(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
等温核酸増幅反応におけるサンプル阻害を排除するための水性組成物であって、
エチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス（２−ピリジルメチル）エタン−１，２−ジアミン、１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−三酢酸、及びこれらの塩からなる群から選択される有機鉄キレート試薬と、
三価鉄と、
０．００５％（質量／体積）以上０．０１９％（質量／体積）未満の濃度の非イオン性界面活性剤と、を含み、
前記水性組成物は、ｐＨが８．４５〜８．８５であり、
前記有機鉄キレート試薬は、三価鉄に対する第１の結合定数が１０４．２以上であり、マグネシウムに対する第２の結合定数が１０３．８未満であり、前記第１の結合定数及び前記第２の結合定数は、ｐＨ８．４５及び２０℃の脱イオン水中で判定される、水性組成物。
【請求項２】
前記有機鉄キレート試薬はＥＧＴＡを含み、前記ＥＧＴＡに対する三価鉄のモル比が０．０４〜０．２８である、請求項１に記載の水性組成物。
【請求項３】
２−ヒドロキシプロパン−１，２，３−トリカルボキシレートを更に含み、前記有機鉄キレート試薬と前記２−ヒドロキシプロパン−１，２，３−トリカルボキシレートは、別々の分子である、請求項１又は２に記載の水性組成物。
【請求項４】
前記非イオン性界面活性剤は、親水親油バランスが１１〜１６である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の水性組成物。
【請求項５】
前記三価鉄は、前記水性組成物に５０μＭ〜３５０μＭの濃度で溶解している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の水性組成物。
【請求項６】
ポリビニルピロリドンを更に含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の水性組成物。
【請求項７】
フッ素系界面活性剤を更に含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
指示染料を更に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
ａ）請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物を標的サンプルと接触させて、水性混合物を形成することと、
ｂ）工程ａ）の前記水性混合物を熱溶解プロセスに付すことと、
ｃ）工程ｂ）に続き、前記水性混合物の一部を等温核酸増幅プロセスに付すことと、を含む、等温核酸増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１４年１２月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／０９６，２１７号、及び２０１５年３月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／１３６，６８２号に基づく優先権を主張するものであり、その開示内容は全て、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０００２】
［背景］
病原体及び他の微生物の検出のための従来の方法は培養法に基づくものであるが、これらは時間がかかり、労力を要し、迅速な結果を提供するための品質管理及び診断検査室のニーズにはもはや適合していない。
【０００３】
微生物の培養、病原体検出における偽陽性といった問題を克服しようとする努力が、ＤＮＡに基づく診断法又は核酸増殖法などの遺伝子検査の開発につながってきた。ＤＮＡに基づく方法の使用は、それぞれの病原性種が、他の生物とその病原性種を区別する固有のＤＮＡ又はＲＮＡシグネチャーを持っているという前提に由来する。これらの技法は最も有望であり、微生物の迅速、高感度、かつ特異的な検出にますます使用されるようになっている。
【０００４】
バイオテクノロジーの進歩が、効率的な核酸増幅のための多種多様なアッセイの開発につながってきた。
【０００５】
微生物／病原体を含有するサンプルの効果的な遺伝子検査には、即時に、又はリアルタイムで結果を出す迅速で高感度なアッセイ法が必要である。分析の時間及び感受性、並びにサンプル中の阻害物質によって引き起こされる核酸増幅の阻害は、遺伝子検査の有用性に関するある種の制限である。
【０００６】
意図する標的の核酸増幅の阻害を効率的かつ迅速に低減又は排除するための組成物及び方法が望まれている。
【０００７】
［概要］
本開示は、核酸増幅反応におけるサンプル阻害を排除するための組成物、及びこの組成物を使用した核酸増幅法を提供する。
【０００８】
第１の態様において、核酸増幅反応におけるサンプル阻害を排除するための水性組成物が提供される。組成物は、有機鉄キレート試薬と、三価鉄と、０．００５％（質量／体積）以上の濃度の非イオン性界面活性剤と、を含むことができる。組成物のｐＨは、約８．４５〜８．８５とすることができる。有機鉄キレート試薬は、三価鉄に対する第１の結合定数が１０４．２以上であり、マグネシウムに対する第２の結合定数が１０３．８未満であり、第１の結合定数及び第２の結合定数は、ｐＨ８．４５及び２０℃の脱イオン水中で判定される。
【０００９】
上記実施形態のいずれかにおいて、有機鉄キレート試薬は、複数のカルボキシレート基を含むことができる。上記実施形態のいずれかにおいて、組成物は、２−ヒドロキシプロパン−１，２，３−トリカルボキシレートを更に含むことができる。上記実施形態のいずれかにおいて、有機鉄キレート試薬はＥＧＴＡを含むことができ、ＥＧＴＡに対する三価鉄のモル比が約０．０４〜約０．２８である。上記実施形態のいずれかにおいて、組成物は、ポリビニルピロリドンを更に含むことができる。
【００１０】
第２の態様において、本開示は、核酸増幅方法を提供し、この方法は、ａ）有機鉄キレート試薬と、三価鉄と、ポリビニルピロリドンと、０．００５％（質量／体積）以上の濃度で組成物中に存在する非イオン性界面活性剤と、を含む組成物を標的サンプルと接触させて、ｐＨが約８．４５〜８．８５の水性混合物を形成することと、ｂ）工程ａ）の水性混合物を熱溶解に付すことと、ｃ）工程ｂ）に続き、水性混合物を等温核酸増幅に付すことと、を含む。有機鉄キレート試薬は、三価鉄に対する第１の結合定数が１０４．２以上であり、マグネシウムに対する第２の結合定数が１０３．８未満であり、第１の結合定数及び第２の結合定数は、ｐＨ８．４５及び２０℃の脱イオン水中で判定される。
【００１１】
一実施形態において、本開示は、等温増幅方法を提供し、この方法は、ａ）有機鉄キレート試薬と、三価鉄と、ポリビニルピロリドンと、０．００５％（質量／体積）以上の濃度で組成物中に存在する非イオン性界面活性剤と、を含む組成物を標的サンプルと接触させて、ｐＨが約８．４５〜８．８５の水性混合物を形成することと、ｂ）工程ａ）の混合物を熱溶解に付すことと、ｃ）工程ｂ）に続き、混合物を等温核酸増幅に付すことと、を含む。有機鉄キレート試薬は、三価鉄に対する第１の結合定数が１０４．２を超え、マグネシウムに対する第２の結合定数が１０３．８未満であり、第１の結合定数及び第２の結合定数は、ｐＨ８．４５及び２０°の脱イオン水中で判定される。
【００１２】
第三の態様において、本開示は、三価鉄、有機鉄キレート試薬、及び非イオン性界面活性剤を含むキットを提供する。有機鉄キレート試薬は、三価鉄に対する第１の結合定数が１０４．２を超え、マグネシウムに対する第２の結合定数が１０３．８未満であり、第１の結合定数及び第２の結合定数は、ｐＨ８．４５及び２０°の脱イオン水中で判定される。
【００１３】
キットのいずれの実施形態においても、有機鉄キレート試薬は、複数のカルボキシレート基を含むことができる。上記実施形態のいずれかにおいて、キットは、２−ヒドロキシプロパン−１，２，３−トリカルボキシレートを更に含むことができる。上記キットの実施形態のいずれかにおいて、有機鉄キレート試薬は、エチレングリコール四酢酸を含むことができ、エチレングリコール四酢酸に対する三価鉄のモル比が約０．０４〜約０．２８である。上記実施形態のいずれかにおいて、キットは、ポリビニルピロリドン、フッ素系界面活性剤、指示染料、防腐剤、緩衝剤、及びＬＡＭＰ−ＢＡＲＴ反応の促進剤、並びにこれらの組合せからなる群から選択される構成成分を更に含むことができる。
【００１４】
上記は、本開示の関連する目的のいくつかを概説したものである。これらの目的は、意図する開示のより顕著な特徴及び用途のいくつかの単なる例示であると解釈すべきである。本開示は、以下の実施形態のより詳細な説明に記載される他の特徴及び利点、又は以下の実施形態のより詳細な説明から明らかになる他の特徴及び利点を含む。
【００１５】
上記の本発明の概要は、本発明の開示される各実施形態又は全ての実装形態を記載することを意図したものではない。以下の説明は、例示的実施形態をより詳細に示すものである。本出願を通じていくつかの箇所において、例示のリストによって指針が示されるが、それらの例示は様々な組み合わせで使用することができる。各事例において、記載されるリストは代表例の群としてのみ役立ち、排他的なリストであると解釈すべきではない。
【００１６】
これらの実施形態及び他の実施形態の更なる詳細について、添付の図面及び以下の説明において述べる。他の特徴、目的及び利点は、説明及び図面、並びに特許請求の範囲から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
前述の要約に加え、以下の本開示の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことでより深く理解される。本開示の説明を支援する目的で、図面には、現在好適であって例示的であると考えられる実施形態が示されている。しかし、本開示は、示された厳密な配置及び手段に限定されないと理解されたい。
【００１８】
【図１】タンパク質を含有するサンプルとのＬＡＭＰ−ＢＡＲＴ反応におけるクエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム（ferric ammonium citrate、FAC）の効果のグラフ表示を示す図である。
【００１９】
【図２】エスクリン又は６，７，−ジヒドロキシクマリンを含有するサンプルとのＬＡＭＰ−ＢＡＲＴ反応におけるＦＡＣの効果を示すピーク到達時間（Time to Peak、TTP）のボックスプロットを示す図である。
【００２０】
【図３】ＬＡＭＰ−ＢＡＲＴ反応におけるＦＡＣに対する界面活性剤の効果を示すＭＣ  ＴＴＰのボックスプロットを示す。
【００２１】
［詳細な説明］
本開示の任意の実施形態を詳しく説明する前に、本発明はその適用において、以下の説明に述べる又は以下の図面に例示する構成の細部及び構成成分の配置に限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であり、様々な方法で実施又は実行することができる。また、本明細書において使用される語句及び専門用語は説明を目的としたものであり、限定するものと見なすべきではないことを理解すべきである。本明細書における「含む（including）」、「備える、含む（comprising）」又は「有する（having）」、及びこれらの変形の使用は、その後に挙げる項目及びその均等物、並びに付加的な項目を包含することを意味する。本開示の範囲から逸脱することなく、他の実施形態を利用することが可能、及び構造的又は論理的な変更を行うことが可能であることを理解されたい。本開示を、以下により詳細に説明する。以下の詳細な説明の目的のために、本開示は、明示的に反対のことが特定されている場合を除き、様々な代替的な変形形態及び一連の工程を想定することができることを理解されたい。したがって、本開示を詳細に説明する前に、本開示は、特に例示したシステム又は実施形態に限定されず、当然のことながら変化し得ることを理解すべきである。本明細書におけるいずれの箇所においても、本明細書において論じられるあらゆる用語の例を含め、例の使用は説明のためにすぎず、本開示又は例示されるいかなる用語の範囲及び意味をも決して限定するものではない。同様に、本開示は、本明細書に示す各種実施形態に限定されるものではない。
【００２２】
本明細書で使用する場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上そうでないことを明確に示さない限り、複数形の指示対象を含む。「及び／又は」という用語は、記載の要素の１つ若しくは全て、又は記載の要素のうちいずれか２つ以上の組合せを意味する。
【００２３】
「約（about）」という用語は、ある範囲の値又は端点について説明するときに使用され、本開示は、言及する特有の値と端点との両方を含むと理解されたい。
【００２４】
本明細書で使用する場合、「備える、含む（comprises）」、「備える、含む（comprising）」、「含む（includes）」、「含む（including）」、「含む（containing）」、「特徴とする（characterized by）」、「有する（having）」という用語、又はこれらの任意の他の変形は、排他的でない包含を網羅することを意図している。
【００２５】
本明細書で使用する場合、「核酸」及び「核酸配列」という語句は互いに交換可能であり、限定することを意図するものではない。「核酸」は、当技術分野で公知の意味を有し、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ）、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、又はｒＲＮＡ）、及びＰＮＡを意味する。核酸は、二本鎖又は一本鎖の立体配置、環状形態、プラスミド、比較的短いオリゴヌクレオチド、ＰＮＡとも呼ばれるペプチド核酸などを含むが、これらに限定されない多種多様な形態であり得る。核酸はゲノムＤＮＡであってもよく、これは染色体全体又は染色体の一部を含むことができる。ＤＮＡは、コーディング（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及び／又はｒＲＮＡをコーディングするための）、及び／又は非コード配列（例えば、セントロメア、テロメア、遺伝子間領域、イントロン、トランスポゾン、及び／又はマイクロサテライト配列）を含んでもよい。核酸は、天然に存在するヌクレオチドのいずれか、更には人工的又は化学的に修飾されたヌクレオチド、突然変異したヌクレオチドなどを含んでもよい。核酸は、非核酸成分、例えば、ペプチド（ＰＮＡで見られるように）、標識（放射性同位体又は蛍光マーカー）などを含むことができる。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「増幅する」及び「増幅」は、ポリヌクレオチド配列を直線的又は指数関数的に増加させるための広範囲に亘る技法を意味する。例示的な増幅技法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction、PCR）、又はプライマー伸長工程を採用する他の任意の方法が挙げられるが、これらに限定されない。増幅のその他の非限定的例としては、リガーゼ検出反応（ligase detection reaction、LDR）、及びリガーゼ連鎖反応（ligase chain reaction、LCR）が挙げられるが、これらに限定されない。増幅方法は、熱サイクリングを含んでもよく、ループ介在等温増幅（Loop mediated isothermal amplification、LAMP-BART）のように、等温で実施してもよい。様々な実施形態において、「増幅生成物」又は「増幅産物」という用語には、増幅反応の任意の数のサイクルからの生成物が含まれる。
【００２７】
本明細書で使用する場合、「ポリメラーゼ連鎖反応」又はＰＣＲは、二本鎖核酸サンプルの鎖を分離する最初の変性工程と、これに続く（ｉ）増幅プライマーが標的配列に隣接する位置へと特異的にアニールすることを可能にするアニーリング工程、（ｉｉ）プライマーを５’〜３’方向に伸長させることにより標的配列に相補的なアンプリコンポリヌクレオチドを形成する伸長工程、及び（ｉｉｉ）標的配列からのアンプリコンの分離を引き起こす変性工程の繰返しと、からなる核酸の増幅法である。上記工程は、好ましくは自動サーモサイクラーを用いて、それぞれ異なる温度にて行ってもよい。
【００２８】
本明細書で使用する場合、「等温で増幅する」又は「等温増幅」、及び同様の用語は、従来のＰＣＲ反応とは異なり、高温と低温との循環を必要とする増幅とは対照的に、一定の温度にて核酸を増幅する方法を意味する。これは、ＤＮＡポリメラーゼが、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼであることを必要とする。プライマーは置換されたＤＮＡ鎖に結合するので、等温増幅は多くの場合、実質的に単一の温度にて行われる。等温増幅においては、増幅の前に、及び、ＤＮＡポリメラーゼが変性温度において不活性化される場合には、任意選択でＤＮＡポリメラーゼの添加前に、核酸サンプル及び任意選択で全てのプライマーを含む反応混合物を、反応混合物中の二本鎖核酸が一本鎖に変性する変性温度（例えば、少なくとも８５℃〜９０℃）に加熱してもよい。
【００２９】
本明細書で使用する場合、「意図する標的」、「標的核酸領域」、「標的特異的核酸」、「標的領域」、「標的シグネチャー配列」、「標的核酸」、「標的核酸配列」、「標的」又は「標的ポリヌクレオチド配列」という用語は、対象の核酸を意味する。
【００３０】
本明細書で使用する場合、「検出する」又は「検出」は、標的ポリヌクレオチド配列又は増幅された標的ポリヌクレオチド配列生成物のサンプルにおける存在又は非存在の開示又は顕示を意味する。検出は、終点、リアルタイム、酵素によるものとすることができ、ゲル上で増幅生成物を分解して予想された増幅生成物が存在するかどうか判定することにより、又は当業者には公知の他の方法により行うことができる。
【００３１】
本明細書で使用する場合、「サンプル」という用語は、核酸を含有すると考えられる出発物質を意味する。サンプル中の核酸を検出することにより、微生物の存在を検出することが可能になる。サンプルの例としては、食品サンプル（ヒト又は動物の消費を意図した食品からのサンプル、例えば、加工食品、未加工食品材料、農産物（例えば、果樹及び野菜）、豆類、肉類（家畜動物及び／又は狩猟動物の）、魚、水産物、ナッツ類、飲料、酒類、発酵ブロス、及び／又は上記の食品のいずれかを含む選択的栄養強化食品マトリックスが挙げられるが、これらに限定されない）、水サンプル、環境サンプル（例えば、土壌サンプル、泥サンプル、ゴミサンプル、下水サンプル、産業廃水サンプル、空気サンプル、又は様々な水域、例えば湖沼、河川、池などからの水サンプル）、空気サンプル（環境又は室内若しくは建物からの）、臨床サンプル、疾患又は病状を有すると考えられるヒトから得られるサンプル、獣医学的サンプル、法医学サンプル、農業サンプル、医薬品サンプル、生物薬剤サンプル、食品の加工及び製造用の表面からのサンプル、及び／又は生物学的サンプルが挙げられるが、これらに限定されない。本開示による非食品サンプルの例は、培養ブロスであってもよい。「培養ブロス」は、本明細書において使用された場合、微生物を培養するための液体培地を意味する。
【００３２】
本明細書で使用する場合、「阻害物」は、その阻害物が存在しないときのアッセイの活性、正確さ又は精度に対して、アッセイの活性、正確さ又は精度を直接的又は間接的に低下させるように作用する、任意の化合物、物質若しくは組成物又はこれらの組合せを意味する。阻害物は、制限なく、分子、原子、又は分子若しくは原子の組合せとすることができる。
【００３３】
本開示の一態様によると、本明細書において使用された場合、「阻害物」という用語は、例えば、増幅反応に使用される酵素の阻害物を意味する。このような阻害物の例としては、タンパク質、ペプチド、脂質、炭水化物、ヘム及びその分解生成物、尿素、胆汁酸、フミン酸、多糖類、細胞膜、並びに細胞質成分が典型的には挙げられるが、これらに限定されない。ＰＣＲに対するヒトの血液中の主な阻害物は、ヘモグロビン、ラクトフェリン、及びＩｇＧであり、これらはそれぞれ赤血球、白血球、及び血漿中に存在する。阻害物の例としては更に、鉄イオン又はその塩、アルカリ金属イオン、遷移金属イオンなどの他の金属塩、及び増殖培地中に存在する指示染料が挙げられる。
【００３４】
本開示の一実施形態において、指示染料であるエスクリンが阻害物として作用し得る。エスクリンは、アエスクラス・ヒポカスタナム（セイヨウトチノキ）から得られるクマリングルコシド（６−（ベータ−Ｄ−グルコピラノシルオキシ）−７−ヒドロキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン、ＣＡＳ番号５３１−７５−９）であり、その澄んだ蛍光溶液を特徴とする。エスクリンは一般に、例えば、リステリア菌培養において、指示薬として細菌培養ブロスに添加される。ｄｅｍｉ−Ｆｒａｓｅｒ（ＤＦ）、ＵＶＭ、及びＦｒａｓｅｒブロスベース（リステリア選択集積ブロスベース）におけるエスクリン反応は、アッセイ阻害の一因である可能性が非常に高いものとして強調されている。この反応において、エスクリン
【化１】
0006650944.tif 000002
は、特定のバクテリアによって６，７ジヒドロキシクマリン（エスクレチン）とグルコースとに加水分解される。エスクレチン
【化２】
0006650944.tif 000003
は次いで、三価鉄イオンと錯体を形成して黒色の錯体となる。エスクレチンはクマリン薬物群であり、クマリンは、ＤＮＡ活性酵素の活性を改変することが公知である。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「界面活性剤」の意味は、当業者が容易に認識する最も広い定義である。即ち、界面活性剤は、液体の表面張力を低下させる、及び／又は２つの液体間の界面張力を低下させる湿潤剤である。水中で正又は負の電荷を持たない水溶性の界面活性剤は、「非イオン性界面活性剤」である。
【００３６】
本明細書で使用する場合、「非イオン性界面活性剤」は、極性基が帯電していない界面活性剤分子を意味する。２種類以上の非イオン性界面活性剤の組合せも、「非イオン性界面活性剤」という用語に包含される。ある特定の実施形態において、１種類以上の界面活性剤を使用してもよい。
【００３７】
本明細書で使用する場合、ポリビニルピロリドン（polyvinylpyrrolidone、PVP）は、Ｎ−ビニルピロリドンモノマーから製造される水溶性ポリマーである。ポリビニルポリピロリドン（Polyvinylpolypyrrolidone、PVPP）は、ＰＶＰの高度に架橋された変性物である。本明細書に記載するように、ポリビニルピロリドン、又はその変性物は、阻害物質を低減又は排除するために増幅反応混合物に含ませることが可能である。変性ＰＶＰとしては、ＰＶＰの高度に架橋された不溶性の変性物であるポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ）が挙げられるが、これに限定されない。当然ながら、ＰＶＰに関する本明細書の開示は、ＰＶＰＰにも適合可能である。
【００３８】
一実施形態において、組成物は、熱加工の用途において使用された場合に表面張力を低下させ良好な熱安定性を示すコーティング添加剤のクラスに属する非イオン性高分子フッ素系界面活性剤を含んでもよい。本開示のある特定の実施形態による非イオン性高分子フッ素系界面活性剤は、３Ｍ（商標）Ｎｏｖｅｃ（商標）フッ素系界面活性剤であるＦＣ−４４３０であってもよい。
【００３９】
本明細書で使用する場合、「エチレングリコール四酢酸」及び「ＥＧＴＡ」という用語は、キレート剤であるエチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸を意味する。ＥＧＴＡは、マグネシウムに対して低い結合性を有する無色の固体であり、カルシウムイオンに対してより選択的である。ＥＧＴＡは、生体細胞に見られるようにマグネシウムよりもカルシウムイオン濃度が低い場合に、緩衝溶液にカルシウムイオンをキレートさせるのに有用である。ＥＧＴＡは、酵素アッセイにおいても有用である。
【００４０】
本明細書で使用する場合、「細胞溶解」という用語は、細胞膜を破壊することにより細胞内の物質を放出させるプロセスを意味し、特に、増幅、例えばＰＣＲ、ＬＡＭＰ−ＢＡＲＴ法などの前に細胞内の物質を細胞から抽出してＤＮＡ又はＲＮＡを単離するプロセスを意味する。
【００４１】
本開示の一実施形態によると、細胞溶解は、熱的方法によって行ってもよい。熱的方法は、細胞サンプルの形態及び反応容器の特性に応じ、当業者が適切に選択し得る。
【００４２】
本明細書で使用する場合、「微生物（microorganism）」又は「微生物（microbe）」という用語は、任意の微細な生物を意味し、単細胞又は多細胞の生物であってもよい。この用語は一般に、１種類以上のバクテリアを限定されることなく含む、適切な培養培地で増殖及び複製することができる任意の原核性又は真核性の微細な生物を指すために使用される。本発明の範囲に包含される微生物には、原核生物、即ちバクテリア及び古細菌、並びに原虫、菌類、藻類などを含む様々な真核生物の形態が含まれる。本明細書で使用する場合、微生物の「培養」又は「増殖」という用語は、微生物の増殖を助長する条件下において、所定の培養培地で微生物を再生させることによって微生物を繁殖させる方法を意味する。より具体的には、適切な培養培地と条件を提供して微生物の少なくとも１回の細胞分裂を円滑化する方法である。培養培地は、微生物増殖に要する栄養素及び必要な物理的増殖パラメーターなどの全てを含有し、更にウイルスを含む固体、半固体又は液体の媒体であってもよい。「標的微生物」という用語は、検出することが望まれる任意の微生物を意味する。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「集積」という用語は、特定の微生物の増殖を、その特定の微生物の増殖を助長する特定の公知の特質を培地及び条件に与えることにより、選択的に促進する培養法を意味する。集積培養の環境は、選択した微生物の増殖を支援し、他の微生物の増殖を阻害する。
【００４４】
従来のＤＮＡに基づく方法の使用は、阻害物の存在によってある程度制限される。このような核酸増殖反応に対して負の効果を有する全ての物質を含むいわゆる阻害物の発生は、遺伝子検査の欠点の１つである。これらの阻害物は、サンプル自体に由来する場合もあれば、サンプルの加工又は核酸抽出の過程でも導入され得る。核酸増殖反応の部分的阻害又は全体的阻害の結果は、それぞれ感度の低下又は偽陽性の結果となる。
【００４５】
数多くの遺伝子に基づく方法が利用可能であるにもかかわらず、意図する標的の核酸増幅の阻害を効率的かつ迅速に低減又は排除するための、迅速で高感度で安価であまり労力を要しない方法は、一つも存在しない。標的サンプル中の病原体の存在を即座に判定するためには、より早く正確で時間がかからず労力の少ないアッセイ技法に対する高まる要求を満たすことができる、信頼性が高く正確なアッセイ法を開発する必要がある。
【００４６】
競合するＰＣＲ系では、使用を容易にするための課題は、プロテアーゼ工程を組み入れることである。このプロテアーゼ工程は、食品タンパク質（とりわけ、赤肉）に加えて溶解細胞を消化することによりサンプル阻害を低減するために使用される。驚くべきことに、本開示による組成物及び方法は、クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウムを使用して阻害タンパク質を中和することによって、サンプルをプロアテーゼ処理する必要性を排除することが見出された。有利なことには、本開示は、単離／精製工程を排除し、現在のアッセイ法をより速く簡単にする。
【００４７】
本開示は、プロテアーゼ処理する必要性又は別の方法でサンプルからバックグラウンドタンパク質を減少させる必要性を排除する、核酸増幅の組成物及び方法を記載する。これはまた、従来の核酸増幅法のアッセイ工程の１つを排除することにもつながる。
【００４８】
本開示は概して、細胞溶解工程と核酸増幅工程とを含み、その間に単離／精製工程、例えばクロマトグラフィ、遠心分離などを伴わない、サンプルの核酸増殖のための新規な組成物（例えば、水性組成物）及び方法に関する。
【００４９】
本開示の組成物は、典型的にはそれぞれの化学成分を含む水溶液として使用される。したがって、いずれの実施形態においても、本開示の組成物は、水を含む。あるいは、本開示の組成物は、水性液体（例えば、水又は水を含有するサンプル）と混合して本開示に従って使用される混合物を形成することができる。所定体積の水性組成物を、所定の量（例えば体積）のサンプルと混合して混合物を形成することができ、この混合物は、サンプル中に微生物が存在する場合それを溶解させるために、処理される（例えば、加熱により）。得られる溶解物の一部を、元のサンプルにおける１種類以上の標的微生物の存在を示す核酸配列を検出するための核増幅プロセスに使用することができる。
【００５０】
典型的には、サンプル（例えば、粉砕牛肉、屠体洗い流し液、プロセス水、環境（例えば、食品加工設備）スワブ又はスポンジからの残留物）を水性液体（例えば、水又は緩衝液）に懸濁させる。このように、第１の所定体積の水性サンプルを、組成物、又は本開示の組成物を含む第２の所定体積の水溶液と混合して、溶解処理が施される混合物を形成する。したがって、本開示の組成物の各構成成分は、サンプルを組成物と混合したときに生じる希釈を考慮した濃度で水性組成物中に存在する。
【００５１】
本開示によると、第１及び第２の所定体積の混合によって形成される混合物の体積に対する第１の所定体積の比は、１：１０以下である。いずれの実施形態においても、第１及び第２の所定体積の混合によって形成される混合物の体積に対する第１の所定体積の比は、約１：１０〜約１：３００である。いずれの実施形態においても、第１及び第２の所定体積の混合によって形成される混合物の体積に対する第１の所定体積の比は、約１：１０、約１：２０、約１：２５、約１：３０、約１：４０、約１：５０、約１：１００、約１：２００、約１：２５０、又は約１：３００である。
【００５２】
したがって、本開示は、有機鉄キレート試薬と三価鉄と非イオン性界面活性剤とを含み、ｐＨが約８．４５〜８．８５の組成物（例えば、水性液体組成物）を提供する。組成物は、核酸増幅法に使用して核酸増幅反応のサンプル阻害を排除することができる。任意選択で、組成物は、ポリビニルピロリドンを含むことができる。
【００５３】
いずれの実施形態においても、組成物に適するｐＨは、少なくとも８．４５である。いずれの実施形態においても、ｐＨは、８．４５〜８．８５の範囲内であってもよい。ある特定の実施形態において、８．６５〜８．７５のｐＨを使用してもよい。他の実施形態において、８．７５〜８．８５のｐＨを使用してもよい。
【００５４】
有機鉄キレート試薬は、三価鉄（Ｆｅ＋３）イオンに対して予め定義された結合定数を有する。ｐＨ８．４５及び２０℃の脱イオン水中では、有機鉄キレート試薬は、三価鉄イオンに対する結合定数が１０４．２以上である。有機鉄キレート試薬は更に、マグネシウム（Ｍｇ＋２）イオンに対して予め定義された結合定数を有する。ｐＨ８．４５及び２０℃の脱イオン水中では、有機鉄キレート試薬は、マグネシウムイオンに対する結合定数が１０３．８未満である。したがって、本開示の水性組成物において、ｐＨ８．４５では、有機鉄キレート試薬は、マグネシウムイオンに対する結合性よりも、三価鉄イオンに対する結合性が高い。
【００５５】
適する有機鉄キレート試薬は、有機分子を含む。いずれの実施形態においても、有機鉄キレート試薬は、水溶性である。いずれの実施形態においても、有機鉄キレート試薬は、複数のカルボキシレート基を含む。適する有機鉄キレート試薬の非限定的例としては、エチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス（２−ピリジルメチル）エタン−１，２−ジアミン（ＴＰＥＮ）、１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、及びこれらの塩が挙げられる。
【００５６】
いずれの実施形態においても、組成物は、三価鉄を更に含む。したがって、本開示の水性組成物は、三価鉄イオンを含んでもよい。いずれの実施形態においても、三価鉄は、クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウムによって組成物に供給することができる。
【００５７】
いずれの実施形態においても、三価鉄は、本開示による水性液体組成物中に約５５μＭ〜３８５μＭの三価鉄イオン（即ち、溶解した三価鉄）の濃度で存在することができる。三価鉄イオンの濃度は、ある特定の実施形態においては少なくとも１１０μＭであってもよく、ある特定の他の実施形態においては、少なくとも１６５μＭであってもよい。三価鉄イオンの濃度は、他の実施形態においては少なくとも２２０μＭであってもよく、他の実施形態においては、少なくとも２７５μＭ又は少なくとも３３０μＭであってもよい。本開示によると、有機鉄キレート試薬がＥＧＴＡを含む水性において、組成物は、溶解した三価鉄／ＥＧＴＡのモル比が約０．０４〜約０．２８である。ある特定の好適な実施形態において、水性組成物は、溶解した三価鉄／ＥＧＴＡのモル比が約０．１４〜約０．１８である。
【００５８】
本開示による液体（例えば、水性液体）組成物のいずれの実施形態においても、三価鉄（クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウムとして供給される）は、約５０μＭ〜３５０μＭの三価鉄イオン濃度を生じる（組成物がサンプルと混合されると）ために存在する。三価鉄イオンの濃度は、ある特定の実施形態においては少なくとも１００μＭであってもよく、ある特定の他の実施形態においては、少なくとも１５０μＭであってもよい。三価鉄イオンの濃度は、他の実施形態においては少なくとも２００μＭであってもよく、他の実施形態においては、少なくとも２５０μＭ又は少なくとも３００μＭであってもよい。本開示によると、有機鉄キレート試薬がＥＧＴＡを含む水性において、組成物は、Ｆｅ３＋／ＥＧＴＡのモル比が約０．０４〜約０．２８である。ある特定の好適な実施形態において、組成物は、Ｆｅ３＋／ＥＧＴＡのモル比が約０．１４〜約０．１８である。
【００５９】
一実施形態において、本開示の組成物は、少なくとも１種類の非イオン性界面活性剤を含む。したがって、組成物は、任意の非イオン性界面活性剤の１種類以上を含んでもよい。好ましくは、非イオン性界面活性剤は、親水親油バランスが約１１〜約１６である。親水親油バランスがこの範囲の界面活性剤は、ＰＣＲ及びＬＡＭＰ核酸増幅反応においてＤＮＡポリメラーゼの十分な活性を可能にすると共に、ＢＡＲＴレポーター技術において十分なルシフェラーゼ及びＡＴＰスルフリラーゼ活性を可能にする。適する非イオン性界面活性剤の例としては、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）及びその誘導体、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１１４、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−４０５、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１０１、ＴＲＩＴＯＮ  Ｎ−４２、ＴＲＩＴＯＮ  Ｎ−５７、ＴＲＩＴＯＮ  Ｎ−６０、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１５、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−３５、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−４５、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１０２、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１５５、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１６５、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−２０７、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−３０５、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−７０５−７０、並びにＴＲＩＴＯＮ  Ｂ−１９５６を含むが必ずしもこれらに限定されないＴＲＩＴＯＮ（商標）シリーズの洗浄剤、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン（Polyoxyethylene、POE）ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ）、ＰＯＥアルキルエーテル（例えば、Ｂｒｉｊ）、ノニルフェノール、ラウリルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ＰＯＥアルキルアミン及びＰＯＥ脂肪酸ビスフェニルエーテル、並びに、例えば３Ｍ  Ｎｏｖｅｃ（商標）工業用液体界面活性剤ＦＣ−４４３０及びＦＣ４４３２、並びにＤｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＦＳシリーズフッ素系界面活性剤などのフッ素系界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
本開示による液体（例えば、水性液体）組成物のいずれの実施形態においても、組成物中のこのような界面活性剤の濃度は、本発明の有益な効果（即ち、核酸増幅の円滑化に関して）が達成される限り、特に限定されない。いずれの実施形態においても、本開示の組成物は、界面活性剤を約０．００５％（ｗ／ｖ）〜約０．３％（ｗ／ｖ）含む。したがって、いずれの実施形態においても、本開示の組成物は、界面活性剤を最大約０．３％（ｗ／ｖ）含む。界面活性剤の濃度は、ある特定の実施形態においては少なくとも０．０１％（ｗ／ｖ）であってもよく、ある特定の他の実施形態においては少なくとも０．０２５％（ｗ／ｖ）であってもよく、別の実施形態では、０．０３２％（ｗ／ｖ）である。
【００６１】
任意選択で、本開示のいずれの実施形態においても、名目分子量が３０ＫＤａ〜１．３ＭＤａのポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を使用してもよい。本開示の一態様において、ＰＶＰは名目分子量が３６０ＫＤａである。
【００６２】
本開示の一実施形態において、ポリビニルピロリドンは、少量の界面活性剤が使用される場合、組成物に含まれてもよい。本開示による液体（例えば、水性液体）組成物の一実施形態において、組成物（サンプル添加前）は、０％ｗ／ｖ〜最大約０．０４７３％ｗ／ｖのＰＶＰを含んでもよい。非イオン性界面活性剤が組成物中に０．００５５％〜０．０１１％ｗ／ｖの濃度で存在する場合、組成物は、約０．０１１％ｗ／ｖ〜約０．０４７３％ｗ／ｖのＰＶＰを含んでもよい。上記濃度のそれぞれは、変性ＰＶＰにも適用される。
【００６３】
本開示のいずれの実施形態においても、ポリビニルピロリドンは、少量の界面活性剤が使用される場合、組成物に含まれてもよい。本開示による液体（例えば、水性液体）組成物の一実施形態において、組成物（サンプル添加後）は、０％ｗ／ｖ〜最大約０．０４３％ｗ／ｖのＰＶＰを含んでもよい。非イオン性界面活性剤が組成物中に０．００５％〜０．０１％ｗ／ｖの濃度で存在する場合、組成物は、約０．０１％ｗ／ｖ〜約０．０４３％ｗ／ｖのＰＶＰを含んでもよい。上記濃度のそれぞれは、変性ＰＶＰにも適用される。
【００６４】
本開示のある特定の実施形態において（例えば、非イオン性界面活性剤濃度が０．０１％ｗ／ｖを超える場合）、ポリビニルピロリドンは、組成物に含まれなくてもよい。
【００６５】
本開示のいずれの実施形態においても、有機鉄キレート試薬は、ＥＧＴＡを含む。いずれの実施形態においても、有機鉄キレート試薬は、組成物に塩の形態で供給することができる。ある特定の実施形態において、組成物は、例えば、ＥＧＴＡのナトリウム塩を含んでもよい。本開示の別の実施形態において、組成物は、例えばＥＧＴＡのカリウム塩を含んでもよい。
【００６６】
本開示による組成物は、Ｆｅ３＋（例えば、クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウムを介して供給される）と、エチレングリコール四酢酸（例えば、エチレングリコール四酢酸の塩（例えば、一価の陽イオン塩）を介して供給される）とを含んでもよい。したがって、組成物には、エチレングリコール四酢酸とＦｅ３＋とのモル比が存在し得る。いずれの実施形態においても、Ｆｅ３＋に対するエチレングリコール四酢酸のモル比は約０．０４〜約０．２８である。
【００６７】
本開示による液体（例えば、水性液体）組成物のいずれの実施形態においても、ＥＧＴＡは、０．５ｍＭ〜５ｍＭの濃度で存在してもよい。いずれの実施形態においても、ＥＧＴＡに対する金属イオンのモル比は少なくとも０．６である。
【００６８】
本開示の一実施形態によると、サンプルは、直接試験されてもよく、試験前に何らかの形で準備又は処理されてもよい。例えば、サンプルは、任意の汚染微生物を集積するために処理してもよく、サンプルに含有される微生物細胞／ウイルス細胞／真菌細胞を分離及び／又は溶解させるために更に処理してもよい。サンプルからの溶解させた微生物細胞は更に、汚染微生物を検出及び／又は識別するための分析用に微生物から遺伝物質を分離及び／又は抽出するために、処理又は準備してもよい。一部の実施形態は、「サンプル中の核酸」又は「サンプル由来の核酸」に関連し、サンプルに含まれる又はサンプルから得られる核酸に関連する。このような核酸は、本明細書に記載の方法により、本明細書に記載の組成物を用いて試験することができる。
【００６９】
本開示のある特定の実施形態において、サンプルは、対象の微生物を他の微生物及び他のサンプル構成成分から最初に分離するために分離を施してもよい。例えば、複雑な構成成分を有する複雑な食品サンプルを分離する方法を使用して食品から微生物を分離することができる。サンプルから分離した微生物を、分析前に集積してもよい。サンプルの分析は、１つ以上の分子法を含んでもよい。例えば、本開示の一部の例示的な実施形態によると、サンプルを汚染していると考えられる１つ以上の微生物核酸配列に特異的な適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、サンプルを核酸増幅（例えば、ＬＡＭＰ−ＢＡＲＴにより）に付してもよい。次いで、サンプルから増幅させた微生物核酸配列の検出を可能とするために、増幅生成物に特定のプローブ（又はレポータープローブ）を用いて更に試験を実施してもよい。一部の実施形態において、微生物核酸配列をサンプルから増幅させる場合には、検出した微生物を更に識別、定量、及び分析する（例えば、限定されるものではないが、微生物菌株、病原性、量などのパラメーターを判定する）ために、増幅生成物に対して更なる分析を実施してもよい。
【００７０】
本開示は概して、核酸増幅方法を提供し、この方法は、ａ）本開示によるいずれかの組成物（例えば、水性組成物）を標的サンプルと接触させて、ｐＨが約８．４５〜８．８５の水性混合物を形成することと、ｂ）工程ａ）の水性混合物を熱溶解に付すことと、ｃ）工程ｂ）に続き、水性混合物の一部を等温核酸増幅に付すことと、を含む。
【００７１】
本開示のいずれの実施形態においても、核酸増幅方法は、ａ）本開示によるいずれかの組成物（例えば、水性組成物）を標的サンプルと接触させて、ｐＨが約８．４５〜８．８５の水性混合物を形成することと、ｂ）工程ａ）の水性混合物を熱溶解に付すことと、ｃ）工程ｂ）に続き、水性混合物を等温核酸増幅に付すことと、を含み、この方法は、サンプル中に存在する干渉成分によって引き起こされる核酸増幅の阻害を排除する。
【００７２】
本開示は概して、核酸増幅方法を提供し、この方法は、ａ）本開示によるいずれかの組成物（例えば、水性組成物）をサンプルと接触させて、ｐＨが約８．４５〜８．８５の水性混合物を形成することと、ｂ）工程ａ）の水性混合物を熱溶解に付すことと、ｃ）工程ｂ）に続き、水性混合物の一部を等温核酸増幅に付すことと、を含む。
【００７３】
本開示による方法で使用される増幅方法は、等温で実施してもよい。等温技法としては、ループ介在等温増幅（loop-mediated isothermal amplification、LAMP）、鎖置換増幅（strand displacement amplification、SDA）、核酸配列ベース増幅（nucleic acid sequence-based amplification、NASBA）が挙げられるが、これらに限定されない。反応は、鎖置換反応を用い、一定の温度で進行する。増幅は、サンプル、プライマー、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ及び基質の混合物を一定の温度にてインキュベートすることにより、単一工程で完了させることができる。標的核酸配列のコピー数を増加させる工程又は反応に加え、増幅方法は、増幅させた標的核酸配列を検出するための工程又は反応を更に含んでもよい。このような検出工程又は反応は当業者には周知で有り、例えば、生物発光のリアルタイムレポーター（bioluminescent real-time reporter、BART）工程又は反応が挙げられる。
【００７４】
本開示の一実施形態において、等温増幅反応は、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ−ＢＡＲＴ）法である。ＬＡＭＰは、等温条件下において、高特異性、高効率で、かつ迅速にＤＮＡを増幅することができる。ＬＡＭＰ法は、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼと、標的ＤＮＡの合計６つの異なる配列を認識し、鎖置換活性を有する４〜６種類の特別に設計されたプライマー一組と、を必要とする。ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）では、標的遺伝子上の６〜８つの異なる領域をそれぞれ認識するように特異的に設計された４〜６種類の異なるプライマーの使用により、標的特異的増幅が達成される。このような方法は、典型的には１５〜６０分に核酸コピーを１０９〜１０１０回増幅する。加えて、増幅反応における、例えばＡＴＰスルフリラーゼ、アデノシン−５’−Ｏ−過硫酸塩、ルシフェリン及びルシフェラーゼの存在は、生物発光（即ち、ＢＡＲＴ反応）によるＬＡＭＰ介在増幅反応の検出を可能にする。
【００７５】
プライマーに加え、ＬＡＭＰ−ＢＡＲＴ技法は、トリス、硫酸塩化合物（例えばＭｇＳＯ４、ＮＨ４ＳＯ４）、及び塩化カリウムを使用して、酵素官能性を維持する。したがって、このような化合物は、ＬＡＭＰ−ＢＡＲＴ共役反応を円滑にするための促進剤として作用する。トリスは有機化合物（より正式には、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとして知られ、式（ＨＯＣＨ２）３ＣＮＨ２を有する）である。ＬＡＭＰなどの鎖置換技法は、トリスを緩衝液として使用し、それにより最良のｐＨでの反応が維持される。
【００７６】
本開示の組成物（例えば、水性組成物）は、組成物を含む水溶液のおおよその温度を監視するために、任意選択で指示染料を含むことができる。有利には、指示染料は、組成物を含む水性混合物が、組成物に接触している微生物細胞の熱溶解に適するおおよその範囲内の温度（例えば、約１００℃）に達したことを示すための、第１の視覚的指標（例えば、第１の視認可能色）を提供することができる。加えて、指示染料は、混合物の一部を取り出して核酸増幅反応へと送るのに適した温度（例えば、０℃以下）に組成物を含む水性混合物が冷却されたことを示すための、第２の視覚的指標（例えば、第２の色）を提供することができる。ある特定のｐＨ指示薬（例えば、少なくとも部分的に約８．８〜約７．２のｐＨに亘る遷移領域を有するもの）は、加熱及び冷却工程中に水性混合物のｐＨが変化した場合に容易に監視できる。
【００７７】
適する可視染料としては、例えばクレゾールレッドが挙げられ、これは、ｐＨが８．８より高いと赤紫色となり、ｐＨが７．２未満であると黄色になる。
【００７８】
本開示の実施形態のいずれかにおいて、指示染料は、クレゾールレッドであってもよい。
【００７９】
ＬＡＭＰを用い、２又は３対のプライマー、及び複製活性に加えて鎖置換活性の高いポリメラーゼを使用して、６０℃〜６５℃の一定の温度にて標的核酸配列を増幅する。ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）反応は、高度に特異的で高感度な等温核酸増幅反応である。ＬＡＭＰは、フォワードインナープライマー（ＦＩＰ）、バックワードインナープライマー（ＢＩＰ）、フォワードディスプレースメントプライマー（Ｆ３）、及びバックワードディスプレースメントプライマー（Ｂ３）と呼ばれる４つの必須プライマーのプライマー一組を採用する。これら４つの異なるプライマーは、標的遺伝子上の６つの異なる領域を識別するために使用され、それにより特異性が高度に増加する。これらのプライマーの作用の特定の性質のため、ＬＡＭＰで生成されるＤＮＡの量は、ＰＣＲベースの増幅に比べてかなり多い。更には、反応を効果的に加速させる２種類の任意のプライマーを含ませることができる。これらは、フォワードループプライマー（ＬＦ）及びバックワードループプライマー（ＬＢ）と呼ばれる。インナープライマー（ＦＩＰ及びＢＩＰ）は、標的ＤＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖の配列を含有する一方、ディスプレースメントプライマー（Ｆ３及びＢ３）及びループプライマー（ＬＦ及びＬＢ）は、それぞれ単一の標的配列を含有する。合計で、ループプライマー（ＬＦ及びＬＢ）を反応に含めると、８つの標的配列が認識される。対象の標的配列を増幅するためにＤＮＡポリメラーゼを使用する。自然界では見つからない人工ＤＮＡポリメラーゼのような多くの異なるＤＮＡポリメラーゼを使用してもよく、最も一般的なのは、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼであり、ゲオバチルス種の大断片（ＧｓｐＳＳＤ）ＤＮＡポリメラーゼはあまり使用されない。
【００８０】
ＬＡＭＰ反応は、インナープライマー（ＦＩＰ及びＢＩＰ）でプライミングされたＤＮＡ合成によって開始される。これに続き、一本鎖ＤＮＡを放出するディスプレースメントプライマー（Ｆ３又はＢ３）でプライミングされたＤＮＡ合成が行われる。この一本鎖ＤＮＡは、標的の他端にハイブリダイゼーションする第２のインナープライマーとディスプレースメントプライマーとでプライミングされたＤＮＡ合成の鋳型として機能する。これは、ステムループＤＮＡ構造を生成する。続くＬＡＭＰサイクリングでは、１つのインナープライマーが生成物上のループにハイブリダイゼーションし、置換ＤＮＡ合成を開始する。これにより、元のステムループＤＮＡと、ステムの長さが二倍の新しいステムループＤＮＡとが生みだされる。サイクリング反応は、１時間未満でおよそ１０９個の標的コピーの蓄積を続ける。１つ又は２つのループプライマー（ＬＦ及び／又はＬＢ）を含ませると、インナープライマーでハイブリダイゼーションされるループを除くステムループにハイブリダイゼーションすることで、ＬＡＭＰ反応が加速し、プライム鎖置換ＤＮＡ合成が加速する。多種多様なＬＡＭＰ増幅検出法が存在する。非特異的標的検出は、陽性ＬＡＭＰ反応ではピロリン酸マグネシウムが析出するために混濁するサンプルの視覚的識別によって、達成してもよい。陽性反応の可視性を向上させるため、様々な薬剤、例えばヒドロキシナフトールブルー又はカルセインを反応に添加してもよい。あるいは、クレゾールレッド、ＳＹＢＲグリーン、Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ又はヨウ化プロピジウムなどのＤＮＡ挿入染料を使用して蛍光検出を達成してもよく、これらは、反応試薬に添加されるか、終点分析のために反応の完了後に添加される。
【００８１】
一実施形態において、本開示は、本開示による組成物中に懸濁させたサンプルを標的核酸種に対する等温核酸増幅反応の構成成分と接触させることにより、増幅反応混合物を供給することと、等温核酸増幅反応が進行するのに十分な条件下で増幅反応混合物をインキュベートすることにより生成物を供給することと、標的核酸種の指標物質が生成物中に存在するかどうか判定することと、を含む方法を提供する。
【００８２】
別の実施形態において、本開示は、増幅反応混合物の等温反応を実施して、本開示による組成物と混合したサンプルを含む溶解物、及び標的核酸種に対する核酸増幅反応の構成成分を含む混合物である生成物を供給することと、標的核酸種の指標物質が生成物中に存在するかどうか判定することと、を含む方法を掲載する。
【００８３】
等温増幅反応の構成成分は、溶液にして供給してもよく、及び／又は乾燥（例えば、凍結乾燥）形態で供給してもよい。１種類以上の構成成分を乾燥形態で供給する場合、再懸濁又は再構成緩衝液を更に使用してもよい。あるいは、サンプルと本開示の組成物とを含む水性混合物の形成後、及び水性混合物に熱溶解手順を施した後に、水性混合物を使用して等温反応の構成成分を再構成することができる。
【００８４】
増幅反応の具体的な種類に基づき、反応混合物は、反応が進行するのに必要な緩衝材、塩、ヌクレオチド、及び他の構成成分を含有することができる。反応混合物は、反応に適する特定の温度にてインキュベートしてもよい。
【００８５】
標的核酸は、動物（例えば、ヒト）、植物、菌類（例えば、酵母）、原生動物、バクテリア、又はウイルス種に存在する核酸であってもよい。例えば、標的核酸は、対象の生物のゲノム（例えば、染色体上に）、又は染色体外核酸上に存在してもよい。一部の実施形態において、標的核酸は、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡである。特定の実施形態において、標的核酸は、対象の生物に特異的である。即ち、標的核酸は、他の生物には見られないもの、又は対象の生物に類似する生物には見られないものである。
【００８６】
本開示には、サンプル中の微生物を検出する方法が必要な様々な分野における種々の用途があり、組成物は、熱溶解工程中にサンプルが保持される懸濁媒体として使用してもよく、ＬＡＭＰ−ＢＡＲＴ核酸増幅試薬の凍結乾燥ペレットを溶解させて反応させる水性媒体として使用してもよい。
【００８７】
本開示は、ユーザーが難なく、有機鉄キレート試薬と三価鉄と非イオン性界面活性剤とＥＧＴＡ（又はその一価塩）とを含み、任意選択でポリビニルピロリドンを含み、ｐＨが約８．４〜８．８５の組成物に、サンプルを単に接触させて水性混合物を形成し、続いて、水性混合物に溶解手順（例えば、熱溶解手順）を施し、水性混合物の冷却後に微生物の検出のために水性混合物を等温核酸増幅反応に付すことを可能にする。
【００８８】
別の実施形態において、本開示は、キットを提供する。一般に、キットは、本開示による有機鉄キレート試薬と三価鉄と非イオン性界面活性剤とを含み、任意選択でポリビニルピロリドンを含む。
【００８９】
一実施形態において、キットは、有機鉄キレート試薬と三価鉄と非イオン性界面活性剤とを含む。有機鉄キレート試薬は、三価鉄に対する第１の結合定数が１０４．２以上であり、マグネシウムに対する第２の結合定数が１０３．８未満であり、第１の結合定数及び第２の結合定数は、ｐＨ８．４５及び２０°の脱イオン水中で判定される。
【００９０】
キットのいずれの実施形態においても、有機鉄キレート試薬は、複数のカルボキシレート基を含むことができる。上記実施形態のいずれかにおいて、キットは、２−ヒドロキシプロパン−１，２，３−トリカルボキシレート（クエン酸）を更に含むことができる。上記キットの実施形態のいずれかにおいて、有機鉄キレート試薬はＥＧＴＡを含むことができ、ＥＧＴＡに対する三価鉄のモル比が約０．０４〜約０．２８である。
【００９１】
別の実施形態において、キットは、フッ素系界面活性剤、指示染料、防腐剤、緩衝剤、及びＬＡＭＰ−ＢＡＲＴ反応の促進剤、並びにこれらの組合せからなる群から選択される構成成分を更に含んでもよい。キットのいずれの実施形態においても、前述の構成成分のうちのいずれか１種類以上がキット内で組成物中に存在してもよい。キットは、標的核酸の増幅のための少なくとも１種のプライマー、例えば２種類のプライマーを含んでもよい。キットは、標的核酸の増幅のための少なくとも１種類の他のプライマーを更に含んでもよく、その標的核酸は、キットにおける１種類以上の他のプライマーの標的と同じ核酸（更には、同じ核酸内の同一配列）とすることができるが、必ずしもそうでなくてもよい。一部の実施形態において、キットは、１種類以上の固有のゲノム配列を増幅するための２種類以上のプライマーを含む。
【００９２】
別の実施形態において、キットは、構成成分（即ち、組成物、その構成成分であるフッ素系界面活性剤、指示染料、防腐剤、緩衝剤、及び／又はＬＡＭＰ−ＢＡＲＴ反応の促進剤）を、単一のパッケージ又は同じキット内の２つ以上のパッケージに含む。２つ以上のパッケージがキットに含まれる場合、各パッケージは、独立して単一の構成成分を、又は多数の構成成分を任意の適切な組合せで、含有することができる。本明細書で使用する場合、単一のキットにおける２つ以上のパッケージ又は容器の組合せを、「パッケージ化された組合せ」と呼ぶ。
【００９３】
キットのいずれの実施形態においても、有機鉄キレート試薬、三価鉄、ポリビニルピロリドン、非イオン性界面活性剤、フッ素系界面活性剤、指示染料、防腐剤、緩衝剤、又は促進剤のうちのいずれか１種類以上は、水溶液に配合される。いずれの実施形態においても、水溶液のｐＨは、約８．４５〜８．８５とすることができる。
【００９４】
キット及びキット内の容器は、任意の公知の材料で製造することができる。例えば、キット自体は、プラスチック材料又は厚紙製としてもよい。構成成分を保持する容器は、例えば、プラスチック材料又はガラスであってもよい。１つのキット内の異なる容器を、異なる材料で製造してもよい。実施形態において、キットは、中に別のキットを含有することができる。
【００９５】
本開示のキットは、標的配列の増幅に有用な構成成分を１種類以上含んでもよい。実施形態において、ＬＡＭＰ−ＢＡＲＴ法を実施するために必要な試薬及び補給品の一部又は全部がキットに含まれている。試薬の非限定的例は、緩衝材（例えば、トリス、ＨＥＰＥＳなどを含有する緩衝液）、塩類、及び鋳型依存型核酸伸長酵素（例えばＴａｑポリメラーゼなどの熱安定酵素）、酵素の活性に適する緩衝液、及び酵素が必要とする追加の試薬、例えばｄＮＴＰ類、ｄＵＴＰ、及び／又はＵＤＧ酵素である。実施形態において、キットは、酵素反応を円滑にするための促進剤、例えば塩化カリウム及び硫酸アンモニウムを含む。補給品の非限定的例は、反応容器（例えば、マイクロチューブ）である。
【００９６】
キットは、高感度、高特異性、操作の容易さ、肉眼による結果判定能力といった利点を有する。
【００９７】
［例示的な実施形態］
実施形態Ａは、
有機鉄キレート試薬と、
三価鉄と、
０．００５％（質量／体積）以上の濃度の非イオン性界面活性剤と、を含む組成物であって、
組成物のｐＨは、約８．４５〜８．８５であり、
有機鉄キレート試薬は、三価鉄に対する第１の結合定数が１０４．２を超え、マグネシウムに対する第２の結合定数が１０３．８未満であり、第１の結合定数及び第２の結合定数は、ｐＨ８．４５及び２０℃の脱イオン水中で判定される、組成物である。
【００９８】
実施形態Ｂは、組成物は水を更に含み、非イオン性界面活性剤は組成物中に０．００５％（質量／体積）以上の濃度で存在する、実施形態Ａに記載の組成物である。
【００９９】
実施形態Ｃは、有機鉄キレート試薬は、複数のカルボキシレート基を含む、実施形態Ａ又はＢに記載の組成物である。
【０１００】
実施形態Ｄは、有機鉄キレート試薬は水溶性である、実施形態Ａ〜Ｃのいずれか１つに記載の組成物である。
【０１０１】
実施形態Ｅは、有機鉄キレート試薬は、ＥＧＴＡ、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス（２−ピリジルメチル）エタン−１，２−ジアミン、１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−三酢酸、及びこれらの塩からなる群から選択される、実施形態Ｄに記載の組成物である。
【０１０２】
実施形態Ｆは、有機鉄キレート試薬はＥＧＴＡを含み、ＥＧＴＡに対する三価鉄のモル比が約０．０４〜約０．２８である、実施形態Ｅに記載の組成物である。
【０１０３】
実施形態Ｇは、ＥＧＴＡは、０．５ｍＭ〜５ｍＭの濃度で存在する、実施形態Ｆに記載の組成物である。
【０１０４】
実施形態Ｈは、ＥＧＴＡは、組成物中にナトリウム又はカリウム塩として存在する、実施形態Ｆ又はＧに記載の組成物である。
【０１０５】
実施形態Ｉは、２−ヒドロキシプロパン−１，２，３−トリカルボキシレートを更に含み、有機鉄キレート試薬と２−ヒドロキシプロパン−１，２，３−トリカルボキシレートは、別々の分子である、実施形態Ａ〜Ｈのいずれか１つに記載の組成物である。
【０１０６】
実施形態Ｊは、非イオン性界面活性剤は、親水親油バランスが約１１〜約１６である、実施形態Ａ〜Ｉのいずれか１つに記載の組成物である。
【０１０７】
実施形態Ｋは、非イオン性界面活性剤は、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ノニルフェノール、ラウリルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリオキシエチレンアルキルアミン、及びポリオキシエチレン脂肪酸ビスフェニルエーテル、並びに前述の非イオン性の界面活性剤のうちのいずれか２種類以上の組合せからなる群から選択される、実施形態Ａ〜Ｊのいずれか１つに記載の組成物である。
【０１０８】
実施形態Ｌは、非イオン性界面活性剤は、最大約０．３％質量／体積の濃度で存在する、実施形態Ａ〜Ｋのいずれか１つに記載の組成物である。
【０１０９】
実施形態Ｍは、三価鉄は、水性組成物に５０μＭ〜３００μＭの濃度で溶解している、実施形態Ｂ〜Ｌのいずれか１つに記載の組成物である。
【０１１０】
実施形態Ｎは、ポリビニルピロリドンを更に含む、実施形態Ａ〜Ｍのいずれか１つに記載の組成物である。
【０１１１】
実施形態Ｏは、ポリビニルピロリドンは、最大０．０４３％ｗ／ｖの濃度で存在する、実施形態Ｎに記載の組成物である。
【０１１２】
実施形態Ｐは、フッ素系界面活性剤を更に含む、実施形態Ａ〜Ｏのいずれか１つに記載の組成物である。
【０１１３】
実施形態Ｑは、フッ素系界面活性剤はＦＣ−４４３０（商標）である、実施形態Ｐに記載の組成物である。
【０１１４】
実施形態Ｒは、指示染料を更に含む、実施形態Ａ〜Ｑのいずれか１つに記載の組成物である。
【０１１５】
実施形態Ｓは、指示染料はクレゾールレッドである、実施形態Ｒに記載の組成物である。
【０１１６】
実施形態Ｔは、防腐剤を更に含む、実施形態Ａ〜Ｓのいずれか１つに記載の組成物である。
【０１１７】
実施形態Ｕは、防腐剤はメチルイソチアゾリノンである、実施形態Ｔに記載の組成物である。
【０１１８】
実施形態Ｖは、サンプル中の微生物の検出に用いるための、実施形態Ａ〜Ｕのいずれか１つに記載の組成物である。
【０１１９】
実施形態Ｗは、サンプルは、食品サンプル、臨床サンプル、又は培養ブロスである、実施形態Ａ〜Ｖのいずれか１つに記載の組成物である。
【０１２０】
実施形態Ｘは、食品サンプルはタンパク質を含む、実施形態Ｗに記載の組成物である。
【０１２１】
実施形態Ｙは、タンパク質はフェリチンである、実施形態Ｘに記載の組成物である。
【０１２２】
実施形態Ｚは、サンプルは培養ブロスを含む、実施形態Ａ〜Ｙのいずれか１つに記載の組成物である。
【０１２３】
実施形態ＡＡは、サンプルはエスクリンを含む、実施形態Ｚに記載の組成物である。
【０１２４】
実施形態ＡＢは、
ａ）実施形態Ｂ〜ＡＡのいずれか１つに記載の組成物を標的サンプルと接触させて、水性混合物を形成することと、
ｂ）工程ａ）の水性混合物を熱溶解プロセスに付すことと、
ｃ）工程ｂ）の後に、水性混合物を等温核酸増幅プロセスに付すことと、を含む、等温核酸増幅方法である。
【０１２５】
実施形態ＡＣは、サンプル中に存在する干渉成分によって引き起こされる核酸増幅の阻害を排除するためのものである、実施形態ＡＢに記載の方法である。
【０１２６】
実施形態ＡＤは、等温核酸増幅方法はループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）法である、実施形態ＡＢ又はＡＣに記載の方法である。
【０１２７】
実施形態ＡＥは、サンプルは、食品サンプル、臨床サンプル、又は培養ブロスである、実施形態ＡＢ〜ＡＤのいずれか１つに記載の方法である。
【０１２８】
実施形態ＡＦは、食品サンプルはタンパク質を含む、実施形態ＡＥに記載の方法である。
【０１２９】
実施形態ＡＧは、タンパク質はフェリチンである、実施形態ＡＦに記載の方法である。
【０１３０】
実施形態ＡＨは、サンプルは培養ブロスである、実施形態ＡＢ〜ＡＧのいずれか１つに記載の方法である。
【０１３１】
実施形態ＡＩは、サンプルはエスクリンを含む、実施形態ＡＨに記載の方法である。
【０１３２】
実施形態ＡＪは、サンプルは、工程ａ）の前に培養ブロス中で約４１．５℃にてインキュベートされる、実施形態ＡＢ〜ＡＩのいずれか１つに記載の方法である。
【０１３３】
実施形態ＡＫは、組成物は、緩衝剤と、ＬＡＭＰ−ＢＡＲＴ反応を円滑にするための促進剤とを更に含む、実施形態ＡＢ〜ＡＪのいずれか１つに記載の方法である。
【０１３４】
実施形態ＡＬは、促進剤は、塩化カリウム、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム七水和物、及びこれらの組合せからなる群から選択される、実施形態ＡＫに記載の方法である。
【０１３５】
実施形態ＡＭは、緩衝剤はトリス塩基を含む、実施形態ＡＫ又はＡＬに記載の方法である。
【０１３６】
実施形態ＡＮは、水性混合物を熱溶解プロセスに付すことは、水性混合物を約１００℃に約１５分間加熱することと、その後に混合物を約４０℃に約５分間冷却することと、を含む、実施形態ＡＢ〜ＡＭのいずれか１つに記載の方法である。
【０１３７】
実施形態ＡＯは、混合物を約４０℃に冷却した後、混合物をＬＡＭＰ−ＢＡＲＴ等温増幅のための試薬と接触させることを更に含む、実施形態ＡＮに記載の方法である。
【０１３８】
実施形態ＡＰは、
三価鉄と、
有機鉄キレート試薬と、
非イオン性界面活性剤と、を含むキットであって、
有機鉄キレート試薬は、三価鉄に対する第１の結合定数が１０４．２以上であり、マグネシウムに対する第２の結合定数が１０３．８未満であり、第１の結合定数及び第２の結合定数は、ｐＨ８．４５及び２０℃の脱イオン水中で判定される、キットである。
【０１３９】
実施形態ＡＱは、有機鉄キレート試薬は、複数のカルボキシレート基を含む、実施形態ＡＰに記載のキットである。
【０１４０】
実施形態ＡＲは、有機鉄キレート試薬は、エチレングリコール四酢酸、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス（２−ピリジルメチル）エタン−１，２−ジアミン、１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−三酢酸、及びこれらの塩からなる群から選択される、実施形態ＡＰに記載のキットである。
【０１４１】
実施形態ＡＳは、ポリビニルピロリドンを更に含む、実施形態ＡＰ〜ＡＲのいずれか１つに記載のキットである。
【０１４２】
実施形態ＡＴは、非イオン性界面活性剤は、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ノニルフェノール、ラウリルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリオキシエチレンアルキルアミン、ポリオキシエチレン脂肪酸ビスフェニルエーテル、及び前述の非イオン性の界面活性剤のうちのいずれか２種類以上の組合せからなる群から選択される、実施形態ＡＰ〜ＡＳのいずれか１つに記載のキットである。
【０１４３】
実施形態ＡＵは、有機鉄キレート試薬は、ＥＧＴＡ、ＢＡＰＴＡ、ＨＥＤＴＡ、ＴＰＥＮ、又は前述の有機鉄キレート試薬のいずれかの一価のカチオン性塩を含む、実施形態ＡＰ〜ＡＴのいずれか１つに記載のキットである。
【０１４４】
実施形態ＡＶは、一価のカチオン性塩は、ナトリウム塩及びカリウム塩から選択される、実施形態ＡＵに記載のキットである。
【０１４５】
実施形態ＡＷは、フッ素系界面活性剤を更に含む、実施形態ＡＰ〜ＡＶのいずれか１つに記載のキットである。
【０１４６】
実施形態ＡＸは、フッ素系界面活性剤はＦＣ−４４３０（商標）である、実施形態ＡＷに記載のキットである。
【０１４７】
実施形態ＡＹは、指示染料を更に含む、実施形態ＡＰ〜ＡＸのいずれか１つに記載のキットである。
【０１４８】
実施形態ＡＺは、指示染料はクレゾールレッドである、実施形態ＡＹに記載のキットである。
【０１４９】
実施形態ＢＡは、防腐剤を更に含む、実施形態ＡＰ〜ＡＺのいずれか１つに記載のキットである。
【０１５０】
実施形態ＢＢは、防腐剤はメチルイソチアゾリノンである、実施形態ＢＡに記載のキットである。
【０１５１】
実施形態ＢＣは、緩衝剤を更に含む、実施形態ＡＰ〜ＢＢのいずれか１つに記載のキットである。
【０１５２】
実施形態ＢＤは、緩衝剤と、ＬＡＭＰ−ＢＡＲＴ反応を円滑にするための促進剤とを更に含む、実施形態ＡＰ〜ＢＣのいずれか１つに記載のキットである。
【０１５３】
実施形態ＢＥは、促進剤は、塩化カリウム、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム七水和物、及びこれらの組合せからなる群から選択される、実施形態ＢＤに記載のキットである。
【０１５４】
実施形態ＢＦは、緩衝剤はトリス塩基を含む、実施形態ＢＥに記載のキットである。
【０１５５】
実施形態ＢＧは、有機鉄キレート試薬、三価鉄、ポリビニルピロリドン、及び非イオン性界面活性剤のうちの少なくとも１種類は、水性媒体に配合される、実施形態ＡＰ〜ＢＦのいずれか１つに記載のキットである。
【０１５６】
実施形態ＢＨは、水性媒体のｐＨは、約８．４５〜８．８５である、実施形態ＢＧに記載のキットである。
【０１５７】
実施形態ＢＩは、使用説明書を含む、実施形態ＡＰ〜ＢＨのいずれか１つに記載のキットである。
【実施例】
【０１５８】
本発明の目的及び利点は、以下の実施例によって更に例示されるが、これらの実施例において列挙された特定の材料及びその量は、他の諸条件及び詳細と同様に、本発明を過度に制限するものと解釈すべきではない。特に指示がない限り、部及び割合は全て重量基準であり、水は全て蒸留水であり、分子量は全て重量平均分子量である。
【０１５９】
実施例１−三価鉄と有機鉄キレート試薬とを含む組成物の、タンパク質を含有するサンプルとのＬＡＭＰ−ＢＡＲＴ反応に対する効果
【０１６０】
サンプル：生肉
【０１６１】
８０％赤身の粉砕牛肉サンプル２５ｇをＮａｓｃｏ  Ｗｈｉｒｌ−ｐａｋ（登録商標）フィルタバッグ中の室温のｄｅｍｉ−Ｆｒａｓｅｒ（３Ｍ）２２５ｍＬに添加し、混合物を２分間消化させた。消化した混合物が入ったバッグを３７℃のインキュベータに入れ、集積のために２４時間インキュベートした。集積したサンプルのアリコート２０μＬを、クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウムをそれぞれ１５０、１００、５０又は０μＭ含有する溶解溶液の４つの異なる調合物５８０μＬに、再現回数３回で、添加した。４つの溶解溶液はそれぞれ、クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウムに加えて、以下の表１に記載する試薬を含有していた。
【０１６２】
【表１】
0006650944.tif 000004
【０１６３】
溶解溶液のチューブを１００℃の３Ｍヒートブロック上で１５分間加熱し、約４０℃に冷却し、アリコート２０μＬを汎用マトリックス制御ＬＭＡＰ−ＢＡＲＴペレット（部品番号ＭＤＭＣ９６ＮＡ、３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ．Ｐａｕｌ、ＭＮが販売）に添加した。ペレットをＭＤＳ装置（部品番号ＭＤＳ１００、３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ．Ｐａｕｌ、ＭＮが販売）に入れ、生物発光（即ち、ＢＡＲＴ反応）を７５分間記録した。
【０１６４】
図１は、Ｆｅ＋３濃度を増加させると反応時間が短くなる用量依存反応における阻害の緩和を実証している。図１は、異なる濃度のＦｅ＋３がＢＡＲＴ発光に及ぼす効果を図示している。光強度は、核酸増幅に正比例する相対光単位（Relative Light Units、RLU）を単位として測定される。図１は、１５０μＭの濃度のＦｅ＋３が最も高いＲＬＵピークをもたらし、１００μＭ及び５０μＭの濃度のＦｅ＋３はそれよりも低いピークをもたらし、Ｆｅ＋３の非存在下（０μＭ）では、ＲＬＵは最小となることを示している。また、反応時間はＦｅ＋３濃度が高いほど短く、Ｆｅ＋３の非存在下（０μＭ）で最も長かった。
【０１６５】
これは、本開示の組成物が、生肉サンプル中に存在するタンパク質によって引き起こされる核酸増幅阻害を低減／排除するという事実を示すものである。
【０１６６】
実施例２−エスクリン又はエスクレチンを含有するサンプルのＬＡＭＰ−ＢＡＲＴ反応における、三価鉄と有機鉄キレート試薬とを含む組成物の効果。
【０１６７】
リステリア種（ＬＭ７２４４）をｄｅｍｉ−Ｆｒａｓｅｒ（３Ｍ）中で一晩培養したものを、４種類の異なる媒体で以下のように連続して（１０−６まで）希釈した。
１．Ｄｅｍｉ−Ｆｒａｓｅｒ（ＤＦ）−ＦＡＣなし
２．Ｄｅｍｉ−Ｆｒａｓｅｒ＋ＦＡＣ（１００μＬ／１０ｍＬ）
３．Ｄｅｍｉ−Ｆｒａｓｅｒ＋６，７ジヒドロキシクマリン［エスクレチン］（０．５２ｇ／Ｌ）
４．Ｄｅｍｉ−Ｆｒａｓｅｒ＋６，７ジヒドロキシクマリン［エスクレチン］（０．５２ｇ／Ｌ）＋ＦＡＣ（１００μＬ／１０ｍＬ）
【０１６８】
次いで、上記媒体のそれぞれを３７℃にて６時間インキュベートした。各サンプルの２０μＬを上記表−１に記載する溶解調合物５８０μＬに添加し、ヒートブロック上で１５分間煮沸し、アリコート２０μＬを３Ｍ（商標）分子検出システム（Molecular Detection System、MDS）の１．０Ｌモノサイトゲネスペレット（部品番号ＭＤＡＬＭ９６ＮＡ、３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ．Ｐａｕｌ、ＭＮが販売）に添加した。
【０１６９】
図２は、上記のように試験を行った４種類の媒体に関し、ＬＡＭＰ−ＢＡＲＴ反応における「ピーク到達時間」（ＴＴＰ）をプロットした図である。「ＴＴＰ」は、３Ｍ分子検出システムを用いて陽性結果となるまでの時間の長さ（分）を意味する。「クマリン」という語は、図２おいて使用する場合、エスクリンの酵素加水分解の生成物である６，７−ジヒドロキシクマリンを意味する。
【０１７０】
これは、本開示の組成物が、エスクリン又はその分解生成物によって引き起こされる核酸増幅阻害を低減／排除するという事実を示すものである。
【０１７１】
実施例３：ＬＡＭＰ−ＢＡＲＴ反応における三価鉄と有機鉄キレート試薬とを含む組成物に対する界面活性剤の効果。
【０１７２】
Ｂｏｌｔｏｎ  Ｂｒｏｔｈに入れた鶏肉の様々な部位及び小片のサンプル２５ｇを５％のウマ溶血血液と共に、４１．５℃にて２４時間インキュベートした。
１）ブロス培養物のアリコート２０μＬを、再現回数３回で、溶解溶液５８０μＬを含有する別々のチューブに添加した。
２）チューブを１５分間ヒートブロックに入れた。
３）その後、チューブラックを室温冷却ブロック上に５分間置いた。
４）最後に、溶解物２０μＬを使用してＭＤＳマトリックス制御ペレットを再構成し、等温増幅反応を実施した。
【０１７３】
溶解溶液は、ＴＲＩＴＯＮ−Ｘ−１００の量を変え、硫酸マグネシウム七水和物（７３．８ｍｇ／Ｌ）を更に存在させたことを除いて、表１に記載するものと同じとした。界面活性剤とＦＡＣを、表２に記載の濃度に従って変化させた。
【０１７４】
【表２】
0006650944.tif 000005
【０１７５】
図３は、表２に記載したデータのボックスプロットであり、界面活性剤レベルを所与の界面活性剤（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００、ＣＭＣ＝１９０ｐｐｍ）の臨界ミセル濃度（Critical Micelle Concentration、CMC）未満に制御すると、三価鉄イオンの抗阻害効果が増大し、性能の向上（即ち、陽性結果までの時間の短縮）をもたらすことを示している。理論に拘束されるものではないが、効果が、生肉サンプルからのタンパク質可溶化の減少によるものである可能性について、調査した。有効界面活性剤濃度の下限は約２０ｐｐｍである。界面活性剤濃度が２０ｐｐｍ未満では、等温増幅反応は、おそらくはチューブ壁に付着していた増幅／検出アッセイ酵素のために阻害された。溶解緩衝液中のクエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウムに加え、界面活性剤レベルを界面活性剤のＣＭＣより低く保つと、有益な効果が得られる。
【０１７６】
本開示は一般に、研究及び診断の両方の使用に適する。即ち、本開示の組成物、方法及びキットは、様々な核酸又は発現遺伝子を識別する目的に、又は他の研究目的に使用し得る。同様に、組成物、方法及びキットは、ヒト及び動物の多くの疾患又は障害を診断するために使用することができる。加えて、これらは、疾患若しくは別の何らかの形で汚染された食品製品（例えば、１種類以上の病原生物／微生物で汚染された食品）、又はサンプル中の毒性のある物質又は毒素産生生物の存在を識別するために使用することができる。したがって、組成物及び方法は、ヒトの健康及び獣医学に関する用途に加え、食品試験及び国土安全保障の用途も有する。
【０１７７】
本明細書において引用した全ての特許、特許出願及び公報並びに電子的に入手可能な資料の全開示が、参照によって組み込まれる。本出願の開示と、参照によって本明細書に組み込まれている任意の文書の開示との間に矛盾が存在する場合には、本出願の開示が優先するものとする。前述の詳細な説明及び実施例は、理解しやすいように示したものにすぎない。それによって不要な限定がなされるものではない。本発明は図示及び記載された細部そのものに限定されず、当業者に明白な変形形態は、特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内に含まれる。
【０１７８】
見出しは全て読者の便宜のためのものであり、明記しない限り、見出しに続く文の意味を限定するために使用されるものではない。
【０１７９】
本明細書に例示的に記載する本発明は、本明細書に具体的に開示しない何らかの要素がなくても好適に実行することができる。したがって、例えば、本明細書ではいずれの場合も、「備える、含む（comprising）」、「から本質的になる（consistingessentially of）」、及び「からなる（consisting of）」という用語のいずれかを、他の２つの用語のいずれかに置き換えることができる。用いた用語及び表現は、限定ではなく説明の用語として使用したものであり、そのような用語及び表現を使用する際、図示及び記載する特徴又はその一部分の何らかの均等物を除外する意図はなく、特許請求される本発明の範囲内で様々な修正形態が可能であることが理解される。したがって、当然ながら、好ましい実施形態及び任意選択の特徴によって、本発明について具体的に開示したが、本明細書に開示する概念の修正形態及び変形形態を、当業者であれば用いることができ、そのような修正形態及び変形形態は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内であると見なされる。
【図１】
0006650944.tif 000006
【図２】
0006650944.tif 000007
【図３】
0006650944.tif 000008