(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療有効量のｐ７５細胞外ドメイン（ｐ７５ＥＣＤ）又はその変異体、類似体若しくは誘導体を含み、前記変異体、類似体若しくは誘導体は、アミノ酸配列の１つ又は複数のアミノ酸の修飾によってｐ７５ＥＣＤとは異なる分子からなるが、ｐ７５ＥＣＤの生物学的活性を保持する、脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）を処置及び／又は予防するための医薬組成物。
【請求項２】
前記変異体、類似体若しくは誘導体がｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ融合物である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ融合物がｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ融合物アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターとして含まれる、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ融合物ＡＡＶベクターが、対象体重１ｋｇ当たり１×１０６〜１×１０１３個のウイルスゲノムの用量で投与される、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ融合物ＡＡＶベクターが、対象体重１ｋｇ当たり１×１０８〜１×１０１３個のウイルスゲノムの用量で投与される、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ融合物が組換えペプチドである、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記組換えｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ融合物ペプチドが、対象体重１ｋｇ当たり０．１〜２５０ｍｇの用量で投与される、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記ｐ７５ＥＣＤが配列番号４により提供されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ融合物が配列番号６により提供されるアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記ｐ７５ＥＣＤ又はその変異体、類似体若しくは誘導体が腹腔内、脳室内、髄腔内又は筋肉内注射を介して投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]本開示は、神経学的障害を診断し、検出し及び／若しくは予後予測する方法、並びに／又は神経学的障害を処置する方法に関する。特定の形態において、本開示はニューロトロフィン受容体ｐ７５及び／又はその細胞外ドメインの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
[0002]ニューロトロフィンは、神経発生、神経生存、増殖、分化、ミエリン形成、軸索伸長及びシナプス可塑性、逆に神経発達の全ての段階におけるアポトーシス及び細胞死、成人寿命、ニューロン損傷並びに疾患への関与を含む、神経系における広範囲の作用をもたらす複雑なシグナリング経路を介して作用する分泌型神経栄養因子の小さなファミリーである。ニューロトロフィンファミリーとしては、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ３）及びニューロトロフィン−４／５（ＮＴ４／５）が挙げられる。ニューロトロフィンは、少なくとも３つの異なるタイプの受容体、トロポミオシン関連キナーゼ（ＴｒＫ）受容体（ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ及びＴｒｋＣ）、ソーティリン及びｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５；同義語としては、ｐ７５ＮＴＲ、ｐ７５（ＮＴＲ）、Ｇｐ８０−ＬＮＧＦＲ、低親和性神経成長因子受容体、低親和性ニューロトロフィン受容体、ＮＧＦ受容体及び腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１６前駆体（ＴＮＦＲＳＦ１６）が挙げられる）に結合することによってそれらの効果を媒介する。ニューロトロフィンの高親和性結合は、補助受容体として相互作用するこれらの受容体タイプのうちの２つを含むことが多い。
【０００３】
[0003]ｐ７５は、高親和性ニューロトロフィンＴｒｋ受容体の相対的発現レベルに依存してニューロンの生存又はアポトーシスを媒介する。ｐ７５は、細胞外ドメイン（又はエクトドメイン）のシェディングを受け、ここで、ｐ７５の細胞外ドメイン（ｐ７５ＥＣＤ）が完全長タンパク質から切断される。ｐ７５ＥＣＤのシェディングは、腫瘍壊死因子−アルファ変換酵素（ＴＡＣＥ）によって、続いてガンマ−セクレターゼによる制御された膜間タンパク質分解によって生理学的に制御される。しかしながら、ｐ７５のシェディングの生理学的及び病理学的意義はわかっていない。ｐ７５のシェディングの調節及びｉｎ  ｖｉｖｏのシェディング後の拡散性ｐ７５ＥＣＤの機能はいまだ決定されていない。
【０００４】
[0004]アルツハイマー病（ＡＤ）、脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）、ハンチントン病、パーキンソン病及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）及びタウオパチー、並びに脊髄損傷のようなニューロン損傷を含む多種多様な神経変性及び精神疾患において、ニューロトロフィンレベル及びシグナリング経路の変化が神経生存及び病態生理に関係があるとされてきたが、ニューロトロフィン又はそれらの受容体の欠損により直接引き起こされることが示されたヒトの疾患はいまだない。
【０００５】
[0005]ＡＤは、世界的におよそ２４００万人が罹患する、認知症の最も一般的な形態である。ＡＤは、記憶喪失、日常生活動作を行う能力の低下、及び神経精神症状又は行動変化を含む進行性の認知衰退を特徴とする。病理学的に、ＡＤ罹患者の脳は、正常な脳には見られない「神経原線維濃縮体」（ＮＦＴ）及び「アミロイドプラーク」を特徴とする。ＡＤにおけるアミロイドプラークは、大脳皮質及び海馬における誤って折り畳まれた毒性のアミロイド−β（Ａβ）タンパク質の蓄積により形成される。Ａβは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の代謝産物であり、正常な脳においては、Ａβの定常状態レベルがＡβの生成及びクリアランスの間のバランスによって維持されている。このバランスは、ＡＤ罹患者では失われている。興味深いことに、Ａβペプチドはｐ７５のリガンドであることがわかっており、シグナリングカスケードを活性化することができる。ｐ７５がＡβ誘発神経毒性を媒介することが提案されている。
【０００６】
[0006]脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）は、高齢者における自然発生的な脳内出血（ＩＣＨ）及び認識機能障害の重要な原因としてますます認識されている。脳アミロイド血管症は、血管性認知症を引き起こす、大脳皮質及び軟膜の小〜中サイズの血管壁におけるＡβの進行性の沈着を特徴とする。脳アミロイド血管症は後部皮質領域、続いて前葉及び頭頂葉を好む。ＣＡＡは、脳血管も冒しうるが、脳幹又は基底核内の脳血管では稀である。ＣＡＡ及びＡＤは異なる状態である。しかしながら、四集団ベース死後研究の再調査は、認知障害のない患者における２８〜３０％及び認知症患者における５５〜６９％のＣＡＡ有病率を示した（Ｋｅａｇｅら、２００９年）。ＣＡＡは、ＡＤ症例の８２〜９８％で認められるが、重度のＣＡＡはＡＤ症例の２５％のみに見られる（Ｃｈａｒｉｄｉｍｏｕら、２０１２年；Ｊｅｌｌｉｎｇｅｒ、２００２年）。
【０００７】
[0007]タウオパチーは、脳内のタウタンパク質の病的凝集を特徴とする神経変性疾患の不均一なクラスである。タウタンパク質は、微小管結合タンパク質（ＭＡＰ）であり、健常者ではチューブリンと相互作用して軸索微小管を安定化し、微小管へのチューブリンのアセンブリーを促進する。タウタンパク質は、中枢神経系のニューロンで豊富であり、その他ではより一般的でないが、ＣＮＳの星状細胞及びオリゴデンドロサイトでも非常に低レベルで発現される。タウオパチーは、タウタンパク質に欠陥が生じてもはや適切に微小管を安定化できなくなったときに結果として生じうる。これは、神経原線維濃縮体（ＮＦＴ）の細胞内蓄積及び生成をきたしうる。タウは、７９個以下の可能性のあるセリン（Ｓｅｒ）及びスレオニン（Ｔｈｒ）リン酸化部位を最も長いタウアイソフォームに有するリン酸化タンパク質である。リン酸化は、正常なタウタンパク質中のこれらの部位のうちのおよそ３０個において報告されているが；過剰リン酸化はＮＦＴの自己組織化と関連している。
【０００８】
[0008]ＮＦＴは、ＡＤ、進行性核上性麻痺、ボクサー認知症（慢性外傷性脳症）、１７癌染色体に連鎖する前頭側頭型認知症とパーキンソニズム、リティコ−ボーディグ病（Ｌｙｔｉｃｏ−Ｂｏｄｉｇ  ｄｉｓｅａｓｅ）（グアムのパーキンソン認知症複合）、（ＡＤに類似したＮＦＴを有するが、プラークを有さない）神経原線維変化型認知症（ｔａｎｇｌｅ−ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ  ｄｅｍｅｎｔｉａ）、神経節膠腫及び神経節細胞腫、髄膜血管腫症、亜急性硬化性全脳炎、ハンチントン病を含む、広範なタウオパチー性疾患（ｔａｕｏｐａｔｈｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）において観察されうる。ＡＤ患者は異なる程度のＮＦＴ合併症を有しうるが、ＮＦＴはＡＤを患わない患者において存在しうる。したがって、タウオパチーはアミロイドプラークと関連しないＡＤの別の構成要素である。
【０００９】
[0009]本明細書に開示される通り、ｐ７５ＥＣＤは、神経学的障害を診断、予防若しくは処置するため並びに／又はアポトーシス及び神経変性からニューロンを保護するために利用されうる神経保護因子であると有利に認識されている。さらに、完全長ｐ７５（ｐ７５ＦＬ）の役割は、神経学的障害を診断するために、加えて若しくはその代わりに有利に利用されることができ、並びに／又はこの因子は神経学的疾患を予防若しくは処置し、並びに／又はアポトーシス及び神経変性からニューロンを保護するために標的化されうる。
【発明の概要】
【００１０】
[0010]本開示の態様によれば、
（ａ）被験対象から生物学的試料を得るステップと、
（ｂ）被験対象の生物学的試料中のｐ７５細胞外ドメイン（ｐ７５ＥＣＤ）及び／又は完全長ｐ７５（ｐ７５ＦＬ）の濃度を測定するステップと、
（ｃ）被験対象の生物学的試料中のｐ７５ＥＣＤ及び／若しくはｐ７５ＦＬの濃度、並びに／又はｐ７５ＥＣＤ：ｐ７５ＦＬの比率を、認知障害のない対照対象又は認知障害のない対照対象群から得られた同等の生物学的試料中のｐ７５ＥＣＤ及び／若しくはｐ７５ＦＬの濃度、並びに／又はｐ７５ＥＣＤ：ｐ７５ＦＬの比率と比較するステップと
を含み、
被験対象におけるｐ７５ＥＣＤ及び／若しくはｐ７５ＦＬの濃度、並びに／又はｐ７５ＥＣＤ：ｐ７５ＦＬの比率が、認知障害のない対照対象又は認知障害のない対照対象群におけるｐ７５ＥＣＤ及び／若しくはｐ７５ＦＬの濃度、並びに／又はｐ７５ＥＣＤ：ｐ７５ＦＬの比率に比べて変更されている場合、アルツハイマー病（ＡＤ）と診断及び／又は予後予測される、被験対象においてアルツハイマー病を診断及び／又は予後予測する方法が提供される。
【００１１】
[0011]ある実施形態では、方法は、
（ａ）被験対象から生物学的試料を得るステップと、
（ｂ）被験対象の生物学的試料中のｐ７５細胞外ドメイン（ｐ７５ＥＣＤ）の濃度を測定するステップと、
（ｃ）被験対象の生物学的試料中のｐ７５ＥＣＤの濃度を、認知障害のない対照対象又は認知障害のない対照対象群から得られた同等の生物学的試料中のｐ７５ＥＣＤの濃度と比較するステップと
を含み、
被験対象におけるｐ７５ＥＣＤの濃度が、認知障害のない対照対象又は認知障害のない対照対象群に比べて減少している場合、アルツハイマー病と診断及び／又は予後予測される。
【００１２】
[0012]ある実施形態では、方法は、
（ａ）被験対象から生物学的試料を得るステップと、
（ｂ）被験対象の生物学的試料中のｐ７５ＥＣＤ及びｐ７５ＦＬの濃度を測定するステップと、
（ｃ）被験対象の生物学的試料中のｐ７５ＥＣＤ及びｐ７５ＦＬの濃度を、認知障害のない対照対象又は認知障害のない対照対象群から得られた同等の生物学的試料中のｐ７５ＥＣＤ及びｐ７５ＦＬの濃度と比較するステップと
を含み、
被験対象におけるｐ７５ＥＣＤ：ｐ７５ＦＬの比率が、認知障害のない対照対象又は認知障害のない対照対象群に比べて減少している場合、アルツハイマー病と診断及び／又は予後予測される。
【００１３】
[0013]ある実施形態では、方法は、
（ａ）被験対象から生物学的試料を得るステップと、
（ｂ）被験対象の生物学的試料中のｐ７５ＦＬの濃度を測定するステップと、
（ｃ）被験対象の生物学的試料中のｐ７５ＦＬの濃度を、認知障害のない対照対象又は認知障害のない対照対象群から得られた同等の生物学的試料中のｐ７５ＦＬの濃度と比較するステップと
を含み、
被験対象におけるｐ７５ＦＬの濃度が、認知障害のない対照対象又は認知障害のない対照対象群に比べて増加している場合、アルツハイマー病と診断及び／又は予後予測される。
【００１４】
[0014]本開示の別の態様によれば、治療有効量のｐ７５細胞外（ｐ７５ＥＣＤ）又はその機能的断片、変異体、類似体若しくは誘導体をそれを必要とする対象に投与するステップを含む、脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）又はタウオパチーを処置及び／又は予防する方法が提供される。
【００１５】
[0015]本開示のさらなる態様では、治療有効量のｐ７５ＥＣＤ又はその機能的断片、変異体、類似体若しくは誘導体をそれを必要とする対象に投与するステップを含む、Ａβのような神経毒性因子により誘導されたアポトーシス及び／又は神経変性に対してニューロンを保護する方法が提供される。
【００１６】
[0016]ある実施形態では、ｐ７５ＥＣＤ又はその機能的断片、変異体、類似体若しくは誘導体は、ｐ７５ＥＣＤである。ある実施形態では、ｐ７５ＥＣＤは、配列番号４により提供されるアミノ酸配列を有する。ある実施形態では、ｐ７５ＥＣＤは、ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ融合物である。ある実施形態では、ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃは、配列番号６により提供されるアミノ酸配列を有する。ある実施形態では、ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ融合物は、ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ融合物アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターとして投与される。ある実施形態では、ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ融合物は組換えペプチドである。ある実施形態では、ｐ７５ＥＣＤは、腹腔内、脳室内、髄腔内又は筋肉内注射を介して投与される。
【００１７】
[0017]ある実施形態では、対象はヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１−１】（ａ）ＡＡＶ−ＧＦＰベクターの設計を示すプラスミドマップ及び（ｂ）ＡＡＶ−ＧＦＰ及びＡＡＶ−ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ調製物の純度及び均一性を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及び（ｃ）ＡＡＶ−ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃベクターの設計を示すプラスミドマップによる、ＡＡＶ−ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃベクターの構築及び特徴付けを提供する。
【図１−２】（ａ）ＡＡＶ−ＧＦＰベクターの設計を示すプラスミドマップ及び（ｂ）ＡＡＶ−ＧＦＰ及びＡＡＶ−ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ調製物の純度及び均一性を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及び（ｃ）ＡＡＶ−ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃベクターの設計を示すプラスミドマップによる、ＡＡＶ−ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃベクターの構築及び特徴付けを提供する。
【図２】中枢神経系におけるｐ７５ＥＣＤの生理学的レベルの証拠、特に（ａ）様々な年齢のＷｔマウスの全脳ホモジネートのＴＢＳ画分中のｐ７５ＥＣＤのＥＬＩＳＡ分析のグラフ表示（ｍｏｎ＝月齢、ｎ＝７）、（ｂ）１月齢及び１２月齢のＷｔマウスの様々な脳領域のｐ７５ＥＣＤレベル（ｎ＝５、平均±平均値の標準誤差、スチューデントのｔ検定、＊＊Ｐ＜０．０１）、（ｃ）１２月齢のＷｔマウスの様々な脳領域のｐ７５ＦＬ及びｐ７５ＥＣＤのウェスタンブロット分析、を提供する。
【図３】ＥＬＩＳＡによる、（ａ）アルツハイマー病（ＡＤ）患者及び同年齢の認知障害のない対照（ＮＤ）におけるヒト脳脊髄液（ＣＳＦ）中のｐ７５ＥＣＤレベルのグラフ表示（ＡＤに関してｎ＝２９、ＮＤに関してｎ＝２７、平均±平均値の標準誤差、スチューデントのｔ検定、＊＊Ｐ＜０．０１）、（ｂ）ヒトＡＤ及びＮＤ脳組織中の完全長ｐ７５（ｐ７５ＦＬ）及びｐ７５ＥＣＤのウェスタンブロット分析、（ｃ）（ｂ）に示されたｐ７５ＦＬ及びｐ７５ＥＣＤのウェスタンブロットバンド密度の定量分析及び（ｄ）（ｂ）に示されたウェスタンブロットバンド密度のｐ７５ＥＣＤ／ｐ７５ＦＬの比率（ＡＤに関してｎ＝１２、ＮＤに関してｎ＝１２、平均±平均値の標準誤差、スチューデントのｔ検定、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）；（ｅ）ＥＬＩＳＡによる、１２月齢のＡＤマウス（Ｔｇ）及び野生型同腹子（Ｗｔ）の脳ホモジネートのトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）画分中のｐ７５ＥＣＤレベルのグラフ表示（Ｔｇに関してｎ＝１３、Ｗｔに関してｎ＝１４、平均±平均値の標準誤差、スチューデントのｔ検定、＊＊Ｐ＜０．０１）、（ｆ）１２月齢のＴｇ及びＷｔマウス由来の脳組織中の完全長ｐ７５（ｐ７５ＦＬ）のウェスタンブロット分析、（ｇ）（ｆ）に示されたｐ７５ＦＬ及びｐ７５ＥＣＤのウェスタンブロットバンド密度の定量分析及び（ｈ）（ｆ）に示されたウェスタンブロットバンド密度のｐ７５ＥＣＤ／ｐ７５ＦＬの比率（Ｔｇに関してｎ＝１３、Ｗｔに関してｎ＝１４、平均±平均値の標準誤差、スチューデントのｔ検定、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）を提供する。
【図４】（ａ）注射後１週間（１ｗ）、２週間（２ｗ）、３週間（３ｗ）及び９ヵ月（９ｍ）におけるＡＤマウス脳ホモジネートのＴＢＳ画分中のｐ７５ＥＣＤについてのＥＬＩＳＡ分析により分析された、３月齢のＡＤマウスの左側脳室へのＡＶＶ−ＥＣＤ−Ｆｃ又はＡＡＶ−ＧＦＰの脳室内注射後のＥＣＤ−ＦＣの発現レベル（１ｗ、２ｗ及び３ｗに関して１群当たりｎ＝５、９ｍ群に関してｎ＝８）、及び（ｂ）ｐ７５ＥＣＤについてのＥＬＩＳＡ分析により分析された、３月齢における左側脳室へのＡＡＶ−ＥＣＤ−Ｆｃ又はＡＡＶ−ＧＦＰの脳室内注射後の１２月齢のＡＤマウスの、１２月齢のＷｔマウスに比較したＴＢＳ画分中のｐ７５ＥＣＤの発現レベル（ＡＡＶ−ＧＦＰ又はＡＡＶ−ＥＣＤ−Ｆｃを注射した１２月齢のＴｇマウスに関してｎ＝８、Ｗｔマウスに関してｎ＝１３）；平均±平均値の標準誤差、ＡＮＯＶＡ、テューキーの検定、＊＊Ｐ＜０．０１）を提供する。
【図５−１】（ａ）プラットフォーム試験の間の潜時（秒）、（ｂ）トレーニングの最終日の移動距離（センチメーター）（平均±平均値の標準誤差、ＡＮＯＶＡ、テューキーの検定、Ｃｏｎに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）及び（ｃ）代表的な自発運動活性を追跡するグラフを示す、モリス水迷路分析；（ｄ）取り外されたプラットフォームの輪を超える数及び（ｅ）プラットフォームが置かれた四分円内を移動した距離（平均±平均値の標準誤差、一方向ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの検定、Ｃｏｎに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）及び（ｆ）代表的な自発行動活性を追跡するグラフを示す、５日目におけるプローブ試験；（ｇ）アームの変更及び（ｈ）自発的な変更試験におけるエントリー数、並びに新規アーム試験におけるエントリーの（ｉ）数及び（ｊ）時間（平均±平均値の標準誤差、一方向ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの検定、Ｃｏｎに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１；Ｗｔに対して＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１）を示す、Ｙ迷路分析；（ｋ）立ち上がり数、（ｌ）移動距離（センチメーター）及び（ｍ）代表的な自発運動活性を追跡するグラフ（平均±平均値の標準誤差、一方向ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの検定、Ｃｏｎに対して＊Ｐ＜０．０５）を示す、オープンフィールド分析における、Ｗｔ同腹子（Ｗｔ、ｎ＝１６）、未処置ＡＤマウス（Ｔｇ、ｎ＝１５）、対照としてのＡＡＶ−ＧＦＰを３ヵ月又は９ヵ月で注射したＡＤマウス（Ｃｏｎ、ｎ＝１４）、処置のために９月齢でＡＡＶ−ＥＣＤ−Ｆｃを注射したＡＤマウス（Ｔｒｅ、ｎ＝１２）及び予防のために３月齢でＡＡＶ−ＥＣＤ−Ｆｃを注射したＡＤマウス（Ｐｒｅ、ｎ＝１１）を含む、１２月齢マウスの行動分析のグラフ表示を提供する。
【図５−２】（ａ）プラットフォーム試験の間の潜時（秒）、（ｂ）トレーニングの最終日の移動距離（センチメーター）（平均±平均値の標準誤差、ＡＮＯＶＡ、テューキーの検定、Ｃｏｎに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）及び（ｃ）代表的な自発運動活性を追跡するグラフを示す、モリス水迷路分析；（ｄ）取り外されたプラットフォームの輪を超える数及び（ｅ）プラットフォームが置かれた四分円内を移動した距離（平均±平均値の標準誤差、一方向ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの検定、Ｃｏｎに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）及び（ｆ）代表的な自発行動活性を追跡するグラフを示す、５日目におけるプローブ試験；（ｇ）アームの変更及び（ｈ）自発的な変更試験におけるエントリー数、並びに新規アーム試験におけるエントリーの（ｉ）数及び（ｊ）時間（平均±平均値の標準誤差、一方向ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの検定、Ｃｏｎに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１；Ｗｔに対して＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１）を示す、Ｙ迷路分析；（ｋ）立ち上がり数、（ｌ）移動距離（センチメーター）及び（ｍ）代表的な自発運動活性を追跡するグラフ（平均±平均値の標準誤差、一方向ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの検定、Ｃｏｎに対して＊Ｐ＜０．０５）を示す、オープンフィールド分析における、Ｗｔ同腹子（Ｗｔ、ｎ＝１６）、未処置ＡＤマウス（Ｔｇ、ｎ＝１５）、対照としてのＡＡＶ−ＧＦＰを３ヵ月又は９ヵ月で注射したＡＤマウス（Ｃｏｎ、ｎ＝１４）、処置のために９月齢でＡＡＶ−ＥＣＤ−Ｆｃを注射したＡＤマウス（Ｔｒｅ、ｎ＝１２）及び予防のために３月齢でＡＡＶ−ＥＣＤ−Ｆｃを注射したＡＤマウス（Ｐｒｅ、ｎ＝１１）を含む、１２月齢マウスの行動分析のグラフ表示を提供する。
【図６−１】（ａ）コンゴーレッド染色を使用して可視化したＡβプラーク沈着（スケールバー＝１ｍｍ）；面積率（ｂ、左パネル）、プラーク密度（ｂ、中パネル）及びコンゴーレッド染色されたプラークのサイズ（ｂ、右パネル）の群間比較；（ｃ）抗体６Ｅ１０免疫組織化学により染色したＡβプラーク（スケールバー＝１ｍｍ）；面積率（ｄ、左パネル）、プラーク密度（ｄ、中パネル）及び６Ｅ１０染色したプラークのサイズ（ｄ、右パネル）の群間比較（（ａ）〜（ｄ）に関して、Ｃｏｎに関してｎ＝１１、Ｔｒｅに関してｎ＝９、Ｐｒｅに関してｎ＝８、平均±平均値の標準誤差、一方向ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの検定、Ｃｏｎに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）；（ｅ−ｉ）脳ホモジネート及び（ｅ−ｉｉ）血清のＴＢＳ、ＳＤＳ及びギ酸（ＦＡ）画分中のＡβ４０、Ａβ４２及び全ＡβのＥＬＩＳＡ分析（脳ホモジネートに関して、Ｃｏｎに関してｎ＝１１、Ｔｒｅに関してｎ＝９、Ｐｒｅに関してｎ＝８；血清に関して、Ｃｏｎに関してｎ＝１４、Ｔｒｅに関してｎ＝１２、Ｐｒｅに関してｎ＝１１、平均±平均値の標準誤差、一方向ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの検定、Ｃｏｎに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）；（ｆ）コンゴーレッド染色により可視化した脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）を示す顕微鏡写真（スケールバー＝１ｍｍ）、（ｇ）Ｃｏｎ，Ｔｒｅ及びＰｒｅ群間のＣＡＡプロフィールの比較（ｎ＝８、平均±平均値の標準誤差、一方向ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの検定、Ｃｏｎに対して＊＊Ｐ＜０．０１）；（ｈ）Ｃｏｎ，Ｔｒｅ及びＰｒｅ群間の脳微小出血の数の比較（ｎ＝８、平均±平均値の標準誤差、一方向ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの検定、Ｃｏｎに対してＣｏｎに対して＊＊Ｐ＜０．０１）；（ｉ）ＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックＡＤマウスにおけるＡβプラーク及びＥＣＤ−Ｆｃの共局在を示す顕微鏡写真（スケールバー：２００μｍ（黒）、４０μｍ（白）、＊はＥＣＤ−Ｆｃとアミロイド−βプラークの共局在を示し、＃はニューロン中のＥＣＤ−Ｆｃの発現を示す）を示す、対照としての３又は９月齢においてＡＡＶ−ＧＦＰを注射した１２月齢のＡＤマウス（Ｃｏｎ、ｎ＝７〜９）、処置のために９月齢においてＡＡＶ−ＥＣＤ−Ｆｃを注射したＡＤマウス（Ｔｒｅ、ｎ＝８〜９）及び予防のために３月齢においてＡＡＶ−ＥＣＤ−Ｆｃを注射したＡＤマウス（Ｐｒｅ）における、ＩｍａｇｅＪソフトウェアにより定量化した、全脳にわたって等間隔の５つの切片中の海馬（ＨＣ）及び新皮質（ＮＣ）中のＡβプラークの面積率、密度及びサイズの動物ごとの分析を提供する。
【図６−２】（ａ）コンゴーレッド染色を使用して可視化したＡβプラーク沈着（スケールバー＝１ｍｍ）；面積率（ｂ、左パネル）、プラーク密度（ｂ、中パネル）及びコンゴーレッド染色されたプラークのサイズ（ｂ、右パネル）の群間比較；（ｃ）抗体６Ｅ１０免疫組織化学により染色したＡβプラーク（スケールバー＝１ｍｍ）；面積率（ｄ、左パネル）、プラーク密度（ｄ、中パネル）及び６Ｅ１０染色したプラークのサイズ（ｄ、右パネル）の群間比較（（ａ）〜（ｄ）に関して、Ｃｏｎに関してｎ＝１１、Ｔｒｅに関してｎ＝９、Ｐｒｅに関してｎ＝８、平均±平均値の標準誤差、一方向ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの検定、Ｃｏｎに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）；（ｅ−ｉ）脳ホモジネート及び（ｅ−ｉｉ）血清のＴＢＳ、ＳＤＳ及びギ酸（ＦＡ）画分中のＡβ４０、Ａβ４２及び全ＡβのＥＬＩＳＡ分析（脳ホモジネートに関して、Ｃｏｎに関してｎ＝１１、Ｔｒｅに関してｎ＝９、Ｐｒｅに関してｎ＝８；血清に関して、Ｃｏｎに関してｎ＝１４、Ｔｒｅに関してｎ＝１２、Ｐｒｅに関してｎ＝１１、平均±平均値の標準誤差、一方向ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの検定、Ｃｏｎに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）；（ｆ）コンゴーレッド染色により可視化した脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）を示す顕微鏡写真（スケールバー＝１ｍｍ）、（ｇ）Ｃｏｎ，Ｔｒｅ及びＰｒｅ群間のＣＡＡプロフィールの比較（ｎ＝８、平均±平均値の標準誤差、一方向ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの検定、Ｃｏｎに対して＊＊Ｐ＜０．０１）；（ｈ）Ｃｏｎ，Ｔｒｅ及びＰｒｅ群間の脳微小出血の数の比較（ｎ＝８、平均±平均値の標準誤差、一方向ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの検定、Ｃｏｎに対してＣｏｎに対して＊＊Ｐ＜０．０１）；（ｉ）ＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックＡＤマウスにおけるＡβプラーク及びＥＣＤ−Ｆｃの共局在を示す顕微鏡写真（スケールバー：２００μｍ（黒）、４０μｍ（白）、＊はＥＣＤ−Ｆｃとアミロイド−βプラークの共局在を示し、＃はニューロン中のＥＣＤ−Ｆｃの発現を示す）を示す、対照としての３又は９月齢においてＡＡＶ−ＧＦＰを注射した１２月齢のＡＤマウス（Ｃｏｎ、ｎ＝７〜９）、処置のために９月齢においてＡＡＶ−ＥＣＤ−Ｆｃを注射したＡＤマウス（Ｔｒｅ、ｎ＝８〜９）及び予防のために３月齢においてＡＡＶ−ＥＣＤ−Ｆｃを注射したＡＤマウス（Ｐｒｅ）における、ＩｍａｇｅＪソフトウェアにより定量化した、全脳にわたって等間隔の５つの切片中の海馬（ＨＣ）及び新皮質（ＮＣ）中のＡβプラークの面積率、密度及びサイズの動物ごとの分析を提供する。
【図７−１】（ａ）抗ＭＡＰ−２及び抗ＮｅｕＮ免疫蛍光（上のパネル）又は抗コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）免疫組織化学（下のパネル）を使用して、ニューロン及び樹状突起の保存された構造全体を示す顕微鏡写真（Ｃｏｎに関してｎ＝１１、Ｔｒｅに関してｎ＝９、Ｐｒｅに関してｎ＝８、平均±平均値の標準誤差、一方向ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの検定、Ｃｏｎに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、スケールバー＝１００μｍ）、これを定量化した（ａ−ｉ、ａ−ｉｉ、ａ−ｉｉｉ、ａ−ｉｖ）；（ｂ）活性化されたカスパーゼ−３（ｃａｓ−３）を用いて免疫蛍光により（スケールバー＝５０μｍ、上のパネル）又はＴＵＮＥＬ染色を用いて（スケールバー＝２５０μｍ、下のパネル）ニューロンのアポトーシスを示す顕微鏡写真、これを定量化した（ｂ−ｉ，ｂ−ｉｉ、ｂ−ｉｉｉ、ｂ−ｉｖ）（Ｃｏｎに関してｎ＝１１、Ｔｒｅに関してｎ＝９、Ｐｒｅに関してｎ＝８、平均±平均値の標準誤差、一方向ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの検定、Ｃｏｎに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）；（ｃ−ｉ）Ｃａ１錐体ニューロン（左）及び異なる樹状突起棘（右、バー＝１０μｍ、ｎ＝３、平均±平均値の標準誤差、一方向ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの検定、Ｃｏｎに対して＊Ｐ＜０．０５）の代表的なゴルジ染色画像により、脊椎骨のゴルジ染色分析を示す顕微鏡写真、（ｃ−ｉｉ）１μｍ当たりの脊椎骨の定量分析；（ｃ−ｉｉｉ）ＳＮＡＰ２５及びＰＳＤ９５を含むシナプス関連タンパク質のウェスタンブロット、及び（ｃ−ｉｖ）（ｃ−ｉｉｉ）のデータの定量分析、及び（ｃ−ｖ）シナプシンＩ（ＳｙｎＩ）、ＶＡＭＰ１、シナプトフィシン（ＳＹＰ）のウェスタンブロット、及び（ｃ−ｖｉ）（ｇ）のデータの代表的な定量化（ｎ＝８、平均±平均値の標準誤差、一方向ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの検定、Ｃｏｎに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）；（ｄ−ｉ）ｐＳｅｒ３９６免疫染色を使用するタウリン酸化の顕微鏡写真（スケールバー＝２００μｍ）、（ｄ−ｉｉ）抗ｐＳ３９６、ｐＴ２３１、ｐＳ２６２及びｐＳ１９９抗体を使用するタウリン酸化のウェスタンブロット分析（ｎ＝８、平均±平均値の標準誤差、一方向ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの検定、Ｃｏｎに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）、その結果は（ｄ−ｉｉｉ）定量化され、並びに各群における（ｄ−ｉｖ）抗ｐｓ３９６、（ｄ−ｖ）抗ｐＴ２３１、（ｄ−ｖｉ）抗ｐＳ２６２、（ｄ−ｖｉｉｉ）抗ｐｓ１９９それぞれの結合の相対強度；（ｅ）抗ＭＡＰ−２及びＤＡＰＩ免疫蛍光で染色した培養初代マウス皮質ニューロンの神経突起伸長の分析の顕微鏡写真（ｎ＝３５、平均±平均値の標準誤差、ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの検定、Ａβ４２ｓｃｒ．に対して＊＊Ｐ＜０．０１、Ａβ４２に対して＃Ｐ＜０．０５、スケールバー＝５０μｍ）、これを（ｆ）定量する；（ｇ）ＡＤの発病におけるｐ７５ＦＬ及びｐ７５ＥＣＤの役割を示す流れ図によって、対照としてのＡＡＶ−ＧＦＰを９ヵ月注射したＡＤマウス（Ｃｏｎ）、処置のために９月齢においてＡＡＶ−ＥＣＤ−Ｆｃを注射したＡＤマウス（Ｔｒｅ）及び予防のために３月齢においてＡＡＶ−ＥＣＤ−Ｆｃを注射したＡＤマウスからの結果を提供する。
【図７−２】（ａ）抗ＭＡＰ−２及び抗ＮｅｕＮ免疫蛍光（上のパネル）又は抗コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）免疫組織化学（下のパネル）を使用して、ニューロン及び樹状突起の保存された構造全体を示す顕微鏡写真（Ｃｏｎに関してｎ＝１１、Ｔｒｅに関してｎ＝９、Ｐｒｅに関してｎ＝８、平均±平均値の標準誤差、一方向ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの検定、Ｃｏｎに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、スケールバー＝１００μｍ）、これを定量化した（ａ−ｉ、ａ−ｉｉ、ａ−ｉｉｉ、ａ−ｉｖ）；（ｂ）活性化されたカスパーゼ−３（ｃａｓ−３）を用いて免疫蛍光により（スケールバー＝５０μｍ、上のパネル）又はＴＵＮＥＬ染色を用いて（スケールバー＝２５０μｍ、下のパネル）ニューロンのアポトーシスを示す顕微鏡写真、これを定量化した（ｂ−ｉ，ｂ−ｉｉ、ｂ−ｉｉｉ、ｂ−ｉｖ）（Ｃｏｎに関してｎ＝１１、Ｔｒｅに関してｎ＝９、Ｐｒｅに関してｎ＝８、平均±平均値の標準誤差、一方向ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの検定、Ｃｏｎに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）；（ｃ−ｉ）Ｃａ１錐体ニューロン（左）及び異なる樹状突起棘（右、バー＝１０μｍ、ｎ＝３、平均±平均値の標準誤差、一方向ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの検定、Ｃｏｎに対して＊Ｐ＜０．０５）の代表的なゴルジ染色画像により、脊椎骨のゴルジ染色分析を示す顕微鏡写真、（ｃ−ｉｉ）１μｍ当たりの脊椎骨の定量分析；（ｃ−ｉｉｉ）ＳＮＡＰ２５及びＰＳＤ９５を含むシナプス関連タンパク質のウェスタンブロット、及び（ｃ−ｉｖ）（ｃ−ｉｉｉ）のデータの定量分析、及び（ｃ−ｖ）シナプシンＩ（ＳｙｎＩ）、ＶＡＭＰ１、シナプトフィシン（ＳＹＰ）のウェスタンブロット、及び（ｃ−ｖｉ）（ｇ）のデータの代表的な定量化（ｎ＝８、平均±平均値の標準誤差、一方向ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの検定、Ｃｏｎに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）；（ｄ−ｉ）ｐＳｅｒ３９６免疫染色を使用するタウリン酸化の顕微鏡写真（スケールバー＝２００μｍ）、（ｄ−ｉｉ）抗ｐＳ３９６、ｐＴ２３１、ｐＳ２６２及びｐＳ１９９抗体を使用するタウリン酸化のウェスタンブロット分析（ｎ＝８、平均±平均値の標準誤差、一方向ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの検定、Ｃｏｎに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）、その結果は（ｄ−ｉｉｉ）定量化され、並びに各群における（ｄ−ｉｖ）抗ｐｓ３９６、（ｄ−ｖ）抗ｐＴ２３１、（ｄ−ｖｉ）抗ｐＳ２６２、（ｄ−ｖｉｉｉ）抗ｐｓ１９９それぞれの結合の相対強度；（ｅ）抗ＭＡＰ−２及びＤＡＰＩ免疫蛍光で染色した培養初代マウス皮質ニューロンの神経突起伸長の分析の顕微鏡写真（ｎ＝３５、平均±平均値の標準誤差、ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの検定、Ａβ４２ｓｃｒ．に対して＊＊Ｐ＜０．０１、Ａβ４２に対して＃Ｐ＜０．０５、スケールバー＝５０μｍ）、これを（ｆ）定量する；（ｇ）ＡＤの発病におけるｐ７５ＦＬ及びｐ７５ＥＣＤの役割を示す流れ図によって、対照としてのＡＡＶ−ＧＦＰを９ヵ月注射したＡＤマウス（Ｃｏｎ）、処置のために９月齢においてＡＡＶ−ＥＣＤ−Ｆｃを注射したＡＤマウス（Ｔｒｅ）及び予防のために３月齢においてＡＡＶ−ＥＣＤ−Ｆｃを注射したＡＤマウスからの結果を提供する。
【図７−３】（ａ）抗ＭＡＰ−２及び抗ＮｅｕＮ免疫蛍光（上のパネル）又は抗コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）免疫組織化学（下のパネル）を使用して、ニューロン及び樹状突起の保存された構造全体を示す顕微鏡写真（Ｃｏｎに関してｎ＝１１、Ｔｒｅに関してｎ＝９、Ｐｒｅに関してｎ＝８、平均±平均値の標準誤差、一方向ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの検定、Ｃｏｎに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、スケールバー＝１００μｍ）、これを定量化した（ａ−ｉ、ａ−ｉｉ、ａ−ｉｉｉ、ａ−ｉｖ）；（ｂ）活性化されたカスパーゼ−３（ｃａｓ−３）を用いて免疫蛍光により（スケールバー＝５０μｍ、上のパネル）又はＴＵＮＥＬ染色を用いて（スケールバー＝２５０μｍ、下のパネル）ニューロンのアポトーシスを示す顕微鏡写真、これを定量化した（ｂ−ｉ，ｂ−ｉｉ、ｂ−ｉｉｉ、ｂ−ｉｖ）（Ｃｏｎに関してｎ＝１１、Ｔｒｅに関してｎ＝９、Ｐｒｅに関してｎ＝８、平均±平均値の標準誤差、一方向ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの検定、Ｃｏｎに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）；（ｃ−ｉ）Ｃａ１錐体ニューロン（左）及び異なる樹状突起棘（右、バー＝１０μｍ、ｎ＝３、平均±平均値の標準誤差、一方向ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの検定、Ｃｏｎに対して＊Ｐ＜０．０５）の代表的なゴルジ染色画像により、脊椎骨のゴルジ染色分析を示す顕微鏡写真、（ｃ−ｉｉ）１μｍ当たりの脊椎骨の定量分析；（ｃ−ｉｉｉ）ＳＮＡＰ２５及びＰＳＤ９５を含むシナプス関連タンパク質のウェスタンブロット、及び（ｃ−ｉｖ）（ｃ−ｉｉｉ）のデータの定量分析、及び（ｃ−ｖ）シナプシンＩ（ＳｙｎＩ）、ＶＡＭＰ１、シナプトフィシン（ＳＹＰ）のウェスタンブロット、及び（ｃ−ｖｉ）（ｇ）のデータの代表的な定量化（ｎ＝８、平均±平均値の標準誤差、一方向ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの検定、Ｃｏｎに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）；（ｄ−ｉ）ｐＳｅｒ３９６免疫染色を使用するタウリン酸化の顕微鏡写真（スケールバー＝２００μｍ）、（ｄ−ｉｉ）抗ｐＳ３９６、ｐＴ２３１、ｐＳ２６２及びｐＳ１９９抗体を使用するタウリン酸化のウェスタンブロット分析（ｎ＝８、平均±平均値の標準誤差、一方向ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの検定、Ｃｏｎに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）、その結果は（ｄ−ｉｉｉ）定量化され、並びに各群における（ｄ−ｉｖ）抗ｐｓ３９６、（ｄ−ｖ）抗ｐＴ２３１、（ｄ−ｖｉ）抗ｐＳ２６２、（ｄ−ｖｉｉｉ）抗ｐｓ１９９それぞれの結合の相対強度；（ｅ）抗ＭＡＰ−２及びＤＡＰＩ免疫蛍光で染色した培養初代マウス皮質ニューロンの神経突起伸長の分析の顕微鏡写真（ｎ＝３５、平均±平均値の標準誤差、ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの検定、Ａβ４２ｓｃｒ．に対して＊＊Ｐ＜０．０１、Ａβ４２に対して＃Ｐ＜０．０５、スケールバー＝５０μｍ）、これを（ｆ）定量する；（ｇ）ＡＤの発病におけるｐ７５ＦＬ及びｐ７５ＥＣＤの役割を示す流れ図によって、対照としてのＡＡＶ−ＧＦＰを９ヵ月注射したＡＤマウス（Ｃｏｎ）、処置のために９月齢においてＡＡＶ−ＥＣＤ−Ｆｃを注射したＡＤマウス（Ｔｒｅ）及び予防のために３月齢においてＡＡＶ−ＥＣＤ−Ｆｃを注射したＡＤマウスからの結果を提供する。
【図７−４】（ａ）抗ＭＡＰ−２及び抗ＮｅｕＮ免疫蛍光（上のパネル）又は抗コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）免疫組織化学（下のパネル）を使用して、ニューロン及び樹状突起の保存された構造全体を示す顕微鏡写真（Ｃｏｎに関してｎ＝１１、Ｔｒｅに関してｎ＝９、Ｐｒｅに関してｎ＝８、平均±平均値の標準誤差、一方向ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの検定、Ｃｏｎに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、スケールバー＝１００μｍ）、これを定量化した（ａ−ｉ、ａ−ｉｉ、ａ−ｉｉｉ、ａ−ｉｖ）；（ｂ）活性化されたカスパーゼ−３（ｃａｓ−３）を用いて免疫蛍光により（スケールバー＝５０μｍ、上のパネル）又はＴＵＮＥＬ染色を用いて（スケールバー＝２５０μｍ、下のパネル）ニューロンのアポトーシスを示す顕微鏡写真、これを定量化した（ｂ−ｉ，ｂ−ｉｉ、ｂ−ｉｉｉ、ｂ−ｉｖ）（Ｃｏｎに関してｎ＝１１、Ｔｒｅに関してｎ＝９、Ｐｒｅに関してｎ＝８、平均±平均値の標準誤差、一方向ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの検定、Ｃｏｎに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）；（ｃ−ｉ）Ｃａ１錐体ニューロン（左）及び異なる樹状突起棘（右、バー＝１０μｍ、ｎ＝３、平均±平均値の標準誤差、一方向ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの検定、Ｃｏｎに対して＊Ｐ＜０．０５）の代表的なゴルジ染色画像により、脊椎骨のゴルジ染色分析を示す顕微鏡写真、（ｃ−ｉｉ）１μｍ当たりの脊椎骨の定量分析；（ｃ−ｉｉｉ）ＳＮＡＰ２５及びＰＳＤ９５を含むシナプス関連タンパク質のウェスタンブロット、及び（ｃ−ｉｖ）（ｃ−ｉｉｉ）のデータの定量分析、及び（ｃ−ｖ）シナプシンＩ（ＳｙｎＩ）、ＶＡＭＰ１、シナプトフィシン（ＳＹＰ）のウェスタンブロット、及び（ｃ−ｖｉ）（ｇ）のデータの代表的な定量化（ｎ＝８、平均±平均値の標準誤差、一方向ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの検定、Ｃｏｎに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）；（ｄ−ｉ）ｐＳｅｒ３９６免疫染色を使用するタウリン酸化の顕微鏡写真（スケールバー＝２００μｍ）、（ｄ−ｉｉ）抗ｐＳ３９６、ｐＴ２３１、ｐＳ２６２及びｐＳ１９９抗体を使用するタウリン酸化のウェスタンブロット分析（ｎ＝８、平均±平均値の標準誤差、一方向ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの検定、Ｃｏｎに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）、その結果は（ｄ−ｉｉｉ）定量化され、並びに各群における（ｄ−ｉｖ）抗ｐｓ３９６、（ｄ−ｖ）抗ｐＴ２３１、（ｄ−ｖｉ）抗ｐＳ２６２、（ｄ−ｖｉｉｉ）抗ｐｓ１９９それぞれの結合の相対強度；（ｅ）抗ＭＡＰ−２及びＤＡＰＩ免疫蛍光で染色した培養初代マウス皮質ニューロンの神経突起伸長の分析の顕微鏡写真（ｎ＝３５、平均±平均値の標準誤差、ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの検定、Ａβ４２ｓｃｒ．に対して＊＊Ｐ＜０．０１、Ａβ４２に対して＃Ｐ＜０．０５、スケールバー＝５０μｍ）、これを（ｆ）定量する；（ｇ）ＡＤの発病におけるｐ７５ＦＬ及びｐ７５ＥＣＤの役割を示す流れ図によって、対照としてのＡＡＶ−ＧＦＰを９ヵ月注射したＡＤマウス（Ｃｏｎ）、処置のために９月齢においてＡＡＶ−ＥＣＤ−Ｆｃを注射したＡＤマウス（Ｔｒｅ）及び予防のために３月齢においてＡＡＶ−ＥＣＤ−Ｆｃを注射したＡＤマウスからの結果を提供する。
【図８】（ａ）ＥＣＤ−ＦｃがＡβにより誘導されたタウの過剰リン酸化を逆行させることを示す、（左）レチノイン酸中で３日間の分化、次いで５μＭ  Ａβ及び示された試薬による処理後のＳＨＳＹ５Ｙ細胞からのウェスタンブロットの結果及び（右）ｐＴａｕ２６２：全Ｔａｕの比率の定量化（ｎ＝３、平均±平均値の標準誤差、一方向ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの検定、対照に対して＊＊Ｐ＜０．０１；Ａβ４２に対して＃＃Ｐ＜０．０１）、（ｂ）（左）ウェスタンブロット分析及び（右）Ａβにより誘導されたタウの過剰リン酸化に対する組換えｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃの濃度依存性の阻害効果の定量化（ｎ＝５、平均±平均値の標準誤差）、並びに（ｃ）（左）セリン９におけるＧＳＫ３βのリン酸化を示すウェスタンブロット分析及び（右）ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃの濃度増大による、Ｓｅｒ９／ＧＳＫ３βにおけるＧＳＫ３βのリン酸化の比率の定量化（ｎ＝５、平均±平均値の標準誤差）を提供する。
【図９】（ａ）モリス水迷路におけるプラットフォーム試験の間の逃避潜時（秒）を示す、（ｂ）プラットフォーム試験の間にプラットフォームへ逃避するために移動した距離を示す、（ｃ）プローブ試験において輪を横断した回数を示す、（ｄ）交替行動のパーセンテージを示す及び（ｅ）Ｙ−迷路試験における新規アームへの進入並びに（ｆ）オープンフィールド試験において移動した距離を示す、ここで、ｐ７５ＥＣＤ−ＴｇはＡＰＰ／ＰＳ１マウスに筋肉内注射されたＡＡＶ−ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃを意味し、ＧＦＰ−ＴｇはＡＰＰ／ＰＳ１マウスに筋肉内注射されたＡＡＶ−ＧＦＰを意味し、Ｃｏｎ−Ｔｇは注射されないＡＰＰ／ＰＳ１マウスを意味し、Ｃｏｎ−Ｗｔは注射されない野生型マウスを意味し；各群に関して動物数＝８、平均±平均値の標準誤差、Ｔｕｋｅｙの検定；ＧＦＰに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、により、ＡＤ（ＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニック）又は野生型マウスへのｐ７５ＥＣＤ又はＧＦＰの末梢注射（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）の結果を提供する。
【図１０−１】（ａ）６Ｅ１０免疫化学を使用して染色したＡβ沈着、スケールバー＝１ｍｍを示す、（ｂ）６Ｅ１０免疫化学を使用して染色したＡβ沈着の面積率の定量化、（ｃ）コンゴーレッド染色を使用して染色したＡβ沈着、スケールバー＝１ｍｍ、（ｄ）コンゴーレッド染色により染色したＡβ沈着の面積率の定量化、（ｅ）ＴＢＳ、ＳＤＳ分画、ＦＡ抽出物及び血清中のＡβレベルのＥＬＩＳＡ定量化、ここで、ＮＣは新皮質を意味し、ＨＣは海馬を意味する、（ｆ）血清Ａβ４０及びＡβ４２レベルは、ｐ７５ＥＣＤペプチド（５０μｇ／５０μｌｉ．ｐ．）の腹腔内注射の２４時間後に有意に増加し、プレブリード（ｐｒｅ−ｂｌｅｅｄ）は血液サンプリング前を意味し、動物数＝８、平均±平均値の標準誤差、Ｔ検定；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１；
【図１０−２】（ａ）６Ｅ１０免疫化学を使用して染色したＡβ沈着、スケールバー＝１ｍｍを示す、（ｂ）６Ｅ１０免疫化学を使用して染色したＡβ沈着の面積率の定量化、（ｃ）コンゴーレッド染色を使用して染色したＡβ沈着、スケールバー＝１ｍｍ、（ｄ）コンゴーレッド染色により染色したＡβ沈着の面積率の定量化、（ｅ）ＴＢＳ、ＳＤＳ分画、ＦＡ抽出物及び血清中のＡβレベルのＥＬＩＳＡ定量化、ここで、ＮＣは新皮質を意味し、ＨＣは海馬を意味する、（ｆ）血清Ａβ４０及びＡβ４２レベルは、ｐ７５ＥＣＤペプチド（５０μｇ／５０μｌｉ．ｐ．）の腹腔内注射の２４時間後に有意に増加し、プレブリード（ｐｒｅ−ｂｌｅｅｄ）は血液サンプリング前を意味し、動物数＝８、平均±平均値の標準誤差、Ｔ検定；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１；
【図１１】（ａ）抗ＧＦＡＰ抗体を使用する免疫組織化学により染色したＡＤマウスの新皮質中の星状細胞を示す、（ｂ）ＧＦＡＰ染色の陽性面積率の定量化、スケールバー＝１ｍｍ、（ｃ）ＡＤマウスの新皮質中のミクログリアを抗ＣＤ４５抗体を使用する免疫組織化学により染色した、（ｄ）ＣＤ４５染色の陽性面積率の定量化、ここで、ＮＣは新皮質を意味し、ＨＣは海馬を意味する、動物数＝８、平均±平均値の標準誤差、Ｔ検定、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１により、ＡＤマウスへのｐ７５ＥＣＤ又はＧＦＰの末梢注射の結果を提供する。
【図１２】（ａ）皮質中のｐＳ３９６の免疫組織化学染色を示し、バー＝１００μｍである、（ｂ）皮質中のｐＳ３９６陽性の面積率の定量化、（ｃ）海馬中のｐＳ３９６の免疫組織化学染色、バー＝１００μｍ、（ｄ）海馬中のｐＳ３９６陽性の面積率の定量化、（ａ）及び（ｃ）におけるＷｔに対して相対強度が正規化された、（ｅ）ｐＳ３９６、ｐＳ１９９、ｐＳ２６２及びｐＴ２３１のウェスタンブロット分析、（ｆ）ｐＳ３９６、ｐＳ１９９、ｐＳ２６２及びｐＴ２３１のバンドの相対強度の定量化、動物数＝８、平均±平均値の標準誤差、Ｔ検定、＊＊Ｐ＜０．０１により、ＡＤマウスへのｐ７５ＥＣＤ又はＧＦＰの末梢注射の結果を提供する。
【図１３】（ａ）逃避潜時を示す、（ｂ、ｃ）漸進的なプラットフォーム学習試験内でプラットフォームを発見するための移動距離、（ｄ）費やした時間及び（ｅ）プラットフォーム四分円への進入回数（ｆ）群間のプローブ試験における、隠されたプラットフォーム部位の横断回数（ｐ７５ＥＣＤＥ−Ｆｃ対Ｆｃ群に関して＊Ｐ＜０．０５、野生型体対Ｆｃ群に関して＃ｐ＜０．０５；野生型において、学習過程の間に学習の１日目と比べて＄ｐ＜０．０５；ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃにおいて、学習過程の間に＊Ｐ＜０．０５の学習の１日目と比べて￥ｐ＜０．０５）（１群当たりｎ＝６、平均±ＳＥＭ、ＡＮＯＶＡ、テューキーの事後試験）により、組換えｐ７５ＥＣＤ―Ｆｃ又はＦｃによる処置後のモリス水迷路（ＭＷＭ）試験の間のｐＲ５（タウ）マウスの結果を提供する。
【図１４】（Ａ）ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ及びＦｃ処置群における、ＰＲ５マウス脳中のＢＡＣＥ１、ｓＡＰＰβ、完全長のＡＰＰ（ＡＰＰ．ＦＬ）及びβアクチンの発現を示すウェスタンブロットと、（Ｂ）ＢＡＣＥ１／βアクチン及び（Ｃ）ｓＡＰＰβ／βアクチンの発現比率（１群当たりｎ＝５、平均±平均値の標準誤差、スチューデントのｔ検定；「Ｆｃ」は１００％に正規化した）の結果を提供する。
【図１５】（Ａ）Ｓｅｒ２０２及びＴｈｒ２０５におけるタウリン酸化のレベル（単一の「ＡＴ８」抗体を使用して）並びにｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ及びＦｃ処置したＰＲ５マウスの脳中の全タウを示すウェスタンブロット画像、と（Ｂ）Ｓｅｒ２０２及びＴｈｒ２０５においてリン酸化されたタウに関する統計解析（Ｆｃに対して＊＊Ｐ＜０．０１）（１群当たりｎ＝５、平均±ＳＥＭ、スチューデントのｔ検定；「Ｆｃ」を１００％に正規化した）の結果を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
[0033]本明細書に開示される通り、個体内に存在する完全長ｐ７５とｐ７５の細胞外ドメイン（ｐ７５ＥＣＤ）のバランスが、個体が広範な神経学的疾患をきたしうる神経変性を患うか否かを支配しうることが認識された。具体的には、ｐ７５ＥＣＤは神経保護因子である。理論に束縛させることを望むものではないが、可溶性ｐ７５ＥＣＤが、ニューロトロフィンのようなリガンドに関して細胞膜に結合したｐ７５と競合し、それによって、神経変性及び／又はアポトーシスをきたしうるｐ７５シグナリングを阻止すると考えられる。
【００２０】
[0034]ＡＤ患者及びＡＤのマウスモデルの脳及び脳脊髄液（ＣＳＦ）中のｐ７５ＥＣＤのレベルが本明細書に記載の通りに研究された。一態様において、ＡＤが、正常な認知障害のない対照対象に比べて、低レベルのｐ７５ＥＣＤ、高レベルの完全長ｐ７５（本明細書中でｐ７５又はｐ７５ＦＬと称される）及び／又は低いｐ７５ＥＣＤ：ｐ７５ＦＬ比率と関連することが認識された。さらに、ｐ７５ＥＣＤ、ｐ７５ＦＬの濃度及び／又はｐ７５ＥＣＤ：ｐ７５ＦＬの比率が、診断マーカー又は予後予測マーカーとして使用されうることが認識されていた。さらに、本明細書に開示される別の態様において、例えば、ｐ７５ＥＣＤの投与によるｐ７５ＥＣＤレベルの回復が、ＡＤ、脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）及びタウ病変のような神経変性疾患を低減させ、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスモデルにおいてＡＤの早期及び後期の両方で学習及び記憶を改善することが見出された。
【００２１】
[0035]したがって、ある態様では、本開示は、
（ａ）被験対象から生物学的試料を得るステップと、
（ｂ）被験対象の生物学的試料中のｐ７５細胞外ドメイン（ｐ７５ＥＣＤ）及び／又は完全長ｐ７５（ｐ７５ＦＬ）の濃度を測定するステップと、
（ｃ）被験対象の生物学的試料中のｐ７５ＥＣＤ及び／若しくはｐ７５ＦＬの濃度、並びに／又はｐ７５ＥＣＤ：ｐ７５ＦＬの比率を、認知障害のない対照対象又は認知障害のない対照対象群から得られた同等の生物学的試料中のｐ７５ＥＣＤ及び／若しくはｐ７５ＦＬの濃度、並びに／又はｐ７５ＥＣＤ：ｐ７５ＦＬの比率と比較するステップと
を含み、
被験対象におけるｐ７５ＥＣＤ及び／若しくはｐ７５ＦＬの濃度、並びに／又はｐ７５ＥＣＤ：ｐ７５ＦＬの比率が、認知障害のない対照対象又は認知障害のない対照対象群におけるｐ７５ＥＣＤ及び／若しくはｐ７５ＦＬの濃度、並びに／又はｐ７５ＥＣＤ：ｐ７５ＦＬの比率に比べて変更されている場合、アルツハイマー病（ＡＤ）と診断及び／又は予後予測される、被験対象においてアルツハイマー病を診断及び／又は予後予測する方法を提供する。
【００２２】
[0036]用語「ｐ７５ＦＬ」、「完全長ｐ７５」、「ｐ７５」及び「ｐ７５ＮＴＲ」は交換可能に使用され、本明細書中で使用される通り、（ｐ７５又はｐ７５ＮＴＲとしても知られる）完全な（完全長）ｐ７５ニューロトロフィン受容体を指す。
【００２３】
[0037]用語「ｐ７５の細胞外ドメイン」、「ｐ７５ＥＣＤ」、「ｐ７５細胞外ドメイン」、「ｐ７５の外胚葉ドメイン」及び「ｐ７５外胚葉」は交換可能に使用され、全てがｐ７５ＦＬの細胞外ドメイン（ｐ７５ＥＣＤ）を可溶性ペプチドとして放出又は「シェディング」する、腫瘍壊死因子アルファ変換酵素（ＴＡＣＥ）／ＡＤＡＭ１７による膜近傍領域におけるｐ７５の切断に続いて、完全長ｐ７５ペプチドから派生しうる断片を指す（Ｗｅｓｋａｍｐら、２００４年）。ある実施形態では、ｐ７５ＥＣＤはｐ７５ＦＬペプチドからシェディングされ、この実施形態では、ｐ７５ＥＣＤは可溶性である。本明細書中で使用される通り、用語「可溶性」は、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドが細胞膜に結合しておらず又は結合されることもなく、したがって、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドがいかなる膜アンカー機能も有さないように、膜貫通（すなわち、脂溶性）ドメインの全て又は実質的な部分の不存在又は機能的な破壊を特徴とすることを意味する。
【００２４】
[0038]本明細書に記載のｐ７５及び／又はｐ７５ＥＣＤは、任意の好適な種に由来することができる。ある実施形態では、ｐ７５及び／又はｐ７５ＥＣＤはヒトに由来する。しかしながら、ある実施形態では、ｐ７５及び／又はｐ７５ＥＣＤは、代わりに、非ヒト霊長類、ラット及び／若しくはマウスのような商業的、科学的、医学的又は個人的に重要な動物、並びに／又は家畜、エキゾチックアニマル及び（競走馬、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ、ライオン、トラ、ゾウ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット及びマウスなどを含む）コンパニオンアニマルのような他の哺乳動物に由来しうる。ある実施形態では、ｐ７５及び／又はｐ７５ＥＣＤは、霊長類、例えば、アカゲザル、チンパンジー、オランウータン、チンパンジー、ゴリラなどに由来してもよい。
【００２５】
[0039]ヒト完全長ｐ７５のヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ番号ＮＭ＿００２５０７のヌクレオチド１２６〜１４０９に、及び配列番号１に提供される。
【００２６】
[0040]ヒト完全長ｐ７５のアミノ酸配列は、配列番号２に提供される。
【００２７】
[0041]ヒトｐ７５ＥＣＤは、配列番号２のアミノ酸２９〜２５０からなり、それぞれが４０個のアミノ酸残基を含有し、それぞれがＮ−グリコシル化部位を含有する４つのシステインに富むドメインが続く、単一のペプチドとしての２８個のアミノ酸を含む（Ｓｃｈｏｒ、２００５年）。ヒトｐ７５ＥＣＤのヌクレオチド配列は、配列番号３に提供される。
【００２８】
[0042]ヒトｐ７５ＥＣＤのアミノ酸配列は、配列番号４に提供される。
【００２９】
[0043]ある実施形態では、ｐ７５ＦＬ及び／又はｐ７５ＥＣＤは遺伝子又はペプチド変異体であることができる。本明細書中で言及されるｐ７５及び／又はｐ７５ＥＣＤの「変異体」は、例えば、アレル変異体によってコードされるｐ７５ＦＬのアイソフォームを表すと理解されるべきである。変異体は本明細書の他所においてさらに詳述される。
【００３０】
[0044]本明細書中で使用される通り、用語「被験対象」は、アルツハイマー病の診断、検出又は予後予測のために評価される個体を指す。ある実施形態では、被験対象はヒトであってもよい。しかしながら、代わりに対象は、非ヒト霊長類のような商業的、科学的、医学的又は個人的に重要な動物並びに、家畜、エキゾチックアニマル及び（競走馬、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ、ライオン、トラ、ゾウ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット及びマウスなどを含む）コンパニオンアニマルのような他の哺乳動物でありうると考えられる。
【００３１】
[0045]本明細書中で使用される通り、用語「認知障害のない対照対象又は認知障害のない対照対象群」は、正常で健康であり、特に認知症関連の神経学的状態（複数可）を患っていないと考えられる個体又は個体群を指す。ある実施形態では、認知障害のない対照対象又は認知障害のない対照対象群は、試料を提供後１０年以内に認知症関連の神経学的状態を発症しない。ある実施形態では、認知障害のない対照対象又は認知障害のない対照対象群は、試料を提供後５年以内に認知症関連の神経学的状態を発症しない。ある実施形態では、認知障害のない対照対象は、被験対象と同じ種である。ある実施形態では、認知障害のない対照対象（複数可）は同年齢であり、ここで、認知障害のない対照対象（複数可）は、被験対象の１０年以内の年齢である。ある実施形態では、認知障害のない対照対象（複数可）は、被験対象の５年以内の年齢である。ある実施形態では、被験対象のｐ７５ＥＣＤ及び／又はｐ７５ＦＬの濃度（又は本明細書に記載のその比率）が、認知障害のない対照対象又は認知障害のない対照対象群におけるｐ７５ＥＣＤ及び／又はｐ７５ＦＬ（又はその比率）の代表的な値であることが知られた参照値と比較される。そのような参照値は、年齢のような、ｐ７５ＥＣＤ及び／又はｐ７５ＦＬの濃度（又はその比率）に影響しうる因子に関して調整されてもよい。
【００３２】
[0046]本明細書中で使用される用語「濃度」は、生物学的試料中のｐ７５ＥＣＤ及び／又はｐ７５ＦＬ分子の量又はレベルを指すことを意図され、絶対量（例えば、ｍｇ／ｍｌ、ｎｇ／ｍｌ、ｐｇ／ｍｌ、ｎｇ／ｇなどで測定される、試料中のｐ７５ＥＣＤ及び／又はｐ７５ＦＬ分子の量）並びに（例えば、ウェスタンブロットの特定のバンドの染色の濃度測定分析により測定され、ここで、任意選択で被験対象の結果が認知障害のない対照対象（複数可）のものに対して正規化されうる）相対量の両方を包含することを意図される。測定された濃度が絶対量である本開示の第１の態様によれば、濃度の変更（すなわち、増加又は減少）があったか否かを決定するために、被験対象におけるｐ７５ＥＣＤ及び／又はｐ７５ＦＬ分子の絶対濃度が、認知障害のない対照対象又は認知障害のない対照群のｐ７５ＥＣＤ及び／又はｐ７５ＦＬの絶対濃度と比較される。或いは、測定された濃度が（例えば、ウェスタンブロット分析の濃度測定分析により測定された）相対量である場合、濃度の変更（すなわち、増加又は減少）があったか否かを決定するために、被験対象におけるｐ７５ＥＣＤ又はｐ７５ＦＬ分子濃度の染色の強度（又は他の相対的測定値）が、認知障害のない対照対象又は認知障害のない対照群におけるｐ７５ＥＣＤ及び／又はｐ７５ＦＬ濃度の染色の強度（又は上記他の相対的測定値）と比較される。
【００３３】
[0047]ｐ７５ＥＣＤの絶対又は相対濃度をｐ７５ＦＬの（それぞれ）絶対又は相対濃度で割ることによって、ｐ７５ＥＣＤ：ｐ７５ＦＬの比率が容易に計算されうることは当業者に明らかである。
【００３４】
[0048]生物学的試料は、ｐ７５ＦＬ及び／又はｐ７５ＥＣＤ濃度のためにサンプリングされうる任意の好適な身体試料（ｂｏｄｙ  ｓａｍｐｌｅ）であってもよい。例えば、生物学的試料は、脳組織、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血清、血漿、全血並びに末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びリンパ球からなる群から選択されてもよい。しかしながら、当業者は、他の組織タイプの体液がｐ７５ＦＬ及びｐ７５ＥＣＤレベルをサンプリングするために好適でありうることを理解する。ある実施形態では、生物学的試料は脳脊髄液である。ある実施形態では、生物学的試料は脳組織である。ある実施形態では、生物学的試料はリンパ球、血漿、血清及び／又は全血から選択される。
【００３５】
[0049]生物学的試料が脳組織である実施形態では、脳組織試料は、対象の死後に或いは当業者に周知の標準的なバイオプシー技術を使用して組織バイオプシーとして得られてもよい。脳組織は、任意選択で、均質化及び／又は超音波処理のような当業者に知られた方法によって処理されうる。当業者は、他の組織タイプが必要に応じて同様に処理されうることを理解する。生物学的試料がＣＳＦである実施形態では、ＣＳＦは、例えば、腰椎穿刺による、当業者に知られた標準的なＣＳＦ収集技術を使用して得られてもよい。
【００３６】
[0050]本明細書中で言及される認知障害のない対照対象（複数可）において測定される、用語「同等の生物学的試料」は、被験対象に関して測定されるものと同じ又は類似するタイプの生物学的試料、又は１つの身体試料中のｐ７５ＦＬ、ｐ７５ＥＣＤの濃度及び／又はｐ７５ＥＣＤ：ｐ７５ＦＬの比率が別の身体試料中のｐ７５ＦＬ、ｐ７５ＥＣＤの濃度及び／又はｐ７５ＥＣＤ：ｐ７５ＦＬの比率（それぞれ）を正確に予測できるものを指す。例えば、当業者は、血漿と血清の間の相違が、血清がフィブリノーゲン及び他の凝固因子を含有しないことのみであるため、血清試料中の分析物の濃度が血漿試料中の同じ分析物の濃度と実質的に等価であることを理解する。したがって、ある実施形態では、血漿及び血清は同等の生物学的試料である。さらに、当業者は、全血はおよそ半分の血清又は血漿を含むため、血清又は血漿試料中の分析物の濃度が全血試料中の分析物の濃度のおよそ２倍に相当することを理解する。したがって、単純な計算によって同等の濃度が変換可能であるため、全血中の分析物の濃度が血漿又は血清と比較されうる。
【００３７】
[0051]本明細書に開示される通り、驚くべきことにＡＤ患者及びＡＤマウスにおいて、それらの認知障害のない対照者に比べてｐ７５ＥＣＤの濃度が減少し、さらに、ＡＤ患者及びＡＤマウスにおいて、それらの認知障害のない対照者に比べてｐ７５ＦＬの濃度が増加していることが認識された。さらに、本明細書に開示される通り、ＡＤ患者及びＡＤマウスにおけるｐ７５ＥＣＤ：ｐ７５ＦＬの比率が、それらの認知障害のない対照者に比べて減少していることが注目された。
【００３８】
[0052]したがって、ある実施形態では、
（ａ）被験対象から生物学的試料を得るステップと、
（ｂ）被験対象の生物学的試料中のｐ７５細胞外ドメイン（ｐ７５ＥＣＤ）の濃度を測定するステップと、
（ｃ）被験対象の生物学的試料中のｐ７５ＥＣＤの濃度を、認知障害のない対照対象又は認知障害のない対照対象群から得られた同等の生物学的試料中のｐ７５ＥＣＤの濃度と比較するステップと
を含み、
被験対象におけるｐ７５ＥＣＤの濃度が、認知障害のない対照対象又は認知障害のない対照対象群に比べて減少している場合、アルツハイマー病（ＡＤ）と診断及び／又は予後予測される、被験対象においてアルツハイマー病を診断及び／又は予後予測する方法。
【００３９】
[0053]アルツハイマー病と診断又は予後予測されるか否かを決定するような、「認知障害のない対照対象又は認知障害のない対照対象群に比べて減少している」と考えうる被験対象におけるｐ７５ＥＣＤの濃度は、対象の種、使用された具体的な体の試料タイプ及び対象の年齢に従って変化しうる。ある実施形態では、ｐ７５ＥＣＤ濃度は、被験対象において認知障害のない対照に比べておよそ２５％〜９９％減少している。ある実施形態では、ｐ７５ＥＣＤ濃度は、被験対象において認知障害のない対照に比べておよそ２５％〜９０％減少している。ある実施形態では、ｐ７５ＥＣＤ濃度は、被験対象において認知障害のない対照に比べておよそ３０％〜８０％減少している。ある実施形態では、ｐ７５ＥＣＤ濃度は、ヒトＡＤ患者において認知障害のないヒト対照に比べておよそ５０％減少している。ある実施形態では、脳脊髄液（ＣＳＦ）において減少はおよそ５０％である。ある実施形態では、脳組織において減少はおよそ７５％である。ある実施形態では、ヒト脳組織においてｐ７５ＥＣＤレベルがヒトＡＤ患者において認知障害のないヒト対照に比べて少なくとも７５％減少している。ある実施形態では、ＡＤと診断又は予後予測する、被験対象のＣＳＦ中のｐ７５ＥＣＤの濃度は、５００ｎｇ／ｍｌ未満である。同様に、ある実施形態では、ＡＤマウスにおいてｐ７５ＥＣＤ濃度がマウスＣＳＦにおいて野生型（Ｗｔ）同腹子に比べておよそ５０％減少しており、代わりの又は追加の実施形態では、減少はマウス脳組織においておよそ５０％である。
【００４０】
[0054]本明細書に開示される通り、ＣＳＦ中のｐ７５ＥＣＤの正常なヒトの濃度範囲は、認知障害のない対照において約５００ｐｇ／ｍｌ〜約１３００ｐｇ／ｍｌにわたる。ある実施形態では、ＡＤと診断又は予後予測されるようなヒト被験対象のＣＳＦ中の減少したｐ７５ＥＣＤの濃度は、５００ｐｇ／ｍｌ未満、好ましくは４００ｐｇ／ｍｌ未満である。ある実施形態では、ＡＤと診断又は予後予測されるような被験対象のＣＳＦ中の減少したｐ７５ＥＣＤの濃度は、３００ｐｇ／ｍｌ未満である。
【００４１】
[0055]別の実施形態では、本開示は、
（ａ）被験対象から生物学的試料を得るステップと、
（ｂ）被験対象の生物学的試料中のｐ７５ＥＣＤ及び完全長ｐ７５（ｐ７５ＦＬ）の濃度を測定するステップと、
（ｃ）被験対象の生物学的試料中のｐ７５ＥＣＤ及びｐ７５ＦＬの濃度を、認知障害のない対照対象又は認知障害のない対照対象群から得られた同等の生物学的試料中のｐ７５ＥＣＤ及びｐ７５ＦＬの濃度と比較するステップと
を含み、
被験対象におけるｐ７５ＥＣＤ：ｐ７５ＦＬの比率が、認知障害のない対照対象又は認知障害のない対照対象群に比べて減少している場合、アルツハイマー病（ＡＤ）と診断及び／又は予後予測される、被験対象においてアルツハイマー病を診断及び／又は予後予測する方法を提供する。
【００４２】
[0056]ある実施形態では、被験対象におけるｐ７５ＥＣＤ：ｐ７５ＦＬの比率は、認知障害のない対照対象又は認知障害のない対照対象群に比べて少なくとも３０％減少している。ある実施形態では、比率は少なくとも５０％減少している。ある実施形態では、比率は少なくとも７５％減少している。ある実施形態では、比率は少なくとも９０％減少している。ある実施形態では、比率は少なくとも９９％減少している。
【００４３】
[0057]なお別の実施形態では、本開示は、
（ａ）被験対象から生物学的試料を得るステップと、
（ｂ）被験対象の生物学的試料中のｐ７５ＦＬの濃度を測定するステップと、
（ｃ）被験対象の生物学的試料中のｐ７５ＦＬの濃度を、認知障害のない対照対象又は認知障害のない対照対象群から得られた同等の生物学的試料中のｐ７５ＦＬの濃度と比較するステップと
を含み、
被験対象におけるｐ７５ＦＬの濃度が、認知障害のない対照対象又は認知障害のない対照対象群に比べて増加している場合、アルツハイマー病（ＡＤ）と診断及び／又は予後予測される、被験対象においてアルツハイマー病を診断及び／又は予後予測する方法を提供する。
【００４４】
[0058]ある実施形態では、被験対象におけるｐ７５ＦＬの濃度が、認知障害のない対照対象又は認知障害のない対照対象群に比べて１０％〜５００％増加している（すなわち、１．１〜５倍）。ある実施形態では、ｐ７５ＦＬの濃度が２０％〜３００％（すなわち、１．２〜３倍）増加している。ある実施形態では、ｐ７５ＦＬの濃度が３０％〜２００％増加している（すなわち、１．３〜２倍）。特定の実施形態では、ｐ７５ＦＬの濃度は、ヒト脳組織において少なくとも２００％（２倍）、又は好ましくは３００％（３倍）増加している。
【００４５】
[0059]しかしながら、本開示の第１の態様の方法の目的のために、認知障害のない対照対象又は認知障害のない対照対象群に比べて被験対象において増加した濃度、減少した濃度と考えられうる又は減少した比率を提供しうるｐ７５ＦＬ及び／又はｐ７５ＥＣＤの量は、どの因子（例えば、ｐ７５ＦＬ、ｐ７５ＥＣＤ又はｐ７５ＥＣＤ：ｐ７５ＦＬの比率）が比較されるか、使用される具体的な身体試料のタイプ及び対象の年齢によって、変化する可能性がある。
【００４６】
[0060]ある実施形態では、本開示の第１の態様において測定されるｐ７５ＦＬ及び／又はｐ７５ＥＣＤはペプチドである。
【００４７】
[0061]ｐ７５ＦＬ及び／又はｐ７５ＥＣＤペプチドの濃度を定量化すること又は測定することは、分子の絶対濃度を測定するために、染色を知られたタンパク質標準品と比較することにより、又はそうでなければ、本明細書に記載の方法を使用することを含む、相対濃度を測定するために濃度測定分析を使用して、被験対象と正常な認知障害のない対照（複数可）の間で相対的染色強度を比較することによるような、当業者に知られた好適な技術を使用して実行されうる。ｐ７５ＦＬ及び／又はｐ７５ＥＣＤペプチドの濃度は、ウェスタンブロット分析、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、並びに抗ｐ７５ＦＬ及び／又はｐ７５ＥＣＤ抗体或いはその断片を使用する（例えば、免疫蛍光染色を含む、組織バイオプシーの区分された試料による）免疫組織化学のようなイムノアッセイから得られた結果の定量化によるような、当業者に周知の技術を使用して決定されうる。しかしながら、例えば、ｐ７５ＦＬ及び／又はｐ７５ＥＣＤを結合しうる任意の他のリガンド（例えば、Ａβ）へのｐ７５ＦＬ及び／又はｐ７５ＥＣＤの結合の検出を含む方法のような、当業者に周知の他の方法を使用してｐ７５ＦＬ及び／又はｐ７５ＥＣＤのレベルを検出し、定量化することも可能である。被験身体試料（複数可）中に存在するｐ７５ＦＬ及び／又はｐ７５ＥＣＤの量を決定するために特に好適な方法は、多様なサンドイッチ、競合又は他のアッセイフォーマットで標識分子を利用するイムノアッセイである。そのようなイムノアッセイは、ｐ７５ＦＬ及び／又はｐ７５ＥＣＤの存在又は不存在の指標であるシグナルを発生させる。さらに、そのようなイムノアッセイによって発生させられたシグナルの強度は、試料（複数可）中に存在するｐ７５ＦＬ及び／又はｐ７５ＥＣＤの量に対して直接的又は間接的に（例えば、逆比例する）相関させられうる。被験身体試料（複数可）中に存在するｐ７５ＦＬ及び／又はｐ７５ＥＣＤの量を決定するために好適な他の方法は、正確な分子量又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルのような、ｐ７５ＦＬ及び／又はｐ７５ＥＣＤに特異的な物理的又は化学的性質の測定を含む方法である。したがって、そのような方法は、バイオセンサー、イムノアッセイに連結された光学機器、バイオチップ、質量分析計、ＮＭＲ分析器及びクロマトグラフィー機器のような分析機器を使用して行われうる。他の好適な方法は、沈降法（例えば、免疫沈降法）、エレクトロケミルミネッセンス（すなわち、電気発生ケミルミネッセンス）、エレクトロケミルミネッセンスサンドイッチイムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）、解離増強型ランタニド蛍光免疫法（ＤＥＬＦＩＡ）、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）、比濁法、ネフェロメトリー、ラテックス増強比濁法及びネフェロメトリーを含みうる。さらに、ゲル電気泳動法、ウェスタンブロッティング及び質量分析のような当業者に周知の方法は、単独で又は上記の他の好適な方法と組み合わせて使用されてもよい。当業者は、他の方法が本明細書に記載の方法に従ってｐ７５又はｐ７５ＥＣＤペプチドの濃度を検出するために好適でありうることを理解する。
【００４８】
[0062]完全長ｐ７５ＦＬペプチド及びｐ７５ＥＣＤペプチドは、当業者に理解されうるｐ７５ＦＬペプチドの異なる領域を認識する特異抗体を使用して識別可能である。例えば、第１の抗体は、本明細書において使用される抗ｐ７５ＥＣＤ抗体（ウサギポリクローナル、９６５０）のように細胞内又は膜貫通領域でなく、ｐ７５の細胞外ドメイン（ｐ７５ＥＣＤ）を特異的に認識し、結合することができ；第２の抗体は、本明細書中で使用される抗ｐ７５ＮＴＲ抗体（ウサギポリクローナル、ＡＢ１５５４，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳ）又は抗ＮＧＦ受容体ｐ７５（カタログ番号ＡＢ１５５４、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳ）のように細胞外ドメインでなく、ｐ７５の細胞内又は膜貫通領域（ｐ７５ＩＣＤ）を特異的に認識し、結合しうる。当業者は、細胞内又は膜貫通領域でなく、ｐ７５の細胞外ドメインを特異的に認識し結合する、或いは細胞外ドメインでなく、ｐ７５の細胞間又は膜貫通領域を特異的に認識し結合する、他の好適な抗体が本開示の方法において容易に使用されうることを理解する。
【００４９】
[0063]しかしながら、ある実施形態では、ｐ７５ＥＣＤの少なくともいくつかは、細胞成分と結合しうる完全長ｐ７５との関係において存在しうる。すなわち、ある実施形態では、完全長ｐ７５は、膜貫通タンパク質として細胞調製物の細胞膜成分と結合するが、可溶性（「シェディングされた」）ｐ７５ＥＣＤは、細胞、組織及び／又は体液調製物の可溶性成分と結合する。ある実施形態では、可溶性（すなわち、「シェディングされた」）ｐ７５ＥＣＤは、当業者に理解される通り、サイズ（すなわち、分子量）に基づくウェスタンブロッティングによって完全長ｐ７５との関連で存在するｐ７５ＥＣＤから識別可能である。或いは、ある実施形態では、可溶性又は「シェディングされた」ｐ７５ＥＣＤは、当業者に理解されうる通り、細胞膜（したがって、膜に結合した完全長ｐ７５）が遠心分離によって、調製物の可溶性成分（したがって、可溶性ｐ７５ＥＣＤ）から分離可能であるように、細胞調製法から界面活性剤又は類似する物質を省くことによって、完全長ｐ７５ＥＣＤから識別可能である。そうでなければ、適切な対照を使用して試料への抗ｐ７５ＥＣＤ抗体の結合の強度及び抗ｐ７５ＩＣＤ抗体の結合の強度を定量化し、単純な計算を使用して絶対量又は比率のいずれかを計算することによって、ｐ７５ＥＣＤの量又はｐ７５ＥＣＤ：ｐ７５ＦＬの比率を決定することが可能である。
【００５０】
[0064]第１の態様の方法は、ｐ７５ＦＬ及び／又はｐ７５ＥＣＤの量或いはその比率の変化が、アルツハイマー病の存在の診断マーカーとして使用されることを可能とする。しかしながら、そのような方法の感度及び特異度は、方法の分析的「質」だけに依存するのみならず；異常な結果を構成するものの定義にも依存しうる。すなわち、典型的に、任意の具体的マーカーに関して、そのマーカーに基づく診断／予後予測試験が完璧な正確性をもって正常な（すなわち、認知障害のない）対象を病気の対象から完全に識別しないように、疾患を有する及び有さない対象に関するマーカーレベルの分布は重複する。よって、いくつかの実施形態では、方法は、例えば、ｐ７５ＦＬ及び／又はｐ７５ＥＣＤの量の変化の値対「正常」及び「病気の」対象（複数可）のその値の相対頻度をプロットすることによって、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を計算するステップをさらに含んでもよい。次いで、この方法で計算されたＲＯＣ曲線下の面積は、決定された被験身体試料（複数可）中のｐ７５ＦＬ及び／又はｐ７５ＥＣＤの量の変化が正確な診断又は予後予測を可能とする蓋然性の尺度として使用可能である。加えて、ＲＯＣ曲線は、決定されたｐ７５ＦＬ及び／又はｐ７５ＥＣＤの量の変化が不正確であると考えられうる場合にさえ使用可能であり、それは、結果を等級付けすることが可能な限りＲＯＣ曲線はなお計算可能であるからである。例えば、対象からの被験身体試料（複数可）から決定されたｐ７５ＦＬ及び／又はｐ７５ＥＣＤの量が、程度（例えば、１＝低度、２＝正常及び３＝高度）に従って等級付けされうる。次いで、この等級付けは正常な対象（複数可）からの結果及び当業者に周知の方法（例えば、Ｈａｎｌｅｙ及びＭｃＮｅｉｌ、１９８２年）に従って作り出されたＲＯＣ曲線と相関させられうる。
【００５１】
[0065]かくして、被験身体試料（複数可）中のｐ７５ＦＬ及び／又はｐ７５ＥＣＤの量の決定は、（ｉ）ｐ７５ＦＬ及び／又はｐ７５ＥＣＤを特異的リガンドと接触させるステップと、（ｉｉ）任意選択で未結合リガンドを除去するステップと、（ｉｉｉ）結合されたリガンドの量を測定するステップとを含んでもよい。（共有結合及び／又は非共有結合により結合されうる）結合されたリガンドは、強度シグナルを発生させる。上述の通り、リガンドは、抗ｐ７５ＦＬ及び／又はｐ７５ＥＣＤ抗体或いはその断片から選択されてもよいが、そうでなければ、例えば、ｐ７５ＦＬ及び／又はｐ７５ＥＣＤに結合する任意の（ペプチド、ポリペプチド、核酸、アプタマー（例えば、核酸又はペプチドアプタマー）、フェチュインのような糖タンパク質及び小分子を含む）化合物のようなｐ７５ＦＬ及び／又はｐ７５ＥＣＤに結合しうる任意の他のリガンドから選択されてもよい。しかしながら、リガンドは、抗ｐ７５ＦＬ及び／又はｐ７５ＥＣＤ抗体或いは（ポリクローナル及びモノクローナル抗体、並びにＦｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）２断片のようなｐ７５ＦＬ及び／又はｐ７５ＥＣＤに結合可能なその断片、並びに一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦＶ抗体）のような組換え抗体を含む）その断片から選択されることが好ましい。そのようなリガンドを調整する方法は、当業者に周知である。
【００５２】
[0066]ある実施形態では、リガンドはｐ７５ＦＬ及び／又はｐ７５ＥＣＤに特異的に結合する。本明細書中で使用される通り、用語「特異的結合」は、リガンドが被験身体試料中に存在する別のペプチド、ポリペプチド又は物質に実質的に結合（すなわち、実質的に「交差反応」）するべきでないことを意味する。特異的に結合されるｐ７５ＦＬ及び／又はｐ７５ＥＣＤは、任意の他の関連ペプチド、ポリペプチド又は物質よりも少なくとも３倍高い、より好ましくは少なくとも１０倍高い、最も好ましくは少なくとも５０倍高い親和性をもって結合されることが好ましい。非特異的結合は、例えば、ウェスタンブロットにおけるそのサイズに従って又は試料中のｐ７５ＦＬ及び／又はｐ７５ＥＣＤの比較的高い存在量により、なお明確に識別され、測定可能である場合、或いは陰性対照試料又は正常対象（複数可）の対照試料を使用するために制御可能である場合、許容されうる。リガンドは、リガンドの検出及び測定を可能とする標識に共有結合又は非共有結合によりカップリングされうる。好適な標識化は、当業者に周知の任意の直接的又は間接的方法によって実行されてもよい。
【００５３】
[0067]本明細書に開示される通り、ｐ７５ＦＬ及び／又はｐ７５ＥＣＤ濃度は、ＣＳＦ及び脳組織を含む組織及び体液から容易に決定可能であることが理解された。ｐ７５及びｐ７５ＥＣＤペプチドレベルも、ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロッティングのような当業者に知られた標準的な方法を使用して血清及びリンパ球中で容易に検出可能である（例えば、Ｚｈｏｕら、２０１３年を参照されたい）。ｐ７５ＦＬ及び／又はｐ７５ＥＣＤは、類似の技術を使用して、他の組織及び体液タイプにおいても任意選択で検出可能ということになる。ある実施形態では、ｐ７５ＦＬは膜貫通分子であり、細胞中で検出可能である。例えば、ｐ７５はリンパ球、マクロファージ、皮膚細胞、シュワン細胞及び多くの神経細胞のような多様な細胞タイプにおいて検出されうる。ｐ７５レベルは、ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロッティングのような当業者に知られた技術（例えば、Ｚｈｏｕら、２０１３年を参照されたい）を使用して、末梢血由来のリンパ球中で容易に検出可能である。
【００５４】
[0068]しかしながら、当業者は、ｐ７５ＦＬレベルが細胞内のｐ７５ＦＬをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子の量を測定することによって間接的に定量化可能であることを理解する。例えば、ｐ７５ｍＲＮＡは、リンパ球、マクロファージ、皮膚細胞、シュワン細胞及び多くの神経細胞のような多様な細胞タイプにおいて検出されうる。実際に、ｐ７５ｍＲＮＡレベルは、リアルタイムリバーストランスクリプターゼＰＣＲ（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）（例えば、Ｚｈｏｕら、２０１３年を参照されたい）及びＲＴ−ＰＣＲのような当業者に知られた技術を使用して末梢血由来のリンパ球中で容易に検出可能である。
【００５５】
[0069]ある実施形態では、第１の態様の方法は、ＡＤを予後予測するために使用されてもよく、ここで、被験対象にＡＤの症状の徴候がないか又は弱い症状の徴候があるにもかかわらず、被験対象におけるｐ７５ＥＣＤ及び／若しくはｐ７５ＦＬの濃度並びに／又はｐ７５ＥＣＤ：ｐ７５ＦＬの比率は、認知障害のない対照対象又は認知障害のない対照対象群におけるｐ７５ＥＣＤ及び／若しくはｐ７５ＦＬの濃度並びに／又はｐ７５ＥＣＤ：ｐ７５ＦＬの比率に比べて変更されている。
【００５６】
[0070]本明細書に開示される通り、ｐ７５ＥＣＤが、アミロイドベータ毒性に対して保護し、タウオパチーに関連したタウリン酸化を低減させることができる神経向性分子であることも理解された。本明細書に開示される通り、アルツハイマー病（ＡＤ）、脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）又はタウオパチーのような神経学的状態に関連した徴候及び／又は症状は、Ａβを過剰発現するマウスモデルにｐ７５細胞外ドメイン（ｐ７５ＥＣＤ）を投与することによって低減されうる。そのような投与は、学習及び記憶を改善することによって神経学的状態の徴候及び／又は症状を低減させ、アミロイドベータによって誘導された神経変性からニューロンを保護し、タウタンパク質のリン酸化を低減しうる。
【００５７】
[0071]したがって、別の態様では、本開示は、治療有効量のｐ７５細胞外ドメイン（ｐ７５ＥＣＤ）をそれを必要とする対象に投与するステップを含む、脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）又はタウオパチーを処置又は予防する方法を提供する。
【００５８】
[0072]ＣＡＡは、ＡＤとは異なる状態であり、血管性認知症を引き起こす、大脳皮質及び軟膜の小〜中サイズの血管壁におけるＡβの進行性の沈着を特徴としうる。本明細書に開示される通り、ｐ７５ＥＣＤの投与がＡＤマウスモデルにおけるＣＡＡ病変をｐ７５ＥＣＤの投与に際して低減することが見出された。したがって、ある実施形態では、本開示は、治療有効量のｐ７５細胞外（ｐ７５ＥＣＤ）をそれを必要とする対象に投与するステップを含む、脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）を処置又は予防する方法を提供する。
【００５９】
[0073]理論にとらわれることを望むものではないが、タウオパチーは、神経原線維濃縮体（ＮＦＴ）と呼ばれる、脳内の欠陥のある過剰にリン酸化されたタウタンパク質の病的凝集に関連した神経変性疾患のクラスである。タウオパチーは、ＡＤ、パーキンソン病、運動ニューロン障害、前頭側頭変性症、ハンチントン病及びピック病を含むタウタンパク質の過剰リン酸化を伴う任意の神経変性疾患を含みうる。本明細書に開示される通り、ｐ７５ＥＣＤの投与が、複数の部位、例えば、セリン３９６、２６２、１９９及びスレオニン２３１におけるタウリン酸化を低減させたことが見出された。したがって、ある実施形態では、本開示は、治療有効量のｐ７５ＥＣＤ細胞外ドメイン（ｐ７５ＥＣＤ）をそれを必要とする対象に投与するステップを含む、タウオパチーを処置又は予防する方法を提供する。
【００６０】
[0074]本明細書中で使用される用語「処置すること」は、ｐ７５ＥＣＤを投与することが、ＡＤ、ＣＡＡ又はタウオパチーの徴候又は症状の少なくともいくつかを低減又は寛解させることを意味することが意図される。
【００６１】
[0075]本明細書中で使用される用語「予防すること」は、ＡＤ、ＣＡＡ及び／又はタウオパチーの診断の前にｐ７５ＥＣＤを投与することが起こり、ＡＤ、ＣＡＡ及び／又はタウオパチーの徴候又は症状の少なくともいくつかの発症を低減し、寛解させ又は遅延させることを意味し；或いはそうでなければ、ｐ７５ＥＣＤを投与することが、ＡＤ、ＣＡＡ及び／又はタウオパチーの徴候又は症状の少なくともいくつかを悪化から防止することを意味することが意図される。したがって、用語「予防すること」は、予防的処置を含むことが意図される。
【００６２】
[0076]投与されるｐ７５ＥＣＤは、任意の目的の種（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ウシ、ウマ、非ヒト霊長類など）に由来しうる。しかしながら、ある実施形態では、ｐ７５ＥＣＤはヒトｐ７５ＥＣＤである。ある実施形態では、ｐ７５ＥＣＤは配列番号３に提供されるヌクレオチド配列又は配列番号４に提供されるアミノ酸配列を有することができる。
【００６３】
[0077]代わりの実施形態では、ｐ７５ＥＣＤはこの配列の機能的断片、変異体、類似体又は誘導体であることができる。例えば、ｐ７５ＥＣＤ（又はその機能的断片）の変異体、類似体又は誘導体は、ｐ７５ＥＣＤ（又はその機能的断片）とは異なる分子からなるが、生物学的活性、特にプロニューロトロフィン及びＡβペプチドに結合する能力においてｐ７５ＥＣＤに対する類似性を保持する。ｐ７５ＥＣＤ（又はその機能的断片）の変異体、類似体又は誘導体は、ｐ７５ＥＣＤ（又はその機能的断片）と実質的な全体的構造の類似性を有するか又は生物学的活性に関与するｐ７５ＥＣＤ（又はその機能的断片）の１つ又は複数の領域とのみ構造的類似性を有してもよい。典型的に、変異体、類似体又は誘導体は、関連するアミノ酸配列の１つ又は複数のアミノ酸の修飾により提供されるか又はその結果である。例えば、配列番号４に提供される配列を含む機能的断片の変異体、類似体又は誘導体は、そのアミノ酸配列への１つ若しくは複数のアミノ酸の付加、そのアミノ酸配列からの１つ若しくは複数のアミノ酸の欠失、及び／又はそのアミノ酸配列の１つ若しくは複数のアミノ酸の置換により提供されるか又はその結果である。アミノ酸配列の変更をもたらすアミノ酸の反転及び他の突然変異変化も包含される。そのような類似体又は誘導体は、突然変異ポリヌクレオチド分子の発現に際して所望のアミノ酸変化（複数可）が達成されるように、ポリヌクレオチド分子にヌクレオチド変化（複数可）を導入することにより、又はそうでなければ、所望のアミノ酸変化（複数可）を組み込んでアミノ酸配列を合成することによって調製されてもよい。アミノ酸の置換は、保存的又は非保存的アミノ酸置換を含んでもよい。保存的アミノ酸置換により、類似する特徴を有し、ペプチド又はポリペプチドの生物学的活性を実質的に変更しない別のアミノ酸によってアミノ酸残基が置換されることが意味される。代表的な保存的アミノ酸置換が、以下の表１に提供される。想定される特定の保存的アミノ酸は：Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ；Ｄ、Ｅ；Ｎ、Ｑ；Ｓ、Ｔ；Ｋ、Ｒ、Ｈ；Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈであり、Ｐ、Ｎα−アルキルアミノ酸は生物学的活性にいかなる実質的な減少又は変動ももたらさない、配列の小さな変異（複数可）を有しうる。これらの変異は、ＧＬｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ；及びＰｒｏ、Ｎα−アルキルアミノ酸のような保存的アミノ酸置換並びに非保存的アミノ酸置換を含んでもよい。
【表１】
0006659050.tif 000002
【００６４】
[0078]類似体又は誘導体が合成によって調製される場合、類似体又は誘導体はカルボキシグルタミン酸及びヒドロキシプロリンのような遺伝コードによりコードされないアミノ酸（単数）又はアミノ酸（複数）を含んでもよいか、或いはＬ−アミノ酸の代わりにＤ−アミノ酸を含んでもよい。かくして、類似体又は誘導体は、ペプチド模倣体のようなｐ７５ＥＣＤ（又はその機能的断片）の模倣体であってもよい。しかしながら、ｐ７５ＥＣＤ（又はその機能的断片）の類似体又は誘導体はアミノ酸配列同一性及び／又は類似性を有する必要はなく、実際に類似体又は誘導体は、全くタンパク質性でなくてもよい。
【００６５】
[0079]配列番号４及び配列番号６に提供されるアミノ酸配列からの小さな変異を有するアミノ酸配列によりコードされるペプチドは、該ペプチドがｐ７５に結合し、ｐ７５を介するシグナリングを防止することができるという条件で、依然として本発明の範囲に属すると理解されるべきである。特に、ｐ７５ＥＣＤの天然の変異体（若しくはアイソフォーム）又は非ヒト種由来のｐ７５ＥＣＤペプチドは、開示された方法のｐ７５ＥＣＤ又はｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ融合ペプチドの範囲に属すると考えられるべきである。
【００６６】
[0080]ある実施形態では、ｐ７５ＥＣＤはｐ７５ＥＣＤ融合物を含み、ここで、ｐ７５ＥＣＤは融合パートナーに融合されている。融合パートナーは、ｐ７５ＥＣＤがその生物学的活性の少なくともいくらかを保持するという条件で、イムノグロブリンのＦｃ領域、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのような当業者に知られた任意の好適な融合パートナーであってもよい。融合生成物は、融合生成物をコードする好適な構築物から該生成物を発現させることによって、又はそうでなければ、ｐ７５ＥＣＤを融合パートナーに化学的に連結することによって生成されてもよい。融合パートナーは、ｐ７５ＥＣＤのｉｎ  ｖｉｖｏの安定性及び血清半減期を改善するべきである。ある実施形態では、ｐ７５ＥＣＤはイムノグロブリンのＦｃドメインに融合されて、ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ融合物を形成する。Ｆｃドメインは、任意の好適なイムノグロブリンからの任意の好適なＦｃドメインでありうる。しかしながら、好ましい実施形態では、ＦｃドメインはヒトＩｇＧに由来する。
【００６７】
[0081]ある実施形態では、Ｆｃ領域は二量体化して、ｐ７５ＥＣＤの二量体形を生成することができる。しかしながら、他の融合パートナーは、三量体、四量体、五量体などのような他のタイプのオリゴマーを形成することができうる。したがって、ｐ７５ＥＣＤは、二量体、三量体、四量体、五量体などのようなオリゴマーであってもよい。ある実施形態では、ｐ７５ＥＣＤは二量体であってもよい。ある実施形態では、ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ融合物はｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ二量体であってもよい。
【００６８】
[0082]ある実施形態では、ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ融合物は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に連結されたヒトｐ７５ＥＣＤ分子を含む。当業者は、そのような融合物が、例えば、使用されるリンカー次第で多数の異なるヌクレオチド及びアミノ酸配列を有しうることを理解する。しかしながら、ある実施形態では、ヒトｐ７５ＥＣＤ−ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン融合物（ヒトｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ）のヌクレオチド配列が配列番号５に提供される。
【００６９】
[0083]同様に、ある実施形態では、ヒトｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ融合物のアミノ酸配列が配列番号６に提供される。ある実施形態では、配列番号６は、配列番号６のアミノ酸残基１〜１６９にｐ７５ＥＣＤペプチドを、続いて残基１７０〜１７９にリンカー「ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ」を、続いて残基１８０〜３９６にＦｃドメインを含む。しかしながら、ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ融合物は、配列番号６により提供される配列の機能的断片、変異体、類似体又は誘導体であってもよいことが理解される。機能的断片、変異体、類似体又は誘導体は、本明細書の他の場所に記載されている。
【００７０】
[0084]ある実施形態では、ｐ７５ＥＣＤ又はｐ７５ＥＣＤ融合物はヌクレオチド分子として対象に投与される。そのようなポリヌクレオチド分子は、例えば、発現ベクター又は発現カセットに存在しうる。中でも好ましい発現ベクターは、所望の宿主細胞タイプ（複数可）の形質導入をもたらすことのできるウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター及び当業者に周知のもののようなアデノ随伴ウイルス（ＡＶＶ）に由来するベクターである。本開示のｐ７５ＥＣＤ又はｐ７５ＥＣＤ融合物をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターは、神経学的障害の処置又は予防のための所望の部位にｐ７５ＥＣＤ又はｐ７５ＥＣＤ融合物のｉｎ  ｖｉｖｏの供給源を提供するために使用されうる。
【００７１】
[0085]好ましい実施形態では、ｐ７５ＥＣＤ又はｐ７５ＥＣＤ融合物は、遺伝子療法に好適な方法で細胞中へヌクレオチドを送達するための手段を提供することが知られたウイルスベクターによって投与される。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター又は単純ヘルペスウイルスベクターは、それらが全て遺伝子療法の目的のために細胞にヌクレオチドを送達することができるため、当業者により理解されうる通り、ウイルスベクターとして使用されうる。ウイルスベクターを介するｐ７５ＥＣＤ又はｐ７５ＥＣＤ融合物の送達は、ＣＮＳ（例えば、脳）内での作用剤の長期発現を媒介することができ、ｐ７５ＥＣＤ又はｐ７５ＥＣＤ融合物の進行中の分泌は、多くの神経学的障害の慢性的性質を考えると望ましい。ある実施形態におけるＡＡＶベクターの使用は、ベクターが単回注射（例えば、頭蓋内又は脳室内注射）として投与されうる限り、有益であり、作用剤の長期の分泌を提供し、加えて、かつて動物又はヒトにおいて報告されてきた病理学的事象のない非常に安全なものであるとも考えられる。ＡＡＶベクターは、遺伝子療法送達のための手段として知られている。したがって、ある実施形態では、ウイルスベクターはＡＡＶベクターであってもよい。ＡＡＶベクターは、当業者に知られた任意の好適なアデノ随伴ウイルスベクター、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２などであってもよい。ある実施形態では、ＡＡＶベクターはＡＡＶ８である。
【００７２】
[0086]「治療有効量」は、有益な又は治療効果を対象において誘発する任意の量である。ある実施形態では、任意の好適な対象のためのＡＡＶベクターの用量は、対象体重１ｋｇ当たり１×１０６〜６×１０１３個のウイルスゲノムである。ある実施形態では、任意の好適な対象のためのＡＡＶベクターの用量は、対象体重１ｋｇ当たり１×１０１１〜６×１０１２個のウイルスゲノムである。
【００７３】
[0087]投与されるアデノ随伴ウイルスベクターの用量は、当業者により十分に理解される通り、変動することができる。例えば、ヒト対象のためには、米国国立衛生研究所の事業としての臨床試験において患者に使用される「安全な」用量は、体重１ｋｇ当たり６×１０１２個のウイルスゲノム（ｖｇ）である。しかしながら、本明細書に記載の方法のためにヒト対象に投与されるアデノウイルスベクターの用量は、体重１ｋｇ当たり１×１０６〜６×１０１３個のｖｇに及びうる。ある実施形態では、ヒト対象に投与されるアデノウイルスベクターの用量は、体重１ｋｇ当たり１×１０１０〜６×１０１２個のウイルスゲノムである。ある実施形態では、ヒト対象に投与されるアデノウイルスベクターの用量は、体重１ｋｇ当たり１×１０１１〜３×１０１２個のウイルスゲノムである。ある実施形態では、アデノウイルスベクターの用量は、これらの用量が安全と考えられるという条件で、より高くてもよく、例えば、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７、１×１０１８、１×１０１８、１×１０１９、１×１０２０などであってもよい。
【００７４】
[0088]ヒト対象において使用されるＡＡＶベクターの用量は、体表面積に基づいて薬物の同等の用量を種を越えて変換するための米国食品医薬品局（ＦＤＡ）の基準［ｍｇ／ｋｇで表したヒトの同等の用量＝ｍｇ／ｋｇで表した動物の用量×（ｋｇで表した動物の体重／ｋｇで表したヒトの体重）０．３３］（Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ、２００３年）を使用して、他の動物のための適切な用量に変換されうる。したがって、マウスにおける「安全な」用量は、８×１０１０個のウイルスゲノムであることができる。しかしながら、当業者は、マウス対象に投与されるアデノ随伴ウイルスベクターの用量が、１×１０５〜１×１０１３個のウイルスゲノムにわたってもよいことを理解しうる。ある実施形態では、マウス対象に投与されるアデノ随伴ウイルスベクターの用量は、１×１０８〜１×１０１２個のウイルスゲノムにわたってもよい。ある実施形態では、マウス対象に投与されるアデノ随伴ウイルスベクターの用量は、１×１０９〜１×１０１１個のウイルスゲノムにわたってもよい。
【００７５】
[0089]本開示のこの態様の実施形態では、ｐ７５ＥＣＤ又はｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ融合物は組換えペプチドである。組換えｐ７５ＥＣＤ又はｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ融合物ペプチドは、当業者に知られた任意の好適な技術を使用して、例えば、培養細菌系における（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における）、酵母発現系、昆虫発現系、ウイルス発現系若しくは真核細胞発現系における発現により生成可能であり、又はペプチドは人工的に合成されることができるなど、その全てが当業者に知られうる。
【００７６】
[0090]ある実施形態では、投与される組換えｐ７５ＥＣＤ又はｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ融合物ペプチドは、有益な又は治療効果を対象において誘発する任意の好適な量であってもよく、投与経路に従って変動してもよい。ある実施形態では、用量は、単一又は複数用量で投与可能な１日当たり、対象の体重１ｋｇ当たり約０．０１〜約５００ｍｇである。好ましくは、用量は、１日当たり約０．１〜約２５０ｍｇ／ｋｇであり；より好ましくは１日当たり約０．５〜約２０ｍｇ／ｋｇである。
【００７７】
[0091]ある実施形態では、本開示のこの態様のｐ７５ＥＣＤ、ｐ７５ＥＣＤ融合物、ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ又はＡＡＶ−ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃは、薬学的に許容される担体、賦形剤及び／又は希釈剤とともに提供される。好適な薬学的に許容される担体、賦形剤及び／又は希釈剤は、当業者に周知である。
【００７８】
[0092]本開示のこの態様のｐ７５ＥＣＤ、ｐ７５ＥＣＤ融合物、ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ又はＡＡＶ−ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃは、任意の好適な経路、例えば、経口で、静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、鼻腔内に、頭蓋内に、髄腔内に又は脳室内に、対象に投与されうる。しかしながら、ｐ７５ＥＣＤ又はｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃは、腹腔内に、筋肉内に、髄腔内に又は脳室内に投与されることが好ましい。
【００７９】
[0093]別の態様では、治療有効量のｐ７５ＥＣＤ又はその類似体をそれを必要とする対象に投与するステップを含む、ｐ７５を介するシグナリングをブロックすることによって、アポトーシス及び／又は神経変性に対してニューロンを保護する方法が提供される。ある実施形態では、ｐ７５ＥＣＤ又はその類似体は、Ａβ、プロＮＧＦ、プロＢＤＮＦ及びプロＮＴ３からなる群から選択される神経毒性分子のｐ７５への結合を防止する。この態様の方法は、上記の実施形態を使用する。
【００８０】
[0094]さらなる態様では、治療有効量のｐ７５細胞外ドメイン（ｐ７５ＥＣＤ）又はその類似体をそれを必要する対象に投与するステップを含む、神経変性疾患又はタウオパチーを処置及び／又は予防する方法が提供され、ここで、神経変性疾患又はタウオパチーは、アルツハイマー病、ＣＡＡ、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ダウン症候群、ハンチントン病、パーキンソン病、運動ニューロン疾患、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ピック病、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、嗜銀顆粒性認知症、神経原線維型認知症、球状グリア（ｇｌｏｂｕｌａｒ  ｌｉａｌ）封入体を伴う白質タウオパチー、前頭側頭型認知症及び染色体１７に連鎖したパーキンソニズムから選択される。この態様の方法は、上記の実施形態を使用する。
【実施例】
【００８１】
実施例１  神経疾患の診断及び処置
材料及び方法
試薬及び抗体
[0095]ＡＡＶ８−ＣＢＡ−ｐ７５ＮＴＲ−ＥＣＤ−Ｆｃ（ＡＡＶ−ＥＣＤ−Ｆｃ）及びＡＡＶ８−ＣＢＡ−ＧＦＰ（ＡＡＶ−ＧＦＰ）のベクターは、Ｖｉｒｏｖｅｋ（ヘイワード、ＣＡ、米国）によって産生及び精製した。ｐｃＤＮＡ３ヒト完全長ｐ７５ＮＴＲは、Ｒａｉｎｅｒ  Ｎｉｅｄｅｎｔｈａｌ博士、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ／Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｈａｎｎｏｖｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ、ハノーファー、ドイツ由来であった。合成Ａβ４２（カタログ番号６２０８０）及びスクランブルＡβ４２（カタログ番号６２０４６）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ（サニーベール、ＣＡ、米国）から購入した。
【００８２】
[0096]ヒトｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ及びＦｃ組換えタンパク質は、下記の通りに調製した。ヒトｐ７５ＥＣＤ及びＦｃヌクレオチド構築物は、標準条件下でプライマー（表２）及びＰＣＲを使用して、またＤＮＡの供給源としてヒトｃＤＮＡを使用して個々に産生し、続いてｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃの融合物タンパク質に関して、断片を、標準条件を使用してオーバーラッピングＰＣＲによって一緒に融合させた。
【００８３】
[0097]
【表２】
0006659050.tif 000003
【００８４】
[0098]ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ及びＦｃ構築物が一旦生成されたら、Ｎｃｏ−Ｉ及びＥｃｏＲ−Ｉ制限酵素を使用して、ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ及びＦｃ構築物をｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクター（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）へクローニングして、次に、ＤＨ１０Ｂ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コンピテント細胞へ形質転換して、続いてＢＬ２１大腸菌コンピテント細胞へ形質転換した。ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ及びＦｃ組換え型ペプチドを発現させるために、ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ及びＦｃのＢＬ２１大腸菌ストックを、大量のルリアブロス（Ｌｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ）（ＬＢ）培養培地に接種して、ＯＤ値が０．４〜０．６に達するまで、３７℃でインキュベートし、続いて１ｍＭ  ＩＰＴＧを使用して、３７℃で３時間、大腸菌においてｐ７５ＥＣＤ及びＦｃの発現を誘導した。大腸菌を５，０００ＲＰＭで、４℃にて１５分間、遠沈させた後、ペレットを低張溶解緩衝液（１０ｍＭ  トリス、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、１〜２ｍｇ／ｍｌのＬｙｓｏｚｙｍｅ、ｐＨ＝８．０）中に再懸濁させて、超音波処理した後、４℃で３０分間の高速遠心分離（１５，０００ＲＰＭ）によって、上清を抽出した。ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ及びＦｃを収集するために、プロテインＧセファロースカラムに上清を通し、次にｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ及びＦｃを、１００ｍＭ  グリシンｐＨ２．５を適用することによってプロテインＧセファロースから溶出させた。続いて、グリシン溶液中のタンパク質をＰＢＳ中で４℃で透析して、ペプチドの純度をクマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｌｕｅ）染色によって確認した。Ｐ７５ＥＣ−Ｆｃはまた、任意の組換えタンパク質の産生の日常的な方法を用いて、酵母、哺乳動物細胞及び昆虫細胞において産生することができる。
【００８５】
[0099]本研究で使用した抗体は、抗ｐ７５ＮＴＲ抗体（ウサギポリクローナル、ＡＢ１５５４、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）、抗ｐ７５ＥＣＤ抗体（ウサギポリクローナル、９６５０、Ｍｏｓｅｓ  Ｃｈａｏ教授からご厚意により頂戴したもの、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｋｉｒｂａｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ニューヨーク、米国）、抗ＴＡＣＥ（ＡＤＡＭ−１７）抗体（ウサギポリクローナル、ａｂ２０５１、Ａｂｃｏｍ、米国、腫瘍壊死因子アルファ変換酵素の検出用）、抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体（マウスモノクローナル、ＭＡＢ１３０２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国、ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃの検出用）、抗ベータアミロイド抗体（マウスモノクローナル、６Ｅ１０、コーヴァンス、米国）、抗ｓＡＰＰβ抗体（ウサギポリクローナル、ＳＩＧ−３９１３８、コーヴァンス、米国）、抗アミロイド前駆タンパク質Ｃ末端抗体（７５１〜７７０ａａ）（ウサギポリクローナル、１７１６１０、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、米国、ＡＰＰ完全長及びＣＴＦ切断産物の検出用）、抗ＡＰＰ  Ｃ末端（６７８〜６９５ａａ）（ウサギポリクローナル、６６８７、Ｃ．Ｈａａｓｓ教授による寛大なる提供、ルートヴィヒマクシミリアン大学ミュンヘン、ミュンヘン、ドイツ）、抗ＢＡＣＥ  Ｃ末端抗体（マウスモノクローナル、クローン６１−３Ｅ７、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国、ベータ部位ＡＰＰ切断酵素の検出用）、抗ＢＡＣＥ１細胞外ドメイン抗体（マウスモノクローナル、ＭＡＢ９３１、Ｒ＆Ｄ、米国、ｉｎ  ｖｉｖｏでの研究における細胞ＢＡＣＥ１レベルの検出用）、抗ネプリライシン抗体（ウサギポリクローナル、ＡＢ５４５８、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）、抗ＲＡＧＥ抗体（ウサギポリクローナル、クローンＤＤ／Ａ１１、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国、終末糖化産物受容体の検出用）、抗ＬＲＰ（マウスモノクローナル、５Ａ６、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、米国、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質の検出用）、抗ＩＤＥ，Ｎ末端（９７〜２７３）抗体（ウサギポリクローナル、ＰＣ７３０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国、インスリン分解酵素の検出用）、抗ＮｅｕＮ抗体（マウスモノクローナル、ＭＡＢ３７７、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国、ニューロン核の検出用）、抗ＣｈＡＴ抗体（ウサギポリクローナル、ａｂ１３７３４９、Ａｂｃａｍ、米国、コリンアセチルトランスフェラーゼの検出用）、抗ＭＡＰ２（マウスモノクローナル、０５−３４６、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国、微小管結合タンパク質２の検出用）、抗グリア線維素酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）抗体（ウサギモノクローナル、０４−１０６２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国、活性アストロサイトの検出用）、抗活性カスパーゼ−３抗体（ウサギポリクローナル、ａｂ１３８４７、Ａｂｃａｍ、米国、アポトーシスの検出用）、抗ＣＤ４５抗体（ラットモノクローナル、ａｂ２５３８６、Ａｂｃａｍ、米国、活性ミクログリアの検出用）、抗ＳＮＡＰ２５抗体（ウサギポリクローナル、ＡＢ１７６２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国、シナプトソーム結合タンパク質−２５の検出用）、抗ＰＳＤ９５抗体（マウスモノクローナル、ＭＡＢ１５９６、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国、シナプス後肥厚部タンパク質９５の検出用）、抗ＳＹＰ���体（マウスモノクローナル、ＭＡＢ３３２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国、シナプトフィジンの検出用）、抗シナプシンＩ（ウサギポリクローナル、５７４７７８、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）、抗ＶＡＭＰ１抗体（ウサギモノクローナル、ａｂ１５１７１２、Ａｂｃａｍ、米国、小胞結合膜タンパク質１の検出用）、抗ｐＳ３９６抗体（ウサギポリクローナル、１１１０２、Ｓｉｇｎａｌｗａｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、米国、セリン３９６でリン酸化されるタウの検出用）、抗ｐＴ２３１抗体（ウサギポリクローナル、１１１１０、Ｓｉｇｎａｌｗａｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、米国、スレオニン２３１でリン酸化されるタウの検出用）、抗ｐＳ２６２抗体（ウサギモノクローナル、ａｂ９２６２７、Ａｂｃａｍ、米国、セリン２６２でリン酸化されるタウの検出用）、抗ｐＳ１９９抗体（ウサギモノクローナル、ａｂ８１２６８、Ａｂｃａｍ、米国、セリン１９９でリン酸化されるタウの検出用）、抗総タウ抗体（ウサギポリクローナル、ａｂ３９５２４、Ａｂｃａｍ、米国）、抗ＧＳＫ３（アルファ＋ベータ）（ホスホＹ２７９＋Ｙ２１６）抗体（ウサギポリクローナル、ａｂ５２１８８、Ａｂｃａｍ、米国）、抗ＧＳＫ３β抗体（ウサギモノクローナル、ａｂ１８８９３、Ａｂｃａｍ、米国、グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３βの検出用）、抗ＧＳＫ３β（ホスホＳ９）抗体（ウサギモノクローナル、ａｂ７５８１４、Ａｂｃａｍ、米国、セリン９でリン酸化されるグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３βの検出用）、抗グリセルアルデヒド３−リン酸塩脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）抗体（ヒツジポリクローナル、ＯＳＧ０００３４Ｗ、Ｏｓｅｎｓｅｓ、オーストラリア）及び抗β−アクチン抗体（ウサギポリクローナル、ａｂ８２２７、Ａｂｃａｍ、米国）である。
【００８６】
ヒトＣＳＦ及び脳組織試料調製
[00100]ヒト脳脊髄液（ＣＳＦ）試料に関する研究は、第三軍医大学の大平病院の倫理委員会によって承認された。ＣＳＦ試料採取に関して、合計５６人の被験者（ＡＤに関してｎ＝２９、ＮＤに関してｎ＝２７）を登録した。腰椎穿刺及びＣＳＦ試料採取に対する書面によるインフォームドコンセントを、全ての参加者又は参加者の代表者から入手した。ＡＤの診断は、ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）を含む国立神経系伝染病・卒中研究所（ＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡ）基準（Ｒａｆｆｉ、２０１３年；ＭｃＫｈａｎｎ他、１９８４年）に従って行った。ＣＳＦ検体は、一晩の絶食後に午前８時００分に滅菌ガラスチューブに収集して、今後の生化学アッセイのための−８０℃で即座に保管した。ヒト脳試料に関する研究は、サウスフロリダ大学の倫理委員会（Ｐｒｏ０００１１６０５）によって承認された。アルツハイマー病及び同年齢の認知障害のない個体の組織学的に確認された事例からの死後のヒト脳試料は、Ｂａｎｎｅｒ  Ｓｕｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（サンシティ、ＡＺ、米国）から入手した。
【００８７】
動物
[00101]ＡＰＰｓｗｅ／ＰＳ１ＤＥ９トランスジェニックマウス（ＡＤのモデルとして使用され、本願明細書中では「ＡＤマウス」と称される）は、ＡＰＰのスウェーデン突然変異を過剰発現し、またエクソン９においてＰＳ１が欠失されており、ここでは、４ヵ月齢から現れるＡβ斑による実質Ａβ負荷の増加、グリア活性化、並びにラジアルアーム水迷路によって実証される６ヵ月齢及びモリス水迷路テストで見られる１２〜１３ヵ月齢での認知機能の欠損をもたらす。
【００８８】
[00102]いくつかの実験に関して、ＡＤ／ｐ７５−／−及びＡＤ／ｐ７５＋／＋マウスを使用して、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）プロセシングに対するｐ７５の効果を研究した。Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドでのＡＰＰｓｗｅ／ＰＳ１ＤＥ９（ＡＤ）を発現するトランスジェニック（Ｔｇ）マウス系統（Ｔｇ）（Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉ及びＰｅｒｒｙ、２０１２年）及び１２９ｓｖバックグラウンドでのｐ７５−／−（ｐ７５ＮＴＲ／ＥｘｏｎＩＩＩ−／−）マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（番号００５８６４）から入手し、第三軍医大学の動物舎及び南オーストラリア大学で繁殖させた。ＡＤ／ｐ７５−／−及びＡＤ／ｐ７５＋／＋マウスを入手して、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）プロセシングに対するｐ７５の効果を研究するために、ｐ７５−／−マウスをＡＤマウスと交雑させて、供給業者の指示書に従うＰＣＲ遺伝子型決定の後に、動物に研究を行った。
【００８９】
[00103]動物は全て、標準条件下で、２２℃及び１２時間の明／暗サイクルで、適宜食物及び水とともに維持した。実施したマウス畜産手順は全て、ＮＨＭＲＣガイドラインに従って、第三軍医大学の動物舎及び南オーストラリア大学動物福祉委員会及びサウスオーストラリアパソロジー（１６ｂ／１２）の動物委員会の承認によって承認された。ＡＤマウスは、ｉｎ  ｖｉｖｏで実験において無作為に分類した。
【００９０】
ヒト脳脊髄液（ＣＳＦ）及び脳並びにマウス脳におけるｐ７５ＥＣＤのレベルの測定
[00104]ヒトＣＳＦ（ＡＤに関してｎ＝２９、ＮＤに関してｎ＝２７）及びヒト脳組織試料（ＡＤに関してｎ＝１２、ＮＤに関してｎ＝１２）におけるｐ７５ＥＣＤのレベルは、ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロットによって定量化した。ＣＳＦにおけるヒトｐ７５ＥＣＤのＥＬＩＳＡ定量化は、製造業者の指示書に従ってＮＧＦ  Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１６キット（カタログ番号ＤＹ３６７、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を使用して実行した。ヒト脳ホモジネート試料のｐ７５ＥＣＤは、抗ＮＧＦ受容体ｐ７５（カタログ番号ＡＢ１５５４、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）を使用してウェスタンブロットによって検出された。１２ヵ月齢のＡＤマウス（Ｔｇ）及び野生型同腹仔（Ｗｔ）（Ｔｇに関してｎ＝１３、Ｗｔに関してｎ＝１４）の脳ホモジネートのトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）分画中のｐ７５ＥＣＤの検出は、同じプロトコールを使用して実行した。
【００９１】
ヒト及びマウス脳におけるＴＡＣＥ活性の測定
[00105]腫瘍壊死因子アルファ変換酵素（ＴＡＣＥ）は、ｐ７５を切断する主要酵素であり、ｐ７５ＥＣＤを放出する。ヒトＣＳＦ（ＡＤに関してｎ＝２９、ＮＤに関してｎ＝２７）におけるＴＡＣＥ活性は、センソライト（ＳｅｎｓｏＬｙｔｅ）（登録商標）５２０  ＴＡＣＥ活性アッセイキット（カタログ番号７２０８５、ＡＮＡＳＰＥＣ、米国）を用いて測定した。製造業者の指示書に従って、酵素活性は、励起／放出＝４９０ｎｍ／５２０ｎｍでモニタリングした。ＡＤマウス脳におけるＴＡＣＥ発現レベルはまた、ＴＡＣＥ抗体（カタログ番号ａｂ２０５１、Ａｂｃｏｍ、米国）を使用してウェスタンブロットで検出した。
【００９２】
Ａβ４２のオリゴマー形態の調製
[00106]本研究では、Ａβ４２のオリゴマー形態を使用した。合成Ａβ４２及びスクランブルＡβ４２は、これまでに記載されるプロトコールに倣って調製した。簡潔に述べると、Ａβ４２ペプチドを、１ｍｇ／ｍｌ濃度で１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ、カタログ番号１０５２２８、Ｓｉｇｍａ、米国）に溶解して、エッペンドルフチューブ（１００μｇ／チューブ）に分取した。ＨＦＩＰをドラフト中で蒸発させて、得られた透明なペプチド膜を、真空下で一晩乾燥させた後、ペレットを使用まで−２０℃で保管した。Ａβ４２のオリゴマー化に関して、乾燥させたペレットをダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に、最終濃度１００μＭになるように再懸濁して、続いて４℃で２４時間インキュベートした。Ａβ４２のオリゴマー形態は、使用前にウェスタンブロットによって検査した（Ｓａａｄｉｐｏｕｒ，Ｋ．他、２０１３年）。
【００９３】
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞培養及びアッセイ
[00107]ヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙを、中国協和医科大学の細胞資源センター（ＣＲＣ）から購入し、３７℃での５％ＣＯ２加湿インキュベーターにおいて、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、１％抗生物質−抗真菌薬混合物を補充したＤＭＥＭ／ＨａｍのＦ−１２の１：１の混合物で構成される成長培地中で培養した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアッセイは全て、少なくとも３回実行した。
【００９４】
[00108]ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＡβ毒性に対するｐ７５ＥＣＤの役割を評価するために、臭化３−（４，５−メチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムを使用した細胞生存度アッセイを実行した。９６ウェル培養プレートで成長させた２４時間後（５０，０００個の細胞／ウェル）、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、０．３〜１０μＭ  Ａβ４２又は０．３〜１０μＭ  Ａβ４２と併せた１０μｇ／ｍｌの組換えｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃのいずれかで２４時間処置した後、０．５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ（カタログ番号Ｍ５６５５、Ｓｉｇｍａ、米国）とともに３７℃で４時間インキュベートした。続いて、生存細胞中でミトコンドリア脱水素酵素によって産生される不溶性紫色ホルマザン結晶を、ＨＣｌ（０．０１Ｍ）中の１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ溶液  １００μｌ中で、３７℃で１５分間溶解させて、５６３ｎｍの光学濃度をマイクロプレートリーダー（シナジー（Ｓｙｎｅｒｇｙ）  Ｈ４、Ｂｉｏ  Ｔｅｋ）で測定した。
【００９５】
[00109]神経突起虚脱に対するｐ７５ＥＣＤの保護効果を評価するために、神経突起増殖アッセイを実行した。ＤＭＥＭ／Ｆ−１２中での２４時間のインキュベーション後に、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、ＤＭＳＯ中に希釈した１％ＦＢＳ及び１０μＭ  オールトランスレチノイン酸（カタログ番号Ｒ２６２５、Ｓｉｇｍａ、米国）を有する媒質中で７日間培養した後、１０μｇ／ｍｌの組換えＥＣＤ−Ｆｃの存在又は非存在下で２４時間、５μＭ  Ａβで処置し、続いて４％パラホルムアルデヒドで１０分間、固定した。種々の群由来の５０個のニューロンの全画像を顕微鏡法によって撮り、ＩｍａｇｅＪを使用することによって、神経突起の長さを測定し、データは、平均値±標準誤差として表し、有意性は、ｐ＜０．０５である場合に達成された。群間の変数は、一元配置分散分析及びテューキーのポストホックによって決定した。
【００９６】
[00110]ｉｎ  ｖｉｔｒｏでタウ−リン酸化に対するｐ７５ＥＣＤの効果を検査するために、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、１０ｍＭ  オールトランスレチノイン酸中で３日間、分化させ、続いて１０μｇ／ｍｌの組換えｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ又はウサギ抗ｐ７５ＥＣＤ抗体（９６５０、ニューヨーク大学のＭｏｓｅｓ  Ｃｈａｏ教授）の存在又は非存在下で２４時間、種々の濃度０．１〜１０μＭ  Ａβ４２オリゴマーとともにインキュベートした。細胞溶解物は、ｐＳ２６２抗体（カタログ番号ａｂ９２６２７、Ａｂｃａｍ、米国）、総タウ抗体（カタログ番号ａｂ３９５２４、Ａｂｃａｍ、米国）、ＧＳＫ３（α＋β）抗体（カタログ番号ａｂ５２１８８、Ａｂｃａｍ、米国）、ｐＳｅｒ９  ＧＳＫ３β抗体（ａｂ７５８１４、Ａｂｃａｍ、米国）及びＧＡＰＤＨ抗体（カタログ番号ＯＳＧ０００３４Ｗ、Ｏｓｅｎｓｅｓ、オーストラリア）を負荷対照として用いたウェスタンブロットに付した。
【００９７】
一次皮質ニューロン培養及びアッセイ
[00111]皮質ニューロンは、１日齢の１２９ｓｖマウス脳から単離して、ポリ−Ｄ−リシン（カタログ番号Ｐ７２８０、Ｓｉｇｍａ、米国）でプレコートしたカバーグラス上で培養した。播種の２４時間後に、ニューロンを、組換えｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ（１０μｇ／ｍｌ）の存在又は非存在下で２４時間、５μＭ  Ａβ４２オリゴマーで処置し、次に４％パラホルムアルデヒドで１０分間、ニューロンを固定して、続いてＤＡＰＩ（カタログ番号Ｄ９５４２、Ｓｉｇｍａ、米国）及びＭＡＰ−２（カタログ番号０５−３４６、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）染色を行った。上述の方法で、神経突起画像を収集及び分析した。
【００９８】
[00112]ＴＡＣＥ発現に対するＡβの効果を研究するために、１日齢の１２９ｓｖマウス由来の皮質ニューロンを単離して、６ウェルプレートにおいて培養し、播種の７２時間後に、ニューロンを０．３、１、３及び１０μＭ濃度のＡβ４２オリゴマーとともに２４時間インキュベートして、続いて細胞溶解物を、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有するＲＩＰＡ緩衝液中に収集した。細胞溶解物を超音波処理した後、１４，０００ｒｐｍで、４℃にて１０分間遠心分離して、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ロックフォード、米国）を使用して、上清の総タンパク質濃度を決定し、ＴＡＣＥタンパク質の発現レベルを定量化するために、総タンパク質３０μｇを、ＴＡＣＥ抗体（カタログ番号ａｂ２０５１、Ａｂｃｏｍ、米国）を用いてウェスタンブロットに付した。
【００９９】
[00113]Ａβがｐ７５を介してＡＰＰのアミロイド形成的プロセシングを媒介するかどうかを解明するために、ｐ７５遺伝子を伴う／伴わない過剰発現したＡＰＰｓｗｅ／ＰＳ１ＤＥ９を保有する１日齢のＡＤ／ｐ７５−／−及びＡＤ／ｐ７５＋／＋マウス由来の皮質ニューロンを単離して、６ウェルプレートにおいて培養し、播種の７２時間後に、ニューロンを、０．１及び０．３μＭ  Ａβ４２オリゴマーで２４時間処置した後、細胞溶解物を、ＲＩＰＡ緩衝液中に収集して、ＡＰＰ抗体（カタログ番号１７１６１０、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、米国）、ｓＡＰＰβ抗体（カタログ番号ＳＩＧ−３９１３８、Ｃｏｖａｎｃｅ、米国）及びＢＡＣＥ１抗体（カタログ番号ＭＡＢ９３１、Ｒ＆Ｄ、米国）を用いて、内因性ＡＰＰを定量化するためにウェスタンブロットに付した。
【０１００】
ＡＡＶ−ＥＣＤ−Ｆｃベクター産生及び精製
[00114]組換えバキュロウイルスは、製造業者のプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従ってＢａｃ−ｔｏ−ｂａｃ系を使用して生成した。まず、標的遺伝子を含有するｐＦａｓｔＢａｃシャトルプラスミドを使用して、それぞれＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細菌を形質転換して、各構築物由来の２つの組換えバクミドクローン（白色コロニー）を選択し、標準的な技法を使用して、ＤＮＡ「ミニプレップ」を調製した。次に、ＤＮＡミニプレップを使用して、組換えバキュロウイルスを生成するようにＳｆ９細胞をトランスフェクトした。組換えバキュロウイルスを一度増幅させて、ＡＡＶ産生に使用した。具体的には、Ｓｆ９細胞を約１×１０７個の細胞／ｍｌになるまで培養して、約５×１０６個の細胞／ｍｌに希釈した。２００ｍｌ容量の希釈Ｓｆ９培養物を、ＡＡＶ  Ｒｅｐ及びＣａｐ遺伝子を含有するヘルパー組換えバキュロウイルス並びにＡＡＶベクター産生用の標的遺伝子を含有する第２の組換えバキュロウイルスで二重感染させた。感染の３日後、Ｓｆ９細胞を収集して、ＳＦ９溶解緩衝液（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１％サルコシル（Ｓａｒｋｏｓｙｌ）、１％トリトンＸ−１００及び１４０ユニット／ｍｌのベンゾナーゼ）中に溶解した。ゲノムＤＮＡを、３７℃で１時間のインキュベーションによって消化した。細胞片は、８，０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離によって除去した。きれいにした溶解物をＣｓＣｌ段階勾配へ負荷して、２８，０００ｒｐｍで２０時間の超遠心分離に付した。ウイルスバンドを、１８ゲージ針を有するシリンジで抜き出して、第２のＣｓＣｌへ負荷して、６５，０００ｒｐｍで２０時間の線形超遠心分離に付した。続いて、ウイルスバンドを抜き出して、２つのＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）に通して、ＣｓＣｌ及び洗浄剤を除去して、同時に０．００１％プルロニックＦ−６８を含有するＰＢＳ緩衝液へ交換した。定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を実行して、標的遺伝子に相当するＱＰＣＲプライマーを使用してＡＡＶベクターゲノムコピー数を決定した。
【０１０１】
[00115]Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入した完全長ｐ７５（ＮＭ＿００２５０７）を含有するプラスミド及びｐ７５−ＥＣＤ−Ｆｃを含有するプラスミドは、Ｖｉｒｏｖｅｋによって供給され、ｐ７５ＥＣＤ−ＦｃをＡＡＶ８ベクター（Ｖｉｒｏｖｅｋによって供給）に挿入し、それはＡＡＶ８の効力を増強するためにＡＡＶ２ホスホリパーゼドメインを有するＡＡＶ８カプシド配列を含有していた。ＡＡＶ２ホスホリパーゼドメインを有するＡＡＶ８カプシド配列の配列は、配列番号１３で提供され、ここでＡＡＶ２ホスホリパーゼドメイン配列は、ヌクレオチド２６〜４３１を含む。ＡＡＶ−ＥＣＤ−Ｆｃベクターは、Ｖｉｒｏｖｅｋによって生成されて、産生されて、精製された。簡潔に述べると、標的遺伝子をＶｉｒｏｖｅｋのＡＡＶ産生シャトルプラスミドへクローニングした。組換えバキュロウイルスを生成及び使用して、Ｓｆ９細胞を感染させて、Ｖｉｒｏｖｅｋに所有権のあるＢＡＣ−ＴＯ−ＡＡＶ技術を用いてＡＡＶベクターを産生した。ＡＡＶベクターは、二重ＣｓＣｌ超遠心分離によって精製され、ＰＤ−１０脱塩カラムを用いて緩衝液交換した。ＡＡＶ力価は、定量的リアルタイムＰＣＲ法によって決定し、純度は、シンプリーブルーサフェスチン（ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  Ｓａｆｅｓｔａｉｎ）アッセイ後にＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検証した（図１−１、図１−２）。鋳型としてのｐ７５プラスミド並びに配列番号７及び配列番号８で提供されるプライマーを使用して、ｐ７５−ＥＣＤ断片をＰＣＲ増幅させた。鋳型としてのｐ７５−ＥＣＤ−Ｆｃ並びに配列番号１１及び配列番号１２によって提供されるプライマーを使用して、Ｆｃ断片をＰＣＲ増幅させた。ＰＣＲは、標準条件下で行った。
【０１０２】
脳室内注射
[00116]ＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックマウスに、３ヵ月齢で「防止」のために、又は９ヵ月齢でＡＤの「処置」のために、左側脳室に一度ＡＡＶ−ＥＣＤ−Ｆｃ又はＡＡＶ−ＧＦＰを注射した。注射座標点は、定位座標：対軸方向−０．６ｍｍ；側方１．２ｍｍ及び腹側２．２ｍｍに倣ってブレグマから取った。注射のＡＡＶ用量は、８×１０１０個のウイルスゲノムであり、体表面積［ｍｇ／ｋｇでのヒト等価用量＝ｍｇ／ｋｇでの動物用量×（ｋｇでの動物体重／ｋｇでのヒト体重）０．３３］に基づいて、種間で薬物等価用量を変換するための米国食品医薬品局（ＦＤＡ）基準に従って、米国国立衛生研究所のサービス（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ）での患者に使用される安全な用量から変換された（Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ、２００３年）。
【０１０３】
行動に関する表現型決定
[00117]操作者等及び研究者等は、群及び介入情報に対して完全盲検であった。動物は全て、１２ヵ月齢で、モリス水迷路テスト、Ｙ−迷路及びオープンフィールドを含む行動に関する課題に付した。モリス水迷路テストは、これまでに報告されるプロトコールに倣って、わずかな変更を伴って行った（Ｗａｎｇ  Ｙ．Ｊ．他、２０１０年；Ｙａｕ  Ｊ．Ｌ．他、２００７年；Ｍａｒｋｏｗｓｋａ，Ａ．Ｌ他、１９９３年）。簡潔に述べると、モリス水迷路テストは、連続して４日間の１日につき４つのプラットフォーム試行、続くプローブ試行から構成された。動作は、ビデオで記録して、画像分析ソフトウェア（ＡＮＹ−迷路、Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ）によって分析した。プラットフォーム試行では、経路の距離及び待ち時間を測定し、プローブ試行では、四分円時間及びアニュラス横断を測定した（Ｍａｒｋｏｗｓｋａ，Ａ．Ｌ他、１９９３年）。自発的交替テスト及び新規アーム探索は、Ｙ−迷路で実行した。自発交替テストに関して、マウスを、５分の期間中に迷路を通って自由に移動させた。交替は、重複する三重組での３つのアームへの連続的な進入と定義した（Ｓａｒｔｅｒ，Ｍ．他、１９８８年）。交替のパーセントは、考えうる交替（アーム進入−２の数と定義される）に対する実際の（総抗体）の比率に１００を乗算したものとして算出した。新規アーム探索に関しては、選択した開始アーム（ホームアーム）の末端にマウスを配置させて、遮断したアーム（新規アーム）のうちの１つを用いて、５分間迷路を探索させた（Ｊｕｎｇ、Ｗ．Ｒ他、２００８）。２時間の間隔後、マウスに、３つのアーム全てを自由に探査させた。新規アーム進入及び新規アームで費やした時間は、３分の検索試行中の３つのアーム全てにおける総時間のパーセントとして算出した。オープンフィールドテストに関して、各マウスをオープンフィールド装置の中央に配置した（Ｄｅｌｌｕ，Ｆ．他、１９９２年；Ｃｏｎｒａｄ，Ｃ．Ｄ他、１９９９年）。経路は、コンピューター追跡システム（ライムライト（Ｌｉｍｅｌｉｇｈｔ）、ＡｃｔｉＭｅｔｒｉｃｓ）を使用して３分間追跡した。さらに、立ち上がり、身繕い、排便及び排尿を記録した。
【０１０４】
組織試料採取
[00118]動物は、６％抱水クロラール（６ｍｌ／ｋｇ）による過量投与することによって安楽死させた。血液を心臓の右心房から試料採取した後、生理食塩水中の０．１％ＮａＮＯ２  １００ｍｌを用いて心臓内灌流を行った。脳を単離して、１ｍｇの可読性を有するデジタル電子天秤で秤量した（ＢＸ−４２０Ｈ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）。組織学的分析用の右脳半球を４％パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．４）中で２４時間固定させて、続く凍結保護のため、３０％ショ糖中で２４時間インキュベートした。脳の冠状切片は、凍結切片用ミクロトームを用いて３５μｍ厚で切断して、使用まで０．１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ中で４℃にて保管した。左脳半球は、液体窒素中で瞬時に凍結させて、今後の生化学的分析用に−８０℃で保管した。
【０１０５】
ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ発現の分析
[00119]ＡＡＶ−ＥＣＤ−Ｆｃの脳室内注射後のＡＤマウス脳におけるｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃの発現は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット及び免疫組織化学によって検査した。ＥＬＩＳＡに関して、新鮮な脳を秤量して、ＴＢＳ中に均質化させた。ホモジネートは、１０，０００の×ｇで、４℃で１０分間遠心分離して、得られた上清を収集した。ＴＢＳ中のｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃを上記のように検出した。ウェスタンブロットに関して、等容量の２×ローディング試料緩衝液と混合した脳抽出物のＴＢＳ分画１０μｌを負荷して、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動した。ゲルをニトロセルロース膜に転写して、次に抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）又は抗ＮＧＦ受容体ｐ７５（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、続いてＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷ二次抗体（ＬＩ−ＣＯＲ）とともにインキュベートして、オデッセイ（Ｏｄｙｓｓｅｙ）蛍光スキャナーを使用することによってスキャンした。免疫組織化学に関して、これまでに記載されるように、浮遊性免疫組織化学プロトコールに倣って抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（カタログ番号ＭＡＢ１３０２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）を使用して、組織切片を染色した（Ｗａｎｇ  Ｙ．Ｊ．他、２００９ｂ）。免疫蛍光を実行して、ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ用のヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体（カタログ番号ＭＡＢ１３０２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）、ニューロン用のＮｅｕＮ抗体（カタログ番号ＭＡＢ３７７、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）、アストロサイト用のＧＦＡＰ抗体（カタログ番号０４−１０６２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）、ミクログリア用のＣＤ４５抗体（ａｂ２５３８６、Ａｂｃａｍ、米国）を使用して、ＥＣＤ−Ｆｃとニューロン又はアストロサイト又はミクログリアとの間の共局在を検査した。切片は、共焦蛍光顕微鏡（Ｒａｄｉａｎｃｅ  ２０００ＭＰ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて観察した。
【０１０６】
病理学及び定量的画像分析
[00120]密集したＡβ斑染色に関して、一連の切片を載せて、コンゴーレッド（カタログ番号Ｃ６２７７、Ｓｉｇｍａ、米国）で染色した。簡潔に述べると、脳全体にわたる一連の５つの等間隔の組織切片（およそ１．３ｍｍ間隔で）を、室温で２０分間、作業用塩化ナトリウム溶液（８０％アルコール及び０．０１％水酸化ナトリウム中で飽和させた塩化ナトリウムを含有）で処置した後、作業用コンゴーレッド溶液（作業用塩化ナトリウム溶液中に飽和コンゴーレッドを含有）へ直接、４５分間配置させて、無水アルコール中で迅速に脱水した。画像は、一定の球温度及び露光を使用して、４倍の倍率で収集し、画像は全て、同じ期間に獲得した。総Ａβ、ミクログリオーシス、アストログリオーシス及び微小出血に関する染色は、これまでに記載されるように加工処理した（Ｗａｎｇ，Ｙ．Ｊ．他、２００９ｂ）。簡潔に述べると、切片を無作為に選択して、それぞれ、総Ａβ（カタログ番号６Ｅ１０、Ｃｏｖａｎｃｅ、米国）、ミクログリア（カタログ番号ａｂ２５３８６、Ａｂｃａｍ、米国）、アストロサイト（カタログ番号０４−１０６２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）及びタウリン酸化（ｐＳ３９６抗体、カタログ番号１１１０２、Ｓｉｇｎａｌｗａｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、米国）に関して浮遊性免疫組織化学を使用して染色した。切片は、一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートして、ビオチン化二次抗体並びに基質としてジアミノベンジジン及びグルコースオキシダーゼを使用したＡＢＣキット（カタログ番号ＰＫ６２００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）を用いてさらに展開させた。新皮質及び海馬の区域は、Ａβ、ミクログリア、アストロサイト免疫染色及びコンゴーレッド陽性Ａβ斑のＩｍａｇｅ  Ｊによって、自動定量化に関して選択され、分析される組織の区域に対する総陽性染色の区域分画を得た。個々の測定の平均は、群の平均値及び標準偏差を算出するのに使用した。
【０１０７】
[00121]脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）染色に関して、一連の５つ連続した切片を、コンゴーレッド法を使用することによって染色した。微小出血染色及び定量化は、上述する方法に倣って実行した（Ｗａｎｇ，Ｙ．Ｊ．他、２００９ａ）。簡潔に述べると、一連の５つの切片をスライド上に載せて、２％塩酸中の２％フェロシアン化カリウム（カタログ番号４５５９８９、Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）を１５分間、続いて１％ニュートラルレッド（カタログ番号Ｎ４６３８、Ｓｉｇｍａ、米国）溶液中の対比染色を１０分間、室温で使用して、ヘモジデリンに関して染色した。微小出血プロファイルは、顕微鏡法で各脳の切片全てで計数し、ヘモジデリン沈着物の平均数は、各切片当たりで算出した。画像分析は全て、盲検様式で加工処理した。
【０１０８】
Ａβ斑とＥＣＤ−Ｆｃとの共局在
[00122]８匹のマウスの動物１匹当たりの海馬を網羅する一連の３つの等間隔の組織切片を、免疫組織化学又は免疫蛍光によって染色した。免疫組織化学に関して、切片を、コンゴーレッドを使用して染色して、続いて抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃとともにインキュベートした。免疫蛍光に関して、切片を、チオフラビンＳ（カタログ番号Ｔ３５１６、Ｓｉｇｍａ、米国）及び抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃを使用して染色して、共焦蛍光顕微鏡（レイディアンス（Ｒａｄｉａｎｃｅ）  ２０００ＭＰ、ＢｉｏＲａｄ）を用いて観察した。
【０１０９】
Ａβに関するＥＬＩＳＡ定量化
[00123]脳ＡβのＥＬＩＳＡ分析は、これまでに記載されるように加工処理した（Ｗａｎｇ  Ｙ．Ｊ．他、２００９ｂ）。簡潔に述べると、凍結させた脳は、プロテアーゼ阻害剤を含有するＴＢＳ中で均質化及び超音波処理した。ホモジネートを、１００，０００ｇで、４℃で１時間遠心分離して、得られた上清を収集し、ＴＢＳ可溶性分画に相当した。得られたペレットは、２％ＳＤＳ及びプロテアーゼ阻害剤を含有する水中に懸濁して、超音波処理した。ＳＤＳ可溶化ホモジネートを、１００，０００×ｇで、４℃で１時間遠心分離して、得られた上清を収集し、ＳＤＳ可溶性分画に相当した。次に、得られたペレットを、７０％ギ酸（ＦＡ）中で抽出して、遠心分離して、得られた上清を収集して、ＦＡ不溶性分画に相当した。ＥＬＩＳＡアッセイの前に、ギ酸抽出物を、１Ｍトリスリン酸緩衝液（ｐＨ１１）への１：２０希釈によって中和し、続いて試料緩衝液中に希釈した。脳抽出物及び血清中のＡβ４０及びＡβ４２の濃度は、製造業者の指示書（Ａβ４０に関しては、ＳＩＧ−３８９５４及びＡβ４２に関しては、ＳＩＧ−３８９５６、Ｃｏｖａｎｃｅ、米国）に従って、ＥＬＩＳＡによって定量的に測定した。元のホモジネートにおける脳組織の湿潤重量を使用して、脳Ａβの最終的な値を、脳の湿潤重量１グラム当たりのピコモルとして表した。
【０１１０】
β−セクレアーゼ活性分析
[00124]β−セクレアーゼ活性は、製造業者のプロトコール（カタログ番号Ｋ３６０−１００、Ｂｉｏ  Ｖｉｓｉｏｎ、米国）に従って測定した。簡潔に述べると、新鮮な脳組織を、液体窒素中で微粉砕して、セクレアーゼ分析用に分取した。製品キットにおいて供給される抽出緩衝液中で、セクレアーゼを抽出し、それらの活性は、レポーター分子ＥＤＡＮＳ及びＤＡＢＣＹＬにコンジュゲートされたセクレアーゼ特異的ペプチドを添加することによって測定した。セクレアーゼによるペプチドの切断は、ＥＤＡＮＳ及びＤＡＢＣＹＬを物理的に分離させ、蛍光シグナルの放出を可能にし、それはセクレアーゼ酵素活性のレベルに比例している。蛍光シグナルを、４９５ｎｍのカットオフで、３５５ｎｍの励起波長及び５１０ｎｍでの放出で読み取った。
【０１１１】
ニューロンアポトーシスの分析
[00125]アポトーシス細胞をアッセイするために、ＴＵＮＥＬ染色及び抗活性化カスパーゼ−３を用いた免疫蛍光を使用した。動物１匹当たりの５つの切片が、ＴＵＮＥＬ又は活性化カスパーゼ−３染色に使用された。ＴＵＮＥＬ染色に関して、ホルマリン固定した冠状脳切片３５μｍにおけるアポトーシス細胞は、製造業者の指示書に従って、原位置でのデスディテクションキット（Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）、ＰＯＤ（カタログ番号１１６８４８１７９１０、Ｒｏｃｈｅ）を使用して標識した。切片をスライド上に載せて、ドラフトにおいて乾燥させた後、室温で、１０分間、ブロッキング溶液とともにインキュベートして、ＰＢＳで２度を洗浄した。氷上の透過化溶液中での２分のインキュベーション後、切片をＰＢＳで二度すすぎ、切片の周囲の区域を乾燥させた。ＴＵＮＥＬ反応混合物を、切片に添加して、加湿チャンバー中で、加湿して、暗所で、３７℃で６０分間インキュベートした。スライドをＰＢＳで三度すすぎ、コンバーター−ＰＯＤを切片に添加した。３７℃で３０分のインキュベーション後に、ＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン）基質又は代替的なＰＯＤ基質を、切片に添加して、室温で、１０分間インキュベートした。免疫蛍光染色に関して、簡潔に述べると、切片を３×２分間、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０中ですすぎ、室温で、ＰＢＳ中の３％ＢＳＡとともに、室温で３０分間インキュベートし、活性なカスパーゼ−３（カタログ番号ａｂ１３８４７、Ａｂｃａｍ、米国）に対する一次抗体とともに、４℃で一晩インキュベートして、ＰＢＳで二度すすぎ、ＰＢＳ中でアレクサフルオロ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ）（登録商標）二次抗体とともに、室温で６０分間インキュベートした。スライド上の切片は、黒い箱を用いて光から保護され、３×５分間、ＰＢＳ中ですすぎ、アンチフェードのマウンティング媒質でカバーガラスを付した。切片は、共焦蛍光顕微鏡（レイディアンス  ２０００ＭＰ、ＢｉｏＲａｄ）で観察された。
【０１１２】
ゴルジ（Ｇｏｌｇｉ）染色による樹状突起棘の定量化
[00126]動物は、６％抱水クロラール（６ｍｌ／ｋｇ）によって麻酔して、０．５％亜硝酸ナトリウムを含有する０．９％塩化ナトリウムで、続いて４％ホルムアルデヒドで、心臓内に灌流させた。マウス脳は、５％重クロム酸カリウム、５％抱水クロラール及び４％ホルムアルデヒドを含有するゴルジ色素溶液でさらに灌流させた。灌流後、脳を０．１ｃｍ×０．１ｃｍ切片に解剖して、室温で３日間、ゴルジ色素溶液を含有する５０ｍｌの不透明なバイアルへ移し、続いて透明なバイアルにおいてさらに３日間、１％硝酸銀溶液中に浸漬させた。振動ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ、ＶＴ１０００  ドイツ）を用いて、脳を３５μｍ厚の切片で連続的に切断した。樹状突起棘の数は、注射条件に対して盲検であった研究者によって、高い倍率（１０００倍）で推定された。
【０１１３】
タンパク質ブロッティング
[00127]完全長ｐ７５（ｐ７５ＦＬ）、ｐ７５ＥＣＤ、Ａβ産生及び分解を含む分子、タウリン酸化並びにシナプス可塑性に関連したシナプスタンパク質（ＳＮＡＰ２５、シナプシン１、ＶＡＭＰ１及びＰＳＤ９５）のレベルを、ウェスタンブロッティングを使用して分析した。動物脳ホモジネート中のタンパク質を、５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、２ｍＭ  ピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５ｍＭ  β−グリセロリン酸、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、０．５μｇ／ｍｌのロイペプチン、１〜２ｍＭ  ＰＭＳＦを含むＲＩＰＡ緩衝液で、脳組織１マイクログラム当たりＲＩＰＡ緩衝液９μｌを添加する比率に基づいて抽出した。試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８〜１５％アクリルアミド）ゲルに付した。分離されたタンパク質は、ニトロセルロース膜へ転写した。ブロットを下記抗体でプロービングした：ＡＰＰｆ１、ＣＴＦβ及びＣＴＦαを認識する抗ＡＰＰ  Ｃ末端（１７１６１０、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、米国）、抗ＢＡＣＥ１（クローン６１−３Ｅ７、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）、抗ネプリライシン（カタログ番号ＡＢ５４５８、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）、抗ＲＡＧＥ（クローンＤＤ／Ａ１１、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）、抗ＬＲＰ（５Ａ６、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、米国）、抗ＩＤＥ（ＰＣ７３０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）、ｐＳ３９６を含む抗ホスホ−タウ（カタログ番号１１１０２、Ｓｉｇｎａｌｗａｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、米国）、ｐＴ２３１（カタログ番号１１１１０、Ｓｉｇｎａｌｗａｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、米国）、ｐＳ１９９（カタログ番号ａｂ８１２６８、Ａｂｃａｍ、米国）、ｐＳ２６２（カタログ番号ａｂ９２６２７、Ａｂｃａｍ、米国）、抗ＳＮＡＰ２５（カタログ番号ＡＢ１７６２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）、抗シナプトフィジンシナプトフィジン（カタログ番号ＭＡＢ３３２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）、抗シナプシンシナプシンＩ（カタログ番号５７４７７８、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）、抗ＶＡＭＰ１（ａｂ１５１７１２、Ａｂｃａｍ、米国）；抗ＰＳＤ９５（ＭＡＢ１５９６、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）、抗β−アクチン（ａｂ８２２７、Ａｂｃａｍ、米国）。バンド密度は、β−アクチンのバンド密度に対して標準化した。膜は、ＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷ二次抗体（ＬＩ−ＣＯＲ）とともにインキュベートして、オデッセイ蛍光スキャナーを使用してスキャンした。
【０１１４】
ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＮＦ−γ及びＴＮＦ−α濃度のＥＬＩＳＡ定量化
[00128]脳抽出物及び血清のＴＢＳ分画中のＩＬ−６度、ＩＬ−１β、ＩＮＦ−γ、ＴＮＦ−αのレベルは、それぞれ、製造業者の指示書（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に従って、ＢＭＳ６０３、ＢＭＳ６００２、ＢＭＳ６０６、ＢＭＳ６０７  ＥＬＩＳＡを使用して定量的に測定した。元のホモジェネートにおける脳組織の湿潤重量を使用して、脳ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＮＦ−γ、ＴＮＦ−αの最終的な値は、脳の湿潤重量１グラム当たりのピコモルとして表した。
【０１１５】
統計分析
[00129]データは、統計分析から排除されなかった。データ収集に関しては、試料は全て、コード化され、分析する研究者は、試料の同一性に関して盲検であった。
【０１１６】
[00130]別記しない限り、本文及び図におけるデータは、平均値±標準誤差として表す。群間の統計学的比較は、値の有意性を実験するために、テューキーの検定、スチューデントｔ検定、一元配置分散分析又は二元配置反復測定分散分析を使用してアッセイした。スピアマンの順位相関係数は、ｐ７５ＥＣＤレベルとＡβ荷重（ｂｕｒｄｅｎ）、炎症及び行動遂行とのｐ７５ＥＣＤの相関を評価するのに使用した。Ｐ値＜０．０５は、有意であると考えられた。これらの分析は全て、ウィンドウズ（Ｗｉｎｄｏｗｓ）バージョン１３．０に関してＳＰＳＳを使用して実行した。
【０１１７】
結果
ｐ７５ＥＣＤのシェディングは、ＡＤ対象及びＡＰＰｓｗｅ／ＰＳ１ｄＥ９マウスの脳において下方制御される
[00131]脳全体又は種々の領域におけるｐ７５ＥＣＤのレベルは、Ｗｔマウスにおいて年齢とともに増加した（図２  ａ、ｂ）。可溶性ｐ７５ＥＣＤは、野生型（Ｗｔ）マウスの脳（図２  ｂ、ｃ）、末梢神経節及び臓器（データは示していない）の多くの異なる領域に存在した。データにより、ｐ７５ＥＣＤのシェディングは、生理学的プロセスであり、正常な認知障害のない対照個体における老化と関連付けられることが示される。
【０１１８】
[00132]ｐ７５ＥＣＤレベルは、ＥＬＩＳＡによってＡＤ患者及びＮＤ対照由来の脳脊髄液（ＣＳＦ）において測定した。ｐ７５ＥＣＤ  ＥＬＩＳＡの感度は、１５０ｐｇ／ｍｌに達し、それは、同じサンプルでのウェスタンブロットによって検証されるように特異的である（ｒ＝０．８１９８、ｐ＜０．０００１）（データは示していない）。ＡＤ患者（ｎ＝２９）の脳脊髄液（ＣＳＦ）におけるｐ７５ＥＣＤレベルは、ＮＤ対照（ｎ＝２７、Ｐ＜０．０１）のＣＳＦにおけるｐ７５ＥＣＤレベルよりも著しく低かった（図３  ａ）。認知障害のない対照に関するＣＳＦにおけるｐ７５ＥＣＤ濃度の平均値±標準誤差は、８６４±３０ｐｇ／ｍｌであり、範囲は、５４９〜１２３３ｐｇ／ｍｌであった。ＣＳＦにおけるＡＤ患者に関するｐ７５ＥＣＤ濃度の平均値±標準誤差は、３４３±３３ｐｇ／ｍｌであり、範囲は、９４〜８４８ｐｇ／ｍｌであった。したがって、ＣＳＦにおける同平均ｐ７５ＥＣＤ濃度は、ＮＤ対照と比較して、ＡＤ患者において２．２２分の１だった。
【０１１９】
[00133]ｐ７５ＥＣＤの存在は、ウェスタンブロットによって、ＡＤ対照の脳において（図３  ｂ、ｃ、ｄ）、及びＡＰＰｓｗｅ／ＰＳ１ｄＥ９（ＡＤ）マウスの脳において（図３  ｅ、ｆ、ｇ）確認した。脳（頭頂葉皮質）におけるｐ７５ＥＣＤレベルは、同年齢且つ同性の認知障害のない対照と比較して、ヒトＡＤ患者において著しく低減した（ＮＤ、ｎ＝１２；Ｐ＜０．０５、図３  ｃ）。認知障害のない対照に対して標準化したＡＤ患者におけるｐ７５ＥＣＤ濃度の相対強度の平均値±標準誤差は、２２±３％であり、ＡＤにおけるｐ７５ＥＣＤの強度が、認知障害のない対照と比較して、４倍を上回って減少することを意味した。
【０１２０】
[00134]比較すると、完全長（ＦＬ）ｐ７５（ｐ７５ＦＬ）は、ＮＤ対照と比較して、ヒトＡＤ患者において著しく増加した（Ｐ＜０．０１、ｎ＝１２；図３  ｃ）。認知障害のない対照に対して標準化したＡＤ患者におけるｐ７５ＦＬ濃度の相対強度の平均値±標準誤差は、３１５±２０％であり、ＡＤにおけるｐ７５ＦＬの強度が、認知障害のない対照と比較して、３倍を上回って増加することを意味した。
【０１２１】
[00135]とりわけ、ｐ７５ＦＬに対するｐ７５ＥＣＤの比率（ｐ７５ＥＣＤ：ｐ７５ＦＬ）は、ＮＤ対照と比較して、ＡＤ患者において著しく低減した（図３  ｄ）。ＡＤ患者に関する比率の平均値±標準誤差（認知障害のない対照の平均値±標準誤差に対して標準化した）は、０．１１±０．０２％であった。したがって、比率は、認知障害のない対照と比較して、ＡＤ患者において９分の１だった。これらの結果により、ＡＤにおいてＥＣＤを除去するためのｐ７５のプロセシングは、正常な認知障害のない対照と比較して、ＡＤ患者において著しく低減したことが示される。
【表３】
0006659050.tif 000004
【０１２２】
[00136]ｐ７５ＥＣＤ及びｐ７５ＦＬの異常発現は、１２ヵ月齢のＡＤマウスの脳において、それらのＷｔ同腹仔と比較する場合に非常に類似していた（図３  ｅ、ｆ、ｇ、ｈ）。具体的には、ＥＬＩＳＡによるマウス脳におけるｐ７５ＥＣＤレベルの平均値±標準誤差は、７５±５ｎｇ／ｍｌであったのに対して、ｗｔ同腹仔におけるｐ７５ＥＣＤ濃度は、２０１±１０ｎｇ／ｍｌであった（図３  ｅ）。したがって、ｐ７５ＥＣＤは、ｗｔマウスよりもＡＤマウスにおいて、２．７分の１だった。
【０１２３】
[00137]ｐ７５ＦＬは、ｗｔ同腹仔と比較して、ＡＤマウスの脳において著しく高いレベルで発現され（図３  ｆ、ｇ）、ｐ７５ＥＣＤは、ｗｔ同腹仔と比較して、ＡＤマウスにおいて著しく低いレベルで発現された（図３  ｆ、ｇ）。具体的には、ｗｔ同腹仔と比較したＡＤマウスにおけるｐ７５ＥＣＤの相対強度の平均値±標準誤差は、６５±４％であった（図３  ｇ）。したがって、ｐ７５ＥＣＤ濃度は、ｗｔ対照と比較して、ＡＤマウスにおいておよそ０．３５分の１だった。
【０１２４】
[00138]ｐ７５ＦＬに対するｐ７５ＥＣＤの比率は、ｗｔ等価体と比較して、ＡＤマウスにおいて著しく低減した（図３  ｈ）。具体的には、ｗｔマウスに対して標準化したＡＤマウスにおけるｐ７５ＥＣＤ：ｐ７５ＦＬ比率の平均値±標準誤差は、４８±４％であり、比率が、ｗｔ同腹仔と比較して、ＡＤマウスにおいて２．１分の１であることを意味した（図３  ｈ）。
【０１２５】
[00139]ＡＤ動物において、脳ｐ７５ＥＣＤレベルは、認知障害、脳Ａβ荷重及び炎症と負に相関している（表３、表４及び表５）。
【表４】
0006659050.tif 000005
【表５】
0006659050.tif 000006
【表６】
0006659050.tif 000007
【０１２６】
[00140]理論に拘束されることは望まないが、これらの結果は、ＥＣＤを除去するためのｐ７５のプロセシングが、正常な野生型同腹仔と比較して、ＡＤにおいて著しく低減したことを示す。
【０１２７】
[00141]腫瘍壊死因子アルファ転換酵素（ＴＡＣＥ）は、ｐ７５のＥＣＤを切断する主な酵素であると報告されている（Ｗｅｓｋａｍｐ，Ｇ．他、２００４年）。本明細書中に開示するように、ＴＡＣＥ活性は、ＡＤマウスの脳において（データは示していない）、及びＡＤ患者のＣＳＦにおいて（データは示していない）、それらのＮＤ又はｗｔ等価体と比較して、著しく低減したことが見出されている。ＡＤマウスにおけるＴＡＣＥ発現もまた、同年齢のＷｔ対照と比較して低減した（データは示していない）。ｐ７５のＴＡＣＥ依存性切断を増加させる神経増殖因子（ＮＧＦ）（Ｕｒｒａ，Ｓ．他、２００７年；Ｋｏｍｍａｄｄｉ，Ｒ．Ｐ．他、２０１１年）と対比して、マウス皮質ニューロンのＡβ処置は、用量依存的性様式で、ＴＡＣＥ発現を著しく低減させた（データは示していない）。理論に拘束されることは望まないが、これらの結果は、ＡＤにおける可溶性ｐ７５ＥＣＤの低減が、Ａβの下流毒性作用であることを示す。
【０１２８】
組換えヒトＥＣＤ−Ｆｃ遺伝子の送達によるＡＤマウスの脳ｐ７５ＥＣＤレベルの回復
[00142]組換えＥＣＤ−Ｆｃが、Ａβ−ｐ７５相互作用を崩壊させて、Ａβ凝集を阻害できること（Ｗａｎｇ，Ｙ．Ｊ．他、２０１１年）、及びｐ７５ＥＣＤレベルが、上述するようにＡＤ脳において低減したことを考慮して、ＡＤ脳におけるｐ７５ＥＣＤレベルの回復が、Ａβの病理学に対してニューロンを保護しうると考えられた。３ヵ月齢での（脳におけるアミロイド斑の発生の前に）ＡＤマウスの側脳室へヒトｐ７５ＥＣＤ及びヒトＩｇＧ  Ｆｃ断片（ＡＡＶ−ＥＣＤ−Ｆｃ）の融合物遺伝子を送達するのにアデノ随伴ウイルス８（ＡＡＶ８）を使用して、ＥＣＤ送達が、Ａβ関連疾患の症状を防止するのに使用することができるかどうかを検査し、また９ヵ月齢で（アミロイド疫病が十分に発達している場合）、ＥＣＤ送達が、Ａβ関連疾患の症状を低減するための処置として使用することができるかどうかを検査した。使用するＡＡＶの用量は、ＡＡＶのヒト臨床試験において使用される用量に等しかった。ＡＡＶ発現緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を対照として使用した。ＥＣＤ−Ｆｃ導入遺伝子の発現は、送達の１週後に検出され、動物が、導入遺伝子から発現されたＥＣＤ−Ｆｃのみを検出するが、内因性ｐ７５ＥＣＤは検出しない抗ヒトＦｃ抗体で検出される際に選別される場合、最大１２ヵ月齢で、新皮質、海馬及び視床のニューロンにおいて依然として安定であった（データは示していない）。
【０１２９】
[00143]ＡＡＶ−ＥＣＤ−Ｆｃを３ヵ月齢で左側脳室において注射する場合、ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃの免疫蛍光は、皮質、海馬及び視床におけるＥＣＤ−Ｆｃの発現を伴って、ＡＡＶを注射した動物の脳切片において抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体（α−ＩｇＧ−Ｆｃ）で検出された（データは示していない）。ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃは、ニューロンにおいて発現されたが、ミクログリア又はアストロサイトでは発現されなかった（データは示していない）。ＡＡＶ−ＥＣＤ−Ｆｃの注射の１週（１ｗ）後、２週（２ｗ）後、３週（３ｗ）後及び９ヵ月（９ｍ）後のＡＤマウス脳ホモジネートのＴＢＳ分画におけるｐ７５ＥＣＤのＥＬＩＳＡ分析により、安定な発現が示された（図４  ａ）。１２ヵ月齢で、トランスフェクション後のＡＤマウスの脳におけるＥＣＤ−Ｆｃのレベルは、同年齢のＷｔマウスのＥＣＤレベルに類似していた（図４  ｂ）。
【０１３０】
脳ｐ７５ＥＣＤレベルの回復は、ＡＤマウスにおける認知低下を防止する
[00144]３ヵ月又は９ヵ月齢で（それぞれ、防止（Ｐｒｅ）又は処置（Ｔｒｅ）として）ＡＡＶ−ＥＣＤ−Ｆｃで処置したＡＤマウスは、ＡＡＶ−ＧＦＰ処置対照マウス（ｃｏｎ）と比較して、モリス水迷路試験においてより良好に行動した。これは、進行性プラットフォーム学習試行を用いたプラットフォーム上へ回避するのにかかる回避待ち時間及び移動距離（図５−１  ａ、ｂ、ｃ）、並びにプラットフォームを用いない探索試行におけるプラットフォーム四分円におけるより多数のプラットフォーム区域横断及び費やされるより多い時間（図５−１  ｄ、ｅ、ｆ）の著しい低減に反映された。これらのデータは、ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃが、防止として３ヵ月に、又は処置として９ヵ月に投与されようと、ＡＤマウスにおいて空間学習及び記憶を著しく改善したことを示す。防止群及び処置群の両方におけるマウスはまた、Ｙ−迷路テストにおける新規アームへのより多くの進入及びより高い自発的交替に反映されるように、ＧＦＰ投与対照よりも、Ｙ−迷路及びオープンフィールドテストにおいて、より良好に行動した。（図５−２  ｇ、ｈ、ｉ、ｊ）。このことは、ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ投与マウスの作業記憶が、ＧＦＰ投与対照マウスの作業記憶よりも良好であったことを示す。また、オープンフィールドテストにおけるＧＦＰ投与対照マウスよりも、ＥＣＤ−Ｆｃ投与マウスにおける、より多数の立ち上がり、より長い移動距離及び中央ゾーンで費やされる時間の低減が見られ（図５−２  ｋ、ｌ）、Ｗｔマウスと同等であった。データにより、ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ投与マウスが、ＧＦＰ投与対照ＡＤマウスよりも良好な全般の自発運動活性を有することが示される。したがって、ＥＣＤ投与は、記憶及び行動に対するＡＤマウスにおける保護効果を提供する。
【０１３１】
脳ｐ７５ＥＣＤレベルの回復は、ＡＤマウスの脳及び血液のＡβレベルを低減させる
[00145]３ヵ月齢（防止）又は９ヵ月（処置）でｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃを投与したＡＤマウスにおいて、海馬（ＨＣ）及び新皮質（ＮＣ）におけるコンゴーレッド染色斑の分画区域及び密度は、ＧＦＰ投与対照と比較して、およそ５０％分低減し（図６−１  ａ、ｂ、ｃ、ｄ）、アミロイド斑が、ｐ７５ＥＣＤ処置後に５０％分低減されることを意味した。抗体６Ｅ１０を用いた免疫組織化学によって同定される海馬及び皮質におけるアミロイド斑負荷もまた、対照と比較して、防止群及び処置群におけるｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃを投与したＡＤマウスにおいて低減した（図６−２  ｅ）。
【０１３２】
[00146]コンゴーレッド染色もまた、脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）に関してマウスを検査するのに使用された。図６−２（ｆ）に示すように、ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃは、血管におけるコンゴーレッド染色によって実証されるようにＣＡＡの重篤性を低減する。図６−２（ｇ）から明らかであるように、ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃは、およそ５０％分のＣＡＡ病変の数を低減させ、対照群に関して定ＣＡＡ病巣の数の平均値±標準誤差が３．９５±０．１２である一方で、防止群は、２．０５±０．１３を有し、処置群は、１．７５±０．２０を有した。微小出血数の平均値±標準偏差もまた、防止群及び処置群の両方においておよそ５０％分低減し（図６−２  ｈ）、対照群は、０．６３±０．０３の微小出血数の平均値±標準偏差を有したのに対して、防止群は、０．３７５の±０．１３の微小出血数の平均値±標準偏差を有し、処置群は、０．２２±０．０２の微小出血数の平均値±標準偏差を有した。これは、Ａβ負荷の増加による対象における処置又は防止としてのｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃの投与が、ＣＡＡ病理学を低減させることを示す。
【０１３３】
[00147]興味深いことに、ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃは、免疫組織化学によって検出されるように、コンゴーレッド又はチオフラビンＳ陽性斑の周辺及び内に局在化され（図６−２  ｉ）、発現したヒトｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃが、Ａβ斑を結合して、Ａβ斑と相互作用することを示唆した。組織学的結果と一致して、ＥＬＩＳＡ試験はまた、防止群及び処置群の両方における脳ホモジネート及び血清のＴＢＳ、ＳＤＳ並びにギ酸分画中の総Ａβ、Ａβ４０又はＡβ４２レベルの著しい低減を示した（図６−２  ｉ、ｊ）。したがって、この結果は、ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ投与が、脳及び血液においてＡβレベルを低減させることを示す。
【０１３４】
脳ｐ７５ＥＣＤレベルの回復は、ＡＤマウスにおけるＢＡＣＥ１発現を阻害することによって、ＡＰＰのアミロイド形成的プロセシングを低減する
[00148]散発性ＡＤにおいて、Ａβは、β部位ＡＰＰ切断酵素（ＢＡＣＥ１）発現をアップレギュレートして、ＡＤ病因につながる悪循環を駆動させる。しかしながら、どの受容体がＡβ−ＪＮＫ−ＢＡＣＥ１の悪循環を媒介するかはわかっていない。理論に拘束されるのを望まないが、ｐ７５が、Ａβ産生をアップレギュレートして（Ｗａｎｇ  Ｙ．Ｊ．他、２０１１年）、正のフィードバックを形成しうることが示唆されている。ｐ７５ＥＣＤ−ＦｃとのＡβ−ｐ７５相互作用の崩壊が、ＡＰＰプロセシング及びＡβ産生に影響を及ぼすことができるかどうかを研究した。ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ処置は、防止群及び処置群の両方におけるＡＰＰ及びＡβ産生のＢＡＣＥ１発現及び活性、ＡＰＰ及びＡβ産生のβ−切断産物（ＣＴＦβ）を著しく低減した（データは示していない）。しかしながら、Ａβ分解酵素ネプリライシン（ＮＥＰ）及びインスリン分解酵素（ＩＤＥ）、並びにＡβ血液脳関門（ＢＢＢ）輸送分子低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）及び終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）は、変化しなかった（データは示していない）。
【０１３５】
[00149]ｐ７５ＥＣＤがｉｎ  ｖｉｖｏでアミロイド形成を抑制するメカニズムを決定するために、一次ニューロンにおけるＢＡＣＥ１、ＡＰＰ及びＡＰＰ断片の発現を検査した。それらによって、培養した一次ニューロンにおけるＢＡＣＥ１発現及びｓＡＰＰβレベルが、Ａβ４２β又はＡβ２５−３５に応答して、用量依存的に増加した（データは示していない）ことが認識された。この増加は、組換えＥＣＤ−Ｆｃの存在によって、又はｐ７５ＫＯニューロンにおいて消失した（データは示していない）。Ａβはまた、ＡＤ／ｐ７５＋／＋ニューロンにおけるＡＰＰの発現を用量依存的に増加させた（ｐ＜０．０５）が、ＡＤ／ｐ７５−／−ニューロンにおけるＡＰＰの発現は増加させなかった（データは示していない）。完全長ＡＰＰのレベルは増加した（ｐ＜０．００１）が、ｓＡＰＰβのレベルは、ＡＤｐ７５＋／＋ニューロンにおけるｓＡＰＰβのレベルと比較して、Ａβの非存在下又は存在下でＡＤ／ｐ７５−／−ニューロンにおいて減少し（ｐ＜０．００１）（データは示していない）、ｐ７５は、Ａβによって促進されるアミロイド形成的ＡＰＰプロセシングに必要とされることを示唆した。したがって、ｐ７５が、Ａβ誘導性ＢＡＣＥ１のアップレギュレーションを媒介する重要な受容体であり、ＡＤの病因を駆動するＡβ−ＢＡＣＥ１悪循環において重要な役割を果たすことが結果により示される。本明細書中に開示されるように、データによりｐ７５ＥＣＤ−ＦｃがＢＡＣＥ１発現の阻害を介してＡβ産生を低減させることが示されるように、ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ処置が、この悪循環を打破することができることが理解された。
【０１３６】
脳ｐ７５ＥＣＤレベルの回復は、ＡＤマウスにおいて神経突起変性、ニューロン死及びタウリン酸化を減衰させる
[00150]ＧＦＰ投与対照ＡＤマウスと比較して、海馬におけるＮｅｕＮ（ニューロン）及びＭＡＰ−２樹状突起及びＣｈＡＴ陽性軸索に関して染色される分画区域は、防止群及び処置群の両方において増加し（図７−１  ａ）、ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ処置が、ＡＤマウスの海馬におけるニューロン構造を保存することができることを示した。海馬におけるゴルジ染色法によって検出される樹状突起棘の数は、防止群及び処置群の両方において著しく増加し（図７−１  ｂ）、そのｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃが、コリン作動性ニューロン及び海馬ニューロンを、Ａβ誘導性毒性から保護することができることを示した。主要なシナプス小胞タンパク質ｐ３８シナプトフィジン、小胞結合膜タンパク質（ＶＡＭＰ）１、シナプトソーム関連タンパク質２５（ＳＮＡＰ２５）、シナプス後肥厚部タンパク質９５（ＰＳＤ９５）及びシナプシンＩ（Ｓｙｎ  Ｉ）を含むシナプスタンパク質のレベルは、防止群及び処置群の両方の脳において著しく増加し（図７−１  ｂ）、ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃが、中枢神経系のニューロンシナプス及び接続性を、Ａβの毒性から保護することができることを示した。防止群及び処置群における海馬における、アポトーシス細胞を同定する活性化されたカスパーゼ−３及びＴＵＮＥＬ染色の分画区域は、対照の分画区域よりも著しく低かった（図７−２  ｃ）。したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏデータと一致して、組換えｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃは、一次皮質ニューロンを、Ａβによって誘発される神経突起虚脱から保護した（図７−４  ｅ）。
【０１３７】
[00151]防止群及び処置群の両方の海馬におけるタウ−ホスホ−Ｓｅｒ３９６陽性ニューロンの分画区域は、対照の分画区域よりも低かった（図７−３  ｄ、上部及び中央パネル）。セリン３９６、２６２、１９９及びスレオニン２３１を含む多重部位でのタウ−リン酸化のレベルは、防止群及び処置群の両方の脳において、一貫して且つ著しく減少し（図７−３  ｄ、中央及び下部パネル）、ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃの投与がタウオパチーと関連したタウリン酸化を低減することを示した。理論に束縛されるのを望まないが、タウリン酸化に対するｐ７５ＥＣＤの効果は、上流ＧＳＫ３βを活性化するＡβを阻止することを介していると考えられる（Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｈｙ，Ｂ．他、２０１２年）。実際に、組換えｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃペプチド及びｐ７５受容体中和抗体はともに、ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株においてＡβに応答して、タウのＳｅｒ２６２のリン酸化の増加を阻止することができることがわかった（図８  ａ）。さらに、組換えｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃは、Ｓ２６２のリン酸化を用量依存的に抑制し、Ａβ４２により誘発されるｐ−Ｓｅｒ９−ＧＳＫ３βを増加させた（図８  ｂ、ｃ）。これらのデータにより、ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃは、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞においてＧＳＫ３β活性の阻害を介してＡβ誘導性タウ過剰リン酸化を低減させることが示される。したがって、ｐ７５ＥＣＤレベルの上昇は、Ａβ誘導性軸索及び神経突起変性、ニューロン死及びタウオパチーと関連付けられるタウ過剰リン酸化から保護することができる。
【０１３８】
脳ｐ７５ＥＣＤレベルの回復は、ＡＤマウスの脳においてミクログリオーシス、アストロサイトーシス及び炎症を減衰させる
[00152]ミクログリオーシス及びアストロサイトーシスを含む脳炎症は、ＡＤの第２の特徴である。防止群及び処置群の両方における皮質並びに海馬におけるＣＤ４５（ミクログリオーシス）及びＧＦＡＰ（アストロサイトーシス）染色の分画区域は、対照群と比較して、著しく低減された（データは示していない）。防止群及び処置群の両方におけるＴＢＳ分画並びに血清中の炎症性サイトカインＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β及びＩＬ−６のレベルもまた、対照群におけるレベルよりも低かった（データは示していない）。学習及び記憶作業におけるより良好な行動並びに神経炎症の低減は、ＥＣＤ−Ｆｃ処置後のアミロイド荷重、タウ−リン酸化及び神経変性の低減に続発する可能性の高い結末である。
【０１３９】
ＡＡＶ８によるＥＣＤ−Ｆｃ遺伝子の送達は、十分許容される
[00153]動物研究の期間中に、動物の死は起こらず、明らかな異常行動は観察されなかった。遺伝子の送達は、動物の体重又は肝臓酵素に著しく影響を与えなかった（データは示していない）。脳、筋肉、心臓、肝臓、肺、腎臓及び腸を含む主な臓器において、認識できる病理学的形態は、観察されなかった（データは示していない）。これらのデータにより、脳におけるＥＣＤ−Ｆｃ融合物遺伝子の長期発現は、ＡＤマウスによって十分許容されることが示唆され、ＡＡＶ−ＥＣＤ−Ｆｃ処置の安全性を示している。
【０１４０】
考察
[00154]本明細書中に開示するように、可溶性ｐ７５ＥＣＤ（すなわち、ｐ７５由来の下記シェディング）が、ＡＤに関する潜在的に有用な治療薬バイオマーカーであることが理解されている。可溶性ｐ７５ＥＣＤは、中枢及び末梢神経系の両方において生理学的に分布され、老化によって発達的に調節される。ｐ７５ＥＣＤレベルは、ＴＡＣＥの発現及び活性におけるＡβ誘導性の低減に潜在的に起因して、ＡＤ対象及びマウスの脳において著しく低減すると理解された。さらに、ｐ７５ＥＣＤが、Ａβ誘導性神経毒性からニューロンを保護し、ＢＡＣＥ１発現及びタウ−リン酸化を抑制することがわかった。さらに、ＡＤマウスの脳におけるｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃの投与によるｐ７５ＥＣＤレベルの回復は、神経変性から脳を保護する。
【０１４１】
[00155]シェディング後の可溶性ｐ７５ＥＣＤの機能は、これまで知られていなかった。本明細書中に開示するように、ｐ７５ＥＣＤが、ＡＤ脳において神経変性からニューロンを保護する神経栄養分子であると理解されている。驚くべきことに、ｐ７５ＥＣＤレベルは、ＡＤにおいて著しく低減し、ＡＤにおける切断プロセスが、Ａβによって損なわれることを示唆する。ＴＡＣＥは、ｐ７５ＥＣＤの産生を調節する生理学的シェダーゼである（Ｗｅｓｔｋａｍｐ他  ２００４年）ため、ＡＤ脳におけるｐ７５ＥＣＤのレベルの低減は、Ａβにより誘発されるＴＡＣＥの発現及び活性の低減に起因して、損なわれたｐ７５切断の起こりうる結果である。
【０１４２】
[00156]本明細書中に開示するように、ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ及びｐ７５ノックアウトマウスの両方が、Ａβ誘導性ＢＡＣＥ１アップレギュレーションを阻止して、アミロイド形成的ＡＰＰプロセシングを阻害することができるため、ｐ７５は、Ａβ誘導性ＢＡＣＥ１アップレギュレーションを媒介することがわかった。本明細書中に記載するデータにより、ｐ７５ＦＬは、Ａβ−ＢＡＣＥサイクルを駆動する主役であることが示唆される。ＡＤ脳におけるｐ７５ＥＣＤレベルの低減は、Ａβの過剰産生に寄与して、悪循環を悪化させる可能性があり、ｉｎ  ｖｉｖｏでのｐ７５ＥＣＤレベルの回復は、ＢＡＣＥ１発現及び関連するアミロイド形成的経路を抑制することができる。ｐ７５ＥＣＤは、ＡＤにおけるＡβ過剰産生に寄与するＡβ−ＢＡＣＥ１悪循環を打破することができる。
【０１４３】
[00157]ｐ７５ＥＣＤは、Ａβ凝集及び堆積（Ｗａｎｇ，Ｙ．Ｊ．他、２０１１年）の抑制、Ａβ過剰産生及び神経毒性、並びにＡβ誘発性タウ−リン酸化を含むＡＤの病因を招く多重レベルのＡβカスケードでニューロンを保護する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでのｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ及びｐ７５抗体による処置は、タウリン酸化を阻止することができ、Ａβ誘導性タウ−リン酸化が、ｐ７５によって媒介される可能性が高いことを示唆する。まとめると、ｐ７５ＥＣＤは、ＡＤにおいて低減され、Ａβ毒性から脳を保護する新規神経栄養分子である。ＡＤ脳におけるｐ７５ＥＣＤレベルの回復は、ＡＤに関する望ましい治療的アプローチでありうる。
【０１４４】
実施例２  ｐ７５ＥＣＤの効果の特異性
[00158]アミロイド荷重に関するｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃの特性を研究するために、組換えｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ又は２つの対照タンパク質（ヒトＩｇＧ又はヒトＩｇＧ  Ｆｃと融合させた組換えヒト維芽細胞増殖因子受容体４ＥＣＤ（ＦＧＦＲ４−Ｆｃ））のうちの１つを、８ヵ月齢のＡＤマウスの海馬へ注射によって、追加的な実験を実行した。組換えｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃの単回注射もまた、注射の１週後に、注射部位上にアミロイド斑の区域分画を著しく低減させたが、ヒトＩｇＧ又はＦＧＦＲ４−Ｆｃはそうではなかった（データは示していない）。ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃがどのように脳におけるアミロイド荷重に影響を及ぼすかという潜在的メカニズムを研究するために、ＴｈＴ試験及び透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）可視化を用いたＡβ細動並びに脱凝集のｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃの効果を検査した。データにより、ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃは、細動におけるＡβ蛍光及び予め形成されたＡβ線維の細動の蛍光を抑制するが、対照タンパク質ヒトＩｇＧ又はＦＧＦＲ４−Ｆｃはそうではないことが示された。ＴＥＭ可視化により、ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃは、Ａβ線維の形成を防止して、予め形成されたＡβ線維を脱凝集させるが、ヒトタンパク質ヒトＩｇＧ又はＦＧＦＲ４−Ｆｃはそうではないことが確立された（データは示していない）。データにより、ｉｎ  ｖｉｖｏでのアミロイド荷重に対するｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃの効果は、特定の事象ではなく、非特異性のタンパク質−Ａβ相互作用に起因しないことが示される。
【０１４５】
[00159]さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏでのデータと一致して、組換えｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃは、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の細胞死を抑制して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＡβによって誘発される神経突起虚脱から皮質ニューロンを保護するＡβによって起動したが、ヒトＩｇＧ及び組換え型ＦＧＦＲ４−Ｆｃはそうではなかった（データは示していない）。
【０１４６】
[00160]これらの実験により、アミロイド荷重に対するｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃの効果が、具体的にはｐ７５ＥＣＤの効果に起因することが示される。
【０１４７】
実施例３  ＡＤマウスにおけるｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃの筋肉内送達は、ＡＤ病因を低減して、認知機能を改善する
[00161]ＡＤマウス（ＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックマウス）又は野生型に、下記の通りにＡＡＶ−ＥＣＤ−Ｆｃを筋肉内注射した：雌ＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックマウスに、３ヵ月齢で脛骨筋で筋肉内に、５μｌ中のＡＡＶ−ＥＣＤ−Ｆｃ又はＡＡＶ−ＧＦＰの２×１０９個のベクターゲノムを注射した。１２ヵ月齢で、マウスは全て、屠殺され、脳を試料採取した。対照群には、ＡＡＶ−ＧＦＰを付与したが、それ以外は同じように処置した。処置後、マウスは、モリス水迷路テストを使用して、マウスを試験した。いくつかの実験において、マウスに、マウス１匹当たり５０μｇ／５０μｌで、組換えｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃペプチドを一度、腹腔内に注射した。他の実験は、上述するように実行した。
【０１４８】
ｐ７５ＥＣＤの筋肉内送達は、ＡＤマウスにおける認知低下を改善する
[00162]ＡＡＶ−ＧＦＰ処置マウスと比較して、ＡＡＶ−ＥＣＤ−Ｆｃで処置したマウスは、モリス水迷路テストにおいてより良好に行動した。これは、進行性プラットフォーム学習試行を用いたプラットフォーム上へ回避する回避待ち時間及び移動する距離、より多数のプラットフォーム区域横断（図９  ａ、ｂ、ｃ）の著しい低減に反映された。データは、ＡＡＶ−ＥＣＤ−Ｆｃ処置が、ＡＤマウスにおいて空間学習及び記憶を著しく改善することを示す。さらに、ＡＡＶ−ＥＣＤ−Ｆｃ処置マウスはまた、ＡＡＶ−ＧＦＰ処置対照よりも、Ｙ−迷路及びオープンフィールドテストにおいて、より良好に行動した。このことは、Ｙ−迷路テストにおける新規アームへのより多くの進入及びより高い自発的交替に反映された（図９  ｄ及びｅ）。ＡＡＶ−ＥＣＤ−Ｆｃ処置マウスの作業記憶が、対照マウスの作業記憶よりも良好であったことが示される。オープンフィールドテストでは、より長い移動距離が、ＡＡＶ−ＧＦＰ処置対照と比較して、ＡＡＶ−ＥＣＤ−Ｆｃ処置マウスにおいて観察され（図９  ｆ）、ＥＣＤ−Ｆｃ処置マウスは、対照ＡＤマウスよりも良好な探索活動を有することを示している。しかしながら、水泳速度は、群間で有意には異ならず、マウスは、同等の自発運動活性を有することを示す。したがって、これらのデータにより、筋肉内ｐ７５ＥＣＤ送達は、ＡＤマウスにおいて認知低下を改善することが示される。
【０１４９】
ｐ７５ＥＣＤの筋肉内送達は、ＡＤマウスの脳及び血液におけるＡβ荷重を低減する
[00163]コンゴーレッド染色又は免疫組織化学によって同定される海馬及び皮質におけるアミロイド斑負荷は、ＡＡＶ−ＧＦＰ処置対照と比較して、ＡＡＶ−ＥＣＤ−Ｆｃ処置ＡＤマウスにおいて低減した（図１０−１、図１０−２  ａ〜ｄ）。組織学的結果と一致して、ＥＬＩＳＡアッセイ試験はまた、ＡＡＶ−ＥＣＤ−Ｆｃ処置ＡＤマウスにおける脳ホモジネート及び血清のトリス緩衝生理食塩水、ＳＤＳ並びにギ酸分画中のＡβ４０及びＡβ４２の著しい低減を示した（図１０−２  ｅ）。しかしながら、ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃを腹腔内注射したＡＤトランスジェニックマウスにおける急性試験では、血清Ａβ４０及びＡβ４２レベルは、各マウス５０μｇ／５０μｌでの一度のｐ７５ＥＣＤペプチドの腹腔内注射の２４時間後に著しく増加し（図１０−２  ｆ）、ｐ７５ＥＣＤは、脳から抹消へのＡβ流出を促進することができることを示した。
【０１５０】
ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃの筋肉内送達は、ＡＤマウスの脳においてミクログリオーシス、アストロサイトーシス及び炎症を減衰させる
[00164]ミクログリオーシス及びアストロサイトーシスを含む脳炎症は、Ａβに続くＡＤ病理学の第２の特徴である。新皮質及び海馬におけるＣＤ４５（ミクログリオーシス）及びＧＦＡＰ（アストロサイトーシス）染色の分画区域は、ＧＦＡＰ及びＣＤ４５陽性染色区域の分画の低減に反映されるように、ＡＡＶ−ＧＦＰ処置ＡＤマウスと比較して、ＡＡＶ−ＥＣＤ−Ｆｃ処置ＡＤマウスにおいて著しく低減された（図１１）。したがって、学習及び記憶作業におけるより行動の改善並びに神経炎症の低減は、アミロイド荷重の低減に加えて、ＥＣＤ−Ｆｃ処置の可能性の高い結末である。
【０１５１】
実施例４  ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃの筋肉内送達は、ＡＤマウスにおいてタウ過剰リン酸化を減衰させる
[00165]タウ病理学を評価するために、ｐＳ３９６、ｐＴ２３１、ｐＳ１９９及びｐＳ２６２のタウタンパク質のリン酸化を、上述するように、ＡＡＶ−ＧＦＰ処置対照と比較して、ＡＡＶ−ＥＣＤ−Ｆｃ処置ＡＤマウスにおいて検査した。これらの部位でのリン酸化は、上述する抗ｐＳ３９６、ｐＴ２３１、ｐＳ２６２及びｐＳ１９９抗体を使用して研究した。これらのリン酸化部位は、それらがＡＤマウスにおけるタウ過剰リン酸化の共通部位であるため、本研究で選択した。皮質及び海馬におけるタウ−ホスホ−Ｓｅｒ３９６陽性ニューロンの分画区域は、ＧＦＰ群の分画区域よりも、ｐ７５ＥＣＤ処置群において著しく低かった（図１２  ａ、ｂ、ｃ及びｄ）。セリン３９６、２６２、１９９及びスレオニン２３１を含む多重部位でのタウリン酸化のレベルは、処置群の脳において、一貫して且つ著しく減少した（図１２  ｅ及びｆ）。これらの見解により、ｐ７５ＥＣＤは、タウ過剰リン酸化に対して保護することが示される。
【０１５２】
実施例５  ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃによるタウオパチーマウスの処置
[00166]過剰リン酸化されたタウの凝集体は、アルツハイマー病又は前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）を患う脳において顕著である。凝集体は、ＦＴＤの家族性症例におけるタウ突然変異の同定後に、動物モデルにおいて再現させた。これには、本発明者等のこれまで精製したトランスジェニックモデルｐＲ５が含まれ、それは、ニューロンにおいてＦＴＤ（Ｐ３０１Ｌ）突然変異微小管結合タンパク質タウ（ＭＡＰＴ）を発現する（Ｄｅｔｅｒｓ他、２００８年）。マウスは、もつれ（ＮＦＴ）形成、記憶障害及びミトコンドリア機能不全を含むタウ凝集を特徴とする。この実験では、３ヵ月齢のｐＲ５マウスを、２つの異なる群に無作為に分けた。処置の最初の週の間に、１０ｍｇ／ｋｇのｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ又は５ｍｇ／ｋｇのＦｃ組換えタンパク質を、ｉｐ注射を介して２度／週、マウスに投与して、マウス血漿中に十分量のタンパク質を供給した。次に、マウスに、ｉｐ注射を介して、総処置期間３ヵ月の残りの期間、１５０〜２００μ用量のＰＢＳ中において、２度／週、５ｍｇ／ｋｇの組換えｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ又は２．５ｍｇ／ｋｇの組換えＦｃタンパク質を付与した。
【０１５３】
タウオパチーを有するマウスの認知機能に対するｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃの効果
[00167]ＰＲ５マウスにおける学習及び記憶機能に対するｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃの効果を評価するために、１２匹の３ヵ月齢のマウスを、２つの群に分けて、ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ又はＦｃ組換えタンパク質を３ヵ月間付与した。並行して、野生型マウスを試験した。同年齢且つ同性の野生型マウスの群を対照として使用した。ＰＲ５マウスに関するモリス水迷路（ＭＷＭ）テストにより、ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃが、Ｆｃ群と比較すると、学習試行の２日目、４日目及び５日目の間に回避待ち時間を（図１３  Ａ）並びに学習試行の２日目、３日目及び５日目の間に移動距離を（図１３  Ｂ及びＣ）、著しく低減することが示された。野生型及びｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ群の学習プロセスは改善された。１日目に対する３日目、４日目及び５日目以内の回避待ち及び移動距離の著しい低減は、野生型群における学習プロセス中に見られた。ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ群において、回避待ち及び移動距離は、学習プロセス中に、１日目に対して４日目及び５日目以内に減少した一方で、学習の著しい改善は、学習プロセス中にＦｃ群では見られなかった。しかしながら、ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃは、標的四分円における平均時間（図１３  Ｄ）、追跡試行セッションにおけるプラットフォーム四分円における進入の数（図１３  Ｅ）を変化させなかった。追跡試行におけるプラットフォームをまたぐ横断の数は、群間で不変であった（図１３  Ｆ）。結果は、ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃが、ＰＲ５マウスにおいて学習のプロセスを改善されることができることを示す。
【０１５４】
ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃは、ＰＲ５マウス脳においてＢＡＣＥ１の発現及びｓＡＰＰβ産生を低減した
[00168]ＰＲ５マウスのＡＤの特徴に対するｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃの効果を評価するために、ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ群及びＦｃ処置群の両方由来の脳溶解物をウェスタンブロットに付して、ＡＤバイオマーカータンパク質であるＢＡＣＥ１、ｓＡＰＰβ及び完全長ＡＰＰ（ＡＰＰ．ＦＬ）を測定するための種々の一次抗体とともにインキュベートした。ウェスタンブロットデータにおけるＰＲ５マウス脳におけるＢＡＣＥ１及びｓＡＰＰβの発現レベルは、ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃが、ＢＡＣＥ１表現を著しく低減することを実証した（ｐ＜０．０５）（図１４  Ａ及びＢ）。さらに、ｓＡＰＰβのレベルが、ＰＲ５マウスのＦｃ群と比較して、ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ処置群において減少することが観察された（図１４  Ａ及びＣ）。
【０１５５】
ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃは、ＰＲ５マウス脳においてタウリン酸化（ｐ．Ｓｅｒ２０２及びＴｈｒ２０５）を阻害した
[00169]ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃが、ＰＲ５マウスにおいてタウリン酸化を阻害するかどうかを試験するために、ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃ又はＦｃのいずれかで処置したＰＲ５マウス由来の脳溶解物を、ウェスタンブロット分析に付して、マウスリン−ＰＨＦ−タウｐＳｅｒ２０２＋Ｔｈｒ２０５モノクローナル（ＡＴ８）抗体を使用してタウリン酸化タンパク質を検出した。本発明者等のデータにより、ｐ７５ＥＣＤ−Ｆｃは、ＰＲ５マウスにおいてタウ（Ｓｅｒ２０２及びＴｈｒ２０５）リン酸化を著しく低減することが示された（ｐ＜０．０１）（図１５  Ａ及びＢ）。
【０１５６】
[00170]本明細書及び併記の特許請求の範囲全体にわたって、文脈が他の場合を要求しない限りは、「を含む」及び「を包含する」という単語並びに「を含んでいる」及び「を包含している」などの変形は、記載される整数又は整数群の包含を意味するが、任意の他の整数又は整数群の排除は意味しないと理解されよう。
【０１５７】
[00171]本明細書中の任意の従来技術に対する参考文献は、かかる従来技術が、共通した一般知識の一部を成すという任意の形態の示唆の承認ではなく、また承認と解釈されるべきではない。
【０１５８】
[00172]本発明は、その使用において、記載する特定の用途に制限されないことは、当業者により理解されよう。本発明は、本明細書中に記載若しくは描写する特定の要素及び／又は特色に関してその好ましい実施形態において全く制限されない。本発明は、開示する実施形態（単数又は複数）に限定されず、併記の特許請求の範囲によって明記及び規定されるような本発明の範囲を逸脱することなく、多数の再編成、変更及び置換が可能であることが理解されよう。
【０１５９】
（参考文献）
Castellani, R.J. & Perry, G. (2012)Arch Med Res 43: 694-698 
Chakravarthy, B. et al. (2012) JAlzheimer's disease : JAD 30: 675-684
Charidimou A, et al. (2012) J NeurolNeurosurg Psychiatry 83:124-37.
Conrad, C.D et al.(1999)  Neurobiol of learning and memory 72: 39-46 (1999)
Dellu, F. et al. (1992) Brain Res 588:132-139 
Detters et al., (2008) Eur J Neurosci.28(1):137-47
Food and Drug Administration (2003) FedRegist 68:2340-2341
Gotz et al. (2001) Science 293(5534):1491-5
Jellinger KA. (2002) J Neural Transm 109:813
Jung, W.R et al. (2008) Neurosci Lett 439,220-225 
Keage HA et al. (2009) BMC Neurol 9: 3.
Kommaddi, R.P. et al. (2011) FASEB J 25:2061-2070 
Markowska A.L et al. (1993) BehavioralNeurosci 107: 627-632.
McKhann G. et al. (1984) Neurology 34:939-944.
Rafii, M.S. (2013) Reviews on RecentClinicalTtrials 8: 110-118 
Saadipour, K. et al. (2013) J Neurochem127: 152-162 
Sarter M. et al. (1988) Psychopharmacology94: 491-495 
Schor, N. F. (2005). Prog Neurobiol 77(3):201-214
Urra, S. et al. (2007) J Biol Chem 282:7606-7615 
Wang, Y.J. et al. (2009a) Neurotoxicity Res15: 3-14 
Wang Y.J. et al. (2009b) Neurobiology ofAging 30: 364-376 
Wang Y.J. et al. (2010) Brain, Behavior,and Immunity 24: 1281-1293 
Wang, Y.J. et al. (2011) J Neurosci 31: 2292-2304
Weskamp, G. et al. (2004) J Biol Chem 279:4241-4249.
Yau J.L. et al. (2007)  J Neurosci.27: 10487-10496
Zhou L et al (2013) J Affect Disorder 150:776-784
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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