(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｈ鎖可変領域（ＶＨ）及びＬ鎖可変領域（ＶＬ）を含む、抗セラミド抗体またはその抗原結合性フラグメントであって：
前記ＶＨは、配列：ＧＹＴＦＴＤＨＴＩＨ（配列番号１）を含むＨ鎖可変領域ＣＤＲ１、配列：ＹＮＹＰＲＤＧＳＴＫＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号２）を含む前記Ｈ鎖可変領域ＣＤＲ２、及び、配列：ＧＦＩＴＴＶＶＰＳＡＹ（配列番号３）を含むＨ鎖可変領域ＣＤＲ３を含み、並びに、
前記ＶＬは、配列：ＲＡＳＫＳＩＳＫＹＬＡ（配列番号４）を含むＬ鎖可変領域ＣＤＲ１、配列：ＳＧＳＴＬＱＳ（配列番号５）を含むＬ鎖可変領域ＣＤＲ２、及び、配列：ＱＱＨＮＥＹＰＷＴ（配列番号６）を含むＬ鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、
前記抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項２】
請求項１に記載の抗セラミド抗体またはその抗原結合性フラグメントであって：
配列番号７を含むＨ鎖可変領域配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有する配列；および、
配列番号８を含むＬ鎖可変領域配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有する配列、
を含む前記抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項３】
抗セラミド抗体またはその抗原結合性フラグメントであって：
配列：ＱＶＱＬＱＱＳＤＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＶＳＧＹＴＦＴＤＨＴＩＨＷＭＫＱＲＰＥＱＧＬＥＷＩＧＹＮＹＰＲＤＧＳＴＫＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＮＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＫＧＦＩＴＴＶＶＰＳＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号４８）であるＨ鎖可変領域配列；および、
配列：ＤＶＱＩＴＱＳＰＳＹＬＡＡＳＰＧＥＴＩＴＩＮＣＲＡＳＫＳＩＳＫＹＬＡＷＹＱＥＫＰＧＫＴＮＫＬＬＩＹＳＧＳＴＬＱＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＭＹＹＣＱＱＨＮＥＹＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号８）であるＬ鎖可変領域配列、
を含む前記抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗セラミド抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、前記抗体がモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、およびｓｃＦｖからなる群から選択される、前記抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項５】
請求項４に記載の抗セラミド抗体であって、ｓｃＦｖである前記抗体。
【請求項６】
請求項１に記載の前記抗セラミド抗体またはその抗原結合性フラグメントと同じ抗原決定基と結合する、抗セラミド抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗セラミド抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、吸入、静脈内、筋肉内、腹腔内、脳脊椎液内、皮下、滑液包内、くも膜下腔内、経口、または局所投与のために調剤されている、前記抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項８】
それを必要とする対象においてアポトーシスを阻害するための薬剤の製造における、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗セラミド抗体またはその抗原結合性フラグメントの使用。
【請求項９】
請求項８に記載の使用であって、前記アポトーシスが移植片対宿主病、放射能疾患、ＧＩ症候群および自己免疫性疾患からなる群から選択される疾患に随伴する前記使用。
【請求項１０】
請求項９に記載の使用であって、前記疾患が放射能疾患またはＧＩ症候群であり、かつ前記抗セラミド抗体またはその抗原結合性フラグメントが、前記対象が放射線に被曝する前に投与される、前記使用。
【請求項１１】
請求項９に記載の使用であって、前記疾患が移植片対宿主病であり、かつ前記対象が移植を受ける前に前記抗セラミド抗体またはその抗原結合性フラグメントが投与される前記使用。
【請求項１２】
請求項１１に記載の使用であって、前記移植片が骨髄移植片である前記使用。
【請求項１３】
対象の透過線への被曝後のＧＩ症候群である該対象におけるアポトーシスの緩和のための薬剤の製造における、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗セラミド抗体またはその抗原結合性フラグメントの使用。
【請求項１４】
請求項１３に記載の使用であって、前記対象の透過線への被曝直後に前記抗セラミド抗体またはその抗原結合性フラグメントを投与する前記使用。
【請求項１５】
請求項１３に記載の使用であって、前記対象の透過線への被曝後２４時間以内に前記抗セラミド抗体またはその抗原結合性フラグメントを投与する前記使用。
【請求項１６】
対象が移植を受ける前または前記対象が移植を受けた後のＧｖＨＤ発症前の、該対象におけるＧｖＨＤにおけるアポトーシスの阻害のための薬剤の製造における、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗セラミド抗体またはその抗原結合性フラグメントの使用。
【請求項１７】
請求項１６に記載の使用であって、前記移植片が骨髄移植片である前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連する出願との相互参照］
本出願は、２０１４年８月７日に出願された米国仮特許出願第６２／０３４，４５３号の優先権を主張する。
【０００２】
本願は、全般的に細胞死を阻害する抗体に関する。具体的には、本発明はセラミドに対する抗体による細胞死の阻害に関する。
【背景技術】
【０００３】
急性放射線症候群（ＡＲＳ）（時に放射線毒性または放射能障害としても知られる）は、たとえば数分程度などの極めて短い時間での、高エネルギーＸ線、ガンマ線、および中性子；などの高線量透過線による身体の大部分の照射によって引き起こされる急性疾患である。この症候群の主な原因は、特定組織における幼若実質幹細胞の枯渇である。ＡＲＳに罹患した人の例は、広島および長崎の原子爆弾生存者、１８８６年のチェルノブイリ原子力発電所事故の後最初に対応した消防士、およびいくつかの滅菌照射器への偶発的被曝である。全般的に、ＡＲＳを引き起こす照射線量は高いものの（すなわち０．７グレイ（Ｇｙ）または７０ｒａｄ超）、０．３Ｇｙまたは３０ｒａｄと低い線量でも軽度の症状が認められることがある。
【０００４】
放射線胃腸（ＧＩ）症候群は、通常約１０Ｇｙ（１０００ｒａｄ）を超える線量で発生するものの、一部の症状は６Ｇｙまたは６００ｒａｄと低線量で発生することがある。ＧＩ管と骨髄の破壊的かつ不可逆的変化により、この症候群での生存の可能性は極めて低い。放射線ＧＩ症候群は、典型的には３つの病期に分けられる。前駆期は被曝より数時間以内に顕在化し、症状には食欲不振、重度の悪心、嘔吐、痙攣、および下痢が含まれる。潜伏期は約２日後より始まり、患者は外見上も気分も良好な場合もあるが、ＧＩ管内表面の細胞および骨髄内の幹細胞は死滅しつつある。被曝より１週間以内に倦怠、食欲不振、重度の下痢、発熱、脱水、および電解質平衡異常を含む症状を伴う明白な疾患期が始まる。通常は２週間以内に感染、脱水および電解質平衡異常によって死亡する。
【０００５】
急性放射線症候群の治療に加えて、現在、急性および慢性白血病、骨髄腫、固形癌を含む数多くの悪性および非悪性疾患の治療に骨髄移植が使用されている。しかし骨髄移植は、宿主において多様な免疫応答を頻繁に惹起し、移植片の拒絶または移植片対宿主病（以降「ＧｖＨＤ」と呼ぶ）を引き起こす。移植に先立ち必要とされる、患者の免疫系を切除または抑制するよう設計された移植前処置により、患者は腫瘍の再発または感染が起こりやすくなる。残念なことに、最近では非血縁者ドナーおよびＨＬＡ不一致ドナーを用いることによってＧｖＨＤの発生率が増加している。ドナー骨髄移植片からＴ細胞を除去するとＧｖＨＤが改善されるものの、この戦略では生着不全率が高まり、また治療的に有益な移植片対腫瘍効果が著しく低下する。このため、全生存は改善しない。さらに、前臨床データは強力であるものの、急性ＧｖＨＤの標準治療である、コルチコステロイドにＴＮＦ拮抗剤を加えることによって、炎症性サイトカイン作用を減少させることによりＧｖＨＤ転帰を改善する試みからは、提供される治療的利益が限られている。
【０００６】
したがって、放射線ＧＩ症候群およびＧｖＨＤの発生率および重症度を低下させるための代替的な戦略に対して、緊喫のニーズが存在する。
【発明の開示】
【０００７】
本願の１つの態様は、抗セラミド抗体、またはその抗原結合性フラグメントであって：Ｎ末端より１位のＧｌｙ、Ｎ末端から２位のＴｙｒまたはＰｈｅ、Ｎ末端から４位のＰｈｅまたはＬｅｕ、およびＮ末端から６位のＴｈｒまたはＨｉｓ、およびＮ末端から１０位のＨｉｓまたはＡｓｎを含む１０アミノ酸のＨ鎖可変領域ＣＤＲ１；Ｎ末端から２位のＡｓｎまたはＩｌｅ、Ｎ末端から４位のＰｈｅまたはＳｅｒ、Ｃ末端から９位のＴｈｒ、Ｃ末端から７位のＴｙｒ、Ｃ末端から６位のＡｓｎ、Ｃ末端から２位および４位のＬｙｓまたはＡｌａを含む１６〜１７アミノ酸のＨ鎖可変領域ＣＤＲ２；Ｎ末端から４位のＴｙｒまたはＴｈｒを含む７から１１アミノ酸のＨ鎖可変領域ＣＤＲ３；Ｎ末端から２位のＡｌａまたはＳｅｒ、Ｎ末端から３位のＳｅｒ、Ｎ末端から５位のＳｅｒまたはＡｓｐ、およびＣ末端から３位のＴｙｒ、Ｓｅｒ、またはＰｈｅを含む１０〜１６アミノ酸のＬ鎖可変領域ＣＤＲ１；Ｎ領域から３位のＳｅｒまたはＡｓｎ、Ｎ末端から５位のＬｙｓまたはＳｅｒおよびＮ末端から７位のＳｅｒまたはＡｓｐを含む７アミノ酸のＬ鎖可変領域ＣＤＲ２；およびＮ末端から１位のＧｌｎ、ＬｅｕまたはＴｒｐ、Ｎ末端から２位のＧｌｎ、Ｎ末端より７位のＰｒｏおよびＮ末端から９位のＴｈｒを含む９アミノ酸のＬ鎖可変領域ＣＤＲ３を含む抗セラミド抗体、またはその抗原結合性フラグメントに向けられる。
【０００８】
本願の他の態様は、本願の抗セラミド抗体と同じ抗原決定基と結合する抗セラミド単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）に向けられる。ｓｃＦｖは：Ｎ末端より１位のＧｌｙ、Ｎ末端より２位のＴｙｒまたはＰｈｅ、Ｎ末端から４位のＰｈｅまたはＬｅｕ、およびＮ末端から６位のＴｈｒまたはＨｉｓ、およびＮ末端から１０位のＨｉｓまたはＡｓｎを含む１０アミノ酸のＨ鎖可変領域ＣＤＲ１；Ｎ末端から２位のＡｓｎまたはＩｌｅ、Ｎ末端から４位のＰｈｅまたはＳｅｒ、Ｃ末端から９位のＴｈｒ、Ｃ末端から７位のＴｙｒ、Ｃ末端から６位のＡｓｎ、Ｃ末端から２位および４位のＬｙｓまたはＡｌａを含む１６〜１７アミノ酸のＨ鎖可変領域ＣＤＲ２；Ｎ末端から４位のＴｙｒまたはＴｈｒを含む７から１１アミノ酸のＨ鎖可変領域ＣＤＲ３；Ｎ末端から２位のＡｌａまたはＳｅｒ、Ｎ末端から３位のＳｅｒ、Ｎ末端から５位のＳｅｒまたはＡｓｐ、およびＣ末端から３位のＴｙｒ、Ｓｅｒ、またはＰｈｅを含む１０〜１６アミノ酸のＬ鎖可変領域ＣＤＲ１；Ｎ領域から３位のＳｅｒまたはＡｓｎ、Ｎ末端から５位のＬｙｓまたはＳｅｒおよびＮ末端から７位のＳｅｒまたはＡｓｐを含む７アミノ酸のＬ鎖可変領域ＣＤＲ２；およびＮ末端から１位のＧｌｎ、ＬｅｕまたはＴｒｐ、Ｎ末端から２位のＧｌｎ、Ｎ末端から７位のＰｒｏおよびＮ末端から９位のＴｈｒを含む９アミノ酸のＬ鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【０００９】
本願の他の態様は、それを必要とする対象において細胞死を阻害する方法であって、本願の抗セラミド抗体または抗セラミド抗体フラグメントの治療的に有効な量を対象に投与することを含む方法に向けられる。
【００１０】
本願のさらなる他の態様は、対象において放射線ＧＩ症候群を治療するか、または放射線ＧＩ症候群の症状を緩和する方法であって、本願の抗セラミド抗体または抗セラミド抗体フラグメントの治療的に有効な量を対象に投与することを含む方法に向けられる。
【００１１】
本出願のさらなる他の態様は、それを必要とする対象におけるＧＩ症候群の細胞死の緩和のための方法に関する。方法は、前記対象の透過線への被曝後に、抗セラミド抗体またはその抗原結合性フラグメントの有効量を投与することを含む。
【００１２】
本発明のさらなる他の態様は、それを必要とする対象におけるＧｖＨＤにおけるアポトーシスの阻害のための方法に関する。方法は、前記対象が移植（片）を受ける前か、または前記対象が移植（片）を受けた後であってもＧｖＨＤの発症の前の、抗セラミド抗体またはその抗原結合性フラグメントの有効量の投与を含む。本発明の他の態様においては、前記移植片は骨髄移植片である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
付属の図面は、本開示の１つまたはそれ以上の実施形態を例示し、また、書かれた記述と共に、本開示の典型的な実施形態の原理を説明する役割を果たす。
【図１】（Ａ）ｍＡｂ  ２Ａ２の可変Ｈ鎖（ＶＨ）およびＬ鎖（ＶＬ）配列、および（Ｂ）２Ａ２クローンおよびヒト生殖細胞系配列のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図２】（Ａ）ヒト化２Ａ２  Ｈ鎖配列および（Ｂ）ヒト化２Ａ２  Ｌ鎖配列を示す。
【図３】粗上清を用いたｈ２Ａ２、９Ｈ１０、９Ｈ１１、７Ｂ１０、９Ａ２、６Ｂ５、および６Ｃ８のインビトロ生物活性の図示である。
【図４】精製抗体による１０ＧｙのＪｕｒｋａｔ細胞アポトーシスの典型的な阻害の図示である。
【図５】ヒト化２ａ２およびマウス７Ｂ１０、６ｃ８および６ｂ５を用いた、陰窩致死性の典型的な阻害の図示である。
【図６】マウス抗体６Ｂ５、６Ｃ８、７Ｂ１０、９Ｈ１０、９Ｈ１１、２Ａ２およびヒト化２Ａ２抗体（ｈ２Ａ２）の典型的な配列の図示、および抗セラミドコンセンサス配列の描出である。アラインメントおよびコンセンサス配列は、コンピュータプログラムＭＵＳＣＬＥマルチ配列アラインメントを用いて生成される。保存度はアラインメントまたは配列グループ上でヒストグラムとして視覚化し、各コラムにスコアを示す。保存されているカラムは「＊」（スコア１１でデフォルトアミノ酸特性グルーピング）で表示し、全ての特性が保持されている変異のカラムには「＋」マーク（スコア１０、全ての特性が保持されることを示す）を付与する。「−」はギャップを意味する。
【図７】６Ｂ５  ｓｃＦｖの典型的なインビトロＪｕｒｋａｔ細胞アポトーシス阻害の図示である。
【図８】被曝前に投与された場合の、インビボにおけるＧＩ陰窩枯渇に対する典型的な６Ｂ５  ｓｃＦｖ保護の例示である。
【図９】被曝後に投与された場合の、インビボにおけるＧＩ陰窩枯渇に対する典型的な６Ｂ５  ｓｃＦｖ緩和の例示である。
【図１０】抗セラミドｓｃＦｖが腸陰窩を用量依存的に保護することの図示である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対し、１５Ｇｙ全身照射（ＴＢＩ）の１５分前に、ヒト化抗セラミド２Ａ２（０〜１０００マイクログラム／マウス）、または組換え抗セラミドｓｃＦｖ  ６Ｂ５（０〜１００マイクログラム／マウス）を静脈注射により投与した。ＴＢＩより３．５日後にマウスを安楽死させ、近位空腸の切断片を摘出し、３．１５ｍｍの切片に切り、４％パラホルムアルデヒドに入れた。近位空腸切片を輪切りにし、マウントし、スライドをＨ＆Ｅ染色した後、ＷｉｔｈｅｒｓとＥｌｋｉｎｄ（１９７０）の方法に従って生存陰窩を定量した。腸陰窩は腸幹細胞の部位であるので、腸幹細胞の生存の代替としてマイクロコロニー測定法が一般的に用いられる。各群マウス数Ｎ＝５。
【図１１】代替的な注射法で投与するとき抗セラミドｓｃＦｖが有効性を保持することの図示である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対し、１５Ｇｙ全身照射被曝より１５分前に、ヒト化２Ａ２抗セラミド抗体（５０ｍｇ／ｋｇ）を静脈内（ＩＶ）、腹腔内（ＩＰ）または皮下（ＳＣ）注射により投与した。あるいは、マウスに対し、１５Ｇｙ全身照射被曝（ＴＢＩ）より１５分前に、抗セラミドｓｃＦｖ  ６Ｂ５  ７．５ｍｇ／ｋｇをＩＶ、ＩＰ、ＳＣ、または筋肉内（ＩＭ）注射により投与した。ＴＢＩより３．５日後にマウスを安楽死させ、近位空腸の切断片を摘出し、３．１５ｍｍの切片に切り、４％パラホルムアルデヒドに入れた。近位空腸切片を輪切りにし、マウントし、スライドをＨ＆Ｅ染色した後、ＷｉｔｈｅｒｓとＥｌｋｉｎｄ（１９７０）の方法に従って生存陰窩を定量した。腸陰窩は腸幹細胞の部位であるので、腸幹細胞の生存の代替としてマイクロコロニー測定法が一般的に用いられる。各群マウス数Ｎ＝５。
【図１２】抗セラミドｈ２ａ２およびｓｃＦｖが放射線ＧＩ症候群の致死作用を保護および緩和することの図示である。（左パネル）Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対し、１４．５Ｇｙ全身照射（ＴＢＩ）の１５分前に、静脈内注射によりヒト化抗セラミド２Ａ２（１０００マイクログラム／マウス）、または皮下注射により組換え抗セラミドｓｃＦｖ  ６Ｂ５（１００マイクログラム／マウス）を投与した。マウスはＴＢＩより１６時間後に５×１０６個の自己由来骨髄細胞を投与され、罹患および死亡について連日モニタリングした。瀕死とみなされたマウスは速やかに安楽死させた。データは、ログ・ランク検定で分析したカプラン−マイヤー生存率プロットを示す。ｈ２Ａ２群およびｓｃＦｖ群について、いずれも生理食塩水対象と比較してｐ＜０．０５。（右パネル）．１４．５Ｇｙ全身照射（ＴＢＩ）より２４時間後に、静脈内注射によりヒト化抗セラミド２Ａ２（１０００マイクログラム／マウス）、または皮下注射により組換え抗セラミドｓｃＦｖ  ６Ｂ５（１００マイクログラム／マウス）を投与した以外は、左パネルと全く同じ方法で実験を実施した。各群マウス数Ｎ＝５。ｈ２Ａ２群およびｓｃＦｖ群について、いずれも生理食塩水対象と比較してｐ＜０．０５。
【図１３】抗セラミドｓｃＦｖが、致死的な急性移植片対宿主病からマウスを保護することの図示である。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ＭＨＣ  Ｈ２ｂハプロタイプ）に対し、１１００ｃＧｙ分割線量全身照射（ＴＢＩ）より１５分前に、ＰＢＳまたは抗セラミドｓｃＦｖ  ６Ｂ５  ７．５ｍｇ／ｋｇを静脈内注射により投与した。マウスは、ＴＢＩより１６〜２０時間後に、Ｂ１０．ＢＲドナーマウス（ＭＨＣ  Ｈ２ｋ２ハプロタイプ）に由来する５×１０６骨髄（ＢＭ）、またはＢＭおよび２×１０６ＣＤ５＋ナイーブＴ細胞からなる同種骨髄移植を受けた。マウスは、４、８、１２および１６日目にＰＢＳまたは抗セラミドｓｃＦｖ  ６Ｂ５  ７．５ｍｇ／ｋｇを投与された。マウスは、体重減少、皮膚病変、体毛の乱れおよび損失、および後彎を含めた、ＧｖＨＤに関連する病的状態について週１回採点し、生存についてモニタリングした。データは、ログ・ランク検定で分析したカプラン−マイヤー生存率プロットを示す。ｓｃＦｖ群について生理食塩水対象と比較してｐ＜０．０５。
【図１４】抗セラミドｓｃＦｖが、致死的な急性移植片対宿主病の際にマウス腸幹細胞を保護することの図示である。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ＭＨＣ  Ｈ２ｂハプロタイプ）に対し、１１００ｃＧｙ分割線量全身照射（ＴＢＩ）より１５分前に、ＰＢＳ、ヒト化ｈ２Ａ２抗体５０ｍｇ／ｋｇまたは抗セラミドｓｃＦｖ  ６Ｂ５  ７．５ｍｇ／ｋｇを静脈内注射により投与した。マウスは、ＴＢＩより１６〜２０時間後に、Ｂ１０．ＢＲドナーマウス（ＭＨＣ  Ｈ２ｋ２ハプロタイプ）に由来する５×１０６骨髄（ＢＭ）またはＢＭおよび２×１０６ＣＤ５＋ナイーブＴ細胞からなる同種骨髄移植を受けた。マウスは、４および８日目にＰＢＳまたは抗セラミドｓｃＦｖ  ６Ｂ５  ７．５ｍｇ／ｋｇを投与された。移植より１０日後にマウスを安楽死させ、近位空腸の切断片を摘出し、３．１５ｍｍの切片に切り、４％パラホルムアルデヒドに入れた。近位空腸切片を輪切りにし、マウントし、スライドをＨ＆Ｅ染色した後、ＷｉｔｈｅｒｓとＥｌｋｉｎｄ（１９７０）の方法に従って生存陰窩を定量した。腸陰窩は腸幹細胞の部位であるので、腸幹細胞の生存の代替としてマイクロコロニー測定法が一般的に用いられる。各群マウス数Ｎ＝５。
【図１５】抗セラミドｈ２ａ２およびｓｃＦｖが、腸間膜リンパ節内でのＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球の保持を高めることの図示である。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ＭＨＣ  Ｈ２ｂハプロタイプ）に対し、１１００  ｃＧｙ分割線量全身照射（ＴＢＩ）より１５分前に、ＰＢＳ、ヒト化ｈ２Ａ２抗体５０ｍｇ／ｋｇまたは抗セラミドｓｃＦｖ  ６Ｂ５  ７．５ｍｇ／ｋｇを静脈内注射により投与した。マウスは、ＴＢＩより１６〜２０時間後に、Ｂ１０．ＢＲドナーマウス（ＭＨＣ  Ｈ２ｋ２ハプロタイプ）に由来する５×１０６骨髄（ＢＭのみ）またはＢＭおよび２×１０６ＣＤ５＋ナイーブＴ細胞からなる同種骨髄移植を受けた。マウスは、その後４および８日目にＰＢＳ、ｈ２Ａ２またはｓｃＦｖ  ６Ｂ５を投与された。マウスは移植より１０日後に安楽死させ、腸間膜リンパ節をフローサイトメトリーで分析した。データは、総ドナー（Ｈ２ｋ２ハプロタイプ陽性）ＣＤ４５＋リンパ球プールに由来するＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の総数を表す。各群マウス数Ｎ＝５。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下の発明を実施するための形態は、任意の当業者が本発明を作製および使用することを可能とするために提示する。説明を目的として、特定の命名を記載して本発明の完全な理解を提供する。しかし、これらの具体的な詳細は本発明の実践に必要でないことは、当業者に明らかとなる。具体的な用途の記述は、代表的な実施例としてのみ提供される。本発明は提示した実施形態に限定することを意図していないものの、本願に開示される原理および特徴と一致する可能な限り最も広い範囲で一致させようとするものである。
【００１５】
本願で用いる「治療的に有効な量」は、ある化合物の量が所望の生物学的または治療的効果を達成する量であること、すなわち治療されているかまたは予防されている列挙された疾患の１つまたはそれ以上の症状を予防、軽減または改善する量であることを意味する。
【００１６】
本願で用いる用語「治療する」、「治療すること」または「治療」は、障害および／またはその付随する症状を軽減または抑制する方法を意味する。本願で用いる用語「予防する」、「予防すること」または「予防」は、対象が障害および／またはその付随する症状を獲得することを阻む方法を意味する。一定の実施形態においては、「予防する」、「予防すること」または「予防」は、障害および／またはその付随する症状を獲得するリスクを低減する方法を意味する。
【００１７】
本願で治療に関して用いる用語「緩和する」、「緩和」および「緩和すること」は、急性事象の発生後の前記事象の治療、たとえば被曝より２４時間後に放射線障害を緩和することを意味する。
【００１８】
同様に、本願で治療に関して用いる用語「保護する」、「保護」および「保護すること」は、ある事象の発生前の前記事象の予防または阻害を目的とした、治療薬剤の予防的投与を意味する。
【００１９】
本願で用いる用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分、すなわち抗原と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子を意味する。用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、かつ具体的には、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体など）、ｓｃＦｖなどの組換え抗体、および抗体フラグメントが所望の生物学的活性を示す限りそれらを包含する。「特異的に結合する」または「免疫反応する」によって、抗体が所望の抗原の１つまたはそれ以上の抗原決定基と反応し、かつポリペプチドおよび脂質を含む他の抗原とは反応（すなわち結合）しないか、または他の抗原よりもさらに低い親和性で結合することを意味する。
【００２０】
用語「抗体」は、全長抗体の一部、一般的には抗原結合またはその可変領域を含む抗体フラグメントも含む。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；二重特異性抗体；直鎖抗体；単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）；および抗体フラグメントより形成される多重特異性抗体を含む。本発明の一定の実施形態においては、組織浸透性または腫瘍浸透性を高めるために、非修飾抗体ではなく抗体フラグメントが用いられる。他の実施形態においては、抗体フラグメントはその血清半減期を延長するようさらに修飾される。
【００２１】
本願で用いる用語「モノクローナル抗体」は、相当均質な抗体集団から得られる１つの抗体、すなわち集団を構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然発生可能な変異を除いて同一であることを意味する。モノクローナル抗体は、本願において、所望の生物学的活性を示す限り、Ｈ鎖および／またはＬ鎖の一部が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか、または相同である一方で、鎖の残りが他の種に由来するかまたは他の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体、さらにはそのような抗体のフラグメントの対応する配列と同一であるか、または相同である「キメラ」抗体を特に含む。
【００２２】
非ヒト抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含むキメラ抗体である。ヒト化抗体は、大部分がヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であって、レシピエントの高頻度可変性領域に由来する残基が、所望の特異性、親和性、および／または能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の高頻度可変性領域に由来する残基によって置換されている、ヒト免疫グロブリンである。ヒト化および他のキメラ抗体を作成する方法は技術上既知である。
【００２３】
「二重特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有する抗体である。二重特異性抗体を作成する方法は技術上既知である。
【００２４】
「ヘテロコンジュゲート抗体」の使用も、本発明の範囲内である。ヘテロコンジュゲート抗体は、共有結合した２つの抗体から構成される。そのような抗体は、たとえば免疫系細胞が望ましくない細胞を標的とするよう提案されている（米国特許第４，６７６，９８０号明細書）。架橋剤を包含する方法を含めた、タンパク質合成化学の既知の方法を用いて抗体をインビトロ調製することができることが意図されている。
【００２５】
本願で用いる用語「ＬＤ５０」は「５０％致死量」または「致死量中央値」を意味し、被験集団の５０％を死滅させるのに必要とされる物質量である。
【００２６】
（放射線誘導性アポトーシスには細胞外セラミドが必要とされる）
スフィンゴ脂質、具体的にはスフィンゴミエリンと強く会合するコレステロールから構成され、無秩序液体バルク細胞膜内で秩序液体ドメインを形成している特徴的な細胞膜マイクロドメインである液状ラフト。ラフトは、タンパク質および脂質組成が周囲の膜と異なり、多数のグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー蛋白質、Ｓｒｃファミリーの二重アシル化チロシンキナーゼ、および膜貫通タンパク質を含むシグナリング分子を収容する。さらにラフトは、抗原と遭遇した際に、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）を含む複数の受容体が活性化するとき、その中またはその外へ移動する部位としての役割を果たす。これらの移動事象がマルチシグナル伝導カスケードにとって重要であることが、エビデンスより示唆される。
【００２７】
スフィンゴ脂質は細胞膜の構造的コンポーネントであり、かつセラミドの生成を通じたシグナル伝導の重要な調節因子である。Ｃ１６セラミドは分化、増殖および発育停止において重要な役割を果たす。またアポトーシスシグナリングの必須コンポーネントでもある。セラミド生成は、多数のチロシン、ウイルス／病原体、環境ストレスおよび化学療法誘導性アポトーシス事象の要件として特定されている。さらに、標的細胞の細胞膜上のセラミドに富む領域は、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導性細胞死に対する感受性にとって重要である。
【００２８】
（致死的ＧＩ症候群の治療および予防）
最近、リーベルキューン陰窩の底部より１〜３位に位置する細胞周期の陰窩底部円柱（ＣＢＣ）細胞が腸幹細胞集団として定義されている。この細胞群は絶え間なく増殖および分化し、絨毛先端からの腸細胞およびその他の分化上皮細胞の生理的な損失を補充することにより、粘膜の解剖学的および機能的完全性を維持する。陰窩−絨毛単位の恒久的破壊にはこのコンパートメントの完全な、またはほぼ完全な枯渇が必要であるとみられる一方で、生存幹細胞クロノーゲンは、１陰窩あたり１個であっても、完全に機能的な陰窩を再生することが可能である。
【００２９】
放射線の標的は消化管微小血管系および腸幹細胞コンパートメントである。微小血管内皮の機能不全は、照射より４時間後にアポトーシスとして検出され、ＧＩ症候群に至る主要な病変を呈する。内皮の機能不全により、ＣＢＣ病変は亜致死から致死に転換され、再生陰窩の喪失をもたらし、ＧＩ毒性を促進する。免疫組織化学的試験および［３Ｈ］ＴｄＲおよびＢｒｄＵｒｄによる標識試験より、陰窩幹細胞死は放射線被曝後に急性的に発生するのではないことが判明した。むしろ、最も早く検出可能な反応は、見かけ上放射線誘発性ＤＮＡ二重鎖切断（ｄｓｂ）がシグナルとなる、Ｓ期後半のチェックポイントから有糸分裂停止までの、線量依存的な一時的進行の遅れである。１２Ｇｙでの照射直後の２４時間の間に、成長停止細胞に急激なアポトーシス死が発生し、総細胞死の３３％に匹敵する。哺乳類細胞においては、ＤＮＡｄｓｂはＤＮＡ障害認識および修復経路、および細胞周期チェックポイント活性の協調的調節を活性化する。腸幹細胞の有糸分裂停止は、この経路における調節された事象を表すとみられる。有糸分裂型細胞死は、この２４〜４８時間後の期間に発生し、全細胞死の６６％を占める。この段階では、腸周長毎の陰窩数に有意な変化はないと見られるものの、通常の陰窩の通過による移動および陰窩から絨毛上皮細胞層への分化細胞の移動、および絨毛先端からの損失により、陰窩のサイズは徐々に小さくなる。１２〜１８時間後の有糸分裂活性の再開は、陰窩幹細胞クロノーゲンの急速な枯渇および周長毎の陰窩数の減少に随伴する。
【００３０】
ＧＩ幹細胞クロノーゲンの致死性は、放射線被曝より３．５日後に生存している陰窩の個数によって最も良好に評価され、線量が上昇するに従って指数関数的に減少する。（Ｃ．Ｓ．Ｐｏｔｔｅｎ  ａｎｄ  Ｍ．Ｌｏｅｆｆｌｅｒ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１０（４），１００１（１９９０），Ｈ．Ｒ．Ｗｉｔｈｅｒｓ，Ｃａｎｃｅｒ  ２８（１），７５（１９７１）およびＪ．Ｇ．Ｍａｊ，Ｆ．Ｐａｒｉｓ，Ａ．Ｈａｉｍｏｖｉｔｚ−Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ６３，４３３８（２００３））。生存幹細胞を含む陰窩は増殖速度が加速され、腸粘膜が正常な構造を取り戻すまで、分割するかまたは発芽して新たな陰窩を生成する典型的な再生陰窩を生成する。数種類のマウスモデルにおけるＴＢＩ実験により、８〜１２Ｇｙ被曝後の生存陰窩幹細胞の個数は、通常、粘膜の完全な回復を支えるのに十分であることが証明される。しかしより高い線量では、幹細胞クロノーゲンの大量損失により陰窩−絨毛系のほぼ完全な崩壊、粘膜の表皮剥落、およびＧＩ症候群による動物の死亡に至ることがある。ＧＩ死を誘導する閾値線量、および５０％ＧＩ致死をもたらすＴＢＩ線量（ＬＤ５０）は系統特異的とみられる。ＴＢＩ被曝したＣ５７ＢＬ／６マウスの剖検試験により、１４Ｇｙに被曝したマウスの２５％および１５Ｇｙに被曝したマウスの１００％は６．８±０．９９日目にＧＩ症候群で死亡したことが判明し、ＧＩ死のＬＤ５０は１４Ｇｙと１５Ｇの間であると予測された。対照的に、ＢＡＬＢ／ｃマウスについて報告されたＬＤ５０Ｄ６（６日目のＬＤ５０、ＧＩ死の代替マーカーとなる）は８．８±０．７２Ｇｙ、ＢＤＦ１マウスについては１１．７±０．２２Ｇｙ、Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスについては１２．５±０．１Ｇｙ、Ｃ３Ｈ／ＳＰＦマウスについては１４．９Ｇｙ（９５％信頼限界１３．９〜１６．０Ｇｙ）、およびＢ６ＣＦ１マウスについては１６．４±０．２Ｇｙであり、マウスのＧＩ症候群による死亡に対する感受性の系統特異的スペクトルを示している。骨髄および肺などの他の臓器の放射線に対する感受性における系統変動も報告されている。
【００３１】
従来、透過線（ＩＲ）は、ゲノムＤＮＡの直接的障害により細胞が死滅し、ゲノムの不安定化を引き起こし、再生細胞の死をもたらすことにより細胞を死滅させると考えられていた。Ｈａｉｍｏｖｉｔｚ−Ｆｒｉｅｄｍａｎら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６３，４３３８（２００３））は、無細胞核系において、ＩＲと細胞膜の相互作用によってアポトーシスシグナルが交互に生成されることがあると立証した。ＩＲの誘導によるアポトーシスおよびクローン原性細胞死には、セラミドを介したラフトのクラスタ化が関与している。消化管（ＧＩ）粘膜のクローン原性コンパートメントは特異的であり、ＧＩ損傷の誘発において放射線の直接的標的であることが、長い間受け入れられてきた。
【００３２】
本願の１つの態様は、抗セラミド抗体、またはその抗原結合性フラグメントであって：Ｎ末端から１位のＧｌｙ、Ｎ末端から２位のＴｙｒまたはＰｈｅ、Ｎ末端から４位のＰｈｅまたはＬｅｕ、およびＮ末端から６位のＴｈｒまたはＨｉｓおよびＮ末端から１０位のＨｉｓまたはＡｓｎを含む１０アミノ酸のＨ鎖可変領域ＣＤＲ１；Ｎ末端から２位のＡｓｎまたはＩｌｅ、Ｎ末端から４位のＰｈｅまたはＳｅｒ、Ｃ末端から９位のＴｈｒ、Ｃ末端から７位のＴｙｒ、Ｃ末端から６位のＡｓｎ、Ｃ末端から２位および４位のＬｙｓまたはＡｌａを含む１６〜１７アミノ酸のＨ鎖可変領域ＣＤＲ２；Ｎ末端から４位のＴｙｒまたはＴｈｒを含む７から１１アミノ酸のＨ鎖可変領域ＣＤＲ３；Ｎ末端から２位のＡｌａまたはＳｅｒ、Ｎ末端から３位のＳｅｒ、Ｎ末端から５位のＳｅｒまたはＡｓｐ、およびＣ末端から３位のＴｙｒ、Ｓｅｒ、またはＰｈｅを含む１０〜１６アミノ酸のＬ鎖可変領域ＣＤＲ１；Ｎ領域から３位のＳｅｒまたはＡｓｎ、Ｎ末端から５位のＬｙｓまたはＳｅｒおよびＮ末端から７位のＳｅｒまたはＡｓｐを含む７アミノ酸のＬ鎖可変領域ＣＤＲ２；およびＮ末端から１位のＧｌｎ、ＬｅｕまたはＴｒｐ、Ｎ末端から２位のＧｌｎ、Ｎ末端より７位のＰｒｏおよびＮ末端から９位のＴｈｒを含む９アミノ酸のＬ鎖可変領域ＣＤＲ３を含む抗セラミド抗体、またはその抗原結合性フラグメントに向けられる。
【００３３】
本願で用いる用語「ＣＤＲ」は、免疫グロブリン（抗体）分子の「相補性決定領域」を意味する。ＣＤＲは、そこで抗体がその特異的抗原と結合する、抗体の可変ドメインの一部である。ＣＤＲは、リンパ球によって生成される抗原特異性の多様性にとって重要である。１つのＩｇＧ分子内の合計１２のＣＤＲおよびＩｇＭ分子内の６０ＣＤＲについて、可変ドメイン毎に３つのＣＤＲ（すなわちＬ鎖の可変ドメインにおけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３およびＨ鎖の可変ドメインにおけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）が存在する。可変ドメイン内では、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２はポリペプチド鎖の可変（Ｖ）領域内に存在し、ＣＤＲ３は、Ｌ鎖領域の場合はＶＪ、Ｈ鎖領域の場合はＶＤＪの組換えによってコードされるので、最大の変動性を示す。
【００３４】
一部の実施形態においては、抗セラミド抗体のＨ鎖可変領域ＣＤＲ１、またはその抗原結合性フラグメントは配列ＧＹＴＦＴＤＨＴＩＨ（配列番号１）を含み、前記Ｈ鎖可変領域ＣＤＲ２は配列ＹＮＹＰＲＤＧＳＴＫＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号２）を含み、Ｈ鎖可変領域ＣＤＲ３は配列ＧＦＩＴＴＶＶＰＳＡＹ（配列番号３）を含み、前記Ｌ鎖可変領域ＣＤＲ１は配列ＲＡＳＫＳＩＳＫＹＬＡ（配列番号４）を含み、Ｌ鎖可変領域ＣＤＲ２は配列ＳＧＳＴＬＱＳ（配列番号５）を含み、前記Ｌ鎖可変領域ＣＤＲ３は配列ＱＱＨＮＥＹＰＷＴ（配列番号６）を含む。
【００３５】
さらなる実施形態においては、抗セラミド抗体、またはその抗原結合性フラグメントは：配列ＱＶＱＬＱＱＳＤＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＶＳＧＹＴＦＴＤＨＴＩＨＷＭＫＱＲＰＥＱＧＬＥＷＩＧＹＮＰＲＤＧＳＴＫＹＮＥＫＦＧＫＡＴＬＴＤＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＮＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＫＧＦＩＴＴＶＶＰＳＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号７）を含むＨ鎖可変領域配列、または配列番号７を含むＨ鎖可変領域配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する配列；および／または配列番号８を含むＬ鎖可変領域配列、または配列ＤＶＱＩＴＱＳＰＳＹＬＡＡＳＰＧＥＴＩＴＩＮＣＲＡＳＫＳＩＳＫＹＬＡＷＹＱＥＫＰＧＫＴＮＫＬＬＩＹＳＧＳＴＬＱＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＭＹＹＣＱＱＨＮＥＹＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号８）を含むＬ鎖可変領域配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％または９５％の配列同等性を有する配列を含む。
【００３６】
他の実施形態においては、抗セラミド抗体のＨ鎖可変領域ＣＤＲ１、またはその抗原結合性フラグメントは配列ＧＹＡＦＳＳＹＷＭＮ（配列番号９）を含み、前記Ｈ鎖可変領域ＣＤＲ２は配列ＱＩＹＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧ（配列番号１０）を含み、Ｈ鎖可変領域ＣＤＲ３は配列ＲＣＹＹＧＬＹＦＤＶ（配列番号１１）を含み、前記Ｌ鎖可変領域ＣＤＲ１は配列ＫＡＳＱＤＩＮＲＹＬＳ（配列番号１２）を含み、前記Ｌ鎖可変領域ＣＤＲ２は配列ＲＡＮＲＬＶＤ（配列番号１３）を含み、かつ前記Ｌ鎖可変領域ＣＤＲ３は配列ＬＱＹＤＥＦＰＹＴ（配列番号１４）を含む。
【００３７】
さらなる実施形態においては、抗セラミド抗体、またはその抗原結合性フラグメントは：配列ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＡＦＳＳＹＷＭＮＷＶＫＱＲＰＧＫＧＬＥＷＩＧＱＩＹＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＴＲＲＣＹＹＧＬＹＦＤＶＷＧＴＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号１５）を含むＨ鎖可変領域配列、または配列番号１５を含むＨ鎖可変領域配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する配列；および／または配列ＤＩＫＭＴＱＳＰＳＳＲＹＡＳＬＧＥＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＩＮＲＹＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＳＰＫＴＬＩＹＲＡＮＲＬＶＤＧＶＰＳＳＲＦＳＧＳＧＳＧＱＤＹＳＬＴＩＳＳＬＥＹＥＤＭＧＩＹＹＣＬＱＹＤＥＦＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１６）を含むＬ鎖可変領域配列、または配列番号１６を含むＬ鎖可変領域配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する配列を含む。
【００３８】
さらなる他の実施形態においては、抗セラミド抗体のＨ鎖可変領域ＣＤＲ１、またはその抗原結合性フラグメントは配列ＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨ（配列番号１７）を含み、前記Ｈ鎖可変領域ＣＤＲ２は配列ＹＩＮＰＳＳＧＹＴＫＹＮＱＦＫＤ（配列番号１８）を含み、Ｈ鎖可変領域ＣＤＲ３は配列ＧＧＹＹＧＦＡＹ（配列番号１９）を含み、前記Ｌ鎖可変領域ＣＤＲ１は配列ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹ（配列番号２０）を含み、前記Ｌ鎖可変領域ＣＤＲ２は配列ＬＴＳＮＬＡＳ（配列番号２１）を含み、前記Ｌ鎖可変領域ＣＤＲ３は配列ＱＱＷＳＳＮＰＬＴ（配列番号２２）を含む。
【００３９】
さらなる実施形態においては、抗セラミド抗体、またはその抗原結合性フラグメントは：配列ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＫＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＳＧＹＴＫＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＹＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＧＹＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号２３）を含むＨ鎖可変領域配列、または配列番号２３を含むＨ鎖可変領域配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する配列；および／または配列ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＬＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹＷＹＱＱＫＰＲＳＳＰＫＰＷＩＹＬＴＳＮＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ（配列番号２４）を含むＬ鎖可変領域配列、または配列番号２４を含むＬ鎖可変領域配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する配列を含む。
【００４０】
さらに他の実施形態においては、抗セラミド抗体のＨ鎖可変領域ＣＤＲ１、またはその抗原結合性フラグメントは配列ＧＦＳＬＴＧＹＧＶＨ（配列番号２５）を含み、前記Ｈ鎖可変領域ＣＤＲ２は配列ＶＩＷＳＧＧＳＴＤＹＮＡＡＦＩＳ（配列番号２６）を含み、Ｈ鎖可変領域ＣＤＲ３は配列ＮＹＧＹＤＹＡＭＤＹ（配列番号２７）を含み、前記Ｌ鎖可変領域ＣＤＲ１は配列ＲＡＳＱＳＩＧＴＳＩＨ（配列番号２８）を含み、前記Ｌ鎖可変領域ＣＤＲ２は配列ＹＡＳＥＳＩＳ（配列番号２９）を含み、前記Ｈ鎖可変領域ＣＤＲ３は配列ＱＱＳＮＳＷＰＦＴ（配列番号３０）を含む。
【００４１】
さらなる実施形態においては、抗セラミド抗体、またはその抗原結合性フラグメントは：配列番号３１を含むＨ鎖可変領域配列、または配列ＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＶＱＰＳＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＳＹＧＶＨＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＳＧＧＳＴＤＹＮＡＡＦＩＳＲＬＳＩＳＫＤＮＳＫＳＱＶＦＦＫＭＮＳＬＱＡＤＤＴＡＩＹＹＣＡＲＮＹＧＹＤＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号３１）を含むＨ鎖可変領域配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する配列；および／または配列ＤＩＬＬＴＱＳＰＡＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＳＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＳＮＳＷＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号３２）を含むＬ鎖可変領域配列、または配列番号３２を含むＬ鎖可変領域配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する配列を含む。
【００４２】
さらに他の実施形態においては、抗セラミド抗体のＨ鎖可変領域ＣＤＲ１またはその抗原結合性フラグメントは配列ＧＹＴＦＴＮＹＷＭＨ（配列番号３３）を含み、前記Ｈ鎖可変領域ＣＤＲ２は配列ＡＩＹＰＧＤＳＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号３４）を含み、Ｈ鎖可変領域ＣＤＲ３は配列ＧＬＹＹＧＹＤ（配列番号３５）を含み、前記Ｌ鎖可変領域ＣＤＲ１は配列ＫＳＳＱＳＬＩＤＳＤＧＫＴＦＬＮ（配列番号３６）を含み、Ｌ鎖可変領域ＣＤＲ２は配列ＬＶＳＫＬＤＳ（配列番号３７）を含み、前記Ｌ鎖可変領域ＣＤＲ３は配列ＷＱＧＴＨＦＰＹＴ（配列番号３８）を含む。
【００４３】
さらなる実施形態においては、抗セラミド抗体、またはその抗原結合性フラグメントは：配列ＥＶＱＬＱＱＳＧＴＶＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＷＭＨＷＶＫＱＲＰＶＱＧＬＥＷＩＧＡＩＹＰＧＤＳＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧＫＡＫＬＴＡＶＴＳＴＳＴＡＦＭＥＬＳＳＬＴＮＥＤＳＡＶＹＹＣＴＧＬＹＹＧＹＤＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ（配列番号３９）を含むＨ鎖可変領域配列、または配列番号３９を含むＨ鎖可変領域配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する配列；および／または配列番号４０を含むＬ鎖可変領域配列または、配列ＤＶＬＭＴＱＴＰＬＴＬＳＶＴＩＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＩＤＳＤＧＫＴＦＬＮＷＬＬＱＲＰＧＱＳＰＫＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＬＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号４０）を含むＬ鎖可変領域配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％または９５％の配列同一性を有する配列を含む。
【００４４】
さらなる他の実施形態においては、抗セラミド抗体、またはその抗原結合性フラグメントは：ａ）配列番号７、１５、２３、３１および３９からなる群から選択される配列を含むＨ鎖可変領域配列、または配列番号７、１５、２３、３１および３９からなる群から選択される配列を含むＨ鎖可変領域配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する配列；および／またはａ）配列番号８、１６、２４、３２および４０からなる群から選択される配列を含むＬ鎖可変領域配列、または配列番号８、１６、２４、３２および４０からなる群から選択される配列を含むＬ鎖可変領域配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する配列を含む。
【００４５】
具体的な実施形態においては、抗セラミド抗体はモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、組換え抗体およびｓｃＦｖからなる群から選択される。
【００４６】
本願の他の態様は、本願の抗セラミド抗体と同じ抗原決定基と結合する抗セラミド単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）に向けられる。ｓｃＦｖは：Ｎ末端から１位のＧｌｙ、Ｎ末端から２位のＴｙｒまたはＰｈｅ、Ｎ末端から４位のＰｈｅまたはＬｅｕ、およびＮ末端から６位のＴｈｒまたはＨｉｓおよびＮ末端から１０位のＨｉｓまたはＡｓｎを含む１０アミノ酸のＨ鎖可変領域ＣＤＲ１；Ｎ末端から２位のＡｓｎまたはＩｌｅ、Ｎ末端から４位のＰｈｅまたはＳｅｒ、Ｃ末端から９位のＴｈｒ、Ｃ末端から７位のＴｙｒ、Ｃ末端から６位のＡｓｎ、Ｃ末端から２位および４位のＬｙｓまたはＡｌａを含む１６〜１７アミノ酸のＨ鎖可変領域ＣＤＲ２；Ｎ末端から４位のＴｙｒまたはＴｈｒを含む７から１１アミノ酸のＨ鎖可変領域ＣＤＲ３；Ｎ末端から２位のＡｌａまたはＳｅｒ、Ｎ末端から３位のＳｅｒ、Ｎ末端から５位のＳｅｒまたはＡｓｐ、およびＣ末端から３位のＴｙｒ、Ｓｅｒ、またはＰｈｅを含む１０〜１６アミノ酸のＬ鎖可変領域ＣＤＲ１；Ｎ領域から３位のＳｅｒまたはＡｓｎ、Ｎ末端から５位のＬｙｓまたはＳｅｒおよびＮ末端から７位のＳｅｒまたはＡｓｐを含む７アミノ酸のＬ鎖可変領域ＣＤＲ２；およびＮ末端から１位のＧｌｎ、ＬｅｕまたはＴｒｐ、Ｎ末端から２位のＧｌｎ、Ｎ末端から７位のＰｒｏおよびＮ末端から９位のＴｈｒを含む９アミノ酸のＬ鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【００４７】
単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、実際には抗体のフラグメントではなく、１０から約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドと接続した、免疫グロブリンのＨ鎖（ＶＨ）およびＬ鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは、通常は柔軟性を目的としたグリシン、さらには可溶性を目的としたセリンまたはスレオニンに富み、ＶＨのＮ末端とＶＬのＣ末端を接続するか、またはＶＨのＣ末端とＶＬのＬ末端を接続することができる。ｓｃＦｖは、定常領域を除去してリンカーを導入しているにもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。
【００４８】
一部の実施形態においては、抗セラミド抗体、その抗原結合性フラグメント、またはｓｃＦＶは組換えＤＮＡ技術を用いて生成される。組換えタンパク質の発現および精製手順は、当該技術において十分に確立されている。
【００４９】
生体系において本願の抗セラミド抗体、その抗原結合性フラグメント、またはｓｃＦＶを発現するために、抗セラミド抗体、その抗原結合性フラグメント、またはｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドが構築される。一定の実施形態においては、組換えポリヌクレオチドは、細菌、哺乳類、植物または昆虫細胞などの選択された原核生物または真核生物宿主細胞における発現に最適化されたコドンである。複製および発現を促進するために、ポリヌクレオチドは、原核生物または真核生物発現ベクターなどのベクターに組み入れることができる。本願に開示されるポリヌクレオチドは多様なベクター（たとえば細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージＤＮＡ、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、偽狂犬病、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスおよび他の多くのウイルスなどのウイルスＤＮＡの組み合わせに由来するベクターを含む）のうちいずれか１つに含めることができるものの、最も一般的には、ベクターはポリペプチド発現産物を生成するのに適した発現ベクターである。発現ベクターにおいては、抗セラミド抗体、その抗原結合性フラグメント、またはｓｃＦＶをコードするポリヌクレオチドは、典型的には近位にかつ適切な転写制御配列（プロモーターおよび任意選択的に１つまたはそれ以上のエンハンサー）の方向に配置して、ｍＲＮＡ合成を誘導する。すなわち、目的のポリヌクレオチド配列は、適切な転写制御配列と機能的に結合する。そのようなプロモーターの例は：ＣＭＶの直前段階のプロモーター、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、バキュロウイルスの多面体プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃまたはｔｒｐプロモーター、ファージＴ７およびλＰＬプロモーター、および原核生物または有核生物細胞またはそのウイルスにおいて遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターを含む。発現ベクターは、典型的には翻訳開始のリボソーム結合部位、および転写ターミネーターも含む。ベクターは、任意選択として発現の増幅にとって適切な配列を含む。さらに、発現ベクターは１つまたはそれ以上の選択的なマーカー遺伝子も任意選択として含み、真核細胞培養に対するジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、またはＥ．ｃｏｌｉにおけるテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性などの、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型形質を提供する。
【００５０】
発現ベクターは、たとえば、翻訳の効率を改善するためなどに追加的な発現要素も含むことができる。これらのシグナルは、たとえばＡＴＧ開始コドン、および隣接配列などを含むことができる。たとえば一部の例では、翻訳開始コドンおよび関連する配列要素は、目的のポリヌクレオチド配列（天然開始コドンなど）と同時に、適切な発現ベクターに挿入される。そのような場合、追加的な翻訳制御シグナルは必要とされない。しかし、ポリペプチドコーディング配列、またはその一部のみが挿入される場合、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルが、抗セラミド抗体またはｓｃＦｖの発現のために提供される。開始コドンは、適正なリーディングフレーム内に配置されて、目的のポリヌクレオチド配列を確実に翻訳させる。外因性転写要素および開始コドンは、天然および合成双方の多様な由来であってよい。所望される場合、使用する細胞系に適したエンハンサーを含めることによって、発現の効率をさらに高めることができる。
【００５１】
本願の抗セラミド抗体またはｓｃＦｖを担持する発現ベクターは、ベクターおよび宿主細胞の選択に応じて、電気穿孔法、リポソーム媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降法、感染、トランスフェクションなどの多様な周知の手順のいずれかによって、宿主細胞に導入することができる。
【００５２】
したがって、抗セラミド抗体、その抗原結合性フラグメント、またはｓｃＦｖをコードする核酸を含む宿主細胞も、本願の特徴の１つである。好ましい宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核生物（すなわち細菌）宿主細胞、さらには真菌（たとえばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅやＰｉｃｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓなどの酵母）細胞、昆虫細胞、植物細胞、および哺乳類細胞（ＣＨＯ細胞など）などの数多くの真核生物宿主細胞を含む。
【００５３】
宿主細胞は、プロモーターを活性化、形質転換細胞を選択、または挿入したポリヌクレオチド配列を増幅するために必要に応じて改変した、従来の栄養培地で培養することができる。温度、ｐＨなどの培養条件は、典型的には、発現のために選択された宿主細胞と共にこれまで用いられたものであり、かつ当業者に明らかとなる。宿主細胞は、任意選択的に、挿入された配列の発現を調節、または発現されたタンパク質を所望の様態でプロセシングするその能力について選択される。そのようなタンパク質の修飾はグリコシル化（およびアセチル化、カルボキシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化など）を含むが、これに限定されない。たとえば（フューリンプロテアーゼなどによって）タンパク質の前駆体型を開裂して成熟型とするなどの翻訳後プロセシングは、宿主細胞の状況において任意選択的に実施される。３Ｔ３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８などの相異なる宿主細胞は、特異的な細胞機構およびそのような翻訳後活性のための特徴的なメカニズムを有し、導入された外来タンパク質の適正な修飾およびプロセシングを確実に行わせるために選択することができる。
【００５４】
組換え抗セラミド抗体、その抗原結合性フラグメント、またはｓｃＦＶポリペプチドの長期的な高収率生産のために、典型的には安定した発現系が用いられる。たとえば、抗セラミド抗体、その抗原結合性フラグメント、またはｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドは、ウイルス由来の複製または内因性発現要素および選択可能マーカー遺伝子を含む発現ベクターを用いて、宿主細胞に導入される。ベクターの導入後、強化培地内で１〜２日間発育させた後、選択培地に切り替える。選択マーカーの目的は選択に対する耐性を付与することであり、またその存在によって導入した配列を問題なく発現する細胞の発育および回収を可能とする。たとえば、安定的に形質転換された耐性群またはコロニーは、細胞の種類に適した細胞培養技術を用いて増殖させることができる。抗セラミド抗体、その抗原結合性フラグメント、またはｓｃＦｖをコードする核酸で形質転換された宿主細胞は、任意選択的に、細胞培養からのコードされたタンパク質の発現および回収に適した条件下で培養される。
【００５５】
好適な宿主細胞株の形質導入、および宿主細胞の適切な細胞密度までの発育後、選択したプロモーターを適切な手段で誘導し（温度シフトまたは化学的誘導など）、細胞を適切な期間培養する。次に、分泌されたポリペプチド産物を培地から回収する。代替的に、細胞を遠心分離で回収し、物理的または化学的手段で破壊し、生成した粗抽出物を保持してさらに精製することもできる。タンパク質の発現に用いられた真核細胞または微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、超音波処理、機械的な破壊、または細胞溶解剤または当業者に周知であるその他の方法を含む任意の簡便な方法で破壊することができる。
【００５６】
発現された抗セラミド抗体、その抗原結合性フラグメント、またはｓｃＦｖは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降法、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ（本願で言及されるタグ系のいずれかを用いるなど）、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、およびレクチンクロマトグラフィを含む数多くの技術上周知な方法のいずれかによって、組換え細胞培養から回収および精製することができる。タンパク質リフォールディングステップを、所望の通りに成熟タンパク質の立体配置を完成させる際に用いることができる。最終的に、最終精製ステップにおいて高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を用いることができる。
【００５７】
一定の実施形態においては、核酸は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞などの原核細胞における導入および発現に好適なベクターに導入される。一部の実施形態においては、発現ベクターは（電気穿孔法などによって）好適な細菌宿主に導入される。他の実施例においては、バキュロウイルス発現ベクター系（ＢＥＶＳ）を用いて、抗セラミド抗体またはｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチド配列が昆虫細胞に導入される。同様に、ＳＦ９と密接に関係するＳＦ２１、およびタマナキンウワバガＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉに由来するＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（Ｈｉ５）細胞株などの代替的な昆虫細胞を用いることができる。
【００５８】
さらなる他の実施形態においては、抗セラミド抗体、その抗原結合性フラグメント、またはｓｃＦＶは、プラスミドベクターまたはウイルスベクターによりインビボ発現される。
【００５９】
一定の実施形態においては、抗セラミド抗体、その抗原結合性フラグメント、およびｓｃＦＶは化学合成によって生成される。簡単に言うと、抗セラミド抗体、その抗原結合性フラグメント、またはｓｃＦｖは、一方のアミノ酸のカルボキシル基またはＣ末端と他方のアミノ酸のアミノ基またはＮ末端の結合によって合成される。意図しない反応の可能性により、保護基が必要となることもある。化学的ペプチド合成はペプチドのＣ末端より開始し、Ｎ末端で終了する。これは、Ｎ末端で開始するタンパク質生合成と逆である。
【００６０】
一部の実施形態においては、抗セラミド抗体、その抗原結合性フラグメント、およびｓｃＦＶは従来の液相または固相合成を用いて合成することもできる。Ｆｍｏｃおよびｔ−Ｂｏｃ固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を用いて、ペプチドをカルボキシ末端からアミノ末端まで伸長させることができる。一定の実施形態においては、反応に添加される最終「アミノ酸」はＰＥＧ化されている。この最終アミノ酸は、カルボキシル−ＰＥＧ−アミン、カルボキシル−ＰＥＯ−アミン、またはアミン−ＰＥＧ−酸と呼ばれ、これによりアミンは遮断されて反応より保護し、酸は遊離して事前に添加された反応中のアミノ酸に由来するアミン基と反応する。ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）およびＰＥＯ（ポリエチレンオキシド）は、エチレングリコールおよびエチレンオキシド単量体の反復サブユニットから構成されるポリマーである。１つの実施形態においては、ＰＥＧ化抗セラミド抗体、その抗原結合性フラグメント、およびｓｃＦｖは、ＰＥＧ部分がポリペプチドのアミノ末端にあるヒスチジン残基（Ｈ）と結合するであろう。１つの実施形態においては、ＰＥＧ部分はサイズが５から３０ｋＤａである。他の実施形態においては、ＰＥＧ部分はサイズが１０から２０ｋＤａである。
【００６１】
合成中にＰＥＧ化末端アミノ酸を使用することに加えて、抗セラミド抗体、その抗原結合性フラグメント、またはｓｃＦｖはＰＥＧ化によってＰＥＧ化しうる。ＰＥＧ化は、ポリエチレングリコールポリマー鎖と他の分子、通常は薬剤または治療タンパク質との共有結合のプロセスである。ＰＥＧ化は、ＰＥＧの反応性誘導体を標的抗セラミド抗体またはｓｃＦｖとインキュベートすることにより達成することができる。ＰＥＧの抗セラミド抗体またはｓｃＦＶとの共有結合は、抗セラミド抗体、その抗原結合性フラグメント、またはｓｃＦｖを宿主の免疫系から「マスク」し（免疫原性および抗原性の低下）、抗セラミド抗体、その抗原結合性フラグメント、またはｓｃＦｖの流体力学的サイズ（溶液内のサイズ）を増大することが可能であり、こうして腎クリアランスを減少させることによって循環時間が延長する。ＰＥＧ化により疎水性タンパク質に水溶性を提供することも可能である。
【００６２】
（アポトーシスを阻害する方法）
本願のさらなる他の態様は、それを必要とする対象における細胞死を阻害する方法であって、本願の抗セラミド抗体またはその抗原結合性フラグメントの治療的に有効な量を対象に投与することを含む方法に向けられる。一部の実施形態においては、抗セラミド抗体は抗セラミドｓｃＦｖである。
【００６３】
一部の実施形態においては、細胞死は移植片対宿主病、放射能疾患、ＧＩ症候群および自己免疫性疾患からなる群から選択される疾患に随伴する。一部のさらなる実施形態においては、疾患は放射能疾患またはＧＩ症候群であり、また抗セラミド抗体、またはその抗原結合性フラグメントは、対象が放射線に被曝する前に投与される。
【００６４】
本出願の他の態様は、それを必要とする対象におけるＧＩ症候群における細胞死の緩和のための方法に向けられる。方法は抗セラミド抗体の有効量の投与を含む。一部の実施形態においては、方法は、前記対象の透過線への被曝直後に、前記対象に対して前記抗セラミド抗体を投与することを含む。他の実施形態においては、方法は、前記対象の透過線への被曝後１時間以内に、前記対象に対して前記抗セラミド抗体を投与することを含む。さらなる他の実施形態においては、方法は、前記対象の透過線への被曝後２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１８時間以内に、前記対象に対して前記抗セラミド抗体を投与することを含む。具体的な実施形態においては、方法は、前記対象の透過線への被曝後２４時間以内に、前記対象に対して前記抗セラミド抗体を投与することを含む。他の実施形態においては、方法は、前記対象の透過線への被曝後３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６または７２時間以内に、前記対象に対して前記抗セラミド抗体を投与することを含む。他の実施形態においては、方法は、前記対象の透過線への被曝前４８、３６、２４、１８、１２、１０、８、６、４、２または１時間以内に、または４５、３０または１５分以内に前記対象に対して前記抗セラミド抗体を投与することを含む。
【００６５】
他のさらなる実施形態においては、疾患は移植片対宿主病であり、また抗セラミド抗体、またはその抗原結合性フラグメントは、対象が移植片を受ける前に投与される。一部の実施形態においては、移植片は骨髄移植片である。さらなる他の実施形態においては、抗セラミド抗体、またはその抗原結合性フラグメントは、対象が移植片を受けた後であっても移植片対宿主病の発症前に投与される。さらに他のさらなる実施形態においては、抗セラミド抗体、またはその抗原結合性フラグメントは、それを必要とする対象に、移植片対宿主病の発症後、移植片対宿主病におけるアポトーシスの緩和に有効な量で投与される。
【００６６】
（抗体の投与）
抗体、またはその抗原結合性フラグメントは、ボーラスとして、または一定の時間をかけた連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊椎液内（intracerobrospinal）、皮下、動脈内、滑液包内、くも膜下腔内、経口、局所または吸入経路などの既知の方法で対象に投与してもよい。
【００６７】
本発明の抗体およびその抗原結合性フラグメントは、通常許容される医薬品として許容される担体内で投与することができる。許容される担体は生理食塩水、緩衝化生理食塩水、グルコース生理食塩水溶液を含むが、これに限定されない。固形支持体、リポソーム、ナノ粒子、マイクロ粒子、ナノスフェア、またはマイクロスフェアも、抗体またはその抗原結合性フラグメントの投与のための担体として用いうる。
【００６８】
抗体、またはその抗原結合性フラグメントの適切な用量（「治療的に有効な量」）は、たとえば治療しようとする状態、状態の重症度および経過、抗体の投与の目的が予防であるか治療であるか、前治療、患者の臨床履歴および抗体に対する反応、使用する抗体またはその抗原結合性フラグメントの種類、および主治医の裁量に依存することになる。抗体、またはその抗原結合性フラグメントは、患者に対して１回、または一連の治療を通じて好適に投与し、また診断以降の任意の時点で患者に投与しうる。抗体、またはその抗原結合性フラグメントは、単独治療として、または当該の状態を治療する上で有用な薬剤または治療法と組み合わせて投与しうる。
【００６９】
一般的な提案として、投与される抗体、またはその抗原結合性フラグメントの治療的に有効な量は、１回投与であれそれ以上の回数の投与であれ、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲となる。具体的な実施形態においては、投与される抗体の範囲は約１ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１μｇ／ｋｇ体重／日、１ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日、１ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日、１０ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１μｇ／ｋｇ体重／日、１０ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日、１００ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１μｇ／ｋｇ体重／日、１００ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１０μｇ／ｋｇ体重／日、１μｇ／ｋｇ体重／日から約１０μｇ／ｋｇ体重／日、１μｇ／ｋｇ体重／日から約１００μｇ／ｋｇ体重／日、１０μｇ／ｋｇ体重／日から約１００μｇ／ｋｇ体重／日、１０μｇ／ｋｇ体重／日から約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、１００μｇ／ｋｇ体重／日から約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、１ｍｇ／ｋｇ体重／日から約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日および１０ｍｇ／ｋｇ体重／日から約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日である。
【００７０】
他の実施形態においては、抗体、またはその抗原結合性フラグメントは１ｎｇ〜１０ｎｇ／注射、１０ｎｇから１００ｎｇ／注射、１００ｎｇから１μｇ／注射、１μｇから１０μｇ／注射、１０μｇから１００μｇ／注射、１００μｇから１ｍｇ／注射、１ｍｇから１０ｍｇ／注射、１０ｍｇから１００ｍｇ／注射、および１００ｍｇから１０００ｍｇ／注射の用量範囲で投与される。
【００７１】
他の具体的な実施形態においては、投与される抗体、またはその抗原結合性フラグメントの用量範囲は、約１ｎｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇである。さらに他の具体的な実施形態においては、投与される抗体の範囲は約１ｎｇ／ｋｇから約１０ｎｇ／ｋｇ、約１０ｎｇ／ｋｇから約１００ｎｇ／ｋｇ、約１００ｎｇ／ｋｇから約１μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇから約１０μｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇから約１００μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇ、および約１ｍｇ／ｋｇから約１５ｍｇ／ｋｇである。
【００７２】
他の具体的な実施形態においては、投与される抗体、またはその抗原結合性フラグメントの量は、またはおおよそは、０．０００６、０．００１、０．００３、０．００６、０．０１、０．０３、０．０６、０．１、０．３、０．６、１、３、６、１０、３０、６０、１００、３００、６００および１０００ｍｇ／日である。予想されるように、用量は状態、サイズ、年齢および患者の病状に依存することになる。
【００７３】
抗体、またはその抗原結合性フラグメントは、適宜または指示に従い、ボーラスとしての単回投与、または連続的注入、またはボーラスまたは連続的注入による複数回投与で投与しうる。複数回投与は、たとえば、１日に複数回、１日１回、２、３、４、５、６または７日毎、毎週、２、３、４、５または６週間毎、または毎月投与してもよい。しかし、他の用量レジメンも有用となりうる。この治療法の進捗は、従来の技術で容易にモニタリングすることができる。
【００７４】
本発明は、制限的と解釈すべきではない以下の実施例によってさらに例示される。本願を通じて引用された全ての引用文献、特許および公開特許明細書、さらには図および表は、本願に参照文献として援用する。
【実施例１】
【００７５】
（２Ａ２  Ａｂのヒト化および産生）
（ハイブリドーマからの２Ａ２の可変Ｌ鎖およびＨ鎖のクローニング）
２Ａ２ハイブリドーマ細胞を遠心分離により回収し、ＲＮＡ精製キットを用いて総ＲＮＡを抽出した。この総ＲＮＡをｃＤＮＡ合成に用い、「ファージディスプレイマニュアル」で公表されたプライマーセットを用いて２Ａ２のＶ領域を最終的に分離した。図１Ａは、２Ａ２の可変Ｈ鎖（ＶＨ）およびＬ鎖（ＶＬ）配列を示す。
【００７６】
（２Ａ２可変領域のヒト化）
通常、げっ歯類抗体はヒトに対して免疫原性となり、かつＨＡＭＡ（ヒト抗マウス抗体）応答またはアナフィラキシーショックを含む非常に重篤な副作用を引き起こす可能性がある。この問題を克服するため、抗体操作を用いて非ヒト抗体をヒト化している。したがって、ＣＤＲ移植法を用いて２Ａ２のＶＬおよびＶＨをヒト化した。
【００７７】
ＣＤＲ移植法は、現在最も頻繁に用いられるげっ歯類ｍＡｂのヒト化のための戦略である。この手法では、げっ歯類ｍＡｂの抗原結合部位を構成するＣＤＲループを対応するヒトフレームワーク領域に移植する。
【００７８】
２Ａ２のものと相同なヒトＶＬおよびＶＨを同定するため、ＶＢＡＳＥオンラインデータベース（ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ）を用いて、２Ａ２の可変領域をヒト生殖系列配列の可変領域と比較した。その結果、２つのヒト生殖系列ＶＬおよびＶＨ配列が確認された。２Ａ２クローンのアミノ酸配列アラインメントおよびヒト生殖系列配列を図１Ｂに示す。
【００７９】
選択した２Ａ２  ＶＨ配列は、ＶＨ１ファミリー由来のヒトＶ遺伝子１〜４６およびヒトＪ遺伝子ＪＨ６に対して最も相同であることが確認された。選択した２Ａ２  ＶＬ配列は、Ｖｋ２ファミリー由来のヒトＶ遺伝子Ａ１およびヒトＪ遺伝子Ｊｋ２に対して最も相同であることが確認された。したがって、２Ａ２  ｍＡｂのヒト化を目的として、マウスＣＤＲ配列のうち３つをそれぞれに含む合成されたＶＬおよびＶＨを、選択したヒトフレームワーク配列に移植した。
【００８０】
（哺乳類細胞におけるヒト化２Ａ２  ＩｇＧ１の発現を目的としたベクターの構築）
本来２Ａ２  ｍＡｂはマウスＩｇＭである。ＩｇＧ１は血清中で最も豊富であり（９ｍｇ／ｍＬ）、その半減期（２１日）は他の抗体のいずれもよりも長く、かつ現在最も流通している治療抗体はＩｇＧ１フォーマットであるので、ＩｇＭ抗体はＩｇＧ１フォーマットに変換される。哺乳類発現ベクターでヒト化２Ａ２  ＩｇＧ１を構築するために、ｐＯｐｔｉＶＥＣおよびｐｃＤＮＡ３．３（インビトロジェン）ベクターを用いた。
【００８１】
（哺乳類細胞におけるヒト化２Ａ２  ＩｇＧ１の発現を目的としたベクター）
典型的なベクターは、幅広い哺乳類細胞における組換えタンパク質の高レベル発現を目的として、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター／エンハンサーを含有する。ヒト化２Ａ２  ＩｇＧ１を構築するために、マウス２Ａ２の３つのＣＤＲをそれぞれ有するヒト可変Ｌ鎖およびＨ鎖を合成し、これら２つのＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲによりヒト定常Ｌ鎖およびＨ鎖に結合した。最後に、ヒト化２Ａ２  Ｌ鎖をｐｃＤＮＡ３．３  ＴＯＰＯにクローニングし、またヒト化２Ａ２  Ｈ鎖をｐＯｐｔｉＶＥＣ  ＴＯＰＯ抗体発現ベクターにクローニングした。ヒト２Ａ２  ＩｇＧ１の配列を図２Ａ〜Ｂに示すが、ヒト定常Ｌ鎖の第１アミノ酸（Ａｒｇｉｎｉｎｅ、赤い網掛け）は、全ヒト化Ｌ鎖の構築の際に欠失したことが示された。これらのヒト２Ａ２  Ａｂ発現ベクターを構築した後、ＤＮＡプラスミドを、ＣＨＯ由来ＤＨＦＲ陰性ＤＧ４４細胞にコトランスフェクトして、２Ａ２  ｈＩｇＧ１抗体を産生する安定した細胞株を作製した。
【００８２】
（抗体産生を目的とした安定細胞株の開発）
高レベルの抗体を産生する細胞株を得るため、ＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ培地およびジェネティシン５００μｇ／ｍＬを含有するＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ培地を用いて２回の選択を行い、続いて、９６ウェルプレート内の半固形培地でＭＴＸゲノムの増幅選択および２回の単一細胞クローンの選択を行い、安定にトランスフェクトされた細胞のプールを選択した。ＥＬＩＳＡ測定定量により抗体の発現レベルをスクリーニングし、選択したｈ２Ａ２ＩｇＧ１−ＣＨＯ細胞（Ｇ３Ａ１０、Ｃ５Ｇ６およびＤ５Ｆ１１）株を徐々にスケールアップした。
【実施例２】
【００８３】
（追加的な抗セラミド抗体の作製）
マウスにおける反復投与試験を目的としたモノクローナル抗体パネルを生成し、免疫原性を検討した。抗原（アルブミン結合ω−ＣＯＯＨ  Ｃ１６−セラミド）を用いて、抗セラミドＭａｂの選択を目的としたＥＬＩＳＡによるハイブリドーマのスクリーニングを実施した。ＢＳＡおよびアルブミン結合ω−ＣＯＯＨ  Ｃ１６ジヒドロセラミドに対して、陽性ヒットをカウンタースクリーニングした。次に、Ｍａｂの生物学的試験（Ｊｕｒｋａｔ細胞アポトーシスのインビトロ阻害、放射線ＧＩ症候群のインビボ阻害）を実施した。９Ｈ１０、９Ｈ１１、９Ａ２、７Ｂ１０、６Ｂ５および６Ｃ８と命名したクローンを試験用に選択したところ、９Ａ２を除く全てがインビトロで生物学的活性を示した。表１に示すように、クローンのパネルはＣ１６：０カルボキシセラミド−ＢＳＡと優先的に結合した。Ａｇ１はＣ１６：０カルボキシセラミド−ＢＳＡ３００ｎｇ／ウェルでコーティングし、Ａｇ２はＣ−１６：０ジヒドロカルボキシセラミド−ＢＳＡ３００ｎｇ／ウェルでコーティングし、Ａｇ３は非結合ＢＳＡ（シグマＡ６００３）３００ｎｇ／ウェルでコーティングした。
【００８４】
（表１−抗セラミドｍＡｂ）
【表１】
0006670297.tif 000002
【００８５】
クローン６Ｂ５および６Ｃ８はＩｇＧと同定された一方、クローン７Ｂ１０、９Ｈ１０および９Ｈ１１はＩｇＭと同定された。ＩｇＧと同定されたものについての追加的なデータを表２に示す。Ａｇ１は炭酸水素ナトリウム中のＣ１６：０カルボキシセラミド−ＢＳＡ５００ｎｇ／ウェルでコーティングし、Ａｇ２は炭酸水素ナトリウム中のＣ−１６：０ジヒドロカルボキシセラミド−ＢＳＡ５００ｎｇ／ウェルでコーティングし、Ａｇ３は炭酸水素ナトリウム中の非結合ＢＳＡ（シグマＡ６００３）５００ｎｇ／ウェルでコーティングした。
【００８６】
（表２−抗セラミドｍＡｂの濃度曲線）
【表２】
0006670297.tif 000003
【００８７】
図３は、クローン９Ｈ１０、９Ｈ１１、７Ｂ１０、６Ｂ５および６Ｃ８がインビトロで生物学的活性を示すことを示す。
【００８８】
Ｊｕｒｋａｔ細胞を１０Ｇｙ透過線照射に被曝させることにより、陽性クローンを生物学的活性についてスクリーニングした。ＩＲの直前にモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を指示された用量で培地に添加し、細胞を１６時間インキュベートした後固定した。ＨＯＥＳＣＨＳＴビスベンズアミド染色および形態学的試験によりアポトーシスを定量した。結果を図４に示した。
【００８９】
クローン７Ｂ１０（ＩｇＭ）、６Ｂ５（ＩｇＧ）および６Ｃ８（ＩｇＧ）について陰窩致死性を検討した。図５は、１５Ｇｙ  ＩＲの１５分前に投与するとき、いずれもが用量依存的に陰窩致死性を阻害したことを示す。
【００９０】
６Ｂ５、６Ｃ８、７Ｂ１０、９Ｈ１０および９Ｈ１１のＣＤＲの配列を決定した。配列データより、これらのＭａｂ間、および２Ａ２（代替的免疫／スクリーニングプロトコルにより作製）のＣＤＲとの著しい相同性が判明した。ＩｇＭは、ＩｇＭ同士および２Ａ２との間でさらに大きな相同性を有するとみられる。同じく、２つのＩｇＧは互い同士が最も類似していた。図６は、６つのマウス抗体Ｈ鎖およびＬ鎖可変領域配列の配列アラインメント、およびヒト化ｈ２Ａ２（ｍ２Ａ２由来）の配列、およびコンピュータで作成したコンセンサス配列の描出を示す。Ｈ鎖可変領域のＣＤＲ１においては、各抗体はＮ末端から１位にＧｌｙ、Ｎ末端から２位にＴｙｒまたはＰｈｅ、Ｎ末端から４位にＰｈｅまたはＬｅｕ、およびＮ末端から５位にＴｈｒまたはＳｅｒおよびＮ末端から１０位にＨｉｓまたはＡｓｎを含む１０アミノ酸を含む。Ｈ鎖可変領域のＣＤＲ２においては、各抗体はＮ末端から２位にＡｓｎまたはＩｌｅ、Ｎ末端から４位にＰｈｅまたはＳｅｒ、Ｃ末端から９位にＴｈｒ、Ｃ末端から７位にＴｙｒ、Ｃ末端から６位にＡｓｎまたはＡｒｇ、Ｃ末端から４位にＬｙｓまたはＡｌａ、およびＣ末端から３位にＰｈｅを含む１６〜１７アミノ酸を含む。マウス抗体のＨ鎖可変領域のＣＤＲ３においては、各抗体はＮ末端から４位にＴｙｒまたはＴｈｒを含む７から１１アミノ酸を含む。Ｌ鎖可変領域のＣＤＲ１においては、各抗体はＮ末端から２位にＡｌａまたはＳｅｒ、Ｎ末端から３位にＳｅｒ、Ｎ末端から５位にＳｅｒまたはＡｓｐ、およびＣ末端から３位にＴｈｒ、ＳｅｒまたはＰｈｅを含む１０〜１６アミノ酸を含む。Ｌ鎖可変領域のＣＤＲ２においては、各抗体はＮ末端から３位にＳｅｒまたはＡｓｎ、Ｎ末端から５位にＬｙｓまたはＳｅｒ、およびＮ末端から７位にＳｅｒまたはＡｓｐを含む７アミノ酸を含む。Ｌ鎖可変領域のＣＤＲ３においては、各マウス抗体はＮ末端から１位にＧｌｎ、ＬｅｕまたはＴｒｐ、Ｎ末端から２位にＧｌｎ、Ｎ末端から７位にＰｒｏ、およびＮ末端から９位にＴｈｒを含む９アミノ酸を含む。
【００９１】
図６には、６Ｂ５、６Ｃ８、７Ｂ１０、９Ｈ１０および９Ｈ１１のＣＤＲ配列に由来する配列情報に基づく、抗セラミドコンセンサス配列Ｈ鎖およびＬ鎖ＣＤＲを示す。驚くべきことに、本発明者らは、抗セラミド抗体のＬ鎖およびＨ鎖可変領域のＣＤＲ領域が一定の保存アミノ酸残基を有することを確認した。一部の実施形態においては、抗セラミド抗体６Ｂ５、６Ｃ８、７Ｂ１０、９Ｈ１０、９Ｈ１１および２Ａ２のうち２つまたはそれ以上の配列から決定されたコンセンサス配列を用いて、コンセンサスＣＤＲ、コンセンサス可変領域、またはコンセンサス可変領域配列と少なくとも８０％、９０％、または９５％の配列同一性を含む可変領域を含むｓｃＦｖ抗体を作製することができる。
【実施例３】
【００９２】
（抗セラミドｓｃＦｖの作製）
Ｍａｂの有効性データに基づき、６Ｂ５のＣＤＲを（２Ａ２と共に）選択し、操作して単鎖Ｆｖとした。２つの単鎖（ｓｃ）Ｆｖ構成体を操作してｓｃＦｖを発現させ、有効性試験用の精製ｓｃＦｖを提供した。６Ｂ５  ｓｃＦｖは容易に発現および精製された。Ｍａｂと同様、Ｊｕｒｋａｔ細胞アポトーシスのインビトロ阻害および放射線ＧＩ症候群のインビボ阻害を用いて、ｓｃＦｖの生物学的試験を実施した。図５は、マイクロコロニー測定により、６Ｂ５  ＩｇＧが陰窩死より保護することを示す。図７は、ｓｃＦｖがＪｕｒｋａｔ細胞アポトーシスを阻害することを示す。図８は、６Ｂ５  ｓｃＦｖを１５Ｇｙ被曝より１５分前に投与した場合、インビボＧＩ陰窩枯渇から保護することを示すことの例示である。図９は、６Ｂ５  ｓｃＦｖを１５Ｇｙ被曝より２４時間後に投与した場合、インビボＧＩ陰窩枯渇から保護することを示す。
【００９３】
（抗セラミドｓｃＦｖは致死的急性移植片対宿主病からマウスを保護する）
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ＭＨＣ  Ｈ２ｂハプロタイプ）に対し、生理食塩水、ヒト化抗セラミドｈ２Ａ２  ５０ｍｇ／ｋｇまたは抗セラミドｓｃＦｖ  ６Ｂ５  ７．５ｍｇ／ｋｇを、指示された投与経路および投与スケジュールにより投与した。投与は１１００ｃＧｙ分割線量全身照射（ＴＢＩ）の１５分前に開始した。次にマウスは、ＴＢＩより１６〜２０時間後に、Ｂ１０．ＢＲドナーマウス（ＭＨＣ  Ｈ２ｋ２ハプロタイプ）に由来する５×１０６個の同種骨髄（ＢＭ）またはＢＭおよび２×１０６個の同種ＣＤ５＋ナイーブＴ細胞からなる同種骨髄移植を受けた。マウスの生存を連日モニタリングした。データは、９０日生存を表すと判定された１０日目の生存を表す。投与予定日０、４および８日目に生理食塩水を静脈内投与したところ、１０日後の生存率は３０％となった。投与予定日０、４および８日目にｈ２Ａ２モノクローナル抗体を静脈内投与したところ、１０日後の生存率は１００％となった（生理食塩水対照に対してｐ＜０．００１）。投与予定日０、４および８日目にｓｃＦＶを静脈内投与したところ、１０日後の生存率は６０％となった（生理食塩水対照に対してｐ＜０．０５）。投与予定日０、２、４、６および８日目に生理食塩水を皮下投与したところ、１０日後の生存率は０％となった。投与予定日０、２、４、６および８日目に生理食塩水を皮下投与したところ、１０日後の生存率は１００％となった（生理食塩水対照に対してｐ＜０．００１）。
【００９４】
図１０に示すように、抗セラミドｓｃＦｖは腸陰窩を用量依存的に保護する。図１１に示すように、代替的な注射法で投与するとき抗セラミドｓｃＦｖは有効性を維持する。図１２に示すように、抗セラミドｈ２ａ２およびｓｃＦｖは放射線ＧＩ症候群の致死作用を保護および緩和する。図１３に示すように、抗セラミドｓｃＦｖは致死的急性移植片対宿主病からマウスを保護する。図１４に示すように、抗セラミドｓｃＦｖは致死的な急性移植片対宿主病の際にマウス腸幹細胞を保護する。図１５に示すように、抗セラミドｈ２ａ２およびｓｃＦｖは腸間膜リンパ節内でのＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球の保持を高める（図１５）。
【００９５】
上記の記述は、当業者に本発明を実践する方法を教示することを目的としており、記述を読むとき当業者に明らかとなるその明白な改変および変法のすべてを詳述することを意図していない。しかしそのような明白な改変および変法は、いずれも以下の請求項に定義される本発明の範囲内に含まれることが意図されている。請求項は、文脈上特に反対のことが示されない限り、そこで意図する目的に合致ために有効な、任意の順の構成要素およびステップを包含することを意図する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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