(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗菌組成物を含む、創傷の処置のための医薬組成物であって、
ここにおいて、該医薬組成物は、配位子修飾されたオキソ水酸化銅ナノ粒子および薬学的に許容可能なキャリヤーおよび薬学的に許容可能なキャリヤーを含み、
ここにおいて、該オキソ水酸化銅ナノ粒子が、該１以上の配位子が非化学量論的に該オキソまたはヒドロキシ基を置換している構造を有し、該１以上の配位子が、カルボン酸配位子またはそのイオン化形態を含み、そして、銅は、遊離銅イオン（Ｃｕ２＋）として医薬組成物中に存在する、
前記医薬組成物。
【請求項２】
抗菌組成物を含む、微生物感染症の処置または予防のための医薬組成物であって、
ここにおいて、該医薬組成物は、配位子修飾されたオキソ水酸化銅ナノ粒子および薬学的に許容可能なキャリヤーおよび薬学的に許容可能なキャリヤーを含み、
ここにおいて、該オキソ水酸化銅ナノ粒子が、該１以上の配位子が非化学量論的に該オキソまたはヒドロキシ基を置換している構造を有し、該１以上の配位子が、カルボン酸配位子またはそのイオン化形態を含み、そして、銅は、遊離銅イオン（Ｃｕ２＋）として医薬組成物中に存在する、
前記医薬組成物。
【請求項３】
ヒトまたは動物の対象を処置するためのものである、請求項１または請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
該微生物感染が、細菌感染症または真菌感染症である、請求項２または請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
該感染症が、グラム陰性またはグラム陽性細菌により引き起こされる、請求項２−４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
該細菌感染が、エスケリキア属の種、例えば大腸菌、スタフィロコッカス属の種、例えばＳ．エピデルミス、Ｓ．アウレウスもしくはメチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（“ＭＲＳＡ”）、バシラス属の種、例えばＢ．サブチリス、シュードモナス属の種、例えばＰ．エルジノーサ、ビブリオ属の種、例えばＶ．フィシェリ、ストレプトコッカス属の種、例えばＳ．ピオゲネスおよびＳ．ニューモニエ、クレブシエラ属の種、マイクロコッカス属の種、例えばＭ．ルテウス、クロストリジウム属の種、例えばＣ．ディフィシル、アシネトバクター属の種、例えばＡ．バウマニ、マイコバクテリウム属の種、例えばＭ．ツベルクローシスまたはサルモネラ属の種、クラミジア属の種、または真菌種、例えばカンジダ属の種、例えばＣ．アルビカンスにより引き起こされる、請求項２−５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
該組成物が、獣医学的投与のためのものである、請求項１−６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
処置または予防が、物品を医薬組成物でコートまたは処理することを含む、請求項１−７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
該物品が、埋め込み式の医学的デバイスまたはコートされた支持体、例えば不織布支持体である、請求項８の医薬組成物。
【請求項１０】
該組成物が、局所投与のために配合される、請求項１−７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
該組成物が、皮膚障害または粘膜の障害の処置のためのものである、請求項１−９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
該配位子修飾されたオキソ水酸化銅ナノ粒子を構成する材料が、ポリマー性構造を有し、ここで該配位子は、該オキソ水酸化銅の固相構造内に分布している、請求項１−１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
該配位子修飾されたオキソ水酸化銅ナノ粒子が、１以上の再現性のある物理化学的特性を有し、ここにおいて、該１以上の再現性のある物理化学的特性が、溶解プロフィール、該組成物中に存在する銅の合計の少なくとも２５％の可溶性銅の放出および／または増殖阻害アッセイにおいて決定されるような抗細菌活性、から選択される、請求項１−１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
該カルボン酸配位子が、線状または環状のモノまたはジカルボン酸配位子である、請求項１−１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
（ａ）該カルボン酸配位子またはそのイオン化形態が、酒石酸もしくはタルタレート、グルコン酸もしくはグルコネート、アジピン酸もしくはアジペート、コハク酸もしくはスクシネート、リンゴ酸もしくはマレエート、グルタル酸もしくはグルタレート、ピメリン酸もしくはピメレート、および／もしくはグルタチオンであるか；あるいは、
（ｂ）該カルボン酸配位子が、アミノ酸もしくは糖酸である、
請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
（ａ）該カルボン酸配位子またはそのイオン化形態が、酒石酸もしくはタルタレートまたはグルコン酸もしくはグルコネートまたはグルタチオンであるか；あるいは、
（ｂ）該カルボン酸配位子またはそのイオン化形態が、アジピン酸もしくはアジペートとの組み合わせでの酒石酸もしくはタルタレートである、
請求項１−１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
（ａ）該組成物中のナノ粒子が、赤外分光法を用いて決定される実証可能なＭ−Ｌ結合を有する；かつ／または
（ｂ）該組成物中のナノ粒子が、ＸＲＤにより決定された際に実質的に非晶質である、
請求項１−１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
該ナノ粒子が、１ｎｍ〜１００ｎｍの平均直径を有する、請求項１−１７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
該ナノ粒子が、１ｎｍ〜１０ｎｍの平均直径を有する、請求項１−１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
該組成物が、６．０〜８．０のｐＨで配合される、請求項１−１９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
該組成物が、該ナノ粒子が配合されているマトリックスをさらに含む、請求項１−２０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
該マトリックスが、ヒドロキシエチルセルロースまたはＰＥＧを含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
該組成物が、局所送達、腟送達、経鼻送達、直腸送達または経口送達のためのものである、請求項１−２２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
請求項１−２３のいずれか１項に記載の医薬組成物を製造するためのプロセスであって、以下の工程：
（ａ）Ｃｕ２＋およびカルボン酸配位子の構成要素を、該構成要素が可溶性となる４．０未満である第１ｐＨ（Ａ）の反応媒体中、に含む溶液を混合し；
（ｂ）４．０未満であるｐＨ（Ａ）を５．０〜１２．０である第２ｐＨ（Ｂ）に変更して該オキソ水酸化銅ナノ粒子組成物の固体沈殿またはコロイドを形成させ；
（ｃ）工程（ｂ）において生成されたオキソ水酸化銅ナノ粒子組成物を分離する；
を含む、前記プロセス。
【請求項２５】
工程（ａ）の溶液が、１種類以上のさらなる配位子または反応構成要素を含む、請求項２４に記載のプロセス。
【請求項２６】
工程（ｃ）が、オキソ水酸化銅ナノ粒子組成物をさらに、乾燥させ、および／または配合する、ことを含む、請求項２４または２５に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オキソ水酸化銅（ｃｏｐｐｅｒ  ｏｘｏ−ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）ナノ粒子を含む抗細菌組成物に、特に配位子修飾された（ｌｉｇａｎｄ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ）オキソ水酸化銅ナノ粒子および可溶性殺生物性銅を送達することができる抗細菌剤としてのそれらの使用に関する。本発明は、さらに、配位子修飾されたオキソ水酸化銅ナノ粒子の、特に創傷治癒または微生物感染の処置もしくは予防のための医学的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
新規の抗微生物薬の開発は、１９８０年代以後次第に減速しており、出現している多剤耐性病原体を前にして暗いシナリオを残している。いわゆる‘スーパーバグ（ｓｕｐｅｒｂｕｇｓ）’は、ますます公衆衛生に対する世界的な脅威として認識されており、無機性薬剤、例えば銅および銀に基づく無機性薬剤を含む新規の抗微生物薬の探求を駆動している。これらの金属は、歴史的に使用されており（ｈａｖｅ  ｈａｄ  ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ  ｕｓａｇｅ）、そして重要なことだが、多数の殺生物機序を介して作用すると仮定されており、それは、微生物が耐性を獲得するために多数の変異を経ることを必要とすることにより、潜在的に臨床的寿命を高める可能性がある。その２種類の金属のうちで、銀は、より大きな抗微生物有効性を示してきた：しかし、費用、インビボ毒性および化学的不安定性が、感染した創傷の治癒のような臨床適用に関するその有用性を制限しているようである。銅は、有効性はより低いが、安価であり、必須の微量栄養素であり、ヒトによってより良く許容され、より多い用量が用いられることを可能にする。しかし、そのより低い殺生物有効性のため、遊離の銅の生物学的利用能を最大限にする送達系の開発が、臨床設定におけるその使用に決定的に重要である。
【０００３】
ＧＢ  １６００４４９（Ｍｏｏｎｅｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）は、主に触媒における使用のための樹脂または石鹸様の物質に関し、ここで、結晶質の金属酸化物粒子が、有機分子の非晶質のマトリックス中で化学量論的様式で取り囲まれて、非極性（油様）溶媒中で溶解し得る金属酸化物組成物をもたらす。ＧＢ  １６００４４９は、これらの組成物が非修飾の微結晶コアを保持していることをＸ線回折により実証しており、それは、その有機分子が、粒子内部に組み込まれているのではなく、粒子の表面上にコートされていることを、示している。
【０００４】
国際公開第２００８／０９６１３０号（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ）は、配位子修飾されたポリオキソヒドロキシ金属イオン材料を記載しており、特に栄養的、医学的、化粧的もしくは生物学的に関連する適用、例えば貧血のようなその材料の構成要素に関連する欠乏の処置のための、またはその材料に結合することができる内因性物質の除去のためのそれらの使用が、開示されている。ホスフェート結合材料としての使用のためのこれらのタイプの材料の例が、国際公開第２０１０／０１５８２７号において記載されている。
【０００５】
国際公開第２０１２／１０１４０７号は、物品を改変された雰囲気条件下で包装用封筒状袋（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）中で保管するための製品の包装における使用のための酸素センサーに関し、ここで、酸素センサーは、場合により１種類以上の配位子により修飾されている金属オキソ水酸化物に基づいている。センサーは、例えばゼラチンのような材料から形成された水和した酸素透過性マトリックス中に存在することができる。
【０００６】
ＤＥ  ２０２０５０１４３３２は、化学的に反応性の基を含有する有機金属ナノ粉末およびポリマー性複合物の形成におけるそれらの使用に関する。
抗微生物性金属イオン、例えば銅の有効な送達に関するアプローチの開発は、当該技術において、特に臨床設定における使用に関して未解決の問題のままである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＧＢ  １６００４４９
【特許文献２】国際公開第２００８／０９６１３０号
【特許文献３】国際公開第２０１０／０１５８２７号
【特許文献４】国際公開第２０１２／１０１４０７号
【特許文献５】ＤＥ  ２０２０５０１４３３２
【発明の概要】
【０００８】
概して、本発明は、典型的には遊離銅イオン（Ｃｕ２＋）の形態の殺生物濃度の銅を送達することができるオキソ水酸化銅から形成されたナノ粒子に関する。本発明のナノ粒子組成物は、先行技術の銅ナノ粒子とは異なり、典型的には１ｎｍ〜１００ｎｍの範囲、より好ましくは１ｎｍ〜１０ｎｍの範囲の平均直径を有し、比較的高い表面積対体積比および対応するバルク相手材と比較して高められた反応性を有し、かつ遊離の銅を効率的に放出してそれらが医薬もしくは抗細菌組成物として作用することを可能にするために十分に不安定である小さい粒子を提供することにより、この結果を達成する。好ましい態様において、これは、オキソ水酸化銅の配位子修飾により達成され、ここで、１以上の配位子でオキソ水酸化銅のオキソまたはヒドロキシ基を非化学量論的に置換する。本明細書で記載される実験は、オキソ水酸化銅ナノ粒子が、抗細菌剤と同じくらい有効であり、商業的に入手可能な酸化銅（ＣｕＯ）ナノ粒子、シリケート安定化水酸化銅ナノ粒子および強いキレート剤、例えばＥＤＴＡを含む銅錯体と比較して優秀であることを、実証している。本発明のオキソ水酸化銅ナノ粒子組成物は、好ましくはカルボン酸配位子またはそのイオン化形態、例えばタルタレートおよびアジペートにより修飾されている。
【０００９】
従って、第１側面において、本発明は、配位子修飾されたオキソ水酸化銅ナノ粒子を含む抗細菌組成物を提供し、ここで、オキソ水酸化銅ナノ粒子は、１以上の配位子が非化学量論的にオキソまたはヒドロキシ基を置換している構造を有し、ここで、１以上の配位子は、カルボン酸配位子またはそのイオン化形態を含む。オキソ水酸化銅ナノ粒子は、ポリマー性構造を有し、ここで配位子は、単にオキソ水酸化銅の粒子の表面上にコートされている、または物理的に吸着されているのではなく、オキソ水酸化銅の固相構造内に分布しているため、本発明者らは、配位子の包含が、ナノ粒子の溶解を調節して殺生物的使用のために利用可能な遊離の可溶性銅イオンを提供するのを助けると信じている。オキソ水酸化銅ナノ粒子は、１以上の再現性のある物理化学的特性、例えば溶解プロフィール、ナノ粒子中に存在する銅の合計の関数としての利用可能になった可溶性銅の百分率、および／または細菌増殖阻害アッセイにおけるナノ粒子の殺生物活性および／または乾燥している組成物を再懸濁した際の不安定性の保持を有することが、好ましい。
【００１０】
さらなる側面において、本発明は、抗細菌剤としての使用のための本明細書で記載されるオキソ水酸化銅ナノ粒子組成物を提供する。
さらなる側面において、本発明は、微生物感染の処置または予防のための方法における使用のための本明細書で記載されるオキソ水酸化銅ナノ粒子組成物を提供し、より好ましくは、ここで、微生物感染は、細菌感染である。オキソ水酸化銅ナノ粒子組成物の医学的使用に関する本発明の側面において、組成物は、ヒトまたは動物の対象を処置するために用いられることができる。
【００１１】
さらなる側面において、本発明は、本明細書で記載される配位子修飾されたオキソ水酸化銅ナノ粒子および薬学的に許容可能なキャリヤーを含む医薬組成物を提供する。
さらなる側面において、本発明は、細菌感染の処置もしくは予防または創傷の処置のための医薬品の調製のための本明細書で記載されるオキソ水酸化銅ナノ粒子組成物の使用を提供する。
【００１２】
さらなる側面において、本発明は、細菌感染を処置または予防する方法であって、処置を必要とする患者に療法上有効量の本明細書で記載されるオキソ水酸化銅ナノ粒子組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００１３】
さらなる側面において、本発明は、本発明の抗細菌組成物によりコートまたは処理されている物品を提供する。
さらなる側面において、本発明は、本発明に従うオキソ水酸化銅ナノ粒子組成物を製造するためのプロセスを提供し、そのプロセスは、以下の工程を含む：
（ａ）Ｃｕ２＋およびカルボン酸配位子、ならびに場合により１種類以上のさらなる配位子または反応構成要素を構成要素が可溶性である第１ｐＨ（Ａ）の反応媒体中に含む溶液を混合し；
（ｂ）ｐＨ（Ａ）を第２ｐＨ（Ｂ）に変更してオキソ水酸化銅ナノ粒子組成物の固体沈殿またはコロイドを形成させ；
（ｃ）工程（ｂ）において生成されたオキソ水酸化銅ナノ粒子組成物を分離し、場合により乾燥させ、および／または配合する。
【００１４】
さらなる側面において、本発明は、上記のプロセスにより得ることができるような配位子修飾されたオキソ水酸化銅ナノ粒子を含む組成物を提供し、ここで、オキソ水酸化銅ナノ粒子は、１以上の配位子が非化学量論的にオキソまたはヒドロキシ基を置換している構造を有し、ここで、１以上の配位子は、カルボン酸配位子またはそのイオン化形態を含む。
【００１５】
さらなる側面において、本発明は、本発明の配位子修飾されたオキソ水酸化銅ナノ粒子を含むように処理された表面を有する物品を提供し、ここで、ナノ粒子は、物品の表面に抗細菌特性を提供する。この方法で処理することができる物品の例、例えば医学的設備、絆創膏および包帯が、下記で提供されている。
【００１６】
本発明のコートされた支持体は、医学的処置の方法における使用のための、例えば微生物感染の処置および／もしくは予防または創傷の処置のためのものであることができることは、理解されるであろう。支持体は、皮膚障害または粘膜の障害の処置および／または予防のためにも有用である可能性がある。従って、さらなる側面において、本発明は、微生物または細菌感染の処置および／または予防のための医薬品の製造における配位子修飾されたオキソ水酸化銅ナノ粒子組成物の使用を提供する。本発明は、皮膚障害または粘膜の障害の処置および／または予防のための医薬品の製造における配位子修飾されたオキソ水酸化銅ナノ粒子組成物の使用も提供する。医薬品は、本発明のコーティングまたはコートされた支持体、例えばコートされた創傷包帯、またはコートされた医学的デバイス、例えば埋め込み式の医学的デバイス、例えばステントであることができる。
【００１７】
本発明の態様は、ここで、付随する図面および実施例への参照により例として、そして限定ではなく記載されるであろう。図１〜６は、比較目的のために提供されている。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】０〜５０ｐｐｍ  Ｃｕの塩化銅への曝露を伴う大腸菌の増殖曲線。細菌の増殖は、時間の経過にわたる光学密度（ＯＤ）の測定により追跡された（上）。アッセイの期間にわたる細菌増殖培地中での塩化銅の溶解度（下）。エラーバーは、標準偏差を表す（ｎ＝３）。
【図２】（Ａ）分散させた直後（０ｈ）および攪拌を伴わずに静置して１時間後の、水中で約１２７０ｐｐｍのＣｕＯおよびＣｕＳｉ  ＮＰ（実験実施例の通り）；懸濁状態で安定のままであったＣｕＳｉ  ＮＰとは異なり、大きなＣｕＯの凝集体（黒い沈殿物）の形成を示している。（Ｂ）約１２７０ｐｐｍ  Ｃｕにおける水懸濁液中でのＣｕＯ  ＮＰのゼータ電位。ＣｕＳｉ  ＮＰの粒径分布（Ｃ）およびゼータ電位（Ｄ）；両方とも水中で約１２００ｐｐｍ銅において分析された。エラーバーは、標準偏差を表す（ｎ＝３）。
【図３】ＣｕＯ  ＮＰ（Ａ）および５０ｐｐｍ  ＣｕにおけるＣｕＳｉ  ＮＰ（Ｂ）への曝露後の大腸菌の増殖曲線、ならびに可溶性銅の対照であるＣｕＣｌ２と比較したそれらのそれぞれの細菌増殖阻害（Ｃ）。５０ｐｐｍ  ＣｕにおけるＣｕＳｉ  ＮＰおよびＣｕＯ  ＮＰの細菌培地中での溶解（Ｄ）。エラーバーは、標準偏差を表す（ｎ＝３）。
【図４】ＣｕＯ  ＮＰ（上）およびＣｕＳｉ  ＮＰ（下）との４時間のインキュベーション後の大腸菌増殖阻害の、３つの異なる銅の濃度（１２．５、２５および５０ｐｐｍ  Ｃｕ）における細菌培地中のナノ粒子および可溶性銅のレベルとの比較。
【図５】１０〜５００ｐｐｍの濃度範囲までのＣｕＣｌ２の希釈における、ｐＨ７．４±０．２のＭＯＰＳ緩衝液中での分散可能なＣｕ（ｎ＝３）。
【図６】（Ａ）約１２７０ｐｐｍ  Ｃｕにおける水中でのｐＨ７．５±０．２におけるＣｕ−ＥＤＴＡストックの溶解度。エラーバーは、２つの分析複製物の標準偏差を表す。（Ｂ）異なる比率でのＣｕＥＤＴＡ錯体とのインキュベーション後の大腸菌増殖阻害。負の値は銅を含まない培地と比較した初期増殖における増大を表すことに注意。（Ｃ）１０〜５００ｐｐｍの濃度範囲までのＣｕＳｉナノ粒子の希釈における、ｐＨ７．４±０．２のＭＯＰＳ緩衝液中での分散可能な銅。エラーバーは、標準偏差を表す（ｎ＝３）。
【図７】（実験実施例の通りに調製された）ＣｕＴａｒｔＡｄナノ粒子の特性付け。Ａ−ｐＨ８において約２５００ｐｐｍ  Ｃｕを含有するように調製された懸濁液のＴＥＭ分析（懸濁液は、ＴＥＭ格子上に滴下された（ｄｒｏｐｃａｓｔ））。Ｂ−３．７２±０．０４ｎｍの平均サイズを示す、動的光散乱法により分析された同じナノ粒子の流体力学粒径分布。Ｃ．ｐＨ８、約１０００ｐｐｍ  ＣｕにおけるＣｕＴａｒｔＡｄ  ＮＰのゼータ電位。Ｄ．非晶質ＣｕＴａｒｔＡｄナノ粒子のＸＲＤスペクトル。赤でのピークは、岩塩（結晶質ＮａＣｌ）に対応し、それは、酸性塩化物含有溶液の水酸化ナトリウムによる中和により形成された。エラーバーは、３つの分析複製物の標準偏差を表す。
【図８】Ａ）細菌培地中での１２．５、２５および５０ｐｐｍ  ＣｕにおけるＣｕＴａｒｔＡｄ  ＮＰの溶解プロフィール；エラーバーは、標準偏差を表す（ｎ＝３）。Ｂ）１０〜５００ｐｐｍの濃度範囲までのＣｕＴａｒｔＡｄ  ＮＰの希釈における、ｐＨ７．４±０．２のＭＯＰＳ緩衝液中での分散可能な銅。エラーバーは、標準偏差を表す（ｎ＝３）。
【図９】両方とも５０ｐｐｍ  Ｃｕにおける可溶性ＣｕおよびＣｕＴａｒｔＡｄナノ粒子とのインキュベーション後の大腸菌（上）およびＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（下）の増殖阻害。エラーバーは、標準偏差を表す（ｎ＝２）。
【図１０】２５０ｐｐｍ  ＣｕにおけるＣｕＴａｒｔＡｄ  ＮＰを含有するＨＥＣマトリックス（Ａ）。２５０ｐｐｍ  Ｃｕを含有するＨＥＣマトリックスからのＣｕの放出。エラーバーは、標準偏差を表す（ｎ＝３）。このアッセイは、銅を含有するＨＥＣ（７．１ｃｍ２の比表面積を有する）をｐＨ７．０±０．２の重炭酸緩衝溶液に曝露し、時間の経過にわたって銅濃度を追跡することで構成されていた。
【図１１】比較目的のために合成された未修飾の水酸化銅（実施例４．Ｎ６）のＸＲＤスペクトルも得られた（下）。後者は、塩素原子が鉱物構造中に組み込まれている化学式Ｃｕ２（ＯＨ）３Ｃｌの水酸化銅であるパラ緑塩銅鉱に対応する結晶パターンを示した（下）。
【図１２】皮膚線維芽細胞（細胞株ＣＣＤ−２５Ｓｋ）の、ＣｕＣｌ２、ＡｇＮＯ３およびタルタレートアジペート修飾オキソ水酸化銅ナノ粒子（ＣｕＴａｒｔＡｄ  ＮＰ）への４８時間の曝露の際の細胞増殖。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
オキソ水酸化銅ナノ粒子組成物
固体配位子修飾ポリオキソヒドロキシ金属イオン材料、特にオキソ水酸化第二鉄に基づく材料の製造および特性付けが、我々のより早期の出願である国際公開第２００８／０９６１３０号および国際公開第２０１０／０１５８２７号において記載されており、その両方が、参照により援用される。対応するプロセスは、本出願で報告される研究において、抗細菌および抗微生物適用における、例えば創傷治癒を促進するための用途を有する本発明の配位子修飾されたオキソ水酸化銅ナノ粒子組成物を提供するように適合させられている。
【００２０】
一般に、このクラスの材料は、非化学量論的な式（ＭｘＬｙ（ＯＨ）ｎ）により表されることができ、ここで、Ｍは、１以上の金属イオンを表し、Ｌは、１以上の配位子を表し、ＯＨは、その基が固体オキソ水酸化物材料において架橋しているか（オキソ基）または表面基であるかのどちらであるかに依存してオキソまたはヒドロキシ基を表す。当該技術で周知であるように、非化学量論的化合物は、十分に定められた自然数の比率により表されることができない元素組成を有する化学化合物であり、すなわち、たとえその材料が再現性のある様式で作製されることができ、一貫して再現性のある特性を有することができるとしても、上記の式中のｘ、ｙおよびｎの下付き文字は、必ずしも全てが自然数ではないであろう。好ましくは、本発明の配位子修飾されたオキソ水酸化銅は、配位子が実質的にランダムにオキソまたはヒドロキシ基を置換しているポリマー性構造を有する。これは、１種類以上の再現性のある物理化学的特性を有するオキソ水酸化銅ナノ粒子、例えば約１ｎｍ〜約１００ｎｍの範囲の平均粒径直径（例えば動的光散乱法により決定される；節１．２．１参照）、再現性のある溶解プロフィール、ナノ粒子が実質的に非晶質である（例えばＸ線回折または透過型電子顕微鏡法を用いて決定される；節１．２．３および１．２．４参照）組成物、および／またはナノ粒子が実証可能な（例えば赤外分光法を用いて決定される）金属−配位子結合を有する組成物の１以上を有する組成物を提供する。加えて、またはあるいは、オキソ水酸化銅ナノ粒子組成物は、ある百分率の可溶性銅を放出することができ、それは、好ましくは組成物中に存在する銅の合計の少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、最も好ましくは少なくとも５０％である。可溶性銅の放出は、（例えば下記の実施例の節において記載されるような）遊離銅放出アッセイにおいて測定されることができる。オキソ水酸化銅ナノ粒子組成物の殺生物特性は、細菌増殖阻害アッセイを用いて測定されることができ、好ましくは標準化された条件下で少なくとも５０％の細菌増殖阻害、より好ましくは少なくとも６０％の細菌増殖阻害、より好ましくは少なくとも７０％の細菌増殖阻害、そしてより好ましくは少なくとも９０％の細菌増殖阻害を達成する。好ましい態様において、大腸菌増殖の完全な（１００％の）阻害が、本発明の抗微生物組成物を用いて、例えば大腸菌が配位子修飾されたオキソ水酸化銅ナノ粒子に約２５ｍｇ／Ｌより上の銅濃度（これらの特定の条件において大腸菌の増殖を完全に阻害する（１００％））で６時間曝露されたアッセイにおいて達成される。適切な増殖阻害アッセイのさらなる例が、節１．３．２において提供されている。
【００２１】
典型的には、金属イオン（例えばＣｕ２＋）は、元々塩の形態で存在すると考えられ、それは、材料の調製において溶解し、次いで配位子（Ｌ）を含むポリオキソ−ヒドロキシ共錯体を形成するように誘導されることができる。下記のように、他の金属イオンが、銅イオン（Ｃｕ２＋）に加えて存在することができる。いずれかの特定の理論により束縛されることを望むわけでは一切ないが、本発明者らは、これらの材料において、そして本発明の配位子修飾されたオキソ水酸化銅ナノ粒子において、金属オキソ水酸化物を修飾するために用いられた配位子の一部は、正式の（ｆｏｒｍａｌ）Ｍ−Ｌ結合により固相内に統合されている、すなわち、配位子（Ｌ）の全てが単にバルク材料中に捕捉もしくは吸着されている、および／または金属オキソ水酸化物材料の粒子の表面上に吸着もしくはコートされているわけではないと信じている。材料中の金属イオンの結合は、物理的分析技法、例えば赤外分光法を用いて決定されることができ、ここで、スペクトルは、金属イオンおよび配位子（Ｌ）の間の結合のピーク特徴、ならびに材料中に存在する他の結合、例えばＭ−Ｏ、Ｏ−Ｈおよび配位子種（Ｌ）中の結合のピーク特徴を有するであろう。あるいは、または加えて、配位子種は、その材料が例えば対応する未修飾の水酸化銅の構造と比較してより非晶質な性質を有するように固相材料中の全体的な秩序を低下させる様式での配位子分子によるオキソまたはヒドロキシル基の置換により、固相構造中に導入されることができる。より無秩序な、または非晶質の構造の存在は、当業者により当該技術で周知の技法を用いて容易に決定されることができる。１つの典型的な技法は、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）である。高解像度透過型電子顕微鏡法は、材料の結晶パターンが視覚的に評価されることを可能にする。それは、一次粒径および構造（例えば面間隔ｄ）を示し、非晶質および結晶質材料の間の分布に関する一部の情報を与えることができる。これは、高角度環状暗視野収差補正走査型透過電子顕微鏡法を用いると、高いコントラストが達成される一方で解像度を維持し、従って材料の一次粒子の表面ならびにバルクが可視化されることを可能にするため、特に明らかである可能性がある。
【００２２】
本明細書で開示されるオキソ水酸化銅ナノ粒子は、例えば抗細菌または抗微生物剤としての使用のための生物学的に有効な濃度の殺生物性銅を送達することができる組成物を提供するために銅イオン（Ｃｕ２＋）を用いる。本発明の組成物は、さらに、生物学的に適合性であり、銅に対する一般的な生理学的許容性の点で非毒性である利点を有することができる。
【００２３】
背景として、当該技術において、銅の酸化物、水酸化物およびオキソ水酸化物は、Ｏおよび／またはＯＨと一緒のＣｕ２＋からなることは周知であり、本特許において集合的に“オキソ水酸化銅”と呼ばれ、それは当該技術において既知である。銅イオン（Ｃｕ２＋）の存在に加えて、他の金属イオン、例えばＣａ２＋、Ｍｇ２＋、Ａｇ＋、Ａｌ３＋、Ｆｅ３＋および／またはＺｎ２＋が、存在することができる。特に、抗微生物特性を有するさらなる金属陽イオン、例えばＡｇ＋を含ませることが、望ましい可能性がある。さらなる好ましいタイプの材料は、銅イオンに加えてＺｎ２＋を含む。
【００２４】
本発明のオキソ水酸化銅ナノ粒子は、例えば可溶性銅の抗細菌活性が望ましい適用における使用のための、可溶性銅の最適な送達のために設計された組成物の開発に基づいている。本明細書における比較例は、臨床用配合物において必要とされる濃度で分散させた際、一般的な銅塩類は、（図５において示されているように）大きくかつ殺生物的に不活性な水酸化銅類として沈殿する傾向があることを、示している。さらに、錯体形成剤（例えばＥＤＴＡ）の添加は、そのような凝集体の形成を防ぎ、銅を溶液状態で保つことができるが、これらの製剤は、錯体形成した銅イオンの限られた生物学的利用能のため、控えめな細菌増殖の阻害を示した。これらの実験は、銅イオンは殺生物活性の原因となる活性な形態であるにもかかわらず、塩の形態は不溶性の水酸化銅類になる傾向があるため、銅塩類はそれらを送達するよい方法ではない、ということを示した。本発明者らは、凝集体として存在することによるか、またはＥＤＴＡのような薬剤により強く錯体形成させることによるかのどちらであれ、銅イオンは生物学的に利用不能であるため、これらのアプローチの両方が望ましくない、ということに思い至った。
【００２５】
従って、本発明は、オキソ水酸化銅ナノ粒子を配位子、例えば食餌性配位子、例えばカルボン酸またはアミノ酸を用いて機能化する（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｓｉｎｇ）ことによる遊離銅イオンの送達のためのナノ粒子システムに関する。好ましいアプローチにおいて、オキソ水酸化銅ナノ粒子の鉱物相が、カルボキシレート配位子、例えばタルタレート、グルコネート、アジペートおよび／またはグルタチオンの使用により修飾され、それは、負の表面電荷を与え、ナノ粒子を水性環境において安定化した。
【００２６】
好ましくは、本発明のオキソ水酸化銅ナノ粒子は、１〜１００ｎｍ、１〜５０ｎｍ、１〜２０ｎｍ、１〜１０ｎｍの平均直径範囲を有する。オキソ水酸化銅ナノ粒子の粒子の大きさは、当該技術において周知の技法、例えば実施例において節１．２．１で実証されているような動的光散乱法を用いて決定されることができる。例として、これは、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ＮａｎｏＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて実施されることができる。典型的な実験において、０．５〜１ｍｌのオキソ水酸化銅ナノ粒子の懸濁液が、小さい使い捨てのキュベット中に室温（２０±２℃）において移されることができ、測定は、以下の設定を用いて実施された：材料屈折率０．１９２、吸収０．１、分散剤屈折率１．３３０、粘度１．００３３１ｍＰａ．ｓ。
【００２７】
修飾がない場合、本明細書で用いられる材料の一次粒子は、金属酸化物のコアおよび金属水酸化物の表面を有し、異なる学問分野内で金属酸化物または金属水酸化物と呼ばれる可能性がある。用語‘オキソヒドロキシ’または‘オキソ水酸化物’の使用は、オキソまたはヒドロキシ基の割合に一切言及せずにこれらの事実を認識することが意図されている。従って、ヒドロキシオキシドが、等しく用いられることができるであろう。疑義を回避するため、水酸化銅は、様々な塩化物をドープされた多形も含み；特に、Ｃｕ２（ＯＨ）３Ｃｌは、塩素原子が結晶構造中に組み込まれた水酸化銅誘導体であり、それは、４つのタイプの鉱物相を示す：緑塩銅鉱、ボタラカイト、パラ緑塩銅鉱および斜アタカマ鉱（ｃｌｉｎｏａｔａｃａｍｉｔｅ）。本発明者らは、本発明のオキソ水酸化銅ナノ粒子組成物が、金属オキソ水酸化物の一次粒子のレベルで変化しており、配位子Ｌの少なくとも一部が一次粒子の構造中に導入されており、すなわちこれは、配位子分子による一次粒子のドーピングをもたらすと信じている。これは、金属オキソ水酸化物粒子が配位子との接触の前に予め形成されている場合に起こるような、一次粒子の構造がそれほど変化しておらず有機性配位子が単に粒子の表面上にコートまたは吸着されている金属オキソ水酸化物および有機分子のナノ混合物の形成と、対比されることができる。
【００２８】
本明細書で記載される配位子修飾されたポリオキソヒドロキシ金属イオン材料の一次粒子は、沈殿により好都合に製造されることができる。沈殿という用語の使用は、しばしば沈降または遠心分離により溶液から分離される材料の凝集体の形成を指す。ここで、用語“沈殿”は、上記のような凝集体および凝集しないが懸濁状態で非可溶性部分として残っている固体材料を（それらが微粒子状またはナノ粒子状（コロイド状または半コロイド状（ｓｕｂ−ｃｏｌｌｏｉｄａｌ））であろうとなかろうと）含む全ての固相材料の形成を記載することが、意図されている。これらの後者の固体材料は、アクア状（ａｑｕａｔｅｄ）微粒子固体とも呼ばれ得る。
【００２９】
本発明において、一般に結晶質ではなく、従って一般に臨界沈殿ｐＨより上で形成される３次元のポリマー性または架橋された構造を有する、ポリマー性構造を有する修飾された金属オキソ水酸化物への言及がなされる可能性がある。本明細書で用いられる際、これは、記載されたように配位子の組み込みは偶然の一致によるものを除いて非化学量論的であるため、材料の構造が規則的な反復する単量体単位を有する厳密な意味でのポリマー性であることを示していると受け取られるべきではない。配位子種は、固相構造中に、オキソまたはヒドロキシ基を置換することにより導入され、それは、固相秩序における変化につながる。ある場合、例えば本明細書で例示されるオキソ水酸化銅ナノ粒子組成物の製造において、配位子種Ｌは、固相材料中の全体的な秩序を低下させる様式での配位子分子によるオキソまたはヒドロキシ基の置換により、固相構造中に導入されることができる。これは、なお全体的な形態において１以上の再現性のある物理化学的特性を有する固体の配位子修飾されたポリオキソヒドロキシ金属イオン材料をもたらすが、その材料は、例えば対応する未修飾の金属オキソ水酸化物の構造と比較してより非晶質な性質を有する。より無秩序または非晶質な構造の存在は、当業者により、当該技術において周知の技法を用いて容易に決定されることができる。１つの典型的な技法は、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）である。高解像度透過型電子顕微鏡法は、材料の結晶パターンが視覚的に評価されることを可能にする。それは、一次粒径および構造（例えば面間隔ｄ）を示し、非晶質および結晶質材料の間の分布に関する一部の情報を与えることができる。この技法を用いれば、上記の化学が、組み込まれた配位子を含まない対応する材料と比較して、我々の記載した材料の非晶質相を増大させることは、明らかである。これは、高角度環状暗視野収差補正走査型透過電子顕微鏡法を用いると、高いコントラストが達成される一方で解像度を維持し、従って材料の一次粒子の表面ならびにバルクが可視化されることを可能にするため、特に明らかである可能性がある。
【００３０】
上記のこれらの物理化学的特性の組み合わせは、銅イオンの急速な放出を促進し、実施例において示されているように、広い範囲のグラム陰性およびグラム陽性菌両方に対する高い殺菌有効性に変換される。重要なことだが、カルボキシレート類で修飾されたオキソ水酸化物は、銅塩類（例えばＣｕＣｌ２）または商業的な銅ナノ粒子とは異なり、ヒドロキシエチルセルロースゲル（局所送達マトリックスの例）のような送達マトリックス中に組み込まれた場合、殺生物レベルで銅を放出することができ、これは、配位子の機能化が、局所用殺生物剤の開発のために、または物品のための抗細菌コーティングを提供することができる組成物を提供するために用いられることができることを、示している。
【００３１】
本発明を用いて有用に調節されることができる特性の例は、以下の特性を含む：溶解（速度、ｐＨ依存性および［Ｃｕ］依存性）、脱凝集、吸着および吸収特徴、反応性−不活性、融点、耐熱性、粒径、磁性、電気的特性、密度、光吸収／反射特性、硬度−軟度、色および封入特性。この文脈において、特性または特徴は、複製実験が好ましくは±１０％、より好ましくは±５％の標準偏差内、さらにもっと好ましくは±２％の制限内で再現性がある場合、再現性があることができる。特に、本発明者らは、オキソ水酸化銅ナノ粒子の特性、例えば不安定性が、例えば貯蔵のために乾燥させられた組成物を再懸濁した際に保持されていることを見出している。
【００３２】
配位子修飾されたオキソ水酸化銅ナノ粒子組成物の溶解プロフィールは、プロセスの異なる段階、すなわち脱凝集および溶解により表されることができる。溶解という用語は、物質の固相から可溶性相への移行を記載するために用いられている。より具体的には、脱凝集は、材料の固体の凝集した相から可溶性相およびアクア状粒子相の合計（すなわち溶液＋懸濁液相）であるアクア相への移行を記載することが意図されている。従って、溶解という用語は、脱凝集とは対照的に、より具体的には、あらゆる固相（凝集またはアクア）から可溶性相への移行を表す。
【００３３】
配位子（Ｌ）
式（ＭｘＬｙ（ＯＨ）ｎ）により表される配位子修飾されたオキソ水酸化銅ナノ粒子組成物において、Ｌは、固相配位子修飾ポリオキソヒドロキシ金属イオン材料中に組み込まれることができる、例えば最初はそのプロトン化された形態またはアルカリ金属イオン形態である１種類以上の配位子または陰イオンを表す。本明細書で記載される材料において、配位子の少なくとも１種類は、カルボン酸配位子またはそのイオン化形態（すなわちカルボキシレート配位子）、例えばタルタレート（または酒石酸）、グルコネート（またはグルコン酸）、アジペート（またはアジピン酸）、グルタチオンおよび／またはアミノ酸および／または糖酸である。好ましくは、配位子は、モノまたはジカルボン酸配位子であり、式ＨＯＣＨ２−Ｒ１−ＣＯＯＨまたはＨＯＯＣ−Ｒ１−ＣＯＯＨ（またはそのイオン化形態）により表されることができ、ここで、Ｒ１は、場合により置換されたＣ１−１０アルキル、Ｃ１−１０アルケニルまたはＣ１−１０アルキニル基である。一般に、Ｒ１がＣ１−１０アルキル基である、より好ましくはＣ２−６アルキル基である配位子の使用が、好ましい。Ｒ１基の好ましい任意の置換基は、例えばリンゴ酸中に存在するような１以上のヒドロキシル基を含む。好ましい態様において、Ｒ１基は、直鎖アルキル基である。カルボン酸配位子のより好ましい群は、酒石酸（またはタルタレート）、グルコネート（またはグルコン酸）、アジピン酸（またはアジペート）、グルタル酸（またはグルタレート）、ピメリン酸（またはピメレート）、コハク酸（またはスクシネート）、およびリンゴ酸（またはマレエート）、ならびにそれらの組み合わせを含む。カルボン酸配位子が酸として存在するか、または部分的もしくは完全にイオン化されてカルボキシレート陰イオンの形態で存在するかのどちらであるかは、ある範囲の要因、例えば材料が製造および／または回収されるｐＨ、製造後の処理または配合工程の使用、ならびにどのように配位子がポリオキソヒドロキシ金属イオン材料中に組み込まれるかに依存するであろう。ある態様において、配位子の少なくともある割合は、材料が典型的にはｐＨ＞４で回収されるため、そして配位子および正に荷電した鉄の間の相互作用が負に荷電したカルボキシレートイオンの存在により大きく増進されるであろうため、カルボキシレート形態で存在するであろう。疑義を回避するため、本発明に従うカルボン酸配位子の使用は、これらの可能性、すなわちカルボン酸として、非イオン化形態で、部分的にイオン化した形態で（例えば配位子がジカルボン酸である場合）、またはカルボキシレートイオンとして完全にイオン化した形態で、およびそれらの混合物で存在する配位子の全てをカバーする。
【００３４】
典型的には、配位子は、固相ポリオキソヒドロキシ金属イオン材料中に、例えば配位子（単数または複数）が存在しないポリオキソヒドロキシル化金属イオン種と比較した固体材料の物理化学的特性の改変を助けるために組み込まれている。本発明のある態様において、配位子（単数または複数）Ｌは、いくらかの緩衝能力も有することができる。本発明において用いられることができる配位子の例は、以下の配位子を含むが、それらに限定されることは決してない：カルボン酸、例えば酒石酸、グルコン酸、アジピン酸、グルタル酸、リンゴ酸、コハク酸、アスパラギン酸、ピメリン酸、クエン酸、乳酸または安息香酸；食物添加剤、例えばマルトール、エチルマルトールまたはバニリン；アミノ酸、例えばトリプトファン、グルタミン、プロリン、バリン、またはヒスチジン；および栄養素ベースの配位子、例えばフォレート、アスコルベート、ピリドキシンまたはナイアシンまたはニコチンアミド；糖酸、例えばグルコン酸。典型的には、金属イオンに関する親和性が異なる２種類の配位子が、これらの材料の製造において用いられるが、１、２、３、４種類またはより多くの種類の配位子が、特定の適用において有用である可能性がある。
【００３５】
多くの適用に関して、配位子は、用いられる条件下で生物学的に適合性である必要があり、一般に反応点において孤立電子対を有する１個以上の原子を有する。配位子は、陰イオン、弱い配位子および強い配位子を含む。配位子は、反応の間にいくらかの本来備わる緩衝能力を有することができる。特定の説明により束縛されることを望むわけではないが、本発明者らは、配位子が２つの相互作用の方式を有すると信じている：（ａ）オキソまたはヒドロキシ基の置換、従って材料内での大部分は共有結合性の特徴による組み込み、および（ｂ）非特異的吸着（イオン対形成）。これらの２つの方式は、おそらく異なる金属−配位子の親和性（すなわち前者に関する強い配位子および後者に関する弱い配位子／陰イオン）に関する。我々の最近の研究において、２タイプの配位子が材料の溶解特徴の調節において、従っておそらく材料の他の特徴の決定において相乗的であるといういくつかの証拠が存在する。この場合、２つの配位子のタイプが用いられ、少なくとも一方（タイプ（ａ））は、材料内で金属結合を示すものとして実証可能である。配位子の有効性は、おそらく特にタイプ（ｂ）の配位子に関して、系の他の構成要素、特に電解質により影響を受ける可能性がある。
【００３６】
金属イオン（単数または複数）の配位子（単数または複数）（Ｌ）に対する比率はまた、本明細書で開示される方法に従って変更されることができる固相の配位子修飾されたポリオキソヒドロキシ金属イオン（ｉｒｏｎ）材料の、その材料の特性を変更するパラメーターである。一般に、Ｃｕ：Ｌの有用な比率は、１０：１、５：１、４：１、３：１、２：１および１：１ならびに１：２、１：３、１：４または１：１０であると考えられ、好ましくは、Ｃｕ：配位子の比率は、１：１以下である。
【００３７】
オキソ水酸化銅ナノ粒子組成物の製造および処理
一般に、本発明のオキソ水酸化銅ナノ粒子組成物は、以下の工程を含むプロセスにより製造されることができる：
（ａ）Ｃｕ２＋およびカルボン酸配位子ならびに場合によりあらゆるさらなる配位子または他の構成要素を含む溶液を、反応媒体中で構成要素が可溶性である第１ｐＨ（Ａ）において混合し；
（ｂ）ｐＨ（Ａ）を第２ｐＨ（Ｂ）に変更して固体沈殿またはオキソ水酸化銅ナノ粒子組成物のコロイドを形成させ；
（ｃ）工程（ｂ）において生成したオキソ水酸化銅ナノ粒子組成物を分離し、場合により乾燥させ、および／または配合する。
【００３８】
用いられることができる条件の例は、以下の条件を含む：４．０未満であるｐＨ（Ａ）および５．０〜１２．０、より好ましくは６．０〜８．０である第２ｐＨ（Ｂ）を使用し、反応を室温（２０〜２５℃）で実施する。一般に、工程（ａ）において、溶液は、２０〜１００ｍＭまたは１ＭのＣｕ２＋および５０〜２５０ｍＭの適切なカルボン酸配位子を含有することが好ましく、より好ましくは約４０ｍＭのＣｕ２＋および１００ｍＭの配位子を含有する。
【００３９】
次いで、候補材料の分離の後、材料が特性付けまたは試験される１以上の工程が行われることができる。例として、上記の材料の１以上の特性、最も注目すべきはその溶解プロフィール、可溶性銅の放出および／または抗細菌特性を決定するための試験が、インビトロまたはインビボで実施されることができる。あるいは、または加えて、そのプロセスは、化学的に、例えば滴定プロセスを通して、もしくは物理的に、例えば微粒子化（ｍｉｃｒｏｎｉｚｉｎｇ）プロセスを通して、オキソ水酸化銅ナノ粒子組成物の最終的な粒径を変化させること、および／または組成物に対して例えば対象への投与のための最終組成物を製造する過程において１以上のさらなる処理工程を施すことを含むことができる。さらなる工程の例は、以下の工程を含むが、それらに限定されない：洗浄、遠心分離、濾過、噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、オーブン乾燥、透析、製粉、造粒、カプセル封入、打錠、混合、圧縮、ナノ化および微粒子化。
【００４０】
ある態様において、追加の工程が、最初の材料の製造およびそれが医薬品として配合されるあらゆるその後の工程の間で実施されることができる。これらの追加の製造後の改変工程は、不純物を除去する、または組み込まれた配位子をさらなる配位子で置き換えるために材料を洗浄する工程を含むことができる。
【００４１】
ヒドロキシおよびオキソ基
本発明は、これらのポリオキソヒドロキシ材料の形成においてヒドロキシ表面基およびオキソ架橋を提供することができる濃度で水酸化物イオンを形成するあらゆる方法を用いることができる。例は、ＭＬ混合物中の［ＯＨ］を増大させるために添加されるであろうアルカリ溶液、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、リン酸ナトリウムおよび重炭酸ナトリウム、またはＭＬ混合物中の［ＯＨ］を減少させるために添加されるであろう酸性溶液、例えば鉱酸もしくは有機酸を含むが、それらに限定されない。
【００４２】
本発明のオキソ水酸化銅ナノ粒子組成物を製造するために用いられる条件は、沈殿の物理化学的性質を制御する、またはそうでなければその収集、回収もしくは１種類以上の賦形剤との配合を助けるために適合されることができる。これは、凝塊形成の目的のある阻害、または続いて材料の特性に影響を及ぼすための使用される乾燥もしくは粉砕工程を含むことができる。しかし、これらは溶液相からの固体抽出のためのあらゆるそのような系に対する一般的な変数である。沈殿した材料の分離後、それは、使用またはさらなる配合の前に場合により乾燥させられることができる。しかし、乾燥した製品は、いくらかの水を保持しており、水和した固相の配位子修飾されたポリオキソヒドロキシ金属イオン材料の形態である可能性がある。当業者には、固相の回収に関する本明細書で記載される段階のいずれにおいても、配位子修飾されたポリオキソヒドロキシ金属イオン材料と混合するが一次粒子を修飾せずに材料の意図される機能に関して配合物を最適化する目的で用いられる賦形剤が添加されることができることは、明らかであろう。これらの例は、糖脂質、リン脂質（例えばホスファチジルコリン）、糖類および多糖類、糖アルコール類（例えばグリセロール）、ポリマー類（例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ））ならびにタウロコール酸であり得るが、それらに限定されない。
【００４３】
配合物および使用
本発明のオキソ水酸化銅ナノ粒子組成物は、抗細菌剤または抗微生物剤としての使用のために、例えば細菌または微生物感染の処置または予防のために配合されることができる。従って、本発明の組成物は、本発明の固相材料の１種類以上に加えて、薬学的に許容可能な賦形剤、キャリヤー、緩衝剤、安定化剤または当業者に周知の他の材料を含むことができる。そのような材料は、非毒性であるべきであり、かつ問題の適用に関する固相材料の有効性に有意に干渉すべきでない。
【００４４】
用語“抗細菌性”は、本明細書で用いられる際、エスケリキア属の種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、例えば大腸菌、スタフィロコッカス属の種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、例えばＳ．エピデルミス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）およびメチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（“ＭＲＳＡ”）、バシラス属の種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、例えばＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シュードモナス属の種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、例えばＰ．エルジノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ビブリオ属の種（Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐ．）、例えばＶ．フィシェリ（Ｖ．ｆｉｓｈｅｒｉ）、ストレプトコッカス属の種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、例えばＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）およびＳ．ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ属の種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．）、マイクロコッカス属の種（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、例えばＭ．ルテウス（Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ）、クロストリジウム属の種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）、例えばＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、アシネトバクター属の種（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、例えばＡ．バウマニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、マイコバクテリウム属の種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）、例えばＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ならびにサルモネラ属の種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．）、またはカンジダ属の種（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐ．）、例えばＣ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）を含む真菌を含むグラム陰性およびグラム陽性微生物により引き起こされる感染症の処置または予防を含む。用語“抗微生物性”は、本明細書で用いられる際、表面への微生物の付着を阻害する、微生物を殺す、および／または微生物の繁殖を阻害する物質を含む物質に適用されることが理解されている。用語“微生物”は、上記で述べられたような細菌、ならびに真菌、例えば酵母、古細菌および原生生物を含む全ての微生物を含むことが理解されている。用語“微生物性”および“抗微生物性”は、それに従って解釈されるべきである。
【００４５】
本発明のオキソ水酸化銅ナノ粒子の使用は、組成物がヒトもしくは動物の対象における感染の処置もしくは予防に関して意図されているか、または細菌もしくは微生物のコロニー形成に耐性である物品の表面を提供することを意図されているかのどちらであるかに応じて異なるであろう。後者の適用の例は、医学用設備または包帯に関するコーティングを提供することを含む。
【００４６】
組成物が例えば創傷または皮膚感染症の処置における対象への投与に関して意図されている態様において、キャリヤーまたは他の構成要素の正確な性質は、組成物の投与の様式または経路（典型的には局所経路による）に関連し得る。これは、固体、半固体もしくはゲルマトリックス中の、または液体キャリヤー、例えば水、石油、動物もしくは植物油、鉱油もしくは合成油中のナノ粒子組成物の配合を含み得る。キャリヤーの例は、生理食塩水溶液、デキストロースもしくは他の糖類溶液またはグリコール類、例えばエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールを含む。
【００４７】
個体に与えられることが予定されている本発明に従って用いられる材料および組成物は、好ましくは“予防的有効量”または“療法上有効量”（場合によっては予防は療法と考えられ得るが）で投与され、これは、個々の臨床状態に対する利益を示すために十分である。投与される実際の量ならびに投与の速度および時間経過は、処置されているものの性質および重症度に依存するであろう。処置の処方、例えば投与量等の決定は、一般開業医および他の医師の責任の範囲内であり、典型的には、処置されるべき障害、個々の患者の状態、送達の部位、投与の方法および開業医に既知の他の要因を考慮する。上記で言及された技法およびプロトコルの例は、Remington’ s Pharmaceutical Sciences, 第20版, 2000, Lippincott, Williams & Wilkinsにおいて見付けられることができる。組成物は、処置されるべき病気に応じて、単独で、または他の処置との組み合わせで、同時にまたは連続的にのどちらでも投与されることができる。
【００４８】
一例において、本発明のオキソ水酸化銅ナノ粒子組成物は、マトリックス、例えばヒドロキシアルキルセルロースマトリックス、例えばヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）もしくはヒドロキシメチルセルロース（ＨＭＣ）、またはポリアルキレングリコールマトリックス、例えばＰＥＧ中で配合される。これらのマトリックスの一部は、ヘルスケア製品および化粧品において広く用いられてきたセルロース誘導体であり、それらがマトリックス調製の間にナノ粒子のそれ以上の処理（例えば加熱および乾燥）を必要とせず、それによりナノ粒子組成物の抗細菌または抗微生物特性に対して最小限の作用を有する利点を有する。
【００４９】
他の態様において、本発明のオキソ水酸化銅ナノ粒子組成物は、局所投与のために、例えば創傷、潰瘍の処置または細菌感染の処置もしくは予防において有用な固体または半固体の軟膏の形態で配合されることができる。そのような適用において、ポリアルキレングリコールが、材料の局所送達に十分に適しており、これは、それらがクリームまたは軟膏を形成し、ある範囲の異なる分子量で入手可能であり、粘度および最終的な軟膏において望ましい可能性のある他の物理的パラメーターの適合を可能にするためである。本発明の局所用製品への適用は、創傷治癒に関する、および抗感染組成物におけるような療法的使用を有する。
【００５０】
組成物が対象への投与のために配合される本発明の全ての側面において、組成物またはそれを含有する配合物のｐＨは、生理的ｐＨまで、好ましくは５．０〜９．０のｐＨまで、より好ましくは６．０〜８．５のｐＨまで上げられることが好ましい。実施例は、本発明の組成物がこれらの条件下で遊離の銅を生物学的に利用可能にすることができることを示している。好都合には、これは、塩基、例えば水酸化ナトリウムまたは炭酸ナトリウムを添加することにより行われることができる。この目的は、対象への投与が結果として意図されない臨床転帰、例えば痛みまたは炎症をもたらさないであろうように、ということである。
【００５１】
有効量の本明細書におけるオキソ水酸化銅ナノ粒子組成物が、例えば皮膚、歯、爪または毛髪への局所適用のために配合されることができる。これらの組成物は、クリーム、ローション、ゲル、懸濁液、分散物、マイクロエマルジョン、ナノ分散物、マイクロスフェア、ヒドロゲル、エマルジョン（水中油および油中水、ならびに多重エマルジョン）および多層性ゲル等（例えばChemistry and Manufacture of Cosmetics, Schlossman et al., 1998を参照）の形態であることができ、水性もしくはシリコン組成物として配合されることができ、または水性の連続的な相中の１以上の油相（または油相中の水相）のエマルジョンとして配合されることもできる。本発明において利用されるキャリヤーのタイプは、局所組成物の特性に依存する。キャリヤーは、固体、半固体または液体であることができる。適切なキャリヤーは、液体または半固体、例えばクリーム、ローション、ゲル、棒状のもの、軟膏、ペースト、スプレーおよびムースである。具体的には、キャリヤーは、クリーム、軟膏、ローションまたはゲル、より具体的には、粒子が沈降するのを防ぐための十分な濃さまたは降伏点を有する形態である。キャリヤーは、それ自体が不活性であることができ、またはそれ自体の利益を有することができる。キャリヤーはまた、抗細菌組成物またはキャリヤー中に配合された他の成分と物理的および化学的に適合性であるべきである。キャリヤーの例は、水、ヒドロキシエチルセルロース、プロピレングリコール、ブチレングリコールおよびポリエチレングリコール、またはそれらの組み合わせを含む。
【００５２】
配位子修飾されたオキソ水酸化銅ナノ粒子組成物の療法的使用に加えて、それらは、物品に対する抗微生物または抗細菌コーティング、例えば織布、不織布、プラスチック、ガラスおよび／または金属を含む支持体上のコーティングとして適用されることもできる。コーティングの抗微生物性の性質は、それらを医学的または個人用ケア適用における使用のための支持体に適用されるのに特に適したものにする。特に、コーティングは、通常の使用において体と、例えば皮膚または粘膜と接触している支持体、例えば包帯、絆創膏および硬膏剤上で特に有用である。
【００５３】
例えば、微生物増殖は、皮膚または粘膜が例えば創傷包帯、おむつまたは下着により覆われている場合に特に問題である。皮膚または粘膜が覆われた状態になるとすぐに、微生物増殖に関する環境条件が向上する。覆われた皮膚または粘膜上に存在する微生物は、特に環境が湿っている、および／または空気に曝露していない場合、増進された速度で増殖することができる。これらの微生物からの分泌物は、皮膚のｐＨを変化させ得る酸性またはアルカリ性排出物、毒性分泌物およびプロテアーゼ分泌物を含む酵素分泌物を含む。これらの分泌物および排出物は、皮膚および粘膜の刺激、そしてより重篤な場合には皮膚または粘膜の崩壊、例えば皮膚炎を引き起こし得る。
【００５４】
皮膚または粘膜の被覆の後に起こり得る特定の状態は、鵞口瘡を含む。鵞口瘡は、カンジダ属の酵母、特にカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）による真菌感染症である。症状は、感染した領域のかゆみ、灼熱感およびひりひりする感触、ならびに炎症を含む。ナプキン（ｓａｎｉｔａｒｙ  ｔｏｗｅｌｓ）、尿失禁パッド、おむつおよび／またはきつい下着の着用は、カンジダの増殖に好都合な状態をもたらす可能性があり、それは鵞口瘡につながり得る。本発明のコーティングは、真菌、例えば酵母に対して有効である可能性があり、従って、本発明のコーティングの上述の物品上への提供は、鵞口瘡の処置および／または予防を可能にすることができることは、理解されるであろう。
【００５５】
同様に、接触性皮膚炎（一般におむつかぶれとして知られている）は、尿失禁パッドまたはおむつの着用により引き起こされ得る。湿った、または濡れた皮膚は、その構造を失い、高いｐＨは、細菌の増殖を促進し、そして細菌は、皮膚組織を崩壊させる酵素を分泌し得る。この環境は、褥瘡（一般に床ずれとして知られている）も促進または悪化させる可能性があり、それは、それらが感染した際に特に問題となる。本発明のコーティングは、細菌に対して有効であることが分かっており、従って、本発明のコーティングのタンポン、ナプキン、尿失禁パッドまたはおむつ上への提供は、接触性皮膚炎および／または褥瘡の処置および／または予防を可能にすることができる。
【００５６】
類似の理由のため、接触性皮膚炎および酵母感染症は、医療用包帯、例えば創傷および火傷のための包帯の下で生じ得る。医療用包帯に関する追加の考慮は、創傷または火傷の細菌感染を予防する必要性である。皮膚が火傷した際、大量の組織が損傷を受ける可能性があり、それは、皮膚の天然の障壁特性を低減または破壊する可能性があり、皮膚を壊す創傷も、皮膚の障壁特性に影響を及ぼす。これは、治癒を遅らせ得る日和見感染に、そして敗血症性ショックにつながり得る。加えて、微生物感染、特に細菌感染は、手術後に問題であり得る。本抗微生物性コーティングでコートされている医学的または外科的デバイス、例えば埋め込み式の医学的デバイスの使用は、手術後感染を予防または処置するのを助けることができる。従って、本発明のコーティングの創傷および／または火傷のための包帯上への提供は、接触性皮膚炎および／または微生物感染の処置および／または予防を可能にすることができる。
【００５７】
従って、本発明のオキソ水酸化銅ナノ粒子組成物は、微生物感染の、および／または皮膚もしくは粘膜障害、例えば炎症および皮膚炎の処置および／または予防のための医薬品の製造において用いられることができる。特に、抗細菌性または抗微生物性コーティングは、創傷の感染、火傷の感染、褥瘡の感染、手術後感染、鵞口瘡、接触性皮膚炎および褥瘡の処置および／または予防のために有用である可能性がある。微生物感染は、あらゆる微生物、特に細菌および／または酵母、例えばスタフィロコッカス属の種、例えばＳ．アウレウス、シュードモナス属の種、例えばＰ．エルジノーサ、マイクロコッカス属の種、例えばＭ．ルテウス、サッカロミケス属の種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、例えばＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、カンジダ属の種、例えばＣ．アルビカンス、スタフィロコッカス属の種、例えばＳ．エピデルミス、ストレプトコッカス属の種、例えばＳ．ピオゲネス、クレブシエラ属の種およびエスケリキア属の種、例えば大腸菌、クラミジア属の種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐ．）によるものであり得る。組成物は、さらに、ウイルスまたは寄生生物に対して有効であることができる。
【００５８】
医薬品は、本発明のコーティング法によりコートされた支持体であることができる。従って、例えば、医薬品は、コートされた支持体、例えばコートされた医学的デバイス、例えば埋め込み式の医学的デバイスであることができる。例は、外科的シード（ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｓｅｅｄ）、カテーテル（例えば尿路カテーテル、血管アクセスカテーテル、硬膜外カテーテル）、血管アクセスポート、血管内センサー、気管切開チューブ、経皮内視鏡胃瘻チューブ、気管内チューブ、埋め込み式プロテーゼデバイス、例えばステントおよび関連する短期留置または生体接触デバイスを含む。医薬品は、コートされた支持体、例えばコートされたおむつ、ナプキン、タンポン、尿失禁パッド、包帯、例えば創傷または火傷用包帯、絆創膏または下着であることができる。これらの支持体の多く（特におむつ、ナプキン、尿失禁パッドおよび包帯、例えば創傷または火傷用包帯）は、不織布構成要素を含み、それは、通常の使用において皮膚または粘膜と接触している可能性がある。本発明者らは、本発明のコーティングおよびコーティング法が不織布支持体に特に適していることを実証している。
【００５９】
本明細書で用いられる際、用語“不織布”は、繊維のウェブから形成されたファブリックまたはテキスタイルを含む。不織布において、繊維は、織られても編まれてもいない。不織布は、典型的には小さい繊維を寄せ集めてシートまたはウェブの形態にし、次いでそれらを機械的に結合させることにより製造される。不織布の例は、ポリプロピレン不織布を含む。
【００６０】
医薬品の製造プロセスは、支持体上に抗微生物性コーティングを提供することを含むことができることは、理解されるであろう。従って、医薬品の製造は、抗微生物性コーティングを提供するための本明細書で記載される方法の工程の全てを含むことができる。
【００６１】
本発明は、本方法によりコートされた支持体も提供する。コートされた支持体は、医学的処置の方法における使用のためのものであることができ、上述のコートされた支持体を可能な医薬品として含むことができる。本発明は、微生物感染の、および／または皮膚もしくは粘膜の障害の処置および／または予防のための医学的処置の方法、ならびにそのような方法における本コートされた支持体の使用も提供することは、理解されるであろう。本発明のコーティング法は、医薬品またはその他としての本明細書で言及される支持体をコートするために適用可能である。
【００６２】
上記の適用と同様に、抗微生物性コーティングは、例えば病院における医学的適用における使用のための他の設備上に提供されることもできる。病院における感染、特に細菌感染、例えばＭＲＳＡおよびクロストリジウム・ディフィシルの制御には、重要な関心が存在する。上記で論じられたように、表面の微生物によるコロニー形成は、特定の問題である。しかし、本コーティングは、多くの微生物種に対して有効であることが分かっており、従って、病院設備の表面上への本抗微生物性コーティングの提供は、有益であり得ることは、理解されるであろう。従って、本発明に従ってコートされることができる支持体は、通常の使用において体または体液と接触する医学的設備およびデバイスを含む。例えば、適切な支持体は、チューブ、流体用袋、カテーテル、注射器ならびに外科用設備、例えばメスおよび鉗子等を含む。加えて、他の設備、例えば病院で用いられる設備（例えばヘルスケア設備）、例えば上衣（例えば手術衣）、外科用マスク、保護手袋（例えば外科用および実験用手袋）、カーテン、制服ならびに寝具、例えば枕カバー、（例えばベビーベットおよび集中治療ベッドにおける）防水マットレスカバーおよびシーツが、本発明に従ってコートされることができる。
【００６３】
代わりのヘルスケア設備は、外科用ドレープ、外科用ソックス、家具、例えばベッドサイドテーブルを含むテーブル、ベッド、および座席の表面、ならびに貯蔵容器、フィルター、サービストレーを含む他の設備を含む。
【００６４】
加えて、本発明のコーティングは、微生物がいない状態を保つことが望ましい設備、例えば食品の処理において用いられる設備、例えば台所の設備および表面、ならびに食品の製造または処理において用いられる工場設備のコーティングにおいて有用である。例えば、本発明に従ってコートされることができる支持体は、容器（例えば食品貯蔵容器）、コンベヤー、刃、ミキサー、ローラーおよび台所用品（例えば切断および給仕器具）を含む。追加の支持体は、食品調製表面、柔軟な、および硬い包装ならびにドアハンドルを含む。
【００６５】
加えて、労働者により着用される防護服、例えばオーバーオール、手袋、マスクおよび帽子が、コートされることができるであろう。コートされることができる他の衣服は、肌着、靴下、競技用衣料品、外科用衣料品、ヘルスケア用衣料品、靴およびブーツを含む。
【００６６】
コーティングに適した他の支持体は、フィルター、例えば医療用フィルター（人工呼吸器用濾過媒体および流体濾過媒体を含む）、ならびにＨＶＡＣ濾過媒体、水濾過媒体および流体濾過媒体を含む他のフィルターを含む。
【００６７】
さらなる適切な支持体は、通貨、デビット／クレジットカード、産業廃棄物および水の取り扱い設備、石油化学製品および原油の生産、流通および貯蔵設備ならびにインフラストラクチャーを含む。追加の適切な支持体は、個人用保護設備および軍事装置、例えば顔面マスク、人工呼吸器、汚染除去用の服および手袋を含む。
【実施例】
【００６８】
全ての実験は、別途記載されない限り、超高純（ＵＨＰ）水（蒸留脱イオン水、１８．２ΩＭ／ｃｍ）を用いて、室温（２０±２℃）で実施された。
１．１  銅材料の合成および調製
１．１．１  塩化銅ストック溶液
ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏを、ＵＨＰ水中で溶解させて、４０ｍＭ（２５４２ｐｐｍ  Ｃｕ）の濃縮ストックを生成し、それをその後のアッセイにおいて用いた。
【００６９】
１．１．２  ＣｕＯナノ粒子
商業的なＣｕＯナノ粒子を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（５４４８６８）から得て、受け取ったまま使用し、本発明の抗細菌組成物との比較のために用いた。ストック懸濁液を、ナノ粉末をＵＨＰ水中で２０ｍＭ（１２７０ｐｐｍ  Ｃｕ）で分散させることにより調製した。
【００７０】
１．１．３  シリケート安定化水酸化銅ナノ粒子（ＣｕＳｉ  ＮＰ）
ＣｕＳｉナノ粒子を、比較目的のために、４００ｍＭケイ酸ナトリウム溶液を約ｐＨ１２において塩化銅溶液（４０ｍＭ  Ｃｕ）と１：１の体積比で混合することにより調製した。結果として得られた２０ｍＭ  Ｃｕおよび２００ｍＭ  Ｓｉを含有する懸濁液を、５Ｍ  ＮａＯＨにより１２±０．２にｐＨ調整し、２４時間攪拌下で維持した。この期間の後、水色の透明な溶液が形成されていた。
【００７１】
１．１．４  Ｃｕ−ＥＤＴＡ錯体
Ｃｕ−ＥＤＴＡ錯体を、ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏおよびエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）二水和物をＵＨＰ水中で溶解させることにより新しく調製した。ｐＨを、１Ｍ  ＮａＯＨにより７．５±０．２に調整した。様々なＣｕ：ＥＤＴＡ比を、銅の濃度を２０ｍＭ（約１２７０ｐｐｍ）で維持する一方でＥＤＴＡの濃度を２０、１００および２００ｍＭで変化させることにより達成し、そうしてそれぞれ１：１、１：５および１：１０のＣｕ−ＥＤＴＡ比を達成した。銅の溶解度は、元素位相分布を用いるＩＣＰ−ＯＥＳにより確証された（２．４．１参照）。
【００７２】
１．１．５  タルタレートアジペート修飾されたオキソ水酸化銅ナノ粒子（ＣｕＴａｒｔＡｄ  ＮＰ）
４０ｍＭ塩化銅、２０ｍＭアジピン酸および２０ｍＭ酒石酸を含む酸性溶液を調製した。この溶液のｐＨ（最初は酸性である）を、５Ｍ  ＮａＯＨの滴加によりｐＨ８．２±０．２まで上げた。最終的な懸濁液は、約４０ｍＭ（２５００ｐｐｍ）のＣｕを含有していた。
【００７３】
実施例１．１．５の通りに合成されたナノ粒子を、銅位相分布に関して特性付けた。合成プロセスの間、ｐＨが増大するにつれて、可溶性銅が粒子状オキソ水酸化銅へと変換された。ｐＨ５より上では、微粒子相は、ほとんどナノ粒子で構成されていた（総微粒子の８０％より大きい割合）。
【００７４】
１．２  ナノ粒子の特性付け
１．２．１  流体力学粒径分布
ナノ粒子の流体力学粒径分布を、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ＮａｎｏＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）上での動的光散乱法（ＤＬＳ）により決定した。典型的な実験において、０．５〜１ｍｌのナノ粒子懸濁液（２．１で調製されたもの）を小さい使い捨てのキュベット中に室温（２０±２℃）で移し、以下の設定を用いて３回の測定を実施した：
材料の屈折率  ０．１９２
吸収  ０．１
分散媒の屈折率  １．３３０
粘度  １．００３３１ｍＰａ．ｓ
１．２．２  ゼータ電位
ゼータ電位を、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ＮａｎｏＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）上で、レーザドップラー微小電気泳動法により、７８．５の誘電率および０．８９ｃＰの粘度を用いて分析した。約１２７０ｐｐｍ  Ｃｕにおけるナノ粒子分散物を、透明な使い捨てのゼータセル中に移して、測定を実施した。
【００７５】
１．２．３  透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）
２５００ｐｐｍ  Ｃｕを含有するＣｕＴａｒｔＡｄ  ＮＰの懸濁液を、ＴＥＭにより分析した。ＴＥＭグリッドを、ナノ粒子懸濁液をメタノール中で分散させて孔開（ｈｏｌｅｙ）炭素薄膜ＴＥＭグリッド（Ａｇａｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に滴下する（ｄｒｏｐ−ｃａｓｔｅｄ）ことにより調製した。画像を、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｘ−Ｍａｘ  ８０  ｍｍ２  ＳＤ検出器およびＡＺＴＥＣ分析ソフトウェアを備えたＣＭ２００  （Ｓ）ＴＥＭ上で得た。
【００７６】
１．２．４  Ｘ線回折（ＸＲＤ）分析
ＣｕＴａｒｔＡｄ  ＮＰを、４５℃で２４時間乾燥させ、手作業で製粉した後、従来のＸ線回折（ＸＲＤ）分析を行った。
【００７７】
１．３  細菌的研究
１．３．１  重金属ＭＯＰＳ（ＨＭＭ）培地、ｐＨ７．２±０．２．
ＨＭＭは、重金属を試験するために開発された銅無含有に定められた培地であり、ここで、細菌の成長に必要とされる全ての基本的栄養素を提供するためにグルコースおよびカサミノ酸（カゼインの酸加水分解物）を補われた。ＨＭＭは、それぞれの試薬の濃縮ストック溶液から調製され、７．２±０．２にｐＨ調整された（表１）。新しく調製された培地を、すぐに１２１℃で１５分間オートクレーブし、冷まし、４±２℃で保管した。オートクレーブされた培地は、調製から１ヵ月以内に使用した。
【００７８】
【表１】
0006775523.tif 000002
【００７９】
１．３．２  細菌増殖阻害アッセイ
抗微生物活性を、銅化合物の存在下での細菌増殖阻害の決定により評価した。比濁アッセイを用いて、細菌濃度を時間の経過にわたって追跡し、これは、これが液体培地における光学密度（５９５ｎｍにおけるＯＤ）に比例し、時間の経過にわたる細菌増殖の容易なスクリーニングを可能にするためであった。大腸菌ＮＣＴＣ１１１００およびスタフィロコッカス・アウレウスＲＮ４２２０が、このアッセイにおける試験された微生物であった。ストック細菌コロニーを、寒天プレートにおいて培養された状態で維持し、実験の前日に、１個のコロニーを１０ｍｌのＨＭＭ液体培地中に移し、インキュベーター中で３０℃において一定の振盪（８０ｒｐｍ）の下で増殖させた。アッセイの日に、細菌懸濁液のＯＤをプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＲＣ  ３５１，Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）上で５９５ｎｍにおいて測定し、ＨＭＭ中で希釈して０．０５〜０．１０のＯＤ（ＣＦＵ）を達成し、細菌の初期濃度がアッセイ全体を通して一定に保たれることを確実にした。銅ストック溶液（節２．１参照）を、ＨＭＭ中で系列希釈して、０．１ｍｌの体積中で０．８〜１００ｐｐｍ  Ｃｕの典型的な濃度を達成した。次に、０．１ｍｌの細菌培養物を添加し、銅と共に３０℃において一定の攪拌（８０ｒｐｍ）の下インキュベートした。アッセイにおける最終的な銅濃度は、０．４〜５０ｐｐｍの範囲であり、ＯＤを７〜８時間の典型的な期間の間１時間おきに測定して細菌増殖を追跡した。ＯＤのバックグラウンド、すなわち細菌により引き起こされたのではないＯＤ吸光度を決定して、銅およびブロスからの読み出しの干渉を除去した。増殖阻害を、以下のように計算した：
【００８０】
【化１】
0006775523.tif 000003
【００８１】
ＯＤ対照：培地（細菌なし）のＯＤを減算した後の、銅の非存在下でＨＭＭ中で培養された細菌のＯＤ。
ＯＤ銅：培地＋一致する濃度の銅（細菌なし）のＯＤを減算した後の、銅の存在下でＨＭＭ中で培養された細菌のＯＤ。
【００８２】
１．３．３  銅−細菌の会合
銅の大腸菌ＮＣＴＣ１１１００培養物との会合を、細菌濃度がアッセイ全体を通して一定のままであるように最初に細菌培養物を（２．３．２において記載されたように）ＨＭＭ中でｐＨ７．２±０．２において定常期に達するまで一夜増殖させることにより研究した。この濃度は、寒天プレート計数により９×１０８ＣＦＵ／ｍｌであると決定された。次に、塩化銅ストック溶液を細菌培養物中で３および１２．５ｐｐｍ  Ｃｕになるように希釈し、３０℃でインキュベートした。試料を０、２、４および８時間の時点で収集した。それぞれの時点において、それぞれの試料の１分割量を用いて総銅濃度を決定し、第２分割量をベンチトップＢｉｏｆｕｇｅ  Ｐｉｃｏ（Ｈｅｒａｅｕｓ）上で１６０００ｇで５分間遠心分離して細菌および会合した銅を沈降させた。上清中の遊離の銅を、（２．４．１におけるように）誘導結合プラズマ光学発光分光法により分析した。最後に、細菌に会合した銅を、下記のように決定した：
［Ｃｕ］細菌に会合＝総［Ｃｕ］−上清［Ｃｕ］
１．４  化学アッセイ
１．４．１  元素銅分析
誘導結合プラズマ光学発光分光法（ＩＣＰ−ＯＥＳ）を用いて、元素銅濃度を決定した。全ての試料を５％ＨＮＯ３（ｖ／ｖ）中で分析の少なくとも２４時間前に希釈し、銅材料を溶解させた。較正標準を、５％ＨＮＯ３中で０．１〜１００ｐｐｍの範囲でマトリックスマッチさせた。銅の検出のために用いられた線は、３２４．７５４ｎｍであった。
【００８３】
１．４．２  銅位相分布：可溶性、ナノ粒子状および微粒子状画分の決定
位相分布を、可溶性（＜１．４ｎｍ）、ナノ粒子状（＜１００ｎｍ）およびサブミクロン／微粒子状（＞１００ｎｍ）の銅を分離することにより決定した。３種類の試料を収集した：１）合計、銅濃度に関して適切に分析した；２）上清、１６０００ｇで５分間遠心分離した後、上清を分析した；および３）可溶性、３ＫＤａフィルターを通して濾過した。次いで、位相分布を以下のように計算した：
【００８４】
【化２】
0006775523.tif 000004
【００８５】
銅ベースのナノ粒子の溶解
銅ナノ粒子の溶解を、細菌増殖培地（ＨＭＭ）において研究した。銅材料を、ストック（節２．１参照）から１２．５、２５および５０ｐｐｍ銅に希釈し、分割量を０、２、４および８時間の時点で収集した。可溶性銅の画分を、節２．４．２において記載されているように位相分布の分析により決定した。
【００８６】
１．４．４  銅の分散性
ストック銅材料を、５０ｍＭ  ３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液中でｐＨ７．４±０．２において希釈した。最終的な銅濃度は、１０〜５００ｐｐｍで変動した。微粒子状の銅を、１６０００ｇで５分間の遠心分離により除去した。合計の銅および上清（すなわち分散している画分）を、節２．４．１において記載されたように誘導結合プラズマ光学発光分光法（ＩＣＰ−ＯＥＳ）により分析した。
【００８７】
１．４．５  ゲルマトリックスからの銅の放出−ゲル放出アッセイ
ＣｕＣｌ２およびＣｕＴａｒｔＡｄナノ粒子を、ｐＨ７〜８において、約２５００ｐｐｍを含有する元のストックをＵＨＰ水中で希釈して２５０ｐｐｍまで下げ、次にヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）を溶解させて２％（ｗ／ｖ）の濃度を達成することにより、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）マトリックス中に組み込んだ。その混合物を、ロータリーシェーカー中で穏やかな攪拌の下で均質なゲルが形成されるまで維持した。１０ｇのゲルを５０ｍｌのｆａｌｃｏｎチューブ中に注ぎ、一夜落ち着かせた（ｓｅｔｔｌｅ  ｄｏｗｎ）。１０ｍｌのｐＨ７±０．２の５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３溶液を注意深くゲルの表面上に移した。試料を２４時間かけて収集し、上部の溶液中の銅濃度をＩＣＰ−ＯＥＳ（節２．４．１参照）により決定した。
【００８８】
２．殺生物性銅イオンに関する送達剤としての銅ベースのナノ粒子
ナノ粒子材料の抗微生物活性を試験するための比濁アッセイが、開発され、ここで、大腸菌濃度が、液体媒体中の光学密度測定により追跡され、それは、銅位相分布のインサイチュでの特性付けを可能にした。細菌を広い範囲の銅濃度の存在下でインキュベートし、塩化銅を、可溶性銅を提供するための参照殺生物性材料として用いた（図１参照）。この研究の次の段階は、適切なナノ粒子材料の選択を必要とした。最初に、約５０ｎｍの示されたサイズを有する商業的なＣｕＯナノ粒子を研究した；しかし、水中で分散させた際、これらのナノ粒子は、大きいミクロンサイズの凝集体を形成した（図２Ａ）。それらの分散性の予想外の欠如は、わずか−７．１±０．５ｍＶのゼータ電位ピークにより証明されるような弱い表面反発により説明された。
【００８９】
従って、本物のナノ粒子剤、すなわちアッセイにおける送達に適した濃度での安定なコロイドの役目を果たすための代替の銅ベースのナノ粒子が、開発された。粒子の毒性が銅のみにより駆動されるであろうように、シリケートが、その抗微生物活性の欠如を考慮して安定化剤として選択された。結果として得られた参照シリケート安定化水酸化銅ナノ粒子（ＣｕＳｉ  ＮＰ）は、そうして共沈により合成され、ここで、塩化銅溶液は、約ｐＨ１２のアルカリ性ケイ酸ナトリウム溶液と混合された。最初に、Ｃｕ２＋イオンが、Ｃｕ（ＯＨ）２として沈殿し、ミクロンサイズの凝集体を形成するが、これらは時間の経過に伴い分散して８．５±０．３ｎｍの流体力学直径ピークを有する小さいナノ粒子を形成した（図２Ｄ）。この分散のプロセスは、負に荷電したシリケートイオンの水酸化銅凝集体への吸着により駆動されていると予想された。加えて、シリケート対銅の高い比率（１０：１）は、ゼータ電位測定により確証されたような効率的な負電荷の反発を確実にし、それは、ナノ粒子が凝塊形成に抵抗するために十分に負に荷電している（−３１±９ｍＶ）ことを示した（図２Ｂ）。
【００９０】
次に、これらの２つの異なるタイプのナノ粒子であるＣｕＯおよびＣｕＳｉの抗微生物活性を、ある範囲の銅濃度（０．８〜５０ｐｐｍ  Ｃｕ）にわたって、大腸菌に対して、可溶性銅対照（ＣｕＣｌ２）と比較した。ナノ粒子は、可溶性銅よりも有効性が低いことが分かり、それは、特に５０ｐｐｍ  Ｃｕの曝露レベルにおいて十分に説明されている（図３）。ここで、ＣｕＳｉＮＰに対する曝露の際の増殖阻害は、より遅い時点においてより顕著であり、これは、ＣｕＳｉ  ＮＰの細菌に対する徐々の、かつ遅延した作用を暗示している。驚くべきことに、観察された凝塊形成にもかかわらず、ＣｕＯナノ粒子は、６時間の時点でＣｕＳｉ  ＮＰと同等の増殖阻害を示した。しかし、時間の経過に伴う阻害における増大は、ＣｕＳｉ  ＮＰほどは顕著ではなかった。ナノ粒子の類似の殺生物速度論、すなわち両方が徐々の、かつ遅延した増殖阻害を示したことは、可溶性銅とは異なる共通のナノ粒子の作用方式、例えば細菌の膜への吸着を暗示している可能性がある。しかし、そのような機序は、ナノ粒子間の物理化学的特性（例えば大きさ、電荷および組成）におけるばらつきにより与えられたものではなさそうに思われる。例えば、異なる表面電荷を有するナノ粒子は、細菌の膜に関する異なる親和性、そして結果的に異なる抗微生物活性を示すことが予想されると考えられ、それはここでは観察されなかった。よりもっともらしくは、ナノ粒子からの銅イオンの放出に基づく溶解に媒介される機序は、塩化銅と比較して遅延した毒性を説明すると考えられ、両方の材料のそれぞれの溶解プロフィールにより支持される。銅イオンの放出は、増殖阻害に一致し、ここで、ＣｕＯ  ＮＰのより速い溶解は、結果としてより早い時点（２〜４時間）におけるより大きい抗微生物有効性をもたらした。４時間後、ナノ粒子の両方から放出された可溶性銅の百分率は、同等であり（銅全体の約４０％）、それは、類似の細菌増殖阻害（約８０％）に換算された。２タイプのナノ粒子の溶解プロフィールにおける類似性は、より小さいＣｕＳｉ  ＮＰはそれらのより高い表面積対体積比のためにより速く溶解することが予想されたため、驚くべきことであったが、ナノ粒子の構造中の不溶性シリケートの存在が溶解を遅らせていた可能性がある。決定的に、溶解および細菌増殖阻害の間の関係は、殺生物活性が両方のタイプのナノ粒子に関して可溶性銅により駆動されていることを暗示した。
【００９１】
‘溶解’理論をさらに解明するため、大腸菌増殖阻害が、細菌培養培地中の可溶性（＜１．１ｎｍ）ならびにナノ粒子状（１〜１００ｎｍ）銅画分に関して比較された。用量反応が、ＣｕＯ材料に関して観察され、ここで、銅の増大するレベル（１２．５、２５および５０ｐｐｍ）は、増殖阻害における増大をもたらした（図４）。しかし、凝塊形成は、結果として非常に低濃度（＜３ｐｐｍ）のナノ粒子状の銅をもたらし、従って、増殖阻害における増大は、この画分に帰せられることはできず、むしろ可溶性銅における増大に帰せられることができるであろう。ＣｕＳｉ  ＮＰは、商業的なＣｕＯ  ＮＰとは異なる様式で挙動した：ここで、材料のより大きい量は、結果として増大したナノ粒子状の銅の濃度（３、１０および３８ｐｐｍ）をもたらしたが、可溶性銅のレベルは比較的変化させなかった（１０〜１５ｐｐｍ）。しかし、ナノ粒子状の銅におけるそのような増大は、結果として追加の殺生物作用をもたらさず、代わりに、増殖阻害は、可溶性銅の比較的静止したレベルと一致していた。
【００９２】
殺生物活性の可溶性銅への依存は、最適な抗細菌有効性は、増殖阻害アッセイのために用いられた媒体中で容易に可溶性銅イオンを送達した（図４）銅塩類により達成されるであろうことを、示唆している。しかし、臨床適用、例えば創傷治癒（切り傷および擦過傷の処置を含む）における抗微生物剤としての銅の使用は、細菌の殺傷において有効である量の銅の送達を可能にするために、抗微生物アッセイにおいて試験された濃度（＜５０ｐｐｍ）よりもはるかに大きい濃度での配合物を必要とする。加えて、これらの配合物は、既に創傷により脆弱である皮膚への極度のｐＨのさらなる有害な作用を回避するために、生理的ｐＨ（ｐＨ６〜８）において送達されるべきである。従って、創傷治癒のための配合物中の銅イオンの適切性が、生物学的利用能の指標としてｐＨ７．４±０．２のＭＯＰＳ緩衝液中でのそれらの分散性（すなわち沈殿しないこと）を定量化することにより調べられた。ほとんどの銅は、大きい遠心分離可能な凝集体として沈殿し、５００ｐｐｍもの高濃度での銅の添加にもかかわらず、分散性画分を最大で約１０ｐｐｍ  Ｃｕまで低減した。
【００９３】
従って、銅塩類は、それらは生物学的に利用可能な銅を制限する沈殿に対して安定ではないため、配合物における限られた使用を有する。
生理的ｐＨにおける銅塩類の望ましくない沈殿は、大きい（遠心分離可能な）水酸化銅凝集体の形成を通して起こり、それは、錯体形成剤（例えばＥＤＴＡ）の使用により予防され得る。例えば、増殖阻害アッセイにおいて、銅は、培地中に存在する錯体形成剤、おそらくアミノ酸により、細菌培地中で可溶性状態で維持された。この戦略の実行可能性は、様々なＣｕ：ＥＤＴＡ比で用いられ、結果として得られた溶液が、細菌アッセイにおいて試験された（図６Ａ）。溶液中の銅の維持にもかかわらず、Ｃｕ−ＥＤＴＡ錯体は、控えめな増殖阻害を示した（＜４０％；図６Ｂ）。興味深いことに、ＥＤＴＡ単独でも抗細菌作用を有し、それは、ほぼ間違いなく錯体の作用のほとんどの原因であり得る。これらの観察は、銅イオンの放出は抗細菌目的に関して本質的である一方で、可溶性銅の形態も重要であり、強い錯体形成剤、例えばＥＤＴＡの存在下にある場合、そのような強いキレート剤は銅に関して細菌と競合し、結果として低減した毒性をもたらすため、遊離銅イオンの利用可能性は低減している、ということを示した。
【００９４】
銅塩類との比較での銅ベースのナノ粒子に関して観察された遅延した増殖阻害（図３）にもかかわらず、ナノ粒子は、銅錯体よりも大きい抗微生物活性を示し、これは、遊離銅イオンを送達するより大きい能力を暗示している。従って、臨床配合物に関するそれらの適切性も、塩化銅に関して記載された条件と同じ条件において試験された。
【００９５】
要約すると、この研究の初期の主体（ｉｎｉｔｉａｌ  ｂｏｄｙ）は、銅ベースのナノ粒子は、細菌に対する直接的な作用をほとんどまたは全く有さず、それらの殺生物活性は、銅の主な殺生物形態である銅イオンの放出により誘発されることを、実証した。遊離銅イオンの放出には適さない銅塩類および銅錯体とは異なり、ナノ粒子は、そのような種に関する送達系としての大きな可能性を有し、臨床適用における配合に関して適切な濃度で分散したままであることができる。しかし、この研究において試験されたＣｕＯおよびＣｕＳｉナノ粒子は、放出される銅の速度が低いことが分かったため、最適ではない。
【００９６】
３．銅イオンの送達のための新規の有効な銅ベースのナノ粒子
３．１  導入
銅ベースのナノ粒子の最大抗微生物有効性は、銅イオンの急速な放出により達成されることができるため、我々は、そのような不安定な（ｌａｂｉｌｅ）材料を、不安定な（ｕｎｓｔａｂｌｅ）鉱物相の形成を促進する合成方法論によりそれらの鉱物構造を改変することにより製造することを試みた。
【００９７】
３．２  配位子修飾されたオキソ水酸化銅ナノ粒子
オキソ水酸化銅鉱物を、水酸化ナトリウムの滴加による塩化銅溶液のｐＨに駆動される沈殿により調製し、それは、銅イオンのオキソ水酸化銅への変換を押し進めた。これは、カルボキシレート配位子、すなわち酒石酸およびアジピン酸の存在下で実施され、それは、配位子の組み込みおよび鉱物の成長前面の表面キャッピングの結果としてナノスケールで鉱物の成長を制御して、２〜５ｎｍのコア構造を有する小さく安定なナノ粒子を製造した（図７）。酒石酸は、おそらくその陰性のカルボキシレート基（その第２ｐＫａであるｐＨ４．４より上で脱プロトン化する）による静電反発により溶液中でのナノ粒子の安定化において重要な役割を果たした。ゼータ電位は、ナノ粒子が、強い粒子反発（｜ゼータ電位｜＞３０ｍＶ）により粒子の凝集を防ぐために十分に負に荷電しており（−３９ｍＶにおけるピーク）、従って非常に安定な懸濁液が形成されることを示した。ＸＲＤ分析は、非晶質の鉱物相を示し、それは、鉱物構造中の酒石酸の組み込みによるようである。対照的に、本発明者らは、銅に関する低い親和性を有する弱い配位子であるアジピン酸は、主に合成の間にｐＨを制御するその緩衝能力のために用いられたと信じている。ＣｕＴａｒｔＡｄ  ＮＰは、おそらく酒石酸による鉱物格子の表面混乱のため、非晶質の鉱物相も示した。非晶質性は、非晶質の鉱物相を有する材料は結晶質の鉱物相を有する材料よりも不安定であるため、不安定性に影響を及ぼし得る。
【００９８】
ＣｕＴａｒｔＡｄナノ粒子の合成の後、抗微生物アッセイにおいて通常用いられる濃度である１２．５、２５および５０ｐｐｍ  Ｃｕまで希釈した際のそれらの溶解プロフィールを、細菌増殖培地において決定した。ナノ粒子は、培地中での希釈後すぐに溶解し（図８）、このアッセイにおいて試験された期間である少なくとも８時間の間溶解状態のままであった。前にＣｕＳｉ  ＮＰに関して観察されたように、ＣｕＴａｒｔＡｄ  ＮＰは、高い銅濃度において分散状態で安定であった（図１０Ｂ）が、ＣｕＳｉ  ＮＰとは異なり、極度に不安定であり、これは、細菌増殖培地中での銅の急速な放出を実証している。
【００９９】
不安定性を確証した後、ＣｕＴａｒｔＡｄ  ＮＰの抗微生物有効性試験を行った。２つの標準的な細菌モデルを、それぞれグラム陰性およびグラム陽性菌である大腸菌およびＳ．アウレウス両方に対する活性を測定するために用いた。ＣｕＴａｒｔＡｄ  ＮＰは、両方の株に対して有効であることが分かり、５０ｐｐｍ  ＣｕのインキュベーションにおいてＳ．アウレウスの増殖を８０％より大きく阻害し、一方で大腸菌の増殖を完全に阻害した（図９Ａ）。これは、同じ濃度において大腸菌の増殖を完全に阻害することができなかったＣｕＳｉ  ＮＰ（図３）と比較した向上を表していた。これらの結果は、抗微生物作用に関する可溶性銅イオンの重要性を補強した；両方のナノ粒子（ＣｕＳｉ  ＮＰおよびＣｕＴａｒｔＡｄ  ＮＰ）は、類似の物理化学的特性（例えば小さい大きさおよび負電荷）を示したが、異なる溶解速度および対応する抗細菌活性における違いを示した。さらに、ＣｕＴａｒｔＡｄ  ＮＰは、可溶性銅と等しい有効性を示し、殺生物性の銅の送達に関するそれらの適切性を実証した。本発明の配位子修飾されたオキソ水酸化銅ナノ粒子は、Ｐ．エルジノーサおよびＳ．アウレウスの病原性モデルを含む広い範囲の微生物に対して殺菌作用を有する（表３）。
【０１００】
【表２】
0006775523.tif 000005
【０１０１】
グラム陰性およびグラム陽性種にわたる広いスペクトルの抗微生物有効性は、数多くの臨床適用に関して、特に、創傷を負った皮膚が曝露される病原体の多様性および数ならびに感染の治癒に対する有害な影響のため、創傷感染症と戦うために有利である。従って、ＣｕＴａｒｔＡｄ  ＮＰの殺生物有効性が実証されたので、局所送達に関するそれらの適切性が、試験された。創傷治癒のための典型的な配合物は、有効物質が含浸され、次いで水分への曝露の際に放出される、包帯またはクリームを含む。ここで、原理証明として、ナノ粒子を、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）マトリックス中に組み込んだ。ＨＥＣは、ヘルスケア製品および化粧品において広く用いられてきたセルロース誘導体であり、包帯または他のマトリックス（例えばポリエチレングリコール）とは異なり、ＨＥＣは、マトリックス調製の間にナノ粒子のそれ以上の処理（例えば加熱および乾燥）を一切必要とせず、それらの物理化学的特性に対する変化は最小限である。従って、ＣｕＴａｒｔＡｄ  ＮＰの組み込みは、単にコロイドを所望の濃度に希釈し、ＨＥＣをその懸濁液中に溶解させ、それが結果としてナノ粒子を埋め込んだ均質なゲルの形成をもたらすことにより、達成された。
【０１０２】
重要なことだが、銅は、このゲルから放出され：２４時間にわたって、ＣｕＴａｒｔＡｄ  ＮＰを２５０ｐｐｍで含浸させたＨＥＣマトリックスは、６４±８ｐｐｍ（細菌増殖を阻害するために十分な濃度より大きい濃度）を放出することが分かった。対照的に、２５０ｐｐｍ塩化Ｃｕを配合されたゲルは、同じ期間にわたって１０ｐｐｍより多くのＣｕを放出することができなかった。これは、生理的ｐＨにおける送達剤としての銅塩類の不適切性を確証した。従って、ＣｕＴａｒｔＡｄナノ粒子は、本明細書において、それらが容易に殺生物性銅イオンを放出し、それが結果として高い抗微生物活性をもたらし、局所送達に適していたため、創傷感染症と戦うための適切な特性を有することが示された。
【０１０３】
４．合成実施例
４．１  ＣｕＳＯ４から調製されたＣｕＯＨ  ４０  Ｔａｒｔ２０  Ａｄ２０ナノ粒子
ナノ粒子は、実施例１．１．５の通りに合成されたが、ＣｕＳＯ４がＣｕＣｌ２の代わりに用いられた。この実施例の通りにＣｕＳＯ４から合成されたナノ粒子が、銅位相分布に関して特性付けられた。合成プロセスの間、可溶性銅は、ｐＨが増大するにつれて粒子状オキソ水酸化銅に変換された。ｐＨ７までに、粒子相は、大部分（銅全体のおおよそ８０％）がナノ粒子で構成されていた。流体力学粒径が、実施例１．１．５の通りに合成されたタルタレート−アジペート修飾されたオキソ水酸化銅ナノ粒子の合成プロセスの間に、動的光散乱法により決定された。増大した分散性に加えて、ｐＨの増大は、結果として低減した粒径をもたらした。例えば、ｐＨ６．５において回収されたナノ粒子は、より高いｐＨにおいて回収された粒子（例えばｐＨ８において４．６±０．５ｎｍ）よりも大きい粒径（７３±１０ｎｍ）を示す。ｐＨ８において回収された際、これらは、１．５〜２０ｎｍの流体力学直径を有しており、平均直径は３〜５ｎｍであった。
【０１０４】
４．２  ＣｕＮＯ３から調製されたＣｕＯＨ  ４０  Ｔａｒｔ２０  Ａｄ２０ナノ粒子
ナノ粒子は、実施例１．１．５の通りに合成されたが、ＣｕＮＯ３がＣｕＣｌ２の代わりに用いられた。この実施例の通りにＣｕＮＯ３から合成されたナノ粒子が、動的光散乱法により特性付けられた。ｐＨ８において回収された際、これらは、２〜１０ｎｍの流体力学直径を有しており、平均直径は３〜５ｎｍであった。
【０１０５】
４．３  ＣｕＯＨ４０  グルコン酸  ６０
ナノ粒子は、実施例１．１．５の通りに合成されたが、グルコン酸（６０ｍＭ）が、酒石酸およびアジピン酸の代わりに用いられた。この実施例の通りにグルコン酸を用いて合成されたナノ粒子が、銅位相分布に関して特性付けられた。合成プロセスの間、可溶性銅は、ｐＨが増大するにつれて粒子状オキソ水酸化銅に変換された。ｐＨ６までに、粒子相は、大部分（銅全体の８０％より大きい割合）がナノ粒子で構成されていた。この実施例の通りにグルコン酸を用いて合成されたナノ粒子が、動的光散乱法により特性付けられた。ｐＨ８において回収された際、これらは、１〜１０ｎｍの流体力学直径を有しており、平均直径は２〜４ｎｍであった。
【０１０６】
４．４  ＣｕＯＨ  ２０  グルタチオン  ２０
ナノ粒子は、実施例１．１．５の通りに合成されたが、グルタチオン（２０ｍＭ）が、酒石酸およびアジピン酸の代わりに用いられた。ＣｕＣｌ２の初期濃度も、２０ｍＭに半減していた。この実施例の通りにグルタチオンを用いて合成されたナノ粒子が、銅位相分布に関して特性付けられた。合成プロセスの間、可溶性銅は、ｐＨが増大するにつれて粒子状オキソ水酸化銅に変換された。ｐＨ３〜４において、粒子相は、大部分（銅全体のおおよそ７０％）が大きい凝集体で構成されていた。ｐＨ６までに、これらのミクロンサイズの粒子は、分散し、粒子状の銅は、大部分（銅全体の８０％より大きい割合）がナノ粒子で構成された状態になった。実施例Ｎ４の通りにグルタチオンを用いて合成されたナノ粒子が、動的光散乱法により特性付けられた。ｐＨ８において回収された際、これらは、１〜５ｎｍの流体力学直径を有しており、平均直径はおおよそ２ｎｍであった。
【０１０７】
４．５  Ｎａ２ＣＯ３を用いて調製されたＣｕＯＨ  ４０  Ｔａｒｔ  ２０  Ａｄ２０ナノ粒子
ナノ粒子は、実施例１．１．５の通りに合成されたが、Ｎａ２ＣＯ３が、ＮａＯＨの代わりに用いられた。この実施例の通りにＮａ２ＣＯ３を滴定剤として用いて合成されたナノ粒子が、銅位相分布に関して特性付けられた。合成プロセスの間、可溶性銅は、ｐＨが増大するにつれて粒子状オキソ水酸化銅に変換された。ｐＨ７までに、粒子相は、大部分（銅全体の９０％より大きい割合）がナノ粒子で構成されていた。（実施例Ｎ５の通りに）Ｎａ２ＣＯ３を滴定剤として用いて合成されたナノ粒子が、動的光散乱法により特性付けられた。ｐＨ８において回収された際、これらは、１〜８ｎｍの流体力学直径を有しており、平均直径は２〜４ｎｍであった。
【０１０８】
４．６  未修飾ＣｕＯＨ  ４０（比較例）
実施例１．１．５において記載されたものと同じ合成方法論に従ったが、酒石酸およびアジピン酸の非存在下であった。未修飾の水酸化銅の合成プロセスの間、ほとんどの可溶性銅は、ｐＨ４．３〜５．２で微粒子に変換された。このｐＨより上では、粒子相は、完全に大きいミクロンサイズの粒子で構成されていた（銅全体の９５％より大きい割合）。結果として得られた材料のＸＲＤスペクトルも得られた（図１１）。後者は、化学式Ｃｕ２（ＯＨ）３Ｃｌの水酸化銅であるパラ緑塩銅鉱に対応する結晶パターンを示し、ここで、塩素原子は、鉱物構造中に組み込まれていた（下）。
【０１０９】
４．７  ＣｕＯＨ  ４０  Ｔａｒｔ  ２０ナノ粒子
タルタレート修飾オキソ水酸化銅ナノ粒子が、実施例１．１．５の通りに合成されたが、アジピン酸の非存在下であった。この実施例の通りにアジピン酸の非存在下で合成されたナノ粒子が、動的光散乱法により特性付けられた。ｐＨ８において回収された際、これらは、２〜１０ｎｍの流体力学直径を有しており、平均直径は３〜５ｎｍであった。
【０１１０】
４．８  ＣｕＯＨ  ２０００  Ｔａｒｔ  １０００ナノ粒子
タルタレート修飾オキソ水酸化銅ナノ粒子が、実施例４．７の通りに合成されたが、より高い濃度（２．０Ｍ銅および１．０Ｍ酒石酸）で合成された。結果として得られた材料は、粘性のスラリーであった。
【０１１１】
４．９  ＣｕＯＨ  ２０００  Ｔａｒｔ  １０００ナノ粒子の再懸濁
Ｎ９において記載されたように調製されたスラリーが、２０ｍＭアジピン酸溶液中で約５０ｍＭ  Ｃｕに希釈され、ｐＨがＮａＯＨにより８に調整された。この実施例の通りに濃縮されたスラリーから合成されたナノ粒子が、動的光散乱法により特性付けられた。ｐＨ８において回収された際、これらは、２〜１０ｎｍの流体力学直径を有しており、平均直径は３〜５ｎｍであった。
【０１１２】
４．１０  未結合の配位子の除去
遊離の配位子および塩類を、エタノール沈殿のプロセスにより除去し、ここで、（実施例１．１．５の通りに合成された）ＣｕＴａｒｔＡｄ  ＮＰの懸濁液を、１：２  ナノ粒子懸濁液：エタノールの体積比でエタノールと混合した。次に、凝塊形成したナノ粒子を１５００ｒｐｍで５分間遠心沈殿させ、上清（遊離の配位子および塩類を含有する）を廃棄した。ナノ粒子を含有するペレットを再懸濁して元の体積にした。
【０１１３】
５．  活性アッセイ
５．１  ＣｕＯＨ  ４０  Ｔａｒｔ２０  Ａｄ２０ナノ粒子の皮膚線維芽細胞への曝露
ヒト皮膚線維芽細胞（細胞株ＣＣＤ−２５ＳＫ）を、５％熱非働化ウシ胎児血清、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、１％ファンギゾンおよび３．８％ウシ血清アルブミンを補った最小必須培地（Ｌ−グルタミンおよびアール塩類を含有）中でＣｕＴａｒｔＡｄ  ＮＰ（０〜２００ｐｐｍ  Ｃｕ）と共に３７℃において加湿した５％  ＣＯ２雰囲気下で４８時間培養した。ＣｕＣｌ２およびＡｇＮＯ３も、陽性対照として並行して試験した。細胞コンフルエンスの百分率を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｚｏｏｍを用いて実験的に決定し、時間の経過にわたってプロットし、試験されたそれぞれの濃度に関する曲線下面積（ＡＵＣ）を決定した。細胞の増殖を、細胞毒性に関する指標として用いて、それは、試験化合物に曝露された細胞のＡＵＣを正常な速度で増殖している細胞（対照）のＡＵＣに対して正規化することにより決定された。
【０１１４】
皮膚線維芽細胞を、ＣｕＣｌ２、ＡｇＮＯ３、または（実施例１．１．５の通りに合成された）配位子修飾された銅ナノ粒子に４８時間曝露した。図１２において示されているように、ＣｕＣｌ２およびＡｇＮＯ３は、銅ナノ粒子（１００ｍｇ／Ｌから）よりも低い濃度（それぞれ５０ｍｇ／Ｌおよび１０ｍｇ／Ｌから）で細胞増殖における低下を引き起こした。低減した毒性に加えて、オキソ水酸化銅ナノ粒子は、低濃度（１０および２５ｍｇ／Ｌ  Ｃｕ）において細胞成長を促進し（細胞増殖を増大させ）、これは、創傷治癒への有益な作用を示している。
【０１１５】
本明細書で引用された、または本出願と共に提出された全ての刊行物、特許および特許出願は、情報開示陳述書の一部として提出された参考文献を含め、参照によりそのまま援用される。
非限定的に、本発明は以下の態様を含む。
［態様１］  配位子修飾されたオキソ水酸化銅ナノ粒子を含む抗細菌組成物であって、該オキソ水酸化銅ナノ粒子が、該１以上の配位子が非化学量論的に該オキソまたはヒドロキシ基を置換している構造を有し、該１以上の配位子が、カルボン酸配位子またはそのイオン化形態を含む、オキソ水酸化銅ナノ粒子を含む抗細菌組成物。
［態様２］  態様１に記載のオキソ水酸化銅ナノ粒子を含む抗細菌組成物であって、該材料が、ポリマー性構造を有し、ここで該配位子は、該オキソ水酸化銅の固相構造内に分布している、オキソ水酸化銅ナノ粒子を含む抗細菌組成物。
［態様３］  態様１または態様２に記載のオキソ水酸化銅ナノ粒子を含む抗細菌組成物であって、該配位子修飾されたオキソ水酸化銅ナノ粒子が、１以上の再現性のある物理化学的特性を有する、オキソ水酸化銅ナノ粒子を含む抗細菌組成物。
［態様４］  先行する態様のいずれか１項に記載のオキソ水酸化銅ナノ粒子を含む抗細菌組成物であって、該１以上の再現性のある物理化学的特性が、溶解プロフィール、該組成物中に存在する銅の合計の百分率としての可溶性銅の放出および／または増殖阻害アッセイにおいて決定されるような抗細菌活性から選択される、オキソ水酸化銅ナノ粒子を含む抗細菌組成物。
［態様５］  先行する態様のいずれか１項に記載のオキソ水酸化銅ナノ粒子を含む抗細菌組成物であって、該カルボン酸配位子が、線状または環状のモノまたはジカルボン酸配位子である、オキソ水酸化銅ナノ粒子を含む抗細菌組成物。
［態様６］  先行する態様のいずれか１項に記載のオキソ水酸化銅ナノ粒子を含む抗細菌組成物であって、該カルボン酸配位子またはそのイオン化形態が、酒石酸もしくはタルタレート、グルコン酸もしくはグルコネート、アジピン酸もしくはアジペート、コハク酸もしくはスクシネート、リンゴ酸もしくはマレエート、グルタル酸もしくはグルタレート、ピメリン酸もしくはピメレート、および／もしくはグルタチオンであり、または該カルボン酸配位子が、アミノ酸もしくは糖酸である、オキソ水酸化銅ナノ粒子を含む抗細菌組成物。
［態様７］  先行する態様のいずれか１項に記載のオキソ水酸化銅ナノ粒子を含む抗細菌組成物であって、該カルボン酸配位子またはそのイオン化形態が、酒石酸もしくはタルタレートまたはグルコン酸もしくはグルコネートまたはグルタチオンである、オキソ水酸化銅ナノ粒子を含む抗細菌組成物。
［態様８］  先行する態様のいずれか１項に記載のオキソ水酸化銅ナノ粒子を含む抗細菌組成物であって、該カルボン酸配位子またはそのイオン化形態が、アジピン酸もしくはアジペートとの組み合わせでの酒石酸もしくはタルタレートである、オキソ水酸化銅ナノ粒子を含む抗細菌組成物。
［態様９］  先行する態様のいずれか１項に記載のオキソ水酸化銅ナノ粒子を含む抗細菌組成物であって、ここで：
（ａ）該組成物中のナノ粒子が、赤外分光法を用いて決定される実証可能なＭ−Ｌ結合を有し；かつ／または
（ｂ）該組成物中のナノ粒子が、ＸＲＤにより決定された際に実質的に非晶質である、オキソ水酸化銅ナノ粒子を含む抗細菌組成物。
［態様１０］  先行する態様のいずれか１項に記載のオキソ水酸化銅ナノ粒子を含む抗細菌組成物であって、該ナノ粒子が、１ｎｍ〜１００ｎｍの平均直径を有し、場合により、該ナノ粒子が、１ｎｍ〜１０ｎｍの平均直径を有する、オキソ水酸化銅ナノ粒子を含む抗細菌組成物。
［態様１１］  先行する態様のいずれか１項に記載のオキソ水酸化銅ナノ粒子を含む抗細菌組成物であって、該組成物が、６．０〜８．０のｐＨで配合される、オキソ水酸化銅ナノ粒子を含む抗細菌組成物。
［態様１２］  先行する態様のいずれか１項に記載のオキソ水酸化銅ナノ粒子を含む抗細菌組成物であって、該組成物が、さらに該ナノ粒子が配合されているマトリックスを含む、オキソ水酸化銅ナノ粒子を含む抗細菌組成物。
［態様１３］  態様１２に記載のオキソ水酸化銅ナノ粒子を含む抗細菌組成物であって、該マトリックスが、ヒドロキシエチルセルロースまたはＰＥＧを含む、オキソ水酸化銅ナノ粒子を含む抗細菌組成物。
［態様１４］  創傷の処置のための方法における使用のための、先行する態様のいずれか１項に記載のオキソ水酸化銅ナノ粒子を含む抗細菌組成物。
［態様１５］  微生物感染症の処置または予防のための方法における使用のための、先行する態様のいずれか１項に記載のオキソ水酸化銅ナノ粒子を含む抗細菌組成物。
［態様１６］  該微生物感染が、細菌感染症または真菌感染症である、態様１５に記載のオキソ水酸化銅ナノ粒子を含む抗細菌組成物。
［態様１７］  態様１４〜１６のいずれか１項に記載のオキソ水酸化銅ナノ粒子を含む抗細菌組成物であって、該組成物が、ヒトまたは動物の対象を処置するためのものである、オキソ水酸化銅ナノ粒子を含む抗細菌組成物。
［態様１８］  態様１５〜１７のいずれか１項に記載のオキソ水酸化銅ナノ粒子を含む抗細菌組成物であって、該感染症が、グラム陰性またはグラム陽性細菌により引き起こされる、オキソ水酸化銅ナノ粒子を含む抗細菌組成物。
［態様１９］  態様１５〜１８のいずれか１項に記載のオキソ水酸化銅ナノ粒子を含む抗細菌組成物であって、該細菌感染が、エスケリキア属の種、例えば大腸菌、スタフィロコッカス属の種、例えばＳ．エピデルミス、Ｓ．アウレウスもしくはメチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（“ＭＲＳＡ”）、バシラス属の種、例えばＢ．サブチリス、シュードモナス属の種、例えばＰ．エルジノーサ、ビブリオ属の種、例えばＶ．フィシェリ、ストレプトコッカス属の種、例えばＳ．ピオゲネスおよびＳ．ニューモニエ、クレブシエラ属の種、マイクロコッカス属の種、例えばＭ．ルテウス、クロストリジウム属の種、例えばＣ．ディフィシル、アシネトバクター属の種、例えばＡ．バウマニ、マイコバクテリウム属の種、例えばＭ．ツベルクローシスまたはサルモネラ属の種、クラミジア属の種、または真菌種、例えばカンジダ属の種、例えばＣ．アルビカンスにより引き起こされる、オキソ水酸化銅ナノ粒子を含む抗細菌組成物。
［態様２０］  態様１〜１３のいずれか１項に記載のオキソ水酸化銅ナノ粒子を含む抗細菌組成物であって、該組成物が、獣医学的投与のためのものである、オキソ水酸化銅ナノ粒子を含む抗細菌組成物。
［態様２１］  態様１〜１３のいずれか１項に記載の配位子修飾されたオキソ水酸化銅ナノ粒子を含む抗細菌組成物および薬学的に許容可能なキャリヤーを含む医薬組成物。
［態様２２］  態様２１に記載の医薬組成物であって、該組成物が、局所送達、腟送達、経鼻送達、直腸送達または経口送達のためのものである、医薬組成物。
［態様２３］  態様１〜１３のいずれか１項に記載の抗細菌組成物でコートまたは処理された物品。
［態様２４］  態様２３に記載の物品であって、該物品が、埋め込み式の医学的デバイスまたはコートされた支持体、例えば不織布支持体である物品。
［態様２５］  態様１〜１３のいずれか１項に記載のオキソ水酸化銅ナノ粒子組成物の、微生物感染の処置または予防のための医薬品の調製のための使用。
［態様２６］  微生物感染症を処置または予防する方法であって、該方法が、処置を必要とする患者に療法上有効量の態様１〜１３のいずれか１項に記載のオキソ水酸化銅ナノ粒子組成物を投与することを含む方法。
［態様２７］  態様１〜１３のいずれか１項に記載の処置の方法における使用のための組成物、使用または方法であって、該組成物が、局所投与のために配合される、組成物、使用または方法。
［態様２８］  態様１〜１３のいずれか１項に記載のオキソ水酸化銅ナノ粒子組成物を製造するためのプロセスであって、該プロセスが、以下の工程：
（ａ）Ｃｕ２＋およびカルボン酸配位子、ならびに場合により１種類以上のさらなる配位子または反応構成要素を該構成要素が可溶性である第１ｐＨ（Ａ）の反応媒体中に含む溶液を混合し；
（ｂ）ｐＨ（Ａ）を第２ｐＨ（Ｂ）に変更して該オキソ水酸化銅ナノ粒子組成物の固体沈殿またはコロイドを形成させ；
（ｃ）工程（ｂ）において生成されたオキソ水酸化銅ナノ粒子組成物を分離し、場合により乾燥させ、および／または配合する；
を含むプロセス。
［態様２９］  配位子修飾されたオキソ水酸化銅ナノ粒子を含む組成物であって、該オキソ水酸化銅ナノ粒子が、該１以上の配位子が非化学量論的に該オキソまたはヒドロキシ基を置換している構造を有し、該１以上の配位子が、カルボン酸配位子またはそのイオン化形態を含む、態様２８に記載のプロセスにより得ることができる組成物。
【図１】
0006775523.tif 000006
【図２】
0006775523.tif 000007
【図３】
0006775523.tif 000008
【図４】
0006775523.tif 000009
【図５】
0006775523.tif 000010
【図６】
0006775523.tif 000011
【図７】
0006775523.tif 000012
【図８】
0006775523.tif 000013
【図９】
0006775523.tif 000014
【図１０】
0006775523.tif 000015
【図１１】
0006775523.tif 000016
【図１２】
0006775523.tif 000017