(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を含む組換えプラスミドが導入された枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を固体培地の表面で繰り返し培養することを含む、タンパク質又はポリペプチドの製造方法。
【請求項２】
微生物を４５世代以上にわたって培養する、請求項１記載のタンパク質又はポリペプチドの製造方法。
【請求項３】
目的のタンパク質又はポリペプチドが加水分解酵素である請求項１又は２記載のタンパク質又はポリペプチドの製造方法。
【請求項４】
加水分解酵素がアルカリセルラーゼ又はアルカリプロテアーゼである請求項３記載のタンパク質又はポリペプチドの製造方法。
【請求項５】
目的遺伝子を含む組換えプラスミドが導入された枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を固体培地の表面で培養し、さらに固体培地の表面で継代培養を繰り返す、該プラスミドの安定化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質又はポリペプチドの製造方法、並びにプラスミドの安定化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子工学の研究が盛んに行われ、遺伝子組換え体微生物を用いてタンパク質等の有用物質を大量に生産させる技術が多数報告されている。
遺伝子組換え体微生物の作製には主に目的遺伝子を組み込んだプラスミドベクターが利用され、宿主内でのプラスミドの保持安定性は目的の有用物質を高生産する上で極めて重要であるが、宿主の複製システム等の問題から、プラスミドは培養の過程で一定の確率で脱落することが知られている。特に、長期培養の過程でプラスミドは脱落し易い。
【０００３】
そこで、プラスミドの安定化に関する技術が検討され、例えば、遺伝子組換え体微生物を、カラギーナンやアルギン酸塩等のゲルで包括固定化する方法が提案されている。なかでも、アルギン酸塩による包括固定化法は、プラスミドを安定化し、宿主からの脱落を抑制することが報告されている（特許文献１、非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平１−１２０２８８号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００２年、第３０巻、ｐ．８６２−８６６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、アルギン酸はそのゲル形成にカチオンが必要で、特にアルギン酸と親和性の高いカルシウムイオンは微生物の生育に阻害を示すため、これを避けると遺伝子組換え体微生物を包括固定化する担体ゲルは機械的に非常に弱いものとなり易い。その上、非特許文献１によれば、遺伝子組換え体微生物が固定化状態から漏出してくるとプラスミドは脱落してしまい、且つプラスミドの脱落した菌体の増殖が優位になってしまう。そのため、アルギン酸塩による包括固定化法は、特に長期培養に不向きと考えられる。
したがって、本発明は、宿主内でのプラスミドの保持安定性を高め、目的の有用物質を効率よく高生産する新たな方法を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、プラスミドの安定性を向上させる技術について種々検討したところ、固体培地を用いて、目的遺伝子を含む組換えプラスミドが導入された微生物を培地の固体表面で培養することにより、プラスミドが安定化し、繰り返し長時間培養してもプラスミドの脱落を抑えることができ、目的の有用物質を効率よく生産できることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を含む組換えプラスミドが導入された微生物を固体培地の表面で繰り返し培養することを含む、タンパク質又はポリペプチドの製造方法を提供するものである。
また、本発明は、目的遺伝子を含む組換えプラスミドが導入された微生物を固体培地の表面で培養し、さらに固体培地の表面で継代培養を繰り返す、該プラスミドの安定化方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法によれば、微生物に導入された組換えプラスミドを長期間安定して保持でき、目的のタンパク質又はポリペプチドを効率よく生産することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明のタンパク質又はポリペプチドの製造方法は、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を含む組換えプラスミドが導入された微生物を固体培地の表面で繰り返し培養することを含む、ものである。
また、本発明のプラスミドの安定化方法は、目的遺伝子を含む組換えプラスミドが導入された微生物を固体培地の表面で培養し、さらに固体培地の表面で継代培養を繰り返す、ものである。
【００１１】
本発明において、組換えプラスミドは制限酵素法等の通常の方法で作製することができる。
例えば、適当なプラスミドベクターを制限酵素で切断し、そこに制限酵素切断配列を端部に有するように構築した目的遺伝子のＤＮＡを添加することによって、該遺伝子ＤＮＡをベクターに挿入することができる。
目的遺伝子は、目的遺伝子産物をコードする遺伝子であり、微生物が生来有する遺伝子であってもよいが、好ましくは微生物が生来的に有さない異種遺伝子であり、なかでもタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子が好ましい。
利用可能なプラスミドベクターとしては、特に制限されず、例えば、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ（株））等が挙げられる。
【００１２】
本発明において、目的のタンパク質又はポリペプチドは、食品、医薬品、化粧品、洗浄剤、繊維、医療検査等の分野で用いられる産業上有用な酵素や生理活性因子等のタンパク質又はポリペプチドが含まれる。
酵素としては、酸化還元酵素（オキシドレダクターゼ）、転移酵素（トランスフェラーゼ）、加水分解酵素（ヒドロラーゼ）、脱離酵素（リアーゼ）、異性化酵素（イソメラーゼ）、合成酵素（リガーゼ／シンセターゼ）等が含まれる。
なかでも、加水分解酵素が好ましく、更にセルラーゼ、α−アミラーゼ、プロテアーゼが好ましく、更にセルラーゼ、プロテアーゼが好ましい。セルラーゼ、プロテアーゼは、アルカリセルラーゼ、アルカリプロテアーゼが好ましい。アルカリセルラーゼ、アルカリプロテアーゼは、アルカリ性領域に至適ｐＨを有するセルラーゼ、プロテアーゼである。
【００１３】
セルラーゼは、多糖加水分解酵素の分類（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２８０，３０９（１９９１））中でファミリー５に属するセルラーゼが好ましく、微生物由来のセルラーゼがより好ましく、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌由来のセルラーゼが更に好ましい。バチルス属細菌由来のセルラーゼとしては、バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８７５）、バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８８６）由来のアルカリセルラーゼが挙げられる。
【００１４】
プロテアーゼは、微生物由来のプロテアーゼが好ましく、バチルス属細菌由来のプロテアーゼがより好ましく、活性中心がセリン残基であるセリンプロテアーゼや金属プロテアーゼが更に好ましい。バチルス属細菌由来のプロテアーゼとしては、バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０４８２）、バチルス  クラウジ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）ＫＳＭ  Ｋ−１６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３３７６）、バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＳＭ−ＫＰ４３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５３２）、バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＳＭ―ＫＰ９８６０株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５３４）、バチルス  Ｎｏ．Ｄ−６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５９２）（プロテアーゼＥ−１）、バチルス  エスピーＹ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０２９）、バチルス  ＳＤ５２１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１１１６２）、バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＳＭ−９８６５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５６６）、ＮＣＩＢ１２２８９、ＮＣＩＢ１２５１３由来のアルカリプロテアーゼが挙げられる。
【００１５】
作製した組換えプラスミドは、コンピテントセル法、プロトプラスト法等の通常の方法で微生物に導入することができる。
本発明において、微生物としては、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に属する微生物等が挙げられる。なかでも、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌が好ましく、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）がより好ましい。
微生物は、各種遺伝子操作によって、塩基配列の挿入、置換、欠失等の変異が生じた変異微生物であってもよい。
【００１６】
本発明では、上記組換えプラスミドが導入された微生物を固体培地の表面で繰り返し培養する。
ここで、「繰り返し培養する」とは、微生物を所定の稠密状態になるまで培養し、その後培養物を新たな培養培地に移し換えて培養する操作を繰り返し行うことをいう。初代培養から１回目の継代培養、１回目から２回目以降の継代培養はそれぞれ同一の培養条件としてもよく、異なる培養条件としてもよい。
培養は、生産性の点から、世代数にして４５代以上、更に７０代以上、こと更８０代以上にわたって行うことが好ましい。
また、継代培養の間隔は、２４時間以内、更には１２時間以内が好ましい。
【００１７】
固体培地は、特に限定されず、微生物の種類に応じたもの、微生物による目的遺伝子産物の生産のために用いられるものでよい。通常、固体培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要な栄養源等を含む固体培地が好ましい。作業性の観点から、寒天培地を用いても良い。
寒天培地の場合、培地中の寒天は、０．５〜５質量％添加することが好ましい。
他の炭素源としては、例えば、糖類（グルコース、アラビノース、キシロース、マンノース、フラクトース、ガラクトース、シュークロース、マルトース、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、イノシット、グリセリン、可溶性澱粉、廃糖蜜、転化糖等）、酢酸等の資化しうる有機酸、エタノール等の低級アルコール類等が挙げられる。なかでも、増殖の点から、糖類を含有するのが好ましい。
窒素源としては、例えば、アンモニア、無機・有機アンモニウム塩、尿素、コーングルテンミール、大豆粉、酵母エキス、肉エキス、魚肉エキス、ポリペプトン、トリプトン、ペプトン、各種アミノ酸、ソイビーンミール等が挙げられる。
無機塩類としては、例えば、硫酸塩、マグネシウム塩、亜鉛塩等が挙げられる。
培地中の寒天以外の炭素源は、増殖の点から、０〜２０質量％添加することが好ましい。また、窒素源は、上記を適宜混合した後に添加することが好ましい。これら培地成分は、必要に応じて培地中に追添することもできる。
また、ＬＢ寒天培地等の市販の固体培地を用いてもよい。
固体培地の形状は、特に制限されず、平板、斜面、高層培地等として用いることができる。これら培地中には、抗生物質や微量成分を適宜必要に応じて添加しても良い。
【００１８】
固体培地の表面で培養する条件は、微生物により目的遺伝子産物が生産される条件であればよい。
培養温度は、微生物の増殖に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、通常、２０〜４８℃が好ましく、２５〜４５℃がより好ましく、更に２８〜３９℃が好ましい。
【００１９】
固体培地に塗沫する微生物の量は、１〜１０００ＣＦＵ／ｍＬが好ましい。  
【００２０】
培養時のｐＨは、通常、６．５〜８．５が好ましく、ｐＨ７．０〜８．０がより好ましい。
【００２１】
培養期間は、微生物の増殖に応じて１〜７日、更に１〜３日、更には１〜２日が好ましい。
【００２２】
例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）によるアルカリセルラーゼ又はアルカリプロテアーゼの生産では、好気的条件下、一定の温度で行うのが好ましい。固体培地を用いる場合には一定の湿度範囲内で乾燥を抑制することが好ましい。
【００２３】
このような培養を行うことにより、プラスミドが安定化し、宿主内のプラスミドの脱落を抑えることができ、効率よく目的のタンパク質又はポリペプチドが得られる。
本発明において、プラスミドの保持率は、１培養あたり０．９以上、好ましくは０．９５以上である。
培養終了後、適当な分離・精製手段により培地から目的遺伝子産物、例えば目的のタンパク質又はポリペプチドを採取することができる。
また、プラスミドが安定に保持された微生物を目的遺伝子産物生産用の培地に供して目的遺伝子産物を高生産させてもよい。
【実施例】
【００２４】
製造例１  アルカリプロテアーゼ遺伝子導入用ベクターによる枯草菌の形質転換
特開２０１４−１６１２８４に示すように、アルカリプロテアーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＨＹ−ＳＰ６４−Ｅ−１を得た。
次いで、組換えプラスミドｐＨＹ−ＳＰ６４−Ｅ−１を、特開２０１４−１５８４３０に示すように構築した枯草菌変異株であるｒｅｃＡ遺伝子欠失株（ｋａｏ１１９株）にプロトプラスト形質転換法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９７９，ｖｏｌ．１６８，ｐ．１１１）によって導入し、形質転換体を得た。
【００２５】
製造例２  アルカリセルラーゼ遺伝子導入用ベクターによる枯草菌の形質転換
特開２０１４−１５８４３０に示すように、アルカリセルラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＨＹ−Ｓ２３７を作製した。
次いで、組換えプラスミドｐＨＹ−Ｓ２３７を、上記と同様の特開２０１４−１５８４３０に示すように構築したｒｅｃＡ遺伝子欠失株（ｋａｏ１１９株）にプロトプラスト形質転換法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９７９，ｖｏｌ．１６８，ｐ．１１１）によって導入し、形質転換体を得た。
【００２６】
実施例１及び実施例２
製造例１で得た形質転換体を適宜希釈・懸濁した後、１５ｍＬのＬＢ−Ｔｃ−Ｓｍ寒天培地（１質量％トリプトン、０．５質量％酵母エキス、１質量％ＮａＣｌ、１０ｐｐｍテトラサイクリン、１質量％スキムミルク、１．５質量％寒天）の表面に１００μＬを塗布し、培養温度３２℃で２日又は３日で植え継いで繰り返し固体培養を行った。
【００２７】
実施例３
製造例２で得た形質転換体を適宜希釈・懸濁した後、１５ｍＬのＬＢ−Ｔｃ−Ｔｂ寒天培地（１質量％トリプトン、０．５質量％酵母エキス、１質量％ＮａＣｌ、１０ｐｐｍテトラサイクリン、１質量％ＣＭＣ、０．０４質量％トリパンブルー、１．５質量％寒天）の表面に１００μＬ塗布し、培養温度３２℃で２日で植え継いで繰り返し固体培養を行った。
【００２８】
比較例１
製造例１で得た形質転換体を、２０ｍＬのＬＢ−Ｔｃ培地（１質量％トリプトン、０．５質量％酵母エキス、１質量％ＮａＣｌ、１０ｐｐｍテトラサイクリン）に１％（ｖ／ｖ）接種し、培養温度３２℃、２００ｒ／ｍｉｎで２日で植え継いで繰り返し振盪培養を行った。
【００２９】
比較例２
培養温度を２５℃とし、３日で植え継いだ以外は比較例１と同様に繰り返し振盪培養を行った。
【００３０】
比較例３
製造例２で得た形質転換体を、２０ｍＬのＬＢ−Ｔｃ−Ｔｂ培地（１質量％トリプトン、０．５質量％酵母エキス、１質量％ＮａＣｌ、１０ｐｐｍテトラサイクリン、１質量％ＣＭＣ、０．０４質量％トリパンブルー）に１％（ｖ／ｖ）接種し、培養温度３２℃、２００ｒ／ｍｉｎで２日で植え継いで繰り返し振盪培養を行った。
【００３１】
〔プラスミド安定性評価及び保持率の算出〕
上記実施例１〜３、比較例１〜３で得た培養物に対して、コロニーカウント法により、下記式に従ってプラスミド保持率の算出を行った。プラスミドを保持しているかどうかは目視により判別を行った。
〔プラスミド保持率の算出〕
プラスミド保持率＝（プラスミドを保持したコロニー数）／（全コロニー数）
培養条件及びプラスミド保持率の結果を表１に示す。
【００３２】
【表１】
0006731232.tif 000002
【００３３】
表１より明らかなように、固体培地で継代培養を行った実施例１〜３ではプラスミドの脱落は認められず、プラスミドを安定に保持していることが確認された。これに対して、液体培養ではプラスミドは脱落し、培養温度２５℃で増殖速度が遅くてもプラスミドは安定に保持されなかった。
【００３４】
〔アルカリプロテアーゼ生産性評価〕
実施例１、比較例１で得られた各世代の形質転換体を、タンパク生産性評価用培地（１．０質量％酵母エキス、１．０質量％魚肉エキス、０．２４質量％金属塩、１６質量％マルトース、３．６質量％アミノ酸混合物、０．４質量％アンモニウム塩、０．２質量％リン酸二カリウム、１０ｐｐｍテトラサイクリン）に接種し、それぞれ３６℃で３日間培養した。
培養後、菌体を除いた培養上清のアルカリプロテアーゼ活性を下記の手順にて測定し、菌体外に分泌生産されたアルカリプロテアーゼの量を求めた。
１／１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）０．９ｍＬ、４０ｍＭ  Ｇｌｔ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ｐ−ニトロアニリド／ジメチルスルホキシド溶液０．０５ｍＬを試験管に採り、３０℃で５分間保温した。これに酵素液（培養上清）０．０５ｍＬを加えて３０℃で１０分間反応を行った後、５％（ｗ／ｖ）クエン酸水溶液２．０ｍＬを加えて反応を停止し、分光光度計を用いて４２０ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度の変化に基づいてサンプル中のアルカリプロテアーゼ量を定量した。１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロアニリンを生成する酵素活性を１Ｕとし、比活性よりアルカリプロテアーゼ生産量を算出した。
結果を表２に示す。
【００３５】
【表２】
0006731232.tif 000003
【００３６】
〔アルカリセルラーゼ生産性評価〕
実施例３、比較例３で得られた各世代の形質転換体を、上記と同じタンパク生産性評価用培地に接種し、それぞれ３６℃で３日間培養した。
培養後、菌体を除いた培養上清のアルカリセルラーゼ活性を下記の手順にて測定し、菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を求めた。
１／７．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、和光純薬）で適宜希釈したサンプル溶液５０μＬに０．４ｍＭ  ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−β−Ｄ−ｃｅｌｌｏｔｒｉｏｓｉｄｅ（生化学工業）を５０μＬ加えて混和し、３０℃にて反応を行った際に遊離するｐ−ニトロフェノール量を４２０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４２０ｎｍ）変化により定量した。１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを遊離させる酵素量を１Ｕとし、比活性よりセルラーゼ生産量は比活性よりアルカリセルラーゼ生産量を算出した。
結果を表３に示す。
【００３７】
【表３】
0006731232.tif 000004
【００３８】
表２及び表３より明らかなように、固体培地で継代培養を行うと、液体培養の場合と比較して、アルカリプロテアーゼ及びアルカリセルラーゼの生産性が高いことが確認された。