(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン生合成酵素をコードする遺伝子であって、そのヌクレオチド配列が配列番号１に示される遺伝子。
【請求項２】
請求項１に記載の遺伝子によりコードされ、そのアミノ酸配列が配列番号２に示されるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン生合成酵素。
【請求項３】
ヌクレオチド配列が配列番号１に示される遺伝子を大腸菌に導入することにより得られることを特徴とする組換え大腸菌。
【請求項４】
請求項３に記載の組換え大腸菌を用いて基質の変換反応を行う工程を含むことを特徴とするＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生合成方法。
【請求項５】
前記基質が、アミノ酸エステルおよびアミノ酸アミドからなる群より選択されるカルボキシル基成分と、アミノ酸、Ｃ−保護アミノ酸およびアミンからなる群より選択されるアミン成分とを含むことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
（１）基質Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩とＬ−グルタミンを緩衝液に溶解し、ｐＨを８．０〜１０．０に調整する工程、
（２）組換え大腸菌を工程（１）で得られた体系に加えて反応させ、反応温度を１５〜４０℃とし、反応系ｐＨを８．０〜１０．０とする工程、および
（３）ｐＨが低下しなくなる時点を反応が終点に達するところとし、反応液を収集し、組換え大腸菌の菌体を遠心分離することにより反応を終了させる工程を含むことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項７】
さらに、組換え大腸菌の菌体を繰り返して使用する工程を含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
（１）ヌクレオチド配列が配列番号１に示される目的遺伝子をクローニングし、発現ベクターｐＥＴ２９ａを用いて該遺伝子を含む組換えベクターを構築し、ヒートショック法にて組換えベクターを発現宿主Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させることによる組換え大腸菌の構築工程、
（２）耐性遺伝子スクリーニング、ＰＣＲおよび制限酵素による切断にて工程（１）で得られた陽性の形質転換体を検証し、斜面培地に保存する工程、
前記斜面培地が、酵母エキス粉末５ｇ／Ｌ、トリプトン１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌおよび粉末寒天２０ｇ／Ｌを１２１℃で１５分間滅菌し、冷却後、カナマイシンを終濃度１０〜１００μｇ／ｍＬとなるように添加したものである。
（３）活性化された組換え大腸菌を種培地に移し、３７℃、２００ｒｐｍの条件で拡大培養を行い、細胞のＯＤ６００が０．４〜１．０となってから、イソプロピルチオガラクトシドを終濃度０．２〜２．０ｍＭとなるように添加して一晩低温での誘導培養を行う工程、
前記種培地が、酵母エキス粉末５ｇ／Ｌ、トリプトン１０ｇ／ＬおよびＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌを１２１℃で１５分間滅菌し、冷却後、カナマイシンを終濃度１０〜１００μｇ／ｍＬとなるように添加したものである。
（４）基質Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩とＬ−グルタミンを緩衝液に溶解し、工程（３）の培養物を加えて、ｐＨを８．０〜９．０に調整し、２５±１℃の条件で体系を反応させ、ｐＨが低下しなくなる時点を反応の終点とし、反応液を収集して菌体を遠心分離することによるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生合成工程、および
（５）工程（４）で分離して得られた菌体を新たな反応系に加え、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを繰り返して生産する工程を含むＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生合成方法。
【請求項９】
ヌクレオチド配列が配列番号１に示される外因性遺伝子を含む組換え出芽酵母。
【請求項１０】
さらに、外因性凝集性遺伝子ＦＬＯ１を含むことを特徴とする請求項９に記載の組換え出芽酵母。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の組換え出芽酵母を用いて基質の変換反応を行う工程を含むことを特徴とするＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生合成方法。
【請求項１２】
前記基質が、アミノ酸エステルおよびアミノ酸アミドからなる群より選択されるカルボキシル基成分と、アミノ酸、Ｃ−保護アミノ酸およびアミンからなる群より選択されるアミン成分とを含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
（１）基質Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩とＬ−グルタミンを溶媒系に溶解し、ｐＨを８．０〜９．０に調整する工程、
（２）組換え出芽酵母を工程（１）で得られた体系に加えて反応させ、反応温度を１０〜４０℃とし、反応系ｐＨを８．０〜９．０とする工程、および
（３）ｐＨが低下しなくなる時点を反応が終点に達するところとし、反応液を収集し、菌体を遠心分離することにより反応を終了させる工程を含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
さらに、組換え出芽酵母を繰り返して使用する工程を含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
（１）ヌクレオチド配列が配列番号１に示される目的遺伝子をクローニングし、発現ベクターｐＹＤ１を用いて該遺伝子を含む組換えベクターを構築し、ヒートショック法にて該組換えベクターを大腸菌ＤＨ５αに形質転換させることによる組換え出芽酵母の構築工程、
（２）アンピシリン耐性遺伝子スクリーニング、ＰＣＲおよび制限酵素による切断にて工程（１）で得られた形質転換体を検証し、斜面培地に保存する工程、
（３）工程（２）で得られた形質転換体から組換え発現ベクターを抽出し、出芽酵母ＥＢＹ１００のコンピテント細胞に形質転換させ、栄養要求性スクリーニングにて陽性の形質転換体を得て、陽性の形質転換体を活性化させてから種培地に接種し、菌体がＯＤ６２０＝０．５〜５．０となるように成長してから誘導培地に移し、組換え出芽酵母を得る工程、
（４）基質Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩とＬ−グルタミンを溶媒系に溶解し、工程（３）の培養物を加えて、ｐＨを８．０〜９．０に調整し、２０±５℃の条件で体系を反応させ、ｐＨが低下しなくなる時点を反応の終点とし、反応液を収集して菌体を分離することによるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生合成工程、および
（５）工程（４）で分離して得られた菌体を新たな反応系に加え、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを繰り返して生産する工程を含むＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生合成方法。
【請求項１６】
（１）ヌクレオチド配列が配列番号１に示される目的遺伝子をクローニングし、発現ベクターｐＹＤ１を用いて該遺伝子を含む組換えベクターを構築し、ヒートショック法にて組換えベクターを大腸菌ＤＨ５αに形質転換させることによる組換え出芽酵母の構築工程、
（２）アンピシリン耐性遺伝子スクリーニング、ＰＣＲおよび制限酵素による切断にて工程（１）で得られた形質転換体を検証し、斜面培地に保存する工程、
（３）工程（２）で得られた形質転換体から組換え発現ベクターを抽出し、出芽酵母ＥＢＹ１００のコンピテント細胞に形質転換させ、栄養要求性スクリーニングにて陽性の形質転換体を得て、陽性の形質転換体を活性化させてから種培地に接種し、菌体がＯＤ６２０＝０．５〜５．０となるように成長してから誘導培地に移し、組換え出芽酵母を得る工程、
（４）ヌクレオチド配列が配列番号６、７に示されるプライマーセットにてヌクレオチド配列が配列番号８に示される凝集性遺伝子ＦＬＯ１を増幅させる工程、
（５）工程（４）で得られた増幅産物を発現ベクターｐＲＳ４２５−ｐＧＫにライゲーションし、ライゲーション産物をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αのコンピテント細胞に形質転換させ、ＬＢ耐性平板培地で形質転換体をスクリーニングし、検証し、自己凝集性組換えベクターを得る工程、
（６）自己凝集性組換えベクターを工程（３）で得られた組換え出芽酵母のコンピテント細胞に形質転換させ、ＬＥＵ要求性スクリーニングにて自己凝集能力を有する組換え出芽酵母を得る工程、
（７）基質Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩とＬ−グルタミンを溶媒系に溶解し、工程（６）の自己凝集能力を有する組換え出芽酵母を加えて、ｐＨを８．０〜９．０に調整し、２０±５℃の条件で体系を反応させ、ｐＨが低下しなくなる時点を反応の終点とし、反応液を収集して菌体を分離することによるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生合成工程、および
（８）工程（７）で分離して得られた菌体を新たな反応系に加え、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを繰り返して生産する工程を含むＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生合成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生合成方法に関し、バイオ技術分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Ｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ）は、Ｎ（２）−Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンとも呼ばれ、高い溶解度、高い水溶性および強い熱安定性等の長所を有しており、段々グルタミン（Ｌ−Ｇｌｎ）の代わりに主要な腸管外栄養サプリメントとなっている。
【０００３】
現在、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンの合成は、主に化学合成法およびバイオ酵素触媒法が使用されている。化学合成法によるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生産は、反応工程が多く、副産物が多く、試薬毒性が大きくかつ環境に優しくない（唐果．Ｎ（２）−Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンジペプチドの合成および反応に関する研究．厦門大学，２００４；中国特許，Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンの合成方法，CN1392156A）。
【０００４】
また、バイオ酵素触媒法は、酵素の使用量が多く、ペプチドの生産効率が低くかつ一部の高疎水性アミノ酸しか触媒合成できない等の短所を有する。CN104480075AおよびCN105274174Aにそれぞれバイオ酵素によりＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを触媒合成する方法が開示されている。これらの方法では、バイオ酵素冷凍乾燥粉末またはバイオ酵素緩衝液を用いて触媒反応を行い、酵素の分離精製コストが高くかつ反応後の回収・再利用が困難であることから、実際の工業化生産に適さない。研究者らは、枯草菌から、無保護のアミノ酸を基質としジペプチドを合成するアミノ酸ライゲーション酵素（Ｌａｌ）を得た（ＣＮ１６７１８４０Ａ）。しかしながら、この酵素はＡＴＰ依存型酵素であり、外因性ＡＴＰの提供が必要とされ、ジペプチドの生産コストが依然として高いから、幅広くマーケティングされることができない（Fermentative production of L-alanyl-L-glutamine by a metabolically engineered Escherichia coli strain expressing L-amino acid α-ligase. Applied and environmentalmicrobiology, 2007, 73(20): 6378-6385.）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、生物変換によりＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを生産する完全な技術手段を提供することを目的とする。Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン合成酵素をコードする優れる外因性遺伝子を探すことから始め、遺伝子工学的方法により組換え菌を構築し、これに基づいて適切なバイオ発酵工学的手段を設計することで、環境に優しく、高効率かつ低コストでＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの工業化生産を実現することを期待している。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明は、まずＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン生合成酵素をコードする遺伝子であって、そのヌクレオチド配列が配列番号１に示される遺伝子を提供する。
また、本発明は、前記ヌクレオチド配列が配列番号１に示される遺伝子によりコードされ、そのアミノ酸配列が配列番号２に示されるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン生合成酵素を提供する。
【０００７】
前記Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン生合成酵素をコードする遺伝子は、基質をＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンに変換する優れる能力を有する。本発明は、該遺伝子を外因性遺伝子とし、微生物工学的手段により組換えプラスミドおよび組換え菌を構築し、さらに組換えた微生物を用いて発酵系において直接Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを触媒合成することで、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンの変換効率を向上すると共に、生物変換工程における酵素の分離精製が困難であること、酵素の活性が不安定であることおよびコストが高いこと等の問題を解決することができる。
【０００８】
用途の面では、本発明は、まず組換え大腸菌を提供し、さらにこの組換え大腸菌を用いるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生合成方法を公開する。本発明に開示される組換え大腸菌は、ヌクレオチド配列が配列番号１に示される遺伝子を大腸菌に導入することにより得られるものである。
【０００９】
前記組換え大腸菌を用いるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生合成方法は、前記組換え大腸菌を用いて基質の変換反応を行う工程を含む。
用途のもう１つの面では、本発明は、ヌクレオチド配列が配列番号１に示される外因性遺伝子を含む組換え出芽酵母を公開する。
前記方法で製造された組換え出芽酵母は、全細胞触媒として、基質を高効率で速くＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンに変換することができ、しかも酵素の分離精製工程が不要である。よって、本発明のもう１つの目的は、上記した本発明の組換え出芽酵母を用いて基質の変換反応を行う工程を含むＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生合成方法を提供することである。
【００１０】
また、本発明は、提供される組換え出芽酵母に基づいて、さらに自己凝集能力を有する組換え出芽酵母を公開する。また、該組換え出芽酵母を用いてＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを生産する生合成方法を公開する。
【発明の効果】
【００１１】
以上のように、本発明は、新たに発見したエステルトランスフェラーゼおよび該酵素をコードする遺伝子に基づき、微生物工学および酵素遺伝子工学的手段を用いて組換え大腸菌および組換え出芽酵母を成功に構築し、これらを全細胞触媒として基質をＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンに変換することで、酵素の分離精製が不要となり、モル変換率が高く、生産速度が速く、菌体が繰り返して使用できる等の利点を有しており、高効率で、環境に優しく、経済的にＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを生産するのを実現する良いチョイスである。また、繰り返して使用する工程により、工業生産のコストを低減すること、および酵素が回収されにくく利用率が低くかつ酵素活性が不安定等の問題を解決することが期待できる。
【００１２】
本発明に公開されるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生産方法のいずれかを使用しても、下記の技術的效果を得ることができる。１）実験原料が経済的で入手されやすい。設備・操作および制御が簡便であり、全細胞による触媒合成の経路が簡単で環境に優しい。しかも酵素の分離精製工程が不要となり、エネルギー消耗および生産コストを低減できる。２）反応速度が速く、反応時間が短く、モル変換率が高く、反応液を遠心分離するだけで反応を終了させることができ、加熱による酵素の不活性化が不要となり高温によるグルタミンの毒性発生を避けることができる。３）菌体細胞の繰り返し使用は、菌体の培養回数を減らし、バイオ酵素の製造および加熱による不活性化にかかるコストを削減し、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンの反応期間を短縮し、生産の効率を向上することができる。よって、本発明は、顕著なマーケティング競争力を有し、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンの工業化生産により適する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
本発明に１２の図面がある。
【図１】組換え大腸菌に用いる組換え発現ベクターの模式的構造図。
【図２】反応温度に対する組換え大腸菌の相対酵素活性変化図。
【図３】繰り返し使用回数に対する組換え大腸菌の相対酵素活性変化図。
【図４】組換え出芽酵母に用いる組換え発現ベクターの模式的構造図。
【図５】組換え出芽酵母細胞表面にディスプレイされるバイオ酵素の蛍光およびレーザー共焦点検証図。
【図６】組換え出芽酵母全細胞によるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの触媒合成に対する基質濃度の影響。
【図７】反応温度に対するＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを触媒合成する組換え出芽酵母の相対酵素活性変化図。
【図８】反応ｐＨに対するＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを触媒合成する組換え出芽酵母の相対酵素活性変化図。
【図９】繰り返し使用回数に対する組換え出芽酵母の相対酵素活性変化図。
【図１０】自己凝集性組換え出芽酵母に用いる組換え発現ベクターの模式的構造図。
【図１１】時間に対する自己凝集性組換え出芽酵母の相対酵素活性変化図。
【図１２】繰り返し使用回数に対する自己凝集性組換え出芽酵母の相対酵素活性変化図。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明では、まず、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン生合成酵素をコードする遺伝子であって、そのヌクレオチド配列が配列番号１に示される遺伝子を得ることが確認できた。この遺伝子のドナーは、スフィンゴバクテリウム属微生物であり、より具体的にスフィンゴバクテリウム・シヤンゲンシス（Sphingobacterium siyangensis）である。
【００１５】
配列番号１の遺伝子配列によりコードされるアミノ酸配列は配列番号２に示される。このアミノ酸配列は６１９個のアミノ酸からなる。最も近いと考えられる従来技術（ＺＬ０３８１７９１６．４）と比べて、３個のアミノ酸が変化する。即ち、１８８位のアミノ酸がＹ（チロシン）からＦ（フェニルアラニン）に変化し、両者がいずれも芳香族アミノ酸であり、これは非荷電の極性Ｒ基アミノ酸から非極性Ｒ基アミノ酸への変化である；５４６／５４７位のアミノ酸がＡＰ（アラニン／プロリン）からＰＳ（プロリン／セリン）に変化し、これは中性アミノ酸／複素環アミノ酸から複素環アミノ酸／水酸基含有アミノ酸への変化であると共に、非極性Ｒ基アミノ酸から非荷電の極性Ｒ基アミノ酸への変化である。なお、酵素機能領域の解析結果は、エステルトランスフェラーゼが主にPeptidase S15（44-331）とPepX_C（382-613）の２つの機能領域を有し、その中、Peptidase S15（44-331）領域がX-Pro dipeptidyl-peptidase（S15 family）に属し、潜在的なエステルトランスフェラーゼの重要な触媒中心領域であり、PepX_C（382-613）領域がＣ末端非触媒領域に属するが、ジペプチジルペプチダーゼ（Ｓ９Ｂタンパク質ファミリーのセリンエキソペプチダーゼ）と多くの類似構造を有することを示す。その生理機能への研究を進める必要があるが、従来技術から、タンパク質のダイマー化は酵素が触媒活性を有するのに必須とされることと、酵素のグリコシル化はその生理機能を影響することとの２つの情報が得られる。本発明では、配列番号２のアミノ酸配列における１８８位のアミノ酸の突然変異により酵素の触媒機能領域を変化させる可能性があり、５４６／５４７位のアミノ酸の突然変異によりタンパク質のダイマー化を変化させる可能性があり、この２点により酵素の触媒活性を影響する。
【００１６】
前記バイオ酵素の遺伝子情報を確定した後、本発明は、さらにプラスミドを増幅し保存する。具体的に、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを用いて、プラスミドを増幅し保存する。
これに基づいて、本発明は、前記外因性遺伝子を持つプラスミドを用いてそれぞれの組換え微生物に用いる組換えベクターを構築し、組換え微生物を構築し、そして組換え微生物を用いて発酵法によるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生産方法を確立する。
【００１７】
前記外因性遺伝子の用途の具体的な第一実施態様は、組換え大腸菌を構築し、そしてこれを用いてＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを生合成することである。
目的遺伝子と発現ベクターを制限酵素により切断した後、組換えることにより組換え大腸菌に用いる組換えベクターを構築する。好ましいベクターはｐＥＴ２９ａである。
【００１８】
従来のバイオ技術における方法を用いて、構築した組換えベクターを発現宿主細胞に形質転換させて目的遺伝子を持つバイオ組換え菌を構築すれば良く、このような方法としては、ヒートショック法が挙げられるが、これに限定されない。本発明では、発現宿主として、具体的に大腸菌を選び、従来技術で形質転換の宿主として使用される全ての大腸菌が使用できる。好ましい例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）が挙げられるが、これに限定されない。
そして、本発明は、前記組換え大腸菌を用いるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生合成方法を提供する。該方法は、少なくとも前記方法により得られた組換え大腸菌を用いて従来技術に従って発酵生産を行うプロセスを含む。このプロセスは、前記組換え大腸菌を用いて基質の変換反応を行う工程に関わる。
【００１９】
Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生合成において、その基質は従来技術によれば、カルボキシル基成分とアミン成分を含む基質である。本発明では、前記カルボキシル基成分は、アミノ酸エステルおよびアミノ酸アミドから選択され、最も好ましくはＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩である。前記アミン成分は、アミノ酸、Ｃ−保護アミノ酸およびアミンから選択され、最も好ましくはＬ−グルタミンである。反応系における基質濃度を反応物の比率反応関係に応じて設定することは、生産に最も有利である。反応基質濃度の上限および下限について制限がない。但し、最も高い反応物濃度は、ある程度で系内における反応基質の溶解度により決められ、反応基質濃度の増加に従って変換がある程度抑制される。さらなる具体的な実施態様において、グルタミンの最も高い溶解度は約２５０ｍＭであるが、生産においてこのレベルより高いレベルで反応物の仕込み量を設定してもよく、例えば、６００ｍＭとする。この場合、最初の反応系において一部不溶の固形状態となるが、反応の進行と伴い、徐々に溶解するので、変換反応の進行を影響しない。よって、該仕込み法は、反応が順調に進行することを保証しながら、操作コストを低減することができる。実施可能な実施態様として、本発明では、最初の反応系における前記カルボキシル基成分とアミン成分の濃度を５０〜６００ｍＭに設定することができる。
【００２０】
また、上記した組換え大腸菌を用いて生物変換によりＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを合成する方法において、変換反応系のｐＨは８．０〜１０．０であり、好ましくは８．０〜９．０である。
さらに、上記した組換え大腸菌を用いて生物変換によりＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを合成する方法において、前記変換反応系における組換え大腸菌の使用量は（体系）ＯＤ６００＝０．５〜５．０である。
【００２１】
最適化した結果によれば、上記した組換え大腸菌を用いるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生合成方法のより具体的な一実施態様は、下記の操作工程を含む方法である。
（１）基質Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩（Ｌ−Ａｌａ−ＯＭｅ）とＬ−グルタミン（Ｌ−Ｇｌｎ）を緩衝液に溶解し、ｐＨを８．０〜１０．０に調整する工程、
（２）組換え大腸菌を工程（１）で得られた体系に加えて反応させ、反応温度を１５〜４０℃とし、反応系のｐＨを８．０〜１０．０とする工程、および
（３）ｐＨが低下しなくなる時点を反応が終点に達するところとし、反応液を収集して菌体を遠心分離することにより反応を終了させる工程。
該具体的な実施態様において、本発明の前記Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生合成経路は、簡略に下記のようにまとめることができる。
【００２２】
【化１】
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【００２３】
前記方法において、工程（１）における前記緩衝液は、当業者が従来技術に従って決めれば良く、好ましくはホウ酸塩緩衝液であるが、これに限定されない。工程（１）では、アルカリ液を用いて体系ｐＨを８．０〜９．０に調整することが好ましい。また、工程（２）における前記反応温度は、好ましくは２５℃である。もちろん、測定や制御誤差によるある程度の温度変動は許される。該工程（２）の反応系ｐＨは、依然として好ましくは８．０〜９．０である。
【００２４】
上記した組換え大腸菌を用いるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生合成方法によれば、触媒反応合成系において全細胞を用いて生産を行うので、反応を適当な程度まで行い組換え大腸菌を物理的分離すれば、反応を終了させることができる。また、分離された組換え大腸菌は、組換え菌として改めて生物変換の反応系に添加し使用することができ、繰り返して使用することが実現できる。よって、該方法の最も重要な一実施態様は、さらに菌体を繰り返して使用する工程を含む。即ち、前記工程（３）の反応終了後で分離して得られた菌体を新たな反応系中に加えて繰り返して使用する。
【００２５】
下記の実施態様により、より完全で詳しく本発明の内容および好ましい態様について説明する。該具体的な実施方式において、前記Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生合成方法は、下記の工程を含む。
（１）ヌクレオチド配列が配列番号１に示される目的遺伝子をクローニングし、発現ベクターｐＥＴ２９ａを用いて該遺伝子を含む組換えベクターを構築し、ヒートショック法にて該組換えベクターを発現宿主Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させることによる組換え大腸菌の構築工程、
（２）耐性遺伝子スクリーニング、ＰＣＲおよび制限酵素による切断にて工程（１）で得られた陽性の形質転換体を検証し、斜面培地に保存する工程、
前記斜面培地が、酵母エキス粉末５ｇ／Ｌ、トリプトン１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌおよび粉末寒天２０ｇ／Ｌを１２１℃で１５分間滅菌し、冷却後、カナマイシンを終濃度１０〜１００μｇ／ｍＬとなるように添加したものである。
（３）活性化された組換え大腸菌を種培地に移し、３７℃、２００ｒｐｍの条件で一晩培養し、所定の接種量で発酵培地に接種し拡大培養を行い、細胞のＯＤ６００が０．４〜１．０となってから、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を終濃度０．２〜２．０ｍＭとなるように添加し一晩低温での誘導培養を行う工程、
前記種培地と発酵培地が、酵母エキス粉末５ｇ／Ｌ、トリプトン１０ｇ／ＬおよびＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌを１２１℃で１５分間滅菌し、冷却後、カナマイシンを終濃度１０〜１００μｇ／ｍＬとなるように添加したものである。
（４）基質Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩（Ｌ−Ａｌａ−ＯＭｅ）とＬ−グルタミン（Ｌ−Ｇｌｎ）を緩衝液に溶解し（請求項５に記載の基質濃度と緩衝液種類に従う）、工程（３）の培養物を加えて、ｐＨを８．０〜９．０に調整し、２５±１℃の条件で体系を反応させ、ｐＨが低下しなくなる時点を反応の終点とし、反応液を収集して菌体を遠心分離することによるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生合成工程、および
（５）工程（４）で分離して得られた菌体を新たな反応系に加え、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを繰り返して生産する工程。
【００２６】
前記外因性遺伝子の用途の具体的な第二実施態様は、組換え出芽酵母を構築し、そしてこれを用いてＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを生合成することである。
【００２７】
配列番号１の外因性遺伝子を持つ保存されたプラスミドに基づいて、目的遺伝子と発現ベクターを制限酵素により切断した後、組換えることにより組換え出芽酵母に用いる組換えベクターを構築する。好ましいベクターはｐＹＤ１である。その後、該組換えベクターを大腸菌ＤＨ５αに形質転換させる。具体的な方法としては、ヒートショック法が挙げられるが、これに限定されない。続いて、アンピシリン抗性遺伝子スクリーニング、ＰＣＲおよび制限酵素による切断にて前記工程で得られた形質転換体を検証し、斜面培地に保存する。所望の組換え出芽酵母を得るために、続いて組換え発現ベクターｉｉを抽出し、出芽酵母のコンピテント細胞に形質転換させ、栄養要求性スクリーニングにて陽性形質転換体を得る必要がある。陽性の形質転換体を活性化させてから種培地に接種し、菌体がＯＤ６２０＝０．５〜５．０となるように成長してから、誘導培地に移し、組換え出芽酵母を得る。原則的に、前記出芽酵母のコンピテント細胞としては、従来技術で形質転換の宿主として使用される全ての出芽酵母のコンピテント細胞が挙げられる。本具体的な実施態様では、前記発現宿主は出芽酵母Saccharomyces cerevisiae EBY100である。この宿主を選ぶ重要な理由の１つは、酵母細胞表面のディスプレイ技術によりエステルトランスフェラーゼのタンパク質を酵母細胞壁タンパク質と融合させ天然コンフォーメーションで細胞表面にアンカーさせることができることである。これは、酵素の固定化に相当する。そのほかの宿主による発現と比べて、ディスプレイ酵素の製造が簡単であり、酵素の分離精製および固定化等の工程が不要となり、酵素制剤の生産コストが低減できる。細胞内酵素と比べて、ディスプレイ酵素は基質および産物の膜貫通抵抗がなく、細胞内の加水分解酵素による触媒産物Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンへの分解作用も存在しない。
【００２８】
特に説明しない限り、本発明で言及する斜面培地は、酵母エキス粉末５．０ｇ／Ｌ、トリプトン１０．０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０．０ｇ／Ｌおよび粉末寒天２０．０ｇ／Ｌを１２１℃で１５分間滅菌し、冷却後、アンピシリンを終濃度１０〜１００μｇ／ｍＬとなるように添加することにより製造される。
【００２９】
前記種培地は、８２ｍＬの超純水にアミノ無しの酵母炭素源０．６７ｇを添加し、固体培地を製造する場合は３．０ｇ／Ｌの粉末寒天を添加し、１２１℃で１５分間滅菌し、滅菌後、アミノ酸混合液１０ｍＬ、ロイシン（６．０ｇ／Ｌ）１ｍＬ、ヒスチジン（２．０ｇ／Ｌ）１ｍＬ、トレオニン（２０．０ｇ／Ｌ）１ｍＬおよび４０ｗｔ％のグルコース５ｍＬを追加することにより製造される。
【００３０】
前記誘導培地は、８２ｍＬの超純水にアミノ無しの酵母炭素源０．６７ｇを添加し、１２１℃で１５分間滅菌し、滅菌後、アミノ酸混合液１０ｍＬ、ロイシン（６．０ｇ／Ｌ）１ｍＬ、ヒスチジン（２．０ｇ／Ｌ）１ｍＬ、トレオニン（２０．０ｇ／Ｌ）１ｍＬおよび４０ｗｔ％のガラクトース５ｍＬを追加することにより製造される。
【００３１】
前記種培地および誘導培地の製造に言及されるアミノ酸混合液は、アルギニン０．２ｇ／Ｌ、アスパラギン酸１．０ｇ／Ｌ、グルタミン酸１．０ｇ／Ｌ、イソロイシン０．３ｇ／Ｌ、リシン０．３ｇ／Ｌ、バリン１．５ｇ／Ｌ、メチオニン０．２ｇ／Ｌ、フェニルアラニン０．５ｇ／Ｌ、セリン３．７５ｇ／Ｌ、チロシン０．３ｇ／Ｌおよびアデニン０．４ｇ／Ｌを含む。
【００３２】
本発明は、構築した組換え出芽酵母に基づいて、さらにＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生合成方法を提供する。該方法は、本発明の前記組換え出芽酵母を用いて基質の変換反応を行う工程を含む。
【００３３】
前記組換え出芽酵母を用いるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生合成において、その基質は従来技術によれば、カルボキシル基成分とアミン成分を含む基質である。本発明では、前記カルボキシル基成分は、アミノ酸エステルおよびアミノ酸アミドから選択され、最も好ましくはＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩である。前記アミン成分は、アミノ酸、Ｃ−保護アミノ酸およびアミンから選択され、最も好ましくはＬ−グルタミンである。反応系における基質濃度を反応物の比率反応関係に応じて設定することは、生産に最も有利である。反応基質濃度の上限および下限について制限がない。但し、最も高い反応物濃度は、ある程度で系内における反応基質の溶解度により決められ、反応基質濃度の増加に従って変換がある程度抑制される。本具体的な実施態様において、グルタミンの最も高い溶解度は約２５０ｍＭであるが、生産においてこのレベルより高いレベルで反応物の仕込み量を設定してもよく、例えば、６００ｍＭとする。この場合、最初の反応系において一部不溶の固形状態となるが、反応の進行と伴い、徐々に溶解するので、変換反応の進行を影響しない。よって、該仕込み法は、反応が順調に進行することを保証しながら、操作コストを低減することができる。実施可能な実施態様において、最初の反応系における前記カルボキシル基成分とアミン成分の濃度を１００〜６００ｍＭに設定することができる。
【００３４】
また、組換え出芽酵母を用いるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの合成方法において、変換反応系ｐＨは６．０〜１０．０であり、好ましくは８．０〜９．０である。前記変換反応の温度は１０〜４０℃であり、好ましくは１８〜２５℃であり、最も好ましくは２０〜２５℃である。
【００３５】
さらに、組換え出芽酵母を用いるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの合成方法において、前記変換反応系における組換え出芽酵母の使用量はＯＤ６２０＝０．５〜５．０である。
【００３６】
最適化した結果によれば、上記した組換え出芽酵母を用いるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生合成方法のより具体的な一実施態様は、下記の操作工程を含む方法である。
（１）基質Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩（Ｌ−Ａｌａ−ＯＭｅ）とＬ−グルタミン（Ｌ−Ｇｌｎ）を溶媒系に溶解し、ｐＨを８．０〜９．０に調整する工程、
（２）組換え出芽酵母を工程（１）で得られた体系に加えて反応させ、反応温度を１０〜４０℃とし、反応系のｐＨを８．０〜９．０とする工程、および
（３）ｐＨが低下しなくなる時点を反応が終点に達するところとし、反応液を収集して菌体を分離することにより反応を終了させる工程。
該具体的な実施態様において、本発明の前記Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生合成経路は、簡略に下記のようにまとめることができる。
【００３７】
【化２】
0006731119.tif 000003
【００３８】
前記方法において、工程（１）における前記緩衝液は、当業者が従来技術に従って決めれば良く、該溶媒系は、水、リン酸塩緩衝液またはホウ酸塩緩衝液のいずれでもよく、好ましくはリン酸塩緩衝液である。工程（１）では、アルカリ液を用いて体系ｐＨを８．０〜９．０に調整することが好ましい。また、工程（２）における前記反応温度は、好ましくは１８〜２５℃であり、最も好ましくは２０〜２５℃である。もちろん、測定や制御誤差によるある程度の温度変動は許される。該工程（２）の反応系ｐＨは、依然として好ましくは８．０〜９．０である。
【００３９】
上記した組換え出芽酵母を用いるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生合成方法によれば、触媒反応合成系において全細胞を用いて生産を行うので、反応を適当な程度まで行い組換え出芽酵母を物理的分離すれば、反応を終了させることができる。また、分離された組換え出芽酵母は、組換え菌として改めて生物変換の反応系に添加し使用することができ、繰り返して使用することが実現できる。よって、該方法の最も重要な一実施態様は、さらに菌体を繰り返して使用する工程を含む。即ち、前記工程（３）の反応終了後で分離して得られた菌体を新たな反応系中に加えて繰り返して使用する。
【００４０】
具体的な実施態様では、出芽酵母は発酵時発酵系において自己沈降する特性を有するので、変換反応終了後、体系を静置し組換え出芽酵母細胞が自己沈降した後、ぜん動ポンプにて反応上清を取り除き分離した組換え出芽酵母を新たな反応系に使用することができる。
【００４１】
下記の実施態様により、より完全で詳しく本発明の内容および好ましい態様について説明する。前記組換え出芽酵母を用いるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生合成方法は、下記の工程を含む。
（１）ヌクレオチド配列が配列番号１に示される目的遺伝子をクローニングし、発現ベクターｐＹＤ１を用いて該遺伝子を含む組換えベクターを構築し、ヒートショック法にて該組換えベクターを大腸菌ＤＨ５αに形質転換させることによる組換え出芽酵母の構築工程、
（２）アンピシリン耐性遺伝子スクリーニング、ＰＣＲおよび制限酵素による切断にて工程（１）で得られた形質転換体を検証し、斜面培地に保存する工程、
前記斜面培地が、酵母エキス粉末５．０ｇ／Ｌ、トリプトン１０．０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０．０ｇ／Ｌおよび粉末寒天２０．０ｇ／Ｌを１２１℃で１５分間滅菌し、冷却後、アンピシリンを終濃度１０〜１００μｇ／ｍＬとなるように添加したものである。
（３）工程（２）で得られた形質転換体から組換え発現ベクターを抽出し、出芽酵母ＥＢＹ１００のコンピテント細胞に形質転換させ、栄養要求性スクリーニングにて陽性の形質転換体を得て、陽性の形質転換体を活性化させてから種培地に接種し、菌体がＯＤ６２０＝０．５〜５．０となるように成長してから誘導培地に移し、組換え出芽酵母を得る工程、
前記種培地は、８２ｍＬの超純水にアミノ無しの酵母炭素源０．６７ｇを添加し、固体培地を製造する場合は３．０ｇ／Ｌの粉末寒天を添加し、１２１℃で１５分間滅菌し、滅菌後、アミノ酸混合液１０ｍＬ、ロイシン（６．０ｇ／Ｌ）１ｍＬ、ヒスチジン（２．０ｇ／Ｌ）１ｍＬ、トレオニン（２０．０ｇ／Ｌ）１ｍＬおよび４０ｗｔ％のグルコース５ｍＬを追加したものである。
【００４２】
前記誘導培地は、８２ｍＬの超純水にアミノ無しの酵母炭素源０．６７ｇを添加し、１２１℃で１５分間滅菌し、滅菌後、アミノ酸混合液１０ｍＬ、ロイシン（６．０ｇ／Ｌ）１ｍＬ、ヒスチジン（２．０ｇ／Ｌ）１ｍＬ、トレオニン（２０．０ｇ／Ｌ）１ｍＬおよび４０ｗｔ％のガラクトース５ｍＬを追加したものである。
【００４３】
前記種培地および誘導培地の製造に言及されるアミノ酸混合液は、アルギニン  ０．２ｇ／Ｌ、アスパラギン酸１．０ｇ／Ｌ、グルタミン酸１．０ｇ／Ｌ、イソロイシン０．３ｇ／Ｌ、リシン０．３ｇ／Ｌ、バリン１．５ｇ／Ｌ、メチオニン０．２ｇ／Ｌ、フェニルアラニン０．５ｇ／Ｌ、セリン３．７５ｇ／Ｌ、チロシン０．３ｇ／Ｌおよびアデニン０．４ｇ／Ｌを含む。
【００４４】
（４）基質Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩（Ｌ−Ａｌａ−ＯＭｅ）とＬ−グルタミン（Ｌ−Ｇｌｎ）を溶媒系に溶解し、工程（３）の培養物を加えて、ｐＨを８．０〜９．０に調整し、２０±５℃の条件で体系を反応させ、ｐＨが低下しなくなる時点を反応の終点とし、反応液を収集して菌体を分離することによるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生合成工程、および
（５）工程（４）で分離して得られた菌体を新たな反応系に加え、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを繰り返して生産する工程。
【００４５】
前記外因性遺伝子の用途の第三実施態様は、構築した組換え出芽酵母に基づいて、さらに自己凝集能力を有する組換え出芽酵母を構築することである。
前記自己凝集能力を有する組換え出芽酵母は、前記組換え出芽酵母の好ましい一実施態様として、さらに外因性凝集性遺伝子ＦＬＯ１を含むことを特徴とする。
【００４６】
前記自己凝集能力を有する組換え出芽酵母は、下記の方法により構築することができる。
（１）ヌクレオチド配列が配列番号６、７に示されるプライマーセットにてヌクレオチド配列が配列番号８に示される凝集性遺伝子ＦＬＯ１を増幅させ、
（２）増幅産物を発現ベクターｐＲＳ４２５−ｐＧＫにライゲーションし、ライゲーション産物をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αのコンピテント細胞に形質転換させ、ＬＢ耐性平板培地で形質転換体をスクリーニングし、検証し、自己凝集性組換えベクターを得て、
（３）自己凝集性組換えベクターを本発明の前記組換え出芽酵母のコンピテント細胞に形質転換させ、ＬＥＵ要求性スクリーニングにて自己凝集能力を有する組換え出芽酵母（自己凝集性組換え出芽酵母）を得る。
【００４７】
本発明は、さらに、得られた自己凝集性組換え出芽酵母に基づいてＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを生合成するもう１つの方法を提供する。この方法は、下記の工程を含む。
（１）ヌクレオチド配列が配列番号１に示される目的遺伝子をクローニングし、発現ベクターｐＹＤ１を用いて該遺伝子を含む組換えベクターを構築し、ヒートショック法にて組換えベクターを大腸菌ＤＨ５αに形質転換させることによる組換え出芽酵母の構築工程、
（２）アンピシリン耐性遺伝子スクリーニング、ＰＣＲおよび制限酵素による切断にて工程（１）で得られた形質転換体を検証し、斜面培地に保存する工程、
（３）工程（２）で得られた形質転換体から組換え発現ベクターを抽出し、出芽酵母ＥＢＹ１００のコンピテント細胞に形質転換させ、栄養要求性スクリーニングにて陽性の形質転換体を得て、陽性の形質転換体を活性化させてから種培地に接種し、菌体がＯＤ６２０＝０．５〜５．０となるように成長してから誘導培地に移し、組換え出芽酵母を得る工程、
（４）ヌクレオチド配列が配列番号６、７に示されるプライマーセットにてヌクレオチド配列が配列番号８に示される凝集性遺伝子ＦＬＯ１を増幅させる工程、
（５）工程（４）で得られた増幅産物を発現ベクターｐＲＳ４２５−ｐＧＫにライゲーションし、ライゲーション産物をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αのコンピテント細胞に形質転換させ、ＬＢ耐性平板培地で形質転換体をスクリーニングし、検証し、自己凝集性組換えベクターを得る工程、
（６）自己凝集性組換えベクターを工程（３）で得られた組換え出芽酵母のコンピテント細胞に形質転換させ、ＬＥＵ要求性スクリーニングにて自己凝集能力を有する組換え出芽酵母を得る工程、
（７）基質Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩とＬ−グルタミンを溶媒系に溶解し、工程（６）の自己凝集能力を有する組換え出芽酵母を加えて、ｐＨを８．０〜９．０に調整し、２０±５℃の条件で体系を反応させ、ｐＨが低下しなくなる時点を反応の終点とし、反応液を収集して菌体を分離することによるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの生合成工程、および
（８）工程（７）で分離して得られた菌体を新たな反応系に加え、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを繰り返して生産する工程。
【００４８】
下記の非限定的な実施例は、本発明の内容をさらに説明するものであり、本発明に対して何ら限定をしない。
【実施例】
【００４９】
実施例１
組換え大腸菌の構築
公知の関連バイオ酵素のヌクレオチド配列（配列番号５）に従ってプライマー（配列番号３、４）を設計し、中国普通微生物菌種保存管理センターに保存されるスフィンゴバクテリウム・シヤンゲンシス（Sphingobacterium siyangensis、菌株番号：1.6855）ゲノムをテンプレートとし該バイオ酵素の配列番号１の遺伝子を増幅した。
【００５０】
ここで、ＰＣＲ反応系：ｄＮＴＰｓ（それぞれ２．５ｍＭ）、４μＬ；１０＊Ｂｕｆｆｅｒ、５μＬ；Ｆ（１０μＭ）、２μＬ；Ｒ（１０μＭ）、２μＬ；ＥｘＴａｑ酵素（５Ｕ／μＬ）、１μＬ；ｄｄＨ２Ｏ、３４μＬ。
ＰＣＲ反応条件：９４℃、５ｍｉｎ、１サイクル；９４℃、３０ｓｅｃ、５５℃、３０ｓｅｃ、７２℃、２ｍｉｎ、３０サイクル；７２℃、７ｍｉｎ、１サイクル。産物は４℃で保存した。
【００５１】
ＰＣＲ産物をゲルで回収精製後、プラスミドｐＭＤＴＭ１９−Ｔにライゲーションし、陽性クローンからプラスミドを抽出後、シークエンシングした。制限酵素による切断で陽性クローンのバイオ酵素遺伝子を得て、同様に処理した発現ベクターｐＥＴ２９ａにライゲーションし、ライゲーション産物をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αのコンピテント細胞に形質転換させ、ＬＢ耐性培地で培養し、単一のコロニーを取り、少量のプラスミドを抽出し、制限酵素による切断で検証し、さらにＤＮＡシークエンシングすることで、バイオ酵素発現ベクターを得た。さらに、ヒートショック法にて発現宿主のコンピテント細胞に形質転換させ、スクリーニングにてＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを触媒合成できる組換え大腸菌を得た。
【００５２】
実施例２
組換え大腸菌の発酵培養
組換え大腸菌をＬＢ液体培地（酵母エキス粉末５ｇ／Ｌ、トリプトン１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ）に接種し、３７℃、２００ｒｐｍの条件で菌体を活性化させた。その後、種培地に移し、３７℃、２００ｒｐｍで一晩振盪培養した。１％の接種量で１．５Ｌの発酵培地に接種し、３７℃、２００ｒｐｍでＯＤ６２０＝０．６〜０．８となるように細胞を通気培養し、誘導剤ＩＰＴＧを加え一晩誘導後、遠心分離にて菌体を収集した。本発明のそのほかの実施例における組換え大腸菌とした。
【００５３】
実施例３
５０ｍＭの基質濃度で全細胞によるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの触媒合成
０．６９８ｇのＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩（５０ｍＭのＬ−Ａｌａ−ＯＭｅ）と１．４６２ｇのＬ−グルタミン（１００ｍＭのＬ−Ｇｌｎ）を測り、９０ｍＬの０．２Ｍ  ｐＨ８．７ホウ酸塩緩衝液に溶解し、温度を２５℃に制御し、６ＭのＮａＯＨ水溶液でｐＨを８．５に調整した。反応系におけるＯＤ６００＝０．７５となるように組換え大腸菌を添加し、６ＭのＮａＯＨ溶液でｐＨを維持し、１０ｍｉｎ後、遠心分離にて細胞を取り除き反応を終了させた。高速液体クロマトグラフィー法（中国薬典２０１０年版二部付録ＶＤ）によりＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの最高濃度は９．０４ｇ／Ｌと測定し、モル変換率は８３．３％であった。
【００５４】
実施例４
１００ｍＭの基質濃度で全細胞によるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの触媒合成
１．３９６ｇのＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩（１００ｍＭのＬ−Ａｌａ−ＯＭｅ）と１．４６２ｇのＬ−グルタミン（１００ｍＭのＬ−Ｇｌｎ）を測り、９０ｍＬの０．２Ｍ  ｐＨ８．７ホウ酸塩緩衝液に溶解し、温度を２５℃に制御し、６ＭのＮａＯＨ水溶液でｐＨを８．５に調整した。反応系におけるＯＤ６００＝２．０となるように組換え大腸菌を添加し、６ＭのＮａＯＨ溶液でｐＨを維持し、１０ｍｉｎ後、遠心分離にて細胞を取り除き反応を終了させた。高速液体クロマトグラフィー法（中国薬典２０１０年版二部付録ＶＤ）によりＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの最高濃度は１５．９２ｇ／Ｌと測定した。
【００５５】
実施例５
２００ｍＭの基質濃度で全細胞によるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの触媒合成
２．７９２ｇのＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩（２００ｍＭのＬ−Ａｌａ−ＯＭｅ）と２．９２４ｇのＬ−グルタミン（２００ｍＭのＬ−Ｇｌｎ）を測り、９０ｍＬの０．２Ｍ  ｐＨ８．７ホウ酸塩緩衝液に溶解し、温度を２５℃に制御し、６ＭのＮａＯＨ水溶液でｐＨを８．５に調整した。反応系におけるＯＤ６００＝２．０となるように組換え大腸菌を添加し、６ＭのＮａＯＨ溶液でｐＨを維持し、１０ｍｉｎ後、遠心分離にて細胞を取り除き反応を終了させた。高速液体クロマトグラフィー法によりＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの最高濃度は３１．３４ｇ／Ｌと測定した。
【００５６】
実施例６
４００ｍＭの基質濃度で全細胞によるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの触媒合成
５．５８４ｇのＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩（４００ｍＭのＬ−Ａｌａ−ＯＭｅ）と５．８４８ｇのＬ−グルタミン（４００ｍＭのＬ−Ｇｌｎ）を測り、９０ｍＬの０．２Ｍ  ｐＨ８．７ホウ酸塩緩衝液に溶解し、温度を２５℃に制御し、６ＭのＮａＯＨ溶液でｐＨを８．５に調整した。反応系におけるＯＤ６００＝２．０となるように組換え大腸菌を反応系に添加し、６ＭのＮａＯＨ溶液でｐＨを維持し、２０ｍｉｎ後、遠心分離にて細胞を取り除き反応を終了させた。高速液体クロマトグラフィー法によりＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの最高濃度は６１．５３ｇ／Ｌと測定した。
【００５７】
実施例７
６００ｍＭの基質濃度で全細胞によるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの触媒合成
８．３７６ｇのＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩（６００ｍＭのＬ−Ａｌａ−ＯＭｅ）と８．７７２ｇのＬ−グルタミン（６００ｍＭのＬ−Ｇｌｎ）を測り、９０ｍＬの０．２Ｍ  ｐＨ８．７ホウ酸塩緩衝液に溶解し、温度を２５℃に制御し、６ＭのＮａＯＨ水溶液でｐＨを８．５に調整した。反応系におけるＯＤ６００＝２．０となるように組換え大腸菌を添加し、６ＭのＮａＯＨ溶液でｐＨを維持し、２０ｍｉｎ後、遠心分離にて細胞を取り除き反応を終了させた。高速液体クロマトグラフィー法（中国薬典２０１０年版二部付録ＶＤ）によりＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの最高濃度は７９．９１ｇ／Ｌと測定した。
【００５８】
実施例８
全細胞によるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの触媒合成に対する反応温度の影響
１％の接種量で組換え大腸菌をＬＢ発酵培地に接種し、３７℃、２００ｒｐｍでＯＤ６２０＝０．７３となるように細胞を通気培養した。その後、誘導剤ＩＰＴＧを加えバイオ酵素の発現を誘導した。細胞を遠心分離しＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの触媒反応を行った。５．５８４ｇのＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩（４００ｍＭのＬ−Ａｌａ−ＯＭｅ）と５．８４８ｇのＬ−グルタミン（４００ｍＭのＬ−Ｇｌｎ）を測り、９０ｍＬの０．２Ｍ  ｐＨ８．７ホウ酸塩緩衝液に溶解し、６ＭのＮａＯＨ溶液でｐＨを８．５に調整し、それぞれの反応温度で触媒合成反応を行った。高速液体クロマトグラフィー法（中国薬典２０１０年版二部付録ＶＤ）によりＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの濃度を測定した。組換え大腸菌全細胞は、１５〜４０℃の範囲でＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを触媒合成することができ、２５℃で全細胞によるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの触媒合成の収量が最も高かった。２５℃での酵素活性を１００％とし、それぞれの反応温度での相対酵素活性を描き、図２に示す。
【００５９】
実施例９
菌体の繰り返し使用によるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの高効率合成
組換え大腸菌の培養は、実施例２の方法と同様にして行った。收集した菌体細胞を実施例３に従って触媒合成反応を行い、反応終了後、高速液体クロマトグラフィー法（中国薬典２０１０年版二部付録ＶＤ）によりＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの濃度を測定し、その酵素活性を１００％とした。
菌体細胞を遠心分離し、次のサイクルの組換え菌として使用し前記反応操作を繰り返し、それぞれ、一回目繰り返して使用した菌体の相対酵素活性は９９．８％、二回目繰り返して使用した菌体の相対酵素活性は９７．８％、三回目繰り返して使用した菌体の相対酵素活性は９４．４％と算出し、結果は図３に示す。菌体を遠心分離にて回収する際、少量の細胞ロスが起こる。よって、組換え大腸菌細胞を数回繰り返して使用してＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを触媒合成する際、酵素活性は安定であり、工業化生産の用途に適する。
【００６０】
実施例１０
従来技術との対比
日本味の素株式会社（特許ZL03817916.4）の酵素法によるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの合成分野に使用されるエステルトランスフェラーゼは、生物学的安全性、変換効率および生産効率等の面で国際的トップレベルである。（Biosci Biotechnol Biochem. 2013;77(3):618-23;2011;75(11):2087-2092）の文献に報告される最も優れる結果は、反応系における細胞のＯＤ６１０が約４．６の場合、２つの基質のモル変換率が６７％であったが、触媒反応の時間が長く４０ｍｉｎであった。これに対して、本特許で構築するエステルトランスフェラーゼ発現系は、細胞量ＯＤ６００が０．７５である反応条件で、１０ｍｉｎのモル変換率が８３．３％と達し、より速い生産効率とより高いモル変換率を有している。
【００６１】
表１により詳しい対比データを示す（日本味の素株式会社のデータソース：Enzymatic production of L-Alany-L-glutamine by recombinant E.coli expressing α-Amino acid ester Acyltransferase from Sphingobacterium siyangensis. Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 2013, 77(3): 618-623.）。この結果からわかるように、本発明の方法は、類似する基質条件で、反応時間が従来技術ZL03817916.4より遥かに短い条件でより優れた変換率を達成することができる。類似する反応系において本発明の細胞酵素の触媒活性がより強いことが分かる。
【００６２】
【表１】
0006731119.tif 000004
【００６３】
実施例１１
組換え出芽酵母の構築
実施例１と同様の方法で外因性バイオ酵素遺伝子（配列番号１）を増幅した。
ＰＣＲ反応終了後、２μＬのＰＣＲ産物を取りアガロースゲル電気泳動にて検出し、ＰＣＲ産物精製キット（ＯＭＥＧＡ、ＵＳＡ）を用いてＰＣＲの増幅産物を精製した後、−２０℃の冷蔵庫に保存した。
【００６４】
ＰＣＲ産物と発現ベクターｐＹＤ１を制限酵素により切断し、精製後、一晩ライゲーションし、ライゲーション産物をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αのコンピテント細胞に形質転換させ、ＬＢ耐性平板培地（培地組成が斜面培地と同じ）で形質転換体をスクリーニングし、それぞれＰＣＲおよび制限酵素による切断にて検証し、さらにＤＮＡシークエンシングした。相違しないと検証したら、酵母組換え発現ベクターを得て、図４に示す。化学法にて出芽酵母ＥＢＹ１００のコンピテント細胞に形質転換させ、栄養要求性スクリーニングにてＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを触媒合成できる組換え出芽酵母を得て、本発明のそのほかの実施例で使用する組換え出芽酵母とした。
【００６５】
実施例１２
組換え出芽酵母の発酵培養
組換え出芽酵母を種培地に接種し、３０℃、１８０ｒｐｍの条件で菌体を活性化させた。その後、種培地に移し拡大培養を行い、３０℃、１８０ｒｐｍで振盪培養した。適切なバイオマスとなるように成長してから、１．０Ｌの誘導培地に接種し、２０℃、１５０ｒｐｍで細胞を通気培養した。１６〜２４ｈ後、タンクに入れ、細胞を遠心分離した。本発明の前記組換え出芽酵母とした。
【００６６】
実施例１３
バイオ酵素の表面ディスプレイの検証
ａ．実施例１２で培養した組換え出芽酵母について、３０００〜５０００ｒｐｍの条件で細胞を遠心分離にて収集し、リン酸塩緩衝液で２回洗浄した。
ｂ．上清を取り除き、１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と１μｇの抗体（anti-V5-FITC）を含有するリン酸塩緩衝液で細胞を再懸濁した。
ｃ．冰上に３０ｍｉｎ放置後、３０００〜５０００ｒｐｍの条件で細胞を遠心分離にて収集し、リン酸塩緩衝液で２回洗浄した。
ｄ．最後は、リン酸塩緩衝液で細胞を再懸濁し、蛍光倒立顕微鏡および共焦点レーザー顕微鏡で観察した。
【００６７】
バイオ酵素が細胞表面にディスプレイされる場合、曝されるＶ５エピトープは測定方法ｂの遊離フルオレセイン標識抗体と特異的に結合することができる。そして、リン酸塩緩衝液で細胞を洗浄し余分な抗体および非特異的に結合した抗体を除去し、最後は４９３ｎｍの励起波長で蛍光シグナル、即ち特異的結合による蛍光シグナルを検出できれば、該バイオ酵素が細胞表面に確実にディスプレイされることを証明できる。
【００６８】
本実施例における前記リン酸塩緩衝液は、１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．７ｍＭの塩化カリウム、１０ｍＭのリン酸塩を含有し、緩衝液ｐＨが７．４であった。
【００６９】
蛍光倒立顕微鏡および共焦点レーザー顕微鏡のそれぞれで検出した蛍光シグナルの結果を図５に示す（Ａ−１／Ａ−２は蛍光倒立顕微鏡の検証結果であり、Ｂ−１／Ｂ−２は共焦点レーザー顕微鏡の検証結果である。）。その中、図Ａ−１／Ｂ−１は白光照射での細胞箇所図であり、図Ａ−２／Ｂ−２は４９３ｎｍの励起波長での細胞蛍光シグナル図であり、同じ箇所で緑色蛍光シグナルを生じる細胞が存在することが分かり、該細胞がバイオ酵素を細胞表面にディスプレイしていることが証明された。
【００７０】
バイオ酵素を細胞表面にディスプレイすることは、酵素の固定化を実現できる。まず、基質および産物の膜貫通抵抗の影響を克服し、反応速度を向上する。また、細胞内酵素と比べて、細胞内プロテアーゼおよびペプチダーゼによる加水分解作用を避けて酵素活性の安定化と産物の集積を維持できると共に、酵素をエンリッチするプロセスが必要な場合、細胞の破砕や酵素の分離精製等の工程が不要となり、生産コストを低減し、経済的利益を上げる。さらに、細胞の繰り返し使用により、酵素の繰り返し使用が実現でき、酵素が回收されにくくコストが高い等の問題を解決できる。
【００７１】
実施例１４
１００ｍＭの基質濃度で酵母全細胞によるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの触媒合成への研究
１．３９６ｇのＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩（１００ｍＭのＬ−Ａｌａ−ＯＭｅ）と１．４６２ｇのＬ−グルタミン（１００ｍＭのＬ−Ｇｌｎ）を測り、９０ｍＬの水に溶解し、温度を２５℃に制御し、６ＭのＮａＯＨ溶液でｐＨを８．５に調整した。スタート時点でサンプルを取り４℃で保存した。反応液におけるバイオマスＯＤ６２０＝０．５〜５．０となるように組換え出芽酵母を反応系に添加し、６ＭのＮａＯＨ溶液でｐＨを維持し、反応終了後、遠心分離し上清を取り４℃で保存した。高速液体クロマトグラフィー法（中国薬典２０１０年版二部付録ＶＤ）により反応時間内のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの最高濃度は７．７ｇ／Ｌと測定し、図６に示す。
【００７２】
実施例１５
２００ｍＭの基質濃度で酵母全細胞によるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの触媒合成への研究
２．７９２ｇのＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩（２００ｍＭのＬ−Ａｌａ−ＯＭｅ）と２．９２４ｇのＬ−グルタミン（２００ｍＭのＬ−Ｇｌｎ）を測り、９０ｍＬの水に溶解し、温度を２５℃に制御し、６ＭのＮａＯＨ溶液でｐＨを８．５に調整した。スタート時点でサンプルを取り４℃で保存した。反応液におけるバイオマスＯＤ６２０＝０．５〜５．０となるように組換え出芽酵母を反応系に添加し、６ＭのＮａＯＨ溶液でｐＨを維持し、反応終了後、遠心分離し上清を取り４℃で保存した。高速液体クロマトグラフィー法（中国薬典２０１０年版二部付録ＶＤ）により反応時間内のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの最高濃度は２０．４ｇ／Ｌと測定し、図６に示す。
【００７３】
実施例１６
基質濃度が５０ｍＭのＬ−Ａｌａ−ＯＭｅ、１００ｍＭのＬ−Ｇｌｎで酵母全細胞によるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの触媒合成への研究
０．６９８ｇのＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩（５０ｍＭのＬ−Ａｌａ−ＯＭｅ）と１．４６２ｇのＬ−グルタミン（１００ｍＭのＬ−Ｇｌｎ）を測り、９０ｍＬの０．２Ｍ  ｐＨ８．７リン酸塩緩衝液に溶解し、温度を２０℃に制御し、６ＭのＮａＯＨ溶液でｐＨを８．５に調整した。スタート時点でサンプルを取り４℃で保存した。反応液におけるバイオマスＯＤ６２０＝０．５〜５．０となるように組換え出芽酵母を反応系に添加し、６ＭのＮａＯＨ溶液でｐＨを維持し、２０ｍｉｎ反応させ、遠心分離し上清を取り４℃で保存した。高速液体クロマトグラフィー法（中国薬典２０１０年版二部付録ＶＤ）により反応時間内のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの濃度は５．８ｇ／Ｌと測定した。
【００７４】
実施例１７
基質濃度が１００ｍＭのＬ−Ａｌａ−ＯＭｅ、２００ｍＭのＬ−Ｇｌｎで酵母全細胞によるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの触媒合成への研究
１．３９６ｇのＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩（１００ｍＭのＬ−Ａｌａ−ＯＭｅ）と２．９２４ｇのＬ−グルタミン（２００ｍＭのＬ−Ｇｌｎ）を測り、９０ｍＬの０．２Ｍ  ｐＨ８．７リン酸塩緩衝液に溶解し、温度を２０℃に制御し、６ＭのＮａＯＨ溶液でｐＨを８．５に調整した。スタート時点でサンプルを取り４℃で保存した。反応液におけるバイオマスＯＤ６２０＝０．５〜５．０となるように組換え出芽酵母を反応系に添加し、６ＭのＮａＯＨ溶液でｐＨを維持し、４０ｍｉｎ反応させ、遠心分離にて反応を終止させ、それぞれ上清を取り４℃で保存した。高速液体クロマトグラフィー法（中国薬典２０１０年版二部付録ＶＤ）により反応時間内のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの濃度は１４．４ｇ／Ｌと測定した。
【００７５】
実施例１８
基質濃度が２００ｍＭのＬ−Ａｌａ−ＯＭｅ、４００ｍＭのＬ−Ｇｌｎで酵母全細胞によるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの触媒合成への研究
２．７９２ｇのＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩（２００ｍＭのＬ−Ａｌａ−ＯＭｅ）と５．８４８ｇのＬ−グルタミン（４００ｍＭのＬ−Ｇｌｎ）を測り、９０ｍＬの０．２Ｍ  ｐＨ８．７リン酸塩緩衝液に溶解し、温度を２０℃に制御し、６ＭのＮａＯＨ溶液でｐＨを８．５に調整した。スタート時点でサンプルを取り４℃で保存した。反応液におけるバイオマスＯＤ６２０＝０．５〜５．０となるように組換え出芽酵母を反応系に添加し、６ＭのＮａＯＨ溶液でｐＨを維持し、６０ｍｉｎ反応させ、遠心分離にて反応を終止させ、上清を取り４℃で保存した。高速液体クロマトグラフィー法（中国薬典２０１０年版二部付録ＶＤ）により反応時間内のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの最高濃度は２４．７ｇ／Ｌと測定した。
【００７６】
実施例１９
酵母全細胞によるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの触媒合成に対する反応系の影響
組換え出芽酵母の培養は実施例１２と同様にして行い、細胞を遠心分離にて収集しＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの触媒反応を行った。水、リン酸塩緩衝液およびホウ酸塩緩衝液の酵母全細胞によるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの触媒合成への影響を研究した。２．７９２ｇのＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩（２００ｍＭのＬ−Ａｌａ−ＯＭｅ）と５．８４８ｇのＬ−グルタミン（４００ｍＭのＬ−Ｇｌｎ）を測り、それぞれ前記３つの反応溶液９０ｍＬに溶解し、反応液におけるバイオマスＯＤ６２０＝０．５〜５．０となるように組換え出芽酵母を反応系に添加し、６ＭのＮａＯＨ溶液でｐＨ＝８．５に維持し、温度を２５℃に制御し、触媒合成反応を行った。１０／３０／６０ｍｉｎの時点でサンプリングし、遠心分離にて酵素反応を終止させ、それぞれ上清を取り４℃で保存した。高速液体クロマトグラフィー法（中国薬典２０１０年版二部付録ＶＤ）によりＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの濃度を測定し、最も適切な反応溶液はリン酸塩緩衝液であることが分かった。
【００７７】
実施例２０
酵母全細胞によるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの触媒合成に対する反応温度の影響
組換え出芽酵母の培養は実施例１２と同様にして行い、細胞を遠心分離にて収集しＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの触媒反応を行った。１０／１５／２０／２５／３０／４０℃の各反応温度の酵母全細胞によるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの触媒合成への影響を研究した。１．３９６ｇのＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩（１００ｍＭのＬ−Ａｌａ−ＯＭｅ）と２．９２４ｇのＬ−グルタミン（２００ｍＭのＬ−Ｇｌｎ）を測り、９０ｍＬの０．２Ｍ  ｐＨ８．７リン酸塩緩衝液溶液に溶解し、反応液におけるバイオマスＯＤ６２０＝０．５〜５．０となるように組換え出芽酵母を反応系に添加し、６ＭのＮａＯＨ溶液でｐＨ＝８．５に維持し、前記それぞれの反応温度で触媒合成反応を行い、３０ｍｉｎ後、遠心分離にて酵素反応を終止させ、高速液体クロマトグラフィー法（中国薬典２０１０年版二部付録ＶＤ）によりＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの濃度を測定した。結果からわかるように、該酵素はより広い温度範囲で高活性を有しており、反応の最適温度は２０℃であるが、２５℃および３０℃と比べて差が小さい。生産エネルギー消耗等の経済的な点から、直接室温（２０〜３０℃）で酵素反応を行ってもよい。結果は図７に示す。
【００７８】
実施例２１
酵母全細胞によるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの触媒合成に対する反応ｐＨの影響
組換え出芽酵母の培養は実施例１２と同様にして行い、細胞を遠心分離にて収集しＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの触媒反応を行った。ｐＨ４／５／６（酢酸塩緩衝液）、６／７／７．５／８／８．５／９（リン酸塩緩衝液）、８／８．５／９／１０（ホウ酸塩緩衝液）の各反応ｐＨの酵母全細胞によるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの触媒合成への影響を研究した。１．３９６ｇのＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩（１００ｍＭのＬ−Ａｌａ−ＯＭｅ）と２．９２４ｇのＬ−グルタミン（２００ｍＭのＬ−Ｇｌｎ）を測り、９０ｍＬの緩衝液に溶解し、反応液におけるバイオマスＯＤ６２０＝０．５〜５．０となるように組換え出芽酵母を反応系に添加し、温度を２０℃に制御し、６ＭのＮａＯＨ溶液でｐＨを前記各反応ｐＨに維持し触媒合成反応を行い、３０ｍｉｎ後、遠心分離にて酵素反応を終止させ、高速液体クロマトグラフィー法（中国薬典２０１０年版二部付録ＶＤ）によりＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの濃度を測定した。該酵素はより広いｐＨ範囲で高活性を有しており、反応の最適ｐＨは８．０であることがわかった。最適な反応基質溶液がリン酸塩緩衝液であることが再び検証された。結果は図８に示す。
【００７９】
実施例２２
組換え出芽酵母の繰り返し使用によるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの高効率合成
組換え出芽酵母の培養は実施例１２と同様にして行い、細胞を遠心分離にて収集しＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの触媒反応を行った。反応条件は下記の通りであった。０．６９８ｇのＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩（５０ｍＭのＬ−Ａｌａ−ＯＭｅ）と１．４６２ｇのＬ−グルタミン（１００ｍＭのＬ−Ｇｌｎ）を測り、９０ｍＬの緩衝液に溶解し、温度を２０℃に制御し、６ＭのＮａＯＨ溶液でｐＨを８に調整し、２０／３０ｍｉｎの時点でサンプリングし、遠心分離にて酵素反応を終止させた。その後、ぜん動ポンプまたは遠心分離にて反応上清を取り除いた後、前記反応条件で反応を数回繰り返した。最後は、高速液体クロマトグラフィー法（中国薬典２０１０年版二部付録ＶＤ）によりＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの濃度を測定した。１回目の反応における組換え出芽酵母細胞の相対酵素活性を１００％とし、２回目の反応における酵母細胞の相対酵素活性は９４．０％、３回目の反応における酵母細胞の相対酵素活性は８６．７％、４回目の反応における酵母細胞の相対酵素活性は８１．０％、５回目の反応における酵母細胞の相対酵素活性は７６．７％と算出し、結果は図９に示す。菌体を回収する際、一部の細胞ロスが起こる。よって、組換え出芽酵母を数回繰り返して使用してＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを触媒合成する際、酵素活性は比較的安定であり、繰り返し使用が可能であり、工業化生産コストを低減し、酵素が回收されにくく利用率が低い等の問題を解決できるから、工業化生産の要求をより満足しうる。
【００８０】
実施例２３
自己凝集性組換え出芽酵母の構築
実施例１１で構築した組換え出芽酵母に基づいて、反応器における担体無しの自己固定化を実現するために、ＮＣＢＩに掲載される凝集性遺伝子ＦＬＯ１のヌクレオチド配列に従い配列番号６、７の上流と下流プライマーを設計し、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）S288cゲノムをテンプレートとし該凝集性遺伝子（配列番号８）を増幅した。
ここで、ＰＣＲ反応系：ｄＮＴＰｓ（それぞれ２．５ｍＭ）、４μＬ；１０＊Ｂｕｆｆｅｒ、５μＬ；Ｆ（１０μＭ）、２μＬ；Ｒ（１０μＭ）、２μＬ；テンプレート、２μＬ；Ｔａｑ酵素（５Ｕ／μＬ）、１μＬ；ｄｄＨ２Ｏ、３４μＬ。
ＰＣＲ反応条件：９４℃、５ｍｉｎ、１サイクル；９４℃、３０ｓｅｃ、５５℃、３０ｓｅｃ、７２℃、５ｍｉｎ、３０サイクル；７２℃、１０ｍｉｎ、１サイクル。産物は４℃で保存した。
ＰＣＲ反応終了後、２μＬのＰＣＲ産物を取りアガロースゲル電気泳動にて検出し、ＰＣＲ産物精製キット（ＯＭＥＧＡ、ＵＳＡ）を用いてＰＣＲの増幅産物を精製した後、−２０℃の冷蔵庫に保存した。
【００８１】
ＰＣＲ産物と発現ベクターｐＲＳ４２５−ｐＧＫを制限酵素により切断し、精製後、一晩ライゲーションし、ライゲーション産物をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αのコンピテント細胞に形質転換させ、ＬＢ耐性平板培地で形質転換体をスクリーニングし、それぞれＰＣＲおよび制限酵素による切断にて検証した。相違しないと検証したら、自己凝集性組換えベクターを得て、図１０に示す。化学法にて実施例１１で構築した組換え出芽酵母のコンピテント細胞に形質転換させ、ＬＥＵ要求性スクリーニングにて凝集顆粒がミリメートルレベールの自己凝集性組換え出芽酵母を得た。構築した自己凝集性組換え出芽酵母は、凝集速度が速く、１〜５秒以内に完全に沈降することができ、凝集顆粒のサイズが適切で２〜４ｍｍである。自己凝集性組換え出芽酵母の発酵培養は実施例１２と同様にして行った。
【００８２】
実施例２４
自己凝集性組換え出芽酵母を用いるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの触媒合成および自己凝集性組換え出芽酵母の繰り返し使用
基質濃度が２００ｍＭのＬ−Ａｌａ−ＯＭｅ、１００ｍＭのＬ−Ｇｌｎで実施例２３で構築した自己凝集性組換え出芽酵母を用いるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの直接触媒合成への研究
２．７９２ｇのＬ−アラニンメチルエステル塩酸塩（２００ｍＭのＬ−Ａｌａ−ＯＭｅ）と１．４６２ｇのＬ−グルタミン（１００ｍＭのＬ−Ｇｌｎ）を測り、９０ｍＬの０．２Ｍ  ｐＨ８．７リン酸塩緩衝液に溶解し、温度を２０℃に制御し、６ＭのＮａＯＨ溶液でｐＨを８．５に調整し、スタート時点でサンプルを取り４℃で保存した。自己凝集性組換え出芽酵母を反応系に添加し、６ＭのＮａＯＨ溶液でｐＨを維持し、それぞれ１５／３０／４５ｍｉｎの時点でサンプリングし、遠心分離にて反応を終止させ、４℃で保存した。高速液体クロマトグラフィー法（中国薬典２０１０年版二部付録ＶＤ）により各反応時間のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの濃度を測定し、結果は図１１に示す。実施例２３で構築した自己凝集性組換え出芽酵母は実施例１１で構築した組換え出芽酵母と同様の触媒活性を持ち、凝集顆粒のサイズが適切で物質移動抵抗がほぼ無くかつＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの高集積量を維持するのに明らかに有利である。
【００８３】
さらに、自己凝集性組換え出芽酵母の繰り返し使用によるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの合成効果を下記のように考察した。
自己凝集性組換え出芽酵母の繰り返し使用の試験方法は実施例２２と同様にして、高速液体クロマトグラフィー法（中国薬典２０１０年版二部付録ＶＤ）によりＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの濃度を測定した。１回目の反応における相対酵素活性を１００％とし、２回目の反応における相対酵素活性は９２.６％、３回目の反応における相対酵素活性は８４.８％、４回目の反応における相対酵素活性は７９.９％、５回目の反応における相対酵素活性は７５.１％と算出し、結果は図１２に示す。結果からわかるように、自己凝集性組換え出芽酵母は数回繰り返して使用しても、安定の触媒活性を維持しており、繰り返し性が良く、反応器における担体無しの自己固定化を実現でき、成長と触媒の２段階をカプリングし、菌体の遠心分離による回收工程が不要となり、生産コストを低減でき、環境に優しい経済型工業化生産モードをより満足しうる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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