(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、損傷したおよび/もしくは傷ついた結合組織、慢性腱症、慢性筋断裂、慢性変性関節症、ならびに/または皮膚炎症性障害を患っている哺乳動物の治療において有用な自己由来組成物を作製する方法:
次の段階を含む、IL-1raおよびTIMPを含む、自己由来組成物の抗炎症性/抗異化性成分を調製する段階:
該哺乳動物から採取された血液をチューブに送る段階；
該血液を約37℃〜約39℃の温度で約24時間インキュベートする段階；
該血液を遠心分離して該血液を上清成分と細胞画分に分ける段階；
抗炎症性/抗異化性成分である該上清成分を採取する段階；
次の段階を含む、自己由来組成物の再生性成分を調製する段階:
ある量の約4％のクエン酸を含むチューブに該哺乳動物から採取された血液を送る段階；
該血液を遠心分離して該血液から多血小板血漿成分を分離する段階；
該多血小板血漿成分を採取する段階；ならびに
該抗炎症性/抗異化性成分である該上清成分を該多血小板血漿成分と混合して該自己由来組成物を提供する段階。
【請求項２】
前記チューブが、ガラス製のバキュテナーチューブである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記チューブが、ポリスチレン製のバキュテナーチューブである、請求項1記載の方法。
【請求項４】
IL-1raおよびTIMPを含む、前記自己由来組成物の抗炎症性/抗異化性成分を調製する段階が、IL-1ra産生を促進するためにCa++の存在下で前記血液を培養する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
前記インキュベートする段階の前に、滅菌済みの注射器および針を用いて、約0.64〜約0.72mMのCa++を含む無菌塩化カルシウム溶液を、自己由来の生理学的流体を有するチューブに直接添加することによって、前記血液を9:1の比率で該無菌塩化カルシウム溶液と共に培養する、請求項4記載の方法。
【請求項６】
IL-1ra産生を増やすために、前記血液を含むチューブに無菌空気を加える段階をさらに含む、請求項4記載の方法。
【請求項７】
前記血液を遠心分離して該血液を上清成分と細胞画分に分ける段階を、約4000〜10000rpmで約10〜20分間実施する、請求項1記載の方法。
【請求項８】
前記血液を遠心分離して該血液を上清成分と細胞画分に分ける段階を、約4000rpmで約10分間実施する、請求項7記載の方法。
【請求項９】
前記上清成分が、アリコートに分けられて後の使用のために保存される、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
前記上清成分が、アリコートに分けられて後の使用のために凍結される、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
ある量の約4％のクエン酸を含むチューブに前記血液を送る段階が、全血9.5(9.5cc):4％クエン酸0.5(0.5cc)の比をもたらす段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
前記血液を遠心分離して該血液から多血小板血漿(PRP)成分を分離する段階が、PRP画分を単離するために約7500rpmで約30秒間実施される、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
新しい血管の発達を促進するために、白血球バフィコート画分が、付加的なVEGF供給源として再生性成分に添加される、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
前記上清成分を前記多血小板血漿成分と混合して前記自己由来組成物を提供する段階が、該上清成分を該多血小板血漿成分と1:1の比で混合する段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
前記哺乳動物がヒトである、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
哺乳動物における損傷したおよび/もしくは傷ついた結合組織、慢性腱症、慢性筋断裂、ならびに/または慢性変性関節症、ならびに皮膚炎症性障害を治療するための自己由来組成物であって、該組成物が、抗炎症性/抗異化性成分を含み、該抗炎症性/抗異化性成分が、哺乳動物の自己血から得られた上清成分を含み、該抗炎症性/抗異化性成分が、IL-1raおよびTIMPを含み、該組成物が、該哺乳動物から得られた多血小板血漿を含む再生性成分をさらに含む、自己由来組成物。
【請求項１７】
前記多血小板血漿が、IL-4、10、13、PDGF、TGF-β、およびVEGFを含む、請求項16記載の自己由来組成物。
【請求項１８】
抗炎症性/抗異化性成分および再生性成分を1:1の比で含む、請求項16記載の自己由来組成物。
【請求項１９】
前記再生性成分が白血球バフィコート画分をさらに含む、請求項16記載の自己由来組成物。
【請求項２０】
哺乳動物における損傷したおよび/もしくは傷ついた結合組織、慢性腱症、慢性筋断裂、ならびに/または慢性変性関節症、ならびに皮膚炎症性障害を治療するための医薬の製造における、請求項16〜19のいずれか一項記載の自己由来組成物の使用。
【請求項２１】
以下の段階を含む、哺乳動物における損傷したおよび/または傷ついた結合組織の治療において有用な自己由来組成物を作製する方法:
次の段階を含む、IL-1raおよびTIMPを含む、該自己由来組成物の抗炎症性/抗異化性成分を調製する段階:
ある量のクエン酸ナトリウムをチューブに添加する段階；
該哺乳動物から採取された血液を該チューブに送る段階；
該血液を約37℃〜約39℃の温度で約24時間インキュベートする段階；
該血液を遠心分離して該血液を上清成分と細胞画分に分ける段階；および
抗炎症性成分である該上清成分を採取する段階；
次の段階を含む、該自己由来組成物の再生性成分を調製する段階:
ある量の約4％のクエン酸を含むチューブに該哺乳動物から採取された血液を送る段階；
該血液を遠心分離して該血液から多血小板血漿成分を分離する段階；および
該多血小板血漿成分を採取する段階；ならびに
該抗炎症性/抗異化性成分である該上清成分を該多血小板血漿成分と混合して該自己由来組成物を提供する段階。
【請求項２２】
抗炎症性/抗異化性成分を調製する段階において、前記クエン酸ナトリウムが、約4％のクエン酸ナトリウム溶液であり、前記血液を前記チューブに送った際に該4％クエン酸ナトリウム溶液と該血液の比が約0.5:9.5になるように該チューブに添加される、請求項21記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、全体として、医薬、より具体的には、慢性腱症、慢性筋断裂(腱炎)、軟骨断裂、慢性変性関節症、例えば変形性関節症を含む、損傷したおよび/または傷ついた結合組織、ならびにアトピー性皮膚炎および慢性創傷を含む慢性炎症性皮膚疾患の治療にとりわけ有用である方法および組成物を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
背景
変形性関節症(「OA」)は、軟骨損傷および滑膜炎症を特徴とする変性関節疾患である。以前のデータは、軟骨高分子の破壊および不可逆的形態変化をもたらす、分子的炎症カスケードに対する変化に言及している1。IL-1、腫瘍壊死因子-α、IL-6、8、およびメタロプロテイナーゼが、変形性関節症の発病において重要な役割を果たしている主な異化性および炎症誘発性分子であることが、少なからぬ証拠によって示されている1。これらのサイトカインは、活性化された滑膜細胞、単核細胞によって、または関節の軟骨それ自体によって産生され、それらの異化作用は、IL-4、10、13、およびIL-1raなどの抑制性サイトカインによって首尾よく妨害され得る1。
【０００３】
同様の炎症および異化経路が、慢性腱炎2および慢性の筋断裂治癒不全3の発病に関与している。IL-1、6、メタロプロテイナーゼ(MMP)、および他の異化性分子を高レベルで産生することによる連続的損傷にさらされている腱細胞2。炎症誘発性サイトカインIL-1およびTNF-αは、同様に慢性筋炎3の発病にも関与している。アトピー性皮膚炎(湿疹)は、最も一般的な再発性の炎症性皮膚病態とみなされている。慢性創傷(糖尿病性創傷を含む)とは、血行不良、神経障害、免疫異常、ならびに全身性疾患の合併症、年齢、および度重なる外傷が原因で3ヶ月以内に治癒しない創傷である。言及した症状はすべて、サイトカインによる細胞シグナル伝達の妨害および真皮層の最大構成要素を形成する細胞外マトリックス(ECM)の減少を特徴とする。特殊な炎症性および異化性の分子経路を標的とすることは、炎症性病変に対して有益な治療的効果を有することができる。この効果は、治療活性を有するタンパク質を用いることによって実現され得る。現在、製薬業界は、インスリン、インターフェロン、血液凝固因子などの組換えタンパク質を作製するために高コストの分子遺伝学的技術を使用している。しかし、組換えタンパク質を作製するこれらの方法は、細菌細胞におけるヒト遺伝子の発現を含む。グリコシル化を含む翻訳後タンパク質修飾のパターンは、ヒトにおいて天然に起こるパターンと異なっている場合がある。これが原因で、ヒト環境において製品が不安定になって、生物学的機能または免疫応答誘発が低減する可能性がある。さらに、最終的な組み換え製品のコストは極めて高い。
【発明の概要】
【０００４】
開示の概要
損傷したおよび/もしくは傷ついた結合組織、慢性腱症、慢性筋断裂、ならびに/または慢性変性関節症、例えば変形性関節症、ならびに皮膚炎症性障害を治療するのに有用な生物活性組成物が説明される。この組成物を作製するための方法もまた、説明される。組成物は、抗炎症性成分/抗異化性成分を含む。抗炎症性成分は、抗異化性成分でもある。本明細書の目的において、抗炎症性成分および抗異化性成分という用語は、同義的に使用され得る。組成物はまた、自己由来の多血小板血漿(PRP)を含む再生性成分も含んでよい。大半のPRP調製プロトコールが、血小板からの増殖因子およびサイトカインの即時放出をもたらす活性化段階を含むのに対し、本発明は、注射された組成物を周辺組織によって後でゆっくり活性化するための、非活性化PRP成分の使用を提供する。
【０００５】
抗炎症性/抗異化性成分は、好ましくはIL-1ra、すなわちIL-1受容体アンタゴニストを含む自己血清を含む。さらに、抗炎症性/抗異化性成分は、好ましくは、高レベルの組織メタロプロテアーゼ阻害物質(TIMP)を含む。
【０００６】
1つの局面によれば、以下の段階を含む、哺乳動物における損傷したおよび/もしくは傷ついた結合組織、慢性腱症、慢性筋断裂、ならびに/または慢性変性関節症、ならびに皮膚炎症性障害を治療するための自己由来組成物を作製する方法が提供される:
A)次の段階を含む、TIMPおよびIL-1raを含む、自己由来組成物の抗炎症性/抗異化性成分を調製する段階:i)哺乳動物から自己由来の生理学的流体、好ましくは血液を採取する段階；ii)血液をチューブに送る段階；iii)血液を約37℃〜約39℃の温度で約24時間インキュベートする段階；iv)血液を遠心分離して、血液を上清成分および細胞画分に分ける段階；ならびにv)上清成分を採取する段階；
B)次の段階を含む、自己由来組成物の再生性成分を調製する段階:i)哺乳動物から血液を採取する段階；ii)約4％のクエン酸ナトリウムの存在下で血液をチューブに送る段階；iv)全血を遠心分離して、多血小板血漿成分を分離する段階；およびv)多血小板血漿成分を採取する段階；ならびに
C)抗炎症性/抗異化性成分である上清成分を多血小板血漿成分と混合して、自己由来組成物を提供する段階。
【０００７】
本開示の目的において、クエン酸ナトリウムおよびクエン酸という用語は、同義的に使用され得る。
【０００８】
別の局面によれば、以下の段階を含む、哺乳動物における損傷したおよび/もしくは傷ついた結合組織、慢性腱症、慢性筋断裂、ならびに/または慢性変性関節症、ならびに皮膚炎症性障害を治療するための自己由来組成物を作製する方法が提供される:
A)次の段階を含む、TIMPおよびIL-1raを含む、自己由来組成物の抗炎症性/抗異化性成分を調製する段階:i)哺乳動物から血液を採取する段階；ii)クエン酸ナトリウムを含むチューブに血液を送る段階；iii)血液を約37℃〜約39℃の温度で約24時間インキュベートする段階；iv)血液を遠心分離して、血液を上清成分および細胞画分に分ける段階；ならびにv)上清成分を採取する段階；
B)次の段階を含む、自己由来組成物の再生性成分を調製する段階:i)哺乳動物から血液を採取する段階；ii)約4％のクエン酸ナトリウムの存在下で血液をチューブに送る段階；iv)全血を遠心分離して、多血小板血漿成分を分離する段階；およびv)多血小板血漿成分を採取する段階；ならびに
C)抗炎症性/抗異化性成分である上清成分を多血小板血漿成分と混合して、自己由来組成物を提供する段階。
【０００９】
さらに別の局面によれば、以下の段階を含む、哺乳動物における損傷したおよび/もしくは傷ついた結合組織、慢性腱症、慢性筋断裂、ならびに/または慢性変性関節症、ならびに皮膚炎症性障害を治療するための自己由来組成物を作製する方法が提供される:
i)哺乳動物から血液を採取する段階；ii)クエン酸ナトリウムをチューブに添加する段階；iii)血液をチューブに送る段階；iv)血液を約37℃〜約39℃の温度で約24時間インキュベートする段階；v)血液を遠心分離して、血液を上清成分および細胞画分に分ける段階；ならびにvi)上清成分を採取する段階。
【００１０】
別の局面によれば、哺乳動物における損傷したおよび/もしくは傷ついた結合組織、慢性腱症、慢性筋断裂、ならびに/または慢性変性関節症、ならびに皮膚炎症性障害を治療するための、本開示の方法によって作製される自己由来組成物が提供される。
【００１１】
別の局面によれば、哺乳動物における損傷したおよび/もしくは傷ついた結合組織、慢性腱症、慢性筋断裂、ならびに/または慢性変性関節症、ならびに皮膚炎症性障害を治療するための自己由来組成物であって、この組成物は、好ましくはクエン酸ナトリウムを含む抗炎症性/抗異化性成分を含み、この抗炎症性/抗異化性成分は、TIMPおよびIL-1raを含む、自己由来組成物が提供される。この組成物は、多血小板血漿を含む再生性成分をさらに含む。
【００１２】
別の局面によれば、哺乳動物における損傷したおよび/もしくは傷ついた結合組織、慢性腱症、慢性筋断裂、ならびに/または慢性変性関節症、ならびに皮膚炎症性障害を治療するための自己由来組成物であって、この組成物が抗炎症性/抗異化性成分を含み、該抗炎症性/抗異化性成分が哺乳動物の自己血から得られた上清成分を含み、該抗炎症性/抗異化性成分がIL-1raおよびTIMPを含み、この組成物が、哺乳動物から得られた多血小板血漿を含む再生性成分をさらに含む、自己由来組成物が提供される。抗炎症性/抗異化性成分は、好ましくは、クエン酸ナトリウムを含む。最も好ましくは、クエン酸ナトリウムは、クエン酸ナトリウムの4％溶液である。
【００１３】
さらに別の局面によれば、哺乳動物における損傷したおよび/もしくは傷ついた結合組織、慢性腱症、慢性筋断裂、ならびに/または慢性変性関節症、ならびに皮膚炎症性障害を治療するための、本発明の自己由来組成物の使用が提供される。
【００１４】
さらに別の局面によれば、以下の段階を含む、哺乳動物の損傷したおよび/もしくは傷ついた結合組織、慢性腱症、慢性筋断裂、ならびに/または慢性変性関節症、ならびに皮膚炎症性障害を治療する方法が提供される:
哺乳動物から血液を採取する段階；
血液をチューブに送る段階；
血液を約37℃〜約39℃の温度で約24時間インキュベートする段階；
血液を遠心分離して、血液を上清成分および細胞画分に分ける段階；および
上清成分を採取する段階；ならびに
次の段階を含む、自己由来組成物の再生性成分を調製する段階:
哺乳動物から血液を採取する段階；
約4％のクエン酸の存在下で血液をチューブに送る段階；
血液を遠心分離して、全血から多血小板血漿成分を分離する段階；
多血小板血漿成分を採取する段階；ならびに
上清成分を多血小板血漿成分と混合して自己由来組成物を提供する段階；ならびに
自己由来組成物を哺乳動物に投与する段階。
【００１５】
さらに別の局面によれば、以下の段階を含む、哺乳動物の損傷したおよび/もしくは傷ついた結合組織、慢性腱症、慢性筋断裂、ならびに/または慢性変性関節症、ならびに皮膚炎症性障害を治療する方法が提供される:
哺乳動物から血液を採取する段階；
クエン酸ナトリウムをチューブに添加する段階；
血液をチューブに送る段階；
血液を約37℃〜約39℃の温度で約24時間インキュベートする段階；
血液を遠心分離して、血液を上清成分および細胞画分に分ける段階；
上清成分を採取する段階；
次の段階を含む、自己由来組成物の再生性成分を調製する段階:
哺乳動物から血液を採取する段階；
クエン酸の存在下で血液をチューブに送る段階；
血液を遠心分離して、全血から多血小板血漿成分を分離する段階；
多血小板血漿成分を採取する段階；
上清成分を多血小板血漿成分と混合して、自己由来組成物を提供する段階；ならびに
自己由来組成物を哺乳動物に投与する段階。
【００１６】
さらに別の局面によれば、以下の段階を含む、哺乳動物の損傷したおよび/もしくは傷ついた結合組織、慢性腱症、慢性筋断裂、ならびに/または慢性変性関節症、ならびに皮膚炎症性障害を治療する方法が提供される:
哺乳動物から血液を採取する段階；
約4％のクエン酸ナトリウムの存在下で血液をチューブに送る段階；
血液を約37℃〜約39℃の温度で約24時間インキュベートする段階；
血液を遠心分離して、血液を上清成分および細胞画分に分ける段階；
上清成分を採取する段階；ならびに
上清成分を哺乳動物に投与する段階。
【００１７】
本明細書において説明する組成物および方法は、ヒトに適用するのに適している。これらはまた、ウマ、イヌ、およびラクダの治療を含む、幅広い獣医学用途にも適している。
【００１８】
本開示は、ヒトにおける変性関節疾患を治療するための、ならびにウマ、イヌ、およびラクダを含む獣医学用途のための、比較的安全であり効果的であり安定であり再生性であり費用対効果が大きい、代替製品を提供する。
[本発明1001]
以下の段階を含む、損傷したおよび/もしくは傷ついた結合組織、慢性腱症、慢性筋断裂、慢性変性関節症、ならびに/または皮膚炎症性障害を患っている哺乳動物の治療において有用な自己由来組成物を作製する方法:
次の段階を含む、IL-1raおよびTIMPを含む、自己由来組成物の抗炎症性/抗異化性成分を調製する段階:
該哺乳動物から血液を採取する段階；
該血液をチューブに送る段階；
該血液を約37℃〜約39℃の温度で約24時間インキュベートする段階；
該血液を遠心分離して該血液を上清成分と細胞画分に分ける段階；
抗炎症性/抗異化性成分である該上清成分を採取する段階；
次の段階を含む、自己由来組成物の再生性成分を調製する段階:
該哺乳動物から血液を採取する段階；
ある量の約4％のクエン酸を含むチューブに該血液を送る段階；
該血液を遠心分離して該血液から多血小板血漿成分を分離する段階；
該多血小板血漿成分を採取する段階；ならびに
該抗炎症性/抗異化性成分である該上清成分を該多血小板血漿成分と混合して該自己由来組成物を提供する段階。
[本発明1002]
前記チューブが、ガラス製のバキュテナーチューブである、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記チューブが、ポリスチレン製のバキュテナーチューブである、本発明1001の方法。
[本発明1004]
IL-1raおよびTIMPを含む、前記自己由来組成物の抗炎症性/抗異化性成分を調製する段階が、IL-1ra産生を促進するためにCa++の存在下で前記血液を培養する段階をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記インキュベートする段階の前に、滅菌済みの注射器および針を用いて、約0.64〜約0.72mMのCa++を含む無菌塩化カルシウム溶液を、自己由来の生理学的流体を有するチューブに直接添加することによって、前記血液を9:1の比率で該無菌塩化カルシウム溶液と共に培養する、本発明1004の方法。
[本発明1006]
IL-1ra産生を増やすために、前記血液を含むチューブに無菌空気を加える段階をさらに含む、本発明1004の方法。
[本発明1007]
前記血液を遠心分離して該血液を上清成分と細胞画分に分ける段階を、約4000〜10000rpmで約10〜20分間実施する、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記血液を遠心分離して該血液を上清成分と細胞画分に分ける段階を、約4000rpmで約10分間実施する、本発明1007の方法。
[本発明1009]
前記上清成分が、アリコートに分けられて後の使用のために保存される、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記上清成分が、アリコートに分けられて後の使用のために凍結される、本発明1001の方法。
[本発明1011]
ある量の約4％のクエン酸を含むチューブに前記血液を送る段階が、全血9.5(9.5cc):4％クエン酸0.5(0.5cc)の比をもたらす段階を含む、本発明1001の方法。
[本発明1012]
前記血液を遠心分離して該血液から多血小板血漿(PRP)成分を分離する段階が、PRP画分を単離するために約7500rpmで約30秒間実施される、本発明1001の方法。
[本発明1013]
新しい血管の発達を促進するために、白血球バフィコート画分が、付加的なVEGF供給源として再生性成分に添加される、本発明1001の方法。
[本発明1014]
前記上清成分を前記多血小板血漿成分と混合して前記自己由来組成物を提供する段階が、該上清成分を該多血小板血漿成分と1:1の比で混合する段階を含む、本発明1001の方法。
[本発明1015]
前記哺乳動物がヒトである、本発明1001の方法。
[本発明1016]
本発明1001〜1014のいずれかの方法によって作製された、哺乳動物における損傷したおよび/もしくは傷ついた結合組織、慢性腱症、慢性筋断裂、ならびに/または慢性変性関節症、ならびに皮膚炎症性障害を治療するための自己由来組成物。
[本発明1017]
哺乳動物における損傷したおよび/もしくは傷ついた結合組織、慢性腱症、慢性筋断裂、ならびに/または慢性変性関節症、ならびに皮膚炎症性障害を治療するための自己由来組成物であって、該組成物が、抗炎症性/抗異化性成分を含み、該抗炎症性/抗異化性成分が、哺乳動物の自己血から得られた上清成分を含み、該抗炎症性/抗異化性成分が、IL-1raおよびTIMPを含み、該組成物が、該哺乳動物から得られた多血小板血漿を含む再生性成分をさらに含む、自己由来組成物。
[本発明1018]
前記多血小板血漿が、IL-4、10、13、PDGF、TGF-β、およびVEGFを含む、本発明1017の自己由来組成物。
[本発明1019]
抗炎症性/抗異化性成分および再生性成分を1:1の比で含む、本発明1017の自己由来組成物。
[本発明1020]
前記再生性成分が白血球バフィコート画分をさらに含む、本発明1017の自己由来組成物。
[本発明1021]
哺乳動物における損傷したおよび/もしくは傷ついた結合組織、慢性腱症、慢性筋断裂、ならびに/または慢性変性関節症、ならびに皮膚炎症性障害を治療するための、本発明1016〜1020のいずれかの自己由来組成物の使用。
[本発明1022]
以下の段階を含む、損傷したおよび/もしくは傷ついた結合組織、慢性腱症、慢性筋断裂、ならびに/または慢性変性関節症、ならびに皮膚炎症性障害を患っている哺乳動物を治療する方法:
次の段階を含む、IL-1raおよびTIMPを含む、自己由来組成物の抗炎症性/抗異化性成分を調製する段階:
該哺乳動物から血液を採取する段階；
該血液をチューブに送る段階；
該血液を約37℃〜約39℃の温度で約24時間インキュベートする段階；
該血液を遠心分離して該血液を上清成分と細胞画分に分ける段階；および
該抗炎症性/抗異化性成分である該上清成分を採取する段階；
次の段階を含む、自己由来組成物の再生性成分を調製する段階:
該哺乳動物から血液を採取する段階；
約4％のクエン酸の存在下で該血液をチューブに送る段階；
該血液を遠心分離して全血から多血小板血漿成分を分離する段階；および
該多血小板血漿成分を採取する段階；
該上清成分を前記多血小板血漿成分と混合して該自己由来組成物を提供する段階；ならびに
該自己由来組成物を該哺乳動物に投与する段階。
[本発明1023]
以下の段階を含む、哺乳動物における損傷したおよび/または傷ついた結合組織の治療において有用な自己由来組成物を作製する方法:
次の段階を含む、IL-1raおよびTIMPを含む、該自己由来組成物の抗炎症性/抗異化性成分を調製する段階:
該哺乳動物から血液を採取する段階；
ある量のクエン酸ナトリウムをチューブに添加する段階；
該血液を該チューブに送る段階；
該血液を約37℃〜約39℃の温度で約24時間インキュベートする段階；
該血液を遠心分離して該血液を上清成分と細胞画分に分ける段階；および
抗炎症性成分である該上清成分を採取する段階；
次の段階を含む、該自己由来組成物の再生性成分を調製する段階:
該哺乳動物から血液を採取する段階；
ある量の約4％のクエン酸を含むチューブに該血液を送る段階；
該血液を遠心分離して該血液から多血小板血漿成分を分離する段階；および
該多血小板血漿成分を採取する段階；ならびに
該抗炎症性/抗異化性成分である該上清成分を該多血小板血漿成分と混合して該自己由来組成物を提供する段階。
[本発明1024]
抗炎症性/抗異化性成分を調製する段階において、前記クエン酸ナトリウムが、約4％のクエン酸ナトリウム溶液であり、前記血液を前記チューブに送った際に該4％クエン酸ナトリウム溶液と該血液の比が約0.5:9.5になるように該チューブに添加される、本発明1023の方法。
[本発明1025]
以下の段階を含む、哺乳動物における損傷したおよび/もしくは傷ついた結合組織、慢性腱症、慢性筋断裂、ならびに/または慢性変性関節症、ならびに皮膚炎症性障害を治療する方法:
次の段階を含む、IL-1raおよびTIMPを含む、自己由来組成物の抗炎症性/抗異化性成分を調製する段階:
該哺乳動物から血液を採取する段階；
クエン酸ナトリウムをチューブに添加する段階；
該血液を該チューブに送る段階；
該血液を約37℃〜約39℃の温度で約24時間インキュベートする段階；
該血液を遠心分離して該血液を上清成分と細胞画分に分ける段階；および
該抗炎症性/抗異化性成分である該上清成分を採取する段階；
次の段階を含む、該自己由来組成物の再生性成分を調製する段階:
該哺乳動物から血液を採取する段階；
ある量の約4％のクエン酸を含むチューブに該血液を送る段階；
該血液を遠心分離して該血液から多血小板血漿成分を分離する段階；
該多血小板血漿成分を採取する段階；
該上清成分を該多血小板血漿成分と混合して該自己由来組成物を提供する段階；ならびに
該自己由来組成物を該哺乳動物に投与する段階。
[本発明1026]
抗炎症性/抗異化性成分を調製する段階において、前記クエン酸ナトリウムが、約4％のクエン酸ナトリウム溶液であり、前記血液を前記チューブに送った際に該4％クエン酸ナトリウム溶液と該血液の比が約0.5:9.5になるように該チューブに添加される、本発明1025の方法。
[本発明1027]
以下の段階を含む、哺乳動物における損傷したおよび/もしくは傷ついた結合組織、慢性腱症、慢性筋断裂、ならびに/または慢性変性関節症、ならびに皮膚炎症性障害を治療するための自己由来組成物を作製する方法:
該哺乳動物から血液を採取する段階；
クエン酸ナトリウムをチューブに添加する段階；
該血液を該チューブに送る段階；
該血液を約37℃〜約39℃の温度で約24時間インキュベートする段階；
該血液を遠心分離して該血液を上清成分と細胞画分に分ける段階；および
該上清成分を採取する段階。
[本発明1028]
抗炎症性/抗異化性成分を調製する段階において、前記クエン酸ナトリウムが、前記血液を前記チューブに送った際に該クエン酸ナトリウムと該血液の比が約1:20になるように、該チューブに添加される、本発明1027の方法。
[本発明1029]
以下の段階を含む、対象における損傷したおよび/もしくは傷ついた結合組織、慢性腱症、慢性筋断裂、ならびに/または慢性変性関節症、ならびに皮膚炎症性障害を治療する方法:
該対象から血液を採取する段階；
クエン酸ナトリウムをチューブに添加する段階；
該血液を該チューブに送る段階；
該血液を約37℃〜約39℃の温度で約24時間インキュベートする段階；
該血液を遠心分離して該血液を上清成分と細胞画分に分ける段階；
該上清成分を採取する段階；ならびに
該上清成分を対象に投与する段階。
[本発明1030]
前記クエン酸ナトリウムが、約4％のクエン酸ナトリウム溶液であり、前記血液を前記チューブに送った際に該4％クエン酸ナトリウム溶液と該血液の比が約0.5:9.5になるように該チューブに添加される、本発明1029の方法。
[本発明1031]
前記抗炎症性/抗異化性成分がクエン酸ナトリウムを含む、本発明1017の自己由来組成物。
[本発明1032]
前記クエン酸ナトリウムが約4％のクエン酸ナトリウム溶液である、本発明1031の自己由来組成物。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】時間に対するIL-1ra濃度(単位pg/ml)の図であり、静止および揺り動かしを含む異なるインキュベーション条件を用いた場合の、様々な時点における、ヒト血清試料中のIL-1raアンタゴニストタンパク質のレベルの比較を示す。
【図２】時間に対するIL-1ra濃度(単位pg/ml)の図であり、空気、Ca++(リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に溶解)、および様々な濃度の血清の存在下での、様々な時点における、ヒト血清試料中のIL-1raアンタゴニストタンパク質のレベルの比較を示す。
【図３】図3aおよび3bは、治療前(3a)の右傍脊柱領域および治療後の正常な状態(3b)のドップラー超音波検査の画像である。
【図４】図4aおよび4bは、ドップラー超音波検査の画像であり、過剰な充血を特徴とする慢性アキレス腱症(図a、治療前の状態)を示す。この慢性アキレス腱症は、自己由来組成物による治療の結果、回復した(図b、治療後の画像診断)。
【図５】24時間のインキュベーションの前および後のTIMP1、TIMP2、およびTIMP4の平均濃度レベルを示すグラフである。
【図６】注射の前および後の、患者8名の視覚的アナログスケール(「VAS」)スケールによる膝関節痛の平均ベースラインを示すグラフである。
【図７】患者8名の膝の疼痛、こわばり、および日常活動能力の平均レベルについて、WOMAC指標による点数の値を示す図表である。
【図８】結果をグラフ形態で示して、1回目、2回目、および3回目の注射後、ならびに注射後2ヶ月および3ヶ月での平均結果の分析(breakdown)を提供している。
【図９】24時間のインキュベーションの前および後のヒト血清試料中のPGDFの平均濃度レベルの比較を示すグラフである。
【図１０】37℃で24時間のインキュベーションの前(ベースラインレベル)および後のヒト血清試料中のMMP2、MMP3、MMP7、MMP9、およびMMP13タンパク質のレベルの比較を示すグラフである。
【図１１】クエン酸ナトリウムの存在下、37℃で24時間のインキュベーションの前(ベースラインレベル)および後のヒト血清試料中のMMP2、MMP3、MMP7、MMP9、およびMMP13タンパク質のレベルの比較を示すグラフである。
【図１２】図11のMMP9のデータを示すグラフである。
【図１３】37℃で24時間のインキュベーションの前(ベースラインレベル)および後のヒト血清試料中、活性化PRP中、および最終組成物中のIL-1βのレベルの比較を示すグラフである。
【図１４】37℃で24時間のインキュベーションの前(ベースラインレベル)および後のヒト血清試料中、活性化PRP中、および最終組成物中のTNF-αのレベルの比較を示すグラフである。
【図１５】37℃で24時間のインキュベーションの前(ベースラインレベル)および後のヒト血清試料中、活性化PRP中、および最終組成物のTIMP2のレベルの比較を示すグラフである。
【図１６】37℃で24時間のインキュベーションの前(ベースラインレベル)および後のヒト血清試料中、活性化PRP中、および最終製品中のIL-1raのレベルの比較を示すグラフである。
【図１７】37℃で24時間のインキュベーションの前(ベースラインレベル)および後のヒト血清試料中、活性化PRP中、および最終組成物中のPDGFのレベルの比較を示すグラフである。
【図１８Ａ】試験した患者17名の疼痛の平均レベルについて、WOMAC指標による点数の値を示す図表である。CA-グループおよびCA+グループのベースラインおよび注射後1ヶ月時点の値を提供している。
【図１８Ｂ】試験した患者17名のこわばりの平均レベルについて、WOMAC指標による点数の値を示す図表である。CA-グループおよびCA+グループのベースラインおよび注射後1ヶ月時点の値を提供している。
【図１８Ｃ】試験した患者17名の日常活動能力の平均レベルについて、WOMAC指標による点数の値を示す図表である。CA-グループおよびCA+グループのベースラインおよび注射後1ヶ月時点の値を提供している。
【図１８Ｄ】試験した患者17名の視覚的アナログ疼痛スケール(VAS)の統計学的解析を示す図表である。CA-グループおよびCA+グループのベースラインおよび注射後1ヶ月時点の値を提供している。
【図１９Ａ】本開示の方法による治療の前の、乾癬を患っている患者の腕の皮膚の写真である。
【図１９Ｂ】本開示の方法による治療後3ヶ月の、乾癬を患っている患者の腕の皮膚の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
詳細な説明
本開示は、相乗的な抗炎症性/抗異化性効果、増殖効果、組織再構築効果、および再生効果を有する生物活性タンパク質によって効果を高められた血清と共に、自己由来の抗炎症性/抗異化性成分、および好ましくは、自己由来の多血小板血漿成分を含む、組成物に関する。
【００２１】
典型的には、このような組成物は、治療活性を有する次のタンパク質を含む:IL-1ra6、IL-47、IL-108、9、IL-1310、PDGF11、TGF-β10、11、およびVEGF12、13、14、16。
【００２２】
IL-1raは、単球、脂肪細胞、および上皮細胞によって分泌される。このタンパク質の治療的に有効な濃度は、ヒト単球を約37℃で約24時間インキュベートすることによって実現する17。IL-4、10、13、PDGF、TGF-βは、血小板および顆粒の内容物であり、PRP成分に含まれて(in)送達される。IL-4、10、13は、白血球に由来する。PDGFは血小板によって産生され、TGF-Bは血小板および一部のT細胞によって放出される。前述のタンパク質の相乗効果を用いると、強力な生物活性を有する自己由来製品が生じる。したがって、再生性生物学的因子ならびに抗炎症性サイトカインおよび増殖因子の供給源としての新しく調製されたPRPと、IL-1阻害物質の供給源としての、インキュベートされた自己血清を含む抗炎症性成分との組合せにより、変形性関節症のような変性症、慢性腱症、および慢性筋断裂、ならびに皮膚炎症性障害を治療するための強力で費用対効果が大きい自己由来治療物質が提供される。
【００２３】
本明細書において使用される場合、「治療」は、対象の疼痛および/または炎症が軽減される緩和治療を含む。
【００２４】
驚くべきことに、本明細書の抗炎症性/抗異化性成分を作製する方法は、IL-1raの産生に加えて、高レベルの組織メタロプロテアーゼ阻害物質(TIMP)の産生を招く。マトリックスメタロプロテアーゼMMPは、活性状態にある場合、関節破壊を引き起こすと考えられている。TIMPは活性MMPを無効にし、それによって、IL-1raと相乗的である付加的な抗異化性の恩恵を与える。
【００２５】
さらに驚くべきことに、本明細書の抗炎症性/抗異化性成分を作製する際、患者の血液を約37℃〜約39℃の温度で約24時間インキュベートする前にクエン酸ナトリウムを添加すると、MMP9、IL-1β、およびTNF-αなど関節に対して異化作用を有する病理学的分子物質が高レベルになるのが防がれ、それにもかかわらず、TIMP、IL-1ra、およびPDGFなどの抗異化性物質および再生性物質のレベルは大幅には低下しない。
【００２６】
変形性関節症、慢性腱症、および慢性筋断裂、ならびに皮膚炎症性障害を治療するための自己由来組成物を作製するための前述の方法は、好ましくは、哺乳動物の自己由来の生理学的流体、好ましくは血液を無菌的技術によって採取する段階を含む。好ましくは、哺乳動物はヒトである。しかし、本明細書の組成物および方法はまた、幅広い獣医学用途にも、例えば、ウマ、イヌ、およびラクダの治療にも適している。
【００２７】
静脈穿刺の部位および採取チューブの表面は、2％のヨードチンキを用いて消毒してよい。部位の消毒を始める前には必ず(any)、ヨウ素に何らかのアレルギーがないか患者に尋ねてよい。また、起こり得る汚染を避けるために、血液採取の前に70％アルコール溶液を用いてチューブカバーが消毒される。
【００２８】
好ましくは、組成物は、自己由来の生理学的流体、好ましくは血液を、好ましくは約37℃〜約39℃の温度で培養することによって調製される。しかし、当業者は、この範囲から外れる温度、例えば、約37℃〜約40℃で血液をインキュベートして、許容範囲の結果を得ることができることを理解するであろう。最も好ましくは、温度は、37℃〜38℃の間である。IL-1raの細胞外濃縮のため、および好ましくはTIMPの産生のために、血液は、好ましくは約24時間、インキュベートされる。好ましくは、クエン酸ナトリウムが、好ましくは4％の濃度のものが、血液を採取して入れる滅菌済みガラスチューブまたはポリスチレンチューブに、インキュベーション前に添加される。特に好ましい態様において、インキュベーションは、添加物を含まない滅菌済みガラスチューブ(Coviden)またはポリスチレン(BD)バキュテナーチューブにおいて行われ得る。1つの態様において、ロッカープラットホーム(24rpm)上または静的条件における自己由来の生理学的流体、好ましくは血液のインキュベーションが、さらに提供される。好ましくは、インキュベーションは、図1に示すような静的条件で実施される。
【００２９】
好ましくは、血液のインキュベーションは、IL-1ra産生を促進するために0.64〜0.72mMのCa++の存在下で行われる15。特に好ましい態様において、インキュベーション前に、滅菌済みの注射器および針を用いて0.64〜0.72mMのCa++含有無菌塩化カルシウム溶液を、血液の入ったチューブに直接添加することによって(9ccの全血に対して1ccの塩化カルシウム溶液)、9:1の比率で、インキュベートした血液を塩化カルシウム溶液で希釈することが可能であり、かつ有利である(図2)。血液を含む滅菌済みチューブに同じ割合の無菌空気を加えて、IL-1ra産生を増やすために血液を大気に曝露してもよい(図2)。特に好ましい態様において、この空気は、インキュベーション前に、滅菌済みの注射器および針を用いて0.22μmのMillexGPフィルターを通過させて、血液の入ったチューブに直接入れる。
【００３０】
好ましくは、クエン酸ナトリウムは、全血9.5(9.5cc):好ましくは4％のクエン酸ナトリウム0.5(0.5cc)の比で、インキュベーション前に血液に添加される。4％クエン酸は、好ましくは、4％クエン酸ナトリウム溶液である。4％クエン酸ナトリウム溶液は、市販品を容易に入手できる。
【００３１】
次いで、インキュベートした血液を遠心分離に供して、上清成分を細胞画分から分ける。遠心分離は、約4000〜10000rpmで約10〜20分間、実施される。好ましくは、遠心分離は、4000rpmで10分間実施される。
【００３２】
次の段階は、上清を吸引する段階、および無菌的技法を用いて後で処理するためにそれをアリコートに分ける段階を含む。この手順は、無菌環境(HEPAフィルターを備えた層流フード)において実施される。生物学的に活性な作用物質を含む上清層3ccを、滅菌済みの注射器および針によって注意深く抜き取る。IL-1raを含む産生物の長期保存は、約-20℃でアリコートを凍結し、約-70℃で最長6ヶ月または最長1年間保存することによって、達成される。
【００３３】
次に、PRPを含む再生性成分の調製は、バキュテナーチューブに血液を抜き取る段階を含む。これは、好ましくは、4％クエン酸の存在下で実施される。好ましくは、全血9.5(9.5cc):4％クエン酸0.5(0.5cc)の比で実施される。次いで、血液は、PRP画分を単離するために、好ましくは約7500rpmで約30秒間の遠心分離に供される。これらの遠心分離パラメーターは、変形性関節症および慢性腱症の治療ならびに皮膚障害に対する最終製品の一部としてのPRP調製物に関して好ましい態様において使用される。PRP画分は、滅菌済みの注射器および針によって無菌条件下で抜き取られる。慢性断裂の治療のための特に好ましい態様において、罹患部位での新しい血管の発達を促進するために、白血球バフィコート画分が、付加的なVEGF供給源としてPRPに添加される。バフィコート層および血漿は、上記に説明したように全血の遠心分離後に滅菌済みの注射器および針を用いて手作業で、または市販のHarvest SmartPrepシステムを用いて、採取される。PRPを含む再生性成分は、凍結も他の保存も受けない(subject)。自己由来組成物は、再生性成分を抗炎症性/抗異化性成分と混合した後すぐに、患者に投与されるべきである。
【００３４】
IL-1raおよび好ましくはTIMPを含む血液を含む、抗炎症性/抗異化性成分は、好ましくは1:1の比で、PRP画分を含む再生性成分と割り当てられて(meted with)、最終製品が得られる。
【００３５】
この製品は、腱由来コラーゲン18および組織由来トロンビンによって後でゆっくり活性化するために、注射される。
【００３６】
本発明は、以下の例示的な実施例の助けを借りてさらに説明される。
【実施例】
【００３７】
実施例1  様々な培養条件における細胞外IL-1ra産生の比較
図1にグラフで示すように、静止インキュベーションおよび揺り動かしながらのインキュベーションを含むインキュベーション条件に曝露されたヒト血清試料中のIL-1raアンタゴニストタンパク質のレベルの比較を様々な時点に実施した。IL-1raは、活性化された血液単球であるマクロファージによって分泌される。このような活性化は、撹拌処理を用いて、血液細胞と採取チューブの内表面とを接触させることによって実現される。細胞構成要素に曝露される内表面面積を増やすことによって、細胞活性化プロセスおよび生物活性分子の分泌を最大にすることができる。 
【００３８】
健常な男性および女性のボランティアドナー10名(21〜60才)の末梢血を、無菌条件下での静脈穿刺によって滅菌済み10ml容ガラスチューブに採取した。標準手順に従って、1本のチューブは、インキュベーション段階を行わずに処理した(対照試料)。ロッカープラットホーム(24rpm)を用いた攪拌の有り無し両方で、37℃にて3.5時間、7時間、および24時間、試料をインキュベートした。インキュベートした試料を4,000rpmで10分間遠心分離し、次いでろ過し、製造(manufacture)プロトコール(インターネットでbio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10014905.pdfから入手可能)に従って、IL-1raの最終濃度を未処理の対照試料(0h)のものと比較した。一元配置ANOVA検定によって、24時間のインキュベーション後のみ、血清中IL-1ra濃度が有意に上昇していることが明らかになった;3.5時間インキュベートした試料および7時間インキュベートした試料では、有意なIL-1ra濃度上昇は観察されなかった。さらに、静止インキュベーション条件と揺り動かしインキュベーション条件との間でも、有意な差は観察されなかった。IL-1ra濃度は、MAGPIX Luminex(商標)技術を用いて評価した。
【００３９】
図2は、次のインキュベーション条件に曝露されたヒト血清試料中のIl-1raアンタゴニストタンパク質のレベルの比較を示す:空気、Ca++(リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に溶解)、および様々な濃度の血清の存在下で24時間のインキュベーション。一元配置ANOVA検定によって、50％希釈血液中での培養のほかに、前述の条件すべてにおいて24時間のインキュベーション後に血清中でのIL-1ra産生が有意に増加していることが明らかになった。
【００４０】
実施例2  変形性関節症および慢性腱症と診断され、自己由来組成物で治療された患者の症例報告
方法および材料:
本明細書の各患者について、患者から血液を採取し;血液をチューブに送り;血液を約37℃〜約39℃の温度で約24時間インキュベートし;血液を遠心分離して、血液を上清成分および細胞画分に分け;かつ抗炎症性成分である上清成分を採取することによって、IL-1raおよびTIMPを含む、自己由来組成物の抗炎症性/抗異化性成分を調製した。同様に、患者から血液を採取し;約4％のクエン酸の存在下で血液をチューブに送り;血液を遠心分離して、全血成分から多血小板血漿成分を分離し;多血小板血漿成分を採取し;かつ抗炎症性/抗異化性成分である上清成分を多血小板血漿成分と混合して自己由来組成物を提供することによって、自己由来組成物の再生性成分を調製した。次いで、自己由来組成物を患者に投与した。
【００４１】
症例1:S、61才。
診断:この患者は、潜行性に発症した両側膝疼痛を訴えており、これは数年前から始まり、この(preceding)6ヶ月以内に強まっていた。膝のMRIは、膝の重度のOAを示していた:右膝における右および大腿骨顆部に係る軟骨全層欠損、ならびに右膝における潜在性(underlying)浮腫を伴う内側大腿骨滑車の後面に係る軟骨全層欠損の量が増えている、内側区画の重度の軟骨症。1年前に、この患者は、コルチゾン注射IAを受けており、これは1ヶ月間、痛みを軽減した。身体検査:膝の可動域(ROM)は最大限であり、靱帯はすべて正常であり、小規模な両側性の滲出(small bilateral effusion)、神経血管検査は正常であった。VASは60であった。
治療:1週間の間隔を空けて3回、患者向けの局所用の自己由来組成物を患者の両側の膝に注射。
結果:患者向けの局所用の自己由来組成物の1回目の注射を両側に行った後、患者は顕著な改善を報告し、VASは3であった。3回目の注射の時点で、ROMは最大限であり、靱帯はすべて正常であり、関節線の疼痛はなく、滲出はなかった。患者は、疼痛の顕著な軽減を報告し、VASは10であり、患者は再び身体活動を始めた。3ヶ月後、追跡調査により、患者が疼痛を感じていないことが示された。
【００４２】
症例2:E、64才。
診断:活動的な男性が、左臀部にVAS60を示した。日常活動に伴う疼痛および長距離の歩行に伴う著しい障害。MRIは、両方の臀部に軽度のOAを示した:両側の股関節の変性および寛骨臼関節唇の変性断裂。理学療法的治療では、疼痛緩和の点から、限定的な成功しか得られなかった。
治療:患者のために調製された局所用の自己由来組成物を1週間の間隔を空けて2回、超音波ガイド下で左臀部に注射。
結果:局所用の自己由来組成物の1回目の注射後、患者は疼痛が85％改善したことを報告した(患者の個人的評価)。局所用の自己由来組成物の2回目の注射後、VASは10であった。5ヶ月後も、VASは10であった。
【００４３】
症例3:A、70才。
診断:ある女性患者が、左膝に慢性疼痛(VASは6であった)圧痛および腫脹を示した。彼女は、歩くこと、立っていること、および階段を上ることが非常に困難な状態であった。彼女は、膝疼痛について助けを得るために理学療法士(6回訪問)、カイロプラクター(6回訪問)のところに行っていたが、成果は出なかった。MRIは、左膝に重度のOAが認められ、大腿骨内側顆部および内側脛骨高原の体重負荷部分における全層軟骨減少が原因で、内側区画が狭くなっていることを示した。
治療:局所用の自己由来組成物を作製し、1週間の間隔を空けて3回、左膝に注射を行った。
結果:局所用の自己由来組成物による治療後、5ヶ月後の追跡来院:患者は、症状が約80％改善し、腫脹がなくなったと報告した;VASは20である。
【００４４】
症例4:J、26才、プロ水泳選手。
診断:傍脊柱筋損傷後の状態、慢性の傍脊柱腱炎。患者は、傍脊柱筋の全体にわたる疼痛を訴えていた。長期間の理学療法では、成果が示されなかった。背中のROMは最大限であり、神経血管検査は正常である。右傍脊柱の充血領域が、カラードップラー図3a)において特定されており、VASは80であった。
治療:超音波技術を用いて、炎症を起こした領域に印を付け、1週間の間隔を空けて自己由来組成物を4回、筋肉内注射した。
図3aおよび3bは、ドップラー超音波検査の画像であり、治療前(図3a)の右傍脊柱領域の充血および治療後の正常な状態(図3b)が明らかになった。
結果:ドップラーにより、炎症がないことが示された(図3b)。この療法から4ヶ月後のVASは10であった。
【００４５】
症例5:S、18才。
診断:右アキレス断裂後の状態。この患者は、アキレス付着点の疼痛を訴えていた:慢性のアキレス腱炎および腱鞘炎。ドップラーにより、この領域における重度の腱内充血が示された(図4a)。VASは60であった。
治療:長期の理学療法およびカイロプラティック治療は、好ましい(positive)結果をまったく示さなかった。自己由来組成物を調製し、超音波ガイドを利用して、1週間の間隔を空けて3回、腱に注射した。
図4aおよび4bは、ドップラー超音波検査の画像であり、過剰な充血を特徴とする慢性アキレス腱症(図4a、治療前の状態)を示した。この慢性アキレス腱症は、自己由来組成物による治療の結果、回復した(図4b、治療後の画像診断)。
結果:ドップラー画像診断において充血は示されなかった(図4b)。注射後5ヶ月の時点の追跡評価でVASは0であった。
【００４６】
実施例3-インビトロ研究
健常な男性および女性のボランティアドナー(21〜60才)の末梢血を、無菌条件下での静脈穿刺によって滅菌済み10ml容ガラスチューブに採取した。標準手順に従って、1本のチューブは、インキュベーション段階を行わずに処理した(対照試料)。試料を様々なインキュベーション条件に曝露し、各試料に由来する血清500μlをアッセイ法のために使用した。解析前に10,000×g、4℃で10分間、試料を遠心分離して、細胞片および凝集物を除去した。MagPlex(商標)ビーズを用いる、BioPlex Pro(商標)Human Cytokine 27-plex Panel、Human TIMP Magnetic Luminex(商標)Performance Assay 4-plex Panel(商標)(Bio-Rad Laboratories, Canada, LTD)解析を、製造業者の取扱い説明書(インターネットでbio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10014905.pdfから入手可能)に従って、平底マイクロタイタープレートにおいて実施した。
【００４７】
手短に言えば、試料を試料希釈液中で1:4に希釈した。標準物質は、水を加えて元に戻し、4倍希釈系列に希釈した。抗体を結合させた捕捉ビーズを調製し、プレートに播いた(plated)。ビーズ溶液は、各ウェルに添加する前にボルテックスした。プレートを洗浄した。洗浄段階はすべて、手動で実施した。第1に、洗浄溶液をプレートに添加し、続いて、そのプレートをシールテープで覆った。1100rpmで30秒間、次いで、300rpmで1.5分間、振盪装置上でプレートをインキュベートした。プレートを振盪装置から取り外し、磁石上で1分間インキュベートした後、上清を廃棄した。洗浄後、希釈した試料および標準物質を、ウェル中のビーズに2ウェルずつ添加した。振盪装置上でプレートを30分間インキュベートし、インキュベーションおよび洗浄後、各ウェルに検出抗体を30分間添加した。振盪装置上でプレートを再びインキュベートし、洗浄段階をもう1回行った後、これらのウェルにストレプトアビジン溶液を10分間添加した。最後のインキュベーション段階の後、ビーズをアッセイ用緩衝液中に再懸濁し、xPONENT(商標)ソフトウェア(Luminex Corporation, Austin, TX, USA)を用いてMagPix(商標)(Luminex Corporation)によってプレートを読み取った。xPONENT(商標)ソフトウェアを用いて、結果を解析した。各分析物について検量線を作成することによって、試料の絶対濃度を決定した。
【００４８】
統計学的解析:いずれの統計試験も、GraphPad Prism(商標)バージョン5.01を用いて実施した。グループ間の比較をするための、ボンフェローニ検査後検定を伴う分散分析(ANOVA)を用いて、統計学的比較を実施した。解析した実験の数は3回以上であった。データは、平均値±標準誤差として示した。p<0.05。
【００４９】
図5は、37℃で24時間のインキュベーションの前(ベースラインレベル)および後のヒト血清試料中のTIMP1、TIMP2、およびTIMP4(MMPSアンタゴニスト)タンパク質のレベルの比較を示すグラフである。二元配置ANOVA検定により、インキュベーション後24時間目時点でのTIMP1およびTIMP2のレベルの統計学的に有意な上昇が明らかになった。
【００５０】
図9は、未処理ヒト血清試料中のPGDFの平均濃度レベルと24時間インキュベートした試料中のPGDFの平均レベルとの比較を示すグラフである。試験データ解析により、処理された試料中のPGDFタンパク質濃度が統計学的に有意に上昇していることが示された。PDGF濃度は、MAGPIX Luminex(商標)技術を用いて評価した。
【００５１】
実施例4  変形性膝関節症の関節痛を治療した患者の結果
患者8名の変形性膝関節症の関節痛の症状を治療した。実施例2で要約した手順に従い、これらの患者に、1週間の間隔を空けて、局所用の自己由来組成物を4回注射した。
【００５２】
臀部およびまたは膝の変形性関節症を患っている患者の疼痛、こわばり、および身体機能を評価するために、視覚的アナログ疼痛スケール(VAS)ならびにウェスタンオンタリオ大学およびマクマスター大学の関節炎指標(WOMAC) 質問表を用いて、注射を受けた後の患者を評価した。図7に示すように、WOMAC質問表データの解析により、長期間(最長3ヶ月)にわたって、患者の日常活動の統計学的に有意な改善、ならびに疼痛およびこわばりのパラメーターの統計学的に有意ではないが改善に向かう好ましい動き(positive dynamic of improvement)を示した。図6に示すように、視覚的アナログ疼痛スケールの統計学的解析により、3回目の注射後の有意な疼痛軽減が明らかになった。
【００５３】
図6は、患者8名の関節痛をVASスケールに基づき平均ベースラインと注射後とで比較したものを示す棒グラフである。この結果から、統計学的に有意に疼痛の平均が減少し、最長で3ヶ月間、効果が持続することが示されている。
【００５４】
図7は、患者8名の疼痛、こわばり、および日常活動能力の平均レベルについてWOMAC指標による点数の値を示す図表である。値は、ベースライン、注射後、注射後2ヶ月および3ヶ月について、提供されている。
【００５５】
図8は、患者8名の結果をグラフ形態で示し、1回目、2回目、3回目の注射後、4回目の注射後2ヶ月および3ヶ月の平均結果の分析を提供している。
【００５６】
図6〜8に示されるこれらの結果は、試験した患者8名を平均した結果である。
【００５７】
実施例5  抗炎症性/抗異化性成分を調製する際にインキュベーション前にクエン酸ナトリウム(CA)を添加する効果
患者15名を試験して、血液を約24時間インキュベーションする前に患者血液にクエン酸ナトリウム(CA)を添加することが、抗炎症性成分中、および抗炎症性成分と再生性成分またはPRP成分との組合せである最終製品中の、MMP9を含むMMP、IL-1β、TNF-α,TIMP2、Il-1ra、およびPDGFのレベルに与える効果を明らかにした。
【００５８】
以下の考察において、用語「血液」および「血清」は、同義的に使用される。
【００５９】
方法および材料:
本明細書の各患者について、抗炎症性/抗異化性成分を以下のようにして調製した。約9.5ccの血液を患者から採取した。次いで、約9.5ccの血液を、約0.5ccの生理食塩水を含む第1のチューブに送った。この生理食塩水は、約0.9％のNaClを含んでいた。さらに約9.5ccの血液は、患者に由来する採取血液であり、約0.5ccの4％クエン酸ナトリウムを含む第2のチューブに送られた。血液採取後、約37℃〜約39℃の温度で約24時間、第1のチューブおよび第2のチューブをインキュベートした。次いで、第1のチューブおよび第2のチューブを遠心分離して、各チューブ中の血液を上清成分および細胞画分に分けた。第1のチューブおよび第2のチューブの上清成分を別々に採取して、生理食塩水を含む第1のチューブに由来する(emanating)第1の抗炎症性/抗異化性成分およびクエン酸ナトリウムを含む第2のチューブに由来する第2の抗炎症性/抗異化性成分を提供した。各患者について、患者から血液を採取し;約4％のクエン酸の存在下で血液をチューブに送り;かつ血液を遠心分離して、全血成分から多血小板血漿成分を分離することによって、再生性成分を調製した。各患者について、多血小板血漿成分を採取し、それぞれ第1のチューブおよび第2のチューブの上清成分と混合して、生理食塩水を含む第1のチューブに由来する第1の最終製品およびクエン酸ナトリウムを含む第2のチューブに由来する第2の最終製品を提供した。
【００６０】
各患者について、血液を抜き取った直後に、MMP2、MMP3、MMP7、MMP9、MMP13、IL-1β、TNF-α、TIMP2、Il-1ra、およびPDGFのベースラインレベルを測定した。15名の各患者について、インキュベーション後約24時間目に、生理食塩水および患者の血液を含む第1のチューブ中のMMP9、IL-1β、TNF-α、TIMP2、Il-1ra、およびPDGFのレベルを測定した。同様に、15名の各患者について、インキュベーション後約24時間目に、クエン酸ナトリウムおよび患者の血液を含む第2のチューブ中のMMP9、IL-1β、TNF-α,TIMP2、Il-1ra、およびPDGFのレベルを測定した。各患者について、多血小板血漿成分をトロンビンと混合し、次いで、MMP9、IL-1β、TNF-α、TIMP2、Il-1ra、およびPDGFのレベルを測定した。各患者について、第1の最終製品および第2の最終製品のそれぞれにおけるMMP9、IL-1β、TNF-α、TIMP2、Il-1ra、およびPDGFのレベルを測定した。図10〜17にグラフで示すこれらの測定値は、試験した患者15名の平均を表している。
【００６１】
試験した患者15名において、インキュベーション0時間時点での天然血清(血液)中IL-1raの平均レベルは、9±4pg/mlと測定された。抗炎症性/抗異化性成分と再生性成分またはPRP成分との組合せの結果として生じる最終製品において、天然血清(血液)中IL-1raの平均測定値は、920±80pg/mlであった。抗炎症性/抗異化性成分にクエン酸ナトリウムを添加した場合とクエン酸ナトリウムを添加しなかった場合の両方とも、こういう状況であった。
【００６２】
試験した患者15名において、インキュベーション0時間時点での天然血清(血液)中PDGFの平均レベルは、1100±300pg/mlと測定された。抗炎症性/抗異化性成分と再生性成分またはPRP成分との組合せの結果として生じる最終製品において、天然血清(血液)中PDGFの平均測定値は、1920±380pg/mlであった。抗炎症性/抗異化性成分にクエン酸ナトリウムを添加した場合とクエン酸ナトリウムを添加しなかった場合の両方とも、こういう状況であった。
【００６３】
試験した患者15名において、インキュベーション0時間時点での天然血清(血液)中TIMP2の平均レベルは、1800 ±150pg/mlと測定された。抗炎症性/抗異化性成分と再生性成分またはPRP成分との組合せの結果として生じる最終製品において、天然血清(血液)中TIMP2の平均測定値は、5500±360pg/mlであった。抗炎症性/抗異化性成分にクエン酸ナトリウムを添加した場合とクエン酸ナトリウムを添加しなかった場合の両方とも、こういう状況であった。
【００６４】
これらの図において、血清(0h)は、採集してすぐに測定された患者血液中の分析物のレベルのベースライン測定値である。血清(24h)+0.5cc生理食塩水は、24時間のインキュベーション後の、生理食塩水と混合された患者血液中の分析物のレベルである。血清(24h)+0.5cc CAは、24時間のインキュベーション後の、4％クエン酸ナトリウム溶液と混合された患者血液中の分析物のレベルである。PRP+トロンビンは、凝固剤としてのトロンビンと組み合わせられたPRP成分中の分析物のレベルである。この測定値は、PRP成分中の分析物のベースラインレベルを示す。PRP+血清+トロンビンまたはPRP+血清(24h)+トロンビンは、抗炎症性/抗異化性成分と再生性成分またはPRP成分の組合せの結果として生じる最終製品中の分析物のレベルであり、その際、抗炎症性/抗異化性成分は、生理食塩水のみを用いてクエン酸ナトリウムを用いずに調製された。PRP+血清+CA+トロンビンまたはPRP+血清(24h)+CA+トロンビンは、抗炎症性/抗異化性成分と再生性成分またはPRP成分の組合せの結果として生じる最終製品中の分析物のレベルであり、その際、抗炎症性/抗異化性成分は、クエン酸ナトリウムを用いて調製された。
【００６５】
実施例2の手順で説明したように抗炎症性/抗異化性成分を調製する際、この成分を作製すると、インキュベーション段階後のIL-1ra(抗炎症性物質)、TIMP(抗異化性物質)、およびPDGF(再生性物質)のレベルが上昇することが観察された。自己由来生物活性組成物を作製する方法は、活性化された血液単核細胞が、好ましい(positive)生物活性分子を分泌する能力に基づいている。しかし、現在では、同じ免疫細胞が、活性化されると病理学的分子物質およびそれらの阻害物質の両方を非選択的に産生することが確認されている。したがって、自己由来生物活性組成物はまた、MMP9のような異化性分子も高濃度で含む。このことは、図10に示すように、患者血液を生理食塩水の存在下、約24時間、約37℃〜約39℃で24時間インキュベートした後に調製された抗異化性成分中の4つのタイプのMMPを定量測定することによって確認された。図10に示すように、MMP2、3、7、13の濃度はインキュベーション後に有意に変化していないことが見出されたの対し、変形性関節症発病に最も重大な意味を持つMMP9の濃度は有意に上昇していた。一元配置ANOVA検定により、インキュベーション後24時間目時点でのMMP9のレベルの統計学的に有意な上昇が明らかになった。
【００６６】
自己由来生物活性組成物中のMMP9濃度上昇が起こることにより、患者治療過程の間に有害作用が現れる場合がある。したがって、この好ましくない成分を選択的に排除することが望ましい。抗凝血剤であるクエン酸ナトリウムが存在すると、ヒト血液白血球によるMMP9放出は顕著に下向き調節される19。9.5cc血液:0.5ccクエン酸ナトリウムの比でクエン酸ナトリウム(CA)が存在するヒト血液を、約37℃〜約39℃の温度で24時間インキュベートしたところ、図11および12に示すように、特にMMP9分泌の著しいダイナミックな変化が見出された。特に、抗炎症性/抗異化性成分を調製する際にクエン酸ナトリウムを添加すると、抗炎症性/抗異化性成分と再生性成分(トロンビンによって活性化したPRP+24h血清)との組合せである最終製品中のMMP9濃度が有意に低下した。抗炎症性/抗異化性成分を調製する際にクエン酸ナトリウムを添加した場合、24時間のインキュベーション後のMMP9レベルは、ベースラインレベル(0h)と比べて変化しなかった。トロンビンを含むPRP成分中のMMP9レベルを測定して、PRP成分中のMMP9のベースラインレベルを示した。この測定から、PRP成分を作製する際に顕著な量のMMP9は産生されないことが示されている。
【００６７】
血液のインキュベーション処理が異化促進性分子MMP9の増加を招くことを考慮して、インキュベートした血清中および抗炎症性/抗異化性成分と再生性成分(トロンビンによって活性化したPRP+24時間インキュベートした血清)との組合せである最終製品中の、他の病理学的分子物質、すなわちIL-1βおよびTNF-αの濃度を調べた。インキュベーション中に活性化白血球によって放出されるこれらの分子に対するクエン酸ナトリウムの効果を調べた。とはいえ(although)、IL-1β濃度およびTNF-α濃度の両方ともインキュベーション時に有意に上昇することが判明した。この現象(effect)は、図13および14に示すように、抗炎症性/抗異化性成分を調製する際にクエン酸ナトリウムを添加することによって、効率的に阻止することができた。
【００６８】
図13に関して、二元配置ANOVA検定により、クエン酸ナトリウムの存在下、約37℃〜約39℃で24時間インキュベートした血清中の、ならびに最終製品(PRP+血清24h+クエン酸ナトリウム(CA)+トロンビン)中のIL-1β濃度が、製品を調製するための以前の方法(PRP+血清24h+生理食塩水)と比べて、統計学的に有意に低下していることが明らかになった。全体を通して言及されるように、最終製品(PRP+血清24h+CA+トロンビン)とは、抗炎症性/抗異化性成分と再生性成分の組合せである。
【００６９】
図14に関して、二元配置ANOVA検定により、クエン酸ナトリウムの存在下、約37℃〜約39℃で24時間インキュベートした血清中の、ならびに最終製品(PRP+血清24h+CA+トロンビン)中のTNF-α濃度が、以前の製品調製方法(PRP+血清24h+生理食塩水)と比べて、統計学的に有意に低下していることが明らかになった。
【００７０】
クエン酸ナトリウムを抗炎症性/抗異化性成分に添加することが、生物活性組成物の調製時に病理学的分子物質の阻害物質に影響を及ぼすかどうかを評価するために、同様の条件でTIMP、Il-1ra、およびPDGFの濃度を調べた。図15、16、および17に示すように、TIMP、Il-1ra、およびPDGFの産生に対するクエン酸ナトリウムの負の影響は観察されなかった。
【００７１】
図15に関して、インキュベーション前(ベースラインレベル)、37℃で24時間のインキュベーション後、活性化PRP、および最終製品中とで、ヒト血清試料中のTIMP2レベルの比較を行った。二元配置ANOVA検定により、クエン酸ナトリウムは、クエン酸ナトリウムの存在下で24時間インキュベートした血清中の、ならびに最終製品(PRP+血清24h+CA+トロンビン)中のTIMP濃度を、以前の製品調製方法(PRP+血清24h+生理食塩水)と比べて、低下させないことが明らかになった。
【００７２】
図16に関して、二元配置ANOVA検定により、クエン酸ナトリウムは、クエン酸ナトリウムの存在下で24時間インキュベートした血清中の、ならびに最終製品(PRP+血清24h+CA+トロンビン)中のIL-1ra濃度を、以前の製品調製方法(PRP+血清24h+生理食塩水)と比べて、低下させないことが明らかになった。
【００７３】
図17に関して、二元配置ANOVA検定により、クエン酸ナトリウムは、24時間インキュベートした血清中の、ならびに最終製品(PRP+血清24h+CA+トロンビン)中のPDGF濃度を、以前の製品調製方法(PRP+血清24h+生理食塩水)と比べて、低下させないことが明らかになった。
【００７４】
実施例6  変形性膝関節症の関節痛の症状を有する患者の治療
実施例2で要約したように、本明細書において説明する方法によって、患者17名の変形性膝関節症の関節痛の症状を治療した。2つのグループの患者に、1週間の間隔を空けて2回の注射を行った。第1のグループの患者7名には、クエン酸ナトリウムの不在下で(CA-)調製した抗炎症性/抗異化性成分を含む製品を与えた。第2のグループの患者10名には、クエン酸ナトリウムの存在下で(CA+)調製した抗炎症性/抗異化性成分を含む製品を与えた。どちらの治療も、いかなる有害事象ももたらさず、安全かつ有効であることが判明した。
【００７５】
臀部および/または膝の変形性関節症を患っている患者の疼痛、こわばり、および身体機能を評価するために、ウェスタンオンタリオ大学およびマクマスター大学の関節炎指標(WOMAC)質問表を用いて、患者を評価した。図18a、18b、および18cにそれぞれ示すように、注射後1ヶ月時点のWOMAC質問表データの予備解析により、クエン酸を含む(CA+)抗炎症性/抗異化性成分で治療した患者における、患者の疼痛、こわばり、および日常活動の統計学的に有意な改善が示された。図18a、18b、および18cにそれぞれ示すように、クエン酸を含まない(CA-)抗炎症性/抗異化性成分で治療した患者グループでは、前述のパラメーターの統計学的に有意ではないが改善に向かう好ましい動きが観察された。図18dに示すように、視覚的アナログ疼痛スケール(VAS)の統計学的解析により、両方のグループでの有意な疼痛軽減が明らかになった。
【００７６】
実施例7  慢性炎症性皮膚疾患
実施例2の方法を、4週間の期間にわたって、重度の乾癬を患っている59才の女性患者に対して実施した。抗炎症性/抗異化性成分を多血小板血漿成分と組み合わせることによって作製した自己由来組成物を、1週間の間隔を空けて自己由来組成物を4回に分けて注射して、女性患者に投与した。治療は、病変部位全体への皮内注射を伴った。治療後4週目までに、劇的な視覚的変化が観察された。注射から3ヶ月後の転帰は、安定しており、乾癬が根絶される効果を伴っていた。図19は、治療前の女性患者の腕の患部写真である。図19bは、4回目の注射後3ヶ月の女性患者の腕の患部写真である。
【００７７】
実施例2の方法を、抗炎症性/抗異化性成分を調製する際にクエン酸ナトリウムを添加して、および添加せずに、アトピー性皮膚炎および慢性創傷などの慢性炎症性皮膚疾患に罹患している対象に実施する。慢性炎症性の皮膚疾患の重症度は低下する。
【００７８】
実施例8  ウマ、イヌ、およびラクダ
抗炎症性/抗異化性成分を調製する際にクエン酸ナトリウムを添加する、および添加しない、実施例2の方法を、損傷したおよび/または傷ついた結合組織を患っているウマ、イヌ、およびラクダに対して実施する。損傷したおよび/または傷ついた結合組織に付随する疼痛の重症度は低下する。
【００７９】
例示的な態様に関連して本発明を説明してきたが、本発明はこれらの厳密な態様に限定されないことを理解すべきである。本発明の範囲から逸脱することなく、前述の本発明の具体的態様に、多数の修正、変更、および改変を加えることができる。特許請求の範囲は、実施例で説明する好ましい態様によって限定されるべきではなく、全体として明細書と一致する最も広範な解釈が与えられるべきである。
【００８０】
参考文献
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これらの参考文献の内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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