(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ｉ）第一Ｆｃドメイン変異体と、
ｉｉ）ＣＤ３に結合する単鎖Ｆｖ領域（ｓｃＦｖ）と、
を含む第一重鎖と、
ｂ）ｉ）第二Ｆｃドメイン変異体と、
ｉｉ）第一可変重ドメインと、
を含む第二重鎖と、
ｃ）第一可変軽ドメイン及び第一定常軽ドメインを含む第一軽鎖と、
を含むヘテロ二量体抗体であって、
前記第一可変重ドメイン及び前記第一可変軽ドメインが、ＣＤ３８に結合し、
前記第二重鎖が、アミノ酸配列ＲＳＷＭＮからなるＣＤＲ１配列、アミノ酸配列ＥＩＮＰＤＳＳＴＩＮＹＡＴＳＶＫＧからなるＣＤＲ２配列およびアミノ酸配列ＹＧＮＷＦＰＹからなるＣＤＲ３配列を含み、前記第一軽鎖が、アミノ酸配列ＲＡＳＱＮＶＤＴＷＶＡからなるＣＤＲ１配列、アミノ酸配列ＳＡＳＹＲＹＳからなるＣＤＲ２配列およびアミノ酸配列ＱＱＹＤＳＹＰＬＴからなるＣＤＲ３配列を含む、前記ヘテロ二量体抗体。
【請求項２】
前記第二重鎖及び前記第一軽鎖が、Ｈ１（配列識別番号４７３）およびＬ１．２４（配列識別番号４７５）である、請求項１に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項３】
前記ｓｃＦｖが、荷電ｓｃＦｖリンカーを有する、請求項１または請求項２に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項４】
荷電ｓｃＦｖリンカーが、３〜８の正電荷を有し、配列識別番号４４３〜４５１からなる群から選択される、請求項３に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項５】
前記第一重鎖が、配列識別番号５２０のＦｃドメインを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項６】
前記第一重鎖が、配列識別番号５２０のアミノ酸２５５〜４８５を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項７】
ａ）請求項１に記載の第一重鎖をコードする第一核酸と、
ｂ）請求項１に記載の第二重鎖をコードする第二核酸と、
ｃ）請求項１に記載の第一軽鎖をコードする第三核酸と、
を含む、核酸組成物。
【請求項８】
ａ）請求項１に記載の第一重鎖をコードする第一核酸を含む第一発現ベクターと、
ｂ）請求項１に記載の第二重鎖をコードする第二核酸を含む第二発現ベクターと、
ｃ）請求項１に記載の第一軽鎖をコードする第三核酸を含む第三発現ベクターと、
を含む、核酸組成物。
【請求項９】
請求項７または請求項８に記載の核酸組成物を含む、宿主細胞。
【請求項１０】
ａ）ｉ）前記第二Ｆｃドメイン変異体と、
ｉｉ）前記第一可変重ドメインと、
を含む前記第二重鎖をコードする第一核酸を含む第一発現ベクターの供給と、
ｂ）ｉ）前記第一Ｆｃドメイン変異体と、
ｉｉ）ＣＤ３に結合する前記単鎖Ｆｖ領域（ｓｃＦｖ）と、
を含む前記第一重鎖をコードする第二核酸を含む第二発現ベクターの供給と、
ｃ）前記第一軽鎖をコードする第三核酸を含む第三発現ベクターの供給と、
を含む、請求項１〜６のいずれかに記載のヘテロ二量体抗体の産生方法であって、
前記第一可変重ドメイン及び前記第一軽鎖の可変軽ドメインが、ＣＤ３８に結合し、
ｄ）前記第一、第二、及び第三発現ベクターが、１：１．５：１．５、１：２：１．５、１：０．６６７：２、１：１：２、１：１．５：２、及び１：２：２からなる群から選択される比で、宿主細胞にトランスフェクトされ、
ｅ）前記宿主細胞において、前記第一、第二、及び第三核酸を発現し、それぞれが第一、第二、及び第三アミノ酸配列を産生し、その結果、前記第一、第二、及び第三アミノ酸配列が、前記ヘテロ二量体抗体を形成する、
前記産生方法。
【請求項１１】
（ｆ）前記ヘテロ二量体抗体の医薬組成物への製剤化をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体を含む、必要とする患者を処置するための組成物。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９の下、２０１４年３月２８日出願の米国仮特許出願第６１／９７２，１７２号、２０１４年７月７日出願の米国仮特許出願第６２／０２５，９７４号、及び２０１４年７月１７日出願の米国仮特許出願第６２／０２５，９３１号に対する優先権を主張し、それらの内容全体が、本参照によって、あらゆる目的に向けて本明細書に組み込まれ、特に、本明細書に概要が記載される図、説明文、及びデータに向けて、本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明は、抗原を同時に共捕捉する新規のイムノグロブリン組成物に関して説明し、当該抗原の両方が、一価で結合される。説明される新規のイムノグロブリンは、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を利用することが好ましい。新規のイムノグロブリン組成物の使用方法も本明細書で説明され、特に、治療目的のためのものである。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
抗体に基づく治療は、癌及び自己免疫疾患／炎症疾患を含む様々な病気の処置に、成功裏に使用されてきた。しかしながら、このクラスの薬物には、依然として改善が必要であり、特に、その臨床的有効性の増進に関して改良が必要である。探索されている１つの手段は、単一イムノグロブリン分子が、２つの異なる抗原を共捕捉するように、追加かつ新規の抗原結合部位を操作し、抗体に基づく薬物にすることである。２つの異なる抗原を捕捉するそのような非天然または代替の抗体形式は、二重特異性体と呼ばれることが多い。抗体可変領域（Ｆｖ）の相当な多様性によって、実質的にいかなる分子でもそれを認識するＦｖを産生することが可能であるため、二重特異性の生成に対する典型的な手法は、新しい可変領域を抗体へ導入することである。
【０００４】
多くの代替抗体形式が、二重特異性ターゲッティングに向けて探索されてきた（Ｃｈａｍｅｓ  ＆  Ｂａｔｙ，２００９，ｍＡｂｓ  １［６］：１−９、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ＆  Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３［９］：１１２６−１１３６、及びＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ，２０１２  ＭＡｂｓ  ４（２）：１８２、これらのすべてが、参照によって、本明細書に明確に組み込まれる）。初期には、二重特異性抗体は、それぞれが単一のモノクローナル抗体を産生する２つの細胞株を融合することによって作られた（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７−５４０）。得られたハイブリッドのハイブリドーマまたはクアドローマは、二重特異性抗体を確かに産生はしたが、少数集団にすぎず、所望の抗体の単離には、広範な精製が必要であった。これに対する操作的な解決策は、抗体断片を使用して、二重特異性体を作ることであった。そのような断片は、全長抗体の複雑な四次構造を欠いているため、可変軽鎖及び可変重鎖を、単一の遺伝子構築物において連結できる。ダイアボディ、単鎖ダイアボディ、直列型ｓｃＦｖ、及びＦａｂ２の二重特異性体を含む、多くの異なる形態の抗体断片が作成されてきた（Ｃｈａｍｅｓ  ＆  Ｂａｔｙ，２００９，ｍＡｂｓ  １［６］：１−９、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ＆  Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３［９］：１１２６−１１３６が、参照によって、本明細書に明確に組み込まれる）。こうした形式は、細菌において高水準で発現でき、サイズが小さいため、有利に浸透する利点を有し得るが、一方で、生体内において速やかに減失すると共に、生産及び安定性に関して、製造性上の障壁が存在し得る。こうした弱点の主要な原因は、抗体断片が、それに関連する機能特性を有する抗体の定常領域を通常は欠いていることにあり、当該関連機能特性には、サイズの大型化、高安定性、ならびに血清における長期半減期の維持（すなわち、新生児型Ｆｃ受容体であるＦｃＲｎ）または精製のための結合部位として働く（すなわち、プロテインＡ及びプロテインＧ）様々なＦｃ受容体及びＦｃリガンドへの結合が含まれる。
【０００５】
より最新の研究では、二重である結合を全長抗体様形式へと操作することによって、断片に基づく二重特異性体が有する欠点に対処することが試みられている（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５［１１］：１２９０−１２９７、ＵＳＳＮ１２／４７７，７１１、Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，ｍＡｂｓ  １［２］：１２８−１４１、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７４６９３、  Ｚｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １３［５］：３６１−３６７、ＵＳＳＮ０９／８６５，１９８、Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１［１６］：１０７０６−１０７１４、Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８０［２０］：１９６６５−１９６７２、ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２５４７２、及びＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ，２０１２  ＭＡｂｓ  ４（２）：１８２、これらはすべて、参照によって、本明細書に明確に組み込まれる）。こうした形式は、抗体断片二重特異性体が有する障壁のいくつかを克服しており、これは、それらがＦｃ領域を含んでいることが主な理由である。こうした形式の１つの重大な弱点は、それらが、ホモ二量体定常鎖に追加で新しい抗原結合部位を構築するため、新しい抗原に対する結合が、常に二価であるということである。
【０００６】
治療用の二重特異性形式において、共標的（ｃｏ−ｔａｒｇｅｔ）として注目される抗原に向けた所望の結合の多くは、二価というよりもむしろ一価である。多くの免疫受容体では、細胞活性化は、一価の結合相互作用の架橋結合によって達成される。架橋結合の機構は、通常は、抗体／抗原免疫複合体によって媒介されるものであるか、またはエフェクター細胞が、標的細胞へと会合することを介するものである。例えば、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、及びＦｃγＲＩＩＩａなどの低親和性Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）は、抗体Ｆｃ領域に一価で結合する。一価の結合は、こうしたＦｃγＲを発現している細胞を活性化しないが、免疫複合体形成または細胞対細胞接触の際は、受容体は、架橋結合され、細胞表面にクラスターを形成し、活性化を引き起こす。例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上のＦｃγＲＩＩＩａのような、細胞殺傷の媒介を担う受容体では、エフェクター細胞が、非常に親和性が高い形式において標的細胞を捕捉するとき、受容体の架橋結合及び細胞の活性化が起こる（Ｂｏｗｌｅｓ  ＆  Ｗｅｉｎｅｒ，２００５，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３０４：８８−９９が、参照によって、明確に組み込まれる）。同様に、Ｂ細胞上で、抑制性受容体であるＦｃγＲＩＩｂは、Ｂ細胞活性化の下方制御を行い、これは、ＦｃγＲＩＩｂが、細胞表面Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）との免疫複合体へと取り込まれるときのみに起こるものであり、ＢＣＲによって認識されるものと同一の抗原と、可溶性ＩｇＧのものとの免疫複合体形成によって媒介される機構である（Ｈｅｙｍａｎ  ２００３，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ８８［２］：１５７−１６１、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｃｌａｔｗｏｒｔｈｙ，２０１０，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０：３２８−３４３が、参照によって、本明細書に明確に組み込まれる）。別の例として、Ｔ細胞のＣＤ３活性化は、その関連するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が、非常に親和性が高い細胞対細胞シナプスにおいて、抗原提示細胞上の抗原負荷されたＭＨＣを捕捉するときのみに起こる（Ｋｕｈｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２４：１３３−１３９）。実際、抗ＣＤ３抗体を使用したＣＤ３の非特異的二価架橋結合は、サイトカインの暴発及び毒性を誘発する（Ｐｅｒｒｕｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８３［２］：９５３−６１、Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ  ＆  Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ，２００７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７：６２２−６３２が、参照によって、明確に組み込まれる）。したがって、実践的な臨床使用に向けた、標的細胞の再配向化殺傷（ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｋｉｌｌｉｎｇ）のためのＣＤ３共会合の好ましいモードは、共捕捉される標的との会合時にのみ活性化をもたらす一価の結合である。
【０００７】
サイクリックＡＤＰリボースヒドロラーゼとしても知られるＣＤ３８は、長いＣ末端細胞外ドメイン、及び短いＮ末端細胞質ドメインを有する２型膜貫通糖タンパク質である。造血細胞の中で、ＣＤ３８が媒介するシグナル伝達に起因する機能性効果の種別には、リンパ球増殖、サイトカイン放出、Ｂ細胞及び骨髄細胞の発生と生存の制御、ならびに樹状細胞の成熟誘導が含まれる。多くの造血器悪性腫瘍、ならびに非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、Ｂ慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、Ｂ及びＴ急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｔ細胞リンパ腫（ＴＣＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を含む様々な造血器悪性腫瘍由来の細胞株において、ＣＤ３８は、制御されていない。一方で、造血系の原始的な多能性幹細胞のほとんどが、ＣＤ３８−である。抗癌物質の発見及び開発が、最近、進展しているにもかかわらず、ＣＤ３８−を発現している腫瘍が関与する癌の形態のほとんどで、依然として予後は、不良である。したがって、癌のそのような形態を処置するための方法の改善が必要である。
したがって、抗体断片から生成された二重特異性体は、生物物理学的及び薬物動態学的なハードルに直面している上に、全長抗体様形式で構築されたこれらの弱点は、一次標的抗原が存在しない状態において、共標的抗原を多価で捕捉し、非特異的な活性化及び潜在的毒性を引き起こすことである。本発明は、この問題を、明確に異なる標的抗原の共会合を可能にする新規の二重特異性形式を導入することによって解決する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｃｈａｍｅｓ  ＆  Ｂａｔｙ，２００９，ｍＡｂｓ  １［６］：１−９
【非特許文献２】Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ＆  Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３［９］：１１２６−１１３６
【非特許文献３】Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，２０１２  ＭＡｂｓ  ４（２）：１８２
【非特許文献４】Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７−５４０
【非特許文献５】Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５［１１］：１２９０−１２９７
【非特許文献６】Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，ｍＡｂｓ  １［２］：１２８−１４１
【非特許文献７】Ｚｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １３［５］：３６１−３６７
【非特許文献８】Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１［１６］：１０７０６−１０７１４
【非特許文献９】Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８０［２０］：１９６６５−１９６７２
【非特許文献１０】Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，２０１２  ＭＡｂｓ  ４（２）：１８２
【非特許文献１１】Ｂｏｗｌｅｓ  ＆  Ｗｅｉｎｅｒ，２００５，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３０４：８８−９９
【非特許文献１２】Ｈｅｙｍａｎ  ２００３，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ８８［２］：１５７−１６１
【非特許文献１３】Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｃｌａｔｗｏｒｔｈｙ，２０１０，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０：３２８−３４３
【非特許文献１４】Ｋｕｈｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２４：１３３−１３９
【非特許文献１５】Ｐｅｒｒｕｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８３［２］：９５３−６１
【非特許文献１６】Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ  ＆  Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ，２００７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７：６２２−６３２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、本発明は、ＣＤ３及びＣＤ３８に結合するヘテロ二量体抗体を提供する。ヘテロ二量体抗体は、第一可変Ｆｃドメイン、及びＣＤ３に結合する単鎖Ｆｖ領域（ｓｃＦｖ）を含む第一重鎖を含む。ヘテロ二量体抗体は、第二Ｆｃ可変Ｆｃドメイン、及び第一可変重ドメイン（ｆｉｒｓｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｄｏｍａｉｎ）を含む第二重鎖も含む。ヘテロ二量体抗体は、第一可変軽ドメイン（ｆｉｒｓｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｄｏｍａｉｎ）、及び第一定常軽ドメイン（ｆｉｒｓｔ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｌｉｇｈｔ  ｄｏｍａｉｎ）を含む第一軽鎖をさらに含み、ここで、当該第一可変重ドメイン、及び当該第一可変軽ドメインは、ＣＤ３８に結合する。
【００１０】
さらなる態様では、本発明は、ＸＥＮＰ１３２４３、ＸＥＮＰ１３５４５、ＸＥＮＰ１３５４６、ＸＥＮＰ１３５４７、ＸＥＮＰ１３５４８、ＸＥＮＰ１３５４９、ＸＥＮＰ１３５５０、ＸＥＮＰ１３５５１、ＸＥＮＰ１３５４４、ＸＥＮＰ１３７５２、ＸＥＮＰ１３７５３、ＸＥＮＰ１３７５４、ＸＥＮＰ１３７５６、ＸＥＮＰ１３７５７、及びＸＥＮＰ１３６９４からなる群から選択されるヘテロ二量体抗体を提供する。
【００１１】
追加の態様では、ｓｃＦｖは、Ｘａａ１が、Ｎ、ＳまたはＨ（配列識別番号４３５）である配列Ｔ−Ｙ−Ａ−Ｍ−Ｘａａ１を有するｖｈＣＤＲ１、Ｘａａ１が、ＹまたはＡ、Ｘａａ２が、ＮまたはＳ、Ｘａａ３が、ＹまたはＡ、及びＸａａ４が、ＤまたはＡ（配列識別番号４３６）である配列Ｒ−Ｉ−Ｒ−Ｓ−Ｋ−Ｘａａ１−Ｎ−Ｘａａ２−Ｙ−Ａ−Ｔ−Ｘａａ３−Ｙ−Ｙ−Ａ−Ｘａａ４−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇを有するｖｈＣＤＲ２、Ｘａａ１が、Ｎ、Ｄ、またはＱ、及びＸａａ２が、ＡまたはＤ（配列識別番号４３７）である配列Ｈ−Ｇ−Ｎ−Ｆ−Ｇ−Ｘａａ１−Ｓ−Ｙ−Ｖ−Ｓ−Ｗ−Ｆ−Ｘａａ２−Ｙを有するｖｈＣＤＲ３、Ｘａａ１が、Ｇ、Ｒ、またはＫ、Ｘａａ２が、ＴまたはＳ、Ｘａａ３が、ＳまたはＧ、及びＸａａ４が、ＮまたはＨ（配列識別番号４３８）である配列Ｘａａ１−Ｓ−Ｓ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｖ−Ｔ−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｙ−Ａ−Ｎを有するｖｌＣＤＲ１、Ｘａａ１が、ＧまたはＤ、Ｘａａ２が、ＫまたはＮ、及びＸａａ３が、ＰまたはＳ（配列識別番号４３９）である配列Ｘａａ１−Ｔ−Ｎ−Ｘａａ２−Ｒ−Ａ−Ｘａａ３を有するｖｌＣＤＲ２、ならびにＸａａ１が、ＡまたはＬ、及びＸａａ２が、ＬまたはＨ（配列識別番号４４０）である配列Ｘａａ１−Ｌ−Ｗ−Ｙ−Ｓ−Ｎ−Ｘａａ２−Ｗ−Ｖを有するｖｌＣＤＲ３を含む配列を有する。
【００１２】
さらなる態様では、ｓｃＦｖは、Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、及びＨ１．３１＿Ｌ１．４７からなる群から選択される。
【００１３】
追加の態様では、抗ＣＤ３可変領域は、
【００１４】
ａ）配列識別番号４１１を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４１３を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１６を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２０を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２５を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３０を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
【００１５】
ｂ）配列識別番号４１２を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４１３を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１６を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２０を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２５を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３０を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
【００１６】
ｃ）配列識別番号４１１を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４１４を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１６を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２０を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２５を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３０を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
【００１７】
ｄ）配列識別番号４１１を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４１３を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１７を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２０を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２５を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３０を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
【００１８】
ｅ）配列識別番号４１１を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４１３を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１８を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２０を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２５を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３０を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
【００１９】
ｆ）配列識別番号４１１を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４１３を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１６を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２１を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２５を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３０を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
【００２０】
ｇ）配列識別番号４１１を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４１３を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１６を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２２を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２５を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３０を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
【００２１】
ｈ）配列識別番号４１１を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４１３を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１６を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２０を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２７を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３０を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
【００２２】
ｉ）配列識別番号４１１を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４１３を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１６を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２０を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２８を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３０を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
【００２３】
ｊ）配列識別番号４１１を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４１３を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１６を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２０を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２５を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３１を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
【００２４】
ｋ）配列識別番号４１１を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４１３を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１６を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２０を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２５を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３０を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
【００２５】
ｌ）配列識別番号４１１を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４１３を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１６を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２３を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２５を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３２を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
【００２６】
ｍ）配列識別番号４１１を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４１３を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１６を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２４を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２５を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３２を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
【００２７】
ｎ）配列識別番号４１２を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４１３を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１７を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２０を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２５を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３０を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
【００２８】
ｏ）配列識別番号４１２を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４１４を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１９を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２０を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２５を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３０を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
【００２９】
ｐ）配列識別番号４１１を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４１５を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１６を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２０を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２５を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３０を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
【００３０】
ｑ）配列識別番号４１１を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４１５を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１６を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２０を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２５を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３０を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
【００３１】
ｒ）配列識別番号４１１を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４１３を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１７を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２０を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２５を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３０を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
【００３２】
ｓ）配列識別番号４１１を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４１３を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１９を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２０を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２５を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３０を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
【００３３】
ｔ）配列識別番号４１１を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４１３を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１７を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２０を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２５を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３３を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
【００３４】
ｕ）配列識別番号４１１を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４１３を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１６を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２０を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２５を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３３を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
【００３５】
ｖ）配列識別番号４１１を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４３４を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１６を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２０を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２５を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３０を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
からなる群から選択される配列を有する。
【００３６】
追加の態様では、抗ＣＤ３可変領域は、
【００３７】
配列識別番号５及び６、配列識別番号９及び１０、配列識別番号１３及び１４、配列識別番号１７及び１８、配列識別番号２１及び２２、配列識別番号２５及び２６、配列識別番号２９及び３０、配列識別番号３３及び３４、配列識別番号３７及び３８、配列識別番号４１及び４２、配列識別番号４５及び４６、配列識別番号４９及び５０、配列識別番号５３及び５４、配列識別番号５７及び５８、配列識別番号６１及び６２、配列識別番号６５及び６６、配列識別番号６９及び７０、配列識別番号７３及び７４、配列識別番号７７及び７８、配列識別番号８１及び８２、配列識別番号８５及び８６、配列識別番号８９及び９０、配列識別番号９３及び９４、配列識別番号９７及び９８、配列識別番号１０１及び１０２、配列識別番号１０５及び１０６、配列識別番号１０９及び１１０、配列識別番号１１３及び１１４、配列識別番号１１７及び１１８、配列識別番号１２１及び１２２、配列識別番号１２５及び１２６、配列識別番号１２９及び１３０、配列識別番号１３３及び１３４、配列識別番号１３７及び１３８、配列識別番号１４１及び１４２、配列識別番号１４５及び１４６、配列識別番号１４９及び１５０、配列識別番号１５３及び１５４、配列識別番号１５７及び１５８、配列識別番号１６１及び１６２、配列識別番号１６５及び１６６、配列識別番号１６９及び１７０、配列識別番号１７３及び１７４、配列識別番号１７７及び１７８、配列識別番号１８１及び１８２、配列識別番号１８５及び１８６、配列識別番号１８９及び１９０、配列識別番号１９３及び１９４、配列識別番号１９７及び１９８、配列識別番号２０１及び２０２、配列識別番号２０５及び２０６、配列識別番号２０９及び２１０、配列識別番号２１３及び２１４、配列識別番号２１７及び２１８、配列識別番号２２１及び２２２、配列識別番号２２５及び２２６、配列識別番号２２９及び２３０、配列識別番号２３３及び２３４、配列識別番号２３７及び２３８、配列識別番号２４１及び２４２、配列識別番号２４５及び２４６、配列識別番号２４９及び２５０、配列識別番号２５３及び２５４、配列識別番号２５７及び２５８、配列識別番号２６１及び２６２、配列識別番号２６５及び２６６、配列識別番号２６９及び２７０、配列識別番号２７３及び２７４、配列識別番号２７７及び２７８、配列識別番号２８１及び２８２、配列識別番号２８５及び２８６、配列識別番号２８９及び２９０、配列識別番号２９３及び２９４、配列識別番号２９７及び２９８、配列識別番号３０１及び３０２、配列識別番号３０５及び３０６、配列識別番号３０９及び３１０、配列識別番号３１３及び３１４、配列識別番号３１７及び３１８、配列識別番号３２１及び３２２、配列識別番号３２５及び３２６、配列識別番号３２９及び３３０、配列識別番号３３３及び３３４、配列識別番号３３７及び３３８、配列識別番号３４１及び３４２、配列識別番号３４５及び３４６、配列識別番号３４９及び３５０、配列識別番号３５３及び３５４、配列識別番号３５７及び３５８、配列識別番号３６１及び３６２、配列識別番号３６５及び３６６、配列識別番号３６９及び３７０、配列識別番号３７３及び３７４、配列識別番号３７７及び３７８、配列識別番号３８１及び３８２、配列識別番号３８５及び３８６、配列識別番号３８９及び３９０、配列識別番号３９３及び３９４、配列識別番号３９７及び３９８、配列識別番号４０１及び４０２、配列識別番号４０５及び４０６、配列識別番号４０９及び４１０からなる群から選択される可変重領域及び可変軽領域を含む。
【００３８】
追加の態様では、ヘテロ二量体抗体は、Ｈ１及びＬ１と、Ｈ１及びＬ１．２４と、Ｈ１及びＬ１．９６と、Ｈ１．７７及びＬ１．９６と、Ｈ１．７７及びＬ１．９７と、Ｈ１．７２及びＬ１．９７と、Ｈ１．７１及びＬ１．９６と、Ｈ１．７７及びＬ１．２４と、からなる対から選択される第一可変重ドメイン及び第一可変軽ドメインを有する。
【００３９】
さらなる態様では、本発明は、上記のヘテロ二量体抗体を提供し、ｓｃＦｖは、荷電ｓｃＦｖリンカーを有する。荷電ｓｃＦｖリンカーは、３〜８の正の電荷を有し得、配列識別番号ｓ４４３〜４５１からなる群から選択される。
【００４０】
追加の態様では、ｓｃＦｖは、配列識別番号４、配列識別番号８、配列識別番号１２、配列識別番号１６、配列識別番号２０、配列識別番号２４、配列識別番号２８、配列識別番号３２、配列識別番号３６、配列識別番号４０、配列識別番号４４、配列識別番号４８、配列識別番号５２、配列識別番号５６、配列識別番号６０、配列識別番号６４、配列識別番号６８、配列識別番号７２、配列識別番号７６、配列識別番号８０、配列識別番号８４、配列識別番号８８、配列識別番号９２、配列識別番号９６、配列識別番号１００、配列識別番号１０４、配列識別番号１０８、配列識別番号１１２、配列識別番号１１６、配列識別番号１２０、配列識別番号１２４、配列識別番号１２８、配列識別番号１３２、配列識別番号１３６、配列識別番号１４０、配列識別番号１４４、配列識別番号１４８、配列識別番号１５２、配列識別番号１５６、配列識別番号１６０、配列識別番号１６４、配列識別番号１６８、配列識別番号１７２、配列識別番号１７６、配列識別番号１８０、配列識別番号１８４、配列識別番号１８８、配列識別番号１９２、配列識別番号１９６、配列識別番号２００、配列識別番号２０４、配列識別番号２０８、配列識別番号２１２、配列識別番号２１６、配列識別番号２２０、配列識別番号２２４、配列識別番号２２８、配列識別番号２３２、配列識別番号２３６、配列識別番号２４０、配列識別番号２４４、配列識別番号２４８、配列識別番号２５２、配列識別番号２５６、配列識別番号２６０、配列識別番号２６４、配列識別番号２６８、配列識別番号２７２、配列識別番号２７６、配列識別番号２８０、配列識別番号２８４、配列識別番号２８８、配列識別番号２９２、配列識別番号２９６、配列識別番号３００、配列識別番号３０４、配列識別番号３０８、配列識別番号３１２、配列識別番号３１６、配列識別番号３２０、配列識別番号３２４、配列識別番号３２８、配列識別番号３３２、配列識別番号３３６、配列識別番号３４０、配列識別番号３４４、配列識別番号３４８、配列識別番号３５２、配列識別番号３５６、配列識別番号３６０、配列識別番号３６４、配列識別番号３６８、配列識別番号３７２、配列識別番号３７６、配列識別番号３８０、配列識別番号３８４、配列識別番号３８８、配列識別番号３９２、配列識別番号３９６、配列識別番号４００、配列識別番号４０４、配列識別番号４０８からなる群から選択される配列を有する。
【００４１】
さらなる態様では、重鎖のＦｃ領域は、ＦｃＲｎ変異体をさらに含み、限定はされないが、４２８Ｌ／４３４Ｓが含まれる。
【００４２】
さらなる態様では、本発明は、Ｆｃ領域及びＣＤ３に結合するｓｃＦｖを含む第一重鎖をコードする第一核酸と、重定常鎖及び重可変鎖を含む第二重鎖をコードする第二核酸と、軽鎖をコードする第三核酸と、を含む核酸組成物を提供し、第二重鎖及び軽鎖のＦｖ領域は、ＣＤ３８に結合する。こうした核酸は、異なる発現ベクターまたは同一のものに存在し得る。本発明は、核酸組成物を含む宿主細胞を提供する。
【００４３】
さらなる態様では、本発明は、本発明の二量体抗体の産生方法を提供し、当該方法は、第一Ｆｃドメイン及び第一可変重鎖を含む第一重鎖をコードする第一核酸を含む第一発現ベクターの提供と、第一Ｆｃドメイン及びＣＤ３に結合する単鎖Ｆｖ領域（ｓｃＦｖ）を含む第二重鎖をコードする第二核酸を含む第二発現ベクターの提供と、軽鎖を含む核酸を含む第三発現ベクターの提供と、を含み、当該第一可変重鎖及び当該軽鎖の可変軽ドメインは、ＣＤ３８に結合する。第一、第二、及び第三発現ベクターは、１：１．５：１．５、１：２：１．５、１：０．６６７：２、１：１：２、１：１．５：２、及び１：２：２からなる群から選択される比で、宿主細胞へトランスフェクトされる。宿主細胞において、第一、第二、及び第三核酸は、第一、第二、及び第三アミノ酸配列をそれぞれ産生し、その結果、当該第一、第二、及び第三アミノ酸配列は、ヘテロ二量体抗体を形成する。
【００４４】
追加の態様では、本発明は、本発明によるヘテロ二量体抗体の投与によって、その必要がある患者の処置方法を提供する。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
ａ）ｉ）第一可変Ｆｃドメインと、
ｉｉ）ＣＤ３に結合する単鎖Ｆｖ領域（ｓｃＦｖ）と、
を含む第一重鎖と、
ｂ）ｉ）第二Ｆｃ可変Ｆｃドメインと、
ｉｉ）第一可変重ドメインと、
を含む第二重鎖と、
ｃ）第一可変軽ドメイン及び第一定常軽ドメインを含む第一軽鎖と、
を含むヘテロ二量体抗体であって、
前記第一可変重ドメイン及び前記第一可変軽ドメインが、ＣＤ３８に結合する、前記ヘテロ二量体抗体。
（項目２）
前記ヘテロ二量体抗体が、ＸＥＮＰ１３５５１であって、前記第一重鎖、前記第二重鎖、及び前記第一軽鎖が、図２０または図２２に示される配列を有する、項目１に記載のヘテロ二量体抗体。
（項目３）
前記ｓｃＦｖが、配列Ｔ−Ｙ−Ａ−Ｍ−Ｘａａ１であって、Ｘａａ１が、Ｎ、ＳまたはＨ（配列識別番号４３５）である前記配列Ｔ−Ｙ−Ａ−Ｍ−Ｘａａ１を有するｖｈＣＤＲ１、配列Ｒ−Ｉ−Ｒ−Ｓ−Ｋ−Ｘａａ１−Ｎ−Ｘａａ２−Ｙ−Ａ−Ｔ−Ｘａａ３−Ｙ−Ｙ−Ａ−Ｘａａ４−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇであって、Ｘａａ１が、ＹまたはＡ、Ｘａａ２が、ＮまたはＳ、Ｘａａ３が、ＹまたはＡ、及びＸａａ４が、ＤまたはＡ（配列識別番号４３６）である前記配列Ｒ−Ｉ−Ｒ−Ｓ−Ｋ−Ｘａａ１−Ｎ−Ｘａａ２−Ｙ−Ａ−Ｔ−Ｘａａ３−Ｙ−Ｙ−Ａ−Ｘａａ４−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇを有するｖｈＣＤＲ２、配列Ｈ−Ｇ−Ｎ−Ｆ−Ｇ−Ｘａａ１−Ｓ−Ｙ−Ｖ−Ｓ−Ｗ−Ｆ−Ｘａａ２−Ｙであって、Ｘａａ１が、Ｎ、Ｄ、またはＱ、及びＸａａ２が、ＡまたはＤ（配列識別番号４３７）である前記配列Ｈ−Ｇ−Ｎ−Ｆ−Ｇ−Ｘａａ１−Ｓ−Ｙ−Ｖ−Ｓ−Ｗ−Ｆ−Ｘａａ２−Ｙを有するｖｈＣＤＲ３、配列Ｘａａ１−Ｓ−Ｓ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｖ−Ｔ−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｙ−Ａ−Ｎであって、Ｘａａ１が、Ｇ、Ｒ、またはＫ、Ｘａａ２が、ＴまたはＳ、Ｘａａ３が、ＳまたはＧ、及びＸａａ４が、ＮまたはＨ（配列識別番号４３８）である前記配列Ｘａａ１−Ｓ−Ｓ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｖ−Ｔ−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｙ−Ａ−Ｎを有するｖｌＣＤＲ１、配列Ｘａａ１−Ｔ−Ｎ−Ｘａａ２−Ｒ−Ａ−Ｘａａ３であって、Ｘａａ１が、ＧまたはＤ、Ｘａａ２が、ＫまたはＮ、及びＸａａ３が、ＰまたはＳ（配列識別番号４３９）である前記配列Ｘａａ１−Ｔ−Ｎ−Ｘａａ２−Ｒ−Ａ−Ｘａａ３を有するｖｌＣＤＲ２、ならびに配列Ｘａａ１−Ｌ−Ｗ−Ｙ−Ｓ−Ｎ−Ｘａａ２−Ｗ−Ｖであって、Ｘａａ１が、ＡまたはＬ、及びＸａａ２が、ＬまたはＨ（配列識別番号４４０）である前記配列Ｘａａ１−Ｌ−Ｗ−Ｙ−Ｓ−Ｎ−Ｘａａ２−Ｗ−Ｖを有するｖｌＣＤＲ３を含む配列を有する、項目１に記載のヘテロ二量体抗体。
（項目４）
前記ｓｃＦｖが、Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、及びＨ１．３１＿Ｌ１．４７からなる群から選択される、項目１〜３のいずれかに記載の組成物。
（項目５）
前記抗ＣＤ３可変領域が、
ａ）配列識別番号４１１を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４１３を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１６を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２０を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２５を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３０を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
ｂ）配列識別番号４１２を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４１３を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１６を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２０を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２５を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３０を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
ｃ）配列識別番号４１１を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４１４を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１６を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２０を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２５を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３０を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
ｄ）配列識別番号４１１を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４１３を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１７を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２０を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２５を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３０を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
ｅ）配列識別番号４１１を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４１３を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１８を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２０を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２５を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３０を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
ｆ）配列識別番号４１１を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４１３を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１６を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２１を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２５を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３０を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
ｇ）配列識別番号４１１を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４１３を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１６を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２２を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２５を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３０を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
ｈ）配列識別番号４１１を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４１３を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１６を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２０を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２７を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３０を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
ｉ）配列識別番号４１１を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４１３を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１６を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２０を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２８を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３０を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
ｊ）配列識別番号４１１を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４１３を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１６を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２０を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２５を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３１を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
ｋ）配列識別番号４１１を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４１３を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１６を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２０を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２５を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３０を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
ｌ）配列識別番号４１１を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４１３を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１６を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２３を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２５を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３２を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
ｍ）配列識別番号４１１を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４１３を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１６を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２４を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２５を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３２を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
ｎ）配列識別番号４１２を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４１３を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１７を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２０を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２５を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３０を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
ｏ）配列識別番号４１２を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４１４を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１９を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２０を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２５を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３０を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
ｐ）配列識別番号４１１を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４１５を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１６を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２０を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２５を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３０を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
ｑ）配列識別番号４１１を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４１５を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１６を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２０を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２５を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３０を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
ｒ）配列識別番号４１１を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４１３を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１７を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２０を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２５を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３０を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
ｓ）配列識別番号４１１を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４１３を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１９を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２０を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２５を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３０を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
ｔ）配列識別番号４１１を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４１３を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１７を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２０を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２５を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３３を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
ｕ）配列識別番号４１１を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４１３を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１６を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２０を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２５を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３３を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
ｖ）配列識別番号４１１を有するｖｈＣＤＲ１、配列識別番号４３４を有するｖｈＣＤＲ２、配列識別番号４１６を有するｖｈＣＤＲ３、配列識別番号４２０を有するｖｌＣＤＲ１、配列識別番号４２５を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列識別番号４３０を有するｖｌＣＤＲ３を含む配列と、
からなる群から選択される配列を有する、項目１または３に記載の組成物。
（項目６）
前記第一可変重ドメイン及び前記第一可変軽ドメインが、Ｈ１及びＬ１と、Ｈ１及びＬ１．２４と、Ｈ１及びＬ１．９６と、Ｈ１．７７及びＬ１．９６と、Ｈ１．７７及びＬ１．９７と、Ｈ１．７２及びＬ１．９７と、Ｈ１．７１及びＬ１．９６と、Ｈ１．７７及びＬ１．２４と、からなる対から選択される、項目１〜５のいずれかに記載のヘテロ二量体抗体。
（項目７）
前記ｓｃＦｖが、荷電ｓｃＦｖリンカーを有する、項目１〜６のいずれかに記載のヘテロ二量体抗体。
（項目８）
前記抗ＣＤ３可変領域が、
配列識別番号５及び６、配列識別番号９及び１０、配列識別番号１３及び１４、配列識別番号１７及び１８、配列識別番号２１及び２２、配列識別番号２５及び２６、配列識別番号２９及び３０、配列識別番号３３及び３４、配列識別番号３７及び３８、配列識別番号４１及び４２、配列識別番号４５及び４６、配列識別番号４９及び５０、配列識別番号５３及び５４、配列識別番号５７及び５８、配列識別番号６１及び６２、配列識別番号６５及び６６、配列識別番号６９及び７０、配列識別番号７３及び７４、配列識別番号７７及び７８、配列識別番号８１及び８２、配列識別番号８５及び８６、配列識別番号８９及び９０、配列識別番号９３及び９４、配列識別番号９７及び９８、配列識別番号１０１及び１０２、配列識別番号１０５及び１０６、配列識別番号１０９及び１１０、配列識別番号１１３及び１１４、配列識別番号１１７及び１１８、配列識別番号１２１及び１２２、配列識別番号１２５及び１２６、配列識別番号１２９及び１３０、配列識別番号１３３及び１３４、配列識別番号１３７及び１３８、配列識別番号１４１及び１４２、配列識別番号１４５及び１４６、配列識別番号１４９及び１５０、配列識別番号１５３及び１５４、配列識別番号１５７及び１５８、配列識別番号１６１及び１６２、配列識別番号１６５及び１６６、配列識別番号１６９及び１７０、配列識別番号１７３及び１７４、配列識別番号１７７及び１７８、配列識別番号１８１及び１８２、配列識別番号１８５及び１８６、配列識別番号１８９及び１９０、配列識別番号１９３及び１９４、配列識別番号１９７及び１９８、配列識別番号２０１及び２０２、配列識別番号２０５及び２０６、配列識別番号２０９及び２１０、配列識別番号２１３及び２１４、配列識別番号２１７及び２１８、配列識別番号２２１及び２２２、配列識別番号２２５及び２２６、配列識別番号２２９及び２３０、配列識別番号２３３及び２３４、配列識別番号２３７及び２３８、配列識別番号２４１及び２４２、配列識別番号２４５及び２４６、配列識別番号２４９及び２５０、配列識別番号２５３及び２５４、配列識別番号２５７及び２５８、配列識別番号２６１及び２６２、配列識別番号２６５及び２６６、配列識別番号２６９及び２７０、配列識別番号２７３及び２７４、配列識別番号２７７及び２７８、配列識別番号２８１及び２８２、配列識別番号２８５及び２８６、配列識別番号２８９及び２９０、配列識別番号２９３及び２９４、配列識別番号２９７及び２９８、配列識別番号３０１及び３０２、配列識別番号３０５及び３０６、配列識別番号３０９及び３１０、配列識別番号３１３及び３１４、配列識別番号３１７及び３１８、配列識別番号３２１及び３２２、配列識別番号３２５及び３２６、配列識別番号３２９及び３３０、配列識別番号３３３及び３３４、配列識別番号３３７及び３３８、配列識別番号３４１及び３４２、配列識別番号３４５及び３４６、配列識別番号３４９及び３５０、配列識別番号３５３及び３５４、配列識別番号３５７及び３５８、配列識別番号３６１及び３６２、配列識別番号３６５及び３６６、配列識別番号３６９及び３７０、配列識別番号３７３及び３７４、配列識別番号３７７及び３７８、配列識別番号３８１及び３８２、配列識別番号３８５及び３８６、配列識別番号３８９及び３９０、配列識別番号３９３及び３９４、配列識別番号３９７及び３９８、配列識別番号４０１及び４０２、配列識別番号４０５及び４０６、配列識別番号４０９及び４１０からなる群から選択される可変重領域及び可変軽領域を含む、項目１〜６のいずれかに記載の組成物。
（項目９）
荷電ｓｃＦｖリンカーが、３〜８の正電荷を有し、配列識別番号４４３〜４５１からなる群から選択される、項目７に記載の組成物。
（項目１０）
前記ｓｃＦｖが、配列識別番号４、配列識別番号８、配列識別番号１２、配列識別番号１６、配列識別番号２０、配列識別番号２４、配列識別番号２８、配列識別番号３２、配列識別番号３６、配列識別番号４０、配列識別番号４４、配列識別番号４８、配列識別番号５２、配列識別番号５６、配列識別番号６０、配列識別番号６４、配列識別番号６８、配列識別番号７２、配列識別番号７６、配列識別番号８０、配列識別番号８４、配列識別番号８８、配列識別番号９２、配列識別番号９６、配列識別番号１００、配列識別番号１０４、配列識別番号１０８、配列識別番号１１２、配列識別番号１１６、配列識別番号１２０、配列識別番号１２４、配列識別番号１２８、配列識別番号１３２、配列識別番号１３６、配列識別番号１４０、配列識別番号１４４、配列識別番号１４８、配列識別番号１５２、配列識別番号１５６、配列識別番号１６０、配列識別番号１６４、配列識別番号１６８、配列識別番号１７２、配列識別番号１７６、配列識別番号１８０、配列識別番号１８４、配列識別番号１８８、配列識別番号１９２、配列識別番号１９６、配列識別番号２００、配列識別番号２０４、配列識別番号２０８、配列識別番号２１２、配列識別番号２１６、配列識別番号２２０、配列識別番号２２４、配列識別番号２２８、配列識別番号２３２、配列識別番号２３６、配列識別番号２４０、配列識別番号２４４、配列識別番号２４８、配列識別番号２５２、配列識別番号２５６、配列識別番号２６０、配列識別番号２６４、配列識別番号２６８、配列識別番号２７２、配列識別番号２７６、配列識別番号２８０、配列識別番号２８４、配列識別番号２８８、配列識別番号２９２、配列識別番号２９６、配列識別番号３００、配列識別番号３０４、配列識別番号３０８、配列識別番号３１２、配列識別番号３１６、配列識別番号３２０、配列識別番号３２４、配列識別番号３２８、配列識別番号３３２、配列識別番号３３６、配列識別番号３４０、配列識別番号３４４、配列識別番号３４８、配列識別番号３５２、配列識別番号３５６、配列識別番号３６０、配列識別番号３６４、配列識別番号３６８、配列識別番号３７２、配列識別番号３７６、配列識別番号３８０、配列識別番号３８４、配列識別番号３８８、配列識別番号３９２、配列識別番号３９６、配列識別番号４００、配列識別番号４０４、配列識別番号４０８からなる群から選択される配列を有する、項目１〜９のいずれかに記載の組成物。
（項目１１）
前記ｓｃＦｖが、配列識別番号３９６の配列を有する、項目２に記載の組成物。
（項目１２）
ＸＥＮＰ１３２４３、ＸＥＮＰ１３５４５、ＸＥＮＰ１３５４６、ＸＥＮＰ１３５４７、ＸＥＮＰ１３５４８、ＸＥＮＰ１３５４９、ＸＥＮＰ１３５５０、ＸＥＮＰ１３５５１、ＸＥＮＰ１３５４４、ＸＥＮＰ１３７５２、ＸＥＮＰ１３７５３、ＸＥＮＰ１３７５４、ＸＥＮＰ１３７５６、ＸＥＮＰ１３７５７、及びＸＥＮＰ１３６９４からなる群から選択される、項目１〜１１のいずれかに記載のヘテロ二量体抗体。
（項目１３）
前記重鎖のＦｃ領域が、ＦｃＲｎ変異体をさらに含む、項目１〜１２のいずれかに記載のヘテロ二量体抗体。
（項目１４）
前記変異体が、４２８Ｌ／４３４Ｓである、項目１３に記載のヘテロ二量体抗体。
（項目１５）
ａ）項目１に記載の第一重鎖をコードする第一核酸と、
ｂ）項目１に記載の第二重鎖をコードする第二核酸と、
ｃ）前記軽鎖をコードする第三核酸と、
を含む、核酸組成物。
（項目１６）
ａ）項目１に記載の第一重鎖をコードする第一核酸を含む第一発現ベクターと、
ｂ）項目１に記載の第二重鎖をコードする第二核酸を含む第二発現ベクターと、
ｃ）前記軽鎖をコードする第三核酸を含む第三発現ベクターと、
を含む、核酸組成物。
（項目１７）
項目１５に記載の核酸組成物を含む、宿主細胞。
（項目１８）
項目１６からなる核酸を含む、宿主細胞。
（項目１９）
ａ）ｉ）第一Ｆｃドメインと、
ｉｉ）第一可変重鎖と、
を含む第一重鎖をコードする第一核酸を含む第一発現ベクターの供給と、
ｂ）ｉ）第一Ｆｃドメインと、
ｉｉ）ＣＤ３に結合する単鎖Ｆｖ領域（ｓｃＦｖ）と、
を含む第二重鎖をコードする第二核酸を含む第二発現ベクターの供給と、
ｃ）軽鎖を含む核酸を含む第三発現ベクターの供給と、
を含む、項目１〜１４のいずれかに記載のヘテロ二量体抗体の産生方法であって、
前記第一可変重鎖及び前記軽鎖の可変軽ドメインが、ＣＤ３８に結合し、
ｄ）前記第一、第二、及び第三発現ベクターが、１：１．５：１．５、１：２：１．５、１：０．６６７：２、１：１：２、１：１．５：２、及び１：２：２からなる群から選択される比で、宿主細胞にトランスフェクトされ、
ｅ）前記宿主細胞において、前記第一、第二、及び第三核酸を発現し、それぞれが第一、第二、及び第三アミノ酸配列を産生し、その結果、前記第一、第二、及び第三アミノ酸配列が、前記ヘテロ二量体抗体を形成する、
前記産生方法。
（項目２０）
項目１〜１４のいずれかに記載のヘテロ二量体抗体の投与による、必要とする患者の処置方法。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１Ａ】図１Ａ及び図１Ｂは、ヒトＣＤ３８の配列を示す。図１Ａは、全長配列を示し、図１Ｂは、細胞外ドメインを示す。
【図１Ｂ】図１Ａ及び図１Ｂは、ヒトＣＤ３８の配列を示す。図１Ａは、全長配列を示し、図１Ｂは、細胞外ドメインを示す。
【図２】ヒトＣＤ３の配列を示す。
【図３Ａ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３Ｂ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３Ｃ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３Ｄ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３Ｅ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３Ｆ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３Ｇ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３Ｈ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３Ｉ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３Ｊ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３Ｋ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３Ｌ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３Ｍ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３Ｎ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３Ｏ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３Ｐ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３Ｑ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３Ｒ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３Ｓ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３Ｔ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３Ｕ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３Ｖ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３Ｗ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３Ｘ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３Ｙ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３Ｚ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３ＡＡ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３ＢＢ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３ＣＣ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３ＤＤ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３ＥＥ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３ＦＦ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３ＧＧ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３ＨＨ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３ＩＩ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３ＪＪ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３ＫＫ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３ＬＬ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３ＭＭ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３ＮＮ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３ＯＯ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３ＰＰ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３ＱＱ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３ＲＲ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３ＳＳ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３ＴＴ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３ＵＵ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３ＶＶ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３ＷＷ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３ＸＸ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図３ＹＹ】図３Ａ〜図３ＹＹは、安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ配列、可変重配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、及び可変軽配列（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のアミノ酸配列を示す。（１番目の配列は、精製を容易にするためにヒスチジンタグを有する型であることにも留意されたい）。ＣＤＲには、下線が引かれている。最適化可変鎖及び最適化軽鎖（ならびにｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域及びＣＤＲに帰属し得ることを理解されるべきである。したがって、全体可変領域の開示は、別々に番号付けされていないが、フレームワーク領域の開示を含むと理解されるべきである。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示される。それぞれのｓｃＦｖリンカーは、図５に示される荷電ｓｃＦｖリンカーで置き換えることができる。すなわち、正であっても、負であっても、図５に示すものを含めて、何らかの荷電ｓｃＦｖリンカーで、図３Ａ〜図３ＹＹ中で強調されている領域を、置換することができる。
【図４Ａ】図４Ａ〜図４Ｉは、本発明及びコンセンサスＣＤＲにおいて有用である、ＣＤ３のｖｈＣＤＲ１−３配列及びｖｌＣＤＲ１−３配列のすべての照合を示す。
【図４Ｂ】図４Ａ〜図４Ｉは、本発明及びコンセンサスＣＤＲにおいて有用である、ＣＤ３のｖｈＣＤＲ１−３配列及びｖｌＣＤＲ１−３配列のすべての照合を示す。
【図４Ｃ】図４Ａ〜図４Ｉは、本発明及びコンセンサスＣＤＲにおいて有用である、ＣＤ３のｖｈＣＤＲ１−３配列及びｖｌＣＤＲ１−３配列のすべての照合を示す。
【図４Ｄ】図４Ａ〜図４Ｉは、本発明及びコンセンサスＣＤＲにおいて有用である、ＣＤ３のｖｈＣＤＲ１−３配列及びｖｌＣＤＲ１−３配列のすべての照合を示す。
【図４Ｅ】図４Ａ〜図４Ｉは、本発明及びコンセンサスＣＤＲにおいて有用である、ＣＤ３のｖｈＣＤＲ１−３配列及びｖｌＣＤＲ１−３配列のすべての照合を示す。
【図４Ｆ】図４Ａ〜図４Ｉは、本発明及びコンセンサスＣＤＲにおいて有用である、ＣＤ３のｖｈＣＤＲ１−３配列及びｖｌＣＤＲ１−３配列のすべての照合を示す。
【図４Ｇ】図４Ａ〜図４Ｉは、本発明及びコンセンサスＣＤＲにおいて有用である、ＣＤ３のｖｈＣＤＲ１−３配列及びｖｌＣＤＲ１−３配列のすべての照合を示す。
【図４Ｈ】図４Ａ〜図４Ｉは、本発明及びコンセンサスＣＤＲにおいて有用である、ＣＤ３のｖｈＣＤＲ１−３配列及びｖｌＣＤＲ１−３配列のすべての照合を示す。
【図４Ｉ】図４Ａ〜図４Ｉは、本発明及びコンセンサスＣＤＲにおいて有用である、ＣＤ３のｖｈＣＤＲ１−３配列及びｖｌＣＤＲ１−３配列のすべての照合を示す。
【図５】適した正荷電または負荷電のｓｃＦｖリンカーを示す。単一電荷を有する、単一の先行技術ｓｃＦｖリンカーは、Ｗｈｉｔｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６（８）：９８９−９９５（１９９３）にちなんで、「Ｗｈｉｔｌｏｗ」と呼ばれる。このリンカーは、ｓｃＦｖにおいて、凝集の低減、及びタンパク質分解に対する安定性の増進に向けて使用されることに留意されたい。
【図６Ａ】図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、及び図６Ｄは、新規の立体変異体（ｓｔｅｒｉｃ  ｖａｒｉａｎｔ）を示す。当業者によって理解されるように、それぞれの表の第一列は、「対応する」単量体の対を表し、すなわち、単量体１は、４０５Ａを有し、対応する立体変異体は、３９４Ｆである。非対称の三重Ｆ形式の構成においては、いずれかの単量体が、いずれかの変異体を有し得ることに留意することが重要である。すなわち、ｓｃＦｖ単量体は、単量体１または単量体２であり得る。かさねて、こうしたセットは、「鎖性（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）」が、幾分か維持される限り、他の立体変異体、ならびに電荷対、アイソタイプ変異体、等比体積変異体（ｉｓｏｓｔｅｒｉｃ  ｖａｒｉａｎｔ）、ｐＩ変異体等を含む他のヘテロ二量体化変異体と、任意選択かつ独立に組み合わせることができる。さらに、「単量体」は、Ｆｃドメインを指し、すなわち、三重Ｆ形式においては、Ｆａｂ構築物（重鎖及び軽鎖）を含む２つのアミノ酸配列が実際は存在するという事実にもかかわらず、一方の単量体は、ｓｃＦｖ構築物であり、もう一方の単量体は、Ｆａｂ構築物である。本発明において使用される、多くの適した立体または「歪曲（ｓｋｅｗ）」変異体を示す。図ａ６は、単独またはｐＩ変異体と組み合わせて使用できる多くの立体変異体を示す（図６に示す変異体のすべてにあてはまる）が、ｐＩ変異体が存在するのであれば、ｐＩ変異体及び立体変異体の「鎖性」は、維持されるべきであることは、当業者によって理解されよう。すなわち、例えば、ｐＩ変異体であるＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ（単量体１）及びＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ（単量体２）を、図２９Ｃの変異体と組み合わせることになるのであれば、立体変異体のｐＩが考慮され、正しい単量体に割り当てられるべきである。すなわち、電荷を変える立体変異体、例えば、（Ｔ４１１Ｅ）は、「負の」単量体に加えられる。
【図６Ｂ】図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、及び図６Ｄは、新規の立体変異体（ｓｔｅｒｉｃ  ｖａｒｉａｎｔ）を示す。当業者によって理解されるように、それぞれの表の第一列は、「対応する」単量体の対を表し、すなわち、単量体１は、４０５Ａを有し、対応する立体変異体は、３９４Ｆである。非対称の三重Ｆ形式の構成においては、いずれかの単量体が、いずれかの変異体を有し得ることに留意することが重要である。すなわち、ｓｃＦｖ単量体は、単量体１または単量体２であり得る。かさねて、こうしたセットは、「鎖性（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）」が、幾分か維持される限り、他の立体変異体、ならびに電荷対、アイソタイプ変異体、等比体積変異体（ｉｓｏｓｔｅｒｉｃ  ｖａｒｉａｎｔ）、ｐＩ変異体等を含む他のヘテロ二量体化変異体と、任意選択かつ独立に組み合わせることができる。さらに、「単量体」は、Ｆｃドメインを指し、すなわち、三重Ｆ形式においては、Ｆａｂ構築物（重鎖及び軽鎖）を含む２つのアミノ酸配列が実際は存在するという事実にもかかわらず、一方の単量体は、ｓｃＦｖ構築物であり、もう一方の単量体は、Ｆａｂ構築物である。本発明において使用される、多くの適した立体または「歪曲（ｓｋｅｗ）」変異体を示す。図ａ６は、単独またはｐＩ変異体と組み合わせて使用できる多くの立体変異体を示す（図６に示す変異体のすべてにあてはまる）が、ｐＩ変異体が存在するのであれば、ｐＩ変異体及び立体変異体の「鎖性」は、維持されるべきであることは、当業者によって理解されよう。すなわち、例えば、ｐＩ変異体であるＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ（単量体１）及びＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ（単量体２）を、図２９Ｃの変異体と組み合わせることになるのであれば、立体変異体のｐＩが考慮され、正しい単量体に割り当てられるべきである。すなわち、電荷を変える立体変異体、例えば、（Ｔ４１１Ｅ）は、「負の」単量体に加えられる。
【図６Ｃ】図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、及び図６Ｄは、新規の立体変異体（ｓｔｅｒｉｃ  ｖａｒｉａｎｔ）を示す。当業者によって理解されるように、それぞれの表の第一列は、「対応する」単量体の対を表し、すなわち、単量体１は、４０５Ａを有し、対応する立体変異体は、３９４Ｆである。非対称の三重Ｆ形式の構成においては、いずれかの単量体が、いずれかの変異体を有し得ることに留意することが重要である。すなわち、ｓｃＦｖ単量体は、単量体１または単量体２であり得る。かさねて、こうしたセットは、「鎖性（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）」が、幾分か維持される限り、他の立体変異体、ならびに電荷対、アイソタイプ変異体、等比体積変異体（ｉｓｏｓｔｅｒｉｃ  ｖａｒｉａｎｔ）、ｐＩ変異体等を含む他のヘテロ二量体化変異体と、任意選択かつ独立に組み合わせることができる。さらに、「単量体」は、Ｆｃドメインを指し、すなわち、三重Ｆ形式においては、Ｆａｂ構築物（重鎖及び軽鎖）を含む２つのアミノ酸配列が実際は存在するという事実にもかかわらず、一方の単量体は、ｓｃＦｖ構築物であり、もう一方の単量体は、Ｆａｂ構築物である。本発明において使用される、多くの適した立体または「歪曲（ｓｋｅｗ）」変異体を示す。図ａ６は、単独またはｐＩ変異体と組み合わせて使用できる多くの立体変異体を示す（図６に示す変異体のすべてにあてはまる）が、ｐＩ変異体が存在するのであれば、ｐＩ変異体及び立体変異体の「鎖性」は、維持されるべきであることは、当業者によって理解されよう。すなわち、例えば、ｐＩ変異体であるＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ（単量体１）及びＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ（単量体２）を、図２９Ｃの変異体と組み合わせることになるのであれば、立体変異体のｐＩが考慮され、正しい単量体に割り当てられるべきである。すなわち、電荷を変える立体変異体、例えば、（Ｔ４１１Ｅ）は、「負の」単量体に加えられる。
【図６Ｄ】図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、及び図６Ｄは、新規の立体変異体（ｓｔｅｒｉｃ  ｖａｒｉａｎｔ）を示す。当業者によって理解されるように、それぞれの表の第一列は、「対応する」単量体の対を表し、すなわち、単量体１は、４０５Ａを有し、対応する立体変異体は、３９４Ｆである。非対称の三重Ｆ形式の構成においては、いずれかの単量体が、いずれかの変異体を有し得ることに留意することが重要である。すなわち、ｓｃＦｖ単量体は、単量体１または単量体２であり得る。かさねて、こうしたセットは、「鎖性（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）」が、幾分か維持される限り、他の立体変異体、ならびに電荷対、アイソタイプ変異体、等比体積変異体（ｉｓｏｓｔｅｒｉｃ  ｖａｒｉａｎｔ）、ｐＩ変異体等を含む他のヘテロ二量体化変異体と、任意選択かつ独立に組み合わせることができる。さらに、「単量体」は、Ｆｃドメインを指し、すなわち、三重Ｆ形式においては、Ｆａｂ構築物（重鎖及び軽鎖）を含む２つのアミノ酸配列が実際は存在するという事実にもかかわらず、一方の単量体は、ｓｃＦｖ構築物であり、もう一方の単量体は、Ｆａｂ構築物である。本発明において使用される、多くの適した立体または「歪曲（ｓｋｅｗ）」変異体を示す。図ａ６は、単独またはｐＩ変異体と組み合わせて使用できる多くの立体変異体を示す（図６に示す変異体のすべてにあてはまる）が、ｐＩ変異体が存在するのであれば、ｐＩ変異体及び立体変異体の「鎖性」は、維持されるべきであることは、当業者によって理解されよう。すなわち、例えば、ｐＩ変異体であるＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ（単量体１）及びＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ（単量体２）を、図２９Ｃの変異体と組み合わせることになるのであれば、立体変異体のｐＩが考慮され、正しい単量体に割り当てられるべきである。すなわち、電荷を変える立体変異体、例えば、（Ｔ４１１Ｅ）は、「負の」単量体に加えられる。
【図７】操作されたヘテロ二量体歪曲（例えば、「立体ヘテロ二量体化」）Ｆｃ変異体の一覧を、ヘテロ二量体の収率（ＨＰＬＣ−ＣＩＥＸにより決定）及び熱安定性（ＤＳＣにより決定）と共に示す。未決定の熱安定性は、「ｎ．ｄ．」と示される。
【図８】図８Ａ〜図８Ｃ。二重特異性イムノグロブリン向けの「三重Ｆ」形式の図。図８Ａは、ｓｃＦｖ−Ｆｃ形式を示す。図８Ｃは、より標準的な二重特異性形式であり、本発明のｐＩ変異体（及び任意選択かつ独立に他のヘテロ二量体化変異体）も利用するものである。図８Ｂは、「三重Ｆ」形式を示す（「ボトルオープナー（ｂｏｔｔｌｅ−ｏｐｅｎｅｒ）」立体配置とも呼ばれることがあり、（任意選択かつ独立に他の二量体化変異体を利用する）。本明細書に記載される実施形態の多くが、二重特異性抗体の抗ＣＤ３成分をｓｃＦｖとして、抗ＣＤ３８成分をＦａｂ断片として有するが、これらは、荷電リンカーを任意選択で有する、ｓｃＦｖである抗ＣＤ３８成分、及び本明細書でＦａｂ断片へと再操作される抗ＣＤ３配列のｓｃＦｖのＦｖ領域と、交換してよいことは、当業者によって理解されよう。
【図９】ＦｃγＲ受容体のいくつか、またはすべてに対する結合の低減に適した多くの「ノックアウト」（「ＫＯ」）変異体を示す。こうしたＫＯ変異体は、図９で説明されるセット内のもの、ならびに立体変異体及びｐＩ変異体を含む、本明細書に概要が記載されるいずれかのヘテロ二量体化変異体のどちらとでも独立かつ任意選択で組み合わせることができ、これは、本明細書に記載される変異体のすべてにではないが、その多くにあてはまることである。例えば、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌは、一覧にあるいずれかの他の単一または二重変異体と組み合わせることができる。さらに、いくつかの実施形態では、両単量体が、同一ＫＯ変異体を含むことが好ましい一方で、異なる単量体上に異なるＫＯ変異体を組み込むこと、及びＫＯ変異体を含む単量体を１つだけ有することが可能である。ＵＳＳＮ６１／９１３，８７０の図及び説明文に対する参照もなされ、「ノックアウト」変異体または「消去（ａｂｌａｔｉｏｎ）」変異体に関連するため、それらはすべて、全体が、参照によって、明確に組み込まれる。
【図１０】操作されたヘテロ二量体歪曲Ｆｃ変異体の一覧をヘテロ二量体の収率（ＨＰＬＣ−ＣＩＥＸにより決定）及び熱安定性（ＤＳＣにより決定）と共に示す。未決定の熱安定性は、「ｎ．ｄ．」と示される。
【図１１】抗ＣＤ３８ｘ抗ＣＤ３二重特異性分子の構造を模式的に示す図である。
【図１２】親和性／安定性が操作された変異体である抗ＣＤ３８ｘ抗ＣＤ３二重特異性分子の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のデータである。
【図１３】抗ＣＤ２８ｘ抗ＣＤ３二重特異性分子によるＲＰＭＩ８２２６多発性骨髄腫細胞の殺傷を示す蛍光ＬＤＨ再配向化Ｔ細胞細胞傷害性（ｒｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）（ＲＴＣＣ）アッセイである。
【図１４】抗ＣＤ３８ｘ抗ＣＤ３二重特異性分子によるＲＰＭＩ８２２６多発性骨髄腫細胞の殺傷を示すＲＴＣＣアッセイ（アネキシンＶ＋）アッセイを示す。ＲＰＭＩ８２２６細胞に対するＴ細胞の比、及びインキュベーション時間を変動させている。
【図１５】親和性／安定性が操作された変異体である抗ＣＤ３８ｘ抗ＣＤ３二重特異性分子の特性を記載した表である。番号付けは、Ｋａｂａｔに従った。
【図１６】抗ＣＤ３８ｘ抗ＣＤ３二重特異性分子のカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＣＤ２０＋細胞に対する結合く。
【図１７】ｈｕＰＢＭＣが移植されたＳＣＩＤマウスにおける、抗ＣＤ３８ｘ抗ＣＤ３二重特異性体によるヒト形質細胞の殺傷。ヒトＩｇＧ２アイソタイプ及びヒトＩｇＥアイソタイプの顕著な減少がみられる。２２日目の平均値±ＳＥＭが示される。ＩｇＧ２のＢＬＱは、＜１μｇ／ｍＬであり、ＩｇＥのＢＬＱは、＜１６ｎｇ／ｍＬである。ＢＬＱ未満のデータポイントは、ＢＬＱ値に割り当てた。
【図１８】ｈｕＰＢＭＣが移植されたＳＣＩＤマウスにおける、抗ＣＤ３８ｘ抗ＣＤ３二重特異性体によるヒト形質細胞の殺傷。ヒトＩｇＭの顕著な減少がみられる。２２日目の平均値±ＳＥＭが示される。ＩｇＭのＢＬＱは、＜０．０３μｇ／ｍＬである。ＢＬＱ未満のデータポイントは、ＢＬＱ値に割り当てた。
【図１９】抗ＣＤ３８ｘ抗ＣＤ３二重特異性抗体による、ＭＭ  ＰＢＭＣにおけるＣＤ３８＋ＣＤ１３８＋細胞の欠乏。
【図２０Ａ】図２０Ａ〜図２０Ｑは、本発明のＣＤ３８ＸＣＤ３ｓｃＦｖボトルオープナーの配列を示す。
【図２０Ｂ】図２０Ａ〜図２０Ｑは、本発明のＣＤ３８ＸＣＤ３ｓｃＦｖボトルオープナーの配列を示す。
【図２０Ｃ】図２０Ａ〜図２０Ｑは、本発明のＣＤ３８ＸＣＤ３ｓｃＦｖボトルオープナーの配列を示す。
【図２０Ｄ】図２０Ａ〜図２０Ｑは、本発明のＣＤ３８ＸＣＤ３ｓｃＦｖボトルオープナーの配列を示す。
【図２０Ｅ】図２０Ａ〜図２０Ｑは、本発明のＣＤ３８ＸＣＤ３ｓｃＦｖボトルオープナーの配列を示す。
【図２０Ｆ】図２０Ａ〜図２０Ｑは、本発明のＣＤ３８ＸＣＤ３ｓｃＦｖボトルオープナーの配列を示す。
【図２０Ｇ】図２０Ａ〜図２０Ｑは、本発明のＣＤ３８ＸＣＤ３ｓｃＦｖボトルオープナーの配列を示す。
【図２０Ｈ】図２０Ａ〜図２０Ｑは、本発明のＣＤ３８ＸＣＤ３ｓｃＦｖボトルオープナーの配列を示す。
【図２０Ｉ】図２０Ａ〜図２０Ｑは、本発明のＣＤ３８ＸＣＤ３ｓｃＦｖボトルオープナーの配列を示す。
【図２０Ｊ】図２０Ａ〜図２０Ｑは、本発明のＣＤ３８ＸＣＤ３ｓｃＦｖボトルオープナーの配列を示す。
【図２０Ｋ】図２０Ａ〜図２０Ｑは、本発明のＣＤ３８ＸＣＤ３ｓｃＦｖボトルオープナーの配列を示す。
【図２０Ｌ】図２０Ａ〜図２０Ｑは、本発明のＣＤ３８ＸＣＤ３ｓｃＦｖボトルオープナーの配列を示す。
【図２０Ｍ】図２０Ａ〜図２０Ｑは、本発明のＣＤ３８ＸＣＤ３ｓｃＦｖボトルオープナーの配列を示す。
【図２０Ｎ】図２０Ａ〜図２０Ｑは、本発明のＣＤ３８ＸＣＤ３ｓｃＦｖボトルオープナーの配列を示す。
【図２０Ｏ】図２０Ａ〜図２０Ｑは、本発明のＣＤ３８ＸＣＤ３ｓｃＦｖボトルオープナーの配列を示す。
【図２０Ｐ】図２０Ａ〜図２０Ｑは、本発明のＣＤ３８ＸＣＤ３ｓｃＦｖボトルオープナーの配列を示す。
【図２０Ｑ】図２０Ａ〜図２０Ｑは、本発明のＣＤ３８ＸＣＤ３ｓｃＦｖボトルオープナーの配列を示す。
【図２１】ＣＤ３８ＸＣＤ３ボトルオープナーの、いくつかの有用なＦｃドメインの変異体を示す。
【図２２Ａ】図２２Ａ及び図２２Ｂは、抗ＣＤ３８ｘ抗ＣＤ３二重特異性体であるＸＥＮＰ１３２４３及びＸＥＮＰ１３５５１向けのアミノ酸配列を、下線を引いたＣＤＲ、及び荷電リンカー（荷電を有さなくてもよく、または図７に示される、正若しくは負のいずれかである、他の荷電リンカーと置換してよい）と共に示す。
【図２２Ｂ】図２２Ａ及び図２２Ｂは、抗ＣＤ３８ｘ抗ＣＤ３二重特異性体であるＸＥＮＰ１３２４３及びＸＥＮＰ１３５５１向けのアミノ酸配列を、下線を引いたＣＤＲ、及び荷電リンカー（荷電を有さなくてもよく、または図７に示される、正若しくは負のいずれかである、他の荷電リンカーと置換してよい）と共に示す。
【図２３Ａ】図２３Ａ、図２３Ｂ、図２３Ｃ、及び図２３Ｄは、抗ＣＤ３８ｘ抗ＣＤ３二重特異性体であるＸＥＮＰ１３２４３及びＸＥＮＰ１３５５１をコードするＤＮＡ配列を示す。
【図２３Ｂ】図２３Ａ、図２３Ｂ、図２３Ｃ、及び図２３Ｄは、抗ＣＤ３８ｘ抗ＣＤ３二重特異性体であるＸＥＮＰ１３２４３及びＸＥＮＰ１３５５１をコードするＤＮＡ配列を示す。
【図２３Ｃ】図２３Ａ、図２３Ｂ、図２３Ｃ、及び図２３Ｄは、抗ＣＤ３８ｘ抗ＣＤ３二重特異性体であるＸＥＮＰ１３２４３及びＸＥＮＰ１３５５１をコードするＤＮＡ配列を示す。
【図２３Ｄ】図２３Ａ、図２３Ｂ、図２３Ｃ、及び図２３Ｄは、抗ＣＤ３８ｘ抗ＣＤ３二重特異性体であるＸＥＮＰ１３２４３及びＸＥＮＰ１３５５１をコードするＤＮＡ配列を示す。
【図２４】ＸＥＮＰ１３２４３及びＸＥＮＰ１３５５１向けの安定プール生成のためのＤＮＡトランスフェクション比のチャートを示す。ＨＣ−Ｆａｂ、ＨＣ−ｓｃＦｖ、及びＬＣ向けにトランスフェクトされたＤＮＡの相対量が記載される。
【図２５Ａ】図２５Ａ、２５Ｂ、２５Ｃ、及び２５Ｄは、ＸＥＮＰ１３２４３及びＸＥＮＰ１３５５１向けの回分培養７日後に回収された安定プールの上清からプロテインＡで精製された材料の陽イオン交換クロマトグラムを示す。ＤＮＡトランスフェクション比が、図２４は記載される。統合ピークエリアが記載される。
【図２５Ｂ】図２５Ａ、２５Ｂ、２５Ｃ、及び２５Ｄは、ＸＥＮＰ１３２４３及びＸＥＮＰ１３５５１向けの回分培養７日後に回収された安定プールの上清からプロテインＡで精製された材料の陽イオン交換クロマトグラムを示す。ＤＮＡトランスフェクション比が、図２４は記載される。統合ピークエリアが記載される。
【図２５Ｃ】図２５Ａ、２５Ｂ、２５Ｃ、及び２５Ｄは、ＸＥＮＰ１３２４３及びＸＥＮＰ１３５５１向けの回分培養７日後に回収された安定プールの上清からプロテインＡで精製された材料の陽イオン交換クロマトグラムを示す。ＤＮＡトランスフェクション比が、図２４は記載される。統合ピークエリアが記載される。
【図２５Ｄ】図２５Ａ、２５Ｂ、２５Ｃ、及び２５Ｄは、ＸＥＮＰ１３２４３及びＸＥＮＰ１３５５１向けの回分培養７日後に回収された安定プールの上清からプロテインＡで精製された材料の陽イオン交換クロマトグラムを示す。ＤＮＡトランスフェクション比が、図２４は記載される。統合ピークエリアが記載される。
【図２６】図２５に示される陽イオン交換クロマトグラムによって同定された、安定プールから生成された異なるタンパク質種の概要。ＤＮＡトランスフェクション比は、図２４に記載されるとおりである。
【図２７】Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群当たりｎ＝５マウス）における、抗ＣＤ３８ｘ抗ＣＤ３二重特異性体であるＸＥＮＰ１３２４３及びＸＥＮＰ１３５５１の薬物動態。非区画解析によって計算された半減期の値が図の説明に記載される。
【図２８】ＣＤ３８＋ＲＰＭＩ８２２６細胞の再配向化Ｔ細胞細胞傷害性。４００，０００個の精製されたヒトＴ細胞と共に、１０，０００個のＲＰＭＩ８２２６を、３７℃で２４時間インキュベートし、アッセイを実施した。細胞傷害性の計測は、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）によるものである。
【図２９】ヒト及びカニクイザルのＣＤ３８及びＣＤ３のＸＥＮＰ１３２４３及びＸＥＮＰ１３５５１に対する結合の動力学であり、表面プラズモン共鳴によって決定された。アッセイ形式が、明記される。
【図３０】ＸＥＮＰ１３２４３（上パネル）及びＸＥＮＰ１３５５１（下パネル）による、カニクイザルにおけるＣＤ２０−ＣＤ３８＋細胞の欠乏。
【図３１】ＸＥＮＰ１３２４３（上パネル）及びＸＥＮＰ１３５５１（下パネル）による、カニクイザルにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ６９の上方制御。
【図３２】等比体積変異体抗体の定常領域、及びそのそれぞれの置換の一覧を示す。ｐＩ＿（−）は、より低いｐＩ変異体であり、ｐＩ＿（＋）は、より高いｐＩ変異体を示す。これらは、本発明の他の二量体化変異体と、任意選択かつ独立に組み合わせることができる。
【図３３】特定の抗ＣＤ３ｓｃＦｖ向けのいくつかの荷電リンカー及びデータを示す。
【図３４】本明細書で「ｐＩ変異体」とも呼ばれる分離変異体（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｖａｒｉａｎｔ）の使用と関連した図であり、本明細書で「歪曲変異体」とも呼ばれる二量体会合変異体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｖａｒｉａｎｔ）と組み合わせられている。こうした変異体は、変異体の効果が、異なるＦｖ領域を有する異なる抗体へ容易に移行するという点で、「プラグアンドプレイ」形式において使用することができ、非常に安定である。
【図３５】一般的な抗ＣＤ３ｓｃＦｖ−Ｆｃの最適化を示す。希少アミノ酸の置き換え、通常とは異なる接触残基でのアミノ酸の置き換え、リンカー操作（安定性及び精製の増進向けであり、例えば荷電ｓｃＦｖリンカーである）の実施、及びＶＬ−ＶＨ配向への変換を含む様々な方法で安定性を増加させた。
【図３６】野生型の安定性を保持するが、ＦｃγＲ結合はすべて除去するＦｃノックアウト（または消去変異体）の使用を示す。
【図３７】試験管内における、抗ＣＤ３Ｘ抗ＣＤ３８ボトルオープナー形式の殺傷及び安定性のデータを示す。
【図３８】ヒト骨髄腫細胞株の殺傷を示す。ＸｍＡｂ１３５５１は、ＣＤ３に対して高親和性を有し、一方で、ＸｍＡｂ１３２４３は、より低い親和性を有する。ダラツムマブは、抗ＣＤ３８二価単一特異性抗体である。
【図３９】マウスにおける、本発明のボトルオープナー二重特異性体の長期半減期活性、及び対応するヒトＩｇの抑制を示す。
【図４０】ＸｍＡｂ１３５５１及びＸｍＡｂ１３２４３の抗ＣＤ３８Ｘ抗ＣＤ３機能を示し、血液及び骨髄におけるサルＣＤ３８＋細胞の欠乏を含むものである。
【図４１】ＣＤ３８＋細胞の欠乏が、Ｔ細胞の再分布及び活性化と相関することを示す。
【図４２】ＸｍＡｂ１３５５１（高ＣＤ３親和性）の産生に向けた安定細胞株の開発及びその対応する収率を示す。
【図４３】収率改善に向けた細胞培養の最適化のいくつかを示し、≧３ｇ／Ｌの力価が得られ、スケールアップでみられるヘテロ二量体／ホモ二量体比に顕著な差は無かった。
【図４４】製造の３つの段階工程から得られた分析結果を示す。工程によって、非常に純粋なヘテロ二量体二重特異性分子が、５５％を超える高収率で得られ、ＨＣＰに加えて、ホモ二量体、ＨＭＷ、及びＬＭＷの混入物が、効果的に除去された。
【図４５Ａ】図４５Ａ〜図４５Ｕは、様々な追加のヘテロ二量体化形式を示し、そのいずれの１つも本発明の抗ＣＤ３配列及び抗ＣＤ３８配列を含むことができる。図４５Ａ〜図４５Ｕは、本発明において使用できる、幅広い種類の多特異性（例えば、ヘテロ二量体化）形式、及びヘテロ二量体化変異体の異なる型の組み合わせを示す（これらは、本明細書で、「ヘテロ二量体骨格（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）」と呼ばれることがある）。さらに、こうした形式のすべてが、以下により完全に論じられるように、Ｆｃ領域において追加の変異体を含むことができ、「消去」変異体または「ノックアウト」変異体（図７）、ＦｃγＲ結合（ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ等）を変えるためのＦｃ変異体、ＦｃＲｎ受容体に対する結合を変えるためのＦｃ変異体等が含まれることに留意されたい。図４５Ａは、本明細書に記載されるすべてのヘテロ二量体化形式に関する二重ｓｃＦｃ−Ｆｃ形式を示し、ｐＩ変異体、ノブインホール（ｋｎｏｂ  ｉｎ  ｈｏｌｅ）（ＫＩＨ、本明細書で立体変異体または「歪曲」変異体とも呼ばれる）、電荷対（立体変異体のサブセット）、等比体積変異体、ならびにＳＥＥＤ体（「鎖交換反応が操作されたドメイン（ｓｔｒａｎｄ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｄｏｍａｉｎ）」、Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｍＡｂｓ  ４：６  ６５３−６６３（２０１２）及びＤａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２０１０  ２３：１９５−２０２参照のこと）などのヘテロ二量体化変異体を含めることができる。ＳＥＥＤ体は、ヒトＩｇＧ及びヒトＩｇＡのＣＨ３ドメインが、お互いに結合しないという事実に依存している。図４５Ｂは、再度、様々なヘテロ二量体化変異体の選択肢と共に二重特異性ＩｇＧを示す。図４５Ｃは、２つの異なる可変重ドメイン及び可変軽ドメインを利用するＤＶＤ−Ｉｇの「ワンアーム化（ｏｎｅ  ａｒｍｅｄ）」型を示す。図４５Ｄは、可変重鎖及び可変軽鎖が、反対側の重鎖上にあるということを除いては、「空アーム（ｅｍｐｔｙ  ａｒｍ）」というより、むしろ類似している。図４５Ｅは、一般的に「ｍＡｂ−Ｆｖ」と呼ばれる。図４５Ｆは、多重ｓｃＦｖ形式（ｍｕｌｔｉ−ｓｃＦｖ  ｆｏｒｍａｔ）を示し、当業者によって理解されるように、本明細書で論じられる「Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ」形式に類似しており、関連するｓｃＦｖ（またはそれに関連する何らかの他の結合リガンドまたは機能性）がいくらでもあり得ることを理解されよう。したがって、図４５Ｆは、１、２、３、または４つのｓｃＦｖ（例えば、二重特異性体向けには、ｓｃＦｖは、「シス」若しくは「トランス」、または分子の１つの「末端」上に両方存在するであろう）を有するであろう。図４５Ｇは、一方が重鎖Ｆａｂ配列を含み、もう一方が軽鎖Ｆａｂ配列を含む２つの異なる重鎖によって形成されているＦａｂを有するヘテロ二量体ＦａｂＦｃを示す。図４５Ｈは、「ワンアーム化Ｆａｂ−Ｆｃ」を示し、１つの重鎖が、Ｆａｂを含む。図４５Ｉは、「ワンアーム化ｓｃＦｖ−Ｆｃ」を示し、一方の重鎖Ｆｃが、ｓｃＦｖを含み、もう一方の重鎖は、「空（ｅｍｐｔｙ）」である。図４５Ｊは、ｓｃＦｖ−ＣＨ３を示し、重鎖ＣＨ���領域のみが使用され、それぞれが、それら独自のｓｃＦｖを有する。図４５Ｋは、ｍＡｂ−ｓｃＦｖを示し、分子の１つの末端が、重鎖の内の１つのｓｃＦｖを使用する一価の会合で、抗原を二価で捕捉する。図４５Ｌは、両重鎖が、追加のｓｃＦｖを含む以外は、同一の構造を示し、追加のｓｃＦｖは、同一抗原、または異なる抗原のいずれにも結合できる。図４５Ｍは、「ＣｒｏｓｓＭａｂ」構造を示し、２つの異なる軽鎖による多重形成の問題は、Ｆａｂ部分において配列交換することにより対処されている。図４５Ｎは、ｓｃＦｖを示し、図４５Ｏは、本明細書に概要が記載されるリンカーによって連結された「ＢｉＴＥ」またはｓｃＦｖ−ｓｃＦｖであり、図４５Ｐは、ＤＡＲＴを示し、図４５Ｑは、ＴａｎｄＡｂを示し、そして図４５Ｒは、ダイアボディを示す。図４５Ｓ、図４５Ｔ、及び図４５Ｕは、本発明において有用である追加の代替骨格形式を示す。
【図４５Ｂ】図４５Ａ〜図４５Ｕは、様々な追加のヘテロ二量体化形式を示し、そのいずれの１つも本発明の抗ＣＤ３配列及び抗ＣＤ３８配列を含むことができる。図４５Ａ〜図４５Ｕは、本発明において使用できる、幅広い種類の多特異性（例えば、ヘテロ二量体化）形式、及びヘテロ二量体化変異体の異なる型の組み合わせを示す（これらは、本明細書で、「ヘテロ二量体骨格（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）」と呼ばれることがある）。さらに、こうした形式のすべてが、以下により完全に論じられるように、Ｆｃ領域において追加の変異体を含むことができ、「消去」変異体または「ノックアウト」変異体（図７）、ＦｃγＲ結合（ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ等）を変えるためのＦｃ変異体、ＦｃＲｎ受容体に対する結合を変えるためのＦｃ変異体等が含まれることに留意されたい。図４５Ａは、本明細書に記載されるすべてのヘテロ二量体化形式に関する二重ｓｃＦｃ−Ｆｃ形式を示し、ｐＩ変異体、ノブインホール（ｋｎｏｂ  ｉｎ  ｈｏｌｅ）（ＫＩＨ、本明細書で立体変異体または「歪曲」変異体とも呼ばれる）、電荷対（立体変異体のサブセット）、等比体積変異体、ならびにＳＥＥＤ体（「鎖交換反応が操作されたドメイン（ｓｔｒａｎｄ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｄｏｍａｉｎ）」、Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｍＡｂｓ  ４：６  ６５３−６６３（２０１２）及びＤａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２０１０  ２３：１９５−２０２参照のこと）などのヘテロ二量体化変異体を含めることができる。ＳＥＥＤ体は、ヒトＩｇＧ及びヒトＩｇＡのＣＨ３ドメインが、お互いに結合しないという事実に依存している。図４５Ｂは、再度、様々なヘテロ二量体化変異体の選択肢と共に二重特異性ＩｇＧを示す。図４５Ｃは、２つの異なる可変重ドメイン及び可変軽ドメインを利用するＤＶＤ−Ｉｇの「ワンアーム化（ｏｎｅ  ａｒｍｅｄ）」型を示す。図４５Ｄは、可変重鎖及び可変軽鎖が、反対側の重鎖上にあるということを除いては、「空アーム（ｅｍｐｔｙ  ａｒｍ）」というより、むしろ類似している。図４５Ｅは、一般的に「ｍＡｂ−Ｆｖ」と呼ばれる。図４５Ｆは、多重ｓｃＦｖ形式（ｍｕｌｔｉ−ｓｃＦｖ  ｆｏｒｍａｔ）を示し、当業者によって理解されるように、本明細書で論じられる「Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ」形式に類似しており、関連するｓｃＦｖ（またはそれに関連する何らかの他の結合リガンドまたは機能性）がいくらでもあり得ることを理解されよう。したがって、図４５Ｆは、１、２、３、または４つのｓｃＦｖ（例えば、二重特異性体向けには、ｓｃＦｖは、「シス」若しくは「トランス」、または分子の１つの「末端」上に両方存在するであろう）を有するであろう。図４５Ｇは、一方が重鎖Ｆａｂ配列を含み、もう一方が軽鎖Ｆａｂ配列を含む２つの異なる重鎖によって形成されているＦａｂを有するヘテロ二量体ＦａｂＦｃを示す。図４５Ｈは、「ワンアーム化Ｆａｂ−Ｆｃ」を示し、１つの重鎖が、Ｆａｂを含む。図４５Ｉは、「ワンアーム化ｓｃＦｖ−Ｆｃ」を示し、一方の重鎖Ｆｃが、ｓｃＦｖを含み、もう一方の重鎖は、「空（ｅｍｐｔｙ）」である。図４５Ｊは、ｓｃＦｖ−ＣＨ３を示し、重鎖ＣＨ���領域のみが使用され、それぞれが、それら独自のｓｃＦｖを有する。図４５Ｋは、ｍＡｂ−ｓｃＦｖを示し、分子の１つの末端が、重鎖の内の１つのｓｃＦｖを使用する一価の会合で、抗原を二価で捕捉する。図４５Ｌは、両重鎖が、追加のｓｃＦｖを含む以外は、同一の構造を示し、追加のｓｃＦｖは、同一抗原、または異なる抗原のいずれにも結合できる。図４５Ｍは、「ＣｒｏｓｓＭａｂ」構造を示し、２つの異なる軽鎖による多重形成の問題は、Ｆａｂ部分において配列交換することにより対処されている。図４５Ｎは、ｓｃＦｖを示し、図４５Ｏは、本明細書に概要が記載されるリンカーによって連結された「ＢｉＴＥ」またはｓｃＦｖ−ｓｃＦｖであり、図４５Ｐは、ＤＡＲＴを示し、図４５Ｑは、ＴａｎｄＡｂを示し、そして図４５Ｒは、ダイアボディを示す。図４５Ｓ、図４５Ｔ、及び図４５Ｕは、本発明において有用である追加の代替骨格形式を示す。
【図４５Ｃ−４５Ｆ】図４５Ａ〜図４５Ｕは、様々な追加のヘテロ二量体化形式を示し、そのいずれの１つも本発明の抗ＣＤ３配列及び抗ＣＤ３８配列を含むことができる。図４５Ａ〜図４５Ｕは、本発明において使用できる、幅広い種類の多特異性（例えば、ヘテロ二量体化）形式、及びヘテロ二量体化変異体の異なる型の組み合わせを示す（これらは、本明細書で、「ヘテロ二量体骨格（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）」と呼ばれることがある）。さらに、こうした形式のすべてが、以下により完全に論じられるように、Ｆｃ領域において追加の変異体を含むことができ、「消去」変異体または「ノックアウト」変異体（図７）、ＦｃγＲ結合（ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ等）を変えるためのＦｃ変異体、ＦｃＲｎ受容体に対する結合を変えるためのＦｃ変異体等が含まれることに留意されたい。図４５Ａは、本明細書に記載されるすべてのヘテロ二量体化形式に関する二重ｓｃＦｃ−Ｆｃ形式を示し、ｐＩ変異体、ノブインホール（ｋｎｏｂ  ｉｎ  ｈｏｌｅ）（ＫＩＨ、本明細書で立体変異体または「歪曲」変異体とも呼ばれる）、電荷対（立体変異体のサブセット）、等比体積変異体、ならびにＳＥＥＤ体（「鎖交換反応が操作されたドメイン（ｓｔｒａｎｄ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｄｏｍａｉｎ）」、Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｍＡｂｓ  ４：６  ６５３−６６３（２０１２）及びＤａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２０１０  ２３：１９５−２０２参照のこと）などのヘテロ二量体化変異体を含めることができる。ＳＥＥＤ体は、ヒトＩｇＧ及びヒトＩｇＡのＣＨ３ドメインが、お互いに結合しないという事実に依存している。図４５Ｂは、再度、様々なヘテロ二量体化変異体の選択肢と共に二重特異性ＩｇＧを示す。図４５Ｃは、２つの異なる可変重ドメイン及び可変軽ドメインを利用するＤＶＤ−Ｉｇの「ワンアーム化（ｏｎｅ  ａｒｍｅｄ）」型を示す。図４５Ｄは、可変重鎖及び可変軽鎖が、反対側の重鎖上にあるということを除いては、「空アーム（ｅｍｐｔｙ  ａｒｍ）」というより、むしろ類似している。図４５Ｅは、一般的に「ｍＡｂ−Ｆｖ」と呼ばれる。図４５Ｆは、多重ｓｃＦｖ形式（ｍｕｌｔｉ−ｓｃＦｖ  ｆｏｒｍａｔ）を示し、当業者によって理解されるように、本明細書で論じられる「Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ」形式に類似しており、関連するｓｃＦｖ（またはそれに関連する何らかの他の結合リガンドまたは機能性）がいくらでもあり得ることを理解されよう。したがって、図４５Ｆは、１、２、３、または４つのｓｃＦｖ（例えば、二重特異性体向けには、ｓｃＦｖは、「シス」若しくは「トランス」、または分子の１つの「末端」上に両方存在するであろう）を有するであろう。図４５Ｇは、一方が重鎖Ｆａｂ配列を含み、もう一方が軽鎖Ｆａｂ配列を含む２つの異なる重鎖によって形成されているＦａｂを有するヘテロ二量体ＦａｂＦｃを示す。図４５Ｈは、「ワンアーム化Ｆａｂ−Ｆｃ」を示し、１つの重鎖が、Ｆａｂを含む。図４５Ｉは、「ワンアーム化ｓｃＦｖ−Ｆｃ」を示し、一方の重鎖Ｆｃが、ｓｃＦｖを含み、もう一方の重鎖は、「空（ｅｍｐｔｙ）」である。図４５Ｊは、ｓｃＦｖ−ＣＨ３を示し、���鎖ＣＨ３領域のみが使用され、それぞれが、それら独自のｓｃＦｖを有する。図４５Ｋは、ｍＡｂ−ｓｃＦｖを示し、分子の１つの末端が、重鎖の内の１つのｓｃＦｖを使用する一価の会合で、抗原を二価で捕捉する。図４５Ｌは、両重鎖が、追加のｓｃＦｖを含む以外は、同一の構造を示し、追加のｓｃＦｖは、同一抗原、または異なる抗原のいずれにも結合できる。図４５Ｍは、「ＣｒｏｓｓＭａｂ」構造を示し、２つの異なる軽鎖による多重形成の問題は、Ｆａｂ部分において配列交換することにより対処されている。図４５Ｎは、ｓｃＦｖを示し、図４５Ｏは、本明細書に概要が記載されるリンカーによって連結された「ＢｉＴＥ」またはｓｃＦｖ−ｓｃＦｖであり、図４５Ｐは、ＤＡＲＴを示し、図４５Ｑは、ＴａｎｄＡｂを示し、そして図４５Ｒは、ダイアボディを示す。図４５Ｓ、図４５Ｔ、及び図４５Ｕは、本発明において有用である追加の代替骨格形式を示す。
【図４５Ｇ−４５Ｊ】図４５Ａ〜図４５Ｕは、様々な追加のヘテロ二量体化形式を示し、そのいずれの１つも本発明の抗ＣＤ３配列及び抗ＣＤ３８配列を含むことができる。図４５Ａ〜図４５Ｕは、本発明において使用できる、幅広い種類の多特異性（例えば、ヘテロ二量体化）形式、及びヘテロ二量体化変異体の異なる型の組み合わせを示す（これらは、本明細書で、「ヘテロ二量体骨格（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）」と呼ばれることがある）。さらに、こうした形式のすべてが、以下により完全に論じられるように、Ｆｃ領域において追加の変異体を含むことができ、「消去」変異体または「ノックアウト」変異体（図７）、ＦｃγＲ結合（ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ等）を変えるためのＦｃ変異体、ＦｃＲｎ受容体に対する結合を変えるためのＦｃ変異体等が含まれることに留意されたい。図４５Ａは、本明細書に記載されるすべてのヘテロ二量体化形式に関する二重ｓｃＦｃ−Ｆｃ形式を示し、ｐＩ変異体、ノブインホール（ｋｎｏｂ  ｉｎ  ｈｏｌｅ）（ＫＩＨ、本明細書で立体変異体または「歪曲」変異体とも呼ばれる）、電荷対（立体変異体のサブセット）、等比体積変異体、ならびにＳＥＥＤ体（「鎖交換反応が操作されたドメイン（ｓｔｒａｎｄ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｄｏｍａｉｎ）」、Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｍＡｂｓ  ４：６  ６５３−６６３（２０１２）及びＤａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２０１０  ２３：１９５−２０２参照のこと）などのヘテロ二量体化変異体を含めることができる。ＳＥＥＤ体は、ヒトＩｇＧ及びヒトＩｇＡのＣＨ３ドメインが、お互いに結合しないという事実に依存している。図４５Ｂは、再度、様々なヘテロ二量体化変異体の選択肢と共に二重特異性ＩｇＧを示す。図４５Ｃは、２つの異なる可変重ドメイン及び可変軽ドメインを利用するＤＶＤ−Ｉｇの「ワンアーム化（ｏｎｅ  ａｒｍｅｄ）」型を示す。図４５Ｄは、可変重鎖及び可変軽鎖が、反対側の重鎖上にあるということを除いては、「空アーム（ｅｍｐｔｙ  ａｒｍ）」というより、むしろ類似している。図４５Ｅは、一般的に「ｍＡｂ−Ｆｖ」と呼ばれる。図４５Ｆは、多重ｓｃＦｖ形式（ｍｕｌｔｉ−ｓｃＦｖ  ｆｏｒｍａｔ）を示し、当業者によって理解されるように、本明細書で論じられる「Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ」形式に類似しており、関連するｓｃＦｖ（またはそれに関連する何らかの他の結合リガンドまたは機能性）がいくらでもあり得ることを理解されよう。したがって、図４５Ｆは、１、２、３、または４つのｓｃＦｖ（例えば、二重特異性体向けには、ｓｃＦｖは、「シス」若しくは「トランス」、または分子の１つの「末端」上に両方存在するであろう）を有するであろう。図４５Ｇは、一方が重鎖Ｆａｂ配列を含み、もう一方が軽鎖Ｆａｂ配列を含む２つの異なる重鎖によって形成されているＦａｂを有するヘテロ二量体ＦａｂＦｃを示す。図４５Ｈは、「ワンアーム化Ｆａｂ−Ｆｃ」を示し、１つの重鎖が、Ｆａｂを含む。図４５Ｉは、「ワンアーム化ｓｃＦｖ−Ｆｃ」を示し、一方の重鎖Ｆｃが、ｓｃＦｖを含み、もう一方の重鎖は、「空（ｅｍｐｔｙ）」である。図４５Ｊは、ｓｃＦｖ−ＣＨ３を示し、���鎖ＣＨ３領域のみが使用され、それぞれが、それら独自のｓｃＦｖを有する。図４５Ｋは、ｍＡｂ−ｓｃＦｖを示し、分子の１つの末端が、重鎖の内の１つのｓｃＦｖを使用する一価の会合で、抗原を二価で捕捉する。図４５Ｌは、両重鎖が、追加のｓｃＦｖを含む以外は、同一の構造を示し、追加のｓｃＦｖは、同一抗原、または異なる抗原のいずれにも結合できる。図４５Ｍは、「ＣｒｏｓｓＭａｂ」構造を示し、２つの異なる軽鎖による多重形成の問題は、Ｆａｂ部分において配列交換することにより対処されている。図４５Ｎは、ｓｃＦｖを示し、図４５Ｏは、本明細書に概要が記載されるリンカーによって連結された「ＢｉＴＥ」またはｓｃＦｖ−ｓｃＦｖであり、図４５Ｐは、ＤＡＲＴを示し、図４５Ｑは、ＴａｎｄＡｂを示し、そして図４５Ｒは、ダイアボディを示す。図４５Ｓ、図４５Ｔ、及び図４５Ｕは、本発明において有用である追加の代替骨格形式を示す。
【図４５Ｋ−４５Ｌ】図４５Ａ〜図４５Ｕは、様々な追加のヘテロ二量体化形式を示し、そのいずれの１つも本発明の抗ＣＤ３配列及び抗ＣＤ３８配列を含むことができる。図４５Ａ〜図４５Ｕは、本発明において使用できる、幅広い種類の多特異性（例えば、ヘテロ二量体化）形式、及びヘテロ二量体化変異体の異なる型の組み合わせを示す（これらは、本明細書で、「ヘテロ二量体骨格（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）」と呼ばれることがある）。さらに、こうした形式のすべてが、以下により完全に論じられるように、Ｆｃ領域において追加の変異体を含むことができ、「消去」変異体または「ノックアウト」変異体（図７）、ＦｃγＲ結合（ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ等）を変えるためのＦｃ変異体、ＦｃＲｎ受容体に対する結合を変えるためのＦｃ変異体等が含まれることに留意されたい。図４５Ａは、本明細書に記載されるすべてのヘテロ二量体化形式に関する二重ｓｃＦｃ−Ｆｃ形式を示し、ｐＩ変異体、ノブインホール（ｋｎｏｂ  ｉｎ  ｈｏｌｅ）（ＫＩＨ、本明細書で立体変異体または「歪曲」変異体とも呼ばれる）、電荷対（立体変異体のサブセット）、等比体積変異体、ならびにＳＥＥＤ体（「鎖交換反応が操作されたドメイン（ｓｔｒａｎｄ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｄｏｍａｉｎ）」、Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｍＡｂｓ  ４：６  ６５３−６６３（２０１２）及びＤａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２０１０  ２３：１９５−２０２参照のこと）などのヘテロ二量体化変異体を含めることができる。ＳＥＥＤ体は、ヒトＩｇＧ及びヒトＩｇＡのＣＨ３ドメインが、お互いに結合しないという事実に依存している。図４５Ｂは、再度、様々なヘテロ二量体化変異体の選択肢と共に二重特異性ＩｇＧを示す。図４５Ｃは、２つの異なる可変重ドメイン及び可変軽ドメインを利用するＤＶＤ−Ｉｇの「ワンアーム化（ｏｎｅ  ａｒｍｅｄ）」型を示す。図４５Ｄは、可変重鎖及び可変軽鎖が、反対側の重鎖上にあるということを除いては、「空アーム（ｅｍｐｔｙ  ａｒｍ）」というより、むしろ類似している。図４５Ｅは、一般的に「ｍＡｂ−Ｆｖ」と呼ばれる。図４５Ｆは、多重ｓｃＦｖ形式（ｍｕｌｔｉ−ｓｃＦｖ  ｆｏｒｍａｔ）を示し、当業者によって理解されるように、本明細書で論じられる「Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ」形式に類似しており、関連するｓｃＦｖ（またはそれに関連する何らかの他の結合リガンドまたは機能性）がいくらでもあり得ることを理解されよう。したがって、図４５Ｆは、１、２、３、または４つのｓｃＦｖ（例えば、二重特異性体向けには、ｓｃＦｖは、「シス」若しくは「トランス」、または分子の１つの「末端」上に両方存在するであろう）を有するであろう。図４５Ｇは、一方が重鎖Ｆａｂ配列を含み、もう一方が軽鎖Ｆａｂ配列を含む２つの異なる重鎖によって形成されているＦａｂを有するヘテロ二量体ＦａｂＦｃを示す。図４５Ｈは、「ワンアーム化Ｆａｂ−Ｆｃ」を示し、１つの重鎖が、Ｆａｂを含む。図４５Ｉは、「ワンアーム化ｓｃＦｖ−Ｆｃ」を示し、一方の重鎖Ｆｃが、ｓｃＦｖを含み、もう一方の重鎖は、「空（ｅｍｐｔｙ）」である。図４５Ｊは、ｓｃＦｖ−ＣＨ３を示し、���鎖ＣＨ３領域のみが使用され、それぞれが、それら独自のｓｃＦｖを有する。図４５Ｋは、ｍＡｂ−ｓｃＦｖを示し、分子の１つの末端が、重鎖の内の１つのｓｃＦｖを使用する一価の会合で、抗原を二価で捕捉する。図４５Ｌは、両重鎖が、追加のｓｃＦｖを含む以外は、同一の構造を示し、追加のｓｃＦｖは、同一抗原、または異なる抗原のいずれにも結合できる。図４５Ｍは、「ＣｒｏｓｓＭａｂ」構造を示し、２つの異なる軽鎖による多重形成の問題は、Ｆａｂ部分において配列交換することにより対処されている。図４５Ｎは、ｓｃＦｖを示し、図４５Ｏは、本明細書に概要が記載されるリンカーによって連結された「ＢｉＴＥ」またはｓｃＦｖ−ｓｃＦｖであり、図４５Ｐは、ＤＡＲＴを示し、図４５Ｑは、ＴａｎｄＡｂを示し、そして図４５Ｒは、ダイアボディを示す。図４５Ｓ、図４５Ｔ、及び図４５Ｕは、本発明において有用である追加の代替骨格形式を示す。
【図４５Ｍ】図４５Ａ〜図４５Ｕは、様々な追加のヘテロ二量体化形式を示し、そのいずれの１つも本発明の抗ＣＤ３配列及び抗ＣＤ３８配列を含むことができる。図４５Ａ〜図４５Ｕは、本発明において使用できる、幅広い種類の多特異性（例えば、ヘテロ二量体化）形式、及びヘテロ二量体化変異体の異なる型の組み合わせを示す（これらは、本明細書で、「ヘテロ二量体骨格（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）」と呼ばれることがある）。さらに、こうした形式のすべてが、以下により完全に論じられるように、Ｆｃ領域において追加の変異体を含むことができ、「消去」変異体または「ノックアウト」変異体（図７）、ＦｃγＲ結合（ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ等）を変えるためのＦｃ変異体、ＦｃＲｎ受容体に対する結合を変えるためのＦｃ変異体等が含まれることに留意されたい。図４５Ａは、本明細書に記載されるすべてのヘテロ二量体化形式に関する二重ｓｃＦｃ−Ｆｃ形式を示し、ｐＩ変異体、ノブインホール（ｋｎｏｂ  ｉｎ  ｈｏｌｅ）（ＫＩＨ、本明細書で立体変異体または「歪曲」変異体とも呼ばれる）、電荷対（立体変異体のサブセット）、等比体積変異体、ならびにＳＥＥＤ体（「鎖交換反応が操作されたドメイン（ｓｔｒａｎｄ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｄｏｍａｉｎ）」、Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｍＡｂｓ  ４：６  ６５３−６６３（２０１２）及びＤａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２０１０  ２３：１９５−２０２参照のこと）などのヘテロ二量体化変異体を含めることができる。ＳＥＥＤ体は、ヒトＩｇＧ及びヒトＩｇＡのＣＨ３ドメインが、お互いに結合しないという事実に依存している。図４５Ｂは、再度、様々なヘテロ二量体化変異体の選択肢と共に二重特異性ＩｇＧを示す。図４５Ｃは、２つの異なる可変重ドメイン及び可変軽ドメインを利用するＤＶＤ−Ｉｇの「ワンアーム化（ｏｎｅ  ａｒｍｅｄ）」型を示す。図４５Ｄは、可変重鎖及び可変軽鎖が、反対側の重鎖上にあるということを除いては、「空アーム（ｅｍｐｔｙ  ａｒｍ）」というより、むしろ類似している。図４５Ｅは、一般的に「ｍＡｂ−Ｆｖ」と呼ばれる。図４５Ｆは、多重ｓｃＦｖ形式（ｍｕｌｔｉ−ｓｃＦｖ  ｆｏｒｍａｔ）を示し、当業者によって理解されるように、本明細書で論じられる「Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ」形式に類似しており、関連するｓｃＦｖ（またはそれに関連する何らかの他の結合リガンドまたは機能性）がいくらでもあり得ることを理解されよう。したがって、図４５Ｆは、１、２、３、または４つのｓｃＦｖ（例えば、二重特異性体向けには、ｓｃＦｖは、「シス」若しくは「トランス」、または分子の１つの「末端」上に両方存在するであろう）を有するであろう。図４５Ｇは、一方が重鎖Ｆａｂ配列を含み、もう一方が軽鎖Ｆａｂ配列を含む２つの異なる重鎖によって形成されているＦａｂを有するヘテロ二量体ＦａｂＦｃを示す。図４５Ｈは、「ワンアーム化Ｆａｂ−Ｆｃ」を示し、１つの重鎖が、Ｆａｂを含む。図４５Ｉは、「ワンアーム化ｓｃＦｖ−Ｆｃ」を示し、一方の重鎖Ｆｃが、ｓｃＦｖを含み、もう一方の重鎖は、「空（ｅｍｐｔｙ）」である。図４５Ｊは、ｓｃＦｖ−ＣＨ３を示し、重鎖ＣＨ���領域のみが使用され、それぞれが、それら独自のｓｃＦｖを有する。図４５Ｋは、ｍＡｂ−ｓｃＦｖを示し、分子の１つの末端が、重鎖の内の１つのｓｃＦｖを使用する一価の会合で、抗原を二価で捕捉する。図４５Ｌは、両重鎖が、追加のｓｃＦｖを含む以外は、同一の構造を示し、追加のｓｃＦｖは、同一抗原、または異なる抗原のいずれにも結合できる。図４５Ｍは、「ＣｒｏｓｓＭａｂ」構造を示し、２つの異なる軽鎖による多重形成の問題は、Ｆａｂ部分において配列交換することにより対処されている。図４５Ｎは、ｓｃＦｖを示し、図４５Ｏは、本明細書に概要が記載されるリンカーによって連結された「ＢｉＴＥ」またはｓｃＦｖ−ｓｃＦｖであり、図４５Ｐは、ＤＡＲＴを示し、図４５Ｑは、ＴａｎｄＡｂを示し、そして図４５Ｒは、ダイアボディを示す。図４５Ｓ、図４５Ｔ、及び図４５Ｕは、本発明において有用である追加の代替骨格形式を示す。
【図４５Ｎ−４９Ｒ】図４５Ａ〜図４５Ｕは、様々な追加のヘテロ二量体化形式を示し、そのいずれの１つも本発明の抗ＣＤ３配列及び抗ＣＤ３８配列を含むことができる。図４５Ａ〜図４５Ｕは、本発明において使用できる、幅広い種類の多特異性（例えば、ヘテロ二量体化）形式、及びヘテロ二量体化変異体の異なる型の組み合わせを示す（これらは、本明細書で、「ヘテロ二量体骨格（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）」と呼ばれることがある）。さらに、こうした形式のすべてが、以下により完全に論じられるように、Ｆｃ領域において追加の変異体を含むことができ、「消去」変異体または「ノックアウト」変異体（図７）、ＦｃγＲ結合（ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ等）を変えるためのＦｃ変異体、ＦｃＲｎ受容体に対する結合を変えるためのＦｃ変異体等が含まれることに留意されたい。図４５Ａは、本明細書に記載されるすべてのヘテロ二量体化形式に関する二重ｓｃＦｃ−Ｆｃ形式を示し、ｐＩ変異体、ノブインホール（ｋｎｏｂ  ｉｎ  ｈｏｌｅ）（ＫＩＨ、本明細書で立体変異体または「歪曲」変異体とも呼ばれる）、電荷対（立体変異体のサブセット）、等比体積変異体、ならびにＳＥＥＤ体（「鎖交換反応が操作されたドメイン（ｓｔｒａｎｄ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｄｏｍａｉｎ）」、Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｍＡｂｓ  ４：６  ６５３−６６３（２０１２）及びＤａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２０１０  ２３：１９５−２０２参照のこと）などのヘテロ二量体化変異体を含めることができる。ＳＥＥＤ体は、ヒトＩｇＧ及びヒトＩｇＡのＣＨ３ドメインが、お互いに結合しないという事実に依存している。図４５Ｂは、再度、様々なヘテロ二量体化変異体の選択肢と共に二重特異性ＩｇＧを示す。図４５Ｃは、２つの異なる可変重ドメイン及び可変軽ドメインを利用するＤＶＤ−Ｉｇの「ワンアーム化（ｏｎｅ  ａｒｍｅｄ）」型を示す。図４５Ｄは、可変重鎖及び可変軽鎖が、反対側の重鎖上にあるということを除いては、「空アーム（ｅｍｐｔｙ  ａｒｍ）」というより、むしろ類似している。図４５Ｅは、一般的に「ｍＡｂ−Ｆｖ」と呼ばれる。図４５Ｆは、多重ｓｃＦｖ形式（ｍｕｌｔｉ−ｓｃＦｖ  ｆｏｒｍａｔ）を示し、当業者によって理解されるように、本明細書で論じられる「Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ」形式に類似しており、関連するｓｃＦｖ（またはそれに関連する何らかの他の結合リガンドまたは機能性）がいくらでもあり得ることを理解されよう。したがって、図４５Ｆは、１、２、３、または４つのｓｃＦｖ（例えば、二重特異性体向けには、ｓｃＦｖは、「シス」若しくは「トランス」、または分子の１つの「末端」上に両方存在するであろう）を有するであろう。図４５Ｇは、一方が重鎖Ｆａｂ配列を含み、もう一方が軽鎖Ｆａｂ配列を含む２つの異なる重鎖によって形成されているＦａｂを有するヘテロ二量体ＦａｂＦｃを示す。図４５Ｈは、「ワンアーム化Ｆａｂ−Ｆｃ」を示し、１つの重鎖が、Ｆａｂを含む。図４５Ｉは、「ワンアーム化ｓｃＦｖ−Ｆｃ」を示し、一方の重鎖Ｆｃが、ｓｃＦｖを含み、もう一方の重鎖は、「空（ｅｍｐｔｙ）」である。図４５Ｊは、ｓｃＦｖ−ＣＨ３を示し、���鎖ＣＨ３領域のみが使用され、それぞれが、それら独自のｓｃＦｖを有する。図４５Ｋは、ｍＡｂ−ｓｃＦｖを示し、分子の１つの末端が、重鎖の内の１つのｓｃＦｖを使用する一価の会合で、抗原を二価で捕捉する。図４５Ｌは、両重鎖が、追加のｓｃＦｖを含む以外は、同一の構造を示し、追加のｓｃＦｖは、同一抗原、または異なる抗原のいずれにも結合できる。図４５Ｍは、「ＣｒｏｓｓＭａｂ」構造を示し、２つの異なる軽鎖による多重形成の問題は、Ｆａｂ部分において配列交換することにより対処されている。図４５Ｎは、ｓｃＦｖを示し、図４５Ｏは、本明細書に概要が記載されるリンカーによって連結された「ＢｉＴＥ」またはｓｃＦｖ−ｓｃＦｖであり、図４５Ｐは、ＤＡＲＴを示し、図４５Ｑは、ＴａｎｄＡｂを示し、そして図４５Ｒは、ダイアボディを示す。図４５Ｓ、図４５Ｔ、及び図４５Ｕは、本発明において有用である追加の代替骨格形式を示す。
【図４５Ｓ−４５Ｕ】図４５Ａ〜図４５Ｕは、様々な追加のヘテロ二量体化形式を示し、そのいずれの１つも本発明の抗ＣＤ３配列及び抗ＣＤ３８配列を含むことができる。図４５Ａ〜図４５Ｕは、本発明において使用できる、幅広い種類の多特異性（例えば、ヘテロ二量体化）形式、及びヘテロ二量体化変異体の異なる型の組み合わせを示す（これらは、本明細書で、「ヘテロ二量体骨格（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）」と呼ばれることがある）。さらに、こうした形式のすべてが、以下により完全に論じられるように、Ｆｃ領域において追加の変異体を含むことができ、「消去」変異体または「ノックアウト」変異体（図７）、ＦｃγＲ結合（ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ等）を変えるためのＦｃ変異体、ＦｃＲｎ受容体に対する結合を変えるためのＦｃ変異体等が含まれることに留意されたい。図４５Ａは、本明細書に記載されるすべてのヘテロ二量体化形式に関する二重ｓｃＦｃ−Ｆｃ形式を示し、ｐＩ変異体、ノブインホール（ｋｎｏｂ  ｉｎ  ｈｏｌｅ）（ＫＩＨ、本明細書で立体変異体または「歪曲」変異体とも呼ばれる）、電荷対（立体変異体のサブセット）、等比体積変異体、ならびにＳＥＥＤ体（「鎖交換反応が操作されたドメイン（ｓｔｒａｎｄ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｄｏｍａｉｎ）」、Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｍＡｂｓ  ４：６  ６５３−６６３（２０１２）及びＤａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２０１０  ２３：１９５−２０２参照のこと）などのヘテロ二量体化変異体を含めることができる。ＳＥＥＤ体は、ヒトＩｇＧ及びヒトＩｇＡのＣＨ３ドメインが、お互いに結合しないという事実に依存している。図４５Ｂは、再度、様々なヘテロ二量体化変異体の選択肢と共に二重特異性ＩｇＧを示す。図４５Ｃは、２つの異なる可変重ドメイン及び可変軽ドメインを利用するＤＶＤ−Ｉｇの「ワンアーム化（ｏｎｅ  ａｒｍｅｄ）」型を示す。図４５Ｄは、可変重鎖及び可変軽鎖が、反対側の重鎖上にあるということを除いては、「空アーム（ｅｍｐｔｙ  ａｒｍ）」というより、むしろ類似している。図４５Ｅは、一般的に「ｍＡｂ−Ｆｖ」と呼ばれる。図４５Ｆは、多重ｓｃＦｖ形式（ｍｕｌｔｉ−ｓｃＦｖ  ｆｏｒｍａｔ）を示し、当業者によって理解されるように、本明細書で論じられる「Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ」形式に類似しており、関連するｓｃＦｖ（またはそれに関連する何らかの他の結合リガンドまたは機能性）がいくらでもあり得ることを理解されよう。したがって、図４５Ｆは、１、２、３、または４つのｓｃＦｖ（例えば、二重特異性体向けには、ｓｃＦｖは、「シス」若しくは「トランス」、または分子の１つの「末端」上に両方存在するであろう）を有するであろう。図４５Ｇは、一方が重鎖Ｆａｂ配列を含み、もう一方が軽鎖Ｆａｂ配列を含む２つの異なる重鎖によって形成されているＦａｂを有するヘテロ二量体ＦａｂＦｃを示す。図４５Ｈは、「ワンアーム化Ｆａｂ−Ｆｃ」を示し、１つの重鎖が、Ｆａｂを含む。図４５Ｉは、「ワンアーム化ｓｃＦｖ−Ｆｃ」を示し、一方の重鎖Ｆｃが、ｓｃＦｖを含み、もう一方の重鎖は、「空（ｅｍｐｔｙ）」である。図４５Ｊは、ｓｃＦｖ−ＣＨ３を示し、���鎖ＣＨ３領域のみが使用され、それぞれが、それら独自のｓｃＦｖを有する。図４５Ｋは、ｍＡｂ−ｓｃＦｖを示し、分子の１つの末端が、重鎖の内の１つのｓｃＦｖを使用する一価の会合で、抗原を二価で捕捉する。図４５Ｌは、両重鎖が、追加のｓｃＦｖを含む以外は、同一の構造を示し、追加のｓｃＦｖは、同一抗原、または異なる抗原のいずれにも結合できる。図４５Ｍは、「ＣｒｏｓｓＭａｂ」構造を示し、２つの異なる軽鎖による多重形成の問題は、Ｆａｂ部分において配列交換することにより対処されている。図４５Ｎは、ｓｃＦｖを示し、図４５Ｏは、本明細書に概要が記載されるリンカーによって連結された「ＢｉＴＥ」またはｓｃＦｖ−ｓｃＦｖであり、図４５Ｐは、ＤＡＲＴを示し、図４５Ｑは、ＴａｎｄＡｂを示し、そして図４５Ｒは、ダイアボディを示す。図４５Ｓ、図４５Ｔ、及び図４５Ｕは、本発明において有用である追加の代替骨格形式を示す。
【図４６Ａ】図４６Ａ、４６Ｂ、及び４６Ｃは、安定性が最適化された、ヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖを示す。置換は、Ｈ１．１＿Ｌ１．４ｓｃＦｖ配列に対して与えられている。アミノ酸の番号付けは、Ｋａｂａｔの番号付けである。
【図４６Ｂ】図４６Ａ、４６Ｂ、及び４６Ｃは、安定性が最適化された、ヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖを示す。置換は、Ｈ１．１＿Ｌ１．４ｓｃＦｖ配列に対して与えられている。アミノ酸の番号付けは、Ｋａｂａｔの番号付けである。
【図４６Ｃ】図４６Ａ、４６Ｂ、及び４６Ｃは、安定性が最適化された、ヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖを示す。置換は、Ｈ１．１＿Ｌ１．４ｓｃＦｖ配列に対して与えられている。アミノ酸の番号付けは、Ｋａｂａｔの番号付けである。
【図４７Ａ】図４７Ａ及び４７Ｂ。本発明において使用される抗ＣＤ３配列向けの可変重鎖及び可変軽鎖であり、「強」結合配列及び「より弱い」結合配列の両方を含む。当業者によって理解されるように、これらは、何らかの標的腫瘍抗原結合ドメインと組み合わせて、Ｆａｂ構築物またはｓｃＦｖ構築物において使用できる。
【図４７Ｂ】図４７Ａ及び４７Ｂ。本発明において使用される抗ＣＤ３配列向けの可変重鎖及び可変軽鎖であり、「強」結合配列及び「より弱い」結合配列の両方を含む。当業者によって理解されるように、これらは、何らかの標的腫瘍抗原結合ドメインと組み合わせて、Ｆａｂ構築物またはｓｃＦｖ構築物において使用できる。
【図４８】Ｂｉａｃｏｒｅアッセイにおける結合親和性を示す。
【図４９】軽鎖、Ｆａｂ−Ｆｃ、及びｓｃＦｖ−Ｆｃの比を変更して使用し、安定プールを生成させた際のヘテロ二量体の純度を示す。
【図５０】ｈｕＰＢＭＣマウスモデルにおける抗ＣＤ３８ｘ抗ＣＤ３二重特異性体によるヒトＩｇＭ及びヒトＩｇＧ２の欠乏である。
【図５１Ａ】図５１Ａ及び図５１Ｂは、ＸＥＮＰ１３２４３及びＸＥＮＰ１３５５１の精製が、ＣＤ３８に対してそれぞれ低親和性及び高親和性を有するように設計されていることを示す。
【図５１Ｂ】図５１Ａ及び図５１Ｂは、ＸＥＮＰ１３２４３及びＸＥＮＰ１３５５１の精製が、ＣＤ３８に対してそれぞれ低親和性及び高親和性を有するように設計されていることを示す。
【図５２Ａ】図５２Ａ、図５２Ｂ、及び図５２Ｃは、ヒト及びサルのＣＤ３８及びＣＤ３に対する結合、ならびにＫｄを示す。
【図５２Ｂ】図５２Ａ、図５２Ｂ、及び図５２Ｃは、ヒト及びサルのＣＤ３８及びＣＤ３に対する結合、ならびにＫｄを示す。
【図５２Ｃ】図５２Ａ、図５２Ｂ、及び図５２Ｃは、ヒト及びサルのＣＤ３８及びＣＤ３に対する結合、ならびにＫｄを示す。
【図５３】骨髄腫細胞の殺傷を示す。
【図５４】標的細胞が数で上回るときでさえ、Ｔ細胞は、連続殺傷体であることを示す。
【図５５】Ｆｃドメインが、半減期を延長することを示す。
【図５６】図１４の実験に向けた投与を示す。
【図５７】より強いｈＩｇ欠乏と、ダラツムマブとの比較を示す。
【図５８】図１６の実験に向けた投与を示す。
【図５９Ａ】図５９Ａ及び図５９Ｂ。二重特異性体は、サルの血液及びリンパ器官において、ＣＤ３８＋細胞を欠乏させる。
【図５９Ｂ】図５９Ａ及び図５９Ｂ。二重特異性体は、サルの血液及びリンパ器官において、ＣＤ３８＋細胞を欠乏させる。
【図６０Ａ】図６０Ａ、６０Ｂ、及び６０Ｃ。図６０Ａ（血液からの再分布）、図６０Ｂ（ＣＤ６９誘導）、及び図６０Ｃ（サイトカイン放出）は、ＣＤ３８＋細胞の欠乏が、Ｔ細胞の再分布及び活性化と相関することを示す。
【図６０Ｂ】図６０Ａ、６０Ｂ、及び６０Ｃ。図６０Ａ（血液からの再分布）、図６０Ｂ（ＣＤ６９誘導）、及び図６０Ｃ（サイトカイン放出）は、ＣＤ３８＋細胞の欠乏が、Ｔ細胞の再分布及び活性化と相関することを示す。
【図６０Ｃ】図６０Ａ、６０Ｂ、及び６０Ｃ。図６０Ａ（血液からの再分布）、図６０Ｂ（ＣＤ６９誘導）、及び図６０Ｃ（サイトカイン放出）は、ＣＤ３８＋細胞の欠乏が、Ｔ細胞の再分布及び活性化と相関することを示す。
【図６１】本発明の特定使用のいくつかの実施形態を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
発明の詳細な説明
Ｉ．外観
本発明は、ＣＤ３抗原及びＣＤ３８抗原の両方に結合する二重特異性抗体を提供する新規の構築物を対象とする。抗体技術における継続問題は、２つの（またはそれより多くの）異なる抗原に同時に結合し、一般に、そのようにして、異なる抗原を近接させることを可能にし、新しい機能性及び新しい治療をもたらす「二重特異性」（及び／または多特異性）抗体が、切望されていることである。一般に、こうした抗体は、重鎖及び軽鎖それぞれの遺伝子を宿主細胞へと含めることによって作られる。これにより、一般に、所望のヘテロ二量体（Ａ−Ｂ）、ならびに２つのホモ二量体（Ａ−Ａ及びＢ−Ｂ）の形成がもたらされる。しかしながら、多特性抗体形成における主な障壁は、ヘテロ二量体抗体を精製してホモ二量体抗体を除去すること、及び／またはホモ二量体形成を上回るようにヘテロ二量体形成に偏らせることが困難であるということである。
【００４７】
本発明は、一般に、いくつかの方法で、抗原を共捕捉できる抗体などのヘテロ二量体タンパク質の創出を対象とし、それぞれの鎖で異なる、定常領域のアミノ酸変異体に依存することで、ヘテロ二量体形成の促進、及び／またはホモ二量体に関してテロ二量体精製の容易化を可能にする。
【００４８】
したがって、本発明は、少なくとも第一抗原及び第二抗原を共捕捉する新規のイムノグロブリン組成物を対象とする。本発明の第一抗原及び第二抗原は、本明細書で、それぞれ抗原１及び抗原２と呼ばれる。抗体の一方の重鎖は、単鎖Ｆｖ（以下に定義される「ｓｃＦｖ」）を含み、もう一方の重鎖は、「定型的な（ｒｅｇｕｌａｒ）」ＦＡｂ形式であって、可変重鎖及び軽鎖を含む。この構造は、本明細書で「三重Ｆ」形式（ｓｃＦｖ−ＦＡｂ−Ｆｃ）、またはボトルオープナーにおおよそ視覚的に類似している（図参照）ことから「ボトルオープナー」形式と呼ばれることがある。２つの鎖は、ヘテロ二量体抗体の形成を促進する定常領域（例えば、Ｆｃドメイン及び／またはヒンジ領域）において、アミノ酸変異体を使用することによって一緒にまとめられており、以下に、より完全に説明される。
【００４９】
本発明の「三重Ｆ」形式には、いくつかの明確に異なる利点が存在する。当該技術分野で知られるとおり、２つのｓｃＦｖ構築物に依存する抗体アナログは、安定性及び凝集の問題を有することが多いが、本発明においては、「定型的な」重鎖及び軽鎖の対を追加することによって、こうした問題を軽減できる。さらに、２つの重鎖及び２つの軽鎖に依存する形式とは対照的に、重鎖及び軽鎖が、不正確に対になる（例えば、重１が、軽２と対になる等）という問題は存在しない。
【００５０】
本発明のヘテロ二量体を生成させるために使用できる機構は、数多く存在する。さらに、当業者によって理解され、以下により完全に説明されるように、こうした機構は、高いヘテロ二量体化を維持するために組み合わせることができる。
【００５１】
１つの機構は、一般に、当該技術分野において、「ノブアンドホール（ｋｎｏｂ  ａｎｄ  ｈｏｌｅ）」（「ＫＩＨ」）と呼ばれるか、または本明細書で「歪曲」変異体と呼ばれることがある。これは、ヘテロ二量体形成に有利に働くと共にホモ二量体形成を抑制する立体的な影響を創出するアミノ酸操作を指し、任意選択で使用することもできる。これは、「ノブアンドホール」と呼ばれることがあり、ＵＳＳＮ６１／５９６，８４６，Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９（７）：６１７（１９９６）、Ａｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７  ２７０：２６、米国特許第８，２１６，８０５号において説明されるとおりである。これらはすべて、全体が、参照によって、本明細書に組み込まれる。図によって多くの「ノブアンドホール」に依存する「単量体Ａ−単量体Ｂ」の対が特定されている。さらに、Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：６７７（１９９８）において説明されるとおり、こうした「ノブアンドホール」変異は、ジスルフィド結合と組み合わせて、形成をヘテロ二量体化へと歪曲することができる。
【００５２】
ヘテロ二量体の生成において有用な追加の機構は、「静電操縦（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｓｔｅｅｒｉｎｇ）」と呼ばれることがあり、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５（２５）：１９６３７（２０１０）において説明されるとおりである。当該文献は、参照によって、その全体が、本明細書に組み込まれる。これは、本明細書で「電荷対」と呼ばれることがある。この実施形態では、静電気が、形成をヘテロ二量体化へと歪曲するために使用される。当業者であれば、これらは、ｐＩに対する効果も有し得、そうすることで、精製に対しても影響を有し得、したがって、場合によっては、ｐＩ変異体にもなり得ると考えられることを理解されるであろう。しかしながら、これらは、ヘテロ二量体化を押し進めるために生成され、精製手段としては使用されなかったため、それらは、「立体変異体」として分類される。これらには、限定はされないが、Ｄ２２１Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対であるＤ２２１Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／Ｌ３６８Ｅ（例えば、これらは、「単量体が対応するセットである）及びＣ２２０Ｒ／Ｅ２２４Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対であるＣ２２０Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／３６８Ｅが含まれる。（以下により完全に説明されるとおり、２２０の変異は、重鎖及び軽鎖のジスルフィド形成に、もはや必要ないシステインを除去するためのものであることに留意されたい）。
【００５３】
本発明には、ヘテロ二量体タンパク質の精製を容易化できるいくつかの基礎的な機構が存在する。すなわち、ｐＩ変異体の使用に依存し、その結果、単量体は、それぞれが異なるｐＩを有し、そうすることで、Ａ−Ａ二量体タンパク質、Ａ−Ｂ二量体タンパク質、及びＢ−Ｂ二量体タンパク質の等電点精製を可能にするものである。あるいは、「三重Ｆ」形式は、サイズに基づく分離も可能にする。以下にさらに概要が記載されるとおり、ヘテロ二量体形成が、ホモ二量体を上回るようにする「歪曲」も可能であり、以下に、一般的に概要が記載されるとおりである。したがって、立体二量体化変異体、及びｐＩ変異体または電荷対変異体の組み合わせは、本発明において、特定用途で有用である。さらに、以下に、より完全に概要が記載されるとおり、三重Ｆ形式のｓｃＦｖ単量体は、精製目的に向けて、さらなるｐＩの増大を与える荷電ｓｃＦｖリンカー（正か負のいずれか）を含むことができる。当業者によって、理解されるとおり、三重Ｆ形式によっては、荷電ｓｃＦｖリンカーのみを有し、追加のｐＩ調整無しでも有用であるが、本発明は、荷電ｓｃＦｖリンカーを有する歪曲変異体（ならびにＦｃ変異体、ＦｃＲｎ変異体、及びＫＯ変異体）の使用も確実に提供する。
【００５４】
ヘテロ二量体三重Ｆ形式を創出するための分離機構としてｐＩを利用する本発明においては、アミノ酸変異体を、単量体ポリペプチドの１つまたは両方に導入することができる。すなわち、単量体（本明細書では、単純化のため「単量体Ａ」と呼ぶ）の内の１つのｐＩが、単量体Ｂから遠ざかるように操作できるか、または単量体Ａ及び単量体Ｂの両方が変更され、単量体ＡのｐＩは増加し、単量体ＢのｐＩは減少する。以下に、より完全に概略が記載されるように、単量体のいずれか、または両方のｐＩの変更は、荷電残基を除去若しくは追加（例えば、中性アミノ酸は、正若しくは負に荷電したアミノ酸残基によって置き換えられ、例えば、グリシンからグルタミン酸への置き換えである）するか、荷電残基を正若しくは負から反対の電荷へと変更（アスパラギン酸からリジンへ）するか、または荷電残基を中性残基へと変更（例えば、リジンからセリンへであり、これにより荷電が消失する）することによって実施できる。多くのこうした変異体が、図に示される。
【００５５】
したがって、この実施形態では、本発明は、少なくとも１つの単量体において、ｐＩの十分な変更の創出を提供し、その結果、ヘテロ二量体は、ホモ二量体から分離できる。当業者によって、理解されるように、そして、以下にさらに論じられるように、これは、「野生型」重鎖定常領域と、そのｐＩが増加若しくは減少（ｗｔ  Ａ−＋Ｂ若しくはｗｔ  Ａ−  −Ｂ）のいずれかとなるように操作された変異体領域と、を使用することによって実施できるか、または一方の領域を増加し、もう一方の領域を減少させること（Ａ＋  −Ｂ−若しくはＡ−  Ｂ＋）によって実施できる。この議論において、どの単量体が、ｓｃＦｖを含み、どれが、Ｆａｂを含むかは、問題ではないことに留意されたい。
【００５６】
したがって、一般に、本発明の構成要素は、抗体の定常領域におけるアミノ酸変異体であり、当該アミノ酸変異体は、アミノ酸置換（「ｐＩ変異体」または「ｐＩ置換」）を単量体の１つまたは両方へ組み込むことによって、「ｐＩヘテロ二量体」（タンパク質が抗体であるとき、それは、「ｐＩ抗体」と呼ばれる）を形成するために、二量体タンパク質の単量体の両方か、もし両方でないなら少なくとも１つの等電点（ｐＩ）を変えることに向けられる。本明細書で示されるように、２つのホモ二量体からのヘテロ二量体の分離は、２つの単量体のｐＩが、わずか０．１ｐＨ単位でも異なれば達成でき、０．２、０．３、０．４、及び０．５、またはそれより大きな差異は、すべて本発明において有用である。
【００５７】
当業者によって理解されるとおり、よい分離を得るために単量体のそれぞれまたは両方に含まれるｐＩ変異体の数は、対象のｓｃＦｖ及びＦａｂの出発ｐＩに依存する部分があるであろう。すなわち、どの単量体を操作するか、またはどの「方向」（例えば、より正、若しくはより負）にするかを決定するために、２つの標的抗原のＦｖ配列が計算され、そこから決定がなされる。当該技術分野で知られるように、異なるＦｖであれば、本発明で活用される異なる出発ｐＩを有する。一般に、本明細書に概要が記載されるように、ｐＩが操作されることにより、それぞれの単量体で、少なくとも約０．１ｌｏｇの総ｐＩ差異がもたらされ、本明細書に概要が記載されるように当該総ｐＩ差異は、０．２〜０．５であることが好ましい。
【００５８】
さらに、当業者によって理解されると共に、本明細書に概要が記載されるように、ヘテロ二量体は、サイズに基づいてホモ二量体から分離できる。例えば、図８に示すように、２つのｓｃＦｖを有するヘテロ二量体（図８Ａ）は、「三重Ｆ」形式のもの（図８Ｂ）及び二重特異性ｍＡｂのもの（図８Ｃ）によって分離できる。これは、利用する追加の抗原結合部位を有する、より高い結合価においてさらに活用できる。例えば、さらに示されるとおり、一方の単量体が、２つのＦａｂ断片を有し、もう一方が、１つのｓｃＦｖを有することになるのであれば、サイズの差異をもたらし、したがって、分子量の差異につながる。
【００５９】
さらに、当業者によって理解されると共に、本明細書に概要が記載されるように、本明細書に概要が記載される形式は、拡張して三重特異性抗体及び四重特異性抗体を供給することもできる。この実施形態では、そのいくつかのバリエーションが図に示されており、いくつかの抗原は、二価で結合されることが可能であることを認識されるであろう（例えば、単一抗原に対する２つの抗原結合部位であって、例えば、Ａ及びＢは、典型的な二価会合の一部であり得、Ｃ及びＤは、任意選択で存在し、任意選択で同一であるか、または異なり得る）。Ｆａｂ及びｓｃＦｖの何らかの組み合わせを、所望の結果及び組み合わせを達成するために利用できることを理解されよう。
【００６０】
ｐＩ変異体が、重鎖の定常領域を使用することによって、二量体化を達成するために使用される場合は、抗体を含む多特異性タンパク質の設計及び精製に対する、よりモジュール型の手法が提供される。したがって、いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体化変異体（歪曲ヘテロ二量体化変異体及び精製ヘテロ二量体化変異体を含む）は、可変領域に含まれておらず、その結果、個々の抗体は、それぞれ操作されなければならない。さらに、いくつかの実施形態では、ｐＩ変異体からもたらされる免疫原性の可能性は、異なるＩｇＧアイソタイプ由来のｐＩ変異体を移入することによって、著しく低減され、その結果、ｐＩは、著しい免疫原性を導入することなく変更される。したがって、解決すべき追加の問題は、ヒト配列含量が高い低ｐＩ定常ドメインの解明であり、例えば、何らかの特定位置における非ヒト残基の最小化または回避である。
【００６１】
１つの実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、ｓｃＦｖを使用した一方の抗原の一価の会合と、ＦＡｂを使用したもう一方の抗原の一価の会合と、を提供する。以下に概要が記載されるとおり、この形式は、変えることもでき、いくつかの実施形態では、３つの抗原の一価の会合、１つの抗原の二価の会合、ならびに第二の抗原の一価の会合（例えば、Ａ及びＣは、同一抗原へ、Ｂは、異なる抗原へ）等が存在する。
【００６２】
このｐＩ操作で起こり得る付帯利点は、血清半減期の延長及びＦｃＲｎ結合の増加でもある。すなわち、ＵＳＳＮ１３／１９４，９０４において説明されるように（参照によって、その全体が組み込まれる）、抗体定常ドメイン（抗体及びＦｃ融合体においてみられるものを含む）のｐＩを下げることは、生体内において、血清での保持が長期化することにつながり得る。血清半減期の増加に向けた、こうしたｐＩ変異体によって、精製に向けたｐＩの変更も促進される。
【００６３】
さらに、本明細書に概要が記載されるとおり、追加の機能性を追加するために、追加のアミノ酸変異体を本発明の二重特異性抗体へ導入してよい。例えば、Ｆｃ領域内に、アミノ酸の変更を（一方の単量体または両方に）追加することで、ＡＤＣＣまたはＣＤＣの増加（例えば、Ｆｃγ受容体に対する結合の変更）を促進でき、毒物及び薬物の追加を可能にするか、またはその収率を増加（例えば、ＡＤＣ向け）させることができ、ならびにＦｃＲｎに対する結合を増加させ、及び／または得られる分子の血清半減期を増加させることができる。本明細書でさらに説明されると共に、当業者によって理解されるとおり、本明細書に概要が記載される変異体のいずれか、及びすべては、任意選択かつ独立して他の変異体と組み合わせることができる。
【００６４】
同様に、機能性変異体の別のカテゴリーは、「Ｆｃγ消去変異体」または「Ｆｃノックアウト（ＦｃＫＯ若しくはＫＯ）変異体である。こうした実施形態では、いくつかの治療用途に向け、Ｆｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ等）の１つまたは複数またはすべてに対するＦｃドメインの通常の結合を低減または除去して、作用の付加的な機構を回避することが望ましい。すなわち、例えば、多くの実施形態では、ＦｃγＲＩＩＩａ結合を消去して、ＡＤＣＣ活性を排除、または著しく低下させることが一般に望ましい。
【００６５】
さらに、本発明は、ＣＤＲ、完全可変軽鎖、及び完全可変重鎖のセット、ならびに関連ｓｃＦｖを含む新規のヒト化抗ＣＤ３配列を提供し、当該関連ｓｃＦｖは、荷電ｓｃＦｖリンカーを任意選択で含む。こうした最適化配列は、他の抗体形式において使用できる。
【００６６】
本発明は、ＣＤＲ、完全可変軽鎖、及び完全可変重鎖のセット、ならびに関連ｓｃＦｖを含む新規の抗ＣＤ３８配列をさらに提供し、当該関連ｓｃＦｖは、荷電ｓｃＦｖリンカーを任意選択で含む。こうした最適化配列は、他の抗体形式において使用できる。
【００６７】
したがって、本発明は、ＣＤ３及びＣＤ３８の両方に結合する、二重特異性である二価抗体を産生するための新規構築物を提供する。
【００６８】
さらに、本発明は、異なる親和性の抗原結合ドメインを提供する。すなわち、抗ＣＤ３配列及び抗ＣＤ３８配列の両方に向けて、いくつかの適応では、より強い親和性が好ましくあり得、一方で、他では、より弱い親和性が有用であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、ＣＤ３に対する「強」または「高親和性」結合体（例えば、１つ例は、Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７として示される重可変ドメイン、及び軽可変ドメインである（必要に応じて任意選択で荷電リンカーを含む））である抗ＣＤ３抗原結合ドメインを含む抗体構築物を提供する。他の実施形態では、本発明は、図４７に示されるとおり、ＣＤ３に対する「軽（ｌｉｔｅ）」または「低親和性」結合体である抗ＣＤ３抗原結合ドメインを含む抗体構築物を提供する。
【００６９】
ＩＩ．定義
本出願をより完全に理解し得るために、いくつかの定義を以下に示す。そのような定義は、文法的に等価であるものを包含することを意図する。
【００７０】
本明細書では、「消去」は、活性の低減または除去を意味する。したがって、たとえば、「ＦｃγＲ結合の消去」は、特定の変異体を含まないＦｃ領域と比較して、Ｆｃ領域アミノ酸変異体が、出発結合の５０％未満を有することを意味し、活性を７０〜８０〜９０〜９５〜９８％喪失していることが好ましく、一般に、活性は、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイにおいて、検出可能な結合水準を下回る。消去変異体（本明細書では、「ＦｃγＲ消去変異体」、「Ｆｃ消去変異体」、「Ｆｃノックアウト」、（「ＦｃＫＯ」）または「ノックアウト」（「ＫＯ」）変異体とも呼ばれることがある）が使用される、特定用途の変異体は、図３５に示すものである。
【００７１】
本明細書では、「ＡＤＣＣ」または「抗体依存性細胞傷害」は、細胞が媒介する反応であり、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性の細胞が、標的細胞上に結合した抗体を認識し、その後に標的細胞の溶解を引き起こすことを意味する。ＡＤＣＣは、ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合と相関しており、ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合の増加は、ＡＤＣＣ活性の増加につながる。
【００７２】
本明細書では、「ＡＤＣＰ」または抗体依存性細胞貪食は、細胞が媒介する反応であり、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性の細胞が、標的細胞上に結合した抗体を認識し、その後に標的細胞の貪食を引き起こすことを意味する。
【００７３】
本明細書では、「改変」は、ポリペプチド配列における、アミノ酸の置換、挿入、及び／若しくは欠失、またはタンパク質に化学的に連結された部分に対する変更を意味する。例えば、改変は、糖質の変更またはタンパク質に付加されたＰＥＧ構造であってよい。本明細書では、「アミノ酸改変」は、ポリペプチド配列における、アミノ酸の置換、挿入、及び／または欠失を意味する。明確化に向けた説明として、別段の記載が無い限り、アミノ酸改変は、常に、ＤＮＡよってコードされるアミノ酸への改変であり、例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡにおいてコドンを有する２０個のアミノ酸である。
【００７４】
本明細書では、「アミノ酸置換」または「置換」は、親ポリペプチド配列における特定位置で、アミノ酸を異なるアミノ酸と置き換えることを意味する。具体的には、いくつかの実施形態では、置換は、特定位置で自然発生しないアミノ酸に対するものであり、生物内において、または何らかの生物において、いずれでも自然発生しない。例えば、置換Ｅ２７２Ｙは、変異体ポリペプチドを指し、この場合、位置２７２で、グルタミン酸が、チロシンで置き換えられているＦｃ変異体である。明確化に向けた説明として、核酸がコードする配列が変わるように操作されているが、出発アミノ酸から変えていないタンパク質（例えば、ＣＧＧ（アルギニンをコードする）をＣＧＡ（依然としてアルギニンをコードする）へと交換すると、宿主組織の発現水準は増加する）は、「アミノ酸置換」ではない。すなわち、同一タンパク質をコードする新しい遺伝子が創出されているにもかかわらず、タンパク質が、出発時の特定位置に、同一のアミノ酸を有するのであれば、それは、アミノ酸置換ではない。
【００７５】
本明細書では、「アミノ酸挿入」または「挿入」は、親ポリペプチド配列における特定位置でのアミノ酸配列の追加を意味する。例えば、−２３３Ｅまたは２３３Ｅは、位置２３３の後かつ位置２３４の前でのグルタミン酸の挿入を指定する。さらに、−２３３ＡＤＥまたはＡ２３３ＡＤＥは、位置２３３の後かつ位置２３４の前でのＡｌａＡｓｐＧｌｕの挿入を指定する。
【００７６】
本明細書では、「アミノ酸欠失」または「欠失」は、親ポリペプチド配列における特定位置でのアミノ酸配列の除去を意味する。例えば、Ｇ２３６−またはＧ２３６＃またはＧ２３６ｄｅｌは、位置２３６でのグリシンの欠失を指定する。さらに、ＥＤＡ２３３−またはＥＤＡ２３３＃は、位置２３３から始まる配列ＧｌｕＡｓｐＡｌａの欠失を指定する。同様に、ヘテロ二量体化変異体のいくつかは、「Ｋ４４７ｄｅｌ」を含み、位置４４７で、リジンが欠失していることを意味する。
【００７７】
本明細書では、「変異体タンパク質」または「タンパク質変異体」または「変異体」は、少なくとも１つのアミノ酸改変の理由によって、親タンパク質のそれとは異なるタンパク質を意味する。タンパク質変異体は、タンパク質自体、タンパク質を含む組成物、またはそれをコードするアミノ配列を指してよい。好ましくは、タンパク質変異体は、親タンパク質と比較して少なくとも１つのアミノ酸改変を有し、例えば、親と比較して、約１〜約７０個のアミノ酸改変、好ましくは、約１〜約５個のアミノ酸改変を有する。以下に説明されるとおり、いくつかの実施形態では、親ポリペプチド、例えば、Ｆｃ親ポリペプチドは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４由来のＦｃ領域などのヒト野生型配列であるが、変異体を有するヒト配列は、「親ポリペプチド」としても働くことができる。本明細書に記載されるタンパク質変異体配列は、好ましくは、親タンパク質配列との比較で、少なくとも約８０％の同一性、最も好ましくは、少なくとも約９０％の同一性、より好ましくは、少なくとも９５〜９８〜９９％の同一性を有する。変異体タンパク質は、変異体タンパク質自体、タンパク質変異体を含む組成物、またはそれをコードするＤＮＡ配列を指し得る。したがって、本明細書では、「抗体変異体」または「変異体抗体」は、少なくとも１つのアミノ酸改変の理由によって、親抗体と異なる抗体を意味し、本明細書では、「ＩｇＧ変異体」または「変異体ＩｇＧ」は、少なくとも１つのアミノ酸改変の理由によって、親ＩｇＧ（再度記載するが、多くの場合、ヒトＩｇＧ配列由来）と異なる抗体を意味し、本明細書では、「イムノグロブリン変異体」または「変異体イムノグロブリン」は、少なくとも１つのアミノ酸改変の理由によって親イムノグロブリン配列のそれと異なるイムノグロブリン配列を意味する。本明細書で使用される「Ｆｃ変異体」または「変異体Ｆｃ」は、Ｆｃドメインにおいてアミノ酸改変を含むタンパク質を意味する。本発明のＦｃ変異体は、それを構成するアミノ酸改変に従って定義される。したがって、例えば、Ｎ４３４Ｓまたは４３４Ｓは、親Ｆｃポリペプチドに対して、位置４３４で置換セリンを有するＦｃ変異体であり、番号付けは、ＥＵインデックスに従うものである。同様に、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓは、親Ｆｃポリペプチドに対して、置換Ｍ４２８Ｌ及び置換Ｎ４３４Ｓを有するＦｃ変異体を定義する。ＷＴアミノ酸の同一性が、特定されていなくてもよく、その場合、先に記載した変異体は、４２８Ｌ／４３４Ｓと呼ばれる。置換が提供される規則は任意であることに留意されたい。つまり、例えば、４２８Ｌ／４３４Ｓは、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓと同一のＦｃ変異体である等である。本発明において論じられ、抗体に関連する位置のすべてで、別段の記載が無い限り、アミノ酸位置の番号付けは、ＥＵインデックスに従うものである。ＥＵインデックス、またはＫａｂａｔ若しくはＥＵの番号付けスキームにあるようなＥＵインデックスは、ＥＵ抗体の番号付けを指す（Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ６３：７８−８５の全体が、これにより、参照によって、本明細書に組み込まれる。）改変は、追加、欠���、または置換であり得る。置換は、自然発生するアミノ酸を含み得、場合によっては、合成アミノ酸を含み得る。例には、米国特許第６，５８６，２０７号、ＷＯ９８／４８０３２、ＷＯ０３／０７３２３８、ＵＳ２００４−０２１４９８８Ａ１、ＷＯ０５／３５７２７Ａ２、ＷＯ０５／７４５２４Ａ２、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２４：９０２６−９０２７、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ，＆  Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  １１：１１３５−１１３７、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００２），ＰＩＣＡＳ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９９：１１０２０−１１０２４、及びＬ．Ｗａｎｇ，＆  Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），Ｃｈｅｍ．１−１０が含まれ、これらはすべて、全体が、参照によって、組み込まれる。
【００７８】
本明細書では、本明細書に記載される「タンパク質」は、少なくとも２つの共有結合したアミノ酸を意味し、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、及びペプチドが含まれる。ペプチジル基は、自然発生するアミノ酸及びペプチド結合、または合成ペプチド模倣構造、すなわち、ペプトイドなどの「アナログ」を含んでよい（Ｓｉｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８９（２０）：９３６７（１９９２）参照。参照にって、全体が組み込まれる）。アミノ酸は、自然発生または合成（例えば、ＤＮＡによってコードされるアミノ酸ではない）のいずれでもよく、当業者によって理解されるとおりである。例えば、ホモ−フェニルアラニン、シトルリン、オルニチン、及びノルロイシンは、本発明の目的に向けた合成アミノ酸であると考えられ、Ｄ及びＬ（ＲまたはＳ）で形成されたアミノ酸の両方を利用してよい。本発明の変異体は、例えば、Ｓｃｈｕｌｔｚらによって開発された技術を使用して組み込まれた合成アミノ酸の使用を含む改変を含んでよく、限定はされないが、Ｃｒｏｐｐ  ＆  Ｓｈｕｌｔｚ，２００４，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．２０（１２）：６２５−３０、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１（２）：７５６６−７１、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，３０３（５６５６）：３７１−３、及びＣｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１（５６３５）：９６４−７によって説明される方法が含まれ、これらはすべて、全体が、参照によって組み込まれる。さらに、ポリペプチドは、１つまたは複数の側鎖または末端の合成誘導体化、グリコシル化、ＰＥＧ化、円順列、環化、他の分子へのリンカー、タンパク質またはタンパク質ドメインへの融合、及びペプチドタグまたはペプチド標識の追加を含んでよい。
【００７９】
本明細書では、「残基」は、タンパク質における位置を意味し、アミノ酸同一性と関連する。例えば、アスパラギン２９７（Ａｓｎ２９７またはＮ２９７とも呼ばれる）は、ヒト抗体ＩｇＧ１における位置２９７の残基である。
【００８０】
本明細書では、「Ｆａｂ」または「Ｆａｂ領域」は、ＶＨイムノグロブリンドメイン、ＣＨ１イムノグロブリンドメイン、ＶＬイムノグロブリンドメイン、及びＣＬイムノグロブリンドメインを含むポリペプチドを意味する。Ｆａｂは、単独でこの領域を指してよく、または全長抗体、抗体断片、またはＦａｂ融合タンパク質の構成においてこの領域を指してよい。本明細書では、「Ｆｖ」または「Ｆｖ断片」または「Ｆｖ領域」は、単一抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメインを含むポリペプチドを意味する。
【００８１】
本明細書では、「ＩｇＧサブクラス改変」または「アイソタイプ改変」は、１つのＩｇＧアイソタイプの１つのアミノ酸を、異なる、位置合わせされたＩｇＧアイソタイプにおいて、対応するアミノ酸に変換するアミノ酸改変を意味する。例えば、ＥＵ位置２９６に、ＩｇＧ１は、チロシンを含み、ＩｇＧ２は、フェニルアラニンを含むため、ＩｇＧ２におけるＦ２９６Ｙ置換は、ＩｇＧサブクラス改変であると考えられる。
【００８２】
本明細書では、「非自然発生改変」は、アイソタイプではないアミノ酸改変を意味する。例えば、ＩｇＧのいずれも位置４３４にセリンを含まないため、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、若しくはＩｇＧ４（またはそのハイブリッド）における置換４３４Ｓは、非自然発生改変であると考えられる。「アイソタイプ」改変は、１つの位置での、１つのアイソタイプアミノ酸の、異なるアイソタイプの主鎖への取り込み（ｉｍｐｏｒｔａｔｉｏｎ）を指し、例えば、ＩｇＧ１アミノ酸の、同一位置でのＩｇＧ２主鎖への取り込みである。
【００８３】
本明細書では、「アミノ酸」及び「アミノ酸同一性」は、ＤＮＡ及びＲＮＡによってコードされる自然に発生する２０個のアミノ酸の１つを意味する。
【００８４】
本明細書では、「エフェクター機能」は、抗体Ｆｃ領域と、Ｆｃ受容体またはＦｃリガンドとの相互作用からもたらされる生化学的現象を意味する。エフェクター機能には、限定はされないが、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びＣＤＣが含まれる。
【００８５】
本明細書では、「ＩｇＧ  Ｆｃリガンド」は、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合し、Ｆｃ／Ｆｃリガンド複合体を形成する、何らかの生物由来の分子、好ましくは、ポリペプチドを意味する。Ｆｃリガンドには、限定はされないが、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃＲｎ、Ｃ１ｑ、Ｃ３、マンナン結合レクチン、マンノース受容体、ブドウ球菌プロテインＡ、ブドウ球菌プロテインＧ、及びウイルスＦｃγＲが含まれる。Ｆｃリガンドは、ＦｃγＲに相同性のＦｃ受容体のファミリーであるＦｃ受容体相同体（ＦｃＲＨ）（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １９０：１２３−１３６の全体が、参照によって、組み込まれる）も含む。Ｆｃリガンドには、Ｆｃに結合する未発見分子を含まれてよい。特定のＩｇＧ  Ｆｃリガンドは、ＦｃＲｎ及びＦｃガンマ受容体である。本明細書では、「Ｆｃリガンド」は、抗体のＦｃ領域に結合し、Ｆｃ／Ｆｃリガンド複合体を形成する、何らかの生物由来の分子、好ましくはポリペプチドを意味する。
【００８６】
本明細書では、「Ｆｃガンマ受容体」、「ＦｃγＲ」、または「ＦｃガンマＲ」は、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合するタンパク質ファミリーの何らかのメンバーを意味し、ＦｃγＲ遺伝子によってコードされる。ヒトにおいては、このファミリーには、限定はされないが、アイソフォームＦｃγＲＩａ、アイソフォームＦｃγＲＩｂ、及びアイソフォームＦｃγＲＩｃを含むＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、アイソフォームＦｃγＲＩＩａ（アロタイプＨ１３１及びアロタイプＲ１３１を含む）、アイソフォームＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ−１及びＦｃγＲＩＩｂ−２を含む）、ならびにアイソフォームＦｃγＲＩＩｃを含むＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ならびにアイソフォームＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプＶ１５８及びアロタイプＦ１５８を含む）、及びアイソフォームＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩｂ−ＮＡ１及びアロタイプＦｃγＲＩＩｂ−ＮＡ２を含む）を含むＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ８２：５７−６５の全体が、参照によって組み込まれる）、ならびに何らかの未発見のヒトＦｃγＲまたはＦｃγＲアイソフォーム若しくはＦｃγＲアロタイプが含まれる。ＦｃγＲは、何らかの生物由来であってよく、限定はされないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、及びサルが含まれる。マウスＦｃγＲには、限定はされないが、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、及びＦｃγＲＩＩＩ−２（ＣＤ１６−２）、ならびに何らかの未発見のマウスＦｃγＲまたはＦｃγＲアイソフォーム若しくはＦｃγＲアロタイプが含まれる。
【００８７】
本明細書では、「ＦｃＲｎ」または「新生児型Ｆｃ受容体」は、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合するタンパク質を意味し、少なくとも一部がＦｃＲｎ遺伝子によってコードされる。ＦｃＲｎは、何らかの生物由来であってよく、限定はされないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、及びサルが含まれる。当該技術分野で知られるように、機能性ＦｃＲｎタンパク質は、２つのポリペプチドを含み、重鎖及び軽鎖と呼ばれることが多い。軽鎖は、ベータ−２−ミクログロブリンであり、重鎖は、ＦｃＲｎ遺伝子によってコードされる。別段の記載が無い限り、ＦｃＲｎまたはＦｃＲｎタンパク質は、ＦｃＲｎ重鎖のベータ−２−ミクログロブリンとの複合体を指す。様々なＦｃＲｎ変異体が、ＦｃＲｎ受容体に対する結合の増加に使用され、場合によっては、血清半減期の増加に使用される。ＦｃＲｎ受容体に対する結合の増加、及び血清半減期の対応する増加を与えるＦｃ変異体には、限定はされないが、４３４Ａ、４３４Ｓ、４２８Ｌ、３０８Ｆ、２５９Ｉ、４２８Ｌ／４３４Ｓ、２５９Ｉ／３０８Ｆ、４３６Ｉ／４２８Ｌ、４３６ＩまたはＶ／４３４Ｓ、４３６Ｖ／４２８Ｌ、２５２Ｙ、２５２Ｙ／２５４Ｔ／２５６Ｅ、及び２５９Ｉ／３０８Ｆ／４２８Ｌが含まれる。すなわち、図８Ｂの三重Ｆ形式は、単量体配列のいずれか、または両方にこうしたＦｃＲｎ変異体のいずれかを有し得る。明確化に向けた説明として、重鎖はそれぞれ異なり、ＦｃＲｎ変異体（及びＦｃ変異体）は、単量体の一方または両方に存在し得る。
【００８８】
本明細書では、「親ポリペプチド」は、後に改変されて変異体が生成する出発ポリペプチドを意味する。親ポリペプチドは、自然発生するポリペプチド、または変異体、または自然発生するポリペプチドの操作された型であってよい。親ポリペプチドは、ポリペプチド自体、親ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を指し得る。したがって、本明細書では、「親イムノグロブリン」は、改変されて変異体が生成する未改変イムノグロブリンポリペプチドを意味し、本明細書では、「親抗体」は、改変されて変異体抗体を生成する未改変抗体を意味する。「親抗体」は、以下に概要が記載される、既知であって、市販の、組換えで産生される抗体を含む。
【００８９】
本明細書では、「Ｆｃ融合タンパク質」または「イムノアドヘシン」は、Ｆｃ領域を含むタンパク質を意味し、当該Ｆｃ領域は、一般に、本明細書で説明される、標的タンパク質に対する結合部分などの異なるタンパク質に、連結（任意選択で、本明細書で説明されるリンカー部分を介する）される。
【００９０】
本明細書では、「位置（ｐｏｓｔｉｏｎ）」は、タンパク質の配列における場所（ｌｏｃａｔｉｏｎ）を意味する。位置は、連続して番号付けしてよく、または確立された形式に従ってよく、例えば、抗体の番号付けのためのＥＵインデックスに従ってよい。
【００９１】
本明細書に記載される、本発明のヘテロ二量体タンパク質の単量体の構成における「鎖性（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）」は、「適合」するＤＮＡの２つの鎖（ｓｔｒａｎｄ）と同様に、ヘテロ二量体化変異体が、「適合」してヘテロ二量体を形成する能力を保つように、それぞれの単量体へと取り込まれることを意味する。例えば、いくつかのｐＩ変異体が、単量体Ａへと操作導入されている（例えば、ｐＩを高くする）のであれば、「電荷対」である立体変異体も利用することができ、ｐＩ変異体を妨害しない。例えば、ｐＩを高くする電荷変異体を、同一「鎖」または同一「単量体」に加えることにより、両機能性が保持される。
【００９２】
本明細書では、「標的抗原」は、所与の抗体の可変領域によって特異的に結合される分子を意味する。標的抗原は、タンパク質、糖質、脂質、または他の化学化合物であってよい。本発明の好ましい標的抗原は、ＣＤ３及びＣＤ３８である。
【００９３】
本明細書では、「標的細胞」は、標的抗原を発現している細胞を意味する。
【００９４】
本明細書では、「可変領域」は、カッパイムノグロブリン、ラムダイムノグロブリン、及び重鎖イムノグロブリンの遺伝子座位をそれぞれ構成するＶ．カッパ遺伝子、Ｖ．ラムダ遺伝子、及び／またはＶＨ遺伝子のいずれかによって実質的にコードされる１つまたは複数のＩｇドメインを含むイムノグロブリンの領域を意味する。
【００９５】
本明細書では、「野生型またはＷＴ」は、天然においてみられるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味し、対立遺伝子変動を含む。ＷＴタンパク質は、意図的に改変されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。
【００９６】
「単鎖可変断片」、「ｓｃＦｖ」、または「単鎖Ｆｖ」は、当該技術分野でよく理解されており、本明細書では、抗体の可変重鎖及び可変軽鎖の融合タンパク質を意味し、通常、リンカーペプチドで連結されている。当該技術分野でよく知られる典型的なｓｃＦｖリンカーは、一般に、長さがアミノ酸で１０〜２５個であり、グリシン及びセリンを含む。
【００９７】
本明細書では、「荷電ｓｃＦｖリンカー」は、少なくとも１つのｓｃＦｖを含むヘテロ二量体抗体の創出及び精製において使用に向けて、荷電アミノ酸を利用するｓｃＦｖリンカーを意味する。適した荷電ｓｃＦｖリンカーは、図に示されるが、他のものを使用できる。一般的に、本発明において使用するための荷電ｓｃＦｖリンカーは、伝統的に使用される（ＧＧＧＧＳ）３−５配列などの標準非荷電ｓｃＦｖリンカーと比較して、３〜８（３、４、５、６、７、または８のすべてが可能である）の電荷の変化を有する（負または正のいずれか）。当業者によって、２つのｓｃＦｖを利用するヘテロ二量体抗体は、１つの電荷リンカー、及び１つの中性リンカー（例えば、正または負に荷電したｓｃＦｖリンカー）、または２つの逆に荷電したｓｃＦｖリンカー（１つが正、１つが負）を有し得ることを理解されよう。
【００９８】
ヘテロ二量体タンパク質
本発明は、多特異性、特に二重特異性結合タンパク質の生成を対象とし、具体的には、ｓｃＦｖを含む一方の単量体、及びＦｖを含むもう一方の単量体を有する多特異的抗体を対象とする。本明細書で論じられるとおり、開示される実施形態の多くが、ＣＤ３に結合するｓｃＦｖ及びＣＤ３８に結合するＦｖ（またはＦａｂ）を使用する。あるいは、本明細書に記載されるｖｈ及びｖｌの抗ＣＤ３８配列をｓｃＦｖ構築物において使用することができ、ここで、抗ＣＤ３単量体は、Ｆａｂである。
【００９９】
抗体
本発明は、多特異性抗体、一般には、治療用抗体の生成に関する。以下に論じられるように、「抗体」という用語が、一般に使用される。本発明において有用である抗体は、本明細書で説明される多くの形式で使用でき、伝統的な抗体、ならびに以下に説明される抗体の誘導体、断片、及び模倣体が含まれる。一般に、「抗体」という用語は、少なくとも１つの定常ドメインを含む何らかのポリペプチドを含み、当該定常ドメインには、限定はされないが、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＬが含まれる。本明細書に記載される特に好ましい抗体は「三重Ｆ」形式の抗体である。
【０１００】
伝統的な抗体構造単位は、典型的には、四量体を含む。それぞれの四量体は、典型的には、ポリペプチド鎖の２つの同一対からなり、それぞれの対が、１つの「軽」鎖（典型的には、約２５ｋＤａの分子量を有する）、及び１つの「重」鎖（典型的には、約５０〜７０ｋＤａの分子量を有する）を有する。ヒト軽鎖は、カッパ軽鎖及びラムダ軽鎖として分類される。本発明は、ＩｇＧクラスを対象とし、ＩｇＧクラスは、いくつかのサブクラスを有し、限定はされないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４が含まれる。したがって、本明細書では、「アイソタイプ」は、その定常領域の化学的特性及び抗原特性によって定義されるイムノグロブリンのサブクラスのいずれかを意味する。治療用抗体は、アイソタイプ及び／またはサブクラスのハイブリッドも含み得ることを理解されるべきである。例えば、参照によって組み込まれる米国公開第２００９／０１６３６９９号に示されるように、本発明は、ＩｇＧ１／Ｇ２ハイブリッドのｐＩ操作を含む。
【０１０１】
それぞれの鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を第一に担う約１００〜１１０個またはそれより多いアミノ酸の可変領域を含み、可変領域は、一般に、当該技術分野及び本明細書で「Ｆｖドメイン」または「Ｆｖ領域」と呼ばれる。可変領域では、３つのループが、重鎖及び軽鎖のＶドメインのそれぞれに向けて集まり、抗原結合部位を形成する。ループのそれぞれは、相補性決定領域と呼ばれ（以下で「ＣＤＲ」と呼ばれる）、アミノ酸配列における変動が最も顕著である。「可変」は、可変領域のある一定のセグメントが、抗体間の配列において広く異なるという事実を指す。可変領域内の可変性は、均等に分布していない。その代わりに、Ｖ領域は、相対的に不変な区間からなり、当該区間は、それぞれの長さがアミノ酸で、９〜１５個か、またはそれより長い「超可変領域」と呼ばれる極度に可変性の、より短い領域によって分離されており、１５〜３０個のアミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。
【０１０２】
ＶＨ及びＶＬは、それぞれが３つの超可変領域（「相補性決定領域」、「ＣＤＲ」）及び４つのＦＲからなり、次の順序で、アミノ末端からカルボキシ末端へと配置される。すなわち、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４である。
【０１０３】
超可変領域は、軽鎖可変領域における、約アミノ酸残基２４〜３４（ＬＣＤＲ１；「Ｌ」は軽鎖を示す）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、及び８９〜９７（ＬＣＤＲ３）、重鎖可変領域における、およそ約３１〜３５Ｂ（ＨＣＤＲ１；「Ｈ」は、重鎖を示す）、約５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、及び約９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸残基；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）、ならびに／または超可変ループを形成するそうした残基（例えば、軽鎖可変領域における残基２６〜３２（ＬＣＤＲ１）、５０〜５２（ＬＣＤＲ２）、及び９１〜９６（ＬＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変領域における２６〜３２（ＨＣＤＲ１）、５３〜５５（ＨＣＤＲ２）、及び９６〜１０１（ＨＣＤＲ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７、由来のアミノ酸残基を包含することが一般的である。本発明の特定のＣＤＲは、以下に説明される。
【０１０４】
本明細書を通して、可変ドメイン（およそ、軽鎖可変領域の残基１〜１０７、及び重鎖可変領域の残基１〜１１３）における残基を指すときは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムが一般に使用される（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ（１９９１））。
【０１０５】
ＣＤＲは、抗体結合の形成に寄与し、またはより具体的には、抗体のエピトープ結合部位の形成に寄与する。「エピトープ」は、パラトープとして知られる、抗体分子の可変領域における特定抗原結合部位と相互作用する決定基を指す。エピトープは、アミノ酸または糖側鎖などの分子の分類であり、通常、特定の構造特性、及び特定の電荷特性を有する。単一抗原が複数のエピトープを有してよい。
【０１０６】
エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基（エピトープの免疫優性成分とも呼ばれる）、及び特異的な抗原結合ペプチドによって、効果的に遮断されるアミノ残基などの、結合に直接関与しない他のアミノ酸残基を含んでよい。換言すれば、当該アミノ酸残基は、特異的な抗原結合ペプチドのフットプリントの範疇である。
【０１０７】
エピトープは、立体構造的、または直線的のいずれでもよい。立体構造的エピトープは、空間的に並置されたアミノ酸によって、直線的ポリペプチド鎖の異なるセグメントから産生される。直線的エピトープは、ポリペプチド鎖における隣接アミノ酸残基によって産生されるものである。立体的エピトープ及び非立体的エピトープは、前者に対する結合であって、後者に対するものではない結合が、変性溶媒の存在下で消失するという点で区別されてよい。
【０１０８】
エピトープは、特有の空間的立体構造において、典型的には少なくとも３個のアミノ酸を含み、より典型的には、少なくとも５または８〜１０個のアミノ酸を含む。同一エピトープを認識する抗体は、１つの抗体が、標的抗原に対する別の抗体の結合を遮断する能力を示す単純なイムノアッセイにおいて検証でき、例えば、「ビニング（ｂｉｎｎｉｎｇ）」である。
【０１０９】
それぞれの鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を第一に担う定常領域を定義する。Ｋａｂａｔらは、重鎖及び軽鎖の可変領域の多数の一次配列を収集した。配列保存の程度に基づき、彼らは、個々の一次配列をＣＤＲ及びフレームワークへと分類し、その一覧を作った（ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｎｏ．９１−３２４２，Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．を参照のこと。参照によって、全体が組み込まれる）。
【０１１０】
イムノグロブリンのＩｇＧサブクラスでは、重鎖において、いくつかのイムノグロブリンドメインが存在する。本明細書では、「イムノグロブリン（Ｉｇ）ドメイン」は、明確に異なる三次構造を有するイムノグロブリンの領域を意味する。本発明における対象は、定常重（ＣＨ）ドメイン及びヒンジドメインを含む重鎖ドメインにある。ＩｇＧ抗体の構成では、ＩｇＧアイソタイプは、それぞれが３つのＣＨ領域を有する。したがって、ＩｇＧの構成における「ＣＨ」ドメインは、次の通りである。「ＣＨ１」は、Ｋａｂａｔにあるように、ＥＵインデックスによる位置１１８〜２２０を指し、「ＣＨ２」は、Ｋａｂａｔにあるように、ＥＵインデックスによる位置２３７〜３４０を指し、及び「ＣＨ３」は、Ｋａｂａｔにあるように、ＥＵインデックスによる位置３４１〜４４７を指す。本明細書に示され、以下に説明されるように、ｐＩ変異体は、以下に論じられる１つまたは複数のＣＨ領域、及びヒンジ領域であり得る。
【０１１１】
本明細書に示される配列は、位置１１８であるＣＨ１領域から始まり、別段の記載が無い限り、可変領域は含まれないことに留意されるべきである。例えば、配列識別番号２の第一アミノ酸は、配列一覧表で、位置「１」であると指定されるが、ＥＵ番号付けによるＣＨ１領域の位置１１８に対応する。
【０１１２】
重鎖のＩｇドメインの別の型は、ヒンジ領域である。本明細書では、「ヒンジ」または「ヒンジ領域」または「抗体ヒンジ領域」または「イムノグロブリンヒンジ領域」は、抗体の第一定常ドメイン及び第二定常ドメインの間にアミノ酸を含む可動性のポリペプチドを意味する。構造的に、ＩｇＧ  ＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置２２０で終了し、ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインは、残基ＥＵ位置２３７から始まる。したがって、本明細書では、ＩｇＧに向けて、抗体ヒンジは、位置２２１（ＩｇＧ１におけるＤ２２１）〜位置２３６（ＩｇＧ１におけるＧ２３６）を含むと定義され、番号付けは、Ｋａｂａｔにあるように、ＥＵインデックスによるものである。いくつかの実施形態では、例えば、Ｆｃ領域の構成では、下位ヒンジ（ｌｏｗｅｒ  ｈｉｎｇｅ）が含まれ、「下位ヒンジ」は、一般的に位置２２６または位置２３０を指す。本明細書に示されるとおり、ｐＩ変異体は、ヒンジ領域においても作ることができる。
【０１１３】
軽鎖は、一般に、２つのドメイン、可変軽ドメイン（Ｆｖ領域を形成する可変重ドメインと共に軽鎖ＣＤＲを含む）、及び定常軽鎖領域（ＣＬまたはＣκと呼ばれることが多い）を含む。
【０１１４】
以下に概要が記載される、追加の置換向けの別の関心領域は、Ｆｃ領域である。本明細書では、「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」は、第一定常領域イムノグロブリンドメイン、及び場合によっては、ヒンジ部分を除く抗体の定常領域を含むポリペプチドを意味する。したがって、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最後の２つの定常領域イムノグロブリンドメイン、ＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常領域イムノグロブリンドメイン、ならびにこうしたドメインに対する可動性のヒンジＮ末端を指す。ＩｇＡ及びＩｇＭ向けに、Ｆｃは、Ｊ鎖を含んでよい。ＩｇＧ向けに、Ｆｃドメインは、イムノグロブリンドメインＣγ２及びイムノグロブリンドメインＣγ３（Ｃγ２及びＣγ３）、ならびにＣγ１（Ｃγ１）及びＣγ２（Ｃγ２）の間の下位ヒンジ領域を含む。Ｆｃ領域の境界は、変わってよいが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、残基Ｃ２２６または残基Ｐ２３０をそのカルボキシ末端に含めると定義されることが通常であり、番号付けは、Ｋａｂａｔにあるように、ＥＵインデックスによるものである。いくつかの実施形態では、以下に、より完全に説明されるように、アミノ酸改変が、Ｆｃ領域に対してなされることで、例えば、１つまたは複数のＦｃγＲ受容体に対する結合、またはＦｃＲｎ受容体に対する結合が変わる。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、抗体は、全長である。本明細書では、「全長抗体」は、抗体の天然の生物学的形態を構成する構造を意味し、以下に概要が記載される１つまたは複数の改変を含む可変領域、及び定常領域を含む。
【０１１６】
あるいは、抗体は、様々な構造を含むことができ、限定はされないが、抗体断片、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、低分子化抗体（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書で「抗体模倣物」と呼ばれることがある）、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体融合体（「抗体結合体」と呼ばれることがある）、及びそれぞれの断片が、それぞれ含まれる。
【０１１７】
１つの実施形態では、抗体は、抗体断片であり、それが、ｐＩ操作などで、ヘテロ二量体を産生するように操作できる少なくとも１つの定常ドメインを含む場合に限られる。使用できる他の抗体断片には、ｐＩが操作される、本発明の１つまたは複数のＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ヒンジドメイン、及びＣＬドメインを含む断片が含まれる。例えば、Ｆｃ融合体は、Ｆｃ領域（ＣＨ２及びＣＨ３、任意選択でヒンジ領域を有する）が別のタンパク質に融合した融合体である。多くのＦｃ融合体が、当該技術分野で知られており、本発明のヘテロ二量体化変異体の追加によって改良できる。この場合、抗体融合体を、ＣＨ１と、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３と、ＣＨ２と、ＣＨ３と、ＣＨ２及びＣＨ３と、ＣＨ１及びＣＨ３と、を含めて作ることができ、それらのいずれか、またはすべてを、本明細書において説明されるヘテロ二量体化変異体のいずれかの組み合わせを利用して、任意選択でヒンジ領域を含めて作ることができる。
【０１１８】
本発明のいくつかの実施形態では、一方の単量体は、Ｆｃドメインに連結されたｓｃＦＶを含む重鎖を含み、もう一方の単量体は、Ｆｃドメインに連結されたＦａｂを含む重鎖を含む。例えば、「典型的な」重鎖、及び軽鎖である。本明細書では、「Ｆａｂ」または「Ｆａｂ領域」は、ＶＨイムノグロブリンドメイン、ＣＨ１イムノグロブリンドメイン、ＶＬイムノグロブリンドメイン、及びＣＬイムノグロブリンドメインを含むポリペプチドを意味する。Ｆａｂは、この領域を単独で指してよく、または全長抗体、抗体断片、若しくはＦａｂ融合タンパク質の構成におけるこの領域を指してよい。本明細書では、「Ｆｖ」または「Ｆｖ断片」または「Ｆｖドメイン領域」は、単一抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメインを含むポリペプチドを意味する。
【０１１９】
キメラ抗体及びヒト化抗体
いくつかの実施形態では、抗体は、異なる種由来の混合物であり得、例えば、キメラ抗体及び／またはヒト化抗体である。一般に、「キメラ抗体」及び「ヒト化抗体」の両方が、複数の種由来の領域を組み合わせる抗体を指す。例えば、「キメラ抗体」は、伝統的に、マウス（または場合によってはラット）由来の可変領域、及びヒト由来の定常領域を含む。「ヒト化抗体」は、一般に、ヒト抗体においてみられる配列と交換された可変ドメインフレームワーク領域を有する非ヒト抗体を指す。一般に、ヒト化抗体では、ＣＤＲを除き、抗体全体が、ヒト起源のポリヌクレオチドによってコードされるか、またはそのＣＤＲ内は除いて、そのような抗体と同一である。ＣＤＲのいくつか、またはすべては、非ヒト生物起源の核酸によってコードされており、抗体を創出するためにヒト抗体可変領域のβシートフレームワークへ移植され、その特異性は、移植されたＣＤＲによって決定される。そのような抗体の創出は、例えば、ＷＯ９２／１１０１８、Ｊｏｎｅｓ，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６において説明されており、これらはすべて、全体が、参照によって、組み込まれる。対応するドナー残基に対して選択されたアクセプターフレームワーク残基の「復帰突然変異（Ｂａｃｋｍｕｔａｔｉｏｎ）」が、初期移植構築物において消失した親和性を回復するために必要であることが多い（ＵＳ５５３０１０１、ＵＳ５５８５０８９、ＵＳ５６９３７６１、ＵＳ５６９３７６２、ＵＳ６１８０３７０、ＵＳ５８５９２０５、ＵＳ５８２１３３７、ＵＳ６０５４２９７、ＵＳ６４０７２１３、これらはすべて、全体が、参照によって、組み込まれる）。ヒト化抗体は、イムノグロブリンの定常領域の少なくとも一部も最適に含むであろうし、これは、典型的には、ヒトイムノグロブリンのものであることから、したがって、典型的には、ヒトＦｃ領域を含むことになる。ヒト化抗体は、遺伝学的に操作された免疫系を有するマウスを使用して生成させることもできる。Ｒｏｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：６３９−６５４の全体が、参照によって、組み込まれる。非ヒト抗体のヒト化及び再形成のための様々な技術及び方法が、当該技術分野でよく知られている（Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａ  ＆  Ｖａｓｑｕｅｚ，２００４，Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂ  Ｃｅｌｌｓ，５３３−５４５，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＳＡ）、及びそこでの引用文献参照のこと。これらはすべて、全体が、参照によって、組み込まれる）ヒト化の方法には、限定はされないが、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，ＵＳＡ  ８６：１００２９−３３、Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１０２９−１０３５、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：４２８５−９，Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７（２０）：４５９３−９、Ｇｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：４１８１−４１８５、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １１：３２１−８において説明される方法が含まれ、これらはすべて、全体が、参照によって、組み込まれる。非ヒト抗体可変領域の免疫原性を低下させるヒト化または他の方法には、例えば、Ｒｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９６９−９７３において説明されるような表面再構成法（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）が含まれ、参照によって、全体が、組み込まれる。１つの実施形態では、親抗体は、親和性が成熟しており、当該技術分野で知られるとおりである。構造に基づく方法が、ヒト化及び親和性の成熟に用いられてよく、例えば、ＵＳＳＮ１１／００４，５９０において説明されるとおりである。ヒト化及び／または抗体可変領域の親和性成熟のために、選択に基づく方法が用いられてよく、限定はされないが、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４：１５１−１６２、Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１６）：１０６７８−１０６８４、Ｒｏｓｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（３７）：２２６１１−２２６１８、Ｒａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：８９１０−８９１５、Ｋｒａｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １６（１０）：７５３−７５９において説明される方法が含まれ、これらはすべて、全体が、参照によって、組み込まれる。他のヒト化方法は、ＣＤＲの一部のみの移植を伴うものでよく、限定はされないが、ＵＳＳＮ０９／８１０，５１０、Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１１１９−１１２５、Ｄｅ  Ｐａｓｃａｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３０７６−３０８４において説明される方法が含まれ、これらはすべて、全体が、参照によって、組み込まれる。
【０１２０】
多特異性抗体構築物
当業者によって理解され、以下により完全に論じられるように、本発明のヘテロ二量体融合タンパク質は、多岐にわたる立体配置をとり、好ましい実施形態は、図Ｂに「三重Ｆ」構築物として示されるものである。
【０１２１】
ヘテロ二量体重鎖定常領域
したがって、本発明は、第一ドメインとして変異体重鎖構築物領域を含む単量体の使用に基づく二量体タンパク質を提供する。本明細書では、「単量体」は、ヘテロ二量体タンパク質の半分を意味する。伝統的な抗体は、実際は、四量体（２つの重鎖、及び２つの軽鎖）であることに留意されるべきである。本発明の構成においては、重鎖−軽鎖の１つの対（適用可能な場合であり、例えば、単量体がＦａｂを含む場合）は、「単量体」であると考えられる。同様に、ｓｃＦｖを含む重鎖領域は、単量体であると考えられる。本質的に、それぞれの単量体は、ヘテロ二量体化操作を可能にするために十分な重鎖定常領域を含み、それが、定常領域のすべてであるか、例えば、Ｃｈ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、Ｆｃ領域（ＣＨ２−ＣＨ３）、またはＣＨ３ドメインのみであるかは、問わない。
【０１２２】
変異体重鎖定常領域は、重鎖定常領域のすべて、または一部を含むことができ、全長構築物、ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、またはその部分が含まれ、その部分には、例えば、ＣＨ２−ＣＨ３またはＣＨ３単独が含まれる。さらに、それぞれの単量体の重鎖領域は、同一主鎖（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３若しくはＣＨ２−ＣＨ３）であるか、または異なり得る。Ｎ末端及びＣ末端の短縮化及び追加も定義に含まれ、例えば、ｐＩ変異体によっては、重鎖ドメインのＣ末端への荷電アミノ酸の追加を含む。
【０１２３】
したがって、一般に、本発明の「三重Ｆ」構築物の一方の単量体は、ｓｃＦｖ領域−ヒンジ−Ｆｃドメイン）であり、もう一方は、（ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３と、関連軽鎖）であって、ヘテロ二量体化変異体を有し、当該ヘテロ二量体化変異体には、立体変異体及びｐＩ変異体、Ｆｃ変異体及びＦｃＲｎ変異体、ならびにこうした領域に含まれる追加の抗原結合ドメイン（任意選択のリンカーを有する）が含まれる。
【０１２４】
本明細書に概要が記載されるヘテロ二量体化変異体（例えば、立体変異体及びｐＩ変異体）に加えて、重鎖領域は、追加のアミノ酸置換も含んでよく、以下に論じられるＦｃγＲ結合及びＦｃＲｎ結合を変えるための変更が含まれる。
【０１２５】
さらに、単量体によっては、「ボトルオープナー」のｓｃＦｖ部分のためのリンカーを利用できる。三重Ｆ形式では、１つの荷電ｓｃＦｖリンカーを使用する。本明細書に示されるとおり、標的抗原向けｓｃＦｖの固有ｐＩ、及びもう一方の標的抗原のＦａｂの固有ｐＩによって、荷電ｓｃＦｖリンカーは、正または負のいずれかであり得る。二重ｓｃＦｖ形式では、単一荷電ｓｃＦｖリンカーのいずれかが、１つの単量体（再度記載するが、正または負のいずれかである）または両方の単量体（１つが正であり、１つが負である）に使用される。この実施形態では、２つのリンカーのそれぞれの電荷は、同一である必要はない（例えば、一方は、＋３であり、もう一方は、−４等である）。
【０１２６】
１つの実施形態では、ｓｃＦｖが、抗ＣＤ３抗原結合部位であり、正に荷電したｓｃＦｖリンカーを含む。あるいは、「ボトルオープナー」構築物のｓｃＦｖが、抗ＣＤ３８抗原結合部位であり得る。
【０１２７】
ヘテロ二量体化変異体は、多くの異なる型の変異体を含み、限定はされないが、立体変異体（電荷変異体を含む）、及びｐＩ変異体が含まれ、任意選択かつ独立して何らかの他の変異体と組み合わせることができる。こうした実施形態では、「単量体Ａ」と、「単量体Ｂ」とを適合させることが重要であり、すなわち、ヘテロ二量体タンパク質が、立体変異体及びｐＩ変異体の両方に依存するのであれば、これらは、それぞれの単量体に正しく適合する必要がある。例えば、それぞれの単量体に存在する変異体が設計され、所望の機能が達成されるように、機能する立体変異体のセット（１つのセットは、単量体Ａに存在し、１つのセットは単量体Ｂに存在する）が、ｐＩ変異体のセット（１つのセットは、単量体Ａに存在し、１つのセットは単量体Ｂに存在する）と組み合わせられる。立体変異体が、電荷も変え得る例では、正しいセットを、正しい単量体に適合させる必要がある。
【０１２８】
本明細書に概要が記載されるヘテロ二量体化変異体（例えば、限定はされないが、図に示されるそうした変異体を含む）は、何らかの他の変異体と任意選択かつ独立に組み合わせることができ、及び何らかの他の単量体に任意選択かつ独立に存在し得ることに留意することが重要である。したがって、例えば、１つの図に由来の、単量体１向けのｐＩ変異体を、異なる図にある、単量体１向けの他のヘテロ二量体化変異体に追加することができ、または単量体２から追加することができる。すなわち、ヘテロ二量体化に重要なことは、１つのセットは、一方の単量体向けであり、１つのセットは、もう一方の単量体向けである、変異体の「セット」が存在するということである。それらは、図１のものから図１のものへ組み合わされる（例えば、単量体１の一覧にあるものは、共に機能する）か、または交換される（単量体１のｐＩ変異体が、単量体２の立体変異体と）かは、重要ではない。しかしながら、本明細書に示されるとおり、上に概要を記載したように組み合わせが作られるとき、「鎖性」は、維持されるべきであり、その結果、好ましいヘテロ二量体化が起こる。例えば、ｐＩを上昇させる電荷変異体は、ｐＩが上昇した変異体、及び／または上昇ｐＩを有するｓｃＦｖリンカー等と共に使用されるべきである。さらに、追加のＦｃ変異体向けに（ＦｃγＲ結合、ＦｃＲｎ結合、消去変異体等向けなど）、どちらかの単量体、または両単量体が、記載した変異体のいずれかを独立かつ任意選択で含むことができる。いくつかの場合では、両単量体が、追加の変異体を有し、いくつかの場合では、１つの単量体のみが、追加の変異体を有するか、またはそれらを組み合わせることができる。
【０１２９】
ヘテロ二量体化変異体
本発明は、例えば、図８Ｂに示される「三重Ｆ」骨格または「ボトルオープナー」骨格の多特異性抗体形式を提供する。
【０１３０】
立体変異体
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体の形成は、立体変異体の追加によって促進され得る。すなわち、それぞれの重鎖におけるアミノ酸を変更することによって、同一Ｆｃアミノ酸配列を有するホモ二量体の形成と比較して、異なる重鎖が、会合してヘテロ二量体構造を形成する可能性が高くなる。適した立体変異体は、図に示される。
【０１３１】
１つの機構は、当該技術分野において、「ノブアンドホール」と一般に呼ばれるものであり、立体的な影響を創出し、ヘテロ二量体形成に有利に働き、ホモ二量体形成を抑制するアミノ酸操作を指し、任意選択で使用することもできる。これは、「ノブアンドホール」と呼ばれることがあり、ＵＳＳＮ６１／５９６，８４６，Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９（７）：６１７（１９９６）、Ａｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７  ２７０：２６、米国特許第８，２１６，８０５号において説明されるとおりであり、これらはすべて、全体が、参照によって、本明細書に組み込まれる。図４及び図５は、以下にさらに説明され、それによって、「ノブアンドホール」に依存する多くの「単量体Ａ−単量体Ｂ」の対が明らかとなる。さらに、Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：６７７（１９９８）において説明されるとおり、こうした「ノブアンドホール」変異は、ジスルフィド結合と組み合わせて、形成をヘテロ二量体化へと歪曲することができる。
【０１３２】
ヘテロ二量体の生成において有用である追加の機構は、「静電操縦」と呼ばれることがあり、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５（２５）：１９６３７（２０１０）において説明されるとおりである。当該文献は、参照によって、その全体が、本明細書に組み込まれる。これは、本明細書で「電荷対」と呼ばれることがある。この実施形態では、静電気が、形成をヘテロ二量体化へと歪曲するために使用される。当業者であれば、これらは、ｐＩに対しても効果を有し得、そうすることで、精製に対しても影響を有し得、したがって、場合によっては、ｐＩ変異体であり得るとも考えられることを理解されるであろう。しかしながら、これらは、ヘテロ二量体化を押し進めるために生成され、精製手段としては使用されなかったため、それらは、「立体変異体」として分類される。これらには、限定はされないが、Ｄ２２１Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対であるＤ２２１Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／Ｌ３６８Ｅ（例えば、これらは、「単量体が対応するセットである）及びＣ２２０Ｒ／Ｅ２２４Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対であるＣ２２０Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／３６８Ｅなどの、図中の、７５％を超えるヘテロ二量体化をもたらす変異体が含まれる。
【０１３３】
追加の単量体Ａ変異体、及び単量体Ｂ変異体を、本明細書に概要が記載されるｐＩ変異体または、ＵＳ２０１２／０１４９８７６の図３７に示される他の立体変異体などの他の変異体と、任意選択かつ独立して、何らかの量で、組み合わせることができる。当該特許文献の図及び説明文が、参照によって、本明細書に明確に組み込まれる。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、本明細書に概要が記載される立体変異体を、ｐＩ変異体（またはＦｃ変異体、ＦｃＲｎ変異体、消去変異体等の他の変異体）を含む何らかのヘテロ二量体化変異体と共に１つまたは両方の単量体へ、任意選択かつ独立して、組み込むことができる。
【０１３５】
ヘテロ二量体向けのｐＩ（等電点）変異体
一般に、当業者によって理解されるように、ｐＩ変異体には２つの一般的なカテゴリーが存在する。タンパク質のｐＩを増加させるもの（塩基性の変更）、及びタンパク質のｐＩを減少させるもの（酸性の変更）である。本明細書に説明されるとおり、こうした変異体の組み合わせは、すべて実施することが可能である。すなわち、一方の単量体が、野生型、または野生型と顕著に異なるｐＩを示さない変異体であり得、もう一方は、より塩基性、またはより酸性であり得る。あるいは、それぞれの単量体が、１つは、より塩基性へ、１つは、より酸性へと変更される。
【０１３６】
ｐＩ変異体の好ましい組み合わせは図に示される。
【０１３７】
重鎖酸性ｐＩの変更
したがって、変異体重鎖定常ドメインを含む１つの単量体が、より正に（例えば、ｐＩの低下）作られることになるとき、次の置換の１つまたは複数を作ることができる。すなわち、Ｓ１１９Ｅ、Ｋ１３３Ｅ、Ｋ１３３Ｑ、Ｔ１６４Ｅ、Ｋ２０５Ｅ、Ｋ２０５Ｑ、Ｎ２０８Ｄ、Ｋ２１０Ｅ、Ｋ２１０Ｑ、Ｋ２７４Ｅ、Ｋ３２０Ｅ、Ｋ３２２Ｅ、Ｋ３２６Ｅ、Ｋ３３４Ｅ、Ｒ３５５Ｅ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ４４７の欠失、Ｃ末端におけるペプチドＤＥＤＥの追加、Ｇ１３７Ｅ、Ｎ２０３Ｄ、Ｋ２７４Ｑ、Ｒ３５５Ｑ、Ｋ３９２Ｎ、及びＱ４１９Ｅである。本明細書に概要が記載され、図に示されるとおり、こうした変更は、ＩｇＧ１に対して示されるが、すべてのアイソタイプ及びアイソタイプハイブリッドを、このように変えることができる。
【０１３８】
重鎖定常ドメインが、ＩｇＧ２〜４由来である場合は、Ｒ１３３Ｅ及びＲ１３３Ｑも使用できる。
【０１３９】
塩基性ｐＩの変更
したがって、変異体重鎖定常ドメインを含む１つの単量体が、より負に（例えば、ｐＩの増加）作られることになるとき、次の置換の１つまたは複数を作ることができる。すなわち、Ｑ１９６Ｋ、Ｐ２１７Ｒ、Ｐ２２８Ｒ、Ｎ２７６Ｋ、及びＨ４３５Ｒである。本明細書に概要が記載され、図に示されるとおり、こうした変更は、ＩｇＧ１に対して示されるが、すべてのアイソタイプ及びアイソタイプハイブリッドを、このように変えることができる。
【０１４０】
抗体ヘテロ二量体軽鎖変異体
抗体に基づくヘテロ二量体の場合で、例えば、単量体の少なくとも１つが、重鎖ドメインに加えて軽鎖を含む場合、ｐＩ変異体を軽鎖に作ることもできる。軽鎖のｐＩを低下させるためのアミノ酸置換には、限定はされないが、Ｋ１２６Ｅ、Ｋ１２６Ｑ、Ｋ１４５Ｅ、Ｋ１４５Ｑ、Ｎ１５２Ｄ、Ｓ１５６Ｅ、Ｋ１６９Ｅ、Ｓ２０２Ｅ、Ｋ２０７Ｅ、及び軽鎖のＣ末端におけるペプチドＤＥＤＥの追加が含まれる。定常ラムダ軽鎖に基づくこのカテゴリーにおける変更には、Ｒ１０８Ｑ、Ｑ１２４Ｅ、Ｋ１２６Ｑ、Ｎ１３８Ｄ、Ｋ１４５Ｔ、及びＱ１９９Ｅでの１つまたは複数の置換が含まれる。さらに、軽鎖のｐＩの増加も可能である。
【０１４１】
アイソタイプ変異体
さらに、本発明の多くの実施形態が、１つのＩｇＧアイソタイプから別のものへの、特定位置でのｐＩアミノ酸の「取り込み」に依存しており、したがって、変異体へ導入される不要な免疫原性の可能性を低下または除去している。すなわち、ＩｇＧ１は、高いエフェクター機能を含めて、様々な理由で、治療用抗体のための共通のアイソタイプである。しかしながら、ＩｇＧ１の重定常領域は、ＩｇＧ２のそれと比較して、より高いｐＩを有している（８．１０対７．３１）。特定位置で、ＩｇＧ２残基を、ＩｇＧ１主鎖へ導入することによって、得られる単量体のｐＩは低下（または増加）し、付加的に血清半減期の長期化を示す。例えば、ＩｇＧ１は、位置１３７にグリシン（ｐＩ５．９７）を有し、ＩｇＧ２は、グルタミン酸（ｐＩ３．２２）を有している。つまり、グルタミン酸の取り込みは、得られるタンパク質のｐＩに影響を与えることになる。以下に説明されるとおり、多くのアミノ酸置換は、一般に、変異体抗体のｐＩに顕著な影響を与えることが必要とされている。しかしながら、以下に論じられるとおり、ＩｇＧ２分子における変更でさえ、血清半減期の増加を可能にすることに留意されるべきである。
【０１４２】
他の実施形態では、非アイソタイプアミノ酸の変更がなされ、得られるタンパク質の全体の電荷状態が低下（例えば、より高いｐＩアミノ酸を、より低いｐＩアミノ酸へと変更することによって）するか、または安定に向けた構造の適応が可能になる等、以下にさらに説明されるとおりである。
【０１４３】
さらに、重定常ドメイン及び軽定常ドメインの両方のｐＩ操作によって、ヘテロ二量体のそれぞれの単量体において、顕著な変化をみることができる。本明細書で論じられるように、２つの単量体のｐＩを少なくとも０．５異なるようにすることで、イオン交換クロマトグラフィー若しくは等電点電気泳動、または等電点感受性の他の方法によっての分離が可能になる。
【０１４４】
等比体積変異体
さらに、図４７に示すとおり、等比体積であるｐＩ変異体、例えば、親アミノ酸とほぼ同一サイズである電荷変異体を作ることができる。
【０１４５】
ｐＩの計算
それぞれの単量体のｐＩは、変異体重鎖定常ドメイン及び融合相手を含めて、可変重鎖定常領域及び総単量体のｐＩに依存し得る。したがって、いくつかの実施形態では、図中のチャートを使用して、変異体重鎖定常ドメインに基づいて、ｐＩの変化が計算される。あるいは、それぞれの単量体のｐＩを、比較することができる。同様に、「出発」可変領域（例えば、ｓｃＦｖまたはＦａｂのいずれか）のｐＩを計算することで、どの単量体が、どの方向に操作されることになるかの情報が得られる。
【０１４６】
より良いＦｃＲｎの生体内結合も与えるｐＩ変異体
ｐＩ変異体が、単量体のｐＩを低減する場合、生体内での血清における保持の改善という利点が追加され得る。
【０１４７】
未だ試験中であるが、Ｆｃ領域は、生体内においてより長い半減期を有すると考えられ、これは、エンドソームにおける、ｐＨ６でのＦｃＲｎに対する結合が、Ｆｃを隔離するためである（Ｇｈｅｔｉｅ  ａｎｄ  Ｗａｒｄ，１９９７  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ．１８（１２）：５９２−５９８の全体が、参照によって組み込まれる）。その後、エンドソームの区画は、細胞表面へとＦｃを再循環させる。区画が、より高いｐＨである約７．４の細胞外空間へと一旦開くと、Ｆｃの放出が誘導され、血液へ戻る。マウスにおいて、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａらは、ｐＨ６及びｐＨ７．４でのＦｃＲｎ結合が増加したＦｃ変異型（Ｆｃ  ｍｕｔａｎｔ）が、実際は、血清濃度が低下しており、野生型Ｆｃと同一の半減期を有することを示した（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：５１７１−５１８０の全体が、参照によって、組み込まれる）。ｐＨ７．４でのＦｃＲｎに向けたＦｃの親和性の上昇は、Ｆｃが放出されて血流へ戻ることを妨げると考えられる。それ故に、生体内におけるＦｃの半減期を増加させるであろうＦｃ変異は、より高いｐＨでのＦｃの放出を、可能なままにしつつ、より低いｐＨでＦｃＲｎ結合を理想的に増加させることになる。アミノ酸であるヒスチジンは、６．０〜７．４のｐＨ範囲において、その電荷状態が変化する。したがって、ヒスチジン残基が、Ｆｃ／ＦｃＲｎ複合体において、重要な位置を占めるという発見は、驚くべきことではない。
【０１４８】
最近、より低い等電点を有する可変領域を有する抗体が、より長い血清半減期も有し得ることが示唆された（Ｉｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  ＰＥＤＳ．２３（５）：３８５−３９２の全体が、参照によって、組み込まれる）。しかしながら、この機構の理解は、依然として不十分である。その上、可変領域は、抗体毎に異なる。ｐＩが低下、及び半減期が延長している定常領域変異体であれば、抗体の薬物動態特性の改善に対する、よりモジュール型の手法を提供するであろうことは、本明細書で説明されるとおりである。
【０１４９】
この実施形態において有用なｐＩ変異体、及び精製の最適化にむけたその使用は、図に開示される。
【０１５０】
変異体の組み合わせ
当業者によって理解されるように、その「鎖性」または「単量体区分（ｍｏｎｏｍｅｒ  ｐａｒｔｉｔｉｏｎ）」が保持される限り、繰り返し記載されているヘテロ二量体化変異体はすべて、任意選択かつ独立に、何らかの方法で組み合わせることができる。さらに、こうした変異体はすべて、ヘテロ二量体化形式のいずれかに組み入れることができる。
【０１５１】
ｐＩ変異体の場合、特定用途に有用な実施形態は、図に示されているが、精製の容易化のために２つの単量体間のｐＩ差異を変える基礎的な規則に従って、他の組み合わせを生成できる。
【０１５２】
本発明の抗体は、一般に、単離されているか、または組換え体である。「単離された」
が、本明細書に開示される様々なポリペプチドについての説明に使用されるとき、それが発現される細胞または細胞培養から、同定され、分離され、及び／または回収されたポリペプチドを意味する。通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製段階によって調製されることになる。「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す。
【０１５３】
「特異的結合（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ）」、または特定の抗原若しくはエピトープ「に特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｂｉｎｄ  ｔｏ）」、または特定の抗原若しくはエピトープ「に向けて特異的（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ）」は、非特異的相互作用とは、測定可能な程に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般に、結合活性を有さない類似構造の分子である対照分子の結合と比較した分子の結合を決定することによって、測定できる。例えば、特異的結合は、標的に類似した対照分子との競合によって決定できる。
【０１５４】
特定の抗原またはエピトープに向けた特異的結合は、例えば、抗原またはエピトープに向けて、抗体が、少なくとも約１０〜４ＭのＫＤ、少なくとも約１０〜５ＭのＫＤ、少なくとも約１０〜６ＭのＫＤ、少なくとも約１０〜７ＭのＫＤ、少なくとも約１０〜８ＭのＫＤ、少なくとも約１０〜９ＭのＫＤ、あるいは、少なくとも約１０〜１０ＭのＫＤ、少なくとも約１０〜１１ＭのＫＤ、少なくとも約１０〜１２ＭのＫＤ、またはそれより高いＫＤを有することによって示すことができ、ＫＤは、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指す。典型的には、抗原に特異的に結合する抗体であれば、抗原またはエピトープに対して、対照分子が、２０倍〜、５０倍〜、１００倍〜、５００倍〜、１０００倍〜、５，０００倍〜、１０，０００倍〜、またはこれらを上回る倍数のＫＤを有することになる。
【０１５５】
また、特定の抗原またはエピトープに向けた特異的結合は、例えば、対照に対して、抗体が、そのエピトープに向けて、少なくとも２０倍〜、５０倍〜、１００倍〜、５００倍〜、１０００倍〜、５，０００倍〜、１０，０００倍〜、またはこれらを上回る倍数の、抗原またはエピトープに向けたＫＡまたはＫａを有することによって示すことができ、ＫＡまたはＫａは、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を指す。
【０１５６】
改変抗体
上に概要を記載した改変に加えて、他の改変を作ることが可能である。例えば、ＶＨドメイン及びＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋の組み込みによって分子を安定;化してよい（Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：１２３９−１２４５の全体が、参照によって、組み込まれる）。さらに、抗体の様々な共有結合性改変が存在し、以下に概要が記載されるように作ることができる。
【０１５７】
抗体の共有結合性改変は、本発明の範囲内に含まれ、常にではないが、一般に、翻訳後修飾によってなされる。例えば、抗体の共有結合性改変のいくつかの型は、選択される側鎖またはＮ末端残基若しくはＣ末端残基と反応が可能な有機誘導体化物質で、抗体の特定アミノ酸残基を反応させることによって、分子へ導入される。
【０１５８】
システイニル残基は、クロロ酢酸またはクロロアセトアミドなどのα−ハロアセテート（及び対応するアミン）と反応させることが最も一般的であり、カルボキシメチル誘導体またはカルボキシアミドメチル誘導体が得られる。システイニル残基は、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルリン酸、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ安息香酸水銀、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール、及び同様のものとの反応によって誘導体化してもよい。
【０１５９】
さらに、システインにおける改変は、抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）の適用において特に有用であり、以下にさらに説明される。いくつかの実施形態では、抗体の定常領域を操作して、薬物部分の、より特異的かつ制御された設置が可能になるように、具体的には、「チオール反応性」である１つまたは複数のシステインを含めることができる。例えば、米国特許第７，５２１，５４１号を参照のこと。当該特許文献は、その全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１６０】
ヒスチジル残基は、ｐＨ５．５〜７．０でのジエチルピロカルボネートとの反応によって誘導体化される。これは、この物質が、ヒスチジル側鎖に相対的に特異的であるためである。パラ−ブロモフェナシルブロミドも有用であり、反応は、ｐＨ６．０で、０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム中で実施することが好ましい。
【０１６１】
リジニル残基、及びアミノ末端残基は、コハク酸または他のカルボン酸の無水物と反応する。こうした物質での誘導体化は、リジニル残基の電荷を逆転する効果を有する。アルファアミノ含有残基の誘導体化に適した他の試薬には、ピコリンイミド酸メチルなどのイミドエステル、ピリドキサールリン酸、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオン、及びトランスアミナーゼが触媒するグリオキシル酸との反応が含まれる。
【０１６２】
アルギニル残基は、１つまたはいくつかの通常の試薬との反応によって改変され、それらの中には、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、及びニンヒドリンがある。グアニジン官能基のｐＫａが高いため、アルギニン残基の誘導体化は、アルカリ条件においてその反応を実施する必要がある。さらに、こうした試薬は、リジンの基、及びアルギニンのイプシロンアミノ基と反応させてもよい。
【０１６３】
芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応による、チロシル残基へのスペクトル標識導入に特定の関心を有して、チロシル残基の特異的改変をしてよい。最も一般には、Ｎ−アセチルイミジゾール（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｉｍｉｄｉｚｏｌｅ）及びテトラニトロメタンが使用され、Ｏ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体がそれぞれ形成される。チロシル残基を、１２５Ｉまたは１３１Ｉを使用してヨウ素化することで、ラジオイムノアッセイでの使用に向けた標識タンパク質が調製され、これには、上に説明したクロラミンＴ法が適している。
【０１６４】
カルボキシ側基（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−−Ｒ’）との反応によって、選択的に改変され、Ｒ及びＲ’は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルフェニル）カルボジイミドなどの任意選択で異なるアルキル基である。さらに、アスパルチル残基及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によって、アスパラギニル残基及びグルタミニル残基に変換される。
【０１６５】
二機能性物質での誘導体化は、以下に説明される方法に加えて様々な方法における使用に向けて、水不溶性の支持マトリックスまたは支持表面に、抗体を架橋するために有用である。一般に使用される架橋物質には、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオン酸）などのジスクシンイミジルエステルを含むホモ二機能性イミドエステル、及びビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二機能性マレイミドが含まれる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの誘導体化物質は、光の存在下で架橋形成が可能である光励起性中間体をもたらす。あるいは、サイノモルガソジェン（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓｏｇｅｎ）ブロミドで活性化された糖質、ならびにすべて全体が、参照によって組み込まれる米国特許第３，９６９，２８７号、第３，６９１，０１６号、第４，１９５，１２８号、第４，２４７，６４２号、第４，２２９，５３７号、及び第４，３３０，４４０号において説明される反応性基質などの反応性の水不溶マトリックスが、タンパク質の固定化に用いられる。当該特許文献はすべて、全体が、参照によって組み込まれる。
【０１６６】
グルタミニル残基及びアスパラギニル残基は、対応するグルタミル残基及びアスパルチル残基へとそれぞれ脱アミノ化されることが多い。あるいは、こうした残基は、穏やかな酸性条件下で脱アミノ化される。こうした残基のいずれの形態も、本発明の範囲内に入る。
【０１６７】
他の改変には、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル残基またはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６［１９８３］の全体が、参照によって組み込まれる）、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び何らかのＣ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。
【０１６８】
さらに、当業者によって理解されるように、標識（蛍光、酵素、磁気、放射性等を含む、はすべて、抗体（及び本発明のその他の組成物）に追加することができる。
【０１６９】
グリコシル化
共有結合性改変の別の型は、グリコシル化の変更である。別の実施形態では、本明細書に開示される抗体は、１つまたは複数の操作されたグリコフォームを含むように改変できる。本明細書では、「操作されたグリコフォーム」は、抗体に共有結合された糖質組成物を意味し、当該糖質組成物は、親抗体のそれとは、化学的に異なる。操作されたグリコフォームは、様々な目的に向けて有用であり得、限定はされないが、当該目的には、エフェクター機能の増進または低下が含まれる。操作されたグリコフォームの好ましい形態は、無フコシル化（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）であり、無フコシル化は、ＡＤＣＣ機能の増加と相関していることが示されており、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体に対する、より堅固な結合を介していると推定される。この構成では、「無フコシル化」は、宿主細胞において産生される抗体の大部分が、フコースを実質的に欠いていることを意味し、例えば、生成する抗体の９０〜９５〜９８％が、抗体の糖質部分の成分（一般に、Ｆｃ領域におけるＮ２９７に付加される）として検知可能なフコースを有さない。無フコシル化抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体に対して、一般に、少なくとも５０％、またはそれより高い親和性を示すと、機能的に定義される。
【０１７０】
操作されたグリコフォームは、当該技術分野において知られる様々な方法によって生成されてよい（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７：１７６−１８０、Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ７４：２８８−２９４、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：２６７３３−２６７４０、Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：３４６６−３４７３、ＵＳ６，６０２，６８４、ＵＳＳＮ１０／２７７，３７０、ＵＳＳＮ１０／１１３，９２９、ＰＣＴ  ＷＯ００／６１７３９Ａ１、ＰＣＴ  ＷＯ０１／２９２４６Ａ１、ＰＣＴ  ＷＯ０２／３１１４０Ａ１、ＰＣＴ  ＷＯ０２／３０９５４Ａ１。これらはすべて、全体が、参照によって、組み込まれる。（Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）技術［Ｂｉｏｗａ，Ｉｎｃ．，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ］、ＧｌｙｃｏＭＡｂ（登録商標）グリコシル化操作技術［Ｇｌｙｃａｒｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＡＧ，Ｚｕｅｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ］）。こうした技術の多くが、Ｆｃ領域に共有結合したフコシル化オリゴ糖及び／または二分岐（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）オリゴ糖の水準を制御することに基づいており、これは、例えば、ＩｇＧを、操作された様々な生物、若しくは操作された細胞株において発現することによってなされ、またはそうでなければ、（例えばＬｅｃ−１３  ＣＨＯ細胞、若しくはラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞において、グリコシル化経路に関与する酵素（例えば、ＦＵＴ８［α１，６−フコシルトランスフェラーゼ］及び／若しくはβ１，４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ［ＧｎＴＩＩＩ］）を制御することによってなされ、またはＩｇＧが発現された後に糖質を改変することによってなされる。例えば、生成の間、フコシル化を阻害する改変された糖類を添加することによるＳｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ機能の「糖操作された抗体」または「ＳＥＡ技術」である。例えば、２００９０３１７８６９を参照のこと。これにより、その全体が、参照によって、組み込まれる。操作されたグリコフォームは、典型的には、異なる糖質またはオリゴ糖を指し、したがって、抗体は、操作されたグリコフォームを含むことができる。
【０１７１】
あるいは、操作されたグリコフォームは、異なる糖質またはオリゴ糖を含むＩｇＧ変異体を指してよい。当該技術分野で知られるように、グリコシル化パターンは、タンパク質の配列（例えば、特定のグリコシル化アミノ酸残基の存在の有無であり、以下に論じられる）、またはタンパク質が産生される宿主細胞若しくは生物の両方に依存し得る。特定の発現系が、以下に論じられる。
【０１７２】
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ−結合型またはＯ−結合型のいずれかである。Ｎ−結合型は、アスパラギン残基の側鎖に対する糖質部分の付加を指す。トリペプチド配列である、アスパラギン−Ｘ−セリン、及びアスパラギン−Ｘ−スレオニンは、アスパラギン側鎖に対する糖質部分の酵素による付加のための認識配列であり、Ｘは、プロリンを除く、何らかのアミノ酸である。したがって、ポリペプチドにおけるこうしたトリペプチド配列のいずれかが存在すれば、潜在的なグリコシル化部位が創出される。Ｏ結合型グリコシル化は、糖であるＮ−アセチルグルコサミン、ガラクトース、またはキシロースの内の１つの、ヒドロキシアミノ酸に対する付加を指し、ヒドロキシアミノ酸は、最も一般には、セリンまたはスレオニンであるが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシセリンが使用されてもよい。
【０１７３】
抗体に対するグリコシル化部位の追加は、アミノ酸配列を変えることによって簡便に達成され、その結果、抗体は、１つまたは複数の上に説明したトリペプチド配列を含む（Ｎ結合型グリコシル化部位向け）。変更は、出発配列に対して１つまたは複数のセリン残基またはスレオニン残基の追加、またはそれらによる置換によってなされてもよい（Ｏ結合型グリコシル化部位向け）。簡便には、抗体のアミノ酸配列は、ＤＮＡレベルでの変更を介して変えることが望ましく、具体的には、事前選択された塩基で、標的ポリペプチドをコードするＤＮＡを変異させることよってなされ、その結果、所望のアミノ酸へと翻訳されることになるコドンが生成される。
【０１７４】
抗体上の糖質部分の数を増加させる別の手段は、グリコシドをタンパク質へ、化学的または酵素的にカップリングすることによるものである。ＮまたはＯ結合型グリコシル化のグリコシル化能力を有する宿主細胞においてタンパク質を生成させる必要が無い点で、こうした手順は、有利である。使用するカップリングの様式によって、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインのものなどの遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、スレオニン、若しくはヒドロキシプロリンのものなどの遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、若しくはトリプトファンのものなどの芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に糖を付加してよい。こうした方法は、ＷＯ８７／０５３３０、及びＡｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｒｉｓｔｏｎ，１９８１，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６において説明されており、両方の全体が、参照によって組み込まれる。
【０１７５】
出発抗体上に存在する糖質部分（例えば、翻訳後修飾によって）の除去は、化学的または酵素的に達成されてよい。化学的脱グリコシル化には、化合物であるトリフルオロメタンスルホン酸または相当する化合物に対して、タンパク質を暴露する必要がある。この処理は、連結糖（ｌｉｎｋｉｎｇ  ｓｕｇａｒ）（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除く大部分またはすべての糖の開裂をもたらす一方で、ポリペプチドはそのままで残る。化学的脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２、及びＥｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１によって説明されており、両方の全体が、参照によって、組み込まれる。ポリペプチド上の糖質部分の酵素的開裂は、様々なエンド−グリコシダーゼ及びエキソ−グリコシダーゼを使用することによって達成でき、全体が、参照によって、組み込まれるＴｈｏｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０によって説明されるとおりである。潜在的グリコシル化部位でのグリコシル化は、化合物であるツニカマイシンの使用によって阻止されてよく、全体が、参照によって組み込まれるＤｕｓｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：３１０５によって説明されるとおりである。ツニカマイシンは、タンパク質−Ｎ−グリコシド結合の形成を遮断する。
【０１７６】
抗体の共有結合性改変の別の型は、様々な非タンパク質性の重合体に対する抗体の連結を含み、非タンパク質性の重合体には、限定はされないが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキアルキレンなどの様々なポリオールが含まれ、例えば、Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓの２００５−２００６ＰＥＧカタログ（Ｎｅｋｔａｒのウェブサイトで入手可能）、全体が、参照によって組み込まれる米国特許第４，６４０，８３５号、第４，４９６，６８９号、第４，３０１，１４４号、第４，６７０，４１７号、第４，７９１，１９２号、または第４，１７９，３３７号に示される様式においてなされる。さらに、当該技術分野で知られるように、ＰＥＧなどの重合体の追加を容易にするために、アミノ酸置換を、抗体内の様々な位置において作ってよい。例えば、参照によって、全体が本明細書に組み込まれる米国公開第２００５／０１１４０３７Ａ１号参照のこと。
【０１７７】
追加の機能性に向けた追加のＦｃ変異体
ｐＩアミノ酸変異体に加えて、様々な理由から実施することのできる、有用なＦｃアミノ酸改変が多く存在し、限定はされないが、１つまたは複数のＦｃγＲ受容体に対する結合の変更、ＦｃＲｎ受容体に対する結合の変更等が含まれる。
【０１７８】
したがって、本発明のタンパク質は、アミノ酸改変を含むことができ、アミノ酸改変には、ｐＩ変異体を含めて、本明細書に概要が記載されるヘテロ二量体化変異体が含まれる。
【０１７９】
ＦｃγＲ変異体
したがって、１つまたは複数のＦｃγＲ受容体に対する結合を変えるために作ることのできる有用なＦｃ置換が多く存在する。結合の増加、及び結合の減少をもたらす置換が有用であり得る。例えば、Ｆｃ  ＲＩＩＩａに対する結合の増加は、一般に、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害。これは、細胞が媒介する反応であって、ＦｃγＲを発現している、非特異性である細胞傷害性の細胞が、標的細胞上に結合した抗体を認識し、その後に標的細胞の溶解を引き起こす反応である）の増加をもたらすことが知られている。同様に、ＦｃγＲＩＩｂ（抑制性受容体）に対する結合の減少も、状況によっては、有益であり得る。本発明において有用であるアミノ酸置換には、ＵＳＳＮ１１／１２４，６２０（特に図４１）、ＵＳＳＮ１１／１７４，２８７、ＵＳＳＮ１１／３９６，４９５、ＵＳＳＮ１１／５３８，４０６において記載されるものが含まれ、これらはすべて、全体が、参照によって、明確に本明細書に組み込まれ、特に、そこで開示される変異体に向けて組み込まれる。有用な特定の変異体には、限定はされないが、２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、３３２Ｅ、３３２Ｄ、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、３２８Ｆ、２６７Ｅ／３２８Ｆ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／３３０Ｙ、２３９Ｄ、３３２Ｅ／３３０Ｌ、及び２９９Ｔが含まれる。
【０１８０】
さらに、ＦｃＲｎ受容体に対する結合増加、及び血清半減期の増加において有用な追加のＦｃ置換が存在し、全体が、参照によって組み込まれるＵＳＳＮ１２／３４１，７６９において具体的に開示されるとおりであって、限定はされないが、４３４Ｓ、４２８Ｌ、３０８Ｆ、２５９Ｉ、４２８Ｌ／４３４Ｓ、２５９Ｉ／３０８Ｆ、４３６Ｉ／４２８Ｌ、４３６ＩまたはＶ／４３４Ｓ、４３６Ｖ／４２８Ｌ、及び２５９Ｉ／３０８Ｆ／４２８Ｌが含まれる。
【０１８１】
Ｆｃ消去変異体
本発明において有用な追加の変異体は、Ｆｃγ受容体に対する結合を消去（例えば、低下または排除）するものである。これは、本発明のヘテロ二量体抗体作用の潜在的機構を低下させる（例えば、ＡＤＣＣ活性の低下）ために望ましくあり得る。多くの適したＦｃ消去変異体が、図３５に示されており、それらを、ｐＩ変異体及び立体変異体を含む何らかの他のヘテロ二量体化変異体と、任意選択かつ独立して組み合わせて含める、または除外することができる。
【０１８２】
特定用途のいくつかの実施形態は、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、歪曲変異体３６８Ｄ／３７０Ｓ、及び消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む第一単量体（「負側」）であって、ｐＩ変異体を含まず、歪曲変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、及び消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む正側と対をなし（両単量体は、ＦｃＲｎ変異体４２８Ｌ／４３４Ｓを任意選択で含む）、正側は、ｓｃＦｖ単量体であり、荷電ｓｃＦｖリンカーを含む（特にｓｃＦｖが抗ＣＤ３であるとき）。第二の実施形態は、Ｉ１９９Ｔ／Ｎ２０３Ｄ／Ｋ２７４Ｑ／Ｒ３５５Ｑ／Ｑ４１９Ｅ／Ｋ４４７ｄｅｌ、歪曲変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、及び消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む第一の負側単量体を利用し（両単量体は、ＦｃＲｎ変異体４２８Ｌ／４３４Ｓを任意選択で含む）、第一の負側単量体は、ｐＩ変異体Ｑ１９６Ｋ／Ｉ１９９Ｔ／Ｐ２７１Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｎ２７６Ｋ、歪曲変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、及び消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む正側と対をなし（両単量体は、ＦｃＲｎ変異体４２８Ｌ／４３４Ｓを任意選択で含む）、正側は、ｓｃＦｖ単量体であり、荷電ｓｃＦｖリンカーを含む（特にｓｃＦｖが、抗ＣＤ３であるとき）。第三の実施形態は、Ｉ１９９Ｔ／Ｎ２０３Ｄ／Ｋ２７４Ｑ／Ｒ３５５Ｑ／Ｎ３８４Ｓ／Ｋ３９２Ｎ／Ｖ３９７Ｍ／Ｑ４１９Ｅ／Ｋ４４７ｄｅｌ、歪曲変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、及び消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む第一の負側単量体を利用し（両単量体は、ＦｃＲｎ変異体４２８Ｌ／４３４Ｓを任意選択で含む）、第一の負側単量体は、ｐＩ変異体を含まず、歪曲変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、及び消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む正側単量体と対をなし（両単量体は、ＦｃＲｎ変異体４２８Ｌ／４３４Ｓを任意選択で含む）、正側は、ｓｃＦｖ単量体であり、荷電ｓｃＦｖリンカーを含む（特にｓｃＦｖが、抗ＣＤ３であるとき）。第四の実施形態は、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、歪曲変異体３６８Ｄ／３７０Ｓ、及び消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋを含む第一の単量体（「負側」）を利用し、第一の単量体は、ｐＩ変異体を含まず、歪曲変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、及び消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋを含む正側と対をなす（両単量体は、ＦｃＲｎ変異体４２８Ｌ／４３４Ｓを任意選択で含む）。第五の実施形態は、Ｉ１９９Ｔ／Ｎ２０３Ｄ／Ｋ２７４Ｑ／Ｒ３５５Ｑ／Ｑ４１９Ｅ／Ｋ４４７ｄｅｌ、歪曲変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、及び消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋを含む第一の負側単量体を利用し（両単量体は、ＦｃＲｎ変異体４２８Ｌ／４３４Ｓを任意選択で含む）、第一の負側単量体は、ｐＩ変異体Ｑ１９６Ｋ／Ｉ１９９Ｔ／Ｐ２７１Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｎ２７６Ｋ、歪曲変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、及び消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋを含む正側と対をなす（両単量体は、ＦｃＲｎ変異体４２８Ｌ／４３４Ｓを任意選択で含む）。第六の実施形態は、Ｉ１９９Ｔ／Ｎ２０３Ｄ／Ｋ２７４Ｑ／Ｒ３５５Ｑ／Ｎ３８４Ｓ／Ｋ３９２Ｎ／Ｖ３９７Ｍ／Ｑ４１９Ｅ／Ｋ４４７ｄｅｌ、歪曲変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、及び消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む第一の負側単量体を利用し（両単量体は、ＦｃＲｎ変異体４２８Ｌ／４３４Ｓを任意選択で含む）、第一の負側単量体は、歪曲変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ及び消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋを含む正側と対をなし（両単量体は、ＦｃＲｎ変異体４２８Ｌ／４３４Ｓを任意選択で含む）、正側は、ｓｃＦｖ単量体であり、荷電ｓｃＦｖリンカーを含む（特にｓｃＦｖが、抗ＣＤ３であるとき）。第七の実施形態は、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、歪曲変異体３６８Ｄ／３７０Ｓ、及び消去変異体Ｓ２３９Ｋ／Ｓ２６７Ｋを含む第一の単量体（「負側」）を利用し、第一の単量体は、ｐＩ変異体を含まず、歪曲変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ及び消去変異体Ｓ２３９Ｋ／Ｓ２６７Ｋを含む正側と対をなし（両単量体は、ＦｃＲｎ変異体４２８Ｌ／４３４Ｓを任意選択で含む）、正側は、ｓｃＦｖ単量体であり、荷電ｓｃＦｖリンカーを含む（特にｓｃＦｖが、抗ＣＤ３であるとき）。第八の実施形態は、Ｉ１９９Ｔ／Ｎ２０３Ｄ／Ｋ２７４Ｑ／Ｒ３５５Ｑ／Ｑ４１９Ｅ／Ｋ４４７ｄｅｌ、歪曲変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ及び消去変異体Ｓ２３９Ｋ／Ｓ２６７Ｋを含む第一の負側単量体を利用し（両単量体は、ＦｃＲｎ変異体４２８Ｌ／４３４Ｓを任意選択で含む）、第一の負側単量体は、ｐＩ変異体Ｑ１９６Ｋ／Ｉ１９９Ｔ／Ｐ２７１Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｎ２７６Ｋ、歪曲変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、及び消去変異体Ｓ２３９Ｋ／Ｓ２６７Ｋを含む正側と対をなし（両単量体は、ＦｃＲｎ変異体４２８Ｌ／４３４Ｓを任意選択で含む）、正側は、ｓｃＦｖ単量体であり、荷電ｓｃＦｖリンカーを含む（特にｓｃＦｖが、抗ＣＤ３であるとき）。第九の実施形態は、Ｉ１９９Ｔ／Ｎ２０３Ｄ／Ｋ２７４Ｑ／Ｒ３５５Ｑ／Ｎ３８４Ｓ／Ｋ３９２Ｎ／Ｖ３９７Ｍ／Ｑ４１９Ｅ／Ｋ４４７ｄｅｌ、歪曲変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、及び消去変異体Ｓ２３９Ｋ／Ｓ２６７Ｋを含む第一の負側単量体を利用し（両単量体は、ＦｃＲｎ変異体４２８Ｌ／４３４Ｓを任意選択で含む）、第一の負側単量体は、ｐＩ変異体を含まず、歪曲変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、及び消去変異体Ｓ２３９Ｋ／Ｓ２６７Ｋを含む正側単量体と対をなし（両単量体は、ＦｃＲｎ変異体４２８Ｌ／４３４Ｓを任意選択で含む）、正側は、ｓｃＦｖ単量体であり、荷電ｓｃＦｖリンカーを含む（特にｓｃＦｖが、抗ＣＤ３であるとき）。第十の実施形態は、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、歪曲変異体３６８Ｄ／３７０Ｓ、及び消去変異体Ｓ２６７Ｋ／Ｐ３２９Ｋを含む第一の単量体（「負側」）を利用し、第一の単量体は、ｐＩ変異体を含まず、歪曲変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ及び消去変異体Ｓ２６７Ｋ／Ｐ３２９Ｋを含む正側と対をなし（両単量体は、ＦｃＲｎ変異体４２８Ｌ／４３４Ｓを任意選択で含む）、正側は、ｓｃＦｖ単量体であり、荷電ｓｃＦｖリンカーを含む（特にｓｃＦｖが、抗ＣＤ３であるとき）。第十一の実施形態は、Ｉ１９９Ｔ／Ｎ２０３Ｄ／Ｋ２７４Ｑ／Ｒ３５５Ｑ／Ｑ４１９Ｅ／Ｋ４４７ｄｅｌ、歪曲変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、及び消去変異体Ｓ２６７Ｋ／Ｐ３２９Ｋを含む第一の負側単量体を利用し（両単量体は、ＦｃＲｎ変異体４２８Ｌ／４３４Ｓを任意選択で含む）、第一の負側単量体は、ｐＩ変異体Ｑ１９６Ｋ／Ｉ１９９Ｔ／Ｐ２７１Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｎ２７６Ｋ、歪曲変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、及び消去変異体Ｓ２６７Ｋ／Ｐ３２９Ｋを含む正側と対をなし（両単量体は、ＦｃＲｎ変異体４２８Ｌ／４３４Ｓを任意選択で含む）、正側は、ｓｃＦｖ単量体であり、荷電ｓｃＦｖリンカーを含む（特にｓｃＦｖが、抗ＣＤ３であるとき）。第十二の実施形態は、Ｉ１９９Ｔ／Ｎ２０３Ｄ／Ｋ２７４Ｑ／Ｒ３５５Ｑ／Ｎ３８４Ｓ／Ｋ３９２Ｎ／Ｖ３９７Ｍ／Ｑ４１９Ｅ／Ｋ４４７ｄｅｌ、歪曲変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、及び消去変異体Ｓ２６７Ｋ／Ｐ３２９Ｋを含む第一の負側単量体を利用し（両単量体は、ＦｃＲｎ変異体４２８Ｌ／４３４Ｓを任意選択で含む）、第一の負側単量体は、ｐＩ変異体を含まず、歪曲変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、及び消去変異体Ｓ２６７Ｋ／Ｐ３２９Ｋを含む正側単量体と対をなし（両単量体は、ＦｃＲｎ変異体４２８Ｌ／４３４Ｓを任意選択で含む）、正側は、ｓｃＦｖ単量体であり、荷電ｓｃＦｖリンカーを含む（特にｓｃＦｖが、抗ＣＤ３であるとき）。
【０１８３】
リンカー
本発明は、例えば、追加の抗原結合部位に加えて、必要に応じて、リンカーを任意選択で提供し、例えば、図１１、１２、及び１３に示されるとおりであり、ここで、分子の「もう一方の末端」が、追加の抗原結合成分を含む。さらに、以下に概要が記載されるように、リンカーも、抗体薬物結合体（ＡＤＣ）系において任意選択で使用される。中心であるｍＡｂ−Ｆｖ構築物の成分を連結するために使用されるとき、リンカーは、一般に、ペプチド結合によって連結された２つ以上のアミノ酸残基を含むポリペプチドであり、本発明の１つまたは複数の成分を連結するために使用される。そのようなリンカーポリペプチドは、当該技術分野においてよく知られている（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８、Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３参照）。本明細書で説明される実施形態のいくつかで、様々なリンカーが有用であり得る。当業者によって理解されるように、本発明において使用されるものには、少なくとも３つの異なるリンカーの型が存在する。
【０１８４】
本明細書に記載される「リンカー」は、「リンカー配列」、「スペーサー」、「繋留配列（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」、またはその文法的相当物も指す。ホモまたはヘテロ二機能性リンカーが、よく知られている（全体が、参照によって組み込まれている１９９４  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙカタログのクロス−リンカーに関する技術セクション、１５５〜２００ページ参照。）。（一般的な「リンカー」及び「ｓｃＦｖリンカー及び「荷電ｓｃＦｖリンカー」の区別に留意されたい）。多くの方針を使用して、分子を一緒に共有結合で連結してよい。こうしたものには、限定はされないが、タンパク質またはタンパク質ドメインのＮ末端及びＣ末端間のポリペプチド連鎖、ジスルフィド結合を介する連鎖、及び化学架橋結合試薬を介した連鎖が含まれる。この実施形態の１つの態様では、リンカーは、組換え技術またはペプチド合成によって生成したペプチド結合である。リンカーペプチドは、次のアミノ酸残基を主に含んでよい。すなわち、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＴｈｒである。リンカーペプチドは、２つの分子を連結するために適切な長さを有するべきであり、そのようにして、それらは、お互いに対して正しい立体構造をとり、その結果、それらは、所望の活性を保持する。１つの実施形態では、リンカーは、長さが、アミノ酸で約１〜５０個、好ましくは、長さが、アミノ酸で約１〜３０個である。１つの実施形態では、長さが、アミノ酸で１〜２０個であるリンカーを使用してよい。有用なリンカーには、グリシン−セリン重合体が含まれ、当該グリシン−セリン重合体には、例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、及び（ＧＧＧＳ）ｎ、ここで、ｎは、少なくとも１である整数であり、グリシン−アラニン重合体、アラニン−セリン重合体、ならびに他の可動性リンカーが含まれる。あるいは、限定はされないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールの共重合体を含む様々な非タンパク質性の重合体が、リンカーとして有用であり得、すなわち、リンカーとして有用であり得る。
【０１８５】
他のリンカー配列は、ＣＬ／ＣＨ１ドメインのすべての残基ではないが、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの何らかの長さの何らかの配列を含んでよく、例えば、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの最初の５〜１２個のアミノ酸残基を含んでよい。リンカーは、イムノグロブリン軽鎖由来であり得、例えば、ＣκまたはＣλである。リンカーは、何らかのアイソタイプのイムノグロブリン重鎖由来であり得、例えば、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃα１、Ｃα２、Ｃδ、Ｃε、及びＣμが含まれる。リンカー配列は、Ｉｇ様タンパク質（例えば、ＴＣＲ、ＦｃＲ、ＫＩＲ）、ヒンジ領域由来の配列、及び他のタンパク質由来の他の天然の配列などの他のタンパク質由来であってもよい。
【０１８６】
抗体−薬物結合体
いくつかの実施形態では、本発明の多特異性抗体は、薬物と結合して、抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）を形成する。一般に、ＡＤＣは、腫瘍学用途において使用され、細胞傷害性物質または細胞増殖抑制性物質の局所送達に向けて、抗体−薬物結合体を使用することで、薬物部分の腫瘍への標的化送達が可能になり、これにより、有効性の向上、毒性の低下等が可能になり得る。この技術の外観は、Ｄｕｃｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２１：５−１３（２０１０）、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．１４（３）：１５４（２００８）、及びＳｅｎｔｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３：２３５−２４４（２００９）において提供されており、これによって、それらはすべて、全体が、参照によって、組み込まれる。
【０１８７】
したがって、本発明は、薬物に結合した多特異性抗体を提供する。一般に、結合は、抗体に対する共有結合によってなされ、以下にさらに説明されるとおり、一般に、リンカーに依存し、リンカーは、ペプチド連鎖であることが多い（以下に説明されるとおり、連鎖は、標的部位または他の部位において、プロテアーゼによる開裂に対して感受性であるように設計してよい）。さらに、上に説明されるとおり、リンカー−薬物単位（ＬＵ−Ｄ）の連鎖は、抗体内のシステインに対する付加によって作ることができる。当業者によって理解されるように、抗体当たりの薬物部分の数は、反応条件によって変更することができ、薬物：抗体の比で、１：１〜１０：１で変わり得る。当業者によって理解されるように、実際の数は、平均値である。
【０１８８】
したがって、本発明は、薬物に結合した多特異性抗体を提供する。以下に説明されるとおり、ＡＤＣの薬物は、何らかの数の物質であり得、限定はされないが、化学療法物質などの細胞傷害性物質、成長阻害物質、毒物（例えば、細菌、真菌、植物、若しくは動物起源の酵素的に活性を有する毒物、またはそれらの断片）、あるいは放射性同位体（すなわち、放射性結合体）が含まれ、提供される。他の実施形態では、本発明は、ＡＤＣを使用する方法をさらに提供する。
【０１８９】
本発明における使用に向けた薬物には、細胞傷害性毒物、具体的には、癌治療向けに使用されるものが含まれる。そのような薬物には、一般に、ＤＮＡ損傷物質、代謝拮抗物質、天然物、及びそれらのアナログが含まれる。細胞傷害性物質の例示のクラスには、ジヒドロ葉酸還元酵素阻害物質、及びチミジル酸合成酵素阻害物質などの酵素阻害物質、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ開裂物質（ＤＮＡ  ｃｌｅａｖｅｒ）、トポイソメラーゼ阻害物質、薬物のアントラサイクリンファミリー、ビンカ薬物、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞傷害性ヌクレオシド、薬物のプテリジンファミリー、ジイネン、ポドフィロトキシン、ドラスタチン、メイタンシノイド、分化誘導物質、ならびにタキソールが含まれる。
【０１９０】
こうしたクラスのメンバーには、例えば、メトトレキサート、メトプテリン、ジクロロメトトレキサート、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、メルファラン、ロイロシン、ロイロシデイン（ｌｅｕｒｏｓｉｄｅｉｎｅ）、アクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＡ、カミノマイシン（ｃａｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシン、及びエトポシドまたはリン酸エトポシドなどのポドフィロトキシン誘導体、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソールを含むタキサン、タキソテールレチノイン酸、ブタン酸、Ｎ８−アセチルスペルミジン、カンプトテシン、カリチアマイシン、エスペラミシン、エンジイン（ｅｎｅ−ｄｉｙｎｅ）、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＳＡ、カリチアマイシン、カンプトテシン、メイタンシノイド（ＤＭ１を含む）、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、ならびにメイタンシノイド（ＤＭ４）ならびにそれらのアナログが含まれる。
【０１９１】
毒物が、抗体−毒物結合体として使用されてよく、毒物には、ジフテリア毒物などの細菌毒物、リシンなどの植物毒物、ゲルダナマイシンなどの小分子毒物（Ｍａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９２（１９）：１５７３−１５８１、Ｍａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １０：１０２５−１０２８、Ｍａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１３：７８６−７９１）、メイタンシノイド（ＥＰ１３９１２１３、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：８６１８−８６２３）、及びカリチアマイシン（Ｌｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ  （１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：２９２８、Ｈｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：３３３６−３３４２）が含まれる。毒物は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、またはトポイソメラーゼ阻害を含む機構によって、その細胞傷害性及び細胞増殖抑制性の効果を発揮してよい。
【０１９２】
多特異性抗体と、メイタンシノイド、ドラスタチン、オーリスタチン、トリコテシン、カリチアマイシン、及びＣＣ１０６５、ならびに毒物活性を有するこうした毒物の誘導体などの、１つまたは複数の小分子毒物と、の結合体を企図する。
【０１９３】
メイタンシノイド
メイタンシノイド薬物部分としての使用に適したメイタンシン化合物は、当該技術分野においてよく知られており、既知の方法に従って天然源から単離できると共に、遺伝学的操作技術（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ（２００２）ＰＮＡＳ  ９９：７９６８−７９７３参照）を使用して、またはメイタンシノール及び既知の方法に従って合成的に調製されたメイタンシノールアナログを使用して、産生できる。以下に説明されるとおり、薬物は、抗体に対する結合に向けて、チオール基またはアミノ基などの機能的活性基の組み込みによって改変されてよい。
【０１９４】
例示のメイタンシノイド薬物部分には、Ｃ−１９−脱クロロ（米国特許第４，２５６，７４６号）（アンサマイトシンＰ２の水素化アルミニウムリチウム還元によって調製される）、Ｃ−２０−ヒドロキシ（またはＣ−２０−脱メチル）＋／−Ｃ−１９−脱クロロ（米国特許第４，３６１，６５０号及び第４，３０７，０１６号）（ストレプトマイセス若しくはアクチノマイセスを使用した脱メチル化、またはＬＡＨを使用した脱塩素化によって調製される）、ならびにＣ−２０−脱メトキシ、Ｃ−２０−アシルオキシ（――ＯＣＯＲ）、＋／−脱クロロ（米国特許第４，２９４，７５７号）（塩化アシルを使用したアシル化によって調製される）ならびに他の位置での改変を有するものなどの改変された芳香族環を有するものが含まれる。
【０１９５】
例示のメイタンシノイド薬物部分には、Ｃ−９−ＳＨ（米国特許第４，４２４，２１９号）（メイタンシノールと、Ｈ２ＳまたはＰ２Ｓ５との反応によって調製される）、Ｃ−１４−アルコキシメチル（脱メトキシ／ＣＨ２ＯＲ）（米国特許第４，３３１，５９８号）、Ｃ−１４−ヒドロキシメチルまたはアシルオキシメチル（ＣＨ２ＯＨまたはＣＨ２ＯＡｃ）（米国特許第４，４５０，２５４号）（ノカルジアから調製された）、Ｃ−１５−ヒドロキシ／アシルオキシ（米国特許第４，３６４，８６６号）（ストレプトマイセスによるメイタンシノールの変換によって調製された）、Ｃ−１５−メトキシ（米国特許第４，３１３，９４６号、及び第４，３１５，９２９号）（Ｔｒｅｗｉａ  ｎｕｄｌｆｌｏｒａから単離された）、Ｃ−１８−Ｎ−ジメチル（米国特許第４，３６２，６６３号、及び第４，３２２，３４８号）（ストレプトマイセスによるメイタンシノールの脱メチル化によって調製された）、ならびに４，５−デオキシ（米国特許第４，３７１，５３３号）（三塩化チタン／メイタンシノールのＬＡＨ還元によって調製された）などの改変を有するものも含まれる。
【０１９６】
特定用途のものとしては、ＤＭ１（米国特許第５，２０８，０２０号において開示され、参照によって組み込まれる）及びＤＭ４（米国特許第７，２７６，４９７号において開示され、参照によって組み込まれる）である。多くの追加のメイタンシノイド誘導体及び方法についても、５，４１６，０６４、ＷＯ／０１／２４７６３、７，３０３，７４９、７，６０１，３５４、ＵＳＳＮ１２／６３１，５０８、ＷＯ０２／０９８８８３、６，４４１，１６３、７，３６８，５６５、ＷＯ０２／１６３６８、及びＷＯ０４／１０３３２７２において参照のこと。これらはすべて、全体が、参照によって、明確に組み込まれる。
【０１９７】
メイタンシノイドを含むＡＤＣ、その調製方法、及びその治療用途は、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号、第５，４１６，０６４号、第６，４４１，１６３号、及び欧州特許ＥＰ０４２５２３５Ｂ１において開示されており、これにより、これらの開示は、参照によって、明確に組み込まれる。ＤＭ１と命名され、ヒト結腸直腸癌を標的とするモノクローナル抗体Ｃ２４２に連結されたメイタンシノイドを含むＡＤＣが、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：８６１８−８６２３（１９９６）において説明された。当該結合体は、培養された結腸癌細胞に対して高度に細胞傷害性であることが明らかとなり、生体内における腫瘍成長アッセイにおいて、抗腫瘍活性を示した。
【０１９８】
ＡＤＣは、Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２）において説明されており、その中で、メイタンシノイドは、ジスルフィドリンカーを介して、ヒト結腸癌細胞株上の抗原に結合しているマウス抗体Ａ７に、またはＨＥＲ−２／ｎｅｕ癌遺伝子に結合する別のマウスモノクローナル抗体ＴＡ．１に、結合された。ＴＡ．１−メイタンシノイド結合体の、ヒト乳癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３に対する細胞傷害性が、試験管内で、試験された。当該ヒト乳癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３は、細胞当たり、３ｘ１０５個のＨＥＲ−２表面抗原を発現している。当該薬物結合体は、遊離のメイタンシノイド薬物と類似した細胞傷害性度を達成し、当該細胞傷害性度は、抗体分子当たりのメイタンシノイド分子数の増加によって、増加させることが可能であった。Ａ７−メイタンシノイド結合体は、マウスにおいて、低い全身性の細胞傷害性を示した。
【０１９９】
オーリスタチン及びドラスタチン
いくつかの実施形態では、ＡＤＣは、ドラスタチンまたはドラスタチンペプチドアナログ及びドラスタチンペプチド誘導体、オーリスタチンに結合した多特異的抗体を含む（米国特許５，６３５，４８３号、第５，７８０，５８８号）。ドラスタチン及びオーリスタチンは、微小管の動力学、ＧＴＰの加水分解、ならびに核及び細胞の分裂に干渉することが示されており（Ｗｏｙｋｅ  ｅｔ  ａｌ（２００１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５（１２）：３５８０−３５８４）、抗癌活性（米国特許第５，６６３，１４９号）及び抗真菌活性（Ｐｅｔｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２：２９６１−２９６５）を有する。ドラスタチン薬物部分またはオーリスタチン薬物部分は、ペプチド薬物部分のＮ（アミノ）末端、またはＣ（カルボキシル）末端を介して抗体に付加してよい（ＷＯ０２／０８８１７２）。
【０２００】
例示のオーリスタチンの実施形態は、Ｎ末端に連結されたモノメチルオーリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦを含み、これは、２００４年３月２８日に公開された「Ｓｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌｕｍｅ  ４５，Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  ６２３において開示され、米国特許公開第２００５／０２３８６４８号において説明されており、この開示は、その全体が、参照によって、明確に組み込まれる。
【０２０１】
例示のオーリスタチンの実施形態は、ＭＭＡＥである（全体が、明確に組み込まれる米国特許第６，８８４，８６９号参照。）。
【０２０２】
別の例示のオーリスタチンの実施形態は、ＭＭＡＦである（全体が、明確に組み込まれるＵＳ２００５／０２３８６４９、５，７６７，２３７、及び６，１２４，４３１参照。）。
【０２０３】
ＭＭＡＥまたはＭＭＡＦ及び様々なリンカー成分（本明細書でさらに説明される）を含む追加の例示の実施形態は、下記の構造及び略語を有する（ここで、Ａｂは、抗体を意味し、ｐは１〜約８である）。
【０２０４】
典型的には、ペプチドに基づく薬物部分は、２つ以上のアミノ酸、及び／またはペプチド断片の間にペプチド結合を形成することによって調製できる。そのようなペプチド結合は、例えば、液相合成法（Ｅ．Ｓｃｈｒｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｋ．Ｌｕｂｋｅ，“Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐｐ７６−１３６，１９６５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ参照）に従って調製でき、液相合成法は、ペプチド化学の分野においてよく知られている。オーリスタチン／ドラスタチン薬物部分は、米国特許第５，６３５，４８３号、米国特許第５，７８０，５８８号、Ｐｅｔｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：５４６３−５４６５、Ｐｅｔｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  １３：２４３−２７７、Ｐｅｔｔｉｔ，Ｇ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９９６，７１９−７２５、Ｐｅｔｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１  ５：８５９−８６３、及びＤｏｒｏｎｉｎａ（２００３）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２１（７）：７７８−７８４の方法に従って調製してよい。
【０２０５】
カリチアマイシン
他の実施形態では、ＡＤＣは、１つまたは複数のカリチアマイシン分子に結合した本発明の抗体を含む。例えば、Ｍｙｌｏｔａｒｇは、最初に市販されたＡＤＣ薬物であり、ペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）としてカリチアマイシンγ１を利用している（全体が、参照によって組み込まれる米国特許第４，９７０，１９８号参照。）。追加のカリチアマイシン誘導体は、米国特許第５，２６４，５８６号、第５，３８４，４１２号、第５，５５０，２４６号、第５，７３９，１１６号、第５，７７３，００１号、第５，７６７，２８５号、及び第５，８７７，２９６号において説明され、すべてが、参照によって明確に組み込まれる。抗体のカリチアマイシンファミリーは、ピコモル以下の濃度で、二本鎖ＤＮＡに切れ目を入れることが可能である。カリチアマイシンファミリー結合体の調製については、米国特許第５，７１２，３７４号、第５，７１４，５８６号、第５，７３９，１１６号、第５，７６７，２８５号、第５，７７０，７０１号、第５，７７０，７１０号、第５，７７３，００１号、第５，８７７，２９６号参照（すべてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎａｍｉｄ  Ｃｏｍｐａｎｙに属す）。使用してよいカリチアマイシンの構造アナログには、限定はされないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α２Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧ、及びθＩ１が含まれる（Ｈｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：３３３６−３３４２（１９９３）、Ｌｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：２９２５−２９２８（１９９８）、及びＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎａｍｉｄに属する上記の米国特許）。抗体に結合できる別の抗腫瘍薬物は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリチアマイシン及びＱＦＡの両方が、細胞内部位で作用を有し、細胞膜を容易には通過しない。したがって、抗体が媒介する内部移行を介した、こうした物質の細胞への取り込みは、それらの細胞傷害性効果を大幅に増進する。
【０２０６】
デュオカルマイシン
ＣＣ−１０６５（参照によって組み込まれる４，１６９，８８８参照。）及びデュオカルマイシンは、ＡＤＣにおいて利用される抗腫瘍抗生物質ファミリーのメンバーである。こうした抗生物質は、副溝において、ＤＮＡをアデニンのＮ３位で、配列選択的にアルキル化することを介して働くようであり、これにより、アポトーシスをもたらすたくさんの現象のを引き起こす。
【０２０７】
デュオカルマイシンの重要なメンバーには、デュオカルマイシンＡ（米国特許第４，９２３，９９０号が、参照によって組み込まれる）、及びデュオカルマイシンＳＡ（米国特許第５，１０１，０３８号が、参照によって組み込まれる）、ならびに多数のアナログが含まれ、当該アナログは、米国特許第７，５１７，９０３号、第７，６９１，９６２号、第５，１０１，０３８号、第５，６４１，７８０号、第５，１８７，１８６号、第５，０７０，０９２号、第５，０７０，０９２号、第５，６４１，７８０号、第５，１０１，０３８号、第５，０８４，４６８号、第５，４７５，０９２号、第５，５８５，４９９号、第５，８４６，５４５号、ＷＯ２００７／０８９１４９、ＷＯ２００９／０１７３９４Ａ１、第５，７０３，０８０号、第６，９８９，４５２号、第７，０８７，６００号、第７，１２９，２６１号、第７，４９８，３０２号、及び第７，５０７，４２０号において説明されており、これらはすべて、参照によって、明確に組み込まれる。
【０２０８】
他の細胞傷害性物質
本発明の抗体に結合できる他の抗腫瘍物質には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾシン、ビンクリスチン及び５−フルオロウラシル、米国特許第５，０５３，３９４号、第５，７７０，７１０号において説明される、ＬＬ−Ｅ３３２８８複合体としてまとめて知られる物質のファミリー、ならびにエスペラミシン（米国特許第５，８７７，２９６号）が含まれる。
【０２０９】
使用できる酵素的に活性な毒物及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒物の非結合性活性断片、菌体外毒物Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンシン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害物質、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害物質、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、ならびにトリコテセンが含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日に公開されたＷＯ９３／２１２３２参照。
【０２１０】
本発明は、抗体と、核酸分解活性を有する化合物と、で形成されるＡＤＣをさらに企図する（例えば、リボヌクレアーゼ、またはデオキシリボヌクレアーゼ、すなわち、ＤＮａｓｅなどのＤＮＡエンドヌクレアーゼ）。
【０２１１】
腫瘍の選択的破壊に向けて、抗体は、高放射性原子を含んでよい。様々な放射性同位体が、放射性物質結合抗体（ｒａｄｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）の産生に利用可能である。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位体が含まれる。
【０２１２】
放射性標識または他の標識を、既知に方法で、結合体に組み込んでよい。例えば、ペプチドは、例えば、水素の代わりにフッ素１９を含有する適したアミノ酸前駆体を使用して、生合成されてよく、または、化学的アミノ酸合成によって合成されてよい。Ｔｃ９９ｍまたはＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、及びＩｎ１１１などの標識は、ペプチド中のシステイン残基を介して付加できる。イットリウム−９０は、リジン残基を介して付加できる。ＩＯＤＯＧＥＮ法（Ｆｒａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８０：４９−５７を、ヨウ素１２３を組み込むために使用できる。他の方法は、「免疫シンチグラフィーにおけるモノクローナル抗体（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ）」（Ｃｈａｔａｌ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）において詳細に説明される。
【０２１３】
複数の抗体を含む組成物では、薬物負荷は、抗体当たりの薬物分子の平均数であるｐによって表される。薬物負荷は、抗体当たり、１〜２０薬物（Ｄ）の範囲であってよい。結合反応の調製における、抗体当たりの薬物の平均数を、質量分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、及びＨＰＬＣなどの通常の手段によって特徴づけてよい。ｐに関する抗体−薬物結合体の定量的な分布を決定してもよい。
【０２１４】
いくつかの事例では、ｐが、他の薬物の負荷を有する抗体−薬物結合体由来のある一定の値である場合、分離、精製、及び均一な抗体−薬物結合体の特徴づけは、逆相ＨＰＬＣまたは電気泳動などの手段によって、達成されてよい。例示の実施形態では、ｐは、２、３、４、５、６、７、若しくは８、またはそれらの分数である。
【０２１５】
抗体−薬物結合体化合物の生成は、当業者によって知られる何らかの技術によって達成できる。簡潔には、抗体−薬物結合体化合物は、抗体単位としての多特異性抗体、薬物、及び任意選択で、薬物と、結合性物質とを連結するリンカーを含むことができる。
【０２１６】
多くの異なる反応が、結合性物質に対する薬物及び／またはリンカーの共有結合に向けて、利用可能である。これは、例えば、抗体分子といった結合性物質のアミノ酸残基の反応によって達成でき、当該アミノ酸残基には、リジンのアミノ基、グルタミン酸及びアスパラギン酸の遊離カルボン酸基、システインのスルフヒドリル基、芳香族アミノ酸の様々な部分が含まれる。共有結合の非特異的方法であって、一般に使用される方法は、カルボジイミド反応であり、化合物のカルボキシ基（またはアミノ基）を、抗体のアミノ基（またはカルボキシ基）へ、連結する反応である。さらに、ジアルデヒドまたはイミドエステルなどの二機能性物質が、化合物のアミノ基を、抗体分子のアミノ基へ連結するために使用されてきた。
【０２１７】
シッフ塩基反応も、結合性物質への薬物の付加に、利用可能である。この方法には、グリコール基またはヒドロキシ基を含む薬物の過ヨウ素酸酸化が関与し、したがって、その後に結合性物質と反応するアルデヒドを形成する。付加は、結合性物質のアミノ基とのシッフ塩基の形成を介して起こる。イソチオシアン酸を、結合性物質に薬物を共有結合で付加するためのカップリング物質として使用することもできる。他の技術は、当業者によって知られており、本発明の範囲内である。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、リンカーの前駆体である中間体が、適切な条件下で、薬物と反応する。他の実施形態では、反応性基が、薬物及び／または中間体に使用される。薬物と、中間体との反応産物、または誘導体化された薬物は、続いて、適切な条件下で本発明の多特異性抗体と反応する。
【０２１９】
本発明の結合体を調製する目的に向けて、所望の化合物に対して、その化合物の反応を、より簡便なものとするために、化学的改変をしてもよいと理解されることになる。例えば、アミン、ヒドロキシル、またはスルフヒドリルなどといった官能基を、薬物の活性または他の性質に与える効果が、最小または許容可能である位置で、薬物に対して付加してよい。
【０２２０】
リンカー単位
典型的には、抗体−薬物結合体化合物は、薬物単位と、抗体単位との間にリンカー単位を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、細胞内または細胞外の条件下で開裂可能であり、その結果、リンカーの開裂によって、適切な環境において、抗体から薬物単位が遊離する。例えば、ある一定のプロテアーゼを分泌する固形腫瘍が、開裂可能であるリンカーの標的として働いてよい。他の実施形態では、細胞内プロテアーゼが利用される。さらに他の実施形態では、リンカー単位は、開裂不可能であり、例えば、リソソームにおいて抗体が分解されることによって、薬物が遊離する。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、リンカーは、細胞内環境（例えば、リソソーム内またはエンドソーム内またはカベオラ内）に存在する開裂物質によって、開裂可能である。リンカーは、例えば、細胞内のペプチダーゼ酵素またはプロテアーゼ酵素によって開裂されるペプチジルリンカーであり得、当該酵素には、限定はされないが、リソソームプロテアーゼまたはエンドソームプロテアーゼが含まれる。いくつかの実施形態では、ペプチジルリンカーの長さは、少なくともアミノ酸が２個であるか、または少なくともアミノ酸が３個であるか、またはそれより長い。
【０２２２】
開裂物質には、限定無しに、カテプシンＢ及びカテプシンＤならびにプラスミン含まれ得、それらのすべてが、ジペプチド薬物誘導体を加水分解し、標的細胞内で活性薬物の遊離をもたらすことが知られている（例えば、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，１９９９，Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ８３：６７−１２３参照）。ペプチジルリンカーは、ＣＤ３８を発現している細胞に存在する酵素によって開裂可能である。例えば、チオール依存性プロテアーゼであるカテプシンＢによって開裂可能なペプチジルリンカーを使用できる（例えば、Ｐｈｅ−ＬｅｕリンカーまたはＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙリンカー（配列識別番号Ｘ））。カテプシンＢは、癌性組織において高度に発現している。そのようなリンカーの他の例は、例えば、米国特許第６，２１４，３４５号において説明されており、参照によってその全体が、あらゆる目的に向けて、本明細書に組み込まれる。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、細胞内プロテアーゼによって開裂可能なペプチジルリンカーは、Ｖａｌ−ＣｉｔリンカーまたはＰｈｅ−Ｌｙｓリンカーである（例えば、ｖａｌ−ｃｉｔリンカーを有するドキソルビシンの合成が説明されている米国特許第６，２１４，３４５号参照。）。
【０２２４】
他の実施形態では、開裂可能なリンカーは、ｐＨ感受性であり、すなわち、ある一定のｐＨ値での加水分解に対して感受性である。典型的には、ｐＨ感受性リンカーは、酸性条件下で加水分解可能である。例えば、リソソームにおいて加水分解可能である、酸性で不安定なリンカー（例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、シス−アコニットアミド、オルトエステル、アセタール、ケタール、及び同様のもの）を使用してよい。（例えば、米国特許第５，１２２，３６８号、第５，８２４，８０５号、第５，６２２，９２９号、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，１９９９，Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ８３：６７−１２３、Ｎｅｖｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４６５３−１４６６１参照。）そのようなリンカーは、血液中の条件などの中性ｐＨ条件下で相対的に安定であるが、リソソームのおよそのｐＨであるｐＨ５．５または５．０より低いｐＨでは不安定である。ある一定の実施形態では、加水分解可能なリンカーは、チオエーテルリンカーである（例えば、アシルヒドラゾン結合を介して、治療用物質に付加したチオエーテルなど（例えば、米国特許第５，６２２，９２９号参照）。
【０２２５】
さらに他の実施形態では、リンカーは、還元条件下で開裂可能である（例えば、ジスルフィドリンカー）。様々なジスルフィドリンカーが、当該技術分野において知られており、例えば、ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル−５−アセチルチオ酢酸）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸）、ＳＰＤＢ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）ブタン酸）及びＳＭＰＴ（Ｎ−スクシンイミジル−オキシカルボニル−アルファ−メチル−アルファ−（２−ピリジル−ジチオ）トルエン）−、ＳＰＤＢ及びＳＭＰＴを使用して形成できるものが含まれる。（例えば、Ｔｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：５９２４−５９３１、Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｉｎ  Ｒａｄｉｏｉｍａｇｅｒｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ（Ｃ．Ｗ  Ｖｏｇｅｌ  ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕ．Ｐｒｅｓｓ，１９８７参照。米国特許第４，８８０，９３５号も併せて参照。）
【０２２６】
他の実施形態では、リンカーは、マロン酸リンカー（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５：１３８７−９３）、マレイミドベンゾイルリンカー（Ｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．３（１０）：１２９９−１３０４）、または３’−Ｎ−アミドアナログ（Ｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．３（１０）：１３０５−１２）である。
【０２２７】
さらに他の実施形態では、リンカー単位は、開裂不可能であり、薬物は、抗体の分解によって放出される（米国公開第２００５／０２３８６４９号参照。その全体が、参照によって、あらゆる目的に向けて、本明細書に組み込まれる）。
【０２２８】
多くの実施形態では、リンカーは、自己崩壊性（ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ）である。本明細書では、「自己崩壊性スペーサー」という用語は、２つの間隔のある化学部分をまとめて共有結合的に連結して、安定な三部構成分子にすることが可能な二機能性の化学的な部分を指す。当該スペーサーは、第一部分に対するその結合が開裂した場合、第二化学部分から自発的に分離することになる。例えば、ＷＯ２００７０５９４０４Ａ２、ＷＯ０６１１０４７６Ａ２、ＷＯ０５１１２９１９Ａ２、ＷＯ２０１０／０６２１７１、ＷＯ０９／０１７３９４、ＷＯ０７／０８９１４９、ＷＯ０７／０１８４３１、ＷＯ０４／０４３４９３、及びＷＯ０２／０８３１８０参照。これらは、薬物−開裂可能基質結合体に向けられており、薬物及び開裂可能基質は、任意選択で、自己崩壊性リンカーを介して連結されており、これらはすべて、参照によって明確に組み込まれる。
【０２２９】
リンカーは、細胞外環境に対して実質的に感受性でないことが多い。本明細書では、リンカーの構成における「細胞外環境に対して実質的に感受性でない」は、抗体−薬物結合体化合物が、細胞外環境（例えば、血漿）に存在するとき、抗体−薬物結合体化合物の試料において、リンカーの約２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、３％以下、または約１％以下しか開裂しないことを意味する。
【０２３０】
リンカーが、細胞外環境に対して実質的に感受性でないかどうかは、例えば、血漿で、抗体−薬物結合体化合物を予め決めた時間（例えば、２、４、８、１６、または２４時間）インキュベートし、その後、血漿中に存在する遊離薬物の量を定量化することによって決定できる。
【０２３１】
相互に排他的ではない他の実施形態では、リンカーは、細胞への内部移行を促進する。ある一定の実施形態では、リンカーは、治療用物質と結合されるとき（すなわち、本明細書に記載される抗体−薬物結合体化合物のリンカー−治療用物質部分の環境において）、細胞への内部移行を促進する。さらに他の実施形態では、リンカーは、オーリスタチン化合物と、本発明の多特異性抗体との両方に結合されるとき、細胞への内部移行を促進する。
【０２３２】
本発明の組成物及び方法と共に使用できる様々な例示のリンカーは、ＷＯ２００４−０１０９５７、米国公開第２００６／００７４００８号、米国公開第２００５０２３８６４９号、及び米国公開第２００６／００２４３１７号において説明される（これらはそれぞれ、その全体が、あらゆる目的に向けて本明細書に組み込まれる）。
【０２３３】
薬物負荷
薬物負荷は、ｐによって表現され、分子における抗体当たりの薬物部分の平均数である。薬物負荷（「ｐ」）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または抗体当たりの部分（Ｄ）が、これらより多くてよいが、平均数は、分数または少数であることが多い。一般に、１〜４の薬物負荷が、有用であることが多く、１〜２も有用である。本発明のＡＤＣは、１〜２０の範囲の薬物部分と結合した抗体の集合を含む。結合反応によるＡＤＣの調製物において、抗体当たりの薬物部分の平均数は、質量分析、及びＥＬＩＳＡアッセイなどの通常の手段によって特徴づけられてよい。
【０２３４】
ｐに関するＡＤＣの定量的な分布を決定してもよい。いくつかの実例では、ｐが、他の薬物の負荷を有するＡＤＣ由来のある一定の値の場合、均一なＡＤＣの分離、精製、及び特徴づけは、電気泳動などの手段によって達成されてよい。
【０２３５】
いくつかの抗体−薬物結合体では、ｐは、抗体上の付加部位の数によって限定されてよい。例えば、上の例示の実施形態のように、付加が、システインチオールである場合、抗体は、１つのみ、若しくはいくつかのシステインチオール基を有してよく、または１つのみ、若しくはいくつかの十分に反応性であるチオール基を有してよく、当該チオール基を介してリンカーを付加してよい。ある一定の実施形態では、例えば、ｐ＞５といった、より多くの薬物負荷は、凝集、不溶性、毒性、またはある一定の抗体−薬物結合体の細胞透過性の消失を引き起こし得る。ある一定の実施形態では、本発明のＡＤＣ向けの薬物負荷は、１〜約８、約２〜約６、約３〜約５、約３〜約４、約３．１〜約３．９、約３．２〜約３．８、約３．２〜約３．７、約３．２〜約３．６、約３．３〜約３．８、または約３．３〜約３．７の範囲である。実際、ある一定のＡＤＣ向けには、抗体当たりの薬物部分の最適な比は、８未満であってよく、約２〜約５であってよい。ＵＳ２００５−０２３８６４９Ａ１参照（参照によって、その全体が、本明細書に組み込まれる）。
【０２３６】
ある一定の実施形態では、結合反応の間に、抗体に結合される薬物部分は、理論的な最大数より少ない。抗体は、例えば、以下に論じられる薬物−リンカー中間体またはリンカー試薬と反応しないリジン残基を含んでよい。一般に、抗体は、薬物部分に連結し得る、遊離であって反応性のシステインチオール基を多くは含まず、実際は、抗体におけるシステインチオール残基のほとんどが、ジスルフィド架橋として存在する。ある一定の実施形態では、抗体を、部分的または完全な還元条件下で、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはトリカルボニルエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）などの還元物質で還元し、反応性のシステインチオール基を生成させてもよい。ある一定の実施形態では、抗体は、リジンまたはシステインなどの反応性の求核基を露出させるために変性条件に供される。
【０２３７】
ＡＤＣの負荷（薬物／抗体比）は、異なる方法で制御されてよく、例えば、（ｉ）薬物−リンカー中間体または抗体に対する、リンカー試薬のモル過剰量の限定によって、（ｉｉ）結合反応の時間または温度の限定によって、（ｉｉｉ）システインチオール改変に向けた部分的還元条件または還元条件の限定によって、（ｉｖ）システイン残基の数及び位置が、リンカー−薬物付加の数、及び／または位置の制御に向けて改変されるようにする、組換え技術による、抗体のアミノ酸配列の操作（本明細書及びＷＯ２００６／０３４４８８（その全体が、参照によって、本明細書に組み込まれる）で開示されるように調製されるｔｈｉｏＭａｂまたはｔｈｉｏＦａｂなど）によって制御されてよい。
【０２３８】
複数の求核基が、薬物−リンカー中間体と反応するか、またはリンカー試薬に続いて薬物部分の試薬と反応する場合、その後に得られる産物は、抗体に対して１つまたは複数の薬物部分が付加した分布を有するＡＤＣ化合物の混合物であると理解されることになる。抗体当たりの薬物の平均数は、二重ＥＬＩＳＡ抗体アッセイによって、混合物から計算されてよく、二重ＥＬＩＳＡ抗体アッセイは、抗体に特異的であると共に薬物に特異的である。混合物中の個々のＡＤＣ分子は、質量分析によって同定されてよく、例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィーといったＨＰＬＣによって分離されてよい。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、単一の負荷値を有する均一なＡＤＣが、電気泳動またはクロマトグラフィーによって、結合体混合物から単離されてよい。
【０２４０】
ＡＤＣの細胞傷害効果の決定方法
薬物または抗体−薬物結合体が、細胞に対する細胞増殖抑制効果、及び／または細胞傷害効果を発揮するかどうかを決定する方法は既知である。一般に、抗体薬物結合体の細胞傷害活性または細胞増殖抑制活性は、細胞培養媒体中で、抗体薬物結合体の標的タンパク質を発現している哺乳類細胞を暴露し、約６時間〜約５日の期間細胞を培養し、そして細胞の生存率を測定することによって、測定できる。細胞に基づく試験内アッセイを、抗体薬物結合体の、生存率（増殖）、細胞傷害性、及びアポトーシスの誘導（カスパーゼの活性化）を測定ために使用できる。
【０２４１】
抗体薬物結合体が、細胞増殖抑制効果を発揮するかどうかを決定するために、チミジン取り込みアッセイを使用してよい。例えば、９６穴プレートに５，０００個細胞／穴の密度で播種された、標的抗原を発現している癌細胞を７２時間培養し、７２時間の最後の８時間、０．５μＣｉの３Ｈ−チミジンに暴露することができる。抗体薬物結合体の存在下、及び非存在下における３Ｈ−チミジンの培養細胞への取り込みを測定する。
【０２４２】
細胞傷害性の決定のために、ネクローシス、またはアポトーシス（プログラムされた細胞死）を測定できる。ネクローシスは、典型的には、細胞膜の透過性が増加し、細胞が膨化し、そして細胞膜が破裂することによって達成される。アポトーシスは、典型的には、膜小疱形成、細胞質凝縮、及び内在性エンドヌクレアーゼの活性化によって特徴づけられる。癌細胞に対するこうした効果のいずれかが決定されれば、抗体薬物結合体が、癌の処置において有用であると示される。
【０２４３】
細胞生存率は、ニュートラルレッド、トリパンブルー、またはＡＬＡＭＡＲ（商標）ブルーなどの色素の細胞内への取り込みを決定することによって測定できる（Ｐａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ３：４７３−４７６参照）。そのようなアッセイでは、細胞を、色素を含む媒体においてインキュベートし、細胞を、洗浄し、そして、残存色素を分光光度的に測定する。残存色素は、色素の細胞への取り込みを反映するものである。タンパク質結合性色素であるスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）も細胞傷害性を測定するために使用できる（Ｓｋｅｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８２：１１０７−１２）。
【０２４４】
あるいは、ＭＴＴなどのテトラゾリウム塩が、生存しており、死んでいない細胞の検出による、哺乳細胞の生存及び増殖に向けた定量的比色分析アッセイにおいて、使用される（例えば、Ｍｏｓｍａｎｎ，１９８３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６５：５５−６３参照）。
【０２４５】
アポトーシスは、例えば、ＤＮＡ断片化の測定によって定量化できる。定量的に試験管内でＤＮＡ断片化を決定するために、市販の測光方法が、利用可能である。そのようなアッセイの例には、ＴＵＮＥＬ（断片化したＤＮＡへの標識化ヌクレオチドの取り込みを検出する）、及びＥＬＩＳＡに基づくアッセイが含まれ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ，１９９９，ｎｏ．２，ｐｐ．３４−３７（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）において説明される。
【０２４６】
アポトーシスは、細胞における形態学的変化を測定することによっても決定できる。例えば、ネクローシスを伴う、細胞膜の統合性の消失は、ある一定の色素（例えば、アクリジンオレンジまたはエチジウムブロミドなどの蛍光色素）の取り込みを測定することによって決定できる。アポトーシス細胞数の測定方法は、Ｄｕｋｅ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，１９９２，ｐｐ．３．１７．１−３．１７．１６）によって説明される。細胞は、ＤＮＡ色素（例えば、アクリジンオレンジ、エチジウムブロミド、またはヨウ化プロピジウム）で標識することもでき、細胞では、クロマチン凝縮及び核膜の内側に沿う辺縁趨向が観察される。アポトーシスを決定するために測定でき
る他の形態学的変化には、例えば、細胞質凝縮、膜小疱形成の増加、及び細胞収縮が含まれる。
【０２４７】
アポトーシス細胞の存在は、培養の付着区画及び「浮遊」区画の両方において測定できる。例えば、両区画は、上清の除去、付着細胞のトリプシン処理、遠心洗浄段階（例えば、２０００ｒｐｍで１０分）後の調製物の統合、及びアポトーシスを検出（例えば、ＤＮＡ断片化の測定）によって回収できる。（Ｐｉａｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５５：３１１０−１６参照）。
【０２４８】
生体内では、本発明の多特異性抗体の治療用組成物の効果は、適した動物モデルにおいて評価できる。例えば、異種間癌モデルを使用でき、癌の外植片または継代した異種移植片を、ヌードマウスまたはＳＣＩＤマウスなどの免疫が損なわれた動物へ導入する（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３：４０２−４０８）。有効性は、腫瘍形成、腫瘍退縮、または腫瘍転移、及び同様のものの阻害を測定するアッセイを使用して測定できる。
【０２４９】
先に記載した方法の実践において使用する治療用組成物は、所望の送達方法に適した担体を含む医薬組成物へと製剤化できる。適した担体には、治療用組成物と組み合わせたとき、治療用組成物の抗腫瘍機能を保持し、一般に、患者の免疫系と非反応性である何らかの材料が含まれる。例には、限定はされないが、無菌リン酸緩衝生理食塩水、静菌水、及び同様のものなどの多くの標準医薬担体のいずれかが含まれる（一般例として、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｏｓａｌ．，Ｅｄ．，１９８０参照）。
【０２５０】
生体内投与向けの抗体組成物
本発明に従って使用する抗体の製剤は、所望の純度を有し、任意選択で、医薬的に許容可能な担体、添加剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．［１９８０］）と共に抗体を混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態において、貯蔵向けに調製される。許容可能な担体、添加剤、または安定剤は、用いられる投与量及び濃度で、レシピエントに対して非毒性であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤、保存剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド、フェノール、ブチルアルコール若しくはベンジルアルコール、メチルパラベン若しくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾールなど）、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、若しくはイムノグロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性重合体、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリジンなどのアミノ酸、単糖、二糖、及びグルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む他の糖質、ＥＤＴＡなどのキレート物質、スクロース、マンニトール、トレハロース、若しくはソルビトールなどの糖、ナトリウムなどの塩形成対イオン、金属複合体（例えば、亜鉛−タンパク質複合体）、ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。
【０２５１】
本明細書に記載される製剤は、処置されている特定の徴候に向けて、必要に応じて複数の活性化合物を含んでもよく、好ましくは、お互いに有害な影響を及ぼすことのない相補的な活性を有するものである。例えば、他の特異性を有する抗体を提供することが望ましくあり得る。あるいは、またはさらに、組成物は、細胞傷害性物質、サイトカイン、成長阻害物質、及び／または小分子アンタゴニストを含んでよい。そのような分子は、意図する目的に向けて、有効な量の組み合わせで、適切に存在する。
【０２５２】
活性成分は、調製するカプセルに封入されてもよく、例えば、コアセルベーション技術によって、または界面重合によって封入されてよく、これらは、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセルまたはゼラチンマイクロカプセル、及びポリ−（メチルメタクリル酸）マイクロカプセルであり、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）、またはマイクロエマルジョンにおいて、封入されてよい。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）において開示される。
【０２５３】
生体内投与に向けて使用される製剤は、無菌、またはそれに近くあるべきである。これは、無菌ろ過膜を通過させるろ過によって容易に達成される。
【０２５４】
持続放出調製物を調製してよい。持続放出調製物の適した例には、抗体を含む固体疎水性重合体の半透性マトリックスが含まれ、当該マトリックスは、成形物品の形態であり、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルである。持続放出マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリル酸）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸及び．ガンマ．エチル−Ｌ−グルタミン酸の共重合体、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸共重合体及び酢酸リュープロリドからなる注射可能なマイクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸共重合体ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシブタン酸が含まれる。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸などの重合体は、１００日を超える期間の分子放出を可能にする一方で、ある一定のヒドロゲルでは、タンパク質の放出期間は、より短い。
【０２５５】
カプセル化された抗体が、体内に長期間残存するとき、抗体は、３７℃での水分へ暴露の結果として変性または凝集し得、生物学的活性の消失と共に免疫原性が変化する可能性をもたらす。関与する機構に応じて、安定化に向けた合理的な方針を立てることができる。例えば、凝集機構が、チオジスルフィド相互交換を介した分子間Ｓ――Ｓ結合形成であると見出されたのであれば、スルフヒドリル残基の改変、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含量の制御、適した添加物の使用、及び特定の重合体マトリックス組成物の開発によって、安定化を達成してよい。
【０２５６】
投与様式
本発明の抗体物質及び化学療法物質は、ボーラスとしての静脈投与、または期間にわたる継続注入による静脈投与などの既知の方法に従って、筋肉内経路、腹腔内経路、脳脊髄内（ｉｎｔｒａｃｅｒｏｂｒｏｓｐｉｎａｌ）経路、皮下経路、関節内経路、関節滑液嚢内経路、くも膜下腔内経路、口腔経路、局所的経路、または吸入経路によって、対象に投与される。抗体の静脈内投与または皮下投与が好ましい。
【０２５７】
処置様式
本発明の方法において、治療は、病気または状態に関する有益な治療応答を提供するために使用される。「有益な治療応答」は、病気若しくは状態における改善、及び／または病気若しくは状態と関連する症状における改善を意図する。例えば、有益な治療応答は、病気における下記の改善の１つまたは複数を指すことになる。（１）新生細胞数の低下、（２）新生細胞死の増加、（３）新生細胞の生存阻害、（５）腫瘍成長の阻害（例えば、ある程度の鈍化、好ましくは停止）、（６）患者生存率の増加、及び（７）病気または状態と関連する１つまたは複数の症状のいくらかの緩和。
【０２５８】
何らかの所与の病気または状態における有益な治療応答は、病気または状態に特有の標準化された応答の診断基準によって決定できる。腫瘍応答は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）スキャン、ｘ−線画像法、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、骨スキャン画像法、内視鏡検査、ならびに骨髄穿刺（ＢＭＡ）及び循環における腫瘍細胞の計数を含む腫瘍生検試料採取などの選別技術を使用して、腫瘍形態学（すなわち、全体的な腫瘍量、腫瘍サイズ、及び同様のもの）における変化で評価できる。
【０２５９】
こうした有益な治療応答に加えて、治療が進行中の対象は、病気に関連する症状において、改善の有利な効果を経験してよい。
【０２６０】
したがって、Ｂ細胞腫瘍に対しては、対象は、いわゆるＢ症状、すなわち、夜間の発汗、熱、体重減少、及び／または蕁麻疹の減少を経験してよい。前悪性状態に対しては、多特異性治療用物質での治療によって、関連悪性状態の発生を遮断、及び／または発生までの時間を延長してよく、当該関連悪性状態の発生は、例えば、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）に罹患している対象における多発性骨髄腫の発生である。
【０２６１】
病気の改善は、完全応答として特徴付けられてよい。「完全応答」は、何らかの、以前には異常であったＸ線試験、骨髄、及び脳脊髄液（ＣＳＦ）の正常化、または骨髄腫の場合は、異常なモノクローナルタンパク質の正常化を伴って、臨床的に検出可能な病気が存在しないことを意図する。
【０２６２】
そのような応答は、本発明の方法による処置の後、少なくとも４〜８週間持続してよく、または時には６〜８週間持続してよい。あるいは、病気の改善は、部分応答であるとして分類されてよい。「部分応答」は、新しい病変が存在せず、すべての測定可能な腫瘍量（すなわち、対象に存在する悪性細胞の数、または腫瘍質量の測定容積、または異常なモノクローナルタンパク質の量）が、少なくとも約５０％の減少することを意図し、４〜８週間、または６〜８週間持続してよい。
【０２６３】
本発明による処置は、使用する薬剤の「治療上有効量」を含む。「治療上有効量」は、必要な投与量及び期間で、所望の治療結果を達成するために有効である量を指す。
【０２６４】
治療上有効量は、個々の病気の状況、年齢、性別及び体重などの要因、ならびに個々における、薬剤の所望応答を引き出す能力に応じて変化してよい。治療上有効量は、抗体または抗体部分の治療上有利な効果が、何らかの毒性効果または有害性効果を凌ぐ量でもある。
【０２６５】
腫瘍治療に向けた「治療上有効量」は、病気の進行の安定化能力によって測定されてもよい。癌を抑制する化合物の能力を、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系において評価してよい。
【０２６６】
あるいは、組成物のこの性質は、当業者に知られる試験管内アッセイによって、化合物が、細胞の成長を抑制する能力、またはアポトーシスを誘導する能力を試験することによって評価してよい。治療用化合物の治療上有効量によって、対象の腫瘍サイズを減少させてよく、またはそうでなければ、対象の症状を回復させてよい。当業者であれば、対象のサイズ、対象の症状の重症度、及び特定組成物、または選択する投与経路などの要因に基づいてそのような量を決定できるであろう。
【０２６７】
投与量レジメンは、最適な所望の応答を提供するように調整される（例えば、治療応答）。例えば、単回ボーラス投与をしてよく、いくつかに分割された用量を、期間にわたって投与してよく、または治療状況の要件が示すように、比例的に用量を減少または増加してよい。非経口組成物を、投与の容易化、及び投与量の均一性担保に向けて、投与量単位形態において製剤化してよい。本明細書では、投与量単位形態は、処置される対象向けの単位投与量として適した、物理的に別々の単位を指す。それぞれの単位は、必要な医薬担体と関連して、所望の治療効果を提供するように計算され、予め決定された量の活性化合物を含む。
【０２６８】
本発明の投与量単位形態のための規格は、（ａ）活性化合物特有の特性、及び達成される特定の治療効果、ならびに（ｂ）そのような活性化合物を、個々の感受性処置向けに配合する技術分野での固有の制限、によって決定されると共に、直接的にそれらに応じて、決定される。
【０２６９】
本発明において使用される多特異性抗体に向けた、効率的な投与量及び投与量レジメンは、処置される病気または状態に依存し、当業者によって決定されてよい。
【０２７０】
本発明において使用される多特異性抗体の治療上有効量のための、例示かつ非限定範囲は、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇなどの約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇなどの約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．３ｍｇ／ｋｇなどの約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、または約３ｍｇ／ｋｇである。別の実施形態では、抗体は、１〜２０ｍｇ／ｋｇの用量などの１ｍｇ／ｋｇ以上の用量で投与され、例えば、５〜２０ｍｇ／ｋｇの用量、例えば、８ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【０２７１】
当該技術分野の医療従事者であれば、必要な医薬組成物の有効量を容易に決定し、処方し得る。例えば、医者または獣医師であれば、医薬組成物において用いられる薬剤を、所望の治療効果を達成するために必要となるよりも低い水準の用量で開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させることができるであろう。
【０２７２】
１つの実施形態では、多特異性抗体は、注入によって、２００〜４００ｍｇ／ｋｇの投与量などの１０〜５００ｍｇ／ｋｇの投与量で毎週投与される。そのような投与は、例えば、３〜５回などの１〜８回繰り返されてよい。投与は、２〜１２時間の期間などの２〜２４時間の期間にわたる継続注入によって実施されてよい。
【０２７３】
１つの実施形態では、毒性を含む副作用を減らす必要があれば、多特異性抗体は、２４時間を超える期間などの長期にわたる、緩徐な継続注入によって投与される。
【０２７４】
１つの実施形態では、多特異性抗体は、４〜６回などの最大８回の投与に向け、２５０ｍｇ〜２０００ｍｇの投与量が毎週投与され、例えば、３００ｍｇ、５００ｍｇ、７００ｍｇ、１０００ｍｇ、１５００ｍｇ、または２０００ｍｇなどの投与量が毎週投与される。投与は、２〜１２時間などの２〜２４時間の期間にわたって継続注入によって実施されてよい。そのようなレジメンは、必要に応じて１回または複数回繰り返されてよく、例えば、６ヶ月後または１２カ月後に繰り替えされてよい。投与量は、例えば、生物学的試料を取得し、多特異性抗体の抗原結合領域を標的とする抗イディオタイプ抗体を使用することにより、投与の際に血液中に存在する本発明の化合物量を測定することによって、決定または調整してよい。
【０２７５】
さらなる実施形態では、多特異性抗体は、毎週１回、２〜１２週間投与され、３〜１０週間など、４〜８週間などの期間投与される。
【０２７６】
１つの実施形態では、多特異性抗体は、維持療法によって投与され、例えば、６ヶ月またはそれより長い期間、１週間に１回などといった投与がなされる。
【０２７７】
１つの実施形態では、多特異性抗体は、多特異性抗体の１回の注入後に、放射性同位体に結合した多特異性抗体の注入を含むレジメンによって投与される。レジメンは、繰り返されてよく、例えば、７〜９日後に繰り返されてよい。
【０２７８】
非限定例として、本発明による処置は、１日の抗体投与量として提供されてよく、その量は、１日当たり、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇであって、１日当たり、０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｍｇ／ｋｇなどであり、処置の開始後、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、若しくは４０日目の内の少なくとも１日に提供されてよく、あるいは処置の開始後、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０週間目の内の少なくとも１週に提供されてよく、またはそれらのいずれかの組み合わせで提供されてよく、単一または分割された用量を使用して、２４、１２、８、６、４、若しくは２時間毎に、またはそれらのいずれかの組み合わせで提供されてよい。
【０２７９】
いくつかの実施形態では、その実施形態の多特異性抗体分子は、例えば、化学療法物質といった、１つまたは複数の追加の治療用物質と組み合わせて使用される。ＤＮＡ損傷化学療法物質の非限定例には、トポイソメラーゼＩ阻害物質（例えば、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシン、及びそれらのアナログまたは代謝物、ならびにドキソルビシン）、トポイソメラーゼＩＩ阻害物質（例えば、エトポシド、テニポシド、及びダウノルビシン）、アルキル化物質（例えば、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、チオテパ、イホスファミド、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、デカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、及びシクロホスファミド）、ＤＮＡインターカレーター（例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、及びカルボプラチン）、ブレオマイシンなどのＤＮＡインターカレーター兼遊離ラジカル発生物質、ならびにヌクレオシド模倣物質（例えば、５−フルオロウラシル、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔｉｂｉｎｅ）、ゲムシタビン、フルダラビン、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン、及びヒドロキシ尿素）が含まれる。
【０２８０】
細胞複製を攪乱する化学療法物質には、パクリタキセル、ドセタキセル、及び関連アナログと、ビンクリスチン、ビンブラスチン及び関連アナログと、サリドマイド、レナリドミド及び関連アナログ（例えば、ＣＣ−５０１３及びＣＣ−４０４７）と、タンパク質チロシンキナーゼ阻害物質（例えば、メシル酸イマチニブ及びゲフィチニブ）と、プロテアソーム阻害物質（例えば、ボルテゾミブ）と、ＩκＢキナーゼの阻害物質を含むＮＦ−κＢ阻害物質と、癌において過剰発現しているタンパク質に結合し、それによって細胞複製を下方制御する抗体（例えば、トラスツズマブ、リツキシマブ、セツキシマブ、及びベバシズマブ）と、癌において上方制御、過剰発現、または活性化していることが知られており、それを阻害することにより、細胞複製が下方制御されるタンパク質または酵素の他の阻害物質と、が含まれる。
【０２８１】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標）（ボルテゾミブ）での処置に先行して、処置と同時に、または処置の後に使用できる。
【０２８２】
すべての引用文献は、それらの全体が、参照によって、明確に本明細書に組み込まれる。
【０２８３】
例示目的に向けて、本発明の特定の実施形態を上に説明したが、添付の特許請求の範囲において説明される本発明から逸脱することなく、当業者によって、詳細の変更を数多く実施し得ることを理解されるであろう。
【実施例】
【０２８４】
本発明を示すために、実施例を以下に提供する。こうした実施例は、本発明を何らかの特定の応用、または実施理論に限定しようと意図するものではない。本発明において論じられる定常領域の位置のすべてで、番号付けは、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ。参照によって、全体が組み込まれる）にあるように、ＥＵインデックスに従う。抗体技術分野の当業者であれば、この慣習が、イムノグロブリン配列の特定領域における、非連続的な番号付けからなっており、イムノグロブリンファミリーにおける保存位置への標準化された参照が可能になっていることを理解されるであろう。したがって、ＥＵインデックスによって定義される、何らかの所与のイムノグロブリンの位置は、その連続配列に対応する必要はないことになる。
【０２８５】
実施例１．プロトタイプ「三重Ｆ」二重特異性抗体
本発明は、第一抗原及び第二抗原を共捕捉する新規のイムノグロブリン組成物について説明する。抗体の一方の重鎖は、単鎖Ｆｖ（本明細書では、「ｓｃＦｖ」）を含み、もう一方の重鎖は、「定型的な」Ｆａｂ形式であり、可変重鎖及び軽鎖を含む（図１参照）。この構造は、本明細書で「三重Ｆ」形式（ｓｃＦｖ−Ｆａｂ−Ｆｃ）と呼ばれることがある。２つの鎖は、二量体Ｆｃ領域によって一緒にまとめられる（図２参照）。Ｆｃ領域は、アミノ酸置換によって改変でき、「三重Ｆ」ヘテロ二量体の効率的な精製を可能にする。さらに、Ｆｃ領域は、アミノ酸置換によって改変され、「三重Ｆ」ヘテロ二量体の形成を促進できる。Ｆｃ置換の例は、以下により完全に説明される。
【０２８６】
Ｆｃ置換を、「三重Ｆ」形式に含めることができ、不要な二重ｓｃＦｖ−Ｆｃホモ二量体及びｍＡｂホモ二量体に関して、所望の「三重Ｆ」ヘテロ二量体の効率的な精製を可能にする。それぞれの単量体の等電点（ｐＩ）を変えるＦｃ置換を含め、その結果、それぞれの単量体が異なるｐＩを有することは、この例である。この場合、所望の「三重Ｆ」ヘテロ二量体は、不要な二重ｓｃＦｖ−Ｆｃホモ二量体及びｍＡｂホモ二量体のそれと比較して、異なるｐＩを有することになり、したがって、「三重Ｆ」ヘテロ二量体の等電点精製を容易にする（例えば、陰イオン交換カラム、陽イオン交換カラム）。こうした置換は、何らかの混入している二重ｓｃＦｖ−Ｆｃホモ二量体及びｍＡｂホモ二量体の、精製後の判定及び監視においても役に立つ（例えば、ＩＥＦゲル、ｃＩＥＦ、及び分析ＩＥＸカラム）。Ｆｃ単量体１及びＦｃ単量体２において作ることでき、所望の「三重Ｆ」ヘテロ二量体の効率的な精製を可能にする置換の一覧については、図３参照のこと。
【０２８７】
Ｆｃ置換は、「三重Ｆ」形式に含めることができ、所望の「三重Ｆ」ヘテロ二量体への形成を、不要な二重ｓｃＦｖ−Ｆｃホモ二量体及びｍＡｂホモ二量体を上回るように歪曲する。例えば、Ｆｃ単量体１及びＦｃ単量体２において作ることができ、産生を「三重Ｆ」ヘテロ二量体へと「歪曲」する置換の一覧については、図４を参照のこと。図３及び図４に記載されるアミノ酸置換は、組み合わせることができ、これにより、何らかの混入している二重ｓｃＦｖ−Ｆｃホモ二量体及びｍＡｂホモ二量体を除去して容易に精製できる「三重Ｆ」ヘテロ二量体の収率の増加につながる。
【０２８８】
「三重Ｆ」形式に含めるためのｓｃＦｖドメインの最適化後に、最適化ｓｃＦｖドメインを様々な標準抗体重鎖と簡便な様式でカップリングできる。例えば、Ｔ細胞の細胞傷害性を補充するための抗ＣＤ３ｓｃＦｖを、様々な抗腫瘍抗原抗体重鎖（例えば、ＣＤ５、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、Ｈｅｒ２、ＨＭ１．２４、及び他の腫瘍抗原に結合するもの）とカップリングできる。標準抗体重鎖と簡便にカップリングできる最適化ｓｃＦｖドメインのさらなる例には、ナチュラルキラー細胞の細胞傷害性に向けた抗ＣＤ１６ｓｃＦｖ、阻害活性に向けた抗ＣＤ３２ｂｓｃＦｖ（ここでは、カップリングされた抗体重鎖は、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ４０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９b、または他の免疫受容体に結合することになる）、及び血液脳関門を横切る輸送に向けた抗トランスフェリン受容体ｓｃＦｖ、抗インスリン受容体、または抗ＬＲＰ１が含まれる。
【０２８９】
実施例２．「三重Ｆ」形式から得られる多特異性抗体
多特異性抗体は、第三の抗原に結合する追加のｓｃＦｖドメインまたはＦａｂドメインを、「三重Ｆ」重鎖の１つのＣ末端に付加することによって構築できる。例として図５参照のこと。あるいは、Ｃ末端ｓｃＦｖまたはＣ末端Ｆａｂは、第一抗原または第二抗原に結合してよく、そのようにして、二価性を与え、その抗原に向けた全体的な結合親和性を増加させる。
【０２９０】
多特異性抗体は、「三重Ｆ」形式のｓｃＦｖ−Ｆｃ重鎖を、図６に示される再編成された抗体重鎖とカップリングすることによっても構築できる。そのような再編成重鎖は、第三の抗原に結合する追加のＦｖ領域、または第一抗原若しくは第二抗原に結合する追加のＦｖ領域を含んでよく、そのようにして、二価性を与え、その抗原に向けた全体的な結合親和性を増加させる。
【０２９１】
実施例３．抗ＣＤ１９Ｆａｂｘ抗ＣＤ３ｓｃＦｖ「三重Ｆ」二重特異性体
抗ＣＤ１９Ｆａｂｘ抗ＣＤ３ｓｃＦｖ「三重Ｆ」二重特異性体のためのアミノ酸配列を図に記載した。不要な二重ｓｃＦｖ−Ｆｃホモ二量体及びｍＡｂホモ二量体を上回る所望の「三重Ｆ」ヘテロ二量体の効率的な精製を可能にするために作られたアミノ酸置換には、下線が引かれている。好ましいヒト化抗ＣＤ３可変領域向けのアミノ酸配列は、図２及び図６（ＣＤＲには下線が引かれている）に記載される。所望の「三重Ｆ」種の発現及び精製のいくつかの例、ならびにその生物学的活性が、以下に挙げられる。
【０２９２】
抗ＣＤ１９Ｆａｂ及び抗ＣＤ３ｓｃＦｖを有する「三重Ｆ」二重特異性体であるＸＥＮＰ１１８７４の産生の概要を、図９に記載する。図９Ａでは、不要な二重ｓｃＦｖ−Ｆｃホモ二量体及びｍＡｂホモ二量体からの、所望の「三重Ｆ」ヘテロ二量体のイオン交換精製が示される。「三重Ｆ」画分の純度は、ＩＥＦゲルによって調べた（データは、ＵＳＳＮ６１／８１８，４１０の図９Ｂに示されており、その図及び説明文が、参照によって、明確に組み込まれる）。最終的に、ＳＥＣを使用して「三重Ｆ」産物の均一なサイズを確認した（データは、ＵＳＳＮ６１／８１８，４１０の図９Ｃに示されており、参照によって、明確に組み込まれる）。
【０２９３】
ＣＤ１９Ｆａｂｘ抗ＣＤ３ｓｃＦｖ「三重Ｆ」二重特異性体であるＸＥＮＰ１１８７４は、強力な生物学的活性を有することが示された。Ｂ細胞欠乏に向けてＴ細胞を強力に補充するＸＥＮＰ１１８７４の能力が、ＵＳＳＮ６１／８１８，４１０の図１０に示され、参照によって、明確に組み込まれる）。
【０２９４】
抗ＣＤ１９Ｆａｂ及び抗ＣＤ３ｓｃＦｖを有する「三重Ｆ」特異性体であるＸＥＮＰ１１９２４の産生は、ＵＳＳＮ６１／８１８，４１０の図１１に概要が記載されており、参照によって明確に組み込まれる。ＵＳＳＮ６１／８１８，４１０の図１１Ａでは、不要な二重ｓｃＦｖ−Ｆｃホモ二量体及びｍＡｂホモ二量体からの、所望の「三重Ｆ」ヘテロ二量体のイオン交換精製が示される。「三重Ｆ」画分の純度は、ＩＥＦゲルによって調べ、（ＵＳＳＮ６１／８１８，４１０の）図１１Ｂに示される。最終的に、ＳＥＣを使用して「三重Ｆ」産物の均一なサイズを確認した（ＵＳＳＮ６１／８１８，４１０の図１１Ｃ参照）。
【０２９５】
ＣＤ１９Ｆａｂｘ抗ＣＤ３ｓｃＦｖ「三重Ｆ」二重特異性体であるＸＥＮＰ１１９２４は、強力な生物学的活性を有することが示された。ＸＥＮＰ１１９２４が、Ｒａｊｉ腫瘍細胞株の殺傷に向けてＴ細胞を強力に補充する能力が、ＵＳＳＮ６１／８１８，４１０の図１２に示される。
【０２９６】
実施例４．抗ＣＤ３８Ｆａｂｘ抗ＣＤ３ｓｃＦｖ「三重Ｆ」二重特異性体
抗ＣＤ３８Ｆａｂｘ抗ＣＤ３ｓｃＦｖ「三重Ｆ」二重特異性体向けのアミノ酸配列は、ＵＳＳＮ６１／８１８，４１０の図１３に記載される。不要な二重ｓｃＦｖ−Ｆｃホモ二量体及びｍＡｂホモ二量体に関して、所望の「三重Ｆ」ヘテロ二量体の効率的な精製を可能にするために作られたアミノ酸置換には、下線が引かれている。所望の「三重Ｆ」種の発現及び精製のいくつかの例、ならびにその生物学的活性が、以下に挙げられる。
【０２９７】
抗ＣＤ３８Ｆａｂ及び抗ＣＤ３ｓｃＦｖを有する「三重Ｆ」二重特異性体であるＸＥＮＰ１１９２５の産生は、ＵＳＳＮ６１／８１８，４１０の図１４に概要が記載される。ＵＳＳＮ６１／８１８，４１０の図１４Ａでは、不要な二重ｓｃＦｖ−Ｆｃホモ二量体及びｍＡｂホモ二量体からの、所望の「三重Ｆ」ヘテロ二量体のイオン交換精製が示される。「三重Ｆ」画分の純度は、ＩＥＦゲルによって調べ、ＵＳＳＮ６１／８１８，４１０の図１４Ｂに示される。最終的に、ＳＥＣを使用して「三重Ｆ」産物の均一なサイズを確認した（ＵＳＳＮ６１／８１８，４１０の図１４Ｃ参照）。
【０２９８】
抗ＣＤ３８Ｆａｂｘ抗ＣＤ３ｓｃＦｖ「三重Ｆ」二重特異性体であるＸＥＮＰ１１９２５は、強力な生物学的活性を有することが示された。ＸＥＮＰ１１９２５が、ＲＰＭＩ８２２６腫瘍細胞株の殺傷に向けてＴ細胞を強力に補充する能力が、ＵＳＳＮ６１／８１８，４１０の図１５に示される。
【０２９９】
実施例５．ｐＩ変更アイソタイプ定常領域変異体の不安定化の同定及び修復
【０３００】
上に説明したとおり、ＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）間のアイソタイプの差異を利用することによって、ｐＩを増加または減少させる置換が免疫原性を誘発する危険の最小化を試みることができる。新規アイソタイプの新しいセットを、この原理に基づいて設計した。こうした新しい変異体は、ＩＳＯ（−）、ＩＳＯ（＋）、及びＩＳＯ（＋ＲＲ）と呼ばれる。こうした新規アイソタイプの熱安定性を、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３（Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３）系（Ｆｃ領域のみ）において決定した。上で説明したとおり、タンパク質を発現及び精製した。この概念証明系向けの配列を図１６に記載した。
【０３０１】
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって決定された熱安定性の測定（図１７）により、ＩＳＯ（−）／ＩＳＯ（＋ＲＲ）ヘテロ二量体（ＸＥＮＰ１２４８８、配列は、図１６参照）は、野生型ＩｇＧ１（ＸＥＮＰ８１５６、配列は、図１６参照）と比較して安定性が低いことが明らかとなった。引き続き、操作を試みたところ、ＩＳＯ（−）重鎖における置換Ｎ３８４Ｓ／Ｋ３９２Ｎ／Ｍ３９７Ｖが、不安定化の原因であると同定した。結果的に、ＩＳＯ（−ＮＫＶ）と命名された変異体を設計し、試験した（図１６参照）。この変異体では、位置３８４、３９２、及び３９７が、野生型ＩｇＧ１（Ｓ３８４Ｎ／Ｎ３９２Ｋ／Ｍ３９７Ｖ）に復帰している。ＩＳＯ（−ＮＫＶ）／ＩＳＯ（＋ＲＲ）ヘテロ二量体（ＸＥＮＰ１２７５７、配列は、図１６参照）の熱安定性をＤＳＣによって測定し、野生型ＩｇＧ１のそれに相当することを明らかにした（図１７）。この結果は、特定のｐＩ変更アイソタイプ置換を選択して、または選択しないことによって、不安定化するものを回避することの重要性を強調するものである。
【０３０２】
実施例６．追加のヘテロ二量体歪曲Ｆｃ変異体
【０３０３】
上に説明したとおり、ヘテロ二量体歪曲Ｆｃ変異体を、不要なホモ二量体に対して、所望のヘテロ二量体の形成へと偏らせるために作ることができる。追加のヘテロ二量体歪曲Ｆｃ変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ−Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ（ＸＥＮＰ１２７６０、配列は、図１８参照）を設計し、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３系（Ｆｃ領域のみ）において試験した。上で説明したとおり、タンパク質を発現及び精製した。
【０３０４】
１回のみの標準プロテインＡ精製段階後に、存在するタンパク質を、陽イオン交換（ＣＩＥＸ）カラムを使用した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって調べた（図１９参照）。これにより、不要なホモ二量体に対する所望のヘテロ二量体の収率の決定が可能になった。Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ−Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ変異体（ＸＥＮＰ１２７６０、図１９の下パネル）の存在によって、この変異体が存在しない場合（ＸＥＮＰ１２７５７、図１９の上パネル）と比較して、所望のヘテロ二量体形成への極度な偏りが導入された。ヘテロ二量体の収率は、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ−Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ変異体を有さないものでは、僅か５２．７％であるのに対し、有するものでは９５．８％であることに留意されたい。
【０３０５】
追加のヘテロ二量体歪曲Ｆｃ変異体も設計及び試験した。図３６は、ヘテロ二量体の収率（ＨＰＬＣ−ＣＩＥＸにより決定）及び熱安定性（ＤＳＣにより決定）と共に、操作されたヘテロ二量体歪曲Ｆｃ変異体の一覧を提供するものである。Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ−Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ変異体が高いヘテロ二量体収率、及び高い熱安定性を有しており、特に好ましい。
【０３０６】
実施例７．Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ構成における追加のヘテロ二量体歪曲Ｆｃ変異体
【０３０７】
ヘテロ二量体歪曲Ｆｃ変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ−Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを、抗ＣＤ１９ｘ抗ＣＤ３Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃへと操作した（アミノ酸配列は、図１５参照）。対照であるＦａｂ−ｓｃＦｖ−ＦｃＸＥＮＰ１３２２８は、こうしたヘテロ二量体歪曲Ｆｃ変異体を欠いているものであった。１回のみの標準プロテインＡ精製段階後に、存在するタンパク質を、等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲルによって調べた。これにより、不要なホモ二量体に対する所望のヘテロ二量体の収率の決定が可能であった。Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ−Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ変異体（ＸＥＮＰ１３１２２、図２２の右レーン）の存在によって、この変異体が存在しない場合（ＸＥＮＰ１３２２８、図２２、左レーン）と比較して、所望のヘテロ二量体（中央のバンド）形成への極度な偏りが導入された。
【０３０８】
実施例７．抗ＣＤ３８ｘ抗ＣＤ３二重特異性抗体の構築
【０３０９】
抗ＣＤ３８抗体であるＯＫＴ１０を、ヒトストリング含量（ｈｕｍａｎ  ｓｔｒｉｎｇ  ｃｏｎｔｅｎｔ）（Ｌａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（２００７），４４：１９８６−１９９８）の最適化によってヒト化し、ヒト化抗ＣＤ３８Ｆｖ及び抗ＣＤ３ドメインを含む二重特異性分子を創出した（図３７）。所望の遺伝子セグメントは、合成オリゴヌクレオチド、及び自動化された遺伝子合成によるＰＣＲ産物からＢｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ）によって合成された。ｐＴＴ５ベクターにおける抗体構築物を２９３Ｅ細胞において発現させ、所望のヘテロ二量体二重特異性体を単離するために、標準プロテインＡ、及びその後のＧＥ  ＨｉＴｒａｐ  ＳＰ陽イオン交換カラムを使用したＩＥＸクロマトグラフィーによって精製した。抗体Ｆｃドメインは、操作されたヘテロ二量体Ｆｃ領域を含み、二重特異性分子の効率的な精製が容易であった。ＣＤ３８に向けた二重特異性体の親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００を使用したＳＰＲでのＦｖ領域変異体のライブラリーの選別によって改善した（図３８）。
【０３１０】
実施例８．抗ＣＤ３８ｘ抗ＣＤ３二重特異性抗体の、試験管内における性質
【０３１１】
最適化された二重特異性分子を、ＬＤＨ再配向化Ｔ細胞細胞傷害性（ＲＴＣＣ）アッセイ（図３９）及びＴ細胞対ＲＰＭＩ８２２６の異なる比を利用したアネキシンＶ＋ＲＴＣＣアッセイ（図４０）における、ＲＰＭＩ８２２６多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞の殺傷能力で選別した。最適化された分子を、直接結合アッセイを使用してカニクイザル抗ＣＤ３８に対する交差反応性を評価した（図４１）。最適化された抗ＣＤ３８ｘ抗ＣＤ３二重特異性分子の様々な性質をまとめた表を、図４２に示す。
【０３１２】
実施例８．ｈｕＰＢＭＣが移植されたＳＣＩＤマウスにおける抗ＣＤ３８ｘ抗ＣＤ３二重特異性体によるヒト血漿細胞の殺傷
【０３１３】
最適化された二重特異性分子を、ｈｕＰＢＭＣが移植されたＳＣＩＤマウスモデルにおけるヒト血漿細胞の殺傷能力で選別した。それぞれ１０匹のマウスの群を０日目にα−ＡＳＧＭ１で処理し、ＳＣＩＤのＮＫ細胞を欠乏させ、その後、１日目に３ｘ１０７個のヒトＰＢＭＣを移植した。４日目に、群を総ＩｇＧ水準に基づいて無作為化した。ＰＢＭＣ移植後の７日目及び１５日目に、抗ＣＤ３８ｘ抗ＣＤ３二重特異性分子、または対照を投与した。ＩｇＧ２、ＩｇＥ、及びＩｇＭの力価を１４日目及び２１日目に決定した。５ｍｇ／ｋｇの用量で、ダラツムマブ（抗ＣＤ３８ＩｇＧ１抗体）を対照として含めた。ダラツムマブと比較して、抗ＣＤ３８ｘ抗ＣＤ３二重特異性分子では、ヒトＩｇアイソタイプの顕著な減少がみられた（図４３及び図４４）。
【０３１４】
実施例４．抗ＣＤ３８ｘ抗ＣＤ３二重特異性抗体による、多発性骨髄腫患者のＰＢＭＣにおけるＣＤ３８＋ＣＤ１３８＋細胞の欠乏
【０３１５】
二人のＭＭドナー由来のＰＢＭＣを１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３８ｘ抗ＣＤ３二重特異性分子と共に、２４時間インキュベートし、細胞を数えた。事前にゲートした生細胞（ＦＳＣ対ＳＳＣによってソートした）由来のＣＤ３８＋ＣＤ１３８＋細胞を数え、イベントをＰＢＳ処理した対照に対して標準化した。結果を、図４５に示す。二重特異性体は、この濃度で、ＭＭ細胞を強力に欠乏させることができた。
【０３１６】
実施例５．抗ＣＤ３８ｘ抗ＣＤ３二重特異性体向けのアミノ酸配列及びＤＮＡ配列
【０３１７】
抗ＣＤ３８ｘ抗ＣＤ３二重特異性体であるＸＥＮＰ１３２４３及びＸＥＮＰ１３５５１のアミノ酸配列及びＤＮＡ配列をそれぞれ図５０及び図５１に記載した。
【０３１８】
実施例６．チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における、抗ＣＤ３８ｘ抗ＣＤ３二重特異性体向けの安定プールの生成
【０３１９】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に、ＸＥＮＰ１３２４３及びＸＥＮＰ１３５５１をコードするＤＮＡをトランスフェクトし、Ｓｅｌｅｘｉｓが所有権を有するＳＵＲＥ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ（商標）を使用し、図３に記載したに比に従って、平行安定プールを生成させた。トランスフェクトされたＤＮＡは、図５２に記載されるＤＮＡを含む単シストロン性ベクターからなるものであった。安定プール細胞を１０ｍＬの回転チューブ内で、７日間培養し、７日目に５ｍＬの培養上清を抜き取り、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによって精製してから、陽イオン交換クロマトグラフィーによって分析した。生成されるであろう可能性のあるタンパク質が、異なる等電点を有するように設計したため、陽イオン交換クロマトグラフィーによって、異なるＤＮＡ比に応じて、どのタンパク質種が、ＣＨＯ細胞によって分泌されたかを分析することが可能であった。図４は、ＸＥＮＰ１３２４３及びＸＥＮＰ１３５５１の両方に向けた、図３に記載の特定ＤＮＡ比のそれぞれで、陽イオン交換クロマトグラムを分類したものである。陽イオン交換クロマトグラフィー分析に使用した条件下で、ＨＣ−Ｆａｂホモ二量体は、約１５分に溶出し、所望のヘテロ二量体特異性体は、約２２分に溶出し、ＨＣ−ｓｃＦｖ単量体は、約２６分に溶出し、そしてＨＣ−ｓｃＦｖホモ二量体は、約２９分に溶出している。異なるタンパク質種の量の概要は、図５４に記載される。
【０３２０】
驚くべきことに、ヘテロ二量体形成は、宿主細胞におけるこうした核酸（ＨＣ−ｓｃＦｖ、ＨＣ及びＬＣ）のトランスフェクション比によって誘起できる。いくつかのＤＮＡのトランスフェクション比によって、プロテインＡで精製された総材料の８０％を超える量で、好ましい二重特異性ヘテロ二量体が形成された。８０％を超えるヘテロ二量体形成に好ましい比は、１：１．５：１．５、１：２：１．５、１：０．６６７：２、１：１：２、１：１．５：２、及び１：２：２である（すべてＨＣ−Ｆａｂ：ＨＣ−ｓｃＦｖ：ＬＣとして記載）。いくつかのＤＮＡ比によって、好ましい二重特異性ヘテロ二量体が、９０％を超える量で形成された。９０％を超えるヘテロ二量体形成に好ましい比は、１：１．５：１．５、１：２：１．５、１：１：２、及び１：２：２である（すべてＨＣ−Ｆａｂ：ＨＣ−ｓｃＦｖ：ＬＣとして記載）。ＤＮＡ比の１つによって、好ましい二重特異性ヘテロ二量体が、９５％を超える量で形成された。９５％を超えるヘテロ二量体形成に特に好ましい比は、１：２：２である（ＨＣ−Ｆａｂ：ＨＣ−ｓｃＦｖ：ＬＣとして記載）。
【０３２１】
実施例７．Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける抗ＣＤ３８ｘ抗ＣＤ３二重特異性体の薬物動態
【０３２２】
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群当たりｎ＝５）に、抗ＣＤ３８ｘ抗ＣＤ３二重特異性体であるＸＥＮＰ１３２４３及びＸＥＮＰ１３５５１を、２ｍｇ／ｋｇの静脈内用量を単回で与えた。試験物投与後１時間の時点、及び投与後１、３、６、１０、１４、１７、及び２１日の時点で、マウスを眼窩静脈叢穿刺（ＯＳＰ）で出血させ、血液を処理して、試験物水準の決定のための血清とした。血清濃度をイムノアッセイによって決定し、図６にプロットした。試験物の半減期をＰｈｏｅｎｉｘ  ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ６．３の非区画分析モジュールを使用して決定した。半減期を図５５に記載した。二重特異性体の設計においてＦｃ領域を含めることによって、典型的なモノクローナル抗体と同等の半減期がもたらされたことに留意されたい。ＢｉＴＥ形式またはＤＡＲＴ形式などの典型的な非Ｆｃ含有二重特異性体は、はるかに短い半減期を有し、半減期は、時間のオーダーである。
【０３２３】
実施例８．抗ＣＤ３８ｘ抗ＣＤ３二重特異性体によって媒介されるＣＤ３８＋ＲＰＭＩ８２２６細胞の再配向化Ｔ細胞細胞傷害性
【０３２４】
抗ＣＤ３８ｘ抗ＣＤ３二重特異性体であるＸＥＮＰ１３２４３及びＸＥＮＰ１３５５１をＣＤ３８＋ＲＰＭＩ８２２６細胞の再配向化Ｔ細胞細胞傷害性を媒介するために使用した。アッセイは、１０，０００個のＲＰＭＩ８２２６細胞を、４００，０００個の精製されたヒトＴ細胞と３７℃で２４時間インキュベートすることからなる構成であった。細胞傷害性の計測は、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）によるものである。結果を図に示す。
【０３２５】
実施例９．抗ＣＤ３８ｘ抗ＣＤ３二重特異性体の結合親和性
【０３２６】
ヒト及びカニクイザルのＣＤ３８及びＣＤ３に向けたＸＥＮＰ１３２４３及びＸＥＮＰ１３５５１の親和性をＢｉａｃｏｒｅ  ３０００を使用した表面プラズモン共鳴で測定した。標準法を使用し、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、動力学的パラメーターを決定した。結果を図に記載する。
【０３２７】
実施例１０．カニクイザルにおける、抗ＣＤ３８ｘ抗ＣＤ３二重特異性体によるＣＤ３８＋細胞の欠乏
【０３２８】
カニクイザルの６つの群（群当たりｎ＝２）に、ＸＥＮＰ１３２４３またはＸＥＮＰ１３５５１のいずれかを静脈内注入を介して投与した。３週間あけて、サル当たり２つの用量を投与した。初期用量は、５、５０、及び５００ｎｇ／ｋｇであり、第二用量は、２、５、及び２０μｇ／ｋｇであった。ＣＤ２０−ＣＤ３８＋細胞の欠乏が、用量依存的な様式で観察された（図参照）。Ｔ細胞補充の証拠が、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ６９の上方制御においてみられた（図参照）。
【図１Ａ】
0006775422.tif 000002
【図１Ｂ】
0006775422.tif 000003
【図２】
0006775422.tif 000004
【図３Ａ】
0006775422.tif 000005
【図３ＡＡ】
0006775422.tif 000006
【図３Ｂ】
0006775422.tif 000007
【図３ＢＢ】
0006775422.tif 000008
【図３Ｃ】
0006775422.tif 000009
【図３ＣＣ】
0006775422.tif 000010
【図３Ｄ】
0006775422.tif 000011
【図３ＤＤ】
0006775422.tif 000012
【図３Ｅ】
0006775422.tif 000013
【図３ＥＥ】
0006775422.tif 000014
【図３Ｆ】
0006775422.tif 000015
【図３ＦＦ】
0006775422.tif 000016
【図３Ｇ】
0006775422.tif 000017
【図３ＧＧ】
0006775422.tif 000018
【図３Ｈ】
0006775422.tif 000019
【図３ＨＨ】
0006775422.tif 000020
【図３Ｉ】
0006775422.tif 000021
【図３ＩＩ】
0006775422.tif 000022
【図３Ｊ】
0006775422.tif 000023
【図３ＪＪ】
0006775422.tif 000024
【図３Ｋ】
0006775422.tif 000025
【図３ＫＫ】
0006775422.tif 000026
【図３Ｌ】
0006775422.tif 000027
【図３ＬＬ】
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【図３Ｍ】
0006775422.tif 000029
【図３ＭＭ】
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【図３Ｎ】
0006775422.tif 000031
【図３ＮＮ】
0006775422.tif 000032
【図３Ｏ】
0006775422.tif 000033
【図３ＯＯ】
0006775422.tif 000034
【図３Ｐ】
0006775422.tif 000035
【図３ＰＰ】
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【図３Ｑ】
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【図３ＱＱ】
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【図３Ｒ】
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【図３ＲＲ】
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【図３Ｓ】
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【図３ＳＳ】
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【図３Ｔ】
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【図３ＴＴ】
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【図３Ｕ】
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【図３ＵＵ】
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【図３Ｖ】
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【図３ＶＶ】
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【図３Ｗ】
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【図３ＷＷ】
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【図３Ｘ】
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【図３ＸＸ】
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【図３Ｙ】
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【図３ＹＹ】
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【図３Ｚ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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【図２０Ｇ】
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【図２０Ｈ】
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【図２０Ｉ】
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【図２０Ｊ】
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【図２０Ｋ】
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【図２０Ｌ】
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【図２０Ｍ】
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【図２０Ｎ】
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【図２０Ｏ】
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【図２０Ｐ】
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【図２０Ｑ】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４５Ｃ−４５Ｆ】
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【図４５Ｇ−４５Ｊ】
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【図４５Ｋ−４５Ｌ】
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【図４５Ｍ】
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【図４５Ｎ−４９Ｒ】
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【図４５Ｓ−４５Ｕ】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４６Ｃ】
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【図４７Ａ】
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【図４７Ｂ】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１Ａ】
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【図５１Ｂ】
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【図５２Ａ】
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【図５２Ｂ】
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【図５２Ｃ】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９Ａ】
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【図５９Ｂ】
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【図６０Ａ】
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【図６０Ｂ】
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【図６０Ｃ】
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【図６１】
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【配列表】
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