(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
昆虫抑制ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド分子であって、該昆虫抑制ポリペプチドが、
（a）配列番号25のアミノ酸配列、または
（b）配列番号25のアミノ酸配列に対して少なくとも98％の同一性を含むアミノ酸配列を含む、前記組換えポリヌクレオチド分子。
【請求項２】
（a）配列番号37のヌクレオチド配列；
（b）配列番号37のヌクレオチド配列に対する少なくとも90％の同一性を含むヌクレオチド配列；または
（c）ストリンジェント条件下で、
（i）配列番号37の4〜885位のヌクレオチド配列の逆相補体を含むポリヌクレオチド分子、もしくは
（ii）配列番号56および配列番号57から成る群から選択されるヌクレオチド配列の逆相補体を含むポリヌクレオチド分子
とハイブリッド形成するヌクレオチド配列を含み、
前記ストリンジェント条件が50％ホルムアミド、1MのNaCl及び1％のSDSにて37℃で4〜12時間のハイブリッド形成及び60℃〜65℃での0．1×SSCにおける洗浄を含む請求項1に記載の組換えポリヌクレオチド分子。
【請求項３】
異種プロモータに操作可能に連結される、請求項1に記載の組換えポリヌクレオチド分子。
【請求項４】
請求項1に記載の組換えポリヌクレオチド分子によってコードされる昆虫抑制組換えポリペプチド。
【請求項５】
前記昆虫抑制組換えポリペプチドが
（a）配列番号25のアミノ酸配列、または
（b）配列番号25のアミノ酸配列に対する少なくとも98％の同一性を含むアミノ酸配列を含む、請求項4に記載の昆虫抑制組換えポリペプチド。
【請求項６】
前記昆虫抑制組換えポリペプチドが鞘翅目の昆虫種に対して抑制活性を示す請求項4に記載の昆虫抑制組換えポリペプチド。
【請求項７】
鞘翅目の前記昆虫種がウエスタンコーンルートワーム、サザンコーンルートワーム、ノーザンコーンルートワーム、メキシカンコーンルートワーム、ブラジリアンコーンルートワーム、またはDiabrotica viridulaとDiabrotica speciosaとから成るブラジリアンコーンルートワーム複合群である請求項6に記載の昆虫抑制組換えポリペプチド。
【請求項８】
前記昆虫抑制組換えポリペプチドが鱗翅目の昆虫種に対して抑制活性を示す請求項4に記載の昆虫抑制組換えポリペプチド。
【請求項９】
鱗翅目の前記種が、ヨーロッパアワノメイガ、サウスウエスタンアワノメイガ、タマナヤガ、ツマジロクサヨトウ、コーンイアーワーム及びダイズシャクトリムシから成る群から選択される請求項8に記載の昆虫抑制組換えポリペプチド。
【請求項１０】
請求項1に記載の組換えポリヌクレオチド分子を含む宿主細胞であって、前記宿主細胞が細菌宿主細胞及び植物宿主細胞から成る群から選択される、前記宿主細胞。
【請求項１１】
請求項1に記載の組換えポリヌクレオチド分子を含む昆虫抑制組成物。
【請求項１２】
さらに、前記昆虫抑制ポリペプチドとは異なる少なくとも1つの他の農薬をコードするヌクレオチド配列を含む請求項11に記載の昆虫抑制組成物。
【請求項１３】
前記少なくとも1つの他の農薬が、昆虫抑制タンパク質、昆虫抑制dsRNA分子及び補助タンパク質から成る群から選択される請求項12に記載の昆虫抑制組成物。
【請求項１４】
前記少なくとも1つの他の農薬が、鱗翅目、鞘翅目または半翅目の1以上の害虫種に対する活性を示す請求項13に記載の昆虫抑制組成物。
【請求項１５】
前記少なくとも1つの他の農薬が、Cry1A、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1A．105、Cry1B、Cry1C、Cry1D、Cry1E、Cry1F、Cry1G、Cry1H、Cry1I、Cry1J、Cry1K、Cry1L、Cry2A、Cry2Ab、Cry3A、Cry3B、Cry4B、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry15、Cry34、Cry35、Cry43A、Cry43B、Cry51Aa1、ET29、ET33、ET34、ET35、ET66、ET70、TIC400、TIC407、TIC417、TIC431、TIC800、TIC807、TIC834、TIC853、TIC900、TIC901、TIC1201、TIC1415、VIP3A、及びVIP3Bタンパク質から成る群から選択される請求項14に記載の昆虫抑制組成物。
【請求項１６】
昆虫抑制に有効な量で請求項4に記載の昆虫抑制組換えポリペプチドを含む昆虫抑制組成物。
【請求項１７】
鞘翅目種の害虫の防除方法であって、前記方法が前記害虫を昆虫抑制の量での請求項4に記載の昆虫抑制組換えポリペプチドに接触させることを含む、前記防除方法。
【請求項１８】
請求項1に記載の組換えポリヌクレオチド分子または請求項4に記載の昆虫抑制組換えポリペプチドを含む種子。
【請求項１９】
請求項10に記載の宿主細胞を含むコモディティ製品であって、前記コモディティ製品が、検出可能な量の前記組換えポリヌクレオチドまたは前記組換えポリヌクレオチドによってコードされる昆虫抑制組換えポリペプチドを含む、前記コモディティ製品。
【請求項２０】
請求項1に記載の組換えポリヌクレオチド分子を含む種子の生産方法であって、前記方法が、
（a）前記組換えポリヌクレオチド分子を含む少なくとも1つの種子を植え付けることと、
（b）前記種子から植物を生育させることと、
（c）前記植物から種子を収穫することとを含み、前記収穫された種子が前記組換えポリヌクレオチド分子を含む、前記生産方法。
【請求項２１】
請求項3に記載の組換えポリヌクレオチド分子を含む組換えベクター。
【請求項２２】
前記ベクターが、プラスミド、バクミド、ファージミド及びコスミドから成る群から選択される請求項21に記載の組換えベクター。
【請求項２３】
昆虫の寄生に耐性のトランスジェニック植物であって、前記トランスジェニック植物の細胞が請求項1に記載の組換えポリヌクレオチド分子または請求項4に記載の昆虫抑制組換えポリペプチドを含む、前記植物。
【請求項２４】
種子の細胞に含まれる、請求項4に記載の昆虫抑制ポリペプチド。
【請求項２５】
植物の細胞に含まれる、請求項4に記載の昆虫抑制ポリペプチド。
【請求項２６】
前記アミノ酸配列が配列番号：25のアミノ酸配列に対して少なくとも99％の同一性を含む、請求項1に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項２７】
前記アミノ酸配列が配列番号：25のアミノ酸配列に対して少なくとも99％の同一性を含む、請求項5に記載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への参照
本出願は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる2014年11月20日に出願された米国仮特許出願62／082,504の利益を主張する。
【０００２】
配列表の組み入れ
配列表のコンピュータで読み取りできる形態を電子申請によってここに添付して出願する。配列表は、その全体が参照によって組み入れられ、2015年11月13日に作成され、ファイル名称「MONS387WO＿ST25．txt」を有し、（MS−ウインドウズの操作システムで測定すると）114kbのサイズであるファイルに含有されている。
【０００３】
発明の分野
本発明は一般に昆虫抑制タンパク質の分野に関する。作物及び種子の農業関連の害虫に対する昆虫抑制活性を示す新規のクラスのタンパク質が開示される。特に、開示されているクラスのタンパク質は、作物及び種子の農業関連の害虫、特に鱗翅目種及び鞘翅目種の害虫に対して殺虫活性がある。開示されている毒素タンパク質の1以上をコードする組換えポリヌクレオチド構築物を含有する植物、植物部位及び種子が提供される。
【背景技術】
【０００４】
とりわけ、トウモロコシ、ダイズ、サトウキビ、コメ、コムギ、野菜及びワタを含む農業上重要な植物の作物収量を改善することはますます重要になっている。増加する人口に食物、衣服を与えるため、及びエネルギーを提供するための農産物の需要増加に加えて、気候関連の影響及び農作業以外で土地を使用する人口増加に由来する圧迫により、農業に利用可能な耕作地の量は減少すると予測されている。これらの因子は、特に植物のバイオテクノロジー及び農耕法に主な改善がない場合、食糧安全保障の厳しい予想をもたらす。これらの圧迫を踏まえると、技術、農業技法及び害虫管理における環境上持続可能な改善は、農業に利用可能な限られた量の耕作地で、作物生産を拡大するために不可欠なツールである。
【０００５】
昆虫、特に鱗翅目及び鞘翅目の範囲内での昆虫は、農作物への被害の主な原因であると考えられ、それによって被害領域にわたる作物収量を低下させる。農業に悪影響を与える鱗翅目の害虫種には、Helicoverpa zea、Ostrinia nubilalis、Diatraea saccharalis、Diatraea grandiosella、Anticarsia gemmatalis、Spodoptera frugiperda、Spodoptera exigua、Agrotis ipsilon、Trichoplusia ni、Chrysodeixis includens、Heliothis virescens、Plutella xylostella、Pectinophora gossypiella、Helicoverpa armigera、Elasmopalpus lignosellus、Striacosta albicosta及びPhyllocnistis citrellaが挙げられるが、これらに限定されない。農業に悪影響を与える鞘翅目の害虫種には、Agriotes spp．、Anthonomus spp．、Atomaria linearis、Chaetocnema tibialis、Cosmopolites spp．、Curculio spp．、Dermestes spp．、Diabrotica spp．、Epilachna spp．、Eremnus spp．、Leptinotarsa decemlineata、Lissorhoptrus spp．、Melolontha spp．、Orycaephilus spp．、Otiorhynchus spp．、Phlyctinus spp．、Popillia spp．、Psylliodes spp．、Rhizopertha spp．、Scarabeidae、Sitophilus spp．、Sitotroga spp．、Tenebrio spp．、Tribolium spp．及びTrogoderma spp．、特に害虫がDiabrotica virgifera virgifera（ウエスタンコーンルートワーム、WCR）である場合、Diabrotica barberi（ノーザンコーンルートワーム、NCR）、Diabrotica virgifera zeae（メキシカンコーンルートワーム、MCR）、Diabrotica balteata（ブラジリアンコーンルートワーム（BZR）、Diabrotica undecimpunctatahowardii（サザンコーンルートワーム、SCR）及びDiabrotica viridulaとDiabrotica speciosa）とから成るブラジリアンコーンルートワーム複合群（BCR）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０００６】
歴史的に、農業における害虫駆除剤として合成化学殺虫剤の集中的散布に依存していた。新たに出現する耐性の課題に加えて、環境及びヒトの健康についての懸念が生物学的農薬の研究及び開発を刺激した。この研究努力は、細菌を含む種々の昆虫病原性微生物種の漸進的な発見及び使用につながった。
【０００７】
生物学的な駆除のパラダイムは、昆虫病原性細菌、特にBacillus属に属する細菌の可能性が生物学的な害虫駆除剤に見出され開発された時にシフトした。Bacillus thuringiensis（Bt）株が特定の昆虫に対して高い毒性を示すことが発見されたので、細菌Btの株は農薬活性を示すタンパク質の供給源として使用されている。Btの主な特徴は、昆虫の腸上皮に有害である作用の孔形成メカニズムを介して感受性昆虫による摂取時に作用する特異的な殺虫エンドトキシン（Cryタンパク質）を含有する1以上の結晶を含有する副胞子小体の産生である。Btに加えて、たとえば、Bacillus sphaericusのような他の桿菌種及び昆虫病原性の表現型に寄与する遺伝子を含有する他の細菌種、たとえば、Brevibacillus laterosporusは害虫管理の可能性を示している。
【０００８】
殺虫毒素タンパク質は、種々の農業応用で採用されて農業上重要な植物を保護し、収量を上げている。殺虫毒素タンパク質を使用して、機械的な方法、たとえば、種々の細菌株を含有する微生物製剤を噴霧し、植物の表面に分散させることによって、及び殺虫毒素タンパク質を発現するトランスジェニック植物及び種子を作出する遺伝情報技法を用いることによって作物の農業関連の害虫を防除する。
【０００９】
殺虫毒素タンパク質を発現するトランスジェニック植物の使用は世界中で適応されている。たとえば、2012年には、26,100,000ヘクタールにBt毒素を発現するトランスジェニック作物が植え付けられた（James,C．Global Status of Commercialized Biotech／GM Crops：2012．ISAAA Brief No．44）。トランスジェニック昆虫防御作物の拡大した使用及び市販の殺虫毒素タンパク質の限られた数によって現在利用されている殺虫タンパク質に耐性を付与する対立遺伝子についての選択圧が作り出されている。殺虫毒素タンパク質に対する標的害虫における耐性の発生はこの技術の有効性及び利点を弱体化させる。そのような利点には、作物の収量の上昇、化学農薬の使用の低減、化学農薬の使用に関連するコストと労力の低減が挙げられる。
【００１０】
新しい形態の殺虫毒素タンパク質の発見及び開発は、殺虫毒素タンパク質を発現しているトランスジェニック作物に対する昆虫の耐性の上昇を管理する中心となる。改善された有効性を伴い、広い範囲の感受性の昆虫種にわたって防除を示す新しいタンパク質毒素は耐性対立遺伝子を発生することができる生き残り昆虫の数を減らすであろう。加えて、同じ害虫に毒性であり、1つの植物にて異なる作用様式を示す2以上のトランスジェニック毒素は標的昆虫種における耐性の確率をさらに減らす。
【００１１】
その結果、たとえば、広い範囲の標的害虫種に対する有効性の上昇及び当該技術で既知のタンパク質と比べて異なる作用様式のような改善された殺虫特性を伴う効果的な殺虫タンパク質を発見し、開発する重要なニーズがある。本出願では、Brevibacillus laterosporus（B．laterosporus）に由来する新規のタンパク質毒素ファミリーが、有意な標的である鱗翅目及び鞘翅目の害虫種に対する、特にウエスタンコーンルートワームに対する殺虫活性を示す類似の毒素タンパク質、変異体タンパク質、及び例となる組換えタンパク質と共に開示される。
【発明の概要】
【００１２】
本明細書で開示されているのは、本明細書ではTIC3668型タンパク質と呼ばれ、作物の1以上の害虫に対して抑制活性を呈することが示されている昆虫抑制性の組換えポリヌクレオチド分子及びそれによってコードされるポリペプチド（毒素タンパク質）の新規の群である。タンパク質のそれぞれは、製剤及び植物体にて単独で使用することができ、または互いに組み合わせて及び他の殺虫タンパク質や毒物と組み合わせて使用することができるので、農業系で現在使用されている殺虫タンパク質及び殺虫化学物質に対する選択肢を提供する。
【００１３】
態様の1つでは、本発明は、配列番号25、配列番号23、配列番号24、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、及び配列番号31から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む昆虫抑制ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド分子を提供する。一実施形態では、組換えポリヌクレオチド分子は、配列番号25、配列番号23、配列番号24、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、及び配列番号31から成る群から選択されるアミノ酸配列に対する少なくとも35％の同一性、たとえば、少なくとも40％、50％、60％、70％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を含む昆虫抑制ポリペプチドをコードする。別の実施形態では、組換えポリヌクレオチド分子は、配列番号37、配列番号33、配列番号35、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、及び配列番号72から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施形態では、組換えポリヌクレオチド分子は、配列番号37、配列番号33、配列番号35、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、及び配列番号72から成る群から選択されるヌクレオチド配列に対する少なくとも35％の同一性、たとえば、少なくとも40％、50％、60％、70％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94%、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を含む。さらなる実施形態では、組換えポリヌクレオチド分子は、（i）配列番号37、配列番号33、配列番号35、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、及び配列番号72から成る群から選択される配列の4〜885位のヌクレオチド配列の逆相補体、または（ii）配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、及び配列番号：61から成る群から選択される配列の逆相補体とハイブリッド形成する配列を含む。別の実施形態では、ハイブリッド形成の条件はストリンジェントな条件であり、たとえば、そのようなストリンジェント条件は50％ホルムアミド、1MのNaCl及び1％のSDSにて37Cで4〜12時間のハイブリッド形成及び60C〜65Cでの0．1×SSCにおける洗浄を含んでもよい。さらなる実施形態では、組換えポリヌクレオチド分子は異種プロモータに操作可能に連結される。
【００１４】
別の態様では、本発明は、本明細書で提供される組換えポリヌクレオチド分子によってコードされる昆虫抑制組換えポリペプチドを提供する。一実施形態では、昆虫抑制組換えポリペプチドは配列番号25、配列番号23、配列番号24、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、及び配列番号31から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、昆虫抑制組換えポリペプチドは、配列番号25、配列番号23、配列番号24、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、及び配列番号31から成る群から選択されるアミノ酸配列に対する少なくとも35％の同一性、たとえば、少なくとも40％、50％、60％、70％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を含む。
【００１５】
さらなる実施形態では、昆虫抑制組換えポリペプチドは、たとえば、ウエスタンコーンルートワーム、サザンコーンルートワーム、ノーザンコーンルートワーム、メキシカンコーンルートワーム、ブラジリアンコーンルートワーム、またはDiabrotica viridula及びDiabrotica speciosaから成るブラジリアンコーンルートワーム複合群を含む鞘翅目の昆虫種に対して抑制活性を呈する。その上さらなる実施形態では、昆虫抑制組換えポリペプチドは、たとえば、ヨーロッパアワノメイガ、サウスウエスタンアワノメイガ、タマナヤガ、ツマジロクサヨトウ、コーンイアーワーム及びダイズシャクトリムシを含む鱗翅目の昆虫種に対して抑制活性を呈する。
【００１６】
さらに別の態様では、本発明は、本発明の組換えポリヌクレオチド分子を含む宿主細胞を提供し、その際、宿主細胞は細菌宿主細胞及び植物宿主細胞から成る群から選択される。特定の実施形態では、細菌宿主細胞には、Agrobacterium、Rhizobium、Bacillus thuringiensis、Brevibacillus lacterosporus、Bacillus cereus、E．coli、Pseudomonas、Klebsiella、及びErwiniaが挙げられる。他の実施形態では、植物細胞には、アルファルファ、バナナ、オオムギ、マメ、ブロッコリ、キャベツ、アブラナ、ニンジン、キャッサバ、トウゴマ、カリフラワー、セロリ、ヒヨコマメ、ハクサイ、ミカン、ココナッツ、コーヒー、トウモロコシ、クローバ、ワタ、ウリ、キュウリ、ベイマツ、ナス、ユーカリ、アマ、ニンニク、ブドウ、ホップ、セイヨウネギ、レタス、テーダマツ、キビ、メロン、ナッツ、カラスムギ、オリーブ、タマネギ、観葉植物、ヤシ、牧草、エンドウマメ、ビーナッツ、コショウ、カキ、キマメ、マツ、ザクロ、ポプラ、ジャガイモ、カボチャ、ラジアータパイン、ダイコン、ナタネ、コメ、根茎、ライムギ、ベニバナ、低木、ソルガム、サザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、カボチャ、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、スイートコーン、モミジバフウ、サツマイモ、スイッチグラス、茶、タバコ、トマト、ライコムギ、芝草、スイカ及びコムギの植物細胞が挙げられる。
【００１７】
さらなる態様では、本発明は、本発明の組換えポリヌクレオチド分子を含んでもよい昆虫抑制組成物を提供する。一実施形態では、昆虫抑制組成物はさらに、少なくとも1つの他の農薬をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。特定の実施形態では、少なくとも1つの他の農薬は、本発明のTIC3668型昆虫抑制ポリペプチドとは異なり、昆虫抑制タンパク質、昆虫抑制dsRNA分子及び補助タンパク質から成る群から選択されてもよい。他の実施形態では、他の農薬は、鱗翅目、鞘翅目または半翅目の1以上の害虫種に対して活性を示す。特定の実施形態では、他の農薬は、Cry1A、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1A．105、Cry1B、Cry1C、Cry1D、Cry1E、Cry1F、Cry1G、Cry1H、Cry1I、Cry1J、Cry1K、Cry1L、Cry2A、Cry2Ab、Cry3A、Cry3B、Cry4B、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry15、Cry34、Cry35、Cry43A、Cry43B、Cry51Aa1、ET29、ET33、ET34、ET35、ET66、ET70、TIC400、TIC407、TIC417、TIC431、TIC800、TIC807、TIC834、TIC853、TIC900、TIC901、TIC1201、TIC1415、VIP3A、及びVIP3Bのタンパク質から成る群から選択される。その上さらなる態様では、本発明は、昆虫抑制に有効な量で、たとえば、TIC3668型昆虫抑制ポリペプチドのような本発明の昆虫抑制組換えポリペプチドを含む昆虫抑制組成物を提供する。
【００１８】
さらに別の態様では、本発明は、鞘翅目種または鱗翅目種の害虫を防除する、及び植物、例えば、作物への鞘翅目種または鱗翅目種の害虫の寄生を防除する方法を提供し、その際、方法は、昆虫を抑制する量の、本発明の、たとえば、TIC3668型昆虫抑制ポリペプチドのような昆虫抑制組換えポリペプチドに害虫を接触させることを含む。
【００１９】
その上さらなる態様では、本発明は、本発明の組換えポリヌクレオチド分子またはTIC3668型昆虫抑制ポリペプチドのような昆虫抑制組換えポリペプチドを含む種子を提供する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、検出できる量の、本発明の組換えポリヌクレオチド分子または本発明のTIC3668型昆虫抑制ポリペプチドのような昆虫抑制ポリペプチドを含むコモディティ製品を提供する。さらなる態様では、本発明のコモディティ製品は、本発明の組換えポリヌクレオチド分子を含む宿主細胞を含んでもよく、その際、コモディティ製品は検出できる量の組換えポリヌクレオチド分子または組換えポリヌクレオチドによってコードされる昆虫抑制組換えポリペプチドを含む。特定の実施形態では、コモディティ製品には、穀類取扱者によって袋詰めされたコモディティコーン、コーンフレーク、コーンケーキ、トウモロコシ粉、コーンミール、コーンシロップ、トウモロコシ油、コーンサイレージ、コーンスターチ、コーンシリアル等、及び相当するダイズ、コメ、コムギ、ソルガム、キマメ、ピーナッツ、果実、メロン、及び野菜のコモディティ製品が、該当する場合、検出できる量の本出願のそのようなポリヌクレオチド及び／またはポリペプチドを含有するそのようなコモディティ製品のジュース、濃縮物、ジャム、ゼリー、マーマレード及び他の食用形態を含めて挙げられてもよい。
【００２１】
さらに別の態様では、本発明は、本発明の組換えポリヌクレオチドを含む種子を生産する方法を提供し、その際、方法は、（a）組換えポリヌクレオチド分子を含む少なくとも1つの種子を植え付けることと、（b）その種子から植物を生育させることと、（c）その植物から種子を収穫することとを含み、収穫された種子は組換えポリヌクレオチド分子を含む。
【００２２】
さらなる態様では、本発明は、本発明の組換えポリヌクレオチド分子を含む組換えベクターを提供する。一実施形態では、組換えベクターはプラスミド、バクミド、ファージミド、及びコスミドから成る群から選択される。
【００２３】
別の態様では、本発明は、昆虫の寄生に耐性の植物を提供し、その際、前記植物の細胞は本発明の組換えポリヌクレオチド分子または昆虫抑制組換えポリペプチドを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】5つの例となるTIC3668型タンパク質に対するコラージュタンパク質TIC4260の配列比較を示す図である。配列の多様性の位置は、この配列比較における灰色の陰影付けにて強調されている。
【図２】例となる葉緑体を標的とした及び標的としない成熟長のTIC3668型タンパク質の植物体でのウエスタンコーンルートワーム（WCR）の抑制活性を示す図である。
【図３】例となる葉緑体を標的とした及び標的としない成熟長のTIC3668型タンパク質の植物体でのWCRの抑制活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
配列の簡単な説明
配列番号1は、ヌクレオチドの1〜951位でのオープンリーディングフレームに由来するTIC3668タンパク質と翻訳終止コドンとをコードするBrevibacillus laterosporus種から得られた組換えポリヌクレオチド配列である。
【００２６】
配列番号2は、配列番号1で示されるようなオープンリーディングフレームに由来するTIC3668前駆体タンパク質のアミノ酸配列翻訳である。
【００２７】
配列番号3は、ヌクレオチドの1〜951位でのオープンリーディングフレームに由来するTIC3669タンパク質と翻訳終止コドンとをコードするBrevibacillus laterosporus種から得られた組換えポリヌクレオチド配列である。
【００２８】
配列番号4は、配列番号3で示されるようなオープンリーディングフレームに由来するTIC3669タンパク質のアミノ酸配列翻訳である。
【００２９】
配列番号5は、ヌクレオチドの1〜951位でのオープンリーディングフレームに由来するTIC3670タンパク質と翻訳終止コドンとをコードするBrevibacillus laterosporus種から得られた組換えポリヌクレオチド配列である。
【００３０】
配列番号6は、配列番号5で示されるようなオープンリーディングフレームに由来するTIC3670前駆体タンパク質のアミノ酸配列翻訳である。
【００３１】
配列番号7は、ヌクレオチドの1〜951位でのオープンリーディングフレームに由来するTIC4076タンパク質と翻訳終止コドンとをコードするBrevibacillus laterosporus種から得られた組換えポリヌクレオチド配列である。
【００３２】
配列番号8は、配列番号7で示されるようなオープンリーディングフレームに由来するTIC4076前駆体タンパク質のアミノ酸配列翻訳である。
【００３３】
配列番号9は、ヌクレオチドの1〜951位でのオープンリーディングフレームに由来するTIC4078タンパク質と翻訳終止コドンとをコードするBrevibacillus laterosporus種から得られた組換えポリヌクレオチド配列である。
【００３４】
配列番号10は、配列番号9で示されるようなオープンリーディングフレームに由来するTIC4078前駆体タンパク質のアミノ酸配列翻訳である。
【００３５】
配列番号11は、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7及び配列番号9で示されたコード配列のそれぞれに由来するDNAセグメントをインフレームで組み合わせてこれら5つの異なるオープンリーディングフレームに由来する配列の変異を含めることによって作り出された、ヌクレオチドの1〜951位でのオープンリーディングフレームに由来するコラージュTIC4260タンパク質と翻訳終止コドンとをコードするBrevibacillus laterosporus種から得られた組換えポリヌクレオチド配列である。
【００３６】
配列番号12は、配列番号11で示されるようなオープンリーディングフレームに由来するコラージュタンパク質のTIC4260の前駆体タンパク質のアミノ酸配列翻訳である。
【００３７】
配列番号13は、ヌクレオチドの1〜951位でのオープンリーディングフレームに由来するTIC4346タンパク質と翻訳終止コドンとをコードするBrevibacillus laterosporus種から得られた組換えポリヌクレオチド配列である。
【００３８】
配列番号14は、配列番号13で示されるようなオープンリーディングフレームのアミノ酸配列翻訳である。
【００３９】
配列番号15は、ヌクレオチドの1〜951位でのオープンリーディングフレームに由来するTIC4826タンパク質と翻訳終止コドンとをコードするBrevibacillus laterosporus種から得られた組換えポリヌクレオチド配列である。
【００４０】
配列番号16は、配列番号15で示されるようなオープンリーディングフレームのアミノ酸配列翻訳である。
【００４１】
配列番号17は、ヌクレオチドの1〜918位でのオープンリーディングフレームに由来するTIC4861タンパク質と翻訳終止コドンとをコードするBrevibacillus laterosporus種から得られた組換えポリヌクレオチド配列である。
【００４２】
配列番号18は、配列番号17で示されるようなオープンリーディングフレームのアミノ酸配列翻訳である。
【００４３】
配列番号19は、ヌクレオチドの1〜945位でのオープンリーディングフレームに由来するTIC4862タンパク質と翻訳終止コドンとをコードするBrevibacillus laterosporus種から得られた組換えポリヌクレオチド配列である。
【００４４】
配列番号20は、配列番号19で示されるようなオープンリーディングフレームのアミノ酸配列翻訳である。
【００４５】
配列番号21は、ヌクレオチドの1〜951位でのオープンリーディングフレームに由来するTIC4863タンパク質と翻訳終止コドンとをコードするBrevibacillus laterosporus種から得られた組換えポリヌクレオチド配列である。
【００４６】
配列番号22は、配列番号21で示されるようなオープンリーディングフレームのアミノ酸配列翻訳である。
【００４７】
配列番号23は成熟TIC3668タンパク質、mTIC3668のアミノ酸配列である。
【００４８】
配列番号24は成熟TIC3669タンパク質、mTIC3669のアミノ酸配列である。
【００４９】
配列番号25は成熟TIC3670タンパク質、mTIC3670のアミノ酸配列である。
【００５０】
配列番号26は成熟TIC4076タンパク質、mTIC4076のアミノ酸配列である。
【００５１】
配列番号27は成熟TIC4078タンパク質、mTIC4078のアミノ酸配列である。
【００５２】
配列番号28は成熟TIC4260タンパク質、mTIC4260のアミノ酸配列である。
【００５３】
配列番号29は成熟TIC4346タンパク質、mTIC4346のアミノ酸配列である。
【００５４】
配列番号30は成熟TIC4826タンパク質、mTIC4826のアミノ酸配列である。
【００５５】
配列番号31は成熟TIC4861タンパク質、mTIC4891のアミノ酸配列である。
【００５６】
配列番号32は植物での発現のために設計されたTIC3668タンパク質をコードする合成ヌクレオチド配列である。
【００５７】
配列番号33は植物での発現のために設計された成熟TIC3668タンパク質、mTIC3668をコードする合成ヌクレオチド配列である。
【００５８】
配列番号34は植物での発現のために設計されたTIC3669タンパク質をコードする合成ヌクレオチド配列である。
【００５９】
配列番号35は植物での発現のために設計された成熟TIC3669タンパク質、mTIC3669をコードする合成ヌクレオチド配列である。
【００６０】
配列番号36は植物での発現のために設計されたTIC3670タンパク質をコードする合成ヌクレオチド配列である。
【００６１】
配列番号37は植物での発現のために設計された成熟TIC3670タンパク質、mTIC3670をコードする合成ヌクレオチド配列である。
【００６２】
配列番号38は植物での発現のために設計されたTIC4076タンパク質をコードする合成ヌクレオチド配列である。
【００６３】
配列番号39は植物での発現のために設計された成熟TIC4076タンパク質、mTIC4076をコードする合成ヌクレオチド配列である。
【００６４】
配列番号40は植物での発現のために設計されたTIC4078タンパク質をコードする合成ヌクレオチド配列である。
【００６５】
配列番号41は植物での発現のために設計された成熟TIC4078タンパク質、mTIC4078をコードする合成ヌクレオチド配列である。
【００６６】
配列番号42は植物での発現のために設計されたTIC4260タンパク質をコードする合成ヌクレオチド配列である。
【００６７】
配列番号43は植物での発現のために設計された成熟TIC4260タンパク質、mTIC4260をコードする合成ヌクレオチド配列である。
【００６８】
配列番号44は植物での発現のために設計されたTIC4346タンパク質をコードする合成ヌクレオチド配列である。
【００６９】
配列番号45は植物での発現のために設計された成熟TIC4346タンパク質、mTIC4346をコードする合成ヌクレオチド配列である。
【００７０】
配列番号46は植物での発現のために設計されたTIC4826タンパク質をコードする合成ヌクレオチド配列である。
【００７１】
配列番号47は植物での発現のために設計された成熟TIC4826タンパク質、mTIC4826をコードする合成ヌクレオチド配列である。
【００７２】
配列番号48は植物での発現のために設計されたTIC4861タンパク質をコードする合成ヌクレオチド配列である。
【００７３】
配列番号49は、植物での発現のために設計された成熟TIC4861タンパク質（mTIC4861）、成熟TIC4862タンパク質（mTIC4862）、及び成熟TIC4863タンパク質（mTIC4863）をコードする合成ヌクレオチド配列である。
【００７４】
配列番号50は植物での発現のために設計されたTIC4682タンパク質をコードする合成ヌクレオチド配列である。
【００７５】
配列番号51は植物での発現のために設計されたTIC4863タンパク質をコードする合成ヌクレオチド配列である。
【００７６】
配列番号52は、本出願で開示され、配列番号1の1〜36位に相当するタンパク質をコードするDNAの（−）鎖とハイブリッド形成するための合成オリゴヌクレオチドを表すヌクレオチド配列である（TIC3668の順行プライマー）。
【００７７】
配列番号53は、本出願で開示され、配列番号1の920〜954位に相当するタンパク質をコードするDNAの（＋）鎖とハイブリッド形成するための合成オリゴヌクレオチドを表すヌクレオチド配列である（TIC3668の逆行プライマー）。
【００７８】
配列番号54は、本出願で開示され、配列番号3の1〜41位に相当するタンパク質をコードするDNAの（−）鎖とハイブリッド形成するための合成オリゴヌクレオチドを表すヌクレオチド配列である（TIC3669の順行プライマー）。
【００７９】
配列番号55は、本出願で開示され、配列番号3の920〜954位に相当するタンパク質をコードするDNAの（＋）鎖とハイブリッド形成するための合成オリゴヌクレオチドを表すヌクレオチド配列である（TIC3669の逆行プライマー）。
【００８０】
配列番号56は、本出願で開示され、配列番号5の1〜36位に相当するタンパク質をコードするDNAの（−）鎖とハイブリッド形成するための合成オリゴヌクレオチドを表すヌクレオチド配列である（TIC3670の順行プライマー）。
【００８１】
配列番号57は、本出願で開示され、配列番号5の920〜954位に相当するタンパク質をコードするDNAの（＋）鎖とハイブリッド形成するための合成オリゴヌクレオチドを表すヌクレオチド配列である（TIC3670の逆行プライマー）。
【００８２】
配列番号58は、本出願で開示され、配列番号7の1〜41位に相当するタンパク質をコードするDNAの（−）鎖とハイブリッド形成するための合成オリゴヌクレオチドを表すヌクレオチド配列である（TIC4076の順行プライマー）。
【００８３】
配列番号59は、本出願で開示され、配列番号7の920〜954位に相当するタンパク質をコードするDNAの（＋）鎖とハイブリッド形成するための合成オリゴヌクレオチドを表すヌクレオチド配列である（TIC4076の逆行プライマー）。
【００８４】
配列番号60は、本出願で開示され、配列番号9の1〜36位に相当するタンパク質をコードするDNAの（−）鎖とハイブリッド形成するための合成オリゴヌクレオチドを表すヌクレオチド配列である（TIC4078の順行プライマー）。
【００８５】
配列番号61は、本出願で開示され、配列番号9の920〜954位に相当するタンパク質をコードするDNAの（＋）鎖とハイブリッド形成するための合成オリゴヌクレオチドを表すヌクレオチド配列である（TIC4078の逆行プライマー）。
【００８６】
配列番号62は、ヌクレオチドの1〜951位でのオープンリーディングフレームに由来するTIC2462タンパク質と翻訳終止コドンをコードするBrevibacillus laterosporus種から得られた組換えポリヌクレオチド配列である。
【００８７】
配列番号63は、配列番号62で示されるようなオープンリーディングフレームのアミノ酸配列翻訳である。
【００８８】
配列番号64は、細菌での発現のための成熟TIC3668タンパク質、mTIC3668をコードする合成ヌクレオチド配列である。
【００８９】
配列番号65は、細菌での発現のための成熟TIC3669タンパク質、mTIC3669をコードする合成ヌクレオチド配列である。
【００９０】
配列番号66は、細菌での発現のための成熟TIC3670タンパク質、mTIC3670をコードする合成ヌクレオチド配列である。
【００９１】
配列番号67は、細菌での発現のための成熟TIC4076タンパク質、mTIC4076をコードする合成ヌクレオチド配列である。
【００９２】
配列番号68は、細菌での発現のための成熟TIC4078タンパク質、mTIC4078をコードする合成ヌクレオチド配列である。
【００９３】
配列番号69は、細菌での発現のための成熟TIC4260タンパク質、mTIC4260をコードする合成ヌクレオチド配列である。
【００９４】
配列番号70は、細菌での発現のための成熟TIC4346タンパク質、mTIC4346をコードする合成ヌクレオチド配列である。
【００９５】
配列番号71は、細菌での発現のための成熟TIC4826タンパク質、mTIC4826をコードする合成ヌクレオチド配列である。
【００９６】
配列番号72は、細菌での発現のための成熟TIC4861（mTIC4861）、TIC4862（mTIC4862）、及びTIC4863（mTIC4863）をコードする合成ヌクレオチド配列である。
【００９７】
発明の詳細な説明
農業上の害虫駆除の当該技術における課題は、標的害虫に対して有効であり、標的害虫種に対して広い範囲の毒性を示し、望ましくない農業問題を生じることなく植物で発現させることができ、植物で商業的に使用されている現在の毒素と比べて代替の作用機序を提供する新しい毒素タンパク質のニーズとして特徴付けることができる。TIC3668によって例示される新規の殺虫タンパク質が本明細書で開示され、これらのニーズのそれぞれに対処し、詳しくは、広い範囲の鞘翅目及び鱗翅目の害虫、さらに詳しくはコーンルートワーム害虫種に対して対処する。
【００９８】
「TIC3668」、「TIC3668タンパク質」、「TIC3668タンパク質毒素」、「TIC3668毒素タンパク質」、「TIC3668−関連の毒素」、「TIC3668−関連のタンパク質毒素のクラスもしくはファミリー」、「TIC3668−関連の毒素タンパク質」、「TIC3668−型のタンパク質」、「TIC3668−様のタンパク質」、「TIC3668−関連の毒素ポリペプチド」、「TIC3668−関連の農薬タンパク質」、または「TIC3668−型の昆虫抑制ポリペプチド」等に対する本出願における参照は、そのようなタンパク質のTIC3668（配列番号2）、TIC3669（配列番号4）、TIC3670（配列番号6）、TIC4076（配列番号8）、TIC4078（配列番号10）、TIC4346（配列番号14）、TIC4826（配列番号16）、TIC4861（配列番号18）、TIC4862（配列番号20）、及びTIC4863（配列番号22）との配列比較が約35％から約100％までの百分率の割合比率のアミノ酸配列同一性を生じるのであれば、昆虫抑制活性を示すどんなタンパク質も含む、鞘翅目の害虫及び鱗翅目の害虫に対して活性を付与するTIC3668（配列番号2）の昆虫抑制ポリペプチド配列及びその昆虫抑制セグメントまたはそれらの組み合わせを含む、それから成る、それに実質的に相同である、それに類似するまたはそれに由来する新規の昆虫抑制タンパク質を指す。本出願で開示されているTIC3668型タンパク質毒素には、TIC3668、TIC3669、TIC3670、TIC4076、TIC4078、TIC4346、TIC4826、TIC4861、TIC4862、TIC4863、及びコラージュTIC4260タンパク質（配列番号12）が含まれる。TIC3668型タンパク質のクラスはタンパク質の前駆体形態と同様に成熟長の形態を含むように意図される。
【００９９】
用語「セグメント」または「断片」は、TIC3668型タンパク質を記載する完全なアミノ酸または核酸の配列より短い保存的なアミノ酸または核酸の配列を記載するのに本出願では使用される。昆虫抑制活性を示すセグメント又は断片は、そのようなセグメント又は断片の配列番号2で示されるTIC3668型タンパク質の対応する区分との配列比較がセグメント又は断片とTIC3668型タンパク質の対応する区分との間で約35〜約100パーセントの任意の割合比率のアミノ酸配列同一性を生じるのであれば、本出願でも開示される。
【０１００】
用語「活性がある」、または「活性」、「農薬活性」または「殺虫活性」、「昆虫抑制性」または「殺虫性」に対する本出願における参照は、抑制すること（増殖、摂食、繁殖力、または生存能力を抑制すること）、抑えること（増殖、摂食、繁殖力、または生存能力を抑えること）、防除すること（有効量のTIC3668型タンパク質を含有する特定の作物にて害虫の寄生を防除すること、害虫の摂食活動を防除すること）、または殺傷すること（害虫の不健全、致死、繁殖力の低下を引き起こすこと）におけるタンパク質毒素のような毒物の有効性を指す。これらの用語は、害虫の毒性タンパク質への曝露が、不健全、致死、繁殖力の低下または成長阻害を生じる、農薬上有効な量の毒性タンパク質を害虫に提供する結果を含むように意図される。これらの用語はまた、農薬上有効な量の毒性タンパク質を植物の中にまたは上に提供した結果としての、植物、植物の組織、植物部位、種子、植物細胞からの、または植物が成長していてもよい特定の幾何的位置からの害虫の撃退も含む。一般に、農薬活性は、増殖、発生、生存能力、摂食行動、交配行動、繁殖力を抑制すること、または昆虫の摂食が原因で生じる有害効果での測定可能な低下において、鱗翅目または鞘翅目の昆虫を含むが、これらに限定されない特定の標的害虫のこのタンパク質、タンパク質断片、タンパク質セグメントまたはポリヌクレオチドに対して効果的である毒性タンパク質の能力を指す。毒性タンパク質は植物によって生産され得るし、または植物にもしくは植物が位置する位置の範囲内の環境に適用され得る。用語「生物活性」、「効果的な」、「有効な」またはそれらの変形は、本発明のタンパク質の標的害虫に対する効果を記載するのに本出願で相互交換可能に利用される用語でもある。
【０１０１】
農薬上有効な量の毒物は、標的害虫の餌にて提供されると、毒物が害虫に接触した際、農薬活性を示す。毒物は当該技術で既知の農薬タンパク質または1以上の化学薬品であることができる。殺虫化学薬品及び殺虫タンパク質作用剤は単独で使用することができ、または互いに組み合わせて使用することができる。化学薬品には、標的害虫における抑制に特異的な遺伝子を標的とするdsRNA分子、有機塩化物、有機リン酸塩、カルバメート、ピレスロイド、ネオニコチノイド及びリアノイドが挙げられるが、これらに限定されない。殺虫タンパク質作用剤には、本出願で述べられるタンパク質毒素、と同様に鱗翅目及び鞘翅目を標的とするものを含む他のタンパク質様毒物と同様に半翅目及び同翅目の種を防除するのに使用するための当該技術で利用できるCryタンパク質のような他の植物害虫を防除するのに使用されるタンパク質毒素も挙げられる。
【０１０２】
害虫、特に作物の害虫に対する参照は、作物の害虫、特にTIC3668関連タンパク質毒素のクラスによって防除されるものを意味することが意図される。しかしながら、害虫への参照はまた、植物の半翅目及び同翅目の害虫も含むことができるとともに、線虫及び真菌は毒物がこれらの害虫を標的とする場合、TIC3668関連タンパク質毒素のクラスの1以上のタンパク質と同時局在するまたは一緒に存在する。
【０１０３】
TIC3668関連タンパク質のクラスを含む個々のタンパク質は共通の機能によって関連付けられ、成虫、蛹、幼虫、及び生まれたての虫を含む、鞘翅目及び鱗翅目の昆虫種に由来する害虫に向けた殺虫活性を示す。鱗翅目の昆虫には、ヤガ科におけるアワヨトウ、ネキリムシ、シャクトリムシ、及びヘリオチン、たとえば、ツマジロクサヨトウ（Spodoptera frugiperda）、シロイチモンジヨトウ（Spodoptera exigua）、バーサアーミーワーム（Mamestra configurata）、タマナヤガ（Agrotis ipsilon）、キャベツシャクトリムシ（Trichoplusia ni）、ダイズシャクトリムシ（Pseudoplusia includens）、ムクナイモムシ（Anticarsia gemmatalis）、グリーンクローバーワーム（Hypena scabra）、オオタバコガ（Heliothis virescens）、グラニュレートカットワーム（Agrotis subterranea）、アワヨトウ（Pseudaletia unipuncta）、ウエスタンカットワーム（Agrotis orthogonia）；メイガ科に由来する穿孔虫、繭を作る昆虫、ウェブワーム、マツマダラメイガ、アオムシ及び葉を喰い荒らす幼虫、たとえば、ヨーロッパアワノメイガ（Ostrinia nubilalis）、ネーブルオレンジワーム（Amyelois transitella）、トウモロコシ根ウェブワーム（Crambus caliginosellus）、ツトガ（Herpetogramma licarsisalis）、ヒマワリガ（Homoeosoma electellum）、モロコシマダラメイガ（Elasmopalpus lignosellus）；ハマキガ科に由来するリーフローラー、植物の芽を貪り喰う毛虫、シードワーム、及びフルーツワーム、たとえば、コドリンガ（Cydia pomonella）、ブドウヒメハマキ（Endopiza viteana）、ナシノヒメシンクイ（Grapholita molesta）、ヒマワリバドモス（Suleima helianthana）；ならびに多数の他の経済上重要な鱗翅目、たとえば、コナガ（Plutella xylostella）、マタアカミムシガ（Pectinophora gossypiella）及びマイマイガ（Lymantria dispar）が挙げられるが、これらに限定されない。鱗翅目の他の害虫には、たとえば、Alabama argillacea（コットンリーフワーム）、Archips argyrospila（フルーツツリーリーフローラー）、Archips rosana  （ヨーロッパリーフローラー）及び他のArchips種、Chilo suppressalis（ニカメイガ、または二化螟蛾）、Cnaphalocrocis medinalis（コブノメイガ）、Crambus caliginosellus（コーンルートウェブワーム）、Crambus teterrellus（ブルーグラスウェブワーム）、Diatraea grandiosella（サウスウエスタンマツマダラメイガ）、Diatraea saccharalis（サトウキビメイガ）、Earias insulana（ミスジアオリンガ）、Earias vittella（クサオビリンガ）、Helicoverpa armigera（オオタバコガ）、Helicoverpa zea（アメリカタバコガまたはオオタバコガ）、Heliothis virescens（ニセアメリカタバコガ）、Herpetogramma licarsisalis（ソドウェブワーム）、Lobesia botrana（ヨーロッパグレープバインモス）、Phyllocnistis citrella（ミカンハモグリガ）、Pieris brassicae（オオモンシロチョウ）、Pieris rapae（輸入アオムシ、またはコモンシロチョウ）、Plutella xylostella（コナガ）、Spodoptera exigua（シロイチモンジョトウ）、Spodoptera litura（ハスモンヨトウ、ハスモンヨトウ）、及びTuta absoluta（トマトハモグリバエ）が挙げられる。鞘翅目の昆虫には、特に害虫が、Diabrotica virgifera virgifera（ウエスタンコーンルートワーム、WCR）、Diabrotica barberi（ノーザンコーンルートワーム、NCR）、Diabrotica virgifera zeae（メキシカンコーンルートワーム、MCR）、Diabrotica balteata（ブラジリアンコーンルートワーム（BZR）、Diabrotica undecimpunctata howardii（サザンコーンルートワーム、  SCR）及びDiabrotica viridulaとDiabrotica speciosaとから成るブラジリアンコーンルートワーム複合群（BCR）である場合、Agriotes spp．、Anthonomus spp．、Atomaria linearis、Chaetocnema tibialis、Cosmopolites spp．、Curculio spp．、Dermestes spp．、Diabrotica spp．、Epilachna spp．、Eremnus spp．、Leptinotarsa decemlineata、Lissorhoptrus spp．、Melolontha spp．、Orycaephilus spp．、Otiorhynchus spp．、Phlyctinus spp．、Popillia spp．、Psylliodes spp．、Rhizopertha spp．、Scarabeidae、Sitophilus spp．、Sitotroga spp．、Tenebrio spp．、Tribolium spp．及びTrogoderma sppが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０４】
「単離されたDNA分子」、「単離されたポリヌクレオチド分子」または同等の用語もしくは語句に対する本出願における参照は、DNA分子が単独で存在する、または他の組成物との組み合わせで存在するが、その天然の環境の範囲内にはないことを意味するように意図される。生物のゲノムのDNA内にて天然に見いだされる、たとえば、コード配列、イントロン配列、非翻訳リーダー配列、プロモータ配列、転写終結配列等のような核酸要素は、その要素が生物のゲノムの範囲内でそれが天然に見いだされるゲノム内の位置にある限り、「単離されている」とは見なされない。しかしながら、これらの要素のそれぞれ及びこれらの要素の下位区分は、その要素が生物のゲノムの範囲内になく、それが天然に見いだされるゲノム内の位置にない限り、本開示の範囲内で「単離されている」ことになる。同様に、殺虫タンパク質またはそのタンパク質の天然に存在する殺虫性の変異体をコードするヌクレオチド配列は、そのヌクレオチド配列がタンパク質をコードする配列が天然に見いだされる細菌のDNAの中にないということであれば、単離されたヌクレオチド配列であるということになる。天然に存在する殺虫タンパク質のアミノ酸配列をコードする合成ヌクレオチド配列は本開示の目的では単離されていると見なされることになる。本開示の目的では、任意のトランスジェニックヌクレオチド配列、すなわち、植物もしくは細菌の細胞のゲノムに挿入されたDNAヌクレオチド配列、または染色体外のベクターに存在するDNAのヌクレオチド配列は、それが細胞を形質転換するのに使用されたプラスミドまたは類似の構造の中に存在しようとすまいと、植物もしくは細菌のゲノムの範囲内に存在しようとすまいと、または植物もしくは細菌に由来する組織、子孫、生物試料もしくはコモディティ製品にて検出可能な量で存在しようとすまいと、単離されたヌクレオチド配列であると見なされることになる。
【０１０５】
本出願にてさらに記載されているように、TIC3668（配列番号2）をコードするオープンリーディングフレーム（ORF）（配列番号1）はBrevibacillus laterosporusEG5552株から得られたDNAにて発見された。次いでTIC3668関連のタンパク質をコードする配列について他の細菌ゲノムをスクリーニングした。EG5552株のTIC3668タンパク質に似ているアミノ酸配列をコードするこれらの他の細菌ゲノムにて同定されたいくつかの他のオープンリーディングフレームには、Brevibacillus laterosporusのEG5551株から得られたDNAにて発見されたTIC3668−様タンパク質TIC3669（配列番号4をコードする配列番号3）、Brevibacillus laterosporusのEG5553株から得られたDNAにて発見されたTIC3670（配列番号6をコードする配列番号5）、Brevibacillus laterosporusのATCC6456株から得られたDNAにて発見されたTIC4076（配列番号8をコードする配列番号7）、Brevibacillus laterosporusのEG4227株から得られたDNAにて発見されたTIC4078（配列番号10をコードする配列番号9）、Brevibacillus laterosporusのEG5551株から得られたDNAにて発見されたTIC4346（配列番号14をコードする配列番号13）、Brevibacillus laterosporusのAG0021D10株から得られたDNAにて発見されたTIC4826（配列番号16をコードする配列番号15）、Brevibacillus laterosporusのEG4227から得られたDNAにて発見されたTIC4861（配列番号18をコードする配列番号17）、TIC4862（配列番号20をコードする配列番号19）及びTIC4863（配列番号22をコードする配列番号21）を含む幾つかの他のオープンリーディングフレームが特定された。追加の1つ、TIC3668様のタンパク質であるTIC4260（配列番号12をコードする配列番号11）は5つの異なるネイティブのTIC3668様タンパク質に由来する天然に存在するアミノ酸配列の変異を組み合わせてコラージュタンパク質を作り出すことによって作り出した。
【０１０６】
各コード配列をクローニングし、微生物宿主細胞で発現させて昆虫バイオアッセイで使用するための組換えタンパク質を作出した。本出願にてさらに記載されているように、これらのタンパク質はウエスタンコーンルートワーム（WCR、Diabrotica virgifera virgifera）、ウエスタンヨーロッパアワノメイガ（ECB、Ostrinia nubialis）、サウスウエスタンアワノメイガ（SWC、Diatraea grandiosella）、及びダイズシャクトリムシ（SBL、Chrysodeixis includens）を含むDiabrotica種に対して生物活性を呈することが示されている。
【０１０７】
TIC3668型タンパク質の驚くべき特徴は、TIC3668、TIC3669、TIC3670、TIC4076、TIC4078、TIC4260、TIC4346、TIC4826、TIC4863についてのアミノ酸1〜23位；TIC4861についての1〜12位；及びTIC4862についての1〜21位に相当するN末端のアミノ酸セグメントの存在である。これらN末端アミノ酸セグメントのそれぞれは各タンパク質から除外されてもよく、各セグメントをコードするポリヌクレオチド配列も除外されてもよい。植物体で発現される場合、驚くべきことにこれら各セグメントの除外は、除外されたセグメントを含有する完全長のタンパク質毒素の発現と比べてコーンルートワーム種に対する殺虫活性の上昇を生じる。上記で参照されるようなN末端アミノ酸セグメントを欠いているタンパク質毒素セグメントを本明細書では「成熟TIC3668型毒素タンパク質」と呼ぶ。一般に、TIC3668型タンパク質の成熟型に対する参照は本明細書では、毒素の名称の前に文字「m」を付けて完全長のネイティブ配列から成熟配列への参照を差別化する。たとえば、TIC3668（配列番号2）についての成熟型のアミノ酸配列はmTIC3668（配列番号23）である。TIC3669（配列番号4）、TIC3670（配列番号6）、TIC4076（配列番号8）、TIC4078（配列番号10）、TIC4260（配列番号12）、TIC4346（配列番号14）及びTIC4826（配列番号16）についての成熟型はそれぞれ、mTIC3669（配列番号24）、mTIC3670（配列番号25）、mTIC4076（配列番号26）、mTIC4078（配列番号27）、mTIC4260（配列番号28）、mTIC4346（配列番号29）及びmTIC4826（配列番号30）である。完全長タンパク質TIC4861（配列番号18）、TIC4862（配列番号20）及びTIC4863（配列番号22）は、互いの配列長の変異体であり、N末端アミノ酸セグメントの長さのみ異なる。TIC4861、TIC4862及びTIC4863からのN末端アミノ酸セグメントの除去は、mTIC4861、mTIC4862及びmTIC4863についての同一の成熟アミノ酸配列を作り出す。従って、mTIC4861、mTIC4862及びmTIC4863についてのアミノ酸配列は同一のポリヌクレオチド配列（mTIC4861、配列番号31）によってコードされる。成熟TIC3668様タンパク質配列は、細菌宿主における発現のための配列番号64（mTIC3668をコードする）、配列番号65（mTIC3669をコードする）、配列番号66（mTIC3670をコードする）、配列番号67（mTIC4076をコードする）、配列番号68（mTIC4078をコードする）、配列番号69（mTIC4260をコードする）、配列番号70（mTIC4346をコードする）、配列番号71（mTIC4826をコードする）、及び配列番号72（mTIC4861、mTIC4862、及びmTIC4863をコードする）によってコードされる。
【０１０８】
TIC3668型ファミリーに対する追加のメンバーは、ファミリーメンバーの一部またはすべてに由来する天然に存在するアミノ酸変異を用いて作り出され、高レベルのアミノ酸配列多様性の且つ新規の特性を伴う新規のタンパク質を作り出すことができる。TIC3668型タンパク質毒素クラスの変異体は、TIC3668型ファミリーメンバーのアミノ酸配列を並べ、新規のアミノ酸配列の中にアミノ酸配列レベルでの差異を組み合わせ、これらの変異体をコードするポリヌクレオチドに適当な変化を作ることによって作出された。そのような例の1つがTIC4260である。配列番号11は、TIC4260タンパク質（配列番号12）をコードするポリヌクレオチド配列である。成熟タンパク質（mTIC4260、配列番号28）は配列番号43のポリヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１０９】
TIC3668型タンパク質毒素の断片は、1以上のアミノ酸をタンパク質のN末端、C末端、中央、または昆虫抑制活性を持つその組み合わせから欠失させる短縮形態であることができる。これらの断片は、TIC3668、TIC3669、TIC3670、TIC4260、TIC4076、TIC4078、TIC4346、TIC4826、TIC4861、TIC4862またはTIC4863の天然に存在するまたは合成の変異体であることができるが、TIC3668、TIC3669、TIC3670、TIC4260、TIC4076、TIC4078、TIC4346、TIC4826、TIC4861、TIC4862またはTIC4863の昆虫抑制活性を保持するまたは改善するべきである。短縮されたN末端またはC末端の欠失変異体には、N末端及び／またはC末端からアミノ酸残基を欠いているTIC3668、TIC3669、TIC3670、TIC4260、TIC4076、TIC4078、TIC4346、TIC4826、TIC4861、TIC4862またはTIC4863のタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。たとえば、TIC3668タンパク質のN末端アミノ酸残基1〜23を欠失させて配列番号2のアミノ酸24〜317を有する毒素タンパク質を生じることができる。TIC3668タンパク質のC末端のアミノ酸末端から10または20のアミノ酸を除去することで殺虫活性が喪失する一方で、単一アミノ酸の除去は活性に影響を及ぼさなかった。
【０１１０】
TIC3668型タンパク質クラスのタンパク質及びTIC3668型タンパク質クラスのタンパク質に類似するタンパク質は、当該技術で既知の種々のコンピュータに基づくアルゴリズムを用いて互いに比較することによって特定することができる（表1及び2を参照）。本明細書で報告されているアミノ酸の配列同一性は、これらの初期設定パラメータ：加重マトリクス：blosum、ギャップオープンペナルティ：10．0、ギャップ拡張ペナルティ：0．05、親水性ギャップ：オン、親水性残基：GPSNDQERK、残基特異的なギャップペナルティ：オン（Thompsonら．（1994）,Nucleic Acids Research,22：4673−4680）を用いたClustal W配列比較の結果である。アミノ酸同一性の百分率は（アミノ酸同一性／対象タンパク質の長さ）を乗じた100％の積によってさらに算出される。他の配列比較アルゴリズムも当該技術で利用でき、Clustal W配列比較を用いて得られるものに類似した結果を提供する。
【０１１１】
タンパク質がクエリにて、たとえば、Clustal W配列比較にて使用され、mTIC4260として記載されているような本発明のタンパク質の少なくとも1つが、クエリタンパク質がクエリタンパク質の長さに沿った85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％もしくはこの範囲内での割合比率である少なくとも約85％〜約100％のアミノ酸配列同一性を示すそのような配列比較にてヒットとして特定される；またはmTIC3668として記載されているような本発明のタンパク質の少なくとも1つが、クエリタンパク質がクエリタンパク質の長さに沿った89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％もしくはこの範囲内での割合比率である少なくとも約89％〜約100％のアミノ酸配列同一性を示すそのような配列比較にてヒットとして特定される；またはmTIC3669及び／またはmTIC3670として記載されているような本発明のタンパク質の少なくとも1つが、クエリタンパク質がクエリタンパク質の長さに沿った90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％もしくはこの範囲内での割合比率である少なくとも約90％〜約100％のアミノ酸配列同一性を示すそのような配列比較にてヒットとして特定される；またはmTIC4826として記載されているような本発明のタンパク質の少なくとも1つが、クエリタンパク質がクエリタンパク質の長さに沿った91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％もしくはこの範囲内での割合比率である少なくとも約91％〜約100％のアミノ酸配列同一性を示すそのような配列比較にてヒットとして特定されるのであれば、鱗翅目の昆虫種に対する昆虫抑制活性を呈するタンパク質はTIC3668型タンパク質毒素クラスのメンバーであることが意図される。
【０１１２】
タンパク質がクエリにて、たとえば、Clustal W配列比較にて使用され、mTIC3668、mTIC3669、mTIC3670、mTIC4076、mTIC4078、mTIC4260、mTIC4346、mTIC4826、mTIC4861、mTIC4862、及びmTIC4863として記載されているような本発明のタンパク質の少なくとも1つが、クエリタンパク質がクエリタンパク質の長さに沿った約35％、40％、50％、60％、70％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％もしくはこの範囲内での割合比率である少なくとも約35％〜約100％のアミノ酸配列同一性を示すそのような配列比較にてヒットとして特定されるのであれば、鞘翅目の昆虫種に対する昆虫抑制活性を呈するタンパク質はTIC3668型タンパク質毒素クラスのメンバーであることが意図される。
【０１１３】
TIC3668型タンパク質毒素クラスの例となるタンパク質がClustal Wアルゴリズムを用いて互いに並べられた。完全長タンパク質の各対についてのアミノ酸配列同一性百分率の対ごとにマトリクスを表1で報告するように作り出した。成熟長タンパク質の各対についての配列同一性百分率の対ごとのマトリクスを表2で報告するように作り出した。
【表１】
0006731408.tif 000002
表の説明：（X）対（Y）間のClustal W配列比較は対ごとのマトリクスで報告される。（N）の下の欄は配列番号を指す。（M）の列はタンパク質の名称（TIC番号）を指す。対すべての間でのアミノ酸同一性百分率を算出し、各欄における第1の数によって表す。各欄における第2の数（括弧内）は対間での同一アミノ酸の数を表す。
【表２】
0006731408.tif 000003
表の説明：（X）対（Y）の間でのClustal W配列比較は対ごとのマトリクスで報告される。（N）の下の欄は配列番号を指す。（M）の列はタンパク質の名称（TIC番号）を指す。対すべての間でのアミノ酸同一性百分率を算出し、各欄における第1の数によって表す。各欄における第2の数（括弧内）は対間での同一アミノ酸の数を表す。
【０１１４】
TIC3668型タンパク質毒素のクラスの完全長タンパク質及び成熟タンパク質は一次構造（保存されたアミノ酸モチーフ）によって、長さ（成熟タンパク質について約295のアミノ酸及び完全長タンパク質について約317アミノ酸）によって、及び他の特徴によっても関連付けることもできる。本発明に由来する完全長タンパク質は変性条件下でタンパク質ゲルを泳動する場合、約35kダルトンの測定された質量を有し、成熟タンパク質は約32kDaの測定された質量を有する。TIC3668型タンパク質毒素のクラスの完全長形態及び成熟形態の特徴を表3及び4にて報告する。
【表３】
0006731408.tif 000004
【表４】
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【０１１５】
開示されているTIC3668型タンパク質毒素クラスのタンパク質は新しいクラスの殺虫タンパク質を表す。表5を参照して、100％同一性に相当する対角線の上側の数はすべて、その特定の行と列が交わる部分で比較される相当するタンパク質間のアミノ酸の差異の数を表す。100％同一性に相当する対角線の下側の数はその特定の行と列が交わる部分で比較される相当するタンパク質の同一性百分率を表す。このタンパク質クラスの成熟長のメンバーは、表5で提供されている配列比較で明らかにされたように、当該技術で既知の他の殺虫タンパク質に対して90．54％を超えるアミノ酸同一性を示さない。本発明の成熟長タンパク質のいずれかに対する最も近い同一性を示す殺虫タンパク質は、mTIC4076、mTIC4346、mTIC4826及びmTIC4863に対して90．5％の配列同一性を持つ米国特許出願公開番号20110030093（AXMI−209）における配列番号50である。本開示のみが鱗翅目に対する活性を教示する一方で、本発明の例となるタンパク質は鞘翅目に対する活性を実証している。H0UDD3＿BRELA、F7TVP6＿BRELA及びU4WSU1＿BRELAは、B．laterosporousから得られていると報告されたゲノム配列におけるオープンリーディングフレームから予測される注釈が付けられていないタンパク質配列である。これらのタンパク質について殺虫活性は報告されていない。
【表５】
0006731408.tif 000006
【０１１６】
本出願で開示されているTIC3668タンパク質はWCRを含む鞘翅目に対する食餌バイオアッセイにて活性を示す。場合によっては鱗翅目への活性も観察される。
【０１１７】
本出願の実施例でさらに記載されているように、TIC3668毒素タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は植物での使用のために設計された。植物での発現のために設計された、昆虫抑制性のTIC3668、TIC3669、TIC3670、TIC4260、TIC4076、TIC4078、TIC4346、TIC4826、TIC4861、TIC4862、及びTIC4863のタンパク質の完全長をコードする例となるポリヌクレオチドは、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、及び配列番号51にて示されている。植物での発現のために設計された、昆虫抑制性のmTIC3668、mTIC3669、mTIC3670、mTIC4260、mTIC4076、mTIC4078、mTIC4346、mTIC4826、mTIC4861、mTIC4862、及びmTIC4863のタンパク質の成熟形態をコードする例となるポリヌクレオチドは、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、及び配列番号49にて示されている。
【０１１８】
これらのポリヌクレオチド配列を含有する発現カセット及びベクターが、当該技術で既知の形質転換の方法及び技法に従って構築され、トウモロコシ植物細胞に導入された。形質転換された細胞は、TIC3668毒素タンパク質を発現していることが観察された形質転換植物にて再生された。農薬活性を調べるために、形質転換植物から得られた植物リーフディスクを用いて鱗翅目または鞘翅目の害虫の幼虫の存在下でバイオアッセイを行った。
【０１１９】
TIC3668型タンパク質毒素クラスの例となるメンバーの昆虫抑制活性は実施例にさらに詳細に記載されている。例となるタンパク質は、共通の機能によって関連付けられ、成虫、蛹、幼虫、及び生まれたての虫を含む、鞘翅目及び鱗翅目の昆虫種に向けた殺虫活性を示す。
【０１２０】
TIC3668型タンパク質をコードする組換えポリヌクレオチド組成物が企図される。たとえば、TIC3668型タンパク質は、そのタンパク質をコードするORFを伴ったポリヌクレオチド分子が構築物が意図される系においてプロモータや発現に必要な他の調節性要素のような遺伝子発現要素に操作可能に連結される組換えDNA構築物で発現させることができる。非限定例には、植物におけるタンパク質の発現のための配列をコードするTIC3668型タンパク質に操作可能に連結される植物で機能的なプロモータ、またはBt細菌もしくは他のBacillus種におけるタンパク質の発現のための配列をコードするTIC3668型タンパク質に操作可能に連結されるBtで機能的なプロモータが挙げられる。エンハンサー、イントロン、非翻訳リーダー、コードされたタンパク質の不動化タグ（Hisタグ）、転座ペプチド（すなわち、色素体輸送ペプチド、シグナルペプチド）、翻訳後修飾酵素のためのポリペプチド配列、リボゾーム結合部位及びRNAi標的部位を含むが、これらに限定されない他の要素をTIC3668型タンパク質コードする配列に操作可能に連結することができる。ここで提供される例となる組換えポリヌクレオチド分子には、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、及び配列番号22にて示されるようなアミノ酸配列を有する各ポリペプチドまたはタンパク質をコードする配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、及び配列番号21のようなポリヌクレオチドに操作可能に連結される異種プロモータが含まれるが、これらに限定されない。本明細書で開示されているタンパク質をコードする組換えポリヌクレオチド分子のコドンは同義コドンによって置換することができる（サイレント置換として当該技術で知られる）。本出願で開示されているTIC3668型タンパク質のいずれかをコードする修飾されたポリヌクレオチドの非限定例は、完全長タンパク質配列については、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、及び配列番号：51にて、ならびに成熟タンパク質配列については配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、及び配列番号49にて示されている。
【０１２１】
TIC3668型タンパク質をコードする配列を含む組換えDNA構築物はさらに、TIC3668型タンパク質、TIC3668型タンパク質とは異なるタンパク質、昆虫抑制dsRNA分子または補助タンパク質をコードするDNA配列と付随して発現するまたは同時発現するように構成することができる1以上の昆虫抑制剤をコードするDNAの領域を含むことができる。補助タンパク質には、たとえば、その発現を助けること、植物におけるその安定性に影響を及ぼすこと、オリゴマー化のための自由エネルギーを最適化すること、その毒性を増強すること、及び活性のその範囲を増やすことによって昆虫抑制剤の有効性に役立つように機能する補因子、酵素、結合相手、または、他の作用剤が挙げられるが、これらに限定されない。補助タンパク質は、たとえば、1以上の昆虫抑制剤の取り込みを促進してもよいし、または毒物の毒性効果を強化してもよい。
【０１２２】
組換えDNA構築物は、タンパク質もしくはdsRNA分子のすべてが1つのプロモータから発現されるように、またはタンパク質もしくはdsRNA分子それぞれが別々のプロモータの制御下になるように、もしくはそれらのいくつかの組み合わせのであるように組み立てることができる。本発明のタンパク質は選択される発現系の種類に応じて、TIC3668タンパク質の1以上のタンパク質が、他のオープンリーディングフレーム及びプロモータも含有する共通のヌクレオチドセグメントから発現される多重遺伝子発現系から発現させることができる。たとえば、細菌の多重遺伝子発現系は単一のプロモータを利用して単一のオペロンの範囲内から多重結合した／直列のオープンリーディングフレームの発現を主導することができる（すなわち、多シストロン性発現）。別の例では、植物の多重遺伝子発現系は、異なるタンパク質または、たとえば、1以上のdsRNA分子のような他の作用因子をそれぞれ発現する多重結合されていない発現カセットを利用することができる。
【０１２３】
TIC3668型タンパク質をコードする配列を含む組換えポリヌクレオチドまたは組換えDNA構築物は、ベクター、たとえば、プラスミド、バキュロウイルス、合成染色体、ビリオン、コスミド、ファージミド、ファージまたはウイルスベクターによって宿主細胞に送達され得る。そのようなベクターを用いて、宿主細胞にてTIC3668型タンパク質をコードする配列の安定な発現または一時的な発現を達成し、またはコードされたポリペプチドのそれに続く発現を達成することができる。TIC3668型タンパク質をコードする配列を含み、宿主細胞に導入される外来性の組換えポリヌクレオチドまたは組換えDNA構築物は、本明細書では「導入遺伝子」と呼ばれる。
【０１２４】
TIC3668型タンパク質をコードする配列のいずれか1以上を発現する組換えポリヌクレオチドを含有するトランスジェニック細菌、トランスジェニック植物細胞、トランスジェニック植物及びトランスジェニック植物部位が本明細書で提供される。用語「細菌細胞」または「細菌」には、agrobacterium、Bacillus、エシェリキア、サルモネラ、シュードモナスまたはリゾビウムの細胞が含まれ得るが、これらに限定されない。用語「植物細胞」または「植物」には、単子葉植物、双子葉植物、アルファルファ、バナナ、オオムギ、マメ、ブロッコリ、キャベツ、アブラナ、ニンジン、キャッサバ、トウゴマ、カリフラワー、セロリ、ヒヨコマメ、ハクサイ、ミカン、ココナッツ、コーヒー、トウモロコシ、クローバ、ワタ、ウリ、キュウリ、ベイマツ、ナス、ユーカリ、アマ、ニンニク、ブドウ、ホップ、セイヨウネギ、レタス、テーダマツ、キビ、メロン、ナッツ、カラスムギ、オリーブ、タマネギ、観葉植物、ヤシ、牧草、エンドウマメ、ビーナッツ、コショウ、キマメ、マツ、ジャガイモ、ポプラ、カボチャ、ラジアータパイン、ダイコン、ナタネ、コメ、根茎、ライムギ、ベニバナ、低木、ソルガム、サザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、カボチャ、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、スイートコーン、モミジバフウ、サツマイモ、スイッチグラス、茶、タバコ、トマト、ライコムギ、芝草、スイカ及びコムギの植物細胞または植物を挙げることができるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、トランスジェニック植物細胞から再生されたトランスジェニック植物及びトランスジェニック植物部位が提供される。特定の実施形態では、トランスジェニック植物は、植物に由来する一部を切断し、折り取り、粉砕し、または別の方法で切り離すことによってトランスジェニック種子から得ることができる。特定の実施形態では、植物部位は、種子、丸莢、葉、花、茎、根またはそれらの一部、またはトランスジェニック植物部位の再生できない部分であることができる。本文脈で使用されるとき、トランスジェニック植物部位の「再生できない」部分は、植物全体を形成するように誘導することができない部分、または有性生殖及び／または無性生殖が可能である植物全体を形成するように誘導することができない部分である。特定の実施形態では、植物部位の再生できない部分はトランスジェニック種子、丸莢、葉、花、茎、または根の一部分である。
【０１２５】
昆虫である鞘翅目または鱗翅目を抑制する量のTIC3668型タンパク質を含むトランスジェニック植物を作製する方法が提供される。そのような植物は、本出願で提供されているTIC3668型タンパク質のいずれかをコードする組換えポリヌクレオチドを植物細胞に導入し、昆虫である鞘翅目または鱗翅目を抑制する量のTIC3668型タンパク質を発現している前記植物細胞に由来する植物を選択することによって作製することができる。植物は、再生、種子、花粉または分裂組織の形質転換法による植物細胞に由来することができる。植物を形質転換する方法は当該技術で既知である。
【０１２６】
加工製品が検出可能な量のTIC3668型タンパク質、その昆虫抑制性のセグメントまたはその断片、またはその特徴的な部分を含む加工植物製品も本出願で開示される。特定の実施形態では、加工製品は、植物部位、植物バイオマス、油、粗びき粉、糖、動物飼料、粉、薄片、糠、糸くず、外皮、加工種子及び種子から成る群から選択される。特定の実施形態では、加工製品は再生可能ではない。植物製品は、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物部位に由来するコモディティ製品または他の商業製品を含むことができ、その際、コモディティ製品または他の製品は、TIC3668型タンパク質の特徴的な部分をコードするまたは含むヌクレオチドセグメントまたは発現RNAまたはタンパク質を検出することによって商取引を介して追跡することができる。
【０１２７】
TIC3668タンパク質を発現している植物は、他の毒素タンパク質を発現している及び／または、たとえば、除草剤耐容遺伝子、収量またはストレス耐容形質を付与する遺伝子等のような他のトランスジェニック形質を発現しているトランスジェニック体と交配することによって交雑することができ、またはそのような形質は、形質がすべて連鎖するように単一のベクターで組み合わせることができる。
【０１２８】
TIC3668型タンパク質をコードする配列及びTIC3668型タンパク質をコードする配列に対する実質的な比率の同一性を有する配列は、たとえば、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）、熱増幅及びハイブリッド形成のような当業者に既知の方法を用いて特定することができる。たとえば、TIC3668型タンパク質毒素クラスのタンパク質を用いてこのクラスのタンパク質に特異的に結合する抗体を作出することができ、それを用いてそのクラスの他のメンバーをスクリーニングし、見いだすことができる。
【０１２９】
さらに、TIC3668型タンパク質毒素クラス（及び逆相補体の配列）をコードするヌクレオチド配列をスクリーニング用のプローブ及びプライマーとして用い、熱サイクル増幅または等温増幅及びハイブリッド形成の方法を用いてそのクラスの他のメンバーを特定することができる。具体的には、配列番号52〜61のいずれかで示される配列に由来するオリゴヌクレオチドを用いて、コモディティ製品に由来するデオキシリボ核酸試料にてTIC3668型導入遺伝子の存在または非存在を判定することができる。オリゴヌクレオチドを採用する特定の核酸検出法の感度を考えると、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、及び配列番号61のいずれかで示される配列に由来するオリゴヌクレオチドを用いて、コモディティ製品のほんの一部のみが配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、及び配列番号61のいずれかを含有するトランスジェニック植物に由来するプールされた供給源に由来するコモディティ製品にてTIC3668、TIC3669、TIC3670、TIC4076、TIC4078、またはTIC4260の導入遺伝子を検出することができることが予測される。そのようなオリゴヌクレオチドを用いて、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、及び配列番号61のそれぞれにてヌクレオチド配列の変異を導入することができることがさらに認識される。そのような「変異誘発」のオリゴヌクレオチドは、トランスジェニック植物宿主細胞にて様々な昆虫抑制活性または多様な発現を示すTIC3668、TIC3669、TIC3670、TIC4076、TIC4078、またはTIC4260のアミノ酸配列変異体を特定するのに有用である。
【０１３０】
ストリンジェントなハイブリッド形成条件下にて本出願で開示されている配列のそれぞれまたはいずれかとハイブリッド形成するヌクレオチド配列によってコードされるヌクレオチド配列のホモログ、たとえば、殺虫タンパク質も本発明の実施形態である。本発明はまた、第2のヌクレオチド配列とハイブリッド形成する第1のヌクレオチド配列を検出する方法も提供し、その際、第1のヌクレオチド配列（またはその逆相補体配列）は殺虫タンパク質またはその殺虫断片をコードし、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下で第2のヌクレオチド配列とハイブリッド形成する。そのような場合、第2のヌクレオチド配列は、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下でTIC3668型タンパク質毒素クラスにて開示されているヌクレオチド配列のいずれかであることができる。ヌクレオチドのコード配列は適当なハイブリッド形成条件下で互いにハイブリッド形成し、これらのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質は他のタンパク質のいずれか1つに対して生成された抗血清と交差反応する。ストリンジェントなハイブリッド形成条件は当該技術で既知であり、所望の適用及び結果に従って変化してもよく、種々の試薬及び条件を包含してもよい。たとえば、高い温度での洗浄はさらにストリンジェント条件を構成する。特定の実施形態では、本発明のハイブリッド形成条件は、少なくとも42℃でのハイブリッド形成と、それに続くそれぞれ室温での2×SSC、0．1％SDSによる5分間の2回の洗浄と、それに続くそれぞれ65℃での0．5×SSC、0．1％SDSでの30分間の2回の洗浄、または68℃でのハイブリッド形成と、それに続く68℃での0．1％SDSを含有する2×SSCにおける洗浄、または50％ホルムアミド、1MのNaCl及び1％SDSにおける37Cでの4〜12時間のハイブリッド形成ならびに0．1×SSCにおける60C〜65Cでの洗浄を含んでもよい。
【０１３１】
遺伝子コードの重複性のために、多数の他の配列は、それらがBacillus株または植物細胞にて殺虫タンパク質を発現するように機能する程度にそのような関連タンパク質及びそれらの配列をコードすることができ、本発明の実施形態であることを当業者は認識するであろうが、当然、多数のそのような重複のコード配列はこれらの条件下ではTIC3668をコードするネイティブのBacillus配列とはハイブリッド形成しないことを認識するであろう。本出願は、TIC3668型タンパク質をコードする配列及びTIC3668型タンパク質をコードする配列に対する実質的な比率の同一性を有する配列を特定するためのそれら及び当業者に既知の他の特定方法の使用を企図する。
【０１３２】
本開示はまた、農薬タンパク質に由来するタンパク質のキメラを含む商業上有用なタンパク質を操作し、クローニングする当該技術で既知の分子法の使用を企図し；たとえば、キメラはTIC3668型タンパク質のセグメントから組み立てられて、TIC3668型タンパク質のセグメントのTIC3668及び関連タンパク質とは異なる多様なタンパク質のセグメントとのTIC3668型タンパク質のセグメントの集合体を含む追加の有用な実施形態を導き出してもよい。TIC3668型タンパク質クラスを、互いに対する及び他のBacillus農薬タンパク質（これらが系統発生学的に近接してまたは離れて関連していようといまいと）に対する配列比較に供してもよく、並べたタンパク質間での置換に有用であるそのようなタンパク質それぞれのセグメントが特定されて、キメラタンパク質の構築を生じてもよい。そのようなキメラタンパク質を害虫バイオアッセイ解析に供し、キメラにおけるそのようなセグメントのそれぞれが由来する親タンパク質に比べて上昇した生物活性及び／または拡大した標的害虫範囲の存在または非存在について特徴付けることができる。ポリペプチドの農薬活性は、ドメインもしくはセグメントを他のタンパク質と交換することによって、または当該技術で既知の指向進化法を用いることによって、特定の害虫または害虫の広い範囲に対する活性についてさらに操作されてもよい。
【０１３３】
TIC3668毒素タンパク質クラスに由来するタンパク質によって昆虫を防除する、特に鱗翅目または鞘翅目の作物への寄生を防除する方法も本出願で開示される。そのような方法は、昆虫、鞘翅目または鱗翅目を抑制する量のTIC3668毒素タンパク質クラスのタンパク質を含む植物を生育させることを含むことができる。特定の実施形態では、そのような方法はさらに、（i）TIC3668型タンパク質毒素クラスのタンパク質を含むまたはコードする組成物を植物または植物に生長する種子に適用することと、（ii）TIC3668型タンパク質毒素クラスのタンパク質をコードするポリヌクレオチドによって植物または植物に生長する植物細胞を形質転換することとの1以上を含むことができる。一般に、TIC3668型タンパク質毒素クラスの任意のタンパク質は、組成物にて提供され、微生物にて提供され、または鱗翅目もしくは鞘翅目の昆虫に対する昆虫抑制活性を付与するトランスジェニック植物にて提供され得ることが企図される。
【０１３４】
特定の実施形態では、TIC3668型タンパク質毒素クラスの組換えポリペプチドは、TIC3668型タンパク質毒素クラスのタンパク質を発現させ、産生させるのに好適な条件下でTIC3668型タンパク質毒素を発現するように形質転換させた組換えBacillusまたは他の組換え細菌の細胞を培養することによって調製される昆虫抑制組成物の殺虫性活性のある成分である。そのような組成物は、上記の組換えポリペプチドを発現している／産生しているそのような組換え細胞の培養物の乾燥、凍結乾燥、ホモジネート、抽出、濾過、遠心分離、沈殿または濃縮によって調製することができる。そのような工程は、Bacillusまたは他の昆虫病原性細菌の細胞抽出物、細胞懸濁液、細胞ホモジネート、細胞溶解物、細胞上清、細胞濾液または細胞ペレットを生じることができる。そのように産生された組換えポリペプチドを得ることによって、組換えポリペプチドを含む組成物は細菌細胞、細菌胞子及び副芽胞封入体を含むことができ、農業昆虫抑制性スプレー製品または食餌バイオアッセイにおける昆虫抑制性製剤として含まれる種々の用途に製剤化することができる。
【０１３５】
一実施形態では、耐性発生の可能性を減らすために、TIC3668型タンパク質毒素クラスに由来する1以上のタンパク質を含む昆虫抑制組成物はさらに、同じ鱗翅目または鞘翅目の昆虫種に対して昆虫抑制活性を示すが、TIC3668型タンパク質毒素とは異なる少なくとも1つの追加のポリペプチドを含むことができる。そのような組成物についての考えられる追加のポリペプチドには、昆虫抑制タンパク質及び昆虫抑制dsRNA分子が挙げられる。害虫を防除するそのようなリボヌクレオチド配列の使用の一例は、Baumら,（米国特許公開2006／0021087A1）にて記載されている。鱗翅目害虫の防除のためのそのような追加のポリペプチドは、Cry1A（米国特許第5,880,275）、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1A．105、Cry1Ae、Cry1B（米国特許公開番号10／525,318）、Cry1C（米国特許第6,033,874号）、Cry1D、Cry1Da及びその変異体、Cry1E、Cry1F、及びCry1A／Fキメラ（米国特許第7,070,982号；同第6,962,705号；及び同第6,713,063号）、Cry1G、Cry1H、Cry1I、Cry1J、Cry1K、Cry1L、たとえば、TIC836、TIC860、TIC867、TIC869及びTIC1100のような、しかし、これらに限定されないCry1−型キメラ、Cry2A、Cry2Ab（米国特許第7,064,249号）、Cry2Ae、Cry4B、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry15、Cry43A、Cry43B、Cry51Aa1、ET66、TIC400、TIC400、TIC800、TIC834、TIC1415、Vip3A、VIP3Ab、VIP3B、AXMI−184、AXMI−196、DIG−3、DIG−4、DIG−5、DIG−11、AfIP−1A及びその誘導体（米国特許公開2014−0033361A1）、AfIP−1B及びその誘導体（米国特許公開2014−0033361A1）、PIP−1APIP−1B（米国特許公開2014−0007292A1）、PSEEN3174（米国特許公開2014−0007292A1）、AECFG−592740（米国特許公開2014−0007292A1）、Pput＿1063（米国特許公開2014−0007292A1）、Pput＿1064（米国特許公開2014−0007292A1）、GS−135及びその誘導体（米国特許公開2012−0233726A1）、GS153及びその誘導体（米国特許公開2012−0192310A1）、GS154及びその誘導体（米国特許公開2012−0192310A1）、GS155及びその誘導体（米国特許公開2012−0192310A1）、米国特許公開2012−0167259A1にて記載されたような配列番号2及びその誘導体、米国特許公開2012−0047606A1にて記載されたような配列番号2及びその誘導体、米国特許公開2011−0154536A1にて記載されたような配列番号2及びその誘導体、米国特許公開2011−0112013A1にて記載されたような配列番号2及びその誘導体、米国特許公開2010−0192256A1にて記載されたような配列番号2及び4ならびにその誘導体、米国特許公開2010−0077507A1にて記載されたような配列番号2及びその誘導体、米国特許公開2010−0077508A1にて記載されたような配列番号2及びその誘導体、米国特許公開2009−0313721A1にて記載されたような配列番号2及びその誘導体、米国特許公開2010−0269221A1にて記載されたような配列番号2または4及びその誘導体、米国特許第7,772,465号（B2）にて記載されたような配列番号2及びその誘導体、WO2014／008054A2にて記載されたようなCF161＿0085及びその誘導体、米国特許公開US2008−0172762A1、US2011−0055968A1、及びUS2012−0117690A1にて記載されたような鱗翅目毒性タンパク質及びその誘導体；US7510878（B2）にて記載されたような配列番号2及びその誘導体、米国特許第7812129（B1）号にて記載されたような配列番号2及びその誘導体のような、しかし、これらに限定されない昆虫抑制タンパク質；ならびに当業者に既知の他の鱗翅目抑制タンパク質から成る群から選択されてもよい。鞘翅目害虫の防除のためのそのような追加のポリペプチドは、Cry3Bb（米国特許第6,501,009号）、Cry1C変異体、Cry3A変異体、Cry3、Cry3B、Cry34／35、5307、Axmi184、Axmi205、AxmiR1、TIC407、TIC417、TIC431、TIC807、TIC853、TIC901、TIC1201、TIC3131、DIG−10、eHIPs（米国特許出願公開番号2010／0017914）のような、しかし、これらに限定されない昆虫抑制タンパク質、及び当業者に既知の他の鞘翅目抑制タンパク質から成る群から選択されてもよい。
【０１３６】
他の実施形態では、そのような組成物／製剤はさらに、さもなければ本発明の昆虫抑制タンパク質によって抑制されない昆虫に対して昆虫抑制活性を示して得られる昆虫抑制の範囲を拡大する少なくとも1つの追加のポリペプチドを含むことができる。たとえば、半翅目害虫の防除のために、たとえば、TIC1415（米国特許出願公開番号2013／0097735）、TIC807（米国特許第8609936号）、TIC834（米国特許出願公開番号2013／0269060）のような半翅目に活性のあるタンパク質及び当業者に既知の他の半翅目に活性のあるタンパク質との、本発明の昆虫抑制タンパク質の組み合わせを使用することができる。鞘翅目、鱗翅目及び半翅目の害虫の防除のための追加のポリペプチドは、Neil Crickmore（btnomenclature．infoでのワールドワイドウェブ）によって維持されているBacillus thuringiensis毒素の命名法ウェブサイトで見いだすことができる。
【０１３７】
特定の殺虫剤に対する耐性を発生する昆虫についての可能性は当該技術で記録されている。昆虫の耐性管理の戦略の1つは、異なる作用様式を介して作動する2つの異なる昆虫抑制剤を発現するトランスジェニック作物を採用することである。従って、いずれか一方の昆虫抑制剤に耐性を持つ昆虫は他方の昆虫抑制剤によって防除することができる。別の昆虫耐性の管理戦略は、標的の鞘翅目または鱗翅目の害虫種に対して保護されず、そのような保護されない植物に逃げ場を提供する植物の使用を採用する。特定の例の1つは、その全体が参照によって組み入れられる米国特許第6,551,962号にて記載されている。
【０１３８】
種子処理、スプレー式の、落下式のまたは擦り付けの製剤でタンパク質と共に使用される本明細書で開示されているタンパク質によっても防除される害虫を防除するために設計される局所適用農薬化合物のような他の実施形態は、土壌に直接適用することができ（土壌潅注）、本明細書で開示されているタンパク質を発現している生育している植物に適用することができ、または開示されているタンパク質の1以上をコードする1以上の導入遺伝子を含有する種子に適用されるように製剤化することができる。種子処理で使用するためのそのような製剤は当該技術で既知の種々の接着剤及び粘着付与剤と共に適用することができる。そのような製剤は、開示されているタンパク質との作用様式で相乗的である農薬を含有することができるので、製剤の農薬は異なる作用様式を介して作用して開示されているタンパク質によって防除することができる同じもしくは類似の害虫を防除し、またはそのような農薬は、TIC3668型タンパク質毒素クラスによって効果的には防除されない広い宿主範囲もしくは植物害虫種の範囲内の害虫を防除するように作用する。
【０１３９】
前述の組成物／製剤はさらに、農業上許容できるキャリア、たとえば、餌、粉末、粉塵、ペレット、顆粒、噴霧、エマルション、コロイド状懸濁液、水溶液、Bacillusの胞子／結晶調製物、種子処理、1以上のタンパク質を発現するように形質転換された組換え植物細胞／植物組織／種子／植物、または1以上のタンパク質を発現するように形質転換された細菌を含むことができる。組換えポリペプチドにおける固有の昆虫抑制性のまたは殺虫剤の抑制のレベル及び植物または餌アッセイに適用される製剤のレベルに応じて、組成物／製剤は、種々の重量の組換えポリペプチド、たとえば、0．0001重量％〜0．001重量％〜0．01重量％〜1％重量〜99重量％の組換えポリペプチドを含むことができる。
【実施例】
【０１４０】
前述のことを考慮して、当業者は、変更が開示されている特定の態様で行われてもよく、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく似たまたは類似の結果を依然として獲得し得ることを十分に理解すべきである。従って、本明細書で開示されている特定の構造的な及び機能的な詳細は限定として解釈されるべきではない。本明細書で引用されている各参考文献の開示全体が本出願の開示の範囲内に組み入れられることが理解されるべきである。
【０１４１】
実施例1：TIC3668関連のタンパク質毒素クラスの発見
互いに比べたとき、異なる特質、たとえば、推測される毒性、プロテオームの多様性、及び形態的な変異を示す細菌株を特定し、当該技術で周知の方法を用いてゲノムの配列決定のために調製した。試験管内のバイオアッセイにて鞘翅目の昆虫に対して抑制活性を示すタンパク質TIC3668（配列番号2）はBrevibacillus laterosporus（B．laterosporous）のEG5552株から発見された。他の株もTIC3668に類似するタンパク質を含有することが見いだされた。これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドのセグメントをクローニングし、組換え宿主株に挿入して発現について調べた。
【０１４２】
熱増幅プライマーを設計してEG5552を含む異なるB．laterosporus細菌株の全ゲノムDNAから遺伝子の完全長コピーを増幅した。別々の熱増幅産物（アンプリコン）を各株から生成し、TIC3668関連のタンパク質をコードし得るオープンリーディングフレームの存在についてこれらを解析した。各アンプリコンは、翻訳開始コドンとインフレームでそれに続き、インフレームの翻訳終止コドンによって終結する、隣接するオープンリーディングフレームを含有する単一のオープンリーディングフレームを有すると判定された。これらの追加の異なる細菌株のそれぞれから得られた推定アミノ酸配列をそれぞれ、配列番号2（TIC3668）、配列番号4（TIC3669）、配列番号6（TIC3670）、配列番号8（TIC4076）、配列番号10（TIC4078）、配列番号14（TIC4346）、配列番号16（TIC4826）、配列番号18（TIC4861）、配列番号20（TIC4862）、配列番号22（TIC4863）にて示す。これらのアンプリコンを、胞子形成特異的な発現プロモータの下流で組換えBacillus thuringiensis（Bt）プラスミド発現ベクターにクローニングし、非結晶性Bt宿主細胞で形質転換した。アンプリコンをE．coli発現系にもクローニングした。得られた組換え株は組換えタンパク質を発現することが観察された。
【０１４３】
実施例2：TIC3668関連のタンパク質毒素クラスの鞘翅目への活性
この実施例は鞘翅目に対するTIC3668様タンパク質によって示される抑制活性を説明する。
【０１４４】
TIC3668、TIC3669、TIC3670、TIC4260、TIC4076及びTIC2462の完全長タンパク質について実施例1にて記載されているような組換え細菌から作出したタンパク質調製物をコロラドハムシ（Leptinotarsa decemlineata,CPB）に対する及び少なくとも1つのコーンルートワーム種に対する昆虫餌オーバーレイバイオアッセイに供した。コーンルートワーム種の既知のメンバーは、Diabrotica virgifera virgifera（ウエスタンコーンルートワーム、WCR）、Diabrotica barberi（ノーザンコーンルートワーム、NCR）、Diabrotica virgifera zeae（メキシカンコーンルートワーム、MCR）、Diabrotica balteata（ブラジリアンコーンルートワーム（BZR）、Diabrotica undecimpunctatahowardii（サザンコーンルートワーム、SCR）及びDiabrotica viridulaとDiabrotica speciosaとから成るブラジリアンコーンルートワーム複合群（BCR）である。
【０１４５】
表6にて明らかにされているように、結果は、TIC3668、TIC3669、TIC3670、TIC4260、及びTIC4076がコーンルートワームに対して致死性を提示したことを示している。AXMI−209タンパク質（TIC2462と比べてアミノ酸レベルで＞99％の同一性であり、たった2つのアミノ酸の差異を呈する）に密接に関連するタンパク質であるTIC2462（配列番号63をコードする配列番号62）がコーンルートワームに対して致死性を提示しなかったということは、こうしてTIC3668様タンパク質毒素クラスの活性をAXMI−209に類似するタンパク質から区別している。驚くべきことに、鞘翅目への活性の指標としてバイオアッセイで通常調べられる種であるコロラドハムシに対する致死性は調べたタンパク質のいずれについても観察されなかった。
【表６】
0006731408.tif 000007
＋＝致死性が観察された
−＝致死性が観察されなかった
NT＝調べなかった
【０１４６】
実施例3：TIC3668タンパク質毒素の成熟形態
この実施例はTIC3668タンパク質毒素クラスの範囲内でのネイティブなタンパク質のアミノ末端における膜通過ペプチドの存在及びTIC3668タンパク質毒素クラスの活性がある成熟毒素タンパク質の発見を説明する。
【０１４７】
TIC3668のコード配列（配列番号1）に由来するアミノ酸配列翻訳のSignalPプログラム（Petersen et．al,（2011）,Nature Methods,8：785−786）を用いた生物情報解析はN末端の最初の23アミノ酸に相当する膜通過セグメントの存在を予測した。
【０１４８】
TIC3668様タンパク質毒素クラスの各メンバーの中での膜通過セグメントの存在を確認するために実験を設計した。TIC3668を非胞子形成特異的Btプロモータの後でBt宿主細胞にクローニングした。得られた培養上清を殺虫活性について調べた。TIC3668に相当するタンパク質の3つの形態が上清から混合物として回収された。完全長のTIC3668タンパク質より短いこれらの異なる断片は質量分析法及びN末端配列解析によって配列番号2で示されるときアミノ酸16、19または24のいずれかをその各アミノ末端で含有することがその後決定された。少量にすぎないTIC3668のこれら3つの短縮形態は培養培地で検出された。最も豊富な形態の検出されたタンパク質は配列番号2で示されるとき24位でのセリンをアミノ末端で有することが観察された。培養上清から濃縮し、精製したタンパク質は人工餌バイオアッセイで調べるとWCRに対する生物活性を呈した。
【０１４９】
殺虫活性を示す各TIC3668型タンパク質について最小のペプチドセグメントを特定するために異なる発現構築物を作り出した。これらの構築物を非結晶性のB．thuringiensis株またはE．coli株に導入した。構築物の1つは、Btの非結晶性株にて配列番号2で示されるときアミノ酸1〜317の完全長TIC3668タンパク質を発現させるために設計した。カルボキシ末端にHISタグ配列（HHHHAHHH）を有するE．coliの発現系における完全長のTIC3668タンパク質及びTIC3668タンパク質の種々のさらに短い変異体形態の発現のために構築物を設計した。E．coliでの発現用に設計された構築物は、（1）配列番号2で示されるときアミノ酸1〜317位の完全長TIC3668タンパク質を発現するように設計された構築物；（2）配列番号2で示されるときアミノ酸16〜317を有するTIC3668変異体タンパク質を発現するように設計された構築物；（3）配列番号2で示されるときアミノ酸24〜317のTIC3668変異体タンパク質を発現するように設計された構築物；（4）配列番号2で示されるときアミノ酸26〜317のTIC3668変異体タンパク質を発現するように設計された構築物；（5）配列番号2で示されるときアミノ酸28〜317のTIC3668変異体タンパク質を発現するように設計された構築物から成った。さらに、N末端10Hisタグ及びTVMV（タバコ脈斑ウイルス）プロテアーゼ部位（MHHHHHHHHHHGTETVRFQ）を伴ったTIC3668タンパク質をE．coli発現系から得て配列番号2で示されるとき残基番号24で出発するTIC3668タンパク質を作出した。
【０１５０】
Bt発現系の上清からタンパク質を得て、質量分析法及びN末端配列解析に供した。Bt発現系は配列番号2で示されるときアミノ酸24〜317の予想されたTIC3668成熟毒素を産生した。タンパク質はE．coliの上清では観察されなかった。周辺細胞質からタンパク質を放出する浸透圧ショックによってタンパク質は各E．coli発現構築物のそれぞれから得られた。完全長タンパク質より短いもののアミノ末端でアミノ酸16または24を含有するように設計された構築物から産生されたタンパク質はその各アミノ末端でこれらのアミノ酸を含有することが確認された。完全長のTIC3668を発現するように設計された構築物から産生されたタンパク質はアミノ末端にて配列番号2で示されるとき24位でのセリンを含有する成熟長のタンパク質を作出した。N末端アミノ酸として配列番号2で示されるときアミノ酸26またはアミノ酸28のいずれかを含有するように設計された構築物から産生されたタンパク質はそれぞれ驚くべきことに、Nアミノ酸としてアミノ酸28だけを含有したということは、N末端にて配列番号2で示されるときアミノ酸番号24を維持するプロセッシングが毒素の安定性に重要であり得ることを示唆している。
【０１５１】
これらの発現系解析で得られたタンパク質試料を実施例2に記載されているような昆虫餌オーバーレイバイオアッセイにてウエスタンコーンルートワーム幼虫に対する試験に供した。この試験からの特定のN末端の短縮は低下した生物活性を示すと判定された。具体的には、配列番号2で示されるときアミノ末端のアミノ酸が26または28である場合、殺虫活性は有意に低下することが観察された。成熟タンパク質より短くなるようにN末端で短縮されている他のTIC3668タンパク質ファミリーメンバー（TIC3668、TIC3669、TIC3670、TIC4076、TIC4078、TIC4260、TIC4346、TIC4826、及びTIC4863についてアミノ酸残基番号24で出発する；TIC4861についてアミノ酸13で出発する；ならびにTIC4862についてアミノ酸22で出発する）はWCRに対して殺虫活性を示す調べたTIC3668型タンパク質の最も短縮型であることを推定することができる。成熟タンパク質と同じ長さに、またはそれより長いTIC3668の変異体はすべて、相対的に低い濃度であってもWCRに対して高い活性を示した。データはまた、TIC3668のE．coliによるプロセッシングは構築物の設計によって変化することも明らかにしている。
【０１５２】
実施例4：植物における発現のためのTIC3668型タンパク質をコードする遺伝子の合成
TIC3668タンパク質、TIC3669タンパク質、TIC3670、TIC4076、TIC4078、TIC4260タンパク質、TIC4346タンパク質、TIC4826タンパク質、TIC4861タンパク質、TIC4862タンパク質、及びTIC4863タンパク質の完全長型及び成熟型をコードするヌクレオチド配列を設計した。米国特許第5,500,365号に一般に記載されている方法に従ってTIC3668、TIC3669及びTIC3670をコードするヌクレオチド配列を合成し、ATTTA及びA／Tが豊富な植物のポリアデニル化配列のような特定の好ましくない問題の配列を回避する一方で、ネイティブのB．laterosperousのタンパク質のアミノ酸配列を保存した。これらのヌクレオチド配列は本明細書では、完全長配列については配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、及び配列番号51として、ならびに成熟配列については配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、及び配列番号49として提供されている。
【０１５３】
実施例5：植物におけるTIC3668型タンパク質の発現のための発現カセット
配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、及び配列番号51にて示されるような配列によって種々の植物発現カセットを設計した。そのような発現カセットは、植物のプロトプラストにおける一時的な発現または植物細胞の形質転換に有用である。典型的な発現カセットは細胞内でのタンパク質の最終的な置き換えに関して設計された。発現カセットのセットの1つはタンパク質がネイティブなN末端セグメントと共に翻訳されるような方法で設計された。発現カセットの別のセットは、N末端セグメントを伴わずに（すなわち、成熟長のタンパク質）タンパク質の発現を可能にするように設計された。発現カセットの別のセットは、インフレームで発現され、且つ成熟長の毒素タンパク質に操作可能に連結される輸送ペプチドを有して葉緑体または色素体のような細胞の小器官への標的化を可能にするように設計された。発現カセットはすべて、複数の隣接して連結されるプロモータ要素、エンハンサー要素または当業者に既知の他の発現要素で構成されて導入遺伝子の発現を増強するプロモータを伴った5’末端で開始するように設計された。プロモータ配列には普通隣接して、プロモータに対して3’での1以上のリーダー配列が続く。リーダー配列に対して3’でイントロン配列が提供されて導入遺伝子の発現を改善する。毒素または輸送ペプチドについてのコード配列及び毒素についてのコード配列は、プロモータ、リーダー及びイントロンの構成で3’に位置した。コード配列の3’に3’UTR配列が提供されて転写の終結を促し、得られた転写物のポリアデニル化に重要な配列を提供する。上述の要素のすべては、たとえば、制限エンドヌクレアーゼ部位またはライゲーションに無関係なクローニング部位のような発現カセットの構築に提供される追加であることが多い配列と隣接して配置された。
【０１５４】
実施例6：TIC3668型タンパク質の発現カセットを含有する形質転換ベクター
TIC3668、mTIC3668、TIC3669、mTIC3669、TIC3670、及びmTIC3670のタンパク質を発現するDNAを植物ゲノムに送達するようにagrobacteriumが介在する形質転換ベクターを構築した。発現カセットは、それらが選択可能なマーカー遺伝子と共に構築物ベクターを含有するagrobacterium宿主によって宿主植物細胞のゲノムに移されるように、agrobacteriumの境界配列間で好適なベクターにクローニングした。さらに具体的には、上記で参照したタンパク質の1つをコードする細胞質の発現カセット全体を含有する制限断片をagrobacterium植物形質転換ベクターにクローニングした。同様に、色素体を標的とする発現カセット全体を含有する制限断片をagrobacterium植物形質転換ベクターにクローニングした。TIC3668型タンパク質の発現カセット（すなわち、標的とされないカセットまたは標的とされるカセット）を含有するベクターをエレクトロポレーションまたは三親交配によってagrobacteriumに導入する。
【０１５５】
それぞれ、ネイティブなB．laterosperousのオープンリーディングフレームに存在するN末端の23アミノ酸（配列番号2で示されるときアミノ酸1〜23）をコードする配列と共にまたはそれを伴わずにTIC4076、TIC4078、TIC4260、TIC4346、TIC4826、TIC4861、TIC4862、及びTIC4863をコードする人工遺伝子を含有する発現カセットを、それらが宿主細胞のゲノムに移されるようにagrobacteriumの境界配列間で好適なベクターにクローニングし、コードされたタンパク質の発現及び生物活性について調べる。
【０１５６】
実施例7：植物におけるTIC3668型タンパク質の鞘翅目への活性
この実施例は、植物で発現され、各害虫に餌として提供された際、鞘翅目のたとえばコーンルートワームの幼虫に対してTIC3668様タンパク質によって示される抑制活性を説明する。
【０１５７】
実施例5にて記載されている発現カセットを含有するベクターを用いてTIC3668、mTIC3668、TIC3669、mTIC3669、TIC3670、及びmTIC3670のタンパク質を発現しているR0のトランスジェニックトウモロコシ植物を作出した。
【０１５８】
F1トランスジェニックのトウモロコシ植物は、形質転換されていない野生型の市販の生殖質植物のR0形質転換体からの花粉による受粉穂によって作出した種子から生育させた。カゴに入れたポットの中の土壌に移した後、F1植物に生まれたてのコーンルートワーム昆虫を寄生させ、制御された条件下で13日間生育させた。Olesonらの0が損傷なしを意味し、3は3以上の節が茎の1．5インチ以内で損傷していることを意味する0〜3の評定尺度を用いて根の損傷の評定（RDR）を決定した（J．D．Oleson,Y−L．Park,T．M．Nowatzki,J．J．Tollefson,“Node−Injury Scale to Evaluate Root Injury by Corn Rootworms”,Journal of Economic Entomology,98（1）：1−8,2005）。昆虫の致死性は生育期間の終了時に残っている三齢幼虫の数を数えることによって評価した。
【０１５９】
第1のセットの実験では、完全長のTIC3668、TIC3669及びTIC3670タンパク質を発現している植物をWCRに対して調べた。事象の幾つかは、平均の根損傷評定（RDR）の値が2〜2．5の間である陰性対照に比べて節損傷で統計的に有意な低下を示したが、商業的に有意な活性は完全長のタンパク質については観察されなかった。
【０１６０】
第2のセットの実験では、葉緑体を標的とするペプチドを伴ったまたは伴わない成熟タンパク質mTIC3668（配列番号23）、mTIC3669（配列番号24）、及びmTIC3670（配列番号25）をトウモロコシ植物で発現させ、WCRに対して調べた。有意なWCRの致死性が各成熟タンパク質で観察された。追加の標的化配列の存在下及び非存在下でmTIC3668、mTIC3669及びmTIC3670を発現している各植物は、陰性対照に比べて節損傷の統計的に有意な低下を示した。タンパク質が葉緑体に対して標的化されているかどうかにかかわらず、F1トウモロコシ植物で発現された場合、図2はmTIC3668及びmTIC3669についての幾つかの事象での平均RDRを示し、図3はmTIC3670についての幾つかの事象での平均RDRを示す。図2及び3の事象名における「TS」は標的化配列の存在を示す。成熟タンパク質mTIC3668、mTIC3669及びmTIC3670を発現しているこれらの事象の多くで商業的に有意な活性が観察された。
【０１６１】
驚くべきことに、TIC3668様タンパク質からの膜通過セグメント（配列番号2で示されるときアミノ酸1〜23）の除去は、トウモロコシ植物で発現された際、コーンルートワームに対する有効性を高めた。植物で発現されると、成熟長のTIC3668様タンパク質は完全長のタンパク質よりも鞘翅目害虫に対する高いレベルの殺虫活性を実証した。
【０１６２】
実施例8：トウモロコシで発現されたTIC3668関連タンパク質のCry3Bb1耐性のWCRに対する殺虫活性
この実施例は、Bt毒素Cry3Bb1への耐性を獲得しているウエスタンコーンルートワーム（WCR）の株に対するTIC3668様タンパク質によって示される殺虫活性を説明する。実施例7に記載されているような方法を用いて作出した、mTIC3668、mTIC3669及びmTIC3670を発現しているF1トランスジェニックのトウモロコシ植物に植物当たりHopkinton株の2000個のWCR卵を寄生させた。
【０１６３】
ウエスタンコーンルートワーム（Diabrotica virgifera virgifera LeConte）のHopkinton株は、トウモロコシ植物で発現されたCry3Bb1への野外で発生した耐性を持つ非休眠性の株である。その株は、連続7年間Cry3Bb1のトウモロコシに植えつけられてきた畑から得られた成虫WCR試料を起源とした。集団を非休眠性のWCR株と3回戻し交配し、Cry3Bb1耐性について3回選抜した（Gassmann et．al（2011）,PLoS ONE,6（7）：e22629；Gassmann et．al,（2012）,GM Crops Food,3（3）：235−244）。コロニーは、アイオワ州立大学のAaron Gassman博士から入手し、ミズーリ州ChesterfieldのMonsanto Biotech Entomologyグループによって維持されている。
【０１６４】
寄生に続いて、WCR−Hopkinton株の卵は48時間以内に孵化し、生まれたての虫が根を摂食し始めた。24日後、土壌から根を取り出し、0〜3の尺度を用いて実施例7に記載されているようにトウモロコシの根の損傷を評価した。表7に示すように、mTIC3668、mTIC3669及びmTIC3670を発現している植物は、対照植物に比べてHopkinton株の生まれたてのWCRの存在下で損傷からトウモロコシの根を保護することに高度に有効であったので、Cry3Bb1毒素に対するWCRの耐性を克服した。
【表７】
0006731408.tif 000008
N：評価した植物の数
【０１６５】
実施例9：野外の試験場所におけるWCRの自然寄生に対するトウモロコシで発現されたTIC3668関連のタンパク質の殺虫活性
この実施例は、米国中西部の圃場におけるWCRの自然寄生に対するTIC3668関連のタンパク質を発現しているトランスジェニックのトウモロコシ植物によって示された低下した根損傷の有効性を説明する。
【０１６６】
実施例7に記載されているような方法を用いて作出したmTIC3668、mTIC3669及びmTIC3670を発現しているF1トランスジェニックのトウモロコシ植物を米国中西部における5つの位置で4月下旬〜5月上旬に植え付けた。これらの位置での試みは、押し寄せるコーンルートワームに対する既存の自然の寄生を当てにした。損傷評価のための根の掘り出しは7月末までに完了した。実施例7に記載されているような節損傷尺度に従ってルートワームによる損傷を判定した。
【０１６７】
根発掘試験の結果は、田畑における栽培のための実践的な条件下で、mTIC3668、mTIC3669及びmTIC3670を発現している植物が自然で押し寄せるコーンルートワームの存在下で損傷からトウモロコシの根を保護することにて高度に有効であることを示した。表8は、評価した植物の数（N）、平均RDR及び位置をまとめたときの試験植物についての標準誤差を示す。
【表８】
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【０１６８】
実施例10：TIC3668関連のタンパク質毒素クラスの鱗翅目への活性
この実施例は、鱗翅目に対するTIC3668様タンパク質によって示される抑制活性を説明する。TIC3668、TIC3669、TIC3670、TIC4076及びTIC4078の完全長のタンパク質について実施例1に記載されているようなタンパク質調製物を、タマナヤガ（BCW、Agrotis ipsilon）、ウエスタンビーンカットワーム（WBC、Striacosta albicosta）、オオタバコガ（CEW、Helicoverpa zea）、ヨーロッパアワノメイガ（ECB、Ostrinia nubilalis）、サトウキビメイガ（SCB、Diatraea saccharalis）、サウスウエスタンマツマダラメイガ（SWC、Diatraea grandiosella）、キャベツシャクトリムシ（CLW、Trichoplusia ni）、ダイズシャクトリムシ（SBL、Chrysodeixis includes）、及びツマジロクサヨトウ（FAW、Spodoptera frugiperda）に対する昆虫餌オーバーレイバイオアッセイに供した。抑制タンパク質バイオアッセイを調製し、実施するプロトコール及び方法は当該技術で既知である。
【０１６９】
特定の鱗翅目の害虫に対する活性は表9で明らかにされたように特定のTIC3668型タンパク質について観察された。
【表９】
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＋＝成長阻害が観察された
＋＋＝成長阻害及び致死性
−＝致死性が観察されなかった
NT＝調べなかった
【０１７０】
実施例11：植物におけるTIC3668型タンパク質の鱗翅目への活性
この実施例は、植物で発現させ、餌として各害虫に提供された際のECB、SWC、BCW、FAW、CEW、SBLに対するTIC3668型タンパク質の抑制活性を説明する。
【０１７１】
TIC3668、TIC3669及びTIC3670を発現しているR0のトウモロコシ植物にて米国特許第8,344,207号に記載されているのと同様に、植物リーフディスクを用いた鱗翅目の害虫に対するバイオアッセイを行った。0（0％の摂食）から11（50％を超える摂食）までの尺度での昆虫によって摂食されたリーフディスクの百分率に基づいた評定スコアに葉の損傷評定（LDR）を割り当てた。評定スコアの段階は5％ごとに増える。殺虫タンパク質を含有していないR0の植物を陰性対照として役立てた。完全長TIC3668型タンパク質の細胞質での発現は、非形質転換対照に比べてCEW、FAW及びSWCに対する食害を減らした。TIC3670タンパク質の細胞質での発現は非形質転換対照に比べてSWCに対する食害を減らした。
【０１７２】
実施例12：コラージュタンパク質TIC4260の創作
この実施例は、TIC3668のファミリーメンバーに基づく新規の遺伝子配列の創作を教示する。ネイティブなTIC3668型タンパク質の5つに由来するアミノ酸変異を組み合わせて、天然に存在するタンパク質と比べて異なるアミノ酸配列の多様性を示す新規のコラージュタンパク質TIC4260（配列番号12）を作り出した。図1はTIC4260との5つのネイティブなTIC3668型タンパク質の配列比較を示す。この配列比較では、配列多様性の位置を灰色の陰影付けにて強調する。TIC4260タンパク質をコードする人工のポリヌクレオチド配列を構築した（配列番号11）。成熟TIC4260タンパク質（mTIC4260、配列番号28）は配列番号43で示されるようなポリヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１７３】
鱗翅目及び／または鞘翅目への毒性活性を示す新規のタンパク質を作り出すために他のTIC3668型タンパク質の類似の配列比較を行うことができる。これらの新規のタンパク質が発現され、精製され、餌バイオアッセイにて鱗翅目及び鞘翅目の昆虫に対して調べられる。これらの新規タンパク質のための発現カセットが作り出され、植物にて形質転換されてこれらのタンパク質を発現し、植物の鱗翅目及び鞘翅目の害虫を防除する。
【０１７４】
本明細書で開示され、請求されている組成物及び方法はすべて本開示に照らせば、過度の実験を行うことなく行い、実行することができる。本発明の組成物及び方法は前述の説明に役立つ実施形態という点で記載されている一方で、変動、変化、改変及び変更が、本発明の真の概念、精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載されている組成物、方法及び方法の工程または方法の工程の順序に適用されてもよいことが当業者に明らかであろう。さらに具体的には、化学的にも、生理的にも関連する特定の作用剤が本明細書に記載されている作用剤について置き換えられてもよい一方で、同等のまたは類似の結果が達成されることが明らかであろう。当業者に明らかなそのような類似の置き換え及び改変はすべて添付のクレームによって定義されているように本発明の精神、範囲及び概念の範囲内にあると見なされる。
【０１７５】
これらの異なる、改善された配列の変異を組み合わせて本発明の範囲内にもある変異体を作り出すことは当業者に明らかであるはずである。
【０１７６】
本明細書で引用されている出版物及び公開された特許文書はすべて、各個々の出版物または特許出願が具体的に且つ個々に参照によって組み込まれるように指示されているのと同程度に参照によって本明細書に組み入れられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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