(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の波長の第１の励起光（１３）を含む第１の励起ビーム（１２）を発する少なくとも一つの第１の光源（１１）と、前記第１の波長とは異なる第２の波長の第２の励起光（１６）を含む第２の励起ビーム（１５）を発する第２の光源（１４）とを有し、前記第１の励起ビーム（１２）および前記第２の励起ビーム（１５）の少なくとも一つを励起光路（Ａ）内に入射結合させる入射結合手段（２０）を有し、前記第１の励起ビーム（１２）および前記第２の励起ビーム（１５）を標本（７０）まで誘導すると共に、前記標本（７０）により発せられた検出光（８２、８４）を検出光路（Ｄ）内に誘導する光学手段（３０、４０、５０）を有する多色走査型顕微鏡であって、
前記光学手段が少なくとも以下の構成要素、すなわち
前記第１の励起光（１３）および前記第２の励起光（１６）の少なくとも一つを、前記標本（７０）により発せられた前記検出光（８２、８４）から分離する少なくとも一つの第１の主カラースプリッタ（３０）と、
少なくとも前記第１の励起光（１３）および前記第２の励起光（１６）により前記標本（７０）を走査するスキャナ（４０）と、
前記第１の励起光（１３）および第２の励起光（１６）を前記標本（７０）の上部または内部に集光させると共に、前記標本（７０）により発せられた前記検出光（８２、８４）を前記検出光路（Ｄ）の方向に誘導する顕微鏡対物レンズ（５０）と、
前記励起光路（Ａ）内の各励起ビームおよび前記検出光路（Ｄ）内の各検出ビームの少なくとも一つに対して設けられていて、異なる励起ビームおよび検出ビームの少なくとも一つに対して光軸がずれている各々の別個の光学要素と、
前記標本（７０）により発せられた前記検出光（８２、８４）を検出する検出部（９０）とを有し、
前記入射結合手段（２０）および前記光学手段（３０、４０、５０）の少なくとも一部が、前記第１の波長を有する前記第１の励起ビーム（１２）を第１の標本位置（７２）まで、および前記第２の波長を有する前記第２の励起ビーム（１５）を前記第１の標本位置（７２）とは異なる第２の標本位置（７４）まで誘導すべく設定および配置されていて、
前記検出部（９０）が、前記第１の標本位置（７２）から発せられた前記検出光（８２）を検出する第１の検出器（９２）を有し、前記第２の標本位置（７４）から発せられた前記検出光（８４）を検出する第２の検出器（９４）を有し、
前記第１の波長を有する前記第１の励起ビームに照射された前記第１の標本位置（７２）から発せられた前記検出光（８２）および前記第２の波長を有する前記第２の励起ビームに照射された前記第２の標本位置（７４）から発せられた前記検出光（８４）、並びに場合に応じて更なる標本位置から発せられ得る検出光が単一の共通ピンホール（６１）を通過する、
ことを特徴とする多色走査型顕微鏡。
【請求項２】
前記第１の励起ビーム（１２）が前記励起光路（Ａ）内に第１の角度で入射結合され、
前記第２の励起ビーム（１５）が前記励起光路（Ａ）内に前記第１の角度とは異なる第２の角度で入射結合されることを特徴とする、請求項１に記載の多色走査型顕微鏡。
【請求項３】
前記第１の励起ビーム（１２）が前記第１の主カラースプリッタ（３０）により、且つ前記第２の励起ビーム（１５）が第２の主カラースプリッタ（３２）により前記励起光路（Ａ）内に入射結合されることを特徴とする、請求項１に記載の多色走査型顕微鏡。
【請求項４】
前記第１の主カラースプリッタ（３０）が、少なくとも前記第１の励起ビーム（１２）を前記励起光路（Ａ）内に入射結合させる第１の区画（３１）を入射結合手段として有し、第２の励起ビーム（１５）を前記励起光路（Ａ）内に入射結合させる第２の区画（３３）を有することを特徴とする、請求項１に記載の多色走査型顕微鏡。
【請求項５】
前記第１の波長および前記第２の波長とは異なる波長の更なる励起光（１９）を含む更なる励起ビーム（１８）を発すべく少なくとも一つの更なる光源（１７）が設けられ、
更なる入射結合手段（３５）が、前記更なる励起ビーム（１８）のために設けられ、且つ、前記更なる励起ビーム（１８）を、前記第１の励起ビーム（１２）を集光可能な前記第１の標本位置（７２）および前記第２の励起ビーム（１５）を集光可能な前記第２の標本位置（７４）とは異なる標本位置（７６）に集光可能なように、前記光学手段（３０、４０、６０）の少なくとも一部と共に設定および配置されていることを特徴とする、請求項１に記載の多色走査型顕微鏡。
【請求項６】
異なる標本位置（７２、７４、７６）から逆向きに放射される検出光（８２、８４、８６）を別々に検出すべく、少なくとも、励起ビームの個数に対応する個数の検出器（９２、９４、９６）が設けられていることを特徴とする、請求項１に記載の多色走査型顕微鏡。
【請求項７】
前記第１の光源が、第１の波長４８８ｎｍを有するアルゴンイオンレーザーであり、前記第２の光源が、第２の波長５６１ｎｍを有するダイオード励起固体（ＤＰＳＳ）レーザーであることを特徴とする、請求項１に記載の多色走査型顕微鏡。
【請求項８】
前記第１の主カラースプリッタが一つ以上のノッチフィルタを有していることを特徴とする、請求項１に記載の多色走査型顕微鏡。
【請求項９】
別個のスキャナが、前記励起光路（Ａ）内に入射結合される各励起ビーム毎に設けられていることを特徴とする、請求項１に記載の多色走査型顕微鏡。
【請求項１０】
前記スキャナ（４０）が、前記顕微鏡対物レンズ（５０）の瞳に配置されていることを特徴とする、請求項１に記載の多色走査型顕微鏡。
【請求項１１】
評価部（８０）が、前記検出器（９２、９４、９６）により提供される測定データを評価すべく設けられていることを特徴とする、請求項１に記載の多色走査型顕微鏡。
【請求項１２】
共焦点顕微鏡である、請求項１に記載の多色走査型顕微鏡。
【請求項１３】
前記共通ピンホール（６１）が、前記第１の検出器および第２の検出器の正面に配置されていることを特徴とする、請求項１に記載の多色走査型顕微鏡。
【請求項１４】
前記共通ピンホール（６１）が、前記第１の検出器および第２の検出器の直接正面に配置されていることを特徴とする、請求項１に記載の多色走査型顕微鏡。
【請求項１５】
前記共通ピンホール（６１）が、使用する異なる検出器の正面に配置されていることを特徴とする、請求項１に記載の多色走査型顕微鏡。
【請求項１６】
前記共通ピンホール（６１）が、前記第１の検出器および第２の検出器の正面、並びに前記検出光路の中間画像平面に配置されていることを特徴とする、請求項１に記載の多色走査型顕微鏡。
【請求項１７】
前記別個の光学要素が別個のレンズから成り、
各々の少なくとも一つの別個のレンズ（２３、２６、２９）が、前記励起光路内の各励起ビームおよび前記検出光路内の各検出ビームの少なくとも一つに対して設けられていて、異なる励起ビームおよび検出ビームの少なくとも一つに対して前記別個のレンズ（２３、２６、２９）の光軸がずれていることを特徴とする、請求項１に記載の多色走査型顕微鏡。
【請求項１８】
複数の別個のレンズ（２３、２６、２９）が、リソグラフィにより共通キャリア上に製造されていることを特徴とする、請求項１に記載の多色走査型顕微鏡。
【請求項１９】
（ｉ）前記励起光路内の各励起ビームに対して別個の光学要素がそれぞれ設けられていて、異なる励起ビームに対して当該別個の光学要素の光軸がずれていること、および
（ｉｉ）前記検出光路内の各検出ビームに対して別個の光学要素がそれぞれ設けられていて、異なる検出ビームに対して当該別個の光学要素の光軸がずれていること
のうちのどちらか一方または両方を特徴とする、請求項１に記載の多色走査型顕微鏡。
【請求項２０】
第１の波長の第１の励起光を含む第１の励起ビームを発する少なくとも一つの第１の光源と、前記第１の波長とは異なる第２の波長の第２の励起光を含む第２の励起ビームを発する第２の光源とを有し、前記第１の励起ビームおよび前記第２の励起ビームの少なくとも一つを励起光路内に入射結合させる入射結合手段を有し、前記第１の励起ビームおよび前記第２の励起ビームを標本まで誘導すると共に、前記標本により発せられた検出光を検出光路内に誘導する光学手段を有する多色走査型顕微鏡であって、
前記光学手段が少なくとも以下の構成要素、すなわち
前記第１の励起光および前記第２の励起光の少なくとも一つを、前記標本により発せられた前記検出光から分離する少なくとも一つの第１の主カラースプリッタと、
少なくとも前記第１の励起光および前記第２の励起光により前記標本を走査するスキャナと、
前記第１の励起光および第２の励起光を前記標本の上部または内部に集光させると共に、前記標本により発せられた前記検出光を前記検出光路の方向に誘導する顕微鏡対物レンズと、
前記励起光路内の各励起ビームおよび前記検出光路内の各検出ビームの少なくとも一つに対して設けられていて、異なる励起ビームおよび検出ビームの少なくとも一つに対して光軸が互いに平行にずれている各々の別個の光学要素と、
前記標本により前記検出光路内に発せられた前記検出光を検出する検出部とを有し、
前記入射結合手段および前記光学手段の少なくとも一部が、前記第１の波長を有する前記第１の励起ビームを第１の標本位置まで、および前記第２の波長を有する前記第２の励起ビームを前記第１の標本位置とは異なる第２の標本位置まで誘導すべく設定および配置されていて、
前記検出部が、前記第１の標本位置から発せられた前記検出光を検出する第１の検出器を有し、前記第２の標本位置から発せられた前記検出光を検出する第２の検出器を有し、
前記第１の波長を有する前記第１の励起ビームに照射された前記第１の標本位置から発せられた前記検出光および前記第２の波長を有する前記第２の励起ビームに照射された前記第２の標本位置から発せられた前記検出光、並びに場合に応じて更なる標本位置から発せられ得る検出光が単一の共通ピンホールを通過する
ことを特徴とする多色走査型顕微鏡。
【請求項２１】
（ｉ）前記励起光路内の各励起ビームに対して別個の光学要素がそれぞれ設けられていて、異なる励起ビームに対して当該別個の光学要素の光軸がずれていること、および
（ｉｉ）前記検出光路内の各検出ビームに対して別個の光学要素がそれぞれ設けられていて、異なる検出ビームに対して当該別個の光学要素の光軸がずれていること
のうちのどちらか一方または両方を特徴とする、請求項２０に記載の多色走査型顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、請求項１のプリアンブルに記載の多色走査型顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
そのような多色走査型顕微鏡は原理的には公知であって、以下の構成要素、すなわち第１の波長の第１の励起光を含む第１の励起ビームを発する少なくとも一つの第１の光源、および第１の波長とは異なる第２の波長の第２の励起光を含む第２の励起ビームを発する第２の光源、第１の励起ビームおよび／または第２の励起ビームを励起光路に入射結合させる入射結合手段、および第１の励起ビームおよび第２の励起ビームを標本まで誘導すると共に、標本により発せられた検出光を検出光路を通して検出部まで誘導する光学手段を有している。
【０００３】
光学手段は少なくとも以下の構成要素、すなわち一方である第１の励起光および／または第２の励起光を、標本により発せられた他方である検出光から分離する少なくとも一つの第１の主カラースプリッタと、少なくとも第１の励起光および第２の励起光により標本を走査するスキャナと、第１の励起光および第２の励起光を標本の上部または内部に集光させると共に、標本により発せられた検出光を検出部の方向に誘導する顕微鏡対物レンズとを有している。
【０００４】
最後に、一般的な多色走査型顕微鏡において、検出部が、標本により発せられた検出光を検出すべく設けられている。
【０００５】
蛍光顕微鏡検査において、特定の標本部分を染色可能な蛍光色素が用いられる。例えば、実質的に細胞核だけを染色する色素がある。他の色素は特に細胞骨格を着色する。これら特定の染色手段により、他の標本部分が視認可能になって干渉を引き起こすことなく個々の標本部分を観察することができる。多くの場合、色により標本部分の種類を明確に検出できるように、異なる仕方で染色された標本部分もまた顕微鏡内で異なる色で示す。基本的な作業は、蛍光顕微鏡が可能な限り色素を互いに分離するものである。このため、一方で励起光をうまく選択することができる。代替的または追加的に、検出スペクトルにより分離が影響を受ける場合がある。しかし、波長を選択することで必ずしも完全な分離が可能な訳ではない。
【０００６】
これについて、図１、図２を参照しながら二つの例を用いて説明する。各々の場合において、励起および発光スペクトル（検出スペクトルとも呼ばれる場合がある）を示し、いずれの場合もｎｍ単位の波長λに対して強度を任意の単位でプロットしている。
【０００７】
図１に、色素Ａｌｅｘａ４８８の励起スペクトルａ１および検出または発光スペクトルｅ１と共に、色素Ａｌｅｘａ６４７の励起スペクトルａ２および検出スペクトルｅ２を示す。図１から分かるように、特に検出または発光スペクトルｅ１、ｅ２の重なりは僅かである。すなわち、これらの色素は互いに良好に分離可能である。
【０００８】
Ａｌｅｘａ４８８の励起は、波長４８８ｎｍの光により実現可能である。当該波長において、第２の色素Ａｌｅｘａ６４７は実際に無視可能な程度にしか共励起しない。しかし、Ａｌｅｘａ６４７の発光は約６２０ｎｍからしか影響を受けない。Ａｌｅｘａ４８８の検出チャネルが４８９ｎｍ〜６１９ｎｍのスペクトル範囲に制限される場合、当該チャネルではＡｌｅｘａ４８８だけが検出される。
【０００９】
他方、Ａｌｅｘａ６４７は、波長６４２ｎｍで効率的に励起可能である。ここで検出を６４３ｎｍ以上の範囲に制限するならば、Ａｌｅｘａ４８８はこの範囲では発光しないため、Ａｌｅｘａ６４７だけが検出される。
【００１０】
第２の例は、同時観測中に分離不可能な色素ＤＡＰＩおよびＦＩＴＣに関するものである。
【００１１】
図２に、色素ＤＡＰＩの励起スペクトルａ３および検出スペクトルｅ３と共に、色素ＦＩＴＣの励起スペクトルａ４および検出スペクトルｅ４を示す。
【００１２】
ＤＡＰＩは、図２で分かるように、ＦＩＴＣを励起することなくＵＶ範囲で励起することができる。ＦＩＴＣが例えば４８８ｎｍで励起されたならば、４８８ｎｍ未満でＦＩＴＣが視認可能になることなくＤＡＰＩを検出することができる。しかし、ＦＩＴＣの発光は、極めて広いＤＡＰＩ発光の範囲で完全に生じるため、ＤＡＰＩ無しにＦＩＴＣを検出することは不可能である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
基本的に、従来技術において完全な分離を可能にする二つの方法が知られている。これら公知の方法の第１のものは、異なる色素で画像の記録を次々に実行するものである。次いで、例えば、最初にＤＡＰＩ色素だけを記録することができる。ＤＡＰＩの励起に際して色素ＦＩＴＣは励起していないため、ＤＡＰＩスペクトル全体を検出することができ、これは信号対雑音比に関して有利である。第１の記録の前後の時点で生じる第２の記録において、ＦＩＴＣは４８８ｎｍで励起される。当該波長は色素ＤＡＰＩを励起させないため、ＦＩＴＣもまたＤＡＰＩとは独立に検出することができる。このような連続的な記録を通じて色素を分離することができる。しかし、正味の画像記録時間は２倍になっている。また、例えばフィルタの切換に更に多くの時間が費されてしまう。結局のところ、当該方法は従って、最適に短い画像記録時間を実現するものではない。
【００１４】
第２の公知の方法において、後続する色素の分離は、同時記録により実現できる。脱混合とも呼ばれる当該方法において、色チャネルの信号を直接評価するのではなく、代わりに、各々のケースで１種類の色素だけが現れる、それらの線形結合を画像として用いる。数学的には、これは誤差がなければ常に可能である。当該方法は、１回記録するだけで済まないため原理的に高速である。しかし、システム的な短所がある。たとえ当該方法が理想的に動作しても、記録する毎に信号対雑音比が悪化する。例えば、色素Ａは色素Ｂのチャネルで信号を生成しないにもかかわらず、依然として雑音に寄与する。換言すれば、何かが除去された場所における雑音レベルが相対的に大きい。また、例えば仮定された色素のスペクトルが厳密には正確でないため、および／または記録に際して例えば飽和した画像領域等の非線形性が生じるため、往々にして分離が完全に管理されない。
【００１５】
本発明の目的は、短い測定時間内に異なる色素により発せられた光の良好な分離を可能にする多色走査型顕微鏡を提供することであると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上述の目的は、請求項１の特徴を有する多色走査型顕微鏡により実現される。
【００１７】
本発明による上述の種類の多色走査型顕微鏡は、入射結合手段および当該光学手段の少なくとも一部が、第１の波長を有する第１の励起ビームを第１の標本位置まで、および第２の波長を有する第２の励起ビームを第１の標本位置とは異なる第２の標本位置まで誘導すべく設定および配置されていて、検出部が、第１の標本位置から発せられた光を検出する第１の検出器および第２の標本位置から発せられた光を検出する第２の検出器を有している点で更に発展している。
【００１８】
多点走査型顕微鏡とも呼ばれる、本発明による多色走査型顕微鏡の好適な変形例について、特に従属請求項および添付図面を参照しながら以下に述べる。
【００１９】
多点励起の原理を多色顕微鏡検査の原理と組み合わせることが本発明の発想の中核をなすものと考えられる。
【００２０】
上述の組み合わせにより、走査型顕微鏡の所与の走査時間で標本の異なる色素のスペクトル分離が改良され、且つ所望または必要なスペクトル分離を行っても走査時間が短縮される点で顕著な利点が得られる。
【００２１】
本明細書に記述する本発明の意味による励起光は電磁放射であり、特にスペクトルの赤外、可視、および紫外領域を意味している。原理的に、所望の強度で必要な電磁放射を提供する全ての放射源は光源として設けられていてよい。特に好適には、レーザー、例えば波長が４８８ｎｍのアルゴンイオンレーザー、または波長が５６１ｎｍのＤＰＳＳレーザーが用いられる。しかし、原理的には他の発光ダイオード、または他の照射手段を用いてもよい。
【００２２】
多色または多点走査型顕微鏡が、原理的に知られている全ての利点および特性を有する共焦点顕微鏡となるように共焦点絞りを検出器の正面に配置することは特に有用である。
【００２３】
絞りは、共焦点平面に置かれているかまたは近接していれば共焦点であるとされる。用語「共焦点平面」は、顕微鏡対物レンズの標本側焦点面に光学的に共役な検出光路の平面に対して用いる。検出器の正面の共焦点絞りは、当該検出器の吸光を標本位置における小さい目標範囲に制限する。
【００２４】
検出対象の電磁放射に対して充分に感度が高く、充分に良好な信号対雑音比を有する検出器は全て原理的に検出器として用いることができる。原理的に、半導体検出器をこの目的に用いることができる。しかし、蛍光顕微鏡検査の主な利用分野では、カウンティングレートが比較的小さい事実により光電子増倍管が用いられることが多い。
【００２５】
本発明の例示的な実施形態において、単に第１の、従って唯一の、主カラースプリッタが設けられている、当該第１の主カラースプリッタはまた、単に主カラースプリッタと表記する場合がある。
【００２６】
また、第１の、および可能な更なる主カラースプリッタはまた、入射結合手段であっても、またはその一部を形成していてもよい。
【００２７】
特に好適な例示的実施形態において、入射結合手段は、第１の励起ビームを第１の角度で励起光路に入射結合し、且つ第２の励起ビームを第１の角度とは異なる第２の角度で励起光路に入射結合すべく設けられている。第１の励起光および第２の励起光は従って、空間的に分離可能である。原理的に、第１のおよび第２の励起光、恐らく更なるスペクトル成分、従って特に波長固有の更なる励起光を励起光路に入射結合可能な、全ての光学部品を入射結合手段として用いることができる。原理的に、回析および／または屈折部品をこの目的に用いることができる。鏡または半透明鏡が特に好適に用いられる。
【００２８】
原理的に、本発明は、一つの主カラースプリッタだけが存在する構造で実現することができる。これらの変形例において、レーザーの異なる組み合わせに対して、異なる主カラースプリッタもまた各々利用可能なように維持されなければならない。主カラースプリッタは、有利な特徴として、所望のスペクトル特性を提供する複数のノッチフィルタを備えていてよい。
【００２９】
更に特に有利な変形例において、第１の主カラースプリッタ以外に、第２の主カラースプリッタが設けられていて、励起光路内に、第１の励起ビームは第１の主カラースプリッタを用いて入射結合され、第２の励起ビームは第２の主カラースプリッタを用いて入射結合される。当該変形例は、異なるレーザー源の各々の組み合わせに対して特別な主カラースプリッタを必要としないことが利点である。
【００３０】
異なる励起光源が原理的には任意に相互結合可能な更なる変形例は、第１の主カラースプリッタが入射結合手段として用いられ、且つ少なくとも第１の励起ビームを励起光路に入射結合する第１の区画、および第２の励起ビームを励起光路に入射結合する第２の区画を有していることを特徴とする。当該例示的実施形態における第１の主カラースプリッタは従って、区画化された要素であって、原理的には励起光の各色用に別個の主カラースプリッタを含んでいる。原理的には、このような構造により、異なる励起光源を主カラースプリッタの各々割り当てられた区画と共に光路内に移動させ、例えばピボット回転させて、再び光路から出すことができる。
【００３１】
本発明による顕微鏡で用いる励起光の異なる色の数は、原理的には制限されないが、実際に利用可能な構造スペースにより制限されるだけである。例えば、更なる有利な変形例において、第１の波長および第２の波長とは異なる（複数の）波長の更なる励起光により更なる励起ビームを発すべく少なくとも一つの更なる光源が設けられ、次いで当該更なる（複数の）励起ビームに有用な更なる入射結合手段が設けられていてよく、当該入射結合手段は、当該更なる（複数の）励起ビームを各々異なる更なる標本位置に集光可能なように、光学手段の少なくとも一部と共に適応的に配置されている。当該一つまたは複数の標本位置は、第１の励起ビームを集光可能な第１の標本位置および第２の励起ビームを集光可能な第２の標本位置とは異なっている。
【００３２】
この状況において、異なる標本領域により逆向きに放射される検出光を別個に検出すべく、少なくとも励起ビームの数に対応する数の検出器を設けることもまた有用である。
【００３３】
原理的には、同一のスキャナを用いて異なる色、従って第１の、第２のおよび更なる励起光の標本を走査する構造が好適である。
【００３４】
スキャナは特に、有利な特徴として、顕微鏡対物レンズの瞳に配置されている。当該構成は、テレセントリック構成とも呼ばれ、標本平面が光学光路に垂直に画定されていれば、励起ビームが標本平面へ常に垂直に入射（impinge）する利点がある。
【００３５】
異なる色に対して空間的に異なる励起点がずれているため、単一のスキャナだけを用いる場合、異なる色に対して記録される画像の空間的ずれも必然的に生じる。このずれは、原理的には評価コンピュータを用いて算出することができる。
【００３６】
特に異なる色の励起点を有する取得画像の空間的なずれの縮小を管理するために、評価部を設けることが有用である。当該評価部は一般に、検出器から送られた測定データを評価すべく機能する。
【００３７】
しかし、原理的には、このように得られた画像は、単一の励起点を有する励起の場合に得られた画像と比較してより小さい。実際、これらの大きさは異なる励起点で記録された全ての画像に共通の重なり合う部分と同程度の大きさに過ぎない。
【００３８】
これらの短所は、励起光路に入射結合される各励起ビーム用に別個のスキャナが設けられた本発明の更なる有利な実施形態では回避できる。
【００３９】
異なる励起点について得られた画像が可能な限り互いに比較可能であることを保証すべく、検出器の正面で用いられるピンホールは、可能な限りサイズが等しくなければならない。可変ピンホールが特に好適に用いられる。変化率については典型的には１：６０であってよい。例えば、直径は１０〜６００μｍの範囲で変化し得る。直径に関する調整の精度については、典型的には直径の１０％より小さい。また、例えば丸いピンホールは直径に依らず可能な限り丸い、または丸いままであるような幾何学的要件がピンホールに課される。原理的には正方形のピンホールも用いることができる。これらは従って、正方形の辺の長さに依らず、正方形をなしていなければならない。偏心については、正方形の辺の長さ、または円形ピンホールの直径の１０％未満でなければならない。
【００４０】
マルチピンホール構成を用いる場合、全てのピンホールについて上述の要件を同時に満たす必要がある。従って、多くの場合有用且つ好適であるように、ピンホールの直径が可変ならば、全てのピンホールの直径が可能な限り同期的に調整可能であることを保証する必要がある。
【００４１】
原理的には、互いに独立に調整可能な個々のピンホールを用いることもできる。その場合同期化を調整する必要がある。
【００４２】
この点で、本発明による顕微鏡の実施形態は特に好適であり、第１の標本位置から発せられた光および第２の標本位置から発せられた光、特に照射された異なる標本位置から発せられた光は全般に、同一の共通なピンホールを通過し、特に共焦点を有する同一の共通なピンホールを通過する。これらの変形例は、一つのピンホールだけを調整すればよいため、照射された異なる標本位置についての部分的光路の全てについて、ピンホールが調整されたならば自動的且つ自然に同期化が生じることを特徴とする。従って、高価且つ連携的に調整可能な複数のピンホールも、複数の個別に調整可能且つ高価な別個のピンホールも必要としない。総合的な較正もまた不要である。
【００４３】
ピンホールという用語を本出願の範囲内で引き続き使用する。
【００４４】
共通ピンホールは、有利な特徴として、検出光路の中間画像平面に配置されていてよい。共通ピンホールは特に好適には、第１の検出器および第２の検出器の正面、好適には直接正面、特に一般には使用する異なる検出器の正面に配置されていてよい。照射された異なる標本位置から発せられた光が通過するピンホールもまた共通ピンホールとして記述する。
【００４５】
本発明による顕微鏡の変形例は、異なる標本位置から入射した光ビームを同一のピンホールを通して誘導可能な適当な光路を提供するため有利であり、励起光路内の各励起ビームおよび／または検出光路内の各検出ビームについて、各々別個の光学手段、特に少なくとも一つの別個のレンズが設けられている。異なる励起ビームおよび／または検出ビームに用いる別個の光学手段、特に別個のレンズの光軸は好適には互いに平行にずれている。
【００４６】
従って特定の照射された標本位置から発せられた検出光を検出ビームと記述する。
【００４７】
このような部分レンズの製造は、連携的に調整可能な複数のピンホールの製造に比べてより簡単且つより安価である。例えば、１パーセント台の小さい焦点距離公差が標準的である。各部分ビームから「見える」ピンホールの光学的サイズは従って当該範囲内だけで同様に変動する。共通のキャリア上にリソグラフィにより製造された特に好適なレンズを用いることができる。このような製造工程もまた高い精度を可能にする。
【００４８】
本発明による顕微鏡の好適な実施形態において、特に励起光路および／または検出光路の等しい位置で、個々の照射された標本位置の別個の部分光路の別個のレンズは、リソグラフィにより共通キャリア上に製造されたレンズである。
【００４９】
光源（群）から標本に至るまでの励起光の経路を励起光路と記述し、これに対応して標本から検出器（群）までの検出光の経路を検出光路と記述する。
【００５０】
励起ビームおよび検出ビームを、励起および／または検出光路の別個の部分光路と記述する。
【００５１】
共通ピンホールの使用は、言わば、比較的実現がより高価な複数のピンホールの正確な要件を、製造がより容易な複数の別個のレンズにもたらすものである。
【発明の効果】
【００５２】
別個のレンズの重要な技術的利点は、異なる標本位置から入射するビームが、互いに平行な視準ビームに変換され、次いで共通ピンホールの正面のレンズにより当該共通ピンホールに正確に集光できることである。
【００５３】
本発明の更なる利点および特徴は、添付図面を参照しながら以下に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】蛍光色素Ａｌｅｘａ４８８およびＡｌｅｘａ６４７の励起および検出スペクトルを示すグラフである。
【図２】蛍光色素ＤＡＰＩおよびＦＩＴＣの励起および検出スペクトルを示すグラフである。
【図３】従来技術による多色走査型顕微鏡の例示的実施形態を示す説明図である。
【図４】本発明による多色走査型顕微鏡の第１の例示的実施形態を示す説明図である。
【図５】本発明による多色走査型顕微鏡の第２の例示的実施形態を示す。
【図６】本発明による多色走査型顕微鏡の第３の例示的実施形態を示す。
【図７】本発明による多色走査型顕微鏡の第３の例示的実施形態を示す。
【図８】本発明による多色走査型顕微鏡の第３の例示的実施形態を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
一般的な走査型顕微鏡について図３を参照しながら説明する。同図に示す走査型顕微鏡１００は必須部品、すなわち第１の光源１１および第２の光源１４、主カラースプリッタ３０、スキャナ４０、顕微鏡対物レンズ５０、および検出部９０を有している。
【００５６】
第１の光源１１は、第１の波長を有する第１の励起光１３を含む第１の励起ビーム１２を発する。これに対応して、第２の光源１４は、第１の波長とは異なる第２の波長を有する第２の励起光１６を含む第２の励起ビーム１５を発する。第１の光源１１の第１の励起光１３は、レンズ２１および入射結合手段２０としての鏡２０を介して、更なる入射結合手段としての半透明鏡２５の上に誘導される。当該半透明鏡２５を介して、第１の励起光１３は、顕微鏡の励起光路に入射結合される。第２の励起光１６は、レンズ２４から半透明鏡２５の方向に誘導される。第２の励起光１６の少なくとも一部は、当該半透明鏡２５により伝達されて、第１の励起光１３と共に、主カラースプリッタ３０に到着する。
【００５７】
主カラースプリッタ３０は、スキャナ４０を介して第１の励起光１３および第２の励起光１６を顕微鏡対物レンズ５０の方向に誘導する。スキャナに支援されて、第１の励起光１３および第２の励起光１６は、各々標本７０の同一試料領域上に誘導される。以下で一般に励起光と称する第１のおよび第２の励起光の入射に応答して、標本７０は光を発するが、これは特に、励起光に比べて波長がより大きい、換言すればエネルギーが低い、蛍光であってよい。標本７０により発せられた当該光は、同一光学部品を介して、従って顕微鏡対物レンズ５０およびスキャナ４０を介して主カラースプリッタ３０へ誘導される。
【００５８】
いずれの場合も、標本７０により発せられた光の成分は、入射励起光よりも波長が大きく、主カラースプリッタ３０により伝達され、レンズ６０を介して共焦点ピンホール６１上に集光される。共焦点ピンホール６１を通過する放射光はレンズ６３を介してビームスプリッタ６４上へ誘導され、標本により発せられた光はここで再度スペクトル分割される。生じた２個の部分は次いで、検出部９０内の第１の検出器９２および第２の検出器９４上へ誘導される。フィルタ９３が検出器９２の正面に配置され、フィルタ９５が検出器９４の正面に配置されている。フィルタ９３および９５は、不要なスペクトル成分を除去すべく機能する。検出器９２および９４の出力は、典型的にはコンピュータである評価部８０に接続されている。図３に示す種類の顕微鏡１００により、先に図１、図２を参照しながら記述したように測定を行うことができる。
【００５９】
本発明による多色走査型顕微鏡２００の第１の例示的実施形態について、図４を参照しながら説明する。
【００６０】
一般に、同一構成要素または同一効果を有する構成要素は、各々の場合において図面内で同一参照符号により識別される。以下、各々の実施形態に特徴的な個々の異なる特徴のみ記述する。
【００６１】
図３の従来技術による顕微鏡１００とは異なり、図４の本発明による顕微鏡２００では、入射結合手段２０、２５、従って鏡２０および半透明鏡２５は、第１の励起ビーム１２および第２の励起ビーム１５が異なる角度で励起光路に入射結合するように配置および構成されている。この結果、第１の励起ビーム１２および第２の励起ビーム１５もまた、異なる角度で主カラースプリッタ３０、スキャナ４０および顕微鏡対物レンズ５０に入射し、最終的に、異なる試料領域（標本７０の標本位置とも称する）に集光されることになる。第１の励起ビーム１２は第１の試料領域７２上に、第２の励起ビーム１５は第２の試料領域７４上に集光される。第１の試料領域７２により発せられた光８２は、同一光学部品、従って顕微鏡対物レンズ５０およびスキャナ４０を通って検出光路の方向に誘導されて主カラースプリッタ３０へ戻り、主カラースプリッタ３０は次いで、エネルギーが低いスペクトル部分を伝達する。その後、第１の標本位置７２により発せられた光８２は、レンズ６０、共焦点ピンホール６２、鏡６６、およびフィルタ９５を通過して検出器９２に到達する。全く同様に、第２の標本位置７４により発せられた光８４は、顕微鏡対物レンズ５０、スキャナ４０、主カラースプリッタ３０、レンズ６０、共焦点ピンホール６５、およびフィルタ９３を介して第２の検出器９４まで誘導される。
【００６２】
本発明の図３に示す実施形態で重要な点は、第１の励起ビーム１２および第２の励起ビーム１５が異なる角度の励起光路に入射結合され、最終的には、異なる標本位置、すなわち第１の標本位置７２および第２の標本位置７４に集光されるように入射結合手段２０、２５が変更されていることである。また、異なる励起光に応答してこれらの異なる標本位置から発せられた放射光８２、８４が、異なる検出器、すなわち第１の検出器９２および第２の検出器９４の支援により検出される点が重要である。
【００６３】
本発明による多色走査型顕微鏡３００の第２の変形例について、図５を参照しながら記述する。図４の例示的実施形態との比較において図５の例示的実施形態の基本的な差異は、第１の励起ビーム１２および第２の励起ビーム１５がもはや同一の第１の主カラースプリッタ３０に入射結合されず、代わりに、第１の励起ビーム１２は第１の主カラースプリッタ３０により、第２の励起ビーム１５は第２の主カラースプリッタ３２により光路に入射結合される。入射結合手段２０、２５はこの目的のため、図４に示す構造から同様に離れるように、すなわち第２の励起ビーム１５がもはや鏡２５を通過する必要がないように配置されている。従って鏡２５はまた、図５の例示的実施形態において全反射鏡であってよい。原理的に、標本７０上への異なる焦点の生成に関して第２の主カラースプリッタ３２を使用する上述の方式により、図４に示す実施形態と基本的に同じ効果が得られる。
【００６４】
差異は実際的な動作に見ることができる。図４の例では、第１の光源１１と第２の光源１４の各々の組み合わせにおいて一般に、適切な特別の第１の主カラースプリッタ３０が必要であるのに対し、図５の例ではもはや必要ではない。ここでは原理的に、第２の主カラースプリッタ３２を有する第２の光源１４は、別の異なる波長の励起光を発する別の光源１４、および別の主カラースプリッタで代替可能である。第１の標本位置７２および第２の標本位置７４により発せられた光８２、８４の検出に関して、第１の検出器９２および第２の検出器９４の支援により、図５の例は図４の変形例と比べて差異がない。
【００６５】
本発明による多色走査型顕微鏡の第３の例示的実施形態について、図６、７および８を参照しながら最後に説明する。図６に励起光路の主要部分、図７に検出光路Ｄの第１の部分、図８に検出光路Ｄの第２の部分を示す。
【００６６】
図６に示す変形例において、第１の光源１１および第２の光源１４以外に、第１のおよび第２の波長とは異なる第３の波長を有する第３の励起光１９を含む更なる第３の励起ビーム１８を発する更なる第３の光源１７が設けられている。
【００６７】
図６に示す例示的実施形態の、これまで述べてきた変形例との比較における基本的差異は、区画化された第１の主カラースプリッタ３０を用いる点である。主カラースプリッタ３０は、第１の区画３１、第２の区画３３、および第３区画３５を有している。第１の区画３１は第１の励起光１３を入射結合させ、第２の区画３３は第２の励起光１６を入射結合させ、第３区画３５は第３の励起光１９を入射結合させるべく機能する。光路の幾何学的形状の詳細を図６に見ることができる。光軸が互いに平行にずれている各々の、特に別個のレンズ２３、２６、２９の支援により、これらの励起ビームは最初に第１の焦点面２２に集光され、そこから更なるレンズ２７を介してスキャナ４０上へ進み、そこから顕微鏡対物レンズ５０上へ進み、顕微鏡対物レンズ５０により励起ビーム１２、１５、１８が第１の標本位置７２、第２の標本位置７４、または第３の標本位置７６に集光される。
【００６８】
励起光の入射に応答して、標本位置７２、７４、７６は、図７に示すように検出光路Ｄとして光８２、８４、８６を発する。標本位置７２、７４、７６により発せられた光８２、８４、８６は次いで、図４、５を参照しながら説明した例示的実施形態と同様に、原理的には第１の主カラースプリッタ３０へ戻る同一の光路を通る。そこで、光ビーム８２、８４、８６のエネルギーがより低いかまたは波長がより高い部分は各々区画３１、３３および３５を通して伝達される。
【００６９】
最後に、図８は、標本位置７２、７４、７６により発せられた光８２、８４、８６がレンズ６０により共焦点ピンホール６１上に集光され、そこからフィルタ９３、９５、９７を介して検出器９２、９４、９６上に入射する様子を示す。本発明において本質的な点は、各々異なる試料領域７２、７４、７６が、異なる波長の励起光により照射され、これらの試料領域７２、７４、７６により逆向きに放射された光８２、８４、８６は次いで異なる検出器９２、９４、９６により各々の場合に検出される。図６〜８の例示的実施形態の特色は、異なる標本位置７２、７４、７６により発せられた検出対象の光８２、８４、８６が同一のピンホール６１を通して誘導される点である。従ってピンホール６１がよりうまく利用される。
【００７０】
図４〜８に示す例において、別個のレンズ２３、２６、２９により共通ピンホール６１の使用が可能になる。これらは、特に図７から分かるように、中間画像平面２２に入射して標本位置７２、７４、７６に戻るビームを、各々が図７のビームスプリッタ３０の右側、および図８の左端で互いに平行なビーム８２、８４、８６上へ視準する。ビーム８２、８４、８６が互いに平行であるという事実により、これらのビームをレンズ６０により共通ピンホール６１上へ集光することができる。
【符号の説明】
【００７１】
Ａ  励起光路
Ｄ  検出光路
ａ１  励起スペクトルＤＡＰＩ
ａ２  励起スペクトルＦＩＴＣ
ａ３  励起スペクトルＡｌｅｘａ４８８
ａ４  励起スペクトルＡｌｅｘａ６４７
ｅ１  発光スペクトルＤＡＰＩ
ｅ２  発光スペクトルＦＩＴＣ
ｅ３  発光スペクトルＡｌｅｘａ４８８
ｅ４  発光スペクトルＡｌｅｘａ６４７
λ  波長
１１  第１の光源
１２  第１の励起ビーム
１３  第１の励起光
１４  第２の光源
１５  第２の励起ビーム
１６  第２の励起光
１７  更なる光源
１８  更なる励起ビーム
１９  更なる励起光
２０  入射結合手段
２１  レンズ
２２  焦点面
２３  レンズ
２４  レンズ
２５  更なる入射結合手段
２６  レンズ
２７  レンズ
２９  レンズ
３０  第１の主カラースプリッタ
３１  第１の主カラースプリッタ３０の第１の区画
３２  第２の主カラースプリッタ
３３  第１の主カラースプリッタ３０の第２の区画
３５  第１の主カラースプリッタ３０の第３区画
４０  スキャナ
３０，４０，５０  光学手段
５０  顕微鏡対物レンズ
６０  レンズ
６１  ピンホール
６２  ピンホール
６３  レンズ
６４  ビームスプリッタ
６５  ピンホール
６６  鏡
７０  標本
７２  第１の標本位置
７４  第２の標本位置
７６  更なる標本位置
８０  評価部
８２  標本位置７２により発せられた検出光
８４  標本位置７４により発せられた検出光
８６  標本位置７６により発せられた検出光
９０  検出部
９２  第１の検出器
９３  フィルタ
９４  第２の検出器
９５  フィルタ
９６  第３検出器
９７  フィルタ
１００  多色走査型顕微鏡
２００  多色走査型顕微鏡
３００  多色走査型顕微鏡
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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