(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フローサイトメトリーにより濃縮された哺乳類腫瘍増殖細胞の製造方法であって、
ａ．組織試料から提供された細胞群を準備する工程であって、前記組織試料が脳腫瘍試料である工程と、
ｂ．工程ａ．の細胞群から、ＥｐｈＡ２を発現し、かつＣＤ４４及びＳＳＥＡ−１から成る群より選択される少なくとも１つの幹細胞マーカーを発現する細胞を、それらの発現レベルに従って細胞選別して、ＥｐｈＡ２発現が低くＣＤ４４発現が低い画分と、ＥｐｈＡ２発現が高くＣＤ４４発現が高い画分とに分け、またはＥｐｈＡ２発現が低くＳＳＥＡ−１発現が低い画分と、ＥｐｈＡ２発現が高くＳＳＥＡ−１発現が高い画分とに分ける工程であって、ＥｐｈＡ２発現が低くＣＤ４４発現が低い画分及びＥｐｈＡ２発現が低くＳＳＥＡ−１発現が低い画分よりも、ＥｐｈＡ２発現が高くＣＤ４４発現が高い画分及びＥｐｈＡ２発現が高くＳＳＥＡ−１発現が高い画分の方が、各々高い腫瘍増殖能を示す、工程と、
ｃ．工程ｂ．で分けられた前記ＥｐｈＡ２発現が高くＣＤ４４発現が高い画分またはＥｐｈＡ２発現が高くＳＳＥＡ−１発現が高い画分の細胞を得る工程と
を含み、それにより、フローサイトメトリーにより濃縮された哺乳類腫瘍増殖細胞を作製する、方法。
【請求項２】
前記工程ａ．の後に、前記脳腫瘍試料を解体して単細胞懸濁液を得る工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組織試料から提供された前記細胞の細胞群が、脳生検から得られる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程ｂ．の細胞選別が、蛍光活性化細胞選別によって行われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＥｐｈＡ２発現レベルが、抗ＥｐｈＡ２抗体を用いて測定される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記工程ｃ．で得られた哺乳類腫瘍増殖細胞が、ヒト及びマウスの腫瘍増殖細胞からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記腫瘍増殖細胞が、ヒト多形性神経膠芽腫増殖細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＥｐｈＡ２が、幹細胞表面マーカーである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞生物学の分野に関し、特には、本物の（bona fide）哺乳類幹細胞の単離された個体群の製造方法及びそのようにして作られる幹細胞の使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、各多細胞生物の初代細胞である。ヒト幹細胞の２つの主要なカテゴリーとしては、胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚幹細胞（ＥＳＣ）と、胎児又は成人組織に由来する体性幹細胞（ＳＣ）がある。前者は、全組織の発生を任されているため、その生物の細胞表現型のすべてを生じさせることができ、一方、成人の体性ＳＣは、原発組織の細胞系譜を創造し、組織の恒常性及び修復に寄与する。細胞を幹細胞として定義するには、主として、２つの特性を満たすことが必要である：「自己再生」と定義される、未分化の安定した表現型を維持しつつ広く増殖する能力と、「多分化能」と定義される、複数の細胞系譜において分化する能力である。最後のものは、ＳＣの供給源に従って可変的に定義される。
【０００３】
要約すれば、幹細胞は、最も簡単な定義によると、自己再生、増殖及び特殊組織への分化の能力を有する細胞の区別できる特有の個体群である。
【０００４】
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、成人幹細胞のうち最も研究されたものであり、診療所への最も成功した転換を享受した。ＨＳＣは、２つの細胞の分類、つまり長期及び短期再増殖細胞に分けることができ、これら細胞の子孫は、血液細胞系譜のレパートリーに分化することができる。
【０００５】
ＨＳＣに加えて、成人幹細胞もまた、皮膚、小腸において広く研究されており、更に最近では筋肉、肝臓、前立腺、胸、心臓及び脳においても確認されている。一般に、これらすべての組織の区画は、増殖する能力と、新しい細胞を発生させて損傷、疾患及び正常細胞の代謝回転に対して失われたものを交換しようとする能力とを有する低頻度細胞の存在を共有しており、それ故に、生涯の組織の恒常性に寄与する。
【０００６】
歴史的に幹細胞を見つけるべきでない一つの組織が脳であったが、現在、成人ニューロン新生は成人の脳でも明らかにされており、分離した中枢神経系（ＣＮＳ）領域に固執している。
【０００７】
神経幹細胞（ＮＳＣ）は、ＣＮＳの中で最も原始的な神経細胞である。最も成熟した神経細胞は、特にニューロンに関して、非常に特定化された細胞であり、酸素状態又は興奮毒性分子等の環境変化に対してかなり敏感であるため、神経組織の発生及び恒常性を持続する上でのＮＳＣの重要性が不可欠である。インビボでの生理的条件下で新しく発生した神経細胞の退化の緩徐な代謝回転は、ＮＳＣが基本的に静止状態のままであることを強調しており、それは、自己再生を受ける能力と幹細胞プールを枯渇させずに分化する能力の間で安定したバランスを維持することを可能にする。
【０００８】
癌の生物学及び治療の分野において最も人目を引く話題の一つに、癌幹細胞（ＣＳＣ）又は腫瘍増殖細胞（ＴＰＣ）と呼ばれる、幹細胞の基本特性を持つ細胞のわずかな割合が固形悪性腫瘍の起源及び維持の原因であるというものがある。
【０００９】
悪性神経膠腫は、最も一般に診断されるＣＮＳの成人原発腫瘍であり、それらの発生率は世界中で増加している。一般に、それらは、治療可能な腫瘍ではなく、ほとんどの患者が治療の有無にかかわらずそれらの疾患に屈している。グレードＩＶ神経膠腫である多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）は、最も悪性で一般的な神経膠腫であり、最先端の造影を手術、放射線治療及び化学療法と組み合わせる積極的な治療にもかかわらず、生存期間中央値は９〜１５箇月である。
【００１０】
体性幹細胞の研究は、確実に、癌の進行及び治療に対する耐性に関与する細胞要素の理解に役立つものであり、細胞の単一の又は確定した個体群を研究することの利点は、大きな又は確定していない個体群とは対照的に、おそらく、異なる個体群が腫瘍の成長及び耐性に対して行う貢献を理解するのに役立つと共に、腫瘍の不均一性についてのより詳細で正確なマッピングを可能にするであろう。
【００１１】
本物の幹細胞の効率的な単離のために多くの試みがなされているが、十分な数で、増殖に必要な状態にあることが必要である。
【００１２】
脳腫瘍増殖細胞は、正常ＮＳＣに類似した特性を共有しており、数種のマーカーの発現、自己再生と分化の能力、並びに細胞の生存及び増殖の制御にかかわるシグナル経路が挙げられる。従って、正常なニューロン新生の制御機構の研究は、脳ＴＰＣの新しい阻害剤の同定につながる可能性があり、脳腫瘍に対してより特異的な新しい治療戦略の開発をもたらす可能性もある。
【００１３】
今まで、正常ＮＳＣの同定や脳ＴＰＣの同定において完全な細胞マーカーはない。
【００１４】
マーカー陽性であるすべての腫瘍細胞が脳ＴＰＣであるわけではなく、すべての脳ＴＰＣが既知のマーカーを発現するわけでもない。例えば、原発性ＧＢＭのサブグループを含む数種の脳腫瘍については、ＴＰＣがＣＤ１３３を発現することが見出された。しかしながら、ＣＤ１３３−ＴＰＣによって駆り立てられるＧＢＭのサブグループが最近明らかにされ、ＣＤ１３３は、幹細胞様の特性にとって不可欠なものではないように見える。
【００１５】
未分化の安定した表現型を維持し（自己再生）、複数の細胞系譜において分化する能力を保持し、再生医療と創薬ほど違う適用にも使用され得る、本物の幹細胞の個体群を単離して得ることを可能にする方法を明らかにする必要性及び重要性をますます感じている。
【発明の概要】
【００１６】
従って、本発明の目的は、本物のＳＣ又はＴＰＣ哺乳類幹細胞の効率的な単離を可能にする方法を提供することにある。
【００１７】
本発明は、本物の哺乳類幹細胞の単離された個体群の製造方法に関するものであり、該方法は、
ａ．細胞の個体群を準備する工程と、
ｂ．工程ａ．の細胞の個体群からＥｐｈＡ２を発現する細胞を選択する工程と、
ｃ．工程ｂ．で選ばれた細胞を単離する工程と
を含み、それによって、本物のＳＣ又はＴＰＣ哺乳類幹細胞の個体群が作製される。
【００１８】
本発明の詳細な説明において更に記載されるように、本発明の方法は、本物の哺乳類幹細胞の単離された個体群の単離を可能にする利点を有する。
【００１９】
本発明は、本発明の方法によって得られる本物の哺乳類幹細胞の単離された個体群に関するものである。
【００２０】
本発明の更なる態様は、本発明に従う本物の哺乳類幹細胞の単離された個体群の使用であって、前述の幹細胞の成長に対して抑制活性を有する化合物のスクリーニングのための使用である。
【００２１】
本発明の更なる態様は、幹細胞の同定及び単離のための細胞表面マーカーとしてのＥｐｈＡ２の使用である。
【００２２】
本発明の特徴及び利点は、以下に報告される詳細な説明と、限定されるものではないが実例となるために与えられた例と、添付の図１〜２から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】図１は、ＥｐｈＡ２レベルに基づく幹細胞様腫瘍原性プールの濃縮を示す。（Ａ）ｈＧＢＭ試料又は樹立ヒト正常神経幹細胞から急性単離した生存（ヨウ化プロピジウム陰性）腫瘍細胞（左上）をＥｐｈＡ２Ｈｉｇｈ及びＥｐｈＡ２Ｌｏｗの画分に分けた（左下）。ＥｐｈＡ２Ｈｉｇｈの画分は、ＥｐｈＡ２Ｌｏｗの画分よりも高いクローン形成指数を示した（右）（ｎ＝４腫瘍）。エラーバー：ＳＥＭ；スチューデントのｔ検定によるＥｐｈＡ２Ｈｉｇｈ対ＥｐｈＡ２Ｌｏｗについて＊＊ｐ＝０．０００４。
【図１Ｂ】（Ｂ）６×１０４個のＥｐｈＡ２Ｈｉｇｈ又はＥｐｈＡ２Ｌｏｗ細胞の頭蓋内移植は、前者の腫瘍増殖能がずっと高いことを確認した（ＭＣテスト、ＥｐｈＡ２Ｈｉｇｈ対ＥｐｈＡ２Ｌｏｗについてログランクｐ値＜０．０００１；ｎ＝８）。
【図１Ｃ】（Ｃ）共焦点画像は、ｈＧＢＭ組織におけるＥｐｈＡ２（赤）及びＳＳＥＡ−１（緑）の広範囲に及ぶ共局在（矢じり；黄色）を示す。バー、２０μｍ。
【図１Ｄ】（Ｄ）同じｈＧＢＭからの細胞をＥｐｈＡ２及びＳＳＥＡ−１レベルに従って分けてゲートを付けた。
【図１Ｅ】（Ｅ）カプラン・マイヤー生存曲線は、２×１０４個及び１×１０４個のＥｐｈＡ２ＨｉｇｈＳＳＥＡ−１Ｈｉｇｈ精製ＴＰＣを頭蓋内に受けたマウス（生存期間中央値：それぞれ１３５日及び１６４日）がＥｐｈＡ２ＬｏｗＳＳＥＡ−１Ｌｏｗ細胞を受けたマウス（それぞれが２３０日で５６％及び６７％の生存）より早く死ぬことを示す。ＭＣ及びＧＢＷテスト、ＥｐｈＡ２ＨｉｇｈＳＳＥＡ−１Ｈｉｇｈ対ＥｐｈＡ２ＬｏｗＳＳＥＡ−１Ｌｏｗについてログランクｐ値＜０．０００１；ｎ＝９）。また、４×１０４個のＥｐｈＡ２ＨｉｇｈＳＳＥＡ−１ＨｉｇｈＴＰＣを移植すると、ＥｐｈＡ２ＬｏｗＳＳＥＡ−１ＬｏｗＴＰＣと比較して、生存が短くなった。
【図１Ｆ】（Ｆ）培養したルシフェラーゼの標識付きＴＰＣをＥｐｈＡ２Ｈｉｇｈ及びＥｐｈＡ２Ｌｏｗのプールに分けたものの限界希釈頭蓋内移植（上）。発光画像解析（下；マウス当たり５，０００個、１，０００個及び１００個の細胞）は、ＥｐｈＡ２ＬｏｗＴＰＣに対してＥｐｈＡ２Ｈｉｇｈの高い腫瘍形成能を示す。エラーバー、ＳＥＭ；＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊ｐ＝０．００２、ＥｐｈＡ２Ｈｉｇｈ対ＥｐｈＡ２Ｌｏｗ。
【図１Ｇ】カプラン・マイヤー分析は、ＥｐｈＡ２ＨｉｇｈＴＰＣを受けたマウスがＥｐｈＡ２Ｌｏｗ細胞を受けたマウスより早く死ぬことを示す（ＭＣ及びＧＢＷテスト、ＥｐｈＡ２Ｈｉｇｈ対ＥｐｈＡ２Ｌｏｗについてログランクｐ値＜０．０００１；ｎ＝９）。
【図２Ａ】図２は、ＥｐｈＡ２ＨｉｇｈＴＰＣが腫瘍形成細胞において豊富であり、インビボで腫瘍成長を持続することを示す。（Ａ−Ｂ）２つの独立したヒト神経膠芽腫組織をＥｐｈＡ２の発現に従って染色し、ゲートを付け、ＦＡＣＳ選別した。例としてＧＢＭ＃２３を示す。バー、１０μｍ。
【図２Ｂ】（Ａ−Ｂ）２つの独立したヒト神経膠芽腫組織をＥｐｈＡ２の発現に従って染色し、ゲートを付け、ＦＡＣＳ選別した。例としてＧＢＭ＃２３を示す。バー、１０μｍ。
【図２Ｃ】（Ｃ）ＧＢＭ＃２３又はＧＢＭ＃２５組織から精製され、Ｓｃｉｄ／ｂｇマウスの異なる濃度にて注入された、無培養腫瘍ＥｐｈＡ２精製個体群の頭蓋内成長。カプラン・マイヤー成長曲線は、低い投与量（２×１０４個又は１×１０４個の細胞）のＥｐｈＡ２Ｈｉｇｈ精製細胞が高い効率で腫瘍を発生する能力を保持しており、一方、ＥｐｈＡ２Ｌｏｗ個体群が低い又はゼロの腫瘍形成能を示したことを示す。また、４×１０４個のＥｐｈＡ２Ｈｉｇｈ細胞を移植すると、ＥｐｈＡ２Ｌｏｗ細胞と比較して、生存が短くなった。（ＭＣ及びＧＢＷテスト、ＥｐｈＡ２Ｈｉｇｈ対ＥｐｈＡ２Ｌｏｗ細胞についてログランクｐ値＜０．０００１；ｎ＝８）。６箇月に亘って腫瘍の成長を評価した。
【図２Ｄ】（Ｄ）ヒト神経膠芽腫（ＧＢＭ＃２４）におけるＥｐｈＡ２（緑）及び幹細胞に関係のあるＣＤ４４マーカー（赤）についての免疫組織化学。矢印は、タンパク質の共局在を示す（黄色）。挿入図：一次抗体なし。バー、１０μｍ。
【図２Ｅ】（Ｅ）同一の神経膠芽腫サンプルにおけるＥｐｈＡ２及びＣＤ４４のフローサイトメトリー分析を示すフロープロット。
【図２Ｆ】（Ｆ）Ｓｃｉｄ／ｂｇマウスの異なる濃度にて注入された、ＧＢＭ＃２４組織から得られるＥｐｈＡ２／ＣＤ４４精製個体群の頭蓋内成長を示すカプラン・マイヤー生存分析。低い投与量（２×１０４又は１×１０４）のＥｐｈＡ２ＨｉｇｈＣＤ４４Ｈｉｇｈ精製ＴＰＣを受けたマウス（生存期間中央値：それぞれ１６２日及び１８７日）が、ＥｐｈＡ２ＬｏｗＣＤ４４Ｌｏｗ細胞を受けたマウス（１９０日及び２１５日での生存がそれぞれ５５％及び７３％）と比べて、腫瘍からかなり早く死ぬ。ＭＣ及びＧＢＷテスト、ログランクｐ値＜０．０００１  ＥｐｈＡ２ＨｉｇｈＣＤ４４Ｈｉｇｈ対ＥｐｈＡ２ＬｏｗＣＤ４４Ｌｏｗ細胞；ｎ＝１１。４×１０４個のＥｐｈＡ２ＨｉｇｈＣＤ４４Ｈｉｇｈ又はＥｐｈＡ２ＬｏｗＣＤ４４Ｌｏｗ細胞の頭蓋内移植は、前者の腫瘍増殖能がずっと高いことを確認した。ＭＣ及びＧＢＷテスト、ログランクｐ値＜０．０００１  ＥｐｈＡ２ＨｉｇｈＣＤ４４Ｈｉｇｈ対ＥｐｈＡ２ＬｏｗＣＤ４４Ｌｏｗ細胞；ｎ＝１１。
【図２Ｇ】ｈＧＢＭ患者の試料から直接得られ、限界希釈分析アプローチによる同所性（頭蓋内）移植設定を受けて検証され、ＥｐｈＡ２Ｌｏｗ、ＥｐｈＡ２ＬｏｗＳＳＥＡ−１Ｌｏｗ及びＥｐｈＡ２ＬｏｗＣＤ４４Ｌｏｗ細胞とも比較した、ＥｐｈＡ２Ｈｉｇｈ、ＥｐｈＡ２ＨｉｇｈＳＳＥＡ−１Ｈｉｇｈ及びＥｐｈＡ２ＨｉｇｈＣＤ４４ＨｉｇｈＦＡＣＳ濃縮細胞画分におけるｈＧＢＭ  ＴＩＣの推定頻度。すべての場合において、ｈＧＢＭ  ＴＩＣの頻度は、「ｌｏｗ」の細胞画分に対して「ｈｉｇｈ」の細胞画分が著しく高かった（ｐ＜０．０００１）。生存期間中央値は、最低投与量の移植細胞について示される。
【図３】図３は、ＥｐｈＡ２レベルに基づいた樹立ヒト正常神経幹細胞の濃縮を示す。（Ａ）ヒト正常神経幹細胞を染色し、ＥｐｈＡ２の発現に従ってゲートを付けてＦＡＣＳ選別した。（Ｂ）ヒト正常神経細胞のクローン効率分析であり、ここで、ＥｐｈＡ２Ｈｉｇｈ画分（左柱）がＥｐｈＡ２Ｌｏｗ画分（右柱）よりも高いクローン形成指数を示した。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、本物のＳＣ又はＴＰＣ哺乳類幹細胞の単離された個体群の製造方法に関するものであり、該方法は、
ａ．細胞の個体群を準備する工程と、
ｂ．工程ａ．の細胞の個体群からＥｐｈＡ２を発現する細胞を選択する工程と、
ｃ．工程ｂ．で選ばれた細胞を単離する工程と
を含み、それによって、哺乳類幹細胞の個体群が作製される。
【００２５】
本発明において、細胞の単離された個体群は、未分化の安定した表現型、多数の継代によって広げる能力及び多数の細胞系譜で分化する能力等の類似の特性を持つ細胞のグループを意味する。
【００２６】
ＥｐｈＡ２（ホモサピエンス−ＧｅｎｅＩＤ：１９６９；ＧＩ：３２９６７３１１；ｐｒｏｔｅｉｎ＿ｉｄ：ＮＰ＿００４４２２．２；ハツカネズミ−ＧｅｎｅＩＤ：１３８３６；ＧＩ：３２４８４９８３；ｐｒｏｔｅｉｎ＿ｉｄ：ＮＰ＿０３４２６９．２）は、タンパク質チロシンキナーゼファミリーのエフリン受容体サブファミリーに属する。Ｅｐｈ及びＥｐｈに関係のある受容体は、特に神経系において、発生現象を媒介するのに関係づけられている。ＥｐｈＡ２の同族リガンドは、エフリンＡ１である。
【００２７】
本発明に従う方法は、高いレベルのＥｐｈＡ２発現に基づくＦＡＣＳによるＴＰＣの濃縮という予期しない利点を有する。
【００２８】
ＥｐｈＡ２Ｈｉｇｈ及びＥｐｈＡ２Ｌｏｗ個体群への細胞蛍光選別は、ＥｐｈＡ２の発現がｈＧＢＭ中におけるＴＰＣプールの大きさ及び腫瘍増殖能と相関していることを明らかにした。
【００２９】
神経膠腫細胞株の研究によればＥｐｈＡ２が細胞成長及び侵襲性に関与していたが、患者独自のＧＢＭにおける実際の標的細胞の同一性及び性質は不明確なままである。
【００３０】
加えて、ＥｐｈＡ２によって影響を受ける細胞機能、ｈＧＢＭ病態生理学においてＥｐｈＡ２の作用を支持する制御機構、及びこの神経膠腫の成長を抑制するシステムを操作する可能性が、十分に特徴づけられていない。ｈＧＢＭは、幹細胞様ＴＰＣとして働く細胞の下位個体群を含有しており、現在、極めて重要な治療標的であることが証明されている。
【００３１】
ＴＰＣにおける重要な制御機構の同定及び特徴づけは、ｈＧＢＭに特異的な治療の開発にとって極めて重要である。ＴＰＣにおけるＥｐｈＡ２存在量は、ｈＧＢＭからのＴＰＣの幹細胞様の潜在能力及び腫瘍増殖能の尺度を与える。それ故に、高いＥｐｈＡ２レベルは、細胞選別によるＴＰＣの濃縮に使用できる。
【００３２】
本発明に従う方法は、正常神経幹細胞とそれらの脳腫瘍における幹細胞様の腫瘍増殖対応物の生理学上の基本的類似を利用するアプローチの重要性を強調する。かかるアプローチは、ＴＰＣに影響を及ぼすことが可能な候補エフェクターを同定するために、正常神経幹細胞における制御システムの研究から得られる豊富な情報を利用することができ、それ故に、より効果的で特異的な抗ＧＢＭ治療を設計するのに役立つ。
【００３３】
好ましい態様において、本発明は、前述の細胞の個体群が、組織試料から、好ましくは生検から、好ましくは脳生検から得られる方法に関する。
【００３４】
更なる態様において、本発明は、前述の選択工程ｂ．が、細胞選別によって、好ましくは蛍光活性化細胞選別によって行われる方法に関する。
【００３５】
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）は、特殊化した種類のフローサイトメトリーである。それは、生体細胞の不均一混合物を、各細胞の特異的な光散乱と蛍光の特徴に基づき、一度に一つのセルで、２つ以上の容器に選別するための方法を与える。
【００３６】
それは、個々の細胞からの蛍光信号の速くて客観性のある定量的な記録を提供するので、有用な科学機器である。
【００３７】
フロー選別機は、生物化学において、そしてそれを超越して、広範囲に及ぶ極めて重要な資源となった。それらの主な目的は、更なる研究のために不均一個体群から興味のある個体群を回収することである。細胞又は粒子がその物理的又は化学的特徴によって特異的に同定できるなら、フロー選別機を用いてそれを分離することができる。
【００３８】
フローサイトメトリーの能力は、非常に特異的な個体群を同定するために多様性分析を使用できることである。
【００３９】
更なる態様において、本発明は、前述の選択工程ｂ．が、細胞をそのＥｐｈＡ２発現レベルに従って選別することを可能にする方法に関する。
【００４０】
更なる態様において、本発明は、前述のＥｐｈＡ２発現レベルが、抗ＥｐｈＡ２抗体を用いて測定される方法に関する。
【００４１】
更なる態様において、本発明は、上記工程ｃ．で単離された哺乳類幹細胞が、ヒト及びマウスの本物の幹細胞からなる群から選択される方法に関する。
【００４２】
更なる態様において、本発明は、上記ヒト及びマウスの本物の幹細胞が、好ましくはヒト又はマウスの神経幹細胞であり、更に好ましくはヒト又はマウスの神経前駆細胞（precursors and progenitors）である方法に関する。
【００４３】
更なる態様において、本発明の方法の工程ｃ．で単離された哺乳類幹細胞は、腫瘍幹細胞であり、好ましくは脳腫瘍幹細胞であり、更に好ましくはヒト多形性神経膠芽腫幹細胞である。
【００４４】
癌の持続的な成長、クローン多様化及び進化、腫瘍転移及び治療後の再発は、腫瘍が始まったかもしれない幹細胞の増殖ポテンシャルの腫瘍細胞による維持の結果である可能性がある。
【００４５】
本発明の方法は、幹細胞の単離を可能にする利点を有しており、癌の進行及び治療に対する耐性に関与する細胞要素の理解に向けた前進を可能にする。細胞の単一の又は確定した個体群を研究することの利点の一つは、大きな又は確定していない個体群とは対照的に、異なる個体群が腫瘍の成長及び耐性に対して行う貢献を理解するのに役立つと共に、腫瘍の不均一性についてのより詳細で正確なマッピングを可能にすることである。
【００４６】
腫瘍の幹細胞画分を効率的に除去する治療だけが長期的応答を引き起こすことができ、それによって、腫瘍の進行を停止する。
【００４７】
更なる態様において、本発明は、前述のＥｐｈＡ２が幹細胞表面マーカーである方法に関する。
【００４８】
癌幹細胞は、いくつかの特性を正常体性幹細胞又は前駆細胞と共有しており、それらは、遺伝的及び分子的シグナル伝達レベルで正常の幹細胞と異なる。
【００４９】
従って、自己再生及びＴＰＣの生存にかかわる特異的マーカーの同定は、治療を改善する新しい戦略の開発に有用である可能性がある。
【００５０】
特に、幹細胞で必要とされるＥｐｈシグナル伝達等の特徴的なシグナル経路の遮断は、癌幹細胞個体群を枯渇するために使用されるべきであり、大質量の腫瘍細胞を減量させるために伝統的な化学療法剤を同時に使用することもあり得る。これは、両方の下位個体群の迅速な除去をもたらし、一部の腫瘍細胞が腫瘍の再発を起こすかもしれない可能性を防ぐことになる。
【００５１】
更なる態様において、本発明は、本発明に従う方法によって得られる哺乳類の本物の幹細胞の単離された個体群に関する。
【００５２】
哺乳類脳内の多数の場所からの多能性ＮＳＣの単離及び特徴づけは、神経科学における最も重要な進歩の一つを示し、神経損傷に応答する内因性ＮＳＣの潜在能力について生じた証拠を提供する。この単離された哺乳類の本物の幹細胞の個体群は、研究室において容易に維持及び培養するという技術的課題を克服する利点を有しており、疾患又は損傷によって失われた又は損傷した細胞を交換することによってヒトの医学的状態を治療することを目的とするような幹細胞に基づいた治療の研究が可能になる。これらの細胞は、正常の成熟細胞型の性質の少なくとも一部を有する幹細胞誘導体を研究室において生じさせるのに有利に使用できる。
【００５３】
本発明の更なる態様は、本発明に従う哺乳類幹細胞の単離された個体群の使用であって、前述の幹細胞の成長に対して抑制活性を有する化合物のスクリーニングのための使用である。
【００５４】
悪性腫瘍又は少なくともその一部は、癌幹細胞を含んでおり、それ故に、実験レベルと臨床レベルの両方で新しい機会を与える。実際、本発明の方法によって得られる哺乳類幹細胞の単離された個体群を有することは、全体的な腫瘍質量の中で少数の細胞プールであるものの、腫瘍を確立及び拡大し、手術を受けてそれを永続化させることに関与している真の原因であるだろう細胞の調査を可能にする。
【００５５】
本発明の更なる態様は、幹細胞の同定及び単離のための細胞表面マーカーとしてのＥｐｈＡ２の使用である。
【００５６】
ＥｐｈＡ２Ｈｉｇｈ及びＥｐｈＡ２Ｌｏｗ個体群への細胞蛍光選別は、ＥｐｈＡ２の発現がＳＣとＴＰＣの両方の濃縮に使用できることと、ＥｐｈＡ２の発現がｈＧＢＭにおけるＴＰＣプールの大きさ及び腫瘍増殖能と相関していることを明らかにする。
【００５７】
好ましい態様において、本発明は、幹細胞の同定及び単離のための細胞表面マーカーとしてのＥｐｈＡ２の使用に関するものであり、ここで、前述の幹細胞は、哺乳類幹細胞であり、好ましくはヒト又はマウスの本物の幹細胞である。
【００５８】
更に好ましい態様において、本発明は、幹細胞の同定及び単離のための細胞表面マーカーとしてのＥｐｈＡ２の使用に関するものであり、ここで、幹細胞は、腫瘍幹細胞であり、好ましくは脳腫瘍幹細胞であり、更に好ましくは多形性神経膠芽腫幹細胞であり、より一層好ましくはヒト多形性神経膠芽腫幹細胞である。
【００５９】
自己再生及び細胞の運命を制御する重要な経路の規制を解除して、抑制されない自己再生につながると考えられる、腫瘍幹細胞、特には脳腫瘍幹細胞の効果的な同定及び単離は、腫瘍を発生及び増殖する癌幹細胞であって、治療の成功へのより効果的な洞察のために従来の治療に耐性を示す癌幹細胞の個体群を得ることを可能にするであろう。
【実施例】
【００６０】
例１．
ＦＡＣＳ分析
世界保健機関ガイドラインに従って組織を得て分類した。腫瘍由来の材料を用いた研究には、成人ヒト神経膠芽腫（ｈＧＢＭ）組織を用い、腫瘍由来でない材料を用いた研究には、正常のヒト脳組織又はマウス脳組織を用いた。組織を解体し、パパイン溶液で消化し、単細胞懸濁液を得た。細胞選別分析のため、細胞を遠心分離し、ＤＮａｓｅ含有ＰＢＳ（１μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）で再懸濁させた。次いで、細胞を、一次抗体：ヤギ抗ＥｐｈＡ２（１：１０；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）又はマウス抗ＳＳＥＡ−１  ＦＩＴＣ複合型及びマウス抗ＣＤ４４  ＰＥ複合型（１：１５；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｅｎｃｅｓ）と一緒に、４℃にて３０分間インキュベートし、単細胞ソートモード及び自動細胞堆積装置（ＡＣＤＵ）を用いて選別及び分析した。ＦＡＣＳＡｒｉａは、４８８、６３３及び紫色レーザーが装備されていた。細胞を同定し、前方及び直交光散乱信号（ＦＳＣ及びＳＳＣ）及び蛍光サイン（ＦＩＴＣ又はＰＥ）上に電気的にゲートを付け、ＣＤ４４、ＳＳＥＡ−１又はＥｐｈＡ２の発現に基づいた分離個体群とした。バックグランド蛍光は、一次抗体を特異的なアイソタイプコントロールと置換することによって推定された。また、各試験条件について自己蛍光の測定も常に行った。記録及びデータ処理のため、計測の生データを電気的に保管した。
【００６１】
クローン培養
クローン形成分析のため、ヒトＧＢＭ及び正常脳組織初代幹細胞様腫瘍増殖細胞又は急性的に単離した細胞の解離から、並びにマウスの脳のもの又は樹立ヒト正常神経幹細胞から得られた、異なるＥｐｈＡ２精製単細胞懸濁液を、自動ＦＡＣＳによって単一ウェル中に置いて、ニューロスフィアとして成長させた。発生した二次スフィアの数を７  ＤＩＶの後で評価した（Ｖｅｓｃｏｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。
【００６２】
例２．
免疫組織化学
ｈＧＢＭ、正常ヒト及びマウス脳からの組織試料を、２４時間４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）に後固定し、３０％から始まる減少濃度にてスクロース溶液中に置いた。ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色及び免疫組織化学的検査を、ＯＣＴ埋め込み厚さ１０μｍクリオスタット切片上で行った（Ｇａｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｖｅｓｃｏｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。以下に示す一次抗体を１０％の正常ヤギ血清（ＮＧＳ；Ｇｉｂｃｏ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）で希釈したものを用いて、組織切片を４℃にて一晩染色した：マウス抗ＥｐｈＡ２クローンＤ７（１：２００；Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、マウス抗ＳＳＥＡ１及びマウス抗ＣＤ４４（１：１００；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）。次いで、ヤギ抗マウスＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８／５４６（１：２０００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いた。ＴＯ−ＰＲＯ−３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって細胞核を対比染色した。一次抗体を取り除くことでネガティブコントロールを得た。Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ２顕微鏡及びＬｅｉｃａ  ＤＭＩＲＥ２共焦点顕微鏡を用いて試料を撮影した。
【００６３】
例３．
同所移植による腫瘍原性の評価
腫瘍形成の分析のため、原発腫瘍の試料を脱凝集させ、上記のように単細胞懸濁液を得た。２×１０４ｃｅｌｌ／μｌの異なるＥｐｈＡ２精製細胞画分の３μｌを、定位固定によって、上述のように、Ｓｃｉｄ／ｂｄマウスの右線条体中に注入した（Ｇａｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。限界希釈アプローチのため、１×１０４個、２×１０４個及び４×１０４個の無培養の腫瘍を解離したＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ２  ＳＳＥＡ−１又はＥｐｈＡ２  ＣＤ４４精製細胞画分、又は１００個、１，０００個及び５，０００個の異なるＥｐｈＡ２精製ＴＰＣ個体群を同所性に注入した。
【００６４】
インビボでの試験の結果はすべてＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ５．０ソフトウェアを用いた統計分析を受けた。カプラン・マイヤー法を用いて生存曲線を推定した。それぞれの５０％罹患率に達するのにかかった日数の生存期間中央値によって、グループを比較した。ログランク検定を用いて生存分布を比較した。ｐ値＜０．０５は、統計的に有意であると見なした。発表された方法によって、腫瘍形成細胞の推定頻度を決定した（Ｈｕ  ａｎｄ  Ｓｍｙｔｈ，２００９）。
【００６５】
例４．
ＴＰＣレンチウイルス感染
細胞にレポーター遺伝子ホタルルシフェラーゼを感染させた（Ａｍｅｎｄｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。限界希釈法によってヒーラ細胞上でのベクターの発現力価を推定した。ＨＩＶ−１  ｇａｇ  ｐ２４抗原免疫捕獲によってベクター粒子を測定した。ベクター感染力を各ベクターについての力価と粒子の比として求めた。ＴＰＣを上澄みに１６時間曝して、遺伝子導入した２３９Ｔ細胞によって一晩調整した。次いで、ウイルスを含有する培地を除去し、新鮮な培地と交換した。インビボＬｕｍｉｎａ分析によって感染効率を評価した。透明な底をした黒色の９６ウェルプレート中の培地において、生物発光細胞を５０００〜１００細胞に連続的に希釈した。撮影の３分前にＤ−ルシフェリン（ＯＮＥ−Ｇｌｏ，ルシフェラーゼ分析システム，Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに１：１（ｖ／ｖ）で加えた。撮影時間は、１ｍｉｎ／プレートであった。
【００６６】
例５．
インビボでの腫瘍の進行分析
インビボＬｕｍｉｎａ分析（Ｘｅｎｏｇｅｎ，Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて撮影した連続写真によって、ＴＰＣ腫瘍原性、腫瘍形成、拡大及び体積を間接的に求めた。動物には、撮影の１５分前に腹腔内注射によって基質Ｄ−ルシフェリン（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を１５０ｍｇ／Ｋｇ与えて、次いで麻酔した（２，５％イソフルラン）（Ｊｅｎｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。ライトタイトカメラボックス内部にある温めた台の上にマウスを置き、２％のイソフルランに連続して曝した。発光測定を週に１度行った。ＩＶＩＳＴＭカメラシステムによって、生物発光腫瘍から発光された低レベルの光を検出し、統合し、デジタル化し、表示した。腫瘍部位の相対的変化を経時的に示すため、背面から見たすべての画像について、疑似カラースケールバーは一致していた。表示された画像の興味のある領域（ＲＯＩ）を腫瘍部位周辺で確認し、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ，Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、全光束（光子数／ｓ／ｃｍ２）として定量化した。
【００６７】
上記の説明及び例から、記載された方法によって達成され、本発明に従って得られる利点が明らかになる。
【００６８】
参考文献
Vescovi, A. L., Parati, E. A., Gritti, A., Poulin, P., Ferrario, M., Wanke, E., Frolichsthal-Schoeller, P., Cova, L., Arcellana-Panlilio, M., Colombo, A., and Galli, R. (1999). Isolation and cloning of multipotential stem cells from the embryonic human CNS and establishment of transplantable human neural stem cell lines by epigenetic stimulation. Experimental neurology 156, 71-83.
Galli, R., Binda, E., Orfanelli, U., Cipelletti, B., Gritti, A., De Vitis, S., Fiocco, R., Foroni, C., DiMeco, F., and Vescovi, A. (2004). Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res 64, 7011-7021.
Hu, Y., and Smyth, G.K. (2009). ELDA: extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. J. Immunol. Methods 347, 70-78.
Amendola, M., Venneri, M. A., Biffi, A., Vigna, E., and Naldini, L. (2005). Coordinate dual-gene transgenesis by lentiviral vectors carrying synthetic bidirectional promoters. Nat Biotechnol 23, 108-116.
Jenkins, D. E., Hornig, Y. S., Oei, Y., Dusich, J., and Purchio, T. (2005). Bioluminescent human breast cancer cell lines that permit rapid and sensitive in vivo detection of mammary tumors and multiple metastases in immune deficient mice. Breast Cancer Res 7, R444-454.
【図１Ａ】
0006775954.tif 000002
【図１Ｂ】
0006775954.tif 000003
【図１Ｃ】
0006775954.tif 000004
【図１Ｄ】
0006775954.tif 000005
【図１Ｅ】
0006775954.tif 000006
【図１Ｆ】
0006775954.tif 000007
【図１Ｇ】
0006775954.tif 000008
【図２Ａ】
0006775954.tif 000009
【図２Ｂ】
0006775954.tif 000010
【図２Ｃ】
0006775954.tif 000011
【図２Ｄ】
0006775954.tif 000012
【図２Ｅ】
0006775954.tif 000013
【図２Ｆ】
0006775954.tif 000014
【図２Ｇ】
0006775954.tif 000015
【図３】
0006775954.tif 000016