(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の細胞老化を評価、判断、監視および／または予測するための生体外方法であって、前記細胞上の少なくとも１種の細胞表面栄養輸送体の発現レベルを測定する工程を含み、前記少なくとも１種の細胞表面栄養輸送体にはＸＰＲ１が含まれる、方法。
【請求項２】
測定した発現レベルを基準発現レベルと比較する工程をさらに含む、請求項１に記載の生体外方法。
【請求項３】
前記少なくとも１種の細胞表面栄養輸送体はＸＰＲ１およびＧＬＵＴ１である、請求項１または請求項２に記載の生体外方法。
【請求項４】
前記細胞は動物細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の生体外方法。
【請求項５】
前記細胞は幹細胞であり、但し、前記細胞はヒト胚性幹細胞ではない、請求項１〜４のいずれか１項に記載の生体外方法。
【請求項６】
前記細胞は成体幹細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の生体外方法。
【請求項７】
前記細胞は、造血幹細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、乳房幹細胞、腸幹細胞、内皮幹細胞、神経幹細胞、嗅覚成体幹細胞、神経堤幹細胞、精巣幹細胞および筋肉幹細胞を含む群において選択される成体幹細胞である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の生体外方法。
【請求項８】
前記発現レベルはＲＮＡレベルで評価される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体外方法。
【請求項９】
前記発現レベルはタンパク質レベルで評価される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体外方法。
【請求項１０】
少なくとも１種の細胞表面栄養輸送体の発現レベルの評価は、細胞表面上の前記少なくとも１種の細胞表面栄養輸送体の検出および定量化に対応する、請求項９に記載の生体外方法。
【請求項１１】
細胞表面上の前記少なくとも１種の細胞表面栄養輸送体の検出および定量化は、前記細胞表面栄養輸送体へのリガンドの結合の検出および／または定量化に対応する、請求項１０に記載の生体外方法。
【請求項１２】
前記リガンドは抗体であるか、あるいはエンベロープウイルスの糖タンパク質の可溶性部分に由来する受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の一部または全体を含む受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）リガンドである、請求項１１に記載の生体外方法。
【請求項１３】
前記ＲＢＤリガンドはＸｅｎｏ．ＲＢＤであり、配列番号１のアミノ酸配列またはその断片を含むか、あるいは配列番号１のアミノ酸配列またはその断片からなる、請求項１２に記載の生体外方法。
【請求項１４】
細胞群の品質を評価するための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の生体外方法。
【請求項１５】
細胞老化もしくは老化のバイオマーカーとしての、ならびに／または細胞分裂の累積のバイオマーカーとしての、または細胞の増殖能および／もしくは分化能のバイオマーカーとしての、または細胞の幹細胞性のバイオマーカーとしての、または細胞群の品質のバイオマーカーとしての、または再生医療もしくは生体外スクリーニングアッセイで使用される細胞群の品質のバイオマーカーとしての、ＸＰＲ１の使用。
【請求項１６】
少なくとも１種の細胞表面栄養輸送体の発現レベルを決定または測定する工程を含む、細胞老化に影響を与える化合物を同定するためのスクリーニング方法であって、前記少なくとも１種の細胞表面栄養輸送体にはＸＰＲ１が含まれる、スクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞老化の評価方法および細胞老化を減速または加速させる化合物（すなわち、それぞれ老化防止剤または老化促進剤）のスクリーニング方法に関する。特に、本発明は、細胞老化のバイオマーカーとしての細胞表面栄養輸送体、特にＸＰＲ１に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療とは、生体の機能性細胞または組織を作製して、年齢、疾患、損傷または先天性欠損により失われた細胞、組織または臓器機能を修復および置換するプロセスを指す。これは、損傷した要素を置換することを含むが、より一般的には、損傷した組織または臓器を修復および／または置換するために生体内で増殖および／または分化する細胞の投与に対応している。従って、再生医療は、以前に修復できなかった組織または臓器の修復を可能にし、移植のために入手可能な臓器の不足という問題を克服する。
【０００３】
幹細胞は、それらの自己複製特性（すなわち、細胞分裂（有糸分裂）周期を多数経ても未分化状態を維持することができる能力）ならびに分化される細胞種を生じることができる能力によって定められる。
【０００４】
幹細胞は、それらの潜在能力、すなわちそれらの分化能に従って分類することができる。全能性幹細胞は全ての細胞種に分化し、それにより完全な生存可能生物を構築することができる。それらは、卵子および精子細胞の融合により生じる。全能性細胞の分化により生じる細胞は多能性細胞であり、これらは３つの胚葉のあらゆる細胞種に分化することができる。多能性幹細胞は、一般にそれらの位置の組織の子孫の限られた数の細胞種に分化することができる。少能性幹細胞は、例えばリンパ系または骨髄系幹細胞などの数種の細胞種にのみ分化することができる。最後に、単能性幹細胞は、それら自身の細胞種のみを生じることができる。
【０００５】
胚性幹細胞とは対照的に、成体幹細胞は、発生後に体内中の分化された組織において見られる。成体幹細胞の供給源としては、例えば、骨髄、血液、角膜および網膜、脳、骨格筋、歯髄、肝臓、皮膚、消化管または膵臓などが挙げられる。
【０００６】
幹細胞のうち、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨芽細胞、筋細胞、軟骨細胞および脂肪細胞などの系統に容易に分化することができる多能性幹細胞である。成体ＭＳＣの臨床的可能性は最近になって完全に文書化され、これらの細胞は世界中で何百回もの臨床試験に現在使用されている。治療のために、ＭＳＣの２つの主要源を使用することができる。第１に、細胞は治療される対象の自己由来の細胞であってもよく、細胞を前記対象から採取し、特定の培養条件下で増殖させて選択的に分化を誘導し、さらにその対象に再投与する。第２に、その対象に投与される細胞の調製に関連する時間および費用を減らすために、同種異系ＭＳＣを使用することができる。従って、同種異系細胞群を構築して、治療で使用するために培養で増殖しなければならない。
【０００７】
但し、成体幹細胞が自己複製能および分化能を示したとしても、これらの特性は永久的なものではない。実際、培養継代を重ねるにつれて、通常老化と呼ばれる非分裂状態になるまで、細胞の倍加時間は増加する傾向がある。さらに、幹細胞の分化能は継代と共に低下する。さらに、ドナー年齢の上昇と共に、ＭＳＣの増殖能および分化能の有意な低下が観察された。
【０００８】
そこで、ＭＳＣの増殖能および分化能を評価する、すなわち細胞の細胞老化を評価するためのシステムが必要とされている。従って、そのようなシステムにより患者への投与前に細胞の治療可能性を確認することができる。
【０００９】
米国特許第８，５７４，８５２号は、コフィリンの発現レベルを測定することにより細胞老化を評価する方法について記載している。コフィリンは、アクチンフィラメントに結合して運動性、発生、極性または細胞質分裂のためのそれらのダイナミクスを促進することができる細胞内タンパク質である。当該発明者らは、標的細胞におけるコフィリンの発現レベルと前記標的細胞の細胞年齢との相関を実証した。
【００１０】
さらに、欧州特許第２５３３０４２号は、細胞老化を監視するためのＰＷ１の検出について記載している。
【００１１】
しかし、先行技術の細胞老化を評価するためのアッセイでは通常、細胞内タンパク質の検出を行い、従って直接検出することはできない。実際、細胞の透過処理が必要であるため、この検出方法の複雑性は増してしまう。従って、細胞表面で発現し、かつその発現が前記細胞の年齢に依存する細胞老化マーカーが必要である。
【００１２】
さらに、細胞老化の早期バイオマーカー、すなわち細胞老化時、特に老化のあらゆる兆候の発生前にその発現または発現における変化を早期に検出することができるバイオマーカーが依然として必要とされている。
【００１３】
本発明では、本発明者らは、ＸＰＲ１細胞表面栄養輸送体の発現レベルが細胞老化と相関することを実証した。従って、本発明は、ＸＰＲ１の細胞老化のバイオマーカー（特に早期バイオマーカー）としての使用、および細胞老化を逆行、減速または加速させる化合物（すなわち、それぞれ老化防止剤または老化促進剤）の同定を目的としたスクリーニングアッセイにおけるＸＰＲ１の使用に関する。
【発明の概要】
【００１４】
従って、本発明は、細胞表面上の少なくとも１種の細胞表面栄養輸送体の発現レベルを測定する工程を含む、細胞の細胞老化を生体外で評価、判断、監視および／または予測する方法に関する。一実施形態では、本発明の方法は、測定した発現レベルを基準発現レベルと比較する工程をさらに含む。
【００１５】
一実施形態では、前記少なくとも１種の細胞表面栄養輸送体は、ＸＰＲ１および／またはＧＬＵＴ１、好ましくはＸＰＲ１である。
【００１６】
一実施形態では、前記細胞は、動物細胞、好ましくはヒトまたはウマの細胞である。別の実施形態では、前記細胞は、前記細胞がヒト胚性幹細胞ではない限り、幹細胞、好ましくは成体幹細胞、より好ましくはＭＳＣである。
【００１７】
一実施形態では、前記発現レベルを、好ましくはＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴ−ｑＰＣＲ、ノーザンブロットおよび／またはハイブリダイゼーション法により、ＲＮＡレベルにおいて評価する。別の実施形態では、前記発現レベルをタンパク質レベルにおいて評価し、好ましくは少なくとも１種の細胞表面栄養輸送体の発現レベルの測定は、細胞表面上の前記少なくとも１種の細胞表面栄養輸送体の検出および定量化に対応している。一実施形態では、細胞表面上の少なくとも１種の細胞表面栄養輸送体の前記検出および定量化は、リガンドの細胞表面栄養輸送体への結合の検出および／または定量化に対応し、好ましくは、前記リガンドは抗体であるか、あるいはエンベロープウイルスの糖タンパク質の可溶性部分由来の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の一部または全体を含む受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）リガンドである。一実施形態では、前記ＲＢＤはＸｅｎｏ．ＲＢＤであり、配列番号１のアミノ酸配列またはその断片を含むかそれらからなる。
【００１８】
一実施形態では、前記方法は、細胞群、好ましくは、再生医療または生体外スクリーニングアッセイで使用される細胞群の品質を評価するためのものである。
【００１９】
本発明は、細胞老化または老化のバイオマーカーおよび／または細胞分裂の累積のバイオマーカーとして、好ましくは細胞の増殖能および／または分化能のバイオマーカーまたは細胞の幹細胞性のバイオマーカーとして、あるいは細胞群、特に再生医療または生体外スクリーニングアッセイで使用される細胞群の品質のバイオマーカーとしての、細胞表面栄養輸送体、好ましくはＸＰＲ１および／またはＧＬＵＴ１の使用にも関する。
【００２０】
本発明の別の目的は、少なくとも１種の細胞表面栄養輸送体の発現レベルを決定または測定する工程を含む、細胞老化に影響を与える化合物を同定するためのスクリーニング方法である。一実施形態では、前記少なくとも１種の細胞表面栄養輸送体は、ＸＰＲ１および／またはＧＬＵＴ１、好ましくはＸＰＲ１である。
【００２１】
本発明はさらに、少なくとも１種の細胞表面栄養輸送体の発現レベルを決定または測定するための手段を含む、本発明の生体外方法または本発明に係るスクリーニング方法を実施するためのキットに関する。一実施形態では、少なくとも１種の細胞表面栄養輸送体の発現レベルを決定または測定するための前記手段は、前記少なくとも１種の細胞表面栄養輸送体に特異的なＰＣＲプライマー対、前記少なくとも１種の細胞表面栄養輸送体に特異的な抗体および／または前記少なくとも１種の細胞表面栄養輸送体に特異的なＲＢＤである。
【００２２】
定義
本発明では、以下の用語は以下の意味を有する。
【００２３】
「細胞老化（cell aging）」とは、連続的な細胞分裂および／または環境条件（例えば、培地組成、酸素濃度など）による細胞の表現型の進行性変化を指す。特に、本明細書で使用される「細胞老化」という用語は、細胞能力の喪失に反映される細胞の表現型の有意な変化を指す。特にＭＳＣでは、細胞老化とは、分化能の喪失（例えば、脂肪細胞系統、骨芽細胞系統、筋細胞系統および／または軟骨細胞系統に分化する能力の進行性喪失）および／または増殖能の喪失（最終的に細胞が活発に分裂することが完全にできなくなることを特徴とする）を指してもよい。一実施形態では、「細胞老化」という用語は、ＭＳＣの分化能の喪失を指し、すなわち細胞老化を克服している（ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ）ＭＳＣが、脂肪細胞系統、骨芽細胞系統、筋細胞系統および軟骨細胞系統から選択される１種（または少なくとも１種）の系統に分化する能力を喪失している。一実施形態では、細胞老化を克服しているＭＳＣは、脂肪細胞系統、骨芽細胞系統、筋細胞系統および軟骨細胞系統から選択される２種の系統に分化する能力を喪失している。別の実施形態では、細胞老化を克服しているＭＳＣは、脂肪細胞系統、骨芽細胞系統、筋細胞系統および軟骨細胞系統から選択される３種の系統（好ましくは脂肪細胞系統、骨芽細胞系統および軟骨細胞系統）に分化する能力を喪失している。別の実施形態では、細胞老化を克服しているＭＳＣは、脂肪細胞系統、骨芽細胞系統、筋細胞系統および軟骨細胞系統に分化する能力を喪失している。一実施形態では、細胞老化により老化が生じ、「老齢細胞」とは、老化が始まった細胞、すなわち老化の兆候（例えば、後で列挙される老化の後期の兆候など）を示す細胞である。一実施形態では、「細胞老化」という用語は、ＭＳＣの増殖能の喪失を指し、好ましくはＭＳＣが老化し始める前の細胞分裂数は最大で２０回であり、より好ましくは最大で１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１回の細胞分裂である。
【００２４】
本明細書で使用される「老化（ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ）」すなわち「複製老化」とは細胞の老化（cellular senescence）を指し、ここで、細胞の老化とは、形態学的変化（例えば、拡大したり不規則な細胞形状など）および最終的に増殖の停止を特徴とする細胞の状態を指す。老化は複雑な現象であり、その原因は恐らく複数であり、未だに大部分が知られていない。特に、老化は、テロメアの短縮またはテロメア構造の変化ならびにＤＮＡ損傷の蓄積を暗示する場合がある。老化の後期の兆候の例としては、限定されるものではないが、倍加時間の増加、顕微鏡検査によって容易に検出することができる形態学的変化（例えば、細胞の肥大化、核の肥大化、不規則形状、扁平形状、顆粒状細胞質など）、脂肪細胞系譜、骨芽細胞系譜、筋細胞系譜および／または軟骨細胞系譜に沿った分化能の喪失、リソソームβ−ガラクトシダーゼまたはｐＨ６β−ガラクトシダーゼ（ＳＡ−β−ｇａｌ）の発現の増加、細胞のトランスクリプトームの変化、例えば限定されるものではないが、ヒトの糖タンパク質ＮＭＢ、再生関連筋肉プロテアーゼ相同体（ＲＡＭＰ）、ＰＭＰ−２２関連ｐ５３アポトーシスエフェクター（ＰＥＲＰ）、リンパ球抗原９６（ＬＹ９６）、シグナル伝達兼転写活性化因子１（ＳＴＡＴ１）、プリオンタンパク質（ＰＲＮＰ）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ａおよびプラスミノーゲン活性化因子阻害剤１型を含むリストから選択される少なくとも１種の遺伝子の発現の上方制御、またはヒアルロン酸合成酵素１（ＨＡＳ１）、ＩＤ１（inhibitor of DNA binding 1）およびオステオプロテゲリンリガンド（ＴＮＦＳＦ１１）を含むリストから選択される少なくとも１種の遺伝子の発現の下方制御、あるいは極小ＲＮＡ、例えば、ｈａｓ−ｍｉｒ−３７１、ｈａｓ−ｍｉｒ−３６９−５Ｐ、ｈａｓ−ｍｉｒ−２９ｃ、ｈａｓ−ｍｉｒ−４９９およびｈａｓ−ｌｅｔ−７ｆを含む群から選択される極小ＲＮＡなどの上方制御が挙げられる。
【００２５】
「幹細胞性」は、例えば、それらの自己複製特性（すなわち、細胞分裂（有糸分裂）の周期を多数経ても未分化状態を維持することができる能力）ならびに分化される細胞種を生じる能力などの幹細胞の一般的な特性を指す用語である。
【００２６】
「増殖能（proliferation capacity）」または「増殖能（proliferation potential）」（これらは同義で使用することができる）とは、細胞の活発に分裂する能力を指す。
【００２７】
「分化能（differentiation capacity）」または「分化能（differentiation potential）」（これらは同義で使用することができる）とは、細胞の少なくとも１種の系統に分化する能力を指す。一実施形態では、当該細胞はＭＳＣであり、「分化能（differentiation capacity）」または「分化能（differentiation potential）」とは、前記ＭＳＣの骨芽細胞系統、筋細胞系統、軟骨細胞系統または脂肪細胞系統のうちの少なくとも１種に分化する、骨芽細胞系統、軟骨細胞系統および脂肪細胞系統の３種に分化する、またはこれら４系統全てに分化する能力を指す。
【００２８】
「ＸＰＲ１」とは、異種栄養性マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、多栄養性（ｐｏｌｙｔｒｏｐｉｃ）ＭＬＶおよび異種栄養性マウス白血病ウイルス関連ウイルス（ＸＭＲＶ）(Giovannini et al, Cell Reports 3, 1866-1873, 2013)による受容体として使用される、後生動物、特にヒトによって発現されるリン酸排出輸送体を指す。一実施形態では、ＸＰＲ１は、配列番号２２（受入番号：ＢＣ０４１１４２．１）によってコードされるヒトのＸＰＲ１（受入番号：ＡＡＨ４１１４２、配列番号２１）である。一実施形態では、ＸＰＲ１は、配列番号２１と少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは配列番号２１と少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含むかそれらからなる。一実施形態では、ＸＰＲ１は、配列番号２２と少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは配列番号２２と少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すヌクレオチド配列によってコードされる。一実施形態では、ＸＰＲ１は、配列番号２１の断片、好ましくは、少なくとも約１００個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも約１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０または６００個のアミノ酸の断片を含むかそれらからなる。
【００２９】
本明細書で使用される「同一性」という用語は、２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のＤＮＡ配列間の関係において使用される場合、それぞれ２つ以上のアミノ酸残基または２つ以上のヌクレオチド残基からなる配列間の一致数によって決定される（それぞれ）ポリペプチドまたはＤＮＡ配列間の配列関連性(sequence relatedness)の程度を指す。「同一性」とは、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）によって扱われるギャップアラインメント（存在すれば）を有する２つ以上の配列のより短い配列間の完全な一致率の尺度である。関連するポリペプチドまたはＤＮＡ配列の同一性は、公知の方法によって容易に計算することができる。そのような方法としては、限定されるものではないが、Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988、Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993、Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994、Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987、Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991、およびCarillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988)に記載されているものが挙げられる。同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間の最大の一致を与えるように設計されている。同一性の決定方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムに記述されている。好ましいコンピュータプログラムによる２つの配列間の同一性の決定方法としては、ＧＡＰ（Devereux et al., Nucl.Acid.Res.12: 387 (1984)、Genetics Computer Group、ウィスコンシン大学、ウィスコンシン州マディソン）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ(Altschul et al., J. MoI. Biol. 215, 403-410 (1990))などのＧＣＧプログラムパッケージが挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）および他の提供源（BLAST Manual, Altschul et al., NCB/NLM/NIH, メリーランド州ベセズダ, 20894; Altschul et al.、上記）から公的に入手可能である。また、周知のSmith Watermanアルゴリズムを使用して同一性を決定してもよい。
【００３０】
「ＧＬＵＴ１」とは、特にヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）によって受容体として使用される、後生動物、特にヒトによって発現されるグルコース取り込み輸送体を指す。一実施形態では、ＧＬＵＴ１は、配列番号２４（受入番号：ＮＭ＿００６５１６．２）によってコードされるヒトＧＬＵＴ１（受入番号ＮＰ＿００６５０７．２、配列番号２３）である。一実施形態ではＧＬＵＴ１は、配列番号２３と少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは配列番号２３と少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含むかそれらからなる。一実施形態では、ＧＬＵＴ１は、配列番号２４と少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは配列番号２４と少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すヌクレオチド配列によってコードされる。一実施形態では、ＧＬＵＴ１は、配列番号２３の断片、好ましくは少なくとも約１００個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも約１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００または４５０個のアミノ酸の断片を含むかそれらからなる。
【００３１】
「リガンド」とは、細胞表面栄養輸送体と複合体を形成するあらゆる物質を指す。典型的なリガンドとしては、限定されるものではないが、ポリペプチドおよびタンパク質が挙げられる。本明細書で使用される「ポリペプチド」とは、ペプチド結合によって互いに結合されたアミノ酸（好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸）の線状ポリマーを指す。タンパク質とは具体的には、１つ以上のポリペプチドおよび任意で非ポリペプチド共同因子から形成された機能的実体を指す。
【００３２】
数字の前の「約」は、前記数字の値の±１０％を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明は、細胞表面上の少なくとも１種の細胞表面栄養輸送体の発現レベルを決定または測定する工程を含む、好ましくは細胞の細胞老化を生体外で評価、判断、監視および／または予測する方法に関する。
【００３４】
一実施形態では、前記方法は、測定した発現レベルを基準発現レベルと比較する工程をさらに含む。
【００３５】
時間と共に、細胞の倍加時間は増加する傾向があり、その分化能は低下する傾向がある。さらに、ＭＳＣの増殖能および分化能の有意な低下は、ドナー年齢の上昇と共に観察された。
【００３６】
従って、一実施形態では、本発明の方法は、細胞の増殖能を測定、評価または決定するためのものである。特定の実施形態では、本発明の方法は、老化の発生前または老化の第１の兆候の発生前、特に細胞分裂が行われなくなる前または老化の後期の兆候の発生前に、培養継代数または細胞分裂数を決定するためのものである。
【００３７】
老化の後期の兆候の例としては、限定されるものではないが、細胞分裂が行われなくなることまたは倍加時間の増加（例えば、細胞の倍加時間の少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０、４０または５０％の増加）、顕微鏡検査によって容易に検出することができる形態学的変化（例えば、細胞の肥大化、核の肥大化、不規則形状、扁平形状、顆粒状細胞質など）、リソソームβ−ガラクトシダーゼレベルの上昇（例えば、米国のCell Signaling社によって提供されているような、老化関連β−ガラクトシダーゼ染色キットを用いて測定することができる）、例えば、ＲＴ−ｑＰＣＲ（ｍＲＮＡレベルにおける発現の検出）またはウェスタンブロット（タンパク質レベルにおける発現の検出）などの当業者によって知られている方法により検出することができる、リソソームβ−ガラクトシダーゼまたはｐＨ６β−ガラクトシダーゼ（ＳＡ−β−ｇａｌ）の発現の増加、容易に（例えばＲＴ−ＰＣＲなどにより）評価することができる細胞のトランスクリプトームの変化、例えば、限定されるものではないが、ヒトの糖タンパク質ＮＭＢ、再生関連筋肉プロテアーゼ相同体（ＲＡＭＰ）、ＰＭＰ−２２関連ｐ５３アポトーシスエフェクター（ＰＥＲＰ）、リンパ球抗原９６（ＬＹ９６）、シグナル伝達兼転写活性化因子１（ＳＴＡＴ１）、プリオンタンパク質（ＰＲＮＰ）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ａおよびプラスミノーゲン活性化因子阻害剤１型を含むリストから選択される少なくとも１種の遺伝子の発現の上方制御、またはヒアルロン酸合成酵素１（ＨＡＳ１）、ＩＤ１およびオステオプロテゲリンリガンド（ＴＮＦＳＦ１１）を含むリストから選択される少なくとも１種の遺伝子の発現の下方制御、容易に（例えばＲＴ−ＰＣＲなどにより）評価することができる極小ＲＮＡ、例えば、ｈａｓ−ｍｉｒ−３７１、ｈａｓ−ｍｉｒ−３６９−５Ｐ、ｈａｓ−ｍｉｒ−２９ｃ、ｈａｓ−ｍｉｒ−４９９およびｈａｓ−ｌｅｔ−７ｆを含む群から選択される極小ＲＮＡなどの上方制御、および、例えば脂肪細胞系統、骨芽細胞系統、筋細胞系統および／または軟骨細胞系統などの特定の系統に分化する能力の喪失が挙げられる。
【００３８】
ＭＳＣの脂肪細胞系譜、骨芽細胞系譜および／または軟骨細胞系譜に沿って分化する能力を評価する方法は当業者によく知られている。
【００３９】
ＭＳＣの脂肪生成経路に沿って分化する能力を評価する方法の非限定的な例は、以下のとおりである。すなわち、細胞を２．１０４個の細胞／ｃｍ２で播種し、１０％ＦＣＳ、０．５ｍＭのイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、１μＭのデキサメタゾン、１０μＭのインスリン、２００μＭのインドメタシンを含むＤＭＥＭ中で培養し、２１日後にOil Red-O染色を行い、プレートリーダーを用いてλ５９５ｎｍで半定量的に分析する。
【００４０】
ＭＳＣの骨形成経路に沿って分化する能力を評価する方法の非限定的な例は、以下のとおりである。すなわち、細胞を２．１０４個の細胞／ｃｍ２で播種し、１０％ＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、１０ｍＭのβ−グリセロリン酸、１０−７Ｍのデキサメタゾンおよび０．２ｍＭのアスコルビン酸を含むＤＭＥＭ中で３週間培養し、３〜４日ごとに培地の変化を観察する。２１日後に、Alcaline phosphatase von Kossaまたはアリザリンレッド染色により細胞を分析する。アリザリンレッド染色を、プレートリーダーを用いてλ５９５ｎｍで半定量的に分析する。
【００４１】
ＭＳＣの軟骨形成経路に沿って分化する能力を評価する方法の非限定的な例は、以下のとおりである。すなわち、２．２．１０５個の細胞を含むペレットを分化培地（例えば、ＯｒｉＣｅｌｌ（商標）間葉系幹細胞軟骨分化培地（Ｃｙａｇｅｎ社）または間葉系幹細胞軟骨分化培地（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社）など）で３週間培養し、その後、１％アルシアンブルー（Ｃｈｒｏｍａ社、ドイツのＫｏｎｇｅｎ）により酸性ムコ多糖類を１０〜３０分間評価する。
【００４２】
さらに、一実施形態では、本発明の方法は、細胞の分化能を測定、評価または決定するためのものである。特定の実施形態では、本発明の方法は、細胞の分化能の消失前に前記細胞がなし得る培養継代数または細胞分裂数を決定するためのものである。例えば、本発明の方法は、１種の特定の系統（脂肪細胞系統、骨芽細胞系統、筋細胞系統または軟骨細胞系統）、以下の３種の系統、脂肪細胞系統、骨芽細胞系統および軟骨細胞系統に分化する能力の喪失前、または細胞の分化能の完全な喪失（すなわち、脂肪細胞系統、骨芽細胞系統、筋細胞系統および軟骨細胞系統に分化する能力の喪失）前の、培養継代数または細胞分裂数を決定するためのものであってもよい。
【００４３】
一実施形態では、当該細胞は、動物細胞、例えば、哺乳類細胞、齧歯類細胞、ネコの細胞、イヌの細胞、ウマの細胞または霊長類細胞、好ましくはヒトの細胞である。
【００４４】
一実施形態では、当該細胞は幹細胞、好ましくは成体幹細胞またはそれらの誘導体である。成体幹細胞の例としては、限定されるものではないが、造血幹細胞、乳房幹細胞、腸幹細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、内皮幹細胞、神経幹細胞、嗅覚成体幹細胞、神経堤幹細胞、精巣幹細胞および筋肉幹細胞が挙げられる。一実施形態では、成体幹細胞は、骨髄、乳腺、腸（特にリーベルキューン腺）、胎盤、脂肪組織、肺、血液、臍帯のホウォートンゼリー、歯、脳（例えば、脳室下帯、歯状回または新皮質など）、鼻（嗅覚成体幹細胞は鼻粘膜の嗅覚粘膜細胞から効率的に採取することができる）、毛包、消化管、坐骨神経、心臓流出路、脊髄神経節および交感神経節または精巣に由来している。
【００４５】
一実施形態では、当該幹細胞は多能性幹細胞、例えば、ＭＳＣまたはそれらの誘導体、例えば、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞（例えば心筋細胞）または脂肪細胞などである。一実施形態では、ＭＳＣは、骨髄、臍帯血、ホウォートンゼリー（例えば、臍帯中に存在するホウォートンゼリーなど）、胎盤、肺、脂肪組織、成体筋肉、角膜基質、歯（例えば、脱落乳歯の歯髄など）、羊水、末梢血などに由来する。一実施形態では、当該細胞はＭＳＣ由来のｈＥＳＣ−ＳＡ００１である。別の実施形態では、当該細胞は骨髄から単離され、かつ／または由来するヒトの初代ＭＳＣである。別の実施形態では、当該細胞はウマのＭＳＣである。
【００４６】
別の実施形態では、当該幹細胞は単能性幹細胞またはそれらの誘導体、例えばケラチノサイトなどである。
【００４７】
一実施形態では、当該細胞は胚性幹細胞またはｉＰＳＣなどの多能性幹細胞に由来し、ここでｉＰＳＣとは人工多能性幹細胞を表す。ｉＰＳＣは、特定の化学物質（例えば、バルプロ酸、ＢＩＸ−０１２９４、ＤＺＮｅｐ、ＳＢ４３１４１２、ＰＤ０３２５９０１、チアゾビビンおよびそれらの混合物など）に曝露し、かつ／または形質移入または形質導入（例えば、遺伝子Ｏｃｔ４（Ｐｏｕ５ｆ１）、Ｓｏｘ２、ｃＭｙｃおよびＫｌｆ４のセット）により成体細胞から直接生じることができる多能性幹細胞の一種である。
【００４８】
一実施形態によれば、当該細胞はヒト胚性幹細胞ではなく、かつ／または当該細胞の採取はヒトの胚の破壊を必要としない。
【００４９】
一実施形態では、当該細胞は神経細胞ではない。別の実施形態では、当該細胞はグリア細胞ではない。
【００５０】
一実施形態では、当該細胞は、早老症候群、好ましくは早老症細胞を有する患者から採取した細胞である。早老症候群は早期老化に似た稀な遺伝性疾患群であり、その定義は広範囲の疾患に適用することができる。家族性アルツハイマー病および家族性パーキンソン病は年配の個体においてより頻繁に生じる２つのよく知られている加齢促進疾患であるが、早老症（ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群（ＨＧＰＳ）ともいう）は、幼児期の非常に稀な進行性疾患である。この疾患は、早期老化（早老症）の特徴、低身長および低体重をもたらす通常は生後一年間で始まる成長障害、皮膚の真下の脂肪層（皮下脂肪組織）の減少、および特徴的な頭蓋顔面異常、例えば、前頭隆起、発育不十分な顎（小顎症）、異常に突き出た目および／または小さい「くちばしのような」鼻を特徴とする。
【００５１】
一実施形態では、当該細胞は培養物中の細胞であり、好ましくは細胞株であり、かつ／または初代細胞に由来する、すなわち組織からすぐに単離された細胞である。一実施形態では、当該細胞は、例えば生検により得られる個体の試料から採取される。好ましくは、個体からの試料採取工程は、本発明の方法の一部ではない。
【００５２】
従って、一実施形態によれば、本発明の方法は、培養物における細胞株または初代細胞の品質を評価するためのものであり、特定の時間における細胞の増殖能および／または分化能を評価する工程を含んでもよい。従って、本実施形態によれば、本発明の方法は、細胞群またはバッチの品質の確認を目的とした品質管理方法に対応してもよい。前記方法は、例えば、再生医療で使用される幹細胞の増殖よび分化能を確認する、または生体外スクリーニングアッセイで使用される細胞の増殖および分化能を確認するのに有用であり得る。
【００５３】
本明細書で使用される「細胞表面栄養輸送体」という用語は、細胞の血漿膜に固定された栄養輸送体を指す。哺乳類細胞は必要な栄養を「栄養輸送体」を介して細胞表面に取り込み、カタボライトおよび他の成分を排出する。栄養および代謝産物またはカタボライトは、例えば、炭水化物、アミノ酸、無機リン酸、ヌクレオシド、脂質、ビタミン、ヘム、イオンなどである。栄養輸送体は、機能の受動または能動機構に基づいて分類することができる。受動（または促進）輸送体は、それらの電気化学的勾配により溶質を膜全体に拡散させることができる。能動輸送体は、例えばＡＴＰ合成または加水分解などの多様なエネルギー共役機構を利用して、膜全体に溶質勾配を作り出す。一実施形態では、細胞表面栄養輸送体はＳＬＣ系に属し、ここでＳＬＣとは溶質輸送体（Solute Linked Carrier）を表す。
【００５４】
細胞表面栄養輸送体の例としては、限定されるものではないが、例えば、グルコース取り込み輸送体（例えば、ＧＬＵＴ１など）などのグルコース輸送体、例えば無機リン酸取り込み輸送体（例えば、ＰｉＴ１もしくはＰｉＴ２など）または無機リン酸排出輸送体（例えば、ＸＰＲ１など）などの無機リン酸輸送体、例えば、中性アミノ酸輸送体（例えば、中性アミノ酸取り込み輸送体（例えば、ＡＳＣＴ１もしくはＡＳＣＴ２など）など）またはカチオン性アミノ酸輸送体（例えば、ＣＡＴ１など）などのアミノ酸輸送体、ヘム輸送体（例えば、ＦＬＶＣＲ１など）、例えばミオイノシトール輸送体（例えば、ＳＭＩＴ１など）などのイノシトール輸送体、および、例えば、リボフラビン取り込み輸送体（例えば、ＲＦＴ１、ＲＦＴ３、ＰＡＲ１もしくはＰＡＲ２など）などのリボフラビン輸送体が挙げられる。
【００５５】
一実施形態では、細胞表面栄養輸送体は、例えば無機リン酸排出輸送体（例えば、ＸＰＲ１など）などの無機リン酸輸送体、または、例えばグルコース取り込み輸送体（例えば、ＧＬＵＴ１など）などのグルコース輸送体である。
【００５６】
一実施形態では、本発明の方法は、ＸＰＲ１および／またはＧＬＵＴ１の発現レベルを測定する工程を含む。好ましくは、本発明の方法は、ＸＰＲ１の発現レベルを測定する工程を含む。一実施形態では、本発明の方法は、ＸＰＲ１およびＧＬＵＴ１の発現レベルを測定する工程を含む。
【００５７】
別の実施形態では、少なくとも１種の細胞表面栄養輸送体は、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ３および／またはＧＬＵＴ４ではない。別の実施形態では、少なくとも１種の細胞表面栄養輸送体はグルコース輸送体ではない。
【００５８】
本明細書で使用される「発現」という用語は、代わりとして、細胞表面栄養輸送体の転写（すなわち、ＲＮＡの発現）または細胞表面栄養輸送体の翻訳（すなわち、タンパク質の発現）あるいは細胞の表面における細胞表面栄養輸送体の存在を指す。
【００５９】
発現レベルの決定方法は当業者にはよく知られており、限定されるものではないが、細胞のトランスクリプトーム（一実施形態では、発現は栄養輸送体の転写に関する）またはプロテオーム（一実施形態では、発現は栄養輸送体の翻訳に関する）の決定が挙げられる。
【００６０】
本発明の一実施形態では、細胞表面栄養輸送体の発現をＲＮＡレベルにおいて評価する。輸送体の転写レベルの評価方法は先行技術でよく知られている。そのような方法の例としては、限定されるものではないが、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴ−ｑＰＣＲ、ノーザンブロット、例えばマイクロアレイの使用などのハイブリダイゼーション法およびそれらの組み合わせ、例えば、限定されるものではないが、ＲＴ−ＰＣＲよって得られた単位複製配列のハイブリダイゼーション、例えば次世代ＤＮＡシーケンシング（ＮＧＳ）またはＲＮＡ−ｓｅｑ（「全トランスクリプトームショットガンシーケンシング」としても知られている）などのシークエンシングが挙げられる。
【００６１】
ＸＰＲ１の発現を評価するために使用することができるＰＣＲまたはｑＰＣＲプライマーの例としては、限定されるものではないが、順方向プライマー：５’−ＡＧＡＧＣＴＴＧＧＧＡＧＡＣＡＡＡＧＣＡ−３’（配列番号２５）−逆方向プライマー：５’−ＧＴＧＧＡＣＡＣＡＡＣＡＴＴＣＧＣＡＡＣ−３’（配列番号２６）のプライマー対が挙げられる。
【００６２】
ＧＬＵＴ１の発現を評価するために使用することができるＰＣＲまたはｑＰＣＲプライマーの例としては、限定されるものではないが、順方向プライマー：５’−ＴＣＡＣＴＧＴＧＣＴＣＣＴＧＧＴＴＣＴＧ−３’（配列番号２７）−逆方向プライマー：５’−ＣＣＴＣＧＧＧＴＧＴＣＴＴＧＴＣＡＣＴＴ−３’（配列番号２８）のプライマー対が挙げられる。
【００６３】
本発明の一実施形態では、細胞表面栄養輸送体の発現をタンパク質レベルにおいて評価する。試料中のタンパク質レベルの決定方法は当該技術分野でよく知られている。そのような方法の例としては、限定されるものではないが、免疫組織化学、マルチプレックス法（Ｌｕｍｉｎｅｘ）、ウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチＥＬＩＳＡ、蛍光結合免疫吸着法（ＦＬＩＳＡ：fluorescent-linked immunosorbent assay）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）などが挙げられる。
【００６４】
本発明の一実施形態では、細胞表面栄養輸送体の発現レベルの決定は特に、細胞表面に存在する前記栄養輸送体の検出および定量化に対応している。細胞表面でタンパク質の存在を分析する方法は当業者にはよく知られており、限定されるものではないが、ＦＡＣＳ分析、免疫組織化学、細胞分画を伴うウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチＥＬＩＳＡ、蛍光結合免疫吸着法（ＦＬＩＳＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）または画像解析、例えばハイコンテント解析などが挙げられる。
【００６５】
一実施形態では、少なくとも１種の細胞表面栄養輸送体の発現レベルの決定は、リガンドの細胞表面栄養輸送体への結合の検出および／または定量化に対応している。好ましくは、前記リガンドは受容体結合ドメインリガンドであり、本発明の方法は、前記受容体結合ドメインリガンドと細胞表面栄養輸送体との間で形成された複合体を検出および／または定量化する工程を含む。別の実施形態では、前記リガンドは前記細胞表面栄養輸送体に特異的な抗体であり、本発明の方法は、前記抗体と前記細胞表面栄養輸送体との間で形成された複合体を検出および／または定量化する工程を含む。
【００６６】
「例えば、受容体結合ドメインリガンドなどのリガンドの細胞表面栄養輸送体への結合を検出および／または定量化する」という表現は、細胞表面栄養輸送体が存在する場合、栄養輸送体とリガンドとの間で複合体が形成されることを意味する。リガンドが、例えば、限定されるものではないが、抗体の定常断片（Ｆｃ）などの検出可能な分子または蛍光化合物（例えば、シアニン染料、アレキサ（Ａｌｅｘａ）色素、量子ドット染色など）に共有結合されている場合に、その複合体を検出することができる。リガンドが当業者によく知られている異なる手段でタグ付けされている場合にも、その複合体を検出することができる。例えば、限定されるものではないが、本発明で使用されるタグは、ヘマグルチニンタグ、ポリアルギニン（Poly Arginine）タグ、ポリヒスチジンタグ、Ｍｙｃタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｓ−タグ、ＨＡＴタグ、３ｘＦｌａｇタグ、カルモジュリン（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）結合ペプチドタグ、ＳＢＰタグ、キチン結合ドメインタグ、ＧＳＴタグ、マルトース結合タンパク質タグ、蛍光タンパク質タグ、Ｔ７タグ、Ｖ５タグおよびＸｐｒｅｓｓタグを含むかそれらからなる群から選択されるタグであってもよい。従って、リガンドの使用により、一方では使用されるリガンドに応じた細胞表面栄養輸送体の同定および検出が、他方では形成された複合体の定量化が可能になる。
【００６７】
一実施形態では、フローサイトメトリー、免疫蛍光または画像解析、例えばハイコンテント解析によって結合の検出または定量化を行う。
【００６８】
本発明のさらなる態様では、当該リガンドは受容体結合ドメインリガンドであり、ここで、前記受容体結合ドメインリガンドは、細胞表面栄養輸送体と相互作用するエンベロープウイルスの糖タンパク質の可溶性部分由来の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の一部または全体を含む。好ましくは、当該リガンドは可溶性であり、すなわち膜貫通ドメインを含まず、従って膜に固定されていない。
【００６９】
「エンベロープウイルスの糖タンパク質の可溶性部分由来」という表現は、当該リガンドがウイルスのエンベロープに含まれる糖タンパク質の断片または部分であり、例えばクローニングにより得ることができることを意味する。
【００７０】
「糖タンパク質」という用語は、エンベロープ糖タンパク質、外被糖タンパク質または融合糖タンパク質を意味するものとして理解されるべきであり、ここで、「糖タンパク質」という用語は、ポリペプチド側鎖に共有結合されたオリゴ糖鎖を含むタンパク質を指す。
【００７１】
「細胞表面栄養輸送体と相互作用する」という表現は、糖タンパク質が細胞の表面に存在する受容体を認識しやすいことを意味する。従って、一実施形態では、細胞表面栄養輸送体と相互作用するリガンドは前記細胞表面栄養輸送体と複合体を形成し、この複合体を上に記載した方法によって検出することができる。
【００７２】
ＲＢＤの一部または全体を含む受容体結合ドメインリガンドを、抗体の定常断片（例えば、ウサギまたはマウス由来のＦｃ断片など）に融合させ、かつ／または蛍光色素または蛍光化合物（例えば、シアニン染料、アレキサ色素、量子ドット染色など）を付加するために化学修飾することができる。
【００７３】
ＲＢＤは、特にウイルスのエンベロープの糖タンパク質中に存在し、従って、その受容体結合ドメインリガンドは、ＲＢＤ全体またはＲＢＤの断片もしくは一部を含む。
【００７４】
一実施形態では、前記ウイルスは、例えば、（ｉ）例えばマウスマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）またはテナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）などのガンマレトロウイルス、および（ｉｉ）例えば霊長類Ｔ細胞白血病ウイルス（例えば、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）およびサルＴ細胞白血病ウイルス（ＳＴＬＶ）など）またはウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）などのデルタレトロウイルスなどのレトロウイルスを含む群から選択される。
【００７５】
ガンマおよびデルタレトロウイルスは、成熟したレトロウイルス粒子中に存在するＥｎｖ糖タンパク質をコードする。Ｅｎｖタンパク質をプロペプチドの形態で合成し、これをフューリン（ｆｕｒｉｎｅ）ペプチダーゼによりゴルジ装置で切断し、２種類のポリペプチド、すなわち膜貫通（ＴＭ）および細胞表面（ＳＵ）成分を得る。ＳＵドメインは２種類の主要なサブドメイン、すなわちＴＭドメインとの相互作用ドメインおよびＲＢＤを含み、さらに宿主細胞膜受容体と相互しやすい。
【００７６】
一実施形態では、可溶性受容体結合ドメインリガンドは異種栄養性マウス白血病ウイルスの糖タンパク質から単離されたものであり、本明細書ではＸｅｎｏ．ＲＢＤと呼ぶ。
【００７７】
一実施形態では、前記Ｘｅｎｏ．ＲＢＤは、配列番号１のアミノ酸配列またはその断片を含むかそれらからなる。
【００７８】
一実施形態では、前記断片は、配列番号１のアミノ酸３６〜３１６を含むかそれらからなる。
【００７９】
一実施形態では、前記断片は、配列番号１のアミノ酸１〜２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４または３１５を含むかそれらからなる。
【００８０】
別の実施形態では、前記断片は、配列番号１のアミノ酸３６〜２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４または３１５を含むかそれらからなる。
【００８１】
別の実施形態では、前記断片は、配列番号３のＤＮＡ配列によってコードされる配列番号２を含むかそれらからなる。
【００８２】
別の実施形態では、前記断片は、配列番号２のアミノ酸３６〜２９６を含むかそれらからなる。
【００８３】
一実施形態では、前記Ｘｅｎｏ．ＲＢＤは、配列番号３９のアミノ酸配列またはその断片を含むかそれらからなる。
【００８４】
一実施形態では、前記断片は、配列番号３９のアミノ酸３６〜３１６を含むかそれらからなる。
【００８５】
一実施形態では、前記断片は、配列番号３９のアミノ酸１〜２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４または３１５を含むかそれらからなる。
【００８６】
別の実施形態では、前記断片は、配列番号３９のアミノ酸３６〜２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４または３１５を含むかそれらからなる。
【００８７】
別の実施形態では、前記断片は、配列番号４１のＤＮＡ配列によってコードされる配列番号４０を含むかそれらからなる。
【００８８】
別の実施形態では、前記断片は、配列番号４０のアミノ酸３６〜２９６を含むかそれらからなる。
【００８９】
一実施形態では、可溶性受容体結合ドメインリガンドは、異種栄養性ＭＲＶの糖タンパク質から単離されたものであり、本明細書ではＸＭＲＶ．ＲＢＤと呼ぶ。一実施形態では、前記ＸＭＲＶ．ＲＢＤは、配列番号２９のアミノ酸配列またはその断片を含むかそれらからなる。
【００９０】
一実施形態では、前記断片は、配列番号２９のアミノ酸１〜２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２または２８３を含むかそれらからなる。
【００９１】
一実施形態では、前記断片は、配列番号２９のアミノ酸３３〜２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２または２８３を含むかそれらからなる。
【００９２】
別の実施形態では、前記断片は、配列番号３５（配列番号２９のアミノ酸１〜２３３に対応する）を含むかそれらからなる。
【００９３】
別の実施形態では、前記断片は、配列番号２９のアミノ酸３３〜２３３を含むかそれらからなる。
【００９４】
一実施形態では、可溶性受容体結合ドメインリガンドは多栄養性ＭＬＶの糖タンパク質から単離されたものであり、本明細書ではＰＭＬＶ．ＲＢＤと呼ぶ。
【００９５】
一実施形態では、前記ＰＭＬＶ．ＲＢＤは、配列番号３０のアミノ酸配列またはその断片を含むかそれらからなる。
【００９６】
一実施形態では、前記断片は、配列番号３０のアミノ酸１〜２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８または２７９を含むかそれらからなる。
【００９７】
一実施形態では、前記断片は、配列番号３０のアミノ酸３３〜２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８または２７９を含むかそれらからなる。
【００９８】
別の実施形態では、前記断片は、配列番号３６（配列番号３０のアミノ酸１〜２２９に対応する）を含むかそれらからなる。
【００９９】
別の実施形態では、前記断片は、配列番号３０のアミノ酸３３〜２２９を含むかそれらからなる。
【０１００】
別の実施形態では、前記ＰＭＬＶ．ＲＢＤは、配列番号３１のアミノ酸配列またはその断片を含むかそれらからなる。
【０１０１】
一実施形態では、前記断片は、配列番号３１のアミノ酸１〜２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９または２７０を含むかそれらからなる。
【０１０２】
一実施形態では、前記断片は、配列番号３１のアミノ酸３３〜２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９または２７０を含むかそれらからなる。
【０１０３】
別の実施形態では、前記断片は、配列番号３７（配列番号３１のアミノ酸１〜２２９に対応する）を含むかそれらからなる。
【０１０４】
別の実施形態では、前記断片は、配列番号３１のアミノ酸３３〜２２９を含むかそれらからなる。
【０１０５】
別の実施形態では、前記ＰＭＬＶ．ＲＢＤは、配列番号３２のアミノ酸配列またはその断片を含むかそれらからなる。
【０１０６】
一実施形態では、前記断片は、配列番号３２のアミノ酸１〜２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８または２７９を含むかそれらからなる。
【０１０７】
一実施形態では、前記断片は、配列番号３２のアミノ酸３３〜２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８または２７９を含むかそれらからなる。
【０１０８】
別の実施形態では、前記断片は、配列番号３８（配列番号３２のアミノ酸１〜２２９に対応する）を含むかそれらからなる。
【０１０９】
別の実施形態では、前記断片は、配列番号３２のアミノ酸３３〜２２９を含むかそれらからなる。
【０１１０】
一実施形態では、可溶性受容体結合ドメインリガンドはヒトＴ細胞白血病ウイルス−２の糖タンパク質から単離されたものであり、本明細書ではＨＴＬＶ２．ＲＢＤと呼ぶ。
【０１１１】
一実施形態では、前記ＨＴＬＶ２．ＲＢＤは、配列番号４のアミノ酸配列またはその断片を含むかそれらからなる。
【０１１２】
一実施形態では、前記断片は、配列番号４のアミノ酸１９〜２２４を含むかそれらからなり、配列番号４のアミノ酸２０〜２２４を含むかそれらからなり、あるいは配列番号４のアミノ酸２１〜２２４を含むかそれらからなる。
【０１１３】
一実施形態では、前記断片は、配列番号４のアミノ酸１〜１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２または２２３を含むかそれらからなる。
【０１１４】
別の実施形態では、前記断片は、配列番号４のアミノ酸１９、２０または２１〜１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２または２２３を含むかそれらからなる。
【０１１５】
別の実施形態では、前記断片は、配列番号６のＤＮＡ配列によってコードされる配列番号５を含むかそれらからなる。
【０１１６】
別の実施形態では、前記断片は、配列番号５のアミノ酸１９、２０または２１〜１７８を含むかそれらからなる。
【０１１７】
一実施形態では、可溶性受容体結合ドメインリガンドはヒトＴ細胞白血病ウイルス−１の糖タンパク質から単離されたものであり、本明細書ではＨＴＬＶ１．ＲＢＤと呼ぶ。一実施形態では、前記ＨＴＬＶ１．ＲＢＤは、配列番号７のアミノ酸配列またはその断片を含むかそれらからなる。
【０１１８】
一実施形態では、前記断片は、配列番号７のアミノ酸１〜１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７または２０８を含むかそれらからなる。
【０１１９】
一実施形態では、前記断片は、配列番号７のアミノ酸２１〜１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７または２０８を含むかそれらからなる。
【０１２０】
別の実施形態では、前記断片は、配列番号３３（配列番号７のアミノ酸１〜１８２に対応する）を含むかそれらからなる。
【０１２１】
一実施形態では、前記断片は、配列番号７のアミノ酸２１〜１８２を含むかそれらからなる。
【０１２２】
一実施形態では、可溶性受容体結合ドメインリガンドはヒトＴ細胞白血病ウイルス−４の糖タンパク質から単離されたものであり、本明細書ではＨＴＬＶ４．ＲＢＤと呼ぶ。一実施形態では、前記ＨＴＬＶ４．ＲＢＤは、配列番号８のアミノ酸配列またはその断片を含むかそれらからなる。
【０１２３】
一実施形態では、前記断片は、配列番号８のアミノ酸１〜１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３または２０４を含むかそれらからなる。
【０１２４】
一実施形態では、前記断片は、配列番号８のアミノ酸２１〜１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３または２０４を含むかそれらからなる。
【０１２５】
別の実施形態では、前記断片は、配列番号３４（配列番号８のアミノ酸１〜１７８に対応する）を含むかそれらからなる。
【０１２６】
別の実施形態では、前記断片は、配列番号８のアミノ酸２１〜１７８を含むかそれらからなる。
【０１２７】
別の実施形態では、前記ＨＴＬＶ４．ＲＢＤは、配列番号４２のアミノ酸配列またはその断片を含むかそれらからなる。
【０１２８】
一実施形態では、前記断片は、配列番号４２のアミノ酸１〜２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２０、６２１、６２２、６２３、６２４、６２５、６２６、６２７、６２８、６２９、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７、６６８、６６９、６７０、６７１、６７２、６７３、６７４、６７５、６７６、６７７、６７８、６７９、６８０、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、６８６、６８７、６８８、６８９、６９０、６９１、６９２、６９３、６９４、６９５、６９６、６９７、６９８、６９９、７００、７１０、７１１、７１２、７１３、７１４、７１５、７１６、７１７、７１８、７１９、７２０、７２１、７２２、７２３、７２４、７２５、７２６、７２７、７２８、７２９、７３０、７３１、７３２、７３３または７３４を含むかそれらからなる。
【０１２９】
一実施形態では、前記断片は、配列番号４２のアミノ酸２４〜２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２０、６２１、６２２、６２３、６２４、６２５、６２６、６２７、６２８、６２９、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７、６６８、６６９、６７０、６７１、６７２、６７３、６７４、６７５、６７６、６７７、６７８、６７９、６８０、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、６８６、６８７、６８８、６８９、６９０、６９１、６９２、６９３、６９４、６９５、６９６、６９７、６９８、６９９、７００、７１０、７１１、７１２、７１３、７１４、７１５、７１６、７１７、７１８、７１９、７２０、７２１、７２２、７２３、７２４、７２５、７２６、７２７、７２８、７２９、７３０、７３１、７３２、７３３または７３４を含むかそれらからなる。
【０１３０】
別の実施形態では、前記断片は、配列番号４２のアミノ酸２２〜２３７を含むかそれらからなり、配列番号４２のアミノ酸２３〜２３７を含むかそれらからなり、あるいは配列番号４２のアミノ酸２４〜２３７を含むかそれらからなる。
【０１３１】
別の実施形態では、前記断片は、配列番号４２のアミノ酸１〜２３６を含むかそれらからなる。別の実施形態では、前記断片は、配列番号４２のアミノ酸２４〜２３６を含むかそれらからなる。
【０１３２】
別の実施形態では、前記断片は、配列番号４５のＤＮＡ配列によってコードされる配列番号４２を含むかそれらからなる。
【０１３３】
一実施形態では、可溶性受容体結合ドメインリガンドはヒトＴ細胞白血病ウイルス−３の糖タンパク質から単離されたものであり、本明細書ではＨＴＬＶ３．ＲＢＤと呼ぶ。一実施形態では、前記ＨＴＬＶ３．ＲＢＤは、配列番号４３のアミノ酸配列またはその断片を含むかそれらからなる。
【０１３４】
一実施形態では、前記断片は、配列番号４３のアミノ酸１〜１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１または４９２、またはその断片を含むかそれらからなる。
【０１３５】
一実施形態では、前記断片は、配列番号４３のアミノ酸２３〜１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１または４９２、またはその断片を含むかそれらからなる。
【０１３６】
別の実施形態では、前記断片は、配列番号４３のアミノ酸１〜１８０を含むかそれらからなる。別の実施形態では、前記断片は、配列番号４３のアミノ酸２３〜１８０を含むかそれらからなる。
【０１３７】
別の実施形態では、前記断片は、配列番号４４のＤＮＡ配列によってコードされる配列番号４３を含むかそれらからなる。
【０１３８】
好ましい実施形態によれば、受容体結合ドメインリガンドは、配列番号１、２、４、５、７、８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２および４３の配列、その断片および変異体を含む群から選択され、より好ましくは配列番号２、５、３３、３４、３５、３６、３７、３８および４０の配列、その断片および変異体を含む群から選択される。別の実施形態によれば、受容体結合ドメインリガンドは、配列番号３、６、４１、４４および４５の配列を含む群から選択されるＤＮＡ配列によってコードされる。
【０１３９】
一実施形態では、受容体結合ドメインリガンドは、配列番号１、２、４、５、７、８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２および４３の配列のうちの１つと少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは配列番号１、２、４、５、７、８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２および４３の配列のうちの１つと少なくとも約７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％またはそれ以上の配列同一性を示す配列を含むかそれらからなる。
【０１４０】
別の実施形態では、受容体結合ドメインリガンドは、配列番号３、６、４１、４４および４５の配列のうちの１つと少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは配列番号３、６、４１、４４および４５の配列のうちの１つと少なくとも約７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すＤＮＡ配列によってコードされる。
【０１４１】
一実施形態では、受容体結合ドメインリガンドは、配列番号１、２、４、５、７、８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２および４３の配列を有するポリペプチドのうちの１種の変異体である。
【０１４２】
本明細書で使用される用語としてのポリペプチド「変異体」は、１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入の点で具体的に本明細書に開示されているポリペプチドとは典型的に異なるポリペプチドである。そのような変異体は天然に生じるものであってもよく、あるいは、例えば、本明細書に記載されているように、かつ／または当該技術分野でよく知られている多くの技術のいずれかを用いて、上記ポリペプチド配列の１つ以上を修飾し、かつポリペプチドの１つ以上の生物活性を評価することにより、合成により生成したものであってもよい。修飾はポリペプチドの構造において行ってもよく、望ましい特性を有する変異体または誘導体ポリペプチドをコードする機能性分子をなお得ることができる。
【０１４３】
ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させて、本発明のリガンドの均等物またはさらに改良された変異体または一部を生成したい場合、当業者は典型的に、コード化ＤＮＡ配列のコドンの１つ以上を変化させる。例えば、細胞表面栄養輸送体に結合するその能力を大きく喪失することなく、特定のアミノ酸をタンパク質構造中の他のアミノ酸で置換してもよい。タンパク質の生物学的機能活性を定めるのはタンパク質の結合能力および性質であるため、特定のアミノ酸配列の置換は、タンパク質配列および当然ながらその基礎をなすＤＮＡコード配列において行ってもよく、それにも関わらず、同様の特性を有するタンパク質を得ることができる。従って、ペプチド配列または前記ペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列において、それらの生物学的有用性もしくは活性を大きく喪失することなく、様々な変化が可能であると想定される。多くの例では、ポリペプチド変異体は、１つ以上の保存的置換を含む。「保存的置換」とは、ペプチド化学の当業者がポリペプチドの二次構造および親水性／疎水性(hydropathic nature)が実質的に変化されないことを期待するように、あるアミノ酸を同様の特性を有する別のアミノ酸で置き換える置換である。従って、上に概説したように、アミノ酸置換は一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、大きさなどに基づいている。上記特性のうちの様々を考慮した例示的な置換は当業者によく知られており、アルギニンおよびリジン、グルタミン酸およびアスパラギン酸、セリンおよびトレオニン、グルタミンおよびアスパラギンならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシンが挙げられる。さらに、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性における類似性に基づいてアミノ酸置換を行ってもよい。例えば、負に荷電したアミノ酸としてはアスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ、正に荷電したアミノ酸としてはリジンおよびアルギニンが挙げられ、同様の親水性値を有する荷電していない極性の頭部基を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシンおよびバリン、グリシンおよびアラニン、アスパラギンおよびグルタミンならびにセリン、トレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが挙げられる。保存的変化を表し得るアミノ酸の他の群としては、（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ、（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ、（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ、および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓが挙げられる。変異体は、さらにまたは代わりとして、非保存的変化を含んでいてもよい。好ましい実施形態では、ポリペプチド変異体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸の置換、欠失または付加により、天然配列とは異なる。変異体は、さらに（または代わりとして）、例えば、ポリペプチドの免疫原性、二次構造および親水性／疎水性に対して最小の影響を有するアミノ酸の欠失または付加によって修飾してもよい。
【０１４４】
一実施形態では、受容体結合ドメインリガンドは、例えばＦｃ断片またはＧＦＰなどの検出タグに融合された受容体結合ドメインの一部または全体を含む融合タンパク質である。Ｆｃ断片の例としては、限定されるものではないが、ウサギＦｃ断片（配列番号１０によってコードされる配列番号９のアミノ酸配列）、およびマウスＦｃ断片（配列番号１２によってコードされる配列番号１１のアミノ酸配列）が挙げられる。
【０１４５】
一実施形態では、受容体結合ドメインリガンドは、マウスＦｃ断片に融合されたＨＴＬＶ２．ＲＢＤ（配列番号１３のＤＮＡ配列によってコードされる）、およびウサギＦｃ断片に融合されたＸｅｎｏ．ＲＢＤ（配列番号１４のＤＮＡ配列によってコードされる）を含む群から選択される。
【０１４６】
一実施形態では、受容体結合ドメインリガンドは、例えば大腸菌、酵母、バキュロウイルス−昆虫細胞または哺乳類細胞（ＨＥＫもしくはＣＨＯなど）発現系などの例えば当該技術分野で知られているあらゆる発現系などを用いるクローニング方法によって得られる。一実施形態では、受容体結合ドメインリガンドの配列は、Ｎ末端において前記受容体結合ドメインリガンドの分泌を可能にするペプチドシグナル配列に融合されている。ペプチドシグナル配列の例としては、限定されるものではないが、ヒトのＩＬ−２ペプチドシグナル（配列番号１５）、ヒトのアルブミンペプチドシグナル（配列番号１６）、ヒトのキモトリプシノーゲンペプチドシグナル（配列番号１７）、ヒトのトリプシノーゲン−２ペプチドシグナル（配列番号１８）、ガウシアルシフェラーゼペプチドシグナル（配列番号１９）、およびマウスＩｇＭペプチドシグナル（配列番号２０）が挙げられる。
【０１４７】
一実施形態では、受容体結合ドメインリガンドは、Ｘｅｎｏ．ＲＢＤ、ＸＭＲＶ．ＲＢＤまたはＰＭＬＶ．ＲＢＤの一部または全体を含み、ＸＰＲ１栄養輸送体に結合する。一実施形態では、受容体結合ドメインリガンドは、ＨＴＬＶ２．ＲＢＤ、ＨＴＬＶ１．ＲＢＤ、ＨＴＬＶ３．ＲＢＤまたはＨＴＬＶ４．ＲＢＤの一部または全体を含み、ＧＬＵＴ１栄養輸送体に結合する。
【０１４８】
本明細書で使用される「基準」という用語は、測定した発現レベルに関する比較のための基準として使用することができるあらゆる好適な基準発現レベルを広く包含する。
【０１４９】
一実施形態では、標準的な基準は、発現レベルを決定するために使用されるものとして細胞の同じ培養物中で以前に決定した個別の基準である。
【０１５０】
本発明の第１の実施形態では、基準発現レベルは、本発明のアッセイを行う日の好ましくは１、２、３、４、５、６、８、９、１０日またはそれ以前、１、２、３、４、５、６、７、８週間前、１、２、３、４、５ヶ月またはそれ以前、あるいは１、２、３、４、５年またはそれ以前に細胞の培養物中で測定した発現レベルである。
【０１５１】
第２の実施形態では、当該細胞を凍結し、その後に解凍し、基準発現レベルは凍結前に測定した発現レベルである。
【０１５２】
これらの実施形態によれば、測定した発現レベルと個別の基準発現レベルとの差は細胞老化または老化を示している。
【０１５３】
本発明の一実施形態では、基準発現レベルは「若い」細胞群で測定した発現レベルである。一実施形態では、若い細胞群は、完全な分化特性（例えば、ＭＳＣの場合、若い細胞は骨芽細胞系譜、軟骨細胞系譜および脂肪細胞系譜に沿って分化することができ、かつ任意で筋細胞系統に分化することができること）を示す。別の実施形態では、若い細胞群は、正常な倍加時間（正常な倍加時間は細胞の種類に依存する）で完全な増殖能を示す。別の実施形態では、若い細胞群は老化の兆候（特に後期の兆候）を示さない（老化の後期の兆候の例は上に列挙されている）。一実施形態では、若い細胞群は、老化の兆候（特に、本発明において列挙されている老化の最後の兆候）の発生前に少なくとも１０回、好ましくは少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０回さらに分裂することができる。一実施形態では、若い細胞群は、１０回以下、好ましくは９、８、７、６、５、４、３、２、１回継代されている。本実施形態によれば、測定した発現レベルと基準発現レベルとの差は細胞老化または老化を示している。
【０１５４】
本発明の一実施形態では、基準発現レベルは、「老齢」細胞群において測定した発現レベルである。一実施形態では、老齢細胞群は有意に変化した分化能を示し、例えば、当該細胞は少なくとも１種の特定の細胞系統にもはや分化することができない（例えば、ＭＳＣの場合、骨芽細胞系統、軟骨細胞系統、脂肪細胞系統または筋細胞系統のうちの少なくとも１種への分化はもはや不可能である）、あるいは以下の３種の系統：骨芽細胞系統、軟骨細胞系統および脂肪細胞系統に分化することができない、あるいはそれ以上分化することができない。別の実施形態では、老齢細胞群は、細胞分裂が行われなくなること、または倍加時間の増加（例えば、細胞の種類に応じた正常な倍加時間と比較して少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０、４０または５０％の倍加時間の増加）を示す細胞群である。別の実施形態では、老齢細胞群は、老化の兆候（特に後期の兆候）（その列挙について上記を参照）を示す細胞群である。別の実施形態では、老齢細胞群は１０回またそれ以上、好ましくは２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０回またはそれ以上継代されている。本実施形態によれば、測定した発現レベルと基準発現レベルとの差がないことは細胞老化または老化を示している。
【０１５５】
一実施形態では、当該基準は、アルゴリズムおよび他の統計的および階層的分類方法を用いて構築される。
【０１５６】
別の態様では、基準発現レベルは、格納された発現レベルを提供するためのデータベースに格納されており、格納された発現レベルを使用して発現レベルの差を決定する。当該データベースは、例えばコンピュータまたはサーバ上に格納されていてもよい。
【０１５７】
一実施形態では、当該発現レベルは正規化されており、すなわち当該発現レベルは、細胞表面栄養輸送体の発現と別の遺伝子またはタンパク質の発現との比に対応している。
【０１５８】
一実施形態では、細胞表面栄養輸送体はＸＰＲ１であり、正規化のために使用される他の遺伝子またはタンパク質はＧＬＵＴ１である。別の実施形態では、細胞表面栄養輸送体はＧＬＵＴ１であり、正規化のために使用される他の遺伝子またはタンパク質はＸＰＲ１である。
【０１５９】
別の実施形態では、細胞表面栄養輸送体はＸＰＲ１またはＧＬＵＴ１であり、好ましくはＸＰＲ１であり、正規化のために使用される他の遺伝子またはタンパク質は、ＧＡＰＤＨ、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＣＤ１６６を含む群から選択される。
【０１６０】
本発明では、２つの数値、特に２つの発現レベルは、第１の数値がより高い（例えば、第１の数値は第２の数値よりも約２０％高い、好ましくは第２の数値よりも約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０％またはそれ以上高い）あるいは、第２の数値よりも低い（例えば、第１の数値は第２の数値よりも約２０％低い、好ましくは第２の数値よりも約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０％またはそれ以上低い）場合、異なるものとみなされる。
【０１６１】
本発明の別の目的は、少なくとも１種の細胞表面栄養輸送体、好ましくはＸＰＲ１および／またはＧＬＵＴ１、より好ましくはＸＰＲ１およびＧＬＵＴ１の発現レベルを測定するための手段を含む、本発明の方法を実施するためのキットである。
【０１６２】
一実施形態では、少なくとも１種の細胞表面栄養輸送体の発現レベルをＲＮＡレベルにおいて評価し、本発明のキットは、全ＲＮＡ抽出のための手段、全ＲＮＡの逆転写のための手段、および少なくとも１種の細胞表面栄養輸送体、好ましくはＸＰＲ１および／またはＧＬＵＴ１のＲＮＡの発現を定量化するための手段を含んでいてもよい。一実施形態では、少なくとも１種の細胞表面栄養輸送体、好ましくはＸＰＲ１および／またはＧＬＵＴ１のＲＮＡの発現を定量化するための手段は、前記細胞表面栄養輸送体、好ましくはＸＰＲ１および／またはＧＬＵＴ１に特異的なＰＣＲまたはｑＰＣＲプライマーである。ＸＰＲ１に特異的なＰＣＴまたはｑＰＣＲプライマーの例としては、限定されるものではないが、順方向プライマー：５’−ＡＧＡＧＣＴＴＧＧＧＡＧＡＣＡＡＡＧＣＡ−３’（配列番号２５）−逆方向プライマー：５’−ＧＴＧＧＡＣＡＣＡＡＣＡＴＴＣＧＣＡＡＣ−３’（配列番号２６）のプライマー対が挙げられる。ＧＬＵＴ１に特異的なＰＣＴまたはｑＰＣＲプライマーの例としては、限定されるものではないが、順方向プライマー：５’−ＴＣＡＣＴＧＴＧＣＴＣＣＴＧＧＴＴＣＴＧ−３’（配列番号２７）−逆方向プライマー：５’−ＣＣＴＣＧＧＧＴＧＴＣＴＴＧＴＣＡＣＴＴ−３’（配列番号２８）のプライマー対が挙げられる。一実施形態では、当該キットは、定量的ＰＣＲを実施するための試薬（例えば、緩衝液、酵素など）も含む。一実施形態では、本発明のキットは、ＲＮＡレベルにおいて少なくとも１種の正規化遺伝子の発現レベルを検出するための手段も含んでいてもよい。
【０１６３】
別の実施形態では、少なくとも１種の細胞表面栄養輸送体の発現レベルをタンパク質レベルにおいて評価し、本発明のキットは、少なくとも１種の細胞表面栄養輸送体、好ましくはＸＰＲ１および／またはＧＬＵＴ１を検出するための手段を含んでいてもよい。一実施形態では、少なくとも１種の細胞表面栄養輸送体を検出するための前記手段は、前記少なくとも１種の細胞表面栄養輸送体、好ましくはＸＰＲ１および／またはＧＬＵＴ１に特異的な抗体である。別の実施形態では、少なくとも１種の細胞表面栄養輸送体を検出するための前記手段は、本発明において定義され、かつ少なくとも１種の細胞表面栄養輸送体に特異的なＲＢＤである。一実施形態では、本発明のキットは、少なくとも１種の正規化タンパク質の発現レベルを検出するための手段も含んでいてもよい。
【０１６４】
本発明は、細胞老化（好ましくは、ＸＰＲ１および／またはＧＬＵＴ１は細胞老化の早期バイオマーカーである）または老化のバイオマーカーおよび／または細胞分裂の累積のバイオマーカーとしての、細胞表面栄養輸送体、好ましくはＸＰＲ１および／またはＧＬＵＴ１にも関する。
【０１６５】
本発明は、細胞の増殖能および／または分化能のバイオマーカーとしての細胞表面栄養輸送体、好ましくはＸＰＲ１および／またはＧＬＵＴ１にも関する。一実施形態では、細胞表面栄養輸送体、好ましくはＸＰＲ１および／またはＧＬＵＴ１は、幹細胞性のバイオマーカーである。
【０１６６】
本発明は、細胞群、特に再生医療に使用される細胞群または生体外スクリーニングアッセイで使用される細胞群の品質のバイオマーカーとしての、細胞表面栄養輸送体、好ましくはＸＰＲ１および／またはＧＬＵＴ１にも関する。
【０１６７】
本発明は、少なくとも１種の細胞表面栄養輸送体、好ましくはＸＰＲ１および／またはＧＬＵＴ１、より好ましくはＸＰＲ１の発現レベルを決定または測定する工程を含む、例えば細胞老化を減速する（老化防止効果）または促進する（加齢促進または老化促進効果）化合物などの細胞老化に影響を与える化合物の生体外スクリーニング方法にも関する。
【０１６８】
一実施形態では、当該生体外方法は、早老症候群、好ましくは早老症に影響を与える化合物をスクリーニングするためのものである。早老症候群および早老症は老化促進モデルである。一実施形態では、当該生体外方法は、老化防止活性により早老症候群を治療するため、好ましくは早老症を治療するために使用することができる化合物をスクリーニングするためのものである。
【０１６９】
一実施形態では、当該生体外方法は、癌細胞に影響を与える化合物をスクリーニングするためのものである。癌細胞はそれらの老化回避能力を特徴とする。一実施形態では、当該生体外方法は、老化促進（または加齢促進）活性により癌細胞を治療するために使用することができる化合物をスクリーニングするためのものである。
【０１７０】
一実施形態では、本発明の方法は、測定した発現レベルを基準発現レベルと比較する工程をさらに含む。
【０１７１】
一実施形態では、基準発現レベルは、試験化合物の老化防止または老化促進効果についての、指標値、１つ以上のリスク予測アルゴリズムから得られたもの、または計算した指標である。基準は細胞集団研究から得られた数または値に相対的であってもよく、前記化合物の老化防止または老化促進効果を試験するために使用されるものと同じであり、かつ同じ培養条件を用いて同じ培地で培養した細胞に基づいていることが好ましい。
【０１７２】
本発明の別の実施形態では、基準発現レベルは、老化促進または老化防止効果を示さないことが知られている化合物に曝露した対照細胞試料における発現レベルの測定から得られる。本実施形態によれば、測定した発現レベルと基準発現レベルとの差は、試験した化合物の老化促進または老化防止効果を示している。
【０１７３】
本発明の別の実施形態では、基準発現レベルは、老化促進または老化防止効果を示すことが知られている化合物に曝露した対照細胞試料における発現レベルの測定から得られる。本実施形態によれば、測定した発現レベルと基準発現レベルとの間に差がないことは、試験した化合物の老化促進または老化防止効果を示している。
【０１７４】
本発明の一実施形態では、基準発現レベルは、試験化合物の非存在下での対照細胞培養物における発現レベルの測定から得られる。本実施形態によれば、測定した発現レベルと基準発現レベルとの差は試験化合物の老化促進または老化防止効果を示している。
【０１７５】
一実施形態では、細胞の培養物を用意し、第１の培養物バッチを試験化合物に曝露し（発現レベルの測定のため）、第２の培養物バッチを試験化合物に曝露しない（基準発現レベルの測定のため）、２つの異なる培養物バッチに分ける。
【図面の簡単な説明】
【０１７６】
【図１Ａ】細胞培養継代（Ｐ：継代）によるＸＰＲ１／ＧＬＵＴ１比の漸進的変化を示すグラフの組み合わせである。累積分裂数および培養継代数によるｈＥＳＣ−ＳＡ００１由来ＭＳＣの倍加時間の漸進的変化。
【図１Ｂ】細胞培養継代（Ｐ：継代）によるＸＰＲ１／ＧＬＵＴ１比の漸進的変化を示すグラフの組み合わせである。累積分裂数および培養継代数によるＸＰＲ１（左のパネル）およびＧＬＵＴ１（右のパネル）の細胞表面発現の漸進的変化。
【図１Ｃ】細胞培養継代（Ｐ：継代）によるＸＰＲ１／ＧＬＵＴ１比の漸進的変化を示すグラフの組み合わせである。累積分裂数および培養継代数によるＸＰＲ１／ＧＬＵＴ１比の漸進的変化。
【図１Ｄ】細胞培養継代（Ｐ：継代）によるＸＰＲ１／ＧＬＵＴ１比の漸進的変化を示すグラフの組み合わせである。累積分裂数および培養継代数によるＸＰＲ１のｍＲＮＡの相対的発現レベル（ＧＡＰＤＨに対して正規化）の漸進的変化。
【図２】ウマの幹細胞株における培養継代数（Ｐ）によるＸＰＲ１発現を示すヒストグラムである。ＭＥＳＦ：可溶性蛍光色素分子等量。
【図３】骨髄由来ｈＭＳＣ細胞株における培養継代数（Ｐ）によるＸＰＲ１発現を示すヒストグラムである。ＭＥＳＦ：可溶性蛍光色素分子等量。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）。
【図４Ａ】ウシ胎児血清の減少により誘導される増殖に関する減速モデルにおける、ＸＰＲ１およびＧＬＵＴ１発現を表す。
【図４Ｂ】ウシ胎児血清の減少により誘導される増殖に関する減速モデルにおける、ＸＰＲ１／ＧＬＵＴ１比を表す。
【図４Ｃ】ウシ胎児血清の減少により誘導される増殖に関する減速モデルにおける、細胞増殖を表す。
【図５】増殖に関する老化加速モデル（マイトマイシン）および老化防止モデル（ラパマイシン）におけるＸＰＲ１／ＧＬＵＴ１比を表す。
【実施例】
【０１７７】
以下の実施例により、本発明についてさらに説明する。
【０１７８】
実施例１：ヒトＭＳＣの増殖能を監視するための方法
【０１７９】
材料および方法
ＭＳＣをTrypLE Express（Life Technologies社）を用いて３７℃で５分間剥離し、９６ウェルＶ型マイクロプレートに移した。各結合のために３．１０４個の細胞を使用した。ＲＢＤを０．１％アジ化ナトリウムおよび１ｍＭのＥＤＴＡを含む培地において対で（Ｇｌｕｔ１．ＲＢＤ．マウスＦｃおよびＸｅｎｏ．ＲＢＤ．ウサギＦｃ）事前に混合した。ＲＢＤをＭＰＣに添加し、３７℃で２０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ／２％ＦＣＳで１回洗浄し、次いで、０．３μｇ／ｍＬのＤＡＰＩを含む結合緩衝液（ＰＢＳ／２％ＦＣＳ／０．１％アジ化ナトリウム／１ｍＭのＥＤＴＡ）中で、Alexa Fluor 647ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、１：４００）およびＲ−ＰＥヤギ抗マウスＩｇＧ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、１：２００）抗体と共にインキュベートして当該分析を生細胞に限定した。４℃で３０分間インキュベートした後、細胞を洗浄し、フローサイトメトリー分析の前に結合緩衝液に再懸濁した。４０５、４８８および６４０ｎｍの励起によりＦＡＣＳＶｅｒｓｅフローサイトメーター（BD Biosciences社）で蛍光シグナルを取得し、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェア（Tree Star社）を用いてデータ分析を行った。死細胞を当該分析から除外した。「Fluorescence minus one」（ＦＭＯ）対照を使用してＲＢＤチャネルにおけるバックグラウンドレベルを確立した（Ｒ−ＰＥおよびＡＦ６４７）。製造業者の説明書に従い、較正ビーズ（R-PEおよびAF647 MESF Quantum Beads、Bangs Laboratories社）を用いて、シグナルを可溶性蛍光色素分子等量（ＭＥＳＦ）値に変換した。
【０１８０】
結果
図１に示すように、ＸＰＲ１の発現レベルは、胚性幹細胞（ＳＡ００１細胞）由来のヒトＭＳＣの累積分裂数と共に増加している。この発現の増加は、細胞表面発現（図１Ｂ）およびｍＲＮＡ発現（図１Ｄ）の両方で観察される。対照的に、ＧＬＵＴ１の発現レベルは累積分裂数と共に減少している（図１Ｂ）。
【０１８１】
さらに、図１Ｃに示すように、ＸＰＲ１／ＧＬＵＴ１比は、胚性幹細胞（ＳＡ００１細胞）由来のヒトＭＳＣの累積分裂数と共に増加している。
【０１８２】
これらの結果から、ＸＰＲ１、ＧＬＵＴ１およびＸＰＲ１／ＧＬＵＴ１比を細胞老化のバイオマーカーとして使用できることが確認される。
【０１８３】
実施例２：ウマの幹細胞におけるＸＰＲ１発現
【０１８４】
材料および方法
ＭＳＣをTrypLE Express（Life Technologies社）を用いて３７℃で５分間剥離し、９６ウェルＶ型マイクロプレートに移した。各結合のために３．１０４個の細胞を使用した。０．１％アジ化ナトリウムおよび１ｍＭのＥＤＴＡを含む培地で希釈したＸｅｎｏ．ＲＢＤ．ウサギＦｃをＭＰＣに添加し、３７℃で２０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ／２％ＦＣＳで１回洗浄し、次いで、０．３μｇ／ｍＬのＤＡＰＩを含む結合緩衝液（ＰＢＳ／２％ＦＣＳ／０．１％アジ化ナトリウム／１ｍＭのＥＤＴＡ）中で、Alexa Fluor 647ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、１：４００）抗体と共にインキュベートして当該分析を生細胞に限定した。４℃で３０分間インキュベートした後、細胞を洗浄し、フローサイトメトリー分析の前に結合緩衝液に再懸濁した。４０５、４８８および６４０ｎｍの励起によりＦＡＣＳＶｅｒｓｅフローサイトメーター（BD Biosciences社）で蛍光シグナルを取得し、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェア（Tree Star社）を用いてデータ分析を行った。死細胞を当該分析から除外した。「Fluorescence minus one」（ＦＭＯ）対照を使用してＲＢＤチャネル（ＡＦ６４７）におけるバックグラウンドレベルを確立した。製造業者の説明書に従い、較正ビーズ（AF647 MESF Quantum Beads、Bangs Laboratories社）を用いてシグナルを可溶性蛍光色素分子等量（ＭＥＳＦ）値に変換した。
【０１８５】
結果
図２に示すように、ＸＰＲ１の発現レベルはウマのＭＳＣにおける培養継代数と共に増加している。従って、この結果から、ＸＰＲ１はウマの幹細胞における細胞老化の潜在的バイオマーカーであることも実証される。
【０１８６】
実施例３：ＸＰＲ１発現および骨髄由来ｈＭＳＣの細胞老化
【０１８７】
材料および方法
異なる継代数（Ｐ４、Ｐ６およびＰ８）における２人のドナーから採取したヒト骨髄由来ＭＳＣを解凍し、６０個の細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種した。α−ＭＥＭ、Ｌ−グルタミン、Ｐ／Ｓおよび１６．５％のロット選択したウシ胎児血清を含む完全培地において細胞を増殖させた。培養物が８０％の集密に達したら、細胞をトリプシン（０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ、Life Technologies社）により３７℃で５分間剥離し、各継代数における各細胞群の数を数えて倍加時間（単位：時間）を決定した。
【０１８８】
各継代数における各バッチの３．１０４個の細胞を、各結合のために９６ウェルＶ型マイクロプレートに移した。
【０１８９】
０．１％アジ化ナトリウムおよび１ｍＭのＥＤＴＡを含む培地においてＸｅｎｏ．ＲＢＤ．ウサギＦｃを調製した。Ｘｅｎｏ．ＲＢＤ．ｒＦｃをＭＳＣに添加し、３７℃で２０分間インキュベートした。細胞を緩衝液Ｂ（ＰＢＳ／２％ＦＣＳ／０．１％アジ化ナトリウム／１ｍＭのＥＤＴＡ）で１回洗浄し、次いで、１μｇ／ｍＬのＤＡＰＩを含む緩衝液Ｂ中でAlexa Fluor 647ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Life Technologies社、１／１０００）と共にインキュベートして当該分析を生細胞に限定した。暗所において４℃で３０分間インキュベートした後、細胞を２回洗浄し、フローサイトメトリー分析の前に緩衝液Ｂに再懸濁した。４０５、４８８および６４０ｎｍの励起によりＦＡＣＳＶｅｒｓｅフローサイトメーター（BD Biosciences社）で蛍光シグナルを取得し、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェア（Tree Star社）を用いてデータ分析を行った。
【０１９０】
死細胞を当該分析から除外した。ＡＦ６４７ヤギ抗ウサギ二次抗体のみで標識した細胞を使用してバックグラウンドレベルを確立した。製造業者の説明書に従い、較正ビーズ（AF647 MESF Quantum Beads、Bangs Laboratories社）を用いて、シグナルを可溶性蛍光色素分子等量（ＭＥＳＦ）値に変換した。
【０１９１】
データはＸＰＲ１の３回の標識の平均±ＳＤを表し、スチューデントｔ−検定を用いて統計的有意性を決定した。ｐ＜０．０５を有意であるとみなした。
【０１９２】
結果
図３に示すように、ＸＰＲ１発現は、細胞分裂数（継代数に反映される）および各ドナーの倍加時間と共に増加している。集団の倍加時間の増加は、細胞が複製老化し始めていることを示している。
【０１９３】
これらの結果から、ＸＰＲ１の増加を骨髄由来のｈＭＳＣにおいて細胞老化のバイオマーカーとして使用できることが確認される。
【０１９４】
実施例４：ＥＳ由来ｈＭＳＣにおけるＦＣＳの減少によって誘導される増殖減速モデルにおけるＸＰＲ１
【０１９５】
材料および方法
胚幹（ＥＳ）細胞由来のｈＭＳＣを、増殖の減速を誘導する漸減濃度のＦＣＳ（２０、５および１％）中で培養した。培養物が７０〜８０％の集密に達したら、細胞を、TrypLE Express（Life Technologies社）を用いて３７℃で５分間剥離し、数を数えて倍加時間（単位：時間）を決定した後、９６ウェルＶ型マイクロプレートに移した。各結合のために３．１０４個の細胞を使用した。０．１％アジ化ナトリウムおよび１ｍＭのＥＤＴＡを含む培地中で、ＲＢＤを対で（Ｇｌｕｔ１．ＲＢＤ．マウスＦｃおよびＸｅｎｏ．ＲＢＤ．ウサギＦｃ）事前に混合した。ＲＢＤをｈＭＳＣに添加し、３７℃で２０分間インキュベートした。細胞を緩衝液Ｂ（ＰＢＳ／２％ＦＣＳ／０．１％アジ化ナトリウム／１ｍＭのＥＤＴＡ）で１回洗浄し、次いで、緩衝液Ｂ中でAlexa Fluor 647ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Life Technologies社、１／１０００）およびＲ−ＰＥヤギ抗マウスＩｇＧ１（Life Technologies社、１／１００）と共にインキュベートした。暗所において４℃で３０分間インキュベートした後、細胞を２回洗浄し、フローサイトメトリー分析の前に緩衝液Ｂに再懸濁した。４０５、４８８および６４０ｎｍの励起によりＦＡＣＳＶｅｒｓｅフローサイトメーター（BD Biosciences社）で蛍光シグナルを取得し、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェア（Tree Star社）を用いてデータ分析を行った。
【０１９６】
「Fluorescence minus One」対照を使用してＲＢＤチャネル（Ｒ−ＰＥおよびＡＦ６４７）におけるバックグラウンドレベル（すなわちノイズ）を確立し、ここで、シグナル／ノイズはＸＰＲ１およびＧｌｕｔ１の発現レベルを表す。データは平均±ＳＤ（３回）を表す。
【０１９７】
結果
図４Ａに示すように、ＸＰＲ１の発現はＦＣＳの濃度の低下と共に増加している。反対に、ＧＬＵＴ１の発現はＥＳ由来ｈＭＳＣにおいて減少している。さらに、ＸＰＲ１／ＧＬＵＴ１比はＦＣＳの濃度の低下と共に増加している（図４Ｂ）。倍加時間（単位：時間）はＦＣＳの濃度の低下と共に増加しており、これは細胞増殖の減速を示している（図４Ｃ）。
【０１９８】
総合的に、これらのデータから、ＸＰＲ１、Ｇｌｕｔ１およびＸＰＲ１／ＧＬＵＴ１比は細胞増殖のバイオマーカーとして使用できることが確認される。
【０１９９】
実施例５：ＥＳ由来ｈＭＳＣにおけるマイトマイシンＣによって誘導される老化加速モデルおよびＥＳ由来ｈＭＳＣにおけるラパマイシンによって誘導される老化防止モデルにおけるＸＰＲ１
【０２００】
材料および方法
［マイトマイシン治療］：８０％集密のＥＳ細胞由来ｈＭＳＣを１μｇ／ｍＬまたは１０μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ（ＭＭＣ、Ｓｉｇｍａ社）で３時間処理するか何も処理しなかった（対照細胞）。ＭＭＣのパルス後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、TrypLE Expressを用いて３７℃で５分間剥離し、フラスコにさらに４日間再播種し、その終わりにＲＢＤ標識のために細胞を剥離し、数を数えて倍加時間（単位：時間）を決定した。
【０２０１】
各結合のために３．１０４個の細胞を使用し、９６ウェルＶ型マイクロプレートに移した。０．１％アジ化ナトリウムおよび１ｍＭのＥＤＴＡを含む培地中で、ＲＢＤを対で（Ｇｌｕｔ１．ＲＢＤ．マウスＦｃおよびＸｅｎｏ．ＲＢＤ．ウサギＦｃ）事前に混合した。ＲＢＤをｈＭＳＣに添加し、３７℃で２０分間インキュベートした。細胞を緩衝液Ｂ（ＰＢＳ／２％ＦＣＳ／０．１％アジ化ナトリウム／１ｍＭのＥＤＴＡ）で１回洗浄し、次いで、緩衝液Ｂ中でAlexa Fluor 647ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Life Technologies社、１／１０００）およびＲ−ＰＥヤギ抗マウスＩｇＧ１（Life Technologies社、１／１００）と共にインキュベートした。暗所において４℃で３０分間インキュベートした後、細胞を２回洗浄し、フローサイトメトリー分析の前に緩衝液Ｂに再懸濁した。４０５、４８８および６４０ｎｍの励起によりＦＡＣＳＶｅｒｓｅフローサイトメーター（BD Biosciences社）で蛍光シグナルを取得し、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェア（Tree Star社）を用いてデータ分析を行った。
【０２０２】
「Fluorescence minus One」対照を使用してＲＢＤチャネル（Ｒ−ＰＥおよびＡＦ６４７）におけるバックグラウンドレベルを確立した。１μｇ／ｍＬおよび１０μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ条件のシグナル／ノイズを対照条件に対して正規化した。
【０２０３】
［ラパマイシン治療］：ラパマイシンは、ヒトの細胞において生体外で細胞の老化を防止し、マウスにおける老化を減速させることが文献に記載されている(Wilkinson, J.E., et al. (2012). Rapamycin slows aging in mice（ラパマイシンはマウスにおいて老化を減速させる）. Aging Cell 11, 675-682)。
【０２０４】
ＥＳ細胞由来ｈＭＳＣを５０００個の細胞／ｃｍ２で播種した１日後に、０．１ｎＭまたは１０ｎＭのラパマイシン（Ｓｉｇｍａ社）で処理した。対照として０．０３％ＤＭＳＯを使用した。処理から３日後、細胞をTrypLE Express（Life Technologies社）を用いて３７℃で５分間剥離し、９６ウェルＶ型マイクロプレートに移した。各結合のために３．１０４個の細胞を使用した。０．１％アジ化ナトリウムおよび１ｍＭのＥＤＴＡを含む培地中で、ＲＢＤを対で（Ｇｌｕｔ１．ＲＢＤ．マウスＦｃおよびＸｅｎｏ．ＲＢＤ．ウサギＦｃ）事前に混合した。ＲＢＤをＭＳＣに添加し、３７℃で２０分間インキュベートした。細胞を緩衝液Ｂ（ＰＢＳ／２％ＦＣＳ／０．１％アジ化ナトリウム／１ｍＭのＥＤＴＡ）で１回洗浄し、次いで、緩衝液Ｂ中でAlexa Fluor 647ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Life Technologies社、１／１０００）およびＲ−ＰＥヤギ抗マウスＩｇＧ１（Life Technologies社、１／１００）と共にインキュベートした。暗所において４℃で３０分間インキュベートした後、細胞を２回洗浄し、フローサイトメトリー分析の前に緩衝液Ｂに再懸濁した。４０５、４８８および６４０ｎｍの励起によりＦＡＣＳＶｅｒｓｅフローサイトメーター（BD Biosciences社）で蛍光シグナルを取得し、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェア（Tree Star社）を用いてデータ分析を行った。
【０２０５】
「Fluorescence minus One」対照を使用してＲＢＤチャネル（Ｒ−ＰＥおよびＡＦ６４７）におけるバックグラウンドレベルを確立した。０．１ｎＭおよび１０ｎＭのラパマイシン条件のシグナル／ノイズを対照条件に対して正規化した。
【０２０６】
結果
データは、対照条件に対して正規化された１μｇ／ｍＬまたは１０μｇ／ｍＬのＭＭＣまたは０．１ｎＭまたは１０ｎＭのラパマイシンで処理したｈＭＳＣのＸＰＲ１／Ｇｌｕｔ１比を表す（図５）。
【０２０７】
老化促進剤マイトマイシンＣはＸＰＲ１／Ｇｌｕｔ１比を用量依存的に増加させ、これにより、ＸＰＲ１／Ｇｌｕｔ１比は、複製老化ともいう細胞の老化促進の潜在的バイオマーカーである（マイトマイシン処理細胞は細胞増殖を停止させることが知られている）ことが確認される。
【０２０８】
老化防止剤ラパマイシンはＸＰＲ１／Ｇｌｕｔ１比を用量依存的に減少させる。
【０２０９】
従って、これらのデータは、ＸＰＲ１／ＧＬＵＴ１比が、老化に影響を与える薬剤、例えば老化防止剤または老化促進剤のスクリーニングおよび同定のためのバイオマーカーになり得ることを強く支持している。
【図１Ａ】
0006670831.tif 000002
【図１Ｂ】
0006670831.tif 000003
【図１Ｃ】
0006670831.tif 000004
【図１Ｄ】
0006670831.tif 000005
【図２】
0006670831.tif 000006
【図３】
0006670831.tif 000007
【図４Ａ】
0006670831.tif 000008
【図４Ｂ】
0006670831.tif 000009
【図４Ｃ】
0006670831.tif 000010
【図５】
0006670831.tif 000011
【配列表】
0006670831000001.app