(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒｅｎｉｌｌａ緑色蛍光タンパク質（Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰ）またはＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼタンパク質（Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃ）で標識された目的のタンパク質を含む第１の構成成分と、
Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰまたはＲｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識された細胞区画標的化部分を含む第２の構成成分と
を含み、
前記目的のタンパク質が前記Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰで標識される場合、前記細胞区画標的化部分は前記Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識され、前記目的のタンパク質が前記Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識される場合、前記細胞区画標的化部分は前記Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰで標識される
目的のタンパク質の輸送及び／または局在化を評価するバイオセンサー。
【請求項２】
前記目的のタンパク質は前記Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識され、前記細胞区画標的化部分は前記Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰで標識される、請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項３】
前記目的のタンパク質が、ｉ）エフェクタータンパク質、ｉｉ）低分子ＧＴＰアーゼに結合するタンパク質、ｉｉｉ）β−アレスチンポリペプチド、ｉｖ）細胞表面受容体タンパク質、ｖ）Ｇタンパク質サブユニットポリペプチド、ｖｉ）シグナル伝達ペプチド、ｖｉｉ）アダプタータンパク質、ｖｉｉｉ）受容体の刺激により形質膜へ動員されるタンパク質、ｉｘ）受容体の刺激により形質膜から隔離されるタンパク質、またはｘ）それらのフラグメントである、請求項１または２に記載のバイオセンサー。
【請求項４】
前記低分子ＧＴＰアーゼに結合するタンパク質が、Ｒｈｏ結合ポリペプチドである、請求項３に記載のバイオセンサー。
【請求項５】
前記目的のタンパク質が細胞表面受容体である、請求項３に記載のバイオセンサー。
【請求項６】
前記細胞表面受容体がＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）または受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）である、請求項５に記載のバイオセンサー。
【請求項７】
前記目的のタンパク質がプレクストリン相同（ＰＨ）ドメインを含む、請求項３に記載のバイオセンサー。
【請求項８】
前記目的のタンパク質がＰＬＣδ１のＰＨドメインを含む、請求項７に記載のバイオセンサー。
【請求項９】
前記目的のタンパク質がホルボールエステル／ジアシルグリセロール結合ドメインを含む、請求項３に記載のバイオセンサー。
【請求項１０】
前記目的のタンパク質がＰＫＣ（Ｃ１ｂ）のホルボールエステル／ジアシルグリセロール結合ドメインを含む、請求項９に記載のバイオセンサー。
【請求項１１】
前記目的のタンパク質が、少なくとも１つのＳＨ２及び／またはＳＨ３ドメインを含むアダプタータンパク質あるいはそのフラグメントである、請求項３に記載のバイオセンサー。
【請求項１２】
前記細胞区画標的化部分が、形質膜（ＰＭ）標的化部分、エンドソーム標的化部分、ゴルジ標的化部分、リソソーム標的化部分、ペルオキシソーム標的化部分、オートファゴソーム標的化部分、リボソーム標的化部分、ミトコンドリア標的化部分、細胞骨格標的化部分または核標的化部分である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のバイオセンサー。
【請求項１３】
前記細胞区画標的化部分が形質膜（ＰＭ）標的化部分またはエンドソーム標的化部分である、請求項１２に記載のバイオセンサー。
【請求項１４】
前記ＰＭ標的化部分が、（ａ）パルミトイル化、ミリストイル化及び／もしくはプレニル化シグナル配列、ならびに／または（ｂ）多塩基配列を含む、請求項１３に記載のバイオセンサー。
【請求項１５】
前記ＰＭ標的化部分が、アミノ酸配列ＭＧＣＩＫＳＫＧＫＤＳ（配列番号１）、ＧＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫＣＶＩＭ（配列番号７）、ＣＭＳＣＫＣＶＬＳ（配列番号４７）、ＣＭＳＣＫＣＣＩＬ（配列番号４３）、またはＳＰＫＫＧＬＬＱＲＬＦＫＲＱＨＱＮＮＳＫＳ（配列番号８）を含む、請求項１４に記載のバイオセンサー。
【請求項１６】
前記エンドソーム標的化部分が、ＦＹＶＥドメインを含む、請求項１３に記載のバイオセンサー。
【請求項１７】
前記エンドソーム標的化部分が、ヒトｅｎｄｏｆｉｎの残基７３９〜８０６（配列番号２０）を含む、請求項１６に記載のバイオセンサー。
【請求項１８】
前記エンドソーム標的化部分が、前記Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃもしくは前記Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰのＣ末端に融合している、及び／または、前記目的のタンパク質が、前記Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃもしくは前記Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰのＮ末端に融合している、請求項１３、１６及び１７のいずれか一項に記載のバイオセンサー。
【請求項１９】
前記目的のタンパク質が、前記Ｒｅｎｉｌｌａ  ＬｕｃのＮ末端に融合しているβ−アレスチンポリペプチドであり、かつ、前記細胞区画標的化部分が、前記Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰのＣ末端の端部に融合している、形質膜（ＰＭ）標的化部分またはエンドソーム標的化部分である、請求項３に記載のバイオセンサー。
【請求項２０】
前記目的のタンパク質が、前記Ｒｅｎｉｌｌａ  ＬｕｃのＮ末端に融合しているＧＰＣＲであり、かつ、前記細胞区画標的化部分が、前記Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰのＣ末端の端部に融合している、形質膜（ＰＭ）標的化部分またはエンドソーム標的化部分である、請求項５に記載のバイオセンサー。
【請求項２１】
前記第１及び第２の構成成分が、５０〜５００個のアミノ酸の可動性ポリペプチドリンカーにより共有結合的に連結している、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のバイオセンサー。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載のバイオセンサーの前記第１及び／または第２の構成成分をコードする、核酸。
【請求項２３】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載のバイオセンサーを発現する、宿主細胞。
【請求項２４】
作用物質が細胞中の目的のタンパク質の輸送を調節するかを決定する方法であって、
前記作用物質の存在及び不在下で請求項１〜２１のいずれか一項に記載のバイオセンサーにおけるＢＲＥＴシグナルを測定することを含み、
前記作用物質の不在下と比べた存在下での前記ＢＲＥＴシグナルの差が、前記作用物質が前記細胞中の前記目的のタンパク質の前記輸送を調節することを示す、前記方法。
【請求項２５】
第１及び第２の条件間の細胞区画における生体分子の量の調節を評価する方法であって、
前記生体分子に結合するタンパク質マーカーで標識されたＲｅｎｉｌｌａ緑色蛍光タンパク質（Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰ）を含む第１の構成成分と
前記タンパク質マーカーで標識されたＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼタンパク質（Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃ）を含む第２の構成成分と
を含むバイオセンサーを提供することと、
前記第１及び第２の条件下のＢＲＥＴ受容体シグナルを測定することと
を含み、
前記第１及び第２の条件間の前記ＢＲＥＴシグナルの差が、前記第１及び第２の条件間の前記細胞区画における前記生体分子の量の調節を示す、前記方法。
【請求項２６】
前記第１の条件が作用物質の存在であり、前記第２の条件が作用物質の不在である、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年９月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／０５２，７３８号の利益を主張し、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、一般に、タンパク質などの生体分子の局在化、移送及び輸送、例えば、細胞表面受容体エンドサイトーシス、再循環、ならびに受容体及びエフェクターの細胞内輸送の評価／モニタリングに関する。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質輸送は、タンパク質が細胞の１つの領域から別の領域に再配置される能動的プロセスである。膜及びそれらのタンパク質構成成分は、複数の構成成分及び経路を有する機構を介して常に入れ替わっている。Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）及び上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）などの細胞表面受容体の活性を調節する１つの機構は、受容体エンドサイトーシスを介するものである。ＧＰＣＲでは、リガンド誘発性受容体エンドサイトーシスが、クラスリン被覆小胞のような特殊化された区画を介してＰＭからの受容体の除去を誘導することができ、これには、連結された受容体へのエンドサイトーシスアダプターであるβ−アレスチンの動員を伴う（Ｃｌａｉｎｇ，Ｌａｐｏｒｔｅ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。内部移行受容体を、多様なリソソーム及び再循環経路に向けて、ヘテロ三量体Ｇタンパク質を介した細胞シグナル伝達の強度及び持続時間に本質的に反対の効果を生じることができ、β−アレスチンのシグナル伝達足場を介して、細胞内膜から特定のシグナル伝達事象を促進することもできる（Ｈａｎｙａｌｏｇｌｕ  ａｎｄ  ｖｏｎ  Ｚａｓｔｒｏｗ  ２００８；Ｐｏｓｎｅｒ  ａｎｄ  Ｌａｐｏｒｔｅ  ２０１０）。治療上の利点が、ＧＰＣＲ／β−アレスチン複合体の細胞内標的化を促進する薬物において提案されているが、いくつかの受容体にとって、ＰＭへの再循環も、生理学的応答の適切な維持にとって必須である。
【０００４】
したがって、受容体輸送の簡素で信頼性の高いモニタリング系が、受容体エンドサイトーシスの機構を研究するため及びＧＰＣＲなどの細胞表面受容体に作用する効率的な治療薬を開発するための鍵である。例えば、アンギオテンシンＩＩ  １型受容体（ＡＴ１Ｒ）は、それが高血圧症、肥大症、線維症及びアテローム性動脈硬化症を含む心血管疾患の発症に関与し（Ｈｕｎｙａｄｙ  ａｎｄ  Ｃａｔｔ  ２００６）、心保護機能を有するリガンドが、受容体及び細胞内ＡＴ１Ｒ／β−アレスチン信号伝達複合体の内部移行も促進しうるので、薬物開発において相当注目されている。したがって、ＧＰＣＲなどの受容体の内部移行を誘発する薬物の傾向を、定量的で高い効率性をもって効率的に評価するアッセイを開発することによって、大きな利点が生じうる。
【０００５】
本記載は、多数の文書を参照しているが、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、以下の項目１〜７３に関する。
１．Ｒｅｎｉｌｌａ緑色蛍光タンパク質（Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰ）またはＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼタンパク質（Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃ）で標識された目的のタンパク質を含む第１の構成成分と、
Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰまたはＲｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識された細胞区画標的化部分を含む第２の構成成分と
を含み、
前記第１のタンパク質が前記Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰで標識される場合、前記細胞区画標的化部分は前記Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識され、前記第１のタンパク質が前記Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識される場合、前記細胞区画標的化部分は前記Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰで標識される目的のタンパク質の輸送及び／または局在化を評価するバイオセンサー。
【０００７】
２．前記目的のタンパク質は前記Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識され、前記細胞区画標的化部分は前記Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰで標識される、項目１に記載のバイオセンサー。
【０００８】
３．前記目的のタンパク質が、Ｒｈｏ結合ポリペプチド、β−アレスチンポリペプチド、細胞表面受容体またはＧタンパク質サブユニットポリペプチドである、項目１または２に記載のバイオセンサー。
【０００９】
４．前記目的のタンパク質がＲｈｏ結合ポリペプチドである、項目３に記載のバイオセンサー。
【００１０】
５．前記目的のタンパク質が細胞表面受容体である、項目３に記載のバイオセンサー。
【００１１】
６．前記細胞表面受容体がＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）である、項目５に記載のバイオセンサー。
【００１２】
７．前記細胞区画標的化部分が、形質膜（ＰＭ）標的化部分、エンドソーム標的化部分、ゴルジ標的化部分、リソソーム標的化部分、ペルオキシソーム標的化部分、オートファゴソーム標的化部分、リボソーム標的化部分、ミトコンドリア標的化部分、細胞骨格標的化部分または核標的化部分である、項目１〜６のいずれか１つに記載のバイオセンサー。
【００１３】
８．前記細胞区画標的化部分が形質膜（ＰＭ）標的化部分である、項目７に記載のバイオセンサー。
【００１４】
９．前記ＰＭ標的化部分またはそのフラグメントが、ＰＭに局在化しているＰＭタンパク質またはそのフラグメントである、項目８に記載のバイオセンサー。
【００１５】
１０．前記ＰＭタンパク質またはそのフラグメントが、（ａ）パルミトイル化、ミリストイル化及び／もしくはプレニル化シグナル配列、ならびに／または（ｂ）多塩基配列を含む、項目９に記載のバイオセンサー。
【００１６】
１１．前記パルミトイル化及び／またはミリストイル化シグナル配列が、ヒトＳｒｃファミリーキナーゼＬｙｎからのものである、項目１０に記載のバイオセンサー。
【００１７】
１２．前記ＰＭ標的化部分が、アミノ酸配列ＭＧＣＩＫＳＫＧＫＤＳ（配列番号１）を含む、項目１１に記載のバイオセンサー。
【００１８】
１３．前記多塩基配列及びプレニル化シグナル配列が、ヒトＫＲＡＳスプライス変異体ｂからのものである、項目１２に記載のバイオセンサー。
【００１９】
１４．前記ＰＭ標的化部分が、アミノ酸配列ＧＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫＣＶＩＭ（配列番号７）を含む、項目１３に記載のバイオセンサー。
【００２０】
１５．前記ＰＭ標的化部分が、ｈＲａｓからのパルミトイル化配列及びプレニル化シグナル配列を含む、項目１０に記載のバイオセンサー。
【００２１】
１６．前記ＰＭ標的化部分が、アミノ酸配列ＣＭＳＣＫＣＶＬＳ（配列番号４７）を含む、項目１５に記載のバイオセンサー。
【００２２】
１７．前記ＰＭ標的化部分が、ｈＲａｓからのパルミトイル化配列及びＲａｌ１からのプレニル化シグナル配列を含む、項目１０に記載のバイオセンサー。
【００２３】
１８．前記ＰＭ標的化部分が、アミノ酸配列ＣＭＳＣＫＣＣＩＬ（配列番号４３）を含む、項目１７に記載のバイオセンサー。
【００２４】
１９．前記ＰＭタンパク質またはそのフラグメントがカベオリン１αである、項目９に記載のバイオセンサー。
【００２５】
２０．前記ＰＭ標的化多塩基配列が、ヒトＧＲＫ５からのものである、項目１０に記載のバイオセンサー。
【００２６】
２１．前記ＰＭ標的化部分が、アミノ酸配列ＳＰＫＫＧＬＬＱＲＬＦＫＲＱＨＱＮＮＳＫＳ（配列番号８）を含む、項目２０に記載のバイオセンサー。
【００２７】
２２．（ｉ）前記ＰＭ標的化部分が、ヒトＳｒｃファミリーキナーゼＬｙｎからのパルミトイル化及び／またはミリストイル化シグナル配列を含み、前記Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃまたは前記Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰのＮ末端に融合している、あるいは（ｉｉ）前記ＰＭ標的化部分が、（ａ）ヒトＫＲＡＳスプライス変異体ｂもしくはＨＲＡＳからの多塩基配列及びプレニル化シグナル配列、（ｂ）ＨＲＡＳからのパルミトイル化配列及びＲａｌ１からのプレニル化シグナル配列、（ｃ）カベオリン１αもしくはそのフラグメント、または（ｄ）ヒトＧＲＫ５からの多塩基配列を含み、前記Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃまたは前記Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰのＣ末端に融合している、項目８〜２１に記載のバイオセンサー。
【００２８】
２３．前記細胞区画標的化部分がエンドソーム標的化部分である、項目７に記載のバイオセンサー。
【００２９】
２４．前記エンドソーム標的化部分が、エンドソームに局在化しているエンドソームタンパク質またはそのフラグメントである、項目２３に記載のバイオセンサー。
【００３０】
２５．前記エンドソームタンパク質またはそのフラグメントが、ＦＹＶＥドメインを含む、項目２４に記載のバイオセンサー。
【００３１】
２６．前記エンドソーム標的化部分が、ヒトｅｎｄｏｆｉｎのＦＹＶＥドメインを含む、項目２３〜２５のいずれか１つに記載のバイオセンサー。
【００３２】
２７．前記エンドソーム標的化部分が、ヒトｅｎｄｏｆｉｎの残基７３９〜８０６（配列番号２０）を含む、項目２６に記載のバイオセンサー。
【００３３】
２８．前記エンドソームタンパク質またはそのフラグメントが、Ｒａｂタンパク質またはそのフラグメントである、項目２３に記載のバイオセンサー。
【００３４】
２９．前記Ｒａｂタンパク質がＲａｂ４またはＲａｂ  １１である、項目２８に記載のバイオセンサー。
【００３５】
３０．前記エンドソーム標的化部分が、前記Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃまたは前記Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰのＣ末端に融合している、項目２３〜２９のいずれか１つに記載のバイオセンサー。
【００３６】
３１．前記目的のタンパク質が、前記Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃまたは前記Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰのＮ末端に融合している、項目２３〜３０のいずれか１つに記載のバイオセンサー。
【００３７】
３２．前記細胞区画標的化部分がゴルジ標的化部分である、項目７に記載のバイオセンサー。
【００３８】
３３．前記ゴルジ標的化部分が、ゴルジに局在化しているゴルジタンパク質またはそのフラグメントである、項目３２に記載のバイオセンサー。
【００３９】
３４．前記ゴルジ標的化部分が、ゴルジに局在化しているｅＮＯＳ１タンパク質またはそのフラグメントである、項目３３に記載のバイオセンサー。
【００４０】
３５．前記ゴルジ標的化部分が、ヒトｅＮＯＳ１の残基１〜７３（配列番号４２）を含む、項目３４に記載のバイオセンサー。
【００４１】
３６．前記第１及び第２の構成成分が、可動性リンカーにより共有結合的に連結している、項目１〜３５のいずれか１つに記載のバイオセンサー。
【００４２】
３７．前記可動性リンカーが、約５０〜約５００個のアミノ酸のポリペプチドである、項目３６に記載のバイオセンサー。
【００４３】
３８．前記可動性リンカーが、約３００個のアミノ酸のポリペプチドである、項目３７に記載のバイオセンサー。
【００４４】
３９．項目１〜３８のいずれか１つに記載のバイオセンサーの第１及び／または第２の構成成分をコードする、核酸。
【００４５】
４０．項目３９に記載の核酸を含む、ベクター。
【００４６】
４１．項目１〜３８のいずれか１つに記載のバイオセンサーを発現する、宿主細胞。
【００４７】
４２．作用物質が細胞中の目的のタンパク質の輸送を調節するかを決定する方法であって、前記作用物質の存在及び不在下で項目１〜３８のいずれか１つに記載のバイオセンサーにおけるＢＲＥＴシグナルを測定することを含み、
前記作用物質の不在下と比べた存在下での前記ＢＲＥＴシグナルの差が、前記作用物質が前記細胞中の前記目的のタンパク質の輸送を調節することを示す、前記方法。
【００４８】
４３．作用物質が細胞において目的の細胞表面受容体の内部移行を誘発するかを決定する方法であって、前記作用物質の存在及び不在下で項目８〜２２のいずれか１つに記載のバイオセンサーにおけるＢＲＥＴシグナルを測定することを含み、
前記作用物質の不在下と比べて存在下でより低いＢＲＥＴシグナルが、前記作用物質が目的の細胞表面受容体の前記内部移行を誘発することを示す、前記方法。
【００４９】
４４．細胞表面における目的の内部移行受容体の再循環を評価する方法であって、
（ａ）本明細書において定義されたＰＭ標的化部分を含む第１及び第２のバイオセンサーを、前記受容体の内部移行を誘発するリガンドの存在下で接触させることと、
（ｂ）前記接触の後に第１のバイオセンサーにおけるＢＲＥＴシグナルを測定することと、
（ｃ）前記第２のバイオセンサーを洗浄して、前記リガンドを除去することと、
（ｄ）前記洗浄の後に第２のバイオセンサーにおけるＢＲＥＴシグナルを測定することと、
（ｅ）第１及び第２のバイオセンサーにおけるＢＲＥＴシグナルを比較して、細胞表面における目的の内部移行受容体の前記再循環を決定することと
を含み、
前記第１のバイオセンサーと比べて前記第２のバイオセンサーのより高いＢＲＥＴシグナルが、細胞表面における目的の内部移行受容体の再循環を示す、前記方法。
【００５０】
４５．洗浄の後にステップ（ｄ）及び（ｅ）をそれぞれ別の時間に反復して、目的の内部移行受容体の再循環の動力学を研究することを更に含む、項目４４に記載の方法。
【００５１】
４６．作用物質が、エンドソーム区画において目的の細胞表面受容体の輸送を誘発するかを決定する方法であって、前記作用物質の存在及び不在下で項目２３〜３１のいずれか１つに記載のバイオセンサーのＢＲＥＴシグナルを測定することを含み、前記作用物質の不在下と比べて存在下におけるより高いＢＲＥＴシグナルが、前記作用物質が前記エンドソーム区画において前記目的の細胞表面受容体の輸送を誘発することを示す、前記方法。
【００５２】
４７．前記方法が、複数のバイオセンサーを使用して実施され、前記バイオセンサーが、それぞれ異なるエンドソーム標的化部分を含む、項目４６に記載の方法。
【００５３】
４８．作用物質が、目的の受容体の薬理学的シャペロンとして作用するかを決定する方法であって、前記作用物質の存在及び不在下で項目８〜２２のいずれか１つに記載のバイオセンサーにおけるＢＲＥＴシグナルを測定することを含み、前記作用物質の不在下と比べて存在下におけるより高いＢＲＥＴシグナルが、前記作用物質が前記目的の受容体の薬理学的シャペロンとして作用することを示す、前記方法。
【００５４】
４９．作用物質が、目的の受容体の薬理学的シャペロンとして作用するかを決定する方法であって、
Ｒｅｎｉｌｌａ緑色蛍光タンパク質（Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰ）またはＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼタンパク質（Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃ）で標識された前記目的の受容体と、Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰまたはＲｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識された小胞体（ＥＲ）標的化部分とを含むバイオセンサーを提供することであって、前記受容体が前記Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰで標識される場合、前記ＥＲ標的化部分は前記Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識され、前記受容体が前記Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識される場合、前記ＥＲ標的化部分は前記Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰで標識される、前記提供することと、
前記作用物質の存在及び不在下でＢＲＥＴ受容体シグナルを測定することと
を含み、
前記作用物質の不在下と比べた存在下でのＢＲＥＴシグナルの減少が、前記作用物質が前記受容体の薬理学的シャペロンとして作用することを示す、前記方法。
【００５５】
５０．前記受容体が突然変異受容体である、項目４８または４９に記載の方法。
【００５６】
５１．前記受容体がＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）である、項目４８〜５０のいずれか１つに記載の方法。
【００５７】
５２．前記ＧＰＣＲが、メラノコルチン−４受容体（ＭＣ４Ｒ）またはバソプレシン２受容体（Ｖ２Ｒ）である、項目５１に記載の方法。
【００５８】
５３．前記受容体がイオンチャネルである、項目４８〜５２のいずれか１つに記載の方法。
【００５９】
５４．前記イオンチャネルが電位開口型カリウムチャネルである、項目５３に記載の方法。
【００６０】
５５．前記電位開口型カリウムチャネルがｈＥＲＧである、項目５４に記載の方法。
【００６１】
５６．前記受容体には前記Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識され、前記ＰＭ標的化部分またはＥＲ標的化部分には前記Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰで標識される、項目４８〜５５のいずれか１つに記載の方法。
【００６２】
５７．前記ＰＭ標的化が、項目９〜２２のいずれか１つにおいて定義されたＰＭ標的化部分である、項目４８〜５６のいずれか１つに記載の方法。
【００６３】
５８．作用物質が、形質膜へのβ−アレスチンの動員を誘発するかを決定する方法であって、
Ｒｅｎｉｌｌａ緑色蛍光タンパク質（Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰ）またはＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼタンパク質（Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃ）で標識された前記β−アレスチン、Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰまたはＲｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識された形質膜（ＰＭ）標的化部分、及びＧＰＣＲを含む細胞または膜調製物を含むバイオセンサーを提供することであって、前記β−アレスチンが前記Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰで標識される場合、前記ＰＭ標的化部分は前記Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識され、前記β−アレスチンが前記Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識される場合、前記ＰＭ標的化部分は前記Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰで標識される、前記提供することと、
前記作用物質の存在及び不在下でＢＲＥＴ受容体シグナルを測定することと
を含み、
前記作用物質の不在下と比べた存在下でのＢＲＥＴシグナルの増加が、前記作用物質が形質膜への前記β−アレスチンの動員を誘発することを示す、前記方法。
【００６４】
５９．前記β−アレスチンが前記Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識される、項目５８に記載の方法。
【００６５】
６０．前記ＰＭ標的化部分ＰＭ標的化が、項目９〜２２のいずれか１つにおいて定義されたＰＭ標的化部分である、項目５８または５９に記載の方法。
【００６６】
６１．第１及び第２の条件間の細胞区画における生体分子の量の調節を評価する方法であって、
前記生体分子に結合するタンパク質マーカーで標識されたＲｅｎｉｌｌａ緑色蛍光タンパク質（Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰ）を含む第１の構成成分と前記タンパク質マーカーで標識されたＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼタンパク質（Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃ）を含む第２の構成成分とを含むバイオセンサーを提供することと、
前記第１及び第２の条件下のＢＲＥＴ受容体シグナルを測定することと
を含み、
前記第１及び第２の条件間のＢＲＥＴシグナルの差が、前記第１及び第２の条件間の前記細胞区画における前記生体分子の量の調節を示す、前記方法。
【００６７】
６２．前記第１の条件が作用物質の存在であり、前記第２の条件が作用物質の不在である、項目６１に記載の方法。
【００６８】
６３．前記生体分子がリン脂質である、項目６１または６２に記載の方法。
【００６９】
６４．前記リン脂質がホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸（ＰＩＰ２）である、項目６３に記載の方法。
【００７０】
６５．前記タンパク質マーカーがプレクストリン相同（ＰＨ）ドメインを含む、項目６４に記載の方法。
【００７１】
６６．前記ＰＨドメインが、ＰＬＣδ１のＰＨドメインである、項目６５に記載の方法。
【００７２】
６７．前記生体分子が二次メッセンジャーである、項目６１または６２に記載の方法。
【００７３】
６８．前記二次メッセンジャーがジアシルグリセロール（ＤＡＧ）である、項目６７に記載の方法。
【００７４】
６９．前記タンパク質マーカーが、ホルボールエステル／ジアシルグリセロール結合ドメインを含む、項目６８に記載の方法。
【００７５】
７０．前記タンパク質マーカーが、ＰＫＣ（Ｃ１ｂ）のホルボールエステル／ジアシルグリセロール結合ドメインを含む、項目６９に記載の方法。
【００７６】
７１．前記タンパク質マーカーが、配列番号７２のアミノ酸配列を含む、項目７０に記載の方法。
【００７７】
７２．ＢＲＥＴシグナルが、プレート読み取り機または顕微鏡検査法を使用して測定される、項目４２〜７１のいずれか１つに記載の方法。
【００７８】
７３．前記Ｒｅｎｉｌｌａ  ＬｕｃがＲｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼＩＩ（ＲｌｕｃＩＩ）である、及び／または前記Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰがＲｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＧＦＰ（ｒＧＦＰ）である、項目１〜３８のいずれか１つに記載のバイオセンサー、または項目４２〜７２のいずれか１つに記載の方法。
【００７９】
本発明の他の目的、利点及び特徴は、添付図面を参照しながら、例示のためだけに提示されている以下の特定の本発明の実施形態の非限定的記載を読むことによって、更に明白になる。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｆは、生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）に基づいたＧＰＣＲエンドサイトーシスセンサーの生成を示す。図１Ａ〜１Ｃ：ＧＰＣＲエンドサイトーシスを評価／モニタリングするＢＲＥＴに基づいたセンサーの３つの立体配置である。形質膜における受容体（図１Ａ）及びβ−アレスチン（図１Ｃ）の量をモニターするため、ｌｙｎキナーゼのアシル化部分（ＭＧＣＩＫＳＫＧＫＤＳ）をｒＧＦＰのＮ末端に標識することによって、ｒＧＦＰを形質膜に係留する。図１Ｂ、１Ｃ：受容体（図１Ｂ）またはβ−アレスチン（図１Ｃ）のいずれかがエンドソームを標的にするかを検査するため、エンドソームにセンサーを繋ぎ止めているｅｎｄｏｆｉｎのＦＹＶＥドメイン（アミノ酸７３９〜８０６）を、ｒＧＦＰのＣ末端と融合させた。ｌｙｎ−ｒＧＦＰ（図１Ｄ）またはｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ（図１Ｅ）のいずれかを発現しているＨＥＫ２９３ＳＬ細胞を、共焦点蛍光顕微鏡検査法に付した。ｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ発現細胞を、５００ｎＭのワートマニンで４０分間処理した（図１Ｅ、右側パネル）。スケールバーは１０μｍである。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｆは、生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）に基づいたＧＰＣＲエンドサイトーシスセンサーの生成を示す。図１Ａ〜１Ｃ：ＧＰＣＲエンドサイトーシスを評価／モニタリングするＢＲＥＴに基づいたセンサーの３つの立体配置である。形質膜における受容体（図１Ａ）及びβ−アレスチン（図１Ｃ）の量をモニターするため、ｌｙｎキナーゼのアシル化部分（ＭＧＣＩＫＳＫＧＫＤＳ）をｒＧＦＰのＮ末端に標識することによって、ｒＧＦＰを形質膜に係留する。図１Ｂ、１Ｃ：受容体（図１Ｂ）またはβ−アレスチン（図１Ｃ）のいずれかがエンドソームを標的にするかを検査するため、エンドソームにセンサーを繋ぎ止めているｅｎｄｏｆｉｎのＦＹＶＥドメイン（アミノ酸７３９〜８０６）を、ｒＧＦＰのＣ末端と融合させた。ｌｙｎ−ｒＧＦＰ（図１Ｄ）またはｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ（図１Ｅ）のいずれかを発現しているＨＥＫ２９３ＳＬ細胞を、共焦点蛍光顕微鏡検査法に付した。ｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ発現細胞を、５００ｎＭのワートマニンで４０分間処理した（図１Ｅ、右側パネル）。スケールバーは１０μｍである。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｆは、生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）に基づいたＧＰＣＲエンドサイトーシスセンサーの生成を示す。図１Ａ〜１Ｃ：ＧＰＣＲエンドサイトーシスを評価／モニタリングするＢＲＥＴに基づいたセンサーの３つの立体配置である。形質膜における受容体（図１Ａ）及びβ−アレスチン（図１Ｃ）の量をモニターするため、ｌｙｎキナーゼのアシル化部分（ＭＧＣＩＫＳＫＧＫＤＳ）をｒＧＦＰのＮ末端に標識することによって、ｒＧＦＰを形質膜に係留する。図１Ｂ、１Ｃ：受容体（図１Ｂ）またはβ−アレスチン（図１Ｃ）のいずれかがエンドソームを標的にするかを検査するため、エンドソームにセンサーを繋ぎ止めているｅｎｄｏｆｉｎのＦＹＶＥドメイン（アミノ酸７３９〜８０６）を、ｒＧＦＰのＣ末端と融合させた。ｌｙｎ−ｒＧＦＰ（図１Ｄ）またはｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ（図１Ｅ）のいずれかを発現しているＨＥＫ２９３ＳＬ細胞を、共焦点蛍光顕微鏡検査法に付した。ｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ発現細胞を、５００ｎＭのワートマニンで４０分間処理した（図１Ｅ、右側パネル）。スケールバーは１０μｍである。
【図１Ｄ】図１Ａ〜１Ｆは、生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）に基づいたＧＰＣＲエンドサイトーシスセンサーの生成を示す。図１Ａ〜１Ｃ：ＧＰＣＲエンドサイトーシスを評価／モニタリングするＢＲＥＴに基づいたセンサーの３つの立体配置である。形質膜における受容体（図１Ａ）及びβ−アレスチン（図１Ｃ）の量をモニターするため、ｌｙｎキナーゼのアシル化部分（ＭＧＣＩＫＳＫＧＫＤＳ）をｒＧＦＰのＮ末端に標識することによって、ｒＧＦＰを形質膜に係留する。図１Ｂ、１Ｃ：受容体（図１Ｂ）またはβ−アレスチン（図１Ｃ）のいずれかがエンドソームを標的にするかを検査するため、エンドソームにセンサーを繋ぎ止めているｅｎｄｏｆｉｎのＦＹＶＥドメイン（アミノ酸７３９〜８０６）を、ｒＧＦＰのＣ末端と融合させた。ｌｙｎ−ｒＧＦＰ（図１Ｄ）またはｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ（図１Ｅ）のいずれかを発現しているＨＥＫ２９３ＳＬ細胞を、共焦点蛍光顕微鏡検査法に付した。ｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ発現細胞を、５００ｎＭのワートマニンで４０分間処理した（図１Ｅ、右側パネル）。スケールバーは１０μｍである。
【図１Ｅ】図１Ａ〜１Ｆは、生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）に基づいたＧＰＣＲエンドサイトーシスセンサーの生成を示す。図１Ａ〜１Ｃ：ＧＰＣＲエンドサイトーシスを評価／モニタリングするＢＲＥＴに基づいたセンサーの３つの立体配置である。形質膜における受容体（図１Ａ）及びβ−アレスチン（図１Ｃ）の量をモニターするため、ｌｙｎキナーゼのアシル化部分（ＭＧＣＩＫＳＫＧＫＤＳ）をｒＧＦＰのＮ末端に標識することによって、ｒＧＦＰを形質膜に係留する。図１Ｂ、１Ｃ：受容体（図１Ｂ）またはβ−アレスチン（図１Ｃ）のいずれかがエンドソームを標的にするかを検査するため、エンドソームにセンサーを繋ぎ止めているｅｎｄｏｆｉｎのＦＹＶＥドメイン（アミノ酸７３９〜８０６）を、ｒＧＦＰのＣ末端と融合させた。ｌｙｎ−ｒＧＦＰ（図１Ｄ）またはｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ（図１Ｅ）のいずれかを発現しているＨＥＫ２９３ＳＬ細胞を、共焦点蛍光顕微鏡検査法に付した。ｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ発現細胞を、５００ｎＭのワートマニンで４０分間処理した（図１Ｅ、右側パネル）。スケールバーは１０μｍである。
【図１Ｆ】図１Ｆ：受容体エンドサイトーシスの際の受容体、ｌｙｎ−ｒＧＦＰ及びＦＹＶＥドメインの同時可視化である。ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞に、Ｂ２Ｒ−ＣＦＰ、ｌｙｎ−ｒＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥを一時的に形質移入した。上側パネルは、基礎状態を示し、下側パネルは、ブラジキニン誘発性Ｂ２Ｒエンドサイトーシスを示した。スケールバーは１０μｍである。
【図１Ｇ】図１Ｇ：ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥセンサーのｍＣｈｅｒｒｙ標識変異体も、ＥＥに集合しているＲａｂ５と共に共局在化した。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｆは、ＢＲＥＴにより測定された用量及び時間依存性ＡＴ１Ｒエンドサイトーシスを示す。図２Ａ：ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞に、ｌｙｎ−ＧＦＰ１０（□）またはｌｙｎ−ｒＧＦＰ（■）のいずれかと共にＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩを形質移入した。細胞を様々な濃度のＡｎｇＩＩと共に４０分間インキュベートし、次にＢＲＥＴを、「材料及び方法」に記載されているように測定した。
【図２Ｂ】図２Ｂ：ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞に、ＧＦＰ１０−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥまたはｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥのいずれかと共にＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩを形質移入した。
【図２Ｃ】図２Ｃ：ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞に、ＧＦＰ１０−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥまたはｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥのいずれかと共にＡＴ１Ｒ及びβａｒｒ２−ＲｌｕｃＩＩを形質移入した。ｌｙｎ−ｒＧＦＰ（図２Ｄ）またはｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ（図２Ｅ）のいずれかと共にＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩが形質移入された細胞を、１００ｎＭのＡｎｇＩＩの不在下または存在下において３７℃で示された時間にわたってインキュベートし、次にＢＲＥＴを測定した。ＢＲＥＴ比の変化は、対照（ＡｎｇＩＩ処理なし）群において観察されたＢＲＥＴ比の率として表される。データは、２〜６回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．として表される。
【図２Ｄ】図２Ｃ：ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞に、ＧＦＰ１０−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥまたはｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥのいずれかと共にＡＴ１Ｒ及びβａｒｒ２−ＲｌｕｃＩＩを形質移入した。ｌｙｎ−ｒＧＦＰ（図２Ｄ）またはｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ（図２Ｅ）のいずれかと共にＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩが形質移入された細胞を、１００ｎＭのＡｎｇＩＩの不在下または存在下において３７℃で示された時間にわたってインキュベートし、次にＢＲＥＴを測定した。ＢＲＥＴ比の変化は、対照（ＡｎｇＩＩ処理なし）群において観察されたＢＲＥＴ比の率として表される。データは、２〜６回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．として表される。
【図２Ｅ】図２Ｃ：ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞に、ＧＦＰ１０−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥまたはｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥのいずれかと共にＡＴ１Ｒ及びβａｒｒ２−ＲｌｕｃＩＩを形質移入した。ｌｙｎ−ｒＧＦＰ（図２Ｄ）またはｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ（図２Ｅ）のいずれかと共にＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩが形質移入された細胞を、１００ｎＭのＡｎｇＩＩの不在下または存在下において３７℃で示された時間にわたってインキュベートし、次にＢＲＥＴを測定した。ＢＲＥＴ比の変化は、対照（ＡｎｇＩＩ処理なし）群において観察されたＢＲＥＴ比の率として表される。データは、２〜６回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．として表される。
【図２Ｆ】図２Ｆ：図２Ｄ及び２Ｅをそれぞれ最大応答に正規化し、一緒にプロットした。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｆは、ＡｎｇＩＩ誘発性ＢＲＥＴ変化による受容体エンドサイトーシス及びβ−アレスチン２の過剰発現を遮断する効果を示す。ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞に、ｐｃＤＮＡまたはダイナミンＫ４４Ａのいずれかと共に、ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ／ｌｙｎ−ｒＧＦＰ（図３Ａ）、ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ／ｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ（図３Ｂ）またはＡＴ１Ｒ／βａｒｒ２−ＲｌｕｃＩＩ／ｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ（図３Ｃ）を形質移入した。細胞を、０．４５Ｍのスクロースの不在下（対照、■、ＤｙｎＫ４４Ａ、○）または存在下（▲）で２０分間インキュベートし、次に、ＢＲＥＴ測定の前に様々な濃度のＡｎｇＩＩで４０分間刺激した。ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞に、ｐｃＤＮＡまたはβ−アレスチン２のいずれかと共に、ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ／ｌｙｎ−ｒＧＦＰ（図３Ｄ）またはＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ／ｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ（図３Ｅ）を形質移入した。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｆは、ＡｎｇＩＩ誘発性ＢＲＥＴ変化による受容体エンドサイトーシス及びβ−アレスチン２の過剰発現を遮断する効果を示す。ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞に、ｐｃＤＮＡまたはダイナミンＫ４４Ａのいずれかと共に、ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ／ｌｙｎ−ｒＧＦＰ（図３Ａ）、ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ／ｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ（図３Ｂ）またはＡＴ１Ｒ／βａｒｒ２−ＲｌｕｃＩＩ／ｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ（図３Ｃ）を形質移入した。細胞を、０．４５Ｍのスクロースの不在下（対照、■、ＤｙｎＫ４４Ａ、○）または存在下（▲）で２０分間インキュベートし、次に、ＢＲＥＴ測定の前に様々な濃度のＡｎｇＩＩで４０分間刺激した。ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞に、ｐｃＤＮＡまたはβ−アレスチン２のいずれかと共に、ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ／ｌｙｎ−ｒＧＦＰ（図３Ｄ）またはＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ／ｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ（図３Ｅ）を形質移入した。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｆは、ＡｎｇＩＩ誘発性ＢＲＥＴ変化による受容体エンドサイトーシス及びβ−アレスチン２の過剰発現を遮断する効果を示す。ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞に、ｐｃＤＮＡまたはダイナミンＫ４４Ａのいずれかと共に、ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ／ｌｙｎ−ｒＧＦＰ（図３Ａ）、ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ／ｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ（図３Ｂ）またはＡＴ１Ｒ／βａｒｒ２−ＲｌｕｃＩＩ／ｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ（図３Ｃ）を形質移入した。細胞を、０．４５Ｍのスクロースの不在下（対照、■、ＤｙｎＫ４４Ａ、○）または存在下（▲）で２０分間インキュベートし、次に、ＢＲＥＴ測定の前に様々な濃度のＡｎｇＩＩで４０分間刺激した。ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞に、ｐｃＤＮＡまたはβ−アレスチン２のいずれかと共に、ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ／ｌｙｎ−ｒＧＦＰ（図３Ｄ）またはＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ／ｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ（図３Ｅ）を形質移入した。
【図３Ｄ】図３Ａ〜３Ｆは、ＡｎｇＩＩ誘発性ＢＲＥＴ変化による受容体エンドサイトーシス及びβ−アレスチン２の過剰発現を遮断する効果を示す。ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞に、ｐｃＤＮＡまたはダイナミンＫ４４Ａのいずれかと共に、ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ／ｌｙｎ−ｒＧＦＰ（図３Ａ）、ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ／ｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ（図３Ｂ）またはＡＴ１Ｒ／βａｒｒ２−ＲｌｕｃＩＩ／ｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ（図３Ｃ）を形質移入した。細胞を、０．４５Ｍのスクロースの不在下（対照、■、ＤｙｎＫ４４Ａ、○）または存在下（▲）で２０分間インキュベートし、次に、ＢＲＥＴ測定の前に様々な濃度のＡｎｇＩＩで４０分間刺激した。ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞に、ｐｃＤＮＡまたはβ−アレスチン２のいずれかと共に、ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ／ｌｙｎ−ｒＧＦＰ（図３Ｄ）またはＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ／ｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ（図３Ｅ）を形質移入した。
【図３Ｅ】図３Ａ〜３Ｆは、ＡｎｇＩＩ誘発性ＢＲＥＴ変化による受容体エンドサイトーシス及びβ−アレスチン２の過剰発現を遮断する効果を示す。ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞に、ｐｃＤＮＡまたはダイナミンＫ４４Ａのいずれかと共に、ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ／ｌｙｎ−ｒＧＦＰ（図３Ａ）、ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ／ｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ（図３Ｂ）またはＡＴ１Ｒ／βａｒｒ２−ＲｌｕｃＩＩ／ｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ（図３Ｃ）を形質移入した。細胞を、０．４５Ｍのスクロースの不在下（対照、■、ＤｙｎＫ４４Ａ、○）または存在下（▲）で２０分間インキュベートし、次に、ＢＲＥＴ測定の前に様々な濃度のＡｎｇＩＩで４０分間刺激した。ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞に、ｐｃＤＮＡまたはβ−アレスチン２のいずれかと共に、ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ／ｌｙｎ−ｒＧＦＰ（図３Ｄ）またはＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ／ｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ（図３Ｅ）を形質移入した。
【図３Ｆ】図３Ｆ：小胞酸性化阻害剤バフィロマイシンＡ（Ｂａｆ）及びクロロキン（ＣＱ）の存在下でのＡＴ１Ｒのエンドサイトーシスである。細胞を、ＢＲＥＴ測定の前に様々な濃度のＡｎｇＩＩと共に４０分間インキュベートした。示されている値は、少なくとも３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．である。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｅは、様々な受容体におけるエンドサイトーシスＢＲＥＴバイオセンサーにより得られる用量応答曲線を示す。図４Ａ：ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞に、ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ、Ｂ２Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ、Ｖ２Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ、またはβ２ＡＲ−ＲｌｕｃＩＩのいずれかと共に、ｌｙｎ−ｒＧＦＰを形質移入した。
【図４Ｂ】図４Ｂ：ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞に、ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ、Ｂ２Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ、Ｖ２Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ、またはβ２ＡＲ−ＲｌｕｃＩＩのいずれかと共に、ｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥを形質移入した。細胞を、様々な濃度の図に記載されている対応する同族リガンドと共に、３７℃で３０分間（図４Ａ）または４０分間（図４Ｂ）インキュベートし、次にＢＲＥＴを測定した。
【図４Ｃ】図４Ｃ：ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞に、ＡＴ１Ｒ、Ｂ２Ｒ、Ｖ２Ｒ、β２ＡＲ、またはＦＰ受容体構築物のいずれかと共に、βａｒｒ２−ＲｌｕｃＩＩ及びＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥを形質移入した。細胞を、ＢＲＥＴ測定の前に様々な濃度の対応する同族リガンドと共に４０分間インキュベートした。それぞれの受容体への同族リガンドは、以下であった。ＡＴ１Ｒ、ＡｎｇＩＩ（四角）；Ｂ２Ｒ、ブラジキニン（ＢＫ、三角）；Ｖ２Ｒ、ＡＶＰ（丸）またはオキシトシン（ＯＴ、星形）；β２ＡＲ、イソプロテレノール（ＩＳＯ、逆三角形）；ＦＰ、ＰＧＦ２α（菱形）。（ａ）〜（ｃ）のデータは、２〜３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．として表される。
【図４Ｄ】図４Ｄ：ＲｌｕｃＩＩ−ＧＲＢ２及びｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ間のＢＲＥＴによるＥＧＦＲエンドサイトーシスのモニタリングである（ＧＲＢ２はＥＧＦＲと相互作用し、ＥＧＦＲ内部移行に参加する）。ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞に、ＲｌｕｃＩＩ−ＧＲＢ２及びｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥと共にＥＧＦＲを形質移入した。細胞を、様々な濃度のＥＧＦと共に３７℃で３０分間インキュベートし、次にＢＲＥＴを測定した。図４Ｄの結果は、２つの独立した実験のうちの１つの代表的な実験の三連の平均±ＳＥである。
【図４Ｅ】図４Ｅ：ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）のアッセイの堅牢度を示すＺ’値の評価である。ＨＥＫ２９３に、ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ／ｌｙｎ−ｒＧＦＰ、ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ／ｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ、またはＡＴ１Ｒ／βａｒｒ２−ＲｌｕｃＩＩ／ｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥを同時形質移入し、４８ウェルプレートで平板培養し、１００ｎＭのＡｎｇＩＩにより３７℃で２０分間刺激して、受容体を形質膜から消失させ、受容体とβアレスチン２の両方をエンドソームに蓄積させた。細胞表面受容体エンドサイトーシスを、ＢＲＥＴ２により評価した。ＢＲＥＴ値を、提示されたグラフにウェル毎に表し、Ｚ’値を、ＡｎｇＩＩ処理群においてそれぞれ０．６４、０．７３及び０．７９により評価し、これは、エンドソームへの受容体内部移行についての堅牢なアッセイを示している。
【図５Ａ−Ｂ】図５Ａ〜５Ｃは、エンドサイトーシスＢＲＥＴアッセイによるリガンド除去の後の受容体の再循環についてのモニタリングを示す。図５Ａ：ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞に、ｌｙｎ−ｒＧＦＰと共にＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩを形質移入した。細胞を、１００ｎＭのＡｎｇＩＩの不在下（対照）または存在下で３０分間インキュベートし、次に細胞を洗浄し、ＡｎｇＩＩの不在下で４５分間更にインキュベートした。ＢＲＥＴ比の変化は、対照（ＡｎｇＩＩ処理なし）群において観察されたＢＲＥＴ比の率として表される。データは、４回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．として表される。図５Ｂ：Ｖ２Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ、Ｂ２Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ、ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ、またはβ２ＡＲ−ＲｌｕｃＩＩのいずれかと共にｌｙｎ−ｒＧＦＰを発現するＨＥＫ２９３ＳＬ細胞を、Ｖ２Ｒでは１００ｎＭのＡＶＰ、Ｂ２Ｒでは１００ｎＭのＢＫ、ＡＴ１Ｒでは１００ｎＭのＡｎｇＩＩ及びβ２ＡＲでは１μＭのＩＳＯである同族リガンドを用いて、図５Ａに記載された細胞再循環に付した。受容体再循環は、リガンド洗い流しの４５分後のＢＲＥＴ比の増加率として表される。全ての値は、データは、３〜４回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．として表される。
【図５Ｃ】図５Ｃ：ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞に、ｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥと共にＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩを形質移入した。細胞を、１００ｎＭのＡｎｇＩＩの不在下（対照）または存在下で３０分間インキュベートし、次に細胞を洗浄し、ＡｎｇＩＩの不在下で４５分間更にインキュベートした。ＢＲＥＴ比の変化は、対照（ＡｎｇＩＩ処理なし）群において観察されたＢＲＥＴ比の率として表される。データは、３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．として表される。
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｆは、ＡＴ１Ｒの輸送及び選別におけるＡｎｇＩＩ類縁体の効果を示す。図６Ａ：ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ／ｒＧＦＰｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥを発現するＨＥＫ２９３ＳＬ細胞を、１００ｎＭのＡｎｇＩＩ（四角）、１００ｎＭのＳＩ（三角）または１μＭのＤＶＧ（丸）にいずれかと共に、示された時間にわたってインキュベートし、次にＢＲＥＴを測定した。ＢＲＥＴ比は、最大ＡｎｇＩＩ応答（６０分間）を１００％に、基礎（リガンドなし）を０％に正規化した。データは、少なくとも３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．として表される。ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞に、ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ／ｌｙｎ−ｒＧＦＰ（図６Ｂ）、ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ／ｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ（図６Ｃ）またはＡＴ１Ｒ／βａｒｒ２−ＲｌｕｃＩＩ／ｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ（図６Ｄ）を形質移入した。細胞を、様々な濃度のＡｎｇＩＩ（四角）、ＳＩ（三角）またはＤＶＧ（丸）と共に、ＢＲＥＴ測定の前に３０分間（図６Ｂ）または４０分間（図６Ｃ、６Ｄ）インキュベートした。データは、少なくとも３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．として表される。
【図６Ｂ】図６Ａ〜６Ｆは、ＡＴ１Ｒの輸送及び選別におけるＡｎｇＩＩ類縁体の効果を示す。図６Ａ：ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ／ｒＧＦＰｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥを発現するＨＥＫ２９３ＳＬ細胞を、１００ｎＭのＡｎｇＩＩ（四角）、１００ｎＭのＳＩ（三角）または１μＭのＤＶＧ（丸）にいずれかと共に、示された時間にわたってインキュベートし、次にＢＲＥＴを測定した。ＢＲＥＴ比は、最大ＡｎｇＩＩ応答（６０分間）を１００％に、基礎（リガンドなし）を０％に正規化した。データは、少なくとも３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．として表される。ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞に、ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ／ｌｙｎ−ｒＧＦＰ（図６Ｂ）、ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ／ｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ（図６Ｃ）またはＡＴ１Ｒ／βａｒｒ２−ＲｌｕｃＩＩ／ｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ（図６Ｄ）を形質移入した。細胞を、様々な濃度のＡｎｇＩＩ（四角）、ＳＩ（三角）またはＤＶＧ（丸）と共に、ＢＲＥＴ測定の前に３０分間（図６Ｂ）または４０分間（図６Ｃ、６Ｄ）インキュベートした。データは、少なくとも３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．として表される。
【図６Ｃ】図６Ａ〜６Ｆは、ＡＴ１Ｒの輸送及び選別におけるＡｎｇＩＩ類縁体の効果を示す。図６Ａ：ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ／ｒＧＦＰｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥを発現するＨＥＫ２９３ＳＬ細胞を、１００ｎＭのＡｎｇＩＩ（四角）、１００ｎＭのＳＩ（三角）または１μＭのＤＶＧ（丸）にいずれかと共に、示された時間にわたってインキュベートし、次にＢＲＥＴを測定した。ＢＲＥＴ比は、最大ＡｎｇＩＩ応答（６０分間）を１００％に、基礎（リガンドなし）を０％に正規化した。データは、少なくとも３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．として表される。ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞に、ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ／ｌｙｎ−ｒＧＦＰ（図６Ｂ）、ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ／ｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ（図６Ｃ）またはＡＴ１Ｒ／βａｒｒ２−ＲｌｕｃＩＩ／ｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ（図６Ｄ）を形質移入した。細胞を、様々な濃度のＡｎｇＩＩ（四角）、ＳＩ（三角）またはＤＶＧ（丸）と共に、ＢＲＥＴ測定の前に３０分間（図６Ｂ）または４０分間（図６Ｃ、６Ｄ）インキュベートした。データは、少なくとも３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．として表される。
【図６Ｄ】図６Ａ〜６Ｆは、ＡＴ１Ｒの輸送及び選別におけるＡｎｇＩＩ類縁体の効果を示す。図６Ａ：ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ／ｒＧＦＰｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥを発現するＨＥＫ２９３ＳＬ細胞を、１００ｎＭのＡｎｇＩＩ（四角）、１００ｎＭのＳＩ（三角）または１μＭのＤＶＧ（丸）にいずれかと共に、示された時間にわたってインキュベートし、次にＢＲＥＴを測定した。ＢＲＥＴ比は、最大ＡｎｇＩＩ応答（６０分間）を１００％に、基礎（リガンドなし）を０％に正規化した。データは、少なくとも３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．として表される。ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞に、ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ／ｌｙｎ−ｒＧＦＰ（図６Ｂ）、ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ／ｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ（図６Ｃ）またはＡＴ１Ｒ／βａｒｒ２−ＲｌｕｃＩＩ／ｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ（図６Ｄ）を形質移入した。細胞を、様々な濃度のＡｎｇＩＩ（四角）、ＳＩ（三角）またはＤＶＧ（丸）と共に、ＢＲＥＴ測定の前に３０分間（図６Ｂ）または４０分間（図６Ｃ、６Ｄ）インキュベートした。データは、少なくとも３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．として表される。
【図６Ｅ】図６Ｅ及び６Ｆ：ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞に、ｒＧＦＰ−ｒａｂ４（図６Ｅ）またはｒＧＦＰ−ｒａｂ１１（図６Ｆ）のいずれかと共にＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩを形質移入した。細胞を、１００ｎＭのＡｎｇＩＩ（四角）、１００ｎＭのＳＩ（三角）または１μＭのＤＶＧ（丸）にいずれかと共に、示された時間にわたってインキュベートし、次にＢＲＥＴを測定した。ＢＲＥＴ比の変化は、対照（リガンド処理なし）群において観察されたＢＲＥＴ比の率として表される。データは、３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．として表される。
【図６Ｆ】図６Ｅ及び６Ｆ：ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞に、ｒＧＦＰ−ｒａｂ４（図６Ｅ）またはｒＧＦＰ−ｒａｂ１１（図６Ｆ）のいずれかと共にＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩを形質移入した。細胞を、１００ｎＭのＡｎｇＩＩ（四角）、１００ｎＭのＳＩ（三角）または１μＭのＤＶＧ（丸）にいずれかと共に、示された時間にわたってインキュベートし、次にＢＲＥＴを測定した。ＢＲＥＴ比の変化は、対照（リガンド処理なし）群において観察されたＢＲＥＴ比の率として表される。データは、３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．として表される。
【図７Ａ】図７Ａ及びＢは、無傷細胞［１２５Ｉ］ＡｎｇＩＩ結合アッセイにより評価したＡＴ１Ｒ内部移行を示す。図７Ａ：ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞に、ＡＴ１Ｒ単独（□）、ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ単独（■）またはｌｙｎ−ｒＧＦＰを伴ったＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ（■）のいずれかを一時的に形質移入した。細胞を、１００ｎＭのＡｎｇＩＩの不在下または存在下において３７℃で３０分間インキュベートし、次に、「材料及び方法」に記載されているように無傷細胞［１２５Ｉ］ＡｎｇＩＩ結合アッセイに付した。図７Ｂ：ｐｃＤＮＡ（□）、ダイナミンＫ４４Ａ（■）またはβ−アレスチン２（■）のいずれかと共にＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ／Ｌｙｎ−ｒＧＦＰを発現するＨＥＫ２９３ＳＬ細胞を、１００ｎＭのＡｎｇＩＩの不在下または存在下において３７℃で３０分間インキュベートし、次に、下記（実施例１）に記載されているように無傷細胞［１２５Ｉ］ＡｎｇＩＩ結合アッセイに付した。受容体エンドサイトーシスを、細胞表面受容体の損失率として表した。データは、３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．として表される。
【図７Ｂ】図７Ａ及びＢは、無傷細胞［１２５Ｉ］ＡｎｇＩＩ結合アッセイにより評価したＡＴ１Ｒ内部移行を示す。図７Ａ：ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞に、ＡＴ１Ｒ単独（□）、ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ単独（■）またはｌｙｎ−ｒＧＦＰを伴ったＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ（■）のいずれかを一時的に形質移入した。細胞を、１００ｎＭのＡｎｇＩＩの不在下または存在下において３７℃で３０分間インキュベートし、次に、「材料及び方法」に記載されているように無傷細胞［１２５Ｉ］ＡｎｇＩＩ結合アッセイに付した。図７Ｂ：ｐｃＤＮＡ（□）、ダイナミンＫ４４Ａ（■）またはβ−アレスチン２（■）のいずれかと共にＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ／Ｌｙｎ−ｒＧＦＰを発現するＨＥＫ２９３ＳＬ細胞を、１００ｎＭのＡｎｇＩＩの不在下または存在下において３７℃で３０分間インキュベートし、次に、下記（実施例１）に記載されているように無傷細胞［１２５Ｉ］ＡｎｇＩＩ結合アッセイに付した。受容体エンドサイトーシスを、細胞表面受容体の損失率として表した。データは、３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．として表される。
【図８】Ｖ２Ｒの高い基礎エンドソーム局在化を示す。ｍＣｈｅｒｒｙ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥと共にＶ２Ｒ−ＹＦＰを一時的に発現するＨＥＫ２９３ＳＬ細胞を、共焦点顕微鏡検査法に付した。スケールバーは１０μｍである。
【図９Ａ】図９Ａは、ｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＹＶＥを伴った、ｒＧＦＰ−ｒａｂ４及びｒＧＦＰ−ｒａｂ１１の小胞局在化を示す。ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞に、ｒＧＦＰ−ｒａｂ４（左側）またはｒＧＦＰ−ｒａｂ１１（右側）のいずれかを形質移入し、次に共焦点顕微鏡検査法に付した。
【図９Ｂ】図９Ｂ〜９Ｄは、ＡｎｇＩＩ媒介ＡＴ１Ｒ内部移行に対するＧαｑ阻害の効果を示す。図９Ｂ：ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞に、Ｌｙｎ−ｒＧＦＰと共にＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩを形質移入した。細胞を、１００ｎＭのＵｂｏの不在下（−Ｕｂｏ）または存在下（＋Ｕｂｏ）で３０分間インキュベートし、次に、ＢＲＥＴ測定の前に様々な濃度のＡｎｇＩＩで３０分間刺激した。
【図９Ｃ】図９Ｃ：ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞に、ｒＧＦＰ−ＦＹＶＥと共にＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩを形質移入した。細胞を、１００ｎＭのＵｂｏの不在下（−Ｕｂｏ）または存在下（＋Ｕｂｏ）で３０分間インキュベートし、次に、ＢＲＥＴ測定の前に様々な濃度のＡｎｇＩＩ、ＳＩ、またはＤＶＧで４０分間刺激した。
【図９Ｄ】図９Ｄ：細胞に、ｒＧＦＰ−ｒａｂ４またはｒＧＦＰ−ｒａｂ１１のいずれかと共にＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩを形質移入した。細胞を、１００ｎＭのＵｂｏの不在下（−Ｕｂｏ）または存在下（＋Ｕｂｏ）で３０分間インキュベートし、次に、１００ｎＭのＡｎｇＩＩ、１００ｎＭのＳＩ、または１μＭのＤＶＧにより、ｒＧＦＰ−ｒａｂ４では１０分間、ｒＧＦＰ−ｒａｂ１１では３０分間刺激し、次にＢＲＥＴを測定した。ＢＲＥＴ比の変化は、対照（リガンド処理なし）群において観察されたＢＲＥＴ比の率として表される。データは、３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．として表される。
【図１０Ａ】図１０Ａ及び１０Ｂは、機能的救出を評価する、ＢＲＥＴに基づいた薬理学的シャペロン（ＰＣ）アッセイ及び隔離アッセイの原理を描写している。図１０Ａ：薬理学的シャペロン（ＰＣ）アッセイは、薬理学的シャペロン救出タンパク質の再局在化に基づいており、このタンパク質はさもなければ異なる細胞内区画に留まっている。再局在化は、ＢＲＥＴを使用して、優先的には形質膜標的化配列（ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ、Ｌｙｎ−ｒＧＦＰまたはＧＦＰ−ＰＢ、これらの記載は図１１Ｄを参照すること）を有するｒＧＦＰにより、検出及び測定される。ｈＥＲＧなどの誤って折り畳まれた受容体及びチャネルは、細胞内区画に留まり、薬理学的シャペロン媒介救出の際に形質膜に移行する。このアッセイでは、受容体にはＲｌｕｃＩＩが、膜にはｒＧＦＰが優先的に標識されており、ＢＲＥＴシグナルは、膜におけるＲｌｕｃＩＩ標識化タンパク質の密度に比例している。誤って折り畳まれたタンパク質は、突然変異体またはＷＴタンパク質のいずれかでありうる。作動薬への曝露によって内部移行する受容体では、救出された受容体の機能を、図１０Ｂに描写されている作動薬誘発性隔離アッセイ（図１Ａに描写されているＢＲＥＴに基づいたセンサーに本質的に対応する）の使用により評価することができる。
【図１０Ｂ】図１０Ｂ：ＢＲＥＴに基づいた作動薬誘発性隔離アッセイの原理である。形質膜（ＰＭ）マーカーに、ＧＦＰ（Ｇ）などのＢＲＥＴ受容体を標識し、目的のＰＣ救出受容体（例えば、ＰＣ救出ＧＰＣＲ）に、ＲＬｕｃ（Ｒ）などのＢＲＥＴ供与体を標識する。作動薬の不在下（左側）では、受容体はＰＭに留まり、ＢＲＥＴ受容体標識化ＰＭマーカーと共局在化しており、したがって強力なＢＲＥＴ受容体シグナルをもたらす。しかし、作動薬の存在下（右側）では、受容体は内部移行し、したがってＰＭにおけるＢＲＥＴ供与体標識化受容体の密度が減少し、このことはＢＲＥＴ受容体シグナルの減少をもたらす。このアッセイは、同じウェルにおいて、受容体のＰＣ媒介細胞表面救出に続いて実施することができ、したがって受容体生物学の２つの異なる局面をモニターする均一系アッセイにおいてである。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜Ｄは、薬理学的シャペロンの特性を検出するセンサーを確証及び最適化するのに使用される構築物を示す。図１１Ａ〜Ｃ：シャペロン救出アッセイは、ヒトＧＰＣＲの野生型（ＷＴ）及び天然に生じる置換（メラノコルチン受容体４：ｈＭＣ４Ｒ及びバソプレシン受容体２：ｈＶ２Ｒ）、ならびにＢＲＥＴ供与体を標識した電位開口型カリウムチャネルＨ２（ｈＥＲＧ）を用いて開発及び試験した。受容体には、ＲｌｕｃＩＩをＣ末端に標識した。ｈＥＲＧチャネルには、ＲｌｕｃＩＩを残基３７９と同等の位置に内部的に標識し、残基３７３〜３７９の配列をリンカー３及びリンカー４のそれぞれの側に複製した（図１１Ｃを参照すること）。可動性リンカーを、受容体／チャネルとＲｌｕｃＩＩ標識の間に使用した。リンカーの配列は、図１１ＡにはＭＣ４Ｒ構築物（リンカー１）、図１１ＢにはＶ２Ｒ構築物（リンカー２）及び図１１ＣにはｈＥＲＧ構築物（リンカー３及び４）のものを示した。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜Ｄは、薬理学的シャペロンの特性を検出するセンサーを確証及び最適化するのに使用される構築物を示す。図１１Ａ〜Ｃ：シャペロン救出アッセイは、ヒトＧＰＣＲの野生型（ＷＴ）及び天然に生じる置換（メラノコルチン受容体４：ｈＭＣ４Ｒ及びバソプレシン受容体２：ｈＶ２Ｒ）、ならびにＢＲＥＴ供与体を標識した電位開口型カリウムチャネルＨ２（ｈＥＲＧ）を用いて開発及び試験した。受容体には、ＲｌｕｃＩＩをＣ末端に標識した。ｈＥＲＧチャネルには、ＲｌｕｃＩＩを残基３７９と同等の位置に内部的に標識し、残基３７３〜３７９の配列をリンカー３及びリンカー４のそれぞれの側に複製した（図１１Ｃを参照すること）。可動性リンカーを、受容体／チャネルとＲｌｕｃＩＩ標識の間に使用した。リンカーの配列は、図１１ＡにはＭＣ４Ｒ構築物（リンカー１）、図１１ＢにはＶ２Ｒ構築物（リンカー２）及び図１１ＣにはｈＥＲＧ構築物（リンカー３及び４）のものを示した。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜Ｄは、薬理学的シャペロンの特性を検出するセンサーを確証及び最適化するのに使用される構築物を示す。図１１Ａ〜Ｃ：シャペロン救出アッセイは、ヒトＧＰＣＲの野生型（ＷＴ）及び天然に生じる置換（メラノコルチン受容体４：ｈＭＣ４Ｒ及びバソプレシン受容体２：ｈＶ２Ｒ）、ならびにＢＲＥＴ供与体を標識した電位開口型カリウムチャネルＨ２（ｈＥＲＧ）を用いて開発及び試験した。受容体には、ＲｌｕｃＩＩをＣ末端に標識した。ｈＥＲＧチャネルには、ＲｌｕｃＩＩを残基３７９と同等の位置に内部的に標識し、残基３７３〜３７９の配列をリンカー３及びリンカー４のそれぞれの側に複製した（図１１Ｃを参照すること）。可動性リンカーを、受容体／チャネルとＲｌｕｃＩＩ標識の間に使用した。リンカーの配列は、図１１ＡにはＭＣ４Ｒ構築物（リンカー１）、図１１ＢにはＶ２Ｒ構築物（リンカー２）及び図１１ＣにはｈＥＲＧ構築物（リンカー３及び４）のものを示した。
【図１１Ｄ】図１１Ｄ：ＢＲＥＴ受容体（ｒＧＦＰ）には、異なる形質膜またはゴルジ装置標的化配列を標識した。Ｎ末端には、Ｌｙｎキナーゼのパルミトイル化及びミリストイル化シグナル配列（Ｌｙｎ−）、Ｃ末端には、ＫＲＡＳスプライス変異体ｂの多塩基配列及びプレニル化シグナル配列（−ＣＡＡＸ）、Ｃ末端には、ヒトＧＲＫ５の多塩基配列（−ＰＢ）、Ｃ末端には、ｈＲａｓの形質膜標的化パルミトイル化配列及びプレニル化シグナル配列、Ｃ末端には、ｈＲａｓの形質膜標的化パルミトイル化配列及びＲａｌ１のプレニル化シグナル配列、Ｃ末端には、ヒトカベオリン１α（カベオラのマーカー）、ならびにＮ末端には、ヒトｅＮＯＳ１のゴルジ標的化配列（残基１〜７３）で標識された。リンカー５、６及び７を、ｒＧＦＰと形質膜標的化配列のＬｙｎ、ＣＡＡＸ及びＰＢのそれぞれとの間に使用した。リンカー８を、ｒＧＦＰと、ｈＲＡＳ（ＣＡＡＸ）及びｈＲＡＳ／Ｒａｌ１（ＣＡＡＸ＝ＣＣＩＬ）のパルミトイル化／プレニル化配列との間、ならびにｒＧＦＰとカベオリン１αとの間に使用した。リンカー９を、ｅＮＯＳのゴルジ標的化配列（１〜７３）とｒＧＦＰとの間に使用した。
【図１２Ａ】図１２Ａ及びＢは、形質膜を標的にするｒＧＦＰの２つの形態の異なる比（滴定）の試験を示す。受容体へのＢＲＥＴ供与体の滴定及びＰＣ救出アッセイを、形質移入細胞において実施し（９６ウェルプレートの１０ウェルへの様々な量のｒＧＦＰ構築物＋２４ｎｇの受容体構築物）、続いて、シャペロン（ＤＣＰＭＰ（Ｎ−（（２Ｒ）−３（２，４−ジクロロフェニル）−１−（４−（２−（（１−メトキシプロパン−２−イルアミノ）メチル）フェニル）ピペラジン−１−イル）−１−オキソプロパン−２−イル）プロピオンアミド）、１０μＭ）またはビヒクル（ＤＭＳＯ）のいずれかにより１６時間処理した。ＨＥＫ２９３に、ｈＭＣ４Ｒ（Ｒ１６５Ｑ）−ＲｌｕｃＩＩ構築物、ならびに異なる量のｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ（図１２Ａ）及びｒＧＦＰ−ＰＢ構築物（図１２Ｂ）を形質移入した。ＢＲＥＴ比は、ＲｌｕｃＩＩ構築物発現（生物発光により評価）に対するＧＦＰ構築物発現（蛍光により評価）の関数として報告されている。
【図１２Ｂ】図１２Ａ及びＢは、形質膜を標的にするｒＧＦＰの２つの形態の異なる比（滴定）の試験を示す。受容体へのＢＲＥＴ供与体の滴定及びＰＣ救出アッセイを、形質移入細胞において実施し（９６ウェルプレートの１０ウェルへの様々な量のｒＧＦＰ構築物＋２４ｎｇの受容体構築物）、続いて、シャペロン（ＤＣＰＭＰ（Ｎ−（（２Ｒ）−３（２，４−ジクロロフェニル）−１−（４−（２−（（１−メトキシプロパン−２−イルアミノ）メチル）フェニル）ピペラジン−１−イル）−１−オキソプロパン−２−イル）プロピオンアミド）、１０μＭ）またはビヒクル（ＤＭＳＯ）のいずれかにより１６時間処理した。ＨＥＫ２９３に、ｈＭＣ４Ｒ（Ｒ１６５Ｑ）−ＲｌｕｃＩＩ構築物、ならびに異なる量のｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ（図１２Ａ）及びｒＧＦＰ−ＰＢ構築物（図１２Ｂ）を形質移入した。ＢＲＥＴ比は、ＲｌｕｃＩＩ構築物発現（生物発光により評価）に対するＧＦＰ構築物発現（蛍光により評価）の関数として報告されている。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜Ｃは、受容体及びｒＧＦＰ−ＣＡＡＸの異なる比でｗｔ及び突然変異ＭＣ４Ｒの細胞表面発現及び機能性ＰＣ媒介救出を示す。ＨＥＫ２９３に、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ構築物（９６ウェルプレートの１０ウェルに７２ｎｇのプラスミド）、ならびに３つの異なる量（グラフに示されているように、１０ウェルに６、１２及び２４ｎｇ）のｈＭＣ４Ｒ  ｗｔ−ＲｌｕｃＩＩ（図１３Ａ）、ｈＭＣ４Ｒ（Ｐ２９９Ｈ）−ＲｌｕｃＩＩ（図１３Ｂ）及びｈＭＣ４Ｒ（Ｒ１６５Ｑ）−ＲｌｕｃＩＩ（図１３Ｃ）を同時形質移入した。細胞表面発現及び機能性（作動薬誘発性隔離）のＰＣ媒介救出を、形質移入細胞においてＢＲＥＴ２により評価し、続いてシャペロン（ＤＣＰＭＰ、１０μＭ、中実黒色及び灰色棒）またはビヒクル（ＤＭＳＯ、白色棒）のいずれかにより１６時間処理した。灰色棒は、受容体隔離を誘発するために作動薬（アルファ−ＭＳＨ）に１時間曝露された、ＤＣＰＭＰ処理細胞から得たデータを表す。予測されたように、ＤＣＰＭＰ処理は、未処理細胞（白色棒）と比較して、ＢＲＥＴシグナルの増加により明らかなように、細胞表面発現の増加を誘発する。作動薬処理は、ＤＣＰＭＰ処理で処理されたが作動薬に曝露されなかった細胞（黒色棒）と比較して、ＢＲＥＴシグナルの減少（灰色棒）により明らかなように、隔離を誘発する。ｗｔ（図１３Ａ）及びＲ１６５Ｑ突然変異（図１３Ｃ）受容体は、ＤＣＰＭＰとα−ＭＳＨ（１０μＭ、３７℃で１時間）の両方に感受性があったが、Ｐ２９９Ｈ突然変異ＭＣ４Ｒは、ＰＣ救出されなかった（図１３Ｂ）。このアッセイの最適な範囲は、６ｎｇの供与体によって既に得られており、形質移入供与体構築物の量の増加は、ｈＭＣ４Ｒ（Ｐ２９９Ｈ）の測定可能な救出をもたらさなかった。
【図１３Ｂ】図１３Ａ〜Ｃは、受容体及びｒＧＦＰ−ＣＡＡＸの異なる比でｗｔ及び突然変異ＭＣ４Ｒの細胞表面発現及び機能性ＰＣ媒介救出を示す。ＨＥＫ２９３に、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ構築物（９６ウェルプレートの１０ウェルに７２ｎｇのプラスミド）、ならびに３つの異なる量（グラフに示されているように、１０ウェルに６、１２及び２４ｎｇ）のｈＭＣ４Ｒ  ｗｔ−ＲｌｕｃＩＩ（図１３Ａ）、ｈＭＣ４Ｒ（Ｐ２９９Ｈ）−ＲｌｕｃＩＩ（図１３Ｂ）及びｈＭＣ４Ｒ（Ｒ１６５Ｑ）−ＲｌｕｃＩＩ（図１３Ｃ）を同時形質移入した。細胞表面発現及び機能性（作動薬誘発性隔離）のＰＣ媒介救出を、形質移入細胞においてＢＲＥＴ２により評価し、続いてシャペロン（ＤＣＰＭＰ、１０μＭ、中実黒色及び灰色棒）またはビヒクル（ＤＭＳＯ、白色棒）のいずれかにより１６時間処理した。灰色棒は、受容体隔離を誘発するために作動薬（アルファ−ＭＳＨ）に１時間曝露された、ＤＣＰＭＰ処理細胞から得たデータを表す。予測されたように、ＤＣＰＭＰ処理は、未処理細胞（白色棒）と比較して、ＢＲＥＴシグナルの増加により明らかなように、細胞表面発現の増加を誘発する。作動薬処理は、ＤＣＰＭＰ処理で処理されたが作動薬に曝露されなかった細胞（黒色棒）と比較して、ＢＲＥＴシグナルの減少（灰色棒）により明らかなように、隔離を誘発する。ｗｔ（図１３Ａ）及びＲ１６５Ｑ突然変異（図１３Ｃ）受容体は、ＤＣＰＭＰとα−ＭＳＨ（１０μＭ、３７℃で１時間）の両方に感受性があったが、Ｐ２９９Ｈ突然変異ＭＣ４Ｒは、ＰＣ救出されなかった（図１３Ｂ）。このアッセイの最適な範囲は、６ｎｇの供与体によって既に得られており、形質移入供与体構築物の量の増加は、ｈＭＣ４Ｒ（Ｐ２９９Ｈ）の測定可能な救出をもたらさなかった。
【図１３Ｃ】図１３Ａ〜Ｃは、受容体及びｒＧＦＰ−ＣＡＡＸの異なる比でｗｔ及び突然変異ＭＣ４Ｒの細胞表面発現及び機能性ＰＣ媒介救出を示す。ＨＥＫ２９３に、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ構築物（９６ウェルプレートの１０ウェルに７２ｎｇのプラスミド）、ならびに３つの異なる量（グラフに示されているように、１０ウェルに６、１２及び２４ｎｇ）のｈＭＣ４Ｒ  ｗｔ−ＲｌｕｃＩＩ（図１３Ａ）、ｈＭＣ４Ｒ（Ｐ２９９Ｈ）−ＲｌｕｃＩＩ（図１３Ｂ）及びｈＭＣ４Ｒ（Ｒ１６５Ｑ）−ＲｌｕｃＩＩ（図１３Ｃ）を同時形質移入した。細胞表面発現及び機能性（作動薬誘発性隔離）のＰＣ媒介救出を、形質移入細胞においてＢＲＥＴ２により評価し、続いてシャペロン（ＤＣＰＭＰ、１０μＭ、中実黒色及び灰色棒）またはビヒクル（ＤＭＳＯ、白色棒）のいずれかにより１６時間処理した。灰色棒は、受容体隔離を誘発するために作動薬（アルファ−ＭＳＨ）に１時間曝露された、ＤＣＰＭＰ処理細胞から得たデータを表す。予測されたように、ＤＣＰＭＰ処理は、未処理細胞（白色棒）と比較して、ＢＲＥＴシグナルの増加により明らかなように、細胞表面発現の増加を誘発する。作動薬処理は、ＤＣＰＭＰ処理で処理されたが作動薬に曝露されなかった細胞（黒色棒）と比較して、ＢＲＥＴシグナルの減少（灰色棒）により明らかなように、隔離を誘発する。ｗｔ（図１３Ａ）及びＲ１６５Ｑ突然変異（図１３Ｃ）受容体は、ＤＣＰＭＰとα−ＭＳＨ（１０μＭ、３７℃で１時間）の両方に感受性があったが、Ｐ２９９Ｈ突然変異ＭＣ４Ｒは、ＰＣ救出されなかった（図１３Ｂ）。このアッセイの最適な範囲は、６ｎｇの供与体によって既に得られており、形質移入供与体構築物の量の増加は、ｈＭＣ４Ｒ（Ｐ２９９Ｈ）の測定可能な救出をもたらさなかった。
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ（Ｋｒａｓ）をコードする多シストロン構築物を示し、ＷＴまたは突然変異ｈＭＣ４ＲのいずれかがＨｅｋ２９３細胞に一時的に発現した。この図は、細胞表面発現のＰＣ救出において類似した結果を示し（白色棒：ＤＭＳＯ対黒色棒：１０μＭのＤＣＰＭＰ）、機能的救出は、作動薬誘発性隔離（＋アルファ−ＭＳＨ、灰色棒）により測定されるように、多シストロン及び非多シストロン構築物から得ることができる（図１３Ａ〜Ｃ）。シャペロンにより前処理されない細胞の作動薬誘発性隔離が示されている（横線の棒）。
【図１３Ｅ】図１３Ｅは、形質膜におけるＢＲＥＴの増加により明らかなように、細胞内に留まっていることが知られているＶ２Ｒ突然変異体のＰＣ媒介救出を示す。細胞表面発現のＰＣ媒介救出を、形質移入細胞においてＢＲＥＴ１により評価し、続いてシャペロン（ＳＲ１２１４６３、１０μＭ、中実黒色棒）またはビヒクル（ＤＭＳＯ、白色棒）のいずれかにより１６時間処理した。
【図１４Ａ】図１４Ａ及び１４Ｂは、ＷＴ及び突然変異（Ｒ１６５Ｑ）ＭＣ４Ｒ細胞表面発現の２つのＰＣ媒介機能性救出についての用量応答曲線を示す。ＨＥＫ２９３に、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ構築物及びｈＭＣ４Ｒ  ｗｔ−ＲｌｕｃＩＩまたはｈＭＣ４Ｒ（Ｒ１６５Ｑ）−ＲｌｕｃＩＩ構築物（９６ウェルプレートの１０ウェルに７２ｎｇのｒＧＦＰ構築物＋２４ｎｇの受容体構築物）を同時形質移入した。細胞表面発現のＰＣ媒介救出の用量応答、続く様々な濃度のＤＣＰＭＰ（図１４Ａ）及び化合物１（図１４Ｂ）による１６時間の処理を、ＢＲＥＴ２によって評価した。ｈＭＣ４Ｒ  ＷＴ−ＲｌｕｃＩＩ（上側曲線）またはｈＭＣ４Ｒ（Ｒ１６５Ｑ）−ＲｌｕｃＩＩ（下側曲線）から得られる結果は、対数目盛として表されるシャペロン濃度の関数として報告されている。ＥＣ５０及び他の曲線パラメーターが、それぞれのグラフの下方に示されている。
【図１４Ｂ】図１４Ａ及び１４Ｂは、ＷＴ及び突然変異（Ｒ１６５Ｑ）ＭＣ４Ｒ細胞表面発現の２つのＰＣ媒介機能性救出についての用量応答曲線を示す。ＨＥＫ２９３に、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ構築物及びｈＭＣ４Ｒ  ｗｔ−ＲｌｕｃＩＩまたはｈＭＣ４Ｒ（Ｒ１６５Ｑ）−ＲｌｕｃＩＩ構築物（９６ウェルプレートの１０ウェルに７２ｎｇのｒＧＦＰ構築物＋２４ｎｇの受容体構築物）を同時形質移入した。細胞表面発現のＰＣ媒介救出の用量応答、続く様々な濃度のＤＣＰＭＰ（図１４Ａ）及び化合物１（図１４Ｂ）による１６時間の処理を、ＢＲＥＴ２によって評価した。ｈＭＣ４Ｒ  ＷＴ−ＲｌｕｃＩＩ（上側曲線）またはｈＭＣ４Ｒ（Ｒ１６５Ｑ）−ＲｌｕｃＩＩ（下側曲線）から得られる結果は、対数目盛として表されるシャペロン濃度の関数として報告されている。ＥＣ５０及び他の曲線パラメーターが、それぞれのグラフの下方に示されている。
【図１５Ａ】図１５Ａ〜１５Ｄは、アッセイの堅牢度を示すＺ’値の評価を示す。ＨＥＫ２９３に、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ構築物及びｈＭＣ４Ｒ  ｗｔ−ＲｌｕｃＩＩ（図１５Ａ及び１５Ｂ）またはｈＭＣ４Ｒ（Ｒ１６５Ｑ）−ＲｌｕｃＩＩ（図１５Ｃ及び１５Ｄ）構築物（９６ウェルプレートの１０ウェルに７２ｎｇのｒＧＦＰ構築物＋２４ｎｇの受容体構築物）を同時形質移入した。細胞表面発現は、図１５Ａ及び１５Ｃではセレンテラジン４００ａを使用してＢＲＥＴ２により、セレンテラジンＨを使用してＢＲＥＴ１により（図１５Ｂ及び１５Ｄ）評価し、続いて１０μＭのＤＣＰＭＰ（４８ウェル）とビヒクル（ＤＭＳＯ）（４８ウェル）で１６時間処理した。ＢＲＥＴ値を、提示されたグラフにウェル毎に表し、Ｚ’値は、ｈＭＣ４Ｒ  ｗｔ受容体では０．６３、突然変異Ｒ１６５Ｑ突然変異ｈＭＣ４Ｒでは０．８２で評価され、両方の受容体が堅牢なアッセイであることを示している。
【図１５Ｂ】図１５Ａ〜１５Ｄは、アッセイの堅牢度を示すＺ’値の評価を示す。ＨＥＫ２９３に、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ構築物及びｈＭＣ４Ｒ  ｗｔ−ＲｌｕｃＩＩ（図１５Ａ及び１５Ｂ）またはｈＭＣ４Ｒ（Ｒ１６５Ｑ）−ＲｌｕｃＩＩ（図１５Ｃ及び１５Ｄ）構築物（９６ウェルプレートの１０ウェルに７２ｎｇのｒＧＦＰ構築物＋２４ｎｇの受容体構築物）を同時形質移入した。細胞表面発現は、図１５Ａ及び１５Ｃではセレンテラジン４００ａを使用してＢＲＥＴ２により、セレンテラジンＨを使用してＢＲＥＴ１により（図１５Ｂ及び１５Ｄ）評価し、続いて１０μＭのＤＣＰＭＰ（４８ウェル）とビヒクル（ＤＭＳＯ）（４８ウェル）で１６時間処理した。ＢＲＥＴ値を、提示されたグラフにウェル毎に表し、Ｚ’値は、ｈＭＣ４Ｒ  ｗｔ受容体では０．６３、突然変異Ｒ１６５Ｑ突然変異ｈＭＣ４Ｒでは０．８２で評価され、両方の受容体が堅牢なアッセイであることを示している。
【図１５Ｃ】図１５Ａ〜１５Ｄは、アッセイの堅牢度を示すＺ’値の評価を示す。ＨＥＫ２９３に、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ構築物及びｈＭＣ４Ｒ  ｗｔ−ＲｌｕｃＩＩ（図１５Ａ及び１５Ｂ）またはｈＭＣ４Ｒ（Ｒ１６５Ｑ）−ＲｌｕｃＩＩ（図１５Ｃ及び１５Ｄ）構築物（９６ウェルプレートの１０ウェルに７２ｎｇのｒＧＦＰ構築物＋２４ｎｇの受容体構築物）を同時形質移入した。細胞表面発現は、図１５Ａ及び１５Ｃではセレンテラジン４００ａを使用してＢＲＥＴ２により、セレンテラジンＨを使用してＢＲＥＴ１により（図１５Ｂ及び１５Ｄ）評価し、続いて１０μＭのＤＣＰＭＰ（４８ウェル）とビヒクル（ＤＭＳＯ）（４８ウェル）で１６時間処理した。ＢＲＥＴ値を、提示されたグラフにウェル毎に表し、Ｚ’値は、ｈＭＣ４Ｒ  ｗｔ受容体では０．６３、突然変異Ｒ１６５Ｑ突然変異ｈＭＣ４Ｒでは０．８２で評価され、両方の受容体が堅牢なアッセイであることを示している。
【図１５Ｄ】図１５Ａ〜１５Ｄは、アッセイの堅牢度を示すＺ’値の評価を示す。ＨＥＫ２９３に、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ構築物及びｈＭＣ４Ｒ  ｗｔ−ＲｌｕｃＩＩ（図１５Ａ及び１５Ｂ）またはｈＭＣ４Ｒ（Ｒ１６５Ｑ）−ＲｌｕｃＩＩ（図１５Ｃ及び１５Ｄ）構築物（９６ウェルプレートの１０ウェルに７２ｎｇのｒＧＦＰ構築物＋２４ｎｇの受容体構築物）を同時形質移入した。細胞表面発現は、図１５Ａ及び１５Ｃではセレンテラジン４００ａを使用してＢＲＥＴ２により、セレンテラジンＨを使用してＢＲＥＴ１により（図１５Ｂ及び１５Ｄ）評価し、続いて１０μＭのＤＣＰＭＰ（４８ウェル）とビヒクル（ＤＭＳＯ）（４８ウェル）で１６時間処理した。ＢＲＥＴ値を、提示されたグラフにウェル毎に表し、Ｚ’値は、ｈＭＣ４Ｒ  ｗｔ受容体では０．６３、突然変異Ｒ１６５Ｑ突然変異ｈＭＣ４Ｒでは０．８２で評価され、両方の受容体が堅牢なアッセイであることを示している。
【図１６Ａ】図１６Ａ及び１６Ｂは、ＢＲＥＴに基づいた細胞表面発現アッセイに対するＤＭＳＯの影響の評価を示す。ＨＥＫ２９３に、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ構築物及びｈＭＣ４Ｒ  ｗｔ−ＲｌｕｃＩＩ（図１６Ａ）またはｈＭＣ４Ｒ（Ｒ１６５Ｑ）−ＲｌｕｃＩＩ（図１６Ｂ）構築物（９６ウェルプレートの１０ウェルに７２ｎｇのｒＧＦＰ構築物＋２４ｎｇの受容体構築物）を同時形質移入した。細胞表面評価についてのＢＲＥＴに基づいたアッセイが、異なるレベルのＤＭＳＯに感受性があるかを評価するため、細胞表面発現をＢＲＥＴ２により評価し、続いて、ＰＣ処理の際に増量濃度のＤＭＳＯ（３％まで）の存在下で１０μＭのＤＣＰＭＰ（右側棒）またはビヒクル（ＤＭＳＯ、左側棒）により１６時間処理した。提示されているように、得られた結果は、このアッセイが少なくとも３％のＤＭＳＯに抵抗性があることを示し、これは、化合物のＨＴＳ用途及び特徴決定と一致している。
【図１６Ｂ】図１６Ａ及び１６Ｂは、ＢＲＥＴに基づいた細胞表面発現アッセイに対するＤＭＳＯの影響の評価を示す。ＨＥＫ２９３に、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ構築物及びｈＭＣ４Ｒ  ｗｔ−ＲｌｕｃＩＩ（図１６Ａ）またはｈＭＣ４Ｒ（Ｒ１６５Ｑ）−ＲｌｕｃＩＩ（図１６Ｂ）構築物（９６ウェルプレートの１０ウェルに７２ｎｇのｒＧＦＰ構築物＋２４ｎｇの受容体構築物）を同時形質移入した。細胞表面評価についてのＢＲＥＴに基づいたアッセイが、異なるレベルのＤＭＳＯに感受性があるかを評価するため、細胞表面発現をＢＲＥＴ２により評価し、続いて、ＰＣ処理の際に増量濃度のＤＭＳＯ（３％まで）の存在下で１０μＭのＤＣＰＭＰ（右側棒）またはビヒクル（ＤＭＳＯ、左側棒）により１６時間処理した。提示されているように、得られた結果は、このアッセイが少なくとも３％のＤＭＳＯに抵抗性があることを示し、これは、化合物のＨＴＳ用途及び特徴決定と一致している。
【図１７Ａ】図１７Ａ及び１７Ｂは、形質移入された及び安定したｒＧＦＰ細胞系におけるＭＣ４Ｒ及びＶ２Ｒ発現のＰＣ媒介救出を示す。ＨＥＫ２９３に、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ構築物（９６ウェルプレートの１０ウェルに７２ｎｇのプラスミド）、ならびに３つの異なる量（グラフに示されているように、１０ウェルに６、１２及び２４ｎｇ）のｈＭＣ４Ｒ（Ｒ１６５Ｑ）−ＲｌｕｃＩＩ（図１７Ａ）またはｈＶ２Ｒ（Ｙ１２８Ｓ）−ＲｌｕｃＩＩ（図１７Ｂ）を同時形質移入した。異なるレベルのｒＧＦＰ−ＣＡＡＸを安定して発現する（低、中程度（中）及び高程度（高））ように選択されたＨＥＫ２９３細胞に、同じ量の受容体構築物を形質移入した。ＭＣ４Ｒの細胞表面発現のＰＣ媒介救出をＢＲＥＴ２により評価し、続いて、１０μＭのＤＣＰＭＰにより、Ｖ２Ｒ（Ｙ１２８Ｓ）−ＲｌｕｃＩＩ発現細胞では、１０μＭのＳＲ１２１４６３シャペロン（逆作動薬及び薬理学的シャペロン特性を有する既知の拮抗薬、Ｓｅｒｒａｄｅｉｌ−Ｌｅ  Ｇａｌ  Ｃ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｖ．２００１，１９（３）：２０１−１４）により、またはビヒクル（ＤＭＳＯ）により、１６時間処理した。データを、ビヒクル（ＤＭＳＯ）で処理された細胞において観察されたＢＲＥＴシグナルの％として、ＭＣ４Ｒ及びＶ２Ｒ発現細胞について表した。提示されたデータは、より高いレベルのｒＧＦＰ−ＣＡＡＸを発現する安定した細胞系によって、より良好な応答を得ることができることを示している。高いレベルのｒＧＦＰ−ＣＡＡＸを発現する安定した細胞系（安定：高）を使用して、受容体−ＲｌｕｃＩＩを同時発現する細胞系を確立することができる。
【図１７Ｂ】図１７Ａ及び１７Ｂは、形質移入された及び安定したｒＧＦＰ細胞系におけるＭＣ４Ｒ及びＶ２Ｒ発現のＰＣ媒介救出を示す。ＨＥＫ２９３に、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ構築物（９６ウェルプレートの１０ウェルに７２ｎｇのプラスミド）、ならびに３つの異なる量（グラフに示されているように、１０ウェルに６、１２及び２４ｎｇ）のｈＭＣ４Ｒ（Ｒ１６５Ｑ）−ＲｌｕｃＩＩ（図１７Ａ）またはｈＶ２Ｒ（Ｙ１２８Ｓ）−ＲｌｕｃＩＩ（図１７Ｂ）を同時形質移入した。異なるレベルのｒＧＦＰ−ＣＡＡＸを安定して発現する（低、中程度（中）及び高程度（高））ように選択されたＨＥＫ２９３細胞に、同じ量の受容体構築物を形質移入した。ＭＣ４Ｒの細胞表面発現のＰＣ媒介救出をＢＲＥＴ２により評価し、続いて、１０μＭのＤＣＰＭＰにより、Ｖ２Ｒ（Ｙ１２８Ｓ）−ＲｌｕｃＩＩ発現細胞では、１０μＭのＳＲ１２１４６３シャペロン（逆作動薬及び薬理学的シャペロン特性を有する既知の拮抗薬、Ｓｅｒｒａｄｅｉｌ−Ｌｅ  Ｇａｌ  Ｃ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｖ．２００１，１９（３）：２０１−１４）により、またはビヒクル（ＤＭＳＯ）により、１６時間処理した。データを、ビヒクル（ＤＭＳＯ）で処理された細胞において観察されたＢＲＥＴシグナルの％として、ＭＣ４Ｒ及びＶ２Ｒ発現細胞について表した。提示されたデータは、より高いレベルのｒＧＦＰ−ＣＡＡＸを発現する安定した細胞系によって、より良好な応答を得ることができることを示している。高いレベルのｒＧＦＰ−ＣＡＡＸを発現する安定した細胞系（安定：高）を使用して、受容体−ＲｌｕｃＩＩを同時発現する細胞系を確立することができる。
【図１８Ａ】図１８Ａ〜１８Ｅ：ｈＥＲＧチャネル（非ＧＰＣＲ）のリガンドを検出するＰＣ救出アッセイである。ｈＥＲＧとｒＧＦＰ−ＣＡＡＸの異なる比でのｗｔ（図１８Ａ）及び突然変異（Ｇ６０１Ｓ、図１８Ｂ）ｈＥＲＧの細胞表面発現及び機能性ＰＣ媒介救出である。ＨＥＫ２９３細胞に、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ構築物（９６ウェルプレートの１０ウェルに７２ｎｇのプラスミド）、ならびに３つの異なる量（グラフに示されているように、１０ウェルに６、１２及び２４ｎｇ）のｈＥＲＧ  ｗｔ−ＲｌｕｃＩＩ（図１８Ａ）及びｈＥＲＧ（Ｇ６０１Ｓ）−ＲｌｕｃＩＩ（図１８Ｂ）を同時形質移入した。細胞表面発現のＰＣ媒介救出を、ＢＲＥＴ２により評価し、続いてシャペロン（アステミゾール、１０μＭ、中実黒色棒）またはビヒクル（ＤＭＳＯ、白色棒）のいずれかにより１６時間処理した。アステミゾール処理は、ビヒクル処理細胞と比較して、ＢＲＥＴシグナルの増加により明らかなように、細胞表面発現の増加を誘発する。ｗｔ（図１８Ａ）及びＧ６０１Ｓ突然変異（図１８Ｂ）ｈＥＲＧは、両方ともＰＣ処理に感受性があり、ｈＥＲＧに結合し、シャペロンとして異なる有効性で作用することが知られているリガンドを特徴決定するために使用した（図１８Ｃ及びＤ）。図１８Ｅでは、ｈＥＲＧ（Ｇ６０１Ｓ）−ＲｌｕｃＩＩ構築物によるアッセイの堅牢度をＺ’値で評価した。細胞表面発現をＢＲＥＴ２により評価し、続いて１０μＭのアステミゾール（４８ウェル）とビヒクル（ＤＭＳＯ）（４８ウェル）により１６時間処理した。ＢＲＥＴ値を、提示されたグラフにおいてウェル毎に表し、Ｚ’値は０．６２２で評価され、ハイスループットスクリーニング用途に適応可能である堅牢なアッセイであることを示している。
【図１８Ｂ】図１８Ａ〜１８Ｅ：ｈＥＲＧチャネル（非ＧＰＣＲ）のリガンドを検出するＰＣ救出アッセイである。ｈＥＲＧとｒＧＦＰ−ＣＡＡＸの異なる比でのｗｔ（図１８Ａ）及び突然変異（Ｇ６０１Ｓ、図１８Ｂ）ｈＥＲＧの細胞表面発現及び機能性ＰＣ媒介救出である。ＨＥＫ２９３細胞に、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ構築物（９６ウェルプレートの１０ウェルに７２ｎｇのプラスミド）、ならびに３つの異なる量（グラフに示されているように、１０ウェルに６、１２及び２４ｎｇ）のｈＥＲＧ  ｗｔ−ＲｌｕｃＩＩ（図１８Ａ）及びｈＥＲＧ（Ｇ６０１Ｓ）−ＲｌｕｃＩＩ（図１８Ｂ）を同時形質移入した。細胞表面発現のＰＣ媒介救出を、ＢＲＥＴ２により評価し、続いてシャペロン（アステミゾール、１０μＭ、中実黒色棒）またはビヒクル（ＤＭＳＯ、白色棒）のいずれかにより１６時間処理した。アステミゾール処理は、ビヒクル処理細胞と比較して、ＢＲＥＴシグナルの増加により明らかなように、細胞表面発現の増加を誘発する。ｗｔ（図１８Ａ）及びＧ６０１Ｓ突然変異（図１８Ｂ）ｈＥＲＧは、両方ともＰＣ処理に感受性があり、ｈＥＲＧに結合し、シャペロンとして異なる有効性で作用することが知られているリガンドを特徴決定するために使用した（図１８Ｃ及びＤ）。図１８Ｅでは、ｈＥＲＧ（Ｇ６０１Ｓ）−ＲｌｕｃＩＩ構築物によるアッセイの堅牢度をＺ’値で評価した。細胞表面発現をＢＲＥＴ２により評価し、続いて１０μＭのアステミゾール（４８ウェル）とビヒクル（ＤＭＳＯ）（４８ウェル）により１６時間処理した。ＢＲＥＴ値を、提示されたグラフにおいてウェル毎に表し、Ｚ’値は０．６２２で評価され、ハイスループットスクリーニング用途に適応可能である堅牢なアッセイであることを示している。
【図１８Ｃ】図１８Ａ〜１８Ｅ：ｈＥＲＧチャネル（非ＧＰＣＲ）のリガンドを検出するＰＣ救出アッセイである。ｈＥＲＧとｒＧＦＰ−ＣＡＡＸの異なる比でのｗｔ（図１８Ａ）及び突然変異（Ｇ６０１Ｓ、図１８Ｂ）ｈＥＲＧの細胞表面発現及び機能性ＰＣ媒介救出である。ＨＥＫ２９３細胞に、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ構築物（９６ウェルプレートの１０ウェルに７２ｎｇのプラスミド）、ならびに３つの異なる量（グラフに示されているように、１０ウェルに６、１２及び２４ｎｇ）のｈＥＲＧ  ｗｔ−ＲｌｕｃＩＩ（図１８Ａ）及びｈＥＲＧ（Ｇ６０１Ｓ）−ＲｌｕｃＩＩ（図１８Ｂ）を同時形質移入した。細胞表面発現のＰＣ媒介救出を、ＢＲＥＴ２により評価し、続いてシャペロン（アステミゾール、１０μＭ、中実黒色棒）またはビヒクル（ＤＭＳＯ、白色棒）のいずれかにより１６時間処理した。アステミゾール処理は、ビヒクル処理細胞と比較して、ＢＲＥＴシグナルの増加により明らかなように、細胞表面発現の増加を誘発する。ｗｔ（図１８Ａ）及びＧ６０１Ｓ突然変異（図１８Ｂ）ｈＥＲＧは、両方ともＰＣ処理に感受性があり、ｈＥＲＧに結合し、シャペロンとして異なる有効性で作用することが知られているリガンドを特徴決定するために使用した（図１８Ｃ及びＤ）。図１８Ｅでは、ｈＥＲＧ（Ｇ６０１Ｓ）−ＲｌｕｃＩＩ構築物によるアッセイの堅牢度をＺ’値で評価した。細胞表面発現をＢＲＥＴ２により評価し、続いて１０μＭのアステミゾール（４８ウェル）とビヒクル（ＤＭＳＯ）（４８ウェル）により１６時間処理した。ＢＲＥＴ値を、提示されたグラフにおいてウェル毎に表し、Ｚ’値は０．６２２で評価され、ハイスループットスクリーニング用途に適応可能である堅牢なアッセイであることを示している。
【図１８Ｄ】図１８Ａ〜１８Ｅ：ｈＥＲＧチャネル（非ＧＰＣＲ）のリガンドを検出するＰＣ救出アッセイである。ｈＥＲＧとｒＧＦＰ−ＣＡＡＸの異なる比でのｗｔ（図１８Ａ）及び突然変異（Ｇ６０１Ｓ、図１８Ｂ）ｈＥＲＧの細胞表面発現及び機能性ＰＣ媒介救出である。ＨＥＫ２９３細胞に、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ構築物（９６ウェルプレートの１０ウェルに７２ｎｇのプラスミド）、ならびに３つの異なる量（グラフに示されているように、１０ウェルに６、１２及び２４ｎｇ）のｈＥＲＧ  ｗｔ−ＲｌｕｃＩＩ（図１８Ａ）及びｈＥＲＧ（Ｇ６０１Ｓ）−ＲｌｕｃＩＩ（図１８Ｂ）を同時形質移入した。細胞表面発現のＰＣ媒介救出を、ＢＲＥＴ２により評価し、続いてシャペロン（アステミゾール、１０μＭ、中実黒色棒）またはビヒクル（ＤＭＳＯ、白色棒）のいずれかにより１６時間処理した。アステミゾール処理は、ビヒクル処理細胞と比較して、ＢＲＥＴシグナルの増加により明らかなように、細胞表面発現の増加を誘発する。ｗｔ（図１８Ａ）及びＧ６０１Ｓ突然変異（図１８Ｂ）ｈＥＲＧは、両方ともＰＣ処理に感受性があり、ｈＥＲＧに結合し、シャペロンとして異なる有効性で作用することが知られているリガンドを特徴決定するために使用した（図１８Ｃ及びＤ）。図１８Ｅでは、ｈＥＲＧ（Ｇ６０１Ｓ）−ＲｌｕｃＩＩ構築物によるアッセイの堅牢度をＺ’値で評価した。細胞表面発現をＢＲＥＴ２により評価し、続いて１０μＭのアステミゾール（４８ウェル）とビヒクル（ＤＭＳＯ）（４８ウェル）により１６時間処理した。ＢＲＥＴ値を、提示されたグラフにおいてウェル毎に表し、Ｚ’値は０．６２２で評価され、ハイスループットスクリーニング用途に適応可能である堅牢なアッセイであることを示している。
【図１８Ｅ】図１８Ａ〜１８Ｅ：ｈＥＲＧチャネル（非ＧＰＣＲ）のリガンドを検出するＰＣ救出アッセイである。ｈＥＲＧとｒＧＦＰ−ＣＡＡＸの異なる比でのｗｔ（図１８Ａ）及び突然変異（Ｇ６０１Ｓ、図１８Ｂ）ｈＥＲＧの細胞表面発現及び機能性ＰＣ媒介救出である。ＨＥＫ２９３細胞に、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ構築物（９６ウェルプレートの１０ウェルに７２ｎｇのプラスミド）、ならびに３つの異なる量（グラフに示されているように、１０ウェルに６、１２及び２４ｎｇ）のｈＥＲＧ  ｗｔ−ＲｌｕｃＩＩ（図１８Ａ）及びｈＥＲＧ（Ｇ６０１Ｓ）−ＲｌｕｃＩＩ（図１８Ｂ）を同時形質移入した。細胞表面発現のＰＣ媒介救出を、ＢＲＥＴ２により評価し、続いてシャペロン（アステミゾール、１０μＭ、中実黒色棒）またはビヒクル（ＤＭＳＯ、白色棒）のいずれかにより１６時間処理した。アステミゾール処理は、ビヒクル処理細胞と比較して、ＢＲＥＴシグナルの増加により明らかなように、細胞表面発現の増加を誘発する。ｗｔ（図１８Ａ）及びＧ６０１Ｓ突然変異（図１８Ｂ）ｈＥＲＧは、両方ともＰＣ処理に感受性があり、ｈＥＲＧに結合し、シャペロンとして異なる有効性で作用することが知られているリガンドを特徴決定するために使用した（図１８Ｃ及びＤ）。図１８Ｅでは、ｈＥＲＧ（Ｇ６０１Ｓ）−ＲｌｕｃＩＩ構築物によるアッセイの堅牢度をＺ’値で評価した。細胞表面発現をＢＲＥＴ２により評価し、続いて１０μＭのアステミゾール（４８ウェル）とビヒクル（ＤＭＳＯ）（４８ウェル）により１６時間処理した。ＢＲＥＴ値を、提示されたグラフにおいてウェル毎に表し、Ｚ’値は０．６２２で評価され、ハイスループットスクリーニング用途に適応可能である堅牢なアッセイであることを示している。
【図１９Ａ】図１９Ａは、形質膜におけるＧＰＣＲへのβ−アレスチン動員をモニタリングするバイオセンサーの立体配置を示す。ＢＲＥＴ受容体（例えば、ｒＧＦＰ、ＧＦＰ１０）に、ＰＭ標的化部分を標識し（したがって、ＢＲＥＴ受容体をＰＭに繋ぎ止め）、β−アレスチンに、ＢＲＥＴ供与体（例えば、ＲｌｕｃＩＩ）を標識する。ＧＰＣＲ作動薬（Ａと表される）の存在下では、β−アレスチンはＧＰＣＲへ動員され、したがって形質膜でのＲｌｕｃＩＩ−β−アレスチンの濃度が増加し、このことはＲｌｕｃＩＩとＰＭ標識化ＧＦＰとの間のエネルギー転移（ＢＲＥＴ）の増加をもたらす。
【図１９Ｂ】図１９Ｂ及び１９Ｃは、増加用量の作動薬イソプロテレノール（ｉｓｏ）による刺激後の、異なるＰＭ標的化部分（Ｌｙｎ、ＣＡＡＸ及びＰＢ−ＧＲＫ５）ならびにＢＲＥＴ受容体（ｒＧＦＰ及びＧＦＰ１０）での、クラスＡのＧＰＣＲであるβ２ＡＲにおけるβ−アレスチン１及びβ−アレスチン２それぞれの動員のＢＲＥＴ比の増加を示す。ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ（四角）を有するβ−アレスチン−ＲｌｕｃＩＩ移行センサーは、両方の受容体にとって最適な範囲を提供する。
【図１９Ｃ】図１９Ｂ及び１９Ｃは、増加用量の作動薬イソプロテレノール（ｉｓｏ）による刺激後の、異なるＰＭ標的化部分（Ｌｙｎ、ＣＡＡＸ及びＰＢ−ＧＲＫ５）ならびにＢＲＥＴ受容体（ｒＧＦＰ及びＧＦＰ１０）での、クラスＡのＧＰＣＲであるβ２ＡＲにおけるβ−アレスチン１及びβ−アレスチン２それぞれの動員のＢＲＥＴ比の増加を示す。ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ（四角）を有するβ−アレスチン−ＲｌｕｃＩＩ移行センサーは、両方の受容体にとって最適な範囲を提供する。
【図１９Ｄ】図１９Ｄ及び１９Ｅは、増加用量の作動薬ＡＶＰによる刺激後の、異なるＰＭ標的化部分（Ｌｙｎ、ＣＡＡＸ及びＰＢ−ＧＲＫ５）ならびにＢＲＥＴ受容体（ｒＧＦＰ及びＧＦＰ１０）での、クラスＢのＧＰＣＲであるＶ２Ｒにおけるβ−アレスチン１及びβ−アレスチン２それぞれの動員のＢＲＥＴ比の増加を示す。
【図１９Ｅ】図１９Ｄ及び１９Ｅは、増加用量の作動薬ＡＶＰによる刺激後の、異なるＰＭ標的化部分（Ｌｙｎ、ＣＡＡＸ及びＰＢ−ＧＲＫ５）ならびにＢＲＥＴ受容体（ｒＧＦＰ及びＧＦＰ１０）での、クラスＢのＧＰＣＲであるＶ２Ｒにおけるβ−アレスチン１及びβ−アレスチン２それぞれの動員のＢＲＥＴ比の増加を示す。
【図１９Ｆ】図１９Ｆは、異なるＰＭ標的化部分（ＫｒａｓのＣＡＡＸ、ＨｒａｓのＣＡＡＸ、ｈＲａｓの形質膜標的化パルミトイル化配列及びＲａｌ１（ＣＣＩＬ）のプレニル化シグナル配列）、ならびにｒＧＦＰに標識したカベオラ構造カベオリン１αのマーカーを使用して評価された、増加用量の作動薬イソプロテレノール（ｉｓｏ）による刺激後の、β２ＡＲへのβ−アレスチン２の動員を示す。ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ（四角）を有するβ−アレスチン−ＲｌｕｃＩＩ移行センサーは、形質膜での密度の増加を示す。ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸマーカーから得た応答と対照的に、β２ＡＲの刺激は、カベオラでのβ−アレスチン２の密度の減少をもたらす。
【図１９Ｇ】図１９Ｇは、ＡＴ１Ｒ刺激の後の形質膜でのβアレスチン２の移行における用量応答曲線を示す。ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞に、Ｌｙｎ−ｒＧＦＰ、またはｒＧＦＰ−ＣＡＡＸもしくはＧＦＰ１０−ＣＡＡＸのいずれかと共にＡＴ１Ｒ及びβａｒｒ２−ＲｌｕｃＩＩを形質移入した。細胞を、ＢＲＥＴ測定の前に様々な濃度のＡｎｇＩＩと共に室温で６分間インキュベートした。データは基礎ＢＲＥＴの率として表される。データは、３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．である。
【図１９Ｈ】図１９Ｈ〜１９Ｊは、βアレスチン２−ＲｌｕｃＩＩ／ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸバイオセンサー、ならびに図１９Ｃ、１９Ｅ及び１９Ｇそれぞれの受容体から得たＺ’値を示す。受容体媒介βアレスチン動員をモニターするこのアッセイは、少なくとも０．７４のＺ’値（０．７４、０．８０及び０．８３８）をもたらし、クラスＡ及びＢのＧＰＣＲの両方にとってスクリーニング（ハイスループットスクリーニングを含む）が適応可能である。
【図１９Ｉ】図１９Ｈ〜１９Ｊは、βアレスチン２−ＲｌｕｃＩＩ／ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸバイオセンサー、ならびに図１９Ｃ、１９Ｅ及び１９Ｇそれぞれの受容体から得たＺ’値を示す。受容体媒介βアレスチン動員をモニターするこのアッセイは、少なくとも０．７４のＺ’値（０．７４、０．８０及び０．８３８）をもたらし、クラスＡ及びＢのＧＰＣＲの両方にとってスクリーニング（ハイスループットスクリーニングを含む）が適応可能である。
【図１９Ｊ】図１９Ｈ〜１９Ｊは、βアレスチン２−ＲｌｕｃＩＩ／ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸバイオセンサー、ならびに図１９Ｃ、１９Ｅ及び１９Ｇそれぞれの受容体から得たＺ’値を示す。受容体媒介βアレスチン動員をモニターするこのアッセイは、少なくとも０．７４のＺ’値（０．７４、０．８０及び０．８３８）をもたらし、クラスＡ及びＢのＧＰＣＲの両方にとってスクリーニング（ハイスループットスクリーニングを含む）が適応可能である。
【図２０Ａ】図２０Ａ及び２０Ｂは、ＲｌｕｃＩＩ−ＰＨ（ＰＬＣδ１）と、ｒＧＦＰ−ＰＨ（ＰＬＣδ１）またはＬｙｎ−ｒＧＦＰもしくはｒＧＦＰ−ＣＡＡＸとのＢＲＥＴにより検出された、形質ＰＩＰ２量におけるＡｎｇＩＩ用量依存性減少を示す。ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞に、ｒＧＦＰ−ＰＨ（ＰＬＣδ１）、Ｌｙｎ−ｒＧＦＰまたはｒＧＦＰ−ＣＡＡＸのいずれかと共にＡＴ１Ｒ及びＨＡ−ＲｌｕｃＩＩ−ＰＨ（ＰＬＣδ１）を形質移入した。細胞を、様々な濃度のＡｎｇＩＩと共に室温で１分間インキュベートし、次にＢＲＥＴを測定した。結果は、単一の代表的実験における三連の平均±Ｓ．Ｅ．である。
【図２０Ｂ】図２０Ａ及び２０Ｂは、ＲｌｕｃＩＩ−ＰＨ（ＰＬＣδ１）と、ｒＧＦＰ−ＰＨ（ＰＬＣδ１）またはＬｙｎ−ｒＧＦＰもしくはｒＧＦＰ−ＣＡＡＸとのＢＲＥＴにより検出された、形質ＰＩＰ２量におけるＡｎｇＩＩ用量依存性減少を示す。ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞に、ｒＧＦＰ−ＰＨ（ＰＬＣδ１）、Ｌｙｎ−ｒＧＦＰまたはｒＧＦＰ−ＣＡＡＸのいずれかと共にＡＴ１Ｒ及びＨＡ−ＲｌｕｃＩＩ−ＰＨ（ＰＬＣδ１）を形質移入した。細胞を、様々な濃度のＡｎｇＩＩと共に室温で１分間インキュベートし、次にＢＲＥＴを測定した。結果は、単一の代表的実験における三連の平均±Ｓ．Ｅ．である。
【図２１Ａ】図２１Ａは、形質膜におけるＧＰＣＲへのβ−アレスチン動員をモニタリングする単分子バイオセンサーの立体配置を示す。ＢＲＥＴ受容体（例えば、ｒＧＦＰ、ＧＦＰ１０）に、ＰＭ標的化部分を標識し（したがって、構築物をＰＭに繋ぎ止め）、可動性リンカーを、ＢＲＥＴ受容体と、β−アレスチンに結合されているＢＲＥＴ供与体（例えば、ＲｌｕｃＩＩ）との間に配置する。ＧＰＣＲ作動薬（Ａと表される）の存在下では、β−アレスチンはＧＰＣＲへ動員され、したがって形質膜でのＲｌｕｃＩＩ−β−アレスチンの濃度が増加し、このことはＲｌｕｃＩＩとＰＭ標識化ＧＦＰとの間のエネルギー転移（ＢＲＥＴ）の増加をもたらす。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、異なる長さの可動式リンカーを有する単分子バイオセンサーを使用して、ＡＶＰによる刺激後のＶ２Ｒへのβ−アレスチン２の動員を評価するＢＲＥＴ比を示す。
【図２１Ｃ】図２１Ｃ〜２１Ｅは、単分子バイオセンサーを使用する、異なるＧＰＣＲ（ＡＴ１Ｒ、Ｖ２Ｒ及びβ２ＡＲ）によるβ−アレスチン２の動員の用量応答曲線を示す。
【図２１Ｄ】図２１Ｃ〜２１Ｅは、単分子バイオセンサーを使用する、異なるＧＰＣＲ（ＡＴ１Ｒ、Ｖ２Ｒ及びβ２ＡＲ）によるβ−アレスチン２の動員の用量応答曲線を示す。
【図２１Ｅ】図２１Ｃ〜２１Ｅは、単分子バイオセンサーを使用する、異なるＧＰＣＲ（ＡＴ１Ｒ、Ｖ２Ｒ及びβ２ＡＲ）によるβ−アレスチン２の動員の用量応答曲線を示す。
【図２２Ａ】図２２Ａは、形質膜へのＰＫＣδ（Ｃ１ｂ）のジアシルグリセロール−（ＤＡＧ−）結合ドメインの移行を測定する、単分子バイオセンサーの概略図を示す。バイオセンサーは、ＰＭ標的化ドメイン／部分（Ｍｅｍ）、ＢＲＥＴ受容体（例えば、ＧＦＰ１０）、可動性リンカー、ＢＲＥＴ供与体（例えば、ＲＬｕｃＩＩ）及びＰＫＣδ、Ｃ１ｂのＤＡＧ結合ドメインを含む。ＰＬＣを活性化すると、膜ＰＩＰ２は、ＩＰ３及びＤＡＧに加水分解される。ＤＡＧ富化は、Ｃ１ｂドメインを膜に結合させ、ＢＲＥＴ受容体（例えば、ＧＦＰ１０）及びＢＲＥＴ供与体（例えば、ＲＬｕｃＩＩ）を互いに近づけて、より高いＢＲＥＴシグナルを誘発する。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、アンギオテンシンＩＩへのＡＴ１Ｒ曝露後のＤＡＧセンサー活性化の動力学を示す。ＨＥＫ２９３細胞を安定して発現するＡＴ１Ｒに、単分子ＤＡＧセンサーのＤＮＡ及びＢＲＥＴをコードする構築物を形質移入した。ＢＲＥＴレベルを４秒毎にモニターした。ＡｎｇＩＩ（最終濃度１００ｎＭ）を、１６回のＢＲＥＴ測定（６４秒）後に加えた。データは、代表的な実験の三連の平均±ＳＤである。
【図２２Ｃ】図２２Ｃ〜２２Ｅは、アンギオテンシンＩＩ（ＡＮＧＩＩ）によるアンギオテンシンＩＩ受容体（ＡＴ１Ｒ）の活性化（図２２Ｃ）、２つの天然リガンドのプロスタグランジン２α（ＰＧＦ２α、中実菱形）及びプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２、中空丸）によるプロスタグランジンＦ受容体（ＦＰ）の活性化（図２２Ｄ）、ウロテンシンＩＩ（ＵＴＩＩ）によるウロテンシンＩＩ受容体（ＧＰＲ１４）の活性化（図２２Ｅ）の後に形質膜で産生されたＤＡＧのレベルを表す、単分子ＤＡＧセンサーから得た用量応答曲線を示す。これらのリガンドから得たＥＣ５０値（ＡＮＧＩＩ＝５．３ｎＭ、ＰＧＦ２α＝１１ｎＭ、ＰＧＥ２＝９０ｎＭ及びＵＴＩＩ＝１．７ｎＭ）は、別の関連アッセイ（カルシウム流入）及び結合について既に公表されているデータに類似している。
【図２２Ｄ】図２２Ｃ〜２２Ｅは、アンギオテンシンＩＩ（ＡＮＧＩＩ）によるアンギオテンシンＩＩ受容体（ＡＴ１Ｒ）の活性化（図２２Ｃ）、２つの天然リガンドのプロスタグランジン２α（ＰＧＦ２α、中実菱形）及びプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２、中空丸）によるプロスタグランジンＦ受容体（ＦＰ）の活性化（図２２Ｄ）、ウロテンシンＩＩ（ＵＴＩＩ）によるウロテンシンＩＩ受容体（ＧＰＲ１４）の活性化（図２２Ｅ）の後に形質膜で産生されたＤＡＧのレベルを表す、単分子ＤＡＧセンサーから得た用量応答曲線を示す。これらのリガンドから得たＥＣ５０値（ＡＮＧＩＩ＝５．３ｎＭ、ＰＧＦ２α＝１１ｎＭ、ＰＧＥ２＝９０ｎＭ及びＵＴＩＩ＝１．７ｎＭ）は、別の関連アッセイ（カルシウム流入）及び結合について既に公表されているデータに類似している。
【図２２Ｅ】図２２Ｃ〜２２Ｅは、アンギオテンシンＩＩ（ＡＮＧＩＩ）によるアンギオテンシンＩＩ受容体（ＡＴ１Ｒ）の活性化（図２２Ｃ）、２つの天然リガンドのプロスタグランジン２α（ＰＧＦ２α、中実菱形）及びプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２、中空丸）によるプロスタグランジンＦ受容体（ＦＰ）の活性化（図２２Ｄ）、ウロテンシンＩＩ（ＵＴＩＩ）によるウロテンシンＩＩ受容体（ＧＰＲ１４）の活性化（図２２Ｅ）の後に形質膜で産生されたＤＡＧのレベルを表す、単分子ＤＡＧセンサーから得た用量応答曲線を示す。これらのリガンドから得たＥＣ５０値（ＡＮＧＩＩ＝５．３ｎＭ、ＰＧＦ２α＝１１ｎＭ、ＰＧＥ２＝９０ｎＭ及びＵＴＩＩ＝１．７ｎＭ）は、別の関連アッセイ（カルシウム流入）及び結合について既に公表されているデータに類似している。
【図２２Ｆ】図２２Ｆは、単分子ＤＡＧセンサーにより測定されたＢＲＥＴ応答が、ＰＬＣ活性化及びジアシルグリセロールの同時発生的産生を反映することを示す。単分子ＤＡＧセンサーを一時的に発現するＨＥＫ２９３細胞は、ＰＬＣ（β２、β３、γ１、γ２、δ１アイソフォーム）の直接活性化因子である、５ｕＭのｍ−３ｍ３ＦＢＳに、示された時間にわたって曝露された。ＰＬＣ活性化は、形質膜におけるＤＡＧレベルの持続的増加を反映する、ＢＲＥＴの増加をもたらす。
【図２２Ｇ】図２２Ｇ及び２２Ｈは、ＤＡＧバイオセンサーの堅牢度を示す。Ｚ’値は、ＤＡＧバイオセンサーについて決定し、ウロテンシンＩＩ（図２２Ｇ）またはプロスタグランジンＦ受容体（図２２Ｈ）を一時的に発現するＨＥＫ２９３を、ＤＡＧバイオセンサーと共に使用した。細胞を、ＢＲＥＴ測定のＸ分前に、１００ｎＭの作動薬（図２２ＧではＵｒｏｌｌ、または図２２ＨではＰＧＦ２α）に曝露した。
【図２２Ｈ】図２２Ｇ及び２２Ｈは、ＤＡＧバイオセンサーの堅牢度を示す。Ｚ’値は、ＤＡＧバイオセンサーについて決定し、ウロテンシンＩＩ（図２２Ｇ）またはプロスタグランジンＦ受容体（図２２Ｈ）を一時的に発現するＨＥＫ２９３を、ＤＡＧバイオセンサーと共に使用した。細胞を、ＢＲＥＴ測定のＸ分前に、１００ｎＭの作動薬（図２２ＧではＵｒｏｌｌ、または図２２ＨではＰＧＦ２α）に曝露した。
【図２３Ａ】図２３Ａは、形質膜へのＰＫＣδ（Ｃ１ｂ）のジアシルグリセロール−（ＤＡＧ−）結合ドメインの移行を測定する、バイオセンサーの概略図を示す。バイオセンサーは、ＢＲＥＴ受容体（例えば、ｒＧＦＰ）及びＰＫＣδ、Ｃ１ｂのＤＡＧ結合ドメインに連結したＢＲＥＴ供与体（例えば、ＲＬｕｃＩＩ）に結合している、ＰＭ標的化ドメイン／部分を含む。ＰＬＣを活性化すると、膜ＰＩＰ２は、ＩＰ３及びＤＡＧに加水分解される。ＤＡＧ富化は、Ｃ１ｂドメインを膜に結合させ、ＢＲＥＴ受容体（例えば、ｒＧＦＰ）及びＢＲＥＴ供与体（例えば、ＲＬｕｃＩＩ）を互いに近づけて、より高いＢＲＥＴシグナルを誘発する。
【図２３Ｂ】図２３Ｂ〜２３Ｄは、ＤＡＧバイオセンサーを使用した、ヒスタミンＨ１受容体（Ｈ１Ｒ）（図２３Ｂ）、ブラジキニン受容体Ｂ２（ＢＫＲＢ２）（図２３Ｃ）、ドーパミンＤ２受容体（Ｄ２Ｒ）（図２３Ｄ）及びβ２ＡＲ（図２３Ｅ）の活性化後の形質膜でのＣ１ｂの動員の用量応答曲線を示す。Ｇｑ共役型受容体（Ｈ１Ｒ及びＢＫＲＢ２）活性化は、ＧｑファミリーのＧタンパク質であるＧ１５の同時発現の不在下で検出可能な応答を本質的にもたらさないＧｉ共役型受容体（Ｄ２Ｒ）またはＧｓ共役型受容体よりも、良好なシグナルをもたらす。
【図２３Ｃ】図２３Ｂ〜２３Ｄは、ＤＡＧバイオセンサーを使用した、ヒスタミンＨ１受容体（Ｈ１Ｒ）（図２３Ｂ）、ブラジキニン受容体Ｂ２（ＢＫＲＢ２）（図２３Ｃ）、ドーパミンＤ２受容体（Ｄ２Ｒ）（図２３Ｄ）及びβ２ＡＲ（図２３Ｅ）の活性化後の形質膜でのＣ１ｂの動員の用量応答曲線を示す。Ｇｑ共役型受容体（Ｈ１Ｒ及びＢＫＲＢ２）活性化は、ＧｑファミリーのＧタンパク質であるＧ１５の同時発現の不在下で検出可能な応答を本質的にもたらさないＧｉ共役型受容体（Ｄ２Ｒ）またはＧｓ共役型受容体よりも、良好なシグナルをもたらす。
【図２３Ｄ】図２３Ｂ〜２３Ｄは、ＤＡＧバイオセンサーを使用した、ヒスタミンＨ１受容体（Ｈ１Ｒ）（図２３Ｂ）、ブラジキニン受容体Ｂ２（ＢＫＲＢ２）（図２３Ｃ）、ドーパミンＤ２受容体（Ｄ２Ｒ）（図２３Ｄ）及びβ２ＡＲ（図２３Ｅ）の活性化後の形質膜でのＣ１ｂの動員の用量応答曲線を示す。Ｇｑ共役型受容体（Ｈ１Ｒ及びＢＫＲＢ２）活性化は、ＧｑファミリーのＧタンパク質であるＧ１５の同時発現の不在下で検出可能な応答を本質的にもたらさないＧｉ共役型受容体（Ｄ２Ｒ）またはＧｓ共役型受容体よりも、良好なシグナルをもたらす。
【図２３Ｅ】図２３Ｂ〜２３Ｄは、ＤＡＧバイオセンサーを使用した、ヒスタミンＨ１受容体（Ｈ１Ｒ）（図２３Ｂ）、ブラジキニン受容体Ｂ２（ＢＫＲＢ２）（図２３Ｃ）、ドーパミンＤ２受容体（Ｄ２Ｒ）（図２３Ｄ）及びβ２ＡＲ（図２３Ｅ）の活性化後の形質膜でのＣ１ｂの動員の用量応答曲線を示す。Ｇｑ共役型受容体（Ｈ１Ｒ及びＢＫＲＢ２）活性化は、ＧｑファミリーのＧタンパク質であるＧ１５の同時発現の不在下で検出可能な応答を本質的にもたらさないＧｉ共役型受容体（Ｄ２Ｒ）またはＧｓ共役型受容体よりも、良好なシグナルをもたらす。
【図２４Ａ】図２４Ａは、Ｇタンパク質の移行及び活性化を測定するバイオセンサーの概略図を示す。バイオセンサーは、ＢＲＥＴ受容体（例えば、ｒＧＦＰ）及びＧタンパク質サブユニット、例えば、Ｇγ（Ｇβγ隔離に基づいたセンサー）またはＧα（Ｇα隔離に基づいたセンサー）に結合したＢＲＥＴ供与体（例えば、ＲＬｕｃＩＩ）に結合したＰＭ標的化ドメイン／部分（例えば、ＣＡＡＸドメイン）を含む。作動薬（Ａ）によりＧＰＣＲを活性化すると、Ｇタンパク質サブユニットはＧＰＣＲから放出され、したがって形質膜におけるＧタンパク質サブユニットの量／密度が低減し、より低いＢＲＥＴシグナルをもたらす。ＢＲＥＴの変化は、ｒＧＦＰマーカーで標識された膜のサブドメインまたは細胞内区画からの移行（ＢＲＥＴの減少）、またはそれへの移行（ＢＲＥＴの増加）も反映しうる。
【図２４Ｂ】図２４Ｂ及び２４Ｃは、イソプロテレノールによるβ１ＡＲ（図２４Ｂ）またはβ２ＡＲ（図２４Ｃ）の刺激に応答して、形質膜（ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ  Ｋｒａｓ）からの様々なＲＬｕｃＩＩ標識化Ｇγサブユニットの隔離を示す。実験の前、ＨＥＫ２９３細胞には、β−アドレナリン作動性受容体、ＷＴ  Ｇβ１サブユニット、ＲｌｕｃＩＩ標識化Ｇγサブユニット（示されているもの）及びＷＴ  Ｇα１５をコードする構築物を、同時形質移入した。ＲｌｕｃＩＩ−Ｇγ１サブユニットとの組み合わせは、これらの２つの受容体にとって用量応答曲線を確立する最適な範囲を提供する。
【図２４Ｃ】図２４Ｂ及び２４Ｃは、イソプロテレノールによるβ１ＡＲ（図２４Ｂ）またはβ２ＡＲ（図２４Ｃ）の刺激に応答して、形質膜（ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ  Ｋｒａｓ）からの様々なＲＬｕｃＩＩ標識化Ｇγサブユニットの隔離を示す。実験の前、ＨＥＫ２９３細胞には、β−アドレナリン作動性受容体、ＷＴ  Ｇβ１サブユニット、ＲｌｕｃＩＩ標識化Ｇγサブユニット（示されているもの）及びＷＴ  Ｇα１５をコードする構築物を、同時形質移入した。ＲｌｕｃＩＩ−Ｇγ１サブユニットとの組み合わせは、これらの２つの受容体にとって用量応答曲線を確立する最適な範囲を提供する。
【図２４Ｄ】図２４Ｄは、β−アドレナリン作動性受容体、ＷＴ  Ｇβ１サブユニット、ＲＬｕｃＩＩ標識化Ｇγサブユニット及びＷＴ  Ｇα１５をコードする構築物が一時的に形質移入されたＨＥＫ２９３細胞のイソプロテレノールによるβ１ＡＲ（丸）及びβ２ＡＲ（三角）の刺激後の、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ（Ｋｒａｓ）からの作動薬促進ＲｌｕｃＩＩ標識化Ｇγ１隔離における用量応答曲線を示す。観察されたＥＣ５０は、これらの受容体におけるイソプロテレノールの報告されたｋｄに類似している。
【図２４Ｅ】図２４Ｅは、イソプロテレノールによるβ１ＡＲの刺激後の、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ  Ｋｒａｓ（丸）、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ  Ｈｒａｓ（四角）及びｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ  ＣＣＩＬ（三角）からの作動薬促進ＲＬｕｃＩＩ標識化Ｇｓ隔離における用量応答曲線を示す。３つのＰＭマーカーにおいて観察された効力は、４．４ｎＭ（ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ  Ｋｒａｓ）から８４７ｎＭ（ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ  ＣＣＩＬ）まで及び、異なるリガンドの薬理学が、特定のマーカーによりモニターされたドメインにおいて明らかに異なりうることを示している。
【図２４Ｆ】図２４Ｆは、１μＭのイソプロテレノールによる示された時間にわたるβ１ＡＲの刺激後の、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ  Ｋｒａｓ（丸）、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ  Ｈｒａｓ（四角）及びｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ  ＣＣＩＬ（三角）からの作動薬促進ＲＬｕｃＩＩ標識化Ｇｓ隔離における動力学を示す。最大応答は、３つのＰＭマーカーにより測定して、大部分が刺激の５分以内に到達している。したがって、図２４ＥにおけるＥＣ５０の差は、用量応答曲線が最大応答で確立されたので、動力学の差によって誘導されたものではない。
【図２４Ｇ】図２４Ｇは、イソプロテレノールによるβ１ＡＲの刺激後の、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ  ＣＣＩＬ（三角）、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ  Ｈｒａｓ（四角）及びゴルジ−ｒＧＦＰ（ｅＮＯＳ１のゴルジ標的化ドメイン、菱形）からの作動薬促進ＲＬｕｃＩＩ標識化Ｇ１２隔離における用量応答曲線を示す。基礎ＢＲＥＴは、Ｇ１２がゴルジマーカーと共局在化したことを示している。しかし、大部分のＧ１２の作動薬誘発性移行は、ＰＭマーカーの使用により観察され、ゴルジでは最小限のものしか観察されない。これらの結果は、Ｇｓ及びＧ１２の両方を、受容体の刺激後に観察できることを示している。
【図２４Ｈ】図２４Ｈは、プロトタイプ作動薬のＵ４６６１９によるトロンボキサンＡ２受容体アイソフォームα（ＴｐαＲ）の刺激後の、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ  Ｋｒａｓ（丸）、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ  Ｈｒａｓ（四角）、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ  ＣＣＩＬ（三角）及びゴルジ−ｒＧＦＰ（ｅＮＯＳ１のゴルジ標的化ドメイン、菱形）への作動薬促進ＲＬｕｃＩＩ標識化Ｇｑ移行における用量応答曲線を示す。用量応答曲線は、ＴｐαＲ、Ｇαｑ  ｐｏｓ１１８ＲｌｕｃＩＩ（Ｇαｑの残基１１８の後ろに挿入されたＲｌｕｃＩＩ）、ＷＴ  Ｇγ５及びＧβ１をコードする、特定のＧｑ阻害剤であるＵｂｏ−Ｑｉｃで２０分間前処理された、またはされない構築物が一時的に形質移入されたＨＥＫ２９３細胞から得た。基礎ＢＲＥＴは、ＧｑがｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ  Ｋｒａｓ（中実丸）とほぼ共局在化していること及びＵｂｏ−Ｑｉｃ（中空丸）による前処理が、このマーカーを有するＧｑの密度を更に増加することを示しており、Ｕ４６６１９への応答範囲を平滑にしている。他のマーカーにより得られる用量応答曲線は、Ｇｑ遮断薬に曝露されない細胞のみにおいて、Ｇｑ密度の増加（ＢＲＥＴの増加；ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ  Ｈｒａｓ、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ  ＣＣＩＬ及びゴルジでは、それぞれ中実四角、中実三角及び中実菱形）を示す。Ｇｑ阻害剤により前処理された細胞では、これらのマーカーによる応答は観察されない（ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ  Ｈｒａｓ、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ  ＣＣＩＬ及びゴルジでは、それぞれ中空四角、中空三角及び中空菱形）。これらの結果は、Ｇタンパク質の移行が、少なくともＧｑでは活性化に関連していること及び作動薬刺激への応答において両方の隔離またはサブドメインへの動員を観察することが可能であることを実証した。
【図２５Ａ】図２５Ａは、形質膜へのタンパク質キナーゼＮ１（ＰＫＮ）のＲｈｏ結合ドメインの移行によるＲｈｏ活性化を測定する、バイオセンサーの概略図を示す。バイオセンサーは、ＢＲＥＴ受容体（例えば、ｒＧＦＰ）及びＰＫＮのＲｈｏ結合ドメインに連結したＢＲＥＴ供与体（例えば、ＲＬｕｃＩＩ）に結合している、ＰＭ標的化ドメイン／部分を含む。Ｇタンパク質が活性化されると、ＲｈｏＧＥＦは、Ｇｑ及びＧ１２／１３ファミリーのものなどの活性化されたＧαサブユニットに動員される、または活性化されたＧαから放出されたＧβγに動員される。このＧＥＦは、Ｒｈｏファミリーの低分子Ｇタンパク質を活性化する。活性化されると、Ｒｈｏは、活性化されたＲｈｏと特異的に相互作用するドメインを有する特定のエフェクターを動員し、ＰＫＮがこれらのエフェクターのうちの１つである。この特性に基づいて、Ｒｈｏ活性化をモニターするセンサーは、ＰＫＮ１  Ｒｈｏ結合ドメイン（ＣＲＩＢ）を、ＢＲＥＴ供与体であるＲｌｕｃＩＩを含有する発現ベクターにサブクローニングすること及び活性化されたＲｈｏが位置する形質膜への移行をモニターすることによって、作り出した。移行は、ＢＲＥＴ受容体（例えば、ｒＧＦＰ）及びＢＲＥＴ供与体（例えば、ＲＬｕｃＩＩ）を互いに近づけて、より高いＢＲＥＴシグナルを誘発する。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、作動薬（Ｕ４６６１９）によるＴｐαＲ刺激後の、形質膜マーカーのｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ  Ｋｒａｓ（丸）、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ  Ｈｒａｓ（逆三角形）及びｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ（ＣＣＩＬ、三角）への作動薬促進ＰＫＮ−ＲＬｕｃＩＩ移行における用量応答曲線を示す。用量応答曲線は、ＴＰαＲ、ＰＫＮ−ＲＬｕｃＩＩ及び形質膜ｒＧＦＰマーカーをコードする構築物が一時的に形質移入されたＨＥＫ２９３細胞から得た。ＴＰαＲは、ＲｈｏＡを活性化することが知られている、プロトタイプＧｑ／１２／１３共役型受容体である。
【図２５Ｃ】図２５Ｃは、ＡＴ１ＲをアンギオテンシンＩＩに曝露した後の、Ｒｈｏセンサー活性化の動力学を示す。ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞に、ＰＫＮ−ＣＲＩＢ−ＲｌｕｃＩＩ及びｒＧＦＰ−ＣＡＡＸと共にＡＴ１Ｒをコードする構築物を形質移入した。最初に細胞を、２秒毎にＢＲＥＴ測定する前に、１００ｎＭのＵｂｏ−Ｑｉｃ（ＦＲ９００３５９としても知られている特定のＧｑ阻害剤）の不在下または存在下で３０分間インキュベートした。タイロード液（非刺激）またはＡｎｇＩＩ（刺激、最終濃度１００ｎＭ）を、３０秒後に注入した。データは、代表的な実験の異なる時点での読み取りの二回の平均である。
【図２５Ｄ】図２５Ｄ〜２５Ｆは、異なるＡｎｇＩＩリガンドによるＲｈｏ活性化に対するＧｑ阻害の影響を示す。ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞に、ＰＫＮ−ＣＲＩＢ−ＲＬｕｃＩＩ及びｒＧＦＰ−ＣＡＡＸと共にＡＴ１Ｒをコードする構築物を形質移入した。細胞を、１００ｎＭのＵｂｏ−Ｑｉｃ（Ｇｑ阻害剤）の不在下（実線）または存在下（点線）で３０分間インキュベートし、次に、ＢＲＥＴ測定の前に様々な濃度のＡｎｇＩＩまたは類縁体で４分間刺激した。データをＡｎｇＩＩのＥｍａｘに正規化した。データは、３〜４回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．として表される。ＡｎｇＩＩ、ｈＡｎｇＩＩＩ、ＳＶｄＦ、ＳＢｐａ、ｈＳａｒｍｅｓｉｎ及びＳＩなどのＧｑ活性化リガンドは、ｕｂｏの存在下で低減された有効性及び右方向へシフトした効力を示した（図２５Ｄ及びＥ）。Ｇｑの遮断は、ＤＶＧ、サララシン及びＴＲＶ媒介Ｒｈｏ活性化に影響を与えず、それは、これらのリガンドがＧｑを活性化しないからである。ＳＩＩは、ｕｂｏ処理によるＥＣ５０の変化のみを示し、ＳＩＩがＧｑ／１１を弱く活性化することを示唆している。
【図２５Ｅ】図２５Ｄ〜２５Ｆは、異なるＡｎｇＩＩリガンドによるＲｈｏ活性化に対するＧｑ阻害の影響を示す。ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞に、ＰＫＮ−ＣＲＩＢ−ＲＬｕｃＩＩ及びｒＧＦＰ−ＣＡＡＸと共にＡＴ１Ｒをコードする構築物を形質移入した。細胞を、１００ｎＭのＵｂｏ−Ｑｉｃ（Ｇｑ阻害剤）の不在下（実線）または存在下（点線）で３０分間インキュベートし、次に、ＢＲＥＴ測定の前に様々な濃度のＡｎｇＩＩまたは類縁体で４分間刺激した。データをＡｎｇＩＩのＥｍａｘに正規化した。データは、３〜４回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．として表される。ＡｎｇＩＩ、ｈＡｎｇＩＩＩ、ＳＶｄＦ、ＳＢｐａ、ｈＳａｒｍｅｓｉｎ及びＳＩなどのＧｑ活性化リガンドは、ｕｂｏの存在下で低減された有効性及び右方向へシフトした効力を示した（図２５Ｄ及びＥ）。Ｇｑの遮断は、ＤＶＧ、サララシン及びＴＲＶ媒介Ｒｈｏ活性化に影響を与えず、それは、これらのリガンドがＧｑを活性化しないからである。ＳＩＩは、ｕｂｏ処理によるＥＣ５０の変化のみを示し、ＳＩＩがＧｑ／１１を弱く活性化することを示唆している。
【図２５Ｆ】図２５Ｄ〜２５Ｆは、異なるＡｎｇＩＩリガンドによるＲｈｏ活性化に対するＧｑ阻害の影響を示す。ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞に、ＰＫＮ−ＣＲＩＢ−ＲＬｕｃＩＩ及びｒＧＦＰ−ＣＡＡＸと共にＡＴ１Ｒをコードする構築物を形質移入した。細胞を、１００ｎＭのＵｂｏ−Ｑｉｃ（Ｇｑ阻害剤）の不在下（実線）または存在下（点線）で３０分間インキュベートし、次に、ＢＲＥＴ測定の前に様々な濃度のＡｎｇＩＩまたは類縁体で４分間刺激した。データをＡｎｇＩＩのＥｍａｘに正規化した。データは、３〜４回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．として表される。ＡｎｇＩＩ、ｈＡｎｇＩＩＩ、ＳＶｄＦ、ＳＢｐａ、ｈＳａｒｍｅｓｉｎ及びＳＩなどのＧｑ活性化リガンドは、ｕｂｏの存在下で低減された有効性及び右方向へシフトした効力を示した（図２５Ｄ及びＥ）。Ｇｑの遮断は、ＤＶＧ、サララシン及びＴＲＶ媒介Ｒｈｏ活性化に影響を与えず、それは、これらのリガンドがＧｑを活性化しないからである。ＳＩＩは、ｕｂｏ処理によるＥＣ５０の変化のみを示し、ＳＩＩがＧｑ／１１を弱く活性化することを示唆している。
【図２５Ｇ】図２５Ｇは、ＡＴ１Ｒ及びアセチルコリン受容体によるＲｈｏ活性化に対するＧｑ阻害の影響を示す。ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞に、ＰＫＮ−ＣＲＩＢ−ＲｌｕｃＩＩ及びｒＧＦＰ−ＣＡＡＸと共にＡＴ１Ｒをコードする構築物を形質移入した。細胞を、ＢＲＥＴ測定の前に１００ｎＭのＡｎｇＩＩまたは１００μＭのカルバコール（ＣＣｈ）のいずれかにより７０秒間刺激する前、１００ｎＭのＵｂｏの不在下（対照）または存在下でインキュベートした。結果は、ＵｂｏがＡｎｇＩＩ媒介ＢＲＥＴ増加を部分的に遮断し、ＣＣｈ媒介応答を完全に遮断することを示し、ＧｑがＡｎｇＩＩ及びＣＣｈによるＲｈｏ活性化において役割を果たすことを示唆している。データは、代表的な実験の三連の平均±ＳＤである。
【図２５Ｈ】図２５Ｈは、Ｒｈｏセンサー活性化のＲｈｏ阻害剤に対する効果を示す。ＡＴ１Ｒ、ＰＫＮ−ｃｒｉｂ−ＲｌｕｃＩＩ及びｒＧＦＰ−ＣＡＡＸを発現するＨＥＫ２９３ＳＬ細胞を、タイロード液中の３μｇ／ｍｌのＣ３毒素（Ｒｈｏ阻害剤、Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ，Ｉｎｃ．）と共に３７℃で約４時間インキュベートし、次に１００ｎＭのＡｎｇＩＩにより室温で７０秒間刺激した。Ｃ３毒素は、作動薬媒介ＢＲＥＴ増加を完全に消滅させ、Ｒｈｏ活性をモニターするセンサーを確証している。
【図２５Ｉ】図２５Ｉは、形質膜へのＰＫＮ移行がＲｈｏ活性化に依存していることを示す。ＴＰαＲ及びＰＫＮセンサー（ＰＫＮ−ＲｌｕｃＩＩ＋ＣＡＡＸ−ｒＧＦＰ）を一時的に発現するＨＥＫ２９３細胞を、Ｒｈｏ阻害剤（ＣＴ０４、Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ，Ｉｎｃ．）により一晩前処理し、または前処理せず、１００ｎＭのＵ４６６１９（ＴＰαＲ作動薬）、１μｇ／ｍｌのＲｈｏ活性化剤ＩＩ（ＣＮ０３、Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ，Ｉｎｃ．）、またはビヒクルに曝露した。Ｒｈｏ阻害剤は、ＴＰαＲ媒介応答を消滅させたが、Ｒｈｏ活性化剤は応答を誘発し、Ｒｈｏ活性をモニターするこのセンサーを確証している。
【図２６Ａ】図２６Ａ及び２６Ｂは、単分子融合構築物のＲｌｕｃＩＩ及び異なるＢＲＥＴ受容体から得たＢＲＥＴ転移を示す。ｒＧＦＰを使用して得たＢＲＥＴシグナルは、典型的なＢＲＥＴ１（Ｖｅｎｕｓ）及びＢＲＥＴ２（ＧＦＰ２）受容体から得たものより１０倍を超えて高かった。図２６Ａは、ＲｌｕｃＩＩがＶｅｎｕｓ、ＧＦＰ２及びｒＧＦＰと対形成したときのエネルギー転移の差を示す。図２６Ｂは、Ｖｅｎｕｓ−、ＧＦＰ２−及びｒＧＦＰ−融合構築物から計算されたＢＲＥＴ比を示す。
【図２６Ｂ】図２６Ａ及び２６Ｂは、単分子融合構築物のＲｌｕｃＩＩ及び異なるＢＲＥＴ受容体から得たＢＲＥＴ転移を示す。ｒＧＦＰを使用して得たＢＲＥＴシグナルは、典型的なＢＲＥＴ１（Ｖｅｎｕｓ）及びＢＲＥＴ２（ＧＦＰ２）受容体から得たものより１０倍を超えて高かった。図２６Ａは、ＲｌｕｃＩＩがＶｅｎｕｓ、ＧＦＰ２及びｒＧＦＰと対形成したときのエネルギー転移の差を示す。図２６Ｂは、Ｖｅｎｕｓ−、ＧＦＰ２−及びｒＧＦＰ−融合構築物から計算されたＢＲＥＴ比を示す。
【図２６Ｃ】図２６Ｃは、ｒＧＦＰ増強ＢＲＥＴシグナルを使用して、形質膜へのベータアレスチンの動員などの密度−ＢＲＥＴに基づいたアッセイにおいても、顕微鏡検査法によってＢＲＥＴをモニターできることを示す。この実験に使用されたアッセイは、プレート読み取り機を使用して測定した、図１９Ｃに提示されたものに類似している。ＨＥＫ２９３細胞に、β２ＡＲ、βアレスチン２−ＲｌｕｃＩＩ及び形質膜マーカーのｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ（Ｋｒａｓ）をコードする構築物を一時的に形質移入した。イソプロテレノールによる刺激は、形質膜においてのみＢＲＥＴシグナルレベルの増加を誘発し、ＢＲＥＴシグナルの増加が、形質膜へのβアレスチンの動員を反映することを示している。
【図２７Ａ】図２７Ａは、ＡＴ１Ｒエンドサイトーシスの調節因子のスクリーニングの結果を示す。ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ及びｒＧＦＰ−ＦＹＶＥを一時的に形質移入した後、ＨＥＫ２９３細胞を３８４ウェル白色組織培養処理プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に分配し、更に２４時間かけて増殖させた。化合物を、化合物のサブライブラリーに応じて最終濃度１５μＭまたは５μｇ／ｍｌで、３８４  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｐｉｎｔｏｏｌ（Ｖ＆Ｐ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して加える。作動薬の様式では、化合物を３７℃で３０分間インキュベートした。ＧＦＰ蛍光は、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（登録商標））の使用によって赤色であり、セレンテラジン４００ａを、マルチドロップ３８４（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））の使用により最終濃度５μＭで加えた。ＢＲＥＴシグナルを読み取る前に、細胞を室温でインキュベートした（ＲＬｕｃは４８０ｎｍであり、ｒＧＦＰは５３０ｎｍであった）。拮抗薬の様式では、化合物を３７℃で３０分間インキュベートした。アンギオテンシンＩＩを１０ｎＭ（ＥＣ８０）で加え、３７℃で更に３０分間インキュベートした。残りのアッセイは、作動薬の様式と同じように実施した。データを、ＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅ（ＩＤＢＳ）の使用により分析し、アンギオテンシンＩＩの活性化に基づいて作動薬％または阻害％として報告した。エンドソームを標的にするＡＴ１Ｒの増強剤（シグナルを１００％超増加する）及び阻害剤（シグナルを５０％超遮断する）として作用する３０及び４２個の化合物が、それぞれ示されている。
【図２７Ｂ】図２７Ｂは、エンドソームへのＢ２Ｒ及びβアレスチン２のエンドサイトーシスについてのスクリーニングにおける化合物番号２１の効果を示し、図２７Ｃは、エンドソームへのＢ２Ｒのエンドサイトーシスについてのスクリーニングにおいて特定された、化合物番号１０及び２９の効果を示す。形質移入の１日前に、ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞を、３５ｍｍガラス底皿に１００，０００個の細胞／皿の密度で播種した。細胞に、Ｂ２Ｒ−ＹＦＰ＋ｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＹＶＥ（図２７Ｂの左側及び中央、ならびに２７Ｃ）、またはＢ２Ｒ＋βアレスチン２−ＹＦＰ（図２７Ｃ）を形質移入した。形質移入の４８時間後、細胞を３０分間にわたって血清飢餓にし、ビヒクル（図２７Ｂ左側及び２７Ｃ左側）、化合物２１（図２７Ｂ中央及び右側）、化合物１０（図２７Ｃ中央）、または化合物２９（図２７Ｃ右側）のいずれかにより３７℃で３０分間前処理した。次に細胞を、ブラジキニン（１μＭ）を用いて、または用いないで（未処理）１５分間刺激した。試料を、アルゴン（５１４ｎｍ）及びＨｅＮｅ  Ｉ（５４３ｎｍ）レーザーを使用するＺｅｉｓｓ（商標）ＬＳＭ−５１０  Ｍｅｔａレーザー走査顕微鏡により分析し、画像（２０４８×２０４８画素）を、６３×油浸レンズの使用により収集した。
【図２７Ｃ】図２７Ｂは、エンドソームへのＢ２Ｒ及びβアレスチン２のエンドサイトーシスについてのスクリーニングにおける化合物番号２１の効果を示し、図２７Ｃは、エンドソームへのＢ２Ｒのエンドサイトーシスについてのスクリーニングにおいて特定された、化合物番号１０及び２９の効果を示す。形質移入の１日前に、ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞を、３５ｍｍガラス底皿に１００，０００個の細胞／皿の密度で播種した。細胞に、Ｂ２Ｒ−ＹＦＰ＋ｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＹＶＥ（図２７Ｂの左側及び中央、ならびに２７Ｃ）、またはＢ２Ｒ＋βアレスチン２−ＹＦＰ（図２７Ｃ）を形質移入した。形質移入の４８時間後、細胞を３０分間にわたって血清飢餓にし、ビヒクル（図２７Ｂ左側及び２７Ｃ左側）、化合物２１（図２７Ｂ中央及び右側）、化合物１０（図２７Ｃ中央）、または化合物２９（図２７Ｃ右側）のいずれかにより３７℃で３０分間前処理した。次に細胞を、ブラジキニン（１μＭ）を用いて、または用いないで（未処理）１５分間刺激した。試料を、アルゴン（５１４ｎｍ）及びＨｅＮｅ  Ｉ（５４３ｎｍ）レーザーを使用するＺｅｉｓｓ（商標）ＬＳＭ−５１０  Ｍｅｔａレーザー走査顕微鏡により分析し、画像（２０４８×２０４８画素）を、６３×油浸レンズの使用により収集した。
【発明を実施するための形態】
【００８１】
発明の開示
本明細書に記載されている研究において、本発明者たちは、受容体及び他のタンパク質などのタンパク質の細胞内局在化及び輸送（例えば、受容体内部移行、再循環、エキソサイトーシス）を評価／モニターすることを可能にする、ＢＲＥＴに基づいたバイオセンサーを開発した。ＧＰＣＲ及びイオンチャネルをモデルとして使用して、本発明者たちは、ｒｅｎｉｌｌａのＢＲＥＴ対であるＲＬｕｃＩＩ−ｒＧＦＰに基づいた感度の良い方法を、受容体及びβ−アレスチン内部移行、ならびに異なる細胞区画へのこれらの輸送のリアルタイムモニタリング及び薬理学的プロファイリングのため、また輸送制御因子の特定のために開発した。これらのセンサーは、所定の細胞局在における、または所定の細胞区画における、受容体と比べた供与体の濃度または密度の変化に依存しており、これは（多くの場合に従来のＢＲＥＴアッセイに当てはまる）直接的なタンパク質間相互作用と無関係に、調節因子によって促進され、異なる細胞局在／区画における大部分のタンパク質輸送にとって、更に応用性及び適応性がある。代表的なＲＬｕｃＩＩ／ｒＧＦＰ  ＢＲＥＴ対などのｒｅｎｉｌｌａのＢＲＥＴ対系の使用は、非常に堅牢で再現性のある応答をもたらし、伝統的なＢＲＥＴ１（Ｒｌｕｃ／Ｖｅｎｕｓ）またはＢＲＥＴ２（ＲｌｕｃＩＩ／ＧＦＰ１０）対と比較して約５〜１０倍を超えてダイナミックレンジを増加することが見出された。一般に、シグナルのダイナミックレンジは、Ｒｌｕｃ／Ｖｅｎｕｓ対（ＢＲＥＴ比の０．０４〜０．０８）を使用すると非常に狭く、ＲＬｕｃＩＩ／ＧＦＰ１０対を使用するバイオセンサー型から得られるものに類似している（実施例３及び１２、図２Ａ〜２Ｃ及び１９Ａ〜１９Ｅを参照すること）。この非常に浅いダイナミックレンジは、受容体及びエフェクター輸送における微妙な変化の分析を大きく制限し、アッセイをハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）にとって非効率な感度にする。本明細書に記載されている感度の良いバイオセンサーは、下記のことに有用でありうる。
●細胞表面受容体内部移行及び再循環（すなわち、受容体が内部移行の後に形質膜に戻ること）のリアルタイムモニタリング。このことは、形質膜からの異なる受容体（例えば、ＧＰＣＲ、ＲＴＫ）の除去を確かめること、逆に、エンドサイトーシスを誘発した後、リガンドの除去後にＰＭのＢＲＥＴシグナルの回復を介する受容体の再循環をモニターすることを可能にする。このことは、受容体輸送のエンドサイトーシスの制御、薬理学及び経路特異性の研究も可能にする。
●異なる細胞内区画における受容体及びβ−アレスチン輸送のリアルタイムモニタリング。このことは、受容体（例えば、ＧＰＣＲ）のクラスリン−及びβ−アレスチン依存性内部移行、ならびに再循環エンドソーム（ＥＮＤ）などの、受容体／β−アレスチン複合体の別個の細胞区画への差次的輸送の評価を可能にする。
●受容体（例えば、ＧＰＣＲ）及びβ−アレスチン輸送の薬理学的プロファイリング。これらは、別個の細胞区画への受容体／β−アレスチン複合体の輸送を制御するリガンドの傾向を評価すること、ならびに受容体の初期内部移行及びＰＭでの受容体（例えば、ＧＰＣＲ）の循環の両方に対する薬物の効果をモニターすることを可能にする。
●ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）を介した調節因子の輸送の特定。アッセイは再現性があり、感度が良いので、受容体（例えば、ＧＰＣＲ）及び他のタンパク質輸送の調節因子を特定するハイスループットスクリーニングを可能にする。原理証明は、ＡＴ１Ｒによって及びこの受容体輸送の新たな小分子制御因子の特定によって、またＢ２Ｒ（実施例１７）のような他のＧＰＣＲによって、提供された。
●受容体の発現を救出することができる作用物質（シャペロン）の特定。シャペロンアッセイは、受容体シグナル伝達と無関係であり、大部分は、特定の標的（受容体）の立体配置を安定化する、またはそれに影響を及ぼすリガンドを検出する結合アッセイである。したがって、不偏的なシグナル伝達において、オルソステリック及びアロステリックリガンドをスクリーンする興味深いアッセイである。この結合アッセイを更に使用して、作用物質の「オフターゲット（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）」効果を特定すること、すなわち、特定の標的に対して特定された作用物質が、また、１つ以上の追加の標的と交差反応するかを決定することができる（このことは、作用物質が、本明細書に記載されているバイオセンサーの使用により１つ以上の追加の標的を「救出」するかを決定することによって、評価することができる）。
●受容体へのタンパク質（例えば、アダプターまたはシグナル伝達タンパク質）の動員（例えば、ＧＰＣＲへのβ−アレスチン動員、Ｇタンパク質サブユニットの隔離、受容体活性化を反映する、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）へのＧｒｂ２の動員）のモニタリング／評価。
【００８２】
異なる細胞区画マーカーが、それらの選択区画（例えば、形質膜（ＰＭ）またはエンドソーム（ＥＮＤ））に留まっており、受容体（またはβアレスチン、Ｇタンパク質サブユニット、エフェクターなどの他の標識化タンパク質）のみが、リガンドによる調節（例えば、作動薬刺激、拮抗薬阻害、または薬理学的シャペロン）によって１つの区画から他の区画に移動するので、ＰＭからＥＮＤへの輸送タンパク質の追跡を可能にし、このことは、ＢＲＥＴシグナルの減少（ＰＭ−ｒＧＦＰ／受容体−ＲｌｕｃＩＩアッセイ）及び／または増加（ＥＮＤ−ｒＧＦＰ／受容体−ＲｌｕｃＩＩアッセイ）によってそれぞれ明らかになりうる。加えて、ＰＭ−ｒＧＦＰ／受容体−ＲｌｕｃＩＩ系を使用して、受容体の再循環を、エンドサイトーシス後のリガンド洗い流しによってモニターすることができる。このアッセイは、受容体のエンドサイトーシス／再循環を表することに限定されず、薬理学的シャペロンの特定及び特徴決定（実施例７〜１１を参照すること）にも、エキソサイトーシス及びタンパク質移行過程を評価／モニターすることにも適応可能である。したがって、異なる細胞内区画の間の任意の種類のタンパク質移動（輸送）を、本明細書に記載されているバイオセンサーの使用により高感度で定量的に評価することができる。
【００８３】
また、これらのバイオセンサーを、タンパク質（例えば、受容体、細胞内タンパク質）輸送のみならず、細胞内のタンパク質及び他の生体分子の任意の種類の局所濃度または密度の変化をモニターすることにも適用することができる。このことは、２つの方法で実行することができる。第１には、ｒＧＦＰまたはＲｌｕｃＩＩに特定の細胞内オルガネラまたは細胞区画マーカーで標識されている場合、任意の特定の条件下で異なる細胞内局在化において目的のタンパク質を追跡することが可能でありうる。第２には、本発明のバイオセンサーを適用して、タンパク質の局所濃度または密度、ならびに脂質または他の生体分子（例えば、二次メッセンジャー）の局所密度をモニターすることができる。ＲＬｕｃＩＩ−ｒＧＦＰ対を適用して、ＰＬＣδ１−ＰＨドメインを使用する膜ＰＩ（４，５）Ｐ２生成を検出した（実施例１３、図２０Ａ及びＢ）。基礎状態では、ＰＬＣδ１−ＰＨ−ＲｌｕｃＩＩ及び、ＰＬＣδ１−ＰＨ−ｒＧＦＰ（またはＬｙｎもしくはＣＡＡＸなどのＰＭ標的化部分に融合されたｒＧＦＰ）は、ＰＩ（４，５）Ｐ２が位置するＰＭに局在化し、それによって局所濃度はＢＲＥＴを生成するのに十分に高くなる。ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）が活性化されると、ＰＩ（４，５）Ｐ２は加水分解され、ＰＬＣδ１−ＰＨドメイン標識化ＲｌｕｃＩＩ及びｒＧＦＰは、サイトゾルの中に分散し、ｒＧＦＰ及びＲｌｕｃＩＩの局所濃度を低減し、したがってＢＲＥＴシグナルを低減する。同様に、ＰＫＣδ（Ｃ１ｂ）のＤＡＧ結合ドメインを使用して、ＩＰ３及びＤＡＧへのＰＩＰ２の加水分解を測定してもよい（図２２Ａ及び２３Ａ）。ＤＡＧ富化は、Ｃ１ｂドメインを膜に結合させ、ＢＲＥＴ受容体（例えば、ＰＭ標的部分に連結されている、ｒＧＦＰ）及びＢＲＥＴ供与体（例えば、Ｃ１ｂに連結されている、ＲＬｕｃＩＩ）を互いに近づけて、より高いＢＲＥＴシグナルを誘発する。同じ理論的根拠によって、任意の種類のタンパク質隔離も検出することができる。ある実施形態において、輸送は、受容体内部移行及び／または再循環である。
【００８４】
したがって、第１の態様において、本発明は、目的のタンパク質／ポリペプチドの局在化及び／または輸送を評価するバイオセンサーであって、Ｒｅｎｉｌｌａ緑色蛍光タンパク質（Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰ）またはＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼタンパク質（Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃ）で標識された目的のタンパク質／ポリペプチドを含む第１の構成成分と、Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰまたはＲｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識された細胞区画標的化部分を含む第２の構成成分とを含み、前記目的のタンパク質／ポリペプチドが前記Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰで標識される場合、前記細胞区画標的化部分は、前記Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識され、前記目的のタンパク質／ポリペプチドが前記Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識される場合、前記細胞区画標的化部分は、前記Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰで標識される、バイオセンサーを提供する。
【００８５】
用語「目的のタンパク質／ポリペプチド」は、任意のタンパク質／ポリペプチド（未変性、突然変異、可溶性、もしくは膜結合）、またはそのフラグメント／部分を指し、１つ以上の細胞区画へのその局在化、移行及び／または動員が評価される。目的のタンパク質は、例えば、受容体、受容体刺激によって形質膜へ動員される、または形質膜から隔離されるタンパク質、核に移行するタンパク質などでありうる。ある実施形態において、目的のタンパク質は、受容体（すなわち、形質膜に結合または包埋していることが見出されるタンパク質）である。ある実施形態において、受容体は、リガンド（例えば、作動薬）結合によって内部移行する。ある実施形態において、受容体は、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）である。「ＧＰＣＲ」は、完全長未変性ＧＰＣＲ分子、ならびに突然変異ＧＰＣＲ分子を指す。ＧＰＣＲのリストは、参照により本明細書に組み込まれるＦｏｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ．５７，２７９−２８８、ならびにＧＰＣＲの最新リストは、ＩＵＰＨＡＲ−ＤＢデータベース（Ｈａｒｍａｒ  ＡＪ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）ＩＵＰＨＡＲ−ＤＢ：ｔｈｅ  ＩＵＰＨＡＲ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌｓ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３７（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ６８０−Ｄ６８５；Ｓｈａｒｍａｎ  ＪＬ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）ＩＵＰＨＡＲ−ＤＢ：ｕｐｄａｔｅｄ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｎｅｗ  ｆｅａｔｕｒｅｓ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４１（Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｉｓｓｕｅ）：Ｄ１０８３−８）において入手可能である。
【００８６】
別の実施形態において、受容体は、イオンチャネル、例えば電位開口型イオンチャネル（例えば、ナトリウム、カルシウム、カリウムチャネル）である。イオンチャネルのリストは、ＩＵＰＨＡＲ−ＤＢデータベース（上記の参考文献を参照すること）において入手可能である。
【００８７】
別の実施形態において、目的のタンパク質／ポリペプチドは、アダプタータンパク質（例えば、シグナル伝達アダプタータンパク質）、その変異体／フラグメントである。アダプタータンパク質は、シグナル伝達経路において主要な細胞の補助であるタンパク質であり、タンパク質結合パートナーを一緒に連結し、かつより大きなシグナル伝達複合体の作成を促進する様々なタンパク質結合モジュール（例えば、ＳＨ２及び／またはＳＨ３ドメイン）を含有する。これらのタンパク質は、通常、それ自体あらゆる固有の酵素活性を欠いているが、代わりに、タンパク質複合体の形成を導く、特異的なタンパク質間相互作用を媒介する。アダプタータンパク質の例には、ＭｙＤ８８、Ｇｒｂ２及びＳＨＣ１が含まれる。
【００８８】
別の実施形態において、目的のタンパク質は、β−アレスチン、β−アレスチン変異体またはその活性部分／フラグメント、例えば、β−アレスチン−１（参照配列：アイソフォーム１ではＮＰ＿００４０３２．２、アイソフォーム２ではＮＰ＿０６４６４７．１）またはβ−アレスチン−２（参照配列：アイソフォーム１ではＮＰ＿００４３０４．１、アイソフォーム２ではＮＰ＿９４５３５５．１、アイソフォーム３では  ＮＰ＿００１２４４２５７．１、アイソフォーム４ではＮＰ＿００１２４４２５８．１、アイソフォーム５ではＮＰ＿００１２４４２５９．１及びアイソフォーム６ではＮＰ＿００１２４４２６０．１）である。
【００８９】
別の実施形態において、目的のタンパク質は、Ｇタンパク質サブユニット、Ｇタンパク質サブユニット変異体、またはその活性部分／フラグメント、例えば、Ｇα、Ｇγ、もしくはＧβサブユニットまたはその活性フラグメントである。
【００９０】
したがって、別の態様において、本発明は、Ｇタンパク質及び／またはＧＰＣＲ活性化を評価するバイオセンサーであって、Ｒｅｎｉｌｌａ緑色蛍光タンパク質（Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰ）またはＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼタンパク質（Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃ）で標識されたＧタンパク質サブユニットまたはその活性フラグメントを含む第１の構成成分と、Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰまたはＲｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識されたＰＭ標的化部分を含む第２の構成成分とを含み、前記Ｇタンパク質サブユニットが前記Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰで標識される場合、前記ＰＭ標的化部分は、前記Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識され、前記Ｇタンパク質サブユニットが前記Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識される場合、前記ＰＭ標的化部分は、前記Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰで標識される、バイオセンサーを提供する。
【００９１】
別の態様において、本発明は、ＧＰＣＲリガンドがＧタンパク質サブユニットの活性を調節するかを評価するバイオセンサーであって、Ｒｅｎｉｌｌａ緑色蛍光タンパク質（Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰ）またはＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼタンパク質（Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃ）で標識された前記Ｇタンパク質サブユニットまたはその活性フラグメントを含む第１の構成成分と、Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰまたはＲｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識されたＰＭ標的化部分を含む第２の構成成分とを含み、前記Ｇタンパク質サブユニットが前記Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰで標識される場合、前記ＰＭ標的化部分は、前記Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識され、前記Ｇタンパク質サブユニットが前記Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識される場合、前記ＰＭ標的化部分は、前記Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰで標識される、バイオセンサーを提供する。
【００９２】
ある実施形態において、前記Ｇタンパク質サブユニットまたはその活性フラグメントは、前記Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識され、前記ＰＭ標的化部分は、前記Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰで標識される。ある実施形態において、Ｇタンパク質サブユニットは、Ｇγサブユニット、例えば、Ｇγ１、Ｇγ２、Ｇγ３、Ｇγ４、Ｇγ５、Ｇγ６、Ｇγ７、Ｇγ８、Ｇγ９、Ｇγ１０、Ｇγ１１、Ｇγ１２、またはＧγ１３である。別の実施形態において、Ｇタンパク質サブユニットは、Ｇαサブユニット、例えば、Ｇｑ、Ｇｓ、Ｇｉ１、Ｇｉ２、Ｇｉ３、Ｇｔ−ｃｏｎｅ、Ｇｔ−ｒｏｄ、Ｇｔ−ｇｕｓ、Ｇｚ、ＧｏＡ、ＧｏＢ、Ｇｏｌｆ、Ｇ１１、Ｇ１２、Ｇ１３、Ｇ１４、またはＧ１５／Ｇ１６である。別の実施形態において、Ｇタンパク質サブユニットは、Ｇβ、例えば、Ｇβ１、Ｇβ２、Ｇβ３、Ｇβ４、またはＧβ５（Ｇβ５−ＳもしくはＧβ５−Ｌ）である。
【００９３】
別の実施形態において、目的のタンパク質は、ＤＡＧに結合するタンパク質、またはその活性部分／フラグメント、例えば、ホルボールエステル／ジアシルグリセロール結合ドメイン（ＤＡＧ結合ドメイン）である。ある実施形態において、ＤＡＧ結合ドメインは、ＰＫＣδ（Ｃ１ｂ）のものである。ＤＡＧ結合ドメイン（一般に、Ｃ１ドメインと呼ばれる）を含む他のタンパク質には、例えば、ＡＫＡＰ１３、ＡＲＡＦ、ＡＲＨＧＡＰ２９、ＡＲＨＧＥＦ２、ＢＲＡＦ、ＣＤＣ４２ＢＰＡ、ＣＤＣ４２ＢＰＢ、ＣＤＣ４２ＢＰＧ、ＣＨＮ１、ＣＨＮ２、ＣＩＴ、ＤＧＫＡ、ＤＧＫＢ、ＤＧＫＤ、ＤＧＫＥ、ＤＧＫＧ、ＤＧＫＨ、ＤＧＫＩ、ＤＧＫＫ、ＤＧＫＱ、ＤＧＫＺ、ＧＭＩＰ、ＨＭＨＡ１、ＫＳＲ１、ＫＳＲ２、ＭＹＯ９Ａ、ＭＹＯ９Ｂ、ＰＤＺＤ８、ＰＲＫＣＡ、ＰＲＫＣＢ１、ＰＲＫＣＤ、ＰＲＫＣＥ、ＰＲＫＣＧ、ＰＲＫＣＨ、ＰＲＫＣＩ、ＰＲＫＣＮ、ＰＲＫＣＱ、ＰＲＫＣＺ、ＰＲＫＤ１、ＰＲＫＤ２、ＰＲＫＤ３、ＲＡＣＧＡＰ１、ＲＡＦ１、ＲＡＳＧＲＰ、ＲＡＳＧＲＰ１、ＲＡＳＧＲＰ２、ＲＡＳＧＲＰ３、ＲＡＳＧＲＰ４、ＲＡＳＳＦ１、ＲＡＳＳＦ５、ＲＯＣＫ１、ＲＯＣＫ２、ＳＴＡＣ、ＳＴＡＣ２、ＳＴＡＣ３、ＴＥＮＣ１、ＵＮＣ１３Ａ、ＵＮＣ１３Ｂ、ＵＮＣ１３Ｃ、ＶＡＶ１、ＶＡＶ２及びＶＡＶ３が含まれる。
【００９４】
別の実施形態において、目的のタンパク質は、ＰＬＣδ１、またはＰＩ（４，５）Ｐ２に結合することができるその活性部分／フラグメント、例えばＰＬＣδ１のプレクストリン相同（ＰＨ）ドメインである。
【００９５】
別の実施形態において、目的のタンパク質は、低分子ＧＴＰアーゼに結合するタンパク質（Ｅｘｐａｓｙ  ＥＮＺＹＭＥエントリー：ＥＣ  ３．６．５．２）である。低分子ＧＴＰアーゼは、Ｇタンパク質のαサブユニットの遠縁である、分子質量２１ｋＤａを有する約５０個の酵素のファミリーであり、細胞増殖制御（Ｒａｓサブファミリー）、膜小胞輸送及び脱殻（ｕｎｃｏａｔｉｎｇ）（Ｒａｂ及びＡＲＦサブファミリー）、核タンパク質移入（Ｒａｎサブファミリー）、ならびに細胞骨格の組織化（Ｒｈｏ及びＲａｃサブファミリー）に関与する。ある実施形態において、目的のタンパク質は、低分子ＧＴＰアーゼのＲａｓスーパーファミリーの１つ以上のメンバー、例えば、ＧＴＰアーゼのＲａｓ、Ｒｈｏ、Ｒａｎ、Ｒａｂ及びＡｒｆのファミリーに結合するタンパク質である。そのような低分子ＧＴＰアーゼの局在化／移行は、Ｒａｓ結合ドメイン（ＲＢＤ）を含むポリペプチド、例えば、ＲＡＦ１のＲＢＤまたは、Ａ８５Ｋ置換を含むその変異体（Ｒａｓにより高い親和性を有する）の使用により、評価することができる。ＲＢＤを含む他のタンパク質には、ＡＲＡＦ、ＢＲＡＦ、ＲＧＳ１２、ＲＧＳ１４、ＴＩＡＭ１及びＰＩ３Ｋが含まれる。したがって目的のタンパク質は、低分子ＧＴＰアーゼに結合するタンパク質、または低分子ＧＴＰアーゼに結合する能力を維持するそのフラグメントの変異体の全て／未変性の配列を含んでもよい。
【００９６】
更なる実施形態において、目的のタンパク質は、低分子ＧＴＰアーゼのＲｈｏスーパーファミリーの１つ以上のメンバー、Ｒｈｏ（Ａ、Ｂ及びＣ）、Ｒａｃ（Ｒａｃ１、２、３、もしくはＲｈｏＧ）、またはＣｄｃ４２（Ｃｄｃ４２、ＲｈｏＱ、もしくはＲｈｏＪ）に結合するタンパク質である。別の実施形態において、目的のタンパク質は、Ｒｈｏタンパク質（ＲｈｏＡ、ＲｈｏＢ及び／もしくはＲｈｏＣ、好ましくはＲｈｏＡ）、またはその活性フラグメント、例えば、Ｃｄｃ４２／Ｒａｃ相互作用的結合（ＣＲＩＢ）ドメインに結合するタンパク質である。ＣＲＩＢドメイン（ＥＭＢＬ−ＥＢＩ／Ｉｎｔｅｒｐｒｏ受入番号ＩＰＲ００００９５）は、低分子ＧＴＰアーゼの多くの推定下流エフェクター（例えば、Ｃｄｃ４２ｐ−及び／またはＲｈｏ様低分子ＧＴＰアーゼ）に存在し、かつ約１５〜１６個のアミノ酸を含む、ＧＴＰアーゼ結合ドメイン（ＧＢＤ、ｐ２１結合ドメイン、ＰＢＤとも呼ばれる）のＮ末端部分内の保存領域である。ＣＲＩＢドメインを含むタンパク質には、哺乳類活性化Ｃｄｃ４２関連キナーゼ（ＡＣＫ）、哺乳類ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ１〜ＰＡＫ４）、Ｒｈｏｔｅｋｉｎ（ＲＴＫＮ）、哺乳類ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳＰ）、セリン／トレオニンタンパク質キナーゼＮ（ＰＫＮ、タンパク質キナーゼＣ関連キナーゼ、ＰＲＫとも呼ばれる）などのタンパク質キナーゼＣスーパーファミリーのキナーゼが含まれる。ある実施形態において、目的のタンパク質は、ヒトＰＫＮ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ参照：Ｑ１６５１２−１）またはＰＫＮ２（Ｕｎｉｐｒｏｔ参照：Ｑ１６５１３）、好ましくはＰＫＮ１のＣＲＩＢドメインを含む。ヒトＰＫＮ１のＣＲＩＢドメインは、配列ＶＱＳＥＰＲＳＷＳＬＬＥＱＬＧ（配列番号４０）を含み、これは未変性ヒトＰＫＮ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ参照：Ｑ１６５１２−１）の残基６〜２０に相当する。
【００９７】
したがって、別の態様において、本発明は、低分子ＧＴＰアーゼ（例えば、Ｒｈｏ）の活性化を評価するバイオセンサーであって、Ｒｅｎｉｌｌａ緑色蛍光タンパク質（Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰ）またはＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼタンパク質（Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃ）で標識された前記低分子ＧＴＰアーゼに結合するドメイン（例えば、ＣＲＩＢドメイン）を含むポリペプチドを含む第１の構成成分と、Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰまたはＲｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識されたＰＭまたはエンドソーム標的化部分を含む第２の構成成分とを含み、前記低分子ＧＴＰアーゼに結合するドメイン（例えば、ＣＲＩＢドメイン）を含む前記ポリペプチドが前記Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰで標識される場合、ＰＭまたはエンドソーム標的化部分は、前記Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識され、前記低分子ＧＴＰアーゼに結合するドメイン（例えば、ＣＲＩＢドメイン）を含む前記ポリペプチドが前記Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識される場合、前記ＰＭまたはエンドソーム標的化部分は、前記Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰで標識される、バイオセンサーを提供する。ある実施形態において、低分子ＧＴＰアーゼは、Ｒｈｏタンパク質（例えば、ＲｈｏＡ）である。ある実施形態において、低分子ＧＴＰアーゼに結合するドメインは、ヒトＰＫＮ１のＣＲＩＢドメインなどのＣＲＩＢドメインである。ある実施形態において、第２の構成成分は、ＰＭ標的化部分を含む。
【００９８】
Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼという用語は、本明細書において使用されるとき、生物発光に使用され、かつＲｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓまたはＲｅｎｉｌｌａ  ｍｕｌｌｅｒｉなどのＲｅｎｉｌｌａ属の生物体から誘導される、酸化酵素を指す。Ｒｅｎｉｌｌａ生物体またはその変異体からの未変性ルシフェラーゼ、例えば、Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）の未変性形態（アミノ酸配列に関して）が、またはＲｌｕｃＩＩもしくはＲｌｕｃ８などのその変異体が含まれる。用語「ＲｌｕｃＩＩ」は、未変性Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼに対して以下のアミノ酸置換：Ａ５５Ｔ、Ｃ１２４Ａ及びＭ１８５Ｖを含む、Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼの変異形態を指す。ある実施形態において、ＲｌｕｃＩＩは、実施例１に描写されている配列（配列番号１０）を含む。用語「Ｒｌｕｃ８」は、未変性Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼに対して以下のアミノ酸置換：Ａ５５Ｔ、Ｃ１２４Ａ、Ｓ１３０Ａ、Ｋ１３６Ｒ、Ａ１４３Ｍ、Ｍ１８５Ｖ、Ｍ２５３Ｌ及びＳ２８７Ｌを含む、Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼの変異形態を指す。未変性Ｒｅｎｉｌｌａ  ｍｕｌｌｅｒｉルシフェラーゼのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＧ５４０９４．１によって開示されている。
【００９９】
用語「Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰ」は、Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓまたはＲｅｎｉｌｌａ  ｍｕｌｌｅｒｉなどのＲｅｎｉｌｌａ属の生物体から誘導される、緑色蛍光タンパク質を指す。Ｒｅｎｉｌｌａ生物体からの未変性ＧＦＰ、またはその変異体が含まれる。ある実施形態において、Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰはＲｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＧＦＰ（本明細書において、「ｒＧＦＰ」と呼ばれる）であり、更なる実施形態において、Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＧＦＰの未変性形態（アミノ酸配列に関して）である。ある実施形態において、ｒＧＦＰは、実施例１に描写されている配列（配列番号１１）を含む。未変性Ｒｅｎｉｌｌａ  ｍｕｌｌｅｒｉ  ＧＦＰのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＧ５４０９８．１によって開示されている。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ及び／またはＲｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰの核酸配列は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されうる（すなわち、「ヒト化」であり、例えばヒト化型のＲｅｎｉｌｌａ  ｍｕｌｌｅｒｉ  ＧＦＰについては、ＷＯ２００２０５７４５１を参照すること）。
【０１００】
共鳴エネルギー転移（ＲＥＴと略される）は、重複する発光／吸収スペクトルを有する、２つの発色団の間のエネルギー転移を表す機構である。２つの発色団（「供与体」と「受容体」）が互いに短い距離（例えば、１０〜１００オングストローム）の範囲内にあり、これらの遷移双極子が適切に配向されている場合、供与体発光団は、その励起状態エネルギーを、非放射性双極子間カップリングを介して受容体発光団に転移することができる。生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）は、供与体生物発光団（ｂｉｏｌｕｍｉｎｏｐｈｏｒｅ）（ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼなどの生物発光酵素）及び受容体蛍光団（例えば、ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰ）の間の非放射性エネルギー転移に基づいている。
【０１０１】
用語「細胞区画標的化部分」は、Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰまたはＲｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃ（例えば、融合タンパク質など）に結合したとき、これらを、例えば、形質膜（または脂質ラフトなどの形質膜の特定のサブドメイン）、エンドソーム（例えば、初期及び／または後期エンドソーム）、リソソーム、ファゴソーム、リボソーム、ミトコンドリア、小胞体、ゴルジ装置、核などの、細胞内の特定の区画、オルガネラまたは局在に向かわせ、それによって、Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰまたはＲｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃの有効濃度を増加する、生体分子、好ましくはポリペプチドまたはペプチドを指す。そのようなマーカーは、典型的には、標的にされた特定の区画において高いレベルで通常見出される、タンパク質（またはその適切なフラグメント）である。タンパク質を、細胞内の特定の区画、オルガネラ、または局在に向かわせるペプチドは、当該技術において知られており、例えば、小胞体（ＥＲ）シグナルペプチド、またはＥＲ回収配列、核局在化シグナル（ＮＬＳ）ペプチド及びミトコンドリア局在化シグナル（ＭＬＳ）ペプチドが含まれる。
【０１０２】
ある実施形態において、細胞区画標的化部分は、形質膜（ＰＭ）標的化部分である。Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰまたはＲｅｎｉｌｌａ  ＬｕｃをＰＭへ動員することができる任意の部分を、バイオセンサーに使用することができる。したがって、Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰまたはＲｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃを、形質膜において見出される任意のタンパク質（例えば、受容体、もしくはＰＭにおいて見出される任意の他のタンパク質）、またはそのフラグメントに融合させてもよい。そのようなタンパク質の例は、カベオリン−１であり、これは、多くの細胞型において見出されるカベオラ（形質膜の小さな（５０〜１００ｎｍ）陥入に相当する一種の脂質ラフト）の主要な構成成分である。ＣＡＶ１遺伝子の選択的スプライシングにより生成される、カベオリン−１の２つのアイソフォームが特定されており、カベオリン−１α（残基２〜１７８を含む）及びカベオリン−１β（３２〜１７８配列に相当する）である。そのような部分の他の例には、ミリストイル化、パルミトイル化及びプレニル化、ならびに多塩基ドメインなどの、タンパク質脂質化／脂肪酸アシル化のためのシグナル配列を含むペプチド／ポリペプチドが含まれる。いくつかのタンパク質は、ミリストイル化、パルミトイル化及び／またはプレニル化されることが知られており（例えば、Ｙｅｓ、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ、Ｌｃｋ、Ｈｃｋ、Ｆｇｒなどのタンパク質キナーゼ及びホスファターゼ、Ｇαタンパク質、一酸化窒素シンターゼ、ＡＤＰリボシル化因子（ＡＲＦ）、カルシウム結合タンパク質、及びＭＡＲＣＫＳなどの膜または細胞骨格関連構造タンパク質（例えば、Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．Ｍａｒ  ２０１０；３（１）：１９−３５；Ａｌｃａｒｔ−Ｒａｍｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（ＢＢＡ）−Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  １８０８，Ｉｓｓｕｅ  １２，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０１１，Ｐａｇｅｓ  ２９８１−２９９４を参照すること）、したがって、これらのタンパク質のいずれかのミリストイル化、パルミトイル化及びプレニル化シグナル配列をバイオセンサーに使用することができる。ある実施形態において、ミリストイル化及び／またはパルミトイル化配列は、Ｌｙｎキナーゼのものである。
【０１０３】
【数１】
0006708633.tif 000002
【０１０４】
【数２】
0006708633.tif 000003
【０１０５】
【数３】
0006708633.tif 000004
【０１０６】
特定の態様において、本発明は、（ｉ）Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰまたはＲｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識されたβ−アレスチンを含む第１の構成成分と、（ｉｉ）Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰまたはＲｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識された形質膜（ＰＭ）標的化部分及びＧＰＣＲを含む第２の構成成分とを含む細胞または膜調製物を含み、前記β−アレスチンが前記Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰで標識される場合、前記ＰＭ標的化部分は前記Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識され、前記β−アレスチンが前記Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識される場合、前記ＰＭ標的化部分は前記Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰで標識される、バイオセンサーを提供する。そのようなバイオセンサーは、形質膜に位置するＧＰＣＲへのβ−アレスチンの動員をモニター／測定することに有用でありうる。
【０１０７】
ある実施形態において、細胞区画標的化部分は、エンドソーム標的化部分である。いくつかのエンドソーム標的化部分／マーカーが当該技術において知られており、タンパク質のＲａｂファミリー（ＲＡＢ４、ＲＡＢ５、ＲＡＢ７、ＲＡＢ９及びＲＡＢ１１）、マンノース６−リン酸受容体（Ｍ６ＰＲ）、カベオリン−１及び−２、トランスフェリン及びその受容体、クラスリン、ならびに初期エンドソーム自己抗原１（ＥＥＡ１）、Ｒａｂｅｎｏｓｙｎ−５、受容体活性化のＳｍａｄアンカー（ａｎｃｈｏｒ）（ＳＡＲＡ）、Ｖｐｓ２７ｐ及びＥｎｄｏｆｉｎなどのＦＹＶＥドメインを含むタンパク質が含まれる。いくつかのマーカーは、初期エンドソーム（例えば、ＲＡＢ４、トランスフェリン及びその受容体、ならびにＦＹＶＥドメインを含むタンパク質）に対してより特異的であり、他のものは、後期エンドソーム（例えば、ＲＡＢ７、ＲＡＢ９及びＭ６ＰＲ）に対してより特異的であり、他のものは、再循環エンドソーム（例えば、ＲＡＢ１１、ＲＡＢ４）に対してより特異的である。したがって、これらのタンパク質またはその適切なフラグメントをＲｅｎｉｌｌａ  ＬｕｃまたはＲｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰに融合して、これらを、エンドソーム局在化に関連付ける／向けることができる。
【０１０８】
ある実施形態において、エンドソーム標的化部分は、ＦＹＶＥドメインを含む。ＦＹＶＥドメインは、３つの保存要素であるＮ末端のＷｘｘＤ、中央のＲＲ／ＫＨＨＣＲ及びＣ末端のＲＶＣモチーフにより定義される。ある実施形態において、エンドソーム標的化部分は、ＥｎｄｏｆｉｎのＦＹＶＥドメイン、例えば、ヒトＥｎｄｏｆｉｎの残基のおよそ７３９から８０６を含む。
【０１０９】
ある実施形態において、細胞区画標的化部分は、例えば、ＬＡＭＰ１及びＬＡＭＰ２などのリソソーム標的化部分である。したがって、これらのタンパク質またはその適切なフラグメントをＲｅｎｉｌｌａ  ＬｕｃまたはＲｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰに融合して、これらを、リソソーム局在化に関連付ける／向けることができる。
【０１１０】
ある実施形態において、細胞区画標的化部分は、例えば、ＰＭＰ７０、ＰＸＭＰ２及びカタラーゼなどのペルオキシソーム標的化部分である。したがって、これらのタンパク質またはその適切なフラグメントをＲｅｎｉｌｌａ  ＬｕｃまたはＲｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰに融合して、これらを、ペルオキシソーム局在化に関連付ける／向けることができる。
【０１１１】
ある実施形態において、細胞区画標的化領域は、例えば、ＡＴＧ（ＡｕＴｏｐｈａＧｙ関連）ファミリータンパク質（ＡＴＧ４、ＡＴＧ５、ＡＴＧ１６、ＡＴＧ１２、Ｌａｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １４，７５９−７７４（２０１３）を参照すること）、ＬＣ３Ａ／Ｂ及びＳＱＳＴＭ１／ｐ６２などのオートファゴソーム標的化部分である。したがって、これらのタンパク質またはその適切なフラグメントをＲｅｎｉｌｌａ  ＬｕｃまたはＲｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰに融合して、これらを、オートファゴソーム局在化に関連付ける／向けることができる。
【０１１２】
ある実施形態において、細胞区画標的化部分は、リボソーム標的化部分である。いくつかのエンドソーム標的化部分／マーカーが、当該技術において知られており、リボソームタンパク質（Ｌ７ａ、Ｓ３及びＳ６）が含まれる。したがって、これらのタンパク質またはその適切なフラグメントをＲｅｎｉｌｌａ  ＬｕｃまたはＲｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰに融合して、これらを、リボソーム局在化に関連付ける／向けることができる。
【０１１３】
ある実施形態において、細胞区画標的化部分は、小胞体（ＥＲ）標的化部分である。いくつかのＥＲ標的化部分／マーカーが、当該技術において知られており、ＥＲｐ７２、ＥＲｐ２９、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、ＧＲＰ７８（ＨＳＰＡ５）、ＧＲＰ９４（ＨＳＰ９０Ｂ１）及びＧＲＰ５８（ＰＤＩＡ３）などのＨＳＰ７０ファミリータンパク質、カルネキシン及びカルレティキュリンが含まれる。したがって、これらのタンパク質またはその適切なフラグメントをＲｅｎｉｌｌａ  ＬｕｃまたはＲｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰに融合して、これらを、ＥＲ局在化に関連付ける／向けることができる。
【０１１４】
ある実施形態において、細胞区画標的化部分は、ゴルジ標的化部分である。いくつかのゴルジ標的化部分／マーカーが、当該技術において知られており、ｅＮＯＳ（例えば、そのＮ末端部分、Ｊ．Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５（１９９６），ｐｐ．１３２７７−１３２８１）、ＧＭ１３０、Ｇｏｌｇｉｎ−９７、５８Ｋタンパク質、トランスゴルジネットワーク膜タンパク質２（ＴＧＯＬＮ２）、ＴＧＮ４６、ＴＧＮ３８、マンノシダーゼ２、シンタキシン６、ＧＭ１３０（ＧＯＬＧＡ２）、Ｇｏｌｇｉｎ−１６０、Ｍｅｍｂｒｉｎ  （ＧＳ２７）、ＧＳ２８、コートマー（Ｃｏａｔｏｍｅｒ）タンパク質、Ｒｂｅｔ１及びＲＣＡＳ１が含まれる。したがって、これらのタンパク質またはその適切なフラグメントをＲｅｎｉｌｌａ  ＬｕｃまたはＲｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰに融合して、これらを、ゴルジ装置局在化に関連付ける／向けることができる。ある実施形態において、ゴルジ標的化部分は、ヒトｅＮＯＳタンパク質のＮ末端部分、例えば、ヒトｅＮＯＳ１の残基１〜７３（配列番号４２）。
【０１１５】
ある実施形態において、細胞区画標的化部分は、ミトコンドリア標的化部分である。いくつかのミトコンドリア標的化部分／マーカーが、当該技術において知られており、ＡＩＦ、ＣＯＸ  ＩＶ、チトクロムＣ、ヘキソキナーゼＩ、ＳＯＤ１、ＳＤＨＡ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ＶＤＡＣ、ＴＯＭＭ２２、ＵＣＰ１、ＵＣＰ２、ＵＣＰ３、ＰＨＢ１  Ｇａｌｐｈａ１２（またはそのＮ末端、Ａｎｄｒｅｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２００８  Ａｕｇ；２２（８）：２８２１−３１．Ｅｐｕｂ  ２００８  Ｍａｒ  ２６）、Ｂｃｌファミリーメンバーのタンパク質またはそのフラグメント、例えば、Ｂｃｌ−ＸＬ（ＲＫＧＱＥＲＦＮＲＷＦＬＴＧＭＴＶＡＧＶＶＬＬＧＳＬＦＳＲＫ、配列番号８７、Ｍｏｓｓａｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ．２０１２  Ｍａｙ  ７；９（５）：１４４９−１４５８）のフラグメントが含まれる。したがって、これらのタンパク質またはその適切なフラグメントをＲｅｎｉｌｌａ  ＬｕｃまたはｒＧＦＰに融合して、これらを、ミトコンドリア局在化に関連付ける／向けることができる。核標的化部分は、新たに合成されたタンパク質をミトコンドリアに向ける１０〜７０アミノ酸長のペプチドであるミトコンドリア標的化シグナルも、含むことができる。これはＮ末端において見出され、疎水性及び陽性荷電アミノ酸の交互パターンからなり、両親媒性ヘリックスを形成する。ミトコンドリア標的化シグナルは、続いてタンパク質をミトコンドリアマトリックスなどのミトコンドリアの異なる領域に向ける、追加のシグナルを含有することができる。
【０１１６】
ある実施形態において、細胞区画標的化部分は、核標的化部分である。いくつかの核標的化部分／マーカーが、当該技術において知られており、ラミンＡ／Ｃ、ヌクレオポリン（ＮＵＰ）、ＡＳＨＬ２、ＥＳＥＴ、ヒストン、ＬＳＤ１、ＰＡＲＰなどのＤＮＡ修復酵素及びＰ８４／ＴＨＯＣ１が含まれる。したがって、これらのタンパク質またはその適切なフラグメントをＲｅｎｉｌｌａ  ＬｕｃまたはＲｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰに融合して、これらを、核局在化に関連付ける／向けることができる。核標的化部分は、核局在化シグナルまたは配列（ＮＬＳ）を含むこともでき、これは、核移送により細胞核に移入されるタンパク質を標識するアミノ酸配列である。典型的には、このシグナルは、タンパク質表面に曝露された陽性荷電リシンまたはアルギニンの１つ以上の短配列からなる。最適に特徴決定された移送シグナルは、核内タンパク質移入のための伝統的なＮＬＳ（ｃＮＬＳ）であり、これは、塩基性アミノ酸の１つ（単一部分（ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ））または２つ（二部分）の区間からなる。単一部分ｃＮＬＳは、ＳＶ４０大型Ｔ抗原ＮＬＳ（１２６ＰＫＫＫＲＲＶ１３２）（配列番号３８）により例示され、二部分ｃＮＬＳは、ヌクレオプラスミンＮＬＳ（１５５ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ１７０）（配列番号３９）により例示される。
【０１１７】
ある実施形態において、細胞区画標的化部分は、核外搬出配列（ＮＥＳ）である。ＮＥＳは、核移送の使用により核膜孔複合体を介して細胞核から細胞質に搬出されるように向けられるタンパク質における、短アミノ酸配列（典型的には、４個の疎水性残基）である。そのようなＮＥＳの配列は、例えばＬｘｘｘＬｘｘＬｘＬであり、ここで、「Ｌ」は疎水性残基（多くの場合、ロイシン）であり、「ｘ」は任意の他のアミノ酸である。サイトゾルから核に移行するタンパク質（例えば、ＥＲＫまたはＭＤＭ２）において、ＢＲＥＴシグナルの減少は、ＮＥＳ部分の使用によって検出される。
【０１１８】
ある実施形態において、細胞区画標的化部分は、細胞骨格標的化部分、例えば、アクチンもしくはそのフラグメント、またはイノシトール−１，４，５−トリスホスフェート−３−キナーゼ−Ａ（ＩＴＰＫＡ）のＮ末端Ｆ−アクチン結合ドメインなどのアクチン結合ドメイン（ＡＢＤ）を含むタンパク質である（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｌｌ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １５，２００９  ｖｏｌ．２０  ｎｏ．２４  ５１６６−５１８０）。ある実施形態において、細胞骨格標的化部分は、配列：ＭＧＶＡＤＬＩＫＫＦＥＳＩＳＫＥＥ（配列番号８８）を含むペプチドである（“Ｌｉｆｅａｃｔ”，Ｒｉｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００８  Ｊｕｌ；５（７）：６０５）。
【０１１９】
別の態様において、本発明は、第１及び第２の条件間の細胞区画における生体分子の量の調節（増加または減少）を評価するバイオセンサーであって、前記生体分子に結合するタンパク質マーカーで標識されたＲｅｎｉｌｌａ緑色蛍光タンパク質（Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰ）を含む第１の構成成分と、前記タンパク質マーカーで標識されたＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼタンパク質（Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃ）を含む第２の構成成分とを含むバイオセンサーを提供する。
【０１２０】
別の態様において、本発明は、第１及び第２の条件間の細胞区画における生体分子の量の調節（増加または減少）を評価するバイオセンサーであって、Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰまたはＲｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識された前記生体分子に結合するタンパク質マーカーを含む第１の構成成分と、Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰまたはＲｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識された細胞区画標的化部分を含む第２の構成成分とを含み、前記タンパク質マーカーがＲｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰで標識される場合、前記細胞区画標的化部分は、Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識され、その逆も同様である、バイオセンサーを提供する。
【０１２１】
そのようなバイオセンサーを、第１及び第２の条件間の、例えば、作用物質の存在下または不在下での細胞区画における生体分子の量の調節を評価する方法に使用することができる。作用物質が細胞区画（例えば、ＰＭ）において生体分子の量を増加する場合、ＢＲＥＴシグナルは、作用物質の存在下で増加し、その逆も同様である。
【０１２２】
タンパク質マーカーは、前記生体分子に結合する任意のタンパク質またはそのフラグメントであってもよく、したがって、前記細胞区画におけるその濃度または密度は、前記細胞区画における前記生体分子（例えば、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰなどの環状ヌクレオチド、ＩＰ３、ＤＡＧ、ＰＩＰ３、Ｃａ２＋イオンを含む二次メッセンジャー）の濃度または密度によって左右される。例えば、ＰＭにおけるＰＬＣδ１局在化は、ＰＩＰ２及び／またはＰＩＰ３の存在によって左右される。ＰＭにおけるＰＩ（４，５）Ｐ２の濃度が減少する場合（ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）がＰＩ（４，５）Ｐ２の加水分解のために活性化されるときに生じる）、ＰＬＣδ１は、サイトゾルに拡散して、ＰＭにおけるその濃度／密度を低減する。したがって、Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃ及びＲｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰ標識化ＰＬＣδ１（もしくはそのフラグメント、例えば、配列番号２５）により、またはＲｅｎｉｌｌａ  ＬｕｃもしくはＲｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰ標識化ＰＬＣδ１及びＲｅｎｉｌｌａ  ＬｕｃもしくはＧＦＰ標識化ＰＭ標的化部分を使用してＢＲＥＴにより測定されうる、ＰＭにおけるＰＬＣδ１（または、ＰＨドメインなどの、ＰＩＰ２及び／またはＰＩＰ３に結合するそのフラグメント）の濃度を、ＰＭにおける生体分子の濃度または密度の指標として使用してもよい。同様に、特定のタンパク質のＰＨドメイン及びＰｈｏｘ相同ドメイン（ＰＸドメイン）（例えば、ａｋｔ及びＰＬＤ１）は、ＰＩＰ３と相互作用し、したがって、ＰＩＰ３結合に選択性があるＰＨまたはＰＸドメインを含むタンパク質マーカーを、ＰＭにおけるＰＩＰ３の濃度または密度の指標として使用することができる。別の例は、Ｃ１ドメイン（ホルボールエステル／ジアシルグリセロール結合ドメインとしても知られている）であり、例えば、タンパク質キナーゼのＮ末端部分に見出される。また、ＰＬＣγ１は、ＰＩＰ３を含む異なるリン脂質に結合することができる。Ｃ１ドメインは、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）に結合し、したがってＣ１ドメインを含むタンパク質マーカーを、ＰＭにおけるＤＡＧの濃度または密度の指標として使用することができる。したがって、二次メッセンジャーなどの生体分子に結合することができ、前記細胞区画におけるその濃度または密度が前記生体分子の濃度または密度によって左右される任意のタンパク質またはタンパク質ドメインを、そのようなバイオセンサーに使用することができる。
【０１２３】
用語「生体分子」は、細胞により産生されうる、または細胞に存在しうる任意の分子、例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）、脂質もしくは脂肪酸、リン脂質、糖（多糖）、またはＡＴＰ、ＡＭＰ、ＡＤＰ、ヒスタミンなどの任意の他の化合物を指す。ある実施形態において、生体分子は、二次メッセンジャー（すなわち、細胞表面の受容体で受け取るシグナルをサイトゾル及び／または核中の標的分子に伝達する分子）、例えば、環状ＡＭＰ、環状ＧＭＰ、イノシトール三リン酸（ＩＰ３）、ホスファチジルイノシトール（例えば、ホスファチジルイノシトール４，５−ビスホスフェートまたはＰＩＰ２、ホスファチジルイノシトール３，４，５−トリホスフェートまたはＰＩＰ３）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、Ｃａ２＋である。ある実施形態において、生体分子は、ジアシルグリセロール及びホスファチジルイノシトールなどのＰＭに見出される疎水性分子（例えば、リン脂質）である。
【０１２４】
変異体は、本明細書において使用されるとき、参照（例えば、未変性）配列に少なくとも６０％の同一性または類似性を有し、その所望の活性、例えば、標的タンパク質に結合する及び／または細胞区画に移行する能力を保持する、タンパク質／ポリペプチドを指す。更なる実施形態において、変異体は、参照（例えば、未変性）配列に少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の類似性または同一性を有し、その所望の活性を保持する。「類似性」及び「同一性」は、２つのポリペプチド分子間の配列類似性／同一性を指す。類似性または同一性は、整列された配列におけるそれぞれの位置を比較することによって決定することができる。アミノ酸配列間の類似性または同一性の程度は、配列により共有される位置での整合または同一アミノ酸の数の関数である。類似性または同一性の比較にとって配列の最適な整列は、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ  ２：４８２の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性整合アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似性検索方法及びこれらのアルゴリズムのコンピューター処理（例えば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．によるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）などの様々なアルゴリズムを使用して実施することができる。配列類似性または同一性は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して（公表された初期設定を使用して）決定することもできる。ＢＬＡＳＴ分析を実施するソフトウエアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｗｅｂ  ｓｉｔｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を介して入手することができる。
【０１２５】
Ｒｅｎｉｌｌａ  ＬｕｃまたはＲｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰを、細胞区画標的化部分のＮ末端、内部、またはＣ末端に融合させることができる。ある実施形態において、細胞区画標的化部分は、ＰＭ標的化部分であり、前記Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃまたは前記Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰのＮ末端の端部に融合されている。ある実施形態において、細胞区画標的化部分は、エンドソーム標的化部分であり、前記Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃまたは前記Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰのＣ末端の端部に融合されている。
【０１２６】
Ｒｅｎｉｌｌａ  ＬｕｃまたはＲｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰを、目的タンパク質のＮ末端、内部（例えば、実施例に記載されている内部ＲｌｕｃＩＩを有するＧαサブユニットを参照すること）、またはＣ末端に融合させることができる。ある実施形態において、Ｒｅｎｉｌｌａ  ＬｕｃまたはＲｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰは、目的のタンパク質のＮ末端の端部に融合している。別の実施形態において、Ｒｅｎｉｌｌａ  ＬｕｃまたはＲｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰは、目的のタンパク質のＣ末端の端部に融合している。
【０１２７】
ある実施形態において、目的のタンパク質はＲｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識され、細胞区画マーカーはＲｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰで標識されている。
【０１２８】
他のドメインまたはリンカーが、上記の第１及び／または第２の構成成分のＮ末端、Ｃ末端、または内部に存在してもよい。ある実施形態において、Ｒｅｎｉｌｌａ  ＬｕｃまたはＲｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰは、目的のタンパク質または細胞区画標的化部分に、直接的（例えば、ペプチド結合を介して）、または適切なリンカー部分、例えば、１個以上のアミノ酸のリンカー（例えば、ポリグリシンリンカー）、もしくは別の種類の化学リンカー（例えば、炭水化物リンカー、脂質リンカー、脂肪酸リンカー、ポリエーテルリンカー、ＰＥＧなど）を介して「間接的」に、共有結合的に連結されうる。ある実施形態において、１つ以上の追加のドメイン（複数可）を、上記に定義された構成成分の前（Ｎ末端）、その間、または後ろ（Ｃ末端）に挿入することができる。ある実施形態において、Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃ及び／またはＲｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰは、ペプチド結合を介して、目的のタンパク質及び／または細胞区画標的化部分に共有結合的に連結されている。ある実施形態において、ペプチドリンカーは、Ｒｅｎｉｌｌａ  ＬｕｃまたはＲｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰと、目的のタンパク質または細胞区画標的化部分との間に存在する。ある実施形態において、リンカーは、約４〜約５０個のアミノ酸、約４〜約４０、３０、もしくは２０個のアミノ酸、または約５〜約１５個のアミノ酸、例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０個のアミノ酸を含む。更なる実施形態において、リンカーは、下記の実施例１及び／または図１１Ａ〜１１Ｄに記載されているリンカーのうちの１つである。
【０１２９】
ある実施形態において、第１及び第２の構成成分は、一緒に連結されて、単分子バイオセンサーをもたらす。第１及び第２の構成成分は、リンカーにより、好ましくは可動性ポリペプチドリンカーにより共有結合する。ある実施形態において、可動性ポリペプチドリンカーは、約５０個から約５００〜１０００個のアミノ酸のランダムアミノ酸配列の長さに相当する、例えば、約１００個から約４００〜５００個のアミノ酸、好ましくは約２００〜４００個のアミノ酸、例えば約３００個のランダムアミノ酸配列の長さに相当する長さを有する。更なる実施形態において、可動性リンカーは、約５０個から約５００〜１０００個のアミノ酸のランダムアミノ酸配列、例えば、約１００個から約４００〜５００個のアミノ酸、好ましくは約２００〜４００個のアミノ酸、例えば約３００個のアミノ酸のランダムアミノ酸配列を含む。可動性アミノ酸リンカー、より詳細には最小限の球状及び最大限の不規則性を有するリンカーを設計する方法は、当該技術において知られている。これは、例えばＧｌｏｂｐｌｏｔ  ２．３プログラムを使用して達成することができる。配列を更に最適化して、推定凝集ホットスポット、局在化ドメイン、ならびに／または相互作用及びリン酸化モチーフを排除することができる。そのような単分子バイオセンサーは、無傷の細胞、ならびに膜調製物においてＢＲＥＴの評価を可能にする。
【０１３０】
別の実施形態において、本発明は、上記に定義された第１及び／または第２の構成成分（複数可）をコードする核酸を提供する。ある実施形態において、核酸は、ベクター／プラスミドに存在し、更なる実施形態では、発現ベクター／プラスミドに存在する。そのようなベクターは、プロモーター、エンハンサー及び／または他の制御因子配列などの１つ以上の転写制御配列（複数可）に作動可能に連結している上記の定義された第１及び／または第２の構成成分（複数可）をコードすることができる、核酸配列を含む。ある実施形態において、核酸は、第１及び第２の構成成分をコードする（多シストロン構築物）。
【０１３１】
用語「ベクター」は、核酸分子を指し、それが連結した別の核酸を移送することができる。好ましいベクターの一つの種類は、エピソーム、すなわち、染色体外複製の可能な核酸である。好ましいベクターは、それらが連結する核酸の自己複製及び／または発現を可能にするものである。作動可能に連結している遺伝子の発現を指示することができるベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。本発明の組み換え発現ベクターは、当業者に既知の標準的な技術によって構築することができ、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）によるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌにおいて見出すことができる。様々な戦略がＤＮＡのフラグメントを連結するために利用可能であり、その選択は、ＤＮＡフラグメントの末端の性質に応じて決まり、当業者によって容易に決定されうる。本発明のベクターは、細菌及び宿主細胞におけるベクターの増殖及び選択を促進する他の配列要素を含有することもできる。加えて、本発明のベクターは、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ部位のためにヌクレオチド配列を含むことができる。選択的マーカー及びレポーター遺伝子などのためのコード配列は、当業者に良く知られている。
【０１３２】
本発明の核酸配列を含む組み換え発現ベクターを、細胞（宿主細胞）に導入することができ、定義された組み換え発現ベクターからタンパク質コード領域を発現することができる生細胞が含まれることがある。生細胞には、培養細胞及び生存生物体内の細胞の両方が含まれうる。したがって、本発明は、本発明の組み換え発現ベクターを含有する宿主細胞も提供する。用語「細胞」、「宿主細胞」及び「組み換え宿主細胞」は、本明細書において交換可能に使用される。そのような用語は、特定の対象の細胞のみならず、そのような細胞の継代または潜在的な継代のことも指す。突然変異または環境の影響のいずれかに起因して、特定の修飾が続く世代に生じることがあるので、そのような継代は、事実、親細胞と同一ではない場合があるが、依然として、本明細書に使用される用語の範囲内に含まれる。
【０１３３】
ベクターＤＮＡを、従来の形質転換または形質移入技術を介して細胞に導入することができる。用語「形質転換」及び「形質移入」は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介形質移入、リポフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクション及びウイルス媒介形質移入を含む、外来性核酸を宿主細胞に導入する技術を指す。宿主を形質転換する、または宿主に形質移入するのに適した方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ（１９８９））及び他の実験室マニュアルにおいて見出すことができる。「転写制御配列／要素」は、作動可能に連結しているタンパク質コード配列の転写を誘発または制御する、開始及び終止シグナル、エンハンサー及びプロモーター、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナルなどのＤＮＡ配列を指す一般的な用語である。第１の核酸配列は、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的に関連して配置されるときに、第２の核酸配列と「作動可能に連結」される。例えば、プロモーターは、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を与える場合、コード配列と作動可能に連結している。一般に、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は、連続的であり、必要であれば、リーディングフレームにおいて２つのタンパク質コード領域を結合する。しかし、例えばエンハンサーが、一般に、数キロベースでプロモーターから離れているときに機能し、イントロン配列が様々な長さのものでありうるので、いくつかのポリヌクレオチド要素は、作動可能に連結しうるが、連続的ではない。
【０１３４】
別の態様において本発明は、第１の構成成分をコードする第１の核酸及び第２の構成成分をコードする第２の核酸を含むキットを提供する。
【０１３５】
別の態様において、本発明は、上記に定義された第１及び／または第２の構成成分（複数可）を含む、または発現する細胞を提供する。別の実施形態において、細胞は、上記に定義された第１及び／または第２の構成成分（複数可）をコードする核酸により形質移入または形質転換されている。本発明は、例えば、当該技術に周知の培養培地及び試薬を使用して、本発明の第１及び／または第２の構成成分（複数可）を発現する、上記に記載されたものなどの組み換え発現系、ベクター及び細胞を更に提供する。細胞は、上記に記載された第１及び／または第２の構成成分（複数可）を発現することができる任意の細胞でありうる。タンパク質の発現に適した宿主細胞及び方法は、当該技術において良く知られている。上記に記載された構成成分（複数可）を発現することができる任意の細胞を、使用することができる。例えば、哺乳類細胞などの真核宿主細胞（例えば、マウス、ラット及びハムスター細胞系などの齧歯類細胞、ヒト細胞／細胞系）を使用することができる。別の実施形態において、上記に記述された細胞は、ヒト細胞系、例えば、胎児腎細胞系（例えば、ＨＥＫ２９３またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞）である。
【０１３６】
ある実施形態において、上記に記述されたバイオセンサーは、第１及び第２の構成成分を含む、または発現する細胞を含む。別の実施形態において、上記に記述されたバイオセンサーは、第１及び第２の構成成分を含む膜調製物を含む。
【０１３７】
別の態様において、本発明は、第１及び第２の条件下における細胞中の目的のタンパク質の輸送を比較する方法であって、前記第１の条件下で本明細書に定義されているバイオセンサーのＢＲＥＴシグナルを測定することと、前記第２の条件下で本明細書に定義されているバイオセンサーのＢＲＥＴシグナルを測定することとを含み、前記第１及び第２の条件間の前記ＢＲＥＴシグナルの差が、前記第１及び第２の条件下での前記目的のタンパク質の輸送における差を示す、前記方法を提供する。ある実施形態において、第１の条件は、活性化なしであり、第２の条件は、（例えば、作動薬を使用した）活性化であり、その逆も同様である。別の実施形態において、第１の条件は、阻害なしであり、第２の条件は、（例えば、拮抗薬を使用した）阻害であり、その逆も同様である。
【０１３８】
別の態様において、本発明は、作用物質が、細胞区画において目的のタンパク質の密度または濃度を調節する（増加または減少する）かを決定する方法であって、前記作用物質の存在下及び不在下で、本明細書に定義されているバイオセンサーのＢＲＥＴシグナルを測定することを含み、前記作用物質の不在下と比べた存在下での前記ＢＲＥＴシグナルの差が、前記作用物質が細胞区画において前記目的のタンパク質の密度または濃度を調節する（増加または減少する）ことを示す、前記方法を提供する。ＢＲＥＴシグナルの増加は、作用物質が、細胞区画において前記目的のタンパク質の密度または濃度を増加することを示し、一方、ＢＲＥＴシグナルの減少は、作用物質が、細胞区画において前記目的のタンパク質の密度または濃度を減少することを示す。
【０１３９】
ＢＲＥＴシグナルを測定する方法及び装置は、当該技術において良く知られている。ＢＲＥＴシグナルは、例えば、Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰシグナルの強度（光強度）を決定することにより、及び／またはＲｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃにより放出されたシグナルもしくは光の強度に対する、Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰにより放出されたシグナルもしくは光の強度の比（ＢＲＥＴ比）を計算することにより、測定することができる。ＢＲＥＴシグナルは、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（供与体）及び／またはｒＧＦＰ（受容体）発光を検出する適切なフィルターセットを備えた、マイクロプレート読み取り機または顕微鏡を使用して測定することができる。
【０１４０】
適切な細胞区画標的化部分を選択することによって、任意の細胞区画（ＰＭ、ＥＲ、ゴルジ、ミトコンドリア、エンドソームなど）への目的のタンパク質の輸送を評価／モニターすることが可能である。例えば、所定の条件または作用物質が、ミトコンドリアへの目的のタンパク質の輸送に影響を与えるかを決定するため、Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰまたはＲｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識されたミトコンドリア標的部分を含むバイオセンサーを、使用することができる。作用物質の存在下または所定の条件下におけるＢＲＥＴシグナルの（作用物質の不在下または異なる条件と比べた）増加は、ミトコンドリアへの目的のタンパク質の「動員」（すなわち、ミトコンドリアにおける目的のタンパク質の濃度／密度の増加）を示す。対照的に、作用物質の存在下または所定の条件下におけるＢＲＥＴシグナルの（作用物質の不在下または異なる条件と比べた）減少は、ミトコンドリアにおける目的のタンパク質の濃度／密度の減少を示す。適切な細胞区画標的化部分を使用することによって、類似した手法を使用して、異なる細胞区画へのタンパク質の輸送について研究することができる。
【０１４１】
ある実施形態において、本方法は、作用物質または条件がエンドソーム区画において目的の細胞表面受容体の輸送を誘発（すなわち、増加）する（すなわち、エンドソームにおいて目的のタンパク質の濃度／密度を増加する）かを決定することを含む。
【０１４２】
したがって、別の態様において、本発明は、エンドソーム区画における目的の細胞表面受容体の輸送を比較する方法であって、前記第１の条件下で本明細書に定義されているエンドソーム標的化部分を含むバイオセンサーのＢＲＥＴシグナルを測定することと、前記第２の条件下で本明細書に定義されているエンドソーム標的化部分を含むバイオセンサーのＢＲＥＴシグナルを測定することとを含み、前記第１及び第２の条件間のＢＲＥＴシグナルの差が、前記第１及び第２の条件下での前記エンドソーム区画での前記目的のタンパク質の輸送における差を示す、前記方法を提供する。
【０１４３】
別の態様において、本発明は、作用物質が、エンドソーム区画における細胞の目的の細胞表面受容体の輸送を誘発（すなわち、増加）するかを決定する方法であって、前記作用物質の存在下及び不在下で、エンドソーム標的化部分、好ましくは、本明細書に定義されているＦＹＶＥドメイン（例えば、ＥｎｄｏｆｉｎのＦＹＶＥドメイン）を含むエンドソーム標的化部分を含むバイオセンサーのＢＲＥＴシグナルを測定することを含み、前記作用物質の不在下と比べた存在下でのより高いＢＲＥＴシグナルが、前記作用物質が前記エンドソーム区画における目的の細胞の細胞表面受容体の輸送を誘発（すなわち、増加）する（すなわち、エンドソームにおける目的のタンパク質の濃度／密度を増加する）ことを示す、前記方法を提供する。
【０１４４】
本明細書に記載されている実験において示されているように、それぞれ異なるエンドソーム標的化部分を含む（例えば、第１のバイオセンサーが初期エンドソームの標的化部分を含み、第２のバイオセンサーが後期エンドソームの標的化部分を含む）複数のバイオセンサーを使用して、エンドソーム経路にわたるタンパク質の輸送を評価／モニターすることが可能である。
【０１４５】
別の態様において、本発明は、第１及び第２の条件下における目的の細胞の細胞表面受容体の内部移行を比較する方法であって、前記第１の条件下で本明細書に定義されているＰＭ標的化部分を含むバイオセンサーのＢＲＥＴシグナルを測定することと、前記第２の条件下で本明細書に定義されているＰＭ標的化部分を含むバイオセンサーのＢＲＥＴシグナルを測定することとを含み、前記第１及び第２の条件間の前記ＢＲＥＴシグナルの差が、前記第１及び第２の条件下での前記目的の細胞表面受容体の内部移行における差を示す、前記方法を提供する。
【０１４６】
別の態様において、本発明は、作用物質が、細胞において目的の細胞表面受容体の内部移行／隔離を誘発するかを決定する方法であって、前記作用物質の存在及び不在下で、本明細書に定義されているＰＭ標的化部分を含むバイオセンサーのＢＲＥＴシグナルを測定することを含み、前記作用物質の不在下と比べて存在下におけるより低いＢＲＥＴシグナルが、前記作用物質が目的の細胞表面受容体の内部移行／隔離を誘発することを示す、前記方法を提供する。
【０１４７】
本明細書に記載されているバイオセンサーは、更に、内部移行した受容体が細胞表面に再循環するかを決定し、再循環するのであれば、受容体再循環の動力学を評価することを可能にする。
【０１４８】
別の態様において、本発明は、細胞表面における目的の内部移行受容体の再循環をモニターする方法であって、（ａ）本明細書において定義されたＰＭ標的化部分を含むバイオセンサーを、前記受容体の内部移行を誘発するリガンドの存在下で接触させることと、（ｂ）バイオセンサーにおける第１のＢＲＥＴシグナルを測定することと、（ｃ）前記バイオセンサーを洗浄して、前記リガンドを除去することと、（ｄ）前記洗浄の後にバイオセンサーにおける第２のＢＲＥＴシグナルを測定することと、（ｅ）前記第１及び第２のシグナルを比較して、細胞表面における目的の内部移行受容体の再循環を決定することと、を含み、前記第１のＢＲＥＴシグナルと比べてより高い第２のＢＲＥＴシグナルが、細胞表面における目的の内部移行受容体の再循環を示す、前記方法を提供する。
【０１４９】
別の態様において、本発明は、細胞表面における目的の内部移行受容体の再循環をモニターする方法であって、（ａ）本明細書において定義されたＰＭ標的化部分を含む第１及び第２のバイオセンサーを、前記受容体の内部移行を誘発するリガンドの存在下で接触させることと、（ｂ）前記接触の後に、第１のバイオセンサーにおけるＢＲＥＴシグナルを測定することと、（ｃ）前記第２のバイオセンサーを洗浄して、前記リガンドを除去することと、（ｄ）前記洗浄の後に、第２バイオセンサーにおけるＢＲＥＴシグナルを測定することと、（ｅ）第１及び第２のバイオセンサーにおけるＢＲＥＴシグナルを比較して、細胞表面における目的の内部移行受容体の再循環を決定することと、を含み、前記第１バイオセンサーと比べて、前記第２のバイオセンサーにおけるより高いＢＲＥＴシグナルが、細胞表面における目的の内部移行受容体の再循環を示す、前記方法を提供する。
【０１５０】
ある実施形態において、本方法は、洗浄の後にステップ（ｄ）及び（ｅ）をそれぞれ別の時間に反復して、目的の内部移行受容体の再循環の動力学を研究することを更に含む。
【０１５１】
別の態様において、本発明は、第１の条件及び第２の条件間におけるＧタンパク質及び／またはＧＰＣＲ活性の調節をモニターする方法であって、前記第１の条件下で本明細書に定義されているＧタンパク質及び／またはＧＰＣＲの調節をモニターするバイオセンサーのＢＲＥＴシグナルを測定することと、前記第２の条件下で本明細書に定義されているＧタンパク質及び／またはＧＰＣＲの調節をモニターするバイオセンサーのＢＲＥＴシグナルを測定することとを含み、前記第１及び第２の条件間のＢＲＥＴシグナルの差が、前記第１及び第２の条件間でのＧタンパク質及び／またはＧＰＣＲ活性の調節を示す、前記方法を提供する。
【０１５２】
ある実施形態において、第１の条件は、試験化合物（例えば、推定阻害剤または作動薬）の不在であり、第２の条件は、試験化合物の存在であり、その逆も同様である。試験化合物の存在下でより低いＢＲＥＴシグナルは、試験化合物が作動薬であることを示す。
【０１５３】
別の態様において、本発明は、ＧＰＣＲリガンドが目的のＧタンパク質サブユニットの活性を調節するかを決定する方法であって、前記ＧＰＣＲリガンドの存在または不在下で本明細書に定義されているＧタンパク質及び／またはＧＰＣＲの調節をモニターするバイオセンサーのＢＲＥＴシグナルを測定することを含み、前記ＧＰＣＲリガンドの不在下と比べた存在下でのＢＲＥＴシグナルの差が、前記ＧＰＣＲリガンドが目的のＧタンパク質サブユニットの活性を調節することを示す、前記方法を提供する。
【０１５４】
別の態様において、本発明は、第１の条件及び第２の条件間における低分子ＧＴＰアーゼの活性の調節をモニターする方法であって、前記第１の条件下で本明細書に定義されている低分子ＧＴＰアーゼの活性化を評価するバイオセンサーのＢＲＥＴシグナルを測定することと、前記第２の条件下で本明細書に定義されている低分子ＧＴＰアーゼの活性化を評価するバイオセンサーのＢＲＥＴシグナルを測定することとを含み、前記第１及び第２の条件間のＢＲＥＴシグナルの差が、前記第１及び第２の条件下での低分子ＧＴＰアーゼの活性の調節を示す、前記方法を提供する。
【０１５５】
ある実施形態において、第１の条件は、試験化合物（例えば、推定阻害剤または作動薬）の不在であり、第２の条件は、試験化合物の存在であり、その逆も同様である。試験化合物の存在下でのより高いＢＲＥＴシグナルは、試験化合物が作動薬であること（ＰＭまたはエンドソームでの低分子ＧＴＰアーゼの動員）を示す。
【０１５６】
別の態様において、本発明は、試験作用物質が、低分子ＧＴＰアーゼ（例えば、Ｒｈｏタンパク質）の活性を調節するかを決定する方法であって、前記試験作用物質の存在または不在下で本明細書に定義されている低分子ＧＴＰアーゼの活性化を評価するバイオセンサーのＢＲＥＴシグナルを測定することを含み、前記試験作用物質の不在下と比べた存在下でのＢＲＥＴシグナルの差が、前記試験作用物質が前記低分子ＧＴＰアーゼの活性を調節することを示す、前記方法を提供する。
【０１５７】
本明細書に記載されているバイオセンサーを使用して、薬理学的シャペロン（ＰＣ）による目的のタンパク質（例えば、ＥＲから適切に退出していない欠陥タンパク質）の「救出」を、評価／モニターすることも可能である。用語「薬理学的シャペロン」（「ＰＣ」）は、本明細書において使用されるとき、タンパク質（例えば、受容体）に結合し、以下の効果の１つ以上を有する分子を指す。（ｉ）タンパク質の安定した分子立体配置の形成を増強する。（ｉｉ）ＥＲから別の細胞位置、好ましくは未変性細胞位置へのタンパク質の正確な輸送を増強する。すなわち、タンパク質のＥＲ関連分解を防止する。（ｉｉｉ）立体配置的に不安定な凝集、すなわち、誤って折り畳まれたタンパク質を防止する。（ｉｖ）タンパク質の少なくとも部分的に野生型の機能、安定性及び／または活性を回復または増強する。ならびに／あるいは（ｖ）タンパク質の異なる折り畳みを誘発する。したがって、タンパク質の薬理学的シャペロンは、タンパク質に結合する分子であり、タンパク質の正確な折り畳み、輸送、非凝集及び／もしくは活性をもたらし、ならびに／またはタンパク質の折り畳みを調節する（シャペロンの不在下での折り畳みと異なるタンパク質の折り畳みを誘発する）。
【０１５８】
リソソーム蓄積障害（ＬＳＤ）に関連する酵素の小分子阻害剤が、突然変異酵素の折り畳み及び活性の両方を救出し、野生型酵素の折り畳み及び活性を増強することが以前に示されている（米国特許第６，２７４，５９７号、同第６，５８３，１５８号、同第６，５８９，９６４号、同第６，５９９，９１９号及び同第６，９１６，８２９号を参照すること）。特に、ＬＳＤに関連する突然変異酵素の特異的競合阻害剤である、グルコース及びガラクトースの小分子誘導体の投与は、突然変異酵素のインビボ及びインビトロ安定性を効果的に増加し、突然変異酵素の活性を増強したことが発見された。この戦略の背後にある元々の理論は、以下である。突然変異酵素タンパク質がＥＲにおいて不正確に折り畳まれるので（Ｉｓｈｉｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９９６；２２０：８１２−８１５）、酵素タンパク質は、正常な移送経路（ＥＲ→ゴルジ装置→エンドソーム→リソソーム）において遅くなり、急速に分解される。したがって、突然変異タンパク質の正確な折り畳みを安定化する化合物は、突然変異タンパク質の活性部位特異的シャペロンとして機能し、ＥＲ品質管理系からの順調な脱出を促進する。酵素阻害剤が触媒中心を占有して、細胞及び動物における酵素立体配置の安定化をもたらす。これらの特異的シャペロンは、酵素の活性部位において結合したので、「活性部位特異的シャペロン（ＡＳＳＣ）」と呼ばれた。
【０１５９】
突然変異酵素を救出することに加えて、ＡＳＳＣは、ＥＲ分泌及び組み換え野生型酵素の活性を増強する。ＡＳＳＣは、過剰発現野生型酵素の折り畳みを促進し、これはさもなければＥＲ品質制御系において遅くなり、その理由は酵素の過剰発現及び過剰産生がＥＲの能力を超えていてタンパク質凝集及び分解をもたらすためである。したがって、折り畳みの際に酵素の安定した分子立体配置を誘発する化合物は、「シャペロン」として機能し、ＥＲからの退出のために酵素を正確な立体配置に安定化する。上記に示されたように、酵素では、１つのそのような化合物が、予想外なことに、酵素の競合的阻害剤であることが分かった。
【０１６０】
ＬＳＤに加えて、多数の多様な疾患が、現在、非未変性タンパク質立体配置の採用によって引き起こされる「コンフォメーション病（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）」として認識されており、これは、ＥＲにおけるタンパク質の遅延をもたらし、最終的にタンパク質の分解をもたらすことがある（Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９９８；３３９：１６８８−１６９５；Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｅｔ  １９９５；２０：４５６−４５９；Ｂｙｃｈｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９５；３５９：６−８；Ｂｒｏｏｋｓ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９７；４０９：１１５−１２０）。例えば、小型合成化合物は、腫瘍抑制タンパク質ｐ５３の突然変異形態のＤＮＡ結合ドメインを安定化し、それによってタンパク質が活性立体配置を維持できることが見出された（Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９９；２８６：２５０７−１０）。受容体の合成は、小分子受容体拮抗薬及びリガンドにより救出されることが示されている（Ｍｏｒｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２０００；１０５：  ８８７−９５；Ｐｅｔａｊａ−Ｒｅｐｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．２００２；２１：１６２８−３７）。膜チャネルタンパク質及び他の形質膜トランスポーターの薬理学的救出も、チャネル遮断薬または基質の使用によって実証されている（Ｒａｊａｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００２；１０５：２８３０−５；Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９；２７４：３１１２３−２６；Ｌｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７；２７２：７０９−１２；Ｐｅｄｅｍｏｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００５；１１５：２５６４−７１）。したがって、本明細書に記載されているバイオセンサーは、タンパク質の発現及び／または正確な成熟を救出するシャペロンを特定することに有用であり、このことは、次に、上記に記載された１つ以上のタンパク質の発現及び／または適切な成熟における欠陥に関連する疾患の治療にも有用でありうる。
【０１６１】
別の態様において、本発明は、作用物質が、目的の受容体の薬理学的シャペロンとして作用するかを決定する方法であって、
Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰまたはＲｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃ、好ましくはＲｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識された前記目的の受容体及びＲｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰまたはＲｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃ、好ましくはＲｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰで標識された形質膜（ＰＭ）標的化部分を含む細胞を含むバイオセンサーを提供することであって、前記受容体が前記Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰで標識される場合、前記ＰＭ標的化部分は前記Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識され、前記受容体が前記Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識される場合、前記ＰＭ標的化部分は前記Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰで標識される、前記提供することと、
前記作用物質の存在及び不在下でＢＲＥＴ受容体シグナルを測定することと、
を含み、
前記作用物質の不在下と比べた存在下でのＢＲＥＴシグナルの増加が、前記作用物質が前記受容体の薬理学的シャペロンとして作用することを示す、前記方法を提供する。
【０１６２】
別の態様において、本発明は、作用物質が、目的のタンパク質の薬理学的シャペロンとして作用するかを決定する方法であって、
Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰまたはＲｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識された前記目的のタンパク質及びｒＧＦＰまたはＲｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識された小胞体（ＥＲ）標的化部分を含む細胞を含むバイオセンサーを提供することであって、前記タンパク質が前記Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰで標識される場合、前記ＥＲ標的化部分は前記Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識され、前記タンパク質が前記Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識される場合、前記ＥＲ標的化部分は前記Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰで標識される、前記提供することと、
前記作用物質の存在及び不在下でＢＲＥＴ受容体シグナルを測定することと
を含み、
前記作用物質の不在下と比べた存在下でのＢＲＥＴシグナルの減少が、前記作用物質が前記受容体の薬理学的シャペロンとして作用することを示す、前記方法を提供する。
【０１６３】
上記に記述された方法は、本明細書に記載されている実験において示されているように、未変性タンパク質／受容体または突然変異受容体を使用して実施することができる。本明細書に記載されている実験は、バイオセンサーが、ＧＰＣＲ、ならびに非ＧＰＣＲ受容体（電位依存性カリウムチャネル）の救出を測定するのに適していることを更に示し、これらが任意のタンパク質または受容体の救出をモニターすることに使用されうる証拠を提供している。ある実施形態において、タンパク質は、未変性ＧＰＣＲまたは突然変異ＧＰＣＲである。更なる実施形態において、ＧＰＣＲは、未変性メラノコルチン−４受容体（ＭＣ４Ｒ）または突然変異ＭＣ４Ｒである。ある実施形態において、突然変異ＭＣ４Ｒは、ＭＣ４Ｒポリペプチドの低減された、または不正確な細胞内折り畳みをもたらす、１個以上の突然変異を含有する。例示的な突然変異は、以下である。Ｐ７８Ｌ、Ｒ１６５Ｑ、Ｒ１６５Ｗ、Ｉ１２５Ｋ、Ｃ２７１Ｙ、Ａ１７５Ｔ、Ｉ３１６Ｌ、Ｉ３１６Ｓ、Ｉ３１７Ｔ、Ｎ９７Ｄ、Ｇ９８Ｒ、Ｎ６２Ｓ、Ｃ２７１Ｒ、Ｓ５８Ｃ、Ｎ６２Ｓ、Ｎ９７Ｄ、Ｙ１５７Ｓ、Ｉ１０２Ｓ、Ｌ１０６Ｐ、Ｌ２５０Ｑ、Ｙ２８７Ｘ、Ｐ２９９Ｈ、Ｓ５８Ｃ、コドン２１１におけるＣＴＣＴ及びコドン２４４へのＴＧＡＴ挿入。別の実施形態において、ＧＰＣＲは、未変性Ｖ２Ｒまたは突然変異Ｖ２Ｒである。更なる実施形態において、突然変異Ｖ２Ｒは、Ｙ１２８ＳまたはＷ１６４Ｓ置換を含む。別の実施形態において、タンパク質は、イオンチャネル、未変性イオンチャネル、または突然変異イオンチャネルであり、更なる実施形態では、ｈＥＲＧなどの電位開口型カリウムチャネルである。
【０１６４】
ある実施形態において、作用物質が薬理学的シャペロンとして作用するかを決定する上記の方法は、救出されたタンパク質／受容体が機能的であるかを、例えばリガンドを使用して決定することを更に含む。
【０１６５】
別の態様において、本発明は、作用物質が、形質膜（ＰＭ）でのβ−アレスチンの動員を誘発するかを決定する方法であって、
Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰまたはＲｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃ、好ましくはＲｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識された前記β−アレスチン、Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰまたはＲｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃ、好ましくはＲｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰで標識された形質膜（ＰＭ）標的化部分及びＧＰＣＲを含む細胞または膜調製物を含むバイオセンサーを提供することであって、前記β−アレスチンが前記Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰで標識される場合、前記ＰＭ標的化部分は前記Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識され、前記β−アレスチンが前記Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃで標識される場合、前記ＰＭ標的化部分は前記Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰで標識される、前記提供することと、
前記作用物質の存在及び不在下でＢＲＥＴ受容体シグナルを測定することと
を含み、
前記作用物質の不在下と比べた存在下でのＢＲＥＴシグナルの増加が、前記作用物質がＰＭでの前記β−アレスチンの動員を誘発することを示す、前記方法を提供する。
【０１６６】
上記に記述された方法は、バイオセンサーを、ルシフェリンなどのＲｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃの基質と接触させて、ｒＧＦＰにより受容される（ｒＧＦＰを励起する）エネルギーを（光の形態で）生じることを含む。ルシフェリンの非限定例には、セレンテラジン（セレンテラジン４００Ａ（ＤｅｅｐＢｌｕｅＣ（商標））、セレンテラジンＨ及びＮａｎｏｌｉｇｈｔ（商標）のＰｒｏｌｕｍｅ  Ｐｕｒｐｌｅ（商標）などのｅ−セレンテラジンの類縁体）、ＶｉｖｉＲｅｎ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａから）、Ｌａｔｉａルシフェリン（（Ｅ）−２−メチル−４−（２，６，６−トリメチル−１−シクロヘキサ−１−イル）−１−ブテン−１−オールホルメート）、細菌ルシフェリン、渦鞭毛藻類ルシフェリンなどの、イミダゾピラジノンに基づいた化合物であるＤ−ルシフェリンが含まれる。ある実施形態において、基質は、セレンテラジン４００Ａ、セレンテラジンＨ、またはＰｒｏｌｕｍｅ  Ｐｕｒｐｌｅ（商標）である。
【０１６７】
本明細書において使用されるとき、用語「作用物質」は、生物活性について試験される、任意の分子、例えば、タンパク質、オリゴペプチド、有機小分子、多糖、ポリヌクレオチドなどを指すために使用される。そのような作用物質は、合成または天然の化合物ライブラリーを含むいくつもの供給源から得ることできる。例えば、無作為化オリゴヌクレオチドの発現を含む、多種多様な有機化合物及び生体分子の無作為及び指向性合成のための多数の手段が、利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物及び動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが利用可能である、または容易に産生される。加えて、天然または合成的に生成されたライブラリー及び化合物は、従来の化学的、物理的及び生化学的な方法によって容易に修飾される。
【０１６８】
陽性対照及び陰性対照を、本方法／アッセイに使用することができる。対照及び試験試料により複数回実施して、統計的に有意な結果を得ることができる。
【０１６９】
ある実施形態において、上記に記述された方法は、ハイスループット方法（ハイスループットスクリーニング、ＨＴＳ）である。用語「ハイスループットスクリーニング」（ＨＴＳ）は、本明細書において使用されるとき、多数（数百、数千）の化合物を、標的分子への結合活性または生物学的活性について急速に並行してスクリーンすることを可能にする方法を指す。そのようなＨＴＳ方法は、典型的には、数個のウェル、例えば、３８４、１５３６または３４５６個のウェルを有するマイクロタイタープレートにおいて実施される。ＨＴＳでは、読み取りシグナルは、高い感度、精度及び再現性で検出されることが重要である。
【実施例】
【０１７０】
本発明を実施するための様式
本発明は、以下の非限定例によって更に詳細に説明される。
【０１７１】
実施例１：材料及び方法
材料。アンギオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ；［Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ］、配列番号）、ポリオルニチン、ポリ−Ｄ−リシン、イソプロテレノール、アルギニン−バソプレシン（ＡＶＰ）、ブラジキニンは、Ｓｉｇｍａ（登録商標）からのものであった。プロスタグランジンＦ２α（ＰＧＦ２α）、プロスタグランジンＥ２及びｕ４６６１９は、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（登録商標）（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）からのものであった。［Ｓａｒ１，Ｉｌｅ８］−ＡｎｇＩＩ（ＳＩ）及び［Ａｓｐ１，Ｖａｌ５，Ｇｌｙ８］−ＡｎｇＩＩ（ＤＶＧ）［Ｓａｒ１−Ｖａｌ５−Ｄ−Ｐｈｅ８］ＡｎｇＩＩ（ＳＶｄＦ）及び［Ｓａｒ１−Ｄ−Ａｌａ８］ＡｎｇＩＩ（ＴＲＶ１２００２７）は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ  ｄｅ  Ｓｈｅｒｂｒｏｏｋｅ（Ｃａｎａｄａ，ＱＣ）において合成された。ＵＢＯ−ＱＩＣは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｏｎｎ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。ヨウ素１２５は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（登録商標）から得た。ダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ウシ胎児血清、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）及び他の細胞培養試薬は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）から購入した。セレンテラジン４００ａ、セレンテラジンＨ及びＰｒｏｌｕｍｅ  Ｐｕｒｐｌｅｌは、Ｇｏｌｄｂｉｏ（登録商標）、Ｂｉｏｔｉｕｍ、またはＮａｎｏｌｉｇｈｔ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのいずれかから購入した。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、２５ｋＤａ、線状）は、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ）から購入した。サケ精子ＤＮＡは、Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）から購入した。Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）からのものであった。制限酵素及びＴ４  ＤＮＡリガーゼは、ＮＥＢ（登録商標）から得た。
【０１７２】
プラスミド及び構築物。ｌｙｎ−ＧＦＰ１０の構築物では、ヒトＬｙｎキナーゼ最初の１１個の残基のコード配列（ＭＧＣＩＫＳＫＧＫＤＳ、配列番号１）及びＧＦＰ１０の全コード領域を、ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）において合成し、注入の使用によりｐｃＤＮＡ３．１／ｚｅｏ（−）にサブクローンした（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（登録商標），ＣＡ）。ｌｙｎ−ｒＧＦＰは、ｌｙｎ−ＧＦＰ１０構築物においてＧＦＰ１０のコード配列を、ＰＣＲ増幅により生成されたヒト化ｒＧＦＰに代えることによって生成した。ＳｔｒｅｐｔａｇＩＩ融合ＧＦＰ１０を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（登録商標）において合成し、ｐｃＤＮＡ３．１／ｚｅｏ（−）にサブクローンした（ＳＴＩＩ−ＧＦＰ１０）。ヒトｅｎｄｏｆｉｎのＦＹＶＥドメイン（アミノ酸７３９〜８０６）を、Ｂｉｏ  Ｂａｓｉｃ（登録商標）Ｉｎｃ．（Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）において合成し、ＳＴＩＩ−ＧＦＰ１０構築物のインフレームにサブクローンした（ＧＦＰ１０−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ）。ｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥは、ＧＦＰ１０−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥのＦＹＶＥドメインを、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）のインフレームにヒト化ｒＧＦＰを含有するベクターに挿入することによって生成した。ｒＧＦＰ−ｒａｂ４及びＲＧＦＰ−ｒａｂ１１は、ｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥのＦＹＶＥドメインを、ＰＣＲ増幅ｒａｂ４及びｒａｂ１１コード配列にそれぞれ代えることによって生成した。ＲｌｕｃＩＩ融合ＡＴ１Ｒを生成するため、シグナルペプチドを含有するヒトＡＴ１Ｒコード配列及びＦｌａｇ配列をＰＣＲ増幅し、ＮｈｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位を介してＲｌｕｃＩＩも含有するｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇｒｏ（＋）のインフレームにサブクローンした。プラスミドコード化ヒトβａｒｒ２−ＲｌｕｃＩＩは、以前に記載されている（Ｑｕｏｙｅｒ，Ｊａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）。ＲｌｕｃＩＩ標識化受容体は、ＭＣ４Ｒ−Ｖｅｎｕｓ構築物の公表された構築物（Ｐ．Ｒｅｎｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．２０１０  Ｄｅｃ；３３５（３）：５２０−３２）及びｈＶ２Ｒ  ｗｔ（Ｍｏｒｅｌｌｏ，Ｊ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，２０００．１０５（７）：ｐ．８８７−９５）を使用して、ＰＣＲによって得た。ＲｌｕｃＩＩ標識化受容体は、Ｄ．Ｄｅｂｌｏｉｓ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ  ｄｅ  Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）からの好意による提供物であるプラスミドコード化ｈＥＲＧを使用して、ＰＣＲによって得た。Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＧＦＰ（ｒＧＦＰ）構築物は、合成コード配列（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，ＵＳＡ）から、ＰＣＲによって得た。ＲｌｕｃＩＩ及びｒＧＦＰ標識化ＰＨドメイン：ＰＬＣδ１のＰＨドメインは、ＰＬＣδ１イメージクローン（ｉｍａｇｅ  ｃｌｏｎｅ）（ＩＭＡＧＥ：５７６９６６５）をテンプレートとして使用してＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を使用して、ＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位へのサブクローンにより、ＧＦＰ１０−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥのｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥドメインを交換した。ＧＦＰ１０−ＰＨ（ＰＬＣδ）のＰＨドメイン���、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）にヒト化ｒＧＦＰを含有するベクター、またはｐｃＤＮＡ３．１（＋）のインフレームにＨＡ−ＲｌｕｃＩＩを含有するベクターのいずれかに挿入した（それぞれ、ｒＧＦＰ−ＰＨ（ＰＬＣδ１）及びＨＡ−ＲＬｕｃＩＩ−ＰＨ（ＰＬＣδ１））。ｈＭＣ４Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ：融合タンパク質のｈＭＣ４Ｒｗｔ−ＲｌｕｃＩＩ、ｈＭＣ４Ｒ（Ｒ１６５Ｑ）−ＲｌｕｃＩＩ及びｈＭＣ４Ｒ−（Ｐ２９９Ｈ）−ＲｌｕｃＩＩをコードするプラスミドは、ＭＣ４Ｒ−Ｖｅｎｕｓ構築物のＭＣ４ＲからＰＣＲ増幅によって得て、ヒト化ＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼＩＩ（ｈＲｌｕｃＩＩ）配列（以前に報告されたｈＲｌｕｃの変異体（Ｌｅｄｕｃ，Ｂｒｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００９））のＮ末端においてインフレームでｐｃＤＮＡ３．１  ＲｌｕｃＩＩベクターにサブクローンした（リンカー配列：ＶＧＧＧＧＳＫＬＰＡＴ、配列番号２）。ｈＶ２Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ：Ｖ２Ｒ置換のＹ１２８Ｓは、Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ（商標）突然変異キット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｓａｎｔａ−Ｃｌａｒａ，ＵＳＡ）により、部位指定突然変異誘発を使用して作成した。融合タンパク質のｈＶ２Ｒ  ｗｔ−ＲｌｕｃＩＩ及びｈＶ２Ｒ（Ｙ１２８Ｓ）−ＲｌｕｃＩＩをコードするプラスミドは、Ｖ２Ｒコード配列のＰＣＲ増幅によって得て、ｈＲｌｕｃＩＩ配列のＮ末端においてインフレームでｐｃＤＮＡ３．１  ＲｌｕｃＩＩベクターにサブクローンした（リンカー配列：ＧＧＳＧＬＫＬＰＡＴ、配列番号３）。ｈＥＲＧ−ＲｌｕｃＩＩ：融合タンパク質のｈＥＲＧ  ｗｔ−ＲｌｕｃＩＩ及びｈＥＲＧ（Ｇ６０１Ｓ）−ＲｌｕｃＩＩをコードするプラスミドは、ｈＥＲＧの残基１〜３７９、ｈＥＲＧの残基３７３〜１１５９及びＲｌｕｃＩＩをコードする３つのフラグメントのＰＣＲ増幅によって得て、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターによってサブクローンした（ＲｌｕｃＩＩのＮ末端のリンカー：ＮＡＡＩＲＳＧＧ、配列番号４及びＲｌｕｃＩＩのＣ末端のリンカー：ＧＧＮＡＡＩＲＳ、配列番号５）。ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ：融合タンパク質のｒＧＦＰ−ＣＡＡＸをコードするプラスミドは、リンカーをコードする逆方向プライマーを有するｒＧＦＰコード配列（配列：ＧＳＡＧＴＭＡＳＮＮＴＡＳＧ、配列番号６）、ならびにＫＲＡＳスプライス変異体ｂの形質膜標的化多塩基配列及びプレニル化シグナル配列：−ＧＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫＣＶＩＭ（名称：ＣＡＡＸ、配列番号７）のＰＣＲ増幅によって得た。ＣＡＡＸ形質膜標的化配列は、ｒＧＦＰコード配列のＣ末端のインフレームにある。ＰＣＲフラグメントは、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターにサブクローンされる。ｒＧＦＰ−ＰＢ：融合タンパク質のｒＧＦＰ−ＰＢをコードするプラスミドは、ＰＣＲ増幅及びＧｉｂｓｏｎ組み立てを使用して、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸのＣＡＡＸモチーフをＧＲＫ５形質膜標的化ドメイン（ＰＢ、配列：ＳＰＫＫＧＬＬＱＲＬＦＫＲＱＨＱＮＮＳＫＳ、配列番号８）に代えることによって得た。完全ベクターｐＣＤＮＡ３．１（＋）ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸは、オリゴコード化ＰＢを使用するＰＣＲにより増幅される。ＰＣＲ反応産物は、ＤｐｎＩにより消化され、精製され、Ｇｉｂｓｏｎ組み立て反応により再環状化される。ＲｌｕｃＩＩ−ＧＲＢ２のクローンニング：ヒトＧＲＢ２変異体１のコード配列を、ＰＣＲ増幅し、ＧＲＢ２及びＲｌｕｃＩＩの間に小さい可動性リンカー（配列：ＧＳＡＧＴ、配列番号９）を有するベクターｐＣＤＮＡ３．１（＋）ＲｌｕｃＩＩにおけるＲｌｕｃＩＩのＣ末端にサブクローンした。全てのＰＣＲを、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼの使用によって実施した。全て構築物を、使用する前にＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１７３】
細胞培養及び一時的形質移入。ヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞を、１０％ウシ胎児血清、１００単位／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを補充したダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）に、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下において３７℃で維持した。ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞を、５％ウシ胎児血清及び２０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを補充したＤＭＥＭにおいて培養した。細胞を、５％ＣＯ２及び９０％湿度により３７℃で増殖させた。
【０１７４】
リン酸カルシウムを使用した形質移入。ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞に、リン酸カルシウム方法を使用して形質移入した（Ｆｅｓｓａｒｔ，Ｓｉｍａａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００５）。細胞を、形質移入の１日前に、１００ｍｍの皿毎に約７．５×１０５の密度で播種し、形質移入を以前に記載されたとおりに実施した（Ｆｅｓｓａｒｔ，Ｓｉｍａａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００５）。形質移入の１８時間後、培地を交換し、細胞を、続く実験のために分けた。全てのアッセイを、形質移入の４８時間後に実施した。
【０１７５】
ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）を使用した形質移入。実験の２日前に、６ウェルプレートのＨＥＫ２９３細胞を、カルシウムまたはマグネシウムを含有しないＰＢＤで洗浄し、脱離させ、形質移入剤としてＰＥＩを（ＰＥＩ／ＤＮＡを３対１の比で）使用して、示されたプラスミドにより形質移入し、次にポリ−Ｌ−オルニチン臭化水素酸塩で前処理された９６ウェルプレートに、ウェル１つあたり３５０００細胞の密度で直接播種した。
【０１７６】
安定したｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ細胞系。６ウェルプレートのＨＥＫ２９３細胞を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、形質移入剤としてポリエチレンイミン２５−ｋＤＡ線状（ＰＥＩ）を（ＰＥＩ／ＤＮＡを３対１の比で）使用して、１．２ｕｇのｒＧＦＰ−ＣＡＡＸコード化構築物／ウェルで形質移入した（Ｈａｍｄａｎ，Ｒｏｃｈｄｉ  ｅｔ  ａｌ．２００７）。ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ構築物は、ハイグロマイシン抵抗性のためにもコードしており、形質移入された細胞をＴ７５皿に播種し、選択（１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシン）を４週間にわたって維持し、ハイグロマイシン抵抗性細胞をＧＦＰ蛍光に対して、異なるレベルのｒＧＦＰ−ＣＡＡＸを発現する個体群にＦＡＣＳ選別した。
【０１７７】
図１Ｂ〜９Ｄ、２５Ｄ〜２５ＦのＢＲＥＴ測定。形質移入した翌日に細胞を脱離させ、ポリオルニチン被覆白色９６ウェルプレートに、ウェル１つあたり約２５０００細胞の密度で再平板培養した。翌日、細胞を、予熱したタイロード緩衝液（１４０ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２、１２ｍＭのＮａＨＣＯ３、５．６ｍＭのＤ−グルコース、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．３７ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）で一回洗浄し、次に、タイロード緩衝液中の様々な濃度のリガンドで示された回数、または単一濃度のリガンドで様々な回数によって３７℃で刺激した。再循環実験では、細胞を、リガンドにより３７℃で３０分間刺激した後、氷冷タイロード緩衝液により３回、またはタイロード緩衝液により１回／酸（５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ４．０）により３回／タイロード緩衝液により２回、洗浄した。全ての洗浄ステップは、氷上で実施した。次に細胞を、更に、タイロード緩衝液と共に水浴において３７℃で４５分間インキュベートした。細胞透過性基質であるセレンテラジン４００ａを、ＢＲＥＴ測定の３〜４分前に、タイロード緩衝液中５μＭの最終濃度で加えた。測定は、ＲｌｕｃＩＩのＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（供与体）及びＧＦＰ１０またはｒＧＦＰ（受容体）発光をそれぞれ検出するため、４１０±８０ｎｍ及び５１５±３０ｎｍのフィルターセットを備えたＳｙｎｅｒｇｙ２（ＢｉｏＴｅｋ（登録商標））マイクロプレート読み取り機を使用して実施した。ＢＲＥＴシグナルは、ＲｌｕｃＩＩの発光強度に対するＧＦＰ１０またはｒＧＦＰの発光強度の比を計算することによって決定した。全てのＢＲＥＴ測定は、３７℃で三連で実施した。
【０１７８】
細胞表面発現及び機能性のＰＣ救出を評価するＢＲＥＴアッセイ（隔離アッセイ）。図１２Ａ〜１８Ｅにおいて、Ｈｅｋ２９３細胞に、このセクションに記載されたＰＥＩを使用して、一時的に形質移入した。９６ウェルプレート毎に形質移入されたＤＮＡは、以下のとおりである。図１２Ａ及び１２Ｂでは、２．４ｎｇのｈＭＣ４Ｒ−ＲｌｕｃＩＩコード化構築物及び増加量のｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ（Ｋｒａｓ）を図１２Ａでは９．６ｎｇまで、図１２ＢではｒＧＦＰ−ＰＢを９．６ｎｇまで用い、図１３Ａ〜１３Ｃでは、０．６、１．２または２．４ｎｇのｈＭＣ４Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ及び４．８ｎｇのｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ（Ｋｒａｓ）を用い、図１３Ｄでは、２．４ｎｇの多シストロンｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ（Ｋｒａｓ）／ＭＣ４Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ構築物を用い、図１３Ｅでは、１．２ｎｇのｈＶ２Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ及び４．８ｎｇのｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ（Ｋｒａｓ）を用い、図１４Ａ〜１６Ｂでは、２．４ｎｇのｈＭＣ４Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ及び７．２ｎｇのｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ（Ｋｒａｓ）を用い、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ（Ｋｒａｓ）を安定して発現しているＨｅｋ２９３細胞には、０．６、１．２または２．４ｎｇのｈＭＣ４Ｒ−ＲｌｕｃＩＩが形質移入され、図１７Ａでは、０．６、１．２または２．４ｎｇのｈＶ２Ｒ＿Ｙ１２８Ｓ−ＲｌｕｃＩＩを用い、図１７Ｂ、図１８Ａ及び１８Ｂでは、０．６、１．２または２．４ｎｇのｈＥＲＧ−ＲｌｕｃＩＩ及び４．８ｎｇのｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ（Ｋｒａｓ）を用い、図１８Ｃ〜１８Ｅでは、０．６ｎｇのｈＥＲＧ−ＲｌｕｃＩＩ及び７．２ｎｇのｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ（Ｋｒａｓ）を用いる。９６ウェルプレートに播種された形質移入細胞を、形質移入の２日後に実施されるＢＲＥＴアッセイの前に、薬理学的シャペロン（ＭＣ４Ｒには、ＤＣＰＭＰ（Ｎ−（（２Ｒ）−３（２，４−ジクロロフェニル）−１−（４−（２−（（１−メトキシプロパン−２−イルアミノ）メチル）フェニル）ピペラジン−１−イル）−１−オキソプロパン−２−イル）プロピオンアミド）もしくは化合物１、Ｖ２Ｒには、ＳＲ１２１４６３、ｈＥＲＧには、アステミゾール、シサプリド、キニジン、ジチアゼム（Ｄｉｔｉａｚｅｍ）、アミオダロン及びアセトアミノフェン）またはビヒクルにより１６時間から１８時間にわたって、それぞれの図において示されたように処理した。ＢＲＥＴアッセイでは、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、タイロード緩衝液に中に放置した。次に細胞を、ＭＣ４Ｒのために、１０μＭのα−ＭＳＨにより３７℃で１時間、任意選択で処理して、細胞表面に発現された受容体の隔離を誘発する作動薬の関数として、機能性のＰＣ救出を評価した（図１３）。Ｒｌｕｃ基質であるＣｏｅｌ−４００ａ（ＢＲＥＴ２実験用）またはセレンテラジンＨ（ＢＲＥＴ１実験用、図１３Ｅ、ならびに１５Ｂ及び１５Ｄ）を、最終濃度の２．５μＭで加え、細胞を更に５分間にわたって更にインキュベートした。次にＢＲＥＴ値を、以下のフィルターを備えたＭｉｔｈｒａｓ  ＬＢ９４０  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒの使用により収集した。ＢＲＥＴ２には、４００ｎｍ±７０ｎｍ（エネルギー供与体）及び５１５ｎｍ±２０ｎｍ（エネルギー受容体）、ＢＲＥＴ１には、４８０ｎｍ±２０ｎｍ（エネルギー供与体）及び５３０ｎｍ±２０ｎｍ（エネルギー受容体）。ＢＲＥＴ値は、ＲｌｕｃＩＩの発光に対する受容体の発光の比を計算することによって決定した。
【０１７９】
ｒＧＦＰマーカーを使用した形質膜へのβアレスチン動員。図１９Ｂ〜１９Ｄでは、ＨＥＫ２９３細胞に、前に記述されたＰＥＩを用いて、９６ウェルプレートのウェル１つあたり、３ｎｇのβアレスチン１−ＲｌｕｃＩＩ（図１９Ｂ及び１９Ｄ）、またはβアレスチン２−ＲｌｕｃＩＩ（図１９Ｃ及び１９Ｅ）＋４．８ｎｇのＰＭマーカー（ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ＝赤色三角、ＧＦＰ１０−ＣＡＡＸ＝円、ｒＧＦＰ−ＰＢ＝緑色三角及びＬｙｎ−ｒＧＦＰ＝四角）＋１０ｎｇのＶ２Ｒ（図１９Ｄ及び１９Ｅ）、または４０ｎｇのβ２ＡＲ（図１９Ｂ及び１９Ｃ）を形質移入した。形質移入の４８時間後、細胞を洗浄し、示された用量により３７℃で１０分間刺激した。次にＣｏｅｌ−４００ａを最終濃度の２．５μＭで加え、更に５分間インキュベートした。ＢＲＥＴをＴｒｉｓｔａｒ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の使用により３７℃で測定した。データを、ＧＦＰ１０−ＣＡＡＸ（Ｋｒａｓ）構築物により得た最大応答の比として正規化した。図１９Ｆでは、ＰＥＩ：ＤＮＡの３：１の比のｓｓＤＮＡ及びＰＥＩにより２μｇに補完された、２００ｎｇのβ２ＡＲ、２０ｎｇのβ−アレスチン２−ＲｌｕｃＩＩ、８００ｎｇのｒＧＦＰ−ＣＡＡＸの形質移入ミックスを、３ｍｌのＨｅｋ２９３ＳＬに加える（３５０，０００細胞／ｍｌ）。細胞を、ポリ−Ｄ−リシン前処理プレートに播種した。形質移入の４８時間後、細胞を洗浄し、タイロード液＋１ｍＭのＣａＣｌ２により３７℃で６０分間プレインキュベートし、次に、示された用量のイソプロテレノールにより３７℃で２分間処理した。次にＣｏｅｌ−４００ａを最終濃度の２．５μＭで加え、更に６分間インキュベートした。ＢＲＥＴをＴｒｉｓｔａｒ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の使用により３７℃で測定した。図１９Ｃ、１９Ｅ、１９Ｈ及び１９Ｉでは、ＨＥＫ２９３細胞に、前に記載されたＰＥＩを用いて、９６ウェルプレートのウェル１つあたり、３ｎｇのβアレスチン２−ＲｌｕｃＩＩ（図１９Ｃ及び１９Ｅ）＋４．８ｎｇのｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ（Ｋｒａｓ）＋１０ｎｇのＶ２Ｒ（図１９Ｉ）、または４０ｎｇのβ２ＡＲ（図１９Ｈ）を形質移入した。形質移入の４８時間後、細胞を洗浄し、９６ウェルの半分を、１００ｎＭのＡＶＰ（図１９Ｈ）または１μＭのイソプロテレノール（図１９Ｈ）により、プレートの残りの半分をビヒクルにより、３７℃で１０分間刺激した。次にＣｏｅｌ−４００ａを最終濃度の２．５μＭで加え、更に５分間インキュベートした。ＢＲＥＴをＴｒｉｓｔａｒ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の使用により３７℃で測定した。Ｚ’値を、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｚｈａｎｇ，Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）により記載されたように計算した。図１９Ｊ及び１９Ｇでは、Ｈｅｋ２９３ＳＬ細胞を、１００ｍｍの皿に播種し、その翌日、細胞に、６００ｎｇのＡＴ１Ｒと共に９０ｎｇのβアレスチン２−ＲｌｕｃＩＩ及び４８０のｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ（Ｋｒａｓ）を、前に記載されたリン酸カルシウム方法により形質移入した（図１９Ｊ）。形質移入の２４時間後、細胞を９６ウェルプレートで再平板培養し、その翌日、ＢＲＥＴ測定の前に、細胞を洗浄し、９６ウェルプレートの半分を１００ｎＭのＡｎｇＩＩ（図１９Ｊ）及びプレートの残りの半分をビヒクルにより、室温で６分間刺激した。（図１９Ｇ）ＨＥｋ２９３ＳＬ細胞には、１００ｍｍの皿において、Ｌｙｎ−ｒＧＦＰ（４８０ｎｇ）、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ（４８０ｎｇ）またはＧＦＰ１０−ＣＡＡＸ（４８０ｎｇ）のいずれかと共に、ＡＴ１Ｒ（６００ｎｇ）及びβアレスチン２−ＲｌｕｃＩＩ（９０ｎｇ）を形質移入した。翌日、細胞を、９６ウェルプレートで再平板培養した。形質移入の４８時間後、細胞を、ＢＲＥＴ測定の前に様々な濃度のＡｎｇＩＩにより６分間刺激した。セレンテラジン４００ａ（最終濃度５μＭ）を、２分間のＡｎｇＩＩ刺激の後に加えた。ＢＲＥＴは、Ｓｙｎｅｒｇｙ２（ＢｉｏＴｅｋ（登録商標））マイクロプレート読み取り機を使用して室温で測定した。Ｚ’値を、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｚｈａｎｇ，Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）により記載されたように計算した。
【０１８０】
βアレスチン動員単分子センサー。図２１Ｂでは、ＰＥＩ：ＤＮＡの３：１の比のｓｓＤＮＡ及びＰＥＩにより１μｇに補完された、２００ｎｇのＶ２Ｒ−ｐＲＫ５、５０ｎｇのβ２ＡＲの、異なるリンカーを有する単分子センサーを、１．２ｍｌのＨＥＫ２９３ＳＬに加えた。細胞を、ポリ−Ｄ−リシン前処理プレートに播種した。形質移入の４８時間後、細胞を洗浄し、タイロード液＋１ｍＭのＣａＣｌ２により３７℃で６０分間プレインキュベートし、次にＡＶＰ（１００ｎＭ）により３７℃で１０分間処理した。セレンテラジン４００ａ（Ｃｏｅｌ−４００ａ）（Ｂｉｏｔｉｕｍ）を最終濃度の２．５μＭで加え、更に５分間インキュベートした。ＢＲＥＴ比をＭｉｔｈｒａｓ  ＬＢ９４０  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の使用により３７℃で測定した。１×の形質移入：図２１Ｃでは、ＰＥＩ：ＤＮＡの３：１の比のｓｓＤＮＡ及びＰＥＩにより４μｇに補完された、４００ｎｇのｓｐｈＡＴ１Ｒ、２００ｎｇのβ２ＡＲの、２００個の残基長さのリンカーを有する単分子センサーを、７ｍｌのＨＥＫ２９３ＳＬに加えた。細胞を、ポリ−Ｄ−リシン前処理プレートに播種した。形質移入の４８時間後、細胞を洗浄し、タイロード液＋１ｍＭのＣａＣｌ２により３７℃で６０分間プレインキュベートし、次に異なる濃度のリガンドにより３７℃で５分間処理した。セレンテラジン４００ａ（Ｃｏｅｌ−４００ａ）（Ｂｉｏｔｉｕｍ）を最終濃度の２．５μＭで加え、更に５分間インキュベートした。ＢＲＥＴ比をＭｉｔｈｒａｓ  ＬＢ９４０  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の使用により３７℃で測定した。
【０１８１】
単分子ＤＡＧセンサー。図２２Ｂ及びＣでは、ｈＡｔ１ＡＲ（約５０ｆｍｏｌ／ｍｇ）を安定して発現するＨＥＫ２９３ＳＬ細胞を、１０％ＦＢＳ及び２０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを補充したＤＭＥＭにおいて培養し、７５，０００細胞／１００ｍｍ皿の密度で播種し、翌日に、前に記載されたリン酸カルシウム方法を使用して、ＤＡＧ単分子センサーをコードする１５０ｎｇの構築物を一時的に形質移入した。形質移入の４８時間後、細胞を洗浄し、Ｃｏｅｌ−４００ａを最終濃度の５μＭまで加え、３分間インキュベートした。図２２Ｂでは、ＢＲＥＴを４秒毎に測定し、次にＡｎｇＩＩを６４秒の時点で、最終濃度の１００ｎＭで加え、作動薬促進刺激の動力学を評価した。データは、代表的な実験の三連の平均±ＳＤである。図２２Ｃでは、細胞を、ＢＲＥＴ測定の１分前に、示されている濃度のＡｎｇＩＩで刺激した。データは、６回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．である。図２２Ｄ及びＥでは、ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞に、ｆｕｇｅｎｅ：ＤＮＡの２：１比を用いるＲｏｃｈｅのプロトコールに従って、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤを形質移入した。ｓｓＤＮＡにより１ｕｇに補完された、単分子センサーをコードする１０ｎｇの構築物及び４００ｎｇの受容体（図２２ＤではＦＰ、２２ＥではＧＰＲ１４）を、６ウェルプレートの１ウェル毎に形質移入した。形質移入の４８時間後、細胞を洗浄し、タイロード緩衝液中で１時間インキュベートした。次に細胞を、それぞれのリガンド（図２２ＤではＰＧＦ２α及びＰＧＥ２、２２ＥではウロテンシンＩＩ）により、示された用量で１分間刺激し、次にＣｏｅｌ−４００ａを最終濃度の２．５μＭで更に５分間加えた。図２２Ｆでは、細胞に図２２Ｄと同様に形質移入したが、構築物をコードする単分子ＤＡＧセンサーのみを用いた。形質移入の４８時間後、細胞を洗浄し、タイロード緩衝液中で１時間インキュベートした。Ｃｏｅｌ−４００ａを最終濃度の２．５μＭで更に５分間加えた。次に細胞を、５μＭのｍ−３ｍ３ＦＢＳまたはビヒクルのみにより示された時間にわたって刺激した。図２２Ｇ及び２２Ｈでは、細胞に、図２２Ｅ及び２２Ｄと同様にそれぞれ形質移入した。形質移入の４８時間後、細胞を洗浄し、タイロード緩衝液中で１時間インキュベートした。９６ウェルプレートの半分のウェルを１００ｎＭのリガンド（図２２ＨではＰＧＦ２α、２２ＧではウロテンシンＩＩ）により１分間刺激し、残りの半分はビヒクルで刺激した。次にＣｏｅｌ−４００ａを最終濃度の２．５μＭで、更なる５分間のインキュベーションのために加えた。図２２Ｄ〜２２Ｈでは、ＢＲＥＴ比をＭｉｔｈｒａｓ  ＬＢ９４０  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の使用により３７℃で測定した。
【０１８２】
ｒＧＦＰマーカーへのＣ１ｂ動員に基づいたＤＡＧセンサー。図２３Ｂ〜Ｄでは、ＨＥＫ２９３細胞に、既に記載されているＰＥＩを使用して、１００ｎｇのＲｌｕｃＩＩ−Ｃ１ｂ、５００ｎｇのｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ（Ｋｒａｓ）及び１００ｎｇの、ヒトヒスタミン１型（Ｈ１Ｒ、Ｇｑ共役型受容体）、ヒトブラジキニン２型（ＢＫＲＢ２、Ｇｑ共役型受容体）、ヒトドーパミン２型（Ｄ２Ｒ、Ｇｉ共役型受容体、陰性対照として使用）の受容体のいずれかを形質移入し、ｓｓＤＮＡにより１μｇに補完された。形質移入の４８時間後、細胞を洗浄し、タイロード緩衝液中において室温で１時間インキュベートした。細胞を、示された用量の対応する作動薬（Ｈ１Ｒにはヒスタミン、ＢＫＲＢ２にはカリジン及びＤ２Ｒにはドーパミン）と共に５分間インキュベートした。次にＰｒｏｌｕｍｅ  Ｐｕｒｐｌｅ（商標）を最終２μＭで更に５分間加えた。ＢＲＥＴ測定を、Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｎｅｏ  Ｍｕｌｔｉ−Ｍｏｄｅ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ）の使用によって実施した。図２３Ｅでは、ＰＥＩ：ＤＮＡの３：１の比のｓｓＤＮＡ及びＰＥＩにより１μｇに補完された、１００ｎｇのβ２ＡＲ、２０ｎｇのＲｌｕｃＩＩ−Ｃ１ｂ、４００ｎｇのｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ（Ｋｒａｓ）及び１００ｎｇのＷＴ  Ｇα１５または１００ｎｇの空ベクター（Ｍｏｃｋ）のいずれかを、１．２ｍｌのＨＥＫ２９３ＳＬ（３５００００細胞／ｍｌ）に加える。細胞を、ポリ−Ｄ−リシン前処理プレートに播種した。形質移入の４８時間後、細胞を洗浄し、タイロード液＋１ｍＭのＣａＣｌ２により３７℃で６０分間プレインキュベートした。次にセレンテラジン４００ａを最終濃度の２．５μＭで加え、６分間インキュベートした。次に細胞を、示された用量のイソプロテレノールで１分間処理した。ＢＲＥＴをＴｒｉｓｔａｒ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の使用により３７℃で測定した。
【０１８３】
Ｇタンパク質移行に基づいたセンサー。図２４Ｂ〜Ｄでは、ＰＥＩ：ＤＮＡの３：１の比のｓｓＤＮＡ及びＰＥＩにより１μｇに補完された、１００ｎｇのＨａ−β１ＡＲまたはＨＡ−β２ＡＲ、５ｎｇの示されたＲｌｕｃＩＩ−Ｇγ、１００ｎｇのＷＴ  Ｇα１５、１００ｎｇのＷＴ  Ｇβ１、２００ｎｇのｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ（Ｋｒａｓ）を、１．２ｍｌのＨｅｋ２９３ＳＬ（３５０，０００細胞／ｍｌ）（図２４Ｂ及びＣ）または２×〜３ｍｌのＨＥＫ２９３ＳＬ（３５０，０００細胞／ｍｌ）（図２４Ｄ）に加える。細胞を、ポリ−Ｄ−リシン前処理プレートに播種した。形質移入の４８時間後、細胞を洗浄し、タイロード液＋１ｍＭのＣａＣｌ２により３７℃で６０分間プレインキュベートした。次にセレンテラジン４００ａを最終濃度の２．５μＭで加え、６分間インキュベートした。次に細胞を、１μＭ（図２４Ｂ及びＣ）または示された用量（図２４Ｄ）のイソプロテレノールのいずれかによって２分間処理した。ＢＲＥＴをＴｒｉｓｔａｒ（登録商標）Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の使用により３７℃で測定した。図２４Ｅ〜Ｇでは、ＰＥＩ：ＤＮＡの３：１の比のｓｓＤＮＡ及びＰＥＩにより１μｇに補完された、１００ｎｇのＨＡ−β１ＡＲ、３０ｎｇのＧαｓ  ｐｏｓ６７ＲｌｕｃＩＩまたはＧα１２  ｐｏｓ８４ＲｌｕｃＩＩ、１００ｎｇのＷＴ  Ｇγ５、１００ｎｇのＷＴ  Ｇβ１、４００ｎｇのｒＧＦＰ−ＣＡＡＸまたはゴルジマーカー（ｅＮＯＳ（１−７３）−ｒＧＦＰ）を、２×〜３ｍｌのＨＥＫ２９３ＳＬ（３５０，０００細胞／ｍｌ）に加える。細胞を、ポリ−Ｄ−リシン前処理プレートに播種した。形質移入の４８時間後、細胞を洗浄し、タイロード液＋１ｍＭのＣａＣｌ２により３７℃で６０分間プレインキュベートした。次にＰｒｏｌｕｍｅ  Ｐｕｒｐｌｅ（商標）を最終濃度の２μＭで加え、６分間インキュベートした。次に細胞を、イソプロテレノールの１μＭで示された時間にわたって（図２４Ｆ）、または示された用量（図２４Ｅ及びＧ）によって４分間処理した、またはしなかった。ＢＲＥＴをＴｒｉｓｔａｒ（登録商標）Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の使用により３７℃で測定した。図２４Ｈでは、ＰＥＩ：ＤＮＡの３：１の比のｓｓＤＮＡ及びＰＥＩにより１μｇに補完された、２００ｎｇのＴＰαＲ、３０ｎｇのＧαｑ  ｐｏｓ１１８ＲｌｕｃＩＩ、１００ｎｇのＷＴ  Ｇγ５、１００ｎｇのＷＴ  Ｇβ１、４００ｎｇのｒＧＦＰ−ＣＡＡＸまたはゴルジマーカー（ｅＮＯＳ（１−７３）−ｒＧＦＰ）を、１．２ｍｌのＨＥＫ２９３ＳＬ（３５０，０００細胞／ｍｌ）に加える。細胞を、ポリ−Ｄ−リシン前処理プレートに播種した。形質移入の４８時間後、細胞を洗浄し、タイロード液＋１ｍＭのＣａＣｌ２により３７℃で６０分間プレインキュベートした。１００ｎＭのＵｂｏ−Ｑｉｃと共に、または伴わないで２０分間インキュベートした。次に細胞を、示された用量のＵ４６６１９で６分間処理した。次にＣｏｅｌ−４００ａを最終濃度の２．５μＭで加え、更に５分間インキュベートした。ＢＲＥＴをＴｒｉｓｔａｒ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｅｒ���ｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の使用により３７℃で測定した。
【０１８４】
ＰＫＮに基づいたＲｈｏＡ活性化アッセイ。図２５Ｂ〜Ｄでは、ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞を、６％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び２０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを補充したＤＭＥＭにおいて３７℃で増殖させた。細胞を、１００ｍｍ皿毎に７．５×１０５細胞の密度で播種し、翌日に、前に記載されたリン酸カルシウム方法を使用して、ＰＫＮ−ｃｒｉｂ−ＲｌｕｃＩＩ（９０ｎｇ）及びｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ（４８０ｎｇ）と共に、ＡＴ１Ｒ（３μｇ）をコードする構築物により一時的に形質移入した。２４時間後、細胞を脱離させ、ポリオルニチン被覆９６ウェル白色プレートに、ウェル１つあたり培地中２５０００細胞の密度で播種した。翌日に、細胞をタイロード緩衝液で１回洗浄し、８０μｌのタイロード緩衝液中に３７℃で放置した。示された場合は、細胞をＵｂｏ−Ｑｉｃの１００ｎＭで３０分間、またはＣ３毒素の３μｇ／ｍｌ（図２５Ｉ）により３７℃で４時間処理した。細胞の刺激及びＢＲＥＴ測定を、室温で実施した。ＢＲＥＴシグナルは、Ｃｏｅｌ−４００ａを最終濃度の５μＭまで添加し、Ｓｙｎｅｒｇｙ２（ＢｉｏＴｅｋ（登録商標））マイクロプレート読み取り機を使用してモニターした。フィルターセットは、ＲｌｕｃＩＩのＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（供与体）及びｒＧＦＰ（受容体）発光を検出するため、４１０±８０ｎｍ及び５１５±３０ｎｍであった。図２５Ｂでは、ＰＥＩ：ＤＮＡの３：１の比のｓｓＤＮＡ及びＰＥＩにより２μｇに補完された、２００ｎｇのＴＰαＲ、２０ｎｇのＰＫＮ−ＲｌｕｃＩＩ、６００ｎｇのＣＡＡＸ−ｒＧＦＰの形質移入ミックスを、３ｍｌのＨｅｋ２９３ＳＬに加える（３５００００細胞／ｍｌ）。細胞を、ポリ−Ｄ−リシン前処理プレートに播種した。形質移入の４８時間後、細胞を洗浄し、タイロード液＋１ｍＭのＣａＣｌ２により３７℃で３０分間プレインキュベートし、次に最終濃度の２．５μＭでＣｏｅｌ−４００ａと共にプレインキュベートし、６分間インキュベートした。細胞を、示された用量のＵ４６６１９により２分間刺激した。ＢＲＥＴを、ＢＲＥＴ４００−ＧＦＰ２／１０フィルターセット（受容体、５１５±２０ｎｍ及び供与体、４００±７０ｎｍのフィルター）を備えた、Ｔｒｉｓｔａｒ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の使用により３７℃で測定した。図２５Ｉ及びＪでは、ＰＥＩ：ＤＮＡの３：１の比のｓｓＤＮＡ及びＰＥＩにより２μｇに補完された、２００ｎｇのＴＰαＲ、２０ｎｇのＰＫＮ−ＲｌｕｃＩＩ、６００ｎｇのＣＡＡＸ−ｒＧＦＰの形質移入ミックスを、３ｍｌのＨｅｋ２９３ＳＬに加える（３５０，０００細胞／ｍｌ）。細胞を、ポリ−Ｄ−リシン前処理プレートに播種した。形質移入の２４時間後、示される場合にはＲｈｏ阻害剤（ＣＴ０４、Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ，Ｉｎｃ）を、最終濃度の２μｇ／ｍｌで一晩加えた。形質移入の４８時間後、細胞を洗浄し、タイロード液＋１ｍＭのＣａＣｌ２により３７℃で６０分間プレインキュベートし、次に、示されたように、１００ｎＭのＵ４６６１９または１μｇ／ｍｌのＲｈｏ活性化剤ＩＩ（ＣＮ０３、Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ，Ｉｎｃ）により３７℃で１分間処理した。次にＣｏｅｌ−４００ａを��終濃度の２．５μＭで加え、更に５分間インキュベートした。ＢＲＥＴをＴｒｉｓｔａｒ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の使用により３７℃で測定した。
【０１８５】
無傷細胞の［１２５Ｉ］−ＡｎｇＩＩ結合。［１２５Ｉ］−ＡｎｇＩＩをＩｏｄｏｇｅｎ方法によって調製し、その比放射能は、以前に記載されている自己置換及び飽和実験（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｂｅａｕｔｒａｉｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）によって決定した。細胞表面受容体の密度は、［１２５Ｉ］−ＡｎｇＩＩをトレーサーとして使用する４℃での結合アッセイによって評価した。ＡＴ１ＲまたはＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩのいずれかを発現するＨＥＫ２９３ＳＬ細胞を、形質移入の１日後に、ポリオルニチン被覆２４ウェルプレートのウェル１つあたり約１２０，０００個の細胞の密度で播種した。翌日に、細胞を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳを有する予熱したＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ−Ｈ）で１回洗浄し、次に１００ｎＭのＡｎｇＩＩの不在下または存在下においてＤＭＥＭ−Ｈ中に３７℃で３０分間インキュベートした。プレートを氷冷酸（５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ４．０）によりそれぞれ５分間かけて氷上で３回素早く洗浄して、刺激を停止させ、残留した表面結合及び非結合ＡｎｇＩＩリガンドの両方を除去した。残有酸を除去及び中和するため、細胞を氷冷タイロード緩衝液により更に２回洗浄した。次に細胞を、結合緩衝液（０．２％ＢＳＡ、５０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ２、５ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４）中０．５ｍｌの［１２５Ｉ］−ＡｎｇＩＩ（約２５０，０００ｃｐｍ）と共に４℃で一晩インキュベートした。非特異的結合は、１μＭのＡｎｇＩＩの存在下で決定した。翌日、細胞を、カルシウム及びマグネシウムを有する氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、０．５ｍｌの０．５Ｎ  ＮａＯＨ／０．０５％ＳＤＳを加えた。放射能は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）１４７０自動γ計数器を使用して数えた。タンパク質量は、製造会社の使用説明書に従い、いくらかの変更を加えて、Ｂｉｏ−ｒａｄ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙキットによって測定した。簡潔には、放射標識ＡｎｇＩＩを伴うことなくインキュベートする以外は細胞を上記と同じように処理し、次に、洗浄した後、ＮａＯＨ／ＳＤＳの代わりに、２ｍｌの希釈Ｐｒｏｔｅｉｎアッセイ試薬を加えた。ピペットを使用して混合した後、試料をプラスチックキュベットに移し、吸光度を５９５ｎｍで測定した。
【０１８６】
共焦点顕微鏡検査法。形質移入の１日前に、ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞を、３５ｍｍガラス底皿に１００，０００細胞／皿の密度で播種した。細胞に、Ｂ２Ｒ−ＣＦＰ、ＬＹＮ−ｒＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥを一時的に形質移入した。形質移入の４８時間後、細胞を３０分間にわたって血清飢餓にし、未処理（無処理）のまま放置した、またはブラジキニン（１μＭ）で１５分間処理した。試料を、アルゴン（５１４ｎｍ）及びＨｅＮｅ  Ｉ（５４３ｎｍ）レーザーを使用するＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ−５１０  Ｍｅｔａレーザー走査顕微鏡により分析し、画像（２０４８×２０４８画素）を、６３×油浸レンズの使用により収集した。ＣＦＰ及びＧＦＰを検出するため、ＵＶ及びアルゴンレーザーは、４０５ｎｍ及び５１４ｎｍの励起フィルター、ならびにＢＰ４２０〜４８０ｎｍまたはＢＰ５０５〜５５０ｎｍの発光フィルターをそれぞれ使用した。ｍＣｈｅｒｒｙ検出では、ＨｅＮｅレーザーは、５４３ｎｍの励起フィルター及びＬＰ５６０ｎｍの発光フィルターのセットを使用した。
【０１８７】
ＢＲＥＴ顕微鏡検査法／画像化。ＨＥＫ２９３Ｓ細胞を、１０％ＦＢＳ、１００単位／ｍｌのペニシリン及び０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭにおいて培養し、ポリ−Ｄ−リシン被覆ガラス底３５ｍｍ培養皿に１〜２×１０５細胞／皿の密度で平板培養した。翌日、細胞に、製造会社プロトコールに従って、皿１つあたり１μｇのＤＮＡ及び３μｌの試薬を使用するＸ−ｔｒｅｍｅ  ＧＥＮＥ  ＨＰ試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、ＲｌｕｃＩＩ融合（ＢＲＥＴ供与体）及びｒＧＦＰ融合（ＢＲＥＴ受容体）構築物を形質移入した。図２６Ａ及び２６Ｂ（発光スペクトル測定）では、細胞に、Ｖｅｎｕｓ、ＧＦＰ２またはｒＧＦＰにＮ末端が融合したＲＬｕｃＩＩを１００ｇ／皿により形質移入した。細胞を、５ｍＭのＥＤＴＡを補充した１ｍｌのＰＢＳの添加により培養物表面から脱離させ、ＰＢＳに再懸濁する。ルシフェラーゼ基質として、１μＭのＰｒｏｌｕｍｅ  Ｐｕｒｐｌｅ（Ｎａｎｏｌｉｇｈｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を加え、発光スペクトルを、基質を添加した２分後にＳｙｎｅｒｇｙ  Ｎｅｏプレート読み取り機（ＢｉｏＴｅｋ）により得た。図２６Ｃ（発光顕微鏡検査法）では、細胞に、１００ｎｇ／皿のＨＡ−β２ＡＲ、５０ｎｇ／皿のβアレスチン２−ＲｌｕｃＩＩ及び５００ｎｇ／皿のｒＧＦＰ−ＣＡＡＸを形質移入した。細胞を、１ｍｌの改変ハンクス平衡塩溶液（１３８ｍＭのＮａＣｌ、５．３３ｍＭのＫＣｌ、０．４４ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．３３ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、４．１６ｍＭのＮａＨＣＯ３、１．０ｍＭのＣａＣｌ２、１．０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）で１回洗浄し、顕微鏡に設置した。１０μＭのＰｒｏｌｕｍｅ  Ｐｕｒｐｌｅ（ＮａｎｏＬｉｇｈｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を皿に添加した。ＢＲＥＴ画像は、フィルター交換器（Ｌａｍｂｄａ１０−２，Ｓｕｔｔｅｒ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を有する６０×対物（Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ  ＴＩＲＦ，ＮＡ１．４９，Ｎｉｋｏｎ）及び画像化カメラ（ＰＩＸＩＳ１０２４，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を備えた、Ｎｉｋｏｎ（登録商標）Ｔｉ−Ｕ顕微鏡を使用して得た。セレンテラジンを加えた直後に、カメラのシャッターを閉じて、空白画像を９０秒間かけて得た。次に画像を、ＢＲＥＴ供与体（４１０／８０ｎｍ）及びＢＲＥＴ受容体（４８０ＬＰまたは５１０／４０ｎｍ）波長に対応するフィルターをそれぞれ９０秒間用いて得た。画像を５分毎に得て、空白画像値を、ＢＲＥＴ供与体及び受容体画像の対応する画素から差し引いて、カメラの暗電流及び標本化雑音からもたらされる光子計数を除去した。それぞれの時点において、ＢＲＥＴ比の画像を、以下のＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウエア、バージョン７．８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）の画素算術関数を使用して生成した。画素色相：受容体画像の計数を供与体画像で割り、初期設定の虹色の色相（紫色が最低（典型的には、０．０）、赤色が最高（典型的には、２．０））に配分することにより計算されたＢＲＥＴレベル、画素明度：自動明度による供与体画像の値。
【０１８８】
Ｚ’値の決定。ＢＲＥＴ１及びＢＲＥＴ２アッセイは、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ構築物及びｈＭＣ４Ｒ  ｗｔ−ＲｌｕｃＩＩまたはｈＭＣ４Ｒ（Ｒ１６５Ｑ）−ＲｌｕｃＩＩ構築物が同時形質移入され（図１５Ａ〜１５Ｄに示されている）、９６ウェルプレートの半分が、薬理学的シャペロン（１０ｕＭのＤＣＰＭＰ）により、プレートのもう半分が対応するビヒクル（ＤＭＳＯ）により処理された、細胞において実施した。Ｚ’値を、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｚｈａｎｇ，Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）により記載されたように計算した。０．４を超えるＺ’値は、堅牢なアッセイであるとみなされる。
【０１８９】
ＤＭＳＯに対する抵抗性の評価。リガンド及び化合物ライブラリーは、多くの場合にＤＭＳＯに溶解されている。細胞表面を評価するＢＲＥＴに基づいたアッセイが、化合物ライブラリーから選択されたリガンドの用量応答曲線に通常は到達するＤＭＳＯの濃度に感受性があるかを評価するため、形質移入された細胞を、図１６に示されているように、異なる濃度のＤＭＳＯを含有するウェルにおいて１０ｕＭのＤＣＰＭＰにより、またはビヒクル（ＤＭＳＯ）により処理した。次にＢＲＥＴ値を以前に記載されたようにして得た。
【０１９０】
データ分析。リガンド媒介エンドソーシスのｔ１／２及びＥＣ５０値の推定値は、ＧｒａｐｈＰａｄ（登録商標）Ｐｒｉｓｍ曲線当てはめプログラムを使用して計算した。この研究の全体を通して提示される曲線は、最良適合を表しており、同様にこのＧｒａｐｈＰａｄ（登録商標）Ｐｒｉｓｍプログラムを使用して生成した。
【０１９１】
配列：本明細書において使用されるポリペプチド及び構築物のアミノ酸配列を、下記に描写する。
ＲｌｕｃＩＩ
ＭＴＳＫＶＹＤＰＥＱＲＫＲＭＩＴＧＰＱＷＷＡＲＣＫＱＭＮＶＬＤＳＦＩＮＹＹＤＳＥＫＨＡＥＮＡＶＩＦＬＨＧＮＡＴＳＳＹＬＷＲＨＶＶＰＨＩＥＰＶＡＲＣＩＩＰＤＬＩＧＭＧＫＳＧＫＳＧＮＧＳＹＲＬＬＤＨＹＫＹＬＴＡＷＦＥＬＬＮＬＰＫＫＩＩＦＶＧＨＤＷＧＡＡＬＡＦＨＹＳＹＥＨＱＤＫＩＫＡＩＶＨＡＥＳＶＶＤＶＩＥＳＷＤＥＷＰＤＩＥＥＤＩＡＬＩＫＳＥＥＧＥＫＭＶＬＥＮＮＦＦＶＥＴＶＬＰＳＫＩＭＲＫＬＥＰＥＥＦＡＡＹＬＥＰＦＫＥＫＧＥＶＲＲＰＴＬＳＷＰＲＥＩＰＬＶＫＧＧＫＰＤＶＶＱＩＶＲＮＹＮＡＹＬＲＡＳＤＤＬＰＫＭＦＩＥＳＤＰＧＦＦＳＮＡＩＶＥＧＡＫＫＦＰＮＴＥＦＶＫＶＫＧＬＨＦＳＱＥＤＡＰＤＥＭＧＫＹＩＫＳＦＶＥＲＶＬＫＮＥＱ（配列番号１０）
ｒＧＦＰ：Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ緑色蛍光タンパク質
ＭＤＬＡＫＬＧＬＫＥＶＭＰＴＫＩＮＬＥＧＬＶＧＤＨＡＦＳＭＥＧＶＧＥＧＮＩＬＥＧＴＱＥＶＫＩＳＶＴＫＧＡＰＬＰＦＡＦＤＩＶＳＶＡＦＳＹＧＮＲＡＹＴＧＹＰＥＥＩＳＤＹＦＬＱＳＦＰＥＧＦＴＹＥＲＮＩＲＹＱＤＧＧＴＡＩＶＫＳＤＩＳＬＥＤＧＫＦＩＶＮＶＤＦＫＡＫＤＬＲＲＭＧＰＶＭＱＱＤＩＶＧＭＱＰＳＹＥＳＭＹＴＮＶＴＳＶＩＧＥＣＩＩＡＦＫＬＱＴＧＫＨＦＴＹＨＭＲＴＶＹＫＳＫＫＰＶＥＴＭＰＬＹＨＦＩＱＨＲＬＶＫＴＮＶＤＴＡＳＧＹＶＶＱＨＥＴＡＩＡＡＨＳＴＩＫＫＩＥＧＳＬＰ（配列番号１１）
ＧＦＰ１０
ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＬＳＹＧＶＱＣＦＳＲＹＰＤＨＭＫＱＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＦＦＫＤＤＧＮＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＹＮＰＨＮＶＹＩＭＡＤＫＱＫＮＧＩＫＶＮＦＫＩＲＨＮＩＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＦＴＱＳＡＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＬＧＭＤＥＬＹＫ（配列番号１２）
ｈＭＣ４Ｒ  ＷＴ：ヒト野生型メラノコルチン４受容体
ＭＶＮＳＴＨＲＧＭＨＴＳＬＨＬＷＮＲＳＳＹＲＬＨＳＮＡＳＥＳＬＧＫＧＹＳＤＧＧＣＹＥＱＬＦＶＳＰＥＶＦＶＴＬＧＶＩＳＬＬＥＮＩＬＶＩＶＡＩＡＫＮＫＮＬＨＳＰＭＹＦＦＩＣＳＬＡＶＡＤＭＬＶＳＶＳＮＧＳＥＴＩＶＩＴＬＬＮＳＴＤＴＤＡＱＳＦＴＶＮＩＤＮＶＩＤＳＶＩＣＳＳＬＬＡＳＩＣＳＬＬＳＩＡＶＤＲＹＦＴＩＦＹＡＬＱＹＨＮＩＭＴＶＫＲＶＧＩＩＩＳＣＩＷＡＡＣＴＶＳＧＩＬＦＩＩＹＳＤＳＳＡＶＩＩＣＬＩＴＭＦＦＴＭＬＡＬＭＡＳＬＹＶＨＭＦＬＭＡＲＬＨＩＫＲＩＡＶＬＰＧＴＧＡＩＲＱＧＡＮＭＫＧＡＩＴＬＴＩＬＩＧＶＦＶＶＣＷＡＰＦＦＬＨＬＩＦＹＩＳＣＰＱＮＰＹＣＶＣＦＭＳＨＦＮＬＹＬＩＬＩＭＣＮＳＩＩＤＰＬＩＹＡＬＲＳＱＥＬＲＫＴＦＫＥＩＩＣＣＹＰＬＧＧＬＣＤＬＳＳＲＹ（配列番号１３）
ｈＭＣ４Ｒ（Ｒ１６５Ｑ）：突然変異Ｒ１６５Ｑ−ｈＭＣ４Ｒ、細胞内に留まり、ＰＣ救出可能
ＭＶＮＳＴＨＲＧＭＨＴＳＬＨＬＷＮＲＳＳＹＲＬＨＳＮＡＳＥＳＬＧＫＧＹＳＤＧＧＣＹＥＱＬＦＶＳＰＥＶＦＶＴＬＧＶＩＳＬＬＥＮＩＬＶＩＶＡＩＡＫＮＫＮＬＨＳＰＭＹＦＦＩＣＳＬＡＶＡＤＭＬＶＳＶＳＮＧＳＥＴＩＶＩＴＬＬＮＳＴＤＴＤＡＱＳＦＴＶＮＩＤＮＶＩＤＳＶＩＣＳＳＬＬＡＳＩＣＳＬＬＳＩＡＶＤＲＹＦＴＩＦＹＡＬＱＹＨＮＩＭＴＶＫＱＶＧＩＩＩＳＣＩＷＡＡＣＴＶＳＧＩＬＦＩＩＹＳＤＳＳＡＶＩＩＣＬＩＴＭＦＦＴＭＬＡＬＭＡＳＬＹＶＨＭＦＬＭＡＲＬＨＩＫＲＩＡＶＬＰＧＴＧＡＩＲＱＧＡＮＭＫＧＡＩＴＬＴＩＬＩＧＶＦＶＶＣＷＡＰＦＦＬＨＬＩＦＹＩＳＣＰＱＮＰＹＣＶＣＦＭＳＨＦＮＬＹＬＩＬＩＭＣＮＳＩＩＤＰＬＩＹＡＬＲＳＱＥＬＲＫＴＦＫＥＩＩＣＣＹＰＬＧＧＬＣＤＬＳＳＲＹ（配列番号１４）
ｈＭＣ４Ｒ（Ｐ２９９Ｈ）：突然変異Ｐ２９９Ｈ−ｈＭＣ４Ｒ、細胞内に留まり、大部分がＰＣ救出不可能
ＭＶＮＳＴＨＲＧＭＨＴＳＬＨＬＷＮＲＳＳＹＲＬＨＳＮＡＳＥＳＬＧＫＧＹＳＤＧＧＣＹＥＱＬＦＶＳＰＥＶＦＶＴＬＧＶＩＳＬＬＥＮＩＬＶＩＶＡＩＡＫＮＫＮＬＨＳＰＭＹＦＦＩＣＳＬＡＶＡＤＭＬＶＳＶＳＮＧＳＥＴＩＶＩＴＬＬＮＳＴＤＴＤＡＱＳＦＴＶＮＩＤＮＶＩＤＳＶＩＣＳＳＬＬＡＳＩＣＳＬＬＳＩＡＶＤＲＹＦＴＩＦＹＡＬＱＹＨＮＩＭＴＶＫＲＶＧＩＩＩＳＣＩＷＡＡＣＴＶＳＧＩＬＦＩＩＹＳＤＳＳＡＶＩＩＣＬＩＴＭＦＦＴＭＬＡＬＭＡＳＬＹＶＨＭＦＬＭＡＲＬＨＩＫＲＩＡＶＬＰＧＴＧＡＩＲＱＧＡＮＭＫＧＡＩＴＬＴＩＬＩＧＶＦＶＶＣＷＡＰＦＦＬＨＬＩＦＹＩＳＣＰＱＮＰＹＣＶＣＦＭＳＨＦＮＬＹＬＩＬＩＭＣＮＳＩＩＤＨＬＩＹＡＬＲＳＱＥＬＲＫＴＦＫＥＩＩＣＣＹＰＬＧＧＬＣＤＬＳＳＲＹ（配列番号１５）
ｈＶ２Ｒ  ＷＴ：ヒト野生型バソプレシン２受容体
ＭＬＭＡＳＴＴＳＡＶＰＧＨＰＳＬＰＳＬＰＳＮＳＳＱＥＲＰＬＤＴＲＤＰＬＬＡＲＡＥＬＡＬＬＳＩＶＦＶＡＶＡＬＳＮＧＬＶＬＡＡＬＡＲＲＧＲＲＧＨＷＡＰＩＨＶＦＩＧＨＬＣＬＡＤＬＡＶＡＬＦＱＶＬＰＱＬＡＷＫＡＴＤＲＦＲＧＰＤＡＬＣＲＡＶＫＹＬＱＭＶＧＭＹＡＳＳＹＭＩＬＡＭＴＬＤＲＨＲＡＩＣＲＰＭＬＡＹＲＨＧＳＧＡＨＷＮＲＰＶＬＶＡＷＡＦＳＬＬＬＳＬＰＱＬＦＩＦＡＱＲＮＶＥＧＧＳＧＶＴＤＣＷＡＣＦＡＥＰＷＧＲＲＴＹＶＴＷＩＡＬＭＶＦＶＡＰＴＬＧＩＡＡＣＱＶＬＩＦＲＥＩＨＡＳＬＶＰＧＰＳＥＲＰＧＧＲＲＲＧＲＲＴＧＳＰＧＥＧＡＨＶＳＡＡＶＡＫＴＶＲＭＴＬＶＩＶＶＶＹＶＬＣＷＡＰＦＦＬＶＱＬＷＡＡＷＤＰＥＡＰＬＥＧＡＰＦＶＬＬＭＬＬＡＳＬＮＳＣＴＮＰＷＩＹＡＳＦＳＳＳＶＳＳＥＬＲＳＬＬＣＣＡＲＧＲＴＰＰＳＬＧＰＱＤＥＳＣＴＴＡＳＳＳＬＡＫＤＴＳＳ（配列番号１６）
ｈＶ２Ｒ（Ｙ１２８Ｓ）：突然変異Ｙ１２８Ｓ−ｈＶ２Ｒ、細胞内に留まり、ＰＣ救出可能
ＭＬＭＡＳＴＴＳＡＶＰＧＨＰＳＬＰＳＬＰＳＮＳＳＱＥＲＰＬＤＴＲＤＰＬＬＡＲＡＥＬＡＬＬＳＩＶＦＶＡＶＡＬＳＮＧＬＶＬＡＡＬＡＲＲＧＲＲＧＨＷＡＰＩＨＶＦＩＧＨＬＣＬＡＤＬＡＶＡＬＦＱＶＬＰＱＬＡＷＫＡＴＤＲＦＲＧＰＤＡＬＣＲＡＶＫＹＬＱＭＶＧＭＹＡＳＳＳＭＩＬＡＭＴＬＤＲＨＲＡＩＣＲＰＭＬＡＹＲＨＧＳＧＡＨＷＮＲＰＶＬＶＡＷＡＦＳＬＬＬＳＬＰＱＬＦＩＦＡＱＲＮＶＥＧＧＳＧＶＴＤＣＷＡＣＦＡＥＰＷＧＲＲＴＹＶＴＷＩＡＬＭＶＦＶＡＰＴＬＧＩＡＡＣＱＶＬＩＦＲＥＩＨＡＳＬＶＰＧＰＳＥＲＰＧＧＲＲＲＧＲＲＴＧＳＰＧＥＧＡＨＶＳＡＡＶＡＫＴＶＲＭＴＬＶＩＶＶＶＹＶＬＣＷＡＰＦＦＬＶＱＬＷＡＡＷＤＰＥＡＰＬＥＧＡＰＦＶＬＬＭＬＬＡＳＬＮＳＣＴＮＰＷＩＹＡＳＦＳＳＳＶＳＳＥＬＲＳＬＬＣＣＡＲＧＲＴＰＰＳＬＧＰＱＤＥＳＣＴＴＡＳＳＳＬＡＫＤＴＳＳ（配列番号１７）
ｈＥＲＧ  ＷＴ：ヒト野生型の電位開口型カリウムチャネルＨ２
ＭＰＶＲＲＧＨＶＡＰＱＮＴＦＬＤＴＩＩＲＫＦＥＧＱＳＲＫＦＩＩＡＮＡＲＶＥＮＣＡＶＩＹＣＮＤＧＦＣＥＬＣＧＹＳＲＡＥＶＭＱＲＰＣＴＣＤＦＬＨＧＰＲＴＱＲＲＡＡＡＱＩＡＱＡＬＬＧＡＥＥＲＫＶＥＩＡＦＹＲＫＤＧＳＣＦＬＣＬＶＤＶＶＰＶＫＮＥＤＧＡＶＩＭＦＩＬＮＦＥＶＶＭＥＫＤＭＶＧＳＰＡＨＤＴＮＨＲＧＰＰＴＳＷＬＡＰＧＲＡＫＴＦＲＬＫＬＰＡＬＬＡＬＴＡＲＥＳＳＶＲＳＧＧＡＧＧＡＧＡＰＧＡＶＶＶＤＶＤＬＴＰＡＡＰＳＳＥＳＬＡＬＤＥＶＴＡＭＤＮＨＶＡＧＬＧＰＡＥＥＲＲＡＬＶＧＰＧＳＰＰＲＳＡＰＧＱＬＰＳＰＲＡＨＳＬＮＰＤＡＳＧＳＳＣＳＬＡＲＴＲＳＲＥＳＣＡＳＶＲＲＡＳＳＡＤＤＩＥＡＭＲＡＧＶＬＰＰＰＰＲＨＡＳＴＧＡＭＨＰＬＲＳＧＬＬＮＳＴＳＤＳＤＬＶＲＹＲＴＩＳＫＩＰＱＩＴＬＮＦＶＤＬＫＧＤＰＦＬＡＳＰＴＳＤＲＥＩＩＡＰＫＩＫＥＲＴＨＮＶＴＥＫＶＴＱＶＬＳＬＧＡＤＶＬＰＥＹＫＬＱＡＰＲＩＨＲＷＴＩＬＨＹＳＰＦＫＡＶＷＤＷＬＩＬＬＬＶＩＹＴＡＶＦＴＰＹＳＡＡＦＬＬＫＥＴＥＥＧＰＰＡＴＥＣＧＹＡＣＱＰＬＡＶＶＤＬＩＶＤＩＭＦＩＶＤＩＬＩＮＦＲＴＴＹＶＮＡＮＥＥＶＶＳＨＰＧＲＩＡＶＨＹＦＫＧＷＦＬＩＤＭＶＡＡＩＰＦＤＬＬＩＦＧＳＧＳＥＥＬＩＧＬＬＫＴＡＲＬＬＲＬＶＲＶＡＲＫＬＤＲＹＳＥＹＧＡＡＶＬＦＬＬＭＣＴＦＡＬＩＡＨＷＬＡＣＩＷＹＡＩＧＮＭＥＱＰＨＭＤＳＲＩＧＷＬＨＮＬＧＤＱＩＧＫＰＹＮＳＳＧＬＧＧＰＳＩＫＤＫＹＶＴＡＬＹＦＴＦＳＳＬＴＳＶＧＦＧＮＶＳＰＮＴＮＳＥＫＩＦＳＩＣＶＭＬＩＧＳＬＭＹＡＳＩＦＧＮＶＳＡＩＩＱＲＬＹＳＧＴＡＲＹＨＴＱＭＬＲＶＲＥＦＩＲＦＨＱＩＰＮＰＬＲＱＲＬＥＥＹＦＱＨＡＷＳＹＴＮＧＩＤＭＮＡＶＬＫＧＦＰＥＣＬＱＡＤＩＣＬＨＬＮＲＳＬＬＱＨＣＫＰＦＲＧＡＴＫＧＣＬＲＡＬＡＭＫＦＫＴＴＨＡＰＰＧＤＴＬＶＨＡＧＤＬＬＴＡＬＹＦＩＳＲＧＳＩＥＩＬＲＧＤＶＶＶＡＩＬＧＫＮＤＩＦＧＥＰＬＮＬＹＡＲＰＧＫＳＮＧＤＶＲＡＬＴＹＣＤＬＨＫＩＨＲＤＤＬＬＥＶＬＤＭＹＰＥＦＳＤＨＦＷＳＳＬＥＩＴＦＮＬＲＤＴＮＭＩＰＧＳＰＧＳＴＥＬＥＧＧＦＳＲＱＲＫＲＫＬＳＦＲＲＲＴＤＫＤＴＥＱＰＧＥＶＳＡＬＧＰＧＲＡＧＡＧＰＳＳＲＧＲＰＧＧＰＷＧＥＳＰＳＳＧＰＳＳＰＥＳＳＥＤＥＧＰＧＲＳＳＳＰＬＲＬＶＰＦＳＳＰＲＰＰＧＥＰＰＧＧＥＰＬＭＥＤＣＥＫＳＳＤＴＣＮＰＬＳＧＡＦＳＧＶＳＮＩＦＳＦＷＧＤＳＲＧＲＱＹＱＥＬＰＲＣＰＡＰＴＰＳＬＬＮＩＰＬＳＳＰＧＲＲＰＲＧＤＶＥＳＲＬＤＡＬＱＲＱＬＮＲＬＥＴＲＬＳＡＤＭＡＴＶＬＱＬＬＱＲＱＭＴＬＶＰＰＡＹＳＡＶＴＴＰＧＰＧＰＴＳＴＳＰＬＬＰＶＳＰＬＰＴＬＴＬＤＳＬＳＱＶＳＱＦＭＡＣＥＥＬＰＰＧＡＰＥＬＰＱＥＧＰＴＲＲＬＳＬＰＧＱＬＧＡＬＴＳＱＰＬＨＲＨＧＳＤＰＧＳ（配列番号１８）
ｈＥＲＧ（Ｇ６０１Ｓ）：突然変異Ｇ６０１Ｓ−ｈＥＲＧ、細胞内に留まり、ＰＣ救出可能
ＭＰＶＲＲＧＨＶＡＰＱＮＴＦＬＤＴＩＩＲＫＦＥＧＱＳＲＫＦＩＩＡＮＡＲＶＥＮＣＡＶＩＹＣＮＤＧＦＣＥＬＣＧＹＳＲＡＥＶＭＱＲＰＣＴＣＤＦＬＨＧＰＲＴＱＲＲＡＡＡＱＩＡＱＡＬＬＧＡＥＥＲＫＶＥＩＡＦＹＲＫＤＧＳＣＦＬＣＬＶＤＶＶＰＶＫＮＥＤＧＡＶＩＭＦＩＬＮＦＥＶＶＭＥＫＤＭＶＧＳＰＡＨＤＴＮＨＲＧＰＰＴＳＷＬＡＰＧＲＡＫＴＦＲＬＫＬＰＡＬＬＡＬＴＡＲＥＳＳＶＲＳＧＧＡＧＧＡＧＡＰＧＡＶＶＶＤＶＤＬＴＰＡＡＰＳＳＥＳＬＡＬＤＥＶＴＡＭＤＮＨＶＡＧＬＧＰＡＥＥＲＲＡＬＶＧＰＧＳＰＰＲＳＡＰＧＱＬＰＳＰＲＡＨＳＬＮＰＤＡＳＧＳＳＣＳＬＡＲＴＲＳＲＥＳＣＡＳＶＲＲＡＳＳＡＤＤＩＥＡＭＲＡＧＶＬＰＰＰＰＲＨＡＳＴＧＡＭＨＰＬＲＳＧＬＬＮＳＴＳＤＳＤＬＶＲＹＲＴＩＳＫＩＰＱＩＴＬＮＦＶＤＬＫＧＤＰＦＬＡＳＰＴＳＤＲＥＩＩＡＰＫＩＫＥＲＴＨＮＶＴＥＫＶＴＱＶＬＳＬＧＡＤＶＬＰＥＹＫＬＱＡＰＲＩＨＲＷＴＩＬＨＹＳＰＦＫＡＶＷＤＷＬＩＬＬＬＶＩＹＴＡＶＦＴＰＹＳＡＡＦＬＬＫＥＴＥＥＧＰＰＡＴＥＣＧＹＡＣＱＰＬＡＶＶＤＬＩＶＤＩＭＦＩＶＤＩＬＩＮＦＲＴＴＹＶＮＡＮＥＥＶＶＳＨＰＧＲＩＡＶＨＹＦＫＧＷＦＬＩＤＭＶＡＡＩＰＦＤＬＬＩＦＧＳＧＳＥＥＬＩＧＬＬＫＴＡＲＬＬＲＬＶＲＶＡＲＫＬＤＲＹＳＥＹＧＡＡＶＬＦＬＬＭＣＴＦＡＬＩＡＨＷＬＡＣＩＷＹＡＩＧＮＭＥＱＰＨＭＤＳＲＩＧＷＬＨＮＬＧＤＱＩＧＫＰＹＮＳＳＳＬＧＧＰＳＩＫＤＫＹＶＴＡＬＹＦＴＦＳＳＬＴＳＶＧＦＧＮＶＳＰＮＴＮＳＥＫＩＦＳＩＣＶＭＬＩＧＳＬＭＹＡＳＩＦＧＮＶＳＡＩＩＱＲＬＹＳＧＴＡＲＹＨＴＱＭＬＲＶＲＥＦＩＲＦＨＱＩＰＮＰＬＲＱＲＬＥＥＹＦＱＨＡＷＳＹＴＮＧＩＤＭＮＡＶＬＫＧＦＰＥＣＬＱＡＤＩＣＬＨＬＮＲＳＬＬＱＨＣＫＰＦＲＧＡＴＫＧＣＬＲＡＬＡＭＫＦＫＴＴＨＡＰＰＧＤＴＬＶＨＡＧＤＬＬＴＡＬＹＦＩＳＲＧＳＩＥＩＬＲＧＤＶＶＶＡＩＬＧＫＮＤＩＦＧＥＰＬＮＬＹＡＲＰＧＫＳＮＧＤＶＲＡＬＴＹＣＤＬＨＫＩＨＲＤＤＬＬＥＶＬＤＭＹＰＥＦＳＤＨＦＷＳＳＬＥＩＴＦＮＬＲＤＴＮＭＩＰＧＳＰＧＳＴＥＬＥＧＧＦＳＲＱＲＫＲＫＬＳＦＲＲＲＴＤＫＤＴＥＱＰＧＥＶＳＡＬＧＰＧＲＡＧＡＧＰＳＳＲＧＲＰＧＧＰＷＧＥＳＰＳＳＧＰＳＳＰＥＳＳＥＤＥＧＰＧＲＳＳＳＰＬＲＬＶＰＦＳＳＰＲＰＰＧＥＰＰＧＧＥＰＬＭＥＤＣＥＫＳＳＤＴＣＮＰＬＳＧＡＦＳＧＶＳＮＩＦＳＦＷＧＤＳＲＧＲＱＹＱＥＬＰＲＣＰＡＰＴＰＳＬＬＮＩＰＬＳＳＰＧＲＲＰＲＧＤＶＥＳＲＬＤＡＬＱＲＱＬＮＲＬＥＴＲＬＳＡＤＭＡＴＶＬＱＬＬＱＲＱＭＴＬＶＰＰＡＹＳＡＶＴＴＰＧＰＧＰＴＳＴＳＰＬＬＰＶＳＰＬＰＴＬＴＬＤＳＬＳＱＶＳＱＦＭＡＣＥＥＬＰＰＧＡＰＥＬＰＱＥＧＰＴＲＲＬＳＬＰＧＱＬＧＡＬＴＳＱＰＬＨＲＨＧＳＤＰＧＳ（配列番号１９）
Ｌｙｎ：Ｌｙｎキナーゼのパルミトリル化及びミリストイル化シグナル配列
ＭＧＣＩＫＳＫＧＫＤＳ（配列番号１）
ＣＡＡＸ−Ｋｒａｓ：ｋＲａｓスプライス変異体ｂの形質膜標的化多塩基配列及びプレニル化シグナル配列
ＧＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫＣＶＩＭ（配列番号７）
ＰＢ：ヒトＧＲＫ５の形質膜標的化多塩基配列
ＳＰＫＫＧＬＬＱＲＬＦＫＲＱＨＱＮＮＳＫＳ（配列番号８）
ｅｎｄｏｆｉｎのＦＹＶＥドメイン
ＱＫＱＰＴＷＶＰＤＳＥＡＰＮＣＭＮＣＱＶＫＦＴＦＴＫＲＲＨＨＣＲＡＣＧＫＶＦＣＧＶＣＣＮＲＫＣＫＬＱＹＬＥＫＥＡＲＶＣＶＶＣＹＥＴＩＳＫ（配列番号２０）
Ｒａｂ４
ＭＳＥＴＹＤＦＬＦＫＦＬＶＩＧＮＡＧＴＧＫＳＣＬＬＨＱＦＩＥＫＫＦＫＤＤＳＮＨＴＩＧＶＥＦＧＳＫＩＩＮＶＧＧＫＹＶＫＬＱＩＷＤＴＡＧＱＥＲＦＲＳＶＴＲＳＹＹＲＧＡＡＧＡＬＬＶＹＤＩＴＳＲＥＴＹＮＡＬＴＮＷＬＴＤＡＲＭＬＡＳＱＮＩＶＩＩＬＣＧＮＫＫＤＬＤＡＤＲＥＶＴＦＬＥＡＳＲＦＡＱＥＮＥＬＭＦＬＥＴＳＡＬＴＧＥＮＶＥＥＡＦＶＱＣＡＲＫＩＬＮＫＩＥＳＧＥＬＤＰＥＲＭＧＳＧＩＱＹＧＤＡＡＬＲＱＬＲＳＰＲＲＡＱＡＰＮＡＱＥＣＧＣ（配列番号２１）
Ｒａｂ１１
ＭＧＴＲＤＤＥＹＤＹＬＦＫＶＶＬＩＧＤＳＧＶＧＫＳＮＬＬＳＲＦＴＲＮＥＦＮＬＥＳＫＳＴＩＧＶＥＦＡＴＲＳＩＱＶＤＧＫＴＩＫＡＱＩＷＤＴＡＧＱＥＲＹＲＡＩＴＳＡＹＹＲＧＡＶＧＡＬＬＶＹＤＩＡＫＨＬＴＹＥＮＶＥＲＷＬＫＥＬＲＤＨＡＤＳＮＩＶＩＭＬＶＧＮＫＳＤＬＲＨＬＲＡＶＰＴＤＥＡＲＡＦＡＥＫＮＧＬＳＦＩＥＴＳＡＬＤＳＴＮＶＥＡＡＦＱＴＩＬＴＥＩＹＲＩＶＳＱＫＱＭＳＤＲＲＥＮＤＭＳＰＳＮＮＶＶＰＩＨＶＰＰＴＴＥＮＫＰＫＶＱＣＣＱＮＩ（配列番号２２）
シグナルペプチド−Ｆｌａｇ−ヒトＡＴ１Ｒ（ｓｐＦｌａｇ−ＡＴ１Ｒ）
ＭＫＴＩＩＡＬＳＹＩＦＣＬＶＦＡＤＹＫＤＤＤＤＡＭＩＬＮＳＳＴＥＤＧＩＫＲＩＱＤＤＣＰＫＡＧＲＨＮＹＩＦＶＭＩＰＴＬＹＳＩＩＦＶＶＧＩＦＧＮＳＬＶＶＩＶＩＹＦＹＭＫＬＫＴＶＡＳＶＦＬＬＮＬＡＬＡＤＬＣＦＬＬＴＬＰＬＷＡＶＹＴＡＭＥＹＲＷＰＦＧＮＹＬＣＫＩＡＳＡＳＶＳＦＮＬＹＡＳＶＦＬＬＴＣＬＳＩＤＲＹＬＡＩＶＨＰＭＫＳＲＬＲＲＴＭＬＶＡＫＶＴＣＩＩＩＷＬＬＡＧＬＡＳＬＰＡＩＩＨＲＮＶＦＦＩＥＮＴＮＩＴＶＣＡＦＨＹＥＳＱＮＳＴＬＰＩＧＬＧＬＴＫＮＩＬＧＦＬＦＰＦＬＩＩＬＴＳＹＴＬＩＷＫＡＬＫＫＡＹＥＩＱＫＮＫＰＲＮＤＤＩＦＫＩＩＭＡＩＶＬＦＦＦＦＳＷＩＰＨＱＩＦＴＦＬＤＶＬＩＱＬＧＩＩＲＤＣＲＩＡＤＩＶＤＴＡＭＰＩＴＩＣＩＡＹＦＮＮＣＬＮＰＬＦＹＧＦＬＧＫＫＦＫＲＹＦＬＱＬＬＫＹＩＰＰＫＡＫＳＨＳＮＬＳＴＫＭＳＴＬＳＹＲＰＳＤＮＶＳＳＳＴＫＫＰＡＰＣＦＥＶＥ（配列番号２３）
ｈＧＲＢ２  ｖ１、ヒトＧＲＢ２変異体１
ＭＥＡＩＡＫＹＤＦＫＡＴＡＤＤＥＬＳＦＫＲＧＤＩＬＫＶＬＮＥＥＣＤＱＮＷＹＫＡＥＬＮＧＫＤＧＦＩＰＫＮＹＩＥＭＫＰＨＰＦＧＮＤＶＱＨＦＫＶＬＲＤＧＡＧＫＹＦＬＷＶＶＫＦＮＳＬＮＥＬＶＤＹＨＲＳＴＳＶＳＲＮＱＱＩＦＬＲＤＩＥＱＶＰＱＱＰＴＹＶＱＡＬＦＤＦＤＰＱＥＤＧＥＬＧＦＲＲＧＤＦＩＨＶＭＤＮＳＤＰＮＷＷＫＧＡＣＨＧＱＴＧＭＦＰＲＮＹＶＴＰＶＮＲＮＶ（配列番号２４）
ＰＬＣδ１のＰＨドメイン
ＤＳＧＲＤＦＬＴＬＨＧＬＱＤＤＥＤＬＱＡＬＬＫＧＳＱＬＬＫＶＫＳＳＳＷＲＲＥＲＦＹＫＬＱＥＤＣＫＴＩＷＱＥＳＲＫＶＭＲＴＰＥＳＱＬＦＳＩＥＤＩＱＥＶＲＭＧＨＲＴＥＧＬＥＫＦＡＲＤＶＰＥＤＲＣＦＳＩＶＦＫＤＱＲＮＴＬＤＬＩＡＰＳＰＡＤＡＱＨＷＶＬＧＬＨＫＩＩＨＨＳＧＳＭＤＱＲＱＫＬＱＨＷＩＨＳＣＬＲＫＡＤＫＮＫＤＮＫＭＳＦＫＥＬＱＮＦＬＫＥＬＮＩ（配列番号２５）
ＨＡ標識
ＭＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号２６）
ヒトｅＮＯＳ１の残基１〜７３
ＭＧＮＬＫＳＶＡＱＥＰＧＰＰＣＧＬＧＬＧＬＧＬＧＬＣＧＫＱＧＰＡＴＰＡＰＥＰＳＲＡＰＡＳＬＬＰＰＡＰＥＨＳＰＰＳＳＰＬＴＱＰＰＥＧＰＫＦＰＲＶＫＮ（配列番号４２）
カベオリン１α
ＭＳＧＧＫＹＶＤＳＥＧＨＬＹＴＶＰＩＲＥＱＧＮＩＹＫＰＮＮＫＡＭＡＤＥＬＳＥＫＱＶＹＤＡＨＴＫＥＩＤＬＶＮＲＤＰＫＨＬＮＤＤＶＶＫＩＤＦＥＤＶＩＡＥＰＥＧＴＨＳＦＤＧＩＷＫＡＳＦＴＴＦＴＶＴＫＹＷＦＹＲＬＬＳＡＬＦＧＩＰＭＡＬＩＷＧＩＹＦＡＩＬＳＦＬＨＩＷＡＶＶＰＣＩＫＳＦＬＩＥＩＱＣＩＳＲＶＹＳＩＹＶＨＴＶＣＤＰＬＦＥＡＶＧＫＩＦＳＮＶＲＩＮＬＱＫＥＩ（配列番号４４）
リンカー１：ｈＭＣ４ＲとＲｌｕｃＩＩとの間のリンカー
ＶＧＧＧＧＳＫＬＰＡＴ（配列番号２）
リンカー２：ｈＶ２ＲとＲｌｕｃＩＩとの間のリンカー
ＧＧＳＧＬＫＬＰＡＴ（配列番号３）
リンカー３：ｈＥＲＧの残基３７９の後ろのＲｌｕｃＩＩのＮ末端におけるリンカー配列
ＮＡＡＩＲＳＧＧ（配列番号４）
リンカー４：ｈＥＲＧの残基３７３の前のＲｌｕｃＩＩのＮ末端におけるリンカー配列
ＧＧＮＡＡＩＲＳ（配列番号５）
リンカー５：Ｌｙｎの形質膜標的化配列（Ｌｙｎ）とｒＧＦＰとの間のリンカー
ＬＳＮＡＴ（配列番号２７）
リンカー６：ｒＧＦＰと、ｋＲＡＳの多塩基／プレニル化配列（ＣＡＡＸ）との間のリンカー
ＧＳＡＧＴＭＡＳＮＮＴＡＳＧ（配列番号２８）
リンカー７：ｒＧＦＰと、ＧＲＫ５の多塩基配列（ＰＢ）との間のリンカー
ＧＧＳＧＬＫＬＰＡＴ（配列番号３）
リンカー８：ｒＧＦＰと、ｈＲＡＳ（ＣＡＡＸ）及びｈＲＡＳ／Ｒａｌ１（ＣＡＡＸ＝ＣＣＩＬ）のパルミトイル化／プレニル化配列との間、ｒＧＦＰとカベオリン１αとの間、ＲｌｕｃＩＩとＧＲＢ２との間のリンカー
ＧＳＡＧＴ（配列番号９）
リンカー９：ｅＮＯＳのゴルジ標的化配列（１〜７３）と、ｒＧＦＰとの間のリンカー
ＧＳＮＡＴ（配列番号４１）
リンカー１０：（ｉ）ｒＧＦＰと、（ｉｉ）ｅｎｄｏｆｉｎのＦＹＶＥドメイン、Ｒａｂ４またはＲａｂ１１との間
ＧＳＧＧＳＧＳＧＧＬＥ（配列番号２９）
リンカー１１：ｓｐＦｌａｇ−ＡＴ１ＲとＲｌｕｃＩＩとの間
ＧＧＳＧＧＫＬＰＡＴ（配列番号３０）
リンカー１２：ＲｌｕｃＩＩと、ＰＬＣδ１のＰＨドメインとの間
ＧＮＡＳＧＴＧＳＧＧＳＧＳＧＧＬＥＭ（配列番号３１）
リンカー１３：ｒＧＦＰと、ＰＬＣδ１のＰＨドメインとの間
ＧＳＧＧＳＧＳＧＧＬＥ（配列番号２９）
リンカー１４：ＨＡ標識とＲｌｕｃＩＩとの間
ＳＮＡＫＬ（配列番号３２）
ｈＶ２Ｒ（Ｗ１６４Ｓ）：突然変異Ｗ１６４Ｓ−ｈＶ２Ｒ、細胞内に留まり、ＰＣ救出可能
ＭＬＭＡＳＴＴＳＡＶＰＧＨＰＳＬＰＳＬＰＳＮＳＳＱＥＲＰＬＤＴＲＤＰＬＬＡＲＡＥＬＡＬＬＳＩＶＦＶＡＶＡＬＳＮＧＬＶＬＡＡＬＡＲＲＧＲＲＧＨＷＡＰＩＨＶＦＩＧＨＬＣＬＡＤＬＡＶＡＬＦＱＶＬＰＱＬＡＷＫＡＴＤＲＦＲＧＰＤＡＬＣＲＡＶＫＹＬＱＭＶＧＭＹＡＳＳＹＭＩＬＡＭＴＬＤＲＨＲＡＩＣＲＰＭＬＡＹＲＨＧＳＧＡＨＷＮＲＰＶＬＶＡＳＡＦＳＬＬＬＳＬＰＱＬＦＩＦＡＱＲＮＶＥＧＧＳＧＶＴＤＣＷＡＣＦＡＥＰＷＧＲＲＴＹＶＴＷＩＡＬＭＶＦＶＡＰＴＬＧＩＡＡＣＱＶＬＩＦＲＥＩＨＡＳＬＶＰＧＰＳＥＲＰＧＧＲＲＲＧＲＲＴＧＳＰＧＥＧＡＨＶＳＡＡＶＡＫＴＶＲＭＴＬＶＩＶＶＶＹＶＬＣＷＡＰＦＦＬＶＱＬＷＡＡＷＤＰＥＡＰＬＥＧＡＰＦＶＬＬＭＬＬＡＳＬＮＳＣＴＮＰＷＩＹＡＳＦＳＳＳＶＳＳＥＬＲＳＬＬＣＣＡＲＧＲＴＰＰＳＬＧＰＱＤＥＳＣＴＴＡＳＳＳＬＡＫＤＴＳＳ（配列番号４６）
ＣＡＡＸ（Ｈｒａｓ）：ｈＲａｓからの形質膜標的化パルミトリル化配列及びプレニル化シグナル配列
ＣＭＳＣＫＣＶＬＳ（配列番号４７）
ＣＡＡＸ（ＣＣＩＬ）：ｈＲａｓからの形質膜標的化パルミトリル化配列及びＲａｌ１からのプレニル化シグナル配列
ＣＭＳＣＫＣＣＩＬ（配列番号  ４３）
ｈＭＣ４Ｒ  Ｎ６２Ｓ突然変異メラノコルチン４受容体、細胞内に留まり、ＰＣ救出可能
ＭＶＮＳＴＨＲＧＭＨＴＳＬＨＬＷＮＲＳＳＹＲＬＨＳＮＡＳＥＳＬＧＫＧＹＳＤＧＧＣＹＥＱＬＦＶＳＰＥＶＦＶＴＬＧＶＩＳＬＬＥＳＩＬＶＩＶＡＩＡＫＮＫＮＬＨＳＰＭＹＦＦＩＣＳＬＡＶＡＤＭＬＶＳＶＳＮＧＳＥＴＩＶＩＴＬＬＮＳＴＤＴＤＡＱＳＦＴＶＮＩＤＮＶＩＤＳＶＩＣＳＳＬＬＡＳＩＣＳＬＬＳＩＡＶＤＲＹＦＴＩＦＹＡＬＱＹＨＮＩＭＴＶＫＲＶＧＩＩＩＳＣＩＷＡＡＣＴＶＳＧＩＬＦＩＩＹＳＤＳＳＡＶＩＩＣＬＩＴＭＦＦＴＭＬＡＬＭＡＳＬＹＶＨＭＦＬＭＡＲＬＨＩＫＲＩＡＶＬＰＧＴＧＡＩＲＱＧＡＮＭＫＧＡＩＴＬＴＩＬＩＧＶＦＶＶＣＷＡＰＦＦＬＨＬＩＦＹＩＳＣＰＱＮＰＹＣＶＣＦＭＳＨＦＮＬＹＬＩＬＩＭＣＮＳＩＩＤＰＬＩＹＡＬＲＳＱＥＬＲＫＴＦＫＥＩＩＣＣＹＰＬＧＧＬＣＤＬＳＳＲＹ（配列番号４８）
ｈＭＣ４Ｒ  Ｒ１６５Ｗ突然変異メラノコルチン４受容体、細胞内に留まり、ＰＣ救出可能
ＭＶＮＳＴＨＲＧＭＨＴＳＬＨＬＷＮＲＳＳＹＲＬＨＳＮＡＳＥＳＬＧＫＧＹＳＤＧＧＣＹＥＱＬＦＶＳＰＥＶＦＶＴＬＧＶＩＳＬＬＥＮＩＬＶＩＶＡＩＡＫＮＫＮＬＨＳＰＭＹＦＦＩＣＳＬＡＶＡＤＭＬＶＳＶＳＮＧＳＥＴＩＶＩＴＬＬＮＳＴＤＴＤＡＱＳＦＴＶＮＩＤＮＶＩＤＳＶＩＣＳＳＬＬＡＳＩＣＳＬＬＳＩＡＶＤＲＹＦＴＩＦＹＡＬＱＹＨＮＩＭＴＶＫＷＶＧＩＩＩＳＣＩＷＡＡＣＴＶＳＧＩＬＦＩＩＹＳＤＳＳＡＶＩＩＣＬＩＴＭＦＦＴＭＬＡＬＭＡＳＬＹＶＨＭＦＬＭＡＲＬＨＩＫＲＩＡＶＬＰＧＴＧＡＩＲＱＧＡＮＭＫＧＡＩＴＬＴＩＬＩＧＶＦＶＶＣＷＡＰＦＦＬＨＬＩＦＹＩＳＣＰＱＮＰＹＣＶＣＦＭＳＨＦＮＬＹＬＩＬＩＭＣＮＳＩＩＤＰＬＩＹＡＬＲＳＱＥＬＲＫＴＦＫＥＩＩＣＣＹＰＬＧＧＬＣＤＬＳＳＲＹ（配列番号４９）
単分子ＤＡＧセンサー
ＭＧＣＩＫＳＫＧＫＤＳＬＳＮＡＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＬＳＹＧＶＱＣＦＳＲＹＰＤＨＭＫＱＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＦＦＫＤＤＧＮＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＹＮＰＨＮＶＹＩＭＡＤＫＱＫＮＧＩＫＶＮＦＫＩＲＨＮＩＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＦＴＱＳＡＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＬＧＭＤＥＬＹＫＧＴＧＴＡＡＫＥＧＥＫＱＫＧＡＭＱＰＳＥＱＱＲＧＫＥＡＱＫＥＫＮＧＫＥＰＮＰＲＰＥＱＰＫＰＡＫＶＥＱＱＥＤＥＰＥＥＲＰＫＲＥＰＭＱＬＥＰＡＥＳＡＫＱＧＲＮＬＰＱＫＶＥＱＧＥＥＲＰＱＥＡＤＭＰＧＱＡＱＳＡＭＲＰＱＬＳＮＳＥＥＧＰＡＲＧＫＰＡＰＥＥＰＤＥＱＬＧＥＰＥＥＡＱＧＥＨＡＤＥＰＡＰＳＫＰＳＥＫＨＭＶＰＱＭＡＥＰＥＫＧＥＥＡＲＥＰＱＧＡＥＤＫＰＡＰＶＨＫＰＫＫＥＥＰＱＲＰＮＥＥＫＡＰＫＰＫＧＲＨＶＧＲＱＥＮＤＤＳＡＧＫＰＥＰＧＲＰＤＲＫＧＫＥＫＥＰＥＥＥＰＡＱＧＨＳＬＰＱＥＰＥＰＭＰＲＰＫＰＥＶＲＫＫＰＨＰＧＡＳＰＨＱＶＳＤＶＥＤＡＫＧＰＥＲＫＶＮＰＭＥＧＥＥＳＡＫＱＡＱＱＥＧＰＡＥＮＤＥＡＥＲＰＥＲＰＡＳＧＧＡＲＥＡＭＴＳＫＶＹＤＰＥＱＲＫＲＭＩＴＧＰＱＷＷＡＲＣＫＱＭＮＶＬＤＳＦＩＮＹＹＤＳＥＫＨＡＥＮＡＶＩＦＬＨＧＮＡＴＳＳＹＬＷＲＨＶＶＰＨＩＥＰＶＡＲＣＩＩＰＤＬＩＧＭＧＫＳＧＫＳＧＮＧＳＹＲＬＬＤＨＹＫＹＬＴＡＷＦＥＬＬＮＬＰＫＫＩＩＦＶＧＨＤＷＧＡＡＬＡＦＨＹＳＹＥＨＱＤＫＩＫＡＩＶＨＡＥＳＶＶＤＶＩＥＳＷＤＥＷＰＤＩＥＥＤＩＡＬＩＫＳＥＥＧＥＫＭＶＬＥＮＮＦＦＶＥＴＶＬＰＳＫＩＭＲＫＬＥＰＥＥＦＡＡＹＬＥＰＦＫＥＫＧＥＶＲＲＰＴＬＳＷＰＲＥＩＰＬＶＫＧＧＫＰＤＶＶＱＩＶＲＮＹＮＡＹＬＲＡＳＤＤＬＰＫＭＦＩＥＳＤＰＧＦＦＳＮＡＩＶＥＧＡＫＫＦＰＮＴＥＦＶＫＶＫＧＬＨＦＳＱＥＤＡＰＤＥＭＧＫＹＩＫＳＦＶＥＲＶＬＫＮＥＱＧＳＧＳＧＦＮＩＤＭＰＨＲＦＫＶＨＮＹＭＳＰＴＦＣＤＨＣＧＳＬＬＷＧＬＶＫＱＧＬＫＣＥＤＣＧＭＮＶＨＨＫＣＲＥＫＶＡＮＬＣＧ（配列番号５０）
単分子βアレスチン１センサー
ＭＧＣＩＫＳＫＧＫＤＳＬＳＮＡＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＬＳＹＧＶＱＣＦＳＲＹＰＤＨＭＫＱＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＦＦＫＤＤＧＮＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＹＮＰＨＮＶＹＩＭＡＤＫＱＫＮＧＩＫＶＮＦＫＩＲＨＮＩＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＦＴＱＳＡＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＬＧＭＤＥＬＹＫＧＴＧＴＡＡＫＥＧＥＫＱＫＧＡＭＱＰＳＥＱＱＲＧＫＥＡＱＫＥＫＮＧＫＥＰＮＰＲＰＥＱＰＫＰＡＫＶＥＱＱＥＤＥＰＥＥＲＰＫＲＥＰＭＱＬＥＰＡＥＳＡＫＱＧＲＮＬＰＱＫＶＥＱＧＥＥＲＰＱＥＡＤＭＰＧＱＡＱＳＡＭＲＰＱＬＳＮＳＥＥＧＰＡＲＧＫＰＡＰＥＥＰＤＥＱＬＧＥＰＥＥＡＱＧＥＨＡＤＥＰＡＰＳＫＰＳＥＫＨＭＶＰＱＭＡＥＰＥＫＧＥＥＡＲＥＰＱＧＡＥＤＫＰＡＰＶＨＫＰＫＫＥＥＰＱＲＰＮＥＥＫＡＰＫＰＫＧＲＨＶＧＲＱＥＮＤＤＳＡＧＫＰＥＰＧＲＰＤＲＫＧＫＥＫＥＰＥＥＥＰＡＱＧＨＳＬＰＱＥＰＥＰＭＰＲＰＫＰＥＶＲＫＫＰＨＰＧＡＳＰＨＱＶＳＤＶＥＤＡＫＧＰＥＲＫＶＮＰＭＥＧＥＥＳＡＫＱＡＱＱＥＧＰＡＥＮＤＥＡＥＲＰＥＲＰＡＳＧＧＡＲＥＡＭＴＳＫＶＹＤＰＥＱＲＫＲＭＩＴＧＰＱＷＷＡＲＣＫＱＭＮＶＬＤＳＦＩＮＹＹＤＳＥＫＨＡＥＮＡＶＩＦＬＨＧＮＡＴＳＳＹＬＷＲＨＶＶＰＨＩＥＰＶＡＲＣＩＩＰＤＬＩＧＭＧＫＳＧＫＳＧＮＧＳＹＲＬＬＤＨＹＫＹＬＴＡＷＦＥＬＬＮＬＰＫＫＩＩＦＶＧＨＤＷＧＡＡＬＡＦＨＹＳＹＥＨＱＤＫＩＫＡＩＶＨＡＥＳＶＶＤＶＩＥＳＷＤＥＷＰＤＩＥＥＤＩＡＬＩＫＳＥＥＧＥＫＭＶＬＥＮＮＦＦＶＥＴＶＬＰＳＫＩＭＲＫＬＥＰＥＥＦＡＡＹＬＥＰＦＫＥＫＧＥＶＲＲＰＴＬＳＷＰＲＥＩＰＬＶＫＧＧＫＰＤＶＶＱＩＶＲＮＹＮＡＹＬＲＡＳＤＤＬＰＫＭＦＩＥＳＤＰＧＦＦＳＮＡＩＶＥＧＡＫＫＦＰＮＴＥＦＶＫＶＫＧＬＨＦＳＱＥＤＡＰＤＥＭＧＫＹＩＫＳＦＶＥＲＶＬＫＮＥＱＧＳＧＳＡＧＴＡＧＤＫＧＴＲＶＦＫＫＡＳＰＮＧＫＬＴＶＹＬＧＫＲＤＦＶＤＨＩＤＬＶＤＰＶＤＧＶＶＬＶＤＰＥＹＬＫＥＲＲＶＹＶＴＬＴＣＡＦＲＹＧＲＥＤＬＤＶＬＧＬＴＦＲＫＤＬＦＶＡＮＶＱＳＦＰＰＡＰＥＤＫＫＰＬＴＲＬＱＥＲＬＩＫＫＬＧＥＨＡＹＰＦＴＦＥＩＰＰＮＬＰＣＳＶＴＬＱＰＧＰＥＤＴＧＫＡＣＧＶＤＹＥＶＫＡＦＣＡＥＮＬＥＥＫＩＨＫＲＮＳＶＲＬＶＩＲＫＶＱＹＡＰＥＲＰＧＰＱＰＴＡＥＴＴＲＱＦＬＭＳＤＫＰＬＨＬＥＡＳＬＤＫＥＩＹＹＨＧＥＰＩＳＶＮＶＨＶＴＮＮＴＮＫＴＶＫＫＩＫＩＳＶＲＱＹＡＤＩＣＬＦＮＴＡＱＹＫＣＰＶＡＭＥＥＡＤＤＴＶＡＰＳＳＴＦＣＫＶＹＴＬＴＰＦＬＡＮＮＲＥＫＲＧＬＡＬＤＧＫＬＫＨＥＤＴＮＬＡＳＳＴＬＬＲＥＧＡＮＲＥＩＬＧＩＩＶＳＹＫＶＫＶＫＬＶＶＳＲＧＧＬＬＧＤＬＡＳＳＤＶＡＶＥＬＰＦＴＬＭＨＰＫＰＫＥＥＰＰＨＲＥＶＰＥＮＥＴＰＶＤＴＮＬＩＥＬＤＴＮＤＤＤＩＶＦＥＤＦＡＲＱＲＬＫＧＭＫＤＤＫＥＥＥＥＤＧＴＧＳＰＱＬＮＮＲ（配列番号５１）
単分子βアレスチン２センサー
ＭＧＣＩＫＳＫＧＫＤＳＬＳＮＡＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＬＳＹＧＶＱＣＦＳＲＹＰＤＨＭＫＱＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＦＦＫＤＤＧＮＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＹＮＰＨＮＶＹＩＭＡＤＫＱＫＮＧＩＫＶＮＦＫＩＲＨＮＩＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＦＴＱＳＡＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＬＧＭＤＥＬＹＫＧＴＧＴＡＡＫＥＧＥＫＱＫＧＡＭＱＰＳＥＱＱＲＧＫＥＡＱＫＥＫＮＧＫＥＰＮＰＲＰＥＱＰＫＰＡＫＶＥＱＱＥＤＥＰＥＥＲＰＫＲＥＰＭＱＬＥＰＡＥＳＡＫＱＧＲＮＬＰＱＫＶＥＱＧＥＥＲＰＱＥＡＤＭＰＧＱＡＱＳＡＭＲＰＱＬＳＮＳＥＥＧＰＡＲＧＫＰＡＰＥＥＰＤＥＱＬＧＥＰＥＥＡＱＧＥＨＡＤＥＰＡＰＳＫＰＳＥＫＨＭＶＰＱＭＡＥＰＥＫＧＥＥＡＲＥＰＱＧＡＥＤＫＰＡＰＶＨＫＰＫＫＥＥＰＱＲＰＮＥＥＫＡＰＫＰＫＧＲＨＶＧＲＱＥＮＤＤＳＡＧＫＰＥＰＧＲＰＤＲＫＧＫＥＫＥＰＥＥＥＰＡＱＧＨＳＬＰＱＥＰＥＰＭＰＲＰＫＰＥＶＲＫＫＰＨＰＧＡＳＰＨＱＶＳＤＶＥＤＡＫＧＰＥＲＫＶＮＰＭＥＧＥＥＳＡＫＱＡＱＱＥＧＰＡＥＮＤＥＡＥＲＰＥＲＰＡＳＧＧＡＲＥＡＭＴＳＫＶＹＤＰＥＱＲＫＲＭＩＴＧＰＱＷＷＡＲＣＫＱＭＮＶＬＤＳＦＩＮＹＹＤＳＥＫＨＡＥＮＡＶＩＦＬＨＧＮＡＴＳＳＹＬＷＲＨＶＶＰＨＩＥＰＶＡＲＣＩＩＰＤＬＩＧＭＧＫＳＧＫＳＧＮＧＳＹＲＬＬＤＨＹＫＹＬＴＡＷＦＥＬＬＮＬＰＫＫＩＩＦＶＧＨＤＷＧＡＡＬＡＦＨＹＳＹＥＨＱＤＫＩＫＡＩＶＨＡＥＳＶＶＤＶＩＥＳＷＤＥＷＰＤＩＥＥＤＩＡＬＩＫＳＥＥＧＥＫＭＶＬＥＮＮＦＦＶＥＴＶＬＰＳＫＩＭＲＫＬＥＰＥＥＦＡＡＹＬＥＰＦＫＥＫＧＥＶＲＲＰＴＬＳＷＰＲＥＩＰＬＶＫＧＧＫＰＤＶＶＱＩＶＲＮＹＮＡＹＬＲＡＳＤＤＬＰＫＭＦＩＥＳＤＰＧＦＦＳＮＡＩＶＥＧＡＫＫＦＰＮＴＥＦＶＫＶＫＧＬＨＦＳＱＥＤＡＰＤＥＭＧＫＹＩＫＳＦＶＥＲＶＬＫＮＥＱＧＳＧＳＡＧＴＡＧＥＫＰＧＴＲＶＦＫＫＳＳＰＮＣＫＬＴＶＹＬＧＫＲＤＦＶＤＨＬＤＫＶＤＰＶＤＧＶＶＬＶＤＰＤＹＬＫＤＲＫＶＦＶＴＬＴＣＡＦＲＹＧＲＥＤＬＤＶＬＧＬＳＦＲＫＤＬＦＩＡＴＹＱＡＦＰＰＶＰＮＰＰＲＰＰＴＲＬＱＤＲＬＬＲＫＬＧＱＨＡＨＰＦＦＦＴＩＰＱＮＬＰＣＳＶＴＬＱＰＧＰＥＤＴＧＫＡＣＧＶＤＦＥＩＲＡＦＣＡＫＳＬＥＥＫＳＨＫＲＮＳＶＲＬＶＩＲＫＶＱＦＡＰＥＫＰＧＰＱＰＳＡＥＴＴＲＨＦＬＭＳＤＲＳＬＨＬＥＡＳＬＤＫＥＬＹＹＨＧＥＰＬＮＶＮＶＨＶＴＮＮＳＴＫＴＶＫＫＩＫＶＳＶＲＱＹＡＤＩＣＬＦＳＴＡＱＹＫＣＰＶＡＱＬＥＱＤＤＱＶＳＰＳＳＴＦＣＫＶＹＴＩＴＰＬＬＳＤＮＲＥＫＲＧＬＡＬＤＧＫＬＫＨＥＤＴＮＬＡＳＳＴＩＶＫＥＧＡＮＫＥＶＬＧＩＬＶＳＹＲＶＫＶＫＬＶＶＳＲＧＧＤＶＳＶＥＬＰＦＶＬＭＨＰＫＰＨＤＨＩＰＬＰＲＰＱＳＡＡＰＥＴＤＶＰＶＤＴＮＬＩＥＦＤＴＮＹＡＴＤＤＤＩＶＦＥＤＦＡＲＬＲＬＫＧＭＫＤＤＤＹＤＤＱＬＣ（配列番号５２）
８４位にＲｌｕｃＩＩが挿入されたヒトＧα１２サブユニット
ＭＳＧＶＶＲＴＬＳＲＣＬＬＰＡＥＡＧＧＡＲＥＲＲＡＧＳＧＡＲＤＡＥＲＥＡＲＲＲＳＲＤＩＤＡＬＬＡＲＥＲＲＡＶＲＲＬＶＫＩＬＬＬＧＡＧＥＳＧＫＳＴＦＬＫＱＭＲＩＩＨＧＲＥＧＳＧＧＧＧＳＭＴＳＫＶＹＤＰＥＱＲＫＲＭＩＴＧＰＱＷＷＡＲＣＫＱＭＮＶＬＤＳＦＩＮＹＹＤＳＥＫＨＡＥＮＡＶＩＦＬＨＧＮＡＡＳＳＹＬＷＲＨＶＶＰＨＩＥＰＶＡＲＣＩＩＰＤＬＩＧＭＧＫＳＧＫＳＧＮＧＳＹＲＬＬＤＨＹＫＹＬＴＡＷＦＥＬＬＮＬＰＫＫＩＩＦＶＧＨＤＷＧＡＡＬＡＦＨＹＳＹＥＨＱＤＫＩＫＡＩＶＨＡＥＳＶＶＤＶＩＥＳＷＤＥＷＰＤＩＥＥＤＩＡＬＩＫＳＥＥＧＥＫＭＶＬＥＮＮＦＦＶＥＴＶＬＰＳＫＩＭＲＫＬＥＰＥＥＦＡＡＹＬＥＰＦＫＥＫＧＥＶＲＲＰＴＬＳＷＰＲＥＩＰＬＶＫＧＧＫＰＤＶＶＱＩＶＲＮＹＮＡＹＬＲＡＳＤＤＬＰＫＭＦＩＥＳＤＰＧＦＦＳＮＡＩＶＥＧＡＫＫＦＰＮＴＥＦＶＫＶＫＧＬＨＦＳＱＥＤＡＰＤＥＭＧＫＹＩＫＳＦＶＥＲＶＬＫＮＥＱＳＧＧＧＧＳＧＴＦＤＱＫＡＬＬＥＦＲＤＴＩＦＤＮＩＬＫＧＳＲＶＬＶＤＡＲＤＫＬＧＩＰＷＱＹＳＥＮＥＥＨＧＭＦＬＭＡＦＥＮＫＡＧＬＰＶＥＰＡＴＦＱＬＹＶＰＡＬＳＡＬＷＲＤＳＧＩＲＥＡＦＳＲＲＳＥＦＱＬＧＥＳＶＫＹＦＬＤＮＬＤＲＩＧＱＬＥＹＭＰＴＥＱＤＩＬＬＡＲＫＡＴＫＧＩＶＥＨＤＦＶＩＫＫＩＰＦＫＭＶＤＶＧＧＱＲＳＱＲＱＫＷＦＱＣＦＤＧＩＴＳＩＬＦＭＶＳＳＳＥＹＤＱＶＬＭＥＤＲＲＴＮＲＬＶＥＳＭＮＩＦＥＴＩＶＮＮＫＬＦＦＮＶＳＩＩＬＦＬＮＫＭＤＬＬＶＥＫＶＫＴＶＳＩＫＫＨＦＰＤＦＲＧＤＰＨＲＬＥＤＶＱＲＹＬＶＱＣＦＤＲＫＲＲＮＲＳＫＰＬＦＨＨＦＴＴＡＩＤＴＥＮＶＲＦＶＦＨＡＶＫＤＴＩＬＱＥＮＬＫＤＩＭＬＱ（配列番号５３）
１１８位にＲｌｕｃＩＩが挿入されたヒトＧαｑサブユニット
ＭＴＬＥＳＩＭＡＣＣＬＳＥＥＡＫＥＡＲＲＩＮＤＥＩＥＲＱＬＲＲＤＫＲＤＡＲＲＥＬＫＬＬＬＬＧＴＧＥＳＧＫＳＴＦＩＫＱＭＲＩＩＨＧＳＧＹＳＤＥＤＫＲＧＦＴＫＬＶＹＱＮＩＦＴＡＭＱＡＭＩＲＡＭＤＴＬＫＩＰＹＫＹＥＨＮＫＡＨＡＱＬＶＲＥＶＤＶＮＡＡＩＲＳＴＲＭＴＳＫＶＹＤＰＥＱＲＫＲＭＩＴＧＰＱＷＷＡＲＣＫＱＭＮＶＬＤＳＦＩＮＹＹＤＳＥＫＨＡＥＮＡＶＩＦＬＨＧＮＡＡＳＳＹＬＷＲＨＶＶＰＨＩＥＰＶＡＲＣＩＩＰＤＬＩＧＭＧＫＳＧＫＳＧＮＧＳＹＲＬＬＤＨＹＫＹＬＴＡＷＦＥＬＬＮＬＰＫＫＩＩＦＶＧＨＤＷＧＡＡＬＡＦＨＹＳＹＥＨＱＤＫＩＫＡＩＶＨＡＥＳＶＶＤＶＩＥＳＷＤＥＷＰＤＩＥＥＤＩＡＬＩＫＳＥＥＧＥＫＭＶＬＥＮＮＦＦＶＥＴＶＬＰＳＫＩＭＲＫＬＥＰＥＥＦＡＡＹＬＥＰＦＫＥＫＧＥＶＲＲＰＴＬＳＷＰＲＥＩＰＬＶＫＧＧＫＰＤＶＶＱＩＶＲＮＹＮＡＹＬＲＡＳＤＤＬＰＫＭＦＩＥＳＤＰＧＦＦＳＮＡＩＶＥＧＡＫＫＦＰＮＴＥＦＶＫＶＫＧＬＨＦＳＱＥＤＡＰＤＥＭＧＫＹＩＫＳＦＶＥＲＶＬＫＮＥＱＣＴＮＡＡＩＲＳＥＫＶＳＡＦＥＮＰＹＶＤＡＩＫＳＬＷＮＤＰＧＩＱＥＣＹＤＲＲＲＥＹＱＬＳＤＳＴＫＹＹＬＮＤＬＤＲＶＡＤＰＡＹＬＰＴＱＱＤＶＬＲＶＲＶＰＴＴＧＩＩＥＹＰＦＤＬＱＳＶＩＦＲＭＶＤＶＧＧＱＲＳＥＲＲＫＷＩＨＣＦＥＮＶＴＳＩＭＦＬＶＡＬＳＥＹＤＱＶＬＶＥＳＤＮＥＮＲＭＥＥＳＫＡＬＦＲＴＩＩＴＹＰＷＦＱＮＳＳＶＩＬＦＬＮＫＫＤＬＬＥＥＫＩＭＹＳＨＬＶＤＹＦＰＥＹＤＧＰＱＲＤＡＱＡＡＲＥＦＩＬＫＭＦＶＤＬＮＰＤＳＤＫＩＩＹＳＨＦＴＣＡＴＤＴＥＮＩＲＦＶＦＡＡＶＫＤＴＩＬＱＬＮＬＫＥＹＮＬＶ（配列番号５４）
６７位にＲｌｕｃＩＩが挿入されたヒトＧαＳサブユニット
ＭＧＣＬＧＮＳＫＴＥＤＱＲＮＥＥＫＡＱＲＥＡＮＫＫＩＥＫＱＬＱＫＤＫＱＶＹＲＡＴＨＲＬＬＬＬＧＡＧＥＳＧＫＳＴＩＶＫＱＭＲＩＬＨＶＮＧＳＧＧＧＧＳＭＴＳＫＶＹＤＰＥＱＲＫＲＭＩＴＧＰＱＷＷＡＲＣＫＱＭＮＶＬＤＳＦＩＮＹＹＤＳＥＫＨＡＥＮＡＶＩＦＬＨＧＮＡＴＳＳＹＬＷＲＨＶＶＰＨＩＥＰＶＡＲＣＩＩＰＤＬＩＧＭＧＫＳＧＫＳＧＮＧＳＹＲＬＬＤＨＹＫＹＬＴＡＷＦＥＬＬＮＬＰＫＫＩＩＦＶＧＨＤＷＧＡＡＬＡＦＨＹＳＹＥＨＱＤＫＩＫＡＩＶＨＡＥＳＶＶＤＶＩＥＳＷＤＥＷＰＤＩＥＥＤＩＡＬＩＫＳＥＥＧＥＫＭＶＬＥＮＮＦＦＶＥＴＶＬＰＳＫＩＭＲＫＬＥＰＥＥＦＡＡＹＬＥＰＦＫＥＫＧＥＶＲＲＰＴＬＳＷＰＲＥＩＰＬＶＫＧＧＫＰＤＶＶＱＩＶＲＮＹＮＡＹＬＲＡＳＤＤＬＰＫＭＦＩＥＳＤＰＧＦＦＳＮＡＩＶＥＧＡＫＫＦＰＮＴＥＦＶＫＶＫＧＬＨＦＳＱＥＤＡＰＤＥＭＧＫＹＩＫＳＦＶＥＲＶＬＫＮＥＱＳＧＧＧＧＳＦＮＧＥＧＧＥＥＤＰＱＡＡＲＳＮＳＤＧＥＫＡＴＫＶＱＤＩＫＮＮＬＫＥＡＩＥＴＩＶＡＡＭＳＮＬＶＰＰＶＥＬＡＮＰＥＮＱＦＲＶＤＹＩＬＳＶＭＮＶＰＤＦＤＦＰＰＥＦＹＥＨＡＫＡＬＷＥＤＥＧＶＲＡＣＹＥＲＳＮＥＹＱＬＩＤＣＡＱＹＦＬＤＫＩＤＶＩＫＱＡＤＹＶＰＳＤＱＤＬＬＲＣＲＶＬＴＳＧＩＦＥＴＫＦＱＶＤＫＶＮＦＨＭＦＤＶＧＧＱＲＤＥＲＲＫＷＩＱＣＦＮＤＶＴＡＩＩＦＶＶＡＳＳＳＹＮＭＶＩＲＥＤＮＱＴＮＲＬＱＥＡＬＮＬＦＫＳＩＷＮＮＲＷＬＲＴＩＳＶＩＬＦＬＮＫＱＤＬＬＡＥＫＶＬＡＧＫＳＫＩＥＤＹＦＰＥＦＡＲＹＴＴＰＥＤＡＴＰＥＰＧＥＤＰＲＶＴＲＡＫＹＦＩＲＤＥＦＬＲＩＳＴＡＳＧＤＧＲＨＹＣＹＰＨＦＴＣＡＶＤＴＥＮＩＲＲＶＦＮＤＣＲＤＩＩＱＲＭＨＬＲＱＹＥＬＬ（配列番号５５）
ヒトＧβ１サブユニット
ＭＳＥＬＤＱＬＲＱＥＡＥＱＬＫＮＱＩＲＤＡＲＫＡＣＡＤＡＴＬＳＱＩＴＮＮＩＤＰＶＧＲＩＱＭＲＴＲＲＴＬＲＧＨＬＡＫＩＹＡＭＨＷＧＴＤＳＲＬＬＶＳＡＳＱＤＧＫＬＩＩＷＤＳＹＴＴＮＫＶＨＡＩＰＬＲＳＳＷＶＭＴＣＡＹＡＰＳＧＮＹＶＡＣＧＧＬＤＮＩＣＳＩＹＮＬＫＴＲＥＧＮＶＲＶＳＲＥＬＡＧＨＴＧＹＬＳＣＣＲＦＬＤＤＮＱＩＶＴＳＳＧＤＴＴＣＡＬＷＤＩＥＴＧＱＱＴＴＴＦＴＧＨＴＧＤＶＭＳＬＳＬＡＰＤＴＲＬＦＶＳＧＡＣＤＡＳＡＫＬＷＤＶＲＥＧＭＣＲＱＴＦＴＧＨＥＳＤＩＮＡＩＣＦＦＰＮＧＮＡＦＡＴＧＳＤＤＡＴＣＲＬＦＤＬＲＡＤＱＥＬＭＴＹＳＨＤＮＩＩＣＧＩＴＳＶＳＦＳＫＳＧＲＬＬＬＡＧＹＤＤＦＮＣＮＶＷＤＡＬＫＡＤＲＡＧＶＬＡＧＨＤＮＲＶＳＣＬＧＶＴＤＤＧＭＡＶＡＴＧＳＷＤＳＦＬＫＩＷＮ（配列番号５６）
ヒトＧγ１サブユニット
ＭＰＶＩＮＩＥＤＬＴＥＫＤＫＬＫＭＥＶＤＱＬＫＫＥＶＴＬＥＲＭＬＶＳＫＣＣＥＥＶＲＤＹＶＥＥＲＳＧＥＤＰＬＶＫＧＩＰＥＤＫＮＰＦＫＥＬＫＧＧＣＶＩＳ（配列番号５７）
ヒトＧγ２サブユニット
ＭＡＳＮＮＴＡＳＩＡＱＡＲＫＬＶＥＱＬＫＭＥＡＮＩＤＲＩＫＶＳＫＡＡＡＤＬＭＡＹＣＥＡＨＡＫＥＤＰＬＬＴＰＶＰＡＳＥＮＰＦＲＥＫＫＦＦＣＡＩＬ（配列番号５８）
ヒトＧγ３サブユニット
ＭＫＧＥＴＰＶＮＳＴＭＳＩＧＱＡＲＫＭＶＥＱＬＫＩＥＡＳＬＣＲＩＫＶＳＫＡＡＡＤＬＭＴＹＣＤＡＨＡＣＥＤＰＬＩＴＰＶＰＴＳＥＮＰＦＲＥＫＫＦＦＣＡＬＬ（配列番号５９）
ヒトＧγ４サブユニット
ＭＫＥＧＭＳＮＮＳＴＴＳＩＳＱＡＲＫＡＶＥＱＬＫＭＥＡＣＭＤＲＶＫＶＳＱＡＡＡＤＬＬＡＹＣＥＡＨＶＲＥＤＰＬＩＩＰＶＰＡＳＥＮＰＦＲＥＫＫＦＦＣＴＩＬ（配列番号６０）
ヒトＧγ５サブユニット
ＭＳＧＳＳＳＶＡＡＭＫＫＶＶＱＱＬＲＬＥＡＧＬＮＲＶＫＶＳＱＡＡＡＤＬＫＱＦＣＬＱＮＡＱＨＤＰＬＬＴＧＶＳＳＳＴＮＰＦＲＰＱＫＶＣＳＦＬ（配列番号６１）
ヒトＧγ７サブユニット
ＭＳＡＴＮＮＩＡＱＡＲＫＬＶＥＱＬＲＩＥＡＧＩＥＲＩＫＶＳＫＡＡＳＤＬＭＳＹＣＥＱＨＡＲＮＤＰＬＬＶＧＶＰＡＳＥＮＰＦＫＤＫＫＰＣＩＩＬ（配列番号６２）
ヒトＧγ８サブユニット
ＭＳＮＮＭＡＫＩＡＥＡＲＫＴＶＥＱＬＫＬＥＶＮＩＤＲＭＫＶＳＱＡＡＡＥＬＬＡＦＣＥＴＨＡＫＤＤＰＬＶＴＰＶＰＡＡＥＮＰＦＲＤＫＲＬＦＣＶＬＬ（配列番号６３）
ヒトＧγ９サブユニット
ＭＡＱＤＬＳＥＫＤＬＬＫＭＥＶＥＱＬＫＫＥＶＫＮＴＲＩＰＩＳＫＡＧＫＥＩＫＥＹＶＥＡＱＡＧＮＤＰＦＬＫＧＩＰＥＤＫＮＰＦＫＥＫＧＧＣＬＩＳ（配列番号６４）
ヒトＧγ１０サブユニット
ＭＳＳＧＡＳＡＳＡＬＱＲＬＶＥＱＬＫＬＥＡＧＶＥＲＩＫＶＳＱＡＡＡＥＬＱＱＹＣＭＱＮＡＣＫＤＡＬＬＶＧＶＰＡＧＳＮＰＦＲＥＰＲＳＣＡＬＬ（配列番号６５）
ヒトＧγ１１サブユニット
ＭＰＡＬＨＩＥＤＬＰＥＫＥＫＬＫＭＥＶＥＱＬＲＫＥＶＫＬＱＲＱＱＶＳＫＣＳＥＥＩＫＮＹＩＥＥＲＳＧＥＤＰＬＶＫＧＩＰＥＤＫＮＰＦＫＥＫＧＳＣＶＩＳ（配列番号６６）
ヒトＧγ１２サブユニット
ＭＳＳＫＴＡＳＴＮＮＩＡＱＡＲＲＴＶＱＱＬＲＬＥＡＳＩＥＲＩＫＶＳＫＡＳＡＤＬＭＳＹＣＥＥＨＡＲＳＤＰＬＬＩＧＩＰＴＳＥＮＰＦＫＤＫＫＴＣＩＩＬ（配列番号６７）
ヒトＧγ１３サブユニット
ＭＥＥＷＤＶＰＱＭＫＫＥＶＥＳＬＫＹＱＬＡＦＱＲＥＭＡＳＫＴＩＰＥＬＬＫＷＩＥＤＧＩＰＫＤＰＦＬＮＰＤＬＭＫＮＮＰＷＶＥＫＧＫＣＴＩＬ（配列番号６８）
ヒトＧα１５サブユニット
ＭＡＲＳＬＴＷＲＣＣＰＷＣＬＴＥＤＥＫＡＡＡＲＶＤＱＥＩＮＲＩＬＬＥＱＫＫＱＤＲＧＥＬＫＬＬＬＬＧＰＧＥＳＧＫＳＴＦＩＫＱＭＲＩＩＨＧＡＧＹＳＥＥＥＲＫＧＦＲＰＬＶＹＱＮＩＦＶＳＭＲＡＭＩＥＡＭＥＲＬＱＩＰＦＳＲＰＥＳＫＨＨＡＳＬＶＭＳＱＤＰＹＫＶＴＴＦＥＫＲＹＡＡＡＭＱＷＬＷＲＤＡＧＩＲＡＣＹＥＲＲＲＥＦＨＬＬＤＳＡＶＹＹＬＳＨＬＥＲＩＴＥＥＧＹＶＰＴＡＱＤＶＬＲＳＲＭＰＴＴＧＩＮＥＹＣＦＳＶＱＫＴＮＬＲＩＶＤＶＧＧＱＫＳＥＲＫＫＷＩＨＣＦＥＮＶＩＡＬＩＹＬＡＳＬＳＥＹＤＱＣＬＥＥＮＮＱＥＮＲＭＫＥＳＬＡＬＦＧＴＩＬＥＬＰＷＦＫＳＴＳＶＩＬＦＬＮＫＴＤＩＬＥＥＫＩＰＴＳＨＬＡＴＹＦＰＳＦＱＧＰＫＱＤＡＥＡＡＫＲＦＩＬＤＭＹＴＲＭＹＴＧＣＶＤＧＰＥＧＳＫＫＧＡＲＳＲＲＬＦＳＨＹＴＣＡＴＤＴＱＮＩＲＫＶＦＫＤＶＲＤＳＶＬＡＲＹＬＤＥＩＮＬＬ（配列番号６９）
ヒトタンパク質キナーゼ１（ＰＫＮ）のＲｈｏ結合ドメイン（ＣＲＩＢ）
ＶＱＳＥＰＲＳＷＳＬＬＥＱＬＧＬＡＧＡＤＬＡＡＰＧＶＱＱＱＬＥＬＥＲＥＲＬＲＲＥＩＲＫＥＬＫＬＫＥＧＡＥＮＬＲＲＡＴＴＤＬＧＲＳＬＧＰＶＥＬＬＬＲＧＳＳＲＲＬＤＬＬＨＱＱＬＱＥ（配列番号７０）
ＲｌｕｃＩＩと、ＰＫＮ１のＲｈｏ結合ドメインとの間のリンカー
ＧＳＡＳＡＧＴＡＴＭＡＳＤＡ（配列番号７１）
ヒトＰＫＣδのＤＡＧ結合ドメインＣ１ｂ
ＦＮＩＤＭＰＨＲＦＫＶＨＮＹＭＳＰＴＦＣＤＨＣＧＳＬＬＷＧＬＶＫＱＧＬＫＣＥＤＣＧＭＮＶＨＨＫＣＲＥＫＶＡＮＬＣＧ（配列番号７２）
ヒトβ１アドレナリン作動性受容体（β１ＡＲ）
ＭＧＡＧＶＬＶＬＧＡＳＥＰＧＮＬＳＳＡＡＰＬＰＤＧＡＡＴＡＡＲＬＬＶＰＡＳＰＰＡＳＬＬＰＰＡＳＥＳＰＥＰＬＳＱＱＷＴＡＧＭＧＬＬＭＡＬＩＶＬＬＩＶＡＧＮＶＬＶＩＶＡＩＡＫＴＰＲＬＱＴＬＴＮＬＦＩＭＳＬＡＳＡＤＬＶＭＧＬＬＶＶＰＦＧＡＴＩＶＶＷＧＲＷＥＹＧＳＦＦＣＥＬＷＴＳＶＤＶＬＣＶＴＡＳＩＥＴＬＣＶＩＡＬＤＲＹＬＡＩＴＳＰＦＲＹＱＳＬＬＴＲＡＲＡＲＧＬＶＣＴＶＷＡＩＳＡＬＶＳＦＬＰＩＬＭＨＷＷＲＡＥＳＤＥＡＲＲＣＹＮＤＰＫＣＣＤＦＶＴＮＲＡＹＡＩＡＳＳＶＶＳＦＹＶＰＬＣＩＭＡＦＶＹＬＲＶＦＲＥＡＱＫＱＶＫＫＩＤＳＣＥＲＲＦＬＧＧＰＡＲＰＰＳＰＳＰＳＰＶＰＡＰＡＰＰＰＧＰＰＲＰＡＡＡＡＡＴＡＰＬＡＮＧＲＡＧＫＲＲＰＳＲＬＶＡＬＲＥＱＫＡＬＫＴＬＧＩＩＭＧＶＦＴＬＣＷＬＰＦＦＬＡＮＶＶＫＡＦＨＲＥＬＶＰＤＲＬＦＶＦＦＮＷＬＧＹＡＮＳＡＦＮＰＩＩＹＣＲＳＰＤＦＲＫＡＦＱＧＬＬＣＣＡＲＲＡＡＲＲＲＨＡＴＨＧＤＲＰＲＡＳＧＣＬＡＲＰＧＰＰＰＳＰＧＡＡＳＤＤＤＤＤＤＶＶＧＡＴＰＰＡＲＬＬＥＰＷＡＧＣＮＧＧＡＡＡＤＳＤＳＳＬＤＥＰＣＲＰＧＦＡＳＥＳＫＶ（配列番号７３）
ヒトβ２アドレナリン作動性受容体（β２ＡＲ）
ＭＧＱＰＧＮＧＳＡＦＬＬＡＰＮＲＳＨＡＰＤＨＤＶＴＱＱＲＤＥＶＷＶＶＧＭＧＩＶＭＳＬＩＶＬＡＩＶＦＧＮＶＬＶＩＴＡＩＡＫＦＥＲＬＱＴＶＴＮＹＦＩＴＳＬＡＣＡＤＬＶＭＧＬＡＶＶＰＦＧＡＡＨＩＬＭＫＭＷＴＦＧＮＦＷＣＥＦＷＴＳＩＤＶＬＣＶＴＡＳＩＥＴＬＣＶＩＡＶＤＲＹＦＡＩＴＳＰＦＫＹＱＳＬＬＴＫＮＫＡＲＶＩＩＬＭＶＷＩＶＳＧＬＴＳＦＬＰＩＱＭＨＷＹＲＡＴＨＱＥＡＩＮＣＹＡＮＥＴＣＣＤＦＦＴＮＱＡＹＡＩＡＳＳＩＶＳＦＹＶＰＬＶＩＭＶＦＶＹＳＲＶＦＱＥＡＫＲＱＬＱＫＩＤＫＳＥＧＲＦＨＶＱＮＬＳＱＶＥＱＤＧＲＴＧＨＧＬＲＲＳＳＫＦＣＬＫＥＨＫＡＬＫＴＬＧＩＩＭＧＴＦＴＬＣＷＬＰＦＦＩＶＮＩＶＨＶＩＱＤＮＬＩＲＫＥＶＹＩＬＬＮＷＩＧＹＶＮＳＧＦＮＰＬＩＹＣＲＳＰＤＦＲＩＡＦＱＥＬＬＣＬＲＲＳＳＬＫＡＹＧＮＧＹＳＳＮＧＮＴＧＥＱＳＧＹＨＶＥＱＥＫＥＮＫＬＬＣＥＤＬＰＧＴＥＤＦＶＧＨＱＧＴＶＰＳＤＮＩＤＳＱＧＲＮＣＳＴＮＤＳＬＬ（配列番号７４）
ヒトプロスタグランジン２α受容体アイソフォームａ（ＦＰ）
ＭＳＭＮＮＳＫＱＬＶＳＰＡＡＡＬＬＳＮＴＴＣＱＴＥＮＲＬＳＶＦＦＳＶＩＦＭＴＶＧＩＬＳＮＳＬＡＩＡＩＬＭＫＡＹＱＲＦＲＱＫＳＫＡＳＦＬＬＬＡＳＧＬＶＩＴＤＦＦＧＨＬＩＮＧＡＩＡＶＦＶＹＡＳＤＫＥＷＩＲＦＤＱＳＮＶＬＣＳＩＦＧＩＣＭＶＦＳＧＬＣＰＬＬＬＧＳＶＭＡＩＥＲＣＩＧＶＴＫＰＩＦＨＳＴＫＩＴＳＫＨＶＫＭＭＬＳＧＶＣＬＦＡＶＦＩＡＬＬＰＩＬＧＨＲＤＹＫＩＱＡＳＲＴＷＣＦＹＮＴＥＤＩＫＤＷＥＤＲＦＹＬＬＬＦＳＦＬＧＬＬＡＬＧＶＳＬＬＣＮＡＩＴＧＩＴＬＬＲＶＫＦＫＳＱＱＨＲＱＧＲＳＨＨＬＥＭＶＩＱＬＬＡＩＭＣＶＳＣＩＣＷＳＰＦＬＶＴＭＡＮＩＧＩＮＧＮＨＳＬＥＴＣＥＴＴＬＦＡＬＲＭＡＴＷＮＱＩＬＤＰＷＶＹＩＬＬＲＫＡＶＬＫＮＬＹＫＬＡＳＱＣＣＧＶＨＶＩＳＬＨＩＷＥＬＳＳＩＫＮＳＬＫＶＡＡＩＳＥＳＰＶＡＥＫＳＡＳＴ（配列番号７５）
ヒトトロンボキサンＡ２受容体アイソフォームα（ＴＰαＲ）
ＭＷＰＮＧＳＳＬＧＰＣＦＲＰＴＮＩＴＬＥＥＲＲＬＩＡＳＰＷＦＡＡＳＦＣＶＶＧＬＡＳＮＬＬＡＬＳＶＬＡＧＡＲＱＧＧＳＨＴＲＳＳＦＬＴＦＬＣＧＬＶＬＴＤＦＬＧＬＬＶＴＧＴＩＶＶＳＱＨＡＡＬＦＥＷＨＡＶＤＰＧＣＲＬＣＲＦＭＧＶＶＭＩＦＦＧＬＳＰＬＬＬＧＡＡＭＡＳＥＲＹＬＧＩＴＲＰＦＳＲＰＡＶＡＳＱＲＲＡＷＡＴＶＧＬＶＷＡＡＡＬＡＬＧＬＬＰＬＬＧＶＧＲＹＴＶＱＹＰＧＳＷＣＦＬＴＬＧＡＥＳＧＤＶＡＦＧＬＬＦＳＭＬＧＧＬＳＶＧＬＳＦＬＬＮＴＶＳＶＡＴＬＣＨＶＹＨＧＱＥＡＡＱＱＲＰＲＤＳＥＶＥＭＭＡＱＬＬＧＩＭＶＶＡＳＶＣＷＬＰＬＬＶＦＩＡＱＴＶＬＲＮＰＰＡＭＳＰＡＧＱＬＳＲＴＴＥＫＥＬＬＩＹＬＲＶＡＴＷＮＱＩＬＤＰＷＶＹＩＬＦＲＲＡＶＬＲＲＬＱＰＲＬＳＴＲＰＲＳＬＳＬＱＰＱＬＴＱＲＳＧＬＱ（配列番号７６）
ヒトウロテンシンＩＩ受容体（ＧＰＲ１４）
ＭＡＬＴＰＥＳＰＳＳＦＰＧＬＡＡＴＧＳＳＶＰＥＰＰＧＧＰＮＡＴＬＮＳＳＷＡＳＰＴＥＰＳＳＬＥＤＬＶＡＴＧＴＩＧＴＬＬＳＡＭＧＶＶＧＶＶＧＮＡＹＴＬＶＶＴＣＲＳＬＲＡＶＡＳＭＹＶＹＶＶＮＬＡＬＡＤＬＬＹＬＬＳＩＰＦＩＶＡＴＹＶＴＫＥＷＨＦＧＤＶＧＣＲＶＬＦＧＬＤＦＬＴＭＨＡＳＩＦＴＬＴＶＭＳＳＥＲＹＡＡＶＬＲＰＬＤＴＶＱＲＰＫＧＹＲＫＬＬＡＬＧＴＷＬＬＡＬＬＬＴＬＰＶＭＬＡＭＲＬＶＲＲＧＰＫＳＬＣＬＰＡＷＧＰＲＡＨＲＡＹＬＴＬＬＦＡＴＳＩＡＧＰＧＬＬＩＧＬＬＹＡＲＬＡＲＡＹＲＲＳＱＲＡＳＦＫＲＡＲＲＰＧＡＲＡＬＲＬＶＬＧＩＶＬＬＦＷＡＣＦＬＰＦＷＬＷＱＬＬＡＱＹＨＱＡＰＬＡＰＲＴＡＲＩＶＮＹＬＴＴＣＬＴＹＧＮＳＣＡＮＰＦＬＹＴＬＬＴＲＮＹＲＤＨＬＲＧＲＶＲＧＰＧＳＧＧＧＲＧＰＶＰＳＬＱＰＲＡＲＦＱＲＣＳＧＲＳＬＳＳＣＳＰＱＰＴＤＳＬＶＬＡＰＡＡＰＡＲＰＡＰＥＧＰＲＡＰＡ（配列番号７７）
ヒトヒスタミン１型受容体（Ｈ１Ｒ）
ＭＳＬＰＮＳＳＣＬＬＥＤＫＭＣＥＧＮＫＴＴＭＡＳＰＱＬＭＰＬＶＶＶＬＳＴＩＣＬＶＴＶＧＬＮＬＬＶＬＹＡＶＲＳＥＲＫＬＨＴＶＧＮＬＹＩＶＳＬＳＶＡＤＬＩＶＧＡＶＶＭＰＭＮＩＬＹＬＬＭＳＫＷＳＬＧＲＰＬＣＬＦＷＬＳＭＤＹＶＡＳＴＡＳＩＦＳＶＦＩＬＣＩＤＲＹＲＳＶＱＱＰＬＲＹＬＫＹＲＴＫＴＲＡＳＡＴＩＬＧＡＷＦＬＳＦＬＷＶＩＰＩＬＧＷＮＨＦＭＱＱＴＳＶＲＲＥＤＫＣＥＴＤＦＹＤＶＴＷＦＫＶＭＴＡＩＩＮＦＹＬＰＴＬＬＭＬＷＦＹＡＫＩＹＫＡＶＲＱＨＣＱＨＲＥＬＩＮＲＳＬＰＳＦＳＥＩＫＬＲＰＥＮＰＫＧＤＡＫＫＰＧＫＥＳＰＷＥＶＬＫＲＫＰＫＤＡＧＧＧＳＶＬＫＳＰＳＱＴＰＫＥＭＫＳＰＶＶＦＳＱＥＤＤＲＥＶＤＫＬＹＣＦＰＬＤＩＶＨＭＱＡＡＡＥＧＳＳＲＤＹＶＡＶＮＲＳＨＧＱＬＫＴＤＥＱＧＬＮＴＨＧＡＳＥＩＳＥＤＱＭＬＧＤＳＱＳＦＳＲＴＤＳＤＴＴＴＥＴＡＰＧＫＧＫＬＲＳＧＳＮＴＧＬＤＹＩＫＦＴＷＫＲＬＲＳＨＳＲＱＹＶＳＧＬＨＭＮＲＥＲＫＡＡＫＱＬＧＦＩＭＡＡＦＩＬＣＷＩＰＹＦＩＦＦＭＶＩＡＦＣＫＮＣＣＮＥＨＬＨＭＦＴＩＷＬＧＹＩＮＳＴＬＮＰＬＩＹＰＬＣＮＥＮＦＫＫＴＦＫＲＩＬＨＩＲＳ（配列番号７８）
ヒトブラジキニン２型受容体（ＢＫＲＢ２）
ＭＦＳＰＷＫＩＳＭＦＬＳＶＲＥＤＳＶＰＴＴＡＳＦＳＡＤＭＬＮＶＴＬＱＧＰＴＬＮＧＴＦＡＱＳＫＣＰＱＶＥＷＬＧＷＬＮＴＩＱＰＰＦＬＷＶＬＦＶＬＡＴＬＥＮＩＦＶＬＳＶＦＣＬＨＫＳＳＣＴＶＡＥＩＹＬＧＮＬＡＡＡＤＬＩＬＡＣＧＬＰＦＷＡＩＴＩＳＮＮＦＤＷＬＦＧＥＴＬＣＲＶＶＮＡＩＩＳＭＮＬＹＳＳＩＣＦＬＭＬＶＳＩＤＲＹＬＡＬＶＫＴＭＳＭＧＲＭＲＧＶＲＷＡＫＬＹＳＬＶＩＷＧＣＴＬＬＬＳＳＰＭＬＶＦＲＴＭＫＥＹＳＤＥＧＨＮＶＴＡＣＶＩＳＹＰＳＬＩＷＥＶＦＴＮＭＬＬＮＶＶＧＦＬＬＰＬＳＶＩＴＦＣＴＭＱＩＭＱＶＬＲＮＮＥＭＱＫＦＫＥＩＱＴＥＲＲＡＴＶＬＶＬＶＶＬＬＬＦＩＩＣＷＬＰＦＱＩＳＴＦＬＤＴＬＨＲＬＧＩＬＳＳＣＱＤＥＲＩＩＤＶＩＴＱＩＡＳＦＭＡＹＳＮＳＣＬＮＰＬＶＹＶＩＶＧＫＲＦＲＫＫＳＷＥＶＹＱＧＶＣＱＫＧＧＣＲＳＥＰＩＱＭＥＮＳＭＧＴＬＲＴＳＩＳＶＥＲＱＩＨＫＬＱＤＷＡＧＳＲＱ（配列番号７９）
ヒトドーパミン２型受容体アイソフォーム１（Ｄ２Ｒ）
ＭＤＰＬＮＬＳＷＹＤＤＤＬＥＲＱＮＷＳＲＰＦＮＧＳＤＧＫＡＤＲＰＨＹＮＹＹＡＴＬＬＴＬＬＩＡＶＩＶＦＧＮＶＬＶＣＭＡＶＳＲＥＫＡＬＱＴＴＴＮＹＬＩＶＳＬＡＶＡＤＬＬＶＡＴＬＶＭＰＷＶＶＹＬＥＶＶＧＥＷＫＦＳＲＩＨＣＤＩＦＶＴＬＤＶＭＭＣＴＡＳＩＬＮＬＣＡＩＳＩＤＲＹＴＡＶＡＭＰＭＬＹＮＴＲＹＳＳＫＲＲＶＴＶＭＩＳＩＶＷＶＬＳＦＴＩＳＣＰＬＬＦＧＬＮＮＡＤＱＮＥＣＩＩＡＮＰＡＦＶＶＹＳＳＩＶＳＦＹＶＰＦＩＶＴＬＬＶＹＩＫＩＹＩＶＬＲＲＲＲＫＲＶＮＴＫＲＳＳＲＡＦＲＡＨＬＲＡＰＬＫＧＮＣＴＨＰＥＤＭＫＬＣＴＶＩＭＫＳＮＧＳＦＰＶＮＲＲＲＶＥＡＡＲＲＡＱＥＬＥＭＥＭＬＳＳＴＳＰＰＥＲＴＲＹＳＰＩＰＰＳＨＨＱＬＴＬＰＤＰＳＨＨＧＬＨＳＴＰＤＳＰＡＫＰＥＫＮＧＨＡＫＤＨＰＫＩＡＫＩＦＥＩＱＴＭＰＮＧＫＴＲＴＳＬＫＴＭＳＲＲＫＬＳＱＱＫＥＫＫＡＴＱＭＬＡＩＶＬＧＶＦＩＩＣＷＬＰＦＦＩＴＨＩＬＮＩＨＣＤＣＮＩＰＰＶＬＹＳＡＦＴＷＬＧＹＶＮＳＡＶＮＰＩＩＹＴＴＦＮＩＥＦＲＫＡＦＬＫＩＬＨＣ（配列番号８０）
ＧＦＰ２−ＲｌｕｃＩＩ融合物
ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＬＳＹＧＶＱＣＦＳＲＹＰＤＨＭＫＱＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＦＦＫＤＤＧＮＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＹＮＳＨＮＶＹＩＭＡＤＫＱＫＮＧＩＫＶＮＦＫＩＲＨＮＩＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＳＴＱＳＡＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＬＧＭＤＥＬＹＫＧＧＧＧＧＤＩＥＦＬＱＰＧＧＳＧＧＧＧＭＴＳＫＶＹＤＰＥＱＲＫＲＭＩＴＧＰＱＷＷＡＲＣＫＱＭＮＶＬＤＳＦＩＮＹＹＤＳＥＫＨＡＥＮＡＶＩＦＬＨＧＮＡＡＳＳＹＬＷＲＨＶＶＰＨＩＥＰＶＡＲＣＩＩＰＤＬＩＧＭＧＫＳＧＫＳＧＮＧＳＹＲＬＬＤＨＹＫＹＬＴＡＷＦＥＬＬＮＬＰＫＫＩＩＦＶＧＨＤＷＧＡＡＬＡＦＨＹＳＹＥＨＱＤＫＩＫＡＩＶＨＡＥＳＶＶＤＶＩＥＳＷＤＥＷＰＤＩＥＥＤＩＡＬＩＫＳＥＥＧＥＫＭＶＬＥＮＮＦＦＶＥＴＶＬＰＳＫＩＭＲＫＬＥＰＥＥＦＡＡＹＬＥＰＦＫＥＫＧＥＶＲＲＰＴＬＳＷＰＲＥＩＰＬＶＫＧＧＫＰＤＶＶＱＩＶＲＮＹＮＡＹＬＲＡＳＤＤＬＰＫＭＦＩＥＳＤＰＧＦＦＳＮＡＩＶＥＧＡＫＫＦＰＮＴＥＦＶＫＶＫＧＬＨＦＳＱＥＤＡＰＤＥＭＧＫＹＩＫＳＦＶＥＲＶＬＫＮＥＱ（配列番号８１）
ｒＧＦＰ−ＲｌｕｃＩＩ融合物
ＭＤＬＡＫＬＧＬＫＥＶＭＰＴＫＩＮＬＥＧＬＶＧＤＨＡＦＳＭＥＧＶＧＥＧＮＩＬＥＧＴＱＥＶＫＩＳＶＴＫＧＡＰＬＰＦＡＦＤＩＶＳＶＡＦＳＹＧＮＲＡＹＴＧＹＰＥＥＩＳＤＹＦＬＱＳＦＰＥＧＦＴＹＥＲＮＩＲＹＱＤＧＧＴＡＩＶＫＳＤＩＳＬＥＤＧＫＦＩＶＮＶＤＦＫＡＫＤＬＲＲＭＧＰＶＭＱＱＤＩＶＧＭＱＰＳＹＥＳＭＹＴＮＶＴＳＶＩＧＥＣＩＩＡＦＫＬＱＴＧＫＨＦＴＹＨＭＲＴＶＹＫＳＫＫＰＶＥＴＭＰＬＹＨＦＩＱＨＲＬＶＫＴＮＶＤＴＡＳＧＹＶＶＱＨＥＴＡＩＡＡＨＳＴＩＫＫＩＥＧＳＬＰＧＧＧＧＧＤＩＥＦＬＱＰＧＧＳＧＧＧＧＭＴＳＫＶＹＤＰＥＱＲＫＲＭＩＴＧＰＱＷＷＡＲＣＫＱＭＮＶＬＤＳＦＩＮＹＹＤＳＥＫＨＡＥＮＡＶＩＦＬＨＧＮＡＡＳＳＹＬＷＲＨＶＶＰＨＩＥＰＶＡＲＣＩＩＰＤＬＩＧＭＧＫＳＧＫＳＧＮＧＳＹＲＬＬＤＨＹＫＹＬＴＡＷＦＥＬＬＮＬＰＫＫＩＩＦＶＧＨＤＷＧＡＡＬＡＦＨＹＳＹＥＨＱＤＫＩＫＡＩＶＨＡＥＳＶＶＤＶＩＥＳＷＤＥＷＰＤＩＥＥＤＩＡＬＩＫＳＥＥＧＥＫＭＶＬＥＮＮＦＦＶＥＴＶＬＰＳＫＩＭＲＫＬＥＰＥＥＦＡＡＹＬＥＰＦＫＥＫＧＥＶＲＲＰＴＬＳＷＰＲＥＩＰＬＶＫＧＧＫＰＤＶＶＱＩＶＲＮＹＮＡＹＬＲＡＳＤＤＬＰＫＭＦＩＥＳＤＰＧＦＦＳＮＡＩＶＥＧＡＫＫＦＰＮＴＥＦＶＫＶＫＧＬＨＦＳＱＥＤＡＰＤＥＭＧＫＹＩＫＳＦＶＥＲＶＬＫＮＥＱ（配列番号８２）
Ｖｅｎｕｓ−ＲｌｕｃＩＩ融合物
ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹＧＫＬＴＬＫＬＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＬＧＹＧＬＱＣＦＡＲＹＰＤＨＭＫＱＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＦＦＫＤＤＧＮＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＹＮＳＨＮＶＹＩＴＡＤＫＱＫＮＧＩＫＡＮＦＫＩＲＨＮＩＥＤＧＧＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＳＹＱＳＡＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＬＧＭＤＥＬＹＫＧＧＧＧＧＤＩＥＦＬＱＰＧＧＳＧＧＧＧＭＴＳＫＶＹＤＰＥＱＲＫＲＭＩＴＧＰＱＷＷＡＲＣＫＱＭＮＶＬＤＳＦＩＮＹＹＤＳＥＫＨＡＥＮＡＶＩＦＬＨＧＮＡＡＳＳＹＬＷＲＨＶＶＰＨＩＥＰＶＡＲＣＩＩＰＤＬＩＧＭＧＫＳＧＫＳＧＮＧＳＹＲＬＬＤＨＹＫＹＬＴＡＷＦＥＬＬＮＬＰＫＫＩＩＦＶＧＨＤＷＧＡＡＬＡＦＨＹＳＹＥＨＱＤＫＩＫＡＩＶＨＡＥＳＶＶＤＶＩＥＳＷＤＥＷＰＤＩＥＥＤＩＡＬＩＫＳＥＥＧＥＫＭＶＬＥＮＮＦＦＶＥＴＶＬＰＳＫＩＭＲＫＬＥＰＥＥＦＡＡＹＬＥＰＦＫＥＫＧＥＶＲＲＰＴＬＳＷＰＲＥＩＰＬＶＫＧＧＫＰＤＶＶＱＩＶＲＮＹＮＡＹＬＲＡＳＤＤＬＰＫＭＦＩＥＳＤＰＧＦＦＳＮＡＩＶＥＧＡＫＫＦＰＮＴＥＦＶＫＶＫＧＬＨＦＳＱＥＤＡＰＤＥＭＧＫＹＩＫＳＦＶＥＲＶＬＫＮＥＱ（配列番号８３）
βアレスチン（１及び２）とＲｌｕｃＩＩとの間のリンカー
ＫＬＰＡＴ（配列番号８４）
ヒトβアレスチン１
ＭＧＤＫＧＴＲＶＦＫＫＡＳＰＮＧＫＬＴＶＹＬＧＫＲＤＦＶＤＨＩＤＬＶＤＰＶＤＧＶＶＬＶＤＰＥＹＬＫＥＲＲＶＹＶＴＬＴＣＡＦＲＹＧＲＥＤＬＤＶＬＧＬＴＦＲＫＤＬＦＶＡＮＶＱＳＦＰＰＡＰＥＤＫＫＰＬＴＲＬＱＥＲＬＩＫＫＬＧＥＨＡＹＰＦＴＦＥＩＰＰＮＬＰＣＳＶＴＬＱＰＧＰＥＤＴＧＫＡＣＧＶＤＹＥＶＫＡＦＣＡＥＮＬＥＥＫＩＨＫＲＮＳＶＲＬＶＩＲＫＶＱＹＡＰＥＲＰＧＰＱＰＴＡＥＴＴＲＱＦＬＭＳＤＫＰＬＨＬＥＡＳＬＤＫＥＩＹＹＨＧＥＰＩＳＶＮＶＨＶＴＮＮＴＮＫＴＶＫＫＩＫＩＳＶＲＱＹＡＤＩＣＬＦＮＴＡＱＹＫＣＰＶＡＭＥＥＡＤＤＴＶＡＰＳＳＴＦＣＫＶＹＴＬＴＰＦＬＡＮＮＲＥＫＲＧＬＡＬＤＧＫＬＫＨＥＤＴＮＬＡＳＳＴＬＬＲＥＧＡＮＲＥＩＬＧＩＩＶＳＹＫＶＫＶＫＬＶＶＳＲＧＧＬＬＧＤＬＡＳＳＤＶＡＶＥＬＰＦＴＬＭＨＰＫＰＫＥＥＰＰＨＲＥＶＰＥＮＥＴＰＶＤＴＮＬＩＥＬＤＴＮＤＤＤＩＶＦＥＤＦＡＲＱＲＬＫＧＭＫＤＤＫＥＥＥＥＤＧＴＧＳＰＱＬＮＮＲ（配列番号８５）
ヒトβアレスチン２
ＭＧＥＫＰＧＴＲＶＦＫＫＳＳＰＮＣＫＬＴＶＹＬＧＫＲＤＦＶＤＨＬＤＫＶＤＰＶＤＧＶＶＬＶＤＰＤＹＬＫＤＲＫＶＦＶＴＬＴＣＡＦＲＹＧＲＥＤＬＤＶＬＧＬＳＦＲＫＤＬＦＩＡＴＹＱＡＦＰＰＶＰＮＰＰＲＰＰＴＲＬＱＤＲＬＬＲＫＬＧＱＨＡＨＰＦＦＦＴＩＰＱＮＬＰＣＳＶＴＬＱＰＧＰＥＤＴＧＫＡＣＧＶＤＦＥＩＲＡＦＣＡＫＳＬＥＥＫＳＨＫＲＮＳＶＲＬＶＩＲＫＶＱＦＡＰＥＫＰＧＰＱＰＳＡＥＴＴＲＨＦＬＭＳＤＲＳＬＨＬＥＡＳＬＤＫＥＬＹＹＨＧＥＰＬＮＶＮＶＨＶＴＮＮＳＴＫＴＶＫＫＩＫＶＳＶＲＱＹＡＤＩＣＬＦＳＴＡＱＹＫＣＰＶＡＱＬＥＱＤＤＱＶＳＰＳＳＴＦＣＫＶＹＴＩＴＰＬＬＳＤＮＲＥＫＲＧＬＡＬＤＧＫＬＫＨＥＤＴＮＬＡＳＳＴＩＶＫＥＧＡＮＫＥＶＬＧＩＬＶＳＹＲＶＫＶＫＬＶＶＳＲＧＧＤＶＳＶＥＬＰＦＶＬＭＨＰＫＰＨＤＨＩＰＬＰＲＰＱＳＡＡＰＥＴＤＶＰＶＤＴＮＬＩＥＦＤＴＮＹＡＴＤＤＤＩＶＦＥＤＦＡＲＬＲＬＫＧＭＫＤＤＤＹＤＤＱＬＣ（配列番号８６）
【０１９２】
実施例２：ＧＰＣＲ輸送のために新たなＢＲＥＴセンサーの生成及び検証
Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＧＦＰ（ｒＧＦＰ）に基づいた新たなＢＲＥＴ受容体を、受容体内部移行及びβアレスチンによるンドソームへの標的化について、評価するために生成した。これらのＢＲＥＴ受容体は、形質膜またはエンドソームにおける特異的発現のために改変され、ＢＲＥＴ供与体：ＲＬｕｃＩＩ標識化ＧＰＣＲ及びβアレスチンと共に使用した（図１Ａ〜Ｃ）。本明細書に開示されているＢＲＥＴアッセイは、特定のタンパク質間相互作用ではなく、受容体に対する供与体の局所濃度の変化に基づいており、したがって、タンパク質相互作用及びその複合体の結合活性における要件によって制限を受けない。その形質膜局在化では、ｒＧＦＰには、最初にｌｙｎドメインを標識した。Ｌｙｎ−ｒＧＦＰは、ＨＥＫ２９３細胞に発現したとき、主に形質膜に局在化した（図１Ｄ及びＦ）。更に、ｅｎｄｏｆｉｎ  ＦＹＶＥドメインをｒＧＦＰに付加すると（ｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ）、明らかに独占的なエンドソーム局在化を示した（図１Ｅ、左側パネル）。ｅｎｄｏｆｉｎ  ＦＹＶＥセンサーのｍＣｈｅｒｒｙ標識変異体（ｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＹＶＥ）も、ＥＥに集合している低分子Ｇタンパク質Ｒａｂ５と共に共局在化した（図１Ｇ）。注目すべきことに、ワートマニンを使用してＰＩ３Ｋを遮断すると、ｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥをサイトゾル及び拡大エンドソーム小胞へ非局在化し（図１Ｅ、右側パネル）、ＰＩ３Ｐ結合を介したエンドソームの繋ぎ止めと一致した。ＧＰＣＲ輸送を可視化するため、ＣＦＰを標識したブラジキニンＢ２受容体（Ｂ２Ｒ−ＣＦＰ）を使用し、ｌｙｎ−ｒＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙ−ｅｎｄｏｆｉｎ  ＦＹＶＥを同時に発現させた（図１Ｆ）。基礎状態では、Ｂ２Ｒ−ＣＦＰは、ｌｙｎ−ｒＧＦＰと共に形質膜に局在化した（上側パネル）。作動薬により刺激すると、Ｂ２Ｒ−ＣＦＰは、ｌｙｎ−ｒＧＦＰから分離し、エンドソームの中に移動し、そこでｍＣｈｅｒｒｙ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥと共に共局在化した（下側パネル）。形質膜及びエンドソームマーカーの両方（すなわち、ｌｙｎ−ｒＧＦＰ及びＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥのそれぞれ）が対応する区画に留まっているので、受容体のみが、作動薬によって１つの細胞区画から別の細胞区画に再分配され、この系を、ＢＲＥＴの使用によって受容体輸送を動的に追跡するのに適したものにしている。
【０１９３】
実施例３：β−アレスチンを用いたＡＴ１Ｒ内部移行及びそのエンドソームへの輸送の評価
ＢＲＥＴ実験を実施して、受容体エンドサイトーシスをモニターした。β−アレスチンと共にクラスリン経路を輸送され、かつエンドソームに向けられている別のＧＰＣＲである（Ｈｅｉｎ，Ｍｅｉｎｅｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９７；Ｚｈａｎｇ，Ｂａｒａｋ  ｅｔ  ａｌ．１９９９；Ａｎｂｏｒｇｈ，Ｓｅａｃｈｒｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．２０００；Ｏａｋｌｅｙ，Ｌａｐｏｒｔｅ  ｅｔ  ａｌ．２０００；Ｇａｂｏｒｉｋ，Ｓｚａｓｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．２００１）アンギオテンシン１型受容体のＣ末端ドメインに、ＲｌｕｃＩＩを融合させた（ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ）。放射性リガンド結合を使用して、改変ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩが非標識化受容体と同じ程度で内部移行したかを最初に検証した（図７Ａ）。ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ及びｌｙｎ−ｒＧＦＰの同時発現は、形質膜からの受容体の効率的な作動薬媒介除去を妨げず（図７Ａ）、この内部移行は、β−アレスチン２の発現により更に増加した、または優性ネガティブＤｙｎａｍｉｎ  Ｋ４４Ａ（ＤｙｎＫ４４Ａ、図７Ｂ）により阻害された。形質膜における共局在化と一致して、ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ及びｌｙｎ−ｒＧＦＰの発現は、基礎状態での高いＢＲＥＴ比を明らかにした（図２Ａ）。シグナルは、生細胞へのＡｎｇＩＩの負荷及び形質膜からの受容体の除去の後に、濃度依存的に急速に減少した。一方、ｌｙｎ−ＧＦＰ１０の発現は、より低い基礎及びＡｎｇＩＩ誘発ＢＲＥＴ比変化の両方を生じた。意外なことに、ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩを、ＧＦＰ１０−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥではなくｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥと共に発現すると、ＡｎｇＩＩ媒介ＢＲＥＴ変化（ΔＢＲＥＴ）に７．７倍の増加をもたらした（図２Ｂ）。同様に、ＡＴ１Ｒを、β−アレスチン２−ＲｌｕｃＩＩと、ＧＦＰ１０−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥではなくｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥと共に発現すると、ΔＢＲＥＴに４．５倍の増加をもたらした（図２Ｃ）。形質膜からの受容体エンドサイトーシス及びそのエンドソームへの標的化の一時的な過程は、次に、形質膜またはエンドソームＢＲＥＴ受容体センサー（例えば、ｌｙｎ−ｒＧＦＰ及びｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ、それぞれ）のいずれかと共にＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩを使用することによって、解決された。形質膜からのＡＴ１Ｒの消失（ｔ１／２約３分）は、そのエンドソームへの蓄積（ｔ１／２約９分）よりも速かった（図２Ｄ〜Ｆ）。
【０１９４】
ＡＴ１Ｒ内部移行及びβ−アレスチンによるエンドソームへの標的化を制御できる程度を、次に調査した。クラスリン被覆ピット調査において鍵である、Ｄｙｎａｍｉｎの優性ネガティブのＤｙｎａｍｉｎ  Ｋ４４Ａ（ＤｙｎＫ４４Ａ）及びスクロースの両方を、エンドサイトーシス遮断薬として使用した（Ｚｈａｎｇ，Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）。形質膜及びエンドソームにおけるＡｎｇＩＩ媒介ＢＲＥＴ応答（ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ／ｌｙｎ−ｒＧＦＰ及びＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ／ｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ、それぞれ）は、ＤｙｎＫ４４Ａの発現によって効率的に阻害された（図３Ａ及びＢ）。ＤｙｎＫ４４Ａの存在下でのエンドソームにおけるＡＴ１Ｒ／β−アレスチン複合体の蓄積の欠如と一致して、微小のＡｎｇＩＩ媒介ＢＲＥＴ比変化が、β−アレスチン２−ＲｌｕｃＩＩとｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥとの間に観察された（図３Ｃ）。同様に、スクロースは、形質膜においてＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩとｌｙｎ−ｒＧＦＰとの間及びエンドソームにおいてＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩと、β−アレスチン２−ＲｌｕｃＩＩまたはｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥのいずれかとの間のＡｎｇＩＩ誘導ＢＲＥＴ応答を有効に遮断した（図３Ａ〜Ｃ）。驚くべきことに、ＤｙｎＫ４４Ａの過剰発現またはスクロース処理は、（ｌｙｎ−ｒＧＦＰを用いた）形質膜において基礎ＢＲＥＴ比を減少したが（図３Ａ）、（ｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥを用いた）エンドソームでは減少しなかった。β−アレスチン発現は、ＡＴ１Ｒエンドサイトーシスを促進する（Ｇａｂｏｒｉｋ，Ｓｚａｓｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。小胞酸性化阻害剤のバフィロマイシンＡ（Ｂａｆ）及びクロロキン（ＣＱ）は、受容体分解及びＡＴ１Ｒ再循環を防止し（Ｈｅｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１９９７  Ａｕｇ；１１（９）：１２６６−７７）、両方ともエンドソームにおけるＡＴ１Ｒの作動薬媒介蓄積を増加した（図３Ｆ）。作動薬媒介ＧＰＣＲエンドサイトーシスにおける重要な役割と一致して、βアレスチン２の過剰発現は、受容体の内部移行（ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ及びｌｙｎ−ｒＧＦＰ）とそのエンドソームへの標的化（ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ及びｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ）の両方において、５０％を超えてＡｎｇＩＩ媒介ΔＢＲＥＴを増強した（図３Ｄ及びＥ）。ＡｎｇＩＩ媒介ＡＴ１Ｒエンドサイトーシスに対するＤｙｎＫ４４Ａまたはβ−アレスチン２の効果も、リガンド結合実験により検証し、、ＢＲＥＴアッセイにおいて観察されたものと一致したことが見出された（図７Ｂ）。まとめると、これらの結果は、ＡＴ１Ｒエンドサイトーシス及びβ−アレスチンによるエンドソームへの輸送を用量及び時間依存的にモニターする、ＢＲＥＴに基づいたアッセイの有用性を強調している。
【０１９５】
実施例４：エンドサイトーシスの測定及び様々な受容体のエンドソームへの輸送
異なるＧＰＣＲにＲｌｕｃＩＩを標識して、これらの輸送を検査した。バソプレシンＶ２受容体−ＲｌｕｃＩＩ（Ｖ２Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ）がｌｙｎ−ｒＧＦＰにより発現すると、ＡＶＰはＢＲＥＴ比応答を用量依存的に減少した。ＡｎｇＩＩ刺激ＡＴ１Ｒと同様に、ＡＶＰは、Ｖ２Ｒの内部移行をｎＭ範囲（それぞれ１．１ｎＭ及び７．８ｎＭ）のＥＣ５０で促進した（図４Ａ）。一方、Ｖ２Ｒに低い親和性を有する（Ｂａｒｂｅｒｉｓ，Ａｕｄｉｇｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９２）オキシトシンは、低い効力で受容体の内部移行を促進した（図４Ａ、ＥＣ５０＝２．２μＭ）。Ｂ２Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ及びβ２アドレナリン作動性受容体（β２ＡＲ）−ＲｌｕｃＩＩも、それぞれ、それらの同族リガンドであるブラジキニン及びイソプロテレノールによるＢＲＥＴ比の用量依存的減少を示した。しかし、本発明者たちは、受容体間の基礎ＢＲＥＴ比において差を観察した。エンドソームへの受容体の輸送が確かめられたとき、Ｂ２Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ及びβ２ＡＲ−ＲｌｕｃＩＩは、ＢＲＥＴ比における作動薬媒介増加に異なる効力も示した（図４Ｂ）。注目すべきことに、Ｖ２Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ及びｒＧＦＰｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥは、Ｂ２Ｒ及び他の受容体と比較して高い基礎ＢＲＥＴ比を示したが（図４Ｂ）、本発明者たちは、ＡＶＰ刺激によるＢＲＥＴ比の強い増加を依然として検出することができた。このより高い基礎シグナルは、顕微鏡検査法によって示唆されているように、Ｖ２Ｒの高い基礎エンドソーム局在化によって引き起こされた可能性があった（図８）。事実、Ｂ２Ｒと対照的に、Ｖ２ＲとｍＣｈｅｒｒｙ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥの共局在化は、作動薬刺激の不在下においてより多く存在した（図１及び８）。次に、エンドソームへの作動薬媒介受容体／β−アレスチン標的化を、異なるＧＰＣＲによりβａｒｒ２−ＲｌｕｃＩＩ及びｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥを使用して検査した。ＡＴ１Ｒ、Ｖ２Ｒ及びＢ２Ｒは、作動薬の刺激を受けると、基礎の６〜８倍のＢＲＥＴ比を促進し（図４Ｃ）、これは、β−アレスチンを伴ってエンドソームに輸送されるクラスＢのＧＰＣＲの輸送と一致した（Ｏａｋｌｅｙ，Ｌａｐｏｒｔｅ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。しかし、イソプロテレノールによるβ２ＡＲの刺激は、ＢＲＥＴシグナルの生成に失敗しており、エンドソームへのβ−アレスチンを伴わないクラスＡのＧＰＣＲの内部移行と一致した（Ｏａｋｌｅｙ，Ｌａｐｏｒｔｅ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。オキシトシンは、エンドソームへのＶ２Ｒ／β−アレスチン複合体の非常に僅かな輸送を示し、一方、内部移行しない（Ｇｏｕｐｉｌ，Ｗｉｓｅｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）ＰＧＦ２α受容体（ＦＰ）では、基礎に対するＢＲＥＴ比の増加は、作動薬刺激の際に検出されなかった（図４Ｃ）。これらの結果は、異なるクラスのＧＰＣＲのリガンド媒介輸送の研究における、これらの形質膜及びエンドソームＢＲＥＴセンサーの使用を支持している。図４Ｄは、形質膜及びエンドソームＢＲＥＴセンサーを、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）などの他の種類の受容体（すなわち、非ＧＰＣＲ）のエンドサイトーシス及び輸送の研究にも使用できることを示す。図４Ｅは、Ａ���ｇＩＩ刺激後のＡＴ１Ｒ−ＲＬｕｃＩＩ／ｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥバイオセンサーの０．７３を超えるＺ’値を示し、エンドソームにおける受容体内部移行の堅牢でＨＴＳに適合するアッセイを示している。
【０１９６】
実施例５：ＢＲＥＴを使用した受容体再循環の研究
ＧＰＣＲ内部移行の後、多くの受容体は、形質膜に戻るように循環する、または他の細胞内区画に輸送されることが示されている（Ｔｓａｏ，Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。作動薬を除去した後の受容体輸送の力学を、異なるｒＧＦＰ／ＲｌｕｃＩＩ  ＢＲＥＴセンサー対の使用により評価した。形質膜への受容体再循環では、ＡｎｇＩＩが３０分間負荷された、ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ及びｌｙｎ−ｒＧＦＰを発現する細胞を洗浄して、作動薬を除去し、ＢＲＥＴ測定の前に更に４５分間回復させた。結果は、ＡｎｇＩＩで前処理した細胞では、ＢＲＥＴ比は対照と比較しておよそ５０％減少し、シグナルは、作動薬除去の４５分後に対照の約９０％に回復したことを示す（すなわち、約８０％の受容体が形質膜に再循環した。図５Ａ）。同じ概念図式が、ＲｌｕｃＩＩ標識化Ｂ２Ｒ、β２ＡＲ及びＶ２Ｒに当てはまった。これらの知見は、８０％を超えるエンドサイトーシスＢ２Ｒ及びβ２ＡＲが細胞表面に再循環し、一方、僅か約３０％のエンドサイトーシスＶ２Ｒが形質膜に戻るように再循環したことを明らかにした（図５Ｂ）。これらの結果は、以前の研究  （Ｉｎｎａｍｏｒａｔｉ，Ｓａｄｅｇｈｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９８；Ｔｓａｏ  ａｎｄ  ｖｏｎ  Ｚａｓｔｒｏｗ  ２０００；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｓｉｍａａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）と十分一致している。初期エンドソームにおける受容体の消失は、次にＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ及びｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥを使用してモニターした。３０分間のＡｎｇＩＩ処理は、非刺激細胞（対照、図５Ｃ）と比較してＢＲＥＴ比を３倍増加した。ＡｎｇＩＩを除去した４５分後、ＢＲＥＴ比は、基礎の１．５倍であり、７５％のＡＴ１Ｒが、細胞表面に戻るように再循環することにより、または別のエンドサイトーシス選別によって、初期エンドソームから消失したことを示唆している。これらの結果は、エンドサイトーシスのＢＲＥＴアッセイを、形質膜への受容体再循環及びエンドソーム選別の力学のモニターに適用できる証拠を提供している。
【０１９７】
図２６Ａ〜２６Ｃは、異なる区画へのβアレスチンの移行／動員によってもたらされるＢＲＥＴシグナルの変化を、ＢＲＥＴ顕微鏡検査法によって測定できること、ならびにＢＲＥＴ受容体としてのｒＧＦＰの使用が、Ｖｅｎｕｓ及びＧＦＰ２などの他のＢＲＥＴ受容体と比較して強いＢＲＥＴシグナルをもたらすことを示している。ＢＲＥＴに基づいた顕微鏡検査法の画像化は、多様な刺激に応答した別個の細胞内区画へのＲｌｕｃ標識化タンパク質の移行をモニターする、画像に基づいた多重的画像化の可能性を開いている。
【０１９８】
実施例６：アンギオテンシン類縁体によるＡＴ１Ｒの差次的選別
次にリガンド媒介受容体エンドサイトーシスを、異なるＡＴ１Ｒリガンドの使用によって検査した。ＡｎｇＩＩ、ＳＩ及びＤＶＧは、明白な偏向シグナル伝達特性を有することが以前に示されている（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｂｅａｕｔｒａｉｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）。エンドソームへのＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩの輸送を一時的に制御する能力を、ｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥの使用によって最初に評価した。結果は、エンドソームへのＡＴ１Ｒの輸送の初期比率は、リガンドとのインキュベーション（例えば、０〜５分間、図６Ａ）の際に類似していた。しかし、ＤＶＧ結合ＡＴ１Ｒは、１０分で最大内部移行を達成し、一方、ＳＩは、２０分後にようやく最大効果を生じ、両方のリガンドは、初期エンドソームにおいて、ＡＴ１Ｒ濃度の促進においてＡｎｇＩＩより有効性がそれぞれ４０％及び２０％少なかった。４０分の最大内部移行を基準として、ＡＴ１Ｒ内部移行を促進する異なるＡｎｇＩＩリガンドの効力及び有効性を比較した。図６Ｂに示されているように、ＡｎｇＩＩ、ＳＩ及びＤＶＧは、ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩとｌｙｎ−ｒＧＦＰのＢＲＥＴ比を、リガンドの最大濃度で同じ程度に減少した。ＡｎｇＩＩ及びＳＩは、ＡＴ１Ｒ内部移行を促進する同じ傾向（それぞれ１．３ｎＭ及び１．５ｎＭ）を有したが、ＤＶＧは有効性が少なかった（７５ｎＭ）。ＳＩ及びＤＶＧの両方とも、ＡｎｇＩＩと比較してエンドソームに少ない受容体蓄積を促進したが（図６Ｃ）、これらの効力の相対的な順番は、ＡＴ１Ｒ内部移行の促進と同じままであった。興味深いことに、ＳＩ及びＤＶＧは、ＡｎｇＩＩと比較して、エンドソームへの受容体を伴うβ−アレスチン２の輸送を弱く促進した（図６Ｄ）。まとめると、これらの知見は、異なるＡｎｇＩＩリガンドが明白なＡＴ１Ｒ／β−アレスチン２複合体選別を引き起こす証拠を提供している。
【０１９９】
ＡＴ１Ｒの潜在的な差次的細胞内輸送を試験するため、エンドソームの他のＢＲＥＴに基づいたセンサーを、Ｒａｂタンパク質（Ｒａｂ）にｒＧＦＰを標識することによって生成した。Ｒａｂは、多数の細胞内区画の間の小胞輸送を調整し、ＧＰＣＲ輸送がたどる経路の特定に使用されてきた（Ｓｅａｃｈｒｉｓｔ及びＦｅｒｇｕｓｏｎ  ２００３）。Ｒａｂ５は、エンドサイトーシス及び短い循環の再循環の両方において見出され、一方、ｒａｂ４は、短及び長い循環の再循環小胞において見出され、ｒａｂ１１は、長いサイクルの再循環小胞及びリソソームに向けられた小胞において見出される（Ｓｅａｃｈｒｉｓｔ及びＦｅｒｇｕｓｏｎ  ２００３）。ｒＧＦＰ−ｅｎｄｏｆｉｎＦＹＶＥ標識エンドソームが主にＲａｂ５陽性であるので、ｒＧＦＰ標識化Ｒａｂ４（ｒＧＦＰ−ｒａｂ４）及びｒａｂ１１（ｒＧＦＰ−Ｒａｂ１１）を生成した。ｒＧＦＰ−ｒａｂ４及びｒＧＦＰ−ｒａｂ１１は、ＨＥＫ２９３細胞に発現されたとき、両方とも良好な小胞局在化を示した（図９Ａ）。ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ／ｒＧＦＰ−ｒａｂ４発現細胞を、ＡｎｇＩＩ、ＳＩまたはＤＶＧと共にインキュベートしたとき、ＢＲＥＴ比は、経時的に増加した（図６Ｅ）。興味深いことに、ＳＩ及びＤＶＧ刺激は、ＡｎｇＩＩよりも有意に高いＢＲＥＴシグナルを生成した（５及び１０分、図６Ｅ）。１０分目に、ＳＩ及びＤＶＧにより増加したＢＲＥＴ比は、ＡｎｇＩＩの２倍を超えていた。シグナルは、ＳＩ及びＤＶＧでは１０分後、ＡｎｇＩＩでは３０分目に横ばいになった。ｒＧＦＰ−ｒａｂ４に類似して、ｒＧＦＰ−ｒａｂ１１も、ＡｎｇＩＩより全体的に高いＢＲＥＴシグナルを、ＳＩ及びＤＶＧによって明らかにした（図６Ｆ）。ＡＴ１Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ／ｒＧＦＰ−ｒａｂ１１のシグナルは、ｒＧＦＰ−ｒａｂ４と比較してゆっくりと経時的に増加し、それぞれ速い及び遅い再循環におけるｒａｂ４及びｒａｂ１１を伴う以前の知見と十分に一致している（Ｈｕｎｙａｄｙ，Ｂａｕｋａｌ  ｅｔ  ａｌ．２００２；Ｌｉ，Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２００８）。ｒＧＦＰ−ｒａｂ４及びｒＧＦＰ−ｒａｂ１１  ＢＲＥＴアッセイの両方においてＳＩ及びＤＶＧは、有意な差を示さなかった。これらの結果は、ＳＩ及びＤＶＧが、ＡｎｇＩＩと比べて、ＡＴ１Ｒをｒａｂ４またはｒａｂ１１陽性小胞に誘導し、ｒａｂ５陽性小胞にあまり誘導しない証拠を提供している。
【０２００】
近年の証拠は、Ｇタンパク質が膜輸送にいくらかの機能を果たすことを示唆しているが、ＡＴ１Ｒ輸送におけるＧαｑの役割は、研究が不十分ある。ＢＲＥＴに基づいたセンサーを使用して、阻害性Ｇαｑが受容体内部移行にどのように影響を与えたかを評価した。Ｇαｑを不活性状態に特異的に止める阻害剤であるＵｂｏ−ＱＩＣによる細胞の処理は、ＰＭ  ＥｓＢＲＥＴアッセイにより評価して、ＡｎｇＩＩ依存性ＡＴ１Ｒ内部移行を防止しなかった（図９Ｂ）。しかし興味深いことに、阻害性Ｇαｑは、Ｒａｂ５含有エンドソームへのＡｎｇＩＩ結合ＡＴ１Ｒの標的化を、２５％を超えて低減した（図９Ｃ）。Ｇαｑの活性化におけるＤＶＧ及びＳＩの欠失と一致して、Ｕｂｏ−ＱＩＣは、これらのエンドソームにおける受容体のリガンド媒介蓄積に効果がなかった。阻害性Ｇαｑは、Ｒａｂ  ４及びＲａｂ１１小胞においてＡｎｇＩＩ結合ＡＴ１Ｒを増加したが、ＤＶＧまたはＳＩにより促進された、エンドソームへの受容体の選別に関してほとんど効果がなかった（図９Ｄ）。これらの知見は、ＡＴ１Ｒ選別が異なるリガンドにより偏向されうることを示唆している。
【０２０１】
実施例７：機能性の救出を評価する、ＢＲＥＴに基づいた薬理学的シャペロン（ＰＣ）アッセイ及び隔離アッセイ
細胞表面発現を測定するため、ＲｌｕｃＩＩ標識化タンパク質と、細胞内局在化標識により形質膜に位置するエネルギー受容体（ｒＧＦＰ）とのＢＲＥＴにおいて検出された、ＲｌｕｃＩＩ標識化タンパク質の形質密度（図１０Ａ、受容体）に基づいて、アッセイを開発した。図１０Ａにおいて、ｒＧＦＰ局在化に使用された標識の例は以下である。ＫＲＡＳスプライス変異体ｂの多塩基配列及びプレニル化シグナル配列（ＣＡＡＸ）、Ｌｙｎ」キナーゼのパルミトリル化及びミリストイル化シグナル配列（Ｌｙｎ）、ならびにヒトＧＲＫ５の形質膜標的化多塩基配列（ＰＢ）。ＲｌｕｃＩＩを標識した、さもなければＥＲに留まっているンパク質の細胞表面発現ＰＣ救出を評価するアッセイの概略図が、図１０Ａに提示及び記載されている。細胞表面発現を評価するＢＲＥＴに基づいたアッセイを、図１０Ｂに描写及び記載されている、受容体の作動薬誘発性隔離の評価に使用することもできる。大部分のＧＰＣＲ及び他の受容体は、作動薬刺激の際に、内部移行する、または形質膜のサブドメインに隔離される。受容体の細胞表面発現のＰＣ救出後の隔離アッセイを、作動薬結合、したがって機能性を反映している受容体活性化の評価に使用することができる。この研究に使用される異なる構築物が図１１に記載されている。図１１Ａには、ＭＣ４Ｒ−ＲｌｕｃＩＩの記載があり、図１１Ｂには、Ｖ２Ｒ−ＲｌｕｃＩＩの記載があり、図１１Ｃには、非ＧＰＣＲの例として使用された、電位開口型カリウムチャネル（ｈＥＲＧ）の記載がある。個別の形質膜標的化配列を有する３つの異なるｒＧＦＰ構築物を、図１１Ｄに記載されているように試験した。提示されている大部分のアッセイでは、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ及びＭＣ４Ｒ−ＲｌｕｃＩＩ構築物を使用して、アッセイの堅牢度、ＤＭＳＯへの抵抗性及び機能性救出について、作動薬促進隔離を誘発するＭＣ４Ｒ作動薬（αーＭＳＨ）の使用により評価することによって説明した。
【０２０２】
細胞表面発現アッセイの最適化では、２つの異なる形質膜標的化配列をｒＧＰＦ（図１１Ｄに記載されている構築物及び標識）について試験した。ＫＲＡＳフラグメント標識は、脂質化（ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ、プレニル化）及び多塩基ドメインの組み合わせにより形質膜に向けて標的化され、ＧＲＫ５フラグメント標識は、ｒＧＦＰ融合タンパク質の脂質化を必要としない多塩基ドメイン（ｒＧＦＰ−ＰＢ）により形質膜に向けて標的化される。図１２では、２つのｒＧＰＦ構築物（図１２Ａ＝ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ及び図１２Ｂ＝ｒＧＦＰ−ＰＢ）の滴定は、突然変異ｈＭＣ４Ｒ（Ｒ１６５Ｑ）−ＲｌｕｃＩＩを一時的に発現する細胞から得られた。図１２Ａに示されているように、ＤＣＰＭＰ処理は、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸでは可飽和ＢＲＥＴ応答をもたらし、この構築物を、続く実験用に選択した。
【０２０３】
ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ及び３つの形態のｈＭＣ４Ｒ細胞を一時的に発現している細胞である、ＭＣ４Ｒの細胞表面発現及び機能性のＰＣ媒介救出の最適化及び検証のため、ｗｔ受容体（ｈＭＣ４Ｒ  ＷＴ−ＲｌｕｃＩＩ）、ＰＣ救出可能突然変異ＭＣ４Ｒ（ｈＭＣ４Ｒ−Ｒ１６５Ｑ−ｒｌｕｃＩＩ）及びＤＣＰＭＰ処理に抵抗性がある（非ＰＣ救出性である）ことが知られている突然変異ＭＣ４Ｒを、ＰＣ処理及び作動薬媒介隔離を誘発する１時間の作動薬処理後の細胞表面発現について試験した。受容体とｒＧＦＰ−ＣＡＡＸの３つの異なる比について、試験した。示されているように、ＤＣＰＭＰ処理は、ＷＴ及びＲ１６５Ｑ  ＭＣ４ＲではＢＲＥＴシグナルの増加をもたらしたが、Ｐ２９９Ｈ突然変異ＭＣ４Ｒではもたらさなかった。ＤＣＰＭＰ処理後に細胞表面に発現したｗｔ及びＲ１６５Ｑ突然変異ＭＣ４Ｒは、両方とも、図１３Ａ〜Ｃに記載されている作動薬誘発性隔離を示した。９６ウェルプレートの１０ウェルあたり２４ｎｇのプラスミドＤＮＡと同等の条件を、隔離アッセイのために選択した。図１３Ｄは、バイオセンサーの異なる構成成分を、同じｍＲＮＡからコード化及び同時発現することができる（多シストロン構築物）。ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ（Ｋｒａｓ）をコードする多シストロン構築物及びＷＴまたは突然変異ｈＭＣ４Ｒのいずれかを、細胞表面発現のＰＣ救出を示すために使用した。多シストロン構築物は、供与体と受容体の固定比の利点及びウイルス感染のためまたは安定した細胞系の確立のために１つの構築物のみを使用する可能性を提供する。図１３Ｅは、シャペロンＳＲ１２１４６３による、細胞内に留まっていることが知られているＶ２Ｒ突然変異体（Ｙ１２８Ｓ及びＷ１６４Ｓ）のＰＣ媒介救出を示す。
【０２０４】
実施例８：ＢＲＥＴに基づいた細胞表面発現アッセイを、シャペロンの効力及び有効性の薬理学的評価に使用することができる。
本アッセイを、ＰＣ特性を有する薬物を特徴決定することに使用できるか確認するため、用量応答曲線を、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ及びｈＭＣ４Ｒ  ＷＴ−ＲｌｕｃＩＩ構築物またはｈＭＣ４Ｒ（Ｒ１６５Ｑ）−ＲｌｕｃＩＩ構築物のいずれかを共発現する細胞の２つの異なるＰＣ（ＤＣＰＭＰ及び化合物１）処理によって得た（図１４）。用量応答曲線の特徴は、以前に記載されたＦＡＣＳに基づいたアッセイ（Ｐ．Ｒｅｎｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．２０１０  Ｄｅｃ；３３５（３）：５２０−３２）により得られるデータに匹敵し、ＢＲＥＴに基づいたアッセイを、リガンドの特徴決定に使用できることが示された。
【０２０５】
Ｚ’値を、ＭＣ４Ｒ細胞表面発現のＰＣ媒介救出のために決定して、開発されたＢＲＥＴに基づいたアッセイの堅牢度を評価した。Ｚ’値は、ｈＭＣ４Ｒ  ｗｔ−ＲｌｕｃＩＩ（図１５Ａ及び１５Ｂ）とｈＭＣ４Ｒ（Ｒ１６５Ｑ）−ＲｌｕｃＩＩ（図１５Ｃ及び１５Ｄ）の両方について得た。細胞表面発現は、図１５Ａ及び１５Ｃではセレンテラジン４００ａを使用してＢＲＥＴ２により、セレンテラジンＨを使用してＢＲＥＴ１により（図１５Ｂ及び１５Ｄ）評価し、続いて１０μＭのＤＣＰＭＰ対ビヒクルで１６時間処理した。Ｚ’値を評価し、ｈＭＣ４Ｒ  ｗｔ受容体では０．６３を超えており、突然変異Ｒ１６５Ｑ突然変異ｈＭＣ４Ｒでは０．８２を超えていた。結果は、このアッセイの堅牢度が、ＷＴ  ＭＣ４Ｒであってもスクリーニング用途の要件に適合することを示している。
【０２０６】
実施例９：ＤＭＳＯに対する抵抗性の評価
リガンド及び化合物ライブラリーは、多くの場合にＤＭＳＯに溶解されている。細胞表面を評価するＢＲＥＴに基づいたアッセイが、化合物ライブラリーから選択されたリガンドの用量応答曲線に通常は到達するＤＭＳＯの濃度に感受性があるかを評価するため、ｈＭＣ４Ｒ  ｗｔ−ＲｌｕｃＩＩ及びｈＭＣ４Ｒ（Ｒ１６５Ｑ）−ＲｌｕｃＩＩを発現する細胞を、異なる濃度のＤＭＳＯを含有するウェルにおいて１０ｕＭのＤＣＰＭＰにより、またはビヒクル（ＤＭＳＯ）により処理した。図１６に示されているように、このアッセイは、少なくとも３％のＤＭＳＯに対して抵抗性があり、これは、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）用途及び用量応答曲線における化合物の特徴決定に適合する。
【０２０７】
実施例１０：安定した細胞系の生成
バイオセンサーを安定して発現する細胞は、通常、スクリーニングの目的にとって好ましい。次にＭＣ４Ｒ及びＶ２Ｒ発現のＰＣ媒介救出を、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸを一時的に発現している細胞及び安定したｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ細胞系において評価して、安定した細胞系において達成されたｒＧＦＰ−ＣＡＡＸのレベルが、スクリーニング用途の堅牢なアッセイに適合するかを決定した。３つの異なる量（グラフに示されているように、１０個のウェルに６、１２及び２４ｎｇ）のｈＭＣ４Ｒ（Ｒ１６５Ｑ）−ＲｌｕｃＩＩ（図１６Ａ）またはｈＶ２Ｒ（Ｙ１２８Ｓ）−ＲｌｕｃＩＩ（図１６Ｂ）を、異なるレベルのｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ（低、中、高）を発現する安定した系に形質移入して、またはｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ構築物と共に、ＨＥＫ２９３細胞に同時形質移入して、ＢＲＥＴ供与体と受容体の異なる比を試験した。ＭＣ４Ｒの細胞表面発現のＰＣ媒介救出を、図１７に示されているように、ＢＲＥＴ２によって評価した。提示されたデータは、より高いレベルのｒＧＦＰを発現する安定した細胞系によって、より良好な応答を得ることができることを示している。これらの安定した細胞系を使用して、受容体−ＲｌｕｃＩＩ及びｒＧＦＰ−ＣＡＡＸの両方を発現する細胞系を確立することができ、これはスクリーニング用途にとって有用である。
【０２０８】
実施例１１：イオンチャネルのＰＣ媒介細胞表面救出を検出するバイオセンサー
ＢＲＥＴに基づいたＰＣ場界細胞表面発現アッセイをｈＥＲＧと結合する薬物の特定及び特徴決定に使用できるかを確認するため、ＲｌｕｃＩＩ標識化構築物を、ｈＥＲＧのＷＴ配列及び既知の細胞内に留まる突然変異体（Ｇ６０１Ｓ）を使用して作成し、細胞表面発現のアステミゾール媒介救出について試験した（図１８Ａ及びＢ）。用量応答曲線は、ｗｔ−ｈＥＲＧ（図１８Ｃ）及び突然変異体（図１８Ｄ）構築物を用いて、異なる有効性及び効力でｈＥＲＧに対してリガンド及び薬理学的シャペロンとして作用することが知られている薬物によって得た。用量応答曲線の特徴は、ＥＬＩＳＡに基づいた阿世にから得たデータに匹敵した（（ＨＥＲＧ−Ｌｉｔｅ：Ｗｉｂｌｅ  ＢＡ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００５，５２（１）：１３６−４５）。ｈＥＲＧ−（Ｇ６０１Ｓ）を使用して得たＺ’値（図１８Ｅ）は、このＢＲＥＴに基づいたアッセイが、堅牢であり、ＨＴＳなどのハイスループット用途に使用して、異なる天然に生じる突然変異ｈＥＲＧの細胞表面発現を救出することができるｈＥＲＧシャペロンを特定すること、またはｈＥＲＧ結合を介して媒介されるオフターゲット効果を有することができる薬物を特定すること、が可能である。
【０２０９】
実施例１２：ＧＰＣＲへのβ−アレスチン動員をモニターするバイオセンサー
次に、ＧＰＣＲ（すなわち、ＧＰＣＲが局在化している形質膜）へのβ−アレスチン（β−ａｒｒ）動員をモニターすることが可能であるかを、形質膜における受容体と比べた供与体の濃度／密度の変化に依存するＢＲＥＴバイオセンサーの使用によって試験した。図１９Ａに示されているように、ＢＲＥＴ受容体（例えば、ＧＦＰ）に、ＰＭ標的化部分を標識し（したがって、ＢＲＥＴ受容体をＰＭに繋ぎ止め）、β−アレスチンに、ＢＲＥＴ供与体（例えば、ＲｌｕｃＩＩ）を標識する。ＧＰＣＲ作動薬の存在下では、β−アレスチンはＧＰＣＲへ動員され、したがって形質膜でのＲｌｕｃＩＩ−β−アレスチンの濃度が増加し、このことはＲｌｕｃＩＩとＰＭ標識化ＧＦＰとの間のエネルギー転移（ＢＲＥＴ）の増加をもたらす。
【０２１０】
図１９Ｂ及び１９Ｃは、イソプロテレノール（ｉｓｏ）及びＡＶＰそれぞれの増加用量による刺激の後、β−アレスチンに低い親和性を有するクラスＡ受容体β２ＡＲ（図１９Ｂ及び１９Ｃ）とβ−アレスチンに高い親和性を有するクラスＢ受容体Ｖ２Ｒ（図１９Ｄ及び１９Ｅ）の２つの異なるＧＰＣＲによる、β−アレスチン１（図１９Ｂ及び１９Ｄ）ならびにβ−アレスチン２（図１９Ｃ及び１９Ｅ）のＢＲＥＴ比の増加を示す。この結果は、適切なＢＲＥＴシグナルが、異なるＰＭ標的化部分（ＧＲＫ５の多塩基ドメインなどの非脂質に基づいた標的化部分を含む）及び異なるＢＲＥＴ受容体を使用して得られること、最適なシグナルが、ＢＲＥＴ受容体としてＣＡＡＸ（Ｋｒａｓ）ＰＭ標的化部分及びｒＧＦＰを使用して得られることを示している（三角）。図１９Ｆは、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ、ＬｙｎまたはＰＢを有するβａｒｒ−ＲｌｕｃＩＩを使用すると、全て、ＧＦＰ１０−ＣＡＡＸなどの伝統的なＲｌｕｃＩＩ：ＧＦＰ１０  ＢＲＥＴ対よりも大きなＢＲＥＴ応答を生じたことを示している。このβ−アレスチン動員をモニターするアッセイは、有利なことに、受容体の修飾を必要とせず、クラスＡ及びＢの両方の授与体にとって（ＨＴＳを含む）スクリーニング用途に適応性がある堅牢なアッセイももたらす（少なくとも０．７４のＺ’値、図１９Ｇ及びＨ）。図２１Ａ〜２１Ｅは、例えば膜抽出物における実験の実施を可能にする、単分子バイオセンサーを使用したβ−アレスチン移行の評価を示す。３００個のアミノ酸の可動性ポリペプチドリンカーは、短いポリペプチドリンカーと比べて良好なＢＲＥＴシグナルを提供した（図２１Ｃ）。
【０２１１】
実施例１３：形質膜におけるＰＩ（４，５）Ｐ２の量をモニターするバイオセンサー
バイオセンサーを適用して、ＰＬＣδ１−ＰＨドメインを使用する膜ＰＩ（４，５）Ｐ２生成を検出した。基礎状態では、ＰＬＣδ１−ＰＨ−ＲｌｕｃＩＩ及び、ＰＬＣδ１−ＰＨ−ｒＧＦＰ（またはｌｙｎ−ｒＧＦＰもしくはｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ）は、ＰＩ（４，５）Ｐ２が位置するＰＭに局在化し、それによって局所濃度／密度は検出可能なＢＲＥＴシグナルを生成するのに十分に高くなる。ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）が、リガンドＡｎｇＩＩによるＡＴ１Ｒの活性化を介して活性化される（したがって、ＰＩ（４，５）Ｐ２の加水分解が誘発される）とき、ＲｌｕｃＩＩ及びｒＧＦＰで標識されたＰＬＣδ１−ＰＨドメインはサイトゾルに拡散し、これによってｒＧＦＰ及びＲｌｕｃＩＩの局所濃度が低減され、したがってＢＲＥＴシグナルが用量依存的に減少した（図２０Ａ及びＢ）。
【０２１２】
実施例１４：形質膜におけるジアシルグリセロール（ＤＡＧ）をモニターするバイオセンサー
ＰＬＣを活性化すると、膜ＰＩＰ２は、ＩＰ３及びＤＡＧに加水分解される。イノシトール三リン酸はサイトゾルに拡散するが、ＤＡＧは、その疎水性のために形質膜に留まる。図２２Ａ及び２３Ａは、形質膜へのＰＫＣδ（Ｃ１ｂ）のジアシルグリセロール−（ＤＡＧ−）結合ドメインの移行を測定する、バイオセンサーの概略図を示す。バイオセンサーは、ＢＲＥＴ受容体（例えば、ｒＧＦＰ、ＧＦＰ１０）及びＰＫＣδ、Ｃ１ｂのＤＡＧ結合ドメインに連結したＢＲＥＴ供与体（例えば、ＲｌｕｃＩＩ）に結合している、ＰＭ標的化ドメイン／部分を含む。ＰＩＰ２の後の形質膜におけるＤＡＧ富化は、Ｃ１ｂドメインを膜に結合させ、ＢＲＥＴ受容体（例えば、ｒＧＦＰ）及びＢＲＥＴ供与体（例えば、ＲｌｕｃＩＩ）を互いに近づけて、より高いＢＲＥＴシグナルを誘発する。図２２Ａに描写されているバイオセンサーでは、ＢＲＥＴ受容体及びＢＲＥＴ供与体構成成分は、一緒に連結されており（単分子バイオセンサー）、このことは、例えば膜抽出物における実験の実施を可能にし、これらの構成成分は、図２３Ａに描写されているバイオセンサーでは、別々に発現している。図２２Ｂ〜２２Ｈ及び図２３Ｂ〜２３Ｅに描写されている結果は、形質膜におけるＤＡＧ蓄積が、両方のバイオセンサーを使用してモニターされうることを示している。図２２Ｆは、Ｎ−（３−トリフルオロメチルフェニル）−２，４，６−トリメチルベンゼンスルホンアミド（ｍ−３Ｍ３ＦＢＳ）を使用するＰＬＣの直接活性を示し、このことは、膜ＰＩＰ２からＩＰ３及びＤＡＧへの加水分解を誘発し（したがって、膜におけるＤＡＧの量を増加し）単分子バイオセンサーを使用して検出されるＢＲＥＴシグナルの増加をもたらした。
【０２１３】
実施例１５：Ｇタンパク質サブユニット隔離をモニターするバイオセンサー
作動薬の不在下では、Ｇタンパク質サブユニットは形質膜に局在化する。作動薬（Ａ）を使用したＧＰＣＲ活性化を受けると、Ｇタンパク質サブユニットは、形質膜から放出される。ＢＲＥＴ受容体（例えば、ｒＧＦＰ、ＧＦＰ１０）に結合しているＰＭ標的化ドメイン／部分及びＧタンパク質サブユニットに連結しているＢＲＥＴ供与体を使用して、ＰＭからのＧタンパク質サブユニットの放出によりもたらされるＢＲＥＴシグナルの減少をモニターすることによって、ＧＰＣＲ活性化をモニターすることが可能である（図２４Ａ）。図２４Ｂ及び２４Ｃは、異なるＲｌｕｃＩＩ標識化Ｇγサブユニットを使用したイソプロテレノールによるβ１ＡＲ及びβ２ＡＲそれぞれの活性化の後のＢＲＥＴ比の変化を示し、Ｇγ１及びＧγ１１が主にβ１ＡＲのシグナル伝達に関与し、Ｇγ１が主にβ２ＡＲのシグナル伝達に関与する証拠を提供している。図２４Ｄ〜２４Ｈは、ＧＰＣＲの作動薬刺激の後の異なる細胞区画への異なるＧタンパク質サブユニットの隔離／移行が、バイオセンサーを使用してモニターされうることを示している。
【０２１４】
実施例１６：ＲｈｏＡ活性化をモニターするバイオセンサー
Ｒｈｏ活性化についてのバイオセンサーは、形質膜に局在化するＲｈｏ（Ｒｈｏ−ＧＴＰ）の活性形態と結合するＰＫＮのＣＲＩＢドメインの、形質膜への動員を、ＢＲＥＴを使用してモニターすることによって設計された。ＢＲＥＴ対は、ＢＲＥＴ供与体としてのＰＫＮのＲｌｕｃＩＩ標識化ＣＲＩＢドメイン及び受容体としての形質膜結合ｒＧＦＰ（ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ）である（図２５Ａ）。図２５Ｂ〜２５Ｇは、ＰＫＮのＣＲＩＢドメインが、Ｇｑ／１２／１３に結合したＧＰＣＲの作動薬刺激により形質膜に移行すること及び移行が、特異的Ｇｑ阻害剤の存在下で減少することを示している。図２５Ｈ〜２５Ｊは、Ｒｈｏバイオセンサーを使用して測定した、ＢＲＥＴ比に対するＲｈｏ調節因子の効果を示している。ＢＲＥＴ比は、Ｒｈｏ活性化剤の存在下で増加し、Ｒｈｏ阻害剤の存在下で減少し、アッセイの特異性が確認されている。
【０２１５】
実施例１７：局在化／輸送バイオセンサーを使用したハイスループットスクリーニングによるＡＴ１Ｒの制御因子の特定
βａｒｒ２−ＲｌｕｃＩＩ及びｒＧＦＰ−ＦＹＶＥを有するＡＴ１Ｒを使用し、１１５，０００個をスクリーンして、エンドソームにおけるＡＴ１ＲのＡｎｇＩＩ媒介局在化を増強または阻害する化合物をＢＲＥＴアッセイにより特定した。３０個の増強剤及び４２個の阻害剤が特定された（図２７Ａ）。図２７Ｂは、スクリーンで特定された化合物番号２１（Ｔｒａｆ  ２１）が、未処理で作動薬刺激された細胞と比較して、エンドソームへのＢ２Ｒ−ＹＦＰまたはβａｒｒ２−ＹＦＰの標的化をブロックすることを示している。図２７Ｃは、スクリーンで特定された化合物番号１０（Ｔｒａｆ  １０）及び番号２９（Ｔｒａｆ  ２９）が、未処理で作動薬刺激された細胞と比較して、エンドソームへのＢ２Ｒ−ＹＦＰまたはβａｒｒ２−ＹＦＰの標的化を増強したことを示している。これらの結果は、本明細書に記載されているバイオセンサーを使用して、ハイスループットスクリーニングによりタンパク質局在化／輸送の制御因子（例えば、作動薬、拮抗薬）を特定できることを示している。
【０２１６】
本発明は、本明細書上記において、特定の実施形態によって記載されてきたが、添付されている特許請求の範囲に定義される発明の主題の精神及び性質から逸脱することなく、変更することができる。特許請求の範囲において、語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」は、制約のない用語として使用され、語句「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ，  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ（含まれるが、これらに限定されない）」と実質的に同等である。単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、特に文脈により明確に指示されない限り、対応する複数対象を含む。
【０２１７】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図２Ａ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図９Ａ】
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【配列表】
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