(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に少なくとも９０％同一の配列を有しトランスポザーゼ活性を有する組換えポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、１４位に対応する位置にＡｒｇ；３３位に対応する位置にＡｌａ；１１５位に対応する位置にＨｉｓ；２１４位に対応する位置にＡｓｐ；２１５位に対応する位置にＡｌａ；２１６位に対応する位置にＶａｌ；２１７位に対応する位置にＧｌｎ；２４３位に対応する位置にＨｉｓ；１３６位に対応する位置にＡｒｇ；２５３位に対応する位置にＨｉｓ及び２５５位に対応する位置にＡｒｇを含む、前記組換えポリペプチド。
【請求項２】
３１４位に対応する位置にＡｓｎを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１の配列を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
３１４位に対応する位置にＴｈｒを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、配列番号３の配列と少なくとも９５％同一である、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号３の配列を含む、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド分子。
【請求項８】
前記分子がｍＲＮＡである、請求項７に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項９】
前記分子が、配列番号２と少なくとも９０％同一の配列を有する、請求項７に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項１０】
前記分子が、配列番号２の配列を有する、請求項７に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリペプチドまたは請求項７に記載のポリヌクレオチド分子を保有する宿主細胞。
【請求項１２】
前記細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞もしくはＴ細胞の前駆細胞である、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
細胞の遺伝子操作方法において使用するための、配列番号１または３のポリペプチドをコードする核酸を含む組成物であって：
前記方法は、
（ａ）前記細胞に、（ｉ）前記組成物；及び（ｉｉ）トランスポゾンリピートに隣接する選択した遺伝子因子をコードするＤＮＡを形質移入し；ならびに
（ｂ）一過性または安定なトランスポザーゼ活性に適した条件下で前記細胞をインキュベートし、それにより、前記選択した遺伝子因子を前記細胞のゲノムに組み込み、操作した細胞を産生することを含む、組成物。
【請求項１４】
細胞の遺伝子操作方法において使用するための、トランスポゾンリピートに隣接する選択した遺伝子因子をコードするＤＮＡを含む組成物であって：
前記方法は、
（ａ）前記細胞に、（ｉ）配列番号１または３のポリペプチドをコードする核酸；及び（ｉｉ）前記組成物を形質移入し；ならびに
（ｂ）一過性または安定なトランスポザーゼ活性に適した条件下で前記細胞をインキュベートし、それにより、前記選択した遺伝子因子を前記細胞のゲノムに組み込み、操作した細胞を産生することを含む、組成物。
【請求項１５】
前記選択した遺伝子因子が、抗体、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする、請求項１３または１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記細胞への形質移入が、前記細胞を電気穿孔することを含む、請求項１３または１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記選択した遺伝子因子が、ＣＡＲをコードし、前記ＣＡＲが、膜結合サイトカインと共発現される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
前記膜結合サイトカインが、ＩＬ−１５である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記分子が、配列番号４の配列を有する、請求項７に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項２０】
前記分子が、配列番号４と少なくとも９０％同一の配列を有する、請求項７に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項２１】
前記分子が、配列番号２と少なくとも９５％同一の配列を有する、請求項７に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項２２】
前記分子が、配列番号４と少なくとも９５％同一の配列を有する、請求項７に記載のポリヌクレオチド分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１６年３月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／１３１，８２７号の利益を主張し、前記文献はその全体を参照により本明細書に援用
【０００２】
［配列表の援用］
２０１６年３月３日に作成された１８ＫＢ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）で計測）のファイル名「ＵＴＦＣＰ１２５６ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」のファイルに含まれる配列表を、電子データで本明細書とともに提出し、これを参照により本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００３】
１．発明の分野
本発明は、一般に、医学、免疫学、細胞生物学、及び分子生物学の分野に関する。ある特定の態様において、本発明の分野は、遺伝子操作におけるトランスポザーゼポリペプチド及びその使用に関する。
【０００４】
２．関連技術の説明
機能的ゲノミクスの時代においては、細胞のゲノム中のコード配列を改変する効率的な手段が必要である。そのようなゲノム操作を用いて、導入遺伝子を安定して発現する細胞を産生するとともに、細胞を再プログラミングすることが可能である。ゲノム操作に用いる好適なツールの１つが、トランスポゾン／トランスポザーゼ系である。トランスポゾンすなわち転移性因子は、（短い）核酸配列であって、その上流及び下流に末端反復配列を有する核酸配列を含み、標的ＤＮＡ配列に対する核酸の切除及び挿入を容易にする酵素をコードしている。いくつかのトランスポゾン／トランスポザーゼ系は、様々な脊椎動物培養細胞株、胚性幹細胞及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいて転移活性を示す魚類由来のＴｃ１／マリナー様因子であるＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）を含む異種ＤＮＡ配列の遺伝子挿入に適合している（Ｉｖｉｃｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９７）。しかしながら、これらの系はいずれも、ヒト／哺乳類細胞の操作には採用されていない。したがって、哺乳類細胞及び生物において高レベルの活性を有するトランスポゾン／トランスポザーゼ系が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
第一の実施形態では、哺乳類細胞内で高いトランスポザーゼ活性を有するかまたはそれからなる組換えポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、実施形態のポリペプチドは、配列番号１（ｈＳＢ１１０）または配列番号３（ｈＳＢ８１）と少なくとも９０％同一である配列を含むかまたはそれからなる。ある特定の態様では、ポリペプチドは、配列番号１もしくは配列番号３の配列、または配列番号１もしくは配列番号３の全長と少なくとも９０％同一である配列を含むかまたはそれからなり、哺乳類細胞内でトランスポザーゼ活性を示す。さらなる態様では、ポリペプチドは、配列番号１または配列番号３と少なくとも９０％同一の配列を含むかまたはそれからなり、哺乳類細胞内でトランスポザーゼ活性を示し、及び以下の特徴の１つ以上を含む：１３６位（ｈＳＢ１１０における）に対応する位置にＡｒｇ、２５３位（ｈＳＢ１１０における）に対応する位置にＨｉｓ、２５５位（ｈＳＢ１１０における）に対応する位置にＡｒｇ及び／または３１４位（ｈＳＢ１１０における）に対応する位置にＴｈｒ。さらなる態様では、上記の少なくとも９０％同一のポリペプチドは、天然に存在するトランスポザーゼ酵素の配列を含まないか、または配列番号５（ＳＢ１１）、配列番号６（ＳＢ１０）もしくは配列番号７（ＳＢ１００ｘ）の配列を含まない。いくつかの態様では、実施形態のポリペプチドは、配列番号１（ｈＳＢ１１０）または配列番号３（ｈＳＢ８１）と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの態様では、実施形態のポリペプチドは、配列番号１（ｈＳＢ１１０）または配列番号３（ｈＳＢ８１）と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列を含むかまたはそれからなり、哺乳類細胞内でトランスポザーゼ活性を示す。いくつかの態様では、実施形態のポリペプチドは、配列番号１（ｈＳＢ１１０）または配列番号３（ｈＳＢ８１）と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列を含むかまたはそれからなり、哺乳類細胞内でトランスポザーゼ活性を示し、及び以下の特徴の１つ以上を含むかまたはそれらからなる：１３６位（ｈＳＢ１１０における）に対応する位置にＡｒｇ、２５３位（ｈＳＢ１１０における）に対応する位置にＨｉｓ、２５５位（ｈＳＢ１１０における）に対応する位置にＡｒｇ及び／または３１４位（ｈＳＢ１１０における）に対応する位置にＴｈｒ。いくつかの態様では、上記の少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のポリペプチドは、天然に存在するトランスポザーゼ酵素の配列を含まないか、または配列番号５（ＳＢ１１）、配列番号６（ＳＢ１０）もしくは配列番号７（ＳＢ１００ｘ）の配列を含まない。さらなる態様では、実施形態のトランスポザーゼポリペプチドは、トランスポザーゼ配列のＮ末端またはＣ末端に融合した異種ポリペプチド配列をさらに含むかまたはそれからなる。例えば、異種ポリペプチド配列は、レポーター、精製タグまたは細胞浸透性ポリペプチド（ＣＰＰ）を含みかまたはそれからなっていてもよい。さらなる態様では、実施形態のポリペプチドがトランスポザーゼ活性を示す哺乳類細胞は、ヒト細胞である。さらなる態様では、ヒト細胞は免疫細胞である。さらなる態様では、ヒト免疫細胞はＴ細胞である。さらなる態様では、Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞（ＴＨ細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ細胞またはＣＴＬ）、メモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）、エフェクターＴ細胞（ＴＥＭ細胞）、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞；サプレッサーＴ細胞としても知られる）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）、ＭＡＩＴ細胞、αβＴ細胞（Ｔαβ細胞）、及び／またはγδＴ細胞（Ｔγδ細胞）である。
【０００６】
さらに別の態様では、実施形態のポリペプチドは、配列番号１（ｈＳＢ１１０）または配列番号３（ｈＳＢ８１）と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列を含むかまたはそれからなり、以下の特徴の１つ以上を含み：１３６位（ｈＳＢ１１０における）に対応する位置にＡｒｇ、２５３位（ｈＳＢ１１０における）に対応する位置にＨｉｓ、２５５位（ｈＳＢ１１０における）に対応する位置にＡｒｇ及び／または３１４位（ｈＳＢ１１０における）に対応する位置にＴｈｒ、さらに以下のさらなる特徴の１つ以上を含む：１４位（ｈＳＢ１１０における）に対応する位置にＡｒｇ、３３位（ｈＳＢ１１０における）に対応する位置にＡｌａ、１１５位（ｈＳＢ１１０における）に対応する位置にＨｉｓ、２１４位（ｈＳＢ１１０における）に対応する位置にＡｓｐ、２１５位（ｈＳＢ１１０における）に対応する位置にＡｌａ、２１６位（ｈＳＢ１１０における）に対応する位置にＶａｌ、２１７位（ｈＳＢ１１０における）に対応する位置にＧｌｎ及び／または２４３位（ｈＳＢ１１０における）に対応する位置にＨｉｓ。いくつかの態様では、上記の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のポリペプチドは、天然に存在するトランスポザーゼ酵素の配列を含まないか、または配列番号５（ＳＢ１１）、配列番号６（ＳＢ１０）もしくは配列番号７（ＳＢ１００ｘ）の配列を含まない。いくつかの態様では、実施形態のポリペプチドは：１４位（ｈＳＢ１１０における）に対応する位置にＡｒｇ、３３位（ｈＳＢ１１０における）に対応する位置にＡｌａ、１１５位（ｈＳＢ１１０における）に対応する位置にＨｉｓ、２１４位（ｈＳＢ１１０における）に対応する位置にＡｓｐ、２１５位（ｈＳＢ１１０における）に対応する位置にＡｌａ、２１６位（ｈＳＢ１１０における）に対応する位置にＶａｌ、２１７位（ｈＳＢ１１０における）に対応する位置にＧｌｎ、及び２４３位（ｈＳＢ１１０における）に対応する位置にＨｉｓからなる群から選択される２、３、４、５、６、７または８個の配列特徴を有する。さらなる態様では、上記の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のポリペプチドは、２１４〜２１７位（ｈＳＢ１１０における）に対応する位置に配列ＤＡＶＱを含む。
【０００７】
いくつかの態様では、実施形態のポリペプチドは、配列番号１（ｈＳＢ１１０）と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列を含むかまたはそれからなり、３１４位（ｈＳＢ１１０における）に対応する位置にＡｓｎを含み、以下の特徴の１つ以上を含む：１３６位（ｈＳＢ１１０における）に対応する位置にＡｒｇ、２５３位（ｈＳＢ１１０における）に対応する位置にＨｉｓ、及び／または２５５位（ｈＳＢ１１０における）に対応する位置にＡｒｇ。いくつかの態様では、上記の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のポリペプチドは、天然に存在するトランスポザーゼ酵素の配列を含まないか、または配列番号５（ＳＢ１１）、配列番号６（ＳＢ１０）もしくは配列番号７（ＳＢ１００ｘ）の配列を含まない。特定の態様では、ポリペプチドは、配列番号１の配列を含むかまたはそれからなる。
【０００８】
他の態様では、実施形態のポリペプチドは、配列番号３（ｈＳＢ８１）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列を含むかまたはそれからなり、３１４位（ｈＳＢ１１０における）に対応する位置にＴｈｒを含み、以下の特徴の１つ以上を含む：１３６位（ｈＳＢ１１０における）に対応する位置にＡｒｇ、２５３位（ｈＳＢ１１０における）に対応する位置にＨｉｓ、及び／または２５５位（ｈＳＢ１１０における）に対応する位置にＡｒｇ。いくつかの態様では、上記の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のポリペプチドは、天然に存在するトランスポザーゼ酵素の配列を含まないか、または配列番号５（ＳＢ１１）、配列番号６（ＳＢ１０）もしくは配列番号７（ＳＢ１００ｘ）の配列を含まない。特定の態様では、ポリペプチドは、配列番号３の配列を含むかまたはそれからなる。
【０００９】
さらなる実施形態において、実施形態によるポリペプチドをコードする配列を含むかまたはそれからなるポリヌクレオチド分子を提供する。いくつかの態様では、この分子はＤＮＡ発現ベクターであってもよい。例えば、ＤＮＡ発現ベクターは、ポリペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現用プロモーター（例えば、Ｔ７もしくはＳＰ６プロモーター）またはポリペプチドの哺乳類細胞内での発現用プロモーターに作動可能に連結したトランスポザーゼコード配列を備えてもよい。いくつかの態様では、ポリヌクレオチド分子は、ＲＮＡまたはｍＲＮＡであってもよい。さらなる態様では、ＲＮＡは、５’‐キャップ、ＩＲＥＳモチーフ、（異種）５’ＵＴＲ、（異種）３’ＵＴＲ及び／またはポリ（Ａ）配列を有してもよい。いくつかの態様では、ＲＮＡは、２０〜３００ヌクレオチドのポリ（Ａ）配列をさらに有してもよい。
【００１０】
さらに別の実施形態では、本発明は、トランスポザーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞に形質移入し、ポリヌクレオチドからポリペプチドを発現させることを含む、上記のトランスポザーゼポリペプチドの作製方法を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、実施形態のポリペプチドまたはポリヌクレオチド分子を保有する宿主細胞を提供する。場合によっては、細胞はヒト細胞のような哺乳類細胞である。ある特定の態様では、細胞は、幹細胞または誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。さらなる態様では、細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫ細胞の前駆細胞、Ｔ細胞、Ｔ細胞の前駆細胞、または免疫細胞である。場合によっては、細胞は、実施形態のトランスポザーゼポリペプチドをコードするＲＮＡを保有してもよい。さらに別の実施形態では、実施形態のポリペプチドまたはポリヌクレオチド分子を保有する細胞の集団を提供する。
【００１１】
別の実施形態では：上記のようなトランスポザーゼポリペプチドまたはそのトランスポザーゼポリペプチドをコードする核酸、及びトランスポゾンリピートに隣接する選択した遺伝子因子をコードする配列を含むＤＮＡベクターを細胞に形質移入し、そして（一過性または安定した）トランスポザーゼ活性に適した条件下で細胞をインキュベートし、それによって、選択した遺伝子因子を細胞のゲノム中に組み込み、操作した細胞を産生することを含む、細胞の遺伝子操作方法を提供する。ある特定の態様では、トランスポゾンリピートに隣接する選択した遺伝子因子をコードするＤＮＡベクターは、実施形態のトランスポザーゼポリペプチドをコードする配列をさらに含む。したがって、ある特定の態様では、実施形態の方法は、トランスポゾンリピートに隣接する選択した遺伝子因子をコードする配列と、プロモーター配列の制御下にある実施形態のトランスポザーゼをコードする配列とを含むＤＮＡベクターを細胞に形質移入し、次いでトランスポザーゼの発現及び活性に適した条件下で細胞をインキュベートし、それによって、選択した遺伝子因子を細胞のゲノムに組み込み、操作した細胞を産生することを含む。いくつかの態様では、この方法は、操作した細胞を単離または培養する第三の段階を含む。いくつかの態様では、選択した遺伝子因子はスクリーニング可能な、すなわち選択マーカーである。さらなる態様では、選択した遺伝子因子は、抗体、阻害性核酸（例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ））、治療用ポリペプチド、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、または免疫細胞機能のエンハンサーをコードしてもよい。特定の態様では、選択した遺伝子因子はＣＡＲまたはＴＣＲをコードする。さらなる態様では、選択した遺伝子因子は、細胞由来の対応する遺伝子を置換または修飾するために（例えば、遺伝子の配列もしくは発現を改変するために、または細胞内の遺伝子発現を「ノックアウト」するために）用いる遺伝子またはその一部であってもよい。いくつかの態様では、形質移入する細胞は、ヒト細胞などの哺乳類細胞である。場合によっては、細胞は幹細胞またはｉＰＳ細胞であってもよい。ある特定の態様では、細胞は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞の前駆細胞、またはＴ細胞の前駆細胞などの免疫系細胞もしくはその前駆細胞であってもよい。
【００１２】
いくつかの態様では、細胞への形質移入は、化学物質ベースの形質移入試薬の使用、細胞の電気穿孔、または細胞の細胞質及び核への核酸及び／またはタンパク質の送達を提供する他の技術を含み得る。例えば、細胞は、塩沈殿物（例えば、ＣａＰＯ４沈殿物）、脂質（例えば、荷電または非極性脂質）、カチオン性ポリマー、ＰＥＧ複合体及び／またはタンパク質複合体（例えば、カチオン性ポリペプチド）を用いて形質移入することができる。いくつかの態様では、形質移入は、リン脂質リポソーム（例えば、グリセロリン脂質またはスフィンゴ脂質を含むリポソーム）などのリポソームの使用を含み得る。さらなる態様では、細胞を、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）またはワクシニアウイルスベクター）で形質導入してもよい。ある特定の態様では、実施形態による使用のためのウイルスベクターは、非組込み型ウイルスベクターである。当業者であれば、ある特定の態様において、実施形態のトランスポザーゼを、トランスポゾンリピートをコードする核酸と共にまたは別々に細胞に送達してもよいことを認識するであろう。例えば、ある特定の態様において、トランスポザーゼを、タンパク質形質移入試薬を使用して組換えポリペプチドとして細胞に送達してもよく、トランスポゾンリピートを含む核酸分子を、核酸形質移入系またはウイルスベクターを用いて送達してもよい。さらなる態様では、トランスポザーゼをコードするＲＮＡと、トランスポゾンリピート及び選択した遺伝子因子を有するＤＮＡとを、同時形質移入する。
【００１３】
さらなる態様において、本方法は、実施形態のトランスポザーゼポリペプチドまたはそのトランスポザーゼポリペプチドをコードする核酸と、トランスポゾンリピートに隣接する選択した遺伝子因子をコードする配列を有するＤＮＡベクターとを細胞集団に形質移入し、次いで、トランスポザーゼの活性に適した条件下で集団をインキュベートし、それによって、選択した遺伝子因子を細胞のゲノムに組み込み、操作した細胞の集団を産生することをさらに含む。特定の態様では、本方法は、トランスポザーゼポリペプチドまたはそのトランスポザーゼポリペプチドをコードする核酸と、トランスポゾンリピートに隣接するＣＡＲをコードする配列を有するＤＮＡベクターとをＴ細胞またはＴ細胞の前駆細胞の集団に形質移入し、トランスポザーゼの活性に適した条件下で集団をインキュベートし、それによって、細胞のゲノム中にＣＡＲを組み込み、操作したＴ細胞またはＴ細胞の前駆細胞の集団を産生することを含む。さらなる態様では、本方法は、トランスポゾンリピートに隣接するＣＡＲをコードする配列と、実施形態のトランスポザーゼをコードする配列（プロモーターに作動可能に連結している）とを有するＤＮＡベクターを、Ｔ細胞またはＴ細胞の前駆細胞の集団に形質移入し、トランスポザーゼ活性に適した条件下で集団をインキュベートし、それによって細胞のゲノム中にＣＡＲを組み込み、操作したＴ細胞またはＴ細胞の前駆細胞の集団を産生することを含む。ＣＡＲを発現するＴ細胞の増殖を選択的に促進する培地中での操作細胞の培養をいくつかの態様において追加的に実施してもよい。
【００１４】
さらに別の実施形態では、前記実施形態に従って、第一に操作Ｔ細胞またはＴ細胞の前駆細胞の集団を取得し、必要に応じてＣＡＲを発現するＴ細胞の増殖を選択的に促進する培地中で細胞を培養して、次いで有効量のＣＡＲ発現Ｔ細胞を対象に投与してＴ細胞応答を提供することを含む、疾患を有するヒト対象におけるＴ細胞応答の提供方法を提供する。
【００１５】
したがって、いくつかの態様では、実施形態の方法は：（ａ）対象から、Ｔ細胞またはＴ細胞の前駆細胞を含む細胞の試料を取得し；（ｂ）トランスポゾンに隣接するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするＤＮＡ、及びＣＡＲをコードするＤＮＡを細胞ゲノムへ組み込むのに有効な実施形態のトランスポザーゼを細胞に形質移入し、ＣＡＲを発現するトランスジェニック細胞集団を提供し；（ｃ）必要に応じて、トランスジェニックＣＡＲ細胞の集団を生体外において、ＣＡＲを発現するＴ細胞の増殖を選択的に促進する培地中で培養し；ならびに（ｄ）有効量のトランスジェニックＣＡＲ細胞を対象に投与して、Ｔ細胞応答を提供することを含む。したがって、いくつかの態様では、トランスジェニックＣＡＲ細胞を、２１日未満、例えば、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２日またはそれ未満の間、生体外で培養する。ある特定の態様では、ＣＡＲ細胞を３〜５日以内の間、生体外で培養する。さらに別の態様では、本方法の工程（ａ）〜（ｄ）（すなわち、ＣＡＲ  Ｔ細胞を投与するための細胞試料の取得）を、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５日以内に終結させる。さらなる態様では、対象由来の細胞試料は、約２００ｍｌ未満の末梢血または臍帯血試料であってもよい。いくつかの態様では、アフェレーシスによって試料を収集してもよい。ある特定の態様では、アフェレーシスを伴わない方法（例えば、静脈穿刺による）によって試料を収集する。さらなる態様において、細胞試料は１７５ｍｌ未満、約１７５ｍｌ未満、１５０ｍｌ未満、約１５０ｍｌ未満、１２５ｍｌ未満、約１２５ｍｌ未満、１００ｍｌ未満、約１００ｍｌ未満、７５ｍｌ未満、約７５ｍｌ未満、５０ｍｌ未満、約５０ｍｌ未満、２５ｍｌ未満、または約２５ｍｌ未満の初期体積を有する（例えば、対象から取得する際、細胞試料は約５０〜約２００ｍｌ、約５０〜約１００ｍｌ、または約１００〜約２００ｍｌの初期体積を有する）。
【００１６】
いくつかの態様では、実施形態の方法は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びトランスポザーゼをコードするＤＮＡを細胞に形質移入することに関する。細胞の形質移入の方法は当該分野で周知であるが、ある特定の態様では、電気穿孔法のような非常に効率的な形質移入法を用いる。例えば、ヌクレオフェクション装置を用いて核酸を細胞に導入してもよい。ある特定の実施形態では、前記形質移入工程は、治療対象の対象内のウイルス配列保有細胞に対して、遺伝毒性を引き起こし、及び／または免疫応答をもたらし得るような、ウイルスを用いた細胞への感染または形質導入を含まない。
【００１７】
実施形態のさらなる態様は、ＣＡＲをコードする発現ベクターを細胞に形質移入することに関する。広範囲のＣＡＲ構築物及びそれらのための発現ベクターは、当該技術分野で公知である。例えば、いくつかの態様において、ＣＡＲ発現ベクターは、プラスミド、直鎖状発現ベクターまたはエピソームなどのＤＮＡ発現ベクターである。いくつかの態様では、ベクターは、ＣＡＲの発現を促進する配列、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリＡシグナル、及び／または１つ以上のイントロンなどのさらなる配列を含む。ある特定の態様では、ＣＡＲコード配列は、トランスポゾン配列と隣接しており、その結果、トランスポザーゼの存在により、形質移入した細胞のゲノムにコード配列を組み込むことが可能になる。
【００１８】
上記に詳述したように、ある特定の態様において、形質移入した細胞のゲノムへのＣＡＲコード配列の組込みを促進する実施形態のトランスポザーゼを用いて、細胞にさらなる形質移入を行う。いくつかの態様では、トランスポザーゼを、ＤＮＡ発現ベクターとして提供する。ある特定の態様では、トランスポザーゼを、発現可能なＲＮＡまたはタンパク質として提供し、それによってトランスジェニック細胞内でトランスポザーゼの長期発現が起こらないようにする。例えば、いくつかの態様では、トランスポザーゼを、ｍＲＮＡ（例えば、キャップ及びポリＡテールを有するｍＲＮＡ）でコードして提供する。
【００１９】
さらなる態様において、実施形態のトランスジェニックＣＡＲ細胞は、Ｔ細胞の増殖及び／または生存を刺激する膜結合サイトカインの発現のための発現ベクターをさらに含む。特に、そのようなサイトカインを有するＣＡＲ細胞は、サイトカインの発現によって生じる刺激のために、活性化及び増殖細胞（ＡａＰＣ）または人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）による生体外での培養をほとんどまたはまったく伴わずに増殖及び／または持続することができる。同様に、そのようなＣＡＲ細胞は、ＣＡＲが認識する大量の抗原が存在しない場合でも（例えば、寛解中の癌患者または最小限の残存疾患を有する患者の場合のように）ｉｎ  ｖｉｖｏで増殖することができる。いくつかの態様において、ＣＡＲ細胞は、Ｃγサイトカイン及び因子（例えば、膜貫通ドメイン）の発現のためのＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクターを保有し、サイトカインの表面での発現を提供する。例えば、ＣＡＲ細胞は、膜結合型のＩＬ‐７、ＩＬ‐１５またはＩＬ‐２１を含むことができる。いくつかの態様では、サイトカインコード配列とサイトカイン受容体とを融合させることによって、サイトカインを膜に繋ぎ止める。例えば、細胞は、ＩＬ‐１５‐ＩＬ‐１５Ｒα融合タンパク質の発現用ベクターを含むことができる。さらなる態様では、膜結合型Ｃγサイトカインをコードするベクターは、ＣＡＲ細胞のゲノムに組み込まれたベクターまたは染色体外ベクター（例えば、エピソームベクター）などのＤＮＡ発現ベクターである。さらなる態様では、膜結合Ｃγサイトカインの発現は誘導性プロモーター（例えば、薬物誘導性プロモーター）の制御下にあり、プロモーター活性を誘導または抑制することによってＣＡＲ細胞内のサイトカインの発現（及びそれによるＣＡＲ細胞の増殖）を制御できる。
【００２０】
実施形態の態様は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｔ細胞またはＴ細胞の前駆細胞を有する患者からの試料を採取することに関する。例えば、場合によっては、試料は、臍帯血試料、末梢血試料（例えば、単核細胞画分）または多能性幹細胞を含む対象由来試料である。いくつかの態様では、対象由来の試料を培養して誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞を生成させ、これらの細胞を用いてＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞またはＴ細胞を産生することができる。細胞試料は、対象から直接培養してもよく、または使用前に凍結保存してもよい。いくつかの態様において、細胞試料を採取することは、細胞試料を収集することを含む。他の態様では、試料を第三者経由で入手する。さらなる態様では、対象由来の試料を処理して、試料中のＴ細胞またはＴ細胞の前駆細胞を精製または濃縮することができる。例えば、試料を勾配精製、細胞培養選択及び／または細胞選別に供することができる（例えば、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を介して）。
【００２１】
いくつかの態様では、実施形態の方法は、抗原提示細胞の使用（例えば、操作した細胞の増殖のための）をさらに含む。例えば、抗原提示細胞は、樹状細胞、活性化及び増殖細胞（ＡａＰＣ）、または不活性化（例えば、照射した）人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であり得る。そのような抗原提示細胞を産生するための方法は、当該技術分野で周知であり、本明細書においてさらに詳述する。したがって、いくつかの態様では、ＣＡＲ細胞集団を増殖させるために、限定的な期間の間、生体外でトランスジェニックＣＡＲ細胞を抗原提示細胞（例えば、不活性化ａＡＰＣ）と共培養する。ＣＡＲ細胞を共培養する工程は、例えばインターロイキン‐２１（ＩＬ‐２１）及び／またはインターロイキン‐２（ＩＬ‐２）を含む培地中で行うことができる。いくつかの態様では、ＣＡＲ細胞と抗原提示細胞とを、約１０：１〜約１：１０；約３：１〜約１：５；または約１：１〜約１：３の比率で共培養する。例えば、ＣＡＲ細胞と抗原提示細胞との共培養は、約１：１、約１：２または約１：３の比率であり得る。
【００２２】
いくつかの態様では、ＡａＰＣまたはａＡＰＣなどのＣＡＲ細胞の培養のための細胞を操作し、特定のポリペプチドを発現させ、ＣＡＲ細胞の増殖を促進する。例えば、細胞は、（ｉ）ＣＡＲが標的とする抗原（すなわち、トランスジェニックＣＡＲ細胞上で発現する）；（ｉｉ）ＣＤ６４；（ｉｉ）ＣＤ８６；（ｉｉｉ）ＣＤ１３７Ｌ；及び／または（ｖ）ａＡＰＣの表面上に発現する膜結合型ＩＬ‐１５を有し得る。いくつかの態様では、ＡａＰＣまたはａＡＰＣは、ＡａＰＣまたはａＡＰＣの表面上に発現するＣＡＲ結合抗体またはその断片を含む。好ましくは、本発明の方法に使用するＡａＰＣまたはａＡＰＣについては、それが感染性物質を含まないことを検査して確認し、及び／または不活性化して非増殖性であることを検査して確認する。
【００２３】
ＡａＰＣまたはａＡＰＣ存在下での増殖は、培養物中のＣＡＲ細胞の数または濃度を増加させることができるが、この手順は、労働集約的であり、高価である。さらに、いくつかの態様では、治療を必要とする対象に対し、可能な限り短時間でトランスジェニックＣＡＲ細胞を再注入すべきである。したがって、いくつかの態様では、トランスジェニックＣＡＲ細胞の生体外での培養期間は、１４日、７日、または３日以内である。例えば、生体外での培養（例えば、ＡａＰＣまたはａＡＰＣの存在下での培養）は、トランスジェニックＣＡＲ細胞の２倍未満の集団に対して実施することができる。さらなる態様では、ＡａＰＣまたはａＡＰＣの存在下でのトランスジェニック細胞の生体外での培養は行わない。
【００２４】
さらに別の態様では、実施形態の方法は、細胞の形質移入後、または細胞の生体外での増殖後に、ＣＡＲを発現するＴ細胞の細胞集団を富化するための工程を含む。例えば、富化工程は、例えばＣＡＲまたはＣＡＲ結合抗体が結合する抗原を用いて細胞を選別する（例えば、ＦＡＣＳによる）ことを含み得る。さらなる態様では、富化工程は、非Ｔ細胞の枯渇またはＣＡＲ発現を欠損している細胞の枯渇を含む。例えば、ＣＤ５６＋細胞を培養集団から枯渇させることができる。さらなる態様では、細胞を対象に投与する際に、ＣＡＲ細胞の試料を保存する（または培養物中で維持する）。例えば、後の増殖または分析のために、試料を凍結保存してもよい。
【００２５】
ある特定の態様では、トランスジェニックＣＡＲ細胞を、内在性Ｔ細胞受容体及び／または内在性ＨＬＡの発現に関して、不活性化する。例えば、Ｔ細胞を操作して、内在性α／βＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の発現を排除することができる。特定の実施形態では、ＣＡＲ＋  Ｔ細胞を遺伝子改変して、ＴＣＲの発現を排除する。いくつかの態様では、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を用いて、ＣＡＲを発現するＴ細胞のＴ細胞受容体α／βを破壊する。ある特定の態様では、ＣＡＲを発現するＴ細胞のＴ細胞受容体αβ鎖を、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼを用いてノックアウトする。
【００２６】
本明細書でさらに詳述するように、実施形態のＣＡＲ細胞を使用して、広範囲の疾患及び病態を治療することができる。本質的に、特定の抗原の特異的または増強された発現を含む任意の疾患は、ＣＡＲ細胞を抗原に標的化することによって治療することができる。例えば、自己免疫疾患、感染症、及び癌を、本発明の方法及び／または組成物を用いて治療することができる。これらには、癌、例えば、原発性、転移性、再発性、治療感受性、難治性の癌（例えば、化学療法抵抗性の癌）が含まれる。癌は、血液、肺、脳、結腸、前立腺、乳房、肝臓、腎臓、胃、子宮頸部、卵巣、睾丸、脳下垂体、食道、脾臓、皮膚、骨などの癌であってもよい（例えば、Ｂ細胞リンパ腫またはメラノーマ）。癌を治療する場合に、ＣＡＲ細胞は、一般的には、癌細胞抗原（腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）としても知られる）を標的とする。
【００２７】
さらに別の態様では、実施形態のトランスジェニックＣＡＲ細胞を使用して、明白な寛解状態の癌患者のような最小限の残存疾患を有する対象（例えば、ＣＡＲ標的抗原の提示が非常に少ない対象）を治療してもよい。新規高感度診断技術を使用して、顕性の癌症状を示さない患者において、癌関連抗原（または癌細胞）を検出することができる。本方法によってそのような患者を治療し、抗原標的化ＣＡＲ細胞を用いて残存疾患を排除してもよい。ある特定の実施形態において、残存疾患を標的化するためのトランスジェニックＣＡＲ細胞は、標的抗原が少量であるにもかかわらずｉｎ  ｖｉｖｏで増殖する能力を保持するため、膜結合型増殖性サイトカインの発現をさらに含む。
【００２８】
実施形態のプロセスを利用して、様々な腫瘍抗原（例えば、ＣＤ１９、ＲＯＲ１、ＣＤ５６、ＥＧＦＲ、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ｃ‐ｍｅｔ、ＧＤ２）に対する結合特異性を有するＣＡＲ＋  Ｔ細胞を製造することができる（例えば、臨床試験用）。本技術を用いて生成したＣＡＲ＋  Ｔ細胞を用いて、白血病（例えば、ＡＭＬ、ＡＬＬ、ＣＭＬ）、感染症及び／または固形腫瘍を有する患者を治療することができる。例えば、実施形態の方法を使用して、細胞増殖性疾患、真菌性、ウイルス性、細菌性または寄生虫の感染症を治療することができる。標的となる可能性のある病原体として、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、トリパノソーマ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、ＨＳＶ、ＲＳＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＪＣウイルス、ＢＫウイルス、またはエボラ病原体が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。実施形態のＣＡＲ細胞が標的とすることができる抗原のさらなる例として、ＣＤ１９、ＣＤ２０、癌胎児性抗原、αフェトプロテイン、ＣＡ‐１２５、５Ｔ４、ＭＵＣ‐１、上皮腫瘍抗原、メラノーマ関連抗原、変異型ｐ５３、変異型ｒａｓ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＥＲＢＢ２、葉酸結合タンパク質、ＨＩＶ‐１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０、ＨＩＶ‐１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ５６、ｃ‐Ｍｅｔ、メオテリン、ＧＤ３、ＨＥＲＶ‐Ｋ、ＩＬ‐１１Ｒα、κ鎖、λ鎖、ＣＳＰＧ４、ＥＲＢＢ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、またはＶＥＧＦＲ２が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。ある特定の態様では、実施形態の方法は、ＣＤ１９またはＨＥＲＶ‐Ｋ発現細胞の標的化に関する。例えば、ＨＥＲＶ‐Ｋ標的化ＣＡＲ細胞は、モノクローナル抗体６Ｈ５のｓｃＦｖ配列を有するＣＡＲを含み得る。さらなる態様において、実施形態のＣＡＲは、サイトカイン、例えば、ＩＬ‐２、ＩＬ‐７、ＩＬ‐１５、ＩＬ‐２１またはそれらの組合せと、複合体化または融合させることができる。
【００２９】
いくつかの実施形態では、医学的病態を有する個体の治療方法を提供し、前記方法は、本明細書に記載する細胞集団由来の有効量の細胞を投与する工程を含み、いくつかの態様においては、１回超、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日、またはそれ以上の間隔をおいて投与する。特定の態様において、癌は、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸管、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、または子宮の癌である。ある特定の態様において、癌はリンパ腫、白血病、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、またはＢ細胞関連自己免疫疾患である。
【００３０】
本明細書及び特許請求の範囲において使用する場合、「ａ」または「ａｎ」は、１つまたはそれ以上を意味し得る。本明細書及び特許請求の範囲において使用する用語「ａ」または「ａｎ」は、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」という用語と併せて用いる場合、１つまたはそれ以上を意味し得る。本明細書及び特許請求の範囲において使用する場合、「別の」または「さらなる」は、少なくとも第二の、またはそれ以上を意味し得る。
【００３１】
本明細書及び特許請求の範囲で使用する場合、「約」という用語は、値が、その値を決定するために用いる装置、方法の誤差の固有の変動、または研究対象者の間に存在する変動を含むことを示すように用いられる。
【００３２】
本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明及び特定の実施例は、本発明のある特定の実施形態を示してはいるが、これらは単に例示を目的としたものに過ぎず、なぜならば、この詳細な説明から、本発明の精神及び範囲内の様々な変更及び修正が、当業者には明らかになるであろうからである。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
配列番号１に少なくとも９０％同一の配列を有する組換えポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、１３６位に対応する位置にＡｒｇ；２５３位に対応する位置にＨｉｓ及び／または２５５位に対応する位置にＡｒｇを有し、前記ポリペプチドが配列番号５の配列を含まない、前記組換えポリペプチド。
（項目２）
以下の特徴の１つ以上を有する、項目１に記載のポリペプチド：
（ａ）１４位に対応する位置にＡｒｇ；
（ｂ）３３位に対応する位置にＡｌａ；
（ｃ）１１５位に対応する位置にＨｉｓ；
（ｄ）２１４位に対応する位置にＡｓｐ；
（ｅ）２１５位に対応する位置にＡｌａ；
（ｆ）２１６位に対応する位置にＶａｌ；
（ｇ）２１７位に対応する位置にＧｌｎ；及び／または
（ｈ）２４３位に対応する位置にＨｉｓ。
（項目３）
前記（ａ）〜（ｈ）の特徴のうちの１、２、３、４、５、６、７または８つを有する、項目２に記載のポリペプチド。
（項目４）
２１４〜２１７位に対応する位置に配列ＤＡＶＱを含む、項目２に記載のポリペプチド。
（項目５）
３１４位に対応する位置にＡｓｎを含む、項目１に記載のポリペプチド。
（項目６）
前記ポリペプチドが、配列番号１の配列と少なくとも９５％同一である、項目５に記載のポリペプチド。
（項目７）
配列番号１の配列を含む、項目５に記載のポリペプチド。
（項目８）
３１４位に対応する位置にＴｈｒを含む、項目１に記載のポリペプチド。
（項目９）
前記ポリペプチドが、配列番号３の配列と少なくとも９０％または少なくとも９５％同一である、項目８に記載のポリペプチド。
（項目１０）
配列番号３の配列を含む、項目９に記載のポリペプチド。
（項目１１）
項目１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド分子。
（項目１２）
前記分子がＤＮＡである、項目１１に記載のポリヌクレオチド分子。
（項目１３）
前記ＤＮＡが前記ポリペプチドの発現用プロモーターを含む、項目１２に記載のポリヌクレオチド分子。
（項目１４）
前記ＤＮＡが哺乳類細胞における前記ポリペプチドの発現用プロモーターを含む、項目１２に記載のポリヌクレオチド分子。
（項目１５）
前記分子がｍＲＮＡである、項目１１に記載のポリヌクレオチド分子。
（項目１６）
５’‐キャップ、ＩＲＥＳモチーフ及び／またはポリ（Ａ）配列を含む、項目１５に記載のポリヌクレオチド分子。
（項目１７）
２０〜３００ヌクレオチドのポリ（Ａ）配列を含む、項目１６に記載のポリヌクレオチド分子。
（項目１８）
前記分子が、配列番号２または配列番号４と少なくとも９０％または少なくとも９５％同一の配列を有する、項目１１に記載のポリヌクレオチド分子。
（項目１９）
前記分子が、配列番号２または配列番号４の配列を有する、項目１１に記載のポリヌクレオチド分子。
（項目２０）
前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞に形質移入し、前記ポリヌクレオチドから前記ポリペプチドを発現させることを含む、項目１に記載のポリペプチドの作製方法。
（項目２１）
項目１に記載のポリペプチドまたは項目１１に記載のポリヌクレオチド分子を保有する宿主細胞。
（項目２２）
前記細胞がヒト細胞である、項目２１に記載の細胞。
（項目２３）
前記細胞が、幹細胞または誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、項目２１に記載の細胞。
（項目２４）
前記細胞が免疫系細胞である、項目２１に記載の細胞。
（項目２５）
前記細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞もしくはＴ細胞の前駆細胞である、項目２４に記載の細胞。
（項目２６）
前記細胞が、項目１に記載のポリペプチドを含む、項目２１に記載の細胞。
（項目２７）
前記細胞が、項目１に記載のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む、項目２１に記載の細胞。
（項目２８）
細胞の遺伝子操作方法であって：
（ａ）前記細胞に、（ｉ）項目１に記載のトランスポザーゼポリペプチドまたは前記ポリペプチドをコードする核酸；及び（ｉｉ）トランスポゾンリピートに隣接する選択した遺伝子因子をコードするＤＮＡを形質移入し；ならびに
（ｂ）一過性または安定なトランスポザーゼ活性に適した条件下で前記細胞をインキュベートし、それにより、前記選択した遺伝子因子を前記細胞のゲノムに組み込み、操作した細胞を産生することを含む、前記遺伝子操作方法。
（項目２９）
項目２８に記載の方法であって、さらに：
（ｃ）前記操作した細胞を単離することを含む、前記方法。
（項目３０）
前記選択した遺伝子因子が、スクリーニング可能または選択マーカーである、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
前記選択した遺伝子因子が、治療用ポリペプチドまたは阻害性核酸をコードする、項目２８に記載の方法。
（項目３２）
前記選択した遺伝子因子が、抗体、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする、項目２８に記載の方法。
（項目３３）
前記選択した遺伝子因子がＣＡＲをコードする、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記細胞がヒト細胞である、項目２８に記載の方法。
（項目３５）
前記細胞が幹細胞または誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、項目２８に記載の方法。
（項目３６）
前記細胞が免疫系細胞またはその前駆細胞である、項目２８に記載の方法。
（項目３７）
前記細胞がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞もしくはＴ細胞の前駆細胞である、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記細胞への形質移入が、ポリマー、ポリペプチドまたは脂質ベースの形質移入試薬の使用を含む、項目２８に記載の方法。
（項目３９）
前記細胞への形質移入が、細胞を電気穿孔することを含む、項目２８に記載の方法。
（項目４０）
項目２８に記載の方法であって、さらに：
（ａ）細胞の集団に、（ｉ）項目１に記載のトランスポザーゼポリペプチドまたは前記ポリペプチドをコードする核酸；及び（ｉｉ）トランスポゾンリピートに隣接する選択した遺伝子因子をコードするＤＮＡを形質移入し；ならびに
（ｂ）トランスポザーゼ活性に適した条件下で前記集団をインキュベートし、それにより、前記選択した遺伝子因子を前記細胞のゲノムに組み込み、操作した細胞の集団を産生することを含む、前記方法。
（項目４１）
項目４０に記載の方法であって、さらに：
（ａ）Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞の集団に、（ｉ）項目１に記載のトランスポザーゼポリペプチドまたは前記ポリペプチドをコードする核酸；及び（ｉｉ）トランスポゾンリピートに隣接するＣＡＲまたはＴＣＲをコードするＤＮＡを形質移入し；ならびに
（ｂ）トランスポザーゼ活性に適した条件下で前記集団をインキュベートし、それにより、前記細胞のゲノム中に前記ＣＡＲを組み込み、操作したＴ細胞またはＴ細胞前駆細胞の集団を産生することを含む、前記方法。
（項目４２）
項目４１に記載の方法であって、さらに：
（ｃ）ＣＡＲまたはＴＣＲを発現するＴ細胞の増殖を選択的に促進する培地中で、前記操作した細胞を培養することを含む、前記方法。
（項目４３）
疾患を有するヒト対象におけるＴ細胞応答の提供方法であって：
（ａ）項目４１に従って、操作したＴ細胞またはＴ細胞前駆細胞の集団を取得し；
（ｂ）必要に応じて、ＣＡＲを発現するＴ細胞の増殖を選択的に促進する培地中で前記細胞を培養し；及び
（ｄ）ＣＡＲを発現するか、もしくはＴＣＲを発現するか、または遺伝子操作した有効量のＴ細胞またはＮＫ細胞または免疫細胞を前記対象に投与して、免疫応答を提供することを含む、前記提供方法。
【００３３】
添付の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の態様をさらに示すために添付する。本明細書に提示する特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面のうちの１つ以上を参照することにより、本発明をよりよく理解し得る。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】トランスポザーゼに基づく細胞操作のための例示的な戦略。本実施例では、ＣＡＲを発現する操作Ｔ細胞を産生する。トランスポゾンリピートに隣接するＣＡＲをコードするトランスポゾンＤＮＡ構築物を、トランスポザーゼをコードするｍＲＮＡと共に、Ｔ細胞に同時形質移入する。この場合、４Ｄ‐ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（商標）電気穿孔システム（Ｌｏｎｚａ  Ｇｒｏｕｐ社、スイス）を形質移入に使用する。一旦細胞に導入されると、トランスポザーゼは一過性に発現し、ＣＡＲ構築物のゲノムＤＮＡへの組込みを媒介する。トランスポザーゼをコードするｍＲＮＡは細胞内で分解され、トランスポザーゼの長期発現が細胞内で起こらないことを保証する。
【図２】ヒストグラムは、図１に概略を示したＣＡＲを形質移入したヒトＴ細胞のフローサイトメトリーデータを示す。実施形態の２つの組換えトランスポザーゼ、ｈＳＢ１１０及びｈＳＢ８１のＳＢ１００ｘに対する結果を比較する。上パネルは、形質移入の８日後の、ＣＡＲ陽性の細胞数（ｙ軸）を、７ＡＡＤ（７‐アミノアクチノマイシンＤ）染色によって評価した非生存細胞（ｘ軸）と比較して示す。下のパネルは、形質移入の１５日後の、ＣＡＲ発現陽性の細胞数（ｙ軸）、及びＣＤ３を発現する細胞数（ｘ軸）を示す。研究の結果は、実施形態の組換えトランスポザーゼが、ＳＢ１００ｘよりも細胞操作において有意により効率的であることを示す。形質移入後８日目までに、ｈＳＢ１１０及びｈＳＢ８１をコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔した細胞の２２％超がＣＡＲを発現するのに対し、ＳＢ１００ｘを使用した細胞ではわずか１５％にとどまる。同様に、１５日目までに、ｈＳＢ１１０及びｈＳＢ８１を用いて電気穿孔した細胞集団の８０％超がＣＡＲ及びＣＤ３を同時発現したのに対し、ＳＢ１００ｘを使用した細胞では７３．４％にすぎなかった。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
［例示的な実施形態の説明］
Ｉ．細胞の遺伝子操作
細胞の遺伝子操作は、広範囲の細胞において所望の遺伝子を安定的に発現させるための有力な技術として登場した。近年、このような技術は、ある病状範囲における治療的介入に用いる細胞に対しても適用されるようになってきた。例えば、疾患関連抗原を標的とする受容体を発現する遺伝子操作Ｔ細胞は、現在、抗癌治療薬として臨床試験中である。トランスポザーゼ系は、特に治療薬として用いる細胞の場合、操作用途に望ましい系であって、これは細胞内で維持されている異種遺伝子因子を導入することがないためであり、このことはウイルスベースの操作系の共通の特徴である。しかしながら、治療介入に必要とされる十分な数の操作Ｔ細胞を提供するためには高い効率が必要である。
【００３６】
本明細書における研究では、ヒト細胞の操作において有意に改善した効率を示すｈＳＢ１１０及びｈＳＢ８１と呼ばれる新規組換えトランスポザーゼ酵素を示す。例えば、ＣＡＲ発現構築物を初代ヒトＴ細胞に組み込むために使用する場合、新規トランスポザーゼは、形質移入後８日目までにその細胞の２０％をはるかに上回るＣＡＲ発現を示す細胞集団を産生することができた（図２）。さらに、１５日目までに、形質移入した集団中の８０％超の細胞がＣＡＲ発現に対して陽性であった（図２）。このようなヒト細胞の高効率遺伝子操作は、従来のトランスポザーゼベースの操作系に比べて、有意に改善していることを意味している。
【００３７】
実施形態のトランスポザーゼコード配列は、哺乳類細胞の高効率遺伝子操作に用いることができる。例えば、トランスポザーゼを、ＣＡＲ発現Ｔ細胞集団の迅速な産生に用いることができる。一実施形態では、トランスポザーゼをコードするｍＲＮＡを、トランスポゾンリピートに隣接する所望のＣＡＲ発現カセットをコードするＤＮＡベクターと共にＴ細胞（またはＴ細胞の前駆細胞）に同時形質移入する。次いで、ＣＡＲ発現Ｔ細胞を精製及び／または選択的に増殖させてもよい。治療に使用するＴ細胞の場合、細胞調製の時間及びコストを低減するために、できるだけ僅かな増殖で済むことが望ましい。重要な点として、本明細書において提供するトランスポザーゼは、ＣＡＲを安定的に発現する細胞の割合を高めることによってそのような操作手順を有意に改善し、したがって、そのような細胞をさらに増殖させるために利用可能である。
【００３８】
ＩＩ．トランスポザーゼポリペプチド及びコード配列
上記の要約に記載されているように、実施形態のある特定の態様は、組換えトランスポザーゼポリペプチド及びそれをコードする核酸に関する。ある特定の態様では、実施形態に従って使用するためのトランスポザーゼは、配列番号１または配列番号３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含むかまたはそれからなるポリペプチドである。ある特定の態様では、トランスポザーゼの実施形態は、配列番号１または配列番号３の配列に対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸の置換、欠失または挿入を含んでいてもよい。例えば、実施形態のトランスポザーゼポリペプチドを、それらの酵素活性を維持させつつ、１か所以上のアミノ酸置換によってさらに改変してもよい。場合により、あるアミノ酸の位置を、異なるトランスポザーゼ配列の対応する位置のアミノ酸で置換することができる。例えば、追加的なトランスポザーゼの配列は、米国特許第６，４８９，４５８号；第７，１４８，２０３号；第８，２２７，４３２号；米国特許出願公開第２０１１／０１１７０７２号；Ｍａｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９及びＩｖｉｃｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７に記載されており、前記文献の各々はその全体を参照により本明細書に援用する。
【００３９】
いくつかの態様では、１か所以上の位置でアミノ酸置換を行うことができ、その置換は、同様の親水性を有するアミノ酸への置換である。相互作用的な生物学的機能性をタンパク質に付与する際のアミノ酸疎水性親水性指標の重要性は、当該技術分野で一般的に理解されている（Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。アミノ酸の相対的なヒドロパシー特性は、最終的なタンパク質の二次構造に寄与し、その二次構造が、タンパク質と他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などとの相互作用を規定することが認められている。したがって、そのような保存的置換は、トランスポザーゼにおいて行うことが可能であり、その活性に僅かな影響しか及ぼさないと考えられる。米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されているように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（０．５）；ヒスチジン−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。これらの値は、規準として使用することができ、したがって、企図する実施形態は、親水性値が±２以内、±１以内、及び±０．５以内のアミノ酸置換を含む。したがって、あるアミノ酸を、それとは異なってはいるが同等の親水性値を有する相同なアミノ酸で置換することによって、本明細書に記載の任意のトランスポザーゼポリペプチドを操作してもよい。±１．０、または±０．５ポイント以内の親水性を有するアミノ酸は相同であると考えられる。
【００４０】
さらなる態様では、実施形態のトランスポザーゼポリペプチドを、精製タグ（例えば、Ｔ７、ポリＨｉｓまたはＧＳＴタグ）、レポーターまたはＣＰＰなどの異種ポリペプチド配列に融合させる。例えば、ポリペプチドを、造影剤などのレポーターに融合（または複合体化）させてもよい。ある場合には、融合タンパク質がトランスポザーゼと異種ポリペプチドとの間の位置に追加のアミノ酸を含み得ることが理解される。通常、これらの配列は、「リンカー配列」または「リンカー領域」と互換的に呼ばれる。リンカー領域は鎖長１残基以上のアミノ酸であってよく、多くの場合、リンカーに柔軟性を付与する１つ以上のグリシン残基（複数可）を含むことは、当業者であれば理解するだろう。そのようなリンカー配列を、１、２、３、４、５、６回、もしくはそれ以上リピートするか、または１つ以上の異なるリンカーと組み合わせてリンカー配列のアレイを形成することができる。いくつかの応用例では、例えば、リンカー領域は、プロテアーゼ切断部位（例えば、精製タグまたはＣＰＰの除去のための）を有してもよい。
【００４１】
本明細書中で使用する場合、ＣＰＰ及び膜移行ペプチド（ＭＴＰ）という用語は、同じ意味で用い、細胞内に内部移行するポリペプチドの能力を高めるペプチド配列のことを指す。実施形態に従って使用するためのＣＰＰの例として、ＨＩＶ  Ｔａｔ、ヘルペスウイルスＶＰ２２、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａアンテナペディアホメオボックス遺伝子産物、プロテグリンＩ、Ｔ１  ＣＰＰ、Ｔ２  ＣＰＰ、またはＩＦＮ７  ＣＰＰに由来するペプチドセグメントが挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない（例えば、参照により本明細書に援用する米国特許出願公開第２０１４０１４０９７６号参照）。
【００４２】
ＩＩＩ．細胞工学
実施形態の態様は、実施形態のトランスポザーゼを用いた哺乳類細胞の遺伝子操作に関する。一般的に、そのような方法は、（ｉ）トランスポザーゼ（またはトランスポザーゼポリペプチド）をコードする第一のベクター及び（ｉｉ）トランスポゾンリピートに隣接する所望の遺伝子因子をコードする第二のベクターを細胞に導入することを含む。このような方法によって、任意のタイプの哺乳類細胞を遺伝子操作することができる。しかしながら、ある特定の態様では、細胞（細胞集団）は、幹細胞、ｉＰＳ細胞、免疫細胞またはこれらの細胞の前駆細胞である。以下に記載する方法は、ＣＡＲ発現のためのＴ細胞（または他の免疫細胞）操作の具体例を扱う。しかしながら、当業者であれば、この方法論が任意の所定の細胞タイプまたは操作構築物に等しく適用し得ることを認識するであろう。
【００４３】
したがって、ある特定の実施形態では、ＣＡＲをコードするＤＮＡ構築物を含む発現ベクターをＴ細胞に形質移入することを含む、抗原特異性再配向（ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ）Ｔ細胞の作製及び／または増殖のための方法を提供する。必要に応じて、そのような細胞を、抗原陽性細胞、組換え抗原、または受容体に対する抗体で刺激して、細胞を増殖させる。
【００４４】
別の態様では、Ｔ細胞を安定的に形質移入して再配向する方法を提供する。実施形態によるそのような形質移入は、当該分野で周知の任意の様々な形質移入技術によって行うことができる。いくつかの態様では、ウイルスベクターまたはウイルス粒子を用いて核酸を細胞に導入することができる。実際、多くの研究者が、ウイルスベクターを使用してＴ細胞に異種遺伝子を移行させてきた。しかしながら、いくつかの態様では、実施形態の形質移入は、ウイルスベクターの使用を伴わない。例えば、形質移入は、電気穿孔、荷電もしくは非荷電脂質、カチオン性ポリマーまたはポリペプチドの使用、塩沈殿または他の非ウイルス性核酸移送（限定はしないが、ソノポレーションなど）によって行うことができる。ある特定の態様では、形質移入は、裸のＤＮＡ（またはトランスポザーゼの場合はＲＮＡもしくはタンパク質）を用いる。裸のＤＮＡを用いることにより、再配向Ｔ細胞を産生するのに必要な時間を短縮することができる。「裸のＤＮＡ」とは、ＣＡＲをコードするＤＮＡが、発現のための適切な向きで発現カセットまたはベクターに含まれることを意味する。実施形態の電気穿孔法は、ＣＡＲを発現し、細胞表面上にそれを保持する安定した形質移入体を産生する。
【００４５】
いくつかの態様では、実施形態のＣＡＲを、「キメラＴＣＲ」としてさらに定義することができ、これはＴ細胞において発現する受容体であって、細胞内シグナル伝達、膜貫通及び細胞外ドメインを有し、その細胞外ドメインが、ＭＨＣに制限されない様式で、Ｔ細胞受容体がその様式では通常は結合しない抗原に特異的に結合する受容体を意味する。適切な条件下での抗原によるＴ細胞の刺激は、細胞の増殖（増大）及び／またはＩＬ‐２の産生をもたらす。本方法は、任意の所与の標的抗原に特異的なキメラＴＣＲ、例えばＨＥＲ２／Ｎｅｕ（Ｓｔａｎｃｏｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、ＥＲＢＢ２（Ｍｏｒｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）、葉酸結合タンパク質（Ｈｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、腎細胞癌（Ｗｅｉｔｊｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、ならびにＨＩＶ‐１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０及びｇｐ４１（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）に特異的なキメラＴＣＲなどを用いた形質移入に対して適用可能である。他の細胞表面標的抗原として、ＣＤ２０、癌胎児性抗原、メソセリン、ＲＯＲ１、ｃ‐Ｍｅｔ、ＣＤ５６、ＧＤ２、ＧＤ３、αフェトプロテイン、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ１２３、ＩＬ‐１１Ｒα、κ鎖、λ鎖、ＣＤ７０、ＣＡ‐１２５、ＭＵＣ‐１、ＥＧＦＲ及び変異体、上皮腫瘍抗原などが挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。
【００４６】
ある特定の態様では、実施形態に従って使用するためのＴ細胞は、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、Ｇ‐ＣＳＦで刺激した後に回収するＰＢＭＣ、骨髄、または臍帯血に由来するＴ細胞のような初代ヒトＴ細胞である。条件には、ｍＲＮＡ及びＤＮＡならびに電気穿孔法の使用が含まれる。形質移入後、細胞を直ちに注入してもよいし、保存してもよい。ある特定の態様では、形質移入後、細胞への遺伝子移送から約１、２、３、４、５日またはそれ以上の範囲内にバルク集団として、数日、数週間、または数か月間、生体外で細胞を増殖させてもよい。さらなる態様では、形質移入後、形質移入体をクローニングし、単一の一体化型の、またはエピソーム的に維持された発現カセットもしくはプラスミド、及びキメラ受容体の発現の存在を示すクローンを生体外で増大させる。増殖のために選択したクローンは、抗原を発現する標的細胞を特異的に認識及び溶解する能力を示す。ＩＬ‐２または他のサイトカイン（例えば、ＩＬ‐７、ＩＬ‐１２、ＩＬ‐１５、ＩＬ‐２１など）による刺激によって組換えＴ細胞を増殖させてもよい。人工抗原提示細胞による刺激によって組換えＴ細胞を増殖させてもよい。人工抗原提示細胞上で、またはＴ細胞表面上のＣＤ３を架橋するＯＫＴ３のような抗体を用いて組換えＴ細胞を増殖させてもよい。人工抗原提示細胞上、またはＴ細胞表面上のＣＤ５２に結合するアレムツズマブのような抗体を用いて、組換えＴ細胞のサブセットを削除してもよい。さらなる態様では、遺伝子操作した細胞を凍結保存してもよい。
【００４７】
注入後のＴ細胞増殖（生存）は：（ｉ）トランスポゾン及び／またはＣＡＲに特異的なプライマーを用いたｑ‐ＰＣＲ及び／またはデジタルＰＣＲ（例えば、Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｄｉｇｉｔａｌ（商標）ＰＣＲ（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ、ハーキュリーズ、カリフォルニア）；（ｉｉ）ＣＡＲ特異的抗体を用いたフローサイトメトリー；及び／または（ｉｉｉ）可溶性ＴＡＡを用いたフローサイトメトリーによって評価してもよい。
【００４８】
本発明のある特定の実施形態において、ＣＡＲ細胞を、それを必要とする個体、例えば、癌または感染症を有する個体に送達する。細胞は、その後、個体の免疫系を増強して、それぞれの癌細胞または病原性細胞を攻撃する。場合によっては、抗原特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞を１回以上個体に投与する。抗原特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞を２回以上個体に投与する場合、投与間の持続時間は、個体内で増殖する時間を許容するのに十分であるべきであり、具体的な実施形態では、投与間の持続時間は、１、２、３、４、５、６、７日間、またはそれ以上の日数である。
【００４９】
キメラ抗原受容体（及び場合によっては機能性ＴＣＲを欠く）の両方を含むように改変した同種異系または自己Ｔ細胞の供給源は、いかなる種類のものでもよいが、具体的な実施形態では、例えば、臍帯血、末梢血、ヒト胚性幹細胞、または誘導多能性幹細胞バンクから細胞を取得する。治療効果を得るための適切な用量は、例えば、好ましくは一連の投与サイクルで、１回の投与あたり少なくとも１０５または約１０５〜約１０１０細胞である。例示的な投薬レジメンは、用量を漸増させる１週間の投与サイクル４回からなり、０日目に少なくとも約１０５細胞で開始し、例えば患者内投与漸増スキームを開始してから数週間以内に、最大約１０１０細胞の標的用量まで漸増的に増加させる。適切な投与様式として、静脈内、皮下、腔内（例えばリザーバーアクセス装置による）、腹腔内、及び腫瘍塊への直接注射が挙げられる。
【００５０】
本発明の医薬組成物は、単独で、または癌を治療するのに有用な他の確立された薬剤と組み合わせて使用することができる。単独で、または他の薬剤と組み合わせて送達するかどうかに関わらず、本発明の医薬組成物は、哺乳類、特にヒトの体内の様々な経路を介して様々な部位に送達され、特定の効果を達成することができる。当業者であれば、複数の経路を投与に使用することができるが、特定の経路が別の経路よりもより迅速かつより効果的な反応を提供し得ることを認識するであろう。例えば、メラノーマの治療に対しては、皮内送達のほうが吸入よりも有効に利用し得る。局所または全身送達は、体腔内への製剤の投与もしくは点滴、エアロゾルの吸入もしくは吹送、または、筋肉内、静脈内、門脈内、肝内、腹膜、皮下、もしくは皮内投与を含む非経口導入による投与によって達成することができる。
【００５１】
実施形態の組成物は、例えば注射などの各用量単位が、所定量の組成物を単独でまたは他の活性薬剤と適切に組み合わせて含む単位剤形で提供することができる。本明細書で使用する単位剤形という用語は、ヒト及び動物対象に対する単位用量として適切な物理的に別個の単位を指し、各単位は、所望の効果を生み出すのに十分な量を計算した所定量の本発明の組成物を、単独でまたは他の活性薬剤と組み合わせて、適切な場合には薬学的に許容可能な希釈剤、担体、またはビヒクルと共に含む。本発明の単位剤形の仕様は、特定の対象内での医薬組成物に関する特定の薬力学に依存する。
【００５２】
望ましくは、有効量または十分な数の単離された形質導入Ｔ細胞が組成物中に存在し、対象に導入され、それによって長期の特異的な抗腫瘍応答を確立し、そのような治療がない場合よりも、腫瘍のサイズを縮小させるか、または腫瘍成長を排除するか、または腫瘍増殖または再増殖を阻害する。望ましくは、一定量の形質導入Ｔ細胞を対象に再導入することによって、腫瘍の元の、すなわち初期の（例えば、「治療０日目」の）サイズに比べて、腫瘍サイズを、約１０％もしくは少なくとも約１０％、約２０％もしくは少なくとも約２０％、約３０％もしくは少なくとも約３０％、約４０％もしくは少なくとも約４０％、約５０％もしくは少なくとも約５０％、約６０％もしくは少なくとも約６０％、約７０％もしくは少なくとも約７０％、約８０％もしくは少なくとも約８０％、約９０％もしくは少なくとも約９０％、約９５％もしくは少なくとも約９５％、約９８％もしくは少なくとも約９８％、または約１００％もしくは１００％縮小させる。
【００５３】
したがって、投与する形質導入Ｔ細胞の量は、投与経路を考慮すべきであり、所望の治療応答を達成するために十分な数の形質導入Ｔ細胞を導入するようなものにすべきである。さらに、本明細書に記載する組成物に含まれる各活性剤の量（例えば、接触させる各細胞あたりの量またはある特定の体重あたりの量）は、異なる用途において変化し得る。一般的に、形質導入Ｔ細胞の濃度は、望ましくは、治療する対象に供給するのに十分な濃度、すなわち少なくとも約１×１０６〜約１×１０９の形質導入Ｔ細胞、さらに望ましくは約１×１０７〜約５×１０８の形質導入Ｔ細胞であるべきだが、しかし、それを上回る、例えば、５×１０８細胞を超えるか、またはそれを下回る、例えば、１×１０７細胞未満のいずれかの任意の適切な量で利用することは可能である。投薬計画は、十分に確立された細胞ベースの療法（例えば、Ｔｏｐａｌｉａｎ  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，１９８７；米国特許第４，６９０，９１５号参照）に基づくことができ、または交互の連続注入戦略を用いることができる。
【００５４】
これらの値は、本発明の実施のための本発明の方法の最適化に際して、専門家が利用する形質導入Ｔ細胞の範囲についての一般的な指針を提供する。このような範囲に関する本明細書の記載は、特定の用途において保証し得るような、より多くのまたはより少量の成分の使用を決して排除するものではない。例えば、実際の用量及びスケジュールは、組成物を他の医薬組成物と併用して投与するかどうかに基づいて、または薬物動態、薬物素因及び代謝の個人間の差異に応じて変化し得る。当業者であれば、特定の状況の緊急性に応じて必要な調整を容易に行うことができる。
【００５５】
ＩＶ．操作構築物
ある特定の具体的な態様では、実施形態のトランスポザーゼ系を用いて、選択した遺伝子因子を終結させる発現構築物で細胞を操作する。このような態様において、選択した遺伝子因子は、実施形態のトランスポザーゼによって機能するＩＲ／ＤＲ配列のようなトランスポゾンリピートに隣接している。選択した遺伝子因子は、細胞に形質移入することを望む任意の配列を含み得るが、ある特定の態様では、その因子は、ポリペプチドコード配列及び哺乳類発現のための適切な発現制御配列をコードする。いくつかの特定の態様では、選択した遺伝的因子は、抗体、Ｔ細胞受容体またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの抗原結合部分をコードする。本明細書中で使用する場合、「抗原」という用語は、抗体またはＴ細胞受容体またはＣＡＲが結合し得る分子のことである。
【００５６】
したがって、本発明の実施形態は、核酸、例えば、ヒト化して免疫原性を低下させたＣＡＲ（ｈＣＡＲ）をはじめとする抗原特異的ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸を包含し、前記ポリペプチドは、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞外ドメインを備え、１つ以上のシグナル伝達モチーフを有する。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の抗原が共有する空間を含むエピトープを認識し得る。デクチン‐１などのパターン認識受容体を使用して、炭水化物抗原に対する特異性を得てもよい。ある特定の実施形態では、結合領域は、モノクローナル抗体の相補性決定領域、モノクローナル抗体の可変領域、及び／またはその抗原結合断片を含み得る。別の実施形態では、その特異性は、受容体に結合するペプチド（例えば、サイトカイン）に由来する。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗原を補完する抗原受容体（例えば、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体）タンパク質の可変ドメインに見出される短いアミノ酸配列であり、したがって特定の抗原に対する特異性を受容体にもたらす。抗原受容体の各ポリペプチド鎖は、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含む。抗原受容体は一般的には２つのポリペプチド鎖からなるため、各抗原受容体には、抗原と接触可能な６つのＣＤＲが存在し、各重鎖及び軽鎖が３つのＣＤＲを有する。免疫グロブリン及びＴ細胞受容体に関連するほとんどの配列変異はＣＤＲにおいて見出されるため、これらの領域は超可変領域と呼ばれることがある。これらのうち、ＣＤＲ３は、ＶＪ（重鎖及びＴＣＲαβ鎖の場合にはＶＤＪ）領域の組換えによってコードされるため、最大の可変性を示す。
【００５７】
ヒトＣＡＲ核酸は、ヒト患者に対する細胞免疫治療を促進するヒト遺伝子であることが企図される。特定の実施形態では、本発明は全長ＣＡＲ  ｃＤＮＡまたはコード領域を含む。抗原結合領域またはドメインは、参照により本明細書に援用する米国特許第７，１０９，３０４号に記載されているような特定のヒトモノクローナル抗体に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）のＶＨ及びＶＬ鎖の断片を有し得るか、または任意の他の抗原結合部分を有し得る。断片は、ヒト抗原特異的抗体の任意の数の異なる抗原結合ドメインであることも可能である。より具体的な実施形態では、断片は、ヒト細胞内での発現のためのヒトコドン使用に最適化した配列でコードした抗原特異的ｓｃＦｖである。
【００５８】
配置は、二重特異性抗体または多量体などの多量体形式であり得る。多量体は、多くの場合、軽鎖及び重鎖の可変部分の交差対形成によって形成され、これはＷｉｎｔｅｒｓによって二重特異性抗体と呼ばれるようになった。構築物のヒンジ部分は、丸ごと削除するものをはじめ、第一のシステインを維持するもの、セリンよりむしろプロリン置換をするもの、第一のシステインまでを切除するものなど、複数の選択肢を有し得る。Ｆｃ部分は削除することができる。任意の安定な及び／または二量体化するタンパク質が、この目的を果たすことができる。Ｆｃドメインのうちの１つのみ、例えば、ヒト免疫グロブリン由来ＣＨ２またはＣＨ３ドメインのいずれかを使用することができる。改変して二量体化を改善したヒト免疫グロブリンのヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域を使用することもできる。免疫グロブリンのヒンジ部分だけを使用することもできる。ＣＤ８αの一部を使用することもできる。
【００５９】
実施形態のキメラ抗原受容体の細胞内シグナル伝達ドメインは、キメラ受容体が配置されている免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化に関与する。「エフェクター機能」という用語は、分化した細胞の特殊な機能を指す。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性またはヘルパー活性であってもよい。ナイーブ、メモリー、または記憶型Ｔ細胞におけるエフェクター機能には、抗原依存性増殖が含まれる。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、特殊化した機能を細胞に行わせるタンパク質の部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を用いるが、多くの場合、細胞内ポリペプチド全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮部分を使用し得る範囲で、そのような短縮部分が依然としてエフェクター機能シグナルを伝達する限り、それを完全な鎖の代わりに用いてもよい。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な、細胞内シグナル伝達ドメインの任意の短縮部分を含むことを意味する。例として、Ｔ細胞受容体のζ鎖またはその任意のホモログ（例えば、η、δ、γまたはε）、ＭＢ１鎖、Ｂ２９、Ｆｃ  ＲＩＩＩ、  Ｆｃ  ＲＩ、及びＣＤ３ζとＣＤ２８などのシグナル伝達分子の組合せ、ＣＤ２７、４‐１ＢＢ、ＤＡＰ‐１０、ＯＸ４０、及びそれらの組合せ、ならびに他の同様の分子及び断片が挙げられる。活性化タンパク質のファミリーの他のメンバーの細胞内シグナル伝達部分、例えばＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃεＲＩなどを使用することができる。これらの選択的膜貫通及び細胞内ドメインを用いたキメラＴ細胞受容体の開示については、Ｇｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）、Ｓｔａｎｃｏｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）、Ｍｏｒｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）、Ｈｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）、Ｗｅｉｊｔｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）、及びＨｅｋｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）参照。ある特定の実施形態では、ヒトＣＤ３ζ細胞内ドメインを、活性化のために用いる。
【００６０】
抗原特異的細胞外ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを、ヒトＩｇＧ４Ｆｃヒンジ及びＦｃ領域などの膜貫通ドメインによって連結してもよい。代替として、ヒトＣＤ４膜貫通ドメイン、ヒトＣＤ２８膜貫通ドメイン、膜貫通ヒトＣＤ３ζドメイン、もしくはシステイン変異ヒトＣＤ３ζドメイン、またはＣＤ１６及びＣＤ８ならびにエリスロポエチン受容体などの他のヒト膜貫通シグナル伝達タンパク質由来の他の膜貫通ドメインが挙げられる。さらなる修飾を膜貫通アミノ酸配列に付加することができる。
【００６１】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ核酸は、膜貫通ドメイン及び改変ＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメインなどの他の共刺激受容体をコードする配列を含む。他の共刺激受容体としては、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ‐４０（ＣＤ１３４）、ＤＡＰ１０、及び４‐１ＢＢ（ＣＤ１３７）の１つ以上が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。ＣＤ３ζによって開始される一次シグナルに加えて、ヒトＣＡＲに挿入したヒト共刺激受容体が提供するさらなるシグナルは、Ｔ細胞の完全な活性化にとって重要であり、ｉｎ  ｖｉｖｏ持続性及び養子免疫治療の治療上の成功を向上させるのに役立ち得る。
【００６２】
特定の実施形態では、本発明は、ＣＡＲをコードするＤＮＡ配列を組み込んだ単離核酸セグメント及び発現カセットに関する。本発明のベクターは、主に、調節された真核生物プロモーター、例えば、ＭＮＤＵ３プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、またはユビキチンプロモーターの制御下で免疫細胞、好ましくはＴ細胞に所望の遺伝子を送達するように設計されている。また、ベクターは、他の理由がなければ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのそれらの操作を容易にするための選択マーカーを含み得る。他の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＤＮＡ鋳型から転写したｍＲＮＡからＣＡＲを発現させることができる。
【００６３】
キメラ抗原受容体分子は組換え体であり、その抗原結合能力と、細胞質尾部に存在する免疫受容体活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を介した活性化シグナル伝達能力の両方によって区別される。抗原結合部分（例えば、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）から生成される）を利用する受容体構築物は、それらがＨＬＡ非依存的様式で標的細胞表面上の天然抗原に結合するという点で「普遍的」であるというさらなる利点をもたらす。例えば、いくつかの研究室が、ＣＤ３複合体のζ鎖（ζ）、Ｆｃ受容体γ鎖、及びスカイチロシンキナーゼの細胞内部分をコードする配列に融合したｓｃＦｖ構築物を報告している（Ｅｓｈｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｆｉｔｚｅｒ‐Ａｔｔａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。ＣＴＬによる腫瘍認識及び溶解を含む再配向されたＴ細胞エフェクター機構は、いくつかのマウス及びヒト抗原ｓｃＦｖ：ζ系に記載されている（Ｅｓｈｈａｒ，１９９７；Ａｌｔｅｎｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｂｒｏｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。
【００６４】
現在まで、キメラ抗原受容体の構築には、通常、非ヒト抗原結合領域が利用されている。マウスモノクローナル抗体のような非ヒト抗原結合領域を用いることによる潜在的な問題は、ヒトエフェクター機能の欠如及び腫瘍塊への浸透能の欠如である。換言すれば、そのような抗体は、抗体依存性細胞毒性またはＦｃ受容体媒介性食作用を介して、補体依存性溶解を媒介するか、またはヒト標的細胞を溶解し、ＣＡＲを発現する細胞を破壊することができない場合があるということである。さらに、非ヒトモノクローナル抗体は、ヒト宿主によって外来タンパク質として認識され得るため、そのような外来抗体の反復注射は、有害な過敏反応を導く免疫応答の誘導をもたらし得る。マウスベースのモノクローナル抗体では、これはしばしばヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答と呼ばれる。したがって、ヒト抗体の使用は、マウス抗体と同様のＨＡＭＡ応答を強く誘発しないため、より好ましい。同様に、ＣＡＲにおけるヒト配列の使用は、免疫系を介した認識を避けることができ、したがって、レシピエントに存在し、ＨＬＡとの関連でプロセシングした抗原を認識する内在性Ｔ細胞による排除を回避することができる。
【００６５】
いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は：ａ）細胞内シグナル伝達ドメイン、ｂ）膜貫通ドメイン、及びｃ）抗原結合領域を含む細胞外ドメインを含む。
【００６６】
特定の実施形態では、ＣＡＲにおける細胞内受容体シグナル伝達ドメインとして、ＣＤ３のζ鎖などのＴ細胞抗原受容体複合体のもの、ならびに単独でまたはＣＤ３ζと直列に配置したＦｃγＲＩＩＩ共刺激シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＤＡＰ１０、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ２などが挙げられる。特定の実施形態では、細胞内ドメイン（細胞質ドメインと呼ぶ場合がある）は、ＴＣＲζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、４‐１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＦｃεＲＩγ、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＩＬ‐２Ｒβ／ＣＤ１２２、ＩＬ‐２Ｒα／ＣＤ１３２、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、及びＣＤ４０の１つ以上のうちの一部またはすべてを含む。いくつかの実施形態では、内在性Ｔ細胞受容体複合体の任意の部分を細胞内ドメインに用いる。いわゆる第３世代のＣＡＲは、例えば、相加効果または相乗効果を得るために融合した少なくとも２つまたは３つのシグナル伝達ドメインを有するため、１つまたは複数の細胞質ドメインを用いてもよい。
【００６７】
キメラ抗原受容体のある特定の実施形態では、受容体の抗原特異的部分（抗原結合領域を含む細胞外ドメインと呼ぶ場合がある）は、デクチン‐１などのパターン認識受容体によって認識される炭水化物抗原を含む腫瘍関連抗原または病原体特異的抗原に対する結合ドメインを有する。腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞の細胞表面上に発現するものであれば、いかなる種類のものであってもよい。腫瘍関連抗原の実施形態の例として、ＣＤ１９、ＣＤ２０、癌胎児性抗原、αフェトプロテイン、ＣＡ‐１２５、ＭＵＣ‐１、ＣＤ５６、ＥＧＦＲ、ｃ‐Ｍｅｔ、ＡＫＴ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、上皮腫瘍抗原、メラノーマ関連抗原、変異型ｐ５３、変異型ｒａｓなどが挙げられる。ある特定の実施形態では、ＣＡＲを膜結合サイトカインと同時発現させ、少量の腫瘍関連抗原が存在する場合に持続性を向上させることができる。例えば、ＣＡＲを膜結合型ＩＬ‐１５と同時発現させることができる。
【００６８】
ある特定の実施形態では、ＨＡ‐１、サバイビン、ＷＴ１、及びｐ５３などの細胞内腫瘍関連抗原を標的としてもよい。これは、ＨＬＡとの関連で細胞内腫瘍関連抗原に基づいて、記載するプロセシングしたペプチドを認識する普遍的なＴ細胞上に発現するＣＡＲによって達成することができる。さらに、普遍的なＴ細胞を遺伝子改変して、ＨＬＡとの関連で細胞内プロセシングした腫瘍関連抗原を認識するＴ細胞受容体対を発現させてもよい。
【００６９】
病原体は、いかなる種類のものであってもよいが、特定の実施形態では、病原体は、例えば、真菌、細菌、またはウイルスである。ウイルス病原体の例として、アデノウイルス科、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、ＪＣウイルス、ＢＫウイルス、ＨＳＶ、ＨＨＶファミリーのウイルス、ピコルナウイルス科、ヘルペスウイルス科、ヘパドナウイルス科、フラビウイルス科、レトロウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、パポバウイルス科、ポリオーマウイルス、ラブドウイルス科、及びトガウイルス科のものが挙げられる。例示的な病原性ウイルスは、天然痘、インフルエンザ、流行性耳下腺炎、麻疹、水痘、エボラ、及び風疹を引き起こす。病原真菌の例として、Ｃａｎｄｉｄａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ、及びＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓが挙げられる。病原菌の例として、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｓｐｉｒｏｃｈｅｔｅｓ、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａが挙げられる。一実施形態では、病原体受容体デクチン‐１を用いて、真菌の細胞壁上の炭水化物構造を認識するＣＡＲを生成することができる。デクチン‐１の特異性に基づいてＣＡＲを発現するように遺伝子改変したＴ細胞は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓを認識し、菌糸増殖を標的とすることができる。別の実施形態では、ウイルス決定基（例えば、ＣＭＶ及びエボラ由来の糖タンパク質）を認識する抗体に基づいてＣＡＲを作製し、ウイルス感染及び病理を阻止することができる。
【００７０】
いくつかの実施形態では、病原性抗原は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの炭水化物抗原であり、それについてＣＡＲの細胞外ドメインは、例えばデクチン‐１を介して、真菌細胞壁の炭水化物のパターンを認識する。
【００７１】
本発明によるキメラ免疫受容体は、当該技術分野で公知の任意の手段によって産生することができるが、好ましくは組換えＤＮＡ技術を用いて産生する。キメラ受容体のいくつかの領域をコードする核酸配列を調製し、分子クローニングの標準技術（ゲノムライブラリースクリーニング、ＰＣＲ、プライマー支援ライゲーション、酵母及び細菌由来のｓｃＦｖライブラリー、部位特異的突然変異誘発など）によって完全なコード配列に組み立てることができる。得られたコード領域を発現ベクターに挿入し、適切な同種異系の発現宿主Ｔ細胞株を形質転換するために使用することができる。
【００７２】
本明細書中で使用する場合、核酸構築物または核酸配列またはポリヌクレオチドとは、Ｔ細胞に形質転換または導入し、転写、翻訳して、産物（例えば、キメラ抗原受容体）を産生することが可能なＤＮＡ分子を意味することを意図している。
【００７３】
実施形態に用いる例示的な核酸構築物（ポリヌクレオチド）において、プロモーターは、キメラ受容体をコードする核酸配列に作動可能に連結しており、すなわち、それらはキメラ受容体をコードするＤＮＡからのメッセンジャーＲＮＡの転写を促進するように配置される。プロモーターは、ゲノム起源のものであっても、合成的に生成するものであってもよい。Ｔ細胞において使用するための様々なプロモーターが、当該技術分野で周知である（例えば、Ｍａｒｏｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）によって開示されたＣＤ４プロモーター）。プロモーターは、構成的または誘導性であることができ、誘導は、特定の細胞型または特定の成熟レベルに関連する。あるいは、多くの周知のウイルスプロモーターも適している。目的のプロモーターとして、β‐アクチンプロモーター、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター、免疫グロブリンプロモーター、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター、レトロウイルスプロモーター、脾フォーカス形成ウイルスプロモーターが挙げられる。プロモーターはエンハンサーと会合していてもいなくてもよく、エンハンサーは特定のプロモーターと天然に会合していてもよく、または異なるプロモーターと会合していてもよい。
【００７４】
キメラ受容体をコードするオープンリーディングフレームの配列は、ゲノムＤＮＡ供給源、ｃＤＮＡ供給源から取得可能か、もしくは合成可能であるか（例えば、ＰＣＲを介して）、またはそれらの組合せである。イントロンがｍＲＮＡを安定化するか、またはＴ細胞特異的発現をもたらすことが見出されているため、ゲノムＤＮＡのサイズ及びイントロンの数に応じて、ｃＤＮＡまたはその組合せを使用することが望ましい場合がある（Ｂａｒｔｈｅｌ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｆｅｌｄ，２００３）。また、内在性または外因性の非コード領域を使用してｍＲＮＡを安定化させることがさらに有効である場合がある。
【００７５】
本発明のキメラ抗原受容体の発現のために、キメラ受容体のＮ末端成分をコードする核酸配列の天然または内在性の転写開始領域を用いて、標的宿主中にキメラ受容体を生成することができる。あるいは、構成的または誘導性発現を可能にする外因性の転写開始領域を用いることができ、発現を、標的宿主、所望の発現レベル、標的宿主の性質などに応じて制御することができる。
【００７６】
同様に、キメラ受容体を表面膜に指向させるシグナル配列は、キメラ受容体のＮ末端成分の内在性シグナル配列であり得る。場合によっては、この配列を異なるシグナル配列と交換することが望ましい場合がある。しかしながら、選択したシグナル配列は、キメラ受容体がＴ細胞の表面上に提示されるように、Ｔ細胞の分泌経路と適合していなければならない。
【００７７】
同様に、キメラ受容体のＣ末端成分をコードする核酸配列の天然に存在するか、または内在性の転写終止領域によって終止領域を提供してもよい。あるいは、終止領域は、異なる供給源に由来してもよい。大部分において、終止領域の供給源は、一般的に、組換えタンパク質の発現に重要であるとは考えられず、広範囲の終止領域を、発現に悪影響を及ぼすことなく用いることができる。
【００７８】
本発明のキメラ構築物は、癌を有するかまたは有すると疑われる対象において、腫瘍のサイズを縮小するか、または腫瘍の増殖または再増殖を予防することによって、これらの対象に応用することができる。したがって、本発明はさらに、本発明のキメラ構築物を対象の単離Ｔ細胞に導入し、形質転換したＴ細胞を対象に再導入することによって、抗腫瘍応答に影響を与え、対象の腫瘍を低減または排除することにより、対象における増殖を低減するか、または腫瘍形成を予防する方法に関する。使用可能な適切なＴ細胞として、細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）または破壊を必要とするＴ細胞受容体を有する任意の細胞が挙げられる。当業者に周知であるように、これらの細胞を対象から単離するための様々な方法が容易に利用可能である。例えば、細胞表面マーカー発現を使用すること、または市販のキット（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ（ロックフォード、イリノイ）からのＩＳＯＣＥＬＬ（商標））を使用することが挙げられる。
【００７９】
キメラ構築物は、他の試薬（脂質、カチオン性ポリマー、ＰＥＧ複合体、タンパク質複合体が挙げられるが必ずしもこれらに限定するものではない）と組み合わせた裸のＤＮＡとして、または適切なベクターに組み込んで、対象自身のＴ細胞に導入することができることが企図される。裸のＤＮＡを用いて電気穿孔によってＴ細胞を安定に形質移入する方法は、当該技術分野で公知である。例えば、参照により本明細書に援用する米国特許第６，４１０，３１９号参照。裸のＤＮＡとは、通常、本発明のキメラ受容体をコードし、発現のために適切な向きでプラスミド発現ベクター中に組み込むＤＮＡのことを指す。利点として、裸のＤＮＡの使用は、本発明のキメラ受容体を発現するＴ細胞の産生に必要な時間を短縮する。
【００８０】
形質移入または形質導入したＴ細胞が、キメラ受容体を表面膜タンパク質として所望の調節及び所望のレベルで発現可能であることが確立されると、所望のシグナル誘導を提供するために、キメラ受容体が宿主細胞において機能的であるかどうかを決定することができる。続いて、形質導入したＴ細胞を対象に再導入または投与して、対象における抗腫瘍応答を活性化する。投与を容易にするために、本発明に従って形質導入したＴ細胞は、さらに薬学的に許容可能であり得る適切な担体または希釈剤を用いて、薬学的組成物にするか、またはｉｎ  ｖｉｖｏでの投与に適したインプラントにすることができる。このような組成物またはインプラントを製造する手段は、当該分野において記載されている（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍａｃｋ，ｅｄ．（１９８０）参照）。適切な場合には、形質導入したＴ細胞は、半固体または液体形態の調製物、例えば、カプセル、溶液、注射液、吸入剤、またはエアロゾルなどに、それらのそれぞれの投与経路のための通常の方法で製剤化することができる。当該技術分野で公知の手段を利用して、標的組織もしくは器官に到達するまで組成物の放出及び吸収を防止もしくは最小化するか、または組成物の時限放出を確実にすることができる。しかしながら、望ましくは、キメラ受容体を発現する細胞を無効にしない薬学的に許容可能な形態を用いる。したがって、望ましくは、形質導入したＴ細胞を、平衡塩類溶液、好ましくはハンクス平衡塩類溶液または生理食塩水を含有する医薬組成物にすることができる。
【００８１】
Ｖ．実施形態のキット
本明細書に記載する任意の組成物を、キットに含めてもよい。いくつかの態様では、実施形態のトランスポザーゼポリペプチド、またはそれをコードする核酸をキットに提供する。そのようなキットには、トランスポゾンリピートをコードするＤＮＡベクター、形質移入試薬、細胞、ＣＡＲ発現構築物、培地、ａＡＰＣ、増殖因子、抗体（例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞の選別または特徴付けのための）及び／またはＣＡＲもしくはトランスポザーゼをコードするプラスミドなどの様々な追加要素を含めてもよい。
【００８２】
非限定的な例において、キットは、実施形態のトランスポザーゼポリペプチドまたはそれをコードする核酸、ＣＡＲ発現構築物（隣接してトランスポゾンリピートを有する）を生成するための１つ以上の試薬、発現構築物の形質移入用の細胞、及び／または発現構築物の形質移入用の細胞を得るための１つ以上の器具（そのような器具は、注射器、ピペット、鉗子、及び／または同様の医学的に承認された装置であってもよい）を含む。さらに別の態様では、電気穿孔装置のような形質移入用装置を含む。
【００８３】
いくつかの実施形態では、内在性ＴＣＲα／β発現を排除するための発現構築物、構築物を生成するための１つ以上の試薬、及び／またはＣＡＲ＋  Ｔ細胞をキットに提供する。いくつかの実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（複数可）をコードする発現構築物を含む。
【００８４】
キットは、本発明の組成物を生成するために適切に分取した本発明の１つ以上の組成物または試薬を含み得る。キットの成分を、水性媒体または凍結乾燥形態のいずれかで包装してもよい。キットの収容手段には、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または他の収容手段が含まれ得るが、その中に成分を配置し、好ましくは適切に分注してもよい。キット中に複数の成分がある場合、キットは、通常、追加の成分を別々に配置し得る第二の、第三の、または他の追加の容器も含む。しかしながら、成分を様々に配合して一つのバイアルに含めてもよい。本発明のキットはまた、通常、キメラ受容体構築物の収容手段及び任意の他の試薬容器を、市販向けに密閉した状態で含む。そのような容器に、射出またはブロー成形したプラスチック容器を備えてもよく、例えばその内部に所望のバイアルを保持する。
【実施例】
【００８５】
ＶＩ．実施例
以下の実施例は、本発明のある特定の実施形態を示すために含まれる。以下の実施例に開示する技術は、本発明の実施において良好に機能するように発明者が見出した技術を表しており、したがってその実施のための好ましい様式を構成するとみなし得ることは、当業者は理解すべきである。しかしながら、本開示に照らして、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、開示する特定の実施形態において多くの変更が可能であり、そうした場合でも同様のまたは類似の結果が得られることを当業者は認識すべきである。
【００８６】
実施例１‐ヒト細胞において高活性を有する組換えトランスポザーゼ
Ｓａｌｍｏ  ｓａｌａｒ（タイセイヨウサケ）由来トランスポザーゼをコードするＤＮＡ配列を操作及びヒト化し、ヒト細胞内での効率を高めた酵素を産生することを試みた。生成したトランスポザーゼの２つの配列（及びそれらの核酸コード配列）を以下に示し、それらをｈＳＢ１１０及びｈＳＢ８１と命名した。
ｈＳＢ１１０（配列番号１）：
１      ｍｇｋｓｋｅｉｓｑｄ  ｌｒｋｒｉｖｄｌｈｋ  ｓｇｓｓｌｇａｉｓｋ  ｒｌａｖｐｒｓｓｖｑ  ｔｉｖｒｋｙｋｈｈｇ  ｔｔｑｐｓｙｒｓｇｒ
６１    ｒｒｖｌｓｐｒｄｅｒ  ｔｌｖｒｋｖｑｉｎｐ  ｒｔｔａｋｄｌｖｋｍ  ｌｅｅｔｇｔｋｖｓｉ  ｓｔｖｋｒｖｌｙｒｈ  ｎｌｋｇｈｓａｒｋｋ
１２１  ｐｌｌｑｎｒｈｋｋａ  ｒｌｒｆａｒａｈｇｄ  ｋｄｒｔｆｗｒｎｖｌ  ｗｓｄｅｔｋｉｅｌｆ  ｇｈｎｄｈｒｙｖｗｒ  ｋｋｇｅａｃｋｐｋｎ
１８１  ｔｉｐｔｖｋｈｇｇｇ  ｓｉｍｌｗｇｃｆａａ  ｇｇｔｇａｌｈｋｉｄ  ｇｉｍｄａｖｑｙｖｄ  ｉｌｋｑｈｌｋｔｓｖ  ｒｋｌｋｌｇｒｋｗｖ
２４１  ｆｑｈｄｎｄｐｋｈｔ  ｓｋｈｖｒｋｗｌｋｄ  ｎｋｖｋｖｌｅｗｐｓ  ｑｓｐｄｌｎｐｉｅｎ  ｌｗａｅｌｋｋｒｖｒ  ａｒｒｐｔｎｌｔｑｌ
３０１  ｈｑｌｃｑｅｅｗａｋ  ｉｈｐｎｙｃｇｋｌｖ  ｅｇｙｐｋｒｌｔｑｖ  ｋｑｆｋｇｎａｔｋｙ
ｈＳＢ１１０（配列番号２）：
１  ＡＴＧＧＧＣＡＡＧＡ  ＧＣＡＡＡＧＡＧＡＴ  ＣＡＧＣＣＡＧＧＡＣ  ＣＴＧＣＧＧＡＡＧＣ  ＧＧＡＴＣＧＴＧＧＡ  ＣＣＴＧＣＡＣＡＡＧ
６１  ＡＧＣＧＧＣＴＣＴＡ  ＧＣＣＴＧＧＧＣＧＣ  ＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧ  ＡＧＡＣＴＧＧＣＣＧ  ＴＧＣＣＴＡＧＡＡＧ  ＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧ
１２１  ＡＣＣＡＴＣＧＴＧＣ  ＧＧＡＡＧＴＡＣＡＡ  ＧＣＡＣＣＡＣＧＧＣ  ＡＣＣＡＣＣＣＡＧＣ  ＣＣＡＧＣＴＡＣＡＧ  ＡＴＣＴＧＧＡＡＧＧ
１８１  ＣＧＧＡＧＡＧＴＧＣ  ＴＧＡＧＣＣＣＣＡＧ  ＧＧＡＣＧＡＧＡＧＡ  ＡＣＡＣＴＣＧＴＧＣ  ＧＣＡＡＧＧＴＧＣＡ  ＧＡＴＣＡＡＣＣＣＣ
２４１  ＣＧＧＡＣＣＡＣＣＧ  ＣＣＡＡＧＧＡＣＣＴ  ＣＧＴＧＡＡＧＡＴＧ  ＣＴＧＧＡＡＧＡＧＡ  ＣＡＧＧＣＡＣＣＡＡ  ＧＧＴＧＴＣＣＡＴＣ
３０１  ＡＧＣＡＣＣＧＴＧＡ  ＡＧＣＧＧＧＴＧＣＴ  ＧＴＡＣＣＧＧＣＡＣ  ＡＡＣＣＴＧＡＡＧＧ  ＧＣＣＡＣＡＧＣＧＣ  ＣＡＧＡＡＡＧＡＡＧ
３６１  ＣＣＣＣＴＧＣＴＧＣ  ＡＧＡＡＣＡＧＡＣＡ  ＣＡＡＧＡＡＧＧＣＣ  ＣＧＧＣＴＧＡＧＡＴ  ＴＣＧＣＣＡＧＡＧＣ  ＣＣＡＣＧＧＣＧＡＣ
４２１  ＡＡＧＧＡＣＡＧＡＡ  ＣＣＴＴＣＴＧＧＣＧ  ＧＡＡＣＧＴＧＣＴＧ  ＴＧＧＡＧＣＧＡＣＧ  ＡＧＡＣＡＡＡＧＡＴ  ＣＧＡＧＣＴＧＴＴＣ
４８１  ＧＧＣＣＡＣＡＡＣＧ  ＡＣＣＡＣＡＧＡＴＡ  ＣＧＴＧＴＧＧＣＧＧ  ＡＡＧＡＡＧＧＧＣＧ  ＡＧＧＣＣＴＧＣＡＡ  ＧＣＣＣＡＡＧＡＡＣ
５４１  ＡＣＣＡＴＣＣＣＣＡ  ＣＡＧＴＧＡＡＧＣＡ  ＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣ  ＡＧＣＡＴＣＡＴＧＣ  ＴＧＴＧＧＧＧＣＴＧ  ＴＴＴＴＧＣＣＧＣＴ
６０１  ＧＧＣＧＧＣＡＣＡＧ  ＧＣＧＣＣＣＴＧＣＡ  ＣＡＡＡＡＴＣＧＡＣ  ＧＧＣＡＴＣＡＴＧＧ  ＡＣＧＣＣＧＴＧＣＡ  ＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣ
６６１  ＡＴＣＣＴＧＡＡＧＣ  ＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡ  ＡＡＣＣＴＣＴＧＴＧ  ＣＧＧＡＡＧＣＴＧＡ  ＡＧＣＴＧＧＧＣＣＧ  ＧＡＡＡＴＧＧＧＴＧ
７２１  ＴＴＣＣＡＧＣＡＣＧ  ＡＣＡＡＣＧＡＣＣＣ  ＣＡＡＧＣＡＣＡＣＣ  ＡＧＣＡＡＧＣＡＣＧ  ＴＧＣＧＧＡＡＡＴＧ  ＧＣＴＧＡＡＧＧＡＣ
７８１  ＡＡＣＡＡＡＧＴＧＡ  ＡＡＧＴＧＣＴＧＧＡ  ＡＴＧＧＣＣＣＡＧＣ  ＣＡＧＴＣＣＣＣＣＧ  ＡＣＣＴＧＡＡＣＣＣ  ＣＡＴＣＧＡＡＡＡＣ
８４１  ＣＴＧＴＧＧＧＣＣＧ  ＡＧＣＴＧＡＡＧＡＡ  ＡＡＧＡＧＴＧＣＧＧ  ＧＣＣＡＧＡＣＧＧＣ  ＣＣＡＣＣＡＡＣＣＴ  ＧＡＣＡＣＡＧＣＴＧ
９０１  ＣＡＣＣＡＧＣＴＧＴ  ＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡ  ＧＴＧＧＧＣＣＡＡＧ  ＡＴＣＣＡＣＣＣＣＡ  ＡＣＴＡＣＴＧＣＧＧ  ＣＡＡＧＣＴＧＧＴＧ
９６１  ＧＡＡＧＧＣＴＡＣＣ  ＣＣＡＡＧＡＧＧＣＴ  ＧＡＣＣＣＡＡＧＴＧ  ＡＡＡＣＡＧＴＴＣＡ  ＡＧＧＧＣＡＡＣＧＣ  ＣＡＣＣＡＡＧＴＡＣ
１０２１  ＴＧＡ
ｈＳＢ８１（配列番号３）：
１      ｍｇｋｓｋｅｉｓｑｄ  ｌｒｋｒｉｖｄｌｈｋ  ｓｇｓｓｌｇａｉｓｋ  ｒｌａｖｐｒｓｓｖｑ  ｔｉｖｒｋｙｋｈｈｇ  ｔｔｑｐｓｙｒｓｇｒ
６１    ｒｒｖｌｓｐｒｄｅｒ  ｔｌｖｒｋｖｑｉｎｐ  ｒｔｔａｋｄｌｖｋｍ  ｌｅｅｔｇｔｋｖｓｉ  ｓｔｖｋｒｖｌｙｒｈ  ｎｌｋｇｈｓａｒｋｋ
１２１  ｐｌｌｑｎｒｈｋｋａ  ｒｌｒｆａｒａｈｇｄ  ｋｄｒｔｆｗｒｎｖｌ  ｗｓｄｅｔｋｉｅｌｆ  ｇｈｎｄｈｒｙｖｗｒ  ｋｋｇｅａｃｋｐｋｎ
１８１  ｔｉｐｔｖｋｈｇｇｇ  ｓｉｍｌｗｇｃｆａａ  ｇｇｔｇａｌｈｋｉｄ  ｇｉｍｄａｖｑｙｖｄ  ｉｌｋｑｈｌｋｔｓｖ  ｒｋｌｋｌｇｒｋｗｖ
２４１  ｆｑｈｄｎｄｐｋｈｔ  ｓｋｈｖｒｋｗｌｋｄ  ｎｋｖｋｖｌｅｗｐｓ  ｑｓｐｄｌｎｐｉｅｎ  ｌｗａｅｌｋｋｒｖｒ  ａｒｒｐｔｎｌｔｑｌ
３０１  ｈｑｌｃｑｅｅｗａｋ  ｉｈｐｔｙｃｇｋｌｖ  ｅｇｙｐｋｒｌｔｑｖ  ｋｑｆｋｇｎａｔｋｙ
ｈＳＢ８１（配列番号４）：
１  ＡＴＧＧＧＣＡＡＧＡ  ＧＣＡＡＡＧＡＧＡＴ  ＣＡＧＣＣＡＧＧＡＣ  ＣＴＧＣＧＧＡＡＧＣ  ＧＧＡＴＣＧＴＧＧＡ  ＣＣＴＧＣＡＣＡＡＧ
６１  ＡＧＣＧＧＣＴＣＴＡ  ＧＣＣＴＧＧＧＣＧＣ  ＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧ  ＡＧＡＣＴＧＧＣＣＧ  ＴＧＣＣＴＡＧＡＡＧ  ＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧ
１２１  ＡＣＣＡＴＣＧＴＧＣ  ＧＧＡＡＧＴＡＣＡＡ  ＧＣＡＣＣＡＣＧＧＣ  ＡＣＣＡＣＣＣＡＧＣ  ＣＣＡＧＣＴＡＣＡＧ  ＡＴＣＴＧＧＡＡＧＧ
１８１  ＣＧＧＡＧＡＧＴＧＣ  ＴＧＡＧＣＣＣＣＡＧ  ＧＧＡＣＧＡＧＡＧＡ  ＡＣＡＣＴＣＧＴＧＣ  ＧＣＡＡＧＧＴＧＣＡ  ＧＡＴＣＡＡＣＣＣＣ
２４１  ＣＧＧＡＣＣＡＣＣＧ  ＣＣＡＡＧＧＡＣＣＴ  ＣＧＴＧＡＡＧＡＴＧ  ＣＴＧＧＡＡＧＡＧＡ  ＣＡＧＧＣＡＣＣＡＡ  ＧＧＴＧＴＣＣＡＴＣ
３０１  ＡＧＣＡＣＣＧＴＧＡ  ＡＧＣＧＧＧＴＧＣＴ  ＧＴＡＣＣＧＧＣＡＣ  ＡＡＣＣＴＧＡＡＧＧ  ＧＣＣＡＣＡＧＣＧＣ  ＣＡＧＡＡＡＧＡＡＧ
３６１  ＣＣＣＣＴＧＣＴＧＣ  ＡＧＡＡＣＡＧＡＣＡ  ＣＡＡＧＡＡＧＧＣＣ  ＣＧＧＣＴＧＡＧＡＴ  ＴＣＧＣＣＡＧＡＧＣ  ＣＣＡＣＧＧＣＧＡＣ
４２１  ＡＡＧＧＡＣＡＧＡＡ  ＣＣＴＴＣＴＧＧＣＧ  ＧＡＡＣＧＴＧＣＴＧ  ＴＧＧＡＧＣＧＡＣＧ  ＡＧＡＣＡＡＡＧＡＴ  ＣＧＡＧＣＴＧＴＴＣ
４８１  ＧＧＣＣＡＣＡＡＣＧ  ＡＣＣＡＣＡＧＡＴＡ  ＣＧＴＧＴＧＧＣＧＧ  ＡＡＧＡＡＧＧＧＣＧ  ＡＧＧＣＣＴＧＣＡＡ  ＧＣＣＣＡＡＧＡＡＣ
５４１  ＡＣＣＡＴＣＣＣＣＡ  ＣＡＧＴＧＡＡＧＣＡ  ＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣ  ＡＧＣＡＴＣＡＴＧＣ  ＴＧＴＧＧＧＧＣＴＧ  ＴＴＴＴＧＣＣＧＣＴ
６０１  ＧＧＣＧＧＣＡＣＡＧ  ＧＣＧＣＣＣＴＧＣＡ  ＣＡＡＡＡＴＣＧＡＣ  ＧＧＣＡＴＣＡＴＧＧ  ＡＣＧＣＣＧＴＧＣＡ  ＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣ
６６１  ＡＴＣＣＴＧＡＡＧＣ  ＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡ  ＡＡＣＣＴＣＴＧＴＧ  ＣＧＧＡＡＧＣＴＧＡ  ＡＧＣＴＧＧＧＣＣＧ  ＧＡＡＡＴＧＧＧＴＧ
７２１  ＴＴＣＣＡＧＣＡＣＧ  ＡＣＡＡＣＧＡＣＣＣ  ＣＡＡＧＣＡＣＡＣＣ  ＡＧＣＡＡＧＣＡＣＧ  ＴＧＣＧＧＡＡＡＴＧ  ＧＣＴＧＡＡＧＧＡＣ
７８１  ＡＡＣＡＡＡＧＴＧＡ  ＡＡＧＴＧＣＴＧＧＡ  ＡＴＧＧＣＣＣＡＧＣ  ＣＡＧＴＣＣＣＣＣＧ  ＡＣＣＴＧＡＡＣＣＣ  ＣＡＴＣＧＡＡＡＡＣ
８４１  ＣＴＧＴＧＧＧＣＣＧ  ＡＧＣＴＧＡＡＧＡＡ  ＡＡＧＡＧＴＧＣＧＧ  ＧＣＣＡＧＡＣＧＧＣ  ＣＣＡＣＣＡＡＣＣＴ  ＧＡＣＡＣＡＧＣＴＧ
９０１  ＣＡＣＣＡＧＣＴＧＴ  ＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡ  ＧＴＧＧＧＣＣＡＡＧ  ＡＴＣＣＡＣＣＣＣＡ  ＣＣＴＡＣＴＧＣＧＧ  ＣＡＡＧＣＴＧＧＴＧ
９６１  ＧＡＡＧＧＣＴＡＣＣ  ＣＣＡＡＧＡＧＧＣＴ  ＧＡＣＣＣＡＡＧＴＧ  ＡＡＡＣＡＧＴＴＣＡ  ＡＧＧＧＣＡＡＣＧＣ  ＣＡＣＣＡＡＧＴＡＣ
１０２１  ＴＧＡ
【００８７】
次に、ｈＳＢ１１０及びｈＳＢ８１トランスポザーゼ、ならびに対照トランスポザーゼを、遺伝子組み込みＣＡＲによって操作ヒトＴ細胞を産生するそれらの能力について試験した。これらの研究用のプロトコールを図１に示す。トランスポゾンリピートが隣接するＣＡＲをコードするトランスポゾンＤＮＡ構築物を、トランスポザーゼポリペプチドをコードするｍＲＮＡとともに、ヒトＴ細胞に共形質移入した。形質移入には、４Ｄ‐ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（商標）電気穿孔システム（Ｌｏｎｚａ）を使用した。電気穿孔後、細胞を培養し、フローサイトメトリーによってＣＡＲ発現を評価した。
【００８８】
これらの研究の結果を図２に示す。上のパネルのヒストグラムは、形質移入の８日後における、７ＡＡＤ染色によって評価した生存不能となった細胞（ｘ軸）に対するＣＡＲ陽性細胞の数（ｙ軸）を示す。下のパネルは、形質移入の１５日後における、ＣＡＲ陽性細胞の数（ｙ軸）、及びＣＤ３を発現する細胞の数（ｘ軸）を示す。これらの結果は、ｈＳＢ１１０及びｈＳＢ８１トランスポザーゼがＳＢ１００ｘよりも、細胞操作において有意により効率的であることを明白に示している。形質移入後８日目までに、ｈＳＢ１１０及びｈＳＢ８１で電気穿孔した細胞のうちの２２％超がＣＡＲを発現する。この時点では、ＳＢ１００ｘで電気穿孔した細胞のうち、１５％のみがＣＡＲを発現した。いずれの試験構築物（７ＡＡＤ染色によって評価した）でも、生存不能細胞の数に有意差は認められなかった。さらに、１５日目までに、ｈＳＢ１１０及びｈＳＢ８１で電気穿孔した細胞集団の８０％超がＣＡＲ及びＣＤ３を共発現した。
【００８９】
本明細書に開示し、特許請求するすべての方法は、本開示に照らして過度の実験をすることなく作製し、実施することができる。本発明の組成物及び方法を、ある特定の実施形態の形式で記載しているが、本発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなく、方法及び工程または本明細書に記載する方法の工程の順序に変形を適用し得ることは当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的にも生理学的にも関連するある特定の薬剤を、本明細書に記載の薬剤と置き換えても、同様または類似の結果が得られるであろうことは明らかである。当業者に明らかなそのような類似の置換及び修飾のすべては、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神、範囲及び概念の範囲内であるとみなされる。
［参考文献］
以下の参考文献は、本明細書の記載を補足する例示的手順または他の詳細を提供する限りにおいて、参照により本明細書に具体的に援用する。
米国特許第４，５５４，１０１号
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米国特許第６，４１０，３１９号
米国特許第６，４８９，４５８号
米国特許第７，１４８，２０３号
米国特許第８，２２７，４３２号
米国特許出願公開第２０１１／０１１７０７２号
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【図１】
0006775515.tif 000002
【図２】
0006775515.tif 000003
【配列表】
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