(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ただ１種類の人工免疫グロブリン単鎖可変断片を有効成分として含み、該人工免疫グロブリン単鎖可変断片が配列番号３１に記載されたアミノ酸配列を含むポリペプチドである、感染性疾患または炎症性疾患の治療用人工免疫グロブリン断片組成物。
【請求項２】
ただ１種類の人工免疫グロブリン単鎖可変断片を有効成分として含み、該人工免疫グロブリン単鎖可変断片が配列番号３１に記載されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである、感染性疾患または炎症性疾患の治療用人工免疫グロブリン断片組成物。
【請求項３】
ただ１種類の人工免疫グロブリン単鎖可変断片を有効成分として含み、該人工免疫グロブリン単鎖可変断片が配列番号３１に記載されたアミノ酸配列を含むポリペプチドである、感染性疾患または炎症性疾患の治療用医薬組成物。
【請求項４】
ただ１種類の人工免疫グロブリン単鎖可変断片を有効成分として含み、該人工免疫グロブリン単鎖可変断片が配列番号３１に記載されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである、感染性疾患または炎症性疾患の治療用医薬組成物。
【請求項５】
前記感染性疾患または炎症性疾患が、血管炎、腎炎、糸球体腎炎、肺炎、またはそれらの組み合わせである、請求項３または４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工ポリクローナル免疫グロブリン組成物、または人工モノクローナル免疫グロブリン組成物に関する。より詳しくは、免疫グロブリンの重鎖可変領域と重鎖定常領域１とヒンジ部分（ＶＨ−ＣＨ１−ｈｉｎｇｅ）とからなる単鎖可変断片（ＳｃＦｖ、ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔともいう）であって、該重鎖可変領域が互いに異なる複数種の単鎖可変断片を有効成分として含む人工ポリクローナル免疫グロブリン組成物に関する。また、本発明は、本発明に係る人工ポリクローナル免疫グロブリン組成物を投与することを含む、感染症または炎症性疾患の治療方法、並びに本発明に係る人工ポリクローナル免疫グロブリン組成物の、感染症または炎症性疾患の治療用医薬組成物の製造における使用に関する。本発明はまた、任意の数の単鎖可変断片、例えば、ただ１種類の単鎖可変断片を含み得る、人工免疫グロブリン断片組成物に関する。
【０００２】
本願は、２０１５年２月２７日に出願された米国特許出願第１４／６３３，２１６号への優先権を主張する出願である。当該米国特許出願第１４／６３３，２１６号は、２０１１年１２月１９日に出願された日本特許出願第２０１１−２７７１６３号への優先権を主張して２０１２年１２月１７日に出願された米国特許出願第１３／７１６，４６９号の一部継続出願である。それぞれの特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００３】
免疫グロブリン（Ｉｇ）は、抗体およびこれと構造上・機能上の関連性のあるタンパク質の総称である。つまり、結合する抗原が明らかになっている免疫グロブリンを、その特定抗原に対応させて抗体と呼んでいる。免疫グロブリンの基本的な分子構造は、軽鎖（Ｌ鎖、ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎともいう）と重鎖（Ｈ鎖、ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎともいう）の大小２種類のポリペプチド２本ずつがジスルフィド結合により連結したものである。重鎖は３つの領域（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）からなる定常領域（Ｃ領域、ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎともいう）とＶＨ領域からなる可変領域（Ｖ領域、ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎともいう）が連結された構造である。ＩｇＭとＩｇＥを除く免疫グロブリンには、ＣＨ１とＣＨ２の間にヒンジ（ｈｉｎｇｅ）部分と呼ばれるペプチドが存在する。軽鎖は、ＣＬ領域からなる定常領域とＶＬ領域からなる可変領域が連結された構造である。可変領域のアミノ酸配列には多様性があり、これによって多様な抗原に対する多様な抗体が生体内で作られている。
【０００４】
従来臨床的に使用されてきた免疫グロブリン製剤は、ヒトの血液から抽出した免疫グロブリンを濃縮した血液製剤であり、細菌などの侵入異物と抗原抗体反応を起こし、生体を守る作用を有する。近年、免疫グロブリン製剤は、重症感染症の他に、特発性血小板減少性紫斑病、無ガンマグロブリン血症、川崎病急性期、ギラン・バレー症候群や血管炎である好酸球性多発血管炎性肉芽腫症（Ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ  Ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｓｉｓ  ｗｉｔｈ  Ｐｏｌｙａｎｇｉｔｉｓ：ＥＧＰＡ、旧名  アレルギー性肉芽腫性血管炎、チャーグ・ストラウス症候群）などにも使用されるようになってきている。そして、これらの治療には、静脈を経由して大量に免疫グロブリンを投与する「ＩＶＩｇ治療」がよく用いられている。このＩＶＩｇ治療は、最近では難治性血管炎などの治療法としても注目されており、その他、国際的にも種々の疾患の治療法として重要視されている。さらに、自己免疫疾患にＩＶＩｇ治療が認可され、これにともない膠原病や筋無力症を対象として、つぎつぎとＩＶＩｇ治療が始まっている。また、ＩＶＩｇ治療は川崎病では２０年にわたる治療実績があり、最近では２ｇ／ｋｇ体重の単回投与がより有効であることで認可されている。以上のように、ＩＶＩｇは重症度の高い疾患や原因不明の難治性疾患にきわめて有効である。また、ＩＶＩｇは副作用がほとんどない点でも有用な治療法である。
【０００５】
免疫グロブリン製剤の作用機序については、いくつかの仮説がある。一つの仮説は、免疫グロブリン製剤に含まれている、未知の抗原に対する抗体を含めた多種類の抗体が薬理効果を発揮しているという説である。また別の仮説は、多種類の抗体のうちのミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）に対する抗体（抗ＭＰＯ抗体）にその効果があり、特にＭＰＯの広範なエピトープに対する多種類の抗ＭＰＯ抗体が薬理効果を発揮しているという説である。両説において共通していることは、免疫グロブリン製剤が多様な免疫グロブリンの混合物であること、すなわちポリクローナルなものであることが治療効果に大きく寄与しているということである。その他にも仮説があるが、例示した２つの仮説はいずれも有力なものである。
【０００６】
現在、臨床的に使用されている免疫グロブリン製剤は血液製剤であるため、原料に由来するウイルスなどの未知の病原体が混入するリスクが常に存在する。事実、病原ウイルスに汚染された血液製剤によって薬害が起こり、大きな社会問題となっている、さらに、対応疾患の増大とともに原料となる血液が不足することも予想されており、血液製剤の免疫グロブリン製剤は安定供給にも不安がある。
【０００７】
このような状況において、患者の感染リスクを減少させ、かつ免疫グロブリン製剤の治癒機転を明らかにする上でも、人工合成品の免疫グロブリン製剤が求められている。人工免疫グロブリン製剤の製造のために、免疫グロブリンの遺伝子を取得し、組換えＤＮＡ技術を用いて該遺伝子を発現させ、純化した免疫グロブリンを取得する方法が行われている。例えば、免疫グロブリンの可変領域のみをマウス由来のものに置き換えたキメラ型抗体（特許文献１）や、可変領域の中のＣＤＲ領域のみをマウス由来のものに置き換えたヒト化抗体（特許文献２）が、組換えＤＮＡ技術によって製造可能である。キメラ型抗体やヒト化抗体は抗体医薬としてすでに実用化されている。また、免疫グロブリン遺伝子を宿主細胞内で可溶状態の正常型タンパク質として発現させる技術として、免疫グロブリンをシャペロニンとの融合タンパク質として発現させる例も知られている（特許文献３）。しかし、これらはすべて単一分子の免疫グロブリン、すなわちモノクローナルの免疫グロブリンである。また、ｃＤＮＡクローンの性状が不安定であることから、精製品の品質が不安定であり、免疫グロブリン製剤としての治療効果や品質管理上に問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平５−３０４９８９号公報。
【特許文献２】特開２０００−１４３８３号公報。
【特許文献３】特開２００４−８１１９９号公報。
【特許文献４】特開２００５−３１２４４５号公報。
【特許文献５】特開２０１３−１４７４９５号公報。
【特許文献６】米国特許出願公開第２０１３／０１６４２９０号明細書。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
血液製剤に代わる人工免疫グロブリン製剤の提供が求められているが、上述のように現在製造されている人工免疫グロブリンはモノクローナルの免疫グロブリンであり、免疫グロブリン製剤としての治療効果や品質管理上に問題がある。
【００１０】
人工免疫グロブリン製剤の効果には、該製剤が多様な免疫グロブリンの混合物であること、すなわちポリクローナルな免疫グロブリンであることが大きく寄与する。ポリクローナル免疫グロブリン混合物の製造は、多様な免疫グロブリン可変領域に対応する複数種の組換えベクターを調製して組換えベクター混合物を調製し、多様な免疫グロブリン可変領域に対応する複数種のポリペプチドを組換え体内で発現させてそれらのポリペプチド混合物を調製することにより実施できる。しかしながら、このような方法で製造された人工ポリクローナル免疫グロブリン混合物には、精製品の性状が一定しないという問題点があった。
【００１１】
本発明者は、上記問題点を解決すべく、免疫グロブリンの重鎖可変領域と重鎖定常領域１とヒンジ部分（ＶＨ−ＣＨ１−ｈｉｎｇｅ）とからなる単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）をコードする複数種の遺伝子の発現用ベクターの混合物を調製することを含む人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法を考案した（特許文献４）。該製造方法は、ＳｃＦｖをコードするただ１種の遺伝子を含むベクターの調製も含み得る。
【００１２】
本発明の課題は、治療効果および安全性が高く、かつ安定的な大量供給が可能な人工ポリクローナル免疫グロブリン組成物を提供することである。本発明の課題は、治療効果および安全性が高く、かつ安定的な大量供給が可能な人工免疫グロブリン断片組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は上記課題を解決すべく、ヒト免疫グロブリンの重鎖可変領域と重鎖定常領域１とヒンジ部分（ＶＨ−ＣＨ１−ｈｉｎｇｅ）とからなるヒト単鎖可変断片（ｈＳｃＦｖ）であって、該重鎖可変領域が互いに異なる複数種のｈＳｃＦｖの混合物を、免疫グロブリンを発現している組織または細胞に由来するｃＤＮＡから組換えＤＮＡ技術を用いて製造し、その効果を血管炎モデルマウスを用いて検証した。その結果、配列表の配列番号１から２０４に記載されたアミノ酸配列で表される２０４のポリペプチドの混合物が、血管炎モデルマウスにおける血管炎症状を軽減することを見出した（特許文献５、６）。本発明者はまた、任意の数のｈＳｃＦｖ、例えば、ただ１種類のｈＳｃＦｖを含み得る組成物を製造した。その結果、本発明者はまた、ただ１種類のｈＳｃＦｖが血管炎、腎炎、糸球体腎炎、肺炎、皮膚炎、またはそれらの任意の組み合わせを、モデルマウスにおいて十分に緩和し得ることを見出した。
【００１４】
すなわち、本発明は以下に関する：
１．ただ１種類の人工免疫グロブリン単鎖可変断片を有効成分として含み、該人工免疫グロブリン単鎖可変断片が配列番号３１に記載されたアミノ酸配列を含むポリペプチドである、人工免疫グロブリン断片組成物、
２．ただ１種類の人工免疫グロブリン単鎖可変断片を有効成分として含み、該人工免疫グロブリン単鎖可変断片が配列番号３１に記載されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである、人工免疫グロブリン断片組成物、
３．ただ１種類の人工免疫グロブリン単鎖可変断片を有効成分として含み、該人工免疫グロブリン単鎖可変断片が配列番号３１に記載されたアミノ酸配列を含むポリペプチドである、感染性疾患または炎症性疾患の治療用医薬組成物、
４．ただ１種類の人工免疫グロブリン単鎖可変断片を有効成分として含み、該人工免疫グロブリン単鎖可変断片が配列番号３１に記載されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである、感染性疾患または炎症性疾患の治療用医薬組成物、
５．前記感染性疾患または炎症性疾患が、血管炎、腎炎、糸球体腎炎、肺炎、皮膚炎、またはそれらの組み合わせである、前項３．または４．の医薬組成物。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、免疫グロブリンを発現している組織または細胞に由来するｃＤＮＡから組換えＤＮＡ技術を用いて製造された、免疫グロブリンの重鎖可変領域と重鎖定常領域１とヒンジ部分（ＶＨ−ＣＨ１−ｈｉｎｇｅ）とからなるＳｃＦｖ、例えばｈＳｃＦｖであって、該重鎖可変領域が互いに異なる複数種のＳｃＦｖ、例えばｈＳｃＦｖを有効成分として含む人工ポリクローナル免疫グロブリン組成物を提供できる。例えば、配列表の配列番号１から２０４に記載されたアミノ酸配列で表される２０４のポリペプチドを有効成分として含む人工ポリクローナル免疫グロブリン組成物を提供できる。
【００１６】
本発明に係る人工ポリクローナル免疫グロブリン組成物は、血液由来の免疫グロブリン製剤と同様に多様の免疫グロブリンを含んでいる。したがって、本発明に係る人工ポリクローナル免疫グロブリン組成物は、治療効果が高く、さらに感染リスクが極めて低いために安全性が高く、かつ安定的な大量供給が可能である。そのため、本発明に係る人工ポリクローナル免疫グロブリン組成物は、ＩＶＩｇ治療に極めて有用である。
【００１７】
本発明によれば、免疫グロブリンを発現している組織または細胞に由来するｃＤＮＡから組換えＤＮＡ技術を用いて製造された人工免疫グロブリン断片組成物を提供できるが、該組成物は有効成分として任意の数のＳｃＦｖ、例えばｈＳｃＦｖを含み、該ＳｃＦｖはそれぞれ免疫グロブリンの重鎖可変領域と重鎖定常領域１とヒンジ部分（ＶＨ−ＣＨ１−ｈｉｎｇｅ）とから構成され、該重鎖可変領域は互いに異なるものである。例えば、配列表の配列番号１から２０４に記載されたアミノ酸配列で表される２０４のポリペプチドの任意の組み合わせ、任意の部分的組み合わせ、またはただ１つを有効成分として含む人工免疫グロブリン断片組成物を提供することができる。例えば、前記ただ１つのポリペプチドは、配列番号３１のアミノ酸を含む、または、該アミノ酸からなるものであり得る。
【００１８】
本発明に係る人工免疫グロブリン断片組成物は、血液由来の免疫グロブリン製剤中にみられるような複数の免疫グロブリンを代理するものである。したがって、本発明に係る人工免疫グロブリン断片組成物は、治療効果が高く、さらに感染リスクが極めて低いために安全性が高く、かつ安定的な大量供給が可能である。そのため、本発明に係る人工免疫グロブリン断片組成物は、ＩＶＩｇ治療に極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ヒト単鎖可変断片（ｈＳｃＦｖ）のクローニングについて説明する図である。（実施例１）
【図２】複数種のｈＳｃＦｖからなる混合物の治療効果を、血管炎自然発症モデルマウスであるＳＣＧ／Ｋｊマウスを使用して検証したスケジュールを説明する図である。（実施例２）
【図３】ｈＳｃＦｖ混合物の投与により、血管炎の指標である血清中ＭＰＯ−ＡＮＣＡ値の減少が認められたことを示す図である。図中、記号「＊」は、有意差（Ｐ＜０．０５）があることを示す。（実施例２）
【図４】ｈＳｃＦｖ混合物の投与により、脾臓重量の低下傾向が認められたことを示す図である。（実施例２）
【図５−Ａ】ｈＳｃＦｖ混合物の投与により、末梢血中の白血球数およびリンパ球数が低下したことを示す図である。図中、記号「＊」は、有意差（Ｐ＜０．０５）があることを示す。（実施例２）
【図５−Ｂ】ｈＳｃＦｖ混合物の投与により、末梢血中の単球数および顆粒球（好中球）数が低下したことを示す図である。（実施例２）
【図５−Ｃ】ｈＳｃＦｖ混合物の投与により、末梢血中の血小板数が低下したことを示す図である。図中、記号「＊」は、有意差（Ｐ＜０．０５）があることを示す。（実施例２）
【図６】ＱＲｑ０１クローンのｈＳｃＦｖを用いた治療により糸球体中の半月体形成が減少したことを示す図である（実施例３）。
【図７】ＱＲｑ０１クローンのｈＳｃＦｖを用いた治療による腎臓内糸球体中の半月体形成の回復について組織学的観察を示す図である（実施例３）。
【図８】ＱＲｑ０１クローンのｈＳｃＦｖを用いた治療による肺臓内の炎症の回復について組織学的観察を示す図である（実施例３）。
【図９−Ａ】ＱＲｑ０１クローンのｈＳｃＦｖを用いた治療による末梢血中の白血球数、リンパ球数を示す図である（実施例３）。
【図９−Ｂ】ＱＲｑ０１クローンのｈＳｃＦｖを用いた治療による末梢血中の単球数、顆粒球（好中球）数を示す図である（実施例３）。
【図１０】ＱＲｑ０１クローンのｈＳｃＦｖを用いた治療による脾臓重量の回復を示す図である（実施例３）。
【図１１】ＱＲｑ０１クローンのｈＳｃＦｖを用いた治療による脾臓内の炎症の回復について組織学的観察を示す図である（実施例３）。
【図１２−Ａ】ＱＲｑ０１クローンのｈＳｃＦｖを用いた治療による血清中のＭＰＯ−ＡＮＣＡの減少を示す図である。
【図１２−Ｂ】ＱＲｑ０１クローンのｈＳｃＦｖを用いた治療による血清中の抗モエシン抗体の減少を示す図である。
【図１３】ＱＲｑ０１クローンのｈＳｃＦｖを用いた治療による血清中のサイトカイン／ケモカイン  レベルの減少を示す図である（実施例３）。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、人工ポリクローナル免疫グロブリン組成物に関する。より詳しくは、本発明は、免疫グロブリンの重鎖可変領域と重鎖定常領域１とヒンジ部分（ＶＨ−ＣＨ１−ｈｉｎｇｅ）とからなる単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）であって、該重鎖可変領域が互いに異なる複数種の単鎖可変断片を有効成分として含む人工ポリクローナル免疫グロブリン組成物に関する。
【００２１】
本発明はまた、人工免疫グロブリン断片組成物に関する。より詳しくは、本発明は、複数種の任意の数の単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）であって、それぞれが免疫グロブリンの重鎖可変領域と重鎖定常領域１とヒンジ部分（ＶＨ−ＣＨ１−ｈｉｎｇｅ）とで構成され、該重鎖可変領域が互いに異なる単鎖可変断片を有効成分として含む人工免疫グロブリン断片組成物に関する。例えば、該人工免疫グロブリン断片組成物は、ただ１種のＳｃＦｖまたは単一のＳｃＦｖを含有し得る。本発明に係る人工免疫グロブリン断片組成物は、好ましくはただ１種のｈＳｃＦｖまたは単一のｈＳｃＦｖを含有するものであり得る。
【００２２】
ポリクローナル免疫グロブリン組成物は、抗原特異性の異なる複数種の免疫グロブリンを含む組成物を意味する。免疫グロブリン断片組成物は、抗原特異性の異なる複数種の任意の数の免疫グロブリンを含む組成物を意味する。例えば、組成物は、特定の抗原特異性を有するただ１種類の免疫グロブリンを含み得る。特定の抗原特異性を有するただ１種類の免疫グロブリンを含有する組成物を、モノクローナル免疫グロブリン組成物と称することがある。
【００２３】
本発明に係る人工ポリクローナル免疫グロブリン組成物は、好ましくは、配列表の配列番号１から２０４に記載されたアミノ酸配列で表される２０４のポリペプチドを有効成分として含む人工ポリクローナル免疫グロブリン組成物である。本ポリペプチドは、ヒトガンマグロブリンの重鎖可変領域と重鎖定常領域１とヒンジ部分（ＶＨ−ＣＨ１−ｈｉｎｇｅ）とからなるヒト単鎖可変断片（ｈＳｃＦｖ）であって、健常成人末梢血単核球から抽出したＲＮＡから組換えｃＤＮＡ技術を使用して製造されたポリペプチドである。本発明に係る人工免疫グロブリン断片組成物は、好ましくは、配列番号１から２０４に記載されたアミノ酸配列で表される２０４のポリペプチドの少なくとも１つ、例えば配列番号３１に記載されたアミノ酸配列で表されるポリペプチドを有効成分として含む人工ポリクローナル免疫グロブリン組成物である。本発明に係る人工免疫グロブリン断片組成物は、また、配列番号３１に記載されたアミノ酸配列を含むポリペプチド、好ましくは配列番号３１に記載されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを有効成分として含む人工ポリクローナル免疫グロブリン組成物であり得る。さらに、本発明に係る人工免疫グロブリン断片組成物は、ただ１種類のＳｃＦｖを含む人工免疫グロブリン断片組成物であって、ここで、該ＳｃＦｖが好ましくは配列番号１から２０４に記載されたアミノ酸配列で表される２０４のポリペプチドから選ばれる１つのポリペプチド、好ましくは、配列番号３１に記載されたアミノ酸配列を含むポリペプチド、より好ましくは配列番号３１に記載されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである、人工免疫グロブリン組成物であり得る。
【００２４】
本発明に係る人工ポリクローナル免疫グロブリン組成物および／または人工免疫グロブリン断片組成物は、必要に応じて、医薬用に許容される担体（医薬用担体）を含む医薬組成物として製造できる。
【００２５】
医薬用担体は、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤および賦形剤を例示できる。これらは得られる製剤の投与形態に応じて適宜選択して使用される。より具体的には、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースを例示できる。これらは、本薬剤の剤形に応じて適宜１種類または２種類以上を組み合わせて使用される。そのほか、安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、界面活性剤、およびｐＨ調整剤などを適宜使用することもできる。安定化剤は、例えばヒト血清アルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体を例示できる。Ｌ−アミノ酸は、特に限定はなく、例えばグリシン、システイン、グルタミン酸などのいずれでもよい。糖類も特に限定はなく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖などの単糖類、マンニトール、イノシトール、キシリトールなどの糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖などの二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸などの多糖類などおよびそれらの誘導体などのいずれでもよい。セルロース誘導体も特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのいずれでもよい。界面活性剤も特に限定はなく、イオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤のいずれも使用できる。界面活性剤には、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系などが包含される。緩衝剤は、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸および／またはそれらに対応する塩（例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）を例示できる。等張化剤は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリンを例示できる。キレート剤は、例えばエデト酸ナトリウム、クエン酸を例示できる。
【００２６】
本発明に係る人工ポリクローナル免疫グロブリン組成物および／または人工免疫グロブリン断片組成物に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択される。通常約０．００００１−７０重量％、好ましくは０．０００１−５重量％程度の範囲である。
【００２７】
本発明に係る人工ポリクローナル免疫グロブリン組成物および／または人工免疫グロブリン断片組成物の用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無など）、および担当医師の判断などに応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり０．０１μｇ乃至１００ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ乃至１ｍｇ程度の範囲である。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行うことができる。上記投与量は１日１回乃至数回に分けて投与することができる。また、必要に応じて、従来行われていたＩＶＩｇ治療で使用されていた用量を参考にして、大量に投与することも可能である。
【００２８】
投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択することができる。この場合、疾患、症状などに応じた適当な投与経路を選択する。本発明に係る薬剤は、経口経路および非経口経路のいずれによっても投与できる。非経口経路としては、通常の静脈内投与、動脈内投与のほか、皮下、皮内、筋肉内などへの投与を挙げることができるが、静脈内投与がより好ましい。特に、ＩＶＩｇ治療で大量に投与する場合は、静脈内投与により投与されることが好ましい。
【００２９】
剤形は、特に限定されず、種々の剤形とすることができる。例えば、溶液製剤として使用できるほかに、これを凍結乾燥化し保存し得る状態にした後、用時、水や生理的食塩水などを含む緩衝液などで溶解して適当な濃度に調製した後に使用することもできる。また持続性剤形または徐放性剤形であってもよい。
【００３０】
具体的には、非経口剤としては、例えば、静脈内注射剤、皮下注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤などの注射剤、経皮投与または貼付剤、軟膏またはローション、口腔内投与のための舌下剤、口腔貼付剤、並びに経鼻投与のためのエアゾール剤、坐剤とすることができるが、これらに限定されない。経口投与のためには、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁液、溶液剤、酒精剤、シロップ剤、エキス剤、エリキシル剤とすることができる。これらの製剤は、製剤工程において通常用いられる公知の方法により製造することができる。
【００３１】
注射剤を調製する場合は、上記化合物にｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤などを添加し、常法により皮下、筋肉内および静脈内用注射剤を製造することができる。この場合のｐＨ調節剤および緩衝剤としてはクエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどを挙げることができる。安定化剤としてはピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、チオグリコール酸、チオ乳酸などを挙げることができる。局所麻酔剤としては塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどを挙げることができる。等張化剤としては、塩化ナトリウム、ブドウ糖などを例示できる。
【００３２】
経口用固形製剤を調製する場合は、上記有効成分に賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤などを加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などを製造することができる。そのような添加剤としては、当該分野で一般的に使用されるものでよく、例えば、賦形剤としては、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などを、結合剤としては、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどを、崩壊剤としては乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などを、滑沢剤としては精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどを、矯味剤としては白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などを例示できる。
【００３３】
経口用液体製剤を調製する場合は、上記化合物に矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯臭剤などを加えて常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤などを製造することができる。この場合矯味剤としては上記に挙げられたもので良く、緩衝剤としてはクエン酸ナトリウムなどが、安定化剤としてはトラガント、アラビアゴム、ゼラチンなどを挙げることができる。
【００３４】
本発明に係る人工ポリクローナル免疫グロブリン組成物および／または人工免疫グロブリン断片組成物は、免疫グロブリン投与治療、例えばＩＶＩｇが奏功する疾患の治療に有用である。このような疾患として、感染症、炎症性疾患、特発性血小板減少性紫斑病、無ガンマグロブリン血症、川崎病急性期、ギラン・バレー症候群、並びに血管炎であるチャーグ・ストラウス症候群など、好ましくは感染症および炎症性疾患、より好ましくは血管炎を例示できる。このような疾患としてまた、腎炎および／または糸球体腎炎を例示できる。さらに、肺炎や皮膚炎などの疾患を例示できる。血管炎は、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症（Ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ  Ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｓｉｓ  ｗｉｔｈ  Ｐｏｌｙａｎｇｉｔｉｓ：ＥＧＰＡ、旧名  アレルギー性肉芽腫性血管炎、チャーグ・ストラウス症候群）、顕微鏡的多発血管炎（ＭＰＡ）、急速進行性糸球体腎炎、血管炎によるびまん性肺胞出血および間質性肺炎、結節性多発動脈炎、多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ、旧名：ウェゲナー肉芽腫症）などを挙げることができる。本発明に係る人工ポリクローナル免疫グロブリン組成物および／または人工免疫グロブリン断片組成物の適用症はこれら疾患に限定されず、免疫グロブリン製剤が奏功する疾患であればいずれの疾患にも適用できる。また、上記疾患から選択される２つ以上の疾患を組み合わせて発症する症例に適用することができる。
【００３５】
本発明はまた、本発明に係る人工ポリクローナル免疫グロブリン組成物および／または人工免疫グロブリン断片組成物を投与することを含む、感染症または炎症性疾患の治療方法を提供する。
【００３６】
本発明はさらに、配列表の配列番号１から２０４に記載されたアミノ酸配列で表されるポリペプチドの、感染症または炎症性疾患の治療用医薬組成物の製造における使用を提供する。複数種の任意の数のポリペプチドを、本発明に係る組成物、方法、および使用に従って、用いることができる。例えば、ただ１種類のペプチド、１〜１５０種類のポリペプチド、１〜１００種類のポリペプチド、１〜７５種類のポリペプチド、１〜５０種類のポリペプチド、１〜２５種類のポリペプチド、１〜１０種類のポリペプチド、５種類のポリペプチド、４種類のポリペプチド、３種類のポリペプチド、または２種類のポリペプチドを用いることができる。
【００３７】
本発明に係る人工ポリクローナル免疫グロブリン組成物および／または人工免疫グロブリン断片組成物の有効成分であるポリペプチドは、例えば組換えＤＮＡ技術を使用して製造できる。具体的にはまず、複数種の該ポリペプチドをコードする複数種の遺伝子を混合し、得られた遺伝子混合物を適当なベクターに接触させて組込み、得られた組換えベクターの混合物を、適当な宿主内にトランスフェクションし、得られた形質転換体を培養して該複数種の遺伝子を発現させ、該培養物からそれら遺伝子によりコードされるポリペプチドの混合物を採取し、精製することにより製造できる。
【００３８】
ベクターは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、宿主の種類および使用目的により適宜選択される。ベクターは、天然に存在するものを抽出したもののほか、複製に必要な部分以外のＤＮＡの部分が一部欠落しているものでもよい。代表的なものとして、プラスミド、バクテリオファージおよびウイルス由来のベクターを例示できる。プラスミドとして、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミドなどを例示できる。バクテリオファージとして、λファージなどを例示できる。ウイルス由来のベクターとして、例えばレトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、パポバウイルス、ＳＶ４０、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病ウイルスなどの動物ウイルス由来のベクター、あるいはバキュロウイルスなどの昆虫ウイルス由来のベクターを例示できる。その他、トランスポゾン由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来のベクターなどを例示できる。あるいは、これらを組合せて作成したベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝学的エレメントを組合せて作成したベクター（コスミドやファージミドなど）を例示できる。
【００３９】
ベクターには、目的遺伝子の機能が発揮されるように遺伝子を組込むことが必要であり、少なくとも目的遺伝子配列とプロモーターとをその構成要素とする。これら要素に加えて、所望によりさらに、複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列、例えば、リボソーム結合配列、ターミネータ、シグナル配列、エンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、および選択マーカーなどから選択した１つまたは複数の遺伝子配列を自体公知の方法により組合せてベクターに組込むことができる。選択マーカーとして、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子などを例示できる。
【００４０】
ベクターに目的遺伝子配列を組込む方法は、自体公知の方法を適用できる。例えば、目的遺伝子配列を適当な制限酵素により処理して特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターと混合し、リガーゼによって再結合する方法が使用される。あるいは、目的遺伝子配列に適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターのマルチクローニングサイトへ挿入することによっても、所望の組換えベクターが得られる。
【００４１】
宿主として、原核生物および真核生物のいずれも使用できる。原核生物として、例えば大腸菌（エシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ））などのエシェリヒア属、枯草菌などのバシラス属、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）などのシュードモナス属、リゾビウムメリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）などのリゾビウム属に属する細菌を例示できる。真核生物として、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）などの酵母、Ｓｆ９やＳｆ２１などの昆虫細胞、あるいはサル腎由来細胞（ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３細胞、ヒトＦＬ細胞や２９３ＥＢＮＡ細胞、アフリカツメガエル卵母細胞などの動物細胞を例示できる。
【００４２】
ベクターの宿主細胞への導入は、自体公知の手段が応用でき、例えば成書に記載されている標準的な方法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー）により実施できる。
【００４３】
本発明に係る人工ポリクローナル免疫グロブリン組成物および／または人工免疫グロブリン断片組成物の有効成分であるポリペプチドは、免疫グロブリンの重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖定常領域一部（ＣＨ１）とを含む融合タンパク質である。抗体重鎖定常領域はその抗体の安定性に寄与するため、本発明に係るポリペプチドは安定性が高く、より血中半減期が長い人工ポリクローナル免疫グロブリン組成物を提供することができる。
【００４４】
本発明に係る人工ポリクローナル免疫グロブリン組成物および／または人工免疫グロブリン断片組成物の有効成分であるポリペプチドは、したがって、製造において宿主細胞として大腸菌を使用して製造できるため、大量培養が容易である。本発明に係るポリペプチドは、簡便かつ大量に製造することができるため、安定的な大量供給が可能である。
【００４５】
本発明に係る人工ポリクローナル免疫グロブリン組成物および／または人工免疫グロブリン断片組成物は、血液由来の免疫グロブリン製剤と同様に多様の免疫グロブリンを含んでいる。したがって、本発明に係る人工ポリクローナル免疫グロブリン組成物および／または人工免疫グロブリン断片組成物は、従来の免疫グロブリン製剤と同様の効果を有する。また、本発明に係る人工ポリクローナル免疫グロブリン組成物および／または人工免疫グロブリン断片組成物は、人工的に製造されているためにウイルスなどの微生物を含まず、感染リスクが極めて少なく、非常に安全性が高い。
【００４６】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明する。本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。下記実施例において、免疫グロブリン遺伝子を抽出するために使用した血液試料の採取は全て、インフォームドコンセントを行って血液提供者の意思確認をした後に実施したものである。
【実施例１】
【００４７】
ヒト人工ガンマグロブリンのクローニングと、その大量培養およびタンパク精製を行った。ヒト人工ガンマグロブリンとして、ヒトガンマグロブリンの重鎖可変領域と重鎖定常領域１とヒンジ部分（ＶＨ−ＣＨ−ｈｉｎｇｅ）とからなるヒト単鎖可変断片（ｈＳｃＦｖ）を、特許文献４に記載の方法により製造した。
【００４８】
１．ｈＳｃＦｖのクローニング（図１）
インフォームドコンセントを得た健常成人２０人の末梢血より末梢血単核球（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ；ＭＮＣ）を分離し、そこからトータルＲＮＡを常法により抽出してプールした。ＶＨの５´端末およびヒンジ領域の３´端末のコンセンサス配列を用いてプライマーを設定した。トータルＲＮＡを鋳型として、コンセンサスプライマーで逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＴ）を行いＶＨ−ＣＨ１−ｈｉｎｇｅをコードするポリクローナルなｃＤＮＡを得た。３´端末にヒスチジン６個をコードする配列を付加した３´端末側プライマーを用いてｃＤＮＡの３´端末にヒスチジンタグコード領域を付加するとともに、５´末端には１６塩基のベクターとの相同配列を付加した。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎシステムを用いてｐＢＡＤベクターに相同入れ替えによってｃＤＮＡを組み込み、ヒートショック法により大腸菌を形質転換させた。アンピシリン含有選択培地上で生育できる形質転換した菌のコロニーを１０００クローン拾い上げ、個々のクローンからプラスミドＤＮＡを抽出してベクター内に組み込まれたｃＤＮＡの塩基配列を、蛍光ターミネータを用いたサンガー法により分析し決定した。また個々のクローンの菌体からタンパク抽出を行い硫酸ドデシルナトリウム−ポリアクリル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で展開した後、ウエスタンブロットにより抗ヒトＦａｂ抗体を用いて、ＶＨ−ＣＨ１−ｈｉｎｇｅがタンパクとして合成されているかを確認した。配列解析からＶＨ−ＣＨ１−ｈｉｎｇｅのポリペプチドを発現できる２７２クローンから、重複しているクローンや、ＶＨ−ＣＨ１−ｈｉｎｇｅの構造が壊れているクローン（異構造クローン２１、重複クローン４６）を除き、最終的にユニーク配列を持つ２０４クローンを得た。これらのクローンを混合し組換えタンパクを発現させた。
【００４９】
２．ｈＳｃＦｖの大量培養とタンパク精製
クローニングで得られたＶＨ−ＣＨ１−ｈｉｎｇｅタンパクを発現するクローンを５００ｍｌのＬＢ培地に混合して３７℃で１６時間培養し、最終濃度１５％のグリセロールを加え、１０ｍｌずつチューブに分注し、−８０℃で凍結保存し、マスターミックスシードとして使用した。５ＬのＬＢ培地に溶解したマスターミックスシードを加え、３７℃で６時間培養、ＯＤ６００が０．４〜０．６になったところで、アラビノースを０．００２％になるように添加し発現誘導し、さらに３７℃にて１６時間培養を行い、遠心により菌体を回収した。得られた菌体をトリス−エチレンジアミン四酢酸（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ）バッファー（ｐＨ８．０）に懸濁し、デオキシコール酸およびリゾチームを添加し、３７℃で撹拌して菌体を可溶化し、さらにＤＮａｓｅＩを添加して大腸菌のＤＮＡを分解し、超音波処理により十分に可溶化した。この懸濁液を高速遠心し不溶性画分（封入体）を沈殿させ、回収した。この不溶性画分を３Ｍ  尿素で洗浄し遠心により回収した後、８Ｍ  尿素で懸濁し室温で１昼夜放置し目的タンパクを可溶化した。高速遠心により不溶性画分を除去し、上清をニッケルキレートカラム（Ｈｉｓ−ｔｒａｐ）によるクロマトグラフィーにより目的タンパクを分離した。さらに精製のためニッケルキレートカラム（Ｈｉｓ−ｔｒａｐ）クロマトグラフィーを再度行い高度精製した。
【００５０】
３．エンドトキシンの除去（低減化）
得られた精製タンパクにはエンドトキシンが混入しており、これを除去するために、タンパク溶液を６Ｍ  グアニジン塩酸を強アルカリにしたバッファーに対し透析し、強アルカリ環境の下に３昼夜放置し、エンドトキシンの加水分解を進め、１０ｋ  ポアの限外濾過によって分解物を除去し、エンドトキシンの低減化を行った。
【００５１】
４．結果
配列表の配列番号１から２０４に記載のアミノ酸配列で表される２０４の異なるポリペプチドをコードする２０４のクローンが得られた。すなわち、２０４の異なるｈＳｃＦｖが得られた。２０４の異なるｈＳｃＦｖの混合物を精製した精製標品に含まれるエンドトキシン濃度は、１０〜５ｎｇ／１ｍｇ  ｈＳｃＦｖであった。
【実施例２】
【００５２】
実施例１で製造した複数種のｈＳｃＦｖからなる混合物の血管炎に対する治療効果を、血管炎自然発症モデルマウスであるＳＣＧ／Ｋｊマウスを使用して検討した。使用したｈＳｃＦｖ混合物は、配列表の配列番号１から２０４に記載のアミノ酸配列で表される２０４の異なるポリペプチドからなる。ｈＳｃＦｖ混合物は、０．４５Ｍ  アルギニン（Ａｒｇ）、０．４５％  グリシン（Ｇｌｙ）、および０．９％  塩化ナトリウムを含む１．５％  Ｄ−マンニトールに溶解して使用した。
【００５３】
まず、１０週齢のＳＣＧ／ＫｊマウスにｈＳｃＦｖを１０〜４０ｍｇ／Ｋｇ／ｄａｙの処方で腹腔内投与（ｉｐ）により５日間連続投与し、１３週齢になったところで、ＣＯ２ガスにて安楽殺し、血管炎の指標である血清中のＭＰＯ−ＡＮＣＡ（ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉ−ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）値、脾臓重量、末梢血中の白血球数、リンパ球数、単球数、顆粒球（好中球）数、および血小板数を測定し、その結果により治療効果を判定した（図２）。
【００５４】
ｈＳｃＦｖ混合物の投与により、血管炎の指標である血清中ＭＰＯ−ＡＮＣＡ値の減少が認められた（図３）。また、脾臓重量の低下傾向が認められ（図４）、さらに、末梢血中の白血球数、リンパ球数、単球数、顆粒球（好中球）数、血小板数が低下した（図５−Ａ、５−Ｂ、および５−Ｃ）。以上の結果から、ｈＳｃＦｖ混合物の治療効果が認められた。
【実施例３】
【００５５】
本発明に係る２０４のｈＳｃＦｖポリペプチドについてさらなる解析を実施し、ＳＣＧ／Ｋｊマウスの炎症症状への特定のｈＳｃＦｖ断片の相対的有効性を測定した。ＳＣＧ／Ｋｊマウスは血管炎自然発症モデルマウスであり、急速進行性糸球体腎炎モデルとしても知られている。本実施例で説明するように、ポリペプチドの１つ、すなわち配列番号３１のアミノ酸配列を有するポリペプチドがＳＣＧ／Ｋｊマウスの腎機能に強力な改善効果、例えば増加した半月体形成率の改善、腎糸球体組織傷害の改善、および肺組織傷害の改善を示した。さらに、該ポリペプチドはまた、ＳＣＧ／Ｋｊマウスの免疫学的機能に改善効果を示した。これら改善効果に加えて、増加した脾臓重量および脾臓組織切片に認められた異常が改善された。これら改善効果に加えてまた、末梢血中の増加した白血球数、リンパ球数、単球数、および顆粒球数が改善された。これら結果は、該ポリペプチドが腎炎、例えば糸球体腎炎などの炎症性疾患の治療に有効であることを示す。
【００５６】
１．材料および方法
【００５７】
［組換えｈＳｃＦｖタンパク質の精製］
【００５８】
実施例１で製造した２０４クローンのｈＳｃＦｖライブラリから、複数種の組換えｈＳｃＦｖタンパク質を単離した。２０４クローンをｑ群、ｔ群、ｄ群、ｕ群の４群に分け、次いで各群内のクローンの１クローンずつからｈＳｃＦｖを精製した。ｈＳｃＦｖタンパク質を血管炎自然発症モデルであるＳＣＧ／Ｋｊマウスに腹腔内投与して治療を行った。各クローンの精製タンパク質は次のように単離した。クローンの培養を３Ｌ行い、次いで菌体を２０  ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて超音波破砕後、ニッケルカラムクロマトグラフィー、ブチルセファロースカラムクロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セファロースカラムクロマトグラフィー、コバルト−セファロースカラムクロマトグラフィーで処理し、その後、９％  塩化ナトリウム、１．５％  Ｄ−マンニトールを含むＰＢＳに置換した。上記手法による検討を繰り返し行って４クローンを選択し、有効な群を得た。
【００５９】
［治療の評価］
【００６０】
ｈＳｃＦｖを１０週齢の雌性ＳＣＧ／Ｋｊマウスに１〜４０ｍｇ／Ｋｇ／ｄａｙの濃度で５日間に亘って腹腔内投与（ｉｐ）し、１３週齢になったところで該マウスをＣＯ２ガスにて安楽殺した。血管炎のバイオマーカである血清中のＭＰＯ−ＡＮＣＡ（ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉ−ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）値、抗モエシン抗体、およびサイトカイン／ケモカイン、脾臓重量、血液細胞中の白血球（ＷＢＣ）数、リンパ球数、単球数、顆粒球（好中球）数を測定した。
【００６１】
さらに、腎臓、肺、および脾臓を１０％  ホルマリンで固定した後、パラフィン包埋して組織切片をスライド上に作成し、ヘマトキシリンエオジン（ＨＥ）染色した。該スライドグラス上の糸球体組織中の最も重要な指標である半月体形成を顕微鏡により観察した。また、該スライドグラス上で肺および脾臓の組織学的観察を行った。
【００６２】
統計解析はスチューデントのｔ−検定により実施した。
【００６３】
２．結果
【００６４】
選択した４クローンの中で、クローンＱＲｑ０１がＳＣＧ／Ｋｊマウスにおける炎症の諸症状の低減に最も効果があった。クローンＱＲｑ０１は配列番号３１に記載のポリペプチドをコードする。結果を図６−図１３に示す。
【００６５】
図６は、クローンＱＲｑ０１  ｈＳｃＦｖ治療により糸球体中の半月体形成が減少したことを示す。糸球体中の半月体形成は、糸球体組織内の血管炎の最も主要な指標であり、そしてＳＣＧ／Ｋｊマウスにおいて増加していたが、クローンＱＲｑ０１  ｈＳｃＦｖを１ｍｇ／Ｋｇ／ｄａｙの濃度で５日間に亘り投与することにより有意に減少した。
【００６６】
図７は、クローンＱＲｑ０１  ｈＳｃＦｖ治療による腎臓内の糸球体中半月体形成の回復について組織学的観察結果を示す。具体的には、  図７は、クローンＱＲｑ０１  ｈＳｃＦｖを１ｍｇ／Ｋｇ／ｄａｙの濃度で５日間に亘り投与することによる糸球体中半月体形成の評価における腎臓組織切片の顕微鏡観察結果を示す。ＳＣＧ／Ｋｊマウスにおける半月体形成は、ほとんど正常糸球体の半月体形成といっていい程度に回復した。図７において、「白丸」は糸球体を指す。
【００６７】
図８は、クローンＱＲｑ０１  ｈＳｃＦｖ治療による肺臓内の炎症の回復について組織学的観察結果を示す。具体的には、  図８は、クローンＱＲｑ０１  ｈＳｃＦｖを１ｍｇ／Ｋｇ／ｄａｙの濃度で５日間に亘り投与することによる肺組織切片の組織学的観察結果を示す。ｈＳｃＦｖ治療をしないコントロールＳＣＧ／Ｋｊマウスでは、組織像で血管炎、出血像、およびリンパ濾胞が観察された。ｈＳｃＦｖ治療により、組織像はほぼ正常を示した。
【００６８】
図９−Ａおよび９−Ｂは、クローンＱＲｑ０１  ｈＳｃＦｖ治療による末梢血中の白血球数、リンパ球数、単球数、顆粒球（好中球）数を示す。ＳＣＧ／Ｋｊマウスで増加していた末梢血中の白血球（ＷＢＣ）数およびリンパ球数（図９−Ａ）、単球数および顆粒球（好中球）数（図９−Ｂ）は、クローンＱＲｑ０１  ｈＳｃＦｖを１ｍｇ／Ｋｇ／ｄａｙの濃度で５日間に亘り投与することにより減少した。
【００６９】
図１０は、クローンＱＲｑ０１  ｈＳｃＦｖ治療による脾臓重量の回復を示す。ＳＣＧ／Ｋｊマウスで増加していた脾臓重量は、クローンＱＲｑ０１  ｈＳｃＦｖを１ｍｇ／Ｋｇ／ｄａｙの濃度で５日間に亘り投与することにより減少した。
【００７０】
図１１は、クローンＱＲｑ０１  ｈＳｃＦｖ治療による脾臓内の炎症の回復について組織学的観察結果を示す。クローンＱＲｑ０１  ｈＳｃＦｖを１ｍｇ／Ｋｇ／ｄａｙの濃度で５日間に亘り投与することにより、溶媒を投与したコントロールＳＣＧ／Ｋｊマウスでは不明瞭であった脾臓内の赤脾髄と白脾髄が明瞭に認められた。
【００７１】
図１２−Ａおよび１２−Ｂは、クローンＱＲｑ０１  ｈＳｃＦｖ治療による血清中のＭＰＯ−ＡＮＣＡおよび抗モエシン抗体の減少を示す。ＳＣＧ／Ｋｊマウスで増加していた血清中のＭＰＯ−ＡＮＣＡ（図１２−Ａ）および抗モエシン抗体（図１２−Ｂ）は、クローンＱＲｑ０１  ｈＳｃＦｖを１ｍｇ／Ｋｇ／ｄａｙの濃度で５日間に亘り投与することにより減少した。抗モエシン抗体は、ＭＰＯ−ＡＮＣＡと同様、ＡＮＣＡ関連血管炎との関連が注目されており、また、顕微鏡的多発血管炎（ＭＰＡ）などの血管炎で陽性になることや、皮膚動脈炎の結節性多発動脈炎への移行に伴って上昇することが報告されている。したがって、クローンＱＲｑ０１  ｈＳｃＦｖ投与による抗モエシン抗体およびＭＰＯ−ＡＮＣＡの減少結果は、クローンＱＲｑ０１  ｈＳｃＦｖの血管炎治療効果を示すものであると考えることができる。
【００７２】
図１３は、クローンＱＲｑ０１  ｈＳｃＦｖ治療による血清中のサイトカイン／ケモカインのレベルの減少を示す。増加していた血清中のサイトカイン／ケモカインのレベルは、クローンＱＲｑ０１  ｈＳｃＦｖを１ｍｇ／Ｋｇ／ｄａｙの濃度で５日間に亘りＳＣＧ／Ｋｊマウスに投与することにより減少した。図１３において、黒色バーおよび白色バーはそれぞれＱＲｑ０１クローンを投与したマウス群および溶媒を投与したマウス群を指す。
【００７３】
凡例
１  コントロール（溶媒）  
２  クローン＝ＱＲｑ０１（１ｍｇ／Ｋｇ／ｄａｙ）
３  クローン＝ＱＲｑ０１ｐ（１ｍｇ／Ｋｇ／ｄａｙ）
４  クローン＝ＱＲｑ０１（４ｍｇ／Ｋｇ／ｄａｙ）
５  クローン＝Ｒｑ０１（４ｍｇ／Ｋｇ／ｄａｙ）
６  クローン＝ＱＲｔ０１（１ｍｇ／Ｋｇ／ｄａｙ）
７  天然のＩｇＧ（４ｍｇ／Ｋｇ／ｄａｙ）
８  ネガティブコントロール（１ｍｇ／Ｋｇ／ｄａｙ）
９  健常コントロール（Ｃ５７ＢＬ／６）
【００７４】
略称：
ＩＬ−１ａ：インターロイキン−１α（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ａｌｐｈａ）
ＩＬ−１ｂ：インターロイキン−１β（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｂｅｔａ）
ＩＬ−２：インターロイキン−２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２）
ＩＬ−３：インターロイキン−３（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３）
ＩＬ−４：インターロイキン−４（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４）
ＩＬ−５：インターロイキン−５（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−５）
ＩＬ−６：インターロイキン−６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６）
ＩＬ−９：インターロイキン−９（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−９）
ＩＬ−１０：インターロイキン−１０（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０）
ＩＬ１２ｐ４０：インターロイキン−１２  サブユニット  ｐ４０（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１２  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｐ４０）
ＩＬ−１２ｐ７０：インターロイキン−１２  サブユニット  ｐ７０（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１２  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｐ７０）
ＩＬ−１３：インターロイキン−１３（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１３）
ＩＬ−１７：インターロイキン−１７（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１７）
Ｅｏｔａｘｉｎ：エオタキシン（ｅｏｔａｘｉｎ）
Ｇ−ＣＳＦ：顆粒球コロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）
ＧＭ−ＣＳＦ：顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）
ＩＦＮ−ｇ：インターフェロンγ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇａｍｍａ）
ＫＣ：ケラチノサイト由来ケモカイン（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）
ＭＣＰ−１：単球走化性因子タンパク質−１（ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１）
ＭＩＰ−１ａ：マクロファージ炎症性タンパク質−１α（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１  ａｌｐｈａ）
ＭＩＰ−１ｂ：マクロファージ炎症性タンパク質−１β（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１  ｂｅｔａ）
ＲＡＮＴＥＳ：活性化により制御される、正常Ｔ細胞で発現および分泌されるタンパク質（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｎｏｒｍａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ）
ＴＮＦ−ａ：腫瘍壊死因子−α（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ）
ＩＬ−１５：インターロイキン−１５（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１５）
ＩＬ−１８：インターロイキン−１８（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１８）
ＦＧＦ−ｂａｓｉｃ：塩基性−線維芽細胞増殖因子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂａｓｉｃ）
ＬＩＦ：白血病阻止因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）
Ｍ−ＣＳＦ：マクロファージコロニー刺激因子（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）
ＭＩＧ：インターフェロンγ誘導性モノカイン（ｍｏｎｏｋｉｎｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇａｍｍａ）
ＭＩＰ−２：マクロファージ炎症性タンパク質−２（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ−２）
ＰＤＧＦ−ｂｂ：血小板由来増殖因子−ＢＢ（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ＢＢ）
ＶＥＧＦ：血管内皮増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）
ＩＬ−６ｓＲ：インターロイキン−６可溶性受容体（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）
ＩＬ−２３：インターロイキン−２３（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２３）
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明は、感染性疾患、炎症性疾患、特発性血小板減少性紫斑病、無ガンマグロブリン血症、川崎病急性期、ギラン・バレー症候群、並びに血管炎である好酸球性多発血管炎性肉芽腫症（Ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ  Ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｓｉｓ  ｗｉｔｈ  Ｐｏｌｙａｎｇｉｔｉｓ：ＥＧＰＡ、旧名  アレルギー性肉芽腫性血管炎、チャーグ・ストラウス症候群）、顕微鏡的多発血管炎（ＭＰＡ）、急速進行性糸球体腎炎、血管炎によるびまん性肺胞出血および間質性肺炎、結節性多発動脈炎、多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ、旧名：ウェゲナー肉芽腫症）など、免疫グロブリン投与治療、例えばＩＶＩｇが奏功する疾患に関する医療分野において極めて有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−Ａ】
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【図５−Ｂ】
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【図５−Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−Ａ】
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【図９−Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−Ａ】
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【図１２−Ｂ】
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【図１３】
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【配列表】
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