(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質リガーゼ活性、好適にはシクラーゼ活性を有する単離ポリペプチドであって、
（ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列；
（ｉｉ）アミノ酸配列であって、その全体の長さにわたり、配列番号１で示される前記アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、且つ、該アミノ酸配列を有するポリペプチドが配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと同一のタンパク質リガーゼ活性および／またはシクラーゼ活性を有するアミノ酸配列；または
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）のアミノ酸配列を有するポリペプチドの断片であって、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸１９〜１６６、より好適には１０〜２００、最も好適には１〜２７７を含み、且つ、該断片が配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと同一のタンパク質リガーゼ活性および／またはシクラーゼ活性を有する、断片
を含むかまたはそれからなる、単離ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項３】
（ｉ）配列番号１の位置１９に対応する位置のアミノ酸残基Ｎと；
（ｉｉ）配列番号１の位置１２４に対応する位置のアミノ酸残基Ｈと；
（ｉｉｉ）配列番号１の位置１６６に対応する位置のアミノ酸残基Ｃとのうちの１つ以上
を含む、請求項１または２に記載の単離ポリペプチド。
【請求項４】
８０％以上、好適には９０％以上の効率で所定のペプチドを環化することができる、請求項１〜３の何れか一項に記載の単離ポリペプチド。
【請求項５】
（ｉ）５００μＭ以下、好適には２５０μＭ以下のＫｍで；もしくは、
（ｉｉ）少なくとも０．０５ｓ−１、好適には少なくとも０，５ｓ−１、より好適には少なくとも１．０ｓ−１、最も好適には少なくとも１．５ｓ−１のｋｃａｔで、または、
それらの両方で、所定のペプチドを環化することができる、請求項１〜４の何れか一項に記載の単離ポリペプチド。
【請求項６】
グリコシル化されている、請求項１〜５の何れか一項に記載の単離ポリペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか一項に記載のポリペプチドをコードする、核酸分子。
【請求項８】
ベクター中に含まれる、請求項７に記載の核酸分子。
【請求項９】
前記ベクターが、前記核酸分子の発現を制御するための調節エレメントをさらに含む、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項１０】
請求項７〜９の何れか一項に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１〜６の何れか一項に記載のポリペプチドを作製するための方法であって、前記ポリペプチドの発現を可能にする条件下で請求項９に記載の宿主細胞を培養すること、および前記宿主細胞または培養培地から前記ポリペプチドを単離することを含む、方法。
【請求項１２】
ペプチドを環化するためのシクラーゼ活性を有するポリペプチドの使用であって、シクラーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、請求項１〜６の何れか一項に記載の単離ポリペプチドである、使用。
【請求項１３】
環化される前記ペプチドが、
（ｉ）好適にはＣ末端アミノ酸配列であるアミノ酸配列（Ｘ）ｏＮ／Ｄ（Ｘ）ｐであって、Ｘは任意のアミノ酸であり、かつｏおよびｐは、互いに独立に２以上の整数であるアミノ酸配列（Ｘ）ｏＮ／Ｄ（Ｘ）ｐ、好適にはアミノ酸配列（Ｘ）ｏＮＨＶ；または
（ｉｉ）Ｃ末端アミノ酸配列（Ｘ）ｏＮ＊／Ｄ＊であって、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｏは２以上の整数であり、かつＣ末端Ｎ／Ｄ残基は、式−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ’）２のアミド基によりＣ末端カルボキシ基、Ｄの場合は好適にはα−カルボキシ基が置換されるようにアミド化され、Ｒ’は任意の残基である、アミノ酸配列（Ｘ）ｏＮ＊／Ｄ＊
を含む、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
環化される前記ペプチドが、Ｎ末端アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２（Ｘ）ｑであって、Ｘは任意のアミノ酸であり；Ｘ１は、Ｐｒｏを除く任意のアミノ酸であり；Ｘ２は、任意のアミノ酸であるが、好適には疎水性アミノ酸、より好適にはＶａｌ、ＩｌｅまたはＬｅｕであり；かつｑは、０または１以上の整数であるアミノ酸配列Ｘ１Ｘ２（Ｘ）ｑを含む、請求項１２または１３に記載の使用。
【請求項１５】
環化される前記ペプチドが、環状シスチンノットポリペプチド、環状ペプチド毒素、環状抗菌ペプチド、環状ヒスタチン、またはヒトもしくは動物の環状ペプチドホルモンの線状前駆体型である、請求項１２〜１４の何れか一項に記載の使用。
【請求項１６】
環化される前記ペプチドは１０個以上のアミノ酸長である、請求項１２〜１５の何れか一項に記載の使用。
【請求項１７】
環化される前記ペプチドが、
（ｉ）配列番号１１０〜１１６および１２８〜１３２のうちの任意の１つで示されるアミノ酸；または
（ｉｉ）アミノ酸配列（Ｘ）ｎＣ（Ｘ）ｎＣ（Ｘ）ｎＣ（Ｘ）ｎＣ（Ｘ）ｎＣ（Ｘ）ｎＣ（Ｘ）ｎＮＨＶ（Ｘ）ｎであって、各ｎは、１〜６から独立に選択される整数であり、かつＸは、任意のアミノ酸であるアミノ酸配列（Ｘ）ｎＣ（Ｘ）ｎＣ（Ｘ）ｎＣ（Ｘ）ｎＣ（Ｘ）ｎＣ（Ｘ）ｎＣ（Ｘ）ｎＮＨＶ（Ｘ）ｎ
を含むかまたはそれからなる、請求項１２〜１６の何れか一項に記載の使用。
【請求項１８】
少なくとも２つのペプチドを連結させるためのタンパク質リガーゼ活性を有するポリペプチドの使用であって、タンパク質リガーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、請求項１〜６の何れか一項に記載の単離ポリペプチドである、使用。
【請求項１９】
連結される前記ペプチドのうちの少なくとも１つが、検出可能マーカ、好適には蛍光マーカまたはビオチンを含む、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
連結される前記ペプチドのうちの少なくとも１つが、
（ｉ）好適にはＣ末端アミノ酸配列であるアミノ酸配列（Ｘ）ｏＮ／Ｄ（Ｘ）ｐであって、Ｘは任意のアミノ酸であり、かつｏおよびｐは、互いに独立に２以上の整数であるアミノ酸配列（Ｘ）ｏＮ／Ｄ（Ｘ）ｐ、好適にはアミノ酸配列（Ｘ）ｏＮＨＶ；または
（ｉｉ）Ｃ末端アミノ酸配列（Ｘ）ｏＮ＊／Ｄ＊であって、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｏは２以上の整数であり、かつＣ末端Ｎ／Ｄ残基は、式−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ’）２のアミド基によりＣ末端カルボキシ基、Ｄの場合は好適にはα−カルボキシ基が置換されるようにアミド化され、Ｒ’は任意の残基である、アミノ酸配列（Ｘ）ｏＮ＊／Ｄ＊
を含む、請求項１８または１９に記載の使用。
【請求項２１】
連結される前記ペプチドのうちの少なくとも１つが、Ｎ末端アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２（Ｘ）ｑであって、Ｘは任意のアミノ酸であり；Ｘ１は、Ｐｒｏを除く任意のアミノ酸であり；Ｘ２は、任意のアミノ酸であるが、好適には疎水性アミノ酸、より好適にはＶａｌ、ＩｌｅまたはＬｅｕであり；かつｑは、０または１以上の整数であるアミノ酸配列Ｘ１Ｘ２（Ｘ）ｑを含む、請求項１８〜２０の何れか一項に記載の使用。
【請求項２２】
連結される前記ペプチドのうちの少なくとも１つが、２５個以上、好適には５０個以上のアミノ酸長である、請求項１８〜２１の何れか一項に記載の使用。
【請求項２３】
ペプチドを環化するための方法であって、前記ペプチドの環化を可能にする条件下で、請求項１〜６の何れか一項に記載の単離ポリペプチドとともに、前記ペプチドを温置することを含む、方法。
【請求項２４】
少なくとも２つのペプチドを連結させるための方法であって、前記ペプチドの連結を可能にする条件下で、請求項１〜６の何れか一項に記載の単離ポリペプチドとともに、前記少なくとも２つのペプチドを温置することを含む、方法。
【請求項２５】
環化される前記ペプチドまたは連結される少なくとも１つのペプチドが、
（ｉ）好適にはＣ末端アミノ酸配列であるアミノ酸配列（Ｘ）ｏＮ／Ｄ（Ｘ）ｐであって、Ｘは任意のアミノ酸であり、かつｏおよびｐは、互いに独立に２以上の整数であるアミノ酸配列（Ｘ）ｏＮ／Ｄ（Ｘ）ｐ、好適にはアミノ酸配列（Ｘ）ｏＮＨＶ；または
（ｉｉ）Ｃ末端アミノ酸配列（Ｘ）ｏＮ＊／Ｄ＊であって、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｏは２以上の整数であり、かつＣ末端Ｎ／Ｄ残基は、式−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ’）２のアミド基によりＣ末端カルボキシ基、Ｄの場合は好適にはα−カルボキシ基が置換されるようにアミド化され、Ｒ’は任意の残基である、アミノ酸配列（Ｘ）ｏＮ＊／Ｄ＊
を含む、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
環化される前記ペプチドまたは連結される前記少なくとも１つのペプチドが、アミノ酸配列Ｎ／Ｄ（Ｘ）Ｐ、好適にはＮＨＶに対してＮ末端で融合されている関心のあるペプチドからなる人工融合ペプチドである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
環化される前記ペプチドまたは連結される少なくとも１つのペプチドが、Ｎ末端アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２（Ｘ）ｑであって、Ｘは任意のアミノ酸であり；Ｘ１は、Ｐｒｏを除く任意のアミノ酸であり；Ｘ２は、任意のアミノ酸であるが、好適には疎水性アミノ酸、より好適にはＶａｌ、ＩｌｅまたはＬｅｕであり；かつｑは、０または１以上の整数であるアミノ酸配列Ｘ１Ｘ２（Ｘ）ｑを含む、請求項２３〜２６の何れか一項に記載の方法。
【請求項２８】
請求項７〜９の何れか一項に記載の核酸を含む、トランスジェニック植物。
【請求項２９】
環化される１つ以上のペプチドまたは連結される１つ以上のペプチド、好適には環状シスチンノットポリペプチド、環状ペプチド毒素、環状抗菌ペプチド、環状ヒスタチン、またはヒトもしくは動物の環状ペプチドホルモンの線状前駆体型をコードする少なくとも１つの核酸分子をさらに含む、請求項２８に記載のトランスジェニック植物。
【請求項３０】
固体支持材料であって、前記固体支持材料上に固定化される請求項１〜６の何れか一項に記載の単離ポリペプチドを含む、固体支持材料。
【請求項３１】
ポリマー樹脂を好適には粒状形態で含む、請求項３０に記載の固体支持材料。
【請求項３２】
前記単離ポリペプチドが、共有結合または非共有結合相互作用によって前記固体支持材料上に固定化される、請求項３０または３１に記載の固体支持材料。
【請求項３３】
前記単離ポリペプチドが、前記固体支持材料の表面にカップリングされている炭水化物結合部分、好適にはコンカナバリンＡに非共有結合される、請求項３２に記載の固体支持材料。
【請求項３４】
クロマトグラフィーカラムのための粒状樹脂材料である、請求項３０〜３３の何れか一項に記載の固体支持材料。
【請求項３５】
少なくとも１つの基質ペプチドのカラム上での環化もしくは連結、またはそれらの両方のための、請求項３４に記載の固体支持材料の使用。
【請求項３６】
少なくとも１つの基質ペプチドの環化または連結のための方法であって、前記少なくとも１つの基質ペプチドの環化もしくは連結、またはそれらの両方を可能にする条件下で、前記少なくとも１つの基質ペプチドを含む溶液を請求項３０〜３４の何れか一項に記載の固体支持材料と接触させることを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素技術の技術分野にあり、具体的には、Ａｓｘ特異的なリガーゼ活性とシクラーゼ活性とを有する新規酵素およびこれらをコードする核酸、ならびに前記酵素の製造の方法に関する。これらの酵素の方法および使用がさらに包含される。
【背景技術】
【０００２】
ペプチドおよびタンパク質のヘッドトゥーテールの大環状化は、構造を束縛してタンパク質分解に対する代謝安定性を促進するためのストラテジーとして使用されている。さらに、束縛された大環状立体構造は、薬理学的活性および経口バイオアベイラビリティを改善することもできる。殆どのペプチドおよびタンパク質は直鎖として産生されるにもかかわらず、６〜７８個の残基の範囲の環状ペプチドが様々な生物において天然に存在する。これらの環状ペプチドは、サイトカイン、ヒスタチン、ユビキチンＣ末端ヒドロラーゼ、コノトキシンおよびブラジキニングラフト化シクロチドの環化における最近の成功により示されるように、通常、熱変性およびタンパク質分解に対して高い耐性を示し、タンパク質工学における新しいトレンドをもたらしてきた。さらに、環状ペプチドは、バリノマイシン、グラミシジンＳおよびシクロスポリンを含む治療剤として使用されてきた。
【０００３】
現在まで、典型的には、化学的方法がペプチドの環化のために使用されている。可能性のある１つのストラテジーは、ネイティブ化学連結である。この方法は、Ｎ末端システインおよびＣ末端チオエステルを必要とし、この要件によって非システイン含有ペプチドに対するその適用が制限される。さらに、化学的方法は、特に大型のペプチドおよびタンパク質に対して必ずしも実現可能ではない。
【０００４】
天然シクラーゼを使用する酵素的方法が理想的ではあるものの、現在知られているペプチドシクラーゼはごく僅かしかなく、これらは様々な理由のために十分に開発されていない。しかし、生来の機能がシクラーゼではないソルターゼＡおよびインテインなどの他の酵素が、様々なペプチドおよびタンパク質の環化のためにうまく適用されてきた。それにもかかわらず、これらの酵素には欠点がある。例えば、ソルターゼＡは、細菌細胞壁に表面タンパク質を固定するトランスペプチダーゼである。その環化反応は通常、一晩の温置および０．１〜１モル濃度当量の酵素を必要とする。さらに、ソルターゼＡは、ペンタペプチド認識配列ＬＰＸＴＧを有し、修飾されたタンパク質上に不必要なタグを残す。インテインは、シクロチド、ヒマワリトリプシン阻害剤およびｑ−デフェンシンの発現のために使用されてきた自己触媒的なスプライシング要素である。しかし、インテイン介在性の環化は、インテインドメインとの標的タンパク質の遺伝子融合を必要とし、タンパク質折り畳みまたは溶解度に影響を及ぼし得ることは不可避である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、当技術分野において、既存の技術の欠点を克服し、理想的には単純で迅速で万能である、ペプチドおよびタンパク質を環化するための改善された手段が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、上記の要件に合う新規のＡｓｘ特異的なタンパク質リガーゼを提供することによって、この要求を満たす。本発明者らは、驚くべきことに、薬用植物であるクリトリア・テルナテア（Ｃｌｉｔｏｒｉａ  ｔｅｒｎａｔｅａ）から単離されたこの酵素が、植物環状ペプチドの大きいファミリーであるシクロチドの合成においてプロセシング酵素と
して使用される天然シクラーゼであることを見出した。この酵素は、５４２，０００Ｍ−１ｓ−１という高い触媒活性を有する、圧倒的な最速の既知のリガーゼであることが分かった。これは、Ｃ末端のトリペプチドモチーフ、Ａｓｘ−Ｈｉｓ−Ｖａｌを認識し、ソーティング配列Ｈｉｓ−Ｖａｌを切断するとともにＡｓｘをＮ末端残基に連結することによりペプチド骨格環化に介在して、環状形態を形成させる。この酵素は、シクロチド前駆体および１４〜５８個の残基のサイズ範囲のシステインに富む様々なペプチドだけでなく、非システイン含有ペプチドおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）も効率的に環化することが示され得る。これにより、所定のペプチドまたはタンパク質の環化が所望される様々な用途において、この酵素は非常に多目的および有用となる。
【０００７】
したがって、第一の態様において、本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる単離ポリペプチドに関する。配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、本明細書で「ブテラーゼ（ｂｕｔｅｌａｓｅ）１」とも呼ばれる。
【０００８】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸分子ならびにこのような核酸を含有するベクター、特にコピーベクターまたは発現ベクターにも関する。
【０００９】
さらなる態様において、本発明は、本明細書で企図されるような核酸または本明細書で企図されるようなベクターを含有する宿主細胞、好適には非ヒト宿主細胞も対象とする。
本発明のまたさらなる態様は、本明細書に記載されるようなポリペプチドを製造するための方法であって、本明細書で企図される宿主細胞を培養すること、およびポリペプチドを培養培地からまたは宿主細胞から単離することを含む、方法である。
【００１０】
またさらなる態様において、本発明は、タンパク質連結のための、特に１つ以上のペプチドを環化するための、本明細書に記載のポリペプチドの使用に関する。
本発明の別の態様は、少なくとも２つのペプチドを連結するか、または１つのペプチドを環化するための
（ｉ）配列番号３〜１０９で示されるアミノ酸配列のうちの任意の１つ；
（ｉｉ）アミノ酸配列であって、その全体の長さにわたり、（ｉ）のアミノ酸配列のうちの任意の１つと、少なくとも６０％、好適には少なくとも７０％、より好適には少なくとも８０％、最も好適には少なくとも９０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）アミノ酸配列であって、その全体の長さにわたり、（ｉ）のアミノ酸配列のうちの任意の１つと、少なくとも８０％、好適には少なくとも９０％、より好適には少なくとも９５％の配列相同性を共有するアミノ酸配列；または
（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）のうちの任意の１つの断片
を含むかまたはそれからなる、ポリペプチドの使用を対象とする。
【００１１】
さらに別の態様において、本発明は、ペプチドを環化するための方法であって、このペプチドの環化を可能にする条件下で、本発明の使用と関連して、このペプチドを上記のポリペプチドとともに温置することを含む、方法に関する。
【００１２】
またさらなる態様において、本発明は、少なくとも２つのペプチドを連結するための方法であって、このペプチドの連結を可能にする条件下で、本発明の使用と関連して、このペプチドを上記のポリペプチドとともに温置することを含む、方法に関する。
【００１３】
別の態様において、本発明は、本発明の単離ポリペプチドが固定化される固体支持材料およびその使用と、このような基質を使用する方法とに関する。
別の態様において、本発明は、本明細書に記載されるようなタンパク質リガーゼ活性お
よび／またはシクラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含むトランスジェニック植物も包含する。本ポリペプチドは、好適にはその植物において天然には存在しない。したがって、本発明は、本発明による異種ポリペプチドを発現するトランスジェニック植物も特色とする。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ｋＢ１−ＮＨＶの酸化的折り畳みを示す。５０％アセトニトリル、１００ｍＭ重炭酸アンモニウム、３ｍＭ還元グルタチオンを含有するｐＨ８．０の緩衝液中で本ペプチドが３０μＭ濃度で１８時間にわたり折り畳まれた。折り畳まれたペプチドはＲＰ−ＨＰＬＣにおいて最後に溶出された。
【図２】ペプチドシクラーゼ活性のＭＳ特性評価を示す。（ａ）ブテラーゼ１が介在するｋＢ１−ＮＨＶ環化の概略図である。ブテラーゼ１の認識部位の残基（Ｐ１、Ｐ１’およびＰ２’）が表示される。（ｂ、ｃ）それぞれ、Ｃ．テルナテア（Ｃ．ｔｅｒｎａｔｅａ）の粗製抽出物が介在するｋＢ１−ＮＨＶ環化、および精製ブテラーゼ１が介在するｋＢ１−ＮＨＶ環化のＭＳプロファイルである。括弧のペプチドは、Ｃ．テルナテア中の天然シクロチドである、クリオチド（ｃｌｉｏｔｉｄｅ）である。生成物である環状ｋＢ１は矢印で示される。（ｄ）タチナタマメレグマインが対照として使用された。ＭＳプロファイルから、タチナタマメレグマインが、ｋＢ１−ＮＨＶ中のアスパラギニル結合を加水分解して、線状（ｌｉｎｅａｒ）のｋＢ１を与えることが示される。Ｋ＋またはＫ２＋で表示されるピークは、それぞれ１個または２個のカリウムイオンの結合に対応するイオン付加物である。
【図３】酵素環化ｋＢ１およびネイティブペプチドの同時溶出を示す。（ａ）酵素環化ｋＢ１のＨＰＬＣプロファイルである。（ｂ）Ｏ．アフィニス（Ｏ．ａｆｆｉｎｉｓ）から抽出されるネイティブｋＢ１のＨＰＬＣプロファイルである。（ｃ）酵素環化およびネイティブｋＢ１の同時溶出プロファイルである。
【図４】ブテラーゼ１によるｋＢ１−ＮＨＶの変換から得られた酵素環化ｋＢ１における環状骨格のＭＳの証拠を示す。（ａ）Ｓ−カルバミドメチル化後の環化ｋＢ１のＭＳプロファイルである。環化ｋＢ１のｍ／ｚ値は２８９１であり、Ｓ−アルキル化後には３２３９となった。３１８２の小さいピークは、５個のシステインのみが修飾された不完全アルキル化のために観察される。（ｂ）トリプシン消化後のＳ−アルキル化ｋＢ１のＭＳプロファイルである。１８Ｄａの質量増加が観察されたが、これは、水分子および環状骨格の付加を示す。（ｃ）３２５７Ｄａのトリプシン消化断片のＭＳ／ＭＳプロファイルである。ペプチド配列はＭＳ／ＭＳスペクトルの上部に示される。ｙ−イオンは、対応するピークの上部に表示する。
【図５】酵素環化ｋＢ１（濃灰色）およびネイティブｋＢ１（薄灰色）の１Ｄ  ＮＭＲスペクトル比較を示す。ｐＨ４．３の９５％Ｈ２Ｏ／５％Ｄ２Ｏ中でペプチドが溶解された。２９８Ｋでスペクトルが記録された。
【図６】ブテラーゼ１の単離、特性評価および相同性モデリングを示す。（ａ）精製ブテラーゼ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。銀染色によってタンパク質が可視化された。左レーンは、精製ブテラーゼ１であり、右レーンは、示される分子量（ｋＤａ）のタンパク質ラダーである。（ｂ）レグマイン特異的プローブＬＰ−１によるブテラーゼ１の表示である。タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解され、Ｃｙ５フィルタを備えたタイフーン（Ｔｙｐｈｏｏｎ）スキャナ（ＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ））によって可視化された。（ｃ）ＥＳＴ配列から推定されるブテラーゼ１前駆体の翻訳配列である。配列は、黒で示される小胞体シグナル、橙色のＮ末端プロドメイン、青色のＡＥＰドメイン、マゼンタの活性ペプチド領域および灰色のＬＳＡＭドメインでカラーコード化される。精製活性酵素の最初および最後の残基（Ｖ４２およびＮ３８３）が表示される。触媒性三連構造（ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｔｒｉａｄ）（Ａｓｎ５９、Ｈｉｓ１６５およびＣｙｓ２０７）の保存的残基は斜字体である。ゲル中トリプシン消化から得られるペプチド配列は下線を付される。（ｄ）ヒトレグマインの構造に基づく酵素原ブテラーゼ１のモデリング構造である。左パネルは、青色で示されるＡＥＰドメイン、マゼンダの活性ペプチド領域および灰色のＬＳＡＭドメインがあるモデル化酵素原ブテラーゼ１を示す。右上部のパネルは、モデル化ブテラーゼ１および鋳型ヒトレグマイン（ＰＤＢ  ＩＤ：４ＦＧＵ；黄色）の構造アライメントを示す。黒色の点線のボックス内で触媒性三連構造残基（Ａｓｎ５９、Ｈｉｓ１６５およびＣｙｓ２０７）が赤い棒状に強調され、右下パネルに拡大図が示される。
【図７】ゲル中トリプシン消化によるブテラーゼ１のタンパク質同定を示す。ＭＳ／ＭＳによって５個の主要なトリプシン消化断片の配列決定が行われ、ＭＳプロファイルの上部に示される。
【図８】レグマン（ｌｅｇｕｍａｎ）特異的プローブＬＰ−１の化学構造を示す。
【図９】ペプチドシクラーゼとしてのブテラーゼ１の動態特性評価を示す。（ａ）４５分間にわたる環化反応のＲＰ−ＨＰＬＣトレースである。基質ｋＢ１−ＮＨＶおよび生成物ｋＢ１が表示される。０．１２５μＭブテラーゼ１および５０μＭ  ｋＢ１−ＮＨＶの存在下で３７℃でこのアッセイが行われた。２２０ｎｍの波長で吸光度が監視された。（ｂ〜ｄ）ｋＢ１−ＮＨＶ、ＳＦＴＩ−ＮＨＶおよびＳＡ−ｋＢ１−ＮＨＶに対するブテラーゼ１動態のミカエリス−メンテンプロットである。生成物のＨＰＬＣ−ピークの面積を濃度に変換することによって、環化速度が計算された。ｋＢ１−ＮＨＶおよびＳＦＴＩ−ＮＨＶの動態測定のために、０．１２５μＭブテラーゼ１および様々な濃度の基質の存在下で３７℃で１２分間にわたりこのアッセイが行われた。ＳＡ−ｋＢ１−ＮＨＶの場合、環化速度が非常に速いため、０．１２５μＭの代わりに５ｎＭの酵素濃度が使用され、温置時間が６分間に短縮された。
【図１０】ｋＢ１のシクロ二量体形成を示す。（ａ）ＲＰ−ＨＰＬＣプロファイルは、ｋＢ１のシクロ二量体形成を示す。この反応は、０．１２５μＭブテラーゼ１および５００μＭ  ｋＢ１−ＮＨＶの存在下で、３７℃で４時間にわたって行った。ピーク１は、ネイティブ環状ｋＢ１と同じ２８９１のｍ／ｚ値を有するｋＢ１の異性体である。ピーク２は２８９３のｍ／ｚ値を有し、これは、ｋＢ１の１個のジスルフィド結合の減少を示す。基質ｋＢ１−ＮＨＶと生成物であるｋＢ１および（ｋＢ１）２とは、ピーク頂端に表示する。（ｂ）ＭＳプロファイルは、ｋＢ１のシクロ二量体形成を示す。Ｋ＋で表示されるピークはカリウム付加物である。
【図１１】ブテラーゼ１による処理後のｋＢ１−ＮＨＶ短縮類似体のＭＳプロファイルを示す。０．１２５μＭブテラーゼ１および５０μＭの各基質の存在下で、３７℃で３０時間にわたりアッセイが行われた。（ａ）ブテラーゼ１で処理されたｋＢ１−ＮＨのＭＳプロファイルである。（ｂ）ブテラーゼ１で処理されたｋＢ１−Ｎ＊のＭＳプロファイルである。ｋＢ１生成物と短縮類似体であるｋＢ１−ＮＨおよびｋＢ１−Ｎ＊とはピーク頂端に表示された。ｍ／ｚ値が２９６９．４であるピークは、１個のシステイン残基がβ−ＭＥによりＳ−アルキル化されている修飾環状ｋＢ１に相当する。Ｋ＋およびＫ２＋で表示されたピークは、それぞれ１個または２個のカリウムイオンの結合に対応するイオン付加物である。
【図１２】ブテラーゼ１による処理後のｋＢ１−ＮＨＶ類似体のＭＳプロファイルを示す。（ａ〜ｄ）Ｐ１位置の保存的ＡｓｎをｋＢ１−ＮＨＶ基質においてＧｌｕ、Ｇｌｎ、ＡｌａまたはＡｓｐ残基により置換した。アッセイは、０．１２５μＭブテラーゼ１および５０μＭの各基質の存在下で、３７℃で４時間にわたって行われた。ｋＢ１−ＮＨＶ類似体の質量はピーク頂端に表示される。ｋＢ１−ＤＨＶの場合、ｍ／ｚ値が２８９２である環化生成物が観察された。Ｋ＋およびＫ２＋で表示されたピークは、それぞれ１個または２個のカリウムイオンの結合に対応するイオン付加物である。
【図１３】タチナタマメレグマインおよびブテラーゼ１によるＺ−ＡＡＮ−ＡＭＣ処理のＨＰＬＣプロファイルを示す。（ａ）対照としてのＺ−ＡＡＮ−ＡＭＣのＨＰＬＣトレースである。（ｂ）タチナタマメレグマインにより触媒された加水分解生成物７−アミノ−４−メチルクマリンを示すＨＰＬＣトレースである。このアッセイは、０．１３ｐｋａｔ（８μＵ）タチナタマメレグマインおよび５０μＭ  Ｚ−ＡＡＮ−ＡＭＣの存在下で、３７℃で３０時間にわたって行われた。（ｃ）Ｚ−ＡＡＮ−ＡＭＣにおけるブテラーゼ１の効果を示すＨＰＬＣトレースである。このアッセイは、０．１２５μＭブテラーゼ１および５０μＭ  Ｚ−ＡＡＮ−ＡＭＣの存在下で、３７℃で３０時間にわたって行われた。３０時間にわたる温置後、顕著な加水分解生成物（矢印で示す）は観察されなかった。２５４ｎｍの波長で吸光度が監視された。
【図１４】ＧＩＧＧＩＲ（配列番号１２３）とのＳＡ−ｐｙｒｏＧｌｕ−ｋＢ１−ＮＨＶ連結のＨＰＬＣプロファイルを示す。（ａ）対照としてのＳＡ−ｐｙｒｏＧｌｕ−ｋＢ１−ＮＨＶのＨＰＬＣトレースである。（ｂ）ブテラーゼ１の非存在下での加水分解生成物ＳＡ−ｐｙｒｏＧｌｕ−ｋＢ１−Ｎを示すＨＰＬＣトレースである。（ｃ）５倍過剰のＧＩＧＧＩＲ（２５０μＭ）の存在下での連結反応を示すＨＰＬＣトレースである。（ｄ）２０倍過剰のＧＩＧＧＩＲ（１ｍＭ）の存在下での連結反応を示すＨＰＬＣトレースである。連結反応は、０．１２５μＭブテラーゼ１および５０μＭ  ＳＡ−ｐｙｒｏＧｌｕ−ｋＢ１−ＮＨＶと様々な濃度のＧＩＧＧＩＲ（０〜１ｍＭ）との存在下で、３７℃で２０分間にわたって行われた。
【図１５】ブテラーゼ介在性ペプチド連結のアクセプタ特異性を示す。（ａ）ブテラーゼ１により促進されるＫＡＬＶＩＮＨＶ（配列番号１２２）およびＸＩＧＧＩＲ（配列番号１２３）の分子間連結である。この反応は、１００ｎＭブテラーゼ１、１００μＭ  ＫＡＬＶＩＮＨＶおよび１ｍＭ  ＸＩＧＧＩＲの存在下で行われ、１０分間または２時間にわたり温置された。ＨＰＬＣピークの面積を濃度に変換することによって、連結収率が計算された。（ｂ）ブテラーゼ１により促進されたＫＡＬＶＩＮＨＶおよびＬＸＧＧＩＲの分子間連結である。この反応は、１００ｎＭブテラーゼ１、１００μＭ  ＫＡＬＶＩＮＨＶおよび１ｍＭ  ＬＸＧＧＩＲの存在下で行われ、１０分間または２時間にわたり温置された。ＨＰＬＣピークの面積を濃度に変換することによって、連結収率が計算された。
【図１６】ヒトニューロメジンＵと、サリューシンａと、アペリンおよびガラニンと、ラットニューロメジンＵとのブテラーゼ介在性の環化を示す。この環化反応は、５０μＭペプチドおよび０．１μＭブテラーゼ１（０．００２モル濃度当量）を含有する５０μＬの反応混合物中で３７℃で行われ、ＭＳにより監視された。
【図１７】Ｃ末端のＡｓｎ−Ｈｉｓ−Ｖａｌモチーフで終止し、Ｎ末端のＧｌｙ−Ｉｌｅで開始する、修飾ＧＦＰのブテラーゼ介在性の環化を示す。この環化反応は、２５μＭ  ＧＦＰおよび０．１μＭブテラーゼ１（０．００４モル濃度当量）の存在下で行われた。この環化反応は、高分解能ＥＳＩ−ＭＳにより監視された。
【図１８】短いペプチドＧＩＧＫ（ビオチン）Ｒ（配列番号１３４）とのＧＦＰのブテラーゼ介在性連結を示す。この連結反応は、０．１２５μＭブテラーゼ１、５０μＭ  ＧＦＰおよび１ｍＭのペプチド基質の存在下で３７℃で３０分間にわたって行われ、ＭＳによって監視された。
【図１９】２０分間の温置の場合における、蛍光標識ペプチドＧＩＲ−ＡＭＣ（ＡＭＣ＝７−アミノ−４−メチルクマリン）と（ａ）ＡＢＬ−Ｍｏｎｏとの間、および蛍光標識ペプチドＧＩＲ−ＡＭＣと（ｂ）ＥＲＫ−Ｄａｒｐとの間の連結のマススペクトロメトリープロファイルを示す。７２３２および７３５４．８は、ＡＢＬ−Ｍｏｎｏおよび一度プロトン化されたその連結生成物のピークである。１０２５１．４および６０３１．３は、１回および２回プロトン化されたＥＲＫ−Ｄａｒｐ連結生成物のピークである。
【図２０Ａ】陰性対照としてのＥＲＫ−Ｄａｒｐ基質のＥＳＩ−ＭＳプロファイルを示す。
【図２０Ｂ】１ｍＭ  ＦＩＴＣ−ＧＫＮＨＶおよび５０ｎＭブテラーゼ１とともに４２℃で１０分間にわたり温置した５０μＭ  ＥＲＫ−ＤａｒｐのＥＳＩ−ＭＳプロファイルを示す。
【図２０Ｃ】陰性対照としてのＧＦＰ−ＮＨＶ基質のＥＳＩ−ＭＳプロファイルを示す。
【図２０Ｄ】１ｍＭ  ＦＩＴＣ−ＧＫＮＨＶおよび５０ｎＭブテラーゼ１とともに４２℃で１０分間にわたり温置した５０μＭ  ＧＦＰ−ＮＨＶのＥＳＩ−ＭＳプロファイルを示す。
【図２１】ユビキチン（配列番号１４８）とペプチドＹＫＮ−チオグリコール酸−Ｖとの間の連結のＨＰＬＣおよびＭＳプロファイルを示す。
【図２２Ａ】ブテラーゼ１介在性の二量体化の分析を示す。Ｇ２Ｋ二量体コアペプチドの構造である。
【図２２Ｂ】ブテラーゼ１介在性の二量体化の分析を示す。２つの異なる可能性のある単連結Ｇ２Ｋペプチドの構造である。
【図２２Ｃ】ブテラーゼ１介在性の二量体化の分析を示す。２つの異なる可能性のある単連結Ｇ２Ｋペプチドの構造である。
【図２２Ｄ】ブテラーゼ１介在性の二量体化の分析を示す。完全に連結された二量体ペプチドの構造である。
【図２２Ｅ】ブテラーゼ１介在性の二量体化の分析を示す。二量体化反応のマススペクトロメトリー分析は、単連結二量体および完全連結二量体の両方の存在を示す。
【図２３Ａ】ブテラーゼ介在性ペプチド環化のアクセプタ特異性を示す。この反応は、５０ｎＭブテラーゼ１、５０μＭペプチドの存在下で行われ、４２℃で６０分間にわたり温置された。ＨＰＬＣピークの面積を濃度に変換することによって、環化収率が計算された。ブテラーゼ１により促進されたＸＬＹＲＲＧＲＹＬＲＲＮＨＶ（配列番号１５７）の分子内環化である。
【図２３Ｂ】ブテラーゼ介在性ペプチド環化のアクセプタ特異性を示す。この反応は、５０ｎＭブテラーゼ１、５０μＭペプチドの存在下で行われ、４２℃で６０分間にわたり温置された。ＨＰＬＣピークの面積を濃度に変換することによって、環化収率が計算された。ブテラーゼ１により促進されたＸＲＬＹＲＧＲＹＬＲＲＮＨＶ（配列番号１５８）の分子内連結である。
【図２３Ｃ】ブテラーゼ介在性ペプチド環化のアクセプタ特異性を示す。この反応は、５０ｎＭブテラーゼ１、５０μＭペプチドの存在下で行われ、４２℃で６０分間にわたり温置された。ＨＰＬＣピークの面積を濃度に変換することによって、環化収率が計算された。ブテラーゼ１により促進されたＧＸＬＹＲＧＲＹＬＲＲＮＨＶ（配列番号１５９）の分子内連結である。
【図２４Ａ】プロスイフト（ＰｒｏＳｗｉｆｔ）ＣｏｎＡ−１Ｓ親和性カラム上に固定化されたブテラーゼ１によるペプチド基質コノトキシンの環状化アッセイを示す。
【図２４Ｂ】プロスイフト（ＰｒｏＳｗｉｆｔ）ＣｏｎＡ−１Ｓ親和性カラム上に固定化されたブテラーゼ１によるペプチド基質ＳＦＴＩの環状化アッセイを示す。
【図２４Ｃ】プロスイフト（ＰｒｏＳｗｉｆｔ）ＣｏｎＡ−１Ｓ親和性カラム上に固定化されたブテラーゼ１によるペプチド基質カラタＢ１の環状化アッセイを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、本発明者らの、非常に高い触媒活性によりペプチドを連結／環化可能なクリトリア・テルナテア（Ｃｌｉｔｏｒｉａ  ｔｅｒｎａｔｅａ）から単離されたペプチドリガーゼ／シクラーゼ酵素の同定に基づく。これは、Ｃ末端のトリペプチドモチーフ、Ａｓｘ−Ｈｉｓ−Ｖａｌを認識し、ソーティング配列Ｈｉｓ−Ｖａｌを切断するとともにＡｓｘをＮ末端残基に連結することによりペプチド骨格環化に介在して、環状形態を形成させる。意義深いことに、本酵素は、シクロチド前駆体と１４〜５８個の残基の大きさの範囲の様々なシステインに富むペプチドとを効率的に環化できるだけでなく、非システイン含有のペプチドおよびタンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）なども効率的に環化できる。これにより、所定のペプチドまたはタンパク質の環化が所望される様々な用途において、本酵素は非常に多目的および有用になる。
【００１６】
本発明は、第一の態様において、単離形態のこの酵素を包含し、より具体的には、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むか、基本的にそれからなるか、またはそれからなる、単離ポリペプチドを対象とする。配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプ
チドは、本明細書で「ブテラーゼ１」とも呼ばれる。「単離」は、本明細書で使用される場合、少なくとも部分的に他の細胞構成要素から分離されている形態のポリペプチドに関し、これは、天然であってもよく、または付随していてもよい。本ポリペプチドは、組み換えポリペプチド、すなわち天然にはそのポリペプチドを産生しない遺伝子操作生物中で産生されるポリペプチドであり得る。
【００１７】
本発明によるポリペプチドは、タンパク質連結活性を呈し、すなわち２個のアミノ酸残基の間のペプチド結合を形成可能であり、これらの２個のアミノ酸残基は、同じまたは異なるペプチドまたはタンパク質上、好適には同じペプチドまたはタンパク質上に位置し、前記連結活性によって前記ペプチドまたはタンパク質が環化されるようになる。したがって、様々な実施形態において、本発明のポリペプチドはシクラーゼ活性を有する。様々な実施形態において、このタンパク質連結またはシクラーゼ活性にはエンドペプチダーゼ活性も含まれ、すなわち本ポリペプチドは、２個のアミノ酸残基の間でペプチド結合を形成し、同時に既存のペプチド結合を切断する。これは、環化が、所定のペプチドの末端の間で起こる必要はなく、内部アミノ酸残基の間でも起こり得、環化のために使用されるアミノ酸に対するアミノ酸Ｃ末端またはＮ末端が切断されることを意味する。好ましい実施形態において、本ポリペプチドは、内部アミノ酸にＮ末端を連結させ、残留するＣ末端アミノ酸を切断することによって、環化ペプチドを形成する。
【００１８】
本明細書で開示されるようなポリペプチドは、連結が起こるアミノ酸Ｃ末端、すなわち連結されるペプチドのＣ末端が、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）またはアスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）の何れか、好適にはアスパラギンであるという点において、「Ａｓｘ特異的」である。様々な実施形態において、本発明によるポリペプチドはまた、アミド化されている、すなわちＣ末端カルボキシ基がアミド基に置換されている、Ｃ末端Ａｓｘ（ＮまたはＤ）残基を有するペプチドに対する連結活性も有する。このアミド基は、一連の連結反応で切断される。したがって、このようなアミド化ペプチド基質は、依然として連結／環化されながら、天然のトリペプチドモチーフＮＨＶを含まない。
【００１９】
「ポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、ペプチド結合により接続されるアミノ酸から作製されるポリマーに関する。本ポリペプチドは、本明細書で定義される場合、５０個以上のアミノ酸、好適には１００個以上のアミノ酸を含み得る。「ペプチド」は、本明細書で使用される場合、ペプチド結合により接続されるアミノ酸から作製されるポリマーに関する。本ペプチドは、本明細書で定義される場合、２個以上のアミノ酸、好適には５個以上のアミノ酸、より好適には１０個以上のアミノ酸、例えば１０〜５０個のアミノ酸を含み得る。
【００２０】
様々な実施形態において、本ポリペプチドは、アミノ酸配列であって、その全体の長さにわたり、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９０．５％、９１％、９１．５％、９２％、９２．５％、９３％、９３．５％、９４％、９４．５％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．２５％もしくは９９．５％同一であるかまたは相同であるアミノ酸配列を含むか、またはこれらからなる。いくつかの実施形態において、これは、アミノ酸配列であって、その全体の長さにわたり、配列番号１で示されるアミノ酸配列と、少なくとも６０％、好適には少なくとも７０％、より好適には少なくとも８０％、最も好適には少なくとも９０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を有するか、またはその全体の長さにわたり、配列番号１で示されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％、好適には少なくとも９０％、より好適には少なくとも９５％の配列相同性を共有するアミノ酸配列を有する。
【００２１】
様々な実施形態において、本ポリペプチドは、成熟酵素の前駆体であり得る。このような実施形態において、これは、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含み得るかまたはそれからなり得る。アミノ酸配列であって、その全体の長さにわたり、配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９０．５％、９１％、９１．５％、９２％、９２．５％、９３％、９３．５％、９４％、９４．５％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．２５％もしくは９９．５％同一であるかまたは相同であるアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含される。
【００２２】
核酸配列またはアミノ酸配列の同一性は一般に配列比較により決定される。この配列比較は、既存の技術で確立され、一般的に使用されるＢＬＡＳＴアルゴリズムに基づき（例えば、アルチュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら著（１９９０年）、「ベーシック・ローカル・アライメント検索ツール（Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ）」、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）第２１５巻、ｐ．４０３〜４１０およびアルチュールら著（１９９７年）：「ギャップ付きのＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：タンパク質データベース検索プログラムの新世代（Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ）」；ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）、第２５巻、ｐ．３３８９〜３４０２を参照）、それぞれ核酸配列およびアミノ酸配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の互いに関連がある類似の連続により原理的に達成される。関連する位置のテーブル状の関連は、「アライメント」と呼ばれる。配列比較（アライメント）、特に多重配列比較は一般的に、当業者にとって利用可能であり、公知であるコンピュータプログラムを用いて作成される。
【００２３】
この類の比較によって、比較されている配列の互いに対する類似性に関して述べることも可能になる。これは通常、パーセンテージ同一性、すなわち、アライメントにおいて同じ位置でのまたは互いに対応する位置での同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の割合として示される。より広く解釈される「相同性」という用語は、アミノ酸配列に関連して、保存的アミノ酸交換、すなわち類似の化学活性を有するアミノ酸の考慮も、これらが通常、タンパク質内で類似の化学活性を発揮するので、包含する。したがって、比較配列の類似性は、「パーセンテージ相同性」または「パーセンテージ類似性」としても示され得る。同一性および／または相同性の指摘は、ポリペプチドまたは遺伝子全体にわたり、または個別の領域のみにわたり行われ得る。したがって、様々な核酸配列またはアミノ酸配列の相同および同一領域は、配列中の一致により定義される。このような領域は、同一の機能を呈することが多い。これらは小さいものであり得、数ヌクレオチドまたは数アミノ酸のみを包含し得る。この類の小さい領域は、タンパク質の全体的活性に必須である機能を発揮することが多い。したがって、これは、個々の領域のみ、および任意選択による小さい領域のみに対する配列の一致を指すために有用であり得る。しかし、別段の断りがない限り、本明細書中での同一性および相同性の指摘は、それぞれ示された核酸配列またはアミノ酸配列の全長を指す。
【００２４】
様々な実施形態において、本明細書に記載のポリペプチドは、配列番号１の位置１９に対応する位置のアミノ酸残基Ｎ；および／または配列番号１の位置１２４に対応する位置のアミノ酸残基Ｈ；および／または配列番号１の位置１６６に対応する位置のアミノ酸残基Ｃを含む。これらのアミノ酸残基は推定的に、このポリペプチドの触媒活性に関与することが分かっている。したがって、好ましい実施形態において、本ポリペプチドは、所定のまたは対応する位置での前述の残基のうちの少なくとも２個、より好適には３個全てを含む。
【００２５】
本発明の単離ポリペプチドは、好適には酵素活性、特にタンパク質リガーゼ活性、好適にはシクラーゼ活性を有する。様々な実施形態において、これは、それらが８０％以上、好適には９０％以上の効率で所定のペプチドを連結することができることを意味する。このタンパク質連結反応、好適には環化反応は、好適には比較的速く、すなわちこのポリペプチドは、５００μＭ以下、好適には２５０μＭ以下のＫｍ；および／または少なくとも０．０５ｓ−１、好適には少なくとも０．５ｓ−１、より好適には少なくとも１．０ｓ−１、最も好適には少なくとも１．５ｓ−１のｋｃａｔで所定のペプチドを環化することができる。好ましいポリペプチドは、両要件、すなわちＫｍおよびｋｃａｔ要件を満たす。このようなミカエリス−メンテン速度式を決定するための方法は当技術分野で周知であり、当業者により日常的に適用され得る。本発明のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有する酵素のタンパク質リガーゼ活性の少なくとも５０％、より好適には少なくとも７０％、最も好適には少なくとも９０％を有することが好ましい。
【００２６】
本明細書に記載の実施形態によるポリペプチドは、アミノ酸改変、特にアミノ酸の置換、挿入または欠失を含み得る。このようなポリペプチドは、例えば、標的遺伝子組み換えによって、すなわち突然変異誘発方法によってさらに開発され、具体的な目的に対して、または特定の特性に関して（例えば、それらの触媒活性、安定性などに関して）最適化される。さらに、本明細書で企図される核酸は、組み換え処方物に導入され、それによって完全に新規のタンパク質リガーゼ、シクラーゼまたは他のポリペプチドを作製するために使用することができる。
【００２７】
様々な実施形態において、リガーゼ／シクラーゼ活性を有するポリペプチドは、翻訳後に修飾、例えばグリコシル化され得る。このような修飾は、組み換え手段によって、すなわち産生時に宿主細胞において直接的に行われ得るか、または、例えばインビトロで、ポリペプチドの合成後に化学的もしくは酵素的に達成され得る。
【００２８】
目標は、例えば基質特異性を変化させる、および／または触媒活性を向上させるために、標的突然変異、例えば置換、挿入または欠失などを既知の分子に導入することであり得る。この目的のために、特に、分子の表面電荷および／または等電点ならびにそれによる基質とのそれらの相互作用が改変され得る。あるいは、またはさらに、ポリペプチドの安定性は、１つ以上の対応する突然変異により促進されることができ、それによりその触媒性能が向上する。個々の突然変異、例えば個々の置換の有利な特性は互いに補い得る。
【００２９】
様々な実施形態において、ポリペプチドは、最初の（ｉｎｉｔｉａｌ）分子としての上記のようなポリペプチドから１つまたは複数の保存的アミノ酸置換によって得ることが可能であることを特徴とし得る。「保存的アミノ酸置換」という用語は、あるアミノ酸残基の別のアミノ酸残基との交換（置換）を意味し、このような交換は、交換されたアミノ酸の位置での極性または電荷の変化につながらない、例えば非極性アミノ酸残基の別の非極性アミノ酸残基への交換である。本発明に関連する保存的アミノ酸置換は、例えばＧ＝Ａ＝Ｓ、Ｉ＝Ｖ＝Ｌ＝Ｍ、Ｄ＝Ｅ、Ｎ＝Ｑ、Ｋ＝Ｒ、Ｙ＝Ｆ、Ｓ＝Ｔ、Ｇ＝Ａ＝Ｉ＝Ｖ＝Ｌ＝Ｍ＝Ｙ＝Ｆ＝Ｗ＝Ｐ＝Ｓ＝Ｔを包含する。
【００３０】
あるいは、またはさらに、ポリペプチドは、断片化によって、または欠失、挿入もしくは置換の突然変異誘発によって、最初の分子として本明細書で企図されるポリペプチドから得ることが可能であることを特徴とし得、少なくとも１５０個、１６０個、１７０個、１８０個、１９０個、２００個、２１０個、２２０個、２３０個、２４０個、２５０個、２６０個、２７０個、２８０個、２９０個、３００個、３１０個、３２０個、３２５個、３３０個、３３１個、３３２個、３３３個、３３４個、３３５個、３３６個、３３７個、３３８個、３３９個、３４０個、３４１個または３４２個の連続的に接続されるアミノ酸
の長さにわたり、最初の分子に一致するアミノ酸配列を包含する。このような実施形態において、最初の分子中に含有されるアミノ酸Ｎ１９、Ｈ１２４およびＣ１６６が依然として存在することが好ましい。
【００３１】
したがって、様々な実施形態において、本発明は、酵素活性を保持する、本明細書に記載のポリペプチドの断片にも関する。これらが、最初の分子、好適には配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドのタンパク質リガーゼ活性および／またはシクラーゼ活性の、少なくとも５０％、より好適には少なくとも７０、最も好適には少なくとも９０％を有することが好ましい。この断片は、好適には少なくとも１５０アミノ酸長、より好適には少なくとも２００アミノ酸長または２５０アミノ酸長、最も好適には少なくとも３００アミノ酸長である。これらの断片が配列番号１の位置１９、１２４および１６６に対応する位置のアミノ酸Ｎ、ＨおよびＣを含むことがさらに好ましい。したがって、好ましい断片は、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸１９〜１６６、より好適には１０〜２００、最も好適には１〜２７７を含む。
【００３２】
本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸分子、ならびにこのような核酸を含有するベクター、特にコピーベクターまたは発現ベクターも本発明の一部をなす。
これらはＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であり得る。これらは、個々の鎖として、この個々の鎖に相補的な個々の鎖として、または２本鎖として存在し得る。特にＤＮＡ分子の場合、３つの可能性のある読み枠の全部における両相補鎖の配列が各場合に考慮されるべきである。異なるコドン、すなわち塩基のトリプレットが同じアミノ酸をコードし得る結果、特定のアミノ酸配列が複数の異なる核酸によってコードされ得るという事実も考慮すべきである。遺伝コードのこの縮重の結果として、上記のポリペプチドのうちの１つをコードし得る全ての核酸配列が本発明のこの対象に含まれる。遺伝コードの縮重にもかかわらず、定められたアミノ酸は個々のコドンに関連付けられるべきであるため、当業者は、明確にこれらの核酸配列を決定することが可能である。したがって、当業者は、アミノ酸配列から開始して、そのアミノ酸配列をコードする核酸を容易に確認することができる。さらに、本発明による核酸に関連して、１つ以上のコドンが同義のコドンにより置換され得る。この態様は、特に本明細書で企図される酵素の異種発現を指す。例えば、全ての生物、例えば産生株の宿主細胞は、特異的なコドン使用を有する。「コドン使用」は、それぞれの生物によるアミノ酸への遺伝コードの翻訳として理解される。タンパク質生合成におけるボトルネックは、核酸上に位置するコドンが、その生物において、比較的少数の負荷されるｔＲＮＡ分子に向かう場合に起こり得る。さらに、同じアミノ酸をコードし、その結果、その生物において、あるコドンが、同じアミノ酸をコードする同義のコドンよりも低い効率で翻訳されるようになる。当該同義のコドンに対するより多くのｔＲＮＡ分子が存在するため、後者は、その生物においてより効率的に翻訳され得る。
【００３３】
例えば、分子生物学またはタンパク質化学の標準的方法と組み合わせた、化学合成またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）など、今日一般的に知られる方法により、当業者は、既知のＤＮＡ配列および／またはアミノ酸配列に基づいて、対応する核酸を完全な遺伝子にまで製造することができる。このような方法は、例えばサンブルック，Ｊ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッチュ，Ｅ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）およびマニアティス，Ｔ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ）著、２００１年、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ）、第３版、コールド・スプリング・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）から知られている。
【００３４】
「ベクター」は、本明細書の目的のために、特徴となる核酸領域として本明細書で企図される核酸を含有する、核酸から作られる構成要素として理解される。これらは、１つの種または細胞株において、複数の世代または細胞分裂にわたり、この核酸を安定な遺伝子
要素として確立させることができる。特に細菌において使用される場合、ベクターは特別なプラスミド、すなわち環状遺伝子要素である。本明細書中での文脈において、本明細書で企図されるような核酸はベクターにクローニングされる。ベクターに含まれるものは、例えば、細菌プラスミド、ウイルスもしくはバクテリオファージに由来するベクターか、または多岐にわたり異なる派生の要素を有する主に合成のベクターまたはプラスミドである。各場合に存在するさらなる遺伝子要素を用いて、ベクターは、適切な宿主細胞における安定なユニットとして、複数世代にわたってベクター自体を確立することが可能である。これらは、個別のユニットとして染色体外に存在し得るか、または染色体もしくは染色体ＤＮＡに組み込まれ得る。
【００３５】
発現ベクターは、それらベクターを含有する宿主細胞において、好ましくは微生物、特に好適には細菌において、複製することが可能であり、含まれる核酸をそこで発現することが可能な核酸配列を包含する。したがって、様々な実施形態において、本明細書に記載のベクターはまた、本発明のポリペプチドをコードする核酸の発現を制御する調節エレメントも含有する。発現は、特に転写を調節する１つまたは複数のプロモータにより影響を受ける。発現は、原則的に、発現される核酸の前に元来位置する天然のプロモータによって起こり得るが、発現ベクター上に供えられる宿主細胞のプロモータによっても、または別の生物もしくは別の宿主細胞の修飾されたもしくは完全に異なるプロモータによっても起こり得る。この場合、本明細書で企図されるような核酸の発現のための少なくとも１つのプロモータが利用可能になり、その発現のために使用される。発現ベクターは、例えば培養条件の変化によって、またはそれらを含有する宿主細胞が特定の細胞密度に到達した際に、または特定の物質、特に遺伝子発現のアクティベータの添加によって、さらに調節され得る。このような物質の一例は、ガラクトース誘導体イソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）であり、これは、細菌ラクトースオペロン（ｌａｃオペロン）のアクティベータとして使用される。発現ベクターと対照的に、含有される核酸はクローニングベクターでは発現されない。
【００３６】
さらなる態様において、本発明は、本明細書で企図されるような核酸または本明細書で企図されるようなベクターを含有する宿主細胞、好適には非ヒト宿主細胞も対象とする。本明細書で企図されるような核酸またはこの核酸を含有するベクターは、好適には微生物に形質転換され、この微生物は実施形態による宿主細胞に相当する。細胞の形質転換のための方法は、既存の技術分野において確立されており、当業者にとって十分に公知である。全ての細胞は、原則的に宿主細胞として適切であり、すなわち原核細胞または真核細胞である。遺伝的に有利であるように、例えば、核酸またはベクターを用いる形質転換とその安定した確立とに関して、操作され得る宿主細胞が好ましく、例えば単細胞真菌または細菌である。さらに、好ましい宿主細胞は、微生物学的およびバイオテクノロジー条件において容易に操作されることで知られている。これは、例えば、容易な培養可能性と、高増殖速度と、発酵培地に関して要求が低いことと、外来タンパク質に対する良好な産生および分泌率とを指す。本ポリペプチドは、それらの製造後、それらを産生する細胞により、例えば糖分子の添加、ホルミル化、アミン化などによってさらに修飾され得る。この類の翻訳後修飾は、本ポリペプチドに機能的に影響し得る。
【００３７】
さらなる実施形態は、例えばベクター上で利用可能にされるがこれら細胞中にも推測的に存在し得る遺伝子調節エレメントに基づいて活性が調節され得る、宿主細胞によって表される。これらは、例えば、アクティベータとして作用する化学物質のコントロールされた添加によって、培養条件を改変することによって、または特定の細胞密度に到達する際に、発現するように刺激され得る。これにより、本明細書で企図されるタンパク質の経済的産生が可能になる。既に記載のように、このような化合物の一例はＩＰＴＧである。
【００３８】
好ましい宿主細胞は原核細胞または細菌細胞である。細菌は、短い世代時間と培養条件
に関して要求が少ないこととによって知られている。結果として、経済的な培養方法または製造方法が確立され得る。さらに、当業者は、発酵技術における細菌に関して豊富な経験を有する。グラム陰性またはグラム陽性細菌は、栄養源、生成物形成速度、時間的要件など、個々の場合に実験的に確認されるべき多岐にわたる理由のために、特定の産生例に対して適切であり得る。
【００３９】
本明細書で企図される宿主細胞は、培養条件のためのそれらの要求に対して改変されることができるか、他のもしくはさらなる選択マーカを含み得るか、または他のもしくはさらなるタンパク質を発現させることもできる。これらは、特に、複数のタンパク質または酵素をトランスジェニックに発現する宿主細胞であり得る。
【００４０】
しかし、宿主細胞はまた、細胞核を保持することを特徴とする真核細胞であってもよい。したがって、さらなる実施形態は、細胞核を保持することを特徴とする宿主細胞によって表され得る。原核細胞と対照的に、真核細胞は、形成されるタンパク質を翻訳後修飾することが可能である。その例は、放線菌などの真菌、またはサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）もしくはクリベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）などの酵母である。これは、例えば、タンパク質が、それらの合成に関して、このような系により可能となる特定の修飾を受けることが意図される場合、特に有利であり得る。真核系が特にタンパク質合成と合わせて行う修飾の１つに、例えば、膜アンカーまたはオリゴ糖などの低分子量化合物の結合が挙げられる。
【００４１】
本明細書で企図される宿主細胞は、通常のように、例えば不連続的または連続的な系において培養および発酵される。前者の場合において、適切な栄養培地に宿主細胞を接種し、実験的に確認されるべき期間の後、その培地から生成物が回収される。連続発酵は、比較的長い期間にわたり細胞が一部は死滅するが一部は再生する流動均衡の達成が知られており、形成されるタンパク質が同時に培地から取り出され得る。
【００４２】
本明細書で企図される宿主細胞は、好適には、本明細書に記載のポリペプチドを製造するために使用される。
したがって、本発明のさらなる態様は、本明細書に記載されるようなポリペプチドを製造するための方法であって、本明細書で企図される宿主細胞を培養すること、およびそのポリペプチドを培養培地または宿主細胞から単離することを含む、方法である。培養条件および培地は、当技術分野で公知の一般的知識および技術を用いることによって使用される宿主生物に基づき、当業者により選択され得る。
【００４３】
またさらなる態様において、本発明は、タンパク質連結、特に１つ以上のペプチドの環化を行うための、上記のポリペプチドの使用に関する。
（ｉ）配列番号３〜１０９で示されるアミノ酸配列のうちの任意の１つ；
（ｉｉ）アミノ酸配列であって、その全体の長さにわたり、（ｉ）のアミノ酸配列のうちの任意の１つと、少なくとも６０％、好適には少なくとも７０％、より好適には少なくとも８０％、最も好適には少なくとも９０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）アミノ酸配列であって、その全体の長さにわたり、（ｉ）のアミノ酸配列のうちの任意の１つと、少なくとも８０％、好適には少なくとも９０％、より好適には少なくとも９５％の配列相同性を共有するアミノ酸配列；または
（ｉｖ）少なくとも２つのペプチドもしくはタンパク質を連結するか、または１つのペプチドもしくはタンパク質を環化するための、リガーゼ／シクラーゼ活性を有する、（ｉ）〜（ｉｉｉ）のうちの任意の１つの断片
を含むか、基本的にそれからなるか、またはそれからなるポリペプチドの使用も包含される。
【００４４】
このような使用の様々な実施形態において、配列番号３〜１０９で示されるアミノ酸配列に基づく（ｉ）〜（ｉｖ）によるポリペプチドは、上記のものなど、配列番号１に基づくポリペプチドである。これは、特に、配列番号１の位置１９、１２４および１６６に対応する位置における保存的アミノ酸残基Ｎ、ＨおよびＣ、ならびに／またはそれらの活性および機能性に関する。
【００４５】
本明細書に記載の酵素の使用がペプチド基質を参照することにより後述される一方で、これらは、対応するポリペプチドまたはタンパク質に対して同様に使用され得ることが理解される。したがって、本発明はまた、ポリペプチドまたはタンパク質が基質として使用される実施形態にも及ぶ。これらのポリペプチドまたはタンパク質は、ペプチド基質に関連して下記のような構造モチーフを含み得る。機能性を保持するヒトペプチドホルモンの断片などのペプチド断片、あるいは、例えばチオデプシペプチドを含む、（骨格）修飾ペプチドなどのペプチド誘導体が利用される実施形態も包含される。したがって、本発明はまた、本明細書で開示されるペプチド基質の断片および誘導体にも及ぶ。
【００４６】
様々な実施形態において、連結または環化されるペプチドは、リガーゼ／シクラーゼにより認識、結合および連結される認識連結配列を含有する限り、一般的には少なくとも１０アミノ酸長の任意のペプチドであり得る。連結または環化されるペプチドのこのアミノ酸配列は、アミノ酸残基ＮまたはＤ、好適にはＮを含み得る。様々な実施形態において、環化されるペプチドは、アミノ酸配列（Ｘ）ｏＮ／Ｄ（Ｘ）ｐを含み、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｏは１以上、好適には２以上の整数であり、かつｐは１以上、好適には２以上の整数である。好ましい実施形態において、（Ｘ）ｐは、Ｈ（Ｘ）ｒまたはＨＶ（Ｘ）ｒであり、ｒは０または１以上の整数である。より好ましい実施形態において、本ペプチドは、アミノ酸配列（Ｘ）ｏＮＨまたは（Ｘ）ｏＮＨＶを含む。このアミノ酸配列は、好適には、連結／環化中にＮに対する全アミノ酸Ｃ末端が切断されるため、連結または環化されるペプチドのＣ末端に、またはその付近に位置する。したがって、全ての前述の実施形態において、ｐまたはｒは、好適には２０以下の整数、好適には５以下の整数である。特に好ましいのは、ｐが２であり（Ｘ）ｐが好適にはＨＸもしくはＨＶであるか、またはｒが０である、実施形態である。
【００４７】
代替的な実施形態において、連結または環化されるペプチドはアミノ酸配列（Ｘ）ｏＮ＊／Ｄ＊を含み得、このアミノ酸配列において、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｏは２以上の整数であり、かつＣ末端カルボキシ基（ＮまたはＤ残基の）は式−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ’）２の基により置換され、Ｒ’は例えばアルキルなどの任意の残基である。このような実施形態において、ＮまたはＤ残基の末端−Ｃ（Ｏ）ＯＨ基、好適にはＤの場合のアルファ−カルボキシ基は、基−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ’）２を形成させるために修飾される。これらのＣ末端がアミド化されているＤまたはＮ残基は、本明細書ではそれぞれＤ＊およびＮ＊により示される。本明細書で開示される酵素は、アミド基を切断し、このＮまたはＤ残基を関心のある別のペプチドのＮ末端またはＮもしくはＤ残基を含む同じペプチドのＮ末端に連結し得ることが分かった。
【００４８】
連結されるペプチドのＮ末端部分は、好適には、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２（Ｘ）ｑを含み、このアミノ酸配列において、Ｘは任意のアミノ酸であってよく；Ｘ１は、Ｐｒｏを除く任意のアミノ酸であってよく；Ｘ２は、任意のアミノ酸であってよいが、好適には疎水性アミノ酸、例えばＶａｌ、ＩｌｅもしくはＬｅｕ、またはＣｙｓであり；かつｑは、０または１以上の整数である。好ましいのは、Ｘ１の位置において、次の順序である：Ｇ＝Ｈ＞Ｍ＝Ｗ＝Ｆ＝Ｒ＝Ａ＝Ｉ＝Ｋ＝Ｌ＝Ｎ＝Ｓ＝Ｑ＝Ｃ＞Ｔ＝Ｖ＝Ｙ＞Ｄ＝Ｅ。「＝」は、それぞれのアミノ酸が同様に好ましいことを示し、一方で「＞」は、この印の前に挙げられるアミノ酸が、この印の後に挙げられるものよりも好ましいことを示す。Ｘ２位置において好ましいのは、次の順序である：Ｌ＞Ｖ＞Ｉ＞Ｃ＞Ｔ＞Ｗ＞Ａ＝Ｆ＞Ｙ＞Ｍ＞Ｑ＞Ｓ
。Ｘ２位置において、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｒ、ＮおよびＨはあまり好ましくない。Ｘ１位置において特に好ましいのはＧおよびＨであり、Ｘ２位置においては、Ｌ、Ｖ、ＩおよびＣであり、例えばジペプチド配列ＧＬ、ＧＶ、ＧＩ、ＧＣ、ＨＬ、ＨＶ、ＨＩおよびＨＣである。
【００４９】
したがって、好ましい実施形態において、連結または環化されるペプチドは、ＮからＣ末端方向で、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２（Ｘ）ｑ（Ｘ）ｏＮ／Ｄ（Ｘ）ｐを含み、このアミノ酸配列において、Ｘ、Ｘ１、Ｘ２、ｏ、ｐおよびｑは上記のように定められ、ｏは、好適には少なくとも７である。様々な実施形態において、（１）ｑは０であり、ｏは、少なくとも７の整数であり；および／または（２）Ｘ１はＧもしくはＨであり；および／または（３）Ｘ２はＬ、Ｖ、ＩもしくはＣであり；および／または（４）ｐは２以上であるが２２以下であり、好適には２〜７であり、より好適にはＨ（Ｘ）ｒもしくはＨＶ（Ｘ）ｒであり、最も好適にはＨＸもしくはＨＶである。様々な実施形態において、（１）ｑは０であり、ｏは少なくとも７の整数であり；（２）Ｘ１はＧまたはＨであり；（３）Ｘ２はＬ、Ｖ、ＩまたはＣであり；（４）ｐは２以上であるが、２２以下であり、好適には２〜７であり、より好適にはＨ（Ｘ）ｒまたはＨＶ（Ｘ）ｒ、最も好適にはＨＸまたはＨＶである。
【００５０】
様々な実施形態において、環化されるペプチドは、環状シスチンノットポリペプチド、特にシクロチドの線状の前駆体型である。シクロチドは、非常に安定な植物タンパク質のトポロジー的にユニークなファミリーである。これらは、６個の保存的システイン残基に関連するシスチンノットモチーフによりさらに制限される、ヘッドトゥーテールの環化ペプチド骨格で並べられる約３０個のアミノ酸を含む。このシスチンノットは、２個のジスルフィド結合と、第三のジスルフィド結合が通されてインターロッキングおよび交差ブレース構造を形成する構造において内部の環を形成するそれらの接続骨格セグメントとから組み立てられる。このシスチンノットコアモチーフ上に重ねられるのは、表面が露出した短いループを呈する、明確に定義されたベータシートおよび一連のターンである。
【００５１】
シクロチドは、それらの骨格ループ内で様々なペプチド配列を表し、広範囲の生物学的活性を有する。したがって、これらは、薬学的用途のための大きな関心である。これらが由来する一部の植物は、カラタ−カラタ（ｋａｌａｔａ−ｋａｌａｔａ）を含め、民間薬において使用される。カラタ−カラタは、原型の（ｐｒｏｔｏｔｙｐｉｃ）シクロチドであるカラタＢ１（ｋＢ１）を含有し、アフリカで分娩を加速するために使用される、植物オルデンランディア・アフィニス（Ｏｌｄｅｎｌａｎｄｉａ  ａｆｆｉｎｉｓ）由来の茶である。その高い安定性は、これらが、ペプチドに基づく薬物設計用途における可能性のある鋳型として注目されていることを意味する。特に、シクロチドのフレームワークへと生理活性ペプチド配列をグラフト化することによって、ペプチドに基づく治療剤を安定化し、それによって薬物としてのペプチドの使用における大きい制限の１つを克服するための新しいアプローチの見込みがもたらされる。
【００５２】
したがって、様々な実施形態において、環化されるペプチドは、１０個以上のアミノ酸長、好適には５０個以下のアミノ酸であり、いくつかの実施形態において、約２５〜３５個のアミノ酸長である。この環化されるペプチドは、配列番号１１０で示されるオルデナンディア・アフィニス由来のシクロチドであるカラタＢ１の前駆体のアミノ酸を含み得るか、またはそれからなり得る。
【００５３】
様々な実施形態において、環化されるペプチドは、アミノ酸配列（Ｘ）ｎＣ（Ｘ）ｎＣ（Ｘ）ｎＣ（Ｘ）ｎＣ（Ｘ）ｎＣ（Ｘ）ｎＣ（Ｘ）ｎＮＨＶ（Ｘ）ｎを含むか、またはそれからなり、このアミノ酸配列において、各ｎは、１〜６から独立に選択される整数であり、かつＸは任意のアミノ酸であり得る。このようなペプチドは、上記のように、６個の
システイン残基間でシスチン結合を形成する環状シスチンノットポリペプチドの前駆体であり、この前駆体は、Ｃ末端のＨＶ（Ｘ）ｎ配列を切断し、次いでＣ末端のＮ残基をＮ末端残基と連結することにより、本明細書に記載の酵素によって環化されることができる。
【００５４】
環化されるペプチドは、様々な実施形態において、米国特許出願公開第２０１２／０２４４５７５号明細書で開示される線状前駆体を含み得る。この文献は、この目的のために、その全体において参照により本明細書に組み込まれる。
【００５５】
様々なさらなる実施形態において、環化されるペプチドとしては、コノトキシン、タナチン（昆虫抗菌ペプチド）およびヒスタチン（ヒト唾液抗菌ペプチド）などのペプチド毒素および抗菌ペプチドの線状前駆体が挙げられるが、それらに限定されない。環化され得る他のペプチドは、ニューロメジン、サリューシンアルファ、アペリンおよびガラニンを含むがそれらに限定されない、環状ヒトペプチドホルモンまたは環状動物ペプチドホルモンの前駆体である。例示的なペプチドは、配列番号１１１〜１１６および１２８〜１３２で示されるアミノ酸配列のうちの任意の１つを含むかまたはそれからなる。
【００５６】
本明細書で開示される酵素および方法を用いて連結または環化され得るさらなるペプチドとしては、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、アドレノメデュリン、インターメジン、プロアドレノメデュリン、アドロピン、アゲレニン、ＡＧＲＰ、アラリン（Ａｌａｒｉｎ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質５、アミリン、アミロイドｂ−タンパク質、両親媒性ペプチド抗生物質、ＬＡＨ４、アンジオテンシンＩ、アンジオテンシンＩＩ、Ａ型（心房性）ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、アパミン、アぺリン、ビバリルジン、ボンベシン、リジル−ブラジキニン、Ｂ型（脳性）ナトリウム利尿ペプチド、Ｃ−ペプチド（インスリン前駆体）、カルシトニン、コカイン・アンフェタミン調節転写産物（ＣＡＲＴ）、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、コレシストキニン（ＣＣＫ）−３３、サイトカイン誘導性好中球走化性因子−１／増殖関連癌遺伝子（ＣＩＮＣ）、コリベリン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子（ＣＲＦ）、コルチスタチン、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、デコルシン（Ｄｅｃｏｒｓｉｎ）、ヒト好中球ペプチド−１（ＨＮＰ−１）、ＨＮＰ−２、ＨＮＰ−３、ＨＮＰ−４、ヒトデフェンシンＨＤ５、ＨＤ６、ヒトベータデフェンシン−１（ｈｂｄ１）、ｈｂｄ２、ｈｂｄ３、ｈｂｄ４、デルタ睡眠誘発ペプチド（ＤＳＩＰ）、ダームシジン−１Ｌ、ダイノルフィンＡ、エラフィン、エンドキニンＣ、エンドキニンＤ、ｂ−リポトロピン、ｇ−エンドルフィン、エンドセリン−１，エンドセリン−２、エンドセリン−３、ビッグ−エンドセリン−１、ビッグ−エンドセリン−２、ビッグ−エンドセリン−３、エンフビリチド（Ｅｎｆｕｖｉｒｉｔｉｄｅ）、エキセンディン−４、ＭＢＰ、ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質（ＭＯＧ）、Ｇｌｕ−フィブリノペプチドＢ、ガラニン、ガラニン様ペプチド、ビッグガストリン（ヒト）、胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）、ガストリン放出ペプチド、グレリン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、ＧＬＰ−２、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ、ＧＨＲＦ）、グアニリン、ウログアニリン、ウログアニリン異性体Ａ、ウログアニリン異性体Ｂ、ヘプシジン、肝臓発現抗菌ペプチド（ＬＥＡＰ−２）、ヒューマニン、ジョイニングペプチド（ｒＪＰ）、キスペプチン−１０、キスペプチン−５４、リラグルチド、ＬＬ−３７（ヒトカテリシジン）、黄体化ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、マガイニン１、マストパラン、ａ−接合因子、肥満細胞脱顆粒（ＭＣＤ）ペプチド、メラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）、ａ−メラニン細胞刺激ホルモン（アルファ−ＭＳＨ）、ミッドカイン、モチリン、神経内分泌調節ペプチド１（ＮＥＲＰ１）、ＮＥＲＰ２、ニューロキニンＡ、ニューロキニンＢ、ニューロメジンＢ、ニューロメジンＣ、ニューロメジンＳ、ニューロメジンＵ８、ニューロノスタチン−１３、ニューロペプチドＢ−２９、ニューロペプチドＳ（ＮＰＳ）、ニューロペプチドＷ−３０、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、ニューロテンシン、ノシセプチン、ノシスタチン、オベスタチン、オレキシン−Ａ、オステオカルシン、オキシトシン、カテスタチン、クロモグラニンＡ、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ
）、ペプチドＹＹ、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド３８（ＰＡＣＡＰ−３８）、血小板因子−４、プレクタシン、プレイオトロフィン、プロラクチン放出ペプチド、ピログルタミン化ＲＦアミドペプチド（ＱＲＦＰ）、ＲＦアミド関連ペプチド−１、セクレチン、血清胸腺因子（ＦＴＳ）、ナトリウムカリウムＡＴＰアーゼ阻害剤−１（ＳＰＡＩ−１）、ソマトスタチン、ソマトスタチン−２８、ストレスコピン、ウロコルチン、サブスタンスＰ、エキスタチン、エンテロトキシンＳＴｐ、ガンギシトキシン（Ｇｕａｎｇｘｉｔｏｘｉｎ）−１Ｅ、ウロテンシンＩＩ、血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）およびバソプレシンならびにそれらの断片および誘導体が挙げられるが、それらに限定されない。前述のペプチドは、ヒト由来、またはラット、マウス、ブタなどの動物由来のものであり得る。それらの全ては当業者にとって周知であり、それらのアミノ酸配列は容易に入手可能である。
【００５７】
様々な他の実施形態において、５０個のアミノ酸長を超えるポリペプチドまたはタンパク質が環化基質として使用される。このような反応において、このポリペプチド／タンパク質は、そのＣ末端をそのＮ末端に連結することによって環化され得る。
【００５８】
様々な実施形態において、本発明の酵素によって２つ以上のペプチドが連結される。これは、２つ以上のペプチドからなる大環状分子の形成を含んでよく、大環状二量体が好ましい。連結されるペプチドは、それらのうちの少なくとも１つが、リガーゼ／シクラーゼによって認識、結合、および連結される認識連結配列を含有する限り、任意のペプチドであり得る。適切なペプチドは、環化ストラテジーと関連して上に記載している。同じまたは異なり得る別のペプチドへの連結のために、複数の同じペプチドを使用することもできる。連結されるペプチドの１つは、例えば酵素活性または別の生物学的機能を有するポリペプチドであり得る。連結されるペプチドは、マーカペプチド、または蛍光マーカもしくはビオチンなどの検出可能マーカを含むペプチドを含むこともできる。このような実施形態によれば、生理活性を有するポリペプチドは検出可能マーカに融合され得る。様々な実施形態において、連結されるペプチドのうちの少なくとも１つは、２５個以上のアミノ酸の長さ、好適には５０個以上のアミノ酸の長さ（したがって、本発明の意味において「ポリペプチド」であり得る）を有する。
【００５９】
連結されるペプチドは、配列番号１１７〜１２７で示されるアミノ酸配列の何れかを含み得るか、またはそれからなり得る。（大環状）二量体を形成させるために連結される好ましいペプチドとしては、配列番号１１７〜１２１のうちの任意の１つにおいて示されるアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられる。線状融合ペプチドを形成させるために（一方のＣ末端ペプチドと）連結される好ましいＮ末端ペプチドとしては、配列番号１１２、１１５および１１７のうちの任意の１つにおいて示されるアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられる。線状融合ペプチドを形成させるために（一方のＮ末端ペプチドと）連結される好ましいＣ末端ペプチドとしては、配列番号１１３、１１４および１１６のうちの任意の１つにおいて示されるアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられる。
【００６０】
連結または環化されるペプチドは、Ａｓｘ含有タグが、連結または融合される関心のあるペプチドのＣ末端に融合されている、融合ペプチドまたはポリペプチドでもあり得る。Ａｓｘ含有タグは、好適には、アミノ酸配列Ｎ／Ｄ（Ｘ）ｐを有し、Ｘは任意のアミノ酸であり、かつｏおよびｐは両方とも、互いに独立に、１以上、好適には２以上の整数である。好ましい実施形態において、タグは、（Ｃ末端）アミノ酸配列ＮＨまたはＮＨＶを含むか、またはこれらからなる。あるいは、アミド化ＮまたはＤ（上記で定められるようなＮ＊またはＤ＊）は、連結もしくは融合されるペプチドまたはポリペプチドのＣ末端に融合され得る。この融合ペプチドまたはポリペプチドが連結される他のペプチドは、上記で定められるとおりであり得る。あるいは、融合ペプチドまたはポリペプチドは、そのＣ末端とＮ末端との間の結合を形成させることによって環化され得る。ある実施形態において
、融合ペプチドまたはポリペプチドは、アミノ酸配列ＮＨＶ（配列番号１３３）のＣ末端タグに融合される緑色蛍光タンパク質であってよく、連結されるペプチドは、アミノ酸配列ＧＩＧＫ（ビオチン化）Ｒ（配列番号１３４）のビオチン化ペプチドであってよい。一般に、ペプチド、例えばシグナル伝達または検出可能部分を有するペプチドなどに連結され得るか、または本明細書に記載の方法および使用を用いて環化され得るポリペプチドおよびタンパク質としては、抗体、抗体断片、抗体様分子、抗体模倣物、ペプチドアプタマ、ホルモン、様々な治療用タンパク質などが挙げられるが、それらに限定されない。
【００６１】
様々な実施形態において、リガーゼ活性は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などのフルオレセイン、または７−アミノ−４−メチルクマリンなどのクマリンを含む、蛍光基など、検出可能な部分を有するペプチドを、上記のものなどのポリペプチドまたはタンパク質に融合するために使用される。様々な実施形態において、タンパク質は、例えば配列番号１４６で示されるアミノ酸配列を有する、ヒト抗ＡＢＬ  ｓｃＦｖなどの抗体断片であってよく、または、例えば配列番号１４７で示されるアミノ酸配列を有するダルピン（ｄａｒｐｉｎ）（設計されたアンキリン反復タンパク質）、例えばヒトＥＲＫに特異的なダルピンなどの抗体模倣物であってよい。
【００６２】
さらに別の態様において、本発明は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を環化するための方法であって、このペプチドの環化を可能にする条件下で、このペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を、本発明の使用と関連して上に記載されるリガーゼ／シクラーゼ活性を有するポリペプチドとともに温置することを含む方法に関する。
【００６３】
またさらなる態様において、本発明は、少なくとも２つのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を連結するための方法であって、このペプチドの連結を可能にする条件下で、このペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を本発明の使用と関連して上に記載されるポリペプチドとともに温置することを含む方法に関する。
【００６４】
様々な実施形態において、これらの方法に従い環化または連結されるペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質は、上記の使用に従い環化または連結されるペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質として同様に定められる。
【００６５】
本明細書に記載の方法および使用において、酵素および基質は、１：１００以上、好適には１：４００以上、より好適には少なくとも１：１０００のモル比で使用され得る。
本反応は、一般的に、最適酵素活性を可能とする温度、通常は周囲（２０℃）〜４０℃において、適切な緩衝液系中で行われる。
【００６６】
上記の方法および使用において、リガーゼ／シクラーゼ活性を有するポリペプチドは、適切な支持材料上に固定化され得る。適切な支持材料としては、クロマトグラフィーカラムなどで使用される様々な樹脂が挙げられる。支持体はビーズの形態を有し得るか、またはマイクロタイタープレートなど、より大きい構造の面であり得る。固定化によって、基質との非常に容易で単純な接触、ならびに合成後の酵素および基質の容易な分離が可能となる。酵素機能を有するポリペプチドが固体カラム材料上に固定化される場合、連結／環化は連続工程であることができ、および／または基質／生成物溶液をそのカラム上で循環させることができる。
【００６７】
したがって、本発明は、ある態様において、固体支持材料であって、当該固体支持材料上に固定化された本発明による単離ポリペプチドを含む、固体支持材料にも及ぶ。固体支持材料は、上記のものなどのポリマー樹脂を好適には粒状形態で含み得る。単離ポリペプチドは、共有結合または非共有結合相互作用によって固体支持材料上に固定化され得る。
【００６８】
例示的な実施形態において、リガーゼ／シクラーゼ活性を有するポリペプチドは、グリコシル化され、カナバリア・エンシホルミス（Ｃａｎａｖａｌｉａ  ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ）（タチナタマメ）から単離されるレクチン（炭水化物結合タンパク質）であるコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）によって固定化され得る。コンカナバリンＡは、糖タンパク質および糖脂質を含む、α−Ｄ−マンノースおよびα−Ｄ−グルコース含有生体分子に特異的に結合する。このＣｏｎＡタンパク質は、糖タンパク質および糖脂質を固定化するために、アフィニティカラム上で固定化形態において使用される。したがって、様々な実施形態において、リガーゼ／シクラーゼ活性を有する単離ポリペプチドは、グリコシル化され、固体支持材料の表面にカップリングされている炭水化物結合部分、好適にはコンカナバリンＡに非共有結合される。
【００６９】
上記の固体支持材料は、少なくとも１つの基質ペプチドのカラム上での環化および／または連結のために、または少なくとも１つの基質ペプチドの環化または連結のための方法において使用されることができ、この方法は、少なくとも１つの基質ペプチドの環化および／または連結を可能にする条件下で、少なくとも１つの基質ペプチドを含む溶液を上記の固体支持材料と接触させることを含む。基質ペプチドは上記のものであり、上記ポリペプチドの基質も含む。
【００７０】
本発明はまた、本明細書に記載されるようなタンパク質リガーゼ活性および／またはシクラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含むトランスジェニック植物も包含する。本ポリペプチドは、好適には、前記植物中に天然に存在しない。したがって、本発明は、本発明による異種ポリペプチドを発現するトランスジェニック植物も特色とする。
【００７１】
様々な実施形態において、このようなトランスジェニック植物は、１つ以上の環化されるペプチドまたは１つ以上の連結されるペプチドをコードする少なくとも１つの核酸分子をさらに含み得る。これらは、本発明の使用および方法と関連して上記で定められるとおりのペプチドであり得る。ある実施形態において、環化されるペプチドは、環状シスチンノットポリペプチドの線状前駆体型、例えば上記で定められるものなどである。環化されるペプチドまたはポリペプチドのこれらの前駆体は、前記植物中に天然で存在し得るが、好適には人工的にも導入され、すなわちそれらをコードする核酸は異種である。
【００７２】
したがって、このようなトランスジェニック植物は、酵素およびその基質の同時発現のために、関心のある環化ペプチドを直接産生し得る。
ポリペプチドおよび核酸に関連する本明細書で開示される全ての実施形態は、同様に、本明細書に記載の使用および方法に対して適用可能であり、逆もまた同様である。
【００７３】
本発明は、次の非限定例によりさらに例示される。
（実施例）
材料。Ｚ−ＡＡＮ−ＡＭＣ（Ｎ−カルボベンジルオキシ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−７−アミド−４−メチルクマリン）およびペプチド基質は、ＧＬバイオケム（ＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍ）（上海）により合成された。各ペプチド基質の酸化的折り畳みは、５０％アセトニトリル、１００ｍＭ重炭酸アンモニウム、３ｍＭ還元グルタチオンを含有するｐＨ８．０の緩衝液中で、３０ｍＭのペプチド濃度で１８時間にわたって行った。タチナタマメレグマインはタカラバイオ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）（日本）から購入した。ネイティブｋＢ１ペプチドは、Ｏ．アフィニス（Ｏ．ａｆｆｉｎｉｓ）の地上部から単離し、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用することによって精製した。レグマイン特異的なＬＰ−１プローブは、マシュー・ボギョ（Ｍａｔｔｈｅｗ  Ｂｏｇｙｏ）（スタンフォード大学）により提供された。
【００７４】
登録コード。ブテラーゼ１に対するヌクレオチド配列が登録番号ＫＦ９１８３４５下でジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）データベースに寄託された。
実施例１：アスパラギニルエンドペプチダーゼ活性およびペプチドシクラーゼ活性のインビトロスクリーニング
緩衝液Ａ中において１００ｍＭの濃度で、レグマインに対する選択的な蛍光発生基質である、蛍光発生基質Ｚ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＡＭＣ（Ｚ−ＡＡＮ−ＡＭＣ）を使用することによって、アスパラギニルエンドペプチダーゼ（ＡＥＰ）活性が決定された（ケムハビ，Ａ．Ａ．（Ｋｅｍｂｈａｖｉ，Ａ．Ａ．）、バトル，Ｄ．Ｊ．（Ｂｕｔｔｌｅ，Ｄ．Ｊ．）、ナイト，Ｃ．Ｇ．（Ｋｎｉｇｈｔ，Ｃ．Ｇ．）およびバレット，Ａ．Ｊ．（Ｂａｒｒｅｔｔ，Ａ．Ｊ．）著、「豆果種子の２つのシステインエンドペプチダーゼ：精製および特異的蛍光アッセイの使用による特性評価（Ｔｈｅ  ｔｗｏ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ
ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ  ｏｆ  ｌｅｇｕｍｅ  ｓｅｅｄｓ：ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙｓ．）」、アーカイブズ・オブ・バイオケミストリ・アンド・バイオフィジックス（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ）、第３０３巻、ｐ．２０８〜２１３（１９９３年）；ソジュカ，Ｄ．（Ｓｏｊｋａ，Ｄ．）ら著、「ＩｒＡＥ−硬ダニ、イクソデス・リシヌス（Ｉｘｏｄｅｓ  ｒｉｃｉｎｕｓ）の消化器官のアスパラギニルエンドペプチダーゼ（レグマイン）（ＩｒＡＥ−Ａｎ  Ａｓｐａｒａｇｉｎｙｌ  ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ（ｌｅｇｕｍａｉｎ）ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｕｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈａｒｄ  ｔｉｃｋ  Ｉｘｏｄｅｓ  ｒｉｃｉｎｕｓ．）」、インターナショナル・ジャーナル・フォー・パラサイトロジー（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．）、第３７巻、ｐ．７１３〜７２４（２００７年）。３８０ｎｍの励起波長および４６０ｎｍの発光波長で放射蛍光が測定された。
【００７５】
第一の実験において、上記の条件下でＣ．テルナテア（Ｃ．ｔｅｒｎａｔｅａ）の粗製抽出物がＺ−ＡＡＮ−ＡＭＣとともに温置された。４６０ｎｍでの蛍光強度の大きい上昇が観察されたが、これは推定上のレグマインの存在を示す。
【００７６】
次いでシクラーゼ活性がアッセイされた。概して、緩衝液Ａ、０．１２５ｍＭブテラーゼ１および様々なペプチド濃度（０．５〜４００ｍＭ）を含有する５０ｍＬ反応混合物中で、インビトロ環化アッセイが行われた。２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によって、酵素濃度が推定された。各反応は３重で（ｉｎ  ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）３７℃にて行われ、５ｍＬの１Ｍ  ＨＣｌ溶液を添加することによって反応停止された。ネクセラ（Ｎｅｘｅｒａ）ＵＨＰＬＣシステム（島津製作所）上で逆相Ｃ１８分析カラム（１５０×２．１ｍｍ、バイダック（Ｖｙｄａｃ））を使用することによって、本ペプチドを分離した。残留線状前駆体または環化生成物のＨＰＬＣ−ピークの面積を濃度に変換することによって、環化速度が計算された。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ（ＡＢＩ４８００  ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦ）によって各ＨＰＬＣピークの同一性を分析した。
【００７７】
プロペプチドとしてＣ末端にＨｉｓ−Ｖａｌ配列を有するシクロチドｋＢ１の線状および酸化的折り畳み形態である、３１残基のペプチド基質ｋＢ１−ＮＨＶ（配列番号１１０）を使用して、Ｃ．テルナテアの粗製抽出物のシクラーゼ活性がアッセイされた（テーブル１および図１）。Ｃ．テルナテアにより産生されるネイティブシクロチドと区別するために、本発明者らのアッセイでは、オルデナンディア・アフィニスで見出されるがＣ．テルナテアでは見出されない原型のシクロチドである、カラタＢ１（ｋＢ１）が基質として選択された。Ｃ．テルナテアのシクロチド前駆体ではＨｉｓ−Ｖａｌモチーフが保存されており、Ｃ末端のジペプチドが、シクロチドの生合成のために十分であることが示されている（グエン，Ｇ．Ｋ．（Ｎｇｕｙｅｎ，Ｇ．Ｋ．）、リム，Ｗ．Ｈ．（Ｌｉｍ，Ｗ．Ｈ．）、グエン，Ｐ．Ｑ．（Ｎｇｕｙｅｎ，Ｐ．Ｑ．）およびタム，Ｊ．Ｐ．（Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．）著、「カサリア・カルタセア（Ｃｈａｓｓａｌｉａ  ｃｈａｒｔａｃｅａ）から
の高度に短縮した前駆体がある新規シクロチドおよびアンシクロチドおよび生理活性におけるメチオニン酸化の効果（Ｎｏｖｅｌ  Ｃｙｃｌｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｕｎｃｙｃｌｏｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｓｈｏｒｔｅｎｅｄ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｈａｓｓａｌｉａ  ｃｈａｒｔａｃｅａ  ａｎｄ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．）」、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第２８７巻、ｐ．１７５９８〜１７６０７（２０１２年）。コンラン，Ｂ．Ｆ．（Ｃｏｎｌａｎ，Ｂ．Ｆ．）ら著、「環状ペプチドカラタＢ１の生合成に関連するプロセシングおよび環化事象への洞察（Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｅｖｅｎｔｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｙｃｌｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｋａｌａｔａ  Ｂ１．）」、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ、第２８７巻、ｐ．２８０３７〜２８０４６（２０１２年））。Ｃ．テルナテアの抽出物によるｋＢ１−ＮＨＶの処理によって、ネイティブ環状ｋＢ１の質量計算値に一致する新しいペプチドが得られた（図２ａ、ｂ）。このペプチド生成物は、（１）ＲＰ−ＨＰＬＣにおけるネイティブ環状ｋＢ１との同時溶出（図３）と、（２）環状骨格を示唆する１８Ｄａの質量増加が結果として起こるトリプシン消化、および連結部位としてｋＢ１配列およびＡｓｎ−Ｇｌｙを確認するＭＳ／ＭＳ分析（図４）と、（３）環化ペプチドおよびネイティブ環状ｋＢ１に対して同一の化学シフトを示した１Ｄ  ＮＭＲ（図５）とによって、環状ｋＢ１としてさらに確認された。カラタＢ１の１Ｄ  ＮＭＲスペクトルに対して、９５％Ｈ２Ｏ／５％Ｄ２Ｏ中において０．１ｍＭ濃度、ｐＨ４．３で、ネイティブｋＢ１ペプチドおよびブテラーゼ環化ｋＢ１ペプチドが調製された。クライオプローブを備える６００ＭＨｚ  ＮＭＲ分光計（ブルカー（Ｂｒｕｋｅｒ））上で両ペプチドの１Ｄ１Ｈスペクトルが記録された。これらの結果は、Ｃ．テルナテアの粗製抽出物においてペプチド大環状化が可能な推定上のリガーゼの存在を示す。
【００７８】
【表１】
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実施例２：ブテラーゼ１の単離、精製、同定および特性評価。
【００７９】
Ｚ−ＡＡＮ−ＡＭＣを手掛かりとするペプチドリガーゼ単離の試みは成功しなかった。粗製抽出物のＨＰＬＣ分離後に強い蛍光強度を与える画分は、ｋＢ１−ＮＨＶを環化することができなかった。代わりに、Ｈｉｓ−Ｖａｌが加水分解されている、ｋＢ１の線状形態に対応するペプチドが観察された。次いで、基質としてｋＢ１−ＮＨＶを用いて、全て
のＨＰＬＣ分離画分が直接スクリーニングされ、蛍光がない画分においてシクラーゼ活性が見出された（図２ｃ）。この結果は、シクラーゼ活性がＡＥＰ活性とは別のものであることを示す。対照として、市販のタチナタマメレグマインは、ｋＢ１−ＮＨＶを環化することができず、生成したのはｋＢ１の線状形態のみであった（図２ｄ）。
【００８０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で３８ｋＤａの単一のタンパク質バンドを得るために、いくつかのクロマトグラフィー段階において推定上のリガーゼが精製された（図６ａ）。単離および精製のために、５００ｍＬの抽出緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、５ｍＭ  ｂ−メルカプトエタノール（ｂ−ＭＥ）、ｐＨ６．０）とともにＣ．テルナテアの３００ｇの鞘がホモジェナイズ処理された。タンパク質分解を最小限に抑えるために、４℃で抽出が行われた。植物残屑を除去するため、ホモジェネートが遠心分離およびろ過された。２０％飽和に到達するまで硫酸アンモニウムが上清に添加された。沈殿したタンパク質が捨てられ、８５％飽和に到達するまで硫酸アンモニウムが連続的に上清に添加された。遠心分離後、上清が捨てられ、沈殿したタンパク質が３００ｍＬの抽出緩衝液中で再溶解された。１０ｋＤａカットオフ透析チューブを用いて、溶解試料が６Ｌの抽出緩衝液に対して一晩透析された。透析した試料が遠心分離およびろ過されて、Ｃ．テルナテアの粗製抽出物が得られた。Ｑ−セファロース・ファスト・フロー（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）陰イオン交換樹脂（ＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））の１００ｍＬスラリーを含有するフラッシュカラムに対して、この粗製抽出物が適用された。このカラムは８００ｍＬの緩衝液Ａ（２０ｍＭリン酸緩衝液、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ｂ−ＭＥ、ｐＨ６．０）で洗浄され、４００ｍＬの緩衝液Ｂ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ｂ−ＭＥ、２００ｍＭ  ＫＣＩ、ｐＨ６．０）で溶出された。１０ｋＤａカットオフ遠心式フィルタユニット（アミコン・ウルトラ（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ）、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））を用いて３ｍＬの最終体積まで溶出物が濃縮された。バイオスーツ（ＢｉｏＳｕｉｔｅ）ＨＰＬＣカラム（３００×２１．５ｍｍ、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ））を用いたサイズ排除クロマトグラフィーに、濃縮した試料が供された。ペプチドシクラーゼ活性がある画分が抜き取られ、分析用ポリワックス（ＰｏｌｙＷＡＸ）ＨＰＬＣカラム（２００×４．６ｍｍ、ポリＬＣ（ＰｏｌｙＬＣ））を用いて陰イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色によって酵素純度が分析された。３００ｇの植物材料からおよそ０．４ｍｇのブテラーゼ１が得られる。
【００８１】
変性条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、精製ブテラーゼ１が分析された。ゲルが銀染色され、タンパク質バンドが切り出され、既に記載されたようなゲル中でのトリプシン消化に供された（ガラーダギ，Ｆ．（Ｇｈａｒａｈｄａｇｈｉ，Ｆ．）、ワインバーグ，Ｃ．Ｒ．（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｃ．Ｒ．）、メーガ，Ｄ．Ａ．（Ｍｅａｇｈｅｒ，Ｄ．Ａ．）、イマイ，Ｂ．Ｓ．（Ｉｍａｉ，Ｂ．Ｓ．）およびミッシュ，Ｓ．Ｍ．（Ｍｉｓｃｈｅ，Ｓ．Ｍ．）著、「銀染色ポリアクリルアミドゲルからのタンパク質のマススペクトロメトリー同定：感度を向上させるために銀イオンを除去するための方法（Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｓｉｌｖｅｒ−ｓｔａｉｎｅｄ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ：Ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｅｍｏｖａｌ  ｏｆ  ｓｉｌｖｅｒ  ｉｏｎｓ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．）」、エレクトロフォレシス（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、第２０巻、ｐ．６０１〜６０５（１９９９年））。ゲル中のトリプシン消化によって、５つの主要なペプチド断片が得られ、次いでこれをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ／ＭＳによって配列決定した（図７）。これらの断片は、北京ゲノム研究所（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）により提供されるＣ．テルナテアのトランスクリプトームデータに対してＢＬＡＳＴ検索され、ブテラーゼ１と呼ばれる新規タンパク質の単一配列と一致することが分かった（図６ｃ）。この酵素は、４℃で３０日間にわたり安定なままであり、活性喪失は最低限である。これは水中で比較的可溶
であり、１０ｍｇ／ｍＬの濃度が達成される。
【００８２】
Ｃ．テルナテアのトランスクリプトームにおけるＥＳＴ配列に基づき、ブテラーゼ１は４８２残基からなり、５３ｋＤａの質量を有することが予想され、一方で精製活性酵素はおよそ３８ｋＤａであり、ブテラーゼ１がタンパク質分解性プロセシングによって翻訳後修飾されることが示唆される（図６ｃ）。ＰＮＧアーゼＦまたはグリコペプチダーゼＡとともにブテラーゼ１を温置することによって分子量の変化は起こらず、ブテラーゼ１がＮ−グリコシル化されていないことが示される（データは示さない）。ＮＣＢＩ非重複タンパク質データベースに対するＢＬＡＳＴｐ検索から、ブテラーゼ１が、レグマインファミリーのいくつかのメンバーと高い配列相同性を共有することが示された。ブテラーゼ１は、グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）由来のレグマイン様タンパク質（ＮＣＢＩ参照配列：ＸＰ＿００３５２５９７９）およびビグナ・ムンゴ（Ｖｉｇｎａ  ｍｕｎｇｏ）由来のＶｍＰＥ−１（ジェンバンク：ＢＡＡ７６７４４．１）と、それぞれ７１％および７０％の配列同一性で最大の相同性を有する。この結果は、ブテラーゼ１がレグマインファミリーの新規メンバーであることを強く示唆する。レグマインに特異的なａｚａ−Ａｓｎエポキシドプローブである蛍光プローブＬＰ−１によるその表示化によって、ブテラーゼ１の酵素学的分類がさらに裏付けられた（図６ｂおよび図８）（リー，Ｊ．（Ｌｅｅ，Ｊ．）およびボギョ，Ｍ．（Ｂｏｇｙｏ，Ｍ．）著、「レグマインのインビボイメージングのための近赤外フルオロフォア（ＮＩＲＦ）標識活性に基づくプローブの開発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｅａｒ−Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ（ＮＩＲＦ）−Ｌａｂｅｌｅｄ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ−Ｂａｓｅｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ
ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  Ｌｅｇｕｍａｉｎ．）」、エー・シー・エス・ケミカル・バイオロジー（ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．）、第５巻、ｐ．２３３〜２４３（２０１０年））。
【００８３】
レグマインは、自己タンパク質分解活性化を受けてＮおよびＣ末端プロドメインを放出する不活性なチモーゲンとして産生される。エドマン配列決定によって、ＶＥＧＴＲがブテラーゼ１のＮ末端配列として明らかになった。Ｃ末端プロセシング部位は、Ａｓｎ３８３とＳｅｒ３８４との間に生じると予想されたが、これは、３８ｋＤａという見かけの分子量と、ビシア・サチバ（Ｖｉｃｉａ  ｓａｔｉｖａ）由来のプロテイナーゼＢおよびタチナタマメレグマインなどの他のレグマインにおける自己切断部位とに基づいている（図６ｃ）（ベッカー，Ｃ．（Ｂｅｃｋｅｒ，Ｃ．）ら著、「プロテイナーゼ−Ｂ、発芽ベッチ（ビシア・サチバＬ）種子からのアスパラギン特異的エンドペプチダーゼの、精製、Ｃｄｎａクローニングおよび特性評価（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｃｄｎａ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−Ｂ，ａｎ  Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ  Ｖｅｔｃｈ（Ｖｉｃｉａ−Ｓａｔｉｖａ  Ｌ）Ｓｅｅｄｓ．）」、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第２２８巻、ｐ．４５６〜４６２（１９９５年）；アベ，Ｙ．（Ａｂｅ，Ｙ．）ら著、「タチナタマメ種子のアスパラギニルエンドペプチダーゼ−タンパク質配列分析における、精製、特性評価および高い有用性（Ａｓｐａｒａｇｉｎｙｌ  Ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｏｆ  Ｊａｃｋ  Ｂｅａｎ  Ｓｅｅｄｓ−Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｕｔｉｌｉｔｙ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）」、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ、第２６８巻、ｐ．３５２５〜３５２９（１９９３年））。
【００８４】
結晶構造が既知であるレグマインファミリーの唯一のメンバーであるヒトレグマインのチモーゲンに基づき、モデラー（ＭＯＤＥＬＬＥＲ）（ｈｔｔｐｓ：／／ｓａｌｉｌａｂ．ｏｒｇ／ｍｏｄｅｌｌｅｒ／）を使用して、ブテラーゼ１の相同性モデルが構築された（サリ，Ａ．（Ｓａｌｉ，Ａ．）およびブルンデル，Ｔ．Ｌ．（Ｂｌｕｎｄｅｌｌ，Ｔ．
Ｌ．）著、「空間的拘束の充足による比較タンパク質モデリング（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ｂｙ  ｓａｔｉｓｆａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐａｔｉａｌ  ｒｅｓｔｒａｉｎｔｓ．）」、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、第２３４巻、ｐ．７７９〜８１５（１９９３）；ダル，Ｅ．（Ｄａｌｌ，Ｅ）およびブランドステター，Ｈ．（Ｂｒａｎｄｓｔｅｔｔｅｒ，Ｈ．）著、「レグマインにおける機構的および構造的研究は、そのチモーゲン性、別個の活性化経路および調節を説明する（Ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ
ｌｅｇｕｍａｉｎ  ｅｘｐｌａｉｎ  ｉｔｓ  ｚｙｍｏｇｅｎｉｃｉｔｙ，ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ，ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．）」、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）、第１１０巻、ｐ．１０９４０〜１０９４５（２０１３年））。ブテラーゼ１のチモーゲン（Ｖ４２〜Ｉ４６８）は、ヒトレグマインと３７．８％の配列同一性を共有する。ブテラーゼ１の構築モデルは、骨格Ｃαに対してＲＭＳＤが０．３５２Åであるヒトレグマインの鋳型構造とよく一致する（図６ｄ）。
【００８５】
先行研究によって、３つの構造部分：ＡＥＰ活性ドメインと、活性ペプチド領域と、レグマイン安定化および活性調整（ＬＳＡＭ：ｌｅｇｕｍａｉｎ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）ドメインとへ、ヒトレグマインのチモーゲンが規定された。後者の２つのドメインは、ヒトレグマインにおいて酵素活性化中に自己切断される。同様に、ブテラーゼ１のモデル化構造も３つの部分に分けることができる：推定上のＡＥＰ活性ドメイン（マリンブルー、Ｖ４２−Ｔ３１８）、活性ペプチド領域（マゼンダ、Ｄ３１９−Ｎ３８３）およびＬＳＡＭドメイン（灰色、Ｓ３８５−Ｉ４６８、ブテラーゼ１の最終活性形態では排除される）。全体的に、ブテラーゼ１のＡＥＰ活性ドメインは４９．８％の配列同一性（Ｖ４２〜Ｔ３１８）を保持し、ヒトレグマインのものと、触媒性三連構造（Ａｓｎ５９、Ｈｉｓ１６５およびＣｙｓ２０７）の良好な構造アライメントを呈する（図６ｄ）。
【００８６】
異なる植物ファミリー由来の２つの非ネイティブ線状ペプチド基質である３１残基ｋＢ１−ＮＨＶおよび１６残基ＳＦＴＩ−ＮＨＶ（配列番号１３５）を用いて、ＨＰＬＣおよびＭＳ分析によってペプチドシクラーゼとしてのブテラーゼ１の動態が決定された。長さおよび配列が異なる非ネイティブ基質であるにもかかわらず、ブテラーゼ１は、優れた収率でこれらのペプチドを効率的に環化した（テーブル１）。
【００８７】
環化反応のＲＰ−ＨＰＬＣトレースから、１：４００の酵素対ペプチド比で、ブテラーゼ１がｋＢ１−ＮＨＶの約４０％を６分以内に環状ｋＢ１に変換し、４５分以内に＞９５％変換に到達したことが明らかになった（図９ａ）。グラフパッド・プリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）を使用してミカエリス−メンテンプロットから計算されたｋＢ１−ＮＨＶに対するブテラーゼ１の見かけの動態パラメータは、ｋｃａｔについては２．２８±０．０５ｓ−１、Ｋｍについては２１３±１０ｍＭであり、触媒効率（ｋｃａｔ／Ｋｍ）については１０，７００Ｍ−１ｓ−１であった（図９ｂ）。さらに、ｋＢ１の５８残基のシクロ二量体（＜１０％）が高基質濃度（＞４００ｍＭ）で観察され、このことから、ブテラーゼ１は、長いペプチドの分子間連結および分子間環化を行うことが可能であることが示唆される（図１０）。
【００８８】
ＳＦＴ１−ＮＨＶに対して、ブテラーゼ１はまた、０．６±０．０２ｓ−１のｋｃａｔ、５１±４ｍＭのＫｍおよび１１，７００Ｍ−１ｓ−１の触媒効率で＞９５％変換収率を示した（図９ｃ）。これらのデータから、ブテラーゼ１が多岐にわたるペプチド基質を環化し得たことが示唆される。
【００８９】
ＳＦＴＩおよびｋＢ１の両方がジスルフィド結合により安定化される環状ペプチドとし
て天然に存在するため、次いで、ブテラーゼ１による環化反応に対してジスルフィド結合による立体構造的な支援が必要か否かが判断された。ヨードアセトアミドによる還元ｋＢ１−ＮＨＶのＳ−アルキル化によって、ＳＡ−ｋＢ１−ＮＨＶが得られた。０．１２５ｍＭブテラーゼ１による５０ｍＭ  Ｓ−アルキル化ペプチド（ＳＡ−ｋＢ１−ＮＨＶ）の処理の結果、１２分以内にその環状形態への＞９５％の変換が起こった（テーブル１）。動態分析から、ｋＢ１−ＮＨＶと比較して、ＳＡ−ｋＢ１−ＮＨＶの触媒効率の５０倍の向上が示された（図９ｄ）。この結果は、ブテラーゼ１によるペプチド環化のためにジスルフィド結合を必要としないことを示す。
【００９０】
Ｃ末端プロペプチドのＰ１’およびＰ２’位置の要求を調べるために、ｋＢ１−ＮＨＶの４種類の類似体が合成された（テーブル１）。ｋＢ１−ＮＨＶより長いプロペプチドを伴う類似体は、環化速度の僅かな低下を示し、触媒効率はｋＢ１−ＮＨＶＩ（配列番号１３６）およびｋＢ１−ＮＨＶＩＡ（配列番号１３７）について、それぞれ４０３２および２９７１Ｍ−１ｓ−１であった（テーブル１およびテーブル２）。対照的に、ブテラーゼ１は、ＶａｌまたはＨｉｓ−Ｖａｌを欠く２種類の短縮類似体（配列番号１３８；配列番号１３９）を環化することにおいて有意に効率が低く、４時間後に＜１０％環状ｋＢ１収率であり、３０時間後に反応は不完全であった（図１１）。この結果、ブテラーゼ１による効率的な環化反応のためにＣ末端ＨＶジペプチドが必要であることが示される。
【００９１】
【表２】
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Ｐ１位置でのブテラーゼ１の基質特異性を決定するために、保存的Ａｓｎ残基をＡｌａまたは密接な関連がある残基、例えばＡｓｐ、ＧｌｕおよびＧｌｎなどで個々に置換することによって、ｋＢ１−ＮＨＶの類似体基質が調製された（テーブル１；配列番号１４０、１４１、１４２、１４３）。ブテラーゼ１とともに４時間にわたり温置した後に、ｋＢ１−ＡＨＶ、ｋＢ１−ＱＨＶまたはｋＢ１−ＥＨＶの環化は観察されなかった（図１２）。ブテラーゼ１は、ｋＢ１−ＤＨＶを環化することができたが、ｋＢ１−ＮＨＶよりも約１００倍遅く、４時間後において環化生成物は１０％未満であった。同様に、本発明者らは、ＳＦＴ１−ＮＨＶおよびＳＦＴ１−ＤＨＶ（配列番号１４４）におけるブテラーゼ１の活性を比較した。ブテラーゼ１は、両ペプチド基質を環化したが、ＳＦＴＩ−ＤＨＶよりもＳＦＴＩ−ＮＨＶで効率が有意に高かった。これらの結果は、Ｃ末端ＮＨＶトリペプチドタグがブテラーゼ１による環化に必要且つ十分であることを示している。
【００９２】
普遍性の証拠を提供するために、コノトキシン（ＭｒｌＡ；配列番号１１１）と、タナチン類似体（昆虫抗菌ペプチド；配列番号１１２）と、ヒスタチン−１ａ、ヒスタチン−１ｂ、ヒスタチン−３ａおよびヒスタチン−３ｂ（ヒト唾液抗菌タンパク質；配列番号１１３〜１１６）とに由来する基質を用いて、ブテラーゼ１が非植物由来タンパク質を環化することができるか否かが調べられた（テーブル３）。ブテラーゼ１は試験した全ペプチドを効率的に環化した。
【００９３】
【表３】
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ブテラーゼ１に対するアッセイにおいてＺ−ＡＡＮ−ＡＭＣがなぜ有用でなかったかを決定するために、０．１２５ｍＭ精製酵素が５０ｍＭ  Ｚ−ＡＡＮ−ＡＭＣとともに温置された。３０時間にわたり温置した後に、蛍光強度の明らかな上昇は観察されず、このことから、ブテラーゼ１がＺ−ＡＡＮ−ＡＭＣを加水分解しなかったことが示される。ＲＰ−ＨＰＬＣ分析から、形成された加水分解生成物は＜３％であったことが示された（図１３）。陽性対照として、タチナタマメレグマインは、同じ実験条件下でＺ−ＡＡＮ−ＡＭＣを完全に加水分解した。この結果は、ブテラーゼ１がプロテアーゼというよりむしろリガーゼとして機能するよう進化してきたことを示唆する。
【００９４】
ｋＢ１のシクロ二量体化は、ブテラーゼ１が、分子間ペプチド連結に介在可能であることを示唆する。Ｃ．テルナテアから単離される＞２４個のネイティブシクロチドの高い配列多様性はまた、ブテラーゼ１が無差別な酵素であり、広い基質特異性があるという興味深い示唆も提供することを指摘することは有意義である。アクセプタ求核剤のＮ末端特異性を定めるために、モデルペプチドとしてＫＡＬＶＩＮＨＶ（配列番号１２２）を使用し、ＸＩＧＧＩＲ（Ｘ＝２０種類の天然アミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｒ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ｐ、Ｃ、Ｍ）のうちの任意の１つ；配列番号１２３）を用いてその連結効率が評価された。０．１ｍＭブテラーゼ１、５０ｍＭ  ＫＡＬＶＩＮＨＶおよび１ｍＭ  ＸＩＧＧＩＲの存在下で反応が行われた。ブテラーゼ１は、広い特異性で分子間ペプチド連結に効率的に介在し、Ｐ１’’位置において、ＰｒｏとＡｓｐおよびＧｌｕなどの酸性アミノ酸とを除く殆どの天然アミノ酸を受容する（図１５ａ）。連結収率は、殆どのペプチドに対して温置１０分以内に６０〜８０％に到達し、観察されたアスパラギニル結合の加水分解は＜５％であった。
【００９５】
Ｐ２’’位置での特異性を定めるために、第二のペプチドライブラリが合成された：ＬＸＧＧＩＲ（配列番号１２４）（Ｘ＝２０種類の天然アミノ酸のうちの任意の１つ）。ブテラーゼ１は、Ｐ１’’位置と比較した場合、Ｐ２’’でより厳格な要求を示し、疎水性アミノ酸、特にＩｌｅ、ＬｅｕおよびＶａｌに対して高い優先度を示す（図１５ｂ）。この結果もまた、コノトキシンおよびヒスタチン−３に対するブテラーゼ１の高触媒効率を説明する。
【００９６】
さらにペプチドＹＲＮＨＶ（配列番号１２５）＋ＧＬＰＶＲ（配列番号１２６）およびＴＲＮＨＶ（配列番号１２７）＋ＧＬＰＶＲ（配列番号１２６）に対しても連結活性が試
験された。連結収率は温置１０分以内に６０に到達した。
【００９７】
ブテラーゼ１の普遍性を明らかにするために、２６〜４０残基の範囲のサイズの５種類の非システイン含有ペプチドホルモンが選択された。４種類の配列がヒトペプチド（ニューロメジンＵ（配列番号１２８）、サリューシンａ（配列番号１２９）、アぺリン（配列番号１３１）およびガラニン（配列番号１３２））由来であり、１種類がラット（ニューロメジンＵ；配列番号１３０）由来であった（テーブル４）。ヒトのガラニンおよびニューロメジンＵは、固有のＡｓｎ残基を含有し、したがって、最終環化生成物中にさらなるソーティング配列を何ら残すことなく、「痕跡のない」連結が可能となる。他のペプチドの場合、リンカー配列として、Ｃ末端でさらなるＡｓｎ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ配列が付加され、ＧｌｙまたはＧｌｙ−ＩｌｅがＮ末端に付加された。５０μＭペプチドおよび０．１μＭブテラーゼ１（０．００２モル濃度当量）を含有する５０μＬ反応混合物中において３７℃で環化反応が行われた。ＨＰＬＣおよびマススペクトロメトリーを使用して反応が監視された。意義深いことに、ブテラーゼ１は、試験した全ペプチドに対して５分以内に＞９５％環化収率を達成した（図１６）。これらのペプチドが無作為に選択され、配列相同性を共有しないという事実から、ブテラーゼ１の無差別さおよび最小基質要件が示唆される。
【００９８】
【表４】
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次に、これらのペプチド基質の環化の動態が調べられた。グラフパッド・プリズムを使用して、ミカエリス−メンテンプロットからブテラーゼ１の見かけの動態パラメータが計算された（テーブル５）。触媒効率は、１×１０５〜１．３×１０６Ｍ−１ｓ−１の範囲であり、システインに富むペプチドにおける本発明者らの先行研究と一致する。この結果は、ジスルフィド、および同様にして多重ジスルフィドにより維持される折り畳まれた構造が、ブテラーゼ１による環化に必要とされないことを確認する。
【００９９】
【表５】
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さらに、Ｃ末端ＮＨＶタグ付きの緑色蛍光タンパク質（配列番号１３３）と短いペプチドＧＩＧＫ（ビオチン）Ｒ（配列番号１３４）との試行連結が行われ、タンパク質標識に対するブテラーゼ１の用途が明らかにされた。この反応に対して、５０μＭのＮＨＶタグ
付きＧＦＰ、０．１２５μＭブテラーゼ１および１ｍＭ  ＧＩＧＫ（ビオチン）Ｒが３７℃で３０分間にわたり温置された。結果は図１７に示される。
【０１００】
ブテラーゼ１がタンパク質を環化し得ることを明らかにするために、Ｃ末端のＡｓｎ−Ｈｉｓ−Ｖａｌモチーフで終止し、Ｎ末端のＧｌｙ−Ｉｌｅで開始する修飾ＧＦＰが構築された（配列番号１４５）。２５μＭ  ＧＦＰおよび０．１μＭブテラーゼ１（０．００４モル濃度当量）の存在下で環化反応が行われた。この環化反応は、ＳＤＳ  ｐａｇｅおよび高分解能ＥＳＩ−ＭＳにより監視されるように、＞９０％収率で１５分以内に完了した（図１８）。比較のために、ＧＦＰのソルターゼ介在性環化は、２４時間の温置およびソルターゼＡの１モル濃度当量を必要とした。したがって、ブテラーゼ１の触媒速度は、モデルタンパク質としてＧＦＰを使用するソルターゼＡより、ほぼ１０，０００速かった。この結果は、ブテラーゼ１が、有望な可能性がある強力なリガーゼであり、ペプチドおよびタンパク質の環化のための代替法を提供し得ることを示す。
【０１０１】
ブテラーゼ１のタンパク質へのビオチンおよびフルオロフォアなどの官能基導入能を調べるために、Ｃ末端およびＮ末端連結が行われ、様々な技術によって結果が分析された。Ｃ末端連結の場合、試験した基質はＡＢＬ−Ｍｏｎｏ（ＡＢＬタンパク質に対する合成ヒトｓｃＦｖ断片；配列番号１４６）とＥＲＫ−Ｄａｒｐ（ＥＲＫに特異的な合成ヒト抗体模倣物（ダルピン）；配列番号１４７）とである（テーブル６）。Ｎ末端連結の場合、試験した基質はユビキチンタンパク質（配列番号１４８）と、ペプチド１（ＹＫＮＨＶ、配列番号１４９）またはそのチオグリコール酸変異体（チオデプシペプチド）（ＹＫＮ−チオグリコール酸−Ｖ）とであった。
【０１０２】
【表６】
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ブテラーゼ１のＣ末端連結能を調べるために、１４４６９．２Ｄａ  ＭＷを有するＡＢＬ−Ｍｏｎｏおよび２０２７０．２Ｄａ  ＭＷを有するＥＲＫ−Ｄａｒｐがブテラーゼ１の存在下で蛍光含有ペプチドＧＩＲ−ＡＭＣ（ＡＭＣ＝７−アミノ−４−メチルクマリン）とともに温置された。ＭＳによって反応が監視された（図１９）。１４７１８．４Ｄａおよび２０５１１．１Ｄａで検出されるピークは、ＧＩＲ−ＡＭＣの付加およびＨｉｓ、Ｖａｌおよび水分子の除去を伴った、ＡＢＬ−ＭｏｎｏおよびＥＲＫ−Ｄａｒｐの連結生成物である。ＥＲＫ−Ｄａｒｐは、２０分温置後にほぼ９０％変換収率に到達する。
【０１０３】
ＥＲＫ−Ｄａｒｐ、ＧＦＰ−ＮＨＶ、およびＦＩＴＣ標識ペプチドであるＦＩＴＣ−ＧＫＮＨＶとのそれらの連結生成物（配列番号１５０）のＭＷが大きいために、ＭＳによる分析は十分に正確ではなかった。マクロ分子をイオン化することを得意とするＥＳＩ−ＭＳ（ホ（Ｈｏ）ら著、ザ・クリニカル・バイオケミスト・レビューズ（Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．）、２００３年、第２４巻、第１号、ｐ．３〜１２）を使用して、大きい連結生成物が調べられた。この連結反応の場合、５０μＭ  ＥＲＫ−Ｄａｒｐおよび５０μＭ  ＧＦＰ−ＮＨＶが１ｍＭ  ＦＩＴＣ−ＧＫＮＨＶおよび５０ｎＭブテラーゼ１とともに４２℃で１０分間にわたり温置された。ＥＳＩ−ＭＳ用の生成物試料を最初にＵＰＬＣにより単離して、塩濃度を低下させた。ＥＳＩ  ｐｒｏｔ  １．０プログラムによってＥＳＩ−ＭＳの結果が分析された。ＥＳＩ−ＭＳにより得られたＥＲＫ−ＤａｒｐのＭＷは、２０２０５±１．５Ｄａであり、理論ＭＷ値との差は僅か２３９Ｄａであった。推定上の連結生成物のＭＷは２０４５３±１．６Ｄａであり、これにより、タンパク質連結の成功が証明される。ＧＦＰ−ＮＨＶおよび推定上の連結生成物のＭＷは、それぞれ２９７２０．０±０．７Ｄａおよび２９９６９．３±０．７Ｄａである（図２０）。
【０１０４】
Ｎ末端連結の場合、反応条件は、１００μＭユビキチン、０，１μＭブテラーゼ１、５００μＭペプチド１、４２℃で温置であった。反応収率は、１５０分後に８２％であった。ＨＰＬＣおよびＭＳにより反応が監視された（図２１）。
【０１０５】
ペプチドデンドリマーは、結合親和性の向上のために活性が向上したことが示された。デンドリマー性ペプチドを作製するためのリガーゼとしてブテラーゼ１を使用する可能性を試験するために、モデルペプチドＹＲＮＨＶ（配列番号１２５）の二量体ペプチドＧ２Ｋ（Ｋ残基により連結されている２個のＧＩＧ配列）への連結が行われた（図２２）。５０μＭ  Ｇ２Ｋ、２０ｎＭブテラーゼ１および２５０μＭ  ＹＲＮＨＶペプチドが３７℃で１時間にわたり温置された。マススペクトロメトリーを使用して、温置の終了時に反応が監視された（図２２）。この結果は、ブテラーゼ１がペプチドの二量体化のためのリガーゼとして作用可能であるという概念実証を提供する。
【０１０６】
ペプチドＧＶ−１０、ＳＶ−１０、ＨＶ−１０、ＥＶ−１０およびＲＶ−１０（配列番号１１７〜１２１）を用いて、二量体化能も試験された。結果はテーブル７に示される。
【０１０７】
【表７】
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実施例３：Ｎ末端環化特異性
ブテラーゼ１のシクラーゼ活性に対するブテラーゼ１のＮ末端特異性をさらに調べるために、３個のペプチドライブラリが合成され、環化について試験された。
【０１０８】
ペプチドライブラリ１：ＸＬＹＲＲＧＲＹＬＲＲＮＨＶ（配列番号１５７）
ペプチドライブラリ２：ＸＲＬＹＲＧＲＹＬＲＲＮＨＶ（配列番号１５８）
ペプチドライブラリ３：ＧＸＬＹＲＧＲＹＬＲＲＮＨＶ（配列番号１５９）
前述のペプチドライブラリにおいて、Ｘは、上記で定められるとおり、２０種類の天然アミノ酸のうちの任意の１つを指定する。Ｃ末端残基ＨＶが切断され、Ｃ末端ＮがそれぞれのペプチドのＮ末端アミノ酸に共有結合されていることを除き、環化されたペプチドは、上記で与えられるものと同じ配列を有する。この反応は、５０ｎＭブテラーゼ１、５０μＭペプチドの存在下で、４２℃で６０分間にわたって行われた。この環化活性試験の結果は、図２３ａ）〜ｃ）において３つのペプチドライブラリの環化収率として示される。
【０１０９】
この実験から、Ｐ２’’残基（Ｎ末端からＣ末端まで計算した場合の位置２の残基）がＬｅｕ／Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｃｙｓのうちの任意の１つである場合、Ｐ１’’残基（すなわち位置１のＮ末端残基）は重要ではないと結論付けることができ、これは、ＸＩＧＧＩＲとＫＡＬＶＩＮＨＶとの分子間連結から本発明者らが得た結果（実施例２）と同様である。さらに、Ｐ１’’残基がＧｌｙである場合、Ｐ２’’は任意の残基であってよく、依然として効率的な環化を可能にする。
【０１１０】
実施例４：カラム上ペプチド環化のためのコンカナバリンＡ樹脂上でのブテラーゼ１の可逆的固定化
コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）は、カナバリア・エンシホルミス（タチナタマメ）から単離されるレクチン（炭水化物結合タンパク質）である。コンカナバリンＡは、糖タンパク質および糖脂質を含む、α−Ｄ−マンノースおよびα−Ｄ−グルコース含有生体分子に特異的に結合する。ブテラーゼ１が組み換え発現され、グリコシル化形態で約３７ｋＤａのタンパク質として単離された（データは示さない）。これが、その炭水化物部分によってプロスウィフト（ＰｒｏＳｗｉｆｔ）（登録商標）ＣｏｎＡ−１Ｓアフィニティカラム（サーモ・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））上に固定化された。固定化ブテラーゼ１は、完全に機能的であり、ＳＦＴＩ−１、ｋＢ１（カラタＢ１）およびコノトキシンのカラム上環化を触媒することができた。この反応は、５０μｇ固定化ブテラーゼ１および５０μＭのペプチド基質の存在下で行われた。（ａ）コノトキシンＧＶ−１７（配列番号１１１）、（ｂ）ＳＦＴＩ−ＮＨＶ（配列番号１３５）、（ｃ）ｋＢ１（配列番号１１０）の環化を説明するＵＰＬＣプロファイルが、図２４に示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
0006708556.tif 000017
【図１０】
0006708556.tif 000018
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
0006708556.tif 000023
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
0006708556.tif 000026
【図１９】
0006708556.tif 000027
【図２０Ａ】
0006708556.tif 000028
【図２０Ｂ】
0006708556.tif 000029
【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
0006708556.tif 000031
【図２１】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２２−３】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
0006708556.tif 000040
【図２４Ｃ】
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【配列表】
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