(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
筋ジストロフィー（MD）、線維筋痛、ミオパシー、慢性炎症性脱髄性多発根神経障害（CIDP）、喘息、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、好酸球性気道炎症、及び乾癬からなる群から選択される慢性炎症性疾患又は障害の症状を処置するか又は改善させるための、配列番号１、２、４、５、及びこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つのペプチドを有効量含む組成物であって、該ペプチドにおける少なくとも１つのセリンがリン酸化され、このような処置を必要としている患者に投与され、そして、前記疾患又は障害の少なくとも１つの症状を処置するか又は改善させるのに有効である、組成物。
【請求項２】
前記慢性炎症性疾患又は障害が、ＭＤである、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記慢性炎症性疾患又は障害が、好酸球性気道炎症である、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
前記慢性炎症性疾患又は障害が、ミオパシーである、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
前記慢性炎症性疾患又は障害が、線維筋痛である請求項１記載の組成物。
【請求項６】
前記慢性炎症性疾患又は障害が、喘息である請求項１記載の組成物。
【請求項７】
前記慢性炎症性疾患又は障害が、乾癬である請求項１記載の組成物。
【請求項８】
前記慢性炎症性疾患又は障害が、COPDである請求項１記載の組成物。
【請求項９】
前記慢性炎症性疾患又は障害が、CIDPである請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
前記医薬組成物が約１００ng〜約５mgの投薬量で投与される、請求項１〜９のいずれか記載の組成物。
【請求項１１】
前記医薬組成物が、請求項１記載の凍結乾燥ペプチドと、薬学的に許容し得る賦形剤とを含む、請求項１〜１０のいずれか記載の組成物。
【請求項１２】
前記賦形剤がマンニトールである請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
前記ペプチドが１０位にホスホセリンを含む配列番号１である、請求項１〜１２記載の組成物。
【請求項１４】
前記ペプチドが、１０位におけるホスホセリンと、酸化メチオニンとを含む配列番号１である、請求項１〜１３記載の組成物。
【請求項１５】
前記ペプチドが、以下の構造を有する、請求項１〜１４のいずれか記載の組成物。
【化１１】
0006659693.tif 000024
【請求項１６】
前記ペプチドが、以下の構造を有する、請求項１〜１５のいずれか記載の組成物。
【化１２】
0006659693.tif 000025
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、参照により本明細書に組み入れられる２０１４年１２月１４日出願の「Modified Peptides and Their Use for Treating Autophagy-Related Diseases」という名称の米国仮出願第６２／０９１，３７９号の利益を主張する。
【０００２】
参照による組み入れ
配列番号１〜６を含むファイル名：P140_seq_listing_ST15.txt、サイズ：６．５KBの配列表の電子版を本明細書と共に提出し、そして、その全体を参照により本明細書に組み入れる。
【０００３】
背景技術
１．  発見の分野。
本発明は、自己免疫疾患及びオートファジー関連自己免疫障害を含む免疫疾患を処置するための修飾ペプチド及びその使用に関する。
【０００４】
２．  背景技術の情報。
自己免疫では、身体自身の構成要素に対して患者の免疫系が活性化される。自己免疫疾患は、希少疾患であるとは考えられていない。一般的に、自己免疫疾患は、全体として世界中で数百万人が罹患しているので、稀であるとさえみなされていない。遺伝的影響（ほとんどが多遺伝子性である）又は環境因子及び代謝因子の結果として、世界の一部の地域、特に集団において、その発症率又は重篤度に関して若干の不均衡が存在する。American Autoimmune Related Diseases Associationによれば、米国では最高５０００万人が自己免疫疾患に罹患している。自己免疫疾患には性差が存在し、女性集団に対する不均衡が十分に確立されている。全ての自己免疫疾患の全体累積罹患率は、約５％であり、男性では約３％、そして、女性では７％である（Hayter and Cook, 2012）。この女性への偏りは、自己免疫疾患の５９％で生じ、恐らく、ホルモンの影響及びＸ染色体にコードされている遺伝子に関連している。一般的に、自己免疫疾患は、若年層（２０〜２９歳の年齢層）で発症する。自己免疫疾患は、６５歳以下の全ての年齢層において女性の主な死因トップ１０に入ると推定されている。
【０００５】
自己免疫疾患という用語の下には、例えば、クローン病／CD；原発性胆汁性肝硬変、重症筋無力症、免疫性血小板減少性紫斑病、関節リウマチ、神経精神全身性エリテマトーデス、眼筋無力症、乾癬性関節炎を含む、自己免疫によって引き起こされる１８を超える病気が存在する。また、一部の個体は、同時に１を超える自己免疫障害を有する場合もあり、このことが、経過観察及び処置の作業を複雑にし、そして、各症例を独特のものにしている。しかし、ほとんどの自己免疫障害に公知の予防法は存在せず、そして、一般的に、特異的な治療法も存在しない。
【０００６】
多数の自己免疫疾患が認識されている。自己免疫疾患は、甲状腺（例えば、グレーブス病、自己免疫性甲状腺炎、橋本病）、膵臓（例えば、インスリン産生ベータ細胞が破壊される１型糖尿病）、及び筋肉（重症筋無力症）等の特定の器官に限定されているか、又は様々な箇所における特定の組織に関わる（例えば、肺及び腎臓における基底膜で発症するグッドパスチャー病）場合、「器官特異的」であると特徴付けられる。対照的に、自己免疫疾患は、全身の様々な器官及び組織に関係している場合、「全身性」に分類される。全身性自己免疫疾患の大きなファミリーの最も象徴的な代表例は、心臓、関節、皮膚、肺、血管、肝臓、腎臓、及び神経系で発症し得る全身性エリテマトーデス（SLE）である。実際には、これら２つの一般的に記載されるファミリーの間に明確な線引きは存在していない。例えば、皮膚の硬化を特徴とする慢性全身性自己免疫疾患である、全身性強皮症としても知られている強皮症は、重篤な形態では血管、筋肉、及び内部器官でも発症する。
【０００７】
免疫寛容の破壊及び自己免疫疾患への進行につながる分子及び細胞機構の解明については、科学界及び臨床界において大きな研究の余地が残されている。現在、普遍的なサインを同定することができていないので、その向性の理由並びにその開始及び維持を誘発する要素に関する手がかりは大いに不足している。また、SLE等の特定の自己免疫疾患において生じる増悪及び寛解の持続期間を支配する事象に関しても比較的わずかしか知られていない。
【０００８】
ほとんどの自己免疫疾患の多因子性及び多形性によって、その診断及び症状を軽減するために適用することができる処置が劇的に複雑になる。非常に稀な症例を除いて、処置は大部分が対症療法的であり、そして、病気の原因を標的とするものではない。過去数十年間にわたる大きな進歩により患者の生存率は顕著に増大したが、有効性、選択性（ひいては、副次的効果の減少）、及び信頼性を兼ね備える革新的な処置的解決策が未だ待たれている。適合した処置がないので、自己免疫患者の生活の質は比較的低い場合があり、そして、疾患が進行するにつれて低下する（特定の症状に関連する疲労、疼痛、発熱）。残念なことに、症状を最小化し、そして、炎症性症候群を減速させるのに必要な薬物処置（すなわち、長期間にわたって使用されるコルチコステロイド、免疫抑制薬、及び腫瘍壊死因子（TNF-α）ブロッカー）は、圧倒的な感染エピソードの繰り返し及び癌の発現は言うまでもなく、腸内出血、腎不全、血圧上昇、不眠症、鬱病、精神病、骨粗鬆症、筋肉喪失、及び糖尿病につながる免疫系全体の変化を誘導する。中枢神経系で発症するもの等の特定の自己免疫疾患又はSLEに関連し得る抗リン脂質症候群において、処置的解決策は限定的であり、特異的ではなく、そして、残念なことに、時に非効率的である（Carrithers, 2014；Hanly, 2014；Inglese and Petracca, 2014；Jeltsch-David and Muller, 2014）。無秩序な自己免疫プロセスに関与し、そして、特異的に再指向され得る分子標的に基づく新規免疫調節ストラテジを開発するために、現在精力的に研究が行われている。この状況では、自己免疫応答、そして、最も具体的にはホメオスタシス及び自己免疫細胞の制御を明白にする細胞及び分子機構をより理解することが中心となる。
【０００９】
オートファジーは、細胞の生存、分化、発生、及びホメオスタシスにおいて極めて重要な役割を果たす正常な生理学的プロセスである。選択的であろうとなかろうと、カノニカルであろうとなかろうと、オートファジープロセスは、元々考えられていたよりもはるかに複雑である。好ましい細胞環境条件であるか又は好ましくない細胞環境条件であるかに応じて、オートファジー機構は、細胞の生存及び細胞死の両方を促進し、それによって、細胞成分の生産と、例えば損傷したか又は過剰なオルガネラ及び他の細胞構成要素の分解との間の決定的なバランスを維持する。オートファジーは、アポトーシス及びプロテアソームによって媒介されるシステム等、幾つかの他の分解経路と複雑で、未だ議論中の、絡み合った結び付きを示す。実験的に既に証明されているか又は予測されている多くの細胞制御機能の中でも、オートファジーは、免疫及び炎症を決定的に制御し、そして、何らかの正常な機能が損なわれたオートファジーのシグナル伝達が、自己免疫関連疾患につながる可能性がある。
【００１０】
したがって、自己免疫疾患を治療及び予防するための処置的介入が当技術分野において現在必要とされている。具体的には、自己免疫疾患の開始及び持続に関与する重要な細胞プロセス、例えば、自己免疫において特に重要な、免疫寛容及び免疫系の適切な有効性の確立及び維持に関与するオートファジープロセスを標的とする処置的介入が必要とされている。したがって、自己免疫障害の症状を治療、予防、及び／又は寛解するための手段として、オートファジープロセスを有利に調節することができる処置的介入を提供することが必要とされている。
【００１１】
概要
本明細書は、本明細書に記載する化学的に修飾されたペプチドがオートファジー、特に過剰の又は増加したCMAの強力な調節因子であるという驚くべき、そして、予想外の発見に基づく処置用組成物及びそれを使用する方法を提供する。本明細書に記載する化学的に修飾されたペプチドは、U1-70Kスプライセオソームタンパク質に由来する。記載するペプチド及び有効量の該ペプチドを含む組成物は、オートファジーフラックスの増加を特徴とする疾患、すなわち、ハイパーオートファジー関連自己免疫障害、例えば、ハイパーCMA関連障害の症状の治療、予防、及び／又は改善に有効である。したがって、特定の更なる態様では、本開示は、オートファジーフラックス、例えば、CMAの増加を特徴とする疾患の症状を治療、予防、及び／又は改善するための記載するペプチド及びそれを含む組成物を作製及び使用する方法を提供する。何らかの特定の理論に縛られるものではないが、記載する組成物は、リソソームの特定の活性をブロックすることによってオートファジーフラックスを低減すると仮定する。
【００１２】
したがって、一態様では、本明細書は、その誘導体、アナログ、及び塩の形態を含む、配列番号１、２、４、及び５の化学的に修飾されたペプチドを提供する。
【００１３】
特定の実施態様では、本明細書は、セリン残基のリン酸化、メチオニン残基の酸化、及びリジン残基のアセチル化、並びにこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの翻訳後修飾を有する、配列番号１：RIHMVYSKRSGKPRGYAFIEY［配列番号１］のアミノ酸配列、すなわち、
【化１】
0006659693.tif 000002
を含むか若しくはからなる単離ペプチド又はその塩類を提供する。この態様の実施態様では、本明細書は、配列番号１のアミノ酸配列を有するか若しくはからなる単離及び／若しくは化学的に修飾されたペプチド（組み換え又は合成）又はその塩を含む組成物であって、該ペプチドが１０位にホスホセリンを含む（すなわち、「P140ペプチド」）組成物を提供する。特定の実施態様では、本明細書は、配列番号１のアミノ酸配列を有するか若しくはからなる単離及び／若しくは化学的に修飾されたペプチド（組み換え又は合成）又はその塩であって、１０位のホスホセリン及び４位の酸化メチオニン残基を含むペプチドを提供する。
【００１４】
特定の更なる実施態様では、配列番号１のペプチドは、アセチル化リジン残基も含む。具体的には、前記配列番号１のペプチドは、１０位のホスホセリンと、４位の酸化メチオニン残基と、８及び１２位のリジンの一方又は両方のアセチル化とを含み、そして、より具体的には、７位のホスホセリンを更に含む。
【００１５】
特定の実施態様では、本明細書は、９位のセリン（Ｓ）がリン酸化されており、そして、３位のメチオニン（Ｍ）が酸化されているアミノ酸配列：IHMVYSKRSGKPRGYAFIEY［配列番号２］を含むか又はからなる、単離及び／若しくは化学的に修飾されたペプチド（組み換え又は合成）又はその塩を提供する。
【００１６】
特定の実施態様では、本明細書は、以下の式を有する化合物Ｉのペプチドを提供する：
【化２】
0006659693.tif 000003
【００１７】
また、化合物Ｉは、IHM(O)VYSKRS(PO3H2)GKPRGYAFIEY［配列番号５］（式中、「M(O)」は、酸化メチオニンを表し、そして、「S(PO3H2)」は、ホスホセリンを表す）によって表すこともできる。
【００１８】
これらペプチドは、ヒトU1 snRNP ７０kDaタンパク質（配列番号３）に由来し、そして、配列番号３の残基１３２から残基１５１まで延在するアミノ酸セグメントによって限界が定められる領域に対応する。形式上、リン酸化されてる残基は、配列番号３の最初のメチオニンから１４０番目の位置のアミノ酸に対応し、そして、酸化される残基は、配列番号３の最初のメチオニンから１３４番目の位置のアミノ酸に対応する。
【００１９】
更なる態様では、本明細書は、セリン残基のリン酸化、メチオニン残基の酸化、及びリジン残基のアセチル化、並びにこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの翻訳後修飾を有する、配列番号２のアミノ酸配列を含むか又はからなる単離及び／若しくは化学的に修飾されたペプチド（組み換え又は合成）又はその塩を提供する。この態様の実施態様では、本明細書は、配列番号２のアミノ酸配列を有するか若しくはからなる単離及び／若しくは化学的に修飾されたペプチド（組み換え又は合成）又はその塩を含む組成物であって、該ペプチドが、９位のホスホセリン及び３位の酸化メチオニン残基を含む組成物を提供する。特定の更なる実施態様では、配列番号２のペプチドは、アセチル化リジン残基も含む。
【００２０】
特定の実施態様では、本明細書は、以下の式を有する化合物IIのペプチドを提供する：
【化３】
0006659693.tif 000004
【００２１】
また、化合物IIは、RIHM(O)VYSKRS(PO3H2)GKPRGYAFIEY［配列番号４］（式中、M(O)は、メチオニンの酸化を表し、そして、S(PO3H2)は、セリンのリン酸化を表す）によって表すこともできる。
【００２２】
したがって、本明細書は、配列番号４及び配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか又はからなるペプチド又はその塩を提供する。
【００２３】
更なる実施態様では、本明細書は、９位のホスホセリン及び３位の酸化メチオニンを含む配列番号２のアミノ酸配列；１０位のホスホセリン及び４位の酸化メチオニンを含む配列番号１のアミノ酸配列；ペプチドが１０位にホスホセリンを含む配列番号１のアミノ酸配列又はその塩、並びにこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つのペプチド又はその塩を有効量含む組成物を提供する。
【００２４】
別の態様では、本明細書は、有効量の本明細書に記載するペプチドのうちの１つ以上と、賦形剤又は担体とを含む組成物を提供する。
【００２５】
更なる態様では、本明細書は、自己免疫疾患、例えば、オートファジー関連免疫系疾患又は障害、例えば、ハイパーオートファジー関連自己免疫疾患又はハイパーCMA関連自己免疫疾患の症状を治療、予防、又は改善する方法であって、有効量の本明細書に記載する処置用組成物をそれを必要としている被験体に投与することを含み、該組成物が、該疾患又は障害の少なくとも１つの症状の治療、予防、及び／又は改善に有効である方法を提供する。
【００２６】
特定の実施態様では、該疾患又は障害は、過剰な又は増加したオートファジー、例えば、CMAに関連する疾患又は障害、関節リウマチ（RA）、多発性硬化症（MS）、ミオパシー、筋ジストロフィー（MD）、クローン病（CD）、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、線維筋痛、多発性筋炎、肺疾患、慢性免疫性血小板減少症（ITP）、神経精神ループス、グジュロー・シェーグレン症候群、関節リウマチ、ギラン・バレー病（慢性／CIDP）、喘息（急性又は慢性）、好酸球性気道炎症、過敏性腸症候群（IBS又はIBD）、慢性炎症性脱髄性多発根神経障害（CIDP）、II型糖尿病、脂肪組織の再生、強皮症、乾癬、アルツハイマー病、又はパーキンソン病からなる群から選択される。
【００２７】
特定の更なる態様では、本明細書は、有効量の本明細書に記載する少なくとも１つのペプチドと、少なくとも１つの追加の生物活性剤、例えば、免疫調節剤、例えば、オートファジーフラックスを阻害又は低減することができる剤とを含む処置用組成物を提供する。特定の実施態様では、該組成物は、更に、本明細書に記載する賦形剤又は担体を含む。
【００２８】
上述の一般的な利用分野は、ほんの一例として与えられるものであって、本開示及び添付の特許請求の範囲の範囲を限定することを意図するものではない。本発明の組成物、方法、及びプロセスに関連する更なる目的及び利点は、本特許請求の範囲、明細書、及び実施例に鑑みて当業者に理解されるであろう。例えば、本発明の様々な態様及び実施態様は、その全てが本明細書によって明示的に企図される多数の組合せにおいて利用され得る。これら更なる利点、目的、及び実施態様は、明示的に、本発明の範囲内に含まれる。発明の背景を解明するために、そして、特定の場合では、実施に関する更なる詳細を提供するために本明細書において用いられる刊行物及び他の材料が、参照により組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
明細書に組み入れられ、そして、明細書の一部を形成する添付図面は、本発明の幾つかの実施態様を例証するものであり、そして、明細書と共に本発明の原理を説明する機能を有する。図面は、本発明の実施態様を例証することのみを目的とし、本発明を限定すると解釈すべきではない。
【図１】オートファジー経路の概略図。（Ａ）３つの主なオートファジーの種類、マクロオートファジー、マイクロオートファジー、及びCMA。マクロオートファジーのプロセスは、所謂隔離膜の形成で始まる。後者は、オートファゴソームと呼ばれる特徴的な二重膜構造を形成する細胞質物質を貪食するために伸長する。後者は、次に、リソソームと融合してオートリソソームになり、その後、貪食された物質が分解される。オートファジーを制御する分子経路は、酵母から高等真核細胞に至るまで高度に保存されている。CMAでは、ペンタペプチドKFERQ様シグナル配列を有するタンパク質が、HSPA8シャペロンによって認識され、これは、次いで、LAMP-2Aに会合して、そのオリゴマー化を誘発する。この事象によって、標的となるタンパク質が、HSPA8を必要とするプロセスを通してリソソームの内腔に移動することができるようになるマイクロオートファジーは、リソソーム膜の貫入を通じたリソソームによる細胞成分の直接隔離を伴う；（Ｂ）マクロオートファジープロセスの主な工程；（Ｃ）MHCII分子によりＴ細胞に提示するためのペプチドの主な供給源としてのオートファジー。略記：CMA、シャペロン介在性オートファジー；ER、小胞体；HLA、ヒト白血球抗原；HSPA8/HSC70、７０KDaの熱ショック同族タンパク質；LAMP-2A、リソソーム関連膜タンパク質−２Ａ；MIIC、主要組織適合複合体クラスII区画；MHCII、主要組織適合複合体クラスII；TCR、Ｔ細胞受容体。
【図２】オートファジーの薬理学的制御因子。薬理学的オートファジー制御因子の介入の可能な部位を示す図。左から右へ：ラパマイシン及びデキサメタゾンは、mTORのキナーゼ活性を阻害し、マクロオートファジーのアップレギュレーションを導く。また、デキサメタゾンは、プレオートファゴソーム構造体に対して作用することが知られている。その標的については未だ議論中であるトレハロースは、mTORとは独立な経路を通じたオートファジーの活性化因子である。バフィロマイシンＡ１は、オートファゴソームとリソソームとの融合を阻害することによって自己貪食空胞の成熟を阻止する。それは、液胞型プロトンATPaseを阻害することによって作用する。マウスへの投与後にクラスリン介在性エンドサイトーシスによるＢリンパ球への取り込み及びリソソームへのホーミングが生じることが証明されているP140ペプチド（▲）及びDSGは、いずれも、インビトロでHSPA8と相互作用し、そして、リソソーム内のpHを変化させる。P140は、オートファジーフラックスのダウンレギュレーションと一致して、オートファジーマーカーであるp62/セクエストソーム１及びMAP1LC3-IIのMRL/lpr B細胞における蓄積を誘発する。このペプチドは、CMA及びマクロオートファジーの両方に影響を及ぼす。CQ及びHCQは、エンドソームの酸性化を阻止するリソソーム作用剤である。これらは、エンドソーム及びリソソームの内部に蓄積し、リソソーム酵素の阻害を引き起こすが、これには、酸性pH、エンドソーム及びリソソームの融合不全、並びにオートリソソームの成熟が必要とされる。略記：CMA、シャペロン介在性オートファジー；CQ、クロロキン；DSG、１５−デオキシスペルグアリン；HCQ、ヒドロキシクロロキン；HSPA8、熱ショックタンパク質８；LAMP-2A、リソソーム関連膜タンパク質−２Ａ；MAP1LC3、微小管関連タンパク質軽鎖３；mTOR、ラパマイシンの哺乳類標的。
【図３】１０位のセリンがリン酸化されている配列番号１からなるペプチドの安定性と比較した、本発明に係るペプチド（化合物II）の３７℃における安定性を示す。グラフは、経時的な（日数で表す）安定性の百分率を表す。曲線Ａ〜Ｃは、それぞれ、２００、１００、及び５０μg/mLの濃度における化合物IIの安定性を表す。曲線Ｄ〜Ｆは、それぞれ、２００、１００、及び５０μg/mLの濃度における、１０位のセリンがリン酸化されている配列番号１からなるペプチドの安定性を表す。
【図４】NaCl（丸の線）、１０位のセリンがリン酸化されている配列番号１からなるペプチド（四角の線）、及び本発明に係る化合物II（三角の線）を注射したマウスの経時的な（週数で表す）累積生存率（パーセント）を表すカプラン・マイヤーグラフ。
【図５】NaCl（丸の線）、１０位のセリンがリン酸化されている配列番号１からなるペプチド（四角の線）、及び本発明に係る化合物II（三角の線）を注射したマウスの経時的な（週数で表す）タンパク尿スコア。
【図６】MRL/lprマウス細胞の細胞過形成の測定。Ｙ軸は、NaCl（丸）、１０位のセリンがリン酸化されている配列番号１からなるペプチド（四角）、及び本発明に係る化合物II（三角）で処理したマウスにおける細胞数／mL（血液）（×１０６）を表す。
【図７】１０位のセリンがリン酸化されている配列番号１からなるペプチドのHSC70タンパク質に対する親和性の測定。曲線は、２５μM（Ａ）、１２．５μM（Ｂ）、６．２５μM（Ｃ）、３．１２μM（Ｄ）、及び１．５６μM（Ｅ）の濃度の１０位のセリンがリン酸化されている配列番号１からなるペプチドを用いることによる、経時的な（秒数で表す）Biacore応答に対応する。
【図８】HSC70タンパク質に対する、本発明に係る化合物IIの親和性の測定。曲線は、２５μM（Ａ）、１２．５μM（Ｂ）、６．２５μM（Ｃ）、３．１２μM（Ｄ）、及び１．５６μM（Ｅ）の濃度の化合物IIを用いることによる、経時的な（秒数で表す）Biacore応答に対応する。
【図９】培養物中１００μg CII/mLの存在下におけるCD4+ T脾細胞の増殖。
【図１０】フローサイトメトリーによって可視化した、MRL/lpr B細胞及びRaji細胞における５．４％ マンニトール又は１０％ トレハロース中の蛍光P140ペプチドの細胞取り込み。Ｂ細胞は、１２〜１４週齢のMRL/lprマウスから採取し（一次細胞）；Raji細胞は、バーキットリンパ腫患者のＢリンパ球から１９６３年に派生した樹立細胞株である。MRL/lpr B細胞及びRaji細胞のいずれにおいてもペプチドをトレハロースで希釈したとき、マンニトールよりもP140の細胞取り込みがはるかに少ない。
【図１１】図１０のＢ細胞の共焦点画像。全ての共焦点画像を同じ顕微鏡設定で撮影した。Rab9（赤）は、リソソームへのホーミング前にP140が局在する後期エンドソーム区画を特定し、DAPI（青）は、DNAを特定する。この結果から、トレハロース中では、Ｂ細胞に入るP140ペプチド（緑）がはるかに少ないというフローサイトメトリーの結果を裏付けるものであった。
【図１２】マウスの好酸球増多性気道炎症の１５日モデルにおいて局所（鼻腔内）又は全身（静脈内）に投与したときのP140ホスホペプチドの抗炎症効果を評価した。簡潔に述べると、生理食塩水 ０．１mL中OVA ５０μg及びalum ２mgを含有する混合物を腹腔内（i.p.）注射することによって、９週齢の雄Balb/cマウスを感作した。５日目にOVA ２５μL、次いで、１２、１３、及び１４日目にOVA及び／又は生理食塩水 ２５μLをi.n.投与することによって、マウスを刺激した。９日目にP140又は溶媒をi.v.注射（２mL/kg）又はi.n.投与（１mL/kg）することによってマウスを処理した。
【図１３】Balb/cマウスのオボアルブミン誘導性気道過好酸球増加症モデルにおける気道炎症細胞の動員に対するP140ホスホペプチドの効果。Balb/cマウスをOVA（０、１、及び２日目）で免疫し、そして、OVA（５日目）及びOVA又は生理食塩水（１２、１３、及び１４日目）に刺激した。９日目に４mg/kgの用量でP140をi.n.（P140-IN）又はi.v.（P140-IV）投与した。BAL中のＡ）好酸球、Ｂ）好中球、Ｃ）マクロファージ、Ｄ）Ｔ細胞、及びＥ）Ｂ細胞の絶対数を示す。ブロックは、平均であり、そして、バーは、SEM値である（ｎ＝１群当たり１又は６）。###対照群に対してｐ≦０．００１、そして、OVA群に対して*ｐ≦０．０５、**ｐ≦０．０１、及び***ｐ≦０．００１。
【図１４】HDM抽出物（Stallergenes）の鼻腔内（i.n.）投与によって９週齢の雄Balb/cマウスを感作した：０、１、２、３、４日目に生理食塩水 ２５μL中１μg、そして、１４及び２１日目に１０μg。２８、２９、及び３０日目にHDM（１μg）及び／又は生理食塩水をi.n.投与することによって、マウスを刺激した。２５日目にP140又は溶媒をi.v.注射（２mL/kg）することによってマウスを処理した。
【図１５】Balb/cマウスのHDM誘導性喘息モデルにおける気道反応性に対するP140ホスホペプチドの効果。ベースライン時、及びエアロゾル化されたPBS及びMCh（５０mg/mL）に応答した、cm H20.s.mL-1として表される気道抵抗Ｒ、cm H20.mL-1として表されるエラスタンスＥ、及びmL.cm H2-1として表されるコンプライアンスＣを、Flexivent（登録商標）で評価した。ブロックは、平均であり、そして、バーは、SEM値である（ｎ＝１群当たり５〜８）。###PBS噴霧とMCh噴霧との間でｐ≦０．００１、そして、＊慢性喘息におけるP140群と溶媒群との間でｐ≦０．０５。
【図１６】Balb/cマウスのHDM誘導性喘息モデルにおける気道炎症細胞の動員に対するP140ホスホペプチドの効果。HDM（Stallergenes）の鼻腔内（i.n.）投与によってBalb/cマウスを感作した：０、１、２、３、４日目にPBS ２５μL中１μg、そして、１４及び２１日目に１０μg。２８、２９、及び３０日目にHDM及び／又はPBSをi.n.投与することによって、マウスを刺激した。２５日目に４mg/kgの用量のP140又は溶媒をi.v.注射（２mL/kg）することによってマウスを処理した。BAL中の好酸球、好中球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、及びDCの絶対数を示す。ブロックは、平均であり、そして、バーは、SEM値である（ｎ＝１群当たり５〜８）。慢性喘息における溶媒群とアレルゲン刺激との間で#ｐ≦０．０５及び###ｐ≦０．００１、そして、慢性喘息におけるP140群と溶媒群との間で*ｐ≦０．０５。
【図１７】未処理ラット（□）と比較した、P140ペプチドで処理したCIDPラット（●）の体重（Ａ）及び臨床経過（Ｂ）。P140ペプチドの注射を赤矢印によって表す。平均値及びSEMを示す。
【図１８】単離唾液腺におけるリンパ球亜群の評価。
【図１９】単離唾液腺における炎症のレベルの評価。
【図２０】単離唾液腺におけるFSの数の評価。
【図２１】関節リウマチのマウスモデルにおけるP140ペプチドの評価。
【図２２】関節リウマチのマウスモデルにおけるP140ペプチドの評価。
【図２３】関節リウマチのマウスモデルにおけるP140ペプチドの評価。
【図２４】関節リウマチのマウスモデルにおけるP140ペプチドの評価。
【図２５】関節リウマチのマウスモデルにおけるP140ペプチドの評価。
【図２６】関節リウマチのマウスモデルにおけるP140ペプチドの評価。
【図２７】関節リウマチのマウスモデルにおけるP140ペプチドの評価。
【図２８】関節リウマチのマウスモデルにおけるP140ペプチドの評価。
【図２９】関節リウマチのマウスモデルにおけるP140ペプチドの評価。
【図３０】関節リウマチのマウスモデルにおけるP140ペプチドの評価。
【図３１】関節リウマチのマウスモデルにおけるP140ペプチドの評価。
【図３２】関節リウマチのマウスモデルにおけるP140ペプチドの評価。
【図３３】毎日の前側直線枠（front straight panes）のサイズの評価、P140対NaC1（独立ｔ検定）。
【図３４】毎日の左前肢のサイズの評価、P140対NaC1（独立ｔ検定）。
【図３５】一晩の炎症のスコアの評価、P140／NaC1対Lupuzor（商標）。
【００３０】
詳細な説明
以下は、本発明の実施において当業者を支援するために提供される本発明の詳細な説明である。当業者は、本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく本明細書に記載する実施態様において修正及び変更を行うことができる。本明細書に記載するものと類似又は均等な任意の方法及び材料を本発明の実施又は試験で用いることもできるが、好ましい方法及び材料について以下に記載する。特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書における本発明の記載において用いられる用語は、特定の実施態様を説明するためだけのものであり、本発明を限定することを意図するものではない。本明細書において言及する全ての刊行物、特許出願、特許、図面、及び他の参照文献は、その全体が参照により明示的に本明細書に組み入れられる。
【００３１】
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。明細書において用いられる用語は、特定の実施態様を説明するためだけのものであり、本発明を限定することを意図するものではない。
【００３２】
ある範囲の値が提供される場合、文脈において特に明確な規定がない限り、その範囲の上限値と下限値の間にある、下限値の単位の１０分の１までの各介在値、及び指定の範囲内の任意の他の指定値又は介在値が本発明に包含されることが理解される。より小さな範囲に独立に含まれ得る、これらのより小さな範囲の上限値及び下限値も本発明に包含されるが、ただし、指定の範囲内の特に除外される任意の限界値に従う。指定の範囲が限界値の一方又は両方を含む場合、これらの含まれる限界値のいずれか又は両方を除外する範囲も本発明に含まれる。
【００３３】
本明細書で使用するとき、以下の用語は、特に規定しない限り、以下の用語に基づく意味を有し得る。しかし、本発明が属する技術分野の当業者によって知られているか又は理解されている他の意味も可能であり、本発明の範囲内であることを理解すべきである。
【００３４】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」は、これら冠詞の文法上の目的語に対する複数の言及を含む（すなわち、１つ又は１つ超又は少なくとも１つを指す）ことに留意すべきである。一例として、「an element（要素）」は、１つの要素又は１つ超の要素を意味する。
【００３５】
用語「約」は、数値又は数値範囲に関連して本明細書で使用するとき、実用的及び／又は理論的な制約に起因して当技術分野において認識及び許容されている特定のレベルのばらつきが存在するという事実を反映している。例えば、特定の装置が動作する及び／又は測定が行われる方式における固有の差異に起因して、多少のばらつきは許容される。上記に関連して、語句「約」は、通常、標準偏差又は標準誤差内の値を包含するために用いられる。
【００３６】
語句「及び／又は」は、明細書及び特許請求の範囲で使用するとき、このように結合される要素の「いずれか又は両方」を意味する、すなわち、一部の場合には連言的に存在し、そして、他の場合には選言的に存在する要素を意味すると理解すべきである。「及び／又は」と共に列挙される複数の要素は、同じように解釈すべきである、すなわち、このように結合される要素のうちの「１つ以上」である。場合により、具体的に特定される要素と関連していようといまいと、「及び／又は」節によって具体的に特定される要素以外の他の要素が存在してもよい。したがって、非限定的な例として、「Ａ及び／又はＢ」に対する言及は、「含む」等のオープンエンドな言語と併用されるとき、一実施態様では、Ａのみ（場合によりＢ以外の要素を含む）；別の実施態様では、Ｂのみ（場合によりＡ以外の要素を含む）；更に別の実施態様では、Ａ及びＢの両方（場合により他の要素を含む）等を指し得る。
【００３７】
明細書及び特許請求の範囲で使用するとき、「又は」は、上に定義した「及び／又は」と同じ意味を有すると理解すべきである。例えば、リスト中の項目を分離するとき、「又は」又は「及び／又は」は、包含的であると解釈されるものとし、すなわち、多数の要素又は要素のリストのうちの少なくとも１つを含むだけでなく、１つ超も含み、そして、場合により更なる列挙されていない項目も含む。明らかに逆の意味を表す用語、例えば、「１つだけ」若しくは「正確に１つ」、又は特許請求の範囲で用いられるとき「からなる」のみが、多数の要素又は要素のリストのうちの正確に１つの要素を含むことを指す。一般的に、用語「又は」は、本明細書で使用するとき、「いずれか」、「１つ」、「１つだけ」、又は「正確に１つ」等の排他的な用語が前に記載されているとき、排他的選択肢（すなわち、「一方又は他方であるが両方ではない」）を示すとしか解釈しないものとする。
【００３８】
特許請求の範囲、並びに上記明細書では、全ての移行句、例えば、「含む」、「包含する」、「保有する」、「有する」、「含有する」、「伴う」、「保持する」、「で構成される」等は、オープンエンドである、すなわち、非限定的に含むことを意味すると理解すべきである。United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures, Section 2111.03.に記載の通り、移行句「からなる」及び「から本質的になる」のみが、それぞれ、クローズド又はセミクローズドな移行句であるものとする。
【００３９】
明細書及び特許請求の範囲で使用するとき、１つ以上の要素のリストを参照する語句「少なくとも１つ」は、要素のリスト内の要素のいずれか１つ又はそれ以上から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、要素のリスト内に具体的に列挙されているそれぞれの及び全ての要素のうちの少なくとも１つを必ずしも含むものではなく、そして、要素のリスト内の要素の任意の組合せを除外するものでもないと理解すべきである。また、この定義は、具体的に特定される要素に関連していようといまいと、語句「少なくとも１つの」が参照する要素のリスト内において具体的に特定される要素以外の要素が場合により存在し得ることを許容する。したがって、非限定的な例として、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ」（又は均等に「Ａ又はＢのうちの少なくとも１つ」、又は均等に「Ａ及び／又はＢのうちの少なくとも１つ」）は、一実施態様では、少なくとも１つ（場合により１つを超えるを含む）のＡを指し得、Ｂは存在せず（そして、場合により、Ｂ以外の要素を含む）；別の実施態様では、少なくとも１つ（場合により１つを超えるを含む）のＢを指し得、Ａは存在せず（そして、場合により、Ａ以外の要素を含む）；更に別の実施態様では、少なくとも１つ（場合により１つを超えるを含む）のＡ及び少なくとも１つ（場合により１つを超えるを含む）のＢ（そして、場合により、他の要素を含む）等を指し得る。
【００４０】
また、１つを超える工程又は行為を含む本明細書に記載する特定の方法では、該方法の工程又は行為の順序は、文脈上特に指定しない限り、必ずしも該方法の行為又は行為が列挙されている順序に限定されるものではないことを理解すべきである。
【００４１】
用語「同時投与」及び「同時に投与する」又は「併用療法」は、処置用剤がある程度、好ましくは有効量で、同時に患者内に存在する限り、同時発生的投与（２つ以上の処置用剤を同時に投与する）及び時間変化的投与（追加の処置用剤の投与時点とは異なる時点で１つ以上の処置用剤を投与する）の両方を指す。特定の好ましい態様では、本明細書に記載する本化合物のうちの１つ以上を、少なくとも１つの更なる生物活性剤（特に、抗癌剤を含む）と組み合せて同時に投与する。特に好ましい態様では、化合物の同時投与によって、相乗的活性及び／又は療法（抗癌活性を含む）が得られる。
【００４２】
用語「化合物」とは、本明細書で使用するとき、特に指定しない限り、本明細書に開示する任意の特定の化学化合物を指し、そして、その互変異性体、位置異性体、幾何異性体、そして、適用可能な場合、光学異性体（鏡像異性体）及び他の立体異性体（ジアステレオ異性体）を含む立体異性体に加えて、文脈上適用可能な場合、その薬学的に許容し得る塩及び誘導体（プロドラッグ形態を含む）を含む。文脈におけるその使用において、化合物という用語は、一般的に、単一の化合物を指すだけでなく、立体異性体、位置異性体、及び／又は光学異性体（ラセミ混合物を含む）等の他の化合物、並びに開示する化合物の特定の鏡像異性体又は鏡像異性的に濃縮された混合物も含み得る。この用語は、また、文脈において活性部位への化合物の投与及び送達を促進するように修飾されている化合物のプロドラッグ形態を指す。本化合物の説明において、特に、多数の置換基及びそれに関連する変数が記載されることに留意する。本明細書に記載する分子は、概して以下に記載する通り、安定な化合物であることが当業者には理解される。結合が示されているとき、二重結合及び単結合の両方が、図示された化合物の枠内で表される。
【００４３】
用語「誘導体」とは、ネイティブな化合物から直接、修飾によって、又は部分置換によって形成される化学組成物、例えば、核酸、ヌクレオチド、ポリペプチド、又はアミノ酸を意味し得るが、決してこれらに限定されるものではない。用語「アナログ」とは、ネイティブな化合物と類似しているが同一ではない構造を有する化学組成物、例えば、核酸、ヌクレオチド、ポリペプチド、又はアミノ酸を意味し得るが、決してこれらに限定されるものではない。
【００４４】
用語「有効量／用量」、「薬学的に有効な量／用量」、「薬学的に有効な量／用量」、又は「処置的に有効な量／用量」は、病態、障害、又は疾患状態の症状を予防するか、発生を阻害するか、改善させるか、遅延させるか、又は治療する（症状をある程度、好ましくは完全に軽減する）のに十分な活性医薬成分の量／用量を意味し得るが、決してこれらに限定されるものではない。有効量は、疾患の種類、用いられる組成物、投与経路、処置される哺乳類の種類、考慮される具体的な哺乳類の身体特性、同時投薬、及び医学分野の当業者が認識する他の要因に依存する。一般的に、剤の効力に依存して０．１mg/kg〜１０００mg/kg（体重）/日の量の活性成分が投与される。このような化合物の毒性及び処置有効性は、例えば、LD50（集団の５０％が死亡する用量）及びED50（集団の５０％において処置的に有効な用量）を決定するための、細胞培養物又は実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性作用と処置効果との間の用量比が、処置指数であり、そして、比LD50／ED50として表すことができる。大きな処置指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を使用してもよいが、未感染細胞に対する潜在的損傷を最小化し、そして、それによって副作用を低減するために、このような化合物が罹患組織の部位を標的とする送達系を設計するように注意すべきである。細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータを、ヒトにおいて使用するための投薬量の範囲の決定において用いることができる。このような化合物の投薬量は、好ましくは、ほとんど又は全く毒性を有しないED50を含む血中濃度の範囲内である。投薬量は、使用される剤形及び利用される投与経路に依存してこの範囲内で変動してよい。本発明の方法で用いられる任意の化合物について、処置的に有効な用量は、細胞培養アッセイから最初に推定することができる。用量は、細胞培養物で求めたIC50（すなわち、症状を最大半分阻害する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために動物モデルで決定してよい。このような情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量をより正確に求めることができる。血漿濃度は、例えば、高性能液体クロマトグラフィによって測定することができる。
【００４５】
用語「薬理組成物」、「処置用組成物」、「処置用製剤」、又は「薬学的に許容し得る製剤」は、所望の活性に最も好適な身体部位に投与（例えば、全身投与）するのに好適な形態である、本発明によって提供される剤の有効な分布を可能にする組成物又は製剤を意味し得るが、決してこれらに限定されるものではない。
【００４６】
用語「薬学的に許容し得る」又は「薬理学的に許容し得る」とは、必要に応じて、動物又はヒトに投与したとき、副作用、アレルギー反応、又は他の有害反応を生じさせない実体及び組成物を意味し得るが、決してこれらに限定されるものではない。
【００４７】
用語「薬学的に許容し得る担体」又は「薬理学的に許容し得る担体」とは、医薬投与に適合する任意の、そして、全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等を意味し得るが、決してこれらに限定されるものではない。好適な担体は、参照により本明細書に組み入れられる、この分野の標準的な参考書であるRemington's Pharmaceutical Sciencesの最新版に記載されている。このような担体又は希釈剤の好ましい例は、水、生理食塩水、フィンゲル液（finger's solutions）、デキストロース溶液、及び５％ ヒト血清アルブミンを含むが、これらに限定されない。リポソーム及び固形油等の非水性ビヒクルを使用してもよい。薬理学的活性物質のためにこのような媒体及び剤を使用することは、当技術分野において周知である。任意の従来の媒体又は剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、組成物におけるその使用が企図される。また、追加の活性化合物を組成物に配合してもよい。
【００４８】
用語「全身投与」とは、例えば、経腸又は非経口であり、そして、全身吸収又は血流中における薬物の蓄積につながる剤の全身分布を生じさせ、続いて、体全体にわたって分布させる投与経路を指す。好適な形態は、一つには、用途又は例えば、経口、経皮、若しくは注射による等の侵入経路に依存する。このような形態は、組成物又は製剤が標的細胞（すなわち、負に帯電しているポリマーが送達されるのが望ましい細胞）に達するのを妨げてはならない。例えば、血流に注入される薬理組成物は、可溶性でなければならない。他の要因は、当技術分野において公知であり、そして、毒性等の検討事項、及び組成物又は製剤がその効果を発揮するのを妨げる形態を含む。全身吸収を導く投与経路は、静脈内、皮下、腹腔内、吸入、経口、肺内、及び筋肉内を含むが、これらに限定されるわけではない。薬物の循環への侵入速度は、分子量又はサイズの関数であることが示されている。本発明の化合物を含むリポソーム又は他の薬物担体の使用は、潜在的に、例えば、細網内皮系（RES）の組織等の特定の組織型に薬物を局在させることができる。例えば、リンパ球及びマクロファージ等の細胞の表面と薬物との会合を促進することができるリポソーム製剤も有用である。
【００４９】
用語「局所投与」とは、病変又は疾患の部位に適切な又は近接する（例えば、約１０cm以内）部位に剤が送達される投与経路を指す。
【００５０】
用語「保存的突然変異」とは、核酸の変化によって化学的に類似のアミノ酸の置換が生じる、コード配列における単一のアミノ酸又は少数のアミノ酸を変化、付加、又は欠失させる核酸の置換、欠失、又は付加を指す。互いに保存的置換として機能し得るアミノ酸は、以下を含む：塩基性：アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）；酸性：アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；親水性：グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）；疎水性：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；硫黄含有：メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）。更に、保存的変異が異なる配列は、一般的に、相同である。
【００５１】
「相同性」とは、２つ以上の核酸分子のヌクレオチド配列又は２つ以上の核酸若しくはアミノ酸配列が部分的に又は完全に同一であることを意味する。特定の実施態様では、相同な核酸又はアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１のアミノ酸配列をコードしている核酸又は配列番号１に対して３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％の配列類似性又は同一性を有する。
【００５２】
「ホモログ」は、天然に存在するものであってもよく、又は関連する配列を有する１つ以上の核酸の人工的合成によって、若しくは１つ以上の核酸を修飾して関連する核酸を生成することによって作製してもよい。核酸は、天然で又は人工的に共通の祖先配列（例えば、オルソログ又はパラログ）に由来するとき、相同である。２つの核酸間の相同性が明示的に記載されていない場合、相同性は、２つ以上の配列間の核酸比較によって推測することができる。配列がある程度、例えば、一次アミノ酸構造レベルで約３０％超の配列類似性を示す場合、共通の祖先を共有していると結論付けられる。 本発明の目的のために、核酸配列が低ストリンジェントな条件下で組み換え及び／又はハイブリダイゼーションできる程度に十分に類似している場合、遺伝子は相同である。更に、その核酸配列が低ストリンジェントな条件下で組み換え又はハイブリダイゼーションできる程度に十分に類似しており、そして、場合により、膜修復活性を示し、そして、場合により、配列番号１〜６のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列内に含有されているエピトープに特異的な抗体によって認識され得る（すなわち、交差反応することができる）場合、ポリペプチドは相同であるとみなされる。
【００５３】
用語「細胞」は、その通常の生物学的な意味であり得るが、決してこれに限定されるものではなく、そして、多細胞生物全体を指すものではない。細胞は、例えば、インビボ、インビトロ、若しくはエクスビボ、例えば、細胞培養物中であってもよく、又は例えば、鳥類、植物、及び哺乳類（例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、類人猿、サル、ブタ、イヌ、及びネコ）を含む多細胞生物中に存在していてもよい。細胞は、原核生物（例えば、細菌細胞）又は真核生物（例えば、哺乳類又は植物の細胞）であってもよい。
【００５４】
用語「宿主細胞」とは、異種核酸を保有するか、又は異種核酸によってコードされているペプチド若しくはタンパク質を発現するために用いることができる細胞を意味し得るが、決してこれらに限定されるものではない。宿主細胞は、細胞のネイティブな（非組み換え）形態内にはみられない遺伝子、人工的手段によって遺伝子が修飾され、そして、細胞に再導入される場合、細胞のネイティブな形態にみられる遺伝子、又は細胞から核酸を除去することなく人工的に修飾されている細胞に対して内因性である核酸を含有し得る。宿主細胞は、真核生物であってもよく、原核生物であってもよい。細菌の培養に必要な一般的な成長条件は、例えば、BERGEY'S MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, Vol. 1, N. R. Krieg, ed., Williams and Wilkins, Baltimore/London (1984)等の教科書に見出すことができる。また、「宿主細胞」は、内因性の遺伝子若しくはプロモータ又はこれら両方が本発明の複合体のポリペプチド成分のうちの１つ以上を生成するように修飾されているものであってもよい。
【００５５】
用語「患者」又は「被験体」は、明細書全体を通して、本発明に係る組成物による処置（予防的処置を含む）が提供される動物、好ましくは、ヒト又はペットを説明するために用いられる。ヒト患者等の特定の動物に特異的な感染症、病態、又は疾患状態の処置については、患者という用語は、イヌ若しくはネコ等のペット又はウマ、ウシ、ヒツジ等の家畜を含む特定の動物を指す。一般的に、本発明では、患者という用語は、特に指定しない限り又はこの用語の使用状況から暗示されない限り、ヒト患者を指す。
【００５６】
本明細書で使用するとき、「P140ペプチド」は、配列番号１、２、４、及び５に例示されているものを含む、スプライセオソームU1-70Kタンパク質に由来するリン酸化ペプチドを意味し得るが、これらに限定されない。特定の例では、P140は、具体的には、１０位のセリンがリン酸化されている配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドを指すために用いられる。
【００５７】
用語「処置的に有効な量又は用量」は、それを必要としている被験体において処置的効果を達成することができる薬物の用量を含む。例えば、薬物の処置的に有効な量は、疾患又は障害、例えば、組織損傷又は筋肉関連疾患若しくは障害に関連する１つ以上の症状を予防又は軽減することができる量であり得る。正確な量は、公知の技術を用いて当業者によって解明可能であり得る（例えば、Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992)；Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999)；Pickar, Dosage Calculations (1999)；及びRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkinsを参照）。
【００５８】
キットは、本発明のマーカーを特異的に検出するための少なくとも１つの試薬（例えば、プローブ）を含む任意の製品（例えば、パッケージ又は容器）である。この製品は、本発明の方法を実施するためのユニットとして宣伝、流通、又は販売されていてよい。このようなキットに含まれている試薬は、感受性及び耐性の遺伝子発現の検出において用いるためのプローブ／プライマー及び／又は抗体を含む。更に、本発明のキットは、好ましくは、好適な検出アッセイについて説明する説明書を含有していてよい。このようなキットは、例えば、癌の症状を示す患者、特に、潜在的に腫瘍の存在を示す患者を診断するための臨床的状況において便利に用いることができる。
【００５９】
本明細書において言及する全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参照文献は、その全体が参照により組み入れられる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先される。更に、材料、方法、及び実施例は、単なる例示であり、そして、限定を意図するものではない。
【００６０】
開示全体が参照により本明細書に組み入れられる以下の参照文献は、本発明で用いられる用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する。Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988)；The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991)；及びHale & Marham, the Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。
【００６１】
本明細書は、本明細書に記載する化学的に修飾されたペプチドがオートファジーの強力な調節因子であるという驚くべき、そして、予想外の発見に基づく処置用組成物及びそれを用いる方法を提供する。特に、本明細書に記載するペプチド及び組成物は、驚くべきことに、シャペロン介在性オートファジー（CMA）を含む過剰のオートファジー又はハイパーオートファジーを低減するのに有効である。したがって、本明細書は、ハイパーオートファジー、例えば、ハイパーCMAに関連する疾患及び障害を処置するための組成物及び方法を提供する。
【００６２】
オートファジーは、リソソームに基づく生理学的プロセスであり、これは、基本条件では、不必要な細胞質の構成成分を連続的に分解するために低レベルで生じ、そして、エネルギー生成のための基質を作製する。酸化的ストレス、低酸素、又は栄養枯渇中、そのレベルは細胞生存を可能にする程度まで上昇する。したがって、オートファジーは、細胞のホメオスタシスに関与している主なハブを表す（Awan and Deng, 2014；He and Klionsky, 2009；Mizushima, 2007；Okamoto, 2014；Ravikumar et al., 2010）。また、脂肪細胞、赤血球、及びリンパ球を含む多くの系列の分化、並びに組織のリモデリングにおいて極めて重要な役割を果たす（Cenci, 2014；Lee et al., 2014；Mizushima and Komatsu, 2011；Mizushima and Levine, 2010；Nedjic et al., 2008；Pampliega et al., 2013）。しかし、特定の環境条件下では、オートファジーは、細胞死も媒介し得、そして、オートファジー細胞死（オートファジー「による」細胞死を指す）をオートファジー「を伴う」細胞死と区別することが機構的に重要である（Kroemer and Levine, 2008；Marino et al., 2014；Ryter at al., 2014；Shen et al., 2012）。したがって、最近の研究は、オートファジーのプロセスとアポトーシスのプロセスとが密接に関係しており、そして、シグナル伝達エレメント間のクロストークを共有していることを示唆している。特に、特定のオートファジー関連（ATG）タンパク質は、オートファジー及びアポトーシスの制御において二重の役割を果たしていることが示されている。これは、例えば、ATG5とその結合パートナーであるATG12、BCL-2相互作用ミオシン／モエシン様コイルドコイルタンパク質１（BECLIN1/beclin-1）、クラスIII PI3K経路と相互作用することによってオートファゴソームの形成中に作用する酵母Atg6/液胞タンパク質ソーティング（Vps）−３０の哺乳類オルソログ、及び微小管関連タンパク質軽鎖３（MAP1LC3/LC3）酵母Atg8の哺乳類オルソログに当てはまる（Kang et al., 2011；Konishi et al., 2012；Li et al., 2012；Marquez et al., 2012）。また、壊死、ネクロプトーシス（制御されたFas依存性、カスパーゼ依存性の非アポトーシス細胞死）、及びピロプトーシス（カスパーゼ−１−依存性の細胞死）等の細胞死の他の形態もオートファジーと相互に関連している（Ryter et al., 2014）。
【００６３】
３つの主な種類のオートファジーが同定されており、そして、その生理学的機能及び細胞質カーゴをリソソームに送達するために用いる機構の両方によって区別することができる（図１Ａ）。該オートファジーは、マクロオートファジー、マイクロオートファジー、及びシャペロン介在性オートファジー、すなわち、CMAである（Cuervo, 2004；Feng et al., 2014, Kaushik and Cuervo, 2012；Okamoto, 2014）。実際には、オートファジーのより多くの形態が報告されている。例えば、（凝集タンパク質に対する）アグリファジー、（ミトコンドリアに対する）マイトファジー、（リボソームに対する）リボファジー、（ペルオキシソームに対する）ペキソファジー、（小胞体、ERに対する）レチキュロファジー、及び（病原体に対する）ゼノファジーに言及することができる。したがって、オートファジーは、元々非選択的（ランダム）な細胞質分解系としてみられていたが、実際は、基質送達の高度に選択的かつ厳密に制御されたプロセスに関与していることを本発明者らは現在認識している。
【００６４】
マクロオートファジー（一般的に「オートファジー」と称され、このことが、一部の場合、文献において混乱を生じさせる場合がある）は、大量に巨大分子及びオルガネラ全体を捕捉する能力を通して、依然として主なオートファジープロセスである。後者は、二重膜オートファゴソームに捕捉され、そこで分解される。したがって、それは、プロテアソーム分解の別の機構を表し、これは、むしろ、短命な細胞内タンパク質を処理するが、次第に理解されつつあるクロストークは、ユビキチン−プロテアソームシステム（UPS）とマクロオートファジーとの間で生じると記載されている（Cuervo and Wong, 2014；Kirkin et al. 2009；Korolchuck et al., 2010；Lilienbaum et al., 2013；Ravikumar et al., 2010）。オートファゴソームとリソソームとの融合によって、飲み込まれた細胞の構成成分（脂質滴及びタンパク質凝集体を含む）がリソソームのグリコシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、及びスルファターゼによって分解されるオートリソソームが形成される（図１Ｂ）。CMAプロセスに関しては、KFERQに生化学的に関連する特定のペプチドモチーフを含有するタンパク質は、リソソームに内部移行し、そして、分解される前に、HSPA8/HSC70シャペロンタンパク質によって認識される（図１Ａ）。対照的に、マイクロオートファジーでは、細胞質成分は、リソソーム膜の貫入によって直接取り込まれる（図１Ａ）。
【００６５】
オートファジー経路は、ATG遺伝子ファミリーに属するタンパク質によって遺伝的に制御され、そして、酵母及び哺乳類において十分に特徴付けられている（Codogno et al., 2012；Klionsky and Emr, 2000；Lamb et al., 2013；Mizushima et al., 2011；Oshumi, 2014；Shibutani and Yoshimori, 2014）。ATGタンパク質は、進化的に保存されており、そして、それぞれオートファジー中に特定の機能を有する。それは、特定のATG遺伝子が、オートファジーと自己免疫との間に存在する関係を理解するために更なる研究が行われた自己免疫症候群に関連している可能性があるという発見に主に基づいている。遺伝解析によって、ATG遺伝子における幾つかの多型が様々な自己免疫障害に対する易罹患性を付与し得ることが効率的に報告された。したがって、SLE患者において実施されたゲノムワイドな関連研究（GWAS）によって、ATG遺伝子に位置する幾つかの一塩基多型（SNP）が同定され、これらは疾患の発生に関連していた（Harley et al., 2008；Orozco et al., 2011）。ATG5とPRDM1との間の遺伝子間領域に位置する１つのSNPは、ATG5 mRNAの発現増加と相関していることが見出された（Zhou et al., 2011）。ATG5とSLEに対する易罹患性との間の遺伝的関連は、個々の研究では確認されているが、他の研究では見出されていない（Jarvinen et al., 2012）。興味深いことに、アジア人における最近のメタ解析は、DRAM1におけるSNPとSLE易罹患性との強い関連を示した（Yang et al., 2013）。この遺伝子は、p53媒介ストレスシグナルに応答するマクロオートファジーの活性化因子をコードしている。CD患者では、GWA研究によって、易罹患性変異体としてATG16L1遺伝子座にマッピングされたrs2241880が同定された（Hampe et al., 2007）。rs2241880と確立されたCARD15/NOD2（ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン含有２）易罹患性変異体との間にCDリスクに関して統計的に有意な相互作用が示された。興味深いことに、rs2241880と、別の密接に関連する炎症性腸疾患である潰瘍性大腸炎との間には関連がなかった。最近のデータによって、Atg16L1変異体マウスが、モデル細菌病原体であるシトロバクター・ローデンチウム（Citrobacter rodentium）によって誘導される腸疾患に対して耐性を有することが示された（Marchiando et al., 2013）。これらマウスで発現した超免疫表現型及び保護効果は、Atg16L1/Nod2二重変異体マウスでは失われ、これは、Nod2欠損に起因する易罹患性がAtg16L1欠損の効果よりも優勢であることを示す。ATG16L1は、オートファゴソームの形成における中心であり、ATG12-ATG5複合体の一部であり、これは、MAP1LC3の動員に必要である（Mizushima et al., 2011）。ATG16L1を除去すると、細胞がオートファゴソームを形成する能力がなくなる（Saitoh et al., 2008）。より最近では、３００位にAla→Thr置換を含有する変異タンパク質が、細胞ストレス中に活性化されるカスパーゼ３による切断に対して高度に感受性であると報告された（Murthy et al., 2014）。ATG16L1T300Aの破壊は、オートファジーを障害し、そして、炎症促進性サイトカインTNF-□及びIL-1□の放出を増大させた。特に、いわゆる免疫関連GTPaseファミリーM（IRGM）遺伝子においてCDに関連する幾つかのSNPが報告されている（Glas et al., 2013；Lu et al., 2013）。結果は、オートファジー遺伝子−IRGM多型は、CDに対する易罹患性を付与するが、特に欧州人において潰瘍性大腸炎に対する易罹患性は付与しない。IRGMは��結核菌（M. Tuberculosis）のような細胞内病原体に対するオートファジー的保護を付与するインターフェロン誘導性GTPaseファミリーのメンバーである。IRGMは、マイコバクテリアのファゴソームの成熟を強化することによって後者を制御する（Singh et al., 2006）。
【００６６】
要するに、これらデータは、感染病原体に対する保護並びに炎症及び自己免疫応答の制御を含む免疫の幾つかの態様に加えて、腫瘍形成及び癌においてオートファジーエレメントの強い影響を主張するものである。逆説的には、細胞及び分子的研究に基づく実験研究が免疫におけるオートファジーの関与を一部解明したのはほんの最近である。感染及び炎症におけるオートファジーの役割について特に強調するこのトピックに関する多数の包括的総説論文が最近刊行されている（Cenci, 2014；Deretic, 2012；Deretic et al., 2013；Gros and Muller, 2014；Levine et al., 2011；Oliva and Cenci；2014；Puleston and Simon, 2013；Ravikumar et al., 2010）。本総説は、主に、有害な免疫応答を回避し、そして、自己に対する障害された寛容を少なくとも部分的に回復させるために、低分子及びペプチドによる免疫系の可能な操作に関連して、自己免疫におけるオートファジーに焦点を合わせている。
【００６７】
自然免疫応答は、重要なことに、自己免疫疾患の誘導及び制御において適応免疫に影響を与える。自然免疫では、オートファジーは、特に、特定のサイトカイン及びケモカインの活性化及び放出を制御することによって、様々なレベルで機能する（Deretic 2012；Deretic et al., 2013；Gros and Muller, 2014；Jones et al., 2013；Saitoh and Akira, 2010）。オートファジーは、TNFα、インターロイキン（IL）-6、IL-8、及びＩ型インターフェロン（IFN）の分泌を活性化するが、一方、IL-1α及びβ（後者は、インフラマソームの活性化を制御することによって、そして、分解についてpro-IL-1βを標的とすることによって）、IL-18、及びＩ型IFNの生成を制御する。次に、幾つかの分泌されたサイトカインがオートファジーに影響を与える。したがって、ヘルパーＴ１型（Th1）及び炎症促進性サイトカイン（例えば、IFN-γ（IRGMを介して）、TNFα、IL-1α及びβ、IL-23）、反応性酸素種（ROS）、及び幾つかのTLRの会合（未だあまり理解されていない機序）はオートファジーを誘導する。TWEAK（C2C12筋管における、アポトーシスのTNF様の弱い誘導因子）、CD4+ T細胞におけるIL-2、末梢血単核細胞（PBMC）におけるIL-6、及び肝細胞癌の細胞株におけるTGF-βもオートファジーを促進する。逆に、Th2及び制御性サイトカイン（例えば、IL-4、IL-13、及びIL-10）は、STAT-3又は-6経路及びセリン／スレオニンタンパク質キナーゼ（AKT）経路に対する効果を介して、セリン／スレオニンタンパク質キナーゼULK1を阻害し、それによって、オートファゴソームを形成するラパマイシンの哺乳類標的（mTOR）を活性化させることが見出された（Gutierrez et al., 2004；Jones et al., 2013）。特に、抗原提示細胞（APC）におけるサイトカイン分泌に対する効果を介して、オートファジーは、免疫応答の極めて重要な制御因子を表す（Cenci, 2014；Deretic et al., 2013；Gros and Muller, 2014；Levine et al., 2011；Nedjic et al., 2008；Ravikumar et al., 2010, Saitoh and Akira, 2010）。
【００６８】
現在の教科書ではこのような非常に重要なレベルまでは未だ認識されていないが、オートファジーは、実際には、適応免疫の様々な態様に対して顕著な効果を発揮する。それは、Ｔ細胞の胸腺選択において主な役割を果たし、Ｔ細胞のホメオスタシス、レパートリ、及び極性化、Ｂ細胞の生存、免疫寛容、並びに抗原提示にも影響を与える。
【００６９】
オートファジーが主要組織適合複合体II（MHCII）分子に自己抗原を送達するための重要な制御エレメントであるという発見は、重要な転換点であった（Dengjel et al., 2005；Paludan et al., 2005；Zhou et al., 2005）。この発見時には、MHC I分子が細胞内起源のタンパク質由来のペプチドをＴ細胞に提示し、一方、MHCII分子は外因性及び膜のタンパク質由来の抗原性ペプチドを提示すると古くから確立されていた。したがって、MHCIIペプチドによるＴ細胞の活性化の全体像が大幅に再検討され、そして、免疫応答と細胞ストレス、細胞代謝、細胞栄養、及び細胞環境との間の新たな関係が示唆され、そして、更に分析された。偶発的に、PI3-キナーゼ活性に作用する強力なマクロオートファジー阻害剤、すなわち、ワートマニン、LY294002、及び３−メチルアデニン（3-MA）を、E□52-68-eGFP（膜貫通タンパク質I-E□に由来するペプチド断片）をトランスフェクトしたマクロファージ細胞株BMC-2と共にインキュベートしたところ、効果を有しないことが示された実験に従って、マクロオートファジーが、細胞質で発現するタンパク質がMHCII分子の内腔ペプチド結合部位にアクセスための機序ではないと結論付けられたことは興味深い（Dani et al., 2004）。その時、試験された抗原の固有の特性、その半減期及び細胞内（小胞性であろうとなかろうと）輸送、並びにAPCの種類から得ることができた矛盾するデータが公開された（Dorfel et al., 2005；Leung et al., 2010；Paludan et al., 2005）。
【００７０】
より最近のデータは、マクロファージ等の他の細胞よりもタンパク質分解活性の低いAPCにおいて、最終的にオートリソソームに達する粒子及びタンパク質がリソソームシステインプロテアーゼ（一般的にカテプシンとして知られている）によって切断されることによりタンパク質断片が生じ、これがMHCII分子のためのペプチドの主な起源を構成することを示した（図１Ｃ）。リソソーム及びオートリソソームは、４〜４．５のpHを有し、これは、カテプシンにとって最適である。したがって、自己免疫の状況において重要なことに、MHCII分子は、リソソームによるタンパク質分解によって生じる内因性抗原から生成されるペプチドに結合することができる。このような内因性抗原は、膜、細胞質（小胞成分を含む）、又は核の起源に由来し得、そして、CD4+ T細胞の初回刺激を促進するためのその後のプロセシング及びMHCII分子による提示のためにオートファジーの幾つかの形態を介してリソソーム内ネットワークに輸送され得る（Blum et al., 2013；Munz, 2012）。興味深いことに、その先駆的な研究において、Stevanovic、Rammensee、及び協力者は、飢餓によるオートファジーの誘導がリソソームにおける活性プロテアーゼのバランスを変化させ（Dengjel et al., 2005）、これが、重要なことに、MHCII分子に負荷されるペプチドの量を変化させ得ることを既に証明している。
【００７１】
過去１０年間にわたって、自己抗原の遊離及びプロセシングに対する特定のプロテアーゼの役割及び制御が広範に研究されており（van Kasteren and Overkleeft, 2014；Villadangos et al., 1999）、そして、特に、カテプシンの異なるセットが様々なAPC、例えば、樹状細胞（DC）及びＢ細胞において機能していることが示された（Burster et al., 2004；Manoury et al., 2002）。また、個々のエンドソームにおいででさえも、プロテアーゼ活性の制御に関与し、そして、抗原提示に強く影響を与える複数の機序（環境によって支配される遺伝子のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションを含む）が存在する（Dengjel et al., 2005；van Kasteren and Overkleeft, 2014）。したがって、リソソーム内プロテアーゼは、最後にＴ細胞に提示される抗原を生成するための重要なプレーヤーである。レグマインとしても知られているアスパラギンエンドペプチダーゼ（AEP）、システインＣ、特定のカテプシン、及び他の依然として特定されていないプロテアーゼが関与する段階的プロセスを介して、リソソーム内プロテアーゼは、MHCII分子に結合している不変異（Ii）鎖をクラスII関連不変異体ペプチド（CLIP）にプロセシングするために作用し、それによって、CD4+ T細胞に提示するためにAPCの細胞表面に輸送される前に、酵素HLA-DM（図１Ｃ）によってCLIPペプチドが高親和性ペプチドに交換されるペプチド受容性MHCII分子を生成する（Neefjes et al., 2011）。また、AEPを含むリソソーム内プロテアーゼは、機能的MHCII分子によって提示されるエピトープを生成するように作用する（Colbert et al., 2009；Matthews et al., 2010；van Kasteren and Overkleeft, 2014）。
【００７２】
これまでに調べられた抗原の多くの例において、安定性が、抗原提示に影響を与える決定要因であることが見出されている。更に、カテプシンを介する切断は、エピトープを遊離させることができるだけでなく、幾つかの他のものを破壊することもできるので、カテプシンの制御は、送達される抗原ペプチドの最終パネルを規定するために更により戦略的に重要である。最後に、抗原提示におけるリソソーム内プロテアーゼの別の重要な役割は、TLR受容体シグナル伝達に対する影響にある。これは、TLR9シグナル伝達に対するクロロキン（CQ）の効果を観察している間に最初に主張され（Hong et al., 2004；Matsumoto et al., 2008）、後に、リソソーム内プロテアーゼがエンドソームTLR3、7、及び8も活性化し（Manoury, 2013）、そして、作用機序が最初の研究で提唱されたものではなかったことが証明されている。実際には、TLR9に対してであろうとエンドソームTLRに対してであろうと、リソソーム内プロテアーゼは、受容体を非シグナル伝達性の完全長形態から、Ｎ末端領域から欠失したより短い形態に変換することによって作用する（Ewald et al., 2008；Park et al., 2008）。特に関与している具体的なプロテアーゼを考慮すると、この効果の背後にある正確な機序については未だ議論が続いているが、プロテアーゼ活性に影響し、その結果、MHCII分子上に提示されるペプチドの量に影響を与えるTLRシグナル伝達がDC成熟の中心となるので、このような効果が戦略的に重要であり得ることに変わりない。これらデータは、自然免疫（上記を参照；Xu et al., 2007）及び適応免疫の両方に関連するオートファジープロセスにおけるTLRの重要性を強調するものである。
【００７３】
また、免疫におけるオートファジーの重要性は、ATG遺伝子を低発現するように操作されたマウス又は細胞を用いて実施した実験から明らかになった。このストラテジを用いて、一部の個体において欠陥があると思われる遺伝子について得られつつある知見に関連して、幾つかのATGタンパク質の潜在的役割によりよくアプローチし、そして、ヒト疾患との幾つかのつながりを確立することが可能であった（Choi et al., 2013；Jiang and Mizushima, 2014；Majai et al., 2014）。したがって、オートファゴソーム膜の伸長に関与している遺伝子であるAtg5がＢ細胞特異的に欠失しているマウスを用いて、オートファジー欠損Ｂ細胞前駆細胞において、骨髄におけるプロＢ細胞段階からプレＢ細胞段階への移行に欠陥があることが示されている（Miller et al., 2008）。Atg5がＢリンパ球において条件的に欠失しているマウスの研究によって、この遺伝子が形質細胞（ＰＣ）のホメオスタシスにとって必須であることが更に明らかになった（Conway et al., 2013）。これらマウスでクラススイッチは生じなかったが、特定の免疫、寄生虫感染、及び粘膜炎症の後に抗体応答が大きく減少した。これらデータ及び他のデータ（Pengo et al., 2013）は、早期Ｂ細胞発生だけでなく、後期Ｂ細胞活性化及びPC分化においてもATG5の重要性を強調している。また、必須のオートファジー遺伝子であるAtg5（Stephenson et al., 2009）、Atg7（Pua et al., 2009；Jia and He, 2011）、Atg3（Jia and He, 2011）の条件的欠失も、末梢Ｔ細胞の生存にとってマクロオートファジーが重要であることを示した。幾つかのAtg遺伝子は、感染の状態において重要である。
【００７４】
したがって、ヒトATG16L1又はマウスAtg7、Atg9a、若しくはAtg14が欠損しているマウス胎仔線維芽細胞（MEF）を用いて、Oshima et al. (2014)は、細胞内病原体であるトキソプラズマ原虫（T. gondii）への免疫関連GTPasesのIFN−γ−誘導性動員において、ATG16L1、ATG7、及びATG16L1の重要性を示したが、ATG9A及びATG14については示されなかった。場合によっては特定の組織において、オートファジー遺伝子が欠失しているか又は過剰発現している、マクロオートファジー、CMA、及びマイトファジーを含む様々な形態のオートファジープロセスにおける多数の例が記載されている。例は、幾つか引用すると、Pink1/parkinノックアウト（KO）マウス、Atg16L1変異体、及び上記Atg16L1/Nod2二重変異体マウス、Sqstm1/p62/A170（シグナル伝達アダプタ／スカフォールドタンパク質としても知られているSQSTM1多機能タンパク質をコードしている）変異体マウス、Beclin-1又はVps34を無効化する条件的欠失モデルである。オートファジー経路の重要な要素の結合パートナーに影響を与える幾つかの突然変異も紹介された。したがって、Ｔ細胞におけるリソソーム関連膜タンパク質２（LAMP-2A）をコードしている遺伝子の欠失が、リステリア菌（L. monocytogenes）による免疫又は感染に対するインビボ欠損応答を引き起こすことが最近示された（Valdor et al., 2014）。これらマウスでは、Ｔ細胞におけるCMAが年齢と共に変化することが見出された。本明細書では、子宮内で死亡するBeclin-1 KOマウス又は少なくとも部分的にアミノ酸生成の不足に起因して産後２４時間以内に死亡するAtg5 KOマウスと同様に、HSPA8が無効化されたマウスは生存不可能であることに言及しなければならない。
【００７５】
上に報告したオートファジーと免疫との間の密接な関係は、オートファジー機構の任意の調節解除が免疫応答の様々な態様に影響を及ぼし得、そして、自己免疫の発現につながり得ることを容易に説明する（Gros and Muller, 2014；Lleo et al., 2007；Pierdominici et al., 2012）。自己反応性リンパ球の生存を可能にする強化されたオートファジーは、自己免疫を促進し得る。更に、細胞内タンパク質の分解を通じて自己抗原を生成するオートファジーは、自己免疫の開始又は維持に関与し得る。SNP及び易罹患性遺伝子に加えて、オートファジープロセスに関連する幾つかの遺伝子の発現が自己免疫中に調節されることが多数の研究によって強調されている。関節リウマチ（RA）では、ATG7及びBECLIN-1の両遺伝子発現が患者由来の破骨細胞で増加することが示されている（Lin et al., 2013）。滑膜炎の制御を通して、発病の重要な要素である炎症促進性サイトカインTNF−αによってAtg7の発現が増加することが見出された。また、他の研究では、自己免疫性脱髄症候群及び多発性硬化症（MS）において、ATG5遺伝子の発現が健常対照に比べて著しく増加することも証明されている（Alirezaei et al., 2009）。
【００７６】
遺伝学的証拠に基づいて、１０年間にわたってオートファジーと自己免疫との間の潜在的関連が示唆されている。しかし、一般的に、自己免疫疾患の開始及び／又は進行におけるオートファジーの役割を示す細胞及び分子レベルにおける実験的論拠は、未だ十分ではない（表１）。SLE患者及びループスの２つの遺伝的に無関係のマウスモデル、すなわち、MRL/lpr及び(NZBxNZW)F1（NZB/W）マウスにおいて、本発明者らは、オートファジーがＴリンパ球で調節解除されることを独創的なレポートで示した（Gros et al., 2012）。自己貪食空胞は、Ｔ細胞で過剰提示されることが見出されており、これは、オートファジーが過活性化していることを示す。この調節解除は、Ｔ細胞がＴ細胞受容体（TCR）関連シグナル伝達経路の化学的活性化因子によって刺激されたときに更により明白であった。増加したオートファジー区画は、全てのＴ細胞でみられた訳ではなく、そのサブセットに制限されていた。オートファジーは、細胞の生存に関与していることが知られているので、これら結果は、オートファジーが疾患中に自己反応性Ｔ細胞の生存を促進し得ることを示唆している。Alessandri et al. (2012)は、Ｔ細胞におけるオートファゴソーム会合MAP1LC3-IIアイソフォームの増加を示し、これは、SLE患者から単離されたナイーブCD4 T細胞で主に生じた。本発明者らによるデータを裏付けるこれら結果は、SLE T細胞においてオートファジー活性の固有の調節解除が存在することを示唆する。著者らは、SLE T細胞がマクロオートファジー誘導に対して耐性を有し、したがって、よりアポトーシスしやすくなる可能性があると結論付けた別の解釈を提唱した。著者らは、Ｔ細胞をラパマイシン又は自己（オートファジー促進性）血清で再刺激することによってこの結論に達した。しかし、SLE T細胞は、既に最高レベルのオートファゴソーム負荷であり、そして、自身の血清に対する再曝露がオートファジー活性に対して更なる効果を有していなかった可能性がある。いずれの場合も、これらデータは、正常Ｔ細胞におけるSLE血清のオートファジーを促進する役割を裏付けるものである。Pierdominici及び共同研究者も、オートファジーの増加が疾患活動性スコアと相関していることを観察し、これは、更なる処置ストラテジにおいて利用することができる重要な情報である（Alessandri et al., 2012；Pierdominici et al., 2012；2014）。
【００７７】
より最近の研究は、上記先駆的な研究を補強し、そして、広げた。したがって、最初に、Clarke et al. (2014)は、NZB/Wマウスにおいて、Ｂ細胞でも、より具体的には、Ｂ細胞発生の早期発生及び移行段階においても（疾患の発症前）、マクロオートファジーの活性化が生じることを示した。ループスの患者では、オートファジーは、健常個体と比べて活性化されており、そして、この場合も、活性化はナイーブＢ細胞で主に生じた。オートファジー阻害剤（例えば、3-MA、バフィロマイシンA1、又はCQ）を用いたとき、形質芽球の分化及び生存はほとんど生じなかった。これら知見は、ループス易発性マウス及びループス患者の血清における自己抗体の過剰産生に関連しているはずである。この研究では、著者らは、Ｂ細胞に加えて、ループス患者由来のＴ細胞でもオートファジーが増加し、そして、いずれの場合も、この活性化が疾患の活動性と相関している可能性があることを確認した。また、Li et al. (2014)は、対照と比べて、ループスの誘導マウスモデル（相同な活性化リンパ球由来のDNAをフロインドアジュバント中で投与した後にループス様疾患を発現するBALB/cマウス）及びループス患者のPBMCから収集したマクロファージにおいてオートファジーが著しく活性化されたことを示す説得力のある結果を報告している。Beclin-1 KOマクロファージの養子移入は、レシピエントマウスの臨床状態（タンパク尿のレベルの低下、典型的な腎臓複合体の沈着の低減、糸球体腎炎の改善）、並びに生物学的特徴（ELISAによって測定したときの血清抗dsDNA抗体レベル並びに循環炎症促進性サイトカインIL-6及びTNF-αの減少）を著しく改善させる。
【００７８】
幾つかの研究によって、他の自己免疫疾患、特にヒトRA（Lin et al., 2013；Kato et al., 2014；Xu et al., 2013）及びMSのモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（Bhattacharya et al., 2014）におけるオートファジーの役割が強調されている。オートファジーは、RA患者由来の破骨細胞において活性化されると考えられ、そして、破骨細胞の分化を制御する（Lin et al., 2013）。Kato et al. (2014)によって、変形性関節炎滑膜線維芽細胞と比べてRA滑膜線維芽細胞でも見出されたこのオートファジープロセスの増加は、 RA滑膜組織におけるアポトーシスレベルの低下と相関している（Xu et al., 2013）。これら観察結果から、過剰産生されたTFN-αによって誘導されるオートファジーの活性化が、関節におけるアポトーシスの低減につながり、そして、より重要なことに、滑膜線維芽細胞の生存を引き起し、これが病状に関与していると結論付けられた。これも、ミスフォールドされたか又は大量すぎる細胞成分を排除するときには細胞保護的であるが、過剰であると有害になり得、そして、負の効果を生じさせ得るオートファジーの二重効果を強調する。
【００７９】
多数の最近の知見は、筋量の制御におけるマクロオートファジーの極めて重要な役割を強調しており、そして、ミオパシー及び筋ジストロフィーにおいてオートファジーの誤制御が報告されている（Sandri et al., 2013）。しかし、例えば、筋肉の炎症及び変性を特徴とする自己免疫成分を有する稀な疾患である線維筋痛又は多発性筋炎の患者に関して（Temiz et al., 2009；Lloyd, 2010）、可能性のあるオートファジープロセスの機能不全に関連する情報は不十分である。他方、CD、SLE、恐らくRA及びMS（表１）を含む幾つかの自己免疫状態、並びに炎症性症候群、特に、肺疾患において、オートファジーの欠陥が観察されている（又は疑われている）（Mizumura et al., 2012）。全てのこれら状況において、オートファジーの調節は、特に適切なフラックス制御を再確立するために、変更を回復させ、そして、処置された患者の臨床状態を改善できることが強く期待される。
【００８０】
最近強調されている通り（Gros and Muller, 2014）、数年間にわたって炎症及び自己免疫疾患を処置するために用いられる幾つかの分子は、ある種又は別の種類のオートファジープロセスを標的とすることがかなり後に見出された。現在では、実際にはオートファジー経路の工程、そして、更には特に単一の経路を正確に標的とする特定の化合物はほとんど存在せず（Anguiano et al., 2013）、そして、かなり驚くべきことに、患者に広く処方されている幾つかのオートファジー制御因子の標的は実際には知られていない。これは、特に、CQ及びヒドロキシクロロキン（HCQ）又はデキサメタゾンに当てはまり、その作用機序（MOA）は、未だ議論中である（以下を参照）。
【００８１】
多数の包括的総説論文は、最近、直接又は間接的にオートファジーを調節するために生成された、化合物、活性化因子、及び阻害因子のファミリーの構造的及び機能的な様々な態様を徹底的に網羅している（Baek et al., 2012；Cheong et al., 2012；Fleming et al., 2011；Gros and Muller, 2014；Jiang and Mizushima, 2014；Renna et al., 2010；Rubinsztein et al., 2012；van Kasteren and Overkleeft, 2014；Vidal et al., 2014）。インビトロ及びインビボの両方で実施された厳密に検定されたアッセイ（Mizushima et al., 2010；Klionsky et al., 2012）において評価された通り、これら低分子の一部は、適切な設定において自己免疫疾患を調節することに関連することが証明され得る。次の項に示す実施例では、本発明者らは、自己免疫疾患における確立された又は有望な臨床的有効性を有するオートファジーの幾つかの薬理学的制御因子に限定する。
【００８２】
薬理学的低分子及びペプチドは、これらを特に自己免疫疾患に対して優れた処置剤にならしめる多数の有利な特性を示す。その合成及び生成が高度に最適化され得、そして、一部の場合では、幾つかの生物製剤と比べて著しく単純になり得、そして、自動化可能なことに加えて、医薬組成物の活性成分として選択される低分子及びペプチドは、その安定性及びロバスト性、取り扱い容易性、患者に投与しなければならない用量が比較的低い、及び比較的低コストであることを特徴とし、これは、大部分の生物製剤に関して依然として合理的である。低分子及び短ペプチドは、それ自体免疫原性ではなく、これは、慢性自己免疫疾患患者の処置についての別の顕著な利点である（Schall and Muller, 2014）。
【００８３】
本明細書は、本明細書に記載する化学的に修飾されたペプチドがオートファジーの強力な調節因子であるという驚くべき、そして、予想外の発見に基づく処置用組成物及びそれを使用する方法を提供する。本明細書に記載する化学的に修飾されたペプチド、例えば、P140ペプチドは、U1-70Kスプライセオソームタンパク質に由来する。記載するペプチド及び有効量の該ペプチドを含む組成物は、オートファジーフラックスの増加を特徴とする疾患、すなわち、ハイパーオートファジー関連、例えば、ハイパーCMA自己免疫障害の症状の治療、予防、及び／又は改善に有効である。したがって、特定の更なる態様では、本開示は、ハイパーオートファジー、例えば、ハイパーCMAのフラックスを特徴とする疾患の症状を治療、予防、及び／又は改善するための、記載するペプチド及びそれを含む組成物を作製及び使用する方法を提供する。
【００８４】
したがって、一態様では、本明細書は、その誘導体、アナログ、及び塩の形態を含む、配列番号１、２、４、及び５の化学的に修飾されたペプチドを提供する。
【００８５】
特定の実施態様では、本明細書は、セリン残基のリン酸化、メチオニン残基の酸化、及びリジン残基のアセチル化、及びこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの翻訳後修飾を有する配列番号１：RIHMVYSKRSGKPRGYAFIEY［配列番号１］のアミノ酸配列、すなわち、
【化４】
0006659693.tif 000005
を含むか若しくはからなる単離ペプチド又はその塩類を提供する。この態様の実施態様では、本明細書は、配列番号１のアミノ酸配列を有するか若しくはからなる単離及び／若しくは化学的に修飾されたペプチド（組み換え又は合成）又はその塩を含む組成物であって、該ペプチドが１０位にホスホセリンを含む組成物を提供する。特定の実施態様では、本明細書は、配列番号１のアミノ酸配列を有するか若しくはからなる単離及び／若しくは化学的に修飾されたペプチド（組み換え又は合成）又はその塩であって、１０位のホスホセリン及び４位の酸化メチオニン残基を含むペプチドを提供する。
【００８６】
特定の更なる実施態様では、配列番号１のペプチドは、アセチル化リジン残基も含む。具体的には、前記配列番号１のペプチドは、１０位のホスホセリンと、４位の酸化メチオニン残基と、８及び１２位のリジンの一方又は両方のアセチル化とを含み、そして、より具体的には、７位のホスホセリンを更に含む。
【００８７】
特定の実施態様では、本明細書は、９位のセリン（Ｓ）がリン酸化されており、そして、３位のメチオニン（Ｍ）が酸化されているアミノ酸配列：IHMVYSKRSGKPRGYAFIEY［配列番号２］を含むか又はからなる、単離及び／若しくは化学的に修飾されたペプチド（組み換え又は合成）又はその塩を提供する。
【００８８】
特定の実施態様では、本明細書は、以下の式：
【化５】
0006659693.tif 000006
を有する化合物Ｉのペプチドを提供する。
【００８９】
また、化合物Ｉは、IHM(O)VYSKRS(PO3H2)GKPRGYAFIEY［配列番号５］（式中、「M(O)」は、酸化メチオニンを表し、そして、「S(PO3H2)」は、ホスホセリンを表す）によって表すこともできる。
【００９０】
これらペプチドは、ヒトU1 snRNP ７０kDaタンパク質（配列番号３）に由来し、そして、配列番号３の残基１３２から残基１５１まで延在するアミノ酸セグメントによって限界が定められる領域に対応する。形式上、リン酸化されている残基は、配列番号３の最初のメチオニンから１４０番目の位置のアミノ酸に対応し、そして、酸化されている残基は、配列番号３の最初のメチオニンから１３４番目の位置のアミノ酸に対応する。
【００９１】
特定の態様では、本明細書は、セリン残基のリン酸化、メチオニン残基の酸化、及びリジン残基のアセチル化、並びにこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの翻訳後修飾を有する、配列番号１のアミノ酸配列を含むか若しくはからなる単離及び／若しくは化学的に修飾されたペプチド（組み換え又は合成）又はその塩を提供する。この態様の実施態様では、本明細書は、配列番号１のアミノ酸配列を有するか若しくはからなる単離ペプチド又はその塩を含む組成物であって、該ペプチドが１０位にホスホセリンを含む組成物を提供する。特定の実施態様では、配列番号１は、４位の酸化メチオニン残基も含む。特定の更なる実施態様では、配列番号１のペプチドは、アセチル化リジン残基も含む。
【００９２】
更なる態様では、本明細書は、セリン残基のリン酸化、メチオニン残基の酸化、及びリジン残基のアセチル化、並びにこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの翻訳後修飾を有する、配列番号２のアミノ酸配列を含むか若しくはからなる単離及び／若しくは化学的に修飾されたペプチド（組み換え又は合成）又はその塩を提供する。この態様の実施態様では、本明細書は、配列番号２のアミノ酸配列を有するか若しくはからなる単離及び／若しくは化学的に修飾されたペプチド（組み換え又は合成）又はその塩を含む組成物であって、該ペプチドが、９位のホスホセリン及び３位の酸化メチオニン残基を含む組成物を提供する。特定の更なる実施態様では、配列番号２のペプチドは、アセチル化リジン残基も含む。
【００９３】
特定の実施態様では、本明細書は、以下の式：
【化６】
0006659693.tif 000007
を有する化合物IIのペプチドを提供する。
【００９４】
また、化合物IIは、RIHM(O)VYSKRS(PO3H2)GKPRGYAFIEY［配列番号４］（式中、M(O)は、メチオニンの酸化を表し、そして、S(PO3H2)は、セリンのリン酸化を表す）によって表すこともできる。
【００９５】
したがって、本明細書は、配列番号４及び配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか若しくはからなるペプチド又はその塩を提供する。
【００９６】
更なる態様では、本明細書は、９位のホスホセリン及び３位の酸化メチオニンを含む配列番号２のアミノ酸配列；ペプチドが１０位にホスホセリンを含む配列番号１のアミノ酸配列又はその塩；１０位のホスホセリン及び４位の酸化メチオニンを含む配列番号１のアミノ酸配列、並びにこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つのペプチド又はその塩を有効量含む組成物を提供する。
【００９７】
本明細書は、配列番号１、２、４、５、及びこれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか若しくはからなるペプチド及び／又はその塩に加えて、それを含む組成物を提供する。
【００９８】
特定の実施態様では、本明細書は、１０位にホスホセリンを含む、配列番号１のアミノ酸配列を有する単離及び／又は化学的に修飾されたペプチド（組み換え又は合成）を提供する。特定の実施態様では、P140ペプチドは、４位の酸化メチオニンも含む（例えば、配列番号４）（本明細書では、化合物II又はP140(MO)とも呼ばれる）。特定の実施態様では、本明細書は、１０位のホスホセリン及び４位の酸化メチオニンを含む配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するペプチド又はその塩と、担体、例えば、薬学的に許容し得る担体とを提供する。特定の更なる実施態様では、本明細書は、有効量の、１０位のホスホセリン及び４位の酸化メチオニンを含む配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するペプチド又はその塩と、担体、例えば、薬学的に許容し得る担体とを含む組成物、例えば、処置用組成物を提供する。
【００９９】
本明細書によれば、それぞれ、配列番号１、２、４、又は５のアミノ酸配列を有する単離及び／又は化学的に修飾されたペプチド（組み換え又は合成）は、少なくとも１つの翻訳後修飾（ペプチドの合成後に生じる修飾）によって修飾される。特定の実施態様では、翻訳後修飾は、リン酸化（リン酸塩PO3H2の付加）、例えば、セリン残基のリン酸化；酸化、例えば、メチオニン残基の酸化；アセチル化、例えば、リジン残基のアセチル化；及びこれらの組合せからなる群から選択される。特定の実施態様では、それぞれ、配列番号１、２、４、又は５のアミノ酸配列を有する単離及び／又は化学的に修飾されたペプチド（組み換え又は合成）は、少なくとも２つの翻訳後修飾によって修飾される。
【０１００】
好ましい実施態様では、本明細書は、９位のホスホセリン及び３位の酸化メチオニンを含む配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する単離及び／若しくは化学的に修飾されたペプチド（組み換え又は合成）又はその塩を提供する。特定の実施態様では、本明細書は、９位のホスホセリン及び３位の酸化メチオニンを含む配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するペプチド又はその塩と、担体、例えば、薬学的に許容し得る担体とを提供する。特定の更なる実施態様では、本明細書は、有効量の、９位のホスホセリン及び３位の酸化メチオニンを含む配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するペプチド又はその塩と、担体、例えば、薬学的に許容し得る担体とを含む組成物、例えば、処置用組成物を提供する。
【０１０１】
別の実施態様では、本明細書は、１０位のホスホセリン及び４位の酸化メチオニンを含む配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する単離及び／若しくは化学的に修飾されたペプチド（組み換え又は合成）又はその塩を提供する。特定の実施態様では、本明細書は、１０位のホスホセリン及び４位の酸化メチオニンを含む配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するペプチド又はその塩と、担体、例えば、薬学的に許容し得る担体とを提供する。特定の更なる実施態様では、本明細書は、有効量の、１０位のホスホセリン又はその塩及び４位の酸化メチオニンを含む配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するペプチドと、担体、例えば、薬学的に許容し得る担体とを含む組成物、例えば、処置用組成物を提供する。
【０１０２】
別の実施態様では、本明細書は、９位のホスホセリン及び３位の酸化メチオニンを含む配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する単離及び／若しくは化学的に修飾されたペプチド（組み換え又は合成）又はその塩を提供する。特定の実施態様では、本明細書は、９位のホスホセリン及び３位の酸化メチオニンを含む配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するペプチド又はその塩と、担体、例えば、薬学的に許容し得る担体とを提供する。特定の更なる実施態様では、本明細書は、有効量の、９位のホスホセリン及び３位の酸化メチオニンを含む配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するペプチド又はその塩と、担体、例えば、薬学的に許容し得る担体とを含む組成物、例えば、処置用組成物を提供する。
【０１０３】
驚くべきことに、そして、予想外にも、本明細書に記載するペプチドが、酸化されていない対応物と比べて、インビトロにおいてより安定であることが見出された。安定性は、実施例の項に開示する通り測定される。リン酸化−酸化ペプチドは、酸化されていない対応物と比べて、溶液中で自然に分解される量が少なく、前記安定性は、その生物学的特性を強化する。更に、本発明者らは、驚くべきことに、先行技術の教示とは対照的に、メチオニンの酸化が、このようなペプチドの生物学的効果に影響を与えることなく、ペプチドの安定性を強化することを特定した。実際、酸化メチオニンを含有するタンパク質又はペプチドは、その三次元構造及び／又は生物活性が破壊されていると当技術分野において大きく報告されている。本明細書に記載の修飾ペプチドは、実施例の項に開示する通り、酸化されていない対応物と本質的に同一の、HSC70タンパク質に対する親和性を有する。
【０１０４】
特定の実施態様では、酸化は、配列番号２の９位及び配列番号１の１０位におけるメチオニン（Ｍ）において生じ、これらは、配列番号３の１３４位と等価な位置である。硫黄原子は、以下に示す通り酸化される。
【化７】
0006659693.tif 000008
【０１０５】
上記ペプチド（配列番号１、２、４、及び５）は、生物合成又は化学合成等の当技術分野において一般的に用いられている技術によって合成することができる。生物合成とは、対象となるペプチドをコードしている核酸分子の転写及び翻訳によって、前記ペプチドをインビボ、インビトロ、又はエクスビボで生成することを指す。
【０１０６】
例えば、核酸配列：MGNATHCAYATGGTNTAYWSNAARMGNWSNGGNAARCCNMGNGGNTAYGCNTTYATHGARTAYTRR［配列番号６］は、配列番号１のペプチドを生成するために、インビトロ系又は宿主生物のいずれかにおいて転写及び翻訳される。生成されたペプチドは、周知の技術に従って精製される。
【０１０７】
化学合成は、必要なアミノ酸を付加することによって所望のペプチドを重合させることからなる。方法は、実施例の項に開示する。
【０１０８】
古典的なFmoc（Ｎ−[９−フルオレニル］メトキシカルボニル）固相化学によって配列番号１及び２のペプチドを化学的に合成し、そして、逆相高性能液体クロマトグラフィ（HPLC；Neimark and Briand, 1993；Monneaux et al., 2003, Eur. J. Immunol. 33,287-296；Page et al., 2009, PloS ONE 4,e5273）によって精製することができる。
【０１０９】
また、それぞれ１０位及び９位の残基がリン酸化されている配列番号１及び２のペプチドを直接合成することもできる。この目的のために、ペプチド合成中、所望の位置においてFmoc-Ser(PO(Obz)OH)-OH-型セリン誘導体を用いた。
【０１１０】
当技術分野において周知のプロトコルに従って、ペプチド合成後にリン酸基（-PO3H2）を付加してもよい。
【０１１１】
アデノシン三リン酸（ATP）の存在下、配列番号１又は２のペプチドをプロテインキナーゼＡ若しくはＣ（PKA又はPKC）又はカゼインキナーゼIIから選択される特異的セリンキナーゼと共にインキュベートすることによってセリンをリン酸化することができる。このようにして、一方のセリン（配列番号２の６位若しくは９位、又は配列番号１の７位若しくは１０位）又は両方のセリンにおいてペプチドがリン酸化される。所望のリン酸化されたペプチドは、例えば、クロマトグラフィによって他のペプチドから分離される。
【０１１２】
当業者の常識に従って当業者が容易に選択することができる特異的保護基を用いることによって、特定の位置（配列番号２の９位又は配列番号１の１０位）に-PO3H2の化学的付加を付加してもよい。
【０１１３】
セリンの特異的リン酸化を可能にする当技術分野において公知の任意の他の技術を用いてもよい。
【０１１４】
特定の実施態様では、メチオニンの酸化は、以下のプロセスに従って実施される：３７℃で４時間、２０mM H2O2で処理するか、又は２２℃で３０〜１８０分間、０．１M ジメチルスルホキシド（DMSO；Me2SO）＋０．５M HClの溶液中で処理する。
【０１１５】
メチオニンの特異的酸化を可能にする当技術分野において公知の任意の他の技術を用いてもよい。
【０１１６】
本明細書に記載する態様又は実施態様のいずれかでは、本明細書によって提供されるペプチドは、当業者に公知の塩の形態、例えば、ナトリウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、塩化物、硫酸塩、アミノ塩酸塩（amino chlorhydate salts）、ホウ化水素塩（borhydrate salts）、ベンゼンスルホン酸塩、リン酸塩、二水素リン酸塩（dihydrogenophosphate salts）、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩（メシラート）、又はｐ−トルエンスルホン酸塩（トシラート）で存在し得る。このリストは、一例として提供されるものであって、本発明を限定することを意味するものではない。例えば、当業者は、当業者の知見に従って適切な塩を容易に決定することができる。
【０１１７】
更なる実施態様では、本明細書は、１０位にホスホセリンを含むアミノ酸配列：RIHMVYSKRSGKPRGYAFIEY［配列番号１］を含むか又はからなるペプチドを提供する。特定の実施態様では、リン酸化ペプチドは、４位に酸化メチオニン又はその塩を更に含む。１つの有利な実施態様では、本発明は、配列番号４のアミノ酸からなる上に定義したペプチド又はその塩に関する。
【０１１８】
医薬組成物
別の態様では、本明細書は、有効量の本明細書に記載するペプチドのうちの１つ以上と、賦形剤又は担体とを含む組成物を提供する。したがって、更なる実施態様では、本明細書は、また、少なくとも本明細書に記載のペプチド又は上記組合せ生成物を含み、更に薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を提供する。
【０１１９】
本明細書に記載するペプチド（本明細書では「活性化合物」とも称される）は、投与に好適な医薬組成物に配合され得る。このような組成物は、典型的には、ペプチドと薬学的に許容し得る担体とを含む。本明細書で使用するとき、用語「薬学的に許容し得る担体」は、医薬投与に適合する任意の、そして、全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等を含むことを意図する。薬理学的活性物質のためにこのような媒体及び剤を使用することは、当技術分野において周知である。任意の従来の媒体又は剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、組成物におけるその使用が企図される。また、追加の活性化合物を組成物に配合してもよい。
【０１２０】
本明細書は、医薬組成物を調製する方法を提供する。このような方法は、薬学的に許容し得る担体を本明細書に記載のペプチドと共に製剤化することを含む。このような組成物は、更に、上記追加の活性剤を含んでいてもよい。したがって、本発明は、更に、薬学的に許容し得る担体を本明細書に記載のペプチドと、そして、１つ以上の追加の活性化合物と共に製剤化することによって医薬組成物を調製する方法を含む。
【０１２１】
本発明の医薬組成物は、その意図する投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例は、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、口腔内、鼻腔内（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、及び直腸内の投与を含む。非経口、皮内、又は皮下への適用のために用いられる溶液又は懸濁液は、以下の成分を含んでいてよい：無菌希釈剤、例えば、注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコール；酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸又は重硫酸ナトリウム；キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸；バッファ、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩；及び塩化ナトリウム又はデキストロース等の浸透圧を調整するための剤。酸又は塩基、例えば、塩酸又は水酸化ナトリウムを用いてpHを調整してよい。非経口調製品は、ガラス又はプラスチックで作製されたアンプル、使い捨てシリンジ、又は複数回投与用バイアルに封入してよい。
【０１２２】
注射可能な用途に好適な医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性である場合）又は分散液、並びに滅菌注射溶液又は分散液を即時調製するための滅菌粉末を含む。静脈内投与の場合、好適な担体は、生理学的食塩水、静菌水、Cremophor EL（BASF；Parsippany, N.J.）、又はリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を含む。全ての場合において、該組成物は、滅菌されていなければならず、そして、容易に注射可能である程度に流体でなければならない。該組成物は、製造及び保存条件下で安定でなければならず、そして、細菌及び真菌等の微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、及びこれらの好適な混合物を含有する溶媒又は分散媒であってよい。例えば、レシチン等のコーティングを使用することによって、分散液の場合は必要な粒径を維持することによって、そして、界面活性剤を使用することによって、適切な流動性を維持することができる。微生物の作用は、例えば、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸等の様々な抗菌剤及び抗真菌剤によって阻止することができる。多くの場合、該組成物中に等張剤、例えば、糖、多価アルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール）、又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物は、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン等の吸収を遅延させる剤を該組成物中に含めることによって、持続的に吸収させることができる。
【０１２３】
滅菌注射液は、必要に応じて、上に列挙した成分のうちの１つ又は成分の組合せと共に、必要量の活性化合物（例えば、ポリペプチド又は抗体）を適切な溶媒中に配合し、次いで、滅菌濾過することによって調製することができる。一般的に、分散液は、塩基性分散媒を含有する滅菌ビヒクルに活性化合物を配合し、次いで、上に列挙したもののうちの必要な他の成分を配合することによって調製される。滅菌注射液を調製するための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は真空乾燥及び凍結乾燥であり、これにより、その既に滅菌濾過された溶液から活性成分＋任意の更なる所望の成分の粉末が得られる。
【０１２４】
経口組成物は、一般的に、不活性希釈剤又は可食性担体を含む。経口組成物は、ゼラチンカプセルに封入されてもよく、又は錠剤に圧縮されてもよい。経口処置用投与の目的のために、活性化合物は、賦形剤と共に配合され、そして、錠剤、トローチ剤、又はカプセル剤の形態で使用され得る。また、経口組成物は、含嗽剤として使用するために流体担体を用いて調製してもよく、この場合、該流体担体中の化合物を経口的に適用し、そして、すすぎ、そして、吐き出すか又は飲み込む。
【０１２５】
吸入によって投与する場合、化合物は、好適な噴射剤、例えば、二酸化炭素等の気体を含有する加圧容器若しくはディスペンサ、又は噴霧器からエアロゾルスプレーの形態で送達される。
【０１２６】
また、経粘膜又は経皮的な手段によって全身投与してもよい。経粘膜又は経皮投与については、浸透するバリアに適切な浸透剤を製剤において用いる。このような浸透剤は、一般的に、当技術分野において公知であり、そして、例えば、経粘膜投与の場合、洗浄剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻腔用スプレー又は坐剤の使用を通して行ってよい。経皮投与の場合、活性化合物は、当技術分野において一般的に知られている通り、外用剤、軟膏剤、ゲル剤、又はクリーム剤に製剤化される。
【０１２７】
また、化合物は、直腸内に送達するために坐剤（例えば、従来の坐剤基剤、例えば、カカオバター及び他のグリセリドを用いて）又は停留浣腸の形態で調製することができる。
【０１２８】
一実施態様では、活性化合物は、例えば、インプラント及びマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤等、身体からの急速な排出に対して該化合物を保護する担体と共に調製される。例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸等の生分解性、生体適合性ポリマーを用いてよい。このような製剤を調製する方法は、当業者に明らかである。また、材料は、Alza Corporation及びNova Pharmaceuticals, Inc.から商業的に入手してもよい。（モノクローナル抗体がその内部又は上に組み込まれているリポソームを含む）リポソーム懸濁液を薬学的に許容し得る担体として用いてもよい。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載の通り、当業者に公知の方法に従って調製することができる。
【０１２９】
投与を容易にし、そして、投薬量を均一にするために、経口又は非経口組成物を単位剤形で製剤化することが特に有利である。本明細書で使用するとき、単位剤形とは、処置される被験体にとって１回の投薬量として適している物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な医薬担体と共同して所望の処置効果を生じさせるように計算された所定の量の活性化合物を含有する。本発明の単位剤形の規格は、活性化合物の独自の特徴、及び達成される具体的な処置効果、及び個体を処置するためにこのような活性化合物を配合する技術分野における固有の制約によって決定され、そして、直接依存する。
【０１３０】
本明細書に提供される方法の特定の実施態様では、該方法は、約１００ng〜約５mgの投薬量の本明細書に記載する処置用又は医薬組成物を投与する工程を含む。特定の実施態様では、例えば、ヒトでは、本明細書に記載する医薬組成物は、担体としてマンニトールを含有してよく、そして、該組成物は、単回投与において、１０μg〜５００μg、好ましくは、２００μg投与される。
【０１３１】
特定の更なる態様では、投薬レジメンは、処置濃度域を必要とする限り１〜３回／週、毎週〜４週間毎、ひいては数年間にわたって再現され得る。好ましい実施態様では、投薬レジメンは、４週間の処置毎に１回であるが、数年間にわたって１年間に２回繰り返してもよい。投与の例は、１２週間にわたって４週間毎にペプチド ２００μgを１回注射することである（すなわち、互いに４週間離して３回注射する）。処置は、６ヶ月間毎に投与することによって延長してよい。
【０１３２】
好ましい薬学的に許容し得る担体は、例えば、キサンタンガム、ローカストビーンガム、ガラクトース、他の糖類、オリゴ糖類及び／又は多糖類、デンプン、デンプン断片、デキストリン、イギリスゴム、並びにこれらの混合物を含んでいてよい。有利には、薬学的に許容し得る担体は、天然起源である。薬学的に許容し得る担体は、単糖又は二糖から選択される不活性糖希釈剤であってもよく、又は該希釈剤を更に含んでもよい。有利な糖は、マンニトールである。
【０１３３】
有利には、本発明は、上に定義した医薬組成物に関し、これは、リポソーム若しくはナノ粒子の形態、又は溶液の形態である。有利な溶液は、１〜１５％、特に約１０％のマンニトールを含む溶液である。溶液は、等張でなければならない。
【０１３４】
また、本発明は、同時、別々、又は逐次使用するための、上に定義した組合せ生成物を含む薬物に関する。
【０１３５】
処置方法
更なる態様では、本明細書は、自己免疫疾患又は慢性炎症性疾患若しくは障害の症状を治療、予防、又は改善する方法であって、有効量の本明細書に記載する処置用組成物をそれを必要としている被験体に投与することを含み、該組成物が、慢性炎症関連疾患又は障害の少なくとも１つの症状を治療、予防、及び／又は改善するのに有効である方法を提供する。
【０１３６】
更なる態様では、本明細書は、ハイパーオートファジー関連免疫系疾患又は障害、例えば、ハイパーCMA関連自己免疫疾患の症状を治療、予防、又は改善する方法であって、有効量の本明細書に記載する処置用組成物をそれを必要としている被験体に投与することを含み、該組成物が、ハイパーオートファジー、例えば、ハイパーCMA関連疾患又は障害の少なくとも１つの症状を治療、予防、及び／又は改善するのに有効である方法を提供する。（例えば、以下の表３）。
【０１３７】
特定の実施態様では、該疾患又は障害は、過剰な又は増加したオートファジー、例えば、CMAに関連する慢性炎症性疾患又は障害である。特定の実施態様では、該疾患又は障害は、関節リウマチ（RA）、多発性硬化症（MS）、ミオパシー、筋ジストロフィー（MD）、クローン病（CD）、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、線維筋痛、多発性筋炎、肺疾患、慢性免疫性血小板減少症（ITP）、神経精神ループス、グジュロー・シェーグレン症候群、関節リウマチ、ギラン・バレー病（慢性／CIDP）、喘息（急性又は慢性）、好酸球性気道炎症、過敏性腸症候群（IBS又はIBD）、慢性炎症性脱髄性多発根神経障害（CIDP）、II型糖尿病、脂肪組織の再生、強皮症、乾癬、アルツハイマー病、又はパーキンソン病のうちの少なくとも１つである。
【０１３８】
特定の実施態様では、自己免疫疾患は、結合組織疾患（非特異的全身器官疾患）のファミリーの自己免疫病理、例えば、全身性エリテマトーデス（SLE）、関節リウマチ、混合結合組織病、シェーグレン症候群、若しくは慢性若年性関節炎；及び／又は器官特異的自己免疫病理、例えば、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、クローン病、又は水疱性疾患から選択される。好ましい実施態様では、自己免疫疾患は、SLEである。
【０１３９】
更なる態様では、本明細書は、また、自己免疫疾患を処置する方法であって、有効量の本明細書に記載する医薬組成物を、このような処置を必要としている被験体（例えば、哺乳類、例えば、ヒト等の患者）に投与する工程を含み、該組成物が、該処置を達成するのに十分である方法を提供する。別の態様では、本明細書は、自己免疫疾患を処置する方法において使用するための本明細書に記載する組成物であって、該方法が、有効量の本明細書に記載する医薬組成物をそれを必要としている患者に投与する工程を含み、該組成物が、該処置を達成するのに十分である組成物を提供する。
【０１４０】
特定の実施態様では、自己免疫疾患は、結合組織疾患（非特異的全身器官疾患）のファミリーの自己免疫病理、例えば、全身性エリテマトーデス（SLE）、関節リウマチ、混合結合組織病、シェーグレン症候群、若しくは慢性若年性関節炎；及び／又は器官特異的自己免疫病理、例えば、多発性硬化症、クローン病、又は水疱性疾患から選択される。好ましい実施態様では、自己免疫疾患は、SLEである。
【０１４１】
本明細書は、また、本明細書に記載するペプチドを含む薬物、及び／又は薬物としてそれを使用するため、特に自己免疫疾患を処置するための本明細書に記載する組合せを提供する。
【０１４２】
任意の特定の理論に縛られるものではないが、本発明者らは、ホスホペプチドの結合及び内部移行を媒介するためにHSC70の結合が重要であり、したがって、HSC70の結合が本明細書に記載するペプチドの処置効果を媒介すると仮定する。したがって、本明細書は、また、細胞表面におけるHSC70の過剰発現によって引き起こされる病態を処置するか又は改善させる方法であって、それを必要としている患者に、有効量のホスホペプチド、例えば、本明細書に記載する修飾ペプチドを投与する工程を含み、該ペプチドが、該病態の少なくとも１つの症状を治療するか又は改善をもたらす方法を提供する。
【０１４３】
１０位のセリンがリン酸化されている配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドは、以下の化合物III：
【化８】
0006659693.tif 000009
に対応する。
【０１４４】
実施例
実施例１：ペプチドの化学合成。
P140ペプチド及びP140(MO)を、古典的なFmoc（Ｎ−[９−フルオレニル］メトキシカルボニル）固相化学を用いて合成し、そして、逆相高性能液体クロマトグラフィ（HPLC；Neimark and Briand, 1993；Monneaux et al., 2003, Eur. J. Immunol. 33,287-296；Page et al., 2009, PloS ONE 4,e5273）によって精製した。その均質性を分析HPLCによって確認し、そして、アイデンティティをFinnigan LCQ Advantage Max system（Thermo Fischer Scientific）においてLC/MSによって評価した。反応の完了後、ペプチドをHPLCによって精製した。
【０１４５】
配列番号３の残基１４０と等価なセリン残基にリン酸化を導入するために、Fmoc-Ser(PO(Obz)OH)-OH-型セリン誘導体を用いた。カップリング時間を３０分間まで増加させ、そして、第２のカップリングを体系的に実施する。酸媒体中で切断した後、各ペプチドを冷エーテルによって沈殿させ、水及びアセトニトリルの溶液に可溶化させ、そして、最後に凍結乾燥させる。次いで、ペプチドをRP-HPLCによって精製し、その完全性及び純度を分析HPLC及び質量分析（Maldi-TOF）によって分析した。上述の通り酸化を導入する。
【０１４６】
実施例２：ペプチドの安定性。
１０位のセリンがリン酸化され、そして、４位のメチオニンが酸化されている配列番号２のペプチド（P140(MO)）及び１０位のセリンがリン酸化されている配列番号１のペプチド（P140）の安定性を、１０％（v/v） マンニトールの溶液中３７℃で測定した。各ペプチドにつき、３つの濃度を試験した：２００、１００、及び５０μg/mL。
【０１４７】
指定の時間に、未変化のペプチドに対応するピークの面積から高性能液体クロマトグラフィによって生理食塩水中でP140及びP140(MO)ペプチドの完全性を測定した。
【０１４８】
結果を図３に示す。
【０１４９】
以下の表１及び２は、結果を要約する：
【０１５０】
【表１】
0006659693.tif 000010
【０１５１】
【表２】
0006659693.tif 000011
【０１５２】
安定性は、HPLCピーク表面を用いることによって測定する。
【０１５３】
P140M(O)の安定性は、各試験濃度（５０〜２００μg/mL）について、３７℃で１００日間にわたって変化しない（１００％、９９．１％、及び９９．４％）。
【０１５４】
P140の安定性は、各試験濃度（５０〜２００μg/mL）について、経時的に減少し、そして、３７℃で１００日間後に低下する（９７．４％、９３．４％、及び８９．６％）。
【０１５５】
これらデータは、ペプチドP140におけるメチオニンの酸化がペプチドの安定性を強化することを証明する。P140M(O)は、１００日間にわたって試験した全ての濃度で安定である。
【０１５６】
実施例２：MRL/lprマウスにおけるペプチドの処置効果。
MRL/lprマウス系統は、ヒト疾患と臨床的に類似していることが見出されている全身性エリテマトーデス様症状を遺伝的に発現しやすいマウス亜系である。このマウス系統はfas遺伝子に突然変異を有することが判明している。また、MRL/lprは、自己免疫疾患においてみられる行動障害及び認知障害、並びに免疫抑制剤の有効性について研究するための有用なモデルである［Monneaux et al., 2003, Eur. J. Immunol. 33,287-296］。
【０１５７】
２．１−生存分析
５週齢雌MRL/lprマウスに、記載の通り（Monneaux et al., 2003, Eur. J. Immunol. 33,287-296）P140又はペプチドP140(MO)を静脈内投与した。全ての実験プロトコルは、local Institutional Animal Care and Use Committee（CREMEAS）の承認を得て実施した。対照として、マウスにNaClを注射した。
【０１５８】
各ペプチド又はNaClにつき２０頭のマウスを用いた。
【０１５９】
結果を図４に示す。
【０１６０】
ログランク（Mantel-Cox）検定を適用し、そして、結果は以下の通りである：NaCl対P140 ｐ＝０．０６８６、NaCl対P140(MO) ｐ＝０．００２６、P140対P140M(O) ｐ＝０．２３６６。
【０１６１】
マウスの中央生存期間は、NaCl＝２５週間、P140＝２９週間、及びP140 (MO)＞４０週間である。これら結果は、マウスにおけるループスの処置におけるインビボでのP140(MO)ペプチドの有効性を証明する。
【０１６２】
２．２−タンパク尿分析
上記マウスのタンパク尿を、Albustix（Bayer Diagnostics）を用いて新鮮尿で測定し、そして、製造業者によって推奨される０〜４の尺度に従って半定量的に推定した（タンパク尿無し＝０；微量＝１；１＋＝２；２＋＝３；３＋＝４；４＋＝５）。
【０１６３】
結果を図５に示す。
【０１６４】
この図では、タンパク尿がそれほど重要ではなく、そして、未処理マウスに比べてP140M(O)処理マウスの方が後で生じることが観察される。
【０１６５】
２．３−細胞充実性分析
MRL/lprマウスに１００μg/１００μL P140又はP140(MO)を注射し、そして、この独自の注射の５日間後に細胞充実性（末梢血）を試験した。カウントは、全ての白血球を含む。試験したマウスの数が少ないことを考慮して、ノンパラメトリック統計検定を実現した（Mann-Whitney）。結果を図６に示す。
【０１６６】
このように、ループスの急性マウスモデルにおいて、配列番号４のペプチドは、末梢細胞過形成を減少させることができ、そして、少なくともP140と同様又はそれ以上の有効性で疾患の生物学的及び臨床的徴候を遅延させる。
【０１６７】
統計値
GraphPad Prism version 5.0を用いて統計検定を実施した。二要因分散分析を用いて、マウスの対照群とペプチド処理群との間のタンパク尿の差の統計的有意性を解析した。対照及びP140アナログで処理した雌MRL/lprマウスの生存期間をカプラン・マイヤー法によって解析し、そして、差の有意性をログランク検定によって決定した。他の変数については、スチューデントｔ検定を用いて統計的有意性を評価した。０．０５未満のｐ値を有意であるとみなした。
【０１６８】
実施例３：HSC70タンパク質に対するペプチドの親和性。
BIAcore 3000システム（Biacore AB）を用いて、P140ペプチドのHSC70タンパク質に対する結合を評価した（Page et al., 2009, and 2011）。センサチップCM5、界面活性剤P20、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）及びＮ−エチル−Ｎ’−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（EDC）を含有するアミンカップリングキット、２−（２−ピリジニルジチオ）エタンアミン（PDEA）、並びにエタノールアミンは、Biacore AB製であった。ランニングバッファとしてHBS-EPバッファ（１０mM HEPES、１５０mM NaCl、３mM EDTA、０．００５％ 界面活性剤P20、pH７．４）を用いてバイオセンサアッセイを実施した。化合物をランニングバッファで希釈した。１０mM HCl １０μLを注入することによって、各実験後にセンサチップ表面を再生した。NHS/EDC−活性化マトリクス上で５０mM ホウ酸バッファ（pH８．３）中PDEA ３５μLを用いて、そのチオール基を通してCM5センサチップのフローセルに組み換えウシHSC70（Stressgen）を固定化した。次いで、１３ng/mm2HSC70に対応する１３，０００応答単位（RU）の応答が固定化されるまで、HSC70 ３５μL（ギ酸バッファ（pH４．３）中１００μg/mL）を注入した。５０mM システイン／１M NaCl溶液 ２０μLを用いて、チップ上の非占有部位を飽和させた。P140ペプチドのHSC70に対する直接結合の測定を、２５℃で２０μL/分の一定流速で実施した。P140ペプチド及びアナログを３分間異なる濃度でフラックスに注入し、その後、３分間解離相であった。パソコンでBIAeval 3.1ソフトウェアを用いて速度パラメータを計算した。単純１：１ラングミュア結合モデルを用いて解析を実施した。対照空チャネル及びブランクバッファ注入から応答シグナルを減じた後、特異的結合プロファイルを得た。c２値及び理論的モデルと比較した残留率分布のランダム性によって、各モデルへの当てはめを判定した。
【０１６９】
結果を表３及び４、並びに図７及び８に示す。
【０１７０】
これら表は、HSC70に対する親和性が、P140ペプチドとP140M(O)ペプチドとの間で統計的に異なっていないことを示す。
【０１７１】
したがって、これら２つのペプチドは、同じ効率でHSC70に結合する。
【０１７２】
実施例３：RAにおけるP140ペプチドの効果。
この実施例では、スプライセオソームU1-70Kタンパク質の配列１３１〜１５１を包含し、そして、１４０位にホスホセリン残基を含有するP140ペプチド（２１merの線状ペプチド）を試験した。P140処理後、オートファジーフラックスのダウンレギュレーションと一致して、オートファジーマーカーであるSQSTM1及びMAP1LC3のMRL/lpr B細胞への蓄積が観察された（Page et al., 2011）。また、シャペロン介在性オートファジー（CMA）もP140ペプチドの標的であることが見出され、そして、CMAに対するP140ペプチドの阻害効果が、HSPA8シャペロンタンパク質と相互作用する能力（Page et al., 2009）及びHSPA8ヘテロ複合体の組成を変化させる能力（Macri et al., in press）に関連している可能性があることが証明された。HSPA8、及びMRL/lpr B細胞で増加するCMAの律速成分であるLAMP-2Aの発現はいずれも、P140ペプチドでマウスを処理した後にダウンレギュレートされる（Page et al., 2011；Macri et al., in press）。マウスにおける疾患発現から保護しない非リン酸化ペプチド（Monneaux et al., 2003）を除いて、P140は、MRL/lpr Bリンパ球に入るクラスリン依存性エンドリソソーム経路を使用し、そして、リソソーム内腔に蓄積し、そこで、リソソームのHSPA8シャペロン化機能を直接妨害し得、また、HSP90に対する効果の結果としてリソソームにおいてLAMP-2Aを不安定化し得る（Macri et al., in press）ことが更に示された。この二重効果は、内因性（自己）抗原のプロセシング及びMHCII分子へのロードに干渉し得、その結果、実験的に既に示されている自己反応性Ｔ細胞の活性化低下につながる（Monneaux et al., 2004；Monneaux et al., 2007）。
【０１７３】
最近の研究では、RA並びに他の自己免疫疾患においてオートファジーが増加する可能性があることが示唆されている（表３；Wilhelm & Muller, submitted）。この活性化は、クローン病（CD）、RA、多発性筋炎（PM）、及び多発性硬化症（MS）について提唱されているが、対照的に、オートファジーが減少する可能性がある自己免疫性糖尿病では提唱されていない。
【０１７４】
【表３】
0006659693.tif 000012
【０１７５】
（１）略記：ATG、オートファジー関連遺伝子；BECN1、ベクリン−１；CD、クローン病；CMA、シャペロン介在性オートファジー；CTSB、カテプシンＢ；CTSD、カテプシンＤ；DRAM1、損傷制御性オートファジー調節因子；EM、電子顕微鏡；FM、蛍光顕微鏡；HSPA8、熱ショックタンパク質８；IRGM、免疫関連GTPaseファミリーＭタンパク質；LAMP-2A、リソソーム関連膜タンパク質２Ａ；MaA、マクロオートファジー、MAP1LC3、微小管関連タンパク質鎖３；MS、多発性硬化症；PCR、ポリメラーゼ連鎖反応；PM、多発性筋炎；PRDM1、正の制御ドメインＩ−結合因子１；RA、関節リウマチ；SLE、全身性エリテマトーデス；WB、ウエスタンブロット。（２）これら変化を評価するために用いた方法を括弧内に記載する。
【０１７６】
エクスビボにおいて、（増殖を誘導する非リン酸化形態とは対照的に、そして、MRL/lprの状況でエクスビボにおいて示されたデータとは対照的に）P140はループス患者由来の末梢Ｔ細胞の増殖を誘導しないが、細胞培養物において高いレベルの制御性サイトカインIL-10を分泌させる（Monneaux et al., 2005）。他の自己免疫疾患患者由来のＴ細胞を試験したとき、培養物において増殖もIL-10生成も観察されなかった（Monneaux et al., 2005）。関節リウマチ（RA）、原発性シェーグレン症候群、自己免疫性難聴、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、及び自己免疫性肝炎の患者（ｎ＝２７）を評価し、加えて、非自己免疫疾患又は感染性疾患で入院している４人の患者も評価した。
【０１７７】
これらデータ（小さな患者群で実施）によって、本発明者らは、ペプチドP140は、末梢ループスCD4+ T細胞を非常に特異的に刺激するが、他の病態生理学的病態を有する患者に由来するＴ細胞は刺激しない可能性が最も高いと結論付けた（Monneaux et al., 2005）。また、これらデータは、これら疾患におけるオートファジーの欠陥の可能性のある制御因子としてのP140ペプチドの潜在的効果とは反対であった。
【０１７８】
次に、RA様疾患を発現するマウスのモデルにP140ペプチドを投与した（本発明者らは、MRL/lpr−ループスになりやすいマウスのネガティブコントロールとしてこのマウスモデルを用いることを見込んでいた）。コラーゲン誘発関節炎（CIA）マウスモデルと呼ばれるこのモデルは、最も一般的に研究されているRAの自己免疫モデルである。このモデルでは、完全フロインドアジュバント（CFA）及びII型コラーゲン（CII）のエマルションでDBA/1マウスを免疫することによって自己免疫性関節炎が誘導され、そして、典型的には、関節炎の最初の徴候は、免疫の２１〜２８日間後に現れる（Brand et al., 2007）。CIAは、ヒトRAと幾つかの病理学的特徴を共有しており、そして、CIIは、RAの標的組織である軟骨における主なタンパク質である。病理学的特徴は、滑膜の過形成、単核細胞の浸潤、及び軟骨の退化を含む。これらマウスにおける易罹患性は、特異的MHCクラスII遺伝子の発現に関連しており、DBA/1はH-2qハプロタイプを有する。
【０１７９】
したがって、本発明者らがMRL/lprマウスにおいて用いた設定（１００μg/注射/マウス）に近い設定で、−１、＋７、＋１４、及び＋２０日目にP140ペプチドをDBA/1マウスに静脈内投与した。CFA中CIIは、＋１及び＋２１日目に注射した（２００μg、皮内経路）。マウスの体重及びその臨床スコアは、非常に古典的な手順に従った。生物学的パラメータも評価した（すなわち、Ｔ細胞の応答、抗体の応答、関節の組織像等）。
【０１８０】
この実験で得られた結果は、スクランブルドペプチドScP140を投与したマウス由来のCD4+ T脾細胞が、培養物に添加されたCIIの存在下、エクスビボで正常に増殖することを示す（図９；１００μg CII/mL；FACSによるCFSEアッセイを用いて測定）。しかし、著しく対照的に、P140ペプチドを投与したマウスの脾臓からCD4 T細胞を回収した場合、増殖は大きく減少した（ScP140とP140との間のｐ＝０．０５３９）。
【０１８１】
CD8+ T細胞を同条件で試験したとき、効果は観察できなかった。はるかにより詳細にこの応答を特徴付ける更なる結果が待たれる。また、組織像は、これら細胞学的データを完全なものにする。
【０１８２】
いかなる場合も、予測することができなかったこれら結果は、本発明者らがP140で処理したMRL/lprループス易発性マウス由来のCD4+ T細胞を試験したときに見出したものをRAにおいて模倣することができる操作スキームを示唆する。MRL/lprマウスでは、P140は、Ｂ細胞表面におけるMHCII発現の著しい減少を誘導し（CMAに対する効果を介して）、したがって、抗原提示細胞による抗原性ペプチドの提示を低減し、これは、重要な事柄として、末梢自己反応性Ｔ細胞の反応性の低下及び疾患状態の改善につながる。したがって、該データは、P140ペプチドが、CMA活性の低下が望ましい様々な他の病的状態において有効であり得ることを示す。
【０１８３】
現在、RAにおいてCMAが変化することを細胞レベルで示す入手可能なデータは存在しない。この病状におけるリソソームの特性に関する情報は存在しない。今後の研究は、オートファジーフラックスがRAマウス及びRA患者由来のＢ細胞において増加し、そして、この状況においてCMAが変化することの可能な実証に集中すべきである。
【０１８４】
特にCD、PM、強皮症（SSc）、及びMSにおいて、関連するデータを蓄積するために他の病態生理学的状況についても試験する。CD（例えば、IL-10 KOマウス、SAMP1/YitFcマウス、又は近交系ラットを用いたペプチドグリカン−多糖モデル）及びMS（実験的自己免疫性脳脊髄炎EAEのマウス及びラットのモデル）については、確立されたマウスモデルが利用可能である。しかし、現在、PM及びSScについては良好な動物モデルが存在しない。
【０１８５】
実施例４：P140粒子のエンドサイトーシス。
P140ペプチド活性には、HSC70の結合及びエンドサイトーシスが重要であると思われる。エンドサイトーシスは、クラスリン経路を通じて生じるはずであると考えられる。これは、ペプチド＋賦形剤が直径３０〜５００nmの範囲のサイズを有しなければならないことを示す。例えば、P140＋マンニトールは、１００nmの範囲であるが、一方、P140＋トレハロースは、１０nm未満であり、したがって、HSC70に有効に結合しない。例えば、図１０は、フローサイトメトリーによって可視化した、MRL/lpr B細胞及びRaji細胞における５．４％ マンニトール又は１０％ トレハロース中の蛍光P140ペプチドの細胞取り込みを示す。Ｂ細胞は、１２〜１４週齢のMRL/lprマウスから採取し（一次細胞）；Raji細胞は、バーキットリンパ腫患者のＢリンパ球から１９６３年に派生した樹立細胞株である。MRL/lpr B細胞及びRaji細胞のいずれにおいてもペプチドをトレハロースで希釈したとき、マンニトールよりもP140の細胞取り込みがはるかに少ない。この結果は、共焦点顕微鏡を用いて確認された（図１１）。共焦点画像は、リソソームへのホーミング前にP140が局在する後期エンドソーム区画を示し、DAPIは、DNAを同定する。この結果は、トレハロースの場合、Ｂ細胞に入るP140ペプチドがはるかに少ないというフローサイトメトリーの結果を裏付ける（表４及び５を参照）。
【０１８６】
【表４】
0006659693.tif 000013
【０１８７】
【表５】
0006659693.tif 000014
【０１８８】
実施例５．マウスにおけるオボアルブミンによって誘導される好酸球性気道炎症の１５日モデルにおけるP140ホスホペプチドの抗炎症効果。
マウスの好酸球増多性気道炎症の１５日モデルにおいて局所（鼻腔内）又は全身（静脈内）に投与したときのP140ホスホペプチドの抗炎症効果を評価した。
【０１８９】
P140ホスホペプチドを滅菌水（Braun）に可溶化させ、そして、１０×濃度の滅菌生理食塩水を添加して、浸透圧を３００mosmに調整した。浸透圧は、マイクロオスモメータ（Loser、１５型）で制御し、そして、検証した（３０２mosm）。
【０１９０】
P140ホスホペプチドは、鼻腔内（i.n.）及び静脈内（i.v.）の経路によって４mg/kgの用量でインビボにおいて用いた。対照動物には、等体積（i.n.については１mL/kg、そして、i.v.については２mL/kg）の生理食塩水を投与した（表６）。
【０１９１】
生理食塩水 ０．１mL中OVA（Sigma-Aldrich） ５０μg及びalum（Sigma-Aldrich） ２mgを含有する混合物を腹腔内（i.p.）注射することによって、９週齢の雄Balb/cマウスを感作した。５日目にOVA ２５μL、次いで、１２、１３、及び１４日目にOVA及び／又は生理食塩水 ２５μLをi.n.投与することによって、マウスを刺激した。９日目にP140又は溶媒をi.v.注射（２mL/kg）又はi.n.投与（１mL/kg）することによってマウスを処理した（図１２を参照）。
【０１９２】
【表６】
0006659693.tif 000015
【０１９３】
（Daubeuf, F. and Frossard, N. 2012. Performing Bronchoalveolar Lavage in the Mouse. Curr Protoc Mouse Biol 2:167-175）に記載の通りLPS刺激の２４時間後にBALを実施した。マウスにIP麻酔した（１５０mg/kg ケタミン−１０mg/kg キシラジン）。心臓から血液を回収し、１０，０００ｇで２分間遠心分離し、そして、−２０℃で血清を保存した。気管の半切除後、プラスチックのカニューレを挿入し、そして、１mLのシリンジで注入した０．９％ NaCl ０．５mLで気腔を洗浄した。この手順を１０回実施した。最初２回の洗浄液の初期濃縮上清（体積＝２×０．５mL投与、〜０．５mL回収）をサイトカイン測定用に回収した。残りのBAL液を遠心分離し（３００ｇで５分間、４℃）、そして、細胞のペレットをプールした。細胞のペレットを０．９％ NaCl ５００μLに懸濁させ、そして、Muse（登録商標）Cell Analyserを用いて合計細胞数を評価した。フローサイトメトリー（LSRII（登録商標）cytometer, BD Bioscience）によって示差細胞数を評価した。黒色マイクロプレートにおいてBAL細胞にFCblock（０．５μL、553142, BD Bioscience）を添加し、室温で２０分間インキュベートした。次いで、マーカー抗体を添加した：CD11c-FITC（557400, BD bioscience）、Gr-1-Pe-eFluor610（61-5931-82, eBioscience）、CD11b-APC-Cy7（557657, BD bioscience）、CD45-AlexaFluor700（103128, BioLegend）、CD3-BV605（564009, BD bioscience）、CD19-PE-Cy7（552854, BD bioscience)。DAPI（５μL、BD bioscience）を添加する前に室温で３０分間抗体をBAL細胞と共にインキュベートし、そして、直ちにフローサイトメトリーを実施した。
【０１９４】
データは、平均±ＳＥＭとして提示する。群間の差を、一要因分散分析、続いて、チューキー事後検定を用いて統計的有意性について検定した。統計解析のために、対照群１、２、及び３をプールした。ｐ≦０．０５のとき、データを有意に異なるとみなした。
【０１９５】
生理食塩水で刺激した対照マウスにおけるBAL液に回収された気道細胞の分析は、i.n.又はi.v.投与されたP140ホスホペプチドが、それ自体、ビヒクル（生理食塩水）と比べてBAL液に回収された細胞の数に対してほとんど効果を有しず、特に、炎症促進効果を有しないことを示す。（表７を参照）。
【０１９６】
【表７】
0006659693.tif 000016
【０１９７】
オボアルブミンで刺激したマウスでは、BAL液に回収された炎症性細胞の合計数が著しく増加する。この効果は、好酸球、好中球、Ｔ及びＢ細胞の流入の著しい増加に関連している（＃＃＃ｐ＜０．００１；図１３）。
【０１９８】
i.v.投与（４mg/kg）したP140ホスホペプチドは、好酸球（−５０％、＊＊＊ｐ＜０．００１）、Ｔ細胞（−６６％、＊＊ｐ＜０．０１）、及びＢ細胞（−４２％、＊ｐ＜０．０５）の動員、並びに好中球の動員（−３８％）を著しく減少させるが、有意差のカットオフは下回らない。対照的に、i.n.経路によって局所的に投与したP140ホスホペプチドは、BALにおける炎症性細胞の動員に対してほとんど効果を有しず、これは、P140が全身作用を通じて作用していることを示唆する。
【０１９９】
このプロジェクトは、オボアルブミンで感作及び刺激されたBalb/cマウスにおける１５日気道過好酸球増加症モデルにおいてi.n.によって局所的に又はi.v.によって全身に投与されたP140ホスホペプチドが、抗炎症効果を有し得るかどうかについて試験することを目的としていた。本発明者らは、OVA又は生理食塩水で刺激する２日間前、すなわち、気管支肺胞洗浄によって気道炎症性細胞を回収する６日間前にi.n.又はi.v.投与されたP140の効果を比較した。
【０２００】
このように、P140のi.v.投与（４mg/kg）は、Balb/cマウスでOVAに対してこの気道過好酸球増加症モデルにおいて抗炎症効果を示すが、一方、i.n.投与は、依然として実質的な効果を有しない。これは、P140の抗炎症活性が、局所作用ではなく全身作用（例えば、脾臓、リンパ器官、骨髄）であることを示唆する。
【０２０１】
実施例６．慢性炎症のマウスモデル（DSS誘導モデル）におけるP140ペプチドの効果の研究。
−２及び−１日目に、P140ペプチド（１００／注射、iv経路；１０頭のマウス）又は生理食塩水のみ（対照群：１０頭のマウス）を正常マウス（C57BL/6；７週齢；雄）に投与した。０日目に、デキストラン硫酸ナトリウム（DSS；２〜３％）を投与して疾患を誘導した。
【０２０２】
体重減少、便の硬さ、下痢、及び血便について毎日動物を検査した。約１４日目又は重症（体重減少＞２５％）の場合はいつでも動物を殺処分した。統計値：マンホイットニー（正確）
【０２０３】
DAIはほとんど差がない（ｐ＝０．５３８６）。しかし、この臨床指数は、マウスモデルにそれほどうまく適合していない。結腸サイズが著しく増加したが、これは、炎症の減少を反映している（ｐ＝０．００１１）。２つの群間で体重の差はみられなかった。しかし、＋３日目及び＋４日目に傾向がみられた。P140群のみにおける＋８日目に対して、対照群では＋６日目に糞便中に血液がみられた。
【０２０４】
実施例７．マウスにおけるチリダニ抽出物（HDM）によって誘導された好酸球性気道炎症の３１日モデルにおけるP140ホスホペプチドの効果。
この研究の目的は、マウスにおけるHDM誘導喘息の３１日モデルに全身（静脈内）投与したP140ホスホペプチドの効果を評価することであった。P140ホスホペプチドを滅菌水（Braun）に可溶化させ、そして、１０×濃度の滅菌生理食塩水を添加して、浸透圧を３００mosmに調整した。浸透圧は、マイクロオスモメータ（Loser、１５型）で制御し、そして、検証した（３０３mosm）。P140ホスホペプチドは、静脈内（i.v.）経路によって４mg/kgの用量でインビボにおいて用いた。対照動物には、等体積（２mL/kg）の生理食塩水を投与した（表８）。
【０２０５】
【表８】
0006659693.tif 000017
【０２０６】
HDM抽出物（Stallergenes）の鼻腔内（i.n.）投与によって９週齢の雄Balb/cマウスを感作した：０、１、２、３、４日目に生理食塩水 ２５μL中１μg、そして、１４及び２１日目に１０μg。２８、２９、及び３０日目にHDM（１μg）及び／又は生理食塩水をi.n.投与することによって、マウスを刺激した。２５日目にP140又は溶媒をi.v.注射（２mL/kg）することによってマウスを処理した（図１４を参照）。
【０２０７】
メタコリン（Flexivent（登録商標））に対する気道応答。３１日目に、気道はPBSに応答し、次いで、記載の通り（Daubeuf et al, Bioprotocol, 645, 2013）、強制振動技術を用いてメタコリンを評価した（Flexivent（登録商標）、SCIREQ, Montreal, Canada）。マウスをキシラジン（Rompun（登録商標）；１mg/kg）の腹腔内注射によって麻酔し、１５分間後に、ペントバルビタールナトリウム（３．６４mg/Kg）を腹腔内注射した。気管を露出させ、そして、１８ゲージの金属針を気管に挿入した。気道をコンピュータ制御された小動物用人工呼吸器に接続し、そして、一回呼吸量１０mL/Kg、１５０呼吸／分の頻度で、そして、２cm H2Oの呼吸端陽圧で準正弦波的に人工呼吸して、自発呼吸に近い平均呼吸量を達成した。ベースライン測定後、インライン噴霧器で生成し、そして、人工呼吸器を通して直接投与したPBSのエアロゾルで各マウスを１０秒間刺激した。次いで、５０mg/mL エアロゾル化したメタコリン（MCh）を１０秒間投与した。ピーク応答、すなわち、気道抵抗（R、cm H20.s.mL-1)、エラスタンス（E、cm H20.mL-1）、及びコンプライアンス（C、mL.cm H20-1)を計算するために統合した３つの最大値の平均としてメタコリンの効果を計算した。
【０２０８】
（Daubeuf et al. 2012）に記載の通り、HDM刺激の２４時間後に気道過敏性を測定した後、BALを実施した。マウスにIP麻酔した（１５０mg/kg ケタミン−１０mg/kg キシラジン）。心臓から血液を回収し、１０，０００ｇで２分間遠心分離し、そして、−２０℃で血清を保存した。
【０２０９】
気管の半切除後、プラスチックのカニューレを挿入し、そして、１mLのシリンジで注入した０．９％ NaCl ０．５mLで気腔を洗浄した。この手順を１０回実施した。最初２回の洗浄液の初期濃縮上清（体積＝２×０．５mL投与、約０．５mL回収）をサイトカイン測定用に回収した。残りのBAL液を遠心分離し（３００ｇで５分間、４℃）、そして、細胞のペレットをプールした。細胞のペレットを０．９％ NaCl ５００μLに懸濁させ、そして、Muse（登録商標）Cell Analyser（Millipore）を用いて合計細胞数を評価した。フローサイトメトリー（LSRII（登録商標）cytometer, BD Bioscience）によって示差細胞数を評価した。黒色マイクロプレートにおいてBAL細胞にFCblock（０．５μL、553142, BD Bioscience）を添加し、室温で２０分間インキュベートした。次いで、マーカー抗体を添加した：CD11c-FITC（557400, BD bioscience）、Gr-1-PeeFluor610 (61-5931-82, eBioscience）、F4/80-PE（12-4801-82, eBioscience）、CD11b-APC-Cy7（557657, BD bioscience）、CD45-AlexaFluor700（103128, BioLegend）、CD3-BV605（564009, BD bioscience）、CD19-PE-Cy7（552854, BD bioscience)。DAPI（５μL、BD bioscience）を添加する前に室温で３０分間抗体をBAL細胞と共にインキュベートし、そして、直ちにフローサイトメトリーを実施した。
【０２１０】
０、１、２、３、４、１４、２１日目に全てのマウスをHDMに感作させ、そして、生理食塩水（慢性喘息）又はHDM（アレルゲンで刺激）で刺激した。結果は、平均±ＳＥＭとして提示する。炎症性細胞についてはスチューデントｔ検定を用いて、そして、気道応答については二要因分散分析、続いてボンフェローニ事後検定を用いて、群間の差を統計的有意性について検定した。ｐ≦０．０５のとき、データを有意に異なるとみなした。
【０２１１】
【表９】
0006659693.tif 000018
0006659693.tif 000019
【０２１２】
慢性喘息における気道応答
生理食塩水で刺激し、溶媒で処理したマウスにおいてFlexivent（登録商標）技術によって評価したベースラインの気道抵抗、エラスタンス、及びコンプライアンスに対して、PBSの吸入は効果を有していなかった（図１５Ａ〜Ｃ）。P140による処理（i.v.、４mg/kg、２５日目）も、溶媒で処理したマウスに比べていずれのパラメータに対しても効果を有していなかった（図１５Ａ〜Ｃ）。しかし、メタコリン（５０mg/mL）の吸入は、生理食塩水で刺激し、溶媒で処理したマウスにおいて、コンプライアンスの減少を伴う、気道抵抗及びエラスタンスの顕著な増加を誘導した（それぞれ、図１５Ａ、Ｂ、及びＣ）。P140による処理は、溶媒群と比べてエラスタンスを有意に減少させ（−６５％、＊ｐ＜０．０５）、そして、気道コンプライアンスを増加させ（＋１１５％、＊ｐ＜０．０５）（図１５）、それに加えて、気道抵抗を減少させた（−４２％）が、有意ではなかった（ｎ＝５）。
【０２１３】
アレルゲン（HDM）で刺激したマウスにおける気道応答
HDMで刺激し、溶媒で処理したマウスにおいてベースラインの気道抵抗、エラスタンス、及びコンプライアンスに対して、PBSの吸入は効果を有していなかった。P140による処理は、溶媒群に比べてアレルゲンで刺激したマウスにおける気道抵抗、エラスタンス、又はコンプライアンスに効果を有していなかった。しかし、メタコリンの吸入は、HDMで刺激し、溶媒で処理したマウスにおいて、コンプライアンスの減少を伴う、気道抵抗及びエラスタンスの有意な増加を誘導した（図１５）。
【０２１４】
慢性喘息における効果（HDMで感作し、生理食塩水で刺激したマウス）
溶媒で処理したマウスにおいて生理食塩水で刺激した際にBAL液に、好酸球（３．８×１０５）、好中球（０．７×１０５）、マクロファージ（０．４×１０５）、Ｔ及びＢリンパ球（１．９×１０５及び０．３×１０５）、並びに樹状細胞（０．２×１０３）が回収された（図１６）。P140による処理（４mg/kg i.v.、２５日目）は、溶媒群に比べて、好中球の数を有意に減少させ（−７１％、＊ｐ＜０．０５）、それに加えて、好酸球（−２５％）及びＢ細胞（−４０％）も減少させたが、有意ではなく、そして、マクロファージの数を４．５倍有意に増加させた（＊ｐ＜０．０５）（図１６）。
【０２１５】
アレルゲンで刺激したマウスにおける効果（HDMで感作し、そして、HDMで刺激した）
HDMで刺激したマウスにおいてBAL液に回収された炎症性細胞の数は、慢性喘息（生理食塩水で刺激）と比べて有意に増加した（図２）。この効果は、HDM刺激に応答した、好酸球（１１．７×１０５、＃＃＃ｐ＜０．００１）、好中球（３．４、＃ｐ＜０．０５５）、Ｔ及びＢ細胞（５．８×１０５及び０．９×１０５、＃ｐ＜０．０５）の流入の有意な増加に関連していた（図１６）。したがって、P140による処理は、溶媒群に比べてHDMで刺激したマウスのBALにおける炎症性細胞の動員に対して効果を示さなかった。
【０２１６】
この研究の目的は、チリダニ（HDM）抽出物に感作したBalb/cマウスの３１日喘息モデルにおいて全身投与したとき、P140ホスホペプチドが抗喘息効果を有し得るかどうかについて試験することであった。HDM又は生理食塩水で刺激する２日間前、すなわち、MChに対する気道応答の評価及び気管支肺胞洗浄による気道炎症性細胞の回収の６日間前に、HDMで感作したマウスにP140をi.v.投与した。
【０２１７】
本発明者らは、ｉ）動物を生理食塩水で更に刺激したときの慢性喘息のモデル（HDMで感作し、生理食塩水で刺激したマウス）及びii）動物をHDMで更に刺激したときのアレルゲン刺激誘導喘息発作のモデル（HDMで感作し、HDMで刺激したマウス）として、全ての動物をHDMに感作する試験を設計することを選択した。したがって、プロトコル設計は、ｉ）毎日の慢性喘息及びii）喘息の急性発作中におけるP140の効果を示すことができた。
【０２１８】
（HDMで感作し、そして、生理食塩水で刺激した）慢性喘息マウスでは、メタコリンは、気道コンプライアンス（Ｃ）の減少を伴う、気道抵抗（Ｒ）及びエラスタンス（Ｅ）の増加として測定される気道閉塞の大きな増加を誘導した。感作されておらず、そして、刺激されてもいない対照Balb/cマウスを観察するために本発明者らが用いた正常値（ベースラインＲ、Ｅ、及びＣ）と比べて、これら値は、慢性喘息のこれらマウスにおける気道過敏の存在の代表的なものである。本発明者らは、P140処理が、溶媒処理群に比べて、MChに対する気道応答を有意に減少させ、気道エラスタンスＥを有意に減少させ、そして、コンプライアンスＣを増加させると共に、気道抵抗Ｒを減少させるが、有意ではないことを示す。これは、P140が本発明者らのアレルギー性慢性喘息モデルにおいて観察される気道過敏を減少させることを示唆する。
【０２１９】
更に、本発明者らは、この研究において、慢性喘息において気道に存在する炎症反応に対するP140処理の効果を観察する。本発明者らの慢性喘息のモデルは、好酸球、好中球、マクロファージ、樹状細胞、Ｔ及びＢ細胞の浸潤を特徴とする。P140処理は、溶媒処理マウスに比べて、気管支肺胞洗浄において回収された好中球の数の有意な減少を誘導し、それに加えて、好酸球及びＢ細胞の減少を誘導したが、有意ではなく、そして、マクロファージの有意な増加を誘導した。喘息は、気道の好酸球性炎症として知られている。より重要なことに、重篤な制御されていない喘息は、浸潤した炎症性細胞の表現型が変化する、最も重要なことには、好中球が気道に浸潤する気道炎症性疾患として記載されている。この表現型は、グルココルチコイド処理に対して耐性であることが多い。したがって、P140ホスホペプチドで観察される効果は、P140が慢性喘息、気道過敏、及び気道炎症において抗喘息能を有することを示唆する。
【０２２０】
任意の特定の理論に縛られるものではないが、P140は、喘息患者において最も無効化する（invalidating）症状のうちの１つである気道過敏の回復を伴う、喘息において気道に存在する慢性炎症、特に、好中球の回復を強化すると考えられる。アレルゲンで刺激したマウス（HDMで感作し、そして、HDMで刺激した）では、HDMが、気道過敏の更なる増大及びBALに回収された気道炎症性細胞の浸潤を誘導した。しかし、P140処理は、このアレルゲン刺激で誘導されたMChに対する気道過敏の増大に対してもBALにおける炎症性細胞の動員に対してもほとんど効果を有していなかった。これは、P140処理が、アレルゲン刺激の２日間前に投与されたとき、喘息の急性発作の反応をブロックするほど強力ではないことを示すが、HDM刺激の非存在下で喘息性気道過敏及び炎症の基底レベルは低下した。
【０２２１】
生理食塩水刺激の２日間前のP140の全身投与（４mg/kg i.v.）は、ベースライン気道過敏を回復させ、そして、毎日の慢性喘息における炎症を回復させる能力を有する。対照的に、P140投与のために用いた条件では、すなわち、HDM刺激の２日間前には、P140は、アレルゲン刺激の結果に対して効果を有しておらず、これは、感作された気道においてアレルゲンの作用を改善することもなく悪化させることもないことを示す。喘息の３１日モデルにおいて測定されたP140のこのような活性は、P140が慢性喘息において有効であり得ることを示す。P140処理とアレルゲン刺激との間の遅延の増加によって、喘息におけるP140の活性を増大させることができる。本発明者らは、繰り返しアレルゲンと接触することによって引き起こされる気道過敏及び気道炎症をP140が予防する、すなわち、毎日の慢性喘息の症状を回復させることができると期待する。
【０２２２】
実施例８．慢性炎症性脱髄性多発根神経障害のラットモデルにおけるp140ペプチドの効果
慢性炎症性脱髄性多発根神経障害（CIDP）は、処置法が限定されている／存在しない末梢神経系（PNS）の自己免疫媒介炎症性疾患である。最近、CIDPの新たな動物モデルである慢性-EANが特性評価された（Brun S, Beaino W, Kremer L, Taleb O, Mensah--Nyagan AG, Lam CD, Greer JM, De Seze J, and Trifilieff T (2015）. Characterizaton a new rat model for chronic inflammatory demyelinating polyradiculoneuropathies. J. Neuroimmunol. 278: 1--10）。このモデルは、免疫組織病理学によって確認される、軸索変性を伴う脱髄の電気生理学的基準を満たしている。慢性疾患の後期は、坐骨神経におけるIL-17サイトカイン陽性細胞及びマクロファージの蓄積、並びに高い血清IL-17レベルを特徴としていた。該モデルは、それを標的とする新たな免疫療法が非常に必要とされている、PNSの慢性ヒト自己免疫媒介炎症性疾患、特にCIDPについてのトランスレーショナルな薬物研究のために用いることができる、CIDPの信頼できかつ再現可能な動物モデルである。したがって、この研究は、CIDPのこの新たな臨床前ラットモデルにおけるP140ペプチドの可能性のある効果を調べようとしている。
【０２２３】
７〜８週齢、体重２５０〜２７０ｇのCharles River（Domaine des Oncins, L’Arbresle, France）から購入した雄Lewisラットを用いた。慢性-EAN（CIDP）を誘導するために、生理食塩水 １００μL及び不完全フロインドアジュバント（SIGMA-Aldrich, St-Quentin Fallavier, France） １００μLに乳化したペプチド（Ac(palm)KRGRQTPVLYAMLDHSRS） ２００μg及び結核菌（Mycobacterium tuberculosis）（H37株 RA、Difco, Detroit, Michigan, USA）を含有する接種材料 ２００μLを尾の基部に皮下注射することによって、ラットをS-palm-P0(180-199)ペプチドで免疫した。
【０２２４】
免疫後（dpi）６０日まで体重及び臨床スコアを毎日評価する。不全麻痺の重症度を以下の通り採点する：０＝病気なし；１＝尾の弛緩；２＝中等度の不全対麻痺；３＝重篤な不全対麻痺；４＝四肢不全麻痺；５＝死亡。
【０２２５】
合計１５頭のラットを用い、そして、以下の表に示す通り処理した。
【０２２６】
【表１０】
0006659693.tif 000020
【０２２７】
水／生理食塩水（１：１０） ５００μL中１００μg/ラット P140ペプチドを、免疫後５、７、９、１３日に、及び、免疫後２２日から研究の最後まで１週間に３回腹腔内注射した。
【０２２８】
ａ）  サイトカインELISA
処理したラット及び未処理ラット由来の血清を免疫後１８、４０、及び６０日に回収した。製造業者の説明書に従って、ラットIL-17に特異的な市販のELISAキット（eBioscience, San Diego, CA, USA）を用いて、未希釈血清中のIL-17サイトカインの濃度をデュープリケートで測定する。
【０２２９】
ｂ）  抗体ELISA
また、ELISAを用いて、抗P0(180-199)抗体の存在について、免疫後１８、４０、及び６０日に、処理したラット及び未処理ラット由来の血清を試験する。０．０５M 炭酸水素塩緩衝溶液（pH９．６、１００μL/ウェル）中２０μg/mLのペプチドで９６ウェルプレートをコーティングし、そして、４℃で一晩インキュベートする。次いで、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）でプレートを洗浄し、そして、３７℃で１時間、PBS中１％ ウシ血清アルブミンでブロッキングする。洗浄後、１／５０００で希釈した血清（１００μL/ウェル）をデュープリケートで添加し、そして、３７℃で２時間インキュベートする。洗浄後、３７℃で２時間、ペルオキシダーゼにカップリングしたヤギ抗ラットIgG（１：２０００、SIGMA--Aldrich）と共にプレートをインキュベートする。激しく洗浄した後、各ウェルを、発色するまで室温でTMB ７５μLと共にインキュベートする。１M H2SO4（２５μL/ウェル）を添加することによって、反応を停止させる。
【０２３０】
ｃ）  免疫細胞化学
PNSにおける炎症性細胞の浸潤及び病理学的変化を評価するために、処理したラット及び未処理ラットを免疫後６０日に殺処分する。ラットをKetamine/Rompunで深く麻酔し、そして、４℃のPBS中４％（v/v） パラホルムアルデヒド（PFA）を心臓内に灌流させる。坐骨神経及び馬尾を切開し、ブアンで固定し、そして、パラフィンに包埋する。
【０２３１】
脱ろう後、切片（５μm）を８０℃で１０分間クエン酸バッファ中で加熱する。内因性ペルオキシダーゼを、水中０．０２％ H2O2で１０分間阻害する。非特異的結合部位を、３０分間PBS中５％ ウシ胎仔血清（Gibco Invitrogen, Camarillo, CA, USA）でブロッキングし、次いで、以下のモノクローナル抗体でブロッキングする：ミエリンについては抗MBP（１：５００；所内で作製）；神経フィラメントについてはSMI-311（１：１０００；Abcam, Paris, France）；マクロファージについてはED1（１：４００；Serotec, Oxford, UK）、及び抗インターロイキン-17（IL-17；１：１００；Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA）。組織切片に対する抗体の結合を、ビオチン化抗マウスIgG（１：２００；Vectastain（登録商標）、Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA）及びアビジン−ビオチン複合体（ABCペルオキシダーゼキット；Vectastain（登録商標）、Vector Laboratories）で可視化し、続いて、IL-17についてはDAB基質（Vector（登録商標）DAB SK-4100, Vector Laboratories）、そして、他の抗体についてはVIP基質（Vector（登録商標）VIP SK-4600, Vector Laboratories）で顕色させる。
【０２３２】
P140ペプチドは、CIDPラットにおける疾患の重篤度に対して効果を示し、そして、慢性化を阻止する。CIDPラットに対するP140ペプチドの効果を調べるために、免疫後５、７、９、１３日に、そして、免疫後２２日から研究の最後までは１週間に３回、動物をP140（１００μg/ラット）で腹腔内処理する。図１７Ａは、最大体重減少が疾患の最高臨床スコアに対応する疾患過程中の体重の変化を示す。この体重減少は、未処理ラットに比べて処理群ではそれほど重要ではない。図１７Ｂに示す通り、P140の処理は、未処理ラットに比べて疾患の発症を遅延させ、そして、最高臨床スコアを低下させるだけでなく、疾患の慢性化を阻止すると思われる。
【０２３３】
実施例９．グジュロー・シェーグレン症候群のマウスモデルであるMRL/lprマウスにおけるP140ペプチドの効果の研究（唾液腺に焦点を当てる）
この研究では、統計解析のために１群あたりのマウスは１０頭の１１〜１２週齢の雌MRL/lprマウスを用いた。各マウスに、９％ NaCl １００μL中ペプチドP140 １００μgを後眼窩に単回注射することによって投与した。５日間後、マウスの血液をヘパリン処理したチューブに回収し、そして、唾液腺（GSS）を除去し、そして、PBS（pH７．４）を含有するエッペンドルフチューブに入れた。
【０２３４】
ペプチドP140の効果を幾つかの系で試験した。
【０２３５】
末梢血における細胞充実性の研究：マウス血液 ３００μLを、供給業者によって提供されるプロトコルに従って（手順Ｂ）、DAKO EasyLyse（ref S2364） ３mLに溶解させる。PBS（pH７．４）−２％（v/v） ウシ胎仔血清で２回洗浄した後、細胞を同バッファ ３００μLにとる。次いで、Turkish Blueの存在下でMalassezセルにおいて細胞を計数して、白血球と残りの赤血球とを識別する。本発明者らは、P140ペプチドが血液中の白血球の量のばらつきを誘導するかどうかを調べるために、血液 １mLあたりの細胞数を推測して、様々な処理群間で比較する。
【０２３６】
器官のクリオスタットの調製
唾液腺（SG）をPBS（pH７．４）で洗浄し、次いで、クリオスタット切片の調製専用のカップに入れる。組織が完全に覆われるまで、カップに「OCT」培地（Cell path, ref. 03803126）を充填する。次いで、カップを液体窒素に浸漬し、次いで、使用まで−８０℃で保存する。
【０２３７】
組織を５マイクロメートルのクリオスタット切片に切断する。切片を室温で一晩（１２時間）放置した。次の日、切片を３０分間１００％ アセトン中でインキュベートした。次いで、後で使用するまで、切片を−８０℃で保存してよい。次いで、切片をPBS（pH７．４）で再水和し、５分間後に免疫染色した。
【０２３８】
免疫染色：
プロトコルは以下の通りである：
PBS−２％（w/v） BSA中で３０分間切片をインキュベートする。
切片をPBS（pH７．４）で５分間×２回洗浄する。
対象となる抗体を典型的にはPBS−２％ BSAで１／２００希釈し、そして、室温で２時間（又は４℃で一晩）切片上で直接インキュベートする。
PBS（pH７．４）で１０分間×３回洗浄する。
PBSで１／５０００希釈したDAPIで１５分間核染色を実施する。
PBS（pH７．４）で１０分間×３回洗浄する。
切片を４％（v/v） パラホルムアルデヒド（PFA）で２０分間固定する。
過剰のPFAを除去し、次いで、「DAKO mounting medium」と共にスライドガラス上にカバースリップを載せ、そして、室温で２分間、光から保護した状態で乾燥させる。
顕微鏡で可視化する。
【０２３９】
ヘマトキシリン／エオシンによるマーキング：
各マウスについて、病巣部位（FS）の数を求める。病巣は、５０個以上の細胞の凝集体として定義する。
【０２４０】
採点システム（評点０〜３）によって炎症SGのレベルを半定量的に求める。グレード０：炎症性細胞無し；グレード１：わずかな血管周囲の炎症及び管周囲の浸潤（＜１００細胞）；グレード２：中等度の数の血管周囲の炎症及び管周囲の浸潤（１００〜５００細胞）；グレード３：炎症病巣の広がりと共に広範囲に及ぶ炎症（＞５００細胞）。
【０２４１】
フローサイトメトリーによる唾液腺の研究
蛍光染色された全唾液腺の細胞を、４℃で４０分間抗体で標識し、FACSCaliburによってデータを収集した。
【０２４２】
【表１１】
0006659693.tif 000021
【０２４３】
末梢血における細胞充実性の研究の結果を提供する。
【０２４４】
切除後に唾液腺の重量を測定した。DNase I（１mg/mL）及びコラゲナーゼＤ（５０μg/mL）を用いて唾液腺を分解した。分解後に全細胞数を評価した。
【０２４５】
この実験では、投与（単回iv注射）の５日間後にマウスを評価し、P140ペプチドはSGの重量に対して統計的に有意な効果を有していなかった（図１８）。
【０２４６】
フローサイトメトリーによる唾液腺の研究
P140処理（５日間；単回iv注射）は、SG処理したMRL/lprマウスに存在する細胞の総数に対して明白な効果を有していなかった（図１８）。
【０２４７】
しかし、リンパ球亜群について調べたとき、特定のリンパ球サブセットにおいてP140ペプチドの効果があることが検出された。P140は、MRL/lprマウスのSGにおいてCD4+ T細胞を減少させた（しかし、CD8+ Tは減少させなかった）。予備実験（図示せず）では、CD4+ T細胞がSGに浸潤した主な細胞亜群であることが分かった。これらＴ細胞は、ほとんどがβTCR + T細胞である。P140ペプチドは、Ｂ細胞の総数に対して統計的に有意な効果を有していなかった。
【０２４８】
顕微鏡による唾液腺の研究
MRL/lprマウス（１アームあたり１０頭のマウス）にペプチドP140（１００μL/マウス iv）を注射した。注射の５日間後、マウスを殺処分し、そして、上に示した通りSGを回収した。組織を５μmのクリオスタット切片に切断する。切片を、組織学で最も頻繁に用いられる方法であるヘマトキシリン／エオシン染色で標識した。炎症のレベル及びFSの数を求めた（図１９及び２０）。サンプル対照群４及び処理群サンプルの代表的な写真を撮影する（バー ５００μm）。
【０２４９】
結果は、ペプチドP140の単回投与の５日間後直ちに、MRL/lprマウスのSGにおけるリンパ球浸潤が有意に減少したことを示す。
【０２５０】
実施例１０．関節リウマチのマウスモデルにおけるP140ペプチドの効果
関節リウマチ（RA）は、関節で発症する慢性炎症性疾患である。この疾患は、様々な期間及び強度の炎症の大発生によって進行する。特に、手及び手首において関節腫脹を引き起こす。通常誘導される、RAの幾つかの動物モデルが利用可能である。以下の報告は、RAの急性モデル、すなわち、モデルK/BxNマウスにおいて得られた結果を記載する。このマウスにおけるP140の潜在的効果を「治癒的」プロトコル及び「予防的」プロトコルにおいて試験した。
【０２５１】
KRN及びMHCクラスII Ag7分子を発現するTCRトランスジェニックマウス（K/BxNマウス）は、重篤な炎症性関節炎を発現した。これらマウスの血清の健常レシピエントマウスへの投与は、約１５日間にわたって炎症性関節炎を引き起し、ピークイグニッションは注射の約７日間後である。
【０２５２】
K/BxN由来のマウス血清投与を２回実施した（０日目及び２日目）。血清の注射（１００μL/マウス）は、８週間C57BL/6（又はB6）マウス（ｎ＝１０）；未処理マウス（ｎ＝１０）において、腹腔内（ip）注射によって実施する。
【０２５３】
P140ペプチド（１００μg/１００μL；iv 後眼窩）を以下の通り投与した。
【０２５４】
治癒的処置：炎症性疾患のピークを導くために１日目及び４日目に注射する。予防的処置：−７日目及び−２日目に注射する。出血S0（０日目）後、６日間毎に瀉血を実施して血清を処分する。炎症がその基底レベルに戻ったとき、約２０日間で試験を終了する（図２１を参照）。
【０２５５】
炎症のピーク中、毎日動物を評価し、そして、関節の腫脹スコアを確立する。それは、０〜４の範囲であり、そして、動物の関節の観察に基づいている。実際には、このスコアは、各肢について与えられ（４つの値）、そして、これら値を足し合わせて０〜１６の範囲の全体スコアを得る（図２２）。
【０２５６】
この実験では、疾患の誘導は最適以下であった。疾患の臨床徴候の有意な増加は観察されなかった。
【０２５７】
２日目（K/BxN血清の注射の２日間後、そして、血清K/BxNの２回目の注射の日）、マウスをP140 NaClで処理すると、体重が減少し始める（１５及び１０％）。５日目から、動物の体重が再度増加し始める：本発明者らは、５日目から研究の最後までの間にP140処理されたマウスでは２０％体重が増加するが、一方、対照マウスでは、５％を超えて体重が増加することを認識する。これら２本の曲線間の差は統計的に有意であった（二要因分散分析）（図２３）。
【０２５８】
動物の肢のサイズの評価
右後肢：０日目〜６日目に後肢の幅が増加し、５〜６日目の３０％が最高であることが分かる。６日目から、この増加は逆行し、そして、約１０日目に正常に戻ることが分かる。これら２本の曲線間の差は統計的に有意であった（二要因分散分析）（図２４）。
【０２５９】
左後肢：肢の幅が約３０％増加し、ピークは約５〜６日目であり、次いで、６日目から次第に正常に戻ることが分かる。これら２本の曲線間の差は統計的に有意であった（二要因分散分析）（図２５）。
【０２６０】
炎症スコアの評価
この実験のために、炎症スコアを各肢（左及び右の後肢）について独立に計算した。スコアは、P140で処理したマウス又は対照マウスのいずれについても最大わずか１．５を超える。＊処理マウスについては、２本の曲線は、二要因分散分析において任意の統計的に有意な差を示さない（図２６）。
【０２６１】
この予備実験中に得られた結果によって、本発明者らは、次の実験の設計に非常に有用な幾つかの重要な点を特定することができた。
【０２６２】
１）  炎症は、非常に穏やかであった（肢のサイズは少し増加、体重はほとんど減少せず、非常に低い炎症スコア）。K/BxN血清の投与モードを血清 １００μL及びビヒクル（NaCl） ５０μLから、ビヒクル無しの１００μLに変更した。
【０２６３】
２）  動物の２本の後肢のみを調べた。しかし、最終的には、前肢もほとんど疾患に罹患していることが観察された。次に、足のスライドにおいて測定された関節の高さについて動物の４本の肢を考慮する。
【０２６４】
３）  次の実験では、動物の全体的な炎症スコアを計算する（４本の肢の個々のスコアを足す）。
【０２６５】
予防的プロトコル：動物の体重の評価
動物の体重の分析は、P140で処理したマウスでは５％、そして、対照マウスでは１０％の体重減少を示した。この体重減少は、初期相（１日目〜７日目）に生じる。対照と比べて処理マウスではわずかに早く元の体重に戻ることが分かる。しかし、２本の曲線間に統計的に有意な差はない（二要因分散分析）（図２７）。
【０２６６】
動物の肢のサイズの評価
右後肢：処理マウスでは約１２％、そして、対照マウスでは約２２％関節のサイズが増加する。この関節のサイズの増加は、０日目〜７日目に生じ、その後、次第に正常に戻る。２本の曲線がわずかに異なることが分かるが、統計的に有意な差はない（二要因分散分析）（図２８）。
【０２６７】
左後肢：処理マウスでは約１５％、そして、対照マウスでは約３０％関節のサイズが増加する。この増加は、０日目〜７日目に生じ、次いで、正常への回復が観察される。２本の曲線のずれがみられるが、統計的に有意な差はない（二要因分散分析）（図２９）。
【０２６８】
右前肢：後肢と同様に、０日目〜７日目に炎症が生じ、そして、７日目以降に正常に戻り、処理マウスは、右前肢の関節において中等度の腫脹を示し（＋２０％）、一方、対照マウスは、ほぼ４５％の増加を示す。２本の曲線間の差は、二要因分散分析において統計的に有意である（ｐ＝０．００６９；＊＊）（図３０）。
【０２６９】
イグニッションのピークを分割することによって、これらの間の曲線の全体ではなく１日毎に比較した場合（独立ｔ検定）（４日目〜１２日目；図３０及び図３３）、本発明者らは、最高の炎症を観察し（７日目）、対照は、処理マウスよりも疾患により罹患している：ｐ＝０．００３７；＊＊。
【０２７０】
左前肢：処理マウスは、関節のサイズにおいて２０％の増加を示し、ｄ’−そして、対照マウスは、’−’４５％である。２本の曲線間の差は、二要因分散分析で統計的に有意である（二要因分散分析−ｐ＝０．０３９７；＊）（図３１）。また、本発明者らは、左前肢の関節サイズの成長曲線から炎症の枠組みを認識した。上述の曲線（図３０）と比べて、それは約３日目〜１０日目である。
【０２７１】
炎症ピーク（７日目）において、対照は、処理マウスよりも疾患の臨床徴候を示すマウスが多いことが分かる：ｐ＝０．００６４；＊＊。上記表現（図３１及び図３４）は、対照と比べて処理マウスの左前肢のサイズの成長を毎日比較する（独立ｔ検定）。
【０２７２】
炎症スコアの評価
炎症スコアを各肢について独立に計算し（左及び右の後及び前肢）、次いで、足し合わせて、各マウスについての全体炎症スコアを得る（図３２）。対照マウスのスコアは約７日目に最高に達し、一方、処理マウスは、５日目を超えない。枠組みは、両曲線において４〜１２日目に認識され、これは、炎症スコアの周期を表す（図３２及び図３５）。２本の曲線は、統計的に有意である：ｐ＝０．０１５６；＊（二要因分散分析）（図３２）。
【０２７３】
この研究では、RAを模倣するK/BxNモデルにおいてP140ペプチドの重要な効果を証明する。全ての臨床徴候（関節腫脹、体重減少、及び炎症スコアの出現）は、弱まる傾向がある。
【０２７４】
予防的モデルにおいて、そして、統計的に有意な方式で、本発明者らは、処理マウスの体重減少が少なく、そして、より早く正常に戻り；肢における炎症が少なく、そして、その変形が限定されており；炎症が最高に達したとき、炎症スコアが急激に減少することが分かる。
【０２７５】
治癒的モデルについては、本発明者らは、疾患の誘導が非常に緩やか又は更にはゼロであることが知られているので、P140ペプチドの効果についての結論を出すことができない。
【０２７６】
特定の態様では、本明細書は、慢性炎症性疾患又はハイパーオートファジー関連自己免疫疾患若しくは障害の症状を処置するか又は改善させるための、有効量の配列番号１、２、４、５、及びこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つのペプチドを含む組成物であって、該ペプチドにおける少なくとも１つのセリンがリン酸化されており、該組成物が、このような処置を必要としている患者に投与され、そして、該組成物が、該疾患又は障害の少なくとも１つの症状の処置又は改善に有効である組成物を提供する。
【０２７７】
特定の態様では、本明細書は、慢性炎症性疾患又はハイパーオートファジー関連自己免疫疾患若しくは障害の症状を処置するか又は改善させる方法で使用するための、有効量の配列番号１、２、４、５、及びこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つのペプチドを含む組成物であって、該ペプチドにおける少なくとも１つのセリンがリン酸化されており、該方法が、このような処置を必要としている患者に該組成物を投与することを含み、そして、該組成物が、該疾患又は障害の少なくとも１つの症状の処置又は改善に有効である組成物を提供する。
【０２７８】
特定の態様では、本明細書は、慢性炎症性疾患又はハイパーオートファジー関連自己免疫疾患若しくは障害の症状を処置するか又は改善させるための医薬を調製するための、有効量の配列番号１、２、４、５、及びこれらの組合せから選択される少なくとも１つのペプチドの使用であって、該ペプチドにおける少なくとも１つのセリンがリン酸化されており、該組成物が、このような処置を必要としている患者に投与され、そして、該組成物が、該疾患又は障害の少なくとも１つの症状の処置又は改善に有効である使用を提供する。
【０２７９】
本明細書に記載する態様又は実施態様のいずれかでは、ハイパーオートファジー関連自己免疫疾患又は障害は、ハイパーシャペロン介在性オートファジー（CMA）関連疾患又は障害である。
【０２８０】
態様又は実施態様のいずれかでは、CMA関連疾患又は障害は、関節リウマチ（RA）、多発性硬化症（MS）、関節リウマチ（RA）、筋ジストロフィー（MD）、喘息、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、神経精神ループス、クローン病（CD）、慢性炎症性脱髄性多発根神経障害（CIDP）、線維筋痛、II型糖尿病、多発性筋炎、肺疾患、及び慢性免疫性血小板減少症（ITP）からなる群から選択される。
【０２８１】
本明細書に記載する態様又は実施態様のいずれかでは、医薬組成物は、約１００ng〜約５mgの投薬量で投与される。
【０２８２】
本明細書に記載する態様又は実施態様のいずれかでは、医薬組成物は、本明細書に記載する凍結乾燥ペプチドと、薬学的に許容し得る賦形剤とを含む。本明細書に記載する態様又は実施態様のいずれかでは、賦形剤は、マンニトールである。
【０２８３】
本明細書に記載する態様又は実施態様のいずれかでは、ペプチドは、以下の構造を有する。
【化９】
0006659693.tif 000022
【０２８４】
本明細書に記載する態様又は実施態様のいずれかでは、ペプチドは、以下の構造を有する。
【化１０】
0006659693.tif 000023
【０２８５】
本発明の好ましい実施態様を本明細書に図示及び説明したが、このような実施態様はほんの一例として提供されるものであることが理解される。多数の変形、変更、及び置換が、本発明の趣旨から逸脱することなく当業者によって行われる。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の趣旨及び範囲内で全てのこのような変形を網羅することを意図する。
【０２８６】
本願を通して引用される全ての参照文献、特許、係属中の特許出願、及び公開特許の内容は、明示的に参照により本明細書に組み入れられる。
【０２８７】
当業者は、単なるルーチンな実験を用いて、本明細書に記載する本発明の特定の実施態様に対する多くの均等物を認識するか又は解明することができる。このような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることを意図する。本明細書に記載する詳細な実施例及び実施態様は、例示目的のためだけに一例として与えられるものであって、決して本発明に対する限定であるとは考えられないことが理解される。それに鑑みて様々な変形又は変更が当業者に示唆され、そして、この出願の趣旨及び範囲内に含まれ、そして、添付の特許請求の範囲の範囲内であると考えられる。例えば、所望の効果を最適化するために成分の相対量を変更してもよく、追加成分を添加してもよく、及び／又は記載されている成分のうちの１つ以上を類似の成分に置換してもよい。本発明のシステム、方法、及びプロセスに関連する更なる有利な特徴及び機能は、添付の特許請求の範囲から明らかになる。更に、当業者は、単なるルーチンな実験を用いて、本明細書に記載する本発明の特定の実施態様に対する多くの均等物を認識するか又は解明することができる。このような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることを意図する。
【図１】
0006659693.tif 000026
【図２】
0006659693.tif 000027
【図３】
0006659693.tif 000028
【図４】
0006659693.tif 000029
【図５】
0006659693.tif 000030
【図６】
0006659693.tif 000031
【図７】
0006659693.tif 000032
【図８】
0006659693.tif 000033
【図９】
0006659693.tif 000034
【図１０】
0006659693.tif 000035
【図１１】
0006659693.tif 000036
【図１２】
0006659693.tif 000037
【図１３】
0006659693.tif 000038
【図１４】
0006659693.tif 000039
【図１５】
0006659693.tif 000040
【図１６】
0006659693.tif 000041
【図１７】
0006659693.tif 000042
【図１８】
0006659693.tif 000043
【図１９】
0006659693.tif 000044
【図２０】
0006659693.tif 000045
【図２１】
0006659693.tif 000046
【図２２】
0006659693.tif 000047
【図２３】
0006659693.tif 000048
【図２４】
0006659693.tif 000049
【図２５】
0006659693.tif 000050
【図２６】
0006659693.tif 000051
【図２７】
0006659693.tif 000052
【図２８】
0006659693.tif 000053
【図２９】
0006659693.tif 000054
【図３０】
0006659693.tif 000055
【図３１】
0006659693.tif 000056
【図３２】
0006659693.tif 000057
【図３３】
0006659693.tif 000058
【図３４】
0006659693.tif 000059
【図３５】
0006659693.tif 000060
【配列表】
0006659693000001.app