(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光シート顕微鏡のための光シートを生成するビーム整形アセンブリであって、
コリメート光を生成するための装置（１）を含み、
前記コリメート光（２）のビーム経路内において、
空間領域内に配置され、非回折限界ビーム（７、７．１）を生成するように構成された回折装置（４、４．１、４．２、４．３）と、
前記非回折限界ビーム（７、７．１）の周波数領域へのフーリエ変換及びマッピングのための集光機能であって、該集光機能が、前記回折装置（４、４．１、４．２）自体により実施されるか、又は前記回折装置（４、４．１、４．２、４．３）の下流に設置され、且つ少なくとも１つの集光光学要素（５．１、５．２、５．３、５．４）を含む集光光学ユニット（５）により実施される、前記集光機能と、
前記周波数領域内に配置され、前記非回折限界ビーム（７、７．１）を修正された非回折限界ビーム（１０、１０．１）に変換するように構成された修正装置（８、８．１、８．２、８．３）と、
前記修正された非回折限界ビーム（１０、１０．１）の前記周波数領域からの逆フーリエ変換のための更なる集光機能であって、該更なる集光機能が、前記修正装置（８、８．１、８．２）自体により実施されるか、又は前記修正装置（８、８．１、８．２、８．３）の下流に設置され、且つ少なくとも１つの集光光学要素（９．１、９．２）を含む更なる集光光学ユニット（９）により実施される、前記更なる集光機能とをさらに含む、ビーム整形アセンブリにおいて、
前記修正された非回折限界ビーム（１０、１０．１）は、Ｎ個の第一の最大強度を含み（ここで、Ｎ≧２である）、前記Ｎ個の第一の最大強度は、前記修正された非回折限界ビーム（１０、１０．１）の伝搬方向に垂直な直線に沿って存在し、
前記光シートを生成するために、
前記修正された非回折限界ビーム（１０、１０．１）を走査するためのスキャナであって、前記修正された非回折限界ビーム（１０、１０．１）の走査が、前記直線に平行に、かつ前記伝搬方向に垂直に行われる、前記スキャナが設けられるか、または
前記修正された非回折限界ビーム（１０、１０．１）の前記伝搬方向に垂直な前記直線に沿った前記Ｎ個の第一の最大強度の数が、Ｎ≧１００であり、前記周波数領域内に配置され、瞳の半分を覆う絞りが設けられることを特徴とする、ビーム整形アセンブリ。
【請求項２】
環状絞り、アキシコン（４．３）、又は空間光変調器（ＳＬＭ）（４．１、４．２）を含む回折装置（４）を特徴とする、請求項１に記載のビーム整形アセンブリ。
【請求項３】
前記修正装置（８）は位相要素（８．１、８．２、８．３）を含み、該位相要素の中に、前記修正された非回折限界ビーム（１０、１０．１）の前記伝搬方向に垂直な直線に沿ってＮ個の第一の最大強度を有する前記修正された非回折限界ビーム（１０、１０．１）を生成するための位相関数がコーディングされており、前記位相要素（８．１、８．２、８．３）は、好ましくは位相板（８．３）又は空間光変調器（ＳＬＭ）（８．１、８．２）により形成されることを特徴とする、請求項１又は２に記載のビーム整形アセンブリ。
【請求項４】
光シート顕微鏡のための光シートを生成するビーム整形アセンブリであって、
コリメート光を生成するための装置（１）を含み、
前記コリメート光（２）のビーム経路内において、
空間領域内に配置され、修正された非回折限界ビーム（１０、１０．１）を生成するように、且つその周波数領域へのフーリエ変換のために構成された回折及び修正装置（４．４）、好ましくは空間光変調器（ＳＬＭ）と、
前記修正された非回折限界ビーム（１０、１０．１）の前記周波数領域からの逆フーリエ変換のための集光機能であって、該集光機能は、前記回折及び修正装置（４．４）自体により実施されるか、又は前記回折及び修正装置（４．４）の下流に設置され、且つ少なくとも１つの集光光学要素（９）を含む集光光学ユニットにより実施される、前記集光機能とをさらに含む、ビーム整形アセンブリにおいて、
前記修正された非回折限界ビーム（１０、１０．１）は、Ｎ個の第一の最大強度を含み（ここで、Ｎ≧２である）、前記Ｎ個の第一の最大強度は、前記修正された非回折限界ビーム（１０、１０．１）の伝搬方向に垂直な直線に沿って存在し、
前記光シートを生成するために、
前記修正された非回折限界ビーム（１０、１０．１）を走査するためのスキャナであって、前記修正された非回折限界ビーム（１０、１０．１）の走査が、前記直線に平行に、かつ前記伝搬方向に垂直に行われる、前記スキャナが設けられるか、または
前記修正された非回折限界ビーム（１０、１０．１）の前記伝搬方向に垂直な前記直線に沿った前記Ｎ個の第一の最大強度の数が、Ｎ≧１００であり、前記周波数領域内に配置され、瞳の半分を覆う絞りが設けられることを特徴とする、ビーム整形アセンブリ。
【請求項５】
前記非回折限界ビーム（７、７．１）は、ベッセルビーム、分割ベッセルビーム、又はマシュービームである、請求項１〜３の何れか一項に記載のビーム整形アセンブリ。
【請求項６】
前記コリメート光を生成するための装置（１）は、レーザ源を含むレーザモジュールを含む、請求項１〜５の何れか一項に記載のビーム整形アセンブリ。
【請求項７】
回折装置（３、３．１、３．２）を照明するための手段を特徴とする、請求項１〜６の何れか一項に記載のビーム整形アセンブリ。
【請求項８】
前記周波数領域内、又は前記修正装置（８、８．１、８．２、８．３）の上流の更なる周波数領域内、又は回折及び修正装置（４．４）の周波数領域内の不要な光をフィルタ処理するための絞り（６）を特徴とする、請求項１〜７の何れか一項に記載のビーム整形アセンブリ。
【請求項９】
ビーム整形、特に光シート顕微鏡検査のための光シートを生成するための方法であって、
コリメート光（２）のビーム経路内の回折装置（４、４．１、４．２、４．３）によって非回折限界ビーム（７、７．１）を生成するステップと、
前記非回折限界ビーム（７、７．１）を周波数領域にフーリエ変換し、且つ強度分布を決定するステップと、
修正された非回折限界ビーム（１０、１０．１）の伝搬方向に垂直な直線に沿った第一の最大強度の数Ｎ（ここで、Ｎ≧２である）と、その間隔とを考慮して前記周波数領域内の前記修正された非回折限界ビーム（１０、１０．１）のスペクトルを計算することにより、前記周波数領域内の前記修正された非回折限界ビーム（１０、１０．１）の前記強度分布を決定するステップと、
前記周波数領域内の前記修正された非回折限界ビーム（１０、１０．１）の位相関数を決定するステップと、
前記周波数領域内にある修正装置（８、８．１、８．２、８．３）内の前記位相関数を使用することにより、前記修正された非回折限界ビーム（１０、１０．１）を生成するステップとを含み、
前記光シートの生成が、
前記修正された非回折限界ビーム（１０、１０．１）を走査するためのスキャナであって、前記修正された非回折限界ビーム（１０、１０．１）が、Ｎ個の第一の最大強度（ここで、Ｎ≧２である）が沿って形成される、前記修正された非回折限界ビーム（１０、１０．１）の伝搬方向に垂直な直線に平行に走査される、前記スキャナによって行われるか、または
数がＮ≧１００である、前記修正された非回折限界ビーム（１０、１０．１）の前記伝搬方向に垂直な前記直線に沿った前記Ｎ個の第一の最大強度と、前記周波数領域内に配置され、瞳の半分を覆う絞りとによって行われる、方法。
【請求項１０】
光シート顕微鏡検査用アセンブリであって、
サンプル（１５）を配置するためのサンプル面（１８）と、
前記サンプル（１５）のストリップを照明し、且つ前記サンプル（１５）の前記ストリップ内で蛍光を励起させるための、請求項１〜８の何れか一項に記載のビーム整形アセンブリを含む照明装置と、
前記蛍光を検出するためのセンサ（２０）を含み、前記サンプル（１５）の前記ストリップの前記蛍光を前記センサ（２０）に結像させるための結像光学ユニットを含み、且つ光シートに対して７０°〜１１０°の角度範囲からの角度をなす検出軸を含み、特に前記光シートに垂直な検出軸を含む検出装置（１９）とを含む、アセンブリ。
【請求項１１】
前記検出装置は共焦点検出のための絞りを含む、請求項１０に記載の光シート顕微鏡検査用アセンブリ。
【請求項１２】
前記絞りは、前記センサ（２０）のローリングシャッタとして形成される、請求項１１に記載の光シート顕微鏡検査用アセンブリ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コリメート光を生成するための装置を含むビーム整形アセンブリであって、コリメート光のビーム経路内において、空間領域では非回折限界ビームを生成するための回折装置と、周波数領域では非回折限界ビームを修正するための修正装置とを含むビーム整形アセンブリに関する。本発明は、ビーム整形のための方法と、サンプルステージを含む光シート顕微鏡検査用アセンブリであって、サンプルのストリップを照明し、且つ蛍光を励起するための光シートを生成するための本発明によるビーム整形アセンブリを含む照明装置を含み、かつ蛍光を検出するためのセンサと、サンプルにより発せられた蛍光をセンサに結像させるための結像光学ユニットと、光シートに垂直な検出軸を含む検出装置とを含むアセンブリとにさらに関する。
【背景技術】
【０００２】
照明ビーム経路と検出ビーム経路とが相互に対して実質的に垂直に配置され、それによってサンプルが結像又は検出レンズの焦点面における、すなわちその光軸に垂直な光シートで照明される顕微鏡は、選択的平面照明顕微鏡検査（ＳＰＩＭ：ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｌａｎｅ  ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、すなわち光シート顕微鏡検査によるサンプル調査のために設計される。光シートで照明することにより、光シートで照明されたサンプルのストリップ内に蛍光が生成される。この目的のために、サンプルは蛍光に適した追加の染料を含むことができる。３次元サンプルが異なる深度の個々の平面内の点ごとに走査されて、その工程中に得られた画像情報がその後合成されて、サンプルの３次元画像を形成する共焦点レーザ走査型顕微鏡検査（ＬＳＭ：ｌａｓｅｒ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）と異なり、ＳＰＩＭ技術は、広域顕微鏡に基づくものであり、サンプルの個々の平面を通る光学セクションに基づいてサンプルを視覚的画像として表現することを可能にする。
【０００３】
ＳＰＩＭ技術の利点は、とりわけ、画像情報の捕捉速度が速いこと、生体サンプルの褪色リスクが低いこと、及びサンプル中への侵入焦点深度が深いことである。
光シート顕微鏡検査の主な利用分野の１つは、数１００μｍ〜数ミリメートルの大きさを有する中規模の有機体の結像である。前記有機体は、一般に、アガロース中に埋め込まれ、それがガラス毛細管内に入れられる。ガラス毛細管は、水の充満したサンプルチャンバ内に上から又は下から導入され、サンプルが毛管からわずかに押し出される。アガロース中のサンプルは光シートで照明され、蛍光は、光シートに垂直に、したがって光シート光学装置にも垂直に位置付けられた検出レンズによってカメラに結像され、これは、非特許文献１又は特許文献１で説明されている。
【０００４】
光シート顕微鏡法のこの方法には３つの主な欠点がある。第一に、検査対象のサンプルが比較的大きく、典型的なサンプルは発生生物学からのものである。さらに、サンプル調製及びサンプルチャンバの寸法から、光シートは比較的厚く、したがって実現可能な軸方向の解像度が限定される。加えて、サンプル調製が複雑であり、標準的サンプル調製及び蛍光顕微鏡検査で慣例的な方法によるセル上への標準的なサンプル取付けと両立しない。
【０００５】
これらの限定を一部回避するために、近年、新たな光シート顕微鏡装検査が実現されており、この場合、照明レンズと検出レンズとが相互に垂直でα１＝α２＝４５°の角度で上からサンプルに向けられる。このようなＳＰＩＭ装置は、例えば特許文献２及び特許文献３に開示されている。
【０００６】
図１ａは、このような正立４５°ＳＰＩＭの配置を概略的に示す。サンプルＰ１は、その中でペトリ皿Ｐ２の底に置かれている。ペトリ皿は、液体Ｐ３、例えば水で満たされ、２つのＳＰＩＭレンズ、すなわち照明レンズＰ４と検出レンズＰ５とが液体Ｐ３中に浸漬される。このようなアセンブリでは、より薄い光シートＰ６を生成できるため、軸方向への解像度が高いという利点が得られる。より高い解像度により、より小さいサンプルを検査できる。この場合、サンプル調製は格段に単純化されている。しかしながら、サンプル調製及びサンプルマウントが依然として標準的なサンプル調製及び蛍光顕微鏡検査で慣例的なセルへの標準的なサンプルマウントと両立しないことは非常に不利なままである。したがって、２枚のＳＰＩＭレンズをペトリ皿内にある液体中に、前記レンズが皿の縁に当たらないように浸漬できるようにするために、ペトリ皿を比較的大きくしなければならない。各種の生検において標準的であるマルチウェルプレートはこの方法に使用できず、それは、レンズをプレートの非常に小さいウェル内に浸すことができないからである。さらに、この方法には、例えば高スループットのスクリーニングが容易にできないという欠点があり、それは、サンプルを交換する際にレンズを洗浄して別のサンプルの汚染を防止しなければならないからである。
【０００７】
これらの問題は、図１ｂに示されるような、いわゆる倒立４５°ＳＰＩＭの配置により回避される。この場合、４５°の配置は維持されるが、２枚のＳＰＩＭレンズ、すなわち照明レンズＰ４と検出レンズＰ５とは上からサンプルに向けられず、サンプルマウントの透明な底部を通じて下から照明され、蛍光が検出される。このようなアセンブリは、本出願人の名義の特許文献４及び特許文献５に開示されている。したがって、例えば、マルチウェルプレート等のすべての典型的なサンプルマウント、ペトリ皿、及びオブジェクトキャリアが使用でき、高スループットでのスクリーニング中のサンプルの汚染は起こり得なくなる。
【０００８】
ここに記載の２種類の光シート顕微鏡検査は、光シートが２枚のＳＰＩＭレンズの一方により生成され、蛍光が２枚のＳＰＩＭレンズの第二のものにより検出されることが共通している。この場合、検出レンズの像面は光シート内にあり、そのため、照明領域が検出器で鮮鋭に結像される。
【０００９】
光シート顕微鏡検査では、対応するビームを生成して、いわゆる光シートに成形することにより、前記光シートでサンプルを照明できるようにしなければならず、これには、わずかな厚さとともに長い長さを有することが理想的である。
【００１０】
光シート顕微鏡検査用アセンブリ内で光シートを使用してサンプルを照明するために、非回折限界ビーム、例えばベッセルビーム、分割ベッセルビーム、又はマシュー（Ｍａｔｈｉｅｕ）ビームを使用できる。ベッセルビーム、分割ベッセルビーム及びマシュービームの横方向のビームプロファイルが図２ａ〜図２ｃに示されている。
【００１１】
図２ａに示されるように、ベッセルビームの中央最大強度は、それと同等のガウシアンビームの焦点より狭い。中央最大強度は、複数のリングにより取り囲まれている。伝搬方向において、ベッセルビームは、ビーム長全体に沿って常に同じビームプロファイルを有する。これは、特に、以下で厚さと呼ぶｙ方向の範囲に関する限り、そのビームプロファイルを変化させない。したがって、原則として、任意の長さのビームを生成でき、中央最大強度はその形状及び構成の点で変化しない。ビーム長を長くするとリングの数のみが増える。
【００１２】
図２ｂに示され、例えば非特許文献２に記載されているように、分割ベッセルビームはベッセルビームと密接な関係がある。そのベッセルビームとの違いは、閉じたリングが半分のリングになっていることである。リングの開口に沿った軸上に第二の最大強度が形成される。原則として、分割ベッセルビームはベッセルビームと同じ特性を有する。しかしながら、ベッセルビームは、はるかに薄い走査光シートを生成できる。
【００１３】
図２ｃに示され、非特許文献３並びに特許文献６及び特許文献７において説明されているようなマシュービームも同様に原則としてベッセルビームと同じ特性を有し、ビームプロファイルは分割ベッセルビームと同様であるが、マシュービームはｙ軸に沿って第二の最大強度を有さない。中央最大強度は半円形の第二の最大強度により取り囲まれ、その強度はｘ軸に沿って外側に向かって減少する。
【００１４】
図２ｃは、長さ１００μｍのマシュービームの横方向、すなわちｘ−ｙ平面内のプロファイルを示し、一方で図２ｄ及び図２ｄ’は伝搬方向、すなわちｘ−ｚ平面内における同じマシュービームのビームプロファイルを示す。中央最大強度の厚さは約０．５５０μｍである。
【００１５】
これらのビームは、照明光学要素により、通常、レーザ源により生成されるコリメートビームで照明することにより生成でき、例えば、その横方向のビームプロファイル（ｘ−ｙ強度プロファイル）が図２ａに示されているベッセルビームの場合、環状絞り、アキシコン、又はＳＬＭが均一ビームのビーム経路内の光学要素として適当である。
【００１６】
非特許文献４に記載されているような環状絞りを用いたベッセルビームの生成は、最も簡単で最も安価な選択肢である。ビーム品質の高いビームは、ごく簡単に生成できる。しかしながら、わずか数パーセントという値の環状絞りのパワー伝達はきわめて低く、したがって、この方法は市販品におけるベッセルビーム生成用として提供されないことが好ましい。
【００１７】
アキシコン、すなわち、例えばガラス等の透明材料からなる回転対称円錐を用いたベッセルビームの生成は非特許文献５に記載されている。環状絞りと異なり、パワー伝達は約１００％である。アキシコンを用いれば、原則的に、単にアキシコンの直径を大きくすることにより、任意の長さのビームを生成することが可能である。
【００１８】
別の可能性は、例えば非特許文献６に記載されているような空間光変調器（ＳＬＭ：ｓｐａｔｉａｌ  ｌｉｇｈｔ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）を使用してベッセルビームを生成することである。この目的のために、アキシコンの位相パターンはＳＬＭ上に表現される。実現可能な最大ビーム長は、ＳＬＭの大きさとピクセル数とにより決まる。ＳＬＭは、ベッセルビームを生成するための最も高価で最も複雑な選択肢であるが、これは最大の多様性を提供する。任意のビーム長及び厚さは、したがって限界内で設定できる。この複数の平行ビームもこの変形型を使用して簡単に生成できる。
【００１９】
その横方向のビームファイル（ｘ−ｙ強度プロファイル）が図２ｂに示されている分割ベッセルビームを生成するために、２つの相対するセグメントをベッセルビームのリング状のスペクトルから絞りにより切り出すことができる。ベッセルビームの生成と同様に、分割ベッセルビームはＳＬＭ又はアキシコンを使用しても生成できる。
【００２０】
マシュービームの生成は、ベッセルビームのそれより複雑である。この目的のためにも、環状絞り、アキシコン、又はＳＬＭが均一ビームのビーム経路内の光学要素として適当である。図２ｃは、マシュービームの横方向のビームプロファイル（ｘ−ｙ強度プロファイル）を示し、図２ｄは伝搬方向への、すなわちｘ−ｚ平面内のビームプロファイルを示し、図２ｄでは図２ｃの平面位置が白い破線で示されている。図２ｄ’は、図２ｄの、その中で白い破線の長方形で示されている抜粋部の拡大図を示す。このようなマシュービームの瞳面の強度スペクトルが図２ｅに示されている。
【００２１】
環状絞りを使用してマシュービームを生成するには、環状絞りが楕円形のガウシアンビームで照明されなければならない。楕円形のガウシアンビームの厚さは、マシュービームの中央最大強度の厚さ及び第二の最大強度の湾曲の程度に影響を与える。ビーム長はリングの厚さで決まる。環状絞りの欠点はここでもパワー伝達の低さである。
【００２２】
マシュービームはまた、空間光変調器（ＳＬＭ）を使用して生成することもできる。最も複雑で最も高価な方法において、２つのＳＬＭがこの目的に使用される。第一のＳＬＭは入射光強度分布を、それがマシュービームの生成に適したものとなるように変化させる。その後、第二のＳＬＭを利用して、前記強度分布の位相が、最終的にマシュービームが生成されるように適応される。この目的のためにＳＬＭにコーディングする必要のある位相パターンは、例えばガーチバーグ−サクストン（Ｇｅｒｃｈｂｅｒｇ−Ｓａｘｔｏｎ）アルゴリズムを使用して計算できる。代替的に、２つのＳＬＭの代わりに、対応する数のピクセルを有する１つのＳＬＭを使用することも可能であり、これは、非特許文献７に記載されている。その間にフルＨＤ解像度を有するＳＬＭが入手可能となっている。これらのＳＬＭは、現在、二重経路で使用できる。強度はＳＬＭディスプレイの第一の半分のＳＬＭディスプレイで扱われ、位相は第二の半分のＳＬＭディスプレイで扱われる。
【００２３】
強度と位相との両方をマシュービームの生成に適応しなければならないため、ＳＬＭを１つのみ使用したビームの生成には必ず妥協が伴う。これは、例えば、非特許文献８に記載されているような変調ブレーズド格子（ｍｏｄｕｌａｔｅｄ  ｂｌａｚｅｄ  ｇｒａｔｉｎｇ）方式を利用すれば可能となり、この場合、不要な光は単純に異なる次数へと回折され、同じＳＬＭによって正しい次数へと通過する光に正しい位相が付与される。この方法の欠点は、パワー伝達が＜５０％の範囲であることである。
【００２４】
マシュービームを生成するための別の可能性は、アキシコンの使用である。
瞳又はそれに関する共役面におけるマシュービームのスペクトルは、図２ｅに示されるように、例えば、次式：
Ｉ（ｖｘ，ｖｙ）＝ｅｘｐ［−（ｖｒ−ｖｒｃ）２／ｄ２］ｓ・ｅｘｐ（−ｖｙ２／ｗ２），  （１）
で計算でき、式中、
【００２５】
【数１】
0006708667.tif 000002
であり、ここで、ｖｘ及びｖｙは瞳内の座標を表し、リング幅に関するリング形スペクトルｖｒｃの直径がｄ、鋭さのパラメータｓ＞０、マシュービームの厚さのパラメータがｗである。スペクトル内のゼロから最大強度までの上昇の勾配は、「鋭さのパラメータ」ｓにより表される。鋭さのパラメータｓが大きいほど、前記上昇が急峻となる。ｗ→∞の場合、マシュービームはベッセルビームに遷移する。
【００２６】
非特許文献９では、ガウシアン光シートを、ゼロを有する光シートに変換するために、板の中央において位相ジャンプπを有する２部式位相板が使用されている。位相板の代わりに、対応するビーム整形を実行するために、ＳＬＭ上で均等な位相関数を表現することが可能であり、これは非特許文献１０により示されている。
【００２７】
ベッセルビームのコヒーレンス合成が非特許文献１１に記載されている。この合成は、あるアルゴリズムを利用して、瞳に入れることのできる位相要素を計算することにより実現される。ベッセルビームのスペクトルが瞳に結像されると、位相要素は複数のベッセルビームを生成し、これらはサンプル上で合成される。位相要素は、位相値０及びπを有する星形格子と同様である。条件として個々のベッセルビーム間の距離は大きくなければならず、なぜなら、大きくない場合に望ましくない干渉効果が発生し得ることを明記する。
【００２８】
光シートを生成するために、上述したこれらの非回折限界ビームは、通常、走査される。ベッセルビーム及び分割ベッセルビームと比較すると、サンプル上の負荷は走査されたマシュービームの場合に最小である。
【００２９】
ビームの第二の最大強度により、走査中に光シートが広くなる。これは、ベッセルビーム及びマシュービームについて図３ａ及び図３ｂに示されている。例えば、長さ１００μｍでその中央最大強度の厚さが０．５５０μｍのマシュービームが走査された場合、その結果として得られる光シートの厚さは２．５μｍである。これは、サンプルで得られた画像における軸方向の解像度の低下及びコントラストの低下という形態で現れる。
【００３０】
非特許文献１２は、スリット絞りを利用し、光シート顕微鏡において共焦点検出を走査されたベッセルビームで実行できる方法を示している。この場合、ギャップ幅は、中央最大強度のみが検出器に結像され、第二の最大強度は抑制されるように設定される。その結果として得られる画像の軸方向の解像度は、ベッセルビームの中央最大強度の厚さに対応する。
【００３１】
共焦点検出もマシュービームで同様に実行でき、ここで、ベッセルビームと比較して、サンプルの保存性がより高いことが証明される。
走査されたマシュービームと共焦点検出との組合せは、光シート顕微鏡で使用された場合、ビームの中央最大強度のみがスリット絞りにより検出される。より高い並列化、すなわち検出器上での検出のために同時に露光されるか、又はアクティブであるピクセルの数を増やすことは、ギャップを広げることによって実現できる。これは軸方向の解像度の低下に直接つながり、なぜなら、より幅広い第二の最大強度も同様に検出されるからである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３２】
【特許文献１】国際公開第２００４／０５３５５８  Ａ１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２０１２／１１０４８８  Ａ２号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２０１２／１２２０２７  Ａ２号パンフレット
【特許文献４】独国特許出願公開第１０  ２０１３  １０７  ２９７  Ａ１号明細書
【特許文献５】独国特許出願公開第１０  ２０１３  １０７  ２９８  Ａ１号明細書
【特許文献６】独国特許出願公開第１０  ２０１２  ０１３  １６３  Ａ１号明細書
【特許文献７】国際公開第２０１４／００５６８２  Ａ２号パンフレット
【非特許文献】
【００３３】
【非特許文献１】フィスケン（Ｈｕｉｓｋｅｎ）ら著、ディベロップメント（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、第１３６巻、１９６３年（２００９年）、「発生生物学における選択的平面照明顕微鏡検査（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｌａｎｅ  ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ）」
【非特許文献２】ファーバッハ（Ｆａｈｒｂａｃｈ）ら著、「自己再構成型分割ベッセルビームによるＬＳＭにおける広視野のサブマイクロ光学断面の提供（Ｓｅｌｆ−ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ｓｅｃｔｉｏｎｅｄ  Ｂｅｓｓｅｌ  Ｂｅａｍｓ  ｏｆｆｅｒ  ｓｕｂｍｉｃｒｏ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｌａｒｇｅ  ｆｉｅｌｄｓ  ｏｆ  ｖｉｅｗ  ｉｎ  ＬＳＭ）」、オプティクス・エクスプレス（Ｏｐｔ  Ｅｘｐｒ）、第２１巻、ｐ．１１４２５、２０１３年
【非特許文献３】グティエレス−ヴェガ（Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ−Ｖｅｇａ）ら著、「光学的マシュービームの実験的デモンストレーション（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｐｔｉｃａｌ  Ｍａｔｈｉｅｕ  ｂｅａｍｓ）」、オプティクス・コミュニケーションズ（Ｏｐｔ  Ｃｏｍｍ．）、第１９５巻、ｐ．３５、２００１年
【非特許文献４】ダーニン（Ｄｕｒｎｉｎ）ら著、「非回折ビーム（Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ−Ｆｒｅｅ  Ｂｅａｍｓ）」、フィジカル・レビュー・レターズ（Ｐｈｙｓ  Ｒｅｖ  Ｌｅｔｔ）、第５８巻、ｐ．１４９９、１９８７年
【非特許文献５】アリモト（Ａｒｉｍｏｔｏ）ら著、「走査光学系におけるアキシコンの結像特性（Ｉｍａｇｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａｘｉｃｏｎ  ｉｎ  ａ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｓｙｓｔｅｍ）」、アプライド・オプティクス（Ａｐｐｌ  Ｏｐｔ）、第３１巻、ｐ．６６５３、１９９２年
【非特許文献６】ボーマン（Ｂｏｗｍａｎ）ら著、「ＳＬＭによるベッセルビームアレイの効率的生成（Ｅｆｆｉｃｉｏｅｎｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｅｓｓｅｌ  ｂｅａｍ  ａｒａｒｙｓ  ｂｙ  ＳＬＭ）」、ユーロピアン・フィジクス・ジャーナル−スペシャルトピックス（Ｅｕｒ  Ｐｈｙｓ  Ｊ  Ｓｐｅｃ  Ｔｏｐ）、第１９９巻、ｐ．１５９、２０１１年
【非特許文献７】ジェサチャー（Ｊｅｓａｃｈｅｒ）ら著、「空間光変調器を用いた完璧に近いホログラムの再構成（Ｎｅａｒ−ｐｅｒｆｅｃｔ  ｈｏｌｏｇｒａｍ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｐａｔｉａｌ  ｌｉｇｈｔ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）」、オプティクス・エクスプレス（Ｏｐｔ  Ｅｘｐｒ）、第１６巻、ｐ．２５９７、２００８年
【非特許文献８】デイヴィス（Ｄａｖｉｓ）ら著、「位相限定フィルタへの振幅情報のコーディング（Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａｍｐｌｉｔｕｄｅ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｎｔｏ  ｐｈａｓｅ−ｏｎｌｙ  ｆｉｌｔｅｒｓ）」、アプライド・オプティクス（Ａｐｐｌ  Ｏｐｔ）、第３８巻、ｐ．５００４、１９９９年
【非特許文献９】フリードリッヒ（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ）ら著、「ＳＴＥＤ−ＳＰＩＭ誘導放出抑制によるシート照明顕微鏡の解像度の向上（ＳＴＥＤ−ＳＰＩＭ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｓｈｅｅｔ  ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）」、バイオフィジクス・ジャーナル（Ｂｉｏ  Ｐｈｙｓ  Ｊ）、第１００巻、Ｌ４３、２０１１年
【非特許文献１０】ワシリユー（Ｖａｓｉｌｙｅｕ）ら著、「より高次のベッセルビーム合成の生成（Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｓｕｐｅｒｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｈｉｇｈｅｒ−ｏｒｄｅｒ  Ｂｅｓｓｅｌ  ｂｅａｍｓ）」、オプティカル・エクスプレス（Ｏｐｔ  Ｅｘｐｒ）、第１７巻、ｐ．２３３８９、２００９年
【非特許文献１１】ケツネン（Ｋｅｔｔｕｎｅｎ）ら著、「伝搬不変スポットアレイ（Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ−ｉｎｖａｒｉａｎｔ  ｓｐｏｔ  ａｒｒａｙｓ）」、オプティクカル・レターズ（Ｏｐｔ  Ｌｅｔｔ）、第１２４７巻、ｐ．２３、１９９８年
【非特許文献１２】ファーバッハ（Ｆａｈｒｂａｃｈ）ら著、「自己再構成ベッセルビームの伝搬安定性によるコントラスト増強結像の実現（Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｓｅｌｆ−ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  Ｂｅｓｓｅｌ  ｂｅａｍｓ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｃｏｎｔｒａｓｔ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｉｍａｇｉｎｇ）」、ネイチャ・コミュニケーションズ（Ｎａｔ  Ｃｏｍｍ）、第３巻、ｐ．６３２、２０１２年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３４】
したがって、本発明の目的は、厚さの薄い光シートの生成に適したビーム整形のためのアセンブリ及び方法を説明することと、検出中に軸方向の解像度がそれによって不利な影響を受けることなく、より高い並列化を可能にする光シート顕微鏡検査用アセンブリを説明することとである。
【課題を解決するための手段】
【００３５】
この目的は、請求項１又は請求項５に記載のビーム整形アセンブリにより、請求項１１に記載のビーム整形方法により、及び請求項１３に記載の光シート顕微鏡検査用アセンブリにより達成される。
【００３６】
ビーム整形アセンブリは、コリメート光を生成するための装置を含み、この装置は、コリメート光を生成するための光源を含むか、又は非コリメート光を生成するための光源と、光源の下流において、光をコリメートするための装置とを含む。このようなコリメート光を生成する装置は、したがって、所定の方法に配向されるコリメート光を生成する。
【００３７】
前記コリメート光のビーム経路内において、ビーム整形アセンブリは、回折装置をさらに含み、これは空間領域内に配置され、回折装置内に入射するコリメート光の回折により非回折限界ビームを生成するように構成される。
【００３８】
さらに、コリメート光を生成するための装置により発せられるコリメート光のビーム経路は、非回折限界ビームの周波数領域へのフーリエ変換及びマッピングのための光学集光機能を含む。前記集光機能は、回折装置自体により実施されるか、又は他に少なくとも１つの集光光学要素を含み、且つ回折装置の下流に設置された集光光学ユニットの装置によって実現される。前記集光光学ユニット又は前記集光光学ユニットの１つの要素又は複数の要素は、したがって、非回折限界ビームを周波数領域にマッピングする役割を果たし、前記マッピングはフーリエ変換により数学的に説明することができる。複数のフーリエ変換及び逆フーリエ変換のシーケンスも、対応してビームを整形し且つ不要な効果を防止するために利用できる。
【００３９】
修正装置が、回折装置の下流に設置された周波数領域内に、換言すれば集光光学ユニットの瞳内に配置され、その周波数領域に、回折限界ビーム又はより正確には回折限界ビームのスペクトルが、例えばレンズによりマッピングされる。前記修正装置は、非回折限界ビームを修正された非回折限界ビームに変換するように構成される。
【００４０】
最後に、ビーム整形アセンブリは、修正された非回折限界ビームのスペクトルの周波数領域からの逆フーリエ変換のための別の光学的集光機能を含む。この集光機能も修正装置自体により、又は修正装置の下流に設置され、且つ少なくとも１つの集光光学要素を含む別の集光光学ユニットにより実施できる。前記集光光学ユニットを利用して、修正された非回折限界ビームは、修正された非回折限界ビームのスペクトルの逆フーリエ変換によって周波数領域から変換し戻され、その後、この時点で前記ビームの使用のためにさらに最適化又は供給できる。
【００４１】
本発明によれば、次に、修正された非回折限界ビームは、修正された非回折限界ビームの伝搬方向に垂直な直線に沿ってＮ個の第一の最大強度を含み、Ｎは２以上の自然数である。したがって、修正された非回折限界ビームの領域におけるｘ−ｙ平面、すなわち修正された非回折限界ビームの伝搬方向に垂直なｚ方向に延びる平面を考える場合、その中では、直線に沿って、好ましくはｘ軸に沿って少なくとも２つの第一の最大強度が発生する。この場合、第一の最大強度は、ｘ−ｙ平面内のすべての位置に沿った最大光強度が存在する位置と定義される。最大光強度が同じ複数の位置がある場合、複数の第一の最大強度が存在する。第一の最大強度に対して、第二の最大強度は、光の強度が最も近い周辺と比較して極大値を含むが、その光の強度は第一の最大強度より低い位置と定義される。
【００４２】
第一の最大強度は、第二の最大強度と比較して、第一の最大強度がそれに沿って形成される直線に垂直な方向への範囲がより小さく、すなわち、好ましくはｙ方向への範囲がより小さいため、高い軸方向の解像度を利用して、同時に、例えば装置内のサンプルを照明するために、又は光シート顕微鏡検査の方法で使用することが意図される光シートを生成するために、修正された非回折限界ビームの複数の最大強度を使用することが可能である。このようなビーム整形アセンブリは、したがって、非常に薄い光シートを非常に高速で生成するのに適している。
【００４３】
これは、特に、異なる位相関数により修正されたマシュービームのｘ−ｙ平面内の強度プロファイルを示す図８ｃ〜図８ｄを、修正されていないマシュービームの強度プロファイルを示す図８ａと、また、ベッセルビームと分割ベッセルビームとの２つの別の修正されていない非回折限界ビームの強度プロファイルを示す図２ａ及び図２ｂと比較すればより明らかとなる。
【００４４】
それぞれ修正されていない非回折限界ビームの場合の第一の最大強度の、及びその第一の最大強度と隣接する第二の最大強度の走査中、又は修正された回折限界ビームの場合のその複数の第一の最大強度の走査中のこのようなビームの挙動に関する図３ａ及び図３ｂと同様に考える場合、軸方向の解像度に関する修正された非回折限界ビームの複数の第一の最大強度を使用する利点は、視覚的画像中で明らかとなる。換言すれば、より高い並列化のため、及びしたがってより高速の検査速度のために、非回折限界ビームの複数の最大強度を使用して光シートを生成することが意図される場合、複数の第一の最大強度がビームの伝搬方向に垂直な直線に沿って生成されるような方法で非回折限界ビームを事前修正することにより、このような光シートで照明されるサンプルの構造の軸方向の解像度の点で顕著な利点が提供される。
【００４５】
この場合、解像度又は解像力とは、構造を区別できる能力を意味し、すなわち、例えば２つの点状の物体間で依然として認識可能な最小距離を指す。本発明により修正された非回折限界ビームによって生成された光シートによるサンプルの検査では、修正された非回折限界ビームの複数の第一の最大強度の使用を通じた高速検査により、直接隣接する構造が別の構造として直接認識できるようにすることのできる能力は、修正されていない非回折限界ビームの第一の最大強度と、対応する隣接する第二の最大値とを使用した場合より顕著に高い。
【００４６】
１つの有利な実施形態において、本発明によるビーム整形アセンブリの回折装置は、環状絞り、アキシコン、又は空間光変調器（ＳＬＭ）を含む。回折装置は、まず、非回折限界ビームを生成する役割を果たす。これは、前述のように、環状絞り又はアキシコンを使用して簡単に実施できる。それに対して、空間光変調器を含む回折装置は、よりコストのかさむソリューションとなる。しかしながら、空間光変調器の使用は、最適な非回折限界ビームの生成及びそれを「さらに処理する」ためにより広い可能性が提供される。空間光変調器は、例えば複数の光学要素の機能を実施でき、すなわち、空間光変調器は、前記要素の代わりに、又はさらには前記光学要素の中の異なる要素の組合せの代わりに光のビーム経路内に挿入できる。
【００４７】
位相要素を含む修正装置を含むビーム整形アセンブリであって、位相要素の中に、修正された非回折限界ビームの伝搬方向に垂直な直線に沿ってＮ個の第一の最大強度を有する修正された非回折限界ビームを生成するための位相関数がコーディングされている、ビーム整形アセンブリはさらに有利である。好ましくは、前記位相要素は位相板又は空間光変調器により形成される。
【００４８】
位相板は、単純であるが修正装置のためのあまり多様性のない選択肢である一方、空間光変調器は、幅広い適応の可能性を提供する。この点において、空間光変調器を使用することにより、例えば、空間光変調器に入射する光の少なくとも１回の位相変化を制御ユニットによって可変とすることができ、制御ユニットは、少なくとも位相変調器の設定に関して空間光変調器を変化させるように構成される。空間光変調器の制御と共に、このような制御ユニットは、当然のことながら、光シート生成アセンブリの他の要素又はビーム整形アセンブリが組み込まれる上位機器の他の要素を制御するように構成することもできる。
【００４９】
純粋な位相要素としての機能の代わりに、修正装置内に含まれるか又は修正装置を構成する空間光変調器はまた、複素空間光変調器として、すなわち、入射光の位相及び強度、すなわち振幅の両方を変化させることのできる空間光変調器として形成することもできる。
【００５０】
本発明によるビーム整形アセンブリの１つの特定の実施形態において、修正装置は、非回折限界ビームを修正された非回折限界ビームに変換するように構成され、修正された非回折限界ビームは、修正された非回折限界ビームの伝搬方向に垂直な直線に沿ってＮ個の第一の最大強度を有し、Ｎは、この特定の実施形態において、１００以上の自然数である。しかしながら、配置の可能性、例えば使用される検出器又は光変調器のピクセル数に応じて、それよりはるかに大きいＮ、例えば５００以上のＮ又は１０００以上のＮを選択することもできる。非回折限界ビームは、修正装置の場所、すなわち周波数領域内のスペクトルの形態で存在する。本発明によるビーム整形アセンブリの特定の実施形態において、瞳の半分を覆う絞りが周波数領域内、例えば瞳内にさらに配置される。Ｎが非常に大きい、すなわち、第一の最大強度の数が非常に多いこのようなアセンブリにおいて、光シートを生成するために修正された非回折限界ビームを走査する必要はなく、これは、ビームの断面がｘ方向に構造を有さず、それと同時に、ｘ方向に非常に大きい領域にわたって延びるからである。
【００５１】
代替的なビーム整形アセンブリは、コリメート光を生成するための装置、したがって、コリメート光を生成するように構成された装置を含み、かかる装置は、コリメート光を生成するための光源又はコリメートされていない光を生成するための光源の何れかと、光源の下流において、光をコリメートするための装置とを含む。この代替的なビーム整形アセンブリは、コリメート光のビーム経路内において、空間領域内に配置され、好ましくは空間光変調器（ＳＬＭ）を含む回折及び修正装置をさらに含む。前記回折及び修正装置は、修正された非回折限界ビームを生成するように構成され、すなわち、非回折限界ビームを生成する中間ステップを有さず、また、それを周波数領域へとフーリエ変換するように構成される。
【００５２】
さらに、前記代替的なビーム整形アセンブリは、ビーム経路内において、修正された非回折限界ビームの周波数領域からの逆フーリエ変換のための集光機能を含み、集光機能は、回折及び修正装置自体により実施されるか、又は回折及び修正装置の下流に配置され、且つ少なくとも１つの集光光学要素を含む集光光学ユニットにより実施される。
【００５３】
本発明によれば、したがって、前記代替的なビーム整形アセンブリでも、回折及び修正装置が修正された非回折限界ビームを生成するように構成されるように、修正された非回折限界ビームは、修正された非回折限界ビームの伝搬方向に垂直な直線に沿ってＮ個の第一の最大強度を含み、Ｎは２以上の自然数である。
【００５４】
有利には、光シートを生成するための両方の代替案における本発明によるアセンブリは、修正された非回折限界ビームを走査するためのスキャナをさらに含み、それによって所望の幅の光シートが生成される。ビームは、Ｎ個の第一の最大強度が沿って配置される直線に平行であり、且つ伝搬方向に垂直な方向に走査される。一般に、修正された非回折限界ビームは、したがって、ｘ方向に沿って走査される。
【００５５】
このようなスキャナは、非常に多くの第一の最大強度が利用され、かつ瞳の半分を被覆するための絞りが周波数領域内に含まれている場合には不要である。
ビーム整形アセンブリ内の非回折限界ビームは、例えば、ベッセルビーム、分割ベッセルビーム、又はマシュービームとすることができる。マシュービームは、特に、修正前にすでに光シートの生成に有利な強度プロファイルを示し、この強度プロファイルは、第一の最大強度の数Ｎが伝搬方向に垂直な直線に沿って生成される修正により、第一の最大強度が沿って配置される直線に垂直であり、且つ伝搬方向に垂直な方向へのその範囲が再び減少されるような方法で、再び有利な影響を受ける。
【００５６】
それ自体がレーザ源を含むレーザモジュールを含む、コリメート光を生成するための装置は、１つの、特に有利で頻繁に使用される本発明によるビーム整形アセンブリの選択肢である。レーザ光は、コリメート光がこの目的のために望ましい場合、多くの照明の用途に使用される。
【００５７】
ビーム整形アセンブリが回折装置を照明するための手段を含み、その手段がコリメート光を生成するための装置からのビームを、回折装置の均一な照明が達成されるような方法で整形すれば有利である。１つの実施形態において、照明のための手段は、レンズ要素を含み、これはコリメート光を生成するための装置から発せられるビームを相応に拡張する。この場合、２つのレンズ要素を使用することが好ましい。しかしながら、レンズ要素の代わりに、レンズ要素の効果を模倣できる光学要素を使用することも可能である。
【００５８】
ビーム整形アセンブリが、修正装置の上流の周波数領域内、又は修正装置の上流の別の周波数領域内、又は代替的に回折及び修正装置の周波数領域内の不要な光をフィルタ処理するための絞りを含んでいればさらに有利である。これにより、例えば、不要なゼロ次数をフィルタで除去できる。
【００５９】
ビーム整形、特に光シート顕微鏡検査のための光シートを生成するための本発明による方法は、以下のステップを含む：
非回折限界ビームが、コリメート光のビーム経路内の回折装置によって生成されるステップ。
【００６０】
非回折限界ビームが、フーリエ変換によって周波数領域中に変換されるステップ。これは、瞳又は対応して共役な平面とすることができる。非回折限界ビームの強度分布、すなわちそのスペクトルは、周波数領域内で、すなわち瞳又は対応して共役な平面内で決定される。
【００６１】
周波数領域内の修正された非回折限界ビームの強度分布は、非回折限界ビームの強度分布にウェッジの位相関数を乗じたものからなるＮ個の複素関数の合計を形成することによって決定される。ウェッジの位相関数は、ここで、各被加数において増加される。
【００６２】
周波数領域内の修正された非回折限界ビームの位相関数が、周波数領域内の修正された非回折限界ビームの強度分布の偏角として決定されるステップ。
修正された非回折限界ビームが、位相関数を周波数領域内にある修正装置内にコーディングすることによって生成されるステップ。
【００６３】
好ましくは、修正された非回折限界ビームは、対応する幅の光シートを生成するために走査される。修正された非回折限界ビームの走査は、したがって、ほとんどの場合で望ましい。しかしながら、非常に大きい数の第一の最大強度Ｎを有する修正された非回折限界ビームが生成され、さらに、瞳又は対応して共役な平面がその面積の半分で覆われる場合、走査プロセスは不要であり、これは、このようにして生成された修正された非回折限界ビームがｘ方向に構造を有さないが、依然としてｙ方向にそれに応じて薄いからである。これは、通常、Ｎが１００以上である場合、特にＮが５００以上である場合である。
【００６４】
修正された非回折限界ビームの厚さには、修正されていない回折限界ビームの厚さを相応に設定することによって影響を与えることができる。
光シート顕微鏡検査用アセンブリは、サンプルを配置するためのサンプル面を含む。前記サンプル面は、サンプルをセットするための、又はサンプルをセットし、固定するためのサンプルステージによって実施することができる。しかしながら、サンプル面はまた、サンプルチャンバ又はマウントによって画定することもでき、その中で、サンプルは、例えば前記サンプルチャンバ又はマウント内の開口内に固定することによって固定位置に保持され、このようにしてサンプル面が画定される。これは、サンプル面内に位置付けられたサンプルが、例えばサンプルステージ、サンプルチャンバ、又はその他の種類のサンプルマウントの設定によってサンプルの中央部分に影ができないように照明することができるように、及びサンプルにより発せられる光が妨害されずに同様に検出可能となるように構成される。サンプル面は、したがって、光シート顕微鏡検査用アセンブリの光路内に障害物が発生しないように配置される。これは、サンプルステージ、サンプルチャンバ、若しくはサンプルマウントのための、適切で光学的に透明な材料を選択することによるか、又は光路内又はその付近にあるそれらの部品について、又はサンプルステージ、サンプルチャンバ、若しくはサンプルマウント内の対応する開口部により、例えばサンプル、オブジェクトキャリア、又はサンプル容器が直接照明され、サンプルにより発せられた光が直接検出可能となるようにすることによって達成される。サンプル面はさらに可動的に構成することもでき、それによって空間内のその位置を空間内の少なくとも１つの方向に、好ましくは２つ又は３つの方向に変更でき、これは、例えば、サンプルステージ、サンプルチャンバ、又はサンプルマウントの移動によって実現できる。サンプルは、対応する光で照明されたときにサンプルからの蛍光をサポートするように調製でき、これは、透明な容器内又はオブジェクトキャリア上に、例えば１枚の透明な板上、又は２枚の透明な板、例えば２枚のガラス板間に位置付けることができる。
【００６５】
光シートを生成するために、照明装置は上述のビーム整形アセンブリを含む。この場合、照明装置は、生成された光シートにより、サンプル面内に配置されたサンプルの１本のストリップが照明され、そこで蛍光が励起されるように配置される。サンプル面内のサンプルを照明する光シートがサンプル面と非平行に通過すれば有利である。
【００６６】
サンプル内のこのような設定の結果として生じ、照明されるストリップは、非常に狭い。その厚さは典型的に０．２μｍ〜１０μｍ、特に厚さ０．４〜１．５μｍである。
最後に、光シート顕微鏡のためのアセンブリは検出装置を含み、これはセンサを有し、すなわち、サンプルにより発せられた蛍光を検出することのできる検出器又は検出手段を有する。ここで、エリアセンサ又は他に蛍光の空間分解検出のための空間分解検出手段が好ましい。
【００６７】
さらに、検出装置は、サンプルによりセンサの検出面に発せられる蛍光を結像させるための結像光学ユニットを含む。この場合、検出面は、結像のための信号が、これらがセンサにより検出される予定の形態で利用可能となる面である。
【００６８】
検出装置は検出軸を含む。前記検出軸は、光シートに対して角度範囲７０°〜１１０°からの、好ましくは角度範囲８０°〜１００°からの角度をなす。検出装置が光シートに垂直な検出軸を含むアセンブリが特に好ましい。
【００６９】
有利には、光シート顕微鏡検査用アセンブリは、サンプルと光シートとの間の相対移動を実施するように構成される。これにより、サンプル内の照明されるストリップを移動させることができる。
【００７０】
光シート顕微鏡検査用アセンブリの１つの有利な構成では、その検出装置は、共焦点検出を可能にするために使用される絞りを含む。
光シート顕微鏡検査用アセンブリ内の共焦点検出のためのこのような絞りは、センサ上の「ローリングシャッタ」として形成することができる。この場合、「ローリングシャッタ」とは、ＣＭＯＳ若しくはｓＣＭＯＳ技術を使用した、すなわち相補型金属酸化膜半導体技術を使用した、又は科学的ＣＭＯＳ技術を使用した「アクティブピクセル」イメージセンサの読み出しプロセスを指す。ＣＣＤセンサと異なり、これらのセンサのピクセルはアクティベートされ、ラインごと又はコラムごとに読み出され、それによってエリアセンサのそれぞれの感光部分が、画像露光内のセンサ領域上で高速で通過する狭いセンサストリップによってのみ形成される。
【００７１】
ここで、本発明が例示的実施形態に基づいて説明される。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１ａ】前述のような先行技術による４５°の配置の正立光シート顕微鏡を示す。
【図１ｂ】前述のような先行技術による４５°の配置の倒立光シート顕微鏡を示す。
【図２】図２ａは、ベッセルビームのｘ−ｙ強度プロファイルを示し、図２ｂは、分割ベッセルビームのｘ−ｙ強度プロファイルを示し、図２ｃは、マシュービームのｘ−ｙ強度プロファイルを示し、図２ｄは、前記マシュービームの伝搬方向への、すなわちｘ−ｚ面内のビームプロファイルを示し、図２ｄ’は、図２ｄの拡大部分を示し、図２ｅは、このようなマシュービームの瞳面内の強度スペクトルを示す。
【図３】図３ａは、先行技術による光シート生成のための走査されたベッセルビームのｘ−ｙ面内の強度の図を示し、図３ｂは、先行技術による光シート生成のための走査されたマシュービームのｘ−ｙ面の強度の図を示す。
【図４】本発明によるビーム整形アセンブリの第一の例示的実施形態を示す。
【図５】本発明によるビーム整形アセンブリの第二の例示的実施形態を示す。
【図６】本発明によるビーム整形アセンブリの第三の例示的実施形態を示す。
【図７】本発明によるビーム整形アセンブリの第四の例示的実施形態を示す。
【図８】図８ａは、マシュービームのｘ−ｙビームプロファイルを示し、図８ｂ−８ｄは、それぞれ２、３、及び５０個の第一の最大強度を有する修正されたマシュービームのｘ−ｙビームプロファイルを示し、図８ｅは、１つの第一の最大強度を有する修正されていないマシュービームのための瞳の不変位相関数を示し、図８ｆ−８ｈは、それぞれ図８ｂ〜図８ｄの２、３、及び５０個の第一最大強度を有する修正されたマシュービームの生成を促進する瞳における位相関数を示し、図８ｉは、瞳内のマシュービームのスペクトル、すなわちその強度を示し、図８ｋ−８ｍは、それぞれ図８ｂ〜図８ｄの２、３、及び５０個の第一の最大強度を有する修正されたマシュービームのスペクトルを示す。
【図９】本発明による光シート顕微鏡検査用アセンブリの第一の例示的実施形態を示す。
【図１０】本発明による光シート顕微鏡検査用アセンブリの第二の例示的実施形態を示す。
【図１１】本発明による光シート顕微鏡検査用アセンブリの第三の例示的実施形態を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
図４は、本発明によるビーム整形アセンブリの第一の例示的実施形態を示す。レーザモジュール１は、ガウシアンレーザビーム２を発する。前記レーザビーム２は、回折装置の照明手段３により拡張され、前記手段はレンズ３．１及び３．２を含み、この例示的実施形態では、空間光変調器（ＳＬＭ）４．１を含む回折装置４の全体が照明される。ガウシアンレーザビーム２は、空間光変調器４．１によってマシュービーム７に変換される。集光光学ユニット５の一部、この場合にはその中に含まれるレンズ５．１はフーリエ変換を行い、それによってマシュービーム７のスペクトルが絞り面６で見ることができる。絞り６を利用してフィルタ処理が行われ、不要な光、例えば空間光変調器（ＳＬＭ）４．１のゼロ次数が抑制される。レンズ５．２及び５．３は、フィルタ処理されたスペクトルを修正装置８上に結像し、ここで、修正装置８は周波数領域内に配置され、第二の空間光変調器（ＳＬＭ）８．１を含む。修正装置８を利用し、すなわちここではｘ方向に沿ってＮ個の第一の最大強度（ここで、Ｎ≧２である）を有する修正されたマシュービームを生成するための位相関数がコーディングされている第二の空間光変調器８．１を利用して、マシュービーム７（より正確にはマシュービーム７のスペクトル）は、対応するＮ個の第一の最大強度を有する修正されたマシュービーム１０のスペクトルに変換される。別の集光光学ユニット、ここではレンズ９により、ＳＬＭ８．１の周波数領域内で生成された修正されたマシュービームのスペクトルは、Ｎ個の第一最大強度を有する修正されたマシュービーム１０に変換される。修正されたマシュービーム１０は、この時点で使用するために供給できる。
【００７４】
図５は、本発明によるビーム整形アセンブリの第二の例示的実施形態を示す。レーザモジュール１はガウシアンレーザビーム２を発する。前記レーザビーム２は、レンズ３．１及び３．２により拡張され、したがって、空間光変調器（ＳＬＭ）４．４を含む回折及び修正装置がその面積全体にわたり均一に照明される。空間光変調器（ＳＬＭ）４．４により、ガウシアンレーザビーム２は、絞り６の位置においてｘ方向に沿ってＮ個の第一の最大強度（ここで、Ｎ≧２である）を有する修正されたマシュービームのスペクトルに変換される。したがって、この場合、関数は、ｘ方向に沿ってＮ個の第一の最大強度（ここで、Ｎ≧２である）を有するマシュービームの生成及び修正を同時に行うことができるような方法でＳＬＭにコーディングされる。絞り６を利用して、不要な光、例えばＳＬＭのゼロ次数を抑制するためにフィルタ処理が実行される。レンズ９を含む集光光学ユニットにより、修正されたマシュービームのスペクトルが修正されたマシュービーム１０に変換される。
【００７５】
図６は、本発明によるビーム整形アセンブリの第三の例示的実施形態を示す。第一の例示的実施形態においてすでに説明したように、レーザモジュール１はガウシアンレーザビーム２を発する。前記レーザビーム２は、レンズ３．１及び３．２を含む回折装置を照明する手段３により拡張され、それにより、この例示的実施形態では、空間光変調器（ＳＬＭ）４．１を含む回折装置４の全体が照明されることになる。ガウシアンレーザビーム２は、空間光変調器４．１によってマシュービーム７に変換される。集光光学ユニット５の一部、この場合にはその中に含まれるレンズ５．１はフーリエ変換を行い、マシュービーム７のスペクトルが絞り面６で見えることになる。絞り６を利用してフィルタ処理が行われ、不要な光、例えば空間光変調器（ＳＬＭ）４．１のゼロ次数が抑制される。レンズ５．２及び５．３は、フィルタ処理されたスペクトルを修正装置８上に結像させ、ここで、修正装置８は周波数領域内に配置されている。前記修正装置は、第三の例示的実施形態では位相板８．３を含む。前記位相板８．３を利用して、マシュービーム７のスペクトルが、ｘ方向に沿ってＮ個の第一の最大強度（ここで、Ｎ≧２である）を有する修正されたマシュービーム１０のスペクトルに変換される。別の集光光学ユニット、ここではレンズ９により、周波数領域内で位相板８．３により生成される修正されたマシュービームのスペクトルは、ｘ方向に沿ってＮ個の第一の最大強度（ここで、Ｎ≧２である）を有する修正されたマシュービーム１０に変換される。その後、修正されたマシュービーム１０は、今度はこの時点で使用するために供給できる。
【００７６】
図７は、本発明によるビーム整形アセンブリの第四の例示的実施形態を示す。ここでも、レーザモジュール１はガウシアンレーザビーム２を発する。前記レーザビーム２は、レンズ３．１及び３．２により拡張され、それにより、空間光変調器（ＳＬＭ）４．８の第一の半分４．２がこの拡張されたレーザビーム２によって照明されることになる。ＳＬＭ４．２のこの第一の半分を利用して、ガウシアンレーザビーム２はマシュービーム７に変換される。この例示的実施形態では、曲面ミラー５．４を含む集光光学ユニット５はマシュービーム７のフーリエ変換を行い、それによってマシュービーム７のスペクトルは空間光変調器（ＳＬＭ）４．８の第二の半分８．２に入射すると見ることができる。ＳＬＭ８．２の第二の半分は、マシュービーム７のスペクトルを、ｘ方向に沿ってＮ個の第一の最大強度（ここで、Ｎ≧２である）を有する修正されたマシュービーム１０のスペクトルに変換する。レンズ９を含む集光光学ユニットを利用して、修正されたマシュービーム１０のスペクトルが、ｘ方向に沿ってＮ個の第一の最大強度（ここで、Ｎ≧２である）を有する修正されたマシュービーム１０に変換される。
【００７７】
図８ａは、図８ｅに示されるように、瞳にも可変位相値がコーディングされていない、修正されていないマシュービーム７のｘ−ｙビームプロファイルを示す。図８ｉは、修正されていないマシュービーム７のスペクトル、すなわち瞳内のその強度を示す。
【００７８】
それと比較して、図８ｂ〜図８ｄは、それぞれ２、３、及び５０個の第一の最大強度を有する修正されたマシュービームのｘ−ｙビームプロファイルを示す。図８ｆ〜図８ｈは、それぞれ図８ｂ〜図８ｄの２、３、及び５０個の第一の最大強度を有する修正されたマシュービームを生成するのに利用される、瞳内の位相関数をそれぞれ示す。この場合、位相値は、ｘ−ｙ面の位置に応じて０〜πで変化し、各々の場合において、ｙ方向に平行に延びるストリップが同じ位相値を有し、ｙ方向に平行に延びる隣接するストリップ自体は、そのストリップ内で同じ位相値を有し、これは、それに隣接するストリップの位相値と異なる。第一の最大強度の数Ｎが増えると、同じ位相値を有するこれらのストリップはますます狭くなる。
【００７９】
図８ｋ〜図８ｍは、図８ｂ〜図８ｄの、それぞれ２、３、及び５０個の第一の最大強度を有する修正されたマシュービームのそれぞれのスペクトルを示す。
したがって、軸方向の解像度を下げずにより高い並列化を実現するために、マシュービーム７は、修正装置内にコーディングされた比較的単純な位相マスクを利用して修正できる。２個の第一の最大強度を有する修正されたマシュービームの場合、何れの第一の最大強度も同じ厚さであり、すなわち、そのｙ方向への範囲は、修正されていないマシュービームの中央の第一の最大強度と同じ大きさである。最大強度が３個以上である場合、その厚さも増大する。原則として、所望の数の第一の最大強度を生成できる。しかしながら、第一の最大強度の厚さが増大するため、このような修正されたマシュービームが例えば光シート顕微鏡内のサンプルを照明するために使用された場合、軸方向の解像度が低下する。これは、共焦点ギャップ検出によって回避できない。ここで、ギャップ検出の代わりに、このようにして軸方向を細かく分割するために、対応するアルゴリズムを有する構造化照明に頼ることが適当である。
【００８０】
２個の第一の最大強度を有する修正されたマシュービームの位相関数は、ヘビサイド単位ステップ関数Ｈ（ｖｘ）を用いた次式：
φ修正済（υｘ，υｙ）＝π・Ｈ（υｘ）    （２）
となる。
【００８１】
この位相パターンは例外であり、それは、後述の方法と異なり、ビームに合わせる必要がなく、任意のマシュービームに使用できるからである。
任意の数の、ただし３個以上の第一の最大強度を有する修正されたマシュービームの位相関数は、以下のように決定される：
１．所望の特性、特にその厚さに関する所望の特性を有する修正されていないマシュービームが生成される。
２．瞳内、又は修正されていないマシュービームの対応する共役面内の強度分布Ｉマシューが決定される。
３．瞳内の修正されたマシュービームのスペクトルが、
Ｉ修正済＝Ｉマシュー  （３）
【００８２】
【数２】
0006708667.tif 000003
を使用して計算され、式中、Ｉ修正済は修正されたマシュービームの強度分布を示し、Φ修正済は瞳又は対応する共役面内の位相を示し、ｖｘ及びｖｙは周波数座標を示し、Ｎは修正されたマシュービームの伝搬方向に垂直な直線に沿って配置される第一の最大強度の数を示し、それによって光シートの幅が決まる。Ｎが大きいほど光シートが広くなり、より多くの第一の最大強度が存在する。Δ傾きは、サンプル内のＮ個の第一の最大強度間の距離の大きさを示す。個々の第一の最大強度間の距離が非常に小さいと、それぞれの第一の最大強度に割り当てられた部分的ビームの干渉が起こる。パラメータΔ傾きにより、マシュービームの隣接する第一の最大強度間の距離が適応される。Δ傾きは、ここで、最適なビームプロファイルが得られるまで適応されなければならない。
４．マシュービームの厚さｗ（式（１）参照）は、強度及びさらに第二の最大強度の数を減らすために適応される。より小さいｗが選択されるほど、検出方向に存在する第二の最大強度が少なくなるが、それと同時に、光シートはより厚くなり、すなわち、光シートの伝搬方向に垂直に延びるｙ方向への光シートの範囲が大きくなる。
【００８３】
空間光変調器（ＳＬＭ）が使用されると、原則として、位相関数の代わりにスペクトル、すなわち、瞳内又は共役面Ｉ修正済内の強度分布を使用することもできる。しかしながら、この場合、位相及びさらに強度又は振幅も空間光変調器によって対応して整形することが必要であり、すなわち、対応する位相及び振幅の数値をＳＬＭにコーディングしなければならない。
【００８４】
図９は、本発明による光シート顕微鏡検査用アセンブリの第一の例示的実施形態を示す。この例示的実施形態の照明装置は、ここで、図４の例で説明したビーム整形アセンブリを使用する。ビーム整形は、したがって、特に２つの空間光変調器によって実現される。修正されたマシュービームが次に相応に整形されると、修正されたマシュービーム１０のスペクトルは、ここで、別の集光光学ユニット９のレンズ９．１及び９．２によってｘｙスキャナ１１に結像される。この場合、このようなスキャナはビーム整形アセンブリに帰することもできる。レンズ１２．１及びチューブレンズ１２．２の組合せが、修正されたマシュービーム１０のスペクトルを、偏光ミラー１３を介して再び照明対物レンズ１４の瞳に結像させる。その後、サンプル面内の水の充満したオブジェクトキャリア１７上にある、この場合にはサンプルステージ１８の上にあるサンプル１５の１本のストリップは、このような走査された修正されたマシュービームで照明される。サンプル１５の照明されたストリップ内の修正されたマシュービームにより励起された蛍光は、検出対物レンズにより、センサ２０を含む検出装置１９へと送られる。検出装置１９を利用して画像が記録され、コンピュータへと送られる。
【００８５】
図１０は、本発明による光シート顕微鏡検査用アセンブリの第二の例示的実施形態を示す。この例示的実施形態における照明装置は、図６の例で説明したビーム整形アセンブリを使用する。この場合、ビームは、空間光変調器及び位相板を利用して実現される。レンズ１２．１及びチューブレンズ１２．２の組合せがここでも、偏光ミラー１３を利用して修正されたマシュービーム１０のスペクトルを照明対物レンズ１４の瞳内に結像させる。その後、サンプル面内の水の充満したオブジェクトキャリア１７上にある、この場合にはサンプルステージ１８の上にあるサンプル１５の１本のストリップは、このような走査された修正されたマシュービーム１０で照明される。この例示的実施形態における検出装置は、設定及び手順の点で図９の例示的実施形態のそれに対応する。
【００８６】
図１１は、最後に、本発明による光シート顕微鏡検査用アセンブリの第三の例示的実施形態を示す。この光シート顕微鏡検査用アセンブリでは、図４〜図７に記載されている例示的実施形態の何れにも対応しないビーム整形アセンブリが使用される。
【００８７】
レーザモジュール１は、ガウシアンレーザビーム２を発する。前記レーザビーム２はレンズ３により拡張される。拡張されたレーザビーム２により照明される回折装置４は、アキシコン４．３を含む。ガウシアンレーザビーム２は、アキシコン４．３によってベッセルビーム７．１に変換される。集光光学ユニット５はレンズを含み、これはベッセルビーム７．１のフーリエ変換を行うために使用され、それによってベッセルビームのスペクトルは絞り面で見ることができる。絞り６を利用して、フィルタ処理が行われ、不要な光、例えばゼロ次数が抑制される。集光光学ユニット５の別のレンズは、フィルタ処理されたベッセルビームのスペクトルを位相板８、８．３上に結像し、それがベッセルビーム７．１を、ｘ方向に沿ってＮ個の第一の最大強度（ここで、Ｎ≧２である）を有する修正されたベッセルビーム１０．１に変換する。修正されたベッセルビーム１０．１のスペクトルは、別の集光光学ユニット９に含まれるレンズ９．１及び９．２を利用してｘｙスキャナ１１に結像される。レンズ１２．１とチューブレンズ１２．２との組合せは、ここでも、偏光ミラー１３を利用して、修正されたベッセルビーム１０．１のスペクトルを再び照明対物レンズ１４の瞳に結像させる。その後、サンプル面１８のオブジェクトキャリア１７上にあるサンプル１５の１本のストリップが、走査された修正されたベッセルビーム１０．１で照明される。サンプル１５のストリップ内で修正されたベッセルビーム１０．１により励起された蛍光は、検出対物レンズによってエリアセンサ２０を含む検出装置１９へと送られる。前記エリアセンサ２０は、特に画像を記録し、前記画像をコンピュータに送るために使用される。
【００８８】
上述し、各種の例示的実施形態において説明した本発明の特徴は、ここで、例として示された組合せだけでなく、他の組合せでも又はそれら単独でも使用でき、何れも本発明の範囲から逸脱しない。
【００８９】
装置の特徴に関する説明は、これらの特徴に関する対応する方法にも同様に当てはまり、方法の特徴も対応して上述装置の機能的特徴を表す。
例示的実施形態では実質的にマシュービームの使用が説明されているが、本願に示される装置及び本願に示される方法はマシュービームに限定されない。装置及び方法は、ベッセルビーム、分割ベッセルビーム、又はその他の非回折限界ビームにも同様に当てはまり、これらに限定されない。しかしながら、マシュービームの使用は、そのビーム特性、例えばｙ方向への強度分布が急速に減少し、したがって、特にベッセルビーム及び分割ベッセルビームと比較してマシュービームのこの出力ビームプロファイルの修正によって原則として薄い光シートを生成するために有利であるｘ−ｙ面内のビームプロファイル等により好ましい。
【図１ａ】
0006708667.tif 000004
【図１ｂ】
0006708667.tif 000005
【図２】
0006708667.tif 000006
【図３ａ】
0006708667.tif 000007
【図３ｂ】
0006708667.tif 000008
【図４】
0006708667.tif 000009
【図５】
0006708667.tif 000010
【図６】
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【図７】
0006708667.tif 000012
【図８】
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【図９】
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【図１０】
0006708667.tif 000015
【図１１】
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