(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トレハロースベースのヒドロゲルを生成する方法であって、
ａ）トレハロースホモポリマーまたはコポリマーを形成する段階；
ｂ）架橋剤を調製する段階；および
ｃ）前記トレハロースホモポリマーまたはコポリマーを前記架橋剤と反応させ、前記トレハロースベースのヒドロゲルを形成する段階
を含み、
前記トレハロースホモポリマーまたはコポリマーが、
Ｒ５−［Ｒ１Ｒ２Ｃ−ＣＲ３Ｒ４］ｎ−Ｒ６
［式中、Ｒ１〜Ｒ４は、水素または少なくとも１個の炭素原子を含む側鎖から独立して選択され、かつ、Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つは、−Ｌ−トレハロース［ここでＬは、トレハロースのヒドロキシル基（−ＯＨ）の少なくとも１つを介してトレハロースをモノマーに連結するリンカー分子である］を含む側鎖であり、ならびに
Ｒ５およびＲ６は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、−Ｃ（ＣＮ）（アルキル）２、−ＳＣ（＝Ｓ）−Ｓ−アルキル、−Ｃ（アルキル）Ｃ（＝Ｏ）−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＯＣ（＝Ｏ）−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−アルキル（ｎ＝１〜１０）および生体分子から成る群より独立して選択される］
の構造を有する、方法。
【請求項２】
前記架橋剤がボロン酸ベースの架橋剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記架橋剤が、構造：
【化１】
0006770508.tif 000015
を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記架橋剤がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記架橋剤対前記トレハロースホモポリマーまたはコポリマーの比率が１：１である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記トレハロースホモポリマーまたはコポリマーと前記架橋剤との前記反応が、ｐＨ７．４でおよびダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）中で起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
タンパク質を安定化し、送達する方法であって、
ａ）請求項１から６のいずれかの方法に従ってトレハロースベースのヒドロゲルを調製する段階；
ｂ）ヒドロゲル形成の時点または形成後のいずれかに、前記トレハロースベースのヒドロゲルにタンパク質を添加し、前記タンパク質と前記トレハロースベースのヒドロゲルとの複合体を形成する段階；および
ｃ）前記タンパク質と前記トレハロースベースのヒドロゲルとの前記複合体に糖溶液を添加するかまたは溶液のｐＨを低下させて、前記複合体から前記タンパク質を放出させる段階
を含む方法。
【請求項８】
トレハロースベースのヒドロゲルの調製の間にタンパク質を添加して、前記タンパク質と前記トレハロースベースのヒドロゲルとの複合体を形成する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質がインスリンである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記糖溶液がグルコース溶液である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
トレハロースベースのヒドロゲルを生成する方法であって、
ａ）トレハロース架橋剤を調製する段階；
ｂ）トレハロースベースのモノマーを調製する段階；および
ｃ）前記トレハロース架橋剤を前記トレハロースベースのモノマーと反応させ、前記トレハロースベースのヒドロゲルを形成する段階
を含み、
前記トレハロース架橋剤が、構造：
【化２】
0006770508.tif 000016
または、
【化３】
0006770508.tif 000017
を有し、
前記トレハロースベースのモノマーが、構造：
【化４】
0006770508.tif 000018
または、
【化５】
0006770508.tif 000019
を有する、方法。
【請求項１２】
前記トレハロース架橋剤を、前記トレハロースベースのモノマーを調製するのに使用するものと同じ化学物質を用いて合成する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記トレハロース架橋剤を、前記トレハロースベースのモノマーを調製するのに使用するものと同じ段階の間に合成する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記段階ｃ）の反応が、レドックス開始剤によって開始されるフリーラジカル重合である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記トレハロース架橋剤が、構造：
【化６】
0006770508.tif 000020
を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記トレハロースベースのモノマーが、構造：
【化７】
0006770508.tif 000021
を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記トレハロース架橋剤が、構造：
【化８】
0006770508.tif 000022
を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記トレハロースベースのモノマーが、構造：
【化９】
0006770508.tif 000023
を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記トレハロースベースのモノマーを精製するＨＰＬＣ精製工程が必要ない、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
タンパク質を安定化する方法であって、
ａ）請求項１１から１９のいずれかの方法に従ってトレハロースベースのヒドロゲルを調製する段階；および
ｂ）ヒドロゲル形成の時点または形成後のいずれかに前記トレハロースベースのヒドロゲルにタンパク質を添加し、前記タンパク質と前記トレハロースベースのヒドロゲルとの複合体を形成する段階
を含み、この段階で前記タンパク質が安定化される方法。
【請求項２１】
前記タンパク質が酵素である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記タンパク質が、熱に暴露された場合に安定化される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記タンパク質が４℃より高い温度で安定化される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記タンパク質が７０℃〜９０℃で安定化される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記タンパク質が、水で希釈するかまたはｐＨを低下させることによって前記タンパク質と前記トレハロースベースヒドロゲルとの前記複合体から放出される、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年８月１２日に出願された米国特許仮出願第６２／０３６，４３１号および２０１５年３月２５日に出願された米国特許仮出願第６２／１３８，１１０号の優先権を主張するものであり、これらはどちらもすべての目的に関して参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府資金による研究開発の記載
本発明は、アメリカ国立科学財団（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）によって与えられた、契約番号ＣＨＥ１１１２５５０の下での連邦政府の支援を得て為された。連邦政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
タンパク質の安定化および送達のためのトレハロースヒドロゲルを作製するための組成物および方法を開示する。具体的には、組成物は、架橋剤を添加した新規トレハロースベースのホモポリマーまたはコポリマーを含み、ここでホモポリマーまたはコポリマーは、タンパク質の安定化および送達のためのトレハロースヒドロゲルを形成する。
【背景技術】
【０００４】
酵素は、水素結合、塩架橋および疎水性相互作用などの複数の非共有結合相互作用によって形成される明確に定義された三次元構造を有する（Ｓｏｍｅｒｏ，１９９５）。高温では、酵素はそれらの最初の構造を失い、変性して、もはや活性を有しない不溶性凝集体を形成する（Ｓｏｍｅｒｏ，１９９５；Ｒａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｆａｇａｉｎ，１９９５）。生物学的工程を触媒するうえでのその高い効率と選択性のゆえに、酵素は数多くの工業目的に使用される（Ｒａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｒａｖｉｎｄｒａｎ  ａｎｄ  Ｓｏｎ，２０１１；Ｓａｍｅｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０；Ｓｃｈｍｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。しかし、タンパク質のこの熱不安定性は、製薬、食品および生物工学産業におけるそれらの適応に負の影響を及ぼす。化学修飾（ＤｅＳａｎｔｉｓ  ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ，１９９９；Ｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）およびタンパク質工学（Ｆｒｏｓｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｍａｔｔｈｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７；Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｉｍａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６）などの多くの技術がこの問題に対処するために開発されてきた。加えて、ポリマーが、酵素の熱安定性を高めるコンジュゲートまたは賦形剤として使用されている（Ｇａｅｒｔｎｅｒ  ａｎｄ  Ｐｕｉｇｓｅｒｖｅｒ，１９９２；Ｌｏｎｇｏ  ａｎｄ  Ｃｏｍｂｅｓ，１９９９；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｋａｚａｎ  ａｎｄ  Ｅｒａｒｓｌａｎ，１９９７；Ｔｏｍｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。しかしこれらのアプローチの一部は、特定の産業および農業適用には費用がかかり過ぎる。
【０００５】
産業適用に関して、高分子ヒドロゲルは酵素安定化のための特に魅力的な材料である。ヒドロゲルによる酵素固定化、特に有機溶媒への固定化は、工業用酵素安定化に関連して広く検討されている（Ｓｈｅｌｄｏｎ，２００７）。酵素は共役反応を必要とせずにヒドロゲルにロードすることができ、これは合成および安定化工程を簡略にする。そして酵素溶液から除去することが困難なポリマー賦形剤と異なり、巨視的ヒドロゲルはろ過または遠心分離によって容易に分離することができる。これらの利点のゆえに、ヒドロゲルは酵素ならびに他のタンパク質の安定化のためにしばしば使用されてきた（Ｌｅｏｂａｎｄｕｎｇ，２００２；Ａｋｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。本明細書において、我々は、高温での酵素の安定性を増強するための有効な賦形剤としてトレハロースに基づく新規ヒドロゲル系を提案する。
【０００６】
トレハロースは、ストレス、例えば熱（Ｌｉｐｐｅｒｔ  ａｎｄ  Ｇａｌｉｎｓｋｉ，１９９２；Ｋａｕｓｈｉｋ  ａｎｄ  Ｂｈａｔ，２００３；Ｂａｐｔｉｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、乾燥（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，，２０００；Ｈｅｎｇｈｅｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｃｒｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）および凍結（Ｂｅａｔｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｓｕｎｄａｒａｍｕｒｔｈｉ  ａｎｄ  Ｓｕｒｙａｎａｒａｙａｎａｎ，２００９；Ｄｕｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）などに対してタンパク質および細胞を安定化することが示されている非還元性二糖である。一部の動物は、環境ストレスに応答してトレハロースを有意のレベルに蓄積し（Ｗｅｓｔｈ  ａｎｄ  Ｒａｍｌｏｖ，１９９１；Ｍａｄｉｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｈ．Ｃｒｏｗｅ，１９７５）、生物学的分子を安定化するトレハロースの能力を強調する。さらに、トレハロースは一般に安全と認められており（ＧＲＡＳ）（Ｊａｉｎ  ａｎｄ  Ｒｏｙ，２００９）、いくつかの医薬品中で安定剤として使用されている（Ｏｈｔａｋｅ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ，２０１１）。我々のグループは以前にトレハロースに基づく線状ポリマーを、タンパク質を安定化し、熱および凍結乾燥に対してそれらの活性を保持する賦形剤（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）またはコンジュゲート（Ｍａｎｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）として利用した。我々は、熱に対して酵素を安定化するトレハロースベースの材料を開発することを目指し、上述した利点のためにヒドロゲルに焦点を合わせた。
【０００７】
ヒドロゲルは、生物医学適用を有する薬物送達ビヒクルとして広く使用されている（Ｒｏｙ  ａｎｄ  Ｇｕｐｔａ，２００３）。特定の誘因に応答する「スマートヒドロゲル」を合成して、特異的に標的化された部位にゲスト薬物を送達し、放出することができる（Ｂａｊｐａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｑｉｕ  ａｎｄ  Ｐａｒｋ，２００１；Ｋｉｙｏｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｍａｎｏ，２００８）。特に、異なる細胞型および細胞区画は個別のｐＨを有しており、これがペイロードの部位特異的放出を可能にするので、ｐＨ応答性ヒドロゲルは薬物送達において頻繁に使用される。例えば、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のｐＨは、典型的には約７．４であるが、サイトゾルはより低いｐＨを有し、癌細胞も正常細胞より酸性である（Ｉｎｇｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。さらに、胃のｐＨは、胃が空であるか食物が摂取されているかによってｐＨ２から４の間である（Ｑｉｕ  ａｎｄ  Ｐａｒｋ，２００１）。それゆえｐＨ応答性ヒドロゲルに関する研究は重要な関心対象分野である。ｐＨ応答性ヒドロゲルを使用した治療薬の経口投与に向けて重要な研究が報告されている。これらのヒドロゲルは、抗生物質、治療用タンパク質およびペプチドの部位特異的送達のために胃を標的とする（Ｌｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｐａｔｅｌ  ａｎｄ  Ａｍｉｊｉ，１９９６；Ｂｅｓｈｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｇｕｏ  ａｎｄ  Ｇａｏ，２００７；Ｎｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｓａｊｅｅｓｈ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｍａ，２００６；Ｓｈａｎｔｈａ  ａｎｄ  Ｈａｒｄｉｎｇ，２０００）。標的部位は胃であり、胃のｐＨは空であるかいっぱいであるかによって２〜４であるので、ヒドロゲルはｐＨ４より酸性の条件下でそれらの治療薬だけを放出しなければならない。この放出は、ヒドロゲルの膨張の度合いを変えることによってまたは架橋剤を開裂することによって生じる。
【０００８】
動物飼料安定剤としてのタンパク質の安定化および送達のためのトレハロースヒドロゲルが当分野で必要とされている。フィターゼは、反芻動物（ウシ、ヒツジ）の消化管に存在する細菌によって産生され、反芻動物が穀物中に認められるフィチン酸をリンの供給源として利用することを可能にする。ヒト、イヌ、鳥等のような非反芻動物（単胃動物）はフィターゼを産生しない。動物栄養学の分野における研究は、動物がカルシウム、リン、他の無機物、炭水化物およびタンパク質のようなフィチン酸結合栄養素を利用できるようにするために飼料にフィターゼを補充するというアイデアを提案している。
【０００９】
これは、ますます重要性を増しつつある動物飼料安定剤（例えばフィターゼ）のための巨大なマーケットである。動物飼料用酵素（例えばフィターゼ）の安定化および送達のためのトレハロースベースのヒドロゲルが当分野で必要とされている。これらのトレハロースベースのヒドロゲルは周囲環境、例えばｐＨ値またはグルコースの存在に応答性であるべきである。
【００１０】
インスリンは、食品医薬品局（ＦＤＡ）で承認された最初の組換えタンパク質薬物であり、糖尿病の治療のために広く使用されている（Ｂｒｏｗｎ，２００５）。しかし、インスリン療法に関連する課題の１つは、インスリンポンプの場合、各食事後にインスリンボーラスの反復注射または挿入を必要とすることであり、これは特に小児および若年成人にとっては問題である（Ｂｕｒｄｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。これらの課題に対処するため、非毒性で耐久性のあるフェニルボロン酸がインスリン放出のための材料中で広く使用されている（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ボロン酸は、１，２−または１，３−ジオールと動的共有結合複合体を形成するので（Ｃａｍｂｒｅ  ａｎｄ  Ｓｕｍｅｒｌｉｎ，２０１１）、ヒドロゲルへのその組込みはグルコース応答性材料をもたらす。ボロン酸ヒドロゲルからのインスリン放出の２つの主たる機構は膨張と競合的結合である（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。膨張機構は、異なるボロン酸種の平衡が、糖類上のジオールなどのジオールへの結合後にアニオン性四面体形態へとシフトすることによって引き起こされ、これはヒドロゲルの浸透圧性膨張を生じさせる（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。あるいは、ボロン酸ベースのポリマー（Ｂａｐａｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）は、インスリンの存在下でジオール含有ポリマーとの複合体生成後にヒドロゲルを形成することができ、その後グルコースによって競合的に置換されて、ヒドロゲルを溶解し、インスリンを放出することができる（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【００１１】
インスリンの制御放出に加えて、タンパク質の不安定性は対処される必要のある重要な問題である。インスリンが貯蔵の間に温度変化にさらされると、健康合併症を生じさせるタンパク質の不活性化をもたらし得る（Ｐｒｙｃｅ，２００９）。不安定性はまた、タンパク質が廃棄され、無駄になることで糖尿病治療の医療費の一因ともなる（Ｗｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。インスリンは、インビボでのその半減期を増大させ（ポリマーの共有結合付着による）（Ｈｉｎｄｓ  ａｎｄ  Ｋｉｍ，２００２）、インスリン六量体形成を防ぐ（アミノ酸配列の変異によって）（Ｈｅｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）ように修飾されているが、環境的熱暴露に対してインスリンを安定化する試験はごくわずかしか報告されていない（Ｌｅｏｂａｎｄｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ａｋｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。Ｐｅｐｐａｓは、インスリンの熱および機械的安定性を高めるためにポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）およびポリ（エチレングリコール）から成るナノスフェアを使用した（Ｌｅｏｂａｎｄｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）が、彼らの系は放出機構を有していなかった。Ａｋｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．は、熱および酵素分解に対してインスリンを安定化するコレステロール担持プルランナノゲルを使用し、生理的ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）レベルに暴露された場合、プルランとＢＳＡの結合によってナノゲルがインスリンを放出した（Ａｋｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。この系はインスリンを安定化することに成功したが、インスリン送達システムにおいて極めて望ましい、グルコース応答性を欠いていた。我々の知る限り、グルコース応答性とインスリン安定化の両方を満たすヒドロゲルはまだ報告されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
タンパク質の安定化および送達のためにトレハロースヒドロゲルが当分野で必要とされている。周囲環境、例えばｐＨ値またはグルコースの存在に応答性であるトレハロースベースのヒドロゲルが当分野で求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
１つの態様では、本発明は、トレハロースベースのヒドロゲルを創製する方法に関する。この方法は、ａ）トレハロースホモポリマーまたはコポリマーを形成する段階；ｂ）架橋剤を調製する段階；およびｃ）トレハロースホモポリマーまたはコポリマーを架橋剤と反応させ、トレハロースベースのヒドロゲルを形成する段階を含む。
【００１４】
１つの実施形態では、トレハロースホモポリマーまたはコポリマーは、Ｒ5−［Ｒ1Ｒ2Ｃ−ＣＲ3Ｒ4］n−Ｒ6の構造を有し、式中、Ｒ1〜Ｒ4は、水素または少なくとも１個の炭素原子を含む側鎖から独立して選択され、かつ、Ｒ1〜Ｒ4の少なくとも１つは、−Ｌ−トレハロース［ここでＬは、トレハロースのヒドロキシル基（−ＯＨ）の少なくとも１つを介してトレハロースをモノマーに連結するリンカー分子である］を含む側鎖であり、Ｒ5およびＲ6は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、−Ｃ（ＣＮ）（アルキル）2、−Ｓ2Ｃ−Ｓ−アルキル、−Ｃ（ＣＯ）（アルキル）−（ＯＣＨ2ＣＨ2）n−ＣＯＯ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ−アルキル（ｎ＝１〜１０）および生体分子から成る群より独立して選択される。
【００１５】
１つの実施形態では、トレハロースホモポリマーまたはコポリマーは、ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体のいずれかである。
【００１６】
１つの実施形態では、架橋剤はボロン酸ベースの架橋剤である。
【００１７】
１つの実施形態では、架橋剤は、以下の構造を有する。
【００１８】
【化１】
0006770508.tif 000002
【００１９】
１つの実施形態では、トレハロースホモポリマーまたはコポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体である。
【００２０】
１つの実施形態では、架橋剤対トレハロースホモポリマーまたはコポリマーの比率は１：１である。
【００２１】
１つの実施形態では、トレハロースホモポリマーまたはコポリマーと架橋剤との反応は、ｐＨ７．４でおよびダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）中で起こる。
【００２２】
１つの態様では、本発明は、タンパク質を安定化し、送達する方法に関する。この方法は、ａ）請求項１〜８からのいずれかの方法に従ってトレハロースベースのヒドロゲルを調製する段階；ｂ）ヒドロゲル形成の時点または形成後のいずれかにトレハロースベースのヒドロゲルにタンパク質を添加し、タンパク質とトレハロースベースのヒドロゲルの複合体を形成する段階；およびｃ）タンパク質とトレハロースベースのヒドロゲルの複合体に糖溶液を添加するかまたは溶液のｐＨを低下させて、複合体からタンパク質を放出させる段階を含む。
【００２３】
１つの実施形態では、トレハロースベースのヒドロゲルの調製の間にタンパク質を添加して、タンパク質とトレハロースベースのヒドロゲルとの複合体を形成する。
【００２４】
１つの実施形態では、タンパク質はインスリンである。
【００２５】
１つの実施形態では、糖溶液はグルコース溶液である。
【００２６】
１つの態様では、本発明は、トレハロースベースのヒドロゲルを創製する方法であって、ａ）トレハロース架橋剤を調製する段階；ｂ）トレハロースベースのモノマーを調製する段階；およびｃ）トレハロース架橋剤をトレハロースベースのモノマーと反応させ、トレハロースベースのヒドロゲルを形成する段階を含む方法に関する。
【００２７】
１つの実施形態では、トレハロース架橋剤は、トレハロースベースのモノマーを調製するのに使用するものと同じ化学物質を用いて合成する。
【００２８】
１つの実施形態では、トレハロース架橋剤は、トレハロースベースのモノマーを調製するのに使用するものと同じ段階の間に合成する。
【００２９】
１つの実施形態では、段階ｂ）の反応は、レドックス開始剤によって開始されるフリーラジカル重合である。
【００３０】
１つの実施形態では、トレハロース架橋剤は、以下の構造を有する。
【００３１】
【化２】
0006770508.tif 000003
【００３２】
１つの実施形態では、トレハロースベースのモノマーは、以下の構造を有する。
【００３３】
【化３】
0006770508.tif 000004
【００３４】
１つの実施形態では、トレハロース架橋剤は、以下の構造を含む。
【００３５】
【化４】
0006770508.tif 000005
【００３６】
１つの実施形態では、トレハロースベースのモノマーは、以下の構造を有する。
【００３７】
【化５】
0006770508.tif 000006
【００３８】
１つの実施形態では、トレハロースベースのモノマーを精製するＨＰＬＣ精製工程は必要ない。
【００３９】
１つの態様では、本発明は、タンパク質を安定化する方法であって、ａ）請求項１３〜２１からのいずれかの方法に従ってトレハロースベースのヒドロゲルを調製する段階；およびｂ）ヒドロゲル形成の時点または形成後のいずれかにトレハロースベースのヒドロゲルにタンパク質を添加し、タンパク質とトレハロースベースヒドロゲルとの複合体を形成する段階を含み、この段階でタンパク質が安定化される方法に関する。
【００４０】
１つの実施形態では、タンパク質は酵素である。
【００４１】
１つの実施形態では、タンパク質は、熱に暴露された場合に安定化される。
【００４２】
１つの実施形態では、タンパク質は４℃より高い温度で安定化される。
【００４３】
１つの実施形態では、タンパク質は７０℃〜９０℃で安定化される。
【００４４】
１つの実施形態では、タンパク質は、水で希釈するかまたはｐＨを低下させることによってタンパク質とトレハロースベースヒドロゲルの複合体から放出される。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、８アームＰＥＧアミン（上）および８アームＰＥＧボロン酸（下）（Ｄ2Ｏ中）の1Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示すグラフのセットである。
【図２】図２（ａおよびｂ）は、（ａ）形成されたトレハロース−ボロン酸ヒドロゲルの写真および（ｂ）ｐＨ７．４のＤ−ＰＢＳ中のＦＩＴＣ標識インスリンを負荷したトレハロース−ボロン酸ヒドロゲルの写真を示す写真のセットである。
【図３】図３は、０、１、５、１０および２０ｍｇ／ｍＬグルコースを含有するＤ−ＰＢＳ中に浸漬した後のポリＳＥＴ−ボロン酸ヒドロゲルの溶解動態を示すグラフである（各群につきｎ＝３）。
【図４】図４は、０、５および１０ｍｇ／ｍＬグルコースを含有するＤ−ＰＢＳ、ｐＨ７．４中に放出されたインスリンを示すグラフである（各群につきｎ＝６）。
【図５】図５は、インスリン（熱制御なし）、ヒドロゲルとインスリン（熱制御なし）、添加剤なしでのインスリン（加熱）、８アームＰＥＧボロン酸とインスリン（加熱）、トレハロースポリマーとインスリン（加熱）およびヒドロゲルとインスリン（加熱）のＥＬＩＳＡ結果を示すグラフである。加熱条件は、９０℃３０分間であった。***は、添加剤なしと比較してｐ＜０．００１であり、＃＃は、８アームＰＥＧボロン酸と比較してｐ＜０．０１である（ｎ＝６）。
【図６】図６は、０、５および１０ｍｇ／ｍＬグルコースを含有するＤ−ＰＢＳ、ｐＨ８．０中に放出されたインスリンを示すグラフである（各群につきｎ＝３）。
【図７】図７は、グルコースの添加後のＤ−ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４中でのカルボキシフルオレセイン放出の蛍光色素分子を放出するトレハロースヒドロゲルの動態試験（ｎ＝３）を示すグラフである。
【図８】図８は、ビス−ＳＡＴ架橋剤（ＣＤ3ＣＮ中）の1Ｈ  ＮＭＲ分光法を示すグラフである。
【図９】図９は、１０％ＴＦＡ水溶液（Ｄ6ＤＭＳＯ中）での処理前（上）および処理後（下）のポリ（ＳＡＴ）の1Ｈ  ＮＭＲ分光法を示すグラフのセットである。
【図１０】図１０は、２５℃で３分（上）および３時間（下）のインキュベーション後のｐＨ７．４  Ｄ−ＰＢＳ、ｐＨ５  ＰＢＳおよび１０％ＴＦＡ中でのＳＥＴヒドロゲル−１の安定性試験を示す写真のセットである。
【図１１】図１１（ａ〜ｅ）は、（ａ）Ｈ2Ｏに溶解した粗ＳＥＴおよびＴＥＭＥＤ、（ｂ）ＡＰＳを添加した後、（ｃ）ヒドロゲルを凍結乾燥した後、（ｄ）凍結乾燥したゲルを再びＨ2Ｏに浸漬した後、および（ｅ）ヒドロゲル（凍結乾燥後に摩砕し、Ｈ2Ｏ中に浸漬した）を洗浄した後を示す写真のセットである。
【図１２】図１２は、添加剤なし、タンパク質に対して１０重量当量または５０重量当量のＳＥＴヒドロゲルと共に７０℃で３０分間加熱する前（対照）および加熱した後のＨＲＰの活性を示すグラフである。
【図１３】図１３は、ＨＲＰ−ＡＦ４８８（緑色）溶液（２５μｍの軸方向分解能）中に２４時間浸漬し、その後手早く洗浄したＳＥＴヒドロゲル−２の縁の軸共焦点顕微鏡画像（１５スキャン）を示す写真のセットである。
【図１４】図１４（ａおよびｂ）は、トレハロースヒドロゲルのＳＥＭ画像を示す写真のセットである。（ａ）５００×倍率での画像および（ｂ）１０００×倍率での画像。
【図１５】図１５は、ＦＩＴＣ標識フィターゼを含有する溶液中で一晩インキュベートし、脱イオン水で洗浄したトレハロースヒドロゲルの共焦点画像を示す写真である。右下角の数字は軸横断面スライス指数を指示する。軸方向分解能＝２μｍ。
【図１６】図１６は、ロードおよび凍結乾燥後のトレハロースヒドロゲルからのＦＩＴＣ標識フィターゼの放出プロフィールを示すグラフである（ｎ＝６）。
【図１７】図１７は、種々の重量当量のトレハロースヒドロゲルと共に加熱した後のフィターゼの活性を示すグラフである。対照を除くすべての試料を５３重量％の水と共に９０℃で１分間加熱した（ｎ＝３）。***＝フィターゼ単独と比較してｐ＜０．００５。
【図１８】図１８は、ＤＣＭ中での沈殿後の粗スチレニルエーテルトレハロース混合物のＬＣ−ＭＳクロマトグラムを示すグラフである。
【図１９】図１９は、粗スチレニルエーテルトレハロース混合物のＤＣＭ洗浄物のＬＣ−ＭＳクロマトグラムを示すグラフである。
【図２０】図２０は、１日後のトレハロースヒドロゲル反応混合物のＬＣ−ＭＳクロマトグラムを示すグラフである。
【図２１】図２１は、凍結乾燥前のトレハロースヒドロゲルからのＦＩＴＣ標識フィターゼの放出プロフィールを示すグラフである（ｎ＝６）。
【図２２】図２２は、一置換、二置換および三置換トレハロースの様々な位置異性体を生じる、トレハロースベースのヒドロゲルにおける第一段階のモノマー合成のＬＣ−ＭＳクロマトグラムを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
［全般］
本発明の材料および方法を説明する前に、本発明は、記載されている特定の方法、プロトコル、材料および試薬に限定されず、これらは異なり得ることが理解される。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することだけを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図されず、本発明の範囲は後日に出願される非仮出願によってのみ限定されることも理解されるべきである。
【００４７】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの」および「その」は、文脈上明らかに異なる指示がない限り複数の言及を包含する。同様に、「１つの」、「１つ以上」および「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では交換可能に使用することができる。「含む」、「包含する」および「有する」という用語は交換可能に使用することができる。
【００４８】
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および学術用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または等価の任意の方法および材料が本発明の実施または試験において使用できるが、好ましい方法および材料をここで述べる。本明細書で具体的に言及されているすべての出版物および特許は、本発明に関連して使用し得る、出版物中で報告されている化学物質、装置、統計解析および方法を説明し、開示することを含むすべての目的に関して参照により本明細書に組み込まれる。本明細書中で引用されるすべての参考文献は、当分野の技術水準を示すとみなされるべきである。本明細書中のいかなる内容も、本発明が先行発明によるそのような開示に先行する権利を有さないことの承認と解釈されるべきではない。
【００４９】
［定義］
組成物および関連する方法を説明する前に、本発明は記載されている特定の方法、プロトコル、材料および試薬に限定されず、これらは異なり得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することだけを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図されず、本発明の範囲は後日に出願される非仮出願によってのみ限定される。
【００５０】
本明細書で述べる本発明は、タンパク質の安定化および送達のためのトレハロースベースのヒドロゲルを提供する。
【００５１】
本発明の１つの実施形態によれば、トレハロースベースのヒドロゲルは、凝集、立体配座変化および／または分解、例えば天然タンパク質の変性または変性した（折りたたまれていないもしくは部分的に折りたたまれた）タンパク質の再生などに対してタンパク質を安定化するために使用され、過酷な環境またはストレス環境でタンパク質を所望の立体配置に維持するのを助け、意図される機能は、少なくとも天然状態のタンパク質と同等に維持されるかまたはタンパク質がストレス環境で有する低い活性に比べて増強される。トレハロースベースのヒドロゲルは、例えば熱、電磁放射線、せん断応力、タンパク質分解による、または還元、酸化もしくはカルバミル化などの化学修飾による分解に対してタンパク質を安定化するように働く。トレハロースベースのヒドロゲルは、水溶液中でまたは、例えば水溶液の乾燥、脱水、蒸発もしくは凍結乾燥（フリーズドライ）によって生成される、乾燥形態でタンパク質を安定化するのに使用し得る。
【００５２】
トレハロースベースのヒドロゲルを生成する１つの方法は、トレハロースホモポリマーまたはコポリマーを予備合成した架橋剤と反応させ、トレハロースベースのヒドロゲルを形成する段階を含み得る。
【００５３】
トレハロースベースのヒドロゲルを生成する別の方法は、トレハロース架橋剤をトレハロースベースのモノマーと共重合させ、トレハロースベースのヒドロゲルを形成する段階を含み得る。
【００５４】
「アリール」という用語は、炭素環式（非複素環式または複素環式）芳香環または単環式、二環式もしくは三環式環系を指す。芳香環または環系は、一般に６〜１０個の炭素原子から成る。アリール基の例には、フェニル、ビフェニル、ナフチルおよびテトラヒドロナフチルが含まれるが、これらに限定されない。フェニルなどの６員アリールが好ましい。
【００５５】
「アルキル」という用語は、置換されていてもよい直鎖または分枝鎖炭化水素基を指す。例としては、メチル（Ｍｅ）、エチル（Ｅｔ）、プロピル（Ｐｒ）、イソプロピル（ｉ−Ｐｒ）、ブチル（Ｂｕ）、イソブチル（ｉ−Ｂｕ）、ｓｅｃ−ブチル（ｓ−Ｂｕ）、ｔｅｒｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル等が含まれる。文脈上別の解釈が要求されない限り、「アルキル」という用語は、その基が２つの位置で結合されるように１個少ない水素原子を含む、すなわち二価のアルキル基も包含する。メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチルおよびｔｅｒｔ−ブチルを含む「Ｃ1-4アルキル」および「Ｃ1-3アルキル」が好ましく、メチルが特に好ましい。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「アルキル」、「アルケニル」という用語および「アルク」という接頭語は、直鎖基および分枝鎖基ならびに環式基、例えばシクロアルキルおよびシクロアルケニルを包含する。特に指定がない限り、これらの基は１〜２０個の炭素原子を含み、アルケニル基は２〜２０個の炭素原子を含む。一部の実施形態では、これらの基は、合計で多くても１０個の炭素原子、多くても８個の炭素原子、多くても６個の炭素原子または多くても４個の炭素原子を有する。環式基は単環式または多環式であってよく、好ましくは３〜１０個の環炭素原子を有する。例示的な環式基には、シクロプロピル、シクロプロピルメチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、アダマンチルならびに置換および非置換ボルニル、ノルボルニルおよびノルボルネニルが含まれる。
【００５７】
特に指定がない限り、「アルキレン」および「アルケニレン」は、上記で定義した「アルキル」および「アルケニル」基の二価形態である。「アルキレニル」および「アルケニレニル」という用語は、それぞれ「アルキレン」および「アルケニレン」が置換されている場合に使用される。例えば、アリールアルキレニル基は、アリール基が結合したアルキレン部分を含む。
【００５８】
「ハロアルキル」という用語は、ペルフルオロ基を含む、１個以上のハロゲン原子によって置換された基を包含する。これは、「ハロ」という接頭語を含む他の基にも当てはまる。適切なハロアルキル基の例は、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル等である。「ハロゲン」は、塩素、臭素、フッ素およびヨウ素を含む元素である。
【００５９】
「ヘテロアリール」という用語は、少なくとも１個の環ヘテロ原子（例えばＯ、Ｓ、Ｎ）を含む芳香環または環系を包含する。一部の実施形態では、「ヘテロアリール」という用語は、２〜１２個の炭素原子、１〜３個の環、１〜４個のヘテロ原子ならびにヘテロ原子としてＯ、Ｓおよび／またはＮを含む環または環系を包含する。適切なヘテロアリール基には、フリル、チエニル、ピリジル、キノリニル、イソキノリニル、インドリル、イソインドリル、トリアゾリル、ピロリル、テトラゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、カルバゾリル、ベンゾオキサゾリル、ピリミジニル、ベンゾイミダゾリル、キノキサリニル、ベンゾチアゾリル、ナフチリジニル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、プリニル、キナゾリニル、ピラジニル、１−オキシドピリジル、ピリダジニル、トリアジニル、テトラジニル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル等が含まれる。
【００６０】
「アリーレン」および「ヘテロアリーレン」という用語は、上記で定義した「アリール」および「ヘテロアリール」基の二価形態である。「アリーレニル（ａｒｙｌｅｎｙｌ）」および「ヘテロアリーレニル（ｈｅｔｅｒｏａｒｙｌｅｎｙｌ）」という用語は、それぞれ「アリーレン」および「ヘテロアリーレン」が置換されている場合に使用される。例えば、アルキルアリーレニル（ａｌｋｙｌａｒｙｌｅｎｙｌ）基は、アルキル基が結合したアリーレン部分を含む。
【００６１】
「ストレス環境」という用語は、本明細書で使用される場合、生体分子の機能特性または活性を低下させる環境を意味する。例えば、環境は、天然のタンパク質に比べてまたはタンパク質がその天然状態で有するものに比べて、タンパク質の機能特性または活性を低下させ得る。ストレス環境は、高温または低温であり得る、有害な熱環境を作り出す温度、有機溶媒などの溶媒、プロテアーゼの存在、ｐＨおよび／または緩衝剤の欠如を含み得る。
【００６２】
本明細書で使用される「生体分子」という用語は、タンパク質、酵素、抗体、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡおよび医薬組成物を指すが、これらに限定されない。そのような生体分子は、熱、乾燥、光、貯蔵、酵素への暴露、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼならびにｐＨ変動を含むがこれらに限定されない環境ストレスにさらされる。
【００６３】
本明細書で使用される「タンパク質」という用語は、１個のアミノ酸（またはアミノ酸残基）のα−炭素に結合したカルボン酸基のカルボキシル炭素原子が隣接アミノ酸のα−炭素に結合したアミノ基のアミノ窒素原子に共有結合されるようになる場合に生じる、ペプチド結合を介して連結された２個以上の個別アミノ酸（天然に存在するか否かにかかわらず）の任意の化合物を指す。これらのペプチド結合およびそれらを含む原子（すなわちα−炭素原子、カルボキシル炭素原子（およびそれらの置換基酸素原子）ならびにアミノ窒素原子（およびそれらの置換基水素原子）は、タンパク質の「ポリペプチド骨格」を形成する。加えて、本明細書で使用される場合、「タンパク質」という用語は「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語を包含すると理解される。同様に、タンパク質フラグメント、類似体、誘導体および変異体は、本明細書では「タンパク質」と称されるか称されてもよく、特に指示されない限り「タンパク質」であるとみなされる。タンパク質の「フラグメント」という用語は、タンパク質の全アミノ酸残基より少ないアミノ酸残基を含むポリペプチドを指す。認識され得るように、タンパク質の「フラグメント」は、アミノ末端、カルボキシル末端および／または内部で（例えば自然のスプライシングによる）切断されたタンパク質の形態であってよく、また変異体および／または誘導体であってもよい。タンパク質の「ドメイン」もまたフラグメントであり、天然に存在するタンパク質に対応する生化学的活性を付与するのに必要とされるタンパク質のアミノ酸残基を含む。本明細書で使用される「タンパク質」という用語は「タンパク質コンジュゲート」も包含し、これは、分子または対象物に互いに連結された「タンパク質」を含む化合物複合体を指す。「複合体」という用語は、本明細書では少なくとも２つの成分を含む化合物を意味するのに使用される。タンパク質は、天然に存在してもよく、その供給源から単離されていてもよい。タンパク質はＤＮＡ組換えまたは突然変異技術を用いて生産され得る。タンパク質は、まるごとの動物においてまたは真核もしくは原核細胞においてインビボで産生され得る；あるいは、タンパク質は、例えば大腸菌溶解物、コムギ胚芽抽出物またはウサギ網状赤血球を使用して、無細胞インビトロ翻訳などのインビトロ法を用いて生成してもよい。無細胞インビトロ翻訳法は、インビトロ転写後に、例えばファージまたはリボソームディスプレイ後に用いることができる。
【００６４】
タンパク質の例には、限定されることなく、リゾチーム、アデノシンデアミナーゼ、Ｌ−アスパラギナーゼ、哺乳動物尿酸オキシダーゼ、インターフェロン、抗ＴＮＦαＦａｂ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、持続性エリスロポエチン受容体活性化剤、ｈＧＨアンタゴニストＢ２０３６、インスリン、インスリンヒト吸入剤、インスリンアスパルト、インスリングルリジン、インスリンリスプロ、イソフェンインスリン、インスリンデテミル、インスリングラルギン、持続型インスリン亜鉛、酢酸プラムリンチド、成長ホルモン（ＧＨ）、ソマトトロピン、メカセルミン、メカセルミンリンファバート、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ｉｉｉ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、プロテインＣ濃縮物、β−グルコセレブロシダーゼ、アルグルコシダーゼ−α、ラロニダーゼ（α−Ｌ−イズロニダーゼ）、イズルスルファーゼ（イズロン酸−２−スルファターゼ）、ガルスルファーゼ、アガルシダーゼ−β（ヒトα−ガラクトシダーゼＡ）、α−１−プロテイナーゼ阻害剤、ラクターゼ、膵酵素、リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、アデノシンデアミナーゼ、プール免疫グロブリン、ヒトアルブミン、エリスロポエチン、エポエチン−α、ダルベポエチン−α、サルグラモスチム（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子；ＧＭ−ＣＳＦ）、オプレルベキン（インターロイキン１１；ＩＬ１１）、ヒト卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、ルトロピン−α、Ｉ型α−インターフェロン、インターフェロンアルファコン１、コンセンサスインターフェロン、アルデスロイキン（インターロイキン２（ＩＬ２）、表皮胸腺細胞活性化因子（ＥＴＡＦ）、アルテオラーゼ（組織プラスミノーゲン活性化因子；ｔＰＡ）、レテプラーゼ（ｔＰＡの欠失ムテイン）、テネクテプラーゼ、ウロキナーゼ、第ＶＩＩａ因子、ドロトレコギン−α（活性化プロテインＣ）、サケカルシトニン、テリパラチド（ヒト副甲状腺ホルモン残基１−３４）、エクセナチド、オクトレオチド、ジボテルミン−α（組換えヒト骨形成タンパク質２；ｒｈＢＭＰ２）、組換えヒト骨形成タンパク質７（ｒｈＢＭＰ７）、酢酸ヒストレリン（ゴナドトロピン放出ホルモン；ＧｎｒＨ）、パリフェルミン（ケラチノサイト増殖因子；ＫＧＦ）、ベカプレルミン（血小板由来増殖因子；ＰＤＧＦ）、トリプシン、ネシリチド、Ａ型ボツリヌス毒素、Ｂ型ボツリヌス毒素、コラーゲス（Ｃｏｌｌａｇｅｓ）、コラゲナーゼ、ヒトデオキシリボヌクレアーゼＩ、ドルナーゼ−α、ヒアルロニダーゼ（ウシ、ヒツジ）、ヒアルロニダーゼ（組換えヒト）、パパイン、Ｌ−アスパラギナーゼ、ラスブリカーゼ、レピルジン、ビバリルジン、ストレプトキナーゼ、アニストレプラーゼ（アニソイル化プラスミノーゲンストレプトキナーゼ活性化剤複合体；ＡＰＳＡＣ）、ベバシズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、アレムツズマブ、リツキシマブ、トラスツズマブ、アバタセプトアナキンラ、アダリムマブ、エタネルセプト、インフリキシマブ、アレファセプト、エファリズマブ、ナタリズマブ、エクリズ��ブ、抗胸腺細胞グロブリン（ウサギ）、バシリキシマブ、ダクリズマブ、ムロモナブ−ＣＤ３、オマリズマブ、パリビズマブ、エンフビルチド、アブシキシマブ、ガラガラヘビ科（Ｃｒｏｔａｌｉｄａｅ）多価免疫Ｆａｂ（ヒツジ）、ジゴキシン免疫血清Ｆａｂ（ヒツジ）、ラニビズマブ、デニロイキンジフチトクス、イブリツモマブ・チウキセタン、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、トシツモマブおよびＩトシツモマブが含まれる。
【００６５】
変性タンパク質は、タンパク質が、折りたたまれていないタンパク質および／または部分的に折りたたまれた再生中間体（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）として非天然形態であるような、完全変性または部分的変性もしくは再生であり得る。変性タンパク質を含有する水溶液または乾燥試料は、これらの形態の１つ以上を含み得る。天然のタンパク質は、折りたたまれた機能的高次構造である。一部のタンパク質は、水溶液中または乾燥試料中に、夾雑凝集物および／または封入体の形態でも存在し得る。
【００６６】
「安定性」という用語は、貯蔵後のタンパク質または他の生体分子の天然の生物活性機能の維持を指す。本発明は、同一の環境条件下でトレハロース安定化剤なしで貯蔵した場合に比べて、タンパク質機能の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％の安定性を提供する。例えば、インスリンのようなタンパク質を本明細書で述べるトレハロースベースのポリマーまたはコポリマーと複合体化させた場合、このインスリンタンパク質は、インスリン単独ではせいぜいそのもとの生物活性の２０％しか保持できないのに比べて、その天然生物活性の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％またはそれを超える割合を保持することが想定される。当業者は、保持される生物活性のパーセントがタンパク質およびストレス依存性であることを認識する。さらに、裸の／非修飾タンパク質に比べて複合タンパク質がその生物活性または機能を維持することができる時間の長さは、それがさらされる環境ストレッサーに依存して異なる。本明細書で述べる複合タンパク質は、同一の環境条件下で非複合天然タンパク質より少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００倍長く生物活性を保持できることが想定される。
【００６７】
本明細書で使用される「抗体」または「抗体分子」という用語は、免疫グロブリン分子または抗原結合ドメインを含む他の分子を指す。本明細書で使用される「抗体」または「抗体分子」という用語は、したがって、全抗体（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ）、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体およびキメラ抗体を包含することが意図されている。
【００６８】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一アミノ酸組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体はまた、「ヒトモノクローナル抗体」も包含し、これは、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する、単一結合特異性を示す抗体を指す。ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合されたヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって生産することができる。
【００６９】
「キメラ抗体」という用語は、通常は組換えＤＮＡ技術によって作製される、ある供給源または種に由来する可変領域、すなわち結合領域と、異なる供給源または種に由来する定常領域の少なくとも一部を含むモノクローナル抗体を指す。キメラ抗体はまた、マウス可変領域とヒト定常領域を含み得る。そのようなマウス／ヒトキメラ抗体は、マウス免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメントおよびヒト免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントを含む、発現された免疫グロブリン遺伝子の産物である。「キメラ抗体」の他の形態は、そのクラスまたはサブクラスがもとの抗体から改変または変更されているものである。そのような「キメラ」抗体は「クラススイッチ抗体」とも称される。キメラ抗体を生産するための方法は、今や当分野で周知の従来の組換えＤＮＡおよび遺伝子トランスフェクション技術を含む。
【００７０】
「抗体」という用語はまた、ヒト化抗体、ヒト抗体および組換えヒト抗体も包含する。「ヒト化抗体」という用語は、フレームワークまたは「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が、親免疫グロブリンの特異性に比べて異なる特異性の免疫グロブリンのＣＤＲを含むように改変されている抗体を指す。好ましい実施形態では、マウスＣＤＲをヒト抗体のフレームワーク領域に移植して「ヒト化抗体」を作製する。特に好ましいＣＤＲは、キメラおよび二官能性抗体に関して上記で言及した抗原を認識する配列を示すものに対応する。
【００７１】
「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を包含する。可変重鎖は、好ましくは生殖細胞系配列ＤＰ−５０に由来し、可変軽鎖は生殖細胞系配列Ｌ６に由来する。この抗体の定常領域はヒトＩｇＧ１型の定常領域である。
【００７２】
「組換えヒト抗体」という用語は、組換え手段によって作製、発現、創製または単離されるすべてのヒト抗体、例えばＳＰ２−０、ＮＳＯもしくはＣＨＯ細胞（ＣＨＯ  Ｋｌのような）などの宿主細胞からまたはヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックである動物（例えばマウス）から単離された抗体、または宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現された抗体を包含する。そのような組換えヒト抗体は、再配列形態のヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。
【００７３】
「抗体」という用語はまた、抗原結合ドメインを含む「抗体フラグメント」または「抗体由来フラグメント」も包含する。本明細書で使用される「抗体フラグメント」という用語は、抗原結合機能を示す任意の適切な抗体フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、ＴａｎｄＡｂ二量体、ミニボディ、モノボディ、ダイアボディおよびそれらの多量体ならびに二重特異性抗体フラグメントを包含することが意図されている。抗体は従来の技術を用いてフラグメント化することができる。例えばＦ（ａｂ’）２フラグメントは、抗体をペプシンで処理することによって生成することができる。生じたＦ（ａｂ’）２フラグメントを、ジスルフィド架橋を還元するように処理してＦａｂ’フラグメントを生成することができる。パパイン消化はＦａｂフラグメントの形成をもたらすことができる。Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、ＴａｎｄＡｂ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、二量体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体フラグメントおよび他のフラグメントも、組換え技術によって合成することができるかまたは化学合成することができる。抗体フラグメントを作製するための技術は当分野において周知であり、記述されている。
【００７４】
抗体または抗体フラグメントは、天然に生産され得るかまたは全面的もしくは部分的に合成によって生成することができる。したがって抗体は、任意の適切な供給源、例えば組換え供給源に由来してもよくおよび／またはトランスジェニック動物もしくはトランスジェニック植物において生産してもよい。したがって、抗体分子はインビトロまたはインビボで作製することができる。好ましくは、抗体または抗体フラグメントは、一般に抗原結合部位を含む抗体軽鎖可変領域（ＶL）および抗体重鎖可変領域（ＶH）を含有する。抗体または抗体フラグメントは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域などの重鎖定常領域の全部または一部を含むことができる。好ましくは、重鎖定常領域はＩｇＧ１重鎖定常領域である。さらに、抗体または抗体フラグメントは、κ軽鎖定常領域またはλ軽鎖定常領域の全部または一部を含むことができる。そのような定常領域の全部または一部は、天然に生産され得るかまたは全面的もしくは部分的に合成であり得る。そのような定常領域の適切な配列は当分野において周知であり、実証されている。
【００７５】
本明細書で使用される「フラグメント」という用語は、生物学的関連性のあるフラグメント（機能的フラグメント）、例えば抗原結合に寄与し得るもしくは抗原結合を可能にする、例えば抗原結合部位の一部もしくは全部を形成する、または抗原の機能の阻害もしくは低減に寄与し得る、または抗原とその天然リガンドとの相互作用の防止に寄与し得るフラグメントを指す。したがってフラグメントは、本発明の抗体の重鎖可変領域（ＶHドメイン）および／または軽鎖可変領域（ＶLドメイン）を含む。フラグメントはまた、抗体の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）もしくはＶHドメインの１つ以上、または抗体の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）もしくはＶLドメインの１つ以上を含み得る。
【００７６】
本明細書で使用される「糖ポリマー」という用語は、３つ以上の単糖類、二糖類または三糖類単位を含むポリマーおよびオリゴマー糖分子を包含する。糖ポリマーは直鎖または非直鎖の両親媒性糖ポリマー誘導体であり得る。具体的には、糖ポリマーは、限定されることなく、トレハロース、エリトロース、トレオース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、キシルロースおよびリブロースを含む１つ以上の糖を含有する。糖ポリマーは、デキストラン、セルロース、アミロース、デンプン、プルラン、マンナン、キチン、キトサン、イヌリン、レバン、キシラン、シクロデキストリン（ただしα、βまたはγシクロデキストリンではない）、シクロアミロースまたはそれらの誘導体であり得る。
【００７７】
糖ポリマー、特に本発明における使用に適するトレハロースベースのホモポリマーまたはコポリマーは、適切な濃度および適切な条件下で、（１）ストレス環境において天然生体分子の機能的特性を保持するために天然生体分子をその天然状態に維持するまたは（２）変性した生体分子を研究者が所望する非天然状態に維持することができるものである。適切なトレハロースベースのホモポリマーまたはコポリマーは、疎水性アミノ酸側鎖を保護するまたは正味の生体分子電荷もしくは水素結合特徴を改変することができるものである。適切なトレハロースベースのホモポリマーまたはコポリマーはまた、水捕捉能力を有するものまたは水素結合特徴を有するものも含み得る。
【００７８】
本明細書で使用される「ヒドロゲル」という用語は、親水性であり、時として水を分散媒とするコロイド状ゲルとして認められるポリマー鎖のネットワークを指す。ヒドロゲルは、高度吸収性の（９０％を超える水を含有することができる）天然または合成ポリマーネットワークである。ヒドロゲルはまた、それらの大きな含水量のゆえに、天然組織に非常に類似したある程度の柔軟性を有する。
【００７９】
ヒドロゲルは、親水性ポリマーまたは親水性コポリマーを含有するポリマーで作られる三次元ネットワークである。ヒドロゲルネットワークは、共有結合、水素結合もしくはイオン性相互作用によるポリマー鎖の架橋によって、または物理的絡み合いによって形成される。ヒドロゲルは、マイクロスケールまたはナノスケールレベルで特定の特性を達成する生体適合性合成材料で調製することができる。分子量または分子量分布の操作を用いて、種々の必要条件を満たすようにヒドロゲルの機械的強度を調節することができる。ヒドロゲルはネットワークの多孔度を調節するように設計することができ、これは放出速度を制御するために好都合に利用できる。ヒドロゲルは、所望に応じて多種多様な外形に設計することができる。必要条件に依存して、ヒドロゲルは、インビトロおよび／またはインビボでの使用のために粒子、フィルム、コーティング、円柱および平板などの種々の幾何学的形状に調製することができる。
【００８０】
ヒドロゲルは、ポリウレタン、シリコーン、シリコーンとポリウレタンのコポリマー、ポリイソブチレンおよびポリイソプレンなどのポリオレフィン、ニトリル、ネオプレン、コラーゲン、アルギン酸塩等を含むがこれらに限定されない、多種多様な生体適合性ポリマー材料から形成することができる。例えば、適切なヒドロゲルは、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸およびポリ（アクリロニトリル−アクリル酸）などのアクリルアミド、ポリウレタン、ポリエチレングリコール、ポリ（Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）などのアクリレートおよびＮ−ビニルピロリドンとアクリレートのコポリマー、Ｎ−ビニルラクタム、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、アクリルアミド、ポリウレタン、ポリアクリロニトリル、ポロキサマー、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドコポリマー、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（ビニルメチルエーテル）、ポリ（ＮＩＰＡＡｍ−コ−ＰＥＧ）等から形成することができる。
【００８１】
適切なヒドロゲルは、疎水性ポリエステル（Ａ−ブロック）と親水性ポリエーテルを含有するＡＢＡトリブロック、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ブロック−エチレンオキシド−ブロック−Ｄ，Ｌ−ラクチド）ＰＬＡ−ＰＥＯ−ＰＬＡのトリブロックコポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−ブロック−エチレンオキシド−ブロック−Ｌ−ラクチド）ＰＬＬＡ−ＰＥＯ−ＰＬＬＡのトリブロックコポリマー、ポリ［（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コグリコリド）−ブロック−エチレンオキシド−ブロック−（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コグリコリド）］ＰＬＧＡ−ＰＥＯ−ＰＬＧＡのトリブロックコポリマー、ポリ［（Ｌ−ラクチド−コグリコリド）−ブロック−エチレンオキシド−ブロック−（Ｌ−ラクチド−コグリコリド）］ＰＬＬＧＡ−ＰＥＯ−ＰＬＬＧＡのトリブロックコポリマー、ポリ［（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コグリコリド）−ブロック−エチレンオキシド−ブロック−（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）］ＰＬＧＡ−ＰＥＯ−ＰＬＧＡのトリブロックコポリマー、ポリ（ε−カプロラクトン−ブロック−エチレンオキシド−ブロック−ε−カプロラクトン）ＰＣＬ−ＰＥＯ−ＰＣＬのトリブロックコポリマー、ポリ［（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−ε−カプロラクトン）−ブロック−エチレンオキシド−ブロック−（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−ε−カプロラクトン）］ＰＬＣ−ＰＥＯ−ＰＬＣのトリブロックコポリマーから形成することができる。出願人は、当業者に認識される任意の他のトリブロックコポリマーも本発明のために使用し得ると考える。
【００８２】
ヒドロゲルは天然生体分子で調製することができる。例えば、適切な天然ヒドロゲルは、ゼラチン、アガロース、アミラーゼ、アミロペクチン、メチルセルロースなどのセルロース誘導体、ヒアルロナン、キトサン、カラゲナン、コラーゲン、Ｇｅｌｌａｎ（登録商標）、アルギン酸塩および他の天然由来のポリマーから形成することができる。例えば、コラーゲンを使用してヒドロゲルを形成することができる。コラーゲンは、組織再生およびリモデリングを誘導するための細胞浸潤足場として使用できる人工細胞外マトリックスを創製するのに使用することができる。適切な天然ヒドロゲルにはアルギン酸塩も含まれる。アルギン酸塩は、藻類から抽出されるまたは細菌によって産生される天然多糖類である。アルギン酸塩は、１，４−結合β−Ｄ−マンヌロン酸残基およびα−Ｌ−グルロン酸残基から成る直鎖アニオン性ポリマーであり得る。１つの実施形態では、生体適合性アルギン酸塩は二価カチオン（例えばＣａ2+）の存在下でヒドロゲルを形成する。したがって、アルギン酸塩ヒドロゲルの合成は、放出が制御されるべきタンパク質がその天然の機能を保持する生理的条件下で実施することができる。アルギン酸塩ヒドロゲルは、官能基化アプタマー被覆ビーズの封入のために使用することができ、また組織再生のためのタンパク質の制御放出ならびにインビトロおよびインビボでのタンパク質送達において使用することができる。別の実施形態では、アガロースを使用してヒドロゲルを形成することができる。
【００８３】
ヒドロゲルは、生物医学適用を有する薬物送達ビヒクルとして広く使用されている（Ｒｏｙ，Ｉ．；Ｇｕｐｔａ，Ｍ．Ｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００３，１０，１１６１−１１７１）。特定の誘因に応答する「スマートヒドロゲル」を合成して、特異的に標的化された部位にゲスト薬物を送達し、放出することができる（Ｂａｊｐａｉ，Ａ．Ｋ．；Ｓｈｕｋｌａ，Ｓ．Ｋ．；Ｂｈａｎｕ，Ｓ．；Ｋａｎｋａｎｅ，Ｓ．Ｐｒｏｇ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．２００８，３３，１０８８−１１１８；Ｇｕｐｔａ，Ｐ．；Ｖｅｒｍａｎｉ，Ｋ．；Ｇａｒｇ，Ｓ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ  ２００２，７，５６９−５７９；Ｑｉｕ，Ｙ．；Ｐａｒｋ，Ｋ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．２００１，５３，３２１−３３９；Ｋｉｙｏｎａｋａ，Ｓ．；Ｓｕｇｉｙａｓｕ，Ｋ．；Ｓｈｉｎｋａｉ，Ｓ．；Ｈａｍａｃｈｉ，Ｉ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００２，１２４，１０９５４−１０９５５；Ｍａｎｏ，Ｊ．Ｆ．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００８，１０，５１５−５２７）。特に、異なる細胞型および細胞区画は個別のｐＨを有しており、これがペイロードの部位特異的放出を可能にするので、ｐＨ応答性ヒドロゲルは薬物送達において頻繁に使用される。例えば、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のｐＨは、典型的には約７．４であるが、サイトゾルはより低いｐＨを有し、癌細胞も正常細胞より酸性である（Ｉｎｇｂｅｒ，Ｄ．Ｅ．；Ｐｒｕｓｔｙ，Ｄ．；Ｆｒａｎｇｉｏｎｉ，Ｊ．Ｖ．；Ｃｒａｇｏｅ，Ｅ．Ｊ．；Ｌｅｃｈｅｎｅ，Ｃ．；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｍ．Ａ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９０，１１０，１８０３−１８１１；Ｗｅｉ，Ｆ．；Ｚｈｕｙｕａｎ，Ｗ．；Ｓｈｅｎｆｅｉ，Ｚ．；Ｈｕｉ，Ｃ．；Ｄａｎ，Ｚ．；Ｙｕａｎ，Ｚ．；Ｙｉｐｉｎｇ，Ｃ．Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．２０１４，５７，１０−１５）。さらに、胃のｐＨは、胃が空であるか食物が摂取されているかによってｐＨ２から４の間である（Ｑｉｕ，Ｙ．；Ｐａｒｋ，Ｋ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．２００１，５３，３２１−３３９）。それゆえｐＨ応答性ヒドロゲルに関する研究は重要な関心対象分野である。ｐＨ応答性ヒドロゲルを使用した治療薬の経口投与に向けて重要な研究が報告されている。これらのヒドロゲルは、抗生物質、治療用タンパク質およびペプチドの部位特異的送達のために胃を標的とする（Ｌｏｗｍａｎ，Ａ．Ｍ．；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ，Ｍ．；Ｋａｊｉｔａ，Ｍ．；Ｎａｇａｉ，Ｔ．；Ｐｅｐｐａｓ，Ｎ．Ａ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１９９９，８８，９３３−９３７；Ｐａｔｅｌ，Ｖ．；Ａｍｉｊｉ，Ｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１９９６，１３，５８８−５９３；Ｂｅｓｈｅｅｒ，Ａ．；Ｗｏｏｄ，Ｋ．Ｍ．；Ｐｅｐｐａｓ，Ｎ．Ａ．；Ｍａｄｅｒ，Ｋ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ  ２００６，１１１，７３−８０；Ｇｕｏ，Ｂ．−Ｌ．；Ｇａｏ，Ｑ．−Ｙ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２００７，３４２，２４１６−２４２２；Ｎｈｏ，Ｙ．Ｃ．；Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｅ．；Ｋｉｍ，Ｈ．Ｉ．；Ｈｗａｎｇ，Ｔ．Ｓ．Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＆  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｈｙｓ���ｃｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｂ−Ｂｅａｍ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ａｔｏｍｓ  ２００５，２３６，２８３−２８８．Ｓａｊｅｅｓｈ，Ｓ．；Ｓｈａｒｍａ，Ｃ．Ｐ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｔ  Ｂ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００６，７６Ｂ，２９８−３０５；Ｓｈａｎｔｈａ，Ｋ．Ｌ．；Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｄ．Ｒ．Ｋ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２０００，２０７，６５−７０）。標的部位は胃であるので、ヒドロゲルはｐＨ３より酸性の条件下でそれらの治療薬だけを放出しなければならない。この放出は、ヒドロゲルの膨張の度合いを変えることによってまたは架橋剤を開裂することによって生じる。
【００８４】
ヒドロゲルは、多量の水を吸収することができる三次元の親水性または両親媒性ポリマーネットワークと定義され得る。ネットワークはホモポリマーまたはコポリマーから成り、共有結合による化学的架橋または物理的（イオン性、疎水性相互作用、絡み合い）架橋の存在に起因して不溶性である。架橋はネットワーク構造および物理的完全性を提供する。ヒドロゲルは水と熱力学的適合性を示し、このことが水性媒質中でヒドロゲルが膨張するのを可能にする。ネットワークの鎖は、細孔が存在し、これらの相当な割合の細孔が１ｎｍ〜１０μｍの寸法であるような方法で結合されている。
【００８５】
「架橋」または「架橋剤」という用語は、本明細書で使用される場合、共有結合またはイオン結合のいずれかを介して少なくとも１つの第二の分子を少なくとも１つの第三の分子に連結することができる分子を指す。１つの実施形態では、第二または第三の分子の少なくとも１つはポリマーである。１つの実施形態では、架橋剤はアームＰＥＧまたは星型ＰＥＧである。
【００８６】
「トレハロース架橋剤」という用語は、本明細書で使用される場合、少なくとも１個のトレハロース基を含有する架橋剤を指す。
【００８７】
「ボロン酸ベースの架橋剤」という用語は、本明細書で使用される場合、ボロン酸と別の化合物との反応から生成される化合物または架橋剤を指す。前記の別の化合物は、一般に架橋のための典型的な構造、例えばマルチアームＰＥＧ構造を有する。
【００８８】
「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」という用語は、本明細書で使用される場合、工業生産から医学まで多くの適用を有するポリエーテル化合物を指す。ＰＥＧの構造は、Ｈ−（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）n−ＯＨである。
【００８９】
本明細書で使用される「アームＰＥＧ」または「分枝ＰＥＧ」または「マルチアームＰＥＧ」という用語は、中心コア基から広がる３〜１０本のＰＥＧ鎖を有するＰＥＧを指す。「星型ＰＥＧ」という用語は、中心コア基から広がる１０〜１００本のＰＥＧ鎖を有するＰＥＧを指す。
【００９０】
「トレハロースベースのモノマー」という用語は、本明細書で使用される場合、モノマーの側鎖に共有結合した少なくとも１個のトレハロースを含むモノマーを指す。安定性を維持しつつ生体分子をインビボで制御送達することは、それらの効率的な治療的使用のために必須である。多種多様な生物医学分野における適用のためのボロン酸含有ヒドロゲルへの関心が高まりつつある（Ｃａｍｂｒｅ，Ｊ．Ｎ．；Ｓｕｍｅｒｌｉｎ，Ｂ．Ｓ．Ｐｏｌｙｍｅｒ  ２０１１，５２，４６３１−４６４３；Ｇｕａｎ，Ｙ．；Ｚｈａｎｇ，Ｙ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．２０１３，４２，８１０６−８１２１；Ｒａｖａｉｎｅ，Ｖ．；Ａｎｃｌａ，Ｃ．；Ｃａｔａｒｇｉ，Ｂ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ  ２００８，１３２，２−１１）。ボロン酸は１，２−または１，３−ジオールと可逆的共有結合複合体を形成するので、ヒドロゲルへのその組込みはグルコース応答性材料をもたらす（Ｋｕｉｖｉｌａ，Ｈ．Ｇ．；Ｋｅｏｕｇｈ，Ａ．Ｈ．；Ｓｏｂｏｃｚｅｎｓｋｉ，Ｅ．Ｊ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９５４，１９，７８０−７８３；Ｓｐｒｉｎｇｓｔｅｅｎ，Ｇ．；Ｗａｎｇ，Ｂ．Ｈ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ２００２，５８，５２９１−５３００；Ｙａｎ，Ｊ．；Ｓｐｒｉｎｇｓｔｅｅｎ，Ｇ．；Ｄｅｅｔｅｒ，Ｓ．；Ｗａｎｇ，Ｂ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ２００４，６０，１１２０５−１１２０９；Ｂａｒｋｅｒ，Ｓ．Ａ．；Ｃｈｏｐｒａ，Ａ．Ｋ．；Ｈａｔｔ，Ｂ．Ｗ．；Ｓｏｍｅｒｓ，Ｐ．Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１９７３，２６，３３−４０）。このグルコース応答性部分により、これらのヒドロゲルはインスリン送達のための装置として一般的に使用されている（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ａ．；Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｋ．；Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｒ．；Ｋａｔａｏｋａ，Ｋ．；Ａｏｙａｇｉ，Ｔ．；Ｍｉｙａｈａｒａ，Ｙ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１０，４６，２２０３−２２０５；Ｗａｎｇ，Ｄ．；Ｌｉｕ，Ｔ．；Ｙｉｎ，Ｊ．；Ｌｉｕ，Ｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０１１，４４，２２８２−２２９０；Ａｎｃｌａ，Ｃ．；Ｌａｐｅｙｒｅ，Ｖ．；Ｇｏｓｓｅ，Ｉ．；Ｃａｔａｒｇｉ，Ｂ．；Ｒａｖａｉｎｅ，Ｖ．Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２０１１，２７，１２６９３−１２７０１；Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ａ．；Ｉｓｈｉｉ，Ｔ．；Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｊ．；Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｈ．；Ｋａｔａｏｋａ，Ｋ．；Ｍｉｙａｈａｒａ，Ｙ．Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ−Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ２０１２，５１，２１２４−２１２８；Ｚｈａｎｇ，Ｃ．；Ｌｏｓｅｇｏ，Ｍ．Ｄ．；Ｂｒａｕｎ，Ｐ．Ｖ．Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．２０１３，２５，３２３９−３２５０；Ｙｕａｎ，Ｗ．；Ｓｈｅｎ，Ｔ．；Ｗａｎｇ，Ｊ．；Ｚｏｕ，Ｈ．Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１４，５，３９６８−３９７１；Ｙａｎｇ，Ｔ．；Ｊｉ，Ｒ．；Ｄｅｎｇ，Ｘ．−Ｘ．；Ｄｕ，Ｆ．−Ｓ．；Ｌｉ，Ｚ．−Ｃ．Ｓｏｆｔ  Ｍａｔｔｅｒ  ２０１４，１０，２６７１−２６７８）。これらのインスリン送達ボロン酸ヒドロゲルの大部分は、グルコースの存在下で膨張して、それによりインスリンを放出するヒドロゲルを形成するためにボロン酸と架橋可能なモノマーを共���合させることによって調製された。
【００９１】
「ワンポット合成」という用語は、本明細書で使用される場合、化学反応の効率を改善する方法を指し、これにより反応物はただ１つの反応器中で連続的な化学反応に供される。これは、中間体化合物の長くて面倒な分離工程および精製を回避することで、化学的収率を増大させ、廃棄物を低減しつつ時間と資源を節約するので、化学者には非常に望ましい。
本発明
【００９２】
本発明は、広範囲の医学、薬学および農業適用に適した生体分子（例えばペプチドまたはタンパク質）の放出を制御するための新規生体適合性親和性の多孔性マトリックス組成物、製剤および方法を開示する。本発明は、一般にペプチドまたはタンパク質放出のための製造が容易で再現可能な組成物および製剤を提供する技術に関する。１つの実施形態では、新規生体適合性親和性の多孔性マトリックス組成物はヒドロゲルである。
【００９３】
具体的には、本発明は、ヒドロゲル、特にトレハロースベースのヒドロゲルに関する。１つの実施形態では、本発明は、ペプチドまたはタンパク質を保護し、制御放出するためのヒドロゲルに関する。１つの具体的な実施形態では、ペプチドまたはタンパク質はインスリンである。
【００９４】
インスリンが貯蔵の間に温度変化にさらされると、健康合併症を生じさせるタンパク質の不活性化をもたらし得るという事実を考慮して、本発明は、高温下でインスリンを安定化するためのヒドロゲルおよびヒドロゲルを使用する方法を開示する。具体的には、本発明は、インスリンの熱および機械的安定性を高めるヒドロゲルおよびヒドロゲルを使用する方法を開示する。同時に、本発明は、インスリンを制御放出するヒドロゲルおよびヒドロゲルを使用する方法も開示する。
【００９５】
例えば、本発明は、インスリン分子を安定化するためのトレハロースベースのヒドロゲルを作製する方法を開示し、ここでインスリン分子はヒドロゲルに共有結合または非共有結合によって結合されていてもよい。そのようなヒドロゲルは周囲環境、例えばグルコースの存在に応答性である。したがって、周囲環境、例えばグルコース濃度を制御することにより、インスリンは本発明のヒドロゲルから制御された方法で放出され得る。
【００９６】
別の実施形態では、ペプチドまたはタンパク質はフィターゼなどの飼料用酵素である。
【００９７】
フィチン酸の変換は、ブタ、家禽および魚類などの単胃種にとってトウモロコシ、ダイズおよびコムギなどの一般的な飼料穀物中に存在するこの貯蔵型のリン酸塩を利用するために必須であるという事実を考慮して、本発明は、高温（例えば室温より高い温度）下での酵素（例えばフィターゼ）の安定化のためのヒドロゲルおよびヒドロゲルを使用する方法を開示する。
【００９８】
１つの具体的な実施形態では、本発明は、最小限の精製手順で市販の出発物質から２段階で合成することができるトレハロースベースのヒドロゲルに関する。１つの実施形態では、単官能性および多官能性トレハロースモノマーを、酸化還元によって開始されるラジカル重合によって架橋して、ヒドロゲルを形成し得る。１つの具体的な実施形態では、動物用原料中で利用される重要な酵素であるフィターゼを用いて、熱に対してタンパク質を安定化するトレハロースヒドロゲルの有効性を示し得る。
【００９９】
例えば、ヒドロゲルへのフィターゼ溶液の添加は、共焦点顕微鏡検査によって確認されたように酵素の内在化を生じさせた。ヒドロゲル中のフィターゼは、９０℃での加熱後、ヒドロゲルが存在しない場合の３９％の活性と比較して１００％の活性を保持した。酵素はまた、ヒドロゲルから回収することもできた。出願人は、本明細書で報告するトレハロースヒドロゲル合成が多種多様な酵素の熱安定化のために容易に拡大可能であるはずだと考える。
【０１００】
具体的には、以下で述べるように、出願人は、フィターゼが、トレハロースヒドロゲルの存在下で９０℃に加熱した場合、１００％の活性を保持することを見出した。実施例３は、ペプチドまたはタンパク質、例えばフィターゼを保護し、制御放出するためのヒドロゲルの詳細な実験を示す。
【０１０１】
１つの態様では、本発明は、トレハロースベースのヒドロゲルを創製するための方法を開示する。そのようなトレハロースベースのヒドロゲルは、タンパク質を安定化し、送達するために使用し得る。１つの具体的な実施形態では、タンパク質はインスリンである。１つの実施形態では、タンパク質（例えばインスリン）を、トレハロースベースのヒドロゲルの調製の前に添加し得る。１つの実施形態では、タンパク質（例えばインスリン）を、トレハロースベースのヒドロゲルの調製の間に添加し得る。１つの実施形態では、タンパク質（例えばインスリン）を、トレハロースベースのヒドロゲルの調製後に添加し得る。
【０１０２】
１つの具体的な実施形態では、タンパク質はフィターゼなどの飼料用酵素である。１つの実施形態では、酵素（例えばフィターゼ）を、トレハロースベースのヒドロゲルの調製の前に添加し得る。１つの実施形態では、酵素（例えばフィターゼ）を、トレハロースベースのヒドロゲルの調製の間に添加し得る。１つの実施形態では、酵素（例えばフィターゼ）を、トレハロースベースのヒドロゲルの調製後に添加し得る。
【０１０３】
１つの実施形態では、トレハロースベースのヒドロゲルを創製する方法であって、（ａ）トレハロースホモポリマーまたはコポリマーを形成する段階；（ｂ）架橋剤を調製する段階；および（ｃ）トレハロースホモポリマーまたはコポリマーを架橋剤と反応させ、トレハロースベースのヒドロゲルを形成する段階を含む方法。
【０１０４】
本発明の方法の１つの実施形態では、トレハロースベースのヒドロゲルは、タンパク質を安定化し、送達するために使用される。１つの実施形態では、タンパク質を、トレハロースベースのヒドロゲルの調製の前に添加し得る。１つの実施形態では、タンパク質を、トレハロースベースのヒドロゲルの調製の間に添加し得る。１つの実施形態では、タンパク質を、トレハロースベースのヒドロゲルの調製後に添加し得る。
【０１０５】
１つの実施形態では、トレハロースホモポリマーまたはコポリマーは、Ｒ5−［Ｒ1Ｒ2Ｃ−ＣＲ3Ｒ4］n−Ｒ6の一般構造を有し、式中、Ｒ1〜Ｒ4は、水素または少なくとも１個の炭素原子を含む側鎖から独立して選択され、かつ、Ｒ1〜Ｒ4の少なくとも１つは、−Ｌ−トレハロース［ここでＬは、トレハロースのヒドロキシル基（−ＯＨ）の少なくとも１つを介してトレハロースをモノマーに連結するリンカー分子である］を含む側鎖であり、ならびにＲ5およびＲ6は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、−Ｃ（ＣＮ）（アルキル）2、−Ｓ2Ｃ−Ｓ−アルキル、−Ｃ（ＣＯ）（アルキル）−（ＯＣＨ2ＣＨ2）n−ＣＯＯ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ−アルキル（ｎ＝１〜１０）および生体分子から成る群より独立して選択される。
【０１０６】
出願人の以前の特許出願、国際公開第２０１３／１１２８９７号は、トレハロースホモポリマーまたはコポリマーを作製する方法を開示した。出願人は、他のトレハロースホモポリマーまたはコポリマーも本発明に適し得ると考える。
【０１０７】
１つの実施形態では、架橋剤はポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体のいずれかである。好ましくは、架橋剤は、複数のアームを有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体である。１つの例示的なポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体をスキーム１に示す。
【０１０８】
１つの実施形態では、本発明における架橋剤はボロン酸ベースの化合物である。ボロン酸は生体適合性であり、グルコースに可逆的に結合することができ、ボロン酸をインスリン送達のための有望な成分にしている。ボロン酸のジオールへの結合はｐＨ依存性であり、ボロン酸塩形態は主として糖類への結合の役割を担う。ボロン酸に基づく架橋剤は、トレハロースポリマー中のジオールに結合することができる。グルコースの添加後、グルコースは、ボロン酸塩とのそのより高い結合親和性により、トレハロースポリマーに取って代わることができる。
【０１０９】
１つの実施形態では、本発明に適するボロン酸はＲ−Ｂ（ＯＨ）2の構造を有し、式中、Ｒ＝アリール、アルキルまたはアルケニルである。１つの好ましい実施形態では、Ｒ＝アリールである。出願人は、ヘテロアリール対応物を含む任意の構造的に類似の化合物も本発明に使用し得ると考える。
【０１１０】
１つの具体的な実施形態では、ボロン酸ベースの架橋剤はポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）−ボロン酸架橋剤である。
【０１１１】
例えば、８アームＰＥＧアミンを、還元的アミノ化によってボロン酸で官能基化してもよい。スキーム１は、１つの例示的なボロン酸ベースの架橋剤を形成するためのボロン酸と８アームＰＥＧアミンとの反応の概要を示す。実施例１は、スキーム１の反応のための詳細な材料および合成手順を含む。
【０１１２】
【化６】
0006770508.tif 000007
【０１１３】
出願人は、８アームＰＥＧアミンと類似の構造を有する他のＰＥＧ化合物を使用して、適切なボロン酸ベースの架橋剤を生成し得ると考える。例えば、任意のアームのＰＥＧ（例えば２、３、４、５、６、７、９または１０アームＰＥＧ）を本発明に使用し得る。例えば、任意の星型ＰＥＧ（例えば１０〜１０００、好ましくは１０〜５００、より好ましくは１０〜１００アームＰＥＧ）も本発明に使用し得る。
【０１１４】
１つの実施形態では、本発明のトレハロースベースのヒドロゲルは、任意のトレハロースホモポリマーまたはコポリマーとボロン酸ベースの架橋剤との反応によって生成してよい。国際公開第２０１３／１１２８９７号に記載されているもののような任意のトレハロースホモポリマーまたはコポリマーが本発明に適し得る。スキーム１と同様にして合成することができる任意のボロン酸ベースの架橋剤が本発明に適し得る。
【０１１５】
本発明に使用できるトレハロースホモポリマーまたはコポリマーは、任意のトレハロースベースのポリマー化合物を含み得る。１つの実施形態では、トレハロースホモポリマーまたはコポリマーは、ＰＥＧベースのポリマーまたはポリスチレニル骨格のポリマーまたはポリメタクリレートベースのポリマーまたはポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）ベースのポリマーであり得る。
【０１１６】
スキーム２は、１つの例示的なトレハロースホモポリマーまたはコポリマーであるポリ（スチレニルエーテルトレハロース）（ポリ（ＳＥＴ））と１つの例示的なボロン酸ベースの架橋剤、８アームＰＥＧボロン酸との、ポリ（ＳＥＴ）−ボロン酸ヒドロゲルを形成する反応を示す。実施例１は、スキーム２の反応のための詳細な材料および合成手順を含む。
【０１１７】
【化７】
0006770508.tif 000008
【０１１８】
１つの実施形態では、本発明のトレハロースベースのヒドロゲルは生理的条件下で合成し得る。例えば、トレハロースホモポリマーまたはコポリマー（例えばポリ（スチレニルエーテルトレハロース）（ポリ（ＳＥＴ））とボロン酸ベースの架橋剤との反応は、中性ｐＨ（例えばｐＨ７．４）および室温の条件下で起こり得る。１つの実施形態では、反応は速やかに、例えば数分以内に起こる。
【０１１９】
１つの実施形態では、反応におけるトレハロースホモポリマーまたはコポリマー対ボロン酸ベースの架橋剤の比率は約１：１である。
【０１２０】
１つの実施形態では、本発明のトレハロースベースのヒドロゲルは、周囲環境、例えばグルコースの存在に応答性であり得る。
【０１２１】
実施例１に示すように、出願人は、ポリ（ＳＥＴ）−ボロン酸ヒドロゲルがグルコースに応答性であることを明らかにする。図３は、グルコースの添加が、フェニルボロン酸に対するグルコースのより高い結合親和性に起因するグルコース−ボロン酸複合体の競合的置換により、トレハロース（ポリマー）とボロン酸（架橋剤）との間のボロン酸エステル結合の脱架橋をもたらしたことを示す。
【０１２２】
図４は、グルコースの存在下でヒドロゲルがインスリンをより迅速に放出したことを示す。例えば、１時間後、１０ｍｇ／ｍＬグルコース溶液中のヒドロゲルは完全に溶解して１００％のインスリン放出を生じたが、同じ期間に５ｍｇ／ｍＬおよび０ｍｇ／ｍＬグルコース溶液中ではそれぞれ８０％および４９％のインスリンが放出された。そこで、出願人は、これらのゲルがインスリン送達適用に利用できることを明らかにする。
【０１２３】
図５は、グルコース応答性トレハロースヒドロゲルが加熱ストレスに対してインスリンを安定化するのに有効であることを示す。例えば、出願人は、トレハロースベースのヒドロゲルがインスリンを著明に安定化し、９０℃に３０分間加熱した後にもとのタンパク質の６３％が検出されたことを明らかにする。インスリンはまた、８アームＰＥＧボロン酸単独の存在下でも部分的に安定化された（３９％シグナル）。そこで、出願人はまた、トレハロースベースのヒドロゲルがインスリンを安定化するのに利用できることも示した。
【０１２４】
１つの態様では、本発明は、上記で論じたトレハロースベースのヒドロゲルを使用することによってタンパク質（例えばインスリンまたは動物飼料安定剤）を安定化し、送達する方法を開示する。
【０１２５】
１つの実施形態では、タンパク質を安定化し、送達する方法であって、ａ）本明細書で開示されるいずれかの方法に従ってトレハロースベースのヒドロゲルを調製する段階；ｂ）ヒドロゲル形成の時点または形成後のいずれかにトレハロースベースのヒドロゲルにタンパク質を添加し、タンパク質とトレハロースベースヒドロゲルの複合体を形成する段階；およびｃ）タンパク質とトレハロースベースヒドロゲルの複合体に糖溶液を添加するかまたは溶液のｐＨを低下させて、複合体からタンパク質を放出させる段階を含む方法。
【０１２６】
１つの実施形態では、本発明は、適切な量のトレハロースベースのヒドロゲルを生体分子と混合することにより、生体分子を環境ストレッサーに対して著明に安定化する、本明細書で論じるトレハロースベースのヒドロゲルの組成物および適用の方法に関する。この実施形態では、トレハロースベースのヒドロゲルと生体分子との間の化学結合の形成は必要ない。トレハロースベースのヒドロゲルは生体分子に共有結合されるのではなく、賦形剤として添加される。
【０１２７】
トレハロースベースのヒドロゲルの適切な濃度は、５０μｇ／ｍＬ、７５μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、７００μｇ／ｍＬ、９００μｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬまたは５ｍｇ／ｍＬであってよく、好ましくは１００μｇ／ｍＬであってよい。ポリマーまたはコポリマー対生体分子の適切な比率は、１：１、１０：１、２０：１、５０：１、１００：１または２００：１であってよく、好ましくは５０：１または１００：１であってよい。１つの実施形態では、ポリマーまたはコポリマー対生体分子の好ましい比率は１：１であってよい。
【０１２８】
別の態様では、本発明は、ｐＨ応答性トレハロースヒドロゲルを作製する方法を開示する。そのようなトレハロースヒドロゲルは、特定の誘因に応答する「スマートヒドロゲル」のために使用してよく、スマートヒドロゲルを合成して、特異的に標的化された部位にゲスト薬物を送達し、放出することができる。１つの実施形態では、トレハロースヒドロゲルは送達ビヒクルであるのみならず、貯蔵および輸送の間の環境ストレッサーに対する安定剤でもある。
【０１２９】
１つの実施形態では、本発明のｐＨ応答性トレハロースヒドロゲルは、トレハロースベースの架橋剤の存在下でトレハロースベースのモノマーを重合させることによって生成し得る。１つの実施形態では、重合反応は、フリーラジカル重合またはレドックス開始重合のいずれかである。
【０１３０】
１つの実施形態では、ｐＨ応答性トレハロースベースのヒドロゲルを創製する方法であって、ａ）トレハロース架橋剤を調製する段階；ｂ）トレハロースベースのモノマーを調製する段階；およびｃ）トレハロース架橋剤を１つのトレハロースベースのモノマーと反応させ、トレハロースベースのヒドロゲルを形成する段階を含む方法。
【０１３１】
１つの実施形態では、トレハロース架橋剤は、トレハロースベースのモノマーを調製するのに使用するのと同様の方法を用いて合成する。出願人の以前の特許出願、国際公開第２０１３／１１２８９７号は、本発明に使用できる多くのトレハロースベースのモノマーを開示した。
【０１３２】
スキーム３は例示的な反応を示す。出願人は、アセタールモノマーとトレハロースとの多くの比率を、トレハロース架橋剤を生成するのに使用し得ると考える。１つの具体的な実施形態では、モノマーに対する二官能基化架橋剤の収率を高めるため、アセタールとトレハロースのモル比は１より大きい。例えば、２．２モル当量の４−ビニルベンズアルデヒドジエチルアセタールをトレハロースに添加した（スキーム３）。ビス−ＳＡＴ架橋剤を、トランスアセタール化反応を介して高収率（５５％〜７２％）で調製した。
【０１３３】
【化８】
0006770508.tif 000009
【０１３４】
１つの実施形態では、トレハロースベースのモノマーを調製する。出願人の以前の特許出願、国際公開第２０１３／１１２８９７号は、本発明に使用できる多くのトレハロースベースのモノマーを開示した。
【０１３５】
１つの具体的な実施形態では、トレハロース架橋剤は、トレハロースベースのモノマーを調製するのに使用するものと同じ化学物質を用いて合成する。例えば、スチレニルアセタールトレハロースモノマー（ＳＡＴ）およびスチレニルエーテルトレハロースモノマー（ＳＥＴ）を使用してｐＨ応答性トレハロースベースヒドロゲルを調製し得る。
【０１３６】
１つの実施形態では、トレハロース架橋剤およびトレハロースベースのモノマーを、当業者に認識される任意の適切な重合反応下で共重合させ得る。１つの実施形態では、トレハロース架橋剤およびトレハロースベースのモノマーを、フリーラジカル重合を介して共重合させ得る。フリーラジカル重合は、熱、酸化還元、光等を含む多くの方法によって開始させ得る。
【０１３７】
１つの具体的な実施形態では、トレハロース架橋剤およびトレハロースベースのモノマーを、熱開始フリーラジカル重合またはレドックス開始フリーラジカル重合または光開始フリーラジカル重合のいずれかを介して共重合させ得る。
【０１３８】
例えばスキーム４および５に示すように、ビス−ＳＡＴ架橋剤を、熱開始またはレドックス開始フリーラジカル重合を介して共重合させ、ＳＡＴおよびＳＥＴヒドロゲルの両方を形成し得る。実施例２は反応の詳細な合成手順を概説する。
【０１３９】
【化９】
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【０１４０】
【化１０】
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【０１４１】
１つの実施形態では、ｐＨ応答性トレハロースヒドロゲルは、タンパク質送達ビヒクルならびに、例えば貯蔵および輸送の間の環境ストレッサーに対する、タンパク質安定剤の両方であり得る。
【０１４２】
１つの具体的な実施形態では、ｐＨ応答性トレハロースヒドロゲルは、ｐＨが５より大きい場合、溶液中でゲル化したままであり得る。別の実施形態では、ｐＨ応答性トレハロースヒドロゲルは、ｐＨが５より小さい場合、溶液中に溶解する。
【０１４３】
実施例２は、例示的なｐＨ応答性トレハロースヒドロゲルおよびそれらの特性を示す。例えば、図９は、例示的なｐＨ応答性トレハロースヒドロゲルとしてポリ（ＳＡＴ）を示す。図９に示すように、ポリ（ＳＡＴ）は一連の酸性ｐＨ中で溶解して、ポリマー骨格中のトレハロースとペンダント部分間のアセタール結合の加水分解を誘導した。ポリマーを１０％ＴＦＡで処理した場合、トレハロースプロトンに対応する1Ｈ  ＮＭＲピーク（図９；上；３．０〜５．５ｐｐｍ）は消失し、アルデヒドピークが見えるようになった。生じたポリマーの1Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、４−ベンズアルデヒドポリマーに関して予想されたトレースと同一であると思われた（図９；下）。
【０１４４】
図１０は、ＳＥＴヒドロゲル−１という別の例示的なｐＨ応答性トレハロースヒドロゲルおよびその特性を示す。ポリ（ＳＡＴ）のヒドロゲルは水性緩衝液に溶解しないが、１０％ＴＦＡ中のＳＥＴヒドロゲル−１は３分以内に完全に溶解した。ゲルは、２５℃で４８時間のインキュベーション後でもｐＨ７．４およびｐＨ５の両方で残存し、アセタール架橋剤結合を逆転させるには低いｐＨが必要であることを示唆した。
【０１４５】
１つの実施形態では、本発明のｐＨ応答性トレハロースヒドロゲルは、タンパク質もしくはペプチド治療薬の胃への送達のためのビヒクルとしてまたは酸誘発性化学合成および水精製において用いられる酵素のための安定剤として使用し得る。
【０１４６】
１つの実施形態では、タンパク質はトレハロースベースのヒドロゲルの調製の前に添加し得る。１つの実施形態では、タンパク質はトレハロースベースのヒドロゲルの調製の間に添加し得る。１つの実施形態では、タンパク質はトレハロースベースのヒドロゲルの調製後に添加し得る。
【０１４７】
１つの実施形態では、タンパク質は酵素であり得る。
【０１４８】
１つの実施形態では、タンパク質は、熱に暴露された場合に安定化される。１つの実施形態では、タンパク質は４℃より上の温度で安定化される。１つの好ましい実施形態では、タンパク質は７０〜９０℃で安定化される。
【０１４９】
１つの態様では、本発明は、タンパク質の熱安定性を高める効率的な賦形剤としての天然二糖類トレハロースに基づくヒドロゲル系に関する。１つの実施形態では、トレハロースヒドロゲルは、簡単な精製段階を用いてトレハロースから２段階だけで調製でき、これをタンパク質の安定化のために直接工業的に適用することができる。
【０１５０】
１つの実施形態では、トレハロースベースのヒドロゲルを創製する方法であって、ａ）トレハロース架橋剤およびトレハロースベースのモノマーを調製する段階；ならびにｂ）トレハロース架橋剤をトレハロースベースのモノマーと反応させ、トレハロースベースのヒドロゲルを形成する段階を含む方法。
【０１５１】
１つの実施形態では、トレハロース架橋剤およびトレハロースベースのモノマーは同じ反応を介して生成される。１つの実施形態では、トレハロース架橋剤は、二置換および２より高い置換度（ＤＳ）を有する任意の他の化合物を含んでよい。
【０１５２】
１つの実施形態では、同じ反応から生成されたトレハロース架橋剤およびトレハロースベースのモノマーは精製しなくてもよい。トレハロース架橋剤およびトレハロースベースのモノマーを含有する反応混合物は、ゲル化のために直接使用し得る。
【０１５３】
１つの実施形態では、トレハロースベースのヒドロゲルはワンポット合成を含み得る。具体的には、トレハロース架橋剤およびトレハロースベースのモノマーをワンポット反応から生成し得る。
【０１５４】
【化１１】
0006770508.tif 000012
【０１５５】
【化１２】
0006770508.tif 000013
【０１５６】
スキーム６および７は、ワンポット合成を介してトレハロースベースのヒドロゲルを作製するための１つの例示的な反応を示す。実施例３は、トレハロースベースのヒドロゲルを生成するための詳細な合成手順を示す。スチレンベースのモノマーを一例として使用したが、当業者に認識されるように本発明は他のモノマーにも適用できる。例えば、メタクリレートも本発明において使用し得る。
【０１５７】
スキーム６に示すように、トレハロースベースのモノマー（例えばＳＥＴ）およびトレハロース架橋剤の両方をワンポット反応から生成することができる。１つの実施形態では、生じたトレハロースベースのモノマー（例えばＳＥＴ）とトレハロース架橋剤の粗混合物をジクロロメタン（ＤＣＭ）中に沈殿させ、ろ過して、ＤＭＳＯおよび高いＤＳを有するトレハロースを除去し得る。
【０１５８】
１つの実施形態では、混合物の粗生成物は、いくつかの位置異性体（例えば２、３、４および６位にスチレンを有するトレハロース）、二官能基化および三官能基化トレハロース、ならびに非修飾トレハロースを含有し得る。粗ＳＥＴをその後ゲル化のために直接使用し得る。
【０１５９】
１つの実施形態では、トレハロースベースのヒドロゲルは、１ｎｍ〜１０μｍ、好ましくは１〜５μｍの寸法である、相当な割合の細孔を示す。
【０１６０】
１つの実施形態では、トレハロースベースのヒドロゲルは、極端な熱条件に対して生体分子（例えば酵素またはフィターゼ）を安定化することができる。図１７に示すように、結果は、タンパク質の工業規模での安定化のためのトレハロースヒドロゲルの合成を示す。トレハロースベースのヒドロゲルは、簡単な合成および精製段階によって調製することができ、これは工業工程では考慮すべき重要な点である。
【０１６１】
１つの実施形態では、トレハロースベースのヒドロゲルは、ペレット化手順または他の高温工程に対して様々な酵素またはタンパク質を安定化するために使用し得る。
【０１６２】
１つの実施形態では、本発明は、タンパク質を安定化する方法であって、ａ）上記で論じたいずれかの方法に従ってトレハロースベースのヒドロゲルを調製する段階；およびｂ）ヒドロゲル形成の時点または形成後のいずれかにトレハロースベースのヒドロゲルにタンパク質を添加し、タンパク質とトレハロースベースヒドロゲルの複合体を形成する段階を含み、この段階でタンパク質が安定化される方法に関する。
【０１６３】
１つの実施形態では、タンパク質は酵素である。
【０１６４】
１つの実施形態では、タンパク質は熱の存在下で安定化される。本発明の方法は、タンパク質が熱に暴露された場合、タンパク質を安定化することができる。
【０１６５】
１つの実施形態では、タンパク質は４℃より高い温度で安定化される。１つの実施形態では、タンパク質は７０℃〜９０℃で安定化される。
【０１６６】
１つの実施形態では、タンパク質は、水で希釈することによってタンパク質とトレハロースベースヒドロゲルの複合体から放出される。１つの実施形態では、タンパク質は、溶液のｐＨ値を低下させることによってタンパク質とトレハロースベースヒドロゲルの複合体から放出される。
【０１６７】
本発明の他の実施形態および使用は、本明細書からの考察および本明細書で開示される本発明の実施から当業者には明らかである。すべての定期刊行物の引用ならびに米国／外国特許および特許出願を含む、何らかの理由により本明細書で引用されるすべての参考文献は、参照により明確におよび完全に本明細書に組み込まれる。本発明は、本明細書で例示され、説明される特定の試薬、製剤、反応条件等に限定されるのではなく、以下の特許請求の範囲に含まれるそれらの改変形態を包含することが理解される。
【実施例】
【０１６８】
［実施例１］
［タンパク質の安定化および送達のためのトレハロースヒドロゲル］
【０１６９】
［材料］
【０１７０】
すべての化学物質はＳｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈおよびＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。８アームＰＥＧアミンはＪｅｎｋｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ａｌｌｅｎ，ＴＸ）から購入した。トレハロースは、Ｔｈｅ  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）から購入し、エタノールで乾燥して、使用時まで減圧下に保持した。アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）は、使用前にアセトンから再結晶化させた。スチレニルエーテルトレハロースモノマー（ＳＥＴ）は、以前に報告された手順（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）を用いて調製した。
【０１７１】
［分析技術］
【０１７２】
ＮＭＲスペクトルはＢｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ  ５００ＭＨｚ分光計で得た。1Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、ポリマーに関しては３０秒の緩和遅延時間で取得した。
【０１７３】
ＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ  ５００ＭＨｚ分光計で記録した。ゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）は、示差屈折率検出器ＲＩＤ−１０Ａおよび２つのＰｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＰＬｇｅｌ  ５μｍ  ｍｉｘｅｄ  Ｄカラム（ガードカラム付き）を備えるＳｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣシステムで実施した。４０℃のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の臭化リチウム（０．１Ｍ）を溶媒として使用した（流量０．６ｍＬ／分）。近単分散ポリ（メチルメタクリレート）標準品（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を較正に用いた。赤外スペクトルは、ユニバーサルＡＴＲアクセサリを備えるＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｏｎｅ装置で得た。分取逆相ＨＰＬＣは、ＵＶ検出器を備えるＳｈｉｍａｄｚｕ ＨＰＬＣシステムにて、Ｌｕｎａ ５μｍ Ｃ１８  １００Ａカラム（分取：５μｍ、２５０×２１．２ｍｍ）を使用し、λ＝２１５ｎｍおよび２５４ｎｍで観測しながら実施した。移動相として無勾配溶媒系（水：メタノール＝５０：５０）を流速１０ｍＬ／分で使用した。蛍光測定はＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ  ＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で行った。紫外−可視吸光度はマイクロプレートリーダーＥＬｘ８００（ＢｉｏＴｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を用いて測定した。
【０１７４】
［方法］
【０１７５】
（トレハロースポリマーの合成）
ＡＩＢＮ（５．２８ｍｇ、３．２２×１０-2ｍｍｏｌ）およびスチレニルエーテルトレハロースモノマー（６３４ｍｇ、１．３８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２．３１ｍＬ）とＨ2Ｏ（４．６１ｍＬ）の混合物に溶解した。３サイクルの凍結脱気（ｆｒｅｅｚｅ−ｐｕｍｐ−ｔｈａｗ）によって酸素を除去し、７５℃で重合を開始させた。８．５時間後に反応物を液体窒素に浸漬することによって重合を停止させた。ポリマーをＨ2Ｏに対する透析（ＭＷＣＯ  ３，５００）によって精製し、Ｍｎ＝７．０ｋＤａおよびD＝１．２８（ヒドロゲル溶解実験用）ならびにＭｎ＝７．６ｋＤａおよびＤ＝１．３３（他のすべての実験用）を有するポリマーを得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００  ＭＨｚ  ｉｎ  Ｄ２Ｏ）δ：７．０１，６．４５，５．０５，３．８１，３．７１，３．５９，３．４８，３．３６，１．５０．
【０１７６】
（ポリ（スチレニルエーテルトレハロース）（ポリ（ＳＥＴ））の合成）
ＡＩＢＮ（５．２８ｍｇ、３．２２×１０-2  ｍｍｏｌ）およびＳＥＴ（６３４ｍｇ、１．３８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２．３１ｍＬ）とＨ2Ｏ（４．６１ｍＬ）の混合物に溶解した。３サイクルの凍結脱気によって酸素を除去し、７５℃で重合を開始させた。８．５時間後に反応物を液体窒素に浸漬することによって重合を停止させた。ポリマーをＨ2Ｏに対する透析（ＭＷＣＯ  ３，５００）によって精製し、７．０ｋＤａのＭnおよび１．２８のＰＤＩを有するポリマーを得た。1Ｈ  ＮＭＲ（５００  ＭＨｚ  ｉｎ  Ｄ2Ｏ）δ：７．０１，６．４５，５．０５，３．８１，３．７１，３．５９，３．４８，３．３６，１．５０．
【０１７７】
（８アームＰＥＧボロン酸の合成）
８アームＰＥＧアミン（４００ｍｇ、１０ｋＤａ、４×１０-2ｍｍｏｌ）および４−ホルミルボロン酸（９６ｍｇ、６．４０×１０-1ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ  ２．８ｍＬに溶解した。ＮａＢＨ3ＣＮ（１８．８５ｍｇ、３．００×１０-1ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を２５℃で撹拌した。５日後、反応溶液をＭｅＯＨに対して２日間およびＨ2Ｏに対して２日間透析することによって精製した。試料を凍結乾燥し、1Ｈ−ＮＭＲ分析はＰＥＧ中のアミン末端基の１００％修飾を示した。1Ｈ  ＮＭＲ（５００  ＭＨｚ  ｉｎ  Ｄ2Ｏ）δ：７．７５（１６Ｈ），７．４１（１６Ｈ），４．１４，３．６９，３．１８（９０８Ｈ）．ＩＲ：δ＝３３９０，２８６９，１６９９，１４５６，１４１０，１３４８，１２９７，１２４７，１０７９，１０４１，９８６，９４７，８３９ｃｍ-1．
【０１７８】
（ポリ（ＳＥＴ）−ボロン酸ヒドロゲルの合成）
ポリ（ＳＥＴ）および８アームＰＥＧボロン酸（１０ｋＤａ）をｐＨ７．４のＤ−ＰＢＳ緩衝液中に溶解し、それぞれ５００ｍｇ／ｍＬおよび２００ｍｇ／ｍＬの濃度にした。ポリ（ＳＥＴ）溶液３μＬおよび８アームＰＥＧアミン溶液２０．５μＬを混合して（１：１＝トレハロース単位：ボロン酸単位）、ヒドロゲルを生じさせた。
【０１７９】
（グルコース応答性試験）
１５の別々に調製したポリ（ＳＥＴ）−ボロン酸ヒドロゲルをｐＨ７．４のＤ−ＰＢＳ緩衝液１５０μＬ中に１時間浸漬した。ヒドロゲルを１５分間空気乾燥し、それらの重量を測定した。次にヒドロゲルの各々をｐＨ７．４のＤ−ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４のＤ−ＰＢＳ緩衝液中の１ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬまたは２０ｍｇ／ｍＬグルコース溶液のいずれか１５０μＬに浸漬した（各条件につき３つのヒドロゲル）。各時点を、１５分間ヒドロゲルを空気乾燥することによって収集し、乾燥ヒドロゲルの重さを量った。
【０１８０】
（ヒドロゲルの溶解動態）
トレハロースポリマー（５００ｍｇ／ｍＬ）およびＰＥＧ架橋剤（２００ｍｇ／ｍＬ）原液をＤ−ＰＢＳ、ｐＨ７．４中で調製した。トレハロースポリマー原液３μＬおよびＰＥＧ架橋剤原液２０．５μＬを添加し、室温で３０分間インキュベートすることによってゲルを調製した。ゲルをＤ−ＰＢＳ中で１時間水和し、その後０、１、５、１０または２０ｍｇ／ｍＬグルコースを含有するＤ−ＰＢＳ  ５ｍＬに移した。各時点で、ゲルの重さを量り、その後それぞれの緩衝液中に戻した。
【０１８１】
（インスリンのＦＩＴＣ標識）
インスリン（０．６５ｍｇ、０．１１２μｍｏｌ）およびフルオレセインイソチオシアネート異性体Ｉ（ＦＩＴＣ）（３．４８ｍｇ、８．９４μｍｏｌ）を１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．３  ０．３３ｍＬ中に溶解することによってインスリンをＦＩＴＣで標識した。混合物を２時間撹拌し、３，０００Ｄａの分子量カットオフ値（ＭＷＣＯ）を有するＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ（商標）チューブを使用して膜を介した反復遠心分離によって遊離ＦＩＴＣを除去した。典型的な標識の程度は、紫外吸光度によって測定した場合（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｉｍｏｖｉｃｈ，１９８３）インスリンにつき約０．７ＦＩＴＣであった。
【０１８２】
［ボロン酸架橋剤およびトレハロースヒドロゲルの調製］
【０１８３】
ボロン酸架橋剤を、４−ホルミルボロン酸および８アームＰＥＧアミンを出発物質として使用して、還元的アミノ化を介して合成した（スキーム１）。フェニルボロン酸での８アームＰＥＧアミンの完全な修飾を1Ｈ  ＮＭＲ分光法によって確認した（図１）。
【０１８４】
合成した８アームＰＥＧボロン酸を、次に、ボロン酸対トレハロース単位１：１の比率でポリ（ＳＥＴ）と混合した（スキーム２）。ゲル化が３分以内に速やかに起こった（図２）。
【０１８５】
（トレハロースヒドロゲルからのＦＩＴＣ標識インスリンの放出）
ＦＩＴＣ標識インスリン（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ、ｐＨ７．４またはｐＨ８）中１３．２２ｍｇ／ｍＬ）をトレハロースポリマーに添加し、５００ｍｇ／ｍＬのポリマー濃度を作製した。ＰＥＧ架橋剤を２００ｍｇ／ｍＬ濃度でＤ−ＰＢＳに溶解した。次に、トレハロースポリマーおよびＦＩＴＣ標識インスリン原液１μＬならびにＰＥＧ架橋剤原液６．８４μＬをＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｌｏ−Ｂｉｎｄ（登録商標）遠心分離管に添加した。遠心分離管をＴｈｅｒｍｏＳｈａｋｅｒ（Ａｌｌｓｈｅｎｇ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｃｈｉｎａ）にて１，５００ｒｐｍ、２１℃で１時間撹拌した。ゲルを、Ｄ−ＰＢＳ  １ｍＬを満たした２４ウェルプレートに移し、３０分間放置して水和させた。次に、タンパク質吸着を防ぐためにＤ−ＰＢＳ中１％ｗｔ／ｖｏｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックしておいた、０、５または１０ｍｇ／ｍＬグルコースを含有するＤ−ＰＢＳ  ０．３ｍＬを満たした９６ウェルプレートにゲルを移した。各時点で、すべての溶液をアリコートに分け、ゲルを含有するウェルには直ちに同じ緩衝液０．３ｍＬを再び満たした。最後の時点後、ウェルを、１００ｍｇ／ｍＬグルコースを含有するＤ−ＰＢＳ  ０．３ｍＬで処理し、３７℃で５分間インキュベートして、ゲルを完全に溶解した。次に測定のためにすべての溶液を移し、ゲル溶解を測定した後、各時点のアリコートの蛍光および残留インスリン溶液を回収した。
【０１８６】
（トレハロースヒドロゲル加熱アッセイ）
最初にインスリンを１ｍｇ／ｍＬ濃度でＤ−ＰＢＳ、ｐＨ７．４に溶解すること、次に３０００Ｄａの分子量カットオフ値（ＭＷＣＯ）を有するＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ（商標）チューブを使用して膜を介した遠心分離によって濃縮することによって、インスリン原液を調製した。タンパク質濃度を２８０ｎｍでの紫外吸光度によって定量化し、試料中の最終インスリン濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになるように溶液を３．９３ｍｇ／ｍＬに希釈した。トレハロースポリマー原液を、インスリン原液にトレハロースポリマーを５００ｍｇ／ｍＬ濃度で溶解することによって調製した。ＰＥＧ架橋剤をＤ−ＰＢＳ中に２００ｍｇ／ｍＬ濃度で溶解した。インスリンまたはトレハロースポリマー原液１μＬおよびＰＥＧ架橋剤原液またはＤ−ＰＢＳ  ６．８４μＬをＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｌｏ−Ｂｉｎｄ（登録商標）遠心分離管に添加し、混合を助けるために管をＴｈｅｒｍｏＳｈａｋｅｒにて１，５００ｒｐｍ、２１℃で１時間撹拌することによって、ゲルを調製した。試料を９０℃で３０分間加熱し、対照を４℃に保持した。すべての試料を、ヒドロゲルを溶解するために１００ｍｇ／ｍＬグルコース１ｍＬで処理した。インスリンの量をＥＬＩＳＡによって検定し、ＥＬＩＳＡは製造者の指示に従って実施した。簡単に説明すると、希釈した試料２５μＬを、捕捉抗体で予備被覆したウェルに添加した。検出抗体を含有する緩衝液を添加し（１００μＬ）、プレートをロッカー上で室温にて１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡ、３−４のために使用したホースラディッシュペルオキシダーゼ上の糖部分に残留ボロン酸が結合するのを防ぐため、インキュベーション後にＨＣｌで酸性にした脱イオン水（ｐＨ＝３．５）３５０μＬでウェルを５回洗浄し、次に洗浄緩衝液３５０μＬで６回洗浄した。これらの付加的な洗浄段階は、対照によって確認されたようにＥＬＩＳＡの結果に影響を及ぼさない。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液を添加し（２００μＬ）、プレートを室温で１５分間インキュベートした後、停止液５０μＬを添加した。検出されたインスリンの量を、製造者によって供給された標準品と比較して４５０ｎｍの吸光度によって定量化した。
【０１８７】
（統計分析）
標本の不等分散を仮定する片側スチューデントｔ検定を使用して、実験群間の差を検定した。ｐ＜０．０５の場合、結果を有意に異なると見なした。
【０１８８】
［ポリ（ＳＥＴ）−ボロン酸ヒドロゲルのグルコース応答性試験］
【０１８９】
調製したポリ（ＳＥＴ）−ボロン酸ヒドロゲルを、次に、グルコース応答性に関して試験した。トレハロース−ボロン酸複合体からのボロン酸エステル結合はグルコース−ボロン酸の結合親和性よりも有意に弱い結合親和性を有すると予想されるので（Ｎａｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）、グルコースは、トレハロースポリマーとボロン酸架橋剤との間のボロン酸エステル結合に取って代わるはずである。これはポリマー鎖およびボロン酸架橋剤を脱架橋し、ヒドロゲルを逆転させる。ポリマーおよび架橋剤はすべて水溶性であり、それゆえ緩衝液に拡散することができるので、ヒドロゲルはこの工程の間に重量を喪失する（ｌｏｏｓｅ  ｗｅｉｇｈｔ）はずである。図３に示すように、ゲルをｐＨ７．４のＤ−ＰＢＳ緩衝液中に浸漬した後、ヒドロゲルはそのもとの重量の３４％を喪失した。これは、ヒドロゲルからの非架橋ポリマーまたは架橋剤の分散に起因し得る。しかし、ヒドロゲルをグルコースと共に緩衝液中に入れた場合、その重量喪失は明らかにより速かった。濃度が高いほどグルコース溶液はヒドロゲルをより迅速に脱架橋する明らかな傾向があった。１０ｍｇ／ｍＬおよび２０ｍｇ／ｍＬグルコース溶液に浸漬したヒドロゲルの重量は、それらが溶液に溶解していたため１０分後には測定できなかったが、１ｍｇ／ｍＬおよび５ｍｇ／ｍＬグルコース溶液中のヒドロゲルは１０分後にまだゲルであった。
【０１９０】
（考察）
現在まで、トレハロースとボロン酸の結合を使用したヒドロゲルはまだ報告されていない。上記データは、我々が以前に報告したトレハロースポリマーとフェニルボロン酸官能基化マルチアームＰＥＧとの間のボロン酸エステル結合を利用することによってヒドロゲルを調製できることを示唆する。ゲル化は生理的条件下で（ｐＨ７．４）敏速であった。さらに、生じたヒドロゲルはグルコース応答性であった。グルコースの添加は、フェニルボロン酸に対するグルコースのより高い結合親和性に起因するグルコース−ボロン酸複合体の競合的置換により、トレハロース（ポリマー）とボロン酸（架橋剤）との間のボロン酸エステル結合の脱架橋をもたらした。予想されたように、より高いグルコース濃度の緩衝液はヒドロゲルの溶解速度を増大させた。これは、これらのゲルがインスリン送達適用に利用できることを示唆する。実際に、今後の研究はこれらのゲルからのインスリンの安定化および放出の検討を含む。
【０１９１】
（結論）
本明細書において、我々は、トレハロース側鎖ポリマーおよび８アームボロン酸官能基化ＰＥＧを使用したヒドロゲルの調製を説明した。トレハロース単位対ボロン酸単位の１：１比率で、ヒドロゲルが３分以内に形成された。様々な条件下でのインキュベーション後にヒドロゲルの、重量喪失を測定することにより、予想されたようにヒドロゲルの変形が認められた。グルコースの濃度が高いほど、ヒドロゲルがより速く溶解した。我々は、トレハロースポリマーを使用前の貯蔵の間のインスリン安定剤として使用するという利点と共に、このトレハロースベースのヒドロゲルが有効なインビボでのグルコース応答性インスリン送達に使用できると期待する。
【０１９２】
［インスリンの安定化および送達のためのグルコース応答性トレハロースヒドロゲル］
我々のグループは以前に、トレハロースグリコポリマーがコンジュゲートまたは賦形剤のいずれかとして凍結乾燥および熱に対するタンパク質の有効な安定剤であることを示した（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｍａｎｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。我々は、ＰｏｌｙＰｒｏｔｅｋ（商標）という名のトレハロースグリコポリマーが、ボロン酸架橋剤と複合体化することによってインスリンを捕捉するのに使用でき、および生じたヒドロゲルはまた、環境ストレッサーに対してインスリンを安定化するという仮説を立てた。この仮説を試験するため、ボロン酸架橋剤を、４−ホルミルフェニルボロン酸および８アームＰＥＧアミンを出発物質として使用して、還元的アミノ化を介して合成した（スキーム１）。フェニルボロン酸でのアミン末端基の完全な修飾を1Ｈ  ＮＭＲ分光法によって確認した（図１、下）。次に、８アームＰＥＧボロン酸をポリ（スチレニルエーテルトレハロース）（ポリＳＥＴ)と、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）中でボロン酸対トレハロース単位の１：１モル比で混合することによってトレハロースヒドロゲルを調製した（スキーム２）。２つの成分の溶液を混合した後、即時にゲル化が生じた（ヒドロゲルの画像に関しては図２）。
【０１９３】
調製したポリＳＥＴボロン酸エステルヒドロゲルを、次に、グルコース応答性に関して試験した。トレハロースはボロン酸と複合体化しないといういくつかの報告があるＮａｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｓｔｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。しかし、トレハロース−ボロン酸結合が多価ボロン酸−ＤＮＡコンジュゲートに関して認められており（Ｈａｒｇｒｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、またトレハロースとホウ酸の会合定数はグルコースより小さいと測定された（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。ボロン酸とトレハロースの弱い会合は一般に糖センシング適用におけるその有用性を限定しているが（Ｊａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、我々は、ヒドロゲルを溶解し、インスリンを放出する、グルコースによるトレハロースポリマーの迅速な置換のために弱い親和性を好都合に使用し得ると考えた。これを試験するため、グルコースの添加後のヒドロゲル重量を測定することによってヒドロゲル溶解の動態を観測した。
【０１９４】
図３に示すように、グルコースを含有する緩衝液中にヒドロゲルを入れた場合、パーセント重量喪失の速度はグルコース濃度が高くなるほど有意に速かった。１０および２０ｍｇ／ｍＬグルコース溶液に浸漬したヒドロゲルの重量は、ヒドロゲルが完全に溶解しており、溶液中で検出不能であったため、１０分後には測定できなかったが、１ｍｇ／ｍＬおよび５ｍｇ／ｍＬグルコース溶液中のヒドロゲルは６０分後にまだインタクトであった。グルコースを含有しないＤ−ＰＢＳにゲルを６０分間浸漬した後、約３４％の重量喪失が認められた。ボロン酸エステル結合は動的平衡状態にあり、トレハロースへの結合は弱いので（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）、トレハロースポリマーはグルコースの不在下でもヒドロゲル表面から緩やかに拡散し得る。しかしグルコースの添加により、重量喪失は著明に加速され、ゲルのグルコース応答性を明らかにした。
【０１９５】
グルコースの添加後のインスリン放出を試験するため、ポリＥＳＴボロン酸ヒドロゲルをＦＩＴＣ標識インスリンの存在下で調製した（図２ｂ）。８アームＰＥＧボロン酸を、ＦＩＴＣ標識インスリンを含有する緩衝液に溶解し、ポリＳＥＴと混合してインスリンを調製し、これらのヒドロゲルを、０、５および１０ｍｇ／ｍＬグルコースを含有する生理的ｐＨ（ｐＨ７．４）のＤ−ＰＢＳに添加した。各時点で溶液からアリコートを採取し、放出されたインスリンを定量した（図４）。ゲル溶解実験と同様に、グルコースの存在下でヒドロゲルはインスリンをより迅速に放出した。１時間後、１０ｍｇ／ｍＬグルコース溶液中のヒドロゲルは完全に溶解して１００％のインスリン放出を生じたが、同じ期間に５ｍｇ／ｍＬおよび０ｍｇ／ｍＬグルコース溶液中ではそれぞれ８０％および４９％のインスリンが放出された。また、塩基性緩衝液（ｐＨ８．０）中でのインスリン放出はすべての条件に関してより緩やかであり（図６）、ボロン酸のｐＫａをより速やかなまたはより遅いインスリン送達のために所望に応じて調整し得ることを示唆した。これは他の系においても利用されている（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【０１９６】
次に、我々は、加熱に対してインスリンを安定化するトレハロースヒドロゲルの能力を試験した。インスリン溶液を、添加物なしで、ポリＳＥＴと共に、８アームＰＥＧボロン酸と共に、およびトレハロースヒドロゲルと共に別々に調製した。試料を９０℃で３０分間加熱して分解を加速し、その後インスリンＥＬＩＳＡで試験してインスリンの構造的完全性を確認した。インスリンおよび４℃で貯蔵したトレハロースヒドロゲルを添加した対照群は、ヒドロゲルがＥＬＩＳＡ結果に影響を及ぼさないことを明らかにした（図５）。
【０１９７】
データは、グルコース応答性トレハロースヒドロゲルが加熱ストレスに対してインスリンを安定化するのに有効であることを示す（図５）。添加物なしのインスリンは分解を受け、加熱後はもはや抗体に結合せず、ＥＬＩＳＡにより２％未満のシグナルを示した。添加物の存在下では有意に多いインスリンが検出された。ポリＳＥＴはインスリンを著明に安定化し、９０℃に３０分間加熱した後、もとのタンパク質の６３％が検出された。インスリンはまた、８アームＰＥＧボロン酸単独の存在下でも部分的に安定化された（３９％シグナル）。文献は、タンパク質安定性へのＰＥＧの作用に関して分裂している；ＰＥＧは、変性状態のタンパク質と疎水性ＰＥＧの相互作用に起因してより高温ではタンパク質変性を促進し得ることが示唆されている（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，１９８７；Ｓｅｎｓｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。しかし、ＰＥＧポリマーの固有の構造が、ＰＥＧがタンパク質を安定化するか不安定化するかを決定し得る。例えば、Ａｍｉｒｇｏｕｌｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．は、線状ＰＥＧが変性状態のタンパク質と相互作用してアンフォールディングを促進することを報告しており、代わりにその表面コーティング適用に星型ＰＥＧを使用した（Ａｍｉｒｇｏｕｌｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ヒドロゲルとしてのポリ（ＳＥＴ）と分枝ＰＥＧの組合せは７４％の安定化をもたらし、これは８アームＰＥＧボロン酸より有意に良好で（ｐ＜０．０１）、ポリ（ＳＥＴ）単独と同様であった。これらの結果は、ポリ（ＳＥＴ）はゲル中の８アームＰＥＧボロン酸に部分的にしか結合しないが、安定化特性を維持することを示唆する。
【０１９８】
要約すると、我々は、インスリン送達のためのトレハロースグリコポリマーに基づくグルコース応答性ヒドロゲルを合成した。結果は、ヒドロゲルがトレハロースポリマーおよびボロン酸架橋剤から容易に調製できることを明らかにする。ゲル化は生理的ｐＨ条件下で起こり、生じたヒドロゲルはグルコース応答性にインスリンを放出することができた。グルコースの添加は、ボロン酸により高い結合親和性を有するグルコースによる競合的置換を介してトレハロースポリマーとボロン酸架橋剤の間のボロン酸エステル結合の開裂をもたらした（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。予想されたように、緩衝液中のより高いグルコース濃度はヒドロゲルの溶解速度を増大させ、負荷されたインスリンのより敏速な放出をもたらした。加えて、トレハロースヒドロゲルは極端な熱ストレスに対してインスリンを有効に保護することができる。タンパク質薬剤の大部分は、それらの活性を維持するために制御された温度下で貯蔵しなければならないので、トレハロースヒドロゲルは一般に、特殊な冷蔵を必要としないことによって患者のクオリティ・オブ・ライフを高めるのに使用し得る。加えて、ボロン酸はｐＨ応答性材料を創製するのに使用されてきたので（Ｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、トレハロースボロン酸ヒドロゲルは、腫瘍近傍の酸性細胞外ｐＨで薬剤を放出する抗癌薬送達剤としての潜在的適用を有し得る（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【０１９９】
［実施例２］
［ｐＨ応答性トレハロースヒドロゲル］
【０２００】
出願人は、トレハロースに基づくユニークなｐＨ応答性ヒドロゲルを提案する。我々の知る限り、トレハロースに基づくｐＨ応答性ヒドロゲルは報告されていない。トレハロースは合衆国医薬品局（ＵＳ  Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）によって一般に安全と認められており、生物中の細胞およびタンパク質のための天然の安定剤として働き、このことがトレハロースを生物医学用途のためのヒドロゲル合成の最適な候補物にする（Ｔｅｒａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。我々は既に、トレハロース側鎖グリコポリマーが熱および凍結乾燥に対してタンパク質活性を維持するのを助けることを報告している（Ｍａｎｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。それゆえ我々は、トレハロースヒドロゲルが送達ビヒクルとしてのみならず、貯蔵および輸送の間の環境ストレッサーに対する安定剤としても働くと予想する。ヒドロゲル合成のために、酸開裂性アセタール結合を有する重合可能なスチレニル基でトレハロースを二官能基化することによって架橋剤を合成した。トレハロースベースのヒドロゲルを、フリーラジカル重合およびレドックス重合の両方を用いて調製した。ヒドロゲルの溶解度を種々のｐＨの水溶液中で試験した。ヒドロゲルは、５より大きいｐＨの溶液中でゲル化したままであり、１０％ＴＦＡに溶解した。
【０２０１】
［材料］
【０２０２】
すべての化学物質はＳｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈおよびＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、特に明記されない限り精製せずに使用した。トレハロースは、Ｔｈｅ  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）から購入し、エタノールで乾燥して、使用時まで減圧下に保持した。アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）は、使用前にアセトンから再結晶化させた。４−ビニルベンズアルデヒドジエチルアセタール、スチレニルアセタールトレハロースモノマー（ＳＡＴ）、スチレニルエーテルトレハロースモノマー（ＳＥＴ）およびポリ（ＳＡＴ）は、上記で論じた以前に報告されている手順（Ｍａｎｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）を用いて調製した。
【０２０３】
［分析技術］
【０２０４】
ＮＭＲスペクトルはＢｒｕｋｅｒ  ＡＶ  ５００およびＤＲＸ  ５００ＭＨｚ分光計で得た。1Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、低分子については２秒およびポリマーに関しては３０秒の緩和遅延時間で取得した。赤外吸収スペクトルは、ＡＴＲアクセサリを備えるＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＦＴ−ＩＲを用いて記録した。ＥＳＩ−ＭＳデータは、ＡＣＱＵＩＴＹ  ＬＣを用いてＷａｔｅｒｓ  ＬＣＴ  ｐｒｅｍｉｅｒで収集した。
【０２０５】
（ビススチレニルアセタールトレハロース架橋剤（ビス−ＳＡＴ）の合成）
火炎乾燥した反応フラスコに、トレハロース（３９８ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）およびＤＭＦ（４ｍＬ）を添加した。ｐ−ＴｓＯＨ（７．０８ｍｇ、３．７２×１０-2ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を１０分間撹拌して、１００℃の油浴に浸漬した。反応物に４−ビニルベンズアルデヒドジエチルアセタール（６００ｍｇ、２．９１ｍｍｏｌ）を緩やかに添加し、反応物を１００℃で２時間撹拌した。反応が完了した後、ＤＭＦの８０％を減圧下で除去し、残りの溶液をベンゼン中で沈殿させた。沈殿物を飽和ＮａＨＣＯ3でろ過し、Ｈ2Ｏで十分に洗浄した。ろ過ケークを収集し、ＥｔＯＨ：Ｈ2Ｏ＝２：１中で再結晶化させて、白色粉末４７８．５ｍｇを７２％収率で得た。1Ｈ  ＮＭＲ（５００  ＭＨｚ  ｉｎ  Ｄ6ＤＭＳＯ）δ：７．４８−７．４４（ｍ，８Ｈ），６．８０−６．７４（ｍ，２Ｈ），５．８４−５．８１（ｄ，Ｊ＝１８．１５Ｈｚ，２Ｈ），５．５６（ｓ，２Ｈ），５．２９−５．２７（ｄ，Ｊ＝１０．３７  Ｈｚ，２Ｈ），５．１０−５．０９（ｍ，２Ｈ），４．１９−４．１６（ｍ，２Ｈ），４．００−３．９７（ｍ，２Ｈ），３．９３−３．８９（ｍ，２Ｈ），３．７２−３．６８（ｔ，Ｊ＝１０．８１Ｈｚ，２Ｈ），３．５８−３．５３（ｍ，２Ｈ），３．４７−３．４４（ｍ，４Ｈ），３．３２−３．３０（ｍ，２Ｈ）．ＥＳＩ−ＭＳ（±１．０）実測値（予測値）：Ｈ+  ５７１．２２（５７１．２２）．
【０２０６】
（フリーラジカル重合を介したＳＡＴヒドロゲルの調製）
ＳＡＴ（２００ｍｇ、４．３８×１０-1ｍｍｏｌ）、ビス−ＳＡＴ（１３．１６ｍｇ、２．３１×１０-2ｍｍｏｌ）およびＡＩＢＮ（０．７２ｍｇ、４．３８×１０-3ｍｍｏｌ）をＤＭＦ  １ｍＬに溶解した。酸素を３回の凍結脱気サイクルによって除去し、反応フラスコを９０℃油浴に浸漬することによって重合を開始させた。３０分以内にゲルが形成し始め、６時間後に反応フラスコを液体窒素に浸漬することによって反応を停止させた。ゲルをＨ2ＯおよびＭｅＯＨで洗浄して未反応モノマーおよび架橋剤を除去した。
【０２０７】
（レドックス重合を介したＳＡＴヒドロゲルの調製）
ＳＡＴ（２０ｍｇ、４．３８×１０-2ｍｍｏｌ）およびビス−ＳＡＴ（０．５ｍｇ、８．７６×１０-4ｍｍｏｌ）をそれぞれＨ2Ｏ（１５０μＬ）およびＤＭＦ（５０μＬ）に別々に溶解した。溶液に、ＴＥＭＥＤ（２．２５×１０-1μＬ、１．５×１０-3ｍｍｏｌ）およびＡＰＳ（２．２８×１０-3ｍｇ／ｍＬで５０μＬ、５．００×１０-4ｍｍｏｌ）を添加してゲル化を開始させた。２時間でヒドロゲルが形成され、生じたゲルをＨ2ＯおよびＭｅＯＨで洗浄することによって精製した。
【０２０８】
（フリーラジカル重合を介したＳＥＴヒドロゲルの調製）
ＳＥＴ（４０．４９ｍｇ、８．８２×１０-2ｍｍｏｌ）、ビス−ＳＡＴ（５ｍｇ、８．７６×１０-3ｍｍｏｌ）およびＡＩＢＮ（０．２９ｍｇ、１．７７×１０-3ｍｍｏｌ）をＤＭＦ  ０．１１ｍＬおよびＨ2Ｏ  ０．２２ｍＬに溶解した。３サイクルの凍結脱気後、ゲル化を８０℃で開始させ、４時間後に液体窒素で冷却することによってゲル化を停止させた。生じたゲルをＨ2ＯおよびＭｅＯＨで洗浄して精製した。
【０２０９】
（ポリ（ＳＡＴ）の加水分解試験）
ポリ（ＳＡＴ）５０ｍｇ（３３，７００ｇ／ｍｏｌ、１．４８×１０-3ｍｍｏｌ）をｐＨ３、ｐＨ４、ｐＨ５および１０％ＴＦＡ水溶液に溶解した。反応物を２５℃で撹拌し、Ｈ2Ｏ（ＭＷＣＯ  ３，５００ｇ／ｍｏｌ）に対して３日間透析して、凍結乾燥した。
【０２１０】
（ＳＥＴヒドロゲルの加水分解試験）
３つのＳＥＴヒドロゲル（各々０．３ｍｇ）にｐＨ７．４  Ｄ−ＰＢＳ、ｐＨ５  ＰＢＳおよび１０％ＴＦＡ溶液５００μＬを添加した。各々の試料の溶解度を経時的に観測した。
【０２１１】
［トレハロース架橋剤およびトレハロースヒドロゲルの調製］
【０２１２】
トレハロース架橋剤を合成するため、我々は、トレハロースモノマーの合成に関して以前に報告された方法を用いた（Ｍａｎｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。モノマーに比べて二官能基化架橋剤の収率を高めるため、２．２モル当量の４−ビニルベンズアルデヒドジエチルアセタールをトレハロースに添加した（スキーム３）。ビス−ＳＡＴ架橋剤を、トランスアセタール化反応（図８）を介して７２％収率で調製した。
【０２１３】
このビス−ＳＡＴ架橋剤を、熱開始フリーラジカル重合およびレドックス重合を介して共重合させ、ＳＡＴおよびＳＥＴの両ヒドロゲルを形成した（スキーム４およびスキーム５）。ＳＡＴヒドロゲルに関しては、両方の合成経路がヒドロゲルをもたらした。ＡＩＢＮ媒介フリーラジカル重合の間に、ヒドロゲル形成が９０℃で３０分以内に認められ、一方レドックス重合は２５℃でゲル化するのに２時間を要した。これに対し、ＳＥＴヒドロゲルはフリーラジカル重合を介してのみ得ることができた。Ｈ2Ｏ／ＤＭＦ（＝２／１）共溶媒中でのフリーラジカル架橋の間に、ＳＥＴモノマーが溶液から析出するのが認められた。すべてのヒドロゲルをＨ2ＯおよびＭｅＯＨで洗浄することによって精製し、未反応出発物質または非架橋ポリマー鎖を除去した。
【０２１４】
ヒドロゲルにおけるアセタール開裂を検討するため、線状ポリ（ＳＡＴ）をモデル系として使用した。ポリ（ＳＡＴ）を一連の酸性ｐＨに溶解し、ポリマー骨格中のトレハロースとペンダント部分間のアセタール結合の加水分解を誘導した。生じたアルデヒドを1Ｈ  ＮＭＲ分光法によって観察した。ｐＨ３〜５では、すべてのトレハロースピークは不変のままであり、アルデヒドピークは観察されなかった（データは示していない）。しかし、ポリマーを１０％ＴＦＡで処理した場合、トレハロースプロトンに対応する1Ｈ  ＮＭＲピーク（図９；上；３．０〜５．５ｐｐｍ）は消失し、アルデヒドピークが見えるようになった。生じたポリマーの1Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、４−ベンズアルデヒドポリマーに関して予想されたトレースと同一であると思われた（図９；下）。
【０２１５】
次に、ポリマーが安定なエーテル結合を含み、架橋剤だけが可逆的結合を有するＳＥＴヒドロゲル−１を、Ｄ−ＰＢＳ  ｐＨ７．４、ＰＢＳ  ｐＨ５および１０％ＴＦＡ水溶液で処理した。架橋により、ヒドロゲルは水性緩衝液に溶解しないはずである。しかしポリ（ＳＡＴ）加水分解試験と同様に、１０％ＴＦＡ中のＳＥＴヒドロゲル−１は３分以内に完全に溶解した。ゲルは、２５℃で４８時間のインキュベーション後でもｐＨ７．４およびｐＨ５の両方で残存し、アセタール架橋剤結合を逆転させるには低いｐＨが必要であることを示唆した（図１０）。
【０２１６】
［考察］
【０２１７】
総合すると、上記データは酸応答性トレハロースベースヒドロゲルの開発を説明する。最初に、トレハロース架橋剤を、ＳＡＴモノマーを調製するのに使用したのと同じ化学物質を用いて合成した。これは、封入された治療用タンパク質の安定化作用を増大させ得る、架橋剤ならびに骨格中にトレハロース部分を含有するヒドロゲルを生じさせた。ＳＡＴはフリーラジカル重合およびレドックス化学の両方を用いてビス−ＳＡＴでヒドロゲルを形成することができたが、ＳＥＴは同じ架橋剤でヒドロゲルを形成することができなかった。これは、それぞれ２５℃、Ｈ2ＯおよびＤＭＦ中でのＳＥＴおよびビス−ＳＡＴの異なる溶解度に起因する可能性が高い。モノマーおよび架橋剤を可溶化するにはより高い温度が必要である。注目に値する所見は、ビス−ＳＡＴ（またはＳＡＴ）のアセタール結合をｐＨ３でも加水分解できないことであった。１０％ＴＦＡを添加した場合のみアセタール結合がアルデヒドへと加水分解された。アセタール結合はこれまでヒドロゲル中のｐＨ応答性架橋剤として使用されてきたので（Ｂａｃｈｅｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｍｕｒｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、この酸安定性は予想外であった。意外な酸安定性は、ベンズアルデヒドアセタールのパラ位置にある、ポリマー骨格に起因すると考えられる。パラ位置の置換基がアセタール結合の酸不安定性に影響を及ぼすうえで重要であることは公知である（Ｍｕｒｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｆｉｆｅ  ａｎｄ  Ｊａｏ，１９６５）。加えて、疎水性骨格は、水がアセタール結合に達するのを妨げ、それにより加水分解を防止し得る。１０％ＴＦＡ溶液を線状ポリ（ＳＡＴ）に添加した場合、すべての側鎖が加水分解されてトレハロースを放出した；ポリベンズアルデヒド骨格だけが精製後に残った。しかし、ｐＨ３〜ｐＨ５の水溶液を添加した場合、1Ｈ  ＮＭＲスペクトルには差がなかった。また、ＳＥＴヒドロゲル−１を１０％ＴＦＡ溶液で処理した場合、ゲルは可溶化し、ビス−ＳＡＴが加水分解したことを示唆した。
【０２１８】
［結論］
【０２１９】
この章において、我々は、ビス−スチレニルアセタール官能基化トレハロース架橋剤を用いた様々なトレハロースヒドロゲルの合成を説明した。２つの異なるトレハロースモノマーは、ＡＩＢＮ媒介フリーラジカル重合を介してこの架橋剤でゲルを形成した。アセタール結合の加水分解は、１０％ＴＦＡ溶液に添加するまで検出されなかった。我々は、これらの酸開裂性トレハロースヒドロゲルが、タンパク質もしくはペプチド治療薬の胃への送達のためのビヒクルとしてまたは酸誘発性化学合成および水精製において用いられる酵素のための安定剤として使用し得ると予想する。
【０２２０】
［実施例３］
［酵素の安定化のためのトレハロースヒドロゲル］
【０２２１】
［緒言］
【０２２２】
本出願は、タンパク質の熱安定性を高める効率的な賦形剤としての天然二糖類トレハロースに基づくヒドロゲル系に関する。このトレハロースヒドロゲルは、簡単な精製段階を用いてトレハロースから２段階だけで調製でき、これをタンパク質の安定化のために直接工業的に適用することができる。
【０２２３】
出願人は、動物飼料産業におけるフィターゼの重要性により、フィターゼの安定化を検討することを選択した。フィターゼは、不消化性フィチン酸中のリン酸塩の高消化型への変換を触媒するリン加水分解酵素である（Ｌｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｋｕｈｎ  ａｎｄ  Ｐａｒｔａｎｅｎ，２０１２；Ｎａｈｍ，２００２；Ｓｉｌｖｅｒｓｉｄｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，２００４）。フィチン酸の変換は、ブタ、家禽および魚類などの単胃種にとってトウモロコシ、ダイズおよびコムギなどの一般的な飼料穀物中に存在するこの貯蔵型のリン酸塩を利用するために必須である（Ｌｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。２０１１年には、フィターゼは５億５千万ドルの世界飼料酵素市場の約６０％を占めた（Ａｄｅｏｌａ  ａｎｄ  Ｃｏｗｉｅｓｏｎ，２０１１）。しかし、動物飼料でのフィターゼの使用における最大の課題は、７０〜９０℃の温度に達する、ペレット化工程の蒸気加熱の間のその低い熱安定性である（Ｌｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｓｌｏｍｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。その熱安定性を高めるためのこれまでの努力にもかかわらず（Ｌｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｓｌｏｍｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｈｕｇｈｅｓ  ａｎｄ  Ｓｏａｒｅｓ，１９９８；Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）、簡単でコスト効率の高い方法はまだ大きな関心対象である。以下で述べるように、出願人は、トレハロースヒドロゲルの存在下で９０℃に加熱した場合、フィターゼが１００％の活性を保持することを見出した。
【０２２４】
［材料］
【０２２５】
すべての化学物質は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃおよびＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、特に明記されない限り精製せずに使用した。トレハロースは、Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｗｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）から購入し、エタノールで乾燥して、使用時まで減圧下に保持した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８マイクロスケールタンパク質標識キット（Ａ３０００６）はｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。液体クロマトグラフィ質量分析（ＬＣＭＳ）のためのすべての溶媒は、ＬＣＭＳグレードでＶＷＲまたはＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。トレハロースはＴｈｅ  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）から購入し、エタノールで共沸乾燥して、使用時まで減圧下に保持した。フィターゼはＰｈｙｔｅｘ，ＬＬＣによって提供された。
【０２２６】
［分析技術］
【０２２７】
紫外−可視スペクトルは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ２０００分光光度計を用いて得た。共焦点顕微鏡検査画像は、Ｌｅｉｃａｌ  ＳＰ２  １Ｐ−ＦＣＳ共焦点顕微鏡から２５μｍの軸方向分解能で得た。ＬＣＭＳ実験は、ＭａｓｓＬｙｎｘ  ４．１ソフトウェアによって制御されるＷａｔｅｒｓ  ＬＣＴ−Ｐｒｅｍｉｅｒ  ＸＥ  Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔに接続したＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣで実施した。質量分析計は、エレクトロスプレーモードで操作されるＭｕｌｔｉ−Ｍｏｄｅ  Ｓｏｕｒｃｅを備えた。トレハロース試料を、Ａｃｑｕｉｔｙ  ＢＥＨ  Ｃ１８  １．７μｍカラム（２．１×５０ｍｍ）を使用して分離し、６分で５〜５０％溶媒Ｂの勾配で溶出した（溶媒Ａ：水、溶媒Ｂ：アセトニトリル、どちらも０．２％ギ酸含有（ｖｏｌ／ｖｏｌ））。質量スペクトルは、ロイシンエンケファリン（Ｓｉｇｍａ  Ｌ９１３３）をロックマス標準品として用いて７０〜２０００のｍ／ｚ範囲にてネガティブイオンモードで記録した。分取逆相ＨＰＬＣは、ＵＶ検出器を備えるＳｈｉｍａｄｚｕ ＨＰＬＣシステムにて、Ｌｕｎａ ５μｍ Ｃ１８  １００Ａカラム（分取：５μｍ、２５０×２１．２ｍｍ）を使用し、λ＝２１５ｎｍおよび２５４ｎｍで観測しながら実施した。直線勾配溶媒系（Ｈ2Ｏ：メタノール＝７０：３０〜５０：５０）を移動相として流速１０ｍＬ／分で使用した。走査電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）画像は、ＵＣＬＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｎａｎｏ  Ａｒｃｈａｅｏｌｏｇｙ（ＭＮＡ）施設において５０Ｐａの低真空および５または２．５ｋＶの高電圧下にスポットサイズ３．０でＦＥＩ  Ｎｏｖａ  Ｎａｎｏ  ２３０  ＳＥＭにて取得した。ヒドロゲルの蛍光画像は、ＣＮＳＩ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ／Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｈａｒｅｄ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ  ａｔ  ＵＣＬＡにおいて共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＳＰ２  １Ｐ−ＦＣＳ，Ｌｅｉｃａ）を用いて取得した。フィターゼの直径（ＰＤＢ：１ＤＫＬ）（Ｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）は、Ｓｗｉｓｓ−ＰｄｂＶｉｅｗｅｒ（Ｓｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）を使用して測定した（Ｇｕｅｘ  ａｎｄ  Ｐｅｉｔｓｃｈ，１９９７）。蛍光測定はＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ  ＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で行った。フィターゼ活性アッセイに関する吸光度はＢｉｏｔｅｋ  ＥＰＯＣＨマイクロタイタープレートリーダーを用いて測定した。
【０２２８】
（トレハロースモノマーおよび架橋剤（粗ＳＥＴ）の合成のためのワンポット反応）
モノマーおよび架橋剤のためのワンポット反応を、以前に報告された文献の手順（Ｔｅｒａｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｓｈｉｂａｔａ，２００４）を修正することによって実施した。水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ、４．４４ｇ、１．１１×１０-1ｍｏｌ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、９６ｍＬ）に添加した。５分間撹拌した後、トレハロース（４．８６ｇ、１．４２×１０-2ｍｏｌ）を反応物に添加した。すべてのトレハロースが溶解した後、４−ビニルベンジルクロリド（０．４ｍＬ、２．８４×１０-3ｍｏｌ）を反応物に緩やかに添加し、２５℃で２４時間撹拌した。粗生成物を、次に、ＤＣＭ  ２Ｌに沈殿させ、高修飾トレハロースを除去した。生じた固体を減圧下で乾燥し、さらに精製することなくゲル化に使用した。
【０２２９】
（フィターゼロードトレハロースヒドロゲルの調製）
先のウィリアムソンエーテル化反応からの粗混合物（３．２３ｇ）をＨ2Ｏ（３．２３ｍＬ）に溶解し、その後テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ、１６μＬ、１．０７×１０-4ｍｏｌ）で処理した。次に、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ、８．０７ｍｇ、３．５４×１０-5ｍｏｌ）の１０ｍｇ／ｍＬ水性原液８０７μＬを添加してゲル化を開始させた。溶液は２５℃で１０分以内にゲル化し始めた。ＬＣＭＳを用いて、非修飾トレハロースと比べた一置換トレハロースの相対量をゲル化前とゲル化後で比較することにより、変換の度合いを定量化した。ＬＣＭＳ分析は、すべての架橋剤が２４時間後に反応していたことを示した。ゲル化後、Ｓｏｘｈｌｅｔ抽出器を用いてゲルをＨ2Ｏで３日間洗浄して、未反応モノマーを除去した。ヒドロゲルを凍結乾燥し、その後微粉末に摩砕した。種々の濃度のフィターゼ溶液１０μＬを各々の乾燥ゲルに添加し、１：１、１：１０および１：４０重量当量のフィターゼ：ヒドロゲル比を作製した。ゲルをフィターゼ溶液と共に４℃で２４時間インキュベートし、凍結乾燥して、熱負荷試験における検査のための白色粉末を得た。
【０２３０】
（フィターゼのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識）
フィターゼ（２ｍｇ、３．５７×１０-2μｍｏｌ）およびＦＩＴＣ（０．３ｍｇ、７．７１×１０-1μｍｏｌ）を５０ｍＭホウ酸緩衝液、ｐＨ８．５（１ｍＬ）に溶解した。混合物を室温で１時間磁気撹拌した。０．５ｍＬ遠心分離ろ過チューブを使用して、ＦＩＴＣがろ液中で紫外−可視分光法によって検出されなくなるまで、過剰のＦＩＴＣを、３，０００Ｄａ  ＭＷＣＯ膜を介した反復遠心分離によって除去した。標識の程度は、紫外吸光度によって測定した場合フィターゼにつき０．２８ＦＩＴＣであった（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｉｍｏｖｉｃｈ，１９８３）。
【０２３１】
（トレハロースヒドロゲルからのフィターゼの放出）
０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０、１０μＬ）中のＦＩＴＣ標識フィターゼ（７４ｍｇ／ｍＬ）をトレハロースヒドロゲル４ｍｇに添加した。混合物を４℃で２４時間インキュベートし、その後凍結乾燥した。ゲルに緩衝液１０００μＬを添加し、ヒドロゲルからのフィターゼの受動拡散を開始させた。それぞれの時点でアリコート（２００μＬ）を採取し、試料に新鮮緩衝液を直ちに補充した。各時点のアリコートの濃度を、ＦＩＴＣ標識フィターゼ検量線を用いて分光蛍光計で測定した蛍光から計算した。
【０２３２】
（ＨＲＰおよびＳＥＴヒドロゲルの熱負荷試験）
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）原液をＨ2Ｏ中７５μｇ／ｍＬ濃度で調製した。原液（６６．６μＬ）を乾燥スチレニルエーテルトレハロースヒドロゲル（ＳＥＴヒドロゲル）に添加し、１：１０または１：５０のＨＲＰ：ＳＥＴヒドロゲル重量当量試料を作製した。ヒドロゲルを含まない非加熱対照試料は、活性アッセイまで４℃で保存した。ＨＲＰ−ヒドロゲル混合物を、ヒドロゲルが完全に水和されるまで約２時間４℃でインキュベートした。ヒドロゲルを、ＭＳＣ−１００  Ｔｈｅｒｍｏ−ｓｈａｋｅｒ（Ｈａｎｇｚｈｏｕ  Ａｌｌｓｈｅｎｇ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｃｈｉｎａ）において５００ｒｐｍで振とうしながら７０℃で３０分間加熱した。その後直ちに試料を冷却し、４℃の冷蔵庫で一晩インキュベートした。活性アッセイのために、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を基質として使用し、１Ｍ  Ｈ2ＳＯ4溶液を停止液として使用した。４５０ｎｍの吸光度から活性を測定した。試験を合計１２回実施した（ｎ＝１２）。
【０２３３】
（共焦点顕微鏡用のＨＲＰ−ＡＦ４８８の調製）
ｐＨ７．４  Ｄ−ＰＢＳ中のホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）溶液（１ｍｇ／ｍＬ）１００μＬに、ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８  ＴＦＰエステル（ＡＦ４８８、１Ｍ重炭酸ナトリウム溶液中１０μＬ）を添加した。反応物を２５℃で３０分間インキュベートし、ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐチューブ（ＭＷＣＯ  ３，０００ｇ／ｍｏｌ）を使用して精製した。精製後のＨＲＰ−ＡＦ４８８の標識の程度は５．２４であった。上記から調製したＳＥＴヒドロゲルを４℃で１２時間ＨＲＰ−ＡＦ４８８  １００μＬ中に浸漬し、Ｈ2Ｏで手早く洗浄した後、共焦点顕微鏡画像を撮影した。
【０２３４】
フィターゼの熱負荷試験。乾燥ヒドロゲルとフィターゼ混合物に、フィターゼに関して５３重量％のＨ2Ｏを添加した。ヒドロゲルを静かに揺り動かしながら４℃で２４時間インキュベートし、溶液を均一に分布させた。その後ヒドロゲルを９０℃で１分間加熱し、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５で希釈して、活性アッセイの前に少なくとも２４時間インキュベートした。
【０２３５】
（フィターゼ活性アッセイ）
対照および熱処理したヒドロゲル（１０μＬ）を、最初に０．２Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ５．５緩衝液１０ｍＬに希釈し、希釈試料の０．５ｍＬアリコートを４つの反応チューブ（ブランク１および試料３）の各々に移した。すべての試料チューブに、１％フィチン酸溶液（０．２Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５）０．５ｍＬを添加し、チューブを３７℃で１５分間インキュベートした。その後１５％トリクロロ酢酸１．０ｍｌの添加によって反応をクエンチングし、フィチン酸０．５ｍＬをブランクチューブに添加した。試料（３０μＬ）を蒸留水で１０倍希釈し、希釈溶液（１５０μＬ）を、マイクロタイタープレート中の２．５％モリブデン酸アンモニウム：１０％硫酸：１０％アスコルビン酸の１：３：１溶液１５０μＬで処理した。プレートを５０℃水浴中で１５分間インキュベートし、４℃で１５分間冷却して、個々のウェルの８２０ｎｍ吸光度を測定した。フィターゼ活性（ＦＴＵ）は、３７℃でｐＨ５．５緩衝液中の１％フィチン酸からの１分当たり１．０マイクロモルの無機リン酸塩の放出を触媒する酵素の量と定義される。
【０２３６】
（統計分析）
標本の不等分散を仮定する片側スチューデントｔ検定を使用した。ｐ＜０．０５の場合、結果を有意に異なると見なした。
【０２３７】
（凍結乾燥されなかったヒドロゲルからのフィターゼの放出）
０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中のＦＩＴＣ標識フィターゼ（３０ｍｇ／ｍＬ）をトレハロースヒドロゲル０．５ｍｇに添加し、ゲルを完全に水和させた（ヒドロゲル１ｍｇにつき水２５μＬ）。混合物を室温で１２時間インキュベートし、その後緩衝液２００μＬを添加して、ヒドロゲルからのフィターゼの受動拡散を開始させた。溶液の半分を様々な時点で除去し、新鮮緩衝液を添加した。各時点のアリコートの濃度を、ＦＩＴＣ標識フィターゼ検量線を用いて分光蛍光計で測定した蛍光から計算した。
【０２３８】
［トレハロースモノマーおよび架橋剤の合成］
［粗ＳＥＴの合成］
【０２３９】
簡単な合成および精製段階は、工業規模の反応における最も重要な要素の１つである。当初、我々は、反応混合物をＤＣＭ中に沈殿させることによってトレハロースモノマーを精製し、その後さらに精製してすべての副生成物を除去したが、そのうちの一部は２より高い置換度（ＤＳ）を有する。しかし、我々は、これらの副生成物を架橋剤として直接使用するトレハロースベースのヒドロゲルの合成を想定した（スキーム６）。モノマー中の架橋剤の存在により、この場合の生成物は線状ポリマーではなくヒドロゲルであると考えられる。この章では、モノマーと架橋剤の粗混合物が出発物質である４−ビニルベンジルクロリドおよびトレハロースから１段階で生成できるので、ＳＥＴモノマーを使用したヒドロゲル合成を説明する（Ｔｅｒａｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｓｈｉｂａｔａ，２００４）。最初に、４−ビニルベンジルクロリドを塩基性条件下で過剰のトレハロースと反応させた。次に、生じた粗混合物をＤＣＭ中に沈殿させ、ろ過して、ＤＭＳＯおよび高いＤＳを有するトレハロースを除去した。この粗生成物はいくつかの位置異性体（２、４および６位にスチレンを有するトレハロース）、二官能基化および三官能基化トレハロース、ならびに非修飾トレハロースを含有した。粗ＳＥＴをその後ゲル化のために直接使用した。
【０２４０】
［ＳＥＴヒドロゲルの合成］
【０２４１】
過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）およびテトラメチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）をラジカル開始剤とする重合を用いて、粗ＳＥＴからＳＥＴヒドロゲルを形成した（スキーム７）。粗ＳＥＴを１ｍｇ／ｍＬ濃度でＨ2Ｏに溶解し、ＴＥＭＥＤを添加した（図１１ａ）。最初は、溶液はゾル相のままであった。しかし、ＡＰＳを添加した後、溶液は２５℃で１０分以内にゲル化し始めた（図１１ｂ）。生じたヒドロゲルは粗混合物と同じ黄色を有していた。ヒドロゲルネットワークは、凍結乾燥およびＨ2Ｏへの再浸漬後もインタクトのままであった（Ｆ図１１ｃおよび１１ｄ）。Ｈ2Ｏで十分に洗浄して黄色を除去し、無色のＳＥＴヒドロゲルを生じさせた（図１１ｅ）。乳鉢を使用して、次に、精製したＳＥＴヒドロゲルを粉末に摩砕し、タンパク質安定化のためおよびまた取扱いの容易さのために表面積を増大させた。次にＨＲＰをタンパク質と共に７０℃で３０分間インキュベートし、その後タンパク質の活性を測定した。タンパク質は、添加物がない場合と比較してヒドロゲルの存在下で有意により活性であることが認められた（図１２）。
【０２４２】
［考察］
【０２４３】
データは、ＳＥＴヒドロゲルが極端なＨＲＰに対してＨＲＰを安定化できることを明らかにする。ヒドロゲルを使用することの利点は、その合成がＨＰＬＣによるモノマーの精製を回避することである。ヒドロゲル製剤のもう１つの利点はその除去の容易さである。ヒドロゲルはＨ2Ｏまたは有機溶媒に可溶性ではないので、簡単なろ過または遠心分離によって混合物から分離することができる。ＳＥＴヒドロゲル−２は、厳しい熱処理を受ける必要がある広範囲の酵素およびタンパク質を安定化し得る。我々のグループは既に、線状トレハロースポリマーを使用して加熱に対する様々なタンパク質の安定化を実証しているので、前述したトレハロースベースのヒドロゲルは他の工業的に重要な酵素またはタンパク質の熱安定化に容易に適用し得る（Ｍａｎｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【０２４４】
我々はＳＥＴヒドロゲルが加熱に対してフィターゼを安定化できることを示したが、フィターゼがゲルの内部に位置するのかまたは表面に吸着されているのかをまだ確認していない。タンパク質の位置を決定することを始めるため、我々は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８テトラフルオロフェニルエステル（ＡＦ４８８）で修飾されたＨＲＰをモデル系として使用した。ＨＲＰ−ＡＦ４８８を有するＳＥＴヒドロゲルを、フィターゼの１００％安定化を示したＳＥＴヒドロゲルと同様の方法で調製した。図１３に示すように、予備的共焦点顕微鏡検査画像は、ＨＲＰ−ＡＦ４８８がヒドロゲルの内部に存在することを指示した。
【０２４５】
［結論］
【０２４６】
タンパク質の工業規模の安定化のためのトレハロースヒドロゲルの合成を詳述した。このヒドロゲルは簡単な合成および精製段階によって調製することができ、これは工業工程では考慮すべき重要な点である。トレハロースヒドロゲルは、ペレット化手順または他の高温工程に対して様々な酵素またはタンパク質を安定化するための有望な系である。
【０２４７】
［熱に対する酵素の安定化のためのトレハロースヒドロゲル］
酵素は、高い選択性で様々な反応を触媒することができ、多くの重要な生物学的過程に関与する。しかし、高温に対する酵素の一般的な不安定性はしばしばそれらの適用を制限する。これに対処するため、我々は、最小限の精製手順を用いて市販の出発物質から２段階でトレハロースベースのヒドロゲルを合成した。単官能性および多官能性トレハロースモノマーをレドックス開始ラジカル重合によって架橋してヒドロゲルを形成した。動物用原料（ａｎｉｍａｌ  ｆｅｅｄｓｔｏｃｋ）中で利用される重要な酵素であるフィターゼを用いて、熱に対してタンパク質を安定化するトレハロースヒドロゲルの有効性を検討した。ヒドロゲルへのフィターゼ溶液の添加は、共焦点顕微鏡検査によって確認されたように酵素の内在化を生じさせた。ヒドロゲル中のフィターゼは、９０℃での加熱後、ヒドロゲルが存在しない場合の３９％の活性と比較して１００％の活性を保持した。酵素はまた、ヒドロゲルから回収することもできた。本明細書で報告したトレハロースヒドロゲル合成は、多種多様な酵素の熱安定化のために容易に拡大可能なはずである。
【０２４８】
［実験結果および考察］
【０２４９】
容易な合成、市販の出発物質および簡単な精製段階は、工業規模での反応における最も重要な要素の一部である（Ｋｕｔｔｒｕｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。そこで、ヒドロゲルを２段階だけで合成した。最初に、４−ビニルベンジルクロリドとトレハロースを使用したウィリアムソンエーテル化反応によって粗生成物混合物を得、その後これをＤＣＭ中に沈殿させた。ＤＣＭ洗浄液は主としてＤＭＳＯと一部のトレハロースならびに一置換および二置換生成物を含有し、一方ゲル化のために使用した沈殿物は、ＨＰＬＣおよびＬＣＭＳによって測定した場合非修飾トレハロースおよびビニル置換生成物（一置換７９％、二置換１６％および三置換５％）から成った（図２０および２１ならびに表１）。我々は、粗モノマー反応混合物の多置換生成物が、粗反応混合物から直接トレハロースベースのヒドロゲルを合成するための架橋剤として使用できると想定した（スキーム６およびスキーム７）。架橋剤の存在により、重合は線状ポリマーではなくヒドロゲルを生じると考えられる。
【０２５０】
次に粗混合物を対のレドックス開始剤、ＡＰＳおよびＴＥＭＥＤを使用したラジカル重合によって重合させた。粗混合物をＴＥＭＥＤと共に水に溶解した（図１１ａ）。ＡＰＳの添加後、溶液は２５℃で１０分以内にゲル化し始めた（図１１ｂ）。生じたヒドロゲルは粗混合物と同じ黄色を有していた。ヒドロゲルネットワークは、凍結乾燥および再水和後もインタクトのままであった（図１１ｃおよび１１ｄ）。１日後、すべての二置換および三置換トレハロースが反応していた（図２０）。Ｓｏｘｈｌｅｔ抽出器を用いて粗ゲルを３日間洗浄し、未反応モノマー、残存開始剤およびトレハロースを除去して、無色のヒドロゲルを得た。精製したトレハロースヒドロゲルを、取扱いの容易さのためおよびフィターゼの内在化のために表面積を増大させるように乳鉢と乳棒を用いて粉末に摩砕した（図１１ｅ）。
【０２５１】
【表１】
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【０２５２】
精製したヒドロゲルを、図１４に示すように可変圧力ＳＥＭによって特徴付けた。画像は、ミクロンサイズの細孔を有するヒドロゲル構造を明らかにした。フィターゼの直径は、結晶構造から測定した場合主軸に沿って約１１．１ｎｍであるので（ＰＤＢ：１ＤＫＬ）（Ｏａｋｌｅｙ，２０１０）、したがってフィターゼはヒドロゲル内に組み込まれると予想された。この仮説を調べるため、我々は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識フィターゼ溶液中でインキュベートし、その後水で手早く洗浄した後、共焦点顕微鏡下でヒドロゲルを観察した（図１５）。ゲルマトリックス全体にわたる蛍光色素分子の均一な分布は、フィターゼがヒドロゲルに完全に内在化され、単にヒドロゲル表面に吸着されるのではないことを明らかにした。細孔径のゆえに、我々は、水で希釈された場合酵素がヒドロゲルから放出されると予測した。実際に、凍結乾燥後のヒドロゲルからのＦＩＴＣ標識フィターゼの放出プロフィールは、６時間でフィターゼの７８％が放出されたことを示した（図１６）。放出プロフィールは、凍結乾燥していないゲルと同様であった（図２１）。結果は、フィターゼがヒドロゲルの内部に内在化されることのさらなる証拠を提供し、またゲルが負荷後の酵素を回収するのに使用できることも明らかにする。
【０２５３】
現在、動物飼料産業においては、ペレット化が動物試料を調製するための最も一般的な工程であり、というのはこれがマッシュ形態に比べて効率を改善し、栄養素の排出を低減するからである（Ｎａｈｍ，２００２；Ｔｈｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｅｌ，１９９６）。典型的には、ペレット化の間、温度は数分間７０〜９０℃に達する。特にフィターゼに関しては、フィターゼを含む乾燥成分をペレットミルコンディショナーで混合し、ここで温度は３５〜４５秒間８０〜９０℃に達し、その後押出して所望のペレットを生成する。このようにして、フィターゼをヒドロゲルに負荷し、蒸気ペレット化工程を模倣する条件（９０℃、１分）で加熱した。フィターゼ溶液を３つの異なる重量当量（１、１０および４０）の凍結乾燥トレハロースヒドロゲルに添加し、２４時間インキュベートした。試料を再び凍結乾燥し、５３重量％の水をフィターゼ負荷トレハロースヒドロゲルに添加して、ゲルをさらに２４時間インキュベートし、蒸気加熱工程の水分量を再現した。水はペレット化工程に必須であるが、極度の加熱下でのフィターゼの変性も促進する（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｓｌｏｍｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。結果は、ヒドロゲルの存在下で加熱したフィターゼが、試験したすべての重量当量に関して有意により高い活性を保持することを示した。１重量当量のみのヒドロゲルを使用した場合でも、加熱しなかった対照が３９％しか活性でなかったのと比較して８１％の活性が保持され、１０および４０重量当量では１００％の酵素活性が保持された（図１７）。平均活性は、フィターゼに対して１０重量当量のヒドロゲルが、最小量のヒドロゲルを使用しつつ、もとのフィターゼ活性を完全に保持する最適量であることを指示した。
【０２５４】
結果は、トレハロースヒドロゲルが極端な熱条件に対してフィターゼを安定化できることを明らかにした。トレハロースヒドロゲルは、その合成が２段階しか必要とせず、大規模に容易に適合させ得る最小限の精製を含むので、工業規模の適用に適し得る。具体的には、提案した方法は、クロマトグラフィ不要の精製、容易に入手可能な出発物質、保護基不要の化学および最小数の段階を使用する（Ｋｕｔｔｒｕｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【０２５５】
ヒドロゲル製剤のもう１つの利点は、その除去の容易さである。放出結果は、関心対象のタンパク質をヒドロゲルから除去できることを明らかにする。放出は数時間で起こり、６時間目で〜８０％が放出された。しかし、これは受動拡散を伴う。ヒドロゲルは水または有機溶媒に可溶性ではないので、簡単なろ過または遠心分離によって混合物から分離することができる。システムを介して洗い流すもしくは水を押圧することによって、またはフィターゼ負荷ヒドロゲルの場合は胃腸管（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｒａｃｋ）で起こる撹拌で、酵素はより速く放出されることが期待できる。ヒドロゲルは、所望する場合はストレス後に添加し、その後タンパク質から除去することができるので、これはこの系の潜在的な利点である。
【０２５６】
加えて、酵素の熱安定性を改善するための酵素の遺伝子操作に関する多大の研究にもかかわらず、複数の最適化の反復または酵素特異的突然変異戦略が通常必要であり、より高いコストを伴う（Ｈｉｍｍｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。それゆえ、本明細書で述べる方法は遺伝子操作技術よりも柔軟で、コスト効果的であり得る。我々のグループは既に、線状トレハロースポリマーが様々なタンパク質を加熱に対して安定化することを実証しているので（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｍａｎｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、本明細書で述べたトレハロースベースのヒドロゲルは、多種多様な工業的に重要な酵素およびタンパク質の熱安定化に容易に適用し得る。
【０２５７】
［結論］
【０２５８】
我々は、モデル酵素としてフィターゼの熱安定化のためのトレハロースヒドロゲルの合成を詳述した。このヒドロゲルは簡単な合成および精製段階によって調製することができ、これは工業工程では考慮すべき重要な点である。生じるトレハロースヒドロゲルは、動物飼料調製のためのペレット化手順における関連温度下でフィターゼの活性を完全に維持した。現在、動物飼料中の多くの酵素がこの蒸気ペレット化工程の間にそれらの活性の大部分を喪失する。本報告におけるフィターゼの安定化によって実証されたように、トレハロースヒドロゲルは高温工程に対して様々な酵素およびタンパク質を安定化するための有望な物質である。
【０２５９】
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４３．Ｄ．Ｌｉｍ，Ｓ．Ｇｏｌｏｖａｎ，Ｃ．Ｗ．Ｆｏｒｓｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｚ．Ｊｉａ，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２０００，７，１０８−１１３．
４４．Ｎ．Ｇｕｅｘ  ａｎｄ  Ｍ．Ｃ．Ｐｅｉｔｓｃｈ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１９９７，１８，２７１４−２７２３．
４５．Ｃ．Ａ．Ｋｕｔｔｒｕｆｆ，Ｍ．Ｄ．Ｅａｓｔｇａｔｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｓ．Ｂａｒａｎ，Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｐ．，２０１４，３１，４１９−４３２．
４６．Ａ．Ｊ．Ｏａｋｌｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１０，３９７，７４５−７４９．
４７．Ｍ．Ｔｈｏｍａｓ  ａｎｄ  Ａ．Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｅｌ，Ａｎｉｍ．Ｆｅｅｄ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．，１９９６，６１，８９−１１２．
４８．Ｍ．Ｅ．Ｈｉｍｍｅｌ，Ｓ．Ｙ．Ｄｉｎｇ，Ｄ．Ｋ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｗ．Ｓ．Ａｄｎｅｙ，Ｍ．Ｒ．Ｎｉｍｌｏｓ，Ｊ．Ｗ．Ｂｒａｄｙ  ａｎｄ  Ｔ．Ｄ．Ｆｏｕｓｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００７，３１５，８０４−８０７．
４９．Ｇｕａｎ，Ｙ．；Ｚｈａｎｇ，Ｙ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．２０１３，４２，８１０６．
５０．Ｒａｖａｉｎｅ，Ｖ．；Ａｎｃｌａ，Ｃ．；Ｃａｔａｒｇｉ，Ｂ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ  ２００８，１３２，２．
５１．Ｋｕｉｖｉｌａ，Ｈ．Ｇ．；Ｋｅｏｕｇｈ，Ａ．Ｈ．；Ｓｏｂｏｃｚｅｎｓｋｉ，Ｅ．Ｊ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９５４，１９，７８０．
５２．Ｓｐｒｉｎｇｓｔｅｅｎ，Ｇ．；Ｗａｎｇ，Ｂ．Ｈ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ２００２，５８，５２９１．
５３．Ｙａｎ，Ｊ．；Ｓｐｒｉｎｇｓｔｅｅｎ，Ｇ．；Ｄｅｅｔｅｒ，Ｓ．；Ｗａｎｇ，Ｂ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ２００４，６０，１１２０５．
５４．Ｂａｒｋｅｒ，Ｓ．Ａ．；Ｃｈｏｐｒａ，Ａ．Ｋ．；Ｈａｔｔ，Ｂ．Ｗ．；Ｓｏｍｅｒｓ，Ｐ．Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１９７３，２６，３３．
５５．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ａ．；Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｋ．；Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｒ．；Ｋａｔａｏｋａ，Ｋ．；Ａｏｙａｇｉ，Ｔ．；Ｍｉｙａｈａｒａ，Ｙ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１０，４６，２２０３．
５６．Ｗａｎｇ，Ｄ．；Ｌｉｕ，Ｔ．；Ｙｉｎ，Ｊ．；Ｌｉｕ，Ｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０１１，４４，２２８２．
５７Ａｎｃｌａ，Ｃ．；Ｌａｐｅｙｒｅ，Ｖ．；Ｇｏｓｓｅ，Ｉ．；Ｃａｔａｒｇｉ，Ｂ．；Ｒａｖａｉｎｅ，Ｖ．Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２０１１，２７，１２６９３．
５８．Ｚｈａｎｇ，Ｃ．；Ｌｏｓｅｇｏ，Ｍ．Ｄ．；Ｂｒａｕｎ，Ｐ．Ｖ．Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．２０１３，２５，３２３９．
５９．Ｙｕａｎ，Ｗ．；Ｓｈｅｎ，Ｔ．；Ｗａｎｇ，Ｊ．；Ｚｏｕ，Ｈ．Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１４，５，３９６８．
６０．Ｙａｎｇ，Ｔ．；Ｊｉ，Ｒ．；Ｄｅｎｇ，Ｘ．−Ｘ．；Ｄｕ，Ｆ．−Ｓ．；Ｌｉ，Ｚ．−Ｃ．Ｓｏｆｔ  Ｍａｔｔｅｒ  ２０１４，１０，２６７１．
６１．Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇ，Ｒ．；Ｐｅｔｅｒｓ，Ｊ．Ａ．；Ｖａｎｂｅｋｋｕｍ，Ｈ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１９９４，２５３，１．
６２．Ｒｏｙ，Ｉ．；Ｇｕｐｔａ，Ｍ．Ｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００３，１０，１１６１．
６３．Ｂａｊｐａｉ，Ａ．Ｋ．；Ｓｈｕｋｌａ，Ｓ．Ｋ．；Ｂｈａｎｕ，Ｓ．；Ｋａｎｋａｎｅ，Ｓ．Ｐｒｏｇ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．２００８，３３，１０８８．
６４．Ｇｕｐｔａ，Ｐ．；Ｖｅｒｍａｎｉ，Ｋ．；Ｇａｒｇ，Ｓ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ  ２００２，７，５６９．
６５．Ｑｉｕ，Ｙ．；Ｐａｒｋ，Ｋ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．２００１，５３，３２１．
６６．Ｋｉｙｏｎａｋａ，Ｓ．；Ｓｕｇｉｙａｓｕ，Ｋ．；Ｓｈｉｎｋａｉ，Ｓ．；Ｈａｍａｃｈｉ，Ｉ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００２，１２４，１０９５４．
６７．Ｍａｎｏ，Ｊ．Ｆ．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００８，１０，５１５．
６８．Ｉｎｇｂｅｒ，Ｄ．Ｅ．；Ｐｒｕｓｔｙ，Ｄ．；Ｆｒａｎｇｉｏｎｉ，Ｊ．Ｖ．；Ｃｒａｇｏｅ，Ｅ．Ｊ．；Ｌｅｃｈｅｎｅ，Ｃ．；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｍ．Ａ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９０，１１０，１８０３．
６９．Ｗｅｉ，Ｆ．；Ｚｈｕｙｕａｎ，Ｗ．；Ｓｈｅｎｆｅｉ，Ｚ．；Ｈｕｉ，Ｃ．；Ｄａｎ，Ｚ．；Ｙｕａｎ，Ｚ．；Ｙｉｐｉｎｇ，Ｃ．Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．２０１４，５７，１０．
７０．Ｌｏｗｍａｎ，Ａ．Ｍ．；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ，Ｍ．；Ｋａｊｉｔａ，Ｍ．；Ｎａｇａｉ，Ｔ．；Ｐｅｐｐａｓ，Ｎ．Ａ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１９９９，８８，９３３．
７１．Ｐａｔｅｌ，Ｖ．；Ａｍｉｊｉ，Ｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１９９６，１３，５８８．
７２．Ｂｅｓｈｅｅｒ，Ａ．；Ｗｏｏｄ，Ｋ．Ｍ．；Ｐｅｐｐａｓ，Ｎ．Ａ．；Ｍａｄｅｒ，Ｋ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ  ２００６，１１１，７３．
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７５．Ｓａｊｅｅｓｈ，Ｓ．；Ｓｈａｒｍａ，Ｃ．Ｐ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｔ  Ｂ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００６，７６Ｂ，２９８．
７６．Ｓｈａｎｔｈａ，Ｋ．Ｌ．；Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｄ．Ｒ．Ｋ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２０００，２０７，６５．
７７．Ｔｅｒａｍｏｔｏ，Ｎ．；Ｓａｃｈｉｎｖａｌａ，Ｎ．Ｄ．；Ｓｈｉｂａｔａ，Ｍ．Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００８，１３，１７７３．
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８８．  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ａ．；Ｉｓｈｉｉ，Ｔ．；Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｊ．；Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｈ．；Ｋａｔａｏｋａ，Ｋ．；Ｍｉｙａｈａｒａ，Ｙ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄｉｔ．２０１２，５１，２１２４−２１２８．
８９．  Ｂａｐａｔ，Ａ．Ｐ．；Ｒｏｙ，Ｄ．；Ｒａｙ，Ｊ．Ｇ．；Ｓａｖｉｎ，Ｄ．Ａ．；Ｓｕｍｅｒｌｉｎ，Ｂ．Ｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１，１３３，１９８３２−１９８３８．
９０．  Ｗａｎｇ，Ｙ．Ｃｈａｉ．，Ｚ．；Ｍａ，Ｌ．；Ｓｈｉ，Ｃ．；Ｓｈｅｎ，Ｔ．；Ｓｏｎｇ，Ｊ．ＲＳＣ  Ａｄｖ．２０１４，４，５３８７７−５３８８４．
９１．  Ｐｒｙｃｅ，Ｒ．ＢＭＪ  ２００９，３３８：ａ２２１８．
９２．  Ｗｅｉｓｓ，Ｒ．Ｃ．；ｖａｎ  Ａｍｅｒｏｎｇｅｎ，Ｄ．；Ｂａｚａｌｏ，Ｇ．；Ａａｇｒｅｎ，Ｍ．；Ｂｏｕｃｈａｒｄ，Ｊ．Ｒ．Ｍａｎａｇｅｄ  ｃａｒｅ  ２０１１，２０，４２−４７．
９３．  Ｈｉｎｄｓ，Ｋ．Ｄ．；Ｋｉｍ，Ｓ．Ｗ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．２００２，５４，５０５−５３０．
９４．  Ｈｅｉｓｅ，Ｔ．；Ｎｏｓｅｋ，Ｌ．；Ｓｐｉｔｚｅｒ，Ｈ．；Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｌ．；Ｎｉｅｍｏｌｌｅｒ，Ｅ．；Ｆｒｉｃｋ，Ａ．Ｄ．；Ｂｅｃｋｅｒ，Ｒ．Ｈ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｏｂｅｓ．Ｍｅｔａｂ．２００７，９，７４６−７５３．
９５．Ｌｅｏｂａｎｄｕｎｇ，Ｗ．；Ｉｃｈｉｋａｗａ，Ｈ．；Ｆｕｋｕｍｏｒｉ，Ｙ．；Ｐｅｐｐａｓ，Ｎ．Ａ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ  ２００２，８０，３５７−３６３．
９６．  Ａｋｉｙｏｓｈｉ，Ｋ．；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｓ．；Ｓｈｉｃｈｉｂｅ，Ｓ．；Ｍｉｘ，Ｄ．；Ｂａｕｄｙｓ，Ｍ．；Ｋｉｍ，Ｓ．Ｗ．；Ｓｕｎａｍｏｔｏ，Ｊ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ  １９９８，５４，３１３−３２０．
９７．  Ｌｅｅ，Ｊ．；Ｌｉｎ，Ｅ．Ｗ．；Ｌａｕ，Ｕ．Ｙ．；Ｈｅｄｒｉｃｋ，Ｊ．Ｌ．；Ｂａｔ，Ｅ．；Ｍａｙｎａｒｄ，Ｈ．Ｄ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０１３，１４，２５６１−２５６９．
９８．  Ｍａｎｃｉｎｉ，Ｒ．Ｊ．；Ｌｅｅ，Ｊ．；Ｍａｙｎａｒｄ，Ｈ．Ｄ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２，１３４，８４７４−８４７９．
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１０１．  Ｈａｒｇｒｏｖｅ，Ａ．Ｅ．；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ａ．Ｄ．；Ａｎｓｌｙｎ，Ｅ．Ｖ．；Ｓｅｓｓｌｅｒ，Ｊ．Ｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１１，２２，３８８−３９６．
１０２．  Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ，Ｒ．；Ｐｅｔｅｒｓ，Ｊ．Ａ．；Ｖａｎ  Ｂｅｋｋｕｍ，Ｈ．Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｒｅｓ．１９９４，２５３，１−１２．
１０３．  Ｊａｍｅｓ，Ｔ．Ｄ．；Ｓａｎｄａｎａｙａｋｅ，Ｋ．Ｒ．Ａ．Ｓ．；Ｓｈｉｎｋａｉ，Ｓ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄｉｔ．１９９６，３５，１９１０−１９２２．
１０４．  Ｒｏｙ，Ｄ．；Ｃａｍｂｒｅ，Ｊ．Ｎ．；Ｓｕｍｅｒｌｉｎ，Ｂ．Ｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００９，２１０６−２１０８．
１０５．  Ｌｅｅ，Ｌ．Ｌ．Ｙ．；Ｌｅｅ，Ｊ．Ｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８７，２６，７８１３−７８１９．
１０６．  Ｓｅｎｓｋｅ，Ｍ．；Ｔｏｒｋ，Ｌ．；Ｂｏｒｎ，Ｂ．；Ｈａｖｅｎｉｔｈ，Ｍ．；Ｈｅｒｒｍａｎｎ，Ｃ．；Ｅｂｂｉｎｇｈａｕｓ，Ｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１４，１３６，９０３６−９０４１．
１０７．  Ａｍｉｒｇｏｕｌｏｖａ，Ｅ．Ｖ．；Ｇｒｏｌｌ，Ｊ．；Ｈｅｙｅｓ，Ｃ．Ｄ．；Ａｍｅｒｉｎｇｅｒ，Ｔ．；Ｒｏｃｋｅｒ，Ｃ．；Ｍｏｌｌｅｒ，Ｍ．；Ｎｉｅｎｈａｕｓ，Ｇ．Ｕ．Ｃｈｅｍｐｈｙｓｃｈｅｍ  ２００４，５，５５２−５５５．
１０８．  Ｌｅｅ，Ｅ．Ｓ．；Ｇａｏ，Ｚ．；Ｂａｅ，Ｙ．Ｈ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ  ２００８，１３２，１６４−１７０．
１０９．  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ａ．Ｂ．；Ｈａｉｍｏｖｉｃｈ，Ｊ．Ｍｅｔｈｏｄ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １９８３，９３，１４７−１５５．
１１０．  Ｙｅ，Ｊ．；Ｃｈｅｎ，Ｙ．；Ｌｉｕ，Ｚ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１４，５３，１０３８６−１０３８９．
１１１．  Ｚｈａｎｇ，Ｗ．；Ｌｉｕ，Ｗ．；Ｌｉ，Ｐ．；Ｘｉａｏ，Ｈ．；Ｗａｎｇ，Ｈ．；Ｔａｎｇ，Ｂ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１４，１２６９７−１２７０１．
【図１】
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【図２（ａａｎｄｂ）】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１（ａ−ｅ）】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４（ａａｎｄｂ）】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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