(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種機能ドメインと連結した触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連９（ｄＣａｓ９）タンパク質を含む、融合タンパク質であって、前記異種機能ドメインが、ＭＳ２、Ｃｓｙ４またはラムダＮタンパク質である、融合タンパク質。
【請求項２】
前記触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質が、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のものである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質が、Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｈ９８３またはＤ９８６；およびＨ８４０またはＮ８６３に変異を含む、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記変異が、
（ｉ）Ｄ１０ＡまたはＤ１０Ｎおよび
（ｉｉ）Ｈ８４０Ａ、Ｈ８４０ＮまたはＨ８４０Ｙ
である、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記異種機能ドメインが、介在リンカーを伴って前記触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質のＮ末端またはＣ末端と連結し、前記リンカーが、前記融合タンパク質の活性に干渉しない、請求項１〜４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
Ｎ末端上、Ｃ末端上および／または前記触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連９（Ｃａｓ９）タンパク質と前記異種機能ドメインとの間に核局在化配列および１つもしくは複数のエピトープタグの一方または両方をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
１つまたは複数の介在リンカーを伴って、Ｎ末端上、Ｃ末端上および／または前記触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連９（Ｃａｓ９）タンパク質と前記異種機能ドメインとの間に核局在化配列および１つもしくは複数のエピトープタグの一方または両方をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記エピトープタグが、ｃ−ｍｙｃ、６ＨｉｓまたはＦＬＡＧである、請求項６または７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、核酸。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（優先権の主張）
本願は、２０１３年３月１５日に出願された米国特許出願第６１／７９９，６４７号；２０１３年６月２１日に出願された米国特許出願第６１／８３８，１７８号；２０１３年６月２１日に出願された米国特許出願第６１／８３８，１４８号および２０１３年１２月２６日に出願された米国特許出願第６１／９２１，００７号の利益を主張するものである。上記出願の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（連邦支援による研究または開発）
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された助成番号ＤＰ１ＧＭ１０５３７８および米国国防総省の国防高等研究計画局により授与された助成番号Ｗ９１１ＮＦ−１１−２−００５６の下、政府の支援を受けてなされたものである。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、ゲノムおよびエピゲノム調節タンパク質、例えば、転写活性化因、ヒストン修飾酵素、ＤＮＡメチル化修飾因子を特定のゲノム遺伝子座にＲＮＡ誘導により標的化するための方法および構築物に関する。
【背景技術】
【０００４】
クラスター化され等間隔にスペーサーが入った短い回文型の反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）およびＣＲＩＳＰＲ関連（ｃａｓ）遺伝子はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と呼ばれ、様々な細菌および古細菌によってウイルスおよび他の外来核酸に対する防御を媒介するのに利用されている。これらの系は、低分子ＲＮＡを用いて外来核酸を配列特異的に検出し、その発現を抑制するものである。
【０００５】
これまでに３種類のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が記載されている（Ｍａｋａｒｏｖａら，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９，４６７（２０１１）；Ｍａｋａｒｏｖａら，Ｂｉｏｌ．Ｄｉｒｅｃｔ  １，７（２００６）；Ｍａｋａｒｏｖａら，Ｂｉｏｌ．Ｄｉｒｅｃｔ  ６，３８（２０１１））。最近の研究では、標的化された二本鎖ＤＮＡ切断を、そのＤＮＡ標的部位に相補的な単一「ガイドＲＮＡ」およびＣａｓ９ヌクレアーゼを用いることによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導するようＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を設計することが可能であることが示されている（Ｊｉｎｅｋら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１２；３３７：８１６−８２１）。この標的化可能なＣａｓ９ベースの系は、培養ヒト細胞（Ｍａｌｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３  Ｆｅｂ  １５；３３９（６１２１）：８２３−６；Ｃｏｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３  Ｆｅｂ  １５；３３９（６１２１）：８１９−２３）で、またゼブラフィッシュではｉｎ  ｖｉｖｏで（ＨｗａｎｇおよびＦｕら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３  Ｍａｒ；３１（３）：２２７−９）内在遺伝子内に標的化された変化を誘発するのにも有効である。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は少なくとも部分的には、変異によってヌクレアーゼ活性が不活性化されたＣａｓ９ヌクレアーゼ（「ｄＣａｓ９」としても知られる）と融合した異種機能ドメイン（例えば、転写活性化ドメイン）を含む融合タンパク質の開発に基づくものである。公開されている研究では、触媒的に活性なＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質および触媒的に不活性なＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質を特定のゲノム遺伝子座に標的化するのにガイドＲＮＡが用いられてきたが、これまで、さらなるエフェクタードメインを動員するのにこの系の使用を適用した研究はない。本研究はほかにも、標的遺伝子の発現レベルを（低下するのではなく）上昇させるＲＮＡ誘導型の過程を初めて示すものである。
【０００７】
さらに、本開示は、多重ｇＲＮＡを用いて複数のｄＣａｓ９−ＶＰ６４の単一のプロモーターへの融合をもたらすことによって、相乗的な転写活性化を生じさせることが可能であることを初めて示すものである。
【０００８】
したがって、第一の態様では、本発明は、遺伝子発現、ヒストンもしくはＤＮＡを修飾する異種機能ドメイン（ＨＦＤ）、例えば、転写活性化ドメイン、転写リプレッサー（例えば、ヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）、例えばＨＰ１αもしくはＨＰ１βなどのサイレンサーまたは転写抑制ドメイン、例えば、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）もしくはｍＳｉｎ３Ａ相互作用ドメイン（ＳＩＤ））、ＤＮＡのメチル化状態を修飾する酵素（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）もしくはＴｅｎ−Ｅｌｅｖｅｎ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ（ＴＥＴ）タンパク質、例えば、Ｔｅｔメチルシトシンジオキシゲナーゼ１としても知られるＴＥＴ１）またはヒストンサブユニットを修飾する酵素（例えば、ヒストンアセチルトランスフェラー（ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）またはヒストンデメチラーゼ）と連結した触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連９（ｄＣａｓ９）タンパク質を含む融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは転写活性化ドメイン、例えばＶＰ６４もしくはＮＦ−κＢ  ｐ６５由来の転写活性化ドメイン；ＤＮＡ脱メチル化を触媒する酵素、例えば、ＴＥＴ；またはヒストン修飾を触媒する酵素（例えば、ＬＳＤ１、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ＨＤＡＣまたはＨＡＴ）または転写サイレンシングドメイン、例えば、ヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）からのもの、例えばＨＰ１αもしくはＨＰ１βの転写サイレンシングドメイン；または生物学的テザー、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓサブタイプＹｐｅｓｔタンパク質４（Ｃｓｙ４）、ＭＳ２もしくはラムダＮタンパク質である。
【０００９】
いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質は化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来である。
【００１０】
いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質は、Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｈ９８３またはＤ９８６；およびＨ８４０またはＮ８６３、例えばＤ１０およびＨ８４０、例えば、Ｄ１０ＡまたはＤ１０ＮおよびＨ８４０ＡまたはＨ８４０ＮまたはＨ８４０Ｙに変異を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、任意で介在リンカーを伴って、触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質のＮ末端またはＣ末端と連結しており、リンカーは融合タンパク質の活性に干渉しないものである。
【００１２】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、任意選択で１つまたは複数の介在リンカーを伴って、Ｎ末端上、Ｃ末端上または触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連９（Ｃａｓ９）タンパク質と異種機能ドメインとの間に核局在化配列および１つまたは複数のエピトープタグ、例えば、ｃ−ｍｙｃ、６ＨｉｓまたはＦＬＡＧタグのうちの一方または両方を含む。
【００１３】
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載される融合タンパク質をコードする核酸ならびにこの核酸を含む発現ベクターおよびこの融合タンパク質を発現する宿主細胞を提供する。
【００１４】
ほかの態様では、本発明は、細胞内での標的遺伝子の発現を増大させる方法を提供する。この方法は、本明細書に記載されるＣａｓ９−ＨＦＤ融合タンパク質を、例えば、細胞と融合タンパク質をコードする配列を含む発現ベクターとを接触させることによって細胞内で発現させ、さらに例えば、細胞と、１つまたは複数のガイドＲＮＡをコードする核酸配列を含む１つまたは複数の発現ベクターとを接触させることによって、標的遺伝子に対して相補性を有する１つまたは複数のガイドＲＮＡを細胞内で発現させることを含む。
【００１５】
特に明記されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はいずれも、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書には本発明で使用する方法および材料が記載されるが、ほかにも、当該技術分野で公知の他の適切な方法および材料を使用することができる。材料、方法および具体例は単に例示的なものであって、限定することを意図するものではない。本明細書で言及される刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリをはじめとする参照物はいずれも、その全体が参照により組み込まれる。不一致が生じた場合、定義を含めた本明細書が優先される．
【００１６】
本発明のその他の特徴と利点は、以下の詳細な説明および図面ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００１７】
この特許または出願ファイルにはカラーで作成された図面が少なくとも１つ含まれている。特許局に請求し、必要な料金を支払うことによって、この特許または特許出願公開のカラー図面（１つまたは複数）付きの写しが得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１−１】図１Ａは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを特定のＤＮＡ配列に動員し、これにより標的化された変化を導入する単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を示す模式図である。示されるガイドＲＮＡの配列は、ＧＧＡＧＣＧＡＧＣＧＧＡＧＣＧＧＵＡＣＡＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ（配列番号９）である。
【図１−２】図１Ｂは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを特定のＤＮＡ配列に動員し、これにより標的化された変化を導入するのに用いる、より長い型のｓｇＲＮＡを示す模式図である。示されるガイドＲＮＡの配列は、ＧＧＡＧＣＧＡＧＣＧＧＡＧＣＧＧＵＡＣＡＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号１０）である。
【図１−３】図１Ｃは、タンパク質のヌクレアーゼ部分を触媒的に不活性にするＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａ変異を含み、転写活性化ドメインと融合し、ｓｇＲＮＡによって特定のＤＮＡ配列に動員されるＣａｓ９タンパク質を示す模式図である。示されるガイドＲＮＡの配列は、ＧＧＡＧＣＧＡＧＣＧＧＡＧＣＧＧＵＡＣＡＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号１０）である。  図１Ｄは、キメラｓｇＲＮＡによるｄＣａｓ９−ＶＰ６４融合タンパク質の特定のゲノム標的配列への動員を示す模式図である。
【図１−４】図１Ｅは、内在ヒトＶＥＧＦＡ遺伝子プロモーターを標的とする１６種類のｓｇＲＮＡの位置および方向を示す略図である。小さい水平方向の矢印はゲノムＤＮＡ配列に相補的なｇＲＮＡの最初の２０ｎｔを表し、５’から３’に向かって指している。灰色のバーは、ヒト２９３細胞で既に明らかにされているＤＮアーゼＩ高感受性部位（Ｌｉｕら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００１  Ａｐｒ  ６；２７６（１４）：１１３２３−３４）を示し、転写開始部位に対して相対的に数字が記載されている（直角の矢印）。
【図２−１】図２Ａは、それぞれｄＣａｓ９−ＶＰ６４とともに発現させるか（灰色のバー）、ｄＣａｓ９−ＶＰ６４無しで発現させた（黒色のバー）様々なｓｇＲＮＡによる、２９３細胞におけるＶＥＧＦＡタンパク質発現の活性化を示す棒グラフである。「方法」に記載される通りにオフターゲットｓｇＲＮＡ対照に対してＶＥＧＦＡの活性化倍数を計算した。各実験は三重反復で実施したものであり、エラーバーは平均の標準誤差を表す。アスタリスクは、対応のある片側ｔ検定による判定でオフターゲット対照よりも有意な上昇（ｐ＜０．０５）がみられた試料を示す。
【図２−２】図２Ｂは、多重ｓｇＲＮＡ発現がｄＣａｓ９−ＶＰ６４タンパク質によるＶＥＧＦＡタンパク質発現の相乗的活性化を誘導することを示す棒グラフである。示されるｓｇＲＮＡの組合せをｄＣａｓ９−ＶＰ６４と同時発現させた２９３細胞のＶＥＧＦＡタンパク質の活性化倍数が示されている。これらの実験ではいずれも、トランスフェクションに使用した個々のｓｇＲＮＡ発現プラスミドの量が同じであったことに留意されたい。図２Ａに記載される通りに活性化倍数の値を計算し、灰色のバーで示した。各組合せについて、個々のｓｇＲＮＡによって誘導された活性化倍数の平均値の合計を計算したものが黒色のバーで示されている。アスタリスクは、分散分析（ＡＮＯＶＡ）による判定で、予測合計値よりも有意に高い（ｐ＜０．０５）ことが明らかになった全組合せを示す。
【図３−１】図３Ａは、内在ヒトＮＴＦ３遺伝子プロモーターを標的とする６種類のｓｇＲＮＡの位置および方向を示す略図である。水平方向の矢印はゲノムＤＮＡ配列に相補的なｓｇＲＮＡの最初の２０ｎｔを表し、５’から３’に向かって指している。灰色の線は、ＵＣＳＣゲノムブラウザでＥＮＣＯＤＥ  ＤＮアーゼＩ高感受性トラックから特定された潜在的なオープンクロマチンの領域を示し、バーの太い部分は最初の転写されるエキソンを示す。示される番号は転写開始部位に相対的なものである（＋１、直角の矢印）。
【図３−２】図３Ｂは、２９３細胞におけるｓｇＲＮＡ誘導型ｄＣａｓ９−ＶＰ６４によるＮＴＦ３遺伝子発現の活性化を示す棒グラフである。示される量のｄＣａｓ９−ＶＰ６４発現プラスミドおよびＮＴＦ３標的化ｓｇＲＮＡ発現プラスミドを共トランスフェクトした２９３細胞について、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって検出し、ＧＡＰＤＨ対照に正規化したＮＴＦ３  ｍＲＮＡの相対発現量（デルタＣｔ×１０４）が示されている。いずれの実験も三重反復で実施したものであり、エラーバーは平均の標準誤差を表す。アスタリスクは、対応のある片側Ｔ検定による判定でオフターゲットｇＲＮＡ対照よりも有意に高い（Ｐ＜０．０５）試料を示している。
【図３−３】図３Ｃは、多重ｇＲＮＡ発現がｄＣａｓ９−ＶＰ６４タンパク質によるＮＴＦ３  ｍＲＮＡ発現の相乗的活性化を誘導することを示す棒グラフである。ｄＣａｓ９−ＶＰ６４発現プラスミドおよび示される量のＮＴＦ３標的化ｇＲＮＡ発現プラスミドの組合せを共トランスフェクトした２９３細胞について、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって検出し、ＧＡＰＤＨ対照に正規化したＮＴＦ３  ｍＲＮＡの相対発現量（デルタＣｔ×１０４）が示されている。これらの実験ではいずれも、トランスフェクションに使用した個々のｓｇＲＮＡ発現プラスミドの量が同じであったことに留意されたい。いずれの実験も三重反復で実施したものであり、エラーバーは平均の標準誤差を表す。各組合せについて、個々のｓｇＲＮＡによって誘導された活性化倍数の平均値の合計を計算したものが示されている。
【図４】ｓｇＲＮＡ発現ベクターの例示的な配列を示す図である。
【図５−１】ＣＭＶ−Ｔ７−Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ−３ＸＦＬＡＧ−ＶＰ６４発現ベクターの例示的な配列を示す図である。
【図５−２】ＣＭＶ−Ｔ７−Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ−３ＸＦＬＡＧ−ＶＰ６４発現ベクターの例示的な配列を示す図である。
【図５−３】ＣＭＶ−Ｔ７−Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ−３ＸＦＬＡＧ−ＶＰ６４発現ベクターの例示的な配列を示す図である。
【図６−１】ＣＭＶ−Ｔ７−Ｃａｓ９再コード化Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ−３ＸＦＬＡＧ−ＶＰ６４発現ベクターの例示的な配列を示す図である。
【図６−２】ＣＭＶ−Ｔ７−Ｃａｓ９再コード化Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ−３ＸＦＬＡＧ−ＶＰ６４発現ベクターの例示的な配列を示す図である。
【図６−３】ＣＭＶ−Ｔ７−Ｃａｓ９再コード化Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ−３ＸＦＬＡＧ−ＶＰ６４発現ベクターの例示的な配列を示す図である。
【図７】Ｃａｓ９−ＨＦＤ、すなわちＣａｓ９−活性化因子の例示的な配列を示す図である。任意選択の３×ＦＬＡＧ配列に下線部が施されており；核局在化シグナルＰＫＫＫＲＫＶＳ（配列番号１１）が小文字で表されており；２つのリンカーが太字で表されており；ＶＰ６４転写活性化因配列、ＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬＧＳＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬＧＳＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬＧＳＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬ（配列番号１２）が四角で囲まれている。
【図８−１】図８Ａ〜図８Ｂは、（８Ａ）ｄＣａｓ９−ＮＬＳ−３×ＦＬＡＧ−ＨＰ１αおよび（８Ｂ）ｄＣａｓ９−ＮＬＳ−３×ＦＬＡＧ−ＨＰ１βの例示的な配列を示す図である。囲み部分＝核局在化シグナル；下線部＝三重ｆｌａｇタグ；二重下線部＝ＨＰ１αヒンジおよびクロモシャドウドメイン。
【図８−２】図８Ａ〜図８Ｂは、（８Ａ）ｄＣａｓ９−ＮＬＳ−３×ＦＬＡＧ−ＨＰ１αおよび（８Ｂ）ｄＣａｓ９−ＮＬＳ−３×ＦＬＡＧ−ＨＰ１βの例示的な配列を示す図である。囲み部分＝核局在化シグナル；下線部＝三重ｆｌａｇタグ；二重下線部＝ＨＰ１αヒンジおよびクロモシャドウドメイン。
【図９】ｄＣａｓ９−ＴＥＴ１の例示的な配列を示す図である。
【図１０】様々なｄＣａｓ９−ＶＰ６４融合構築物で得られた結果を示す棒グラフである。検証した構築物のうち、最適化されたｄＣａｓ９−ＶＰ６４構造には、Ｎ末端ＮＬＳ（ＮＦＮ）およびｄＣａｓ９とＶＰ６４の間に配置された追加のＮＬＳ（Ｎ）またはＦＬＡＧタグ（ＮＦ）が含まれていた。ＲＮＡ誘導型ｄＣａｓ９−ＶＰ６４融合物が媒介する転写活性化によってヒトＨＥＫ２９３細胞におけるＶＥＧＦＡ遺伝子の発現が活性化された。ｄＣａｓ９−ＶＰ６４の変異体をコードする発現プラスミドと、ＶＥＧＦＡ開始コドン上流の領域にある部位を標的とする３種類のｇＲＮＡを発現するプラスミドとを共トランスフェクトした（この実験では、ｇＲＮＡが単一のｇＲＮＡから発現し、Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼによるプロセシングを受けた）。ＶＥＧＦＡタンパク質発現はＥＬＩＳＡによって測定したものであり、二重反復の平均が示されており、エラーバーは平均の標準誤差を表す。
【図１１】図１１Ａ〜図１１Ｂは、触媒的にＣａｓ９機能を不活性化する代替の置換変異を有するｄＣａｓ９−ＶＰ６４活性化因子の活性を示す棒グラフである。（１１Ａ）残基Ｄ１０およびＨ８４０に対する様々なＣａｓ９不活性化置換を有するｄＣａｓ９−ＶＰ６４タンパク質を発現するプラスミドをそれぞれ、単一のｇＲＮＡまたはＶＥＧＦＡ上流領域を標的とする３種類の標的の異なるｇＲＮＡ（それぞれ青色のバーと赤色のバー）とともにＨＥＫ２９３細胞に共トランスフェクトした。（１１Ｂ）上記ｄＣａｓ９−ＶＰ６４変異体を発現するプラスミドを、単一のＶＥＧＦＡ標的化ｇＲＮＡを安定に発現するＨＥＫ２９３細胞系にもトランスフェクトした。ＥＬＩＳＡによりＶＥＧＦＡタンパク質レベルを測定し、二重反復の平均および平均の標準誤差（エラーバー）を示した。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
詳細な説明
本明細書には、異種機能ドメイン（例えば、転写活性化ドメイン）の、細胞および生きた生物体の特定のゲノム位置へのＲＮＡ誘導型標的化を可能にすることを目的として、触媒的に不活性化された型のＣａｓ９タンパク質と融合したこれらの異種機能ドメインの融合タンパク質が記載される。
【００２０】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、細菌においてプラスミドおよびウイルスの侵入から保護するため防御機序として進化してきた。外来核酸に由来する短いプロトスペーサーがＣＲＩＳＰＲ遺伝子座内に組み込まれ、次いで転写され、プロセシングを受けて短いＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）になる。第二のｔｒａｃｒＲＮＡと複合体を形成したこのｃｒＲＮＡは、その侵入核酸との配列相補性を利用して、外来核酸のＣａｓ９媒介性切断とこれに続く破壊を誘導する。２０１２年、Ｄｏｕｄｎａらは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの融合物からなる単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで特定のＤＮＡ配列へのＣａｓ９ヌクレアーゼの動員を媒介し得ることを示した（図１Ｃ；Ｊｉｎｅｋら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１２）。
【００２１】
より最近では、さらに長い型のｓｇＲＮＡを用いて、ヒト細胞およびゼブラフィッシュに標的化された変化が導入されている（図１Ｂ；Ｍａｌｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１３、ＨｗａｎｇおよびＦｕら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３  Ｍａｒ；３１（３）：２２７−９）。Ｑｉらは、触媒的に不活性な変異型のＣａｓ９（ｄＣａｓ９とも呼ばれる）のｇＲＮＡ媒介性動員によって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の特定内在遺伝子およびヒト細胞のＥＧＦＰレポーター遺伝子の抑制を引き起こすことが可能であることを示した（Ｑｉら，Ｃｅｌｌ  １５２，１１７３−１１８３（２０１３））。この研究はＲＮＡ誘導型Ｃａｓ９技術を遺伝子発現の調節に適用できる可能性を示したものであるが、プログラム可能なｓｇＲＮＡまたは二重ｇＲＮＡｓ（ｄｇＲＮＡ、すなわち、カスタマイズされたｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）によって特定のゲノム部位に動員される能力を破壊せずに異種機能ドメイン（例えば、転写活性化ドメイン）とｄＣａｓ９とを融合させることが可能かどうかについては検討も実証もしていない。
【００２２】
本明細書に記載されるように、Ｃａｓ９媒介性ヌクレアーゼ活性を誘導することに加えて、ＣＲＩＳＰＲ由来ＲＮＡを用いて、Ｃａｓ９と融合した異種機能ドメイン（Ｃａｓ９−ＨＦＤ）をゲノムの特定部位に標的化することが可能である（図１Ｃ）。例えば、本明細書に記載されるように、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を用いてＣａｓ９−ＨＦＤ、例えばＣａｓ９−転写活性化因（以降、Ｃａｓ９−活性化因子と呼ぶ）を特定遺伝子のプロモーターに標的化することによって、標的遺伝子の発現を増大させることが可能である。このように、ガイドＲＮＡの配列相補性によって定められる標的特異性によってＣａｓ９−ＨＦＤをゲノム内の部位に局在させることが可能である。標的配列は、ＰＡＭ配列（ＲＮＡによって特定される配列に隣接し、Ｃａｓ９タンパク質によって特定される２〜５ヌクレオチドの配列）も含む。
【００２３】
Ｃａｓ９−ＨＦＤは、異種機能ドメイン（例えば転写活性化ドメイン、例えば、ＶＰ６４またはＮＦ−κＢ  ｐ６５の転写活性化ドメイン）と、触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質（ｄＣａｓ９）のＮ末端またはＣ末端とを融合することによって作製される。
【００２４】
Ｃａｓ９
いくつかの細菌がＣａｓ９タンパク質変異体を発現する。現在、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９が最もよく用いられているが、他のＣａｓ９タンパク質にも化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９と高レベルの配列同一性を有し、同じガイドＲＮＡを利用するものがある。それ以外のものはさらに多様であり、利用するｇＲＮＡが異なり、認識するＰＡＭ配列（ＲＮＡによって定められる配列に隣接するタンパク質によって定められる、２〜５のヌクレオチドの配列）も異なる。Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉらは多数の細菌群のＣａｓ９タンパク質を分類し（ＲＮＡ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：５，１−１２；２０１３）、その付図１および付表１に多数のＣａｓ９タンパク質を列記しており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。ほかのＣａｓ９タンパク質については、Ｅｓｖｅｌｔら，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３  Ｎｏｖ；１０（１１）：１１１６−２１およびＦｏｎｆａｒａら，“Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ  ｏｆ  Ｃａｓ９  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｃｈａｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｄｕａｌ−ＲＮＡ  ａｎｄ  Ｃａｓ９  ａｍｏｎｇ  ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ．”  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｎｏｖ  ２２．［印刷前電子出版］ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｔ１０７４に記載されている。
【００２５】
本明細書に記載の方法および組成物には様々な種のＣａｓ９分子を用いることができる。化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびサーモフィルス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＣａｓ９分子が本開示の大部分の対象となるが、ほかにも、本明細書に列記する他の種のＣａｓ９タンパク質に由来するか、これに基づくＣａｓ９分子を用いることができる。換言すれば、本記載の大部分が化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびサーモフィルス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＣａｓ９分子を用いるものであるが、他の種のＣａｓ９分子をその代わりに用いることができる。このような種としては、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉら，２０１３の付図１に基づいて作成した以下の表に記載される種が挙げられる。
【００２６】
【表１】
0006657069.tif 000002
0006657069.tif 000003
0006657069.tif 000004
0006657069.tif 000005
【００２７】
本明細書に記載される構築物および方法は上に挙げたいずれかのＣａｓ９タンパク質およびその対応するガイドＲＮＡまたはこれに相当する他のガイドＲＮＡの使用を含み得る。サーモフィルス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ−９のＣａｓ９  ＣＲＩＳＰＲ１系がヒト細胞で機能することがＣｏｎｇらに示されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，８１９（２０１３））。さらに、Ｊｉｎｅｋらは、サーモフィルス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）およびＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）のＣａｓ９オルソログ（異なるガイドＲＮＡを利用すると思われる髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）およびジェジュニ菌（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）のＣａｓ９オルソログではない）が、わずかに効率が低下するものの、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）二重ｇＲＮＡによって誘導されて標的プラスミドＤＮＡを切断し得ることをｉｎ  ｖｉｔｒｏで明らかにしている。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本発明の系は、細菌にコードされるか、哺乳動物細胞での発現にコドン最適化され、Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｈ９８３またはＤ９８６およびＨ８４０またはＮ８６３の変異、例えば、Ｄ１０Ａ／Ｄ１０ＮおよびＨ８４０Ａ／Ｈ８４０Ｎ／Ｈ８４０Ｙを含む化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質を用いてタンパク質のヌクレアーゼ部分の触媒的に不活性な状態にし；これらの位置における置換は、（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕら，Ｃｅｌｌ  １５６，９３５−９４９（２０１４）に記載されているように）アラニンであってよく、また他の残基、例えばグルタミン、アスパラギン、チロシン、セリンまたはアスパラギン酸、例えばＥ７６２Ｑ、Ｈ９８３Ｎ、Ｈ９８３Ｙ、Ｄ９８６Ｎ、Ｎ８６３Ｄ、Ｎ８６３ＳまたはＮ８６３Ｈであってよい（図１Ｃ）。本明細書に記載の方法および組成物に使用することができる触媒的に不活性な化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９は以下の通りであり、例示的なＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａの変異は太字で表され、下線が施されている。
【００２９】
【表２】
0006657069.tif 000006
0006657069.tif 000007
【００３０】
いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるＣａｓ９ヌクレアーゼは、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の配列と少なくとも約５０％同一である、すなわち、配列番号１３と少なくとも５０％同一である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は配列番号１３と約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％同一である。
【００３１】
いくつかの実施形態では、本明細書で使用される触媒的に不活性なＣａｓ９は、触媒的に不活性な化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の配列と少なくとも約５０％同一である、すなわち、配列番号１３と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％同一であり、ここでは、Ｄ１０およびＨ８４０の変異、例えばＤ１０Ａ／Ｄ１０ＮおよびＨ８４０Ａ／Ｈ８４０Ｎ／Ｈ８４０Ｙが維持される。
【００３２】
いくつかの実施形態では、配列番号１３との差はいずれも非保存領域内にあり、これはＣｈｙｌｉｎｓｋｉら，ＲＮＡ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：５，１−１２；２０１３（例えば、その付図１および付表１）；Ｅｓｖｅｌｔら，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３  Ｎｏｖ；１０（１１）：１１１６−２１およびＦｏｎｆａｒａら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２０１４）４２（４）：２５７７−２５９０．［印刷前電子出版  ２０１３  Ｎｏｖ  ２２］ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｔ１０７４に記載されている配列の配列アライメントによって確認され、ここでは、Ｄ１０およびＨ８４０の変異、例えばＤ１０Ａ／Ｄ１０ＮおよびＨ８４０Ａ／Ｈ８４０Ｎ／Ｈ８４０Ｙが維持される。
【００３３】
２つの配列のパーセント同一性を決定するには、最適比較目的で配列を整列させる（最適な整列に必要であれば第一および第二のアミノ酸または核酸配列の一方または両方にギャップを導入し、また非相同配列を無視することができる）。比較目的で整列させる参照配列の長さは少なくとも５０％である（いくつかの実施形態では、参照配列の長さの約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％または１００％）を整列させる。次いで、対応する位置のヌクレオチドまたは残基を比較する。第一の配列のある位置が、第二の配列の対応する位置と同じヌクレオチドまたは残基によって占められていれば、２つの分子はその位置において同一である。２つの配列のパーセント同一性は、２つの配列の最適な整列のために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた、２つの配列に共通する同一の位置の数の関数となる。
【００３４】
配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて実施することができる。本願の目的には、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３）のアルゴリズムを使用し、ギャップペナルティが１２、ギャップ伸長ペナルティが４、フレームシフトギャップペナルティが５のＢｌｏｓｓｕｍ６２スコア行列を用いて、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性を決定する。
【００３５】
異種機能ドメイン
転写活性化ドメインはＣａｓ９のＮ末端に融合しても、Ｃ末端に融合してもよい。さらに、本記載では転写活性化ドメインを例にあげているが、ほかにも当該技術分野で公知の他の異種機能ドメイン（例えば、転写リプレッサー（例えば、ＫＲＡＢ、ＥＲＤ、ＳＩＤなど、例えば、ｅｔｓ２リプレッサー因子（ＥＲＦ）リプレッサードメイン（ＥＲＤ）のアミノ酸４７３〜５３０、ＫＯＸ１のＫＲＡＢドメインのアミノ酸１〜９７またはＭａｄ  ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）のアミノ酸１〜３６；Ｂｅｅｒｌｉら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９５：１４６２８−１４６３３（１９９８）を参照されたい）またはヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１、ｓｗｉ６としても知られる）、例えば、ＨＰ１αもしくはＨＰ１βなどのサイレンサー；固定化ＲＮＡ結合配列、例えばＭＳ２コートタンパク質，エンドリボヌクレアーゼＣｓｙ４またはラムダＮタンパク質が結合するＲＮＡ結合配列などと融合した長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）を動員し得るタンパク質またはペプチド；ＤＮＡのメチル化状態を修飾する酵素（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）またはＴＥＴタンパク質）；あるいはヒストンサブユニットを修飾する酵素（例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（例えば、リジンまたはアルギニン残基をメチル化する）またはヒストンデメチラーゼ（例えば、リジンまたはアルギニン残基を脱メチル化する））を用いることができる。このようなドメインのいくつかの配列、例えば、ＤＮＡ中のメチル化シトシンのヒドロキシル化を触媒するドメインの配列が当該技術分野で公知である。例示的なタンパク質は、ＤＮＡ中の５−メチルシトシン（５−ｍＣ）を５−ヒドロキシメチルシトシン（５−ｈｍＣ）ｎ変換する酵素である、Ｔｅｎ−Ｅｌｅｖｅｎ−Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ（ＴＥＴ）１〜３のファミリーを含む。
【００３６】
ヒトＴＥＴ１−３の配列は当該技術分野で公知であり、これを下の表に示す。
【００３７】
【表３】
0006657069.tif 000008

【００３８】
いくつかの実施形態では、触媒ドメインの完全長配列の全部または一部、例えば、システインリッチ延長と７つの高度の保存されたエキソンによってコードされる２ＯＧＦｅＤＯドメインとを含む触媒モジュール、例えば、アミノ酸１５８０〜２０５２を含むＴｅｔ１触媒ドメイン、アミノ酸１２９０〜１９０５を含むＴｅｔ２およびアミノ酸９６６〜１６７８を含むＴｅｔ３を含み得る。例えば、３種類すべてのＴｅｔタンパク質の重要な触媒残基を示す整列に関しては、Ｉｙｅｒら，Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ．２００９  Ｊｕｎ  １；８（１１）：１６９８−７１０．Ｅｐｕｂ  ２００９  Ｊｕｎ  ２７の図１を、また完全長配列に関してはその付属資料（ｆｔｐサイトｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂ／ａｒａｖｉｎｄ／ＤＯＮＳ／ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ＿ｍａｔｅｒｉａｌ＿ＤＯＮＳ．ｈｔｍｌで入手可能）を参照されたい（例えば、ｓｅｑ  ２ｃを参照されたい）；いくつかの実施形態では、配列はＴｅｔ１のアミノ酸１４１８〜２１３６またはＴｅｔ２／３の対応する領域を含む。
【００３９】
その他の触媒モジュールは、Ｉｙｅｒら，２００９で特定されているタンパク質に由来するものであり得る。
【００４０】
いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは生物学的テザーであり、ＭＳ２コートタンパク質、エンドリボヌクレアーゼＣｓｙ４またはラムダＮタンパク質の全部または一部（例えば、これらのＤＮＡ結合ドメイン）を含む。これらのタンパク質を用いて、特異的なステムループ構造を含むＲＮＡ分子をｄＣａｓ９  ｇＲＮＡ標的化配列によって特定される場所に動員することができる。例えば、ＭＳ２コートタンパク質、エンドリボヌクレアーゼＣｓｙ４またはラムダＮと融合したｄＣａｓ９を用いて、Ｃｓｙ４結合配列、ＭＳ２結合配列またはラムダＮ結合配列と連結したＸＩＳＴまたはＨＯＴＡＩＲなどの長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）を動員することができる（例えば、Ｋｅｒｙｅｒ−Ｂｉｂｅｎｓら，Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  １００：１２５−１３８（２００８）を参照されたい）。あるいは、Ｃｓｙ４結合配列、ＭＳ２結合配列またはラムダＮタンパク質結合配列を例えば、Ｋｅｒｙｅｒ−Ｂｉｂｅｎｓら（上記）に記載されているように、別のタンパク質と連結してもよく、本明細書に記載の方法および組成物を用いて、このタンパク質をｄＣａｓ９結合部位に標的化してもよい。いくつかの実施形態では、Ｃｓｙ４は触媒的に不活性である。
【００４１】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質はｄＣａｓ９と異種機能ドメインとの間にリンカーを含む。これらの融合タンパク質（または連結構造の融合タンパク質同士）に使用し得るリンカーは、融合タンパク質の機能に干渉しない任意の配列を含み得る。好ましい実施形態では、リンカーは短く、例えば２〜２０アミノ酸であり、通常は柔軟である（すなわち、グリシン、アラニンおよびセリンなどの自由度の高いアミノ酸を含む）。いくつかの実施形態では、リンカーはＧＧＧＳ（配列番号１４）またはＧＧＧＧＳ（配列番号１５）からなる１つまたは複数の単位、例えば、２回、３回、４回またはそれ以上反復したＧＧＧＳ（配列番号１４）またはＧＧＧＧＳ（配列番号１５）の単位を含む。ほかにも、これ以外のリンカー配列を使用することができる。
【００４２】
使用方法
記載されるＣａｓ９−ＨＦＤ系は、内在遺伝子の発現の改変に有用で用途の多いツールである。これを達成するのに現在用いられている方法では、標的とする各部位について新規に設計したＤＮＡ結合タンパク質（設計された亜鉛フィンガーまたは転写活性化因子様エフェクターＤＮＡ結合ドメインなど）が必要である。これらの方法は、各標的部位と結合するよう特異的に設計された大型のタンパク質を発現させる必要があるため、それを多重化する容量に制限がある。しかし、Ｃａｓ９−ＨＦＤは、Ｃａｓ９−ＨＦＤタンパク質１つのみの発現を必要し、それは複数の短いｇＲＮＡの発現によってゲノムの複数の部位を標的とさせ得る。したがって、この系は同時に多数の遺伝子の発現を誘導する、または単一の遺伝子、プロモーターもしくはエンハンサーに複数のＣａｓ９−ＨＦＤを動員するのに容易に用いることが可能である。この能力は用途の範囲が広く、例えば、基礎的な生物学的研究では、遺伝子機能を研究し、単一経路の複数の遺伝子の発現を操作するためにこれを用いることが可能であり、また合成生物学では、これにより研究者が細胞内に複数の入力シグナルに応答する回路を作製することが可能となる。この技術は比較的容易に実施し多重化に適用することが可能であることから、用途が多岐にわたる汎用性の高い技術となる。
【００４３】
本明細書に記載される方法は、細胞と、本明細書に記載されるＣａｓ９−ＨＦＤをコードする核酸および選択された遺伝子に対する１つまたは複数のガイドＲＮＡをコードする核酸とを接触させて、遺伝子の発現を調節することを含む。
【００４４】
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
一般的に言えば、ガイドＲＮＡには２つの系、すなわち、一緒に機能してＣａｓ９による切断を誘導する別個のｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを用いる系１および２つの別個のガイドＲＮＡを単一の系に組み合わせるキメラｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドを用いる系２（単一ガイドＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと呼ばれる。このほか、Ｊｉｎｅｋら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１２；３３７：８１６−８２１を参照されたい）がある。ｔｒａｃｒＲＮＡは様々な長さに短縮することが可能であり、様々な長さのものが別個の系（系１）およびキメラｇＲＮＡ系（系２）の両方で機能することが示されている。例えば、いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、その３’末端から少なくとも１ｎｔ、２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１５ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔまたは４０ｎｔ短縮されていてよい。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、その５’末端から少なくとも１ｎｔ、２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１５ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔまたは４０ｎｔ短縮されていてよい。あるいは、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、５’末端および３’末端の両方から、例えば、５’末端で少なくとも１ｎｔ、２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１５ｎｔまたは２０ｎｔ、３’末端で少なくとも１ｎｔ、２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１５ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔまたは４０ｎｔ短縮されていてよい。例えば、Ｊｉｎｅｋら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１２；３３７：８１６−８２１；Ｍａｌｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３  Ｆｅｂ  １５；３３９（６１２１）：８２３−６；Ｃｏｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３  Ｆｅｂ  １５；３３９（６１２１）：８１９−２３；ならびにＨｗａｎｇおよびＦｕら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３  Ｍａｒ；３１（３）：２２７−９；Ｊｉｎｅｋら，Ｅｌｉｆｅ  ２，ｅ００４７１（２０１３）を参照されたい。系２では一般に、キメラｇＲＮＡの長さが長いほどオンターゲット活性が高いことがわかっているが、様々な長さのｇＲＮＡの相対的特異性は現時点では明らかにされておらず、したがって、場合によっては短いｇＲＮＡを用いる方が望ましいことがある。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、転写開始部位を含む転写開始部位の上流約１００〜８００ｂｐ以内、例えば、転写開始部位の上流約５００ｂｐ以内、または転写開始部位の下流約１００〜８００ｂｐ以内、例えば、約５００ｂｐ以内にある領域に相補的である。いくつかの実施形態では、２種類以上のｇＲＮＡをコードするベクター（例えば、プラスミド）、例えば、標的遺伝子の同じ領域の異なる部位を対象とする２種類、３種類、４種類、５種類またはそれ以上のｇＲＮＡをコードするプラスミドを用いる。
【００４５】
ガイドＲＮＡ、例えば、５’末端にゲノムＤＮＡ標的部位の相補鎖に相補的な１７〜２０ｎｔを有する単一ｇＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡを用いて、例えば配列ＮＧＧの追加のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を有する特定の１７〜２０ｎｔゲノム標的にＣａｓ９ヌクレアーゼを誘導することができる。したがって、本発明の方法は、通常通りにトランスコードされたｔｒａｃｒＲＮＡと融合したｃｒＲＮＡを含み、５’末端に標的配列、例えば、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、例えばＮＧＧ、ＮＡＧまたはＮＮＧＧの５’側に隣接する標的配列の相補鎖の２５〜１７ヌクレオチド、任意選択で２０以下のヌクレオチド（ｎｔ）、例えば、２０ｎｔ、１９ｎｔ、１８ｎｔまたは１７ｎｔ、好ましくは１７ｎｔまたは１８ｎｔに相補的な配列を有する単一ガイドＲＮＡ、例えば、Ｍａｌｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１３  Ｆｅｂ  １５；３３９（６１２１）：８２３−６に記載されている単一Ｃａｓ９ガイドＲＮＡの使用を含み得る。いくつかの実施形態では、単一Ｃａｓ９ガイドＲＮＡは、配列：
（Ｘ１７〜２０）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ（ＸＮ）（配列番号１）；
（Ｘ１７〜２０）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＡＡＡＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣ（ＸＮ）（配列番号２）；
（Ｘ１７〜２０）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧＧＡＡＡＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣ（ＸＮ）（配列番号３）；
（Ｘ１７〜２０）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（ＸＮ）（配列番号４）、
（Ｘ１７〜２０ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号５）；
（Ｘ１７〜２０）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号６）；または
（Ｘ１７〜２０）ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号７）；
からなり、
配列中、Ｘ１７〜２０は、標的配列の連続する１７〜２０ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列である。単一ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡについては既に文献（Ｊｉｎｅｋら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．３３７（６０９６）：８１６−２１（２０１２）およびＪｉｎｅｋら，Ｅｌｉｆｅ．２：ｅ００４７１（２０１３））に記載されている。
【００４６】
ガイドＲＮＡは、リボ核酸とＣａｓ９との結合に干渉しない任意の配列であり得るＸＮを含んでよく、（ＲＮＡ中の）Ｎは０〜２００、例えば、０〜１００、０〜５０または０〜２０であり得る。
【００４７】
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、３’末端に１つまたは複数のアデニン（Ａ）またはウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ  ＰｏｌＩＩＩ転写を停止させる終止シグナルとして用いられる１つまたは複数のＴが任意選択で存在するので、ＲＮＡは分子の３’末端に１つまたは複数のＵ、例えば、１〜８つまたはそれ以上のＵ（例えば、Ｕ、ＵＵ、ＵＵＵ、ＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵＵＵＵ）を含む。
【００４８】
本明細書に記載される実施例の一部では単一ｇＲＮＡを用いるが、ほかにもこの方法を二重ｇＲＮＡ（例えば、天然の系にみられるｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡ）とともに用いてもよい。この場合、単一ｔｒａｃｒＲＮＡを、本発明の系を用いて発現させる複数の異なるｃｒＲＮＡとともに使用し、例えば、以下のような：
（Ｘ１７〜２０）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号１０２）；  
（Ｘ１７〜２０）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号１０３）；または
（Ｘ１７〜２０）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号１０４）
とｔｒａｃｒＲＮＡ配列とを使用する。この場合、ｃｒＲＮＡを本明細書に記載の方法および分子のガイドＲＮＡとして使用し、ｔｒａｃｒＲＮＡを同じまたは異なるＤＮＡ分子から発現させ得る。いくつかの実施形態では、この方法は、細胞と、配列ＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号８）またはその活性部分（活性部分とは、Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９と複合体を形成する能力を保持している部分のことである）を含むか、これよりなるｔｒａｃｒＲＮＡとを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、その３’末端から少なくとも１ｎｔ、２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１５ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔまたは４０ｎｔ短縮されていてよい。別の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、その５’末端から少なくとも１ｎｔ、２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１５ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔまたは４０ｎｔ短縮されていてよい。あるいは、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、５’末端および３’末端の両方から、例えば、５’末端で少なくとも１ｎｔ、２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１５ｎｔまたは２０ｎｔ、３’末端で少なくとも１ｎｔ、２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１５ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔまたは４０ｎｔ短縮されていてよい。例示的なｔｒａｃｒＲＮＡ配列は配列番号８のほかにも、以下のものを含む：
ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号１０５）もしくはその活性部分；または
ＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号１０６）もしくはその活性部分。
【００４９】
（Ｘ１７〜２０）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号１０２）をｃｒＲＮＡとして用いるいくつかの実施形態では、以下のｔｒａｃｒＲＮＡを用いる：ＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号８）またはその活性部分。
【００５０】
（Ｘ１７〜２０）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号１０２）をｃｒＲＮＡとして用いるいくつかの実施形態では、以下のｔｒａｃｒＲＮＡを用いる：ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号１０５）またはその活性部分。
【００５１】
（Ｘ１７〜２０）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号１０４）をｃｒＲＮＡとして用いるいくつかの実施形態では、以下のｔｒａｃｒＲＮＡを用いる：ＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号１０６）またはその活性部分。
【００５２】
いくつかの実施形態では、オフターゲット効果を最小限に抑えるため、ｇＲＮＡをゲノムの残りの部分の任意の配列と異なる少なくとも３つ以上のミスマッチである部分に標的化する。
【００５３】
ロックト核酸（ＬＮＡ）などの修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、修飾オリゴヌクレオチドをより好ましい（安定な）コンホメーションにロックすることによってＲＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションの特異性を増大させることが示されている。例えば、２’−Ｏ−メチルＲＮＡは２’酸素と４’炭素の間に追加の共有結合が存在する修飾塩基であり、これをオリゴヌクレオチド内に組み込むことによって全体の熱安定性および選択性を改善することができる（式Ｉ）。
【化１】
0006657069.tif 000009
【００５４】
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｔｒｕ−ｇＲＮＡは、１つまたは複数の修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含み得る。例えば、本明細書に記載の短縮ガイドＲＮＡ分子は、標的配列に相補的なガイドＲＮＡの１７〜１８ｎｔまたは１７〜１９ｎ５’領域の１つ、一部または全部が修飾されていてよく、例えば、ロックされていてよく（２’−Ｏ−４’−Ｃメチレン架橋）、５’−メチルシチジンであってよく、２’−Ｏ−メチル−プソイドウリジンであってよく、あるいはリボースリン酸骨格がポリアミド鎖に置き換わっていてよく（ペプチド核酸）、例えば、合成リボ核酸であってよい。
【００５５】
他の実施形態では、ｔｒｕ−ｇＲＮＡ配列の１つ、一部または全部のヌクレオチドが修飾されていてよく、例えば、ロックされていてよく（２’−Ｏ−４’−Ｃメチレン架橋）、５’−メチルシチジンであってよく、２’−Ｏ−メチル−プソイドウリジンであってよく、あるいはリボースリン酸骨格がポリアミド鎖に置き換わっていてよく（ペプチド核酸）、例えば、合成リボ核酸であってよい。
【００５６】
いくつかの実施形態では、単一ガイドＲＮＡおよび／またはｃｒＲＮＡおよび／またはｔｒａｃｒＲＮＡは、３’末端に１つまたは複数のアデニン（Ａ）またはウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを含み得る。
【００５７】
既存のＣａｓ９ベースのＲＧＮは、目的とするゲノム部位への標的化を誘導するのにｇＲＮＡ−ＤＮＡヘテロ二本鎖の形成を利用するものである。しかし、ＲＮＡ−ＤＮＡヘテロ二本鎖ではそのＤＮＡ−ＤＮＡ対応物よりも無差別な範囲の構造が形成され得る。実際、ＤＮＡ−ＤＮＡ二本鎖の方がミスマッチに対する感度が高く、このことは、ＤＮＡ誘導型ヌクレアーゼがオフターゲット配列と容易には結合せず、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼに比して特異性が高いことを示唆している。したがって、本明細書に記載の方法に使用可能なガイドＲＮＡはハイブリッド、すなわち、１つまたは複数のデオキシリボヌクレオチド、例えば短いＤＮＡオリゴヌクレオチドが、ｇＲＮＡの全部または一部、例えばｇＲＮＡの相補性領域の全部または一部と置き換わったハイブリッドであり得る。このＤＮＡベースの分子は、単一ｇＲＮＡ系の全部または一部と置き換わってもよく、あるいは二重ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ系のｃｒＲＮＡおよび／またはｔｒａｃｒＲＮＡの全部または一部と置き換わってもよい。一般にＤＮＡ−ＤＮＡ二本鎖の方がＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖よりもミスマッチに対する許容性が低いことから、相補性領域内にＤＮＡを組み込むこのような系の方がより高い信頼性で目的とするゲノムＤＮＡ配列を標的とするはずである。このような二本鎖を作製する方法は当該技術分野で公知であり、例えば、Ｂａｒｋｅｒら，ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００５  Ａｐｒ  ２２；６：５７；およびＳｕｇｉｍｏｔｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０００  Ｓｅｐ  １９；３９（３７）：１１２７０−８１を参照されたい。
【００５８】
さらに、別個のｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを用いる系では、その一方または両方が合成であり、１つまたは複数の修飾（例えば、ロックト）ヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含むものであり得る。
【００５９】
細胞との関連において、Ｃａｓ９と上に挙げた合成ｇＲＮＡとの複合体を用いて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ系のゲノム全域にわたる特異性を改善することが可能である。
【００６０】
記載される方法は、本明細書に記載のＣａｓ９  ｇＲＮＡと融合タンパク質を細胞内で発現させるか、細胞と接触させることを含み得る。
【００６１】
発現系
本明細書に記載される融合タンパク質およびガイドＲＮＡを使用するためには、それをコードする核酸から発現させるのが望ましいであろう。これは様々な方法で実施することができる。例えば、ガイドＲＮＡまたは融合タンパク質をコードする核酸を中間ベクターにクローン化して原核細胞または真核細胞を形質転換し、複製および／または発現させる。中間ベクターは通常、融合タンパク質をコードする核酸を保管または操作するか、融合タンパク質を産生するための原核生物ベクター、例えばプラスミドもしくはシャトルベクターまたは昆虫ベクターである。このほか、ガイドＲＮＡまたは融合タンパク質をコードする核酸を発現ベクターにクローン化して植物細胞、動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞もしくはヒト細胞、真菌細胞、細菌細胞または原生動物細胞に投与してもよい。
【００６２】
ガイドＲＮＡまたは融合タンパク質をコードする配列を発現させるためには通常、転写を指令するプロモーターを含む発現ベクターにサブクローン化する。適切な細菌プロモーターおよび真核プロモーターは当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版，２００１）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編，２０１０）に記載されている。設計したタンパク質を発現させるための細菌発現系を例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌種およびサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）で入手することができる（Ｐａｌｖａら，１９８３，Ｇｅｎｅ  ２２：２２９−２３５）。そのような発現系のキットが市販されている。哺乳動物細胞、酵母および昆虫細胞用の真核発現系は当該技術分野で周知であり、同じく市販されている。
【００６３】
核酸の発現を指令するために使用するプロモーターは、具体的な用途によって決まる。例えば、融合タンパク質の発現および精製には通常、強力な構成的プロモーターを使用する。これに対して、遺伝子調節のために融合タンパク質をｉｎ  ｖｉｖｏで投与する場合、融合タンパク質の具体的な用途に応じて構成的プロモーターまたは誘導プロモーターのいずれかを使用することができる。さらに、融合タンパク質の投与に好ましいプロモーターは、ＨＳＶ  ＴＫなどの弱いプロモーターまたはこれと類似する活性を有するプロモーターであり得る。プロモーターはほかにも、トランス活性化に応答性の要素、例えば、低酸素応答要素、Ｇａｌ４応答要素、ｌａｃリプレッサー応答要素ならびにテトラサイクリン調節系およびＲＵ−４８６系などの小分子制御系を含み得る（例えば、ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７；Ｏｌｉｇｉｎｏら，１９９８，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，５：４９１−４９６；Ｗａｎｇら，１９９７，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，４：４３２−４４１；Ｎｅｅｒｉｎｇら，１９９６，Ｂｌｏｏｄ，８８：１１４７−５５；ならびにＲｅｎｄａｈｌら，１９９８，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：７５７−７６１を参照されたい）。
【００６４】
発現ベクターは通常、プロモーターに加えて、原核または真核宿主細胞で核酸を発現するのに必要なほかのあらゆる要素を含む転写単位または発現カセットを含む。したがって、典型的な発現カセットは、例えば融合タンパク質をコードする核酸配列と作動可能に連結されたプロモーターと、例えば効率的な転写産物のポリアデニル化、転写停止、リボソーム結合部位または翻訳停止に必要な任意のシグナルとを含む。カセットのほかの要素としては、例えば、エンハンサーおよび異種スプライスイントロンシグナルを挙げ得る。
【００６５】
細胞内に遺伝情報を輸送するのに使用する具体的な発現ベクターは、意図する融合タンパク質の用途、例えば、植物、動物、細菌、真菌、原生動物などでの発現を考慮して選択する。標準的な細菌発現ベクターとしては、ｐＢＲ３２２ベースのプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３ＤなどのプラスミドならびにＧＳＴおよびＬａｃＺなどの市販のタグ融合発現系が挙げられる。好ましいタグ融合タンパク質はマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）である。操作したＴＡＬＥ反復タンパク質の精製にこのようなタグ融合タンパク質を用いることができる。このほか組換えタンパク質にエピトープタグ、例えばｃ−ｍｙｃまたはＦＬＡＧを付加して、単離、発現のモニタリングならびに細胞局在および細胞内局在のモニタリングに便利な方法を得ることができる。
【００６６】
真核発現ベクターには真核ウイルスの調節要素を含む発現ベクター、例えば、ＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクターおよびエプスタイン・バーウイルス由来のベクターを用いることが多い。その他の例示的な真核ベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥおよびＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーターをはじめとする真核細胞での発現に効果を示すプロモーターの指令を受けてタンパク質を発現させる他の任意のベクターが挙げられる。
【００６７】
ガイドＲＮＡを発現させるためのベクターは、ガイドＲＮＡの発現を駆動するＲＮＡ  ＰｏｌＩＩＩプロモーター、例えば、Ｈ１、Ｕ６または７ＳＫプロモーターを含み得る。これらのヒトプロモーターは、プラスミドトランスフェクション後に哺乳動物細胞にｇＲＮＡを発現させる。あるいは、例えばｖｉｔｒｏ転写にＴ７プロモーターを使用してもよく、ＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写させてから精製することができる。短いＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡをはじめとする低分子ＲＮＡの発現に適したベクターを使用することができる。
【００６８】
一部の発現系は、安定にトランスフェクトされた細胞系を選択するためのマーカー、例えばチミジンキナーゼ、ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼおよびジヒドロ葉酸レダクターゼなどを有する。このほか、昆虫細胞にバキュロウイルスベクターを用いてポリヘドリンプロモーターをはじめとする強力なバキュロウイルスプロモーターの指令の下に融合タンパク質をコードする配列を置くものなど、高収率の発現系が適している。
【００６９】
発現ベクターに通常含まれる要素としてはほかにも、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で機能するレプリコン、組換えプラスミドを保有する細菌の選択を可能にする抗生物質耐性をコードする遺伝子およびプラスミドの非必須領域にあり組換え配列の挿入を可能にする固有の制限部位が挙げられる。
【００７０】
標準的なトランスフェクション法を用いて、大量のタンパク質を発現する細菌、哺乳動物、酵母または昆虫の細胞系を作製し、次いで標準的な技術を用いてこのタンパク質を精製する（例えば、Ｃｏｌｌｅｙら，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１７６１９−２２；Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８２（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒら編，１９９０）を参照されたい）。真核および原核細胞の形質転換を標準的な技術により実施する（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９７７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３２：３４９−３５１；Ｃｌａｒｋ−ＣｕｒｔｉｓｓおよびＣｕｒｔｉｓｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １０１：３４７−３６２（Ｗｕら編，１９８３）を参照されたい）。
【００７１】
宿主細胞内に外来ヌクレオチド配列を導入するあらゆる既知の方法を用い得る。このような方法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リポソーム、マイクロインジェクション、裸のＤＮＡ、プラスミドベクター、ウイルスベクター（エピソーム型および組込み型の両方）およびクローン化したゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡをはじめとする外来遺伝物質を宿主細胞内に導入する他のあらゆる周知の方法の使用が挙げられる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，上記を参照されたい）。唯一必要なのは、用いる具体的な遺伝子工学的方法で、選択したタンパク質の発現が可能な宿主細胞内に遺伝子を少なくとも１つ良好に導入することができることである。
【００７２】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、タンパク質が核に移行するための核局在化ドメインを含む。核局在化配列（ＮＬＳ）がいくつか知られており、任意の適切なＮＬＳを使用し得る。例えば、多くのＮＬＳが二連塩基反復（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ  ｂａｓｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ）と呼ばれる複数の塩基性アミノ酸を有する（Ｇａｒｃｉａ−Ｂｕｓｔｏｓら，１９９１，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１０７１：８３−１０１に概説されている）。二連塩基反復（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ  ｂａｓｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ）を含むＮＬＳをキメラタンパク質の任意に部分に配置し、核内に局在化するキメラタンパク質を生じさせることができる。好ましい実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質の最終的な機能には通常、タンパク質が核内に局在する必要があるため、最終的な融合タンパク質に核局在化ドメインを組み込む。しかし、最終的なキメラタンパク質内にあるＤＢＤドメイン自体または別の機能ドメインに内因性の核移行機能がある場合、別個に核局在化ドメインを付加する必要がないこともある。
【００７３】
本発明は、ベクターおよびベクターを含む細胞を含む。
【実施例】
【００７４】
本発明は以下の実施例でさらに説明されるが、これらの実施例は特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【００７５】
実施例１．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性化因子系の設計：
強力な合成ＶＰ６４活性化ドメイン（Ｂｅｅｒｌｉら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５，１４６２８−１４６３３（１９９８））と、触媒的に不活性化されたｄＣａｓ９タンパク質のカルボキシ末端とを融合することによって、ＲＮＡ誘導型転写活性化因子を作製することが可能であるとする仮説を立てた（図１Ｄ）。
【００７６】
ヒト細胞内でガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を発現させるため、Ｕ６プロモーターによって駆動される完全長キメラｇＲＮＡ（最初にＪｉｎｅｋら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１２）に記載されたｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの融合物）を発現するベクターを設計した。ｇＲＮＡ発現プラスミドの構築を以下の通りに実施した。可変２０ｎｔ  ｇＲＮＡ標的化配列をコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドのペアをアニールさせて、４ｂｐのオーバーハングを有する短い二本鎖ＤＮＡフラグメントを作製した（表１）。
【００７７】
【表４】
0006657069.tif 000010
0006657069.tif 000011
【００７８】
上記フラグメントをＢｓｍＢＩ消化プラスミドｐＭＬＭ３６３６に連結して、キメラの約１０２ｎｔ一本鎖ガイドＲＮＡ（Ｍａｌｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３  Ｆｅｂ  １５；３３９（６１２１）：８２３−６；Ｈｗａｎｇら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３  Ｍａｒ；３１（３）：２２７−９）をコードしヒトＵ６プロモーターによって発現されるＤＮＡを得た。ｐＭＬＭ３６３６プラスミドおよびその完全ＤＮＡ配列はＡｄｄｇｅｎｅから入手可能である。図４を参照されたい。
【００７９】
Ｃａｓ９活性化因子を設計するため、Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ触媒変異（既にＪｉｎｅｋら，２０１２；およびＱｉら，２０１３に記載されている）を野生型またはコドン最適化Ｃａｓ９配列に導入した（図５）。上記変異は、Ｃａｓ９が二本鎖切断を誘導しないよう触媒的に不活性な状態にするものである。１つの構築物では、不活性化Ｃａｓ９のＣ末端に三重ｆｌａｇタグ、核局在化シグナルおよびＶＰ６４活性化ドメインを融合した（図６）。ＣＭＶプロモーターによってこの融合タンパク質の発現を駆動した。
【００８０】
ｄＣａｓ−ＶＰ６４発現プラスミドの構築を以下の通りに実施した。既に記載されている通りに、開始コドンの５’側にＴ７プロモーター部位、Ｃａｓ９コード配列のカルボキシ末端に核局在化シグナルを付加するプライマーを用いて、不活性化Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ変異を保有するＣａｓ９ヌクレアーゼ（ｄＣａｓ９）をコードするＤＮＡをプラスミドｐＭＪ８４１（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号３９３１８）からＰＣＲにより増幅し、ＣＭＶプロモーターを含むプラスミドにクローン化して（Ｈｗａｎｇら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，２２７−２２９（２０１３））、プラスミドｐＭＬＭ３６２９を得た。三重ＦＬＡＧエピトープをコードするオリゴヌクレオチドをアニールさせ、プラスミドｐＭＬＭ３６２９のＸｈｏＩ部位およびＰｓｔＩ部位にクローン化して、Ｃ末端ｆｌａｇＦＬＡＧタグを有するｄＣａｓ９を発現するプラスミドｐＭＬＭ３６４７を作製した。プラスミドｐＭＬＭ３６４７のＦＬＡＧタグ化ｄＣａｓ９の下流にＧｌｙ４ＳｅｒリンカーをコードするＤＮＡ配列とこれに続く合成ＶＰ６４活性化ドメインを導入して、プラスミドｐＳＬ６９０を得た。このほか、ヒト細胞での発現にコドン最適化されたＦＬＡＧタグ化Ｃａｓ９配列をコードするプラスミドｐＪＤＳ２４７にＤ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ変異をＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発（Ａｇｉｌｅｎｔ）により導入して、プラスミドｐＭＬＭ３６６８を得た。次いで、Ｇｌｙ４ＳｅｒリンカーをコードするＤＮＡ配列およびＶＰ６４活性化ドメインをｐＭＬＭ３６６８に導入して、ｐＭＬＭ３７０５という名称のコドン最適化ｄＣａｓ９−ＶＰ６４発現ベクターを得た。
【００８１】
細胞培養、トランスフェクションおよびＥＬＩＳＡアッセイを以下の通りに実施した。Ｆｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−Ｒｅｘ２９３細胞を１０％ＦＢＳ、１％ｐｅｎｓｔｒｅｐおよび１％Ｇｌｕｔａｍａｘを添加したＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で維持した。製造業者の説明書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により細胞をトランスフェクトした。簡潔に述べると、１６０，０００個の２９３細胞を２４ウェルプレートに播種し、翌日、ｇＲＮＡプラスミド２５０ｎｇ、Ｃａｓ９−ＶＰ６４プラスミド２５０ｎｇ、ｐｍａｘＧＦＰプラスミド３０ｎｇ（Ｌｏｎｚａ）、Ｐｌｕｓ試薬０．５μｌおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ  １．６５μｌでトランスフェクトした。トランスフェクションの４０時間後、トランスフェクトした２９３細胞から組織培地を回収し、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ社のＨｕｍａｎ  ＶＥＧＦ−Ａ  ＥＬＩＳＡキット「Ｈｕｍａｎ  ＶＥＧＦ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」を用いて、分泌されたＶＥＧＦ−Ａタンパク質をアッセイした。
【００８２】
２９３細胞のヒトＶＥＧＦＡ遺伝子の上流、下流または転写開始部位に位置する３つのＤＮアーゼＩ高感受性部位（ＨＳＳ）内にある標的配列に対して１６種類のｓｇＲＮＡを構築した（図１Ｅ）。
【００８３】
１６種類のＶＥＧＦＡを標的とするｇＲＮＡが新規なｄＣａｓ９−ＶＰ６４融合タンパク質を動員する能力を検証する前に、最初に上記ｇＲＮＡがそれぞれヒト２９３細胞内の目的とする標的部位にＣａｓ９ヌクレアーゼを誘導する能力を評価した。この目的のために、ｇＲＮＡ発現ベクターおよびＣａｓ９発現ベクターを１：３の比でトランスフェクトしたが、それは、これまでの最適化実験で、Ｕ２ＯＳ細胞にプラスミドを１：３の比で用いて高レベルのＣａｓ９誘導ＤＮＡ切断が得られることが示されたからである。
【００８４】
ＶＥＧＦＡ標的化ｇＲＮＡをコードするプラスミド１２５ｎｇおよび活性なＣａｓ９ヌクレアーゼ（ｐＭＬＭ３６３９）をコードするプラスミド３７５ｎｇを細胞にトランスフェクトしたことを除いて、ｄＣａｓ９−ＶＰ１６  ＶＥＧＦＡ実験について上に記載した通りに２９３細胞のトランスフェクションを実施した。トランスフェクションの４０時間後、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の説明書に従って用い、ゲノムＤＮＡを単離した。Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＩＩ高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）および３％ＤＭＳＯならびに以下のタッチダウンＰＣＲサイクル：９８℃、１０秒；７２〜６２℃、−１℃／サイクル、１５秒；７２℃、３０秒を１０サイクル、次いで９８℃、１０秒；６２℃、１５秒；７２℃、３０秒を２５サイクル用いて、ＶＥＧＦＡプロモーター内の３つの異なる標的化領域のＰＣＲ増幅を実施した。プライマーｏＦＹＦ４３４（５’−ＴＣＣＡＧＡＴＧＧＣＡＣＡＴＴＧＴＣＡＧ−３’（配列番号８２））およびｏＦＹＦ４３５（５’−ＡＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＡＡＧＴＧＡＧＧＴ−３’（配列番号８３））を用いて−５００領域を増幅した。プライマーｏＦＹＦ４３８（５’−ＧＣＡＣＧＴＡＡＣＣＴＣＡＣＴＴＴＣＣＴ−３’（配列番号８４））およびｏＦＹＦ４３９（５’−ＣＴＴＧＣＴＡＣＣＴＣＴＴＴＣＣＴＣＴＴＴＣＴ−３’（配列番号８５））を用いて転写開始部位付近の領域を増幅した。プライマーｏＦＹＦ４４４（５’−ＡＧＡＧＡＡＧＴＣＧＡＧＧＡＡＧＡＧＡＧＡＧ−３’（配列番号８６））およびｏＦＹＦ４４５（５’−ＣＡＧＣＡＧＡＡＡＧＴＴＣＡＴＧＧＴＴＴＣＧ−３’（配列番号８７））を用いて＋５００領域を増幅した。既に記載されている通りにＡｍｐｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）を用いてＰＣＲ産物を精製し、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩアッセイを実施し、ＱＩＡＸＣＥＬキャピラリー電気泳動系で分析した（Ｒｅｙｏｎら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ３０，４６０−４６５（２０１２））。
【００８５】
１６種類のｇＲＮＡはいずれも、既に記載されているＴ７Ｅ１遺伝子型同定アッセイを用いた評価でそれぞれの標的部位へのＣａｓ９ヌクレアーゼ誘導挿入欠失変異の効率的な導入を媒介することができた（表２）。したがって、１６種類のｇＲＮＡはいずれも、ヒト細胞内でＣａｓ９ヌクレアーゼと複合体を形成し、特定の標的ゲノム部位にその活性を誘導することができる。
【００８６】
【表５】
0006657069.tif 000012
【００８７】
これらの同じｇＲＮＡによってｄＣａｓ９−ＶＰ６４タンパク質を、ヒト細胞内の特定のゲノム部位に標的化することが可能であるかどうかを検証するため、ＶＥＧＦＡタンパク質の酵素結合免疫測定を以下の通りに実施した。ＶＥＧＦを標的とするｓｇＲＮＡおよびｄＣａｓ９−ＶＰ６４をコードするプラスミドをトランスフェクトしたＦｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−Ｒｅｘ  ＨＥＫ２９３細胞の培地をトランスフェクションの４０時間後に回収し、ＶＥＧＦＡタンパク質の発現を既に記載されている通りにＥＬＩＳＡにより測定した（Ｍａｅｄｅｒら，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０，２４３−２４５（２０１３））。ｓｇＲＮＡとｄＣａｓ９−ＶＰ６４の両方を発現する細胞に由来する培地中のＶＥＧＦＡタンパク質の濃度を、オフターゲットｓｇＲＮＡ（ＥＧＦＰレポーター遺伝子内に配列を標的とする）およびｄＣａｓ９−ＶＰ６４を発現する細胞に由来する培地中のＶＥＧＦＡタンパク質の濃度で除することにより、ＶＥＧＦＡ発現の活性化倍数を計算した。
【００８８】
検証した１６種類のｇＲＮＡのうち１５種類が、ヒト２９３細胞内でｄＣａｓ９−ＶＰ６４と共発現した場合にＶＥＧＦＡタンパク質発現の有意な増加を誘導した（図２Ａ）。観察されたＶＥＧＦＡ誘導の程度は２〜１８．７倍の範囲の活性化であり、平均は５倍の活性化であった。対照実験では、１６種類のｇＲＮＡ単独の発現、ｄＣａｓ９−ＶＰ６４単独の発現およびｄＣａｓ９−ＶＰ６４と、ＥＧＦＰレポーター遺伝子配列と結合するよう設計した「オフターゲット」ｇＲＮＡとの共発現ではいずれも、ＶＥＧＦＡ発現の増大を誘導することはできなかったことが明らかになり（図２Ａ）、プロモーター活性化には特異的ｇＲＮＡとｄＣａｓ９−ＶＰ６４タンパク質の両方が同時発現する必要があることが示された。したがって、ｄＣａｓ９−ＶＰ６４をヒト細胞内で安定に発現させ、ｇＲＮＡによって特定のゲノム遺伝子座の転写を活性化するよう誘導することが可能である。ｇＲＮＡ３でトランスフェクトした細胞において最大のＶＥＧＦＡ増加が観察され、この細胞ではタンパク質発現が１８．７倍誘導された。興味深いことに、最も成績の良かった３種類のｇＲＮＡおよび発現を３倍以上誘導することができる９種類のｇＲＮＡのうち６種類が、−５００領域（転写開始部位の約５００ｂｐ上流）を標的とする。
【００８９】
一態様では本明細書に記載される系が可変ｇＲＮＡを用いて共通のｄＣａｓ９−ＶＰ６４活性化因子融合物を動員するものであるため、単一細胞内で複数のガイドＲＮＡを発現させることによって、内在遺伝子標的を多重に、または組み合わせて活性化することが可能であると考えることができる。この可能性を検証するため、ｄＣａｓ９−ＶＰ６４発現プラスミドを、それぞれがＶＥＧＦＡプロモーターから発現を誘導する４種類のｇＲＮＡ（Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３およびＶ４）の発現プラスミドとともに２９３細胞にトランスフェクトした。全４種類のｇＲＮＡとｄＣａｓ９−ＶＰ６４の同時発現によりＶＥＧＦＡタンパク質発現の相乗的活性化（すなわち、予想される個々の活性化因子の相加効果を上回る活性化倍数）が誘導された（図２Ｂ）。さらに、この４種類の活性化因子のうち３種類を様々に組み合わせた場合にも、ＶＥＧＦＡプロモーターが相乗的に活性化された（図２Ｂ）。転写の相乗的活性化は複数の活性化因子ドメインが単一のプロモーターに動員されることに起因すると考えられるため、以上の実験では複数のｇＲＮＡ／ｄＣａｓ９−ＶＰ６４複合体が同時にＶＥＧＦＡプロモーターと結合していると可能性が高い。
【００９０】
以上の実験は、ヒトＨＥＫ２９３細胞内でＣａｓ９−ＨＦＤ、例えばＣａｓ９−アクチベータータンパク質（ＶＰ６４転写活性化ドメインを保有する）と、ヒトＶＥＧＦ−Ａプロモーターの部位に対して２０ｎｔの配列相補性を有するｓｇＲＮＡとを同時発現させることによって、ＶＥＧＦ−Ａ発現の上方制御を生じさせることが可能であることを示している。ＥＬＩＳＡアッセイによりＶＥＧＦ−Ａタンパク質の増加を測定し、個々のｇＲＮＡがＣａｓ９活性化因子融合タンパク質とともに機能して、ＶＥＧＦ−Ａタンパク質レベルを最大で約１８倍増大させ得ることがわかった（図２Ａ）。さらに、同じプロモーターの様々な部位を標的とする複数のｇＲＮＡをＣａｓ９活性化因子融合タンパク質とともに導入することによって、転写相乗作用を介して活性化増大をさらに大きくすることができた（図２Ｂ）。
【００９１】
実施例２．内在ヒトＮＴＦ３遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性化因子系の設計
今回の観察結果の一般性を拡大するため、本発明者らは、ＲＮＡ誘導型活性化因子プラットフォームを用いてヒトＮＴＦ３遺伝子の発現を誘導することが可能であるかどうかを検証した。この検証を実施するため、ヒトＮＴＦ３プロモーターの予測ＤＮアーゼＩ高感受性部位（ＨＳＳ）に対して６種類のｓｇＲＮＡを設計し、これらのｇＲＮＡをそれぞれ発現するプラスミドと、ｄＣａｓ９−ＶＰ６４タンパク質をコードし、ヒト細胞での発現にコドン最適化されたプラスミドとを共トランスフェクトした（図３Ａ）。
【００９２】
検証した６種類のｇＲＮＡはいずれも、定量的ＲＴ−ＰＣＲによる検出でＮＴＦ３転写レベルの有意な増大を誘導した（図３Ｂ）。この６種類のＲＮＡ誘導型活性化因子の活性化倍数の数値を正確に計算することはできなかったが（転写の基底レベルが実質的に検出不可能であったため）、活性化されたＮＴＦ３  ｍＲＮＡ発現の平均レベルは４倍の範囲で変化した。トランスフェクトするｇＲＮＡ発現プラスミドおよびｄＣａｓ９−ＶＰ６４発現プラスミドの量を減らすとＮＴＦ３遺伝子の活性化が低くなり（図３Ｂ）、これは明確な用量依存性の効果を示している。
【００９３】
さらに、２９３細胞にｄＣａｓ９−ＶＰ６４発現プラスミドとＮＴＦ３標的化ｇＲＮＡ発現プラスミドを単独で、ならびに単一および二重の組合せで共トランスフェクトした。ＮＴＦ３  ｍＲＮＡの相対発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより検出し、ＧＡＰＤＨ対照に正規化した（デルタＣｔ×１０４）。上記実験ではいずれも、トランスフェクションに使用した個々のｇＲＮＡ発現プラスミドの量を同じにした。図３Ｂは、この多重ｇＲＮＡ発現がｄＣａｓ９−ＶＰ６４タンパク質によるＮＴＦ３  ｍＲＮＡ発現の相乗的活性化を誘導したことを示している。
【００９４】
実施例３．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−ＭＳ２、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−Ｃｓｙ４およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−ラムダＮ融合物系の設計―生物学的テザーの作製
不活性化されたｄＣａｓ９のＮ末端またはＣ末端にＭＳ２コートタンパク質、Ｃｓｙ４ヌクレアーゼ（好ましくは触媒的に不活性なＣｓｙ４、例えば、Ｈａｕｒｗｉｔｚら，３２９（５９９７）：１３５５−８（２０１０）に記載されているＨ２９Ａ変異体）またはラムダＮが融合した融合タンパク質を作製する。ＭＳ２およびラムダＮは特定のＲＮＡ配列と結合するバクテリオファージタンパク質であり、したがって、その特定のＭＳ２またはラムダＮ  ＲＮＡ結合配列でタグ化した異種ＲＮＡ配列をｄＣａｓ９タンパク質に係留するアダプターとして用いることができる。ｄＣａｓ９−ＭＳ２融合物またはｄＣａｓ９−ラムダＮ融合物と、ＭＳ２またはラムダＮステムループ認識配列と５’末端または３’末端で融合した長いキメラ非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）とを同時発現させる。キメラＸｉｓｔまたはキメラＲｅｐＡ  ｌｎｃＲＮＡはがｄＣａｓ９融合物によって特異的に動員され、標的遺伝子発現を測定することによって、この戦略が標的化サイレンシングを誘導する能力を評価する。コートタンパク質およびキメラＲＮＡに対する様々な変化を試験することによってこの系を最適化する。ＭＳ２コートタンパク質に対するＮ５５ＫおよびデルタＦＧ変異がタンパク質凝集を防ぎ、ステムループＲＮＡに対する親和性を増大させることが以前に示されている。さらに、本発明者らは、ＭＳ２コートタンパク質に対する親和性を増大させることが報告されている高親和性ＣループＲＮＡ変異体を検証する。ＭＳ２およびラムダＮタンパク質の例示的な配列を以下に記載するが、ＭＳ２は二量体として機能するため、ＭＳ２タンパク質は融合した一本鎖二量体配列を含み得る。
【００９５】
１．単一ＭＳ２コートタンパク質（ｗｔ、Ｎ５５ＫまたはデルタＦＧ）をｄＣａｓ９のＮ末端またはＣ末端に融合した融合物の例示的な配列。
ＭＳ２コートタンパク質のアミノ酸配列：
ＭＡＳＮＦＴＱＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶＴＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＱＮＲＫＹＴＩＫＶＥＶＰＫＶＡＴＱＴＶＧＧＶＥＬＰＶＡＡＷＲＳＹＬＮＭＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＳＤＣＥＬＩＶＫＡＭＱＧＬＬＫＤＧＮＰＩＰＳＡＩＡＡＮＳＧＩＹ（配列番号８８）
ＭＳ２  Ｎ５５Ｋ：
ＭＡＳＮＦＴＱＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶＴＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＱＫＲＫＹＴＩＫＶＥＶＰＫＶＡＴＱＴＶＧＧＶＥＬＰＶＡＡＷＲＳＹＬＮＭＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＳＤＣＥＬＩＶＫＡＭＱＧＬＬＫＤＧＮＰＩＰＳＡＩＡＡＮＳＧＩＹ（配列番号８９）
ＭＳ２デルタＦＧ：
ＭＡＳＮＦＴＱＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶＴＶＡＰＳＮＦＡＮＧＩＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＱＮＲＫＹＴＩＫＶＥＶＰＫＧＡＷＲＳＹＬＮＭＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＳＤＣＥＬＩＶＫＡＭＱＧＬＬＫＤＧＮＰＩＰＳＡＩＡＡＮＳＧＩＹ（配列番号９０）
【００９６】
２．二量体ＭＳ２コートタンパク質（ｗｔ、Ｎ５５ＫまたはデルタＦＧ）をｄＣａｓ９のＮ末端またはＣ末端に融合した融合物の例示的な配列。
二量体ＭＳ２コートタンパク質：
ＭＡＳＮＦＴＱＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶＴＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＱＮＲＫＹＴＩＫＶＥＶＰＫＶＡＴＱＴＶＧＧＶＥＬＰＶＡＡＷＲＳＹＬＮＭＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＳＤＣＥＬＩＶＫＡＭＱＧＬＬＫＤＧＮＰＩＰＳＡＩＡＡＮＳＧＬＹＧＡＭＡＳＮＦＴＱＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶＴＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＱＮＲＫＹＴＩＫＶＥＶＰＫＶＡＴＱＴＶＧＧＶＥＬＰＶＡＡＷＲＳＹＬＮＭＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＳＤＣＥＬＩＶＫＡＭＱＧＬＬＫＤＧＮＰＩＰＳＡＩＡＡＮＳＬＩＮ（配列番号９１）
ＭＡＳＮＦＴＱＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶＴＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＱＫＲＫＹＴＩＫＶＥＶＰＫＶＡＴＱＴＶＧＧＶＥＬＰＶＡＡＷＲＳＹＬＮＭＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＳＤＣＥＬＩＶＫＡＭＱＧＬＬＫＤＧＮＰＩＰＳＡＩＡＡＮＳＧＬＹＧＡＭＡＳＮＦＴＱＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶＴＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＱＫＲＫＹＴＩＫＶＥＶＰＫＶＡＴＱＴＶＧＧＶＥＬＰＶＡＡＷＲＳＹＬＮＭＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＳＤＣＥＬＩＶＫＡＭＱＧＬＬＫＤＧＮＰＩＰＳＡＩＡＡＮＳＬＩＮ（配列番号９２）
二量体ＭＳ２デルタＦＧ：
ＭＡＳＮＦＴＱＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶＴＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＱＫＲＫＹＴＩＫＶＥＶＰＫＧＡＷＲＳＹＬＮＭＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＳＤＣＥＬＩＶＫＡＭＱＧＬＬＫＤＧＮＰＩＰＳＡＩＡＡＮＳＧＬＹＧＡＭＡＳＮＦＴＱＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶＴＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＱＫＲＫＹＴＩＫＶＥＶＰＫＧＡＷＲＳＹＬＮＭＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＳＤＣＥＬＩＶＫＡＭＱＧＬＬＫＤＧＮＰＩＰＳＡＩＡＡＮＳＬＩＮ（配列番号９３）
【００９７】
３．ラムダＮをｄＣａｓ９のＮ末端またはＣ末端に融合した融合物の例示的な配列。
ラムダＮのアミノ酸配列：
ＭＤＡＱＴＲＲＲＥＲＲＡＥＫＱＡＱＷＫＡＡＮ（配列番号９４）または
ＭＤＡＱＴＲＲＲＥＲＲＡＥＫＱＡＱＷＫＡＡＮＰＬＬＶＧＶＳＡＫＰＶＮＲＰＩＬＳＬＮＲＫＰＫＳＲＶＥＳＡＬＮＰＩＤＬＴＶＬＡＥＹＨＫＱＩＥＳＮＬＱＲＩＥＲＫＮＱＲＴＷＹＳＫＰＧＥＲＧＩＴＣＳＧＲＱＫＩＫＧＫＳＩＰＬＩ（配列番号９５）
【００９８】
４．Ｃｓｙ４をＣａｓ９のＮ末端またはＣ末端に融合した融合物の例示的配列
Ｈａｕｒｗｉｔｚら，３２９（５９９７）：１３５５−８（２０１０）にＣｙｓ４の例示的な配列が、例えば不活性型のものが記載されている。
【００９９】
ラムダＮまたはＭＳ２に対する同種ステムループ認識配列と５’末端または３’末端で融合した調節ＲＮＡ、例えば、ＨＯＴＡＩＲ、ＨＯＴＴＩＰ、ＸＩＳＴまたはＸＩＳＴ  ＲｅｐＡなどの長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）も発現する細胞内で構築物を発現させる。ＭＳ２の野生型配列および高親和性配列はそれぞれ、ＡＡＡＣＡＵＧＡＧＧＡＵＵＡＣＣＣＡＵＧＵＣＧ（配列番号９６）およびＡＡＡＣＡＵＧＡＧＧＡＵＣＡＣＣＣＡＵＧＵＣＧ（配列番号９７）である（Ｋｅｒｙｅｒ−Ｂｉｂｅｎｓら，上記，図２を参照されたい）；ラムダＮが結合するｎｕｔＬ配列およびｎｕｔＲ  ＢｏｘＢ配列はそれぞれ、ＧＣＣＣＵＧＡＡＧＡＡＧＧＧＣ（配列番号９８）およびＧＣＣＣＵＧＡＡＡＡＡＧＧＧＣ（配列番号９９）である。Ｃｓｙ４が結合する配列は、ＧＴＴＣＡＣＴＧＣＣＧＴＡＴＡＧＧＣＡＧ（短縮された２０ｎｔ）（配列番号１００）またはＧＵＵＣＡＣＵＧＣＣＧＵＡＵＡＧＧＣＡＧＣＵＡＡＧＡＡＡ（配列番号１０１）である。
【０１００】
ＭＳ２結合配列でタグ化されたｌｎｃＲＮＡを発現する細胞内でｄＣａｓ９／ＭＳ２が標的部位と結合すると、そのｌｎｃＲＮＡがｄＣａｓ９結合部位に動員され、ｌｎｃＲＮＡがリプレッサー、例えばＸＩＳＴであればｄＣａｓ９結合部位付近の遺伝子が抑制される。同様に、ラムダＮ結合配列でタグ化されたｌｎｃＲＮＡを発現する細胞内でｄＣａｓ９／ラムダＮが標的部位と結合すると、そのｌｎｃＲＮＡがｄＣａｓ９結合部位に動員される。
【０１０１】
実施例４．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−ＨＰ１融合物系の設計―配列特異的サイレンシング
本明細書に記載されるｄＣａｓ９融合タンパク質は、サイレンシングドメイン、例えば、ヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１、ｓｗｉ６としても知られる）、例えばＨＰ１αまたはＨＰ１βを標的とするのに用いることもできる。クロモドメインが除去された短縮型のＨＰ１αまたはＨＰ１βを特定の遺伝子座に対して標的として、ヘテロクロマチン形成および遺伝子サイレンシングを誘導することができる。ｄＣａｓ９と融合した短縮ＨＰ１の例示的な配列を図８Ａ〜８Ｂに示す。ＨＰ１配列を上記のように不活性化されたｄＣａｓ９のＮ末端またはＣ末端に融合することができる。
【０１０２】
実施例５．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−ＴＥＴ融合物系の設計―配列特異的脱メチル化
本明細書に記載されるｄＣａｓ９融合タンパク質は、ＤＮＡのメチル化状態を修飾する酵素（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）またはＴＥＴタンパク質）を標的とするのに用いることもできる。短縮型のＴＥＴ１を特定の遺伝子座に対して標的として、ＤＮＡ脱メチル化を触媒することができる。ｄＣａｓ９と融合した短縮ＴＥＴ１の例示的な配列を図９に示す。ＴＥＴ１配列を上記のように不活性化されたｄＣａｓ９のＮ末端またはＣ末端に融合することができる。
【０１０３】
実施例６．最適化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−ＶＰ６４融合物の設計
ＶＰ６４活性化ドメインを保有するｄＣａｓ９ベースの転写活性化因子の活性を、これらの融合物内の核局在化シグナル（１つまたは複数）（ＮＬＳ）および３×ＦＬＡＧタグの数および位置を変化させることによって、最適化した（図１０）。Ｎ末端ＮＬＳおよびｄＣａｓ９配列とＶＰ６４配列の間にあるＮＬＳの両方を含むｄＣａｓ９−ＶＰ６４融合物では一貫してより高いレベルの標的遺伝子活性化が誘導されたが、これは活性化因子の核局在化の増強によるものである可能性が考えられる（図１０）。さらに、３×ＦＬＡＧタグをｄＣａｓ９のＣ末端とＶＰ６４のＮ末端の間に配置したところ、さらに高いレベルの活性化が観察された。３×ＦＬＡＧタグは人工リンカーとしての役割を果たし、ｄＣａｓ９とＶＰ６４の間に必要な間隔が生じさせ、おそらくＶＰ６４ドメインの折り畳み（ｄＣａｓ９付近に拘束されていると不可能であると考えられる）を向上させるか、ＲＮＡポリメラーゼＩＩを動員する転写メディエーター複合体によるＶＰ６４の認識を向上させると考えられる。あるいは、負に帯電した３×ＦＬＡＧタグが偶発的な転写活性化ドメインとして機能し、ＶＰ６４ドメインの効果を増強する可能性もある。
【０１０４】
実施例７．最適化された触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質（ｄＣａｓ９）
ｄＣａｓ９ドメインのＣａｓ９のヌクレアーゼ活性を失活させる不活性化変異の性質を変化させることによって、ｄＣａｓ９−ＶＰ６４活性化因子の活性をさらに最適化した（図１１Ａ〜１１Ｂ）。これまでに公開された研究では、触媒残基Ｄ１０およびＨ８４０をアラニンに変異させて（Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ）、ＤＮＡの加水分解を媒介する活性部位のネットワークを破壊している。これらの位置におけるアラニン置換によってｄＣａｓ９が不安定化するため、活性が最適に至らないとする仮説を立てた。そこで、Ｄ１０またはＨ８４０におけるより構造的に保存された置換（例えば、アスパラギンまたはチロシン残基への置換：Ｄ１０Ｎ、Ｈ８４０ＮおよびＨ８４０Ｙ）であれば、これらの異なる変異を有するｄＣａｓ９−ＶＰ６４融合物による遺伝子活性化が増大するかどうかを確認するため、このような置換を検証した。上記変異型置換を有するｄＣａｓ９−ＶＰ６４変異体を内在ヒトＶＥＧＦＡ遺伝子の上流領域を標的とする３種類のｇＲＮＡとともにＨＥＫ２９３細胞に共トランスフェクトしたところ、上記変異体のうち１つを除く全変異体でＶＥＧＦＡタンパク質発現の増大が観察された（図１１Ａ）。しかし、ｄＣａｓ９−ＶＰ６４変異体を上記ｇＲＮＡのうちの１種類のみと共トランスフェクトした場合（図１１Ａ）または単一のＶＥＧＦＡ標的化ｇＲＮＡを発現するＨＥＫ２９３由来細胞系に共トランスフェクトした場合（図１１Ｂ）、この効果はそれほど著しいものではなかった。
【０１０５】
その他の実施形態
ここまで本発明をその詳細な説明と関連させて記載してきたが、上記説明は例示説明を目的とするものであり、添付の「特許請求の範囲」の範囲によって定められる本発明の範囲を限定するものではないことを理解するべきである。その他の態様、利点および改変は以下の特許請求の範囲内にある。
本発明は、以下の態様を包含し得る。
［１］
異種機能ドメインと連結した触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連９（ｄＣａｓ９）タンパク質を含む、融合タンパク質。
［２］
前記異種機能ドメインが転写活性化ドメインである、上記［１］に記載の融合タンパク質。
［３］
前記転写活性化ドメインが、ＶＰ６４またはＮＦ−κＢ  ｐ６５由来のものである、上記［２］に記載の融合タンパク質。
［４］
前記異種機能ドメインが、転写サイレンサーまたは転写抑制ドメインである、上記［１］に記載の融合タンパク質。
［５］
前記転写抑制ドメインが、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）またはｍＳｉｎ３Ａ相互作用ドメイン（ＳＩＤ）である、上記［４］に記載の融合タンパク質。
［６］
前記転写サイレンサーが、ヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）、例えばＨＰ１αまたはＨＰ１βである、上記［４］に記載の融合タンパク質。
［７］
前記異種機能ドメインが、ＤＮＡのメチル化状態を修飾する酵素である、上記［１］に記載の融合タンパク質。
［８］
前記ＤＮＡのメチル化状態を修飾する酵素が、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）またはＴＥＴタンパク質である、上記［７］に記載の融合タンパク質。
［９］
前記ＴＥＴタンパク質がＴＥＴ１である、上記［８］に記載の融合タンパク質。
［１０］
前記異種機能ドメインが、ヒストンサブユニットを修飾する酵素である、上記［１］に記載の融合タンパク質。
［１１］
前記ヒストンサブユニットを修飾する酵素が、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）またはヒストンデメチラーゼである、上記［１］に記載の融合タンパク質。
［１２］
前記異種機能ドメインが生物学的テザーである、上記［１］に記載の融合タンパク質。
［１３］
前記生物学的テザーが、ＭＳ２、Ｃｓｙ４またはラムダＮタンパク質である、上記［１２］に記載の融合タンパク質。
［１４］
前記触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質が、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のものである、上記［１］に記載の融合タンパク質。
［１５］
前記触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質が、Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｈ９８３またはＤ９８６；およびＨ８４０またはＮ８６３に変異を含む、上記［１］に記載の融合タンパク質。
［１６］
前記変異が、
（ｉ）Ｄ１０ＡまたはＤ１０Ｎおよび
（ｉｉ）Ｈ８４０Ａ、Ｈ８４０ＮまたはＨ８４０Ｙ
である、上記［１５］に記載の融合タンパク質。
［１７］
前記異種機能ドメインが、任意選択の介在リンカーを伴って前記触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質のＮ末端またはＣ末端と連結し、前記リンカーが、前記融合タンパク質の活性に干渉しない、上記［１］に記載の融合タンパク質。
［１８］
任意選択で１つまたは複数の介在リンカーを伴って、Ｎ末端上、Ｃ末端上および／または前記触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連９（Ｃａｓ９）タンパク質と前記異種機能ドメインとの間に核局在化配列および１つもしくは複数のエピトープタグの一方または両方をさらに含む、上記［１］に記載の融合タンパク質。
［１９］
前記エピトープタグが、ｃ−ｍｙｃ、６ＨｉｓまたはＦＬＡＧである、上記［１８］に記載の融合タンパク質。
［２０］
上記［１］〜［１９］のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする、核酸。
［２１］
上記［２０］に記載の核酸を含む、発現ベクター。
［２２］
細胞の標的遺伝子の発現を増大させる方法であって、前記細胞内で上記［２］〜［３］に記載の融合タンパク質と、前記標的遺伝子に対する１つまたは複数のガイドＲＮＡとを発現させることを含む、方法。
［２３］
細胞の標的遺伝子を減少させる方法であって、前記細胞内で上記［４］〜［６］に記載の融合タンパク質と、前記標的遺伝子に対する１つまたは複数のガイドＲＮＡとを発現させることを含む、方法。
［２４］
細胞の標的遺伝子またはそのプロモーターもしくはエンハンサー（１つまたは複数）のＤＮＡメチル化を減少させる方法であって、前記細胞内で上記［７］〜［９］に記載の融合タンパク質と、関連する標的遺伝子配列に対する１つまたは複数のガイドＲＮＡとを発現させることを含む、方法。
［２５］
細胞の標的遺伝子またはそのプロモーターもしくはエンハンサー（１つまたは複数）と結合しているヒストンを修飾する方法であって、前記細胞内で上記［１０］〜［１１］に記載の融合タンパク質と、関連する標的遺伝子配列に対する１つまたは複数のガイドＲＮＡとを発現させることを含む、方法。
【図１−１】
0006657069.tif 000013
【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
0006657069.tif 000019
【図３−２】
0006657069.tif 000020
【図３−３】
0006657069.tif 000021
【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
0006657069.tif 000024
【図５−３】
0006657069.tif 000025
【図６−１】
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【図６−２】
0006657069.tif 000027
【図６−３】
0006657069.tif 000028
【図７】
0006657069.tif 000029
【図８−１】
0006657069.tif 000030
【図８−２】
0006657069.tif 000031
【図９】
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【図１０】
0006657069.tif 000033
【図１１】
0006657069.tif 000034
【配列表】
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