(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタサーコウイルスが夾雑する溶液のｐＨを３.８〜７.０に調整する工程、及び
ｐＨを調製した溶液を、バクテリオファージ  ＰＰ７に対するＬＲＶが４以上であるろ過膜で処理する工程を含み、
前記溶液がタンパク質を含み、タンパク質濃度が０.１０〜１.５ｗ／ｖ％であり、
前記ろ過膜の前記ＬＲＶは、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、及び１０7ｐｆｕ／ｍＬのバクテリオファージ  ＰＰ７を含み、ｐＨが７．４であるＰＢＳバッファー溶液を５０Ｌ／ｍ2負荷した場合におけるＬＲＶである、ブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法。
【請求項２】
前記ｐＨを調製した溶液におけるグリシン濃度は、０〜０．５０Ｍである、請求項１に記載のブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法。
【請求項３】
０.０１０〜０.４０Ｍのグリシンを含む、請求項２に記載のブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法。
【請求項４】
０.２０〜０.３５Ｍのグリシンを含む、請求項２に記載のブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法。
【請求項５】
前記タンパク質がＩｇＧである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法。
【請求項６】
前記ｐＨを調製した溶液を、５０〜１００Ｌ／ｍ2で処理する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法。
【請求項７】
ブタサーコウイルスに対するＬＲＶが２以上である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血漿分画製剤やバイオ医薬品の製造工程に混入したウイルスに対する対策は、ウイルスの検出、不活化及び除去である。
ウイルスを不活化する方法には、加熱処理法や化学薬品処理法（例えば、Ｓｏｌｖｅｎｔ／Ｄｅｔｅｒｇｎｔ：Ｓ／Ｄ処理）等がある。これらの方法は、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ；ＨＩＶ）やＣ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ；ＨＣＶ）等のエンベロープウイルスに対して特に有効な不活化処理方法として知られている。
しかし、ヒトパルボウイルスＢ１９（Ｈｕｍａｎ  ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ  Ｂ１９；Ｂ１９）やＡ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ａ  ｖｉｒｕｓ；ＨＡＶ）等のノンエンベロープウイルスは、上記ウイルス不活化方法に対して抵抗性を有しており、エンベロープウイルスに対するほどの効果が期待できない。【０００３】
ウイルスを除去する方法には、膜ろ過法等がある。膜ろ過法は、粒子の大きさに応じて分離操作を行うので、分離する対象の化学的特性や熱的性質に拘わらず、大きさのみに応じて、ウイルスを除去することができるという利点があると考えられている。そのため、近年、ウイルス除去膜による膜ろ過法が一般的に採用されている。また、セルロース系ウイルス除去膜は素材が親水性の天然素材であるため、タンパク製剤の膜への吸着が少なく、幅広い製剤の製造において用いられている。【０００４】
ノンエンベロープウイルスであるパルボウイルスとしては、例えば、Ｂ１９、マウス微小ウイルス（Ｍｉｎｕｔｅ  ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  ｍｉｃｅ；ＭＶＭ）、ブタパルボウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ；ＰＰＶ）等がある。
Ｂ１９はパルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）に属する直鎖一本鎖ＤＮＡウイルスであり、その大きさは約１８〜２４ｎｍである。
パルボウイルス等に対する堅牢性の高いウイルス除去方法としても、ウイルス除去膜による膜ろ過法が普及している。この膜ろ過法の基本原理は、使用するウイルス除去膜の孔径によって、目的タンパク質はウイルス除去膜を通過するが、ウイルスは通過できない条件を設定することによって達成される。【０００５】
特許文献１には、Ｂ１９の除去について、アミノ酸溶液をｐＨ４〜８に調整することによりＢ１９を凝集させ、膜にＢ１９を捕捉させる手法が開示されている。
また、特許文献２には、タンパク質溶液をｐＨ６未満かつ電気伝導度７ｍＳ／ｃｍ以下に調整して保持することによりＢ１９を凝集させ、次いで単分散状態のウイルス径よりも大きい膜孔径を有する親水性膜に該タンパク質溶液を透過させることを特徴とする、タンパク質溶液中のウイルスを除去する方法が開示されている。【０００６】
ブタサーコウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ；以下、「ＰＣＶ」という場合がある。）は現在知られている最も小さなウイルスであり、その粒子径は１６〜２０．７ｎｍである。ＰＣＶは、サーコウイルス科に属し、例えばＰＣＶ１、ＰＣＶ２等に分類される。ＰＣＶはバイオ医薬品の製造工程に混入するリスクの高いウイルスの一つであり、２０１０年に混入事例が報告されている。ＰＣＶは、低ｐＨ処理、加熱処理にも耐性であり、非特許文献１における検討によれば、ＰＣＶを単分散させた溶液中でのウイルス除去膜の除去率は、Ｐｌａｎｏｖａ２０Ｎで０．１−０．７ｌｏｇ、Ｐｌａｎｏｖａ１５Ｎで１．３−１．８ｌｏｇと低いウイルス除去性能しか得られず、多くのバイオ医薬品の製造工程で導入されているウイルス除去膜では除去できない。
一方、非特許文献１には、ＰＣＶはイオン交換体処理では吸着除去できることが開示されているものの、これまでに、より効果的にＰＣＶを除去する方法の検討が十分にされているとはいえない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００４−３３９０７９号公報
【特許文献２】特開２００６−１５１８４０号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｙａｎ  Ｂ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ  （ＰＣＶ）  ｒｅｍｏｖａｌ  ｂｙ  Ｑ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｐｒｏｇ．  ２０１３；  ２９：１４６４−１４７１．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明が解決しようとする課題は、ブタサーコウイルスが夾雑する溶液の新規な処理方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法として、特定のｐＨに調整したブタサーコウイルスが夾雑する溶液を、特定のろ過膜で処理する、新規な処理方法を提供することができることを見出し、本発明を完成した。【００１１】
本発明は、以下のとおりである。
（１）
ブタサーコウイルスが夾雑する溶液のｐＨを３.０〜７.０に調整する工程、及び
ｐＨを調製した溶液を、バクテリオファージ  ＰＰ７に対するＬＲＶが４以上であるろ過膜で処理する工程を含む、ブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法。
（２）
前記ｐＨを調製した溶液が０．５０Ｍ以下のグリシンを含む、（１）に記載のブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法。
（３）
０.０１０〜０.４０Ｍのグリシンを含む、（２）に記載のブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法。
（４）
０.２０〜０.３５Ｍのグリシンを含む、（２）に記載のブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法。
（５）
前記ブタサーコウイルスが夾雑する溶液が５．０ｗ／ｖ％以下のタンパク質を含む、（１）〜（４）のいずれかに記載のブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法。
（６）
前記ブタサーコウイルスが夾雑する溶液のタンパク質濃度が０.１０ｗ／ｖ％未満の場合、前記ブタサーコウイルスが夾雑する溶液のｐＨを３.０〜６.０に調整する、（５）に記載のブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法。
（７）
前記ブタサーコウイルスが夾雑する溶液のタンパク質濃度が０.１０〜１.５ｗ／ｖ％の場合、前記ブタサーコウイルスが夾雑する溶液のｐＨを３.８〜７.０に調整する、（５）に記載のブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法。
（８）
前記タンパク質がＩｇＧである、（５）〜（７）のいずれかに記載のブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法。
（９）
前記ｐＨを調製した溶液を、５０〜１００Ｌ／ｍ2で処理する、（１）〜（８）のいずれかに記載のブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法。
（１０）
ブタサーコウイルスに対するＬＲＶが２以上である、（１）〜（９）のいずれかに記載のブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法。
（１１）
被処理溶液のｐＨを３.０〜７.０に調整する工程、及び
ｐＨを調製した溶液を、バクテリオファージ  ＰＰ７に対するＬＲＶが４以上であるろ過膜で処理する工程を含む、溶液の処理方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ブタサーコウイルスが夾雑する溶液の新規な処理方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１において、０．３０Ｍグリシンバッファーを用いて、ｐＨ３．０〜８．０の条件下でのＰＣＶ除去能力の変化を確認した結果を示す図である。
【図２】実施例２において、０．１０〜２．０Ｍグリシンバッファー（ｐＨ４．０）の条件下での、ＰＣＶ除去能力の変化を確認した結果を示す図である。
【図３】実施例３において、０．１０％ＩｇＧ及び０．１０Ｍグリシン条件下でのｐＨのＰＣＶ除去に及ぼす影響を確認した結果を示す図である。
【図４】実施例４において、０．１０％ＩｇＧ及びｐＨ６．０条件下でのグリシン濃度のＰＣＶ除去に及ぼす影響を確認した結果を示す図である。
【図５】実施例５において、０．３０Ｍグリシンバッファー（ｐＨ６．０）条件下でのＩｇＧ濃度のＰＣＶ除去に及ぼす影響を確認した結果を示す図である。
【図６】実施例６において、１．０％ＩｇＧ含有０．３０Ｍグリシン（ｐＨ６．０）条件下でのＰ−１５及びＰ−２０でのろ過後のＩｇＧ回収率を確認した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施形態」と言う。）について説明する。本発明は、以下の実施形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施できる。
【００１５】
本実施形態の、ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）が夾雑する溶液の処理方法は、
ブタサーコウイルスが夾雑する溶液のｐＨを３.０〜７.０に調整する工程、及び
ｐＨを調製した溶液を、バクテリオファージ  ＰＰ７に対するＬＲＶが４以上であるろ過膜で処理する工程を含む。
【００１６】
本実施形態の処理方法に供される試料は、ＰＣＶが夾雑する溶液である。
本明細書において「ＰＣＶが夾雑する溶液」は、ＰＣＶが溶液中に存在する溶液であってもよく、ＰＣＶの夾雑可能性がある溶液を含む。
ＰＣＶの夾雑可能性がある溶液としては、ＰＣＶが実際に夾雑している必要はなく、溶液の作成過程において、ＰＣＶが夾雑する可能性がある溶液であってよい。ＰＣＶの夾雑可能性がある溶液としては、ＰＣＶが夾雑していることを妨げるものではない。
ＰＣＶが夾雑する溶液としては、例えば、ＰＣＶの夾雑可能性があるタンパク質を含む溶液であってもよいし、ＰＣＶの夾雑可能性があり、タンパク質を含まない溶液であってもよく、ＰＣＶが夾雑し、タンパク質を含む溶液であってもよく、ＰＣＶが夾雑し、タンパク質を含まない溶液であってもよい。
ＰＣＶが夾雑する溶液としては、例えば、ヒトや哺乳動物等の体内液体成分である体液等が挙げられ、体液の具体例としては、特に限定されるものではないが、血液（血清及び血漿）、唾液、汗、尿、鼻水、精液、血漿、リンパ液、酵素及び組織液等が挙げられる。
ＰＣＶが夾雑する溶液としては、これらの体液等を原料として精製して得られた溶液であってもよく、体液等を希釈して得られる体液等を含有する溶液であってもよい。
ＰＣＶが夾雑する溶液には、細胞培養後の培地、細胞培養後の培養上清等であってもよく、細胞としては遺伝子組換えの技術のために使用される細胞であってもよい。
ＰＣＶが夾雑する溶液としては、これらの培地等を原料として精製して得られた溶液であってもよく、培地等を希釈して得られる培地等を含有する溶液であってもよい。
ＰＣＶが夾雑する溶液としては、細胞培養で作られるワクチン、抗体医薬、遺伝子組み換え製剤等であってもよい。また、その製造工程において生体組織由来の酵素を用いるような製剤等であってもよい。
【００１７】
本明細書において、ＰＣＶが夾雑する溶液には、タンパク質を含んでいても含んでいなくてもよいが、５．０ｗ／ｖ％以下のタンパク質を含む、すなわち、０〜５．０ｗ／ｖ％のタンパク質を含むことが好ましい。
本実施形態において体液や培地等を原料として精製して得られた溶液には、タンパク質が含まれる。
【００１８】
本実施形態において、ＰＣＶが夾雑する溶液に含有されるタンパク質としては、特に限定されないが、例えば、抗体、エリスロポイエチン、トロンボポイエチン、組織型プラスミノーゲンアクチベータ、プロウロキナーゼ、トロンボモジュリン、アンチトロンビンＩＩＩ、プロテインＣ、血液凝固因子ＶＩＩ、血液凝固因子ＶＩＩＩ、血液凝固因子ＩＸ、血液凝固因子Ｘ、血液凝固因子ＸＩ、血液凝固因子ＸＩＩ、プロトロンビン複合体、フィブリノゲン、アルブミン、性腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子、アクチビン、骨形成因子、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ等の幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン２、インターロイキン６、インターロイキン１０、インターロイキン１１、可溶性インターロイキン４受容体、腫瘍壊死因子α、Ｄｎａｓｅｌ、ガラクトシダーゼ、αグルコシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ヘモグロビン、トランスフェリン等のタンパク質、及びこれらタンパク質の部分断片が挙げられる。
本実施形態において、ＰＣＶが夾雑する溶液に含有されるタンパク質としては、上述のタンパク質又はそのタンパク質の部分断片に放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、又は異なるタンパク質又はそのタンパク質の部分断片等を化学的又は遺伝子工学的に結合させたタンパク質又はそのタンパク質の部分断片であってもよい。
ＰＣＶが夾雑する溶液に含有されるタンパク質としては、免疫グロブリン等の抗体が好ましく、免疫グロブリンのうちでもＩｇＧが好適である。
【００１９】
ＰＣＶが夾雑する溶液にタンパク質を含有する場合、ＰＣＶが夾雑する溶液の具体例としては、特に限定されるものではないが、抗体製剤の製造工程で得られる溶液が挙げられる。
抗体の分離精製工程では、原料血漿のイオン濃度、アルコール濃度、反応温度及びタンパク濃度を適切に組み合わせることによって、原料血漿中に含まれているタンパク質の溶解度をコントロールし、特定のタンパクを沈殿させる。そして、沈殿させたタンパク質と上澄みを高速遠心分離器で分離した後、必要な沈殿物又は上澄みを採取する。そして、その得られた沈殿物又は上澄みに対し、前記条件とは異なる条件を適宜設定することで別のタンパク質を沈殿させる。以上の工程を繰り返して原料血漿から不純物を順次除去していくことで、高純度の抗体を含有する溶液が得られる。抗体の分離精製工程中に得られる溶液のいずれも、本実施形態におけるＰＣＶが夾雑する溶液として用いることができる。
【００２０】
抗体としては、例えば、ヒト抗体、ヒト型キメラ抗体及びヒト型相補性決定領域移植抗体等のヒト化抗体、並びにこれらの抗体断片等が挙げられる。
抗体は可変領域（Ｖ領域）と定常領域（Ｃ領域）より構成され、重鎖の可変領域をＶＨ、軽鎖の可変領域をＶＬ、重鎖の定常領域をＣＨ、軽鎖の定常領域をＣＬという。
ヒト型キメラ抗体とは、ヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬとヒト抗体のＣＨ及びＣＬとからなる抗体をいう。ヒト型キメラ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを設計、構築し、ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするｃＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ移植抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒト免疫グロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
ヒト以外の動物とは、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等をいう。また、ＩｇＧの共存によってＭＶＭ、ＰＰＶの凝集が阻害されることが知られている。
【００２１】
抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ及びＣＤＲを含むペプチド等が挙げられる。
Ｆａｂは、ＩｇＧ型抗体分子をタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。Ｆａｂは、抗体をタンパク質分解酵素パパインで処理することにより又は、該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより、製造することができる。
【００２２】
本実施形態において、ＰＣＶが夾雑する溶液のｐＨを３.０〜７.０に調整する工程は、ＰＣＶが夾雑する溶液のｐＨを測定し、ｐＨを３.０〜７.０に調整することにより行われる。
ＰＣＶが夾雑する溶液のタンパク質濃度が０．１０ｗ／ｖ％未満の場合には、ＰＣＶが夾雑する溶液のｐＨをｐＨ３．０〜６．０に調整するのが好ましい。
ＰＣＶが夾雑する溶液のタンパク質濃度が０．１０〜１．５ｗ／ｖ％の場合には、ＰＣＶが夾雑する溶液のｐＨを３．８〜７．０に調整するのが好ましく、より好ましくはｐＨ５．５〜６．５に調整する。
ｐＨ調整は塩基、酸及び緩衝液を用いて行なうことができる。塩基としては、例えば、水酸化ナトリウムが挙げられ、酸としては、無機酸及び有機酸のいずれを用いてもよく、例えば、塩酸が挙げられ、緩衝液としては、例えば、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液及びリン酸緩衝液等が挙げられる。
【００２３】
ウイルス除去の観点から、ｐＨを調整して得られた溶液は、グリシンを含むことが好ましい。
ｐＨを調整した溶液におけるグリシン濃度は０．５０Ｍ以下、すなわち、０〜０．５０Ｍであることが好ましく、より好ましくは０．０１０〜０．４０Ｍであり、さらに好ましくは０．２０〜０．３５Ｍである。
ＰＣＶが夾雑する溶液のタンパク質濃度が０．１０〜１．５ｗ／ｖ％の場合には、ｐＨを調整した溶液におけるグリシン濃度を０．０１０〜０．５０Ｍに調整するのが好ましく、より好ましくは０．０１０〜０．３０Ｍに調整する。
【００２４】
ＰＣＶが夾雑する溶液にタンパク質が含有される場合、ｐＨを調整した溶液におけるグリシン濃度やｐＨは、当該タンパク質の濃度によっても適宜調整される。
本実施形態においては、ｐＨを調整することによって、目的タンパク質の性質及び収率に影響を与えることなく、ろ過によりＰＣＶを効果的に除去することができる。また、グリシン濃度を好適な範囲に調整することによって、より効果的にＰＣＶを除去することができる。
これは、理論に束縛されるものではないが、試料中に夾雑するＰＣＶが凝集し、試料中に含有される目的タンパク質の分子よりも凝集したＰＣＶが大きくなることにより、効率的に除去されたためと考えられる。
【００２５】
本実施形態において、ｐＨを調製した溶液を、バクテリオファージ  ＰＰ７に対するＬＲＶが４以上であるろ過膜で処理する工程は、バクテリオファージ  ＰＰ７に対するＬＲＶが４以上であるろ過膜に、ｐＨを調製した溶液を通液することにより行われる。
本実施形態においては、バクテリオファージ  ＰＰ７に対するＬＲＶが４以上であるろ過膜で処理することで、ＰＣＶを効果的に除去することができる。
【００２６】
バクテリオファージ  ＰＰ７に対するＬＲＶが４以上であるろ過膜とは、使用するろ過膜に対し、バクテリオファージ  ＰＰ７を含む溶液を５０Ｌ／ｍ2負荷した場合におけるＬＲＶが４以上となる膜である。バクテリオファージ  ＰＰ７を含む溶液としては、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ溶液（ＰＢＳバッファー、ｐＨ  ７．４）にバクテリオファージ  ＰＰ７濃度を１０7ｐｆｕ／ｍＬとしたものが用いられる。
【００２７】
使用するろ過膜の形状は、特に限定されるものではないが、例えば、平膜であってもよいし、中空糸膜であってもよい。平膜を用いる場合、一枚でろ過を行ってもよいし、複数枚重ねてろ過を行ってもよい。
【００２８】
バクテリオファージ  ＰＰ７に対するＬＲＶが４以上であるろ過膜に、ｐＨを調製した溶液を通液してろ過することにより、ｐＨを調製した溶液は、バクテリオファージ  ＰＰ７に対するＬＲＶが４以上であるろ過膜で処理される。
ろ過方法は、全ろ過で行ってもよいし、クロスフロー方式で行ってもよい。
バクテリオファージ  ＰＰ７に対するＬＲＶが４以上であるろ過膜で処理する前に、平均孔径が２０ｎｍよりも大きい孔径の膜で予備的に処理してもよい。
【００２９】
バクテリオファージ  ＰＰ７に対するＬＲＶが４以上であるろ過膜の具体例としては、セルロースからなるＰｌａｎｏｖａTM１５Ｎ（旭化成メディカル（Ａｓａｈｉ  Ｋａｓｅｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ）社製）及びＰｌａｎｏｖａTM２０Ｎ（旭化成メディカル（Ａｓａｈｉ  Ｋａｓｅｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ）社製）、親水化ＰＶＤＦからなるＰｌａｎｏｖａTMＢｉｏＥＸ（旭化成メディカル（Ａｓａｈｉ  Ｋａｓｅｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ）社製）及びＰｅｇａｓｕｓ  ＳＶ４（Ｐａｌｌ社製）、並びに親水化ＰＥＳからなるＶｉｒｏｓａｒｔ  ＣＰＶ  （Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製）及びＶｉｒｅｓｏｌｖｅ  Ｐｒｏ  （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）等が挙げられる。
バクテリオファージ  ＰＰ７に対するＬＲＶが４以上であるろ過膜として、セルロースからなるウイルス除去膜の場合、ウイルス除去膜が有する空孔の平均孔径によって好ましい膜を規定することもできる。ウイルス除去膜が有する空孔の平均孔径は、例えば、１３ｎｍ以上２１ｎｍ以下である。
【００３０】
空孔の平均孔径は、国際公開第２０１５／１５６４０１号に記載の方法を参考にして、以下の計算式により算出することができる。
平均孔径（ｎｍ）＝２×１０３×√（Ｖ・ｄ・μ／Ｐ・Ａ・Ｐｒ）
ここで、Ｖは透水量（ｍＬ／分）、ｄは膜厚（μｍ）、μは水の粘度（ｃｐ）、Ｐは圧力差（ｍｍＨｇ）、Ａは膜面積（ｃｍ2）、Ｐｒは空孔率（％）を示す。
透水量は、１０本の糸を束ね、１６ｃｍの有効長さになるようにモジュールを作成し、得られたモジュールの一端を閉とし、他端に２００ｍｍＨｇの圧力をかけ、３７℃で水を通した。このとき膜を通して出てくる水の量を透水量として測定した。
膜面積は、乾燥状態での内径を測定して算出した。また、膜厚は、乾燥状態における膜厚を意味する。
空孔率は、以下の計算式により算出する。
空孔率（％）＝（１−ρａ／ρｐ）×１００
中空糸の見掛け密度ρａは、以下の計算式により算出し、ρｐはセルロースの密度（ｇ／ｃｍ3）を意味する。
中空糸の見掛け密度（ｇ／ｃｍ3）＝Ｗｄ／Ｖｗ＝４Ｗｄ／πｌ（Ｄｏ2−Ｄｉ2）
ここで、Ｗｄは中空糸の絶乾重量（ｇ）、Ｖｗは中空糸の見かけ体積（ｃｍ3）を意味し、ｌは中空糸の長さ（ｃｍ）、Ｄｏは中空糸の外径（ｃｍ）、Ｄｉは中空糸の内径（ｃｍ）を意味する。
【００３１】
本実施形態において、ＬＲＶとは、ウイルス除去係数（Ｌｏｇ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  Ｖａｌｕｅ）を意味し、対数で表されるウイルスの減少度であって、除去係数ともいう。
ＬＲＶは、以下の計算式により求められる。
ＬＲＶ＝Ｌｏｇ［（Ｖ1×Ｔ1））］／［（Ｖ2×Ｔ2））］
Ｖ1：ウイルス除去処理工程前の試料の容量
Ｔ1：ウイルス除去処理工程前のウイルス量（力価）
Ｖ2：ウイルス除去処理工程後の試料の容量
Ｔ2：ウイルス除去処理工程後のウイルス量（力価）
【００３２】
バクテリオファージ  ＰＰ７のウイルス量は、特に限定されるものではないが、プラークアッセイ法（Ｐｌａｑｕｅ  ａｓｓａｙ  ｍｅｔｈｏｄ）で測定することができる。
プラークアッセイ法は、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００８；Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｖｏｌｕｍｅ  ６２  Ｎｏ．Ｓ−４に記載の方法に従い、実施することができる。
バクテリオファージ  ＰＰ７を含む溶液サンプルを段階希釈し、それぞれのサンプルを緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）と混合した後、軟寒天を加える。混合溶液を寒天プレート上に注ぎ、固化させた後に３７℃で一日培養する。翌日肉眼でプラーク数を計測し、下記式により元の溶液に含まれていたファージ濃度ｐｆｕ（ｐｌａｑｕｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）／ｍＬを算出する。
（プラーク数×希釈倍率）ｐｆｕ／サンプル量（ｍＬ）  ｐｆｕ／ｍＬ
【００３３】
本実施形態においては、本実施形態に処理方法によるＰＣＶ除去の指標として、ＬＲＶにより確認することができる。
ＰＣＶに対するＬＲＶは、上記式において、ＰＣＶのウイルス量測定することにより求めることができる。
ＰＣＶのウイルス量は、特に限定されるものではないが、定量ＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：  Ｑ−ＰＣＲ）で測定することができる。
定量ＰＣＲ法は、Ｙａｎｇらの方法（非特許文献１に記載）に従い、実施することができる。この場合、プライマーとしてＰＣＶ−１  ＴＭ Ｆｗｄ．： ＡＧＡＡＡＧＧＣＧＧＧＡＡＴＴＧＡＡＧＡＴＡＣ（配列番号１）、ＰＣＶ−１  ＴＭ Ｒｅｖ．：ＣＡＣＡＣＣＣＣＧＣＣＴＴＣＡＧＡＡ（配列番号２）、プローブとしてＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ：６ＦＡＭ−ＣＧＴＣＴＴＴＣＧＧＣＧＣＣＡＴＣＴＧＴＡＡＣＧ−ＴＡＭＲＡ（配列番号３）を使用する。
本実施形態においては、ＰＣＶのＬＲＶを測定した場合に、２以上である場合に効果的にＰＣＶが除去されたと判断することができる。
【００３４】
本実施形態において、バクテリオファージ  ＰＰ７に対するＬＲＶが４以上であるろ過膜に供されるｐＨを調整した溶液は、ウイルス除去膜面積当たりのろ過液量として、５０〜１００Ｌ／ｍ2で処理することが好適である。
５０〜１００Ｌ／ｍ2で処理することにより、ウイルス除去膜にタンパク質等の目詰まりを生じることなく、効果的に試料をろ過することができる。
ウイルス除去膜面積は、ろ過面（一次側の表面）の面積として計算する。平膜の場合は、２辺の長さから算出した面積であり、中空糸膜の場合は、中空糸の内側（内表面）の面積となる。
ろ過液量は、一定のろ過圧力条件下でのろ過において、ろ過時間により調節することができる。
【００３５】
本実施形態のＰＣＶが夾雑する溶液の処理方法により、ＰＣＶを含む溶液を所定のｐＨに溶液調製を行うことで、一般的なウイルス除去膜の孔径よりも小さいＰＣＶを凝集させ、ウイルス除去膜で除去することができる。また、本実施形態のＰＣＶが夾雑する溶液の処理方法により、ＰＣＶの夾雑可能性がある溶液（夾雑していない場合を含む）に対して安全性を担保できるという効果を得ることができる。
したがって、本実施形態においては、被処理溶液のｐＨを３.０〜７.０に調整する工程、及びｐＨを調製した溶液を、バクテリオファージ  ＰＰ７に対するＬＲＶが４以上であるろ過膜で処理する工程を含む、溶液の処理方法をも提供する。
本実施形態のＰＣＶが夾雑する溶液がタンパク質を含有する場合には、ウイルス除去膜で処理することにより、安全性とタンパク質透過性を同時に満足させることができる。また、本実施形態のＰＣＶが夾雑する溶液がタンパク質を含有しない場合には、ウイルス除去膜で処理することにより、ＰＣＶを除去することができる。
すなわち、本実施形態の処理方法により、ＰＣＶを含む溶液から、ＬＲＶ４以上の膜を用いてろ過することにより、溶液からＰＣＶを除去することができ、また、ＰＣＶの夾雑可能性のある溶液に対し、ろ過することにより、安全性を担保できる。加えて、本実施形態の処理方法により、タンパク質含有の有無によらず、本方法によりＰＣＶを除去することができ、また、タンパク質含有液であれば、高い透過性・安全性を同時に満足することができる。
以下の実施例に示すとおり、ある態様においては、本実施形態の処理方法によれば、目的タンパク質の回収率は８０％以上であった。すなわち、本実施形態の処理方法により、ＰＣＶが除去された安全性の高い製品を提供することができる。
【実施例】
【００３６】
本発明の理解を助けるために、以下に実施例を示して具体的に本発明を説明するが、本発明は本実施例に限定されるものでないことはいうまでもない。【００３７】
（実施例１）グリシンバッファー条件下での至適ｐＨの検討
０.３０Ｍグリシンバッファーを用いて、ｐＨ３．０〜８．０の条件下でのＰＣＶ除去能力の変化をＬＲＶにより確認した。【００３８】
１．材料・使用
・ウイルス株（ＰＣＶ）：ＰＣＶのウイルスソースは豚腎臓由来株化細胞（ＰＫ（１５）細胞: ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ−３３）の培養液を用いた。ＰＫ（１５）細胞、１.０ｘ１０5  ｃｅｌｌｓ／ｍＬを５％ウシ胎児血清含有ダルベッコ改変イーグル培地に播種・培養し（３７℃、５％ＣＯ2）、培養４日目の培養上清をウイルスソースとして用いた。ウイルスソースの保存は−８０℃で行った。ウイルスソースのゲノム濃度は１０．１７Ｌｏｇ ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬであった。
・グリシンバッファー：１．２Ｌの純水に対し、２７．０ｇのグリシン（購入メーカー：ＷＡＫＯ）を加え、スターラーで撹拌し、溶解させた。グリシンが完全に溶解した後、スターラーで撹拌しながら０．５０Ｍの塩酸または水酸化ナトリウム水溶液を加えて目的のｐＨに調整した。
・使用ろ過膜：旭化成メディカル株式会社製のＰｌａｎｏｖａ１５Ｎ（以下、「Ｐ−１５」と称する）、Ｐｌａｎｏｖａ２０Ｎ（以下、「Ｐ−２０」と称する）、Ｐｌａｎｏｖａ３５Ｎ（以下、「Ｐ−３５」と称する）を用いた。膜面積は０.００１ｍ2であり、ＰＰ７に対するＬＲＶは、Ｐ−１５及びＰ−２０は＞６．５であり、Ｐ−３５は０であった。
・ＰＣＲ用試薬：ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｐｒｏｂｅ ＰＣＲ Ｋｉｔ、入手先ＱＩＡＧＥＮ
・ＩｇＧ：献血ヴェノグロブリンＩＨ（日本血液製剤機構）、濃度１０％、生物種ヒト【００３９】
２．方法
ｐＨ３．０〜８．０に調整した０．３０Ｍグリシンバッファー０．１Ｌに、それぞれＰＣＶを１ｍＬ加えた（１／１００量に相当）。これらの試料を使用ろ過膜に対し、ろ過圧０．０８ＭＰａ、処理溶液量０．０３Ｌの条件で、デッドエンドろ過を行った。
ろ過膜は、実施例としてＰ−１５、Ｐ−２０、比較例としてＰ−３５を用いた。ろ過前後のＰＣＶゲノム量をＱ−ＰＣＲ法により測定し、ＬＲＶを算出した。
結果を図１及び表１に示す。【００４０】
３．ＰＣＶ除去能力は、以下の式で算出される除去係数（ＬＲＶ）に基づいて判断した。
ＬＲＶ＝Ｌｏｇ  ［（Ｖ1×Ｔ1））］／［（Ｖ2×Ｔ2））］
Ｖ1：ウイルス除去処理工程前の試料のＰＣＶゲノム容量
Ｔ1：ウイルス除去処理工程前のＰＣＶゲノム量
Ｖ2：ウイルス除去処理工程後の試料のＰＣＶゲノム容量
Ｔ2：ウイルス除去処理工程後のＰＣＶゲノム量【００４１】
４．結果
上記の濃度の、グリシンバッファー存在下においてＰＣＶは、ｐＨ依存的にウイルス除去膜で除去されることが確認された。ｐＨ４．０におけるＰ−１５及びＰ−２０ＬＲＶは≧５．０であった（表１・図１）。ｐＨ４．０におけるＰ−３５のＬＲＶは３．８であった。なお、図１に示す矢印の箇所は、検出限界以下にウイルスが減少したことを示す。【００４２】
【表１】
0006731055.tif 000002
【００４３】
（実施例２）至適グリシン濃度の検討
本実施例では、０．１０〜２．０Ｍグリシンバッファー（ｐＨ４．０）の条件下でのＰＣＶ除去能力の変化を確認した。グリシンバッファーのｐＨを４に固定し、グリシン濃度を０．１〜２．０Ｍ条件とした他は、実施例１と同様に各試料を調製した。各試料について実施例１と同手法によりろ過を行い、ＬＲＶを算出した。結果を図２及び表２に示す。【００４４】
【表２】
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【００４５】
Ｐ−１５、Ｐ−２０のいずれを用いた場合でも、グリシン濃度０．１０Ｍ、０．３０ＭにおけるＬＲＶはそれぞれ≧４．５、≧５．０であった。グリシン濃度が０．５０Ｍの場合、ＬＲＶはそれぞれ４．２、３．９であった。Ｐ−３５を用いた場合には、グリシン濃度０．１０Ｍ、０．３０ＭにおけるＬＲＶはそれぞれ４．５、３．８であった（表２）。なお、図２に示す矢印の箇所は、検出限界以下にウイルスが減少したことを示す。【００４６】
０．１０Ｍグリシンバッファー（ｐＨ４．０）の条件下ではＩｇＧ濃度が低い条件でウイルス除去能力が高かった。【００４７】
（実施例３）０．１０％ＩｇＧ及び０．１０Ｍグリシン条件下での至適ｐＨの検討
本実施例では、０．１０％ＩｇＧ及び０．１０Ｍグリシン条件下でのｐＨのＰＣＶ除去に及ぼす影響を確認した。０．１０Ｍグリシンバッファー（ｐＨ３．５〜６．０）に０．１０％ＩｇＧを添加した他は、実施例１と同様に各試料を調製した。Ｐ−１５を用いて実施例１と同条件にて各試料のろ過を行い、ＬＲＶを算出した。結果を図３及び表３に示す。【００４８】
【表３】
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【００４９】
（実施例４）０．１０％ＩｇＧ及びｐＨ６．０条件下での至適グリシン濃度の検討
本実施例では、０．１０％ＩｇＧ及びｐＨ６．０条件下でのグリシン濃度のＰＣＶ除去に及ぼす影響を確認した。０．１０〜０．５０Ｍのグリシンバッファー（ｐＨ６．０）に０．１０％ＩｇＧを添加した他は、実施例１と同様に各試料を調製した。Ｐ−１５及びＰ−２０を用いて実施例１と同条件にて各試料のろ過を行い、ＬＲＶを算出した。結果を図４及び表４に示す。【００５０】
【表４】
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【００５１】
（実施例５）０．３０Ｍグリシン及びｐＨ６．０条件下でのタンパク質濃度の検討
本実施例では、０．３０Ｍグリシンバッファー（ｐＨ６）条件下でのＩｇＧ濃度のＰＣＶ除去に及ぼす影響を確認した。０．３０Ｍグリシンバッファー（ｐＨ６）に０．１０〜５．０％ＩｇＧを添加した他は、実施例１と同様に各試料を調製した。ＩｇＧ濃度１．０％の条件では、Ｐ−１５とＰ−２０をそれぞれ２本ずつ用い、それ以外のＩｇＧ濃度ではＰ−２０を用いて、実施例１と同条件にて各試料のろ過を行い、ＬＲＶを算出した。結果を図５及び表５に示す。【００５２】
【表５】
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【００５３】
（実施例６）１％ＩｇＧ含有０．３０Ｍグリシン（ｐＨ６．０）条件下でのろ過によるタンパク質回収率
本実施例では、１％ＩｇＧ含有０．３０Ｍグリシン（ｐＨ６．０）条件下でのＰ−１５及びＰ−２０でのろ過後のＩｇＧ回収率を確認した。ろ過後のＩｇＧの回収率は吸光光度計により測定した（Ａ２８０ｎｍ）。Ｐ−１５及びＰ−２０に対し１５０ｍＬ及び５３ｍＬの試料液量を負荷したとき、ろ過後の回収液量は、１４７．６ｍＬ及び５０．７ｍＬであった。回収率（％）は、それぞれ負荷したサンプルのＩｇＧ量を１００％としたときのろ過後サンプルのＩｇＧ量を示した。Ｐ−２０では９８％、Ｐ−１５では９４％の回収率であった（図６）。【００５４】
本出願は、２０１６年８月９日出願の日本特許出願（特願２０１６−１５６５０６号）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明の方法は、特に、血漿分画製剤やバイオ医薬品の製造において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００５６】
配列番号１は、プライマー（ＰＣＶ−１  ＴＭ Ｆｗｄ．）の塩基配列を示す。
配列番号２は、プライマー（ＰＣＶ−１  ＴＭ Ｒｅｖ．）の塩基配列を示す。
配列番号３は、プローブ（ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ）の塩基配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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