(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１８又は２０で表されるアミノ酸配列からなる標識ペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載の標識ペプチドをコードする核酸。
【請求項３】
請求項２に記載の核酸を含むベクター。
【請求項４】
対象タンパク質と請求項１に記載の標識ペプチドとの融合タンパク質。
【請求項５】
請求項４に記載の融合タンパク質をコードする核酸を含むベクター。
【請求項６】
対象タンパク質に、配列番号１８又は２０で表されるアミノ酸配列からなる標識ペプチドを結合する工程を備える前記対象タンパク質を安定化する方法。
【請求項７】
請求項１に記載の標識ペプチドに対する特異的結合物質。
【請求項８】
対象タンパク質と、配列番号１８又は２０で表されるアミノ酸配列からなる標識ペプチドとの融合タンパク質に、前記標識ペプチドに対する特異的結合物質を接触させる工程を備える前記融合タンパク質の検出方法。
【請求項９】
対象タンパク質と、配列番号１８又は２０で表されるアミノ酸配列からなる標識ペプチドとの融合タンパク質に、前記標識ペプチドに対する特異的結合物質を接触させる工程を備える前記融合タンパク質の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標識ペプチドおよびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞膜透過性タンパク質を応用したタンパク質療法の開発が顕著である。しかし、タンパク質を用いた療法では、細胞や個体に投与後、タンパク質がプロテオソームやファゴソーム、オートファージやタンパク質分解酵素等によって分解され、その結果、投与タンパク質があまり効力を発揮しない場合や、極めて頻繁に投与する必要が生じる場合が多い。そのため、タンパク質の分解を抑制し、安定化する方法が求められている。
【０００３】
これまでに、タンパク質の分解を抑制する活性を有するアミノ酸配列として、ネイスセリア・メンニギチジスのＰ６４Ｋ抗原のＮ末端領域の最初の４７アミノ酸から誘導されたモチーフ等が開示されている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４０７１２８２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１に開示されているタンパク質の分解を抑制可能なモチーフは、タンパク質の安定化に寄与するが、相同性を有するアミノ酸配列が天然に複数存在するため、タンパク質の検出又は精製用のタグとしての用途には適さない。
【０００６】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、タンパク質を安定化させ、かつ、容易に検出することができる技術を提供することを目的とする。また、本発明は、標識ペプチド、核酸、ベクター、融合タンパク質、対象タンパク質を安定化する方法、特異的結合物質、融合タンパク質の検出方法および融合タンパク質の精製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下のとおりである。
（１）配列番号１８又は２０で表されるアミノ酸配列からなる標識ペプチド。
（２）（１）に記載の標識ペプチドをコードする核酸。
（３）（２）に記載の核酸を含むベクター。
（４）対象タンパク質と（１）に記載の標識ペプチドとの融合タンパク質。
（５）（４）に記載の融合タンパク質をコードする核酸を含むベクター。
（６）対象タンパク質に、配列番号１８又は２０で表されるアミノ酸配列からなる標識ペプチドを結合する工程を備える前記対象タンパク質を安定化する方法。
（７）（１）に記載の標識ペプチドに対する特異的結合物質。
（８）対象タンパク質と、配列番号１８又は２０で表されるアミノ酸配列からなる標識ペプチドとの融合タンパク質に、前記標識ペプチドに対する特異的結合物質を接触させる工程を備える前記融合タンパク質の検出方法。
（９）対象タンパク質と、配列番号１８又は２０で表されるアミノ酸配列からなる標識ペプチドとの融合タンパク質に、前記標識ペプチドに対する特異的結合物質を接触させる工程を備える前記融合タンパク質の精製方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、本来プロテアソーム、オートファージやその他タンパク質分解酵素などによって速やかに分解されるタンパク質を安定化させ、かつ、容易に検出することができる。さらに、上記タンパク質の精製、機能解析やその他分子生物学的な解析のためのツール等として活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】融合タンパク質の検出方法の一実施形態を説明する模式図である。
【図２】実施例１におけるｐｃＤＮＡから得られた融合タンパク質の発現量をウエスタンブロッティング法により比較した画像である。
【図３】実施例２におけるｐｃＤＮＡから得られた融合タンパク質の発現量をウエスタンブロッティング法により比較した画像である。
【図４】実施例３におけるｐｃＤＮＡから得られた融合タンパク質の発現量をウエスタンブロッティング法により比較した画像である。
【図５】実施例４におけるｐｃＤＮＡから得られた融合タンパク質の発現量をウエスタンブロッティング法により比較した画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、必要に応じて図面を参照しながら、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、図面中、同一又は相当部分には同一符号を付し、重複する説明は省略する。
【００１１】
＜標識ペプチド＞
（第一実施形態）
一実施形態において、本発明は、下記式［１］で表される天然に存在しないアミノ酸配列からなる標識ペプチドを提供する。
(ＸＦＮＸＮ)ｍＸｐ(ＸＦＮＸＮ)ｎＸｑ    ［１］
式［１］中、Ｘは、それぞれ独立してアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基を表し、Ｆはフェニルアラニン残基を表し、Ｎはアスパラギン残基を表し、ｍは０〜５の整数を表し、ｎは１〜５の整数を表し、ｐは１〜２０の整数を表し、ｑは１〜４の整数を表す。
【００１２】
本実施形態の標識ペプチドによれば、後述の融合タンパク質を分解から防ぎ安定化させることができる。さらに、天然に存在しないアミノ酸配列であることから、後述の標識ペプチドに対する特異的結合物質を用いることで、標識ペプチドと融合したタンパク質を高感度で検出することができ、また高純度で精製することができる。
【００１３】
本明細書において、「タンパク質が安定化した」とは、本実施形態の標準ペプチドを付加することにより、タンパク質がタンパク質分解酵素等によって分解されにくくなること、又は、タンパク質の合成速度が早まることを意味する。例えば、細胞内にタンパク質を導入した場合に、当該タンパク質の半減期が通常よりも長いことを意味する。さらに、タンパク質が安定化したか否かについては、標識ペプチドを融合したタンパク質および融合していないタンパク質を作製し、通常のウエスタンブロッティング法を用いて、タンパク質を検出することにより評価することができる。
【００１４】
本明細書において、「天然に存在しないアミノ酸配列」とは、天然に存在するタンパク質内に存在しないアミノ酸配列を意味する。例えば、標識ペプチド配列をクエリーとして、２０１５年２月２５日付けのｎｒデータベース（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｄｂ／）を、ｂｌａｓｔｐ（ｖｅｒ.  ２．２．３０）（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＡＧＥ＝Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）プログラムを用いて検索した結果、アライメントスコアが８０以下、より好ましくは６０以下、さらに好ましくは５０以下のタンパク質しかヒットしてこないことを意味する。
【００１５】
タンパク質を安定化させる活性が高い観点から、式［１］中のＸで表される、グルタミン酸残基の数はアスパラギン酸残基の数より多いことが好ましい。また、ｍは、０〜２であることが好ましい。ｎは、１であることが好ましい。ｐは、８であることが好ましい。ｑは、４であることが好ましい。具体的な標識ペプチドとしては、例えば、配列番号１０、１８および２０で表されるアミノ酸配列からなる標識ペプチドが挙げられる。
【００１６】
（第二実施形態）
また、一実施形態において、本発明は、下記式［２］で表される天然に存在しないアミノ酸配列からなる標識ペプチドを提供する。下記式［２］で表されるように、本実施形態の標識ペプチドは、上記式［１］で表される標識ペプチドのＮ末端側に、Ｎ末端からＣ末端側に向かって、メチオニン残基およびバリン残基がこの順に付加したものである。本実施形態の標識ペプチドをＮ末端に有する融合タンパク質は、発現量が上昇し、安定性が向上している。
ＭＶ(ＸＦＮＸＮ)ｍＸｐ(ＸＦＮＸＮ)ｎＸｑ    ［２］
式［２］中、Ｍはメチオニン残基を表し、Ｖはバリン残基を表す。Ｘ、Ｆ、Ｎ、ｍ、ｎ、ｐ、ｑは、上述したとおりの意味を表す。
【００１７】
＜標識ペプチドをコードする核酸＞
一実施形態において、本発明は、上述した標識ペプチドをコードする核酸を提供する。前記標識ペプチドをコードする核酸としては、例えば、配列番号９、１７、１９に記載の塩基配列からなる核酸、又は、配列番号９、１７、１９に記載の塩基配列と８０％以上、例えば８５％以上、例えば９０％以上、例えば９５％以上の同一性を有し、タンパク質を安定化する活性を有するペプチドをコードする塩基配列からなる核酸等が挙げられる。なお、配列番号９、１７、１９に示す塩基配列は、後述の実施例で用いられた配列番号１０、１８、２０のアミノ酸配列からなる標識ペプチドをコードする核酸の塩基配列である。
【００１８】
＜標識ペプチドをコードする核酸を含むベクター＞
一実施形態において、本発明は、上述した核酸を含むベクターを提供する。本実施形態のベクターは、発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターとしては特に制限されず、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３等の大腸菌由来のプラスミド；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等の枯草菌由来のプラスミド；ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５等の酵母由来プラスミド；λファージ等のバクテリオファージ；アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、レンチウィルス、ワクシニアウィルス、バキュロウィルス等のウィルス；及びこれらを改変したベクター等を用いることができる。これらは融合タンパク質発現ベクター作製用であってもよい。
【００１９】
上述の発現ベクターにおいて、標識ペプチド発現用プロモーターとしては特に限定されず、例えば、ＥＦ１αプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウィルス）プロモーター、ＨＳＶ−ｔｋプロモーター等の動物細胞を宿主とした発現用のプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、ＲＥＦ（ｒｕｂｂｅｒ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）プロモーター等の植物細胞を宿主とした発現用のプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、ｐ１０プロモーター等の昆虫細胞を宿主とした発現用のプロモーター等を使用することができる。これらプロモーターは、融合タンパク質を発現する宿主に応じて、適宜選択することができる。
【００２０】
上述の発現ベクターは、さらに、マルチクローニングサイト、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、複製起点等を有していてもよい。
【００２１】
＜融合タンパク質＞
（第一実施形態）
一実施形態において、本発明は、対象タンパク質と上述した標識ペプチドとの融合タンパク質を提供する。
【００２２】
本実施形態の融合タンパク質によれば、対象タンパク質は、上述した標識ペプチドと結合した融合タンパク質として存在することで、細胞内に導入した場合でも、タンパク質分解酵素等による分解が抑制され、安定化させることができる。
【００２３】
本実施形態の対象タンパク質は、特に限定されないが、例えば、細胞の核内に局在するタンパク質、細胞質又は細胞膜に局在するタンパク質等が挙げられる。核内に局在するタンパク質としては、細胞の初期化因子であるＳｏｘ−２、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｇｌｉｓ１等の転写因子、細胞周期に係る因子であるＤＰ−１、ｐ５３等の転写因子、転写を活性化させる因子であるＧＡＬ４、Ｆｏｘｐ３等の転写因子、核内受容体であるＲＡＲα等の受容体等が挙げられる。細胞質又は細胞膜に局在するタンパク質としては、シグナル伝達に関連する因子であるＳｏｃｓ３、Ｄｋｋ１、Ｗｎｔ３等の因子等が挙げられる。
【００２４】
本実施形態の融合タンパク質において、対象タンパク質が分解されず、かつ、対象タンパク質の有する活性等に影響がない限り、対象タンパク質と標的ペプチドとの融合の位置は特に限定されない。後述する実施例で示すように、標的ペプチドは融合タンパク質のどこに位置していてもよく、対象タンパク質のＮ末端側、Ｃ末端側又は対象タンパク質の内部のいずれに位置していても、対象タンパク質を安定化する効果を発揮することができる。
【００２５】
（第二実施形態）
本実施形態の融合タンパク質は、細胞透過性のモチーフをさらに有していてもよい。細胞透過性のモチーフとしては、例えば、ＭＴＭ（Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｎｇ  ｍｏｔｉｆ）等が挙げられる。ＭＴＭは、繊維芽細胞増殖因子であるヒトのＦＧＦ４（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ４）の疎水性シグナル配列領域に由来するアミノ酸配列からなペプチドであり、例えば、配列番号２１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（Ｈａｗｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．,  ２００５  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｖｏｌ．１１  Ｎｏ．（８）：８９２‐８）等が挙げられるがこれに限定されない。融合タンパク質はＭＴＭを有することで、細胞膜透過性を有し、容易に細胞膜内に導入され、活性を失うことなく機能することができる。本実施形態の融合タンパク質において、ＭＴＭの融合の位置は特に限定されず、融合タンパク質のＮ末端側又はＣ末端側のいずれに連結してもよい。
【００２６】
融合タンパク質は、例えば次のような方法により作成することができる。まず、融合タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを用いて、宿主を形質転換する。続いて、当該宿主を培養して融合タンパク質を発現させる。培地の組成、培養の温度、時間、誘導物質の添加等の条件は、形質転換体が生育し、融合タンパク質が効率よく産生されるよう、公知の方法に従って当業者が決定できる。また、例えば、選択マーカーとして抗生物質抵抗性遺伝子を発現ベクターに組み込んだ場合、培地に抗生物質を加えることにより、形質転換体を選択することができる。続いて、宿主が発現した融合タンパク質を適宜の方法により精製することにより、融合タンパク質が得られる。
【００２７】
＜融合タンパク質をコードする核酸＞
一実施形態において、本発明は、上述した融合タンパク質をコードする核酸を提供する。本実施形態の核酸を導入した発現ベクターを作製することで、安定性が向上したタンパク質を発現させることができる。
【００２８】
＜融合タンパク質をコードする核酸を含むベクター＞
一実施形態において、本発明は、上述した融合タンパク質をコードする核酸を含むベクターを提供する。本実施形態のベクターは、発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターとしては、上述した標識ペプチドをコードする核酸を含むベクターと同様のものが挙げられる。
【００２９】
＜対象タンパク質を安定化する方法＞
一実施形態において、本発明は、対象タンパク質に、上述した標識ペプチドを結合する工程を備える前記対象タンパク質を安定化する方法を提供する。
【００３０】
対象タンパク質に標識ペプチドを結合する工程は、具体的には、対象タンパク質をコードする核酸断片と、標識ペプチドをコードする核酸断片とをＬｉｇａｔｉｏｎ等により連結させることにより、実施することができる。上記の核酸を発現させて得られる融合タンパク質は、標識ペプチドを有していない対象タンパク質と比較して、安定性が向上している。
【００３１】
＜標識ペプチドに対する特異的結合物質＞
一実施形態において、本発明は、上述した標識ペプチドに対する特異的結合物質を提供する。本実施形態の特異的結合物質としては、上述した標識ペプチドに対する抗体、抗体断片、アプタマー、受容体等が挙げられる。
【００３２】
抗体は、例えば、マウス等のげっ歯類の動物に標識ペプチドを抗原として免疫することによって作製することができる。また、例えば、ファージライブラリーのスクリーニングにより作製することができる。抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。
【００３３】
アプタマーとは、標識物質に対する特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。標識ペプチドに特異的結合能を有する核酸アプタマーは、例えば、ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）法等により選別することができる。また、標識ペプチドに特異的結合能を有するペプチドアプタマーは、例えば酵母を用いたＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法等により選別することができる。
【００３４】
詳細については後述するが、本実施形態の特異的結合物質によれば、上述した融合タンパク質を高感度に検出することができる。また、融合タンパク質を高純度に精製をすることができる。
【００３５】
＜融合タンパク質の検出方法＞
一実施形態において、本発明は、上述した融合タンパク質に、上述した標識ペプチドに対する特異的結合物質を接触させる工程を備える前記融合タンパク質の検出方法を提供する。
【００３６】
本実施形態の検出方法によれば、上述した標識ペプチドが天然に存在しないアミノ酸配列からなることから、上述した融合タンパク質を容易に検出することができる。
【００３７】
融合タンパク質に特異的結合物質を接触させる工程は、例えば、次のように実施することができる。まず、融合タンパク質を発現させた宿主を緩衝液に懸濁して超音波破砕等の方法で破壊する。続いて、例えば、破砕液をＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法により、分子量の違いにより分離する。さらに、電気泳動で分離したタンパク質をゲルからメンブレンに移し、ブロッキング剤でメンブレン上をコーティングする。続いて、メンブレン上の融合タンパク質に、上述した標識ペプチドに対する特異的結合物質を接触させ、検出する。
図１は、融合タンパク質の検出方法の一実施形態を説明する模式図である。例えば、マウス由来の上述した標識ペプチドに対する一次抗体を用いた場合、前記一次抗体を融合タンパク質に直接結合させる。さらに、マウス由来のタンパク質に結合する抗体に標識をつけた標識二次抗体を前記一次抗体に反応させて、最終的に融合タンパク質を検出することができる（図１参照）。
【００３８】
標識には酵素を用いる系、蛍光を用いる系など、公知の方法を用いることができる。例えば、酵素を用いる系では、ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）や ＡＰ（Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）などで標識した二次抗体を一次抗体に反応させて、酵素活性による発色や化学発光により検出する。化学発光による検出には、Ｘ線フィルムへの露光検出、あるいは化学発光を検出可能なスキャナーを必要とするが、発色法に比べ１０〜５０倍以上も感度が高いので、微量タンパク質の検出が容易になる。蛍光法は、Ｃｙ３やＣｙ５で標識した二次抗体を蛍光検出するので、定量性に優れている。
【００３９】
＜融合タンパク質の精製方法＞
一実施形態において、本発明は、上述した融合タンパク質に、上述した標識ペプチドに対する特異的結合物質を接触させる工程を備える前記融合タンパク質の精製方法を提供する。
【００４０】
本実施形態の精製方法によれば、上述した標識ペプチドが天然に存在しないアミノ酸配列からなることから、上述した融合タンパク質を容易に精製することができる。
【００４１】
本明細書において、「精製」は、「分離」、「回収」、「吸着」等といいかえることができる。
【００４２】
本実施形態の精製方法は、例えば、次のように実施することができる。まず、融合タンパク質を発現させた宿主を緩衝液に懸濁して超音波破砕等の方法で破壊する。続いて、標識ペプチドに対する特異的結合物質が固定された固相と、前記融合タンパク質を含む破砕液を接触させる。すると、融合タンパク質中の標識タンパク質が標識ペプチドに対する特異的結合物質に吸着することにより、融合タンパク質を固相に吸着させることができる。
【００４３】
続いて、固相に吸着した融合タンパク質を緩衝液等で洗浄する。その後、固相に吸着した融合タンパク質に、例えば、ｐＨを変化させること、又は、塩を添加すること等により、融合タンパク質を固相から解離させ回収すればよい。
【００４４】
上述の固相としては、従来の精製方法において用いられるものであれば特に限定はなく、例えば、ビーズ、膜、中空糸膜、プラスティック基板、ウェルプレート、スライドガラス、表面プラズモン共鳴測定装置等の測定機器のセンサーチップ等が挙げられる。ビーズ、膜等の形態である固相は、カラムに充填されていてもよい。
【００４５】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４６】
＜実験例１＞
１−１．発現プラスミドの作製
標識ペプチドおよびヒトＳｏｘ２タンパク質（以下、「ｈＳｏｘ２」という場合がある。）からなる融合タンパク質を哺乳動物培養細胞で発現させるため、ｐｃＤＮＡ発現プラスミド（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）に、下記表１に示す試験例１〜２７の融合タンパク質をコードするｃＤＮＡをＬｉｇａｔｉｏｎにより挿入した。融合タンパク質には、Ｆｌａｇタグ（以下、「Ｆｌａｇ」という場合がある。）も導入した。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
表１中、「ｋｏｚａｋ-Ｍｅｔ」は、コザック配列を示している。コザック配列(Ｋｏｚａｋ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ)は、真核生物のｍＲＮＡに出現する共通配列であり、主に翻訳の開始に関与している。脊椎動物では「（ｇｃｃ）ｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧ」と表され、なかでも開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のＲ（プリン塩基・アデニンまたはグアニン）と開始コドンの次のＧが重要な役割を果たすと考えられている。「ＡＵＧ」の部分は、タンパク質のＮ末端のメチオニン残基をコードしている。今回は、「ｃｃｇｃｃ（ｋｏｚａｋ）−ＡＵＧ（Ｍｅｔ）」で表される塩基配列を用いた。
今回使用した標識ペプチドの塩基配列およびアミノ酸配列については、配列表の配列番号１〜２０に記載した。また、ヒトＳｏｘ２の塩基配列およびアミノ酸配列については、配列表の配列番号２３および２４に記載した。
【００４９】
Ｆｌａｇタグは、配列番号２２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドであり、この配列をペプチドすることで、ウエスタンブロッティングによる検出が極めて容易になること（ウエスタンブロッティングに用いるＨＲＰ融合Ｆｌａｇ抗体（ＳＩＧＭＡ社）は極めて高感度でＦｌａｇタグ融合タンパク質を検出可能である。）から使用した。
【００５０】
各プラスミドを含む単一クローン化した大腸菌を各々アンピシリン入りＬＢ培地を用いて培養した。遠心分離により集菌後、アルカリＳＤＳ法およびＰＥＧ沈殿法を用い、発現プラスミドを精製した。
【００５１】
１−２．細胞培養
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｙ（ＨＥＫ）の細胞を無血清培地に馴化し浮遊細胞化した細胞）を１０％ＦＢＳ入りダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉ−ｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ、ＤＭＥＭ）（抗生物質としてペニシリンとストレプトマイシンを含む）により培養した。トランスフェクション用には、トランスフェクション時に５０％コンフルエントとなるように、前日に１２ウェルディッシュにＨＥＫ２９３Ｔ細胞を撒いた。
【００５２】
１−３．トランスフェクション
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に試験例１〜２７の発現プラスミドをトランスフェクションした。発現プラスミドは、上述のものを各２００ｎｇ用い、補正用にｐｃＤＮＡ発現プラスミドを各々計３．０μｇとなるように加え、さらにＴＥバッファー２０μＬ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ、ＥＤＴＡ））、２Ｍ塩化カルシウム溶液３μＬを加えた。トランスフェクション試薬には、ＨＢＳバッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）、２８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４）を用いた。発現プラスミド溶液に、ＨＢＳバッファー２０μＬを２回に分けてゆっくりと加え、撹拌懸濁した。発現プラスミド溶液中のＤＮＡと、リン酸カルシウムとの複合体を形成するため、３０分間静置した。その間、細胞の培地を交換した。発現プラスミド溶液中のＤＮＡと、リン酸カルシウムとの複合体を培地に添加し、ゆっくりと混ぜ合わせた。ＣＯ２インキュベーターに置き、５％ＣＯ２濃度、３７℃の条件下で培養を続けた。
【００５３】
１−４．ウエスタンブロッティング法による融合タンパク質の検出
（１）細胞抽出液の調製
トランスフェクション後、２４時間培養を続けた細胞から培地を捨て、１ｍＬリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）を加え、軽いピペッティングで細胞を剥がし、１．５ｍＬのチューブに移した。１．５ｋｒｐｍの遠心分離で細胞を回収し、上清を捨てた。沈殿した細胞に８０μＬのＮＥＴ−Ｎ＋バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．９）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＮＰ−４０およびプロテアーゼインヒビターカクテルを使用直前に添加したもの）を加え、数回ピペッティングにより抽出し、１３．５ｋｒｐｍ、４℃で遠心分離を行った。上清を別の新しい１．５ｍＬのチューブに移し、８０μＬの２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを加え、撹拌した。９８℃で１分間煮沸し、電気泳動用のサンプルを調製した。
【００５４】
（２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による融合タンパク質の分離
１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより、各レーンの細胞抽出液サンプルを５μＬずつロードし電気泳動した。電気泳動後、ゲル板からゲルを外した。
【００５５】
（３）ゲルからメンブレンへの転写
電気泳動により得られたゲルをトランスファーバッファーに浸した。ゲルをトランスファーブロット（ＢｉｏＲＡＤ社）にセットし、ゲル上に分離したサンプルタンパク質をＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフロライド）メンブレン（ミリポア社）に転写した。
【００５６】
（４）ブロッキング
サンプルタンパク質を移したＰＶＤＦメンブレンをブロッキングバッファー（ナカライ社）に浸した。
【００５７】
（５）抗体反応
ＴＢＳＴバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）で４回洗浄後、一次抗体としてＨＲＰ融合抗Ｆｌａｇ抗体、またサンプルの抽出液の均一性を補正するためにハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチンに特異的な抗体（抗β-アクチン, モノクローナル抗体, ペルオキシダーゼ結合）を用いた。
【００５８】
（６）検出
検出はケミルミワン（Ｃｈｅｍｉ−Ｌｕｍｉ  Ｏｎｅ）（ナカライ社）をＨＲＰの基質として用い、発色をハイパーフィルム（ＧＥヘルスケア社）によって検出した。結果は、図２に示した。
【００５９】
１−５．結果
対照である試験例１よりも発現量が多いものは、分解抑制活性を有すると判断できる。図２から、Ｎ末端領域に標識ペプチドが配置した融合タンパク質では、配列番号４、１０、１２の標識ペプチドを融合したヒトＳｏｘ２の発現が高かった。
また、Ｃ末端領域に標識ペプチドを配置した融合タンパク質では、配列番号２、１０、１８、２０の標識ペプチドを融合したヒトＳｏｘ２の発現が高かった。
さらに、Ｋｏｚａｋ−Ｍｅｔおよび標識ペプチドをＮ末端領域に配置した融合ペプチドでは、配列番号２、１０、１８、２０の標識ペプチドを融合したヒトＳｏｘ２の発現が高かった。
従って、配列番号２、１０、１８、２０の標識ペプチドは、ヒトＳｏｘ２と融合したタンパク質において、分解耐性活性を十分に有することが明らかになった。
【００６０】
＜実験例２＞
２−１．発現プラスミドの作製
標識ペプチドおよびヒトＲＡＲαタンパク質（以下、「ｈＲＡＲα」という場合がある。）からなる融合タンパク質を哺乳動物培養細胞で発現させるため、ｐｃＤＮＡ発現プラスミド（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）に、表２に示す融合タンパク質をコードするｃＤＮＡをＬｉｇａｔｉｏｎにより挿入した。融合タンパク質には、Ｆｌａｇタグも導入した。また、ヒトＲＡＲαの塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号２５および２６に記載した。
【００６１】
【表２】
0006646310.tif 000003
【００６２】
２−２．細胞培養
実験例１の１−２．と同様に行った。
２−３．トランスフェクション
実験例１の１−３．と同様の手順により、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に試験例２８〜５４の発現プラスミドをトランスフェクションした。
２−４．ウエスタンブロッティング法による融合タンパク質の検出
実験例１の１−４．と同様に行った。結果を図３に示した。
【００６３】
２−５．結果
図３から、Ｎ末端領域に標識ペプチドが配置した融合タンパク質では、配列番号２、４、６、１６の標識ペプチドを融合したヒトＲＡＲαの発現が高かった。
また、Ｃ末端領域に標識ペプチドを配置した融合タンパク質では、配列番号１０、１８、２０の標識ペプチドを融合したヒトＲＡＲαの発現が高かった。
さらに、Ｋｏｚａｋ−Ｍｅｔおよび標識ペプチドをＮ末端領域に配置した融合ペプチドでは、配列番号１２の標識ペプチドを融合したヒトＲＡＲα以外はすべてにおいて発現が高かった。
従って、配列番号２、１０、１８、２０の標識ペプチドは、ヒトＲＡＲαと融合したタンパク質においても、分解耐性活性を十分に有していることが明らかになった。
【００６４】
＜実験例３＞
３−１．発現プラスミドの作製
標識ペプチドおよびヒトＤＰ−１タンパク質（以下、「ｈＤＰ−１」という場合がある。）からなる融合タンパク質を哺乳動物培養細胞で発現させるため、ｐｃＤＮＡ発現プラスミド（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）に、表３に示す融合タンパク質をコードするｃＤＮＡをＬｉｇａｔｉｏｎにより挿入した。融合タンパク質には、Ｆｌａｇタグも導入した。また、ヒトＤＰ−１の塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号２７および２８に記載した。
【００６５】
【表３】
0006646310.tif 000004
【００６６】
なお、「ｈＤＰ−１ΔＣ３９５」とは、ヒトＤＰ−１タンパク質中のタンパク質分解に抵抗性を有するＣ末端領域を欠損した変異体を示す。「ｈＤＰ−１ΔＣ３９５」のｃＤＮＡは、以下のプライマー（ＦｏｗａｒｄおよびＲｅｖｅｒｓｅ１）を用いたＰＣＲにより増幅した。また、表３中の試験例５７および５８に示す融合タンパク質をコードするｃＤＮＡは、以下のプライマー（ＦｏｗａｒｄおよびＲｅｖｅｒｓｅ２）を用いたＰＣＲにより増幅した。
【００６７】
【表４】
0006646310.tif 000005
【００６８】
ＰＣＲ反応液は以下の組成であった。
【００６９】
【表５】
0006646310.tif 000006
【００７０】
以上の組成のＰＣＲ反応液を以下のサイクルで反応させた。
【００７１】
【表６】
0006646310.tif 000007
【００７２】
ＰＣＲ増幅産物を制限酵素処理し、同制限酵素処理したｐｃＤＮＡ３−ＦｌａｇベクターにＬｉｇａｔｉｏｎし挿入した。挿入はミニプレップ後、制限酵素処理し確認した。また全配列が正しいことをシークエンスにより確認した。
【００７３】
３−２．細胞培養
実験例１の１−２．と同様に行った。
３−３．トランスフェクション
実験例１の１−３．と同様に行った。
３−４．ウエスタンブロッティング法による融合タンパク質の検出
実験例１の１−４．と同様に行った。結果を図４に示した。
【００７４】
３−５．結果
図４から、Ｃ末端領域に標識ペプチドを配置した融合タンパク質では、ヒトＤＰ−１の発現が見られなかった。
さらに、Ｋｏｚａｋ−Ｍｅｔおよび標識ペプチドをＮ末端領域に配置した融合ペプチドでは、配列番号２０の標識ペプチドを融合したヒトＤＰ−１の発現が高かった。
従って、配列番号２０の標識ペプチドとヒトＤＰ−１との融合したタンパク質では、Ｎ末端領域に配置した場合において、分解耐性活性を有することが明らかになった。
【００７５】
＜実験例４＞
４−１．発現プラスミドの作製
標識ペプチドおよびヒトＦｏｘｐ３タンパク質（以下、「ｈＦｏｘｐ３」という場合がある。）からなる融合タンパク質を哺乳動物培養細胞で発現させるため、ｐｃＤＮＡ発現プラスミド（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）に、表７に示す融合タンパク質をコードするｃＤＮＡをＬｉｇａｔｉｏｎにより挿入した。融合タンパク質には、Ｆｌａｇタグも導入した。また、ヒトＦｏｘｐ３の塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号３１および３２に記載した。
【００７６】
【表７】
0006646310.tif 000008
【００７７】
４−２．細胞培養
実験例１の１−２．と同様に行った。
４−３．トランスフェクション
実験例１の１−３．と同様に行った。
４−４．ウエスタンブロッティング法による融合タンパク質の検出
実験例１の１−４．と同様に行った。結果を図５に示した。
【００７８】
４−５．結果
図５から、Ｃ末端領域に標識ペプチドを配置した融合タンパク質では、配列番号１８および２０の標識ペプチドを融合したヒトＦｏｘｐ３の発現が高かった。
さらに、Ｋｏｚａｋ−Ｍｅｔおよび標識ペプチドをＮ末端領域に配置した融合ペプチドでは、配列番号１８および２０の標識ペプチドを融合したヒトＦｏｘｐ３の発現が高かった。
従って、配列番号１８および２０の標識ペプチドは、ヒトＦｏｘｐ３と融合したタンパク質においても、分解耐性活性を十分に有していることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明によれば、タンパク質を安定化させ、かつ、容易に検出又は精製することができる。本発明によれば、分解が速いタンパク質を安定化させ、機能解析やその他分子生物学のツールとして活用することができる。
【符号の説明】
【００８０】
１…メンブレン、２…ブロッキング剤、３…融合タンパク質、４…一次抗体（標識ペプチドに対する抗体）、５…標識二次抗体、６…その他のタンパク質
【図１】
0006646310.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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