(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類組織に由来する細胞混合物を提供すること、
多能性間葉系幹細胞を取得するために、前記細胞混合物からインスリン様成長因子−１受容体、ＣＤ１３，ＣＤ２９，ＣＤ３４，ＣＤ４４，ＣＤ４５，ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５，ＣＤ１１７，ＣＤ１６６，ＨＬＡ−ＡＢＣ，ＨＬＡ−ＤＲ，Ｏｃｔ−４，Ｓｏｘ−２，ＮａｎｏｇとＳＳＥＡ−４を同時に発現する複数の細胞を分離する分離工程を行うこと、
を含む多能性間葉系幹細胞の分離方法。
【請求項２】
前記分離工程は、インターロイキン２２受容体に対して陽性を示す細胞を分離することを更に含むことを特徴とする請求項１に記載の多能性間葉系幹細胞の分離方法。
【請求項３】
前記哺乳類組織は、骨髄、歯髄、胎盤、臍帯、臍帯血及び脂肪からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１に記載の多能性間葉系幹細胞の分離方法。
【請求項４】
虚血性心疾患用の治療薬物の調製に用いられる分離された間葉系幹細胞の用途であって、
前記分離された間葉系幹細胞は、インスリン様成長因子−１受容体抗体を用いて分離され、次に、インスリン様成長因子−１受容体の発現を増強するために血小板由来の成長因子ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）を２．５−５０ｎｇ／ｍｌ含む培地で培養されることを特徴とする分離された間葉系幹細胞の用途。
【請求項５】
前記虚血性心疾患は、心筋梗塞であることを特徴とする請求項４に記載の分離された間葉系幹細胞の用途。
【請求項６】
前記虚血性心疾患用の治療薬物は、心筋梗塞による線維症を減少する薬物又は免疫応答を減少する薬物を含むことを特徴とする請求項４に記載の分離された間葉系幹細胞の用途。
【請求項７】
個体の脳組織損傷の治療薬物の調製に用いられる分離された間葉系幹細胞の用途であって、
前記分離された間葉系幹細胞は、インスリン様成長因子−１受容体抗体を用いて分離され、次に、インスリン様成長因子−１受容体の発現を増強するために血小板由来の成長因子ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）を２．５−５０ｎｇ／ｍｌ含む培地で培養されることを特徴とする分離された間葉系幹細胞の用途。
【請求項８】
前記脳組織損傷は、脳虚血性疾患に起因することを特徴とする請求項７に記載の分離された間葉系幹細胞の用途。
【請求項９】
前記脳虚血性疾患は、脳卒中であることを特徴とする請求項８に記載の分離された間葉系幹細胞の用途。
【請求項１０】
前記脳組織損傷は、神経変性疾患に起因することを特徴する請求項７に記載の分離された間葉系幹細胞の用途。
【請求項１１】
前記神経変性疾患はパーキンソン病であることを特徴とする請求項１０に記載の分離された間葉系幹細胞の用途。
【請求項１２】
前記個体の脳組織損傷の治療薬物は、グルコースの代謝活性を増加する薬物、血管新生を促進する薬物又は神経突起の再生を促進する薬物を含むことを特徴とする請求項７に記載の分離された間葉系幹細胞の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞に関し、特に、特別な受容体を発現する間葉系幹細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ）は、生体内における未分化のネイティブ細胞であり、長時間に絶えずに複製、増殖して、且つ分化して特殊形態や機能を持つ成熟細胞に誘導される能力を有する。幹細胞は、ソースによって、主に、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ；ＥＳＣｓ）及び成体幹細胞（ａｄｕｌｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）の２つに分けられ、胚性幹細胞は胞胚内の内細胞塊に由来し、成体幹細胞は様々な組織に由来する。幹細胞は、更に、その分化能力によって、主に、完全な能力を有し、完全胚又は生体に分化発育することのできる全能性幹細胞（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）、３つの胚層に分化する能力を有するが、完全胚又は生体に発育することができず、ある組織又は器官の全ての細胞を形成することのできる多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）、例えば神経幹細胞、血球幹細胞、肝臓幹細胞、皮膚幹細胞等のような特定組織の幹細胞を含む複能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）の３つに分けられる。
【０００３】
間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ；ＭＳＣｓ）は、成体幹細胞であり、多能性幹細胞に属し、幹細胞増殖及び多方向化の能力を有し、体に必要な神経細胞、血管細胞、グリア細胞、脂肪細胞又は骨細胞等の多種の間質組織に分化することができる。間葉系幹細胞は、骨髄、脂肪、歯髄又は臍帯等の間質組織から取得されることができ、取得出所によって、ある特定の組織に分化する傾向がある能力を有し、体内組織が損傷された場合、直接又は間接に修復することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
間葉系幹細胞は、神経、心臓、肝臓、肺臓、腎臓、骨格、軟骨、網膜損傷の修復に適用されることができ、近年、その免疫調節機能が更に発見され、多くの免疫障害の治療に役立つ可能性がある。間葉系幹細胞は、抗原性が他の幹細胞より小さく、臨床使用時に造血幹細胞のように移植前に必ず前もって厳格にマッチングする必要がなく、胚性幹細胞のように使用時に倫理的配慮が必要ないため、非常に良い細胞治療の源である。臨床適用において、間葉系幹細胞の自己複製能力及び多能性分化能力が非常に重要であるため、間葉系幹細胞の多能性の維持に関連する細胞表面受容体は、幹細胞医療の関連技術の研究開発の主要な課題の一つとなる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の態様は、哺乳類組織に由来する細胞混合物を提供すること、分離工程を行うことを含む多能性間葉系幹細胞の分離方法を提供する。分離工程は、多能性間葉系幹細胞を取得するために、細胞混合物からインスリン様成長因子−１受容体、ＣＤ１３，ＣＤ２９，ＣＤ３４，ＣＤ４４，ＣＤ４５，ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５，ＣＤ１１７，ＣＤ１６６，ＨＬＡ−ＡＢＣ，ＨＬＡ−ＤＲ，Ｏｃｔ−４，Ｓｏｘ−２，ＮａｎｏｇとＳＳＥＡ−４を同時に発現する複数の細胞を分離する。
【００１３】
多能性間葉系幹細胞の分離方法によれば、分離工程は、インターロイキン−２２受容体（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ  １；ＩＬ２２ＲＡ１）に対して陽性を示す細胞を分離することを更に含む。
【００１４】
多能性間葉系幹細胞の分離方法によれば、哺乳類組織は、骨髄、歯髄、胎盤、臍帯、臍帯血及び脂肪からなる群から選ばれるものである。
【００１５】
これによって、本発明の多能性間葉系幹細胞の分離方法は、哺乳類組織に由来する細胞混合物から、ＩＧＦ１Ｒに対して陽性を示す細胞を選別し、より好ましくは、ＩＬ２２ＲＡ１に対して陽性を示す細胞を更に選別することができ、選別されたものは多能性分化能力を有する間葉系幹細胞であるため、多能性間葉系幹細胞を迅速且つ専一に精製することができる。
【００１６】
本発明の別の態様は、虚血性心疾患用の治療薬物を調製するための、分離された間葉系幹細胞の用途を提供する。この分離された間葉系幹細胞は、インスリン様成長因子−１受容体抗体を用いて分離され、次に、インスリン様成長因子−１受容体の発現を増強するために血小板由来の成長因子ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）を２．５−５０ｎｇ／ｍｌ含む培地で培養される。
【００１７】
分離された間葉系幹細胞の用途によれば、虚血性心疾患は、心筋梗塞である。
【００１８】
分離された間葉系幹細胞の用途によれば、虚血性心疾患の薬物は、心筋梗塞による線維症を減少する薬物又は免疫応答を減少する薬物であってよい。
【００１９】
これによって、本発明の分離された間葉系幹細胞は、細胞治療に使用される場合、心筋梗塞後の左心室の機能障害を低減し、梗塞面積を削減し、心筋梗塞による線維症及び免疫応答を減少することができるため、個体の虚血性心疾患の治療に用いられることができる。
【００２０】
本発明のさらに別の態様は、個体の脳組織損傷の治療薬物を調製するための、分離された間葉系幹細胞の用途を提供する。この分離された間葉系幹細胞は、インスリン様成長因子−１受容体抗体を用いて分離され、次に、インスリン様成長因子−１受容体の発現を増強するために血小板由来の成長因子ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）を２．５−５０ｎｇ／ｍｌ含む培地で培養される。
【００２１】
分離された間葉系幹細胞の用途によれば、脳組織損傷は、例えば脳卒中のような脳虚血性疾患に起因する。
【００２２】
分離された間葉系幹細胞の用途によれば、脳組織損傷は、例えばパーキンソン病のような神経変性疾患に起因する。
【００２３】
分離された間葉系幹細胞の用途によれば、個体の脳組織損傷の治療薬物は、グルコース代謝活性を増加する薬物、血管新生を促進する薬物又は神経突起の再生を促進する薬物であってよい。
【００２４】
これによって、本発明の分離された間葉系幹細胞は、細胞治療に使用される場合、グルコースの代謝活性を増加し、血管新生を促進し、神経突起の再生を強化することができるため、脳組織が損傷された個体の治療に用いられることができる。
【００２５】
読者に本開示内容を基本的に理解させるために、以上の発明内容は、本開示内容の簡単な要約を提供することを主旨とする。この発明内容は、本開示内容の完全な概要ではなく、且つ本発明の態様の重要／主要素子を指定し又は本発明の範囲を限定することを意味しない。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
下記図面の説明は、本発明の上記、他の目的、特徴、メリット及び態様をより分かりやすくするためのものである。
【図１Ａ】臍帯間葉系幹細胞の初代培養の顕微鏡写真図である。
【図１Ｂ】本発明の分離された間葉系幹細胞のインスリン様成長因子−１受容体（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  １  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＩＧＦ１Ｒ）の発現の結果図である。
【図１Ｃ】本発明の分離された間葉系幹細胞のインターロイキン−２２受容体（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ  １；ＩＬ２２ＲＡ１）の発現の結果図である。
【図１Ｄ】本発明の分離された間葉系幹細胞のホウォートンゼリーにおける細胞の特異性細胞表面分子の発現の結果図である。
【図１Ｅ】本発明の分離された間葉系幹細胞のホウォートンゼリーにおける細胞の特異性細胞表面分子の発現の結果図である。
【図１Ｆ】本発明の分離された間葉系幹細胞の多能性マーカーの発現の結果図である。
【図２】本発明の分離された間葉系幹細胞の増殖の指数図である。
【図３Ａ】ヒト臍帯血血清（ｈｕｍａｎ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｓｅｒｕｍ；ｈＵＣＳ）とウシ胎仔血清（Ｆｅｔａｌ  Ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ；ＦＣＳ）のヒト細胞ホルモンチップの分析チャートである。
【図３Ｂ】ｈＵＣＳとＦＣＳのＥＬＩＳＡ分析チャートである。
【図４Ａ】本発明の分離された間葉系幹細胞にｓｈＲＮＡを導入した後のＩＧＦ１Ｒの発現レベルの分析チャートである。
【図４Ｂ】本発明の分離された間葉系幹細胞の増殖の傾向グラフである。
【図４Ｃ】本発明の分離された間葉系幹細胞の細胞増殖の分析チャートである。
【図５Ａ】本発明の分離された間葉系幹細胞のフローサイトメトリーによる二重染色法の分析チャートである。
【図５Ｂ】本発明の分離された間葉系幹細胞の免疫蛍光染色による二重染色法の顕微鏡写真図である。
【図５Ｃ】間葉系幹細胞が多能性マーカーを発現する定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果図である。
【図６Ａ】本発明の分離された間葉系幹細胞が異なる組織細胞に分化する顕微鏡写真図である。
【図６Ｂ】本発明の分離された間葉系幹細胞が神経細胞に分化する顕微鏡写真図である。
【図７Ａ】異なる用量のインスリン様成長因子−１（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  １、ＩＧＦ１）を本発明の分離された間葉系幹細胞に処理した後で、そのＩＧＦ１Ｒ及び走化性因子ＣＸＣＲ４の発現レベルの分析チャートである。
【図７Ｂ】異なる用量の血小板由来成長因子−ＢＢ（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ）を本発明の分離された間葉系幹細胞に処理した後で、そのＩＧＦ１Ｒと走化性因子ＣＸＣＲ４の発現レベルの分析チャートである。
【図７Ｃ】異なる用量のＩＧＦ１及びＰＤＧＦ−ＢＢを本発明の分離された間葉系幹細胞に同時に処理した後で、そのＩＧＦ１Ｒの発現レベルの分析チャートである。
【図７Ｄ】異なる用量のＩＧＦ１及びＰＤＧＦ−ＢＢを本発明の分離された間葉系幹細胞に同時に処理した後で、そのリン酸化プロテインキナーゼＢ（ｐ−Ａｋｔ）とリン酸化シグナル伝達兼転写活性化因子−３（ｐ−Ｓｔａｔ３）の発現レベルの分析チャートである。
【図８Ａ】ラットの体揺れテストの結果図である。
【図８Ｂ】ブロッキングテストのラットの体揺れテストの結果図である。
【図９Ａ】ラットの垂直活動テストの結果図である。
【図９Ｂ】ラットの垂直活動時間テストの結果図である。
【図９Ｃ】ラットの垂直運動数テストの結果図である。
【図１０】ラットの前肢握力テストの結果図である。
【図１１Ａ】細胞療法後のラットの[18Ｆ]フルオロ−２−デオキシグルコース陽電子放出断層撮影法（ＦＤＧ−ＰＥＴ）画像である。
【図１１Ｂ】細胞療法後のラットの[18Ｆ]ＦＤＧ−ＰＥＴイメージを定量化した図。
【図１２】細胞療法後のラットの損傷された脳組織の抗アポトーシスタンパク質の発現レベルの分析チャートである。
【図１３Ａ】細胞療法後のラットの脳組織におけるビスベンズイミドで標示された細胞核とヒト細胞核抗原との共発現（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）の顕微鏡写真図である。
【図１３Ｂ】細胞療法後のラット脳組織に移植された本発明の分離された間葉系幹細胞数の顕微鏡写真図である。
【図１４Ａ】脳卒中ラットの損傷された脳組織に移植された本発明の分離された間葉系幹細胞のＧＦＡＰとＩＧＦ１Ｒ又はＣＸＣＲ４との共発現の顕微鏡写真図である。
【図１４Ｂ】脳卒中ラットの損傷された脳組織に移植された本発明の分離された間葉系幹細胞のＭＡＰ−２とＩＧＦ１Ｒ又はＣＸＣＲ４との共発現の顕微鏡写真図である。
【図１４Ｃ】脳卒中ラットの損傷された脳組織に移植された本発明の分離された間葉系幹細胞のＮｅｕＮとＩＧＦ１Ｒ又はＣＸＣＲ４との共発現の顕微鏡写真図である。
【図１５Ａ】脳卒中ラットの損傷された脳組織に移植された本発明の分離された間葉系幹細胞のｖＷＦとＩＧＦ１Ｒ又はＣＸＣＲ４との共発現の顕微鏡写真図である。
【図１５Ｂ】本発明の分離された間葉系幹細胞を移植した脳卒中ラットのＦＩＴＣ−デキストラン灌流の結果図である。
【図１５Ｃ】本発明の分離された間葉系幹細胞の脳卒中ラットの血管密度測定の結果図である。
【図１６】本発明の分離された間葉系幹細胞を移植した脳卒中ラットの虚血性脳の脳血流量の結果図である。
【図１７Ａ】神経突起の再生のインビボ試験の結果図である。
【図１７Ｂ】神経突起の再生のインビトロ試験の結果図である。
【図１８】本発明の分離された間葉系幹細胞を移植した急性心筋梗塞ラットの心筋梗塞面積図である。
【図１９Ａ】本発明の分離された間葉系幹細胞を移植した急性心筋梗塞ラットの心臓超音波画像である。
【図１９Ｂ】本発明の分離された間葉系幹細胞を移植した急性心筋梗塞ラットの心臓超音波を定量化した図である。
【図２０】本発明の分離された間葉系幹細胞を移植した３日後の急性心筋梗塞ラットの免疫組織化学的染色法の結果図である。
【図２１】本発明の分離された間葉系幹細胞を移植した３日後の急性心筋梗塞ラットの免疫蛍光染色法の結果図である。
【図２２】本発明の分離された間葉系幹細胞を移植した３日後の急性心筋梗塞ラットの炎症性因子の発現レベルの分析チャートである。
【図２３】本発明の分離された間葉系幹細胞を移植した２８日後の急性心筋梗塞ラットのマッソントリクローム染色法の結果図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本明細書の開示内容は、特定な細胞表面受容体を発現し、且つ自己複製能力及び多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）分化能力を有する分離された間葉系幹細胞を提供する。本明細書の開示内容は、分離された間葉系幹細胞に特定な細胞表面受容体を大量に発現させ、且つ多能性分化能力を維持することのできる分離された間葉系幹細胞の培養方法を更に提供する。本明細書の開示内容は、また、哺乳類組織に由来する細胞混合物から、多能性分化能力を有する間葉系幹細胞を迅速且つ専一に選別することのできる多能性間葉系幹細胞の分離方法を提供する。なお、本明細書の開示内容は、虚血性心疾患用の治療薬物又は個体の脳組織損傷の治療薬物の調製に適用されることのできる分離された間葉系幹細胞の用途を提供する。
以下、「間葉系幹細胞クローン原性増殖方法」は「分離された間葉系幹細胞の培養方法」と、「自己更新」は「自己複製」と、それぞれ読み替える。
【００２８】
更にいうと、本発明は、インスリン様成長因子−１受容体（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  １  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＩＧＦ１Ｒ）を発現する分離された間葉系幹細胞を提供する。以下、本発明の分離された間葉系幹細胞を示す。ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞は、多能性のものであり、そのソースがヒト細胞であってよく、より好ましくは臍帯間葉系幹細胞である。本発明の間葉系幹細胞クローン原性増殖方法は、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞をヒト臍帯血血清（ｈｕｍａｎ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｓｅｒｕｍ；ｈＵＣＳ）を含有する培地で培養して、ｈＵＣＳの濃度が１〜１０％（ｖ／ｖ）であり、より好ましくは２％（ｖ／ｖ）である。本発明の多能性間葉系幹細胞の分離方法は、哺乳類組織由来する細胞混合物から、ＩＧＦ１Ｒに対して陽性を示す細胞を選別し、より好ましくは、インターロイキン−２２受容体（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ  １、ＩＬ２２ＲＡ１）に対して陽性を示す細胞を更に選別することができ、即ち細胞混合物から多能性間葉系幹細胞を分離することができ、哺乳類組織は、骨髄、歯髄、胎盤、臍帯、臍帯血及び脂肪からなる群から選ばれるものである。
【００２９】
本発明のＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞は、虚血性心疾患用の治療薬物や個体の脳組織損傷の治療薬物の調製に適用されることができる。更に言うと、本発明のＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞は、心筋梗塞後の左心室の機能障害を低減させ、梗塞面積を削減し、心筋梗塞による線維症及び免疫応答を減少することができるため、心筋梗塞のような、個体の虚血性心疾患の治療に用いられることができる。また、本発明のＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞は、グルコースの代謝活性を増加し、血管新生を促進し、神経突起の再生を強化することができ、且つＩＧＦ１Ｒと走化性因子受容体ＣＸＣＲ４との交互作用によって、神経リモデリングの効果を有するため、脳組織が損傷した個体の治療に用いられることができる。脳組織損傷は、脳虚血性疾患又は神経変性疾患であってよく、脳虚血性疾患が脳卒中であってよく、神経変性疾患がパーキンソン病であってよい。
【００３０】
以下、本明細書に使用される特定な名詞を説明する。
【００３１】
インスリン様成長因子１（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  １  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＩＧＦ１）の細胞表面受容体は、チロシンキナーゼ受容体ファミリーに属する。そのリガンドＩＧＦ１は、分子構造がポリペプチドホルモンのインスリンと類似するホルモンであり、成長発育及び成人の合成代謝において重要な作用を有する。
【００３２】
インターロイキン−２２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２２；ＩＬ２２）の細胞表面受容体は、そのリガンドＩＬ−２２が抗炎症及び炎症促進の二重特性を有する細胞因子であり、多種の免疫細胞により分泌することができる。
【００３３】
間質細胞由来因子１（ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒ−１ａ；ＳＤＦ−１）の特異的受容体ＣＸＣＲ４は、体内の大部分の組織及び器官に発現され、３５２個のアミノ酸からなるＧタンパク質結合受容体（Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＧＰＣＲ）であり、７回膜貫通構造を有する。そのリガンドＳＤＦ−１は、リンパ細胞に対して強力な走化性を有する。
【００３４】
当業者が過度に解読せずに、本発明を完全に利用し実践することができるように、下記具体的な実験例によって更に本発明を例示的に説明するが、これらの実験例は、本発明の範囲を制限するものではなく、本発明の材料及び方法を如何に実施するかを説明するためのものである。
【００３５】
＜実験例＞
【００３６】
第１部分  本発明のＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞
【００３７】
１．１  ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞の調製
【００３８】
ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を調製するために、本実験例では、哺乳類組織としてヒト臍帯組織を使用し、ヒト臍帯組織におけるヒト臍帯間葉系幹細胞はホウォートンゼリー（Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ  ｊｅｌｌｙ）からのものである。収集されたヒト臍帯組織をまずＣａ2+及びＭｇ2+を含有しないＰＢＳ（ＤＰＢＳ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で３回洗浄した後で、中心線方向においてはさみで切り、且つホウォートンゼリーから臍帯動脈、臍帯静脈及び外膜を抽出した。また、ホウォートンゼリーの間質組織を０．５ｃｍ3より小さい立方体に切り取り、コラゲナーゼ１型（Ｓｉｇｍａ）で処理し、且つ３７℃で５％のＣＯ2、９５％の飽和湿度で１４〜１８時間培養した。また、外植体に対して、それぞれ２％のｈＵＣＳ又は１０％のウシ胎仔血清（Ｆｅｔａｌ  Ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ；ＦＣＳ）を含有するＤＭＥＭを細胞培地として、且つ細胞培地に抗生物質を添加し、３７℃で５％のＣＯ2、９５％の飽和湿度で５〜７日静置培養した。外植体から外へ成長する紡錘形接着細胞を発見するまで、ヒト臍帯組織の外植体培養を維持した。
【００３９】
図１Ａを参照されたい。図１Ａは、臍帯間葉系幹細胞の初代培養の顕微鏡写真図であり、黒い矢は外植体を示し、４〜８世代培養した後で、細胞が外植体から移行して、且つ細胞形態は均一な紡錘形になることが見られた。
【００４０】
次に、フローサイトメトリーによって初代培養の臍帯間葉系幹細胞の細胞表面分子を分析した。分析された細胞表面分子として、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ２２ＲＡ１、ホウォートンゼリーにおける細胞の特異性細胞表面分子及び多能性マーカーを含む。ホウォートンゼリーにおける細胞の特異性細胞表面分子は、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１６６、ＨＬＡ−ＡＢＣ及びＨＬＡ−ＤＲを含む。多能性マーカーは、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、Ｎａｎｏｇ及びＳＳＥＡ−４を含む。
【００４１】
図１Ｂ〜図１Ｆを参照されたい。図１Ｂは、本発明の分離された間葉系幹細胞のＩＧＦ１Ｒの発現の結果図である。図１Ｃは、本発明の分離された間葉系幹細胞のＩＬ２２ＲＡ１の発現の結果図である。図１Ｄ及び図１Ｅは、本発明の分離された間葉系幹細胞のホウォートンゼリーにおける細胞の特異性細胞表面分子の発現の結果図である。図１Ｆは、本発明の分離された間葉系幹細胞の多能性マーカーの発現の結果図である。
【００４２】
図１Ｂにおいて、まず、フローサイトメトリーによって初代培養の臍帯間葉系幹細胞のＩＧＦ１Ｒの発現を分析し、次に、Ｗｅｓｔｅｒｎブロッティング法によって異なるソースの間葉系幹細胞のＩＧＦ１Ｒの発現を分析した。分析された細胞種類は、ヒト線維芽細胞、ヒト歯髄幹細胞、脂肪間葉系幹細胞、臍帯間葉系幹細胞及び骨髄間葉系幹細胞を含み、図１Ｂの結果に示すように、異なるソースの間葉系幹細胞の何れにもＩＧＦ１Ｒの発現が見られた。
【００４３】
図１Ｃ〜図１Ｆでは、フローサイトメトリーによって初代培養の臍帯間葉系幹細胞のＩＬ２２Ｒ１Ａの発現、ホウォートンゼリーにおける細胞の特異性細胞表面分子の発現及び多能性マーカーの発現を分析した。図１Ｃの結果に示すように、初代培養の臍帯間葉系幹細胞にＩＬ２２Ｒ１Ａの発現が見られ、対照群と比べて約４５．４％の臍帯間葉系幹細胞がＩＬ２２Ｒ１Ａを発現した。図１Ｄ及び図１Ｅの結果に示すように、初代培養の臍帯間葉系幹細胞にＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６及びＨＬＡ−ＡＢＣの発現が見られ、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７及びＨＬＡ−ＤＲの発現が見られないので、初代培養の臍帯間葉系幹細胞が造血幹細胞発現型ではないことが判明される。図１Ｆの結果に示すように、初代培養の臍帯間葉系幹細胞の何れにも、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、Ｎａｎｏｇ及びＳＳＥＡ−４の多能性分化能力を表す多能性マーカーが発見された。
【００４４】
実験的に更にフローサイトメトリーにより分析された細胞からＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を選別した。精製の方法として、細胞と抗ＩＧＦ１抗体とを混合させた後で、ＦＡＣＳＴＡＲ+フローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって抗ＩＧＦ１抗体で感染した細胞を選別して、更にコーンブルー排除試験（ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｔｅｓｔ）によって選別された細胞を分析し、細胞生存率が約９６％であった。
【００４５】
１．２  ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞の培養
【００４６】
選別されたＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞に対して、それぞれ２％のｈＵＣＳ又は１０％のＦＣＳを含有するＤＭＥＭを細胞培地として、且つ細胞培地に抗生物質を添加し、３７℃で５％のＣＯ2、９５％の飽和湿度の雰囲気で培養した。且つｈＵＣＳ及びＦＣＳを含有するもののそれぞれに培養されるＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞の成長動態学を分析した。
【００４７】
図２を参照されたい。図２は、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞の増殖の指数図である。図２の結果に示すように、ｈＵＣＳを含有する培地で培養されたＩＧＦ１Ｒ＋間葉系幹細胞の分裂速度は、ＦＣＳを含有する培地で培養されたＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞より速く、その１世代を倍増する時間は２２時間であり、且つ高齢及び自発的分化の跡が見られずに、１５０日以上増殖することができる。
【００４８】
ｈＵＣＳを含有する培地でＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を培養する場合のメリットを評価するために、実験的にヒト細胞ホルモンチップ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈTM）でｈＵＣＳ及びＦＣＳにおける複数の特定な細胞ホルモンを分析し比較した。本実験例において、合計で４２つの細胞ホルモンを分析し、且つ光学密度によってｈＵＣＳ又はＦＣＳにおける細胞ホルモンの発現レベルを測定した。
【００４９】
図３Ａを参照されたい。図３Ａは、ｈＵＣＳとＦＣＳのヒト細胞ホルモンチップの分析チャートであり、Ｐがポジティブコントロールを示し、Ｎがネガティブコントロールを示す。図３Ａの結果に示すように、ｈＵＣＳにおいて、表皮成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ＥＧＦ；ブロック１）、アンギオゲニン（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ、ＡＮＧ；ブロック２）、マクロファージ炎症性タンパク質（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＭＩＰ−１δ；ブロック３）、走化性ホルモンＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、ｎｏｒｍａｌ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｐｒｅｓｕｍａｂｌｙ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ；ＲＡＮＴＥＳ；ブロック４）及び血小板由来成長因子−ＢＢ（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ）の５つの細胞ホルモンの発現レベルはＦＣＳよりはるかに高く、この５つの細胞ホルモンの発現レベルの差の倍数はそれぞれ２倍、３倍、３倍、２倍及び４倍であった。それに比べて、ｈＵＣＳ及びＦＣＳにおいて、インスリン様成長因子１（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  １；ＩＧＦ−１）の発現レベルは類似であった。
【００５０】
ｈＵＣＳ及びＦＣＳにおけるＰＤＧＦ−ＢＢ及びＩＧＦ−１の濃度をより正確に定量的に測定するために、本実験例では、ｈＵＣＳ及びＦＣＳをサンプルとして、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）によってＰＤＧＦ−ＢＢ及びＩＧＦ−１の濃度分析を行った。
【００５１】
図３Ｂを参照されたい。図３Ｂは、ｈＵＣＳとＦＣＳのＥＬＩＳＡ分析チャートである。図３Ｂの結果に示すように、２つの血清におけるＩＧＦ１の発現レベルが類似するが、ＰＤＧＦ−ＢＢの部分において、ｈＵＣＳに含有されるＰＤＧＦ−ＢＢ濃度は、ＦＣＳにおける含有量よりはるかに高かった（ｐ＜０．０５）。
【００５２】
１．３  ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞の自己更新能力
【００５３】
ＩＧＦ１Ｒ情報経路が間葉系幹細胞の自己更新の調整制御に役立つかを検討するために、実験的にレンチウイルスによってＩＧＦ１Ｒを標的とするｓｈＲＮＡ（ＬＶ−ＩＧＦ１Ｒ−ｓｈ、ｓｃ−２９３５８−Ｖ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をｈＵＣＳ又はＦＣＳを含有する培地で培養されたＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞にそれぞれ導入することで、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞におけるＩＧＦ１Ｒの発現を低下させ、また、実験対照群として、実験的にレンチウイルスによって対照群のｓｈＲＮＡ（ＬＶ−ｃｏｎｔｒｏｌ−ｓｈ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をｈＵＣＳ又はＦＣＳを含有する培地で培養されたＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞にそれぞれ導入した。且つレンチウイルスに４８時間感染された後で、ｓｈＲＮＡが導入されたＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞のＩＧＦ１Ｒの発現レベルをＷｅｓｔｅｒｎブロッティング法によって分析した。また、ｓｈＲＮＡが導入された後のＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞の成長動態学を分析した。
【００５４】
図４Ａ〜図４Ｂを参照されたい。図４Ａは、ｓｈＲＮＡを導入した後のＩＧＦ１Ｒの発現レベルの分析チャートである。図４Ｂは、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞の増殖の傾向グラフである。図４Ａでは、レンチウイルスによってＬＶ−ＩＧＦ１Ｒ−ｓｈをそれぞれ導入し及びＬＶ−ｃｏｎｔｒｏｌ−ｓｈを導入したＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞、及びｓｈＲＮＡを導入していないＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞の合計で４つのグループがあった。図４Ａでは、４つのグループのＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞の何れもｈＵＣＳを含有する培地で培養された。図４Ａの結果に示すように、レンチウイルスに４８時間感染した後で、ＬＶ−ＩＧＦ１Ｒ−ｓｈが導入されたグループは、ＬＶ−ｃｏｎｔｒｏｌ−ｓｈが導入されたグループと比べて、そのＩＧＦ１Ｒの発現レベルが低下し、その他のグループのＩＧＦ１Ｒの発現レベルが相当であった。図４Ｂでは、ｈＵＣＳを含有する培地で培養され且つＬＶ−ｃｏｎｔｒｏｌ−ｓｈを導入したＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞（ＬＶ−ｃｏｎｔｒｏｌ−ｓｈ  Ｕ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞）、ＦＣＳを含有する培地で培養され且つＬＶ−ｃｏｎｔｒｏｌ−ｓｈを導入したＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞（ＬＶ−ｃｏｎｔｒｏｌ−ｓｈ  Ｆ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞）、ｈＵＣＳを含有する培地で培養され且つＬＶ−ＩＧＦ１Ｒ−ｓｈを導入したＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞（ＬＶ−ＩＧＦ１Ｒ−ｓｈ−Ｕ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞）、及びＦＣＳを含有する培地で培養され且つＬＶ−ＩＧＦ１Ｒ−ｓｈを導入したＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞（ＬＶ−ＩＧＦ１Ｒ−ｓｈ−Ｆ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞）という合計で４つのグループがあった。図４Ｂの成長動態学の結果に示すように、ｈＵＣＳ又はＦＣＳを含有する培地で培養されたＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞に関わらず、ＬＶ−ＩＧＦ１Ｒ−ｓｈが導入されると、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞の増殖が緩和された。
【００５５】
本実験例は、更に、ウラシル類似体（Ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ；ＢｒｄＵ）によってＤＮＡを標示し、細胞増殖の分析法（ＢｒｄＵ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）で検出し、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞の増殖潜在力を検討した。実験的に、まずＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞をサプリメントを添加していない培地で４〜６時間培養し、更にＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を２％のｈＵＣＳ、１０％のＦＣＳ又は１００ｎｇ／ｍＬのＳＤＦ−１を含有する培地で２日それぞれ培養し、且つＬＶ−ｃｏｎｔｒｏｌ−ｓｈ又はＬＶ−ＩＧＦ１Ｒ−ｓｈをそれぞれ導入し、更にＢｒｄＵ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｋｉｔｓ（Ｒｏｃｈｅ）でＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞の増殖状況を分析した。
【００５６】
図４Ｃを参照されたい。図４Ｃは、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞の細胞増殖の分析チャートである。図４Ｃにおいて、ＳＤＦ−１の添加された培地で培養されたＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を陽性対照群として、ｈＵＣＳを含有する培地で培養され且つＬＶ−ｃｏｎｔｒｏｌ−ｓｈを導入したＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞、ＦＣＳを含有する培地で培養され且つＬＶ−ｃｏｎｔｒｏｌ−ｓｈを導入したＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞、ｈＵＣＳを含有する培地で培養され且つＬＶ−ＩＧＦ１Ｒ−ｓｈを導入したＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞、及びＦＣＳを含有する培地で培養され且つＬＶ−ＩＧＦ１Ｒ−ｓｈを導入したＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞という合計で５つのグループがあった。図４Ｃの結果に示すように、ｈＵＣＳを含有する培地で培養されたＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞は、明らかにＦＣＳを含有する培地で培養されたＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞より多くのＢｒｄＵが埋め込まれる。比較によると、ｈＵＣＳ又はＦＣＳを含有する培地で培養されたＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞に関わらず、ＬＶ−ＩＧＦ１Ｒ−ｓｈを導入した後で、ＢｒｄＵの埋め込み量が大幅に低下するので、ＩＧＦ１Ｒは間葉系幹細胞の増殖時に不可欠な細胞表面受容体であることが判明した。
【００５７】
１．４  ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞の多能性
【００５８】
ＩＧＦ１ＲがＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞の多能性に関連するかを検討するために、実験的にそれぞれＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞にＩＧＦ１Ｒ／Ｏｃｔ−４抗体、ＩＧＦ１Ｒ／Ｓｏｘ−２抗体、ＩＧＦ１Ｒ／Ｎａｎｏｇ抗体、ＩＧＦ１Ｒ／ＳＳＥＡ４抗体を二重染色させ、更にそれぞれフローサイトメトリー及び免疫蛍光染色法によってＩＧＦ１Ｒと多能性マーカーとの共発現の状況を分析した。
【００５９】
図５Ａ及び図５Ｂを参照されたい。図５Ａは、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞のフローサイトメトリーによる二重染色法の分析チャートである。図５Ｂは、ＩＧＦ１Ｒ+間質幹細胞の免疫蛍光染色による二重染色法の顕微鏡写真図であり、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞の細胞が５つの独立したサンプルからのものである。図５Ａ及び図５Ｂの結果に示すように、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞の中でＩＧＦ１Ｒと多能性マーカーＯｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、Ｎａｎｏｇ及びＳＳＥＡ−４が共発現し、図５Ｂの結果から更に分かるように、ＩＧＦ１ＲもＣＸＣＲ４と共発現することが判明した。
【００６０】
本実験例は、更に定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）でＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞とＩＧＦ１Ｒを発現しない間葉系幹細胞（ＩＧＦ１Ｒ−間葉系幹細胞）の多能性マーカーの発現の違いを検討した。図５Ｃを参照されたい。図５Ｃは、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞及びＩＧＦ１Ｒ−間葉系幹細胞が多能性マーカーを発現する定量的ＲＴ−ＰＣＲ結果図であり、試験された細胞はそれぞれＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞及びＩＧＦ１Ｒ−間葉系幹細胞であり、且つヒト線維芽細胞を陰性対照群として、ヒト誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ；ｉＰＳ）を陽性対照群とした。結果に示すように、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ＳＳＥＡ−４又はＮａｎｏｇの発現に関わらず、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞はＩＧＦ１Ｒ−間葉系幹細胞の発現レベルより高く、ＩＧＦ１Ｒは間葉系幹細胞が多能性を維持する重要な細胞表面受容体であることが判明した。
【００６１】
１．５  ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞の分化能力
【００６２】
本実験例は、更に、体外分化試験によってｈＵＣＳ又はＦＣＳを含有する培地でＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を培養し、その多能性分化能力に影響を及ぼすかを検討した。実験的にそれぞれｈＵＣＳ又はＦＣＳを含有する培地で培養されて５〜１０世代を継代したＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を、５×１０3細胞／ｃｍ2の密度で細胞培養皿に播種し、且つそれぞれ１０％のＦＣＳ又は２％のｈＵＣＳを含有する異なる分化培地でＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を培養し、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、血管新生及び神経細胞に分化するようにガイドし且つ顕微鏡で細胞形態を観察し、更に染色法によって分化後の細胞種類を確認した。
【００６３】
図６Ａ及び図６Ｂを参照されたい。図６Ａは、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞が異なる組織細胞に分化する顕微鏡写真図である。図６Ｂは、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞が神経細胞に分化する顕微鏡写真図である。
【００６４】
図６Ａでは、オイルレッド組織染色（ｏｉｌ  ｒｅｄ  Ｏ  ｓｔａｉｎ）によって分化後の細胞が脂肪細胞であることを確認し、アリザリンレッド染色（Ａｌｉｚａｒｉｎ  ｒｅｄ  Ｓ  ｓｔａｉｎ）によって分化後の細胞が骨芽細胞であることを確認し、アルシアンブルー染色（Ａｌｃｉａｎ  ｂｌｕｅ  ｓｔａｉｎ）によって分化後の細胞が軟骨細胞であることを確認し、且つ明視野での細胞形態によってＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞が血管新生するかを確認した。図６Ａの結果に示すように、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞は、分化培地の培養によって、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞及び血管新生に分化することができる。
【００６５】
図６Ｂにおける明視野の顕微鏡写真に示すように、神経細胞分化培地で培養されたＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞は、拡張神経の突起状構造の細胞形態が見られ、分化後の細胞は神経細胞であることが判明した。本実験例は、更に、免疫蛍光染色によって分化後の細胞が成熟した神経マーカーを発現するかを確認し、成熟した神経マーカーは、ＧＦＡＰ（ｇｌｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＭＡＰ−２（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）、Ｏ４及びＴｕｊ−１（Ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｌａｓｓ  ＩＩＩ  ｂｅｔａ−ｔｕｂｕｌｉｎ）を含む。図６Ｂの結果に示すように、分化後の細胞に４つの成熟した神経マーカーが何れも発現し、分化後の細胞が確実に神経細胞であることが証明された。
【００６６】
また、下記の表１を参照されたい。表１は、２％のｈＵＣＳを含有する分化培地又は１０％のＦＣＳを含有する分化培地で培養されたＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞に、４つの成熟した神経細胞マーカーの発現の割合である。結果に示すように、２％のｈＵＣＳを含有する分化培地で培養されたＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞は、どの成熟した神経マーカーの発現割合でも１０％のＦＣＳを含有する分化培地で培養されたものより高く、ｈＵＣＳを含有する培地で培養されたＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞は神経細胞により容易に分化することが判明した。
【００６７】
【表１】
0006766082.tif 000002
【００６８】
１．６  ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞の調整制御メカニズム
【００６９】
本実験例では、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞のＩＧＦ１Ｒ及びＣＸＣＲ４の発現レベルが単独にＩＧＦ１により調整制御されるか、又はＩＧＦ１及びＰＤＧＦ−ＢＢ（ｈＵＣＳとＦＣＳとが違う主要な成分）により調整制御されるかを検討した。実験的に、まずそれぞれ異なる用量のＩＧＦ１又は異なる用量のＰＤＧＦ−ＢＢを注ぎＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を処理し、且つＷｅｓｔｅｒｎブロッティング法によってＩＧＦ１Ｒ及びＣＸＣＲ４の発現レベルを探知した。
【００７０】
図７Ａ〜図７Ｃを参照されたい。図７Ａは、異なる用量のＩＧＦ１をＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞に処理した後で、そのＩＧＦ１Ｒ及びＣＸＣＲ４の発現レベルの分析チャートである。図７Ｂは、異なる用量のＰＤＧＦ−ＢＢをＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞に処理した後で、そのＩＧＦ１Ｒ及びＣＸＣＲ４の発現レベルの分析チャートである。図７Ｃは、異なる用量のＩＧＦ１及びＰＤＧＦ−ＢＢをＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞に同時に処理した後で、そのＩＧＦ１Ｒの発現レベルの分析チャートである。＊は実験群（異なる用量ＩＧＦ１又は／及びＰＤＧＦ−ＢＢを加えるグループ）が対照群（ＩＧＦ１及びＰＤＧＦ−ＢＢを加えないグループ）と比べてＰ＜０．０５であることを示し、＊＊は実験群が対照群と比べてＰ＜０．０１であることを示す。図７Ａの結果に示すように、ＩＧＦ１を添加すると、ＩＧＦ１Ｒ＋間葉系幹細胞のＩＧＦ１Ｒの発現を低下させ、且つ両者の関係に用量依存性があるが、ＣＸＣＲ４の発現を増加し、且つＩＧＦ１濃度が５ｎＭである場合、ＣＸＣＲ４の発現レベルが最高となる。図７Ｂの結果に示すように、ＰＤＧＦ−ＢＢを添加すると、ＩＧＦ１Ｒ及びＣＸＣＲ４の発現を向上させると共に、用量依存性が存在する。図７Ｃの結果に示すように、ＰＤＧＦ−ＢＢをＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞に加えると、ＩＧＦ１によるＩＧＦ１Ｒの発現低下を効果的に抑制することができる。
【００７１】
ＰＤＧＦ−ＢＢがＩＧＦ１よりも細胞増殖の情報経路をより効果的に活性化制御するかを更に確定するために、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞に異なる濃度のＩＧＦ１又は異なる濃度のＰＤＧＦ−ＢＢ（血清がない条件で）をそれぞれ処理し、且つＷｅｓｔｅｒｎブロッティング法によってリン酸化プロテインキナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  Ａｋｔ；ｐ−Ａｋｔ）及びリン酸化シグナル伝達兼転写活性化因子−３（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ３；ｐ−Ｓｔａｔ３）の発現レベルを探知した。
【００７２】
図７Ｄを参照されたい。図７Ｄは、異なる用量のＩＧＦ１及びＰＤＧＦ−ＢＢをＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞に同時に処理した後で、そのｐ−Ａｋｔ及びｐ−Ｓｔａｔ３の発現レベルの分析チャートであり、＊は実験群（異なる用量のＩＧＦ１又は／及びＰＤＧＦ−ＢＢを加えたグループ）が対照群（ＩＧＦ１及びＰＤＧＦ−ＢＢを加えないグループ）と比べてＰ＜０．０５であることを示す。図７Ｄの結果に示すように、ＰＤＧＦ−ＢＢの添加はｐ−Ａｋｔ及びｐ−Ｓｔａｔ３の発現レベルを明らかに増加するが、ＩＧＦ１の添加はｐ−Ａｋｔ及びｐ−Ｓｔａｔ３の発現レベルの増加に対して役立たない。本試験は、またｐ−Ａｋｔ阻害剤（ＬＹ２９４００２）及びｐ−Ｓｔａｔ３阻害剤（ＡＧ４９０）をＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞にそれぞれ加えて、ＰＤＧＦ−ＢＢによるＡｋｔ及びＳｔａｔ３のリン酸化が完全に抑制（結果に示しない）される。上記の結果から示すように、ＰＤＧＦ−ＢＢは、ＩＧＦ１と比べてより下流の重要な情報伝達経路を効果的に活性化し、ｈＵＣＳを含有する培地がＦＣＳを含有する培地よりも間葉系幹細胞の培地に好適に用いられることが判明した。
【００７３】
第２部分  ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞の脳組織損傷の治療への使用
【００７４】
ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞が自己更新能力及び多能分化能力を有することが既に判明されるので、この部分の実験例では、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞の脳組織損傷個体の治療への使用の効果を検討した。
【００７５】
２．１  ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞の移植の脳卒中ラットモデルの神経行動に対する改善
【００７６】
本実験例では、脳卒中ラットモデルでＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞の体内での自己更新能力及び神経再生潜在力を評価し、且つ神経機能が回復するかを評価するために、３種類の神経機能欠損モードによって脳卒中前後のラットの神経行動を検出した。
【００７７】
脳卒中ラットモデルに対して、脳虚血／再灌流モデル（ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｍｏｄｅｌ）によってラットにおける一時的局所脳虚血の症状を模擬し、試験動物として体重２５０〜３００ｇの雄ＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットを使用した。ラットの脳虚血／再灌流モデルでは、ラットの両側総頸動脈（ｃｏｍｍｏｎ  ｃａｒｏｔｉｄ  ａｒｔｅｒｉｅｓ；ＣＣＡ）及び右中大脳動脈（ｍｉｄｄｌｅ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ａｒｔｅｒｙ；ＭＣＡ）を閉塞することで局所性脳虚血を誘発し、９０分間閉塞した後で解除して再灌流し、１時間後更に細胞をラットに静脈移植し、注射した細胞量が２×１０6であった。実験的に、まずラットを５組に分け、それぞれ５種類の異なる細胞又はキャリアを注射して細胞治療し、グループ１の細胞はｈＵＣＳを含む培地に培養されたＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞（Ｕ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞）であり、グループ２の細胞はＦＣＳを含む培地に培養されたＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞（Ｆ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞）であり、グループ３の細胞はｈＵＣＳを含む培地に培養された間葉系幹細胞（Ｕ−間葉系幹細胞）であり、グループ４の細胞はＦＣＳを含有する培地に培養された間葉系幹細胞（Ｆ−間葉系幹細胞）であり、グループ５はＰＢＳ（キャリア）をラット体内に注射して対照群とした。グループ１のラットについて、更にブロッキングテストを行い、それぞれＣＸＣＲ４抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）とＩＧＦ１Ｒ阻害剤（ＰＰＰ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を注射することで、ＣＸＣＲ４とＩＧＦ１Ｒをブロッキングした。ＣＸＣＲ４抗体を腹腔内注射でラット体内に２週注射し、注射頻度は２回／週であった。ＰＰＰを腹腔内注射でラット体内に３日間注射し、注射量は２０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙであった。
【００７８】
神経行動の検出時間点は脳虚血／再灌流の前の５日、細胞移植後の第１日、第７日、第１４日及び第２８日であった。３種類の神経機能欠損モードとして、それぞれラットの体左右の非対称、活動能力及び前肢握力を評価した。
【００７９】
ｉ．体揺れテスト
【００８０】
ラットの体左右の非対称は、体揺れテストで評価され、実験的に、まずラットをテールから上の１０ｃｍのフィードケージ底板にハンギングし、且つラットの横方向の移動回数を記録し、特に虚血性対側の頭部揺れ頻度は連続２０で計数し、且つベースラインスコアで標準化を行った。
【００８１】
図８Ａ及び図８Ｂを参照されたい。図８Ａは、ラットの体揺れテストの結果図である。図８Ｂは、ブロッキングテストのラットの体揺れテストの結果図である。図８Ａの結果に示すように、何れの間葉系幹細胞を移植されたラットでも、対照群に比べて明確な神経機能回復を有する。ｈＵＣＳを含む培地で培養された間葉系幹細胞を移植したグループ（グループ１及びグループ３）のラットの神経機能回復の状況は、更に、ＦＣＳを含む培地で培養された間葉系幹細胞のグループ（グループ２及びグループ４）よりも良く、グループ１（Ｕ−ＩＧＦ１Ｒ+ＵＭＳＣｓを移植した）が他のグループよりも明確な治療効果を有する。図８Ｂの結果に示すように、ＣＸＣＲ４抗体又はＰＰＰを加えてＣＸＣＲ４又はＩＧＦ１Ｒをブロッキングした後、ブロッキングテスト群のラットの神経機能回復結果が対照群に相当し、ＣＸＣＲ４又はＩＧＦ１ＲをブロッキングするとＵ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を移植する治療効果を抑制することが判明される。
【００８２】
ｉｉ．活動能力テスト
【００８３】
ラットの活動能力について、ＶｅｒｓａＭａｘ動物活動監視システム（Ａｃｃｕｓｃａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によってラットを２時間検出した。ＶｅｒｓａＭａｘ動物活動監視システムは、１６個の水平赤外線センサー及び８個の垂直赤外線センサーを含み、垂直センサーはそれぞれチェンバー底板の上方の１０ｃｍに位置し、ラットの活動能力運動については、チェンバー内のラットの運動によりビームを遮断する回数を定量した。測定した３つの垂直運動パラメータは、垂直活動、垂直活動時間及び垂直運動数であった。
【００８４】
図９Ａ〜図９Ｃを参照されたい。図９Ａは、ラットの垂直活動テストの結果図である。図９Ｂは、ラットの垂直活動時間テストの結果図である。図９Ｃは、ラットの垂直運動数テストの結果図である。図９Ａ〜図９Ｃの結果に示すように、間葉系幹細胞を移植したラットは、対照群に比べて明確な活動能力の改善を有する。Ｕ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を移植したグループは、更に、Ｆ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を移植したグループに比べて活動能力を改善する程度はより大きいが、ＣＸＣＲ４抗体又はＰＰＰを加えてＣＸＣＲ４又はＩＧＦ１Ｒをブロッキングするブロッキングテストグループは、ラットの活動能力の結果が対照群に相当し、ＣＸＣＲ４又はＩＧＦ１Ｒをブロッキングすると、Ｕ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を移植する治療効果を抑制することが判明される。
【００８５】
ｉｉｉ．前肢握力テスト
【００８６】
ラットの前肢握力テストについては、握力計（ＴＳＥ−Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって検出した。実験的にそれぞれラットの各前肢の握力を測定し、ラットの２０回の握力の平均値を算出し、且つ同側と対側との握力比率を算出した。なお、本実験例にも、細胞治療前及び細胞治療後のラットの握力の比率を算出することで、細胞治療後のラット握力の改変を評価した。
【００８７】
図１０を参照されたい。図１０は、ラットの前肢握力テストの結果図である。図１０の結果に示すように、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を移植したラットは、対照群のラットに比べて、細胞治療後のラットの前肢握力が大幅に改善される。Ｕ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を移植したグループは、Ｆ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を移植したグループに比べて前肢握力が改善される程度がより大きいが、ＣＸＣＲ４抗体又はＰＰＰを加えてＣＸＣＲ４又はＩＧＦ１Ｒをブロッキングするブロッキングテストグループは、ラットの前肢握力が対照群に相当し、ＣＸＣＲ４又はＩＧＦ１ＲをブロッキングするとＵ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を移植する治療効果を抑制することが判明される。
【００８８】
上記３つの神経機能欠損モード試験は、類似した結果を示し、ＩＧＦＲ−１+間葉系幹細胞は、脳卒中ラットの神経行動を改善することができ、Ｕ−ＩＧＦＲ−１+間葉系幹細胞は更にＦ−ＩＧＦＲ−１+間葉系幹細胞よりも神経再生の潜在力を一層有し、且つこの神経再生がＩＧＦ１ＲとＣＸＣＲ４受容体の方法によるものであることが判明される。
【００８９】
２．２：ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞の移植によるグルコース代謝の向上
【００９０】
Ｕ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を移植すると脳虚血ラットのグルコース代謝活性に影響を及ぼすかを検討するために、本実験例は、小型動物専用陽電子スキャナ（ｍｉｃｒｏＰＥＴ）によって[18Ｆ]フルオロ−２−デオキシグルコース陽電子放出断層撮影法（ｆｌｕｏｒｏ−２−ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ  ｐｏｓｉｔｒｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ；ＦＤＧ−ＰＥＴ）で細胞治療後のラット脳組織のグルコース代謝を検出した。
【００９１】
図１１Ａ及び図１１Ｂを参照されたい。図１１Ａは細胞療法後のラットの[18Ｆ]ＦＤＧ−ＰＥＴ画像である。図１１Ｂは細胞療法後のラットの[18Ｆ]ＦＤＧ−ＰＥＴイメージを定量化した図であり、検出したラットは細胞療法後の４週のラットであり、検出したグループは共に５組であり、それぞれＵ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を移植したラット（Ｎ＝６）、Ｆ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を移植したラット（Ｎ＝６）、Ｕ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を移植すると共にＰＰＰを注射したラット（Ｎ＝６）、Ｕ−ＩＧＦ１Ｒ+間質干細胞を移植すると共にＣＸＣＲ４抗体を注射したラット（Ｎ＝６）及び対照群ラット（ＰＢＳを注射し、Ｎ＝６）であった。図１１Ａの結果に示すように、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を移植したラットは損傷された脳組織（図における右脳）のグルコース代謝を増加することができ、Ｕ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を移植したグループは損傷された脳組織のグルコース代謝を改善する程度が更にＦ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を移植したグループよりも大きい。図１１Ｂは[１８Ｆ]ＦＤＧ−ＰＥＴの画像を半定量し、図１１Ｂの結果に示すように、Ｕ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞の移植によって増加したグルコース代謝活性は、ＰＰＰ又はＣＸＣＲ４抗体を注射してＣＸＣＲ４又はＩＧＦ１Ｒをブロッキングした後、ラットの損傷された脳組織でのグルコース代謝活性が対照群に相当し、ＣＸＣＲ４又はＩＧＦ１ＲをブロッキングするとＵ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を移植することでグルコース代謝活性を増加する効果を抑制することが判明される。
【００９２】
２．３：ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞の静脈移植による抗アポトーシスタンパク質の発現の増加
【００９３】
Ｕ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞による脳卒中ラットの治療は、生存因子の発現を増加することで神経機能を改善するかを検討するために、実験的にＷｅｓｔｅｒｎブロッティング法によって細胞療法後のラットの損傷された脳組織における抗アポトーシスタンパク質の発現を検出し、検出した抗アポトーシスタンパク質はＢｃｌ−２（Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ２）及びＢｃｌ−ｘＬ（Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ−ｅｘｔｒａ  ｌａｒｇｅ）であった。本実験例にも細胞療法後のラットの損傷された脳組織における向アポトーシスタンパク質の発現を検出し、検出した向アポトーシスタンパク質はＢａｘ（ＢＣＬ２−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ）とＢａｄ（Ｂｃｌ−２−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｄｅａｔｈ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）であった。
【００９４】
図１２を参照されたい。図１２は、細胞療法後のラットの損傷された脳組織の抗アポトーシスタンパク質の発現レベルの分析チャートである。図１２の結果に示すように、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞治療を行ったラットは、損傷された脳組織において抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−２とＢｃｌ−ｘＬの発現レベルが増加し、且つＵ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞で治療されたラットのＢｃｌ−２とＢｃｌ−ｘＬの発現レベルの増加がより明らかになり、Ｆ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞グループ（Ｎ＝６）は対照群（Ｎ＝６）に比べてｐ＜０．０５とし、Ｕ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞グループ（Ｎ＝６）は対照群（Ｎ＝６）に比べてｐ＜０．０１とする。比較すると、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞（Ｕ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞及びＦ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞）で治療されたラットは、損傷された脳組織における向アポトーシスタンパク質ＢａｘとＢａｄの発現レベルは対照群に相当する。
【００９５】
２．４：ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞治療による体内の神経分化の増加
【００９６】
移植されたＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞は神経グリア細胞に分化することができるかを分析するために、実験的に細胞療法後の２８日の脳卒中ラットについて、共役焦点レーザー走査顕微鏡を利用して、免疫蛍光染色法によって脳卒中ラットの損傷された脳組織に移植されたＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞の数を確認し、免疫蛍光二重染色法によって移植されたＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞のその分化した細胞の形態を確定した。
【００９７】
図１３Ａ及び図１３Ｂを参照されたい。図１３Ａは、細胞療法後のラット脳組織におけるビスベンズイミドで標示された細胞核とヒト細胞核抗原との共発現（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）の顕微鏡写真図である。図１３Ｂは、細胞療法後のラット脳組織に移植されたＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞数の顕微鏡写真図である。図１３Ａの結果に示すように、すべてのビスベンズイミドで標示されたＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞は、何れもヒト細胞核抗原（ｈＮＡ）を発現し、細胞のソースがヒト組織であると確認された。図１３Ｂの結果に示すように、Ｕ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を移植したグループ（Ｎ＝８）はＦ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を移植したグループ（Ｎ＝８）に比べて、損傷された脳組織においてより多い移植されたＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞がある（ｐ＜０．０５）。しかしながら、ブロッキングテストグループ（同時にＵ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を移植すると共にＰＰＰを注射するか又は同時にＵ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を移植すると共にＣＸＣＲ４抗体を注射する）に示すように、移植されたＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞の数の差異はＰＰＰ又はＣＸＣＲ４抗体を注射することによって解消される。
【００９８】
更に移植されたＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞の分化した細胞の形態を確定するために、実験的に免疫蛍光二重染色法によって特定細胞形態マーカー、ＩＧＦ１Ｒ及びＣＸＣＲ４を標示することで、特定細胞形態マーカーとＩＧＦ１Ｒとの共発現の状況、及び特定細胞形態マーカーとＣＸＣＲ４との共発現の状況を確定し、且つビスベンズイミド（ｂｉｓｂｅｎｚｉｍｉｄｅ）で細胞核を標示し、特定細胞形態マーカーは星状グリア細胞マーカーＧＦＡＰ（ｇｌｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ニューロン特異性細胞スケルトンタンパク質ＭＡＰ−２（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）及び神経核マーカーＮｅｕＮ（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｔｉｇｅｎ）を含む。
【００９９】
図１４Ａ〜図１４Ｃを参照されたい。図１４Ａは、脳卒中ラットの損傷された脳組織に移植されたＵ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞のＧＦＡＰとＩＧＦ１Ｒ又はＣＸＣＲ４との共発現の顕微鏡写真図である。図１４Ｂは、脳卒中ラットの損傷された脳組織に移植されたＵ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞のＭＡＰ−２とＩＧＦ１Ｒ又はＣＸＣＲ４との共発現の顕微鏡写真図である。図１４Ｃは、脳卒中ラットの損傷された脳組織に移植されたＵ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞のＮｅｕＮとＩＧＦ１Ｒ又はＣＸＣＲ４との共発現の顕微鏡写真図である。
【０１００】
図１４Ａ〜図１４Ｃの結果に示すように、Ｕ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を移植した脳卒中ラットの損傷された脳組織領域において、幾つかのビスベンズイミドで標示され且つＣＸＣＲ４を発現する細胞は、これらの細胞がそれぞれ神経細胞マーカー（ＧＦＡＰ、ＭＡＰ−２及びＮｅｕＮ）を共発現する。なお、ビスベンズイミドで標示され且つＩＧＦ１Ｒを発現する細胞も見られ、これらの細胞もそれぞれ神経細胞マーカー（ＧＦＡＰ、ＭＡＰ−２及びＮｅｕＮ）を共発現する。
【０１０１】
また、以下の表２を参照されたい。表２は、免疫蛍光二重染色法によって移植されたＵ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞の脳卒中ラット脳組織（Ｎ＝８）又はＦ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞の脳卒中ラット脳組織（Ｎ＝８）を標示し、且つ免疫蛍光二重染色法におけるビスベンズイミドで標示された細胞とＧＦＡＰ、ＭＡＰ−２及びＮｅｕＮとの共発現の割合を算出する。表２に示すように、移植されたＵ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞の脳卒中ラット脳組織細胞は、ビスベンズイミドとＧＦＡＰ、ＭＡＰ−２又はＮｅｕＮとの共発現の割合（それぞれ９．５％、１２％及び１０％）は何れも移植されたＦ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞の脳卒中ラット脳組織細胞（それぞれ４％、５％及び４％である）よりも高く、Ｕ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞で脳卒中ラットを治療すると、移植されたＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞は神経細胞に分化しやすいことが判明される。
【０１０２】
【表２】
0006766082.tif 000003
【０１０３】
２．５：ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞の移植で体内の血管新生への促進
【０１０４】
本試験では、免疫蛍光二重染色法、ＦＩＴＣ−デキストラン灌流及び血管密度測定によって、Ｕ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞の移植による脳卒中ラットの大脳虚血領域の血管生成の増加を検討した。
【０１０５】
実験的に免疫蛍光二重染色法によって血管内皮細胞マーカーｖＷＦ（Ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ）、ＩＧＦ１Ｒ及びＣＸＣＲ４を標示し、血管内皮細胞マーカーとＩＧＦ１Ｒとの共発現の状況、及び血管内皮細胞マーカーとＣＸＣＲ４との共発現の状況を確認して、且つビスベンズイミドで細胞核を標示した。図１５Ａを参照されたい。図１５Ａは、脳卒中ラットの損傷された脳組織に移植されたＵ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞のｖＷＦとＩＧＦ１Ｒ又はＣＸＣＲ４との共発現の顕微鏡写真図である。図１５Ａの結果に示すように、脳卒中ラットの虚血性脳半球の血管周り細胞及び内皮領域には、幾つかのベンジルイミドで標示された細胞がＩＧＦ１Ｒ又はＣＸＣＲ４を共発現し、且つこれらの細胞が血管内皮細胞マーカー（ｖＷＦ）を共発現することが判明した。
【０１０６】
本試験では、更に、ＦＩＴＣ−デキストラン灌流で脳卒中ラットの虚血脳組織における微小循環を評価することで、脳卒中ラットの虚血組織における血管新生の状況を検討し、評価されたグループはＵ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞が移植された脳卒中ラット（Ｎ＝６）、Ｆ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞が移植された脳卒中ラット（Ｎ＝６）及びＰＢＳを注射した対照群の脳卒中ラット（Ｎ＝６）であった。図１５Ｂを参照されたい。図１５Ｂは、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞が移植された脳卒中ラットのＦＩＴＣ−デキストラン灌流の結果図であり、図１５Ｂの結果に示すように、Ｕ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞が移植された脳卒中ラットはその他のグループ（Ｆ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を移植したもの又は対照群）に比べて、脳微血管灌流を明らかに増加した。
【０１０７】
本実験例では、更に、免疫蛍光染色法によって脳卒中ラットの虚血脳組織スライスにおける血管内皮細胞マーカーＣＤ３１を標示することで、血管密度を算出し、評価されたグループはＵ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞が移植された脳卒中ラット（Ｎ＝６）、Ｆ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞が移植された脳卒中ラット（Ｎ＝６）及びＰＢＳを注射した対照群の脳卒中ラット（Ｎ＝６）であった。図１５Ｃを参照されたい。図１５Ｃは、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞が移植された脳卒中ラットの血管密度測定の結果図である。図１５Ｃの結果に示すように、Ｕ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞が移植された脳卒中ラットは虚血脳組織における血管密度がその他のグループよりも高く、Ｕ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞が移植されたものはＦ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞が移植されたものに比べてｐ＜０．０５であり、Ｕ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞が移植されたものは対照群に比べてｐ＜０．０１であった。
【０１０８】
上記結果から、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を脳卒中ラット体内に移植して細胞治療を行い、脳卒中ラットの虚血性脳組織における血管新生を増加し、且つｈＵＣＳを含む培地で培養されたＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を移植して虚血性脳組織における血管新生を増加する潜在力を一層有することが判明した。
【０１０９】
２．６：ｈＵＣＳを含有する培地で培養されたＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞の移植による虚血性脳の脳血流量の増加
【０１１０】
血管密度が増加すると、常に脳血流量（ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｆｌｏｗ；ＣＢＦ）が増加し、更に酸素、栄養物質をより効果的に提供すると共にニューロンの生存率を向上させることができる。このため、本実験例では、更に、脳卒中ラットの虚血性脳組織における脳血流量を監視した。実験的に、まずラットを抱水クロラール（ｃｈｌｏｒａｌ  ｈｙｄｒａｔｅ）で麻酔し、レーダードゥビューアマイクロフラワー（Ｍｏｏｒ  Ｉｎｓｔｒｕｔｍｅｎｔｓ）で脳卒中ラットの虚血性脳組織の局所の血液灌流状況を監視し、実験のグループはＵ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞が移植された脳卒中ラット（Ｎ＝６）、Ｆ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞が移植された脳卒中ラット（Ｎ＝６）及びＰＢＳを注射した対照群の脳卒中ラット（Ｎ＝６）であった。図１６を参照されたい。図１６は、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞が移植された脳卒中ラットの虚血性脳の脳血流量の結果図である。図１６の結果に示すように、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を移植すると脳卒中ラットの虚血脳組織における脳血流量を増加することができ、且つＵ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を移植すると脳卒中ラットの虚血脳組織における脳血流量が増加する幅度はより大きくなり、Ｕ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を移植したものはＦ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を移植したものと比べてｐ＜０．０５であり、Ｕ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞が移植されたものは対照群に比べてｐ＜０．０１であった。
【０１１１】
２．７：ＣＸＣＲ４とＩＧＦ１Ｒとの交互作用のＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞による神経再生に対する調整
【０１１２】
本実験例では、脳卒中ラットの虚血脳組織の神経突起の再生、及び間葉系幹細胞と初期大脳皮質細胞（ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｃｅｌｌｓ；ＰＣＣ）との共培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）後の神経突起の再生を定量することで、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞と神経組織との交互作用が体内及び体外の神経突起の成長に刺激するかを検討した。
【０１１３】
インビボ試験の部分において、実験的にＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を脳卒中ラットの体内に静脈移植し、移植された細胞グループはＵ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞、Ｆ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞、ブロッキングテスト群及び対照群であり、ブロッキングテスト群はＬＶ−ＩＧＦ１Ｒ−ｓｈが導入されたＵ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞とＬＶ−ＣＸＣＲ４−ｓｈが導入されたＵ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を脳卒中ラット体内に移植し、対照群はＰＢＳを脳卒中ラット体内に静脈注射した。ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞が移植された後２８日の脳卒中ラットを犠牲して、その脳組織スライスを免疫蛍光染色して神経細胞特異性マーカーＩＩＩ−ｔｕｂｕｌｉｎを標示し、且つイメージ分析ソフトウェア（ＳｉｇｍａＳｃａｎ）で神経突起の長さを算出し、且つ神経細胞が細胞体の直径よりも２倍以上大きい細胞を神経突起細胞（ｎｅｕｒｉｔｅ−ｂｅａｒｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）として算出した。
【０１１４】
図１７Ａを参照されたい。図１７Ａは、神経突起の再生のインビボ試験の結果図である。図１７Ａの結果に示すように、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を移植すると脳卒中ラットの虚血脳組織における神経突起の再生を改善することができ、Ｕ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞が移植された脳卒中ラットは、虚血脳組織における神経突起の再生数は明らかにその他のグループよりも高くて、且つその神経突起の長さも明らかにその他のグループよりも長い。しかし、ブロッキング試験組の結果に示すように、ＩＧＦ１Ｒ又はＣＸＣＲ４をブロッキングするとＵ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を移植することで増加した神経突長さと神経突起細胞数を抑制する。
【０１１５】
ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞が初期大脳皮質細胞の酸素とグルコース供給不足（ｏｘｙｇｅｎ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ；ＯＧＤ）の反応に影響を与えることができるかを評価するために、本実験例では、更に、初期大脳皮質細胞とＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を酸素とグルコース供給不足の雰囲気に共培養して、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞はＵ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞、Ｆ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞及びブロッキングテスト群を含み、ブロッキングテスト群の細胞はＬＶ−ＩＧＦ１Ｒ−ｓｈを導入したＵ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞及びＬＶ−ＣＸＣＲ４−ｓｈを導入したＵ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞であり、実験的にまた酸素とグルコース供給不足の雰囲気で単独的に培養された初期大脳皮質細胞を対照群とする。更に共培養後の細胞を免疫蛍光染色でＩＩＩ−ｔｕｂｕｌｉｎを標示し、上記の方法によって神経突起の再生とニューロンの生存率を測定した。
【０１１６】
図１７Ｂを参照されたい。図１７Ｂは、神経突起の再生のインビトロ試験の結果図である。図１７Ｂの結果に示すように、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞と共培養すると初期大脳皮質細胞の酸素とグルコース供給不足の状況での神経突起細胞数と神経突起長さを増加することができ、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞が酸素とグルコース供給不足での初期大脳皮質細胞の神経突起の再生に寄与することができ、Ｕ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞と共培養するグループは神経突起の再生数は明らかにその他のグループよりも高く、且つその神経突起長さも明らかにその他のグループよりも長いことを示す。しかし、ブロッキング試験組の結果に示すように、ＩＧＦ１Ｒ又はＣＸＣＲ４をブロッキングするとＵ−ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞によって増加した神経突長さと神経突起細胞数を抑制する。
【０１１７】
上記体内と体外の神経突起の再生試験の結果に示すように、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞は、虚血低酸素性脳組織／脳細胞の神経突起の再生に寄与することができ、且つｈＵＣＳを含む培地で培養されたＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を移植すると更に虚血低酸素性脳組織／脳細胞における神経突起の再生を増加する潜在力を有し、且つこの神経突起の再生はＩＧＦ１ＲとＣＸＣＲ４受容体の方法によるものである。
【０１１８】
第３部分：ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞の虚血性心疾患の治療への使用
【０１１９】
前記実験例から分かるように、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞は自己更新能力及び多能性分化能力を有し、且つＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞は脳組織損傷個体を治療する効果を有し、この部分の実験例ではＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を虚血性心疾患の治療に用いる効果を検討した。
【０１２０】
３．１：ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞の適用による心筋梗塞後の左室機能不全の減少及び心筋梗塞後の梗塞面積の減少
【０１２１】
本実験例では、急性心筋梗塞（ａｃｕｔｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆｒａｃｔｉｏｎ；ＡＭＩ）ラットモデルで、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞の移植によって心筋梗塞後の心肌機能回復を改善するかを評価した。
【０１２２】
急性心筋梗塞ラットモデルとして、ラットの左前下行（ｌｅｆｔ  ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｄｅｓｃｅｎｄｉｎｇ；ＬＡＤ）冠状動脈を閉塞することでラット一過性心臓虚血の症状を模擬した。本試験では、試験動物として体重２５０〜３００ｇの雄性ＳＤラットを使用した。実験的に、まず、ラットを２％のイソフルラン（１００％酸素において）で麻酔し、全体麻酔した後で手術台の上に上向きに置いて、口に呼吸器（ＳＮ−４８０−７）を挿入して、１ｍＬ／１００ｇの一回換気量及び８０回／分間の呼吸頻度で人工通気した。更に肋骨リトラクタ（ＭＹ−９４５４Ｓ）で胸骨左縁４、５肋の隙間に沿って縦切開し、且つ左肺で生理食塩水を浸すガーゼで排気した。心膜を切って、その後、６−０−ポリエチレン製の縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ）を使用して左前下行の冠状動脈を閉塞し、肉眼で閉塞領域が白になることを観察し、心電図のＴ波は高くなり、胸部を縫合する前に肺を再び膨らませて、急性心筋梗塞ラットモデルを完成した。急性心筋梗塞ラットを３組に分けて、それぞれ細胞数が２×１０6の間葉系幹細胞又はＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を静脈移植し、更に生理食塩水を注射して対照群とした。本試験においてまた偽手術グループ（ｓｈａｍ）のラットがあり、それは上記同じ手術工程を行ったが、偽手術グループの左前下行冠状動脈を閉塞しなかった。
【０１２３】
図１８を参照されたい。図１８は、間葉系幹細胞とＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を移植した急性心筋梗塞ラットの心筋梗塞面積図である。実験的に間葉系幹細胞が移植された後２８日の急性心筋梗塞ラットを犠牲して、心臓組織スライスを塩化トリフェニルテトラゾリウム（ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）溶液に浸して、更にデヒドロゲナーゼ（ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を浸し、壊死領域が赤青色になることが発見され、梗塞されない領域が赤レンガ色になった。図１８の結果に示すように、間葉系幹細胞を移植すると急性心筋梗塞ラットの心筋梗塞面積を改善することができ、梗塞領域の動脈血管壁の厚さを増加することもでき、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞が移植された急性心筋梗塞ラットは、その心筋梗塞面積の減少した幅及び梗塞領域動脈血管壁の厚さの増加幅は間葉系幹細胞が移植されたグループよりも高かった。
【０１２４】
本実験例では、更に、Ｍモードの心臓超音波によって心筋梗塞後の２８日のラットの左心室機能を分析することで、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞で虚血性心疾患を治療する効果を評価し、分析されたグループは間葉系幹細胞が移植された急性心筋梗塞ラット、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞が移植された急性心筋梗塞ラット、対照群ラット及び偽手術グループラットを含んだ。図１９Ａ及び図１９Ｂを参照されたい。図１９Ａは、間葉系幹細胞とＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞が移植された急性心筋梗塞ラットの心臓超音波画像である。図１９Ｂは、間葉系幹細胞とＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞が移植された急性心筋梗塞ラットの心臓超音波を定量化した図である。図１９Ａと図１９Ｂの結果によると、間葉系幹細胞とＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞が移植されたグループは対照群に比べて、心臓超音波の分析において低い左心室収縮末期径（ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｅｎｄ  ｓｙｓｔｏｌｉｃ  ｄｉａｍｅｔｅｒ；ＬＶＥＳＤ）／左心室拡張末期径（ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｅｎｄ  ｄｉａｓｔｏｌｉｃ  ｄｉａｍｅｔｅｒ；ＬＶＥＤＤ）、及び高い射出率（ｅｊｅｃｔｉｏｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎ；ＥＦ）／フラクション短縮（ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ；ＦＳ）を検出することができるが、急性心筋梗塞ラットの心拍数に影響を与えなく、間葉系幹細胞とＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を移植すると急性心筋梗塞ラットの左心室機能を改善することができることが判明した。更にＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞が移植された急性心筋梗塞ラットは、その左心室機能が改善された幅度はその他のグループよりも高かった。
【０１２５】
３．２：ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞の虚血心肌に対する抗炎症影響
【０１２６】
本実験例では、更に、間葉系幹細胞とＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を急性心筋梗塞ラットに移植すると、心筋梗塞後の炎症反応を抑制することができるかを検討した。実験的に間葉系幹細胞とＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞が移植された後の３日の急性心筋梗塞ラットを犠牲して、心臓組織スライスを免疫組織化学的染色法によって炎症の程度を検出し、免疫蛍光染色法によってマクロファージの発現を検出して定量的ＲＴ−ＰＣＲで炎症性因子の発現レベルを検出した。
【０１２７】
図２０を参照されたい。図２０は、間葉系幹細胞とＩＧＦＩＲ＋間葉系幹細胞を移植した後３日後の急性心筋梗塞ラットの免疫組織化学的染色法の結果図である。図２０において、上図はヘマトキシリンーエオジン染色（Ｈ＆Ｅ  ｓｔａｉｎ）された急性心筋梗塞ラットの心臓組織スライスの顕微鏡写真図であり、心臓組織の炎症の状況を０〜５級に分けて、級数が高いほど炎症程度が重度になることを示し、且つ異なるグループで撮影した結果を、上記標準に従って分類及び統計を行い、統計の結果を図２０の下図に示す。図２０の結果に示すように、間葉系幹細胞とＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を移植すると急性心筋梗塞ラットの心臓組織の炎症程度を改善することができ、且つＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を移植すると急性心筋梗塞ラットの心臓組織炎症を改善する能力がより良く、間葉系幹細胞グループは対照群に比べてｐ＜０．０５であり、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞グループは対照群に比べてｐ＜０．０１であった。
【０１２８】
間葉系幹細胞とＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を移植した後３日の急性心筋梗塞ラットが心臓組織でのマクロファージの発現を更に検出するために、実験的に急性心筋梗塞ラットの心臓組織スライスに対して免疫蛍光染色法によってマクロファージマーカーＣＤ６８を標示し、且つ蛍光顕微鏡で結果を観察した。図２１を参照されたい。図２１は、間葉系幹細胞とＩＧＦＩＲ＋間葉系幹細胞を移植した後３日後の急性心筋梗塞ラットの免疫蛍光染色法の結果図である。図２１の結果に示すように、間葉系幹細胞とＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞が移植されたグループは対照群に比べて、心筋梗塞後３日後のラットの心臓組織において、少ないＣＤ６８＋細胞が心筋梗塞周り領域に浸潤され、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞が移植されたグループは、ＣＤ６８＋細胞の発現レベルが明らかにその他のグループよりも少なかった。ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を移植すると急性心筋梗塞ラットの心臓組織の炎症程度を大幅に改善することができることが判明した。
【０１２９】
虚血心肌に炎症細胞の浸潤が常に炎症性因子の発現を増加することが観察され、本試験は更に定量的ＲＴ−ＰＣＲで心筋梗塞後の３日後のラットの心臓組織における炎症性因子の発現レベルを検出し、検出された炎症性因子はＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γを含み、本実験例には抗炎症因子ＩＬ−１０の発現レベルを更に検出した。図２２を参照されたい。図２２は、間葉系幹細胞とＩＧＦＩＲ＋間葉系幹細胞を移植した後３日後の急性心筋梗塞ラットの炎症性因子の発現レベルの分析チャートである。図２２の結果に示すように、間葉系幹細胞とＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞が移植されたグループは対照群に比べて、心筋梗塞後の３日後のラットの心臓組織において、炎症性因子ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γの発現レベルは何れも低下され、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞が移植されたグループにおいて、炎症性因子ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γの発現レベルの低下幅はより大きい。抗炎症因子の発現レベルは炎症性因子の発現レベルと逆であり、間葉系幹細胞とＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞が移植されたグループは抗炎症因子ＩＬ−１０の発現レベルを増加し、ＩＧＦ１Ｒ+間質干細胞が移植されたグループにおいて、抗炎症因子ＩＬ−１０の発現レベルの増加された幅はより大きくて、この結果もＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を移植すると急性心筋梗塞ラットの心臓組織の炎症程度を大幅に改善することができることが判明した。
【０１３０】
３．３：ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞治療での心筋梗塞による線維症の減少
【０１３１】
心臓の筋線維は、一般的な筋線維と異なり、長時間に作動して血液を体の各部分に押すことができる。心筋梗塞時、心肌に不可逆の壊死が発生し、且つ壊死された部分は繊維組織で切り替えられ、数週後線維症が発生する。本実験例では、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を移植すると心筋梗塞による線維症現象を減少することができるかを検討した。実験的に間葉系幹細胞が移植された後の２８日の急性心筋梗塞ラットを犠牲して、心臓組織スライスに対してマッソントリクローム染色法（Ｍａｓｓｏｎ’ｓ  ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）を行い、ラットの心臓組織の線維症の状況を観察し、コラーゲン繊維が青色であり、筋肉繊維が赤色であり、分析されたグループは間葉系幹細胞が移植された急性心筋梗塞ラット、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞が移植された急性心筋梗塞ラット、対照群ラット及び偽手術グループラットを含んだ。
【０１３２】
図２３を参照されたい。図２３は、間葉系幹細胞とＩＧＦＩＲ＋間葉系幹細胞を移植した後２８日の後の急性心筋梗塞ラットのマッソントリクローム染色法の結果図である。図２３において、上図はマッソントリクローム染色法によって染色された急性心筋梗塞ラットの心臓組織スライスの顕微鏡写真図である。心臓組織における線維症の状況を０〜５級に分けて、級数が高いほど線維症程度が重度になることを示し、且つ異なるグループで撮影された結果を、上記標準に応じて分類及び統計を行い、統計の結果を図２３の下図に示す。図２３の結果に示すように、間葉系幹細胞とＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を移植すると、急性心筋梗塞ラットの心臓組織の線維症の状況を改善することができ、且つＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞を移植すると、急性心筋梗塞ラットの心臓組織線維症を改善する能力がより良く、間葉系幹細胞グループは対照群に比べてｐ＜０．０５であり、ＩＧＦ１Ｒ+間葉系幹細胞グループは対照群に比べてｐ＜０．０１であった。
【０１３３】
以上をまとめると、本発明の分離された間葉系幹細胞は、細胞表面でインスリン様成長因子−１受容体を発現し、自己更新及び多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）分化の特性を有する。本発明の間葉系幹細胞クローン原性増殖方法において、培地の原料としてｈＵＣＳを使用し、ｈＵＣＳに成長因子に富み、特にＰＤＧＦ−ＢＢによって、間葉系幹細胞にインスリン様成長因子−１受容体を大量に発現させ、且つ多能性分化能力を維持することができ、ヒト臍帯血血清を使用する培地は取得しやすく、且つ非ヒト血清の使用によるアレルギー反応及びウイルス又は病原体感染の危険を避けることができる。本発明の多能性間葉系幹細胞の分離方法は、哺乳類組織由来する細胞混合物から、ＩＧＦ１Ｒに対して陽性を示す細胞を選別することができ、より好ましくは、ＩＬ２２ＲＡ１に対して陽性を示す細胞を更に選別することができ、選別されたものは多能性分化能力を有する間葉系幹細胞であるため、多能性間葉系幹細胞を迅速且つ専一に精製することができる。本発明の分離された間葉系幹細胞を細胞治療に用いるとき、個体の脳組織損傷と個体の虚血性心疾患の治療に用いることができる。更に、個体の脳組織損傷を治療する部分において、本発明の分離された間葉系幹細胞によって、グルコースの代謝活性を増加し、血管新生を促進し、神経突起の再生を強化し、且つＩＧＦ１ＲとＣＸＣＲ４との交互作用によって、神経リモデリングの効果を持つようになることができる。個体の虚血性心疾患を治療する部分において、本発明の分離された間葉系幹細胞は、心筋梗塞後の左心室の機能障害を低減させ、梗塞面積を削減し、心筋梗塞による線維症及び免疫応答を減少することができる。本発明では、実施形態を前述の通りに開示したが、これは本発明を限定するものではなく、当業者なら誰でも、本発明の精神と領域から逸脱しない限り、多様の変更や修正を加えることができる。従って、本発明の保護範囲は、特許請求の範囲で指定した内容を基準とする。
【図１Ａ】
0006766082.tif 000004
【図１Ｂ】
0006766082.tif 000005
【図１Ｃ】
0006766082.tif 000006
【図１Ｄ】
0006766082.tif 000007
【図１Ｅ】
0006766082.tif 000008
【図１Ｆ】
0006766082.tif 000009
【図２】
0006766082.tif 000010
【図３Ａ】
0006766082.tif 000011
【図３Ｂ】
0006766082.tif 000012
【図４Ａ】
0006766082.tif 000013
【図４Ｂ】
0006766082.tif 000014
【図４Ｃ】
0006766082.tif 000015
【図５Ａ】
0006766082.tif 000016
【図５Ｂ】
0006766082.tif 000017
【図５Ｃ】
0006766082.tif 000018
【図６Ａ】
0006766082.tif 000019
【図６Ｂ】
0006766082.tif 000020
【図７Ａ】
0006766082.tif 000021
【図７Ｂ】
0006766082.tif 000022
【図７Ｃ】
0006766082.tif 000023
【図７Ｄ】
0006766082.tif 000024
【図８Ａ】
0006766082.tif 000025
【図８Ｂ】
0006766082.tif 000026
【図９Ａ】
0006766082.tif 000027
【図９Ｂ】
0006766082.tif 000028
【図９Ｃ】
0006766082.tif 000029
【図１０】
0006766082.tif 000030
【図１１Ａ】
0006766082.tif 000031
【図１１Ｂ】
0006766082.tif 000032
【図１２】
0006766082.tif 000033
【図１３Ａ】
0006766082.tif 000034
【図１３Ｂ】
0006766082.tif 000035
【図１４Ａ】
0006766082.tif 000036
【図１４Ｂ】
0006766082.tif 000037
【図１４Ｃ】
0006766082.tif 000038
【図１５Ａ】
0006766082.tif 000039
【図１５Ｂ】
0006766082.tif 000040
【図１５Ｃ】
0006766082.tif 000041
【図１６】
0006766082.tif 000042
【図１７Ａ】
0006766082.tif 000043
【図１７Ｂ】
0006766082.tif 000044
【図１８】
0006766082.tif 000045
【図１９Ａ】
0006766082.tif 000046
【図１９Ｂ】
0006766082.tif 000047
【図２０】
0006766082.tif 000048
【図２１】
0006766082.tif 000049
【図２２】
0006766082.tif 000050
【図２３】
0006766082.tif 000051