(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出対象となるタンパク質をイオン性界面活性剤で前処理する工程、半導体センシングデバイス上に固定化されたプローブ分子と前記タンパク質とを相互作用させる工程、及び該相互作用によるゲート電極上の表面電位変化を検出する工程を含むことを特徴とするタンパク質の検出方法。
【請求項２】
前記前処理工程の前に、イオン性可溶化剤を含む抽出液でタンパク質を抽出後、該イオン性可溶化剤を除去する工程を含む請求項１記載のタンパク質の検出方法。
【請求項３】
前記イオン性界面活性剤が、陰イオン性界面活性剤である請求項１又は２記載のタンパク質の検出方法。
【請求項４】
前記陰イオン性界面活性剤が、硫酸塩である請求項１〜３のいずれか１項記載のタンパク質の検出方法。
【請求項５】
前記硫酸塩が、ドデシル硫酸塩である請求項４記載のタンパク質の検出方法。
【請求項６】
前記半導体センシングデバイスが、半導体上に反応ゲート絶縁部としてシリコン酸化物又は無機酸化物を含む第１の絶縁層が形成された電界効果トランジスタの前記第１の絶縁層の上に、反応性官能基を有するアルコキシシランの単分子膜からなる第１の有機単分子膜を形成し、該第１の有機単分子膜にプローブ分子を前記反応性官能基を介して直接又は架橋分子を用いて結合させてなる、プローブ分子／有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を検出部として備えるものである請求項１〜５のいずれか１項記載のタンパク質の検出方法。
【請求項７】
前記プローブ分子が、抗体である請求項１〜６のいずれか１項記載のタンパク質の検出方法。
【請求項８】
前記反応性官能基を有するアルコキシシランが、下記式（１）で表される請求項６又は７記載のタンパク質の検出方法。
【化１】
0006731664.tif 000006
（式中、Ｒは、アミノ基、アミノオキシ基、カルボキシル基又はチオール基である。Ｒ1は、炭素数３〜２２の直鎖状のアルキレン基である。Ｒ2〜Ｒ4は、それぞれ独立に、炭素数１〜５の直鎖状若しくは分岐状のアルキル基又は炭素数２〜５の直鎖状若しくは分岐状のアルコキシアルキル基である。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）は、生体分子の検出に非常に有望なツールである。ＦＥＴを用いると、生体分子の吸着に伴うゲート表面の電荷密度変化を電気信号として直接検出するため、ラベルフリー検出が可能であり、低コストで迅速な生体分子の検出が可能である。それゆえ、ＦＥＴを用いた生体分子の検出に関する研究が広く行われている。
【０００３】
ＦＥＴによるタンパク質検出は、デバイ長内に存在するタンパク質由来の電荷を検出することで可能となる。そのため、電荷の少ないタンパク質の検出は原理的に困難であり、検出可能な対象分子に限度があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−４００７号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】J. Biol. Chem. vol. 276, pp. 35227-35230, 2001
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、前記事情に鑑みなされたもので、これまでＦＥＴによる検出が困難であったタンパク質であっても、ＦＥＴを用いて簡便かつ高感度に検出することを可能にする方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、前記目的を達成するため鋭意研究を行った結果、タンパク質をイオン性界面活性剤で前処理することで、タンパク質が有する電荷が増え、これまでＦＥＴによる検出が困難であったタンパク質であっても、高感度でタンパク質を検出することが可能となることを見出し、本発明をなすに至った。
【０００８】
したがって、本発明は、下記タンパク質の検出方法を提供する。
１．検出対象となるタンパク質をイオン性界面活性剤で前処理する工程、半導体センシングデバイス上に固定化されたプローブ分子と前記タンパク質とを相互作用させる工程、及び該相互作用によるゲート電極上の表面電位変化を検出する工程を含むことを特徴とするタンパク質の検出方法。
２．前記前処理工程の前に、イオン性可溶化剤を含む抽出液でタンパク質を抽出後、該イオン性可溶化剤を除去する工程を含む１のタンパク質の検出方法。
３．前記イオン性界面活性剤が、陰イオン性界面活性剤である１又は２のタンパク質の検出方法。
４．前記陰イオン性界面活性剤が、硫酸塩である１〜３のいずれかのタンパク質の検出方法。
５．前記硫酸塩が、ドデシル硫酸塩である４のタンパク質の検出方法。
６．前記半導体センシングデバイスが、半導体上に反応ゲート絶縁部としてシリコン酸化物又は無機酸化物を含む第１の絶縁層が形成された電界効果トランジスタの前記第１の絶縁層の上に、反応性官能基を有するアルコキシシランの単分子膜からなる第１の有機単分子膜を形成し、該第１の有機単分子膜にプローブ分子を前記反応性官能基を介して直接又は架橋分子を用いて結合させてなる、プローブ分子／有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を検出部として備えるものである１〜５のいずれかのタンパク質の検出方法。
７．前記プローブ分子が、抗体である１〜６のいずれかのタンパク質の検出方法。
８．前記反応性官能基を有するアルコキシシランが、下記式（１）で表される６又は７のタンパク質の検出方法。
【化１】
0006731664.tif 000002
（式中、Ｒは、アミノ基、アミノオキシ基、カルボキシル基又はチオール基である。Ｒ1は、炭素数３〜２２の直鎖状のアルキレン基である。Ｒ2〜Ｒ4は、それぞれ独立に、炭素数１〜５の直鎖状若しくは分岐状のアルキル基又は炭素数２〜５の直鎖状若しくは分岐状のアルコキシアルキル基である。）
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、イオン性界面活性剤で前処理することでタンパク質が有する電荷が増えるため、これまで検出が困難であったタンパク質でも高感度で検出することが可能である。また、これまで検出可能であったタンパク質であっても、より高感度で検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の半導体センシングデバイスを示す断面図であり、（Ａ）は電界効果トランジスタ、（Ｂ）は電界効果トランジスタのゲート電極の絶縁層上に有機単分子膜を形成した状態、（Ｃ）は有機単分子膜にプローブ分子が固定化された状態を示す。
【図２】オンチップデバイスのユニット構成例を示し、（Ａ）は部分平面図、（Ｂ）はその拡大断面図である。
【図３】本発明の半導体センシングデバイスを用いたタンパク質検出の概念図である。
【図４】実施例１で測定したＳＤＳ処理したソバアレルゲン添加前後のデバイス特性の評価結果を示すグラフであって、ゲート電圧０.４〜０.５Ｖの範囲における電流−電圧曲線である。
【図５】比較例１で測定したＳＤＳ処理をしていないソバアレルゲン添加前後のデバイス特性の評価結果を示すグラフであって、ゲート電圧０.４〜０.５Ｖの範囲における電流−電圧曲線である。
【図６】比較例２で測定したＳＤＳ処理した卵白アルブミン添加前後のデバイス特性の評価結果を示すグラフであって、ゲート電圧０.４〜０.５Ｖの範囲における電流−電圧曲線である。
【図７】実施例２、３及び比較例３で測定したゲート電圧シフト値を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のタンパク質の検出方法は、検出対象となるタンパク質をイオン性界面活性剤で前処理する工程、半導体センシングデバイス上に固定化されたプローブ分子とタンパク質とを相互作用させる工程、及び該相互作用によるゲート電極上の表面電位変化を検出する工程を含む。
【００１２】
本発明において検出対象となるタンパク質は、特に限定されないが、本発明の方法は電荷が少ないタンパク質の検出に特に有効である。例えば、ソバアレルゲン、コムギアレルゲン、ダイズアレルゲン等の食物アレルゲン、植物のアレルゲン等の検出に有効である。
【００１３】
前記タンパク質を試料から抽出する方法は、特に限定されず、従来公知の方法を採用することができる。例えば、食物から食物アレルゲンを抽出する場合は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、グアニジン塩酸塩、尿素等の可溶化剤（変性剤）を含む抽出液を用いて抽出する方法が知られている。本発明の方法においては、このような方法で得られたタンパク質を含む抽出液をそのまま後述するイオン性界面活性剤で処理してもよい。ただし、ＳＤＳ等のイオン性可溶化剤を含む抽出液でタンパク質を抽出した場合は、後述するイオン性界面活性剤で処理する前にイオン性可溶化剤を除去することが好ましい。イオン性可溶化剤を除去する方法としては、透析法、クロマトグラフィー、沈殿法等の公知の方法が挙げられる。
【００１４】
本発明の方法においては、検出対象となるタンパク質をイオン性界面活性剤で前処理する。タンパク質をイオン性界面活性剤で前処理することで、タンパク質に電荷が付与され、ＦＥＴによる検出が可能となる。
【００１５】
前記イオン性界面活性剤としては、硫酸塩、スルホン酸塩、カルボン酸塩等の陰イオン性界面活性剤、第４級アンモニウム塩、アルキルアミン塩等の陽イオン性界面活性剤、アルキルベタイン等の両性界面活性剤が挙げられる。具体的には、陰イオン性界面活性剤としては、ＳＤＳ、ドデシル硫酸リチウム等のドデシル硫酸塩、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム等が挙げられる。陽イオン性界面活性剤としては、臭化セチルトリメチルアンモニウム等が挙げられる。両性界面活性剤としては、ＣＨＡＰＳ等が挙げられる。これらのうち、陰イオン性界面活性剤が好ましく、ＳＤＳ、ドデシル硫酸リチウム等がより好ましい。
【００１６】
イオン性界面活性剤によるタンパク質の処理方法としては、例えば、タンパク質を含む溶液にイオン性界面活性剤を含む溶液を添加する方法が挙げられる。
【００１７】
前記タンパク質を含む溶液としては、タンパク質を水又は緩衝液に溶解させたものが挙げられる。前記緩衝液としては、リン酸緩衝液、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝生理食塩水、ＭＥＳ緩衝生理食塩水、ＭＯＰＳ緩衝生理食塩水、ＰＩＰＥＳ緩衝生理食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水等が好ましく使用できる。前記タンパク質を含む溶液のｐＨは、５〜１０が好ましく、６〜９がより好ましく、７〜８が更に好ましい。ｐＨを調整するため、前記溶液に酸や塩基を添加してもよい。
【００１８】
また、前記タンパク質を含む溶液に、Ｃａ2+、Ｍｇ2+、ＮＨ4+等のイオン、グアニジン、尿素等の変性剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）等のキレート剤、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ−４０等の非イオン界面活性剤等を加えてもよい。前記イオンを加える場合、その濃度は、０.１〜１０ｍＭが好ましく、０.５〜５ｍＭがより好ましい。前記キレート剤を加える場合、その濃度は、０.１〜１０ｍＭが好ましく、０.５〜５ｍＭがより好ましい。非イオン界面活性剤を加える場合、その濃度は、０.００１〜１０体積％が好ましく、０.０５〜５体積％がより好ましい。
【００１９】
前記イオン性界面活性剤を含む溶液としては、イオン性界面活性剤を水又は緩衝液に溶解させたものが挙げられる。前記緩衝液としては、前述したものと同様のものが挙げられる。前記イオン性界面活性剤を含む溶液のｐＨは、５〜１０が好ましく、６〜９がより好ましく、７〜８が更に好ましい。ｐＨを調整するため、前記溶液に酸や塩基を添加してもよい。
【００２０】
前記タンパク質を含む溶液に前記イオン性界面活性剤を含む溶液を添加した後の溶液（以下、処理溶液ともいう。）中のタンパク質の最終濃度は、１ｐｇ／ｍＬ〜１,０００ｍｇ／ｍＬが好ましく、１０ｐｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬがより好ましく、１００ｐｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬが更に好ましい。タンパク質の最終濃度が前記範囲であると、ＦＥＴを用いて検出することが十分に可能となるため、好ましい。
【００２１】
また、前記処理溶液中のイオン性界面活性剤の最終濃度は、０.００１〜２０質量％が好ましく、０.０１〜１０質量％がより好ましく、０.０５〜５質量％が更に好ましい。イオン性界面活性剤の最終濃度が前記範囲であると、タンパク質に十分に電荷が付与されるため好ましい。
【００２２】
検出対象となるタンパク質をイオン性界面活性剤で前処理した後、半導体センシングデバイスを用いてタンパク質を検出する。図３に、半導体センシングデバイスを用いたタンパク質の検出方法の概念を示す。この検出方法では、有機単分子膜上に固定化されたプローブ分子とタンパク質とを相互作用させ、この相互作用により生じる絶縁層の表面電位変化を電気信号として検出する。なお、図３中、１２は検出対象となるタンパク質である。他の構成についての詳細は後述する。
【００２３】
ここで、イオン性界面活性剤で前処理したタンパク質にはその表面に電荷が存在するため、デバイス上に固定化されたプローブ分子とタンパク質とが相互作用した場合、ゲート電極上の表面電位がシフトする。この場合、電流一定下においては電位シフトを、電圧一定下においては電流のシフトをシグナルとして検出することができる。なお、ｎ型の電界効果トランジスタを用いた場合とｐ型の電界効果トランジスタを用いた場合とでは、閾値電圧のシフトは互いに逆になる。
【００２４】
デバイス上に固定化されたプローブ分子とタンパク質とを相互作用させるには、前記処理溶液をゲート電極上に載せればよい。デバイス上に固定化されたプローブ分子とタンパク質とを相互作用させるときの温度は、０〜５０℃が好ましく、２０〜４５℃がより好ましく、室温（２０〜２５℃）〜体温（３５〜３７℃）が更に好ましい。反応時間は、３０秒間〜１時間が好ましく、１〜３０分間がより好ましく、５〜１５分間が更に好ましい。
【００２５】
前記プローブ分子は、検出対象となるタンパク質に結合するものであれば特に限定されない。前記プローブ分子としては、例えば、抗体が挙げられる。本発明において抗体とは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等の免疫グロブリンや、抗体フラグメント（Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ')2）を含むものとする。また、抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。
【００２６】
また、デバイス上に固定化されたプローブ分子とタンパク質とを相互作用させる工程と、該相互作用によるゲート電極上の表面電位変化を検出する工程との間に、洗浄工程を設けてもよい。前記洗浄工程において使用する洗浄液は、前述したデバイス上に固定化されたプローブ分子とタンパク質とを相互作用させるときに用いる生理的条件を満たす溶液が好ましい。また、前記洗浄液には、更に前述したイオン、キレート剤、界面活性剤等を加えてもよい。この場合、前述した濃度になるように添加することが好ましい。
【００２７】
本発明で用いる半導体センシングデバイスは、半導体上に反応ゲート絶縁部としてシリコン酸化物又は無機酸化物を含む第１の絶縁層が形成された電界効果トランジスタの前記第１の絶縁層の上に、反応性官能基を有するアルコキシシランの単分子膜からなる第１の有機単分子膜を形成し、該第１の有機単分子膜にプローブ分子を前記反応性官能基を介して直接又は架橋分子を用いて結合させてなる、プローブ分子／有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を検出部として備えるものである。
【００２８】
前記検出部のうち、絶縁層／半導体構造部分は、半導体上に反応ゲート絶縁部としてシリコン酸化物又は無機酸化物を含む絶縁層が形成された電界効果トランジスタを利用することができ、その構成は、従来公知のものを利用することができる。前記絶縁層は、シリコン酸化物であることが好ましい。電界効果トランジスタは、ｎ型でもｐ型でもよい。この電界効果トランジスタとしては、例えば、図１（Ａ）に示されるようなものが例示される。なお、図１中、１はシリコン基板、２はシリコン酸化物又は無機酸化物（ガラス、アルミナ等）を含む絶縁層、４はゲート電極、５はソース電極、６はドレイン電極、７はドープ領域を示す。
【００２９】
そして、図１（Ｂ）に示されるように、絶縁層２上に第１の有機単分子膜３が形成される。ここで、本発明においては、基本原理として、絶縁層表面上のプローブ分子とタンパク質の結合反応に伴う表面電位変化を電気信号として検出する構成とする。なお、前記絶縁層の厚さは、１０〜１００ｎｍ、特に１０〜５０ｎｍが好ましい。
【００３０】
前記第１の有機単分子膜は、反応性官能基を有するアルコキシシランの単分子膜からなる。前記反応性官能基を有するアルコキシシランは、下記式（１）で表されるものであることが好ましい。
【化２】
0006731664.tif 000003
（式中、Ｒは、アミノ基、アミノオキシ基、カルボキシル基又はチオール基である。Ｒ1は、炭素数３〜２２の直鎖状のアルキレン基である。Ｒ2〜Ｒ4は、それぞれ独立に、炭素数１〜５の直鎖状若しくは分岐状のアルキル基又は炭素数２〜５の直鎖状若しくは分岐状のアルコキシアルキル基である。）
【００３１】
前記Ｒとしては、アミノ基又はカルボキシル基が好ましく、アミノ基がより好ましい。
【００３２】
前記Ｒ1で示される直鎖状のアルキレン基は、炭素数が３〜２２であり、炭素数が３〜１８であることが好ましく、炭素数が３〜８であることがより好ましい。炭素鎖が短い方が、有機単分子膜の有する疎水性が弱くなり、ターゲットタンパク質の疎水性相互作用に起因する非特異的吸着を抑制することができるため好ましい。
【００３３】
前記Ｒ1の具体例としては、トリメチレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基、ヘプタメチレン基、オクタメチレン基、ノナメチレン基、デカメチレン基、ウンデカメチレン基、ドデカメチレン基、トリデカメチレン基、テトラデカメチレン基、ペンタデカメチレン基、ヘキサデカメチレン基、ヘプタデカメチレン基、オクタデカメチレン基、ノナデカメチレン基、エイコサメチレン基、ヘンエイコサメチレン基、ドコサメチレン基が挙げられる。これらのうち、炭素数３〜１８のものが好ましく、炭素数３〜８のものがより好ましい。
【００３４】
また、前記Ｒ2〜Ｒ4は、それぞれ独立に炭素数１〜５、好ましくは１〜２の直鎖状若しくは分岐状のアルキル基又は炭素数２〜５、好ましくは炭素数２〜３の直鎖状若しくは分岐状のアルコキシアルキル基である。前記Ｒ2〜Ｒ4の具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、メトキシメチル基、エトキシメチル基、２−メトキシエチル基、２−エトキシエチル基等が挙げられる。これらのうち、特にメチル基、エチル基、２−メトキシエチル基等が好ましい。
【００３５】
前記Ｒがアミノ基、カルボキシル基又はチオール基であるアルコキシシランとしては、市販品を使用し得る。また、前記Ｒがアミノオキシ基であるアルコキシシランは、下記スキームにしたがって合成できる。
【化３】
0006731664.tif 000004
（式中、Ｒ1〜Ｒ4は、前記と同じ。Ｒ5は、Ｒ1から炭素数が２減少した直鎖状のアルキレン基である。）
【００３６】
前記Ｒがアミノオキシ基であるアルコキシシランは、トリアルコキシヒドロシランとＯ−アルケニルヒドロキシルアミンとを白金系触媒で処理することによって調製することができる。例えば、窒素雰囲気下、トリアルコキシヒドロシランとＯ−アルケニルヒドロキシルアミンとの混合物に、ヘキサクロロ白金(IV)酸等の白金系触媒を加え、１０〜２００℃で１〜１,２００時間、より好ましくは６０〜１２０℃で１２〜４８時間反応させることにより調製できる。成膜操作には、過剰のトリアルコキシヒドロシランを例えば蒸留等の操作により除去したものを使用することが好ましい。
【００３７】
第１の有機単分子膜は、前記アルコキシシランを気相化学反応又は液相反応によって絶縁層上に形成し、その最適化、例えば、有機分子の自己集積化機能によって単分子が最密パッキングされた膜が形成される。気相化学反応によって単分子膜を成膜する場合は、例えば、容器に基板及びアルコキシシランを封入し、ドライルーム中で好ましくは８０〜２００℃で１〜２４時間、より好ましくは１００〜１３０℃で２〜５時間反応させることで成膜できる。液相反応によって単分子膜を成膜する場合は、例えば、アルコキシシランを含む有機溶媒中に基板を浸漬し、好ましくは２０〜８０℃で１分間〜２４時間、より好ましくは５５〜６５℃で１５〜２０分間静置することで成膜できる。
【００３８】
前記有機溶媒としては、トルエン、メタノール、エタノール等が挙げられ、特にトルエン、メタノール等が好ましい。
【００３９】
前記電界効果トランジスタの半導体上には、更に、参照ゲート絶縁部としてシリコン酸化物又は無機酸化物を含む第２の絶縁層を形成することができる。この第２の絶縁層の上には、第２の有機単分子膜として、プローブ分子及びタンパク質のいずれとも反応しない有機分子で構成された単分子膜を形成し、この単分子膜／絶縁層／半導体構造を参照部とすることができる。なお、反応ゲート絶縁部と参照ゲート絶縁部とを、電位変化測定において互いに影響を与えない程度に離間させれば、反応ゲート絶縁部の第１の絶縁層と参照ゲート絶縁部の第２の絶縁層とを同一層内に設けることもできる。
【００４０】
図２は、有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を検出部９及び参照部８に適用したオンチップデバイスのユニット構成例を示す。なお、図２中、１はシリコン基板、２は絶縁層、１０はテンプレート部である。このデバイスのユニット構成は図示した構成に限定されず、検出部と参照部とは必ずしも１対１の関係で配置する必要はなく、必要に応じて検出部及び参照部の数及び組合せを適宜変更して配置することができる。また、検出部及び参照部は各々数〜数十μｍのサイズで形成可能である。
【００４１】
前記第２の有機単分子膜としては、フッ素化されていてもよい炭素数８〜２２の直鎖状アルキル基を有するアルコキシシランの単分子膜が好ましい。なお、有機単分子膜としてアルコキシシランの単分子膜を用いる場合、前記第２の絶縁層はシリコン酸化物で形成されたものが好ましい。
【００４２】
第２の有機単分子膜は、絶縁層上に均一な膜を形成させるため、自己集積化膜であることが好ましい。具体的には、下記式（２）で表されるトリアルコキシシランの単分子膜であることが好ましい。
【化４】
0006731664.tif 000005
（式中、Ｒ6は、炭素数８〜２２、好ましくは炭素数１０〜１８の直鎖状アルキル基であり、水素原子の一部又は全部がフッ素原子で置換されていてもよい。Ｒ7〜Ｒ9は、それぞれ独立に、炭素数１〜５、好ましくは炭素数１〜２の直鎖状若しくは分岐状のアルキル基又は炭素数２〜５、好ましくは炭素数２〜３の直鎖状若しくは分岐状のアルコキシアルキル基である。）
【００４３】
前記Ｒ6として具体的には、ｎ−オクチル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基、ｎ−ウンデシル基、ｎ−ドデシル基、ｎ−トリデシル基、ｎ−テトラデシル基、ｎ−ペンタデシル基、ｎ−ヘキサデシル基、ｎ−ヘプタデシル基、ｎ−オクタデシル基、ｎ−ノナデシル基、ｎ−エイコシル基、ｎ−ヘンエイコシル基、ｎ−ドコシル基等が挙げられる。
【００４４】
前記Ｒ7〜Ｒ9として具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、メトキシメチル基、エトキシメチル基、２−メトキシエチル基、２−エトキシエチル基等が挙げられる。
【００４５】
前記トリアルコキシシランとして具体的には、CH3(CH2)7Si(OCH3)3、CH3(CH2)7Si(OC2H5)3、CH3(CH2)8Si(OCH3)3、CH3(CH2)8Si(OC2H5)3、CH3(CH2)9Si(OCH3)3、CH3(CH2)9Si(OC2H5)3、CH3(CH2)10Si(OCH3)3、CH3(CH2)10Si(OC2H5)3、CH3(CH2)11Si(OCH3)3、CH3(CH2)11Si(OC2H5)3、CH3(CH2)12Si(OCH3)3、CH3(CH2)12Si(OC2H5)3、CH3(CH2)13Si(OCH3)3、CH3(CH2)13Si(OC2H5)3、CH3(CH2)14Si(OCH3)3、CH3(CH2)14Si(OC2H5)3、CH3(CH2)15Si(OCH3)3、CH3(CH2)15Si(OC2H5)3、CH3(CH2)16Si(OCH3)3、CH3(CH2)16Si(OC2H5)3、CH3(CH2)17Si(OCH3)3、CH3(CH2)17Si(OC2H5)3、CH3(CH2)18Si(OCH3)3、CH3(CH2)18Si(OC2H5)3、CH3(CH2)19Si(OCH3)3、CH3(CH2)19Si(OC2H5)3、CH3(CH2)20Si(OCH3)3、CH3(CH2)20Si(OC2H5)3、CH3(CH2)21Si(OCH3)3、CH3(CH2)21Si(OC2H5)3、CF3(CF2)5(CH2)2Si(OCH3)3、CF3(CF2)5(CH2)2Si(OC2H5)3、CF3(CF2)6(CH2)2Si(OCH3)3、CF3(CF2)6(CH2)2Si(OC2H5)3、CF3(CF2)7(CH2)2Si(OCH3)3、CF3(CF2)7(CH2)2Si(OC2H5)3、CF3(CF2)8(CH2)2Si(OCH3)3、CF3(CF2)8(CH2)2Si(OC2H5)3、CF3(CF2)9(CH2)2Si(OCH3)3、CF3(CF2)9(CH2)2Si(OC2H5)3、CF3(CF2)10(CH2)2Si(OCH3)3、CF3(CF2)10(CH2)2Si(OC2H5)3、CF3(CF2)11(CH2)2Si(OCH3)3、CF3(CF2)11(CH2)2Si(OC2H5)3、CF3(CF2)12(CH2)2Si(OCH3)3、CF3(CF2)12(CH2)2Si(OC2H5)3、CF3(CF2)13(CH2)2Si(OCH3)3、CF3(CF2)13(CH2)2Si(OC2H5)3、CF3(CF2)14(CH2)2Si(OCH3)3、CF3(CF2)14(CH2)2Si(OC2H5)3、CF3(CF2)15(CH2)2Si(OCH3)3、CF3(CF2)15(CH2)2Si(OC2H5)3、CF3(CF2)16(CH2)2Si(OCH3)3、CF3(CF2)16(CH2)2Si(OC2H5)3、CF3(CF2)17(CH2)2Si(OCH3)3、CF3(CF2)17(CH2)2Si(OC2H5)3、CF3(CF2)18(CH2)2Si(OCH3)3、CF3(CF2)18(CH2)2Si(OC2H5)3、CF3(CF2)19(CH2)2Si(OCH3)3、CF3(CF2)19(CH2)2Si(OC2H5)3等が挙げられる。
【００４６】
なお、第１及び第２の有機単分子膜は、パターニングにより所望の位置に形成することができる。特に、オンチップでの集積化デバイスを形成するためには、有機単分子膜のパターニングが有効である。例えば、検出部の絶縁層表面には、プローブ分子固定化のために反応性官能基を有する有機分子で構成された第１の単分子膜を、一方で、参照部、更には非ゲート部（テンプレート部）においては、タンパク質の非特異的な吸着を避けるために、プローブ分子及びタンパク質のいずれとも反応しない有機分子で構成された第２の有機単分子膜を、パターニングにより位置選択的に形成する。
【００４７】
参照部としては、第２の有機単分子膜として第１の有機単分子膜と同様の単分子膜に、測定対象のタンパク質と相互作用しない化合物を固定化したものを利用することも可能である。すなわち、測定対象のタンパク質と相互作用しない化合物／有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を参照部とすることもできる。この場合、参照部は、前述した検出部における有機単分子膜形成方法及び後述する化合物固定化方法と同じ方法にしたがって形成することができる。
【００４８】
前記半導体センシングデバイスには、前記検出部の第１の有機単分子膜にプローブ分子が固定化される。例えば、図１（Ｃ）に示されるように、第１の有機単分子膜３にプローブ分子１１が結合される。
【００４９】
前記プローブ分子は、直接又は架橋分子を介して前記有機単分子膜に固定化される。架橋分子としては、例えば、グルタルアルデヒド等が挙げられる。この場合、前記有機単分子膜をグルタルアルデヒド修飾する方法は、特に限定されないが、例えば０.０１〜２５質量％のグルタルアルデヒドを含むリン酸緩衝生理食塩水（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２.７ｍＭ ＫＣｌ、８.１ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ、１.５ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ７.４、以下１×ＰＢＳという。）中で、１０〜５０℃で１分〜２４時間反応させればよい。
【００５０】
次に、プローブ分子中のアミノ基等の反応性官能基をグルタルアルデヒドと反応させることでプローブ分子を固定化する。具体的には、例えば、プローブ分子を含む溶液（溶媒は超純水又は１×ＰＢＳ）中で、１０〜５０℃で１分〜２４時間反応させればよい。好ましくは、１０〜３５℃で１分〜６０分間反応させればよい。前記プローブ分子の濃度は、１ｐｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬが好ましく、１ｎｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬがより好ましい。
【実施例】
【００５１】
以下、調製例、製造例、実施例及び比較例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。
【００５２】
［１］試料の調製
［調製例１］
ソバ種子から抽出したＲＮＡからｃＤＮＡを調製し、ソバアレルゲンタンパク質をコードする遺伝子領域をＰＣＲで増幅した。ソバアレルゲンタンパク質を遺伝子組み換え技術によりＨｉｓタグ融合タンパク質として発現させるため、得られた配列をタグ配列の付いたベクター（pET-22b(+)、Novagen社製）に挿入し、大腸菌（Escherichia coli BL21(DE3) Rosetta gami2、Novagen社製）に導入した。この大腸菌を用いて組換えソバアレルゲンタンパク質を大量発現させ、ニッケルセファロース（ＧＥヘルスケアジャパン社製）で精製し、組換えソバアレルゲンタンパク質を調製した。
【００５３】
［調製例２］
調製した組換えソバアレルゲンタンパク質をBALB/cマウス（日本エスエルシー(株)製）に複数回注入し、免疫した。このマウスの脾臓を摘出し、これをマウスのミエローマ細胞と融合させて、抗体産生ハイブリドーマを作製した。この抗体産生ハイブリドーマ浮遊液をBALB/cマウス腹腔内に注入し、プロテインカラム（ＧＥヘルスケアジャパン社製）で精製し、抗ソバアレルゲンモノクローナル抗体を取得した。この抗体をPierce Mouse IgG1 Fab and F(ab')2 Micro Preparation Kit 44680（Thermo Scientific社製）を用いて、酵素的に消化してＦａｂフラグメントを調製した。
【００５４】
［２］Ｆａｂフラグメント固定化半導体センシングデバイスの構築
［製造例１］
Ｆａｂフラグメント／有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を検出部として備えるデバイスを構築した。絶縁層としてはシリコン酸化物を用いた。検出部の第１の有機単分子膜として、アミノプロピルトリエトキシシランを用いて単分子膜を形成した。以下にデバイス作製方法について記載する。
【００５５】
凸版印刷(株)製の１０μｍ長、１,０００μｍ幅のｎ型ＦＥＴからアセトンを用いて超音波処理することでフォトレジスト膜を除去した。ゲート表面にヒドロキシ基を導入して活性部位を作製するため、プラズマリアクターＰＲ３０１（ヤマト科学(株)製）を用いて、２００ＷのＯ2プラズマに１分間暴露した。
アミノプロピルトリエトキシシラン（シグマアルドリッチ社製）を１質量％含むトルエン中にデバイスを浸漬し、アルゴン雰囲気下、６０℃で７分間静置することで、ゲート上へ単分子膜を成膜した。単分子膜を形成したＦＥＴをメタノール／トルエン混合溶媒（質量比１：１）を用いて超音波洗浄し、エタノールでリンスした。
【００５６】
アミノ系単分子膜修飾された検出部のゲート電極に、プローブ分子として前記Ｆａｂフラグメントを固定化した。まず、有機単分子膜のアミノ基とＦａｂフラグメントとを架橋するための架橋分子として、グルタルアルデヒドを反応させた。具体的には、２.５質量％のグルタルアルデヒド溶液（溶媒：１×ＰＢＳ）０.０１ｍＬ中に、末端がアミノ基の単分子膜が形成されたデバイスの検出部を浸漬し、室温で３０分間反応させ、単分子膜をグルタルアルデヒド修飾した。グルタルアルデヒド修飾したＦＥＴを５０μｇ／ｍＬのＦａｂ溶液（溶媒：１×ＰＢＳ）０.０４ｍＬと反応させることでＦａｂを単分子膜に固定化した。未反応のグルタルアルデヒドは、１０ｍＭのエタノールアミン溶液（溶媒：１×ＰＢＳ）と室温で１時間反応させることで不活性化した。
【００５７】
［３］ソバアレルゲンの検出
［実施例１］
Ｆａｂ固定化デバイスをホルダーに設置し、デバイスの検出部を０.０１×ＰＢＳ０.５ｍＬに１０分間浸漬した。浸漬後、室温で、Ｆａｂ固定化デバイスの電流−電圧曲線を、Ｈｇ／Ｈｇ2ＳＯ4参照電極を用い、デジタルソースメータ（ケースレー社製、２６１２）で測定した。測定条件はゲート電圧−３〜０.５Ｖ、ドレイン電圧１Ｖとした。続いて、１０μｇ／ｍＬのソバアレルゲン溶液（溶媒：１×ＰＢＳ）０.４５ｍＬに対して、陰イオン性界面活性剤である１質量％ＳＤＳ溶液（溶媒：１×ＰＢＳ）０.０５０ｍＬを添加して、測定溶液Ａを準備した。更に、ゲート表面上に測定溶液Ａを添加し、６０分静置した後、１×ＰＢＳ３ｍＬ及び０.０１×ＰＢＳ３ｍＬでリンスを行った。その後、ゲート表面上に０.０１×ＰＢＳを０.５ｍＬ添加して１０分間静置した後、タンパク質吸着デバイスの電流−電圧曲線を測定し、タンパク質添加前後でのゲート電圧シフトΔＶｇを評価した。
【００５８】
［比較例１、２］
前記測定溶液Ａのかわりに、陰イオン性界面活性剤で前処理していない、１０μｇ／ｍＬのソバアレルゲン溶液（溶媒：１×ＰＢＳ）である測定溶液Ｂ（比較例１）、又は５ｍｇ／ｍＬの卵白アルブミン（ＯＶＡ）溶液（溶媒：１×ＰＢＳ）０.４５ｍＬに対して１質量％ＳＤＳ溶液０.０５ｍＬを添加して調製した測定溶液Ｃ（比較例２）を用いた以外は、実施例１と同様の方法でタンパク質吸着デバイスの電流−電圧曲線を測定し、タンパク質添加前後でのゲート電圧シフトΔＶｇを評価した。
【００５９】
Ｆａｂ固定化デバイスに対する、陰イオン性界面活性剤で前処理したソバアレルゲン添加前後のデバイス特性の評価結果を図４に、陰イオン性界面活性剤で前処理しないソバアレルゲン添加前後のデバイス特性の評価結果を図５に、陰イオン性界面活性剤で前処理したＯＶＡ添加前後のデバイス特性の評価結果を図６に、それぞれ示す。実線がタンパク質添加前のデバイス特性、破線がタンパク質添加後のデバイス特性をそれぞれ表す。Ｆａｂ固定化デバイスに陰イオン性界面活性剤で前処理したソバアレルゲンを添加した場合、電流−電圧曲線が正方向に大きくシフトした。一方で、Ｆａｂ固定化デバイスに陰イオン性界面活性剤で前処理していないソバアレルゲンを添加した場合、電流−電圧曲線の変化は僅かであった。
【００６０】
なお、陰イオン性界面活性剤で前処理したＯＶＡを添加しても、電流−電圧曲線の変化はほとんど確認されなかった。これは、ＦａｂとＯＶＡとが抗原抗体反応を起こさなかったためである。
【００６１】
［実施例２、３、比較例３］
１ｇ中に０μｇ（比較例３）、１０μｇ（実施例２）又は１００μｇ（実施例３）のソバタンパク質が含まれるクッキーを使用した（ソバタンパク質濃度：０、１０又は１００ｐｐｍ）。クッキーをビニル袋内で粉砕し、５０ｍＬチューブに粉末クッキーを１ｇ量りとった。その後、１質量％ＳＤＳ含有ＰＢＳ１９ｍＬを添加し、振とうした（約１００ｒｐｍ、室温、２４時間）。振とう終了後、溶液を遠心分離（３,０００×ｇ、室温、２０分間）し、上澄み液を濾過した。ＳＤＳ含有ＰＢＳを加えた濾液を１００℃で５分間加熱した。その後、溶液中に存在する遊離のＳＤＳを、SDS-Out Precipitation Kit（Thermo Scientific社製）を用いて除去することで、ＳＤＳ処理したクッキー抽出液を精製した。すなわち、濾液の１／２０量のSDS-Out Precipitation Reagentを加え、氷上で２０分間冷却した。これを１０,０００×ｇ、１０分間遠心分離し、上清をHandee Spin Cup Columnに移し、更に１０,０００×ｇで１分間遠心分離し、フロースルーを測定に使用した。
得られたクッキー抽出液中のソバアレルゲンを、実施例１と同様の方法でゲート電圧シフトΔＶｇを測定することで検出した。結果を図７に示す。
【００６２】
以上の結果より、イオン性界面活性剤でタンパク質を前処理することでタンパク質の内在電荷が増強され、通常では検出が困難なタンパク質でも検出可能となることが示された。
【符号の説明】
【００６３】
１  シリコン基板
２  絶縁層
３  第１の有機単分子膜
４  ゲート電極
５  ソース電極
６  ドレイン電極
７  ドープ領域
８  参照部
９  検出部
１０  テンプレート部
１１  プローブ分子
１２  検出対象となるタンパク質
【図１】
0006731664.tif 000007
【図２】
0006731664.tif 000008
【図３】
0006731664.tif 000009
【図４】
0006731664.tif 000010
【図５】
0006731664.tif 000011
【図６】
0006731664.tif 000012
【図７】
0006731664.tif 000013