(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を増殖させるためのヒト脂肪由来幹細胞（ｈＡＤＳＣ）に基づくシステムであって、ｈＡＤＳＣと、ｈＡＤＳＣの培養に適した培地と、ＨＣＶとを含み、
前記ｈＡＤＳＣが、第１〜６継代細胞であり特異的マーカーＤＬＫ−１に対して陽性であるシステム。
【請求項２】
前記ＨＣＶが、ＨＣＶに感染した個体の血液、血清、血漿もしくは体液に由来するか、または臨床ＨＣＶ単離物である、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記ＨＣＶが、遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、４ｇ、４ｈ、４ｉ、４ｊ、５ａおよび６ａまたはそれらの任意の組み合わせである、請求項１または２に記載のシステム。
【請求項４】
前記ＨＣＶが、遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂまたは混合型２ａ＋２ｂである、請求項３に記載のシステム。
【請求項５】
前記システムがＨＣＶの完全な複製を支援する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項６】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を増殖させる方法であって、ＨＣＶの複製に適した条件下でｈＡＤＳＣの培養に適した培地中でＨＣＶを増殖させるためにｈＡＤＳＣを使用することを含み、
前記ｈＡＤＳＣが、第１〜６継代細胞であり特異的マーカーＤＬＫ−１に対して陽性である、方法。
【請求項７】
前記ＨＣＶが、ＨＣＶに感染した個体の血液、血清、血漿もしくは体液に由来するか、または臨床ＨＣＶ単離物である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＨＣＶが、遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、４ｇ、４ｈ、４ｉ、４ｊ、５ａおよび６ａ、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＨＣＶが、遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂまたは混合型２ａ＋２ｂである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法がＨＣＶの完全な複製を支援する、請求項６〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ＨＣＶの増殖、またはＨＣＶ生活環分析の実施、または抗ウイルス化合物の選抜、またはそのようなＨＣＶに感染した被験体のＨＣＶの特性評価のための、ｈＡＤＳＣの使用であって、前記ｈＡＤＳＣが第１〜６継代細胞であり特異的マーカーＤＬＫ−１に対して陽性である使用。
【請求項１２】
ＨＣＶ感染の診断、またはＨＣＶの増殖、またはＨＣＶ生活環分析の実施、または抗ウイルス化合物の選抜、またはそのようなＨＣＶに感染した被験体のＨＣＶの特性評価のための、キットの製造におけるｈＡＤＳＣの使用であって、前記ｈＡＤＳＣが第１〜６継代細胞であり特異的マーカーＤＬＫ−１に対して陽性である使用。
【請求項１３】
ａ）ｈＡＤＳＣを提供する工程であって、前記ｈＡＤＳＣが第１〜６継代細胞であり特異的マーカーＤＬＫ−１に対して陽性である工程、
ｂ）ｈＡＤＳＣの培養に適した培地中で、前記被験体から得た生体試料と共にｈＡＤＳＣをインキュベートする工程、
ｃ）前記ｈＡＤＳＣを、ＨＣＶ複製を可能にするのに十分な時間培養する工程、および
ｄ）ＨＣＶ複製のレベルを検出する工程を含む、方法。
【請求項１４】
前記生体試料が、血液、血清、血漿または体液に由来するものである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
抗ＨＣＶ化合物を選抜する方法であって、
ａ）第１容器内の培地中のｈＡＤＳＣを候補化合物の非存在下でＨＣＶと接触させる工程であって、前記ｈＡＤＳＣが第１〜６継代細胞であり特異的マーカーＤＬＫ−１に対して陽性である工程；
ｂ）前記第１容器内の前記培地中のＨＣＶのレベルを前記候補化合物の非存在下で決定する工程；
ｃ）第２容器内の培地中のｈＡＤＳＣを候補化合物の存在下でＨＣＶと接触させる工程；
ｄ）前記第２容器内の前記培地中のＨＣＶのレベルを前記候補化合物の存在下で決定する工程；
ｅ）前記候補化合物の存在下でのＨＣＶのレベルを、前記候補化合物の非存在下でのＨＣＶのレベルと比較する工程；および
ｆ）前記候補化合物の存在下でのＨＣＶレベルが前記候補化合物の非存在下でのＨＣＶレベルよりも低い場合に前記候補化合物を抗ＨＣＶ化合物として同定する工程を含む、方法。
【請求項１６】
ＨＣＶのレベルが、ＨＣＶ力価、ＨＣＶ核酸のレベル、またはＨＣＶポリペプチドのレベルを測定することによって決定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記候補化合物が、化学化合物、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、抗体、核酸、アンチセンス核酸、ｓｈＲＮＡ、リボザイムおよび小分子化学化合物からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＨＣＶが、遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、４ｇ、４ｈ、４ｉ、４ｊ、５ａおよび６ａまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＨＣＶ遺伝子型の少なくとも１つである、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＨＣＶが、遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂおよび混合型２ａ＋２ｂからなる群から選択されるＨＣＶ遺伝子型の少なくとも１つである、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を増殖させるためのシステムおよび方法ならびにその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＣＶは、フラビウイルス科のエンベロープを有するプラス鎖ＲＮＡウイルスである。それは、非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）から始まる９．６ｋｂのゲノムを含有し、引き続いて、構造タンパク質（コア、Ｅ１およびＥ２）と、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５を含む非構造（ＮＳ）タンパク質とをコードする配列を含有している（総説については参考文献１、２参照）。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の感染とは異なり、ＨＣＶ感染は、肝臓徴候と肝外徴候との両方を呈する多面的疾患であり３、ＨＣＶは非肝細胞に存在することができるが４〜６、それはウイルスの存続および再活性化において役割を担っている可能性がある。しかしながら、ＨＣＶの肝外複製を調べる試験管内システムは厳しい制約を受けてきた。初代細胞に関して、血清ＨＣＶ（ＨＣＶｓｅｒ）の直接感染はヒトおよびチンパンジーの肝細胞でのみ実証されており、それは培養下での維持が難しく、また、細胞特性がドナー間で著しく変動する。その上、ほとんどの試験管内細胞培養方法は、天然ウイルスではなく分子クローンを使用するものである（総説については参考文献７参照）。また、これらのモデルは、臨床ＨＣＶ単離物の感染を支援すると近年報告されているＨＬＺ０１肝細胞腫細胞株を含めた非初代細胞内でウイルスを増殖させる８。したがって、データを実際の臨床上のウイルス−宿主相互作用にどの程度まで外挿できるかは懸念事項であり続けている。
【０００３】
したがって、血清Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を増殖させる代替のシステムおよび方法が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
この概要は、本発明の特質および本質を手短に示す発明の概要を提示するために提供する。これは、特許請求の範囲または特許請求の範囲の意味を解釈または限定するために用いられるものではないという理解と共に、提供される。
【０００５】
一態様において、本開示は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を増殖させるためのヒト脂肪由来幹細胞（ｈＡＤＳＣ）に基づくシステムであって、ｈＡＤＳＣと、ｈＡＤＳＣの培養に適した培地と、ＨＣＶとを含むシステムを提供する。いくつかの実施形態において、ｈＡＤＳＣは、初代細胞または継代細胞、好ましくは第１〜１５継代細胞、より好ましくは第１〜６継代細胞である。いくつかの実施形態において、ｈＡＤＳＣは、特異的マーカーＤＬＫ−１（すなわち、Ｐｒｅｆ−１）に対して陽性である。いくつかの実施形態において、ＨＣＶは、ＨＣＶに感染した個体の血液、血清、血漿もしくは体液に由来するか、または臨床ＨＣＶ単離物である。いくつかの実施形態において、ＨＣＶは、１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、４ｇ、４ｈ、４ｉ、４ｊ、５ａおよび６ａならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される遺伝子型、好ましくは遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂまたは混合型２ａ＋２ｂである。いくつかの実施形態において、システムは、感染性ウイルスの産生を含めてＨＣＶの完全な複製を支援する。
【０００６】
別の態様において、本開示は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を増殖させる方法であって、ＨＣＶの複製に適した条件下でｈＡＤＳＣの培養に適した培地中でＨＣＶを増殖させるためにｈＡＤＳＣを使用することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、ｈＡＤＳＣは、初代細胞または継代細胞、好ましくは第１〜１５継代細胞、より好ましくは第１〜６継代細胞である。いくつかの実施形態において、ｈＡＤＳＣは、特異的マーカーＤＬＫ−１（すなわち、Ｐｒｅｆ−１）に対して陽性である。いくつかの実施形態において、ＨＣＶは、ＨＣＶに感染した個体の血液、血清、血漿もしくは体液に由来するか、または臨床ＨＣＶ単離物である。いくつかの実施形態において、ＨＣＶは、１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、４ｇ、４ｈ、４ｉ、４ｊ、５ａおよび６ａならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される遺伝子型、好ましくは遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂまたは混合型２ａ＋２ｂである。いくつかの実施形態において、方法は、ＨＣＶの完全な複製を支援する。
【０００７】
別の態様において、本開示は、ＨＣＶの増殖、またはＨＣＶ生活環分析の実施、またはＨＣＶ感染の診断、または抗ウイルス化合物の選抜、またはそのようなＨＣＶに感染した被験体のＨＣＶの特性評価のための、ｈＡＤＳＣの用途を提供する。
【０００８】
別の態様において、本開示は、ＨＣＶ感染の診断、またはＨＣＶの増殖、またはＨＣＶ生活環分析の実施、または抗ウイルス化合物の選抜、またはそのようなＨＣＶに感染した被験体のＨＣＶの特性評価のための、キットの製造におけるｈＡＤＳＣの用途を提供する。
【０００９】
別の態様において、本開示は、被験体のＨＣＶ感染を診断する方法であって、
ａ）ｈＡＤＳＣを提供する工程、
ｂ）ｈＡＤＳＣの培養に適した培地中で、被験体から得た生体試料と共にｈＡＤＳＣをインキュベートする工程、
ｃ）上記ｈＡＤＳＣを、ＨＣＶ複製を可能にするのに十分な時間培養する工程、および
ｄ）ＨＣＶ複製のレベルを検出する工程を含み、
ＨＣＶ複製の検出が、上記被験体がＨＣＶに感染していることを指し示す、方法を提供する。
【００１０】
いくつかの実施形態において、上記生体試料は、血液、血清、血漿または体液に由来するものである。
【００１１】
別の態様において、本開示は、抗ＨＣＶ化合物を選抜する方法であって、
ａ）．第１容器内の培地中のｈＡＤＳＣを候補化合物の非存在下でＨＣＶと接触させる工程；
ｂ）．第１容器内の培地中のＨＣＶのレベルを候補化合物の非存在下で決定する工程；
ｃ）．第２容器内の培地中のｈＡＤＳＣを候補化合物の存在下でＨＣＶと接触させる工程；
ｄ）．第２容器内の培地中のＨＣＶのレベルを候補化合物の存在下で決定する工程；
ｅ）．候補化合物の存在下でのＨＣＶのレベルを、候補化合物の非存在下でのＨＣＶのレベルと比較する工程；および
ｆ）．候補化合物の存在下でのＨＣＶレベルが候補化合物の非存在下でのＨＣＶレベルよりも低い場合に候補化合物を抗ＨＣＶ化合物として同定する工程を含む、方法を提供する。
【００１２】
いくつかの実施形態において、ＨＣＶのレベルは、ＨＣＶ力価、ＨＣＶ核酸のレベル、またはＨＣＶポリペプチドのレベルを測定することによって決定される。
【００１３】
いくつかの実施形態において、候補化合物は、化学化合物、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、抗体、核酸、アンチセンス核酸、ｓｈＲＮＡ、リボザイムおよび小分子化学化合物からなる群から選択される少なくとも１つである。
【００１４】
いくつかの態様において、ＨＣＶは、遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、４ｇ、４ｈ、４ｉ、４ｊ、５ａおよび６ａならびにそれらの任意の組み合わせからなる群、好ましくは遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂおよび混合型２ａ＋２ｂからなる群から選択されるＨＣＶ遺伝子型の少なくとも１つである。
【００１５】
その他の態様は以下に記載される。
【００１６】
上記の概要および以下の詳細な説明は、限定ではなく例として含まれる添付の図面と併せて読むと、よりよく理解される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】ヒト脂肪由来ＤＬＫ−１＋幹細胞は生体内でＨＣＶの標的となる。（Ａ）３人のＨＣＶ（＋）個体（表１）の脂肪組織を手術創から採集し、ＨＣＶ特異的５’−ＵＴＲ（２２３ｂｐ）のＲＴ−ＰＣＲのためにＲＮＡを抽出した。３人のＨＣＶ（−）個体から採集した脂肪組織もまた比較のために並行して研究し、ＨＣＶ（＋）血清を陽性対照として用いた。
【図１Ｂ】（Ｂ）ＨＣＶ（＋）個体の脂肪組織を細かく刻み、ホモジネートし、遠心分離して浮遊物、緩衝液および細胞ペレットの層にした。細胞ペレットの赤血球をさらに溶解してＳＶＦを採集した。各細胞母集団からＲＮＡを抽出し、５’−ＵＴＲのＲＴ−ＰＣＲに供した。ウイルス転写物はＳＶＦ細胞に検出され、浮遊物中には検出されなかった（左パネル）。ＳＶＦ細胞をさらにＤＬＫ−１＋細胞とＤＬＫ−１＋細胞とに免疫分離し、ＲＴ−ＰＣＲのためにＲＮＡを個別に抽出した。ウイルス転写物はＤＬＫ−１＋細胞に存在しており、ＤＬＫ−１−細胞には存在していなかった（右パネル）。データは、３人のＨＣＶ（＋）ドナーからの細胞を使用した３回の実験を代表するものである。
【図１Ｃ】（Ｃ）３人のＨＣＶ感染個体から単離されたＤＬＫ−１−細胞およびＤＬＫ−１＋細胞のＲＮＡを、ＨＣＶマイナス鎖ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲのために抽出した。ＨＣＶ（＋）個体から単離されたヒト初代肝細胞（ＰＨＨ）を陽性対照として使用した。
【図１Ｄ】（Ｄ）ＨＣＶ（−）およびＨＣＶ（＋）の個体から単離されたＤＬＫ−１−（パネルｂおよびｅ）およびＤＬＫ−１＋細胞（パネルｃおよびｆ）を、ウイルスＮＳ５（ｃの茶色標識）およびヘマトキシリン染色（核の青色標識）の免疫細胞化学のためにサイトスピンスライド上で回転させた。マウスＩｇＧ１対照抗体による未分画ＳＶＦ細胞の染色（パネルａおよびｄ）を陰性対照として用いた。データは、３人のＨＣＶ（＋）ドナーおよび３人のＨＣＶ（−）ドナーからの試料を代表するものである。
【図１Ｅ】（Ｅ）ＨＣＶ（＋）またはＨＣＶ（−）の個体からの脂肪組織について、ＤＬＫ−１（赤色標識、パネルｂ、ｃおよびｈの矢印）およびウイルスＮＳ５（茶色標識、パネルｅおよびｆ）およびヘマトキシリン（青色標識、パネルｄ〜ｆおよびｉ〜ｊ）の染色を同じ切片に対して順次行った。ＨＣＶ（＋）脂肪組織では、ＤＬＫ−１＋細胞（赤色標識、矢印、パネルｂおよびｃ）はＮＳ５  Ａｇ（褐色標識、矢印、パネルｅおよびｆ）を共発現した。ＨＣＶ（−）脂肪組織では、ＤＬＫ−１＋細胞（パネルｈ、矢印）はＮＳ５を発現しなかった（パネルｊ、矢印；ｈ対ｊ）。ウサギＩｇＧ（パネルａおよびｇ）またはマウスＩｇＧ１（パネルｄおよびｉ）による染色を陰性対照として用いた。パネルｂ、ｅおよびｃ、ｆは、別個のドナーからのものであった。データは、３人のＨＣＶ（＋）ドナーおよび３人のＨＣＶ（−）ドナーを代表するものである。
【図１Ｆ】（Ｆ）４人のＨＣＶ（＋）個体の脂肪組織から単離されたＤＬＫ−１＋細胞を生体外で４９日間培養し、７日毎に上清を５’−ＵＴＲのｑＲＴ−ＰＣＲのために回収した。データは、各時点について３回の平均±ＳＤとして表したものである。
【図２Ａ】ナイーブＤＬＫ−１＋ｈＡＤＳＣは、試験管内での血清ＨＣＶ感染を許容する。（Ａ）ヒト初代肝細胞（ＰＨＨ）をＨＣＶ（−）ドナーから単離し、皿の中に３日間置き、その後にＨＣＶｓｅｒ（レーン「＋」、左パネル）またはＨＣＶ（−）対照血清（レーン「−」、左）を投与した。投与３時間後に、ＰＨＨをさらに５日間培養し、ＲＮＡを５’−ＵＴＲ（左パネル）のＲＴ−ＰＣＲのために抽出した。並行して、ＨＣＶ（−）ドナーから単離されたｐ−３またはｐ−４のＤＬＫ−１＋ｈＡＤＳＣに、培地交換を７日毎にしながら懸濁液中で０．２ｍｏｉのＨＣＶｓｅｒを投与した。表示のある時点において、上清および細胞を別々に採集し、ＲＮＡを５’−ＵＴＲのＲＴ−ＰＣＲのために抽出した。データは、１０回の実験を代表するものである。ＨＣＶ（＋）血清のＲＮＡもまたＲＴ−ＰＣＲのために対照として抽出した。
【図２Ｂ】（Ｂ）上清ならびに、ｄ１４およびｄ２８のＨＣＶｓｅｒ−１ｂ感染ｈＡＤＳＣの細胞を回収し、ＲＮＡをＨＣＶ特異的マイナス鎖ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲのために抽出した。データは、４回の実験を代表するものである。＊：ＨＣＶｓｅｒによる感染後に洗浄してから１時間後に採集した０日目の培養上清。
【図２Ｃ】（Ｃ）ウサギ抗ヒトＤＬＫ−１抗体（赤色標識、パネルｂおよびｆ）に続くマウス抗ＮＳ５抗体（パネルｄおよびｈ；ｄ中の褐色標識）およびヘマトキシリン（青標識、ｃ、ｄ、ｇおよびｈ）の３重染色を同じ切片に対して行うために、ＨＣＶｓｅｒ−１ｂまたはＨＣＶ（−）対照血清を投与されたｄ１４のｈＡＤＳＣをサイトスピンスライド上にスピンした。ＨＣＶｓｅｒに感染したＤＬＫ−１＋ｈＡＤＳＣはＮＳ５Ａを含有していたが（パネルｂ対ｄ）、ＨＣＶ（−）対照血清を投与された細胞は、ＮＳ５が無く、ＤＬＫ−１を発現した（パネルｆ対ｈ）。ウサギＩｇＧおよびマウスＩｇＧ１での染色を陰性対照として用いた（それぞれ、パネルａおよびｅ、ならびにｃおよびｇ）。結果は４回の実験を代表するものである。
【図２Ｄ】（Ｄ）ｄ１４（パネルｂおよびｃ）およびｄ２１（パネルｅおよびｆ）のＨＣＶｓｅｒ−１ｂ感染ｈＡＤＳＣの透過電子顕微鏡写真。ＨＣＶ（−）対照血清に曝露されたＤ１４Ｖ細胞およびＤ２１細胞をパネルａおよびｄに示した。パネルｂ〜ｆの挿入図は、黄色の四角または黄色の矢印の拡大図である。パネルｂ、ｃ、ｅおよびｆの挿入図中の白い矢印はウイルス粒子を指し示し、パネルｄの挿入図中の白い矢印は、未感染ｈＡＤＳＣのタマネギ形状の膜構造体を指し示す。データは、ＨＣＶｓｅｒ−１ｂによる感染からの２回の実験およびＨＣＶｓｅｒ−２ａによる感染からの１回の実験を代表するものである。
【図２Ｅ】（Ｅ）７日毎に回収したＨＣＶｓｅｒ−１ｂ感染ｈＡＤＳＣの細胞溶解物（左パネル）および上清（右パネル）におけるウイルス５’−ＵＴＲのｑＲＴ−ＰＣＲ。データは、３回の実験から得た平均±ＳＤとして表したものである。
【図２Ｆ】（Ｆ）１〜４週間連続培養したＨＣＶｓｅｒ−１ｂ感染ｈＡＤＳＣの上清中のウイルス５’−ＵＴＲ複製物（ｑＲＴ−ＰＣＲによる）を定量した。データは、４回の実験から得た平均±ＳＤとして表したものである。
【図３Ａ】ＨＣＶｓｅｒ感染は、細胞に関してはドナー非特異的であり、ウイルスに関しては遺伝子型交差性であり、ｍｉＲ−１２２以外の様々な宿主因子によって媒介される。（Ａ）「ドナー１」のＰ−２のｈＡＤＳＣをＨＣＶｓｅｒ−１ｂに感染させ、２１日目の上清（「ＨＣＶａｄｓｃ（１）」と表示）を０．２２μｍの細孔フィルタで濾過し、「ドナー２」のｐ−３のｈＡＤＳＣに感染させるために使用し、その２１日目の上清（「ＨＣＶａｄｓｃ（２）」と表示）を、「ドナー３」のｐ−６のｈＡＤＳＣを感染させるために使用した。２１日目の上清中のウイルス複製数をｑＲＴ−ＰＣＲによって定量した。データは、感染ｈＡＤＳＣの各バッチについて３回の平均±ＳＤとして表したものである。
【図３Ｂ】（Ｂ）ｐ２、ｐ６、ｐ９およびｐ１５でのｈＡＤＳＣをＨＣＶｓｅｒ−１ｂに感染させ、２１日目の上清中（左）および細胞溶解物中（右）のウイルス転写物をｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した。データは、独立した３回の実験から得た平均±ＳＤとして表したものである。
【図３Ｃ】（Ｃ）ｐ０、ｐ２、ｐ６、ｐ９およびｐ１５のｈＡＤＳＣのＤＬＫ−１発現のＲＴ−ＰＣＲ。いずれのバッチの細胞も、同じドナーからのものであった。Ｎ：陰性対照として、逆転写酵素なし。データは、３人の異なるドナーからの細胞を使用した実験を代表するものである。
【図３Ｄ】（Ｄ）ｐ５でのｈＡＤＳＣを混合遺伝子型２ａ＋２ｂのＨＣＶｓｅｒに感染させ、連続培養した。ｄ２１およびｄ５６において細胞をＲＴ−ＰＣＲのために回収して、遺伝子型特異的なコア抗原をコードするｍＲＮＡ（左の遺伝子型２ａでは１７４ｂｐ、右の遺伝子型２ｂでは１２３ｂｐ）を検出した。Ｎ：陰性対照としての、ＨＣＶ（−）対照血清を投与されたｄ２１細胞。Ｐ：陽性対照としてのＨＣＶ（＋）血清そのもの（混合遺伝子型２ａ＋２ｂ）。Ｍ：マーカー。データは、２人のＨＣＶｓｅｒ遺伝子型２ａ＋２ｂ感染ドナーからの血清を使用した実験を代表するものである。
【図３Ｅ】（Ｅ）ｐ０、ｐ２、およびｐ６のｈＡＤＳＣのＣＤ８１、ＬＤＬ−Ｒ、ＳＲ−Ｂ１およびＥＧＦＲの表面発現に関するフローサイトメトリー。黒線：アイソタイプ対照Ａｂ。赤線：抗ＣＤ８１、抗ＬＤＬ−Ｒ、抗ＳＲ−Ｂ１または抗ＥＧＦＲのＡｂ。データは、細胞の各継代についての３回の実験を代表するものである。
【図３Ｆ】（Ｆ）ｐ０、ｐ２およびｐ６のｈＡＤＳＣのオクルディン（ＯＣＬＮ）、クローディン−１（ＣＬＤＮ１）、ＮＰＣ１Ｌ１およびｍｉＲ−１２２の発現のＲＴ−ＰＣＲ（左パネル）。データは、３人のドナーからのｈＡＤＳＣを代表するものである。Ｎ：陰性対照として、逆転写酵素なし。Ｐ：陽性対照としての、ＨＣＶ（−）個体から単離されたヒト初代肝細胞。また、ｐ０、ｐ２、ｐ６のｈＡＤＳＣでのｍｉＲ−１２２発現を、Ｈｕｈ７．５またはＨＣＶ（−）ヒト初代肝細胞（ＰＨＨ、右パネル）と比較してｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した。データは、３人の異なるドナーからのｈＡＤＳＣおよびＰＨＨをそれぞれ使用してｐ０のｈＡＤＳＣに対する発現レベルとして平均±ＳＤで表したものである。
【図３Ｇ】（Ｇ）ＨＣＶｓｅｒ−１ｂによる投与の前にｐ２のｈＡＤＳＣを１時間、表示の濃度のブロッキングモノクローナル抗ＣＤ８１（クローンＪＳ−８１）、抗ＬＤＬ−Ｒ（クローンＣ７）もしくは抗ＥＧＦＲ（クローンＬＡ１）のＡｂまたはポリクローナル抗ＳＲ−Ｂ１  Ａｂで前処理した。Ａｐｏ−Ｅをブロッキングするために、抗ＡｐｏＥ抗体（クローンＥ６Ｄ１０）を表示の濃度でＨＣＶｓｅｒに添加し、続いてそれをｈＡＤＳＣとの３時間のインキュベーションに使用した。２１日目の上清のウイルス５’−ＵＴＲ転写物を定量した。アイソタイプ：アイソタイプ対照抗体（１００μｇ／ｍｌ）による処理。データは、（アイソタイプＡｂによる処理に対して）３回の実験から得た画分阻害の平均±ＳＤとして表されている。また、各処理後の細胞生存率をトリパンブルーで評価した。
【図３Ｈ】（Ｈ）ｐ２のｈＡＤＳＣに、ＯＣＬＮ、ＣＬＤＮ１、ＮＰＣ１Ｌ１またはＤＧＡＴ−１に特異的なｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。スクランブルＲＮＡによるトランスフェクションを対照として用いた。トランスフェクションの４８時間後に細胞を洗浄し、ＨＣＶｓｅｒ−１ｂに感染させ、２１日目の上清中のウイルス５’−ＵＴＲ複製物を定量した。ＯＣＬＮおよびＣＬＤＮ１のノックダウンは同じ実験で実施し、他方、ＮＰＣ１Ｌ１またはＤＧＡＴ−１のノックダウンは別の実験で行った。細胞生存率は、各トランスフェクションの後にトリパンブルー色素排除アッセイによって測定され、スクランブルｓｉＲＮＡによるトランスフェクションと比較して有意な変化はなかった。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤとして表されている。
【図３Ｉ】（Ｉ）ｐ４〜ｐ５の接着性ｈＡＤＳＣをＨＣＶｓｅｒ−１ｂに感染させ、培養下で段階的用量のリバビリン、テラプレビルおよびシクロスポリンＡを２１日間連続して添加した。また、ｈＡＤＳＣを段階的濃度のＩＦＮαと共に１６時間インキュベートしてその後にＨＣＶｓｅｒ−１ｂに曝露した。各処理の後、細胞生存率をトリパンブルーで評価した。データは、独立した３回の実験から得た平均±ＳＤとして表したものである。
【図４Ａ】ＨＣＶａｄｓｃは、物理的性質がＪＦＨ１／ＨＣＶｃｃとは異なっており、ヒト初代肝細胞に対して感染性である。（Ａ）２１日目のＨＣＶｓｅｒ−２ａ感染ｈＡＤＳＣの上清からＨＣＶａｄｓｃ（遺伝子型２ａ）を採集し、１０〜４０％のイオジキサノール中で平衡遠心分離による密度勾配アッセイに供した。比較のために、ＨＣＶｓｅｒ（遺伝子型２ａ）およびＪＦＨ１／ＨＣＶｃｃの濃度勾配アッセイも並行して実施した。データは、５回の実験を代表するものである。
【図４Ｂ】（Ｂ）ＨＣＶｃｃ画分１３は、ウイルス複製物１つ当たりの重量（ｎｇ）として表すと、ＨＤＬおよびＬＤＬ／ＶＬＤＬの量が最も低かった。データは、３人のドナーからのＨＣＶｓｅｒおよびそれらに対応するＨＣＶａｄｓｃを代表するものである。
【図４Ｃ】（Ｃ）ＡｐｏＥおよびＡｐｏＢの測定から、ＡｐｏＥ含有量は、ＨＣＶｓｅｒの主要画分が最も高く、続いてＨＣＶａｄｓｃが高く、他方でＨＣＶｃｃ画分１３ではＡｐｏＥ含量をほとんど検出できなかったということが実証された（左パネル）。対照的に、ＡｐｏＢはＨＣＶｓｅｒ画分２においてのみ検出された（右パネル）。データは、ＨＣＶｓｅｒ（遺伝子型２ａ）およびその対応するＨＣＶａｄｓｃ（つまり、ＨＣＶａｄｓｃをＨＣＶｓｅｒ−感染ｈＡＤＳＣによって生成させた）を使用した１回の実験であり、３人のＨＣＶｓｅｒドナーによる代表である。
【図４Ｄ】（Ｄ）６ｃｍのペトリ皿内でＰ２のｈＡＤＳＣをＨＣＶｓｅｒ（遺伝子型２ａ）またはＨＣＶｃｃに曝露した。感染後のｈＡＤＳＣを１４日間または２１日間連続培養し（培地交換なし）、培養終了時に上清中（左パネル）および細胞溶解物中（右パネル）の５’−ＵＴＲ複製数をｑＲＴ−ＰＣＲにより定量した。結果より、ＨＣＶｃｃがｈＡＤＳＣにおいて効率的に感染／複製しなかったことが分かった。データは、３回の実験から得た平均±ＳＤとして表したものである。
【図４Ｅ】（Ｅ）ＨＣＶｃｃ感染または非感染のＨｕｈ７．５培養物の上清中、およびＨＣＶｃｃ感染またはＨＣＶｓｅｒ感染のｈＡＤＳＣの２１日目の上清中のウイルス５’−ＵＴＲのＲＴ−ＰＣＲ。データは、３回の実験を代表するものである。
【図４Ｆ】（Ｆ）ＨＣＶ（−）患者から単離されたＰＨＨを、３日間放置して付着させ、その後、ＨＣＶｓｅｒ−１ｂまたはＨＣＶｓｅｒ−２ｂに感染したｈＡＤＳＣから回収された２１日目の上清に３時間曝露するか、または対照血清による投与に供した。感染５日後に細胞ＲＮＡを５’−ＵＴＲのＲＴ−ＰＣＲのために抽出した。ＨＣＶｓｅｒ−１ｂ自体を陽性対照として使用した。データは、３回の実験を代表するものである。
【図４Ｇ】（Ｇ）３人のＨＣＶ（−）ドナー（ドナー１、２および３）から単離された１×１０４／ウェルのＰＨＨを３日間、６ウェルプレートで接種培養して細胞を付着させ、４日目にＰＨＨを、（３人の別個のドナーから回収した）ＨＣＶｓｅｒ−１ｂの３つの異なるバッチの１つに別々に感染させた。ＨＣＶｓｅｒ−１ｂを使用して対応するＨＣＶａｄｓｃを生成させ、また並行してそれを使用してＰＨＨを感染させた。ＨＣＶｓｅｒおよびそれに対応するＨＣＶａｄｓｃを対にしてＰＨＨの同じバッチに感染させた。感染５日後にＰＨＨ上清を回収し、５’−ＵＴＲ複製物を定量した。陰性対照として、（同様に３人の異なるドナーからの）ＨＣＶ（−）対照血清へのＰＨＨの曝露を用いた。データは、３回の各感染から得た平均±ＳＤとして表したものである。
【図５】ヒト脂肪組織のホモジネートの遠心分離による種々の層への分離。記載されているように９、ＨＣＶ（＋）個体の脂肪組織を遠心分離し、浮遊物、緩衝液および細胞ペレットの層に分離した（左パネル）。浮遊母集団は成熟脂肪細胞を含有している。細胞ペレットを回収し、ＲＢＣ溶解緩衝液で処理して赤血球を溶解させて、間質血管細胞群（ＳＶＦ）細胞を採集し、ＳＶＦ細胞を、初代（０継代）ｈＡＤＳＣとみなすことのできるＤＬＫ−１＋ヒト脂肪生成幹細胞（ｈＡＤＳＣ）の免疫選択に供した。
【図６Ａ】選択された画分の純度、およびＤＬＫ−１のＲＴ−ＰＣＲ。（Ａ）ＭｏＦｌｏ  ＸＤＰフローサイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＣＡ、米国）を使用してＤＬＫ−１＋（左）およびＤＬＫ−１−（右）の画分中のＤＬＫ−１＋細胞の割合を決定し、Ｓｕｂｍｉｔソフトウェアで解析した。ＤＬＫ−１＋画分およびＤＬＫ−１−画分の９９．５％の自家蛍光の排除を用いて、各画分の陽性染色細胞を決定するためのゲートを設定した。アイソタイプ対照抗体（ウサギＩｇＧ）と共にインキュベートした未分画ＳＶＦ細胞を使用して、同様の結果が得られた。データは、６回の実験を代表するものである。
【図６Ｂ】（Ｂ）未分画ＳＶＦ細胞、選択されたＤＬＫ−１−およびＤＬＫ−１＋細胞１０からＲＮＡを抽出し、ＤＬＫ−１のＲＴ−ＰＣＲに供した（プライマーは記載のとおり１１）。ＤＬＫ−１＋細胞での豊富な発現とは対照的に、ＤＬＫ−１−細胞はＤＬＫ−１のｍＲＮＡをほとんど発現しなかった。データは、４回の実験を代表するものである。
【図７】ＨＣＶ感染ヒト初代肝細胞（ＰＨＨ）はＮＳ５抗原を発現した。ＰＨＨをＨＣＶ（−）またはＨＣＶ（＋）ドナー（それぞれパネルａおよびｂならびにｃおよびｄ）から採集し、培養のためにコラーゲンＩ被覆ウェルに播種した。対照実験として、本発明者らは、ＨＣＶ（＋）またはＨＣＶ（−）ドナーから新たに単離された、アルギニン不含ＷｉｌｌｉａｍｓＥ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、米国）中で培養したヒト初代肝細胞（ＰＨＨ；播種数１ｘ１０４細胞／ウェル）に対するＮＳ５染色の特異性を調べた。９日目に細胞を洗浄し、同様に記載されているサイトスピンスライド上で細胞を染色する方法（「Ｍｅｔｈｏｄｓ」参照）を採用してウェル内で免疫細胞化学に供した。データは、３人のＨＣＶ（＋）ドナーおよび３人のＨＣＶ（−）ドナーからのＰＨＨを使用した３回の実験を代表するものである。注記：歴史的に、感染肝臓組織中のＨＣＶ抗原を検出することは困難であった。しかし、単離された細胞の染色は、発色の時間を十分に制御する限り（「Ｍｅｔｈｏｄｓ」参照）、肝臓組織の染色ほどには非特異的でないようである。
【図８】ＨＣＶ感染個体の脂肪組織中のＤＬＫ−１＋細胞は、ＨＣＶ  ＮＳ５抗原を共発現した。脂肪組織をＨＣＶ感染個体から採集し（表１）、Ｍｅｔｈｏｄに記載されているとおりに、抗ＤＬＫ−１  Ａｂ（赤色標識、白色矢印、パネルａおよびｂ）に続いて抗ＮＳ５  Ａｂ（茶色標識、白色矢印、パネルｃおよびｄ）およびヘマトキシリン（パネルｃおよびｄの青色標識）を使用して同じ切片に対して免疫染色を行った。調べたＨＣＶ（＋）脂肪組織のいずれの切片においても、高倍率視野（４００倍）で約０〜４個のＤＬＫ−１＋ＮＳ５＋細胞を検出することができた。パネルａおよびｃはドナー２からのものであり、パネルｂおよびｄはドナー３からのものであった。アイソタイプ対照抗体による染色像は、図１Ｅに示したものに類似していた。
【図９】懸濁液中でｈＡＤＳＣを感染させるプロトコル。ｈＡＤＳＣをＨＣＶ（−）個体から調製し、記載されているように培養下で継代した１２、１３。第２〜６継代のｈＡＤＳＣを、ＨＣＶ（＋）血清を新鮮な培地で希釈することによって調節した０．２ｍｏｉ（５×１０５個のｈＡＤＳＣ細胞に対してＨＣＶ５’−ＵＴＲ複製数が１×１０５）のＨＣＶｓｅｒに曝露した（表２）。３時間後、細胞をＰＢＳで５回洗浄し、続いて６ｍｌの新鮮な培地で培養した。７、１４、２１および２８日目に上清および細胞溶解物を採集し、ＲＮＡを５’−ＵＴＲのＲＴ−ＰＣＲのために抽出した。
【図１０】プラスチックに接着したｈＡＤＳＣのＨＣＶｓｅｒによる感染。ｈＡＤＳＣを１日間、６ｃｍのペトリ皿で接種培養して細胞を付着させた。続いてＨＣＶｓｅｒを終体積２ｍｌの培地に添加して、０．５ｍｉ（２×１０５個のｈＡＤＳＣ細胞に対して１×１０５個の５’−ＵＴＲ複製物）で細胞を３時間インキュベートした。穏やかに洗浄した後、５ｍｌの新鮮な培地中でＨＣＶｓｅｒ感染ｈＡＤＳＣを、７日毎の培地交換の有り無し（それぞれ経路ａまたはｂ）で培養した。
【図１１】ｐ２およびｐ６のｈＡＤＳＣのウイルス複製効率は、ｐ９およびｐ１５細胞のウイルス複製効率よりも高かった。様々な継代のｈＡＤＳＣを懸濁液中でＨＣＶｓｅｒ−１ａまたはＨＣＶｓｅｒ−２ａに曝露した。感染後、２１日目の上清のウイルス５’−ＵＴＲ転写物および細胞溶解物（連続培養物）をｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した。結果により、ｐ２およびｐ６の細胞とは対照的にｐ９およびｐ１５の細胞は細胞溶解物中および上清中のウイルス複製物が有意に少ない、ということが分かった。データは、３回の実験の平均±ＳＤとして表したものである。
【図１２】ＣＤ８１、ＬＤＬＲ、ＳＲ−Ｂ１およびＥＧＦＲの遮断、ならびにＡｐｏＥの中和は、２１日目のＨＣＶｓｅｒ感染ｈＡＤＳＣ培養物の細胞溶解物中のウイルス複製物を減少させた。Ｐ−２のｈＡＤＳＣを、ＣＤ８１（クローンＪＳ−８１）、ＬＤＬ−Ｒ（クローンＣ７）もしくはＥＧＦＲ（クローンＬＡ１）に対するモノクローナルＡｂ、またはＳＲ−Ｂ１に対するポリクローナルＡｂを段階用量で使用して前処置を１時間行い、次いで洗浄し、その後、ＨＣＶｓｅｒ−１ｂを投与した。ＡｐｏＥ遮断のために様々な濃度の抗ＡｐｏＥ抗体（クローンＥ６Ｄ１０）を、ｈＡＤＳＣと共に３時間インキュベートする前に、記載のとおりに１４ＨＣＶ（＋）血清に室温で１時間添加した。ＨＣＶ（＋）血清では、上清での測定（図３Ｇ）と一致して、ｈＡＤＳＣのＣＤ８１、ＬＤＬ−Ｒ、ＳＲ−Ｂ１およびＥＧＦＲの遮断ならびにＡｐｏＥの中和は、細胞溶解物中のウイルス転写物の量を用量依存的に有意に減少させた。その一方で、抗体の処理自体はｈＡＤＳＣ生存率に有意な影響を与えなかった。データは、各処理について３回の平均±ＳＤとして表したものである。
【図１３Ａ】オクルディン（ＯＣＬＮ）、クローディン−１（ＣＬＤＮ１）、ＮＰＣ１Ｌ１またはＤＧＡＴ−１をノックダウンした後の２１日目の細胞溶解物での、ｓｉＲＮＡトランスフェクション後のＲＴ−ＰＣＲ、およびウイルス複製数。（Ａ）オクルディン、クローディン−１またはＮＰＣ１Ｌ１のノックダウンを記載のとおりに１５、１６実施し、記載のとおりに１６、１７ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＯＣＬＮおよびＣＬＤＮ１のノックダウンは同じ実験で実施したが、ＮＰＣ１Ｌ１のノックダウンは別個の実験で実施した。データは、３回の実験を代表するものである。
【図１３Ｂ】（Ｂ）ＤＧＡＴ１のｓｉＲＮＡプローブは、Ａｍｂｉｏｎ（カタログ番号１１７８２および１１７８４）から得た予め設計されたｓｉＲＮＡであった。スクランブルＲＮＡおよびＤＧＡＴ１に特異的なｓｉＲＮＡのトランスフェクション、ｑＲＴ−ＰＣＲ、ならびにウェスタンブロット分析を記載のとおりに１８実施した。データは、４回の実験から得た平均±ＳＤとして表したものであり、１８Ｓ  ｒＲＮＡに対して標準化された相対比として示される。
【図１３Ｃ】（Ｃ）ノックダウン後、ｈＡＤＳＣをＨＣＶｓｅｒ−１ｂに曝露し、２１日目の細胞溶解物の５’−ＵＴＲ複製数をｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した。ｓｉＲＮＡトランスフェクション自体は、スクランブルｓｉＲＮＡによるトランスフェクションと比較して細胞生存率に有意に影響を与えず、トランスフェクションの４８時間後にトリパンブルー排除試験によって決定された。明らかに、ＤＧＡＴ１ノックダウンは、細胞よりも上清においてより顕著な阻害効果を有した（パネルＣ対図３Ｈ）。これは、ＤＧＡＴ１ノックダウンが細胞内の複製と放出との両方を損なうという知見と一致するが、ウイルス放出はより顕著に影響を受けたようである１９。データは、４回の実験から得た平均±ＳＤとして表したものであり、スクランブル対照によるトランスフェクションに対する相対比として示される。
【図１４】ｈＡＤＳＣにおけるシクロフィリンＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ。記載されているように２０、シクロフィリンＡ（ＣｙｐＡ）のＲＴ−ＰＣＲをｐ０〜ｐ６のｈＡＤＳＣで実施した。ナイーブＨｕｈ７．５細胞を陽性対照として使用した。データは、４回の実験を代表するものである。
【図１５Ａ】ＨＣＶｓｅｒ、ＪＦＨ１／ＨＣＶｃｃおよびＨＣＶａｄｓｃの主要画分（密度勾配による）の合計脂質含有量。ＨＤＬおよびＬＤＬ／ＶＬＤＬのレベルをＨＤＬおよびＬＤＬ／ＶＬＤＬコレステロールアッセイキット（Ａｂｃａｍ）によって検出した。ＡｐｏＢおよびＡｐｏＥの量を、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）ＥＬＩＳＡヒトＡｐｏＢ免疫アッセイキット、およびＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）ＥＬＩＳＡヒトＡｐｏＥ免疫アッセイキット（Ｒ＆Ｄ）によって、製造者の指示に従って測定した。また、種々の画分でのＨＤＬおよびＬＤＬ／ＶＬＤＬ、ＡｐｏＢならびにＡｐｏＥの量を１複製物当たりの重量に規格化した。（Ａ）ＨＣＶｓｅｒ（特に画分２）は、ＨＤＬおよびＬＤＬ／ＶＬＤＬの「合計」量がＨＣＶｃｃまたはＨＣＶａｄｓｃよりも高かった。
【図１５Ｂ】（Ｂ）ＨＣＶｓｅｒおよびＨＣＶａｄｓｃの別の２バッチの分析は、脂質およびＡｐｏＥ／Ｂ含量の同じパターンを示した。
【図１５Ｃ】（Ｃ）ＨＣＶｓｅｒおよびＨＣＶａｄｓｃの別の２バッチの分析は、脂質およびＡｐｏＥ／Ｂ含量の同じパターンを示した。
【図１６】ＪＦＨ１／ＨＣＶｃｃ感染Ｈｕｈ７．５の効率４×１０５個のＨｕｈ７．５細胞／ウェルを一晩、６ウェルプレートで接種培養した。１日後に細胞を洗浄し、ＨＣＶｃｃウイルス接種物（０．５ｍｏｌ）と共に３時間インキュベートした。洗浄後に細胞を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％の非必須アミノ酸の補充されたＤＭＥＭ中で培養した。感染の３日後に上清を採集し、ＲＮＡを５’−ＵＴＲ転写物のｑＲＴ−ＰＣＲのために抽出した。ウイルス接種物に曝露されていないナイーブＨｕｈ７．５細胞を陰性対照として使用した。データは、３回の実験から得た平均±ＳＤとして表したものである。この実験は、ｈＡＤＳＣの感染に使用したＨＣＶｃｃ接種物の感染力を立証した（図４Ｄ）。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明のいくつかの態様を、例示のために示される応用に関して以下に記載する。本発明の完全な理解を提供するために多くの具体的な詳細、関係、および方法が示されていることを理解されたい。しかしながら、１つ以上の具体的な詳細なしで、または他の方法によって、本発明を実施できることは、当業者によって容易に認識されるであろう。本発明は行為または事象の順序によって限定されない、というのも、いくつかの動作は他の行為または事象とは異なる順序でかつ／または同時に生じる可能性があるからである。さらに、本発明に従って方法論を実施するためには、示されている全ての行為または事象が必要とされるわけではない。
【００１９】
（定義）
別段の定義がない限り、本明細書中で用いられる科学技術用語および命名法は、本発明が関係する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。概して、細胞培養、感染、分子生物学方法などのための手順は、当該技術分野において用いられる一般的な方法である。そのような標準的技法は、参考マニュアル、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）などに見出すことができる。
【００２０】
本明細書中で用いられる単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈から明白な別段の表示がない限り、複数形も含むことが意図される。さらに、用語「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「共に（ｗｉｔｈ）」、またはそれらの変形が詳細な説明および／または特許請求の範囲において用いられている限りにおいて、そのような用語は、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同様に包括的であること意図したものである。
【００２１】
本明細書で使用する用語「約」は、量、一時的持続時間などのような測定可能な値に言及している場合、指定された値からの±２０％または±１０％、より好ましくは±５％、よりいっそう好ましくは±１％、よりさらに好ましくは±０．１％の変動を（そのような変動が開示の方法を実施するのに適切である場合）包含することを意図している。
【００２２】
本明細書中で用いられる用語「脂肪組織」は、白色脂肪、黄色脂肪または褐色脂肪からなる代謝的に主要な重要性を有する散在性の臓器を定義する。脂肪組織は脂肪細胞および間質を有する。脂肪組織は動物の体全体に見られる。例えば、哺乳類では、脂肪組織は大網、骨髄、皮下腔および周囲の大部分の臓器に存在する。
【００２３】
本明細書中で用いられる用語「幹細胞」は、それ自体およびさらなる分化した子孫細胞を産生することのできる成体未分化細胞を定義する。
【００２４】
「ヒト脂肪由来幹細胞」、「ｈＡＤＳＣ」、「ヒト脂肪由来ＤＬＫ−１＋幹細胞」および「ヒト脂肪生成ＤＬＫ−１＋細胞」という用語は交換可能に用いられ、本明細書で用いられているところでは、脂肪組織を含有する組織源から得られる親細胞であるかまたは親細胞を有する、ヒト成体幹細胞である。これらの細胞は、表皮成長因子様ファミリー２１のメンバーであり脂肪生成に必須である特異的マーカーＤＬＫ−１（すなわち、Ｐｒｅｆ−１）を発現し、この発現は成熟脂肪細胞において完全に消滅する２２〜２４。
【００２５】
本明細書中で用いられる用語「初代細胞」は、個体から得た細胞または組織から直接誘導される細胞を指す。本明細書中で用いられる「継代細胞」は、初代細胞から継代培養された細胞を指す。本明細書中で用いられる「継代数」は、細胞が初代細胞から継代培養された回数を指す。例えば、第１継代細胞（Ｐ１細胞）は、初代細胞を直接継代培養することによって得られる細胞であり、第２継代細胞（Ｐ２細胞）は、第１継代細胞を直接継代培養することによって得られる細胞である、などである。
【００２６】
本明細書中で用いられる場合、「培養」、「培養する」、「増殖させる（ｇｒｏｗ）」、「増殖する（ｐｒｏｐａｇａｔｅ）」および「増殖（ｐｒｏｐａｇａｔｉｎｇ）」という用語は、交換可能に用いられ、調製された培地中で細胞を試験管内で増殖させることをいう。本明細書中で用いられる場合、「培養システム（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ）」「培養システム（ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）」「増殖システム（ｐｒｏｐａｇａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍ）」および「増殖システム（ｐｒｏｐａｇａｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）」という用語は交換可能に用いられ、ウイルス粒子を生成させる細胞を含む細胞培養物を指す。特に、本発明の培養システムは、ＨＣＶを生成する培養下のｈＡＤＳＣを含む。システムは、感染性ウイルスの産生を含めたＨＣＶの完全な複製（例えば、付着、細胞内への侵入、複製、成熟など）、特に、ウイルス侵入、（−）鎖および（＋）鎖の合成を含めた複製、ウイルスタンパク質合成、ウイルス組み立て、ウイルス輸送、またはウイルス放出を支援する。
【００２７】
本明細書中で用いられる「試料」または「生体試料」という用語は、被験体または試験管内培養物から単離された生体材料を意味する。生体試料は、核酸、ポリペプチドまたは、被験体もしくは試験管内細胞培養物におけるその他の生物学的、物理学的もしくは病理学的プロセスのマーカーを検出するのに適した任意の生体材料を含有し得、培地、体液、組織ならびに、被験体または試験管内細胞培養物から得られた細胞性および／または非細胞性の材料を含み得る。
【００２８】
本明細書中で用いられる場合、用語「診断」は、疾患または障害の存在の判定をいう。本発明のいくつかの実施形態では、特定の疾患または障害の存在の判定を可能とする、診断を行う方法が提供される。
【００２９】
本明細書中で用いられる場合、「患者」、「被験体」、「個体」などの用語は互換的に用いられ、本明細書に記載の方法を受けることのできる任意の動物を指す。特定の非限定的な実施形態において、患者、被験体または個体はヒトである。
【００３０】
（説明）
本発明は、ｈＡＤＳＣがＨＣＶによる感染に対して許容性であるという発見に関する。
【００３１】
（ｈＡＤＳＣ）
ヒト脂肪由来幹細胞は、中胚葉由来の多能性成体幹細胞であり、簡単に大量に得ることができる９。これらの細胞は、表皮成長因子様ファミリー２１のメンバーであり脂肪生成に必須である特異的マーカーＤＬＫ−１（すなわち、Ｐｒｅｆ−１）を発現し、この発現は成熟脂肪細胞において完全に消滅する２２〜２４。ヒト脂肪生成ＤＬＫ−１＋細胞（ｈＡＤＳＣ）は複数の細胞系統に分化できるということが、相次ぐ証拠によって実証されており（総説については参考文献２５、２６参照）、ｈＡＤＳＣは再生療法の考案に有望なツールとなっている。様々な解剖学的区画にある間葉系幹細胞がウイルスの感染に対して感受性であることも報告されている２７〜３２。しかし、ウイルス性疾患におけるｈＡＤＳＣの役割はまだ探究されていない。
【００３２】
一般に、ｈＡＤＳＣは任意の利用可能な供給源から得ることができる。一実施形態では、ｈＡＤＳＣは適切な組織源から分離される。適切なｈＡＤＳＣの組織源としては、限定はしないが、任意の脂肪含有組織、例えば、褐色脂肪組織または、皮下白色脂肪組織などの白色脂肪組織が挙げられる。典型的には、ヒト脂肪組織は、外科的切除または脂肪吸引を用いて生存ドナーから得られる。いくつかの実施形態では、脂肪組織は、被験体の予め選択された領域、すなわち、腹部、臀部、鼠径部および腹膜、またはそれらの任意の組み合わせから得られる。
【００３３】
一実施形態では、ｈＡＤＳＣは、腹部または臀部の皮下脂肪組織から単離される。一実施形態では、ｈＡＤＳＣは初代細胞、すなわち個体の脂肪組織に直接由来する細胞である。別の実施形態では、ｈＡＤＳＣは、継代細胞、例えば第１〜１５継代細胞、好ましくは第１〜６継代細胞である。
【００３４】
ｈＡＤＳＣなどのＡＤＳＣを分離、単離および増殖させる方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、米国特許第６，３９１，２９７１Ｂ１号；第６，７７７，２３１Ｂ１号明細書；米国特許第５，７８６，２０７号明細書；米国特許出願第２００５／００７６３９６Ａ１号明細書；Ｂｕｒｒｉｓら（１９９９）Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １３：４１０−７；Ｅｒｉｃｋｓｏｎら（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００２年１月１８日；２９０（２）：７６３−９；Ｇｒｏｎｔｈｏｓら（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、１８９：５４−６３；Ｈａｌｖｏｒｓｅｎら（２００１）Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ５０：４０７−４１３；Ｈａｌｖｏｒｓｅｎら（２００１）Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．７（６）：７２９−４１；Ｈａｒｐら（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２８１：９０７−９１２；Ｓａｌａｄｉｎら（１９９９）Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ＆Ｄｉｆｆ  １０：４３−４８；Ｓｅｎら（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８１：３１２−３１９；Ｚｈｏｕら（１９９９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：５１３−５１７；Ｅｒｉｃｋｓｏｎら（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００２年１月１８日；２９０（２）：７６３−９；Ｇｒｏｎｔｈｏｓら（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、１８９：５４−６３；Ｈａｌｖｏｒｓｅｎら（２００１）Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ５０：４０７−４１３；Ｈａｌｖｏｒｓｅｎら（２００１）Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．２００１年１２月７日；（６）：７２９−４１；Ｈａｒｐら（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２８１：９０７−９１２；Ｓａｌａｄｉｎら（１９９９）Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ＆Ｄｉｆｆ  １０：４３−４８；Ｓｅｎら（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８１：３１２−３１９；Ｚｈｏｕら（１９９９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：５１３−５１７；ＺｕＩｃら（２００１）Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．７：２１１−２２８；Ｈａｕｎｅｒら（１９８７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂｏｌ．６４：８３２−８３５；Ｋａｔｚら（１９９９）Ｃｌｉｎ．Ｐｌａｓｔ．Ｓｕｒｇ．２６：５８７−６０３に記載されている。
【００３５】
例を示すにすぎないが、いくつかの形態学的方法、生化学的方法または分子に基づく方法を用いて当該細胞を単離することができる。一態様において、ｈＡＤＳＣは、細胞の大きさおよび粒度に基づいて単離される、というのもｈＡＤＳＣは小さく粒状であるからである。あるいはｈＡＤＳＣは、幹細胞が分化細胞よりも長いテロメアを有する傾向にあることから、テロメアの長さをアッセイすることまたはテロメラーゼ活性をアッセイすることによって単離することができる。
【００３６】
あるいは、ｈＡＤＳＣに特異的な細胞マーカーを選択することによって免疫組織化学的にｈＡＤＳＣを他の細胞から分離することができる。ｈＡＤＳＣは、間葉系幹細胞マーカーＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ７１、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１１７およびＳＴＲＯ−１を発現する。それらは、造血系統マーカーＣＤ４５、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ１０４およびＣＤ１０６ならびに、内皮細胞（ＥＣ）マーカーＣＤ３１、ＣＤ１４４およびフォンビルブラント因子に対して陰性である（Ｚｕｋら、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  １３（１２）：４２７９−４２９５、２００２；Ｍｕｓｉｎａら、Ｂｕｌｌ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  １３９（４）：５０４−５０９、２００５；Ｒｏｍａｎｏｖら、Ｂｕｌｌ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  １４０（１）：１３８−１４３、２００５）。形態学的には、それらは線維芽細胞様であり、試験管内での増殖後にそれらの形状を維持している（Ｚｕｋら、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  １３（１２）：４２７９−４２９５、２００２；Ａｒｒｉｇｏｎｉら、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ  ３３８（３）：４０１−４１１、２００９；Ｚａｎｎｅｔｔｉｎｏら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２１４（２）：４１３−４２１、２００８）。種々の態様において、ｈＡＤＳＣは、ＤＬＫ−１＋の免疫選択によって単離される。
【００３７】
別の実施形態では、ｈＡＤＳＣは、市販の供給源、または確立されたｈＡＤＳＣの系統から得られる。そのようなｈＡＤＳＣの非限定的な例は、Ｐｏｉｅｔｉｃｓ（商標）ヒト脂肪由来幹細胞（カタログ番号ＰＴ−５００６、Ｌｏｎｚａ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．）およびＡＴＣＣ（登録商標）ＰＣＳ−５００−０１１（商標）などである。
【００３８】
（細胞培養物）
一般に、ｈＡＤＳＣは、当該技術分野において利用可能な周知の培地中で維持しかつ増殖させることができる。このような培地としては、限定はしないが、ケラチノサイトＳＦＭ（Ｋ培地）、ダルベッコ改変イーグル培地（登録商標）（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ  Ｆ１２培地（登録商標）、イーグル最少必須培地（登録商標）、Ｆ−１２Ｋ培地（登録商標）、イスコフ改変ダルベッコ培地（登録商標）ＲＰＭＩ−１６４０培地（登録商標）、間葉系幹細胞基礎培地（ＡＴＣＣ（登録商標）ＰＣＳ−５００−０３０（商標））および間葉系幹細胞成長キット−低血清（ＡＴＣＣ（登録商標）ＰＣＳ−５００−０４０（商標））が挙げられる。
【００３９】
また、本発明では、哺乳動物血清、好ましくはウシ胎児血清による細胞培養培地の補充が考えられる。本発明のいくつかの実施形態では、そのような哺乳動物血清濃度は、０体積％〜２０体積％、好ましくは５体積％〜１５体積％、より好ましくは１０体積％の範囲である。血清の例としては、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウシ血清（ＢＳ）、仔ウシ血清（ＣＳ）、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、新生仔ウシ血清（ＮＣＳ）、ヤギ血清（ＧＳ）、ウマ血清（ＨＳ）、ヒト血清、ニワトリ血清、ブタ血清、ヒツジ血清、ウサギ血清、血清代替品およびウシ胎児液が挙げられる。
【００４０】
成長因子、ホルモン、アミノ酸、脂質、ミネラルなどの追加の補給物も、最適な成長および増殖のために必要な微量元素を細胞に供給するために好適に使用できる。そのような補給物は市販されている。これらの補給物の適切な濃度を決定することは、当業者の技量の範囲内である。
【００４１】
（ＨＣＶ）
本発明によるＨＣＶは、ｈＡＤＳＣに感染することのできる任意のＨＣＶ、またはＨＣＶ感染個体から分離されることのできる任意のＨＣＶとすることができる。一実施形態において、ＨＣＶは、遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、４ｇ、４ｈ、４ｉ、４ｊ、５ａおよび６ａまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＨＣＶ遺伝子型の少なくとも１つである。別の実施形態において、ＨＣＶは、遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂおよび混合型２ａ＋２ｂからなる群から選択されるＨＣＶ遺伝子型の少なくとも１つである。
【００４２】
一態様において、本発明は、ＨＣＶを増殖させるためのｈＡＤＳＣに基づくシステムを含み、それはｈＡＤＳＣを含む。別の態様において、本発明は、ＨＣＶの増殖、またはＨＣＶ生活環分析の実施、またはＨＣＶ感染の診断、または抗ウイルス化合物の選抜、またはＨＣＶに感染した被験体のＨＣＶの特性評価のために本発明のｈＡＤＳＣまたはＨＣＶ培養システムを使用する方法を含む。
【００４３】
ＨＣＶのレベルは、当該技術分野において既知の任意の技法によって決定することができる。そのような技法としては、ＨＣＶタンパク質を試験するものである抗ＨＣＶ  ＥＬＩＳＡアッセイ（酵素結合免疫吸着検定法）が挙げられる。増幅試験されたＲＮＡによるＨＣＶ複製の試験（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応すなわちＰＣＲ、分岐ＤＮＡアッセイ）を用いてもよい。ＨＣＶのＲＮＡの合成は、実際には、リアルタイムＰＣＲ用に設計された装置を使用して単一工程でＲＴ−ＰＣＲによって、またはＨＣＶ特異的放射性プローブを使用してフィルタ上のＲＮＡのハイブリダイゼーションによって、分析され得る。例えば、ＨＣＶゲノムの増幅を可能にする特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、単離ＲＮＡを、対になった逆転写および増幅、例えば、逆転写とポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）による増幅とに供してもよい。その後、上記被験体に、感染したＨＣＶの遺伝子型を決定すべく直接配列決定を実施してもよい。
【００４４】
種々の実施形態において、ＨＣＶのレベルは、ＨＣＶ力価、ＨＣＶ核酸のレベル、またはＨＣＶポリペプチドのレベルを測定することによって決定される。
【００４５】
種々の実施形態において、候補化合物の非存在下で認められるＨＣＶレベルと比較して、候補化合物の存在下で認められるＨＣＶのレベルの低下は、候補化合物の阻害活性を指し示す。
【００４６】
本発明によれば、候補化合物としては、限定はしないが、化学化合物、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、抗体、核酸、アンチセンス核酸、ｓｈＲＮＡ、リボザイムおよび小分子化学化合物が挙げられる。
【００４７】
本明細書中で開示されているとおり、選抜方法を用いて同定した抗ＨＣＶ化合物を、感受性動物モデルでさらに試験することができる。
【００４８】
（キット）
関連する態様において、本発明はまた、ＨＣＶの増殖、またはＨＣＶ生活環分析の実施、またはＨＣＶ感染の診断、または抗ウイルス化合物の選抜、またはＨＣＶに感染した被験体のＨＣＶの特性評価のための、本明細書に記載のｈＡＤＳＣおよびｈＡＤＳＣの培養に適した培地を含むキットを提供する。
【００４９】
本発明を、以下の実施例によってさらに説明する。これらの実施例は、本発明を例示することを意図したものに過ぎず、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。以下の実施例における実験方法は、特に指定しない限り、慣例的な条件、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらによりＭｏｌｅｃｕｌｅ  Ｃｌｏｎｅ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年に記載されている条件、または製造業者によって指示された条件の下で実施した。
【実施例】
【００５０】
＜材料および方法＞
（臨床試料）
全ての臨床脂肪組織および肝臓試料は、Ｋａｏｈｓｉｕｎｇ医科大学病院から施設研究委員会の承認を得て入手した（ＫＭＵＨ−ＩＲＢ−９６０４７７、ＫＭＵＨ−ＩＲＢ−９６０３４３およびＫＭＵＨ−ＩＲＢ−２０１２０４０４）。手続きに先立ち、全てのドナーから書面によるインフォームドコンセントを得た。
【００５１】
（新鮮な脂肪組織の分画およびＤＬＫ−１＋細胞の培養）
ＨＣＶ（＋）脂肪組織は、肝細胞癌腫を切除するための手術創（開腹術）から得た。ＨＣＶ（−）脂肪組織については、先に記載されているとおりに１３、乳癌の乳房切除直後の乳房再建術を受けた女性の横軸型腹直筋皮弁から得た。脂肪吸引を受けている肥満者からもＨＣＶ（−）脂肪組織を得た（表１）。手術前に乳癌の管理のために補助化学療法または放射線療法を受けた患者は一人もいなかった。
【００５２】
試料採集後、組織を無菌標準生理食塩水で洗浄し、検体を無菌バッグに入れて速やかに調製のために送った。新鮮な脂肪組織を、免疫組織化学のために固定するか、または記載されているとおりに１２、１３、３３遠心分離（８００ｇ、１０分）によって上部（成熟脂肪細胞および結合組織を含む）の浮遊層（浮遊物）と、中間部の緩衝液層と、底部の沈降細胞ペレットとに分画するために使用した。簡潔に述べると、はさみで脂肪組織を完全に細かく刻んで小片にし、カルシウムおよびマグネシウムを含まないＰＢＳで洗浄し、続いてＰＢＳ中で３０分間、０．０７５％コラゲナーゼ（３７．５ｍｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して３７℃で定常撹拌によって消化した。
【００５３】
底層の細胞ペレット（すなわちＳＶＦ細胞）を回収し、記載されているとおりに１２、３４（赤血球を溶解させるために）ＲＢＣ溶解溶液で処理し、続いて１００μｍのＳｔｅｒｉｆｌｉｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルタで濾過した。ＳＶＦ細胞の数および生存率は、トリパンブルーで染色した後にＣｏｕｎｔｅｓｓセルカウンター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して測定した。その後、記載されているとおりに１０ＳＶＦ細胞を免疫磁気ビーズによってＤＬＫ−１＋細胞について陽性選択し、細胞ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲまたはｑＲＴ−ＰＣＲのために抽出した。ＤＬＫ−１＋細胞も（ウイルスＮＳ５抗原についての）免疫細胞化学に供した。
【００５４】
いずれの試料についても、脂肪試料採取から細胞の単離までの間隔は３時間以下であった。ＤＬＫ−１＋細胞を培養するために、記載されているとおりに１３）１ｘ１０５個の細胞を６ｃｍのペトリ皿に４９日間置き、７日毎に（培地交換と同時進行で）上清をＲＮＡ抽出のために採集した。
【００５５】
（ＤＬＫ−１＋細胞の免疫選択）
ＨＣＶ感染またはＨＣＶ未感染の個体から調製したＲＢＣ溶解した未分画ＳＶＦ細胞をポリクローナルウサギ抗ＤＬＫ１抗体（Ａｂｃａｍ、米国）と共に４℃で３０分間インキュベートした。記載されているとおりに１０細胞を、０．８ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２、２０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有するＨＢＳＳ中で２回洗浄し、磁気マイクロビーズに結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｉｎｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）と共に４℃で３０分間インキュベートした。細胞懸濁液を洗浄し、ＭｉｄｉＭＡＣＳセパレータ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）内のカラムに通し、その結果、ＤＬＫ−１−細胞が通過し、ＤＬＫ−１＋細胞がカラムに保持された。両方の細胞画分をＨＢＳＳ中で２回洗浄した。細胞生存率は、ＤＬＫ−１＋画分およびＤＬＫ−１−画分についてそれぞれ＞９６％および＞９７％であった。ＲＴ−ＰＣＲまたはｑＲＴ−ＰＣＲのためにＲＮＡを抽出した。別個の実験において、細胞を免疫細胞化学のためにサイトスピンスライドに固定した（５〜７×１０３細胞／スライド）。試験管内感染の実験では、ＨＣＶ（＋）血清（ＨＣＶｓｅｒ）への曝露後、ＤＬＫ−１＋細胞を、表示の期間、培養および継代した（記載されているとおりに１３継代培養した）。その後、ＲＮＡをウイルス５’−ＵＴＲ転写物のＲＴ−ＰＣＲまたはｑＲＴ−ＰＣＲのために抽出した。
【００５６】
（ＨＣＶｓｅｒによるｈＡＤＳＣ感染）
この研究では、２つのプロトコルを採用した。
【００５７】
（１）プロトコル１、懸濁液中での感染−本発明者らは、ナイーブｈＡＤＳＣの第２継代（ｐ−２）〜第６継代までをＨＣＶｓｅｒ感染のために使用した。８００μｌの新鮮な培地中に懸濁させた５ｘ１０５個のｈＡＤＳＣに合計２００μｌのＨＣＶ血清（１ｘ１０５個の５’−ＵＴＲ複製物を含有する）を、エッペンドルフチューブ内で０．２の感染多重度（ＭＯＩ）で添加し、続いて３７℃で３時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、さらに７、１４、２１および２８日間培養し、上清中および細胞溶解物中のＲＮＡを５’−ＵＴＲのＲＴ−ＰＣＲのために採集した。また、免疫細胞化学および透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）研究のために細胞を回収した。
【００５８】
（２）プロトコル２、接着形態での感染―ｐ−２〜ｐ−６のナイーブｈＡＤＳＣを６ｃｍのペトリ皿内に１日間接種培養して細胞を付着させ、ＨＣＶｓｅｒを終体積２ｍｌの培地に０．５ｍｏｉ（２×１０５個のｈＡＤＳＣ細胞に対して１×１０５個の５’−ＵＴＲ複製物）で３時間添加した。穏やかに洗浄した後、５ｍｌの新鮮な培地中で細胞を、７日毎の培地交換の有り無しで培養した。
【００５９】
（５’−ＵＴＲのＲＴ−ＰＣＲおよび定量的ＲＴ−ＰＣＲ）
ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ウイルスＲＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｂａｓｌｅ、スイス）を使用してＲＮＡを１４０μｌのＨＣＶ（＋）血清またはＨＣＶｓｅｒ感染ｈＡＤＳＣ培養物の上清から抽出した。ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）ＲＮＡミニキット（Ａｍｂｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、米国）を製造業者の指示に従って使用して、細胞溶解物由来のＲＮＡを単離した。その後、高容量ｃＤＮＡ逆転写キットを使用してＲＮＡを一本鎖ｃＤＮＡに変換し、続いてＧｏＴａｑ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ、米国）を使用してＰＣＲを行った。ウイルス複製物を定量するために、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）ＶｉｉＡ（商標）７リアルタイムＰＣＲシステムを使用して、Ｃ型肝炎ウイルスアドバンスドキット（ＰｒｉｍｅｒＤｅｓｉｇｎ  Ｌｔｄ．、英国）でＰＣＲを行った。ＨＣＶ特異的な逆方向プライマーおよび増幅プライマーは、ＡＢＩプライマー３．０  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｓｏｆｔ  Ｗｏｒｄに従って設計した。記載されているとおりに３５、プライマー５’−ＡＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧ−３’を逆転写に使用し、ＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲに使用するプライマーを、別のＨＣＶ遺伝子型の高度に保存された５’−非翻訳領域（ＵＴＲ）に適合させた。
【００６０】
（ヒト脂肪組織に対する免疫組織化学（ＩＨＣ））
新鮮な脂肪組織を手術創から採集し、ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。組織を５μｍの切片に切断し、脱ろうし、その後、クエン酸緩衝液（１０ｍＭのクエン酸、ｐＨ６．０）に浸し、抗原回復のためにマイクロ波で加熱した。室温で３０分間、５％のＢＳＡでブロッキングした後、ポリクローナルウサギ抗ＤＬＫ１抗体（１：１５０；カタログ番号ａｂ２１６８２、Ａｂｃａｍ、米国）またはウサギＩｇＧ  Ａｂ（１：１５０、カタログ番号ＡＢ−１０５−Ｃ、Ｒ＆Ｄ）を４℃で一晩適用し、続いてアルカリフォスファターゼ結合抗ウサギＩｇＧ二次抗体（１：５００；Ｊａｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を室温で１時間適用し、その後、ｆａｓｔ  ｒｅｄ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅシステム（シグマアルドリッチ）で発色させた。連続的なＮＳ５染色のために、試料をＰＢＳに１０分間浸漬してカバーガラスを取り外し、スライドを０．３％のＨ２Ｏ２中で３０分間、室温でインキュベートして、内因性ペルオキシダーゼに由来する非特異的バックグラウンドを減少させた。室温で３０分間、５％ＢＳＡでブロッキングした後、マウス抗ＮＳ５抗体（１：２００、クローンＢＧＮ／１２４６／５Ｇ７、カタログ番号０２００−０４２３、ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）またはマウスＩｇＧ１アイソタイプＡｂ（１：１００、カタログ番号１４−４７１４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を４℃で一晩添加した。本発明者らの経験では、既に試料をパラフィンに包埋していたため、脂肪組織に対するＮＳ５染色には細胞浸透手順が不要であった。その後、切片を西洋ワサビペルオキシダーゼポリマーＱｕａｎｔｏ試薬（抗マウス、既製、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に室温で７分間インキュベートし、ＵｌｔｒａＶｉｓｉｏｎ  Ｑｕａｎｔｏ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（発色用ＤＡＢ基質含有；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で発色させた。その後、切片をヘマトキシリンで染色し、カバーガラスを元どおりに配置し、それによって細胞輪郭がわずかに変化した（図１Ｅに示すとおり）。ＴｉｓｓｕｅＦＡＸＳ走査ソフトウェア（ＴｉｓｓｕｅＧｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して高品質顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）、高速コンピュータハードウェアおよび高解像度スクリーンによってＤＬＫ１およびＮＳ５Ａの染色の電子画像をキャプチャした。続いて、画像内の同じ領域を選択し、比較および共局在化の分析のために視覚化した。
【００６１】
脂肪組織（図１Ｅ）では、発色に必要な最適時間は、ＨＣＶ感染状態に拘らず、様々なドナーからの組織の中で著しく変動（つまり、ドナー間での変動）した。本発明者らは方法を何度も改変し、発色のための時間が重大な意味を持つことを発見した。本発明者らが従った指針は、アイソタイプＡｂ染色（ウサギＩｇＧまたはマウスＩｇＧ１）の色信号を最も弱く生じる発色の最大時間をまず決定することであり、その後、この発色の期間を抗ＤＬＫ−１  Ａｂ染色または抗ＮＳ５  Ａｂ染色に採用した。これは、基質の過剰発色による偽陽性がほとんど生じないこと、およびアイソタイプＡｂ染色のバックグラウンドが低くなることを確実にするためであった。
【００６２】
ＨＣＶ（＋）ドナー１（表１）の脂肪組織についての本発明者らの研究では、有意な色信号が現れる前のウサギＩｇＧ染色の発色の最大時間は４０〜５０秒であったことから、ＤＬＫ−１染色の発色は４０〜５０秒に定めた。同様に、有意な色シグナルのないマウスＩｇＧ１染色の発色の最大時間は１５秒という短さであったが、それを抗ＮＳ５  Ａｂ染色の発色時間として定めた。対照的に、ドナー２およびドナー３の脂肪組織では、ウサギＩｇＧ染色の最適な発色時間は３０秒であり、マウスＩｇＧ１染色の場合はわずか１０秒であったことから、これらの期間をそれぞれ抗ＤＬＫ−１染色および抗ＮＳ５  Ａｂ染色の発色のために定めた。ＨＣＶ（−）試料を染色する際、同様の指針に従った。
【００６３】
（免疫細胞化学（ＩＣＣ））
未分画ＳＶＦ細胞またはＤＬＫ−１＋ｈＡＤＳＣまたはＤＬＫ−１−細胞の免疫細胞化学のために、ＩＨＣの場合と同様の指針に従って、最適な発色時間をどの対照実験においても上記のとおりに予め決定した。表示の時点において細胞を回収し、サイトスピンによりポリリジン被覆ガラススライドに接着させ、続いて４％のホルマリンで２０分間固定した。ＤＬＫ−１染色のために、細胞を３７℃で３０分間、０．０５％のトリプシン溶液によって抗原回復に供し、その後、ＤＤＷによって３回すすいだ。Ｕｌｔｒａ  Ｖ  Ｂｌｏｃｋ緩衝液（ＵｌｔｒａＶｉｓｉｏｎ  Ｑｕａｎｔｏ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍの中の試薬、Ｔｈｅｒｍｏ、米国）で５分間ブロッキングした後、細胞を４℃で一晩ウサギ抗ＤＬＫ１抗体またはウサギＩｇＧと共にインキュベートし、続いてアルカリホスファターゼ結合抗ウサギＩｇＧ二次抗体と共に室温で１時間インキュベートし、ｆａｓｔ  ｒｅｄ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅシステム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で５〜６分間（ほとんどの場合）発色させた。（図２Ｃに示すように同じスライド上で染色された）ＨＣＶ特異的ＮＳ５の単染色または逐次染色のために、スライドをＰＢＳ中に１０分間置いてカバーガラスを取り外し、封入剤を洗い流し、０．３％のＴｒｉｔｏｘ−１００と１％のＢＳＡとを含有するＰＢＳで細胞を３０分間浸透させブロッキングし、その後、ＵｌｔｒａＶｉｓｉｏｎ  Ｑｕａｎｔｏ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ、米国）を適用した。次いで、細胞をＨｙｄｒｏｇｅｎ  Ｐｅｒｏｘｉｄｅ  Ｂｌｏｃｋ（Ａｂｃａｍ、ＭＡ、米国）中で１０分間インキュベートして、内因性ペルオキシダーゼに起因する非特異的なバックグラウンド染色を減少させた。洗浄後、細胞をＵｌｔｒａ  Ｖ  Ｂｌｏｃｋ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ、米国）と共に５分間インキュベートして非特異的なバックグラウンド染色をブロッキングし、マウスモノクローナル抗ＮＳ５抗体を含有する希釈緩衝液と共に４℃で一晩インキュベートした。マウスＩｇＧ１による染色を陰性対照として用いた。翌日、細胞をＰｒｉｍａｒｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ  Ｑｕａｎｔｏ溶液と共に１０分間インキュベートし、さらに１０分間、ＨＲＰ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｑｕａｎｔｏと共にインキュベートし、各試薬適用の間にＰＢＳで洗浄した。最後に、３０μｌのＤＡＢ  Ｑｕａｎｔｏ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎを１ｍｌのＤＡＢ  Ｑｕａｎｔｏ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅに添加し、旋回混合し、発色のために細胞に（ほとんどの場合）２〜３分間適用した。洗浄後、スライドに永久封入剤を載せ、カバーガラスで覆い、ＴｉｓｓｕｅＦＡＸＳ顕微鏡（ＺＥＩＳＳ）を使用して視覚化し、撮影した。
【００６４】
（血清ＨＣＶ感染ｈＡＤＳＣについての透過型電子顕微鏡検査）
ＴＥＭ研究のために、ｈＡＤＳＣを回収し、記載されているとおりに３６調製し、透過型電子顕微鏡（ＪＥＭ２０００  ＥＸＩＩ；ＪＥＯＬ、東京、日本）で調べた。
【００６５】
（ＨＣＶ２ａおよび２ｂのコア抗原をコードするｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ）
ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）ＲＮＡミニキット（Ａｍｂｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、米国）を製造者の指示に従って使用してｈＡＤＳＣのＲＮＡを単離した。高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＲＮＡを一本鎖ｃＤＮＡに変換した。逆転写に使用した特異的プライマーは５’−ＡＴＧＴＡＣＣＣＣＡＴＧＡＧＧＴＣＧＧＣ−３’であった。ＰＣＲに使用したプライマーは、別のＨＣＶ遺伝子型のコアタンパク質領域に適合させた。第１回目のＰＣＲには、以下の設定での熱プロファイルを用いて、（順方向）５’−ＣＧＣＧＣＧＡＣＴＡＧＧＡＡＧＡＣＴＴＣ−３’および（逆方向）５’−ＣＧＣＧＣＧＡＣＧＣＧＴＡＡＡＡＣＴＴＣ−３’を含有するプライマー混合物を使用した：９４℃で２分間、続いて９４℃で４５秒間と５５℃で４５秒間と７２℃で９０秒間とを３５サイクル、次いで最終伸長のために７２℃で７分間。２回目のＰＣＲにおける遺伝子型同定に使用した型特異的なアンチセンスプライマーは、５’−ＣＣＡＡＧＡＧＧＧＡＣＧＧＧＡＡＣＣＴＣ−３’（２ａ型）および５’−ＡＣＣＣＴＣＧＴＴＴＣＣＧＴＡＣＡＧＡＧ−３’（２ｂ型）であり、熱プロファイルは以下の設定とした：９５℃で２分間、続いて９５℃で３０秒間と６０℃で３０秒間と７２℃で３０秒間とを３０サイクル、次いで最終伸長のために７２℃で７分間３７、３８。
【００６６】
（フローサイトメトリーおよびブロッキング実験）
懸濁液中の様々な継代の０．５〜１×１０５個のｈＡＤＳＣを４℃で１時間、マウス抗ヒトＣＤ８１モノクローナルＡｂ（クローンＪＳ−８１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＬＤＬ−Ｒ  Ａｂ（クローンＣ７、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、抗ＥＧＦＲ  Ａｂ（クローンＬＡ１、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）またはウサギポリクローナル抗ＳＲＢ１  Ａｂ（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）で染色した。それぞれの対照は、マウスＩｇＧ１またはポリクローナルウサギＩｇＧであった。洗浄後、細胞をさらにフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合二次Ａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＰＡ、米国）と共にインキュベートし、Ｃｅｌｌ  Ｑｕａｎｔａ（商標）ＳＣ高解像度フローサイトメトリー（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ、米国）により分析した。細胞表面分子をブロッキングするために、（ウェル内に接着した）２ｘ１０５個のｈＡＤＳＣを３７℃で、表示用量（１〜１００μｇ／ｍｌ）の抗体を含有する１ｍｌの無血清Ｋ培地で前処理した。それぞれのアイソタイプ抗体による処理を対照として用いた。１時間後、未希釈のＨＣＶ（＋）血清をエッペンドルフチューブ内に加えて、抗体存在下での３時間インキュベーションのためにＭＯＩを０．２にした。その後、細胞を洗浄し、連続培養のために６ｃｍのペトリ皿内に接種培養した。ＡｐｏＥ遮断のために様々な濃度の抗ＡｐｏＥ抗体（クローンＥ６Ｄ１０）を、ｈＡＤＳＣと共に３時間インキュベートする前に、記載のとおりに１４ＨＣＶ（＋）血清に室温で１時間添加した。２１日間の連続培養後に上清および細胞を回収し、ＲＮＡを抽出してウイルス５’−ＵＴＲ転写物を定量した。別個の実験では、ウェル内のｈＡＤＳＣを表示用量のＩＦＮα（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＯ、米国）で１６時間、Ｋ培地中で３回前処理し、その後、遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａおよび２ｂのＨＣＶ（＋）血清に曝露した。２１日後、細胞溶解物中の５’−ＵＴＲ転写物をｑＲＴ−ＰＣＲによって定量し、ビヒクル（ＰＢＳ）対照で処理した細胞と比較した画分阻害として結果を計算した。
【００６７】
（ｍｉＲ−１２２のＲＴ−ＰＣＲのためのＲＮＡ抽出）
ｍｉＲ−１２２のＲＴ−ＰＣＲのためのプライマーを調製し、記載されているとおりに３９実施した。細胞からの全ＲＮＡをＲＮＡ抽出試薬ＲＥｚｏｌ（商標）Ｃ＆Ｔ（Ｐｒｏｔｅｃｈ、台北、台湾）で単離した。ｍｉＲ−１２２レベルを決定するために本発明者らは、ＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｓキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して抽出ＲＮＡを逆転写し、ｍｉＲ−１２２のＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ＡｓｓａｙによるリアルタイムＰＣＲ解析のテンプレートとしてｃＤＮＡを使用した。
【００６８】
（合成ｓｉＲＮＡと遺伝子サイレンシング）
オクルディンおよびクローディン−１に特異的なｓｉＲＮＡを、記載されているとおりに１５、４０、４１Ｄｈａｒｍａｃｏｎによって合成した。それらの各々の標的配列は、ＵＡＡＣＡＵＵＡＧＧＡＣＣＵＵＡＧＡＡ（クローディン−１）およびＧＵＧＡＡＧＡＧＵＡＣＡＵＧＧＣＵＧＣ（オクルディン）である。ＮＰＣ１Ｌ１を記載のとおりに１６調製し、ＤＧＡＴ−１のｓｉＲＮＡを記載のとおりに１９調製した。Ｘｆｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、特異的なｓｉＲＮＡを６ウェル細胞プレートのウェル内のｈＡＤＳＣにトランスフェクトした。ＨＣＶ感染は、ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞をＨＣＶｓｅｒと共に３７℃で３時間インキュベートし、その後ＨＣＶｓｅｒをＰＢＳで洗い流すことによって行った。記載されているとおりに１５、１９、４０、４１、トランスフェクション後４８時間目の細胞をＲＴ−ＰＣＲのために溶解して遺伝子サイレンシングの度合いを決定した。２１日間の培養後にＨＣｖｓｅｒ感染ｈＡＤＳＣの細胞溶解物および上清を５’−ＵＴＲのｑＲＴ−ＰＣＲのために採集した。
【００６９】
（ＪＦＨ１／ＨＣＶｃｃおよびＨｕｈ７．５細胞）
Ｈｕｈ７．５細胞を、１０％の熱不活性化ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と０．１ｍＭの非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とを含有するＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。試験管内ゲノムＪＦＨ−１  ＲＮＡを転写し、先に記載されているとおりに４２電気穿孔によって細胞に送達した。その後、トランスフェクトした細胞を完全なＤＭＥＭに移し、３〜４日毎に継代した。通常の実践では、完全長ＪＦＨ１  ｃＤＮＡでトランスフェクトした細胞からの馴化培地を、１０分間の遠心分離（３，０００×ｇ）によって浄化し、使用前に滅菌濾過（０．２μｍ酢酸セルロース、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）した。より長期間の保存のために、ＨＣＶｃｃを等分し、−８０℃で保存した。４℃で一晩のインキュベーションのためにウイルスを、１／４体積の滅菌濾過済４０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール−８０００のＰＢＳ液の添加によって濃縮した。ウイルス沈殿物を遠心分離（８，０００×ｇ、１５分）によって回収し、記載されているとおりに４３ＰＢＳ中に再懸濁した。
【００７０】
（薬物阻害アッセイ）
抗ウイルス薬であるリバビリン、シクロスポリンＡおよびＩＦＮαは全てＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。テラプレビルは、米国マサチューセッツ州のＳｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから得た。段階用量のリバビリン、テラプレビルまたはシクロスポリンＡを０日目にペトリ皿内のＨＣＶｓｅｒ感染ｈＡＤＳＣの培地に添加し、２１日間培養した。ＩＦＮα処理に関しては、ｈＡＤＳＣを１６時間、表示用量のＩＦＮαで前処理し、その後、ＨＣＶｓｅｒと共にインキュベートした。その後、細胞溶解物のウイルス５’−ＵＴＲ転写物を、ビヒクル対照で処理した細胞と比較した画分阻害として定量および計算した。ビヒクル対照は、リバビリンおよびＩＦＮαの場合はＰＢＳ、シクロスポリンＡおよびテラプレビルの場合は０．１％のＤＭＳＯとした。
【００７１】
（ＨＣＶｓｅｒ、ＨＣＶａｄｓｃおよびＨＣＶｃｃの浮遊密度）
ＨＣＶｃｃおよびＨＣＶａｄｓｃの培地を、先に記載されているとおりにＰＥＧ−８０００で濃縮した。いずれの試料も５００μｌの無血清培地に再懸濁させ、先に記載されているとおりに４４、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５５）と１５０ｍＭのＮａＣｌと０．０２％のＢＳＡとを含有する溶液を使用して調製した１０％〜４０％のイオジキサノール（それぞれ０．５ｍｌ）の連続イオジキサノール（ＯｐｔｉＰｒｅｐ、Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ、ノルウェー）密度勾配の上に積層した。勾配をＳＷ−４１ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で６時間、４℃で４０，０００ｒｐｍで超遠心分離した。超遠心分離後、上部の勾配から１７個の画分を回収した（各画分は５００μｌ含んでいた）。最後に、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ウイルスＲＮＡミニキット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｂａｓｌｅ、スイス）を使用して各画分から全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡを、定量的ＲＴ−ＰＣＲによるＨＣＶ  ＲＮＡ検出のために使用した。
【００７２】
（ＡｐｏＢ、ＡｐｏＥおよびコレステロールの測定）
Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）ＥＬＩＳＡヒトアポリポタンパク質Ｂ／ＡｐｏＢイムノアッセイキットおよびＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）ＥＬＩＳＡヒトアポリポタンパク質Ｅ／ＡｐｏＥイムノアッセイキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＡｐｏＢおよびＡｐｏＥの発現を製造者の説明に従って検出した。ＨＤＬおよびＬＤＬ／ＶＬＤＬのコレステロールを、ＨＤＬおよびＬＤＬ／ＶＬＤＬコレステロールアッセイキット（Ａｂｃａｍ）によって検出した。様々な浮遊密度の画分中のＨＤＬおよびＬＤＬ／ＶＬＤＬのＡｐｏＢ、ＡｐｏＥおよびコレステロールの発現レベルを複製物に対して規格化した。
【００７３】
（ＨＣＶｓｅｒまたはＨＣＶａｄｓｃによるヒト初代肝細胞（ＰＨＨ）の感染）
ＨＣＶ関連またはＨＣＶ非関連の肝細胞癌腫のために外科的切除された肝臓検体から新鮮な非腫瘍性肝組織を採取し、ＰＨＨを単離し、記載されているとおりに４５培養した。ＰＨＨを３日間接種培養して、コラーゲンＩ被覆６ウェルプレート上に細胞を付着させた。４日目に細胞を穏やかに洗浄し、ＨＣＶｓｅｒまたはそれに対応するｄ２１のｈＡＤＳＣ増殖ＨＣＶ（＋）上清（１×１０４個のＨＣＶ５’−ＵＴＲ複製物を含有する）と混合されたアルギニン不含ＷｉｌｌｉａｍｓＥ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、米国）中で終体積を０．５ｍｌとして３時間培養した。感染後、細胞を洗浄し、１ｍｌの培地中で感染後ｄ５まで毎日新鮮な培地を交換しながらさらに培養した。その後、５’−ＵＴＲのＲＴ−ＰＣＲのためのＲＮＡ抽出のために細胞を溶解した。
【００７４】
（実施例１：ｈＡＤＳＣは生体内でＨＣＶの標的となる）
臨床上、ＨＣＶ感染の興味深い特徴は、ＨＣＶ（＋）患者が慢性的に感染した肝臓内に過剰な脂肪蓄積、すなわち脂肪肝を有し得４６、４７、脂肪肝の重症度が肝線維症の割合と相関するようである４８、という点である。また、最近の研究により、ＨＣＶのＲＮＡ複製は、飽和脂肪酸の利用可能性を高めることによって刺激され、多価不飽和脂肪酸または脂肪酸合成の阻害剤によって阻害される、ということが示されている４９、５０。これらの知見は、脂肪代謝がＨＣＶの生活環において重要な役割を果たすことを示唆している。したがって本発明者らは、脂肪組織の細胞成分が生体内でのＨＣＶ感染に関与している可能性があるという仮説を立てた。
【００７５】
本発明者らの仮説を試すために、本発明者ら、ＨＣＶ感染またはＨＣＶ未感染の個体（表１）から皮下脂肪組織を採集し、ＨＣＶｓｅｒ遺伝子型１ｂ（ＨＣＶｓｅｒ−１ｂ）を陽性対照として使用してＨＣＶ特異的５’−ＵＴＲ転写物のＲＴ−ＰＣＴのためにＲＮＡを抽出した。
【００７６】
表１Ａは皮下脂肪組織および肝臓組織のＨＣＶ（＋）ドナー。いずれの患者も、肝細胞癌腫の外科的切除のために開腹術を受けた。脂肪組織［おおよそ（２〜２．５ｃｍ）３］は手術創（開腹術）から採集し、肝臓組織は、切除した肝臓の（病変から離れた）非腫瘍部分から採集した。患者番号は、図１Ｆ中に示されているのと同じであった。
【００７７】
表１ＢはＨＣＶ（−）肝臓組織のドナー。患者は、ＨＢＶ関連または非Ｂ型もしくは非Ｃ型の肝細胞癌腫の犠牲者であり、肝切除術を受けた。
【００７８】
【表１】
0006670322.tif 000002
【００７９】
興味深いことに、ＨＣＶ（＋）個体（遺伝子型１ｂまたは２ａの患者番号１〜３、表１）の脂肪組織は、ＨＣＶ（−）個体のそれとは対照的に、ウイルス５’−ＵＴＲ（２２３ｂｐ、図１Ａ）を含有していた。血液からの汚染の可能性を排除し、ウイルス転写物を発現する細胞源を定義するために、本発明者らは、記載されているとおりに１２、１３、３３遠心分離によって脂肪組織を、成熟脂肪細胞を含有する上部の浮遊層（浮遊物）と、中間部の緩衝液層と、底部の沈降細胞ペレットとに分画した（図５）。細胞ペレットを回収し、さらにＲＢＣ溶解緩衝液で処理して赤血球を溶解させて、間質血管細胞群（ＳＶＦ）細胞を採集した。その後、浮遊物層およびＲＢＣ溶解ＳＶＦ細胞から別々にＲＮＡを抽出したが、緩衝液層からはＲＮＡをほとんど抽出できなかった（データ示さず）。ＲＴ−ＰＣＲから、浮遊物層ではウイルス５’−ＵＴＲが全く検出されず、その一方でＳＶＦ細胞ではウイルス転写物が検出されたことが実証された（左パネル、図１Ｂ）。
【００８０】
本発明者らは次に、記載されているとおりに１０免疫磁気ビーズによってＳＶＦ細胞からのＤＬＫ−１＋細胞の正の選択を行い、フローサイトメトリー分析により、正の選択をした細胞の＞９９．７％がＤＬＫ−１を発現することを確認した（図６）。その後、ＲＴ−ＰＣＲのためにＲＮＡをＤＬＫ−１＋細胞およびＤＬＫ−１−細胞から別々に抽出したところ、ウイルス転写物はＤＬＫ−１＋細胞に存在するがＤＬＫ−１−細胞には存在しないことが確認された（右図、図１Ｂ）。本発明者らはまた、ＨＣＶ（＋）ヒト初代肝細胞（ＰＨＨ）から抽出したＲＮＡを陽性対照として使用して、ＨＣＶ特異的マイナス鎖ＲＮＡ５１のＲＴ−ＰＣＲを実施した。データは、ＨＣＶ複製中間体が、３人のＨＣＶ（＋）ドナーの中でもＤＬＫ−１＋細胞には存在するがＤＬＫ−１−細胞には存在しない、ということを裏付けた（３７５ｂｐ；図１Ｃ）。また、マウス抗ＨＣＶ  ＮＳ５抗体（クローンＢＧＮ／１２４６／５Ｇ７）および（細胞核を識別するための）ヘマトキシリンを用いた免疫細胞化学のために、ＤＬＫ−１＋細胞およびＤＬＫ−１−細胞を別々にサイトスピンスライド上にスピンした。ＨＣＶ（−）個体から単離された細胞もまた比較のために染色した。５’−ＵＴＲのｍＲＮＡ発現と一致して、ＨＣＶ（＋）ドナーから単離されたＤＬＫ−１＋細胞はＮＳ５抗原（茶色標識、パネルｃ、図１Ｅ）を発現したが、ＤＬＫ−１−細胞のＮＳ５発現は、ＨＣＶの感染状況に拘らずバックグラウンドに近いものであった（パネルｂおよびｅ）。アイソタイプ抗体（マウスＩｇＧ１）によるＨＣＶ（＋）またはＨＣＶ（−）の未分画ＳＶＦ細胞の染色を、対照として用いた（パネルａおよびｄ、図１Ｅ）。ヘマトキシリン染色（青色標識）は、ＮＳ５＋細胞が細胞破片ではなく本物の有核細胞であることを裏付けた（パネルｃ、図１Ｅ）。抗ＮＳ５抗体の特異性は、ＨＣＶ（＋）ＰＨＨの染色において検証された（図７）。
【００８１】
生体内での検証のために本発明者らは、ＨＣＶ感染およびＨＣＶ未感染の個体から採集した皮下脂肪組織に対して免疫組織化学的研究を実施した。組織切片を最初に抗ＤＬＫ−１  Ａｂで染色した。ＰＢＳによる浸漬および洗浄の後に、抗ＮＳ５  Ａｂおよびヘマトキシリンを使用して同じ切片に対して染色を行った。結果は、ＨＣＶ感染およびＨＣＶ未感染の両方の個体から採集された脂肪組織において、ＤＬＫ−１が、マウス脂肪組織内５２の同様に記載されている位置で検出されたこと（赤色標識、白色矢印、それぞれパネルｂおよびｃならびにｈ、図１Ｅ）を示した。さらに、ＮＳ５＋細胞は、ＨＣＶ（＋）脂肪組織（茶色標識、白色矢印、パネルｅおよびｆ、図１Ｅ）では視覚化されたが、ＨＣＶ（−）試料（パネルｊ）では視覚化されなかった。とりわけ、ウイルスＮＳ５はＨＣＶ（＋）試料におけるＤＬＫ−１発現と共局在化した（パネルｂ対ｅ、およびｃ対ｆ、図１Ｅ；ｂおよびｅならびにｃおよびｇは別個のドナーからのものであり、図８も参照のこと）。ＨＣＶ（＋）脂肪組織では、調べたいずれの切片においても、１つの高倍率視野（４００Ｘ）当たり約０〜４個のＤＬＫ−１＋ＮＳ５＋細胞が見つかった。
【００８２】
ＨＣＶ（＋）個体のｈＡＤＳＣがウイルスを産生したか否かを判定するために本発明者らは、ＨＣＶ（＋）患者から単離されたＤＬＫ−１＋細胞を培養し、上清中でのウイルス複製数を７日毎に定量した。興味深いことに、ウイルスの転写物は最初の４週間ではほとんど検出されなかったが、ｄ２８〜ｄ３５以降の上清で検出され始め、複製数は時間依存的に増加した（ｄ４９まで；図１Ｆ）。さらに、長期培養した際のウイルス転写物の量は、細胞の単離されたそれぞれの患者の血清ウイルス力価と相関しているようであった（図１Ｆおよび表１）。
【００８３】
まとめると、本発明者らのデータは、ｈＡＤＳＣが生体内でＨＣＶの標的となるという証拠を提供する。
【００８４】
（実施例２：ナイーブＨＣＶ（−）ｈＡＤＳＣは試験管内においてＨＣＶｓｅｒ感染および複製に対して感受性である）
ナイーブＨＣＶ（−）ｈＡＤＳＣが試験管内でのＨＣＶｓｅｒ感染および複製に対して感受性であるか否かを調べるために、本発明者らはＨＣＶ（−）個体由来のｈＡＤＳＣを調製し、それらを培養下で継代した。（エッペンドルフチューブ内の）懸濁液中の第３継代（ｐ−３）またはｐ−４の細胞を、最終体積を１ｍｌとして０．２ｍｏｉ（すなわち、５×１０５個のｈＡＤＳＣ細胞に対して１×１０５の５’−ＵＴＲ複製数）のＨＣＶｓｅｒ（表２）と共にインキュベートした。
【００８５】
表２は本研究で使用したＨＣＶ（＋）血清のＨＣＶ遺伝子型および５’−ＵＴＲ複製数である。いずれの患者も、ＨＩＶまたはＢ型肝炎ウイルスの感染の証拠を全く有していなかった。患者には急性感染症の徴候も全くなかった。血清を２０１１年９月〜２０１４年２月に回収し、直ちに使用するか、または使用するまで−８０℃で保存した。患者番号１〜５の血清は図２Ａ〜Ｄにおいて用い、残りは図２Ｅ〜Ｆ、図３および図４において用いた。
【００８６】
【表２】
0006670322.tif 000003
【００８７】
３時間後、細胞を洗浄し、７日毎に培地交換しつつ培養するために６ｃｍのペトリ皿に移し、上清および細胞溶解物を、ＲＮＡ抽出のために７、１４、２１および２８日目に採集した（図９のプロトコル）。ＨＣＶｓｅｒ感染性の対照として、非腫瘍肝臓組織から単離されたＨＣＶ（−）ＰＨＨ（記載４５および表１のとおり）を、ウェル内に３日間接種培養して細胞を付着させ、次いで４日目に、ＨＣＶｓｅｒまたはＨＣＶ（−）対照血清（血液型ＡＢ）と共に３時間インキュベートし、洗浄後、ＰＨＨをさらに５日間培養してから、細胞ＲＮＡ抽出を行った。結果は、ＨＣＶｓｅｒに曝露されたＰＨＨが実際にウイルス５’ＵＴＲ（「＋」と標識、左、図２Ａ）を発現した一方、ＨＣＶ（−）対照血清に曝露された細胞（「−」と標識）がそれを発現しなかったことを示した。
【００８８】
ウイルス転写物は、感染後の培養ではｄ７上清またはｄ７細胞溶解物のいずれにも検出できなかったが、全ての実験においてｄ１４細胞溶解物中に、また１８回のうち１０回の実験において上清中に、検出可能となった（右、図２Ａ；８人のドナーからのｈＡＤＳＣを使用した全１８回の実験、表３）。一方、５’−ＵＴＲは、全ての実験の中でもｄ２１とｄ２８との両方の上清中ならびに細胞溶解液中に一貫して検出された（右、図２Ａ）。
【００８９】
本発明者らはまた、ＨＣＶ特異的マイナス鎖ＲＮＡを調べ、その結果は、ｄ１４とｄ２８との両方のＨＣＶｓｅｒ−１ｂ感染ｈＡＤＳＣが複製中間体を発現し、それが上清中には存在しないことを予想どおり裏付けた（図２Ｂ）。ＨＣＶ感染患者から単離されたＰＨＨを陽性対照として使用した。
【００９０】
さらに確認するために、感染ｈＡＤＳＣを逐次免疫細胞化学研究のためにガラススライド上にスピンした。細胞を最初に抗ＤＬＫ−１抗体で染色し、続いて同じ切片に対して抗ＮＳ５抗体およびヘマトキシリンで染色した。結果は、ＤＬＫ−１（パネルｆ）を発現したがＮＳ５（パネルｈ）を発現しなかった対照血清投与ｈＡＤＳＣとは対照的に、ｄ１４のＨＣＶｓｅｒ−１ｂ感染ｈＡＤＳＣがＤＬＫ−１（赤色標識、パネルｂ、図２Ｃ）を実際に発現し、それらがＲＴ−ＰＣＲの所見と一致してＮＳ５（茶色標識、パネルｄ、図２Ｃ）も発現したことを示した。アイソタイプ抗体であるウサギＩｇＧおよびマウスＩｇＧ１（それぞれ抗ＤＬＫ−１および抗ＮＳ５抗体の対照）による染色は、バックグラウンドの色を実証した（それぞれパネルａおよびｃ、ならびにｅおよびｇ）。事実上全てのＨＣＶｓｅｒ感染ＤＬＫ−１＋細胞がＮＳ５を発現した（パネルｂ対ｄ）ことから、臨床分離物の感染に対するｈＡＤＳＣの許容性は、細胞の（１つ以上の）部分集合に限定されるのではなく、一般化された特性であるようであった。
【００９１】
Ｄ１４およびｄ２１のＨＣＶｓｅｒ−ｈＡＤＳＣも透過型電子顕微鏡で研究した。ＨＣＶ（−）対照血清に曝露されたｈＡＤＳＣ（パネルａおよびｄ、図２Ｄ）と比較して、直径約５０〜６０ｎｍのウイルス粒子をｈＡＤＳＣの外側（挿入図中の白矢印、パネルｂおよびｅ、図２Ｄ）および内側（挿入図中の白矢印、パネルｃおよびｆ、図２Ｄ）で可視化することができた。細胞の外側で同定されたウイルス粒子は、二重膜（黄色矢印および、拡大した挿入図、パネルｂ）または電子的に密な膜構造体（黄色矢印および、拡大した挿入図、パネルｅ）からなる膜小胞に包み込まれていた。対照的に、細胞内に見つかったウイルス粒子は、膜状の覆いを有さない自由形態（黄色四角および、拡大した挿入図、パネルｃ；白矢印で示されたウイルス粒子）であるかまたは、多数の丸い同心円状の膜によって取り囲まれていた（「タマネギ形状」、黄色四角および、拡大した挿入図、パネルｆ；白矢印で示されたウイルス粒子）。
【００９２】
懸濁液中でｈＡＤＳＣを感染させることに加えて（図２、Ａ〜Ｄ）、本発明者らはまた、６ｃｍのペトリ皿内にｈＡＤＳＣを１日間接種培養することによって接着させたｈＡＤＳＣを感染させ、その後、０．５ｍｏｉ（２×１０５個のｈＡＤＳＣ細胞に対して１×１０５個の５’−ＵＴＲ複製物）のＨＣＶｓｅｒを２ｍｌの終体積で３時間、細胞に投与した。穏やかに洗浄した後、７日毎に培地交換しつつ細胞を５ｍｌの新鮮な培地中で培養した（図１０）。上清および細胞溶解物のＲＮＡを７、１４、２１および２８日目に抽出し、ｑＲＴ−ＰＣＲに供した。結果は、７日目の細胞溶解物においてウイルス転写物は、上清中のそれらの非存在にも拘らず、一貫して検出可能であることを明らかにした（右パネルに対して左パネル、図２Ｅ）。さらに、細胞溶解物中のウイルス複製物は、第２週（左パネル、図２Ｅ）に最も顕著に増加したが、上清での増加は、１週遅れて、つまり第３週に最も顕著であった（右パネル、図２Ｅ）。
【００９３】
このシステムによって産生された全ウイルス複製物を測定するために、本発明者らは、培地交換なしでＨＣＶｓｅｒ感染ｈＡＤＳＣを連続的に培養し（図１０）、表示の培養期間の終了時に上清を回収した。ｑＲＴ−ＰＣＲは、２８日間の培養後の総複製数が約３×１０５／ｍｌとなって第３週に最も実質的なウイルス放出（上清中）が起こることを裏付けた（図２Ｆ）。
【００９４】
【表３】
0006670322.tif 000004
【００９５】
（実施例３：ｈＡＤＳＣ産生ビリオンは、臨床分離物の生物学的特性を示す本物の「ビリオン」である）
ｈＡＤＳＣ産生ビリオン（「ＨＣＶａｄｓｃ」と表示）の感染性を調べるために本発明者らは、「ドナー１」のｐ２のｈＡＤＳＣをＨＣＶｓｅｒ−１ｂに感染させ、２１日目に上清（「ＨＣＶａｄｓｃ（１）」と表示）を回収した。０．２２μｍの細孔フィルタで濾過した後、ＨＣＶａｄｓｃ（１）を使用して「ドナー２」のｈＡＤＳＣに感染させてＨＣＶａｄｓｃ（２）を作り、続いてそれを使用して「ドナー３」のｈＡＤＳＣに感染させた。結果は、ＨＣＶａｄｓｃが、ＨＣＶｓｅｒによる最初の感染に見られるように比較的一貫した複製効率で、様々なドナーのナイーブｈＡＤＳＣに対して感染性を有することを裏付けた（図３Ａ）。最初にＨＣＶｓｅｒ−１ａ、ＨＣＶｓｅｒ−２ａおよびＨＣＶｓｅｒ−２ｂに感染させたｈＡＤＳＣの上清に由来するＨＣＶａｄｓｃについても，同様の観察がなされた（データ示さず）。
【００９６】
本発明者らは次に、ＨＣＶｓｅｒ−１ｂでｐ２、ｐ６、ｐ９およびｐ１５のｈＡＤＳＣを感染させることによって様々な継代数でのｈＡＤＳＣの許容性を研究し、２１日間の連続培養後にウイルス複製物を測定した。結果は、ｐ２およびｐ６の細胞とは対照的にｐ９およびｐ１５のｈＡＤＳＣが上清中と細胞溶解物中との両方において非常に低いレベルのウイルス転写物を有することを示した（それぞれ左パネルおよび右パネル、図３Ｂ）。ＨＣＶｓｅｒ−１ａおよびＨＣＶｓｅｒ−２ａによる感染についても同様の観察がなされた（図１１）。ナイーブ［ＨＣＶ（−）］ｈＡＤＳＣのＤＬＫ−１発現を定義する実験において本発明者らは、ＤＬＫ−１発現が、ＨＣＶ感染の許容性について言及されている類似の傾向に追従してｐ０からｐ６までは検出可能であったがしかしｐ９では減少し、ｐ１５では検出不能であったことを見出した（図３Ｃ）。
【００９７】
しかも、ｈＡＤＳＣは遺伝子型１または２の感染を好まないようである（図３Ｂおよび図１１）。これをさらに調べるために本発明者らは、ｐ５のｈＡＤＳＣに混合遺伝子型２ａ＋２ｂのＨＣＶｓｅｒを感染させ、ＲＴ−ＰＣＲのために細胞を回収して、遺伝子型特異的なコア抗原をコードするｍＲＮＡを検出した。実際には、混合型２ａ＋２ｂのＨＣＶｓｅｒ自体は（陽性対照として）、遺伝子型２ａと２ｂとの両方のコア抗原をコードするｍＲＮＡ（１７４ｂｐおよび１２３ｂｐ、レーン「Ｐ」、それぞれ左パネルおよび右パネル；図３Ｄ）を発現したが、それは、遺伝子型２ａ＋２ｂ感染ｈＡＤＳＣのｄ２１およびｄ５６の細胞溶解物中にも検出された。この実験では、ＨＣＶ（−）対照血清を投与した細胞を陰性対照（「Ｎ」と標識）として使用した。したがって、臨床分離物による感染に対するｈＡＤＳＣの許容性は、少なくとも遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａおよび２ｂについて遺伝子型交差性である。
【００９８】
テトラスパニンＣＤ８１、ＬＤＬ−Ｒ、ＳＲ−Ｂ１、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、アポリポタンパク質（Ａｐｏ）Ｅ、オクルディン、クローディン−１、ニーマンピックＣ１様１（ＮＰＣ１Ｌ１）コレステロール吸収受容体およびジアシルグリセロールアセチルトランスフェラーゼ１（ＤＧＡＴ−１）を含めた宿主因子は、ウイルス付着または付着後の段階のいずれかで、ヒト肝細胞または肝細胞腫細胞株におけるＨＣＶ感染／複製を媒介することが示されている１５、１６、１９、５３〜５８。本発明者らは、ｈＡＤＳＣにおけるこれらの分子の発現をフローサイトメトリーまたはＲＴ−ＰＣＲによって調べた。
【００９９】
フローサイトメトリーにより、ｐ０（すなわち接着性ＳＶＦ細胞）、ｐ２およびｐ６のｈＡＤＳＣがＣＤ８１、ＬＤＬ−Ｒ、ＳＲ−Ｂ１およびＥＧＦＲを明瞭に発現することが明らかになった（図３Ｅ）。ＲＴ−ＰＣＲも、オクルディン（ＯＣＬＮ）、クローディン−１（ＣＬＤＮ１）およびＮＰＣ１Ｌ１をコードするｍＲＮＡは発現されるがｍｉＲ−１２２は発現されないことを裏付けた（図３Ｆ左）。対照的に、ｍｉＲ−１２２は、Ｈｕｈ７．５肝細胞腫細胞において豊富に（ｈＡＤＳＣより約６０倍高く）発現され、ＰＨＨではよりいっそう豊富であった（約２０００倍高い；図３Ｆ右）。
【０１００】
これらの分子の役割を判定するために本発明者らは、ＨＣＶｓｅｒ−１ｂの投与の前にｐ２のｈＡＤＳＣを１時間、ＣＤ８１（クローンＪＳ−８１）、ＬＤＬ−Ｒ（クローンＣ７）もしくはＥＧＦＲ（クローンＬＡ−１）に対するモノクローナルＡｂまたはＳＲ−Ｂ１に対するポリクローナルＡｂの段階用量で前処理した。ＡｐｏＥ遮断のために様々な濃度の抗ＡｐｏＥ抗体（クローンＥ６Ｄ１０）を、感染に使用する前に、記載されているとおりに１４ＨＣＶ（＋）血清に室温で１時間添加した。２１日目の上清中のウイルス転写物の定量から、ＨＣＶ（＋）血清におけるＣＤ８１、ＬＤＬ−Ｒ、ＳＲ−Ｂ１、ＥＧＦＲの遮断およびＡｐｏＥの中和は用量依存的にウイルス複製の量を有意に減少させたことが示され、その一方で、処理自体は細胞生存率に有意な影響を与えなかった（図３Ｇ）。細胞溶解物のウイルス複製物の同様の用量応答減少もまた認められた（図１２）。
【０１０１】
本発明者らはまた、ｐ２のｈＡＤＳＣを、ＨＣＶｓｅｒ−１ｂによる感染の前に、オクルディンまたはクローディン−１に特異的なｓｉＲＮＡでトランスフェクトするか、または記載されているとおりに１５、１６ＮＰＣ１Ｌ１についての別個の実験においてトランスフェクトした。本発明者らはまた、脂質滴へのＨＣＶヌクレオカプシドコアの輸送に必要な、肝細胞腫細胞株におけるＨＣＶ産生にとって重要な１９分子であるＤＧＡＴ−１の役割を調べた。ＲＴ−ＰＣＲはｍＲＮＡノックダウン（図１３）の効果を裏付けたが、次いでそれは、２１日間の培養後に上清中（図３Ｈ）および細胞溶解物中（図１３）のウイルス複製物を減少させた。
【０１０２】
最後に本発明者らは、抗ウイルス薬の阻害効果を調べた。ｐ４〜５の細胞をウェルに接種培養し、ＨＣＶｓｅｒ−１ｂに曝露し、リバビリン、テラプレビルまたはシクロスポリンＡ（シクロフィリンＡ阻害剤）を含む段階濃度の抗ウイルス薬を培地に添加した。ＩＦＮα処理に関しては、ｈＡＤＳＣを１６時間、表示用量のＩＦＮαで前処理し、その後、ＨＣＶｓｅｒと共にインキュベートした。その後、２１日目の細胞溶解物中のウイルス転写物を、ビヒクル対照で処理した細胞と比較した画分阻害として測定および計算した。結果は、ＨＣＶ複製がリバビリン、テラプレビル、シクロスポリンＡおよびＩＦＮαによって用量応答的に阻害されることを実証した（図３Ｉ）。ｐ０、ｐ２およびｐ６のｈＡＤＳＣにおけるシクロフィリンＡの発現は、本発明者らの予備実験において確認された（図１４）。したがって、ＨＣＶａｄｓｃは、臨床分離物の生物学的特性を示す本物の「ビリオン」である。
【０１０３】
（実施例４：ｈＡＤＳＣは、完全なＨＣＶ複製を可能にする生体内ＨＣＶ保有宿主である）
ＨＣＶａｄｓｃの物理的特性を評価するために本発明者らは、ＨＣＶｓｅｒ、ＨＣＶｃｃおよびＨＣＶａｄｓｃの浮遊密度プロファイルを、記載されているとおりに４３平衡遠心分離によって比較した。研究したいずれのウイルスも、遺伝子型２ａに由来するものであった。以前の報告４３、５９、６０と一致して、ＨＣＶｓｅｒはより低い密度１．０３９（画分２）および１．０８０（画分７）の画分に大量のＲＮＡを有していたが、ＨＣＶｃｃの場合は１．１３２にピークがあった（画分１３；図４Ａ）。ＨＣＶａｄｓｃでのＲＮＡの最高量は密度１．０８０（画分７）で認められ、続いてより高い密度１．１２４および１．１５６（画分１２および１５）に２つのピークが認められた。興味深いことに、ＨＣＶａｄｓｃの１．０８０のピークはＨＣＶｓｅｒのピークと同一であった（図４Ａ）。したがって、ＨＣＶａｄｓｃの物理的性質はＨＣＶｃｃよりもむしろ臨床分離物に類似している。
【０１０４】
本発明者らはまた、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ／ＬＤＬ、ならびにＡｐｏＥおよびＡｐｏＢを含む各主要画分の脂質およびアポリポタンパク質（Ａｐｏ）のプロファイルを決定した。ＨＣＶｓｅｒはＨＣＶｃｃおよびＨＣＶａｄｓｃと比較して最も高い総脂質量を有するようであった（図１５）が、それは、ウイルス増殖の微小環境が異なっていた（血清対培地）ため、予期しないものではなかった。さらに、ウイルス複製物１つ当たりの重量（ｎｇ）として表すと、ＨＣＶｃｃ画分１３はＨＤＬおよびＬＤＬ／ＶＬＤＬ含有量が最も低かった（図４Ｂ）。また、ＨＣＶｓｅｒの主要分画はＡｐｏＥ含有量が（ｐｇ／複製物換算で）最も高く、続いてＨＣＶａｄｓｃおよびＨＣＶｃｃ画分１３は検出可能なＡｐｏＥレベルをほとんど有していなかった（図４Ｃ）。このように、ＨＣＶａｄｓｃは、ウイルス粒子関連脂質含量においてもＨＣＶｓｅｒとの類似性をＨＣＶｃｃよりも高く示す。興味深いことに、ＡｐｏＢはＨＣＶａｄｓｃのいずれの画分にも検出されず、ＡｐｏＥとは対照的にＡｐｏＢがｈＡＤＳＣにおける感染に必要でない可能性があることを示唆していた（図３Ｇ）。
【０１０５】
本発明者らはまた、ＨＣＶｓｅｒに加えてＪＦＨ１／ＨＣＶｃｃのウイルス接種物にｐ２のｈＡＤＳＣを感染させることにより、ｈＡＤＳＣに対する様々なウイルスの感染性を比較した。対照として、Ｈｕｈ７．５細胞におけるＨＣＶｃｃ複製を並行して実施した。本発明者らは、Ｈｕｈ７．５細胞におけるＨＣＶｃｃの効率的な複製（図１６）とは対照的にＨＣＶｃｃ感染ｈＡＤＳＣが、１４日間または２１日間の培養後に上清または細胞溶解物のいずれにおいても５’−ＵＴＲ転写物をほとんど産生せず（図４Ｄ）、ｈＡＤＳＣのＨＣＶｓｅｒ感染が以前と同様の複製動態を呈した（図４Ｄ対３Ａ）ことを見出した。ナイーブＨｕｈ７．５およびＨＣＶｃｃ感染Ｈｕｈ７．５細胞の２１日目の上清ならびに、ＨＣＶｃｃ感染またはＨＣＶｓｅｒ感染のｈＡＤＳＣの上清を、ＲＮＡ抽出のために回収し、ＲＴ−ＰＣＲに供した。結果は、Ｈｕｈ７．５のＨＣＶｃｃ感染およびｈＡＤＳＣのＨＣＶｓｅｒ感染（それぞれレーン２およびレーン４、図４Ｅ）とは対照的に、ＨＣＶｃｃ感染ｈＡＤＳＣ上清にはウイルス転写物が全く検出されなかったことを裏付けた（レーン３、図４Ｅ）。
【０１０６】
次に本発明者らは、ナイーブＰＨＨに対するＨＣＶａｄｓｃの感染性を調べた。記載されているとおりに４５ＰＨＨをＨＣＶ（−）個体から単離し、３日間培養（１×１０４細胞／皿）して細胞を付着させ、その後、ＨＣＶｓｅｒ−１ｂ感染ｈＡＤＣＳ培養物の２１日目の上清から調製したＨＣＶａｄｓｃに曝露した。感染５日後に細胞ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲのために抽出した。結果は、対照血清投与ｈＡＤＳＣの上清による感染（陰性対照としてのもの、レーン「１」、図４Ｆ）とは対照的に、ＨＣＶａｄｓｃ感染ＰＨＨが実際にウイルス５’−ＵＴＲ（「２」および「３」と標識、図４Ｆ）を発現したことを示した。
【０１０７】
最後に、異なる３人のドナーからのＰＨＨを準備し、上記のようにウェルに播種した。４日目に、（異なる３人の個体からの）ＨＣＶ（−）対照血清、（別個の３人のドナーからの）ＨＣＶｓｅｒ−１ｂおよびそれに対応するＨＣＶａｄｓｃに細胞を感染させた。ＨＣＶｓｅｒおよび対応するＨＣＶａｄｓｃを対にして、同じバッチのＰＨＨに感染させた。上清を感染５日後に回収し、５’−ＵＴＲ複製物を定量した。ＨＣＶ（−）対照血清へのＰＨＨの曝露を陰性対照として用いた。結果は、臨床分離物によるＰＨＨ感染において以前に報告されているとおりに６１ＨＣＶｓｅｒの感染が変動性の高い複製動態をもたらすことを示した。ＨＣＶａｄｓｃによる感染も、ウイルス力価の上昇をもたらし、それはＨＣＶｓｅｒ感染の場合と同様に変動性が高かった（図４Ｇ）。これらの所見は、肝細胞に対するＨＣＶａｄｓｃの感染性を裏付けた。
【０１０８】
要約すると、ｈＡＤＳＣは、完全なＨＣＶ複製を可能にする生体内ＨＣＶ保有宿主であり、以前には認識されていなかった臨床的なＨＣＶ−宿主相互作用の場所を意味する。その上、ｈＡＤＳＣは、臨床ＨＣＶ単離物の試験管内増殖を可能にする初めての非肝臓初代細胞種であり、それは、ＨＣＶの生活環を読み解くための新規ツールとなり得、抗ウイルス戦略の開発を促進し得る。
【０１０９】
本明細書中で言及されている全ての刊行物および特許は、参照によって本明細書中に組み込まれる。本発明の範囲および精神から逸脱することなく、記載された本発明の方法およびシステムの様々な改変および変形が当業者にとって明らかであろう。特定の好ましい実施形態に関連して本発明を記載してきたが、特許請求の範囲に記載の本発明は必要以上にそのような特定の実施形態に限定されるべきではないことを理解されたい。実際に、細胞培養、分子生物学、生化学または関連分野の当業者に明らかな本発明を実施するための記載された態様の様々な改変は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図されている。
【０１１０】
（参考文献）
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２８．Ａｖａｎｚｉ，Ｓ．ら  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｃｅｎｔａ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ／ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ８、ｅ７１４１２（２０１３）。
２９．Ｓｏｌａｎｄ，Ｍ．Ａ．ら  Ｐｅｒｉｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｓｕｒｇｅｏｎｓ  １４、８２０−８３０（２０１４）。
３０．Ｋｈａｔｒｉ，Ｍ．およびＳａｉｆ，Ｙ．Ｍ．Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｓ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２２、４６１−４６８（２０１３）。
３１．Ｇｉｂｅｌｌｉｎｉ，Ｄ．ら  ＨＩＶ−１  ａｎｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｇｐ１２０  ａｆｆｅｃｔ  ｔｈｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｖｅｓｓｅｌ  ｗａｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８、４０（２０１１）。
３２．Ｍａ，Ｒ．ら  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ｊｏｕｒｎａｌ  ８、４８６（２０１１）。
３３．Ｒｏｄｂｅｌｌ、Ｍ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆａｔ  ｃｅｌｌｓ．ＩＩ．Ｔｈｅ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｃ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ  ａｌｐｈａ  ｔｏｘｉｎ）  ａｎｄ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｏｎ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ａｎｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２４１、１３０−１３９（１９６６）。
３４．Ｅｔｏ，Ｈ．ら  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  ａｓｐｉｒａｔｅｄ  ａｎｄ  ｅｘｃｉｓｅｄ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ．Ｐｌａｓｔ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ  Ｓｕｒｇ  １２４、１０８７−１０９７（２００９）。
３５．Ｂｕｋｈ，Ｊ．，Ｐｕｒｃｅｌｌ，Ｒ．Ｈ．およびＭｉｌｌｅｒ，Ｒ．Ｈ．Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  米国  ８９、１８７−１９１（１９９２）。
３６．Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｙ．Ｋ．，Ｆｅｉｎｓｔｏｎｅ，Ｓ．Ｍ．，Ｋｏｈａｒａ，Ｍ．，Ｐｕｒｃｅｌｌ，Ｒ．Ｈ．およびＹｏｓｈｉｋｕｒａ，Ｈ．Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ：  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｉｒｕｓ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２３、２０５−２０９（１９９６）。
３７．Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｈ．ら  Ｔｙｐｉｎｇ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｂｙ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｅｒｓ：  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｕｒｖｅｙｓ  ａｎｄ  ｔｒａｃｉｎｇ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｓｏｕｒｃｅｓ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７３（Ｐｔ  ３）、６７３−６７９（１９９２）。
３８．Ｔｏｎｉｕｔｔｏ，Ｐ．ら  Ｄｉｓｃｏｒｄａｎｔ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｂｙ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｒｅｇｉｏｎｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３４、２３８２−２３８５（１９９６）。
３９．Ｊｏｐｌｉｎｇ，Ｃ．Ｌ．，Ｙｉ，Ｍ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ａ．Ｍ．，Ｌｅｍｏｎ，Ｓ．Ｍ．およびＳａｒｎｏｗ，Ｐ．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ  ａｂｕｎｄａｎｃｅ  ｂｙ  ａ  ｌｉｖｅｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９、１５７７−１５８１（２００５）。
４０．Ａｌ−Ｓａｄｉ，Ｒ．ら  Ｏｃｃｌｕｄｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｆｌｕｘ  ａｃｒｏｓｓ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｂａｒｒｉｅｒ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ３００、Ｇ１０５４−１０６４（２０１１）。
４１．Ｊｉａｎｇ，Ｊ．ら  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８６、７２５６−７２６７（２０１２）。
４２．Ｋａｔｏ，Ｔ．ら  Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １、２３３４−２３３９（２００６）。
４３．Ｌｉｎｄｅｎｂａｃｈ，Ｂ．Ｄ．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９、６２３−６２６（２００５）。
４４．Ｌｉｎｄｅｎｂａｃｈ，Ｂ．Ｄ．ら  Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ−ｇｒｏｗｎ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｉｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｃａｎ  ｂｅ  ｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  米国  １０３、３８０５−３８０９（２００６）。
４５．Ｂｈｏｇａｌ，Ｒ．Ｈ．ら  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅｄ  ｌｉｖｅｒ  ｔｉｓｓｕｅ：  ａ  ｏｎｅ  ｈｕｎｄｒｅｄ  ｌｉｖｅｒ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ６、ｅ１８２２２（２０１１）。
４６．Ｃｌａｒｋ，Ｊ．Ｍ．，Ｂｒａｎｃａｔｉ，Ｆ．Ｌ．およびＤｉｅｈｌ，Ａ．Ｍ．Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２２、１６４９−１６５７（２００２）。
４７．Ｎｅｇｒｏ，Ｆ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｌｉｖｅｒ  ｓｔｅａｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｗｏｒｌｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ：ＷＪＧ  １２、６７５６−６７６５（２００６）。
４８．Ａｄｉｎｏｌｆｉ，Ｌ．Ｅ．ら  Ｓｔｅａｔｏｓｉｓ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｖｅｒ  ｄａｍａｇｅ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＨＣＶ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ａｎｄ  ｖｉｓｃｅｒａｌ  ｏｂｅｓｉｔｙ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３３、１３５８−１３６４（２００１）。
４９．Ｋａｐａｄｉａ，Ｓ．Ｂ．およびＣｈｉｓａｒｉ，Ｆ．Ｖ．Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｈｏｓｔ  ｇｅｒａｎｙｌｇｅｒａｎｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  米国  １０２、２５６１−２５６６（２００５）。
５０．Ｍａｎｋｏｕｒｉ，Ｊ．ら  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｉｐｉｄ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＭＰ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  米国  １０７、１１５４９−１１５５４（２０１０）。
５１．Ｒｏｙｅｒ，Ｃ．ら  Ａ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｕｍａｎ  Ｋｕｐｆｆｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３８、２５０−２５６（２００３）。
５２．Ｏｌｓｏｎ，Ｌ．Ｅ．およびＳｏｒｉａｎｏ，Ｐ．Ｄｅｖ  ＰＤＧＦＲｂｅｔａ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｍｕｒａｌ  ｃｅｌｌ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｆａｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ  ２０、８１５−８２６（２０１１）。
５３．Ｐｉｌｅｒｉ，Ｐ．ら  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｔｏ  ＣＤ８１．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２、９３８−９４１（１９９８）。
５４．Ｍｏｌｉｎａ，Ｓ．ら  Ｓｅｒｕｍ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｉｓ  ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ  ＣＤ８１  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８２、５６９−５７４（２００８）。
５５．Ｐｌｏｓｓ，Ａ．ら  Ｈｕｍａｎ  ｏｃｃｌｕｄｉｎ  ｉｓ  ａ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｅｎｔｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４５７、８８２−８８６（２００９）。
５６．Ｅｖａｎｓ，Ｍ．Ｊ．ら  Ｃｌａｕｄｉｎ−１  ｉｓ  ａ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ａ  ｌａｔｅ  ｓｔｅｐ  ｉｎ  ｅｎｔｒｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ４４６、８０１−８０５（２００７）。
５７．Ｌｉｕ，Ｓ．ら  Ｈｕｍａｎ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｅｎｔｒｙ  ｂｙ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ５６、４８４−４９１（２０１２）。
５８．Ｌｕｐｂｅｒｇｅｒ，Ｊ．ら  ＥＧＦＲ  ａｎｄ  ＥｐｈＡ２  ａｒｅ  ｈｏｓｔ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｅｎｔｒｙ  ａｎｄ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １７、５８９−５９５（２０１１）。
５９．Ｋａｎｔｏ，Ｔ．ら  Ｂｕｏｙａｎｔ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ  ｆｒｏｍ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｈｏｓｔｓ：  ｔｗｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｉｎ  ｓｕｃｒｏｓｅ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｄｅｎｓｉｔｙ−ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ｌｉｖｅｒ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １９、２９６−３０２（１９９４）。
６０．Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ，Ｒ．，Ｆｒｅｓｅ，Ｍ．およびＰｉｅｔｓｃｈｍａｎｎ，Ｔ．Ｎｏｖｅｌ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ．Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．６３、７１−１８０（２００４）。
６１．Ｇｏｎｄｅａｕ，Ｃ．ら  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  ＨＣＶ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｓｅｒａ：  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｏｎ  ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｒｅｌｅｖａｎｔ  ｍｏｄｅｌ．Ｇｕｔ（２０１３）。
【図１Ａ】
0006670322.tif 000005
【図１Ｂ】
0006670322.tif 000006
【図１Ｃ】
0006670322.tif 000007
【図１Ｄ】
0006670322.tif 000008
【図１Ｅ】
0006670322.tif 000009
【図１Ｆ】
0006670322.tif 000010
【図２Ａ】
0006670322.tif 000011
【図２Ｂ】
0006670322.tif 000012
【図２Ｃ】
0006670322.tif 000013
【図２Ｄ】
0006670322.tif 000014
【図２Ｅ】
0006670322.tif 000015
【図２Ｆ】
0006670322.tif 000016
【図３Ａ】
0006670322.tif 000017
【図３Ｂ】
0006670322.tif 000018
【図３Ｃ】
0006670322.tif 000019
【図３Ｄ】
0006670322.tif 000020
【図３Ｅ】
0006670322.tif 000021
【図３Ｆ】
0006670322.tif 000022
【図３Ｇ】
0006670322.tif 000023
【図３Ｈ】
0006670322.tif 000024
【図３Ｉ】
0006670322.tif 000025
【図４Ａ】
0006670322.tif 000026
【図４Ｂ】
0006670322.tif 000027
【図４Ｃ】
0006670322.tif 000028
【図４Ｄ】
0006670322.tif 000029
【図４Ｅ】
0006670322.tif 000030
【図４Ｆ】
0006670322.tif 000031
【図４Ｇ】
0006670322.tif 000032
【図５】
0006670322.tif 000033
【図６Ａ】
0006670322.tif 000034
【図６Ｂ】
0006670322.tif 000035
【図７】
0006670322.tif 000036
【図８】
0006670322.tif 000037
【図９】
0006670322.tif 000038
【図１０】
0006670322.tif 000039
【図１１】
0006670322.tif 000040
【図１２】
0006670322.tif 000041
【図１３Ａ】
0006670322.tif 000042
【図１３Ｂ】
0006670322.tif 000043
【図１３Ｃ】
0006670322.tif 000044
【図１４】
0006670322.tif 000045
【図１５Ａ】
0006670322.tif 000046
【図１５Ｂ】
0006670322.tif 000047
【図１５Ｃ】
0006670322.tif 000048
【図１６】
0006670322.tif 000049