(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１０のアミノ酸を含むキメラ抗原レセプター分子をコードする核酸分子。
【請求項２】
請求項１に記載の前記核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項３】
当該発現ベクターはレンチウイルスベクターである、請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項４】
前記キメラ抗原レセプターをコードする前記ヌクレオチド配列に先行する、配列番号２のアミノ酸配列を含むＧＭＣＳＦＲａシグナル配列をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記キメラ抗原レセプターをコードする前記ヌクレオチド配列に続くＴ２Ａリボソームスキップ配列をコードするヌクレオチド配列及び短縮型ＣＤ１９をコードするヌクレオチド配列をさらに含み、ここで、Ｔ２Ａリボソームスキップ配列は配列番号８のアミノ酸配列からなり、及び、前記短縮型ＣＤ１９が配列番号９のアミノ酸配列からなる、かつ、ここで、前記短縮型ＣＤ１９をコードするヌクレオチド配列は前記Ｔ２Ａリボソームスキップ配列をコードする前記ヌクレオチド配列に続く、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項６】
請求項４に記載の前記核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項７】
前記発現ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項６に記載の発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
操作された(engineered)Ｔ細胞を用いる治療を含む、腫瘍特異的Ｔ細胞に基づく免疫療法が、抗腫瘍治療について研究されている。ある場合には、このような療法に使用されるＴ細胞は、十分長い期間、in  vivoで活性を維持しない。ある場合には、Ｔ細胞の腫瘍特異性は比較的低い。従って、より長期の抗腫瘍作用（functioning）を持つ腫瘍特異的癌治療のための当該技術分野における必要性が存在する。
【背景技術】
【０００２】
未分化星状細胞腫（ＡＡ−グレードＩＩＩ）及びグリア芽細胞腫（ＧＢＭグレードＩＶ）を含む悪性神経膠腫（Malignant  gliomas,  ＭＧ）は、米国において毎年新たに診断される約２万例の発生率を有する。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎによると、米国の２０１０年の国勢調査データに基づく悪性脳腫瘍患者の総有病者数は約１４万人である。ＭＧはまれな疾患であるが、悪性の挙動及びほぼ均一に致死的な点で、非常に攻撃的で異種である。高度(high-grade)ＭＧの現在の標準治療法は、短期間の利益しかもたらさず、且つ、これらの脳腫瘍は事実上治癒不可能である。実際、中枢神経系（ＣＮＳ）における位置によって課せられた既に重度の病的状態をしばしば悪化させる現代の外科的及び放射線治療技術であっても、５年生存率はかなり低い。さらに、疾患が再発した大部分の患者にとって、治療選択肢はほとんどない。従って、特に最先端(frontline)療法に続いて再発／進行した患者に対して、より効果的な治療法に対する重要な必要性があり、この患者集団の臨床試験への参加が正当である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ＣＡＲ  Ｔ細胞は、抗原特異的な腫瘍集団を特異的に認識するように操作することができるので、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）操作されたＴ細胞を利用する養子Ｔ細胞療法（adoptive  T  cell  therapy）（ＡＣＴ）は、ＭＧの再発率を低下させる安全かつ有効な方法を提供し得（Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０  Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１０：９５６３０４；  Ａｈｍｅｄ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １６：４７４；  Ｓａｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１４  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０：９７２；  Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１２  １８：２１９９；  Ｃｈｏｗ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２１：６２９）、且つ、Ｔ細胞は脳実質を通過して標的に移動し、浸潤性悪性細胞を死滅させることができる（Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １６：４８９２；  Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７９：３３３２；  Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １６：４８９２；  Ｙａｇｈｏｕｂｉ  ２００９  Ｎａｔ  Ｃｌｉｎ  ＰＲａｃｔ  Ｏｎｃｏｌ  ６：５３）。前臨床試験は、ＩＬ１３Ｒα２標的化ＣＡＲ  ＋  Ｔ細胞が、幹様(stem-like)及び分化した神経膠腫細胞の両方に対して強力な主要組織適合複合体（ＭＨＣ）非依存性のＩＬ１３Ｒα２特異的細胞溶解活性を示し、且つ、in  vivoで確立された神経膠腫異種移植の退縮を誘発することを実証した（Ｋａｈｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００４  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４：９１６０；  Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１２  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １８：２１９９）。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
概要
本明細書には、細胞外ドメインと、膜貫通(transmembrane)領域と、細胞内シグナル伝達(signaling)ドメインと、を含むキメラ膜貫通免疫受容体（キメラ抗原レセプター(chimeric  antigen  receptors)又は「ＣＡＲ」）が記載されている。細胞外ドメインは、インターロイキン−１３Ｒα２（ＩＬ１３Ｒα２）に結合するＩＬ−１３リガンド、及び場合により、例えばヒトＦｃドメインの一部を含むスペーサーで構成されている。膜貫通部分は、ＣＤ４膜貫通ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ３膜貫通ドメイン又は４ＩＢＢ膜貫通ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３複合体のζ鎖由来のシグナル伝達ドメイン（ＣＤ３ζ）及び１つ以上の共刺激ドメイン(costimulatory  domains)、例えば、４−１ＢＢ共刺激ドメインを含む。細胞外ドメインは、ＣＡＲが、Ｔ細胞の表面上に発現されると、Ｔ細胞の活性を、神経膠腫を含む腫瘍細胞の表面上に発現される受容体であるＩＬ１３Ｒα２を発現するこれらの細胞に導く(direct)ことを可能にする。重要なことに、ＣＡＲのＩＬ１３Ｒα２結合部分は、結合特異性を増加させるアミノ酸改変(modification)、例えばＥ１３Ｙ突然変異を含む。細胞内領域にＣＤ３ζと直列の(in  series)４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）共刺激ドメインなどの共刺激ドメインを含めることにより、Ｔ細胞は共刺激シグナルを受け取ることができる。Ｔ細胞、例えば患者特異的な自己Ｔ細胞は、本明細書に記載のＣＡＲを発現するように操作することができ、且つ、操作された細胞は、ＡＣＴにおいて拡大され、使用され得る。種々のＴ細胞サブセットを使用することができる。加えて、ＣＡＲは、ＮＫ細胞などの他の免疫細胞で発現され得る。患者が、本明細書に記載のＣＡＲを発現する免疫細胞で治療される場合、その細胞は、自己由来(autologous)又は同種異系の(allogenic)Ｔ細胞であり得る。場合によっては、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋であるＣＤ４＋及びＣＤ８＋セントラルメモリー(central  memory)Ｔ細胞（ＴＣＭ）であり、且つ、このような細胞の使用は、患者特異的Ｔ細胞の他のタイプの使用と比較して養子移植(adoptive  transfer)後の細胞の長期持続性を改善することができる。
【０００５】
本明細書に記載されるのは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ｒをコードする核酸分子であって、前記キメラ抗原レセプターが、
ヒトＩＬ−１３又は１〜１０個（例えば、１又は２）のアミノ酸改変を有するその変異体(variant)と；
ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１〜１０個（例えば、１又は２）のアミノ酸改変を有するその変異体、ＣＤ８膜貫通ドメイン又は１〜１０個（例えば、１又は２）のアミノ酸改変を有するその変異体、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又は１〜１０個（例えば、１又は２）のアミノ酸改変を有するその変異体、及びＣＤ３ζ膜貫通ドメイン又は１〜１０個（例えば、１又は２）のアミノ酸改変を有するその変異体、から選択される膜貫通ドメインと；
共刺激ドメインと；及び
ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン又は(of)１〜１０個のアミノ酸改変を有するその変異体と；
を含む、核酸分子である。
【０００６】
様々な実施形態において、共刺激ドメインは、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１〜１０個（例えば、１又は２）のアミノ酸改変を有するその変異体、４ＩＢＢ共刺激ドメイン又は１〜１０個（例えば、１又は２）のアミノ酸改変を有するその変異体、及びＯＸ４０共刺激ドメイン又は１〜１０個（例えば、１又は２）のアミノ酸改変を有するその変異体からなる群から選択される。特定の実施形態では、１〜１０個（例えば、１又は２）のアミノ酸改変を有する４ＩＢＢ共刺激ドメイン又はその変異体が存在する。
【０００７】
さらなる実施形態は、前記ＣＡＲは、
ＩＬ１３Ｒα２対(versus)ＩＬ１３Ｒα１の結合特異性を増加させる１〜１０個のアミノ酸改変を有するヒトＩＬ１３の変異体；
前記ヒトＩＬ−１３又はその変異体が、１〜５個のアミノ酸改変を有する配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）３のアミノ酸配列を含むＩＬ−１３変異体であり、ただし、配列番号３の１１位におけるアミノ酸がＥ以外であり；
ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１〜１０個（例えば、１又は２）のアミノ酸改変を有するその変異体、４ＩＢＢ共刺激ドメイン又は１〜１０個（例えば、１又は２）のアミノ酸改変を有するその変異体、及びＯＸ４０共刺激ドメイン又は１〜１０個（例えば、１又は２）のアミノ酸改変を有するその変異体、からなる群から選択される２つの異なる共刺激ドメイン；
ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体、４ＩＢＢ共刺激ドメイン又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体、及びＯＸ４０共刺激ドメイン又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体、からなる群から選択される２つの異なる共刺激ドメイン；
共刺激ドメイン；及び
ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン又は(of)１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体；
前記ＩＬ−１３又はその変異体と前記膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサー領域（例えば、前記スペーサー領域が、配列番号４，１４〜２０，５０及び５２１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む）；
前記スペーサーがＩｇＧヒンジ領域を含み；
前記スペーサー領域が１０〜１５０のアミノ酸を含み；
前記４−１ＢＢシグナル伝達ドメインが、配列番号６のアミノ酸配列を含み；
前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号７のアミノ酸配列を含み；及び
３〜１５個のアミノ酸のリンカーが前記共刺激ドメインと前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン又はその変異体との間に位置する。２つの共刺激ドメインが存在する特定の実施形態では、一方は４−ＩＢＢ共刺激ドメインであり、他方はＣＤ２８及びＣＤ２８ｇｇから選択される共刺激ドメインである。
【０００８】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号１０，３１〜４８及び５２から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現し；
前記キメラ抗原レセプターは、配列番号１１のアミノ酸を含むＩＬ−１３／ＩｇＧ４／ＣＤ４ｔ／４１−ＢＢ領域及び配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含み；
前記キメラ抗原レセプターは、配列番号１０，３１〜４８及び５２のアミノ酸配列を含む。
【０００９】
また、キメラ抗原レセプターをコードする発現カセットを含むベクターによって形質導入されたヒトＴ細胞の集団であって、キメラ抗原レセプターが、
ヒトＩＬ−１３又は１〜１０個のアミノ酸改変を有するその変異体と；
ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１〜１０個のアミノ酸改変を有するその変異体、ＣＤ８膜貫通ドメイン又は１〜１０個のアミノ酸改変を有するその変異体、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又は１〜１０個のアミノ酸改変を有するその変異体、及びＣＤ３ζ膜貫通ドメイン又は１〜１０個のアミノ酸改変を有するその変異体、から選択される膜貫通ドメインと；
共刺激ドメインと；及び
ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン又は(of)１〜１０個のアミノ酸改変を有するその変異体と；
を含む、集団が開示される。種々の実施形態において、
ヒトＴ細胞の集団は、配列番号１０，３１〜４８及び５２から選択されるアミノ酸配列を含むキメラ抗原レセプターを発現するベクターを含み；
Ｔ細胞の前記集団が、セントラルメモリー(central  memory)Ｔ細胞（Ｔｃｍ  ｃｅｌｌｓ）に含まれる（例えば、前記細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％はＴｃｍ細胞であり；
前記Ｔｃｍ細胞の少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％がＣＤ４＋であり、前記Ｔｃｍ細胞の少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％がＣＤ８＋細胞である）。
【００１０】
また、患者の癌を治療する方法であって、
キメラ抗原レセプターをコードする発現カセットを含むベクターによって形質導入された自己又は同種異系のヒトＴ細胞の集団（例えば、Ｔｃｍ細胞を含む自己又は同種異系のヒトＴ細胞、例えば細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％がＴｃｍ細胞であり；Ｔｃｍ細胞の少なくともの１５％、２０％、２５％、３０％、３５％がＣＤ４＋であり、Ｔｃｍ細胞の少なくともの１５％、２０％、２５％、３０％、３５％がＣＤ８＋である）を投与することを含み、
キメラ抗原レセプターが配列番号１０，３１〜４８及び５２から選択されるアミノ酸配列を含む、
方法が記載される。様々な実施形態において、ヒトＴ細胞の集団は、セントラルメモリーＴ細胞を含み；
癌はグリア芽腫(glioblastoma)であり；及び
形質導入されたヒトＴ細胞は、前記患者からＴ細胞を得るステップと、前記Ｔ細胞を処理してセントラルメモリーＴ細胞を単離するステップと、及び前記セントラルメモリー細胞の少なくとも一部分をＴ細胞に変換するステップと、
を含む方法によって、キメラ抗原レセプターをコードする発現カセットを含むウイルスベクターにより(to  with)調製され(where  prepared)、
キメラ抗原レセプターは、配列番号１０，３１〜４８及び５２から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１１】
配列番号１０及び配列番号１０，３１〜４８及び５２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
５個以下のアミノ酸置換、欠失又は挿入の存在を除いて、配列番号１０，３１〜４８及び５２から選択されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
５個以下のアミノ酸置換の存在を除いて、配列番号１０及び配列番号１０，３１〜４８及び５２から選択されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；及び
２個以下のアミノ酸置換の存在を除いて、配列番号１０及び配列番号１０，３１〜４８及び５２から選択されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子．
もまた記載される。
【００１２】
本明細書に記載されるある種のＣＡＲ、例えばＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζＣＡＲ及びＩＬ１３（ＥＱ）ＣＤ２８−ＢＢζＣＡＲは、特定の他のＩＬ１３標的化ＣＡＲと比較して特定の有益な特徴を有する。例えば、これらはＩＬ１３Ｒαに対する選択性が改善し、より低いＴｈ２サイトカイン産生、特に低いＩＬ１３産生を引き出す。
【００１３】
ＩＬ１３Ｒα２を標的とするＣＡＲを発現するＴ細胞は、膠芽細胞腫のような癌、ならびに髄芽細胞腫、乳癌、頭頸部癌、腎癌、卵巣癌及びカポジ肉腫を含むがこれらに限定されないＩＬ１３Ｒα２を発現する他の癌の治療に有用であり得る。したがって、本開示は、本明細書に記載のＣＡＲを発現するＴ細胞を用いて癌を治療するための方法を含む。
【００１４】
本開示はまた、本明細書に記載のＣＡＲのいずれかをコードする核酸分子（例えば、ＣＡＲのうちの１つをコードする核酸配列を含むベクター）及び本明細書に記載のＣＡＲのいずれかを発現する単離されたＴリンパ球をコードする。
【００１５】
本明細書に記載のＣＡＲは、ＩＬ１３ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサー領域を含むことができる。様々な異なるスペーサーを使用することができる。それらのいくつかは、ヒトＦｃ領域の少なくとも一部、例えばヒトＦｃ領域のヒンジ部分又はＣＨ３ドメイン又はその変異体を含む。以下の表１は、本明細書に記載されるＣＡＲにおいて使用され得る様々なスペーサーを提供する。
【００１６】
表１：    スペーサーの例
【表１】
0006657195.tif 000002
0006657195.tif 000003
【００１７】
いくつかのスペーサー領域は、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）ヒンジ領域、すなわち免疫グロブリンのＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間にある配列の全部又は一部、例えばＩｇＧ４  Ｆｃヒンジ又はＣＤ８ヒンジ、を含む。いくつかのスペーサー領域は、免疫グロブリンＣＨ３ドメイン又はＣＨ３ドメイン及びＣＨ２ドメインの両方を含む。免疫グロブリン由来の配列は、１つ以上のアミノ酸改変、例えば、１，２，３，４又は５個の置換、例えば、オフターゲット結合を減少させる置換、を含むことができる。
【００１８】
「アミノ酸改変」とは、タンパク質又はペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を指す。「アミノ酸置換」又は「置換」とは、親ペプチド又はタンパク質配列における特定の位置のアミノ酸を、別のアミノ酸で置換することを意味する。置換は、得られたタンパク質中のアミノ酸を非保存的な(non-conservative)やり方で（すなわち、特定のサイズ又は特徴を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸から別のグループに属するアミノ酸にコドンを変化させることによって）、又は保存的な(conservative)やり方で（すなわち、特定のサイズ又は特徴を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸から、同じグループに属するアミノ酸へのコドンを変化させることによって）、変更するためにすることができる。このような保存的(conservative)変化は、一般に、得られるタンパク質の構造及び機能の変化をより少なくする。以下はアミノ酸の種々のグループの例である：
１）無極性Ｒ基を有するアミノ酸：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン；
２）非荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸：グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン；
３）荷電した極性Ｒ基を有するアミノ酸（ｐＨ６．０で負に荷電した）：アスパラギン酸、グルタミン酸；
４）塩基性アミノ酸（ｐＨ６．０で正に帯電）：リジン、アルギニン、ヒスチジン（ｐＨ６．０）。別のグループは、フェニル基を有するアミノ酸、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシン、であり得る。
【００１９】
特定の実施形態では、スペーサーは、非修飾スペーサー中に存在するアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基で置換された１つ以上のアミノ酸残基を含むＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４に由来する。１つ以上の置換されたアミノ酸残基は、限定されないが、２２０，２２６，２２８，２２９，２３０，２３３，２３４，２３５，２３４，２３７，２３８，２３９，２４３，２４７，２６７，２６８，２８０，２９０，２９２，２９７，２９８，２９９，３００，３０５，３０９，２１８，３２６，３３０，３３１，３３２，３３３，３３４，３３６，３３９の位置における１以上のアミノ酸残基、又はそれらの組み合わせから選択される。以下でより詳細に説明するこの番号付けスキームにおいて、表１のＩｇＧヒンジ配列及びＩｇＧ４ヒンジリンカー（ＨＬ）配列の最初のアミノ酸がそうであるように(as  is)、表１のＩｇＧ４（Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ｑ）スペーサーの最初のアミノ酸は２１９であり、表１のＩｇＧ４（ＨＬ−ＣＨ３）スペーサーの最初のアミノ酸は２１９である。
【００２０】
いくつかの実施形態では、改変スペーサーは、限定されないが、以下のアミノ酸残基置換：Ｃ２２０Ｓ，Ｃ２２６Ｓ，Ｓ２２８Ｐ，Ｃ２２９Ｓ，Ｐ２３０Ｓ，Ｅ２３３Ｐ，Ｖ２３４Ａ，Ｌ２３４Ｖ，Ｌ２３４Ｆ，Ｌ２３４Ａ，Ｌ２３５Ａ，Ｌ２３５Ｅ，Ｇ２３６Ａ，Ｇ２３７Ａ，Ｐ２３８Ｓ，Ｓ２３９Ｄ，Ｆ２４３Ｌ，Ｐ２４７Ｉ，Ｓ２６７Ｅ，Ｈ２６８Ｑ，Ｓ２８０Ｈ，Ｋ２９０Ｓ，Ｋ２９０Ｅ，Ｋ２９０Ｎ，Ｒ２９２Ｐ，Ｎ２９７Ａ，Ｎ２９７Ｑ，Ｓ２９８Ａ，Ｓ２９８Ｇ，Ｓ２９８Ｄ，Ｓ２９８Ｖ，Ｔ２９９Ａ，Ｙ３００Ｌ，Ｖ３０５Ｉ，Ｖ３０９Ｌ，Ｅ３１８Ａ，Ｋ３２６Ａ，Ｋ３２６Ｗ，Ｋ３２６Ｅ，Ｌ３２８Ｆ，Ａ３３０Ｌ，Ａ３３０Ｓ，Ａ３３１Ｓ，Ｐ３３１Ｓ，Ｉ３３２Ｅ，Ｅ３３３Ａ，Ｅ３３３Ｓ，Ｅ３３３Ｓ，Ｋ３３４Ａ，Ａ３３９Ｄ，Ａ３３９Ｑ，Ｐ３９６Ｌ、又はそれらの組み合わせ、を含む（ただしこれらに限定されない）ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，又はＩｇＧ４から誘導される。
【００２１】
特定の実施形態では、改変スペーサーは、未改変領域に存在するものとは異なるアミノ酸残基で置換された１つ以上のアミノ酸残基を含むＩｇＧ４領域に由来する。１つ以上の置換アミノ酸残基は、位置２２０，２２６，２２８，２２９，２３０，２３３，２３４，２３５，２３４，２３７，２３８，２３９，２４３，２４７，２６７，２６８，２８０，２９０，２９２，２９７，２９８，２９９，３００，３０５，３０９，２１８，３２６，３３０，３３１，３３２，３３３，３３４，３３６，３３９の１つ以上のアミノ酸残基から選択されるが、又はそれらの組合せのうちの少なくとも１つを含む（ただしこれらに限定されない）。
【００２２】
いくつかの実施形態では、改変スペーサーは、以下のアミノ酸残基置換：  ２２０Ｓ，２２６Ｓ，２２８Ｐ，２２９Ｓ，２３０Ｓ，２３３Ｐ，２３４Ａ，２３４Ｖ，２３４Ｆ，２３４Ａ，２３５Ａ，２３５Ｅ，２３６Ａ，２３７Ａ，２３８Ｓ，２３９Ｄ，２４３Ｌ，２４７Ｉ，２６７Ｅ，２６８Ｑ，２８０Ｈ，２９０Ｓ，２９０Ｅ，２９０Ｎ，２９２Ｐ，２９７Ａ，２９７Ｑ，２９８Ａ，２９８Ｇ，２９８Ｄ，２９８Ｖ，２９９Ａ，３００Ｌ，３０５Ｉ，３０９Ｌ，３１８Ａ，３２６Ａ，３２６Ｗ，３２６Ｅ，３２８Ｆ，３３０Ｌ，３３０Ｓ，３３１Ｓ，３３１Ｓ，３３２Ｅ，３３３Ａ，３３３Ｓ，３３３Ｓ，３３４Ａ，３３９Ｄ，３３９Ｑ，３９６Ｌ、又はそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含むＩｇＧ４領域に由来する（ただしこれらに限定されない）。ここで未改変スペーサー中のアミノ酸は、示された位置で上記の同定されたアミノ酸で置換されている。
【００２３】
本明細書で論じる免疫グロブリン中のアミノ酸位置については、番号付けは、ＥＵインデックス又はＥＵ番号付けスキームによる（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．  １９９１  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，本明細書にその全体が参考として援用される）。Ｋａｂａｔ又はＥＵ番号付けスキームにおけるようなＥＵインデックス又はＥＵインデックスは、ＥＵ抗体の番号付けを指す（Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９６９  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ６３：７８−８５）。
【００２４】
様々な膜貫通ドメインを、ＩＬ１３Ｒａ２に対するＣＡＲに使用することができる。表２は、適切な膜貫通ドメインの例を含む。スペーサードメインが存在する場合、膜貫通ドメインはスペーサードメインに対するカルボキシ末端に位置する。
【００２５】
表２：  膜貫通ドメインの例
【表２】
0006657195.tif 000004
【００２６】
本明細書に記載されるＣＡＲの多くは、１つ以上（例えば、２つ）の共刺激ドメインを含む。共刺激ドメイン（複数可）は、膜貫通ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとの間に位置する。表３は、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインの配列と共に適切な共刺激ドメインの例を含む。
【００２７】
表３：  共刺激ドメインの例
【表３】
0006657195.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】示されるようにＩＬ１３Ｒα２特異的ヒトＩＬ−１３変異体（ｈｕＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ））、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃスペーサー（ｈｕγ４Ｆｃ）、ヒトＣＤ３ζ鎖の細胞質（ｈｕＣＤ３ζｃｙｔ）部分から構成される、ＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）−ゼータカインＣＡＲ（左）の概略描写である。また、ＩｇＧ４スペーサーのＣＨ２ドメインに位置する２つの点突然変異Ｌ２３５Ｅ及びＮ２９７Ｑ（赤で示されている）を除いてＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）−ゼータカインと同じＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζＣＡＲ、及び共刺激４−１ＢＢ細胞質ドメイン（４−１ＢＢ細胞）の添加も示されている。
【図２】図２のＡ〜Ｃは、オープンリーディングフレームの特定のベクターを示す。Ａは、２６７０ヌクレオチドＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ−Ｔ２ＡＣＤ１９ｔ構築物のｃＤＮＡオープンリーディングフレームの図であり、ここで、ＩＬ１３Ｒα２特異的リガンドＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）、ＩｇＧ４（ＥＱ）Ｆｃヒンジ、ＣＤ４トランスメンブラン、４−１ＢＢ細胞質シグナル伝達、３つのグリシンリンカー、及びＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ  ＣＡＲのＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメイン、並びにＴ２Ａリボソームスキップ及び短縮型(truncated)ＣＤ１９配列が示されている。ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζＣＡＲ及びＣＤ１９ｔの表面発現を駆動するヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体α及びＣＤ１９シグナル配列もまた示される。Ｂは、宿主ゲノムに組み込まれるであろう長い末端反復（「Ｒ」で示される）が隣接する(flanked)配列の図である。Ｃは、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ−Ｔ２Ａ−ＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７プラスミドのマップである。
【図３】ｐＨＩＶ７の構築を示す。
【図４】ｐＨＩＶ７の要素を示す。
【図５】ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ／ＣＤ１９ｔ＋ＴＣＭの生産スキームを示す。
【図６】図６のＡ〜Ｃは、表面トランスジーン及びＴ細胞マーカー発現のフローサイトメトリー分析の結果を示す。ＩＬ−１３（ＥＱ）ＢＢζ／ＣＤ１９ｔ＋ＴＣＭ  ＨＤ００６．５及びＨＤ１８７．１は、抗ＩＬ−１３−ＰＥ及び抗ＣＤ８−ＦＩＴＣで同時染色して、ＣＤ８＋ＣＡＲ＋及びＣＤ４＋（すなわちＣＤ８陰性）ＣＡＲ＋細胞（Ａ）を検出するか、  抗ＣＤ１９−ＰＥ及び抗ＣＤ４−ＦＩＴＣで、ＣＤ４＋ＣＤ１９ｔ＋及びＣＤ８＋（すなわちＣＤ４陰性）ＣＡＲ＋細胞（Ｂ）を検出する。蛍光色素共役(fluorochromeconjugated)抗ＣＤ３、ＴＣＲ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ２８（灰色ヒストグラム）又はアイソタイプ対照（黒ヒストグラム）で染色したＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ／ＣＤ１９ｔ＋ＴＣＭ  ＨＤ００６．５及びＨＤ１８７．１（Ｃ）。すべての場合において、生存可能なリンパ球に基づく百分率（ＤＡＰＩ陰性）はアイソタイプより上に染色された。
【図７】図７のＡ〜Ｂは、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ＋ＴＣＭのＩＬ１３Ｒα２特異的エフェクター機能のin  vitro機能的特徴付けを示す。ＩＬ１９（ＥＱ）ＢＢＺ／ＣＤ１９ｔ＋ＴＣＭ  ＨＤ００６．５及びＨＤ１８７．１を、ＣＤ１９ｔ発現に基づく１０：１のＥ：Ｔ比を用いた６時間５１Ｃｒ放出アッセイにおいてエフェクターとして使用した。ＩＬ１３Ｒα２陽性腫瘍標的は、ＩＬ１３Ｒα２（Ｋ５６２−ＩＬ１３Ｒα２）及び一次神経膠腫系統ＰＢＴ０３０−２を発現するように操作されたＫ５６２であり、ＩＬ１３Ｒα２陰性腫瘍標的対照はＫ５６２親系統であった（Ａ）。ＩＬ１３Ｒα２陽性(positive)及び陰性(negative)標的との１０：１のＥ：Ｔ比での一晩の同時培養後、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ／ＣＤ１９ｔ＋ＴＣＭ  ＨＤ００６．５及びＨＤ１８７．１を抗原依存性サイトカイン産生について評価した。サイトカインレベルは、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  ＰｒｏヒトサイトカインＴＨ１／ＴＨ２アッセイキットを用いて測定し、ＩＮＦ−γを報告した（Ｂ）。
【図８】図８のＡ〜Ｃは、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ／ＣＤ１９ｔ＋ＴＣＭの養子移入後の確立された神経膠腫腫瘍異種移植片の退行を実証する研究の結果を示す。ＥＧＦＰ−ｆｆＬｕｃ＋ＰＢＴ０３０−２腫瘍細胞（１×１０５）を、ＮＳＧマウスの右前脳に定位固定した。５日目に、マウスは、２×１０６ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ／ＣＤ１９ｔ＋ＴＣＭ（１．１×１０６ＣＡＲ＋；ｎ＝６）、２×１０６モック(mock)ＴＣＭ（ＣＡＲなし、ｎ＝６）又はＰＢＳ（ｎ＝６）のいずれかを受けた。各群の代表的なマウスは、Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅを用いて相対的な腫瘍負荷(burden)を示した（Ａ）。ｆｆＬｕｃフラックス（光子／秒）の定量化は、モック(mock)形質導入ＴＣＭ及びＰＢＳと比較してＩＬ１３ＢＱζ／ＣＤ１９ｔ＋ＴＣＭが腫瘍退縮を誘導することを示す（＃ｐ＜０．０２、＊ｐ＜０．００１、反復測定ＡＮＯＶＡ）（Ｂ）。カプランマイヤー生存曲線（ｎ＝６／グループ）は、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ／ＣＤ１９ｔ＋ＴＣＭで処置したマウスの有意に改善した生存率（ｐ＝０．０００８；対数ランク検定）を示す（Ｃ）。
【図９】図９のＡ〜Ｃは、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺＴＣＭ及びＩＬ１３−ゼータカインＣＴＬクローンの抗腫瘍効果を比較する研究の結果を示す。ＥＧＦＰ−ｆｆＬｕｃ＋ＰＢＴ０３０−２ＴＳｓ（１×１０５）をＮＳＧマウスの右前脳内に定位固定的に移植した。８日目に、マウスは、１．６×１０６モックＴＣＭ（ＣＡＲなし）か、１．０×１０６ＣＡＲ＋ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζＴＣＭ（１．６×１０６総Ｔ細胞、６３％ＣＡＲ）か、１．０×１０６ＩＬ１３−ゼータカインＣＤ８＋ＣＴＬ  ｃｌ．２Ｄ７（クローナルＣＡＲ＋）か、処置なしのいずれかを受けた（１群当たりｎ＝６）。各グループの代表的なマウスは、Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅを用いて相対的な腫瘍負荷を示した（Ａ）。経時的な(over  time)ｆｆＬｕｃフラックス(flux)（光子／秒）の自然対数の線形回帰線であり、Ｐ値は、時間ごとの相互作用比較である（Ｂ）。ＩＬ１３−ゼータカインＣＤ８＋ＣＴＬ  ｃｌ．２Ｄ７と比較してＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζＴＣＭで処置したマウスについて、Ｋａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ生存分析（１群あたりｎ＝６）が有意に改善された生存を示した（ｐ＝０．０２；対数ランク検定）（Ｃ）。
【図１０】図１０のＡ〜Ｃは、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζＴＣＭ及びＩＬ１３−ゼータカインＣＴＬクローンの抗(ant)腫瘍効果を比較する研究の結果を示す。ＥＧＦＰ−ｆｆＬｕｃ＋ＰＢＴ０３０−２  ＴＳｓ（１×１０５）をＮＳＧマウスの右前脳内に定位固定的に移植した。８日目に、マウスは、１．３×１０６モックＴＣＭ（ＣＡＲなし；ｎ＝６），１．０，０．３か、０．１×１０６ＣＡＲ＋ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζＴＣＭ（７８％CAR＋；ｎ＝６），１．０，０．３か、０．１×１０６  ＩＬ１３−ゼータカインＣＤ８＋ＣＴＬ  ｃｌ．２Ｄ７（クローナルＣＡＲ＋；ｎ＝６〜７）か、処置なしのいずれかを受けた（ｎ＝５）。各グループの代表的なマウスのＸｅｎｏｇｅｎ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅは、相対的な腫瘍負荷を示した（Ａ）。ｆｆＬｕｃフラックス(flux)（光子／秒）の自然対数の線形回帰線は、ＩＬ−１３（ＥＱ）ＢＢζＴＣＭは、第１世代のＩＬ１３−ゼータカインＣＴＬ  ｃｌ．２Ｄ７、モック（ｍｏｃｋ）ＴＣＭ及び腫瘍のみと比較して優れた腫瘍退縮を達成することが示されている（Ｂ）。腫瘍注射後２７日の群あたりの平均フラックス(flux)は、０．１×１０６  ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζＴＣＭ用量が、ＩＬ１３−ゼータカインＣＤ８  ＋  ＣＴＬ  ｃｌ．  ２Ｄ７の１０倍高い１．０×１０６用量よりも優れていることを実証する（ｐ＝０．０４３；ウェルチ２サンプルｔ−検定）（Ｃ）。
【図１１】図１１は、ＩＬ１３−ゼータカインＣＴＬクローンと比較して改善された持続性を示すＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζＴｃｍディスプレイを実証する研究の結果を示す。ＣＤ３免疫組織化学は、Ｔ細胞注入の７日後の腫瘍部位におけるＴ細胞持続性を評価する。有意な数のＴ細胞がＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζＴｃｍについて検出される（上のパネル）。対照的に、生存可能なＣＤ３＋  ＩＬ１３−ゼータカインＴ細胞はごくわずかしか検出されない（下のパネル）。
【図１２】図１２のＡ〜Ｄは、大きな確立された腫瘍についてのＣＡＲ＋  Ｔ細胞送達（ｉ．ｃ．対ｉ．ｖ．）の経路を比較する実験の結果を示す。ＥＧＦＰ−ｆｆＬｕｃ＋  ＰＢＴ０３０−２  ＴＳｓ（１×１０５）をＮＳＧマウスの右前脳内に移植した。１９及び２６日目に、マウスに５×１０６  ＣＡＲ＋  ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ＋  Ｔｃｍ（１１．８×１０６全細胞；ｎ＝４）か、又はモックＴｃｍ（１１．８×１０６細胞；ｎ＝４）のいずれかを、尾静脈を介してｉ．ｖ．注入した。あるいは、１９日目、２２日目、２６日目及び２９日目に、マウスに、１×１０６  ＣＡＲ＋  ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ＋  Ｔｃｍ（２．４×１０６個の全細胞；ｎ＝４）か、又はモックＴｃｍ（２．４×１０６細胞；ｎ＝５）のいずれかを、ｉ．ｃ．注入した。経時的な(over  time)平均ｆｆＬｕｃフラックス(flux)（光子／秒）は、ｉ．ｃ．送達されたＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζＴｃｍは、１９日目の腫瘍の腫瘍退行を媒介する。比較すると、ｉ．ｖ．送達されたＴ細胞は、未処理又はモックＴｃｍ対照と比較して腫瘍負荷の減少を示さなかった（Ａ）。Ｋａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ生存曲線は、ｉ．ｖ．投与したＣＡＲ＋  Ｔｃｍで処置したマウスと比較して、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺＴｃｍでｉ．ｃ．処置したマウスの生存率の改善を示す（ｐ＝０．０００３対数ランク検定）（Ｂ）。ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺＴｃｍでｉ．ｖ．処置したマウス（Ｃ）対(versus) ｉ．ｃ．処置したマウス（Ｄ）の代表的なＨ＆Ｅ及びＣＤ３  ＩＨＣ。ＣＤ３＋  Ｔ細胞は、ｉ．ｃ．処置した群においてのみ検出され、ｉ．ｖ．処置したマウスの場合、腫瘍又は周囲の脳実質においてＣＤ３＋細胞は検出されなかった。
【図１３】図１３のＡ〜Ｂは、腫瘍内（ｉ．ｃ．ｔ）か、又は脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）のいずれかの頭蓋内に注入されたＣＡＲ＋  Ｔ細胞が、反対側の半球上の腫瘍に往来する(traffic)ことができることを示す研究結果を示す図である。ＥＧＦＰ−ｆｆＬｕｃ＋  ＰＢＴ０３０−２  ＴＳｓ（１×１０５）をＮＳＧマウスの左右の前脳部に定位移植した。６日目に、マウスに、１．０×１０６  ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ＋  Ｔｃｍを、右腫瘍部位において、ｉ．ｃ．注入した（１．６×１０６総細胞；６３％ＣＡＲ；ｎ＝４）。多巣性神経膠腫実験モデルの模式図（Ａ）。ＣＤ３  ＩＨＣは、左右の腫瘍部位の両方に浸潤するＴ細胞を示す（Ｂ）。
【図１４】図１４のＡ〜Ｃは、ＩＬ１３Ｒα２特異的ＣＡＲの共刺激ドメインを評価する一連の研究の結果を示す。ＣＤ２８及び４１ＢＢの両方を含む第３世代のＣＡＲに対して、４−１ＢＢ又はＣＤ２８のいずれかを組み込んだ第２世代のＣＡＲに対して、補助刺激を欠く第１世代のＣＤ３ｚ  ＣＡＲを含む様々な細胞内エンド／シグナル伝達ドメインを比較するＩＬ１３Ｒａ２特異的ＣＡＲ構築物の概略図。すべてのＣＡＲカセットはまた、形質導入された細胞のマーカーとして、Ｔ２Ａリボソームスキップ及び短縮型(truncated)ＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）配列を含む（Ａ）。ＣＤ４及びＣＤ８  ＴＣＭをレンチウイルスで形質導入し、ＣＡＲ発現Ｔ細胞を、抗ＣＤ１９を介して免疫学的に濃縮した。フローサイトメトリーによって測定されるＣＤ１９及びＩＬ１３（すなわち、ＣＡＲ）発現レベル（Ｂ）。各ＣＡＲ構築物の安定性は、ＣＡＲ（ＩＬ１３）平均蛍光強度（ＭＦＩ）を形質導入マーカー（ＣＤ１９ｔ）のそれで割ることによって決定した（Ｃ）。ＣＡＲを含む４−１ＢＢは、ＣＤ１９ｔ形質導入マーカーと比較して最も低い発現レベルを示した。
【図１５】図１５のＡ〜Ｂは、４−１ＢＢ補助刺激ドメインを含むＩＬ１３Ｒα２特異的ＣＡＲがより少ないＴｈ１及びＴｈ２サイトカインを産生することを実証する研究の結果を示す。Ｌ１３Ｒα２発現ＰＢＴ０３０−２腫瘍細胞標的を死滅させる指示されたモック形質導入又はＣＡＲ発現Ｔ細胞の能力を、示されたエフェクター：標的比で４時間５１  Ｃｒ放出アッセイで測定した。３重の(triplicate)ウェルの平均％クロム放出＋Ｓ．Ｄ．が描かれている（Ａ）。予想通り、モック形質導入Ｔ細胞は標的を効率的に溶解しなかった。対照的に、全てのＣＡＲ発現Ｔ細胞は同様の様式で腫瘍細胞を溶解した。指示されたモック形質導入又はＣＡＲ発現Ｔ細胞を、ＩＬ１３Ｒα２発現ＰＢＴ０３０−２腫瘍細胞と１０：１の比で一晩共培養し、上清をサイトメトリービーズアレイによりＩＬ−１３及びＩＦＮ−γレベルについて分析した（Ｂ）。３重の(triplicate)ウェルの平均＋Ｓ．Ｄ．が描かれている。興味深いことに、ζ、４１ＢＢ−ζ又はＣＤ２８−４１ＢＢ−ζＣＡＲを発現するＴ細胞は、ＣＤ２８−ζＣＡＲを発現するＴ細胞よりも低い抗原刺激性サイトカイン産生を示した。
【図１６】図１６のＡ〜Ｃは、ＩＬ１３Ｒα２特異的ＣＡＲのin  vivo有効性の一連の研究の結果を示す。ＮＳＧマウスは、０日目にｆｆＬｕｃ  ＋  ＰＢＴ０３０−２腫瘍細胞の頭蓋内注射を受け、８日目にＰＢＳ（腫瘍のみ）か、モック形質導入Ｔ細胞か、又は指定されたＩＬ１３Ｒα２特異的ＣＡＲを発現するＴ細胞のいずれかでｉ．ｃ．処置のために、（ｎ＝９〜１０マウス／群）の６群にランダム化した。次いで、定量的生物発光イメージングを行って、時間の経過とともに腫瘍増殖をモニターした。各グループの代表的なマウスの生物発光画像（Ａ）。各群における経時的なルシフェラーゼ活性の総フラックスレベルの平均＋Ｓ．Ｅ．（Ｂ）。２７日目の各マウスのフラックスレベル。ＣＤ２７−ＣＡＲを発現するＴ細胞で処置したものを除いて、ＩＬ１３Ｒα２特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置した全ての群は、模擬形質導入Ｔ細胞で処置したマウスと比較して、統計的に有意な腫瘍体積の減少を示す（Ｃ）。
【図１７】図１７は、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ／  ＣＤ１９ｔ＋（配列番号１０）のアミノ酸配列を示す。
【図１８】図１８は、ＩＬ１３（ＥＱ）４１ＢＢζ［ＩＬ１３（ＥＱ）４１ＢＢζＴ２Ａ−ＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７；ｐＦ０２６３０］（配列番号１２）及びＣＤ１９Ｒｏｐ＿ｅｐＨＩＶ７（ｐＪ０１６８３）（配列番号１３）の配列比較を示す。黄色の強調表示は、ＧＭ  ＣＳＦシグナル配列（ＩＬ１３ｏｐ）を含むＩＬ−１３最適化コンドン領域を示す。強調表示は、ＩｇＧ４最適化コドン領域（ＩｇＧ４ｏｐ  ［Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ｑ］）を示す。強調表示は、ＩｇＧ４ヒンジ領域（Ｌ２３５Ｅ及びＮ２９７Ｑ）内の予想される２つのアミノ酸変化を示す。強調表示は、ＣＤ４膜貫通型の最適化コドン領域を示す。強調表示は４１ＢＢ細胞質シグナル伝達領域（４１ＢＢ  ｃｙｔｏ）を示す。灰強調表示は、３つのグリシンリンカー（ｇ３）を示す。灰色の強調表示は、ＣＤ３ゼータ最適化コドン領域（ｚｅｔａ  ｏｐ）を示す。強調表示はＴ２Ａ配列（Ｔ２Ａ）を示す。強調表示は、短縮型ＣＤ１９配列（ＣＤ１９ｔ）を示す。
【図１９】図１９は、ＩＬ１３（ＥｍＹ）−ＣＤ８ｈ３−ＣＤ８ｔｍ２−４１ＢＢゼータ（ＧＭＳＣＦＲａシグナルペプチドを有する配列番号３１；ＧＭＳＣＦＲａシグナルペプチドを含まない配列番号３９）のアミノ酸配列を示す。
【図２０】図２０は、ＩＬ１３（ＥｍＹ）−ＣＤ８ｈ３−ＣＤ２８ｔｍ−ＣＤ２８ｇｇ−４１ＢＢ−ゼータ（ＧＭＳＣＦＲａシグナルペプチドを有する配列番号３２；ＧＭＳＣＦＲａシグナルペプチドを含まない配列番号４０）のアミノ酸配列を示す。
【図２１】図２１は、ＩＬ１３（ＥｍＹ）−ＩｇＧ４（ＨＬ−ＣＨ３）−ＣＤ４ｔｍ−４１ＢＢ−ゼータ（ＧＭＳＣＦＲａシグナルペプチドを有する配列番号３３；ＧＭＳＣＦＲａシグナルペプチドを含まない配列番号４１）のアミノ酸配列を示す。
【図２２】図２２は、ＩＬ１３（ＥｍＹ）−ＩｇＧ４（Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ｑ）−ＣＤ８ｔｍ−４１ＢＢ−ゼータ（ＧＭＳＣＦＲａシグナルペプチドを有する配列番号３４；  ＧＭＳＣＦＲａシグナルペプチドを含まない配列番号４２）のアミノ酸配列を示す。
【図２３】図２３は、ＩＬ１３（ＥｍＹ）−リンカー−ＣＤ２８ｔｍ−ＣＤ２８ｇｇ−４１ＢＢ−ゼータのアミノ酸配列を示す（ＧＭＳＣＦＲａシグナルペプチドを有する配列番号３５；  ＧＭＳＣＦＲａシグナルペプチドを含まない配列番号４３）。
【図２４】図２４は、ＩＬ１３（ＥｍＹ）−ＨＬ−ＣＤ２８ｍ−ＣＤ２８ｇｇ−４１ＢＢ−ゼータのアミノ酸配列を示す（ＧＭＳＣＦＲａシグナルペプチドを有する配列番号３６；  ＧＭＳＣＦＲａシグナルペプチドを含まない配列番号４４）。
【図２５】図２５は、ＩＬ１３（ＥｍＹ）−ＩｇＧ４（ＨＬ−ＣＨ３）−ＣＤ２８ｔｍ−ＣＤ２８ｇｇ−４１ＢＢ−ゼータのアミノ酸配列を示す（ＧＭＳＣＦＲａシグナルペプチドを有する配列番号３７；  ＧＭＳＣＦＲａシグナルペプチドを含まない配列番号４５）。
【図２６】図２６は、ＩＬ１３（ＥｍＹ）ＩｇＧ４を示す（Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ｑ）−ＣＤ２８ｔｍ−ＣＤ２８ｇｇ−４１ＢＢ−ゼータのアミノ酸配列（ＧＭＳＣＦＲａシグナルペプチドを有する配列番号３８；  ＧＭＳＣＦＲａシグナルペプチドを含まない配列番号４６）。
【図２７】図２７は、ＩＬ１３（ＥｍＹ）−ＣＤ８ｈ３−ＣＤ８ｔｍ−４１ＢＢゼータのアミノ酸配列を示す（ＧＭＳＣＦＲａシグナルペプチドを有する配列番号４７；  ＧＭＳＣＦＲａシグナルペプチドを含まない配列番号４８）。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下に、様々なＩＬ１３Ｒα２特異的キメラ抗原レセプターの構造、構築及び特徴付けについて説明する。キメラ抗原（ＣＡＲ）は、少なくとも細胞外認識ドメイン、膜貫通(transmembrane)領域、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む組換え生体分子である。したがって、用語「抗原」は、抗体に結合する分子に限定されず、標的に特異的に結合することができるいずれの分子に限定されない。例えば、ＣＡＲは、細胞表面受容体に特異的に結合するリガンドを含むことができる。細胞外認識ドメイン（細胞外ドメインとも呼ばれるか、又は単にそれが含む認識要素によっても言及される）は、標的細胞の細胞表面上に存在する分子に特異的に結合する認識要素を含む。膜貫通領域は膜中のＣＡＲを固定する(anchors)。細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３複合体のζ鎖由来のシグナル伝達ドメインを含み、及び必要に応じて１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。ＣＡＲは、ＭＨＣ制限とは無関係に、抗原に結合し、且つ、Ｔ細胞活性化を伝達する(transduce)ことができる。従って、ＣＡＲは、それらのＨＬＡ遺伝子型にかかわらず、抗原陽性腫瘍を有する患者集団を治療することができる「普遍的な(universal)」免疫受容体である。腫瘍特異的ＣＡＲを発現するＴリンパ球を用いる養子(adoptive)免疫療法は、癌の治療のための強力な治療戦略であり得る。
【００３０】
本明細書に記載される１つのＩＬ１３Ｒα２特異的ＣＡＲは、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζと呼ばれる。このＣＡＲは、様々な重要な機能(features)を含み、ＩＬ１３α２への結合の特異性を改善するアミノ酸変化を有するＩＬ１３α２リガンド；有益な共刺激を提供するためにＣＤ３ζと直列のＣＤ１３７（４−１ＢＢ）のドメイン；Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）による結合を減少させる様式でＣＨ２領域（Ｌ２３５Ｅ；  Ｎ２９７Ｑ）内の２つの部位で変異したＩｇＧ４  Ｆｃ領域を含む。本明細書に記載の他のＣＡＲは、第２の共刺激ドメインを含む。
【００３１】
場合によっては、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζＣＡＲを含む本明細書に記載のＣＡＲは、ＣＡＲオープンリーディングフレームの後にＴ２Ａリボソームスキップ配列及びトランケートされたＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）（細胞質シグナル伝達テイルを欠く（アミノ酸３２３でトランケートされた））が続くベクターを用いて作製することができる。この配置では、ＣＤ１９ｔの同時発現(co-expression)は、遺伝子改変細胞の正確な測定を可能にし、且つ、遺伝子改変細胞のポジティブな選択を可能にする不活性で非免疫原性の表面マーカーを提供するだけでなく、細胞の効率的な細胞追跡及び／又は養子移植後のｉｎ  ｖｉｖｏでの治療用Ｔ細胞のイメージングを可能にする。ＣＤ１９ｔの共発現は、臨床的に利用可能な抗体及び／又は治療細胞を選択的に除去し、それによって自殺スイッチとして機能する免疫毒素試薬を使用して、in  vivoでの形質導入細胞の免疫学的標的化のためのマーカーを提供する。
【００３２】
グリオーマは、ＩＬ１３受容体、及び特に高親和性ＩＬ１３受容体を発現する。しかし、ＩＬ１３受容体とは異なり、神経膠腫(glioma)細胞は、ＩＬ４Ｒβ又はγｃ４４の必要条件とは無関係にＩＬ１３に結合することができるユニークなＩＬ１３Ｒα２鎖を過剰発現する。そのホモログＩＬ４と同様に、ＩＬ１３はＣＮＳの外側に多面的(pleotropic)免疫調節活性を有する。ＩＬ１３及びＩＬ４の両方は、Ｂリンパ球によるＩｇＥ産生を刺激し、且つ、マクロファージによる前炎症性サイトカイン産生を抑制する。
【００３３】
放射性標識ＩＬ１３でのオートラジオグラフィーを用いた詳細な研究は、研究されたほとんどすべての悪性神経膠腫組織において豊富なＩＬ１３結合を示した。この結合は、腫瘍セクション内で及び単一細胞分析において非常に均一である。しかしながら、ＩＬ１３Ｒα２ｍＲＮＡに特異的な分子プローブ分析は、正常な脳要素による神経膠腫特異的受容体の発現を検出せず、且つ、放射性標識ＩＬ１３によるオートラジオグラフィーも、正常なＣＮＳにおける特異的ＩＬ１３結合を検出できなかった。これらの研究は、共有されたＩＬ１３Ｒα１／ＩＬ４β／γｃ受容体が正常なＣＮＳにおいて検出可能に発現されないことを示唆している。したがって、ＩＬ１３Ｒα２は、神経膠腫の非常に特異的な細胞表面標的であり、且つ、神経膠腫の治療のために設計されたＣＡＲのための適切な標的である。
【００３４】
しかし、広く発現されるＩＬ１３Ｒα１／ＩＬ４β／γｃ受容体複合体へのＩＬ１３ベースの治療分子の結合は、ＣＮＳ外側の正常組織に対する望ましくない毒性を媒介する可能性を有し、及びしたがって、これらの薬剤(agents)の全身投与を制限する。天然の(native)グルタミン酸に対するチロシンのアミノ酸１３におけるＩＬ１３アルファヘリックスＡにおけるアミノ酸置換は、ＩＬ１３Ｒα１／ＩＬ４β／γｃ受容体に対するＩＬ１３の親和性を選択的に減少させる。しかしながら、この変異体（ＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）と称される）のＩＬ１３Ｒα２への結合は、野生型(wild-type)ＩＬ１３と比較して増加した。したがって、この最小限に改変されたＩＬ１３類似体は、グリオーマ細胞に対するＩＬ１３の特異性及び親和性を同時に増加させる。したがって、本明細書に記載されるＣＡＲは、アミノ酸１３に変異（ＥからＹ又はＥから何かほかのアミノ酸、例えばＫ又はＲ又はＬ又はＶなど）を含むＩＬ１３を含む（Ｄｅｂｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５：３１４３ｓのナンバリングによる）。しかしながら、天然の(natural)配列を有するＩＬ１３も使用することができ、及び特に、改変Ｔ細胞を腫瘍塊に直接注射するなどの局所的に投与する場合に有用であり得る。
【００３５】
本明細書中に記載されるＣＡＲは、当技術分野で公知の任意の手段によって産生され得るが、好ましくは組換えＤＮＡ技術を用いて産生される。キメラ受容体のいくつかの領域をコードする核酸は、当該分野で公知の標準的な分子クローニング技術（ゲノムライブラリースクリーニング、ＰＣＲ、プライマーアシストライゲーション、部位特異的突然変異誘発など）によって調整され、完全なコード配列に組み立てることができる。得られたコード領域は、好ましくは発現ベクターに挿入され、適切な発現宿主細胞株、好ましくはＴリンパ球細胞株、及び最も好ましくは自己Ｔリンパ球細胞株を形質転換するために使用される。
【００３６】
選択されていないＰＢＭＣ又は富化(enriched)ＣＤ３  Ｔ細胞又は富化ＣＤ３又はメモリーＴ細胞サブセットを含む、患者から単離された様々なＴ細胞サブセットは、ＣＡＲ発現のためのベクターで形質導入され得る。セントラルメモリーＴ細胞は、１つの有用なＴ細胞サブセットである。セントラルメモリーＴ細胞は、所望の受容体を発現する細胞を免疫学的に選択するために、例えばＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）装置を使用して、ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ６２Ｌ＋細胞を選択することにより末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離することができる。セントラルメモリーＴ細胞のために富化された細胞は、例えば、ＩＬ１３Ｒα２特異的ＣＡＲ（例えば、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ）の発現を導くＳＩＮレンチウイルスベクターで形質導入された抗ＣＤ３／ＣＤ２８で、並びに、in  vivo検出及び潜在的なex  vivo選択の両方のための非免疫原性表面マーカーであるトランケートされたヒトＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）で、活性化され得る。活性化／遺伝子改変されたセントラルメモリーＴ細胞は、ＩＬ−２／ＩＬ−１５でin  vitroで拡大され、次いで凍結保存され得る。
【実施例】
【００３７】
実施例１：  ＩＬ１３Ｒα２特異的ＣＡＲの構築及び構造
有用なＩＬ１３Ｒα２特異的ＣＡＲの構造を以下に記載する。コドン最適化ＣＡＲ配列は、Ｆｃレセプター媒介認識モデルを大きく減少させる２つの突然変異（Ｌ２３５Ｅ；Ｎ２９７Ｑ）を含むＩｇＧ４ＦｃスペーサーであるＩＬ１３Ｒα１への潜在的結合を減少させるために、単一部位で突然変異した膜結合(membrane-tethered)ＩＬ−１３リガンド（Ｅ１３Ｙ）、ＣＤ４膜貫通ドメイン、共刺激４−１ＢＢ細胞質シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含む。Ｔ２Ａリボソームスキップ配列は、このＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζＣＡＲ配列を、不活性で非免疫原性の細胞表面検出／選択マーカーであるＣＤ１９ｔから分離する。このＴ２Ａ結合は、単一の転写産物からのＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ及びＣＤ１９ｔの両方の座標発現をもたらす。図１Ａは、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ−Ｔ２ＡＣＤ１９ｔ構築物をコードする２６７０ヌクレオチドのオープンリーディングフレームの概略図である。この図では、ＩＬ１３Ｒα２特異的リガンドＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）、ＩｇＧ４（ＥＱ）Ｆｃ、ＣＤ４膜貫通、４−１ＢＢ細胞質シグナル伝達、３−グリシンリンカー及びＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺＣＡＲのＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメイン、並びにＴ２Ａリボソームスキップ及びＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺＣＡＲの短縮型(truncated)ＣＤ１９配列は、すべて示されている。ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺＣＡＲ及びＣＤ１９ｔの表面発現を駆動するヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体α及びＣＤ１９シグナル配列も示される。したがって、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ−Ｔ２ＡＣＤ１９ｔ構築物は、ＩＬ１３Ｒα２特異的ヒンジ最適化、共刺激性キメラ免疫レセプター配列（ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺと呼ばれる）、リボソームスキップＴ２Ａ配列及びＣＤ１９ｔ配列を含む。
【００３８】
ヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体αリーダーペプチドとＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）リガンド５Ｌ２３５Ｅ／Ｎ２９７Ｑ改変ＩｇＧ４Ｆｃヒンジ（二重変異がＦｃＲ認識を妨害する）、ＣＤ４膜貫通、４−１ＢＢ細胞質シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメイン配列との融合によりＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ配列を生成した。この配列は、コドン最適化の後に新規に(de  novo)合成された。Ｔ２Ａ配列は、Ｔ２Ａ含有プラスミドの消化から得た。ＣＤ１９ｔ配列は、リーダーペプチド配列にまたがるものから、ＣＤ１９含有プラスミドの膜貫通成分（すなわち、塩基対１〜９７２）まで得られた。全３つの断片、１）ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ、２）Ｔ２Ａ、及び３）ＣＤ１９ｔを、ｅｐＨＩＶ７レンチウイルスベクターの多重クローニング部位にクローン化した。適切な細胞にトランスフェクトされると、ベクターは図１Ｂに模式的に示された配列を宿主細胞ゲノムに組み込む。図１Ｃは、９５１５塩基対ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ−Ｔ２Ａ−ＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７プラスミドそれ自体の模式図を提供する。
【００３９】
図２に概略的に示すように、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ  ＣＡＲは、いくつかの重要な点において、ＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）Ｒ−ゼータカインと呼ばれる先に記載されたＩＬ１３Ｒα２特異的ＣＡＲとは異なる（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１２  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８：２１９９）。ＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）−ゼータカインは、示されるように、ＩＬ１３Ｒα２特異的ヒトＩＬ−１３ムテイン(mutein)（ｈｕＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ））、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃスペーサー（ｈｕγ４Ｆｃ）、ヒトＣＤ４膜貫通（ｈｕＣＤ４  ｔｍ）及びヒトＣＤ３ζ鎖細胞質ｈｕＣＤ３ζｃｙｔ）部分から構成される。対照的に、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ）は、ＩｇＧ４スペーサーのＣＨ２ドメインに位置する２つの点変異、Ｌ２３５Ｅ及びＮ２９７Ｑ、及び共刺激４−１ＢＢ細胞質ドメイン（４−１ＢＢ細胞）を有する。対照的に、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ）は、ＩｇＧ４スペーサーのＣＨ２ドメインに位置する２つの点変異、Ｌ２３５Ｅ及びＮ２９７Ｑ、及び共刺激４−１ＢＢ細胞質ドメイン（４−１ＢＢ細胞）を有する。
【００４０】
実施例２：  ＩＬ１３Ｒα２特異的ＣＡＲの発現に使用されるｅｐＨＩＶ７の構築及び構造
ｐＨＩＶ７プラスミドは、臨床ベクターＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ−Ｔ２Ａ−ＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７がＣｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｏｐｅ（ＣＯＨ）のＴ細胞治療研究研究所（ＴＣＴＲＬ）で得られた親プラスミドである。ＣＡＲの発現に用いたｅｐＨＩＶ７ベクターは、ｐＨＩＶ７ベクターから作製した。重要なことに、このベクターは、ヒトＥＦ１プロモーターを用いてＣＡＲの発現を駆動する。ベクターの５’及び３’配列はいずれも以前にＨＸＢｃ２プロウイルスから派生したように、ｐｖ６５３ＲＳＮ由来であった。ポリプリントラクトフラップ配列（ｃＰＰＴ）は、ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＲｅｐｏｓｉｔｏｒｙからのＨＩＶ−１株ｐＮＬ４−３由来であった。ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）配列は以前に記載されている。
【００４１】
ｐＨＩＶ７の構築を図３に概略的に示す。簡単に説明すると、介在するＳＬ３−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｎｅｏ）を有するｇａｇ−ｐｏｌプラス５‘及び３’長末端反復配列（ＬＴＲ）由来６５３ｂｐを含むｐｖ６５３ＲＳＮは、以下のようにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングした。：  ステップ１では、５’ＬＴＲからｒｅｖ−応答エレメント（ＲＲＥ）の配列がｐ５‘ＨＩＶ−１  ５１となり、次に５’ＬＴＲがＴＡＴＡボックスの上流の配列を除去することによって改変され、最初にＣＭＶエンハンサーに連結し、次にＳＶ４０複製起点に連結した（ｐ５‘ＨＩＶ−２）。ステップ２では、３’ＬＴＲをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングして、ｐ３’ＨＩＶ−１を作製した後、３’ＬＴＲエンハンサー／プロモーターにおける４００ｂｐの欠失を行い、ＨＩＶ  Ｕ３中のシス調節エレメントを除去し、ｐ３’ＨＩＶ−２を形成した。ステップ３では、ｐ５’ＨＩＶ−３及びｐ３’ＨＩＶ−２から単離した断片をライゲーションしてｐＨＩＶ−３を作製した。ステップ４では、ｐ３’ＨＩＶ−３を生成するために余分な上流のＨＩＶ配列を除去することによりｐ３’ＨＩＶ−２をさらに修飾し、ｐ３’ＨＩＶ−３にＷＰＲＥを含む６００ｂｐのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩフラグメントを添加してｐ３’ＨＩＶ−４を作製した。ステップ５では、ｐＨＩＶ−３  ＲＲＥをＰＣＲによりサイズを減少させ、ｐＨＩＶ−３（示さず）由来５’断片に、及びｐ３’ＨＩＶ−４ライゲーションして、ｐＨＩＶ−６を作製した。ステップ６では、ＨＩＶ−１  ｐＮＬ４−３（５５）由来のｃＰＰＴ  ＤＮＡフラップ配列を含む１９０ｂｐのＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをｐＮＬ４−３から増幅し、ｐＨＩＶ６のＲＲＥ配列とＷＰＲＥ配列の間に配置してｐＨＩＶ−７を作製した。この親プラスミドｐＨＩＶ７−ＧＦＰ（ＧＦＰ、緑色蛍光タンパク質）を用いて、４−プラスミド系を用いて親ベクターをパッケージングした。
【００４２】
ウイルスゲノムをベクターに効率的にパッケージングするためには、パッケージングシグナル、ｐｓｉΨが必要とされる。ＲＲＥ及びＷＰＲＥは、ＲＮＡ転写物の輸送及び導入遺伝子の発現を増強する。フラップ配列は、ＷＰＲＥと組み合わせて、哺乳類細胞におけるレンチウイルスベクターの形質導入効率を高めることが実証されている。
【００４３】
ウイルスベクターの産生に必要なヘルパー機能）は、３つの別個のプラスミドに分割され、組換えによる複製コンピテントレンチウイルスの生成の確率を低下させる。：
１）ｐＣｇｐは、ウイルスベクターアセンブリに必要なｇａｇ／ｐｏｌタンパク質をコードする。
【００４４】
２）ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ２は、効率的なパッケージングのためにウイルスゲノムの輸送を助けるためにＲＲＥ配列に作用するＲｅｖタンパク質をコードする。
【００４５】
３）ｐＣＭＶ−Ｇは、ウイルスベクターの感染性のために必要とされる水疱性口炎ウイルス（vesiculo-stomatitis  virus,  ＶＳＶ）の糖タンパク質をコードする。
【００４６】
ｐＨＩＶ７にコードされたベクターゲノムとヘルパープラスミドとの間に最小のＤＮＡ配列相同性が存在する。相同性の領域は、
ｐＣｇｐヘルパープラスミドのｇａｇ／ｐｏｌ配列中に位置する約６００ヌクレオチドのパッケージングシグナル領域；
３種全てのヘルパープラスミド中のＣＭＶプロモーター配列；及び
ヘルパープラスミドｐＣｇｐ中のＲＲＥ配列
を含む。多数の組換え事象を必要とするので、これらの領域の相同性に起因して複製コンピテント組換えウイルスが生成される可能性は非常に低い。加えて、得られたいずれの組換え体は、レンチウイルス複製に必要な機能的ＬＴＲ及びｔａｔ配列を欠いているであろう。
【００４７】
ＣＭＶプロモーターをＥＦ１α−ＨＴＬＶプロモーター（ＥＦ１ｐ）で置き換え、新しいプラスミドをｅｐＨＩＶ７と命名した（図４）。ＥＦ１ｐは５６３ｂｐを有し、ＣＭＶプロモーターを切除した後、ＮｒｕＩ及びＮｈｅＩを用いてｅｐＨＩＶ７に導入した。
【００４８】
野生型ウイルスの病原性に必要であり、標的細胞の生産的感染に必要とされるｇａｇ／ｐｏｌ及びｒｅｖを除くレンチウイルスゲノムは、この系から除かれている。加えて、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ−Ｔ２ＡＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７ベクター構築物はインタクトな３’ＬＴＲプロモーターを含有しないので、標的細胞における発現及び逆転写ＤＮＡプロウイルスゲノムは不活性ＬＴＲを有する。この設計の結果、ＨＩＶ−１由来(derived)配列はプロウイルスから転写されず、治療配列のみがそれぞれのプロモーターから発現される。ＳＩＮベクターにおけるＬＴＲプロモーター活性の除去は、宿主遺伝子の意図しない活性化の可能性を有意に減少させることが期待される（５６）。表４は、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ−Ｔ２ＡＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７に存在する種々のレギュレーター要素をまとめたものである。
【００４９】
表４：  ＩＬ１３（ＥＱ）４１ＢＢＺ−Ｔ２Ａ−ＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７の機能的要素
【表４】
0006657195.tif 000006
【００５０】
実施例３：患者Ｔ細胞の形質導入のためのベクターの作製
各プラスミド（ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ−Ｔ２Ａ−ＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７；ｐＣｇｐ；ｐＣＭＶ−Ｇ；及びｐＣＭＶ−Ｒｅｖ２）について、十分な量のプラスミドＤＮＡを産生するために発酵槽に接種するために使用されるシードバンクが生成される。プラスミドＤＮＡは、レンチウイルスベクターの産生に使用する前に、同一性、無菌性及びエンドトキシンについて試験される。
【００５１】
簡単に述べると、細胞を、２９３Ｔ作業細胞（ＷＣＢ）から増殖させ、無菌性及びウイルス汚染の存在を確認するために試験した。２９３Ｔ  ＷＣＢからの２９３Ｔ細胞のバイアルを解凍した(thawed)。十分な数の細胞が存在し、ベクター産生及び細胞培養の維持のために適切な数の１０層細胞工場（ＣＦ）をプレートするまで、細胞を成長させ、増殖させた。単一の細胞列を生産に使用することができる。
【００５２】
レンチウイルスベクターは、１０  ＣＦまでのサブバッチで産生された。同じ週に２つのサブバッチを作製することができ、約２０Ｌのレンチウイルス上清／週の産生をもたらす。１つのロットの製品を製造するために、すべてのサブバッチから製造された材料を下流の処理段階でプールした。２９３Ｔ細胞を２９３Ｔ培地（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）中でＣＦ中に播種した。ファクトリーを３７℃のインキュベーターに置き、ＣＦのすべての層上に細胞の均一な分布を得るために水平に平らにした。２日後、Ｔｒｉｓ：ＥＤＴＡ、２Ｍ  ＣａＣｌ２、２Ｘ  ＨＢＳ、及び４つのＤＮＡプラスミドの混合物を含むＣａＰＯ４法を用いて、上記の４つのレンチウイルスプラスミドを細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後３日目に、分泌されたレンチウイルスベクターを含む上清を回収し、精製し、濃縮した。上清をＣＦから取り除いた後、各ＣＦからエンド・オブ・プロダクション・セルを回収した。各ファクトリーから細胞をトリプシン処理し、遠心分離により収集した。細胞を凍結培地に再懸濁し、凍結保存した。これらの細胞は、その後、複製能力のある(replication-competent)レンチウイルス（ＲＣＬ）試験に使用された。
【００５３】
ベクターを精製及び製剤化するために、細胞の破片(debris)を除去するために膜濾過によって粗製上清を清澄化した。宿主細胞ＤＮＡ及び残存プラスミドＤＮＡは、エンドヌクレアーゼ消化（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標））によって分解された。ウイルス上清を０．４５μｍのフィルターを用いて細胞破片について清澄化した。清澄化された上清を予め秤量した容器に採取し、そこにＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）を加えた（最終濃度５０Ｕ／ｍＬ）。残留プラスミドＤＮＡ及び宿主ゲノムＤＮＡに対するエンドヌクレアーゼ消化は、３７℃で６時間行った。エンドヌクレアーゼ処理した上清の初期接線流限外濾過（ＴＦＦ）濃度を用いて、粗上清から残留低分子量成分を除去し、ウイルスを約２０倍濃縮した。浄化されたエンドヌクレアーゼ処理ウイルス上清を、５００ｋＤのＮＭＷＣＯを有する中空繊維カートリッジに、流速(flux  rate)を最大にしながら、剪断速度を約４，０００秒−１以下に維持するように設計された流速で循環させた。ヌクレアーゼ処理された上清のダイアフィルトレーションは、カートリッジの性能を維持するために濃縮プロセスの間に開始された。ダイアフィルトレーション緩衝液としてＰＢＳ中に４％ラクトースを使用して、８０％透過物置換率を確立した。ウイルス上清を標的体積に持ってきて、２０倍濃度の粗上清を示し、透析液交換率を１００％として４回の追加交換容量でダイアフィルトレーションを続けた。
【００５４】
ウイルス産物のさらなる濃縮は、高速遠心分離技術を使用することによって達成された。レンチウイルスの各サブバッチを、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ−２６プラス６０００  ＲＰＭ（６，０８８  ＲＣＦ）で、６℃で１６−２０時間遠心分離してペレット化した(pelleted)。次いで、各サブバッチからのウイルスペレットをＰＢＳ中の４％ラクトースを含む５０ｍＬ容量で再構成した。この緩衝液中の再構成されたペレットは、ウイルス調製のための最終製剤を表す。ベクター濃縮プロセス全体は約２００倍の体積減少をもたらした。全てのサブバッチの完了後、材料を次に−８０℃に置き、各サブバッチからの試料を無菌性について試験した。サンプルの無菌性を確認した後、サブバッチを３７℃で頻繁に撹拌しながら急速に解凍した。次いで、この物質をプールし、ウイルスベクタースイート(suite)のクラスＩＩ型Ａ／Ｂ３バイオセーフティキャビネット内にマニュアルでアリコートした。滅菌ＵＳＰクラス６、外周ネジ(externally  threaded)Ｏリングクリオバイアル中の濃縮レンチウイルス１ｍＬの充填構成を使用した。ＣＯＨの応用技術開発センター（ＣＡＴＤ）の品質システム（ＱＳ）は、ＣＢＧのためのポリシーと標準的な運用手順に従い、現在のグッド・マニュファクチャリング・プラクティス（ｃＧＭＰ）に準拠してすべての材料(materials)をリリースした。
【００５５】
レンチウイルスベクター調製物の純度を保証するために、残留宿主ＤＮＡ混入物及び残留宿主及びプラスミドＤＮＡの移入について試験した。他の試験の中でも、正確なベクターが存在することを確実にするために、ＲＴ−ＰＣＲによってベクター同一性を評価した。すべての放出基準は、この研究での使用を意図したベクターについて満たされた。
【００５６】
実施例４：  ＡＣＴでの使用に適したＴ細胞の調製
Ｔリンパ球は、白血球除去(leukopheresis)によって患者から得られ、適切な同種異系又は自己Ｔ細胞サブセット、例えばセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、ＣＡＲを発現するように遺伝的に改変され、次いで抗癌治療を達成するために、いずれの臨床上許容される手段を提供する。
【００５７】
ＴＣＭの製造戦略の概要を図８に示す（ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ／ＣＤ１９ｔ＋  ＴＣＭの製造スキーマ）。具体的には、合意された研究参加者から得られたアフェレーシス(apheresis)産物を、フィコール（ficolled）、洗浄し、一晩インキュベートする。ＧＭＰグレードの抗ＣＤ１４、抗ＣＤ２５及び抗ＣＤ４５ＲＡ試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）及びＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）分離装置を用いて、単球、調節性Ｔ細胞及びナイーブＴ細胞集団を細胞から枯渇させる。枯渇(depletion)後、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）分離装置でＤＲＥＧ５６−ビオチン（ＣＯＨ臨床グレード）及び抗ビオチンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、ＣＤ６２Ｌ＋  ＴＣＭ細胞について陰性画分細胞を富化する(enriched)。
【００５８】
富化後、ＴＣＭ細胞を、完全なＸ−Ｖｉｖｏ１５プラス５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２及び０．５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５中に処方し、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）細胞培養バッグに移し、Ｄｙｎａｌ  ＣｌｉｎＥｘ（登録商標）Ｖｉｖｏ  ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激した。刺激の５日後まで、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ−Ｔ２Ａ−ＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７レンチウイルスベクターを用いて感染多重度（ＭＯＩ）１．０〜０．３で細胞に形質導入する。細胞増殖に必要な完全なＸ−Ｖｉｖｏ１５及びＩＬ−２及びＩＬ−１５サイトカインの添加により４２日まで培養を維持する（細胞密度は３×１０５〜２×１０６生存細胞／ｍＬ、培養の毎週月曜日、水曜日及び金曜日のサイトカイン補充を維持する）。細胞は、典型的には、２１日以内にこれらの条件下で約１０９細胞に拡大する。培養期間の終わりに、細胞を採取し、２回洗浄し、臨床等級の凍結保存培地（Ｃｒｙｏｓｔｏｒｅ  ＣＳ５，ＢｉｏＬｉｆｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）中で処方する。
【００５９】
Ｔ細胞注入の日（複数可）に、低温保存及び放出された生成物を解凍し、洗浄し、再注入のために処方する。放出された細胞産物を含有する低温保存バイアルを液体窒素貯蔵から取り出し、解凍し、冷却し、ＰＢＳ／２％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）洗浄緩衝液で洗浄する。遠心分離後、上清を除去し、細胞を保存料なし通常生理食塩水（ＰＦＮＳ）／２％ＨＳＡ輸液希釈液に再懸濁する。品質管理試験のためにサンプルを取り除く。
【００６０】
健康ドナーから調達された細胞についての２つの適格試験(qualification  runs)を、上記の製造プラットフォームを使用して実施した。各前臨床適格試験製品には、ヒトドナー（ＨＤ）番号ＨＤ００６．５及びＨＤ１８７．１が割り当てられた。重要なことに、表５に示すように、これらの適格試験は２８日以内に＞８０倍に拡大し、増殖した細胞はＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢγ／ＣＤ１９ｔトランスジーンを発現した。
【００６１】
表５：  臨床前の適格試験製品からの発現データの要約
【表５】
0006657195.tif 000007
【００６２】
実施例５：  ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢγ／ＣＤ１９ｔ＋  ＴＣＭにおける表面トランスジーン導入遺伝子及びＴ細胞マーカー発現のフローサイトメトリー分析
実施例４に記載されている２つの前臨床適格試験製品を、前臨床試験で以下に記載するように使用した。図６Ａ〜Ｃは、表面トランスジーン及びＴ細胞マーカー発現のフローサイトメトリー分析の結果を示す。ＩＬ−１３（ＥＱ）ＢＢγ／ＣＤ１９ｔ＋  ＴＣＭ  ＨＤ００６．５及びＨＤ１８７．１を抗ＩＬ−１３−ＰＥ及び抗ＣＤ８−ＦＩＴＣで共染色してＣＤ８＋  ＣＡＲ＋及びＣＤ４＋（すなわちＣＤ８陰性）ＣＡＲ＋細胞を検出した（図６Ａ）。又は抗ＣＤ１９−ＰＥ及び抗ＣＤ４−ＦＩＴＣを用いてＣＤ４＋  ＣＤ１９ｔ＋及びＣＤ８＋（すなわちＣＤ４陰性）ＣＡＲ＋細胞を検出することができる（図６Ｂ）。ＴＣＲ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ２８（灰色ヒストグラム）又はアイソタイプ対照（黒色ヒストグラム）でＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢγ／ＣＤ１９ｔ＋  ＴＣＭ  ＨＤ００６．５及びＨＤ１８７．１を染色した。（図６Ｃ）。図６Ａ〜Ｃのそれぞれにおいて、示されたパーセンテージは、アイソタイプの上に染色された生存リンパ球（ＤＡＰＩ陰性）に基づく。
【００６３】
実施例６：  ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢγ／ＣＤ１９ｔ＋  ＴＣＭのエフェクター活性
ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ／  ＣＤ１９ｔ＋  ＴＣＭのエフェクター活性を評価し、この分析の結果を図７Ａ〜Ｂに示す。簡単に説明すると、ＩＬ１９（ＥＱ）ＢＢγ／ＣＤ１９ｔ＋  ＴＣＭ  ＨＤ００６．５及びＨＤ１８７．１を、ＣＤ１９ｔ発現に基づく１０Ｅ：１Ｔ比を使用する６時間５１Ｃｒ放出アッセイにおいてエフェクターとして使用した。ＩＬ１３Ｒα２陽性腫瘍標的は、ＩＬ１３Ｒα２（Ｋ５６２−ＩＬ１３Ｒα２）及び一次神経膠腫系統ＰＢＴ０３０−２を発現するように操作されたＫ５６２であり、ＩＬ１３Ｒα２陰性腫瘍標的対照はＫ５６２親系統であった（図７Ａ）。ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢγ／ＣＤ１９ｔ＋  ＨＤ００６．５及びＨＤ１８７．１を、上記のように同じＩＬ１３Ｒα２陽性及び陰性標的を用いて１０Ｅ：１Ｔ比で一晩の共培養後の抗原依存性サイトカイン産生について評価した。サイトカインレベルは、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  ＰｒｏヒトサイトカインＴＨ１／ＴＨ２アッセイキットを用いて測定し、ＩＮＦ−γレベルを示す（図７Ｂ）。
【００６４】
実施例７：ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢγ／ＣＤ１９ｔ＋  ＴＣＭのin  vivo抗腫瘍活性
以下に記載される研究は、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢγ／ＣＤ１９ｔ＋  ＴＣＭがin  vivoマウスモデルにおいて抗腫瘍効果を示すことを実証する。具体的には、我々は、ＥＧＦＰ及びホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）レポーター遺伝子の両方を発現するように操作されたＩＬ１３Ｒα２＋初代低−継代グリア芽細胞腫腫瘍球系統(line)ＰＢＴ０３０−２に対するＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢγ／ＣＤ１９ｔ＋  ＴＣＭの抗腫瘍効力を評価した（ＰＢＴ０３０−２  ＥＧＦＰ：ｆｆＬｕｃ）（６）。無血清培地中で腫瘍球（ＴＳ）として増殖した患者の神経膠芽腫標本由来の一次系統（ＰＢＴ）のパネル。これらの拡張されたＴＳ系統は、幹細胞マーカーの発現、多細胞分化及び低い細胞数で免疫無防備状態のマウス（ＮＳＧ）において同所性腫瘍を開始する能力を含む幹細胞様の特徴を示す。ＩＬ−１３Ｒα２特異的ＣＡＲ発現Ｔ細胞のＮＳＧマウスにおけるin  vivo抗腫瘍活性を評価するために、ＰＢＴ０３０−２  ＥＧＦＰ：ｆｆＬｕｃ  ＴＳ開始異種移植片モデル（０．１×１０６細胞；  ５日生着）を以前に使用しており、それにより、２×１０６  ２週間にわたる細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の３回の注入は、腫瘍増殖を減少させることが示された。しかし、これらの実験では、ＰＢＴ０３０−２腫瘍の大部分が最終的に再発した。対照的に、ＰＢＴ０３０−２  ＥＧＦＰ：ｆｆＬｕｃ  ＴＳ開始腫瘍（０．１×１０６細胞；  ５日間の生着）に対して、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢγ／ＣＤ１９ｔ＋  ＴＣＭ（１．１×１０６  ＣＡＲ＋  ＴＣＭ；  ２×１０６全ＴＣＭ）の単一回注射は、図８Ａ〜Ｃに示すように）。ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢγ／ＣＤ１９ｔ＋  ＴＣＭは、ＰＢＳ又はモック(mock)形質導入ＴＣＭ（ＣＡＲ無し）で処置したＮＳＧマウスと比較して、ｆｆＬｕｃフラックス(flux)を有意に減少させ（ｐ＜０．００１、＞１８日）、生存率を有意に改善する（ｐ＝０．０００８）。
【００６５】
簡潔には、ＥＧＦＰ−ｆｆＬｕｃ＋  ＰＢＴ０３０−２腫瘍細胞（１×１０５）をＮＳＧマウスの右前脳内に定位固定的に移植した。５日目に、２×１０６  ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢγ／ＣＤ１９ｔ＋  ＴＣＭ（１．１×１０６  ＣＡＲ＋；  ｎ＝６）、２×１０６モックＴＣＭ（ＣＡＲなし、ｎ＝６）又はＰＢＳ（ｎ＝６）のいずれかを受けた。図８Ａは、各群の代表的なマウスを示し、Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅを用いた相対腫瘍負荷を示す。ｆｆＬｕｃフラックス（光子／秒）の定量化は、モック形質導入ＴＣＭ及びＰＢＳと比較してＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ／ＣＤ１９ｔ＋  ＴＣＭが腫瘍退縮を誘導することを示す（＃ｐ＜０．０２、＊ｐ＜０．００１、反復測定ＡＮＯＶＡ）（図８Ｂ）。図８Ｃに示すように、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢγ／ＣＤ１９ｔ＋  ＴＣＭで処置したマウスについて、Ｋａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ生存曲線（１群につきｎ＝６）が有意に改善された生存を示す（ｐ＝０．０００８；対数ランク検定）。
【００６６】
実施例８：  抗腫瘍効力及びＴ細胞持続性におけるＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ＋  Ｔｃｍ及び非Ｔｃｍ  ＩＬ１３−ゼータカインＣＤ８＋  ＣＴＬクローンの比較
以下に記載される研究は、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ＋  Ｔｃｍと以前に作製されたＩＬ１３Ｒα２特異的ヒトＣＤ８＋  ＣＴＬを比較した（（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１２  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １８：２１９９  及びＫａｈｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００４  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４：９１６０に記載される）ＩＬ１３−ゼータカインＣＤ８＋  ＣＴＬ）。ＩＬ１３−ゼータカインはＣＤ３ζ刺激ドメインを使用し、共刺激ドメインを欠き、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ＋と同じＩＬ１３変異体を使用する。ＩＬ１３−ゼータカインは、ＣＤ３ζ刺激ドメインを使用し、共刺激ドメインを欠き、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ＋と同じＩＬ１３変異体を使用する。
【００６７】
無血清培地中で腫瘍球（ＴＳ）として増殖させた患者の神経膠芽細胞腫検体からの一次系統（ＰＢＴ）のパネルを作製した（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１２  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １８：２１９９；  Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６９：８８８６）。これらの拡大されたＴＳ系統は、幹細胞マーカーの発現、多系統分化及び低い細胞数で免疫無防備状態のマウス（ＮＳＧ）において同所性腫瘍を開始する能力を含む幹細胞様の特徴を示す。ＥＧＦＰ及びホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）レポーター遺伝子（ＰＢＴ０３０−２  ＥＧＦＰ：ｆｆＬｕｃ）（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１２  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １８：２１９９）の両方を発現するように操作されたＩＬ１３Ｒα２＋初代低−継代グリア芽細胞腫ＴＳ系ＰＢＴ０３０−２を、以下に概説する実験のために使用した。
【００６８】
最初に、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ＋  Ｔｃｍ産物の単一回投与（１×１０６  ＣＡＲ  Ｔ細胞）を、８日目にＰＢＴ０３０−２  ＥＧＦＰ：ｆｆｕｃ  ＴＳ開始異種移植片（０．１ｘ１０６細胞）に対して評価したＩＬ１３−ゼータカインＣＤ８＋  ＣＴＬクローンと比較した。ＩＬ１３Ｒα２特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＩＬ１３−ゼータカインＣＴＬ及びＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζＴｃｍ）は、未処理及びモックＴｃｍ（ＣＡＲ陰性）コントロール（図９Ａ及び９Ｂ）と比較して、確立ＰＢＴ０３０−２腫瘍に対する抗腫瘍活性を示したが、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ＋  Ｔｃｍは、我々の第１世代のＩＬ１３−ゼータカインＣＤ８  ＋  ＣＴＬクローンと比較して１５０日以上生存しているマウスで有意に改善された生存及び耐性腫瘍寛解を媒介した（図９Ｃ）。
【００６９】
これらの２つのＩＬ１３Ｒα２−ＣＡＲ  Ｔ細胞産物の治療有効性をさらに比較するために、８日目のＰＢＴ０３０−２  ＥＧＦＰ：ｆｆｕｃ  ＴＳ開始腫瘍に対する１．０，０．３及び０．１×１０  ６  ＣＡＲ  Ｔ細胞の用量滴定を行った（図１０Ａ〜Ｃ）。ＩＬ１３−ゼータカインＣＤ８  ＋  ＣＴＬ  ｃｌ．２Ｄ７の最高用量（１×１０６）媒介性抗腫瘍応答が、６匹中３匹の動物におけるＸｅｎｏｇｅｎ  Ｆｌｕｘによって測定されたが（図１０Ｃ）、より低いＣＡＲ  Ｔ細胞用量で有意な抗腫瘍応答は観察されなかった。比較すると、ＩＬｘ（ＥＱ）ＢＢζ＋  Ｔｃｍ産物の注入は、０．１×１０６  ＣＡＲ  Ｔ細胞のような少数の処置を含む、全ての用量レベルで大部分のマウスにおいて完全な腫瘍退縮を媒介した。これらのデータは、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ＋  Ｔｃｍが、抗腫瘍効力においてＩＬ１３−ゼータカインＣＤ８＋  ＣＴＬクローンより少なくとも１０倍強力であることを実証する。改善された抗腫瘍効果は、腫瘍微小環境における改善されたＴ細胞持続性によるものである。ｉ．ｃ．注入の７日後のＣＤ３＋  Ｔ細胞の評価は、腫瘍微小環境において有意な数のＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ＋  Ｔｃｍを示したが、第１世代のＩＬ１３−ゼータＣＴＬはほとんど存在しなかった（図１１）。
【００７０】
実施例９：  大きなＴＳ開始ＰＢＴ腫瘍の治療のためのＣＡＲ  Ｔ細胞送達経路の比較
以下は、侵襲性原発性ＰＢＴ系統に対する抗腫瘍活性について、静脈内（ｉ．ｖ．）又は頭蓋内（ｉ．ｃ．）の送達経路を比較する試験である。パイロット研究（データ示さず）では、予想外にｉ．ｖ．  ＰＢＴ０３０−２  ＥＧＦＰ：ｆｆＬｕｃ腫瘍の処置のためのＰＢＳと比較して、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ＋  Ｔｃｍ投与の治療効果は得られなかった。これは、ｉ．ｃ．投与したＣＡＲ＋  Ｔ細胞で観察された頑強な治療効力とは対照的である。ＰＢＴ０３０−２腫瘍の５日目が、末梢から治療用Ｔ細胞を補充するには小さすぎる可能性があると推論すると、より大きい１９日目のＰＢＴ０３０−２  ＥＧＦＰ：ｆｆＬｕｃ腫瘍に対するｉ．ｖ．対(versus)ｉ．ｃ．送達から構成される比較をした。これらの研究のために、ＰＢＴ０３０−２移植マウスを、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ＋  Ｔｃｍ、又はモックＴｃｍ（ＣＡＲなし）の２つのｉ．ｖ．注入（５×１０６ＣＡＲ＋  Ｔｃｍ；１９日目及び２６日目）又は４回のｉ．ｃ．注入(infusion)（１×１０６ＣＡＲ＋  Ｔｃｍ；１９、２２、２６及び２９日目）で処置した。ここでも、ｉ．ｖ．投与されたＣＡＲ＋  Ｔ細胞に対するＸｅｎｏｇｅｎイメージング又はＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存分析によってモニターされる治療上の利点はない（図１２Ａ及び１２Ｂ）。対照的に、強力な抗腫瘍活性が、ｉ．ｃ．投与したＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ＋  Ｔｃｍの場合に観察された（図１２Ａ〜Ｂ）。次に、Ｔ細胞注射の７日後のマウスコホート(cohort)から脳を採取し、ＩＨＣによってＣＤ３  ＋ヒトＴ細胞について評価した。驚くべきことに、モックＴｃｍ又はＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζＴｃｍのいずれかで、ｉ．ｖ．処理したマウスの場合、腫瘍又はヒトＴ細胞が典型的に存在するマウス脳領域（すなわち、軟髄膜）において検出可能なＣＤ３＋ヒトＴ細胞は存在しなかった（図１２Ｃ）、腫瘍親和性(tropism)の欠損を示唆する。これは、ｉ．ｃ．処理したマウスで検出された有意な数のＴ細胞とは対照的である（図１２Ｄ）。
【００７１】
腫瘍由来サイトカイン、特にＭＣＰ−１／ＣＣＬ２は、腫瘍へのＴ細胞の補充に重要である。したがって、ＰＢＴ０３０−２腫瘍細胞を評価したところ、この系統は、これまでにｉ．ｃ．移植された腫瘍にｉ．ｖ．投与されたエフェクターＣＤ８＋  Ｔ細胞を誘引することが示された神経膠腫系統、Ｕ２５１Ｔ細胞に匹敵する高レベルのＭＣＰ−１／ＣＣＬ２を産生することが分かった（データは示していない）。悪性神経膠腫は、高度に浸潤性の腫瘍であり、しばしば提示において多焦点である。上記の研究は、ＩＬ１３ＢＢＺ  ＴＣＭが浸潤したＰＢＴ０３０−２などの腫瘍を排除し、長期耐久性抗腫瘍活性を媒介することができることを立証している。多巣性疾患へのトラフィックへの頭蓋内送達ＣＡＲ  Ｔ細胞の能力もまた調べた。この研究のために、ＰＢＴ０３０−２  ＥＧＦＰ：左半球及び右半球の両方にｆｆＬｕｃ  ＴＳを移植し（図１３Ａ）、ＣＡＲ＋  Ｔ細胞を右の腫瘍部位にのみ注射した。我々は、評価された全てのマウス（ｎ＝３）について、注射部位（すなわち右腫瘍）及び左半球の腫瘍内の両方においてＴ細胞注入後７日目のＣＤ３  ＩＨＣによってＴ細胞を検出した（図１３Ｂ）。これらの知見は、ＣＡＲ＋  Ｔ細胞が離れた部位で腫瘍病巣に入り込んで(traffic)且つ、浸潤することができるというエビデンスを提供する。Ｕ２５１Ｔ神経膠腫細胞系を用いた第２の腫瘍モデルにおいても同様の所見が観察された（データ示さず）。
【００７２】
実施例１０：  共刺激ドメインの比較
種々の共刺激ドメインを評価するために一連の研究を行った。評価した種々のＣＡＲを図１４Ａに模式的に示し、共刺激ドメインを欠く第一世代のＣＤ３ζＣＡＲ、４−１ＢＢ共刺激ドメイン又はＣＤ２８共刺激ドメインのいずれかを組み込んだ第二世代のＣＡＲ２つ、及びＣＤ２８共刺激ドメイン及び４１ＢＢ共刺激ドメインを両方含有する第３世代のＣＡＲを含んだ。全てのＣＡＲ構築物はまた、形質導入細胞のマーカーとして、Ｔ２Ａリボソームスキップ配列及び短縮型ＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）配列を含む。
【００７３】
ＣＤ４及びＣＤ８  ＴＣＭをレンチウイルスで形質導入し、ＣＡＲ発現Ｔ細胞を抗ＣＤ１９を介して免疫学的に富化した(enriched)。フローサイトメトリーで測定したＣＤ１９及びＩＬ１３（すなわち、ＣＡＲ）発現レベル。結果を図１４Ｂに示す。各ＣＡＲ構築物の安定性は、ＣＡＲ（ＩＬ１３）平均蛍光強度（ＭＦＩ）を形質導入マーカー（ＣＤ１９ｔ）のそれで割ることによって決定した（図１４Ｃ）。４−１ＢＢ共刺激ドメインを含む２つのＣＡＲは、ＣＤ１９ｔ形質導入マーカーと比較して最も低い発現レベルを示した。
【００７４】
ＩＬ１３Ｒα２発現ＰＢＴ０３０−２腫瘍細胞標的を死滅させる指示されたモック形質導入又はＣＡＲ発現Ｔ細胞の能力を、指示されたエフェクター：標的比で、４時間５１Ｃｒ放出アッセイで決定した。この研究の結果を図１５Ａに示す（３重(triplicate)ウェルの平均クロム放出％±Ｓ．Ｄ．が示されている）。予想通り、モック形質導入Ｔ細胞は標的を効率的に溶解しなかった。対照的に、全てのＣＡＲ発現Ｔ細胞は同様の様式で腫瘍細胞を溶解した。図１５Ｂは、示されたモック形質導入又はＣＡＲ発現Ｔ細胞を、ＩＬ１３Ｒα２発現ＰＢＴ０３０−２腫瘍細胞と１０：１の比で一晩共培養し、上清をサイトメトリービーズアレイによるＩＬ−１３及びＩＦＮ−γレベルについて分析した研究の結果を示す。興味深いことに、ζ、４１ＢＢ−ζ又はＣＤ２８−４１ＢＢ−ζＣＡＲを発現するＴ細胞は、ＣＤ２８−ζＣＡＲを発現するＴ細胞よりも低い抗原刺激性サイトカイン産生を示した。
【００７５】
種々のＣＡＲのin  vivo有効性を以下のように試験した。簡潔に述べると、ＮＳＧマウスは、０日目にｆｆＬｕｃ＋  ＰＢＴ０３０−２腫瘍細胞の頭蓋内注射を受け、８日目にＰＢＳ（腫瘍のみ）、模擬形質導入Ｔ細胞又は指定されたＩＬ１３Ｒα２特異的ＣＡＲを発現するＴ細胞のいずれかでｉ．ｃ．処置した６群に（６〜１０匹マウス／群）にランダム化した。次いで、定量的生物発光イメージングを行って、時間の経過とともに腫瘍増殖をモニターした。各群における代表的なマウスの生物発光像（図１６Ａ）。２７日目の各マウスについてのフラックスレベル（図１６Ｂ）。ＣＤ２８−ＣＡＲを発現するＴ細胞で処置したものを除いて、ＩＬ１３Ｒα２特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置した全ての群は、モック形質導入Ｔ細胞で処置したマウスと比較して、統計的に有意な腫瘍体積の減少を示す（図１６Ｃ）。
【００７６】
実施例１１：ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ／ＣＤ１９ｔのアミノ酸配列
ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ／  ＣＤ１９ｔの完全アミノ酸配列を図１７に示す。全配列（配列番号１）は、：
２２アミノ酸のＧＭＣＳＦシグナルペプチド（配列番号２）、１１２アミノ酸のＩＬ−１３配列（配列番号３；太字で示すアミノ酸置換Ｅ１３Ｙ）；
２２９アミノ酸のＩｇＧ４配列（配列番号４；太字のアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＮ２９７Ｑを有する）；
２２アミノ酸のＣＤ４膜貫通配列（配列番号５）；
４２アミノ酸４−１ＢＢ配列（配列番号６）；
３アミノ酸のＧｌｙリンカー；
１１２アミノ酸のＣＤ３ζ配列（配列番号７）；
２４アミノ酸Ｔ２Ａ配列（配列番号８）；及び
３２３アミノ酸のＣＤ１９ｔ配列（配列番号９）；
を含む。
【００７７】
成熟キメラ抗原レセプター配列（配列番号１０）は、：
１１２アミノ酸のＩＬ−１３配列（配列番号３；太字で示すアミノ酸置換Ｅ１３Ｙ）；
２２９アミノ酸のＩｇＧ４配列（配列番号４；太字のアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＮ２９７Ｑを有する）；
２２アミノ酸のＣＤ４配列（配列番号５）；
４２アミノ酸４−１ＢＢ配列（配列番号６）；
３アミノ酸のＧｌｙリンカー；及び
１１２アミノ酸のＣＤ３ζ配列（配列番号７）；
を含む。このＣＡＲ配列（配列番号１０）内には、ＩＬ−１３／ＩｇＧ４／ＣＤ４ｔ／４１−ＢＢ配列（配列番号１１）が含まれ、これには：
１１２アミノ酸のＩＬ−１３配列（配列番号３；太字で示すアミノ酸置換Ｅ１３Ｙ）；
２２９アミノ酸のＩｇＧ４配列（配列番号４；太字のアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＮ２９７Ｑを有する）
２２アミノ酸のＣＤ４配列（配列番号５）；及び
４２アミノ酸の４−１ＢＢ配列（配列番号６）；
を含む。ＩＬ１３／ＩｇＧ４／ＣＤ４ｔ／４−１ＢＢ配列（配列番号１１）は、Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙリンカーなどのリンカーによって、１１２アミノ酸のＣＤ３ζ配列（配列番号７）に連結することができる。ＣＡＲ配列（配列番号１０）の前に２２アミノ酸のＧＭＣＳＦシグナルペプチド（配列番号２）を配置することができる。
【００７８】
図１８は、ＩＬ１３（ＥＱ）４１ＢＢζ［ＩＬ１３（ＥＱ）４１ＢＢζＴ２Ａ−ＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７；ｐＦ０２６３０］（配列番号１２）及びＣＤ１９Ｒｏｐ＿ｅｐＨＩＶ７（ｐＪ０１６８３）（配列番号１３）の配列の比較を示す。
【００７９】
実施例１２：  ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ／ＣＤ１９ｔのアミノ酸配列
図１９〜２６は、ＩＬ１３Ｒα２に対して指向された追加のＣＡＲのアミノ酸配列を示し、特定の細胞内ドメインの間に位置するＧｌｙＧｌｙＧｌｙスペーサーを除いて、様々なドメインが標識される。それぞれには、ヒトＩＬ１３及びＴｙｒを含むＧｌｕ（配列番号３；強調されたアミノ酸置換Ｅ１３Ｙ）が含まれる。これらのＣＡＲを発現するために使用される発現ベクターにおいて、発現されるアミノ酸配列は、
２４アミノ酸Ｔ２Ａ配列（配列番号８）；及び
３２３アミノ酸のＣＤ１９ｔ配列（配列番号９）、
を含み得、ＣＡＲ発現細胞の表面上の切断された(truncated)ＣＤ１９配列の協調的発現を可能にする。
【００８０】
ヒトＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）ドメイン、ＣＤ２８ｔｍドメイン、ＣＤ２８ｇｇ共刺激ドメイン、４−１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζドメインＣＡＲ骨格を含み、且つ、ＨＬ（２２アミノ酸）スペーサー、ＣＤ８ヒンジ（４８アミノ酸）スペーサー、ＩｇＧ４−ＨＬ−ＣＨ３（１２９アミノ酸）スペーサーか、又はＩｇＧ４（ＥＱ）（２２９アミノ酸）スペーサーを含む、ＣＡＲのパネルを、７２時間共培養アッセイにおいて評価されるように、ＩＬ−１３Ｒａ２特異的死滅を媒介するそれらの能力について試験した。この系においてＣＡＲ発現が低いと思われるＨＬ（２２個のアミノ酸）を除いて、全てが活性であった。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
0006657195.tif 000014
【図６】
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【図７】
0006657195.tif 000016
【図８】
0006657195.tif 000017
【図９】
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【図１０】
0006657195.tif 000019
【図１１】
0006657195.tif 000020
【図１２】
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【図１３】
0006657195.tif 000022
【図１４】
0006657195.tif 000023
【図１５】
0006657195.tif 000024
【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
0006657195.tif 000026
【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【図１７−１】
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【図１８】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
0006657195.tif 000032
【図１８−３】
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【図１８−４】
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【図１８−５】
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【図１８−６】
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【図１８−７】
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【図１８−８】
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【図１８−９】
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【図１８−１０】
0006657195.tif 000040
【図１８−１１】
0006657195.tif 000041
【図１８−１２】
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【図１８−１３】
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【図１８−１４】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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