(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
繊維支柱、複数の繊維管、及び繊維コアを含み、
前記繊維コアと前記複数の繊維管は構造が異なっており、
前記複数の繊維管は、前記繊維コアの外周に沿って整列しており、前記繊維支柱に包囲されており、
前記繊維支柱、前記複数の繊維管、及び前記繊維コアは、生体適合性の第１ポリマーを含み、
前記複数の繊維管は中空管であり、前記繊維コアは多孔質であることを特徴とする、骨の修復又は再生のための足場。
【請求項２】
α−三カルシウムリン酸塩、β−三カルシウムリン酸塩、及びハイドロキシアパタイト（ＨＰＡ）からなる群から選択される材料から調製される、1つ又は複数の円柱状の支持柱をさらに備えることを特徴とする、請求項１に記載の足場。
【請求項３】
前記繊維支柱、前記繊維管、及び前記繊維コアがそれぞれ独立して、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレン、ポリウレタン、ポリアリールエーテルケトン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリ（DL-乳酸）、ポリ（L-乳酸）、ポリ（グリコリド）、ポリ（ε-カプロラクトン）、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（グリコネート）、ポリ（ヒドロキシ酪酸）、ポリ（ヒドロキシ吉草酸）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（カルボン酸）、ポリ（プロピレン・フマル酸）、ポリ（リン酸）、ポリ（無水酸）、ポリ（イミノカルボネート）、ポリ（ホスファゼン）、及びそれらのコポリマー、混合体、組み合わせからなる群から選択される第１のポリマーを含むことを特徴とする、請求項１に記載の足場。
【請求項４】
前記第１のポリマーが、ポリ（L-乳酸）（PLLA）を含むことを特徴とする、請求項３に記載の足場。
【請求項５】
前記繊維支柱、前記繊維管及び前記繊維コアが、それぞれ独立して、ゼラチン、アルギン酸、ヒアルロン酸、及びポリ（アクリル酸）ヒドロゲルからなる群から選択される架橋ヒドロゲルを含むことを特徴とする、請求項１に記載の足場。
【請求項６】
前記架橋ヒドロゲルがゼラチンを含むことを特徴とする、請求項５に記載の足場。
【請求項７】
前記繊維支柱、前記繊維管、及び前記繊維コアの少なくとも1つが、第２の被覆ポリマーをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の足場。
【請求項８】
前記第２の被覆ポリマーが、ポリ（D-乳酸）（PDLA）を含むことを特徴とする、請求項７に記載の足場。
【請求項９】
前記繊維管内に脱細胞化組織をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の足場。
【請求項１０】
前記脱細胞化組織が、脱細胞化されたヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を含むことを特徴とする、請求項９に記載の足場。
【請求項１１】
間葉系幹細胞（MSC）、筋肉由来幹細胞、及び脂肪由来幹細胞からなる群から選択される幹細胞をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の足場。
【請求項１２】
前記幹細胞がMSCであることを特徴とする、請求項１１に記載の足場。
【請求項１３】
前記支柱の前記繊維が、前記支柱の長手方向軸に沿って0〜90度の角度で整列していることを特徴とする、請求項１に記載の足場。
【請求項１４】
前記角度が15〜45度の範囲であることを特徴とする、請求項１３に記載の足場。
【請求項１５】
前記角度が15度であることを特徴とする、請求項１３に記載の足場。
【請求項１６】
前記足場が無機質化されていることを特徴とする、請求項１に記載の足場。
【請求項１７】
前記足場が熱焼結されていることを特徴とする、請求項１に記載の足場。
【請求項１８】
骨の修復又は再生のための足場を製造する方法であって、
a）複数の繊維管で繊維コアを包囲するステップと、
b）複数の繊維管を繊維シートで包囲して支柱を形成するステップ、及び、
c）支柱を焼結するステップを含み、
ここで前記複数の繊維管は中空管であり、前記繊維コアは多孔質であることを特徴とする、製造方法。
【請求項１９】
ステップaにおいて、繊維コアの周囲に1つ以上の支持柱を配置するステップをさらに含み、前記1つ以上の支持柱はHPAを含むことを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記繊維管内に組織を播種し、前記組織を脱細胞化するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記足場上に幹細胞を播種するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
焼結前、焼結後、又はその両方で、前記繊維シート、繊維コア又は繊維管の少なくとも1つを無機質化するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
患者の骨の置換又は修復を必要とする部位に移植することにより使用されることを特徴とする、請求項１に記載の足場。
【請求項２４】
移植することにより使用される足場であって、
a）患者に皮下ポケットを作製するステップ、及び、
b）足場をポケット内に配置するステップ
を含むステップにより移植することを特徴とする、請求項１に記載の足場。
【請求項２５】
ステップaの前に足場上に幹細胞を播種するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項２４に記載の足場。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本出願は、2014年12月9日に出願された米国仮出願第62/089,350号の利益を主張し、参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、骨の修復及び再生のための天然の組織及び微小構造を模倣するデバイスに関する。また、前記デバイスを製造する方法、及びそのようなデバイスを必要とする被験体に埋め込む方法も提供される。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
骨損傷及び変性を含む様々な骨疾患は、世界中で増大している問題である。骨の修復及び再生に直面する主な課題は、天然の骨組織と同様の二重の構造的及び機能的組織を有するデバイスを構築することの困難さである。皮質及び海綿の骨には、２つのタイプの構造が存在する。前者は一般的に後者を包囲していると観察される。皮質骨は、骨の長手方向軸に平行に配向された非常に圧縮された骨で構成されている。骨単位（osteon）内の管（channel）様構造は、脈管構造及び神経の成長のための、ハバース管としても知られる保護空間を提供する。前記構造の高い引っ張り強度及び機械的強度はまた、マイクロクラックの拡大を防止する。皮質骨に包囲された海綿骨は、機械的強度は弱いが、細孔の広範なネットワークを特徴とし、それは著しく変化する場合がある。
【０００４】
骨の修復及び再生のために、異なる技術及びデバイスが開発されている。しかしながら、それらの多くはまだ重大な欠点を有する。整形外科手術における標準的アプローチである自家移植は、供給、及びドナーの部位疾病率によって制限される。同種移植片を使用する別の治療は、自家移植の欠点を克服するが、それはさらに、より多くの伝染病の発生及びより高い失敗率などの問題にかかわる。より最近では、骨組織工学に適用するための様々な足場が開発されている。しかしながら、大部分の足場は、天然の骨組織に見られるような二重の構造組織を有していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
天然の骨の構造的な類似性を提供するだけでなく、組織成長に適した生物学的親和性も示す生体適合性デバイスが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
概要
本発明は、骨の修復及び再生に適した生体適合性の足場を提供する。前記足場は、骨組織のハバースシステムを模倣する管を含み、望ましい機械的特性及び生物学的親和性を示す。特に、足場は、細胞増殖、骨芽細胞分化及び血管新生を促進し、長期生存能力及び機械的強度を維持する能力を特徴とする。前記足場は、複雑な粉砕骨折を修復するための現在の方法にとって代わる潜在力を有しており、骨片は、プレート、ピン、ネジ、及びパテと一緒に繋ぎ合わされる。この複数の断片は、骨を作り直す(remodel)ために細胞が異なる断片のすべてを移動しなければならないため、不安定化とより長い治癒時間をもたらす。本発明を使用して、より簡単な外科的処置、増大した機械的安定性、及び細胞が新しい骨及び血管組織を生成するためのより簡単で容易な経路のために、断片は完全に除去され、前記足場と置き換えられる。
【０００７】
１つの態様では、複数の繊維管及び繊維支柱を含み、後者は前者を包囲し、骨の修復及び再生用の足場が提供される。包囲する支柱及び繊維管は、それぞれ皮質骨及び骨単位の生理学的範囲内の直径を有する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、前記足場は、複数の繊維管によって包囲される円筒形繊維コアをさらに含む。海綿円錐を模倣する前記繊維コアは、架橋ヒドロゲルと第１のポリマーとから構成される。全体の構造は、皮質及び海綿の領域を有する天然の骨の二重構造組織を模倣する。
【０００９】
生体適合性の維持及び所望の機械的特性を提供するために、前記足場は、繊維コアの周囲に1つ又は複数の支持柱円柱をさらに含む場合がある。円柱又は柱は繊維管の周囲及び/又は繊維管内に配置されてもよい。円柱又は柱は、セラミックスなどの任意の適切な材料から作ることができる。これらの円柱又は柱は、リン酸カルシウムの1つのタイプ又はいくつかのタイプの混合体から構成することもできる。これらのタイプには、ヒドロキシアパタイト（HPA）、αリン酸三カルシウム、βリン酸三カルシウムが含まれる。例示的な実施形態では、HPAから構成される支持柱は、繊維管全体に均一に分布し、骨単位を模倣する。好ましくは、前記柱は、骨単位に類似した直径を有する。
【００１０】
前記繊維管、繊維支柱、及び繊維コアは、第１のポリマー及び架橋ヒドロゲルから構成される繊維から製造される。異なる繊維成分中の第１のポリマーは、同じであっても異なっていてもよい。同様に、前記繊維管、繊維支柱、及び繊維コア中の架橋ヒドロゲルは、個々の成分ごとに変化する場合がある。
【００１１】
前記足場成分のポリマーは、機械的強度及び生物学的適合性及び親和性の要件を満たさなければならない。第１ポリマーの非限定的な例には、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレン、ポリウレタン、ポリアリールエーテルケトン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリ（DL-乳酸）、ポリ（L-乳酸）、ポリ（ε-カプロラクトン）、ポリ（ジオキサオノン）、ポリ（グリコネート）、ポリ（ヒドロキシ酪酸）、ポリ（ヒドロキシ吉草酸）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（カルボン酸）、ポリ（プロピレン・フマル酸）、ポリ（リン酸）、ポリ（カーボネート）、ポリ酸無水物、ポリ（イミノカーボネート）、ポリ（ホスファゼン）及びそれらのコポリマー、混合体及び組み合わせが挙げられる。
【００１２】
架橋ヒドロゲルは、繊維管及び繊維支柱の構造的な完全性を強化する。架橋はまた、無機質化中に水溶性ヒドロゲルが洗い流されるのを防止する。適切なヒドロゲルの非限定的な例としては、ゼラチン、アルギン酸、ヒアルロン酸、及びポリ（アクリル酸）ヒドロゲルが挙げられる。
【００１３】
いくつかの実施形態では、繊維支柱、繊維管、及び繊維コアの少なくとも１つは、第２の被覆ポリマーをさらに含む。被覆ポリマーは、足場の種々の成分を一緒に連結する焼結工程を助ける働きをする。
【００１４】
本発明の足場は、その生物活性性質によっても特徴付けられる。いくつかの実施形態では、繊維管は、脱細胞化された脈管構造のネットワークを提供する血管などの脱細胞化組織を含み、新生血管の生成のために脈管系統の下で骨単位を模倣する繊維管内の細胞を誘導する。その一方で、これらの細胞における成長因子のレベルは十分低いため、有害な影響を回避できる。
【００１５】
いくつかの実施形態では、前記足場は、骨細胞（骨芽細胞）及び血管細胞（血管内皮細胞）となる播種された幹細胞をさらに含む。前記足場内の材料は、（インタクトな骨由来の、移植された又は隣接する）幹細胞を、骨芽細胞を産生する骨、及び血管内皮細胞を産生する血管に変換する能力を有する。
【００１６】
支柱の長手方向軸に対する繊維角度も重要な機械的特性に寄与する。いくつかの実施形態では、支柱を包囲する繊維は、支柱の長手軸に対して0〜90度の角度で整列する。繊維角は、繊維支柱の圧縮率及び降伏強度に寄与し、容易に調節することができる。
【００１７】
いくつかの実施形態では、前記角度は約15〜約45度の範囲である。
【００１８】
いくつかの実施形態では、前記角度は約15度である。いくつかの実施形態では、角度はランダムである。
【００１９】
いくつかの実施形態において、前記足場は無機質化される。無機質化は、降伏応力及び圧縮率に関して、前記足場の望ましい機械的特性を向上させる。無機質化された足場はまた、骨芽細胞分化に対してより良い結果をもたらす。
【００２０】
いくつかの実施形態では、前記足場は熱焼結される。
【００２１】
別の態様では、骨の修復及び再生のための足場を製造する方法が提供される。一般に、この方法は、
a）複数の繊維管で繊維コアを包囲するステップと、
b）複数の繊維管を繊維シートで包囲して支柱を形成するステップ、及び、
c）支柱を焼結するステップ
を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、前記方法は、支持柱を繊維コアの周りに及び/又は繊維管内に均一に配置するステップをさらに含む。
【００２３】
いくつかの実施形態では、前記方法は、繊維管内の組織を播種し、脱細胞化することをさらに含む。好ましくは、前記組織は血管である。
【００２４】
いくつかの実施形態では、前記方法は、幹細胞を足場上に全体に播種することをさらに含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、前記繊維管、繊維シート及び繊維コアは、それぞれ独立して、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレン、ポリウレタン、ポリアリールエーテルケトン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリラクチド、ポリグリコール酸、ポリ（DL-乳酸）、ポリ（L-乳酸）、ポリ（ε-カプロラクトン）、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（グリコン酸）、ポリ（ポリ（ヒドロキシ酪酸）、ポリ（ヒドロキシ吉草酸）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（カルボン酸）、ポリ（プロピレンフマル酸）、ポリ（リン酸）、ポリ（カルボネート）、ポリ（無水酸）、ポリ（イミノカーボネート）、ポリ（ホスファゼン）、及びこれらのコポリマー、混合体及び組み合わせからなる群から選択される第１ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、前記第１のポリマーはPLLAを含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、繊維管、繊維シート及び繊維コアの少なくとも１つは、独立して、ゼラチン、アルギン酸、ヒアルロン酸及びポリ（アクリル酸）ヒドロゲルからなる群から選択される架橋ヒドロゲルを含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、繊維管、繊維支柱、及び繊維コアの少なくとも１つは、第２の被覆ポリマーをさらに含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、封入シートの繊維は、支柱の長手方向軸に対して0度〜90度の角度で整列する。
【００２９】
いくつかの実施形態では、繊維管、繊維シート、及び繊維コアを含む個々の成分を足場に組み込む前に無機質化することができる。
【００３０】
いくつかの実施形態では、前記足場は、焼結前、焼結後、又はその両方で無機質化される。
【００３１】
本発明のさらなる態様は、被験体において骨修復又は骨再生をもたらす方法である。前記方法は、骨再生を必要とする骨欠損又は領域を本発明の足場で移植又は接触させることを含む。いくつかの実施形態では、修復又は再生を必要とする骨は、皮質骨、海綿骨、又はその両方である。
【００３２】
別の態様では、本発明の足場を移植する方法であって、
a）皮下ポケットを作製するステップ、及び、
b）前記足場を前記ポケットに配置するステップ、
を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態では、前記方法は、骨欠損を作製し、骨欠損内に前記足場を配置するステップを含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、ステップaの前に足場幹細胞上に幹細胞を播種するステップをさらに含む。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
詳細
様々な実施形態は、皮質及び海綿領域を有する天然の骨の二重構造構成を模倣する足場を提供する。本発明の足場は、高い表面積、高い多孔性、及び相互連結した細孔ネットワークによって特徴付けられる。結果として、それらは望ましい機械的特性を示すだけでなく、細胞の付着及び増殖を促進する。
【００３５】
この特許文献全体にわたって、様々な刊行物が参照される。これらの刊行物の開示全体は、開示された事項が関係する技術水準をより完全に説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。以下の文章は、本足場の特定の構成要素又は対応する製造工程のステップを参照又は例示することができるが、本発明の範囲をそのような特定の参照又は例に限定することを意図するものではない。ポリマーの供給源及び足場の特徴などの実用的及び経済的な考慮の観点から、当業者は様々な改変を行うことができる。特許請求の範囲の主題をより明確かつ簡潔に説明するために、以下の定義は、本明細書で使用される用語の意味に関するガイダンスを提供することを意図している。
【００３６】
定義
本明細書で使用される冠詞「a」及び「an」は、他に示されない限り、「１つ以上」又は「少なくとも１つ」を意味する。すなわち、不定冠詞「a」又は「an」による本発明の任意の要素への言及は、複数の要素が存在する可能性を排除するものではない。
【００３７】
「約」は、その参照数字表示の±10%の参照数字表示を意味する。
【００３８】
足場と成分
１つの態様では、複数の繊維管と、複数の繊維管を包囲する繊維支柱とを含む、骨の修復又は再生のための足場が提供される。天然の骨の構造及び特性を模倣するために、包囲する繊維支柱及び繊維管は、好ましくは、それぞれ皮質骨及び骨骨の生理学的範囲内の直径を有する。いくつかの実施形態では、本足場はまた、繊維管によって包囲された円筒状の繊維コアを含む。繊維管及び繊維コアは、それぞれ天然の骨の皮質骨及び海綿骨を模倣する。繊維管は、血管の発達を誘導し、様々な因子が発達する結合と血管との間を移動することを可能にする。
【００３９】
いくつかの実施形態では、本足場は、足場に置かれた荷重を支える支持柱を含み、適切な特性に到達することを保証する。前記柱は、繊維管が分配されるセクション全体にわたって、又は繊維コアの周りに均一に分布されてもよい。支持柱の好ましい材料は、HAP（ハイドロキシアパタイト）である。他のミネラル又はポリマーも、柱の強度を微調整するために組み込むことができる。足場における支持柱の利用は、強度の不一致、結合の欠如、及び従来のデバイスに関連する分解の欠如などの問題を克服する。
【００４０】
本足場の前記繊維管は、種々のタイプの組織工学で報告されている脱細胞化された組織を含む場合がある（例えば、Hoenickaら、“Development Of Endothelium-Denuded Human Umbilical Veins As Living Scaffolds For Tissue-Engineered Small-Calibre Vascular Grafts; Biomed Mater、2013 Feb; 7（4）：324-36; Leeら、“Scaffold Technologies For Controlling Cell Behavior In Tissue Engineering.” 8（1）：010201）。本発明に適した組織は、ヒト伏在静脈及びヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）などの血管を含む。脱細胞化された細胞を繊維管に組み込むことにより、発達した組織への栄養の輸送のために移植後に足場を通って血液が移動することが可能になる。
【００４１】
幹細胞はまた、複数の細胞系統に分化させるために本足場に組み込むこともできる。種々のタイプの幹細胞が組織工学のための文献に報告されている（例えば、Liら、“Sustained Release of Bone Morphogenetic Protein 2 via Coacervate Improves the Osteogenic Potential of Muscle-Derived Stem Cells.”, Stem Cells Transl. Med. Sep 2013; 2（9）：667-677を参照）。例えば、本発明に適した幹細胞は、例えば、筋肉由来幹細胞（MDSC）、脂肪由来幹細胞、及び間葉幹細胞（MSC）を含み、同種異系又は天然であり得る。幹細胞は、繊維管及び繊維コアを含む足場全体、又は足場の特定の部分に配置することができる。
【００４２】
足場の構成要素の製造のための材料の選択は、適切な高い引張り及び圧縮特性に対する機械的要件を満たさなければならない。一方で、足場内での細胞の移動及び増殖を促進するために、材料は、骨構造の重要な生物学的態様を表す、適切な細孔径、多孔性及び細孔相互連結性を有するネットワークの形成を促進しなければならない。適切な機械的強度を維持するために、本足場は少なくとも約7%、9%、11%、13%又は15%のHPAを含有する。柱を支えるHPAの追加は、足場の強度をさらに高める。
【００４３】
繊維管、繊維支柱及び繊維コアの製造には、様々な材料を使用することができる。いくつかの実施形態では、繊維管、繊維支柱、及び繊維コアは、それぞれ独立して、第１のポリマー及び架橋ヒドロゲルから構成される。第１のポリマーの非限定的な例は、強化ポリマー、ナイロン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレン、ポリウレタン、ポリアリールエーテルケトン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリラクチド、ポリグリコリド、合成又は天然コラーゲン、ポリ（DL-乳酸）、ポリ（L-乳酸）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（ジオキサネート）、ポリ（グリコネート）、ポリ（ヒドロキシ酪酸）、ポリ（ヒドロキシ吉草酸）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（カルボン酸）、ポリ（プロピレン・フマル酸）、ポリ（リン酸）、ポリ（カーボネート）、ポリ（無水酸）、ポリ（イミノカーボネート）、ポリ（ホスファゼン）、及びそれらのコポリマー、混合体及び組み合わせを含む。足場の異なる成分中の第１のポリマー及び架橋ヒドロゲルは、同じであっても異なっていてもよい。
【００４４】
架橋されたヒドロゲルは、足場の望ましい特性を向上させ、無機質化工程から防ぐ。さらに、ヒドロゲル被覆は、組織増殖及び細胞増殖に影響を及ぼす多孔性に寄与する場合がある。
【００４５】
種々のタイプのコラーゲン及び変性コラーゲンを含むヒドロゲルは、例えばポリペプチドベースのヒドロゲル、多糖類ベースのヒドロゲル及び石油化学ベースのヒドロゲルを含む天然源又は人工的手段から利用可能である。種々のタイプのヒドロゲルは、本足場の構成要素を製造するために、個々に又は互いに組み合わせて使用することができる。一般に使用されるヒドロゲルは、ゼラチン、アルギン酸、ヒアルロン酸、及びポリ（アクリル酸）ヒドロゲルを含む。いくつかの実施形態では、前記ヒドロゲルはゼラチンである。
【００４６】
ヒドロゲルを、様々な薬剤によって架橋することができる。得られた架橋ヒドロゲルは、足場の作製及びその後の骨組織の成長に適した物理的及び化学的特性を付与することができる。架橋剤の非限定的な例は、グルタルアルデヒド、ポリ（エチレングリコールジアクリレート（PEGDA）、ポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、ジビニルスルホン及びそれらの誘導体を含む。前記架橋剤、例えば1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドは塩酸塩などの対応する塩を含む。ヒドロゲルの量及び架橋の程度は、繊維材料及びヒドロゲルの特定の成分などの種々の要因に依存する。架橋方法は、文献で容易に利用可能であり、過度の実験なしに実施することができる（例えば、Nilimanka、International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences、2013,5（4）、55-58; Henninkら、Adv.Drug Deliv. Rev. 2002 Jan 17; 54（1）：13-36を参照）。いくつかの実施形態では、架橋剤はグルタルアルデヒドである。
【００４７】
本足場は個々の成分から構成されているので、繊維管、繊維支柱及び繊維コアは、コンパクトで相互接続された構造を形成することが必要である。したがって、各構成要素は、好ましくは、製造工程中で、他の構成要素と結合するための部位も含む。いくつかの実施形態では、繊維管、繊維支柱、及び繊維コアのうちの1つ以上は、熱焼結工程の間に異なる成分を連結するのに役立つ第２の被覆ポリマーをさらに含む。好ましくは、第２のポリマーは、第１のポリマーの融点よりも低い融点を有し、足場成分の機械的強度及び物理的特性を低下させない。いくつかの実施形態では、第２の被覆ポリマーはポリ（D-乳酸）である。
【００４８】
第１のポリマー、第２のポリマー及び架橋ヒドロゲルの間の比は、ポリマー及びヒドロゲルのタイプ、修復又は再生される特定の骨、及び足場作製のために使用される技術に依存して変化させることができる。例示的な実施形態では、第１のポリマーとヒドロゲルとの重量比は、約20：1、約15：1、約10：1、約5：1及び約1：1を含む。例示的な実施形態では、第1ポリマーと第２ポリマーとの重量比は、約10：1、約5：1、約3：1、約1：1、約1：3、約1：5及び約1：10を含む。足場に対して相互接続されたネットワークの形成を容易にするか、又は所望の機械的及び/又は生物学的特性を強化する追加の成分が、本足場の構成成分に加えられてもよい。
【００４９】
本足場の支柱の繊維角度は、降伏応力及び圧縮弾性率を含む機械的特性に寄与する。支柱中の繊維が足場の縦軸に対して0°又は90°に整列すると、最も弱い機械的性質が観察される。繊維角度が15°、30°又は45°である場合、支柱は、増加した降伏強度及びヤング率を示す。足場の例示的な実施形態では、約10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、及び85°を含む。
【００５０】
足場の製造方法
A.繊維管の製作
繊維管は、適切なポリマーをコア充填剤上にエレクトロスピニングすることによって製造することができ、コア充填剤は後で除去して、骨組織のハバースシステムを模倣する中空管を形成することができる。
【００５１】
コア充填剤は、例えば、回転マンドレルに適切な材料をエレクトロスピニングすることを含む様々な技術によって調製することができる。次いで、得られた電子スピンマットを切断し、コア充填剤として厚い繊維に圧延する。第１のポリマーの溶液とヒドロゲルの溶液とを含む混合物を次にコア充填剤にエレクトロスピニングし、続いて第２のポリマーポリマー溶液を第１のポリマー/ヒドロゲル層の上にエレクトロスピニングする。
【００５２】
第１のポリマー、ヒドロゲル、及び第２の被覆ポリマーは、上記の通りである。第１のポリマー、第２のポリマー及び架橋ヒドロゲルの間の比率は、ポリマー及びヒドロゲルのタイプ、修復又は再生される特定の骨、及び足場作製に使用される技術を含む要因に応じて変化してもよい。当業者は、足場の特定の原料の供給源及び必要性の観点から、過度の実験をすることなく各薬剤の適切な量を容易に決定することができる。いくつかの実施形態では、第１のポリマーはポリ（L-乳酸）（PLLA）であり、ヒドロゲルはゼラチンであり、第２の被覆ポリマーはポリ（D-乳酸）（PDLA）である。
【００５３】
ヒドロゲルの繊維管内での架橋は、任意の適切な手段によって達成することができる。例えば、繊維管は、架橋剤の溶液に浸漬されてもよく、又は架橋剤の蒸気に曝露されてもよい。架橋工程の条件（例えば、濃度、温度、長さ）は、特定のヒドロゲル、架橋剤、及び架橋の望ましい程度に依存する。いくつかの実施形態では、繊維管はグルタルアルデヒドの蒸気に曝露される。いくつかの実施形態において、架橋の時間は、約5分、約30分、約45分、約1時間、約2〜10時間、約5〜15時間、約2〜17時間である。
【００５４】
コア充填剤は、生物学的、化学的、物理的手段によって除去することができる。例えば、生物分解性ポリマーからなるコア繊維は、所望の期間内に生分解が完了する場合に、繊維管を構築するのに適している。コア充填剤は、コア材料を適切な溶媒に溶解し、それを洗浄して中空管を形成することによっても除去することができる。例示的な実施形態では、コア充填剤は、水性条件下で容易に溶出されて、骨単位の足場の内部に生体模倣ハバース管を生成するポリ（エチレンオキシド）（PEO）から構成される。
【００５５】
無機質化は、足場の生存能力だけでなく、その機械的特性にも寄与する。したがって、いくつかの実施形態では、繊維管は予め無機質化される。予備無機質化処理は、将来の無機質沈着のための無機質シードを提供し、またコア充填剤を除去する働きもする。コア充填剤が可溶性である例示的な実施形態では、塩の水溶液による予備無機質化も充填剤を洗い流して中空管を生成する。予備無機質化のための塩の非限定的な例としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、及び塩化マグネシウムが挙げられる。
【００５６】
繊維コアの製造
繊維コアは、繊維管について上述したのと同様に製造することができる。しかし、繊維コアが多孔質の海綿骨部分を模倣すると考えられるので、繊維材料上の多孔度を提供又は変更するために追加のステップを採用することができる。非限定的な例示的手順は、以下のステップを含む：結晶埋め込みエレクトロスピニングマットを得るためにポリL-乳酸（PLLA）及び塩結晶を有するゼラチンをエレクトロスピニングするステップ；エレクトロスピニングマット上にポリD-L乳酸繊維の追加薄層をエレクトロスピニングするステップ；孔を作るために浸出することによって結晶を除去するステップ；得られたマットを円形に切断し、それらを円筒形に積み重ねるステップ；円柱を焼結して繊維コアを提供するステップ。別の方法として、小さなマットを支柱に巻きつけ、追加の大きな支柱を増やして支柱を囲むことによって円柱を構築することができる。
【００５７】
C.支持柱の製作
支持柱は、１つ又は複数の適切な生体適合性材料によって調製することができる。長さ及び形状は、修復又は再生される特定の骨のタイプに応じて変化する場合がある。いくつかの実施形態では、支持柱の直径はほぼ骨単位の直径である。限定されない例示的な手順では、粉末状のヒドロキシアパタイトは、水で円筒形の鋳型にしっかりと充填され、所定の圧力下で一定時間保持される。次いで、得られた支持柱を高温で長時間焼結する。
【００５８】
D.包囲シートの製造
包囲シートは、第２の被覆ポリマーを回転マンドレル上にエレクトロスピニングすることによって製造することができる。次いで、第１のポリマー溶液とヒドロゲル溶液の混合物を、被覆ポリマーの層上にエレクトロスピニングする。所望の特性及び包囲シートの意図された用途に応じて、第２の被覆ポリマーの別の層を、第１のポリマー/ヒドロゲルの層上に任意にエレクトロスピニングしてもよい。
【００５９】
前記包囲シート中のヒドロゲルは、過度の実験をすることなく当業者によって決定できる適切な条件下で架橋される。
【００６０】
第１のポリマー、第２のポリマー及びヒドロゲルは上記の通りである。繊維管及び包囲シートは、同じ又は異なる第１のポリマー、同じ又は異なる第２の被覆ポリマー、及び、同じ又は異なるヒドロゲルを有する場合がある。
【００６１】
包囲シートは、上記の条件下で予備無機質化されてもよい。予備無機質化は足場の無機質の全体量を増加させることによって力学に影響を与える場合がある。
【００６２】
E.足場作製
足場は、皮質骨の構造又は皮質骨及び海綿骨システムを模倣するように作製することができる。皮質骨様足場は、一般に、複数の繊維管を包囲シートで包み、支柱を形成することによって製造される。皮質骨及び海綿骨の二重構造システムは、繊維円筒状コアの周りに繊維管をさらに整列させることによって構築することができる。
【００６３】
いくつかの実施形態では、足場の製造は、以下のステップを含む：
a）複数の繊維管で繊維コアを包囲するステップと、
b）複数の繊維管を繊維シートで囲んで支柱を形成するステップと、
c）支柱を焼結する。
前記繊維管、繊維コア及び繊維シートの各々は、架橋ヒドロゲル、第１のポリマー、及び場合により第２の被覆ポリマーを含む。第１のポリマー、第２のポリマー及びヒドロゲルは上記の通りである。
【００６４】
いくつかの実施形態では、本方法は、ステップaにおいて繊維コアの周りに1つ以上の支持柱を配置するステップをさらに含み、ここで支持柱はHPAを含む。柱の量及び位置は、再生されるべき特定の部位及び骨に依存する。いくつかの実施形態では、柱は、繊維管が配置されている部分に均一に分布している。あるいは、柱を繊維コアの周囲に配置することができる。
【００６５】
いくつかの実施形態では、本方法は、組織を繊維管に播種するステップをさらに含む。適切な組織には、HUVECなどの血管細胞が含まれる。細胞が組織化された血管に成長した後、脱細胞化ステップが行われる。
【００６６】
いくつかの実施形態において、幹細胞は、移植ステップの前に足場に播種される。細胞を播種するための具体的な手順は、文献でよく知られており、過度の実験によって当業者によって実施することができる。
【００６７】
支柱の中心に繊維コアがない場合、足場は皮質骨を模倣する。いくつかの実施形態では、支柱の繊維管は、第１のポリマー及びヒドロゲルを含む円筒状の繊維コアの周りに整列される。得られる足場は、皮質骨及び海綿骨のシステムに構造的及び機能的に類似性を有する。
【００６８】
熱焼結は、ポリマーのタイプ及び足場の望ましい特性に依存して、異なる長さの異なる温度で行うことができる。いくつかの例示的な実施形態では、焼結は、約40℃、約45℃、約50℃、約55℃、約60℃、約65℃、約70℃、約75℃、約80℃、約85℃又は約90℃である。焼結時間は、約15分、約30分、約45分、約60分又は約90分を超えることができる。
【００６９】
包囲繊維シートの長さ及び幅は、製造された足場が修復又は再生されるべき骨のサイズに適合するように調節することができる。同様に、繊維管の直径も骨単位の生理学的範囲内でなければならない。例示的な実施形態では、繊維管の直径は約1mmであり、繊維コアの直径は約4mmであるので、最終支柱は約6mmの直径を有し、これは約2：1の海綿と皮質部分の比と換算される。いくつかの実施形態において、海綿部分と皮質部分との間の比は、約3：1、5：2、5：3、7：3又は7：4である。
【００７０】
前記包囲シートは、繊維管の周りに巻かれる前に異なる角度から切断されて、シートの繊維が得られた支柱の長手方向軸に対して特定の角度になるようにすることができる。様々な繊維角度は足場に対して異なる機械的強度をもたらす。いくつかの実施形態では、包囲シートは、その中の繊維が約10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°又は85°の繊維角度を有するように切断され、繊維管の周りに巻かれる。いくつかの実施形態では、繊維角度はランダムであり、特定のパターンに従う必要はない。いくつかの実施形態では、1つ以上の支柱が混合された角度を有する場合がある。
【００７１】
いくつかの実施形態では、足場はさらに無機質化される。無機質化は、足場を室温又は高温で、1つ以上の塩の溶液中でインキュベートすることを含む。塩の非限定的な例には、NaCl、KCl、CaCl、MgCl2、及びNaH2PO4が含まれる。インキュベーション時間は、約30分、約1時間、約2時間、約5時間、約12時間、約16時間、約24時間、約36時間、約48時間、又は48時間を超えることができる。
【００７２】
種々の緩衝剤もまた、無機質化のための溶液中に含まれてもよい。本発明での使用に適した緩衝剤としては、例えば、リン酸ナトリウムなどのリン酸塩;リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム等の一塩基性リン酸塩;リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウムなどの二塩基性リン酸塩;クエン酸ナトリウム（無水又は脱水）などのクエン酸塩;重炭酸ナトリウム及び重炭酸カリウムなどの重炭酸塩を含み、使用される場合がある。いくつかの実施形態では、単一の緩衝剤、例えば二塩基性緩衝剤が使用される。いくつかの実施形態では、緩衝剤の組み合わせ、例えば、三塩基性緩衝剤と一塩基性緩衝剤との組み合わせが使用される。
【００７３】
骨の修復又は再生のための方法
別の態様では、本発明の足場の移植を含む骨修復又は再生のための方法が提供される。使用される足場のサイズ及び長さは、被験体の特定の状態を考慮して過度の実験をすることなく、当業者によって決定できる。
【００７４】
足場を移植する方法
別の態様では、骨の修復を必要とする被験体に足場を移植するための方法であって、
a）患者に皮下のポケットを作製するステップ、及び、
b）請求項1に記載の足場を前記ポケット内に配置するステップを含む。
代替的に、本方法は、骨欠損を作製し、骨欠損内に足場を配置するステップを含む場合がある。骨欠損又はポケットは、骨のいかなる形態又はいかなる形状の物理的変化であってもよい。いくつかの実施形態では、本方法は、足場幹細胞上に播種するステップをさらに含む。適切な幹細胞は、例えば、筋肉由来幹細胞（MDSC）及び間葉幹細胞（MSC）を含む。
【実施例１】
【００７５】
エレクトロスピニング
ポリ（L-ラクチド）（PLLA）（固有粘度=2.0 dl/g、Mw=152,000）をSigma Aldrich（St.Louis、MO、米国）から購入した。ポリ（D,L-ラクチド）（PDLA）（固有粘度0.6-0.8 dL/g）はSurModicsPharmaceuticals（Birmingham、AL、米国）から購入した。ジクロロメタン（DCM）、テトラヒドロフラン（THF）及びジメチルホルムアルデヒド（DMF）は、Fisher Scientific（ペンシルベニア州ピッツバーグ、米国）から購入した。ブタ皮膚由来のゼラチンA型はSigma Aldrich（St.Louis、MO、米国）から購入した。NaCl、KCl、CaCl2・H2O、MgCl2・6H2O、NaHCO3及びNaH2PO4は、Fisher Scientific（Pittsburgh、PA、USA）から購入した。
【００７６】
エレクトロスピニング溶液は、75%DCM及び25%DMF中にPLLAを7%w/vに溶解し、75%THF及び25%DMF中に22%w/vにPDLAを溶解することによって調製した。PLLA/ゼラチン混合物は、ゼラチンを1mlの脱イオン水（dI）に溶解し、それを7%PLLA溶液に添加することによって作製した。溶液中のゼラチンの量は、溶液中のPLLAの量の10%w/wに等しかった。2つの溶液は混和しないので、エレクトロスピニングの前に混合するために1時間ボルテックスした。ポリマー溶液を16mlのバッチで作製し、ゼラチン/PLLA及びPLLA溶液の全容量を等しくするために、1mlのDCMを1mlのゼラチンで置き換えた。
【００７７】
最初に、PDLA溶液を、18ゲージの針を備えた5mlプラスチックシリンジに充填し、5mL/hの速度で押し出した。PDLAを回転（〜2000RPM）5cm直径のマンドレル上に15mlの距離で全容積1mlでエレクトロスピニングし、+12kV及び-5kVの電圧を印加した。次いで、ゼラチン/PLLAを5cmの作動距離でPDLA層上に直接エレクトロスピニングした。印加された電圧は+18kVと-7kVであった。1mlのPDLAの追加の層をゼラチン/PLLA層の上にエレクトロスピニングした。
【００７８】
ポリ（エチレンオキシド）を10%エタノールに溶解し、10%w/vの溶液に溶解した。この溶液を直径5cmの回転マンドレル上に5ml/時間の速度で10cmの作動距離でエレクトロスピニングした。3mlの全容量を+10V及び-3Vの電圧でエレクトロスピニングした。エレクトロスピニングされたマットを3mm幅のストリップに切断し、繊維に巻き次の工程に使用した。
【００７９】
個々の骨単位様足場を、以前に報告されたセットアップ（Andricら、Materials Science＆Engineering C-Materials for Biological Applications 2011; 31：2）を用いて回転PEO繊維上にエレクトロスピニングした。繊維を設置して、負に帯電した標的の前に置いた。PLLA/ゼラチン混合物を、以下のパラメータ：5cmの作動距離、5ml/hrの押出速度、及び+17V及び-9Vの電圧を用いて、最初に1.5mlの総容量までエレクトロスピニングした。これに続いて、作動距離15cm、押出速度5ml/時間、及び+13V及び-8Vのパラメータを用いて、PDLA溶液を全量0.5mlでエレクトロスピニングした。すべての足場のゼラチンを2.5%グルタルアルデヒドの蒸気中で2時間架橋させた。
【００８０】
足場の熱焼結
個々の成分を一緒に54℃で45分間加熱焼結することにより、完全な足場を組み立てた。エレクトロスピニングされたマットを1.2cmのストリップに切断し、4mmのセグメントに巻き、熱焼結した。骨単位様足場を小さなセグメントに切断し、コアの周りに配置し、すべてをエレクトロスピニングシートで包んだ。最終的なデザインは、4mm幅で、骨単位様セグメントで囲まれ、最終直径6mmにエレクトロスピニングされたシートで包まれた「海綿（trabecular）」コアで構成された。これは、海綿と皮質の部分について2：1の比を提供した。
【００８１】
足場の無機質化
全足場は、10X SBF（Tasら、Journal of Materials Research 2004; 19：2742）中でのインキュベーションによって以前に報告された方法を用いて無機質化された。簡単には、NaCl、KCl、CaCl2・H2O、MgCl2 ・6H2O及びNaH2PO4を用いてストック溶液を作製し、室温で保存した。無機質化プロセスの前に、激しく撹拌しながらNaHCO3を加え、以下のイオン濃度を生じた：Ca2+25mM、HPO4 2- 10mM、Na+ 1.03M、K+ 5mM、Mg2+ 5mM、Cl- 1.065M及びHCO3- 10mM。エレクトロスピニングされた足場を200mlの10×SSBF中、室温で6時間、24時間及び48時間インキュベートし、無機質化溶液を2時間ごとに交換した。10X SBFから取り出した後、すべてのサンプルをdl水ですすぎ、足場に付着していない無機質を除去し、終夜真空乾燥させた。
【００８２】
予備無機質化処理を施した足場について、個々の骨単位及びエレクトロスピニングされたシートを1時間無機質化し、次いで水ですすぎ、終夜晩真空乾燥させた。次に、エレクトロスピニング片を上記のように加熱焼結した。
【００８３】
アリザリンレッド染色
無機質沈着及び分布は、アリザリンレッド染色によって特徴付けられた。足場を、Cryostat HM 550（Thermo Scientific Microm, Walldorf、ドイツ）を用いて200μm切片に採切し、水ですすぎ、一晩乾燥させた。次いで、足場切片を40mMアリザリンレッド溶液で10分間染色した。足場をdl水で5回洗浄し、ステレオスコープ（Vision Engineering、New Milford、CT、米国）を用いて画像化した。細胞研究からの足場を70%エタノール中で1時間固定し、水ですすぎ、上記と同じプロトコールに従った。
【００８４】
機械的性質
足場を、Instron 5869（Bioplus Bath（Norwood、MA、米国））を用いて圧縮して機械的に試験した。試験は37℃でリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）（pH=7.4）中で行った。3つの無機質化時間、6時間、24時間及び48時間を検討し、各群につき6つの試料を試験した（n=6）。12mm×6mm（高さ対直径比2：1）の足場を、1.2mm/分（10%の染色/分）の均一なひずみ速度で破損するまで圧縮して試験した。データを分析して、降伏応力及び圧縮弾性率を決定した。
【００８５】
無機質灰分重量
足場上の鉱物の量を定量するために、ポリマーを燃焼させて無機質灰分の重量を決定した。試料の初期重量を記録した後、試料をセラミック製のるつぼに入れ、700℃で24時間高温炉（Model FD1535M、Fisher Scientific、Pittsburgh、PA、米国）に入れた。冷却後、無機質灰分の重量を記録し、平均無機質百分率堆積物を無機質灰分重量対サンプル元重量の比として計算した。群当たり3つのサンプルを試験した（n=3）。
【００８６】
細胞研究
マウス前骨芽細胞（MC3T3-E1、ATCC）、Manassas、VA、USA）を、10%ウシ胎児血清（FBS、Cellgro、Mediatech）及び1%ストレプトマイシン/ペニシリン（Cellgro、Mediatech、Manassas、VA、USA）を補充したアルファ最小必須培地（α-MEM、Cellgro、Mediatech、Manassas、VA、米国）中で培養した。足場をCryostat HM 550（Thermo Scientific Microm、Walldorf、ドイツ）を用いて450μm切片に切断し、脱イオン水に終夜浸漬し、真空乾燥させた。次いで、Silastic Medical Adhesive（Dow Corning、Midland、MI、米国）を使用して、足場を24ウェル超低クラスタープレート（Costar）に固定し、30分間70%エタノール中で滅菌し、その後30分間UV光に曝露した。次いで、足場をPBSで洗浄し、細胞培養培地に一晩浸漬した。
【００８７】
2つのグループの足場を使用し、足場を24時間無機質化した（Min24）及び無機質化していない足場（MinO）を使用した。約100,000個の細胞を各足場に播種し、1時間付着させた後、培地を最終容量1mlになるように添加した。細胞を播種した後、培地に3mMのβ-グリセロホス酸及び10μg/mlのL-アスコルビン酸を補充した。培地を1日おきに交換し、培養物を加湿雰囲気かつ5%CO2中で37℃でインキュベートした。細胞を28日間培養し、7、14、21及び28日目にデータを収集した。
【００８８】
細胞生存率は、Cell Titer 96TM水溶液セル水溶液細胞増殖アッセイ（MTSアッセイ）（Promega、Madison、WI、米国）を使用して、以下の足場MinO（n=6）及びMin24（n=6）上で測定された。増殖アッセイの各時点（7、14、21、及び28日目）に培地を除去し、300μlの新鮮培地及び60μlのMTS溶液を各ウェルに加え、37℃、5%CO2で3時間インキュベートした。インキュベーション後、混合液300μlを48穴プレートに移し、300μlのdI水で希釈した。プレートリーダーを用いてプレートを490nmで読み取った。MTS吸光度値を細胞数と相関させるために、既知の細胞数に対する検量線を試験開始時に行った。
【００８９】
オステオカルシンELISAアッセイ
オステオカルシン（OCN）は、分化の後期段階の成熟骨芽細胞によって産生される非コラーゲン性タンパク質である。これは、Biomedical Technologies, Inc（Stoughton、MA）からのELISAキットを用いて培地中で測定した。培地サンプル（n=4）を28日間にわたって収集し、研究の終了まで-80℃で保存した。アッセイは製造業者の説明書に従って行い、吸光度は450nmで読み取った。オステオカルシン含有量は、ng/細胞として表される。
【００９０】
アリザリンレッド及び蛍光染色
無機質沈着及び分布は、アリザリンレッド染色によって特徴付けられた。各時点で、足場をPBSで洗浄し、新しいウェルプレートに移した。足場を4℃で1時間70%エタノールで固定し、40mMアリザリンレッド溶液で10分間染色した。足場をdl水で5回洗浄し、冷凍モールドに入れ、OCT包埋剤に包埋し、-20℃で凍結させた。足場をCryostat HM 550（Thermo Scientific Microm、Walldorf、ドイツ）を用いて50μmの切片に切断し、光学顕微鏡（Leica Microsystems LAS AF 6000、Bannockburn、IL、米国）を用いて画像化した。
【００９１】
足場上の細胞付着を、蛍光染色によって定性的に観察した。足場を室温で3.7%パラホルムアルデヒド及び0.5%Triton X-100で固定し、ファロイジン及びDAPIで染色した。足場を、蛍光顕微鏡（Leica Microsystems、Bannockburn、IL、米国）を用いて画像化した。
【００９２】
結果
本研究において、完全な3次元エレクトロスピニング足場を作製し、無機質化し、次いで10X SBF中でインキュベートした。足場は、二重の構造、すなわち、骨単位様の足場で囲まれた内核で構成されていた。足場はさらに、機械的特性、無機質沈着及び分布、並びに足場上の細胞活性を決定するために特徴付けられた。
【００９３】
アリザリンレッド染色
アリザリンレッド染色を用いて足場を横切る無機質沈着を観察した。6時間の無機質化の後、無機質は外側の縁及び骨単位に見られるが、中央のコアには見られない。無機質化時間が長くなるにつれて、足場にはより多くの無機質が観察される。24時間及び48時間後、足場は完全に無機質で覆われ、2つの無機質化時間の間に差異は見られない。
【００９４】
無機質灰分重量
無機質灰分の重量を決定して、足場上に存在する無機質の量を定量した。無機質化時間を増加させると無機質沈着が増加し、各灰分重量は以前の時点からのものよりも有意に高かった。
【００９５】
機械的性質
足場を、10%歪み/分の速度で圧縮した模擬生理学的条件下で試験した。降伏応力及び圧縮弾性率を決定するためにデータを解析した。無機質化の6時間後及び24時間から48時間の無機質化の間の機械的特性に有意差は見られなかった。24時間及び48時間無機質化した足場は、6時間及び0時間無機質化した足場よりも有意に高い降伏応力を有していた。24時間無機質化された足場は、非無機質化された足場（0時間）よりも著しく高い圧縮弾性率を有していた。
【００９６】
細胞研究
足場上のM3T3-E1細胞の増殖を、7、14、21及び28日目のMTSアッセイを用いて定量し、490nmでの吸光度を記録した。4週間にわたって、いずれの時点においても群間に差異は観察されなかった。両群とも、7日目から14日目、21日目のMinO群、及び14日目から21日目のMin24群の28日にわたる吸光度は有意に増加した。
【００９７】
オステオカルシンELISAアッセイ
骨芽細胞の分化は、研究の過程にわたってオステオカルシンの発現によって測定された。この研究の最後の2週間にOCN分泌が増加した。また、18〜20日及び25〜27日に無機質化足場上のOCN分泌の有意な増加があった。
【００９８】
アリザリンレッド及び蛍光染色
細胞研究中の各時点で、足場を固定し、アリザリンレッドで染色して、無機質沈着及び分布を視覚化した。0日目、研究の開始前に、無機質足場上に少量の無機質を予備無機質化処理から見ることができ、より多くの量の無機質をMin24足場に見ることができる。研究の過程で、増加した量の無機質が両方の足場タイプで観察されるが、全体的なMin24足場は、より多くの無機質が存在するようである。
【００９９】
足場を蛍光染色して、足場上の細胞付着及び分布を視覚化した。足場の厚さや表面の粗さが問題になった。細胞は足場の端部及び骨単位の内部に観察される。
【実施例２】
【０１００】
繊維コアの製造（海綿部分の模倣）：ポリL-乳酸（PLLA）及びゼラチンナノファイバーを塩結晶でエレクトロスピニングし、結晶をエレクトロスピニングマットに包埋する。ポリD-L乳酸ナノ繊維の薄層をマット上にエレクトロスピニングする。次にマトリックスを1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩（EDC）に暴露することにより架橋させる。塩結晶は浸出によって除去され、孔が残る。大きな孔は、足場内の拡散及び細胞の浸潤を増加させる。塩を除去した後、得られたナノファイバーマットを円形に切断し、円筒形に積み重ね、54℃で40分間焼結させる。
【０１０１】
（皮質部分を模倣する）繊維管の作製：PLLA-ゼラチン及びコラーゲンナノファイバーは、上記のようにエレクトロスピニングされる。ポリマーは回転ポリエチレンオキシド（PEO）マイクロファイバー（直径0.295±0.044mm）上にスピニングされる。次いで0.25mlのPDLLAを繊維にエレクトロスピニングし、架橋させる。PEOは非常に水溶性であるために使用される。架橋後、新たに形成された足場をdI水に1時間入れてPEO繊維を溶解させ、中空管を残す。
【０１０２】
支持柱の作製：粉末状のヒドロキシアパタイトを円筒形の鋳型に水で緊密に充填し、44MPaの一定圧力下で10分間保持する。次いで、支柱を700℃で10時間焼結する。
【０１０３】
足場の製造：足場の中央に繊維コアを配置し、繊維管及びHAP支持柱をその周囲に配置する。アセンブリ全体をナノファイバー製PDLA-PLLAシートで包み、制御可能な直径の金型に入れて、焼結中にデバイスを一緒に保持する（54℃で40分間）。焼成後、足場全体が、特殊電場無機質化室で無機質化され、電界を使用して足場を介してイオンを強く通すことによって、通常の静的無機質化よりもはるかに短い時間で足場全体を無機質化する。足場は、模擬体液中で5V下で8時間無機質化される（毎時間変化する）。足場は少なくとも30%に無機質化されている。無機質化後、足場の物理的及び機械的特性が評価される。次いで、HUVECを2週間繊維管内に播種し、組織化された新血管を作製する。次いで、これらの血管を脱細胞化し、足場をクリロトームを用いて直径5mm、厚さ2mmにスライスする。足場をエチレンオキシドガスを用いて滅菌し、自己マウスBMSCを移植の1週間前に足場に播種する。