(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜１０に示す塩基配列からなるプローブを固定化したことを特徴とする病原性大腸菌検出用担体。
【請求項２】
配列番号１〜１０に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブを固定化したことを特徴とする病原性大腸菌検出用担体。
【請求項３】
配列番号１に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつO26のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブ、
配列番号２に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつO45のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブ、
配列番号３に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつO103のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブ、
配列番号４に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつO111のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブ、
配列番号５に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつO121のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブ、
配列番号６に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつO145のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブ、
配列番号７に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつO157のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブ、
配列番号８に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつインチミン遺伝子を検出するプローブ、
配列番号９に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ志賀毒素１型遺伝子を検出するプローブ、
配列番号１０に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ志賀毒素２型遺伝子を検出するプローブ、
を固定化したことを特徴とする病原性大腸菌検出用担体。
【請求項４】
配列番号１に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブに対して相補的な塩基配列からなり、かつO26のＯ抗原合成遺伝子領域を検出するプローブ、
配列番号２に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブに対して相補的な塩基配列からなり、かつO45のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブ、
配列番号３に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブに対して相補的な塩基配列からなり、かつO103のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブ、
配列番号４に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブに対して相補的な塩基配列からなり、かつO111のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブ、
配列番号５に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブに対して相補的な塩基配列からなり、かつO121のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブ、
配列番号６に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブに対して相補的な塩基配列からなり、かつO145のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブ、
配列番号７に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブに対して相補的な塩基配列からなり、かつO157のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブ、
配列番号８に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブに対して相補的な塩基配列からなり、かつインチミン遺伝子を検出するプローブ、
配列番号９に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブに対して相補的な塩基配列からなり、かつ志賀毒素１型遺伝子を検出するプローブ、
配列番号１０に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブに対して相補的な塩基配列からなり、かつ志賀毒素２型遺伝子を検出するプローブ、
を固定化したことを特徴とする病原性大腸菌検出用担体。
【請求項５】
配列番号１に示す塩基配列からなるプローブ、配列番号１に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブ、配列番号１に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつO26のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブ、及び配列番号１に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブに対して相補的な塩基配列からなり、かつO26のＯ抗原合成遺伝子領域を検出するプローブからなる第一のプローブ群から選択された一又は二以上のプローブ、
配列番号２に示す塩基配列からなるプローブ、配列番号２に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブ、配列番号２に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつO45のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブ、及び配列番号２に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブに対して相補的な塩基配列からなり、かつO45のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブからなる第二のプローブ群から選択された一又は二以上のプローブ、
配列番号３に示す塩基配列からなるプローブ、配列番号３に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブ、配列番号３に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつO103のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブ、及び配列番号３に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブに対して相補的な塩基配列からなり、かつO103のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブからなる第三のプローブ群から選択された一又は二以上のプローブ、
配列番号４に示す塩基配列からなるプローブ、配列番号４に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブ、配列番号４に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつO111のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブ、及び配列番号４に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブに対して相補的な塩基配列からなり、かつO111のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブからなる第四のプローブ群から選択された一又は二以上のプローブ、
配列番号５に示す塩基配列からなるプローブ、配列番号５に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブ、配列番号５に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつO121のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブ、及び配列番号５に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブに対して相補的な塩基配列からなり、かつO121のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブからなる第五のプローブ群から選択された一又は二以上のプローブ、
配列番号６に示す塩基配列からなるプローブ、配列番号６に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブ、配列番号６に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつO145のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブ、及び配列番号６に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブに対して相補的な塩基配列からなり、かつO145のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブからなる第六のプローブ群から選択された一又は二以上のプローブ、
配列番号７に示す塩基配列からなるプローブ、配列番号７に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブ、配列番号７に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつO157のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブ、及び配列番号７に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブに対して相補的な塩基配列からなり、かつO157のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子を検出するプローブからなる第七のプローブ群から選択された一又は二以上のプローブ、
配列番号８に示す塩基配列からなるプローブ、配列番号８に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブ、配列番号８に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつインチミン遺伝子を検出するプローブ、及び配列番号８に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブに対して相補的な塩基配列からなり、かつインチミン遺伝子を検出するプローブからなる第八のプローブ群から選択された一又は二以上のプローブ、
配列番号９に示す塩基配列からなるプローブ、配列番号９に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブ、配列番号９に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ志賀毒素１型遺伝子を検出するプローブ、及び配列番号９に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブに対して相補的な塩基配列からなり、かつ志賀毒素１型遺伝子を検出するプローブからなる第九のプローブ群から選択された一又は二以上のプローブ、及び、
配列番号１０に示す塩基配列からなるプローブ、配列番号１０に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブ、配列番号１０に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ志賀毒素２型遺伝子を検出するプローブ、及び配列番号１０に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなる核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブに対して相補的な塩基配列からなり、かつ志賀毒素２型遺伝子を検出するプローブからなる第十のプローブ群から選択された一又は二以上のプローブを固定化したことを特徴とする病原性大腸菌検出用担体。
【請求項６】
病原性大腸菌のＤＮＡにおける標的領域を増幅させるためのプライマーセットと、増幅産物の有無を確認するためのプローブが固定された担体を含む病原性大腸菌検出用キットであって、
前記プライマーセットが、配列番号１１に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１２に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第一のプライマーセット、配列番号１３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１４に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第二のプライマーセット、配列番号１５に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１６に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第三のプライマーセット、配列番号１７に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１８に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第四のプライマーセット、配列番号１９に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２０に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第五のプライマーセット、配列番号２１に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２２に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第六のプライマーセット、配列番号２３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２４に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第七のプライマーセット、配列番号２５に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２６に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第八のプライマーセット、配列番号２７に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２８に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第九のプライマーセット、及び配列番号２９に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号３０に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第十のプライマーセットを含み、
前記担体が、請求項１〜５のいずれかに記載の病原性大腸菌検出用担体である
ことを特徴とする病原性大腸菌検出用キット。
【請求項７】
病原性大腸菌のＤＮＡにおける標的領域をＰＣＲにより増幅させて、増幅産物の有無を確認する工程を含む病原性大腸菌の検出方法であって、
ＰＣＲ用反応液に、配列番号１１に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１２に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第一のプライマーセット、配列番号１３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１４に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第二のプライマーセット、配列番号１５に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１６に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第三のプライマーセット、配列番号１７に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１８に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第四のプライマーセット、配列番号１９に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２０に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第五のプライマーセット、配列番号２１に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２２に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第六のプライマーセット、配列番号２３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２４に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第七のプライマーセット、配列番号２５に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２６に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第八のプライマーセット、配列番号２７に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２８に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第九のプライマーセット、及び配列番号２９に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号３０に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第十のプライマーセットと、試料とを含有させ、
前記試料に、病原性大腸菌のＤＮＡが含有されている場合、
前記ＰＣＲ用反応液を使用して、前記病原性大腸菌のＤＮＡにおける標的領域を増幅させ、
得られた増幅産物を、請求項１〜５のいずれかに記載の病原性大腸菌検出用担体に滴下して、相補的な塩基配列を有するプローブと結合させ、前記病原性大腸菌を検出する
ことを特徴とする病原性大腸菌の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病原性大腸菌を検出するための病原性大腸菌検出用担体、病原性大腸菌検出用キット、及び病原性大腸菌の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
米国における牛挽肉の細菌規格において、病原性大腸菌の中でもヒトに重篤な症状を引き起こすものとして、７つの血清型（O26、O45、O103、O111、O121、O145、O157）が規定されている。このうち、O157については牛肉加工業者に対する検査義務があり、流通品で検出された場合はリコール勧告の対象となる。また、その他のものについては、一般に牛肉加工業者による自主検査が行われており、流通品で検出された場合には同様にリコール勧告の対象となっている。これらの病原性大腸菌は、通称ＴＯＰ７と呼ばれている。
ＴＯＰ７の定義は、１個体で、Ｏ抗原合成遺伝子領域の遺伝子（血清型がO26、O45、O103、O111、O121、O145、O157のいずれかのもの）、インチミン遺伝子（eae）、及び志賀毒素遺伝子（stx）の３因子を全て保有している病原性大腸菌とされている。このため、これらの病原性大腸菌の検査は、これら３因子を分析することにより行うことができる。
【０００３】
これらの病原性大腸菌の検査方法として、例えば、Ｄｕ  Ｐｏｎｔ社の病原性大腸菌検査キットである「ＢＡＸ」を用いた方法が知られている（以下、公知技術１と称する）。この方法は、一次スクリーニングと二次スクリーニングの二段階で行われる。一次スクリーニングではリアルタイムＰＣＲによってインチミン遺伝子と志賀毒素遺伝子の検査が行われ、個体毎に片方のみが陽性の場合又は両方が陰性の場合には、陰性との判定が行われる。両方が陽性の場合には、二次スクリーニングが行われる。二次スクリーニングではリアルタイムＰＣＲによってＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子の検査が行われる。Ｏ抗原合成遺伝子領域の遺伝子の検査は、O157用のキット、O26, O111, O121用のキット、及びO45, O103, O145用のキットの３種類のキットを用いることにより、各個体のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子の血清型の識別が行われる。したがって、この方法では、病原性大腸菌の検出のために、最大で４種類のキットを使用する必要がある。
【０００４】
また、タカラバイオ株式会社のＥＨＥＣ（Ｏ antigens） ＰＣＲ  Ｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔを用いた検査方法も知られている（以下、公知技術２と称する）。この方法では、血清型毎のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子と、インチミン遺伝子、及び志賀毒素遺伝子を増幅させるためのプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物を電気泳動で解析することによって、病原性大腸菌の検出が行われる。なお、この方法では、検出対象の病原性大腸菌の血清型として、ＴＯＰ７のうちのO45が含まれていないため（代わりにO165が含まれている）、上記ＴＯＰ７の全てを検出することはできない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１３−２２００３２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、公知技術１は、上記の通り、病原性大腸菌の検出のために最大で４種類のキットを使用する必要があるため、労力を要するという問題があった。また、一次スクリーニングで陽性だったサンプルを選んで、次いで二次スクリーニングを行う必要があるため、操作が煩雑となり、検体を取り違える可能性があるという問題もあった。
また、公知技術２は、電気泳動で解析する方法であることから、判定の客観性に乏しく、上記の通り、ＴＯＰ７の全てを検出できないという問題もあった。
【０００７】
病原性大腸菌の検出方法に関連する発明として、特許文献１に記載の大腸菌Ｏ抗原型の検査方法を挙げることができる。この方法では、ＬＡＭＰ法によって、大腸菌Ｏ抗原に特異的な塩基配列を増幅し、得られた増幅産物に基づき病原性大腸菌の検出が行われている。
しかしながら、この方法では、ＴＯＰ７のいずれの病原性大腸菌も検出対象とされておらず、ＴＯＰ７の病原性大腸菌を検出することはできなかった。
【０００８】
そこで、本発明者らは鋭意研究し、ＴＯＰ７の病原性大腸菌を、迅速かつ精度高く特異的に同時に検出することが可能なプローブを搭載したＤＮＡチップを開発することに成功し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、病原性大腸菌の中でもヒトに重篤な症状を引き起こすことで知られている７つの血清型（O26、O45、O103、O111、O121、O145、O157）の病原性大腸菌を、迅速かつ精度高く特異的に同時に検出することが可能な病原性大腸菌検出用担体、病原性大腸菌検出用キット、及び病原性大腸菌の検出方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するため、本発明の病原性大腸菌検出用担体は、配列番号１〜１０に示す塩基配列からなるプローブを固定化した構成としてある。
【００１０】
また、本発明の病原性大腸菌検出用キットは、病原性大腸菌のＤＮＡにおける標的領域を増幅させるためのプライマーセットと、増幅産物の有無を確認するためのプローブが固定された担体を含む病原性大腸菌検出用キットであって、前記プライマーセットが、配列番号１１に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１２に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第一のプライマーセット、配列番号１３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１４に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第二のプライマーセット、配列番号１５に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１６に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第三のプライマーセット、配列番号１７に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１８に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第四のプライマーセット、配列番号１９に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２０に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第五のプライマーセット、配列番号２１に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２２に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第六のプライマーセット、配列番号２３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２４に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第七のプライマーセット、配列番号２５に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２６に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第八のプライマーセット、配列番号２７に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２８に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第九のプライマーセット、及び配列番号２９に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号３０に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第十のプライマーセットを含み、前記担体が、上記の病原性大腸菌検出用担体である構成としてある。
【００１１】
また、本発明の病原性大腸菌の検出方法は、病原性大腸菌のＤＮＡにおける標的領域をＰＣＲにより増幅させて、増幅産物の有無を確認する工程を含む病原性大腸菌の検出方法であって、ＰＣＲ用反応液に、配列番号１１に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１２に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第一のプライマーセット、配列番号１３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１４に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第二のプライマーセット、配列番号１５に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１６に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第三のプライマーセット、配列番号１７に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１８に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第四のプライマーセット、配列番号１９に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２０に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第五のプライマーセット、配列番号２１に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２２に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第六のプライマーセット、配列番号２３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２４に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第七のプライマーセット、配列番号２５に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２６に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第八のプライマーセット、配列番号２７に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２８に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第九のプライマーセット、及び配列番号２９に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号３０に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第十のプライマーセットと、試料とを含有させ、前記試料に、病原性大腸菌のＤＮＡが含有されている場合、前記ＰＣＲ用反応液を使用して、前記病原性大腸菌のＤＮＡにおける標的領域を増幅させ、得られた増幅産物を、上記の病原性大腸菌検出用担体に滴下して、相補的な塩基配列を有するプローブと結合させ、前記病原性大腸菌を検出する方法としてある。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、病原性大腸菌の中でもヒトに重篤な症状を引き起こすことで知られている７つの血清型（O26、O45、O103、O111、O121、O145、O157）の病原性大腸菌を、迅速かつ精度高く特異的に同時に検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の実施形態に係る病原性大腸菌検出用担体に固定化されるプローブの塩基配列を示す図である。
【図２】本発明の実施形態に係る病原性大腸菌検出用担体により検出する対象の病原性大腸菌の標的領域を増幅させるためのプライマーの塩基配列を示す図である。
【図３】本発明の実施形態に係る病原性大腸菌検出用担体に固定化されたプローブ（血清型O26、O45、O103、O111に対応するもの）について検出された蛍光強度（Ｓ／Ｎ比値）を示す図である。
【図４】本発明の実施形態に係る病原性大腸菌検出用担体に固定化されたプローブ（血清型O121、O145、O157に対応するもの）について検出された蛍光強度（Ｓ／Ｎ比値）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の病原性大腸菌検出用担体、病原性大腸菌検出用キット、及び病原性大腸菌の検出方法の一実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の実施形態及び後述する実施例の具体的な内容に限定されるものではない。
【００１５】
［病原性大腸菌検出用担体］
本実施形態の病原性大腸菌検出用担体は、図１に示すプローブ（配列番号１〜１０）を、基板上に固定化したものであれば特に限定されない。この病原性大腸菌検出用担体は、例えばスポット型又は合成型のＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイなどとして製造することができる。
【００１６】
（病原性大腸菌）
本実施形態の病原性大腸菌検出用担体により検出する対象の病原性大腸菌は、Ｏ抗原合成遺伝子領域の遺伝子がO26、O45、O103、O111、O121、O145、O157の７つの血清型（serotype）のいずれかであり、病原性大腸菌のＴＯＰ７と呼ばれるものである。
ここで、血清型とは、特異抗体を用いて細菌表面抗原の相違を検出することにより同種の細菌をより細かく分類する時に用いられる型を意味する。大腸菌のＯ抗原は、１８４種類が知られている。
【００１７】
また、ＴＯＰ７の定義は、１個体で、Ｏ抗原合成遺伝子領域の遺伝子（血清型がO26、O45、O103、O111、O121、O145、O157のいずれかのもの）、インチミン遺伝子（eae）、及び志賀毒素遺伝子（stx）の３因子を全て保有している病原性大腸菌である。
インチミン遺伝子は、腸管付着性因子というタンパク質をコードする遺伝子である。また、志賀毒素遺伝子（stx）は、「志賀毒素（Shiga  toxin）」というタンパク質をコードする遺伝子であり、志賀毒素１型遺伝子（stx1）と、志賀毒素２型遺伝子（stx2）の２種類が知られている。
【００１８】
（プローブ）
本実施形態における病原性大腸菌を検出するためのプローブは、配列番号１〜１０によりそれぞれ特定される塩基配列からなる核酸断片である。
このうち、配列番号１に示す塩基配列からなるものがO26のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子から選択されたプローブであり、配列番号２に示す塩基配列からなるものがO45のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子から選択されたプローブであり、配列番号３に示す塩基配列からなるものがO103のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子から選択されたプローブであり、配列番号４に示す塩基配列からなるものがO111のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子から選択されたプローブであり、配列番号５に示す塩基配列からなるものがO121のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子から選択されたプローブであり、配列番号６に示す塩基配列からなるものがO145のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子から選択されたプローブであり、配列番号７に示す塩基配列からなるものがO157のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子から選択されたプローブである。また、配列番号８に示す塩基配列からなるものがeaeから選択されたプローブであり、配列番号９に示す塩基配列からなるものがstx1から選択されたプローブであり、配列番号１０に示す塩基配列からなるものがstx2から選択されたプローブである。
【００１９】
本実施形態の病原性大腸菌検出用担体によれば、このようにＴＯＰ７の病原性大腸菌を検出するための７種類のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子と、インチミン遺伝子及び志賀毒素遺伝子を検出するためのプローブを固定化することにより、これらの病原性大腸菌を、迅速かつ精度高く特異的に同時に検出することが可能となっている。
【００２０】
本実施形態の病原性大腸菌検出用担体に固定化される上記プローブは、いずれも２０〜３４塩基程度の長さであり、一般的なＤＮＡ合成装置により合成できる。後述する実施例で病原性大腸菌検出用担体に固定化した配列番号１〜１０に示す塩基配列からなるプローブは、いずれもＤＮＡ合成装置により合成したものを使用した。なお、後述する実施例でＰＣＲに用いた配列番号１１〜３０に示す塩基配列からなるプライマーも１８〜２６塩基程度の長さであり、ＤＮＡ合成装置により合成したものを使用した。
【００２１】
また、本実施形態における配列番号１〜１０に示す塩基配列からなるプローブは、当該配列そのものに限定されず、配列番号１〜１０に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加されたプローブを用いることができる。また、配列番号１〜１０に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブを用いることもできる。また、これらのプローブや配列番号１〜１０に示す塩基配列からなるプローブに対して、相補的な塩基配列からなるプローブを用いることもできる。
【００２２】
なお、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡに対して高い相同性（相同性が９０％以上、好ましくは９５％以上）を有するＤＮＡが、配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ハイブリダイズする条件が挙げられる。通常、完全ハイブリッドの溶解温度（Ｔｍ）より約５℃〜約３０℃、好ましくは約１０℃〜約２５℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合をいう。ストリンジェントな条件については、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、特に11.45節「Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅｓ」に記載されている条件等を使用することができる。
【００２３】
なお、図２に示す配列番号１１〜３０の塩基配列からなる各プライマーについても同様に、当該配列そのものに限定されず、配列番号１１〜３０に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加されたプライマーであって、配列番号１１〜３０に示す塩基配列からなるプライマーを用いた場合と同一の領域を増幅できるものを用いることもできる。また、配列番号１１〜３０に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマーであって、配列番号１１〜３０に示す塩基配列からなるプライマーを用いた場合と同一の領域を増幅できるものを用いることもできる。
【００２４】
（病原性大腸菌検出用担体の作成）
本実施形態の病原性大腸菌検出用担体は、配列番号１〜１０に示す塩基配列からなるプローブを用いて、既存の一般的な方法で製造することができる。
例えば、本実施形態の病原性大腸菌検出用担体として貼り付け型のＤＮＡチップを作成する場合は、ＤＮＡスポッターによりプローブをガラス基板上に固定化して、各プローブに対応するスポットを形成することにより作成することができる。また、合成型ＤＮＡチップを作成する場合は、光リソグラフィ技術により、ガラス基板上で上記配列を備えた一本鎖オリゴＤＮＡを合成することにより作成することができる。さらに、基板はガラス製に限定されず、プラスチック基板やシリコンウエハー等を用いることもできる。また、基板の形状は平板状のものに限定されず、様々な立体形状のものとすることもでき、その表面に化学反応が可能となるように官能基を導入したものなどを用いることもできる。
【００２５】
本実施形態の病原性大腸菌検出用担体は、配列番号１〜１０に示す塩基配列からなるプローブの全部を固定化したものとすることが好ましい。
また、本実施形態の病原性大腸菌検出用担体は、配列番号１〜１０に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加されたプローブの全部又は一部をさらに固定化したものとすることも、配列番号１〜１０に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブの全部又は一部をさらに固定化したものとすることもでき、これらのプローブ又は配列番号１〜１０に示す塩基配列からなるプローブに対して、相補的な塩基配列からなるプローブの全部又は一部をさらに固定化したものとすることもできる。
【００２６】
［病原性大腸菌検出用キット］
本実施形態の病原性大腸菌検出用キットには、病原性大腸菌のＤＮＡにおける標的領域を増幅させるためのプライマーセットと、増幅産物の有無を確認するためのプローブが固定された病原性大腸菌検出用担体とが含まれる。
具体的には、プライマーセットとしては、配列番号１１に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１２に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるO26のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子を増幅させるためのプライマーセット、配列番号１３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１４に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるO45のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子を増幅させるためのプライマーセット、配列番号１５に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１６に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるO103のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子を増幅させるためのプライマーセット、配列番号１７に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１８に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるO111のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子を増幅させるためのプライマーセット、配列番号１９に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２０に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるO121のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子を増幅させるためのプライマーセット、配列番号２１に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２２に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるO145のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子を増幅させるためのプライマーセット、配列番号２３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２４に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるO157のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子を増幅させるためのプライマーセット、配列番号２５に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２６に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるeaeを増幅させるためのプライマーセット、配列番号２７に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２８に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるstx1を増幅させるためのプライマーセット、配列番号２９に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号３０に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるstx2を増幅させるためのプライマーセットが含まれる。
【００２７】
また、病原性大腸菌検出用担体としては、O26のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子から選択された配列番号１に示す塩基配列からなるプローブ、O45のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子から選択された配列番号２に示す塩基配列からなるプローブ、O103のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子から選択された配列番号３に示す塩基配列からなるプローブ、O111のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子から選択された配列番号４に示す塩基配列からなるプローブ、O121のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子から選択された配列番号５に示す塩基配列からなるプローブ、O145のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子から選択された配列番号６に示す塩基配列からなるプローブ、O157のＯ抗原合成遺伝子領域の遺伝子から選択された配列番号７に示す塩基配列からなるプローブ、eaeから選択された配列番号８に示す塩基配列からなるプローブ、stx1から選択された配列番号９に示す塩基配列からなるプローブ、及びstx2から選択された配列番号１０に示す塩基配列からなるプローブを固定化したものを好適に用いることができる。
【００２８】
このような本実施形態の病原性大腸菌検出用キットは、上記プライマーセットを用いて増幅された増幅産物を当該病原性大腸菌検出用担体に滴下し、増幅産物を相補的な塩基配列からなるプローブに結合させることによって病原性大腸菌を検出するために用いられる。
【００２９】
［病原性大腸菌の検出方法］
本実施形態の病原性大腸菌の検出方法は、検出対象の病原性大腸菌のＤＮＡにおける標的領域を増幅させて、増幅産物の有無を確認する工程を含む病原性大腸菌の検出方法であって、ＰＣＲ用反応液に、配列番号１１に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１２に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第一のプライマーセット、配列番号１３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１４に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第二のプライマーセット、配列番号１５に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１６に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第三のプライマーセット、配列番号１７に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１８に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第四のプライマーセット、配列番号１９に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２０に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第五のプライマーセット、配列番号２１に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２２に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第六のプライマーセット、配列番号２３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２４に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第七のプライマーセット、配列番号２５に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２６に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第八のプライマーセット、配列番号２７に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２８に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第九のプライマーセット、及び配列番号２９に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号３０に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなる第十のプライマーセットと、試料とを含有させ、試料に、病原性大腸菌のＤＮＡが含有されている場合、上記のＰＣＲ用反応液を使用して、病原性大腸菌のＤＮＡにおける標的領域を増幅させ、得られた増幅産物を、上記の病原性大腸菌検出用担体に滴下して、相補的な塩基配列を有するプローブと結合させ、病原性大腸菌を検出する方法であれば良く、具体的な実施形態及び実施例の構成に限定されるものではないが、例えば以下のような方法とすることができる。
【００３０】
病原性大腸菌を取得して必要に応じて増菌する。そして、得られた病原性大腸菌からゲノムＤＮＡを抽出する。ゲノムＤＮＡの抽出は、ＣＴＡＢ法（Cetyl  trimethyl  ammonium  bromide）による方法やＤＮＡ抽出装置を用いる方法など、一般的な手法により行うことができる。
次に、抽出したゲノムＤＮＡにおける標的領域を増幅させる。すなわち、ゲノムＤＮＡにおける標的領域を含むＤＮＡ断片を増幅させる。この標的領域の増幅方法は、特に限定されないが、ＰＣＲ法を好適に用いることができる。ＰＣＲ法では、標的領域を増幅させるためのプライマーセットを含有するＰＣＲ反応液を用いて、標的領域を増幅させる。ＰＣＲ装置としては、一般的なサーマルサイクラーなどを用いることができる。
【００３１】
本実施形態の病原性大腸菌の検出方法では、例えば以下のような反応条件でＰＣＲを行うことにより、病原性大腸菌の標的領域を好適に増幅させることができる。
（ａ）９５℃  ２分、（ｂ）９５℃（ＤＮＡ変性工程）  １０秒、（ｃ）６０℃（アニーリング工程）  ２０秒、（ｄ）７２℃（ＤＮＡ合成工程）  ３０秒（（ｂ）〜（ｄ）を４０サイクル）、（ｅ）７２℃  ２分
【００３２】
ＰＣＲ用反応液としては、例えば以下の組成からなるものを使用することが好ましい。すなわち、核酸合成基質（ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（dCTP、dATP、dTTP、dGTP））、プライマーセット、核酸合成酵素（ＥＸ  Ｔａｑ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなど）、試料のゲノムＤＮＡ、緩衝液、及び残りの成分として水を含むＰＣＲ反応液を好適に使用することができる。
【００３３】
次に、増幅産物を本実施形態の病原性大腸菌検出用担体に滴下し、この病原性大腸菌検出用担体に固定化されたプローブにハイブリダイズした増幅産物の標識を検出することで、増幅産物の有無を確認する。これによって、検査対象に存在している病原性大腸菌を特定することができる。
標識の検出は、蛍光スキャニング装置など一般的な標識検出装置を用いて行うことができ、例えば東洋鋼鈑株式会社のＢＩＯＳＨＯＴ（登録商標）を用いて、増幅産物の蛍光強度を測定することにより行うことができる。測定結果は、Ｓ／Ｎ比値（Signal  to  Noise  ratio）値として得ることが好ましい。Ｓ／Ｎ比値にもとづいて、測定結果が陽性であるか陰性であるかを精度高く判定することができるためであり、一般にＳ／Ｎ比値が３以上の場合に、陽性と判定することができる。本明細書中に記載のＳ／Ｎ比値は、（メディアン蛍光強度値−バックグラウンド値）÷バックグラウンド値にて算出される。なお、標識としては蛍光に限定されず、その他のものを用いることもできる。
【００３４】
本実施形態の病原性大腸菌検出用担体、病原性大腸菌検出用キット、及び病原性大腸菌の検出方法によれば、ＴＯＰ７の病原性大腸菌を特異的に識別できるプローブを用いることにより、これらを迅速かつ精度高く特異的に同時に検出することが可能になっている。
これによって、病原性大腸菌の検出の省力化が可能となり、また検体取り違えによる誤判定を防止することが可能となる。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明の実施形態に係る病原性大腸菌検出用担体、病原性大腸菌検出用キット、及び病原性大腸菌の検出方法の効果を確認するために行った試験について、具体的に説明する。
【００３６】
病原性大腸菌検出用担体としては、ジーンシリコン（登録商標）（東洋鋼鈑株式会社製）を用い、図１に示される配列番号１〜１０のプローブを固定化したものを使用した。各プローブは、ライフテクノロジーズジャパン株式会社により合成したものを使用した。また、各プローブの基板への固定化は、マイクロアレイヤーにより行った。
【００３７】
大腸菌としては、大阪大学微生物病研究所（Research Institute for Microbial Diseases (RIMD), Osaka University）から入手した菌株と、岐阜大学大学院医学系研究科  病原微生物遺伝子資源保存センター（Gifu Type Culture Collection (GTC), Department of Microbiology, Gifu University School of Medicine）から入手した菌株を使用した。具体的には、以下の２８種類の菌株を使用した。
No.1  RIMD 05091877（血清型O26）、No.2  RIMD 5091905（血清型O26）、No.3  RIMD 05091933（血清型O26）、No.4  RIMD 05091932（血清型O26）、No.5  RIMD 05091858（血清型O45）、No.6  GTC 03590（血清型O45）、No.7  RIMD 05091878（血清型O103）、No.8  RIMD 0509463（血清型O103）、No.9  RIMD 05092051（血清型O103）、No.10  RIMD 05092043（血清型O103）、No.11  RIMD 05092050（血清型O103）、No.12  RIMD 05092015（血清型O111）、No.13  RIMD 05091865（血清型O111）、No.14  RIMD 05091866（血清型O111）、No.15  RIMD 05092026（血清型O111）、No.16  RIMD 05092027（血清型O111）、No.17  RIMD 05091875（血清型O121）、No.18  RIMD 05091859（血清型O121）、No.19  RIMD 0509481（血清型O121）、No.20  RIMD 05092058（血清型O121）、No.21  RIMD 05092061（血清型O121）、No.22  RIMD 05091870（血清型O145）、No.23  RIMD 05092063（血清型O145）、No.24  RIMD 05091860（血清型O157）、No.25  RIMD 05091868（血清型O157）、No.26  RIMD 05091906（血清型O157）、No.27  RIMD 05091904（血清型O157）、No.28  RIMD 0509516（血清型O157）
このうち、No.6  GTC 03590（血清型O45）、No.8  RIMD 0509463（血清型O103）、No.19  RIMD 0509481（血清型O121）、及びNo.28  RIMD 0509516（血清型O157）は病原性を有さない菌株であり、残りは病原性を有するものである。
【００３８】
これらの大腸菌の菌株をそれぞれ入れた各アンプルに、ニュートリエントブロス（日本ベクトン・ディッキソン株式会社）を注ぎ、均一な菌液になるまで静かなピペッティング操作で懸濁した。得られた菌懸濁液をハートインヒュージョン寒天培地（日水製薬株式会社）に塗抹し、３７℃で一晩好気培養して復生、増菌した。増菌した菌のコロニーを白金耳でかき集め、これらをＤＮＡ抽出用菌体とした。
次に、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（株式会社キアゲン）を用い、マニュアルに記載のグラム陰性菌の抽出方法に従って、上記各ＤＮＡ抽出用菌体からＤＮＡを抽出した。このＤＮＡ抽出液をＰＣＲにおいて使用するテンプレートとした。
【００３９】
そして、ＰＣＲ法により、それぞれの増幅対象領域を菌株毎に増幅した。このとき、各Ｏ抗原合成遺伝子領域の遺伝子、インチミン遺伝子（eae）、志賀毒素１型遺伝子（stx1）、及び志賀毒素２型遺伝子（stx2）の４種類の遺伝子について、１つのＰＣＲ反応液を使用して同時に増幅を行った。
プライマーセットとしては、図２に示す１０組のプライマーセットを使用し、各ＰＣＲ反応液には、これらの全てのプライマーセット（Primer mix）を含有させた。これらのプライマーセットは、シグマアルドリッチジャパン合同会社により合成したものを使用した。なお、図２において、「Ｆ／Ｒ」は、フォワードプライマー（Ｆ）とリバースプライマー（Ｒ）の区別を示している。また、「修飾」は、蛍光標識のCy5を用いて、フォワードプライマーとリバースプライマーのどちらの５’末端に標識を行ったかを示している。
【００４０】
ＰＣＲ用反応液としては、Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ株式会社製）を使用し、菌株毎に、次の組成のものを作成した。
１．10x Ex Taq buffer  2.5μl
２．dNTPmix  2.0μl
３．Primer mix  1.0μl
４．Template  DNA  5.0μl（20pg/μl）
５．Ex  Taq  HotStart  DNA  polymerase  0.125μl
６．水（全体が２５．０μｌになるまで加水）
【００４１】
上記ＰＣＲ用反応液を使用して、核酸増幅装置（サーマルサイクラーｅｐグラジエント  エッペンドルフ株式会社製）により、次の条件でＤＮＡの増幅を行った。
（a）９５℃  ２分
（b）９５℃  １０秒
（c）６０℃  ２０秒
（d）７２℃  ３０秒（（b）〜（d）を４０サイクル）
（e）７２℃  ２分
【００４２】
次に、ＰＣＲ増幅産物に緩衝液（３×ＳＳＣクエン酸−生理食塩水＋０．３％ＳＤＳ）を混合して、上記病原性大腸菌検出用担体（ＤＮＡチップ）に滴下した。この病原性大腸菌検出用担体を４５℃で１時間静置し、上記緩衝液を用いてハイブリダイズしなかったＰＣＲ産物をＤＮＡチップから洗い流した。
そして、標識検出装置（ＢＩＯＳＨＯＴ）を用いて、病原性大腸菌検出用担体に固定化された各プローブにおける蛍光強度（プローブに結合した増幅産物の蛍光強度）を測定して、各プローブにおけるＳ／Ｎ比値を取得した。その結果を図３、図４に示す。
【００４３】
これらの図に示されるように、各菌株について、それぞれ対応する血清型の菌を検出するためのプローブにおいて蛍光が検出されており、それ以外のプローブにおいて蛍光は検出されておらず、偽陽性及び偽陰性が生じないことが確認された。なお、病原性を有さないNo.6  GTC 03590（血清型O45）、No.8  RIMD 0509463（血清型O103）、No.19  RIMD 0509481（血清型O121）、及びNo.28  RIMD 0509516（血清型O157）については、インチミン遺伝子（eae）、志賀毒素１型遺伝子（stx1）、及び志賀毒素２型遺伝子（stx2）のいずれに対応するプローブにおいても蛍光が検出されないことが確認された。
したがって、本実施形態の病原性大腸菌検出用担体、病原性大腸菌検出用キット、及び病原性大腸菌の検出方法によれば、７つの血清型（O26、O45、O103、O111、O121、O145、O157）の病原性大腸菌を、迅速かつ精度高く特異的に同時に検出できることが明らかとなった。
【００４４】
本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、本実施形態の病原性大腸菌検出用担体において、各プローブを１スポットずつ、又は複数スポットずつ固定化することができる。また、本実施形態における病原性大腸菌以外の細菌を検出するためのその他のプローブを、本実施形態におけるプローブと共に固定化することもでき、適宜変更することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明は、７つの血清型（O26、O45、O103、O111、O121、O145、O157）の病原性大腸菌の検査を行う場合に好適に利用することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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