(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象から取得されたステージＩＩのミスマッチ修復良好（ｐＭＭＲ）結腸直腸がん（ＣＲＣ）試料を解析するための方法であって、
ステージＩＩのｐＭＭＲ  ＣＲＣを含む試料を、Ｇアルファ相互作用小胞結合タンパク質−完全長（ＧＩＶ−ｆｌ）タンパク質特異的結合剤と接触させること；
試料におけるＧＩＶ−ｆｌタンパク質の発現をスコアリングして、試料のＧＩＶ−ｆｌ状態を決定すること；
対象におけるＣＲＣのリンパ管浸潤（ＬＶＩ）状態を決定すること；及び
ＧＩＶ−ｆｌ状態及びＬＶＩ状態に基づいて試料を解析すること
を含み、
対象の起こり得る無増悪生存（ＰＦＳ）を予測することを補助するための方法であり、
より高いＬＶＩ及び高いＧＩＶ−ｆｌレベルは、より高い確率の再発と関連する、方法。
【請求項２】
診断時の対象の年齢、ＣＲＣについて陽性のリンパ節の数；対象の性別、腫瘍分化の情況、がんのＴステージ；及びどちら側に結腸がんが存在したのかを含む、対象の１又は複数の特性を決定すること；並びに
ＧＩＶ−ｆｌ状態、ＬＶＩ状態、及び対象の前記１又は複数の特性に基づいて、試料を解析すること
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＧＩＶ−ｆｌ状態、ＬＶＩ状態、及び対象の特性の１又は複数を、コンピューターに入力すること；並びに
コンピューターから出力を生成し、それによって試料を解析すること
をさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ＧＩＶ−ｆｌタンパク質特異的結合剤が、ＧＩＶ−ｆｌ抗体を含む、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
ＧＩＶ−ｆｌ抗体が、ＧＩＶ−ｆｌ抗体クローンＳＰ１７３を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＧＩＶ−ｆｌタンパク質の発現をスコアリングすることが、
ａ．０から３のスケールで、試料の陽性ＧＩＶ−ｆｌ染色の程度を決定することであって、ここで試料の総面積の０％−１０％が陽性染色される場合、陽性染色の程度には０が割り当てられ、試料の総面積の１１％−３５％が陽性染色される場合、陽性染色の程度には１が割り当てられ、試料の総面積の３６％−５０％が陽性染色される場合、陽性染色の程度には２が割り当てられ、試料の総面積の５１％−１００％が陽性染色される場合、陽性染色の程度には３が割り当てられる、試料の陽性ＧＩＶ−ｆｌ染色の程度を決定すること；
ｂ．０（陰性）、１（弱い）、２（中程度）から３（強い）のスケールで、試料の染色のＧＩＶ−ｆｌ強度；ＧＩＶ−ｆｌの程度及び強度スコアを決定すること；
ｃ．陽性ＧＩＶ−ｆｌ染色の程度及び染色のＧＩＶ−ｆｌ強度を合計し、それによって０から６までのＧＩＶ−ｆｌスコア値を生成すること；並びに
ｄ．ＧＩＶ−ｆｌスコア値が０−２である場合に試料がＧＩＶ−ｆｌ陰性であると決定すること、又はＧＩＶ−ｆｌスコア値が３−６である場合に試料がＧＩＶ−ｆｌ陽性であると決定すること
を含む、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＧＩＶ−ｆｌタンパク質の発現をスコアリングすることが、
ａ．試料のＧＩＶ−ｆｌ染色の総面積が１０％よりも高いかどうかを決定すること、又はＧＩＶ−ｆｌ染色強度が３＋（強い）であるかどうかを決定すること；及び
ｂ．試料のＧＩＶ−ｆｌ染色の総面積が、任意の染色強度で１０％よりも高い場合、若しくはＧＩＶ−ｆｌ染色強度が、任意のパーセントで３＋である場合に、試料がＧＩＶ−ｆｌ陽性であると決定すること；又は０、１＋又は２＋の染色強度での試料のＧＩＶ−ｆｌ染色の総面積が１０％未満である場合に、試料がＧＩＶ−ｆｌ陰性であると決定すること
を含む、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
化学療法又は生物療法による治療に応答する可能性が低い対象から、化学療法又は生物療法による治療に応答する可能性が高い対象を識別する方法である、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
対象が、化学療法又は生物療法による治療に応答する可能性が高い対象として同定された場合、該対象を化学療法又は生物療法による治療のために選択することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
化学療法又は生物療法が、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標））、セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、ｚｉｖ−アフリベルセプト（ＺＡＬＴＲＡＰ（登録商標））、イリノテカン（ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標））又はそれらの組合せを含む、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
対象が、化学療法未治療の対象である、請求項１から１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
試料が、手術切除標本、組織生検又は穿刺吸引物を含む、請求項１から１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
組織生検が、組織切片を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
試料が、固定された試料である、請求項１から１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料である、請求項１から１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
試料が、ステージＩＩａのｐＭＭＲ  ＣＲＣ試料である、請求項１から１５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
試料が、ステージＩＩｂのｐＭＭＲ  ＣＲＣ試料である、請求項１から１５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８】
試料のミスマッチ修復（ＭＭＲ）状態を決定することをさらに含む、請求項１から１７の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９】
試料をＧＩＶ−ｆｌタンパク質特異的結合剤と接触させることが、自動化組織染色器を用いて実施される、請求項１から１８の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ＧＩＶ−ｆｌタンパク質の発現をスコアリングすることが、視覚的検査、又は対応するデジタル画像の画像解析を含む、請求項１から１９の何れか一項に記載の方法。
【請求項２１】
視覚的検査が、光学顕微鏡を利用して実施される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＧＩＶ−ｆｌタンパク質の発現をスコアリングすることが、試料の総面積の視覚的検査を含む、請求項１から２１の何れか一項に記載の方法。
【請求項２３】
試料におけるＧＩＶ−ｆｌタンパク質の発現をスコアリングすることが、試料へのＧＩＶ−ｆｌタンパク質特異的結合剤の結合の直接的又は間接的検出を含む、請求項１から２２の何れか一項に記載の方法。
【請求項２４】
１又は複数の工程が、適切にプログラムされたコンピューターによって実施される、請求項１から２３の何れか一項に記載の方法。
【請求項２５】
コンピューター実装方法であって、
ＧＩＶ−ｆｌ特異的結合剤で検出可能に標識されたステージＩＩの結腸直腸がん（ＣＲＣ）試料を示す表示された画像内の測定されたＧＩＶ−ｆｌタンパク質発現に少なくとも基づいて、ＧＩＶ−ｆｌタンパク質発現スコアを生成することであって、ここでＣＲＣ試料は対象から取得されたものであり、ＧＩＶ−ｆｌタンパク質発現スコアが：
（ｉ）０から３のスケールで、試料の陽性ＧＩＶ−ｆｌ染色の程度を決定することであって、ここで試料の総面積の０％−１０％が陽性染色される場合、陽性染色の程度には０が割り当てられ、試料の総面積の１１％−３５％が陽性染色される場合、陽性染色の程度には１が割り当てられ、試料の総面積の３６％−５０％が陽性染色される場合、陽性染色の程度には２が割り当てられ、試料の総面積の５１％−１００％が陽性染色される場合、陽性染色の程度には３が割り当てられ；
０（陰性）、１（弱い）、２（中程度）から３（強い）のスケールで、試料の染色のＧＩＶ−ｆｌ強度を決定すること、
陽性ＧＩＶ−ｆｌ染色の程度及び染色のＧＩＶ−ｆｌ強度を合計し、それによって、０から６までのＧＩＶ−ｆｌスコア値を生成すること；及び
ＧＩＶ−ｆｌスコア値が０−２である場合に試料がＧＩＶ−ｆｌ陰性であると決定すること、若しくはＧＩＶ−ｆｌスコア値が３−６である場合に試料がＧＩＶ−ｆｌ陽性であると決定すること
によって生成されるか；又は
（ｉｉ）試料のＧＩＶ−ｆｌ染色の総面積が１０％よりも高いかどうかを決定すること、又はＧＩＶ−ｆｌ染色強度が３＋（強い）であるかどうかを決定すること；及び
試料のＧＩＶ−ｆｌ染色の総面積が、任意の染色強度で１０％よりも高い場合、若しくはＧＩＶ−ｆｌ染色強度が、任意のパーセントで３＋である場合に、試料がＧＩＶ−ｆｌ陽性であると決定すること；又はＧＩＶ−ｆｌ染色の総面積が、０、１＋又は２＋の試料の染色強度で１０％未満である場合に、試料がＧＩＶ−ｆｌ陰性であると決定すること
によって生成される、ＧＩＶ−ｆｌタンパク質発現スコアを生成すること；並びに
試料のＧＩＶ−ｆｌタンパク質発現スコアを出力すること
を含み、
対象の起こり得る無増悪生存（ＰＦＳ）を予測する方法であり、
より高いＬＶＩ及び高いＧＩＶ−ｆｌレベルは、より高い確率の再発と関連する、コンピューター実装方法。
【請求項２６】
対象のリンパ管浸潤（ＬＶＩ）状態を入力すること；及び
対象の予後を出力すること
をさらに含む、請求項２５に記載のコンピューター実装方法。
【請求項２７】
診断時の対象の年齢、ＣＲＣについて陽性のリンパ節の数；対象の性別、腫瘍分化の情況、がんのＴステージ；及びどちら側に結腸がんが存在したのかを含む、対象の１又は複数の特性を入力することをさらに含む、請求項２５に記載のコンピューター実装方法。
【請求項２８】
コンピューティングシステムに請求項２５から２７の何れか一項に記載の方法を実施させるコンピューターで実行可能な命令を含む、１又は複数の非一時的コンピューター可読媒体。
【請求項２９】
対象から取得されたステージＩＩのミスマッチ修復良好（ｐＭＭＲ）結腸直腸がん（ＣＲＣ）試料を解析するためのシステムであって、
試料中のＧＩＶ−ｆｌのレベルを測定するための手段；
対象のリンパ管浸潤（ＬＶＩ）状態を決定するための手段；
ＧＩＶ−ｆｌの測定されたレベルをＧＩＶ−ｆｌ参照値と比較するための実装ルール；
ＬＶＩ状態をＬＶＩ状態参照値と比較するための実装ルール；並びに
前記ルールを実装するための手段
を備え、それによって、ＣＲＣ再発の起こり得るリスク及び／又は化学療法若しくは生物療法に対するＣＲＣの起こり得る応答の指標が、ＧＩＶ−ｆｌの測定されたレベル及びＬＶＩ状態に基づいて提供され、
対象の起こり得る無増悪生存（ＰＦＳ）を予測するシステムであり、
より高いＬＶＩ及び高いＧＩＶ−ｆｌレベルは、より高い確率の再発と関連する、システム。
【請求項３０】
診断時の対象の年齢、ＣＲＣについて陽性のリンパ節の数；対象の性別、腫瘍分化の情況、がんのＴステージ；及びどちら側に結腸がんが存在したのかを含む、対象の１又は複数の特性を決定するための手段；並びに
前記１又は複数の特性の測定されたレベルを、１又は複数の特性についての参照値と比較するための実装ルール
をさらに含む、請求項２９に記載のシステム。
【請求項３１】
ＧＩＶ−ｆｌ特異的結合剤、又はＧＩＶ−ｆｌ遺伝子配列に特異的な核酸プローブ；及び
ＬＶＩの決定を可能にする特異的結合剤
を含む、対象の起こり得る無増悪生存（ＰＦＳ）を予測するためのキットであって、
より高いＬＶＩ及び高いＧＩＶ−ｆｌレベルは、より高い確率の再発と関連する、キット。
【請求項３２】
ミスマッチ修復タンパク質特異的結合剤；顕微鏡スライド；標識された二次抗体；及びＩＨＣのためのバッファーの、１又は複数をさらに含む、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
ＧＩＶ−ｆｌタンパク質特異的結合剤が、ＧＩＶ−ｆｌ抗体を含む、請求項３１又は３２に記載のキット。
【請求項３４】
ＧＩＶ−ｆｌ抗体が、ＧＩＶ−ｆｌ抗体クローンＳＰ１７３を含む、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
ＬＶＩの決定を可能にする特異的結合剤が、ＣＤ３４又はリンパ内皮に特異的な抗体を含む、請求項３１から３４の何れか一項に記載のキット。
【請求項３６】
ミスマッチ修復タンパク質特異的結合剤が、ｍｕｔＬホモログ１（ＭＬＨ１）；減数分裂後隔離増加２（ＰＭＳ２）；ＭｕｔＳタンパク質ホモログ２  Ｍｓｈ２（ＭＳＨ２）及び／又はＭｕｔＳタンパク質ホモログ６（ＭＳＨ６）に特異的な１又は複数の抗体を含む、請求項３２から３５の何れか一項に記載のキット。
【請求項３７】
対象から取得されたステージＩＩのミスマッチ修復良好（ｐＭＭＲ）結腸直腸がん（ＣＲＣ）試料を解析するための方法であって、
試料からＲＮＡを単離すること；
ＲＮＡを含有する試料を、Ｇアルファ相互作用小胞結合タンパク質−完全長（ＧＩＶ−ｆｌ）ｍＲＮＡに特異的な核酸プローブと接触させること；
試料中のＧＩＶ−ｆｌ  ｍＲＮＡの量を決定すること
を含み、
対象の起こり得る無増悪生存（ＰＦＳ）を予測することを補助するための方法であり、
より高いＬＶＩ及び高いＧＩＶ−ｆｌ  ｍＲＮＡレベルは、より高い確率の再発と関連する、方法。
【請求項３８】
試料中のＧＩＶ−ｆｌ  ｍＲＮＡの量が、定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって決定される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
試料中のＧＩＶ−ｆｌ  ｍＲＮＡの量が、コントロール遺伝子のｍＲＮＡの量に対して相対的に決定される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
ＣＲＣ腫瘍試料中のＧＩＶ−ｆｌ  ｍＲＮＡの相対的量が、非腫瘍試料中のＧＩＶ−ｆｌ  ｍＲＮＡの相対的量と比較される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
試料中のＧＩＶ−ｆｌ  ｍＲＮＡの量が、コントロール試料中のＧＩＶ−ｆｌ  ｍＲＮＡの量を超える場合に、試料にＧＩＶ−ｆｌ陽性を割り当てることをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
対象のＬＶＩ状態を決定することをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
対象から取得されたステージＩＩのミスマッチ修復良好（ｐＭＭＲ）結腸直腸がん（ＣＲＣ）試料を解析するためのキットであって、
ＲＮＡを含有する試料を、Ｇアルファ相互作用小胞結合タンパク質−完全長（ＧＩＶ−ｆｌ）ｍＲＮＡに特異的な核酸プローブと接触させるための手段と；
試料中のＧＩＶ−ｆｌ  ｍＲＮＡの量を決定するための手段
とを含み、
対象の起こり得る無増悪生存（ＰＦＳ）を予測するためのキットであり、
より高いＬＶＩ及び高いＧＩＶ−ｆｌ  ｍＲＮＡレベルは、より高い確率の再発と関連する、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願とのクロスリファレンス
本出願は、２０１４年２月１７日出願の米国特許仮出願第６１／９４０７０５号に対する優先権を主張する。
【０００２】
分野
ステージＩＩの結腸直腸がん（ＣＲＣ）試料（例えば、ミスマッチ修復良好（ｍｉｓ−ｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ  ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ）、ｐＭＭＲ試料）を解析するための方法、システム及びキットが、本明細書に提供される。かかる方法は、ＣＲＣのリンパ管浸潤（ＬＶＩ）状態を決定することと組み合わせて、Ｇアルファ相互作用小胞結合タンパク質（ＧＩＶ、ギルジン（ｇｉｒｄｉｎ）としても公知）完全長（ＧＩＶ−ｆｌ）発現をスコアリングして、ＣＲＣについてＧＩＶ−ｆｌ状態を提供することを含み得る。
【０００３】
共同研究契約に関わる団体
Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏは、本明細書に開示される発明を管理する共同研究契約に関わる団体である。
【背景技術】
【０００４】
転移は、身体中の遠位の位置への腫瘍細胞の移動が関与する、多段階の複雑なプロセスである。移動又は浸潤するがん細胞は、増殖因子勾配を感知するために走化性受容体を利用し、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達を増幅しなければならない（Muller等, Nature, 2001. 410(6824):50-6）。ヒト上皮がんでは、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達経路は、がん浸潤の間に頻繁に過剰活性化され（Larue及びBellacosa, Oncogene, 2005. 24(50):7443-54）、効率的な細胞移動と共役したＰＩ３Ｋ−Ａｋｔの進行性の増強は、高い転移能の特徴である（Qiao等, Cancer Res, 2007. 67(11):5293-9）。しかし、機械的に同定された生物学的マーカーを使用した、腫瘍の転移能の正確な予測は、一部しか成功していない（Fidler, Nat Rev Cancer, 2003. 3(6):453-8）。ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達、アクチン再構築、運動性及び浸潤に関連する遺伝子／タンパク質の発現が腫瘍間で変動することを示す最近の研究（Qiao等, Cell Cycle, 2008. 7(19):2991-6）にもかかわらず、それらのほとんどは、予後判定のためのバイオマーカーとしての、がん治療機関への移行はできていない。したがって、その作用機序の特徴が十分に明らかにされ、治療機関でがん患者の再発又は転移のリスクを階層化するようにも機能し得る、腫瘍浸潤の間に役割を果たすことが証明された分子／マーカーについての研究が継続している。
【発明の概要】
【０００５】
本出願は、ミスマッチ修復良好（ｐＭＭＲ）であるステージＩＩ（例えば、ステージＩＩａ又はＩＩｂ）の結腸直腸がんを有する患者の、高リスク又は低リスクとしての分類、即ち、彼らのＣＲＣが再発又は進行する可能性が高いかどうかの分類を可能にする方法を提供する。進行について高リスクの患者は、化学療法又は生物療法を受けるように選択され得るが、低リスクの患者は、化学療法も生物療法も受けないように選択され得るので、かかる方法は有用である。一部の例では、これらの方法は、高リスクを有すると同定された患者を、化学療法又は生物療法で治療することを含む。さらに、開示された方法は、化学予測のため、即ち、化学療法又は生物療法に応答する可能性がより高いＣＲＣ  ｐＭＭＲステージＩＩ（例えば、ステージＩＩａ又はＩＩｂ）の腫瘍（例えば、開示された方法によって高リスクと分類されたもの）を同定するために使用され得る。
【０００６】
対象における完全長Ｇアルファ相互作用小胞結合タンパク質（ＧＩＶ−ｆｌ）の発現の決定（例えば、ＧＩＶ−ｆｌ発現をスコアリングすることによる）、及びリンパ管浸潤（ＬＶＩ）状態の決定は、高い精度で、（例えば、少なくとも２年以内、又は少なくとも５年以内に）再発する可能性が高いそれらのステージＩＩのＣＲＣ、及び再発する可能性が低いそれらのステージＩＩのＣＲＣを予測できることが、本明細書で示される。一部の例では、これらの方法は、ステージＩＩのＣＲＣが再発する可能性が高いかどうか、したがって化学療法又は生物療法で治療すべき高リスク腫瘍であるかどうかを決定するために、対象の１又は複数の他の特性、例えば、診断時の対象の年齢、ＣＲＣについて陽性のリンパ節の数、対象の性別、腫瘍分化の情況、がんのＴステージ；及びどちら側に結腸がんが存在したのかもまた使用する。
【０００７】
したがって、本開示は、例えば、１年以内、２年以内、３年以内、４年以内、５年以内、又は６年以内に進行することについて高リスク又は低リスクを有するものとしてＣＲＣを分類するなどのために、対象から取得されたステージＩＩのｐＭＭＲ  ＣＲＣ試料を解析するための方法を提供する。特定の例では、この方法は、ステージＩＩのＣＲＣ試料を、ＧＩＶ−ｆｌタンパク質特異的結合剤、例えば、ＧＩＶ−ｆｌに特異的な抗体（即ち、Ｃ末端、例えばＣ末端の７６２又は７６３個のアミノ酸を欠くＧＩＶの形態を検出できない）と接触させることを含む。この方法は、試料におけるＧＩＶ−ｆｌタンパク質の発現をスコアリングして、試料のＧＩＶ−ｆｌ状態（例えば、陽性又は陰性）を決定することもまた含む。
【０００８】
一例では、ＧＩＶ−ｆｌタンパク質の発現をスコアリングすることは、０から３のスケールで、試料の陽性ＧＩＶ−ｆｌ染色の程度を決定することであって、ここで試料の総面積の０％−１０％が陽性染色される場合、陽性染色の程度には０が割り当てられ、試料の総面積の１１％−３５％が陽性染色される場合、陽性染色の程度には１が割り当てられ、試料の総面積の３６％−５０％が陽性染色される場合、陽性染色の程度には２が割り当てられ、試料の総面積の５１％−１００％が陽性染色される場合、陽性染色の程度には３が割り当てられる、決定すること；０（陰性）、１（弱い）、２（中程度）から３（強い）のスケールで、試料の染色のＧＩＶ−ｆｌ強度を決定すること；陽性ＧＩＶ−ｆｌ染色の程度及び染色のＧＩＶ−ｆｌ強度を合計し、それによって、０から６までのＧＩＶ−ｆｌスコア値を生成すること；並びにＧＩＶ−ｆｌスコア値が０−２である場合に試料がＧＩＶ−ｆｌ陰性であると決定すること、又はＧＩＶ−ｆｌスコア値が３−６である場合に試料がＧＩＶ−ｆｌ陽性であると決定することを含む。
【０００９】
別の一例では、ＧＩＶ−ｆｌタンパク質の発現をスコアリングすることは、試料のＧＩＶ−ｆｌ染色の総面積が１０％よりも高いかどうかを決定すること、又は試料のＧＩＶ−ｆｌ染色強度が３＋（強い）であるかどうかを決定することを含む。例えば、ネガティブコントロール試薬での強度と類似の任意の検出可能なシグナルも薄灰色／黄褐色シグナルも存在しない場合、試料は陰性（０）とスコアリングされ得る；ネガティブコントロール試薬で、及びバックグラウンドにおいて見られるものよりも高い明褐色染色強度が存在する場合、試料は弱い（１＋）とスコアリングされ得る；褐色強度が存在する場合、試料は中程度（２＋）とスコアリングされ得る；又は暗褐色から黒色のシグナル強度が存在する場合、試料は強い（３＋）強度とスコアリングされ得る。ＧＩＶ−ｆｌ状態は、試料のＧＩＶ−ｆｌ染色の総面積が、任意の強度で１０％よりも高い場合、若しくはＧＩＶ−ｆｌ染色強度が、任意のパーセントで強い（３＋）場合に、陽性であると決定される；又はＧＩＶ−ｆｌ状態は、ＧＩＶ−ｆｌ染色の総面積が、試料について０、１＋又は２＋の染色強度で１０％未満である場合に、陰性であると決定される。この方法は、例えば、生存ＣＲＣ細胞が、腫瘍中に存在する血管又はリンパ管のいずれか中に存在するかどうかを決定することによって、対象のリンパ管浸潤（ＬＶＩ）状態を決定することもまた含む。一部の例では、この方法は、対象の１又は複数のさらなる特性、例えば、診断時の対象の年齢、ＣＲＣについて陽性のリンパ節の数、対象の性別、腫瘍分化の情況、がんのＴステージ；及びどちら側に結腸がんが存在したのかを決定することをさらに含む。決定されたＧＩＶ−ｆｌ状態、ＬＶＩ状態、及び任意選択的に対象の特性の１又は複数は、コンピューター又はアルゴリズムに入力され、これが次いで出力を生成し、それによって試料を解析する。一部の例では、この出力は、ＣＲＣが進行する（例えば転移する）可能性が高いかどうかに関しての指標である。例えば、出力は、ＣＲＣが高リスク又は低リスクであるという表示であり得る。一部の例では、出力は、対象の起こり得る無増悪生存（ＰＦＳ）である。これは、医師が、化学療法も生物療法も必要としない（低リスク）化学療法未治療の対象から、化学療法又は生物療法による治療に応答する可能性が高い（高リスク）化学療法未治療の対象を同定することを可能にできる。開示された方法の１又は複数の工程は、適切にプログラムされたコンピューターによって実施され得る。
【００１０】
この方法は、高リスクと同定された対象を、化学療法又は生物療法、例えば、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標））、セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、ｚｉｖ−アフリベルセプト（ＺＡＬＴＲＡＰ（登録商標））、イリノテカン（ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））及びオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標））のうち１又は複数で治療することもまた含み得る。
【００１１】
コンピューター実装方法もまた提供される。一例では、この方法は、ＧＩＶ−ｆｌ抗体で検出可能に標識されたステージＩＩの結腸直腸がん（ＣＲＣ）試料を示す表示された画像内の測定されたＧＩＶ−ｆｌタンパク質発現に少なくとも基づいて、ＧＩＶ−ｆｌタンパク質発現スコアを生成することであって、ここでＣＲＣ試料は対象から取得されたものであり、ＧＩＶ−ｆｌタンパク質発現スコアが、（ｉ）０から３のスケールで、試料の陽性ＧＩＶ−ｆｌ染色の程度を決定することであって、ここで試料の総面積の０％−１０％が陽性染色される場合、陽性染色の程度には０が割り当てられ、試料の総面積の１１％−３５％が陽性染色される場合、陽性染色の程度には１が割り当てられ、試料の総面積の３６％−５０％が陽性染色される場合、陽性染色の程度には２が割り当てられ、試料の総面積の５１％−１００％が陽性染色される場合、陽性染色の程度には３が割り当てられる、決定すること；０から３のスケールで、試料のＧＩＶ−ｆｌ染色強度スコア（例えば、全体的又は支配的な染色強度）を決定すること（例えば、ネガティブコントロール試薬での強度と類似の任意の検出可能なシグナルも薄灰色／黄褐色シグナルも存在しない場合、試料は陰性（０）とスコアリングされ得る；ネガティブコントロール試薬で、及びバックグラウンドにおいて見られるものよりも高い明褐色染色強度が存在する場合、試料は弱い（１）とスコアリングされ得る；褐色強度が存在する場合、試料は中程度（２）とスコアリングされ得る；又は暗褐色から黒色のシグナル強度が存在する場合、試料は強い（３）強度とスコアリングされ得る）、陽性ＧＩＶ−ｆｌ染色の程度及び染色のＧＩＶ−ｆｌ強度を合計し、それによって、０から６までのＧＩＶ−ｆｌスコア値を生成すること；及びＧＩＶ−ｆｌスコア値が０−２である場合に試料がＧＩＶ−ｆｌ陰性であると決定すること、又はＧＩＶ−ｆｌスコア値が３−６である場合に試料がＧＩＶ−ｆｌ陽性であると決定することによって生成されるか、又は（ｉｉ）試料のＧＩＶ−ｆｌ染色の総面積が１０％よりも高いかどうかを決定すること、又はＧＩＶ−ｆｌ染色強度が３＋（強い）かどうかを決定すること（例えば、ネガティブコントロール試薬での強度と類似の任意の検出可能なシグナルも薄灰色／黄褐色シグナルも存在しない場合、試料は陰性（０）とスコアリングされ得る；ネガティブコントロール試薬で、及びバックグラウンドにおいて見られるものよりも高い明褐色染色強度が存在する場合、試料は弱い（１＋）とスコアリングされ得る；褐色強度が存在する場合、試料は中程度（２＋）とスコアリングされ得る；又は暗褐色から黒色のシグナル強度が存在する場合、試料は強い（３＋）強度とスコアリングされ得る）、及び試料のＧＩＶ−ｆｌ染色の総面積が、任意の強度で１０％よりも高い場合、若しくはＧＩＶ−ｆｌ染色強度が、任意のパーセントで強い（３＋）場合に、試料がＧＩＶ−ｆｌ陽性であると決定すること；又はＧＩＶ−ｆｌ染色の総面積が、試料について０、１＋又は２＋の染色強度で１０％未満である場合に、試料がＧＩＶ−ｆｌ陰性であると決定することによって生成される、ＧＩＶ−ｆｌタンパク質発現スコアを生成することことを含む。試料について得られたＧＩＶ−ｆｌタンパク質発現スコアは、視覚的又は可聴的出力など、コンピューターから出力され得る。一部の例では、これらのコンピューター実装方法は、対象のリンパ管浸潤（ＬＶＩ）状態をコンピューターに入力すること、及び任意選択的に、診断時の対象の年齢、ＣＲＣについて陽性のリンパ節の数；対象の性別、腫瘍分化の情況、がんのＴステージ；及びどちら側に結腸がんが存在したのかを含む、対象の１又は複数の特性をコンピューターに入力することをさらに含む。一部の例では、対象の１又は複数の特性には、腫瘍悪性度、ＬＶＩ、試験したリンパ節の数、神経周囲浸潤が存在するかどうか、局在化した穿孔が存在するかどうか、及び辺縁が不確定か陽性かが含まれる。次いで、コンピューターは、ＣＲＣが進行する（例えば転移する）可能性が高いかどうかなどの出力を提供し得る。例えば、この出力は、ＣＲＣが高リスク又は低リスクであるという表示、対象の起こり得る無増悪生存（ＰＦＳ）、対象についての予後、対象が化学療法若しくは生物療法から利益を得る可能性が高いかどうか、又はそれらの組合せであり得る。
【００１２】
コンピューティングシステムに本明細書に提供される方法を実施させるコンピューターで実行可能な命令を含む、１又は複数の非一時的コンピューター可読媒体も提供される。
【００１３】
対象から取得されたステージＩＩのミスマッチ修復良好（ｐＭＭＲ）結腸直腸がん（ＣＲＣ）試料を解析するためのシステムも提供される。かかるシステムは、試料中のＧＩＶ−ｆｌのレベルを測定するための手段（例えば、ＧＩＶ−ｆｌ特異的抗体）；及び対象のＬＶＩ状態を決定するための手段（例えば、Ｈ＆Ｅ、又はＣＤ３４及び／若しくはリンパ内皮などのＬＶＩマーカーに特異的な抗体）を含み得る。一部の例では、このシステムは、ＧＩＶ−ｆｌの測定されたレベルに基づいて、試料のＧＩＶ−ｆｌ状態（例えば、陽性又は陰性）を決定するための実装ルールを含む。一部の例では、このシステムは、ＧＩＶ−ｆｌの測定されたレベルを、ＧＩＶ−ｆｌポジティブ又はネガティブコントロールなどのＧＩＶ−ｆｌ参照値と比較するための実装ルールを含む。一部の例では、このシステムは、例えば、ＬＶＩマーカーの測定されたレベルに基づいて、又は組織学的マーカー（例えば、Ｈ＆Ｅ染色）に基づいて、試料のＬＶＩ状態（例えば、陽性又は陰性）を決定するための実装ルールを含む。一部の例では、このシステムは、測定されたＬＶＩマーカーを、ＬＶＩポジティブ又はネガティブコントロールなどのＬＶＩ参照値又は試料と比較するための実装ルールを含む。一部の例では、ＧＩＶ−ｆｌ及び／又はＬＶＩ参照値は、記憶された値である。一部の例では、ＧＩＶ−ｆｌ及び／又はＬＶＩ参照値は、測定するための前記手段によってコントロール試料から測定されたＧＩＶ−ｆｌ及び／又はＬＶＩのレベルである。このシステムは、ルールを実装するための１又は複数の手段を含み得て、それによって、ＣＲＣ再発の起こり得るリスク及び／又は化学療法若しくは生物療法に対するＣＲＣの起こり得る応答の指標が、ＧＩＶ−ｆｌ及びＬＶＩ状態に基づいて提供される。一部の例では、このシステムは、診断時の対象の年齢、ＣＲＣについて陽性のリンパ節の数；対象の性別、腫瘍分化の情況、がんのＴステージ；及びどちら側に結腸がんが存在したのかを含む、対象の１又は複数の特性を決定するための手段；並びに１又は複数の特性の測定されたレベルを、１又は複数の特性についての参照値と比較するための実装ルール、もまた含む。
【００１４】
本開示は、本明細書に提供される方法と共に使用され得るものなどのキットもまた提供する。一例では、このキットは、抗体クローンＳＰ１７３などのＧＩＶ−ｆｌ特異的結合剤を含む。このキットは、以下のうち１又は複数を含み得る：ＬＶＩの決定を可能にする特異的結合剤（例えば、ＣＤ３４に特異的な抗体及び／又はリンパ内皮に特異的な抗体）；ミスマッチ修復タンパク質特異的結合剤（例えば、ｍｕｔＬホモログ１（ＭＬＨ１）；減数分裂後隔離増加２（ＰＭＳ２）；ＭｕｔＳタンパク質ホモログ２  Ｍｓｈ２（ＭＳＨ２）、ＭｕｔＳタンパク質ホモログ６（ＭＳＨ６）に特異的な抗体、又はかかる抗体の組合せ）；顕微鏡スライド；標識された二次抗体；及びＩＨＣのためのバッファー。
【００１５】
一部の実施態様では、本開示は、対象から取得されたステージＩＩのミスマッチ修復良好（ｐＭＭＲ）結腸直腸がん（ＣＲＣ）試料を解析するための方法であって、試料からＲＮＡを単離すること；ＲＮＡを含有する試料を、Ｇアルファ相互作用小胞結合タンパク質−完全長（ＧＩＶ−ｆｌ）ｍＲＮＡに特異的な核酸プローブと接触させること；及び試料中のＧＩＶ−ｆｌ  ｍＲＮＡの量を決定することを含む方法を含む。別の実施態様では、ＧＩＶ−ｆｌ  ｍＲＮＡに特異的な核酸プローブ及びＧＩＶ−ｆｌ遺伝子配列に特異的な少なくとも１対のプライマーを含む、ステージＩＩのミスマッチ修復良好（ｐＭＭＲ）結腸直腸がん（ＣＲＣ）試料を解析するためのキットが開示される。
【００１６】
本開示の上述及び他の目的及び特徴は、添付の図面を参照して進行する以下の詳細な説明からより明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本明細書に開示される統計的モデル化において使用される工程を記載するデータフロー図である。
【図２Ａ−Ｂ】ＩＢＬのＧＩＶ抗体又は実施例１に記載されるＳＰ１７３  Ａｂを用いた（Ａ）正常及び（Ｂ）がん性結腸試料のＩＨＣ染色を示すデジタル画像を示す図である。
【図２Ｃ】がん性細胞株のＧＩＶ−ｆｌ  ＩＨＣ染色を示すデジタル画像を示す図である。
【図３Ａ−Ｃ】異なる量の実施例１に記載されるＧＩＶ抗体を用いた、浸潤性がん細胞株（Ａ）ＭＤＡ  ＭＢ２３１；（Ｂ）ＤＬＤ１の、及び（Ｃ）正常肝臓における、ＩＨＣ染色を示すデジタル画像を示す図である。
【図４Ａ−Ｂ】異なる量の実施例１に記載されるＧＩＶ抗体を用いた、ＧＩＶ陰性（Ａ）及びＧＩＶ陽性（Ｂ）結腸がん症例のＩＨＣ染色を示すデジタル画像を示す図である。
【図５Ａ−Ｂ】（Ａ）０又は（Ｂ）１＋のスコアを有する結腸直腸がんにおける、実施例１に記載されるＧＩＶ抗体を使用したＩＨＣ染色を示すデジタル画像を示す図である。
【図５Ｃ−Ｄ】（Ｃ）２＋又は（Ｄ）３＋のスコアを有する結腸直腸がんにおける、実施例１に記載されるＧＩＶ抗体を使用したＩＨＣ染色を示すデジタル画像を示す図である。
【図６】表７に示されるＧＩＶ−ｆｌの程度及び強度スコアのスコアリングアルゴリズムを使用して、ミスマッチ修復良好（ｐＭＭＲ）、ミスマッチ修復欠損（ｄＭＭＲ）、ｐＭＭＲ／ＧＩＶ陽性、ｐＭＭＲ／ＧＩＶ陰性によって階層化された全てのステージＩＩのＣＲＣ対象（Ｔ３＋Ｔ４）についてのカプランマイヤー曲線を示す図である。
【図７Ａ】表７からのＧＩＶ−ｆｌの程度及び強度スコアを使用したカプランマイヤー生存曲線を示す図である。
【図７Ｂ】ＧＩＶ−ｆｌ予測スコアを使用したカプランマイヤー生存曲線を示す図である。
【図８】表７に示されるＧＩＶ−ｆｌ予測スコアのスコアリングアルゴリズムを使用して、ミスマッチ修復良好（ｐＭＭＲ）、ミスマッチ修復欠損（ｄＭＭＲ）、ｐＭＭＲ／ＧＩＶ陽性、ｐＭＭＲ／ＧＩＶ陰性によって階層化された化学療法未治療のステージＩＩのＣＲＣ対象（Ｔ３＋Ｔ４）についてのカプランマイヤー曲線を示す図である。
【図９】調整された部分的χ２統計によってランク付けされた潜在的予測変数のドットプロットを示す図である。
【図１０】（Ａ）２年及び（Ｂ）５年の無増悪生存についての４つの統計的予測モデルについてのＡＵＣプロットを示す図である。
【図１１】ＧＩＶ−ｆｌ及びＬＶＩを含む統計的モデルに基づいた、化学療法未治療のステージＩＩのＴ３  ＣＲＣ患者についての予測性曲線を示す図である。
【図１２】ＧＩＶ＋ＬＶＩ及びＭＭＲについて階層化されたＢｉｏＧｒｉｄ  １コホートからの化学療法未治療の（上のグラフ）及び化学療法治療された（下のグラフ）ステージＩＩのＴ３  ＣＲＣ患者についてのカプランマイヤー曲線を示す図である。
【図１３】ＧＩＶ＋ＬＶＩ及びＭＭＲについて階層化されたＢｉｏＧｒｉｄ  ２コホートからの化学療法未治療の（上のグラフ）及び化学療法治療された（下のグラフ）ステージＩＩのＴ３  ＣＲＣ患者についてのカプランマイヤー曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
配列表
配列番号１は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）寄託番号ＢＡＥ４４３８７のタンパク質配列である。
1 meneiftpll eqfmtsplvt wvktfgplaa gngtnldeyv alvdgvflnq vmlqinpkle
61 sqrvnkkvnn daslrmhnls ilvrqikfyy qetlqqlimm slpnvliigk npfseqgtee
121 vkkllllllg cavqcqkkee fieriqgldf dtkaavaahi qevthnqenv fdlqwmevtd
181 msqediepll knmalhlkrl iderdehset iielseerdg lhflphasss aqspcgspgm
241 krtesrqhls veladakaki rrlrqeleek teqlldckqe leqmeielkr lqqenmnlls
301 darsarmyrd eldalrekav rvdklesevs rykerlhdie fykarveelk ednqvlletk
361 tmledqlegt rarsdklhel ekenlqlkak lhdmemerdm drkkieelme enmtlemaqk
421 qsmdeslhlg weleqisrts elseapqksl ghevneltss rllklemenq sltktveelr
481 ttvdsvegna skilkmeken qrlskkveil eneivqekqs lqncqnlskd lmkekaqlek
541 tietlrense rqikileqen ehlnqtvssl rqrsqisaea rvkdiekenk ilhesikets
601 sklskiefek rqikkelehy kekgeraeel enelhhleke nellqkkitn lkitcekiea
661 leqenseler enrklkktld sfknltfqle slekensqld eenlelrrnv eslkcasmkm
721 aqlqlenkel esekeqlkkg lellkasfkk terlevsyqg ldienqrlqk tlensnkkiq
781 qleselqdle menqtlqknl eelkisskrl eqlekenksl eqetsqlekd kkqlekenkr
841 lrqqaeikdt tleennvkig nlekenktls keigiykesc vrlkeleken kelvkratid
901 iktlvtlred lvseklktqq mnndleklth elekiglnke rllhdeqstd dryklleskl
961 estlkkslei keekiaalea rleestnynq qlrqelktvk knyealkqrq deermvqssp
1021 pisgednkwe resqettrel lkvkdrliev ernnatlqae kqalktqlkq letqnnnlqa
1081 qilalqrqtv slqeqnttlq tqnaklqven stlnsqstsl mnqnaqlliq qsslenenes
1141 vikeredlks lydslikdhe klellherqa seyesliskh gtlksahknl evehrdledr
1201 ynqllkqkgq ledlekmlkv eqekmllenk nhetvaaeyk klcgendrln htysqllket
1261 evlqtdhknl ksllnnskle qtrleaefsk lkeqyqqldi tstklnnqce llsqlkgnle
1321 eenrhlldqi qtlmlqnrtl leqnmeskdl fhveqrqyid klnelrrqke kleekimdqy
1381 kfydpspprr rgnwitlkmr klikskkdin rerqksltlt ptrsdssegf lqlphqdsqd
1441 sssvgsnsle dgqtlgtkks smvalkrlpf lrnrpkdkdk mkacyrrsms mndlvqsmvl
1501 agqwtgsten levpddistg krrkelgama fsttainfst vnssagfrsk qlvnnkdtts
1561 fedispqgvs ddsstgsrvh asrpasldsg rtstsnsnnn aslhevkaga vnnqsrpqsh
1621 ssgefsllhd heawsssgss piqylkrqtr sspvlqhkis etlesrhhki ktgspgsevv
1681 tlqqfleesn kltsvqikss sqenlldevm kslsvssdfl gkdkpvscgl arsvsgktpg
1741 dfydrrttkp eflrpgprkt edtyfissag kptpgtqgki klvkesslsr qskdsnpyat
1801 lprassvist aegttrrtsi hdfltkdsrl pisvdsppaa adsnttaasn vdkvqesrns
1861 ksrsreqqss  
【００１９】
配列番号２は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）寄託番号Ｑ３Ｖ６Ｔ２のタンパク質配列である。
1 MENEIFTPLL EQFMTSPLVT WVKTFGPLAA GNGTNLDEYV ALVDGVFLNQ VMLQINPKLE
61 SQRVNKKVNN DASLRMHNLS ILVRQIKFYY QETLQQLIMM SLPNVLIIGK NPFSEQGTEE
121 VKKLLLLLLG CAVQCQKKEE FIERIQGLDF DTKAAVAAHI QEVTHNQENV FDLQWMEVTD
181 MSQEDIEPLL KNMALHLKRL IDERDEHSET IIELSEERDG LHFLPHASSS AQSPCGSPGM
241 KRTESRQHLS VELADAKAKI RRLRQELEEK TEQLLDCKQE LEQMEIELKR LQQENMNLLS
301 DARSARMYRD ELDALREKAV RVDKLESEVS RYKERLHDIE FYKARVEELK EDNQVLLETK
361 TMLEDQLEGT RARSDKLHEL EKENLQLKAK LHDMEMERDM DRKKIEELME ENMTLEMAQK
421 QSMDESLHLG WELEQISRTS ELSEAPQKSL GHEVNELTSS RLLKLEMENQ SLTKTVEELR
481 TTVDSVEGNA SKILKMEKEN QRLSKKVEIL ENEIVQEKQS LQNCQNLSKD LMKEKAQLEK
541 TIETLRENSE RQIKILEQEN EHLNQTVSSL RQRSQISAEA RVKDIEKENK ILHESIKETS
601 SKLSKIEFEK RQIKKELEHY KEKGERAEEL ENELHHLEKE NELLQKKITN LKITCEKIEA
661 LEQENSELER ENRKLKKTLD SFKNLTFQLE SLEKENSQLD EENLELRRNV ESLKCASMKM
721 AQLQLENKEL ESEKEQLKKG LELLKASFKK TERLEVSYQG LDIENQRLQK TLENSNKKIQ
781 QLESELQDLE MENQTLQKNL EELKISSKRL EQLEKENKSL EQETSQLEKD KKQLEKENKR
841 LRQQAEIKDT TLEENNVKIG NLEKENKTLS KEIGIYKESC VRLKELEKEN KELVKRATID
901 IKTLVTLRED LVSEKLKTQQ MNNDLEKLTH ELEKIGLNKE RLLHDEQSTD DSRYKLLESK
961 LESTLKKSLE IKEEKIAALE ARLEESTNYN QQLRQELKTV KKNYEALKQR QDEERMVQSS
1021 PPISGEDNKW ERESQETTRE LLKVKDRLIE VERNNATLQA EKQALKTQLK QLETQNNNLQ
1081 AQILALQRQT VSLQEQNTTL QTQNAKLQVE NSTLNSQSTS LMNQNAQLLI QQSSLENENE
1141 SVIKEREDLK SLYDSLIKDH EKLELLHERQ ASEYESLISK HGTLKSAHKN LEVEHRDLED
1201 RYNQLLKQKG QLEDLEKMLK VEQEKMLLEN KNHETVAAEY KKLCGENDRL NHTYSQLLKE
1261 TEVLQTDHKN LKSLLNNSKL EQTRLEAEFS KLKEQYQQLD ITSTKLNNQC ELLSQLKGNL
1321 EEENRHLLDQ IQTLMLQNRT LLEQNMESKD LFHVEQRQYI DKLNELRRQK EKLEEKIMDQ
1381 YKFYDPSPPR RRGNWITLKM RKLIKSKKDI NRERQKSLTL TPTRSDSSEG FLQLPHQDSQ
1441 DSSSVGSNSL EDGQTLGTKK SSMVALKRLP FLRNRPKDKD KMKACYRRSM SMNDLVQSMV
1501 LAGQWTGSTE NLEVPDDIST GKRRKELGAM AFSTTAINFS TVNSSAGFRS KQLVNNKDTT
1561 SFEDISPQGV SDDSSTGSRV HASRPASLDS GRTSTSNSNN NASLHEVKAG AVNNQSRPQS
1621 HSSGEFSLLH DHEAWSSSGS SPIQYLKRQT RSSPVLQHKI SETLESRHHK IKTGSPGSEV
1681 VTLQQFLEES NKLTSVQIKS SSQENLLDEV MKSLSVSSDF LGKDKPVSCG LARSVSGKTP
1741 GDFYDRRTTK PEFLRPGPRK TEDTYFISSA GKPTPGTQGK IKLVKESSLS RQSKDSNPYA
1801 TLPRASSVIS TAEGTTRRTS IHDFLTKDSR LPISVDSPPA AADSNTTAAS NVDKVQESRN
1861 SKSRSREQQS S  
【００２０】
詳細な説明
用語及び方法の以下の説明は、本開示をより良く説明するため、さらに本開示の実施において当業者を導くために提供される。単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「この（ｔｈｅ）」とは、文脈が明確に他を示さない限り、１つ又は１超を指す。例えば、用語「（１つの）細胞を含む」は、単数又は複数の細胞を含み、語句「少なくとも１つの細胞を含む」と等価とみなされる。用語「又は」とは、文脈が明確に他を示さない限り、述べられた代替的要素の単一の要素又は２以上の要素の組合せを指す。本明細書で使用する場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」とは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。したがって、「Ａ又はＢを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、さらなる要素を排除せず、「Ａ、Ｂ、又はＡ及びＢを含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味する。本明細書で言及されるＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）寄託番号の日付は、少なくとも２０１４年２月１７日の早期に入手可能な配列である。特許及び特許出願を含む全ての参考文献、並びに本明細書で引用されるＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）寄託番号は、参照により援用される。
【００２１】
特記しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する当該技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似又は等価な方法及び材料が、本開示の実施又は試験において使用され得るが、適切な方法及び材料は以下に記載される。材料、方法及び例は、例示に過ぎず、限定を意図しない。
【００２２】
本開示の種々の実施態様の概説を容易にするために、特定の用語の以下の説明が提供される：
【００２３】
抗体：免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、即ち、抗原（例えば、ＧＩＶ−ｆｌ、ＣＤ３４又はＭＭＲタンパク質）を特異的に結合する（かかる抗原と免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子。例示的抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体及びヒト化抗体、例えば、完全長ＧＩＶに特異的なもの（例えば、実施例１に記載されるＡｂを使用するなどして、配列番号１又は２のＣ末端アミノ酸を検出できる）が含まれる。一部の例では、抗体は、診断的であり得、例えば、完全長ＧＩＶ（ＧＩＶ−ｆｌ）などのタンパク質の存在を検出するために使用され得る。一部の実施態様では、診断的ＧＩＶ−ｆｌ抗体は、実施例１で産生された抗体の軽鎖可変ドメイン及び／又は重鎖可変ドメインを含む。一部の例では、ＧＩＶ−ｆｌ抗体は、完全長ＧＩＶタンパク質に特異的に結合するが、Ｃ末端が欠失したＧＩＶタンパク質（例えば、一部の例では、Ｃ末端の７６２又は７６３個のアミノ酸を欠くＧＩＶΔＣＴ）には結合しない。
【００２４】
一部の例では、抗体は、ＧＩＶ−ｆｌに対する高い結合親和性、例えば、少なくとも約１×１０−８Ｍ、少なくとも約１．５×１０−８、少なくとも約２．０×１０−８、少なくとも約２．５×１０−８、少なくとも約３．０×１０−８、少なくとも約３．５×１０−８、少なくとも約４．０×１０−８、少なくとも約４．５×１０−８又は少なくとも約５．０×１０−８Ｍの結合親和性を有する。特定の実施態様では、完全長ＧＩＶに結合する抗体は、≦１０４ｎＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。一実施態様では、Ｋｄは、目的の抗体のＦａｂバージョン及びその抗原を用いて実施される放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される（例えば、Chen等, J. Mol. Biol. 293:865-881, 1999を参照のこと）。別の例では、Ｋｄは、約１０反応単位（ＲＵ）において、固定化されている抗原ＣＭ５チップを備えた２５℃のＢＩＡＣＯＲＥＳ−２０００又はＢＩＡＣＯＲＥＳ−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用して、表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。結合は、以下：ウェスタンブロット、イムノブロット、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫沈降法、表面プラズモン共鳴、化学発光、蛍光偏光、リン光、免疫組織化学的解析、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析、マイクロサイトメトリー、マイクロアレイ、顕微鏡法、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）及びフローサイトメトリーが含まれるがこれらに限定されない当該技術分野で標準的な種々の方法を使用して測定され得る。
【００２５】
天然に存在する抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ）は、ジスルフィド結合によって相互接続された４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む。本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、細胞における１又は複数の抗体鎖をコードする核酸の発現によって産生される組換え抗体もまた含む（例えば、米国特許第４７４５０５５号；米国特許第４４４４４８７号；国際公開第８８／０３５６５号；欧州２５６６５４号；欧州１２０６９４号；欧州１２５０２３号；Faoulkner等, Nature 298:286, 1982；Morrison, J. Immunol. 123:793, 1979；Morrison等, Ann Rev. Immunol. 2:239, 1984を参照のこと）。
【００２６】
用語「抗体」は、天然に存在する抗体又は組換え抗体の抗原結合断片もまた含む。用語「抗体」内に包含される結合断片の具体的な非限定的な例には、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ及び単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が含まれる。Ｆａｂは、インタクトな軽鎖及び１つの重鎖の一部分を得るための酵素パパインによる全抗体の消化によって、又は遺伝子操作によって等価に産生される抗体分子の一価の抗原結合断片を含有する断片である。Ｆａｂ’は、インタクトな軽鎖及び重鎖の一部分を得るために、ペプシンによって全抗体を処理し、その後還元することによって取得される抗体分子の断片である；２つのＦａｂ’断片が、抗体分子１つ当たり取得される。（Ｆａｂ’）２は、引き続く還元を伴わずに、酵素ペプシンによって全抗体を処理することによって、又は遺伝子操作によって等価に取得される、抗体の断片である。Ｆ（Ａｂ’）２は、ジスルフィド結合によって一緒になった２つのＦＡｂ’断片のダイマーである。Ｆｖは、２つの鎖として発現される軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域を含む遺伝子操作された断片である。単鎖抗体（「ＳＣＡ」）は、遺伝的に融合された単鎖分子として適切なポリペプチドリンカーによって連結された、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含む、遺伝子操作された分子である。これらの断片を作製する方法は、当該技術分野で常套的である。
【００２７】
接触させる：１つの薬剤を別の薬剤と近位にし、それによって、これらの薬剤を相互作用させること。例えば、ＧＩＶ−ｆｌ抗体は、生物学的試料（例えば、ステージＩＩのＣＲＣ試料）を含有する顕微鏡スライド又は他の表面に適用され得、それによって、ＧＩＶ−ｆｌ抗体によって特異的に認識される試料中のＧＩＶ−ｆｌタンパク質の検出を可能にし得る。
【００２８】
検出する：薬剤が存在するか存在しないかを決定すること。一部の例では、これは、定量化をさらに含み得る。例えば、特定のタンパク質（例えば、ＧＩＶ−ｆｌ）に特異的な抗体の使用は、がん組織を含有する試料などの試料中のタンパク質の検出を可能にする。特定の例では、検出可能な標識からの放出シグナル（例えば、標的が存在する場合のシグナルにおける増加）が検出される。検出は、バルクであってもよく、その結果、巨視的数の分子が、同時に観察できる。検出は、顕微鏡、及びバックグラウンドノイズを低減させるための全内部反射などの技術を使用した、単一分子からのシグナルの同定もまた含み得る。
【００２９】
Ｇアルファ相互作用小胞結合タンパク質（ＧＩＶ、ギルジンとしても公知）（ＯＭＩＭ６０９７３６）：Ｇαｉに対する非受容体型グアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）。ＧＩＶのＣ末端中の独自のＧＥＦモチーフは、Ｇαｉの活性化に必要である（Garcia-Marcos等, Proc Natl Acad Sci U S A, 2009. 106:3178-83）。Ｇαｉを活性化し、「遊離」Ｇβγを放出することによって、ＧＩＶは、Ｇβγ−ＰＩ３Ｋ経路を介してＡｋｔシグナル伝達を増幅する（Garcia-Marcos等, Proc Natl Acad Sci U S A, 2009. 106:3178-83）。三量体Ｇタンパク質、Ｇαｉ及びＧＩＶを含む分子複合体は、Ａｋｔを増強し、アクチンを再構築し、細胞移動を誘発するために、増殖因子（ＥＧＦ（Enomoto等, Dev Cell, 2005. 9:389-402；Ghosh等, J Cell Biol, 2008. 182:381-93））、ＩＧＦ（Jiang等, Cancer Res, 2008. 68(5):1310-8）、ＶＥＧＦ（Kitamura等, Nat Cell Biol, 2008. 10(3):329-37）、インスリン（Garcia-Marcos等, Proc Natl Acad Sci U S A, 2009. 106:3178-83；Ghosh等, J Cell Biol, 2008. 182:381-93、Anai等, J Biol Chem, 2005. 280:18525-35）にとって必要である。
【００３０】
ＧＩＶのＣ末端は、ＥＧＦＲの自己リン酸化された細胞質テイルに直接結合し、それによって、リガンド活性化された受容体にＧタンパク質を連結させる。ＧＩＶのＣ末端がインタクトである場合、Ｇαｉ−ＧＩＶ−ＥＧＦＲシグナル伝達複合体がアセンブルされ、ＥＧＦＲ自己リン酸化が増強され、受容体の原形質膜（ＰＭ）との会合が延長される。したがって、運動性を誘発するＰＭベースのシグナル（ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ及びＰＬＣγ１）が増幅され、アクチンが再構築され、細胞移動が誘発される（Ghosh等, Mol. Biol. Cell. 2010. 21:2338-54）。したがって、ＧＩＶのＣ末端は、前縁において、リガンド活性化された受容体（Ghosh等, Mol. Biol. Cell. 2010. 21:2338-54）を、それらの相互作用が細胞移動に必須な３つの成分、アクチン（Enomoto等, Dev Cell, 2005. 9:389-402）、Ａｋｔ（Enomoto等, Dev Cell, 2005. 9:389-402；Anai等, J Biol Chem, 2005. 280:18525-35）及びＧαｉ（Garcia-Marcos等, Proc Natl Acad Sci U S A, 2009. 106:3178-83）に連結させる共通のプラットフォームとして機能する。
【００３１】
ＧＩＶは、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）に直接結合しそれを活性化するチロシンリン酸化タンパク質である。種々の受容体のリガンド刺激の際に、ＧＩＶは、受容体型チロシンキナーゼ及び非受容体型チロシンキナーゼの両方によって、チロシン−１７６４及びチロシン−１７９８においてリン酸化される。これらのリン酸化事象は、ＰＩ３Ｋの調節サブユニットｐ８５αのアミノ末端及びカルボキシル末端Ｓｒｃ相同性２ドメインへのＧＩＶの直接的結合を可能にし、ＰＩ３Ｋとの受容体会合を安定化し、原形質膜においてＰＩ３Ｋ活性を増強して、細胞移動を誘発する。
【００３２】
ヒトＧＩＶ遺伝子（ＣＣＤＣ８８Ａ）は、一部の例では、約２２０ｋＤａの予測された分子量を有する、１８７０アミノ酸（ヒトＧＩＶのアイソフォームでは１８７１）のタンパク質をコードする。ＧＩＶの構造は、いくつかの異なる領域に分割され得る：微小管結合性フードドメイン（アミノ酸１−１９５）、コイルドコイルオリゴマー化ドメイン（アミノ酸１９６−１３０４）、Ｇアルファ結合ドメイン（アミノ酸１３４３−１４２４）、ホスホイノシチド（ＰＩ４Ｐ）結合ドメイン（アミノ酸１３９０−１４０８）、Ａｋｔ、アクチン及び受容体結合ドメイン（アミノ酸１６２３−１８７０）、ＧＥＦモチーフ（アミノ酸１６７４−１６９４）の約１５ａａ下流であるＳＨ２ドメイン（アミノ酸１７１４−１８１５）。ＧＩＶ  ｍＲＮＡ発現は、乳房、結腸直腸、肺の悪性黒色腫、腎細胞癌、胃癌、膵臓癌、食道癌及び甲状腺癌を含むいくつかのがんにおいて、転移性進行の間に上方調節される。
【００３３】
ＧＩＶ配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）配列データベース（例えば、寄託番号ＮＰ＿００１１２９０６９及びＢＡＥ４４３８７．１（タンパク質）、並びにＡＢ２０１１７２．１及びＮＭ＿００１１３５５９７．１（核酸））から、公に入手可能である。ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）寄託番号Ｑ３Ｖ６Ｔ２は、１８７１ａａのＧＩＶ−ｆｌ変異体を提供する。当業者は、ＧＩＶ変異体を含む、さらなるＧＩＶの核酸及びタンパク質配列を同定できる。
【００３４】
ハイブリダイゼーション：ＤＮＡ、ＲＮＡの２つの鎖の、又はＤＮＡとＲＮＡとの間の相補的領域間で塩基対を形成し、それによって、二重鎖分子を形成すること。特定の程度のストリンジェンシーを生じるハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション方法の性質、並びにハイブリダイズする核酸配列の組成及び長さに依存して変動する。一般に、ハイブリダイゼーションの温度及びハイブリダイゼーションバッファーのイオン強度（例えば、Ｎａ＋濃度）が、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する。ハイブリダイゼーションバッファー中の、ハイブリダイゼーションを減少させる化学物質（例えば、ホルムアミド）の存在もストリンジェンシーを決定する（Sadhu等, J. Biosci. 6:817-821, 1984）。特定の程度のストリンジェンシーを達成するためのハイブリダイゼーション条件に関する計算は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ（第９章及び第１１章）において議論されている。ＩＳＨのためのハイブリダイゼーション条件は、Ｌａｎｄｅｇｅｎｔ等、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７７：３６６−３７０、１９８７；Ｌｉｃｈｔｅｒ等、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．８０：２２４−２３４、１９８８；及びＰｉｎｋｅｌ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：９１３８−９１４２、１９８８においても議論されている。
【００３５】
標識：例えば、分光光度法、フローサイトメトリー又は顕微鏡（例えば、光学顕微鏡）による検出が可能な薬剤。例えば、１又は複数の標識が抗体に結合され得、それによって、標的タンパク質（例えばＧＩＶ）の検出を可能にする。例示的標識には、放射性同位体、フルオロフォア、リガンド、化学発光剤、ハプテン、酵素及びそれらの組合せが含まれる。
【００３６】
リンパ管浸潤（ＬＶＩ）：ＣＲＣ細胞などの腫瘍細胞の、血管又はリンパ管中への浸潤。腫瘍細胞が血管又はリンパ管中に存在する場合、対象又は腫瘍のＬＶＩ状態は陽性である。腫瘍細胞が血管中にもリンパ管中にも存在しない場合、対象又は腫瘍のＬＶＩ状態は陰性である。しかし、対象又は腫瘍がＬＶＩ陽性である場合、これは、腫瘍がリンパ節に広がったことを必ずしも意味しない。
【００３７】
正常細胞又は組織：非腫瘍、非悪性の細胞及び組織。
【００３８】
ミスマッチ修復良好（ｐＭＭＲ）：ＣＲＣなどの腫瘍は、欠損ＭＭＲ（ｄＭＭＲ）系を有する腫瘍とは対照的に、ＤＮＡミスマッチ修復系（ＭＭＲ）が良好である場合、ｐＭＭＲ陽性と言われる。ｐＭＭＲを有するがんは、低頻度のマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）を示し得る。常套的方法が、ＰＣＲを使用するＭＳＩ試験、又はＩＨＣによるＭＭＲタンパク質、ＭＬＨ１、ＰＭＳ２、ＭＳＨ２及びＭＳＨ６の発現の解析などによって、ＭＭＲの存在又は非存在を決定するために使用され得る。
【００３９】
プライマー：標的核酸中の配列とハイブリダイズし、合成に適切な条件下で、核酸の相補鎖に沿ったかかる合成の開始点として作用することが可能な、オリゴヌクレオチド。完全な相補性は、プライマー伸長が生じるのに必要ではない。しかし、（特に３’末端近傍に）完全な相補性を有するプライマーは、ミスマッチ、特に、３’末端又はその近傍にミスマッチを有するプライマーよりも、効率的に伸長される。
【００４０】
プローブ：標的核酸中の配列とハイブリダイズし、検出可能に標識され得る、オリゴヌクレオチド。プローブは、プローブを核酸ポリメラーゼによって延長不能なものにする３’末端修飾などの修飾；及び１又は複数の発色団を有し得る。
【００４１】
定量的ＰＣＲ又は定量的ＲＴ−ＰＣＲ：標的核酸が定量的に検出される核酸増幅反応。ＱＰＣＲは、独立変数が増幅サイクルの数であり、従属変数が、増幅の各サイクルにおいて測定される、増幅依存的な測定可能なパラメーター（例えば、ハイブリダイゼーションの際に、又は核酸ポリメラーゼのヌクレアーゼ活性によるプローブの加水分解の際に、特異的プローブによって放出される蛍光の量）である関数のグラフである「増殖曲線」によって特徴が明らかにされる、Ｈｏｌｌａｎｄ等、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：７２７６−７２８０及び米国特許第５２１００１５号を参照のこと。増幅依存的な測定可能なパラメーターは、他の変数のなかでも、標的核酸の初期量を反映する。増殖曲線は、典型的には、所定の大きさの測定可能なパラメーターが達成されるサイクルの数である、「閾値までのサイクル」値又は「Ｃｔ値」によって特徴が明らかにされる。より低い又は「より早い」Ｃｔ値は、より多い量の入力標的核酸を反映するが、より高い又は「より遅い」Ｃｔ値は、より少ない量の入力標的核酸を反映する。
【００４２】
試料：対象から取得された、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ（ｍＲＮＡを含む）、タンパク質、インタクトな細胞（例えば、組織試料）又はそれらの組合せを含有する生物学的標本。例には、少なくとも１つのがん細胞を含有する標本（がん試料又はがん組織試料）、例えば、手術切除標本、組織若しくは腫瘍生検、穿刺吸引物、気管支肺胞洗浄、胸膜液、痰、手術標本、リンパ節、転移又は剖検材料が含まれる。他の例では、試料には、コントロール試料、例えば、非がん性の細胞又は組織試料が含まれる。一例では、コントロールは、ネガティブコントロール、例えば、検出可能なＧＩＶ−ｆｌタンパク質を含まないことが既知の試料である（肝臓試料中の肝細胞は、ＧＩＶ−ｆｌ抗体では染色されない）。別の一例では、コントロールは、ポジティブコントロール、例えば、検出可能なＧＩＶ−ｆｌを含むことが既知の試料（例えば、ＣＯＳ−７細胞の試料；ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−１６５１、又は肝臓試料中の非肝細胞、例えば、類洞、星状細胞）である。
【００４３】
特異的結合剤：規定された標的、例えば、ＧＩＶ−ｆｌタンパク質などのタンパク質のみに実質的に又は優先的に結合する薬剤。一部の例では、ＧＩＶ−ｆｌ特異的結合剤は、完全長ＧＩＶタンパク質に特異的に結合するが、Ｃ末端が欠失したＧＩＶタンパク質（例えば、一部の例では、Ｃ末端の７６２又は７６３個のアミノ酸を欠くＧＩＶΔＣＴ）には結合しない。
【００４４】
ＧＩＶ−ｆｌタンパク質特異的結合剤は、ＧＩＶ−ｆｌタンパク質のみに、又はＧＩＶ−ｆｌタンパク質内の特定の領域（例えば、Ｃ末端）のみに、実質的に結合する。例えば、「ＧＩＶ−ｆｌ特異的結合剤」には、抗体、及びＧＩＶ−ｆｌポリペプチドに実質的に結合する、アプタマーなどの他の薬剤が含まれる。抗体は、ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、及びそれらの免疫学的に有効な部分（「断片」）であり得る。特定の薬剤がＧＩＶ−ｆｌポリペプチドのみに実質的に結合するという決定は、常套的手順を使用する又は適応させることによって、容易に行われ得る。１つの適切なインビトロアッセイは、ウェスタンブロット法手順（Harlow及びLane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1999を含む、多くの標準的な教科書に記載されている）を使用する。
【００４５】
対象：ヒト及び非ヒト哺乳動物、例えば獣医学対象を含むカテゴリー、生存多細胞脊椎動物生物。特定の例では、対象は、がん、例えば、結腸直腸がん、例えば、ステージＩＩのＣＲＣ（例えば、ステージＩＩａ又はＩＩｂのＣＲＣ）を有している、又はそれらを有する疑いがある対象である。一部の例では、ステージＩＩのＣＲＣは、Ｔ３、Ｔ３／４又はＴ４である。一部の例では、対象は、化学療法未治療である（即ち、それらのＣＲＣに対する化学療法治療も生物療法治療も、以前に受けていない）。一部の例では、対象は、化学療法未治療ではない。
【００４６】
治療的有効量：疾患の前進を防止し、その進行を遅延させ、若しくはその後退を引き起こすのに十分な用量、又は疾患、例えばがん、例えば結腸直腸がん（例えば、ステージＩＩのＣＲＣ）によって引き起こされる症候を低減させることが可能な用量。一例では、治療的有効量は、腫瘍のサイズ若しくは容積、又は腫瘍の数（例えば、転移の数）を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％又は少なくとも９０％低減させるのに十分な、例えば、ＣＲＣ腫瘍のサイズ、容積又は数（例えば転移）を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％又は少なくとも９０％低減させるのに十分な、化学療法又は生物療法の量である。
【００４７】
〜に十分な条件下：所望の活性を許容する任意の環境を記述するために使用される語句。一例には、抗体を、試料中の１又は複数の標的タンパク質（例えば、ＧＩＶ−ｆｌ）の検出を可能にするのに十分な、生物学的試料と接触させることが含まれる。
【００４８】
概要
ステージＩＩの結腸直腸がん（ＣＲＣ）を有する患者の常套的管理は、いまだ困難である。ステージＩＩのＣＲＣ患者の約２５％は、アジュバント化学療法及び／又は生物療法を受ける（一般に、より若い患者及び臨床病理学的特性によって規定されるような高リスクを有する患者）。最終的には、小さいが明確な利益（全生存における約３％の絶対的改善）が、特にミスマッチ修復良好（ｐＭＭＲ）である腫瘍を有する患者において、アジュバント化学療法で観察される。
【００４９】
本出願は、ｐＭＭＲであるステージＩＩ（例えば、ステージＩＩａ又はＩＩｂ）の結腸直腸がんを有する患者の、高リスク又は低リスクとしての分類、即ち、ＣＲＣが進行又は再発する可能性が高いかどうかの分類を可能にする方法を提供する。例えば、ＣＲＣは、局所リンパ節に（例えば、ＣＲＣステージＩＩＩへの進行）、あるいは遠位リンパ節又は他の臓器、例えば肝臓若しくは肺に（例えば、ＣＲＣステージＩＶへの進行）、局所的に（がんが同じエリアに再出現する）進行又は再発し得る。進行又は再発について高リスクの患者は、進行について低リスクのＣＲＣを有する患者よりも、化学療法又は生物療法からの利益を示す可能性がより高いので、開示された方法は有用である。一部の例では、これらの方法は、高リスクのＣＲＣを有すると同定された患者を化学療法又は生物療法で治療することを含む。完全長Ｇアルファ相互作用小胞結合タンパク質（ＧＩＶ−ｆｌ）の発現の決定（例えば、ＧＩＶ−ｆｌ発現をスコアリングすることによる）、及び対象のリンパ管浸潤（ＬＶＩ）状態の決定は、（例えば、少なくとも２年以内又は少なくとも５年以内に）再発する可能性が高い、したがって高リスクであるステージＩＩのＣＲＣ、及び再発する可能性が低く、したがって低リスクであるステージＩＩのＣＲＣを、高い精度で予測できることが、本明細書で示される。一部の例では、これらの方法は、ステージＩＩのＣＲＣが再発する可能性があるかどうか、したがって化学療法又は生物療法で治療すべき高リスク腫瘍であるかどうかを決定するために、対象の１又は複数の他の特性、例えば、診断時の対象の年齢、ＣＲＣについて陽性のリンパ節の数、対象の性別、腫瘍分化の情況、がんのＴステージ；及びどちら側に結腸がんが存在したのかもまた使用する。一部の例では、対象の１又は複数の特性には、以下のうち１又は複数が含まれる：腫瘍悪性度、ＬＶＩ、試験したリンパ節の数、神経周囲浸潤が存在するかどうか、局在化した穿孔が存在するかどうか、及び辺縁が不確定か陽性か。
【００５０】
完全長ＧＩＶタンパク質（ＧＩＶ−ｆｌ）、より具体的には、重要なモチーフ（ＥＧＦＲ結合、Ａｋｔ／アクチン結合及びＧＥＦ）を含有するそのＣ末端（例えば、それぞれ配列番号１又は配列番号２のＣ末端の７６２又は７６３個のアミノ酸）は、選択的スプライシングによって、乳房及び結腸直腸腫瘍の細胞において、調節不全にされる（Ghosh等, Mol. Biol. Cell. 2010. 21:2338-54）。浸潤性が低いがん細胞及び前浸潤性の早期ステージの結腸直腸癌では、ＧＩＶ−ｆｌは、Ｃ末端トランケートされた変異体ＧＩＶΔＣＴによって置き換えられる。浸潤性が高いがん細胞及び後期ステージの浸潤性癌では、ＧＩＶ−ｆｌは高度に発現される。結果として、全てではない一部の腫瘍細胞及び腫瘍だけが、機能的にインタクトなＣ末端を含有するＧＩＶ−ｆｌを発現し、ＧＩＶ−ｆｌ発現は、転移性進行と相関する。
【００５１】
がん浸潤及び血管新生の間のＧＩＶ−ｆｌの分子的及び生物学的機能についての利用可能な情報の幅広さ（Garcia-Marcos等, Proc Natl Acad Sci U S A, 2009. 106(9):3178-83；Garcia-Marcos等, J Biol Chem. 2010. 285:12765-77；Enomoto等, Dev Cell, 2005. 9(3):389-402；Ghosh等, J Cell Biol, 2008. 182(2):381-93；Jiang等, Cancer Res, 2008. 68(5):1310-8；Kitamura等, Nat Cell Biol, 2008. 10(3):329-37；Anai等, J Biol Chem, 2005. 280(18):18525-35；Ghosh等, Mol. Biol. Cell. 2010. 21:2338-54；Enomoto等, Ann N Y Acad Sci, 2006. 1086:169-84；Weng等, Cancer Sci. 2010. 101:836-42）、並びにＧＩＶのＣ末端の存在が、転移性が低いがん（結腸、乳房及び膵臓）から転移性が高いがんを識別でき、それによって、結腸直腸がん患者において生存を予後判定できるという観察（Garcia-Marcos等, Faseb J. 2011. 25:590-99）にもかかわらず、予後不良を有するどのステージＩＩの結腸直腸患者（例えば、ミスマッチ修復良好（ｐＭＭＲ）である患者）がアジュバント化学療法又は生物療法から利益を得るかを決定するために、ＧＩＶ−ｆｌの発現が、他のインジケーターと組み合わせて使用され得るかどうかは、未だ決定されていない。
【００５２】
本開示は、例えば、対象から取得されたＣＲＣ試料を使用することによって、ステージＩＩ（例えば、ステージＩＩａ又はステージＩＩｂ）のｐＭＭＲ  ＣＲＣを解析又は特徴付けるための方法を提供する。一部の例では、方法は、試料を取得することを含む。一部の例では、これらの方法は、化学療法又は生物療法による治療に応答する可能性が低い、ステージＩＩのｐＭＭＲ  ＣＲＣを有する対象（例えば、化学療法未治療である対象）から、化学療法又は生物療法による治療に応答する可能性が高い、ステージＩＩのｐＭＭＲ  ＣＲＣを有する対象（例えば、化学療法未治療である対象）を識別する。開示された方法は、対象の起こり得る無増悪生存（ＰＦＳ）を予測するため、例えば、対象が、がんの進行も再発もなしの、少なくとも１年間、少なくとも２年間、少なくとも３年間、少なくとも４年間、少なくとも５年間、少なくとも６年間又は少なくとも７年間のＰＦＳを有するかどうかを予測するためにも、使用され得る。
【００５３】
方法は、ステージＩＩのＣＲＣ試料（例えば、Ｔ３又はＴ３／４である）を、ＧＩＶ−ｆｌに特異的な特異的結合剤と接触させることを含む。かかる特異的結合剤、例えば、アプタマー又は抗体は、ＧＩＶ−ｆｌに特異的に結合できるが、ＧＩＶのＣ末端トランケーション（ＧＩＶΔＣＴ、例えば、Ｃ末端の７６２又は７６３個のアミノ酸を欠くＧＩＶタンパク質）には結合しない。これは、試料中のＧＩＶ−ｆｌの存在の決定を可能にする。一部の例では、自動化組織染色器が、ＧＩＶ−ｆｌ一次抗体（及びさらなる抗体又は他のＩＨＣ試薬）の適用のために使用される。
【００５４】
ＧＩＶ−ｆｌタンパク質の発現は、例えば、試料のＧＩＶ−ｆｌ状態（例えば、陽性又は陰性）を決定するために、試料におけるその染色を検出することによってスコアリングされる。一例では、ＧＩＶ−ｆｌタンパク質の発現をスコアリングすることは、試料を試験すること、並びに全体的なＧＩＶ−ｆｌ染色のパーセント及び支配的なＧＩＶ−ｆｌ染色強度の特徴を明らかにすること又は決定することを含む。一部の例では、ＧＩＶ−ｆｌタンパク質の発現をスコアリングすることは、例えば、光学顕微鏡を使用した、ＧＩＶ−ｆｌ染色の視覚的検査を含む。一部の例では、ＧＩＶ−ｆｌ発現をスコアリングすることは、例えば顕微鏡スライド上に存在する試料の総面積の視覚的検査を含む。一部の例では、ＧＩＶ−ｆｌ発現をスコアリングすることは、例えば、スライド撮像器を使用した、試料の総面積の検査を含む。ＧＩＶ−ｆｌ発現をスコアリングすることは、試料へのＧＩＶ−ｆｌタンパク質特異的結合剤の結合の直接的又は間接的検出を含み得る。
【００５５】
一部の例では、顕微鏡スライドは、スライドスキャナーを使用して、処理及び／又は画像化される。スライドスキャナーは、当該技術分野で公知であり、これには、米国特許第８６２５９３０号；米国特許第８６０９０２３号及び米国特許第８２９０２３６号（全て本明細書で参照により援用される）中に開示されたもの、並びにＶＭＳＩから入手可能なものが含まれ得る。一部の例では、画像解析は、染色パターン、例えばＧＩＶ−ｆｌ発現を評価又は識別するために使用される。例えば、スライドのデジタル画像を使用したＧＩＶ−ｆｌ発現の自動化スコアリング、及びコンピューターベースの画像解析、例えば、米国特許第８６２５９３０号；米国特許第８５３７１８１号；米国特許第８５１５６８３号；及び米国特許第８４２８８８７号；（全て本明細書で参照により援用される）中に開示されたもの、並びにＶＭＳＩから入手可能なものが使用され得る。
【００５６】
一例では、ＧＩＶ−ｆｌ発現をスコアリングする方法は、０から３のスケールで、試料の陽性ＧＩＶ−ｆｌ染色の程度を決定することを含み、ここで試料の総面積の０％−１０％が陽性染色される場合、陽性染色の程度には０が割り当てられ、試料の総面積の１１％−３５％が陽性染色される場合、陽性染色の程度には１が割り当てられ、試料の総面積の３６％−５０％が陽性染色される場合、陽性染色の程度には２が割り当てられ、試料の総面積の５１％−１００％が陽性染色される場合、陽性染色の程度には３が割り当てられる。さらに、０（陰性）、１（弱い）、２（中程度）から３（強い）のスケールで、試料の染色のＧＩＶ−ｆｌ強度が決定される。例えば、ネガティブコントロール試薬での強度と類似の任意の検出可能なシグナルも薄灰色／黄褐色シグナルも存在しない場合、試料は陰性（０）とスコアリングされ得る；ネガティブコントロール試薬で、及びバックグラウンドにおいて見られるものよりも高い明るい染色強度（例えば、明褐色）が存在する場合、試料は弱い（１）とスコアリングされ得る；中程度の染色強度（例えば、褐色）が存在する場合、試料は中程度（２）とスコアリングされ得る；又は暗い染色強度（例えば、褐色から黒色のシグナル強度）が存在する場合、試料は強い（３）強度とスコアリングされ得る。検出される色は、使用される検出システムに依存する。一部の例では、陽性ＧＩＶ−ｆｌ染色の程度及び染色のＧＩＶ−ｆｌ強度が、コンピューター又はアルゴリズムに入力される。陽性ＧＩＶ−ｆｌ染色の程度及び染色のＧＩＶ−ｆｌ強度が合計され、それによって、０から６までのＧＩＶ−ｆｌスコア値を生成する。０から６までのこの値に基づいて、ＧＩＶ−ｆｌスコア値が０−２である場合に試料はＧＩＶ−ｆｌ陰性であると決定される、又はＧＩＶ−ｆｌスコア値が３−６である場合に試料はＧＩＶ陽性であると決定される。一部の例では、ＧＩＶ−ｆｌスコア値及び／又は試料のＧＩＶ−ｆｌ状態（例えば、陽性又は陰性）は、例えば、視覚的又は可聴的出力で、コンピューター又はアルゴリズムによって出力される。一部の例では、ＧＩＶ−ｆｌスコア値及び／又は試料のＧＩＶ−ｆｌ状態（例えば、陽性又は陰性）は、アルゴリズムに入力される。
【００５７】
別の例では、ＧＩＶ−ｆｌ予測スコアと呼ばれる、試料のＧＩＶ−ｆｌタンパク質発現をスコアリングすることは、試料のＧＩＶ−ｆｌ染色の総面積が、任意の染色強度で１０％よりも高いかどうかを決定すること、及び／又はＧＩＶ−ｆｌ染色強度が、任意のパーセント陽性で強い（３＋）かどうかを決定することを含む。例えば、ネガティブコントロール試薬での強度と類似の任意の検出可能なシグナルも薄灰色／黄褐色シグナルも存在しない場合、試料は陰性（０）とスコアリングされ得る；ネガティブコントロール試薬で、及びバックグラウンドにおいて見られるものよりも高い明るい染色強度（例えば、明褐色）が存在する場合、試料は弱い（１＋）とスコアリングされ得る；中程度の染色強度（例えば、褐色）が存在する場合、試料は中程度（２＋）とスコアリングされ得る；又は暗い染色強度（例えば、褐色から黒色のシグナル強度）が存在する場合、試料は強い（３＋）強度とスコアリングされ得る。検出される色は、使用される検出システムに依存する。この情報に基づいて、試料のＧＩＶ−ｆｌ染色の総面積が、任意の染色強度で１０％よりも高い場合、若しくはＧＩＶ−ｆｌ染色強度が、任意のパーセント陽性で強い（３＋）場合に、試料にＧＩＶ−ｆｌ陽性が割り当てられる；又はＧＩＶ−ｆｌ染色の総面積が、試料について０、１＋又は２＋の染色強度で１０％未満である場合に、試料にＧＩＶ−ｆｌ陰性が割り当てられる。一部の例では、試料のＧＩＶ−ｆｌ状態（例えば、陽性又は陰性）は、例えば、視覚的又は可聴的出力で、コンピューター又はアルゴリズムによって出力される。一部の例では、試料のＧＩＶ−ｆｌ状態（例えば、陽性又は陰性）値は、アルゴリズムに入力される。
【００５８】
別の例では、ＧＩＶ−ｆｌ発現は、ＧＩＶ−ｆｌ  ｍＲＮＡを定量化することによって評価される。この方法は、腫瘍試料からＲＮＡを単離すること、及び例えば、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を介して、特異的ヌクレオチドプローブを使用して、ＧＩＶ−ｆｌ  ｍＲＮＡを定量的に検出することを含む。一部の例では、ＧＩＶ−ｆｌ  ｍＲＮＡの相対的量は、ＧＩＶ−ＦＬ  ｍＲＮＡの絶対的量をハウスキーピング遺伝子のものと比較することによって決定される。なお他の例では、腫瘍試料中のＧＩＶ−ｆｌ  ｍＲＮＡの相対的量は、コントロール、例えば、非腫瘍試料中のＧＩＶ−ｆｌ  ｍＲＮＡの相対的量と比較される。ＧＩＶ−ｆｌ  ｍＲＮＡの相対的量が、コントロール試料中のＧＩＶ−ｆｌ  ｍＲＮＡの相対的量よりも実質的に高い場合、腫瘍試料にはＧＩＶ−ｆｌ陽性が割り当てられる。
【００５９】
この方法は、例えば、血管又はリンパ管中へのＣＲＣの浸潤が存在するかどうかを決定するために試料を試験することによって、対象のリンパ管浸潤（ＬＶＩ）状態（例えば、陽性又は陰性）を決定することも含む。かかる決定は、Ｈ＆Ｅ又は抗体、例えば、リンパ内皮に特異的な抗体（例えば、Ａｂ  Ｄ２−４０）若しくはＣＤ３４抗体で染色した試料の顕微鏡などの常套的方法を使用して行われ得る。
【００６０】
この方法は、対象の１又は複数の特性を決定することを任意選択的に含み得る。一部の例では、対象の１又は複数の特性は、例えば、視覚的又は可聴的出力で、コンピューター又はアルゴリズムによって出力される。一部の例では、対象の１又は複数の特性は、アルゴリズムに入力される。例示的特性には、診断時の対象の年齢、ＣＲＣについて陽性のリンパ節の数、対象の性別（雄性又は雌性）、腫瘍分化の情況（例えば、中程度、低い又は高い）、ＣＲＣのＴステージ（例えば、原発腫瘍のサイズ及び／又は程度を反映する、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４又はＴ３／４）、並びにどちら側に結腸がんが存在したのか（例えば、右又は左）が含まれるがこれらに限定されない。決定され得る入力される対象の他の例示的特性には、以下が含まれるがこれらに限定されない：腫瘍悪性度、ＬＶＩ、試験したリンパ節の数、神経周囲浸潤が存在するかどうか、局在化した穿孔が存在するかどうか、及び辺縁が不確定か陽性か。
【００６１】
この方法は、ＧＩＶ−ｆｌ状態、ＬＶＩ状態、及び任意選択的に対象の特性の１又は複数を、コンピューター又はアルゴリズムに入力すること、並びに次いで、コンピューター又はアルゴリズムから出力を生成し、それによって、試料を解析又は特徴を明らかにすることを含み得る。例えば、出力は、解析されるＣＲＣが、高リスクのＣＲＣ（再発又は進行する可能性が高い）かどうか、又は解析されるＣＲＣが、低リスクのＣＲＣ（再発又は進行する可能性が低い）かどうか、の指標であり得る。例えば、出力は、視覚的若しくは可聴的に「高リスク」、「低リスク」であり得、又は化学療法若しくは生物療法が対象に投与されるべきか否かの指標を提供し得る。
【００６２】
一部の例では、方法は、対象が、化学療法又は生物療法による治療に応答する可能性が高い対象（例えば、化学療法未治療の対象）として同定されたら、該対象を化学療法又は生物療法による治療のために選択することをさらに含む。一部の例では、かかる対象には、治療的有効量の１又は複数の適切な化学療法又は生物療法、例えば、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標））、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、ｚｉｖ−アフリベルセプト（Ｚａｌｔｒａｐ（登録商標））、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））、オキサリプラチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ（登録商標））又はそれらの組合せが投与される。対照的に、対象が、化学療法又は生物療法による治療に応答する可能性が低い対象（例えば、化学療法未治療の対象）として同定されたら、かかる対象には、化学療法も生物療法も投与されないが、緊密なモニタリングに割り当てられ得る。
【００６３】
開示された方法を使用して解析される試料は、常套的であり、これには、組織生検（例えば、組織切片）又は穿刺吸引物が含まれ得る。一部の例では、試料は、固定された試料、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料である。
【００６４】
開示された方法の１又は複数の工程は、適切にプログラムされたコンピューターによって実施され得る。
【００６５】
コンピューター実装方法もまた提供される。かかる方法は、ＧＩＶ−ｆｌ抗体で検出可能に標識されたステージＩＩのｐＭＭＲ試料を示す表示された画像内の測定されたＧＩＶ−ｆｌタンパク質発現に少なくとも基づいて、ＧＩＶ−ｆｌタンパク質発現スコアを生成することを含み得、ＣＲＣ試料は、対象から取得される。ＧＩＶ−ｆｌタンパク質発現スコアは、（ｉ）０から３のスケールで、試料の陽性ＧＩＶ−ｆｌ染色の程度を決定することであって、ここで試料の総面積の０％−１０％が陽性染色される場合、陽性染色の程度には０が割り当てられ、試料の総面積の１１％−３５％が陽性染色される場合、陽性染色の程度には１が割り当てられ、試料の総面積の３６％−５０％が陽性染色される場合、陽性染色の程度には２が割り当てられ、試料の総面積の５１％−１００％が陽性染色される場合、陽性染色の程度には３が割り当てられる、決定すること；上記のように、０（陰性）、１（弱い）、２（中程度）から３（強い）のスケールで、試料の染色のＧＩＶ−ｆｌ強度を決定すること、陽性ＧＩＶ−ｆｌ染色の程度及び染色のＧＩＶ−ｆｌ強度を合計し、それによって、０から６までのＧＩＶ−ｆｌスコア値を生成すること、及びＧＩＶ−ｆｌスコア値が０−２である場合に試料がＧＩＶ陰性であると決定すること、若しくはＧＩＶ−ｆｌスコア値が３−６である場合に試料がＧＩＶ陽性であると決定すること；又は（ｉｉ）上記スコアリング方法を使用して、試料のＧＩＶ−ｆｌ染色の総面積が、任意の染色強度で１０％よりも高いかどうかを決定すること、若しくはＧＩＶ−ｆｌ染色強度が強い（３＋）かどうかを決定すること；及び試料のＧＩＶ−ｆｌ染色の総面積が、任意の染色強度で１０％よりも高い場合、若しくはＧＩＶ−ｆｌ染色強度が、任意のパーセント陽性で強い（３＋）場合に、試料がＧＩＶ陽性であると決定すること；又はＧＩＶ−ｆｌ染色の総面積が、試料について０、１＋又は２＋の染色強度で１０％未満である場合に、試料がＧＩＶ陰性であると決定することによって生成され得る。試料について得られたＧＩＶ−ｆｌタンパク質発現スコアは、例えば、使用者又はアルゴリズムに、コンピューターによって出力され得る。
【００６６】
コンピューター実装方法は、対象のリンパ管浸潤（ＬＶＩ）状態を入力すること、並びに診断時の対象の年齢、ＣＲＣについて陽性のリンパ節の数、対象の性別、腫瘍分化の情況、がんのＴステージ；及びどちら側に結腸がんが存在したのかを含む、対象の１又は複数の特性を任意選択的に入力すること（入力され得る対象の他の例示的特性には、以下が含まれるがこれらに限定されない：腫瘍悪性度、ＬＶＩ、試験したリンパ節の数、神経周囲浸潤が存在するかどうか、局在化した穿孔が存在するかどうか、及び辺縁が不確定か陽性か）、並びに対象の予後又は診断を出力することをさらに含み得る。例えば、出力は、ＣＲＣが高リスクか低リスクか、したがって患者がそれぞれ化学療法／生物療法を受けるべきか否かについての指標であり得る。
【００６７】
コンピューティングシステムに本明細書に提供される方法を実施させるコンピューター実行可能な命令を含む、１又は複数の非一時的コンピューター可読媒体も提供される。
【００６８】
対象から取得されたステージＩＩ（例えば、ステージＩＩａ又はＩＩｂ）のミスマッチ修復良好（ｐＭＭＲ）結腸直腸がん（ＣＲＣ）試料を解析するためのシステムも提供される。かかるシステムは、試料中のＧＩＶ−ｆｌのレベルを測定するための手段（例えば、ＧＩＶ−ｆｌ特異的抗体）；及び対象のＬＶＩ状態を決定するための手段（例えば、Ｈ＆Ｅ、又はＣＤ３４及び／若しくはリンパ内皮などのＬＶＩマーカーに特異的な抗体）を含み得る。一部の例では、かかる手段には、光学顕微鏡、自動化組織若しくはスライド染色器、コンピューター、又はそれらの組合せが含まれる。一部の例では、システムは、ＧＩＶ−ｆｌの測定されたレベルに基づいて、試料のＧＩＶ−ｆｌ状態（例えば、陽性又は陰性）を決定するための実装ルールを含む。ＧＩＶ−ｆｌ発現をスコアリングする方法は、本明細書で議論される。一部の例では、システムは、ＧＩＶ−ｆｌの測定されたレベルを、ＧＩＶ−ｆｌポジティブ又はネガティブコントロールなどのＧＩＶ−ｆｌ参照値と比較するための実装ルールを含む。一部の例では、システムは、例えば、ＬＶＩマーカー又は他の組織学的若しくは構造的マーカー（例えば、Ｈ＆Ｅ染色）の測定されたレベルに基づいて、試料のＬＶＩ状態（例えば、陽性又は陰性）を決定するための実装ルールを含む。一部の例では、システムは、測定されたＬＶＩマーカーを、ＬＶＩポジティブ又はネガティブコントロールなどのＬＶＩ参照値又は試料と比較するための実装ルールを含む。一部の例では、ＧＩＶ−ｆｌ及び／又はＬＶＩ参照値は、記憶された値又は記憶されたデジタル画像である。一部の例では、ＧＩＶ−ｆｌ及び／又はＬＶＩ参照値は、測定するための前記手段によってコントロール試料から測定されたＧＩＶ−ｆｌ及び／又はＬＶＩのレベルである。システムは、ルール（例えば、コンピューター又はアルゴリズム）を実装するための１又は複数の手段もまた含み得て、それによって、ＣＲＣ再発の起こり得るリスク及び／又は化学療法若しくは生物療法に対するＣＲＣの起こり得る応答の指標が、ＧＩＶ−ｆｌ及びＬＶＩ状態に基づいて提供される。一部の例では、システムは、診断時の対象の年齢、ＣＲＣについて陽性のリンパ節の数；対象の性別、腫瘍分化の情況、がんのＴステージ；及びどちら側に結腸がんが存在したのかを含む、対象の１又は複数の特性を決定するための手段（又は、アルゴリズムにかかる特性を入力するための手段、例えば、キーボード又はコンピュータープログラム）；並びに１又は複数の特性の測定されたレベルを、１又は複数の特性についての参照値と比較するための実装ルール、もまた含む。
【００６９】
本開示は、本明細書に提供される方法と共に使用され得るものなどのキットもまた提供する。一例では、キットは、抗体クローンＳＰ１７３などのＧＩＶ−ｆｌ特異的結合剤を含む。キットは、以下のうち１又は複数を含み得る：ＬＶＩの決定を可能にする特異的結合剤（例えば、ＣＤ３４に特異的な抗体及び／又はリンパ内皮に特異的な抗体）；ミスマッチ修復タンパク質特異的結合剤（例えば、ｍｕｔＬホモログ１（ＭＬＨ１）；減数分裂後隔離増加２（ＰＭＳ２）；ＭｕｔＳタンパク質ホモログ２（ＭＳＨ２）、ＭｕｔＳタンパク質ホモログ６  ＭＳＨ６に特異的な抗体、又はかかる抗体の組合せ）；例えばＥＧＦＲ、Ｂａｘ、Ｂｃｌ、ｐ５３などの他の腫瘍マーカーに特異的な抗体；顕微鏡スライド（例えば、ガラススライド及びカバーガラス）；標識された二次抗体（例えば、検出可能な標識を含み、キット中の一次抗体の検出を可能にするもの）；及びＩＨＣのためのバッファー（例えば、ＶＭＳＩのＣＣ１バッファー）。別の一実施態様では、キットは、ＧＩＶ−ｆｌ  ｍＲＮＡ発現を測定するための試薬を含有する。この実施態様では、キットは、ＧＩＶ−ｆｌ  ｍＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズすることが可能な核酸プローブを含む。キットは、ＧＩＶ−ｆｌ  ｍＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドプライマー、コントロール遺伝子、例えば、「ハウスキーピング」遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー及び１又は複数のプローブ、ヌクレオシド三リン酸、逆転写活性及びＤＮＡ複製活性を提供するための１又は複数のＤＮＡポリメラーゼ、並びに１又は複数のＤＮＡポリメラーゼの活性を支持するためのバッファー及び補助因子、のうち１又は複数を含む、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）のための試薬もまた含有し得る。
【００７０】
ステージＩＩのｐＭＭＲ結腸直腸がん試料を解析する方法
対象から取得されたステージＩＩ（例えば、ＩＩａ及びＩＩｂ、それぞれ、Ｔ３及びＴ４とも呼ばれる）のミスマッチ修復良好（ｐＭＭＲ）結腸直腸がん（ＣＲＣ）試料を解析するための方法が、本明細書で開示される。ステージＩＩａのＣＲＣは、筋固有層を通って漿膜下組織中に、又は腹膜で覆われていない大腸周囲若しくは直腸周囲組織中に浸潤する腫瘍として一般に特徴を明らかにされるが、ステージＩＩｂのＣＲＣは、腫瘍が他の臓器若しくは構造を直接浸潤する場合、及び／又は内臓腹膜を穿孔する場合である。対照的に、ステージＩＩｃは、ＣＲＣが、結腸壁の漿膜を通って広がっているが、近傍の臓器には広がっていない場合である。一部の例では、かかる方法は、試料を取得した対象について、良い又は悪い転帰を予後判定するために使用される。例えば、これらの方法は、ＣＲＣが元の診断後少なくとも１、２、３、４、５、６又はさらには７年間進行する可能性が高いかどうかを決定できる。例えば、方法が、ＣＲＣが進行する（例えば、手術後に再発又は転移する可能性が高い）ことを予測する場合、これは、ＣＲＣが高リスクであり、対象が化学療法又は生物療法を受けるべきであることを示す。対照的に、方法が、ＣＲＣが進行しない（例えば、手術後に再発又は転移する可能性が低い）ことを予測する場合、これは、ＣＲＣが低リスクであり、対象が化学療法も生物療法も受けるべきでないこと（それらが利益を受ける可能性は低いので）を示す。したがって、方法は、化学療法又は生物療法を受けることから利益を得る可能性が高いステージＩＩのｐＭＭＲ  ＣＲＣを有する対象を同定するために、化学予測因子として使用され得る。
【００７１】
これらの方法は、ステージＩＩ（例えば、ＩＩａ又はＩＩｂ）のｐＭＭＲ  ＣＲＣがＧＩＶ−ｆｌタンパク質発現について陽性か陰性かを決定することを含み得る。例えば、方法は、ＧＩＶ−ｆｌタンパク質発現をスコアリングすることを含み得る。ＧＩＶ−ｆｌ陽性ＣＲＣは浸潤性がより高いので、ＧＩＶ−ｆｌ陽性であるＣＲＣ  ｐＭＭＲ腫瘍は、一般に、ＧＩＶ−ｆｌ陰性であるものよりも悪い予後を有する（例えば、ＧＩＶ−ｆｌ陰性ＣＲＣを有する対象よりも、１、２、３、４、５、６又はさらには７年以内に進行する可能性がより高いがん）。即ち、ＧＩＶ−ｆｌは、有害な予後因子である。しかし、全てのＧＩＶ−ｆｌ陽性ＣＲＣが化学療法又は生物療法に応答するわけではない。したがって、本発明者らは、化学療法又は生物療法に応答する可能性が高いステージＩＩのｐＭＭＲ  ＧＩＶ−ｆｌ陽性ＣＲＣがんを同定できるさらなる臨床変数を同定した。かかる方法は、化学療法又は生物療法による治療に応答すると予測されるステージＩＩのｐＭＭＲ  ＣＲＣを有するとして、対象を同定するために使用され得る。一部の例では、かかる対象は、それらのＣＲＣに対する化学療法剤又は生物療法剤によって以前に治療されている。他の例では、かかる対象は、それらのＣＲＣに対する化学療法剤によっても生物療法剤によっても以前に治療されていない（化学療法未治療）。
【００７２】
開示された方法は、試料のＧＩＶ−ｆｌ状態を提供又は決定するために、ＧＩＶ−ｆｌ発現を検出すること又は測定することを含む。かかる状態には、ＧＩＶ−ｆｌタンパク質スコア（例えば、０、１、２、３、４、５又は６）、ＧＩＶ−ｆｌ陽性又はＧＩＶ−ｆｌ陰性のうち１又は複数が含まれ得る。かかる方法は、ＣＲＣ細胞を含有する試料（例えば、対象から取得された試料）を、ＧＩＶ−ｆｌタンパク質特異的結合剤と接触させることを含み得る。ＧＩＶ−ｆｌタンパク質特異的結合剤の例には、抗体、例えば、高い特異性でＧＩＶ−ｆｌに結合するがＧＩＶΔＣＴには結合しない、モノクローナル抗体（例えば、ウサギモノクローナル抗体クローンＳＰ１７３、実施例１を参照のこと）、ポリクローナル抗体、キメラ抗体及びそれらの断片、並びにアプタマーが含まれる。これらのＧＩＶ−ｆｌタンパク質特異的結合剤は、試料中のＧＩＶ−ｆｌタンパク質にＧＩＶ−ｆｌタンパク質特異的結合剤を結合させる条件下で、試料と共にインキュベートされ得る。一例では、ＣＴＣ試料におけるＧＩＶ−ｆｌタンパク質発現が検出又は測定され、次いで、これらの測定値に基づいて、ＧＩＶ−ｆｌタンパク質発現スコアが、試料について決定される。このスコアに基づいて、試料がＧＩＶ−ｆｌ陽性か陰性かが決定される。
【００７３】
一例では、ＣＲＣ試料のＧＩＶ−ｆｌスコアは、以下のように決定される。試料の陽性ＧＩＶ−ｆｌ染色の程度は、０から３のスケールでスコアリングされ、試料の総面積の０％−１０％がＧＩＶ−ｆｌについて陽性染色される場合、陽性染色の程度には０が割り当てられ、試料の総面積の１１％−３５％がＧＩＶ−ｆｌについて陽性染色される場合、陽性染色の程度には１が割り当てられ、試料の総面積の３６％−５０％がＧＩＶ−ｆｌについて陽性染色される場合、陽性染色の程度には２が割り当てられ、試料の総面積の５１％−１００％がＧＩＶ−ｆｌについて陽性染色される場合、陽性染色の程度には３が割り当てられる。さらに、０（陰性）、１（弱い）、２（中程度）から３（強い）のスケールでの試料の染色のＧＩＶ−ｆｌ強度が、上記方法を使用して決定又は計算される。一部の例では、陽性ＧＩＶ−ｆｌ染色の程度及び染色のＧＩＶ−ｆｌ強度の各々についての値は、コンピューター又はアルゴリズムに入力される。陽性ＧＩＶ−ｆｌ染色の程度及び染色のＧＩＶ−ｆｌ強度の各々についての値が合計され、それによって、０から６までのＧＩＶ−ｆｌスコア値を生成する。０から６までのこの値に基づいて、ＧＩＶ−ｆｌスコア値が０−２である場合に試料がＧＩＶ−ｆｌ陰性であること、又はＧＩＶ−ｆｌスコア値が３−６である場合に試料がＧＩＶ−ｆｌ陽性であることが決定される。
【００７４】
別の例では、ＣＲＣ試料のＧＩＶ−ｆｌスコアは、以下のように決定される。試料は、上記方法を使用して、試料のＧＩＶ−ｆｌ染色の総面積が１０％よりも高いかどうかを決定するため、及び／又はＧＩＶ−ｆｌ染色強度が３＋（強い）かどうかを決定するために解析される。この情報に基づいて、試料のＧＩＶ−ｆｌ染色の総面積が、任意の染色強度で１０％よりも高い場合、若しくはＧＩＶ−ｆｌ染色強度が、任意のパーセントで強い（３＋）場合に、試料にはＧＩＶ−ｆｌ陽性が割り当てられ；又は試料のＧＩＶ−ｆｌ染色の総面積が、０、１＋又は２＋の染色強度で１０％未満である場合に、試料にはＧＩＶ−ｆｌ陰性が割り当てられる。
【００７５】
試料中の標的タンパク質を検出するために抗体及び他のタンパク質特異的結合剤を使用する方法は、常套的であり、本開示は、特定の方法に限定されない。一部の例では、ＩＨＣが、例えば光学顕微鏡と組み合わせて、利用される。例えば、試料におけるＧＩＶ−ｆｌタンパク質発現は、試料へのＧＩＶ−ｆｌタンパク質特異的結合剤の結合によって、直接的又は間接的に検出され得る。一部の例では、試料をＧＩＶ−ｆｌタンパク質特異的結合剤と接触させること、及び試料におけるＧＩＶ−ｆｌタンパク質発現を検出することは、自動化組織染色器で実施される。一部の例では、ＧＩＶ−ｆｌタンパク質発現を検出することは、例えば光学顕微鏡を利用することによる、視覚的検査を利用する。
【００７６】
試料から単離されたｍＲＮＡを使用してｍＲＮＡ発現を検出する方法も、同様に常套的である。これらの方法には、例えばＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いた定量的逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、又はＰＣＲなしの系、例えばＩｎｖａｄｅｒ（登録商標）アッセイ（Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、例えばマイクロアレイの一部としての、固定化されているプローブへのハイブリダイゼーション、又は利用可能な若しくは利用可能になるであろうｍＲＮＡを定量化する任意の他の方法が含まれる。
【００７７】
この方法は、対象のリンパ管浸潤（ＬＶＩ）状態（例えば、陽性又は陰性）を知ることに依存する。ＬＶＩを決定する方法は、顕微鏡を使用するなど、常套的である。例えば、ＣＲＣ試料は、血管又はリンパ管中へのＣＲＣの浸潤が存在したかどうかを決定するために、例えば顕微鏡を使用して解析され得る。ＬＶＩ状態は、ステージＩＩのｐＭＭＲ  ＣＲＣが、化学療法又は生物療法に応答する可能性が高いか低いかを決定するために、ＧＩＶ−ｆｌ状態と組み合わせて使用され得る。
【００７８】
この方法は、対象の１又は複数の特性を決定することを、任意選択的に含み得る。一部の例では、対象の１又は複数の特性は、例えば、視覚的又は可聴的出力で、コンピューター又はアルゴリズムによって出力される。一部の例では、対象の１又は複数の特性は、アルゴリズムに入力される。例示的特性には、診断時の対象の年齢、ＣＲＣについて陽性のリンパ節の数、対象の性別（雄性又は雌性）、腫瘍分化の情況（例えば、中程度、低い又は高い）、ＣＲＣのＴステージ（例えば、原発腫瘍のサイズ及び／又は程度を反映する、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４又はＴ３／４）、並びにどちら側に結腸がんが存在したのか（例えば、右又は左）が含まれるがこれらに限定されない。対象の１又は複数の特性と組み合わせた、及び一部の例ではＬＶＩ状態とも組み合わせたＧＩＶ−ｆｌ状態は、ステージＩＩのｐＭＭＲ  ＣＲＣが、化学療法又は生物療法に応答する可能性が高いか低いかを決定するために使用され得る。
【００７９】
一部の例では、開示された方法は、化学療法又は生物療法による治療に応答する可能性が高い又は応答すると予測されたステージＩＩのｐＭＭＲ  ＣＲＣを有するとして、対象を同定する方法である。例えば、この方法は、対象から取得された腫瘍試料がＧＩＶ−ｆｌ陽性であり、患者がＬＶＩ陽性である場合に、その対象が化学療法又は生物療法による治療から利益を得ると決定することを含み得る。かかる同定された対象は、化学療法による治療のために選択され得る。さらに、この方法は、かかる同定及び選択された対象に、治療的有効量の化学療法又は生物療法を投与することを含み得る。対照的に、この方法は、対象から取得された腫瘍試料がＧＩＶ−ｆｌ陰性であり、患者がＬＶＩ陰性である場合に、その対象が化学療法による治療から利益を得ないと決定することを含み得る。
【００８０】
一部の例では、試験試料におけるＧＩＶ−ｆｌタンパク質発現は、コントロール、例えば、ポジティブ及び／又はネガティブコントロールと比較される。したがって、一部の例では、この方法は、１又は複数のコントロール試料においてＧＩＶ−ｆｌタンパク質発現を検出すること又は測定することを含む。例えば、肝臓試料中の肝細胞は、ＧＩＶ−ｆｌを内因性に発現せず、したがって、染色強度について０、又はＧＩＶ−ｆｌタンパク質発現について染色された総面積について１０％未満とスコアリングすべきである。対照的に、ＣＯＳ−７細胞は、ＧＩＶ−ｆｌを発現し、したがって、染色強度について２若しくは３、又はＧＩＶ−ｆｌタンパク質発現について染色された総面積について５０％超とスコアリングすべきである。
【００８１】
開示された方法の１又は複数の工程は、システム又は適切にプログラムされたコンピューターによって実施され得る。例えば、ＧＩＶ−ｆｌタンパク質発現は、画像化解析システム又はコンピューターを使用して、検出及びスコアリングされ得る。一部の例では、システム又はコンピューターは、スコア、例えば、陽性ＧＩＶ−ｆｌ染色の程度については０、１、２若しくは３のスコア；０、１、２若しくは３のＧＩＶ−ｆｌ染色強度のスコア；０、１、２、３、４、５若しくは６のＧＩＶ−ｆｌ染色スコア、又は試料がＧＩＶ−ｆｌ陽性か陰性かを計算するために使用される、ＧＩＶ−ｆｌタンパク質スコア又は値の出力を提供する。さらに、ＬＶＩ状態は、画像化解析システム又はコンピューターを使用して検出され得る。一部の例では、システム又はコンピューターは、ＬＶＩ陽性又は陰性などのＬＶＩ状態の出力を提供する。一部の例では、システム又はコンピューターは、ＣＲＣが進行（例えば再発）する可能性が高いかどうか及び／又は化学療法若しくは生物療法に応答する可能性が高いかどうかの出力を提供する。一部の例では、出力は、視覚的又は可聴、例えば、プリントアウトである。一部の例では、出力は、例えばコンピューター可読媒体上に記憶される。
【００８２】
したがって、ステージＩＩのｐＭＭＲ  ＣＲＣが高リスクか低リスクか、したがってＣＲＣが化学療法又は生物療法に応答する可能性が高いかどうかを決定するための、コンピューター実装方法が、本明細書に提供される。かかる方法は、ＧＩＶ−ｆｌ抗体で検出可能に標識されたＣＲＣ試料を示す表示された画像内の測定されたＧＩＶ−ｆｌタンパク質発現に少なくとも基づいて、ＧＩＶ−ｆｌタンパク質発現スコアを生成することを含み得、ＣＲＣ試料は、対象から取得される。ＧＩＶ−ｆｌタンパク質発現スコアは、ＣＲＣ細胞におけるＧＩＶ−ｆｌタンパク質の発現を検出することによって生成され得る。ＧＩＶ−ｆｌタンパク質発現スコアを生成する方法は、本明細書に提供される。試料について得られたＧＩＶ−ｆｌタンパク質発現スコアは、例えば、使用者又はアルゴリズムに、コンピューターによって出力され得る。コンピューター実装方法は、対象のＬＶＩ状態（例えば、陽性又は陰性）を入力することをさらに含み得る。あるいは、ＬＶＩ状態は、ＣＲＣ試料（例えば、Ｈ＆Ｅで又はリンパ内皮のマーカー、抗体Ｄ２−４０で、又はＣＤ３４抗体で染色されたもの）を示す表示された組織学画像に少なくとも基づいて決定され得る。コンピューター実装方法は、診断時の対象の年齢、ＣＲＣについて陽性のリンパ節の数、対象の性別、腫瘍分化の情況、がんのＴステージ；及びどちら側に結腸がんが存在したのかを含む、対象の１又は複数の特性を入力すること、並びに対象についての予後又は診断を出力することを任意選択的に含み得る。例えば、出力は、ＣＲＣが高リスクか低リスクか、したがって患者がそれぞれ化学療法又は生物療法を受けるべきか否かについての指標であり得る。
【００８３】
コンピューティングシステムにかかる方法を実施させるコンピューターで実行可能な命令を含む、１又は複数の非一時的コンピューター可読媒体も提供される。
【００８４】
Ａ．ＧＩＶ−ＦＬの検出
対象から取得されたステージＩＩのｐＭＭＲ  ＣＲＣ試料は、１又は複数のＣＲＣ細胞中に、検出可能なレベルのＧＩＶ−ｆｌタンパク質などのＧＩＶ−ｆｌを含有するかどうかを決定するために解析される。したがって、試料は、試料中のＧＩＶ−ｆｌタンパク質の存在、例えば、定性的又は半定量的測定値を検出又は測定するために解析され得る。特定の実施態様では、開示された方法は、試料中の腫瘍細胞中のＧＩＶ−ｆｌタンパク質の存在の定性的測定値を利用する。ＧＩＶ−ｆｌスコアに基づいて、試料は、ＧＩＶ−ｆｌ陽性又は陰性であると決定される。
【００８５】
一部の例では、ＧＩＶ−ｆｌは、１８７０又は１８７１アミノ酸長、例えば、それぞれ、配列番号１又は２である。対照的に、ＧＩＶΔＣＴは、Ｇタンパク質活性化ＥＦドメインを含むＣ末端の７６２又は７６３個のアミノ酸（例えば、それぞれ、配列番号１又は配列番号２のＣ末端の７６２又は７６３個のアミノ酸）を欠く。トランケーションは、エクソン１９の終端において生じ、Ｑ１１０８において終結し、Ｃ末端に、イントロン−１９配列の翻訳から生じる３つのさらなるアミノ酸（ＶＶＩ）を含有するタンパク質を生じる。したがって、トランケートされたＧＩＶタンパク質のＣ末端配列は、ＱＴＱＮＡＫＬＱＶＶＩである。ＧＩＶ−ｆｌ特異的結合剤は、ＧＩＶ−ｆｌを検出するが、ＧＩＶΔＣＴは検出しない。
【００８６】
ＩＨＣは、対象由来の試料中に存在するＧＩＶ−ｆｌタンパク質を検出又は測定するために使用され得る。ＩＨＣは、抗原と特異的結合剤、例えば、抗体又はアプタマーとの相互作用を検出することによって、試料（例えば、腫瘍試料、例えば、ＧＩＶ−ｆｌを発現するＣＲＣ細胞又は組織を含む組織の一部分又は切片）中の抗原（例えばタンパク質）の存在又は分布を決定できる。抗原（例えば、ＧＩＶ−ｆｌ）を含む試料は、抗体−抗原結合を可能にする条件下で、ＧＩＶ−ｆｌ特異的抗体（例えば、実施例１に記載されるＳＰ１７３  Ａｂ）と共にインキュベートされる。抗体−抗原結合は、抗体にコンジュゲートされた検出可能な標識によって（直接的検出）、又は一次抗体に対して惹起された二次抗体にコンジュゲートされた検出可能な標識によって（例えば、間接的検出）、検出され得る。間接的検出の他の例では、抗体−抗原結合は、二次抗体に結合することが可能な三次抗体（例えば、二次抗体に対して惹起された、又は二次抗体にコンジュゲートされた分子、例えばハプテンに対して惹起された）にコンジュゲートされた検出可能な標識によって検出される。ＩＨＣに使用され得る例示的な検出可能な標識には、放射性同位体、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート及びローダミン）、ハプテン、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）及び色素原（例えば、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）又はＦａｓｔ  Ｒｅｄ）が含まれるがこれらに限定されない。一部の例では、抗原−抗体結合の検出は、シグナル増幅（例えば、チラミドシグナル増幅又は関連の方法）もまた含む。シグナル増幅方法には、その全内容が本明細書に参照により援用される米国特許出願公開第２０１２／０１７１６６８号に記載される方法が含まれ得る。
【００８７】
一部の例では、ＧＩＶ−ｆｌ特異的結合剤は、抗体、例えば、ポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体、又はそれらの断片である。かかるＧＩＶ−ｆｌ−特異的結合剤、例えば抗体は、一部の例では、ＧＩＶ−ｆｌとＧＩＶΔＣＴとの間を識別するために使用され得る。したがって、一部の例では、ＧＩＶ−ｆｌ抗体は、高い親和性でＧＩＶΔＣＴに結合することはない（例えば、ＧＩＶΔＣＴのみが存在する場合、検出可能なシグナルを生成しない）。所望される場合、ＧＩＶ−ｆｌ抗体は、ＧＩＶ−ｆｌタンパク質／抗体複合体の検出、及び一部の場合にはその定量化を可能にするために、検出可能な標識を含み得る。他の例では、ＧＩＶ−ｆｌ抗体は、適切な標識された二次抗体を用いて検出される。さらなる例では、ＧＩＶ−ｆｌ抗体は、適切な標識された三次抗体を用いて検出される。
【００８８】
ＧＩＶ−ｆｌ発現を検出するために使用され得る抗体は、公知であり、本明細書に提供される（例えばＳＰ１７３）。当業者は、他の抗体が、現在入手可能なもの又は将来開発されるものを含め、本明細書に提供される方法において使用され得ることを理解する。例えば、特定の標的タンパク質に対する抗体を調製する方法は、当該技術分野で周知である。ＧＩＶ−ｆｌタンパク質又はその断片若しくは保存的変異体（例えば、Ｃ末端の７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、５０又は２０個のアミノ酸内の領域などの、ＧＩＶ−ｆｌのＣ末端の独自の領域）は、ＧＩＶ−ｆｌタンパク質のエピトープに対して免疫反応性である又はそれと特異的に結合する抗体を産生するために使用され得る。異なるエピトープ特異性を有するプールされたモノクローナル抗体から本質的になる抗体、ポリクローナル抗体、並びに異なるモノクローナル抗体調製物が含まれる。ポリクローナル抗体の調製は、当業者に周知である。例えば、Ｇｒｅｅｎ等、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｓｅｒａ」、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、ｐ１−５、Ｍａｎｓｏｎ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、１９９２；Ｃｏｌｉｇａｎ等、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｓｅｒａ  ｉｎ  Ｒａｂｂｉｔｓ，Ｒａｔｓ，Ｍｉｃｅ  ａｎｄ  Ｈａｍｓｔｅｒｓ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２．４．１章、１９９２を参照のこと。モノクローナル抗体の調製も同様に慣習的である（例えば、Kohler及びMilstein, Nature 256:495, 1975；Coligan等, sections 2.5.1-2.6.7；並びにHarlow等, Antibodies: a Laboratory Manual, p 726, Cold Spring Harbor Pub., 1988を参照のこと）。
【００８９】
一部の例では、試料は、対象（例えば、ＧＩＶ−ｆｌを発現することが既知又はＧＩＶ−ｆｌを発現する疑いがある腫瘍試料、例えば、ステージＩＩのｐＭＭＲ  ＣＲＣ）から取得され、ＩＨＣのために処理される。例えば、試料は、例えばホルマリン及びパラフィンで固定及び包埋され得る。次いで、試料は、ガラス顕微鏡スライドなどの支持体上にマウントされ得る。例えば、試料は、一連の薄い切片にスライスされ得（例えば、ミクロトームを使用して）、これらの切片は、顕微鏡スライド上にマウントされ得る。一部の例では、単一のスライドが、同じがん試料由来の複数の組織切片を含むか、又は同じがん試料由来の切片は、異なるスライド上に配置され得る。次いで、がん（例えば、ＣＲＣ）試料の異なる切片は、異なる抗体、例えば、抗ＧＩＶ−ｆｌ抗体及びネガティブコントロール抗体（例えば、ＣＲＣ中の内因性の抗原には特異的に結合しない抗体）で個々に標識され得る。即ち、１つの切片は、ＧＩＶ−ｆｌ抗体で標識され得、別の切片は、ネガティブコントロール抗体（例えば、試料中には内因性に存在しない標的に結合する抗体）で標識され得る。一部の例では、同じ対象由来の別々のスライドが、Ｈ＆Ｅで染色される（例えば、同じ腫瘍試料由来の隣接又は連続切片）。一部の例では、目的のさらなるタンパク質は、さらなる抗体（例えば、他の腫瘍マーカー、例えば、ＥＧＦＲ、Ｂａｘ、ＭＭＲタンパク質（例えば、ＭＬＨ１；ＰＭＳ２；ＭＳＨ２及びＭＳＨ６）、ｐＡＫＴ、ＰＴＥＮ及びＰＩ３Ｋ突然変異体に特異的な抗体）によって標識することによって、同じ又はさらなる組織試料において検出され得る。一部の例では、自動化スライド又は組織染色器（例えば、ＶＥＮＴＡＮＡ  ＢＥＮＣＨＭＡＲＫ機器、例えば、ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  ＸＴ又はＢｅｎｃｈＭａｒｋ  ＧＸ機器）が、スライドを染色及び処理するために使用され得る。
【００９０】
一部の例では、試料中のＧＩＶ−ｆｌタンパク質を検出することは、試料へのＧＩＶ−ｆｌ抗体の結合の間接的検出を含む（例えば、ＧＩＶ−ｆｌ（一次）抗体は、検出可能に標識されない）。例えば、試料は、ＧＩＶ−ｆｌ抗体が試料中のＧＩＶ−ｆｌタンパク質に結合するのに十分な条件下で、ＧＩＶ−ｆｌ抗体（例えばＳＰ１７３）と接触させられる。次いで、試料は、二次抗体がＧＩＶ−ｆｌ抗体に結合するのに十分な条件下で、ＧＩＶ−ｆｌ抗体に特異的に結合できる二次抗体（例えば、ＧＩＶ−ｆｌ抗体がウサギ抗体の場合には抗ウサギ抗体、又はＧＩＶ−ｆｌ抗体がマウス抗体の場合には抗マウス抗体）と接触させられる。二次抗体は、検出可能に標識され得る。検出可能な標識は、二次抗体にコンジュゲートされ得る。一部の例では、二次抗体にコンジュゲートされた検出可能な標識は、直接検出され得る（例えば、蛍光性標識、又は適切な基質の存在下で検出可能な反応生成物を産生し得る酵素）。他の例では、二次抗体は、１又は複数のハプテン（例えば、フルオレセイン、ジニトロフェニル、ビオチン又は３−ヒドロキシキノキサリン−２−カルボン酸（ＨＱ））にコンジュゲートされる。次いで、試料は、三次抗体がハプテンに結合するのに十分な条件下で、ハプテンがコンジュゲートされた二次抗体に特異的に結合できる三次抗体（例えば、抗ハプテン抗体、例えば、抗ＨＱ抗体）と接触させられる。一部の例では、三次抗体は、検出可能な標識、例えば、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）又はアルカリホスファターゼ（ＡＰ））にコンジュゲートされる。次いで、試料は、酵素の存在下で検出可能な反応生成物を産生する１又は複数の試薬と接触させられる。一部の例では、試料は、ＨＲＰ基質（例えば過酸化水素）及びＨＲＰの存在下で視覚的に検出可能な生成物を産生する色素原（例えばＤＡＢ）と接触させられる。一部の例では、試料中のＧＩＶ−ｆｌタンパク質を検出することは、ＶＥＮＴＡＮＡ  ＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＤＡＢ  ＩＨＣ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ、カタログ番号７６０−７００）又はＶＥＮＴＡＮＡ  ｕｌｔｒａＶｉｅｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＤＡＢ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ、カタログ番号７６０−５００）を使用して実施される。
【００９１】
特定の実施態様では、試料中のＧＩＶ−ｆｌタンパク質を検出することは、シグナル増幅を含む間接的検出を含む。一部の例では、シグナル増幅は、シグナル増幅なしでは弱い染色のみを示し得るＧＩＶ−ｆｌ陽性標本の明白な検出を可能にする。ＩＨＣのためのシグナル増幅方法は、当業者に公知である。一部の例では、シグナル増幅には、Ｔｙｒａｍｉｄｅ  Ｓｉｇｎａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＴＳＡ（商標））としても公知のＣＡｔａｌｙｚｅｄ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ（ＣＡＲＤ）が含まれる。この方法の１つのバリエーションでは、酵素がコンジュゲートされた二次抗体（例えば、ＨＲＰがコンジュゲートされた二次抗体）が、一次抗体に結合する。次に、ＨＲＰ酵素と相互作用する場合におそらくはフリーラジカルになる、ビオチン化チラミドの基質（チラミンは、４−（２−アミノエチル）フェノールである）が使用される。次いで、フェノール性ラジカルは、周辺材料と迅速に反応し、したがって、ビオチンを近くに沈着又は固定する。このプロセスは、より多くの基質（ビオチン化チラミド）を提供し、より多くの局在化したビオチンを構築することによって、反復される。最後に、「増幅された」ビオチン沈着が、蛍光性分子に結合されたストレプトアビジンを用いて検出される。あるいは、増幅されたビオチン沈着は、アビジン−ペルオキシダーゼ複合体を用いて検出され得、これが次いで、ＤＡＢと接触させられて、褐色の色を生じる。
【００９２】
他の例では、シグナル増幅は、試料をＨＲＰがコンジュゲートされた三次抗体と接触させた後に、試料に結合した一次抗体の部位又はその近傍にＨＱを沈着させるのに十分な条件下で、試料を過酸化水素及びチラミド−ＨＱコンジュゲートと接触させることを含む。次いで、試料は、ＨＱに特異的に結合する、酵素がコンジュゲートされた抗体（例えば、ＨＲＰ又はＡＰがコンジュゲートされた抗体）と接触させられる。一部の例では、この酵素がコンジュゲートされた抗体は、ＨＲＰがコンジュゲートされた三次抗体と同じである。他の例では、酵素がコンジュゲートされた抗体は、ＨＲＰがコンジュゲートされた三次抗体とは異なる抗体である。次いで、試料は、酵素の存在下で検出可能な反応生成物を産生する１又は複数の試薬と接触させられる。一部の例では、試料は、ＨＲＰ基質（例えば過酸化水素）及びＨＲＰの存在下で視覚的に検出可能な生成物を産生する色素原（例えばＤＡＢ）と接触させられる。一部の例では、シグナル増幅は、ＶＥＮＴＡＮＡ  ＯｐｔｉＶｉｅｗ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号７６０−０９９）を使用して実施される。
【００９３】
Ｂ．ＧＩＶ−ｆｌ発現をスコアリングすること
ＧＩＶ−ｆｌ発現について試料をスコアリングするために、検出可能に標識されたＧＩＶ−ｆｌを有するＣＲＣ試料（例えば、ＣＲＣ試料の切片を含有する１又は複数のスライド、例えば、１、２、３、４又は５つのスライド）が使用される。試料は、例えば上記セクションＡに記載されたように、ＧＩＶ−ｆｌに特異的な抗体（又は他のタンパク質特異的結合剤、例えばアプタマー）並びに適切に標識された二次及び／又は三次抗体で標識され得る。
【００９４】
当業者は、腫瘍性である試料の部分（例えば、腫瘍細胞）及び正常な組織又は細胞である試料の部分を、例えば、形態学的及び／又は組織学的特性に基づいて、同定できる。一部の例では、試料は、組織及び細胞の形態学を同定することを補助するために、Ｈ＆Ｅ（例えば、隣接組織切片）で染色される。
【００９５】
抗ＧＩＶ−ｆｌ標識された試料（又はそのデジタル画像）は、例えば、病理学者又はコンピューターによって視覚的に検査され得る（例えば、光学顕微鏡を用いて又は用いずに）。一部の例では、試料全体（例えば、組織切片全体）は、例えば、約２×−２０×の倍率で、例えば光学顕微鏡を使用して、視覚的に検査される。一部の例では、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＶＩＡＳ）が、染色強度又は染色の総面積をデジタルで定量化するために使用される。高解像度の画像がとられ、同じスライド上のクリアなエリアと比較した、ＧＩＶ−ｆｌと関連する色素原の光学濃度（ＯＤ）が得られ得る。標本１つ当たり３つ以上の異なるエリアが解析され得る。平均ＯＤは、その標本についてのＧＩＶ−ｆｌの発現のデジタル尺度として記録され得る。
【００９６】
開示された方法は、例えば、試料のＧＩＶ−ｆｌスコアを最初に決定することによって、ＣＲＣ試料がＧＩＶ−ｆｌ陽性か陰性かを決定するために使用され得る。一例では、ＣＲＣ試料のＧＩＶ−ｆｌスコアは、以下のように決定される。試料の陽性ＧＩＶ−ｆｌ染色の程度は、０から３のスケールでスコアリングされ、試料の総面積の０％−１０％がＧＩＶ−ｆｌについて陽性染色される場合、スコアには０が割り当てられ（即ち、％陽性ビンには０が割り当てられ得る）、試料の総面積の１１％−３５％がＧＩＶ−ｆｌについて陽性染色される場合、スコアには１が割り当てられ（即ち、％陽性ビンには１が割り当てられ得る）、試料の総面積の３６％−５０％がＧＩＶ−ｆｌについて陽性染色される場合、スコアには２が割り当てられ（即ち、％陽性ビンには２が割り当てられ得る）、試料の総面積の５１％−１００％がＧＩＶ−ｆｌについて陽性染色される場合、スコアには３が割り当てられる（即ち、％陽性ビンには３が割り当てられ得る）。さらに、０から３＋（強い）のスケールで、試料の染色のＧＩＶ−ｆｌ強度の値又はスコアが、決定又は計算される。染色強度を決定する一般的方法（例えば、半定量的ＩＨＣ方法）は、当業者に公知である。例えば、０のスコアは、バックグラウンドを上回る染色が存在しない場合に使用され、１又は１＋は、弱い強度の染色について使用され、２又は２＋は、中程度の強度の染色について使用され、３又は３＋は、強い強度の染色について使用される（例えば、上で議論したとおり）。したがって、染色のＧＩＶ−ｆｌ強度のビンには、０、１、２又は３が割り当てられ得る。一部の例では、陽性ＧＩＶ−ｆｌ染色の程度及び染色のＧＩＶ−ｆｌ強度の各々について決定された値は、コンピューター又はアルゴリズムに入力される。陽性ＧＩＶ−ｆｌ染色の程度及び染色のＧＩＶ−ｆｌ強度の値又はスコアが合計され、それによって、０から６までのＧＩＶ−ｆｌスコア値を生成する。０から６までのこの値に基づいて、ＧＩＶ−ｆｌスコア値が０−２である場合、試料はＧＩＶ−ｆｌ陰性であると決定される、又はＧＩＶ−ｆｌスコア値が３−６である場合、試料はＧＩＶ−ｆｌ陽性であると決定される。
【００９７】
別の例では、ＣＲＣ試料のＧＩＶ−ｆｌスコアは、以下のように決定される。試料は、上記の方法を使用して、試料のＧＩＶ−ｆｌ染色の総面積が、１０％よりも高いかどうかを決定するため、及び／又はＧＩＶ−ｆｌ染色強度が、任意のパーセント陽性細胞で強い（３＋）かどうかを決定するために、解析される。この情報に基づいて、試料のＧＩＶ−ｆｌ染色の総面積が、任意の染色強度で１０％よりも高い場合、若しくはＧＩＶ−ｆｌ染色強度が、任意のパーセントで強い（３＋）場合、試料にはＧＩＶ−ｆｌ陽性が割り当てられる；又はＧＩＶ−ｆｌ染色の総面積が、試料について０、１＋又は２＋の染色強度で１０％未満である場合、試料にはＧＩＶ−ｆｌ陰性が割り当てられる。
【００９８】
一部の例では、スコアリング方法は、ＧＩＶ−ｆｌ標識された腫瘍試料を、ＧＩＶ−ｆｌ特異的結合剤（例えば、抗体）で標識された１又は複数のコントロール（例えば、試験試料と同じＩＨＣ実行でアッセイされるコントロール）と比較することも含む。一部の例では、コントロールには、ポジティブコントロール、例えば、ＧＩＶ−ｆｌ陽性であることが既知の細胞（例えば、ＣＯＳ−７細胞）を含む試料が含まれる。他の例では、コントロールには、ネガティブコントロール、例えば、ＧＩＶ−ｆｌ陰性であることが既知の細胞（例えば、肝細胞）を含む試料が含まれる。一部の例では、ポジティブ及び／又はネガティブコントロール試料は、アッセイ試薬及び機器の適切な機能を確実にするための、システムレベルのコントロールである。一例では、これらのコントロールには、ポジティブコントロール及びネガティブコントロールの両方が含まれる。
【００９９】
他の例では、ネガティブコントロールには、ネガティブコントロール抗体で染色されたステージＩＩのｐＭＭＲ  ＣＲＣ試料（例えば、ステージＩＩａ又はステージＩＩｂ）が含まれる。一部の例では、ネガティブコントロール抗体は、ＣＲＣ試料中に内因性には存在しない標的抗原に特異的に結合する抗体である。一部の例では、ネガティブコントロール抗体は、免疫グロブリン、例えばモノクローナル抗体である。ネガティブコントロール抗体による染色は、対象由来の試料におけるバックグラウンド染色のレベルを評価するために使用され得る。一部の例では、ネガティブコントロール抗体で染色された試料は、ＧＩＶ−ｆｌ特異的結合剤（例えば、抗体）で染色された試料と同じ対象由来の試料（例えば、試料由来の隣接又は連続切片）である。他の例では、ネガティブコントロール抗体で染色された試料は、ＧＩＶ−ｆｌ特異的結合剤（例えば、抗体）で染色された試料とは異なる対象由来である。
【０１００】
なお別の例では、ＧＩＶ−ｆｌの発現は、ｍＲＮＡを定量化することによって測定される。新鮮な又はホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥＴ）を含むいくつかの技術が、組織からｍＲＮＡを精製するために公知である、例えば、米国特許第６２４８５３５号「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｆｒｏｍ  ｆｏｒｍａｌｉｎ−ｆｉｘｅｄ  ｐａｒａｆｆｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ」を参照のこと。ハウスキーピング遺伝子と比較した標的遺伝子のＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡの定量的検出も同様に、当該技術分野で公知である、例えば、米国特許第８５８６３１１号を参照のこと。典型的な反応は、フォワード及びリバースプライマーを含む。プライマーのうち少なくとも一方、好ましくは逆転写工程に使用されるプライマーは、残留ＤＮＡの増幅を回避するために、標的遺伝子の２つのエクソンの接合点にわたる。完全長転写物（ＧＩＶ−ｆｌ）を検出するために、少なくとも１つのプライマーは、遺伝子の最後のコーディングエクソンに特異的である。一部の実施態様では、ＧＩＶ−ｆｌ  ｍＲＮＡの相対的量は、「ハウスキーピング遺伝子」と呼ばれることがある、構成的レベルの転写を有する遺伝子のｍＲＮＡの検出された量との比較によって決定される。比較は、２つの測定値の差異又は比率を決定することによって実施され得る。ハウスキーピング遺伝子の例には、ベータ−アクチン、ＧＡＤＰＨ、トランスフェリン受容体遺伝子又はＴＭＥＭ５５Ｂ遺伝子が含まれるがこれらに限定されない。なお他の例では、腫瘍試料中のＧＩＶ−ｆｌ  ｍＲＮＡの相対的量は、コントロール、例えば、非腫瘍試料中のＧＩＶ−ｆｌ  ｍＲＮＡの相対的量と比較される。ＧＩＶ−ｆｌ  ｍＲＮＡの相対的量が、コントロール試料中のＧＩＶ−ｆｌ  ｍＲＮＡの相対的量よりも実質的に高い場合、腫瘍試料にはＧＩＶ−ｆｌ陽性が割り当てられる。
【０１０１】
Ｃ．ＬＶＩ
開示された方法は、対象のリンパ管浸潤（ＬＶＩ）状態（例えば、陽性又は陰性）を考慮に入れる。ＬＶＩを決定する方法は、顕微鏡を使用するなど、常套的である。例えば、ＣＲＣ試料は、例えば、Ｈ＆Ｅで、又はリンパ内皮に特異的な抗体、例えばＤ２−４０で、又はＣＤ３４に特異的な抗体で染色された画像の顕微鏡法を使用して、血管又はリンパ管中へのＣＲＣの浸潤が存在したかどうかを決定するために解析され得る。ＬＶＩ状態は、ステージＩＩａ又はＩＩｂのｐＭＭＲ  ＣＲＣが化学療法又は生物療法に応答する可能性が高いか低いかを決定するために、ＧＩＶ−ｆｌ状態と組み合わせて使用され得る。
【０１０２】
Ｄ．他の臨床変数
開示された方法は、対象の１又は複数の特性（又は対象についての公知の特性をコンピューター又はアルゴリズムに入力すること）を考慮に入れる。一部の例では、対象の１又は複数の特性は、例えば、視覚的又は可聴的出力で、コンピューター又はアルゴリズムによって出力される。一部の例では、対象の１又は複数の特性は、アルゴリズムに入力される。例示的特性には、診断時の対象の年齢、ＣＲＣについて陽性のリンパ節の数、対象の性別（雄性又は雌性）、腫瘍分化の情況（例えば、中程度、低い又は高い）、ＣＲＣのＴステージ（例えば、原発腫瘍のサイズ及び／又は程度を反映する、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４又はＴ３／４）、並びにどちら側に結腸がんが存在したのか（例えば、右又は左）が含まれるがこれらに限定されない。ＧＩＶ−ｆｌ状態は、対象の１又は複数の特性と組み合わせて、及び一部の例ではＬＶＩ状態とも組み合わせて、ステージＩＩのｐＭＭＲ  ＣＲＣが化学療法又は生物療法に応答する可能性が高いか低いかを決定するために使用され得る。
【０１０３】
Ｅ．試料
一部の例では、開示された方法は、試料を取得する工程、解析のために試料を調製する工程（例えば、試料を固定すること、試料をＧＩＶ−ｆｌ抗体と接触させること、又はＨ＆Ｅ染色）、又はそれら両方を含む。対象から手術切除標本などの生物学的試料を取得する方法は、当該技術分野で公知である。例えば、結腸直腸組織、リンパ節組織、結腸直腸細胞又はリンパ節細胞などの組織を取得する方法は、常套的である。例えば、細胞性材料を含有するＣＲＣ由来の試料は、腫瘍の全て又は一部の外科的切除によって、腫瘍から穿刺吸引物を収集することによって、並びに当該技術分野で公知の他の方法によって、取得され得る。一部の例では、試料は、ステージＩＩのＣＲＣ（例えば、ステージＩＩａ又はＩＩｂ）を有している、又はそれらを有する疑いがある対象から取得される。特定の例では、対象から取得された試料は、腫瘍細胞、例えば、腫瘍の少なくとも一部分を含む。一部の例では、対象由来の試料は、正常（例えば、非腫瘍）組織又は細胞も含む。一部の例では、腫瘍試料は、対象からの取り出しの際に１０％中性緩衝ホルマリン中に配置される。
【０１０４】
試料は、新鮮な、凍結された、又は固定されたものであり得る。一部の例では、試料は、固定によって収集後に処理され、一部の例では、ワックス（例えば、パラフィン）包埋される。マウントされた細胞及び組織調製物のための固定剤は、当該技術分野で周知であり、これには、ホルマリン固定剤、９５％アルコール性Ｂｏｕｉｎ固定剤；９５％アルコール固定剤；Ｂ５固定剤、Ｂｏｕｉｎ固定剤、Ｋａｒｎｏｖｓｋｙ固定剤（グルタルアルデヒド）、Ｈａｒｔｍａｎ固定剤、Ｈｏｌｌａｎｄｅ固定剤、Ｏｒｔｈ溶液（ジクロメート固定剤）及びＺｅｎｋｅｒ固定剤が含まれるがこれらに限定されない（例えば、Carson, Histotechology: A Self-Instructional Text, Chicago:ASCP Press, 1997を参照のこと）。ＧＩＶ−ｆｌ染色強度は、使用される特定の固定剤（例えば、９５％アルコール、ＡＦＡ、Ｂ５又はＰｒｅｆｅｒ）に依存して変動し得る。特定の例では、試料は、中性緩衝ホルマリン（例えば、１０％中性緩衝ホルマリン）又は亜鉛ホルマリン中で固定される。一部の例では、試料は、少なくとも約６時間（例えば、約６−４８時間、１２−２４時間又は約６、１２、１６、１８、２４、３６若しくは４８時間）、固定される。さらなる例では、試料は、収集の約６時間以内（例えば、約１５分間、３０分間、１、２、３、４、５又は６時間以内）に、固定剤中に配置される。
【０１０５】
一部の例では、試料は、固定されたワックス包埋組織試料、例えば、腫瘍細胞を含む固定されたワックス包埋組織試料であり得る。一部の例では、試料は、直接的又は間接的に（例えば、標識された二次抗体で）標識され得るＧＩＶ−ｆｌに特異的な一次抗体で標識された、一部の例では、Ｈ＆Ｅで（例えば、同じ試料由来の隣接又は連続切片を使用して）さらに染色される、腫瘍細胞を含む組織切片である。
【０１０６】
一部の例では、試料（又はその画分）は、固体支持体上に存在する。固体支持体は、生物学的試料を有し、試料中の成分（例えば、タンパク質）の簡便な検出を可能にする。例示的支持体又は基材には、顕微鏡スライド（例えば、ガラス顕微鏡スライド又はプラスチック顕微鏡スライド）、カバーガラス（例えば、ガラス製カバーガラス又はプラスチック製カバーガラス）、組織培養皿、マルチウェルプレート、メンブレン（例えば、ニトロセルロース又はフッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ））又はＢＩＡＣＯＲＥ（商標）チップが含まれる。
【０１０７】
Ｆ．治療の方法
開示された方法は、化学療法又は生物療法による治療のために対象を同定及び／又は選択することをさらに含み得る。例えば、開示された方法が、ＣＲＣが高リスクであることを示す場合、対象は、化学療法又は生物療法による治療のために選択され得るが、開示された方法が、ＣＲＣが低リスクであることを示す場合、対象は、化学療法又は生物療法を控えるように選択され得る。さらに、開示された方法は、対象から取得された試料が、高リスクである（例えば、例えば試料がＧＩＶ−ｆｌ陽性かつＬＶＩ陽性である場合、進行又は再発する可能性が高いもの）と結論付けられる場合に、１又は複数の化学療法又は生物療法を対象に投与することをさらに含み得る。対照的に、開示された実施態様は、例えば、対象から取得された腫瘍試料が、低リスクである（例えば、例えば試料がＧＩＶ−ｆｌ陰性かつＬＶＩ陰性である場合、進行又は再発する可能性が高いもの）と結論付けられる場合に、化学療法又は生物療法から利益を受ける可能性が低い対象を同定することをさらに含み得る。
【０１０８】
１．例示的ＣＲＣ化学療法及び生物学的療法
ＣＲＣ化学療法及び生物療法には、治療的有効量で投与される場合に所望の応答を誘導する治療剤が含まれる（例えば、腫瘍のサイズ若しくは容積を低減させること、又は転移のサイズ、容積若しくは数を低減させることなどによる、ＣＲＣの治療）。使用され得るＣＲＣ化学療法及び生物療法の例には、以下のうち１又は複数が含まれるがこれらに限定されない：５−フルオロウラシル（例えば、Ａｄｒｕｃｉｌ（登録商標）、Ｅｆｕｄｅｘ（登録商標）、Ｆｌｕｏｒｏｐｌｅｘ（登録商標））、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）（ベバシズマブ）、Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標）（イリノテカン塩酸塩）、カペシタビン（例えば、Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、オキサリプラチン（例えば、Ｅｌｏｘａｔｉｎ（登録商標））、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ）、ロイコボリンカルシウム、レゴラフェニブ、Ｓｔｉｖａｒｇａ（登録商標）（レゴラフェニブ）、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）（パニツムマブ）、Ｗｅｌｌｃｏｖｏｒｉｎ（登録商標）（ロイコボリンカルシウム）及びＺａｌｔｒａｐ（登録商標）（Ｚｉｖ−アフリベルセプト）。ＣＲＣのための薬物組合せ使用の例には、以下が含まれるがこれらに限定されない：ＣＡＰＯＸ（カペシタビン及びオキサリプラチン）、ＦＯＬＦＩＲＩ（５−ＦＵ、ロイコボリン及びイリノテカン）、ＦＯＬＦＩＲＩ−ベバシズマブ、ＦＯＬＦＩＲＩ−セツキシマブ、ＦＯＬＦＯＸ（５−ＦＵ、ロイコボリン及びオキサリプラチン）並びにＸＥＬＯＸ。
【０１０９】
一例では、ＣＲＣ化学療法又は生物療法は、ＣＲＣ細胞の死滅を増加させる（又はそれらの生存能力を低減させる）。かかる死滅は、ＣＲＣ細胞の１００％低減を生じる必要はない；例えば、（例えば、ＣＲＣ化学療法による治療も生物療法による治療もない場合と比較して）少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の、生存ＣＲＣ細胞の数における低減を生じるＣＲＣ化学療法が、本明細書に提供される方法において使用され得る。例えば、ＣＲＣ化学療法又は生物療法は、（例えば、化学療法も生物療法もなしの場合と比較して）少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％、ＣＲＣ細胞の増殖を低減させ得る。
【０１１０】
一例では、ＣＲＣ化学療法又は生物療法は、ＧＩＶ−ｆｌの発現又は活性を減少させる。かかる阻害は、ＧＩＶ−ｆｌの発現又は活性の１００％低減を生じる必要はない；例えば、（例えば、ＣＲＣ化学療法による治療も生物療法による治療もない場合と比較して）少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の、ＧＩＶ−ｆｌの発現又は活性における低減を生じるＣＲＣ化学療法が、本明細書に提供される方法において使用され得る。例えば、ＣＲＣ化学療法又は生物療法は、遺伝子発現（転写、プロセシング、翻訳、翻訳後修飾）に干渉し得る。
【０１１１】
一例では、ＣＲＣ生物療法は、ヒト化抗体などの抗体を含むか、又はかかる抗体からなる。かかる抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体又はキメラ抗体であり得る。上述のように、特定の標的に特異的な抗体を作製する方法は、常套的である。一部の例では、治療抗体は、毒素にコンジュゲートされる。
【０１１２】
ＣＲＣ生物療法の他の例には、阻害性核酸分子、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ又はリボザイムが含まれる。かかる分子は、ＧＩＶ−ｆｌ遺伝子発現を減少又は排除するために使用され得る。ＧＩＶ−ｆｌ核酸を特異的に標的化しその発現を調節する任意の型のアンチセンス化合物が、使用のために企図される。アンチセンス化合物は、標的核酸分子（例えば、ＧＩＶ−ｆｌ）と特異的にハイブリダイズし、その発現をモジュレートする化合物である。これらの化合物は、一本鎖、二本鎖、環状、分岐鎖又はヘアピン化合物として導入され得、構造的エレメント、例えば、内部又は末端のバルジ又はループを含有し得る。二本鎖アンチセンス化合物は、二本鎖化合物を形成するようにハイブリダイズした２本の鎖、又は全体的若しくは部分的に二本鎖の化合物のハイブリダイゼーション及び形成を可能にするのに十分な自己相補性を有する単一の鎖であり得る。一部の例では、アンチセンスＧＩＶ−ｆｌオリゴヌクレオチドは、一本鎖アンチセンス化合物であり、その結果、アンチセンスオリゴヌクレオチドがＧＩＶ−ｆｌ  ｍＲＮＡにハイブリダイズする場合、二重鎖は、ＲＮａｓｅＨによって認識され、ｍＲＮＡの切断を生じる。他の例では、ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ経路を介して遺伝子発現を調節するｍＲＮＡ分子と少なくとも部分的に相補的な、約２１−２３ヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡ分子である。さらなる例では、ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡへと切断されるタイトなヘアピンを形成するＲＮＡオリゴヌクレオチドである。ｓｉＲＮＡ分子は、一般に約２０−２５ヌクレオチド長であり、３’末端上に２ヌクレオチドのオーバーハングを有し得るか、又は平滑末端であり得る。一般に、ｓｉＲＮＡの一方の鎖は、標的核酸と少なくとも部分的に相補的である。ＧＩＶ−ｆｌ遺伝子を特異的に標的化するアンチセンス化合物は、ｍＲＮＡ配列などのＧＩＶ−ｆｌヌクレオチド配列と相補的な化合物を設計することによって調製され得る。ＧＩＶ−ｆｌアンチセンス化合物は、ＧＩＶ−ｆｌを特異的にハイブリダイズし、その発現を調節するために、ＧＩＶ−ｆｌ核酸分子と１００％相補的である必要はない。例えば、アンチセンス化合物、又は二本鎖化合物である場合にはその化合物のアンチセンス鎖は、ＧＩＶ−ｆｌ核酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％相補的であり得る。特異性についてアンチセンス化合物をスクリーニングする方法は、周知である（例えば、米国特許出願公開第２００３−０２２８６８９号を参照のこと）。さらに、阻害性核酸分子を設計、調製及び使用する方法は、当業者の能力の範囲内である。さらに、ＧＩＶ−ｆｌについての配列は、公に入手可能である。
【０１１３】
２  化学療法又は生物療法及び他の薬剤の投与
一部の例では、開示された方法は、高リスクのステージＩＩのｐＭＭＲ  ＣＲＣを有する対象に、治療的有効量の１又は複数のＣＲＣ化学療法又は生物療法を提供することを含む。方法並びにかかる薬剤及び治療の治療的投薬量は、当業者に公知であり、例えば熟練の臨床医によって決定され得る。一部の例では、開示された方法は、化学療法又は生物療法と組み合わせて（例えば、順次、実質的に同時に、又は同時に）、対象に手術及び／又は放射線療法を提供することをさらに含む。投与は、単一又は複数の用量によって達成され得る。方法並びにかかる薬剤及び治療の治療的投薬量は、当業者に公知であり、熟練の臨床医によって決定され得る。必要とされる用量は、対象の種、年齢、体重及び全身状態、使用されている特定の治療剤、並びにその投与様式に依存して、対象毎に変動する。
【０１１４】
ＣＲＣ化学療法又は生物療法を含む治療剤は、当該技術分野で公知の任意の適切な手段を使用して、治療を必要とする対象に投与され得る。投与の方法には、皮内、経皮、筋肉内、腹腔内、非経口、静脈内、皮下、膣、直腸、鼻腔内、吸入、経口又は遺伝子銃によるものが含まれるがこれらに限定されない。鼻腔内投与とは、一方又は両方の鼻孔を介した鼻及び鼻道中への組成物の送達を指し、これには、スプレー機構若しくは液滴機構による、又は治療剤のエアロゾル化を介した送達が含まれ得る。
【０１１５】
吸入剤による、ＣＲＣ化学療法又は生物療法を含む治療剤の投与は、スプレー又は液滴機構による送達を介して、鼻又は口を介してであり得る。送達は、挿管を介して、呼吸器系の任意のエリアに直接であり得る。非経口投与は、一般に、注射によって達成される。注射剤は、液体溶液若しくは懸濁物のいずれかとして、注射前に液体中の懸濁物の溶液にするのに適切な固体形態で、又はエマルジョンとして、従来の形態で調製され得る。注射溶液及び懸濁物は、滅菌の粉末、顆粒及び錠剤から調製され得る。投与は、全身性又は局所であり得る。
【０１１６】
ＣＲＣ化学療法又は生物療法を含む治療剤は、任意の適切な様式で、例えば薬学的に許容される担体と共に、投与され得る。薬学的に許容される担体は、投与されている特定の組成物、並びに組成物を投与するために使用される特定の方法によって、一部決定される。したがって、本開示の薬学的組成物の広範な種々の適切な製剤が存在する。本開示において有用な薬学的に許容される担体（ビヒクル）は、従来のものである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、第１５版（１９７５）は、１又は複数の治療剤の薬学的送達に適切な組成物及び製剤を記載している。
【０１１７】
非経口投与のための調製物には、滅菌の水溶液又は非水溶液、懸濁物及びエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、及び注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体には、生理食塩水／食塩水及び緩衝媒体を含め、水、アルコール性／水性の溶液、エマルジョン又は懸濁物が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル又は不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルには、流体及び栄養補充剤、電解質補充剤（例えば、リンゲルデキストロースに基づくもの）などが含まれる。例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤及び不活性気体などの、防腐剤及び他の添加剤もまた存在し得る。
【０１１８】
局所投与のための製剤には、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレー、液体及び粉末が含まれ得る。従来の薬学的担体、水性、粉末又は油性基剤、増粘剤などが、必要又は所望され得る。
【０１１９】
経口投与のための、ＣＲＣ化学療法又は生物療法を含む治療剤には、粉末若しくは顆粒、水若しくは非水性媒体中の懸濁物若しくは溶液、カプセル剤、サシェ剤又は錠剤が含まれる。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤又はバインダーが望まれ得る。
【０１２０】
ＣＲＣ化学療法又は生物療法を含む治療剤は、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸及びリン酸、並びに有機酸、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸及びフマル酸との反応によって、又は無機塩基、例えば水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、並びに有機塩基、例えば、モノ−、ジ−、トリアルキル及びアリールアミン並びに置換エタノールアミンとの反応によって形成される、薬学的に許容される酸付加塩又は塩基付加塩として投与され得る。
【０１２１】
ＣＲＣ化学療法及び生物療法には、抗腫瘍化学療法剤、抗生物質、アルキル化剤及び抗酸化剤、キナーゼ阻害剤並びに他の薬剤、例えば抗体が含まれ得る。使用され得るさらなる化学療法剤の特定の例には、アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルメチン、シクロホスファミド、イホスファミド及びメルファラン）、ニトロソウレア類（例えば、カルムスチン、ホテムスチン、ロムスチン及びストレプトゾシン）、白金化合物（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン及びＢＢＲ３４６４）、ブスルファン、ダカルバジン、メクロレタミン、プロカルバジン、テモゾロミド、チオテパ及びウラムスチン；葉酸（例えば、メトトレキサート、ペメトレキセド及びラルチトレキセド）、プリン（例えば、クラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリン及びチオグアニン）、ピリミジン（例えば、カペシタビン）、シタラビン、フルオロウラシル及びゲムシタビン；植物アルカロイド、例えば、ポドフィルム（例えば、エトポシド及びテニポシド）；微小管結合剤（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン（ナベルビン）ビンクリスチン、エポチロン、コルヒチン、ドラスタチン１５、ノコダゾール、エピポドフィロトキシン、リゾキシン並びにそれらの誘導体及びアナログ）、ＤＮＡインターカレーター又はクロスリンカー（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、マイトマイシン、例えば、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、クロラムブシル、シクロホスファミド並びにそれらの誘導体及びアナログ）、ＤＮＡ合成阻害剤（例えば、メトトレキサート、５−フルオロ−５’−デオキシウリジン、５−フルオロウラシル及びそれらのアナログ）；アントラサイクリンファミリーメンバー（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン及びバルルビシン）；代謝拮抗剤、例えば、細胞傷害性／抗腫瘍抗生物質、ブレオマイシン、リファンピシン、ヒドロキシウレア及びマイトマイシン；トポイソメラーゼ阻害剤、例えば、トポテカン及びイリノテカン；モノクローナル抗体、例えば、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ及びトラスツズマブ；光線感作物質、例えば、アミノレブリン酸、アミノレブリン酸メチル、ポルフィマーナトリウム及びベルテポルフィン、酵素、酵素阻害剤（例えば、カンプトテシン、エトポシド、ホルメスタン、トリコスタチン並びにそれらの誘導体及びアナログ）、キナーゼ阻害剤（例えば、イマチニブ、ゲフィチニブ及びエルロチニブ）、遺伝子制御因子（例えば、ラロキシフェン、５−アザシチジン、５−アザ−２’−デオキシシチジン、タモキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、ミフェプリストン並びにそれらの誘導体及びアナログ）；並びに他の薬剤、例えば、アリトレチノイン、アルトレタミン、アムサクリン、アナグレリド、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アキシチニブ、ベキサロテン、ベバシズマブ、ボルテゾミブ、セレコキシブ、デニロイキンジフチトクス、エストラムスチン、ヒドロキシカルバミド、ラパチニブ、パゾパニブ、ペントスタチン、マソプロコール、ミトタン、ペグアスパルガーゼ、タモキシフェン、ソラフェニブ、スニチニブ、ベムラフェニブ、バンデタニブ及びトレチノインが含まれる。方法及びかかる薬剤の治療的投薬量は、当業者に公知であり、熟練の臨床医によって決定され得る。上記分類のうち１又は複数の中に入っても入らなくてもよい他の治療剤、例えば抗腫瘍剤も記載された特異的結合剤との組合せ投与に適切である。かかる薬剤の選択及び治療的投薬量は、当業者に公知であり、熟練の臨床医によって決定され得る。
【０１２２】
一部の例では、ＧＩＶ−ｆｌ阻害性核酸（例えば、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ）の用量は、約１ｍｇから約１０００ｍｇ、約１０ｍｇから約５００ｍｇ又は約５０ｍｇから約１００ｍｇである。一部の例では、アンチセンス化合物の用量は、約１ｍｇ、約１０ｍｇ、約５０ｍｇ、約１００ｍｇ、約２５０ｍｇ、約５００ｍｇ又は約１０００ｍｇである。一部の実施態様では、阻害性核酸の用量は、約１．０ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、又は約５．０ｍｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、又は約２５から約５０ｍｇ／ｋｇである。一部の例では、阻害性核酸の用量は、約１．０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１２．５ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約４５ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ又は約１００ｍｇ／ｋｇである。これらの投薬量は、例に過ぎず、適切な用量が、常套的実験のみを使用して当業者によって決定され得ることが理解される。
【０１２３】
一部の実施態様では、抗体又は抗体コンジュゲートの用量は、約１ｍｇ／ｋｇから約２５ｍｇ／ｋｇ、例えば、約２ｍｇ／ｋｇから約１５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、又は約２ｍｇ／ｋｇから約８ｍｇ／ｋｇである。一部の例では、抗体の用量は、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ又は約２５ｍｇ／ｋｇである。他の実施態様では、抗体の用量は、約５０ｍｇ／ｍ２から約５００ｍｇ／ｍ２、例えば、約５０ｍｇ／ｍ２から約４００ｍｇ／ｍ２、約１００ｍｇ／ｍ２から約４００ｍｇ／ｍ２又は約２５０ｍｇ／ｍ２から約４００ｍｇ／ｍ２である。一部の例では、用量は、約５０ｍｇ／ｍ２、約１００ｍｇ／ｍ２、約１５０ｍｇ／ｍ２、約２００ｍｇ／ｍ２、約２５０ｍｇ／ｍ２、約３００ｍｇ／ｍ２、約４００ｍｇ／ｍ２又は約５００ｍｇ／ｍ２である。これらの投薬量は、例に過ぎず、適切な用量が、常套的実験のみを使用して当業者によって決定され得ることが理解される。
【０１２４】
Ｇ．出力
ＧＩＶ−ｆｌ発現の検出、並びにＧＩＶ−ｆｌタンパク質スコア及びＧＩＶ−ｆｌ状態、並びにＬＶＩ状態及び任意選択的に他の患者特性の決定の後に、アッセイ結果（例えば、ＧＩＶ−ｆｌ状態及びＬＶＩ状態）、知見、予後、予測及び／又は治療推奨が記録され得、例えば、技術者、医師及び／又は患者に連絡され得る。特定の実施態様では、コンピューターが、かかる情報を、関係者、例えば、患者及び／又は主治医に連絡するために使用される。ＧＩＶ−ｆｌ状態、ＬＶＩ状態、及び任意選択的に他の患者特性、ＣＲＣが高リスクか低リスクか（例えば、ＣＲＣが進行又は再発する可能性が高いかどうか、したがって、化学療法又は生物療法に応答する可能性が高いかどうか）に関する出力に基づいて、試料が取得された対象には、治療計画、例えば、化学療法若しくは生物療法による治療又はそれらによらない治療が割り当てられ得る。
【０１２５】
一実施態様では、出力（ＣＲＣが高リスクか低リスクか）に基づく予後、予測及び／又は治療推奨は、アッセイが完了し、予後が生成された後、可能な限りすぐに、関係者に連絡される。結果及び／又は関連情報は、対象を治療している医師によって、対象に連絡され得る。あるいは、これらの結果は、例えば報告書を提供することによる書面、電子的形態の連絡、例えば電子メール、又は電話を含む、連絡の任意の手段によって、関係者に直接連絡され得る。連絡は、電子メール連絡の場合など、適切にプログラムされたコンピューターの使用によって促進され得る。特定の実施態様では、試験の結果並びに／又は試験から引き出された結論及び／若しくは試験に基づく治療推奨を含有する連絡は、電気通信学の当業者に知られたコンピューターハードウェア及びソフトウェアの組合せを使用して、生成され得、関係者に自動的に送達され得る。医療指向性の連絡システムの一例は、米国特許第６２８３７６１号に記載されている；しかし、本開示は、特定の連絡システムを利用する方法に限定されない。
【０１２６】
本開示の方法の特定の実施態様では、試料のアッセイ、ＧＩＶ−ｆｌタンパク質発現のスコアリング、腫瘍の予後、及びアッセイ結果又は予後の連絡を含む方法工程の全て又は一部は、多様な（例えば、外国の）管轄権で実施され得る。
【０１２７】
Ｈ．コンピューター可読媒体
本明細書のコンピューター可読媒体のいずれかは、非一時的（例えば、メモリ、磁気記憶、光学式記憶など）であり得る。
【０１２８】
本明細書に記載される記憶作用のいずれかは、１又は複数のコンピューター可読媒体（例えば、コンピューター可読記憶媒体又は他の有形的媒体）中に記憶することによって実装され得る。
【０１２９】
記憶されたと記載された事物のいずれかは、１又は複数のコンピューター可読媒体（例えば、コンピューター可読記憶媒体又は他の有形的媒体）中に記憶され得る。
【０１３０】
本明細書に記載される方法のいずれかは、１又は複数のコンピューター可読媒体（例えば、コンピューター可読記憶媒体又は他の有形的媒体）中の（例えば、かかる媒体上にコード化された）コンピューターで実行可能な命令によって実装され得る。かかる命令は、コンピューターに方法を実施させることができる。本明細書に記載されるテクノロジーは、種々のプログラミング言語で実装され得る。
【０１３１】
本明細書に記載される方法のいずれかは、１又は複数のコンピューター可読記憶デバイス（例えば、メモリ、磁気記憶、光学式記憶など）中に記憶されたコンピューターで実行可能な命令によって実装され得る。かかる命令は、コンピューターに方法を実施させることができる。
【０１３２】
Ｉ．統計的予測モデル
これらの方法は、統計的予測モデルを利用する。ＧＩＶ−ｆｌ状態、ＬＶＩ状態、及び任意選択的に他の臨床的特性に基づいて、これらの方法は、ステージＩＩのｐＭＭＲ  ＣＲＣが化学療法又は生物療法に応答する可能性が高いかどうかについて予測する。モデルを開発するにあたり、別の変数を一定に保ちつつ、各変数を把握した。これらの統計的モデルは、Ｃｏｘ比例ハザードモデル化を利用した（Cox, Journal of the Royal Statistical Society, Series B 34 (2): 187-220, 1972）。
【０１３３】
数学的に、Ｃｏｘ比例ハザード生存モデル化は、確率密度関数（分子）及び生存関数（分母）の比である、故障率とも呼ばれるハザード関数ｈ（ｔ）の観点から、イベントまでの時間の転帰を規定する。潜在的予測因子は、以下のように、この統計的モデル中に組み込まれ得る：
0006657103.tif 000002
【０１３４】
これらのモデルでは、ｈ０（ｔ）は、ベースラインハザード（線形モデルにおける切片と類似）であり、ハザード関数は、ｐ推定された係数βにおいて線形であり、ｐ予測因子は、係数を通じて相加的であり、カテゴリカル型又は連続型のいずれかであり得る。Ｃｏｘ比例ハザードモデルは、ベースラインハザードｈ０（ｔ）についてのパラメトリックな仮定をいずれも行わず、βが推定される場合、これらは、予測因子内で経時的に比例すると仮定される。推定された係数は、一般的な統計的技術である部分尤度方法を使用して取得される。オープンソースパッケージＲ（ｗｗｗ．Ｒｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）及びＳＡＳソフトウェアバージョン９．３（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｒｅｙ、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ）を、統計的プログラミングに使用した。
【０１３５】
各予測因子についての、べき乗されフィッティングされた係数、
0006657103.tif 000003
は、予測因子におけるハザード率間の比率を記述する「ハザード比」と解釈される；カテゴリカル型予測因子について、これは、任意の時間ｔにおける別の群と比較した、１つの群において生じるイベント（再発）の確率であり、連続型予測因子について、これは、隣接区間と比較した、予測因子の一部の区間にわたって生じるイベントの確率である（再び、任意の時間ｔにおける）。１よりも小さい比率は、参照群（分母）がより高い確率の再発を有することを示し、１よりも大きい比率は、コンパレーターカテゴリーがより高い確率の再発を有することを示す。例えば、ＧＩＶ−ｆｌ陽性及びＬＶＩを用いると、ＧＩＶ−ｆｌ陰性及びＬＶＩ陰性群を参照として使用した。表１１中の結果の第３のセットは、両方の変数がフィッティングされたモデル中に含まれる場合の、ＧＩＶ−ｆｌ陽性（ＧＩＶ−ｆｌ陰性と比較して）及びＬＶＩ陽性（ＬＶＩ陰性と比較して）についての推定されたハザード比を示す（それぞれ、２．５６及び２．０７）。フィッティングされたモデルは、指数関数的尺度で線形であるので、これらの変数の両方が陽性（例えば、共に値１を取る、したがってＸ１＝１かつＸ２＝１）である場合についての２因子ハザード比は、ハザード比の−積によって推定される：
0006657103.tif 000004
【０１３６】
ＧＩＶ−ｆｌが陽性（Ｘ１＝１）であり、ＬＶＩが陰性（Ｘ２＝０）である場合、２因子ハザード比は、以下になる（ｅｘｐ（０）＝１であることに留意のこと）：
0006657103.tif 000005
【０１３７】
そしてさらに、ＧＩＶ−ｆｌ及びＬＶＩが共に陰性（Ｘ１＝０かつＸ２＝０）である場合、２因子ハザード比は、以下になる：
0006657103.tif 000006
【０１３８】
したがって、いずれも有さない患者と比較して、これらの変数単独のいずれかよりも、ＧＩＶ−ｆｌ発現及びＬＶＩの両方について陽性の患者について、より高い確率の再発が存在する；両方の変数を有する患者は、ＧＩＶ−ｆｌ陽性又はＬＶＩのいずれも有さない患者と比較して、再発する可能性が５倍高い。再発のリスクのこの比率は、ＧＩＶ陽性単独についての２．５６のリスク及びＬＶＩ単独についての２．０７よりも高い。多因子ハザード比のいずれかは、多因子モデル（例えば、「全ての」臨床変数を含むモデル）から、この様式で取得できる。ハザード比は対称ではないが、それは、これが定義上、０と∞との間の数だからである；このハザード比のｌｏｇに関してこれらの推定を試験することはよくあることだが、それは、比率が次いで、∞から∞へと至る対称的な数だからである。後者の場合、陰性ｌｏｇハザード比は、特定の群と比較して、参照群が再発する可能性がより高い場合を記述し、陽性ｌｏｇハザード比は、参照群が再発する可能性がより低い場合を記述する。
【０１３９】
分類のために、化学療法未治療の患者集団を使用して係数を推定し、線形予測因子（Ｌｐ）は、高リスク及び低リスクについてのカットポイントとして、最大感受性／感度及び特異性を本発明者らに与えるものである。具体的には、線形予測因子は、任意のｐ因子モデル（ここで、ｐは、予測因子の数である）について、各化学療法未治療患者について取得され、
0006657103.tif 000007
である。Ｌｐについてのカットポイントは、感受性／感度及び特異性の両方が最大化される場合に取得される：ｍａｘ（感受性／感度、特異性）＝ｍａｘ（感受性／感度  特異性）。この最適なカットポイントが計算されると、これは、カットポイントを化学療法治療された個体に単に適用することによって、独立した集団におけるＸの新たな値に適用され得る。高リスク個体は、Ｌｐ＞カットポイントを有する個体であり、低リスク個体は、Ｌｐ＜カットポイントを有する個体である。統計的予測を検証するために、これらの高リスク及び低リスクのカテゴリーを、化学療法治療された集団中の各個体についての実際の再発と比較する。最終Ｌｐは、個々の患者リスクを決定するために使用され得、高リスク患者は、化学療法又は生物療法の治療から利益を得る可能性が高い。
【０１４０】
図１中のデータフロー図は、統計的モデル化において使用される工程を記載している。
0006657103.tif 000008
及びＬｐ値は、臨床医に提供され得る入力である。次いで、臨床医は、これらの変数を使用し、予測因子の各個体の値Ｘｐの値に基づいて、個体のリスクを決定できる。図中に示されるプロセスは、各評価に必要なわけではない；これは、入力を取得するために使用されるプロセスの説明である。
【０１４１】
最後の工程は、化学療法又は生物療法を受けた患者の集団への、統計的モデル化の適用である。この工程は、高リスクとして分類された患者について、そのうち８０％が化学療法又は生物療法に実際に応答したことを実証している（陽性予測値＝高リスクの分類を考慮して再発を有さない確率）。
【０１４２】
本開示は、以下の非限定的な実施例によって例示される。
【実施例】
【０１４３】
実施例１
ＧＩＶ抗体の生成及び染色条件の最適化
この実施例は、完全長ＧＩＶタンパク質に特異的なウサギモノクローナル抗体を生成するために使用した方法を記載する。
【０１４４】
ＧＩＶに特異的なウサギモノクローナル抗体は、ヒトＧＩＶの最後の１１個のＣ末端アミノ酸（ＳＫＳＲＳＲＥＱＱＳＳ、配列番号２のアミノ酸１８６１−１８７１）を使用して生成した。この抗ＧＩＶウサギモノクローナル抗体は、クローン番号ＳＰ１７３（ＶＭＳＩカタログ番号Ｍ４７３４）である。
【０１４５】
実施例２
ＩＨＣ染色条件の最適化
この実施例は、免疫組織化学（ＩＨＣ）による、完全長ＧＩＶタンパク質を標的化する４つのＧＩＶ抗体（３つの市販のポリクローナル抗体及び実施例１に記載されるウサギモノクローナル抗体）の評価を記載する。各ＩＨＣアッセイを、ネガティブコントロールとして機能した肝臓症例（正常、脂肪肝及び肝硬変）に対して開発した。
【０１４６】
実施例１で生成したＧＩＶ抗体（ＳＰ１７３）を、完全長ＧＩＶタンパク質を検出するそれらの能力について、ヒトＧＩＶのＣ末端部分に対して惹起された３つの他の抗体と比較した。試験した３つの市販の抗体は、以下であった：（１）ヒトギルジンの７８個のＣ末端アミノ酸（１７３８−１８１５）に対して惹起されたアフィニティ精製されたウサギポリクローナル抗体である、Ｓｉｇｍａ  Ｐｒｅｓｔｉｇｅの抗ＧＩＶ（カタログ番号ＨＰＡ０３８１０１）；（２）ヒト起源のギルジンのＣ末端におけるペプチドマッピングに対して惹起されたアフィニティ精製されたウサギポリクローナル抗体である、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．の抗ＧＩＶ（Ｔ−１３）（カタログ番号ｓｃ−１３３３７１）；及び（３）ヒトギルジンの１９個のＣ末端アミノ酸に対して開発されたアフィニティ精製されたウサギポリクローナル抗体である、Ｉｍｍｕｎｏ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｃｏ．の抗ＧＩＶ（ＩＢＬ、カタログ番号１８９７９）。
【０１４７】
ＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＤＡＢ  ＩＨＣ検出キット（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．［ＶＭＳＩ］、カタログ番号７６０−７００）を、完全長ＧＩＶタンパク質（ＧＩＶ−ｆｌ）のクロモジェニック検出に使用した。対比染色を、ＤＡＢシグナルを増強するために、スライドをヘマトキシリンＩＩ及びＢｌｕｉｎｇ試薬と共にインキュベートすることによって達成した。以下のパラメーター：抗体滴定；一次抗体インキュベーション時間及び温度；抗原回復条件及び抗体希釈剤を試験した。
【０１４８】
滴定系列を実施して、一次抗体濃度を最適化した。各一次抗体を、ＶＭＳＩ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔ（カタログ番号９５１１９）を使用して、種々の濃度（Ｓｉｇｍａ  Ｐｒｅｓｔｉｇｅの抗体について０．６から６０μｇ／ｍｌ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚの抗体について０．１から５μｇ／ｍｌ；ＩＢＬの抗体について０．４から１６μｇ／ｍｌ；及び実施例１で生成したＧＩＶ抗体ＳＰ１７３について０．１から１００μｇ／ｍｌ）に希釈し、肝臓及び結腸直腸がん組織上に、８５μｌの容積で適用した。Ｓｉｇｍａ  ＰｒｅｓｔｉｇｅのＧＩＶ抗体は、試験した全ての濃度で陰性染色を示した。結果として、この抗体はさらなる解析から排除した。
【０１４９】
Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚの抗体（０．６７μｇ／ｍｌ）、ＩＢＬの抗体（８μｇ／ｍｌ）及びＳＰ１７３（１０μｇ／ｍｌ）についての初期力価を選択した後に、抗原回復条件を最適化し、一次抗体希釈剤をスクリーニングした。以下の希釈剤を試験した：ＶＭＳＩ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔカタログ番号９５１１９；９５０２８；９００３９；９００４０；及び９０１０３。正常及び脂肪肝の症例を、ＧＩＶ  ＩＨＣ最適化のための特異性評価として機能するように使用した。
【０１５０】
Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚの抗体についての最適な希釈剤は、９５１１９であり、ＩＢＬ（８μｇ／ｍｌ）については９００３９であり、ＧＩＶ抗体ＳＰ１７３については９００４０であった。最適な事前処理条件は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ及びＩＢＬの抗体についてはＣＣ１細胞馴化試薬（より穏やかなＴｒｉｓベースの細胞馴化バッファー）中で９５℃で６４分間のインキュベーション、並びにＧＩＶ抗体ＳＰ１７３についてはＣＣ１細胞馴化試薬中で９５℃で４８分間のインキュベーションであった。一次抗体中でのインキュベーションに最適な時間量は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ及びＩＢＬの抗体については３７℃で１６分間であり、ＧＩＶ抗体ＳＰ１７３については３７℃で１２分間であった。
【０１５１】
実施例３
ＧＩＶ抗体による正常肝臓試料の染色
コントロール肝臓標本に対する、各ＧＩＶ抗体についての、実施例２に記載された同定された最適なアッセイ条件、即ち、９５１１９中０．６７μｇ／ｍｌのＳａｎｔａ  ＣｒｕｚのＧＩＶ抗体、希釈剤９００３９中８μｇ／ｍｌのＧＩＶ（ＩＢＬ）抗体、及び希釈剤９００４０中１０μｇ／ｍｌのＧＩＶ  Ａｂ  ＳＰ１７３を使用して、ＩＨＣを使用して肝臓試料を染色した。
【０１５２】
肝臓において以前に決定されたＧＩＶ  ｍＲＮＡレベルに基づくと、肝細胞は陰性のままであったが、全ての炎症細胞（Ｋｕｐｐｆｅｒマクロファージ、星状細胞）は、類洞空間において陽性染色を示した。ＧＩＶ免疫染色は、病理学者が評価した。２つのＧＩＶ抗体クローン（ＩＢＬ及び実施例１のＳＰ１７３抗体）は、これらの基準を満たした。両方の抗体が、非常に類似したシグナル強度で、正常及び脂肪肝試料上の類洞及び星状細胞を検出した。肝細胞（ネガティブコントロール）及び任意の硬変肝臓試料上で染色を生じた抗体は存在しなかった。ＩＢＬ抗体は、一部の血管を染色し、他の点では、染色は陰性であった。したがって、ＩＢＬ抗体及び実施例１のＳＰ１７３抗体によるＩＨＣは、非肝細胞において、主に細胞質の染色を伴って、陽性類洞を示し、肝細胞では完全に陰性であった。一部の正常細胞（胆管）は、核染色を有した。対照的に、Ｓａｎｔａ  ＣｒｕｚのＧＩＶ抗体は、非肝細胞において陰性染色を生じ、肝細胞において限局的な赤みを生じ、したがって、この抗体は、さらなる解析から排除した。
【０１５３】
実施例４
ＧＩＶ抗体による、肝臓及び結腸直腸がん試料の染色
正常、脂肪肝及び肝硬変患者由来の３６の肝臓症例のセット（肝臓コホート）を、最適化された染色手順（実施例２）で染色して、最適化されたＧＩＶ  ＩＨＣのための特異性評価として機能するようにした。試料を、実施例１の最適化されたＧＩＶ  ＳＰ１７３抗体のＩＨＣアッセイ（表１）及びＧＩＶ−ＩＢＬ抗体のＩＨＣアッセイ（表２）によって染色した。
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【０１５４】
ＧＩＶ−ＩＢＬ及びＧＩＶ  Ａｂ  ＳＰ１７３抗体の両方が、中程度から重症の線維症を有する全ての肝臓試料においてＧＩＶタンパク質を検出したが、ＧＩＶは、正常肝臓では検出不能なままであった。Ｃ型肝炎患者の間で、これら２つの抗体による染色は、炎症スコアとも、肝脂肪症とも、大した相関は示さなかったが、それらの線維症重症度スコアとは、以前に観察された相関を示した。
【０１５５】
ＧＩＶ  ＩＨＣの予後判定能力を試験するために、１０人の患者のＣＲＣコホート（表３）を、同じ最適化された染色手順で染色し、病理学者がスコアリングした。
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【０１５６】
ＩＢＬ抗体及びＳＰ１７３抗体は、肝臓症例上で同じ特異性を有したが、これらの抗体の感受性／感度及び特異性は、結腸直腸組織上で異なっていた。ＧＩＶ抗体ＳＰ１７３は、ＩＢＬ抗体よりも感受性が高く、より強い染色を生じたが、正常結腸上でいくらかの非特異的染色もまた有した（おそらくはクロモジェニック沈着）（図２Ａ）。しかし、この非特異的染色は、腫瘍染色に対して影響を有さなかった；腫瘍エリアの染色は、非常に特異的なままであった（図２Ｂ）。ＧＩＶ抗体ＳＰ１７３を用いたＧＩＶ  ＩＨＣは、５人のＧＩＶ陽性患者を同定し、そのうち２人は再発を有した。ＩＢＬ抗体を用いたＧＩＶ  ＩＨＣは、間質細胞において強い陽性染色を生じたが、腫瘍細胞の細胞質では、弱い、大部分が陰性の染色を生じた（図２Ｂ）。再発を有する全ての結腸直腸がん症例を検出することができたので、これらの結果は、ＧＩＶ抗体ＳＰ１７３  ｌがより感受性が高いことを実証している。したがって、この抗体を、さらなる解析のために選択した。
【０１５７】
実施例５
ＧＩＶ抗体によるがん試料及びマウスＧＩＶ−ＫＯ組織の染色
この実施例は、ＧＩＶ  ＩＨＣ染色をさらに最適化するために使用した方法を記載する。
【０１５８】
ウサギモノクローナル抗ＧＩＶ抗体ＳＰ１７３を使用するＧＩＶ  ＩＨＣアッセイを使用した（実施例２を参照のこと）。ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  ＸＴ自動化染色器（ＶＭＳＩ）のための公称染色条件は、表４に列挙される。使用した一次抗体濃度は、希釈剤９００４０中に１０μｇ／ｍｌであった。対比染色を、ＤＡＢシグナルを増強するために、スライドをヘマトキシリンＩＩ及びＢｌｕｉｎｇ試薬と共にインキュベートすることによって達成した。肝臓組織において確立された条件と共に、最適化された一次抗体製剤を使用して、非肝細胞（類洞、星状細胞）は陽性染色されたが、肝細胞は陰性のままであった。
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【０１５９】
注釈付きのがん細胞株（ＧＩＶ−ｆｌタンパク質の発現は、ＲＴ−ＰＣＲによって以前に決定された）を使用して、ＧＩＶ  ＩＨＣアッセイの特異性及び感受性／感度を試験した：
−  ＤＬＤ１結腸浸潤性：検出可能なＧＩＶ−ｆｌ  ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質、
−  ＨＴ２９結腸低浸潤性：検出不能なＧＩＶ−ｆｌ  ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質、
−  Ｌｓ１７４Ｔ結腸低浸潤性：検出不能なＧＩＶ−ｆｌ  ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質、
−  ＭＤＡ  ＭＢ２３１乳房浸潤性：検出可能なＧＩＶ−ｆｌ  ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質、
−  ＭＣＦ７乳房非浸潤性：検出不能なＧＩＶ−ｆｌ  ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質。
【０１６０】
公開されたデータによれば、高度に浸潤性の細胞株は、それらの非浸潤性対応物よりも、２０−５０倍多いＧＩＶ完全長タンパク質レベルを有する。非浸潤性細胞は、Ｃ末端トランケートされたＧＩＶタンパク質（完全長ｍＲＮＡを選択的スプライシングすることによって創出される）を主に含有し、したがって、これらの細胞株は、Ｃ末端終端に対して惹起されたＧＩＶ（ｆｌ）抗体（ＳＰ１７３、実施例１を参照のこと）とは、大した反応性を示さないはずである。上記ＧＩＶ  ＩＨＣアッセイを、これらの細胞株に適用した。染色されたスライドは、病理学者が評価した。
【０１６１】
公開されたデータと一致して、ＧＩＶ  ＩＨＣアッセイは、浸潤性乳房ＭＤＡ  ＭＢ２３１及び結腸ＤＬＤ１細胞株において陽性染色を生じたが、非浸潤性又は低浸潤性の細胞株は、完全長ＧＩＶタンパク質については主に陰性であった（図２Ｃ）。定常情況、飢餓情況又はＥＧＦ刺激した細胞のＧＩＶ−ｆｌ発現において、ＩＨＣによって差異は観察されなかった。
【０１６２】
ＧＩＶ  ＩＨＣアッセイを、解剖されたＧＩＶ  ＫＯマウス臓器に対して評価した。ヘテロ接合性及びホモ接合性試料は、野生型と比較して低減されたＧＩＶ染色を示したが、ＧＩＶタンパク質の完全な枯渇は、ＩＨＣによっては検出されなかった。ギルジンについてのホモ接合性（−／−）又はヘテロ接合性（−／＋）を一致させるために、一次抗体濃度を、１０から５、２．５及び１μｇ／ｍｌに減少させた。ＫＯマウス臓器は、１ｕｇ／ｍｌのＧＩＶ−Ａｂ濃度でさえも、陽性染色を示した。
【０１６３】
ＧＩＶの完全な枯渇は、突然変異体マウスにおいて生じる可能性は低いので、注釈付きのコントロール細胞株及び正常肝臓試料を使用して、ＧＩＶ抗体濃度を仕上げた。ＧＩＶ  ＩＨＣアッセイを、５、２．５及び１μｇ／ｍｌの一次抗体を使用したこと以外、最適な条件で反復した。乳房がん細胞株は、１μｇ／ｍｌの一次抗体においても陽性のままであったが、有意に低減されたシグナル又はシグナルの完全な喪失のいずれかが、５μｇ／ｍｌの抗体で、正常肝臓及び浸潤性結腸細胞株において観察された（図３Ａ−３Ｃ）。
【０１６４】
より低い抗体濃度によるＧＩＶ染色も１０人の患者のＣＲＣコホートで試験した（表３）（より良い及びより悪い転帰）。５μｇ／ｍｌのＧＩＶ力価は、結腸症例においてＧＩＶ状態を変化させず（図４Ａ−４Ｂ）、むしろ不要なバックグラウンド染色を減少させたので、最終ＧＩＶ抗体濃度は、７．５μｇ／ｍｌに設定した。
【０１６５】
実施例６（予言的）
ｑＲＴ−ＰＣＲによってＧＩＶ−ｆｌ遺伝子発現のレベルを評価する
ＣＲＣ患者試料をこの実験で使用する。ＲＮＡを、例えば、それぞれ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｔ  Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｅ  Ｆ  Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＪ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．１９８２又は米国特許第６２４８５３５号に記載されるプロトコールを使用して、新鮮若しくは凍結した組織又はＦＦＰＥＴから単離する。
【０１６６】
この実施例では、ＧＩＶ−ｆｌ標的の増幅は、ＧＩＶ−ｆｌ  ｍＲＮＡに特異的なフォワードプライマー、リバースプライマー及び検出プローブを利用する。プライマーの１つは、ＧＩＶ遺伝子の最後のコーディングエクソンに特異的である。並行反応は、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＤＰＨに特異的なフォワードプライマー、リバースプライマー及び検出プローブを利用する。例示的反応混合物は、０．０７５−０．２μＭの各フォワードプライマー、リバースプライマー及び検出プローブ、ヌクレオシド三リン酸、３ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのトリシンｐＨ８．０、５５ｍＭの酢酸カリウム、１６０−２００μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰ、１６０μＭのｄＴＴＰ（又は任意選択的に３２０μＭのｄＵＴＰ及び０．２Ｕ／μＬのウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ）、逆転写酵素活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１．２５％−２％のＤＭＳＯ、２．５ｍＭの酢酸マグネシウム及び標的ＤＮＡ（鋳型）を含む。増幅及び解析を、Ｒｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０機器（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．）を使用して実施する。例示的温度プロファイルは以下である：５０℃で５分間；９５℃（１０秒間）から５５−６５℃（３０秒間）を２サイクル、その後、９３℃（１０秒間）から５５−６５℃（３０秒間）を４０−６０回サイクリング、３７℃への冷却（１０秒間）１サイクル、及び２５℃への冷却（１０秒間）１サイクル。蛍光データを、各５５−６５℃工程の開始時に収集し、Ｃｔ値を、各試料中の標的ＧＩＶ−ｆｌ  ｍＲＮＡ及びコントロールＧＡＤＰＨ  ｍＲＮＡを増幅する反応について決定した。ＧＩＶ−ｆｌ遺伝子の相対的発現を、標的遺伝子とコントロール遺伝子との間のＣｔ値の差異として測定する。
【０１６７】
実施例７
結腸直腸がん（ＣＲＣ）におけるアッセイ検証
この実施例は、既知の臨床的転帰を有するステージＩＩのＣＲＣ試料の大きいコホートにおいて、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって、ＧＩＶ発現を解析的に検証するために使用した方法を記載する。
【０１６８】
１セットの１９２のステージＩＩの結腸直腸がん症例を使用して、予測バイオマーカーとしてＧＩＶ発現を検証して、ＭＭＲ良好（ｐＭＭＲ）ステージＩＩのＣＲＣについて腫瘍の再発／予後をさらに予測した。試料を、最適化されたＧＩＶ免疫組織化学アッセイ（表１）で染色した。陰性染色のために、ウサギモノクローナルネガティブコントロールＩｇを、一次抗体として使用した（ＶＭＳＩカタログ番号７９０−４７９５；表５）。
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【０１６９】
染色したスライドを、支配的なシグナル強度及び陽性腫瘍細胞染色の百分率についてスコアリングした（表６）。
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【０１７０】
表６に示すように、ＧＩＶ  ＩＨＣは、全ての結腸直腸がん症例において評価可能であった。間質組織は、一貫して強く陽性染色されたが、腫瘍上皮は、変動する染色強度及び陽性腫瘍細胞の百分率で、変動する染色パターン（細胞質及び／又は核染色）を示した。図５Ａ−５Ｄは、ヒト結腸直腸がんにおけるＧＩＶのＩＨＣ染色の例を示す。
【０１７１】
実施例８
ＧＩＶ−ｆｌスコアリングアルゴリズムの開発
この実施例は、１９２のＣＲＣ試料について実施例６に記載されたデータに基づいて、ＧＩＶ  ＩＨＣ染色のためのスコアリングアルゴリズムを開発するために使用した方法を記載する。
【０１７２】
ＧＩＶ  ＩＨＣデータを使用して、スコアリングアルゴリズムを開発した。染色の強度及び陽性染色の程度を別々に又は組み合わせて取り込んだ、１１のスコアリング測定基準を評価した（表７）。これらのうち７つは、４つのカテゴリーへのパーセント染色のビニングを必要とし、次いで、これらに、合計した又は染色強度を乗算したかのいずれかであるランク数（０−３）を割り当てた。次に、陽性及び陰性ＧＩＶは、これらの合計積からのカットポイントに基づいた。残り４つの測定基準を、染色強度のみ又はパーセント染色のみのいずれかに基づいて開発し、次いで、これらの測定基準の各々について２つの異なる型のカットポイントを使用して、陽性及び陰性ＧＩＶを定義した。
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【０１７３】
統計的文脈では、関連性は、マーカー陽性及びマーカー陰性の患者についての転帰における差異によって実証される。これを、ＧＩＶ−ｆｌ陽性患者とＧＩＶ−ｆｌ陰性患者との間の生存曲線の分離を試験することによって確立した。これは、統計的予測とは異なる；一般に、関連性は、必要ではあるが十分ではない、予測値についての指標である（Pepe等, Am J Epidemiol 159:882-90, 2004）。
【０１７４】
スコアリング測定基準の全てが、ＧＩＶ発現と進行との間の強い相関を示したが、ＧＩＶ−ｆｌの程度及び強度スコア（表７中で太字かつ下線）のみが、ｐＭＭＲの化学療法未治療の患者において腫瘍増殖停止時間転帰を伴って、統計的に有意な関連性（ｐ値＝０．０２１２）を実証した（図６）。図６は、ＧＩＶ−ｆｌの程度及び強度スコアのスコアリング系を使用して、ステージＩＩのＣＲＣ試料のｐＭＭＲ集団中のＧＩＶ−ｆｌ状態を階層化することによって達成される分離を示す。上から下への線は、悪化する予後、即ち、経時的に生存の尤度が低いことを示す。上の線は、ｄＭＭＲ試料を示し、下の線は、ｐＭＭＲかつＧＩＶ陽性の試料を示す。ｐＭＭＲ集団についての生存曲線は、比較目的のために示される。このログランク検定についてのｐ値は、０．０２１２であり、ＧＩＶ−ｆｌ陽性群と陰性群との間の生存経験における統計的分離を実証している。これは、ＧＩＶ−ｆｌが予測値を提供できることを確立している。
【０１７５】
したがって、一部の例では、ＧＩＶ−ｆｌ染色は、０から３のスケールで、試料の陽性ＧＩＶ−ｆｌ染色の程度を最初に決定することによって、ｐＭＭＲであるステージＩＩ（例えばステージＩＩａ）の結腸がん試料において評価され、試料の総面積の０％−１０％が陽性染色される場合、陽性染色の程度には０が割り当てられ、試料の総面積の１１％−３５％が陽性染色される場合、陽性染色の程度には１が割り当てられ、試料の総面積の３６％−５０％が陽性染色される場合、陽性染色の程度には２が割り当てられ、試料の総面積の５１％−１００％が陽性染色される場合、陽性染色の程度には３が割り当てられる。次いで、得られた値（０、１、２又は３）を、試料の染色のＧＩＶ−ｆｌ強度（０（陰性）、１（弱い）、２（中程度）から３（強い）のスケールでの強度スコア）に加算して、ＧＩＶ−ｆｌの程度及び強度スコア値を提供する。したがって、患者が、２の染色のＧＩＶ−ｆｌ強度で、８％の陽性ＧＩＶ−ｆｌ染色の程度を有する場合、患者は、パーセント陽性について０を受け、ＧＩＶ−ｆｌの程度及び強度スコア値は、０＋２＝２である。ＧＩＶ−ｆｌの程度及び強度スコア値が０−２である場合、この試料には、ＧＩＶ−ｆｌ染色について陰性が割り当てられ、３−６のＧＩＶ−ｆｌの程度及び強度スコア値には、ＧＩＶ−ｆｌ染色について陽性が割り当てられる。したがって、各患者又は試料は、全体的なパーセント染色及び全体的な強度について、ビニングされたスコアに基づいて陽性又は陰性のいずれかである。
【０１７６】
表７中のＧＩＶ−ｆｌの程度及び強度スコアのスコアリングアルゴリズムの代わりに使用できる、より単純なスコアリング測定基準を開発した。この方法は、ＧＩＶ−ｆｌ  Ａｂを使用して試料を染色することにも依存する。ＧＩＶ−ｆｌ予測スコアと呼ばれる、このより単純なＧＩＶ−ｆｌスコアリング測定基準では、症例又は試料は、（１）その全体的なパーセント染色が任意の染色強度で１０％よりも高い場合、又は（２）支配的な染色強度が任意のパーセントで３＋である場合、ＧＩＶ陽性とみなされる。したがって、一部の例では、ＧＩＶ−ｆｌ染色は、試料におけるＧＩＶ−ｆｌ染色の全体的なパーセントが、（任意の染色強度で）１０％よりも高い場合、又は試料におけるＧＩＶ−ｆｌ染色の支配的な強度が（染色の程度に関わりなく）３＋である場合に、試料をＧＩＶ−ｆｌ陽性とスコアリングすることによって、ｐＭＭＲステージＩＩ（例えば、ステージＩＩａ）の結腸がん試料において評価される。対照的に、ｐＭＭＲステージＩＩの結腸がん試料が、１０％未満の全体的なＧＩＶ−ｆｌ染色を有し、３＋未満の支配的なＧＩＶ−ｆｌ染色強度を有する場合、これには、ＧＩＶ−ｆｌ陰性が割り当てられる。
【０１７７】
図７Ａ−７Ｂに示すように、両方のスコアリング測定基準（ＧＩＶ−ｆｌの程度及び強度スコア並びにＧＩＶ−ｆｌ予測スコア）が、それぞれ２．０３及び１．７５のハザード比（ＨＲ）で、生存による識別を提供した。
【０１７８】
新たなＩＨＣアッセイは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織中の完全長ＧＩＶタンパク質（ＧＩＶ−ｆｌ）を検出できる。１９２の結腸直腸症例を、ＭＭＲに対するＩＨＣによって最初に評価し、次いでＧＩＶタンパク質に対するＩＨＣによって評価した。１９２の試料のうち、１０２の症例が、ｐＭＭＲの化学療法未治療の患者であり、３２／１０２の患者のみが、疾患再発を示した（進行＝イエス）。最適化されたスコアリングアルゴリズムに基づいて、１６／３２（５０％；ＧＩＶ−ｆｌの程度及び強度スコア）又は１８／３２（５６％；ＧＩＶ−ｆｌ予測スコア）の、再発を有する患者が、ＧＩＶ陽性腫瘍を有した（表８）。したがって、ステージＩＩのＣＲＣ（例えば、ステージＩＩａ）がｐＭＭＲかつＧＩＶ−ｆｌ陽性である場合、これは、例えば、１２から９６か月以内、例えば、１２か月以内、２４か月以内、３６か月以内、４８か月以内、６０か月以内、７２か月以内、８４か月以内、又は９６か月以内に、患者が進行又は再発を経験する可能性がより高いことを示している。再発は、局所再発（同じエリアにおいて再度がんになる）、又は局所リンパ節（ステージＩＩＩ）若しくは遠位リンパ節（ステージＩＶ、転移性）若しくは他の部位（例えば、肝臓又は肺）のいずれかへのがんの進行であり得る。
0006657103.tif 000021
【０１７９】
このデータは、ＩＨＣによるＧＩＶの検出が、アジュバント化学療法で以前に治療されていないｐＭＭＲのステージＩＩ（例えば、ステージＩＩａ）の結腸直腸がんを有する患者において、再発についての個体のリスクを定義することにおいて、予後バイオマーカーとして使用できることを実証している。
【０１８０】
実施例９
ステージＩＩのＣＲＣにおけるＧＩＶ−ｆｌ発現及び腫瘍増殖停止時間の統計的予測モデル
この実施例は、ステージＩＩのＣＲＣ患者についての予後／予測インジケーターとして、ｐＭＭＲ及びＧＩＶ発現と組み合わせた他のマーカーを評価するために使用した方法を記載する。
【０１８１】
統計的モデルを、実施例７に記載されたコホートからの化学療法未治療の患者のサブセットから開発した。ＧＩＶ−ｆｌ予測スコアを、統計的予測モデル化のために繰り越した。次いで、この統計的モデルを、化学療法を受けている患者のサブセットに、フィッティングされた統計的予測モデルを適用することによって評価した。統計的予測モデルの開発は、４つの工程で始めた：１）バイオマーカーと転帰（無増悪生存、ＰＦＳ）との間の関連性を評価すること；２）モデル選択；３）統計的予測能力の評価；及び４）個体レベルでの予測能力を実証すること。最後に、個々の患者リスクを通知するため；並びにバイオマーカーＧＩＶ−ｆｌを含む統計的予測モデルが治療応答を予測する能力を実証するためのモデルの妥当性を、決定した。
【０１８２】
実施例７に記載されるコホートは、１０３人のｐＭＭＲの化学療法未治療の患者を含み、評価可能な患者の３１％（３２／１０３）が、疾患再発を経験した。表９は、１０３人のｐＭＭＲの化学療法未治療の患者を記述する臨床的及び病理学的変数の分布を記載している。このコホートを、転帰の適切な特徴づけを確実にするために、再発についてオーバーサンプリングした。スコアリングアルゴリズムの目的のために、１０３人全ての患者を使用した。統計的予測モデルの開発のために、この集団をステージＩＩａ患者に限定したが、それは、この下位群の患者が、高リスク及び低リスクの分類、並びにアジュバント化学療法についての決定の明確化をさらに必要とするからである。
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【０１８３】
スコアリングアルゴリズム
染色強度及びパーセント染色を取り込んだ１１のスコアリングアルゴリズムを評価した。これは、実施例７においては１９２全てのステージＩＩのＣＲＣ試料を分析したが、ここでは、腫瘍病理学的ステージ３又は４（例えば、Ｔ３／４）のいずれかであった１０３人の化学療法未治療の患者のサブセットだけを分析したことを除いて、実施例７で実施したものと類似である。これらの測定基準の一部は、パーセント染色及び強度をビニングし、次いで、これらの尺度の両方を含むスコア（乗法的又は相加的のいずれか）を取得することによって、創出した。他の測定基準は、最大ランクの試験統計量と関連するパーセント染色を見出し、高い及び低いパーセント染色が生存曲線間での最大の差異を示した点を測定することによって、パーセント染色を最適化した方法を使用した（Larson及びSchumacher, Biometrics,48, 73-85, 1992）。
【０１８４】
表１０は、評価した最も堅固な測定基準、及び無増悪生存による分離におけるそれらの性能をまとめる。「最適な」パーセントの染色（＞１０％）を取り込んだ単純な測定基準（ＧＩＶ−ｆｌ予測スコア）は、高い強度（３＋）のＧＩＶ−ｆｌ予測スコアもまた含み（実施例７を参照のこと）、これは、統計的予測モデル化のために繰り越されたスコアリングアルゴリズムである。４４パーセント（４５／１０３）のステージＩＩ患者（Ｔ３＋Ｔ４）は、ＧＩＶ−ｆｌ陽性であった；４７パーセント（４２／９０）のステージＩＩ患者は、ＧＩＶ−ｆｌ陽性であった。ステージＩＩ集団単独に適用した場合のＧＩＶ−ｆｌ予測スコアについてのハザード比は、２．５６（ＣＩ：１．１５、５．８７）であった。
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【０１８５】
マーカーと進行との間の統計的関連性を確立する
統計的文脈では、関連性は、マーカー陽性及びマーカー陰性の患者についての転帰における差異によって実証される。これを、ＧＩＶ−ｆｌ陽性患者とＧＩＶ−ｆｌ陰性患者との間の生存曲線の分離を試験することによって、本明細書で確立した。これは、統計的予測とは異なる；一般に、関連性は、必要ではあるが十分ではない、予測値についての指標である（Pepe, Am J Epidemiol 159:882-90, 2004）。
【０１８６】
図８は、ＧＩＶ−ｆｌ予測スコアアルゴリズムを使用して、１０３人の化学療法未治療の患者について、ｐＭＭＲ集団中のＧＩＶ−ｆｌ状態を階層化することによって達成される分離を示す。ｄＭＭＲ集団についての生存曲線は、比較目的のために示される。このログランク検定についてのｐ値は、０．０２０９であり、ＧＩＶ−ｆｌ陽性群と陰性群との間の生存経験における統計的分離を実証している。これは、ＧＩＶ−ｆｌが予測値を提供することを実証している。４０パーセント（１８／４５）のＧＩＶ−ｆｌ陽性患者は、再発を経験した；２６パーセント（１４／５７）のＧＩＶ−ｆｌ陰性患者は再発した。
【０１８７】
変数選択及びＣｏｘ比例モデル
ＧＩＶ−ｆｌに加えて、統計的予測モデル中に含めるための変数を同定するために、モデルに割り当てるのに利用可能な自由度がどのくらいかを最初に決定した。生存解析のために、これは一般に、オーバーフィッティングすることなく、最大で、１０又は２０によって除算したイベントの数にフィットさせることができる。オーバーフィッティングは、性能が過大評価されているときに統計的予測として顕れ、これは、統計的モデルが実際に適用される場合に、予測されたほど十分には機能しないことを意味している。この特定の試料について、モデルのオーバーフィッティングなしに、およそ２の自由度をフィットさせることが可能であると予測された。部分的χ２（各変数が寄与する自由度に合わせて調整された）を使用してこの統計的モデルにおいてより重要であると思われる変数を同定した。これらの試験統計量は、各変数を除去したモデルと比較した、完全モデルからの尤度における差異を比較するフィッティングの良さの統計的尺度、逸脱を比較することに基づく。
【０１８８】
無増悪生存を記述することに関してより重要な変数は、大きい部分的χ２を有するが、あまり重要でない変数は、より小さい値を有する。試料サイズが十分に大きい場合、一般に、全ての利用可能な臨床的及び利用可能な記述的情報を使用する方がよい；しかし、潜在的重要な変数の間で選択する場合、部分的χ２に基づく選択が、段階的選択方法に依存する選択方法に好ましい。
【０１８９】
図９に示すように、最初の２つの変数（ＧＩＶ−ｆｌ陽性及びリンパ管浸潤（ＬＶＩ）、右上の２つのドット）と他の重要な変数（左側のドット）との間には、明確な描写が存在する。これは、ＧＩＶ−ｆｌ及びＬＶＩを用いた予測モデルが、どのステージＩＩ（例えば、ステージＩＩａ）のｐＭＭＲ  ＣＲＣが化学療法又は生物療法から利益を得るかを決定するために使用できることを示している。
【０１９０】
表１１は、単一変数、多変数（表１１に列挙した全ての可能な予測因子を含む）についてのＣｏｘ比例ハザードモデル、並びにＧＩＶ−ｆｌ及びＬＶＩ変数だけを用いた最終モデルからの結果を示すまとめである。これらのハザード比は、全てのモデルについて（影響の方向に関して）一致しており、より高いＬＶＩ及び高いＧＩＶ−ｆｌレベルは、より高い確率の再発と関連した。表１１は、ＱＵＡＳＡＲ及びＣＡＬＧＢ研究コホートを使用した１２遺伝子再発スコア（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ、ＣＡ）検証研究（Gray等, J. Clin. Oncol. 29:4611-4619, 2011；Venook等, J. Clin. Oncol. 31:1775-81, 2013）と類似の様式でモデル化される；これらの変数のほとんどの方向性は、これらのコホートにおいて見られたものと類似している。適切な差異（例えば、雌性におけるより高いリスクの再発及び右側の腫瘍）は、このコホートにおける小さい試料サイズに起因し得、これらの変数は、無増悪生存（ＰＦＳ）における統計的に有意な差異は実証しなかった。
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【０１９１】
予測能力の評価
この統計的予測モデルの予測能力を、２つの方法で評価した。最初に、ＲＯＣ曲線下の面積（ＡＵＣ）を使用して、モデルが患者を高リスク及び低リスクにどれだけ良好に分類したかを評価した。モデルの内部検証を、モデルオーバーフィッティングに起因するＡＵＣにおけるバイアスを測定することによって決定した；バイアスは、ブーツストラップリサンプリングを使用することによって推定される。ブーツストラップリサンプルは、復元を伴って取得されるランダム試料である。この問題について、２００のリサンプルを使用し、これらのリサンプルの各々について、ＡＵＣの尺度を取得した。オーバーフィッティングは、これらのリサンプルと比較して、フィッティングされたモデルで見られる楽観主義と推定される；調整されたＡＵＣは、試料サイズが適切にフィットさせることができるものよりも多くの変数が含まれる場合に見ることができた、潜在的な過度に楽観的なＡＵＣに合わせて調整する方法である。
【０１９２】
比較されたモデルは、このコホートについての最も有用な統計的予測モデルとして提唱されたモデルである：（１）臨床的／記述的変数のみを含むモデル、このモデルは、患者リスクを評価するために現在実際に使用されている情報を理論的に含有するから；並びに（２）完全モデル、マーカー及び現在の実務上の変数の両方を含むモデル；並びにＧＩＶ−ｆｌ（マーカー）モデル単独（ベースラインとして）。この完全モデルは、全ての患者情報を使用するので、全ての他のモデルを凌ぐと予測される。しかし、これらのデータについて、この統計的モデルの性能は、オーバーフィッティングに起因して評価が難しい可能性がある。
【０１９３】
２年及び５年ＰＦＳについてのＲＯＣ曲線は、図１０Ａ及び１０Ｂに示される。図の注釈に示されるＡＵＣは、潜在的オーバーフィッティングに合わせて調整されておらず、むしろ、これらは表１２に示される。ＡＵＣが大きくなるほど、マーカーの感受性／感度及び特異性（真陽性値及び真陰性値とも呼ばれる）は良くなる。ＡＵＣは、Ｍａｘ（感受性／感度、特異性）において最も高い−一般に、「良い」ＡＵＣ値は、０．７０よりも高い。表１２は、２つよりも多い変数がモデル中に追加される場合に、未調整のＡＵＣと調整済のＡＵＣとの間の差異がより大きいことを示している。具体的には、完全モデル（全ての臨床的／記述的変数及びＧＩＶ−ｆｌマーカー）及び臨床的モデル（臨床的／記述的変数のみ）の両方は、かなり良い未調整のＡＵＣ値を有する；しかし、オーバーフィッティングに合わせて調整された場合、ＬＶＩ＋ＧＩＶ−ｆｌモデルは、２年及び５年の両方のＰＦＳについて完全モデルと同様に等しく機能する。
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【０１９４】
個体レベルの予測能力
ＡＵＣ、感受性／感度、特異性、Ｂｒｉｅｒスコア及び他の測定基準は、統計的予測能力の尺度であるが、これらの尺度と予測の尺度との統合が、しばしば失われる。予測性曲線と呼ばれる、Ｐｅｐｅ（J. Epidemiol. 167:362, 2008）に記載される方法を使用して、分類及びリスク予測のこれら２つの尺度を組み合わせた。予測性曲線のｙ軸は、各患者についての予測された転帰（本明細書では、ｌｏｇスケールでのハザード比）であり、ｘ軸は、分類からの累積リスクである。ＧＩＶ−ｆｌマーカーについてのこれらの個体レベルの確率を、色でコード化した（赤色ＧＩＶ−ｆｌ陰性、青色ＧＩＶ−ｆｌ陽性）。
【０１９５】
図１１は、ＧＩＶ−ｆｌ及びＬＶＩ統計的モデルに基づいた、ステージＩＩａの化学療法未治療のＣＲＣ患者についての予測性プロットを示す。比率スケールは対称ではないので、解釈の容易さのために、ハザードスケールはｌｏｇスケールである；これは、「有意性」のスケールを１から０にシフトさせ、その結果、０を上回る値は、より高い確率の進行を実証し、０を下回る値は、より低い確率の進行を示す。この統計的モデルについて、５０％を僅かに下回る患者が、より高いリスクの進行を有し、これらの患者の大部分は、ＧＩＶ−ｆｌ陽性である。リスク／ｌｏｇハザードスケールの下端には、なおＧＩＶ−ｆｌ陽性である５人の患者が存在し、ＧＩＶ−ｆｌ陰性である高リスクの進行を有する６人の患者が存在する；しかし一般に、ＧＩＶ−ｆｌ陽性患者は、高い確率の進行を有し、低リスク及び低い確率の進行を一般に有するＧＩＶ−ｆｌ陰性患者と比較して、高リスクと分類される。
【０１９６】
モデルの妥当性
予測が意図される患者の下位試料において予測するこのモデルの能力を決定した。ＧＩＶ−ｆｌ及びＬＶＩ統計的予測モデルを、アジュバント化学療法を受けたコホートからの患者に適用した（表１３及び１４）。その予測は、アジュバント化学療法から利益を得ていると予測された患者が、実際に利益を得たというものである。これは、コホートの下位サンプリングされた集団であるので、妥当性のある外部モデルは存在せず、したがって、統計的モデル（及びマーカー）の予測値に焦点を当てた。感受性／感度及び特異性の両方の最大を、フィッティングされた統計的予測モデルが化学療法治療された患者集団に適用される場合の、予測された確率についてのカットポイントとして使用した。したがって、高リスク患者（予測された確率≧２年ＰＦＳについて０．２２及び５年ＰＦＳについて０．２４）が高い陽性予測値を有する可能性が高いという仮定を試験して、各対象を、これらのカットポイントに基づいて高リスク及び低リスクに分類した。
【０１９７】
表１５及び１６は、ＧＩＶ−ｆｌ及びＬＶＩ統計的モデルの予測された確率に基づいた、推定された利益を示す。このモデルは、２０／３７の人々が、２年の時点で化学療法から利益を受けているはずであると予測した（表１３）。実際、１５／２０が化学療法に応答した（陽性予測値（ＰＰＶ）＝０．７５）。さらに、２５／３７の人々が、５年の時点で化学療法から利益を受けているはずであると予測された（表１４）。実際、２０／２５が化学療法に応答した（ＰＰＶ＝０．８０）。これらの値は、アジュバント化学療法から利益を得る患者を分類するための中程度に高いレベルの予測値を示す。
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【０１９８】
完全モデル（全ての予測因子＋ＧＩＶ−ｆｌ標識化）の陽性予測値を決定し、表１５及び１６に示す。表１５及び１６は、ＧＩＶ−ｆｌ及び全ての臨床病理学的変数についての統計的予測モデルを使用した、ステージＩＩａ（Ｔ３）患者についての予測有用性を示す。表１５に示すように、このモデルは、１２／３７の人々が、化学療法から利益を得ているはずであると予測し、１０／１２が化学療法に応答した（ＰＰＶ＝０．８３）。表１６に示すように、このモデルは、１９／３７の人々が、化学療法から利益を得ているはずであると予測し、１６／１９が化学療法に応答した（ＰＰＶ＝０．８４）。それぞれ２年及び５年のＰＦＳについての０．８３及び０．８４の得られた値は、高い予測有用性を実証する。
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【０１９９】
まとめると、ＧＩＶ−ｆｌは、他の臨床病理学的変数、例えば、ＬＶＩ、年齢、陽性リンパ節の数、性別、腫瘍分化、Ｔステージ、又は腫瘍が存在する側と併せて使用した場合、化学療法未治療のステージＩＩ患者を高リスク及び低リスク集団に分類するために使用され得る。これらの方法を使用して高リスクと分類された患者は、化学療法を受けるように割り当てられ得るが、これらの方法を使用して低リスクと分類された患者は、化学療法を受けないように割り当てられ得る。
【０２００】
一例では、このモデルは、ＧＩＶ−ｆｌ状態及びＬＶＩからなった。当業者は、他の臨床病理学的変数、例えば、年齢、陽性リンパ節の数、性別、腫瘍分化、Ｔステージ、又は腫瘍が存在する側のうち１又は複数が、このモデル中に含まれ得ることを理解する。この統計的予測モデルを、化学療法治療した下位群に適用した場合、このモデルは、高い陽性予測値（ＰＰＶ）を有した。この高いＰＰＶは、統計的モデルの性能（例えば、ＡＵＣ）と共に、予後的有用性の証拠を与える。
【０２０１】
ＢｉｏＧｒｉｄ  ２を使用したモデル検証
表１７及び１８は、２つのコホート（ＢｉｏＧｒｉｄ  １及びＢｉｏＧｒｉｄ  ２と称する）のデータ概要を提供する。
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【０２０２】
ＢｉｏＧｒｉｄ  １及び２のハザード比
表１９、２０及び２１は、種々のモデルについてのハザード比（ＨＲ）並びに関連する９５％信頼区間及びｐ値を示す。
【０２０３】
表１９は、これらのリスクモデルによって階層化される高リスク群対低リスク群のＨＲを示す。全てのリスク階層化は、ＢｉｏＧｒｉｄ  １において開発した訓練セットにおいて開発したモデルに基づく。
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【０２０４】
表２０及び２１は、単一変数モデル、並びにＧＩＶ及びＬＶＩを含む多変数モデルの両方における、各変数のＨＲを示す。
【０２０５】
表２０は、ＢｉｏＧｒｉｄ  １、ｐＭＭＲ、Ｔ３、化学療法未治療の集団におけるＧＩＶ及び臨床変数についてのハザード比を実証する。列３−５は、単一変数モデルについてのＨＲ、ＣＩ及びＰ値を示す。列６−８は、ＧＩＶ＋ＬＶＩモデル中の各変数についてのＨＲ、ＣＩ及びＰ値を示す。
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【０２０６】
表２１は、ＢｉｏＧｒｉｄ  １、ｐＭＭＲ、Ｔ３、化学療法未治療の集団におけるＧＩＶ及び臨床変数についてのハザード比を実証する。列３−５は、単一変数モデルについてのＨＲ、ＣＩ及びＰ値を示す。列６−８は、ＧＩＶ＋ＬＶＩモデル中の各変数についてのＨＲ、ＣＩ及びＰ値を示す。
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【０２０７】
ＢｉｏＧｒｉｄ  ２のＡＵＣ
表２２は、種々のモデルについてのＲＯＣ曲線下の面積（ＡＵＣ）を提供する。全てのモデルを、ＢｉｏＧｒｉｄ  １において開発した訓練セットにおいて開発し、次いで、ＢｉｏＧｒｉｄ  ２／ｐＭＭＲ／化学療法未治療データに適用した。
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【０２０８】
ＢｉｏＧｒｉｄ  １及びＢｉｏＧｒｉｄ  ２のリスク予測
表２３−２６は、観察された再発対５年リスク予測の２行２列の表を提供する。全てのリスク予測は、訓練セットにおいて開発したモデルに基づく。
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【０２０９】
表２７は、ＰＰＶ及び誤計算率を提供する。ＰＰＶ＝高リスクかつ再発なしの数／高リスクの数。
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【０２１０】
カプランマイヤー曲線
図１２−１３は、ＢｉｏＧｒｉｄ  ２からの種々のマーカー／ＬＶＩ組合せについてのカプランマイヤー曲線を提供する。全てのリスク階層化は、上の訓練セットにおいて開発されたモデルに基づく。
【０２１１】
上述の図及び表からわかるように、ＧＩＶは、ステージＩＩのＣＲＣにおける再現性よい予後及び予測バイオマーカーとして、２つの独立したコホートにわたって検証されている。
【０２１２】
本開示の原理が適用され得る多くの可能な実施態様を考慮すると、例示された例は、本開示の例に過ぎず、本発明の範囲を限定すると解釈すべきでないことが、認識されるべきである。むしろ、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって規定される。したがって、本発明者らは、これらの請求項の範囲及び精神の内に入る全てを、本発明者らの発明として特許請求する。
【図１】
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【図２Ａ−Ｂ】
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【図２Ｃ】
0006657103.tif 000043
【図３Ａ−Ｃ】
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【図４Ａ−Ｂ】
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【図５Ａ−Ｂ】
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【図５Ｃ−Ｄ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
0006657103.tif 000053
【図１１】
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【図１２】
0006657103.tif 000055
【図１３】
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【配列表】
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