(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
周囲温度で生物試料中に含まれる核酸を安定化する方法であって、
ａ）生物試料をキレート化剤を含む水性組成物と接触させて、混合物を形成するステップであって、前記キレート化剤が少なくとも約１５０ｍＭの濃度で存在し、前記組成物のｐＨが９．５超であるステップと、
ｂ）（ａ）の前記混合物を均一化して均一混合物を形成するステップと、
ｃ）周囲温度で前記均一混合物を貯蔵するステップと、を含み、
前記キレート化剤が１，２−シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、テトラアザシクロドデカン四酢酸（ＤＯＴＡ）、テトラアザシクロテトラデカン四酢酸（ＴＥＴＡ）、デスフェリオキシミン、またはこれらのキレート化剤類似体から選択される、方法。
【請求項２】
前記核酸がデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物試料が、糞便試料、土壌試料、下水試料、廃水試料、または水試料である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記生物試料が哺乳動物から得られた糞便試料である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記哺乳動物はヒトである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
下記要件（ａ）〜（ｇ）の少なくとも１種を満たす、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（ａ）前記キレート化剤がＣＤＴＡである、
（ｂ）前記キレート化剤の濃度が１５０ｍＭ〜５００ｍＭ、または２５０ｍＭ〜３５０ｍＭ、または３００ｍＭである、
（ｃ）前記組成物のｐＨが９．５超〜１１．５、または１０．５〜１１．５、または１１である、
（ｄ）前記組成物がｐＨ９．５超〜１１．５の範囲に緩衝化可能な少なくとも１種の緩衝剤をさらに含み、
（ｅ）前記組成物が水溶性有機溶媒をさらに含み、
（ｆ）前記組成物が界面活性剤をさらに含み、および
（ｇ）前記組成物が消泡剤をさらに含む。
【請求項７】
前記水溶性有機溶媒がＣ１−Ｃ６アルカノールである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記水溶性有機溶媒がエタノールであり、前記エタノールが前記組成物中に２４体積％未満の濃度で存在する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記混合物が均一化手段を使って均一化される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記均一化手段が少なくとも１個のミキシングボールである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法が、前記少なくとも１個のミキシングボールを含む試料容器中で前記生物試料および前記組成物の混合物を形成するステップと、前記試料容器を密閉するステップと、前記少なくとも１個のミキシングボールの存在下で前記混合物を振盪することにより前記混合物を均一化するステップとを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記振盪することを手で行う、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
以下の要件（ａ）〜（ｃ）のいずれかを満たす、請求項１１または１２に記載の方法。
（ａ）前記少なくとも１個のミキシングボールが、ステンレス鋼ミキシングボールまたはタングステンカーバイドミキシングボールである、
（ｂ）前記少なくとも１個のミキシングボールが、直径が５．６〜１１．１ｍｍ、密度が少なくとも７．６ｇ／ｃｍ３であるステンレス鋼ミキシングボールである、または
（ｃ）前記少なくとも１個のミキシングボールが、直径が７．１〜８．７ｍｍ、密度が少なくとも７．６ｇ／ｃｍ３であるステンレス鋼ミキシングボールであり、且つ前記試料容器は、内径が１２．９ｍｍの丸底チューブである。
【請求項１４】
下記要件（ａ）または（ｂ）のいずれか一方を満たす、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
（ａ）前記生物試料がヒトから得られた糞便試料であり、前記核酸がヒトＤＮＡである、あるいは、
（ｂ）前記核酸が微生物ＤＮＡであり、前記方法は前記生物試料のマイクロバイオームプロファイルを安定に保持する。
【請求項１５】
前記生物試料がヒトから得られた糞便試料であり、前記核酸がヒトＤＮＡであり、前記ヒトＤＮＡは、下記期間：
室温で少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも３０日間、もしくは少なくとも６０日間、
３７℃〜５０℃の温度で少なくとも７日間、もしくは少なくとも１４日間、および／または
−２０℃で少なくとも３０日間
にわたり安定に保持可能である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記生物試料のマイクロバイオームプロファイルを安定化するための方法であって、前記核酸が微生物ＤＮＡであり、前記生物試料のマイクロバイオームプロファイルは、下記期間：
室温で少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも３０日間、もしくは少なくとも６０日間、
３７℃〜５０℃の温度で少なくとも７日間、もしくは少なくとも１４日間、および／または
−２０℃で少なくとも３０日間
にわたり安定に保持可能である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
周囲温度で生物試料中に含まれる核酸を安定化するための水性組成物であって、前記水性組成物がキレート化剤を含み、前記キレート化剤が少なくとも１５０ｍＭの濃度で存在し、前記組成物のｐＨが９．５超であり、前記キレート化剤がＣＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡ、デスフェリオキシミン、またはこれらのキレート化剤類似体から選択されるものである、水性組成物。
【請求項１８】
前記核酸がデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記生物試料が糞便試料、土壌試料、下水試料、廃水試料、または水試料である、請求項１７または１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記生物試料が哺乳動物から得られた糞便試料である、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記哺乳動物がヒトである、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
下記要件（ａ）〜（ｇ）の少なくとも１種を満たす、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の組成物。
（ａ）前記キレート化剤がＣＤＴＡである、
（ｂ）前記キレート化剤の濃度が１５０ｍＭ〜５００ｍＭ、または２５０ｍＭ〜３５０ｍＭ、または３００ｍＭである、
（ｃ）前記組成物のｐＨが９．５超〜１１．５、または１０．５〜１１．５、または１１である、
（ｄ）前記組成物がｐＨ９．５超〜１１．５の範囲に緩衝化可能な少なくとも１種の緩衝剤をさらに含み、
（ｅ）前記組成物が水溶性有機溶媒をさらに含み、
（ｆ）前記組成物が界面活性剤をさらに含み、および
（ｇ）前記組成物が消泡剤をさらに含む。
【請求項２３】
前記水溶性有機溶媒がＣ１−Ｃ６アルカノールである、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記水溶性有機溶媒がエタノールであり、前記エタノールが前記組成物中に３０体積％未満の濃度、または２４体積％未満の濃度で存在する、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記生物試料がヒトから得られた糞便試料であり、前記核酸がヒトＤＮＡである、またが前記核酸が微生物ＤＮＡであり、前記組成物が前記生物試料のマイクロバイオームプロファイルを安定化するためのものである、請求項１７〜２４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
周囲温度で生物試料中に含まれる核酸を安定化するためのキットあって、
ａ）再密閉可能な蓋を有する試料容器と、
ｂ）キレート化剤を含む水性組成物であって、前記キレート化剤が少なくとも１５０ｍＭの濃度で存在し、ｐＨが９．５超である組成物と、
ｃ）均一化手段と、
ｄ）前記生物試料またはその一部を前記試料容器中に移す手段と、
ｅ）使用のための説明書と、を含み
前記キレート化剤がＣＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡ、デスフェリオキシミン、またはこれらのキレート化剤類似体から選択されたものである、キット。
【請求項２７】
前記組成物が前記試料容器内に収容されている、および／または前記均一化手段が前記試料容器内に収容されている、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
前記核酸がデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、請求項２６または２７に記載のキット。
【請求項２９】
前記生物試料が糞便試料、土壌試料、下水試料、廃水試料、または水試料である、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３０】
前記生物試料が哺乳動物から得られた糞便試料である、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３１】
前記哺乳動物はヒトである、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
下記要件（ａ）〜（ｇ）の少なくとも１種を満たす、請求項２６〜３１のいずれか１項に記載のキット。
（ａ）前記キレート化剤がＣＤＴＡである、
（ｂ）前記キレート化剤の濃度が１５０ｍＭ〜５００ｍＭ、または２５０ｍＭ〜３５０ｍＭ、または３００ｍＭである、
（ｃ）前記組成物のｐＨが９．５超〜１１．５、または１０．５〜１１．５、または１１である、
（ｄ）前記組成物がｐＨ９．５超〜１１．５の範囲に緩衝化可能な少なくとも１種の緩衝剤をさらに含み、
（ｅ）前記組成物が水溶性有機溶媒をさらに含み、
（ｆ）前記組成物が界面活性剤をさらに含み、および
（ｇ）前記組成物が消泡剤をさらに含む。
【請求項３３】
前記水溶性有機溶媒がＣ１−Ｃ６アルカノールである、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
前記水溶性有機溶媒がエタノールであり、前記エタノールが前記組成物中に３０体積％未満の濃度、または２４体積％未満の濃度で存在する、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
前記生物試料がヒトから得られた糞便試料であり、前記核酸がヒトＤＮＡである、あるいは前記核酸が微生物ＤＮＡであり、前記キットが前記生物試料のマイクロバイオームプロファイルを安定化するためのものである、請求項２６〜３４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３６】
前記均一化手段が少なくとも１個のミキシングボールである、請求項２６〜３５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３７】
（ａ）前記少なくとも１個のミキシングボールが、ステンレス鋼ミキシングボールまたはタングステンカーバイドミキシングボールである、
（ｂ）前記少なくとも１個のミキシングボールが、直径が５．６〜１１．１ｍｍ、密度が少なくとも７．６ｇ／ｃｍ３であるステンレス鋼ミキシングボールである、または
（ｃ）前記少なくとも１個のミキシングボールが、直径が７．１〜８．７ｍｍ、密度が少なくとも７．６ｇ／ｃｍ３であるステンレス鋼ミキシングボールであり、且つ前記試料容器が、内径が１２．９ｍｍの丸底チューブである、
請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
前記核酸がＤＮＡであり、前記生物試料が哺乳動物から得られた糞便試料であり、前記組成物は、ｐＨが１０．５〜１１．５であり、
２５０ｍＭ〜３５０ｍＭ、または３００ｍＭのＣＤＴＡ、
３０ｍＭ〜７０ｍＭ、または５０ｍＭのベータアラニン、
２１．５体積％〜２３．５体積％、または２３．５体積％のエタノール、
０〜１％（ｗ／ｖ）、または０．５％（ｗ／ｖ）のナトリウムドデシルスルフェート、および
０〜０．２％（ｖ／ｖ）または０．１％（ｖ／ｖ）の量の消泡剤
を含む、それらから本質的に構成される、またはそれらから構成されるものであり、
前記消泡剤はシリコーンポリマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
内径が１２．９ｍｍ、直径が５．６〜１１．１ｍｍ、密度が少なくとも７．６ｇ／ｃｍ３である少なくとも１個のステンレス鋼ミキシングボールを含む丸底チューブ中で前記糞便試料と前記組成物との混合物を形成するステップと、前記丸底チューブを密閉するステップと、前記少なくとも１個のステンレス鋼ミキシングボールの存在下で前記混合物を手で振盪することにより前記混合物を均一化するステップとを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記核酸が微生物ＤＮＡであり、前記方法が前記糞便試料のマイクロバイオームプロファイルを安定化し、前記糞便試料の前記マイクロバイオームプロファイルが、
室温で、少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも３０日間、もしくは少なくとも６０日間；
３７℃〜５０℃の温度で少なくとも７日間、もしくは少なくとも１４日間；および／または
−２０℃で少なくとも３０日間
にわたり安定に保持可能である、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記核酸がＤＮＡであり、前記生物試料が哺乳動物から得られた糞便試料であり、前記組成物は、ｐＨが１０．５〜１１．５であり、
２５０ｍＭ〜３５０ｍＭ、または３００ｍＭのＣＤＴＡ、
３０ｍＭ〜７０ｍＭ、または５０ｍＭのベータアラニン、
２１．５体積％〜２３．５体積％、または２３．５体積％のエタノール、
０〜１％（ｗ／ｖ）、または０．５％（ｗ／ｖ）のナトリウムドデシルスルフェート、および
０〜０．２％（ｖ／ｖ）または０．１％（ｖ／ｖ）の量の消泡剤
を含む、それらから本質的に構成される、またはそれらから構成されるものであり、前記消泡剤はシリコーンポリマーである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項４２】
前記糞便試料のマイクロバイオームプロファイルを安定化するためのものである、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記核酸がＤＮＡであり、前記生物試料が哺乳動物から得られた糞便試料であり、前記組成物はｐＨが１０．５〜１１．５であり、
２５０ｍＭ〜３５０ｍＭ、または３００ｍＭのＣＤＴＡ、
３０ｍＭ〜７０ｍＭ、または５０ｍＭのベータアラニン、
２１．５体積％〜２３．５体積％、または２３．５体積％のエタノール、
０〜１％（ｗ／ｖ）、または０．５％（ｗ／ｖ）のナトリウムドデシルスルフェート、および
０〜０．２％（ｖ／ｖ）または０．１％（ｖ／ｖ）の量の消泡剤
を含む、それらから本質的に構成される、またはそれらから構成されるものであり、前記消泡剤はシリコーンポリマーである、請求項２６に記載のキット。
【請求項４４】
前記核酸が微生物のＤＮＡであり、前記キットが前記生物試料のマイクロバイオームプロファイルを安定化するためのものである、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
前記均一化手段が直径が５．６〜１１．１ｍｍ、および密度が少なくとも７．６ｇ／ｃｍ３である少なくとも１個のステンレス鋼ミキシングボールであり、且つ前記試料容器が、内径が１２．９ｍｍの丸底チューブである、請求項４３または４４に記載のキット。
【請求項４６】
前記核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）である、請求項１の方法。
【請求項４７】
前記核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）である、請求項１７の組成物。
【請求項４８】
前記核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）である、請求項２６のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、生物試料中の核酸を安定化する分野に関する。より具体的には、本発明は糞便などの複雑な生物試料中に存在するヒトおよび微生物の両方のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を安定化する組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糞便は、長い間、動物の消化管由来の潜在的に感染性のある廃棄物として分類されており、この廃棄物は、蟯虫および／またはそれらの卵などの寄生生物を試験するために、または症候性動物およびヒト中の病原菌および真菌を検出するために収集される。しかしながら、近年、オーダーメイド医療ならびにプレバイオティクスおよびプロバイオティクスの広範にわたる商業化の増加に伴い、この「廃棄」物の診断および、特に、予後における価値が急上昇した。食習慣における単純な変化が、糞便中の微生物叢または微生物群の組成に影響を与えることが明らかになり（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１１；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）、このことが、次に、健康に影響を与え、特定の疾患の発生率を減らす。
【０００３】
消化（ＧＩ）管のコロニー形成は出生時に始まり、次第に成長する微生物群は、個人の遺伝的構成、年齢、性別、栄養、抗生物質の使用およびその他の消費された医薬品、疾患状態、生活習慣、地理的な位置／環境、化学曝露、外科的処置などの多くの影響を受けて形成される。多様な微生物群は、約１００兆個の細菌からなる腸コロニーを形成し、これはヒトの健康、特に食物消化、宿主エネルギー代謝、必須ビタミンの合成、上皮成熟、胆汁酸塩の分解、薬剤および食事由来の発癌物質、ならびに病原体のコロニー形成から腸の保護における重要な役割を果たす。
【０００４】
「腸マイクロバイオーム」とは、ヒトＧＩ系におけるこの巨大な一群の共生微生物およびそれらの集団的相互作用ゲノムを特徴付けるために付与された用語である。しかし、これらの腸微生物叢と宿主生理機能との間の機能的相互作用の理解はまだ始まったばかりである。ヒトマイクロバイオームプロジェクトにより、腸マイクロバイオームはヒトゲノムより約１５０倍大きく、およそ３００〜１０００細菌種および７０００を越える株からなることが明らかになった。ほとんどの哺乳動物では、４つの細菌門：ファーミキューテス門、バクテロイデス門、放線菌門およびプロテオバクテリア門が腸マイクロバイオームの大半を占めている（Ｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。新しい作業の領域は、腸マイクロバイオームと、腸寄生生物、ウイルス、酵母、および多数の真菌、例えば、カンジダ、サッカロマイセス、アスペルギルス、およびアオカビ類との相互作用の分析に関する。一部の専門家は、ヒトゲノムのみによりコードされる全情報では、身体の生物学的機能の全てを実行するには十分でないことを示唆し（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｍａｚｍａｎｉａｎ，２０１０）、１つの説明として、細菌とヒトの間の共生を挙げている。約１０パーセントのヒトの細胞のみが実際にヒトであり、微生物が残りの９０パーセントを構成することから、ヒトは我々の微生物ゲストまたは超個体に対するホストであると考えることができる。
【０００５】
何十年もの間、腸の微生物は結腸癌の開始に結びつけられてきた（Ａｒｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９６９；Ｍｏｏｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ，１９９５）。より最近では、ヘリコバクターピロリ感染が胃癌、胃リンパ腫、および消化性潰瘍疾患の主要な原因として特定されている（Ｐａｒｓｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。しかし、腸微生物は、我々がどのように感じ、振る舞うかに関し、我々が知っているより多くの影響を与えることが分かっている。腸と脳との間で通信が存在するという証拠が増加していることに起因して、腸は「第２の脳」と呼ばれている。心臓血管疾患、糖尿病、ストレス／不安症、自閉症、クローン病、過敏性腸疾患（ＩＢＤ）、アレルギー性疾患、代謝症候群、および神経系炎症などの多数の疾患は、腸マイクロバイオームの調節不全に起因する可能性があることが証拠から示唆される。しかし、研究者らは、何が、現在「マイクロバイオーム−腸−脳軸」と名付けられているのか、すなわち、ＧＩ管にコロニー形成する微生物が、その宿主中で、どのようにして、腸を越えて生物学的機能に影響を与えることができるのかということ、特に、それによって腸マイクロバイオームが免疫学的、内分泌および神経学的疾患に影響を与える、分子機序またはクロストークを解明し始めたところである（Ｇｒｅｎｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｋｉｎｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。例えば、多くの微生物は、ＧＡＢＡ、ノルアドレナリン、セロトニン、ドーパミン、およびアセチルコリンなどの神経伝達物質または神経伝達のモジュレーターである神経代謝物を生成する。これらは、腸中の神経終末に直接作用するか、またはＧＩ管全体に存在する腸クロム親和性細胞を介して作用する。食物繊維由来の炭水化物はまた、微生物により破砕され、向神経活性化学物質、例えば、ｎ−ブチレート、酢酸塩、硫化水素およびプロピオネートを生ずる。さらに、微生物は、タンパク質、炭水化物、およびその他の分子などの代謝物を放出し、これらの代謝物は腸を出て、身体全体の疾患の情報伝達に関与し得る。
【０００６】
健康な個人および病気の個人のいずれでも、腸の微生物群を構成する数百の種々の種を特定することのみならず、細菌共同体全体としての機能の理解を得ることが極めて重要である。例えば、微生物叢の組成は、増殖基質としての食用成分の競合、糖の抑制性発酵産物への変換、増殖基質の産生、バクテリオシン（他の細菌種に対する毒性分子）の放出、自然免疫系の刺激、腸壁にコロニー形成する微生物に対する競合および腸障壁機能、などを決定する。残念なことに、従来の微生物学的培養技術は、適切な増殖栄養素および全体の腸内微生物叢をインビトロで繁殖させるための複雑な条件へのそれらの依存性に由来する大きな制約が原因で、腸マイクロバイオームのメンバーの素性および機能を決定するためにはほとんど役立たないことが明らかになった。全腸内微生物叢の２０〜４０％のみが標準的培養技術で培養できるに過ぎない（Ａｐａｊａｌａｈｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）と推定され、そのため、培養に基づく方法では、微生物の生物多様性の大多数が見逃されてきた。この因子は、その多くが嫌気性である腸内微生物叢のインビトロ生存率を保証する必要性によってさらに倍加される（Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ，２０００）。
【０００７】
多くの培地は、本質的に一部の細菌を選択し、特に、追加のまたは選択的な薬剤を要求する細菌あるいは糞便または腸内物質からの直接的培養を促進しない生理的な状態における細菌を選択する。また、腸内微生物叢を特定し特徴付けるための従来の形態学的調査および生化学的試験は、極めて労働集約的で、時間がかかり、また精度を欠いており、そのために、多数の個人由来の検体を分析し、異なる個人由来の細菌種間の関連性を比較するためのそれらの有効性が制限されている。したがって、培養非依存性の分子ツール、例えば、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に基づく手法、ＴａｑＭａｎプローブ、デジタルおよびＬＡＴＥ  ＰＣＲ、ならびにメタゲノミクスシーケンシング、と併せて、マイクロバイオームを捕らえて安定化し、または収集の時点で「スナップショット」をとるための方法が、これらの制限および偏りを克服し、それにより、この恵まれたエコシステムの真の詳細な状態が明らかにされるために必要である。
【０００８】
今日では、２０人の入院患者あたりおよそ１人が院内感染（ＨＡＩ）に罹患すると思われる。ほとんどのタイプのＨＡＩは減少傾向にあるが、既知の病原性共生生物であるクロストリジウム・ディフィシレが原因の感染の発生は、病院および長期保健医療施設の患者を苦しめる増加傾向にある問題である。クロストリジウム・ディフィシレ感染（ＣＤＩ）は、消化管腸内菌共生バランス失調、すなわち、常在性微生物叢の破壊に起因すると考えられている。抗生物質処置は、通常クロストリジウム・ディフィシレを制御しているＧＩ管中のほとんどの細菌を死滅させる。この変えられた環境中では、クロストリジウム・ディフィシレが複製し、腸の内層を攻撃する毒素を産生し、下痢〜命に関わる炎症および結腸の内層の出血に及ぶ症状を引き起こす。米国疾病予防管理センター（ＣＤＣ）によると、クロストリジウム・ディフィシレだけで、米国内で、１４，０００人／年の死亡に繋がっている。病院内では、糞便中に放出されたクロストリジウム・ディフィシレ胞子は、主として汚染体表面または汚染物を触った保健医療職員の手を介して患者および表面に移される。再発性クロストリジウム・ディフィシレ感染に対する効果的な処置は、広く利用可能にはなっていない。逆説的であるが、クロストリジウム・ディフィシレ感染に対する一次処置は、より多くの抗生物質の投与であり、約２０％の患者が１ヶ月以内に再発し、これらの患者の多くは、反復攻撃を受ける。
【０００９】
非正統的な代替法である、糞便微生物叢移植（ＦＭＴ）では、１人の「ドナー」由来の糞便が患者腸に注入され、この方法は、再発性ＧＩ感染の処置において、抗生物質より遥かに効果的であることが分かっている。健康なドナー由来の糞便の注入は、微生物平衡の障害を復元することにより、クロストリジウム・ディフィシレなどの有害な細菌を寄せ付けず、繰り返す消耗性の発作に悩まされている患者においても疾患を根絶するように見える。オランダのアムステルダム大学での小規模調査では、再発性クロストリジウム・ディフィシレ感染の１６人の患者中１５人が、ドナー糞便の十二指腸注入で治癒した（ｖａｎ  Ｎｏｏｄ，Ｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３））。これは、抗生物質バンコマイシンの２週間の治療計画を受けた患者の２７％のみに対比できる。ドナー糞便の注入により、患者のＧＩ管中の微生物の多様性が改善され、この多様性が一定の期間にわたり継続したことが示された。最近、Ｓｏｎｇら（２０１３）は、再発性クロストリジウム・ディフィシレ感染（ＲＣＤＩ）患者由来の糞便の試料中の微生物叢の多様性および豊富さの減少がＦＭＴ後回復し、健康なドナーと同様になったという以前の報告を確認した。この横断的な調査では、ＦＭＴは主にファーミキューテス門およびプロテオバクテリア門に影響を与え、糞便微生物叢はＦＭＴ後の患者中で少なくとも１６週間にわたり変化し続けた。
【００１０】
重要なのは、ＲＣＤＩを処置するためのＦＭＴの成功に関与する作用機序が未知のままであり、適切なドナーまたは理想的なドナー微生物叢を判定する臨床的に検証された一連のパラメータが存在しないことである。複数の時点において、現場で糞便試料を収集し、健康なドナーおよびＲＣＤＩ患者の両方の多数の個人からの周囲温度にて組成物中でサンプリングされたマイクロバイオームのスナップショットをとるための容易で効果的な手段が、集団中の健康な個人のＧＩ管中に認められる「コア」マイクロバイオームをマッピングするために必要であり、その「コア」マイクロバイオーム上にＲＣＤＩ患者のマイクロバイオームの変化を重ね合わせ得る。最終的には、将来のＲＣＤＩ患者は、抗生物質を使ってではなく、特別注文によるプロバイオティクス（経口で摂取されて有益な細菌を身体に回復させる、生きている細菌を含む調製物／補助剤）およびプレバイオティクス（標的の選択されたＧＩ微生物叢群の活性を促進する非消化性食物成分、例えば、オリゴ糖）またはシンバイオティクス（プロバイオティクスおよびプレバイオティクスの相乗的組み合わせ）を使って処置され、それらのマイクロバイオームを健康な状態に戻すことになるであろう。
【００１１】
未知の、潜在的に有害な微生物を導入するリスクを避けるために、一部の病院はセルフバンキングシステムを構築し始めている。院内獲得「スーパーバグ」による起こりうる感染に対する防御手段として、患者の糞便を将来の使用のために預けることができる。移植のために、患者自身の糞便を使用することにより、有害な微生物の導入のリスクが大幅に低減され、伝染病に関する、無関係のドナー由来の糞便の時間がかかり高価な選別が避けられる。残念なことに、特定の人々の「エコシステム」は、しかしながら彼らを他の人より病気の影響を受けやすくするように見える。したがって、患者自身の糞便を再導入することに関連する起こりうる欠点は、短期の利益を提供するのみであり、クロストリジウム・ディフィシレなどの有害な微生物を治癒しないかもしれないことである。早晩、マイクロバイオーム研究は、ヒトの健康を定義するのを助け、その結果、完全に特徴付けされた有益な細菌の「カクテル」から構成され、この「生の」糞便を移植する粗製の方法に取って代わる、個別化された「細菌療法」の開発に役立つ「コア」または「キーストーン」細菌種の特定に至るであろう。実際に、現時点でも、極めて多様な腸関連障害、例えば、ＩＢＤおよび炎症性大腸炎のために、プロバイオティクス療法が提案されている。基本的には、ドナーの微生物叢の全ての種の特性を明らかにし、疾患に対する感受性を予測する診断マーカーを特定し、最終的に「個別化された」健康管理を提供することを試みている研究者および臨床医は、試験される糞便試料が、微生物群の「分解された」または人為的な表現ではなく、ドナーのインビボマイクロバイオームの真の表現または「スナップショット」を提供していることに確信を持つ必要がある。したがって、収集の時点で、直ちに、糞便のマイクロバイオームを捕らえ、安定化するまたはスナップショットをとる効果的な手段が不可欠である。
【００１２】
結腸直腸癌（ＣＲＣ）は、ヨーロッパおよび米国では最高の癌死亡率を有する。ＣＲＣは初期段階で検出されれば治癒可能性が高い（＞９０％）と知られており、早期癌検診を価値のあるものにしている。長年にわたり、癌を検出するための多くの感受性の高い検査方法、例えば、二重対比バリウム注腸、大腸内視鏡検査、および軟性Ｓ状結腸鏡検査などが考案されてきた。しかし、患者にとって不快でありおよび侵襲的であることに加えて、これらの方法に関連する財務コスト、インフラ、および人的資源の要件が、大きな障害となっている。コストに加えて、これらの検査法の低スループットの性質により、全国規模での一次検診としてそれらを実施することが妨げられる。
【００１３】
現時点で、別の結腸直腸癌のスクリーニング方法は、糞便潜血検査（ＦＯＢＴ）である。本試験は糞便試料中のヘモグロビンの存在を検出し、ＣＲＣの間接的予測因子としてＧＩ管中の出血の存在または非存在を判定する。この試験は高価ではないが、その感受性および陽性的中率は極めて低く、偽陽性の発生率は高い。したがって、危険な状態にあるおよび／または症状のある個人の両方の疾患の診断のための、ならびに無症候性集団のルーチン的な診断スクリーニングのための、感受性が良好で、信頼性が高く、費用効率のよい、規模拡大可能な方法が強く求められている。理想的には、個人は、自宅で個人的に糞便の一部を定常的に採集して安定化し、その後、それを試験施設に郵送してＣＲＣおよび他の疾患に関しスクリーニングされるであろう。
【００１４】
結腸管腔中に脱落し、糞便から回収された腫瘍細胞の直接検出および検査は、潜血よりも結腸直腸癌の明確な予測因子であるということは、すでに認められている。しかし、癌またはその他の疾患を示す「標的」または変異したヒトＤＮＡは、多くの場合野性型ＤＮＡ（例えば、正常結腸細胞由来の細菌ＤＮＡおよびヒトＤＮＡ）の高いバックグラウンド中で低い頻度（例えば、ＣＲＣについては合計ヒトＤＮＡの１％）で生物試料中に通常は存在し、内在性ヒトＤＮアーゼ（例えば、デオキシリボヌクレアーゼＩ）および／または細菌性ヌクレアーゼ（例えば、小球菌ヌクレアーゼ）にさらされる。この複雑な検体では、糞便試料中に存在するどのわずかな「標的」ヒトＤＮＡも、研究室に到着する前でさえヌクレアーゼおよび環境条件により急速に分解される可能性があり、診断試験の臨床的感受性に悪い影響を与える。豊富なヌクレアーゼに加えて、糞便が消化管から排出されるとすぐに、腸中の細菌の９９％を構成する嫌気性細菌が空気にさらされる。空気、特に酸素は嫌気性細菌にとって有毒性環境であり、４〜５分以内に５０％を死滅させ、わずか２０分後に嫌気性菌の９５〜９７％を死滅させる（Ｂｒｕｓａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。この場合も、大抵の糞便試料が、研究室または保健医療施設ではなく家庭で採取されることを考慮すると、糞便中の全体マイクロバイオームおよびヒトＤＮＡの代表的な眺望または「スナップショット」を得ることは難題である。
【００１５】
生物試料中の全核酸を、試料の取り扱い中、輸送および貯蔵中に分解しないように安定化することは必須である。生物試料中の核酸の分解を最小限にするために、全試料またはそれらの一部をドライアイス（−７８℃）上において集中化された試験施設に輸送し、そこで解凍してすぐに処理するか、または凍結保存する（−８０℃〜−２０℃）ことは標準的技法である。収集した試料が直ちに凍結され、試験施設までの輸送中に凍結状態を維持し、分析の前に最適条件下で貯蔵することを保証するために必要なコスト、物流およびインフラは、特に大規模および集団ベースのスクリーニング用途においては、大きな難題およびリスクを提起する。非集中的な試料分析のための「代表的」試料を提供し、なお最大限の試料の一貫性を保持することは、またさらに困難である場合がある。それぞれの試料の核酸プロファイルの真の表現を捕らえ維持する、より頑強で標準化された試料取り扱い方法および組成物を開発することが非常に望ましい。
【００１６】
マイクロバイオームとその健康なまたは病気のヒト宿主との間の関係の調査は、一定期間にわたる微生物細菌集団の特定およびモニタリングに依存している。最近の発見により、予後的および診断的価値を有するバイオマーカーとしての、これらの微生物プロファイルの有用性が示されている。このようなバイオマーカーの開発には、腸マイクロバイオームの動的性質に起因して、一定の期間にわたる大きな集団の反復サンプリングが必須であることが、文献中では明らかになってきている。マイクロバイオームワイド関連研究（ＭＷＡＳ）として知られるこれらの調査は、低いドナーコンプライアンス、信頼できない生物試料の自己収集、高コストおよび厄介な輸送および取り扱い手順などの課題を抱えている。
【００１７】
糞便サンプリングおよび微生物叢分析のための現在の方法は、マイクロバイオーム安定化と相いれない温度に試料を暴露する可能性がある条件下での検体の輸送を含む。試料収集、輸送、処理および分析中にマイクロバイオームを適切に安定化するのに失敗すると、マイクロバイオームプロファイルの生物学的および臨床的意味を見えにくくするというリスクがある。従って、インビボマイクロバイオームプロファイルの最良の表現を確実にするために、適切な解析前の手順が必要である。
【００１８】
周囲温度での輸送および貯蔵中における、糞便などの複雑な生物試料中の核酸、特に、ヒトおよび微生物の両方のＤＮＡの安定化のための組成物および方法が必要とされている。
【００１９】
この背景情報は、出願者が考えている既知の情報を本発明に可能な限り関連づけるために提供されている。前述のいずれかの情報が本発明に対する先行技術となることを承認することを必然的に意図するものではなく、そのように解釈されるべきものでもない。
【発明の概要】
【００２０】
本発明の目的は、周囲温度で生物試料中に含まれる核酸を安定化するための組成物、方法、およびキットを提供することである。
【００２１】
一態様では、周囲温度で生物試料中に含まれる核酸を安定化する方法を提供し、方法は、ａ）生物試料を得るステップと；ｂ）生物試料をキレート化剤を含む水性組成物と接触させて混合物を形成するステップであって、キレート化剤が少なくとも約１５０ｍＭの濃度で存在し、かつ組成物が少なくとも約９．５のｐＨを有するステップと；ｃ）（ｂ）の混合物を均一化して均一混合物を形成するステップと；ｄ）均一混合物を周囲温度で保存するステップとを含む。
【００２２】
別の態様では、周囲温度で生物試料中に含まれる核酸を安定化するための水性組成物を提供し、水性組成物はキレート化剤を含み、キレート化剤が少なくとも約１５０ｍＭの濃度で存在し、組成物が少なくとも約９．５のｐＨを有する。
【００２３】
さらに別の態様では、周囲温度で生物試料に含まれる核酸を安定化するためのキットが提供され、キットは、ａ）再密閉可能な蓋を有する試料容器と；ｂ）キレート化剤を含む水性組成物であって、キレート化剤が少なくとも約１５０ｍＭの濃度で存在し、組成物が少なくとも約９．５のｐＨを有し、この組成物が任意選択で試料容器内に収容されている組成物と；ｃ）均一化手段であって、任意選択で試料容器内に収容されている均一化手段と；ｄ）生物試料またはその一部を試料容器中に移す手段と；ｄ）使用説明書とを含む。
【００２４】
一実施形態では、核酸はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。
【００２５】
別の実施形態では、生物試料は糞便試料、土壌試料、下水試料、廃水試料、または水試料から選択される。別の実施形態では、生物試料は糞便試料である。別の実施形態では、糞便試料は哺乳動物から得られる。さらに別の実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【００２６】
別の実施形態では、キレート化剤は１，２−シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、テトラアザシクロドデカン四酢酸（ＤＯＴＡ）、テトラアザシクロテトラデカン四酢酸（ＴＥＴＡ）、デスフェリオキシミン（ｄｅｓｆｅｒｉｏｘｉｍｉｎｅ）、またはこれらのキレート化剤類似体から選択される。別の実施形態では、キレート化剤はＣＤＴＡである。
【００２７】
別の実施形態では、キレート化剤の濃度は約１５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、または約２５０ｍＭ〜約３５０ｍＭである。さらに別の実施形態では、キレート化剤の濃度は約３００ｍＭである。
【００２８】
さらに別の実施形態では、組成物は約９．５〜約１１．５、または約１０．５〜約１１．５のｐＨを有する。別の実施形態では、組成物は約１１のｐＨを有する。
【００２９】
またさらに別の実施形態では、組成物は、９．５〜１１．５のｐＨ範囲で緩衝できる少なくとも１種の緩衝剤をさらに含む。別の実施形態では、緩衝剤はベータアラニンである。
【００３０】
さらに別の実施形態では、組成物は、Ｃ１−Ｃ６アルカノールなどの水溶性有機溶媒をさらに含む。別の実施形態では、水溶性有機溶媒はエタノールである。さらに別の実施形態では、エタノールは組成物中に約３０体積％未満の濃度で存在する。またさらに別の実施形態では、エタノールは組成物中に約２４体積％未満の濃度で存在する。
【００３１】
別の実施形態では、組成物は、ナトリウムドデシルスルフェートなどの界面活性剤をさらに含む。さらに別の実施形態では、組成物は、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ａなどの消泡剤をさらに含む。またさらに別の実施形態では、組成物はトリクロサンまたはプロクリンなどの抗菌剤をさらに含む。
【００３２】
さらに別の実施形態では、核酸は微生物ＤＮＡである。
【００３３】
さらに別の実施形態では、核酸は微生物ＤＮＡであり、方法は生物試料のマイクロバイオームプロファイルを安定化する。さらに別の実施形態では、方法は生物試料のマイクロバイオームプロファイルを、室温で少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも３０日間、もしくは少なくとも６０日間；または約３７℃〜約５０℃の温度で少なくとも７日間、もしくは少なくとも１４日間；および／または−２０℃で少なくとも３０日間安定にする。
【００３４】
さらに別の実施形態では、核酸は微生物ＤＮＡであり、組成物／キットは生物試料のマイクロバイオームプロファイルを安定化するためのものである。
【００３５】
さらに別の実施形態では、核酸はヒトＤＮＡである。さらに別の実施形態では、方法はヒトＤＮＡを、室温で少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも３０日間、もしくは少なくとも６０日間；または約３７℃〜約５０℃の温度で少なくとも７日間、もしくは少なくとも１４日間；および／または−２０℃で少なくとも３０日間安定にする。
【００３６】
またさらに別の実施形態では、上記方法は、均一化手段を使って、生物試料と水性組成物との混合物を均一化することを含む。
【００３７】
別の実施形態では、上述の方法およびキットの均一化手段は少なくとも１個のミキシングボールである。さらに別の実施形態では、少なくとも１個のミキシングボールはステンレス鋼ミキシングボールまたはタングステンカーバイドミキシングボールである。さらに別の実施形態では、少なくとも１個のミキシングボールは、約５．６〜１１．１ｍｍの直径および少なくとも約７．６ｇ／ｃｍ３の密度を有するステンレス鋼ミキシングボールである。またさらに別の実施形態では、ステンレス鋼ミキシングボールは約７．１〜８．７ｍｍの直径を有し、試料容器は約１２．９ｍｍの内径を有する丸底チューブである。
【００３８】
別の実施形態では、方法は、少なくとも１個のミキシングボールを含む試料容器中で生物試料と水性組成物との混合物を形成すること、試料容器を密閉すること、および少なくとも１個のミキシングボールの存在下で混合物を振盪することにより混合物を均一化することを含む。さらに別の実施形態では、振盪は手で行われる。
【００３９】
他の実施形態では、核酸を安定化することは、周囲温度で貯蔵中に、生物試料中に含まれる核酸の相対存在量を保存することを含む。
【００４０】
さらに別の実施形態では、周囲温度で糞便試料中に含まれるＤＮＡを安定化する方法が提供され、方法は、ａ）哺乳動物から糞便試料を取得するステップと；ｂ）糞便試料を約１０．５〜約１１．５のｐＨを有する水性組成物と接触させるステップであって、組成物が、約２５０ｍＭ〜約３５０ｍＭの量のＣＤＴＡ；約３０ｍＭ〜約７０ｍＭの量のβ−アラニン；約２１．５体積％〜約２３．５体積％の量のエタノール；  約０〜約１％（ｗ／ｖ）の量のナトリウムドデシルスルフェート；および約０〜約０．２％（ｖ／ｖ）の量のＡｎｔｉｆｏａｍ  Ａを含む、それらから本質的に構成される、またはそれらから構成されるステップと；ｃ）（ｂ）の混合物を均一化して均一混合物を形成するステップと；ｄ）周囲温度で均一混合物を貯蔵するステップとを含む。さらに別の実施形態では、水性組成物は約１１のｐＨを有し、約３００ｍＭの量のＣＤＴＡ；約５０ｍＭの量のβ−アラニン；約２３．５体積％のエタノール；約０．５（ｗ／ｖ）の量のナトリウムドデシルスルフェート；および約０．１％（ｖ／ｖ）の量のＡｎｔｉｆｏａｍ  Ａを含む、それらから本質的に構成される、またはそれらから構成される。さらに別の実施形態では、上記方法は、約１２．９ｍｍの内径を有し、約５．６〜１１．１ｍｍの直径および少なくとも約７．６ｇ／ｃｍ３の密度を有する少なくとも１個のステンレス鋼ミキシングボールを含む丸底チューブ中で、糞便試料と水性組成物の混合物を形成すること、丸底チューブを密閉すること、および少なくとも１個のステンレス鋼ミキシングボールの存在下で、手で混合物を振盪することにより混合物を均一化することを含む。別の実施形態では、ＤＮＡは微生物ＤＮＡであり、方法は糞便試料のマイクロバイオームプロファイルを安定化する。
【００４１】
さらに別の実施形態では、周囲温度で糞便試料中に含まれるＤＮＡを安定化するための水性組成物を提供し、糞便試料が哺乳動物から取得され、組成物が約１０．５〜約１１．５のｐＨを有し、かつ、約２５０ｍＭ〜約３５０ｍＭの量のＣＤＴＡ；約３０ｍＭ〜約７０ｍＭの量のβ−アラニン；約２１．５体積％〜約２３．５体積％の量のエタノール；約０〜約１％（ｗ／ｖ）の量のナトリウムドデシルスルフェート；および約０〜約０．２％（ｖ／ｖ）の量のＡｎｔｉｆｏａｍ  Ａを含む、それらから本質的に構成される、またはそれらから構成される。さらに別の実施形態では、水性組成物は約１１のｐＨを有し、約３００ｍＭの量のＣＤＴＡ；約５０ｍＭの量のβ−アラニン；約２３．５体積％のエタノール；約０．５（ｗ／ｖ）の量のナトリウムドデシルスルフェート；および約０．１％（ｖ／ｖ）の量のＡｎｔｉｆｏａｍ  Ａを含む、それらから本質的に構成される、またはそれらから構成される。別の実施形態では、ＤＮＡは微生物ＤＮＡであり、組成物は糞便試料のマイクロバイオームプロファイルを安定化するためのものである。
【００４２】
またさらに別の実施形態では、周囲温度で生物試料に含まれる核酸を安定化するためのキットが提供され、キットは、ａ）再密閉可能な蓋を有する試料容器と；ｂ）約１０．５〜約１１．５のｐＨを有し、約２５０ｍＭ〜約３５０ｍＭの量のＣＤＴＡ；約３０ｍＭ〜約７０ｍＭの量のβ−アラニン；約２１．５体積％〜約２３．５体積％の量のエタノール；約０〜約１％（ｗ／ｖ）の量のナトリウムドデシルスルフェート；および約０〜約０．２％（ｖ／ｖ）の量のＡｎｔｉｆｏａｍ  Ａを含む、それらから本質的に構成される、またはそれらから構成される水性組成物であって、任意選択で試料容器内に収容されている水性組成物と；ｃ）均一化手段であって、任意選択で試料容器内に収容されている均一化手段と；ｄ）生物試料またはその一部を試料容器中に移す手段と；ｄ）使用説明書とを含む。別の実施形態では、水性組成物は約１１のｐＨを有し、約３００ｍＭの量のＣＤＴＡ；約５０ｍＭの量のβ−アラニン；約２３．５体積％の量のエタノール；約０．５％（ｗ／ｖ）の量のナトリウムドデシルスルフェート；および約０．１％（ｖ／ｖ）の量のＡｎｔｉｆｏａｍ  Ａを含む、それらから本質的に構成される、またはそれらから構成される。さらに別の実施形態では、核酸は微生物ＤＮＡであり、キットは生物試料のマイクロバイオームプロファイルを安定化するためのものである。またさらに別の実施形態では、均一化手段は約５．６〜１１．１ｍｍの直径および少なくとも約７．６ｇ／ｃｍ３の密度を有する少なくとも１個のステンレス鋼ミキシングボールであり、試料容器は約１２．９ｍｍの内径を有する丸底チューブである。
【００４３】
本発明をよりよく理解するために、本発明のその他の態様およびさらなる特徴に加えて、添付図面と併せて使用される以下の記述を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、２人のドナー由来の糞便試料のマイクロバイオームプロファイルにおける差異を図示する（ＰＣＲ−ＤＧＧＥ分析）。
【図２】図２は、１）異なる濃度のＣＤＴＡ（１５０〜５００ｍＭ）を含む組成物、２）異なる濃度のＥＤＴＡ（１５０〜５００ｍＭ）を含む組成物、および３）安定化溶液なしに貯蔵された糞便（非安定化）中での、室温でＴ＝０および１４日後の糞便試料中の高分子量ＤＮＡの品質を示すアガロースゲルである。
【図３】図３は、マイクロバイオームプロファイル安定性の、本組成物の試料均一化およびｐＨへの依存性を図示する。
【図４】図４は、室温で各種組成物中に１４日間貯蔵された糞便試料のＤＧＧＥ分析を示す。
【図５】図５は、室温で異なる組成物中に４日間貯蔵された糞便試料のＤＧＧＥ分析を示す。
【図６】図６は、室温で異なるｐＨ値の組成物中に９日間貯蔵された糞便試料中の高分子量ＤＮＡの品質を示すアガロースゲルである。
【図７】図７は、本組成物において、（Ａ）複数のガラスビーズおよび（Ｂ）ステンレス鋼ボールを使った混合により得られた結果を示すアガロースゲルである。
【図８Ａ】図８は、室温で本組成物中に貯蔵時の、（Ａ）０日目、（Ｂ）６日目、（Ｃ）７日目、（Ｄ）１４日目、（Ｅ）１ヶ月目、および（Ｆ）２ヶ月目でのＤＮＡの品質を示すアガロースゲルである。
【図８Ｂ】図８は、室温で本組成物中に貯蔵時の、（Ａ）０日目、（Ｂ）６日目、（Ｃ）７日目、（Ｄ）１４日目、（Ｅ）１ヶ月目、および（Ｆ）２ヶ月目でのＤＮＡの品質を示すアガロースゲルである。
【図８Ｃ】図８は、室温で本組成物中に貯蔵時の、（Ａ）０日目、（Ｂ）６日目、（Ｃ）７日目、（Ｄ）１４日目、（Ｅ）１ヶ月目、および（Ｆ）２ヶ月目でのＤＮＡの品質を示すアガロースゲルである。
【図８Ｄ】図８は、室温で本組成物中に貯蔵時の、（Ａ）０日目、（Ｂ）６日目、（Ｃ）７日目、（Ｄ）１４日目、（Ｅ）１ヶ月目、および（Ｆ）２ヶ月目でのＤＮＡの品質を示すアガロースゲルである。
【図８Ｅ】図８は、室温で本組成物中に貯蔵時の、（Ａ）０日目、（Ｂ）６日目、（Ｃ）７日目、（Ｄ）１４日目、（Ｅ）１ヶ月目、および（Ｆ）２ヶ月目でのＤＮＡの品質を示すアガロースゲルである。
【図８Ｆ】図８は、室温で本組成物中に貯蔵時の、（Ａ）０日目、（Ｂ）６日目、（Ｃ）７日目、（Ｄ）１４日目、（Ｅ）１ヶ月目、および（Ｆ）２ヶ月目でのＤＮＡの品質を示すアガロースゲルである。
【図９】図９は、本組成物中に保存された同じドナー検体由来の糞便試料の一定分量を用いて３回繰り返して行ったＤＧＧＥゲルを示す。
【図１０Ａ】図１０は、（Ａ）室温で１４日間、および（Ｂ）室温で７日間および２ヶ月間、本組成物中に貯蔵された糞便試料のマイクロバイオームプロファイルの代表的ＤＧＧＥゲルおよび％類似度（ゲルの下部）を示す。
【図１０Ｂ】図１０は、（Ａ）室温で１４日間、および（Ｂ）室温で７日間および２ヶ月間、本組成物中に貯蔵された糞便試料のマイクロバイオームプロファイルの代表的ＤＧＧＥゲルおよび％類似度（ゲルの下部）を示す。
【図１１】Ａ−Ｂ。図１１Ａおよび１１Ｂは、本組成物中に３７℃で貯蔵された２人のドナー由来の糞便試料のアガロースゲルを示す。
【図１２Ａ】図１１Ａおよび１２Ｂは、本組成物中に３７℃で貯蔵された２人のドナー由来の糞便試料のＤＧＧＥ分析を示す。
【図１２Ｂ】図１１Ａおよび１２Ｂは、本組成物中に３７℃で貯蔵された２人のドナー由来の糞便試料のＤＧＧＥ分析を示す。
【図１３】Ａ−Ｅ。図１３Ａ〜Ｅは、本組成物中に−２０℃、室温、および５０℃で貯蔵された３人のドナー由来の糞便試料のアガロースゲルを示す。
【図１４】Ａ−Ｄ。図１４Ａ〜Ｄは、本組成物中に５０℃および−２０℃で貯蔵された３人のドナー由来の糞便試料のアガロースゲル電気泳動を示す。
【図１５】Ａ−Ｂ。図１５Ａ〜Ｂは、本組成物中に５０℃で１４日間貯蔵された２人のドナー由来の糞便試料のＤＧＧＥ分析を示す。
【図１６】Ａ−Ｂ。図１６Ａ〜Ｂは、本組成物中に−２０℃で１１日間貯蔵された２人のドナー由来の糞便試料のＤＧＧＥ分析を示す。
【図１７】図１７は、本組成物中で、５回の凍結／解凍サイクルにさらされた糞便試料のアガロースゲルを示す。
【図１８】図１８は、本組成物中で、５回の凍結／解凍サイクルにさらされた糞便試料のＤＧＧＥ分析を示す。
【図１９】図１９は、種々の温度および時間（３日間および１４日間）にわたり安定化溶液中に貯蔵された試料がＯＴＵ存在量における高レベルの類似度を示す主座標分析（ＰＣｏＡ）である。
【図２０】図２０は、種々の温度および時間（３日間および１４日間）にわたり安定化溶液中におよび安定化溶液を使わずに貯蔵された試料の科レベルの存在量比率を示す。
【図２１】図２１は、新しい試料および１０４Ｂ  ｐＨ１１安定化試料内でおよび試料間でのＢｒａｙ−Ｃｕｒｔｉｓの非類似度距離を示す。マン・ホイットニー検定は全ての条件で同等の非類似度を示し、統計的差異は観察されなかった。
【図２２】図２２は、１０４Ｂ  ｐＨ１１安定化試料が豊富さを保持していることを示す。豊富さは個別のＯＴＵに対し存在／非存在を割り付けることにより評価し、シャノン指数を使って比較した。マン・ホイットニー検定は、新しい試料と１０４Ｂ  ｐＨ１１試料との間で有意差を示さなかった。
【図２３】図２３は、１０４Ｂ  ｐＨ１１試料が高度に再現可能なマイクロバイオームプロファイルを与えることを示す。Ｂｒａｙ−Ｃｕｒｔｉｓ距離に関するマン・ホイットニー検定では、３回の繰り返し試料において同等の非類似度を示した。
【図２４】図２４は、新しい試料と比較した場合の非安定化糞便試料と１０４Ｂ  ｐＨ１１（２３℃で１４日間）糞便試料と凍結（−８０℃で１４日間）糞便試料との間のＢｒａｙ−Ｃｕｒｔｉｓ距離非類似度を示す。マン・ホイットニー検定（＊Ｐ≦０．０５）を使って、有意な非類似度を評価した。
【図２５】図２５は、代表的ドナーのマイクロバイオーム重み付きＵｎｉｆｒａｃ  ％類似度のデンドログラムを示す。３回の生物学的反復実験からの抽出をそれぞれの条件に対し実施した。新しい試料に対する低い％類似度は、マイクロバイオームプロファイルにおける経時変化を示す。
【図２６】図２６は、模擬輸送条件にさらされた１０４Ｂ  ｐＨ１１試料のＤＮＡ一貫性を示す。代表的ドナーの試料は、２３℃で１４日間、５０℃で１日間、３７℃で３日間貯蔵されるか、または複数回の凍結−解凍サイクルにさらされた。新しい試料も対照として−８０℃で１４日間貯蔵された。
【図２７】図２７は、模擬出荷条件にさらされた１０４Ｂ  ｐＨ１１試料のＢｒａｙ−Ｃｕｒｔｉｓ距離非類似度を示す。マン・ホイットニー検定は、種々の温度で貯蔵された１０４Ｂ  ｐＨ１１試料と−８０℃で貯蔵された試料との間で差異を示さなかった。有意な非類似度は、対をなす−８０℃試料と比較した場合、３７℃で保持された非安定化試料または凍結−解凍（Ｆ／Ｔ）条件にさらされた試料で観察された（それぞれ、Ｐ≦０．０５およびＰ≦０．０１）。
【図２８】図２８は、４０℃で５日間、様々な濃度のＣＤＴＡを含む本組成物およびＣＤＴＡ不含の組成物で処理された２人のドナー由来の糞便試料の細菌集団プロファイルのＤＧＧＥ分析を示す。
【図２９】図２９は、周囲温度で２１日間、本組成物「１０４Ｂ  ｐＨ１１」またはＴＥＮ  ｂｕｆｆｅｒで処理された２人のドナー由来の糞便試料の細菌集団プロファイルのＤＧＧＥ分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本明細書で記載の核酸を安定化するための組成物の役割は、周囲温度で長期間、糞便試料などの生物試料中で核酸を安定化することおよび全体ＤＮＡプロファイルの「スナップショットをとる」ことであることに留意されたい。ＤＮＡなどの核酸の抽出と単離は、本明細書で記載の組成物を使って糞便試料中に含まれる核酸の安定化を行った後に、市販の抽出キットを使ってその後のステップで行われる。好ましくは、本明細書で記載の核酸を安定化するための組成物は、カオトロピック塩（例えば、グアニジニウムチオシアネート（ＧｕＳＣＮ）またはグアニジニウム塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）などのグアニジニウム塩）、尿素、固定液（例えば、ホルマリン、パラホルムアルデヒドなど）、還元剤、ポリカチオン（ポリリジンまたはポリアクリルアミドなど）またはクロロホルムを含まない。プロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ）、リゾチームなどの酵素は、本明細書で記載の組成物を使って糞便試料中に含まれる核酸の安定化を行うために必要ではなく、したがって好ましくは本明細書で記載の組成物中に含まれない。したがって、核酸を安定化する本組成物および方法は、多くの場合特殊な貯蔵および輸送条件を必要とする高価なおよび／または有毒性の化合物の使用を避ける。
【００４６】
特に断らなければ、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者により一般に理解されているものと同じ意味を有する。
【００４７】
本明細書および請求項で用いられる単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上別段の明確な記載がない限り、複数形の指示対象を包含する。
【００４８】
本明細書で使用する場合、用語の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、後に続くリストが非包括的であり、任意のその他の追加の適切な項目、例えば、必要に応じて１つまたは複数のさらなる特徴（単一または複数）、構成要素（単一または複数）および／または成分（単一または複数）を含んでも、または含まなくてもよいことを意味するものと理解される。
【００４９】
本明細書で使用される場合「試料」という用語は、目的の物質、特に核酸、および任意選択で興味のあるタンパク質またはその他の生体分子を潜在的に含有する任意の検体を意味するものと理解される。用語の「試料」は、水溶液などの溶液、細胞、組織、生検材料、粉末、または１種または複数種のこれらの集団を包含してよい。試料は生物試料、例えば、唾液、痰、頬側スワブ試料、血清、血漿、血液、軟膜、咽頭、鼻部／鼻部咽頭または洞スワブまたは分泌物、咽頭スワブまたは擦過物、尿、粘液、糞便／便／排泄物、直腸スワブ、病変スワブ、キームス、吐瀉物、胃液、膵液、消化（ＧＩ）管液または固形物、精液／精子、尿道スワブおよび分泌物、脳脊髄液、乳汁分泌または月経生成物、卵黄、羊水、水様液、硝子体液、頸部分泌物またはスワブ、膣液／分泌物／スワブまたは擦過物、骨髄試料および吸引液、胸水および浸出液、汗、膿、涙液、リンパ液、気管支または肺洗浄液または吸引液、腹膜浸出液、細胞培養液および細胞懸濁液、結合組織、上皮、上皮スワブおよびスメア、粘膜、筋組織、胎盤組織、生検材料、滲出液、臓器組織、神経組織、毛髪、皮膚、または爪であって良く、前述の試料は、例えば、哺乳動物を含む脊椎動物から採取できる。哺乳動物は、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、家畜（例えば、雌ウシ、ヤギ、またはヒツジ）、ならびにイヌ、ネコ、ウマ、などであってよい。
【００５０】
一実施形態では、生物試料は糞便試料であり、対象は哺乳動物である。別の実施形態では、生物試料は糞便試料であり、対象はヒトである。
【００５１】
他のタイプの生物試料には、植物、植物抽出物、藻類、土壌試料、下水、廃水、水、環境試料、食糧、家畜飼料、動物飼料、汚染されたまたは潜在的感染表面または設備のスワブ（例えば、肉処理表面）、病院、ナーシングホーム、外来患者用施設、医療施設の「接触」表面からのスワブ、などが含まれる。さらにその他の実施形態では、生物試料は、土壌試料、下水試料、廃水試料、または水試料から選択され、これらの試料のいずれかに糞便が混入していてもよい。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」または「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）」という用語は、任意の顕微鏡的生物および生殖細胞を意味すると理解され、これらには、すべての原核生物、すなわち、真正細菌および始原細菌、および種々の形態の真核生物が含まれ、原虫類、真菌（例えば、酵母）、藻類、および輪虫類およびプラナリアなどの動物が含まれる。例えば、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子シーケンシングを使ってヒト糞便中で最も頻繁に検出される細菌群には、ファーミキューテス門、バクテロイデス門、スピロヘータ門、フソバクテリウム門、デルタプロテオバクテリア綱、イプシロンプロテオバクテリア門、アルファプロテオバクテリア綱、ベータプロテオバクテリア綱、ガンマプロテオバクテリア綱、ユリ古細菌門、真核生物ドメイン、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｈｉｏｖｉｂｒｉｏ、Ｔｍ７、藍色細菌門、放線菌門、ベルコミクロビウム門およびレンティスファエラ門が含まれる。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「ウイルス」または「ビリオン」という用語は、他の生物の生細胞内でのみ複製する任意の小さい感染病原体を意味すると理解される。ウイルスは動物および植物から細菌および古細菌に及ぶ全てのタイプの生活形に感染でき、ほとんどあらゆる生態系で生存できる。現時点で、ヒトの疾患を引き起こすことが分かっている次の２１の科のウイルスが存在する。アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科、パピローマウイルス科、ポリオーマウイルス科、ポックスウイルス科、ヘパドナウイルス科、パルボウイルス科、アストロウイルス科、カリシウイルス科、ピコルナウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、トガウイルス科、ヘペウイルス科、レトロウイルス科、オルトミクソウイルス科、アレナウイルス科、ブニヤウイルス科、フィロウイルス科、パラミクソウイルス科、ラブドウイルス科、レオウイルス科（およびＤ型肝炎ウイルス、現在割り当てられていない）。ウイルス中の遺伝物質はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）であり得る。
【００５４】
本明細書で記載の組成物により安定化される核酸は、ＤＮＡまたはｍＲＮＡもしくはウイルスＲＮＡを含むＲＮＡであってよい。一実施形態では、核酸はＤＮＡである。別の実施形態では、ＤＮＡはヒト、ウイルス、および微生物由来である。さらに別の実施形態では、本明細書で記載の組成物により安定化される核酸はヒトＤＮＡおよび微生物ＤＮＡを含む。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「周囲温度」という用語は、収集の時点から、輸送中（通常はより短い期間（例えば、５日間未満）であるが、相対的に極端な温度を伴う可能性がある）、ならびに分析の前の長期貯蔵中に、生物試料（例えば、糞便試料）と本明細書で記載の核酸安定化組成物との混合物がさらされる可能性のある温度の範囲を意味する。一実施形態では、温度は、約−２０℃〜約６０℃の範囲の周囲温度である。別の実施形態では、周囲温度は室温であり、約１５℃〜約３０℃の範囲である。
【００５６】
糞便試料を本明細書で記載の水性組成物と接触させて混合物を形成するステップは、糞便の排出後可能な限りすぐに行うべきであり、また、混合物を均一化して均一混合物を形成するステップは、糞便試料中に含まれる核酸を安定化するために、可能な限り早く、好ましくは直ちに行うべきである。
【００５７】
通常、唾液、血液、痰、糞便／便、および尿などの生物試料中のＤＮＡおよびＲＮＡの化学的安定化は、適切なｐＨを維持するための緩衝液の使用により、ならびに、金属レドックスサイクル現象または金属イオンの核酸のリン酸塩骨格への結合を防ぐためのキレート化剤の使用により実現される。本明細書で使用される場合、「キレート化剤（ｃｈｅｌａｔｏｒ）」または「キレート化剤（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）」という用語は、特定の金属イオン（例えば、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋）と可溶で安定な錯体を形成してそれらのイオンを封鎖し、それにより、それらのイオンが通常、その他の成分、例えば、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮアーゼ）またはエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ）およびエキソヌクレアーゼ（例えば、３’→５’エキソヌクレアーゼ）などのＧＩ管中に豊富に存在する酵素と反応できないようにする、化学薬品を意味するものと理解される。ＧＩ管中のＤＮアーゼの主起源は膵臓の分泌物、ならびに常在性微生物である。本組成物では、キレート剤（単一または複数）は、生物試料中のＤＮアーゼおよび微生物の増殖の抑制に関与する。キレート化剤は、例えば、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡ）、１，２−シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）グリシン、トリエチレンテトラアミン（ＴＥＴＡ）、テトラアザシクロドデカン四酢酸（ＤＯＴＡ）、デスフェリオキシミン、クエン酸塩無水物、クエン酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、クエン酸アンモニウム、二クエン酸アンモニウム、クエン酸、クエン酸二アンモニウム、クエン酸鉄アンモニウム、およびクエン酸リチウムであってよい。これらのキレート化剤は、単独で使用してもまたはこれらの２種以上を組み合わせて使用してもよい。好ましい実施形態では、ＥＤＴＡより強力なキレート化剤（すなわち、金属に結合した場合、ＥＤＴＡより高い解離定数を有するキレート化剤）が望ましく、これらには、限定されないが、ＣＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡ、およびデスフェリオキシミン、またはこれらのキレート化剤類似体が含まれ、約１５０ｍＭ〜約６００ｍＭの量で、好ましくは約１５０〜約５００ｍＭの量で、さらにより好ましくは約２５０ｍＭ〜約３５０ｍＭの量で、最も好ましくは約３００ｍＭの量で、単独または組み合わせて使用される。最も望ましくは、本組成物中のキレート化剤はＣＤＴＡである。
【００５８】
ＥＤＴＡは製造工業、研究室、化粧品、医薬品および一部の食品において広く使用されている化学薬品である。その利用は、その金属イオン、特に二価およびそれより高い価数の金属イオンと「キレートを形成する」その能力に基づいている。ＣＤＴＡはこれらの分野ではそれほどよく使われてはいないが、ＥＤＴＡと共通の金属イオンキレートを形成する能力を有する。重要なのは、両方のキレート化剤の親和性は、異なる金属イオンに対して大幅に変化することである。ログ目盛りで表されている親和性の尺度である、Ｋ１を下表１に示す。収載された最初の５つのキレート化剤は、窒素基に結合した異なる数および構成のカルボキシレート（Ｒ−ＣＯＯ−）基を有する。表１では、ＯＰＴは窒素基のみに基づくキレート化剤としての比較のために示されている。
【００５９】
表１のＣＤＴＡとＥＤＴＡとの比較は、それらが非常に異なることを示す。ｌｏｇＫ１値の差異は、２．３（Ｍｇ２＋）；２．６（Ｃａ２＋）；２．４（Ｍｎ２＋）；約３（Ｆｅ３＋）；３．６（Ｃｏ２＋）；０．８（Ｃｕ２＋）；２．９（Ｚｎ２＋）である。すなわち、ＣＤＴＡは、大抵の金属に対し、ＥＤＴＡより２００〜４，０００倍強く結合する。
【００６０】
【表１】
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【００６１】
金属と錯体を形成するＣＤＴＡのこのより強力な能力の１つの結果は、ＣＤＴＡまたはＥＤＴＡの同じ濃度の存在下で、任意の遊離金属イオンの濃度がより低くなるであろうということである。しかし、より重要なことは、核酸またはタンパク質などの生体分子と錯体形成される金属イオンの量が顕著に低くなるであろうということである。溶液中の核酸は金属イオンに結合していることが知られており、このような金属を取り除くことにより、それらの化学的安定性が改善される可能性がある。このことは、二分子酸素、超酸化物陰イオンおよび過酸化水素などの種から電子を得るまたは電子を失うことにより異なる酸化状態で存在し得る、Ｍｎ、Ｆｅ、ＣｏおよびＣｕなどの遷移金属に対して特に重要である場合がある。最終的に、金属と錯体形成するＣＤＴＡのより強力な能力は、活性な高次構造を安定化するためにＣａ２＋およびＭｇ２＋を必要とする大量のＤＮアーゼを天然に含むことが分かっている、糞便などの生物試料中の核酸の分解を抑えるために開発された組成物において、極めて有益である。
【００６２】
【表２】
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【００６３】
研究室または研究環境での実務に影響する、ＣＤＴＡとＥＤＴＡとの間の他の差異が存在する。恐らく、ＥＤＴＡのｋ１およびｋ２  ｐＫａ値がより低い（上表２参照）ことが理由で、ｐＨ７．０で二ナトリウム型を調製すること（酸型から出発して）がかなり難しい。ＥＤＴＡより高濃度のＣＤＴＡ溶液を調製できる。最終的に、ＣＤＴＡの二ナトリウム型は、ＥＤＴＡの二ナトリウムの限られた溶解度に対比して、エタノール中に高度に可溶である。これらの差異により、製造の観点から、ＣＤＴＡがキレート化剤の最良の選択となる。
【００６４】
一般に、１種または複数種の適切な緩衝液を使って、本組成物のｐＨを所望のアルカリ性の範囲に維持できる。この場合、組成物は緩衝されて、生物試料のｐＨを適切なｐＨで維持し、上記組成物は周囲温度で上記核酸を安定化する。一実施形態では、組成物は、約９．５〜約１１．５のこのましい範囲内のｐＨを維持するために、２５℃で８．０〜１２．５の範囲のｐＫａ値（対数の酸解離定数）を有する１種、２種、またはそれを超える緩衝剤（非限定的例は表３を参照）を含む。酸解離定数、Ｋａは溶液中の酸の強度の定量的尺度である。Ｋａ値が大きくなれば、溶液中の分子の解離がより多くなり、したがって酸がより強くなる。Ｋａ値は多くの桁の大きさをまたがるので、酸解離定数の対数尺度、ｐＫａが実際上よく使われる。ｐＫａの値がより大きくなれば、いずれかの所定のｐＨでの解離度がより小さく、すなわち、酸がより弱くなる。
【００６５】
生物内では、酸−塩基の恒常性および酵素動力学は、細胞内および身体内に存在する多くの酸および塩基のｐＫａ値に依存する。化学においては、ｐＫａ値の知識は、緩衝液の調製のために必要であり、また、酸または塩基と金属イオンとの間で錯体を形成するための相互作用の定量的理解のための必要条件でもある。当業者なら、所定の化合物／緩衝液は、その濃度が十分であり、溶液のｐＨがそのｐＫａに近い（約１ｐＨ単位内）場合にのみ、溶液のｐＨを緩衝できることを理解するであろう。一実施形態では、本組成物のｐＨは約９．５〜約１１．５の範囲である。好ましい実施形態では、組成物のｐＨは約１０．５〜約１１．５の範囲であり、好ましくは、ｐＨは約１１である。緩衝剤（単一または複数）の量は、例えば、約１ｍＭ〜約１Ｍの間である。
【００６６】
特定の実施形態では、組成物は、ｐＨを約９．５〜約１１．５の所望の範囲内に維持するために、主緩衝剤としてベータアラニンを含む。ｐＨを約１１に維持するために、１０〜１２の範囲のｐＫａを有する緩衝液を表３から選択できる。ＣＤＴＡおよびＥＤＴＡなどのカルボキシレートキレート化剤はまた、この範囲での緩衝能に寄与し得る。しかし、ＣＤＴＡおよびＥＤＴＡのｐＫａ（ｋ４）値（表２）は著しく異なる。ＥＤＴＡのより低いｐＫａ（ｋ４）値（表２）は、本組成物を所望のｐＨ領域の下端での維持を容易にするのにＥＤＴＡを潜在的に役立つようにする。しかし、ＣＤＴＡのより高いｐＫａ（ｋ４）値は、所望の範囲の上端（すなわち、ｐＨ１１）で、ベータアラニン（または表３のその他の緩衝液）の緩衝能の強化にＣＤＴＡをより適合可能にする。
【００６７】
【表３−１】
0006670765.tif 000004
【００６８】
【表３−２】
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【００６９】
β−アラニンは、本出願の組成物に特に好適な緩衝液である。一実施形態では、組成物のｐＨは、約１０．５〜約１１．５であり、β−アラニンは約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約３０ｍＭ〜約７０ｍＭの量で存在し、最も好ましくは約５０ｍＭの量で存在する。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「水溶性」または「水混和性有機溶媒」という用語は、通常は液体であり、溶質、化学的に異なる液体、固体または気体を溶解する任意の炭素含有物質または化合物を意味すると理解される。水溶性有機溶媒は、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ｎ−ブタノール、ヘキサノール、またはこれらの任意の組み合わせなどの、１種または複数種の直鎖であってもまたは分岐していてもよい短鎖（例えば、Ｃ１−Ｃ６）アルカノールであってよい。本組成物の一実施形態では、好ましいアルコールはエタノールである。別の実施形態では、水溶性有機溶媒（例えば、エタノール）は、約３０体積％未満、好ましくは約２４体積％未満、例えば約２１．５体積％〜約２３．５体積％、最も好ましくは約２３．５体積％の濃度で組成物中に存在する。他の実施形態では、水溶性有機溶媒は存在しなくてよい。
【００７１】
通常、ほとんどのタンパク質を変性させるためには３０％を超えるエタノールが必要であることが当該技術分野において知られている。溶液からＤＮＡを沈殿させるためには、６０％を超えるエタノールまたは５０％を超えるイソプロパノールが必要である。無水エタノールまたはメタノールを組織学、病理学および細胞生物学において固定液として通常は使用して、生化学反応を終了させる。一部のタンパク質は、２０〜５０％（ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）の範囲での、エタノールおよびアセトンなどの水混和性有機溶媒の添加により沈殿させることができる。エタノールはタンパク質の脱水または水分活性の低下を生じさせ、続いて、タンパク質間の静電引力、凝集および不溶化が起こる。理論に拘泥する意図はないが、発明者らは、本組成物中の相対的に小さいパーセンテージの水混和性有機溶媒が、固定剤の性質をほとんど有さないか全く有さず、むしろ、生物学的（例えば、糞便）試料の混合および分散を容易にし、本組成物中に含まれているかもしれない他の化学化合物の溶解度を向上させると考えている。さらに、可燃性液体の出荷／輸送に関して、危険物の運搬（ＴＤＧ）規制（国連（ＵＮ）番号１１７０）の適用除外を受けるために、エタノールなどの有機溶媒を溶液の２４体積％未満に保持するのが望ましい。そうでない場合は、２４％を超えるエタノールを含む溶液はクラス３（可燃性液体）に分類され、特殊梱包が義務づけられ、輸送の複雑さおよびコストが増大する。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「界面活性剤」または「サーファクタント」という用語は、両親媒性で、タンパク質中の非共有結合を破壊でき、それらを変性し、分子にそれらの本来の二次、三次および／または四次構造を失わせることができる任意の有機化合物を意味すると理解される。適切な界面活性剤は、例えば、アニオン性洗剤（例えば、ナトリウムドデシルスルフェート（ＳＤＳ）リチウムドデシルサルフェート、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリル硫酸アンモニウムなど）、カチオン性洗剤（例えば、セトリモニウムブロミド／セチルトリメチルアンモニウムブロミド／ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドまたはＣＴＡＢ、セチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣ）、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）などの第四級アンモニウム塩）双性イオン界面活性剤（例えば、ベタイン，３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）または非イオン性洗剤（例えば、ツイーン、トリトンＸ、またはＢｒｉｊなど）であってよい。しかし、ＤＮＡと一緒に使用する場合は、ＣＴＡＢはあまり理想的ではない。界面活性剤はこれらの酵素の複合体構造を破壊することによりＤＮアーゼの作用を抑制し、本組成物中の生物試料の分散を容易にし、種々の化学種の可溶化を促進できる。本組成物の特定の実施形態では、界面活性剤はＳＤＳである。他の実施形態では、界面活性剤（例えば、ＳＤＳ）は、水性組成物中に、約０〜４％（ｗ／ｖ）、好ましくは約０〜１％（ｗ／ｖ）、最も好ましくは約０．５％（ｗ／ｖ）の量で存在してよい。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「消泡剤」または「脱泡剤」という用語は、泡の形成を減らすか、または妨げる化学添加剤を意味すると理解される。発明者らは、特定の実施形態の本組成物を含むチューブ中の一部の生物試料、特に糞便試料を急速に、完全に分散するために必要な激しい振盪の間に、泡の形成を認めた。均一化手段を用いても用いなくても、上記泡は完全な混合を妨げ、一部の試料では、完全な混合を阻止した。消泡剤、例えば、活性なシリコーンポリマーである、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ａ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号Ａ−５６３３）は、生物試料と本組成物との上記混合中に泡の形成を顕著に低下させた。したがって、泡の形成を最小限にするために、界面活性剤を含む組成物中に消泡剤を含めるのが好ましいであろう。単独でまたは２種以上の組み合わせで使用してもよい適切な消泡剤の他の例には、不溶性の油、ポリジメチルシロキサンおよびその他のシリコーン、特定のアルコール、ステアリン酸塩およびグリコールが挙げられる。他の実施形態では、消泡剤（例えば、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ａ）は、水性組成物中に、約０〜１％（ｖ／ｖ）、好ましくは約０〜０．２％（ｖ／ｖ）の量で存在してよい。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「抗菌剤」という用語は、それらの非存在下での生物体の増殖速度に比べて、生物体の増殖速度を低減させる物質または物質群を意味すると理解される。生物体の増殖速度の低下は、少なくとも５％、より望ましくは少なくとも１０％、さらに望ましくは、少なくとも２０％、５０％、または７５％、最も望ましくは、９０％以上であってよい。定義は生物体の生存率、毒性、または病原性に影響する物質にも及ぶ。抗菌剤は天然（例えば、細菌由来の）、合成、または組換えであってよい。抗菌剤は静菌性、殺菌性、または両方の性質であってよい。抗菌剤は、阻害される細胞の生存率に影響を与えることなく細胞分裂を抑制する場合は、静菌性である。抗菌剤は、細胞死を引き起こす場合は、殺菌性である。細胞死は通常、液体増殖培地中で細胞増殖がないこと（例えば、濁度の非存在）により、または固体表面上で細胞増殖がないこと（例えば、寒天上でコロニー形成の非存在）により検出される。当業者なら、所定の濃度で静菌性である物質または物質群は、より高い濃度では殺菌性である場合があることを知っている。当該技術分野において既知の一般的抗菌剤としては、特定のアルコール、トリクロサンまたはイルガサン、およびプロクリン９５０が挙げられる。任意選択で、本組成物はトリクロサンなどの抗菌剤を含んでもよい。他の実施形態では、抗菌剤（例えば、トリクロサン）は、水性組成物中に、約０〜２％（ｗ／ｖ）、好ましくは約０〜０．５％（ｗ／ｖ）の量で存在してよい。
【００７５】
本明細書で記載の組成物は、生物試料、特に、糞便試料と混合される場合、周囲温度でその中に含まれる核酸を安定化し、それにより、核酸は均一化された混合物の貯蔵時に長時間安定化される。
【００７６】
一実施形態では、生物試料はヒト対象から得た糞便試料であり、核酸はＤＮＡである。
【００７７】
当業者なら、試料中の高分子量ＤＮＡの存在が、貯蔵条件下で試料内のＤＮＡ安定化の一般的指標を与え得ることを理解するであろう。これはアガロースゲル電気泳動により評価でき、この方法は、高分子量ＤＮＡの品質（例えば、クリスプバンド対スミアリング）の指標ならびに高分子量ＤＮＡの量の定量的尺度を与え得る（デンシトメトリー分析により）。
【００７８】
高分子量ＤＮＡの安定化に加えて、本明細書で記載の組成物は、生物試料、特に、糞便試料と混合した場合に、周囲温度でその中に含まれる核酸を安定化し、それにより、均一化された混合物の長時間の貯蔵時に微生物および／またはヒトの核酸の相対的存在量が維持される。当業者に既知の多くの技術、例えば、核酸の増幅またはハイブリダイゼーションを利用する技術を使って、微生物および／またはヒトの核酸の相対的存在量が維持されているかどうかを判定できる。均一化された混合物の長時間貯蔵時に、微生物のおよび／またはヒトの核酸の相対的存在量が維持されているかどうかを評価するために使用できる別の技術は、以降でさらに詳細に説明されるＰＣＲ−ＤＧＧＥ分析である。標的１６Ｓプロファイル（操作的分類単位の（ＯＴＵの）相対的存在量を決定するため）ならびにゲノムＤＮＡの全メタゲノムショットガンシークエンシング（ＷＭＳ：微生物遺伝子／核酸の相対的存在量を決定するため）も使用できる。
【００７９】
一代表的実施形態では、特にヒトＤＮＡの安定化は、組成物と共に本明細書記載の方法により一定時間（ｔ貯蔵）インキュベートされた糞便試料などの生物試料から得たＤＮＡが標的ヒト遺伝子の検出可能な産物へのＰＣＲ増幅を支える能力を保持しているかどうかを、より具体的には、ＰＣＲ産物の増幅のレベルが時間ゼロ時点での同じ均一混合物から抽出および精製されたＤＮＡまたはその他の対照混合物のレベルに類似であるかどうかを判定することにより評価できる。下の実施例でさらに記載のように、組成物と共に本明細書記載の方法によりインキュベートされたＴ＝０およびＴ＝ｔ貯蔵時点の糞便試料から生成されたヒトＤＮＡは、ヒト遺伝子を標的とするプライマーを使ってリアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）で増幅でき、Ｔ＝０およびＴ＝ｔ貯蔵精製ＤＮＡの一定分量から得られるＣｔ値の変化（ΔＣｔ）によりヒトＤＮＡ安定性の定量的尺度を得ることができる。約２未満のΔＣｔ値は、ヒトＤＮＡが貯蔵期間にわたり安定化されていることを示す。約１未満のΔＣｔ値は優れた安定化を示す。
【００８０】
一実施形態では、組成物と共に本明細書記載の方法によりインキュベートされた糞便試料中に含まれるヒトＤＮＡは、少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも３０日間、または少なくとも６０日間、室温で安定化されている。別の実施形態では、組成物と共に本明細書記載の方法によりインキュベートされた糞便試料中に含まれるヒトＤＮＡは、３７℃または５０℃などの高温で、少なくとも７日間、または少なくとも１４日間、安定化されている。さらに別の実施形態では、組成物と共に本明細書記載の方法によりインキュベートされた糞便試料中に含まれるヒトＤＮＡは、−２０℃で、少なくとも１ヶ月間（すなわち、３０日間）安定化されている。
【００８１】
別の実施形態では、核酸は微生物ＤＮＡであり、方法は生物試料（例えば、糞便試料）のマイクロバイオームプロファイルを安定化する。本明細書で使用される場合、「マイクロバイオームプロファイル」という用語は、特定の環境内の全体微生物群および生体分子、ならびにそれらの相対量を一般に意味する。
【００８２】
以降でさらに詳細に記載されるように、マイクロバイオームプロファイルの安定性は、例えば、細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を標的とするプライマー対および変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）分析を使って、特定の期間（ｔ貯蔵）の間、周囲温度で均一混合物の貯蔵後に、生物試料と本明細書で記載の組成物との均一混合物から抽出、生成されたＤＮＡのＰＣＲを行うことにより測定できる。当業者なら、目的の種間に差異がある限りにおいて、可変および非可変領域を有する他の細菌遺伝子を標的にできることを理解するであろう。その後、得られたＰＣＲ−ＤＧＧＥプロファイルは、時間ゼロの時点での同じ均一混合物またはその他の生物試料と組成物との対照混合物から抽出、精製されたＤＮＡに対し、同じようにＰＣＲ−ＤＧＧＥ分析を行うことにより得られるプロファイルと比較される。一実施形態では、糞便試料などの生物試料のマイクロバイオームプロファイルは、周囲温度で（ｔ貯蔵）後のＰＣＲ−ＤＧＧＥプロファイルが、Ｔ＝０時点でのＰＣＲ−ＤＧＧＥプロファイルに対し少なくとも７５％の類似度、最も好ましくは、Ｔ＝０時点でのＰＣＲ−ＤＧＧＥプロファイルに対し少なくとも８２％の類似度を示す場合に、特定の期間（ｔ貯蔵）、周囲温度で安定化されていると見なすことができる。
【００８３】
別の実施形態では、マイクロバイオームプロファイルの安定性は、例えば、特定の時間の間、周囲温度での均一な混合物の貯蔵後に生物試料と本明細書で記載の組成物との均一な混合物から抽出、精製されているＤＮＡ由来の細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の可変領域（例えば、Ｖ４超可変領域）を、増幅しシーケンシングすることにより測定できる。その後、得られたシーケンシング情報は、時間ゼロの時点での同じ均一な混合物またはその他の対照から抽出、精製されているＤＮＡに対し同様にして細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の可変領域の増幅およびシーケンシングを行うことにより得られる情報と比較される。実施例でさらに詳細を示すように、得られたシーケンシングデータの種々の形態の、当業者に既知のバイオインフォマティクス分析を使って、貯蔵条件下におけるマイクロバイオームの安定性を評価できる。
【００８４】
一実施形態では、組成物と共に本明細書記載の方法によりインキュベートされた糞便試料のマイクロバイオームプロファイルは、少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも３０日間、または少なくとも６０日間、室温で安定化されている。別の実施形態では、組成物と共に本明細書記載の方法によりインキュベートされた糞便試料のマイクロバイオームプロファイルは、３７℃または５０℃などの高温で、少なくとも７日間、または少なくとも１４日間、安定化されている。さらに別の実施形態では、組成物と共に本明細書記載の方法によりインキュベートされた糞便試料のマイクロバイオームプロファイルは、−２０℃で、少なくとも１ヶ月間（すなわち、３０日間）安定化されている。
【００８５】
発明者らは、意外にも、アルカリ性ｐＨ（ｐＨ≧９．５、好ましくはｐＨ１１）に緩衝された、極めて高濃度の一般にはあまり使われていないキレート化剤、ＣＤＴＡを使って、周囲温度で長期間にわたり、核酸を速やかに効果的に捕らえて安定化し、全体ＤＮＡプロファイルの「スナップショットをとる」ことができるということを見出した。
【００８６】
特に、発明者らは、意外にも、より低いｐＨ値に緩衝された安定化組成物に比べて、より強力なアルカリ性ｐＨ（約ｐＨ１０．５〜１１．５、好ましくは約ｐＨ１１）に緩衝された組成物が、マイクロバイオームＤＮＡの改善された安定性を示すことを見出した。これを予測することは可能ではなく、下記の観点から、実際に予想外のことであった。より高いｐＨでは、シトシンの脱アミノ化が加速されることが一般的に知られている。また、ＤＮＡはより高いｐＨでより容易に変性することも知られている。また、ＤＮＡ中の脱プリン塩基部位（低頻度で発生する）もまたより容易に切断される。したがって、発明者らが、アガロースゲル電気泳動、細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子シーケンシングおよびＤＧＧＥに基づいて、より高いｐＨ値で、ＤＮＡ／マイクロバイオームプロファイルがより安定であるように見えることを観察したことは驚くべきことである。
【００８７】
理論に束縛されるものではないが、明らかに改善された安定性の理由は、単に「化学的」なものではないと考えられる。すなわち、より強いアルカリ性ｐＨは、恐らくいくつかの理由の組み合わせによりマイクロバイオームＤＮＡの改善された安定性を示すと思われ、その理由の一部を下記で提案する。
【００８８】
本明細書で記載の組成物中で、ＤＮＡ／マイクロバイオーム安定化に関し、ＣＤＴＡがＥＤＴＡよりはるかに良好に機能することが観察された。ＥＤＴＡおよびＣＤＴＡに対する４つのｐＫａ値を上表２に示す。これらの値を踏まえると、これは、アルカリ性ｐＨで、ｐＨが１１に近づくに伴い、ＣＤＴＡは３つの負電荷を有するが、ＥＤＴＡは４つの負電荷を有することを意味する。ここでも、理論に束縛されるものではないが、恐らく、ＥＤＴＡに比べてＣＤＴＡのはるかに良好な性能の理由は、より低い負電荷に起因するものである。
【００８９】
マイクロバイオーム調査の目的は、ＤＮＡを安定化し、最終的に全ての細胞から同じ比率で、好ましくは１００％のＤＮＡを１００％の細胞から放出させることである。放出されたＤＮＡの「プロファイル」の安定化は、より高いｐＨにおいて、より良好である可能性がある。理由はこれがこの目的に到達するのにより近づき得るためである。換言すれば、ｐＨ９．５に比較して、ｐＨ１１では、より広い範囲の細菌ＤＮＡを安定化し最終的に放出できる。
【００９０】
ＤＮＡが放出されると、ＤＮＡは糞便試料中のＤＮアーゼによる分解から保護される必要がある。あるＤＮアーゼは補助因子として金属イオンを必要とするが、他のものはそれを必要としない。この場合も、理論に束縛されるものではないが、より高いｐＨが第２クラスのＤＮアーゼを抑制するのに、より効果的であり得るであろう。
【００９１】
糞便中の未知の因子（例えば、阻害剤）がＤＮＡに結合し、それを封鎖するか、またはＰＣＲ増幅を阻止する可能性がある。より高いｐＨがこれらの可能性の片方または両方を改善する可能性がある。
【００９２】
最終的に、糞便試料の安定化組成物中への収集後に、細菌の増殖を防止する必要がある。そうでない場合は、ＤＮＡ／マイクロバイオームの「プロファイル」が変化するであろう。より高いｐＨは、一部の微生物種の増殖の抑制においてより低いｐＨ（９．５）より効果的であろう。
【００９３】
糞便などの、複雑で、高度に変わりやすい、固形および半固形試料タイプに対しては、試料を組成物と収集時点で直ちに混合する機械的なまたは物理的手段を提供することも必要である。本組成物中の新たに採集した生物試料の迅速な均一化および完全な破壊により、周囲温度で長期間にわたる試料中の全体ＤＮＡプロファイルの代表的スナップショットの安定化が確実に行える。下記の実施例で示されるように、本組成物が採集された固形糞便試料に加えられるが、適切に混合されない場合には、均一に混合されているこれらの試料に比べて、ＤＮＡの品質は損なわれる。したがって、インビボ（Ｔ＝０）状態の表現となるようにＤＮＡを安定化するためには、試料の適切な混合は非常に重要である。例えば、このような試料から抽出され、続けてアガロースゲル電気泳動が行われるＤＮＡは、一部のドナー由来の試料においては、高分子量ＤＮＡの分解を示す場合がある。また、下記実施例で認められるように、一部のドナー由来の糞便試料の不適切な混合は、細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ  ＰＣＲおよびＤＧＧＥ分析で測定して、マイクロバイオームプロファイルに対する有害な変化に繋がる。
【００９４】
多くの場合、生物試料収集、特に、糞便収集は、ドナーによって、彼らの自宅で個人的に行われるのが最良である。この状況では、ドナーはより快適であり、使用説明書および適切な生物試料収集器具または安定化化学薬品または溶液を含むキットが提供されれば、ドナーは直ちに新しい生物試料を収集し安定化できる。このようにして試料を収集することは、インビボ状態に可能な限り精密に合致したＤＮＡプロファイルを有する、その後の抽出および分析のために最良の品質の核酸を確保するのに役立つ。しかし、自宅または遠隔の現場の収集場所で生物試料を収集し安定化するためには、ドナーは、彼ら自身で彼らの収集試料を安定化溶液と手動でまたは物理的に混合するための、単純で、安全で直感的であるが、非常に効果的な手段の提供を受ける必要がある。好ましくは、この混合手段は安価であり、電気、設備または特殊な訓練を必要としない。
【００９５】
収集時点で、安定化溶液と混合されないか、または直ちにドライアイス上で凍結されない場合には、ＤＮＡは、空気への暴露時に、生物試料（例えば、糞便）中で速やかに分解する。血液および尿などの、均一な、液体生物試料の場合は、混合は重要な問題ではないが、限られた量の溶液と時間で、糞便などの固形および半固形の不均一生物試料の破壊は、非常に問題である場合がある。多くの混合手段（例えば、ガラス／シリカ粒子（１ｍｍ以下；２．６５ｇ／ｃｍ３）、ガラス／シリカビーズ（２〜４ｍｍ；２．６５ｇ／ｃｍ３）、大理石（１２．７ｍｍ）、アルミナ酸化物ボール（７．９ｍｍ；３．９５ｇ／ｃｍ３）、およびシリコンナイトライドボール（７．１〜７．９ｍｍ；３．２１ｇ／ｃｍ３））を用いた多くの実験を通して、発明者らは、本組成物を含む標準的な市販の研究用チューブまたは輸送チューブ（例えば、１０ｍＬ丸底チューブ（９２ｘ１５．３ｍｍ）、カタログ番号６０．６１０；Ｓａｒｓｔｅｄｔ）に収集された全ての糞便試料タイプ（ブリストル便形状尺度のタイプ１〜７）の完全な破壊と均一化が、チューブ中に少なくとも１個の、チューブの内径（例えば、１２．９ｍｍ）より小さい寸法の大きくて（５．６〜１１．１ｍｍ、好ましくは７．９ｍｍ）密な（７．６〜１５．６３ｇ／ｃｍ３）金属ボールを入れた単純な手混合により達成できることを発見した。
【００９６】
発明者らは、標準的市販の研究用チューブに対する均一化手段の最適選択を決定した。これには以下が含まれる。１）チューブの形状（例えば、チューブの内側の底または基部）を均一化手段の形状と一致させて（例えば、少なくとも１個のミキシングボール、例えば、ステンレス鋼ミキシングボールである均一化手段に対する丸底チューブ）、チューブまたは容器の手の届きにくい領域中での固形材料の圧密化および／または閉じ込めを防止すること；２）均一化手段に可能な最も高密度の材料（例えば、タングステンカーバイド（１５．６３ｇ／ｃｍ３）、ステンレス鋼（７．６〜８．０ｇ／ｃｍ３））の選択；３）チューブまたは容器の内径よりわずかに小さい外径を有する均一化手段の選択（例えば、均一化手段がミキシングボールの場合、ミキシングボールは混合チューブの内径より約４〜６ｍｍ、好ましくは約４〜５ｍｍ、および最も好ましくは約５ｍｍ小さい直径を有するであろう）；４）手で振盪する間に均一化手段が運動量を得るのを可能にするために、試料および安定化溶液の上に「上部空間」を有するチューブまたは容器の選択。ミキシングボールは規則的なまたは不規則な形状であってよく（例えば、こぶ、スパイク、などでよく、完全な球である必要はない）、また上に記載したように好ましくは、少なくとも５．０ｇ／ｃｍ３、最も好ましくは、少なくとも７．６ｇ／ｃｍ３の密度を有することに留意されたい。
【００９７】
均一化手段／ボールがチューブに対して小さすぎると、試料は、安定化溶液中に分散されることなく、均一化手段／ボールの周りを通過する。対照的に、均一化手段／ボールがチューブ（１２．９ｍｍ内径）に対し大きすぎる（例えば、１１．１ｍｍより大きい）と、試料は均一化手段／ボールとチューブの壁との間で分散または「粉砕」されず、均一化手段／ボールが十分な運動量を得られず、試料はチューブの片方または両方の端部に圧密化された状態になる。理想的には、均一化手段（例えば、７．９ｍｍのタングステンカーバイドまたはステンレス鋼ボール）の外径がチューブ（例えば、１２．９ｍｍの内径を有する上記の１０ｍＬのＳａｒｓｔｅｄｔチューブ）の内側垂直壁を約５ｍｍ（ボールの両側に２．５ｍｍずつ）の間隙でちょうど通過する場合に、均一化手段はホモジナイザーとして効果的に機能し、固形および半固形糞便試料（例えば、４００ｍｇ；タイプ１〜７）を急速に分解または破壊し、本組成物（例えば、２ｍＬ）中に集め、均一な液体試料を形成し、これは容易にピペット採取または操作して、研究室で処理することができる。この均一化手段は、集めた生物試料が、たとえ固形糞便であっても、速やかにおよび完全に破壊され、それによって、本組成物に素早く接触させられることを確実にする。重要なことに、発明者らは、タイミングよく（２０〜３０秒）単に手でチューブを振盪させることにより試料の完全な破壊を達成するためには、チューブ／容器に対比した均一化手段の直径だけでなく、均一化手段の密度が重要であることを定めた。糞便（例えば、タイプ４）が粘着性で、展性のある性質であることが多いために、この試料の完全な均一化は、球状の均一化手段を使う場合には平底または円錐底チューブでは達成困難であった。したがって、球状の均一化手段に対する丸底チューブが最良の性能であった。
【００９８】
本発明は、特に複雑で、不均一な生物試料中の全ＤＮＡを周囲温度で安定化し、それに続く、ヒトおよび動物の医療診断および臨床研究（例えば、疾患および感染の診断、ヒトの健康における微生物の役割、微生物進化、毒性、薬剤耐性、および疫学を研究するための集団ゲノム科学）、食の安全（食物／肉加工プラント）、土壌および廃水サンプリング（環境試験）、バイオセキュリティーまたはバイオディフェンス（生物兵器）、動物の飼料試験、植物および動物科学／産業、などで使用するための新規で、普遍的に適用可能な方法および組成物を提供する。研究者および臨床医両方の新規で急速に拡大している興味の対象は、腸内微生物叢または腸マイクロバイオームである。健康なドナー由来の糞便中の微生物のプロファイルは、病気の個人のプロファイルとはどのように異なるのか？  ヒト腸内マイクロバイオームの操作は健康にとって利益をもたらし得るのか？  研究、環境、および経済的理由のために、家畜、特に肉および乳製品用に飼育されている動物の反芻胃中の数千の異なる微生物の分析への極めて大きな関心も存在する。
【００９９】
本発明は、輸送または貯蔵中に低温流通体系を維持することを必要とせずに、生物試料の収集および調製を単純化して円滑にし、その後のヒト、動物および微生物のＤＮＡの検出のための高品質の試料を提供する。本発明は、ａ）高スループットまたは自動システムを備えた中央研究室または試験施設、ｂ）最小限の研究室インフラおよび設備を備えた地方のまたは移動式の医院、およびｃ）電気のない遠隔地で使用できる。さらに、病気のおよび潜在的に感染している個人が医院または病院へ移動して生物試料を提供する必要がなく、感染症の広がりを最小限にし、爆発的感染の制御と監視を容易にし、かつ処置に対する患者の応答の迅速な評価およびモニタリングを可能にする。
【０１００】
本明細書で記載の閉じた収集および均一化システム／キットは、製造するのに安価であり、追加の研究室設備（例えば、ボルテックス）を購入する必要がない。最も重要なことは、本組成物、１つまたは複数の均一化ボール、およびまさに硬い糞便（ブリストル便形状尺度のタイプ１〜２）試料を含むキャッピングされたチューブのマニュアル振盪により、試料の完全な破壊を数秒で達成でき、均一混合物が得られることである。ドナーの自己収集により、感染の蔓延および他のドナーの試料との起こりうる相互汚染が減らされる。特に、この試料収集および均一化プロセスは、研究室または臨床的経験のない、専門家でない人でも、彼らの自宅で個人的に行うことができ、ドナーの関与およびコンプライアンスを大きく改善できる。下流試験結果の品質に対し重要なことに、本発明は「新しい」生物試料の安全な収集および安定化を可能にし、試験施設への生のまたは未処理の生物試料の輸送および／または変化する貯蔵条件中に観察される分解を劇的に減らす。
【０１０１】
重要なことに、本発明は研究者および臨床医に、切実に必要とされる安定化された代表的生物試料を提供し、それから偏りのないＤＮＡが抽出できる。偏りのないＤＮＡ入力、すなわち、試料収集時点での腸マイクロバイオームの代表的スナップショットは、健康なおよび疾患を有するヒトにおける、ヒト腸内微生物細菌集団の変化の度合いの調査のために、下流分析の品質と正確さを高め、対象間および対象内の差異、ならびに試験間差異のより正確な比較評価を可能にする。損なわれていない、偏りのない富んだ高分子量ＤＮＡは、メタゲノムライブラリー作製および配列ベースまたは機能的選別ベース手法による損なわれていない遺伝経路のキャラクタリゼーションにとって重要である。さらに、生物試料中のＤＮＡの過度の分解は、ショットガンシークエンシングの効率を低下させる。
【０１０２】
あたらしい糞便中の細菌集団に関連して、糞便から抽出された系統的ＤＮＡ組成物に注意が払われるようになってきたのはここ数年に過ぎない。収集後に糞便試料を凍結し、非常に多様な期間の後に、シーケンシングまたは定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）などの下流分析のためにＤＮＡを抽出することは、主に実用的な理由による慣例である。しかし、重要なことに、発表された調査の間およびその内で、１）「新しい」糞便の排便と凍結との間の時間；２）輸送の条件および期間；３）分析の前に、糞便が凍結されている時間の長さ；４）凍結糞便を解凍するために採用される時間の長さと温度；および５）最初の一定分量が単離されてＤＮＡ用の処理がされる前の、収集からの変わりやすい時間、において大きなばらつきがあるように見える。これらの調査では、Ｔ＝０は、排便の時間ではなく、収集され、凍結され、さらにはしばしば貯蔵されたこれらの試料が処理のために解凍された瞬間を表す。
【０１０３】
しかし、ヒト微生物叢のメタゲノム調査において、調査は、糞便試料の貯蔵条件が推定された細菌集団組成に悪影響を与える可能性があることを明確に示している。例えば、Ｂａｈｌら（２０１２）は、ｑＰＣＲおよび重要な細菌性群を標的とする１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子６種の異なるプライマー対を使って、抽出前に−２０℃で５３±５日間凍結した糞便試料は、２つの最も優勢な門、すなわち、腸微生物学でバイオマーカーとして使われることが多い、ファーミキューテス門とバクテロイデス門との間の比率に影響を与えたことを示した。特に、バクテロイデス門に対するファーミキューテス門の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子比率は、凍結された糞便試料中では、凍結されていない同じ試料に比べて著しく高かった。切実に必要とされているのは、収集された糞便試料中の元のまたはインビボの微生物群の少なくとも３つの重要な側面を捕らえまたはそのスナップショットをとり、ｉ）それぞれの微生物の存在量、ｉｉ）全体細菌集団の豊富さ、およびｉｉｉ）全体微生物ＤＮＡプロファイル、を安定化する手段である。
【０１０４】
複雑な糞便試料由来の全ゲノム細菌ＤＮＡの効率的で偏りのない安定化（および抽出）は、腸内の細菌集団の分子ベースの調査、例えば、ドナーのインビボ状態を表すマイクロバイオームプロファイルを生成するための非常に重要な第一ステップである。特に、微生物細菌集団の調査は、収集後直ちに微生物叢プロファイルの「スナップショット」を捕らえることを必要とする。現在の糞便試料の現場収集は、実用的でなく、高価で、規模拡大可能でないことは明らかである（ＭｃＩｎｎｅｓ  ＆  Ｃｕｔｔｉｎｇ，２０１０）。試料収集に関する問題が矛盾する結果および低い再現性の原因となっていることも、現場ではよく知られている。さらに、固形試料の取り扱いは、自動化に対する課題を提起し、コストを増大させ、長期にわたる調査の規模を制限する。
【０１０５】
研究室をまたぐ調査間および調査内の大きな偏りを除くために、輸送および長期の貯蔵中に好ましくない、時には極端な温度にさらされる前に、生物試料の収集および収集時点での安定化のための標準化されたまたは普遍的な方法を開発し実施することが必要である。効果的なＤＮＡ安定化組成物中の、試料収集の時点での生物試料、特に、タイプが極めて変化しやすい複雑で不均一な、液体から硬い固形までの試料を均一化する本方法は、全体試料中のＤＮＡの最大の一貫性を確保し、可能な限りインビボに近い状態を表す。
【０１０６】
現時点で、多くの調査がドナーを動員して糞便試料を収集し、安定化手段を提供しないかまたは輸送中にアイスパックを必要としている。米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）ロードマップの下に開始されたプログラムである、ヒトマイクロバイオームプロジェクト（ＨＭＰ）はヒトマイクロバイオームの特性を明らかにし、ヒトの健康および疾患におけるその役割を解析する調査のスポンサーになっている。ＨＭＰコアマイクロバイオームサンプリング調査（Ｃｏｒｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  Ｓａｍｐｌｉｎｇ  ｓｔｕｄｙ）に参加している全メンバーは、特に、ＧＩ管からの検体収集について概説している手順マニュアル（Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）（ＭｃＩｎｎｅｓ  ＆  Ｃｕｔｔｉｎｇ，２０１０）（セクション７．３．３参照）に従う必要がある。対象は糞便収集キットを与えられ、検体を医院に戻す前の２４時間以内に糞便検体を収集することが要求される。ＨＭＰキットは、大きなマーガリン入れに似た２つの糞便収集容器（１つは予備）、Ｔｈｅｒｍｏｓａｆｅ出荷容器（段ボール箱内の大きな発泡スチロールの箱）、８〜１０個の検体輸送用ｐｏｌａｒ  ｐａｃｋ（保冷剤パック）（約４℃で）、使用説明書、ラベル、およびその他の包装材料を含む。検体収集前に、対象はゲルパックを自分のフリーザー中に少なくとも１２時間入れる必要がある。糞便を収集容器中に直接入れ、蓋をして、全体容器をＺｉｐｌｏｃｋ中で密封し、発泡スチロールの箱に梱包する前に、８〜１０個の凍結ゲルパックで完全に取り囲む。発泡スチロールの箱を閉じて、段ボール箱の内側で密封し、対象はこの嵩高い梱包体を臨床検査室に輸送する。
【０１０７】
氷上またはドライアイス上に詰め込まれ、嵩高い発泡スチロールおよび段ボール容器中に封入された新しい検体を輸送する既存の低温流通体系の要件は、非常に高価で、中等度から多数のドナーを必要とする調査を行う研究者にとっては、法外に高くさえある。段ボール輸送箱またはオーバーパック（１６ｘ１３ｘ１４インチ）内の発泡スチロール容器中の凍結アイスパックで取り囲んだ市販の糞便収集容器の単なる輸送は、米国内のＵＰＳ翌日配達サービスを使って、各約１７５ドルかかる。この試算は、糞便収集容器およびすべての輸送材料のコストを勘定に入れていない。また、多くの試験施設は、生物試料がドライアイス上で輸送されることを要求し、これはこの輸送試算にかなりのコストを追加する。研究室がこれらの大きな輸送容器を受け取ると、スタッフは直ちに梱包をといて、素早く生物試料を処理するか、またはバッチ処理を行うことができるまで、収集容器を大きな貯蔵フリーザー中に置く必要がある。対照的に、本発明は、現在の輸送コストおよび不都合の大部分を改善し、さらに、最も重要なことに、収集された生物試料中のＤＮＡが周囲温度で収集の時点で安定化されていることを保証する。ドナーの観点からは、生物試料を彼らの自宅で個人的に収集し、検体のごく一部を既に安定化溶液を含む、なじみのあるチューブまたは容器に移し、チューブにキャップをして、手で振盪させて混合し、チューブをバイオハザード・バッグ中に密封し、クッション封筒または小さい箱に入れて、現状コストの何分の１かで試験施設に郵送する。
【実施例】
【０１０８】
材料と方法
次の一般的材料と方法は、異なる条件がそこで指定されている場合を除き、以下の実施例で使用される。
【０１０９】
糞便試料の収集
健康なドナーはそれぞれ次の収集用支給品が与えられた：ａ）糞便収集容器（便器上に配置）；ｂ）約４００ｍｇの糞便の容量測定収集用シリンジ（すなわち、４００ｍｇの収集容積に調節したプランジャーを備え、先端を切断した３ｍＬのシリンジ）；ｃ）本組成物（２ｍＬ）を含む丸底Ｓａｒｓｔｅｄｔチューブ（１０ｍＬの丸底チューブ（９２ｘ１５．３ｍｍ）、カタログ番号６０．６１０；Ｓａｒｓｔｅｄｔ）、および種々の均一化手段（例えば、７．９ｍｍステンレス鋼ボールベアリング、４２０／４４０ＳＳ  Ｇｒａｄｅ２５、Ａｉｍａｒｋ  Ｔｒａｖｅｒｓ  ＬＴＤ、または下に記載のその他のもの）；およびｄ）糞便収集説明書。チューブを収集前および収集後に秤量して、収集された糞便試料の実際の量を測定した。それぞれのドナーは印を付けた容積（４００ｍｇ）までシリンジの先端を糞便で満たし、糞便試料をチューブに移すことを要求される。試料の完全な均一化のために、チューブは手で２０〜３０秒間振盪された。
【０１１０】
本組成物中での糞便試料からのＤＮＡ抽出
特に断りのない限り、４００ｍｇの糞便を、２ｍＬの本組成物（下記実施例で指定される）および７．９ｍｍステンレス鋼ボールベアリングを含むＳａｒｓｔｅｄｔチューブ（１０ｍＬ丸底チューブ（９２ｘ１５．３ｍｍ）、カタログ番号６０．６１０；Ｓａｒｓｔｅｄｔ）に移した。ＤＮＡは、いくつかの市販のＤＮＡ単離キットを利用して、収集され本組成物中に貯蔵された糞便試料の２５０μＬの一定分量から容易に抽出された。本組成物中の糞便試料は、ＰｏｗｅｒＳｏｉｌ（登録商標）ＤＮＡ単離キット（ＭＯ  ＢＩＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号１２８８８−１００）、ＰｏｗｅｒＦｅｃａｌ（商標）ＤＮＡ単離キット（ＭＯ  ＢＩＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号１２８３０−５０）、ｂｅａｄ−ｂｅａｔｉｎｇを組み込んだＺｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｅｃａｌ  ＤＮＡ  ＭｉｎｉＰｒｅｐ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号Ｄ６０１０）、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｆｅｃｅｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号５１５０４）およびＰＳＰ  Ｓｐｉｎ  Ｆｅｃｅｓ  ＤＮＡ  Ｐｌｕｓ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｅｋ、カタログ番号１０３８１１０２００）に適合することが分かった。
【０１１１】
ＰｏｗｅｒＦｅｃａｌ（登録商標）ＤＮＡ単離キット使用説明書に従って、  次の手順を行った［注意：６５℃の加熱ステップは除いた］：
１．提供されたＰｏｗｅｒＢｅａｄチューブに、７５０μＬのビーズ溶液および本組成物中の２５０μＬの糞便試料を加えた。チューブを緩やかにボルテックスして混合した。
２．６０μＬの溶液Ｃ１を加え、チューブを数回反転させるか、または短時間ボルテックスした。
３．ＰｏｗｅｒＢｅａｄチューブをボルテックスアダプターに固定し、最大速度で１０分間ボルテックスした。
４．ＰｏｗｅｒＢｅａｄチューブを１０，０００ｘｇで３０秒間、遠心分離した。
５．上清を清浄な２ｍＬの採集チューブ（支給品）に移した。
６．２５０μＬの溶液Ｃ２を加え、チューブを５秒間ボルテックスした後、４℃で５分間インキュベートした。
７．採集チューブを室温にて１３，０００ｘｇで１分間遠心分離した。
８．ペレットを避けながら、６００μＬまで（これ以下）の上清を清浄な２ｍＬのチューブに移した。
９．２００μＬの溶液Ｃ３を加え、チューブを短時間ボルテックスした後、４℃で５分間インキュベートした。
１０．チューブを室温にて１３，０００ｘｇで１分間遠心分離した。
１１．ペレットを避けながら、７５０μＬまで（これ以下）の上清を清浄な２ｍＬのチューブに移した。
１２．使用前に溶液Ｃ４を混合した。上清に１２００μＬの溶液Ｃ４を加え、チューブを５秒間ボルテックスした。
１３．６７５μＬをスピンフィルター装置にロードし、１３，０００ｘｇで１分間遠心分離した。通過画分を破棄し、追加の６７５μＬの上清をスピンフィルター装置に加えて、１３，０００ｘｇで１分間遠心分離した。残存上清をスピンフィルター装置にロードし、１３，０００ｘｇで１分間遠心分離した。
１４．５００μＬの溶液Ｃ５をスピンフィルター装置に加え、室温にて１３，０００ｘｇで３秒間遠心分離した。通過画分を破棄した。
１５．再度、室温にて１３，０００ｘｇで１分間、遠心処理を行った。
１６．スピンフィルターを清浄な２ｍＬの採集チューブ（支給品）に注意深く入れた。
１７．１００μＬの溶液Ｃ６を白色フィルター膜の中央に加えた。
１８．チューブを室温にて１３，０００ｘｇで３０秒間遠心分離した。
１９．ＤＮＡを凍結貯蔵した（−２０〜−８０℃）。
【０１１２】
精製試料中のＤＮＡ濃度の測定
Ａ．ＤＮＡ濃度の吸光度測定
２６０ｎｍ（Ａ２６０ｎｍ）での吸光度の測定はＤＮＡの定量化によく使用される。２６０ｎｍで１．０の吸光度は、純粋な二本鎖ＤＮＡの５０ｎｇ／μＬの濃度に相当する。ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００ｃ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）を使って、各種条件下にて本組成物で処理された、または処理されていない、精製された糞便試料からのＤＮＡ収量を測定した。２μＬ容積の各ＤＮＡ試料を受台上に置き、２２０ｎｍ〜３５０ｎｍを走査し、２３０ｎｍ、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍで吸光度を測定した。試料ＤＮＡ濃度（ｎｇ／μＬ）、Ａ２６０／Ａ２８０比、およびＡ２６０／Ａ２３０比がＮａｎｏＤｒｏｐ２０００ｃソフトウェアにより報告された。試料濃度にそれぞれのＤＮＡ溶出容積を乗算することにより、試料当たりの全ＤＮＡ収量が計算された。
【０１１３】
Ｂ．ＤＮＡ濃度の蛍光定量
Ａ２６０ｎｍを使う場合の欠点には、（Ｉ）アッセイの非感受性および（ｉｉ）特に、高度に精製されていない試料中の、ＲＮＡなどの非ＤＮＡ成分による干渉、が挙げられる。精製試料からのＤＮＡ収量は、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）蛍光染料（２００ｘ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｐ７５８１）を使っても定量化される；Ｌａｍｂｄａ  ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号２５２５０−０１０）を使って検量線を生成した［３回繰り返して；０〜５０ｎｇ／μＬ］。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）は、ナノグラム以下の量の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の高感度定量化を可能にする蛍光二本鎖ＤＮＡ結合染料（４８５ｎｍ励起／５３５ｎｍ発光）である。３回繰り返し採取した一定分量のそれぞれの精製試料およびＬａｍｂｄａ  ＤＮＡ基準を黒色平底９６ウエルマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、カタログ番号６５５２０９）中で処理し、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ）を使って蛍光を測定した。
【０１１４】
安定化組成物中で貯蔵した試料中のＤＮＡの一貫性
ＰｉｃｏＧｒｅｅｎで測定した濃度（上記）に基づいて、一定分量のそれぞれの精製試料を１０ｎｇ／μＬに希釈した。ＤＮＡの一貫性を評価するために、それぞれの希釈され、精製された糞便試料からの約８０ｎｇを、１００ボルトで３０分間の電気泳動により１％アガロースゲル上で分離した。ゲルを蒸留水中の１μｇ／ｍＬの臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）中で室温にて１５分間染色し、濯ぎを行い、ＤｉｇｉＤｏｃ−ＩＴ（商標）イメージングシステム（ＵＶＰ  ＬＬＣ）を使って、ＵＶトランスイルミネーター上で撮影した。ゲル上の染色バンドが、ＤＮＡラダーに比べて、シャープで、＞２３ｋｂの場合は、ＤＮＡは安定化されており損なわれていないと判定した。１Ｋｂ＋ＤＮＡラダー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１０７８７−０１８）またはＬａｍｂｄａ  ＤＮＡ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ断片（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１５６１２−０１３）をサイズ基準として使用した。
ａ．１％アガロースゲルを調製した（８０ｍＬ  １ｘＴＡＣ＋０．８ｇアガロース）。
ｂ．２μＬの５ｘローディングバッファーを１０ｎｇ／μＬの精製試料の８μＬに添加した。
ｃ．調製した１％アガロースゲルのウエル中に、１０μＬの調製試料（ステップｂ）；５μＬのＬａｍｂｄａ  ＤＮＡ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ断片および／または５μＬ  １Ｋｂ  ＤＮＡラダーを加えた。
ｄ．ゲルを１００Ｖで３０分間泳動した。
ｅ．ゲルをＥｔＢｒ（５００μＬの１ｍｇ／ｍＬ  ＥｔＢｒ＋５００ｍＬの水）中で１５分間染色した。
ｆ．ゲルを水中で５分間脱染した。
ｇ．ＵＶ下で画像を取得した。
【０１１５】
変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）
本組成物中の種々のマイクロバイオーム（糞便、唾液、痰、皮膚、など）の安定性を正確に再現性よく評価するために、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）と呼ばれる新規の方法を利用した。この方法は、細菌の１６Ｓ  細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の可変領域（この場合では、Ｖ３領域）を採取し、ＰＣＲおよび隣接保存領域に対するプライマーを使ってそれを増幅する場合、アンプリコンは細菌種に固有の融点を有することになる（たとえ、ヌクレオチドの差異が融解物に影響を与え、それにより異なるプロファイルを与えるとしても）という考えに基づいている。
【０１１６】
この方法が複数種の細菌を含む試料に適用される場合、保存プライマーを使った増幅は多くのアンプリコンを生じ、これらの全てはおおよそ同じ長さであるが、非保存領域では異なるヌクレオチド構成を有する。次に、これらのアンプリコンは、勾配を有する変性溶液（尿素およびフォルムアミド）を含むゲル上で泳動される。アンプリコンはそれらのヌクレオチド構成に応じてゲル上の異なる場所で変性し、それにより、試料中に存在した全ての種を分離する。
【０１１７】
ＤＮＡアンプリコンが一本鎖型に変性しないようにするために、可変部分が変性するとゲル上のアンプリコンの移動を遅らせる、約３０ヌクレオチドのＣＧクランプを順方向プライマーに加えた。一般に、ゲル上の４０％〜６０％の変性勾配が良好な分離を与え、同時に、腸内種の大部分を捕捉する。アンプリコンの変性を容易にし、また、泳動を通してゲルを同じ温度に保持するために、ゲルは一定の６０℃で泳動される。
【０１１８】
ＤＧＧＥゲル画像をＳｙｎｇｅｎｅ  ＧｅｎｅＴｏｏｌｓソフトウェア（バージョン４．０３．００、Ｓｙｎｇｅｎｅ）を使って解析した。３０ピクセルの半径を有するローリングディスク法を使って、画像のバックグラウンドを減算した。レーンをマニュアルで検出し、設定した。Ｒｆ開始および終了位置および角度をマニュアルに設定し、ゲル中の「スマイリング」を調節した。分析用のバンドはそれぞれのレーンで自動的に検出された；ピーク検出をデフォルトに設定した（最小幅：７ピクセル、最小ピーク高さ：３、および最小ピーク容積：１％）。プロファイルをマッチングパラメータメニューの「プロファイル」タイプを使って設定精度１％で一致させた。プロファイル比較により、０〜１００の範囲の類似度値を有する、自動的に生成された類似度マトリックスを得た。一般的に言って、％類似度に関しては、これは２つのプロファイル間の任意の変化、通常はバンド強度間の差異を指す。したがって、％類似度は種の存在量の差異の尺度を与える。プロファイル間にバンドがない場合は、バンドの強度がただ減少する場合よりも、％類似度に与える影響は大きい。
【０１１９】
図１に示すＤＧＧＥゲルは、２人の異なるドナー由来の糞便試料のマイクロバイオームプロファイルがどのように見えるかを示し、第１の糞便試料（ドナーＡ）と第２の糞便試料（ドナーＢ）との間には、２２％の類似度しか存在しない。
【０１２０】
ＰＣＲ−ＤＧＧＥは下記の手順に従って実行された。
ＤＧＧＥのためのＰＣＲ増幅（順方向プライマー上に５’クランプを有する１６Ｓ  プライマーを使用する）
ａ．２μＬの１０ｎｇ／μＬ  ＤＮＡを１２連ＰＣＲチューブに加えた。
ｂ．マスターミックスを調製した（９８μＬ／反応）：７６．７μＬの水、１０μＬの１０ｘＰＣＲ緩衝液、４μＬの５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、２μＬの１０ｐｍｏｌ逆方向プライマー（ＰＰＵＮ５１８Ｒ、５’−ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧ−３’）、２μＬの１０ｐｍｏｌ順方向プライマー（ＰＲＢＡ３３８Ｆ、５’−ＣＧＣＣＣＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＣＡＣＧＧＧＧＧＧＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ−３’）、および０．８μＬの５Ｕ／μＬ  Ｔａｑ。
ｃ．９８μＬのマスターミックスをそれぞれのチューブに加えた。
ｄ．従来のＰＣＲ装置でＰＣＲを行った：９２℃で２分間を１サイクル；９２℃で６０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で６０秒間を２８サイクル；続けて、７２℃で６分間を１サイクル。
【０１２１】
ＰＣＲアンプリコンのＤＧＧＥ
ａ．４０％および６０％変性溶液中の８％アクリルアミド／ビスゲルのストック溶液を調製した：
【０１２２】
【表４】
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ｂ．Ｄｃｏｄｅシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）用の使用説明書パンフレットに従って、ガラスプレートおよびスペーサーを組み立てた。
ｃ．４０％および６０％変性溶液を使って、平行勾配を有する８％アクリルアミド／ビスゲルを調製し、注入するために、次の手順を使用した：
・２０ｍＬの４０％および６０％変性溶液を、「低密度」および「高密度」とそれぞれ標識された２つの別のビーカーに秤取した。
・２００μＬの１０％過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）を各溶液に加えた。
・２０μＬのＴＥＭＥＤを各溶液に加えた。
・溶液をかき回すことによりよく混合した。
・各溶液を別個の２０ｍＬシリンジ中に満たした。
・シリンジをゲル充填装置に取り付けた。この装置は、トップフィリングに「低密度」または「高密度」と指定されている。
・注意：１．０ｍｍスペーサーを有する１６ｘ１６ｃｍゲル用の容積調節設定を１８．５ｍＬとした。
・Ｙ配管をそれぞれのシリンジに取り付け、配管の他端にニードルを取り付けた。
・ニードルをガラスプレートの間に配置した。
・勾配が平らになる時間を有するように、ホイールを回転させることによりゲルをゆっくりと一様に注入した。
・ゲルを数時間重合させた。
・Ｙ配管を水で洗い流した。
ｄ．ゲル泳動システムを１ｘＴＡＥ緩衝液を使って５５℃に予備加熱した。
ｅ．８μＬのＦｅｒｍｅｎｔａｓの６ｘローディングダイを４２μＬのＰＣＲ産物に添加した。
ｆ．再循環ポンプのスイッチを入れる前に、試料をウエルから追い出しゲル中に入れるために、ゲルを２００Ｖで５分間泳動した。
ｇ．再循環ポンプをオンにして、ゲルを７０Ｖで１４時間泳動した。
ｈ．ゲルを１ｘＳｙｂｒ  Ｇｏｌｄで３０分間染色した（２５０ｍＬの１ｘＴＡＥ＋２５μＬの１０，０００ｘＳｙｂｒＧｏｌｄ）。
ｉ．ゲルを１ｘＴＡＥ中で５分間脱染した。
ｊ．ＵＶ下で画像を取得した。
【０１２３】
ユニバーサルプライマー（Ｖ３領域）を使って１６Ｓ  ｒＲＮＡ  ＰＣＲを行い、続けて、ＤＣｏｄｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使ってＤＧＧＥを行った。
【０１２４】
１６Ｓ  ｒＲＮＡシーケンシング
１６Ｓ  ｒＲＮＡシーケンシングライブラリー調製、シーケンシングおよびバイオインフォマティクス解析を行った。Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＭｉＳｅｑ（登録商標）（２５０サイクル）を使って、Ｖ４超可変領域ペアードエンドアンプリコンシーケンシングを行った。ＱＩＩＭＥおよびカスタムスクリプトを使って、配列のクオリティフィルタリングを行った。ペアードエンドリードをアセンブルし、ＵＣＬＵＳＴにより９７％クラスター化された、Ｇｒｅｅｎｇｅｎｅｓリファレンスデータベースに対しサーチした。データ正規化後、ＯＴＵ（操作的分類単位）に対する加重付きＵｎｉｆｒａｃ存在量データ（差異の合計を全ての存在量の合計で除算することによるペアワイズ正規化を用いて、試料間の分類群存在量差異を利用する）および非加重Ｕｎｉｆｒａｃ出現率データ（分類群の存在／非存在のみを考慮する）を使って試料間距離を測定した。
【０１２５】
本組成物中に貯蔵された精製糞便試料由来のヒトＤＮＡの増幅
全ＤＮＡ抽出（ＭｏＢｉｏ  ＰｏｗｅｒＳｏｉｌまたはＰｏｗｅｒＦｅｃａｌ  ＤＮＡ単離キット）の前に、本組成物中に収集され（下記で詳述）室温で２週間貯蔵された糞便試料中のヒトＤＮＡの安定性を、単一コピーのヒトチミジル酸シンターゼ遺伝子（ＴＹＭＳ座位；ＮＭ００１０７１．２）を標的とするプライマーを使ってリアルタイムＰＣＲまたは定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）で評価した。それぞれの反応について、５０ｎｇの精製ＤＮＡを下記を含む２５μＬ容積中で増幅した：１ｘＰＣＲ緩衝液（２０ｍＭトリス、５０ｍＭ  ＫＣｌ）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭ  ｄＮＴＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５０μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、１μＭ  ＳＹＴＯ９染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．４μＭの各プライマー  ｈＴＳｍ１４３Ｆ（５’−ＧＣＣＣＴＣＴＧＣＣＡＧＴＴＣＴＡ−３’）およびｈＴＳｍ１４３Ｒ（５’−ＴＴＣＡＧＧＣＣＣＧＴＧＡＴＧＴ−３’；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１Ｕ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。ＴＳ１４３標的に対する増幅条件は：９５℃で５分間を１サイクル；９５℃で２０秒間、５５℃で２０秒間、７２℃で３０秒間を３５サイクル；続けて、７２℃で１０分間を１サイクル。融解曲線プログラムを組み込み、これは次から構成された：４．４℃／秒のランプ速度により９５℃で３０秒間（データ取り込みなし）、２．２℃／秒のランプ速度により７２℃で１０分間（データ取り込みなし）、０．１１℃／秒のランプ速度で９５℃まで（連続データ取り込み）。ＤＮＡ試料をＣｏｒｂｅｔｔ  Ｒｏｔｏｒｇｅｎｅ  ＲＧ−６０００で３回繰り返して実行し、Ｒｏｔｏｒｇｅｎｅ６０００シリーズソフトウェア１．７を使って、各サンプルのＣｔ値を計算した。Ｃｔ値は、増幅曲線が検出の閾値と交差する時点でのサイクル数比率を意味する。閾値ラインを設定して試料曲線のそれぞれとの交点を計算することにより、各サンプルのＣｔ値が確定される。閾値ラインは実験の指数関数的相で設定され、ノイズを回避するためバックグラウンドレベルより著しく高く、後のサイクルにおけるシグナルのプラトーの開始より低い。一般に、Ｃｔ値は試料中のＤＮＡの量に反比例する。ΔＣｔは、異なる時間、例えば、試料収集後Ｔ＝０およびＴ＝１４日に同じ試料から採取された２つの一定分量から得られるＣｔ値の差異を表す。
【０１２６】
実施例１−糞便試料中のＤＮＡを安定化するための組成物中の異なるキレート化剤の比較
糞便中の膨大な量のヌクレアーゼ（大部分は細菌に由来する）のために、発明者らは、本組成物の開発中に、異なるキレート化剤、およびこれらの濃度に関して実験を行った。
【０１２７】
この実施例で記載される組成物は、２３．５％のエタノール、０．５％のＳＤＳ、および０．１％のＡｎｔｉｆｏａｍ  Ａ、ならびに様々な量のＥＤＴＡまたはＣＤＴＡを含み、５０ｍＭのβ−アラニンでｐＨ  １１に緩衝されていた。この実施例および以降の実施例において、エタノールおよびＡｎｔｉｆｏａｍ  Ａの百分率は（％ｖ／ｖ）であり、その他の成分（ＳＤＳ、トリクロサン）の百分率は、（％ｗ／ｖ）である。
【０１２８】
図２を参照すると、糞便が健康なドナーにより収集され、市販のキット（ＰｏｗｅｒＳｏｉｌまたはＰｏｗｅｒＦｅｃａｌ  ＤＮＡ単離キット）を使うＤＮＡ抽出の前に、４００ｍｇの試料が種々の安定化溶液中で均一化され、または安定化緩衝液の非存在下で（非安定化）１４日間、室温（ＲＴ、１９〜２３℃）で貯蔵された。Ｔ＝０およびＴ＝１４日での精製ＤＮＡの品質または一貫性を比較すると、アガロースゲルは明確に、未処理糞便中の高分子量ＤＮＡがＲＴで貯蔵中に著しく分解し（対照、アガロースゲルの最後の２つのレーン）、ゲル上にスメアを形成することを示す。同じドナーの糞便由来の試料（４００ｍｇ）は、１）増加量のＣＤＴＡ（１５０、３００、５００ｍＭ）を含む本組成物；および２）ＣＤＴＡがＥＤＴＡ（１５０、３００、５００ｍＭ）で置換された本組成物、中で同様に均一化された。
【０１２９】
意外にも、糞便試料を含む全ての試験濃度（１５０、３００、５００ｍＭ）で、新しく収集した試料（Ｔ＝０）および１４日のＲＴ暴露後の両方で、高分子量ＤＮＡの安定化に対し、ＣＤＴＡはＥＤＴＡより著しく良好な性能を示した（図２）。実際に、ＣＤＴＡではなく、ＥＤＴＡは、１５０ｍＭを超える濃度で高分子量ＤＮＡの安定化（および抽出）に対し期せずして有害であった。
【０１３０】
さらに、上の材料と方法セクションに記載されているように、より高い濃度（１５０、３００および５００ｍＭ）のＥＤＴＡおよびＣＤＴＡの比較（表４）は、細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲおよびアンプリコンのＤＧＧＥ分析により例示されるように、マイクロバイオームプロファイルを安定化することに関し、ＣＤＴＡがＥＤＴＡより優れているという驚くべき発見を裏付ける。ＲＴで１４および３０日後に、ＣＤＴＡを含む本組成物中で貯蔵された糞便試料由来のＤＮＡは、Ｔ＝０で処理された対照試料に対し高いパーセントの類似性を維持した。対照的に、ＥＤＴＡで置換された本組成物中で貯蔵された同じ糞便由来のＤＮＡのマイクロバイオームプロファイルは、対照試料（Ｔ＝０で処理された；表４）と比較して、ＲＴで経時的に非類似度の増加を示した。
【０１３１】
【表５】
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【０１３２】
したがって、ＣＤＴＡは意外にも、複雑で非均一な糞便中の、損なわれていない、高品質の高分子量ＤＮＡを安定化する能力およびマイクロバイオームプロファイルのスナップショットをとる能力に関して、ＥＤＴＡより優れていた。したがって、ＥＤＴＡより高い解離定数を有するＣＤＴＡなどのキレート化剤は、糞便試料などの生物試料中のＤＮＡの最良の安定化を提供し、本明細書で記載の組成物中で使用するために特に好ましい。試料収集時点で試料を安定化するこの能力は、研究室をまたぐ調査間および調査内で現在認められる大きい偏りを排除するのに役立つであろう。
【０１３３】
実施例２−本組成物中の糞便試料安定性におけるｐＨおよびキレート化剤の役割
細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲおよびアンプリコンのＤＧＧＥ分析により例示されるように、糞便試料混合、ｐＨ、およびキレート化剤濃度の間の複雑な関係を、マイクロバイオームプロファイル安定性に与える影響に関し調査した。
【０１３４】
４つの実験の最初に、健康なドナーが糞便を集め、４００ｍｇの糞便をそれぞれ単一の７．９ｍｍステンレス鋼ボールおよび２ｍＬの組成物「１０４Ｂ  ｐＨ９．５」（３００ｍＭのＣＤＴＡ、２３．５％のエタノール、０．５％のＳＤＳ、０．１％のＡｎｔｉｆｏａｍ  Ａ、ｐＨ９．５）または「１０４Ｂ  ｐＨ１１」（３００ｍＭのＣＤＴＡ、５０ｍＭのβ−アラニン、２３．５％のエタノール、０．５％のＳＤＳ、０．１％のＡｎｔｉｆｏａｍ  Ａ、ｐＨ１１）を含む４つのチューブ中に移した。チューブ中の試料は非撹拌のままにする（ミックスなし）か、または手振盪で均一化し（ミックス）、その後、周囲温度条件で研究室に戻した。試料収集後３〜４時間以内に、ＤＮＡ抽出のために２５０μＬの一定分量を各チューブから取り出し（Ｔ＝０）、その後３０℃で２４時間、続いて−２０℃で１１日間（Ｔ＝１１）貯蔵することにより試料にストレスを加えた。その後、第２の一定分量からＤＮＡ抽出を行った。精製ＤＮＡを定量化し、その後１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子ＰＣＲアンプリコンを分離するＤＧＧＥを使って細菌集団プロファイルとして、またはフィンガープリントとして、分解する。各組成物に関するＴ＝０での対照試料と比較して、試料（ＤＧＧＥゲルのレーン）間のパーセント類似度をＳｙｎｇｅｎｅ  ＧｅｎｅＴｏｏｌｓソフトウェア（材料と方法のセクション参照）を使って別々に計算した。
【０１３５】
図３は、本組成物のｐＨが９．５から１１に高められる場合に、「１１日目ミックスなし」試料と「０日目ミックス」試料との間の改善されたパーセント類似度またはマイクロバイオームプロファイル安定性を示し、ｐＨ１１がｐＨ９．５よりも付加的なＤＮＡ安定性を与えることを示す。また、本均一化手段の密なスチールボールを使ったチューブ中の「１１日目ミックス」試料は、両方のｐＨ値、特にｐＨ１１で、「１１日目ミックスなし」試料に比べて、一貫して改善されたマイクロバイオームプロファイル安定性をもたらした。
【０１３６】
第２の実験では、ｐＨとＣＤＴＡの濃度との間の関係が扱われた。健康なドナーの糞便由来の一定分量（４００ｍｇ）を、７．９ｍｍステンレス鋼金属ボールおよび２ｍＬの下記の３種の組成物の内の１種を含むチューブ中に移した：１）１０４Ｂ  ｐＨ９．５（上記の通り）；２）５０ｍＭのＣＤＴＡ、５０ｍＭのβ−アラニン、２３．５％のエタノール、０．５％のＳＤＳ、０．２％のトリクロサン、０．１％のＡｎｔｉｆｏａｍ  Ａ、ｐＨ１１．５；および３）５０ｍＭのＣＤＴＡ、２３．５％のエタノール、０．５％のＳＤＳ、０．２％のトリクロサン、０．１％のＡｎｔｉｆｏａｍ  Ａ、ｐＨ９．５。試料を手混合により均一化し、周囲温度条件下で研究室に戻し、そこで、Ｔ＝０の一定分量（２５０μＬ）を採取し、ＤＮＡを抽出した。試料の残りを室温で４日および１４日間貯蔵し、各時点で一定分量を取り出し、ＤＮＡを抽出した。
【０１３７】
アガロースゲル電気泳動は、ｐＨ９．５での３００ｍＭのＣＤＴＡ組成物（１０４Ｂ  ｐＨ９．５）が高分子量ＤＮＡを少なくとも１４日間安定化し、ｐＨ９．５またはｐＨ１１．５で、５０ｍＭのＣＤＴＡ組成物を含むその他の２種の組成物よりも、高分子量ＤＮＡを安定化する点で優れていたことを明らかにした（データは示さず）。しかし、損なわれていない高分子量ＤＮＡの存在が、マイクロバイオームのスナップショットが達成されたことを確実に示しているわけではない。効果的な安定化溶液が存在しない場合は、細菌種は、ＤＮＡの合計量ならびにその品質を変えることなく、複製できるか、または全滅する可能性がある。したがって、試料のマイクロバイオームプロファイルを、上記材料と方法セクションに記載のように、細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲおよびアンプリコンのＤＧＧＥ分析により調査した。
【０１３８】
図４および表５を参照すると、ＤＧＧＥ分析は、ｐＨ９．５での３００ｍＭのＣＤＴＡ組成物が、室温で少なくとも１４日間、マイクロバイオームプロファイルの優れた安定化（ｔ＝０対照に比べて、９４〜９６％の類似度）を示したことを明らかにした。ｐＨ９．５での３００ｍＭのＣＤＴＡ組成物の、マイクロバイオームプロファイルの安定化における有効性は、意外にも、ｐＨ９．５での５０ｍＭのＣＤＴＡ組成物の有効性（室温で１４日後にｔ＝０対照と比較してわずか１５％の類似度を示した）より優れていた。５０ｍＭのＣＤＴＡを含むｐＨ１１．５組成物は、５０ｍＭのＣＤＴＡを含むｐＨ９．５組成物で認められるマイクロバイオームプロファイル当たりのＤＮＡの大きな分解をいくらか「救う」ように思われる。
【０１３９】
したがって、高濃度のＣＤＴＡと大幅にアルカリ性のｐＨとの組み合わせが、糞便試料のマイクロバイオームプロファイルを安定化するために必要である。
【０１４０】
【表６】
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【０１４１】
第３の実験では、本組成物中のｐＨとＣＤＴＡの濃度との間の関係がさらに扱われた。健康なドナーの糞便由来の一定分量（４００ｍｇ）を、７．９ｍｍステンレス鋼金属ボールおよび２ｍＬの下記の２種の組成物の内の１種を含むチューブ中に移した：１）３００ｍＭのＣＤＴＡ、２３．５％のエタノール、０．５％のＳＤＳ、０．２％のトリクロサン、０．１％のＡｎｔｉｆｏａｍ  Ａ、ｐＨ９．５；および２）５０ｍＭのＣＤＴＡ、２３．５％のエタノール、０．５％のＳＤＳ、０．２％のトリクロサン、０．１％のＡｎｔｉｆｏａｍ  Ａ、ｐＨ７．４。試料を手混合により均一化し、周囲条件下で研究室に戻し、そこで、Ｔ＝０の一定分量（２５０μＬ）を採取し、ＤＮＡを抽出した。試料の残りを室温で４日間貯蔵した後、第２の一定分量を取り出し、処理した。
【０１４２】
アガロースゲル電気泳動は、ＲＴで４日間にわたり、ｐＨ９．５での３００ｍＭのＣＤＴＡ組成物が、ｐＨ７．４での５０ｍＭのＣＤＴＡ組成物よりも大きい程度に糞便中の損なわれていない高分子量ＤＮＡを安定化することを明らかにし、またＤＧＧＥ分析は、この組成物が糞便のマイクロバイオームプロファイルの安定化に対しても優れていることを示した（それぞれ、Ｔ＝０に対し９７％の類似度、Ｔ＝０に対し１０％の類似度−図５および表６参照）。ｐＨ７．４組成物で均一化された糞便のマイクロバイオームプロファイル安定性（ＲＴで４日後、Ｔ＝０に対し１０％の類似度）はまた、ｐＨ９．５での５０ｍＭのＣＤＴＡ組成物で均一化された糞便のマイクロバイオームプロファイル安定性（ＲＴで４日後、Ｔ＝０に対し９１％の類似度（上述の通り））よりもかなり低かった。
【０１４３】
【表７】
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【０１４４】
第４の実験では、本組成物中のｐＨと固定された高濃度のＣＤＴＡとの間の関係が扱われた。健康なドナーの糞便由来の一定分量（４００ｍｇ）を、７．９ｍｍステンレス鋼金属ボールおよび２ｍＬの下記の２種の組成物の内の１種を含むチューブ中に移した：１）３００ｍＭのＣＤＴＡ、２３．５％のエタノール、０．５％のＳＤＳ、０．２％のトリクロサン、０．１％のＡｎｔｉｆｏａｍ  Ａ、ｐＨ７．４；および２）３００ｍＭのＣＤＴＡ、２３．５％のエタノール、０．５％のＳＤＳ、０．２％のトリクロサン、０．１％のＡｎｔｉｆｏａｍ  Ａ、ｐＨ９．５。試料を手混合により均一化し、周囲条件下で研究室に戻し、そこで、Ｔ＝０、２４時間、および９日目の一定分量（２５０μＬ）を採取し、ＤＮＡを抽出した。
【０１４５】
アガロースゲル電気泳動は、高濃度（３００ｍＭ）のＣＤＴＡの存在下であっても、ｐＨ９．５での組成物と混合された糞便試料は、中性のｐＨに近い条件（ｐＨ７．４）での組成物と混合された糞便試料に比べて、高分子量ＤＮＡの安定化に対し優れていることを示した（図６参照）。
【０１４６】
実施例１で示された結果と共に、これらの実験は、室温貯蔵中に、損なわれていない高分子量ＤＮＡおよび安定なマイクロバイオームプロファイルを保存する最適条件は、組成物のｐＨが９．５以上、好ましくはｐＨ１０．５〜１１．５または約ｐＨ１１であり、ＣＤＴＡの濃度が５０ｍＭより大きい、好ましくは少なくとも約１５０ｍＭ、最も好ましくは約３００ｍＭである場合であることを示す。
【０１４７】
実施例３−ガラスビーズおよびステンレス鋼ビーズで混合後の糞便の安定化
健康なドナー由来の糞便の４００ｍｇの一定分量を、下記を含む４つのチューブ中に移した：１）２ｍＬの安定化溶液１０４Ｂ  ｐＨ９．５（上記の通り）および４個の４ｍｍガラスビーズ＋１０個の２ｍｍガラスビーズ；２）２ｍＬの安定化溶液１０４Ｂ  ｐＨ１１（上記の通り）および４個の４ｍｍガラスビーズ＋１０個の２ｍｍガラスビーズ；３）２ｍＬの安定化溶液１０４Ｂ  ｐＨ９．５および１個の６ｍｍステンレス鋼ボール；４）２ｍＬの安定化溶液１０４Ｂ  ｐＨ１１および１個の６ｍｍステンレス鋼ボール。全４つのチューブは、混合されるまで手でドナーにより振盪され、周囲条件下で研究室に戻された。試料収集の３〜４時間以内に、ＤＮＡを抽出、定量化し、それぞれの精製試料の８０ｎｇをアガロースゲルに供した（材料と方法のセクションおよび図７参照）。一定分量を取り出す前に、ガラスビーズ試料をボルテックスし、スチールボール含有試料を震盪した。
【０１４８】
この実施例は、室温で新しく収集された糞便中の損なわれていない高分子量ＤＮＡ（＞２３ｋｂ）を安定化するためのステンレス鋼ミキシングボールの使用の利点を実証する。アガロースゲル上の高分子量ＤＮＡの品質を比較した場合、ｐＨ９．５および１１の本組成物、および単一の高密度ステンレス鋼ボールを含む研究室チューブ中での糞便試料の混合（図７Ｂ）は、２種の寸法の複数の小さいガラスビーズを使った混合（図７Ａ）より優れていることが明らかになった。複数のガラスビーズおよび本組成物（１０４Ｂ  ｐＨ９．５）を含む糞便の手混合は、ステンレス鋼ボールを使った混合よりもかなり長い時間を要し、後者は損なわれていない高分子量ＤＮＡの保存の点で優れた結果を実証した。ガラスビーズで混合した試料中のＤＮＡの一貫性における改善は、意外にも、より高いアルカリ性（ｐＨ１１）の組成物を使った場合に観察され、これは、安定化溶液の混合／均一化手段およびｐＨの両方が重要であることを示唆する。
【０１４９】
実施例４−本組成物の容量耐性
糞便は不均一な生物試料で、消化器系、食事および総体的な健康の状態に応じて、外観または硬さが大きく変化する場合がある。便は通常は半固形で、粘液コーティングを有する。ブリストル便形状尺度またはチャートは、ヒト糞便の形態をタイプ１（堅果のようなバラバラの硬い塊）からタイプ７（９０％超が水で、固形物片がなく、完全に液状）までの７つのカテゴリーに分類するように設計された医用補助具である。一般に、糞便は、約７０〜８０％の水と、２０〜３０％の固形物から構成されるが、この割合は試料タイプ（１〜７）または糞便の腸内滞留時間に応じて変化する。糞便間の堅さおよび含水量のばらつきは、糞便収集および安定化溶液との一貫性のある完全な混合に関し、大きな課題を提起する。タイプ１〜３の試料は安定化溶液中に完全に分散させて均一液体を生成するのが特に困難であり、試料（したがってＤＮＡ）を希釈せずには下流の分析に至らない。また、タイプ１〜３の試料は、他の試料タイプより、ゆっくりと液体、すなわち、安定化溶液を吸収する傾向が大きく、濃厚で半固形の懸濁液になり、これは研究室でピペット操作をするのが困難な場合がある。タイプ４〜７の試料のより高い含水量およびより柔らかい粘稠度は、これらの試料の安定化溶液中でのより容易な混合およびピペット操作を可能にする。処置中に、糞便試料からのＤＮＡの抽出に使用される方法（または市販キット）によりばらつきが生じる場合もある。
【０１５０】
糞便の不均一性を考慮して、損なわれていない高分子量ＤＮＡを一貫して安定化する本組成物の堅牢さが、次の比率実験で対比された。２つの別の実験で、３人の健康なドナーが糞便試料（４００ｍｇ）を、７．９ｍｍステンレス鋼ボールおよび種々の容量の１０４Ｂ  ｐＨ１１安定化溶液（上記の通り）を含むチューブ中に採取し、次の糞便：安定化溶液の比率を得た−１：３、１：４、１：５、１：６、１：８および１：１０。注意：粗雑な器具を使って正確に４００ｍｇの糞便を繰り返し採取することは非常に困難であるので、「実際の比率」および目的の「比率」をゲル上に示す。チューブを試料収集の前後に秤量して、組成物の容量あたりの収集された糞便の正確な量を決定した。チューブを手で振盪し、室温にてＴ＝０（図８Ａ）、６日後（図８Ｂ）、７日後（図８Ｃ）、１４日後（図８Ｄ）、１ヶ月後（図８Ｅ）および２ヶ月後（図８Ｆ）に２５０μＬの一定分量を取り出した。場合によっては、２つの一定分量を抽出して反復実験の再現性を実証した（図８Ａ、Ｃ〜Ｆ）。ＤＮＡを抽出し、８０ｎｇを１％アガロースゲルに供した（図８Ａ〜Ｆ）。アスタリスク（＊）でマークしたレーンでは、一部の試料が精製後に１０ｎｇ／μＬ未満のＤＮＡ濃度であったという事実のために、８０ｎｇより少ないＤＮＡが加えられた。ＤＧＧＥゲル（図１０Ａおよび１０Ｂ）もこれらの実験で実施し、パーセント類似度を分析してこれらの試料中のマイクロバイオームプロファイルの安定性を判定した。
【０１５１】
この実施例は、広範囲の糞便：安定化溶液比率により、室温でＴ＝０〜少なくとも２ヶ月の貯蔵試料中で、損なわれていない高分子量ＤＮＡが得られたことを実証した（図８Ａ〜Ｆ）。わずか０．８ｍＬ〜５．４ｍＬほどの本組成物により、これらの条件下で少なくとも２ヶ月間、４００ｍｇの糞便中に含まれたＤＮＡおよびマイクロバイオームプロファイルが成功裏に安定化された（図８Ａ〜Ｆおよび１０Ａ〜Ｂ）。この広範な「作用」範囲は、研究者に、ドナーが非常に多様な量の糞便試料を固定容積の安定化溶液を含むチューブ中に移すことができ、さらに、試料は室温で少なくとも２ヶ月間安定であるという安心感を与える。ＤＧＧＥを使って分析された３回繰り返しの一定分量の試料（図９）は、同じ糞便検体から採取された一定分量間のマイクロバイオームプロファイルが非常によく一致する（９７％以上）ことを実証した。さらに、比率実験試料のＤＧＧＥゲル分析は、マイクロバイオームプロファイルが広範囲の糞便：本組成物の安定化溶液の比率（１：１．８〜１：１０．６）で、室温で長期間にわたり非常に安定化される（７日後で８８％以上；１４日後で９１％以上；２ヶ月後で７９％以上）ことを示した（図１０Ａおよび１０Ｂ）。
【０１５２】
したがって、糞便：安定化溶液の好ましい比率は約１：１〜１：２０、好ましくは１：１〜１：１０、より好ましくは１：３〜１：８、最も好ましくは、糞便：安定化溶液の比率は、約１：５である。
【０１５３】
本明細書で記載の組成物は、多数の糞便試料を収集する方法に関し研究者に大変革をもたらす。もはや研究者は、コストおよびドライアイス上の試料輸送の物流管理または何ヶ月もの間の数百〜数千の糞便試料のフリーザー中での貯蔵の理由から調査を制限する必要はない。本組成物を含むチューブ中に収集された試料は、周囲温度でクッション封筒に入れて輸送し、研究者の都合でバッチ処理するために研究室で室温にて貯蔵できる。
【０１５４】
実施例５−本組成物中および極端な温度下での試料の安定化
本明細書で記載の各種組成物は、「周囲」温度で、健康なヒトドナーの糞便中の高分子量ＤＮＡおよびマイクロバイオームプロファイルを効果的に、速やかに安定化する。上述のように、「周囲」は、生物試料の収集、輸送、貯蔵および処理中に観察される代表的な暴露温度を意味する。生物試料が世界中のどこで収集／輸送／貯蔵されるかに応じて、温度は、容易に、時には短時間で、−２０℃〜５０℃の範囲になる場合がある。未処理の生物試料は、これらの温度を超えると、特に高温で、分解することは、当該技術分野において公知である。収集した試料中のＤＮＡを可能な限りインビボに近い状態で維持するための、すなわち、糞便試料中のヒトＤＮＡなどの、既存の損なわれていない高分子量ＤＮＡの分解を防ぐ、および／または部分的に分解した核酸のさらなる分解を防ぐための、さらには糞便試料のマイクロバイオームプロファイルを安定化するための、頑強で普遍的な生物試料安定化溶液が必要とされている。
【０１５５】
【表８】
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【０１５６】
発明者らにより開発された６種のＤＮＡ安定化組成物（表７）の性能を、複雑で不均一な様々な糞便試料を用い、例えば、−２０℃、室温（通常、１９〜２３℃）、３７℃、および５０℃の広範囲の周囲温度について試験して比較した。第１の実験では、２人の健康なドナーがそれぞれ４００ｍｇの糞便を、２ｍＬの異なる組成物（表７）および１個の７．９ｍｍのステンレス鋼ボールを含む６つのチューブ中に移した。チューブを手で振盪して糞便試料を均質化し、一定分量（２５０μＬ）をＤＮＡ抽出（Ｔ＝０）用に直ちに取り出した後、チューブを３７℃で７日間および２１日間貯蔵した。
【０１５７】
図１１Ａおよび１１Ｂは、試験した全ての組成物が、糞便試料が３７℃で貯蔵された場合に、損なわれていない高分子量ＤＮＡを少なくとも３週間安定化したことを示す。３７℃で２１日後、ＣＢＳ、ＣＢＳＡ１、およびＣＢＳＡ２組成物中に貯蔵された便試料から回収されたＤＮＡの濃度は、その他の組成物中の試料より低く、ドナーＡおよびＢについてアガロースゲル上で弱いバンドを生じた（図１１Ａおよび１１Ｂ）。意外にも、ＤＧＧＥ分析（図１２Ａおよび１２Ｂ）は、これらの試料中のマイクロバイオームプロファイルが、大腸菌の最適増殖温度である３７℃で最初の週の間は、同様に安定であり、２１日の時点の前に変化が始まったことを示した。ｐＨ１１に緩衝された３００ｍＭのＣＤＴＡに加えて、エタノールが、高分子量ＤＮＡおよびマイクロバイオームプロファイルの両方の安定化または回復に対し有益であるように見えた。
【０１５８】
第２の実験では、３人の健康なドナーがそれぞれ４００ｍｇの糞便を、２ｍＬの１０４Ｂおよび１個の７．９ｍｍのステンレス鋼ボールを含む３つのチューブ中に移した。チューブを手で振盪し、糞便試料を均質化し、一定分量（２５０μＬ）をＤＮＡ抽出（Ｔ＝０）用に直ちに取り出した後、チューブを５０℃で３日間と５日間、室温で１ヶ月間、および−２０℃で１ヶ月間、貯蔵した（図１３Ａ〜Ｅ）。図１３Ａ〜Ｅは、１０４Ｂが高分子量ＤＮＡを５０℃で５日間（図１３Ｂ〜Ｃ）、室温で１ヶ月間（図１３Ｄ）、および−２０℃で１ヶ月間、安定化したことを示す（図１３Ｅ）。それぞれのドナーにより収集された３回の繰り返し糞便試料は全て、試験温度または試験期間に関係なく、損なわれていない高分子量ＤＮＡを含んでいた。
【０１５９】
第３の実験では、３人の健康なドナーがそれぞれ４００ｍｇの糞便を３つのチューブ中に移した。２つのチューブは、２ｍＬの１０４ＢおよびＣＢＥ（表７）ならびに１個の７．９ｍｍのステンレス鋼ボールをそれぞれ含んだ；第３のチューブは空（なし）とした。安定化溶液を含むチューブを手で振盪して糞便試料を均一化し、一定分量（２５０μＬまたは２５０ｍｇ）をＤＮＡ抽出（Ｔ＝０）用にそれぞれのチューブから直ちに取り出した後、チューブを５０℃で５日間および１４日間、または−２０℃で１１日間貯蔵した（図１４Ａ〜Ｄ）。図１４Ａ〜Ｃは、１０４ＢおよびＣＢＥの両方が、損なわれていない高分子量ＤＮＡを、少なくとも５０℃で２週間維持し、一方、対照（なし）試料は時間と共に分解の兆候を示した。意外にも、ＤＧＧＥ分析（図１５Ａおよび１５Ｂ）は、これらの試料中のマイクロバイオームプロファイルが、ＤＮＡのような生体分子にとって極端な温度である５０℃で２週間、同様に安定であったことを示した。興味深いことに、パーセント類似度は、５０℃で５日間貯蔵した試料でより高く、１４日間ではそうではなく、このような極端な温度への長期の曝露がＤＮＡそれ自体のある程度の化学的不安定性に繋がることを示している。
【０１６０】
図１４Ｄは、１０４ＢおよびＣＢＥの両方が−２０℃で凍結された（およびその後に解凍された）試料中の高分子量ＤＮＡを少なくとも１１日間維持したことを示す。しかし、安定化溶液の非存在下では、−２０℃で、糞便はＤＮＡ分解の特徴的兆候を示した。ドナーＡ（なし）試料では、大部分の高分子量ＤＮＡが分解され、アガロースゲル上ではスメアとして現れた。対照的に、ドナーＢおよびＣ試料では、少量の高分子量ＤＮＡがまだ検出でき、ドナーのばらつきを示している。安定化溶液を含まない試料のＤＧＧＥ分析により、マイクロバイオームプロファイルは−２０℃で安定ではなく、対照Ｔ＝０に対する％類似度はドナーＡおよびＣについてそれぞれ５２および６９％であったことが確認された。対照的に、対照（なし）に対する高％類似度から示されるように（図１６Ａおよび１６Ｂ）、−２０℃にて１１日間１０４ＢおよびＣＢＥ中でマイクロバイオームプロファイルは安定であった。
【０１６１】
まとめると、これらの実施例は、１０４ＢおよびＣＢＥの両方が、極端な温度で長期間貯蔵された糞便試料中のＤＮＡを安定化することを示す。
【０１６２】
実施例６−本組成物中でインキュベートされた糞便試料の凍結／解凍サイクルに伴う安定性
上記で考察したように、マイクロバイオームプロファイルは、貯蔵または預ける目的のために糞便がただ１回の凍結および解凍に暴露されると、変化することが当該技術分野において公知である。この分解は、０℃以下で輸送されおよび／または貯蔵されるすべての収集試料に無用の片寄りを付加する。この実施例では、糞便が３人の健康なドナーから収集され、４００ｍｇの試料が空のチューブおよびガラスビーズ（４個の４ｍｍおよび１０個の２ｍｍビーズ）と共に２ｍＬの本組成物（「１０４Ｂ  ｐＨ９．５」；上記で定義の通り）を含むチューブに移された。安定化溶液およびガラスビーズを含むチューブは、完全に混合されるまで激しくボルテックスされた。０日目のＤＮＡ抽出用の２５０ｍｇまたは２５０μＬの一定分量の取り出し後、試料チューブを−２０℃のフリーザーに貯蔵し、１０日間にわたり、フリーザーと室温との間で、各温度で２４時間保持して、５サイクル循環させた。試料チューブを、産業における標準的方法の、５０℃で３時間かけて解凍した。
【０１６３】
０日目の一定分量のアガロースゲル分析は、本組成物中に採取した場合、それぞれのドナーの糞便が高分子量ＤＮＡを含んでいたことを示す（図１７）。意外にも、凍結／解凍（Ｆ／Ｔ）の５サイクル後、ＤＮＡは損なわれないままであった（図１７）。ＤＧＧＥ分析により、本組成物中の試料のマイクロバイオームプロファイルは、５回のＦ／Ｔサイクル後に、９４％の類似度で安定なままであることが確認された（図１８）。全く対照的に、非保護試料はマイクロバイオームプロファイルのかなりの劣化を示した。ただ１回のＦ／Ｔサイクル後に、プロファイルは、−２０℃暴露前の、０日目の「新しく収集された試料」のプロファイルに対し、ほんの５２％の類似であった。したがって、本組成物は、凍結および解凍の複数回のサイクルで、損なわれていない高分子量ＤＮＡを保存するだけでなく、マイクロバイオームプロファイルも安定化し、これらの貯蔵条件に関連する片寄りを劇的に低減させる。
【０１６４】
実施例７−本組成物中の収集された糞便試料の均一化
上述のように、発明者らは、全てのタイプの糞便試料（ブリストル便形状尺度、１〜７）を完全に確実に均一化するために、標準的な市販の１０ｍＬの研究用チューブおよび／または輸送用チューブ（９２ｍｍｘ１５．３ｍｍ、内径約１２．９ｍｍ）で使えると思われる多くの異なった材料で実験した。混合は、ドナーが同意し、一貫して安定化した生物試料を提供することを保証するために、手で、比較的短い時間で（１８０秒以内）行うべきであると判断した。当業者なら、本実施例（詳細な説明を参照）で使われるものより大きいまたは小さい容器に対して適切な均一化手段を選択する方法を理解するであろう。
【０１６５】
標準的な使い捨ての３ｍＬシリンジを、小さい容量の糞便を収集して本組成物（「１０４Ｂ  ｐＨ１１」；上記定義の通り）および均一化手段を含む上記採集チューブに移すように改造した。シリンジのニードル用のテーパー付き先端部または取り付け具を切り離し、均一な直径の外筒を露出させた。プランジャーを、糞便を含む容器中へ押し込んだ際に、一貫性のある量の糞便、例えば、４００ｍｇの収集を容易にする位置に予備セットした。試料収集中にシリンジ外筒の空気を逃がすための小さいベント孔を、シリンジの外筒に開けた。加えられる試料を含むシリンジをチューブの開口部に移し、プランジャーを押し下げて、２ｍＬの安定化溶液および均一化手段（例えば、以下で特定される均一化ボール）を含むチューブ中に４００ｍｇの試料を入れた。チューブをキャッピングし、手で、約２０〜４０秒、硬いタイプ１試料に対しては、さらに長く（１〜３分）震盪した。均一化手段の存在下で、試料を前後の動きで激しく震盪後、糞便試料は安定化溶液中に分散された。
【０１６６】
選択された容器が研究用または輸送用チューブ／バイアルの場合は、本組成物中の不均一で複雑な試料の完全な分散のために、適切な寸法、形状および密度の均一化「ボール」または「球」が重要である。損なわれていない高分子量ＤＮＡの存在から明らかなように、収集の時点での収集試料の完全な均一化もヒトおよび微生物ＤＮＡの最適安定化のために重要であり、ならびに細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲおよびアンプリコンのＤＧＧＥ分析により例示されるように、マイクロバイオームプロファイルの安定化のために重要である。上述のように、球状の均一化手段に関しては、固形物がチューブの内側のデッドスペース中に圧密化されるのを防止するために、輸送用チューブ／バイアルの底部も、均一化手段の形を反映した円形であるべきである。例えば、球状の均一化手段を用いる糞便試料（特にタイプ１〜３）の最適な均一化は、円錐形または平底チューブを用いて行うのは非常に困難である。球状の均一化手段が、垂直チューブ壁が底面と交差する円錐面とも、９０度の角度とも直接接触できず、これらのデッドスペース／領域中での糞便物質の圧密化を引き起こす。
【０１６７】
次表８〜１０は、標準的研究用／輸送用チューブ（例えば、カタログ番号６０．６１０、Ｓａｒｓｔｅｄｔ）に関して最適均一化手段を見つけるために発明者らが試験したいくつかの異なる市販の材料を例示している。
【０１６８】
【表９】
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【０１６９】
【表１０】
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【０１７０】
【表１１】
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【０１７１】
試料タイプ１および２の糞便は、非常に密で、ほとんど水を含まず、均一化手段なしに、それらを適度な時間内に（３分未満）本組成物中に手で分散させるのを困難にしている。より柔らかい糞便（タイプ３〜６）に対して、均一化手段はまだ必要であり、手によるチューブの混合時間は、試料タイプの増加に伴い大きく短縮される（表８〜１０）。タイプ７または下痢の試料を本組成物と共に分散するために、均一化手段は必須ではない。これに関して、「ホモジナイザー」の目的は、電気または電池を使用することなく、不均一な固形または半固形試料を安定化溶液全体を通して完全に破壊し、分散することであった。
【０１７２】
均一化手段の重要な特徴には、１）材料の密度、２）生物試料用の容器の内径に関する寸法、および３）容器に関する形状、が含まれる。ガラス（約２．４〜４．５ｇ／ｃｍ３）／ポリ（メチルメタクリレート）またはＰＭＭＡ（約１．２ｇ／ｃｍ３）／シリカ（約１．６〜２．０ｇ／ｃｍ３）／ジルコニア（約６．０２ｇ／ｃｍ３）／セルロースアセテート（約１．３ｇ／ｃｍ３）／ポリエチレン（約０．９〜１．３ｇ／ｃｍ３）粒子（１．２ｍｍ未満）および小さいビーズ（４ｍｍ以下）は、内径１２．９ｍｍの標準的研究用チューブ中のタイプ１〜４糞便に対するホモジナイザーとして機能させるには、十分な寸法でも、密度でもなかった（表８）。重要なことに、アルミナ（３．９５ｇ／ｃｍ３）から作製された大きな７．９ｍｍボールまたは７．１〜７．９ｍｍシリコンナイトライド（３．２１ｇ／ｃｍ３）および１２．７ｍｍガラス大理石でも、１８０秒未満の時間内に２ｍＬの本組成物中にタイプ１〜３糞便試料（４００ｍｇ）を分散させることができなかった（表８）。意外にも、１８０秒のチューブの振盪後にも、固形物質が本組成物中にそのままで残された。これらの実験結果は、より密度の高い材料、すなわち、３．９５ｇ／ｃｍ３を超える密度の材料の試験につながる。残念なことに、３．９５ｇ／ｃｍ３〜７．６ｇ／ｃｍ３の間の密度のボールは市販されておらず、したがって、糞便試料で試験できなかった。
【０１７３】
次に、ステンレス鋼（７．６〜７．９ｇ／ｃｍ３、表９および１０）およびタングステンカーバイトボール（１５．６３ｇ／ｃｍ３、表８）を、丸底チューブ内の２ｍＬの本組成物中の４００ｍｇ糞便試料で試験した。意外にも、硬い堅果様タイプ１糞便試料でも、７．１〜７．９ｍｍタングステンカーバイドおよび７．１〜８．７ｍｍステンレス鋼ボールにより、それぞれ、１４０秒以下および１８０秒以下で均一化された。タイプ２試料は、７．１〜７．９ｍｍタングステンカーバイドおよび７．１〜８．７ｍｍステンレス鋼ボールにより、それぞれ、４０秒以下および８０秒以下で均一化された。タングステンカーバイド（７．１〜７．９ｍｍ）およびステンレス鋼ボール（７．１〜８．７ｍｍ）は、それぞれ、タイプ３試料を３０秒以下および８０秒以下、タイプ４試料を１５秒以下および５５秒以下、タイプ５試料を１５秒以下および５０秒、およびタイプ６試料を１０秒以下および２２秒以下で均一化した。
【０１７４】
同様に、７．９ｇ／ｃｍ３〜１５．６３ｇ／ｃｍ３の間の密度のボールは、入手または試験できなかった；しかし、当業者なら、７．１〜８．７ｍｍの寸法範囲のこのような均一化手段が、１８０秒未満の時間で糞便試料を確実に破壊することを予測するであろう。単にコストと入手しやすさのために、ステンレス鋼ボールがタングステンカーバイトボールより好ましく、最適直径は７．１〜８．７ｍｍであった。同じ寸法の第２のボールの追加は通常、混合時間の短縮に有益であることが分かった（表８および９）。場合によっては、２つ以上の寸法のボールの組み合わせが、糞便試料の均一化に必要な時間の短縮に有益であった（表１０）。
【０１７５】
７．１〜８．７ｍｍボールが１２．９ｍｍ内径のチューブで最良の性能であったことを考慮すると、ボールの両側の約２．１〜２．９ｍｍのすきまが、チューブ中で短時間に試料を均一化するのに最適な適合を与えた。ステンレス鋼ボールが５．６ｍｍ以下または９．５ｍｍ以上の直径であった場合、硬いタイプ（１〜４）の糞便試料の混合時間が増加した。したがって、固形から液体までの粘稠度の範囲の糞便試料に関するこれらの結果を考慮して、本明細書で記載の実施例では、特に指示がない限り、均一化手段として７．９ｍｍステンレス鋼ボールが好ましく採用された。
【０１７６】
実施例８−本組成物を用いる腸微生物叢プロファイルの安定化
腸微生物叢の分析は、ヒトの健康における微生物の有益なおよび有害な役割を調査する研究者にとって関心が高くなりつつある。腸微生物叢の何らかの分析のためには、インビボ状態を表す微生物叢プロファイルの「スナップショット」を正確に捕らえること（すなわち、操作的分類単位［ＯＴＵ］の相対的存在量が収集時間から試料処理および分析の時間まで、変化しないでいることを保証すること）が必須であり、したがって、収集の時点での試料の安定化はこのような調査にとって最も重要である。便試料収集および微生物叢分析の現在の方法は、周囲温度、４℃または凍結での試料の輸送を伴う。しかし、これらの方法は、マイクロバイオーム安定化と相いれない温度に試料を暴露する可能性があり、また、便検体の凍結はバクテロイデス属に対するファーミキューテス門の比率を変えることが以前に示されている（Ｂａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３２９：１９３−１９７）。
【０１７７】
この実施例では、高感度で市販の利用可能な方法である、Ｖ４超可変領域の１６Ｓ  ｒＲＮＡシーケンシングを使って、マイクロバイオームの安定性が評価された。この調査のために、４人のドナーがそれぞれ１つの便検体を収集し、等量の試料（４００ｍｇ）および１個の７．９ｍｍステンレス鋼ミキシングボールを、安定化溶液を含まない３つのチューブおよび安定化溶液（３００ｍＭのＣＤＴＡ、０．５％のＳＤＳ、２３．５％のエタノール、０．１％のＡｎｔｉｆｏａｍ  Ａ、０．２％のトリクロサン、ｐＨ９．５）を含む６つのチューブに入れた。ドナーは試料を周囲温度で研究室に輸送し、そこで、Ｔ＝０の一定分量（２５０μＬまたは２５０ｍｇ）を取り出し、ＰｏｗｅｒＦｅｃａｌ（商標）ＤＮＡ単離キット（ＭｏＢｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使ってＤＮＡを抽出した。１人のドナー当たり、および１つの安定化条件あたり１つの試料を、それぞれの試験温度（−２０℃、４℃、２３℃、３７℃−安定化溶液中のみ）で３日間および１４日間貯蔵し、続けて、ＤＮＡ抽出を行った。安定化溶液中の１つの試料を５回の凍結−解凍サイクルに暴露した。
【０１７８】
示された時点で、一定分量からＤＮＡを抽出し、１６Ｓ  ｒＲＮＡシーケンシングライブラリー調製、シーケンシングおよびバイオインフォマティクス解析のために発送した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＭｉＳｅｑ（登録商標）（２５０サイクル）を使って、Ｖ４超可変領域ペアードエンドアンプリコンシーケンシングを行った。
【０１７９】
図１９および２０は、安定化溶液中で完全に保存された試料はＯＴＵ存在量において高程度の類似度を有することを示すデータである。
【０１８０】
図１９では、重み付きＵｎｉｆｒａｃ非類似度値に基づく主座標分析（ＰＣｏＡ）により、２人のドナー（ＢおよびＤ）において、ＰＣｏＡプロット（安定化緩衝液中で貯蔵された試料は、１桁目が４〜９の識別番行、例えば、Ｄ４およびＢ４を有し、それぞれのドナーに対し、「安定化剤含有」円にグループ化される）上のタイトなクラスタリングにより示されるように、種々の温度（−２０℃、４℃、周囲温度、３７℃）および時間（３日間および１４日間）にわたり安定化溶液中に保存された試料が、高レベルのＯＴＵ存在量の類似度を示すことが実証される。対照的に、安定化溶液なしで貯蔵された試料（１桁目が０〜３の識別番行、例えば、Ｄ３−１およびＢ３−１を有し、それぞれのドナーに対し、「安定化剤なし」円にグループ化される試料）は、試料間のより大きな距離により示されるように、ＯＴＵ存在量の類似性の低下を示した。重要なことに、ＯＴＵの存在または非存在を評価する際に、全４人のドナーの安定化試料と安定化溶液を含まない試料との間で統計的有意差が存在（それぞれｐ＝０．００２、０．００２、０．００２および０．００９、Ｕｎｉｆｒａｃ測定）した。−２０℃で貯蔵された安定化溶液不含の試料（ＰＣｏＡプロット上の試料Ｂ２−１、Ｂ２−２、Ｄ２−１およびＤ２−２）において最大のプロファイル変化が観察され、これは、−２０℃で安定化溶液中に貯蔵された試料と有意に異なっていた（ｐ＝０．０２８、重み付きＵｎｉｆｒａｃ測定）；そのため、新規安定化溶液中の試料の貯蔵は、非安定化凍結試料で観察される微生物のプロファイルの変化を防ぐことができることを示している（図１９）。
【０１８１】
図２０では、ファミリーレベルでの相対的存在量により、本安定化溶液を含まずに貯蔵された試料の組成物中の、種々の温度での経時的な（３日間および１４日間）変化が示される。特に、安定化溶液不含のドナーＤの試料において、ベースラインに比較して、ラクノスピラ科、ルミノコッカス科およびプレボテラ科の増加、およびバクテロイデス科の低下が観察される。対照的に、安定化溶液で種々の温度および時間にわたり貯蔵された試料は、ベースライン試料に比べて、試料の微生物の組成を維持した。
【０１８２】
このデータは、目的の表現型に対し腸微生物叢における変化を確実に相関させるためには、収集の時点でプロファイルを安定化する再現可能な方法、現在の温度ベースの安定化方法では効果的に実現できない何かを持つことが重要である。ここで実証した安定化化学は、種々の輸送温度で腸微生物叢のインビボプロファイル（すなわち、ＯＴＵのタイトなクラスタリング）を維持する能力を有し、研究者がデータの信頼性および調査間比較を改善することを可能にする。安定化化学はまた、管理されない自己収集の容易さを高め、現状では物流的に困難な大きな集団調査を特に可能にするであろう。
【０１８３】
実施例９−本組成物中のヒトＤＮＡの安定化
糞便試料収集、ＤＮＡの抽出および定量化ならびにヒトＤＮＡの増幅のさらなる詳細に関しては、材料と方法セクションを参照されたい。
【０１８４】
３人の健康なドナーは、糞便試料を自宅で収集するための説明書および用具を与えられた。便器に取り付けられた大きな容器に排便後、約４００ｍｇの糞便を直ちに、本組成物（「１０４Ｂ  ｐＨ１１」；上記で定義）および１個の７．９ｍｍステンレス鋼ボールを含む１０ｍＬの丸底チューブに移した。チューブをキャッピング後、ドナーは密閉したチューブを約２０秒間震盪して組成物中の試料を均一化した。通常、ドナーは収集の３〜４時間以内に、均一化された試料を研究室に周囲温度で戻した。研究室では、Ｔ＝０（２５０μＬ）を各チューブから取り出し、残りを室温（ＲＴ）で１４日間貯蔵し、その時点で第２の一定分量（２５０μＬ）を取り出した。
【０１８５】
ＰｏｗｅｒＦｅｃａｌ（登録商標）ＤＮＡ単離キットを使って各一定分量からＤＮＡを精製した；ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）蛍光染料および蛍光測定法を使ってＤＮＡ収量を定量した（材料と方法のセクションを参照）。Ｔ＝０およびＴ＝１４日目糞便試料から精製したヒトＤＮＡを、単一コピーヒトチミジル酸合成酵素遺伝子を標的にしたプライマーを用いるリアルタイムまたは定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）で増幅した。Ｃｔ値の変化（ΔＣｔ）、すなわち、同じ試料由来のＴ＝０およびＴ＝１４日目の精製された一定分量から得た３回繰り返したＣｔ値の差を下表１１に示す。各ドナーに対し、Ｔ＝０およびＴ＝１４日目での精製された試料中で検出されたヒトＤＮＡの量は同等である。直ちに処理された糞便試料またはＲＴで２週間貯蔵された糞便試料由来のＤＮＡの差は１サイクル未満であるので、この実施例は、全３人のドナーについて、ヒトＤＮＡが本組成物中で安定であることを実証している。
【０１８６】
【表１３】
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【０１８７】
実施例１０−本組成物は室温で１４日間、および模擬輸送条件下でマイクロバイオームプロファイルを安定化する
本組成物は、腸マイクロバイオームプロファイリングのための、簡単な自己収集および糞便由来の微生物ＤＮＡの安定化を可能にする。本組成物は、収集の時点での微生物プロファイルのスナップショットを独特の方法で捕らえ、それを室温で１４日間維持できる。
【０１８８】
この実施例では、６人の健康なドナーが糞便試料を自宅で収集するための説明書および用具を与えられた。便器に取り付けられた大きな容器に排便後、約４００ｍｇの糞便を直ちに、本組成物（「１０４Ｂ  ｐＨ１１」；上記で定義）および１個の７．９ｍｍステンレス鋼ボールを含む１０ｍＬの丸底チューブに移した。チューブをキャッピング後、ドナーは密閉したチューブを約２０秒間震盪して組成物中の試料を均一化した。６人のドナーはそれぞれ、同じバルク糞便試料（合計でｎ＝１８）から本組成物中に３種の試料を収集した。さらに、４００ｍｇの分取量の新しい糞便を同じバルク糞便試料から各ドナーにより収集し、ヒトマイクロバイオームプロジェクトの標準的な手順（手順マニュアル−ヒトマイクロバイオームプロジェクト、２０１０）に従って、凍結コールドパックを備えた発泡スチロールの箱中の空の１０ｍＬチューブに移した。
【０１８９】
ベースラインＤＮＡ抽出を収集の３時間以内に行った。ベースライン分析として、０．２５ｍＬの一定分量を１０４Ｂ  ｐＨ１１試料から採取し、ＰｏｗｅｒＦｅｃａｌ（登録商標））ＤＮＡ単離キット（ＭＯ  ＢＩＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使って抽出した。各０．２５ｍＬの試料は、約５０ｍｇの糞便および２００μＬの安定化液、１０４Ｂ  ｐＨ１１を含んだ。等量の糞便（約５０ｍｇ）を新しい非安定化試料から抽出した。残りの１０４Ｂ  ｐＨ１１試料および新しい非安定化試料を一定分量採取し、室温（２３±３℃）で１４日間貯蔵するか、または模擬輸送条件（５０℃で１日、３７℃で３日間または凍結−解凍を３サイクル、ここで１サイクルは−２０℃で最小限３時間および３０℃で最小限３時間から構成される）に晒した。さらに、各ドナー由来の一定分量の新しい便を対照として−８０℃で貯蔵した。室温、模擬輸送条件または−８０℃で１４日間保持後、ＰｏｗｅｒＦｅｃａｌ  ＤＮＡ単離キットを使って、第２の一定分量を全試料から抽出した。
【０１９０】
ＤＮＡ濃度および収量をＱｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使って測定した。約５０ｎｇの精製ＤＮＡを０．８％アガロースゲルで泳動し臭化エチジウムで染色することにより、ＤＮＡの経時的な一貫性および安定性を評価した。Ｌａｍｂｄａ  Ｈｉｎｄ  ＩＩＩラダーを使って、精製ＤＮＡのサイズを決定した。
【０１９１】
ＭｅｔａｎｏｍｅのＭｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅにより、１６Ｓ  ｒＲＮＡシーケンシングライブラリー調製、シーケンシングおよびバイオインフォマティクス解析を行った。Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＭｉＳｅｑ（登録商標）を使って、Ｖ４超可変領域ペアードエンドアンプリコンシーケンシングを行った。ＱＩＩＭＥおよびカスタムスクリプトを使って、配列のクオリティフィルタリングを行った。ペアードエンドリードをアセンブルし、ＵＣＬＵＳＴにより９６％でクラスター化されたＧｒｅｅｎｇｅｎｅｓリファレンスデータベースと比較した。データ正規化後、操作的分類単位（ＯＴＵ）存在量データの加重付きＵｎｉｆｒａｃを使って（差異の合計を全ての存在量の合計で除算することによるペアワイズ正規化を用いて、試料間の分類群存在量差異を利用する）試料間距離を測定した。差異の合計を全検出ＯＴＵ存在量の合計で除算することによるペアワイズ正規化を使ってＢｒａｙ−Ｃｕｒｔｉｓ距離を測定した。全てのＢｒａｙ−Ｃｕｒｔｉｓ測定で、収集直後に抽出された新しい試料と一致したドナーがペアワイズ比較の片側として使用された。ＯＴＵの合計数に対する各ＯＴＵの比率を測定し、その後この比率の自然対数を乗じることにより、各安定化方法に対するシャノン指数（ＳＩ）の分析を行った。全ＯＴＵにわたり得られた積の合計により、各サンプルについてのＳＩが得られた。試料収集方法がマン・ホイットニー検定を用いて比較された。
【０１９２】
結果
本組成物はマイクロバイオームプロファイルの収集時点の中立性を維持する
マイクロバイオームの調査には、生成されたプロファイルがドナー中に存在するインビボ微生物細菌集団を表すことが必要である。したがって、収集および安定化方法がマイクロバイオームに変化を持ち込むべきではない。化学的安定化緩衝液の使用は、一部の微生物の増殖を加速し、同時にその他の微生物を崩壊させることにより、試料中の微生物の組成を変える可能性がある。理想的な条件では、安定化液は中立であるべきである（すなわち、マイクロバイオームに対しどのような偏りも与えるべきではない）。新しいおよび１０４Ｂ  ｐＨ１１安定化ｔ＝０試料由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡマイクロバイオームプロファイルの比較は、本組成物が中立のプロファイルを維持し、偏りを与えないことを示した（図２１）。
【０１９３】
異なる統計的方法（例えば、重み付きＵｎｉｆｒａｃ）による相対的ＯＴＵ存在量の調査は、微生物群の価値のある説明を提供する。しかし、それは、低存在量の微生物の寄与を最小化することにより、微生物群の理解を不明確にする場合がある。適切なマイクロバイオームプロファイルの調査は、微生物細菌集団の「豊富さ」の保存を必要とする。豊富さは、試料中に存在する微生物種（ＯＴＵ）の計数として定義され、温度、ｐＨ、酸素濃度および化学的組成などの環境条件に極めて影響を受けやすい。これらおよびその他の因子が細菌増殖または崩壊を誘発し、それにより、試料中に検出されるＯＴＵの数を変えることがある。
【０１９４】
６人のドナー由来の新しいおよび１０４Ｂ  ｐＨ１１安定化試料を、収集の直後に抽出した。１０４Ｂ  ｐＨ１１試料で特定された微生物ＯＴＵを、対応する新しい試料中に存在するＯＴＵと比較した。ＯＴＵ存在量データを存在／非存在コールに変換することにより、多様性を示すシャノン指数（ＳＩ）を計算した。ＳＩ値に対するマン・ホイットニー検定は、１０４Ｂ  ｐＨ１１試料とあたらしい試料との間で有意差を示さず、１０４Ｂ  ｐＨ１１が試料の豊富さに影響を与えなかったことを示す（図２２）。
【０１９５】
試料収集における変動性の発生源
Ｂｒａｙ−Ｃｕｒｔｉｓ分析は、新しい試料および１０４Ｂ  ｐＨ１１  ｔ＝０試料反復実験内で系統的非類似度を示した。このような非類似度の発生源を理解するために、糞便試料の収集および処理中に導入される変動性を評価した。生物学的変動性は、同じバルク試料内の異なる部位から収集された３種の新しい試料および３種の１０４Ｂ  ｐＨ１１試料由来のマイクロバイオームプロファイルを生成することにより評価した。技術的変動性は、１０４Ｂ  ｐＨ１１収集試料を使うことにより対処された。理由は、この収集システムは、均一化された液体試料を提供し、処理中の実験誤差が低減されているためである。同じチューブ由来の反復ＤＮＡ抽出（抽出変動性）および同じＤＮＡ由来の反復ＰＣＲ／シーケンシング（ＤＮＡシーケンシング変動性）のプロファイルを比較した。反復グループ内でＢｒａｙ  Ｃｕｒｔｉｓの非類似度距離を生成し、図２３に示す。
【０１９６】
新しいおよび１０４Ｂ  ｐＨ１１収集試料の生物学的反復実験において、類似の変動性が観察された（それぞれ、Ｂｒａｙ−Ｃｕｒｔｉｓ距離０．１４±０．０１および０．１１±０．０１）。分析により、技術的および生物学的変動性は、１６Ｓ  ｒＲＮＡマイクロバイオームプロファイルにいくらかの非類似度を与える（Ｂｒａｙ−Ｃｕｒｔｉｓ距離の生物学的変動性０．１１；抽出変動性０．０９およびシーケンシング変動性０．０８）ことが示された。結論として、観察された非類似度の発生源は、技術的または生物学的変動性により説明でき、１０４Ｂ  ｐＨ１１はどのような偏りも与えない。
【０１９７】
１０４Ｂ  ｐＨ１１はマイクロバイオームプロファイルを室温で少なくとも１４日間、効果的に保存する
プロファイルの中立性を維持することに加えて、マイクロバイオームの調査には、微生物群構造の正確な経時的保存が必要である。我々は、２３℃で１４日間にわたる保存中の試料を安定化する１０４Ｂ  ｐＨ１１の能力を評価した。
【０１９８】
対になった１０４Ｂ  ｐＨ１１−安定化試料および新しい試料を、時間ゼロの時点（Ｔ０）および再度室温（２３℃）で１４日間貯蔵後に抽出した。新しい試料も対照として−８０℃で１４日間貯蔵された。試料の類似度をＢｒａｙ−Ｃｕｒｔｉｓ距離を使って評価した。マン・ホイットニー分析は、対応する新しい試料と比較した場合、２３℃で１４日間の１０４Ｂ  ｐＨ１１試料と、−８０℃試料との間で有意差を示さなかった（図２４）。対照的に、非安定化試料は、−８０℃対照または室温で貯蔵した１０４Ｂ  ｐＨ１１と比較した場合、有意な非類似度を示した。
【０１９９】
反復実験間の再現性を理解するために、新しい１０４Ｂ  ｐＨ１１収集試料（Ｔ０およびＴ１４日）および非安定化試料（Ｔ１４日）を使って、重み付きＵｎｉｆｒａｃクラスター分析を行った。得られたデンドログラム（図２５）は、新しい試料と１０４Ｂ  ｐＨ１１安定化試料との間で、１４日後（９６％類似度）でさえも、タイトなクラスタリングを示す。非安定化試料は、新しい試料のプロファイルから大きく離れて一緒にクラスター化された（約６３％類似度）。したがって、適切な安定化は、経時的に、プロファイルクラスタリングへの大きな効果を有する。
【０２００】
１０４Ｂ  ｐＨ１１は、模擬輸送条件下でマイクロバイオームプロファイルを効果的に保存する
試料は通常、収集点から処理研究室への輸送中に望ましくない条件に暴露される。標準的輸送条件を模擬するために、非安定化および１０４Ｂ  ｐＨ１１安定化試料を、５０℃で１日間、３７℃で３日間、または複数回の凍結−解凍（Ｆ／Ｔ）サイクルに暴露した。１０４Ｂ  ｐＨ１１は高分子量ＤＮＡバンドを保存したが、非安定化試料は、特に５０℃または凍結−解凍サイクルへの暴露時に、様々な程度の分解を示した（図２６）。
【０２０１】
最終的に、１６Ｓ  ｒＲＮＡ分析により、１０４Ｂ  ｐＨ１１は、極端な温度であっても微生物群構造を保存することが確認された。一般的な輸送温度に暴露された１０４Ｂ  ｐＨ１１試料と、−８０℃で保持された対応する試料のＢｒａｙ−Ｃｕｒｔｉｓ距離を比較するマン・ホイットニー検定は、有意差を示さなかった。逆に、−８０℃で保持された試料と比較すると、３７℃で保持されたまたは凍結−解凍サイクルに暴露された非安定化試料は、有意差を示した（図２７）。
【０２０２】
結論
メタゲノムとの関係において、安定化は、経時的に測定される、ａ）中立性（偏りのないプロファイルを捕らえる能力）、ｂ）再現性（極めてよく一致した一定分量がそこから採取できる、均一な試料材料）、およびｃ）一貫性（分子量）、を包含する多次元属性である。厳しく制御された実験および厳密な分析に基づいて、１０４Ｂ  ｐＨ１１は、実際の輸送および取り扱い条件を通じヒト糞便中の腸微生物叢を効果的に安定化した。これは、ＭＷＡＳのコスト効果スケーリングにとって、ならびにバイオマーカーの発見および開発のためのデータ品質の最適化にとって、極めて重要である。
【０２０３】
実施例１１−高温での試料安定化におけるキレート化剤の役割に対するさらなる調査
試料内の微生物プロファイルの安定性はまた、高温に敏感でもある。これらの条件では、有害なヌクレアーゼが活性化される可能性があるのみでなく、いくつかの種が増殖を開始する可能性もある。ＤＮアーゼの作用を停止し、加えて、細菌増殖を抑制するために、キレート化剤（ＣＤＴＡ）の存在は、この場合、特に有益である。
【０２０４】
この実験では、健康なドナーが糞便を集め、４００ｍｇの糞便を単一の７．９ｍｍステンレス鋼ボールおよび次のように様々な最終濃度のキレート化剤ＣＤＴＡと共に２ｍＬの本組成物を含むチューブ中に移した：ａ）３００ｍＭのＣＤＴＡ、５０ｍＭのβ−アラニン、２３．５％のエタノール、０．５％のＳＤＳ、０．１％のＡｎｔｉｆｏａｍ  Ａ、ｐＨ１１（「１０４Ｂ  ｐＨ１１」）；ｂ）１５０ｍＭのＣＤＴＡ、５０ｍＭのβ−アラニン、２３．５％のエタノール、０．５％のＳＤＳ、０．１％のＡｎｔｉｆｏａｍ  Ａ、ｐＨ１１、またはｃ）５０ｍＭのβ−アラニン、２３．５％のエタノール、０．５％のＳＤＳ、０．１％のＡｎｔｉｆｏａｍ  Ａ、ｐＨ１１（キレート化剤なし）。試料を手振盪で均一化し（ミックス）、その後、室温条件で研究室に戻した。試料収集の２４時間以内に、ＤＮＡ抽出（Ｔ＝０）のために、２５０μＬの一定分量を各チューブから取り出した。その後、第２の一定分量からＤＮＡを抽出する前に、収集試料を４０℃で５日間（Ｔ＝５）貯蔵した。精製ＤＮＡを定量化し、その後、ＤＧＧＥを使って１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子ＰＣＲアンプリコンを分離して細菌集団プロファイルとして、またはフィンガープリントとして分解する。各組成物のＴ＝０の対照試料と比較して、試料（ＤＧＧＥゲルのレーン）間のパーセント類似度をＳｙｎｇｅｎｅ  ＧｅｎｅＴｏｏｌｓソフトウェア（材料と方法のセクション参照）を使って別々に計算した。
【０２０５】
図２８は、ＣＤＴＡ不含の組成に比べて、ＣＤＴＡが１５０ｍＭまたは３００ｍＭの濃度で存在する場合、本組成物に関する「５日目」試料と「０日目」試料との間での、高温における優れた比率の類似度またはマイクロバイオームプロファイルの安定性を示す。これは、高温で微生物プロファイルの安定性を維持するためには、本組成物中にキレート化剤が必要であることを示している。糞便試料が４０℃で貯蔵された場合、３００ｍＭのＣＤＴＡおよび１５０ｍＭのＣＤＴＡを含む組成物では、「５日目」の微生物プロファイルは、「０日目」に比べて、それぞれ９６％および９５％類似していた。比較すると、糞便試料を４０℃で貯蔵した場合、ＣＤＴＡ不含の組成物中で「５日目」の微生物プロファイルは、「０日目」に比べて７１％であった。
【０２０６】
実施例１２−先行技術組成物に比べて、本組成物中の試料の優れた安定化
患者試料中の核酸は、患者から試料を取り出した後で分解する傾向がある。この分解は、損なわれていない核酸の存在を基準にして試料を病気（例えば、癌性の）として採点する核酸一貫性アッセイの有効性を減少させる可能性がある。ＡＰ  ＳｈｕｂｅｒとＤＨ  Ｗｈｉｔｎｅｙ（米国特許出願公開第２００８／０１２４７１４号）は、組織および体液試料中の核酸を安定化するための方法を記載しており、この場合の安定化溶液には、緩衝液、塩、およびキレート化剤（例えば、「ＴＥＮ  ｂｕｆｆｅｒ」）を含む。
【０２０７】
この実験では、健康なドナーが糞便を集め、４００ｍｇの糞便を単一の７．９ｍｍステンレス鋼ボールおよび２ｍＬの本組成物（組成物１；３００ｍＭのＣＤＴＡ、５０ｍＭのβ−アラニン、２３．５％のエタノール、０．５％のＳＤＳ、０．１％のＡｎｔｉｆｏａｍ  Ａ、ｐＨ１１（「１０４Ｂ  ｐＨ１１」））を含むチューブ中に移すか、またはｉｉ）約４００ｍｇの糞便を２ｍＬの「ＴＥＮ  ｂｕｆｆｅｒ」（組成物２；１０ｍＭのトリス塩酸、１ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８、米国特許出願公開第２００８／０１２４７１４号）を含むチューブ中に移した。両チューブ中の試料を手振盪で均一化し（ミックス）、その後、室温条件で、研究室に戻した。試料収集の２４時間以内に、ＤＮＡ抽出（Ｔ＝０）のために、２５０μＬの一定分量を各チューブから取り出した後、第２の一定分量からＤＮＡを抽出する前に、室温条件下で２１日間（Ｔ＝２１）貯蔵した。精製ＤＮＡを定量化し、その後、ＤＧＧＥを使って１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子ＰＣＲアンプリコンを分離して細菌集団プロファイルとして、またはフィンガープリントとして分解する。各組成物のＴ＝０の対照試料と比較して、試料（ＤＧＧＥゲルのレーン）間のパーセント類似度をＳｙｎｇｅｎｅ  ＧｅｎｅＴｏｏｌｓソフトウェア（材料と方法のセクション参照）を使って別々に計算した。
【０２０８】
図２９は、ＴＥＮ  ｂｕｆｆｅｒ組成物と比較して、本組成物に関する「２１日目」の試料と「０日目」の試料との間の、優れた比率の類似度またはマイクロバイオームプロファイル安定性を示し、本組成物が当該技術分野における他の既知の組成物より改善されたＤＮＡ安定性を提供することを示す。糞便試料を本「１０４Ｂ  ｐＨ１１」組成物中に貯蔵した場合、「２１日目」のドナーＡおよびＢ微生物プロファイルは、「０日目」に比べて、それぞれ、８２％および９４％類似していた。比較すると、糞便試料を米国特許出願公開第２００８／０１２４７１４号の組成物中に貯蔵した場合、「２１日目」のドナーＡおよびＢ微生物プロファイルは、「０日目」に比べて、それぞれ、７０％および５０％類似していた。
【０２０９】
米国特許出願公開第２００８／０１２４７１４号はまた、［００５９］の材料と方法セクションで、０．５Ｍのトリス、０．１５ＭのＥＤＴＡ、および１０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ９．０）からなる「安定化緩衝液」にも言及している。しかし、その後の実施例中で特に参照されている唯一の安定化緩衝液／溶液は、上記の「ＴＥＮ  ｂｕｆｆｅｒ」であり、請求項および安定化溶液に関する説明の教示はまた、「ＴＥＮ  ｂｕｆｆｅｒ」を含む実施形態を対象にしている。従って、「安定化緩衝液」が試験されたということ、またはそれが米国特許出願公開第２００８／０１２４７１４号で教示の方法で有効に機能するであろうことは明らかでない。それにもかかわらず、１５０ｍＭのＣＤＴＡ、５０ｍＭのβ−アラニン、２３．５％のエタノール、０．５％のＳＤＳ、０．１％のＡｎｔｉｆｏａｍ  Ａ、ｐＨ１１を含む本組成物に対する上記米国特許出願公開第２００８／０１２４７１４号の「安定化緩衝液」の性能の比較調査を、実施例１に記載のものと同じ条件下で行った。
【０２１０】
組成物および時間によるマイクロバイオーム安定性の評価中に、ＰＣＲを使った細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡの増幅およびアンプリコンのＤＧＧＥ分析は、ｐＨ１１で１５０ｍＭのＣＤＴＡを含む本組成物がｐＨ９．０で１５０ｍＭのＥＤＴＡを含む米国特許出願公開第２００８／０１２４７１４号の「安定化緩衝液」（７９％）よりも、３０日間のインキュベーション後、対照（Ｔ＝０）に対し、より大きなパーセント類似度（８６％）を維持したことを示した。
【０２１１】
したがって、本出願の組成物は、米国特許出願公開第２００８／０１２４７１４号に開示の組成物に比較して、糞便試料中のマイクロバイオームプロファイルのより優れた安定化を提供する。
【０２１２】
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23. US 2008/0124714 (A.P. Shuber and D.H. Whitney).
【０２１３】
本明細書で言及した全ての出版物、特許および特許出願は、本発明が属する当業者の技術のレベルを示し、あたかもそれぞれ個々の出版物、特許または特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれると示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１４】
本発明は前述のように記載されているが、同内容は様々な方法で変更可能であることは明らかであろう。このような変更は、本発明の趣旨および範囲からの乖離であると見なされるべきものではなく、また、全てのこのような修正は、当業者には明らかであるように、次の請求項の範囲内に含まれることが意図されている。請求項の範囲は、説明のための好ましい実施形態セットに限定されるべきではなく、全体として説明と一致する最も広い解釈を与えられるべきである。
【配列表フリーテキスト】
【０２１５】
配列番号１：  ＰＰＵＮ５１８Ｒ
配列番号２：  ＰＲＢＡ３３８Ｆ
配列番号３：  ｈＴＳｍ  １４３Ｆ
配列番号４：  ｈＴＳｍ  １４３Ｒ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0006670765.tif 000021
【図８Ａ】
0006670765.tif 000022
【図８Ｂ】
0006670765.tif 000023
【図８Ｃ】
0006670765.tif 000024
【図８Ｄ】
0006670765.tif 000025
【図８Ｅ】
0006670765.tif 000026
【図８Ｆ】
0006670765.tif 000027
【図９】
0006670765.tif 000028
【図１０Ａ】
0006670765.tif 000029
【図１０Ｂ】
0006670765.tif 000030
【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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