(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗酸化剤と遺伝子を対象に共送達するための複合体であって、抗酸化剤と遺伝子の共送達が可能なキャリア、抗酸化剤、およびプラスミドＤＮＡを含み、
ここで、抗酸化剤と遺伝子の共送達が可能なキャリアが、リポソームまたは脂質コートされた生分解性ポリマーであり、
抗酸化剤と遺伝子の共送達が可能なキャリアがリポソームである場合、抗酸化剤を含むリポソーム粒子の表面にプラスミドＤＮＡが付着しており、
抗酸化剤と遺伝子の共送達が可能なキャリアが脂質コートされた生分解性ポリマーである場合は、抗酸化剤と生分解性ポリマーを混合した粒子を脂質コートしたものの表面にプラスミドＤＮＡが付着している、
前記複合体。
【請求項２】
リポソームがカチオン性リポソームであり、当該カチオン性リポソームは、以下：
ジドデシルジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；
Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）；
１，２−ジオレオイルオキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；
１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）；
ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）；
ジオクタデシル−ジメチル−アンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；
１，２−ジミリストイルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）；
２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミウム  トリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）；
３β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチル−アミノエタン−カルバモイル−コレステロール）（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）；および
Ｏ，Ｏ’−ジテトラデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミン  クロリド；
からなる群より選択される少なくとも１つのカチオン性脂質、および以下：
ジアシルホスファチジルコリン；
リゾホスファチジルコリン；
ジアシルホスファチジルグリセロール；
ジアシルホスファチジン酸；
ジアシルホスファチジルセリン；
ジアシルホスファチジルエタノールアミン；
スフィンゴミエリン；
セラミド；
ジアシルグリセロール；および
コレステロール；
からなる群より選択される少なくとも１つの非カチオン性脂質（ここで非カチオン性脂質に含まれるアシル基は、炭素数が１２〜２０の飽和または不飽和アシル基である）、により構成される、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
脂質コートされた生分解性ポリマーが、カチオン性脂質でコートされた生分解性ポリマーであり、ここで当該カチオン性脂質は、以下：
ジドデシルジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；
Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）；
１，２−ジオレオイルオキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；
１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）；
ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）；
ジオクタデシル−ジメチル−アンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；
１，２−ジミリストイルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）；
２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミウム  トリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）；
３β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチル−アミノエタン−カルバモイル−コレステロール）（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）；および
Ｏ，Ｏ’−ジテトラデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミン  クロリド；
からなる群より選択され、
そしてここで当該生分解性ポリマーは、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）共重合体、ポリカプロラクトン、ポリジオキサノン、およびキトサン、からなる群より選択される、
請求項１に記載の複合体。
【請求項４】
抗酸化剤が、ポルフィリン系抗酸化剤、フタロシアニン系抗酸化剤、アスコルビン酸、グルタチオン、尿酸、メラトニン、ウロビリノーゲン、トコフェロール類、トコトリエノール類、カロテノイド、キサントフィル類、ポリフェノール、フラボノイド類、からなる群より選択される、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項５】
抗酸化剤がポルフィリン系抗酸化剤であり、当該ポルフィリン系抗酸化剤は、
下記式（Ｉ）で表されるカチオン性金属ポルフィリン錯体：
【化１】
0006731730.tif 000012
（式中、
Ｍは錯体を形成するための金属原子を示し、
Ａｒ１、Ａｒ２、Ａｒ３、およびＡｒ４、はそれぞれ独立して無置換のまたは置換基を有してもよい炭素環式または複素環式芳香族基を示し、そしてＡｒ１、Ａｒ２、Ａｒ３、およびＡｒ４、の少なくとも１つはカチオン性の基を有する芳香族基である）；
である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項６】
抗酸化剤がポルフィリン系抗酸化剤であり、当該ポルフィリン系抗酸化剤は、
下記式（ＩＩ）で表されるカチオン性金属ポルフィリンダイマー：
【化２】
0006731730.tif 000013
（式中、
Ｍは錯体を形成するための金属原子を示し、
Ａｒ１およびＡｒ１’はピリジンを示し、ここでピリジンの１位はＸに、４位がポルフィリンにそれぞれ結合しており、
Ａｒ２、Ａｒ３、およびＡｒ４、並びに、Ａｒ２’、Ａｒ３’、およびＡｒ４’、はそれぞれ独立して無置換のまたは置換基を有してもよい炭素環式または複素環式芳香族基を示し、
Ｘは、−ＣＨ２−フェニル−ＣＨ２−であるか、下記式（ＩＩＩ）ないし（Ｖ）のいずれかで表される：
−Ｃ２Ｈ４−（ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２）ａ−  ・・・・  （ＩＩＩ）
（式中、ａは、１〜１０の整数を示す）
−Ｃ２Ｈ４−（ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｂ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−  ・・・  （ＩＶ）
−Ｃ３Ｈ６−（ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｂ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−  ・・・（Ｖ）
（式中、ｂは３〜５の整数を示す））
である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項７】
プラスミドＤＮＡが、以下：
エピジェネティクスの制御に関わる酵素またはタンパク質をコードするＤＮＡ；
エピジェネティクスの制御に関わる酵素またはタンパク質の発現を抑制するアンチセンス核酸または二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ；
エピジェネティクスの制御に関わる酵素またはタンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ；
からなる群より選択されるＤＮＡを含む、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項に記載の複合体を含む、医薬組成物。
【請求項９】
ＣＯＰＤを治療するための医薬組成物であって、抗酸化剤と遺伝子の共送達が可能なキャリア、抗酸化剤、およびプラスミドＤＮＡで構成される複合体を含み、
ここで、抗酸化剤と遺伝子の共送達が可能なキャリアが、リポソームまたは脂質コートされた生分解性ポリマーであり、
抗酸化剤と遺伝子の共送達が可能なキャリアがリポソームである場合、抗酸化剤を含むリポソームに対してプラスミドＤＮＡが複合化されており、
抗酸化剤と遺伝子の共送達が可能なキャリアが脂質コートされた生分解性ポリマーである場合は、抗酸化剤と生分解性ポリマーを混合した粒子を脂質コートしたものに対してプラスミドＤＮＡが複合化されており、
ここで、抗酸化剤は下記式（ＩＩ）で表されるカチオン性金属ポルフィリンダイマー：
【化３】
0006731730.tif 000014
（式中、
Ｍは錯体を形成するための金属原子を示し、
Ａｒ１およびＡｒ１’はピリジンを示し、ここでピリジンの１位はＸに、４位がポルフィリンにそれぞれ結合しており、
Ａｒ２、Ａｒ３、およびＡｒ４、並びに、Ａｒ２’、Ａｒ３’、およびＡｒ４’、はそれぞれ独立して無置換のまたは置換基を有してもよい炭素環式または複素環式芳香族基を示し、
Ｘは、−ＣＨ２−フェニル−ＣＨ２−であるか、下記式（ＩＩＩ）ないし（Ｖ）のいずれかで表される：
−Ｃ２Ｈ４−（ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２）ａ−  ・・・・  （ＩＩＩ）
（式中、ａは、１〜１０の整数を示す）
−Ｃ２Ｈ４−（ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｂ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−  ・・・  （ＩＶ）
−Ｃ３Ｈ６−（ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｂ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−  ・・・（Ｖ）
（式中、ｂは３〜５の整数を示す））
からなる群より選択されるポルフィリン系抗酸化剤であり、
プラスミドＤＮＡはヒストン脱アセチル化酵素２（ＨＤＡＣ２）をコードするプラスミドＤＮＡである、
前記医薬組成物。
【請求項１０】
ＣＯＰＤを治療するための医薬組成物であって、抗酸化剤と遺伝子の共送達が可能なキャリア、抗酸化剤、およびプラスミドＤＮＡで構成される複合体を含み、
ここで、抗酸化剤と遺伝子の共送達が可能なキャリアが、ジドデシルジメチルアンモニウムブロマイド（ＤＤＡＢ）およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）で構成されるリポソームであり、
抗酸化剤が下記式（ＶＩ）：
【化４】
0006731730.tif 000015
で表されるカチオン性Ｍｎポルフィリンダイマーであり、そして
プラスミドＤＮＡが、ＨＤＡＣ２をコードするプラスミドＤＮＡである、
前記医薬組成物。
【請求項１１】
ＣＯＰＤを治療するための医薬組成物であって、抗酸化剤と遺伝子の共送達が可能なキャリア、抗酸化剤、およびプラスミドＤＮＡで構成される複合体を含み、
ここで、抗酸化剤と遺伝子の共送達が可能なキャリアが、１，２−ジオレオイルオキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）でコートされたポリ乳酸粒子であり、
抗酸化剤が下記式（ＶＩ）：
【化５】
0006731730.tif 000016
で表されるカチオン性Ｍｎポルフィリンダイマーであり、当該抗酸化剤はポリ乳酸粒子中に存在し、
プラスミドＤＮＡが、ＨＤＡＣ２をコードするプラスミドＤＮＡであり、当該プラスミドＤＮＡは、脂質でコートされたポリ乳酸粒子の表面に付着している、
前記医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、抗酸化剤と遺伝子を対象に共送達するための複合体に関する。当該複合体は、抗酸化剤と遺伝子の共送達が可能なキャリア、抗酸化剤、およびプラスミドＤＮＡを含む。本出願はまた、抗酸化剤と遺伝子の共送達が可能な複合化剤に関する。本出願はさらに、当該複合体を含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
１９６０年代以降、ヒストンのアセチル化と緊密なクロマチン構造のリモデリングが、遺伝子誘導と関係していることが認識されてきたが、遺伝子が転写因子とヒストンアセチル化によって転写活性化される分子機序がよく理解されるようになったのは、つい最近のことである。遺伝子発現制御にはクロマチン構造の変化が重要であり、このようにクロマチンの構造変化により遺伝子発現の制御を行う機構はエピジェネティクス機構と呼ばれている。クロマチン構造は前述したヒストンアセチル化やＤＮＡ／ヒストンのメチル化などの後天的な化学修飾により変化し、この後天的修飾は様々な要因で起こり得るものである。
【０００３】
また、近年ではエピジェネティクな異常が疾患の発症、病理の悪化に関係することが報告されており、疾患治療においてはエピジェネティクな異常を正常化することを考慮に入れる必要がある。
【０００４】
一方、活性酸素種（ＲＯＳ）は生体活動に必須なエネルギー代謝を行うミトコンドリアにおいて消費される酸素の０．４〜４％から産生される。ＲＯＳにはスーパーオキシド（Ｏ２・−）や、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、ペルオキシ亜硝酸イオン（ＯＮＯＯ−）、そして非常に反応性の高いヒドロキラジカル（・ＯＨ）などが含まれ、これらのＲＯＳは、生体防御や細胞内シグナル伝達などに利用されており、生体内において重要な役割を担っているが、その一方では高い反応性によりＤＮＡや脂質等の生体分子を酸化変性させ、様々な細胞障害を誘発させる原因となることが知られている。このように生体機能におけるＲＯＳは「両刃の刃」となっており、通常は、役割を終えたＲＯＳは、生体内に存在するＲＯＳを消去する抗酸化物質により速やかに還元消去される。しかしながら、過剰に生成したＲＯＳが生体恒常性を損なうとき、ＲＯＳは臓器レベルの障害を誘発し、動脈硬化・腎不全などの重篤な疾患を惹起する。
【０００５】
このように前述したエピジェネティクスと活性酸素種（ＲＯＳ）はそれぞれ病理に関わっていることは明白であるが、近年ではこの２つが相互に関わっていることが報告され始めており、抗酸化とエピジェネティクな異常の改善を同時に行うことの有用性が示唆されている。
【０００６】
例えば、アルツハイマー病の原因の１つと考えられているアミロイドベータ（Ａβ）は過酸化水素による酸化架橋により凝集し、病理進行に関わっていることが知られている。同時に過酸化水素がＡβの前駆体の産生を担う遺伝子のプロモーター領域の低メチル化に寄与することでＡβの産生増加が引き起こされることも報告されている。また、過剰な過酸化水素にさらされたヒト大腸がん細胞ＳＮＵ−４０７において、がん抑制遺伝子であるRunt domain transcription factor 3（RUNX3）のプロモーター領域のメチル化が増大することによりがん抑制遺伝子がサイレンシングされ、ＲＯＳによる酸化傷害とともにエピジェネティクな機構を介して、大腸がんの進行に関わっている。そして慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）においては、ＯＮＯＯ−がヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ２）を直接ニトロ化、あるいはＨ２Ｏ２などのＲＯＳがＰＩ３ｋσ−Ａｋｔ過程を介して、ユビキチン化やリン酸化などの後天的修飾を与えることでプロテアソーム分解を促進させる。これによりＨＤＡＣ２の発現および活性が低下し、結果、炎症性遺伝子の発現が増加し、慢性的な炎症反応となる（非特許文献１、２）。
【０００７】
このようにＲＯＳが直接的に酸化傷害を与えることで発病させるだけでなく、エピジェネティクな異常を引き起こすことで疾患をより促進させることが判明してきている。双方が影響し合って疾患を引き起こしているため、片方のみの治療では再度疾患に状態に陥ってしまう可能性が高く、ＲＯＳによる酸化傷害とエピジェネティクな異常を同時に治療することが根治治療には重要であると考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Malhotra, D., et al., J. Clin. Invest., 121(11):4289-4302, 2011
【非特許文献２】P. J. Barnes, et al., Eur. Respir. J., 25:552-563, 2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述のように、活性酸素種（ＲＯＳ）による酸化傷害とエピジェネティクな異常を同時に治療することを可能にするための、新しい治療法の開発が求められている。
【００１０】
例えば、炎症性疾患は、炎症性遺伝子の過剰発現による炎症性サイトカインの異常産生、慢性的な炎症反応による組織の破壊が導かれる難治疾患である。中でも、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は罹患者数が２億１０００万人と推計されており、がん、心筋梗塞、脳卒中に次ぐ世界４大成人病の一つである。ＣＯＰＤ以外の疾患群については予防・治療が進歩し、死亡率を過去四半世紀で半減させているのに対し、ＣＯＰＤの死亡率は一度も減ることがなく、ひたすら増え続けている。ＣＯＰＤは、喫煙が主な発症機序であるが、大気汚染も影響を与えていると考えられ、今後も患者は増え続ける可能性が極めて高い。日本での推定患者数は７００万人ともいわれているが、実際に治療を受けている患者は５０万人程度であり、患者数の増加は確実に起こる。２０３０年には死亡原因の第３位に浮上することが懸念されている。現在、ＣＯＰＤの根治療法はなく、禁煙、酸素療法、ステロイド投与等の対処療法で進行を防いでいる状態である。さらに、超高齢化が進む日本では、ＣＯＰＤ患者は加速度的に増えることが予想されており、新しい治療法の開発が急務とされている。
【００１１】
本出願は、エピジェネティクスに基づく病理メカニズムを有する疾患に対して、活性酸素種の除去、及び、エピジェネティクな異常の改善、すなわちエピジェネティクス制御に関わる酵素またはタンパク質の発現異常の改善、を同時に行うことが可能な剤を提供する。本出願は、抗酸化剤と遺伝子を対象に共送達するための複合体を提供する。当該複合体は、抗酸化剤と遺伝子の共送達が可能なキャリア、抗酸化剤、およびプラスミドＤＮＡを含む。プラスミドＤＮＡは、エピジェネティクスの制御に関わる酵素またはタンパク質をコードするＤＮＡ、または当該酵素またはタンパク質の発現または活性を抑制する分子をコードするＤＮＡを含むものであってもよい。本出願はまた、当該複合体を含む医薬組成物を提供する。本出願はさらに、抗酸化剤と遺伝子の共送達が可能な複合化剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために、エピジェネティクスと活性酸素種が病理に関わる疾患の治療戦略について慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）をモデルとして鋭意研究を行った。ＣＯＰＤの病理メカニズムとして、活性酸素種によるヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ２）の機能不全というエピジェネティクス異常が提唱されている。このことから、本発明者らはＣＯＰＤの治療のために、活性酸素種消去によるＨＤＡＣ２の後天的修飾の抑制およびＨＤＡＣ２の発現量の回復という２種類のターゲットを同時に治療する戦略について検討した。そのために、活性酸素種消去のための抗酸化剤、ＨＤＡＣ２の発現量回復のためのＨＤＡＣ２をコードするプラスミドＤＮＡ、および当該抗酸化剤とプラスミドの共送達が可能なキャリア、を含む複合体を用いたところ、ＣＯＰＤモデルにおいて優れた抗炎症効果およびステロイド不応性の改善が観察された。当該知見に基づいて、本発明は完成された。
【００１３】
すなわち、一態様において、本発明は以下のとおりであってよい。
［態様１］
抗酸化剤と遺伝子を対象に共送達するための複合体であって、抗酸化剤と遺伝子の共送達が可能なキャリア、抗酸化剤、およびプラスミドＤＮＡを含む、前記複合体。
［態様２］
抗酸化剤と遺伝子の共送達が可能なキャリアが、リポソーム、生分解性ポリマーまたは脂質コートされた生分解性ポリマーである、態様１に記載の複合体。
［態様３］
リポソームがカチオン性リポソームであり、当該カチオン性リポソームは、以下：
ジドデシルジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；
Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）；
１，２−ジオレオイルオキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；
１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）；
ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）；
ジオクタデシル−ジメチル−アンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；
１，２−ジミリストイルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）；
２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミウム  トリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）；
３β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチル−アミノエタン−カルバモイル−コレステロール）（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）；および
Ｏ，Ｏ’−ジテトラデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミン  クロリド；
からなる群より選択される少なくとも１つのカチオン性脂質、および以下：
ジアシルホスファチジルコリン；
リゾホスファチジルコリン；
ジアシルホスファチジルグリセロール；
ジアシルホスファチジン酸；
ジアシルホスファチジルセリン；
ジアシルホスファチジルエタノールアミン；
スフィンゴミエリン；
セラミド；
ジアシルグリセロール；および
コレステロール；
からなる群より選択される少なくとも１つの非カチオン性脂質（ここで非カチオン性脂質に含まれるアシル基は、炭素数が１２〜２０の飽和または不飽和アシル基である）、により構成される、態様２に記載の複合体。
［態様４］
生分解性ポリマーが、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）共重合体、ポリカプロラクトン、ポリジオキサノン、およびキトサン、からなる群より選択される、態様２に記載の複合体。
［態様５］
脂質コートされた生分解性ポリマーが、カチオン性脂質でコートされた生分解性ポリマーであり、ここで当該カチオン性脂質は、以下：
ジドデシルジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；
Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）；
１，２−ジオレオイルオキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；
１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）；
ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）；
ジオクタデシル−ジメチル−アンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；
１，２−ジミリストイルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）；
２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミウム  トリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）；
３β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチル−アミノエタン−カルバモイル−コレステロール）（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）；および
Ｏ，Ｏ’−ジテトラデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミン  クロリド；
からなる群より選択され、
そしてここで当該生分解性ポリマーは、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）共重合体、ポリカプロラクトン、ポリジオキサノン、およびキトサン、からなる群より選択される、
請求項２に記載の複合体。
［態様６］
抗酸化剤が、ポルフィリン系抗酸化剤、フタロシアニン系抗酸化剤、アスコルビン酸、グルタチオン、尿酸、メラトニン、ウロビリノーゲン、トコフェロール類、トコトリエノール類、カロテノイド、キサントフィル類、ポリフェノール、フラボノイド類、からなる群より選択される、態様１ないし５のいずれか１項に記載の複合体。
［態様７］
抗酸化剤がポルフィリン系抗酸化剤であり、当該ポルフィリン系抗酸化剤は、
下記式（Ｉ）で表されるカチオン性金属ポルフィリン錯体：
【００１４】
【化１】
0006731730.tif 000002
【００１５】
（式中、
Ｍは錯体を形成するための金属原子を示し、
Ａｒ１、Ａｒ２、Ａｒ３、およびＡｒ４、はそれぞれ独立して無置換のまたは置換基を有してもよい炭素環式または複素環式芳香族基を示し、そしてＡｒ１、Ａｒ２、Ａｒ３、およびＡｒ４、の少なくとも１つはカチオン性の基を有する芳香族基である）；および
下記式（ＩＩ）で表されるカチオン性金属ポルフィリンダイマー：
【００１６】
【化２】
0006731730.tif 000003
【００１７】
（式中、
Ｍは錯体を形成するための金属原子を示し、
Ａｒ１およびＡｒ１’はピリジンを示し、ここでピリジンの１位はＸに、４位がポルフィリンにそれぞれ結合しており、
Ａｒ２、Ａｒ３、およびＡｒ４、並びに、Ａｒ２’、Ａｒ３’、およびＡｒ４’、はそれぞれ独立して無置換のまたは置換基を有してもよい炭素環式または複素環式芳香族基を示し、
Ｘは、−ＣＨ２−フェニル−ＣＨ２−であるか、下記式（ＩＩＩ）ないし（Ｖ）のいずれかで表される：
−Ｃ２Ｈ４−（ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２）ａ−  ・・・・  （ＩＩＩ）
（式中、ａは、１〜１０の整数を示す）
−Ｃ２Ｈ４−（ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｂ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−  ・・・  （ＩＶ）
−Ｃ３Ｈ６−（ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｂ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−  ・・・（Ｖ）
（式中、ｂは３〜５の整数を示す））
からなる群より選択される、態様１ないし５のいずれか１項に記載の複合体。
［態様８］
プラスミドＤＮＡが、以下：
エピジェネティクスの制御に関わる酵素またはタンパク質をコードするＤＮＡ；
エピジェネティクスの制御に関わる酵素またはタンパク質の発現を抑制するアンチセンス核酸または二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ；
エピジェネティクスの制御に関わる酵素またはタンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ；
からなる群より選択されるＤＮＡを含む、態様１ないし７のいずれか１項に記載の複合体。
［態様９］
態様１ないし８のいずれか１項に記載の複合体を含む、医薬組成物。
［態様１０］
ＣＯＰＤを治療するための医薬組成物であって、態様１ないし８のいずれか１項に記載の複合体を含み、ここでプラスミドＤＮＡはヒストン脱アセチル化酵素２（ＨＤＡＣ２）をコードするプラスミドＤＮＡである、前記医薬組成物。
［態様１１］
ＣＯＰＤを治療するための医薬組成物であって、抗酸化剤と遺伝子の共送達が可能なキャリア、抗酸化剤、およびプラスミドＤＮＡで構成される複合体を含み、
ここで、抗酸化剤と遺伝子の共送達が可能なキャリアが、ジドデシルジメチルアンモニウムブロマイド（ＤＤＡＢ）およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）で構成されるリポソームであり、
抗酸化剤が下記式（ＶＩ）：
【００１８】
【化３】
0006731730.tif 000004
【００１９】
で表されるカチオン性Ｍｎポルフィリンダイマーであり、そして
プラスミドＤＮＡが、ＨＤＡＣ２をコードするプラスミドＤＮＡである、
前記医薬組成物。
［態様１２］
ＣＯＰＤを治療するための医薬組成物であって、抗酸化剤と遺伝子の共送達が可能なキャリア、抗酸化剤、およびプラスミドＤＮＡで構成される複合体を含み、
ここで、抗酸化剤と遺伝子の共送達が可能なキャリアが、１，２−ジオレオイルオキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）でコートされたポリ乳酸粒子であり、
抗酸化剤が下記式（ＶＩ）：
【００２０】
【化３−２】
0006731730.tif 000005
【００２１】
で表されるカチオン性Ｍｎポルフィリンダイマーであり、当該抗酸化剤はポリ乳酸粒子注に存在し、
プラスミドＤＮＡが、ＨＤＡＣ２をコードするプラスミドＤＮＡであり、当該プラスミドＤＮＡは、脂質でコートされたポリ乳酸粒子の表面に付着している、
前記医薬組成物。
［態様１３］
抗酸化剤およびプラスミドＤＮＡを複合化するための複合化剤であって、カチオン性リポソームおよび生分解性ポリマーからなる群より選択され、
ここでカチオン性リポソームは、以下：
ジドデシルジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；
Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）；
１，２−ジオレオイルオキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；
１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）；
ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）；
ジオクタデシル−ジメチル−アンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；
１，２−ジミリストイルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）；
２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミウム  トリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）；
３β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチル−アミノエタン−カルバモイル−コレステロール）（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）；および
Ｏ，Ｏ’−ジテトラデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミン  クロリド；
からなる群より選択される少なくとも１つのカチオン性脂質、および以下：
ジアシルホスファチジルコリン；
リゾホスファチジルコリン；
ジアシルホスファチジルグリセロール；
ジアシルホスファチジン酸；
ジアシルホスファチジルセリン；
ジアシルホスファチジルエタノールアミン；
スフィンゴミエリン；
セラミド；
ジアシルグリセロール；および
コレステロール；
からなる群より選択される少なくとも１つの非カチオン性脂質（ここで非カチオン性脂質に含まれるアシル基は、炭素数が１２〜２０の飽和または不飽和アシル基である）、により構成されるものであり、そして
生分解性ポリマーは、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）共重合体、ポリカプロラクトン、ポリジオキサノン、およびキトサン、からなる群より選択される、
前記複合化剤。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の複合体は、対象において、抗酸化剤による活性酵素種消去と、プラスミドＤＮＡによるエピジェネティクな異常の改善を同時に行うことができるものである。したがって、本発明の複合体は、エピジェネティクスと活性酸素種が病理に関わる疾患に対するエピジェネティクスに基づいた根治治療のために有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、ＣＯＰＤをモデルとした本発明の複合体による２つの治療ターゲットを示す模式図である。（ａ）はＣＯＰＤの病理メカニズムを示す模式図である。（ｂ）は本発明の複合体によるＣＯＰＤ治療のための２つのターゲットを示す模式図である。
【図２】図２は、ＣＯＰＤモデルにおけるＤＮＡ複合化脂質コートＭｎＰＤ含有ＰＬＡナノ粒子の抗炎症効果及びステロイド耐性抑制効果を示すグラフである。＊は、有意差ががることを示す（ｐ＜０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下に本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。
【００２５】
抗酸化剤と遺伝子を対象に共送達するための複合体
一態様において、本出願は、抗酸化剤と遺伝子を対象に共送達するための複合体であって、抗酸化剤と遺伝子の共送達が可能なキャリア、抗酸化剤、およびプラスミドＤＮＡを含む、前記複合体に関する。
【００２６】
抗酸化剤と遺伝子の共送達が可能なキャリア、抗酸化剤、およびプラスミドＤＮＡとしては、以下に詳述するものを用いることができる。
【００２７】
抗酸化剤と遺伝子の共送達が可能なキャリア、抗酸化剤、およびプラスミドＤＮＡで構成されるプラスミドを作製する手順は、これらの成分を含む複合体が形成される限りにおいて特に制限はない。先に任意の二つの成分で複合体を形成した後、残りの一つの成分をさらに追加して複合体を形成してもよい。あるいは、三つの成分すべてを同時に混合して複合体を形成してもよい。複合体を形成する条件は、当業者が適宜選択することができる。
【００２８】
例えば、抗酸化剤と遺伝子の共送達が可能なキャリアがリポソームである場合には、リポソームを構成する脂質と抗酸化剤を先に混合して抗酸化剤を含むリポソームを作製し、次いでプラスミドＤＮＡを複合化させてもよい。
【００２９】
あるいは、抗酸化剤と遺伝子の共送達が可能なキャリアがポリ乳酸である場合には、抗酸化剤とプラスミドを先に混合しておき、そこにポリ乳酸を加えて攪拌することにより複合体を形成してもよい。
【００３０】
抗酸化剤と遺伝子の共送達が可能なキャリアが脂質コートされたポリ乳酸等の生分解性ポリマーである場合は、抗酸化剤と生分解性ポリマーを混合して粒子を形成し、それを脂質でコートした後、さらにプラスミドＤＮＡを複合化させることにより複合体を調製してもよい。
【００３１】
抗酸化剤と遺伝子の共送達が可能なキャリア／抗酸化剤およびプラスミドＤＮＡを複合化するための複合化剤
抗酸化剤と遺伝子の共送達が可能なキャリアは、抗酸化剤と遺伝子の両方を対象に投与する際に保持することができ、そして抗酸化剤と遺伝子の両方を対象の細胞内に送達することができるキャリアであれば特に限定されない。抗酸化剤と遺伝子の共送達が可能なキャリアには、例えば、リポソーム、生分解性ポリマーまたは脂質コートされた生分解性ポリマーが含まれる。
【００３２】
抗酸化剤と遺伝子の共送達が可能なキャリアとして用いられるリポソームは、好ましくはカチオン性リポソームである。カチオン性リポソームは、少なくとも１つのカチオン性脂質により構成されるものであってもよい。あるいは、カチオン性リポソームは、少なくとも１つのカチオン性脂質と少なくとも１つの非カチオン性脂質により構成されるものであってもよい。
【００３３】
カチオン性リポソームを構成するカチオン性脂質は、特に限定されないが、以下：
ジドデシルジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；
Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）；
１，２−ジオレオイルオキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；
１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）；
ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）；
ジオクタデシル−ジメチル−アンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；
１，２−ジミリストイルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）；
２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミウム  トリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）；
３β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチル−アミノエタン−カルバモイル−コレステロール）（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）；および
Ｏ，Ｏ’−ジテトラデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミン  クロリド；
からなる群より選択されるものであってもよい。好ましいカチオン性脂質としては、ジドデシルジメチルアンモニウムブロマイド（ＤＤＡＢ）が挙げられる。
【００３４】
カチオン性リポソームを構成する非カチオン性脂質は、特に限定されないが、以下：
ジアシルホスファチジルコリン；
リゾホスファチジルコリン；
ジアシルホスファチジルグリセロール；
ジアシルホスファチジン酸；
ジアシルホスファチジルセリン；
ジアシルホスファチジルエタノールアミン；
スフィンゴミエリン；
セラミド；
ジアシルグリセロール；および
コレステロール；
からなる群より選択されるものであってもく、ここで上記非カチオン性脂質に含まれるアシル基は、炭素数が１２〜２０の飽和または不飽和アシル基である。例えば、上記非カチオン性脂質に含まれるアシル基は、ドデカノイル基（ラウロイル基）、テトラデカノイル基（ミリストイル基）、ペンタデカノイル基、ヘキサデカノイル基（パルミトイル基）、９−ヘキサデセノイル基（パルミトレノイル基）、ヘプタデカノイル基（マルガロイル基）、オクタデカノイル基（ステアロイル基）、９−オクタデセノイル基（オレオイル基）、１１−オクタデセノイル基（バクセノイル基）、９，１２−オクタデカジエノイル基（リノレオイル基）、９，１２，１５−オクタデカントリエノイル基（９，１２，１５−リノレノイル基）、６，９，１２−オクタデカトリエノイル基（６，９，１２−リノレノイル基）、エイコサノイル基（アラキジノイル基）、８，１１−エイコサジエノイル基、５，８，１１−エイコサトリエノイル基、５，８，１１−エイコサテトラエノイル基（アラキドノイル基）、などが挙げられる。好ましい非カチオン性脂質としては、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、および／または、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）が挙げられる。
【００３５】
抗酸化剤と遺伝子の共送達が可能なキャリアとして用いられる生分解性ポリマーは、特に限定されないが、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）共重合体、ポリカプロラクトン、ポリジオキサノン、およびキトサン、からなる群より選択される生分解性ポリマーである。
【００３６】
抗酸化剤と遺伝子の共送達が可能なキャリアとして用いられる脂質コートされた生分解性ポリマーは、特に限定されないが、カチオン性脂質でコートされた生分解性ポリマーである。ここで、当該カチオン性脂質および生分解性ポリマーは、リポソームおよび生分解性ポリマーについて上述したものを使用することができる。
【００３７】
また、上記抗酸化剤と遺伝子の共送達可能なキャリアは、抗酸化剤およびプラスミドＤＮＡを複合化するための複合化剤としても把握されるものである。
【００３８】
抗酸化剤
本願の複合体に含まれる抗酸化剤は、抗酸化活性を有する化合物である限り特に限定されないが、例えば、ポルフィリン系抗酸化剤、フタロシアニン系抗酸化剤、アスコルビン酸、グルタチオン、尿酸、メラトニン、ウロビリノーゲン、トコフェロール類、トコトリエノール類、カロテノイド、キサントフィル類、ポリフェノール、フラボノイド類、からなる群より選択される抗酸化剤であってもよい。
【００３９】
ポルフィリン系抗酸化剤として、例えば、カチオン性金属ポルフィリン錯体またはカチオン性金属ポルフィリンダイマーが挙げられる。好ましい態様において、ポルフィリン系抗酸化剤はカチオン性金属ポルフィリンダイマーである。
【００４０】
カチオン性金属ポルフィリン錯体は、下記の式（Ｉ）：
【００４１】
【化４】
0006731730.tif 000006
【００４２】
で表される化合物であってもよい。
【００４３】
前記式（Ｉ）における中心金属Ｍは、特に制限はないが、好ましくは遷移金属である。例えば、中心金属Ｍは、マンガン原子、ニッケル原子、鉄原子、銅原子、コバルト原子、および亜鉛原子からなる群より選択することができる。さらに好ましい中心金属はマンガン原子である。
【００４４】
前記式（Ｉ）におけるＡｒ１、Ａｒ２、Ａｒ３、およびＡｒ４、はそれぞれ独立して無置換のまたは置換基を有してもよい炭素環式または複素環式芳香族基である。当該芳香族基は、単環式のものでも、多環式のものでも、あるいは、縮合環式のものであってもよい。炭素環式の芳香族基としては例えば、炭素数６〜３６、好ましくは６〜２０の単環式、多環式、または縮合環式の炭素環式芳香族基が挙げられる。これには例えば、ベンゼン環、ナフタレン環などから誘導される基が挙げられる。複素環式の芳香族基としては、１個または２個異常の窒素原子、酸素原子または硫黄原子を有する５〜１０員の単環式、多環式、または縮合環式の複素環から誘導される基である。これには例えば、ピリジン環、ピリミジン環、アゾール環などおから誘導される基である。好ましい芳香族基としては、フェニル基や４−ピリジル基などが挙げられる。
【００４５】
前記式（Ｉ）のＡｒ１、Ａｒ２、Ａｒ３、およびＡｒ４の少なくとも１つはカチオン性の基を有する芳香族基である。芳香族基が有するカチオン性の基としては、炭素数１〜２０、好ましくは炭素数１〜１０、さらに好ましくは炭素数１〜５程度の直鎖状または分枝状のアルキル基などによりカチオン化されたアンモニウム基やスルホニウム基などが挙げられるが、第四級アンモニウム基が好ましい。これらのカチオン性の基は芳香族基に直接結合していてもよいが、炭素数１〜２０、好ましくは炭素数１〜１０、さらに好ましくは炭素数１〜５程度の直鎖状または分枝状のアルキレン基を解して結合していてもよい、また、カチオン性の基は芳香族基の置換基として有していてもよいが、芳香族基の異種原子、好ましくは窒素原子が炭素数１〜２０、好ましくは炭素数１〜１０、さらに好ましくは１〜５程度の直鎖状または分枝状のアルキル基などによりカチオン化されたものであってもよい。このような芳香族基としては、例えば、４−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアミノフェニル基、４−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアミノフェニル基などの４−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリ低級アルキルアミノフェニル基、Ｎ−メチル−４−ピリジル基、Ｎ−エチル−４−ピリジル基などのＮ−低級アルキル−４−ピジリル基、Ｎ，Ｎ’−ジ置換イミダゾール基などが挙げられる。また、これらのカチオン性の基を有する芳香族基が、フェニル基やナフチル基などの炭素環式芳香族基に直接またはアルキレン基、アミド基、またはエステル基などを解して結合した基となっていてもよい。
【００４６】
これらの芳香族基は、置換基を有していてもよい。芳香族基が有していてもよい置換基としては、炭素数１〜２０、好ましくは炭素数１〜１０、さらに好ましくは１〜５の直鎖状または分枝状のアルキル基、アミノ基、前記したアルキル基で置換されているアミノ基、前記したアルキル基を含むアルコキシ基などが挙げられる。
【００４７】
前記式（Ｉ）のＡｒ１、Ａｒ２、Ａｒ３、およびＡｒ４の少なくとも１つはカチオン性の基を有する芳香族基であるが、好ましくはこれらの芳香族基のうちの２つ以上がカチオン性の基を有するものである。例えば、Ａｒ１、Ａｒ２、Ａｒ３、およびＡｒ４のすべてが、Ｎ−メチル−４−ピリジル基などのＮ−低級アルキル−４−ピリジル基、４−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアミノフェニル基などの４−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリ低級アルキルアミノフェニル基、Ｎ，Ｎ’−ジ置換イミダゾール基である化合物；Ａｒ１、Ａｒ２、およびＡｒ３がＮ−メチル−４−ピリジル基などのＮ−低級アルキル−４−ピリジル基、４−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアミノフェニル基などの４−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリ低級アルキルアミノフェニル基、Ｎ，Ｎ’−ジ置換イミダゾール基であり、Ａｒ４がフェニル基である化合物；Ａｒ１およびＡｒ２がＮ−メチル−４−ピリジル基などのＮ−低級アルキル−４−ピリジル基、４−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアミノフェニル基などの４−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリ低級アルキルアミノフェニル基、またはＮ，Ｎ’−ジ置換イミダゾール基であり、Ａｒ３およびＡｒ４がフェニル基である化合物；Ａｒ１およびＡｒ３がＮ−メチル−４−ピリジル基などのＮ−低級アルキル−４−ピリジル基、４−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアミノフェニル基などの４−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリ低級アルキルアミノフェニル基、またはＮ，Ｎ’−ジ置換イミダゾール基であり、Ａｒ２およびＡｒ４がフェニル基である化合物；などが挙げられる。
【００４８】
カチオン性金属ポルフィリンダイマーは、下記の式（ＩＩ）：
【００４９】
【化５】
0006731730.tif 000007
【００５０】
で表される化合物であってもよい。
【００５１】
前記式（ＩＩ）における中心金属Ｍは、特に制限はないが、好ましくは遷移金属である。例えば、中心金属Ｍは、マンガン原子、ニッケル原子、鉄原子、銅原子、コバルト原子、および亜鉛原子からなる群より選択することができる。さらに好ましい中心金属はマンガン原子である。
【００５２】
前記式（ＩＩ）におけるＡｒ１およびＡｒ１’はピリジンを示し、ここでピリジンの１位はＸに、４位がポルフィリンにそれぞれ結合している。
【００５３】
前記式（ＩＩ）におけるｒ２、Ａｒ３、およびＡｒ４、並びに、Ａｒ２’、Ａｒ３’、およびＡｒ４’、はそれぞれ独立して無置換のまたは置換基を有してもよい炭素環式または複素環式芳香族基である。当該芳香族基は、単環式のものでも、多環式のものでも、あるいは、縮合環式のものであってもよい。炭素環式の芳香族基としては例えば、炭素数６〜３６、好ましくは６〜２０の単環式、多環式、または縮合環式の炭素環式芳香族基が挙げられる。これには例えば、ベンゼン環、ナフタレン環などから誘導される基が挙げられる。複素環式の芳香族基としては、１個または２個異常の窒素原子、酸素原子または硫黄原子を有する５〜１０員の単環式、多環式、または縮合環式の複素環から誘導される基である。これには例えば、ピリジン環、ピリミジン環、アゾール環などおから誘導される基である。好ましい芳香族基としては、フェニル基や４−ピリジル基などが挙げられる。
【００５４】
これらの芳香族基は、置換基を有していてもよい。芳香族基が有していてもよい置換基としては、炭素数１〜２０、好ましくは炭素数１〜１０、さらに好ましくは１〜５の直鎖状または分枝状のアルキル基、アミノ基、前記したアルキル基で置換されているアミノ基、前記したアルキル基を含むアルコキシ基などが挙げられる。
【００５５】
前記式（ＩＩ）において、Ｘは、−ＣＨ２−フェニル−ＣＨ２−であるか、下記式（ＩＩＩ）ないし（Ｖ）のいずれかで表される：
−Ｃ２Ｈ４−（ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２）ａ−  ・・・・  （ＩＩＩ）
（式中、ａは、１〜１０の整数を示す）
−Ｃ２Ｈ４−（ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｂ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−  ・・・  （ＩＶ）
−Ｃ３Ｈ６−（ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｂ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−  ・・・（Ｖ）
（式中、ｂは３〜５の整数を示す）
好ましくは、Ｘは−ＣＨ２−フェニル−ＣＨ２−である。
【００５６】
好ましいポルフィリン系抗酸化剤は、下記の式（ＶＩ）：
【００５７】
【化６】
0006731730.tif 000008
【００５８】
を有するカチオン性マンガンポルフィリンダイマーである。
【００５９】
プラスミドＤＮＡ
本願の複合体に含まれるプラスミドＤＮＡは、特に限定されないが、本願の複合体を適用する対象において、酵素またはタンパク質の発現量または活性を変調することができるものである。このようなプラスミドＤＮＡとして、例えば、酵素またはタンパク質をコードするＤＮＡ；対象において酵素またはタンパク質の発現を抑制するアンチセンス核酸または二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ；あるいは、酵素またはタンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ；を含むプラスミドＤＮＡが挙げられる。
【００６０】
酵素またはタンパク質をコードするＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡは、本願の複合体が適用された対象において当該酵素またはタンパク質を発現する。それにより、当該酵素またはタンパク質の発現量を増加させることができる。
【００６１】
対象において酵素またはタンパク質の発現を抑制するアンチセンス核酸または二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡは、本願の複合体が適用された対象においてアンチセンス核酸または二本鎖ＲＮＡを発現する。それにより、アンチセンス核酸の作用またはＲＮＡ干渉の作用に基づいて、当該酵素またはタンパク質の発現を抑制することができる。
【００６２】
酵素またはタンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントをコードするＤＮＡは、本願の複合体が適用された対象において当該酵素またはタンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントを発現する。それにより、当該酵素またはタンパク質の活性が抑制または亢進する。特定の酵素またはタンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントは当業者に周知の方法により作製することができ、またそれらをコードするＤＮＡも当業者は適宜同定することができる。抗体のフラグメントは、特に限定されないが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖが含まれる。
【００６３】
好ましい態様において、本願の複合体に含まれるプラスミドＤＮＡはエピジェネティクスの制御に関わる酵素またはタンパク質の発現量または活性を変調することができるものである。このようなプラスミドＤＮＡは、例えば、エピジェネティクスの制御に関わる酵素またはタンパク質をコードするＤＮＡ；対象において当該酵素またはタンパク質の発現を抑制するアンチセンス核酸または二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ；あるいは、当該酵素またはタンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ；を含むものである。エピジェネティクスの制御に関わる酵素またはタンパク質には、例えば、ＤＮＡメチル化酵素、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ヒストン修飾酵素、クロマチン構造因子、クロマチンリモデリング因子、クロマチンインスレーター等が含まれる。好ましい態様において、エピジェネティクスの制御に関わる酵素またはタンパク質はヒストン脱アセチル化酵素２（ＨＤＡＣ２）である。
【００６４】
特に好ましい態様において、本願の複合体に含まれるプラスミドＤＮＡはＨＤＡＣ２をコードするプラスミドＤＮＡである。
【００６５】
医薬組成物
別の態様において、本出願は、抗酸化剤と遺伝子を対象に共送達するための複合体を含む医薬組成物に関する。
【００６６】
本発明の医薬組成物は、経口投与、または、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、もしくは経直腸投与などの非経口投与により投与することができる。経口投与に適した製剤には、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、溶液剤、シロップ剤などが挙げられる。非経口投与に適した製剤として、本発明の医薬組成物を無菌溶液または坐剤として調製してもよい。本発明の医薬組成物は公知の方法により製剤化することができ、投与方法や患者により適宜製剤することができる。例えば、本発明の医薬組成物は、本発明の抗酸化剤と遺伝子を対象に共送達するための複合体を有効成分として含有し、これに製薬上許容される担体、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着香料、着色剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などと共に公知の方法により製剤化することができる。
【００６７】
本発明の医薬組成物の有効投与量は、病態や患者により相違するが、一般的には、１日あたり抗酸化剤が１μｇ〜１ｇ、プラスミドＤＮＡが０．６ｍｇ〜６００ｍｇになるように投与することができる。本発明の医薬組成物は、１回で投与する、１日数回にわけて投与する。あるいは、連続的に投与する。医師をはじめとする医療従事者は、患者の属性および／または病態等に応じて、本発明の医薬組成物の投与量、投与間隔、投与時間、投与手順、投与部位等の用法または用量を適宜決定することができる。そのようにして適宜決定される用法または用量で投与される本発明の医薬組成物もまた、本発明の範囲内である。
【００６８】
本発明の抗酸化剤と遺伝子を対象に共送達するための複合体を有効成分とする医薬組成物による予防や治療に適する疾患としては、エピジェネティクスの異常で引き起こされる疾患が挙げられる。このような疾患の例としては、特に限定されるものではないが、例えば炎症性肺疾患（ＣＯＰＤ）などの炎症性疾患、大腸がん、アルツハイマー型認知症等が挙げられる。
【実施例】
【００６９】
以下に本発明の具体例を示す。これらの具体例は、本発明を理解するための説明を提供することを目的とするものであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００７０】
実施例１：ダイマー型Ｍｎポルフィリン錯体（ＭｎＰＤ）の製造
（１）Ｈ２４ＰｙＰ３Ｐ（５−（４−ピリジル）−１０，１５，２０−トリフェニル−２１Ｈ,２３Ｈ−ポルフィリン）の合成
１ｌの三つ口フラスコにプロピオン酸５００ｍｌを加え、１７３℃にて３０分間攪拌・還流した。温度一定後、ベンズアルデヒド１４ｍｌ、４−ピリジンカルボキシアルデヒド６ｍｌを加え、続いて精製したピロールを１２．５ｍｌ加えた。
【００７１】
１．５時間加熱攪拌後、９０℃まで放冷し、エチレングリコール３５０ｍｌを滴下した。室温まで放冷した後、冷蔵庫で一晩静置した。
【００７２】
冷却後の溶液を吸引濾過し、冷やしたエタノール／メタノール＝１：１溶液で洗浄した後に紫粉末の６種類のポルフィリンからなる混合物を回収した。
【００７３】
得られたポルフィリンの混合物を、シリカゲルクロマトグラフィーにより１００％ＣＨＣｌ３で溶出させてＴＰＰ（テトラフェニルポルフィリン）を溶出した。次いで、目的化合物となるＨ２４ＰｙＰ３Ｐを溶出させた。分画の溶媒を留去し、紫色の目的のポルフィリンを得た。合成の確認はＵＶスペクトル測定と１Ｈ−ＮＭＲで行った。結果は次に示す。
【００７４】
Ｈ２４ＰｙＰ３Ｐの極大吸収波長：λｍａｘ  ４２１ｎｍ（ｓｏｒｅｔ帯）
Ｈ２４ＰｙＰ３Ｐの１Ｈ−ＮＭＲ：９．４４（２Ｈ）（ピリジン環の２，６位の水素原子），９．０２（２Ｈ）（ピリジン環の３，５位の水素原子），８．９８（２Ｈ）（ピロールのβ位の水素原子），８．９５（２Ｈ）（ピロールのβ位の水素原子），８．８７（４Ｈ）（ピロールのβ位の水素原子），８．２４（６Ｈ）（フェニル基の水素原子），７．９１−７．８４（９Ｈ）（フェニル基の水素原子），４．７０（３Ｈ）（メチル基の水素原子），−２．９１（２Ｈ）（環内部の水素原子）
Ｈ２４ＰｙＰ３Ｐの構造式：
【００７５】
【化７】
0006731730.tif 000009
【００７６】
（２）ダイマー型ポルフィリン錯体（Ｈ２ＰＤ：１，３−ジ［５−（Ｎ−メチレン−ピリジニウム−４−イル）−１０，１５，２０−トリフェニル−２１Ｈ，２３Ｈ−ポルフィリン］ベンゼンジブロミド）合成
１００ｍｌの三つ口フラスコに前記（１）で得たポルフィリンＨ２４ＰｙＰ３Ｐの１００ｍｇとメタキシレンジブロマイド１９ｍｇを入れ、ｄｒｙ  ＤＭＦを５ｍｌ加え、９０℃、窒素フロー下で２４時間加熱還流した。
【００７７】
ロータリーエバポレーターにより、反応混合物の溶媒を留去した。メタノールを加え、不溶なＨ２４ＰｙＰ３Ｐを濾過で除いた後、エバポレートし、溶媒を留去した。
【００７８】
得られたポルフィリン混合物をシリカゲルクロマトグラフィーによりクロロホルム／メタノール／ＤＭＦ＝４：１：０．０２の混合溶媒で溶出させ、Ｈ２４ＰｙＰ３Ｐおよび一置換体を溶出させた。次いで、３番目に溶出してきた目的化合物であるＨ２ＰＤを溶出させた。分画の溶媒を留去し、目的のポルフィリンを得た。合成の確認はＵＶスペクトル測定と１Ｈ−ＮＭＲで行った。結果を次に示す。
【００７９】
Ｈ２ＰＤの極大吸収波長：λｍａｘ  ４１５ｎｍ（ｓｏｒｅｔ帯）
Ｈ２ＰＤの１Ｈ−ＮＭＲ：９．７２（４Ｈ）（ピリジン環の２，６位の水素原子）９．１３（４Ｈ）（ピリジン環の３，５位水素原子）８．９４（４Ｈ）（ピロールのβ位水素原子）８．７９（４Ｈ）（ピロールのβ位の水素原子）８．５４（８Ｈ）（ピロールのβ位の水素原子）８．３３（１Ｈ）（キシリルの２位の水素原子）８．２２（４Ｈ）（フェニル基の２，６位の水素原子）８．０９（２Ｈ）（キシリルの４，６位の水素原子）７．９１−７．８５（７Ｈ）（キシリルの５位とフェニル基の３，４，５位の水素原子）７．６２−７．５６（１２Ｈ）（フェニル基の２，４，６位の水素原子）７．３７−７．３５（８Ｈ）（フェニル基３，５位の水素原子）６．４０（４Ｈ）（ベンジルの水素原子）−２．９６（４Ｈ）（環内部の水素原子）
Ｈ２ＰＤの構造式：
【００８０】
【化８】
0006731730.tif 000010
【００８１】
（３）Ｈ２ＰＤへのＭｎ導入
１００ｍｌの三つ口フラスコに前記（２）で得られたＨ２ＰＤを加えて、メタノールに溶解させた後、１０当量の酢酸マンガン４水和物を加え、５０℃で加熱還流し、ＵＶ-可視スペクトルを用いてポルフィリンのソーレー帯のシフトおよび吸光度変化から金属導入の確認ができるまで反応を行った。
【００８２】
反応終了後、エバポレートすることで溶媒を留去した。得られた固体を水に再溶解させ、ヘキサフルオロリン酸アンモニウムを適量加え、吸引濾過し、濾紙上の緑色固体を回収した。合成の確認はＵＶスペクトル測定と元素分析で行った。結果を次に示す。
【００８３】
ＭｎＰＤの極大吸収波長：４６７ｎｍ（ｓｏｒｅｔ帯）
ＭｎＰＤの元素分析：理論値（％）Ｃ：６５．４８,Ｈ：４．４２，Ｎ：７．３１  実測値（％）Ｃ：６５．４３，Ｈ：４．５９，Ｎ：７．３２
ＭｎＰＤの構造式：
【００８４】
【化９】
0006731730.tif 000011
【００８５】
実施例２：ＤＮＡ複合化ＭｎＰＤ含有リポソームの調製
（１）ＭｎＰＤ含有リポソームの調製
２０ｍｌナスフラスコにＭｎＰＤ０．１２ｍｇ、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）０．０１２４ｇ、ジドデシルジメチルアンモニウムブロマイド（ＤＤＡＢ）３．４ｍｇを入れ、クロロホルム／メタノール＝１：１の混合溶媒５ｍｌに溶解させた。ロータリーエバポレーターを用いることで溶媒を留去し、乾燥薄膜を作製した。
【００８６】
乾燥薄膜にＰＢＳ（−）５ｍｌを加え、氷水中で４０分間超音波攪拌を行うことで、ＭｎＰＤリポソーム分散液を得た。粒径は７１．９±１７．６ｎｍ、ゼータ電位は＋２５．８ｍＶの値を示した。
（２）ＤＮＡとの複合化
エッペンドルフチューブ内で前記（１）のリポソーム溶液とプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）溶液を任意のｍｏｌ比で混合し、常温で１時間静置することでリポソームの構成成分であるカチオン性脂質のＤＤＡＢとアニオン性のｐＤＮＡの電荷比（＋／−）が１となるように複合化させた。粒径は５５８．８±１３６．１ｎｍ、ゼータ電位は＋４．５１ｍＶの値を示した。
【００８７】
実施例３：ＭｎＰＤ／ｐＤＮＡ複合体含有ＰＬＡ粒子の調製
エッペンドルフチューブに０．４ｍＭ  ＭｎＰＤ５０μＬと０．０８５６ｍｇ／ｍＬのｐＧＬ３溶液７５μＬを加え、室温で１時間静置し、複合化させた。ここで、ｐＧＬ３はルシフェラーゼをコードするＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡである。１０ｍＬバイアル瓶に複合体溶液を移し、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）１５０μＬを加えて溶解させた。４００ｒｐｍの速度で１時間攪拌し、ポリ乳酸（ＰＬＡ；重量平均分子量１０，０００）０．００２５ｇを加え、同条件で再び攪拌した。１時間後、蒸留水２ｍＬ加えて、分画分子量１００−５００の透析膜に移し、２日間攪拌した。その後、透析膜内の溶液を５０ｍＬ遠沈管に移し、１０００ｒｐｍで１５分間遠心し、回収した。
【００８８】
粒径は３６５．８±４３３．９ｎｍを示した。
【００８９】
実施例４：ＭｎＰＤ含有リポソームおよびＤＮＡ複合化ＭｎＰＤ含有リポソームの細胞集積能評価
ＭｎＰＤ含有リポソームおよびＤＮＡ複合化ＭｎＰＤ含有リポソームの細胞膜内への取り込み評価は、Ａ５４９細胞（ヒト肺胞基底上皮腺がん細胞）を用いて行った。
【００９０】
Ａ５４９細胞の培養は１０％ＦＢＳ、１％抗生物質含有ＤＭＥＭ培地にて５％ＣＯ２、３７℃の条件で行った。コンフルエントになった細胞を計測して、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度で１２ウェルプレート上に播種し、２４時間インキュベーター内で培養した。ＭｎＰＤ、ＭｎＰＤ含有リポソーム、ＤＮＡ複合化ＭｎＰＤリポソームを各種濃度が０〜１００μＭになるように添加し、４時間培養後、培地を除去し、ＰＢＳ洗浄により細胞膜に付着しているポルフィリンを除去した。洗浄後、１００μｌ／ｗｅｌｌのｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓで細胞を溶解させ、細胞溶解液をサンプル管に回収した。最後に回収した細胞溶解液に硝酸（０．５Ｎ  ＨＮＯ３）を加え、細胞を破壊し、静置した。細胞含有硝酸溶液の上清をサンプルとし、細胞内に取り込まれている金属ポルフィリンの中心金属を、原子吸光分析によって定量した。
【００９１】
ＤＮＡ複合化ＭｎＰＤ含有リポソームの添加濃度が２０μＭの場合は添加量の５％程度が細胞内に取り込まれた。
【００９２】
実施例５：ＤＮＡ複合化ＭｎＰＤ含有リポソームのｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗酸化活性評価
Ａ５４９細胞の培養は１０％ＦＢＳ、１％抗生物質含有ＤＭＥＭ培地にて５％ＣＯ２、３７℃の条件で行った。コンフルエントになった細胞を計測して、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度で１２ウェルプレート上に播種し、２４時間インキュベーター内で培養した。ＭｎＰＤ、ＤＮＡ複合化ＭｎＰＤリポソームを各種濃度が０〜１００μＭになるように添加し、４時間培養後、培地を除去し、ＰＢＳ洗浄により細胞膜に付着しているポルフィリンを除去した。洗浄後、１００μｌ／ｗｅｌｌのｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓで細胞を溶解させ、Ｍｎポルフィリン錯体細胞溶解液をサンプル管に回収した。サンプルを熱湯中で５分間静置し、内因性のカタラーゼを失活させた。クラーク型溶存酸素電極のセルの中に１０ｍＭ過酸化水素溶液１００μｌ、回収したＭｎポルフィリン錯体含有細胞溶解液１００μｌ、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）８００μｌを加えて、過酸化水素がポルフィリン錯体により分解される様子を過酸化水素の分解に伴い発生する酸素を電気化学的に検出、追跡した。
【００９３】
ＤＮＡ複合化ＭｎＰＤリポソームを添加した場合においても酸素産生が見られ、細胞内の環境でもＤＮＡ複合化ＭｎＰＤリポソームが抗酸化活性を発揮することが示された。
【００９４】
実施例６：ＤＮＡ複合化ＭｎＰＤ含有リポソームのｉｎ  ｖｉｔｒｏ遺伝子発現評価
Ａ５４９細胞の培養は１０％ＦＢＳ、１％抗生物質含有ＤＭＥＭ培地にて５％ＣＯ２、３７℃の条件で行った。コンフルエントになった細胞を計測して、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度で９６ウェルプレート上に播種し、２４時間インキュベーター内で培養した。
【００９５】
ルシフェラーゼをコードしたｐＧＬ３を用いて、ＰＢＳ（−）中でｐＤＮＡ濃度が２００ｎｇ／ｗｅｌｌとなるようにｐＤＮＡを任意の電荷比でＭｎＰＤ含有リポソームと混合し、室温で１時間静置し、複合体を形成させた。
【００９６】
各複合体のＰＢＳ（−）溶液を上記のＡ５４９細胞の培養培地中に添加し、インキュベーター内で５％ＣＯ２、３７℃の条件で４時間培養後、培地交換を行った。その後同条件で４８時間培養後、培地を除去し、ＰＢＳ洗浄により細胞膜に付着している複合体を除去した。洗浄後、２０μｌ／ｗｅｌｌのｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓで細胞を溶解させ、１００μｌのルシフェリン溶液を加え、よく混合したものをエッペンドルフチューブに回収し、ルシフェリンの化学発光量をルミノメーターで測定した。
【００９７】
Ｎａｋｅｄ  ＤＮＡに比べて約１０００倍の遺伝子発現効率を示し、調製した複合体が十分な遺伝子発現能を有していることが示された。
【００９８】
実施例７：ウェスタンブロット法によるＨＤＡＣ２発現量評価
Ａ５４９細胞の培養は１０％ＦＢＳ、１％抗生物質含有ＤＭＥＭ培地にて５％ＣＯ２、３７℃の条件で行った。コンフルエントになった細胞を計測して、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度で１２ウェルプレート上に播種し、２４時間インキュベーター内で培養した。
【００９９】
ＨＤＡＣ２をコードしたｐＤＮＡを用いて、ＰＢＳ（−）中でｐＤＮＡ濃度が１０００ｎｇ／ｗｅｌｌとなるようにｐＤＮＡを任意の電荷比でＭｎＰＤ含有リポソームと混合し、室温で１時間静置し、複合体を形成させた。
【０１００】
各複合体のＰＢＳ（−）溶液を上記のＡ５４９細胞の培養培地中に添加し、インキュベーター内で５％ＣＯ２、３７℃の条件で４時間培養後、培地交換を行った。その後同条件で４８時間培養後、培地を除去し、ＰＢＳ洗浄により細胞膜に付着している複合体を除去した。洗浄後、１００μｌ／ｗｅｌｌのｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓで細胞を溶解させ、その内９０μｌはエッペンドルフチューブに回収し、残りの１０μｌはタンパク定量用に分取した。タンパク定量の結果から、希釈倍率を決定し、サンプルバッファーで希釈した。タンパク質のジスルフィド結合を切断するために９５℃で５分間熱処理を行った。作製したサンプルをポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（濃縮ゲル：３０％アクリルアミド、Ｔｒｉｓ  ｐＨ６．８、１０％ＳＤＳ、１０％ＡＰＳ、ＴＥＭＥＤ、ＤＤＷ；分離ゲル：３０％アクリルアミド、Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．８、１０％ＳＤＳ、１０％ＡＰＳ、ＴＥＭＥＤ、ＤＤＷ）によって分離し、タンク式ブロッティング装置を用いて、ゲルからＰＶＤＦ膜へタンパクを転写した。タンパクを転写した膜に一次抗体（抗ＨＤＡＣ２マウス抗体、及び抗β−アクチンウサギ抗体）：ｗａｓｈバッファー＝１：１０００溶液で一次抗体処理を一晩行い、次いで、二次抗体（ＨＲＰ−複合化抗マウス抗体、ＨＲＰ−複合化抗ウサギ抗体）：ｗａｓｈバッファー＝１：１０００溶液で二次抗体処理を行った。Prime Western Blotting Detection Systemを使用し、発光検出することでＨＤＡＣ２発現量を半定量的に評価した。
【０１０１】
未処理細胞に対して、ＨＤＡＣ２の発現量が約３倍に増加しており、調製した複合体を用いることで十分量のＨＤＡＣ２が発現することが示された。
【０１０２】
実施例８：ＥＬＩＳＡによる複合体のＨＤＡＣ２活性評価
Ａ５４９細胞の培養は１０％ＦＢＳ、１％抗生物質含有ＤＭＥＭ培地にて５％ＣＯ２、３７℃の条件で行った。コンフルエントになった細胞を計測して、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度で１２ウェルプレート上に播種し、２４時間インキュベーター内で培養した。
【０１０３】
ＨＤＡＣ２をコードしたｐＤＮＡを用いて、ＰＢＳ（−）中でｐＤＮＡ濃度が１０００ｎｇ／ｗｅｌｌとなるようにｐＤＮＡを任意の電荷比でＭｎＰＤ含有リポソームと混合し、室温で１時間静置し、複合体を形成させた。
【０１０４】
各複合体のＰＢＳ（−）溶液を上記のＡ５４９細胞の培養培地中に添加し、インキュベーター内で５％ＣＯ２、３７℃の条件で４時間培養後、培地交換を行った。その後同条件で４８時間培養後、培地を除去し、ＰＢＳ洗浄により細胞膜に付着している複合体を除去した。洗浄後、１００μｌ／ｗｅｌｌのｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓで細胞を溶解させ、エッペンドルフチューブに回収した。
【０１０５】
回収したサンプルにＥＬＩＳＡを用いて、蛍光強度の変化を検出することで各複合体のＨＤＡＣ２活性評価を行った。未処理細胞のＨＤＡＣ２活性を１００％とした時に、調製した複合体を添加した場合にＨＤＡＣ２の活性が１０３％に増加していることが示された。
【０１０６】
実施例９：過酸化水素によるＨＤＡＣ２発現量低下に対するＤＮＡ複合化ＭｎＰＤ含有リポソームのＨＤＡＣ２保護効果の検討
Ａ５４９細胞の培養は１０％ＦＢＳ、１％抗生物質含有ＤＭＥＭ培地にて５％ＣＯ２、３７℃の条件で行った。コンフルエントになった細胞を計測して、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度で１２ウェルプレート上に播種し、２４時間インキュベーター内で培養した。
【０１０７】
ＨＤＡＣ２をコードしたｐＤＮＡを用いて、ＰＢＳ（−）中でｐＤＮＡ濃度が１０００ｎｇ／ｗｅｌｌとなるようにｐＤＮＡを任意の電荷比でＭｎＰＤ含有リポソームと混合し、室温で１時間静置し、複合体を形成させた。
【０１０８】
各複合体のＰＢＳ（−）溶液を上記のＡ５４９細胞の培養培地中に添加し、インキュベーター内で５％ＣＯ２、３７℃の条件で４時間培養後、培地交換を行った。その後同条件で４８時間培養後、過酸化水素を１００μＭ／ｗｅｌｌになるように添加し、４時間培養した。４時間培養後、培地を除去し、１００μｌ／ｗｅｌｌのｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓで細胞を溶解させ、その内９０μｌはエッペンドルフチューブに回収し、残りの１０μｌはタンパク定量用に分取した。タンパク定量の結果から、希釈倍率を決定し、サンプルバッファーで希釈した。タンパク質のジスルフィド結合を切断するために９５℃で５分間熱処理を行った。作製したサンプルをポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（濃縮ゲル：３０％アクリルアミド、Ｔｒｉｓ  ｐＨ６．８、１０％ＳＤＳ、１０％ＡＰＳ、ＴＥＭＥＤ、ＤＤＷ；分離ゲル：３０％アクリルアミド、Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．８、１０％ＳＤＳ、１０％ＡＰＳ、ＴＥＭＥＤ、ＤＤＷ）によって分離し、タンク式ブロッティング装置を用いて、ゲルからＰＶＤＦ膜へタンパクを転写した。タンパクを転写した膜に一次抗体（抗ＨＤＡＣ２マウス抗体、及び抗β−アクチンウサギ抗体）：ｗａｓｈバッファー＝１：１０００溶液で一次抗体処理を一晩行い、次いで、二次抗体（ＨＲＰ−複合化抗マウス抗体、及びＨＲＰ−複合化抗ウサギ抗体）：ｗａｓｈバッファー＝１：１０００溶液で二次抗体処理を行った。Prime Western Blotting Detection Systemを使用し、発光検出することでＨＤＡＣ２発現量を半定量的に定量した。過酸化水素により発現量の低下するＨＤＡＣ２を定量し、それに対して各複合体がＨＤＡＣ２発現量の低下を抑制できるかどうかを検討することで複合体のＨＤＡＣ２保護効果を評価した。
【０１０９】
未処理細胞のＨＤＡＣ２発現量を１００％としたときに、過酸化水素処理により、ＨＤＡＣ２発現量が６０％程度に低下した。それに対して調製した複合体を添加した場合に約２００％まで発現量が増加した。
【０１１０】
実施例１０：過酸化水素によるＨＤＡＣ２発現量低下に対するＤＮＡ複合化ＭｎＰＤ含有リポソームのＨＤＡＣ２活性改善効果の検討
Ａ５４９細胞の培養は１０％ＦＢＳ、１％抗生物質含有ＤＭＥＭ培地にて５％ＣＯ２、３７℃の条件で行った。コンフルエントになった細胞を計測して、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度で１２ウェルプレート上に播種し、２４時間インキュベーター内で培養した。
【０１１１】
ＨＤＡＣ２をコードしたｐＤＮＡを用いて、ＰＢＳ（−）中でｐＤＮＡ濃度が１０００ｎｇ／ｗｅｌｌとなるようにｐＤＮＡを任意の電荷比でＭｎＰＤ含有リポソームと混合し、室温で１時間静置し、複合体を形成させた。
【０１１２】
各複合体のＰＢＳ（−）溶液を上記のＡ５４９細胞の培養培地中に添加し、インキュベーター内で５％ＣＯ２、３７℃の条件で４時間培養後、培地交換を行った。その後同条件で４８時間培養後、過酸化水素を１００μＭ／ｗｅｌｌになるように添加し、４時間培養した。４時間培養後、培地を除去し、１００μｌ／ｗｅｌｌのｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓで細胞を溶解させ、エッペンドルフチューブに回収した。回収したサンプルにＥＬＩＳＡを用いて、化学発光量の変化を検出することで各複合体のＨＤＡＣ２活性改善効果の検討を行った。
【０１１３】
未処理細胞のＨＤＡＣ２活性を１００％としたときに、過酸化水素処理により、ＨＤＡＣ２活性が５０％まで低下した。それに対して調製した複合体を添加すると６０％までＨＤＡＣ２活性が回復した。
【０１１４】
実施例１１：過酸化水素とＬＰＳによるＣＯＰＤモデルにおけるＤＮＡ複合化ＭｎＰＤ含有リポソームのステロイド耐性抑制効果の検討
Ａ５４９細胞の培養は１０％ＦＢＳ、１％抗生物質含有ＤＭＥＭ培地にて５％ＣＯ２、３７℃の条件で行った。コンフルエントになった細胞を計測して、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度で４８ウェルプレート上に播種し、２４時間インキュベーター内で培養した。
【０１１５】
ＨＤＡＣ２をコードしたｐＤＮＡを用いて、ＰＢＳ（−）中でｐＤＮＡ濃度が２００ｎｇ／ｗｅｌｌとなるようにｐＤＮＡを任意の電荷比でＭｎＰＤ含有リポソームと混合し、室温で１時間静置し、複合体を形成させた。
【０１１６】
各複合体のＰＢＳ（−）溶液を上記のＡ５４９細胞の培養培地中に添加し、インキュベーター内で５％ＣＯ２、３７℃の条件で４時間培養後、培地交換を行った。その後同条件で４８時間培養後、過酸化水素を１００μＭ／ｗｅｌｌになるように添加し、４時間培養した。４時間培養後、培地交換し、０．２ｎｇ／ｗｅｌｌとなるようにＬＰＳを、１００μＭ／ｗｅｌｌとなるようにデキサメタゾンを添加し、１６時間培養した。その後、培地を除去し、５０μｌ／ｗｅｌｌのｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓで細胞を溶解させ、細胞溶解液をエッペンドルフチューブに回収した。過酸化水素とＬＰＳの共処理によるＣＯＰＤモデルにおいてはステロイドであるデキサメタゾンの投与はＩＬ−８産生量を抑制することができない（ステロイド耐性）。ＣＯＰＤモデルにおけるＩＬ−８産生量を定量し、それに対して複合体の投与がステロイドの作用を正常化し、ＩＬ−８産生量が減少するかを検討することで複合体のステロイド耐性抑制効果を評価した。また、評価はＥＬＩＳＡで行い、蛍光強度の変化からＩＬ−８産生量の変化を算出した。
【０１１７】
未処理細胞においてＩＬ−８産生量は約４００ｐｇ／ｍＬであり、過酸化水素とＬＰＳの処理により、ＩＬ−８産生量が約１２００ｐｇ／ｍＬまで増加した。それに対してデキサメタゾンを添加した場合、ＩＬ−８産生量を抑制することはできなかった（ステロイド耐性）。しかし、ＤＮＡ複合化ＭｎＰＤ含有リポソームを共投与した場合にはＩＬ−８産生量が約５００ｐｇ／ｍＬまで減少し、調製した複合体がＣＯＰＤモデルにおけるステロイド耐性を抑制することに成功したことが示された。
【０１１８】
実施例１２：ＤＮＡ複合化脂質コートＭｎＰＤ含有ＰＬＡナノ粒子の調製
マンガンポルフィリンダイマー（ＭｎＰＤ）含有ポリ乳酸（ＰＬＡ）ナノ粒子は、以下の手順で調製した。まず、ＭｎＰＤ  １ｍｇとＰＬＡ  １００ｍｇはメタノール／アセトン混合溶媒に溶解した。得られた溶液は、ポリビニルアルコール溶液３０ｍＬに添加し、撹拌した。撹拌したのち、遠心分離により粒子を沈降した。次に上清を除去し、蒸留水を３０ｍＬ添加し、遠心分離を行った。この作業を２回繰り返した。最後に上清除去し、蒸留水を１０ｍＬ添加し、粒子を再懸濁した。得られた懸濁液は、凍結乾燥によりＭｎＰＤ含有ＰＬＡナノ粒子を得た。粒径は２６５±７８ｎｍ、ゼータ電位は-６．７ｍＶの値を示した。
【０１１９】
得られた粒子への脂質コートは以下の手順で行った。まず、２ｍｇカチオン性脂質（１，２−ジオレオイルオキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ））はクロロホルムに溶解し、ロータリーエバポレータを用いて溶媒を蒸散し、脂質薄膜を得た。得られた脂質薄膜に対して、ＰＢＳに懸濁したＭｎＰＤ含有ＰＬＡ粒子  ４ｍｇを添加し、超音波処理を行った。超音波処理後、静置し脂質コートしたＭｎＰＤ含有ＰＬＡナノ粒子を得た。
【０１２０】
最後に、脂質コートしたＭｎＰＤ含有ＰＬＡナノ粒子  ６９０ｎｇはＰＢＳ中でＨＤＡＣ２をコードしたプラスミドＤＮＡ  ２００ｎｇを添加し、室温で１時間静置することにより、ＤＮＡ複合化脂質コートＭｎＰＤ含有ＰＬＡナノ粒子を得た。粒径は４１４±１７ｎｍ、ゼータ電位は＋２１ｍＶの値を示した。
【０１２１】
実施例１３：過酸化水素とＬＰＳによるＣＯＰＤモデルにおけるＤＮＡ複合化脂質コートＭｎＰＤ含有ＰＬＡナノ粒子の抗炎症効果及びステロイド耐性抑制効果の検討
Ａ５４９細胞の培養は１０％ＦＢＳ、１％抗生物質含有ＤＭＥＭ培地にて５％ＣＯ２、３７℃の条件で行った。コンフルエントになった細胞を計測して、５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度で９６ウェルプレート上に播種し、２４時間インキュベーター内で培養した。
【０１２２】
実施例１２で調製したＤＮＡ複合化脂質コートＭｎＰＤ含有ＰＬＡナノ粒子のＰＢＳ（−）溶液を上記のＡ５４９細胞の培養培地中に添加した。インキュベーター内で５％ＣＯ２、３７℃の条件で４８時間培養後、過酸化水素を１００μＭ／ｗｅｌｌとなるように添加し、４時間インキュベートした。その後、０．２ｎｇ／ｗｅｌｌとなるようにＬＰＳを、１００μＭ／ｗｅｌｌとなるようにデキサメタゾン（Ｄｅｘ．）を添加し、１６時間インキュベートした。その後、培地を除去し、回収した細胞を５０μｌ／ｗｅｌｌのｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓで溶解し、ＥＬＩＳＡによる炎症性サイトカイン（ＩＬ−８）発現量評価を行った。
【０１２３】
結果を図２に示す。過酸化水素とＬＰＳで処理した細胞は、ＩＬ−８産生量が増大した。ＤＮＡ複合化脂質コートＭｎＰＤ含有ＰＬＡナノ粒子を添加した細胞では、過酸化水素とＬＰＳで処理した細胞に対して、ＩＬ−８産生量が有意に抑制された（ｐ＜０．０５）。さらにキャリアとデキサメタゾンを添加することで、キャリアのみと比較してＩＬ−８量のさらなる低下を導いた（ｐ＜０．０５）。
【産業上の利用可能性】
【０１２４】
本発明の複合体は、抗酸化剤とプラスミドＤＮＡの共送達により、抗酸化剤による活性酸素種消去と、プラスミドＤＮＡによるエピジェネティクな異常の改善を同時に達成することができるものである。したがって、従来は対症療法しか存在しなかったエピジェネティクス異常と活性酸素種が病理に関わる疾患の根治治療への応用が期待される。
【図１】
0006731730.tif 000017
【図２】
0006731730.tif 000018