(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（ａ）から（ｃ）のいずれかを含む、α−１，６−グルコシル転移反応を触媒する活性を有する酵素剤。
（ａ）配列番号３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号３に示すアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、α−１，６−グルコシル転移反応を触媒する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号３に示すアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなり、α−１，６−グルコシル転移反応を触媒する活性を有するタンパク質。
【請求項２】
下記の（ａ）から（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドが導入された形質転換細胞の培養上清を含む、α−１，６−グルコシル転移反応を触媒する活性を有する酵素剤。
（ａ）配列番号４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつα−１，６−グルコシル転移反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して９０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチドであって、かつα−１，６−グルコシル転移反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
α−１，４−グルコシド結合および／またはα−１，６−グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類からα−１，６−グルカンを製造するために用いられる、請求項１または２何れか一項に酵素剤。
【請求項４】
α−１，４−グルコシド結合および／またはα−１，６−グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類が澱粉部分分解物である、請求項３に記載の酵素剤。
【請求項５】
前記α−１，６−グルカンが、重合度２から３０を有するイソマルトオリゴ糖および／またはイソマルトメガロ糖である、請求項３または４に記載の酵素剤。
【請求項６】
α−１，４−グルコシド結合および／またはα−１，６−グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類に、請求項１から５のいずれか一項に記載の酵素剤を作用させて、α−１，６−グルカンを得る反応工程を含む、α−１，６−グルカンの製造方法。
【請求項７】
前記反応工程の前に、下記の工程を含む、請求項６に記載の製造方法。
澱粉を加水分解して、α−１，４−グルコシド結合および／またはα−１，６−グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類を得る工程。
【請求項８】
請求項６または７に記載の方法を実施してα−１，６−グルカンを得る工程、および前記工程で得られたα−１，６−グルカンを用いて食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を得る工程を含む、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α−１，６−グルコシル転移反応を触媒する活性を有するタンパク質、および当該タンパク質を含むα−１，６−グルカンを製造するために用いられる酵素剤に関する。本発明は、α−１，４−グルコシド結合および／またはα−１，６−グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類に上記酵素剤を作用させて、α−１，６−グルカンを得る工程を含む、α−１，６−グルカンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｄ−グルコースが主としてα−１，６結合で構成された糖質（α−１，６−グルカン）は遅消化性および持続的消化性であることが報告されている（特許文献１）。遅消化性および持続的消化性の糖質は、摂取しても血糖値の上昇が緩やかであるため、例えば血糖値の急激な上昇を避ける必要のある糖尿病患者であっても利用できる糖質として有用である。また、α−１，６−グルカンのうち、重合度（Degree of Polymerization:ＤＰ）１０〜５０のイソマルトメガロ糖が、腸管バリア機能の亢進作用を有することが報告されている（特許文献２）。他にも、イソマルトメガロ糖鎖（ＤＰ１０〜１００）の両末端または非還元末端のみに、α−１，４結合で構成されたアンカー糖鎖を有するアンカー型イソマルトメガロ糖が、水難溶性化合物の溶解促進作用を有することが報告されている（特許文献３）。このように、α−１，６−グルカンは食品や医療などのさまざまな分野において、有用な糖質素材として期待されている。
【０００３】
α−１，６−グルカンの酵素的な製造方法としては、ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）由来デキストランスクラーゼを用いる方法（特許文献４）、グルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxydans）由来デキストリンデキストラナーゼを用いる方法（特許文献５、特許文献６）、パエニバシラス属（Paenibacillus sp.）に属する５９８Ｋ株由来のデキストラングルカナーゼを用いる方法（特許文献７）、およびサーモアナエロバクター・シデロフィラス（Thermoanaerobacter siderophilus）由来の、α−１，６−グルコシル転移活性を有する酵素を用いる方法（特許文献８）が開示されている。
【０００４】
しかし、上記デキストランスクラーゼを用いる製造方法では、原料糖質であるスクロースのグルコース部分しか利用されないため、対糖デキストラン収率が５０％を超えることはないという問題があった。
【０００５】
一方、デキストリンデキストラナーゼ、デキストラングルカナーゼ、およびα−１，６−グルコシル転移活性を有する酵素は、澱粉部分分解物を基質としてα−１，６−グルカンを製造できる。特にサーモアナエロバクター・シデロフィラス由来の、α−１，６−グルコシル転移活性を有する酵素は６０℃まで安定的であり、枯草菌(Bacillus subtilis)を宿主とする異種発現が可能である(特許文献８)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２０１６／０４７６１６
【特許文献２】特開２０１５−２０５８５６号公報
【特許文献３】特開２０１７−１１４９４３号公報
【特許文献４】特開平８−１７３１７８号公報
【特許文献５】特開２００１−２５８５８９号公報
【特許文献６】特開２００７−１８１４５２号公報
【特許文献７】特開２０１２−０９５６０６号公報
【特許文献８】特許第６４１７０６１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来、α−１，６−グルコシル転移活性を有する酵素は知られていたが、より効率的にα-１,６-グルカンを製造することができる酵素の開発が求められていた。本発明は、α−１，６−グルカンを効率的に製造することができるα−１，６−グルコシル転移反応を触媒する活性を有するタンパク質、当該タンパク質を有効成分とするα-１,６-グルカン製造用酵素剤、および当該酵素剤を用いたα−１，６−グルカンの製造方法を提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、従来のα−１，６−グルコシル転移活性を有する酵素と比べて、α−１，６−グルカンをより効率的に製造することができるタンパク質を見出し、本発明を完成させるに至った。本発明はこの知見に基づくものである。
【０００９】
本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］ α−１，６−グルコシル転移反応を触媒する活性を有する、下記の(ａ)から(ｃ)のいずれかのタンパク質。
(ａ) 配列番号３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；
(ｂ) 配列番号３に示すアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質；
(ｃ) 配列番号３に示すアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
［２］ テピディバシラス・デカトゥレンシス（Tepidibacillus decaturensis）に由来し、下記の性質を有するタンパク質。
(1) α-１,６-グルコシル転移反応を触媒する活性を有する；
(2) ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより測定された分子量が９５，０００〜１０５，０００である；
(3) 至適ｐＨが３．９〜４．６である；
(4) 安定ｐＨ範囲が４．２〜９．０である；
(5) 至適温度が５０〜５５℃である；
(6) 温度安定性が５０℃以下である。
［３］ 下記の(ａ)から(ｃ)のいずれかのポリヌクレオチドが導入された形質転換細胞の培養上清。
（ａ）配列番号４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して９０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド。
［４］ ［１］もしくは［２］に記載のタンパク質および／または［３］に記載の培養上清を含む、α−１，４−グルコシド結合および／またはα−１，６−グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類からα-１,６-グルカンを製造するために用いられる酵素剤。
［５］ α−１，４−グルコシド結合および／またはα−１，６−グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類が澱粉部分分解物である、［４］に記載の酵素剤。
［６］ 上記α−１，６−グルカンが、重合度２から３０を有するイソマルトオリゴ糖および／またはイソマルトメガロ糖である、［４］または［５］に記載の酵素剤。
［７］ α−１，４−グルコシド結合および／またはα−１，６−グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類に、［４］から［６］のいずれか一に記載の酵素剤を作用させて、α−１，６−グルカンを得る反応工程を含む、α−１，６−グルカンの製造方法。
［８］ 上記反応工程の前に、下記の工程を含む、［７］に記載の製造方法。
澱粉を加水分解して、α-１,４-グルコシド結合および／またはα−１，６−グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類を得る工程。
［９］ ［７］または［８］に記載の方法を実施してα−１，６−グルカンを得る工程、および上記工程で得られたα−１，６−グルカンを用いて食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を得る工程を含む、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品の製造方法。
［１０］ 糖受容体と糖供与体に、［４］から［６］のいずれか一に記載の酵素剤を作用させる工程を含む、配糖体の製造方法。
［１１］ 糖供与体がマルトオリゴ糖である、［１０］に記載の配糖体の製造方法。
［１２］ 糖受容体がアルコール性水酸基を有する化合物またはフェノール性水酸基を有する化合物である、［１０］または［１１］に記載の配糖体の製造方法。
［１３］ ［１０］から［１２］のいずれか一に記載の方法を実施して配糖体を得る工程、および上記工程で得られた配糖体を用いて食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を得る工程を含む、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、α−１，６−グルコシル転移反応を触媒する活性を有する新規タンパク質を提供することができる。本発明によれば、従来のα−１，６−グルコシル転移反応を触媒する活性を有する酵素と比較して、α−１，６−グルカンをより効率的に製造することができる。本発明によれば、原料（基質）として澱粉加水分解物（澱粉部分分解物）を用いてα−１，６−グルカンを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】図１Ａは、テピディバシラス・デカトゥレンシス由来の仮想タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。下線を付した領域は、シグナルペプチド配列である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、テピディバシラス・デカトゥレンシス由来の仮想タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号２）を示す。下線を付した領域はシグナルペプチド配列に対応する塩基配列である。
【図２】図２は、テピディバシラス・デカトゥレンシス由来の仮想タンパク質を枯草菌に分泌させ精製したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥである。Ｍ：分子量マーカー、Ｓ：精製タンパク質(Ｃ末Ｈｉｓ−ｔａｇ)。
【図３】図３は、テピディバシラス・デカトゥレンシス由来の仮想タンパク質を枯草菌に分泌させた培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥである。当該仮想タンパク質のバンドを矢印で示す。Ｍ：分子量マーカー、Ｓ：培養上清。
【図４】図４は、異なるｐＨにおける精製タンパク質の相対酵素活性を示すグラフである。黒丸（●）は最大酵素活性を１００％（ｐＨ４．２）としたときの、各ｐＨにおける相対活性（％）を示し、白丸（○）は各ｐＨ（ｐＨ２．５〜１１．０、０．５刻み）の緩衝液中４℃で２４時間保持した後の残存活性（％）を示す。グラフに記載したｐＨは、至適ｐＨについては反応液中の実測値であり、ｐＨ安定性についてはタンパク質を添加し保持した後の緩衝液の実測値である。
【図５】図５は、温度３０から８０℃における精製タンパク質の相対酵素活性を示すグラフである。黒丸（●）は最大酵素活性を１００％（温度５５℃）としたときの、各温度における相対活性（％）を示し、白丸（○）は各温度で６０分間保持した後の残存活性（％）を示す。
【図６】図６は、Ｇ６７リッチシラップのＨＰＬＣ分析のクロマトグラムである。保持時間74.810および71.327分のピークはそれぞれ順にＤＰ６および７の糖質を示している。
【図７Ａ】図７Ａは、Ｇ６７リッチシラップを原料とした反応生成物のＨＰＬＣ分析の結果である。反応生成物５−１から５−３は、タンパク質の添加量が異なり、それぞれのタンパク質添加量は３１．２、６２．４、および１２５μＬ／ｇ−ｄｓである。反応生成物５−１から５−３のクロマトグラムにおいて、保持時間９６〜９８分に位置するピークはＤＰ１の糖質を示し、左隣りの（保持時間が短い）ピークから左へ順にＤＰ２以上の糖質を示している。
【図７Ｂ】図７Ｂは、反応生成物５−１から５−３のデキストラナーゼ（ｄｅｘ．）処理後のクロマトグラムを示す。反応生成物５−１から５−３のデキストラナーゼ（ｄｅｘ．）処理後のクロマトグラムにおいて、保持時間９７〜９９分に位置するピークはＤＰ１の糖質を示し、左隣りの（保持時間が短い）ピークから左へ順にＤＰ２以上の糖質を示している。
【図８】図８は、原料として使用した澱粉部分分解物（液化液）のＨＰＬＣ分析のクロマトグラムである。
【図９Ａ】図９Ａは、澱粉部分分解物（液化液）を原料とした反応生成物のＨＰＬＣ分析のクロマトグラムである。反応生成物６−１および６−２は、タンパク質の添加量が異なり、それぞれのタンパク質添加量は３１．２および１２５μＬ／ｇ−ｄｓである。保持時間約９７分に位置するピークはＤＰ１の糖質を示し、左隣りの（保持時間が短い）ピークから左へ順にＤＰ２以上の糖質を示している。
【図９Ｂ】図９Ｂは、反応生成物６−１および６−２のデキストラナーゼ（ｄｅｘ．）処理後のクロマトグラムを示す。保持時間約９８分に位置するピークはＤＰ１の糖質を示し、左隣りの（保持時間が短い）ピークから左へ順にＤＰ２以上の糖質を示している。
【図１０】図１０は、デキストラナーゼ処理生成物量（ＨＰＬＣ  Ａｒｅａ％）の経時変化を示すグラフである。白丸（〇）は反応生成物６−１について、および白四角（□）は反応生成物６−２についてのデキストラナーゼ処理後のＤＰ１〜３の増加量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に記載する本発明の説明は、代表的な実施形態や具体例に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に限定されるものではない。なお、本明細書において「〜」を用いて表される数値範囲は「〜」の前後に記載される数値を下限値および上限値として含む範囲を意味する。また、本発明に記載される重合度（ＤＰ）は、これらグルコシド結合の種類に関係なく、構成糖であるグルコースの重合度を意味する。本発明のタンパク質による反応生成物の糖組成（％）は、ＨＰＬＣで検出されたピークの総面積を１００とした場合の、各糖質に対応するピークの面積比率（％）として算出したものである。
【００１３】
（タンパク質）
本発明は、α−１，６−グルコシル転移反応を触媒する活性を有する、下記の(ａ)から(ｃ)のいずれかのタンパク質を提供する。
(ａ) 配列番号３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；
(ｂ) 配列番号３に示すアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質；
(ｃ) 配列番号３に示すアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
【００１４】
配列番号３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は、微好気性細菌テピディバシラス・デカトゥレンシス（Tepidibacillus decaturensis）のゲノム情報から取得した配列番号１のアミノ酸配列（NCBI Reference Sequence: WP_068722961.1）からシグナルペプチドを削った配列である。ここで、配列番号１に示すアミノ酸配列のアノテーションは仮想タンパク質（Hypothetical protein）となっており、その具体的活性は本願以前には知られていなかった。
【００１５】
本発明者らは、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質が、α−１，６−グルコシル転移反応を触媒する活性を有することを発見した。本明細書中、「α−１，６−グルコシル転移反応を触媒する活性」または「α−１，６−グルコシル転移活性」は、糖転移反応により、α−１，６−グルコシド結合を形成する反応を触媒する活性を意味する。
【００１６】
α-１,６-グルコシル転移活性の評価は、α−１，６−グルコシル転移活性を有するタンパク質を、マルトース、マルトトリオース、イソマルトース、およびイソマルトトリオースのいずれかを基質として反応させ、得られた反応生成物において、基質からα−１，６結合でグルコースを転移伸長した糖を検出することにより行うことができる。
【００１７】
α−１，６−グルコシル転移活性の評価は、具体的には、例えばマルトース高含有シラップを含む反応液に、α−１，６−グルコシル転移活性について評価するタンパク質を添加して５３℃にて７２時間酵素処理し、酵素処理後の反応液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分析し、α−１，６結合でグルコースを転移伸長した糖を検出することにより実施することができる。糖の転移伸長がα−１，６結合によるものであることは、酵素処理後の反応液をデキストラナーゼで更に処理し、分解された糖をＨＰＬＣ分析により検出することにより確認することができる。
【００１８】
配列番号３に示すアミノ酸配列に対して９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα-１,６-グルコシル転移活性を示すタンパク質も本発明に係るタンパク質に含むことができる。アミノ酸配列同一性は、比較する２本のアミノ酸配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならばギャップを導入した後、２本のアミノ酸配列間で同一であるアミノ酸残基のパーセントとして定義される。アミノ酸配列同一性は、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより決定することができる。
【００１９】
さらには、配列番号３に示すアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質からなり、且つα−１，６−グルコシル転移活性を有するタンパク質も本発明に係るタンパク質に含むことができる。本明細書中の「１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
【００２０】
本発明のタンパク質は、α−１，６−グルコシル転移反応を触媒する活性のほかに、α−１，４−グルコシル転移反応を触媒する活性を有することができる。本明細書中、「α−１，４−グルコシル転移反応を触媒する活性」または「α−１，４−グルコシル転移活性」は、α−１，４−グルコシド結合を形成する糖転移反応を触媒する活性を意味する。α−１，４−グルコシル転移活性の評価は、α−１，４−グルコシル転移活性を有するタンパク質を、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、またはマルトペンタオースのいずれかを基質として反応させ、得られた反応生成物において、基質からα−１，４結合でグルコースを転移伸長した糖を検出することにより行うことができる。本発明のタンパク質は、α−１，４−／α−１，６−グルコシド結合加水分解反応を触媒する活性をさらに有することができるが、α−１，４−グルコシド結合加水分解反応を触媒する活性の発現は限定的であってもよい。本明細書中、「α−１，４−／α−１，６−グルコシド結合加水分解反応を触媒する活性」または「α−１，４−／α−１，６−グルコシド結合加水分解活性」は、それぞれα−１，４−／α−１，６−グルコシド結合を切断する加水分解反応を触媒する活性である。
【００２１】
本発明のタンパク質は、後記のとおり、枯草菌に組換えタンパク質として産生させることができる。一般に枯草菌を宿主とする組換えタンパク質の生産は分泌発現の利点があり、菌体を破砕せずに、培養上清をそのまま酵素反応に用いることができるため、工業スケールで使用する酵素の生産に使用されている。しかし、組換えタンパク質の種類によって、培養上清中での酵素活性の発現に差がある。本発明のタンパク質は、従来のα-１,６-グルコシル転移活性を有する酵素と比べて、形質転換された枯草菌の培養上清のまま用いても、α−１，６−グルカンをより効率的に製造することができる。
【００２２】
後記の実施例は、形質転換された枯草菌の培養上清を反応に用いた場合において、特許文献８に記載のサーモアナエロバクター・シデロフィラス（Thermoanaerobacter siderophilus）由来のα−１，６−グルコシル転移活性を有する酵素と比較して、本発明のタンパク質が、α−１，６−グルカンをより効率的に製造できることを示している。
【００２３】
本発明のタンパク質は、化学合成により合成したタンパク質であってもよいし、遺伝子組換え技術により作製した組換えタンパク質であってもよい。以下に、組換えタンパク質を作製する場合について説明する。
【００２４】
(ａ)配列番号３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、(ｂ)配列番号３に示すアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、および(ｃ)配列番号３に示すアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質は、遺伝子工学的手法によって調製することができる。例えば、配列番号３のアミノ酸配列をコードする遺伝子は、宿主細胞内で複製可能であるか、あるいは染色体に組み込まれかつ同遺伝子を発現可能な状態で含むＤＮＡ分子として、特に発現ベクターに挿入された形態で宿主細胞の形質転換を行い、宿主細胞を培養することで産生させることができる。このＤＮＡ分子は、配列番号３に示されるアミノ酸配列などをコードするポリヌクレオチドをベクター分子に組み込むことによって得ることができる。本発明の好ましい態様によれば、このベクターはプラスミドである。本発明におけるＤＮＡ分子の作成は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed (Sambrook、 Maniatisら、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))）に記載の方法に準じて行なうことができる。
【００２５】
本発明において利用できるベクターは、使用する宿主細胞の種類を勘案しながら、ウイルス、プラスミド、コスミドベクターなどから適宜選択できる。例えば、宿主細胞が枯草菌の場合はｐＪＥＸＯＰＴ２系（特開２００９−１７８４１号公報を参照）、ｐＨＴ系のプラスミド、大腸菌の場合はλファージ系のバクテリオファージ、ｐＥＴ系、ｐＵＣ系、ｐＣｏｌｄ系、ｐＧＥＸ系のプラスミド、酵母の場合はＹＥｐ、ＹＣｐ系、ＹＩＰ系のベクター、あるいはｐＬｅｕ４、ｐＰＰＬｅｕ４、ｐＪＰＬｅｕ系（特開平４−２１８３８２号公報に記載）などが挙げられるが、これらに制限されない。このプラスミドは形質転換体を選択するためのマーカーを含んでいてもよく、該選択マーカーとしては薬剤耐性マーカーや栄養要求マーカー遺伝子を使用することができるが、これらに制限されない。
【００２６】
さらに、本発明で利用できる発現ベクターは、タンパク質遺伝子の発現に必要なＤＮＡ配列、例えばプロモーター、ターミネーター、リボゾーム結合部位、転写終結シグナルなどの転写調節信号、翻訳調節信号などを有することができる。該プロモーターとしては、枯草菌においてはズブチリシン、ＳＰＡＣ等のプロモーター、酵母ではアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、酸性フォスファターゼ（ＰＨＯ）、ガラクトース遺伝子（ＧＡＬ）、グリセルアルデビド３リン酸脱水素酵素遺伝子（ＧＡＰ）等のプロモーターを用いることができるが、これらに制限されない。シグナルペプチドはタンパク質を菌体外に分泌させるため、生産性が高くなるという利点があるので使用することが好ましい。また、シグナルペプチドを枯草菌や酵母由来のもの（例えば、インベルターゼシグナル、酸性フォスファターゼシグナル、λ−ファクターシグナルなど）に置き換えることができる。また、大腸菌においては、一般に慣用されるｌａｃプロモーターやＴ７プロモーターのほかに、ｃｓｐＡプロモーター等を用いて分子シャペロンを同時に発現させるなど、発現をより効率化する工夫を行うことができる。
【００２７】
形質転換を行なった宿主細胞の培養は、使用する宿主細胞に関して一般的な方法を用いることができる。通常は、１〜４日程度の培養により細胞内または細胞外の培養物中にタンパク質が生成され蓄積される。培養条件（培地、ｐＨ、温度等）に関しては、例えば、細菌では２５〜３７℃、酵母では２５〜３０℃、真核細胞では３７℃程度が一般的である。培養条件については、遺伝子発現実験マニュアル（講談社）等を参照することができる。
【００２８】
宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌等の細菌、カンディダ・ウチリス（Candida utilis）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccaromyces cerevisiae）、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）等の酵母以外に、リゾープス・ニベウス（Rhizopus niveus）、リゾープス・デルマー（Rhizopus delemar）や高等真核生物（例えばＣＨＯ細胞など）を用いることができる。枯草菌としてはバチルス（Bacillus）属に属する微生物を用いることが好ましい。バチルス属にはタンパク質を菌体外へ分泌する株（例えば、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）など）が存在することが知られている。またプロテアーゼを殆ど分泌しない株も知られており、このような株を宿主として用いることも好ましい。本発明においては、宿主細胞として酵母、糸状菌または細菌が好ましいが、細菌がより好ましく、特にバチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）が好ましい。後記する実施例に示すように、Bacillus subtilis ISW1214を宿主として配列番号４の遺伝子を発現させたところ、Bacillus subtilis ISW1214では培養上清および精製タンパク質に酵素活性が認められた。
【００２９】
形質転換体が産生した組換えタンパク質の単離・精製は、公知の分離方法や精製方法を適当に組み合わせて行なうことができる。これらの分離・精製方法としては例えば塩沈殿、溶媒沈殿のような溶解性の差を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過およびＳＤＳ−ポリアクリル電気泳動のような分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーのような電荷の差を利用する方法、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーのような疎水性の差を利用する方法、さらに等電点電気泳動のような等電点の差を利用する方法、このほかにアフィニティークロマトグラフィー等が挙げられる。実施例に記載した精製方法のほかに、一般的な分離・精製法に関しては、例えば蛋白質・酵素の基礎実験法（南江堂）等を参照することができる。
【００３０】
本発明は、テピディバシラス・デカトゥレンシス（Tepidibacillus decaturensis）に由来し、下記の性質を有するタンパク質を提供する。
(1) α−１，６−グルコシル転移反応を触媒する活性を有する；
(2) ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された分子量が９５，０００〜１０５，０００である；
(3) 至適ｐＨが３．９〜４．６である；
(4) 安定ｐＨ範囲が４．２〜９．０である；
(5) 至適温度が５０℃〜５５℃である；
(6) 温度安定性が５０℃以下ある。
【００３１】
本発明の、テピディバシラス・デカトゥレンシスに由来するタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定される分子量が約９９，０００である。なお、本明細書では、分子量は、プラスミドに組換えて、枯草菌を宿主細胞として発現分泌させたタンパク質について表わしている。実施例１において９９，５００と測定されたタンパク質は、Ｃ末端側にＨｉｓ−ｔａｇ（ヒスチジン６個付加）を有し、且つ推定１７アミノ酸よりなる分泌シグナルが切断されたタンパク質である。タンパク質が菌体外に分泌される際、分泌シグナルは切断されるが、その切断部位については多少ずれる場合がある。実際の切断部位については確認していないが、シグナルペプチド予測サーバーＳｉｇｎａｌＰ４．１（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）により予測された切断部位のスコアが高いアミノ酸から数アミノ酸程度の範囲で切断されていると推測される。好ましい実施態様において、本発明のタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定される分子量が９５，０００から１０５，０００の範囲である。
【００３２】
本発明のタンパク質は、温度４０℃で測定した場合、ｐＨ４．２で最大活性を示し、至適ｐＨは３．９〜４．６である。また、本発明のタンパク質は、温度４℃で２４時間保持する試験において、ｐＨ４．２〜９．０で安定であった。なお、至適ｐＨおよびｐＨ安定性は、マルトース分解活性を、実施例３.１項および３．２項に示す条件で測定したものである。
【００３３】
本発明のタンパク質は、ｐＨ６．０で測定した場合、温度５５℃で最大活性を示し、至適温度５０℃〜５５℃である。また、本発明のタンパク質は、ｐＨ６．０で６０分間保持した試験において、５０℃以下で安定であった。なお、至適温度および温度安定性は、マルトース分解活性を、実施例３.３項および３．４項に示す条件で測定したものである。
【００３４】
本発明のタンパク質の至適ｐＨおよび至適温度並びにｐＨ安定性および温度安定性は、マルトースを基質としたグルコース生成量に基づくマルトース分解活性を測定したものである。本発明のタンパク質では、マルトースのグルコースへの分解は、α−１，４−グルコシル転移反応、α−１，６−グルコシル転移反応、およびα−１，４−グルコシド結合加水分解反応によって起きる可能性がある。α−１，４−グルコシル転移活性、α−１，６−グルコシル転移活性およびα−１，４−グルコシド結合加水分解活性には、おおよそ同じ触媒部位が関わっていると考えられるので、いずれも同様の反応特性（至適ｐＨおよび温度並びにｐＨおよび温度安定性）を示すと考えられるため、反応特性の評価にマルトース分解活性を用いた。
【００３５】
本発明のタンパク質は、基質として、これらに限定されないが、マルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、および澱粉部分分解物などに作用することができる。マルトオリゴ糖およびイソマルトオリゴ糖としては、これらに限定されないが、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、マルトオクタオース、イソマルトース、イソマルトトリオース、イソマルトテトラオース、イソマルトペンタオース、イソマルトヘキサオース、イソマルトヘプタオース、イソマルトオクタオース、パノース、およびイソパノースを挙げることができる。澱粉部分分解物については、後記する。
【００３６】
（培養上清）
本発明は、下記の(ａ)から(ｃ)のいずれかのポリヌクレオチドが導入された形質転換細胞の培養上清を提供する。
（ａ）配列番号４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して９０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド。
【００３７】
配列番号４に示す塩基配列は、微好気性細菌テピディバシラス・デカトゥレンシス（Tepidibacillus decaturensis）のゲノム情報から取得した配列番号１のアミノ酸配列（NCBI Reference Sequence: WP_068722961.1）からシグナルペプチドを削ったアミノ酸配列（配列番号３）をコードする塩基配列である。
【００３８】
配列番号４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、且つα−１，６−グルコシル転移活性を示すタンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入された形質転換細胞の培養上清も、本発明に含むことができる。「配列番号４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、配列番号４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖をプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法等を採用することにより取得できるポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）を意味する。「ストリンジェントな条件」は、例えば、０．７〜１．０Ｍ塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜５×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成：１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を使用し、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等が挙げられる（Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed (Sambrook、Maniatisら、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))）。
【００３９】
また、配列番号４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチドであり、且つα-１,６-グルコシル転移活性を示すタンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入された形質転換細胞の培養上清も、本発明に含むことができる。配列同一性は、比較する２本の塩基配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならばギャップを導入した後、２本の塩基配列間で同一である塩基のパーセントとして定義される。塩基配列同一性は、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより決定することができる。
【００４０】
上記形質転換細胞は、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）であることが好ましい。また、本発明の培養上清は、細胞を実質的に含まないものであり、細胞はフィルターや遠心分離などにより除去することができる。
【００４１】
本発明の培養上清は、α−１，６−グルコシル転移反応を触媒する活性を有する。本発明の培養上清は、菌体を破砕せずに、培養上清をそのまま反応に用いて、α−１，６−グルカンを製造することができる。特許文献８に記載のサーモアナエロバクター・シデロフィラス（Thermoanaerobacter siderophilus）由来の遺伝子を、枯草菌を宿主細胞として発現分泌させた培養上清も、α-１,６-グルカンを製造するために用いることができる。これと比較して、本発明のテピディバシラス・デカトゥレンシス由来の遺伝子を、枯草菌を宿主細胞として発現分泌させた培養上清は、より効率的にα−１，６−グルカンを製造できる。具体的には、後記の実施例では、本発明のタンパク質は、コントロールとして使用した特許文献８のサーモアナエロバクター・シデロフィラス由来の酵素の４分の１の添加量で、同程度のα−１，６−グルカンを製造できることが示された。さらに、本発明のタンパク質は、反応４８時間でα−１，６−グルコシル転移反応がプラトー付近に達することから、α−１，６−グルコシル転移反応生成物をより短時間で製造できることが示唆された。
【００４２】
（酵素剤）
本発明は、上記α−１，６−グルコシル転移反応を触媒する活性を有するタンパク質および／または上記培養上清を含み、α−１，４−グルコシド結合および／またはα−１,６−グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類からα−１，６−グルカンを製造するために用いられる酵素剤を提供する。本発明の酵素剤を、タンパク質のα−１，６−グルコシル転移活性の発現に好適な条件下、反応液中でα−１，４−グルコシド結合および／またはα−１，６−グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類と接触させることにより、タンパク質のα−１，６−グルコシル転移作用により、α−１，６結合でグルコースが転移伸長され、α−１，６−グルカンが得られる。
【００４３】
本発明の基質である、α−１，４−グルコシド結合および／またはα−１，６−グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類の例として、マルトオリゴ糖およびデキストリンを挙げることができる。本明細書において、「オリゴ糖」は、単糖分子がグルコシド結合によって２〜１０個結合した糖質を意味し、「多糖類」は、単糖分子がグルコシド結合によって、多数個、具体的には１０個より多く重合した糖質を意味する。マルトオリゴ糖は、グルコースがα−１，４結合で結合した重合度２から１０の糖質であり、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、マルトオクタオースなどがある。イソマルトオリゴ糖は、グルコースがα−１，４結合およびα−１，６結合で結合したもの、並びにグルコースがα−１，６結合のみで結合したもので、重合度２から１０の糖質であり、イソマルトース、パノース、イソマルトトリオース、イソマルトテトラオース、イソパノース、イソマルトペンタオース、イソマルトヘキサオース、イソマルトヘプタオース、イソマルトオクタオースなどがある。デキストリンは、澱粉を部分的に加水分解することにより得られ、α−１，４結合およびα−１，６結合でグルコースが結合された多様な重合度の糖質の混合物として得られる。一般に、デキストロース当量（ＤＥ）が１０以上２０以下の範囲をマルトデキストリン、ＤＥが１０未満をデキストリンと区別する場合があるが、本明細書で使用する場合「デキストリン」は、ＤＥの範囲にかかわらず、澱粉を低分子化したものを意味し、マルトデキストリンを含む用語として使用する。
【００４４】
本発明の酵素剤を用いてα−１，６−グルカンを生成する場合、澱粉部分分解物を原料として利用することができる。澱粉部分分解物は、主としてデキストリンであり、その一部にマルトオリゴ糖およびイソマルトオリゴ糖を含むからである。澱粉部分分解物は、澱粉を酸または酵素により加水分解し、必要に応じて分離精製することで得ることができる。
【００４５】
本発明の酵素剤を用いて生成されるα−１，６−グルカンは、グルコースを構成糖とするグルコース重合度２以上のオリゴ糖または多糖類であって、α−１，６−グルコシド結合を有するものであればよい。すなわち、α−１，６−グルカンは、α−１，６結合のほかに、α−１，２−、α−１，３−、およびα−１，４−グルコシド結合を有していてもよい。本発明のα−１，６−グルカンの詳細については、後述する。
【００４６】
（α−１，６−グルカンの製造方法）
本発明のα−１，６−グルカンの製造方法は、α−１，４−グルコシド結合および／またはα−１，６−グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類に、本発明の酵素剤を作用させて、α−１，６−グルカンを得る反応工程を含む。本発明の酵素剤を、α−１，６−グルコシル転移活性の発現に好適な条件下、反応液中で、α−１，４−グルコシド結合および／またはα−１，６−グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類と接触させることにより、α−１，６−グルコシル転移作用により、α−１，６結合でグルコースが転移伸長され、α−１，６−グルカンを製造することができる。
【００４７】
本発明のα−１，６−グルカンの製造方法で使用する基質であるα−１，４−グルコシド結合および／またはα−１，６−グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類の例として、マルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖およびデキストリンを挙げることができる。
【００４８】
マルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖およびデキストリンの説明は、前述のとおりである。マルトオリゴ糖およびイソマルトオリゴ糖は高純度の試薬レベルのものであっても、マルトオリゴ糖シラップのように純度の低いものであってもよい。本発明に使用できるマルトオリゴ糖として、これらに制限されないが、フジオリゴ♯３６０、フジオリゴ♯４５０（日本食品化工）などが挙げられる。また、本発明に使用できるイソマルトオリゴ糖として、これらに制限されないが、イソマルト５００、イソマルト９００（昭和産業）などが挙げられる。また、本発明に使用できるデキストリンとして、これらに制限されないが、パインデックス♯１、パインデックス♯２、パインデックス♯４、パインデックス♯６、パインデックス♯１００（松谷化学工業）などが挙げられる。基質濃度は、反応液中の０．１〜４０％（ｗ／ｗ）の範囲であることができるが、これに制限されない。基質濃度は高い方が、糖転移活性が高まるため、より高濃度のα-１,６-グルカンを得るという観点からは、基質濃度は高い方が好ましい。また一般的に、酵素は基質存在下で耐熱性が向上する観点からも、基質濃度は高い方が好ましい。
【００４９】
本発明のα−１，６−グルカンの製造方法は、必要に応じて、上記の反応工程の前に、澱粉を加水分解して、α−１，４−グルコシド結合および／またはα−１，６−グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類を得る工程を含むことができる。本工程では、澱粉を常法により、酸または酵素により加水分解し、必要に応じて分離精製することにより、マルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖およびデキストリンを得ることができるが、これらがα−１，４−グルコシド結合および／またはα−１，６−グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類である。本工程では、澱粉の加水分解の程度を適宜調製することができる。分解の程度は、デキストロース当量（ＤＥ）で示すことができる。本工程の澱粉の加水分解物のＤＥは、これに制限されないが、２〜７０であればよく、後の反応工程で製造することが望まれるα−１，６−グルカンの重合度に適したＤＥに調製することができる。また、澱粉加水分解物としては、短鎖長アミロースを使用することができる。さらに、澱粉加水分解物としては、一般的な澱粉（例えば、コーンスターチ、馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉、小麦澱粉、米澱粉、タピオカ澱粉等）を酸または酵素（例えば、α−アミラーゼ等）を用いて処理した液化液を用いることもできる。
【００５０】
本発明のα−１，６−グルカンの製造方法では、重合度２〜３０のα−１，６−グルカンを製造することができる。重合度２〜３０のα−１，６−グルカンは、重合度２〜３０のα−１，６−グルカンを多く含む糖質の混合物として製造される。この混合物の組成は、さまざまな反応条件、例えば、基質の種類や濃度、反応時間、その他の酵素を使用するか否か、使用する場合にはその酵素の種類により、変動する。好ましい実施形態において、本発明で製造されるα−１，６−グルカン含有組成物の組成は、ＤＰ３〜３０の糖質が７０％以上であり、特に８０％以上であることができる。好ましい実施形態において、本発明で製造されるα−１，６−グルカン含有組成物の組成は、ＤＰ１０〜２０の糖質が３０％以上であることができ、特に４０％以上であることができる。更には、本発明で製造されるα−１，６−グルカン含有組成物の組成は、ＤＰ１０〜３０の糖質が３０％以上であることができ、特に４０％以上であることができ、さらには５０％以上であることができる
【００５１】
本発明で製造することができるα−１，６−グルカンは、イソマルトオリゴ糖および／またはイソマルトメガロ糖であってもよい。イソマルトオリゴ糖は、グルコースがα−１，６結合を含む結合様式で結合した重合度２から１０の糖質であり、イソマルトメガロ糖は、グルコースがα−１，６結合を含む結合様式で結合した重合度が１０〜１００の糖質である。本発明で製造することができるα−１，６−グルカンは、特に、重合度２〜３０のイソマルトオリゴ糖および／またはイソマルトメガロ糖であることが好ましい。本発明の酵素剤を使用し、基質の種類および濃度や反応条件などを調節することにより、所望の重合度を有するイソマルトオリゴ糖および／またはイソマルトメガロ糖を製造することができる。
【００５２】
好ましい実施形態において、本発明のα−１，６−グルカンの製造方法では、重合度３〜２０の糖質の含有割合が高いα−１，６−グルカンを製造することができる。この場合の基質は、重合度３〜１０のマルトオリゴ糖またはイソマルトオリゴ糖が好ましく、特に重合度５〜１０のマルトオリゴ糖またはイソマルトオリゴ糖がより好ましい。好ましい別の実施形態において、本発明の製造方法では、デキストリンを基質として使用することにより、重合度３〜２０の糖質の含有割合が高いα−１，６−グルカンを製造することができる。この場合の基質は、ＤＥ３〜２０程度のデキストリンが好ましく、ＤＥ４〜１０程度のデキストリンがより好ましい。好ましいさらに別の実施形態において、本発明の製造方法では、重合度３〜２０の糖質の含有割合が高いα−１，６−グルカンを製造することができる。
【００５３】
本発明のα−１，６−グルカンの製造方法の反応工程では、本発明の酵素剤と、その他の酵素を併用することができる。その他の酵素は、これに制限されないが、酵素剤の基質となりうる澱粉部分分解物を増加させ、α−１，６結合によるグルコース転移伸長の効率とα−１，６−グルカンの収率を高めるために、本発明の酵素剤と併用することができる。
【００５４】
その他の酵素は、これに制限されないが、α−１，４−グルコシド結合および／またはα−１，６−グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類のα−１，４結合やα−１，６結合を切断するために使用することができる。特に、澱粉部分分解物の分解の程度が低い場合に、重合度が高い糖質のα−１，４結合やα−１，６結合を切断するために使用することができる。本発明は特定の理論に限定されるものではないが、澱粉部分分解物のα−１，４結合やα−１，６結合の切断により、本酵素剤の基質となりうる澱粉部分分解物が増加し、本酵素剤のα−１，６結合によるグルコース転移伸長が効率よく生じると考えられるためである。
【００５５】
その他の酵素としては、例えばα−アミラーゼ（例えば、クライスターゼ（登録商標）Ｌ−１）、イソアミラーゼ、および／またはプルラナーゼを挙げることができるが、これらに制限されない。本発明に用いるα−アミラーゼ、イソアミラーゼ、およびプルラナーゼの起源や調整方法などは特に限定されるものではない。α−アミラーゼは、澱粉などのα−１，４結合を切断して、多糖、オリゴ糖、マルトースに分解する酵素であり、イソアミラーゼは、澱粉などのα−１，６結合を切断する酵素であり、プルラナーゼはプルラン（α−１，４結合、α−１，４結合およびα−１，６結合の繰り返しを含む多糖類）のα−１，６結合を切断する酵素である。本発明の酵素剤と上記その他の酵素を併せて澱粉部分分解物に作用させることで、効率よくかつ高い収率でα−１，６−グルカンを得ることができる。
【００５６】
上記反応工程で使用する本発明の酵素剤、並びに併用する場合にはα−アミラーゼ、イソアミラーゼおよび／またはプルラナーゼの反応液中の各濃度（ユニット数）は、基質である澱粉部分分解物の種類（すなわち、分解の程度）や反応液中の濃度、さらには反応時間の長さ等を考慮して適宜決定することができる。また、その他の酵素を併用する場合には、本発明の酵素剤、α−アミラーゼ、イソアミラーゼおよびプルラナーゼの濃度比率も、基質である澱粉部分分解物の種類や各酵素の起源や性能に応じて適宜決定することができる。
【００５７】
上記反応工程の反応温度は、本発明の酵素剤が安定的に作用する温度域であれば、特に制限はない。α−１，６−グルカンの合成効率を高めるためには、本発明のα−１，６−グルコシル転移反応を触媒する活性を有するタンパク質がより効率よく作用する温度域に、反応温度を設定することが好ましい。本発明のタンパク質は、基質非存在下では５０℃以下の温度で安定である。従って、本酵素剤を使用する反応系（基質存在下）の温度は、例えば、３５〜６０℃といった温度域に設定することができる。工業的規模の反応系では正確な温度管理が難しい場合があるが、本酵素剤は、幅広い温度域で安定的に使用できる点で有利である。
【００５８】
上記反応工程は、反応温度３５〜６０℃で行うことができるが、４５〜５５℃が好ましい。本発明のタンパク質は、至適温度が５５℃であり、高い活性を示すためである。
【００５９】
また、上記反応工程の反応温度は、その他の酵素を併用する場合には、本発明の酵素剤、並びにα−アミラーゼ、イソアミラーゼおよび／またはプルラナーゼが安定に作用する温度域であればよい。上記のとおり、本発明の酵素剤は幅広い温度域で安定性を有するため、併用するその他の酵素が安定に活性化する温度を勘案して、反応系で使用するすべての酵素の活性が十分に利用できる範囲に、温度設定ができる場合が多い。
【００６０】
反応温度は、反応時間の全体を通して一定である必要はなく、反応時間の初期に併用するその他の酵素の活性を高めることが望ましい場合には、その酵素の活性が高くなる温度域に、反応初期の温度を設定し、反応時間の中期や後期には、本発明の酵素剤の活性が高くなる温度域に温度を設定するなど、適宜調整することができる。
【００６１】
上記反応工程の反応ｐＨは、本発明の酵素剤が安定的に作用するｐＨ範囲であれば、特に制限はなく、反応温度などのその他の条件に合わせて、適宜設定することができる。α−１，６−グルカンの合成効率を高めるためには、本発明のα−１，６−グルコシル転移反応を触媒する活性を有するタンパク質がより効率よく作用するｐＨ範囲に、反応ｐＨを設定することが好ましい。本発明のα−１，６−グルコシル転移反応を触媒する活性を有するタンパク質はｐＨ４．２で最大活性を示し、至適ｐＨは３．９〜４．６であるので、上記反応工程の反応ｐＨを３．９〜４．６に設定することができるが、この範囲に限定されない。
【００６２】
上記反応工程の反応時間は、反応温度や基質の濃度、その他の酵素を併用する場合には使用する酵素の活性等を考慮して適宜決定できる。本分野の従来技術に基づいて、α−１，６−グルカンを製造するための、好適な反応時間を適宜決定することができる。
【００６３】
上記反応工程の反応により、α−１，６−グルカンを含む水溶液が得られる。この水溶液から、エタノールなどを用いた有機溶媒による沈殿法、クロマト分画法や限外濾過膜による処理などを用いることによりα−１，６−グルカンを精製することができる。これらの方法は、単独の操作によって、またはいくつかの操作を組み合わせることにより、より効率的にα−１，６−グルカンを精製することができる。
【００６４】
本発明の食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品の製造方法は、本発明の酵素剤を、α−１，４−グルコシド結合および／またはα−１，６−グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類に作用させて、α−１，６−グルカンを製造して、α−１，６−グルカンを得る工程、および上記工程で得られたα−１，６−グルカンを用いて食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を得る工程を含むことができる。
【００６５】
本発明の酵素剤を、α−１，４−グルコシド結合および／またはα−１，６−グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類に作用させて、α−１，６−グルカンを製造して、α−１，６−グルカンを得る工程は、上述のα−１，６−グルカンの製造方法に基づいて実施することができる。
【００６６】
上記工程で得られたα−１，６−グルカンを用いて食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を得る工程では、本発明のα−１，６−グルカンを原料の一つとして、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品を製造すること、またはα−１，６−グルカンそのものを適当な形態（粉末、液体など）に調製し、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品として提供することができる。
【００６７】
本発明の配糖体を製造する方法は、糖受容体と糖供与体に、本発明の酵素剤を作用させる工程を含む、配糖体の製造方法である。なお、糖受容体と糖供与体に本発明のタンパク質を発現する微生物を作用させてもよい。糖供与体と糖受容体を含む溶液に本酵素剤を作用させることにより、糖受容体にグリコシル基が少なくとも一つ転移した配糖体を作製することができる。本発明の配糖体を製造する方法は、上述のα−１，６−グルカンの製造方法に基づき反応温度やｐＨを適宜設定して実施することができる。本発明の配糖体を製造する方法では、糖受容体の性質に応じて、反応温度を調整することができる。本酵素剤は、比較的幅広い温度域で安定的に使用できるため、多様な化合物の配糖体の製造に用いることができる。
【００６８】
糖供与体としては、本発明の酵素剤によりグリコシル転移する化合物であればいずれでもよい。より具体的には、マルトオリゴ糖が挙げられ、マルトースおよびマルトトリオースが好ましい。
本発明の方法で製造された配糖体は、その糖部分と糖以外の化合物の結合部位にグリコシド結合を有することができる。
【００６９】
糖受容体としては、本発明の酵素剤によりグリコシル基が転移する水酸基を有する化合物であれば、いずれでもよい。具体的には、アルコール類（例えばエタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、Ｌ−メントール、１−ブタノール、２−ブタノール）、ポリオール類（例えばグリセロール、プロピレングリコール）、ビタミン類（例えばＬ−アスコルビン酸、レチノール、イノシトール、トコフェロール）、フラボノイド類（例えばケルセチン、カテキン、ルチン、ヘスペリジン）、フェノール誘導体（例えばハイドロキノン）等を用いることができ、水酸基を有した化合物であれば特に限定されない。また、糖受容体が酸化されやすい場合は、必要に応じて還元剤を反応系に添加しておくことも有効である。
【００７０】
本発明の酵素剤で製造された配糖体は、食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品の原料の一つとして使用することができ、また当該配糖体そのものを食品、飼料、餌料、化粧料、または医薬品として提供することもできる。本発明の酵素剤で製造された配糖体は、水に溶解しやすく、室温において固形粉末として存在可能であり、さらに品質が安定であることから、飲食品、医薬品並びに化粧品等へ広く利用することができる。
【００７１】
本発明の食品の製造方法で製造される食品の例には、限定されるものではないが、各種炭水化物類（パン、麺、米飯、餅）、各種和菓子類（せんべい、あられ、おこし、求肥、餅類、まんじゅう、どら焼き、ういろう、餡類、羊羹、水羊羹、錦玉、カステラ、飴玉）、各種洋菓子類（パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、ドーナツ、蒸しケーキ、プリン、ゼリー、ムース、ババロア、カスタードクリーム、シュークリーム、ワッフル、スポンジケーキ、チョコレート、チューインガム、キャラメル、ヌガー、キャンディー、シロップ類）、各種氷菓（アイスクリーム、シャーベット、ジェラート、かき氷）、各種ペースト状食品（フラワーペースト、ピーナッツペースト、マーガリン、フルーツペースト）、各種飲料（果汁含有飲料、果汁ジュース、野菜ジュース、サイダー、ジンジャーエール、アイソトニック飲料、アミノ酸飲料、ゼリー飲料、コーヒー飲料、緑茶、紅茶、ウーロン茶、麦茶、乳飲料、乳酸菌飲料、ココア、ビール、発泡酒、第三のビール、ノンアルコール飲料、ビール風味飲料、リキュール、チューハイ、清酒、果実酒、蒸留酒、栄養ドリンク、健康飲料、粉末飲料）、果物・野菜加工品（ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果、漬物）、各種乳製品（チーズ、ヨーグルト、バター、練乳、粉乳）、粉末食品（粉末スープ、粉末ムース、粉末ゼリー、粉末甘味料）、栄養食、ダイエット食、スポーツ用栄養食、流動食、半固形流動食、介護食、嚥下食等が挙げられる。
【００７２】
本発明の飼料または餌料の製造方法で製造される飼料および餌料の例には、限定されるものではないが、家畜、家禽、魚介類、昆虫（ミツバチ、蚕など）用飼料および餌料を挙げることができる。その形態としては、粉体、ペレット、錠剤、練り餌、カプセルなどを挙げることができるが、これらに限定されない。
【００７３】
本発明の化粧料の製造方法で製造される化粧料の例には、限定されるものではないが、保湿剤および美容剤などを挙げることができる。それらの形態としては、乳液、クリームおよびエマルジョンなどを挙げることができるが、これらに限定されない。
【００７４】
本発明の医薬品の製造方法で製造される医薬品の例には、限定されるものではないが、例えば抗肥満剤、血糖値上昇抑制剤などを挙げることができ、それらの形態としては、錠剤、粉剤、液剤、カプセル剤などを挙げることができるが、これらに限定されない。
【実施例】
【００７５】
以下の例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。なお、本明細書において、特に記載しない限り、「％」、「部」等は質量基準であり、数値範囲はその端点を含むものとして記載される。また、操作手順は特に記載しない限り、Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed (Sambrook、Maniatisら、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))に記載の方法に従った。
【００７６】
実施例１：枯草菌を宿主とした菌体外発現（１）
１．発現プラスミドの構築
種々の微生物について新規酵素探索を行い、テピディバシラス・デカトゥレンシス（Tepidibacillus decaturensis）由来のアミノ酸配列（NCBI Reference Sequence: WP_068722961.1）を選出し、機能解析を行った。このアミノ酸配列（配列番号１）およびアミノ酸配列をコードする遺伝子（以下、目的遺伝子という）の塩基配列（配列番号２）を、それぞれ図１Ａおよび図１Ｂに示す。配列番号３に示すアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列からシグナルペプチドを削った配列である。配列番号４に示す塩基配列は、配列番号２の塩基配列からシグナルペプチドに該当する箇所を削った配列である。配列番号２に示す塩基配列は、枯草菌での発現に最適化するために、コドン補正が行われている。
【００７７】
目的遺伝子を枯草菌（Bacillus subtilis）で発現させるための発現プラスミドを構築した。まず、pUC57ベクターに配列番号２に記載の塩基配列が挿入されたプラスミドを鋳型として、センス鎖増幅についてはベクターのシグナルペプチド配列の末端と相同な塩基配列を付加したプライマーを用いて、アンチセンス鎖増幅についてはＨｉｓ−Ｔａｇの配列の一部を付加したプライマーを用いて、目的遺伝子をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ条件を以下に示す。ＰＣＲ増幅の反応液の総量は１００μＬであった。
２×Ｐｒｉｍｅｓｔａｒ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）  ５０μＬ
１０μＭ  プライマー（TdGH15A-Fw）                              ２μＬ
１０μＭ  プライマー（TdGH15A-His-Rv）                          ２μＬ
１ｎｇ／μＬ  テンプレート                                      ２μＬ
Ｈ2Ｏ                                                         ４４μＬ
【００７８】
使用プライマーを表１に示す。
【表１】
0006650546.tif 000002
【００７９】
ＰＣＲ増幅反応のプログラムは、まず９６℃に１分間保持した後、９８℃で１０秒間→５５℃で５秒間→７２℃で３５秒間を１サイクルとして３５サイクル行った後に、さらに７２℃で５分間保持した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、増幅断片（２、６９４ｂｐ）に相当するバンドをゲルから切り出し、illustraTM GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE)を用いて抽出し精製した。
【００８０】
Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）クローニング反応で用いる線状化プラスミドの調製のため、ベクターｐＪＥＸＯＰＴ２（特開２００９−１７８４１号および特開２００９−１７８４２号を参照）を本実施例に最適化するために改変したプラスミド(Ｃ末端にHis-tag配列を付加など)を鋳型として、表２に示したプライマーを用いてＰＣＲを行った。センス鎖増幅についてはＨｉｓ−ｔａｇの配列を含めたプライマーを用い、アンチセンス鎖増幅についてはベクターのシグナルペプチド配列の末端から増幅するように組んだプライマーを用いた。
【００８１】
【表２】
0006650546.tif 000003
【００８２】
ＰＣＲ増幅の反応液の組成は、プライマーおよび鋳型以外は目的遺伝子の増幅に使用したものと同様であった。ＰＣＲ増幅反応のプログラムは、まず９６℃に１分間保持した後、９８℃で１０秒間→５５℃で５秒間→７２℃で３５秒間を１サイクルとし３５サイクルを行った後に、さらに７２℃で５分間保持した。増幅産物をアガロースゲル電気泳動に供し、目的遺伝子の増幅ＤＮＡ断片長（6,953bp）に相当するバンドを切り出し、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いて抽出し精製した。目的遺伝子の増幅ＤＮＡ断片およびベクターｐＪＥＸＯＰＴ２の増幅断片を、In-Fusion HD Cloning Kit（タカラバイオ）を用いて連結した。連結反応は５０℃に１５分間保持することで行った。
【００８３】
連結反応溶液２．５μＬを用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換し、培養した培養液からillustraTM plasmidPrep Mini Spin Kit(GE)によりプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドを「タンパク質１（Ｈｉｓ−ｔａｇ付加）−枯草菌発現用プラスミド」とした。
【００８４】
２．組換えタンパク質の発現
上記のタンパク質１（Ｈｉｓ−ｔａｇ付加）−枯草菌発現用プラスミドをプロトプラスト化した枯草菌ＩＳＷ１２１４（タカラバイオ）に導入し、７．５μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含む再生寒天培地（組成：８．１％コハク酸ナトリウム、１％寒天、０．５％カザミノ酸、０．５％酵母エキス、０．１５％リン酸２水素カリウム、０．３５％リン酸水素２カリウム、０．５％グルコース、０．４％塩化マグネシウム、０．０１％ウシ血清アルブミン、０．００１％メチオニン、および０．００１％ロイシン）にて３０℃で２日間培養した。得られたコロニーを前培養培地、続いて本培養培地で培養した（特開２００９−１７８４１号および特開２００９−１７８４２号に記載のとおり培養したが、培地の組成は改変したものを使用した）。遠心分離（１５、０００×ｇ、４℃、５分間）を行い、上清を０．４５μｍフィルター（メルク）で濾過したものを培養上清とした。
【００８５】
３．組換えタンパク質の精製
エコノカラム(BIO-RAD)にNi担体(Chelating Sepharose Fast Flow(GE)にNiを結合させたもの)を約２０ｍＬ充填したものをＮｉカラムとして、自然落下法（オープンカラム）によりアフィニティークロマトグラフィーを実施した。結合バッファー（２０ｍＭ  リン酸二水素ナトリウム、５００ｍＭ  塩化ナトリウム、３０ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ７．４）をベッドボリュームの４倍量通液してカラムの平衡化を行った後に、実施例１の「２．組換えタンパク質の発現」で調製した培養上清を３０ｍＬ供してさらに結合バッファーを通液した（素通り画分）。結合バッファーをベッドボリュームの５倍量以上通液した（洗浄画分）後に、溶出バッファー（２０ｍＭ  リン酸二水素ナトリウム、５００ｍＭ  塩化ナトリウム、５００ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ７．４）をベッドボリュームの５倍量通液することで、目的遺伝子によりコードされるタンパク質の溶出を行った（溶出画分）。各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、精製の純度を確認した。
【００８６】
溶出画分について、Amicon Ultra 50Kを用いて濃縮を行った。濃縮した精製タンパク質に対して透析を行い、精製タンパク質の溶液組成を20 mM HEPES-NaOH(pH 7.0)へと置換し、4℃で保存した。また、波長２８０ｎｍの吸光度とアミノ酸配列をNucleic and/or Amino Acid contents(http://www.gen-info.osaka-u.ac.jp/~uhmin/study/gc_content/index_ja.html)に入力して、タンパク質濃度を算出した。また精製タンパク質をSDS-PAGEに供し、単一バンドであることを確認した（図２）。分子量は９９，５００であると測定した。本実施例１により得られた精製タンパク質を、本タンパク質１という。
【００８７】
実施例２：枯草菌を宿主とした菌体外発現（２）
１．発現プラスミドの構築
目的遺伝子を枯草菌（Bacillus subtilis）で発現させるための発現プラスミドを構築した。まず、pUC57ベクターに配列番号２に記載の塩基配列が挿入されたプラスミドを鋳型として、センス鎖増幅についてはベクターのシグナルペプチド配列の末端と相同な塩基配列を付加したプライマーを用いて、アンチセンス鎖増幅についてはターミネーター配列の一部を付加したプライマーを用いて、目的遺伝子をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ条件を以下に示す。ＰＣＲ増幅の反応液の総量は１００μＬであった。
２×Ｐｒｉｍｅｓｔａｒ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）  ５０μＬ
１０μＭ  プライマー（TdGH15A-Fw）                              ２μＬ
１０μＭ  プライマー（TdGH15A-Rv）                              ２μＬ
１ｎｇ／μＬ  テンプレート                                      ２μＬ
Ｈ2Ｏ                                                         ４４μＬ
【００８８】
使用プライマーを表３に示す。
【表３】
0006650546.tif 000004
【００８９】
ＰＣＲ増幅反応のプログラムは、まず９６℃に１分間保持した後、９８℃で１０秒間→５５℃で５秒間→７２℃で３５秒間を１サイクルとして３５サイクル行った後にさらに７２℃で５分間保持した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、増幅断片（２、６９７ｂｐ）に相当するバンドをゲルから切り出し、illustraTM GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit(GE)を用いて抽出し精製した。
【００９０】
Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）クローニング反応で用いる線状化プラスミドの調製のため、ベクターｐＪＥＸＯＰＴ２（特開２００９−１７８４１号および特開２００９−１７８４２号を参照）を本実施例に最適化するために改変したプラスミドを鋳型として、表４に示したプライマーを用いてＰＣＲを行った。アンチセンス鎖増幅についてはベクターのシグナルペプチド配列の末端から増幅するように組んだプライマーを用いた。
【００９１】
使用プライマーを表４に示す。
【表４】
0006650546.tif 000005
【００９２】
ＰＣＲ増幅の反応液の組成は、プライマーおよび鋳型以外は目的遺伝子の増幅に使用したものと同じであった。ＰＣＲ増幅反応のプログラムは、まず９６℃に１分間保持した後、９８℃で１０秒間→５５℃で１５秒間→７２℃で３５秒間を１サイクルとし３５サイクルを行った。増幅産物をアガロースゲル電気泳動に供し、目的遺伝子のＤＮＡ断片（６，９３５ｂｐ）に相当するバンドを切り出し、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いて抽出し精製した。目的遺伝子の増幅ＤＮＡ断片およびベクターｐＪＥＸＯＰＴ２の増幅断片を、In-Fusion HD Cloning Kit（タカラバイオ）を用いて連結した。連結反応は５０℃に１５分間保持することで行った。
【００９３】
連結反応溶液２．５μＬを用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換し、培養した培養液からillustraTM plasmidPrep Mini Spin Kit (GE)によりプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドを「タンパク質２−枯草菌発現用プラスミド」とした。
【００９４】
２．組換えタンパク質の発現
上記のタンパク質２−枯草菌発現用プラスミドをプロトプラスト化した枯草菌ＩＳＷ１２１４（タカラバイオ）に導入し、７．５μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含む再生寒天培地（組成：８．１％コハク酸ナトリウム、１％寒天、０．５％カザミノ酸、０．５％酵母エキス、０．１５％リン酸２水素カリウム、０．３５％リン酸水素２カリウム、０．５％グルコース、０．４％塩化マグネシウム、０．０１％ウシ血清アルブミン、０．００１％メチオニン、および０．００１％ロイシン）にて３０℃で２日間培養した。得られたコロニーを前培養培地、続いて本培養培地で７０時間培養した（特開２００９−１７８４１号および特開２００９−１７８４２号に記載のとおり培養したが、培地の組成は改変したものを使用した）。遠心分離（５，０００×ｇ、４℃、５分間）を行い、上清を０．４５μｍフィルター（メルク）で濾過したものを培養上清とした。この培養上清をSDS-PAGEに供し、目的のサイズ（９９，３００）付近にバンドが出ていることを確認した（図３）。実施例２により得られたタンパク質を、本タンパク質２という。
【００９５】
実施例３：タンパク質の理化学的諸性質
実施例１で得た本タンパク質１の至適ｐＨ、ｐＨ安定性、至適温度、および温度安定性を確認するために、本タンパク質１のマルトース分解活性をグルコースの生成量に基づき、以下の通り測定した。酵素活性単位１Ｕは、各反応１分間に１μｍｏｌのグルコースを生成する酵素量と定義する。
【００９６】
１．至適ｐＨ
至適ｐＨを求める際には、ｐＨ２．５〜１１．０（０．５刻み）の１００ｍＭ  Britton-Robinson緩衝液を用いて酵素活性を測定した。５（ｗ／ｖ）％  Ｄ−（＋）−Ｍａｌｔｏｓｅ  ２０μＬ、１００ｍＭ  Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液（ｐＨ２．５〜１１．０）２０μＬ、および超純水６０μＬからなる混合液に、希釈緩衝液Ａ（２０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、ＢＳＡ  １ｍｇ／ｍＬ）を用いて４０．３μｇ／ｍＬに希釈した本タンパク質１を１０μＬ添加し、４０℃、３０分間保持した。保持後、２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）を１００μＬ添加し、反応停止した。反応停止後の液１００μＬにグルコースＣ−ＩＩテストワコーを１００μＬ添加し、３７℃、２０分間保持した。保持後、４９２ｎｍの吸光度を測定し、グルコース（０〜０．００８％）で作製した検量線に基づいて、反応によって生じたグルコース量を求めた。酵素活性を決定したところ、本タンパク質は、ｐＨ４．２で最大活性を示し、３．９〜４．６で最大活性の９５％以上の活性を示した（図４、黒丸）。尚、至適ｐＨの測定はｎ＝３で行った。
【００９７】
２．ｐＨ安定性
ｐＨ安定性を評価する際には、８０６μｇ／ｍＬの本タンパク質１  ５μＬ、１００ｍＭ  Britton-Robinson緩衝液（ｐＨ２．５〜１１．０）１０μＬ、および超純水３５μＬからなる混合液を４℃で２４時間保持した後に、希釈緩衝液Ｂ（２００ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、ＢＳＡ１ｍｇ／ｍＬ）を用いて、本タンパク質１を１６．１μｇ／ｍＬに希釈したものを各ｐＨサンプルとした。また、８０６μｇ／ｍＬの本タンパク質１を希釈緩衝液Ｂを用いて、濃度１６．１μｇ／ｍＬとなるように希釈したものをコントロールとした。
【００９８】
５（ｗ／ｖ）％  Ｄ−（＋）−Ｍａｌｔｏｓｅ ２０μＬ、１００ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）２０μＬ、超純水６０μＬからなる混合液に各ｐＨサンプル及びコントロールを１０μＬ添加し、４０℃、３０分間保持した。保持後、２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）を１００μＬ添加し、反応停止した。反応停止後の液１００μＬにグルコースＣ−ＩＩテストワコーを１００μＬ添加し、３７℃、２０分間保持した。保持後、４９２ｎｍの吸光度を測定し、反応によって生じたグルコース量を求め、残存活性を測定した。残存活性は、コントロールの活性に対する、各ｐＨサンプルの活性の割合（％）により算出した。残存活性７０％以上を示すｐＨの範囲をｐＨ安定域とした場合、本タンパク質のｐＨ安定域は４．２〜９．５であった（図４、白丸）。残存活性８０％以上を示すｐＨの範囲は５．５〜９．５であり、残存活性９０％以上を示すｐＨの範囲は６．５〜９．０であり、残存活性９５％以上を示すｐＨの範囲は７．５〜８．５であった。尚、ｐＨ安定性の測定はｎ＝３で行った。
【００９９】
３．至適温度
至適温度を求める際には、３０〜８０℃（５℃刻み）における酵素活性を測定した。５％（ｗ／ｖ）Ｄ−（＋）−Ｍａｌｔｏｓｅ  ２０μＬ、１００ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）２０μＬ、超純水６０μＬからなる混合液に希釈緩衝液Ａを用いて４０．３μｇ／ｍＬに希釈した本タンパク質１を１０μＬ添加し、各温度（３０〜８０℃）で、３０分間保持した。保持後、２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）を１００μＬ添加し、反応停止した。反応停止後の液１００μＬにグルコースＣ−ＩＩテストワコーを１００μＬ添加し、３７℃、２０分間保持した。保持後、４９２ｎｍの吸光度を測定し、反応によって生じたグルコース量を求め、酵素活性を求めたところ、５５℃で最大活性を示し、５０〜５５℃の範囲で最大活性の９５％以上の活性を示した（図５、黒丸）。尚、至適温度の測定はｎ＝３で行った。
【０１００】
４．温度安定性
温度安定性を評価する際には、８０６μｇ／ｍＬの本タンパク質１を５μＬ、１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１０μＬ、および超純水３５μＬからなる混合液を各温度（３０〜８０℃）、１時間保持した後に、水冷した。水冷後、希釈緩衝液Ａを用いて本タンパク質１を４０．３μｇ／ｍＬに希釈したものを各温度サンプルとした。また、８０６μｇ／ｍＬの本タンパク質１を希釈緩衝液Ａを用いて、濃度４０．３μｇ／ｍＬとなるように希釈したものをコントロールとした。
【０１０１】
５％（ｗ／ｖ）Ｄ−（＋）−Ｍａｌｔｏｓｅ  ２０μＬ、１００ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）２０μＬ、超純水６０μＬからなる混合液に希釈した各温度サンプル及びコントロールを１０μＬ添加し、４０℃、３０分間保持した。保持後、２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）を１００μＬ添加し、反応停止した。反応停止後の液１００μＬにグルコースＣ−ＩＩテストワコーを１００μＬ添加し、３７℃、２０分間保持した。保持後、４９２ｎｍの吸光度を測定し、反応によって生じたグルコース量を求め、残存活性を測定した。
【０１０２】
残存活性は、コントロールの活性に対する各温度サンプルの活性の割合（％）により算出した。残存活性９０％以上を示す温度の範囲を温度安定域とした場合、本タンパク質の温度安定域は５０℃までだった（図５、白丸）。尚、温度安定性の測定はｎ＝３で行った。
【０１０３】
実施例４：糖化試験１
１．方法
今回の試験用に分画調整したマルトヘキサオースおよびマルトヘプタオース高含有シラップ（Ｇ６７リッチシラップ）を終濃度３０％となるように超純水に溶解し、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を終濃度５０ｍＭ、ＣａＣｌ2を終濃度３ｍＭ、およびＮａＮ3を終濃度０．０２％となるように添加した反応液を用意した。各反応液に、実施例２で調製した枯草菌の培養上清（本タンパク質２）を、３１．２、６２．４または１２５μＬ／ｇ−ｄｓ添加し、５３℃で７２時間反応させた。反応後の反応液を１０分間沸騰水中に保持して酵素を失活させたサンプルを冷却および適宜希釈した後にアンバーライトＭＢ４を加えて脱塩後、０．４５μｍフィルターで濾過を行った。得られた反応生成物をその後の分析に用いた。また、コントロールとして、特許文献８に記載の枯草菌の培養上清（コントロール酵素：サーモアナエロバクター・シデロフィラス（Thermoanaerobacter siderophilus）由来α−１，６−グルコシル転移酵素）を用い、上記同様の操作を行った。本タンパク質２とコントロール酵素として用いた培養上清は、同じ培養条件で培養したものである。
【０１０４】
糖組成は反応生成物をＨＰＬＣに供することで分析した。分析条件はカラム：ＭＣＩ  ＧＥＬＣＫ０２ＡＳ（三菱ケミカル）、溶離液：超純水、流速：０．７ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：８０℃、検出器：示差屈折率検出器とした。反応生成物の糖組成（％）は、ＨＰＬＣで検出されたピークの総面積を１００とした場合の、各糖質に対応するピークの面積比率（％）として算出した。なお、保持時間３０分がＤＰ３０に相当することが分かっていたため、保持時間３０分未満のエリア面積を、ＤＰ３１以上の面積として算出した。
【０１０５】
反応生成物中のα-１,６結合量を確認するため、本タンパク質２の反応生成物に対してデキストラナーゼ処理を行った。デキストラナーゼ処理は、固形分濃度１％の試料０．５ｍＬに２００ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で２００倍希釈したデキストラナーゼＬ「アマノ」を２０μＬ添加し、５３℃に２４時間保持した。デキストラナーゼ処理後に、糖組成分析を行った。本タンパク質２の反応生成物の糖組成と、デキストラナーゼ処理後の糖組成を比較し、デキストラナーゼ処理後のＤＰ１〜３の増加量を算出し（［ＤＰ１〜３の増加量（％）］＝［デキストラナーゼ処理後のＤＰ１〜３の糖組成（％）］−［デキストラナーゼ処理前のＤＰ１〜３の糖組成（％）］）、当該増加量をα-１,６-結合量の指標とした。ＤＰ１〜３の糖組成はカラム：ＭＣＩ  ＧＥＬ  ＣＫ０４Ｓ（三菱ケミカル）、溶離液：超純水、流速：０．４ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：７０℃、検出器：示差屈折率検出器の条件で分析した。
【０１０６】
２．結果
図６にＧ６７リッチシラップのＨＰＬＣ分析のクロマトグラムを示す。また、図７Ａおよび７Ｂに本タンパク質２による反応生成物およびそのデキストラナーゼ処理物のＨＰＬＣ分析のクロマトグラムを示す。表５に、Ｇ６７リッチシラップ、本タンパク質２の反応生成物、およびコントロール酵素の反応生成物の糖組成並びにデキストラナーゼ処理後のＤＰ１〜３の増加量（％）を示す。
【０１０７】
【表５】
0006650546.tif 000006
【０１０８】
原料のＧ６７リッチシラップは、ＤＰ６および７の糖質をそれぞれ約３７％および約３５％含み、ＤＰ３から９の糖質を約９７％含むものであった（図６、表５）。
【０１０９】
反応生成物中のＤＰ１０〜２０の含有割合は、原料と比べ、顕著に増加している。ＤＰ１０〜２０の含有割合は、原料の２．１％が、本タンパク質２の反応生成物５−１から５−３の全てにおいて４０％以上に増加し、コントロール酵素の反応生成物Ｃ−１からＣ−３ではＣ−３のみが４０％以上に増加していた。（図７Ａ、表５）。
また、本タンパク質２およびコントロール酵素共に、酵素添加量が多いほど、反応生成物中のＤＰ１〜２の含有割合が増加する傾向があった（図７Ａ、表５）。
さらに、本タンパク質２では、酵素添加量が多いほど、反応生成物中のＤＰ２０〜３０の含有割合が増加する傾向があった（図７Ａ、表５）。
【０１１０】
一方で、本タンパク質２およびコントロール酵素共に、反応生成物中のＤＰ３〜９の含有割合は、原料と比べ、顕著に減少していた。酵素添加量が多いほど、反応生成物中のＤＰ３〜９の含有割合が減少する傾向があった。ＤＰ３〜９の含有割合は、原料では９７．２％であるが、最も低い反応生成物５−３では４５．７％に減少している（図７Ａ、表５）。
【０１１１】
デキストラナーゼ処理を施した反応生成物中のＤＰ１〜３の増加量については、本タンパク質２の反応生成物５−１から５−３およびコントロール酵素の反応生成物Ｃ−２およびＣ−３（Ｃ−１は除く）において、いずれも３０％以上であった（図７Ｂ、表５）。ＤＰ１〜３の増加量は、デキストラナーゼによるα-１,６結合の加水分解により生じたものであるため、本実施例では、反応生成物中で増加したＤＰ１０〜３０は、本タンパク質２のα-１,６転移活性により生成されたものであることが明らかになった。
【０１１２】
以上の結果から、本タンパク質２では酵素添加量が最も少ない反応生成物５−１（酵素添加量：３１．２μＬ/ｇ-ｄｓ）でも、反応生成物のＤＰ１０以上の割合が４０％を超えた。一方、コントロール酵素では反応生成物のＤＰ１０以上の割合が４０％を超えたのは、酵素添加量が最も多い反応生成物Ｃ−３（酵素添加量：１２５μＬ/ｇ−ｄｓ）のみであった。酵素添加量の比較では、本タンパク質２は、コントロール酵素の４分の１の添加量で、同程度のα-１，６-グルカンを製造できることが示された。
すなわち、枯草菌の培養上清を用いると、テピディバシラス・デカトゥレンシス由来の本タンパク質は、サーモアナエロバクター・シデロフィラス由来のコントロール酵素に比べ、より効率的にα-１，６-グルカンを製造できることが示された。
【０１１３】
実施例５：糖化試験２
１．方法
今回の試験のために調製した澱粉部分分解物（液化液ともいう）（Ｂｘ２７．１）にｐＨ６．０のＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液を終濃度５０ｍＭ、ＮａＮ3を終濃度０．０２％となるように添加して５３℃で保持した。本タンパク質２を３１．２μＬ／ｇ−ｄｓ若しくは１２５μＬ／ｇ−ｄｓ、ＧＯＤＯ−ＦＩＡ（合同酒精、ＦＩＡ）を２００Ｕ／ｇ−ｄｓ、プルラナーゼ「アマノ」３（天野エンザイム、ＰＵＬ３）を０．２ｍｇ／ｇ−ｄｓ添加した。また、クライスターゼＬ−１（天野エンザイム、Ｌ−１）０．０１ｍｇ／ｇ−ｄｓを反応開始時と反応２４時間時にそれぞれ添加した。反応液を経時的にサンプリングし、デキストラナーゼ処理および糖組成分析を行った。反応７２時間後の反応液をｐＨ６．０としてクライスターゼＬ−１を０．２ｍｇ／ｇ−ｄｓ添加後、８０℃に保持し、ヨード消去反応を行った。ヨード呈色はＢｘ５に希釈した反応液１ｍＬに１０ｍＭヨウ素溶液を４０μＬ添加して確認した。いずれの系も反応１時間でヨード呈色が消失したため、ｐＨ４．０として１０分間沸騰水中で保持し酵素を失活させた。ヨード消去後の反応液をアンバーライトＭＢ４で脱塩後、０．４５μｍフィルターでろ過し、その後の分析に用いた。反応生成物の糖組成の分析およびデキストラナーゼ処理の条件は、実施例４と同様に行った。
【０１１４】
２．結果
【表６】
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【０１１５】
原料の液化液ではＤＰ３１以上を７１．７％含み、ＤＰ１０〜２０を１１．８％含んでいた（表６、図８）。
反応７２時間後（ヨード消去後）の本タンパク質２の反応生成物では、ＤＰ３１以上は、原料の液化液（７１．７％）に比較して顕著に減少し、反応生成物６−１では１．３％、反応生成物６−２では２．９％であった。一方、反応生成物のＤＰ１０〜２０は、原料の液化液（１１．８％）に比較して顕著に増加しており、反応生成物６−１が５１．１％、反応生成物６−２が４２．３％であった（表６、図９Ａ）。
またヨード消去後にデキストラナーゼ処理後のＤＰ１〜３の増加量が反応生成物６−１で４５．１％、反応生成物６−２で４７．８％であり（表６、図９Ｂ）、基質をＧ６７リッチシラップとした時（表５、３４．７〜４１．１％）に比べ、大きい値であった。加えて、ＤＰ１〜３の増加量を経時的に調べると、反応生成物６−１および６−２共に、反応２４時間時点で３０％以上あり、反応４８時間時点では４５％程度まで上昇していた（図１０）。反応４８時間でα−１，６−転移反応がプラトー付近に達することが分かった（図１０）。
【０１１６】
以上の結果から、本タンパク質は澱粉部分分解物（液化液）を基質とした際にも、複数の加水分解酵素を併用することで、α−１，６−グルカンを効率的に製造できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１１７】
本発明は、α−１，６−グルカンを使用することができる食品や医療などのさまざまな分野において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１１８】
配列番号１および３：テピディバシラス・デカトゥレンシス由来のタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２および４：配列番号１および３のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号５から１１：プライマーの塩基配列
【要約】
【課題】α−１，６−グルカンを効率的に製造することができるα−１，６−グルコシル転移反応を触媒するタンパク質、当該タンパク質を有効成分とするα−１，６−グルカン製造用酵素剤、および酵素剤を用いたα−１，６−グルカンの製造方法を提供すること。
【解決手段】本発明によれば、α−１，６−グルコシル転移反応を触媒する活性を有する、下記の(ａ)から(ｃ)のいずれかのタンパク質が提供される。(ａ) 配列番号３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；(ｂ) 配列番号３に示すアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質；(ｃ) 配列番号３に示すアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。本発明によれば、上記タンパク質を含む、α−１，４−グルコシド結合および／またはα−１，６−グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類からα−１，６−グルカンを製造するために用いられる酵素剤が提供される。本発明によれば、α−１，４−グルコシド結合および／またはα−１，６−グルコシド結合を有するオリゴ糖および／または多糖類に、上記酵素剤を作用させて、α−１，６−グルカンを得る反応工程を含む、α−１，６−グルカンの製造方法が提供される。
【選択図】なし【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【配列表】
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