(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
チオレドキシンをコードする遺伝子が改変された非ヒトモデル動物であって、
前記改変された遺伝子が、基質タンパク質のジスルフィド結合を還元するために消費される単位時間あたりのNADPH（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）量を減少させ、その減少割合が10％から90％の範囲にあることを特徴とする、非ヒトモデル動物。
【請求項２】
老化、腎臓病、心血管疾患、高血圧、大動脈解離、慢性閉塞性肺疾患、年齢依存性てんかん、脂質代謝異常、貧血、骨粗鬆症および免疫異常からなる群から選択されるいずれかの疾患にモデルとして適応される、請求項１に記載の非ヒトモデル動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化ストレスが深く関わる疾患研究動物として、特に、老化、腎臓病、心血管疾患、高血圧、大動脈解離、慢性閉塞性肺疾患、年齢依存性てんかん、脂質代謝異常、貧血、骨粗鬆症、免疫異常などのモデル動物として有用な非ヒトモデル動物に関し、特にチオレドキシンをコードする遺伝子が改変された非ヒトモデル動物に関するものである。
背景技術【０００２】
生体には抗酸化酵素や抗酸化物質による抗酸化力が備わっており、生体の酸化還元状態を制御することによって多彩な酸化ストレスに適応しホメオスタシスを維持するシステム（レドックス制御：redox regulation）がある。しかし、生体の内因性あるいは外因性の原因により生じる酸化ストレスをこの制御機構が十分処理することができなくなるか、もしくは、制御機構が何らかの原因で破綻してしまうと、生体に様々な障害が現れてくる。過度の酸化ストレスはDNAや蛋白質、脂質等に障害を与え、細胞の機能障害や細胞死を引き起こすため、がんや老化等における重要な原因の１つと考えられている。【０００３】
チオレドキシンはヒト、ラット、マウスともに105個のアミノ酸からなる分子量約12kDa蛋白質で、その活性部位に２個のシステイン残基を持つ。そのシステイン残基間でのジチオール／ジスルフィド交換反応により基質の酸化還元反応に寄与する。ジチオールを持つ還元型チオレドキシンは基質蛋白質のジスルフィド結合を還元し、自らは酸化型となる。【０００４】
チオレドキシンは、酸化ストレスを引き起こす原因である紫外線、放射線、酸化剤、ウイルス感染、虚血再灌流障害、抗がん剤投与など、様々な要因によって誘導され、種々の遺伝子発現を調節する転写因子や細胞内のシグナル伝達分子の活性を制御している（J. Annual Review of Immunology. 15, 351-369 (1997)、Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure 30, 421-455 (2001)）。チオレドキシンは、酸化ストレス誘導性の疾患に対しては防御的に作用し、種々の化学物質や抗がん剤に抵抗性を示し、チオレドキシンの発現は長寿命傾向に関与している（J Gerontol A Biol Sci Med Sci.,66A: 1286-1299 (2011)、The Journal of Clinical Investigation 112(9), 1395-1406 (2003)、Nephrol Dial Transplant; 22: 1547-1557 (2007)）。従来技術としてチオレドキシン欠損マウスが作製されているが、この欠損遺伝子ホモ接合体マウスは胎児期に死亡してしまい、ヘテロ接合体は正常である（非特許文献１）。また、ドミナントネガティブ効果を持つチオレドキシン遺伝子を心臓に発現させ、肥大型心筋症モデルとなるトランスジェニック動物が存在する（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Developmental Biology 178, 179-185 (1996)
【非特許文献２】J Clin Invest.  112, 1395-1406 (2003)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
解決しようとする問題点は、チオレドキシンの機能低下により引き起こされる様々な疾患の非ヒト動物モデルが存在しないことである。本発明は、老化、腎臓病、心血管疾患、高血圧、大動脈解離、慢性閉塞性肺疾患、年齢依存性てんかん、脂質代謝異常、貧血、骨粗鬆症、免疫異常などのモデルとして適用可能な、非ヒト動物モデルを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、チオレドキシンの機能低下により発症する老化、腎臓病、心血管疾患、高血圧、大動脈解離、慢性閉塞性肺疾患、年齢依存性てんかん、脂質代謝異常、貧血、骨粗鬆症、免疫異常などの疾患モデルとして適用可能な、非ヒト動物モデルを提供する。本発明者らは、上記課題を解決するために、ゲノム上にランダムに点突然変異を誘発する化学変異原エチルニトロソウレアを雄ラットに投与し、雌ラットと交配して作製した仔ラット群より表現型異常を示すラットを選別し、遺伝子の異常を確認したところ、原因遺伝子はTxn1遺伝子の変異であることを初めて確認した。さらに研究を重ねた結果、Txn1遺伝子の変異を有する非ヒト動物であって、ホモ接合体であっても出生可能であり、老化、腎臓病、心血管疾患、高血圧、慢性閉塞性肺疾患、年齢依存性てんかん、脂質代謝異常、貧血、骨粗鬆症、免疫異常などの疾患モデルとして適用しうる非ヒト動物モデルの作製に成功し、本発明を完成した。【０００８】
すなわち本発明は、以下よりなる。
１．チオレドキシンをコードする遺伝子が改変された非ヒトモデル動物。
２．チオレドキシンをコードする改変された遺伝子が、基質タンパク質のジスルフィド結合を還元するために消費される単位時間あたりのNADPH（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）量を減少させ、その減少割合が10％から90％の範囲にあることを特徴とする、前項１に記載の非ヒトモデル動物。
３．老化、腎臓病、心血管疾患、高血圧、大動脈解離、慢性閉塞性肺疾患、年齢依存性てんかん、脂質代謝異常、貧血、骨粗鬆症および免疫異常からなる群から選択されるいずれかの疾患にモデルとして適応される、前項１または２に記載の非ヒトモデル動物。
４．前項１〜３のいずれか1に記載の疾患モデルを用いることを特徴とする薬剤のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のチオレドキシンをコードする遺伝子が改変された非ヒトモデル動物は、老化、腎臓病、心血管疾患、高血圧、大動脈解離、慢性閉塞性肺疾患、年齢依存性てんかん、脂質代謝異常、貧血、骨粗鬆症、免疫異常などの疾患を示し、これらの疾患の病態解明や治療薬のスクリーニング法として用いるモデル動物として使用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】表現型異常を示すラットのTxn1遺伝子の変異を、シークエンス解析した結果を示す図である。当該ラットについて、Txn1遺伝子の第54番目のコドンTTCがCTCへ変化しており、その結果第54番目のアミノ酸がフェニルアラニン（F）からロイシン（L）に置換していることが確認された図である。（実施例１）
【図２】Txn1遺伝子改変ラットのTxn1遺伝子変異箇所（54番目のF）付近のアミノ酸（48-66番目）について、他の動物種とアライメント解析を示す図である。
【図３】Txn遺伝子がコードするチオレドキシンが全身の多臓器（腎臓、心臓、肝臓、脳）に発現していることを示す図である。（実験例１）
【図４】組換えTxn1精製蛋白の機能解析を示す図である。A：野生型、F54L変異型、C35S変異型のチオレドキシン蛋白が精製されていることを示す。B:チオレドキシンが基質タンパク質のジスルフィド結合を還元するために消費されるNADPHの減少を示す図である。C：チオレドキシン蛋白の基質タンパク質のジスルフィド結合を還元するために消費される単位時間あたりのNADPH（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）の消費量を示した図である。F54L変異型は野生型と比し、26.9％〜53.9％に消費量が低下、C35Sは2.55％〜7.45％に消費量が低下していることを示している。F54L変異型のNADPH消費量は野生型より低く、C35Sよりも高い。D：野生型とF54L変異型の抽出蛋白を混合しても活性阻害がなく、F54L変異型がドミナントネガティブ効果を持たないことを示している。（実験例２）
【図５】腎臓におけるチオレドキシンの機能解析を示す図である。A：野生型、F54L変異型ヘテロ、F54L変異型ホモラットの組織抽出蛋白の濃度がほぼ同一であることを示す。B:チオレドキシンが基質タンパク質のジスルフィド結合を還元するために消費されるNADPHの減少を示す図である。C: チオレドキシンの単位時間あたりのNADPH消費を示す図である。変異型ヘテロラットおよびホモラットのチオレドキシンの単位時間あたりのNADPH消費は野生型ラットより低いことを示している。野生型と比し、変異型で30.6％〜32.2％に単位時間あたりのNADPH消費の低下が認められる。D：野生型とホモの抽出蛋白を混合しても活性阻害がなく、F54L変異型がドミナントネガティブ効果を持たないことを示している。（実験例３）
【図６】野生型とTxn1遺伝子改変ラット（ホモおよびヘテロ）の生存曲線と性差を示す図である。Txn1遺伝子改変ラットでは雌で寿命が長くなった。（実験例４）
【図７】野生型とTxn1遺伝子改変ラット（ホモおよびヘテロ）の全身健康状態を示した図である。A：雄の体重変化を示し、ホモで３ヶ月以降、ヘテロで11ヶ月以降体重減少が認められる。B：雌の体重変化を示し、ホモで３ヶ月以降、ヘテロで11ヶ月以降体重減少が認められる。C：４か月時の外見と肉眼的臓器所見を示す。ホモでは顕著なやせ、脊椎変形、脱毛、内臓脂肪の著減、胸腺退縮が認められる。D：11か月時の外見と肉眼的臓器所見を示す。ヘテロでは顕著なやせ、脊椎変形、脱毛、内臓脂肪の著減、胸腺退縮が認められる。（実験例５）
【図８】遺伝子改変ラットにおける進行性腎機能障害、高コレステロール血症、貧血を示す図である。A:血清アルブミン、B：血中尿素窒素（Blood Urea Nitrogen；Bun）、C：総コレステロール（Total Cholesterol; T-Cho）、D：ヘモグロビン（Hb）、E：尿中アルブミン/Cr量(Urinary Albumin/Cr)、F：尿潜血、G：血糖値（Glucose, Glu）、H：白血球数の月齢推移を示す図である。（実験例６）
【図９】野生型および遺伝子改変ラットにおける腎臓のMasson trichrome染色写真である。腎臓の線維化の進行を示している（実験例６）
【図１０】野生型および遺伝子改変ラットにおける腎臓のPAS（Periodic Acid Schiff）染色写真である。Txn1遺伝子改変ラットにおける糸球体病変、尿細管病変を示している。（実験例６）
【図１１】野生型および遺伝子改変ラットにおける循環器疾患を示す。血圧測定データおよび大血管動脈の中膜の断裂、線維の不整、石灰化、心筋拡張を示す写真である。（実験例７）
【図１２】野生型およびTxn1遺伝子改変ラットにおける肺病理組織写真である。（実験例８）
【図１３】野生型およびTxn1遺伝子改変ラットにおける胸腺病理組織写真である。（実験例９）
【図１４】野生型およびTxn1遺伝子改変ラットにおける卵巣萎縮を示す病理組織写真である。（実験例１０）
【図１５】野生型およびTxn1遺伝子改変ラットにおける骨・ミネラル代謝を示す図である。A：カルシウム、B:無機リン、C:アルカリホスファターゼの月齢推移を示す図である。D:生後４ヶ月の野生型とTxn1遺伝子改変ラットのコンピュータ断層撮影（Computed Tomography：CT）の画像を示す図である。左は全体像を、右は腹部の断面像を示している。（実験例１１）
【図１６】Txn1遺伝子改変ラットにおけるてんかん発作の状態を示す脳波である。（実験例１２）
【図１７】Txn1遺伝子改変ラットにおける脳病変を示す病理写真である（実験例１３）
【図１８】CRISPR/Cas９システムを用いたゲノム編集技術により作成されたTxn1遺伝子改変マウスの写真図とTxn１遺伝子のシークエンス解析結果を示す図である。遺伝子改変マウスF0-#3（ホモ接合型；母親、約１４週齢）と、その産仔F1マウス４匹（ヘテロ接合型；雄３匹、雌１匹；約３週齢）、および、F0-#3マウスのTxn1遺伝子をシークエンス解析した図である。Txn1遺伝子の第54番目のコドンTTCがCTCへ変化しており、その結果第54番目のアミノ酸がフェニルアラニン（F）からロイシン（L）に置換していることが確認された。（実験例１４）
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の非ヒトモデル動物は、チオレドキシンをコードする遺伝子が改変され、チオレドキシンの機能が低下することが原因で発症する疾患の非ヒトモデル動物である。本発明における非ヒトモデル動物としては、ヒトを除く哺乳動物が挙げられ、例えば、サル、マーモセット、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウスなどが挙げられる。特に、ラット、マウス、モルモットなどのげっ歯類の取扱いが容易であるため好ましく、中でもラットが好ましい。
【００１２】
本発明の非ヒトモデル動物は、チオレドキシンをコードする遺伝子が改変されてなる非ヒトモデル動物である。チオレドキシンはヒト、ラット、マウスともに105個のアミノ酸からなる分子量約12kDaの蛋白質で、その活性部位に２個のシステイン残基を有する。そのシステイン残基間でジチオール／ジスルフィド交換反応により基質の酸化還元反応に寄与する。ジチオールを有する還元型チオレドキシンは基質蛋白質のジスルフィド結合を還元し、自らは酸化型となる。チオレドキシンをコードする遺伝子は、TXN、TRX、TRX1、TRDX、Txn1、Txn、Trx1またはADFと呼ばれるいずれかの遺伝子である。例えば、ヒト由来の遺伝子はTXN、TRX、TRX1またはTRDXと呼ばれ、ラット由来遺伝子はTxn1またはTxnと呼ばれ、マウス由来遺伝子はTxn1、Txn、Trx1またはADFと呼ばれる。チオレドキシンをコードする遺伝子として、例えばラット由来遺伝子Txn1はGenBank Accession No. NM_053800 （配列番号１）に示される塩基配列で特定される遺伝子が挙げられ、Txn1蛋白質は配列番号２に示すアミノ酸配列で特定される。
【００１３】
（配列番号１）
ATGGTGAAGCTGATCGAGAGCAAGGAAGCTTTTCAGGAGGCCCTGGCCGCTGCGGGAGACAAGCTTGTGGTAGTGGACTTCTCTGCCACGTGGTGTGGACCTTGCAAAATGATCAAGCCCTTCTTTCATTCCCTCTGTGACAAGTATTCCAATGTGGTGTTCCTTGAAGTAGACGTGGATGACTGCCAGGATGTTGCTGCAGACTGTGAAGTCAAATGCATGCCGACCTTCCAGTTCTATAAAAAGGGTCAAAAGGTTGGGGAGTTCTCTGGTGCTAACAAGGAAAAGCTCGAAGCCACTATTACGGAGTTTGCCTAA
（配列番号２）
MVKLIESKEAFQEALAAAGDKLVVVDFSATWCGPCKMIKPFFHSLCDKYSNVVFLEVDVDDCQDVAADCEVKCMPTFQFYKKGQKVGEFSGANKEKLEATITEFA
【００１４】
本発明のチオレドキシンをコードする遺伝子が改変された非ヒト動物モデルは、ホモ接合体モデルまたはヘテロ接合体モデルの各々において、例えば、老化、腎臓病、心血管疾患、高血圧、大動脈解離、慢性閉塞性肺疾患、年齢依存性てんかん、脂質代謝異常、貧血、骨粗鬆症、免疫異常などの疾患を示す。以下、当該改変された遺伝子を、単に「改変型チオレドキシン遺伝子」ともいう。本発明における改変型チオレドキシン遺伝子は、チオレドキシンが作用する基質蛋白の還元機能を10％〜90％、好ましくは10％〜70％、より好ましくは26.9％〜53.9％に低下させればよい。C35Sのチオレドキシンが2.55％〜7.45％に消費量が低下していたことから、本発明における改変型チオレドキシン遺伝子の機能低下範囲は、C35Sの減少範囲を除外する値である。改変型チオレドキシン遺伝子は第54番目のアミノ酸がFからLに置換されたチオレドキシンを発現しうる塩基配列であってもよい。そのような塩基配列としては、第54番目のコドンTTCがCTCへ改変されているチオレドキシンをコードする塩基配列の他、遺伝子コドンの縮重のため、改変型チオレドキシンと同じアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするいずれかの塩基配列であってもよい。
【００１５】
本発明の遺伝子改変非ヒトモデル動物は、当該動物のゲノム上のチオレドキシンをコードする塩基配列（改変型チオレドキシン遺伝子）により改変型チオレドキシンを発現しうる動物であればよい。そのような動物は、改変型チオレドキシン遺伝子をゲノム上に配置させることで達成しうる。例えば、遺伝子工学技術を用いて人為的に個体の遺伝情報を変化させることで作製することができる。遺伝子改変非ヒトモデル動物は、例えば外部から特定の遺伝子を導入したトランスジェニック動物、特定の遺伝子を置換させたノックイン動物が挙げられる。また、モデルとなる動物の染色体に遺伝子の導入、欠失、置換さらにはエフェクターとの組み合わせによるゲノム編集（Genome Editing）により作製することができる。
【００１６】
トランスジェニック非ヒト動物は、一般的には、トランス遺伝子とよばれる外来性の遺伝子を宿主のゲノムに人為的に組み込み、これが世代をこえて受け継がれる非ヒト動物をいう。宿主が保有する蛋白質とは異なる変異型蛋白質を発現させる目的等により、作製されることが多い。トランスジェニック非ヒトの作製方法は、自体公知の方法、例えばマイクロインジェクション法を採用することができる。ドナー動物から採取した受精卵前核へ本発明の改変型チオレドキシン遺伝子を導入し、当該受精卵をレシピエント動物の卵管内に移植し、自然分娩させてトランスジェニック非ヒト動物を産生することができる。本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原生殖細胞を含む前駆細胞などに対して、好ましくは、非ヒト動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、受精卵の卵割前の単細胞または卵割段階でかつ一般に8細胞期以前）において、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、DEAE-デキストラン法などにより本発明の改変型チオレドキシン遺伝子を導入することにより作製することができる。また、該遺伝子導入方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに本発明の改変型チオレドキシン遺伝子を導入し、細胞培養、組織培養などを作製し、これらの細胞を上述の生殖細胞系前駆体細胞と自体公知の細胞配合法により融合させることによりトランスジェニック非ヒト動物を作製することもできる。
【００１７】
遺伝子が導入された受精卵は、次に仮親の卵管に移植されて胎児となり、出生後3-4週齢で体の一部（マウスやラットの場合には、例えば、尾部先端）からDNAを抽出し、サザン解析やPCR法により導入遺伝子の存在を確認することができる。導入遺伝子の存在が確認された個体を初代とすれば、導入遺伝子はその子（F1）に伝達される。さらに、このF1個体を野生型動物または他のF1動物と交配させることにより、2倍体染色体の片方（ヘテロ接合）または両方（ホモ接合）に導入遺伝子を有する個体（F2）を作製することができる。
【００１８】
他の態様によれば、第54番目のアミノ酸がFからLに置換されたチオレドキシンを発現する本発明の非ヒト動物は、上記本発明の改変型チオレドキシン遺伝子をES細胞（embryonic stem cell）に導入することによって作製することもできる。例えば、正常ラット胚盤胞に由来するHPRT陰性（ヒポキサンチングアニン・フォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を欠いている）ES細胞に、上記本発明の改変型チオレドキシン遺伝子を導入することにより作製可能である。本発明の改変型チオレドキシン遺伝子がラット内在性遺伝子上にインテグレートされたES細胞をHATセレクション法により選別する。次いで、選別したES細胞を、別の正常非ヒト動物から取得した受精卵（胚盤胞）にマイクロインジェクションする。該胚盤胞を仮親としての別の正常非ヒト動物の子宮に移植する。そうして該仮親非ヒト動物から、キメラトランスジェニック非ヒト動物が生まれる。該キメラトランスジェニック非ヒト動物を正常非ヒト動物と交配させることによりヘテロトランスジェニック非ヒト動物を得ることができる。該ヘテロトランスジェニック非ヒト動物同士を交配することにより、ホモトランスジェニック非ヒト動物が得られる。これらのトランスジェニック非ヒト動物は、本発明のチオレドキシンをコードする遺伝子が改変したモデル動物ということができる。
【００１９】
他の態様によれば、第54番目のアミノ酸がFからLに置換されたチオレドキシンを発現するノックイン非ヒト動物は、上記本発明の改変型チオレドキシン遺伝子をES細胞に導入することによって作製することができる。例えば、ラット等の正常非ヒト動物のES細胞に、本発明の改変型チオレドキシン遺伝子を導入することにより作製可能である。本発明の改変型チオレドキシン遺伝子が非ヒト動物の内在性遺伝子上に置換されたES細胞を、G418を用いたポジティブセレクション法とヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子を用いたネガティブセレクション法により選別する。次いで、選別したES細胞を、別の正常非ヒト動物から取得した受精卵（胚盤胞）にマイクロインジェクションする。該胚盤胞を仮親としての別の正常非ヒト動物の子宮に移植する。そうして該仮親非ヒト動物から、キメラノックイン非ヒト動物が生まれる。該キメラノックイン非ヒト動物を正常非ヒト動物と交配させることによりヘテロノックインラットを得ることができる。該ヘテロノックインラット同士を交配することにより、ホモノックイン非ヒト動物が得られる。これらのノックイン非ヒト動物は、本発明のチオレドキシンをコードする遺伝子が改変した非ヒトモデル動物ということができる。
【００２０】
さらに別の態様では、本発明の非ヒトモデル動物は、ゲノム編集の手法を用いて作製することもできる。ゲノム編集の方法は、自体公知の方法または今後開発されるあらゆる手法を適用することができる。例えば、CRISPR/CasシステムやTranscription Activator-Like Effector Nucleases（TALEN）、Zinc Finger Nuclease（ZFN）等の技術により、モデルとなる動物について遺伝子特異的な破壊や目的遺伝子のノックイン等を行い、本発明の非ヒトモデル動物を作製することができる。
【実施例】
【００２１】
以下、本発明の理解を深めるために、実施例および実験例により本発明の内容を具体的に説明する。【００２２】
（実施例１）Txn1遺伝子改変ラットの作製
本実施例では、表現型異常を示すラットの解析を行い、当該解析結果に基づくTxn1遺伝子改変ラットの作製について説明する。【００２３】
１）表現型異常を示すラットの確認
ゲノム上にランダムに点突然変異を誘発する化学変異原エチルニトロソウレア（N-ethyl-N-nitorosourea；ENU）（40mg/kg）を雄ラットF344/NSlcに2回（9, 10週齢時）腹腔内投与し、雌ラットF344/NSlcと交配することで、仔ラット群を作製した。仔ラット群の中から表現型異常を示すラットを選別し、表現異常に関わる遺伝子を検索した。遺伝子の解析として、野生型との交配により戻し交雑群を作製し、全染色体上のDNA多型マーカーを用いて病型との連鎖解析を行った。これにより表現型異常に関わる関連座位を絞り込み、次世代シークエンサーを用いたゲノムシークエンス解析により、原因遺伝子はTxn1遺伝子の変異であることを同定した。図１は、自動キャピラリーシークエンサー（ABI3100）を用いたシークエンス解析により、当該ラットのチオレドキシンTxn1遺伝子変異を解析した結果を示す。当該表現型異常を示すラットはTxn1遺伝子の第54番目のコドンTTCがCTCへ変化しており、その結果第54番目のアミノ酸がFからLに置換していることが確認された（F54L）。【００２４】
当該ラットのチオレドキシン変異箇所（第54番目のF）付近のアミノ酸について、他の動物種とアライメント解析を行った。第54番目のアミノ酸であるFは、動物種を超えて保存されていた（図２）。このことは、この第54番目のFはチオレドキシン蛋白質の機能において重要なアミノ酸であること、FからLへの変異は表現型異常に重要な役割を担っている可能性を示唆している。【００２５】
２）Txn1遺伝子改変ラットの作製
上記１）において確認されたTxn1遺伝子の第54番目のコドンTTCがCTCへ変化したラットについて、10世代以上同系統の野生型（Wild Type：WT）と戻し交配を行い、遺伝的バックグラウンドをWTに一致させ、Txn1遺伝子改変ラット（ヘテロ接合体：Hetero）を作製した。当該ヘテロ接合体のTxn1遺伝子改変ラット同士を交配することにより、ホモ接合体のTxn1遺伝子改変ラットとヘテロ接合体のTxn1遺伝子改変ラットおよび野生型ラット（WT）を得た。以下の実験では、この同胞のWTをコントロールとして使用した。以降において、ホモ接合体の変異ラットを「Homo」といい、ヘテロ接合体の変異ラットを「Hetero」ということとする。また、野生型ラット（WT）は「WT」という。以下の実験例においても同様である。【００２６】
（実験例１）Txn1遺伝子改変ラットにおけるTxn1蛋白質の発現解析
実施例１で作製したTxn1遺伝子改変ラットについて、Txn1蛋白質の発現を確認した。生後１ヶ月、４ヶ月のWT、Hetero、Homo、および、生後12ヶ月のWT、Heteroから腎臓、心臓、肝臓、脳の組織を摘出後、液体窒素で凍結し、超低温冷凍庫に保管した。各組織よりLysis Bufferにて蛋白質を抽出後、超音波処理を行った。冷却遠心機にて沈殿物を除去し、蛋白質濃度を測定後、抗Txn1抗体、および、インターナルコントロールである抗GAPDH抗体を用いたウエスタンブロットを行なった。WTに比し、Hetero、Homoラットの各組織におけるTxn1蛋白質は発現量に大きな差がないことが明らかになった。このことより、変異型Txn1蛋白質も分解されることなく安定に発現していると考えられた。【００２７】
（実験例２）Txn1遺伝子組換え蛋白質を用いたTxn1活性測定
本実験例では、実施例１で作製したHomoラット、および、WTラットのTxn1遺伝子cDNAを用いてTxn1組換え蛋白質を作成し、Txn1活性の測定を行なった。WT、および、Homoラットの組織からRNAを抽出後、RT-PCRにて正常型(WT)、および、変異型(F54L)のcDNAを作成し、FLAG-tagを持つpCMV-Tag2Bベクターに挿入した。また、Txn1の活性中心である35番目のシステインをセリンに変異させた変異型C35Sを作成しpCMV-Tag2Bベクターに導入した。作成したプラスミドは全てシークエンス解析により配列を確認した。各ベクター（WT、F54L、C35S、 Empty vector)をヒト正常培養細胞HEK293に導入し遺伝子発現させた後、抗FLAG 抗体 ビーズ(Sigma；ANTI-FLAG M2 Agarose Affinity Gel、A2220）を用いて、FLAG融合型チオレドキシン蛋白を精製した。蛋白濃度を定量し、抗Txn1抗体(Cell Signaling Technology, #2298)、抗FLAG抗体(Sigma, F3165)を用いたウエスタンブロットにて各蛋白量を比較確認した後、     Thioredoxin Activity Assay Kit (Redoxica, TR-7011K)と微量分光光度計(DeNovix社、 DS-11+)を用いてTxn1の活性測定を行なった。【００２８】
図4Aに抗Txn1抗体、抗FLAG抗体を用いたウエスタンブロットの結果を示している。図4Bは、Txn1が基質タンパク質のジスルフィド結合を還元するために消費されるNADPHの減少を示す図である。図4Cは、Txn1蛋白の単位時間あたりのNADPHの消費量を示した図である。変異型F54Lは正常型WTに比べて、26.9％〜53.9％に単位時間あたりのNADPHの消費量が低下(350pgで53.9%へ低下、2400pgで26.9%へ低下）していることが明らかになった。変異型C35Sは2.55％〜7.45％に低下していた。図4Dは、F54L変異型の抽出蛋白を正常型WTと混合してもF54Lに活性阻害がなく、F54L変異型がドミナントネガティブ効果を持たないことを示している。【００２９】
（実験例３）Txn1遺伝子改変ラットにおけるTxn1活性測定
本実験例では、実施例１で作製したHomo、Hetero、および、野生型WTラットの組織より蛋白質を抽出し、Txn1の活性測定を行なった。 生後４ヶ月のHomo、Hetero、WTの組織を摘出後、液体窒素で凍結し、超低温冷凍庫に保管した。Lysis Bufferを用いて腎臓組織から蛋白を抽出し超音波処理を行った後、冷却遠心機にて沈殿物を除去し蛋白濃度を定量した。抗Txn1抗体(Cell Signaling Technology, #2298)を用いたウエスタンブロットにて蛋白量を確認した後、Thioredoxin Activity Assay Kit (Redoxica, TR-7011K)と微量分光光度計(DeNovix社、 DS-11+)を用いてTxn1の活性測定を行なった。【００３０】
図5Aは抗Txn1抗体を用いたウエスタンブロットの結果を示している。WT、Hetero、Homoラットの組織抽出蛋白の濃度がほぼ同一であることがわかる。図5Bは、Txn1が基質タンパク質のジスルフィド結合を還元するために消費されるNADPHの減少を示す図である。図5Cは抽出蛋白50μg、および、100μgを用いて測定したTxn1の単位時間あたりのNADPHの消費量を示す図である。HeteroおよびHomoラットのTxn1の単位時間あたりのNADPHの消費量はWTラットより低いことを示している。WTに比しHomoで30.6％〜32.2％に活性低下 (50μg で32.2%へ低下、100μg で30.6%へ低下)が認められる。図5DはWT抽出蛋白50μg(WT)、Homo抽出蛋白50μg(Homo)、および、WT抽出蛋白50μgとHomo抽出蛋白50μgの混合溶液(WT+Homo)を用いて測定したTxn1活性の結果を示している。Homo抽出蛋白をWT抽出蛋白と混合しても活性阻害がなく、F54L変異型がドミナントネガティブ効果を持たないことが明らかになった。【００３１】
（実験例４）Txn1遺伝子改変ラットの寿命
本実験例では、実施例１で作製したHomo、Hetero、および、野生型WTラットについて、寿命を確認した。WTの寿命が2〜3年であるのに比べ、Homoは生後約3-4ヶ月で死亡し、Heteroは9ヶ月頃から死亡する傾向が認められ、Txn1遺伝子改変ラットは寿命が短いこと、また性差があり雄のTxn1遺伝子改変ラットは雌よりも寿命が短いことが確認された（図６）。これにより、当該Txn1遺伝子改変ラットは老化および腎臓病、心血管疾患、高血圧、大動脈解離、慢性閉塞性肺疾患、年齢依存性てんかん、脂質代謝異常、貧血、骨粗鬆症、免疫異常の疾患の性差の研究に有用な動物モデルとして利用可能であると考えられた。【００３２】
（実験例５）Txn1遺伝子改変ラットの体重と全身健康状態の変化
本実験例では、実施例１で作製したHomo、Hetero、および、野生型WTラットの体重を0-12ヶ月までの月齢を追って測定し、健康状態を観察した。図7Aは雄の体重変化を、図7Bは雌の体重変化を示したグラフである。ホモで３ヶ月以降、ヘテロで11ヶ月以降に体重減少が認められる。図7Cに生後４ヶ月時の外見と肉眼的臓器所見を示す。ホモでは顕著なやせ、脊椎変形、脱毛、内臓脂肪の著減、胸腺退縮が認められる。図7Dに生後11ヶ月時の外見と肉眼的臓器所見を示す。ヘテロでは顕著なやせ、脊椎変形、脱毛、内臓脂肪の著減、胸腺退縮が認められる。【００３３】
（実験例６）Txn1遺伝子改変ラットにおける進行性腎機能障害
本実験例では、実施例１で作製したHomo、Hetero、および、野生型WTラットにおける進行性腎機能障害、高コレステロール血症、貧血の病態について確認した。0-12ヶ月までの月齢を追って血液および尿を採取し、生化学検査を行った。図８のAは血清アルブミン、Bは血中尿素窒素（Blood Urea Nitrogen；Bun）、Cは総コレステロール（Total Cholesterol; T-Cho）、Dはヘモグロビン（Hb）、Eは尿中アルブミン量(Urinary Albumin)、Fは尿潜血、Gは血糖値（Glucose, Glu）、Hは白血球数の月齢推移を示している。Homoは生後３ヶ月で尿中アルブミンとBunが高値となり、末期腎不全にて3-4ヶ月で死亡し、Heteroは７ヶ月頃から尿中アルブミンとBunが上昇し、約１年で末期腎不全となり死亡した。【００３４】
生後１ヶ月、３ヶ月のWT、Hetero、Homoラット、および、生後10-12ヶ月のWT、Heteroラットの腎臓を摘出し、病理組織学的解析を行った。図９は腎臓の切片をMasson trichrome染色した写真である。腎臓の線維化の進行を示している。図１０は腎臓の切片をPeriodic Acid-Schiff (PAS)染色した写真である。Txn1遺伝子改変ラットにおける糸球体病変、尿細管病変を示している。すなわち、糸球体の硬化、管内および管外細胞増殖、メサンギウム細胞増多、尿細管萎縮、尿細管拡張、尿細管壊死、間質線維化が認められる。【００３５】
末期腎不全による透析患者は世界的に増加しており、医療経済上の大きな問題である。わが国の透析患者数は2011年には約30万人（全国民450人に１人）で、その原因は種々であるが、末期腎不全の予備軍である慢性腎臓病（CKD）患者数はわが国の成人の12.9％で、1330万人（成人の8人に1人）が治療介入の必要なCKD患者と推定されている。全世界でCKDは患者数５億人と言われている。CKDの背景因子は糖尿病、高血圧などの生活習慣病が多く、社会の高齢化の影響もあり、今後10年間さらに患者が増えると見込まれている。当該Txn1遺伝子改変ラットは腎機能低下の進行が速いため、短期間で治療薬の効果判定ができる点、特に臨床上問題となる生命予後の延長の評価ができる点において、本Txn1遺伝子改変ラットは優れた慢性腎臓病モデルラットとして利用可能である。実験誘発性の腎臓病モデルは多数あるが本発明は遺伝性の慢性腎臓病モデルであり、他の腎臓病モデルとは異なり事前に動物に処置を施すことなく自然発症により症状が出る点、他の腎臓病モデルが特定の症状しか呈しないのに比し本慢性腎臓病モデルラットは多くの腎臓病関連合併症を呈する点に優位性がある。本発明ラット、本発明ラットから単離される細胞、およびチオレドキシンの単位時間あたりのNADPH消費を正常の10％〜90％に低下させた細胞は、病態の機序解明研究のみならず、病態を反映したバイオマーカーの探索、治療剤のスクリーニングや薬剤の効能解析に利用可能と考えられる。【００３６】
（実験例７）Txn1遺伝子改変ラットにおける心疾患
本実験例では、実施例１で作製したHomo、Hetero、および、野生型WTラットにおける心疾患の病態について確認した。【００３７】
図１１はWT、Hetero、Homoラットにおける循環器疾患を示している。左のグラフは血圧測定データと心拍数のデータである。Homoは生後３ヶ月で血圧が高値になり、Heteroラットでは７ヶ月頃から血圧が高値になる。中央には、生後11ヶ月のWT、Hetero、および、生後３ヶ月のHomoの大血管の切断面を示している。大血管の中膜の断裂、石灰化および、線維の不整が観察される。右には生後９ヶ月のWTとHeteroから摘出した心臓と、心室レベルでの断割面の組織切片を示した。HeteroやHomoで線維化、炎症細胞浸潤、心筋拡張が観察された。【００３８】
（実験例８）Txn1遺伝子改変ラットにおける慢性閉塞性肺疾患
本実験例では、実施例１で作製したHomo、Hetero、および、野生型WTにおける慢性閉塞性肺疾患の病変について確認した。【００３９】
図１２には、Homo、Hetero、および、WTの肺の組織切片を示した。WTに比べて、Hetero、Homoでは、気腫性の変化が見られた。すなわち、Txn1遺伝子改変ラットでは、細気管支壁のリンパ球浸潤、肺胞腔の融合・拡張を認めた。【００４０】
（実験例９）Txn1遺伝子改変ラットにおける胸腺萎縮
本実験例では、実施例１で作製したHomo、Hetero、および、野生型WTにおける胸腺萎縮について確認した。胸腺はT細胞の分化、成熟など免疫系に関与する一次リンパ器官であり、胸小葉とよばれる二葉からなる。成熟した胸腺において外側の部分である皮質には未熟なリンパ球が存在し、内側の髄質はリンパ球のほかにマクロファージや樹状細胞といった抗原提示の細胞などが認められる。【００４１】
図１３には、Homo、Hetero、および、WTの胸腺の組織切片を示した。WTでは胸腺全体が染色されるのに比べて、生後３ヶ月のHomo、10-12ヶ月のHeteroでは脂肪化と萎縮が進み、胸腺組織を示すのはほんの一部だけであった。胸腺は加齢とともに脂肪化が始まり、萎縮が進むといわれており、WTに比べてHomo、Heteroで早期に萎縮が起きることが認められた。【００４２】
（実験例１０）Txn1遺伝子改変ラットにおける卵巣萎縮
本実験例では、実施例１で作製したHomo、および、野生型WTにおける卵巣萎縮について確認した。WTに比べて、Homoラットでは卵巣萎縮、成熟卵胞の減少が観察された（図１４）。【００４３】
（実験例１１）Txn1遺伝子改変ラットにおける骨・ミネラル代謝の解析
本実験例では、実施例１で作製したHomo、Hetero、および、野生型WTラットについて0-12ヶ月までの月齢を追って採血し、カルシウム、無機リン、アルカリホスファターゼについて生化学検査を行った。また、Homo、Hetero、および、WTについて月齢4ヶ月でコンピュータ断層撮影（Computed Tomography：CT）を行った。【００４４】
図１５のAはカルシウム、Bは無機リン、Cはアルカリホスファターゼの月齢推移を示している。その結果、Homoでは３ヶ月頃、Heteroでは１１ヶ月頃からまた無機リンの上昇（高リン血症）が観察された。３ヶ月のHomoでアルカリホスファターゼの低下が観察された。図１５Dの左に全体像を、右側に腹部の断面像を示している。HomoはWTに比べ、やせ細って筋肉が弱り、体幹および下肢骨格筋の容量の減少が観察された。【００４５】
（実験例１２）Txn1遺伝子改変ラットにおけるてんかん発作
本実験例では、実施例１で作製したHomo、Hetero、および、野生型WTラットにおけるてんかん発作について確認した。てんかん発作は生後4-5週齢に集中して出現し、６週齢以降、てんかん発作は徐々に減少して消失した。より詳しくは、年齢依存的に変容を示すてんかん発作について確認した。【００４６】
Txn1遺伝子改変ラットは４週齢から疾走する部分発作と繰り返し飛び跳ねる発作および全身強直発作が出現した。（図１６A）は、4-5週齢のHeteroの発作時のビデオ脳波同時記録を示したものである。20秒毎に一瞬体がビクッとなって飛び上がる発作を繰り返し、脳波上はてんかん発作に一致した速波と低電圧化を認め、ヒトにおけるウエスト症候群のシリーズ形成性てんかん性スパズムに類似の発作を認めた。また、一瞬の飛び跳ね発作時には全般性多棘波が出現しており、ミオクロニー様発作（図１６B）が認められた。さらに、棘徐波複合を伴う欠神様発作が確認された（図１６C）。【００４７】
（実験例１３）遺伝子改変ラットにおける脳病理解析
Txn1遺伝子改変ラットのてんかん発作が観察される前の生後３週齢から、４週齢、５週齢、７週齢の脳病変をHE染色で病理検査を行った。ヘテロで３週齢から５週齢において脳の下丘、視床、視床下部に空胞変性を認めた（図17B）。この所見は、Homoでも認められ、より病変部位が広かった。（図17C）に下丘の空胞変性の拡大写真をしめす。この変性は、生後７週齢では治癒した（図17Aと図17B）。【００４８】
年齢依存性てんかんは、小児期に認められるてんかん症候群である。脳の発達に伴って病型が変化する特徴があり、特定の年齢で発症と病型の年齢依存性変化が認められる。この齢依存性変化には、自然に治癒することも含まれる。年齢依存性てんかんには、ウエスト症候群、レノックス・ガストー症候群、Doose症候群、小児欠神てんかん、中心・側頭部に棘波をもつ良性小児てんかん等が該当する。【００４９】
近年、遺伝子解析により、様々な年齢依存性てんかんの原因遺伝子が同定されている。それに伴い世界各国のてんかん研究施設でモデル動物作製が試みられているが、遺伝子改変マウス・ラットでは年齢依存性てんかんの病態や病変を反映するモデル動物が存在しない。Txn1遺伝子改変ラットは優れた年齢依存性てんかんモデルラットとして利用可能と考えられる。本発明ラット、本発明ラットから単離される神経細胞、およびチオレドキシンの単位時間あたりのNADPH消費を正常の10％〜90％に低下させた細胞は、病態の機序解明研究のみならず、発症予防法、治療剤のスクリーニングや薬剤の効能解析に利用可能と考えられる。【００５０】
（実験例１４）Txn1遺伝子改変マウスの作製
CRISPR/Cas9システムを用いてTxn1遺伝子改変マウスを作成した。まず、マウスTxn1遺伝子の第54番目のコドン近辺の配列を含むガイドRNAを作成し、Cas9蛋白、および、54番目コドンの変異型配列を持つ１本鎖DNA断片（サイレント変異２箇所を含む）と共にC57BL/6J マウスの受精卵に導入した。導入した受精卵136個を仮母親の子宮に移植した。出生した仔マウスF0は９匹であったが５匹が死亡した。残り４匹（F0-#1、F0-#2、F0-#3、F0-#4）の尻尾先端を切除し、得られたDNAを用いて、Txn1遺伝子第54番目のコドンを含む363塩基をPCRで増幅しシークエンス解析を行った。上記の遺伝子改変マウスF0をC57BL/6J野生型マウスと交配を行い、産仔マウスF1を得た。【００５１】
図１８上段は、F0-#3マウス（ホモ接合体の遺伝子改変マウス；雌）と、その産仔F1マウス４匹（ヘテロ接合体の遺伝子改変マウス；雄３匹、雌１匹）の写真図である。図１８下段は、Txn1遺伝子改変マウスF0-#3のTxn1遺伝子をシークエンス解析した図である。Txn1遺伝子の第54番目のコドンTTCがCTCへ変化しており、その結果第54番目のアミノ酸がフェニルアラニン（F）からロイシン（L）に置換していることが確認された。【００５２】
以上詳述したように、本発明のチオレドキシンをコードする遺伝子が改変された非ヒトモデル動物は、酸化ストレスが深く関わる疾患研究動物として、特に、老化、腎臓病、心血管疾患、慢性閉塞性肺疾患、年齢依存性てんかん、脂質代謝異常、貧血、骨粗鬆症、免疫異常などのモデル動物として有用である。また、健康食品や栄養食品の有効性評価にも有用である。【００５３】
本発明のチオレドキシンをコードする遺伝子が改変された非ヒトモデル動物は、前述の複数の疾患が出現するため、複数の臓器疾患の連関の病態解析に有用である。例えば、心腎連関、心肺連関、腎脳連関などである。また、医薬品、健康食品などが、併存する複数の疾患に及ぼす影響を評価するのに有用である。例えば、心臓疾患に対する医薬品等が、併存する腎臓疾患や肺疾患にどのように影響・効果を及ぼすか、腎臓疾患に対する医薬品等が、併存する心臓疾患や脳疾患にどのように影響・効果を及ぼすか等、人の多臓器疾患患者への医薬品開発、健康食品開発等に有用である。【００５４】
本発明のチオレドキシンをコードする遺伝子が改変された非ヒトモデル動物は、各臓器や胎児繊維芽細胞等の初代培養細胞およびその株化細胞や幹細胞、本発明の非ヒトモデル動物由来のiPS細胞を提供することができる。それぞれの細胞は、老化、腎臓病、心血管疾患、慢性閉塞性肺疾患、年齢依存性てんかん、脂質代謝異常、貧血、骨粗鬆症などの研究や治療剤のスクリーニング等に、応用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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