(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん患者の処置に使用して血液中の前転移性循環腫瘍細胞凝集物を減少させるための、ヒト血小板発現核内因子κＢ活性化受容体リガンド（ｐＲＡＮＫＬ）を認識するＲＡＮＫＬ特異的アンタゴニスト剤であって、ここで、前記剤が、抗体、抗体断片、ＲＡＮＫ−Ｆｃ融合タンパク質、およびオステオプロテジェリンの不活性型からなる群から選択される、前記剤。
【請求項２】
交差反応性であり、ｐＲＡＮＫＬと、可溶性核内因子κＢ活性化受容体リガンド（ｓＲＡＮＫＬ）および膜結合型核内因子κＢ活性化リガンド（ｍＲＡＮＫＬ）の少なくとも一方とを認識する、請求項１に記載の剤。
【請求項３】
ｐＲＡＮＫＬに結合し、それによって、ｐＲＡＮＫＬが播種性がん細胞上のその受容体の活性化を阻害する、請求項１または２に記載の剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の剤であって、前記剤がｐＲＡＮＫＬ単量体または多量体に結合し、好ましくは血小板表面結合ｐＲＡＮＫＬまたは血小板表面から切断されたｐＲＡＮＫＬと複合体を形成する、前記剤。
【請求項５】
前転移性循環腫瘍細胞凝集物が、血小板と腫瘍細胞との凝集物である、請求項１〜４のいずれか1項に記載の剤。
【請求項６】
がん患者が微小残存疾患のリスクがあるか、またはこれに罹患しており、場合により患者が血液試料中に検出可能なレベルの循環性腫瘍細胞を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の剤。
【請求項７】
患者が上皮性腫瘍および間葉腫瘍からなる群から選択される固形腫瘍、または内胚葉、中胚葉および／もしくは外胚葉起源の腫瘍、または白血病などの血液由来がんに罹患している、請求項１〜６のいずれか１項に記載の剤。
【請求項８】
患者が乳がん、膵がん、胃がん、食道がん、腎細胞癌、肺癌、結腸／直腸／大腸がん、メラノーマ、前立腺がん、頭頸部がん、または白血病に罹患している、請求項１〜７のいずれか１項に記載の剤。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の剤であって、処置が腫瘍の少なくとも一部を除去するための外科的介入および／または照射と組み合わせられ、前記剤がネオアジュバントまたはアジュバント療法のために投与される、前記剤。
【請求項１０】
前記剤が、ヒト抗体もしくはヒト化抗体、その抗原結合性断片、またはＲＡＮＫ−Ｆｃ融合タンパク質である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の剤。
【請求項１１】
全身投与によって、好ましくは、静脈内注入またはボーラス注入によって治療有効量が患者に投与される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の剤。
【請求項１２】
アジュバントもしくはネオアジュバント併用療法、好ましくは化学療法、キナーゼ阻害剤を用いる療法および／または免疫療法と組み合わせて患者に投与される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん患者を処置することにおける使用のための、ヒト血小板発現核内因子κＢ活性化受容体リガンド（ｐＲＡＮＫＬ）を認識し、場合により中和するＲＡＮＫＬ特異的アンタゴニスト剤、リード候補薬剤（ｌｅａｄ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ａｇｅｎｔ）を同定するための方法、およびがん患者における転移能を予測する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
研究開発の広い分野ががんの処置に焦点をおいている。開発中の生成物は、キナーゼ阻害剤から、血管形成阻害剤、腫瘍標的に対するモノクローナル抗体、アポトーシス誘発剤、抗腫瘍ワクチン接種、および様々な腫瘍標的に対する、様々な細胞毒性効果を有する従来の化学療法薬にわたる。がん患者の予後は、転移を発症するリスクによって主に決定される。
【０００３】
転移中、宿主細胞が播種性腫瘍細胞に動員されて、転移性進行を促進する特殊化された微小環境（「ニッチ」）を形成するが、これらのニッチの集合を導く機構は、ほとんど未知である。Ｌａｂｅｌｌｅら（ＰＮＡＳ  ２０１４，Ｅ３０５３−３０６１）は、例えば、腫瘍細胞由来よりもむしろ血小板由来シグナルが「初期転移性ニッチ」を形成するための腫瘍細胞への顆粒球の急速な動員に必要であることを報告している。血小板は、循環を通る間に腫瘍細胞と相互作用し、それによって血小板−腫瘍細胞凝集物を形成し、複数の機構を通した転移を強化することが報告されている。
【０００４】
Ｇａｙら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２０１１，１１：１２３−１３４）は、腫瘍転移への血小板の寄与を総説している。とりわけ、循環系内で、血小板は、腫瘍細胞を免疫異物除去から保護し、内皮でのそれらの停止を促進し、二次的病変の確立を支持する。腫瘍細胞への血小板の接着および血小板ヘテロ凝集物中へのそれらの組込みは、腫瘍細胞をＮＫ細胞活性から遮蔽することが報告されている。
【０００５】
骨転移は、重度の疾患負荷および痛みをもたらす多くのがんの高頻度の合併症である。ＲＡＮＫ（ＮＦκＢ活性化受容体）リガンド（ＲＡＮＫＬ）によるがん細胞遊走および骨転移の制御が、Ｊｏｎｅｓら（Ｎａｔｕｒｅ  ２００６，４４０：６９２−６９６）によって報告されている。ＲＡＮＫＬは、受容体ＲＡＮＫを発現するヒト上皮がん細胞およびメラノーマ細胞の遊走をトリガーする。ＲＡＮＫは、がん細胞株および患者における一連のがん細胞上で発現される。メラノーマ転移のマウスモデルでは、オステオプロテジェリンによるＲＡＮＫＬのｉｎ  ｖｉｖｏ中和は、麻痺からの完全な保護および骨における腫瘍負荷の著しい減少をもたらすが、他の器官においてはもたらさない。骨微小環境によって作製されたＲＡＮＫＬは、ＲＡＮＫ陽性腫瘍細胞のための温床と考えられる。
【０００６】
Ｄｏｕｇａｌｌら（ＢｏｎｅＫＥｙ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２０１４，３：５１９）は、ＲＡＮＫＬを、その同族受容体、ＲＡＮＫを通して作用する破骨細胞機能および生存の必須のメディエーターと報告している。前臨床データは、ＲＡＮＫＬ阻害による腫瘍誘発破骨細胞形成の遮断が骨破壊に対して保護するだけでなく、がんモデルにおける確立された骨転移の進行を阻害しかつ新規の骨転移の形成を遅延させもすることをしっかりと確立した。骨転移を有する患者では、骨格合併症は、増加した破骨細胞活性によって駆動され、病的骨折、脊髄圧迫および骨への放射線療法または整形外科手術の必要性（一まとめに骨格関連事象（ＳＲＥ）として知られる）をもたらし得る。ＲＡＮＫＬに対する完全なヒトモノクローナル抗体であるデノスマブは、骨に転移した固形腫瘍を有する患者におけるＳＲＥを防ぐまたは遅延させることが報告されている。腫瘍誘発骨融解、骨破壊および骨格腫瘍進行におけるその中心的役割に加えて、破骨細胞に依存しないＲＡＮＫＬの直接的なプロ転移性（ｐｒｏ−ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ）効果に関する証拠が明らかになってきている。例えば、ＲＡＮＫＬは、ＲＡＮＫ発現がん細胞上の活性を通した転移も刺激し、増加した浸潤および遊走をもたらす。
【０００７】
Ｔａｎら（Ｎａｔｕｒｅ  ２０１１，４７０（７３３５）：５４８−５５３）は、繊維芽細胞動員、腫瘍浸潤性ＣＤ４＋Ｔ細胞がＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナル伝達を通して乳がん転移を刺激することを報告している。
【０００８】
デノスマブは、商品名プロリアの下で骨粗鬆症のリスクを有する閉経後女性における使用に関して、および固形腫瘍からの骨転移を有する患者におけるＳＲＥの予防のためのＸｇｅｖａとしてＵ．Ｓ．  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎによって承認された。臨床治験は、巨細胞腫、骨転移を有する複数の骨髄腫、および悪性の高カルシウム血症においてデノスマブを調査していた。
【０００９】
ＲＡＮＫ／ＲＡＮＫＬを標的にする療法は、例えば、ＲＡＮＫＬ特異的結合剤、とりわけ、デノスマブ、組換えＲＡＮＫ−Ｆｃ（Ｓｃｈｍｉｅｄｅｌら  ２０１３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７３（２）：６８３−９４）、またはＲＡＮＫＬ−ナノボディ（ＷＯ２００８１４２１６４Ａ２）に関わる。ＲＡＮＫＬ結合ペプチドは、骨吸収および／または破骨細胞活性を阻害することが報告されている（ＷＯ２０１２１６３８８７Ａ１）。
【００１０】
進行型固形腫瘍を有する患者における骨転移に及ぼすデノスマブの効果は、一連の文献、例えば、Ｒｏｌｆｏ  Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１４，ｎｏ．１，２０１４，ｐｐ１５−２６）、Ｓｃａｇｌｉｏｔｔｉ  Ｇｉｏｒｇｉｏ  Ｖｉｔｔｏｒｉｏら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｏｒａｃｉｃ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．７，ｎｏ．１２，２０１２，ｐｐ１８２３−１８２９）、Ｍｏｒｉｋａｗａ  Ｋ．ら（Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｅｍｂａｓｅ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ＸＰ００２７３６１３６；およびＪａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．５２，ｎｏ．７，２０１２，ｐｐ１０３５−１０４０）、Ｔａｋｅｓｈｉ  Ｙｕａｓａら（Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．５，２０１２，ｐｐ２２１−２２９）、Ｈｉｌｂｅ  Ｗｏｌｆｇａｎｇら（Ｍａｇａｚｉｎｅ  ｏｆ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ＡＴ，ｖｏｌ．６，ｎｏ．２，２０１３，ｐｐ７５−８２）、Ｌａｓｚｌｏ  Ｋｏｐｐｅｒ（Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ＆Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．１８，ｎｏ．４，２０１２，ｐｐ７４３−７４７）、Ｓｏｎｙａ  Ｊ．Ｓｎｅｄｅｃｏｒら（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｖｏｌ．３４，ｎｏ．６，２０１２，ｐｐ１３３４−１３４９）、Ｓａｒａｈ  Ｐａｙｔｏｎ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｕｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．９，ｎｏ．１，２０１１，ｐｐ１−１）、ＷＯ２０１３／１７６４６９およびＤＡＴＡＢＡＳＥ  ＷＰＩ，Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＧＢ，ＸＰ００２７３６１３８；ＵＳ２０１２／１１４６６５Ａ１、およびＷＯ０１／０８６９９Ａ１）において報告されている。
【００１１】
Ｎａｋａｎｉｓｈｉら（Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ２０１４，Ｅａｒｌｙ  Ｏｎｌｉｎｅ  １−７）は、樹状細胞（ＤＣ）によって媒介されるＴｈ２応答を増強し、それによって、アレルギー性炎症に寄与する血小板の役割を報告している。トロンビン受容体アゴニストペプチド（ＴＲＡＰ）−活性化血小板は、ＲＡＮＫＬを発現することが見出され、骨髄ＤＣの成熟を誘発した。
【００１２】
Ｂ．Ａ．  Ｋｅｒｒら（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，ｖｏｌ．３２，ｎｏ．３６，２０１３，ｐｐ４３１９−４３２４）は、骨への前転移性（ｐｒｅ−ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ）腫瘍コミュニケーションを支配する血小板の役割を報告している。
【００１３】
Ｓｈａｒｍａ  Ｄｅｖａら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２２９，ｎｏ．８，２０１４，ｐｐ１００５−１０１５）は、腫瘍進行における血小板の役割を報告している。血小板は、腫瘍細胞を免疫宿主応答から遮蔽し、腫瘍細胞生存を促進することが報告されている。
【００１４】
Ｅｓｐｏｓｉｔｏ  Ｍａｒｋら（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＧＢ，ｖｏｌ．１５１，ｎｏ．２，ｐｐ２２２−２３３）は、骨転移において腫瘍間質相互作用を標的にすることを報告している。循環性腫瘍細胞生存は、ＴＧＦβの血小板分泌および血小板凝集物の形成によって増強されることが報告されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、転移性疾患の改善された処置、およびそれぞれの抗転移薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
この目的は、本発明の当該物質によって解決される。
本発明は、血液中の前転移性病変（ｌｅａｓｏｎｓ）を防ぐまたは減少させるためにがん患者を処置することにおける使用のためのヒト血小板発現核内因子κＢ活性化受容体リガンド（ｐＲＡＮＫＬ）を認識するＲＡＮＫＬ特異的アンタゴニスト剤を提供する。特に、医学的使用は、がん細胞を有する血小板の前転移性循環細胞凝集物の予防または減少を含む。かかる凝集物は、ｐＲＡＮＫＬを発現する活性化血小板としての血小板を特に含む。特に、ＲＡＮＫＬ特異的アンタゴニスト剤は、血液中のかかる前転移性循環細胞凝集物の形成時に転移を促進するＲＡＮＫ−ＲＡＮＫＬ相互作用時にシグナルの伝達を防ぐ、または血液中のかかる前転移性循環細胞凝集物の形成を防ぐ有効量で使用される。
【００１７】
特に、ｐＲＡＮＫＬを結合することおよび中和することにより、
ａ）前転移性腫瘍細胞の内転移を阻害し、
ｂ）ｐＲＡＮＫＬを発現するまたはＲＡＮＫ−ＲＡＮＫＬシグナル伝達を誘発する血小板および／もしくはがん（または腫瘍）細胞の活性化を阻害し、それによって、細胞がプロ転移性になる形質転換を阻害し、ならびに／または
ｃ）場合により、転移形成が後に続く血行性（ｈａｅｍａｔｏｇｅｎｅｏｕｓ）伝播を発症するリスクを阻害する。
【００１８】
ｐＲＡＮＫＬは、特に、がん細胞と相互作用する場合、上方制御されていると分かる。したがって、本明細書に記載の薬剤によって阻害またはｐＲＡＮＫＬを中和することにより、前転移性病変が下方調節される。
【００１９】
前転移性病変は、前駆体病変の細胞に典型的に関わっており、これは、それががん性になる前に、またはがん細胞の場合、それが転移性になる前に細胞の外見または性質の変化によって特徴付けられる。
【００２０】
したがって、本発明は、がん患者が前転移性病変（ｌｅａｓｏｎｓ）を防ぐまたは減少させる有効量の薬剤で処置される処置の新しい方法を提供する。
特に、がん細胞は、ＲＡＮＫ陽性がん細胞から生じる。がん細胞は、ＲＡＮＫ陽性腫瘍形成がん細胞または腫瘍細胞、特に、固形腫瘍細胞、または血液および造血器官に関わるＲＡＮＫ陽性がん細胞、例えば、白血病とすることができる。特に、前転移性病変は、ニッチを形成し、それによって、例えば、遠隔器官もしくは骨転移におけるがん転移を促進するまたは転移を発症するリスクを増加させる循環前転移性細胞集団と考えられる活性化血小板−がん細胞凝集物を決定することによって同定される。活性化血小板と相互作用すると、がん細胞は、前転移性病変のさらなる特徴であるＲＡＮＫＬ陽性がん細胞に形質転換され得る。かかる血小板−がん細胞凝集物は、血液由来であるので、転移性リスクまたは潜在性も血液由来または血行性と称される。
【００２１】
薬剤は、ｐＲＡＮＫＬのみを特異的に認識かつ中和し得る、またはＲＡＮＫＬの様々な形を交差特異的に認識する。特に、薬剤は、交差反応性であり、ｐＲＡＮＫＬと、可溶性核内因子κＢ活性化受容体リガンド（ｓＲＡＮＫＬ）および膜結合型核内因子κＢ活性化リガンド（ｍＲＡＮＫＬ）の少なくとも一方または両方とを認識するかつ場合により中和する。
【００２２】
特に、薬剤は、ヒトＲＡＮＫＬ（配列番号３）の完全なアミノ酸配列、またはｐＲＡＮＫＬの細胞外部分におけるエピトープ、例えば、配列番号３のＡＡ６９〜ＡＡ３１７）を含み得るＲＡＮＫＬポリペプチドを認識し、特に、ＲＡＮＫＬまたはｐＲＡＮＫＬおよび場合によりＲＡＮＫＬの任意の他の形へのＲＡＮＫの結合と競合し、それによって、ＲＡＮＫ−ＲＡＮＫＬシグナル伝達を実質的に阻害する。
【００２３】
特に、薬剤は、ｐＲＡＮＫＬに結合し、それによって、ｐＲＡＮＫＬががん細胞上の、例えば、播種性または転移性腫瘍細胞上のその受容体を活性化することを阻害する。
特に、薬剤は、ｐＲＡＮＫＬ単量体、または血小板の表面上で相互作用しているＲＡＮＫＬ分子の多量体などの多量体に結合し、例えば、ここで、１つまたは複数のｐＲＡＮＫＬ分子は、互いに相互作用している、かつ／または血小板に結合していない１つまたは複数のＲＡＮＫＬ分子、もしくはｓＲＡＮＫＬと相互作用している血小板の表面上で結合している。かかる多量体は、二量体、または三量体、またはより高い多量体とすることができ、血小板表面結合ｐＲＡＮＫＬおよび／もしくは血小板表面から切断されたｐＲＡＮＫＬ、ならびに／またはｓＲＡＮＫＬ、および／またはｍＲＡＮＫＬと複合体を好ましくは形成する。したがって、結合は、例えば、血小板の表面上で、血小板とがん細胞間の微小環境中で、または血小板表面からのｐＲＡＮＫＬの切断時に循環中で起こり得る。
【００２４】
特に、転移は、遠隔器官、例えば、肺、肝臓、腸、皮膚、筋肉、脾臓、膵臓、腎臓、骨、または脳のいずれかにおける腫瘍細胞凝集での血液由来である。特に、血液およびリンパ系の原発性固形腫瘍またはがんに罹患している患者において血行性転移性疾患を発症するリスクは、効果的に減少され得る。
【００２５】
特に、がん患者は、微小残存疾患および／または転移性疾患の再発のリスクがあるまたはこれらに罹患しており、場合により、ここで、患者は、例えば、全血またはその血液画分中の播種性腫瘍細胞の数によって、または特異的腫瘍細胞マーカーによって決定される血液試料中に検出可能なレベルの循環性腫瘍細胞を有する。腫瘍細胞の検出可能な数は、少なくとも５ｍＬ、または７．５ｍＬ、または１０ｍＬの全血の試料中の例えば、１０未満、または５未満、または４、３、２、または１つの循環性腫瘍細胞である。
【００２６】
特定の実施形態によれば、患者は、上皮性腫瘍および間葉腫瘍からなる群から選択される固形腫瘍、または内胚葉、中胚葉および／もしくは外胚葉起源の腫瘍、または白血病などの血液由来がんに罹患している。
【００２７】
特に、患者は、乳がん、膵がん、胃がん、食道がん、腎細胞癌、肺癌、結腸／直腸／大腸がん、メラノーマ、前立腺がん、頭頸部がん、または白血病に罹患している。
特定の態様によれば、処置は、腫瘍の少なくとも部分を除去するための外科的介入と組み合わせられる、かつ／または放射線療法と組み合わせられ、薬剤は、ネオアジュバントまたはアジュバント療法のために投与される。したがって、患者は、特に、外科的介入および／もしくは放射線療法の準備をしているまたはこれらを受けている、または外科的介入および／もしくは放射線療法によって処置され、外科手術前または後に本発明による薬剤でさらに処置される。特定の例によれば、かかる処置は、外科手術前１から３０日、または外科手術中、または外科手術後１から３０日以内に開始し得、薬剤は、連続した期間、例えば、１から１２カ月間、またはさらに長く投与され得、ここで、薬剤は、定期的間隔で投与される。外科的介入は、例えば、腫瘍塊の治療的除去、または生検である。外科手術は、それによって、血小板−腫瘍細胞凝集物形成を誘発する、血流中へ腫瘍細胞を播種する特定のリスク因子と考えられる。同様に、放射線療法は、腫瘍細胞の血行性伝播をトリガーし得る。したがって、本発明の方法は、固形腫瘍細胞を潜在的に播種する外科手術および／または放射線療法との組合せで特に示される。
【００２８】
特定の態様によれば、薬剤は、アジュバントもしくはネオアジュバント併用療法、好ましくは化学療法、キナーゼ阻害剤療法および／または免疫療法と組み合わせて患者に投与される。上皮がん細胞マーカー、可溶性因子、または抗血管新生療法からなる群から選択されるものなどのかかる併用療法は、がん細胞、例えば、任意の腫瘍関連抗原を特に標的にする。
【００２９】
特定の態様によれば、薬剤は、抗体、抗体断片、ＲＡＮＫ−Ｆｃ融合タンパク質などの受容体−融合タンパク質、オステオプロテジェリンの不活性型などのペプチド、もしくはその断片、ＲＡＮＫ特異的有機小分子などの小分子、またはアプタマーからなる群から選択される。典型的な小分子は、Ｃｏｓｔｅ  Ｅ，ら  Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ２０１５；７４：２２０−２２６．ｄｏｉ：１０．１１３６／ａｎｎｒｈｅｕｍｄｉｓ−２０１３−２０３７００に報告されているようなＲＡＮＫＬおよびＴＮＦの小分子阻害剤である。特定の例は、ΙκＢおよび細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）のＲＡＮＫＬ誘発リン酸化を阻害する能力があるブタンジオールビフェニルカルボン酸エステルの誘導体である。例えば、以下の式によって特徴付けられるＡＢＤ３２８およびＡＢＤ３４５など、エステル結合がケトンによって置換されている化合物が使用され得る：
【００３０】
【化１】
0006766060.tif 000002
【００３１】
特に、薬剤は、デノスマブなどのヒト抗体もしくはヒト化抗体、またはその機能的変異体、または前述のもののいずれかの抗原結合性断片、またはＲＡＮＫ−Ｆｃ融合タンパク質である。デノスマブ（Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）は、ＲＡＮＫＬに特異的な完全なヒトｌｇＧ２モノクローナル抗体であり、これは、いろいろな転移性腫瘍を有する患者における骨吸収マーカーを抑制すると報告されており、骨転移の予防および処置に関する複数の臨床治験において調査されている。化学的に、それは、２つの重および２つの軽鎖からなる。各軽鎖は、２１５のアミノ酸からなる。各重鎖は、４つの分子内ジスルフィドを有する４４８のアミノ酸からなる。重鎖アミノ酸配列は、配列番号１によって同定され；軽鎖アミノ酸配列は、配列番号２によって同定される。
【００３２】
特に、薬剤は、Ｆｃエフェクター機能を減少させるように操作されており（例えば、ＦｃγＲｌｌｌａ、またはＣＤ１６に著しく結合しない）、したがって、著しい抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示さないヒトｌｇＧ１  ＦｃなどのＦｃ抗体断片を含む。Ｆｃエフェクター機能を減少させるための点変異を含む典型的なＦｃ断片は、以下の変異の少なくとも１つによって特徴付けられる：Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、ｄｅｌｔａＧ２３６、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ、ここで、命名法は、カバットのＥＵインデックスによる。
【００３３】
代わりに、薬剤は、ＡＤＣＣなどのＦｃエフェクター機能（例えば、ＦｃγＲｌｌｌａ、またはＣＤ１６への結合）を有するヒトｌｇＧ１  ＦｃなどのＦｃ抗体断片を含む。かかる薬剤は、それによって、免疫系のエフェクター細胞が、血小板および／またはがん細胞、好ましくは、がん−血小板凝集物である標的細胞を活発に破壊する細胞媒介免疫防御という追加の利点を有する。
【００３４】
特定の態様によれば、薬剤は、全身投与によって、好ましくは、静脈内注入またはボーラス注入によって治療有効量で患者に投与される。
デノスマブを用いる先行技術の療法は、皮下処置に典型的に関わる。本発明は、ＲＡＮＫＬを発現する活性化循環血小板、または循環血小板−がん細胞凝集物を標的にする。したがって、静脈内経路が特に好ましい。
【００３５】
好ましい用量は、例えば、０．５から１０００ｍｇ、好ましくは１〜４００ｍｇにわたる。皮下に投与される場合、好ましい投薬量は、０．５から４００ｍｇにわたる。
本発明は、固形腫瘍の少なくとも部分を除去するための外科的介入および／もしくは放射線療法の準備をしているまたはこれらを受けている、またはかかる外科的介入および／もしくは放射線療法を受けた患者などのがん患者における前転移性病変、または微小残存疾患および／もしくは転移性疾患の再発を防ぐまたは処置するのに効果的であるリード候補薬剤を同定するための方法であって、
ａ）がん細胞培養物を提供するステップ；
ｂ）試験薬剤を有する反応混合物中で細胞培養物をヒト血液血小板と接触させるステップ；および
ｃ）試験薬剤が
ｉ）ｐＲＡＮＫＬによるＲＡＮＫシグナル伝達を阻害する；かつ／もしくは
ｉｉ）がん細胞への血小板結合のレベルを低下させる
かどうかを検出するステップ
を含む細胞に基づくアッセイにおいて１つまたは複数の試験薬剤をスクリーニングし、それによって、前転移性病変を防ぐまたは処置するリード候補薬剤、ならびに場合により、がん患者における微小残存疾患および／または転移性疾患の再発を防ぐまたは処置するその潜在性を同定するステップを含む方法をさらに提供する。
【００３６】
特に、検出ステップｃ）は、試験薬剤が
ｉ）ｐＲＡＮＫＬによるＲＡＮＫシグナル伝達を阻害する；かつ
ｉｉ）がん細胞への血小板結合のレベルを低下させる
かどうかの両方を試験することに関わる。
【００３７】
特に、トロンビン−活性化血小板、またはがんもしくは腫瘍細胞によって活性化される、例えば、ＲＡＮＫＬ−陰性腫瘍細胞によって活性化されるものなどの活性化血小板は、ｐＲＡＮＫＬを発現させるためにかかるスクリーニングアッセイにおいて使用される。
【００３８】
特に、アッセイは、機能的アンタゴニストまたは推定上のアンタゴニスト（試験薬剤）がアゴニスト（ＲＡＮＫＬ）によって媒介される受容体（ＲＡＮＫ）シグナル伝達を阻害する能力を測定する中和アッセイである。例えば、化合物は、化合物が受容体媒介シグナル伝達を実質的に阻害する場合、ＲＡＮＫＬ特異的アンタゴニスト剤として同定され得る。
【００３９】
本発明は、がん患者における転移能を予測する方法であって、
ａ）末梢血または血小板含有血液画分の試料を提供するステップ；
ｂ）前記試料中のｐＲＡＮＫＬ発現を決定し、前転移性病変と遠隔転移の発症の可能性増加との指標となる発現差異を基準値と比較するステップ
を含む方法をさらに提供する。
【００４０】
例えば、試料または血小板は、定義された転移能を有する標準的ながん細胞でインキュベートされ得、血小板−がん細胞相互作用によるＲＡＮＫシグナル伝達のレベルが特定の転移能に関する基準値を得るために決定され得る。同様に、血小板は、トロンビンで活性化され得、試料中のｐＲＡＮＫＬレベルは、標準と比較して決定され得る。
【００４１】
ｐＲＡＮＫＬ発現は、例えば、ヌクレオチド配列もしくはｐＲＡＮＫＬポリペプチド、またはその断片の発現などのｐＲＡＮＫＬ発現のレベルとして決定される。レベルは、定性的だけでなく、半定量的に、または定量的にも決定され得る。
【００４２】
基準値は、正もしくは負の対照、または両方に由来し得る。正の対照は、例えば、転移性疾患状態に罹患しているがん患者からの血小板のｐＲＡＮＫＬ発現のレベルを表している。負の対照は、例えば、健常対照対象のｐＲＡＮＫＬ発現レベルを表している。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ＲＡＮＫＬトランスフェクトメラノーマ細胞を使用した肺転移モデルを示す図である。ヒトＲＡＮＫＬ（ＲＡＮＫＬ＋）を発現するようにトランスフェクトされた黒色によって同定される）マウスＢ１６−Ｆ１０メラノーマ細胞（ＡＴＣＣ）または対照細胞（親）をＣ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈に注入した。Ｂ１６−Ｆ１０細胞（マウスあたり１００，０００細胞）。血流を通して心臓を通過した後、悪性細胞は、肺に播種する。動物の肺中の転移性負荷を３週間後に分析し、これは、ＲＡＮＫＬ＋細胞が使用された場合、増強されたＲＡＮＫＬ媒介シグナル伝達時の大幅に増加した転移を示している。これは、肺における黒色面積のより高い量および破壊された肺構造によって明らかにされる。
【図２】休止および活性化栓球上でのＲＡＮＫＬ発現を示す図である。健常ドナーのヒト血小板を血液試料の遠心分離によって単離し、次いで、０．２Ｕ／ｍｌの古典的血小板アゴニストトロンビンで刺激した（活性化）または無処置で放置した（休止）。活性化マーカーＰ  ｓｅｌｅｃｔｉｎ（ＣＤ６２Ｐ）およびＲＡＮＫＬの血小板表面発現をフローサイトメトリーによって分析した。
【図３】ＲＡＮＫ−Ｆｃ−ＫＯの構造を示す図である。ＲＡＮＫ−Ｆｃ−ＫＯ融合タンパク質は、その親和性および結果的に、Ｆｃ受容体ＣＤ１６への結合を低下させるためにアミノ酸交換Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／ΔＧ２３６／Ａ３２７Ｇ／Ａ３３０Ｓ；Ａｒｍｏｕｒら  ２００３，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４０（９）：５８５−９３；Ｓｃｈｍｉｅｄｅｌら  ２０１３）を含有するヒト受容体ＲＡＮＫ（Ｑ２５−Ｐ２０７；Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＮＰ＿０００３８３０）およびヒトｌｇＧ１  Ｆｃ部分（Ｐ２１７−Ｋ４４７）の細胞外ドメインからなる。ここで、全てのナンバリングは、カバット［ＥＵ−インデックス］による。
【図４】ＲＡＮＫ−Ｆｃ−ＫＯを使用した肺転移モデルを示す図である。親Ｂ１６−Ｆ１０メラノーマ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの示された数の尾静脈に注入した（マウスあたり７５，０００）。加えて、種々の群のマウスを、示したように、腫瘍細胞注入前２４ｈでの３μｇ／ｇ抗ＧＰＩｂα抗体の適用による血小板枯渇、ＲＡＮＫ−Ｆｃ−ＫＯ（腫瘍細胞注入の日に、マウスあたり１００μｇ、２および４日後に繰り返した）ならびに適切な対照（ｃｔｒｌ）で処置した。肺転移の数を３週間後のマウスの屠殺後に計数した。
【図５】ＲＡＮＫＬブロッキングによって不死化されたＭＣＦ１０Ａ細胞における血小板誘発（プロ転移性）ＥＭＴシグナル伝達の予防を示す図である。ＥＭＴ分析に関する標準的なモデルとしてのＭＣＦ１０Ａ細胞（ＡＴＣＣ）を間葉系表現型ＺＥＢ（ジンク（Ｚｉｎｋ）フィンガーＥ−ｂｏｘ結合ホメオボックス１、左カラム）、およびＮカドヘリン（右カラム）に関する（Ａ）ＲＡＮＫＬおよび（Ｂ）マーカーに関する定量的（ｑｕａｎｔｉｔｉａｔｉｖｅ）リアルタイムＰＣＲによって研究した。この目的を達成するために、ＲＮＡを単離し、逆転写し、通例の技法によるＳＹＢＲ−ｇｒｅｅｎ  ｂａｓｅｄ  ＰＣＲに供した。（Ａ）ＭＣＦ１０Ａ細胞および適切な対照の標的（ＲＡＮＫＬ）対参照（ＲＰＬ１３）遺伝子発現の比を示す。結果は、負の対照とＭＣＦ１０Ａ細胞間の差違を示しておらず、そのため、ＭＣＦ１０Ａ細胞自体がＲＡＮＫＬを発現するということを除外した。（Ｂ）ＭＣＦ１０Ａ細胞におけるプロ転移性ＥＭＴ遺伝子シグネチャーの分析をＲＡＮＫＬ−中和抗体デノスマブ（１０μｇ／ｍｌ）の存在または非存在下での単独（無処置）または血小板（血小板／腫瘍細胞の比５：１）での培養の２日後に行った。血小板の存在は、プロ転移性ＥＭＴ遺伝子発現に関するマーカーとしてのＺＥＢおよびＮカドヘリンｍＲＮＡ発現の誘発を引き起こし、これはデノスマブの存在によって実質的に減少した。
【図６】配列を示す図である。デノスマブ重および軽鎖アミノ酸配列：配列番号１：重鎖配列番号２：軽鎖ヒトＲＡＮＫＬアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＢ８６８１１．１）：配列番号３：全長配列
【図７】ＲＡＮＫＬの中和は、不死化ＭＣＦ１０Ａ細胞の血小板誘発遊走を防ぐ。１＊１０５  ＭＣＦ１０Ａ細胞をＲＡＮＫＬ−中和抗体デノスマブまたはそれぞれのアイソタイプ対照（各５μｇ／ｍｌ）の存在または非存在下で単独（無処置）でまたはヒト血小板（１．５＊１０５／μｌ）とともにトランスウェルインサート（８μｍポアサイズ）のトップチャンバーに播種した。インキュベーションの２４ｈ後、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）を下部チャンバーに加えて、化学誘引物質として働かせた。合計４８ｈのインキュベーション後、膜の上部側上の非運動性細胞を除去した一方、下部側上の遊走した細胞を固定し、ＤＡＰＩで染色し、顕微鏡下で計数した。
【図８】血小板特異的ＲＡＮＫＬノックアウトマウスを使用した肺転移モデルを示す図である。ｌｏｘＰ部位がＲＡＮＫＬ遺伝子に両端に隣接しているＢ６．１２９−Ｔｎｆｓｆ１１ｔｍ１．１  Ｃａｏｂ／Ｊマウス（以下、ＲＡＮＫＬ  ｆｌ／ｆｌと称される）および巨核球／血小板（ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｔｅ／ｐｌａｔｅｔｅｌｅｔ）特異的リコンビナーゼ（以下、Ｐｆ４ｃｒｅと称される）を含有するＣ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（Ｐｆ４−ｃｒｅ）Ｑ３Ｒｓｋｏ／Ｊマウスを両方ともＴｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ  ＵＳＡ）から入手し、繁殖させてＲＡＮＫＬが巨核球／血小板（ｐｌａｔｅｔｅｌ）において特異的にノックアウトされているＲＡＮＫＬ  ｆｌ／ｆｌ  Ｐｆ４  ｃｒｅ／＋ノックアウト（ｋｏ）マウスを作製した。血小板発現ＲＡＮＫＬの効果の決定のために、Ｂ１６−Ｆ１０メラノーマ細胞（マウスあたり７５，０００）を尾静脈を通してＲＡＮＫＬ  ｆｌ／ｆｌ  Ｐｆ４  ｃｒｅ／＋ノックアウト（ｋｏ）マウスまたはＣ５７ＢＬ／６対照マウス（ｃｔｒｌ）（ｋｏ、ｎ＝８動物；ｃｔｒｌ、ｎ＝５動物）に注入した。肺転移の数を３週間後にマウスの屠殺後に計数した。
【図９】ＲＡＮＫＬの中和は、ＳＫ−Ｍｅｌメラノーマ細胞における血小板誘発プロ転移性ＥＭＴシグナル伝達を防ぐ。（Ａ）ＳＫ−Ｍｅｌ（ＡＴＣＣ）細胞を抗ＲＡＮＫＬ抗体（充填されたヒストグラム）またはそれぞれのアイソタイプ対照（点線）、それに続く抗マウス−ＰＥを使用したフローサイトメトリーによって分析した。アイソタイプ対照とＲＡＮＫＬ特異的抗体結合間の差違は観察されず、そのため、ＳＫ−Ｍｅｌ細胞自体がＲＡＮＫＬを発現するということを除外した。（Ｂ）ＳＫ−Ｍｅｌメラノーマ細胞におけるプロ転移性ＥＭＴ遺伝子シグネチャーの分析を単独（無処置）でまたは血小板（血小板／腫瘍細胞の比２００：１）または血小板およびＲＡＮＫＬ−中和抗体デノスマブ（５μｇ／ｍｌ）での培養の１日後に行った。次いで、間葉系表現型のマーカーである、ＺＥＢ（ジンク（Ｚｉｎｋ）フィンガーＥ−ｂｏｘ結合ホメオボックス１）、Ｔｗｉｓｔおよびビメンチンを定量的（ｑｕａｎｔｉｔｉａｔｉｖｅ）リアルタイムＰＣＲによって分析した。この目的を達成するために、ＲＮＡを単離し、逆転写し、通例の技法によるＳＹＢＲ−ｇｒｅｅｎ  ｂａｓｅｄ  ＰＣＲに供した。
【００４４】
血小板の存在は、デノスマブの存在によって実質的に減少した３つ全てのマーカー遺伝子のプロ転移性ｍＲＮＡ発現を誘発した。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
「アジュバント」という用語は、本明細書では、例えば、改善された療法のための外科的介入および／または放射線療法中または後のがんの処置を表すべきである。
「ネオアジュバント」という用語は、本明細書では、例えば、改善された療法のための外科的介入および／または放射線療法前のがんの処置を表すべきである。
【００４６】
「ＲＡＮＫＬ特異的アンタゴニスト剤」という用語は、本明細書では、ＲＡＮＫＬを実質的に中和し、かつ／またはその受容体ＲＡＮＫへのＲＡＮＫＬの結合を減少させもしくは阻害し、それによってＲＡＮＫ−ＲＡＮＫＬシグナル伝達経路をアンタゴナイズするＲＡＮＫＬ結合剤である化合物を表すべきである。
【００４７】
薬剤のアンタゴニスト機能は、アゴニスト（ＲＡＮＫＬ）によって活性化された受容体（ＲＡＮＫ）への細胞応答を減少させる、阻害するまたは防ぐことによって特に特徴付けられる。アンタゴニストは、特に、同じ結合部位でＲＡＮＫＬに可逆的に結合し得るまたは受容体を必ずしも活性化することなく、内在性受容体として結合部位（活性部位）に干渉する競合的アンタゴニストである。
【００４８】
薬剤は、例えば、小有機または無機分子、炭水化物、生物学的巨大分子、ペプチド、タンパク質（本明細書で、ポリペプチドとも称される）、ペプチド類似体、ペプチド模倣薬、抗体の抗原結合性断片を含めた抗体、核酸、核酸類似体、および前述のもののいずれかの組合せからなる群から選択される任意の適した結合剤またはリガンドとすることができる。一部の実施形態では、ＲＡＮＫＬ特異的アンタゴニスト剤は、免疫療法薬である。薬剤の特定の例は、抗体、受容体またはオステオプロテジェリン（不活性であるまたはその受容体ＲＡＮＫへのアゴニストＲＡＮＫＬ結合を避けるために不活性にされた）、受容体−融合タンパク質、例えば、ＲＡＮＫ−Ｆｃ融合タンパク質、ペプチド、アプタマー、または小分子からなる群から選択される。
【００４９】
アンタゴニスト剤を作製するかつ特徴付けるための方法は、当技術分野で既知である。好ましい実施形態では、アンタゴニスト結合剤は、１つまたは複数の細胞に基づくアッセイを使用して予め定義された特性に関して作製され、スクリーニングされる。かかるアッセイは、結合剤に対する細胞の応答、例えば、細胞生存、細胞死、細胞形態の変化、または天然遺伝子もしくはレポーター遺伝子の細胞発現などの転写活性化をモニターすることにしばしば関わる。
【００５０】
組換えポリペプチドアンタゴニスト剤の作製は、例えば、発現構築物またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターを含めた組換えポリペプチドを作製するための発現系を好ましくは用いる。
【００５１】
一実施形態では、アンタゴニスト剤は、潜在的薬物候補を含有するコンビナトリアルライブラリー（ランダムまたはセミランダム）、例えば、ペプチドライブラリー、抗体ライブラリー、または化学化合物ライブラリーを用いるスクリーンを含むものなどの創薬プロセスを通して同定される。スクリーンは、例えば、フローサイトメトリーを使用してハイスループットに行われ得、場合により、活性と非活性またはブロックされたＲＡＮＫ／ＲＡＮＫＬ相互作用を識別し得る。生物学的スクリーンは、ｐＲＡＮＫＬを特異的に標的にする新規なアンタゴニスト剤を見出すことを目標とし得る。
【００５２】
ＲＡＮＫ−ＲＡＮＫＬシグナル伝達を「実質的に減少させるまたは阻害する」は、アンタゴニスト剤が（ｉ）ＲＡＮＫへのＲＡＮＫＬの結合を５０％を超えて、好ましくは６０％、７０％、８０％、９０％または９５％を超えて阻害する、またはかかる結合を完全に阻害する；かつ／または（ｉｉ）ＲＡＮＫＬ誘発経路、特に、ＲＡＮＫ刺激、例えば、ＭＡＰＫ（マイトジェン−活性化タンパク質キナーゼ）もしくはＳＲＣ−キナーゼの活性に続くシグナル伝達、または例えば、以下の例の節に記載された肺モデルにおいて決定される転移形成に関わるＮＦ−κＢシグナルを機能的に阻害することを意味する。かかる機能的阻害は、例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％を超えてまたは完全な阻害で転移形成を阻害する。
【００５３】
代わりに、機能的阻害は、ｅｘ  ｖｉｖｏで決定され得、例えば、標準的なアッセイにおけるＥｒｋ１／２およびＳｒｃの活性化によってもたらされる細胞骨格再構成を通したがん細胞の遊走を決定する。特に、腫瘍細胞の遊走および浸潤潜在性は、多孔性および／または細胞外−マトリックス模倣バリアを通過した細胞の部分を決定することによって測定され得る。かかる機能的阻害は、例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％を超えてまたは完全な阻害で遊走および／または浸潤を阻害している。
【００５４】
機能的阻害は、例えば、Ｅ−カドヘリン、クローディン、ＳＮＡＩＬ、またはフィブロネクチンのいずれかを決定する定量的ＰＣＲに基づく方法によって、ｐＲＡＮＫＬを標的にすることによって、上皮−間葉系転換（ＥＭＴ）遺伝子シグネチャー、特に、がん細胞における転移関連遺伝子の下方制御を測定することによっても決定され得る。
【００５５】
「抗体」という用語は、本明細書では、リンカー配列を有するまたは有さない免疫グロブリンの重および／または軽鎖の定常および／または可変ドメインと理解される抗体ドメインからなるまたはこれを含むポリペプチドまたはタンパク質を表すべきである。抗体は、本明細書では、ＶＨ、ＶＬもしくはＶＨＨなどの単一可変抗体ドメインのＣＤＲ結合部位、またはＶＬ／ＶＨ対などの可変抗体ドメインの対の結合部位、ＶＬ／ＶＨドメイン対およびＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）、（Ｆａｂ）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、もしくは全長抗体などの定常抗体ドメインを含む抗体を特に含む、ＲＡＮＫＬ抗原またはかかる抗原の１つまたは複数のエピトープを結合する特異的抗原−結合部位を有する。
【００５６】
例えば、ＶＨ、ＶＬまたはＶＨＨなどの単一可変抗体ドメイン、またはＶＬ／ＶＨ対などの可変抗体ドメインの対を含めたリンキング配列もしくはヒンジ領域を有するまたは有さない可変および／もしくは定常抗体ドメインの組合せを含むまたはこれからなる抗体、ＶＬ／ＶＨドメイン対および例えば、ＩｇＧ型（例えば、ｌｇＧ１、ｌｇＧ２、ｌｇＧ３、またはｌｇＧ４亜型）、ｌｇＡ１、ｌｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体の重鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、（Ｆａｂ）２、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、Ｆｖ、または全長抗体などの定常抗体ドメインを含むまたはこれからなる抗体などの特異的抗体フォーマットは、本発明に従って使用され得る。「全長抗体」という用語は、自然発生の抗体単量体において通例見出されるＦｃドメインおよび他のドメインの少なくとも大部分を含む任意の抗体分子を表すために使用され得る。このフレーズは、特定の抗体分子が抗体断片ではないことを強調するために本明細書で使用される。
【００５７】
「抗体」という用語は、種々の標的抗原に対する他の抗体を実質的に含まない、または抗体ドメインの異なる構造配置を含む単離された形の抗体を特に含むべきである。さらに、単離された抗体は、例えば、種々の特異性を有するモノクローナル抗体または抗体断片などの少なくとも１つの他の抗体を有する単離された抗体の組合せを含有する組合せ調製物に含まれ得る。
【００５８】
「抗体」という用語は、ヒトもしくはマウスなどの哺乳類などのヒト種、または雌鳥などのトリを含めた動物起源の抗体にあてはまるべきであり、この用語は、動物起源の配列、例えば、ヒト配列に基づく組換え抗体を特に含むべきである。
【００５９】
「抗体」という用語は、マウスおよびヒト起源の配列などの種々の種の起源の配列を有するキメラ抗体にさらにあてはまる。
抗体に関して使用される「キメラの」という用語は、重および軽鎖のアミノ酸配列のそれぞれの１つの部分が特定の種由来のまたは特定のクラスに属する抗体における相当する配列と相同である一方、鎖の残りのセグメントが別の種またはクラスにおける相当する配列と相同である抗体を表す。典型的に、軽と重鎖の両方の可変領域は、哺乳動物の１つの種に由来する抗体の可変領域を模倣する一方、定常部分は、別のものに由来する抗体の配列と相同である。例えば、可変領域は、例えば、ヒト細胞調製物由来の定常領域と組み合わせた非ヒト宿主生物からの容易に利用可能なＢ−細胞またはハイブリドーマを使用した現在既知の供給源に由来し得る。
【００６０】
「抗体」という用語は、ヒト化抗体にさらにあてはまり得る。
抗体に関して使用される「ヒト化」という用語は、非ヒト種からの免疫グロブリンに実質的に由来する抗原結合部位を有する分子を表し、ここで、分子の残りの免疫グロブリン構造は、ヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づく。抗原結合部位は、定常ドメイン上に融合した完全な可変ドメインまたは可変ドメインにおける適切なフレームワーク領域（ＦＲ）上に移植された相補性決定領域（ＣＤＲ）のみを含み得る。抗原−結合部位は、野生型とすることができるまたは例えば、１つまたは複数のアミノ酸置換によって修飾されてい得る、好ましくはヒト免疫グロブリンにより綿密に似るように修飾されてい得る。ヒト化抗体の一部の形は、全てのＣＤＲ配列（例えば、マウス抗体からの６つ全てのＣＤＲを含有するヒト化マウス抗体）を保存する。他の形は、本来の抗体に対して改変されている１つまたは複数のＣＤＲを有する。
【００６１】
「抗体」という用語は、ヒト抗体にさらにあてはまる。
抗体に関して使用される「ヒト」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変および定常領域を有する抗体を含むと理解される。本発明のヒト抗体は、例えば、ＣＤＲにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン配列（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのランダムまたは部位特異的突然変異誘発によってまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの体細胞変異によって導入された変異）によってコードされないアミノ酸残基を含み得る。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリンライブラリーからまたは１つもしくは複数のヒト免疫グロブリンに関してトランスジェニックな動物から単離された抗体を含む。
【００６２】
「抗体」という用語は、任意のクラスまたはサブクラスの抗体に特にあてはまる。それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、抗体は、抗体ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの主要なクラスに割り当てられ得、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ｌｇＧ１、ｌｇＧ２、ｌｇＧ３、ｌｇＧ４、ｌｇＡ１、およびｌｇＡ２にさらに分けられ得る。
【００６３】
用語は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、特に、組換え抗体にさらにあてまはり、異なる起源からの遺伝子または配列、例えば、マウス、キメラ、ヒト化抗体、またはハイブリドーマ由来抗体を含む、動物、例えば、ヒトを含めた哺乳類から生じた抗体などの組換え手段によって調製された、発現された、創出されたまたは単離された全ての抗体および抗体構造を含む。さらなる例は、抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から単離された抗体、または抗体もしくは抗体ドメインの組換え、コンビナトリアルライブラリーから単離された抗体、または他のＤＮＡ配列への抗体遺伝子配列のスプライシングに関わる任意の他の手段によって調製された、発現された、創出されたもしくは単離された抗体を表す。
【００６４】
抗体ドメインは、天然構造のものとすることができるまたは例えば、抗原結合特性または安定性もしくはＦｃ受容体ＦｃＲｎおよび／もしくはＦｃγ受容体（ＦＣＧＲ）への結合などの機能的特性などの任意の他の特性を修飾するために突然変異誘発または誘導体化によって修飾されてい得る。ポリペプチド配列は、ループ配列によって連結された抗体ドメイン構造の少なくとも２つのβストランドからなるβバレル構造を含む場合、抗体ドメインであると考えられる。
【００６５】
「抗体」という用語は、抗体の誘導体、特に、本明細書で抗体の機能的変異体とも称される機能的に活性な誘導体も表すことが理解されよう。抗体誘導体は、抗体の任意のドメインが他の抗体、例えば、ＣＤＲループを含む結合構造、受容体ポリペプチドだけでなく、リガンド、足場タンパク質、酵素、毒素などの１つまたは複数の他のタンパク質の任意の位置で融合し得る１つまたは複数の抗体ドメインまたは抗体および／または融合タンパク質の任意の組合せと理解される。抗体の誘導体は、共有結合、静電相互作用、ジスルフィド結合などの様々な化学的技法による他の物質への会合または結合によって得られ得る。抗体に結合している他の物質は、脂質、炭水化物、核酸、有機および無機分子またはその任意の組合せ（例えば、ＰＥＧ、プロドラッグまたは薬物）とすることができる。特定の実施形態では、抗体は、例えば、抗体−薬物コンジュゲート体を得るために薬物を含む誘導体である。特に、抗体は、タグと一緒に使用され得る。したがって、抗体は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ診断としての使用のためを含めた分析または診断目的のためなどのタグを含む誘導体とすることができる。それが、その標的抗原への抗体の結合への負の影響を有さないまたは容認できる負の影響を有する限り、使用可能なタグに関する特定の限定事項はない。適したタグの例は、Ｈｉｓ−タグ、Ｍｙｃ−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、カルモジュリン−タグ、ＧＳＴ−タグ、ＭＢＰ−タグ、およびＳ−タグを含む。別の特定の実施形態では、抗体は、ラベルを含む誘導体である。「ラベル」という用語は、本明細書では、「ラベルされた」抗体を作製するために抗体に直接的にまたは間接的にコンジュゲートしている検出可能な化合物または組成物を表す。例えば、放射性同位体ラベルまたは蛍光ラベルなどのラベルは、それ自体で検出可能であり得る、または酵素ラベルの場合、検出可能である基質化合物または組成物の化学的改変を触媒し得る。
【００６６】
誘導体という用語は、機能的であり、例えば、特定の標的に結合する機能的変異体として役立ち得る、例えば、糖鎖工学によって作製された、例えば、特定のグリコシル化パターンを有する抗体の断片、変異体、類似体または相同体も含む。
【００６７】
抗体配列に関する「グリコ操作された」という用語は、糖鎖工学の結果として修飾された免疫原性特性、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを有するグリコシル化変異体を表すべきである。全ての抗体は、各アイソタイプがＮ結合型炭水化物構造の別個のアレイを有する重鎖定常領域における保存された位置での炭水化物構造を含有し、これは、タンパク質集合、分泌または機能的活性に不定に影響する。ｌｇＧ１型抗体は、各ＣＨ２ドメインにおけるＡｓｎ２９７での保存されたＮ結合型グリコシル化部位を有する糖タンパク質である。Ａｓｎ２９７に付着している２つの複合二分岐オリゴ糖は、ＣＨ２ドメイン間に埋められており、ポリペプチド主鎖との広範な接触を形成し、それらの存在は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）などのエフェクター機能を媒介するために抗体に不可欠である。例えば、例えばＡ、またはＴ２９９にＮ２９７を変異させることを通したＮ２９７でのＮ−グリカンの除去は、減少したＡＤＣＣを有するアグリコシル化抗体を典型的にもたらす。
【００６８】
抗体グリコシル化の主要な差違は、細胞株間で生じ、小さな差違さえも種々の培養条件下で増殖された所与の細胞株に関して見られる。細菌細胞における発現は、アグリコシル化抗体を典型的に提供する。
【００６９】
抗体は、活性Ｆｃ部分を欠き得、したがって、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの鎖を欠く任意の抗体を特に含むＦＣＧＲ結合部位を有さない抗体ドメインから構成される、または例えば、Ｆｃエフェクター機能を減少させる、特に、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を抑止するまたは減少させるための修飾によって、Ｆｃエフェクター機能を欠く抗体ドメインを含む。かかる修飾は、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性によって測定される無修飾（野生型）抗体の１０％未満、好ましくは５％未満のＦｃエフェクター機能を表すと典型的に理解される、Ｆｃエフェクター機能の減少またはＦｃエフェクター機能の欠如を達成するために、突然変異誘発、例えば、ＦＣＧＲ結合部位における変異によってまたは抗体のＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性に干渉する誘導体または薬剤によってもたらされ得る。
【００７０】
本発明の抗体は、Ｆｃエフェクター機能を示し得るまたは示し得ない。作用のモードは、Ｆｃエフェクター機能なしに腫瘍細胞微小環境におけるＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナル伝達を阻害することによって主に媒介されるけれども、Ｆｃは、補体を動員し得、免疫複合体の形成を通して循環から標的血小板−腫瘍細胞凝集物の除去を助け得る。
【００７１】
典型的な抗体は、ＦｃＲｎへの結合部位を維持するためになど、Ｆｃ断片またはＦｃ断片の少なくとも部分を含み、それによって、ｉｎ  ｖｉｖｏでの本質的な半減期を有する抗体を得る。
【００７２】
さらなる例は、例えば、ｌｇＧ２亜型へのｌｇＧ１の切り換えによるまたは例えば、ヒトｌｇＧ１  ＦｃにおけるＥ２３３Ｐおよび／またはＬ２３４Ｖおよび／またはＬ２３５Ａおよび／またはＤ２６５Ｇおよび／またはＡ３２７Ｑおよび／またはＡ３３０Ａおよび／またはＧ２３６、欠失および／またはＡ３２７Ｇおよび／またはＡ３３０ＳによるＦｃ受容体への結合を減少させるための修飾による可能なＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性の減少を得るためのＦｃの修飾を表し、ここで、ナンバリングは、カバット［ＥＵ−インデックス］による。
【００７３】
別の例は、例えば、Ｎ２９７ＱなどのＫ．Ｏ．グリコシル化部位によって免疫原性を減少させるための修飾を表し、これは、レクチン受容体への損なわれた結合を提供する。
典型的な抗体は、例えば、ｌｇＧ２または任意の他の免疫グロブリン型もしくは亜型のフレームワークに組み込まれた、デノスマブ、またはその機能的変異体もしくは抗原結合性断片である。例えば、デノスマブ抗原−結合部位またはＣＤＲ配列は、Ｆｃエフェクター機能を有するまたは有さないｌｇＧ１抗体中に組み込まれ得る。
【００７４】
「抗体」という用語は、親ＣＤＲ配列の機能的に活性なＣＤＲ変異体を有する抗体、および親抗体の機能的に活性な変異抗体を含めた抗体の変異体も表すと理解されよう。例えば、デノスマブの機能的変異体は、本明細書でさらに記載されるように操作されかつ使用され得る。
【００７５】
特に、本発明の抗体由来の抗体変異体は、少なくとも１つまたは複数の（親抗体の）ＣＤＲ領域またはそのＣＤＲ変異体、例えば、機能的に活性である、例えば、ＲＡＮＫＬ抗原に特異的に結合する、少なくとも１つのＣＤＲまたはＦＲ領域における、または重鎖（ＨＣ）もしくは軽鎖（ＬＣ）の定常領域における少なくとも１つの点変異を有する重鎖可変領域の少なくとも３つのＣＤＲおよび／または軽鎖可変領域の少なくとも３つのＣＤＲを含み得る。
【００７６】
「変異体」という用語は、例えば、特に、例えば、抗体安定性、エフェクター機能または半減期を操作するために定常ドメインにおいて、または例えば、当技術分野で利用可能な親和性成熟技法によって、抗原結合性特性を改善するために可変ドメインにおいて特定の抗体アミノ酸配列または領域を除去する、交換する、これへの挿入を導入するまたはアミノ酸配列を化学的に誘導体化するための突然変異誘発方法によって得られるミュータント抗体または抗体の断片などの抗体を特に表すべきである。例えば、ランダム化技法によって得られる、望ましい位置での点変異を含めた既知の突然変異誘発方法のいずれかが用いられ得る。一部の場合では、位置は、例えば、可能なアミノ酸のいずれかまたは抗体配列をランダム化するための好ましいアミノ酸の選択でランダムに選択される。「突然変異誘発」という用語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を改変するための任意の技術で認識された技法を表す。突然変異誘発の好ましい型は、エラープローンＰＣＲ突然変異誘発、飽和突然変異誘発、または他の部位特異的突然変異誘発を含む。
【００７７】
抗体の「機能的に活性な変異体」という用語は、１つもしくは複数のアミノ酸の挿入、欠失もしくは置換、またはアミノ酸配列、またはヌクレオチド配列内のヌクレオチドにおける、または例えば、ＣＤＲ配列では、Ｎ末端および／もしくはＣ末端１、２、３、もしくは４アミノ酸、および／または中心の１、２、３、もしくは４アミノ酸（すなわち、ＣＤＲ配列の中央における）における配列の遠位末端の一方もしくは両方での１つもしくは複数のアミノ酸残基の化学的誘導体化によってこの配列（親抗体または親配列）の修飾から生じる配列を意味し、この修飾は、この配列の活性に影響しない、特に、損なわない。選択された標的抗原への特異性を有する結合部位の場合では、抗体の機能的に活性な変異体は、例えば、特定のエピトープへの微細な特異性、親和性、アビディティー、ＫｏｎまたはＫｏｆｆ割合などを変更するために変更されるけれども、所定の結合特異性、または実質的に同じ生物活性をなお有する。例えば、親和性成熟抗体は、機能的に活性な変異抗体と特に理解される。したがって、親和性成熟抗体における修飾されたＣＤＲ配列は、機能的に活性なＣＤＲ変異体と理解される。
【００７８】
好ましくは、高親和性で、特に、高接触および／もしくは低分離割合、または結合の高いアビディティーでｐＲＡＮＫＬに結合する薬剤が使用される。結合親和性は、解離定数（Ｋｄ、またはＫＤ）として既知である、結合部位の半分が占められる、薬剤の濃度の観点で通常特徴付けられる。通常、結合剤は、Ｋｄ＜１０−８Ｍ、好ましくは、Ｋｄ＜１０−９Ｍを有する高親和性結合剤と考えられ、Ｋｄ＜１０−１０Ｍがさらにより好ましい。
【００７９】
しかし、代替的に好ましい実施形態では、個々の抗原結合親和性は、例えば、少なくとも２つの抗原に結合する場合、例えば、１０−６Ｍ未満および最大１０−８ＭのＫｄを有する中程度の親和性のものである。
【００８０】
「実質的に同じ生物活性」という用語は、本明細書では、比較可能なまたは親抗体に関して決定される活性の少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、例えば、少なくとも１００％、または少なくとも１２５％、または少なくとも１５０％、または少なくとも１７５％、または例えば、最大２００％である実質的に同じ活性によって示される活性を表す。
【００８１】
好ましい実施形態では、親抗体の機能的に活性な変異体は、
ａ）抗体の生物学的に活性な断片であり、断片は、分子の配列の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％または９９％を含み；
ｂ）少なくとも１つのアミノ酸置換、付加および／または欠失によって抗体に由来し、ここで、機能的に活性な変異体は、少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％および最も好ましくは少なくとも９７％、９８％または９９％の抗体などの分子またはその部分との配列同一性を有し；かつ／または
ｃ）ポリペプチドまたはヌクレオチド配列に異種性の抗体またはその機能的に活性な変異体および追加的に、少なくとも１つのアミノ酸またはヌクレオチドからなる。
【００８２】
本発明の１つの好ましい実施形態では、本発明の抗体の機能的に活性な変異体は、上記の変異体と実質的に同一であるが、それが異なる種の相同の配列に由来するという点で、それぞれ、そのポリペプチドまたはヌクレオチド配列とは異なる。これらは、自然発生の変異体または類似体と称される。
【００８３】
「機能的に活性な変異体」という用語は、自然発生の対立遺伝子の変異体、およびミュータントまたは任意の他の非自然発生の変異体も含む。当技術分野で既知のように、対立遺伝子の変異体は、ポリペプチドの生物学的機能を本質的に改変しない１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、または付加を有すると特徴付けられる（ポリ）ペプチドの代替の形である。
【００８４】
機能的に活性な変異体は、例えば、１つまたは複数の点変異によるポリペプチドまたはヌクレオチド配列における配列改変によって得られ得、ここで、配列改変は、本発明の組合せで使用される場合、改変されていないポリペプチドまたはヌクレオチド配列の機能を保持するまたは改善する。かかる配列改変は、（保存的）置換、付加、欠失、変異および挿入を含み得るが、これらに限定されない。
【００８５】
保存的置換は、それらの側鎖および化学的特性において関連しているアミノ酸のファミリー内で起こるものである。かかるファミリーの例は、塩基性側鎖を有する、酸性側鎖を有する、非極性脂肪族側鎖を有する、非極性芳香族側鎖を有する、無電荷の極性側鎖を有する、小さい側鎖を有する、大きい側鎖を有するなどのアミノ酸である。
【００８６】
点変異は、種々のアミノ酸に関する１つまたは複数の単一（非連続的）または一対のアミノ酸の置換または交換、欠失または挿入の点で操作されていないアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列の発現をもたらすポリヌクレオチドの操作と特に理解される。
【００８７】
好ましい点変異は、同じ極性および／または電荷のアミノ酸の交換を表す。この点で、アミノ酸は、６４のトリプレットコドンによってコードされる２０の自然発生のアミノ酸を表す。これらの２０アミノ酸は、中性電荷、正電荷、および負電荷を有するものに分割され得る：
「中性」アミノ酸は、それらのそれぞれの３つの文字および単一文字コードおよび極性とともに以下に示されている：
アラニン：（Ａｌａ、Ａ）非極性、中性；
アスパラギン：（Ａｓｎ、Ｎ）極性、中性；
システイン：（Ｃｙｓ、Ｃ）非極性、中性；
グルタミン：（Ｇｉｎ、Ｑ）極性、中性；
グリシン：（Ｇｌｙ、Ｇ）非極性、中性；
イソロイシン：（Ｉｌｅ、Ｉ）非極性、中性；
ロイシン：（Ｌｅｕ、Ｌ）非極性、中性；
メチオニン：（Ｍｅｔ、Ｍ）非極性、中性；
フェニルアラニン：（Ｐｈｅ、Ｆ）非極性、中性；
プロリン：（Ｐｒｏ、Ｐ）非極性、中性；
セリン：（Ｓｅｒ、Ｓ）極性、中性；
トレオニン：（Ｔｈｒ、Ｔ）極性、中性；
トリプトファン：（Ｔｒｐ、Ｗ）非極性、中性；
チロシン：（Ｔｙｒ、Ｙ）極性、中性；
バリン：（Ｖａｌ、Ｖ）非極性、中性；および
ヒスチジン：（Ｈｉｓ、Ｈ）極性、正（１０％）中性（９０％）。
「正に」荷電したアミノ酸は、以下である：
アルギニン：（Ａｒｇ、Ｒ）極性、正；および
リシン：（Ｌｙｓ、Ｋ）極性、正。
「負に」荷電したアミノ酸は、以下である：
アスパラギン酸：（Ａｓｐ、Ｄ）極性、負；および
グルタミン酸：（Ｇｌｕ、Ｅ）極性、負。
【００８８】
本明細書で記載された抗体配列および相同体に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列同一性の部分としていかなる保存的置換も考慮せずに、必要な場合、最大パーセント配列同一性を達成するために配列を整列させかつギャップを導入した後、特定のポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基の百分率と定義される。当業者は、比較される配列の全長にわたる最大アライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含めた、アライメントを測定するための適切なパラメーターを決定し得る。
【００８９】
「標的」または「標的抗原」という用語と互換的に本明細書で使用される「抗原」という用語は、抗体結合部位による結合を通して抗原を認識する抗体などの抗原を特異的に認識する、または標的を特異的に結合する能力がある薬剤によって認識される標的分子全体またはかかる分子の断片を表すべきである。特に、抗原の下部構造、例えば、免疫学的に関連している、「エピトープ」、例えば、Ｂ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープと一般に称されるポリペプチドまたは炭水化物構造は、かかる結合部位によって認識され得る。「エピトープ」という用語は、本明細書では、特定の結合パートナーを完全に作り上げ得るまたは本明細書に記載の薬剤の結合部位への特定の結合パートナーの部分であり得る分子構造を特に表すべきである。エピトープは、炭水化物、ペプチド構造、脂肪酸、有機、生化学的もしくは無機物質またはその誘導体およびその任意の組合せから構成され得る。エピトープが、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質などのペプチド構造に含まれる場合、それは、少なくとも３アミノ酸、好ましくは５から４０アミノ酸、より好ましくは約１０〜２０アミノ酸を通常含むことになる。エピトープは、直線的または立体構造エピトープとすることができる。直線的エピトープは、ポリペプチドまたは炭水化物鎖の一次配列の単一セグメントからなる。直線的エピトープは、隣接してい得るまたは重複してい得る。立体構造エピトープは、ポリペプチドを折り畳んで、三次構造を形成することによって一緒にされたアミノ酸または炭水化物からなり、アミノ酸は、直線的配列において必ずしも互いに隣接していない。
【００９０】
本明細書に記載の抗原は、ヒトＲＡＮＫＬ、特に、ｐＲＡＮＫＬであるが、ｐＲＡＮＫＬへの特異的結合剤は、ｓＲＡＮＫＬおよび／またはｍＲＡＮＫＬを交差特異的に認識し得る、またはｐＲＡＮＫＬならびにｓＲＡＮＫＬおよびｍＲＡＮＫＬのいずれか（または両方）と交差反応性である。ヒトｐＲＡＮＫＬは、ヒト血液血小板（栓球とも称される）、例えば、そこに結合するアンタゴニストで標的とされ得る、好ましくは活性化血小板によって、ヒト血液血小板の表面上で発現される抗原から生じるＲＡＮＫＬと特に理解される。血小板は、（ＲＡＮＫＬ陰性）がん細胞と相互作用して、かかるがん細胞を、それ自体がＲＡＮＫＬを発現する能力がある前転移性病変に形質転換もし得る。したがって、アンタゴニスト剤は、がん細胞発現ＲＡＮＫＬも標的にし得る。ｐＲＡＮＫＬは、血小板の表面から脱離または脱落され得、可溶性リガンドとしてのアンタゴニスト剤によって阻害され得る。ｐＲＡＮＫＬは、血小板の表面上で発現された場合、エピトープの到達性の点でｓＲＡＮＫＬとは異なり得る。ｍＲＡＮＫＬは、組織、またはがん細胞によって発現され得、血小板および／または別のがん細胞とさらに相互作用する。ＲＡＮＫＬの他の形と比較した、またはがん細胞および骨芽細胞などの他の起源の細胞から生じるＲＡＮＫＬと比較した、ｐＲＡＮＫＬのさらなる構造的差違は、ｐＲＡＮＫＬのアミノ酸配列およびグリコシル化パターンの分析を通して明らかであり得る。
【００９１】
「ＲＡＮＫＬ」という用語は、細胞によって天然に発現され、細胞、例えば、ヒト血液血小板または腫瘍細胞の表面に結合している、または末梢血の試料中で決定される、循環において可溶性ＲＡＮＫＬとして存在するヒトＲＡＮＫＬの任意の変異体、アイソフォームおよび種相同体を含む。
【００９２】
ｐＲＡＮＫＬの好ましいエピトープは、ＲＡＮＫＬ抗原の細胞外部分、特に、ｐＲＡＮＫＬの細胞外部分または膜貫通ＲＡＮＫＬの細胞外部分、例えば、血小板または細胞の表面上で到達可能であるエピトープに組み込まれている。
【００９３】
本明細書に記載のアンタゴニスト剤は、ＲＡＮＫＬのエピトープに結合し、これは、その受容体ＲＡＮＫへのＲＡＮＫＬ結合の実質的な阻害をもたらし、それによって、シグナル伝達経路を阻害する。ＲＡＮＫＬは、ＲＡＮＫを発現する様々ながん細胞の生存を促進し、遊走を誘発するので、本明細書で記載されたアンタゴニスト剤は、がんまたは腫瘍細胞の前転移性遊走および凝集を防ぐまたは減少させることによって、がん細胞の増殖および転移に干渉する。
【００９４】
本明細書に記載の「転移」という用語は、例えば、本来のまたは原発性腫瘍から離れた二次的部位への悪性腫瘍の伝播を表すべきである。これは、原発性腫瘍からのがん細胞の脱離に通常関わり、がん細胞は、身体循環に入り、定着して、身体のどこか他のところで正常な組織内で増殖する。かかる原発性腫瘍は、がん起源の部位で増殖する腫瘍と理解される。造血疾患（白血病、リンパ腫および骨髄腫）は、診断時に播種性と考えられる。しかしながら、造血がんも転移性腫瘍を形成し得る。まれであるけれども、肺、心臓、中枢神経系、および他の組織への血液およびリンパ系がんの転移が報告された。転移性腫瘍細胞は、転移を作製する能力を有するまたは既に転移性腫瘍の部分である細胞と理解される。特に、本明細書で言及される原発性がん細胞および／または転移は、例えば、標準的な免疫組織化学的またはＰＣＲに基づく方法によって決定されるように、ＲＡＮＫ陽性である。
【００９５】
原発性間葉腫瘍の例は、例えば、筋肉、繊維組織、および血管組織に由来する軟部組織腫瘍である。
原発性中胚葉および／または外胚葉腫瘍の中には、それぞれ、メラノーマおよび／またはアメロブラストーマならびに肺の原始神経外胚葉性腫瘍がある。
【００９６】
代表的な原発性、上皮細胞がんは、数ある中でも、乳、前立腺、肺、膀胱、子宮、卵巣、脳、頭頸部、食道、膵臓、胃、生殖細胞、および大腸がんを含む。
特定の重要なＲＡＮＫ陽性腫瘍疾患は、乳がん、膵がん、胃がん、食道がん、腎細胞癌、肺癌、結腸／直腸／大腸がん、メラノーマ、前立腺がん、頭頸部がん、またはＲＡＮＫ陽性腫瘍実体と関連している他の疾患である。
【００９７】
血液がんの中には、白血病、リンパ腫、または骨髄腫がある。
白血病に罹患している患者は、本明細書に記載の抗ＲＡＮＫＬ処置から特に利益を得る可能性があるが、これは、白血病細胞中へのＲＡＮＫシグナル伝達は、例えば、それらの増殖性潜在性を増強し得るかつ／または例えば、化学療法および／またはキナーゼ阻害剤での抗がん治療介入に対するそれらの耐性を改変し得るからである。
【００９８】
がんおよび原発性腫瘍に関して処置された患者は、がんに関連する微小残存疾患をしばしば保持する。つまり、患者は、臨床的尺度によって、処置に応答した疾患の完全な寛解を有し得るけれども、破壊を免れたがん細胞の小画分は、残り得る。この残留集団の型およびサイズは、患者の連続した処置に関する重要な予後因子である。
【００９９】
ある特定の実施形態では、患者は、原発性がん療法（例えば、化学療法、放射線療法および／または外科手術）後に微小残存疾患を有する。本明細書に記載のアンタゴニスト剤は、腫瘍縮小療法または微小残存疾患を処置するための他の治療介入、例えば、免疫療法と、および／または維持療法として、例えば、別のがん処置の休止後に長期または延長された療法として特に組み合わせられる。さらに、アンタゴニスト剤は、がんもしくは腫瘍の再増殖もしくは再発、または転移性疾患における転移形成の再発を、例えば、少なくとも１カ月以上遅延させる。
【０１００】
特定の転移性腫瘍細胞は、遠隔器官における転移形成をトリガーする、循環における前転移性腫瘍細胞凝集物を発達させる傾向がある播種性腫瘍細胞である。驚くべきことに、播種性ＲＡＮＫ陽性腫瘍細胞が循環においてＲＡＮＫＬ陽性血小板と凝集し得、かかる凝集物は、転移形成を誘導することが分かった。活性化血小板は、ｐＲＡＮＫＬを上方制御し得、それによって、腫瘍細胞上のＲＡＮＫを刺激し、したがって、それらを前転移性にする。したがって、本明細書に記載のように有利に処置されたがん患者は、リンパ管を通してではないかほとんどこれを通してではなく、血管を通して主に転移する腫瘍疾患またはがんに罹患している。
【０１０１】
血小板−がん細胞凝集物は、特に、ｐＲＡＮＫＬを発現する血小板の活性化時に、プロ転移性、または転移のプレフォームと理解される。かかるプレフォームは、転移とは異なるが、これは、凝集物が循環に存在し、遠隔器官における転移としてのより大きい腫瘤にまだ増殖していないからである。この点で、プロ転移性血小板−がん細胞凝集物は、ＲＡＮＫ陽性腫瘍性疾患の具体的実例と考えられる。
【０１０２】
「播種性腫瘍細胞」という用語は、本明細書では、腫瘍を有する患者の循環において見出される腫瘍細胞を主に表す。この用語は、腫瘍の大部分が循環において見出される血液腫瘍を典型的に含まないけれども、「播種性腫瘍細胞」という用語は、血液がんに罹患している患者における（前）転移性腫瘍細胞も包含している。血液がんは、がん細胞との血小板の接触をトリガーし得、それらがいったん転移すれば循環における播種性血小板−がん細胞接触凝集物を場合によりもたらす。血液がん細胞は、リンパまたは血管の壁を貫通する能力を獲得し、その後、それらは、循環（播種性）腫瘍細胞として血流を通して身体における他の部位および組織まで循環することができ、転移性または二次的腫瘍移植片として既知の臨床的に検出可能な腫瘍をやがて形成する。さらに、ｐＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナル伝達は、血液がん疾患進行をトリガーし得る。
【０１０３】
血小板−がん細胞凝集物に関する「プロ転移性」という用語は、本明細書では、以下の様式で理解される。がんもしくは腫瘍細胞および／または血小板は、凝集の傾向およびＲＡＮＫ陽性腫瘍細胞へのｐＲＡＮＫＬ陽性血小板のその後の結合、およびＲＡＮＫ−ＲＡＮＫＬシグナル伝達の開始のために、プロ転移性、すなわち転移を促進するとすることができる。がん細胞と腫瘍微小環境の様々な構成要素間の相互作用は、腫瘍進行および転移に影響を及ぼすが、これらの転移促進効果の根底にある分子機構は、なお不明確である。がん−血小板または腫瘍−血小板クロストークの経路を同定するかつ理解することは、ｐＲＡＮＫＬを標的にして、その最も初期の段階で転移を防ぐ療法の開発につながり得、これは、改善された患者予後をもたらす。
【０１０４】
「前転移性病変」は、本明細書では、転移促進微小環境（前転移性ニッチ）の創出につながるがん内転移の初期細胞および分子事象によって特徴付けられる前駆体病変と理解される。驚くべきことに、播種性腫瘍細胞が栓球、特に、ｐＲＡＮＫＬを発現する活性化栓球の動員時に転移を引き起こすことが分かった。検出可能な（プロ転移性）血小板−がん細胞凝集物を場合により形成する血液血小板との相互作用を通して、微小環境におけるＲＡＮＫ−ＲＡＮＫＬシグナル伝達時に、がん細胞は、前転移性になり、したがって、それが転移性になる前にその外見または性質を変化させる。したがって、ｐＲＡＮＫＬは、前転移性病変であるまたはない細胞を区別する特徴と考えられる。したがって、ｐＲＡＮＫＬは、その最も初期の発端で転移を検出するかつ防ぐための転移予防または手法の新しい標的である。
【０１０５】
プロ転移性血小板−がん細胞凝集物を減少させることによって、器官特異的転移形成のリスクが大きく減少する。特に、これは、内臓または中皮転移を表す、または肝臓、肺、骨、腸、皮膚、筋肉、脾臓、脳、または腎臓などの器官を標的にし、多くの場合では、骨以外の部位を標的にする。内臓転移は、特に、内臓、身体の内部器官における転移、特に、心臓もしくは肺などの胸部または肝臓、膵臓もしくは腸などの腹部内のものを表す。中皮転移は、胸膜および腹膜などの中皮におけるまたはここでのがん細胞の増殖を表す。特に、中皮転移は、例えば、転移によって引き起こされる罹患中皮の炎症反応および／または増加した透過性により、中皮によって囲まれた腔における体液、特に、胸膜および／または腹部浸出液の蓄積につながり得る。
【０１０６】
「転移能」という用語は、本明細書では、微小残存疾患を発症する、転移性疾患の再発に関する潜在性、急速に進行する転移性がんに関する潜在性、または標準的な療法、例えば、化学療法および／もしくは免疫療法に対する耐性を示す転移性がんに関する潜在性を表すべきである。
【０１０７】
増加したまたは高い転移能は、遠隔転移または複数の部位もしくは器官への転移、または局所的、組織特異的、器官特異的、もしくは部位特異的転移を形成する傾向を示す。高い転移能は、がん患者において示され、ここで、播種性腫瘍細胞の比較的高い負荷が循環において決定される。特に、がん患者の末梢血試料は、基準値と比較して、ｐＲＡＮＫＬ、またはｓＲＡＮＫＬもしくはｍＲＡＮＫＬのいずれかを発現する検出可能な血小板、またはがん細胞および血小板の集合体の増加した数を含有する。高い転移能の細胞株に関する例は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（例えば、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ）で入手可能な、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ陽性乳がんを有する患者の転移性部位に由来する乳房癌腫細胞株）、またはＳＫ−Ｍｅｌ−５（例えば、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ）で入手可能な、悪性メラノーマを有する患者の転移性部位に由来するメラノーマ細胞株）である。
【０１０８】
対照的に、低い転移能は、転移の低い割合または非転移性腫瘍を示している。低い転移能のＲＡＮＫ陽性がんは、循環における腫瘍細胞の低いまたは限定された量でのみ存在する。特に、がん患者の末梢血試料は、ｐＲＡＮＫＬを発現する検出可能な血小板、またはｐＲＡＮＫＬ、または腫瘍細胞および血小板の集合体の低いまたは限定された数のみを含有する。低い転移能の細胞株に関する例は、ＭＣＦ−７（例えば、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ）で入手可能な、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ陽性乳がんを有する患者の転移性部位に由来する乳房癌腫細胞株）、またはＳＫ−ＢＲ−３（例えば、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ）で入手可能な、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ陽性乳がんを有する患者の転移性部位に由来する乳房癌腫細胞株）である。
【０１０９】
播種性腫瘍細胞を分析するかつｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでのそれらの転移能を評価する方法は、当技術分野で既知である。かかる方法は、ｐＲＡＮＫＬ発現の特定の決定によって、または血液試料、もしくはその血小板含有画分における前転移性病変、特に、プロ転移性血小板−がん細胞凝集物のレベルを決定することによって改善され得る。
【０１１０】
本明細書でさらに記載される転移能を予測する方法に基づく予後アッセイは、患者が薬剤、例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣薬、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、またはがんもしくは転移性疾患などのがんと関連している他の障害を処置するための他の薬物候補で適切に処置されているかどうかを決定するために使用され得る。例えば、かかるアッセイは、対象が化学療法薬を投与されるべきであるかどうかを決定するために使用され得る。
【０１１１】
「患者」という用語は、本明細書では、温血哺乳類、特に、ヒトを表すべきである。特に、本発明の医学的使用フォーマットまたは処置のそれぞれの方法は、がん、腫瘍または転移性疾患の予防法または処置を必要としている患者にあてはまる。患者は、初期または後期疾患に罹患してい得る、または患者は、例えば、遺伝的素因によってかかる疾患にかかりやすい。
【０１１２】
本明細書に記載の「医薬組成物」という用語は、ヒトに投与するのに適した組成物、すなわち薬学的に許容される構成要素を含有する組成物を表すべきである。好ましくは、医薬組成物は、担体、希釈液または緩衝液、もしくは浸透圧修飾因子などの医薬賦形剤と一緒に活性化合物またはその塩を含む。
【０１１３】
本発明のアンタゴニスト剤は、医薬組成物で特に提供される。保管のために調製された安定な医薬組成物が企図される。特定の実施形態では、純度の望ましい程度を有する薬剤は、薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤と混合され、凍結乾燥製剤、水溶液または水中油型エマルションとして提供される。典型的に、かかる組成物は、容認できる薬務に既知であり要求される薬学的に許容される担体を含み、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８０）Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．を参照されたい。かかる担体の例は、５から８の範囲内のｐＨに適した緩衝液で場合により緩衝された、生理食塩水、リンゲル液またはデキストロース溶液などの無菌化担体を含む。
【０１１４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、無菌である必要があることになる。これは、除菌膜または他の適した方法を通したろ過によって容易に達成される。
本明細書に記載の使用のための薬剤を含む医薬組成物の投与は、特に、全身的経路によるまたは非経口投与による、例えば、静脈内、筋肉内または皮下経路によるだけでなく、経口、鼻腔内、耳内、経皮、粘膜、局所（例えば、ゲル、軟膏、ローション、クリームなど）、腹腔内、筋肉内、肺内、経膣、非経口、直腸または眼内である。非経口投与に使用される代表的な製剤は、例えば、無菌溶液または懸濁液としての静脈内、筋肉内、または皮下注射に適したものを含む。
【０１１５】
特に、例えば、静脈内（ｉｎｔｒａｖｅｎｅｏｕｓ）インフュージョンまたはボーラス注入としての静脈内（ｉｎｔｒａｖｅｎｅｏｕｓ）投与が好ましい。デノスマブは、皮下経路によって投与されることが既知である。ｐＲＡＮＫＬを標的にする新しい指標では、デノスマブ薬剤は、それが長期間、循環において利用可能であるように特に投与され、したがって、皮下経路は、特に、あまり好ましくないまたは避けられる。
【０１１６】
本発明は、活性物質としてアンタゴニスト剤を治療有効量で含有する医薬調製物を含む。
本明細書に記載のアンタゴニスト剤の「有効量」または「十分な量」という用語のいずれかと互換的に本明細書で使用される「治療有効量」という用語は、対象に投与された場合、臨床結果を含めた有益なまたは望ましい結果をもたらすのに十分な量または活性であり、そのように、有効量またはそのシノニムは、それが適用される文脈に依存する。疾患の文脈では、薬剤の治療有効量は、例えば、転移性疾患を防ぐまたは処置するために、前転移性病変、血小板−がん細胞凝集物、またはプロ転移性腫瘍細胞凝集物の下方制御または減少から利益を得る疾患または状態を処置する、調節する、減弱する、反転させる、影響を及ぼすために使用され得る。有効量は、かかる疾患または障害を処置する、防ぐまたは阻害するために十分である化合物の量を意味することが意図されている。かかる量に相当することになるアンタゴニスト剤の量は、所与の薬物または化合物、医薬製剤、投与の経路、疾患または障害の型、対象の同一性または処置される宿主などの様々な因子に依存して変動することになるが、それにもかかわらず、当業者によって常法に従って決定され得る。
【０１１７】
さらに、アンタゴニスト剤の治療有効量での対象（がん患者）の処置または予防レジメンは、単回投与からなり得る、または代わりに、一連の適用を含み得る。例えば、アンタゴニスト剤は、少なくとも１年に１回、少なくとも半年に１回または少なくとも１カ月に１回投与され得る。しかしながら、別の実施形態では、アンタゴニスト剤は、所与の処置に関して約１週間に１回から約毎日の投与まで対象に投与され得る。処置期間の長さは、疾患の重症度、患者の年齢、アンタゴニスト剤の濃度および活性などのいろいろな因子に依存する。処置または予防法に使用される効果的な投薬量は、特定の処置または予防法レジメンの過程にわたって増加または低下し得ることが理解されよう。投薬量の変化が生じ得、当技術分野で既知の標準的な診断アッセイによって明らかとなり得る。一部の例では、長期にわたる投与が必要であり得る。
【０１１８】
それを必要とするヒト患者に提供されるものなどのアンタゴニスト剤の治療有効量は、特に、０．５〜１０００ｍｇ、好ましくは１〜４００ｍｇの範囲内であり得、最大３００ｍｇ、最大２００ｍｇ、最大１００ｍｇまたは最大１０ｍｇがさらにより好ましいが、より高い用量が、外科的介入、または外科的介入直後に調製する場合、外科手術後１〜７日以内に処置を開始する場合などに、例えば、急性疾患状態を処置するために示され得る。皮下用量は、典型的に、０．５から４００ｍｇにわたる。
【０１１９】
「処置」という用語は、本明細書では、予防的（すなわち、疾患または疾患状態を防ぐために）または治療的（すなわち、疾患または疾患状態を処置するために）目的のために患者を処置することを常に表すべきである。患者の処置は、がんの場合、典型的に治療的であることになる。しかしながら、例えば、ＲＡＮＫ−ＲＡＮＫＬシグナル伝達効果に依存して、疾患進行のリスクがあるまたは二次的疾患状態もしくは副反応を発症するリスクがある原発性疾患に罹患している患者の場合、処置は、予防的とすることができる。予防法に関するかかる処置は、例えば、治療有効量を用いる処置または療法とも本明細書で称される。
【０１２０】
一実施形態では、アンタゴニスト剤は、例えば、疾患修飾単独療法として患者に投与される唯一の治療的活性薬剤である。
代わりに、アンタゴニスト剤は、標準的な処置、例えば、悪性疾患を処置するための化学療法薬を含むが、これらに限定されない１つまたは複数の他の治療薬と組み合わせて投与される。
【０１２１】
併用療法では、アンタゴニスト剤は、例えば、併用療法の前、同時または後に、混合物として、または１つもしくは複数の他の治療的レジメンと同時に投与され得る。
アンタゴニスト剤の生物学的特性は、細胞、組織、および生物全体実験においてｅｘ  ｖｉｖｏで特徴付けられ得る。当技術分野で既知のように、薬物は、疾患または疾患モデルに対する処置に関する薬物の有効性を測定するために、または薬物の薬物動態、薬力学的性質、毒性、および他の特性を測定するために、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、およびサルを含むが、これらに限定されない動物においてｉｎ  ｖｉｖｏでしばしば試験される。動物は、疾患モデルと称され得る。治療用物質は、ヌードマウス、ＳＣＩＤマウス、異種移植マウス、およびトランスジェニックマウス（ノックインおよびノックアウトを含めた）を含むが、これらに限定されないマウスにおいてしばしば試験される。かかる実験法は、薬物が適切な半減期、エフェクター機能、アポトーシス活性およびＩｇＧ阻害活性を有する治療用物質として使用される潜在性の決定に関する意味あるデータを提供し得る。任意の生物、好ましくは哺乳動物が試験に使用され得る。例えば、ヒトとのそれらの遺伝的類似性のために、霊長類、サルは、適した治療的モデルとすることができ、したがって、薬剤の有効性、毒性、薬物動態、薬力学的性質、半減期、または他の特性を試験するために使用され得る。ヒトにおける物質の試験は、薬物としての承認に最終的に必要であり、これらの実験が本明細書で企図される。したがって、本発明のアンタゴニスト剤は、それらの治療的有効性、毒性、免疫原性、薬物動態、および／または他の臨床特性を決定するために動物モデルにおいてまたはヒトにおいて試験され得る。デノスマブは、確立された生物学的特性を有する市販の生成物であるが、栓球とのがん細胞の相互作用を阻害する抗ｐＲＡＮＫＬ効果は、驚異的であることが判明した。
【０１２２】
本明細書に記載のＲＡＮＫＬ特異的薬剤に関しての「特異的な」という用語は、分子の異種性集団において目的の同族リガンド（ＲＡＮＫＬ）を決定する結合反応を表すべきである。したがって、指定された条件、例えば、イムノアッセイ条件下で、その特定の標的に特異的に結合する薬剤は、試料に存在する他の分子に相当量で結合しない。
【０１２３】
特異的結合部位または特異的薬剤は、標的のみを典型的に認識し、他の標的と交差反応性ではない。なお、特異的結合部位は、標的の１つまたは複数のエピトープ、アイソフォームまたは変異体に特異的に結合し得る、または他の関連する標的抗原、例えば、相同体または類似体に交差反応性とすることができる。
【０１２４】
特異的結合は、選択されるように、標的同一性、高、中もしくは低結合親和性またはアビディティーの観点から、結合が選択的であることを意味する。結合定数または結合動態が少なくとも１０倍異なる場合、選択的結合は、通常達成され、好ましくは、差違は、少なくとも１００倍であり、少なくとも１０００倍がより好ましい。
【０１２５】
本明細書で「外科手術」とも称される「外科的介入」という用語は、腫瘍、特に、固形腫瘍などの原発性腫瘍の全てもしくは部分および／または１つまたは複数の転移を含む組織の外科的除去、例えば、生検、摘出または切除を表すべきである。
【０１２６】
特定の例によれば、休止または活性化栓球によるＲＡＮＫＬ発現の効果は、肺転移マウスモデルにおいて試験された。ヒトの系では、活性化栓球が、非活性化栓球と比較してより高いレベルでＲＡＮＫＬを発現したことが示される。
【０１２７】
別の例によれば、ＲＡＮＫ−Ｆｃ融合タンパク質が使用され（Ｓｃｈｍｉｅｄｅｌら  ２０１３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７３（２）：６８３−９４）、これは、ヒトＲＡＮＫ受容体およびヒトｌｇＧ１のＦｃから構成され、２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／ΔＧ２３６／Ａ３２７Ｇ／Ａ３３０Ｓ（カバット、ＥＵインデックスによる命名法）であるＦｃ受容体ＦｃγＲｌｌｌａ、ＣＤ１６へのその親和性を減少させる点変異を含む。肺転移マウスモデルにおける転移形成に及ぼすＲＡＮＫ−Ｆｃ融合タンパク質の効果が決定された。ＲＡＮＫ−Ｆｃ融合タンパク質によるＲＡＮＫＬの中和は、栓球枯渇とほぼ同じくらい効果的であることが示された。
【０１２８】
別の例は、ｐＲＡＮＫＬが血小板によってＲＡＮＫＬ陰性腫瘍細胞に移動され、それによって、腫瘍細胞をＲＡＮＫＬ陽性のものに形質転換することを示し得る。ｐＲＡＮＫＬが腫瘍細胞におけるプロ転移性ＥＭＴ事象を誘発し、マトリゲルを通した腫瘍細胞の遊走に影響することも確立され得る。巨核球および血小板におけるＲＡＮＫＬ発現を条件的にノックアウトするマウスノックアウトモデルでは、実際に、ｐＲＡＮＫＬが前転移性病変を誘発し、ｐＲＡＮＫＬ阻害が転移形成を阻害するまたは減少させることが示され得る。
【０１２９】
前述の説明は、以下の例を参照して、より完全に理解されることになる。しかしながら、かかる例は、本発明の１つまたは複数の実施形態を行う方法の単に典型であり、本発明の範囲を限定すると読まれるべきではない。
【実施例１】
【０１３０】
肺転移マウスモデルにおけるＲＡＮＫＬトランスフェクトメラノーマ細胞によるＲＡＮＫＬ発現
ヒトＲＡＮＫＬをトランスフェクトされたマウスメラノーマＢ１６−Ｆ１０細胞または親細胞株を肺転移のマウスモデルにおいて使用した。トランスフェクト、ＲＡＮＫＬ陽性細胞の適用は、親細胞（対照）と比較して動物の肺における大幅に増強された転移性（ｍｅｔａｓｔａｓｔｉｃ）負荷をもたらした（図１）。ヒトＲＡＮＫＬがマウスＲＡＮＫを刺激し得ることが既知であるので、これらのデータは、ＲＡＮＫＬ陽性腫瘍細胞を投与されたマウスにおける増加した転移性（ｍｅｔａｓｔａｓｔａｔｉｃ）負荷が腫瘍細胞への増強されたＲＡＮＫシグナル伝達によると示唆している。これは、パラ−および／またはオートクリン刺激時のＲＡＮＫ陽性腫瘍細胞の増強された転移を示すＪｏｎｅｓら（２００６）からの研究とも一致している。この実験は、通常の環境下で利用可能なレベルを超えたＲＡＮＫ刺激のためにＲＡＮＫＬを提供すると、転移能が増強されることを明らかにする。腫瘍細胞へのｐＲＡＮＫＬの寄与／移動を、それへのＲＡＮＫＬのトランスフェクションは模倣する。
【実施例２】
【０１３１】
活性化栓球上でのｐＲＡＮＫＬ発現
血小板は、腫瘍転移を促進することが既知であるので、血小板上での潜在的ＲＡＮＫＬ表面発現の分析を行った。低レベルのＲＡＮＫＬが休止血小板上で検出される一方、重大なＲＡＮＫＬ表面発現がトロンビンでの血小板活性化後に得られた（図２）。したがって、腫瘍細胞との凝集物の形成時にも生じる血小板の活性化は、ＲＡＮＫＬ発現の急速な上方制御をもたらす。次いで、上方制御されたＲＡＮＫＬは、腫瘍細胞上のＲＡＮＫと相互作用し、これを刺激するために容易に利用可能となってしまう。
【実施例３】
【０１３２】
ＲＡＮＫ−Ｆｃ融合タンパク質
ヒト受容体ＲＡＮＫおよびヒト免疫グロブリンＧ（ｈｌｇＧ１）の細胞外画分を含有する免疫受容体−Ｆｃ融合タンパク質を調製した（図３）。融合タンパク質は、生理学的条件下でのＣＤ１６へのＦｃ部分の結合を阻害するｌｇＧ１部分におけるアミノ酸交換によるＦｃ受容体（ＦｃｙＲｌｌｌａ、ＣＤ１６）への著しく減少した親和性を示す（２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／ΔＧ２３６／Ａ３２７Ｇ／Ａ３３０Ｓ、Ａｒｍｏｕｒら，１９９９，Ｓｃｈｍｉｅｄｅｌら，２０１３）。この構築物は、デノスマブとは対照的に、ヒトとマウスＲＡＮＫＬの両方への結合を示し、したがって、ＲＡＮＫＬ中和のマウスモデルにおける利用に有利である（Ｂｏｓｓｅｎら  ２００６，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１  （２）：１３９６４−７１；Ｋｏｓｔｅｎｕｉｋら  ２００９，Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  ２４（２）：１８２−９５）。
【実施例４】
【０１３３】
肺転移モデルにおけるＲＡＮＫＬ中和の効果
ｉｎ  ｖｉｖｏでの活性化（例えば、血流における循環性腫瘍細胞のコーティング後）時に発現されるｐＲＡＮＫＬの役割を試験するために、メラノーマ肺転移モデルを適用した。親メラノーマ細胞を使用して、このモデルにおける生理学的マウスｐＲＡＮＫＬの役割を特徴付けた。転移の数は、血小板枯渇時に大幅に減少し、これは、前の報告とも一致している。興味深いことに、ＲＡＮＫ−Ｆｃ−ＫＯ融合タンパク質を使用したマウスＲＡＮＫＬの中和は、血小板枯渇において得られた結果と比較可能であるより少ない数の転移をもたらした（図４）。これらのデータは、転移がｐＲＡＮＫＬによって媒介され、その中和が転移形成を防ぎ得るという事実を指摘している。
【実施例５】
【０１３４】
ＲＡＮＫＬの中和は、不死化ＭＣＦ１０Ａ細胞における血小板誘発プロ転移性ＥＭＴシグナル伝達を防ぐ。
第１のステップとして、本発明者らは、定量的リアルタイムＰＣＲを用いて、ＥＭＴ分析のための古典的モデルであるＭＣＦ１０Ａ細胞自体がＲＡＮＫＬを発現することを除外した。これは、腫瘍発現ＲＡＮＫの刺激が血小板とは独立してオートクリン／パラクリン様式で起こらなかったことを確認するのに役立った。その後、以前報告されたように、ＭＣＦ１０Ａ細胞をヒト血小板でインキュベートして、血液中の腫瘍細胞の血小板−コーティングを模倣した（Ｋｏｐｐら  ２００９，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６９（１９）：７７７５−８３；Ｐｌａｃｋｅら  ２０１２，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７２（２）：４４０−８；およびＰｌａｃｋｅら  ２０１２，１８９（１）：１５４−６０）。共培養をデノスマブの存在または非存在下で追加で行って、血小板由来ＲＡＮＫＬを中和した。ＺＥＢおよびＮカドヘリンｍＲＮＡの誘発の定量的リアルタイムＰＣＲ分析は、血小板の存在がＭＣＦ１０Ａ細胞における２つのプロ転移性遺伝子の発現を誘発したことを実証した。これは、デノスマブでＲＡＮＫＬをブロッキングすることによって大幅に減少し、それによって、実際、ｐＲＡＮＫＬが凝集物の形成時に腫瘍細胞に及ぼす血小板のプロ転移性効果を媒介し、ｐＲＡＮＫＬの中和が腫瘍細胞の転移能を限定するのに役立ち得るという明らかな証拠を提供している。
【実施例６】
【０１３５】
ＲＡＮＫＬの中和は、不死化ＭＣＦ１０Ａ細胞の血小板誘発遊走を防ぐ。
悪性細胞の遊走潜在性は、それらが転移を形成する能力に重要であるので、本発明者らは、血小板由来ＲＡＮＫＬも腫瘍細胞遊走に影響するかどうかを研究した。この目的を達成するために、ＭＣＦ１０Ａ細胞をトランスウェルアッセイ系において用いた。ＭＣＦ１０Ａ細胞をヒト血小板でインキュベートして、トランスウェルシステムの上部チャンバーにおいてアイソタイプ対照またはデノスマブの存在または非存在下で上記のように血液中の腫瘍細胞の血小板−コーティングを模倣した。４８ｈ後、ＥＧＦ勾配に従って下部チャンバーへ遊走した細胞の数を決定した。本発明者らは、血小板の存在が遊走した細胞の数を明白に増強し、これは、血小板由来ＲＡＮＫＬがデノスマブの存在によって中和された場合、大きく減少したことを観察した。これは、ｐＲＡＮＫＬが凝集物の形成時に悪性細胞の遊走潜在性、したがって、それらのプロ転移性表現型を増強し、ｐＲＡＮＫＬの中和が腫瘍細胞の転移能を限定するのに役立ち得ることを実証している（図７）。
【実施例７】
【０１３６】
血小板特異的ＲＡＮＫＬノックアウトマウスを使用した肺転移モデル。
ｉｎ  ｖｉｖｏでのｐＲＡＮＫＬの役割をさらに試験するために、Ｂ１６−Ｆ１０メラノーマ肺転移モデルを用いた。血小板発現ＲＡＮＫＬの役割を特に評価するために、ＲＡＮＫＬがフロックス部位（以下、ＲＡＮＫＬ  ｆｌ／ｆｌと称される）を含有する１２９−Ｔｎｆｓｆ１１ｔｍ１．１  Ｃａｏｂ／Ｊマウスおよび巨核球（ｍｅｇａｋａｒｉｏｃｔｅ）／血小板（ｐｌａｔｅｔｅｌｅｔ）特異的リコンビナーゼ（以下、Ｐｆ４ｃｒｅと称される）を含有するＣ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（Ｐｆ４−ｃｒｅ）Ｑ３Ｒｓｋｏ／Ｊマウスを繁殖させて、ＲＡＮＫＬが巨核球（ｍｅｇａｋａｒｉｏｃｙｔｅｓ）／血小板（ｐｌａｔｅｔｅｌ）において特異的にノックアウトされているＲＡＮＫＬ  ｆｌ／ｆｌ  Ｐｆ４  ｃｒｅ／＋ノックアウト（ｋｏ）マウスを作製した。血小板発現ＲＡＮＫＬの効果の決定のために、Ｂ１６−Ｆ１０メラノーマ細胞（マウスあたり７５，０００）をＲＡＮＫＬ  ｆｌ／ｆｌ  Ｐｆ４  ｃｒｅ／＋ノックアウト（ｋｏ）マウスまたはＣ５７ＢＬ／６対照マウス（ｃｔｒｌ）における尾静脈を通して注入した。血小板におけるＲＡＮＫＬの欠如は、ｃｔｒｌ群と比較して、ｋｏにおける肺転移の実質的に減少した数をもたらした（図８）。これらのデータは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの転移形成におけるｐＲＡＮＫＬの特定の関与をさらに確かめ、ｐＲＡＮＫＬの中和が転移を防ぐのに役立ち得るという本発明者らの手法を支持している。
【実施例８】
【０１３７】
ＲＡＮＫＬの中和は、ＳＫ−Ｍｅｌメラノーマ細胞における血小板誘発プロ転移性ＥＭＴシグナル伝達を防ぐ。
不死化ＭＣＦ１０Ａ細胞で得られた結果を確かめ、拡張するために、本発明者らは、悪性メラノーマ細胞株ＳＫ−Ｍｅｌ（ＡＴＣＣ）を用いた。フローサイトメトリー分析は、悪性細胞自体がＲＡＮＫＬを発現したことを除外して、腫瘍発現ＲＡＮＫの刺激がオートクリン／パラクリン様式で起こらず、むしろ、血小板に依存していたことを確認した（図９Ａ）。図９Ｂにおいて示された実験では、ＳＫ−Ｍｅｌ細胞をヒト血小板でインキュベートして、前に記載されたように血液中の腫瘍細胞の血小板−コーティングを模倣した。共培養をデノスマブ（５μｇ／ｍｌ）の存在または非存在下で行って、血小板由来ＲＡＮＫＬを中和した。２４ｈ後、ＺＥＢ  ｍＲＮＡの誘発の定量的リアルタイムＰＣＲ分析は、ＭＣＦ１０Ａ細胞と同様に、血小板の存在がこのプロ転移性遺伝子の発現を誘発し、これは、デノスマブで血小板由来ＲＡＮＫＬをブロッキングすることによって大きく減少したことを実証した。類似した効果が転移形成／ＥＭＴに関わる２つのさらなる遺伝子であるＴｗｉｓｔおよびビメンチンの発現レベルの分析でも観察された。これらの分析は、図５において記載されたＭＣＦ１０Ａ細胞で得られた本発明者らの知見を確かめかつ拡張し、実際、ｐＲＡＮＫＬが、凝集物の形成時に腫瘍細胞に及ぼす血小板のプロ転移性効果を媒介し、ｐＲＡＮＫＬの中和が腫瘍細胞の転移能を限定するのに役立ち得るというさらなる証拠を提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0006766060.tif 000010
【図９】
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【配列表】
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