(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞壁加水分解関連タンパク質の活性が内在的活性に比べて不活性化されるように変異された、Ｌ−リジン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物であって、細胞壁加水分解関連タンパク質が、細胞壁関連加水分解酵素またはＮ‐アセチルムラモイル‐Ｌ‐アラニンアミダーゼであり、前記細胞壁加水分解関連タンパク質が、配列番号１〜４で表示されるアミノ酸配列を有するタンパク質からなる群から選択された１種以上のタンパク質である、微生物。
【請求項２】
前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である、請求項１に記載のＬ−リジン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
【請求項３】
（ｉ）請求項１または２に記載のコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階；及び
（ｉｉ）前記培養による培地または前記微生物からＬ−リジンを回収する段階を含む、Ｌ−リジンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＬ−リジン生産能を有する微生物及びそれを用いたＬ−リジン生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物飼料やヒトの医薬品、または化粧品産業に用いられているＬ−アミノ酸、特にＬ−リジンは主にコリネバクテリウム属菌株やエシェリキア属菌株を利用した発酵により生産されている。これによりＬ−リジンを生産するための高効率生産菌株及び発酵工程技術の開発のための様々な研究が行われているが、まだ発酵後半の生産能減少の原因になりうる細胞溶解制御に対する研究は不十分な実情である。
【０００３】
一方、細胞壁加水分解酵素（cell wall hydrolases）は、バクテリアの細胞壁を分解する酵素として知られており、 ペプチドグリカン（peptidoglycan）を有する全ての微生物に存在する（非特許文献１）。このような細胞壁加水分解酵素に対する研究が多様なバクテリアで進行されているが、その正確な活性調節機序に対しては知られていない。
【０００４】
最近微生物の培養時に発生される細胞溶解機序に対するモデルが肺炎球菌（Pneumococcal）で提示されたことがある（非特許文献２）。具体的に、まず細胞が多様なストレスに露出されると、細胞外部壁に存在する細胞壁加水分解酵素の活性が増加して細胞壁の分解が始まる。このような細胞壁加水分解酵素の持続的な作用で細胞が溶解されると、細胞質に存在する細胞壁加水分解酵素が細胞外部に露出される。一連の過程が持続的に起こって細胞壁加水分解酵素の量が細胞外部の閾値（threshold）を超えると、回りの細胞が溶解される機序が報告されたことがある。しかし、発酵培養の過程中に発生される細胞溶解とアミノ酸生産との連関性に対しては公知されたことはない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】韓国特許登録第１０‐０１５９８１２号
【特許文献２】韓国特許登録第１０‐０９２４０６５号
【特許文献３】韓国特許登録第１０‐００７３６１０号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Rice KC & Bayles KW. MicrobiolMol Biol Rev. 2008. 72:85-109
【非特許文献２】Mellroth P et al. J Biol Chem. 2012. 287:11018-29
【非特許文献３】Moore, S., Stein, W. H., J. Biol. Chem.1948, 176, 367-388
【非特許文献４】Binder et al. Genome Biology 2012, 13:R40
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは代表的なＬ−リジン生産菌株であるコリネバクテリウム属微生物からＬ−リジン生産能を増加させうる有効形質を持続的に探索するために鋭意努力した結果、細胞壁加水分解に関連するタンパク質をコードする遺伝子が欠損される場合、Ｌ−リジン生産能が増加することを確認した。また、類似な機能を有するタンパク質をコードする遺伝子が欠損するとき、リジン生産能増加に影響があることをさらに確認することにより、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一つの目的は、Ｌ−リジン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を提供することにある。
【０００９】
本発明のもう一つの目的は、前記Ｌ−リジン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を用いてＬ−リジンを製造する方法を提供することにある。
【発明の効果】
【００１０】
本発明による微生物である細胞壁加水分解に関連するタンパク質の内在的活性に比べて、減少または不活性化されたコリネバクテリウム属微生物は、発酵後半の生産能の増加を誘導する新たな菌株であって、Ｌ−リジン生産能を有しているコリネバクテリウム属微生物に新しいパラダイムとして適用され、高収率でＬ−リジンを生産することができる微生物を提供しうる。これにより、製造されたＬ−リジンを動物飼料または動物飼料添加剤だけでなく、ヒトの食品または食品添加剤、医薬品などの多様な製品に応用させることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
前記目的を達成するために、本発明は一つの様態として細胞壁加水分解関連タンパク質の活性が内在的活性に比べて不活性化されるように変異された、Ｌ−リジン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
【００１２】
本発明において用語、「細胞壁加水分解関連タンパク質」は、コリネバクテリウム属微生物において細胞壁を加水分解させうる関連タンパク質を意味する。前記細胞壁加水分解関連タンパク質は、細胞壁関連加水分解酵素（cell wall-associated hydrolase）またはＮ‐アセチルムラモイル‐Ｌ‐アラニンアミダーゼ（N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase）タンパク質であってもよいが、これに制限されるものではない。
【００１３】
前記に記述されたように、微生物で細胞壁を加水分解させうる関連タンパク質活性を有すると、当該タンパク質及び遺伝子配列は公知のデータベースから得ることができ、その例としてＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋなどがあるが、これに制限されない。
【００１４】
前記細胞壁関連加水分解酵素は、特にこれに制限されないが、コリネバクテリウム属微生物、具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のＮＣｇ１１４８０遺伝子コードタンパク質、ＮＣｇ１２１０７遺伝子コードタンパク質またはＮＣｇ１２１０８遺伝子コードタンパク質であってもよい。具体的な例として、細胞壁関連加水分解酵素は配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列または配列番号３のアミノ酸配列を有してもよいが、前記活性を有するタンパク質配列は制限なく含まれてもよい。また、細胞壁関連加水分解酵素の活性を有するタンパク質をコードする塩基配列であれば、制限なく含まれることができ、具体的な例として、配列番号５の塩基配列、配列番号６の塩基配列または配列番号７の塩基配列によりコードされるタンパク質であってもよいが、これに制限されない。
【００１５】
前記Ｎ‐アセチルムラモイル‐Ｌ‐アラニンアミダーゼ（N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase）はコリネバクテリウム属微生物、具体的にはコリネバクテリウム・グルタミカム由来のＮＣｇ１２９８６遺伝子をコードするタンパク質であってもよい。具体的な例として、前記Ｎ‐アセチルムラモイル‐Ｌ‐アラニンアミダーゼは配列番号４のアミノ酸配列を有してもよいが、前記活性を有するタンパク質であれば、そのアミノ酸配列は制限なく含まれてもよい。また、Ｎ‐アセチルムラモイル‐Ｌ‐アラニンアミダーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列であれば制限なく含まれてもよく、具体的な例として、配列番号８の塩基配列によりコードされるタンパク質であってもよいが、これに制限されない。
【００１６】
本発明の前記各タンパク質は、前記各配列番号で記載したアミノ酸配列だけでなく、前記配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含まれてもよい。このような相同性を有する配列として実質的に前記各タンパク質と同一または相応する効能を現すタンパク質を示すアミノ酸配列であれば、制限なく含まれる。また、このような相同性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列も本発明の範囲内に含まれるのは自明である。
【００１７】
また、本発明の前記各タンパク質をコードする遺伝子は、前記各配列番号で記載したアミノ酸をコードする塩基配列だけでなく、前記配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を示す塩基配列として実質的に前記各タンパク質と同一または相応する効能を現すタンパク質をコードする遺伝子配列であれば、制限なく含む。また、このような相同性を有する塩基配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換または付加された塩基配列も本発明の範囲内に含まれるのは自明である。
【００１８】
本発明で使用される用語、「相同性」とは、タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列やアミノ酸配列の類似な程度を意味するが、相同性が十分高い場合、該当遺伝子の発現産物は同一または類似な活性を有することができる。すなわち、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド部分（moiety）間の同一性のパーセントをいう。一つの部分から他の一つの部分までの配列間の相同性は周知の当該技術により決定されうる。例えば、相同性は、配列情報を整列して容易に入手可能なコンピュータプログラムを利用して二つのポリヌクレオチド分子または二つのポリペプチド分子間の配列情報を直接整列して決定されうる。前記コンピュータプログラムはＢＬＡＳＴ(ＮＣＢＩ)、ＣＬＣ Ｍａｉｎ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ (ＣＬＣ ｂｉｏ)、ＭｅｇＡｌｉｇｎＴＭ(ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ)などであってもよい。また、ポリヌクレオチド間の相同性は、相同領域間の安定された二本鎖を構成する条件下でポリヌクレオチドを混成化した後、一本鎖特異的ヌクレアーゼで分解させて、分解された断片のサイズを決定することにより、決定することができる。
【００１９】
本発明において用語、「内在的活性」は、本来微生物が変形される前の状態または天然の状態で有しているタンパク質の活性状態を意味する。
【００２０】
前記「酵素の活性が内在的活性に比べて不活性化されるように変異された」は、酵素をコードする遺伝子の発現が天然型菌株または変形前の菌株に比べて全く発現されない場合、または発現されてもその活性がないかまたは減少されたことを意味する。
【００２１】
このように活性が内在的活性に比べて不活性化されることは、本来微生物が天然の状態または変形前の状態で有している酵素の活性と比較するとき、その活性がないかまたは減少されたことを意味する。前記減少は、前記酵素をコードする遺伝子の変異などにより酵素自体の活性が本来微生物が有している酵素の活性に比べて減少した場合と、これをコードする遺伝子の発現阻害または翻訳（translation）阻害などにより細胞内で全体的な酵素活性の程度が天然型菌株または変形前の菌株に比べて低い場合、これらの組み合わせも含む概念である。
【００２２】
前記「活性がない場合」は、酵素をコードする遺伝子の発現が天然型菌株または変形前の菌株に比べて全く発現されない場合及び/または発現されてもその活性が除去された場合を意味する。
【００２３】
このような酵素活性が不活性化されるように変異させる方法は、当該分野によく知られている多様な方法の適用により達成させることができる。前記方法の例として、前記酵素の活性が除去された場合を含み、前記酵素の活性が減少されるように突然変異された遺伝子で染色体上の前記酵素をコードする遺伝子を代替する方法；前記酵素をコードする染色体上の遺伝子の発現調節配列に変異を導入する方法；前記酵素をコードする遺伝子の発現調節配列を活性が弱いかまたはない配列に交替する方法；前記酵素をコードする染色体上の遺伝子の全体または一部を欠失させる方法；前記染色体上の遺伝子の転写体に相補的に結合して前記ｍＲＮＡから酵素への翻訳を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）を導入する方法；前記酵素をコードする遺伝子のＳＤ配列の上流にＳＤ配列と相補的な配列とを人為的に付加して２次構造物を形成させてリボソーム（ribosome）の付着を不可能にする方法及び該当配列のＯＲＦ（open reading frame）の３’末端にプロモーターを付加して逆転写させるＲＴＥ（Reverse transcription engineering）方法などがあり、これらの組み合わせによっても達成することができるが、前記例により特別に制限されるものではない。
【００２４】
具体的に、酵素をコードする遺伝子の一部または全体を欠失する方法は、細菌内の染色体挿入用ベクターを介して染色体内の内在的目的タンパク的を暗号化するポリヌクレオチドを、一部の核酸配列が欠失されたポリヌクレオチドまたはマーカー遺伝子に交替することにより実行されうる。このような遺伝子の一部または全体を欠失する方法の一例として、相同組換えにより遺伝子を欠失させる方法を利用してもよい。
【００２５】
前記で「一部」とは、ポリヌクレオチドの種類に応じて相異するが、具体的には１〜３００個、具体的には１〜１００個、より具体的には１〜５０個であってもよいが、特にこれに制限されるものではない。
【００２６】
前記で「相同組換え（homologous recombination）」とは、互いに相同性を有する遺伝子鎖の座位で連結交換を介して起こる遺伝子組換えを意味する。
【００２７】
本発明の具体的な実施例によると、相同組換えにより前記タンパク質を不活性化させた。
【００２８】
具体的に、発現調節配列を変形する方法は、前記発現調節配列の核酸配列に欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせで発現調節配列上の変異を誘導して行うか、さらに弱いプロモーターに交替するなどの方法により行うことができる。前記発現調節配列には、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、及び転写と解読の終結を調節する配列を含む。
【００２９】
また、染色体上の遺伝子配列を変形する方法は、前記酵素の活性がさらに減少されるように遺伝子配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換、またはこれらの組み合わせで配列上の変異を誘導して行うか、さらに弱い活性を有するように改良された遺伝子配列または活性がなくなるように改良された遺伝子配列に交替することにより行うことができる。
【００３０】
本発明において用語、「Ｌ‐リジン生産能を有する微生物」は、発酵によりＬ‐リジンを生産することができる微生物菌株を意味する。その例として、本発明にかかる操作により細胞壁加水分解に関連するタンパク質の活性が内在的活性に比べて不活性化されるように変異させて、リジン生産のための発酵中に発生する細胞溶解を制御してＬ‐リジン生産能を増加させることができる菌株を含むが、これに限定されない。
【００３１】
本発明で前記Ｌ‐リジン生産能を有する微生物は、本発明の細胞壁加水分解関連タンパク質の活性が内在的活性に比べて不活性化されるように変異されうるすべてのコリネバクテリウム属微生物を含んでもよい。その例として、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム・ファーメンタム（Brevibacterium fermentum）などが用いられてもよいが、これに制限されない。その一例として、前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）を用いてもよい。前記変異されたコリネバクテリウム属微生物は細胞壁加水分解関連タンパク質の活性が内在的活性に比べて不活性化されるように変異されない微生物に比べてＬ‐リジン生産能が増大された特徴を有する。
【００３２】
本発明のもう一つの様態として、（ｉ）本発明の前記細胞壁加水分解関連タンパク質の活性が内在的活性に比べて非活性化されるように変異された、Ｌ‐リジン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を培養する段階；及び（ｉｉ）前記培養による培養物または前記微生物からＬ‐リジンを回収する段階を含む、Ｌ‐リジンの製造方法を提供する。
【００３３】
前記Ｌ‐リジン生産能が増加されたコリネバクテリウム属微生物は前記で説明したとおりである。
【００３４】
本発明において用語、「培養」は、微生物を適当に人工的に調節した環境条件で生育させたことを意味する。本発明でコリネバクテリウム属微生物を用いてＬ‐リジンを培養する方法は当業界に広く知られている方法を利用して行うことができる。具体的に、前記培養は、バッチ工程、注入バッチまたは反復注入バッチ工程（fed batch or repeated fed batch process）で連続式で培養してもよいが、これに限定されるものではない。
【００３５】
培養に用いられる培地は、適切な方式で特定菌株の要件を満たさなければならない。コリネバクテリウム菌株に対する培養培地は公知されている（例えば、Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981）。使用されうる糖源としては、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デンプン、セルロースのような糖及び炭水化物、大豆油、ひまわり油、ヒマシ油、ココナッツ油のような油及び脂肪、 パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、グルコン酸、酢酸、ピルビン酸のような有機酸が含まれてもよいが、これに限定されるものではない。これらの物質は個別的に、または混合物として使用されてもよい。使用されうる窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、大豆、小麦、及び尿素または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが含まれてもよいが、これに制限されるものではない。窒素源もまた個別的に、または混合物として使用されてもよい。使用されうるリン源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは相応するナトリウム含有塩が含まれてもよいが、これに限定されるものではない。また、培養培地は成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含有してもよい。最後に、前記物質に加えて、アミノ酸及びビタミンのような必須成長物質が使用されてもよい。また、培養培地に適切な前駆体が使用されてもよい。前記された原料は、培養過程で培養培地に適切な方式によって回分式または連続式で添加されてもよい。このような多様な培養方法は、例えば、文献（"Biochemical Engineering" by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176）に開示されている。
【００３６】
水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアのような基礎化合物またはリン酸または硫酸のような酸化合物を適切な方式で用いて培養物のｐＨを調節してもよい。または、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡生成を抑制してもよい。好気状態を維持するために、培養培地内に酸素または酸素含有気体（例、空気）を注入してもよい。培養培地の温度は通常２０〜４５℃、好ましくは２５〜４０℃であってもよいが、条件に応じて変更可能である。培養は、希望するＬ‐アミノ酸の生成量が最大限に得られるまで続けてもよい。このような目的で通常１０〜１６０時間で達成されうる。Ｌ‐リジンは培養培地の中に排出されるか、細胞中に含まれてることもある。
【００３７】
本発明のＬ‐リジンを生産する方法は、前記微生物または培地からリジンを回収する段階を含んでもよい。微生物または培養物からＬ‐リジンを回収する方法は、当業界に周知の方法、例えば、遠心分離、ろ過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化及びＨＰＬＣなどが使用されてもよいが、これらの例に限定されるものではない。
【００３８】
前記回収段階は精製工程を含んでもよい。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例を介して本発明をより詳細に説明する。これら実施例は、単に本発明を例示するためのもので、本発明の範囲がこれら実施例により制限されるものとして解釈されるわけではない。
【００４０】
実施例１：トランスポゾンを用いたランダム突然変異ライブラリーの製作
リジン生産能を増加させる遺伝子を獲得するための目的で、下記の方法によりベクターライブラリーを製作した。まず、ＥＺ-Ｔｎ５ＴＭ＜Ｒ６Ｋγｏｒｉ/ＫＡＮ-２＞Ｔｎｐ ＴｒａｎｓｐｏｓｏｍｅＴＭ Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を用いて得られたプラスミドをＫＣＣＭ１１０１６Ｐ（前記微生物はＫＦＣＣ１０８８１として公開された後、ブダペスト条約下の国際寄託機関に再寄託されてＫＣＣＭ１１０１６Ｐと寄託番号を付与される、特許文献１）菌株を親菌株とし、形質転換してカナマイシン（２５ｍｇ/ｌ）が含まれた複合平板培地に塗抹し、約２０，０００個のコロニーを確保した。
【００４１】
＜複合平板培地（ｐＨ７．０）＞
ブドウ糖１０ｇ、ペプトン １０ｇ、肉抽出物 ５ｇ、酵母抽出物 ５ｇ、脳心臓浸出液 １８．５ｇ、ＮａＣｌ ２．５ｇ、尿素 ２ｇ、ソルビトール ９１ｇ、寒天 ２０ｇ（蒸留水１リットル基準）
【００４２】
実施例２：トランスポゾンを用いたランダム突然変異ライブラリーのスクリーニング
前記実施例１で確保した約２０，０００個のコロニーをそれそれ３００μｌの選別培地に接種して９６ディープウェルプレートで３２℃、１０００ｒｐｍで約２４時間培養した。培養液で生産されたＬ-リジンの生産量を分析するためにニンヒドリン法を利用した（非特許文献３）。培養が完了した後、培養上清液１０μｌとニンヒドリン反応溶液１９０μｌとを６５℃で３０分間反応させた後、波長５７０ｎｍで分光光度計で吸光度を測定し、対照区であるＫＣＣＭ１１０１６Ｐと比較して高い吸光度を示す変異菌株として約６０種余りのコロニーを選別した。その他のコロニーは対照区として用いられたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ菌株と類似するかまたは減少した吸光度を示した。
【００４３】
前記選別された６０種余りの菌株は、前記と同様の方法で培養した後、ニンヒドリン反応を繰り返し、結果的にＫＣＣＭ１１０１６Ｐ菌株対比Ｌ‐リジン生産能が向上された上位１０種の菌株を選抜した。
【００４４】
＜選別培地（ｐＨ８．０）＞
ブドウ糖１０ｇ、硫酸アンモニウム ５．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．８ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ １６．４ｇ、ビオチン １００μｇ、チアミン塩酸塩 １０００μｇ、パントテン酸カルシウム ２０００μｇ、ニコチンアミド ２０００μｇ（蒸留水１リットル基準）
【００４５】
実施例３：選別されたランダム突然変異株のＬ‐リジン生産能の分析
前記実施例２で選抜された１０種の菌株を対象にＬ‐リジン生産能が増加された菌株を最終選別するため、下記の培地を用いてフラスコにおける再現性テストを行った。前記１０種の菌株と対照群とを下記の種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに接種し、３０℃で２０時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。その後、１ｍｌの種培養液を下記の生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに接種して、３７℃で９６時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。前記種培地と生産培地との組成はそれぞれ下記のとおりである。培養が完了した後、ＨＰＬＣを用いて培養液内のＬ‐リジン濃度を分析し、各突然変異株のＬ‐リジン生産濃度を下記表１に示した。
【００４６】
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
ブドウ糖２０ｇ、ペプトン １０ｇ、酵母抽出物 ５ｇ、尿素 １．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０.５ｇ ビオチン １００μｇ、チアミン塩酸塩 １０００μｇ、パントテン酸カルシウム ２０００μｇ、ニコチンアミド ２０００μｇ（蒸留水１リットル基準）
【００４７】
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
ブドウ糖１００ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ４０ｇ、大豆タンパク質 ２.５ｇ、トウモロコシ浸漬固形分（Corn Steep Solids） ５ｇ、尿素 ３ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０.５ｇ ビオチン １００μｇ、チアミン塩酸塩 １０００μｇ、パントテン酸カルシウム ２０００μｇ、ニコチンアミド ３０００μｇ、 ＣａＣＯ３ ３０ｇ（蒸留水１リットル基準）
【００４８】
【表１】
0006646075.tif 000002
【００４９】
前記選抜された１０種の変異株の中、Ｌ‐リジン生産能が有意に向上された菌株としてＫＣＣＭ１１０１６Ｐ/ｍｔ‐１及びＫＣＣＭ１１０１６Ｐ/ｍｔ‐８が最終選別された。
【００５０】
実施例４：最終選別株におけるＬ‐リジン生産能関連遺伝子の確認及び追加候補遺伝子の選別
本実施例では、前記実施例３で最終選別された菌株を対象にトランスポゾンのランダム挿入により欠損された遺伝子を同定しようとした。ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ/ｍｔ‐１とＫＣＣＭ１１０１６Ｐ/ｍｔ‐８とのゲノムＤＮＡを抽出して溶解した後、ライゲーションして大腸菌ＤＨ５αで形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ/ｌ）が含まれたＬＢ固体培地に塗抹した。形質転換されたコロニー２０種をそれぞれ選別した後、未知の遺伝子一部が含まれたプラスミドを獲得し、ＥＺ-Ｔｎ５ＴＭ＜Ｒ６Ｋγｏｒｉ/ＫＡＮ-２＞Ｔｎｐ ＴｒａｎｓｐｏｓｏｍｅＴＭ Ｋｉｔに含まれている配列番号９及び配列番号１０の配列を用いて塩基配列を分析した結果（表２）、突然変異株でそれぞれＮＣｇｌ２１０８、ＮＣｇｌ２９８６遺伝子が不活性化されていたことが分かった。
【００５１】
【表２】
0006646075.tif 000003
【００５２】
前記実施例３で選別された変異株において、欠損されたものとして同定されたＮＣｇｌ２１０８、ＮＣｇｌ２９８６遺伝子はコリネバクテリウムに内在的に存在する遺伝子であって、細胞壁加水分解に関連するタンパク質として同定された。
【００５３】
このような、トランスポゾンを用いたランダム突然変異株における２種の細胞壁加水分解に関連するタンパク質が選別された結果を基に、細胞壁加水分解に関連する遺伝子の欠損は、Ｌ‐リジン生産能の増加に効果的であると判断した。したがって、ＮＣｇｌ２１０８とＮＣｇｌ２９８６以外の細胞壁加水分解に関連する遺伝子を米国国立生物情報センター（ＮＣＢＩ）で探索した。 
【００５４】
探索結果、コリネバクテリウムに内在的に存在するＮＣｇｌ１４８０とＮＣｇｌ２１０７遺伝子が細胞壁加水分解に関連するタンパク質としてさらに選別された。これにより、ＮＣｇｌ１４８０とＮＣｇｌ２１０７遺伝子の欠損の時も、Ｌ‐リジン生産能に影響があるかどうかを確認するため、前記２つの遺伝子を追加欠損候補遺伝子として選別した。
【００５５】
実施例５：ＮＣｇｌ１４８０、ＮＣｇｌ２１０７、ＮＣｇｌ２１０８及びＮＣｇｌ２９８６遺伝子の不活性化のための組換えプラスミドの製作
本実験例では、ＮＣｇｌ１４８０、ＮＣｇｌ２１０７、ＮＣｇｌ２１０８及びＮＣｇｌ２９８６遺伝子の不活性化とＬ‐リジン生産能との影響を確認するために、前記実施例４で選別されたＮＣｇｌ１４８０、ＮＣｇｌ２１０７、ＮＣｇｌ２１０８及びＮＣｇｌ２９８６遺伝子をコリネバクテリウムＬ‐リジン生産菌株の染色体上から欠損させるための組換えプラスミドを製作した。 
【００５６】
米国国立衛生研究所の遺伝子銀行（NIH Genbank）に報告された塩基配列に根拠して、ＮＣｇｌ１４８０、ＮＣｇｌ２１０７、ＮＣｇｌ２１０８及びＮＣｇｌ２９８６の配列番号１，２，３、及び４のアミノ酸及びこれをそれぞれコードする配列番号５，６，７及び８のヌクレオチド配列を確保した。各ＮＣｇｌ１４８０、ＮＣｇｌ２１０７、ＮＣｇｌ２１０８及びＮＣｇｌ２９８６のオープンリーディングフレーム（open reading frame）が内部的に喪失された遺伝子断片を製作するために、前記配列番号５，６，７及び８を基に、それぞれ配列番号１１〜１４、１５〜１８、１９〜２２、及び２３〜２６のプライマーを製作した。その配列を下記表３に示した。
【００５７】
【表３】
0006646075.tif 000004
【００５８】
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１１及び配列番号１２、配列番号１３及び配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２、配列番号２３及び配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６をプライマーとして用い、ＰＣＲ[Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories]を行った。ＰＣＲ条件は変性９５℃、３０秒；アニリーング５０℃、３０秒；及び重合反応７２℃、１分を３０回繰り返した。
【００５９】
その結果、ＮＣｇｌ１４８０遺伝子の上流と下流の部分、３１９ｂｐと４１０ｂｐが含まれた２対のＤＮＡ断片（ＮＣｇｌ１４８０‐Ａ及びＮＣｇｌ１４８０‐Ｂ）、ＮＣｇｌ２１０７遺伝子の上流と下流の部分、３２４ｂｐと３００ｂｐが含まれた２対のＤＮＡ断片（ＮＣｇｌ２１０７‐Ａ及びＮＣｇｌ２１０７‐Ｂ）、ＮＣｇｌ２１０８遺伝子の上流と下流の部分、３８１ｂｐと３７７ｂｐが含まれた２対のＤＮＡ断片（ＮＣｇｌ２１０８‐Ａ及びＮＣｇｌ２１０８‐Ｂ）、そしてＮＣｇｌ２９８６遺伝子の上流と下流の部分、３５６ｂｐと３７４ｂｐが含まれた２対のＤＮＡ断片（ＮＣｇｌ２９８６‐Ａ及びＮＣｇｌ２９８６‐Ｂ）を得た。ＰＣＲにより増幅された前記ＤＮＡ断片は、インフュージョンクローニングキット（Invitrogen）を用いて、 ｐＤＺプラスミド（特許文献２）に接合した後、大腸菌ＤＨ５αで形質転換して、２５ｍｇ/Ｌのカナマイシンが含まれたＬＢ固体培地に塗抹した。ＰＣＲを通じて目的とした遺伝子が挿入されたプラスミドで形質転換されたコロニーを選別した後、通常に知られているプラスミド抽出法によりプラスミドを獲得した。前記プラスミドをそれぞれｐＤＺ‐ΔＮＣｇｌ１４８０、ｐＤＺ‐ΔＮＣｇｌ２１０７、ｐＤＺ‐ΔＮＣｇｌ２１０８及びｐＤＺ‐ΔＮＣｇｌ２９８６と命名した。ｐＤＺ‐ΔＮＣｇｌ１４８０はＮＣｇｌ１４８０の遺伝子１６７２ｂｐが、ｐＤＺ‐ΔＮＣｇｌ２１０７はＮＣｇｌ２１０７の遺伝子１０２６ｂｐが、ｐＤＺ‐ΔＮＣｇｌ２１０８はＮＣｇｌ２１０８の遺伝子５７６ｂｐが、ｐＤＺ‐ΔＮＣｇｌ２９８６はＮＣｇｌ２９８６の遺伝子１０９２ｂｐが喪失された。
【００６０】
実施例６：リジン生産菌株であるＫＣＣＭ１１０１６Ｐ由来の細胞壁加水分解に関連するタンパク質遺伝子不活性化菌株の製作及び評価
代表的なＬ‐リジン生産コリネバクテリウム属菌株であるＫＣＣＭ１１０１６Ｐ菌株を基盤に、前記で選別した細胞壁加水分解関連タンパク質遺伝子の不活性化菌株を製作して、そのリジン生産能を評価しようとした。
【００６１】
前記実施例５で製作した４種の組換えプラスミド（ｐＤＺ‐ΔＮＣｇｌ１４８０、ｐＤＺ‐ΔＮＣｇｌ２１０７、ｐＤＺ‐ΔＮＣｇｌ２１０８及びｐＤＺ‐ΔＮＣｇｌ２９８６）を電気パルス法を利用してコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐにそれぞれ形質転換させて、相同組換えにより染色体上の目的遺伝子が不活性化された菌株をＰＣＲ方法により製造した。製造された不活性化菌株をそれぞれＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ΔＮＣｇｌ１４８０、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ΔＮＣｇｌ２１０７、 ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ΔＮＣｇｌ２１０８、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ΔＮＣｇｌ２９８６と命名した。
【００６２】
前記４種の菌株と対照群とを下記の種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに接種して、３０℃で２０時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。その後、１ｍｌ種培養液を下記の生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに接種して、３７℃で９６時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。前記種培地と生産培地との組成はそれぞれ下記のとおりである。
【００６３】
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
ブドウ糖２０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ １０ｇ、ペプトン １０ｇ、酵母抽出物 ５ｇ、尿素 １．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ、ＭｇＳＯ４・Ｈ２Ｏ ０.５ｇ ビオチン １００μｇ、チアミン塩酸塩 １０００μｇ、パントテン酸カルシウム ２０００μｇ、ニコチンアミド ２０００μｇ（蒸留水１リットル基準）
【００６４】
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
ブドウ糖１００ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ４０ｇ、大豆タンパク質 ２.５ｇ、トウモロコシ浸漬固形分（Corn Steep Solids） ５ｇ、尿素 ３ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ、ＭｇＳＯ４・Ｈ２Ｏ ０.５ｇ ビオチン １００μｇ、チアミン塩酸塩 １０００μｇ、パントテン酸カルシウム ２０００μｇ、ニコチンアミド ３０００μｇ、 ＣａＣＯ３ ３０ｇ（蒸留水１リットル基準）
【００６５】
培養を終了した後、ＨＰＬＣを利用して分析したＬ‐リジン濃度を下記表４に示した。表４の結果は３回繰り返した実験結果値であり、平均値で生産能を評価した。
【００６６】
【表４】
0006646075.tif 000005
【００６７】
その結果、前記表４で示したように、親菌株ＫＣＣＭ１１０１６ＰからＮＣｇｌ１４８０、ＮＣｇｌ２１０７、ＮＣｇｌ２１０８及びＮＣｇｌ２９８６遺伝子が不活性化された菌株でリジン生産能がそれぞれ３．２％、５．４％、１３％及び１５％増加した。
【００６８】
このような結果は、コリネバクテリウム属微生物で細胞溶解を起こすことができる細胞壁加水分解に関連するタンパク質を不活性化させることにより、Ｌ-リジン生産能を向上させうることを示唆する。
【００６９】
そこで、さらに多様なコリネバクテリウム属微生物において前記細胞壁加水分解関連タンパク質を不活性化させた場合も、同様の効果があるかどうかを下記で実験した。
【００７０】
実施例７：Ｌ‐リジン生産菌株であるＫＣＣＭ１０７７０Ｐ由来の細胞壁加水分解に関連するタンパク質不活性化菌株の製作及び評価
リジン生合成経路が強化されたＬ‐リジン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ（特許文献２）で細胞壁加水分解に関連するタンパク質の不活性化効果が前記実施例６の実験結果と類似であるかを比較するため、４種の細胞壁加水分解に関連するタンパク質が不活性化された菌株を前記実施例６と同様の方法で製造して、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ：：ΔＮＣｇｌ１４８０、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ：：ΔＮＣｇｌ２１０７、 ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ：：ΔＮＣｇｌ２１０８、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ：：ΔＮＣｇｌ２９８６と命名し、Ｌ‐リジン生産能を比較した。
【００７１】
前記菌株のリジン生産能を比較するために、各対照群と共に実施例６と同様の方法で培養し、培養を終了した後、ＨＰＬＣを利用して分析したＬ‐リジン濃度は下記表５で示した。表５の結果は３回繰り返した実験結果値であり、平均値で生産能を評価した。
【００７２】
【表５】
0006646075.tif 000006
【００７３】
その結果、前記表５で示したように、親菌株ＫＣＣＭ１０７７０ＰからＮＣｇｌ１４８０、ＮＣｇｌ２１０７、ＮＣｇｌ２１０８及びＮＣｇｌ２９８６遺伝子がそれぞれ不活性化された菌株でリジン生産能がそれぞれ２．２％、４．３％、１２．１％及び１４．２％増加した。
【００７４】
したがって、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ（特許文献２）においても前記実施例６のように細胞壁加水分解に関連するタンパク質を不活性化させることにより、Ｌ‐リジン生産能を向上させうることを確認した。
【００７５】
実施例８：Ｌ‐リジン生産菌株であるＫＣＣＭ１１３４７Ｐ由来の細胞壁加水分解に関連するタンパク質不活性化菌株の製作及び評価
人工変異法により製作されたコリネバクテリウム・グルタミカムＬ‐リジン生産菌株であるＫＣＣＭ１１３４７Ｐ（前記微生物はＫＦＣＣ１０７５０として公開された後、ブダペスト条約下の国際寄託機関に再寄託されて、ＫＣＣＭ１１３４７Ｐを付与された、特許文献３）でも細胞壁加水分解に関連するタンパク質の不活性化の効果を確認するために、４種の細胞壁加水分解に関連するタンパク質が不活性化された菌株を前記実施例６と同様の方法で製造して、ＫＣＣＭ１１３４７Ｐ：：ΔＮＣｇｌ１４８０、ＫＣＣＭ１１３４７Ｐ：：ΔＮＣｇｌ２１０７、 ＫＣＣＭ１１３４７Ｐ：：ΔＮＣｇｌ２１０８、ＫＣＣＭ１１３４７Ｐ：：ΔＮＣｇｌ２９８６と命名し、Ｌ‐リジン生産能を比較した。
【００７６】
前記菌株のリジン生産能を比較するために、各対照群と共に実施例６と同様の方法で培養して、培養を終了した後、ＨＰＬＣを利用して分析したＬ‐リジン濃度は下記表６で示した。表６の結果は３回繰り返した実験結果値であり、平均値で生産能を評価した。
【００７７】
【表６】
0006646075.tif 000007
【００７８】
その結果、前記表６で示したように、親菌株ＫＣＣＭ１１３４７ＰからＮＣｇｌ１４８０、ＮＣｇｌ２１０７、ＮＣｇｌ２１０８及びＮＣｇｌ２９８６遺伝子が不活性化された菌株でリジン生産能がそれぞれ２％、２．４％、１１．７％及び１４．4％増加した。
【００７９】
したがって、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１３４７Ｐ（特許文献３）においても前記実施例６及び７のように細胞壁加水分解に関連するタンパク質を不活性化させることにより、Ｌ‐リジン生産能を向上させることを確認した。
【００８０】
実施例９：Ｌ‐リジン生産菌株であるＣＪ３Ｐ由来の細胞壁加水分解に関連するタンパク質不活性化菌株の製作及び評価
コリネバクテリウム・グルタミカム野生株に３種の変異[ｐｙｃ（Ｐ４５８Ｓ）、ｈｏｍ（Ｖ５９Ａ）、ｌｙｓＣ（Ｔ３１１Ｉ）]を導入して、Ｌ‐リジン生産能を有することになったコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ３Ｐ（非特許文献４）においても前記実施例６，７，８と同様に細胞壁加水分解に関連するタンパク質の不活性化効果を調べるために、４種の細胞壁加水分解に関連するタンパク質が不活性化された菌株を前記実施例６と同様の方法で製造して、ＣＪ３Ｐ：：ΔＮＣｇｌ１４８０、ＣＪ３Ｐ：：ΔＮＣｇｌ２１０７、ＣＪ３Ｐ：：ΔＮＣｇｌ２１０８、ＣＪ３Ｐ：：ΔＮＣｇｌ２９８６と命名し、Ｌ‐リジン生産能を比較した。
【００８１】
前記菌株のリジン生産能を比較するために、各対照群と共に実施例６と同様の方法で培養し、培養を終了した後、ＨＰＬＣを利用して分析したＬ‐リジン濃度は下記表７で示した。表７の結果は３回繰り返した実験結果値であり、平均値で生産能を評価した。
【００８２】
【表７】
0006646075.tif 000008
【００８３】
その結果、前記表７で示したように、親菌株ＣＪ３ＰからＮＣｇｌ１４８０、ＮＣｇｌ２１０７、ＮＣｇｌ２１０８及びＮＣｇｌ２９８６遺伝子が不活性化された菌株でリジン生産能がそれぞれ３％、１．３％、１２．７％及び１６％増加した。
【００８４】
したがって、コリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ３Ｐにおいても前記実施例６，７，８の実験結果のように細胞壁加水分解に関連するタンパク質を不活性化させることにより、Ｌ‐リジン生産能を向上させることを確認した。
【００８５】
実施例１０：Ｌ‐リジン生産菌株であるＫＣＣＭ１１０１６Ｐ由来の細胞壁加水分解に関連するタンパク質の同時不活性化菌株の製作及び評価
前記実施例からＬ‐リジン生産菌株であるコリネバクテリウム属において細胞壁加水分解関連タンパク質をそれぞれ不活性化させた場合、Ｌ‐リジン生産能が増加されること確認した後、関連タンパク質を２種以上同時に不活性化させる場合もＬ‐リジン生産能が増加されるかを確認しようとした。
【００８６】
そこで、Ｌ‐リジン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐで細胞壁加水分解に関連するタンパク質の同時不活性化による効果を確認するために次の実験を行った。単独欠損の場合、Ｌ‐リジン生産能向上に効果が高い２種の細胞壁加水分解に関連するタンパク質遺伝子（ＮＣｇｌ２１０８とＮＣｇｌ２９８６）が同時に不活性化された菌株を前記実施例６と同様の方法で製造して得られた菌株をＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ΔＮＣｇｌ２１０８/ΔＮＣｇｌ２９８６と命名し、Ｌ‐リジン生産能を比較した。
【００８７】
前記菌株のリジン生産能を比較するために、対照群と共に実施例６と同様な方法で培養し、培養を終了した後、ＨＰＬＣを利用して分析したＬ‐リジン濃度は下記表８に示した。表８の結果は３回繰り返した実験結果値であり、平均値で生産能を評価した。
【００８８】
【表８】
0006646075.tif 000009
【００８９】
その結果、前記表８で示したように、親菌株ＫＣＣＭ１１０１６ＰからＮＣｇｌ２１０８及びＮＣｇｌ２９８６遺伝子が同時不活性化された菌株でリジン生産能が約２１．６％増加した。
【００９０】
このような結果は、細胞壁加水分解に関連するタンパク質を１種だけでなく、２種以上同時にコリネバクテリウム属微生物で不活性化させた場合も、Ｌ‐リジン生産能を向上させうることを示唆する。
【００９１】
そこで、前記菌株、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ‐ΔＮＣｇｌ２９８６をＣＡ０１‐２２９２と命名し、ＣＡ０１‐２２９２は２０１４年１２月５日付でブダペスト条約下、国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に国際寄託しＫＣＣＭ１１６２７Ｐと寄託番号を付与された。
【００９２】
前記の結果から、Ｌ‐リジン生産菌株における細胞壁加水分解に関連するタンパク質の内在的活性に比べて、不活性化は発酵中に発生する細胞溶解を制御することによりＬ‐リジン生産能を増加させるのに効果があったことを確認した。また、このような細胞壁加水分解に関連するタンパク質は１種だけでなく、２種以上の同時不活性化もＬ‐リジン生産能を増加させることを確認し、新規のＬ‐リジン生産菌株を提供することができた。
【００９３】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形で実施されることができることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例は、すべての面で例示的なものであり、限定的なものではないと理解するべきである。本発明の範囲は、前記の詳細な説明ではなく、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【００９４】
0006646075.tif 000010
【配列表】
0006646075000001.app