(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＬＥを予防し、及び／又は、治療するための医薬組成物であって、ラロピプラント及びＣＡＹ１０４７１（ＴＭ３００８９）を含む、医薬組成物。
【請求項２】
ラロピプラント及びＣＡＹ１０４７１が、１つの医薬組成物に配合されている、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
ラロピプラント及びＣＡＹ１０４７１が、同時使用、別々の使用、又は間隔を空けた使用のために、別々の医薬組成物に配合されている、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項４】
ラロピプラント及びＣＡＹ１０４７１が、二次性リンパ性臓器への好塩基球ホーミングを妨害する、請求項１〜３のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項５】
ラロピプラント及びＣＡＹ１０４７１が、自己抗体力価の増大ならびに／又はＳＬＥ紅斑及び／又は臓器傷害の発生を予防し、これらの程度を制限し、或いはこれらを減少させる、請求項１〜３のいずれか一項記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳＬＥを予防し、及び／又は、治療するのに使用するための、ＰＴＧＤＲ−１アンタゴニスト、ＰＴＧＤＲ−２アンタゴニスト、二重ＰＴＧＤＲ−１／ＰＴＧＤＲ−２アンタゴニスト、又は、ＰＴＧＤＲ−１アンタゴニストとＰＴＧＤＲ−２アンタゴニストとの組み合わせ、ならびに、それらを含有する医薬組成物に関する。
【０００２】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、種々の臓器、例えば、関節及び皮膚に影響を及ぼすおそれがあり、腎臓の合併症（ループス腎炎、ＬＮ）が制御されないと死に至る、多因子性自己免疫疾患である。Ｂ細胞疾患であると考えた場合、自然免疫系及び適応免疫系の両方が、ＳＬＥ中に調節不全であり、主に核内抗原（ＡＮＡ）、例えば、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に対する自己抗体である主要なループス病原性因子の生成を協同して増幅する。その抗原及び補体因子に凝集すると、これらの自己抗体は、ターゲット臓器に沈着した場合、慢性炎症を媒介する循環性免疫複合体を形成するであろう。この疾患の紅斑は、通常、強力な免疫サプレッション処置及び高用量のコルチコステロイドにより抑制される。最近の臨床試験では、Ｂ細胞コンパートメントを直接ターゲッティングすることにより、ＳＬＥを有する対象における自己抗体生成を減少させるのが目的とされたが、十分な有効性を証明することができなかった。紅斑が発生するのを予防するための新たな治療戦略を開発することは、生物医学的コミュニティにおける大きな課題である。
【０００３】
好塩基球は、ほとんど表れない循環性白血球の１つであり、アレルギー性及び寄生虫性疾患におけるその関与が周知である。過去１０年の間に、好塩基球について、その弱い存在にも関わらず、強力な免疫レギュラトリー機能を有することが示された。好塩基球が、形質細胞の生存及びｉｎ  ｖｉｖｏでの抗体生成を支持することができ、一方で、一部のＢ細胞活性化因子、例えば、ＢＡＦＦ（Ｂ細胞活性化因子）、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ４０リガンド又はＣＤ１５４）、インターロイキン（ＩＬ）−４及びＩＬ−６を発現することができることが、以前に示された（Voehringer, D., Nat. Rev. Immunol. 13, 362-375 (2013)；Charles, N. et al., Nat. Med. 16, 701-707 (2010)）。この免疫モデュラトリーな役割は、Ｔ細胞及びＢ細胞の分化及び成熟に役立つことができる二次性リンパ性臓器（ＳＬＯ）に蓄積するその能力に関連している（Charles, N. et al., Nat. Med. 16, 701-707 (2010)；Leyva-Castillo, J.M., et al., Nat Commun 4, 2847 (2013)；Otsuka, A., et al., Nat Commun 4, 1739 (2013)）。ＳＬＯへの好塩基球蓄積をもたらすメカニズムは、ほとんど理解されていない。
【０００４】
Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフリガンド１２（ＣＸＣＬ１２）は、骨髄からのストローマ細胞、腹腔、ＳＬＯ、及び腎臓により主に分泌されるケモカインである。ＣＸＣＬ１２は、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフレセプター４（ＣＸＣＲ４）とのその特異的な相互作用を介して、間葉系幹細胞、Ｂ細胞、及び好中球の生理学的分布をレギュレーションすることにより、ホメオスタシスケモカインとして機能する。ＣＸＣＬ１２の過剰発現は、炎症組織において生じ、他の疾患の中でも、ガン及びループス腎炎の病因である（Wang, A., et al., J. Immunol. 182, 4448-4458 (2009)；Balabanian, K., et al., J. Immunol. 170, 3392-3400 (2003)；Hummel, S., Van Aken, H. & Zarbock, A.. Curr. Opin. Hematol. 21, 29-36 (2014)）。
【０００５】
プロスタグランジンＤ２（ＰＧＤ２）は、アラキドン酸から、シクロオキシゲナーゼ及び組織特異的ＰＧＤ２シンターゼ（ＰＧＤＳ）により生成される。ＰＧＤ２は、種々のホメオスタシス機能に寄与し、２つの公知のＰＧＤ２レセプター（ＰＴＧＤＲ）：ＰＴＧＤＲ−１（又は、ＤＰ、Ｄプロスタノイドレセプター）及びＰＴＧＤＲ−２（又は、ＤＰ−２、２型Ｔヘルパー（ＴＨ２）細胞において発現される化学誘引物質レセプター類似分子であるＣＲＴＨ２としても公知）とのその相互作用による、炎症の開始及び消散に関与する。好塩基球は、腹膜血中白血球の中でも、最高レベルに広範囲でのＰＴＧＤＲ−１を発現する。ＰＴＧＤＲ−２発現は、より制限され、好塩基球、好酸球、及びＴＨ２  ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化及び化学遊走を媒介する。これらの２つのレセプターの作用は、競合的であるか、又は、協同的である場合がある。ＰＧＤ２は、アレルギー性及び肺性疾患、潰瘍性大腸炎、及び腎線維症に関与している。リポカリン型ＰＧＤＳ（Ｌ−ＰＧＤＳ）は、炎症している腎臓（Nagata, N., et al., FEBS J 276, 7146-7158 (2009)）及び活動性ＬＮ患者の尿（Suzuki, M., et al., Pediatr. Res. 65, 530-536 (2009)；Somparn, P., et al., J. Proteomics 75, 3240-3247 (2012)）において、de novo発現されることが近年見出された。
【０００６】
しかしながら、ＰＧＤ２／ＰＴＧＤＲ系は、ＳＬＥにおいて特徴付けられていない。
【０００７】
この観点において、国際公開公報第２００９／０８５１７７号には、二重ＰＴＧＤＲ−１／ＰＴＧＤＲ−２アンタゴニストが開示されており、これらのアンタゴニストがＳＬＥを含む疾患リストの予防及び／又は治療に有用である場合があることが示唆されている。しかしながら、この文献において具体的に評価された治療効果は、喘息に対してのみである。ＳＬＥの提案された予防及び／又は治療は、具体化されていない。
【０００８】
本発明者らにより、近年、好塩基球が、自発性マウスＳＬＥモデル（Ｌｙｎ−／−マウス）及び４２名の患者の小さなコホートの両方において、ＳＬＯに蓄積することにより、ＬＮの進行に関与したことが示された。同ＳＬＯにおいて、好塩基球は、自己反応性Ｔ細胞及びＢ細胞を、ＩｇＥ及びＩＬ−４依存性経路により支持する（Charles, N. et al., Nat. Med. 16, 701-707 (2010)）。強力な好塩基球アクチベータ又は化学誘引物質の生成が、ループス発病中に調節不全になることが公知であるため（Pellefigues, C. & Charles, N., Curr. Opin. Immunol. 25, 704-711 (2013)）、ＳＬＥ中の好塩基球のＳＬＯへのリクルートの基礎をなすメカニズムが調査された。
【０００９】
本発明者らにより、好塩基球がこの疾患の紅斑中に活性化される２つの新規な経路が特定された。
【００１０】
組織慢性炎症は、ループスの間に全身濃度が調節不全になる好塩基球活性化因子の分泌をもたらす。ＳＬＥを有する個体の新たなより大きいコホートにおいて、本発明者らにより、好塩基球減少がＳＬＥ患者に特徴的であり、疾患の活動性に関連したことが確認された。さらに、他の腎疾患と比較した場合、好塩基球減少は、ループス腎炎に特異的であった。この好塩基球減少は、好塩基球の一部の公知及び新たな活性化マーカーにおける特異的な発現パターンに関連した。実際には、タンパク質レベル及び好塩基球表面でのＣＸＣＲ４発現は、活動性の患者において顕著に増大し、好塩基球減少に関連する。
【００１１】
本発明者らにより、疾患の活動性及び好塩基球減少が互いに、そして、ＰＧＤ２／ＰＴＧＤＲ及びＣＸＣＬ１２／ＣＸＣＲ４系に密接に関連していたことが見出された。
【００１２】
活動性ループスの対象の好塩基球におけるその変化した発現パターンの他にも、ＣＸＣＲ４及びＣＤ１６４により、ＳＬＥ好塩基球のｅｘ  ｖｉｖｏにおけるＣＸＣＬ１２媒介性遊走の劇的に増大した感受性がもたらされた。非滅菌腹膜炎患者において、本発明者らにより、遊走された好塩基球は、その「非遊走」血中好塩基球対照と比較して、ＣＸＣＲ４を劇的に過剰発現していたことが証明された。このことから、ヒトＣＸＣＲ４＋好塩基球の血管外漏出及び遊走が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＣＸＣＬ１２により誘引され、腹膜での好塩基球減少がもたらされた可能性があることが、強く示唆される。マウスでは、ＣＸＣＬ１２により、注入部位及び対応する排出リンパ節において、ＣＸＣＲ４＋好塩基球の再分布が誘引された。このことから、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＣＸＣＬ１２に対する好塩基球の遊走能が証明される。ヒト及びマウスの両方におけるこれらの遊走能は、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、ＰＧＤ２／ＰＴＧＤＲ系により可能となった。
【００１３】
さらに、本発明者らにより、ＰＧＤ２合成が、ＳＬＥ対象において増大し、好塩基球減少に関連したことが証明された。このＰＧＤ２媒介性ＣＸＣＲ４依存性好塩基球遊走は、少なくとも部分的に、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける好塩基球自体によるその合成に基づくＰＧＤ２の自己分泌作用によるものであった。これにより、ＣＸＣＲ４の外在化がもたらされる。特に、ＳＬＥを有する対象及びＬｙｎ−／−マウスの両方において、本発明者らにより、ＰＧＤ２（ＰＧＤ２／ＰＴＧＤＲ系）が、ループス中に、ＳＬＯへのＣＸＣＲ４依存性好塩基球リクルートを増大させたことが見出された。このことから、ループス傾向マウスにおいて、繰返しのＰＧＤ２注入により観察された疾患の紅斑が説明される。これらのデータは、ループス発病中におけるＰＧＤ２のＣＸＣＲ４媒介性病因作用を強調している。このことから、推定の治療ターゲットとして、両方の系が特定される。
【００１４】
このため、本発明者らにより、ＰＴＧＤＲ特異的アンタゴニストを使用して、ＳＬＥ患者におけるこれらの系を変化させることが、Ｌｙｎ−／−ループス様マウスモデルにおいて示された好塩基球依存性自己抗体生成及び腎臓炎症を打破するものであり、ＳＬＯへの好塩基球ホーミングを妨害することにより、ＳＬＥ紅斑及び長期臓器傷害を制限するものであることが結論付けられた。
【００１５】
本発明者らにより、ループス様マウスモデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏでＰＴＧＤＲと拮抗することは、他の細胞種の割合に影響を及ぼすことなく、短命の形質細胞に影響を及びして、ＳＬＯへのＣＸＣＲ４依存性好塩基球リクルートを妨害することが証明された。この処置により、短命の形質細胞数、腎臓の炎症、及び自己抗体力価を、ほんの１０日において減少させるのが達成された。
【００１６】
定義
「ループス」又は「全身性エリテマトーデス」もしくは「ＳＬＥ」という用語は、本明細書において、その通例の意味で使用され、自己抗体の存在、発疹、口内潰瘍、漿膜炎、神経障害、低血球数、関節痛、及び腫れにより特徴付けられる自己免疫障害を含む。診断に使用される検査は、抗体検査（例えば、抗核抗体（ＡＮＡ）パネル、抗二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、抗リン脂質抗体、抗Ｓｍｉｔｈ抗体）；低白血球、ヘモグロビン、又は血小板を示すためのＣＢＣ；胸膜炎又は心膜炎を示す胸部Ｘ線；腎臓生検；尿中の血液、円柱、又はタンパク質を示す検尿を含む。
【００１７】
「ループス腎炎」は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）により引き起こされる腎臓の炎症により特徴付けられる障害を意味する。ループス腎炎は、糸球体に沈着したＩｇＭ、ＩｇＧ、及びＩｇＡ含有免疫複合体により特徴付けられる。これらの免疫複合体は、核コンポーネントに対する特異性を有する自己抗体（抗核抗体（ＡＮＡ））又は核酸（例えば、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ））に対する特異性を有する自己抗体により形成される。
【００１８】
したがって、本明細書で使用する場合、全身性エリテマトーデス又は「ＳＬＥ」の予防及び／又は治療は、ループス腎炎の予防及び／又は治療を包含する。
【００１９】
本発明の文脈において、「処置すること」又は「処置」という用語は、治療的使用（すなわち、所定の疾患を有する対象における）を指し、このような障害又は状態の１つ以上の兆候の進行を反転させ、緩和し、阻害することを意味する。したがって、処置は、疾患の完全な治癒をもたらす処置のみだけでなく、疾患の進行を遅らせ、及び／又は、対象の生存を伸ばす処置も意味する。
【００２０】
「予防すること」は、予防的使用（すなわち、所定の疾患の進行に感受性の対象における）を意味する。
【００２１】
「プロスタグランジンＤ２」又は「ＰＧＤ２」は、９α，１５Ｓ−ジヒドロキシ−１１−オキソ−プロスタ−５Ｚ，１３Ｅ−ジエン−１−オイック酸（ＩＵＰＡＣ名）（ＣＡＳ番号：４１５９８−０７−６）である。
【００２２】
「ＰＴＧＤＲ−１」又は「ＤＰ」又は「Ｄプロスタノイドレセプター」は、プロスタグランジンＤ２用のレセプターであり、その活性は、アデニラートシクラーゼを刺激して、細胞内ｃＡＭＰの増大をもたらすＧタンパク質により主に媒介される。ヒトＰＴＧＤＲ−１タンパク質の例示的な配列は、UniProtデータベースにおいて、アクセッション番号Q13258（特に、Q13258-1：アイソフォーム１、２０１５年１月７日の登録バージョン１３３）で利用可能である。ＰＴＧＤＲ−１をコードする完全なｍＲＮＡ配列は、Genbankにおいて、アクセッション番号EF577397.1（リリース：１２２；発行日：２０１４年１１月２１日）で利用可能である。
【００２３】
「ＰＴＧＤＲ−２」又は「２型Ｔヘルパー（ＴＨ２）細胞において発現された化学誘引物質レセプター類似分子」もしくは「ＣＲＴＨ２」又は「ＤＰ２」は、プロスタグランジンＤ２用のＧタンパク質共役レセプターであり、ＣＤ４＋エフェクターＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞において優先的に発現されている。ヒトＰＴＧＤＲ−２タンパク質の例示的な配列は、UniProtデータベースにおいて、アクセッション番号Q9Y5Y4（２０１５年１月７日の登録バージョン１２０）で利用可能である。ＰＴＧＤＲ−２をコードする完全なｍＲＮＡ配列は、Genbankにおいて、アクセッション番号AY507142.1（リリース：１２２；発行日：２０１４年１１月２１日）で利用可能である。
【００２４】
本明細書で使用する場合、「アンタゴニスト」という用語は、ターゲット及び／又はシグナル伝達経路の発現及び／又は生物学的活性を、部分的に又は完全に、ブロックし、阻害し、減少させ、又は中和する、任意の分子を意味する。
【００２５】
「ＰＴＧＤＲ−１アンタゴニスト」は、ＰＴＧＤＲ−１タンパク質の発現及び／又は生物学的活性を、部分的に又は完全に、ブロックし、阻害し、中和し、又は妨害する分子を意味する。これは、ＰＧＤ２／ＰＴＧＤＲ−１相互作用を、ブロックし、阻害し、減少させ、又は妨害することを含むが、これらに限定されない。ＰＴＧＤＲ−１アンタゴニストは、例えば、ＰＧＤ２中和抗体、すなわち、ＰＧＤ２に結合し、ＰＧＤ２がＰＴＧＤＲ−１に結合するのを妨害する抗体を含む。
【００２６】
「ＰＴＧＤＲ−２アンタゴニスト」は、ＰＴＧＤＲ−２タンパク質の発現及び／又は生物学的活性を、部分的に又は完全に、ブロックし、阻害し、中和し、又は妨害する分子を意味する。これは、ＰＧＤ２／ＰＴＧＤＲ−２相互作用を、ブロックし、阻害し、減少させ、又は妨害することを含むが、これらに限定されない。ＰＴＧＤＲ−２アンタゴニストは、例えば、ＰＧＤ２中和抗体、すなわち、ＰＧＤ２に結合し、ＰＧＤ２がＰＴＧＤＲ−２に結合するのを妨害する抗体を含む。
【００２７】
適切なアンタゴニスト分子は、具体的には、生体分子、例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、アプタマー、アンチセンス、干渉ＲＮＡ、又は非生物学的な大型又は小型分子（１０kDa未満）、特に、有機小分子を含むが、これらに限定されない。
【００２８】
アンタゴニストは、ＰＴＧＤＲ−１又はＰＴＧＤＲ−２遺伝子発現の阻害剤であることができる。遺伝子発現の阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド及び干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）を含む。
【００２９】
「ｉＲＮＡ」という用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離されたＲＮＡ（部分的に精製されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、リコンビナントに生成されたＲＮＡ）、ならびに、付加、欠失、置換、及び／又は１つ以上のヌクレオチドの改変により天然のＲＮＡとは異なる改変ＲＮＡを含む。このような改変は、非ヌクレオチド材料の、例えば、ＲＮＡの端部又は内部（ＲＮＡの１つ以上のヌクレオチドにおける）への付加を含むことができる。ｉＲＮＡ分子におけるヌクレオチドは、非標準的なヌクレオチドも含むことができる。同ヌクレオチドは、非天然ヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含む。まとめると、このような改変ｉＲＮＡ化合物は全て、天然ＲＮＡの類似体と呼ばれる。ｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉を媒介する能力を有する天然ＲＮＡに十分類似することのみを必要とする。本明細書で使用する場合、「ＲＮＡ干渉を媒介する」という表現は、ＲＮＡ干渉機構又はプロセスにより影響を受けるｍＲＮＡを区別する能力を意味し、これを示す。ＲＮＡ干渉を媒介するＲＮＡは、ＲＮＡ干渉機構と相互作用し、これにより、この機構に特定のｍＲＮＡを分解させ、ターゲットタンパク質の発現を他の方法で減少させる。一実施態様において、ｉＲＮＡ分子は、その配列が対応する特定のｍＲＮＡを開裂させる。配列の完全な対応が存在することは必要なく、この対応は、ｉＲＮＡがターゲットｍＲＮＡの開裂又は同ｍＲＮＡの発現の欠損により、ＲＮＡ干渉阻害させるのを可能にするのに十分である必要がある。ｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡ部分と一部の更なる部分、例えば、デオキシリボヌクレオチド部分とを含むことができる。ＲＮＡ分子におけるヌクレオチドの総数は、ＲＮＡ干渉の効果的な媒介体であるために、適切には、４９個未満である。好ましいＲＮＡ分子では、ヌクレオチド数は、１６〜２９個、より好ましくは、１８〜２３個、及び最も好ましくは、２１〜２３個である。
【００３０】
上記されたように、ｉＲＮＡという用語は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいて開裂されてｓｉＲＮＡを形成することができる他のＲＮＡ種を含むが、これらに限定されない。
【００３１】
「短干渉ＲＮＡ」又は「ｓｉＲＮＡ」は、ＲＮＡ二本鎖（二本鎖領域）を含み、１つ又は２つの一本鎖オーバーハングである３’又は５’オーバーハングを更に含むことができる。
【００３２】
「低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）」は、ターゲット遺伝子の一部に相補的な（ターゲット遺伝子の１つ以上の転写物に相補な）ＲＮＡセグメントを意味し、ステム−ループ（ヘアピン）構造を有する。
【００３３】
「マイクロＲＮＡ」又は「ｍｉＲＮＡ」は、約２２のヌクレオチド長であり、内因的にコードされるＲＮＡであり、同ＲＮＡは、転写後にターゲット遺伝子をレギュレーションし、一般的に、高い組織特異的又は発達段階特異的な方法で発現される。既存のｍｉＲＮＡ遺伝子の特徴に基づいて、人工のｍｉＲＮＡを設計し、発現させることができる。ｍｉＲ−３０（マイクロＲＮＡ３０）アーキテクチャは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター系発現プラスミド（Zeng et al, 2005, Methods enzymol. 392:371-380）からｍｉＲＮＡ（又はｓｉＲＮＡ）を発現させるのに使用することができる。一部の例では、ｍｉＲＮＡ前駆分子は、２つ以上のステム−ループ構造を含むことができる。複数のステム−ループ構造は互いに、リンカー、例えば、核酸リンカー、ｍｉＲＮＡフランキング配列、他の分子、又はそれらの幾つかの組み合わせを介して連結することができる。
【００３４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ターゲットＲＮＡに、ＲＮＡ−ＲＮＡもしくはＲＮＡ−ＤＮＡ又はＲＮＡ−ＰＮＡ（タンパク質核酸；Egholm et al, 1993 Nature 365, 566）相互作用により結合し、このターゲットＲＮＡの活性を変化させる非酵素的核酸分子である。典型的には、アンチセンス分子は、ターゲット配列に対して、アンチセンス分子の連続的な配列に沿って相補である。加えて、アンチセンスＤＮＡは、ＲＮＡを、ＤＮＡ−ＲＮＡ相互作用によりターゲットすることにより、二本鎖中のターゲットＲＮＡを消化するＲＮａｓｅＨを活性化するのに使用することができる。
【００３５】
「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子、すなわち、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子の免疫学的に活性な部分を意味する。したがって、抗体という用語は、抗体分子全体のみではなく、抗体フラグメントならびに抗体及び抗体フラグメントの変異体（誘導体を含む）も包含する。特に、本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（例えば、キメラ、ヒト化、又はヒト抗体）、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体のフラグメント、又はディアボディに相当することができる。
【００３６】
「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の一部、好ましくは、インタクトな抗体の抗原結合領域又は可変領域を含む。抗体フラグメントの例は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｄ、ｄＡｂ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、ＣＤＲ、ディアボディ、及び抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体を含む。
【００３７】
「アプタマー」は、分子認識に関して抗体に対する代替を提供する分類の分子である。アプタマーは、任意の分類のターゲット分子を、高い親和性及び特異性で仮想的に認識する能力を有するオリゴヌクレオチド又はオリゴペプチド配列である。このようなリガンドは、Tuerk C. and Gold L., Science, 1990, 249(4968):505-10に記載された、ランダム配列ライブラリのSystematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment（ＳＥＬＥＸ）により単離することができる。ランダム配列ライブラリは、ＤＮＡのコンビナトリアル化学合成により得ることができる。このライブラリにおいて、各メンバーは、固有の配列の最終的に化学修飾された直線状オリゴマーである。この分類の分子の可能性ある修飾、使用、及び利点は、Jayasena S.D., Clin. Chem., 1999, 45(9):1628-50にレビューされている。ペプチドアプタマーは、プラットフォームタンパク質により提示される立体構造的に拘束された抗体可変領域、例えば、ツーハイブリッド法（Colas et al., Nature, 1996,380, 548-50）によりコンビナトリアルライブラリから選択されたE. coliチオレドキシンＡからなる。
【００３８】
本願全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、全ての具体的に言及された特徴と、任意の追加的な特定されていない特徴とを包含すると解釈されたい。本明細書で使用する場合、「含む」という用語の使用は、具体的に言及された特徴以外の特徴が存在しない（すなわち、「からなる」）実施態様も開示する。
【００３９】
さらに、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、複数系を除外するものではない。
【００４０】
本発明の説明
本発明は、ＳＬＥを予防し、及び／又は、治療するための方法に使用するためのＰＴＧＤＲ−１アンタゴニストに関する。また、本発明は、ＳＬＥを予防し、及び／又は、治療するための医薬を製造するための、ＰＴＧＤＲ−１アンタゴニストの使用に関する。さらに、本発明は、ＳＬＥを予防し、及び／又は、治療するのを必要とする患者において、ＳＬＥを予防し、及び／又は、治療するための方法であって、前記患者にＰＴＧＤＲ−１アンタゴニストを投与することを含む、方法に関する。
【００４１】
別の態様によれば、本発明は、ＳＬＥを予防し、及び／又は、治療するための方法に使用するためのＰＴＧＤＲ−２アンタゴニストに関する。また、本発明は、ＳＬＥを予防し、及び／又は、治療するための医薬を製造するための、ＰＴＧＤＲ−２アンタゴニストの使用に関する。さらに、本発明は、ＳＬＥを予防し、及び／又は、治療するのを必要とする患者において、ＳＬＥを予防し、及び／又は、治療するための方法であって、前記患者にＰＴＧＤＲ−２アンタゴニストを投与することを含む、方法に関する。
【００４２】
ＰＴＧＤＲ−１アンタゴニスト
実施態様によれば、前記ＰＴＧＤＲ−１アンタゴニストは、小分子（small molecule）アンタゴニストである。
【００４３】
数多くのＰＴＧＤＲ−１アンタゴニストが、当技術分野において説明されている。
【００４４】
前記小分子アンタゴニストは、特に、以下に開示された式Ｉ〜ＶＩで表示される化合物からなる群より選択される。
【００４５】
（ｉ）国際公開公報第０３０６２２００号に記載された式（Ｉ）
【化１】
0006770522.tif 000002
［式中、
ｎが、０又は１であり、ｍが、１、２、又は３であり、Ｒ１が、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、ハロゲン化Ｃ１〜Ｃ３アルキル、又はシクロプロピルであり、Ｒ２が、４−クロロフェニル又は２，４，６−トリクロロフェニルである］
で表示される化合物及びその薬学的に許容し得る塩。
【００４６】
好ましくは、式Ｉで表示される化合物は、以下に示された立体配置を有する（すなわち、キラル中心がＲ配置を有する）。
【化２】
0006770522.tif 000003
【００４７】
特に、式Ｉ又はＩＩで表示される化合物は、ラロピプラント、すなわち、（−）−［４−（４−クロロベンジル）−７−フルオロ−５−（メタン−スルホニル）−１，２，３，４−テトラヒドロシクロペンタ［ｂ］インドール−３−イル］酢酸：
【化３】
0006770522.tif 000004
及びその薬学的に許容し得る塩である。
【００４８】
ラロピプラントは、脂質代謝異常を処置するためのナイアシンにより誘引される潮紅を阻害することについて、ＦＤＡにより認可されている。
【００４９】
（ｉｉ）国際公開公報第０１７９１６９号に開示された化合物、すなわち、２−［（１Ｒ）−９−（４−クロロベンジル）−８−（（Ｒ）−メチル−スルフィニル）−２，３，４，９−テトラヒドロ−１Ｈ−カルバゾール−１−イル］酢酸もしくはその薬学的に許容し得る塩、又は、２−［（１Ｒ）−９−（４−クロロベンジル）−８−（（Ｓ）−メチル−スルフィニル）−２，３，４，９−テトラヒドロ−１Ｈ−カルバゾール−１−イル］酢酸もしくはその薬学的に許容し得る塩。
【００５０】
（ｉｉｉ）国際公開公報第０２０８１８６号に開示された化合物：
【化４】
0006770522.tif 000005
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が、それぞれ独立して、（１）水素及び（２）Ｒｃからなる群より選択され、
Ｒ４及びＲ５が、それぞれ独立して、（１）Ｈ、（２）Ｆ、（３）ＣＮ、（４）Ｃ１〜６アルキル、（５）ＯＲａ、及び（６）Ｓ（Ｏ）ｎＣ１〜６アルキルからなる群より選択され、そしてここで、前記アルキル基はそれぞれ、場合により、ハロゲンにより置換されており、又は、
同じ炭素原子上のＲ４及びＲ５が、オキソを表わし、又は、
同じ炭素原子上又は隣接する炭素原子上のＲ４及びＲ５がまとまって、３又は４員環を形成しており、同環が、０又は１つのＮ、Ｓ、又はＯから選択されるヘテロ原子を含有し、場合により、Ｆ、ＣＦ３、及びＣＨ３から選択される１つ又は２つの基により置換されており、
Ｒ６が、（１）Ｈ、（２）ＯＲａ及びハロゲンから独立して選択される１〜６個の基により場合により置換されているＣ１〜６アルキル、ならびに、（３）１〜４個のハロゲンにより場合により置換されているヘテロシクリルからなる群より選択され、又は、
隣接する炭素原子に付着しているＲ５及びＲ６が共に、３又は４員環を形成しており、同環が、０又は１つのＮ、Ｓ、又はＯから選択されるヘテロ原子を含有し、Ｆ、ＣＦ３、及びＣＨ３から選択される１つ又は２つの基により場合により置換されており、
Ｘが、Ｃ＝Ｏ、ＳＯ２、及びＣ１〜４アルキルからなる群より選択され、そしてここで、前記アルキルが、場合により、１〜６個のハロゲンにより置換されており、
Ａｒが、アリール又はヘテロアリールであり、それぞれ、場合により、Ｒｃから独立して選択される１〜４個の基により置換されており、
Ｑが、（１）ハロゲン、（２）アリール、（３）ヘテロアリール、（４）ＯＨ、（５）ＯＣ１〜６アルキル、（６）ＣＯＯＨ、（７）ＣＯＮＲａＲｂ、（８）Ｃ（Ｏ）ＮＳＯ２Ｒ７、（９）テトラゾリルから独立して選択される１〜６個の基により場合により置換されているＣ１〜６アルキルであり、そしてここで、アリール、ヘテロアリール、及びアルキルがそれぞれ、場合により、ハロゲン、ＣＦ３、及びＣＯＯＨから独立して選択される１〜６個の基により置換されており、
Ｑ及びＲ６が共に、３又は４員環を形成しており、同環が、場合により、Ｎ、Ｓ、又はＯから選択されるヘテロ原子を含有し、場合により、（１）ハロゲン、（２）オキソ、（３）ＯＲａ、（４）ＣＯＯＨ、（５）Ｃ（Ｏ）ＮＨＳＯ２Ｒ７、及び（６）テトラゾリルから独立して選択される１つ又は２つの基により置換されており、
Ｒ７が、（１）１〜６個のハロゲンで場合により置換されているＣ１〜６アルキル、（２）アリール、及び（３）ヘテロアリールからなる群より選択され、そしてここで、前記アリール及びヘテロアリールが、場合により、ハロゲン、ＯＣ１〜５アルキル、Ｃ１〜５アルキルにより置換されており、そしてここで、前記アルキルが、場合により、１〜６個のハロゲンにより置換されており、
Ｒａ及びＲｂが、ハロゲン及び１〜６個のハロゲンで場合により置換されているＣ１〜６アルキルから独立して選択され、
Ｒｃが、（１）ハロゲン、（２）ＣＮ、（３）ハロゲン、ＮＲａＲｂ、Ｃ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（ＯＲａ）ＲａＲｂ、及びＯＲａから独立して選択される、１〜６個の基で場合により置換されているＣ１〜６アルキル、（４）ハロゲン及びＯＲａから独立して選択される、１〜６個の基で場合により置換されているＣ２〜６アルケニル、（５）ヘテロシクリル、（６）アリール、（７）ヘテロアリール、（８）Ｃ（Ｏ）Ｒａ、（９）Ｃ（ＯＲａ）ＲａＲｂ、（１０）Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、（１１）ＣＯＮＲａＲｂ、（１２）ＯＣＯＮＲａＲｂ、（１３）Ｓ（Ｏ）ｎＲ７、（１４）ＮＲａＣ（Ｏ）ＯＣ１〜６アルキル（式中、アルキルが、場合により、１〜６個のハロゲンにより置換されている）、及び（１５）Ｓ（Ｏ）ｎＮＲａＲｂであり、そしてここで、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールが、場合により、ハロゲンから独立して選択される１〜４個の基により置換されており、ｎが、０、１、又は２である］
ならびに、その薬学的に許容し得る塩、水和物、及びエステル。
【００５１】
（ｉｖ）国際公開公報第０３０６２２００号に開示された化合物：
【化５】
0006770522.tif 000006
［式中、
ｎが、０又は１であり、ｍが、１、２、又は３であり、Ｒ１が、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、ハロゲン化Ｃ１〜Ｃ３アルキル、又はシクロプロピルであり、Ｒ２が、４−クロロフェニル又は２，４，６−トリクロロフェニルである］
及びその薬学的に許容し得る塩。
【００５２】
特に、式ＩＶで表示される化合物は、（−）−［４−（４−クロロベンジル）−７−フルオロ−５−（メタンスルホニル）−１，２，３，４−テトラヒドロシクロペンタ［ｂ］インドール−３−イル］酢酸：すなわち、
【化６】
0006770522.tif 000007
又はその薬学的に許容し得る塩である。
【００５３】
（ｖ）国際公開公報第２００４１０３９７０号に開示された化合物：
【化７】
0006770522.tif 000008
［式中、
ｍが、１又は２であり、Ｒ１が、１〜５個のハロゲン原子で場合により置換されているＣ１〜Ｃ３アルキルである］
及びその薬学的に許容し得る塩。
【００５４】
前記式Ｖで表示される化合物は、特に、
［（３Ｒ）−４−［（１Ｓ）−１−（４−クロロフェニル）エチル］−７−フルオロ−５−（メチルスルホニル）−１，２，３，４−テトラヒドロシクロペンタ［ｂ］インドール−３−イル］酢酸及びその薬学的に許容し得る塩、
［（１Ｒ）−９−［（１Ｓ）−１−（４−クロロフェニル）エチル］−６−フルオロ−８−（メチルスルホニル）−２，３，４，９−テトラヒドロ−１Ｈ−カルバゾール−１−イル］酢酸及びその薬学的に許容し得る塩、
［（１Ｒ）−９−［（１Ｒ）−１−（４−クロロフェニル）−２−フルオロエチル］−６−フルオロ−８−（メチルスルホニル）−２，３，４，９−テトラヒドロ−１Ｈ−カルバゾール−１−イル］酢酸及びその薬学的に許容し得る塩、ならびに、
［（１Ｒ）−９−［（１Ｒ）−１−（４−クロロフェニル）−２，２−ジフルオロエチル］−６−フルオロ−８−（メチルスルホニル）−２，３，４，９−テトラヒドロ−１Ｈ−カルバゾール−１−イル］酢酸及びその薬学的に許容し得る塩
からなる群より選択される。
【００５５】
（ｖｉ）欧州特許第２７６２１４１号に記載された、［２−（オキサゾール−２−イル）−５−（４−｛４−［（プロパン−２−イル）オキシ］フェニルスルホニル｝ピペラジン−１−イル）フェノキシ］酢酸
【化８】
0006770522.tif 000009
又はその薬学的に許容し得る塩。この化合物は、公知の方法、例えば、国際公開公報第２００７／０３７１８７号又は同第２００８／１２３３４９号に記載された方法に基づいて合成することができる。
【００５６】
例示的なＰＴＧＤＲ−１アンタゴニストは、国際公開公報第９７／００８５３号、同第９８／２５９１９号、同第０１／６６５２０号、同第０２／０９４８３０号、同第０３／０２２８１４号、同第０３／０７８４０９号、及び同第２００４／１０３３７０号；欧州特許出願公開公報第９４５４５０号、同第９４４６１４号、及び同第１３０５２８６号；ならびに米国特許出願公開公報第２００４０２２０２３７号、同第２００７０２４４１０７号、及び同第２００８０１９４６００号において、ＰＧＤ２拮抗活性を有すると記載された化合物を含むが、これらに限定されない。これらの文献は全て、その全体が参照により組み入れられる。
【００５７】
他の実施態様によれば、ＰＴＧＤＲ−１アンタゴニストは、生体分子アンタゴニストである。
【００５８】
例えば、前記ＰＴＧＤＲ−１アンタゴニストは、ＰＴＧＤＲ−１に対する、抗体、好ましくは、モノクローナル抗体もしくは抗体フラグメント、又はアプタマーである。ポリクローナル又はモノクローナル抗体を製造する方法は、当業者に容易に利用可能である。
【００５９】
前記ＰＴＧＤＲ−１アンタゴニストは、ＰＴＧＤＲ−１発現を阻害する、アンチセンス又は干渉ＲＮＡであることもできる。
【００６０】
実施態様において、前記ＰＴＧＤＲ−１アンタゴニストは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、国際公開公報第０２／０８１６２８号に開示された、配列番号：４４１５〜配列番号：５４８３の内の１つを含むか、又は、からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００６１】
ＰＴＧＤＲ−２アンタゴニスト
実施態様によれば、前記ＰＴＧＤＲ−２アンタゴニストは、小分子（small molecule）アンタゴニストである。
【００６２】
数多くのＰＴＧＤＲ−１アンタゴニストが、当技術分野において説明されている。
【００６３】
一部の実施態様では、ＰＴＧＤＲ−２アンタゴニストは、下記からなる群より選択される。
【００６４】
（ｉ）国際公開公報第２０１３０８８１０９号に開示された化合物：
【化９】
0006770522.tif 000010
［式中、
Ｒ１が、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ２が、ハロゲンであり、
Ｒ３が、ハロ、ＯＨ、ＣＮ、Ｒ６、ＣＯＲ６、ＣＨ２Ｒ６、ＯＲ６、ＳＲ６、ＳＯ２Ｒ６、又はＳＯ２ＹＲ６から選択される１つ以上の置換基で場合により置換されている、アリール又はヘテロアリールであり、
Ｒ６が、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、又はヘテロアリールであり、それらのいずれかが、ハロ、ＯＨ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、又はＯ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）から選択される１つ以上の置換基で場合により置換されていることができ、
Ｙが、ＮＨ又は直鎖もしくは分岐Ｃ１〜Ｃ４アルキレン鎖であり、
Ｒ４が、Ｈ又はＣ１〜Ｃ４アルキルであり、
Ｒ５が、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アリール、（ＣＨ２）ｍＯＣ（＝Ｏ）Ｃ１〜Ｃ６アルキル、（（ＣＨ２）ｍＯ）ｎＣＨ２ＣＨ２Ｘ、（ＣＨ２）ｍＮ（Ｒ７）２、又はＣＨ（（ＣＨ２）ｍＯ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ８）２であり、
ｍが、１又は２であり、
ｎが、１〜４であり、
Ｘが、ＯＲ７又はＮ（Ｒ７）２であり、
Ｒ７が、水素又はメチルであり、
Ｒ８が、Ｃ１〜Ｃ８アルキルである］
又はその薬学的に許容し得る塩、水和物、溶媒和物、又は錯体。
【００６５】
（ｉｉ）欧州特許第０２４２５１８号に記載されたシクロアルカノ（１，２−ｂ）インドール−スルホンアミド
【化１０】
0006770522.tif 000011
［式中、
Ｒ１が、Ｈ、フッ素、メチル、メトキシ、ベンジルオキシ、又はヒドロキシルであり、
Ｒ２が、フッ素、塩素、トリフルオロメチル、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又はメトキシにより置換されているフェニルであり、
Ｙが、０又は１である］
又はその薬学的に許容し得る塩。
【００６６】
特に、式ＶＩＩＩで表示される化合物は、下記からなる群から選択される。
−欧州特許第１０５１３９８号に記載された、ラマトロバン（（Ｒ）−３−［［（４−フルオロフェニル）スルホニル］アミノ］−１，２，３，４−テトラヒドロ−９Ｈ−カルバゾール−９−プロパン酸）：
【化１１】
0006770522.tif 000012
又はその熱力学的に安定な形態、
−及び、ラマトロバンの類似物、特に、ＴＭ３０６４２（３−｛３−［（４−フルオロ−ベンゼンスルホニル）−メチル−アミノ］１，２，３，４−テトラヒドロ−カルバゾール−９−イル｝−プロピオン酸）：
【化１２】
0006770522.tif 000013
ＴＭ３０６４３（［３−（４−フルオロ−ベンゼンスルホニルアミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロ−カルバゾール−９−イル］−酢酸）：
【化１３】
0006770522.tif 000014
ＴＭ３００８９（ＣＡＹ１０４７１とも呼ばれる）（ＣＡＳ  ６２７８６５−１８−３:２−［３−［（４−フルオロフェニル）スルホニル−メチルアミノ］−１，２，３，４−テトラヒドロカルバゾール−９−イル］酢酸）：
【化１４】
0006770522.tif 000015
【００６７】
（ｉｉｉ）ＯＣ０００５４９（５−フルオロ−２−メチル−３−（２−キノリニルメチル）−１Ｈ−インドール−１−酢酸）
【化１５】
0006770522.tif 000016
【００６８】
（ｉｖ）セチピプラント
【化１６】
0006770522.tif 000017
【００６９】
ＡＺＤ１９８１（４−（アセチルアミノ）−３−［（４−クロロフェニル）チオ］−２−メチル−１Ｈ−インドール−１−酢酸）。
【００７０】
更なるＰＴＧＤＲ−２アンタゴニストは、下記公報：欧州特許第１，１７０，５９４号、同第１，４３５，３５６号、国際公開公報第２００３／０６６０４６号、同第２００３／０６６０４７号、同第２００３／０９７０４２号、同第２００３／０９７５９８号、同第２００３／１０１９６１号、同第２００３／１０１９８１号、同第２００４／００７４５１号、同第２００４／０３２８４８号、同第２００４／０３５５４３号、同第２００４／１０６３０２号、同第２００５／０１９１７１号、同第２００５／０５４２３２号、同第２００５／０１８５２９号、同第２００５／０４０１１２号、ドイツ国特許第２，４０７，３１８号、国際公開公報第２００５／０４０１１４号、同第２００５／０４４２６０号、同第２００５／０９５３９７号、同第２００５／１００３２１号、同第２００５／１０２３３８号、同第２００５／１２３７３１号、同第２００６／０３４４１９号、同第２００６／０９５１８３号、同第２００７／１０７７７２号、同第２００８０２４７４６号、米国特許第７，４０５，２１５号に見出すことができる。これらの文献はそれぞれ、その全体が参照により組み入れられる。
【００７１】
他の実施態様によれば、ＰＴＧＤＲ−２アンタゴニストは、生体分子アンタゴニストである。
【００７２】
例えば、前記ＰＴＧＤＲ−２アンタゴニストは、ＰＴＧＤＲ−２に対する、抗体、好ましくは、モノクローナル抗体もしくは抗体フラグメント、又はアプタマーである。実施態様において、前記ＰＴＧＤＲ−２アンタゴニストは、例えば、国際公開公報第２０１４１４４８６５号に記載された、ＰＴＧＤＲ−２発現細胞を枯渇させる抗体である。
【００７３】
前記ＰＴＧＤＲ−２アンタゴニストは、ＰＴＧＤＲ−２発現を阻害する、アンチセンス又は干渉ＲＮＡであることもできる。
【００７４】
二重ＰＴＧＤＲ−１／ＰＴＧＤＲ−２アンタゴニスト
本明細書で使用する場合、二重ＰＴＧＤＲ−１／ＰＴＧＤＲ−２アンタゴニストは、ＰＴＧＤＲ−１及びＰＴＧＤＲ−２それぞれに対するアンタゴニスト活性の比が１：１０〜１０：１、特に、１：５０〜５０：１、好ましくは、１：１００〜１００：１、更に好ましくは、１：２５０〜２５０：１である、アンタゴニストである。
【００７５】
本発明の枠組みにおいて使用することができる二重ＰＴＧＤＲ−１／ＰＴＧＤＲ−２アンタゴニストは、例えば、国際公開公報第２００９／０８５１７７号に記載された化合物：
【化１７】
0006770522.tif 000018
［式中、
Ｒ１が、アルキル又はシクロアルキルであり、Ｒ２が、ハロ、アルキル、ハロアルキル、アルコキシ、ハロアルコキシ、又はシクロアルキルであり、Ｘが、クロロ又はフルオロである］
及びその薬学的に許容し得る塩を含む。
【００７６】
好ましくは、前記式ＶＩで表示される化合物は、ＡＭＧ８５３（２−（４−（４−（tert−ブチルカルバモイル）−２−（２−クロロ−４−シクロプロピルフェニルスルホンアミド）フェノキシ）−５−クロロ−２−フルオロフェニル）酢酸）：
【化１８】
0006770522.tif 000019
である。
【００７７】
ＡＭＧ８５３及びこの化合物を調製する方法は、Liu et al., ACS Med Chem Lett. 2011 Mar 2;2(5):326-30にも記載されている。
【００７８】
ただし、ある実施態様では、式ＶＩで表示される二重ＰＴＧＤＲ−１／ＰＴＧＤＲ−２アンタゴニストは、本発明の範囲から除外される。
【００７９】
ＰＴＧＤＲ−１及び／又はＰＴＧＤＲ−２に対する分子のアンタゴニスト活性の特徴決定は、例えば、Liu et al., ACS Med Chem Lett. 2011 Mar 2;2(5):326-30に記載された方法により行うことができる。これらの方法は、下記を含む。
【００８０】
（ｉ）ＰＴＧＤＲ−１及び／又はＰＴＧＤＲ−２に対する分子のＩＣ５０を決定すること。これは、例えば、ヒトＰＴＧＤＲ−１又はＰＴＧＤＲ−２を安定して発現しているＨＥＫ−２９３細胞において行うことができる。結合を測定するために、検出可能にラベルされたＰＧＤ２、例えば、［３Ｈ］−ＰＧＤ２を、ＨＥＫ−２９３（ＰＴＧＤＲ−１又はＰＴＧＤＲ−２）細胞と共に、アッセイされる分子の増大する濃度の存在下においてインキュベーションする。インキュベーション後、細胞を洗浄し、細胞に結合した状態のラベルされたＰＧＤ２量を、適切な方法（例えば、［３Ｈ］−ＰＧＤ２の場合には、シンチレーションカウント）により測定する。［３Ｈ］−ＰＧＤ２の結合の５０％阻害を達成するのに必要とされる化合物濃度（ＩＣ５０）を決定した。結合バッファーは、０．５％ ＢＳＡ（バッファー結合）又は５０％ ヒト血漿（血漿結合）のいずれかを含有する。
【００８１】
（ｉｉ）ＰＴＧＤＲ−１に対する分子の親和性を決定すること。これを、例えば、クエン酸デキストロースバキュテナー管に吸引された全血において、試験分子又はＤＭＳＯで処理し、ついで、ＰＧＤ２の用量応答により刺激することで行うことができる。ついで、細胞を溶解し、ｃＡＭＰを、競合的ＥＬＩＳＡを使用して測定する。ＤＭＳＯのみを含有するサンプルと、試験分子を含有するサンプルとにおけるＰＧＤ２に対する用量応答の比較を、Ｓｃｈｉｌｄ式（Schild HO. PA2, a new scale for the measurement of drug antagonism. Brit J Pharmacol 1947;2:189-206）を使用するＫｂを決定するのに使用する。
【００８２】
（ｉ）ＰＴＧＤＲ−２に対する分子の親和性を決定すること。これを、例えば、クエン酸デキストロース抗凝固管に吸引された全血において、試験分子又はＤＭＳＯで処理し、ついで、ＰＧＤ２の用量応答により刺激することで行うことができる。蛍光色素コンジュゲート抗体を使用して、ＰＴＧＤＲ−２陽性顆粒球をラベルする。ＰＴＧＤＲ−２レセプターの内部移行を、フローサイトメトリーによりモニターする。Ｋｂを、Ｓｃｈｉｌｄ式を使用して決定する。
【００８３】
単独又は組み合わせでの処置
両ＰＴＧＤＲが協同する可能性があるため、ＰＴＧＤＲ−１及びＰＴＧＤＲ−２の両方を拮抗することは、ループスを治療し、及び／又は、予防するのに有利な治療法である。さらに、これにより、２つのＰＧＤ２レセプターの一方のみをターゲットにする場合、ブロックされないＰＴＧＤＲによる、好塩基球及び他の細胞におけるＰＧＤ２作用の増強の何らかのリスクが避けられるべきである。
【００８４】
実施態様によれば、前記ＰＴＧＤＲ−１（又はＰＴＧＤＲ−２アンタゴニスト）は、二重ＰＴＧＤＲ−１／ＰＴＧＤＲ−２アンタゴニストである。
【００８５】
別の実施態様によれば、前記ＰＴＧＤＲ−１アンタゴニストは、二重ＰＴＧＤＲ−１／ＰＴＧＤＲ−２アンタゴニストではない。前記実施態様では、ＰＴＧＤＲ−１アンタゴニストは、ＳＬＥの予防及び／もしくは治療のための唯一の活性成分（単独処置）として、又は、ＳＬＥの予防及び／もしくは治療のための少なくとも（二重ＰＴＧＤＲ−１／ＰＴＧＤＲ−２アンタゴニストではない）ＰＴＧＤＲ−２アンタゴニストとの組み合わせにおいてのいずれかで使用される。
【００８６】
別の実施態様によれば、前記ＰＴＧＤＲ−２アンタゴニストは、二重ＰＴＧＤＲ−１／ＰＴＧＤＲ−２アンタゴニストではない。前記実施態様では、ＰＴＧＤＲ−２アンタゴニストは、ＳＬＥの予防及び／もしくは治療のための唯一の活性成分（単独処置）として、又は、ＳＬＥの予防及び／もしくは治療のための少なくとも（二重ＰＴＧＤＲ−１／ＰＴＧＤＲ−２アンタゴニストではない）ＰＴＧＤＲ−１アンタゴニストとの組み合わせにおいてのいずれかで使用される。
【００８７】
加えて、実施態様において、ＰＴＧＤＲ−１アンタゴニスト、ＰＴＧＤＲ−２アンタゴニスト、又はＰＴＧＤＲ−１アンタゴニストとＰＴＧＤＲ−２アンタゴニストとの組み合わせが、ループスを処置するための任意の他の標準的な治療との組み合わせで使用される。ループスの処置に有用な治療剤は、非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、ヒドロキシクロロキン、コルチコステロイド、シクロホスファミド、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノラール酸モフェチル（ＭＭＦ）（ColleCept（登録商標））、ベリムマブ、デヒドロエピアンドロステロン、及びリツキシマブを含むが、これらに限定されない。
【００８８】
ＰＴＧＤＲ−１及び／又はＰＴＧＤＲ−２アンタゴニストと、場合により更に、ループスの処置のための標準的な治療剤とは、前記ＰＴＧＤＲ−１及び／又はＰＴＧＤＲ−２アンタゴニストならびに、場合により更に、ループスの処置のための標準的な治療剤と、少なくとも１つの担体、賦形剤、又は希釈剤とを含む、１つ以上の医薬組成物に配合される。
【００８９】
「薬学的に」又は「薬学的に許容し得る」は、哺乳類、特に、ヒトに適切に投与された場合、有害なアレルギー性又は他の望ましくない反応を生じない分子実体及び成分を意味する。薬学的に許容し得る担体、賦形剤、又は希釈剤は、任意の種類の、無毒性の固体、半固体、又は液体の充填材、希釈剤、カプセル化材料、又は配合助剤を意味する。
【００９０】
本発明の組成物に使用することができる薬学的に許容し得る担体及び賦形剤は、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、自己乳化薬剤送達システム（ＳＥＤＤＳ）、例えば、ｄ−ａ−トコフェロールポリエチレングリコール１０００スクシナート、薬学的な投与形態に使用される界面活性剤、例えば、Tween又は他の類似するポリマー性送達マトリックス、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、バッファー物質、例えば、ホスファート、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩又は電解質、例えば、硫酸カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアクリラート、ロウ、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、及び羊毛脂を含むが、これらに限定されない。
【００９１】
当業者に理解されるように、医薬組成物は、意図された投与経路に適合するように安定的に配合される。適切な投与経路の例は、局所経路、経口経路、鼻内経路、眼内経路、非経口経路（例えば、筋肉内、皮下、静脈内、腹腔内、又は局所注入を含む）を含む。組成物が消化管及び腸の酵素から活性原理を保護することができる経口投与に適した形態にあるという条件で、経口経路を使用することができる。
【００９２】
好ましくは、本医薬組成物は、注射剤について薬学的に許容し得る担体を含有する。本医薬組成物は、特に、無菌で、等張性の生理食塩水（リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、もしくは塩化マグネシウム等、又は、このような塩の混合物）、又は、滅菌水又は生理食塩水を適切に加えることにより注射用溶質を形成することができる乾燥、特に、凍結乾燥された組成物であることができる。
【００９３】
組み合わせ治療のために、（ｉ）ＰＴＧＤＲ−１アンタゴニスト及びＰＴＧＤＲ−２アンタゴニスト、（ｉｉ）ＰＴＧＤＲ−１アンタゴニスト及びループスの処置のための標準的な治療剤、（ｉｉｉ）ＰＴＧＤＲ−２アンタゴニスト及びループスの処置のための標準的な治療剤、又は（ｉｖ）ＰＴＧＤＲ−１アンタゴニスト、ＰＴＧＤＲ−２アンタゴニスト、及びループスの処置のための標準的な治療剤が、１つの医薬組成物に配合され、又は、前記ＰＴＧＤＲ−１アンタゴニスト、ＰＴＧＤＲ−２アンタゴニスト、及びループスの処置のための標準的な治療剤が、同時使用、別々の使用、又は間隔を空けた使用のために、別々の医薬組成物に配合される。
【００９４】
このため、本発明は、ＳＬＥを予防し、及び／又は、治療するための方法に使用するための、ＰＴＧＤＲ−１アンタゴニスト及びＰＴＧＤＲ−２アンタゴニスト；又は二重ＰＴＧＤＲ−１／ＰＴＧＤＲ−２アンタゴニスト；ＰＴＧＤＲ−１アンタゴニスト及びループスの処置のための標準的な治療剤；ＰＴＧＤＲ−２アンタゴニスト及びループスの処置のための標準的な治療剤；ＰＴＧＤＲ−１アンタゴニスト、ＰＴＧＤＲ−２アンタゴニスト、及びループスの処置のための標準的な治療剤；又は二重ＰＴＧＤＲ−１／ＰＴＧＤＲ−２アンタゴニスト及びループスの処置のための標準的な治療剤を含む医薬組成物も提供する。
【００９５】
したがって、ＳＬＥを予防し、及び／又は、治療するのを必要とする患者において、ＳＬＥを予防し、及び／又は、治療するための方法であって、前記患者に、ＰＴＧＤＲ−１アンタゴニスト及びＰＴＧＤＲ−２アンタゴニスト又は二重ＰＴＧＤＲ−１／ＰＴＧＤＲ−２アンタゴニストを投与することを含む、方法が提供される。前記方法の実施態様において、ループスの処置のための標準的な治療剤を、ＰＴＧＤＲ−１アンタゴニスト及びＰＴＧＤＲ−２アンタゴニスト又は二重ＰＴＧＤＲ−１／ＰＴＧＤＲ−２アンタゴニストと共に投与する更なる工程である。ＳＬＥを予防し、及び／又は、治療するのを必要とする患者において、ＳＬＥを予防し、及び／又は、治療するための方法であって、前記患者に、ＰＴＧＤＲ−１アンタゴニスト又はＰＴＧＤＲ−２アンタゴニストと、ループスの処置のための標準的な治療剤とを投与することを含む、方法も、本発明の一部を構成する。
【００９６】
また、本発明は、ＳＬＥを予防し、及び／又は、治療するための方法において、同時使用、別々の使用、又は間隔を空けた使用のために、組み合わせられた調製物として使用するための、ＰＴＧＤＲ−１アンタゴニスト及びＰＴＧＤＲ−２アンタゴニスト；又は二重ＰＴＧＤＲ−１／ＰＴＧＤＲ−２アンタゴニスト；ＰＴＧＤＲ−１アンタゴニスト及びループスの処置のための標準的な治療剤；ＰＴＧＤＲ−２アンタゴニスト及びループスの処置のための標準的な治療剤；ＰＴＧＤＲ−１アンタゴニスト、ＰＴＧＤＲ−２アンタゴニスト、及びループスの処置のための標準的な治療剤；又は二重ＰＴＧＤＲ−１／ＰＴＧＤＲ−２アンタゴニスト及びループスの処置のための標準的な治療剤に関する。
【００９７】
本発明のＳＬＥを予防し、及び／又は、治療する方法は、好ましくは、有効量のＰＴＧＤＲ−１及び／もしくはＰＴＧＤＲ−２アンタゴニストならびに／又はループスの処置のための標準的な治療剤を使用する。
【００９８】
「有効量」という表現は、所定の疾患を予防し、及び／又は、治療するのに十分な量を意味することを意図している。この量は、利用される治療剤の有効性、使用される任意の担体の性質、疾患の重症度、及び患者の年齢により変動するであろうことが理解されるであろう。任意の所定の組成物に適切な量の決定は、適切な治療レベルを評価するのに設計された一連の標準的な試験から、当業者の範囲内である。
【００９９】
本発明によれば、ＰＴＧＤＲ−１アンタゴニスト及び／又はＰＴＧＤＲ−２アンタゴニストは、二次性リンパ性臓器への好塩基球ホーミングを妨害する。
【０１００】
本発明の枠組みにおいて、ＰＴＧＤＲ−１アンタゴニスト及び／又はＰＴＧＤＲ−２アンタゴニストは、自己抗体力価の増大及び／又はＳＬＥ紅斑の発生を予防し、これらの程度を制限し、これらを減少させる。代替的に又は更に、ＰＴＧＤＲ−１アンタゴニスト及び／又はＰＴＧＤＲ−２アンタゴニストは、特に、腎臓、心臓、肺、及び脳に対する臓器傷害の発生も予防し、この程度を制限し、これを減少させる。実施態様において、ＰＴＧＤＲ−１アンタゴニスト及び／又はＰＴＧＤＲ−２アンタゴニストは、ループス腎炎の発生を予防し、この程度を制限し、これを減少させる。
【０１０１】
本発明は、下記図面及び実施例を考慮して更に例示されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】ヒト血中好塩基球ゲーティング戦略及びＳＬＥ疾患活動性の関数における活性化状態  （ａ）対照（ＣＴ、ｎ＝１００）と比較した、無症状、中程度、又は活動性ＳＬＥ（それぞれ、ｎ＝６０／４０／８２）を有する対象からの血中好塩基球における、ＣＤ２０３ｃレベルのフローサイトメトリー分析。（ｂ）対照（ＣＴ、ｎ＝９０）と比較した、無症状、中程度、又は活動性ＳＬＥ（それぞれ、ｎ＝４３／３３／６６）を有する対象からの血中好塩基球における、ＣＤ６２Ｌレベルのフローサイトメトリー分析。（ｃ）対照（ＣＴ、ｎ＝１２）と比較した、無症状、中程度、又は活動性ＳＬＥ（それぞれ、ｎ＝１４／６／１２）を有する対象からの血中好塩基球における、ＣＤ６３レベルのフローサイトメトリー分析。（ａ〜ｃ）データを、対照の平均に対して正規化し、任意単位において、平均＋ｓ．ｅ．ｍ．として表現する。統計学的分析は、マン−ホイットニー検定によった。ＮＳ：有意差なし、＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１。
【図２】好塩基球減少及び好塩基球活性化状態は、疾患の活動性と相関し、他の活動性腎疾患の中でも、ループス腎炎に特異的である。  （ａ）オンライン法で定義された、健康な対照（ＣＴ）及び無症状、中程度、又は活動性ＳＬＥを有する対象（それぞれ、ｎ＝８７／５８／３８／８４）からのフローサイトメトリーにより決定された、１μLあたりの血中好塩基球。（ｂ）線形目盛で示された、血中好塩基球数とＳＬＥＤＡＩとの間の標本相関（ｒ＝−０．３６２９、ｐ＜０．０００１）。（ｃ）健康な対照（ＣＴ）及び無症状、中程度、又は活動性ＳＬＥを有する対象（それぞれ、ｎ＝９６／６０／４０／８４）からのフローサイトメトリーにより決定された、血中ＨＬＡ−ＤＲ＋好塩基球の割合。（ｄ）ＳＬＥ患者（ｎ＝１８４）対対照（ｎ＝９７）におけるＨＬＡ−ＤＲ＋好塩基球の割合（太線、ＡＵＣ＝０．９０９１）及びＳＬＥ患者（ｎ＝１２３）対対照（ｎ＝３９）におけるｄｓＤＮＡ特異的ＩｇＧ力価（破線、ＡＵＣ＝０．８３８４）の受信者動作特性（ＲＯＣ）分析。（ｅ）健康な対照と比較した、下記の活動性腎疾患：ＩｇＡ−Ｎ：ＩｇＡ腎症；ＨＳＰ：ヘノッホ−シェーンライン紫斑病腎症、ＤＮ：糖尿病性腎症；ＭＮ：膜性腎症、ＯＧＮ：他の糸球体腎症；ＮＧＫＤ：非糸球体腎疾患；ａＬＮ：活動性ループス腎炎を有する対象からの（ａ）におけるのと同じ、１μLあたりの血中好塩基球（それぞれ、ｎ＝４０／２０／３９／２２／４２／４６／８１／８７）。（ｆ）対照（ｎ＝９６）と比較した、（ｅ）におけるのと同じ活動性腎疾患を有する患者（それぞれ、ｎ＝４０／２０／３９／２１／５１／４７／７７）における血中ＨＬＡ−ＤＲ＋好塩基球の割合。（ａ、ｃ、ｅ、ｆ）データを、平均＋ｓ．ｅ．ｍ．として表現する。統計学的分析は、マン−ホイットニー検定によった。健康な対照の中央値に対する比較を、各バーの上方に示し、示された場合、対応するバーに示す。ＮＳ：有意差なし、＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１。
【図３】ＰＧＤ２／ＰＴＧＤＲ及びＣＸＣＬ１２／ＣＸＣＲ４系は、ＳＬＥ患者特異的好塩基球表現型に寄与する。  （ａ）健康な対照（ＣＴ）及び無症状、中程度、又は活動性ＳＬＥを有する対象（それぞれ、ｎ＝７１／４８／３１／６０）からの血中好塩基球におけるＰＴＧＤＲ−２（ＣＲＴＨ２）レベルのフローサイトメトリー分析。（ｂ）ＥＩＡにより測定された、対照及び無症状、中程度、又は活動性ＳＬＥを有する個体（それぞれ、ｎ＝２９／３１／１９／３７）からの血漿中の１１β−プロスタグランジンＦ２α（１１β−ＰＧＦ２α）レベル。（ｃ）低い（ｎ＝５１）又は高い（ｎ＝３４）１１β−ＰＧＦ２α血漿レベル（それぞれ、ＣＴ力価平均＋２標準偏差を下回る又は上回る力価）に基づいて分類されたＳＬＥを有する対象における血液１μlあたりの血中好塩基球。（ｄ）ＣＴ及び無症状、中程度、又は活動性ＳＬＥを有する対象（それぞれ、ｎ＝６６／３２／２０／５１）からの血中好塩基球におけるＣＸＣＲ４レベルのフローサイトメトリー分析。（ｅ）ＥＬＩＳＡにより測定された、対照及び無症状、中程度、又は活動性ＳＬＥを有する個体（それぞれ、ｎ＝６３／４３／２９／５９）からの血漿中のＣＸＣＬ１２レベル。（ｆ）ＣＴ及び無症状、中程度、又は活動性ＳＬＥを有する対象（それぞれ、ｎ＝３３／１５／７／２６）からの血中好塩基球におけるＣＤ１６４レベルのフローサイトメトリー分析。（ａ、ｄ、ｆ）データを、ＣＴ値の平均に対して正規化し、任意単位として表現する。（ａ〜ｆ）統計学的分析は、マン−ホイットニー検定によった。健康な対照の中央値に対する比較を、各バーの上方に示し、示された場合、対応するバーに示す。データを、平均＋ｓ．ｅ．ｍ．として表現する。ＮＳ：有意差なし、＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１。
【図４】血漿１１β−ＰＧＦ２α及びＣＸＣＬ１２の力価、好塩基球ＣＸＣＲ４及びＣＤ１６４の発現レベル、ならびに、ループス特異的好塩基球減少間の関連  （ａ）対数目盛で示された、血液１mLあたりの血中好塩基球数と、１１β−ＰＧＦ２α血漿レベルとの間の標本相関（ｒ＝−０．２５８５、Ｐ＝０．０１６９、ｎ＝８５）。（ｂ）対数目盛で示された、血液１mLあたりの血中好塩基球数と、好塩基球における相対的なＣＸＣＲ４レベル（図２ｄにおいて定義）との間の標本相関（ｒ＝−０．４６９２、Ｐ＜０．０００１、ｎ＝１０１）。（ｃ）低い又は高いＣＸＣＬ１２血漿レベル（それぞれ、対照力価平均＋２標準偏差を下回る又は上回る力価）に基づいて分類された活動性ＳＬＥを有する患者における血液１μlあたりの血中好塩基球。データを、平均＋ｓ．ｅ．ｍ．として表現する。統計学的分析は、マン−ホイットニー検定によった。＊：Ｐ＜０．０５。（ｄ）対数目盛で示された、血液１mLあたりの血中好塩基球数と、好塩基球における相対的なＣＤ１６４レベル（図２ｆにおいて定義）との間の標本相関（ｒ＝−０．４１６５、Ｐ＝０．００２９、ｎ＝４９）。
【図５】ｅｘ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣＸＣＲ４媒介性好塩基球遊走は、ＰＧＤ２により向上される。  （ａ）健康な対照（ＣＴ、ｎ＝６）及びＳＬＥ患者（ｎ＝６）からのヒト血中好塩基球の、ＣＸＣＬ１２勾配に対する遊走アッセイ法。（ｂ）ＩＬ−３、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ２、及びＰＧＤ２勾配に対する、健康な対照（対照、それぞれ、ｎ＝８／４／３／４／７）及びＳＬＥ患者（ＳＬＥ、それぞれ、ｎ＝６／３／６／３／５）からのヒト血中好塩基球の遊走アッセイ法。（ｃ）ＥＬＩＳＡにより測定され、対照の平均値（ｎ＝３８）に対して正規化された、無症状、中程度、又は活動性ＳＬＥ個体（それぞれ、ｎ＝４１／２９／５１）からの血漿中の相対的なｄｓＤＮＡ特異的ＩｇＥレベル。（ａ〜ｃ）統計学的分析は、ＣＴと比較して、マン−ホイットニー検定によった。（ｄ）ＰＧＤ２、マウス抗ヒトＩｇＥ、又はＩＬ−３を含まず（−）又は含んだ（＋）、１８時間のインキュベーション後の血中好塩基球におけるＣＸＣＲ４発現レベルを、フローサイトメトリーにより評価した。（ｅ）ＣＸＣＬ１２勾配に対して（ｄ）におけるのと同様に刺激されたヒト血中好塩基球の遊走アッセイ法。（ｄ、ｅ）統計学的分析は、対応のあるスチューデントｔ検定によった。（ｆ）腹膜透析を受けている患者及び非殺菌腹膜炎を処置されている患者（ｎ＝６）からの腹膜及び血中好塩基球間の示された好塩基球マーカーの発現レベル変動を、フローサイトメトリーにより評価した。統計学的分析は、理論値０と比較した、１サンプルのｔ検定によった。（ａ、ｂ、ｅ）本方法で記載された補正された遊走。（ａ〜ｆ）データを、平均＋ｓ．ｅ．ｍ．として表現する。ＮＳ：有意差なし、＃：Ｐ＝０．０６、＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１。
【図６】最適以下のＩｇＥ媒介性好塩基球活性化により、ヒト好塩基球における増大したＰＴＧＤＲ−２発現がもたらされる。  ＰＧＤ２、マウス抗ヒトＩｇＥ、又はＩＬ−３を含まず（−）又は含んだ（＋）、１８時間のインキュベーション後の、健康なドナーからの血中好塩基球におけるＰＴＧＤＲ−２（ＣＲＴＨ２）発現レベル（オンライン法において定義）。統計学的分析は、対応のあるスチューデントｔ検定によった。
【図７】ＰＧＤ２は、ループス傾向マウスに生じているＳＬＯへのＣＸＣＬ１２依存性好塩基球ホーミングを向上させるのに十分である。  （ａ）ＷＴ全体又はＬｙｎ−／−脾細胞からの好塩基球のＣＸＣＬ１２に対するｅｘ  ｖｉｖｏ遊走。（ｂ）加齢のＷＴ（ｎ＝１６）及びＬｙｎ−／−（ｎ＝１４）動物における示されたコンパートメントからの好塩基球でのＣＸＣＲ４発現レベル。データを、ＷＴ血中好塩基球のＣＸＣＲ４の平均発現レベルに対して正規化する。統計学的分析を、対応する遺伝子型の血液コンパートメントに対する１つの所定のコンパートメントについての値と比較して、各バーの上方に直接載せた。各コンパートメントについての両遺伝子型間の統計学的分析も示す。（ｃ）ＰＢＳ又はＣＸＣＬ１２の腹腔内（ｉｐ）注入後２４時間での、定常状態（−）値（それぞれ、ｎ＝１３／１５／５）と比較した、若いＷＴマウスにおける腹膜あたりの好塩基球数。（ｄ）ＰＢＳ注入マウスの平均値に対して正規化された、ＰＢＳ又はＰＧＤ２  ｉｐ注入後２４時間での、若いＬｙｎ−／−マウスの腸間膜リンパ節（ｍＬＮ）からの好塩基球におけるＣＸＣＲ４発現レベル。（ｅ）示された化合物のｉｐ注入後２４時間での若いＬｙｎ−／−マウスのｍＬＮにおける好塩基球数。（ｆ）示された化合物と共に２４時間ｅｘ  ｖｉｖｏでインキュベーションされ、対照の平均値に対して正規化された１５週齢ＷＴマウスからの脾臓好塩基球におけるＣＸＣＲ４発現レベル。（ａ〜ｆ）データを、平均±ｓ．ｅ．ｍ．として表現する。好塩基球数及びＣＸＣＲ４発現を、フローサイトメトリーにより評価した。統計学的分析は、ウェルチ補正を使用する対応のないｔ検定（ａ〜ｅ）及び対応のあるスチューデントｔ検定（ｆ）によった。ＮＳ：有意差なし、＃：Ｐ＝０．０５８、＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１。
【図８】マウスへのＣＸＣＬ１２又はＰＧＤ２のｉｐ注入により、ＳＬＯ及び腹膜におけるＣＸＣＲ４依存性好塩基球蓄積が誘引される。  （ａ）ＰＢＳ（ｎ＝１３）又はＣＸＣＬ１２（ｎ＝１５）の腹腔内（ｉｐ）注入後２４時間での、定常状態（−）値（ｎ＝５）と比較した、若いＷＴマウスの腸間膜リンパ節（ｍＬＮ）中の生きたＣＤ４５＋細胞における好塩基球の割合（×１０３）。（ｂ）示された化合物のｉｐ注入後２４時間での若いＬｙｎ−／−マウスの脾臓における好塩基球数。（ｃ）示された化合物のｉｐ注入後２４時間でのＬｙｎ−／−マウスの腹膜における好塩基球数。データを、平均±ｓ．ｅ．ｍ．として表現する。統計学的分析は、ウェルチ補正を使用する対応のないスチューデントｔ検定によった。ＮＳ：有意差なし、＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１。
【図９】ｃＡＭＰ及びＰＴＧＤＲ特異的アゴニストは、ｅｘ  ｖｉｖｏにおけるマウス脾臓好塩基球によるＣＸＣＲ４発現に作用する。  （ａ〜ｂ）フローサイトメトリーにより決定された、示された濃度のＮ６，２’−Ｏ−ジブチリル−アデノシン  ３’：５’−サイクリック一リン酸（ｄｂ−ｃＡＭＰ）又は１μM ＰＧＤ２を含まず（−）又は含んで（＋）、４時間インキュベーションされた脾細胞中の、好塩基球（ＣＤ１９−ＴＣＲβ−ＣＤ３−ＣＤ４９ｂ＋ＦｃεＲＩα＋ＣＤ１２３＋ＣＤ４５ｌｏとして定義）及びＴ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＴＣＲβ＋細胞として定義）における相対的なＣＸＣＲ４発現レベル。統計学的分析は、対応のあるスチューデントｔ検定によった。ＮＳ：有意差なし、＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１。（ｃ）フローサイトメトリーにより決定された、示された濃度（nM）の示された化合物：ＤＫ−ＰＧＤ２：１３，１４−ジヒドロ−１５−ケト−ＰＧＤ２（ＰＴＧＤＲ−２特異的アゴニスト）；ＢＷ２４５ｃ：３−（３−シクロへキシル−３−ヒドロキシプロピル）−２，５−ジオキソ−（Ｒ＊，Ｓ＊）−（±）−４−イミダゾリンヘプタン酸（ＰＴＧＤＲ−１特異的アゴニスト）を含まず（０）又は含んで、４時間インキュベーションされた脾臓好塩基球（（ａ）において定義）における相対的なＣＸＣＲ４発現レベル。統計学的分析は、２要因−ＡＮＯＶＡ、続けて、テューキー多重比較検定によった。（ａ〜ｃ）データを、対照の平均値に対して正規化する（群あたりに、ｎ＝４〜８）。データを、平均＋ｓ．ｅ．ｍ．として表現する。全ての実験を、８〜１２週齢ＷＴマウスからの脾細胞により実現した。
【図１０】ＳＬＯへの好塩基球蓄積の妨害により、ループス様疾患活動性が弱められる。  （ａ、ｂ）ＰＢＳ（白丸）又はＰＧＤ２単独（白四角）を１０日にわたって注入された１０〜１２週齢Ｌｙｎ−／−マウス、及び、ＰＧＤ２注入され、本方法で記載されたように好塩基球を枯渇され（ＭＡＲ−１）（白菱形）又は枯渇されていない（ＩｇＧ）（白三角）同マウスからの腸間膜（ａ）又は他の（子宮頸管、上腕、及び鼠径部）リンパ節（ｂ）における、シングレットの生きたＣＤ４５＋細胞の中での好塩基球（ＣＤ１９−ＴＣＲβ−ＣＤ４９ｂ＋ＦｃεＲＩα＋ＣＤ１２３＋ＣＤ４５ｌｏ）の割合。（ｃ）（ｂ）におけるのと同じマウスからのＬＮ好塩基球におけるＩＡ−ＩＥ発現レベル。ＮＡ：非該当。（ｄ、ｅ）（ｂ）におけるのと同じマウスにおける脾臓（ｄ）及びリンパ節（ｅ）における、シングレットの生きたＣＤ４５＋細胞の中での短命の形質細胞ＣＤ１９＋ＣＤ１３８＋の割合。（ｆ）（ｂ）で示されたマウスからの腎臓におけるＣ３及びＩｇＧ沈着についての代表的な免疫蛍光染色（スケールバー＝１mm）ならびに、ＰＢＳ（ｎ＝３）、ＰＧＤ２（ｎ＝４）、ＰＧＤ２＋対照ＩｇＧ（ｎ＝３）、及びＰＧＤ２＋ＭＡＲ−１（ｎ＝３）注入マウスにおけるその対応する定量。（ｇ）１０日の期間にわたるＰＢＳ又はＰＧＤ２処置の前後での、尿中アルブミン／クレアチニン比の増大  倍。（ａ〜ｅ）好塩基球、形質細胞数、及びＩＡ−ＩＥ発現レベルを、フローサイトメトリーにより評価した。（ａ〜ｇ）データを、平均±ｓ．ｅ．ｍ．として表現する。統計学的分析は、対応のないスチューデントｔ検定によった。＃：Ｐ＝０．０５７１、＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１。３つの独立した実験の内の１つの代表例を示す。
【図１１】ＳＬＯにおける好塩基球蓄積の妨害により、ループス様疾患活動性が弱められる。  ＰＴＧＤＲ−１及びＰＴＧＤＲ−２アンタゴニストで１０日間処置された（ｎ＝８）又は処置されていない（媒体、ｎ＝９）、加齢のＬｙｎ−／−マウスからの腎臓におけるＣ３及びＩｇＧ沈着についての免疫蛍光染色の定量。
【図１２】ＰＴＧＤＲをターゲッティングすることにより、ＳＬＯにおけるＣＸＣＲ４媒介性好塩基球蓄積が妨害され、ループス様疾患活動性が弱められる。  （ａ〜ｈ）オンライン法で記載されたように、ＰＴＧＤＲ−１及びＰＴＧＤＲ−２アンタゴニストで１０日間処置された又は処置されていない（媒体）、加齢の野生型（ＷＴ）及びＬｙｎ−／−マウスとの間の比較。（ａ、ｂ、ｃ）リンパ節（子宮頸管、腋の下、鼠径部、及び腸間膜）（ａ）及び脾臓（ｂ）における生きたＣＤ４５＋細胞の中での好塩基球のフローサイトメトリー分析。（ｃ）脾臓好塩基球におけるＣＸＣＲ４発現レベル。（ｄ）（ａ）におけるのと同じリンパ節における生きたＣＤ４５＋細胞の中での短命の形質細胞ＣＤ１９＋ＣＤ１３８＋の割合を、フローサイトメトリーにより決定した。（ｅ）ＥＬＩＳＡにより測定された、示されたマウスからの血漿中のｄｓＤＮＡ特異的ＩｇＧの４５０nmでの光学密度（Ｏ．Ｄ．）値（×１０３）。（ｆ）ＥＬＩＳＡにより測定された、示されたマウスからの血漿中の総ＩｇＥレベル。（ｇ、ｈ）ＥＬＩＳＡにより測定された、示されたマウスからの総腎臓タンパク質抽出物１mgあたりのＩＬ−４（ｇ）及びＩＬ−１β（ｈ）濃度（pg）。（ａ〜ｈ）ＷＴ媒体、ｎ＝５；ＷＴ処置、ｎ＝４；Ｌｙｎ−／−媒体、ｎ＝８；Ｌｙｎ−／−処置、ｎ＝８。データを、平均±ｓ．ｅ．ｍ．として表現する。統計学的分析は、対応のないスチューデントｔ検定によった。ＮＳ：有意差なし、＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１。
【図１３】ＰＴＧＤＲアンタゴニストによる処置により、ＳＬＯにおける好塩基球蓄積が特異的に減少し、短命の形質細胞数及び血清ＡＮＡ力価の減少がもたらされる。  （ａ〜ｄ）ＰＴＧＤＲ−１及びＰＴＧＤＲ−２アンタゴニストで１０日間処置された又は処置されていない（媒体）、加齢の野生型（ＷＴ）とＬｙｎ−／−マウスとの間の比較。（ａ、ｂ）ＣＤ４５＋骨髄（ＢＭ）細胞（ａ）及び血中白血球（ｂ）の中での好塩基球割合のフローサイトメトリー分析。（ｃ）生きたＣＤ４５＋細胞の中での短命の形質細胞ＣＤ１９＋ＣＤ１３８＋のフローサイトメトリー分析。（ｄ）ＥＬＩＳＡにより測定された、示されたマウスからの血漿中の抗核抗体（ＡＮＡ）レベル。（ａ〜ｄ）ＷＴ媒体、ｎ＝５；ＷＴ処置、ｎ＝４；Ｌｙｎ−／−媒体、ｎ＝８；Ｌｙｎ−／−処置、ｎ＝８。データを、平均＋ｓ．ｅ．ｍ．として表現する。（ａ〜ｃ）。統計学的分析は、対応のないスチューデントｔ検定によった。（ｄ）統計学的分析は、マン−ホイットニー検定によった。ＮＳ：有意差なし、＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１。
【図１４】図面による概要  全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）では、自己寛容の喪失により、自己反応性（ＡＲ）Ｔ及びＢ細胞の増殖が誘引される。自己反応性形質細胞は、核起源の自己抗原及び補体因子と結合して、循環性免疫複合体（ＣＩＣ）を形成するであろう、自己反応性抗体を分泌する。これらのＣＩＣ又は自己反応性抗体のターゲット臓器への沈着は、局所病変、炎症（及びＰＧＤ２生成）、及び臓器傷害に関連する。正常な好塩基球は、ＣＩＣがＦｃレセプター（ＦｃεＲＩ及びＦｃγＲ）に結合することにより活性化されて、より多くのプロスタグランジンＤ２（ＰＧＤ２）レセプター（ＰＴＧＤＲ）及び活性化マーカー、例えば、ＣＤ２０３ｃを発現することができる。慢性的な炎症が定着すると、ＰＧＤ２を含む種々の炎症性メディエーターが血中に分泌される。ＰＧＤ２は、循環性好塩基球自体によるＰＧＤ２生成を誘引して、ＰＧＤ２の自己分泌作用をもたらすのに十分である。これにより、ＣＸＣＲ４の表面発現の増大がもたらされ、ＣＸＣＬ１２勾配に対する好塩基球感受性が可能となる。結果として、好塩基球は、ＳＬＯにより遊走するようになる。同ＳＬＯは、ループス発病中に、より多くのＣＸＣＬ１２を分泌するのが公知である。その点で、好塩基球は、自己反応性Ｔ及びＢ細胞を、活性化分子、例えば、ｍＢＡＦＦ、ＭＨＣ−ＩＩのその発現又は種々のサイトカイン、例えば、ＩＬ−４及びＩＬ−６の分泌により支援する。さらに、好塩基球は、自己反応性抗体生成及びＢ細胞のＩｇＥクラススイッチを促進することができる。ＣＩＣ及び自己反応性ＩｇＥ力価が増大すると、臓器炎症、ＰＧＤ２及びＣＸＣＬ１２力価、ならびにＳＬＯへの好塩基球ホーミングがターゲッティングされるであろう。好塩基球は、疾患の増幅ループを駆動させ、ＳＬＯへのそのリクルートを妨害することにより、自己抗体力価の上昇及びその後の紅斑が防止されるであろうことが推定される。
【実施例】
【０１０３】
実施例１：材料及び方法
マウス
C57BL/6J野生型（ＷＴ）マウスを、Charles River Laboratories（L’Arbresle, France）から購入した。純粋なC57BL/6バックグラウンドのＬｙｎ−／−マウスを、当動物施設で飼育した。ループス様疾患研究のために、マウスを、処置及び分析前に、最大４０週間成長させた。他のｅｘ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ分析のために、特に断りない限り、若いマウスを、８〜１２週齢とした。French and European guidelinesに遵守して使用し、地方倫理委員会及びフランス国政府の調査部門により、動物実験計画０２４８４．０１に基づいて承認された、特定の病原体フリー条件で、マウスを維持した。
【０１０４】
患者
血液サンプルを、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）及び慢性腎疾患の長期前向き試験に登録された成人対象から収集した。この研究は、Comite Regional de Protection des Personnes（CRPP, Paris, France）により、参照ＩＤ−ＲＣＢ  ２０１４−Ａ００８０９−３８に基づいて承認された。入院患者の診断は、サンプル処理及びフローサイトメトリー分析時には、研究者には知らされていなかった。ＳＬＥサンプルを、入院患者及び外来患者から取得した。臨床データを、Comission Nationale de l’Informatique et des Libertes（CNIL）による承認後に収集した。全てのＳＬＥ対象は、American College of Rheumatology classification criteria for SLEを満たした。ＳＬＥ及び健康な対照（ＨＣ）ドナーの特徴を、表１（以下）に示す。ループス活動性を、ＳＥＬＥＮＡ−ＳＬＥＤＡＩ（Safety of Estrogens in Lupus Erythematosus National Assessment - SLE Disease Activity Index）スコアにより評価した。ＳＬＥＤＡＩスコアに基づいて、ループス活動性を、無症状（０〜１）、中程度（２〜４）、及び活動性（＞４）として分類した。全てのサンプルを、ヘパリン採血管に収集し、４時間以内に処理した。書面でのインフォームドコンセントを、全ての対象から得た。活動性ループス腎炎の対象を、ＩＳＮ／ＲＰＳ分類（Weening, J.J., et al., J. Am. Soc. Nephrol. 15, 241-250 (2004)）に基づいて、組織学的活動性分類ＩＩＩ又はＩＶ＋／−Ｖ腎炎により定義した。
【０１０５】
抗体及びフローサイトメトリー
全ての抗体は、商業的な供給元からとした。フローサイトメトリーの取得を、DIVAソフトウェアを使用するLSRII Fortessa（BD Biosciences）により行った。血液サンプル処理法は、以前に記載された通りとした（Charles, N. et al., Nat. Med. 16, 701-707 (2010)）。マーカー発現レベルに関する全てのデータを、対象となる細胞上に示されたマーカーの幾何学的な平均蛍光強度（Ｇｅｏ  ＭＦＩ）と対応するアイソタイプ対照のＧｅｏ  ＭＦＩとの間の比として表現する。データを、図中の凡例に示されたように、正規化し、又は、正規化しなかった。データ分析を、FlowJo v.X.0.7（Treestar）で実現した。
【０１０６】
ケモカイン、サイトカイン、１１β−ＰＧＦ２α、及び免疫グロブリン測定アッセイ法
全ての商業的なアッセイ法を、製造メーカーの説明に従って行った。１１β−プロスタグランジンＦ２α酵素免疫アッセイ法（ＥＩＡ）キットを、Cayman Chemicals（Ann Arbor, MI）から得た。マウスＡＮＡ酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）キットを、ADI（San Antonio, TX）から得た。ヒト及びマウスＣＸＣＬ１２  ＥＬＩＳＡキットを、R&D Systems（Minneapolis, MN）から得た。腎臓中のサイトカイン含量の評価は、以前に記載された（Charles, N. et al., Nat. Med. 16, 701-707 (2010)）。マウスＩＬ４及びＩＬ１β  ＥＬＩＳＡキットを、BioLegend（San Diego, CA）から得た。マウスＩｇＥ定量ＥＬＩＳＡキットを、Bethyl Laboratories（Montgomery, TX）から得た。ヒト及びマウス抗ｄｓＤＮＡ  ＩｇＧ及びＩｇＥを、以前に記載されたように定量した（Charles, N. et al., Nat. Med. 16, 701-707 (2010)）。吸光度を、Infinite 200 Proプレートリーダー（TECAN, Mannedorf, Switzerland）により評価した。
【０１０７】
ヒト好塩基球の精製及び濃縮
ヒト好塩基球を、培養、刺激、及び化学遊走実験のために、ヒト好塩基球濃縮キット（Stemcell Technologies, Grenoble, France）によるネガティブ選択により、９５％超に精製した。一部の化学遊走実験において、ヒト好塩基球を、ＰＥコンジュゲート抗ＣＤ３、ＣＤ１９、及びＣＤ８９（BioLegend）のカクテルを使用することによる、ヒトＰＥポジティブ選択キット（Stemcell Technologies）でのネガティブ選択により、３〜５％に濃縮した。これらのキットを、製造メーカーの説明に従って使用した。
【０１０８】
イメージングフローサイトメトリー
十分なサンプルが収集されるまで、好塩基球を、上記されたように３〜５％に濃縮し、９０％ ＦＣＳ  １０％ ジメチルスルホキシド中において、−８０℃で凍結させた。解凍させた細胞を、製造メーカーの説明に従って、染色し、固定し（ＩＣ固定バッファー、eBioscience）、透過処理した（Wash Perm Buffer、BioLegend）。抗ヒトＣＸＣＲ４又はそのアイソタイプ（BioLegend）を、細胞内染色に使用した。ＤＡＰＩを、サイトメトリー分析前に加えた。好塩基球を、シングレット細胞／Ｆｏｃｕｓ  ｈｉｇｈ／ＤＡＰＩ  ｈｉｇｈ／ＰＥ-ＣＤ１２３＋ＦｃεＲＩα＋ＣＤ３０３-としてゲーティングした。ＣＸＣＲ４発現を、各好塩基球について、平均好塩基球ＣＸＣＲ４  ＦＭＯ（蛍光マイナス１）強度におけるそのＣＸＣＲ４強度の幾何学的平均の比として決定した。内部移行スコアを、膜マーカーとしてＦｃ□ＲＩ□染色を使用し、プローブとしてＣＸＣＲ４染色を使用して決定した。各サンプルについて、外在化スコアは、［１−内部移行スコア］に相当する。全ての分析を、ImageStream X Mark IIイメージングフローサイトメトリー及びIDEAS v6ソフトウェア（AMNIS）を使用して行った。
【０１０９】
好塩基球の培養及び刺激
ヒト好塩基球及びマウス脾細胞を、２０％ 熱不活性化ウシ胎児血清を加えた培養培地（Glutamax及び２０mM ＨＥＰＥＳ、１mM ピルビン酸Ｎａ、非必須アミノ酸１×（全て、Life Technologies, Saint-Aubin, Franceから）１００μg/ml ストレプトマイシン及び１００U/ml ペニシリン（GE Healthcare, Velizy, France）、ならびに３７．５μM β−メルカプトエタノール（Sigma-Aldrich, MO）を含むＲＰＭＩ１６４０）中において、３７℃及び５％ ＣＯ２で培養した。遊走アッセイ法の前に１８時間の長さの刺激を、培養培地中において、１mLあたりに１×１０６個の細胞で、１nM ＩＬ−３（Peprotech）、１μM プロスタグランジンＤ２（ＰＧＤ２）、１μM ＰＴＧＤＲ−１特異的アゴニストであるＢＷ２４５ｃ、１μM ＰＴＧＤＲ−２特異的アゴニストである１３，１４−ジヒドロ−１５−ケトプロスタグランジンＤ２（ＤＫ−ＰＧＤ２）（全て、Cayman chemicalsから）、又は５ng/mL 抗ＩｇＥ（マウス抗ヒトＩｇＥ又はラット抗マウスＩｇＥ、両方とも、Thermo Scientificから）を加えることにより行った。全ての細胞を、任意の遊走アッセイ法前に、２回洗浄した。対照条件を、常に、刺激条件と同じ媒体濃度とした。
【０１１０】
ＰＴＧＤＲアンタゴニスト、ＰＧＤ２、及びＨ−ＰＧＤＳ阻害剤によるＣＸＣＲ４過剰発現モデュレーションについて、精製された好塩基球を、０．１％ ＢＳＡ＋／−下記化合物：媒体（０．１‰ エタノール）、１μM ＰＴＧＤＲ−１アンタゴニストであるラロピプラント、１μM ＰＴＧＤＲ−２アンタゴニストであるＣＡＹ１０４７１、１もしくは１０μM ＰＧＤ２、１μM プロスタグランジンＤシンターゼ（造血型）阻害剤Ｉ（カタログ＃１６２５６）（全て、Cayman chemicalsから）を含有するＲＰＭＩ中に再懸濁させた。細胞を、３７℃及び５％ ＣＯ２において、４時間インキュベーションした。示されたマーカーの表面発現を、フローサイトメトリーにより評価した。
【０１１１】
好塩基球の遊走及びアポトーシスアッセイ法
遊走アッセイ法を、Transwell  ５μmポリカーボネートパーミアブルサポート  ６．５mmインサート（Corning, New York, NY）中の０．１％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Sigma-Aldrich）を加えた培養培地において、１×１０５個の精製された好塩基球又は２×１０５個の濃縮された好塩基球について、１mLあたりに１×１０６個の細胞で、３７℃及び５％ ＣＯ２において、３時間行った。上側及び下側チャンバからの精製又は濃縮好塩基球を、アッセイ法の最後に計測した。好塩基球の含量及び表現型を、フローサイトメトリーにより、１００個超の好塩基球を分析することで決定した。ヒト好塩基球の精製又は濃縮によっては、試験された全てのケモカインについての測定された遊走において何ら差異が示されなかった。遊走を、下側チャンバ中の好塩基球数と上側及び下側チャンバ中の好塩基球数との間の比として定義した。同時遊走を、下側チャンバに何らケモカインを含ませずに観察された遊走として定義した。補正された遊走を、特異的遊走と同時遊走との間の差として定義した。遊走アッセイ法について、下記濃度（最適であるとことが公知）を、各化合物について使用した。ヒトＩＬ−３：３００pM（Peprotech）、ヒトＣＣＬ３、ＣＣＬ５、及びＣＸＣＬ１２：５０nM；ＣＸＣＬ２（全て、BioLegendから）及びＰＧＤ２（Cayman chemicals）：１００nM。ヒトＣＣＬ３、ＣＣＬ５、及びＣＸＣＬ２、及びＰＧＤ２に対する遊走を、両チャンバ中に３００pM ＩＬ−３の存在下において行った。ＩＬ−３による遊走は、ケモカインチズム（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｔｉｓｍ）を表わす。ＩＬ−３を、両チャンバに同じ濃度になるように加え、ＩＬ−３を含ませずに観察された同時遊走と比較した。ＩＬ−３又はＰＧＤ２（上記）との２４時間のインキュベーションの好塩基球アポトーシスにおける効果を、BD BiosciencesからのＦＩＴＣアネキシンＶアポトーシス検出キットを使用することにより推定し、製造メーカーの説明に従って使用した。
【０１１２】
ｉｎ  ｖｉｖｏ実験
ＣＸＣＬ１２誘引好塩基球ｉｎ  ｖｉｖｏ遊走アッセイ法について、１００ng マウスＣＸＣＬ１２を含有するＰＢＳ又はＰＢＳ単独 ２００μLを、８〜１２週齢のＷＴマウスに腹腔内（ｉｐ）注入した。ＰＧＤ２誘引好塩基球ｉｎ  ｖｉｖｏ遊走アッセイ法について、ＰＢＳ単独（エタノール ２μLを含む）又はＰＢＳ±２０nmole ＰＧＤ２±２００μg ＡＭＤ３１００（全て、Cayman chemicals） １００μLを、８〜１２週齢のＬｙｎ−／−マウスにおいて、ｉｐ注入した。全ての場合において、２４時間後、マウスを安楽死させ、腹膜腔、血液、腸間膜リンパ節、及び脾臓を収集し、以前に記載されたように（Charles, N. et al., Nat. Med. 16, 701-707 (2010)）、ＦＡＣＳ分析用に調製した。ＰＧＤ２注入による疾患進行を促進させるために、１２週齢のＬｙｎ−／−マウスに、ＰＢＳ中の２０nmole ＰＧＤ２又は媒体を、１０日の間に２日毎に、合計６回の注入でｉｐ注入した。マウスを、最後の注入の翌日に分析した。ＰＴＧＤＲアンタゴニストによる処置について、加齢のＷＴ及びＬｙｎ−／−マウスを、水道水中の経口用量５mg/kg ラロピプラント及びＣＡＹ１０４７１（Cayman chemicals）又は当量のエタノール（媒体）により、１日２回、１０日間処置した。ついで、マウスを安楽死させ、血液、血漿、脾臓、骨髄、腎臓、及びリンパ節（子宮頸管、上腕、鼠径部、及び腸間膜）を、以前に記載された（Charles, N. et al., Nat. Med. 16, 701-707 (2010)）ように分析した。この処置により、種々の臓器における重量及び細胞数は影響を受けなかった。細胞生存率を、Ghost Dye Violet 510（Tonbo, San Diego, CA）の利用により評価した。
【０１１３】
ＩｇＧ及びＣ３の糸球体沈着及び腎機能の分析
Ｃ３及びＩｇＧ沈着の免疫蛍光分析用の腎臓調製物は、以前に記載された通りである（Charles, N et al. Nat. Med., 2010, 16, 701-707, 2159）。Ｃ３及びＩｇＧ沈着の定量を、ImageJソフトウェア（v1.49p, NIH, USA）を使用することにより実現した。少なくとも２０個の糸球体を、腎臓あたりに定量した。腎機能の評価について、アルブミン／クレアチニン比（ＡＣＲ）を決定した。尿を、各マウスから処置の前後に収集した。アルブミン濃度を、マウスアルブミンＥＬＩＳＡ（Bethyl laboratories, Montgomery, TX）により測定した。クレアチニンアッセイ法（R&D systems, Minneapolis, MN）を使用して、尿中クレアチニン濃度を決定した。結果を、処置前後のＡＣＲ比に対応する増大倍率として表現する。
【０１１４】
統計学的分析
適切な分析を行うために、分布を、サンプルサイズに応じて、ダゴスティーノ−パーソンオムニバス正規性検定又はコルモゴロフ−スミルノフ検定により評価した。３つ以上の群を比較した場合、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）検定を、有意差（ｐ＜０．０５）が達成された場合に、示されたポスト検定前に行った。全ての検定実行を、両側とした。統計を、GraphPad Prism V5及びV6（GraphPad）ならびにSTATA 12（Statacorp）ソフトウェアにより行った。
【０１１５】
実施例２：結果
ＳＬＥ及びループス腎炎特異的な好塩基球表現型
ＳＬＥを有する個体のコホート（ｎ＝１８８、表１）において、まず、ＳＬＥ対象の好塩基球が、健康な対照（ＨＣ）の対象（ｎ＝９８、図１ａ〜ｂ、表１）（Charles, N. et al., Nat. Med. 16, 701-707 (2010)）と比較して、増大したＣＤ２０３ｃ（好塩基球活性化マーカー）及びＣＤ６２Ｌ（Ｌ−セレクチン、白血球ローリングに関与）の発現により示された、活性化された表現型を有したことを確認した。
【０１１６】
しかしながら、ＳＬＥでの好塩基球は、（そのＣＤ６３発現レベルにより測定された場合、図１ｃ）脱顆粒化表現型を表わさなかった。好塩基球減少は、ＳＬＥ疾患活動性インデックス（ＳＬＥＤＡＩ、American College of Rheumatology Ad Hoc Committee on Systemic Lupus Erythematosus Response, C. The American College of Rheumatology response criteria for systemic lupus erythematosus clinical trials: measures of overall disease activity. Arthritis Rheum. 50, 3418-3426 (2004)）に関連する疾患の良好なマーカーであると考えられる（スピアーマンｒ係数＝−０．３６２９、Ｐ＜０．０００１）（図２ａ、ｂ）。一方、ＨＬＡ−ＤＲ陽性好塩基球の割合は、ＳＬＥ対象を健康な対照（ＨＣ）と区別する（ＤｅＬｏｎｇ法によるＲＯＣ  ＡＵＣ比較（DeLong, E.R. et al., Biometrics 44, 837-845 (1988)）：Ｐ＝０．０３）（図２ｃ、ｄ）のに、抗ｄｓＤＮＡ  ＩｇＧ（ＲＯＣ  ＡＵＣ＝０．８３８４）より、良好であった（受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線下面積（ＡＵＣ）＝０．９０９１）。さらに、好塩基球減少及び高割合のＨＬＡ−ＤＲ＋好塩基球は、他の活動性腎疾患と比較して、活動性ループス腎炎に特異的なマーカーであった（図２ｅ、ｆ）。特に、これらのＳＬＥ特異的好塩基球パラメータは、血液収集時のＳＬＥ患者の処置及び性別とは独立していた（データを示さず）。要するに、これらのデータから、活性化好塩基球、末梢好塩基球減少、及び高割合のＨＬＡ−ＤＲ＋好塩基球は、活動性ＳＬＥ個体のホールマークであることが確認された。さらに、データから、ループス環境は、（検出可能な脱顆粒化応答なしに）最適以下での好塩基球活性化及びＳＬＯへの好塩基球の再分布を駆動させることが、強く示唆される。
【０１１７】
【表１】
0006770522.tif 000020
【０１１８】
ＳＬＥ対象からの好塩基球におけるＰＧＤ２／ＰＴＧＤＲ及びＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２系
ループス発病中における好塩基球の活性化及びＳＬＯへの再分布を解明するために、ＳＬＥ対象からの好塩基球において、ＨＣに対する、ループス又は慢性炎症性疾患を有する個体において調節不全になることが公知（Pellefigues, C. & Charles, N., Curr. Opin. Immunol. 25, 704-711 (2013)）の化学遊走分子に対するレセプターの発現レベルを分析した。大部分のスクリーニングされたレセプター発現は、ＨＣ好塩基球において観察された発現とは有意には異ならなかった（表２）。特に、胸腺間質性リンパ球新生因子レセプター（ＴＳＬＰ−Ｒ）、ＩＬ−３３レセプター（Ｔ１／ＳＴ２）、Ｃ−Ｃモチーフリガンドレセプター（ＣＣＲ）４、ＣＣＲ６、及びＣＣＲ７を、好塩基球において検出することができなかった（表２）。
【０１１９】
しかしながら、ＰＴＧＤＲ−２発現は、ＳＬＥ個体からの好塩基球において増大していた（表２、図３ａ）。同様に、その血漿中のそのリガンド力価も増大していた（主な血漿ＰＧＤ２代謝物である１１β−ＰＧＦ２αレベルで表現される）（図３ｂ）。ＳＬＥを有する対象における１１β−ＰＧＦ２α力価と血中好塩基球数との間の逆相関が見出された（スピアーマンｒ＝−０．２５８５、Ｐ＝０．０１６９）（データを示さず）。さらに、高レベルの１１β−ＰＧＦ２αは、ＳＬＥ対象における好塩基球減少が大きくなるのに関連していた（図３ｃ）。まとめると、これらのデータから、ＰＧＤ２及びそのレセプターは、ループス中における好塩基球の活性化及び血管外漏出に関連していることが、強く示唆される。
【０１２０】
ＣＸＣＲ４発現は、全てのＳＬＥ個体からの好塩基球において増大していたが、活動性ＳＬＥ患者は、更により顕著な増大を示した（表２、図３ｄ）。ＣＸＣＬ１２血漿力価は、好塩基球においてそのレセプターと同じ増大パターンに従い、増大していた（図３ｅ）。好塩基球ＣＸＣＲ４発現レベルは、ＳＬＥ対象における血中好塩基球数と負に相関していた（スピアーマンｒ＝−０．４６９２、Ｐ＜０．０００１）（図４ｂ）。さらに、活動性ＳＬＥ対象において、高いＣＸＣＬ１２力価は、よりはっきりした好塩基球減少に関連していた（図４ｃ）。エンドリン（ＣＤ１６４）は、ＣＸＣＲ４に会合した場合、ＣＸＣＬ１２に対する感受性を向上させる膜透過シアロムチンであり、ヒト好塩基球活性化マーカーとしても公知である。活動性ＳＬＥ対象からの好塩基球におけるＣＤ１６４レベルは、ＣＸＣＲ４と同じ発現パターンに従い、好塩基球減少と相関した（スピアーマンｒ＝−０．４１６５、Ｐ＝０．００２９）。このことから、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣＸＣＬ１２に対するＳＬＥ好塩基球の感受性の増大が示唆される（図３ｆ及び図４ｄ）。好塩基球は、大部分は細胞内において、ＣＸＣＲ４を発現するのが公知である。イメージングフローサイトメトリーによる分析から、ＳＬＥ患者の好塩基球は、増大したＣＸＣＲ４含量を有し、ＨＣ好塩基球においてより外在化したことが示された（データを示さず）。
【０１２１】
【表２】
0006770522.tif 000021
【０１２２】
ＣＸＣＬ１２は、腹膜透析中に最も過剰発現される遺伝子の１つとして説明されており、腹膜炎中にＰＧＤ２と共に活発に分泌される。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるヒト好塩基球遊走を研究するために、同遊走を、非滅菌腹膜炎について処置された患者からの血液及び腹膜透析流体の両方において分析した。ＣＸＣＲ４発現は、その血液対照と比較して、炎症した腹膜にリクルートされたヒト好塩基球において、劇的に増大していた（データを示さず）。この好塩基球リクルートは、活動性の慢性特発性蕁麻疹において以前に示されたように（Jain, S. Dermatology research and practice 2014, 674709）、末梢好塩基球減少と関連していた（データを示さず）。このことから、ヒトＣＸＣＲ４＋好塩基球は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＣＸＣＬ１２及びＰＧＤ２分泌炎症組織に遊走する可能性があり、末梢好塩基球減少は、この活発な好塩基球リクルートを反映していることが、強く示唆される。
【０１２３】
要するに、これらのデータから、ＰＧＤ２／ＰＴＧＤＲ及びＣＸＣＬ１２／ＣＸＣＲ４系の両方が、ＳＬＥ紅斑中の好塩基球活性化経路として特定され、その関連する好塩基球減少を説明することができる。したがって、これらの系は、活動性ループスを有する個体におけるＳＬＯへの記載された好塩基球蓄積に寄与する可能性がある。
【０１２４】
ＰＧＤ２／ＰＴＧＤＲ系は、ループス中のＣＸＣＲ４依存性好塩基球遊走を向上させる。
上記知見の機能的な重要性を評価するために、ＨＣ及び活動性ＳＬＥ対象から精製された好塩基球のｅｘ  ｖｉｖｏにおける遊走アッセイ法を行った。ＳＬＥ好塩基球は、ＣＸＣＬ１２勾配に際立って引き寄せられた。一方、ＨＣ好塩基球は、引き寄せられなかった（図５ａ）。このことは、ＣＸＣＲ４及びＣＤ１６４発現におけるその差異を反映している（図３ｄ、ｆ）。しかしながら、ＰＧＤ２を含めた、他の一般的な好塩基球化学誘引化合物については、差異は検出されなかった（図５ｂ）。ＰＧＤ２力価がＳＬＥにおける好塩基球減少に関連しており（図３ｃ）、自己反応性ＩｇＥが活動性ＳＬＥ対象に存在する（図５ｃ及びDema, B., et al,. PLoS One 9, e90424 (2014)）ため、次に、これらの因子が、好塩基球のＣＸＣＬ１２に対する遊走を増強するかどうかを調査した。精製されたヒト好塩基球の標準的な培養物では、ＩＬ−３の存在下において阻害される経路である細胞内ＣＸＣＲ４の外在化が誘引されるのが公知である。精製された好塩基球を１μM ＰＧＤ２で１８時間プライミングすることにより、そのＣＸＣＲ４発現及びそのＣＸＣＬ１２に対する遊走が増大され（図５ｄ、ｅ）、そのアポトーシスを誘引することなく（データを示さず）、ＰＴＧＤＲ−２内部移行が誘引された（データを示さず）。このＰＧＤ２プライミングにより、好塩基球表面において、高親和性ＩｇＥレセプターアルファ鎖（ＦｃεＲＩα）発現におけるわずかな増大が誘引された。この増大は、ＩｇＥ依存性刺激に対するその感受性を増大させることができる（データを示さず）。最適以下での抗ＩｇＥ刺激（MacGlashan, D., Jr., Clin. Exp. Allergy 40, 1365-1377 (2010)）により、（ｉ）好塩基球におけるＣＸＣＲ４発現が増大される傾向にあり（図５ｄ）（この増大により、ＣＸＣＬ１２に対するその遊走が影響を受ける可能性があったが、統計学的な有意差は達成されなかった（図５ｅ））、（ｉｉ）好塩基球におけるＰＴＧＤＲ−２発現レベルを向上させ（図６ａ）、（ｉｉｉ）好塩基球の脱顆粒化を誘引しなかった（データを示さず）。好塩基球に影響を有し、ＳＬＥ中に調節不全になることが公知の他の試験化合物（ＣＣＬ３、ＣＸＣＬ２、及びＣＣＬ５）によっては、ＰＧＤ２により誘引されたように、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける向上したＣＸＣＲ４外在化が誘引されなかった（データを示さず）。
【０１２５】
ＣＸＣＬ１２は、腹膜透析中に最も過剰発現される遺伝子の１つとして説明されており、腹膜炎中にＰＧＤ２と共に活発に分泌される。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるヒト好塩基球遊走を研究するために、同遊走を、非滅菌腹膜炎について処置された患者からの血液及び腹膜透析流体の両方において分析した。ＣＸＣＲ４は、その血液対照と比較して、炎症した腹膜にリクルートされたヒト好塩基球において劇的に増大することが見出された（図５ｅ）。この好塩基球リクルートは、活動性の慢性特発性蕁麻疹において以前に示されたように、末梢好塩基球減少に関連していた（補助的に図５ｂ）。これにより、ヒトＣＸＣＲ４＋好塩基球は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＣＸＣＬ１２及びＰＧＤ２分泌炎症組織に遊走する可能性があることが証明された。
【０１２６】
次に、ＰＧＤ２がヒト好塩基球によりＣＸＣＲ４外在化を誘引したメカニズムを研究した。ＰＴＧＤＲ−１及びＰＴＧＤＲ−２は両方とも、一方、他方、又は両レセプターの拮抗により、ＣＸＣＲ４外在化のブロックがもたらされたため、協同的に関与した（データを示さず）。さらに、ＰＴＧＤＲをブロックすることにより、同時ＣＸＣＲ４外在化の減少がもたらされた。このことから、ヒト好塩基球のｅｘ  ｖｉｖｏ培養及び／又はＰＧＤ２媒介性刺激のいずれかにより、ヒト好塩基球は、ＰＧＤ２を生成し、好酸球が有するのと同様の自己分泌作用を有するのがもたらされたことが示唆された。この仮説を確認するために、ＰＴＧＤＲアンタゴニストにより誘引される阻害と同じ、同時ＣＸＣＲ４外在化の阻害をもたらす、特異的Ｈ−ＰＧＤＳ阻害剤を使用し、ＰＴＧＤＲ−２内部移行が減少した（データを示さず）。Ｈ−ＰＧＤＳ阻害剤作用が１０倍高いＰＧＤ２濃度によってのみ克服された（データを示さず）という事実と共に、ここでは、ＰＧＤ２により、ＣＸＣＲ４外在化が好塩基球自体によるＰＧＤ２生成を刺激することにより部分的にもたらされるという上記仮説が確認された。
【０１２７】
要するに、これらのデータから、ＰＧＤ２／ＰＴＧＤＲ系が、そのＣＸＣＲ４の発現及び外在化の両方を増大させることにより、ＳＬＥ患者の好塩基球のＣＸＣＬ１２感受性に直接影響を及ぼすこと、及び、ループス環境（自己反応性ＩｇＥ、ＣＸＣＬ１２、及びＰＧＤ２を含む）が、好塩基球血管外漏出及び末梢好塩基球減少をもたらすこのクロストークを容易にすることが、強く示唆される。このため、ＰＧＤ２は、ＳＬＥ個体において、ＳＬＯへのＣＸＣＲ４依存性好塩基球遊走を可能にするのに必要とされる場合がある。実際に、ＰＧＤ２／ＰＴＧＤＲ及びＣＸＣＬ１２／ＣＸＣＲ４系の両方が、ループス対象における好塩基球減少及び疾患活動性に関連していた（図３）。
【０１２８】
Ｌｙｎ−／−ループス傾向マウスにおけるＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２及びＰＧＤ２／ＰＴＧＤＲ系
加齢のＬｙｎ−／−マウスが、ＩｇＥ、ＩＬ−４、及び好塩基球依存性ループス様腎炎に寄与する、好塩基球依存性ＴＨ２バイアスに進行することが、以前に示されている（Charles, N. et al., Nat. Med. 16, 701-707 (2010)；Charles, N., et al., Immunity 30, 533-543 (2009)）。このループス様疾患モデルにおいて、ＳＬＯにおける好塩基球蓄積は、疾患の増幅ループをもたらす（Charles, N., et al., Immunity 30, 533-543 (2009)）。
【０１２９】
次に、このマウスモデルが、ＳＬＥ対象と同様に、ＣＸＣＬ１２／ＣＸＣＲ４及びＰＧＤ２／ＰＴＧＤＲ系の両方に関わっていたかどうかを評価した。ｅｘ  ｖｉｖｏ遊走アッセイ法において、Ｌｙｎ−／−脾臓好塩基球は、ＣＸＣＬ１２に対して遊走した。一方、そのＷＴ対照は遊走しなかった（図７ａ）。これは、ＳＬＥ対象とＨＣとの間で観察された差異（図５ａ）に類似している。ＣＸＣＲ４発現レベルは、加齢の動物におけるそのＷＴ対照と比較して、血液、骨髄（ＢＭ）、及びＳＬＯからのＬｙｎ−／−好塩基球において向上していた（図７ｂ）。さらに、ＣＸＣＲ４発現は、その血液対照と比較して、ＳＬＯからのＷＴ及びＬｙｎ−／−好塩基球において増大していた。このことから、これらの臓器におけるその蓄積におけるＣＸＣＲ４の関与が示唆される（図７ｂ）。ＷＴマウスにおけるＣＸＣＬ１２腹腔内（ｉｐ）注入により、注入部位（図７ｃ）及び排出腸間膜リンパ節（ｍＬＮ）（図８ａ）へのｉｎ  ｖｉｖｏ好塩基球遊走が誘引された。
【０１３０】
ＰＧＤ２のｉｎ  ｖｉｖｏでのｉｐ注入により、ヒト好塩基球においてｅｘ  ｖｉｖｏで増大され（図５ｄ）、ＳＬＯ及び腹膜においてその蓄積が促進された（図７ｅ及び図８ｂ、ｃ）のと同様に、ｍＬＮ  Ｌｙｎ−／−好塩基球におけるＣＸＣＲ４発現が増大された（図７ｄ）。さらに、Ｌｙｎ−／−マウスにおけるＰＧＤ２のｉｎ  ｖｉｖｏでのｉｐ注入により、腹膜透析患者において観察された（データを示さず）ように、定常状態条件（データを示さず）と比較して、顕著であるが、一過性の末梢好塩基球減少がもたらされた。このＰＧＤ２誘引好塩基球リクルートは、ＣＸＣＲ４の特異的アンタゴニストであるＡＭＤ３１００との同時注入により、ＳＬＯ及び腹膜の両方における好塩基球リクルートが完全に消滅された（図７ｅ及び図８ｂ、ｃ）ことから、ＣＸＣＬ１２／ＣＸＣＲ４系に厳密に依存していた。マウスにおいて、ＰＧＤ２誘引ＣＸＣＲ４アップレギュレーションは、ｅｘ  ｖｉｖｏでの脾臓ＷＴ好塩基球におけるその特異的なアゴニスト（それぞれ、ＢＷ２４５ｃ及びＤＫ−ＰＧＤ２）の作用により示されたように、ＰＴＧＤＲ−１及びＰＴＧＤＲ−２（ＣＲＴＨ２）の両方により同様に媒介された（図７ｆ）。両アゴニストにより、Ｔ及びＢ細胞を含む他のＷＴ脾細胞でのＣＸＣＲ４発現における、顕著であるが、非常に低い増大が誘引された（データを示さず）。
【０１３１】
ＰＴＧＤＲ−１は、ＰＧＤ２による結合に基づいて、サイクリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）生成を誘引するのが公知である。次に、ｅｘ  ｖｉｖｏでのマウスＷＴ脾臓好塩基球によるＣＸＣＲ４外在化における膜透過性ｃＡＭＰ（Ｎ６，２’−Ｏ−ジブチリル−アデノシン  ３’：５’−サイクリック一リン酸（ｄｂ−ｃＡＭＰ））の作用を分析した。好塩基球は、ｄｂ−ｃＡＭＰ曝露に基づいて、この化合物に対するＴ細胞（図９ｂ）より１００倍高い感受性で、ＣＸＣＲ４を外在化させた（図９ａ）。ＰＧＤ２は、ＰＴＧＤＲ−１により十分なｃＡＭＰを誘引して、好塩基球において観察されたのとは異なり、これらの環境におけるＴ細胞によるＣＸＣＲ４外在化をもたらすことが不可能であった（図９ａ、ｂ）。Ｈ−ＰＧＤＳ阻害剤の存在下又は非存在下における各ＰＴＧＤＲ特異的アゴニストの用量応答実験から、両ＰＴＧＤＲが、ＰＴＧＤＲ−１媒介性ｃＡＭＰ生成における自己分泌法に機能するＰＴＧＤＲ−２誘引ＰＧＤ２合成により、好塩基球におけるＣＸＣＲ４外在化を協同的に誘引することができたことが、再度示唆された（図９ｃ）。
【０１３２】
これらの結果から、加齢のＬｙｎ−／−マウスにおいて、ＳＬＥ対象においてと同様に、ＰＧＤ２は、ＰＴＧＤＲ−１及びＰＴＧＤＲ−２の両方の活性化によるそのＣＸＣＲ４発現レベルをモデュレーションすることにより、炎症組織及びＳＬＯにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＸＣＬ１２依存性好塩基球蓄積を増大させることが、強く示唆される。
【０１３３】
ＰＧＤ２の慢性的な曝露により、好塩基球依存性的にループス様疾患の進行が促進される。
したがって、疾患の進行が始まる前のループス傾向マウスにおけるＰＧＤ２のより慢性的な曝露により、ＳＬＯにおける好塩基球の慢性的な蓄積、自己反応性形質細胞数の増大、及び疾患の進行の促進がもたらされるべきである。この仮説を確かめるために、若い（１２週齢）Ｌｙｎ−／−マウスに、ＰＧＤ２を、１０日にわたって２日毎に、繰返しｉｐ注入した。予想通りに、好塩基球は、そのＣＸＣＲ４発現レベルを増大させ（データを示さず）、その増大したＩＡ−ＩＥ発現により示された（図１０ｃ）ように活性化されたＳＬＯ全体に蓄積した（図１０ａ、ｂ）。これは、ＳＬＯにおけるＣＤ１９＋ＣＤ１３８＋形質細胞の向上した割合に関連した（図１０ｄ、ｅ）。これにより、Ｃ３及びＩｇＧ沈着定量により示されたように（図１０ｆ）、腎臓における免疫複合体の増大された沈着がもたらされる。その結果として、ほぼ全てのＰＧＤ２注入Ｌｙｎ−／−マウスにおいて、そのＰＢＳ注入対照とは異なり、プロトコール終了時に、アルブミン尿が増大した（図１０ｇ）。分析された他の免疫細胞種は、そのＣＸＣＲ４表面発現において、何ら顕著な増大を示さなかった（データを示さず）。重要なことに、このＰＧＤ２誘引ループス様疾患促進は、好塩基球に依存性であった。プロトコール全体の間の抗体媒介性（ＭＡＲ−１）好塩基球枯渇により、疾患進行におけるＰＧＤ２の作用の完全な救済がもたらされたためである（図１０ｂ〜ｅ）。これらの結果から、ＳＬＯにおけるＣＸＣＲ４依存性好塩基球蓄積を可能にすることにより、ＰＧＤ２は、ループス様疾患及び自己抗体媒介性腎傷害に寄与することが確認された。
【０１３４】
ＰＧＤ２系をターゲッティングすることにより、ＳＬＯにおけるＣＸＣＲ４媒介性好塩基球蓄積が減少し、ループス様疾患が弱められる。
マウスのループスにおけるＣＸＣＬ１２／ＣＸＣＲ４系をターゲッティングすることは、既に記載されており、疾患活動性における幾らかの有効性が示されている（Balabanian, K., et al., J. Immunol. 170, 3392-3400 (2003)、Wang, A., et al., J. Immunol. 182, 4448-4458 (2009)）。しかしながら、最初に抗ＨＩＶ剤として開発された（ＡＭＤ３１００による）ＣＸＣＲ４拮抗は、造血幹細胞の放出を誘引し、ホメオスタシス機能を妨害するのが公知である（Devi, S. et al.. J. Exp. Med. 210, 2321-2336, (2013)、Hummel, S. et al., Curr. Opin. Hematol. 21, 29-36 (2014)）。ＰＧＤ２／ＰＴＧＤＲ系をブロックすることによりループス傾向Ｌｙｎ−／−マウスからの好塩基球におけるＣＸＣＲ４アップレギュレーションを妨害することは、ＳＬＯにおける自己抗体生成の好塩基球依存性増幅ループを無効にするのにより安全なアプローチであると考えられた。
【０１３５】
ついで、加齢のＬｙｎ−／−及びＷＴマウスを、ＰＴＧＤＲ−１及びＰＴＧＤＲ−２の両方の特異的アンタゴニストであるラロピプラント及びＣＡＹ１０４７１それぞれによる、各用量５mg/kgで１０日にわたる１日２回での、経口強制栄養により処置した。この処置により、脾臓好塩基球におけるＣＸＣＲ４発現の低下（図１２ｃ）に関連する、Ｌｙｎ−／−動物のＳＬＯにおける好塩基球数の劇的な減少がもたらされた（図１２ａ、ｂ）。注目すべきことに、ＢＭ及び血中の好塩基球割合は、この処置により影響を受けなかった（図１３ａ、ｂ）。これらの結果により、ＰＴＧＤＲをターゲッティングすることによるＳＬＯにおける好塩基球蓄積を無効にすることからなるアプローチが確かめられた。
【０１３６】
予想通りに、好塩基球蓄積におけるこの減少は、ＣＤ１９＋ＣＤ１３８＋短命の形質細胞数の有意な減少に関連していた（図１２ｄ及び図１３ｃ）。特に、分析された全ての他の免疫細胞集団（Ｂ細胞、好中球、Ｌｙ６Ｃ＋単球、及びＬｙ６Ｃ−単球）の割合は、そのＣＸＣＲ４発現レベルが影響を受けた処置によっては、影響を受けないままであった（データを示さず）。ＳＬＯにおける好塩基球蓄積を無効にすることによるＬｙｎ−／−動物におけるＰＴＧＤＲ妨害により、総ＩｇＥ血漿濃度（図１２ｆ）により測定されたように、その自己抗体力価（図１２ｅ及び図１３ｄ）及びそのＴＨ２バイアスが減少した。その結果として、この処置により、Ｃ３及びＩｇＧ沈着の腎臓含量（図１１）ならびに炎症促進性サイトカインＩＬ−４及びＩＬ−１β（図１２ｇ、ｈ）における有意な減少も可能となった。したがって、ＰＴＧＤＲアンタゴニストによる短期間処置により、ループス傾向動物において観察された疾患活動性の効果的な減弱が可能であった。
【０１３７】
要するに、これらの結果から、ＰＧＤ２／ＰＴＧＤＲ系を標的とすることが、ＳＬＥにおける価値のある新規な治療アプローチであることができることが示唆される。実際に、ＳＬＯへのＣＸＣＬ１２依存性好塩基球ホーミングを妨害することによるＰＴＧＤＲ妨害は、自己抗体生成の好塩基球依存性増幅ループを遮断し、ＳＬＥにおける紅斑及びその後の臓器傷害を効果的に予防することができる（図１４）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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