(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＫＣＮＩＰ４、ＧＡＴＡ４、ＧＦＲＡ１、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＣＤＨ６、ＺＳＣＡＮ１、ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ及びＬＨＸ８からなる群より選択される少なくとも３個のマーカー遺伝子のメチル化状態を決定すること、及び前記メチル化状態を、健康な対照者の前記少なくとも３個のマーカー遺伝子のメチル化状態と比較することを含む、単離されたサンプル中で子宮頸部細胞が腫瘍であるか、腫瘍になりやすいかを同定する方法。
【請求項２】
前記マーカー遺伝子が高度メチル化されているかどうかを決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＫＣＮＩＰ４、ＧＡＴＡ４、ＧＦＲＡ１、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＣＤＨ６、ＺＳＣＡＮ１、ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ及びＬＨＸ８からなる群から選択される少なくとも４個のマーカー遺伝子のメチル化状態を決定することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
少なくともＫＣＮＩＰ４、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５及び／又はＺＳＣＡＮ１のメチル化状態を決定することを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ＣＤＨ６、ＧＡＴＡ４及びＬＨＸ８の少なくとも１個のメチル化状態を決定することを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ＫＣＮＩＰ４、ＧＡＴＡ４、ＧＦＲＡ１、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＣＤＨ６、ＺＳＣＡＮ１、ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ及びＬＨＸ８のメチル化状態を決定することを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
マーカー遺伝子のパネルが、ＪＡＭ３、ＥＰＢ４１Ｌ３及びＣ１３ＯＲＦ１８の少なくとも１個も含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
以下のマーカー遺伝子のパネル：
ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ／ＣＤＨ６／ＥＰＢ４１Ｌ３；ＧＦＲＡ１／ＥＰＢ４１Ｌ３／ＣＤＨ６；ＧＦＲＡ１／ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ／ＣＤＨ６；ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ／ＣＤＨ６；ＧＦＲＡ１／ＥＰＢ４１Ｌ３／ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ；ＪＡＭ３／ＧＦＲＡ１／ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ；ＧＦＲＡ１／ＣＤＨ６；及びＧＦＲＡ１／ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ
の少なくとも１個の遺伝子のメチル化状態を決定することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも２個のマーカー遺伝子のパネルのメチル化状態を決定すること、及び前記メチル化状態を、健康な対照者の前記少なくとも２個のマーカー遺伝子のパネルのメチル化状態と比較することを含む、単離されたサンプル中で子宮頸部細胞が腫瘍であるか、腫瘍になりやすいかを同定する方法であって、
前記マーカー遺伝子のパネルが以下のマーカー遺伝子の組み合わせ：
ＪＡＭ３／ＣＤＨ６；ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ／ＣＤＨ６／ＥＰＢ４１Ｌ３；ＧＦＲＡ１／ＥＰＢ４１Ｌ３／ＣＤＨ６；ＣＤＨ６／ＥＰＢ４１Ｌ３；ＪＡＭ３／ＥＰＢ４１Ｌ３／ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ；Ｃ１３ＯＲＦ１８／ＪＡＭ３／ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ；ＧＦＲＡ１／ＥＰＢ４１Ｌ３／ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ；ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ／ＥＰＢ４１Ｌ３；Ｃ１３ＯＲＦ１８／ＣＤＨ６；ＪＡＭ３／ＧＦＲＡ１／ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ；ＧＦＲＡ１／ＣＤＨ６；ＪＡＭ３／ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ；ＪＡＭ３／ＥＰＢ４１Ｌ３／ＧＦＲＡ１；ＧＦＲＡ１／ＥＰＢ４１Ｌ３；Ｃ１３ＯＲＦ１８／ＪＡＭ３／ＧＦＲＡ１；ＪＡＭ３／ＧＦＲＡ１；及びＣ１３ＯＲＦ１８／ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ
の少なくとも１個を含む方法。
【請求項１０】
前記方法が、少なくとも６５％の感度及び／又は特異性を有するＣＩＮ２又はそれ以上（ＣＩＮ２＋）の子宮頸癌の検出を可能にする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記遺伝子のメチル化状態が、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）を用いて決定される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記メチル化状態が、表１Ａのエントリー１〜１６から選択される配列を含む若しくはからなるプライマーのセットを用いるか、及び／又は表１Ｂのエントリー１７〜２４から選択される配列を含む若しくはからなるプローブを用いて決定される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記サンプルが子宮頸部擦過物又は自己採集した膣スワブであるか、又は前記サンプルが液体ベースの細胞診断サンプルである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
単離されたサンプル中で子宮頸部細胞が腫瘍であるか、腫瘍になりやすいかを同定する際に用いるキットであって、
以下のマーカー遺伝子の組み合わせ：
ＪＡＭ３／ＣＤＨ６；ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ／ＣＤＨ６／ＥＰＢ４１Ｌ３；ＧＦＲＡ１／ＥＰＢ４１Ｌ３／ＣＤＨ６；ＣＤＨ６／ＥＰＢ４１Ｌ３；ＪＡＭ３／ＥＰＢ４１Ｌ３／ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ；Ｃ１３ＯＲＦ１８／ＪＡＭ３／ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ；ＧＦＲＡ１／ＥＰＢ４１Ｌ３／ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ；ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ／ＥＰＢ４１Ｌ３；Ｃ１３ＯＲＦ１８／ＣＤＨ６；ＪＡＭ３／ＧＦＲＡ１／ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ；ＧＦＲＡ１／ＣＤＨ６；ＪＡＭ３／ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ；ＪＡＭ３／ＥＰＢ４１Ｌ３／ＧＦＲＡ１；ＧＦＲＡ１／ＥＰＢ４１Ｌ３；Ｃ１３ＯＲＦ１８／ＪＡＭ３／ＧＦＲＡ１；ＪＡＭ３／ＧＦＲＡ１；及びＣ１３ＯＲＦ１８／ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ
の少なくとも１個のメチル化状態を検出することができるプライマー及びプローブ；
任意に、対象者から子宮頸部細胞を採るためのＡｙｒｅのスパチュラ及び／又は子宮頸部ブラシを含むキット。
【請求項１５】
以下のマーカー遺伝子の組み合わせ：
Ｃ１３ＯＲＦ１８／ＪＡＭ３／ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ；ＪＡＭ３／ＧＦＲＡ１／ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ；及びＪＡＭ３／ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ
の少なくとも１個のメチル化状態を検出することができるプライマー及びプローブを含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
表１Ａのエントリー１〜１６から選択される配列を含む又はからなる少なくとも１個の遺伝子特異的プライマーを含む、請求項１４又は１５に記載のキット。
【請求項１７】
表１Ｂのエントリー１７〜２４から選択される配列を含む又はからなる少なくとも１個の遺伝子特異的プローブを含む、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１８】
さらなる遺伝子のための遺伝子特異的試薬をさらに含み、前記さらなる遺伝子のメチル化状態が子宮頸癌の発生率に関連する、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１９】
子宮頸癌の検出又はスクリーニングを補助するための方法であって、
ａ）子宮頸部細胞又は子宮頸部細胞からの核酸を含む試験サンプルについて細胞学評価を行う工程；
ｂ）健康な対照者の子宮頸部細胞又は子宮頸部細胞からの核酸を含む試験サンプルについての細胞学評価と比較して、ａ）が陽性である場合、ＫＣＮＩＰ４、ＧＡＴＡ４、ＧＦＲＡ１、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＣＤＨ６、ＺＳＣＡＮ１、ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ及びＬＨＸ８からなる群より選択される少なくとも３個の遺伝子のメチル化状態をアッセイする工程；
ｃ）ｂ）の少なくとも３個の遺伝子がメチル化されている場合、女性を膣頸管検査に付す工程；
ｄ）ｂ）の少なくとも３個の遺伝子がメチル化されていない場合、女性をより定期的な細胞学検査に付す工程
を含む方法。
【請求項２０】
子宮頸癌の検出又はスクリーニングを補助するための方法であって、
ａ）ＫＣＮＩＰ４、ＧＡＴＡ４、ＧＦＲＡ１、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＣＤＨ６、ＺＳＣＡＮ１、ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ及びＬＨＸ８からなる群から選択される少なくとも３個の遺伝子のメチル化状態をアッセイする工程；
ｂ）ａ）の少なくとも３個の遺伝子が、健康な対照者の前記少なくとも３個の遺伝子のメチル化状態と比較して、メチル化されている場合、細胞学検査を行う工程；
ｃ）ｂ）が陽性と判定された場合、女性を膣頸管検査に付す工程；
ｄ）ｂ）が陰性である場合、女性を６ヶ月後にＨＰＶ検査のための追跡調査に付す工程
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、子宮頸癌に対する感受性を検出するための方法、試薬及びキットに関する。特に、本発明は、子宮頸部上皮内腫瘍のグレード２／３のスクリーニングを改善する新規なメチル化マーカー、及び単離されたサンプル中の子宮頸部細胞が腫瘍であるか、腫瘍になりやすいかを同定するためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
子宮頸癌は、明確な前癌段階である子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）を特徴とする。集団ベースのスクリーニングプログラムによるこれらのＣＩＮ病変の同定及びその後の治療によって、子宮頸癌の発生率及び死亡率の有意な減少がもたらされた（参考文献１，２）。子宮頸部スメアの細胞診断に基づく検査は、最も広く用いられている子宮頸癌のスクリーニング方法であるが、ＣＩＮ２又はそれ以上（ＣＩＮ２＋）の検出感度が約５５％しかない（参考文献３〜５）ため理想的な方法ではない。子宮頸癌の発癌は、高リスクのヒトパピローマウイルス（ｈｒＨＰＶ）と非常に関連している（参考文献６）。大規模な無作為試験によって、ｈｒＨＰＶ検査の感度が細胞学検査よりも有意に高いことが示されている（参考文献４，７〜１０）。しかし、ｈｒＨＰＶ検査の特異性が、特に若いスクリーニング集団では比較的低く（参考文献３，１１〜１３）、それによって、婦人科医への不必要な照会、偽陽性女性の不安、及びより高額の健康管理システムの費用が生じうる。最後に、近い将来、ＣＩＮと子宮頸癌の流行は、おそらくｈｒＨＰＶの予防接種を用いる一次予防を導入した国では減少するであろう。この流行の減少によって、現在のスクリーニング検査の陽性の予測値は、当然減少することになる（参考文献１４）。従って、子宮頸癌の新規なスクリーニングツールとして、高感度及び高特異性の両方を有する他の客観的バイオマーカーが必要である。
【０００３】
正常組織と（前）悪性病変における異なるＤＮＡメチル化パターンは、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）に基づく診断アプローチの優れた標的である。腫瘍サプレッサー遺伝子のプロモーターの過剰メチル化は、子宮頸部の発癌の初期事象であり、従って過剰メチル化の分析は、子宮頸部腫瘍の早期発見に特に関連し得る（参考文献１５〜１７）。ＣＩＮ及び子宮頸癌の検出のための子宮頸部擦過物におけるメチル化マーカーの評価は、実現可能である（参考文献１７〜２３）。ＷＯ２００６／００７９８０も参照のこと。しかし、高感度及び高特異性の両方を有するメチル化マーカーを見出すことは、依然として課題である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ゲノムワイドな新規なメチル化マーカーの同定のために、長年にわたって徐々により洗練されたアプローチが開発されてきた（参考文献２４）。他のグループの類似の研究の中、我々は、プロモーター領域の薬理学的なアンマスキングに、マイクロアレイによって分析された再発現、ＯｐｅｎＡｒｒａｙプラットフォーム上でのハイスループットな定量的メチル化特異的ＰＣＲ（ＱＭＳＰ）、及びメチル−ＤＮＡ免疫沈降、続くマイクロアレイ分析（ＭｅＤＩＰ）を組み合わせて、その結果、遺伝子Ｃ１３ＯＲＦ１８、ＪＡＭ３、ＥＰＢ４１Ｌ３及びＴＥＲＴを発見及び評価したとの我々の経験を、以前に報告した（参考文献２１，２２，２５）。ＷＯ２００９／１１５６１５も参照のこと。これらの遺伝子の診断の成績は、ｈｒＨＰＶ陽性個体群において、４３％〜７１％の間のＣＩＮ２＋を検出する感度と８９％〜１００％の間の特異性とを示した（参考文献２１）。しかし、これまでの新規なメチル化マーカーの発見のための戦略は、癌組織と正常組織との相違に基づいており、その結果、腫瘍についての感度は高いが、ＣＩＮ２／３病変の検出感度が低すぎるマーカーが得られたに過ぎない。我々のＭｅＤＩＰ研究では、正常組織及びＣＩＮ３病変のＤＮＡメチロームが分析された（参考文献２５）。しかし、この技術の欠点は、主として高度にメチル化された大量の反復ＤＮＡが認識され、その結果、特異性がより低いことである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで、本発明者らは、正常な子宮頸部とＣＩＮ２／３病変とを区別することができる新規なメチル化マーカーを同定して評価することに着手した。そのために、ＣＩＮ２／３病変からのＤＮＡと正常な子宮頸部組織からのＤＮＡの新規かつより特異的で革新的なゲノムワイドなメチル化分析が開発された。メチル化ＤＮＡを特異的に精製するために、ヒトＭｅＣＰ２の抗体結合メチル結合ドメイン（ＭＢＤ）を用いるメチル化ＣｐＧアイランド回収アッセイ（ＭＩＲＡ）を適用した。二本鎖ＣｐＧメチル化ＤＮＡに対するＭＢＤ複合体のより高い親和性によって、ＭｅＤＩＰ分析と比較してより高いメチルＤＮＡ配列の濃縮が得られる。次世代シーケンシングによって、同定された新規なメチル化領域（メチルキャップ（MethylCap）シークエンシング）が明らかにされた。子宮頸部擦過物の診断評価は、８個の新たに同定された遺伝子における相対的なメチル化レベルが、基礎をなす組織病変の重症度とともに増加することを示した。新規なメチル化マーカーは、集団ベースのスクリーニングからのｈｒＨＰＶ陽性女性のトリアージ試験として有利に適用することができる。マーカーの組み合わせは、改善された診断的価値を提供することが見出された。
【０００６】
１つの実施態様では、本発明は、ＫＣＮＩＰ４、ＧＡＴＡ４、ＧＦＲＡ１、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＣＤＨ６、ＺＳＣＡＮ１、ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ（当技術分野でＡＬ５９０７０５．４としても知られる）及びＬＨＸ８からなる群より選択される少なくとも２個のマーカー遺伝子のメチル化状態を決定することを含む、単離されたサンプル中で子宮頸部細胞が腫瘍であるか、腫瘍になりやすいかを同定する方法を提供する。
【０００７】
より具体的には、これらの遺伝子の高度メチル化が子宮頸癌の指標であることが判明した。従って、本発明の方法は、好ましくは、前記マーカー遺伝子が高度メチル化されているかどうかを決定することを含む。これを本明細書では「メチル化陽性」とも呼ぶ。
【０００８】
上記のマーカーのいくつかは、個々に疾患と関係があるとされている。例えば、ＷＯ２００９／１１５６１５は、１１１個の個々のマーカーのセットを開示し、これらのうちＧＡＴＡ４はそのメチル化状態が子宮頸癌に関連している。ＫＣＮＩＰ４、ＧＦＲＡ１、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＣＤＨ６又はＺＳＣＡＮ１のいずれかのメチル化状態の分析が、様々なタイプの癌について当技術分野で報告されている。しかし、子宮頸癌に対するこれらの遺伝子の予後の値は全く開示されていない。ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ又はＬＨＸ８のメチル化状態と疾患との関連は、先行技術には全く言及されていない。従って、子宮頸部腫瘍（ＣＩＮ２／３）を同定するための本発明のマーカー遺伝子の組み合わせの予後の値は、当技術分野で開示又は示唆されたことがない。
【０００９】
１つの実施態様では、本発明の方法は、少なくともＫＣＮＩＰ４、及び／又は少なくともＧＡＴＡ４、及び／又は少なくともＧＦＲＡ１、及び／又は少なくともＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、及び／又は少なくともＣＤＨ６、及び／又は少なくともＺＳＣＡＮ１、及び／又は少なくともＡＮＫＲＤ１８ＣＰ、及び／又は少なくともＬＨＸ８のメチル化状態を決定することを含む。２個のメチル化マーカーの好ましい組み合わせには、ＡＮＫＲＤ１８ＣＰとＣＤＨ６；ＧＦＲＡ１とＣＤＨ６；及びＧＦＲＡ１とＡＮＫＲＤ１８ＣＰが含まれる。
【００１０】
列挙された遺伝子のアクセッション番号は、http：//www.ncbi.nlm.nih.govで見つけることができる。もちろん、適切な場合、遺伝子配列の各々の機能的に関連する変異体も、本発明の方法に従って検出することができることを当業者は理解するであろう。例えば、多数のスプライス変異体のメチル化状態は、本発明の方法に従って決定することができる。データベースに記載されたヌクレオチド配列との、変異体の配列のヌクレオチド配列同一性が、好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％である。ヌクレオチド配列同一性のパーセンテージを決定するコンピュータプログラムは当技術分野で利用可能であり、例えば国立生物工学情報センターから入手可能なＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）が含まれる。
【００１１】
１つの実施態様では、本方法は、ＫＣＮＩＰ４、ＧＡＴＡ４、ＧＦＲＡ１、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＣＤＨ６、ＺＳＣＡＮ１、ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ及びＬＨＸ８からなる群から選択される少なくとも３個、好ましくは少なくとも４個、より好ましくは少なくとも５個のマーカー遺伝子のメチル化状態を決定することを含む。例えば、以下のマーカー遺伝子の組み合わせ：
・ＧＦＲＡ１、ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ及びＣＤＨ６
・ＧＦＲＡ１、ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ及びＬＨＸ８
・ＧＦＲＡ１、ＣＤＨ６及びＬＨＸ８
・ＧＦＲＡ１、ＣＤＨ６、ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ及びＬＨＸ８
・ＧＦＲＡ１、ＣＤＨ６、ＺＳＣＡＮ１及びＡＮＫＲＤ１８ＣＰ
・ＧＦＲＡ１、ＣＤＨ６、ＺＳＣＡＮ１、ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ及びＬＨＸ８
の各々を用いることができる。
【００１２】
１つの好ましい態様において、少なくともＫＣＮＩＰ４、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５及び／又はＺＳＣＡＮ１のメチル化状態が決定される。別の好ましい態様において、ＣＤＨ６、ＧＡＴＡ４及びＬＨＸ８の少なくとも１個のメチル化状態が決定される。さらに別の好ましい態様では、ＧＦＲＡ１及びＡＮＫＲＤ１８ＣＰの少なくとも１個のメチル化状態、又はＡＮＫＲＤ１８ＣＰ及びＬＨＸ８の少なくとも１個のメチル化状態が決定される。
【００１３】
特定の実施態様では、ＫＣＮＩＰ４、ＧＡＴＡ４、ＧＦＲＡ１、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＣＤＨ６、ＺＳＣＡＮ１、ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ及びＬＨＸ８のメチル化状態が決定される。
【００１４】
複数の目的遺伝子を同じ反応で検出するために本発明の方法を使用することが可能である。いくつかの特定のプライマーセットを使用して、いくつかの核酸標的の増幅を同じ反応混合物中で行うことができる。これは「多重化」と呼ばれることがある。多重化は、同じ反応で目的遺伝子及び参照遺伝子の両方を検出する状況で利用することもできる。
【００１５】
理解されるように、本発明のマーカーのパネルは、子宮頸癌の同定、診断、予後判定及び／若しくはスクリーニングに有用であることが当技術分野で知られている任意のマーカー遺伝子又はマーカー遺伝子の組み合わせと、組み合わせるか、あるいはこれらで補足することができる。例えば、ＷＯ２００４／０８７９５７、ＷＯ２００６／００７９８０、ＷＯ２００９／１１５６１５又はＷＯ２０１１／０３６１７３を参照のこと。
【００１６】
新たに同定された遺伝子を我々が以前に報告したパネル（Ｃ１３ＯＲＦ１８、ＪＡＭ３、ＥＰＢ４１Ｌ３及びＴＥＲＴ；参照：ＷＯ２０１１／０３６１７３）に組み合わせたところ、驚くべきことに、ＪＡＭ３／ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ、Ｃ１３ＯＲＦ１８／ＪＡＭ３／ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ及びＪＡＭ３／ＧＦＲＡ１／ＡＮＫＲＤ１８ＣＰの組み合わせのＣＩＮ２＋の感度が７２〜７４％であり、ｈｒＨＰＶ検査のＣＩＮ２＋の感度（７９％）と同等であることが明らかにされた。集団ベースのスクリーニングでパップスメア試験の陽性結果後のトリアージ設定において、我々の遺伝子のパネルの特異性は７６〜７９％であり、これはｈｒＨＰＶ検査の特異性（４２％）よりも有意に高かった（ｐ≦０．０５）。
【００１７】
従って、１つの実施態様では、マーカー遺伝子のパネルは、ＪＡＭ３、ＥＰＢ４１Ｌ３及びＣ１３１ＲＦ１８の少なくとも１個をさらに含む。本発明の方法は、例えば、以下のマーカー遺伝子のパネル：
・ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ、ＣＤＨ６及びＥＰＢ４１Ｌ３
・ＧＦＲＡ１、ＥＰＢ４１Ｌ３及びＣＤＨ６
・ＧＦＲＡ１、ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ及びＣＤＨ６
・ＧＦＲＡ１、ＥＰＢ４１Ｌ３及びＡＮＫＲＤ１８ＣＰ
・ＪＡＭ３、ＧＦＲＡ１及びＡＮＫＲＤ１８ＣＰ
の少なくとも１個の遺伝子のメチル化状態を決定することを含む。
【００１８】
本明細書では、少なくとも第１のマーカー遺伝子と第２のマーカー遺伝子のパネルのメチル化状態を決定することを含む、単離されたサンプル中で子宮頸部細胞が腫瘍であるか、腫瘍になりやすいかを同定する方法であって、少なくとも第１のマーカー遺伝子がＫＣＮＩＰ４、ＧＦＲＡ１、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＣＤＨ６、ＺＳＣＡＮ１、ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ及びＬＨＸ８からなる群から選択され、少なくとも第２のマーカー遺伝子がＪＡＭ３、ＥＰＢ４１Ｌ３及びＣ１３ＯＲＦ１８から選択される方法が提供される。好ましくは、マーカー遺伝子のパネルが以下のマーカー遺伝子の組み合わせ：
ＪＡＭ３／ＣＤＨ６；ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ／ＣＤＨ６／ＥＰＢ４１Ｌ３；ＧＦＲＡ１／ＥＰＢ４１Ｌ３／ＣＤＨ６；ＣＤＨ６／ＥＰＢ４１Ｌ３；ＪＡＭ３／ＥＰＢ４１Ｌ３／ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ；Ｃ１３ＯＲＦ１８／ＪＡＭ３／ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ；ＧＦＲＡ１／ＥＰＢ４１Ｌ３／ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ；ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ／ＥＰＢ４１Ｌ３；Ｃ１３ＯＲＦ１８／ＣＤＨ６；ＪＡＭ３／ＧＦＲＡ１／ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ；Ｃ１３ＯＲＦ１８／ＪＡＭ３／ＥＰＢ４１Ｌ３；ＪＡＭ３／ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ；ＪＡＭ３／ＥＰＢ４１Ｌ３／ＧＦＲＡ１；ＧＦＲＡ１／ＥＰＢ４１Ｌ３；Ｃ１３ＯＲＦ１８／ＪＡＭ３／ＧＦＲＡ１；ＪＡＭ３／ＧＦＲＡ１；及びＣ１３ＯＲＦ１８／ＡＮＫＲＤ１８ＣＰを含む。
【００１９】
以下に示すように、本発明の方法は、既存の方法よりも高い感度及び／又は高い特異性を有するＣＩＮ２又はそれ以上（ＣＩＮ２＋）の子宮頸癌の検出を可能にする。１つの実施態様において、本発明の方法は、少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％の感度及び／又は特異性を有するＣＩＮ２＋の子宮頸癌の検出を可能にする。例えば、感度及び特異性の両方は、少なくとも６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％又は７５％である。
【００２０】
分析されるサンプルは、子宮頸部擦過物、好ましくは自己採集した膣スワブであるか、又はサンプルが液体ベースの細胞診断サンプルである。
【００２１】
メチル化分析の利点は、それが客観的な試験であることと、ｈｒＨＰＶ検査に使用される同じ材料で実施できることであり、これらによって本分析が自己サンプリングした材料にとっても興味深いものになる。異なるメチル化マーカーは、既にｈｒＨＰＶ陽性女性でトリアージ試験として検査されている。しかし、ほとんどのマーカーでは、高い特異性を得るためにカットオフ値が設定された。新しく見出されたマーカーの利点は、カットオフ値が必要でないことである。ＰＣＲ生成物が陰性である場合（すなわち、特定の生成物の増幅がない場合）、サンプルは陰性とされ、０を超える任意の比率の場合は陽性とされる。選択された遺伝子のこの特有の特徴によって、客観的で解釈が容易な検査が可能になる。
【００２２】
マーカー遺伝子のメチル化状態を決定する方法は、当技術分野で公知である。１つの実施態様では、少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマーがシトシンを含まないように設計され、改変された配列及び改変されていない配列を増幅する。続いて、改変された配列にハイブリダイズするプライマーを用いてさらなる増幅を行い、それによってメチル化を表示することができる。あるいは、特定のプローブを用いる検出工程を行い、それによってメチル化を表示することができる。あるいは、メチル化感受性酵素を用いた制限切断を、増幅に組み合わることができ、この場合、メチル化領域のみが増幅される。
【００２３】
あるいは、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼを用いて、メチル化ＣｐＧジヌクレオチドモチーフを検出することができる。そのようなエンドヌクレアーゼは、非メチル化認識部位と比較してメチル化認識部位を優先的に切断するか、又はメチル化認識部位に対して非メチル化を優先的に切断することができる。あるいは、メチル化形態又は非メチル化形態のいずれかのＣｐＧジヌクレオチドモチーフを選択的に改変し、それによってＣｐＧジヌクレオチドモチーフを変換する化学試薬を用いることができる。改変された生成物は、直接に、又は容易に区別可能な生成物を生成するさらなる反応の後に検出することができる。電気泳動、クロマトグラフィー及び質量分析を含むがこれらに限定されない、変化した大きさ及び電荷を検出する手段を用いて、改変された生成物を検出することができる。このような選択的な改変のための化学試薬の例には、ヒドラジン及び亜硫酸水素イオンが含まれる。ヒドラジン改変ＤＮＡは、ピペリジンで処理してそれを切断することができる。亜硫酸イオン処理ＤＮＡは、アルカリで処理することができる。本発明の１つの態様において、メチル化シトシン残基と比較して非メチル化シトシン残基を選択的に改変するか、又は非メチル化シトシン残基と比較してメチル化シトシン残基を選択的に改変する化学試薬で、適用され得る遺伝子又はそのプロモーター領域の少なくとも一部を接触させる工程、並びに前記接触によって生成された生成物を検出する工程によって、メチル化を検出される。さらなる実施態様では、化学試薬は亜硫酸水素イオンを含む。さらなる実施態様では、この方法は、遺伝子の亜硫酸水素イオンが接触した部分をアルカリで処理することをさらに含む。
【００２４】
電気泳動、ハイブリダイゼーション、増幅、定量的メチル化特異的ＰＣＲ（ＱＭＳＰ）、シークエンシング、リガーゼ連鎖反応、クロマトグラフィー、質量分析を含むが、これらに限定されない、特定の配列に依存する他の検出手段を用いることができる。これらの技術を組み合わせて用いることもできる。
【００２５】
好ましい実施態様では、本発明の方法は、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、好ましくはリアルタイム定量的メチル化特異的ＰＣＲ（ＱＭＳＰ）を用いて遺伝子のメチル化状態を決定することを含む。ＤＮＡ入力のために調整するため、過剰メチル化の比率は、参照遺伝子、例えばβ−アクチン又はβ−カテニンのＤＮＡレベルに対して有利に計算される。
【００２６】
特定の局面において、メチル化状態が、表１Ａのエントリー１〜１６から選択される配列を含む若しくはからなるプライマーのセットを用いるか、及び／又は表１Ｂのエントリー１７〜２４から選択される配列を含む若しくはからなるプローブを用いて決定される。
【００２７】
関連する実施態様では、本発明は、子宮頸癌の検出又はスクリーニングのための方法であって、ａ）子宮頸部細胞又は子宮頸部細胞からの核酸を含む試験サンプルについて細胞学評価を行う工程；ｂ）ａ）が陽性である場合、ＫＣＮＩＰ４、ＧＡＴＡ４、ＧＦＲＡ１、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＣＤＨ６、ＺＳＣＡＮ１、ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ及びＬＨＸ８からなる群より選択される少なくとも２個の遺伝子のメチル化状態をアッセイする工程；ｃ）ｂ）の少なくとも２個の遺伝子がメチル化されている場合、女性を膣頸管検査に付す工程；ｄ）ｂ）の少なくとも２個の遺伝子がメチル化されていない場合、女性をより定期的な細胞学検査に付す工程を含む方法を提供する。
【００２８】
関連する実施態様では、本発明は、子宮頸癌の検出又はスクリーニングのための方法であって、ａ）ＫＣＮＩＰ４、ＧＡＴＡ４、ＧＦＲＡ１、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＣＤＨ６、ＺＳＣＡＮ１、ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ及びＬＨＸ８からなる群から選択される少なくとも２個の遺伝子のメチル化状態をアッセイする工程；ｂ）ａ）の少なくとも２個の遺伝子がメチル化されている場合、細胞学検査を行う工程；ｃ）ｂ）が陽性と判定された場合、女性を膣頸管検査に付す工程；ｄ）ｂ）が陰性である場合、女性を６ヶ月後にＨＰＶ検査のための追跡調査に付す工程を含む方法を提供する。
【００２９】
本発明はまた、単離されたサンプル中で子宮頸部細胞が腫瘍であるか、腫瘍に、好ましくは子宮頸部腫瘍（ＣＩＮ２／３）になりやすいかを同定する際に用いるキットに関する。本発明のキットは、ＫＣＮＩＰ４、ＧＡＴＡ４、ＧＦＲＡ１、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＣＤＨ６、ＺＳＣＡＮ１、ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ及びＬＨＸ８からなる群より選択される少なくとも２個の遺伝子のための遺伝子特異的なプライマー；前記少なくとも２個の遺伝子のための遺伝子特異的プローブ；及び、好ましくは、対象者から子宮頸部細胞を採るための道具、例えばＡｙｒｅのスパチュラ及び／又は子宮頸部ブラシの存在を特徴とする。
【００３０】
別の実施態様では、本キットは、少なくとも２個のマーカー遺伝子のための遺伝子特異的なプライマーであって、前記少なくとも第１のマーカー遺伝子がＫＣＮＩＰ４、ＧＦＲＡ１、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＣＤＨ６、ＺＳＣＡＮ１、ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ及びＬＨＸ８からなる群から選択され、前記少なくとも第２のマーカー遺伝子がＪＡＭ３、ＥＰＢ４１Ｌ３及びＣ１３ＯＲＦ１８から選択される遺伝子特異的なプライマー；前記少なくとも２個の遺伝子のための遺伝子特異的プローブ；及び、任意に、対象者から子宮頸部細胞を採るためのＡｙｒｅのスパチュラ及び／又は子宮頸部ブラシを含む。
【００３１】
好ましくは、本キットは、以下のマーカー遺伝子の組み合わせ：
ＪＡＭ３／ＣＤＨ６；ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ／ＣＤＨ６／ＥＰＢ４１Ｌ３；ＧＦＲＡ１／ＥＰＢ４１Ｌ３／ＣＤＨ６；ＣＤＨ６／ＥＰＢ４１Ｌ３；ＪＡＭ３／ＥＰＢ４１Ｌ３／ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ；Ｃ１３ＯＲＦ１８／ＪＡＭ３／ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ；ＧＦＲＡ１／ＥＰＢ４１Ｌ３／ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ；ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ／ＥＰＢ４１Ｌ３；Ｃ１３ＯＲＦ１８／ＣＤＨ６；ＪＡＭ３／ＧＦＲＡ１／ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ；ＧＦＲＡ１／ＣＤＨ６；ＪＡＭ３／ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ；ＪＡＭ３／ＥＰＢ４１Ｌ３／ＧＦＲＡ１；ＧＦＲＡ１／ＥＰＢ４１Ｌ３；Ｃ１３ＯＲＦ１８／ＪＡＭ３／ＧＦＲＡ１；ＪＡＭ３／ＧＦＲＡ１；及びＣ１３ＯＲＦ１８／ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ
の少なくとも１個のための遺伝子特異的プライマーを含む。
【００３２】
本発明のキットで用いられる好ましいプライマー及びプローブは、表１Ａ又は表１Ｂに記載のヌクレオチド配列を含む又はから本質的になるプライマー及びプローブから選択される。１つの実施態様では、本キットは表１Ａのエントリー１〜１６から選択される配列を含む又はからなる１個以上の遺伝子特異的プライマーを含む。あるいは又はさらに、本キットは、表１Ｂのエントリー１７〜２４から選択される配列を含む又はからなる少なくとも１個の遺伝子特異的プローブを含む。
【００３３】
これに関連して、本発明はまた、表１Ａ又は表１Ｂに列挙されたヌクレオチド配列からなる単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００３４】
本キットは、さらなる遺伝子のための遺伝子特異的試薬をさらに含んでもよく、前記さらなる遺伝子のメチル化状態が子宮頸癌の発生率に関連するものであり、好ましくは前記さらなる遺伝子がＪＡＭ３、ＥＰＢ４１Ｌ３及び／又はＣ１３ＯＲＦ１８を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】新規なＣＩＮ２＋のメチル化マーカーの同定のために用いられる手順のフロー図である。
【図２】正常（Ｎｌ）及び癌（Ｃａ）患者からの擦過物をＱＭＳＰで試験した９遺伝子のメチル化率を示す。メチル化の相対的レベルは、癌擦過物で有意により高い（ＰＡＸ２を除く全ての遺伝子，ｐ＜０．００１）。
【図３】遺伝子当たりのメチル化率のＲＯＣ曲線分析を示す。
【図４−１】ＣＩＮ０、ＣＩＮ１、ＣＩＮ２、ＣＩＮ３及び（ｍｉ）Ｃａを有する患者からの擦過物をＱＭＳＰで試験した４個の新規なマーカー遺伝子の各々のメチル化率を示す。メチル化の相対レベルは、より重篤な組織学的異常（すべての遺伝子，ｐ＜０．００１）と共に有意に増加する。
【図４−２】ＣＩＮ０、ＣＩＮ１、ＣＩＮ２、ＣＩＮ３及び（ｍｉ）Ｃａを有する患者からの擦過物をＱＭＳＰで試験した４個の新規なマーカー遺伝子の各々のメチル化率を示す。メチル化の相対レベルは、より重篤な組織学的異常（すべての遺伝子，ｐ＜０．００１）と共に有意に増加する。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
実験の部
患者と方法
一般的な手順
ＣＩＮ２／３病変のＤＮＡメチロームを特徴づけて、新規なＣＩＮ２又はそれ以上（ＣＩＮ２＋）のメチル化マーカーを同定するために、以下の手順を適用した（参照：図１）。最初に、１８個のＣＩＮ２／３病変（６個のＣＩＮ２及び１２個のＣＩＮ３）、２０個の正常な子宮頸部及び健康なボランティアの白血球ＤＮＡの２個のプールの新鮮な凍結マクロ切開上皮組織から単離したＤＮＡ上で、ペアエンド配列（メチルキャップ（MethylCap）シークエンシング）を有するヒトＭｅＣＰ２のＭＢＤを用いてメチル化ＤＮＡを濃縮した。示差的メチル化領域（differentially methylated regions：ＤＭＲ）を同定するために、我々はプロモーター領域及びエクソン領域の読み取りデータを検索した。我々は、偽陽性の結果を防ぐするために、白血球数を低くしながら、正常な子宮頸部とＣＩＮ２／３の子宮頸部の間で有意差を示すメチル化マーカーを選択した。マーカーを、高い特異性（正常な子宮頸部でのメチル化が無い）と高感度（ＣＩＮ２／３病変でのメチル化）でランク付けした。ランキングの上位１５個の遺伝子について、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）プライマーを設計し、メチル化パターンを、初めにメチルキャップシークエンシングで用いた同じＤＮＡ上で検査した。この第１の検証工程は、ＭＳＰバンド強度とメチルキャップシークエンシングからの読み取りデータの数とを相関させることにより、メチルキャップシークエンシングデータの検査を可能にした。第２の検証工程では、完全に独立した患者コホート（子宮頸癌（ｎ＝１３）、ＣＩＮ２／３病変（ｎ＝１９）及び正常な子宮頸部（ｎ＝１７））から単離したＤＮＡ上でＭＳＰ分析を行うことで、ＣＩＮ２／３病変での高いメチル化と正常な子宮頸部での高い非メチル化の分布率が分析された。ＤＮＡは、マクロ切開ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）上皮組織から単離した。
【００３７】
最後に、新たに発見されたメチル化マーカーの診断評価を、子宮頸部擦過物上のＱＭＳＰによって行った。最初に、子宮頸癌患者（ｎ＝１００）及び同様の年齢の健康な対照者（ｎ＝８９）からのランダムに選択された多数の擦過物について、新規なバイオマーカーのメチル化率を試験した。第２に、新規なメチル化マーカーの診断ツールとしての可能性を、集団ベースのスクリーニングでの異常なパップスメアと言及され、ランダムに選択された患者（ｎ＝２１５）からの大きなシリーズの擦過物で評価した。参照基準として組織学的検査を用いた。
【００３８】
患者のサンプル
フローニンゲン大学医療センター（University Medical Center Groningen：ＵＭＣＧ）の外来診療所に照会された、子宮頸癌又は集団ベースのスクリーニングでの異常なパップスメアを有するすべての患者は、ＵＭＣＧの施設審査委員会（Institutional Review Board：ＩＲＢ）に承認された、我々の進行中の「メチル化試験」に参加するよう常に依頼された。子宮頸部組織、擦過物及び臨床病理学的データを将来を見越して収集し、組織バンクに保管した。我々のメチル化試験の中で、正常な子宮頸部からの組織サンプル、擦過物及び臨床病理学的データも、非悪性の理由のために子宮摘出術を受ける予定の患者から収集された。正常対照群に用いられる全ての子宮頸部組織は、組織病理学的に正常と判定した。子宮頸癌と言及された患者は、全身麻酔下の骨盤検査及び生体組織検査でＦＩＧＯ基準に従ってステージ分類された。全身麻酔下の手術の前に、両群（子宮頸癌ステージ群及び良性婦人科手術群）から子宮頸部擦過物を採取した。集団ベースのスクリーニングで異常なパップスメアと言及されたすべての患者は、特にこの試験のために膣頸管検査の前に追加のパップスメアを受けた。膣頸管検査では、生体組織検査及び／又はＬＬＥＴＺ（Large Loop Excision of the Transformation）を行った。組織サンプルは経験豊富な婦人科病理学者によってスコア化され、参照基準として組織学的分類が用いられた。日常的な診断評価への干渉が予想されなければ、ＣＩＮ病変からの検体を回収し、−８０℃で保存した。臨床病理学的データが、患者のファイルから回収され、大規模な匿名のパスワードで保護された施設の婦人科癌（Gynecologic Oncology）データベースに保存された。すべての患者は書面によるインフォームドコンセントを行った。
【００３９】
メチルキャップシークエンシング分析に用いた凍結組織サンプルでは、ＣＩＮ２／３患者の年齢の中央値は３５歳（ＩＱＲ３０〜３９）であり、正常な子宮頸部の患者の年齢の中央値は４３歳（ＩＱＲ４１〜４４）であった。ＦＦＰＥサンプルの独立コホートの患者では、ＣＩＮ２／３患者の年齢の中央値は３７歳（ＩＱＲ３４〜４１）であり、正常な子宮頸部の患者の年齢の中央値は４３歳（ＩＱＲ４０〜４４）であり、子宮頸癌患者の年齢の中央値は４９歳（４２〜５４歳の範囲）であった。子宮頸部擦過物では、子宮頸癌患者の年齢の中央値は５０歳（ＩＱＲ３９〜６４）であり、正常な子宮頸部の患者の年齢の中央値は４７歳（ＩＱＲ４３〜５３）であった。子宮頸癌患者のステージは、ＦＩＧＯステージＩＡ１が１人（１％）、ＦＩＧＯステージＩＢ１が３１人（３１％）、ＦＩＧＯステージＩＢ２が１８人（１８％）、ＦＩＧＯステージＩＩＡが２１人（２１％）、ＦＩＧＯステージＩＩＢが１７人（１７％）、ＦＩＧＯステージＩＩＩＡが１人（１％）、ＦＩＧＯステージＩＩＩＢが８人（８％）、及びＦＩＧＯステージＩＶが３人（３％）であった。子宮頸癌患者の組織学的分類は、扁平上皮癌（ＳＣＣ）が７０人（７０％）、腺癌（ＡＤ）が２１人（２１％）、腺扁平上皮癌（ＡＳＣ）が３人（３％）、未分化癌が６人（６％）であった。異常なパップスメアと言及された患者の年齢の中央値は３７歳（ＩＱＲ３２〜４３）であった。これらの患者の組織学的分類は、ＣＩＮ無しが２７人、ＣＩＮ１が３８人、ＣＩＮ２が４５人、ＣＩＮ３が６１人、及びｍｉＣａが４４人（ＳＣＣ２９人、ＡＤ１２人、ＡＳＣ３人）であった。パップスメアは、パパニコロウ（Papanicolaou）システムに従って分類された。表４に、組織学的サブグループごとにパップ分類（及びベセスダ（Bethesda）への翻訳）を示す。
【００４０】
メチルキャップシークエンシングに用いた全ての凍結組織サンプル及びＦＦＰＥサンプルから、１０μｍの組織切片を切断し、マクロ切開を行って上皮細胞を濃縮した。切断の前と後に、ヘマトキシリン及びエオシンスライドを行い、上皮細胞の存在を確認した。子宮頸部擦過物を５ｍｌの氷冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；６．４ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４；１．５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４；０．１４Ｍ ＮａＣｌ；２．７ｍＭ ＫＣｌ）に回収し、さらなる処理まで氷冷下、保持した。これらの５ｍｌの細胞懸濁液のうち、１ｍｌを細胞形態学的評価に使用した。残る４ｍｌを遠心分離し、細胞ペレットを１ｍｌのＴＲＡＰ洗浄緩衝液に懸濁し、４個の画分に分離した。２個の画分を、以前に記載（参考文献２１）したようにＤＮＡ単離のために乾燥ペレットとして−８０℃で保存した。
【００４１】
ＤＮＡ単離
ＦＦＰＥ組織からの組織スライドを、１００％キシレン、次いで１００％エタノールを用いて脱パラフィンした（参考文献１７）。新鮮凍結マクロ切開サンプル及び子宮頸部擦過物からのゲノムＤＮＡを、以前に記載（参考文献２１）したように標準的なオーバーナイトの１％ＳＤＳ及びプロテイナーゼＫの処理、塩−クロロホルム抽出、及びイソプロパノール沈殿により単離した。ＤＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄し、１５０μｌのＴＥ−４（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ；０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）に溶解した。ＢＩＯＭＥＤ−２プロトコールに従って多重ＰＣＲでゲノムＤＮＡを増幅し、ＤＮＡの構造的完全性を確認した（参考文献２７）。メチルキャップシークエンシングサンプルについては、製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社，米国カリフォルニア州カールスバッド）のプロトコールに従って、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ｄｓＤＮＡアッセイキットを用いてＤＮＡ量を測定した。子宮頸部擦過物については、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ＮＤ−１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社，米国マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて、ＤＮＡ濃度及び２６０／２８０比率を測定した。＞１．８の２６０／２８０比率がすべてのサンプルに必要であった。
【００４２】
メチル化ＣｐＧアイランドＤＮＡの捕捉、それに続く次世代シークエンシング（メチルキャップシークエンシング）
製造業者（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ社，ベルギー，リエージュ）の説明書に従って、メチルキャップキットを用いてメチル化ＤＮＡ断片をメチル結合ドメインで捕捉した。このキットは、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグを含むグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）とのＣ末端融合物として、ヒトＭｅＣＰ２のメチル結合ドメイン（ＭＢＤ）からなる。捕捉する前に、ＤＮＡサンプル（５００ｎｇ）をＢｉｏｒｕｐｔｏｒ（商標）ＵＣＤ−２００（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ社，ベルギー，リエージュ）を用いて３００〜１０００ｂｐｓの大きさの範囲にせん断し、約３００ｂｐの断片を単離した。４人の健康な対照群の白血球ＤＮＡを２セットの２サンプルに含めた。捕捉されたＤＮＡは、プロトコール（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社，米国カリフォルニア州サンディエゴ）に従って、イルミナゲノムアナライザーＩＩプラットフォーム上でペアエンド配列決定がされた。その結果を、Ｂｏｗｔｉｅソフトウェアを用いてヌクレオチド配列上にマッピングし（参考文献２８）、ＢｉｏＢｉｘ社のＨ２Ｇ２ブラウザ（http://h2g2.ugent.be/）を用いて可視化し、ヒト参照ゲノム（ＮＣＢＩビルド３７）を用いて処理した。ペアエンド断片はユニークであり、互いに４００ｂｐ以内に位置していた（参考文献２９）。
【００４３】
メチルキャップシークエンシング解析
統計分析のために、プロモーターの読み取り（転写開始部位の−２０００ｂｐ〜＋５００ｂｐ）及びエキソン領域を回収した。正常な子宮頸部とＣＩＮ２／３病変との違いを同定するために、我々は読み取ったデータをメチル化の陽性又は陰性に分割した。サンプルが０又は１の読み取りを示した場合は、サンプルを陰性とした。サンプルが≧３の読み取りを示した場合、サンプルをメチル化陽性とした。続いて、ＣＩＮ２／３について最も高い特異性及び最も高い感度に基づいて、領域をランク付けした。候補のマーカーは、以下の基準を満たすべきである。１）偽陽性の結果を防ぐために白血球における読み取りが低いか陰性であること。両方の白血球サンプルが＞１の読み取りを示した場合、又は１個の白血球サンプルが＞２の読み取りを示した場合、この領域を除外した。２）正常な子宮頸部群の少なくとも７５％（１５／２０）がメチル化されていないこと（０又は１の読み取り）。３）ＣＩＮ２／３病変群の少なくとも２８％（５／１８）がメチル化されていること（＞３の読み取り）。
【００４４】
メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）によるメチルキャップシークエンシングデータの検査と検証
ランキングの上位１５個の遺伝子（１６ＤＭＲ）ためのＭＳＰプライマーを設計した。ＥＺ ＤＮＡメチル化キット（Ｚｙｍｏ社，ＢａｓｅＣｌｅａｒ社，オランダ，ライデン）の推奨に従って、単離されたゲノムＤＮＡ（１μｇ／サンプル）の亜硫酸水素ナトリウム処理を行った。Ｈ２Ｇ２ブラウザから得られた配列を用いて、ＭＳＧの設計と解析を行った。各反応は、６００ｎＭのＭＳＰプライマー、１．５μｌの亜硫酸水素塩処理ＤＮＡ（約１５ｎｇ）、標準のＰＣＲ成分（Ａｐｐｈｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）及び０．５Ｕ ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を含む３０μｌの全反応容量で行った。ＭＳＰの条件は、１０分間の９５℃まで加熱；９５℃で６０秒間；６０℃で６０秒間；７２℃で６０秒間；合計４０サイクル；７２℃で７分間の最終伸長工程である。健康な女性からの白血球ＤＮＡを陰性対照として用い、インビトロで（ＳｓｓＩ酵素によって）メチル化した白血球ＤＮＡを各ＭＳＰの陽性対照として用いた。
【００４５】
定量的メチル化特異的ＰＣＲ（ＱＭＳＰ）
我々のグループが以前に報告した通り、定量分析のための内部（ＦＡＭ−ＺＥＮ／ＩＢＦＱ）標識ハイブリダイゼーションプローブを用いて、ＱＭＳＰを行った（参考文献２１）。プライマー及びプローブの配列を表１に記す。メチル化に依存しない内部参照遺伝子として、β−アクチンを用いた。
【００４６】
【表１Ａ】
0006766312.tif 000002
【００４７】
【表１Ｂ】
0006766312.tif 000003
【００４８】
３００ｎＭのフォワードプライマー及びリバースプライマー、２５０ｎＭのハイブリダイゼーションプローブ、５μｌの２ｘＱｕａｎｔｉＴｅｃｈ Ｐｒｏｂｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ Ｈｉｌｄｅｎ社，ドイツ）及び２．５μＬの亜硫酸水素塩改変ＤＮＡ（約２５ｎｇ）を含む１０μｌの最終容量で、ＱＭＳＰ反応を行った。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００ＨＴ配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）によって、各サンプルを３回分析した。陰性対照及び陽性対照はＭＳＰで用いたものと同じであった。各プレート上で、及びインビトロでメチル化した白血球ＤＮＡの連続希釈物にセットした各々のプライマー−プローブによって、標準曲線分析を行った。３個のウェルのうち少なくとも２個がメチル化陽性であり、Ｃｔ値が５０未満であり、少なくとも２２５ｐｇのβ−アクチンのＤＮＡ入力である場合、ＤＮＡサンプルはメチル化されたとした。目的のメチル化された領域の平均の量を参照のβ−アクチン遺伝子の平均の量で割って１００００を掛ける計算によって、目的の領域のメチル化の相対的レベルを決定した（参考文献３０）。以前に我々のグループが報告した４個の遺伝子（Ｃ１３ＯＲＦ１８、ＪＡＭ３、ＥＰＢ４１Ｌ３及びＴＥＲＴ）を我々の分析に含めて、これらの公知の遺伝子の感度及び特異性を新たに同定されたメチル化マーカーのものと比較した。これらのマーカーのＱＭＳＰを、以前に記載（参考文献２１）したように行った。
【００４９】
ＨＰＶ検査
以前に報告（参考文献３０）したように、一般的なプライマー媒介ＰＣＲ（ＧＰ５＋／６＋）を用いてｈｒＨＰＶ検査を行った。ＨＰＶの型の分類及び臨床的に関連するＨＰＶ感染の検出のために、ＣＯＢＡＳ（登録商標）４８００ＨＰＶ検査によって、ＧＰ５＋／６＋陽性症例を検査した。ＣＯＢＡＳ ＨＰＶ検査では、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８を個別に検出し、同時に１２種類の追加のｈｒＨＰＶの型を同定した（参考文献３１）。ＣＯＢＡＳ（登録商標）ＨＰＶ検査は、集団ベースのスクリーニングプログラムからの擦過物に関する分子病理の我々のＩＳＯ１５１８９認定研究所で日常的に用いられいる。本検査におけるＣＯＢＡＳ（登録商標）ＨＰＶ検査では、Ｐｒｅｓｅｒｖｃｙｔ（登録商標）の液体ベースの擦過物が入手できず、既に単離したＤＮＡのみが入手できたため、ＰＣＲのみのワークフローを用いた。このワークフローは、診断ルーチンで以前に検査された臨床サンプルから単離されたＤＮＡで最初に検証され、その結果、液体ベースのサンプルと同等の結果を示した。
【００５０】
統計分析
ＳＰＳＳソフトウェアパッケージ（ＳＰＳＳ２０，米国イリノイ州シカゴ）を用いて、統計分析を行った。スピアマンの順位相関係数を用いて、メチルキャップシークエンシングの読み取りデータとＭＳＰバンド強度とを比較した。分類ごとのメチル化データはピアソンのカイ２乗検定を用いて分析した。受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を生成し、ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を試験性能の尺度として用いた。マン・ホイットニーのＵ検定及びクラスカル・ワリス検定を用いて、２以上の群でメチル化率の差をそれぞれ決定した。ステューデントのＴ検定を用いて、陽性のメチル化及び年齢を比較した。異常細胞診断と言及された患者群における、ＤＮＡメチル化マーカーとｈｒＨＰＶによる感度及び特異性を比較するために、Ｈａｗａｓｓによって記載された拡張マクネマー検定を行った（参考文献３２）。０．０５より低いＰ値は統計的に有意であるとした。
【実施例】
【００５１】
結果
メチルキャップシークエンシングによる示差的メチル化遺伝子の同定
ゲノムワイドなメチルキャップシークエンシングを用いて、ＣＩＮ２／３の形成異常の子宮頸部細胞のＤＮＡメチル化プロファイルを正常な子宮頸部細胞のものと比較し、ＣＩＮ２／３に特異的なＤＭＲを同定した。我々の基準を適用した後、１６３個の遺伝子を含む１７６個のＤＭＲが残った（データは示していない）。
【００５２】
上位１５個の示差的メチル化遺伝子の検査と検証
メチルキャップシークエンシングデータを検査するために、１６３個の同定された遺伝子から上位１５個の遺伝子を選択した。１５個の遺伝子中の１４個の遺伝子のためのＭＳＰプライマーを設計し、最適化することができた。選択された１４個の遺伝子の検査によって、１１個の遺伝子についてＭＳＰバンド強度とメチルキャップシークエンシングデータの読み取りデータとの間に有意な相関が示された。１個の遺伝子（ＰＣＤＨ１７）は白血球の高いメチル化レベルを示したため、さらなる検証から除外された。残る１０個の遺伝子は検査工程に合格し、その後の検証工程に進んだ。表２は、どの遺伝子が検証の異なる工程を継続したかの概要を示す。
【００５３】
【表２】
0006766312.tif 000004
【００５４】
第２の検証工程は、１３個の子宮頸癌、１９個のＨＳＩＬ病変（８個のＣＩＮ２、８個のＣＩＮ３及び３個のａｄＣＩＳ）及び１７個の正常な子宮頸部からなる、独立した無作為に選択された新規な患者コホートのＦＦＰＥ組織からのＤＮＡ上でＭＳＰによって行われた。分析された１０個の遺伝子のうち９個の遺伝子は、正常サンプルでメチル化レベルが低く、正常サンプルとＨＳＩＬ病変の間で有意な示差的なメチル化があり、白血球のメチル化もほとんど又は全くないこと（ｐ＜０．０５）（表３）が示された。これらの９個の遺伝子（ＺＳＣＡＮ１、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ、ＰＡＸ２、ＣＤＨ６、ＧＦＲＡ１、ＧＡＴＡ４、ＫＣＮＩＰ４及びＬＨＸ８）を、子宮頸部擦過物のさらなる診断評価のために選択した（表３）。
【００５５】
【表３】
0006766312.tif 000005
【００５６】
正常な擦過物と癌の擦過物のＱＭＳＰによる診断評価
新規なメチル化マーカーの診断的価値を評価するために、２個のコホートの患者からの子宮頸部擦過物を用いた。コホート１）正常な擦過物と腫瘍の擦過物、及びコホート２）集団ベースのスクリーニングで異常なパップスメア（≧Ｐａｐ２）と言及された患者からの擦過物である。コホート１では、無作為に選択された子宮頸癌患者１００人及び組織学的に正常な子宮頸部と確認された患者８９人からの擦過物を用いた。ＱＭＳＰ分析によって、９個の選択された遺伝子のうち８個の遺伝子において、正常な擦過物と比較して腫瘍の擦過物のほうがＤＮＡメチル化の相対的レベルがより高いこと（ｐ＜０．００１）（図２）が示された。子宮頸癌におけるメチル化率の曲線下面積（ＡＵＣ）は、８遺伝子ではＡＵＣ＞０．９１を示したが、１個の遺伝子（ＰＡＸ２）では０．５９のＡＵＣを示した。そこで、ＰＡＸ２はさらなる分析から除外された（図３）。正常な子宮頸部の女性では、９個のすべての遺伝子のメチル化陽性率は年齢と関係しなかった（データは示していない）。
【００５７】
正常／ＬＳＩＬ擦過物とＨＳＩＬ擦過物のＱＭＳＰによる診断評価
コホート２では、集団ベースのスクリーニングから異常なパップスメアと言及された２１５人の連続した患者からの擦過物が用いられた。正常な擦過物と腫瘍の擦過物で示差的なメチル化を示した８個の遺伝子を、続いてコホート２で試験した。分析された８個のすべての遺伝子（ＺＳＣＡＮ１、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ、ＣＤＨ６、ＧＦＲＡ１、ＧＡＴＡ４、ＫＣＮＩＰ４及びＬＨＸ８）のメチル化のレベル及び頻度は、基礎をなす組織病変の重症度とともに増加した（ｐ＜０．００１）（図４及び表４）。
【００５８】
より高い／より低い感度及び／又は特異性を達成するためのカットオフ値を設定せずに、遺伝子ＺＳＣＡＮ１、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５及びＫＣＮＩＰ４がＣＩＮ２＋病変の検出に高い感度（≧９０％）を達成し、ＣＤＨ６、ＧＡＴＡ４及びＬＨＸ８ではＣＩＮ２＋に対する感度が７３〜８４％（表５Ａ）であった。ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ及びＧＦＲＡ１では、ＣＩＮ２＋に対する感度は４６〜６１％であり、これらの遺伝子は特に高い特異性（８２％〜９２％）を示した。我々の分析では、我々のグループによって以前に記載された４遺伝子（Ｃ１３ＯＲＦ１８、ＪＡＭ３、ＥＰＢ４１Ｌ３及びＴＥＲＴ）のマーカーパネルも含めて、これら公知遺伝子の感度及び特異性を新たに同定されたメチル化マーカーのものと比較した。遺伝子Ｃ１３ＯＲＦ１８は、以前に記載（参考文献２１）されたような再現性のある高い特異性（９５％）の結果を示し、ＣＩＮ２＋に対して比較的低い４０％の感度を示した。ＪＡＭ３及びＥＰＢ４１Ｌ３は、ＣＩＮ２＋に対して６３〜６９％の感度及び７９〜９１％の特異性を示した。遺伝子ＴＥＲＴは、高い特異性を有することが以前に記載されたが、この結果を再現することができず、我々の分析では特異性が４６％しかなく、他方、ＣＩＮ２＋病変に対する感度は８２％であった。
【００５９】
ｈｒＨＰＶの状態とトリアージ試験
ｈｒＨＰＶ検査は、集団ベースのスクリーニングで異常な細胞診断と言及された患者群について実施した。２１５人の患者中の６人では、ＨＰＶ検査を実施するのに不十分な材料しか得られなかった。ＧＰ５＋／６＋ＰＣＲ及びＣＯＢＡＳ ＨＰＶ検査によって、ｈｒＨＰＶが１５２／２０９（７３％）のサンプルで検出された。表４は、基礎をなす組織学的診断との関係におけるＨＰＶの状態を示す。ｈｒＨＰＶは、１２／２６（４６％）のＣＩＮ病変の無い患者で、２４／３６（６７％）のＣＩＮ１患者で、３６／４５（８０％）のＣＩＮ２患者で、４９／５９（８３％）のＣＩＮ３患者で、及び３１／４３（７２％）のｍｉＣａ患者で存在した。ＣＩＮ２＋に対するｈｒＨＰＶ検査の感度は７９％であり、特異性は４２％であった。
【００６０】
【表４】
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【００６１】
遺伝子ＣＤＨ６、ＧＡＴＡ４及びＬＨＸ８では、感度及び特異性の結果は、ＣＩＮ２＋に対して７３〜８４％の感度及び４０〜６０％の特異性であり、ｈｒＨＰＶ検査の感度及び特異性と同等であった（表５Ａ）。
【００６２】
【表５Ａ】
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【００６３】
表５Ｂは、ｈｒＨＰＶ陽性女性（ｎ＝１５２）からの擦過物におけるＣＩＮ２＋及びＣＩＮ３＋に対する感度及び特異性を示し、これらは表５Ａに示すように群全体に対する結果と同等であった。遺伝子ＺＳＣＡＮ１、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５及びＫＣＮＩＰ４はまた、ＣＩＮ２＋の検出に対して高い感度（≧９２％）を示し、ＣＤＨ６、ＧＡＴＡ４、ＥＰＢ４１Ｌ３、ＴＥＲＴ及びＺＳＣＡＮ１６では、ＣＩＮ２＋に対する感度は７２〜８５％であった。ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ、ＪＡＭ３、Ｃ１３ＯＲＦ１８及びＧＦＲＡ１では、ＣＩＮ２＋に対する感度は４３〜６８％であったが、これらの遺伝子は８６〜９４％の高い特異性を示した。現在のオランダの集団ベースのスクリーニングプログラムでは、ｐａｐ２／ｐａｐ３ａ（ＡＳＣＵＳ／ＬＳＩＬ）を有する女性からの擦過物は、ｈｒＨＰＶによるトリアージ試験で６ヶ月後に再検査される。従って、我々はまた、この群におけるｈｒＨＰＶ及びメチル化マーカーによるトリアージ試験の結果を示す（表５Ｂ）。ｈｒＨＰＶによるトリアージ試験は、ＣＩＮ２＋に対する８２％の感度と４１％の特異性を示す。ＧＡＴＡ４、ＬＨＸ８及びＴＥＲＴは同等の結果を示す。
【００６４】
【表５Ｂ】
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【００６５】
遺伝子の異なる組み合わせを分析して、最も高い感度と特異性の組み合わせを有する最良のメチル化マーカーパネルを見い出した。この分析のために、試験した組み合わせのいずれかの遺伝子が陽性であれば、サンプルは陽性とした。３個を超える遺伝子を組み合わせに加えることで、メチル化試験の特異性は減少し、感度は最小限で増加した。ＣＩＮ２＋に対する最も高い感度及び特異性の組み合わせを有する遺伝子の組み合わせは、ＪＡＭ３／ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ、Ｃ１３ＯＲＦ１８／ＪＡＭ３／ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ及びＪＡＭ３／ＧＦＲＡ１／ＡＮＫＲＤ１８ＣＰであり、これらの感度は７２％、７４％及び７３％であり、ｈｒＨＰＶ検査（７９％）と同等である。両方の組み合わせの特異性は、７１％及び７６％であり、ｈｒＨＰＶ検査（４２％）より有意に高かった（ｐ≦０．０５）。表６は、他のすべての組み合わせでは、ＣＩＮ２＋病変を検出する感度が６４〜８０％であり、組み合わせられる特異性が５８〜８８％であることを示す。
【００６６】
【表６】
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【００６７】
ｈｒＨＰＶ陽性擦過物において、最良の３個の組み合わせ（ＪＡＭ３／ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ、Ｃ１３ＯＲＦ１８／ＪＡＭ３／ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ及びＪＡＭ３／ＧＦＲＡ１／ＡＮＫＲＤ１８ＣＰ）のＣＩＮ２＋に対する感度と特異性（感度：７６〜７７％；特異性：８１〜８３％）（表７）は、全集団と同等であった。
【００６８】
【表７】
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【００６９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
0006766312.tif 000014
【図４−２】
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【配列表】
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