(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子の形態で、マトリクス内に埋め込まれた、生きている大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を提供するための方法であって、前記マトリクスがアルギン酸塩、マルトデキストリン又はデキストラン、及びスクロース又はトレハロースを含み、前記方法が：
・大腸菌をアルギン酸塩と混合すること、
・粒子を形成すること、
・前記粒子を、マルトデキストリン又はデキストラン、及びスクロース又はトレハロースを含む保存溶液と接触させること、及び
・０．３以下の水分活性（ａｗ）を得るために乾燥させること、
を含む、方法。
【請求項２】
前記乾燥させることが空気乾燥させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記乾燥させることが空気乾燥機中で前記粒子を乾燥させることを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記乾燥させることがデシケーター中で前記粒子を乾燥させることを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記乾燥させることが最初に空気乾燥機中で乾燥させ、次にデシケーター中で乾燥させることを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記乾燥させることがフリーズドライさせることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記マトリクスが、１０より小さい（スクロース又はトレハロース）／（マルトデキストリン又はデキストラン）比を含み、前記比が重量％／重量％である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記比が５より小さい、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記比が約１である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記マトリクスがＬ−グルタミン酸の塩を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記大腸菌が非病原性大腸菌である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１５年２月１１日に、Eric Nadeauによって出願された米国仮特許出願番号第62/114,829号についての利益を主張する。その全体を参照することにより、本開示に上記参照文献の内容が援用される。
【０００２】
本願は全体として、生きている大腸菌を埋め込むための、改良された乾燥マトリクス、その製造方法及びその使用の技術分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
細菌の芽胞は休眠している生活形態であり、乾燥状態及び脱水状態において無制限に生存することができる。ヒトにとっては、細菌の芽胞は、下痢のような穏便な胃腸の病気の店頭販売できる予防薬、又は健康食品若しくは栄養サプリメントのいずれかとして利用することができる。農業においては、細菌の芽胞はまた、成長促進剤としての抗生物質の潜在的な代替物として、一層注目されている（Hongら、FEMS Microbiology Reviews, 2005, 29: 813-835）。大腸菌（エシェリヒア・コリ（Escherichia coli (E. coli)））は、しかしながら芽胞を形成せず、そのような細菌は、芽胞を形成する細菌と比べると乾燥状態及び／又は脱水状態に対する耐性が弱い。それにも関わらず、多くの用途において、ある目的のために十分に生存でき及び／又は十分な細菌活性がある形態で、大腸菌を保存及び保管する必要がある。
【０００４】
この点について、細菌にとって様々な実用的な保存条件及び保管条件が以前から提案されている。
【０００５】
フリーズドライ（凍結乾燥（lyophilisation）ともいう）は、乾燥している間に低温に曝すために、細菌の保存及び保管にしばしば用いられている（Rhodes、Exploitation of microorganisms ed. Jones, DG, 1993, p.411-439, London: Chapman & Hall）。しかしながら、その方法は時間がかかること、エネルギー消費が激しいことに加え、生存率を有意に低下させるという望ましくない特徴がある。保護試薬が提案されているが、フリーズドライ期間の、ある添加剤の保護効果は微生物種で、ばらつく（Font de Valdezら、Cryobiology, 1983, 20: 560-566）。
【０００６】
デシケーション（desiccation）を用いるような空気乾燥法もまた、細菌の保存及び保管に用いられている。減圧乾燥はフリーズドライと類似する工程である一方、０〜４０℃で、３０分〜数時間行われる。この工程の利点は、産物を凍結しないので、エネルギー消費が小さく、それに関連して経済的影響が小さいことである。産物の視点では、凍結による損傷が起こらない。しかしながら、低温又は室温でのデシケーションは遅く、コンタミネーションを避けるために過剰な注意を払うことが求められ、しばしば生存率が十分でないという結果をもたらす（Lievenseら、Adv Biochem Eng Biotechnol., 1994, 51: 71-89）。
【０００７】
アルギン酸カルシウム（Ca-alginate）ビーズのような、親水コロイドを形成するポリサッカライド・マトリクスに細菌を封入することは、広い用途において、及び異なる用途の範囲を拡げる際に、細菌の保存及び保管のためにも用いられている（Islamら、J. Microbiol. Biotechnol., 2010, 20: 1367-1377）。代謝能力及び生理学的能力が十分にある状態で細菌を維持するために、そして所望の利益を得るために、そのようなマトリクスに、適した保存製剤を添加することが提案されている。保存製剤は典型的には、保管・輸送している間及びその目的の場所において、微生物細胞を安定化し、保護するのを補助する、適した担体及び添加剤の中に有効成分（ingredient）を含有する。
【０００８】
マンニトールは、室温下及び０．２より低い水分活性（ａｗ）下で１０週間まで細菌の高い生存率を可能にするので、マンニトールは、フリーズドライの間、アルギン酸カルシウムに封入した細菌にとって、効果的な保存製剤成分として記載されている（Efiuvwevwereら、Appl. Microbiol. Biotechnol., 1999, 51:100-104）。トレハロースと糖アルコールの相助作用のある混合物もまた、空気乾燥したアルギン酸カルシウムに封入した細菌にとって、効果的な保存製剤成分であるとして記載されている。そこでは、トレハロースは、スクロースよりも有意に高いガラス転移点（即ち、それぞれ１１０℃と、ほんの６５℃の比較）のために、スクロースの代わりに用いられる（U.S. 8,097,245）。カルボキシル酸塩及び水和したタンパク質の相助作用のある混合物もまた、フリーズドライしたアルギン酸カルシウムに封入した細菌にとって、効果的な保存製剤成分であるとして記載されている（U.S. 2013/0,296,165）。該相助作用のある混合物は、両方のケースにおいて、効果的な乾燥を促進するために、減圧条件下で泡立てたり、沸騰させることを必要とせず、強化されたガラス構造を提供する。
【０００９】
しかしながら、新規製剤の開発は挑戦的な仕事であり、全ての製剤が、ある細菌にとって効果的である訳でない（Yougら、Biotechnol Bioeng., 2006 Sep 5;95(1):76-83）。
【００１０】
上記の観点から、大腸菌にとって改善された保存及び保管条件を提供する必要がある。
【発明の概要】
【００１１】
本開示は、広くは、マトリクスに埋め込まれた、生きている大腸菌（E.coli）に関し、前記マトリクスの水分活性（ａｗ）は０．３以下であり、前記マトリクスは親水コロイドを形成するポリサッカライドである、第一のポリサッカライド、第一のポリサッカライドとは異なる第二のポリサッカライド、及びスクロース、トレハロース又はそれらの組合せを含むジサッカライドを含む。
【００１２】
本開示はまた、広くは、マトリクスを形成する組成物に関し、前記組成物は、親水コロイドを形成するポリサッカライドである第一のポリサッカライド、第一のポリサッカライドとは異なる第二のポリサッカライド、及びスクロース、トレハロース又はそれらの組合せを含むジサッカライド、並びに大腸菌（E.coli）を含む。
【００１３】
本開示は、広くは、生きている大腸菌（E.coli）を含む粒子を提供する方法にも関する。
【００１４】
本開示は、広くは、生きている大腸菌（E.coli）を含むマトリクスにも関し、前記マトリクスの水分活性（ａｗ）は０．３以下であり、前記マトリクスは親水コロイドを形成するポリサッカライドである第一のポリサッカライド、第一のポリサッカライドとは異なる第二のポリサッカライド、及びスクロース、トレハロース又はそれらの組合せを含むジサッカライドを含む。
【００１５】
本開示に記載され、相互に排除的でない実施形態の全ての特徴が、互いに組み合わせられ得る。一実施形態の要素は、更なる記載なく、他の実施形態において利用され得る。添付の図と組み合わせて、特定の実施形態についての以下の記載を概観することで、当業者にとっては、本発明の他の態様及び特徴は明確となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
特定の実施形態についての詳細な説明は、本開示においては図を参照して以下に提供される。
【図１】図１は、本開示の一実施形態に従い、細菌の培養液を調製するための非限定的な流れ図を示す。
【図２】図２は、本開示の一実施形態に従い、大腸菌が埋め込まれたビーズを乾燥させるための非限定的な流れ図を示す。
【図３】図３は、本開示の一実施形態に従い、空気乾燥後の細菌の生存率に与える保存液Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３及びＳ４の影響を示す非限定的な棒グラフを示す。
【図４】図４は、本開示の一実施形態に従い、空気乾燥後の細菌の生存率に与える保存液Ｓ１、Ｓ５、Ｓ６及びＳ７の影響を示す非限定的な棒グラフを示す。
【図５】図５は、本開示の一実施形態に従い、空気乾燥後の細菌の生存率に与える保存液Ｓ１、Ｓ０、Ｓ８及びＳ９の影響を示す非限定的な棒グラフを示す。
【図６】図６は、本開示の一実施形態に従い、空気乾燥後の細菌の生存率に与える保存液Ｓ１、Ｓ１０、Ｓ１１及びＳ１２の影響を示す非限定的な棒グラフを示す。
【図７】図７は、本開示の一実施形態に従い、空気乾燥後の細菌の生存率に与える保存液Ｓ１、Ｓ１３、Ｓ１４及びＳ１５の影響を示す非限定的な棒グラフを示す。
【図８】図８は、本開示の一実施形態に従い、空気乾燥後の細菌の生存率に与える保存液Ｓ１、Ｓ１６、Ｓ１７及びＳ１８の影響を示す非限定的な棒グラフを示す。
【図９】図９は、本開示の一実施形態に従い、空気乾燥後の細菌の生存率に与える保存液Ｓ１及びＳ１９の影響を示す非限定的な棒グラフを示す。
【図１０−１】図１０は、図３から９についての生データを示す。
【図１０−２】図１０は、図３から９についての生データを示す。
【００１７】
図においては、実施形態は実施例によって説明される。発明の詳細な説明及び図はある実施形態を説明するためのものでしかなく、その理解の補助であることは、明確に理解されるべきである。請求の範囲は、本開示の実施形態によって限定されるべきでなく、明細書全体の記載に合せて最も広く解釈されるべきである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
実施形態の詳細な説明
これより、本開示の原理を実践することができる態様を説明するために、特定の実施例を記載する。
【００１９】
本開示に記載の大腸菌は、生きている細菌である。つまり、乾燥したマトリクスに埋め込まれた細菌は非活性状態にあると考え得るが、これらの細菌は該マトリクスを水分に曝すことで活性状態に復活させ得る。
【００２０】
本開示に記載の大腸菌は、任意の組換え若しくは野生型大腸菌株又はそれらの任意の混合を含む。一実施形態においては、該大腸菌は非病原性株である。一実施形態においては、該非病原性大腸菌株は、カナダ国際寄託当局（ＩＤＡＣ）に２００５年１月２１日にアクセッション番号：IDAC210105-01として寄託された株、若しくはカナダ国際寄託当局（ＩＤＡＣ）に２０１３年６月２０日に寄託され、アクセッション番号：IDAC200613-01が割り当てられた株、又はこれらの組合せである。
【００２１】
本開示に記載のマトリクスは、親水コロイドを形成するポリサッカライドを含む。いくつかのポリサッカライドは、それ単独で又はそれらの任意の組合せにおいて、本明細書において記載された使用に適している。
【００２２】
アミロースを豊富に含むデンプンは、沸騰水でデンプン顆粒を水和させ、高せん断ミキサーを用いて顆粒を分散させ、その溶液を約０から１０℃に冷却した後に、硬いゲルを形成することができるポリサッカライドである。ゲルの硬度及び強度は、溶液中のデンプンの濃度に依存し、最も高い効果が得られる濃度は１０％ｗ／ｖまでである。薄く切ったデンプンゲル・マトリクスは、保存混合液において生きた細菌を保持することもでき、腸液又は胃液によって殆ど消化されないので、細菌は該デンプンマトリクス内で胃液による破壊から保護される。腸内微生物フローラによって高アミロースデンプンが速やかに分解され、その時に、運搬された生きた細菌が、その結果、無傷な状態で放出されるという事実によって、調節された細菌の放出機構が提供される。
【００２３】
ペクチンは、高アミロースデンプンと非常に良く似た挙動を示す、別の適したポリサッカライドである。ペクチンゲル・マトリクスは、糖ポリマーのカルボキシル基の間で架橋を形成するＣａ２＋のような二価の陽イオンを添加することで、その強度をさらに増強し得るので、ペクチンはさらなる利点がある。
【００２４】
アルギン酸塩は、二価の陽イオンとクロスリンクすることで、硬いゲルマトリクスを形成し得る、別の適したポリサッカライドである。該アルギン酸塩は、アルギン酸塩ポリサッカライドと二価の陽イオン、例えばＣａ２＋と内部でのクロスリンクによって、例えば、アルギン酸塩を、Ｃａ２＋溶液槽に、薄い筋状、糸状又は実質的に球形ビーズの形状で押し出すことによって、硬いゲルマトリクスに硬化し得る。アルギン酸塩はＣａ２＋との相互作用する際に硬化する。マトリクスを調製する代替的な方法は、Ｃａ２＋を含有している槽に混合液を霧状にして吹き込むことである。
【００２５】
一実施形態では、親水コロイドを形成するポリサッカライドはマトリクスにおいて、全乾燥物質の重量％で０．１％〜２０％の数値で存在する。一実施形態では、親水コロイドを形成するポリサッカライドはマトリクスにおいて、全乾燥物質の重量％で０．１％〜１９％、又は０．１％〜１８％、又は０．１％〜１７％、又は０．１％〜１６％、又は０．１％〜１５％、又は０．１％〜１４％、又は０．１％〜１３％、又は０．１％〜１２％又は１％〜１２％（この中の任意の数値を含む）の数値で存在する。
【００２６】
本明細書に記載されたマトリクスは、更にジサッカライド及びポリサッカライドを含む。本開示は、マトリクスにおいて含むのに適する、いくつかの濃度及び配分割合を開示する。一実施形態では、ジサッカライド／ポリサッカライドの適した比は、重量％／重量％において、１０より小さい、又はより好ましくは５より小さい。一実施形態では、ジサッカライド／ポリサッカライドの比は、重量％／重量％において、約１である。
【００２７】
一実施形態では、ジサッカライドはマトリクスにおいて、全乾燥物質の重量％で０．１％〜９０％、又は０．１％〜７５％、又は０．１％〜５０％、又は０．１％〜３５％、又は０．１％〜２０％、又は０．１％〜１５％又は０．１％〜１０％（この中の任意の数値を含む）の数値で存在する。
【００２８】
限定されない一実施形態では、ジサッカライドはスクロースを含む。
【００２９】
本発明の限定されない更なる一実施形態では、ジサッカライドはトレハロースを含む。
【００３０】
限定されない一実施形態では、ポリサッカライドはマルトデキストリンを含む。
【００３１】
限定されない更なる一実施形態では、ポリサッカライドはデキストランを含む。
【００３２】
限定されない更なる一実施形態では、デキストランは２０〜７０ｋＤａの分子量を有する。
【００３３】
一実施形態では、マトリクスは更にＬ−グルタミン酸の塩を含む。限定されない一実施形態では、塩はＬ−グルタミン酸のナトリウム塩である。
【００３４】
本明細書に記載されたマトリクスは、０．０４≦ａｗ≦０．３、例えば０．０４≦ａｗ≦２．５、０．０４≦ａｗ≦２．０、０．０４≦ａｗ≦１．５などの水分活性（ａｗ）を有する。本開示における文脈では、「水分活性」又は「ａｗ」は、水の利用可能性を指し、システムにおける水のエネルギー状態を表わす。水分活性は、当該技術分野において公知の材料及び手順に従い、例えばアクアラブ水分活性測定装置４ＴＥ（Decagon Devices, Inc., U.S.A）を用いて、測定してもよい。
【００３５】
マトリクスを形成するための組成物もまた提供され、該組成物は親水コロイドを形成するポリサッカライドである第一のポリサッカライド、第一のポリサッカライドとは異なる第二のポリサッカライド、及びスクロース、トレハロース又はそれらの組合せを含むジサッカライド、並びに大腸菌（E.coli）を含む。
【００３６】
生きている大腸菌（E.coli）を含む粒子を提供する方法もまた提供され、該方法は、親水コロイドを形成するポリサッカライドである第一のポリサッカライド、第一のポリサッカライドとは異なる第二のポリサッカライド、及びスクロース、トレハロース又はそれらの組合せを含むジサッカライド、並びに大腸菌（E.coli）を含む粒子を提供すること、前記粒子を０．３以下の水分活性（water water activity）（ａｗ）にまで乾燥させることを含む。
【００３７】
限定されない一実施形態では、生きている大腸菌は、少なくとも０．４、又は少なくとも０．５、又は少なくとも０．６又は少なくとも０．７の粒子におけるａｗ減少倍数（fold reduction）を維持する。
【実施例】
【００３８】
以下の実施例の各々の場合において、３つの保存用液を、保存用液Ｓ１と共に試験した。試験は３重で行い、以下の式に従って片側の（one）標準偏差を計算した。
【００３９】
【数１】
0006731416.tif 000002
0006731416.tif 000003
【００４０】
以下の実施例の各々の場合において、当該技術分野において公知のプロトコールに従って、コロニー形成ユニット（ＣＦＵ）数を測定することにより、細菌の生存率を評価した。
【００４１】
以下の実施例において用いた保存溶液を、表１に示す。
【００４２】
【表１】
0006731416.tif 000004
1X：ないことを意味する、2N/A：適用できないことを意味する
【００４３】
１．実施例１
ａ．大腸菌の培養
図１に準拠して、最初のステップ１００において非動物由来トリプティック・ソイ・アガーで大腸菌（E.coli）株を培養した。次いで、単離した６つのコロニーを用い、２番目のステップ２００において大腸菌株を、非動物由来トリプティック・ソイ・ブロス（ＴＳＢ；ＴＳＢ１Ｌに対して、ソイペプトンＡ３  ＳＣ（Organotechnie）２０ｇ、無水デキストロース（USP規格、J.T.Baker）２．５ｇ、塩化ナトリウム（USP規格、J.T.Baker）５ｇ、二塩基性リン酸カリウム（USP規格、Fisher Chemical）２．５ｇ）３０ｍＬ中において、３７℃で２時間、２００ｒｐｍで撹拌培養した。生じた培養液１をＴＳＢで１０倍希釈し、次いで、３番目のステップ３００において大腸菌株を、非動物由来ＴＳＢ１００ｍＬ中において、３７℃で２時間、２００ｒｐｍで撹拌培養するのに用いた。生じた培養液２をＴＳＢで１０倍希釈し、次いで、４番目のステップ４００において大腸菌株を、非動物由来ＴＳＢ  １Ｌ中において、３７℃で５時間、２００ｒｐｍで撹拌培養するのに用いた。次いで、生じた培養液３をマトリクスに大腸菌を埋め込むために用いた。本明細書記載の培養プロトコールの変更及び改良は可能であり、本教示を踏まえると当業者にとって明らかになる。例えば、非病原性大腸菌を、当該技術分野で公知のプロトコール（Son & Taylor, Curr. Protcoc. Microbiol., 2012, 27: 5A.4.1-5A.4.9）に従って、嫌気条件で培養しても良い。以下の実施例のビーズを調製する際に、カナダ国際寄託当局（ＩＤＡＣ）に２００５年１月２１日に、アクセッション番号IDAC210105-01で寄託した非病原性大腸菌株を選択しても良い。
【００４４】
ｂ．マトリクスの調製
混合液を得るために、ＢａｃｔｏＴＭペプトン（１．５ｇ、BD, Mississauga, Canada）を加温した水１．５Ｌに混合した。アルギン酸塩（３０ｇ  Grindsted（登録商標）、DuPontTMDanisco（登録商標）、Mississauga、Canada）を、３６０ｒｐｍでマグネティック・バーを用いて混合しながら、混合液にゆっくりと添加した。２％アルギン酸塩（ｍ／ｖ）溶液を得るため、アルギン酸塩の完全な可溶化液を約３時間かけて得た。次いで、溶液（マグネティック・バーを含む）を標準的な条件でオートクレーブした。本明細書に記載されたマトリクスの調製プロトコールの変更及び改良は可能であり、本教示を踏まえると、当業者にとって明らかになる。
【００４５】
ｃ．マトリクスへの大腸菌の埋め込み
スラリー（slurry）を得るために、マグネティック・バーで撹拌しつつ、オートクレーブ済みのマトリクス溶液に、以下のものを順に添加した。非動物由来ＴＳＢ  １Ｌ、非動物由来ＴＳＢ  １Ｌ中の、生じた大腸菌の培養液３を０．５Ｌ（図１に準拠）。スラリーは、Ｔｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＴＭＲｅａｃｔｉ−ＶａｐＴＭエバポレーターから続く９穴吐出シリンジシステムを用いて、重合槽（水中、３００ｍＭ塩化カルシウム、０．１ｗｔ／ｖ％のＢａｃｔｏＴＭトリプトン、０．１ｗｔ／ｖ％のＢａｃｔｏＴＭペプトン及び０．０５ｗｔ／ｖ％のＢａｃｔｏＴＭイーストエクトラクト）に押し出され、ビーズを形成した。重合槽は、スラリーを注入する間、ゆっくりと撹拌した。マトリクスビーズを約３０分間クロスリンクさせ、次いで、生じた硬化したビーズを回収した。本明細書に記載された埋め込みプロトコールの変更及び改良は可能であり、本教示を踏まえると、当業者にとって明らかになる。
【００４６】
ｄ．埋め込まれた大腸菌の乾燥及び試験
保存溶液の各々について、乾燥及び試験を少なくとも３重で行った。図２に準拠して、１番目のステップ５００において、マトリクスに大腸菌を埋め込んだビーズを保存溶液Ｓ１、保存溶液Ｓ２、保存溶液Ｓ３又は保存溶液Ｓ４に入れ、約２０分間、ゆっくりと撹拌した。各々の場合において、保存溶液に浸漬した後の総ＣＦＵ５５０を決定した。次いで、２番目のステップ６００においては、セミドライビーズを得るために、ビーズを室温で約２４時間、空気乾燥機のトレードライヤー上に置いた。各々の場合において、アクアラブ水分活性測定装置４ＴＥ（Decagon Devices, Inc., U.S.A）を用いてセミドライビーズで水分活性（ａｗ）６５０を測定した。次いで、３番目のステップ７００において、セミドライビーズをデシケーターに約６４時間置き、乾燥した濾過空気を吹き付けた。本開示の一実施形態に従い、乾燥プロセス８００は、少なくとも２ステップ：セミドライビーズを得るために、室温で２４時間、空気乾燥機にビーズを置くことを含むステップ６００、及びドライビーズを得るために６４時間、デシケーターにセミドライビーズを置くことを含むステップ７００、を含む。各々の場合において、ドライビーズにおける、総ＣＦＵ７５０を決定し、水分ａｗ７６０を測定した。水分活性ａｗが０．３以下のドライビーズを得た。
【００４７】
各々の場合において、図２に準拠して、ａｗ減少倍数を以下に従って計算した。
【００４８】
【数２】
0006731416.tif 000005
【００４９】
各々の場合において、図２に準拠して、生存率低下を以下に従って計算した。
【００５０】
【数３】
0006731416.tif 000006
【００５１】
各々の場合において、生存率低下の平均値及び保存溶液Ｓ１で得られた結果に対して標準化した生存率低下の平均値を計算した。
【００５２】
結果を図３に示す。保存溶液Ｓ４では、水分活性が０．１４２±０．００４に維持されている一方で、標準化した生存率低下の平均値は０．３２を示した。
【００５３】
実施例１の結果を編集したものを、表２及び表３に示す。これらの結果は、保存溶液Ｓ４の成分が乾燥したマトリクスに埋め込まれた大腸菌の生存率及び乾燥プロセス７００に対する耐性に有意な効果を提供したことを実証する。
【００５４】
【表２】
0006731416.tif 000007
【００５５】
【表３】
0006731416.tif 000008
【００５６】
ｅ．埋め込み乾燥した大腸菌の飼料への取り込み（「ペレット化」）
乾燥したマトリクスを飼料へ取り込むプロトコール、例えば飼料添加物の形状での取り込みは当該技術分野において公知である。それを行う説明的実例は、例えば１トンの飼料に５００ｇ〜１０００ｇの乾燥したマトリクスビーズを取り込ませることによって行うことができる。所望により、飼料は、不活性化したイースト産物も適量含み得る。例えば、埋め込まれた大腸菌を含む乾燥したマトリクスビーズは、他の全ての含有物と共にホモジナイゼーション槽において混合される。好ましくは、混合物はペレット化工程の間、連続して混合する。次いで、混合された材料は、エクストルーダーに向かって送られる。次いで、エクストルーダーに送られるときに、混合した材料に蒸気があてられる（すなわち、そのために、この段階において混合物の温度は上昇する）。次いで、エクストルーダー内部の経路を通過する間、混合物には適した圧力がかけられる（圧力と温度は上昇し、最高温度の到達点は約７５℃である）。次いで、形成されたペレットはエクストルーダーから冷却槽に排出される（更なる冷却によって３０〜４０℃に急激に温度が低下し、周囲の温度に達する）。飼料添加物（埋め込まれた大腸菌を含むマトリクス）を含むペレット化された飼料は、次いで、例えば袋／容器で保管され得る。本明細書に記載されたペレット化プロトコールの変更及び改良は可能であり、本教示を踏まえると、当業者にとって明らかになる。
【００５７】
２．実施例２
各々の保存溶液について、乾燥及び試験は、少なくとも３重で行った。図２に準拠して、１番目のステップ５００においては、実施例１にある通り、調製したビーズを保存溶液Ｓ１、保存溶液Ｓ５、保存溶液Ｓ６又は保存溶液Ｓ７に入れ、約２０分間ゆっくりと撹拌した。各々の場合において、保存溶液に浸漬した後に、総ＣＦＵ５５０を決定した。次いで、２番目のステップ６００においては、セミドライビーズを得るために、ビーズを室温で約２４時間、空気乾燥機のトレードライヤー上に置いた。各々の場合において、アクアラブ水分活性測定装置４ＴＥ（Decagon Devices, Inc., U.S.A）を用いてセミドライビーズで水分活性（ａｗ）６５０を測定した。次いで、３番目のステップ７００において、セミドライビーズをデシケーターに約６４時間置き、乾燥した濾過空気を吹き付けた。本開示の一実施形態によれば、乾燥プロセス８００は、少なくとも２ステップ：セミドライビーズを得るために、室温で２４時間、空気乾燥機にビーズを置くことを含むステップ６００、及びドライビーズを得るために６４時間、デシケーターにセミドライビーズを置くことを含むステップ７００、を含む。各々の場合において、ドライビーズにおける総ＣＦＵ７５０を決定し、水分ａｗ７６０を測定した。水分活性ａｗが０．３以下のドライビーズを得た。
【００５８】
各々の場合において、図２に準拠して、ａｗ減少倍数を以下に従って計算した。
【００５９】
【数４】
0006731416.tif 000009
【００６０】
各々の場合において、図２に準拠して、生存率低下を以下に従って計算した。
【００６１】
【数５】
0006731416.tif 000010
【００６２】
各々の場合において、生存率低下の平均値及び保存溶液Ｓ１で得られた結果に対して標準化した生存率低下の平均値を計算した。
【００６３】
結果を図４に示す。保存溶液Ｓ７では、水分活性が０．２９８±０．０１３に維持されている一方で、標準化した生存率低下の平均値は０．３８を示した。
【００６４】
実施例２の結果を編集したものを、表４及び表５に示す。これらの結果は、保存溶液Ｓ７の成分が乾燥したマトリクスに埋め込まれた大腸菌の生存率及び乾燥プロセス７００に対する耐性に有意な保護効果を提供したことを実証する。
【００６５】
【表４】
0006731416.tif 000011
【００６６】
【表５】
0006731416.tif 000012
【００６７】
３．実施例３
各々の保存溶液について、乾燥及び試験は、少なくとも３重で行った。図２に準拠して、１番目のステップ５００においては、実施例１にある通り調製したビーズを保存溶液Ｓ１、保存溶液Ｓ０、保存溶液Ｓ８又は保存溶液Ｓ９のいずれかに入れ、約２０分間ゆっくりと撹拌した。各々の場合において、保存溶液に浸漬した後に、総ＣＦＵ５５０を決定した。次いで、２番目のステップ６００においては、セミドライビーズを得るために、ビーズを室温で約２４時間、空気乾燥機のトレードライヤー上に置いた。各々の場合において、アクアラブ水分活性測定装置４ＴＥ（Decagon Devices, Inc., U.S.A）を用いてセミドライビーズで水分活性（ａｗ）６５０を測定した。次いで、３番目のステップ７００において、セミドライビーズをデシケーターに約６４時間置き、乾燥した濾過空気を吹き付けた。本開示の一実施形態に従い、乾燥プロセス８００は、少なくとも２ステップ：セミドライビーズを得るために、室温で２４時間、空気乾燥機にビーズを置くことを含むステップ６００、及びドライビーズを得るために６４時間、デシケーターにセミドライビーズを置くことを含むステップ７００、を含む。各々の場合において、ドライビーズにおける総ＣＦＵ７５０を決定し、水分ａｗ７６０を測定した。水分活性ａｗが０．３以下のドライビーズを得た。
【００６８】
各々の場合において、図２に準拠して、ａｗ減少倍数を以下に従って計算した。
【００６９】
【数６】
0006731416.tif 000013
【００７０】
各々の場合において、図２に準拠して、生存率低下を以下に従って計算した。
【００７１】
【数７】
0006731416.tif 000014
【００７２】
各々の場合において、生存率低下の平均値及び保存溶液Ｓ１で得られた結果に対して標準化した生存率低下の平均値を計算した。
【００７３】
結果を図５に示す。
【００７４】
実施例３の結果を編集したものを、表６及び表７に示す。
【００７５】
【表６】
0006731416.tif 000015
【００７６】
【表７】
0006731416.tif 000016
【００７７】
４．実施例４
各々の保存溶液について、乾燥及び試験は、少なくとも３重で行った。図２に準拠して、１番目のステップ５００においては、実施例１にある通り調製したビーズを保存溶液Ｓ１、保存溶液Ｓ１０、保存溶液Ｓ１１又は保存溶液Ｓ１２のいずれかに入れ、約２０分間ゆっくりと撹拌した。各々の場合において、保存溶液に浸漬した後に、総ＣＦＵ５５０を決定した。次いで、２番目のステップ６００においては、セミドライビーズを得るために、ビーズを室温で約２４時間、空気乾燥機のトレードライヤー上に置いた。各々の場合において、アクアラブ水分活性測定装置４ＴＥ（Decagon Devices, Inc., U.S.A）を用いてセミドライビーズで水分活性（ａｗ）６５０を測定した。次いで、３番目のステップ７００において、セミドライビーズをデシケーターに約６４時間置き、乾燥した濾過空気を吹き付けた。本開示の一実施形態によれば、乾燥プロセス８００は、少なくとも２ステップ：セミドライビーズを得るために、室温で２４時間、空気乾燥機にビーズを置くことを含むステップ６００、及びドライビーズを得るために６４時間、デシケーターにセミドライビーズを置くことを含むステップ７００、を含む。各々の場合において、ドライビーズにおける総ＣＦＵ７５０を決定し、水分ａｗ７６０を測定した。水分活性ａｗが０．３以下のドライビーズを得た。
【００７８】
各々の場合において、図２に準拠して、ａｗ減少倍数を以下に従って計算した。
【００７９】
【数８】
0006731416.tif 000017
【００８０】
各々の場合において、図２に準拠して、生存率低下を以下に従って計算した。
【００８１】
【数９】
0006731416.tif 000018
【００８２】
各々の場合において、生存率低下の平均値及び保存溶液Ｓ１で得られた結果に対して標準化した生存率低下の平均値を計算した。
【００８３】
結果を図６に示す。保存溶液Ｓ７では、標準化した生存率低下の平均値０．５８が示された。
【００８４】
実施例４の結果を編集したものを、表８及び表９に示す。
【００８５】
【表８】
0006731416.tif 000019
【００８６】
【表９】
0006731416.tif 000020
【００８７】
５．実施例５
各々の保存溶液について、乾燥及び試験は、少なくとも３重で行った。図２に準拠して、１番目のステップ５００においては、実施例１にある通り調製したビーズを保存溶液Ｓ１、保存溶液Ｓ１３、保存溶液Ｓ１４又は保存溶液Ｓ１５のいずれかに入れ、約２０分間ゆっくりと撹拌した。各々の場合において、保存溶液に浸漬した後に、総ＣＦＵ５５０を決定した。次いで、２番目のステップ６００においては、セミドライビーズを得るために、ビーズを室温で約２４時間、空気乾燥機のトレードライヤー上に置いた。各々の場合において、アクアラブ水分活性測定装置４ＴＥ（Decagon Devices, Inc., U.S.A）を用いてセミドライビーズで水分活性（ａｗ）６５０を測定した。次いで、３番目のステップ７００において、セミドライビーズをデシケーターに約６４時間置き、乾燥した濾過空気を吹き付けた。本開示の一実施形態によれば、乾燥プロセス８００は、少なくとも２ステップ：セミドライビーズを得るために、室温で２４時間、空気乾燥機にビーズを置くことを含むステップ６００、及びドライビーズを得るために６４時間、デシケーターにセミドライビーズを置くことを含むステップ７００を含む。各々の場合において、ドライビーズにおける総ＣＦＵ７５０を決定し、水分ａｗ７６０を測定した。水分活性ａｗが０．３以下のドライビーズを得た。
【００８８】
各々の場合において、図２に準拠して、ａｗ減少倍数を以下に従って計算した。
【００８９】
【数１０】
0006731416.tif 000021
【００９０】
各々の場合において、図２に準拠して、生存率低下を以下に従って計算した。
【００９１】
【数１１】
0006731416.tif 000022
【００９２】
各々の場合において、生存率低下の平均値及び保存溶液Ｓ１で得られた結果に対して標準化した生存率低下の平均値を計算した。
【００９３】
結果を図７に示す。保存溶液Ｓ７では、標準化した生存率低下の平均値０．３５が示された。
【００９４】
実施例５の結果を編集したものを、表１０及び表１１に示す。
【００９５】
【表１０】
0006731416.tif 000023
【００９６】
【表１１】
0006731416.tif 000024
【００９７】
６．実施例６
各々の保存溶液について、乾燥及び試験は、少なくとも３重で行った。図２に準拠し、１番目のステップ５００においては、実施例１にある通り調製したビーズを保存溶液Ｓ１、保存溶液Ｓ１６、保存溶液Ｓ１７又は保存溶液Ｓ１８のいずれかに入れ、約２０分間ゆっくりと撹拌した。各々の場合において、保存溶液に浸漬した後に、総ＣＦＵ５５０を決定した。次いで、２番目のステップ６００においては、セミドライビーズを得るために、ビーズを室温で約２４時間、空気乾燥機のトレードライヤー上に置いた。各々の場合において、アクアラブ水分活性測定装置４ＴＥ（Decagon Devices, Inc., U.S.A）を用いてセミドライビーズで水分活性（ａｗ）６５０を測定した。次いで、３番目のステップ７００において、セミドライビーズをデシケーターに約６４時間置き、乾燥した濾過空気を吹き付けた。本開示の一実施形態に従い、乾燥プロセス８００は、少なくとも２ステップ：セミドライビーズを得るために、室温で２４時間、空気乾燥機にビーズを置くことを含むステップ６００、及びドライビーズを得るために６４時間、デシケーターにセミドライビーズを置くことを含むステップ７００、を含む。各々の場合において、ドライビーズにおける総ＣＦＵ７５０を決定し、水分ａｗ７６０を測定した。水分活性ａｗが０．３以下のドライビーズを得た。
【００９８】
各々の場合において、図２に準拠して、ａｗ減少倍数を以下に従って計算した。
【００９９】
【数１２】
0006731416.tif 000025
【０１００】
各々の場合において、図２に準拠して、生存率低下を以下に従って計算した。
【０１０１】
【数１３】
0006731416.tif 000026
【０１０２】
各々の場合において、生存率低下の平均値及び保存溶液Ｓ１で得られた結果に対して標準化した生存率低下の平均値を計算した。
【０１０３】
結果を図８に示す。
【０１０４】
実施例６の結果を編集したものを、表１２及び表１３に示す。
【０１０５】
【表１２】
0006731416.tif 000027
【０１０６】
【表１３】
0006731416.tif 000028
【０１０７】
７．実施例７
各々の保存溶液について、乾燥及び試験は、少なくとも３重で行った。図２に準拠して、１番目のステップ５００においては、実施例１にある通り調製したビーズを保存溶液Ｓ１又は保存溶液Ｓ１９のいずれかに入れ、約２０分間ゆっくりと撹拌した。各々の場合において、保存溶液に浸漬した後に、総ＣＦＵ５５０を決定した。次いで、２番目のステップ６００においては、セミドライビーズを得るために、ビーズを室温で約２４時間、空気乾燥機のトレードライヤー上に置いた。各々の場合において、アクアラブ水分活性測定装置４ＴＥ（Decagon Devices, Inc., U.S.A）を用いてセミドライビーズで水分活性（ａｗ）６５０を測定した。次いで、３番目のステップ７００において、セミドライビーズをデシケーターに約６４時間置き、乾燥した濾過空気を吹き付けた。本開示の一実施形態に従い、乾燥プロセス８００は、少なくとも２ステップ：セミドライビーズを得るために、室温で２４時間、空気乾燥機にビーズを置くことを含むステップ６００、及びドライビーズを得るために６４時間、デシケーターにセミドライビーズを置くことを含むステップ７００、を含む。各々の場合において、ドライビーズにおける総ＣＦＵ７５０を決定し、水分ａｗ７６０を測定した。水分活性ａｗが０．３以下のドライビーズを得た。
【０１０８】
各々の場合において、図２に準拠して、ａｗ減少倍数を以下に従って計算した。
【０１０９】
【数１４】
0006731416.tif 000029
【０１１０】
各々の場合において、図２に準拠して、生存率低下を以下に従って計算した。
【０１１１】
【数１５】
0006731416.tif 000030
【０１１２】
各々の場合において、生存率低下の平均値及び保存溶液Ｓ１で得られた結果に対して標準化した生存率低下の平均値を計算した。
【０１１３】
結果を図９に示す。
【０１１４】
実施例７の結果を編集したものを、表１４及び表１５に示す。
【０１１５】
【表１４】
0006731416.tif 000031
【０１１６】
【表１５】
0006731416.tif 000032
【０１１７】
８．実施例８
各々の保存溶液について、乾燥及び試験は、少なくとも３重で行った。図２に準拠して、１番目のステップ５００においては、実施例１にある通り調製したビーズを保存溶液Ｓ１、保存溶液Ｓ２、保存溶液Ｓ３及び保存溶液Ｓ４に入れ、約２０分間ゆっくりと撹拌した。次いで、セミドライビーズを得るために、ビーズを室温で約２４時間、空気乾燥機のトレードライヤー上に置いた。次いで、セミドライビーズをデシケーターに約６４時間置き、乾燥した濾過空気を吹き付けた。水分活性ａｗが０．３以下のドライビーズを得た。
【０１１８】
各々の場合において、ドライビーズの１ｇ当たりのＣＦＵを測定することによって、４℃の保管条件下における４週間後の株の生存率を試験した。試験は少なくとも３重で行い、片側の標準偏差を計算した。
【０１１９】
実施例８の結果を表１６に示す。試験した全ての保存溶液は、４℃で保管した場合、４週間、飼料添加株に安定性をもたらした。
【０１２０】
【表１６】
0006731416.tif 000033
【０１２１】
９．実施例９
各々の保存溶液について、乾燥及び試験は、少なくとも３重で行った。実施例１にある通り調製したビーズを保存溶液Ｓ１、保存溶液Ｓ５、保存溶液Ｓ６及び保存溶液Ｓ７に入れ、約２０分間ゆっくりと撹拌した。次いで、セミドライビーズを得るために、ビーズを室温で約２４時間、空気乾燥機のトレードライヤー上に置いた。次いで、セミドライビーズをデシケーターに約６４時間置き、乾燥した濾過空気を吹き付けた。水分活性ａｗが０．３以下のドライビーズを得た。
【０１２２】
各々の場合において、ドライビーズの１ｇ当たりのＣＦＵを測定することによって、４℃の保管条件下における４週間後の株の生存率を試験した。試験は少なくとも３重で行い、片側の標準偏差を計算した。
【０１２３】
実施例９の結果を表１７に示す。試験した全ての保存溶液は、４℃で保管した場合、４週間、飼料添加株に安定性をもたらした。
【０１２４】
【表１７】
0006731416.tif 000034
【０１２５】
１０．実施例１０
各々の保存溶液について、乾燥及び試験は、少なくとも３重で行った。実施例１にある通り調製したビーズを保存溶液Ｓ１、保存溶液Ｓ０、保存溶液Ｓ８及び保存溶液Ｓ９のいずれかに入れ、約２０分間ゆっくりと撹拌した。次いで、セミドライビーズを得るために、ビーズを室温で約２４時間、空気乾燥機のトレードライヤー上に置いた。次いで、セミドライビーズをデシケーターに約６４時間置き、乾燥した濾過空気を吹き付けた。水分活性ａｗが０．３以下のドライビーズを得た。
【０１２６】
各々の場合において、ドライビーズの１ｇ当たりのＣＦＵを測定することによって、４℃の保管条件下における４週間後の株の生存率を試験した。試験は少なくとも３重で行い、片側の標準偏差を計算した。
【０１２７】
実施例１０の結果を表１８に示す。試験した全ての保存溶液は、４℃で保管した場合、４週間、飼料添加株に安定性をもたらした。
【０１２８】
【表１８】
0006731416.tif 000035
【０１２９】
１１．実施例１１
各々の保存溶液について、乾燥及び試験は、少なくとも３重で行った。実施例１にある通り調製したビーズを保存溶液Ｓ１、保存溶液Ｓ１０、保存溶液Ｓ１１及び保存溶液Ｓ１２のいずれかに入れ、約２０分間ゆっくりと撹拌した。次いで、セミドライビーズを得るために、ビーズを室温で約２４時間、空気乾燥機のトレードライヤー上に置いた。次いで、セミドライビーズをデシケーターに約６４時間置き、乾燥した濾過空気を吹き付けた。水分活性ａｗが０．３以下のドライビーズを得た。
【０１３０】
各々の場合において、ドライビーズの１ｇ当たりのＣＦＵを測定することによって、４℃の保管条件下における４週間後の株の生存率を試験した。試験は少なくとも３重で行い、片側の標準偏差を計算した。
【０１３１】
実施例１１の結果を表１９に示す。試験した全ての保存溶液は、４℃で保管した場合、４週間、飼料添加株に安定性をもたらした。
【０１３２】
【表１９】
0006731416.tif 000036
【０１３３】
１２．実施例１２
各々の保存溶液について、乾燥及び試験は、少なくとも３重で行った。実施例１にある通り調製したビーズを保存溶液Ｓ１、保存溶液Ｓ１３、保存溶液Ｓ１４及び保存溶液Ｓ１５のいずれかに入れ、約２０分間ゆっくりと撹拌した。次いで、セミドライビーズを得るために、ビーズを室温で約２４時間、空気乾燥機のトレードライヤー上に置いた。次いで、セミドライビーズをデシケーターに約６４時間置き、乾燥した濾過空気を吹き付けた。水分活性ａｗが０．３以下のドライビーズを得た。
【０１３４】
各々の場合において、ドライビーズの１ｇ当たりのＣＦＵを測定することによって、４℃の保管条件下における４週間後の株の生存率を試験した。試験は少なくとも３重で行い、片側の標準偏差を計算した。
【０１３５】
実施例１２の結果を表２０に示す。試験した全ての保存溶液は、４℃で保管した場合、４週間、飼料添加株に安定性をもたらした。
【０１３６】
【表２０】
0006731416.tif 000037
【０１３７】
１３．実施例１３
各々の保存溶液について、乾燥及び試験は、少なくとも３重で行った。実施例１にある通り調製したビーズを保存溶液Ｓ１、保存溶液Ｓ１６、保存溶液Ｓ１７及び保存溶液Ｓ１８のいずれかに入れ、約２０分間ゆっくりと撹拌した。次いで、セミドライビーズを得るために、ビーズを室温で約２４時間、空気乾燥機のトレードライヤー上に置いた。次いで、セミドライビーズをデシケーターに約６４時間置き、乾燥した濾過空気を吹き付けた。水分活性ａｗが０．３以下のドライビーズを得た。
【０１３８】
各々の場合において、ドライビーズの１ｇ当たりのＣＦＵを測定することによって、４℃の保管条件下における４週間後の株の生存率を試験した。試験は少なくとも３重で行い、片側の標準偏差を計算した。
【０１３９】
実施例１３の結果を表２１に示す。試験した全ての保存溶液は、４℃で保管した場合、４週間、飼料添加株に安定性をもたらした。
【０１４０】
【表２１】
0006731416.tif 000038
【０１４１】
１４．実施例１４
各々の保存溶液について、乾燥及び試験は、少なくとも３重で行った。実施例１にある通り調製したビーズを保存溶液Ｓ１及び保存溶液Ｓ１９のいずれかに入れ、約２０分間ゆっくりと撹拌した。次いで、セミドライビーズを得るために、ビーズを室温で約２４時間、空気乾燥機のトレードライヤー上に置いた。次いで、セミドライビーズをデシケーターに約６４時間置き、乾燥した濾過空気を吹き付けた。水分活性ａｗが０．３以下のドライビーズを得た。
【０１４２】
各々の場合において、ドライビーズの１ｇ当たりのＣＦＵを測定することによって、４℃の保管条件下における４週間後の株の生存率を試験した。試験は少なくとも３重で行い、片側の標準偏差を計算した。
【０１４３】
結果を表２２に示す。試験した全ての保存溶液は、４℃で保管した場合、４週間、飼料添加株に安定性をもたらした。
【０１４４】
【表２２】
0006731416.tif 000039
【０１４５】
まとめると、本願発明者は、驚くべきことに、また意外にも、本明細書に記載の埋め込まれた、生きている大腸菌（E.coli）を含むマトリクスは、所定の期間、例えばその商業的利用で求められる４週間にわたって、細菌の十分な生存率（ＣＦＵ）を保つことができることを観察した。例えば、通常、細菌に関連する恩恵的効果を提供するための十分な生存率（動物飼料１ｇ当たりのＣＦＵ）を維持しつつ、動物飼料を保管し、運搬し、取扱い、ひいては動物に与えることができるように、マトリクスをペレット化した動物飼料に取り込ませることに成功した。
【０１４６】
本発明のタイトル又はサブタイトルは読者の便宜のために本開示を通して使われても良いが、これらは本発明の範囲を決して制限してはならないことに留意すること。更には、ある理論が本明細書において提案され開示されていても良いが、本開示に従って本発明が実施される限り、作用についての任意の具体的な理論又はスキーム（scheme）にこだわることなく、これらの理論が正しいか間違っているかに関わらず、本発明の範囲を決して制限してはならない。
【０１４７】
本明細書を通して引用された全ての参考文献は、全ての目的のために、それらの全体を参照することによって本明細書に援用される。
【０１４８】
本明細書を通して、ある用語の前に用いられる用語「a」は、該用語が指すものの１以上を含有する、態様を包含することが、当業者に理解される。本明細書を通して、「含む(including)」、「含有する(containing)」又は「によって特徴づけられる(characterized by)」と同義である用語「含む(comprising)」は、包括的又はオープンエンド(open-ended)であり、追加的な、列挙されていない要素又は方法手順を除外するものでないことは、当業者に理解される。
【０１４９】
別段の定義がない限り、本明細書中で用いられる全ての技術及び科学用語は、本発明に関連する当業者によって普遍的に理解される意味と、同じ意味を持つ。矛盾がある場合、定義を含む本文書が調整する。
【０１５０】
本開示中で用いられる場合、用語「およそ(around)」「約(about)」又は「約(approximately)」は一般的に当該技術分野で一般的に受け入れられる許容誤差の範囲内を意味する。そのため、本明細書で示される数的な量は、「およそ(around)」「約(about)」又は「約(approximately)」という用語が明記されていない場合は、推察され（inferred）得るように、一般的に、そのような許容誤差を含む。
【０１５１】
本開示は、ある態様について、かなり詳細に記載されているが、変更及び改良することが可能であり、本教示を踏まえると、当業者にとって明らかとなる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0006731416.tif 000046
【図８】
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【図９】
0006731416.tif 000048
【図１０−１】
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【図１０−２】
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