(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Patched受容体薬物排出活性をインビトロ又はエクスビボで低下させる又は阻害するための、パニセイン化合物の使用であって、
パニセイン化合物が、式（Ｉ）：
【化１】
0006657209.tif 000019
［式中、
−  Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アミノアルキル、Ｃ１−Ｃ６ヒドロキシアルキル、Ｃ１−Ｃ６ハロゲノアルキル又は−ＯＲ４であり、
−  Ｒ２は、Ｈ又はＣ１−Ｃ６アルキルであり、
−  Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、−ＣＨ２ＯＲ４、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ４、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ４、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ４又は−ＣＨ２ＮＨＲ４であり、
−  各Ｒ４は、独立して、−Ｈ又はＣ１−Ｃ６アルキルであり、
−  Ｒは、
【化２】
0006657209.tif 000020
［式中、
−  結合（１）及び（２）は、互いに独立して、単結合又は二重結合であり、かつ、結合（１）及び（２）は、同時に二重結合ではなく、
−  Ｒ５は、結合（１）が単結合である場合に存在し、存在する場合、Ｒ５は、−Ｈ又は−ＯＲ６を表し、そして
−  存在する場合、各Ｒ６は、独立して、Ｈ又はＣ１−Ｃ６アルキルである］
である］
で示される化合物又はその薬学的に許容し得る塩である、使用。
【請求項２】
Ｒが、
【化３】
0006657209.tif 000021
［存在する場合、各Ｒ６及びＲ５は、独立して、請求項１で定義されたとおりであり、好ましくは、Ｒ６は、Ｈであり、そしてＲ５は、Ｈ又はＯＨである］
からなる群より選択される、請求項１記載の使用。
【請求項３】
式（Ｉ）の化合物が、以下の特徴：
ｉ．   Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル又は−ＯＲ４であり、及び／又は
ii．   Ｒ２は、Ｈ又はＣ１−Ｃ６アルキルであり、及び／又は
iii．  Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、−ＣＨ２ＯＲ４又は−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ４であり、及び／又は
iv．   各Ｒ４は、独立して、−Ｈ又はＣ１−Ｃ６アルキル、好ましくは、Ｃ１−Ｃ３アルキルである、
の１つ又はいくつかを含む、請求項１又は２記載の使用。
【請求項４】
式（Ｉ）の化合物が、パニセインＣ、パニセインＢ３及びパニセインＡヒドロキノンより選択される、請求項１〜３のいずれか一項記載の使用。
【請求項５】
前記薬物が化学療法薬である、請求項１〜４のいずれか一項記載の使用。
【請求項６】
少なくとも１つの化学療法薬と組み合わせて使用するための、請求項１〜４のいずれか一項に定義されるパニセイン化合物を含む、医薬組成物であって、対象におけるガンの処置に使用するための、ガン転移の予防に使用するための、及び／又はガン再発の予防に使用するための医薬組成物であって、当該ガン細胞がPatched受容体を発現する、医薬組成物。
【請求項７】
ガンが、メラノーマ、乳ガン、甲状腺ガン、前立腺ガン、結腸ガン、直腸ガン、食道ガン、胃ガン、卵巣ガン、肺ガン、膵臓ガン、神経膠腫、副腎皮質癌腫、小児固形悪性腫瘍、白血病、多発性骨髄腫及び肉腫からなる群より選択される、請求項６記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記少なくとも1つの化学療法薬が、シスプラチン、ドキソルビシン、メトトレキサート、テモゾロマイド、５−ＦＵ、ダカルバジン、ドセタキセル及びベムラフェニブからなる群より選択される、請求項６又は７記載の医薬組成物。
【請求項９】
対象が哺乳動物、好ましくはヒトである、請求項６〜８のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項１０】
対象がガンに罹患し、かつ化学療法に対して耐性のヒトである、請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
同時に、別々に又は逐次的に使用されるべき、請求項１〜４のいずれか一項に定義される少なくとも１つのパニセイン化合物及び少なくとも１つの化学療法薬を含む、組成物であって、対象におけるガンの処置に使用するための、ガン転移の予防に使用するための、及び／又はガン再発の予防に使用するための組成物であって、当該ガン細胞がPatched受容体を発現する、組成物。
【請求項１２】
別個の容器に入った、請求項１〜４のいずれか一項に定義される少なくとも１つのパニセイン化合物及び少なくとも１つの化学療法薬を含む、キットであって、対象におけるガンの処置に使用するための、ガン転移の予防に使用するための、及び／又はガン再発の予防に使用するためのキットであって、当該ガン細胞がPatched受容体を発現する、キット。
【請求項１３】
請求項１１記載の組成物を調製するための、請求項１２記載のキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、概して、医薬及びガン処置の分野に関する。
【０００２】
本発明は、より具体的には、Patched受容体薬物排出活性、特に化学療法薬排出活性及び化学療法耐性をインビトロ又はエクスビボで低下させる又は阻害するための、パニセイン（panicein）又はその誘導体若しくは類似体の使用に関する。
【０００３】
本開示は、特に、それを必要とする対象においてガン治療を可能にする又はガン処置の効率を向上させるための、医薬組成物の調製用のそのような化合物の使用に更に関する。実際、本発明の化合物は、対象においてガンを処置するために、ガン転移を予防するために、及び／又はガン再発を予防するために、少なくとも１つの化学療法薬と組み合わせて有利に使用され得る。
【０００４】
本発明はまた、対象において、ガン、ガン転移及び／又はガン再発を予防又は処置するための方法を開示する。本発明は更に、本発明による組成物を調製するために及び／又は本明細書に記載の方法を実施するために適したキットを提供する。
【背景技術】
【０００５】
世界中で毎年８００万人がガンで死亡している。ガンは、米国及びヨーロッパにおいて死因第２位である。多くの固形腫瘍では、手術及び第一選択化学療法による癌腫の縮小にもかかわらず、患者の死を引き起こす薬物に対する耐性が発生する。化学療法剤に対する耐性に関するこの現象は、現実の公衆衛生上の問題である。
【０００６】
ヘッジホッグ（Ｈｈ）シグナル伝達経路は、細胞分化及び増殖を制御する。それは、胚発生の間、そして成人期において、幹細胞恒常性及び組織再生における重要な役割を果たす。しかし、Ｈｈシグナル伝達は、ガンの発生、進行及び転移にも関与している。実際に、Ｈｈシグナル伝達の異常な活性化は、多くの高悪性度のガン、例えば、乳ガン、肺ガン、結腸直腸ガン、卵巣ガン、膵臓ガン、メラノーマ又は多発性骨髄腫において（Varjosalo and Taipale 2008; Scales and de Sauvage, 2009）、特に、化学療法剤に対して耐性を示す細胞（例えばガン幹細胞又は腫瘍始原細胞）において同定されている。近年、Yueら（2014）は、Ｈｈシグナル伝達が、肺扁平上皮癌腫（ＳＣＣ）の再発、転移及び化学療法に対する耐性に関与することを示した。いくつかの研究は、Ｈｈシグナル伝達受容体Smoothened（Ｓｍｏ）をアンタゴナイズすることが、腫瘍形成及び腫瘍進行を妨げる方法を提供し得ることを示している。Ｈｈ経路において最も一般的に使用されるアンタゴニストは、植物アルカロイドシクロパミンである（Taipale et al. 2000）。Genentechは、Ｈｈ経路に関して長い間続いている研究プロジェクトを有しており、基底細胞癌腫処置のための新薬を同定した。ビスモデギブは、Ｓｍｏを標的とすることによってＨｈシグナル伝達を選択的に阻害するように設計された、ファースト・イン・クラスの治験中の経口医薬である（Garber, 2008 Scales and de Sauvage, 2009）。いくつかのガンの増殖のためにはソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）のようなＨｈモルフォゲンの自己分泌発現が必要であること（Dahmane et al., 1997; Karhadkar et al., 2004）、及び間質細胞由来Ｓｈｈはまた、腫瘍中のＨｈ経路を活性化できること（Becher et al., 2008）が報告されている。１つのＳｈｈ特異的モノクローナル抗体（５Ｅ１）は、小細胞肺癌腫を含むいくつかの腫瘍の増殖を阻止することが示されている（Watkins et al., 2003）。Ｈｈ経路のアンタゴニストは、過剰活動性Ｈｈ経路自体を有する腫瘍を標的とすることに加えて、Ｈｈリガンドを用いる腫瘍を成長させて血管新生を誘導すること（Pola et al., 2001; Nagase et al., 2008）又は腫瘍増殖を支持する他のタイプの間質細胞を動員することに影響を及ぼし得る。成人はＨｈ経路の阻害に耐えることができるため（Berman et al., 2002; Kimura et al., 2008）、Ｈｈシグナル伝達を特異的に遮断することは、異常なＨｈ経路活性化に起因する様々なガンのための有効な処置を提供する。しかし、Ｈｈ経路の一過性阻害が有する骨成長への重大な影響のために、髄芽腫のような小児腫瘍の全身処置は実現可能ではない（Kimura et al., 2008）。
【０００７】
２つの異なる遺伝子（Patched 1及びPatched 2）は、Ｈｈモルフォゲン受容体であるショウジョウバエ（Drosophila）Patchedの相同体をコードする。Patched 2を欠損したマウスは生存可能であるが、脱毛症及び表皮形成不全を発症し、かつPatched 1における１つの変異誘発遺伝子の存在下で腫瘍発生率を増加させる。次にPatched 1の損失は、Ｈｈ経路の完全な活性化をもたらし、このことはPatched 1がショウジョウバエPatchedの機能的オルソログであることを示唆している（Varjosalo and Taipale, 2008）。Patched 1（Patchedという）は、その発現がＨｈ経路の活性化により誘導され、多くのガン：肺、乳房、皮膚の基底細胞、前立腺、結腸、脳（Scales and de Sauvage, 2009; Blotta et al., 2012; Jeng et al., 2014）及び骨髄性白血病（Zhao et al., 2009; Queiroz et al., 2010）において過剰発現される。最近の研究は、Patchedが胃ガン及び甲状腺ガンの早期マーカーであることを示唆している（Saze Z et al., 2012; Xu X et al., 2012）。既に記載されているように、いくつかのガンでは、モルフォゲンＨｈは、ガン細胞自身によって過剰産生され、その受容体であるPatchedと相互作用することによってＨｈシグナル伝達を活性化する。２００７年にNakamura及び共同研究者らは、Ｈｈとの相互作用に関与するPatchedの細胞外ドメインの１つに対する抗体の使用が膵臓ガン細胞の増殖を阻害することを示した。２０１２年に、彼らは、Patchedとの相互作用に関与するＨｈ由来の３つのペプチドが、２つの膵臓ガン細胞株の増殖を抑制し、インビトロ及びインビボの両方で転写因子Ｇｌｉ１の発現を減少させ得ることを示した（Nakamura et al., 2012）。
【０００８】
発明者らは、Ｈｈ受容体Patchedが薬剤排出活性を有し、かつ化学療法剤に対するガン細胞の耐性に寄与し得ることを発見した（Bidet et al., 2012; 特許文献１）。実際、彼らは、酵母中で発現させたヒトPatchedタンパク質が、多くの転移性ガンを処置するために使用される様々な化学療法剤（ドキソルビシン、メトトレキサート、テモゾロミド、５−ＦＵ）に対する耐性を付与し、かつドキソルビシンを排出させることを示した。この酵母モデルは、線維芽細胞（Ｈｈ経路の研究のためによく使用される）並びにメラノーマ及び白血病細胞株のようなPatchedを過剰発現するヒトガン細胞株にまで拡張されている。これらの細胞は、Patched内部移行及び分解を誘導するPatchedリガンドＨｈの存在下でより少ないドキソルビシンを放出（排出）する。これらの様々な細胞株を用いて実施した生存率試験は、Ｈｈの存在がドキソルビシンの細胞毒性を増加させることを示した。これらの結果は、Ｈｈ受容体Patchedがガン細胞の化学療法剤に対する耐性現象に関与する可能性があり、Patchedを抗ガン治療の新しい標的として提案することが可能であることを示唆している（特許文献１）（図１）。
【０００９】
現在、利用可能なPatchedのアンタゴニストはない。したがって、Patched受容体の薬剤排出活性を阻害することができ、ガン治療に使用し得る化合物が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２０１２／０８０６３０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
発明者らは、ここで、ガン細胞からの薬剤排出、特に化学療法剤排出を防止するための活性分子を提供する。これらの分子は、Patched薬剤排出活性を阻害することによって、医師がガン細胞の増殖を防止又は制御する（好ましくは、低下させる）ことを可能にする。これらは、有利には、Patchedを発現する任意のガンに対する化学療法処置の有効性を増加させることを可能にする。発明者らは、本明細書において、これらの分子が、更に転移及び／又はガン再発のリスク低下を可能にすることを示す。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
したがって、本発明は、Patched受容体薬剤排出活性をインビトロ又はエクスビボで低下させる又は阻害するための、パニセイン化合物又はその誘導体若しくは類似体の使用に関する。
【００１３】
特定の実施態様において、パニセイン化合物は、式（Ｉ）：
【化１】
0006657209.tif 000002
［式中、
−  Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アミノアルキル、Ｃ１−Ｃ６ヒドロキシアルキル、Ｃ１−Ｃ６ハロゲノアルキル又は−ＯＲ４を表し、
−  Ｒ２は、Ｈ又はＣ１−Ｃ６アルキルであり、
−  Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、−ＣＨ２ＯＲ４、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ４、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ４、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ４又は−ＣＨ２ＮＨＲ４を表し、
−  各Ｒ４は、独立して、−Ｈ又はＣ１−Ｃ６アルキルであり、
−  Ｒは、下記：
【化２】
0006657209.tif 000003
［式中、
−  結合（１）及び（２）は、互いに独立して、単結合又は二重結合であり、好ましくは、結合（１）及び（２）は、同時に二重結合ではなく、
−  Ｒ５は、結合（１）が単結合である場合に存在する。存在する場合、Ｒ５は、−Ｈ又は−ＯＲ６を表し、そして
−  存在する場合、各Ｒ６は、独立して、Ｈ又はＣ１−Ｃ６アルキルである］からなる群より選択される］で示される化合物又はその薬学的に許容し得る塩である。
【００１４】
特に好ましい実施態様において、式（Ｉ）の化合物は、パニセインＣ、パニセインＢ３、パニセインＢ２及びパニセインＡヒドロキノンより選択される。
【００１５】
また本明細書において、対象におけるガンの処置に使用するための、ガン転移の予防に使用するための、及び／又はガン再発の予防に使用するための、少なくとも１つの化学療法薬と組み合わせて使用するためのパニセイン化合物が記載されている。
【００１６】
本発明の別の目的は、典型的には、対象におけるガンの処置に使用するための、ガン転移の予防に使用するための、及び／又はガン再発の予防に使用するための、同時に、別々に又は逐次的に使用される、少なくとも１つのパニセイン化合物及び好ましくは少なくとも１つの化学療法薬を含む組成物である。
【００１７】
また本明細書において、別個の容器に入った少なくとも１つのパニセイン化合物及び少なくとも１つの化学療法薬を含むキット、並びに典型的には本発明による組成物を調製するための該キットの使用も記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】Patched：ガン処置のための新しい処置標的  Patchedの化学療法剤排出活性の模式図。Dｘｒ：ドキソルビシン、ＣＳＣ：ガン幹細胞
【図２−１】ムラサキカイメンムコサ抽出物は、ドキソルビシンに対するヒトPatched発現酵母の耐性を阻害する Ａ．ムラサキカイメンムコサ海綿体。Ｂ．ムラサキカイメンムコサメタノール画分は、ドキソルビシンに対するPatched発現酵母の耐性を阻害する物質を含有する。ｈＰｔｃを発現する酵母の出芽酵母（S.cerevisiae）を、ＤＭＳＯに溶解したムラサキカイメンムコサ粗抽出物のメタノール画分１０μｇ/mLの存在下、及び１０μMのドキソルビシン（ｄｘｒ）の存在下又は非存在下で、９６ウェルプレート中で増殖させた。酵母の増殖を６００nmでの吸光度で測定し、示された結果は３回の独立した実験の平均である。Ｃ．ムラサキカイメンムコサメタノール画分の精製プロファイル。分取フェニル−ヘキシルＨＰＬＣカラムを、下記条件で使用した：勾配を（４７ Ｈ２Ｏ：５３ ＡＣＮ：０．１ ＴＦＡ）で開始し（０ Ｈ２Ｏ：１００ ＡＣＮ：０．１ ＴＦＡ）とする、流速：１０．０mL/分、注入量：１００mg/mLで７５μL。
【図２−２】Ｄ．ムラサキカイメンムコサメタノール画分から精製した５つの化合物は、ｈＰｔｃ−発現酵母のｄｘｒに対する耐性を強力に阻害する。ＤＭＳＯに溶解した精製化合物（１０μｇ/mLで）を、１０μM ｄｘｒを含有するか又は含有しない増殖培地に添加した。酵母の増殖は、６００nmでの吸光度によって測定した。
【図３】化合物Ｐ２（パニセインＣ）、Ｐ３（パニセインＢ３）、Ｐ４（パニセインＢ２）及びＰ５（パニセインＡヒドロキノン）の構造。
【図４】Patchedタンパク質を過剰発現するメラノーマ細胞。 Ａ．３つの異なるメラノーマ細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭｅＷｏ及びＡ３７５）由来の全抽出物に対するウサギ抗Patched抗体（１／１０００）を用いたウエスタンブロッティング。Patchedは、１５０KDaであると予想される。βチューブリンを添加コントロールとして使用した。Ｂ．Patched抗体（１／２００）及びローダミン抗ウサギ抗体を用いるＭｅＷｏ及びＡ３７５の免疫標識。Patched標識（赤色）を、可視光線でＤＡＰＩ（青色）及び細胞の画像に重ねた。ローダミン−抗ウサギ抗体単独では、これらの細胞上にシグナルを一切示さなかった（図示せず）。
【図５】パニセインは、メラノーマ細胞に対するドキソルビシン細胞毒性を増加させる。  ６０％〜７０％コンフルエントに達するように、細胞を完全ＤＭＥＭ培地中、９６ウェルプレートで増殖させた。次いで培地を除去し、１０μM（又はＥＣ５０測定のための増加濃度）のパニセイン又はコントロールとしてのＤＭＳＯを含有する完全ＤＭＥＭ培地 １００μL/ウェルと交換した。２時間後、ドキソルビシンを含有する完全ＤＭＥＭ培地 １００μLを、半分のウェルに加えて、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５及びＭｅＷｏについては２μMの最終濃度、Ａ３７５については１．５μMの最終濃度を得た。２４時間後に細胞生存率を測定した。化合物Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４及びＰ５の細胞生存率への効果、並びに化合物Ｐ５の用量応答を、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５（Ａ）、ＭｅＷｏ（Ｂ）及びＡ３７５（Ｃ）について示す。Ｄ．パニセインによるｄｘｒ細胞毒性の増強が示されている。少なくとも３つの独立した実験の平均（＋／−sem）を報告する。
【図６】パニセインは、ドキソルビシン排出を阻害する。 Ａ．化合物Ｐ５は、メラノーマ細胞ＭｅＷｏ及びＡ３７５からのドキソルビシン排出を阻害する。細胞をカバーガラス上で増殖させ、１０μMのドキソルビシンと共に３７℃で２時間インキュベートし、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で迅速に濯いだ。各細胞株の１つのカバーガラスを、ドキソルビシンの負荷コントロールのために直ちに固定した。その他のカバーガラスを、ＤＭＳＯ又は１０μMの化合物Ｐ５を補充した緩衝液と共に穏やかに振とうしながら３０分間インキュベートし、直ちに固定した。ドキソルビシン細胞内蛍光を落射蛍光によって可視化し、各条件について３つの異なるフィールドの３０個以上の細胞についてImage Jソフトウェアを用いて分析した。Ｐ＜０．０５（＊＊：Ｐ＜０．００５、＊＊＊：Ｐ＜０．０００５）で有意性に達するスチューデントｔ検定を用いて結果を分析した。Ｂ．パニセインは、Patched−発現酵母からのドキソルビシン排出を阻害する。野生型Patchedを発現する酵母（ｈＰｔｃ、黒色）、変異体Patched G509VD513Y（ｈＰｔｃＶＸＸＸＹ、灰色）を発現する酵母及びコントロール酵母（白色）を、５mMの２−デオキシ−Ｄ−グルコース及び１０μMのｄｘｒを補充した緩衝液中で４℃にて２時間インキュベートした。遠心分離及び上清除去の後、１つの試料を負荷コントロールのために直ちに固定し、その他の試料をＤＭＳＯ又は１０μMのパニセインを補充した５mMの２−デオキシ−Ｄ−グルコースを含有する緩衝液中に、２５℃で１０分間穏やかに振とうしながら再懸濁した。遠心分離及び上清除去の後、試料を固定し、落射蛍光顕微鏡観察のためにカバーガラス上に置いた。ｄｘｒ細胞内蛍光の定量化は、各条件について３つの異なるフィールドの３０個以上の酵母についてImage Jソフトウェアを用いて行った。Ｐ＜０．０５（＊）で有意性に達するスチューデントｔ検定を用いて結果を分析した。
【図７】パニセインＡヒドロキノンは、Patched構造モデルにおいてドキソルビシン結合部位の近くに強力なドッキングクラスターを示す。  Patched構造のモデル化は、大腸菌（Escherichia coli）のＲＮＤファミリー由来の主要多剤排出トランスポーターであるＡｃｒＢの結晶構造に基づいて行われており、Murakamiら（Nature 2006）によりドキソルビシンの有り及び無しで記載されている。ＡｃｒＢ−薬物複合体は、３つのプロトマーからなる。ｄｘｒは、３つのプロトマーのうちの１つのペリプラズムドメインに見出された。Patchedのモデル構造へのパニセインＡヒドロキノンのドッキングは、ｄｘｒ結合部位に近いクラスターでの結合に対する強い蓋然性を示している。
【図８−１】パニセインは、他の化学療法剤に対する耐性を阻害する。  最終濃度１０μMでパニセインを、２mMのダカルバジン（Ａ）、５０μMのシスプラチン（Ｂ）、
【図８−２】又は１０μMのベムラフェニブ（Ｃ）を含有する酵母増殖培地に添加した。ｈＰｔｃ発現酵母の増殖を６００nmでの吸光度で測定した。（Ｄ）ニュートラルレッドを用いた生存率試験は、パニセインＡヒドロキノン（１０μM）が、Ａ３７５メラノーマ細胞に対するベムラフェニブの細胞毒性を強力に増加させることを示している。
【図９】メラノーマにおけるPatchedの発現。 （ａ）Patchedタンパク質は、様々なガンで発現する（組織でのＩＨＣ、Human Protein Atlasウェブサイトから抽出したデータ）。（ｂ）１５４個のメラノーマ試料におけるPatched ｍＲＮＡ（ONCOMINEウェブサイトから抽出したデータ）。
【図１０−１】パニセインＡヒドロキノンは、アポトーシス性メラノーマ細胞の数を強力に増加させる  ＤＭＳＯ、パニセイン及び／又はｄｘｒでの処理の２４時間後に細胞をサンプリングし、アネキシンＶ及びＤＡＰＩ共染色によりアポトーシスを測定した。早期アポトーシスの細胞は、アネキシンＶ陽性及びＤＡＰＩ陰性であり、後期アポトーシスの細胞は、アネキシンＶ及びＤＡＰＩ二重陽性である。
【図１０−２】ヒストグラムは、３つの独立した実験からの後期アポトーシスにおける細胞の平均パーセンテージ（＋／−SEM）を表し、Ｐ＜０．０５（＊）（＊＊：Ｐ＜０．００５）で有意性に達するスチューデントｔ検定を用いて分析された。
【図１１】パニセインＡヒドロキノンは、Patchedタンパク質の発現又は安定性には影響しない。  １０μMのパニセインＡヒドロキノン（Ｐ５）又はＤＭＳＯでの処理の２４時間後のＭＥＷＯ及びＡ３７５細胞からの全抽出物に対するウエスタンブロッティング。
【図１２−１】この図は、メラノーマ細胞（Ａ）及び酵母（Ｂ）の蛍光画像を用いて、図６と同じ実験を報告する。Ａ．化合物Ｐ５は、メラノーマ細胞ＭｅＷｏ及びＡ３７５からのドキソルビシン排出を阻害する。細胞をカバースガラス上で増殖させ、１０μMのドキソルビシンと共に３７℃で２時間インキュベートし、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で迅速に濯いだ。各細胞株の１つのカバーガラスを、ドキソルビシンの負荷コントロールのために直ちに固定した。その他のカバーガラスを、ＤＭＳＯ又は１０μMの化合物Ｐ５を補充した緩衝液と共に穏やかに振とうしながら３０分間インキュベートし、直ちに固定した。ｄｘｒ細胞内蛍光を落射蛍光によって可視化し（左部分）、各条件について３つの異なるフィールドの３０個以上の細胞についてImage Jソフトウェアを用いて分析した。Ｐ＜０．０５（＊＊：Ｐ＜０．００５、＊＊＊：Ｐ＜０．０００５）で有意性に達するスチューデントｔ検定を用いて結果を分析した（右部分）。
【図１２−２】Ｂ．パニセインは、Patched−発現酵母からのドキソルビシン排出を阻害する。野生型Patched（ｈＰｔｃ、黒色）を発現する酵母、変異体Patched G509VD513Y（ｈＰｔｃＶＸＸＸＹ、灰色）を発現する酵母及びコントロール酵母（白色）を、５mMの２−デオキシ−Ｄ−グルコース及び１０μMのｄｘｒを補充した緩衝液中で４℃にて２時間インキュベートした。遠心分離及び上清除去の後、１つの試料を負荷コントロールのために直ちに固定し、その他の試料をＤＭＳＯ又は１０μMのパニセインを補充した５mMの２−デオキシ−Ｄ−グルコースを含有する緩衝液中に２５℃で１０分間穏やかに振とうしながら再懸濁した。遠心分離及び上清除去の後、試料を固定し、落射蛍光顕微鏡観察のためにカバーガラス上に置いた（左部分）。ｄｘｒ細胞内蛍光の定量化は、各条件について３つの異なるフィールドの３０以上の酵母についてImage Jソフトウェアを用いて行った。Ｐ＜０．０５（＊）で有意性に達するスチューデントｔ検定を用いて結果を分析した（右部分）。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
［発明の詳細な説明］
発明者らは、再発ガンの臨床管理に使用される化学療法剤であるドキソルビシンのような薬物の排出にPatched受容体が関与していることを示し、Patchedがガン細胞の化学療法耐性に寄与し得ることを示唆した（Bidet et al. 2012、国際公開第２０１２／０８０６３０号）。彼らは、Patched薬物排出活性を阻害することができる分子を同定するための革新的な試験を開発した。第１の試験は、ドキソルビシン含有培地でヒトPatchedを過剰発現する酵母の増殖を阻害する分子の能力に基づいた。次に活性分子は、以下を増加させるそれらの能力について試験された：１）Patchedを過剰発現するガン細胞株に対するドキソルビシン細胞毒性、２）いくつかのメラノーマ細胞株に対するドキソルビシンの細胞毒性効果、及び３）Patchedを発現する様々なガン細胞株に対する化学療法薬細胞毒性。該分子はまた、ヒトメラノーマ細胞を移植されたマウス並びに乳ガンの再発及び転移のマウスモデルにおいて、腫瘍処置及び転移発生の予防について試験される。
【００２０】
これに関連して、本発明者らは、海洋性海綿動物から抽出された特定の化合物、特にパニセインが、Patched過剰発現酵母におけるドキソルビシン、ダカルバジン及びシスプラチンのような化学療法剤の排出を阻害することができ、それにより酵母の増殖が阻害されることを示した。本発明者らは更に、本発明のパニセイン化合物が、ドキソルビシンに対するPatched発現メラノーマ細胞株の感受性を有意に増加させることを示した。以下の実施例で十分に示されるように、Patched発現メラノーマ細胞株に対するドキソルビシンの細胞毒性は、ドキソルビシンがパニセインＣ、パニセインＢ３、パニセインＢ２又はパニセインＡヒドロキノンのようなパニセインと組み合わせて使用された場合に有意に増加した。
【００２１】
注目すべきことに、試験されたパニセインは、２０μMまでの濃度で単独で（すなわち、いかなる化学療法剤も存在しないで）使用された場合、メラノーマ細胞に対して有意な細胞毒性を示さなかった。
【００２２】
発明者らの知見によれば、Patched受容体を阻害し、Patched受容体発現ガン細胞に対するドキソルビシンのような化学療法剤の細胞毒性を増強するパニセインの能力は、先行技術において記載も示唆もされていなかった。
【００２３】
したがって、本発明の第１の目的は、Patched受容体薬物排出活性をインビトロ又はエクスビボで低下させる又は阻害するパニセイン化合物又はその誘導体及び類似体の使用に関する。
【００２４】
本明細書で使用する場合、パニセイン化合物（本明細書では「パニセイン」とも呼ばれる）は、セスキテルペノイド（sesquiterpenoid）キノン及び対応するキノールを指す。パニセインは、特に、海洋性海綿動物、特に地中海（Mediterranean）海洋性海綿動物のような海洋生物から抽出される。例えば、パニセインＣ、パニセインＢ３、パニセインＢ２及びパニセインＡヒドロキノンのようなパニセインは、ムラサキカイメンムコサ（Haliclona mucosa）のようなムラサキカイメン属（Haliclona）に属する地中海海洋性海綿動物から単離され得る。パニセインの単離に用いる目的の別の海洋性海綿動物は、例えばナミイソカイメン（Halichondria panacea）である。海洋性海綿動物からパニセイン及び関連化合物を抽出する方法は、Casapulloら（1973）などに記載されており、その開示は、参照により本明細書中に援用される。
【００２５】
本明細書で使用する場合、類似体又は誘導体は、セスキテルペノイドキノン又はセスキテルペノイドキノールから誘導される化学構造を有する化合物を包含する。特定の実施態様において、パニセインの類似体又は誘導体は、天然のパニセインの立体異性体を指し得るか、或いは１つ又はいくつかの化学的修飾のために天然のパニセインとは異なる化合物を指し得る。化学的修飾は、非限定的に、化学的置換基の導入、或いは、別の基（特に生物学的等価基（すなわち、類似の物理的又は化学的特性を有する）による）による又はパニセインの特性（例えば、生物活性、溶解性、薬物動態学的特性又は細胞標的指向化）を増強又は改善する化学基による、化学基の置換を含む。本明細書で使用する場合、類似体及び誘導体は、非限定的に、パニセインの立体異性体、プロドラッグ及び代謝産物を含む。
【００２６】
より具体的な実施態様において、本発明は、Patched受容体薬物排出活性をインビトロ又はエスビボで低下させる又は阻害するための、式（Ｉ）：
【化３】
0006657209.tif 000004
［式中、
−  Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アミノアルキル、Ｃ１−Ｃ６ヒドロキシアルキル、Ｃ１−Ｃ６ハロゲノアルキル又は−ＯＲ４であり、
−  Ｒ２は、Ｈ又はＣ１−Ｃ６アルキルであり、
−  Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、−ＣＨ２ＯＲ４、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ４、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ４、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ４又は−ＣＨ２ＮＨＲ４であり、
−  各Ｒ４は、独立して、−Ｈ又はＣ１−Ｃ６アルキルであり、
−  Ｒは：
−  式（ＩＩａ）で示される基：
【化４】
0006657209.tif 000005
−  式（ＩＩｂ）で示される基：
【化５】
0006657209.tif 000006
−  式（ＩＩｃ）で示される基：
【化６】
0006657209.tif 000007
［式中、
−  結合（１）及び（２）は、互いに独立して、単結合又は二重結合であり、好ましくは、結合（１）及び（２）は、同時に二重結合ではなく、
−  Ｒ５は、結合（１）が単結合である場合に存在する。存在する場合、Ｒ５は、−Ｈ又は−ＯＲ６を表す。好ましくは、存在する場合、Ｒ５は、−Ｈ又はＯＨであり、そして
−  存在する場合、各Ｒ６は、独立して、Ｈ又はＣ１−Ｃ６アルキルであり、好ましくは、各Ｒ６は、Ｈ又はＣＨ３のようなＣ１−Ｃ３アルキルである］からなる群より選択される］で示される化合物又はその薬学的に許容し得る塩の使用に関する。
【００２７】
結合（１）が二重結合である場合、Ｒ５が存在しないことは言うまでもない。
【００２８】
本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容し得る」は、しっかりした医学的判断の範囲内で、対象における組織との接触に適しているか、又は対象に投与され得、妥当なベネフィット／リスク比に見合った過剰な毒性又は他の合併症を伴わない、組成物、化合物、塩などを指す。例えば、薬学的に許容し得る塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、塩化物塩、アンモニウム塩、酢酸塩などを包含する。
【００２９】
本明細書で使用する場合、Ｃ１−Ｃ６アルキルは、１〜６個の炭素原子を含む直鎖状又は分岐状のアルキル基を包含する。好ましいＣ１−Ｃ６アルキル基は、メチル、エチル、プロピル及びイソプロピルのようなＣ１−Ｃ３アルキルである。特に好ましいアルキル基は、メチルである。
【００３０】
「ヒドロキシアルキル」は、式−Ａ−ＯＨ（式中、Ａは、アルキレン基を表す）の基を指す。
【００３１】
「アミノアルキル」は、式−Ａ−ＮＨ２（式中、Ａは、アルキレン基を表す）の基を指す。
【００３２】
「ハロゲノアルキル」は、式−Ａ−Ｈａｌ（式中、Ａは、アルキレン基を表し、そしてＨａｌは、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ又はＦのようなハロゲンを表す）の基を指す。
【００３３】
本明細書で使用する場合、「ヒドロキシアルキル」、「アミノアルキル」及び「ハロゲノアルキル」は、１〜６個の炭素原子、好ましくは１〜３個の炭素原子を含む。
【００３４】
特定の実施態様において、結合（１）は、単結合であり、そして結合（２）は、二重結合である。別の実施態様において、結合（１）は、二重結合であり、そして結合（２）は、単結合である。
【００３５】
いくつかの実施態様において、式（Ｉ）の化合物は、以下の特徴の１つ又はいくつかを含む：
ｉ．   Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル又は−ＯＲ４であり、及び／又は
ii．   Ｒ２は、Ｈ又はＣ１−Ｃ６アルキルであり、及び／又は
iii．  Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、−ＣＨ２ＯＲ４又は−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ４であり、及び／又は
iv．   各Ｒ４は、独立して、−Ｈ、又はＣ１−Ｃ６アルキル、好ましくは、Ｃ１−Ｃ３アルキルである。
【００３６】
特定の実施態様において、本発明の化合物は、上記に列挙した特徴の全てを含む。
【００３７】
いくつかの他の実施態様において、式（Ｉ）の化合物は、以下の特徴の１つ又はいくつか（１、２又は３つ）を含む：
（i）    Ｒ１は、Ｈ又はＯＨであり、及び／又は
（ii）   Ｒ２は、Ｈ又はＣＨ３であり、及び／又は
（iii）  Ｒ３は、−ＣＨ３又は−Ｃ（＝Ｏ）Ｈである。
【００３８】
いくつかの代替の又は追加の実施態様において、式（Ｉ）の化合物は、Ｒが下記：
【化７】
0006657209.tif 000008
［Ｒ６及びＲ５は、先で定義されたとおりである。好ましくは、Ｒ５は、Ｈ又はＯＨである。好ましくは、各Ｒ６は、Ｈである］からなる群より選択されるような化合物である。
【００３９】
いくつかの他の実施態様において、式（Ｉ）の化合物は、Ｒが下記：
【化８】
0006657209.tif 000009
［式中、Ｒ６は、先で定義されたとおりである］からなる群より選択されるような化合物である。
【００４０】
特定の態様において、式（Ｉ）の化合物は、Ｒが下記：
【化９】
0006657209.tif 000010
で示されるような化合物であり得る。
【００４１】
いくつかの特定の実施態様において、式（Ｉ）の化合物は天然のパニセインであり、これは、該化合物が生物から、特に海洋性海綿動物から、例えば抽出によって得ることができることを意味する。好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、下記の表（Ｉ）に示されるパニセイン、その薬学的に許容し得る塩、代謝物及びプロドラッグ並びにその立体異性体より選択される。
【００４２】
【表１】
0006657209.tif 000011
【００４３】
いくつかの実施態様において、式（Ｉ）の化合物は、パニセインＡヒドロキノン、パニセインＢ３、パニセインＣ、パニセインＧ、パニセインＡ、パニセインＢ１、パニセインＢ２及びパニセインＣの中より選択される。
【００４４】
いくつかの特定の実施態様において、式（Ｉ）の化合物は、パニセインＤ、パニセインＥ、パニセインＦ１及びパニセインＡ２と異なる。
【００４５】
本発明のいくつかの好ましい実施態様において、式（Ｉ）の化合物は、下記：
【化１０】
0006657209.tif 000012
及びその薬学的に許容し得る塩からなる群より選択される。
【００４６】
本発明の別の好ましい実施態様において、式（Ｉ）の化合物は、パニセインＡヒドロキノン、パニセインＣ、パニセインＢ３及びパニセインＢ２の誘導体又は類似体、好ましくは、パニセインＡヒドロキノンの誘導体又は類似体である。
【００４７】
パニセインＡヒドロキノンの好ましい誘導体又は類似体は、パニセインＡキノンである。
【００４８】
本発明の化合物は、抽出、半合成又は全合成のような当業者に周知の方法によって得ることができる。例えば、海洋性海綿動物からパニセイン及び関連化合物を抽出する方法は、Casapulloら（1973）及びZubiaら（1994）などに記載されており、その開示は、参照により本明細書中に援用される。パニセインはまた、化学合成により調製され得る。例えば、Davisら（2005）は、パニセインＡの全合成について記載している。パニセインの類似体又は誘導体は、従来の化学反応を用いて抽出によって得られたパニセインから、全合成によって、又は半合成によって得ることができる。
【００４９】
更なる態様において、本発明は、Patched受容体薬物排出活性をインビトロ又はエクスビボで低下させる又は阻害するための、少なくとも１つのパニセイン化合物又はその誘導体を含む抽出物の使用に関する。いくつかの実施態様において、該抽出物は、いくつかのパニセインを含み得る。例えば、該抽出物は、２、３、４、５、６又はそれ以上の別個のパニセインを含み得る。
【００５０】
好ましい抽出物は、ムラサキカイメンムコサ又はナミイソカイメンのような海洋性海綿動物から得られる。本発明のパニセイン又は抽出物を得るための目的の他の海洋性海綿動物は、非限定的に、Ircinia variabilis、Agelas oroides、Cymbaxinella damicornis、Aplysina cavernicola、Haliclona fulva、Crambe crambe、Haliclona sarai、Acanthella acuta及びCrambe taillieziを包含する。
【００５１】
特定の抽出物は、少なくとも１０μｇ/mLの、本発明によるパニセイン又はそのようなパニセインの混合物を含む。また、そのような抽出物の精製画分も本発明に包含される。特定の抽出物は、少なくとも１０μｇ/mLのパニセインの最終濃度、例えば１５又は２０μｇ/mLを含むメタノール性抽出物である。
【００５２】
本発明はまた、化学療法剤に対するガンの感受性を増加させるための、少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容し得る塩の使用に関する。
【００５３】
本発明の更なる目的は、化学療法剤についてガンの耐性を低下させるための、少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容し得る塩の使用である。
【００５４】
また、対象におけるガンの処置に使用するための、ガン転移の予防に使用するための、及び／又はガン再発の予防に使用するための、少なくとも１つの化学療法薬と組み合わせて使用するための、本発明による式（Ｉ）の化合物（又はその薬学的に許容し得る塩）、又は本発明による少なくとも２つの式（Ｉ）の化合物（又はその薬学的に許容し得る塩）を含む組成物が記載されている。
【００５５】
用語「対象」は、任意の対象を指し、典型的には患者、特に、化学療法及び／又は放射線療法のようなガンの処置を受けている対象、或いはガンの発生のリスクを有する、又はリスクを有すると疑われる対象を示す。
【００５６】
対象は、好ましくは哺乳動物、更により好ましくはヒト、例えば、ガンを罹患しており、かつ化学療法に対して耐性のあるヒトである。
【００５７】
対象は、典型的にはガン患者、好ましくは腫瘍細胞がPatched受容体を発現する患者、及び／又は、間質細胞及び／又は腫瘍細胞がヘッジホッグ（Ｈｈ）タンパク質を発現する患者であり、該患者は好ましくは化学療法に対して耐性である。
【００５８】
対象は、完全な従来の処置プロトコルの一部、例えば全処置プロトコルの少なくとも１サイクル、例えば２サイクルの全処置プロトコルに曝され得る。
【００５９】
ガンは、腫瘍細胞又はガン細胞がPatched受容体を発現又は過剰発現する限り、任意の種類のガン又は新生物であり得る。典型的なガンは、第一選択化学療法に対して耐性のガンである。
【００６０】
Patched受容体を発現若しくは過剰発現するか、又はＨｈ経路の異常発現を有するガンは、例えば、メラノーマ（Cretnick et al. 2009）、乳ガン（Smith et al. 2014, Jeng ks et al. 2013）、甲状腺ガン（Hinterseher al. 2014, Xu H. et al. 2012）、前立腺ガン（Kim et al. 2011, Chung et al. 2010）、結腸ガン（Wang et al. 2013, Xu M. et al. 2012）、直腸ガン（Qualtrough et al. 2004）、食道ガン（Zhu W. et al. 2011）、胃ガン（Lee SJ et al. 2013）、卵巣ガン（Sabol et al. 2012）、肺ガン（Li et al. 2012, Gialmanidis et al. 2009）、膵臓ガン（Ma et al. 2014, Nakamura et al. 2012）、神経膠腫（Yu et al. 2014）、副腎皮質癌腫（Mus-Veteau et al.、未公開データ）、小児固形悪性腫瘍（例えば、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、腎芽細胞腫又は肝芽腫）（Oue et al. 2010）、また、非固形ガン（例えば、リンパ性白血病又は骨髄性白血病のような白血病）（Cea et al. 2013）、多発性骨髄腫（Blotta et al. 2012）及び骨肉腫のような肉腫（Lo et al. 2014）より選択される。図９に示す蛋白質構造データバンク（Protein data bank）及びOncomineのデータを参照のこと。このガンは転移性ガンであってもなくてもよい。
【００６１】
本発明の特定の実施態様において、化学療法剤は、例えば、アントラサイクリン、抗腫瘍抗生物質、アルキル化剤、代謝拮抗剤、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、紡錘体毒のような抗有糸分裂剤、ＤＮＡ挿入剤、タキサン、アルキル化剤、プラチナベースの成分、特異的キナーゼ阻害剤、ホルモン、サイトカイン、抗血管新生剤、抗体（特にモノクローナル抗体）及びＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体）−３リガンドより選択される、薬剤である。
【００６２】
いくつかの化学療法剤を含むことができる処置は、予防される又は処置される具体的なガンに応じて、ガン専門医によって選択される。
【００６３】
抗腫瘍抗生物質は、例えば、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、マイトマイシンＣ又はミトキサントロンを含む；
【００６４】
アルキル化剤は、例えば、ダカルバジン、ブスルファン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、メクロレタミン、オキサリプラチン、ウラムスチン又はテモゾロミドを含む；
【００６５】
代謝拮抗剤の例は、アザチオプリン、カペシタビン、シタラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、メトトレキサート、フルオロウラシル（５−ＦＵ）又はペメトレキセドである；
【００６６】
植物アルカロイドは、例えば、ビンブラスチン又はビンクリスチン（ビノレルビン）を含む；
【００６７】
トポイソメラーゼ阻害剤は、例えば、イリノテカン、トポテカン又はエトポシドを含む；
【００６８】
紡錘体毒は、例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン及びビノレルビンより選択される；
【００６９】
タキサンは、例えば、ドセタキセル、ラロタキセル、カバジタキセル、パクリタキセル（ＰＧ−パクリタキセル及びＤＨＡ−パクリタキセル）、オルタタキセル、テセタキセル及びタキソプレシンより選択される；
【００７０】
プラチナベースの成分の例は、ＣＤＤＰ及びＯＸＰである；
【００７１】
具体的なキナーゼ阻害剤の例は、例えば、ＢＲＡＦキナーゼ阻害剤（例えば、ベムラフェニブ）である；
【００７２】
タモキシフェン及び抗アロマターゼ薬は、典型的には、ホルモン療法との関連で使用される。
【００７３】
免疫療法との関連で使用可能なサイトカインの例は、ＩＬ−２（インターロイキン−２）及びＩＦＮ（インターフェロン）α（ＩＦＮａ）である；
【００７４】
抗ＣＤ２０（汎Ｂ細胞抗原）又は抗Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ（ヒト上皮増殖因子受容体−２／ＮＥＵ）は、モノクローナル抗体の例である。
【００７５】
好ましい実施態様において、化学療法薬又は化学療法剤は、シスプラチン、ドキソルビシン、メトトレキサート、テモゾロミド、５−ＦＵ、ダカルバジン及びベムラフェニブより選択される。
【００７６】
本発明の特定の実施態様において：
−  パニセインＡヒドロキノンは、シスプラチン、ドキソルビシン、ダカルバジン又はベムラフェニブの少なくとも１つと組み合わせて使用され、
−  パニセインＣは、シスプラチン、ドキソルビシン、ダカルバジン又はベムラフェニブの少なくとも１つと組み合わせて使用され、
−  パニセインＢ３は、シスプラチン、ドキソルビシン、ダカルバジン又はベムラフェニブの少なくとも１つと組み合わせて使用され、そして
−  パニセインＢ２は、シスプラチン、ドキソルビシン、ダカルバジン又はベムラフェニブの少なくとも１つと組み合わせて使用され、
−  シスプラチンは、パニセインＡヒドロキノン、パニセインＣ、パニセインＢ３及びパニセインＢ２の少なくとも１つと組み合わせて使用され、
−  ドキソルビシンは、パニセインＡヒドロキノン、パニセインＣ、パニセインＢ３及びパニセインＢ２の少なくとも１つと組み合わせて使用され、
−  ダカラバジンは、パニセインＡヒドロキノン、パニセインＣ、パニセインＢ３及びパニセインＢ２の少なくとも１つと組み合わせて使用され、そして
−  ベムラフェニブは、パニセインＡヒドロキノン、パニセインＣ、パニセインＢ３及びパニセインＢ２の少なくとも１つと組み合わせて使用される。
【００７７】
特定のメラノーマは、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）；シスプラチン；Ｂ−Ｒａｆ阻害剤（PLX4032又はベムラフェニブ）；ソラフェニブ及び／又はテモゾロミド；電気化学療法；又はＴＮＦアルファ、特に高用量のＴＮＦアルファによる分離式肢灌流を用いて従来法で処置されるメラノーマである。特定の実施態様において、メラノーマは、前述の細胞毒性における通常療法に耐性のメラノーマである（Jahnke et al. 2014）。
【００７８】
特定の乳ガンは、アントラサイクリン、タキサン、ハーセプチン、抗ＰＡＲＰ（ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ）、抗ＰＩ３Ｋ（ホスホイノシチド３−キナーゼ）、ｍＴＯＲ（哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（mammalian Target of Rapamycin））阻害剤、ナベルビン、ゲムシタビン、抗エストロゲン剤、抗アロマターゼ剤、及び／又はＴＬＲ−３リガンドを用いて従来法で処置される乳ガンである。特定の実施態様において、乳ガンは、前述した細胞毒性における通常療法に耐性の乳ガンである（Fonseca et al. 2014）。
【００７９】
特定の甲状腺ガンは、放射性ヨウ素又はチロシンキナーゼ阻害剤、好ましくはＲＥＴ阻害剤で処置される甲状腺ガンである。特定の実施態様において、甲状腺ガンは、前述した細胞毒性における通常療法に耐性の甲状腺ガンである（Ma et al. 2014）。
【００８０】
特定の前立腺ガンは、タキサン用いて従来法で処置される前立腺ガンである。特定の実施態様において、前立腺ガンは、タキサンに耐性の前立腺ガンである（Parks et al. 2014）。
【００８１】
特定の結腸ガンは、ＯＸＰ及び／又は５−フルオロウラシル（５ ＦＵ）とフォリン酸との組み合わせを用いて従来法で処置される結腸ガンである。特定の実施態様において、結腸ガンは、前述した細胞毒性における通常療法に耐性の結腸ガンである（Kolosenko et al. 2014）。
【００８２】
特定の転移性大腸ガンは、５ ＦＵ及びＯＸＰ又はイリノテカンを用いて従来法で処置される転移性大腸ガンである。
【００８３】
特定の直腸ガンは、ＣＤＤＰ及び／又は５ ＦＵを用いて従来法で処置される直腸ガンである。特定の実施態様において、直腸ガンは、前述した細胞毒性における通常療法に耐性の直腸癌腫である（Fan et al. 2013）。
【００８４】
特定の食道ガンは、ＣＤＤＰを用いて処置される食道ガン、典型的にはＣＤＤＰに耐性の食道ガンである。
【００８５】
特定の肺ガンは、プラチナ（platine）又はペメトレキセド（Alimta（登録商標））を用いて従来法で処置される肺ガンである。
【００８６】
特定の初期段階の非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）は、ＣＤＤＰ及び／又はエトポシドを用いて、或いはタキサン及びアバスチン［抗ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）抗体］を用いて従来法で処置されるＮＳＣＬＣである。
【００８７】
特定の実施態様において、肺ガンは、前述の細胞毒性における通常療法に耐性のＮＳＣＬＣである（Cheng and Chen 2014）。
【００８８】
特定の骨肉腫は、アントラサイクリン、イマチニブ（Gleevec（登録商標））を用いて従来法で処置される。特定の実施態様において、骨肉腫は、前述の細胞毒性における通常療法に耐性の骨肉腫である（Duan et al. 2014）。
【００８９】
特定の神経芽細胞腫は、アントラサイクリン又はアルキル化剤を用いて、特に自家骨髄移植又は幹細胞移植に関連して従来法で処置される神経芽細胞腫である。特定の実施態様において、神経芽細胞腫は、アントラサイクリン又はアルキル化剤に耐性である。
【００９０】
特定の白血病は、アザシチジンを用いて従来法で処置されるリンパ性白血病又は骨髄性白血病である。特定の実施態様において、白血病は、細胞毒性における通常療法に耐性である（Lehmann-Che et al. 2014）。
【００９１】
特定の急性リンパ性白血病は、アントラサイクリン、ビンブラスチン及び／又はビンクリスチンで処置される急性リンパ性白血病、典型的にはアントラサイクリン、ビンブラスチン及び／又はビンクリスチンに耐性の急性リンパ性白血病である。
【００９２】
特定の多発性骨髄腫は、アントラサイクリン、ボルテゾミブ、レブリミド、サリドマイド及び／又はアルキル化剤を用いて、特に自家骨髄又は幹細胞移植に関連して従来法で処置される悪性血液疾患である。特定の実施態様において、多発性骨髄腫は、前述の細胞毒性における通常療法に耐性の多発性骨髄腫である（Blotta et al. 2012）。
【００９３】
特定の神経膠腫は、テモゾロミド、プロカルバジン、イオムスチン又はメトトレキサートを用いて従来法で処置される、頻発し、かつ破壊的な成人の原発性悪性脳腫瘍である。特定の実施態様において、神経膠腫は、前述の細胞毒性における通常療法に耐性の神経膠腫である。
【００９４】
特定のグリア芽細胞腫は、テモゾロミドを用いて従来法で処置されるグリア芽細胞腫である。特定の実施態様において、グリア芽細胞腫は、細胞毒性における通常療法に耐性である（Wu et al. 2014）。
【００９５】
特定の副腎皮質癌腫は、化学療法剤（エトポシド、ドキソルビシン及びシスプラチン）と抗アドレナリン作用物質（ミトナン）との組み合わせを用いて従来法で処置される稀な細胞癌腫である。特定の実施態様において、副腎皮質癌腫は、細胞毒性における通常療法に耐性である。
【００９６】
特定の膵臓ガンは、ゲムシタビンを用いて従来法で処置される膵臓ガンである。特定の実施態様において、膵臓ガンは、前述の細胞毒性における通常療法に耐性である（Zhu et al. 2012）。
【００９７】
特定の卵巣ガンは、シスプラチンのようなプラチナベースの化学療法を用いて従来法で処置される卵巣ガンである。特定の実施態様において、卵巣ガンはプラチナベースの化学療法に耐性である（He et al. 2014）。
【００９８】
本開示は更に、医薬組成物又は医薬を調製するための、先で定義したとおりの本発明の化合物（開示された実施態様のいずれかを含む）の使用に関し、該組成物は、それを必要とする対象においてガン処置又はガン治療の効率を向上させることを可能にする。本発明の化合物は、特に、対象においてガンを処置するために、ガン転移を予防するために、及び／又はガン再発を予防するために、少なくとも１つの化学療法薬又は任意の他の処置上活性な化合物と組み合わせて有利に使用することができる。
【００９９】
したがって、好ましい医薬組成物は、組み合わせ製剤として、ガンの処置において使用される少なくとも１つの薬物、典型的には本明細書に記載の少なくとも１つの化学療法薬、又は任意の他の処置上活性な化合物を、該ガンの処置において、同時、別々又は逐次の使用のために含む。
【０１００】
その他の処置上活性な化合物は、例えば、スタチン、Smoothened受容体のアンタゴニスト及びＧＬＩ１転写因子のアンタゴニストから選択され得る。
【０１０１】
（i）ガンを予防又は処置する方法、（ii）化学療法剤に対するガンの感受性を増加させる方法、及び（iii）化学療法剤においてガンの耐性を低下させる方法であって、該方法の各々が、それを必要とする対象に、有効量の、開示された実施態様のいずれかを含む先に定義されたとおりの少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物又は先に定義されたとおりの医薬組成物を、好ましくは、本明細書に記載されているようなガンの予防又は処置において古典的に使用される化学療法薬と一緒に（併用製剤として）投与することを含む方法も本明細書に記載されている。
【０１０２】
別の特定の実施態様において、前記方法は更に、ガン又はガン処置における副作用を予防又は処置するための、有効量の別の処置上活性な化合物を投与することを含む。
【０１０３】
「処置」とは、ガンの治癒的処置を意味する。治癒的処置は、ガンを完全に処置（治癒）する又は部分的に処置する（腫瘍増殖の安定化、遅延又は退行を誘導する）処置として定義される。
【０１０４】
本明細書で使用する場合、「処置有効量又は用量」とは、対象、好ましくはヒトにおいて、ガンを予防、除去、遅らせるか、或いは、該疾患によって引き起こされる又は関連する１つ若しくはいくつかの症状又は障害を減少させるか遅延させる、本発明の化合物の量を指す。本発明の化合物及びその医薬組成物の、有効量、より一般的には投薬レジメンは、当業者によって決定及び適応され得る。有効量は、従来の技術の使用によって、及び類似の状況下で得られた結果を観察することによって、決定され得る。本発明の化合物の処置有効用量は、処置又は予防される疾患、その重大さ、投与経路、関与する任意の併用療法、患者の年齢、体重、全身の医学的状態、病歴などに応じて変化する。
【０１０５】
典型的には、患者に投与される化合物の量は、ヒト患者の場合、体重１kgあたり約０．０１〜５００mgの範囲であり得る。特定の実施態様において、本発明による医薬組成物は、０．０１mg/kg〜３００mg/kgの本発明の化合物、例えば２５〜３００mg/kgを含む。
【０１０６】
特定の態様において、本発明の化合物は、非経口経路、経口経路又は静脈内（ＩＶ）注射によって対象に投与され得る。本発明の化合物又はナノ粒子は、対象に毎日（例えば、１日に１、２、３、４、５、６又は７回）、数日間連続して（例えば２〜１０日連続して、好ましくは、３〜６日連続して）投与され得る。該処置は、１、２、３、４、５、６若しくは７週間、又は２週間若しくは３週間ごとに、或いは１、２若しくは３ヶ月ごとに繰り返され得る。或いは、２回の処置サイクルの間に休止期間（例えば１、２、３、４又は５週間）を有してもよい数回の処置サイクルが行われ得る。本発明の化合物又はナノ粒子は、例えば、１週間に１回、２週間に１回又は１ヶ月に１回の単回投与として投与され得る。処置は、１年に１回又は１年に数回繰り返され得る。用量は、当業者によって決定され得る適切な間隔で投与される。選択される量は、投与経路、投与期間、投与時間、選択された式（Ｉ）の化合物の排出速度、或いは該化合物と組み合わせて使用される様々な製品の排出速度、患者の年齢、体重及び身体状態並びに患者の病歴、並びに医薬において公知の任意の他の情報を含む多数の要因に依存する。
【０１０７】
投与経路は、経口又は非経口、典型的には直腸、舌下、鼻腔内、腹腔内（ＩＰ）、静脈内（ＩＶ）、動脈内（ＩＡ）、筋肉内（ＩＭ）、小脳内、髄腔内、腫瘍内及び／又は皮内であり得る。医薬組成物は、上記経路の１つ又はいくつかに適応される。医薬組成物は、好ましくは、適切な無菌溶液の注射により若しくは静脈内注入により、又は消化管を介して液体若しくは固体の投与形態で投与される。
【０１０８】
医薬組成物は、薬学的に適合する溶媒中の溶液として、又は適切な薬学的溶媒若しくはビヒクル中のゲル、油、エマルション、懸濁液若しくは分散液として、或いは当該技術分野において公知の方法で固体のビヒクルを含有するピル、錠剤、カプセル剤、散剤、坐剤などとして、可能であれば持続放出及び／又は遅延放出を付与する剤形若しくはデバイスを介して、製剤化され得る。このタイプの製剤では、セルロース、脂質、炭酸塩又はデンプンのような剤が有利に使用される。
【０１０９】
製剤（液体及び／又は注射用及び／又は固体）中で使用され得る剤又はビヒクルは、賦形剤又は不活性ビヒクル、すなわち薬学的に不活性及び非毒性のビヒクルである。
【０１１０】
薬学的使用に適合し、かつ当業者に公知の、例えば、生理食塩の、生理学的な、等張の及び／又は緩衝化された溶液が挙げられ得る。組成物は、分散剤、可溶化剤、安定剤、防腐剤などより選択される１つ以上の剤又はビヒクルを含み得る。
【０１１１】
特定の例は、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、シクロデキストリン、ポリソルベート80、マンニトール、ゼラチン、ラクトース、リポソーム、植物又は動物油、アラビアゴムなどである。好ましくは、植物油が使用される。
【０１１２】
経口投与に適した本発明の製剤は、各々が所定量の活性成分を含有する、カプセル剤、サッシェ剤（sachets）、錠剤又はロゼンジ剤（lozenges）として別個の単位の剤形で；散剤又は顆粒の剤形で；水性液剤又は非水性液剤中の溶液又は懸濁液の剤形で；或いは水中油型エマルション又は油中水型エマルションの剤形であり得る。
【０１１３】
非経口投与に適した製剤は、好都合には、好ましくはレシピエントの血液と等張である活性成分の無菌油性又は水性製剤を含む。またこのような製剤はすべて、他の薬学的に適合性があり、かつ非毒性の補助剤、例えば、安定化剤、抗酸化剤、結合剤、着色剤、乳化剤又は香味物質を含むことができる。
【０１１４】
したがって、本発明の製剤は、薬学的に許容し得る担体及び含まれてもよい他の処置成分と共に、活性成分を含む。担体は、該製剤のその他の成分と適合し、そのレシピエントに有害ではないという意味で「許容可能」でなければならない。医薬組成物は、有利には、適切な無菌溶液の注射若しくは静脈内注入によって、又は消化管を経由する経口投与として適用される。これらの化学療法剤の大部分を安全かつ有効に投与するための方法は、当業者に公知である。加えて、それらの投与は標準的な文献に記載されている。
【０１１５】
本発明の別の目的は、別個の容器に入った本発明による少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物及び好ましくは少なくとも１つの化学療法薬を含むキットである。キットは更に、本明細書に記載の方法のいずれかを実施するための、例えば、対象においてガンを予防又は処置するため、ガン転移を予防又は処置するため、及び／又はガン再発を予防又は処置するための、本発明による組成物を調製するための説明書を含むことができる。
【０１１６】
特定の実施態様において、本発明は、本明細書に記載の組成物を調製するための本発明によるキットの使用に関する。
【０１１７】
別の特定の実施態様において、キットは、本明細書に記載の方法のいずれかを、特に、対象においてガンを処置するための、ガン転移を予防するための、及び／又はガン再発を予防するための方法を実施するのに適している。
【０１１８】
本発明の更なる態様及び利点は、以下の実験の部で開示されるが、これは例示に過ぎないとみなされるべきである。
【実施例】
【０１１９】
生物学的材料
ムラサキカイメンムコサの標本は、２０１３年２月〜５月に、ラード  ド  ヴィルフランシュ−シュル−メール（the rade de Villefranche-sur-Mer）（フランス）の人目につかない洞穴又は洞窟で２０又は４０ｍの深さの範囲で潜水用呼吸装置（SCUBA diving）を使用して手で収集し、使用するまで凍結した。
【０１２０】
ヒトメラノーマ細胞株ＭＥＷＯ及びＡ３７５は、ATCCから購入したもので、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５は、C. Vandierから入手し、それは元々ATCCから購入したものである。３つの細胞株を、１０％ＦＢＳ、１００U/mLペニシリン及び１００mg/mLストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地中で、５％ＣＯ２／９５％空気の水を飽和させた(water-saturated)雰囲気中、３７℃で増殖させた。
【０１２１】
Ｋ６９９サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）酵母株（R. Arkowitzより親切に寄贈されたＭａｔａ、ｕｒａ３及びｌｅｕ ２−３）を、ｐＹＥＰ−ｈＰｔｃ−ＭＡＰ（ヒトPatched過剰発現）、ｐＹＥＰ−ｍＭｙｏ−ＭＡＰ（コントロ−ル）又はｐＹＥＰ−ｈＰｔｃＧ５０９ＶＤ５１３Ｙ−ＭＡＰ（変異Patched発現）発現ベクターで形質転換し、６００nmでのＯＤが５〜７になるまで、記載されている（Bidet et al. 2011）ように１８℃で増殖させた。
【０１２２】
スクリーニング試験１：ドキソルビシンに対するPatched発現酵母の耐性への海綿体抽出物の効果。
ヒトPatchedを発現するサッカロマイセス・セレビシエを、最小培地（ロイシン不含の、グルコースとアミノ酸との混合物２％を補充）１０mL中で３０℃にて増殖させた。対数期（ＯＤ６００＝５〜７）が得られたとき、酵母を同じ培地中でＯＤ６００＝１〜２まで前培養した。次いで酵母を、９６ウェルプレート中、グルコース２％を含有する富栄養培地で希釈した。メタノール画分又は精製画分（最終濃度１０μｇ/mL）をすべてのウェルに添加し、ドキソルビシン（最終濃度１０μM）を半分のウェルに添加した。プレートをシェーカー（マイクロタイタープレートシェーカーSSL5 Stuart）上、１２５０rpmで１８℃にてインキュベートし、６００nmでの吸光度を約７２時間記録した。
【０１２３】
スクリーニング試験２：ドキソルビシンの細胞毒性に対する海綿体画分の効果。
メラノーマ細胞ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、Ｍｅｗｏ及びＡ３７５を、９６ウェルプレートに播種し、６０％〜７０％コンフルエンスに達するまで、ＤＭＥＭ完全培地で４８時間増殖させた。次いで、培地を除去し、既定濃度の関心ある化合物又はコントロールとしてＤＭＳＯを含有するＤＭＥＭ完全培地１００μL/ウェルと交換した。２時間後、ドキソルビシンを含有するＤＭＥＭ完全培地１００μLを半分のウェルに添加して、２μMドキソルビシンを得た。プレートを５％ＣＯ２／９５％空気の水を飽和させた雰囲気下で３７℃にてインキュベートした。２４時間後、マイクロプレートを、１００μL/ウェル（wells）のニュートラルレッド（ＮＲ）溶液（ＤＭＥＭ中５０μｇ/mL）と共に３７℃で３時間インキュベートした。ＰＢＳで４℃にて急速洗浄した後、マイクロプレートを、吸い取り紙の上で穏やかに数回タップした。細胞を、１％酢酸、４９％Ｈ２Ｏ、５０％エタノールを含有する１００μLの溶液で、７００rpmで３分間ボルテックスして可溶化し、６００nmでの吸光度を測定した。Regressiソフトウェアを用いてＥＣ５０を計算した。
【０１２４】
タンパク質の定量化
タンパク質濃度は、Bio-Radキットを使用してBradford法によって決定した。
【０１２５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティング
メラノーマ細胞由来の全抽出物を調製した。試料を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、標準的な技術を用いてニトロセルロース膜（Amersham）にトランスファーした。ブロッキング緩衝液（２０mmol/Ｌ トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．５、４５０mmol/Ｌ ＮａＣｌ、０．１％Tween-20及び４％脱脂乳）中で室温にて１時間後、ニトロセルロース膜を、ウサギ抗Patched抗血清（Ab130.6  １：１０００  M. Ruatからの寛大な贈り物、又はAbcamからのAb39266  １／１０００）及びモノクローナルマウス抗βチューブリン抗体（Sigma；１／１０００）と共に４℃で一晩インキュベートした。３回洗浄した後、膜を、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した抗マウス（１：５０００）又は抗ウサギ（１：３０００）免疫グロブリン（Dako）と共に４５分間インキュベートした。検出は、Las3000（Fuji）でECLキット（Millipore）を用いて行った。
【０１２６】
薬剤排出の測定
メラノーマ細胞において：メラノーマ細胞にドキソルビシンを取り込ませるために、プロトコルはBidetら（2012）のものを適用した。細胞を１２ウェルプレート中のカバーガラス上に播種し、８０％コンフルエンスまで増殖させた。カバーガラスを、生理緩衝液（１４０mM ＮａＣｌ、５mM ＫＣｌ、１mM ＣａＣｌ２、１mM ＭｇＳＯ４、５mMグルコース、２０mM ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）中のドキソルビシン（１０μM）と共に３７℃で２時間インキュベートし、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で迅速に濯いだ。各細胞株の１つのカバーガラスを直ちに、ドキソルビシンの負荷コントロールのために４％パラホルムアルデヒド（Sigma）で１０分間固定した。その他のカバーガラスを、ＤＭＳＯ又は１０μMのパニセインを補充した生理的緩衝液と共に３７℃で穏やかに振盪しながら３０分間インキュベートし、直ちに４％パラホルムアルデヒドで固定した。カバーガラスを、対物レンズ４０×及びAlexa 594プローブ用のフィルターを使用する落射蛍光顕微鏡によって観察した。ドキソルビシンの細胞内蛍光の定量化は、各条件について３つの異なるフィールドの３０個以上の細胞についてImage Jソフトウェアを用いて行った。Ｐ＜０．０５で有意性に達するスチューデントｔ検定を用いて結果を分析した。
【０１２７】
酵母において：Patched（ｈＰｔｃ）を発現する酵母、変異体Patched（ｈＰｔｃＧ５０９ＶＤ５１３Ｙ）を発現する酵母又はコントロール酵母を、冷水で洗浄し、５mMの２−デオキシ−Ｄ−グルコースを補充したＨｅｐｅｓ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）にＯＤ６００が１０になるように再懸濁し、１０μMのドキソルビシンと共に低温室中４℃で２時間、光から保護された回転ホイール上でインキュベートした。酵母を遠心分離し、上清を除去した。１つの試料を、ドキソルビシン添加コントロールのために４％パラホルムアルデヒドで直ちに固定した。その他の試料を、ＤＭＳＯ又は１０μMのパニセインを補充した５mMの２−デオキシ−Ｄ−グルコースを含有するＨｅｐｅｓ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）に再懸濁し、光から保護されたBenchmark Multi-therm shakeで穏やかに振盪しながら２０℃で１０分間インキュベートした。試料を１８，０００ｇで１分間遠心分離し、上清を除去し、酵母を４％パラホルムアルデヒドで固定した。１０μLの各試料をカバーガラス上に置き、対物レンズ６３×及びAlexa 594用のフィルターを使用する落射蛍光顕微鏡によって観察した。ドキソルビシンの細胞内蛍光の定量化は、各条件について３つの異なるフィールドの３０個以上の細胞についてImage Jソフトウェアを用いて行った。Ｐ＜０．０５で有意性に達するスチューデントｔ検定を用いて結果を分析した。
【０１２８】
結果
ムラサキカイメンムコサメタノール画分は、ドキソルビシン対するPatched発現酵母の耐性を阻害する物質を含有する。
発明者らは、９６ウェルプレート中、既述（Bidet et al., 2011, 2012）のように、形質膜にヒトPatchedを発現する酵母の出芽酵母を培養した。ムラサキカイメンムコサ粗抽出物のメタノール画分を調製し、１０mg/mLでＤＭＳＯに溶解し、ドキソルビシン（ｄｘｒ）を補充した、又は補充していない酵母培地に１０μｇ/mLの最終濃度で添加した。既に報告されている（Bidet et al., 2012）ように、ヒトPatchedは、広範囲のガンを処置するために使用されるアルキル化剤であるｄｘｒによる増殖阻害に対する耐性を付与する（図２Ｂ）。ムラサキカイメンムコサ由来のメタノール画分は、それ単独（ｄｘｒの非存在）で酵母の増殖に対する影響が小さく、ｄｘｒの存在下ではｈＰｔｃ発現酵母の増殖を有意に阻害する（図２Ｂ）。このことは、ムラサキカイメンムコサ由来のメタノール画分が、Patched過剰発現酵母のｄｘｒに対する耐性を阻害できる化合物を含有していることを示唆している。
【０１２９】
次いで、ムラサキカイメンムコサ由来のメタノール画分を、分取Ｃ１８逆相ＨＰＬＣにより精製して、９種類の化合物（Ｐ１〜Ｐ９）を得た（図２Ｃ）。精製画分を、ｄｘｒの存在下又は非存在下で酵母増殖培地に添加した（図２Ｄ）。これらの画分のうちの５つは、Patched発現酵母のｄｘｒに対する耐性を強力に阻害することができた：Ｐ２、Ｐ３、Ｐ５、Ｐ６及びＰ７。酵母増殖に対するＰ４及びＰ９の効果はより低かった。
【０１３０】
1 H NMRスペクトルは、これらの化合物のうちの４つの同定を可能にし、それらの純度を確認した。これらの化合物は、パニセインファミリーのメンバーである：パニセイン−Ｃ（Ｐ２）、パニセイン−Ｂ３（Ｐ３）、パニセイン−Ｂ２（Ｐ４）及びパニセイン−Ａ−ヒドロキノン（Ｐ５）（図３）。
【０１３１】
ムラサキカイメンムコサから精製したパニセインは、メラノーマ細胞に対するドキソルビシンの細胞毒性を増加させる。
ムラサキカイメンムコサ抽出物から精製したパニセインのｄｘｒ細胞毒性に対する効果を評価するために、３つのメラノーマ細胞株を選択した。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞は、Ｍ１４メラノーマ細胞株に由来し、ガン転移を研究するために使用される（Rae et al., 2007）。メラノーマ転移部位（リンパ節組織）に由来するＭｅＷｏ細胞株及びヒト悪性メラノーマに由来するＡ３７５細胞株は、そして、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ変異を有する。これらの３つの細胞株は、ウエスタンブロッティング（図４Ａ）及びPatched抗体を用いる免疫蛍光標識（図４Ｂ）によって示されるように、Patchedタンパク質を過剰発現し、かつ転移能を有することが公知である。
【０１３２】
細胞生存率測定前に、細胞をパニセイン、及びｄｘｒ有り又無しで２４時間処理した（図５）。結果は、化合物Ｐ２、Ｐ３及びＰ４が、ｄｘｒによって誘導されるＭＤＡ−ＭＢ−４３５及びＭｅＷｏに対する細胞死亡率を約２倍増加させるが、Ａ３７５に対しては効果を及ぼさないことを示す。Ｐ５は、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５及びＭｅＷｏに対するｄｘｒ細胞毒性を約５〜８倍、そしてＡ３７５に対するｄｘｒ細胞毒性を２倍増加させる。Ｐ５は、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭｅＷｏ及びＡ３７５細胞について、それぞれ９．３μM、５μM及び２２．５μMで５０％のｄｘｒ細胞毒性増強を誘導する。アネキシンＶ及びＤＡＰＩ標識は、化合物Ｐ５が早期アポトーシスを増加させることを示している（図１０）。
【０１３３】
パニセインＡヒドロキノン又はＤＭＳＯで２４時間処理したＭＥＷＯ又はＡ３７５細胞について実施したウェスタンブロット分析は、パニセインＡヒドロキノンが、これらの細胞におけるPatched発現又は分解に効果がないことを示した（図１１）。
【０１３４】
パニセインはドキソルビシン排出を阻害する。
カバーガラス上で増殖させたメラノーマ細胞にｄｘｒを添加し、固定（添加コントロール用）し、又はＤＭＳＯ（排出コントロール）若しくはパニセインを含有する排出緩衝液と共にインキュベートしてから固定し、細胞イメージングを用いて分析した（図６Ａ及び１２Ａ）。細胞におけるｄｘｒ蛍光強度は、実験によって少なくとも３０細胞について定量化され、かつ、「健常な」ケラチノサイトＨａＣａＴとは対照的に、化合物Ｐ５の存在が、Ａ３７５及びＭｅＷｏ細胞中へのｄｘｒを有意に（約２５％）増加させたことを示している。これらの結果は、パニセインＡヒドロキノンがメラノーマ細胞からのドキソルビシン排出を阻害することを示唆している。
【０１３５】
パニセインがPatched阻害によりｄｘｒ排出を阻害するかどうかを確かめるために、発明者らは、ヒトPatchedを過剰発現する酵母及びコントロール酵母におけるｄｘｒ排出を比較した。ｄｘｒを添加した後、酵母を遠心分離し、ｄｘｒ添加コントロール（ＬＣ）のために固定し、又は排出測定のためにＤＭＳＯ若しくはパニセインを補充した緩衝液中に再懸濁した。２０℃で１０分後、酵母を回収して固定し、カバーガラス上に置いた。ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーターを阻害するために、添加及び排出の間に、緩衝液に２−デオキシ−Ｄ−グルコースを加えた。少なくとも３０個の酵母のｄｘｒ蛍光強度を各実験について測定した。図６Ａ及び１２Ａは、３つの独立した実験の平均蛍光強度を示す。Patchedのｄｘｒ排出活性によって、コントロール緩衝液（ＤＭＳＯ含有）中、排出後のｈＰｔｃ発現酵母で測定したｄｘｒ蛍光は、コントロール酵母で測定したものより有意に低かった（Bidet et al., 2012）。排出中に化合物Ｐ４及びＰ５と共にインキュベートしたｈＰｔｃ発現酵母は、コントロール酵母とは対照的に有意に高いｄｘｒ蛍光量を示し（図６Ｂ及び１２Ｂ並びに表２）、このことは、これらの化合物がPatchedのｄｘｒ排出活性を有意に阻害できることを示唆している。これは、Patched変異体ＶＸＸＸＹを過剰発現する酵母を用いて確認された。Patchedは、その推定第４膜貫通セグメントにモチーフＧＸＸＸＤ（ニーマン・ピック（Niemann-Pick）疾患タンパク質（ＮＰＣ１）において高度に保存されている）及びＡｃｒＢのようなＲＮＤファミリーの多くの細菌性ＭＤＲトランスポーターを保持する（Bidet et al., 2012）。ｈＰｔｃＶＸＸＸＹは、５０９位のグリシンがバリンによって置き換えられ、５１３位のアスパラギン酸がチロシンによって置き換えられた二重変異を有する。ｈＰｔｃＶＸＸＸＹを過剰発現する酵母は、野生型ｈＰｔｃを過剰発現する酵母よりもｄｒｘによる増殖阻害に対する耐性が低い（Bidet et al., 2012）。先の観察によれば、変異体タンパク質ｈＰｔｃＶＸＸＸＹを発現する酵母は、野生型ｈＰｔｃを発現する酵母よりも、排出後に有意に多くのｄｘｒを含んでいた（図６Ｂ）。ｈＰｔｃＶＸＸＸＹ酵母におけるｄｘｒの量は、コントロール酵母におけるｄｘｒの量と同等であり、ｈＰｔｃがｄｘｒを細胞外に輸送することを確信させる。野生型ｈＰｔｃを発現する酵母とは反対に、ｈＰｔｃＶＸＸＸＹを発現する酵母では、排出緩衝液中のパニセインの存在は、ｄｘｒ含量を増加させなかった（図６Ｂ及び１２Ｂ、表２）。これらの結果は、パニセインがPatchedのｄｘｒ排出活性を阻害するという仮説を支持する。
【０１３６】
【表２】
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【０１３７】
パニセインＡヒドロキノンは、ＡｃｒＢ構造及びPatched構造モデルの両方でドキソルビシン結合部位の近くに強力なドッキングクラスターを示す。
Murakamiら（2006）によって、大腸菌におけるＲＮＤファミリー由来の主要多剤排出トランスポーターであるＡｃｒＢの結晶構造が、ドキソルビシンの有り及び無しで記載された。ＡｃｒＢ−薬物複合体は、３つのプロトマーからなり、それらの各々は、輸送サイクルの３つの機能状態のうちの１つに対応する異なるコンフォメーションを有する。結合した基質は、３つのプロトマーのうちの１つのペリプラズムドメインに見出された。大量の結合ポケットは芳香族であり、マルチサイト結合を可能にする。
【０１３８】
Isabelle Broutin（Laboratoire de Cristallographie et RMN Biologiques, UMR 8015 CNRS, Faculte de Pharmacie Paris V France）は、化合物Ｐ２及びＰ５のＡｃｒＢ−ｄｘｒ構造へのドッキングを行った。この分析は、多くのクラスターにおけるＰ２結合について低い蓋然性を示し、より興味深いことに、ｄｘｒ結合部位に近いクラスターにおけるＰ５の結合の高い蓋然性を示す。次いでIsabelle Broutinは、ＡｃｒＢ構造からPatchedの構造のモデルを実現化し、化合物Ｐ２とＰ５とのドッキングを実施して、ＡｃｒＢ構造上のドッキングに関して報告された結果と同じ結果を得た（図７）。
【０１３９】
この分析は、パニセインＡヒドロキノンがPatchedのｄｘｒ結合部位の近くに結合し、ｄｘｒ結合を阻止し得ることを示している。これは、パニセインＡヒドロキノンの存在下で観察されたｄｘｒ排出の阻害とよく一致している。
【０１４０】
パニセインはまた、Patched過剰発現によって酵母に付与されたダカルバジン及びシスプラチンに対する耐性を阻害する。
酵母中のヒトPatchedの発現は、ダカルバジン又はシスプラチンのようなメラノーマを処置するために現在使用されている他の化学療法剤の存在下で増殖する能力を、これらの酵母に付与する。発明者らの結果は、増殖培地中の化合物Ｐ２、Ｐ３又はＰ５の存在が、ダカルバジン、シスプラチン及びベムラフェニブに対する酵母の耐性を阻害することを示す（図８）。
【０１４１】
結論
本発明者らの結果は、地中海海綿体ムラサキカイメンムコサから精製したいくつかのパニセイン、特にパニセインＡヒドロキノンがインビトロでメラノーマ細胞に対するドキソルビシン細胞毒性を増強できることを初めて示す。排出測定は、パニセインがPatchedのｄｘｒ排出活性を阻害することを強力に示唆している。この仮説は、パニセインＡヒドロキノンがｄｘｒ結合部位の近くで結合する高い蓋然性を有することを示している、大腸菌多剤輸送体ＡｃｒＢの構造及びPatchedの構造モデルで実現されたドッキングによって支持される。これは、パニセインＡヒドロキノンのPatchedへの結合がｄｘｒ排出を阻止することを示す。これらの結果はまた、パニセインが、ダカルバジン、シスプラチン及びベムラフェニブのようなメラノーマを処置するために現在使用されている他の化学療法剤に対するPatchedによって付与された耐性を阻害できることを示す。
【０１４２】
参考文献
【表３】
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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