＲ２とも記載する。）をさらに添加して反応させ、この間の吸光度の変化を測定することにより目的成分を定量することが出来る。前記液状試薬において、微生物由来のカタラーゼとサルコシンオキシダーゼとは、Ｒ１またはＲ２の少なくともいずれかに共存する。
前記試薬（またはキット）は、上記の形態のほか、適当な担体に酵素などを担持させた形態のいわゆるドライシステム等と呼ばれるキットやセンサーを用いる方法など、種々の形態をとることができる。
【００２８】
本発明の試薬に用いる微生物由来のカタラーゼについては、上記で説明したとおりである。
【００２９】
本発明の試薬に用いるサルコシンオキシダーゼは、サルコシンおよび水の存在下に作用して、グリシン、ホルムアルデヒドおよび過酸化水素を生成する酵素である。この酵素は、例えばアースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）  ｓｐ  、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）  ｓｐ  、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）  ｓｐ．  、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｔｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．などの微生物から採取されるもの、または、これらの遺伝子を大腸菌等の他の微生物に組み込ませた遺伝子組換え法により、製造されたものなどがあり、また、遺伝子的に性質を改変したものも包含する。
【００３０】
サルコシンオキシダーゼは、緩衝液に溶解されていることが好ましい。従来から、用いられている緩衝液にはトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液などが挙げられるが、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液は濃度、温度によってｐＨが変動しやすいため、近年、体外診断薬の緩衝液としては、ＧＯＯＤ緩衝液が多く用いられるようになってきている。
【００３１】
ＧＯＯＤ緩衝液とは、両性イオン緩衝液であって、その多くは緩衝剤として両性電解質のアミノ酸、特に置換タウリン類あるいはＮ−置換グリシン類を用いてなるが、中には、脂肪族アミンや両性イオン緩衝液でないものも一部含まれている。これらのＧＯＯＤ緩衝剤としては、ＭＥＳ（ｐＫａ６．１５）、Ｂｉｓ−ｔｒｉｓ（ｐＫａ６．４６）、ＡＤＡ（ｐＫａ６．８０）、ＰＩＰＥＳ（ｐＫａ６．８０）、ＡＣＥＳ（ｐＫａ６．９０）、コラミンクロリド（ｐＫａ７．１０）、ＢＥＳ（ｐＫａ７．１５）、ＭＯＰＳ（ｐＫａ７．２０）、ＴＥＳ（ｐＫａ７．５０）、ＨＥＰＥＳ（ｐＫａ７．５５）、ＨＥＰＰＳ（ｐＫａ８．００）、Ｔｒｉｃｉｎｅ（ｐＫａ８．１５）、グリシンアミド（ｐＫａ８．２０）、Ｂｉｃｉｎｅ（ｐＫａ８．３５）、ＴＡＰＳ（ｐＫａ８．４０）、ＣＨＥＳ（ｐＫａ９．５０）およびＣＡＰＳ（ｐＫａ１０．４０）などが例示される。特にＰＩＰＥＳまたはＭＯＰＳが好ましい。
【００３２】
ＧＯＯＤ緩衝液そのもの中には、金属イオンあるいはハロゲンイオン、硝酸イオン等を含有するものではないが、ＧＯＯＤ緩衝剤を用いて所望のｐＨ緩衝液を得る場合には、通常、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ溶液を用いる。
【００３３】
サルコシンオキシダーゼを含むＧＯＯＤ緩衝液とは、上記酵素を溶解させたＧＯＯＤ緩衝液であり、該緩衝液のｐＨは、約６．９〜８．５であることが好ましい。
【００３４】
サルコシンオキシダーゼを含む溶液中のサルコシンオキシダーゼの濃度は、酵素の起源によっても異なるが、通常、約３〜５０Ｕ／ｍｌで好適に用いられる。
【００３５】
本発明のサルコシンオキシダーゼ溶液には、さらに防腐剤、界面活性剤などをサルコシンオキシダーゼの反応に特に悪い影響を及ぼさない範囲で添加してもよい。防腐剤としてはアジ化ナトリウム、キレート剤、抗生物質、防菌剤、防黴剤などが挙げられる。界面活性剤としては非イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、両性イオン界面活性剤などが挙げられる。
【００３６】
また、該緩衝液中にはクレアチンまたはクレアチニン測定に必要な他の試薬、例えばクレアチンアミジノヒドロラーゼ、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、または過酸化水素測定試薬などが含まれていてもよい。
【００３７】
本発明に用いられるペルオキシダーゼとしては、特に限定されないが、西洋ワサビ又は微生物由来等のものが好適なものとして例示される。サルコシンオキシダーゼを含む溶液中のペルオキシダーゼの濃度は、酵素の起源によっても異なるが、通常、約０．５〜１００Ｕ／ｍｌで好適に用いられる。
【００３８】
本発明の試薬に用いる酸化還元系発色試薬は、過酸化水素と反応して呈色するものであれば、いかなる種類の色素を用いてもよく、例えば水素供与体とカップラーの組み合わせ（いわゆるトリンダー試薬）、ロイコ体、テトラゾリウム塩等が挙げられる。その使用量や添加の形態などについては特に限定されない。これらはいずれも、市販品などを入手することができる。
【００３９】
酸化還元系発色試薬としては、例えば、一般的に４−アミノアンチピリンなどのカップラーとフェノールまたはアニリンおよびそれらの誘導体などの水素供与体（色原体ともいう）をペルオキシダーゼ存在下に反応させ、生成する色素の増加を吸光度測定する方法あるいはメタノールとカラターゼを作用させ、生成するホルムアルデヒドを化学的または酵素的に比色定量する方法などが用いられる。
【００４０】
カップラーとしては、４−アミノアンチピリン、３−メチル−２−ベンドチアゾリンヒドラシゾン等が使用されるが特に限定されるものではない。
また、色原体としては、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−２，５−ジメチルアニリン等が挙げられるが特に限定されるものではない。
【実施例】
【００４１】
以下に、本発明を、実施例を用いて説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００４２】
実施例１
下記のクレアチニン測定試薬の第一試薬に、コリネバクテリウム属由来またはアルスロバクター属由来のカタラーゼを試薬中終濃度で５０Ｕ／ｍＬになるように調製して測定試薬とし、調製直後および１０℃保存後の試薬について下記測定条件で測定した。試料としては精製水および標準液として５ｍｇ／ｄＬクレアチニン水溶液を測定し、標準液測定吸光度より精製水測定吸光度を差し引いた吸光度を標準液測定感度として求めた。調製直後の標準液測定感度を１００％として１０℃保存後の標準液測定感度を相対％として算出した。比較例として、カタラーゼを牛由来の東洋紡社製ＣＡＯ−５０９を各々試薬中終濃度で５０Ｕ／ｍＬになるように調製した測定試薬で同様の検討を行なった。
【００４３】
（試薬の調製）
下記組成からなるクレアチニン測定試薬をそれぞれ調製した。
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ７．５
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１）  ５Ｕ／ｍＬ
サルコシンオキシダーゼ（東洋紡社製ＳＡＯ−３４１）  ５Ｕ／ｍＬ
クレアチンアミジノヒドロラーゼ（東洋紡社製ＣＲＨ−２２１）  ３０Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン    ０．０５ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ７．５
クレアチニンアミドヒドロラーゼ（東洋紡社製ＣＮＨ−３１１）  ３００Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）  ２０Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン  ０．３ｇ／Ｌ
【００４４】
（測定法）
日立７１７０形自動分析機を用いた。試料４μＬに第一試薬  １８０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を６０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で５４６ｎｍにおける吸光度を測定した。            
【００４５】
【表１】
0006672581.tif 000002
【００４６】
結果    表１に示す。比較例では保存後の標準液感度の低下があるが、実施例では標準液測定感度の低下がほとんどみられず良好な安定性を示す。
【００４７】
実施例２
実施例１の第一試薬のサルコシンオキシダーゼの活性測定を次の方法で実施し、活性残存率（調製直後の活性値に対する活性値の割合）を調べた。活性残存率（安定性）を表２に示す。
【００４８】
（サルコシンオキシダーゼ活性測定法）
Ａ液：０．２Ｍ  サルコシン溶液、Ｂ液：０．１％４−アミノアンチピリン水溶液、Ｃ液：０．１％フェノール水溶液、Ｄ液：２５Ｕ／ｍｌ  ペルオキシダーゼ水溶液を各々調製し、Ａ液１０ｍｌに、Ｂ液２ｍｌ、Ｃ液およびＤ液各４ｍｌを添加混合し、活性測定試薬とする。当該試薬２ｍｌに対し、被検の酵素溶解液０．１ｍｌを添加後、３７℃でインキュベートし、添加３分後から１分間当たりの波長５００ｎｍにおける吸光度の増加速度から活性を算出する。活性値はＵ／ｍｌ＝  ΔＯＤ（ＯＤｔｅｓｔ−ＯＤｂｌａｎｋ）×３．０５×希釈倍率／（１３．５  ×０．５  ×１  ×１０×０．０５）  式から算出した。
【００４９】
【表２】
0006672581.tif 000003
【００５０】
結果    表１に示す。比較例では保存後のサルコシンオキシダーゼの活性低下が顕著であるが、実施例では１０℃、１９ヶ月保存後の残存率は約８７％以上を示し良好な安定性を示す。
【００５１】
以上のように、本発明では、カタラーゼを含むサルコシンオキシダーゼの溶液において微生物由来のカタラーゼを共存させることにより、１０℃保存で１９ヶ月後のサルコシンオキシダーゼの残存活性が約８７％以上であるサルコシンオキシダーゼ溶液が得られる。従来から用いられているウシ由来のカタラーゼに比べ、微生物由来のカタラーゼがサルコシンオキシダーゼの溶液中での活性低下に対する影響を受けにくいことを意味する。また、クレアチン測定液状試薬としても、１０℃で１９ヶ月保存後の標準液測定感度は、ほとんど低下がみられず良好な安定性を示す。したがって、本発明により、溶液状態で長期間（少なくとも上限１０℃以下にて保存した場合、１９ケ月以上）の安定なサルコシンオキシダーゼ溶液ならびに該溶液を含むクレアチン測定液状試薬ならびにクレアチニン測定液状試薬が得られる。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明によれば、カタラーゼとサルコシンオキシダーゼとを含む酸化酵素−ペルオキシダーゼ−酸化還元発色試薬系による生体成分測定において、長期間安定して確度高く測定することができる。