(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネコ属由来の細胞を元株とした遺伝子組換型細胞であって、
前記元株のゲノムに、感染型env遺伝子のコード配列領域を有した非感染性のRD-114ウイルス関連配列、並びに前記感染型env遺伝子のコード配列領域を有しない非感染性のRD-114ウイルス関連配列が少なくとも一つずつ内在しているとともに、
前記感染型env遺伝子のコード配列領域を有した非感染性のRD-114ウイルス関連配列中の前記感染型env遺伝子が人為的にノックアウトされた遺伝子組換型細胞。
【請求項２】
前記元株がCRFK細胞である請求項1記載の遺伝子組換型細胞。
【請求項３】
請求項1又は請求項2記載の遺伝子組換型細胞にワクチン用ウイルス株を感染させ、増幅させる手順を含むワクチン製造方法。
【請求項４】
ネコ属由来の細胞のゲノムに、感染型env遺伝子のコード配列領域を有した非感染性のRD-114ウイルス関連配列、並びに前記感染型env遺伝子のコード配列領域を有しない非感染性のRD-114ウイルス関連配列が少なくとも一つずつ内在しているとともに、
前記感染型env遺伝子のコード配列領域を有した非感染性のRD-114ウイルス関連配列中の前記感染型env遺伝子の有無を判定することで、感染性RD-114ウイルスの発現可能性の有無を判定する感染性RD-114ウイルス発現リスク検出方法。
【請求項５】
ネコ属由来の細胞のゲノムに、感染型env遺伝子のコード配列領域を有した非感染性のRD-114ウイルス関連配列、並びに前記感染型env遺伝子のコード配列領域を有しない非感染性のRD-114ウイルス関連配列が少なくとも一つずつ内在しているとともに、
前記感染型env遺伝子のコード配列領域を有した非感染性のRD-114ウイルス関連配列中の前記感染型env遺伝子を人為的にノックアウトする手順を含む遺伝子組換型細胞製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ネコ属由来の細胞を元株とした遺伝子組換型細胞であって、その元株のゲノムに内在しているRD-114ウイルスの感染型env遺伝子が人為的にノックアウトされた遺伝子組換型細胞、その細胞を用いたワクチン製造方法、感染性RD-114ウイルスの発現可能性の有無を判定する感染性RD-114ウイルス発現リスク検出方法、遺伝子組換型細胞製造方法などに関連する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチン製造方法の一つとして、細胞培養によるワクチン製造が広く実用化されている。イヌやネコの感染症に対するワクチン製造においても、ネコヘルペスウイルス、ネコカリシウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、イヌアデノウイルス、イヌジステンパーウイルス、イヌパルボウイルス、イヌコロナウイルス、イヌパラインフルエンザウイルスなどに対するワクチンの製造に、CRFK細胞（Crandell-Rees  feline  kidney  cells）などのネコ属由来株化細胞などが使用されている。
【０００３】
内在性レトロウイルス（ERV；endogenous  retrovirus）は、太古におけるレトロウイルス感染の際に祖先の生殖細胞系列に遺伝子が挿入されたことで、哺乳類のゲノムの一部に内在性に組み込まれているレトロウイルスである。哺乳類のゲノム中には、過去のレトロウイルス感染の痕跡である内在性レトロウイルスが約10%存在するとされている。そのほとんどは、長い年月の間に生じたゲノムDNAの変異・欠失などの蓄積により、ウイルスとしての複製能・感染性を失っているが、一部の内在性レトロウイルスは感染性を保持しているとされ、発症する例もいくつか報告されている。
【０００４】
イエネコは、RD-114ウイルスと呼ばれる感染性の内在性レトロウイルスを有している。ネコのゲノムに内在するRD-114ウイルスのゲノムは、他のレトロウイルスと同様、プロモーター活性のある2つのLTR（long  terminal  repeat）に挟まれた領域に、構造タンパク質をコードするgag遺伝子、逆転写酵素などをコードするpol遺伝子、エンベロープタンパク質をコードするenv遺伝子などを有する。
【０００５】
RD-114ウイルスに関し、非特許文献1では、当時の知見として、イエネコのゲノム中にRD-114ウイルスと相同性を有する配列が約20コピー存在し、gag遺伝子とpol遺伝子のコード領域ではその中の制限酵素サイトが保存されていたのに対し、env遺伝子はその多くが大幅に欠失していたことが報告された。同文献では、感染性RD-114ウイルスが同定され（その後、「Sc3c」と命名された。）、その分子クローンが作製された（その後、「pSc3c」と命名された。）。
【０００６】
非特許文献2では、ネコ属由来株化細胞であるCRFK細胞、MCC細胞（feline  large  granular  lymphoma  cells）、FER細胞（feline  embryonic  fibroblasts  cells）がRD-114ウイルスの感染性粒子を産生していることが報告された。非特許文献3では、ネコ由来株化細胞を用いて製造されたネコ及びイヌ用のいくつかの弱毒生ワクチン中に、感染性のRD-114ウイルスの感染性粒子が混入していることが報告された。
【０００７】
一方、RD-114ウイルスのネコ又はイヌに対する病原性はまだ明らかではないが、前述の非特許文献2では、いくつかのネコ由来株化細胞がRD-114ウイルスに対して感受性を有することが、非特許文献4には、イヌ初代培養細胞やイヌ由来株化細胞で、RD-114ウイルスが感染し増殖することができることが、それぞれ報告された。
【０００８】
その他、非特許文献5では、CRFK細胞より分離された感染性RD-114ウイルスであるCRT株が同定され、その分子クローンであるpCRT1が作製されるとともに、そのpCRT1の遺伝子配列は、RD-114ウイルスを最初に同定した際のクローンであるpSc3cのものとほとんど同一であり、env遺伝子のコード領域に対応するアミノ酸配列には置換がないことが報告された。非特許文献6では、感染性RD-114ウイルスの3つの分子クローン（pSc3c、pCRT1、pRD-UCL）の配列の比較が行われた。
【非特許文献１】Reeves,  R.H.  &  O'Brien,  S.  J.  Molecular  genetic  characterization  of  the  RD-114  gene  family  of  endogenous  feline  retroviral  sequences.  J  Virol  52,164-171(1984).
【非特許文献２】Okada,  M.,  Yoshikawa,  R.,  Shojima,  T.,  Baba,  K.  &  Miyazawa,  T.  Susceptibility  and  production  of  a  feline  endogenous  retrovirus  (RD-114  virus)  in  various  feline  cell  lines.  Virus  Res  155,  268-273(2011).
【非特許文献３】Miyazawa,  T.,  Yoshikawa  R.,  Golder  M.,  Okada  M.,  Stewart  H.,  and  Palmarini  M.  Isolation  of  an  infectious  endogenous  retrovirus  in  a  proportion  of  live  attenuated  vaccines  for  pets.  J.  Virol.  84:3690-3694(2010).
【非特許文献４】Yoshikawa R.  ,  Yasuda  J.,  Kobayashi  T.,  Miyazawa  T.  Canine  ASCT1  and  ASCT2  are  functional  receptors  for  RD-114  virus  in  dogs  J.  Gen.   Virol.  93,  603-607(2012)
【非特許文献５】Yoshikawa,  R.,  Sato,  E.,  Igarashi,  T.  &  Miyazawa,  T.  Characterization  of  RD-114  virus  isolated  from  a  commercial  canine  vaccine  manufactured  using  CRFK  cells.  J  Clin  Microbiol  48,  3366-3369(2010).
【非特許文献６】Shimode,  S.  et al.  Sequence  comparison  of  three  infectious  molecular  clones  of  RD-114  virus.  Virus  Genes  45,  393-397(2012).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述の通り、ネコ由来株化細胞などを用いて製造されたワクチン中に、感染性のRD-114ウイルスが混入する可能性があることが明らかになっている。
【００１０】
現在、RD-114ウイルスのネコ又はイヌに対する病原性はまだ明らかではなく、その影響は不明である。しかし、他の内在性レトロウイルスでは発症する例がいくつか報告されており、RD-114ウイルスについても、ネコやイヌで発症するリスクを完全には排除できない。従って、ワクチン中へのRD-114ウイルスの混入の可能性を確実に排除した、RD-114ウイルスフリーのワクチンを製造することが望ましい。
【００１１】
そこで、本発明は、RD-114ウイルスフリーのネコ用又はイヌ用などのワクチンを製造するための新規手段を提供することなどを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、(1)ネコのゲノムの中から、6つのRD-114ウイルス関連配列を同定するとともに、(2)それらの配列でコードされたウイルスが全て非感染性であること、(3)感染型env遺伝子のコード配列領域を有した非感染性のRD-114ウイルス関連配列と、感染型env遺伝子のコード配列領域を有しない非感染性のRD-114ウイルス関連配列とがゲノムに内在している場合、遺伝子組換えにより感染性RD-114ウイルス粒子が産生されること、(4)ゲノムに内在しているRD-114ウイルスの感染型env遺伝子をノックアウトすることにより、感染性RD-114ウイルス粒子の産生を阻止できること、(5)従って、ゲノムに内在しているRD-114ウイルスの感染型env遺伝子がノックアウトされた遺伝子組換型細胞を用いてワクチンを製造することにより、RD-114ウイルスフリーのワクチンを製造できることを新規に見出した。
【００１３】
そこで、本発明では、ネコ属由来の細胞を元株とした遺伝子組換型細胞であって、前記元株のゲノムに内在しているRD-114ウイルスの感染型env遺伝子が人為的にノックアウトされた遺伝子組換型細胞などを提供する。
【００１４】
上述の通り、ネコのゲノム中には、RD-114ウイルスのゲノム配列と相同性を有する配列は複数あるとされているにもかかわらず、従来、感染性RD-114ウイルスと同一の配列は発見されておらず、感染性RD-114ウイルスのコード領域は特定されていなかった。それに対し、本発明は、遺伝子組換えによる感染性RD-114ウイルス粒子の産生メカニズムを明らかにするとともに、RD-114ウイルスの感染型env遺伝子は非常に高度に保存されていないとウイルスとしての感染性を失う一方、その遺伝子が高度に保存されている領域はゲノム中では限られていることを見出し、その領域を特定した。また、感染型env遺伝子をノックアウトすることで感染性RD-114ウイルス粒子の産生を阻止できることを見出した。このように、ノックアウトすべき遺伝子を限られた部位に特定できたことで、遺伝子組換え型細胞の作出を実現可能なものとすることができた。
【００１５】
本発明では、元株のゲノムに内在しているRD-114ウイルスの感染型env遺伝子を人為的にノックアウトすることで、万が一ウイルスが発現したとしても感染性ウイルス粒子の有効な再構成を阻止できる。従って、ネコ属由来の細胞をRD-114ウイルスフリーにすることができ、さらに、この遺伝子組換え細胞をネコ又はイヌ用のワクチン製造などに適用することで、RD-114ウイルスフリーのネコ又はイヌ用のワクチンを製造することができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、RD-114ウイルスフリーのネコ用又はイヌ用などのワクチンを製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
＜本発明に係る遺伝子組換型細胞＞
本発明は、ネコ属由来の細胞を元株とした遺伝子組換型細胞であって、前記元株のゲノムに内在しているRD-114ウイルスの感染型env遺伝子が人為的にノックアウトされた遺伝子組換型細胞をすべて包含する。なお、本発明は、この実施形態のみに狭く限定されない。
【００１８】
上述の通り、この遺伝子組換型細胞は、RD-114ウイルスの感染型env遺伝子をノックアウトすることで、感染性RD-114ウイルスの発現が阻止されており、RD-114ウイルスフリーである。
【００１９】
遺伝子組換え前の元株となる細胞は、少なくとも、ゲノム中にRD-114ウイルスの感染型env遺伝子を内在しているものであればよく、原則的にはネコ属由来の細胞であるが、それのみに狭く限定されない。
【００２０】
例えば、元株となる細胞のゲノムに感染性RD-114ウイルスのコード配列と同一の配列が内在していない場合であっても、前記元株のゲノムに、前記感染型env遺伝子のコード配列領域を有した非感染性のRD-114ウイルス関連配列、並びに前記感染型env遺伝子のコード配列領域を有しない非感染性のRD-114ウイルス関連配列が少なくとも一つずつ内在している場合、遺伝子組換えにより、感染性RD-114ウイルスが産生される可能性がある。従って、本発明は、これらの株を元株とした遺伝子組換型細胞をもすべて包含する。
【００２１】
元株としては、例えば、ネコ属由来の初代培養細胞、ネコ属由来の継代細胞、ネコ属由来の株化細胞のいずれであってもよい。上述の通り、例えば、ネコ属由来株化細胞であるCRFK細胞（Crandell-Rees  feline  kidney  cells）、MCC細胞（feline  large  granular  lymphoma  cells）、FER細胞（feline  embryonic  fibroblasts  cells）はRD-114ウイルスの感染性粒子を産生しており、本発明を適用できる。
【００２２】
例えば、前記元株がCRFK細胞である場合、後述する通り、CRFK細胞のゲノムには、3つのRD-114ウイルス関連配列が存在する。そのうち、染色体C1上に存在するRD-114ウイルス関連配列は、非感染性であるが、env遺伝子のコード配列領域が、感染性RD-114ウイルスの分子クローンの配列と100％の相同性を有する。
【００２３】
上述の通り、感染性RD-114ウイルスとして、例えば、Sc3c株及びCRT1株が報告されている。これらの全長ゲノム配列は公知文献より入手できる。なお、CRT1株の全長ゲノム配列は、GenBankにも登録されている（accession  number  AB559882.1）。
【００２４】
Sc3c株は、8,409塩基の配列としてコードされており、その中に、gag遺伝子（947〜2,599位）、pol遺伝子（2,600〜6,169位）、env遺伝子（6,204〜7,901位）のコード領域が含まれている。CRT1株は、8,315塩基の配列としてコードされており、その中に、gag遺伝子（900〜2,552位）、pol遺伝子（2,553〜6,122位）、env遺伝子（6,157〜7,854位）のコード領域が含まれている。Sc3c株とCRT1株のenv遺伝子がコードしたアミノ酸配列は100％の相同性を示す。
【００２５】
ノックアウトの対象とする「RD-114ウイルスの感染型env遺伝子」は、ネコ属由来の細胞のゲノムに内在し、Sc3c株又はCRT1株のenv遺伝子と高い相同性を示し、かつ発現後に感染性RD-114ウイルス粒子を産生可能なenv遺伝子のコード配列を有した遺伝子である。なお、env遺伝子が感染性RD-114ウイルス粒子を産生する能力を保持するためには、原則的には、Sc3c株又はCRT1株のenv遺伝子と100％又はそれに近い相同性を要求される。
【００２６】
本発明において、RD-114ウイルス関連配列は、原則的にはネコ属由来の細胞のゲノムに内在し、RD-114ウイルス（例えば、Sc3c株、CRT1株など）の遺伝子と相同性を有する配列である。この配列から発現したRD-114ウイルス又はRD-114様ウイルスが感染性を有している場合を「感染性」とし、そうでない場合を「非感染性」とする。
【００２７】
＜本発明に係る遺伝子組換型細胞製造方法＞
本発明は、ネコ属由来の細胞のゲノムに内在するRD-114ウイルスの感染型env遺伝子を人為的にノックアウトする手順を含む遺伝子組換型細胞製造方法を全て包含する。
【００２８】
RD-114ウイルスの感染型env遺伝子のノックアウトする方法は、細胞内のゲノムの特定の位置をノックアウトする方法であればよく、公知の方法を広く用いることが可能である。例えば、TALEN（Transcription  Activator-Like  Effector  Nucleases）、ジンクフィンガーヌクレアーゼなどの人工ヌクレアーゼを用いた方法、CRISPR(Clustered  Regularly  Interspaced  Short  Palindromic  Repeats)/CASシステムを応用した方法などを採用できる。
【００２９】
ネコ属由来の細胞のゲノムに内在するRD-114ウイルスの感染型env遺伝子を人為的にノックアウトすることにより、ネコ属由来の細胞をRD-114ウイルスフリーにすることができる。
【００３０】
＜本発明に係るワクチン製造方法＞
本発明は、上述の遺伝子組換型細胞にワクチン用ウイルス株を感染させ、増幅させる手順を含むワクチン製造方法を全て包含する。
【００３１】
ワクチン用ウイルス株としては、ワクチンとして用いることが可能な株であって、ワクチン製造の際にネコ属由来株化細胞などで増殖しうる株を全て包含する。例えば、ネコヘルペスウイルス、ネコカリシウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、イヌアデノウイルス、イヌジステンパーウイルス、イヌパルボウイルス、イヌコロナウイルス、イヌパラインフルエンザウイルスなどの弱毒株は、ワクチンとして用いられる株であり、かつワクチン製造の際にネコ属由来株化細胞などを使用することができるため、適用範囲に含まれる。
【００３２】
例えば、上述の遺伝子組換型細胞にワクチン用ウイルス株を感染させる工程、ワクチン用ウイルス株を培養し増殖させる工程、ウイルス液を回収する工程、回収したウイルス液を精製する工程などを含む方法でワクチンを製造することにより、RD-114ウイルスフリーのワクチンを製造することができる。
【００３３】
＜本発明に係る感染性RD-114ウイルス発現リスク検出方法＞
本発明は、ネコ属由来の細胞のゲノムにおける、RD-114ウイルスの感染型env遺伝子の有無を判定することで、感染性RD-114ウイルスの発現可能性の有無を判定する感染性RD-114ウイルス発現リスク検出方法を広く包含する。
【００３４】
上述の通り、ゲノム中に存在するRD-114ウイルス関連配列が全て非感染性である場合にも、感染型env遺伝子のコード配列領域を有している場合は、遺伝子組換えにより、感染性RD-114ウイルス粒子が産生される可能性がある。
【００３５】
それに対し、ネコ属由来の細胞のゲノムにおける、RD-114ウイルスの感染型env遺伝子の有無を判定することで、感染性RD-114ウイルスの発現可能性の有無を判定することができる。
【００３６】
ネコ属由来の細胞のゲノムに、RD-114ウイルスの感染型env遺伝子が存在するかどうかの判定は、公知の方法によって行うことができる。
【００３７】
例えば、ゲノムDNAを抽出後、上述の感染型env遺伝子の配列上又はその周囲に存在する制限酵素サイトで切断し、DNAの断片長をゲル電気泳動などで確認することにより、感染型env遺伝子が存在するかどうかの判定を行ってもよい。また、感染型env遺伝子の配列のプローブを作成し、抽出されたゲノムDNA又はその断片がそのプローブとハイブリダイズするかどうかを検出することにより、感染型env遺伝子が存在するかどうかの判定を行ってもよい。また、PCR法などにより感染型env遺伝子の配列又はその周囲を特異的に増幅させ、その増幅産物の長さをゲル電気泳動などで確認することにより、感染型env遺伝子が存在するかどうかの判定を行ってもよい。その他、ゲノムDNA又はその断片の配列を取得し、その中に感染型env遺伝子の配列が含まれるかどうかを照合することにより、感染型env遺伝子が存在するかどうかの判定を行ってもよい。
【実施例１】
【００３８】
実施例1では、ネコのゲノムの中から、RD-114ウイルス関連配列の同定を試みた。
【００３９】
まず、SSEARCH  programを用いて、RD-114ウイルスのCRT株の完全ゲノム配列との相同性に基づいて、イエネコのゲノム（Felis_catus_6.2）内にRD-114プロウイルスコード領域があるかどうかを探索した。その結果、感染性RD-114ウイルスの3つのクローン（pSc3c、pCRT1、pRD-UCL）と同一の配列を有するプロウイルスのコード領域は同定されなかったが、染色体C2上に、不完全なRD-114ウイルス関連配列（RDRS；RD-114  virus-related  sequence）を発見し、「RDRS  C2a」とした。
【００４０】
また、サザンブロット解析により、全ネコゲノム中に、RD-114ウイルスを誘導できるRD-114ウイルス関連配列が存在するかどうかを調べた。ネコ由来細胞から抽出したゲノムDNAを制限酵素HindIIIで切断し、gagプローブでハイブリダイズさせた結果、RD-114ウイルス産生細胞であるCRFK細胞、並びにRD-114ウイルス非産生細胞であるG355-5細胞（feline  fetal  astrocyte  cell  line）、fcwf-4細胞（Felis  catus  whole  fetus-4  cell  line）、FeT-J細胞（interleukin-2-independent  feline  T-cell  line）などで、2.6kbの断片が検出された。一方、ネコ由来細胞から抽出したゲノムDNAを制限酵素HindIIIで切断し、envプローブでハイブリダイズさせた結果、RD-114ウイルス産生細胞であるCRFK細胞では3.2kbの断片が検出されたが、RD-114ウイルス非産生細胞ではそのバンドが検出されなかった。その他、制限酵素SacII、EcoRI、SphIのいずれかで切断し、gagプローブ、polプローブ、envプローブのいずれかでハイブリダイズさせた結果、RD-114関連配列におけるenv遺伝子のコピー数はgag遺伝子又はpol遺伝子のコピー数よりも低いことが分かった。この知見は、先行文献の知見とも一致した。
【００４１】
そこで、RD-114ウイルスのenv遺伝子を標的としたinverse  nested  PCR法を行い、その増幅DNAのTOPOクローニングを行った後、その配列を調べた結果、CRFK細胞のゲノムより、3つのRD-114ウイルス関連配列を同定した。それらを、上述の「RDRS  C2a」の他、その配列の存在した染色体の名称に基づき、それぞれ、「RDRS  A2」、「RDRS  C1」とした。
【００４２】
同様に、ネコのPBMCs（peripheral  blood  mononuclear  cells）の初代培養細胞のゲノムより、3つのRD-114ウイルス関連配列を同定した。それらを、上述の「RDRS  C2a」の他、その配列の存在した染色体の名称に基づき、それぞれ、「RDRS  E3」、「RDRS  D4」とした。
【００４３】
同様に、上述のRD-114ウイルスの感染性粒子を産生している細胞であるFER細胞のゲノムより、2つのRD-114ウイルス関連配列を同定した。それらを、上述の「RDRS  C2a」の他、その配列の存在した染色体の名称に基づき、「RDRS  C2b」とした。
【００４４】
以上のように、ネコのゲノムより合計6つのRD-114ウイルス関連配列を同定した。この中に、上述の3つの感染性RD-114ウイルス分子クローンと同一配列のものはなかった。
【００４５】
図1は、今回同定した6つのRD-114ウイルス関連配列の全長のゲノム構造を模式的に示した図である。図中のΔは核酸の欠失を、塗りつぶしたΔは核酸の挿入を、「gag」、「pol」、「env」はそれぞれの遺伝子のORF（open  reading  frame）を、「LTR」はlong  terminal  repeatの領域を、数値は感染性RD-114ウイルスクローンとの相同性を、それぞれ表す。
【００４６】
図1に示す通り、この6つのRD-114ウイルス関連配列のうち、RDRS  A2、RDRS  C1、RDRS  D4、RDRS  C2bの4つはenv遺伝子の完全長のORFを有しており、そのうちRDRS  C1、RDRS  C2bの2つのenv遺伝子コード配列は、感染性RD-114ウイルスクローンにおけるenv遺伝子コード配列と100％の相同性を示した。また、RDRS  C1、RDRS  C2b、の2つはgag、pol、envの3つの遺伝子の全てで完全長のORF（open  reading  frame）を有していた。
【実施例２】
【００４７】
実施例1の結果、図1に示す通り、RDRS  C1、RDRS  C2bの2つはgag、pol、envの3つの遺伝子の全てで完全長のORF（open  reading  frame）を有し、かつenv遺伝子コード配列が感染性RD-114ウイルスクローンにおけるenv遺伝子コード配列と100％の相同性を示した。特に、RDRS  C1は、感染性RD-114ウイルスクローンにおけるコード配列に最も近似していた。
【００４８】
そこで、実施例2では、RDRS  C1にコードされたRD-114ウイルスが感染性を有するものであるかどうかを検討した。
【００４９】
RDRS  C1は、感染性RD-114ウイルスの分子クローンであるpSc3cの塩基配列と比較して、pSc3cの491位（プライマー結合部位内）のアデニン(a)がグアニン（g）に、3,748位（pol遺伝子内）のアデニン(a)がグアニン（g）に、5,394位（pol遺伝子内）のチミン（t）がシトシン（c）に、5,719位（pol遺伝子内）のアデニン(a)がグアニン（g）に、それぞれ変異していた。
【００５０】
そこで、まず、pcDNA3.1プラスミドベクターにRDRS  C1のDNA配列を組み込み、RDRS  C1の発現ベクター（pRDRS  C1）を作製した。また、そのpRDRS  C1を鋳型とし、PrimeSTAR  GXL  Polymerase（TaKaRa社製）により、それぞれ、3,748位のaをgに、5,394位のtをcに、5,719位のaをgに変異させた3種類の遺伝子組換えプラスミドベクターを作製した。
【００５１】
HEK293T細胞にpRDRS  C1又は各遺伝子組換えプラスミドベクターをそれぞれトランスフェクトし、48時間後にその上清を回収して調製し、サンプルのウイルスとした。そのウイルスを標的細胞（TE671細胞）にアプライしてLacZ  marker  rescue  assayを行い、X-gal染色による染色性の有無によって各ウイルスの感染性を調べた。陽性対照にはpSc3cをトランスフェクトして調製したウイルス（Sc3c）を供した。
【００５２】
その結果、pRDRS  C1をトランスフェクトして調製したウイルスをサンプルとした場合の結果は陰性であり、RDRS  C1にコードされたRD-114ウイルスは感染性を有しないことが分かった。
【００５３】
また、3,748位のaをgに変異させた遺伝子組換えプラスミドベクター、及び、5,719位のaをgに変異させた遺伝子組換えプラスミドベクターをトランスフェクトして調製したウイルスをサンプルとした場合の結果は陰性であったのに対し、5,394位のtをcに変異させた遺伝子組換えプラスミドベクターをトランスフェクトして調製したウイルスをサンプルとした場合の結果は陽性であった。
【００５４】
この結果は、感染性RD-114ウイルスの分子クローンであるpSc3cの塩基配列のうち、5,394位のチミン（t）がシトシン（c）に変異すると、非感染性になることを示唆するとともに、RDRS  C1における5,394位のシトシン（c）への変異が、RDRS  C1にコードされたRD-114ウイルスが非感染性であることの決定的な原因であることを示唆する。
【実施例３】
【００５５】
上述の通り、CRFK細胞はRD-114ウイルスの感染性粒子を産生することが分かっている。しかし、実施例1ではCRFK細胞がRDRS  C2a、RDRS  A2、RDRS  C1の3つのRD-114ウイルス関連配列を有することが分かったが、実施例1及び実施例2より、それらの配列がいずれもCRFK細胞由来の感染性RD-114ウイルスであるCRT1のコード配列とは一致しないこと、及び、それらの配列が非感染性のものであることが分かった。
【００５６】
そこで、実施例3では、CRFK細胞では遺伝子組み換えによってRD-114ウイルスの感染性粒子が産生されると仮定し、RDRS  A2とRDRS  C1との間の遺伝子組換えによって感染性のRD-114ウイルスが産生されるかどうかを調べた。
【００５７】
RDRS  C1と同様、pcDNA3.1プラスミドベクターにRDRS  A2のDNA配列を組み込み、RDRS  A2の発現ベクター（pRDRS  A2）を作製した後、HEK293T細胞にpRDRS  C1及びpRDRS  A2をコトランスフェクトした結果、複製能のあるウイルスの回収に成功した。
【００５８】
そのウイルスを標的細胞（TE671細胞）にアプライしてLacZ  marker  rescue  assayを行い、ウイルスのタイターを計測した。タイターの計測はtriplicateで行った。
【００５９】
結果を図2に示す。図2は、pRDRS  C1及びpRDRS  A2をコトランスフェクトして得たウイルスのタイターを表すグラフである。図中の横軸はウイルスを感染させた日から測定日までの日数（dpi）を、縦軸はウイルスのタイター（virus  titer、単位：log10f.f.u/mL）を、それぞれ表わし、図中の「A2」の折線はpRDRS  A2を単独でトランスフェクトして得られたウイルスのタイターを、「C1」の折線はpRDRS  C1を単独でトランスフェクトして得られたウイルスのタイターを、「A2+C1」の折線はpRDRS  C1及びpRDRS  A2をコトランスフェクトして得られたウイルスのタイターを、「RD-114」は陽性対照としてpCRT1をトランスフェクトして得られたウイルスのタイターを、それぞれ表わす。
【００６０】
図2に示す通り、pRDRS  C1又はpRDRS  A2を単独でトランスフェクトして得られたウイルスではタイターが低く、非感染性であったのに対し、pRDRS  C1及びpRDRS  A2をコトランスフェクトして得られたウイルスでは、既知の感染性RD-114ウイルスであるCRT1とほぼ同等にまでタイターが回復した。
【００６１】
続いて、pRDRS  C1及びpRDRS  A2をコトランスフェクトして得られた遺伝子組換えウイルスのゲノム配列を、RDRS  C1及びRDRS  A2と比較した結果、pol遺伝子内では、3,748位がa、5,394位がt、6169位がaで、RDRS  A2の配列と一致した。一方、env遺伝子内では、7,049位がcで、RDRS  C1の配列と一致した。
【００６２】
その他、pol遺伝子内の3,224位ではRDRS  C1、RDRS  A2、既知のSc3cではcであったのに対しaに変異し、同4,357位ではRDRS  C1、RDRS  A2、既知のSc3cではcであったのに対しtに変異していた。491位ではRDRS  C1及びRDRS  A2ではgであったのに対しaに変異しており、これはSc3cと一致していた。5,072〜5,073位の塩基はgaであり、RDRS  C1及びSc3cと一致し、RDRS  A2における同部位の塩基（gga）とは異なっていた。LTRの長さが、RDRS  C1よりも27bp短くなった。
【００６３】
pRDRS  C1及びpRDRS  A2をコトランスフェクトして得られた遺伝子組換えウイルスのゲノム配列を、既知のpSc3cと比較した結果、3,224位及び4,357位以外はすべて一致しており、アミノ酸配列が置換される変異は、3,224位のみであった。
【００６４】
以上の通り、本実施例により、RDRS  C1とRDRS  A2の遺伝子組換えによって、感染性RD-114ウイルスが産生されることが明らかになった。
【実施例４】
【００６５】
実施例4では、ネコ属由来株化細胞であるCRFK細胞のゲノムに内在しているRD-114ウイルスの感染型env遺伝子を、TALENを用いた方法で人為的に編集することにより、RD-114ウイルスノックアウトCRFK細胞を作製した。
【００６６】
TALENは、TAL  effectorのDNA結合ドメインと制限酵素FokIのDNA切断ドメインとを連結した人工ヌクレアーゼである。TAL  effectorのDNA結合ドメインは、アミノ酸配列が高度に保存された17〜18回程度のリピート構造を有し、その各繰り返し単位（モジュール）はそれぞれ約34アミノ酸で構成される。各モジュールの34アミノ酸のうち、それぞれの12、13番目のアミノ酸残基はDNA配列中の一塩基を認識する。そのため、各モジュールを、それぞれの12、13番目のアミノ酸残基が標的塩基（A、T、G、Cのいずれか）と結合するアミノ酸になるように形成し、それらをつなぎ合わせた構成とすることにより、DNA中の特定の17〜18bp前後の塩基配列を認識し、当該認識配列に結合するTAL  effectorを形成できる。一方、制限酵素FokIのDNA切断ドメインは、二量体化することで、DNA二本鎖切断活性を示す。そこで、DNAの塩基配列上の標的配列において、約14〜20塩基の間隔を挟んで、標的配列の上流側（left）と下流側（right）の配列を認識するTALENをそれぞれ形成し、各TALENを標的配列の上流側と下流側にそれぞれ結合させ、両TALENの制限酵素FokI部位同士を二量体化させることで、特定の標的配列内で二本鎖DNAを切断させることができる。切断されたDNA二重鎖は、細胞内在の機構によって修復され、その際に標的配列内に欠損・変異などが導入される。
【００６７】
本実施例では、TALENを用いた方法により、CRFK細胞のゲノムに内在するRD-114ウイルスの感染型env遺伝子をノックアウトするため、感染性RD-114ウイルス・CRT1株の全ゲノム配列情報（accession  number  AB559882.1）に基づいて、その配列中、env遺伝子コード領域内の6,938〜6,952位を標的配列とし、その標的配列の上流側（left）と下流側（right）の配列を認識する一組のTALEN（それぞれ、left  TALEN、right  TALEN）を設計した。具体的には、公知方法により、left  TALENは標的配列の上流側（6,921〜6,937位、配列番号1）を認識するように、right  TALENは標的配列の下流側（6,953〜6,969位のアンチセンス鎖側の5’末端から3’末端方向の配列、配列番号2）を認識するように、それぞれ、TALENを設計した。なお、env遺伝子は、SU領域（CRT1株では6,157〜7,278位）とTM領域（同7,279〜7,854位）を有する。SU領域はレトロウイルス感染に必要な部位で、特異的な受容体への結合を可能にし、SU領域と受容体の相互作用はTM領域の構造変化を誘導し、宿主細胞膜との融合を誘導する（Coffin  et  al.,  Retroviruses,  1997、Zhao  et  al.,  J.  Virol.,  1998）。この知見に基づき、本実施例では、感染型env遺伝子のSU領域内に標的配列（6,938〜6,952位）を設定した。前記感染型env遺伝子のSU領域内のゲノムが編集（塩基配列の部分欠損など）されたことにより前記感染型env遺伝子がノックアウトされた構成とすることで、確実、有効かつ高効率に感染型env遺伝子をノックアウトできる可能性がある。
【００６８】
上記のように設計された各TALENをコードする塩基配列をそれぞれプラスミドベクターpcDNA3.1に組み込み、left  TALENを発現する組換えプラスミドベクター、及び、right  TALENを発現する組換えプラスミドベクターをそれぞれ作製した。
【００６９】
次に、CRFK細胞（細胞数5x105）を100μL  R  buffer(Neon  Transfection  system,  invitrogen)に浮遊させ、各TALENプラスミドベクター1.8μg、及び、ピューロマイシン（puromycin）耐性遺伝子発現ベクター0.36μgをエレクトロポレーションによりコトランスフェクトした（エレクトロポレーションの条件：pulse  voltage：1400V、pulse  width：20ms、pulse  number：2）。
【００７０】
また、対照として、同様の方法により、トランスフェクション効率の評価のためにGFP発現ベクターのトランスフェクションを、陰性対照（mock）としてpcDNA3.1ベクターのトランスフェクションを行った。その結果、トランスフェクションから1日後、GFP陽性細胞が90%以上を占め、高いトランスフェクション効率が確認された。
【００７１】
トランスフェクションの2日後、TALENにより誘導された変異をSurveyor  (Cel-I)  nuclease  assayにより検出した。QIAamp  DNA  Blood  Mini  kit(QIAGEN,  Valencia,  CA)を使用してゲノムDNAを抽出し、PrimeSTAR  GXL  polymerase(TaKaRa,  Shiga,  Japan)を使用し、配列番号3及び4のプライマー（それぞれ、CRT1の6,897〜6,914位及び7,111〜7,130位の配列より設計）でPCRを行った。そのPCR増幅産物に熱変性をかけ、Surveyor  nuclease(Transgenomic,  Omaha,  NE,  USA)により切断し、アガロースゲル電気泳動によりTALEN誘導性の変異を検出した。その結果、高い変異導入効率を確認できた。アガロースゲル電気泳動像をImageJ  software（National  Institute  of  Health,  Bethesda,  MD,  USA、  Hansen  et  al.,  J.  Vis.  Exp.,  2012）により解析したところ、29.32 %の確立で非相同末端結合（nonhomologous  end  joining,  NHEJ）が起こっていると推察された。
【００７２】
また、PCR産物をpCR  BluntII  TOPO  plasmid  vector(Life  technologies,  Carlsbad,  CA,  USA)にクローニングし、RD-114ウイルスの感染型env遺伝子座位のシークエンス解析を行った結果、10クローン中2クローンで、フレームシフトを伴う変異がみられ、env遺伝子のオープンリーディングフレームが破壊されており、CRFK細胞における変異導入率は20%であった。
【００７３】
トランスフェクトされたCRFK細胞を4μg/mLのPuromycin(InvivoGen,  San Diego,  CA,  USA)を添加して培養した後、変異導入効率を上げるため、その細胞に対して、上記と同様の手順・条件・試薬で、再度トランスフェクションを行った。
【００７４】
次に、変異導入CRFK細胞のセレクションを行った。まず、二回のトランスフェクションを行ったCRFK細胞を10cmディッシュに播種し、4μg/mLのPuromycinを添加して培養した。その際、未成熟のコロニーの成長を助けるため、フィーダー細胞としてAH927細胞を共培養した。なお、AH927細胞は、RD-114ウイルス感染型env遺伝子の座位を自身のゲノム上に保有していない。培養中、Puromycinを添加した培地の交換を3日ごとに行った。AH927細胞との共培養を開始してから1ヶ月後、31個の単細胞由来クローンをピックアップし、96穴プレートに分離・培養した。その2日後、細胞コロニーを24穴プレートに移すとともに、一部の細胞を回収し、そのゲノムDNAを抽出し、上記と同じプライマーでPCRを行い、また、そのPCR産物のシークエンス解析を行った。その結果、31クローンのうち、1クローンで、標的としたenv遺伝子における変異導入がみられた。このクローンでは、CRFK細胞のゲノム中、RDRS  A2の配列中のenv遺伝子で、一方の対立遺伝子における4塩基の挿入及び他方の対立遺伝子における5塩基の欠失が、RDRS  C1の配列中のenv遺伝子で、一方の対立遺伝子における4塩基の欠失及び他方の対立遺伝子における918塩基の欠失（env遺伝子以降の64塩基を加え、連続する計982塩基の欠失）が、それぞれ確認された。このクローンについては、純度を上げるため、再度、細胞のクローン化過程を繰り返し、得られた細胞をRD-114ウイルスノックアウトCRFK細胞とした。
【実施例５】
【００７５】
実施例5では、RD-114ウイルスノックアウトCRFK細胞において、RD-114ウイルス粒子産生が抑制されているか、評価した。
【００７６】
実施例4で作製したRD-114ウイルスノックアウトCRFK細胞を3日間培養し、その培養上清を回収し、0.45μmフィルターで濾過滅菌し、DNase  I(Roche  Diagnostics,  Indianapolis,  IN)処理した後、培養上清中のRD-114ウイルスRNAのコピー数をReal-Time  RT-PCRにより測定した。Real-Time  RT-PCRでは、TaKaRa  Ex  Taq  HS  DNA  polymerase  (TaKaRa)を使用し、TaqmanプローブにCRT1の6,938〜6,952位の配列（両TALENのDNA結合配列の間の配列；配列番号5）のものを用い、プライマーに配列番号6（CRT1の6,857〜6,876位の配列）及び配列番号7（同6,986〜7,005位の配列）のものを用いた。なお、対照として、未処理のCRFK細胞を用いて、同様の手順で培養上清中のRD-114ウイルスRNAのコピー数を測定した。
【００７７】
その結果、未処理のCRFK細胞（対照）では、RNAレベルで、4.41×106コピー/mL以上のRD-114ウイルス粒子が検出されたのに対し、RD-114ウイルスノックアウトCRFK細胞におけるRD-114ウイルス粒子産生は検出限界以下のレベルであった。
【００７８】
続いて、RD-114ウイルスノックアウトCRFK細胞から産生・放出されるRD-114ウイルスの力価を、フォーカスアッセイ（Sakaguchi  et al.,  J  Vet  Med  Sci.,  2008）により評価した。QN10S細胞（1×104）を24穴プレートに播種し、１日後、RD-114ウイルスノックアウトCRFK細胞の培養上清（0.45μmフィルター濾過済）を、ポリブレン8μg/mL存在下で、QN10S細胞に接種した。接種の7日後、フォーカスの数を測定した。なお、対照として、未処理のCRFK細胞についても、その培養上清を用いて、同様の手順でフォーカスアッセイを行った。
【００７９】
その結果、フォーカスアッセイにおいても、未処理のCRFK細胞の培養上清の力価は、3.25×103f.f.u/mLであったのに対し、RD-114ウイルスノックアウトCRFK細胞では、感染性のRD-114ウイルス粒子の産生は検出限界以下のレベルにまで強く抑制されていた。
【００８０】
以上の通り、本実施例より、実施例4で作製したRD-114ウイルスノックアウトCRFK細胞では、RD-114ウイルス粒子産生が抑制されていたことが実証された。
【実施例６】
【００８１】
実施例6では、RD-114ウイルスノックアウトCRFK細胞の生存性を調べた。
【００８２】
実施例4で作製したRD-114ウイルスノックアウトCRFK細胞、及び、対照として未処理のCRFK細胞を、それぞれ96穴プレートに播種し（1×105/well）、2日間培養した後、Cell  Proliferation  Kit  I(MTT)  (Roche)を用いて、付属プロトコルに従い、Wallac  1420  ARVOsx(PerkinElmer  Life  Sciences,  Boston,  MA)で、波長595nmにおける吸光度を測定した。
【００８３】
その結果、RD-114ウイルスノックアウトCRFK細胞と未処理のCRFK細胞とで、吸光度は、それぞれ、1.077及び1.105であり、同等であった。このことより、実施例4で作製したRD-114ウイルスノックアウトCRFK細胞は、未処理のCRFK細胞と、細胞の生存性において同等レベルであり、TALENを用いてRD-114ウイルスをノックアウトしても、細胞の増殖性には影響を及ぼさないことが示された。
【実施例７】
【００８４】
実施例7では、RD-114ウイルスノックアウトCRFK細胞におけるネコパルボウイルスの増殖性を調べた。
【００８５】
ネコパルボウイルスの供試ウイルス株として、猫汎白血球減少症ウイルス（feline  panleukopia  virus  ；FPLV、[feline  parvovirus]）V142株を用いた。実施例4で作製したRD-114ウイルスノックアウトCRFK細胞、及び、対照として未処理のCRFK細胞に、FPLV  V142株をMOI（multiplicity  of  infection)＝0.1で接種し、37℃で1時間感作後、PBSで3回洗浄し、2mLのメディウムで培養した。そして、感作から2、4、6日後に、その培養上清をウイルス液として回収し、それぞれ-80℃で保存した。
【００８６】
回収したパルボウイルスの力価の測定を、FL74細胞を用いて行った(Ikeda  et  al.,  J  Vet  Med  Sci.,  1998、Sassa  et al.,  J  Vet  Med  Sci.,  2006)。FL74細胞を96ウェルプレートに播種し、回収したウイルス液を解凍後、各ウエル100μLずつ接種した。その1週間後にCPEの有無を判定し、Reed＆Muenchの式によりTCID50/mLを算出した。
【００８７】
その結果、RD-114ウイルスノックアウトCRFK細胞から回収したパルボウイルスの力価は、感作2日後のもので6.26×102  TCID50/mL、同4日後のもので1.57×105  TCID50/mL、同6日後のもので1.78×107  TCID50/mLであり、一方、未処理のCRFK細胞から回収したパルボウイルスの力価は、感作2日後のもので3.16×102  TCID50/mL、同4日後のもので6.26×104  TCID50/mL、同6日後のもので3.03×106  TCID50/mLであり、どちらの細胞においても、ネコパルボウイルスの増殖性はほぼ同等であった。
【実施例８】
【００８８】
実施例8では、RD-114ウイルスノックアウトCRFK細胞におけるネコカリシウイルスの増殖性を調べた。
【００８９】
ネコカリシウイルスの供試ウイルス株として、ネコカリシウイルス（feline  calicivirus  ;FCV）01-106株を用いた。実施例4で作製したRD-114ウイルスノックアウトCRFK細胞、及び、対照として未処理のCRFK細胞に、FCV  01-106株をMOI＝0.1もしくは0.01で接種し、37℃で1時間感作後、PBSで3回洗浄し、2mLのメディウムで培養した。そして、感作から2日後に、その培養上清をウイルス液として回収し、それぞれ-80℃で保存した。
【００９０】
回収したネコカリシウイルスの力価の測定を、CRFK細胞を用いて、実施例7と同様の手順で行った。
【００９１】
その結果、RD-114ウイルスノックアウトCRFK細胞から回収したウイルスの力価は、MOI=0.1で接種したもので1.06×108  TCID50/mL、MOI=0.01で接種したもので3.99×107  TCID50/mLであり、一方、未処理のCRFK細胞から回収したカリシウイルスの力価は、MOI=0.1で接種したもので2.95×108  TCID50/mL、MOI=0.01で接種したもので4.67×108  TCID50/mLであった。本結果より、RD-114ウイルスノックアウトCRFK細胞におけるネコカリシウイルスの増殖性は、未処理のCRFK細胞における場合よりは低かったが、RD-114ウイルスノックアウトCRFK細胞でも充分にネコカリシウイルスが増殖することが分かった。
【実施例９】
【００９２】
実施例9では、RD-114ウイルスノックアウトCRFK細胞におけるネコヘルペスウイルスの増殖性を調べた。
【００９３】
ネコヘルペスウイルスの供試ウイルス株として、ネコウイルス性鼻気管炎ウイルス（feline viral  rhinotracheitis  virus  ;FVRV、[feline  herpes  virus  type  1;  FHV-1）00-015株を用いた。実施例4で作製したRD-114ウイルスノックアウトCRFK細胞、及び、対照として未処理のCRFK細胞に、細胞数2×105に対し1,000倍もしくは10,000倍希釈ウイルス液50μLを接種し、感作4日後に、その培養上清をウイルス液として回収し、それぞれ-80℃で保存した。
【００９４】
回収したヘルペスウイルスの力価の測定を、CRFK細胞を用いて、実施例7などと同様の手順で行った。
【００９５】
その結果、RD-114ウイルスノックアウトCRFK細胞から回収したウイルスの力価は、1,000倍希釈のもので2.64×107  TCID50/mL、10,000倍希釈のもので2.73×108  TCID50/mLであり、一方、未処理のCRFK細胞から回収したヘルペスウイルスの力価は、1,000倍希釈のもので8.44×107  TCID50/mL、10,000倍希釈のもので1.53×108  TCID50/mLであり、どちらの細胞においても、ネコヘルペスウイルスウイルスの増殖性はほぼ同等であった。
【００９６】
以上のように、実施例7〜9に示す通り、RD-114ウイルスノックアウトCRFK細胞においても、未処理のCRFK細胞と同様、ネコパルボウイルス、ネコカリシウイルス、ネコヘルペスウイルスは、充分に増殖することが示された。これらの結果及び上記実施例5の結果は、RD-114ウイルスノックアウトCRFK細胞が、イヌ・ネコのウイルス感染症に対する弱毒生ワクチン製造用の株化細胞として有用であり、かつ同ワクチンへの感染性RD-114ウイルスの感染性粒子の混入を極力抑制できること、即ち、RD-114ウイルスノックアウトCRFK細胞を用いることで、RD-114ウイルスフリーのワクチンを製造できることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】実施例1において、今回同定した6つのRD-114ウイルス関連配列の全長のゲノム構造を模式的に示した図。
【図２】実施例3において、pRDRS  C1及びpRDRS  A2をコトランスフェクトして得たウイルスのタイターを表すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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