(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｉ）からなる群から選択される可変重鎖ＣＤＲ（ＶＨＣＤＲ）および可変軽鎖ＣＤＲ（ＶＬＣＤＲ）を含む、抗ヒトＧＩＴＲアゴニスト抗体またはその抗原結合断片：
（ａ）配列番号２２のＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号２３のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号２９のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列；並びに配列番号３０のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号３３のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号３４のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列；
（ｂ）配列番号８４のＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号８０のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号２９のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列：並びに配列番号８５のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号８２のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号８３のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２２のＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号２４のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号２９のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列；並びに配列番号３１のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号３３のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号３４のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列；
（ｄ）配列番号８４のＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号８０のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号２９のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列；並びに配列番号８６のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号８２のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号８３のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列；
（ｅ）配列番号２２のＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号２５のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号２９のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列；並びに配列番号３０のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号３３のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号３４のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列；
（ｆ）配列番号２２のＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号２６のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号２９のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列；並びに配列番号３０のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号３３のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号３４のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列；
（ｇ）配列番号２２のＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号２７のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号２９のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列；並びに配列番号３０のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号３３のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号３４のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列；
（ｈ）配列番号２２のＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号２５のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号１０９のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列；並びに配列番号３０のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号３３のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号３４のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列；および
（ｉ）配列番号８４のＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号８０のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号１０９のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列；並びに配列番号８５のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号８２のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号８３のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列。
【請求項２】
以下のＶＣＤＲおよびＶＣＤＲを含む、請求項１の抗体：配列番号２２のＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号２５のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号２９のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列；並びに配列番号３０のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号３３のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号３４のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列。
【請求項３】
前記抗体または抗原結合断片または抗原結合分子が、ヒト化されている、請求項１または２に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項４】
ＩｇＧアイソタイプ抗体Ｆｃ領域を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項５】
インタクトなまたは増加されたＦｃＲエフェクター機能を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項６】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号４のシステインリッチドメイン１および配列番号５のシステインリッチドメイン２を含むエピトープに結合し、前記抗体、抗原結合断片または抗原結合分子が、インタクトなまたは増加されたＦｃＲエフェクター機能を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項７】
重鎖可変領域が、配列番号１６と少なくとも９５％の配列同一性を有し、軽鎖可変領域が、配列番号１７と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項８】
配列番号１６を含む重鎖と配列番号１７を含む軽鎖とを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項９】
配列番号６、８、１０、１２、１４、９９および１０５から選択される配列を含む重鎖可変領域、および配列番号７または９を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１０】
配列番号６のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）、および配列番号７のアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）；
配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬ；
配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬ；
配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬ；
配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬ；
配列番号９９のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬ；または
配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１１】
配列番号９９のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１２】
配列番号６５、配列番号６９、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号１００または配列１０６のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６６または配列番号７０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１３】
配列番号６５のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６６のアミノ酸配列を含む軽鎖；
配列番号６９のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号７０のアミノ酸配列を含む軽鎖；
配列番号７３のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６６のアミノ酸配列を含む軽鎖；
配列番号７５のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６６のアミノ酸配列を含む軽鎖；
配列番号７７のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６６のアミノ酸配列を含む軽鎖；
配列番号１００のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６６のアミノ酸配列を含む軽鎖；または
配列番号１０６のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６６のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１４】
配列番号１００のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１５】
第２の抗体または抗原結合断片と架橋している、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１６】
前記抗体がグリコシル化されている、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１７】
齧歯類ＧＩＴＲと交差反応しない、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片と医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１〜１７のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項２０】
配列番号１０１の核酸配列を有するＶＨおよび配列番号１０２の核酸配列を有するＶＬを含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項２１】
請求項１９または２０に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項２２】
請求項１９もしくは２０に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２１に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２３】
請求項２２に記載の宿主細胞を使用して、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体分子または抗原結合断片を産生させる方法。
【請求項２４】
個体におけるがんまたは感染性疾患の処置のための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片を含む、医薬組成物。
【請求項２５】
前記抗体または抗原結合断片が、化学療法剤または細胞毒と併用投与される、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記抗体または抗原結合断片が、ＰＤ−１のアンタゴニストと併用投与される、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記個体が、上皮がん、癌（carcinoma）、肉腫およびリンパ腫からなる群から選択されるがんを有する、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記個体が、腎がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を含む肺がん、神経膠腫、線維肉腫、膵臓がん、黒色腫、乳がん、気管支がん、結腸直腸がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、膀胱がん、脳または中枢神経系のがん、末梢神経系のがん、食道がん、子宮頸がん、子宮または子宮内膜がん、口腔または咽頭がん、肝臓がん、精巣がん、胆道がん、小腸または虫垂がん、唾液腺がん、甲状腺がん、副腎がん、骨肉腫、軟骨肉腫、血液組織のがん、および頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）からなる群から選択されるがんを有する、請求項２４〜２７のいずれか１に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記抗体または抗原結合断片が、腫瘍部位でのＴｅｆｆ：Ｔｒｅｇ比の上昇を誘導する、請求項２４〜２８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
それを必要とする個体におけるがんまたは感染性疾患の処置に使用するための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１４年１０月８日に出願した米国特許仮出願第６２／０６１，６４４号、２０１５年７月２９日に出願した米国特許仮出願第６２／１９８，６７３号、および２０１５年９月１８日に出願した米国特許仮出願第６２／２２０，７６４号の優先権および利益を主張するものであり、仮出願の各々は、その全体が参照により本明細書に組み入れられている。
【０００２】
本発明は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１８／グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（「ＧＩＴＲ」）と結合する抗体、抗体断片、および抗原結合分子、より具体的には、アゴニストである、受容体によるシグナル伝達を刺激する、および／または免疫応答をモジュレートする、抗体、抗体断片、および抗原結合分子に関する。
【背景技術】
【０００３】
グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（「ＧＩＴＲ」）は、腫瘍壊死因子スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーであり、このスーパーファミリーは、２０より多くのＩ型膜貫通タンパク質、いくつかのスプライシングバリアント、およびいくつかのウイルスタンパク質を含み、それらすべてが、共通の構造的特色としてシステインリッチドメインを有する。ＧＩＴＲの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は３つのシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）からなり、それに膜貫通ドメイン（ＴＭ）、そして細胞内ドメイン（ＩＣＤ）が続く。
【０００４】
ＧＩＴＲ発現は、マウスおよびヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞上で構成的に検出され、活性化によりさらに増加されうる。対照的に、エフェクターＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞およびＣＤ８＋ＣＤ２５−Ｔ細胞は、低レベルから検出不能レベルのＧＩＴＲを発現し、Ｔ細胞受容体活性化後に急速に上方調節される。ＧＩＴＲの発現は、活性化されたＮＫ細胞、樹状細胞およびマクロファージでも検出されている。ＧＩＴＲの下流のシグナル伝達経路は、ＭＡＰＫおよびカノニカルＮＦκＢ経路を含むことが証明されている。様々なＴＲＡＦファミリーメンバーがＧＩＴＲの下流のシグナル伝達中間体として意味づけられている（Nocentini et al. (2005) Eur.J. Immunol., 35:1016-1022）。
【０００５】
ＧＩＴＲによる細胞の活性化は、細胞型および微小環境に依存していくつかの機能を果すと考えられており、そのような機能は、増殖およびエフェクター機能を増強するための共刺激、調節性Ｔ細胞による抑制の阻害、ならびに活性化誘導細胞死が含むがこれらに限定されない（Shevach and Stephens (2006) Nat. Rev. Immunol., 6:613-618）。Ｋｏら（(2005) J. Exp.Med., 202:885-891）は、マウスＧＩＴＲに対するアゴニストモノクローナル抗体が、マウス同種腫瘍モデルにおいて腫瘍特異的免疫を有効に誘導し、定着腫瘍を根絶することを初めて実証した。加えておよび／または代替的に、機能的Ｆｃエフェクター活性を有する抗ｍＧＩＴＲは、一部の前臨床モデルにおいて、調節性Ｔ細胞を枯渇させること、ならびに選ばれた腫瘍環境でＴエフェクター細胞増殖およびサイトカイン分泌を増進させることが証明されている。これらの知見は、ｍＧＩＴＲに対するアゴニスト抗体が免疫寛容のバランスを壊すことができ、そしてまたそれによってＴ細胞が腫瘍および持続ウイルス感染症と闘うことが可能になることを示唆している。しかし、今までの研究は、齧歯類系における代替抗体の使用に主として焦点を合わせている。マウスおよびヒトＧＩＴＲ間の構造の相違のため、マウスでの代替物研究で見られる知見がヒトＧＩＴＲ機能の修飾に転換可能であるのかどうかは不明である。
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、ヒトグルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１８（「ＧＩＴＲ」）と特異的に結合する抗体であって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは架橋されたときにｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｈＧＩＴＲアゴニスト活性を有し、ｉｎ  ｖｉｖｏではｈＧＩＴＲ活性を付与し、腫瘍部位でＴｅｆｆ：Ｔｒｅｇ比の上昇を誘導して腫瘍進行の阻害をもたらす、抗体を同定した。したがって、本発明は、ヒトＧＩＴＲを発現する細胞と特異的に結合し、細胞内シグナル伝達を促進する、および／またはヒトＧＩＴＲを発現する細胞を標的化することによって免疫応答をモジュレートする、アゴニスト抗体、抗体断片、および抗原結合分子を提供する。一態様では、本発明は、ヒトＧＩＴＲと特異的に結合する単離された抗体、抗体断片、および抗原結合分子を提供し、抗体、抗体断片、および抗原結合分子は、システインリッチドメイン１（「ＣＲＤ１」、配列番号４：ＣＧＰＧＲＬＬＬＧＴＧＴＤＡＲＣＣＲＶＨＴＴＲＣＣＲＤＹＰＧＥＥＣＣＳＥＷＤＣ）とシステインリッチドメイン２（「ＣＲＤ２」、配列番号５：ＭＣＶＱＰＥＦＨＣＧＤＰＣＣＴＴＣＲＨＨＰＣＰＰＧＱＧＶＱＳＱＧＫＦＳＦＧＦＱＣ）とを含むエピトープと結合し、抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、ＧＩＴＲのアゴニストであり、ならびに抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、場合により、インタクトなまたは増加されたＦｃＲエフェクター機能を有する。
【０００７】
一部の実施形態では、抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、ヒトＧＩＴＲの配列番号８８を含むエピトープと結合する。一部の実施形態では、抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、ヒトＧＩＴＲの配列番号８８を含むエピトープと結合する抗体または抗体断片と競合する。一部の実施形態では、抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、ヒトＧＩＴＲの配列番号８８の中の少なくとも１つのアミノ酸残基と結合し、例えば、抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、ヒトＧＩＴＲの配列番号８８と重複するエピトープと結合する。
【０００８】
一部の実施形態では、抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、ヒトＧＩＴＲのＣＲＤ１（残基３４〜７２、配列番号４）および残基７８を含むエピトープと結合する。一部の実施形態では、抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、ヒトＧＩＴＲのＣＲＤ１（残基３４〜７２、配列番号４）および残基７８の中のエピトープと結合する抗体または抗体断片と競合する。一部の実施形態では、抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、ヒトＧＩＴＲのＣＲＤ１（残基３４〜７２、配列番号４）および残基７８の中の少なくとも１つのアミノ酸残基と結合し、例えば、抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、ヒトＧＩＴＲのＣＲＤ１（残基３４〜７２、配列番号４）および残基７８と重複するエピトープと結合する。
【０００９】
一部の実施形態では、抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、配列番号１と結合し、（ａ）ｉ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号２２を含み、ｉｉ）重鎖ＣＤＲ２が配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６および配列番号２７のいずれか１つから選択される配列を含み、ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号２９または配列番号１０９を含む、ヒト重鎖を構成する重鎖可変領域と、（ｂ）ｉ）軽鎖ＣＤＲ１が配列番号３０または配列番号３１を含み、ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３３を含み、ｉｉｉ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号３４を含む、軽鎖可変領域とを含む。
【００１０】
一部の実施形態では、抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、配列番号８８と結合し、（ａ）ｉ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号２２を含み、ｉｉ）重鎖ＣＤＲ２が配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６および配列番号２７のいずれか１つから選択される配列を含み、ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号２９または配列番号１０９を含む、ヒト重鎖を構成する重鎖可変領域と、（ｂ）ｉ）軽鎖ＣＤＲ１が配列番号３０または配列番号３１を含み、ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３３を含み、ｉｉｉ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号３４を含む、軽鎖可変領域とを含む。
【００１１】
抗体、抗体断片、または抗原結合分子のさらなる実施形態に関して、一部の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１６の可変領域と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有し、軽鎖は、配列番号１７の可変領域と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。特定の実施形態では、抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、配列番号１６を含む重鎖と配列番号１７を含む軽鎖とを含む。一部の実施形態では、抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、配列番号１６を含む重鎖と配列番号１７を含む軽鎖とを含む抗体と競合する。
【００１２】
一部の実施形態では、重鎖ＦＲ４は、ヒト生殖系列ＦＲ４である。特定の実施形態では、重鎖ＦＲ４は、配列番号４２である。
【００１３】
一部の実施形態では、軽鎖ＦＲ４は、ヒト生殖系列ＦＲ４である。特定の実施形態では、軽鎖ＦＲ４は、配列番号５０である。
【００１４】
一部の実施形態では、ｉ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号２２または配列番号８４を含み、ｉｉ）重鎖ＣＤＲ２が配列番号２８または配列番号８０を含み、ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号２９または配列番号１０９を含み、ｉｖ）軽鎖ＣＤＲ１が配列番号３０または配列番号８５を含み、ｖ）軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３３または配列番号８２を含み、ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号３４または配列番号８３を含む、抗体、抗体断片、または抗原結合分子を提供する。
【００１５】
一部の実施形態では、ｉ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号２２を含み、ｉｉ）重鎖ＣＤＲ２が配列番号２３を含み、ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号２９を含み、ｉｖ）軽鎖ＣＤＲ１が配列番号３０を含み、ｖ）軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３３を含み、ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号３４を含む、抗体、抗体断片、または抗原結合分子を提供する。
【００１６】
一部の実施形態では、ｉ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号２２を含み、ｉｉ）重鎖ＣＤＲ２が配列番号２４を含み、ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号２９を含み、ｉｖ）軽鎖ＣＤＲ１が配列番号３１を含み、ｖ）軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３３を含み、ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号３４を含む、抗体、抗体断片、または抗原結合分子を提供する。
【００１７】
一部の実施形態では、ｉ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号２２を含み、ｉｉ）重鎖ＣＤＲ２が配列番号２５を含み、ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号２９を含み、ｉｖ）軽鎖ＣＤＲ１が配列番号３０を含み、ｖ）軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３３を含み、ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号３４を含む、抗体、抗体断片、または抗原結合分子を提供する。
【００１８】
一部の実施形態では、ｉ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号２２を含み、ｉｉ）重鎖ＣＤＲ２が配列番号２６を含み、ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号２９を含み、ｉｖ）軽鎖ＣＤＲ１が配列番号３０を含み、ｖ）軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３３を含み、ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号３４を含む、抗体、抗体断片、または抗原結合分子を提供する。
【００１９】
一部の実施形態では、ｉ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号２２を含み、ｉｉ）重鎖ＣＤＲ２が配列番号２７を含み、ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号２９を含み、ｉｖ）軽鎖ＣＤＲ１が配列番号３０を含み、ｖ）軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３３を含み、ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号３４を含む、抗体、抗体断片、または抗原結合分子を提供する。
【００２０】
一部の実施形態では、ｉ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号２２を含み、ｉｉ）重鎖ＣＤＲ２が配列番号２５を含み、ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号１０９を含み、ｉｖ）軽鎖ＣＤＲ１が配列番号３０を含み、ｖ）軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３３を含み、ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号３４を含む、抗体、抗体断片、または抗原結合分子を提供する。
【００２１】
さらなる態様では、本発明は、ＧＩＴＲに特異的に結合する抗体、抗体断片、または抗原結合分子を提供し、抗体または抗体断片は、ｉ）重鎖のＣＤＲ１が、配列番号２２、配列番号７９または配列番号８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ｉｉ）重鎖のＣＤＲ２が、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号６２および配列番号８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ｉｉｉ）重鎖のＣＤＲ３が、配列番号２９または配列番号１０９を含み、ｉｖ）軽鎖のＣＤＲ１が、配列番号３０、配列番号３１、配列番号６３、配列番号８１、配列番号８５および配列番号８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ｖ）軽鎖のＣＤＲ２が、配列番号３３、配列番号６４および配列番号８２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖のＣＤＲ３が、配列番号３４または配列番号８３を含む、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。
【００２２】
抗体、抗体断片、または抗原結合分子の他の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号６、配列番号８、配列番号１２、配列番号１４、配列番号９９および配列番号１０５からなる群から選択される配列の可変領域と少なくとも９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有し、軽鎖可変領域は、配列番号９および配列番号７からなる群から選択される配列の可変領域と少なくとも９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。特定の実施形態では、単離された抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号９９および配列番号１０５のいずれかから選択される配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号７または配列番号９を含む軽鎖可変ドメインとを含む。一部の実施形態では、単離された抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、配列番号６の重鎖可変ドメインと配列番号７の軽鎖可変ドメインとを含む。一部の実施形態では、単離された抗体または抗体断片は、配列番号８を含む重鎖可変ドメインと、配列番号９を含む軽鎖可変ドメインとを含む。他の実施形態では、単離された抗体または抗体断片は、配列番号１０を含む重鎖可変ドメインと、配列番号７を含む軽鎖可変ドメインとを含む。他の実施形態では、単離された抗体または抗体断片は、配列番号１２を含む重鎖可変ドメインと、配列番号７を含む軽鎖可変ドメインとを含む。他の実施形態では、単離された抗体または抗体断片は、配列番号１４を含む重鎖可変ドメインと、配列番号７を含む軽鎖可変ドメインとを含む。
【００２３】
抗体、抗体断片、または抗原結合分子のさらなる実施形態に関して、一部の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号９９の可変領域と少なくとも９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有し、軽鎖可変領域は、配列番号７の可変領域と少なくとも９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。一部の実施形態では、単離された抗体または抗体断片は、配列番号９９を含む重鎖可変ドメインと、配列番号７を含む軽鎖可変ドメインとを含む。
【００２４】
抗体、抗体断片、または抗原結合分子のさらなる実施形態に関して、一部の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１０５の可変領域と少なくとも９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有し、軽鎖可変領域は、配列番号７の可変領域と少なくとも９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。一部の実施形態では、単離された抗体または抗体断片は、配列番号１０５を含む重鎖可変ドメインと、配列番号７を含む軽鎖可変ドメインとを含む。
【００２５】
一部の実施形態では、ＧＩＴＲと結合する抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、ヒト化される。ある特定の実施形態では、抗体または抗体断片は、ヒト定常領域を含む。
【００２６】
一部の実施形態では、抗体断片は、Ｆａｂ’断片である。一部の実施形態では、抗体断片は、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）である。一部の実施形態では、抗体断片は、シングルドメイン抗体またはナノボディである。
【００２７】
一部の実施形態では、抗体または抗体断片は、第２の抗体または抗体断片と架橋される。一部の実施形態では、抗体は、グリコシル化される。
【００２８】
一部の実施形態では、抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、ＩｇＧである。ある特定の実施形態では、抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、ＩｇＧアイソタイプ抗体Ｆｃ領域を含む。特定の実施形態では、抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２アイソタイプ抗体Ｆｃ領域を含む。ある特定の実施形態では、抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体である。一部の実施形態では、抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、該抗体または抗体断片のＦｃ受容体との結合をモジュレートする（すなわち、増加または減少させる）少なくとも１つの変異を含有する。一部の実施形態では、抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、該抗体、抗体断片、または抗原結合分子をモジュレートして（すなわち、増加または減少させて）Ｆｃ受容体を活性化する、少なくとも１つの変異を含有する。特定の実施形態では、抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、該抗体または抗体断片のＦｃ受容体との結合を増加させる少なくとも１つの変異を含有する。ある特定の実施形態では、抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、該抗体、抗体断片、または抗原結合分子を増加させてＦｃ受容体を活性化する、少なくとも１つの変異を含有する。
【００２９】
一部の実施形態では、抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、ヒトおよび非ヒト霊長類ＧＩＴＲと交差反応する。一部の実施形態では、抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、齧歯類ＧＩＴＲ、例えば、ラットＧＩＴＲまたはマウスＧＩＴＲと交差反応しない。
【００３０】
関連態様では、本発明は、本明細書に記載の本発明の抗体、抗体断片、または抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。一部の実施形態では、軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５２、配列番号５４および配列番号１０２から選択される核酸配列と少なくとも９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を有する。一部の実施形態では、重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号１０１および配列番号１０７から選択される核酸配列と少なくとも９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を有する。一部の実施形態では、軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５２、配列番号５４および配列番号１０２から選択される核酸配列を有する。一部の実施形態では、重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号１０１および配列番号１０７から選択される核酸配列を有する。
【００３１】
関連態様では、本発明は、本明細書に記載の本発明の抗体、抗体断片、または抗原結合分子と医薬的に許容される担体とを含む組成物をさらに提供する。一部の実施形態では、本発明は、個体に投与するための、本発明の抗体、抗体断片、または抗原結合分子を含む医薬組成物を提供する。
【００３２】
一部の実施形態では、組成物は、標的抗原、例えば、がん関連抗原または腫瘍関連抗原をさらに含む。一部の実施形態では、標的抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原または寄生虫抗原である。
【００３３】
一部の実施形態では、組成物は、ＣＴＬＡ４のアンタゴニストをさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、ＬＡＧ３のアンタゴニストをさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、ＴＩＭ３のアンタゴニストをさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１（例えば、Ｂ７−Ｈ１またはその類似体、ＰＤ−１抗体）相互作用の阻害剤をさらに含む。ある特定の実施形態では、組成物は、ＰＤ−１のアンタゴニストをさらに含む。ある特定の実施形態では、組成物は、ＰＤ−Ｌ１のアンタゴニストをさらに含む。
【００３４】
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載の本発明の抗体または抗体断片を含むキットをさらに提供する。
【００３５】
一部の実施形態では、キットは、抗体と併用投与（co-administration）するための第２の薬剤をさらに含む。一部の実施形態では、第２の薬剤は、標的抗原、例えば、がん関連抗原または腫瘍関連抗原である。一部の実施形態では、標的抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原または寄生虫抗原である。
【００３６】
一部の実施形態では、第２の薬剤は、ＣＴＬＡ４のアンタゴニストである。一部の実施形態では、第２の薬剤は、ＴＩＭ３のアンタゴニストである。一部の実施形態では、第２の薬剤は、ＬＡＧ３のアンタゴニストである。一部の実施形態では、第２の薬剤は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１（例えば、Ｂ７−Ｈ１またはその類似体、ＰＤ−１抗体）相互作用の阻害剤である。ある特定の実施形態では、第２の薬剤は、ＰＤ−１のアンタゴニストである。ある特定の実施形態では、第２の薬剤は、ＰＤ−Ｌ１のアンタゴニストである。
【００３７】
場合により、抗体または抗体断片と第２の薬剤は、混合物として提供される。場合により、抗体または抗体断片と第２の薬剤は、別々の製剤で提供される。
【００３８】
別の態様では、本発明は、それを必要とする個体のＴ細胞応答を強化する方法であって、本明細書に記載の治療有効量の本発明の抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体または抗体断片を個体に投与することを含む、方法を提供する。さらなる態様では、本発明は、個体のＴ細胞応答の強化に使用するための、本発明の抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体または抗体断片を提供する。さらなる態様では、本発明は、個体のＴ細胞応答の強化に使用するための、本発明の抗体または抗体断片を含む組成物を提供する。
【００３９】
さらなる態様では、本発明は、それを必要とする個体における腫瘍関連抗原を発現するがんの腫瘍成長を処置する方法であって、本明細書に記載の治療有効量の本発明の抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体、抗体断片、または抗原結合分子を個体に投与することを含む、方法を提供する。本発明は、個体のがんの腫瘍成長の処置に使用するための、本発明の抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体または抗体断片をさらに提供する。本発明は、個体における腫瘍関連抗原を発現するがんの腫瘍成長の低減、阻害または予防に使用するための、本発明の抗体または抗体断片を含む組成物をさらに提供する。
【００４０】
方法および医学的使用の実施形態に関して、一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、抗原と併用投与される。一部の実施形態では、抗原は、がん関連抗原または腫瘍関連抗原である。一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体または抗体断片は、患者からのがん細胞、すなわち自家がん細胞と併用投与される。
【００４１】
一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、ＣＴＬＡ４のアンタゴニストと併用投与される。一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、ＬＡＧ３のアンタゴニストと併用投与される。一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、ＴＩＭ３のアンタゴニストと併用投与される。一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体または抗体断片は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１（例えば、Ｂ７−Ｈ１）相互作用の阻害剤と併用投与される。ある特定の実施形態では、抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、ＰＤ−１のアンタゴニストと併用投与される。ある特定の実施形態では、抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、ＰＤ−Ｌ１のアンタゴニストと併用投与される。
【００４２】
一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、化学療法剤または細胞毒と併用投与される。
【００４３】
一部の実施形態では、Ｔ細胞応答は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）Ｔ細胞応答である。一部の実施形態では、Ｔ細胞応答は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）応答である。
【００４４】
一部の実施形態では、患者は、腫瘍関連抗原を発現するがんを有する。一部の実施形態では、がんは、黒色腫、卵巣がん、結腸直腸がん、前立腺、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）および乳がんからなる群から選択される。一実施形態では、がんのタイプは、膵臓がん、黒色腫、乳がん、肺がん、気管支がん、結腸直腸がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、膀胱がん、脳または中枢神経系のがん、末梢神経系のがん、食道がん、子宮頸がん、子宮または子宮内膜がん、口腔または咽頭がん、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、肝臓がん、腎臓がん、精巣がん、胆道がん、小腸または虫垂がん、唾液腺がん、甲状腺がん、副腎がん、骨肉腫、軟骨肉腫、および血液組織のがんからなる群から選択される。
【００４５】
一部の実施形態では、患者は、感染性疾患、例えば、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌抗原または寄生虫抗原を有する。一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体は、（例えば、ＨＣＶ、ＨＳＶまたはＨＩＶからの）ウイルス抗原と併用投与される。一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体は、細菌抗原と併用投与される。一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体は、真菌抗原と併用投与される。一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体は、寄生虫抗原（例えば、フィラリア症）と併用投与される。
【００４６】
さらに他の実施形態では、治療に使用するための、単離された抗体、抗体断片、または抗原結合分子を提供する。ある特定の実施形態では、それを必要とする個体のＴ細胞応答の強化に使用するための、抗体、抗体断片、または抗原結合分子を提供する。ある特定の実施形態では、それを必要とする個体の腫瘍成長の処置に使用するための、抗体、抗体断片、または抗原結合分子を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
定義
「抗体」は、対応する抗原に非共有結合的に、可逆的にかつ特異的に結合することができる、免疫グロブリンファミリーのポリペプチドを指す。例示的抗体構造ユニットは、四量体を含む。各四量体は、ジスルフィド結合によって接続されている同一の２対のポリペプチド鎖であって、各対が１本の「軽」鎖（約２５ｋＤ）と１本の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有するポリペプチド鎖で構成されている。認知されている免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖は、κまたはλのどちらかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δまたはεとして分類され、そしてまたこれらは、それぞれ、免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを規定する。本発明の抗体は、あらゆるアイソタイプ／クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ）またはあらゆるサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）のものであることができる。各鎖のＮ末端は、抗原認識に主に関与する、アミノ酸約１００〜１１０以上の可変領域を規定する。用語、可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）は、それぞれ、これらの軽鎖および重鎖領域を指す。Ｖ領域に加えて、重鎖および軽鎖の両方は、定常（Ｃ）領域またはドメインを含有する。分泌型の免疫グロブリンＣ領域は、３つのＣドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、場合によりＣＨ４（Ｃμ）、およびヒンジ領域で構成されている。膜結合型の免疫グロブリンＣ領域は、膜および細胞内ドメインも有する。各軽鎖は、Ｎ末端にＶＬを有し、続いてそのもう一方の末端に定常ドメイン（Ｃ）を有する。ＶＬは、ＶＨと整列しており、ＣＬは、重鎖の第１の定常ドメインと整列している。ＶＨとＶＬが互いに対合して単一の抗原結合部位を形成している。本明細書で使用する場合の「普通抗体」ＩｇＧ免疫グロブリンは、天然に存在する立体配置の抗体を指す。典型的に、普通抗体ＩｇＧは、ジスルフィド結合によって互いに連結されている２本の同一の重鎖と２本の同一の軽鎖である、４本の鎖を有する。本明細書で使用する場合、「抗体」は、特定の結合特異性、すなわち、ＧＩＴＲに対する結合特異性を有する、抗体および普通抗体構造のバリエーションも包含する。したがって、ＧＩＴＲに対して特定の結合特異性を有する、完全長抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体は、この概念の範囲内である。
【００４８】
抗体は、インタクト免疫グロブリンとして存在するか、または様々なペプチダーゼでの消化によって生成される、十分に特性決定された多数の断片として存在する。したがって、例えば、ペプシンは、抗体をそのヒンジ領域のジスルフィド結合の下で消化して、Ｆａｂ’の二量体であるＦ（ａｂ）’２を生成し、Ｆａｂ’自体は、ジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１につながれている軽鎖である。Ｆ（ａｂ）’２を穏やかな条件下で還元してヒンジ領域のジスルフィド結合を破壊することによって、Ｆ（ａｂ）’２二量体をＦａｂ’単量体に変換することができるだろう。Ｆａｂ’単量体は、本質的に、ヒンジ領域の一部を伴うＦａｂである。Paul, Fundamental Immunology 3d ed. (1993)。様々な抗体断片がインタクト抗体の消化に関して定義されているが、そのような断片が化学的にまたは組換えＤＮＡ方法論の使用によって新たに合成されうることは、当業者には理解されるであろう。本明細書で使用する場合、「抗体断片」は、ＧＩＴＲの特異性およびアゴニスト活性を保持する、全抗体の修飾によって生成された抗体の１つもしくは複数の部分、または組換えＤＮＡ方法論を使用して新たに合成されたものを指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ断片、一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｄ（ＶｈおよびＣＨ１ドメイン）、ｄＡｂ（Ｖｈおよび単離されたＣＤＲ）；および同じ結合特異性を有するこれらの断片の多量体バージョン（例えば、Ｆ（ａｂ’）２）が挙げられる。抗体断片を、シングルドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖＮＡＲ、ビスｓｃＦｖ、および抗体様化合物の他のバリエーションに組み込んで、本発明において提供する結合特異性および活性を獲得しうる。
【００４９】
本発明に関して使用する場合の「Ｆａｂ」ドメインは、重鎖可変ドメイン、定常領域ＣＨ１ドメイン、軽鎖可変ドメイン、および軽鎖定常領域ＣＬドメインを含む。ドメインの相互作用は、ＣＨ１ドメインとＣＬドメイン間のジスルフィド結合によって安定化される。一部の実施形態では、Ｆａｂの重鎖ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へＶＨ−ＣＨの順序であり、Ｆａｂの軽鎖ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へＶＬ−ＣＬの順序である。一部の実施形態では、Ｆａｂの重鎖ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へＣＨ−ＶＨの順序であり、Ｆａｂの軽鎖ドメインは、ＣＬ−ＶＬの順序である。Ｆａｂは、昔はインタクト免疫グロブリンのパパイン消化によって同定されたが、本発明に関して「Ｆａｂ」は、典型的に、任意の方法によって組換え産生される。各Ｆａｂ断片は、抗原結合に関して一価であり、すなわち、単一の抗原結合部位を有する。
【００５０】
ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端部分が、「Ｆｃ」ドメインである。本明細書で使用する場合の「Ｆｃ領域」は、第１の定量領域免疫グロブリンドメインを含まない、抗体の定常領域を指す。Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメインと、ＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメインと、これらのドメインのＮ末端側の可動性ヒンジとを指す。ＩｇＡおよびＩｇＭについては、ＦｃはＪ鎖を含みうる。ＩｇＧについては、Ｆｃは、免疫グロブリンドメインＣγ２およびＣγ３、ならびにＣγ１とＣγ間のヒンジを含む。Ｆｃ領域の境界は変動しうるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、残基Ｃ２２６またはＰ２３０からそのカルボキシル末端までを含むと通常は定義されると当技術分野では了解されており、このナンバリングの使用は、Ｋａｂａｔら（1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, Va）におけるようなＥＵインデックスによるものである。「Ｆｃ領域」は、孤立してこの領域を指すか、または抗体もしくは抗体断片に関連してこの領域を指すこともある。「Ｆｃ領域」は、Ｆｃ領域の、例えばＣＨ２およびＣＨ３領域に関する、天然に存在する対立遺伝子のバリアント、ならびにエフェクター機能をモジュレートする修飾形態を含む。Ｆｃ領域は、生物学的機能を変える結果とならないバリアントも含む。例えば、生物学的機能を実質的に失うことなく、１つまたは複数のアミノ酸を免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端またはＣ末端から欠失させることができる。例えば、ある特定の実施形態では、Ｃ末端リジンが修飾、置き換えまたは除去されることがある。ある特定の実施形態では、Ｆｃ領域の１つまたは複数のＣ末端残基が変更または除去される。ある特定の実施形態では、Ｆｃ領域の１つまたは複数のＣ末端残基（例えば、末端リジン）が欠失される。ある特定の実施形態では、Ｆｃ領域の１つまたは複数のＣ末端残基が代替アミノ酸で置換される（例えば、末端リジンが置き換えられる）。当技術分野において公知の一般的規則に従って、活性に対してわずかな影響しか及ぼさないようなバリアントを選択することができる（例えば、Bowie, et al., Science 247:306-1310, 1990を参照されたい）。Ｆｃドメインは、ＦｃＲなどの細胞受容体によって認識される部分であって、補体活性化タンパク質、Ｃ１ｑが結合する部分である。ＣＨ２エクソンの５’部分にコードされている下ヒンジ領域は、ＦｃＲ受容体との結合のために抗体内での可動性をもたらす。
【００５１】
「相補性決定ドメイン」または「相補性決定領域（「ＣＤＲ」）」は同義語として、ＶＬおよびＶＨの超可変領域を指す。ＣＤＲは、抗体鎖の標的タンパク質結合部位であって、そのような標的タンパク質に対する特異性を有する部位である。ヒトＶＬまたはＶＨ各々に３つのＣＤＲ（Ｎ末端から順次ナンバリングしてＣＤＲ１〜３）があり、これらは可変ドメインの約１５〜２０％を構成する。ＣＤＲは、標的タンパク質のエピトープに対して構造的に相補性であり、したがって、結合特異性の直接的原因となる。ＶＬまたはＶＨの残りのストレッチ、いわゆるフレームワーク領域、は、アミノ酸配列のバリエーションをあまり示さない（Kuby, Immunology, 4th ed., Chapter 4.W.H.Freeman & Co., New York, 2000）。
【００５２】
ＣＤＲおよびフレームワーク領域の位置は、当技術分野において周知の様々な定義、例えば、カバット、コチア、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース（ＩＭＧＴ）（ワールドワイドウェブのｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／で）およびＡｂＭを使用して、決定することができる（例えば、Johnson et al., Nucleic Acids Res., 29:205-206 (2001)、Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)、Chothia et al., Nature, 342:877-883 (1989)、Chothia et al., J. Mol. Biol., 227:799-817 (1992)、Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol., 273:927-748 (1997)を参照されたい）。抗原結合部位の定義は、次のものにも記載されている：Ruiz et al., Nucleic Acids Res., 28:219-221 (2000)、およびLefranc, M.P., Nucleic Acids Res., 29:207-209 (2001)、MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745 (1996)、およびMartin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9268-9272 (1989)、Martin et al., Methods Enzymol., 203:121-153 (1991)、およびRees et al., In Sternberg M.J.E.(ed.), Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, 141-172 (1996)。
【００５３】
カバットに従って、ＶＨにおけるＣＤＲアミノ酸残基は、３１〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）とナンバリングされ、ＶＬにおけるＣＤＲアミノ酸残基は、２４〜３４（ＬＣＤＲ１）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）および８９〜９７（ＬＣＤＲ３）とナンバリングされる。コチアに従って、ＶＨにおけるＣＤＲアミノ酸は、２６〜３２（ＨＣＤＲ１）、５２〜５６（ＨＣＤＲ２）および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）とナンバリングされ、ＶＬにおけるＣＤＲアミノ酸残基は、２６〜３２（ＬＣＤＲ１）、５０〜５２（ＬＣＤＲ２）および９１〜９６（ＬＣＤＲ３）とナンバリングされる。カバットとコチアの両方のＣＤＲ定義を組み合わせることにより、ＣＤＲは、ヒトＶＨにおけるアミノ酸残基２６〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）、ならびにヒトＶＬにおけるアミノ酸残基２４〜３４（ＬＣＤＲ１）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）および８９〜９７（ＬＣＤＲ３）からなる。
【００５４】
用語「結合特異性決定因子」または「ＢＳＤ」は同義語として、抗体の結合特異性の決定に必要な相補性決定領域内の最小連続または非連続アミノ酸配列を指す。最小結合特異性決定因子は、１つまたは複数のＣＤＲ配列内にありうる。一部の実施形態では、最小結合特異性決定因子は、抗体の重鎖および軽鎖のＣＤＲ３配列の一部分または全長の中に存在する（すなわち、部分または全長によってのみ決定される）。
【００５５】
本明細書で使用する場合の「抗体軽鎖」または「抗体重鎖」は、それぞれ、ＶＬまたはＶＨを含むポリペプチドを指す。内在性ＶＬは、遺伝子セグメントＶ（可変）およびＪ（連結部）によってコードされ、内在性ＶＨは、Ｖ、Ｄ（多様性）およびＪによってコードされる。ＶＬまたはＶＨの各々は、ＣＤＲはもちろん、フレームワーク領域も含む。本出願では、時には、抗体軽鎖および／または抗体重鎖を総称して「抗体鎖」と呼ぶこともある。これらの用語は、当業者には容易に理解されるように、ＶＬまたはＶＨの基本構造を壊さない変異を含有する抗体鎖を包含する。
【００５６】
本明細書で使用する場合の用語「結合価」は、ポリペプチド内の可能性のある標的結合部位の数を指す。各標的結合部位は、１つの標的分子に、または標的分子上の特異的部位に、特異的に結合する。ポリペプチドが１つより多くの標的結合部位を含む場合、各標的結合部位は、同じ分子に特異的に結合するか、または異なる分子に特異的に結合しうる（例えば、異なる分子、例えば異なる抗原と結合するか、または同じ分子上の異なるエピトープと結合しうる）。例えば、普通抗体は、２つの結合部位を有し、二価である。抗体、抗原結合分子、およびそれらの断片は、一価（すなわち、１つの標的分子に結合する）、二価、または多価（すなわち、１つより多くの標的分子に結合する）でありうる。
【００５７】
モノクローナルまたはポリクローナル抗体の調製には、当技術分野において公知の任意の技法を使用することができる（例えば、Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975)、Kozbor et al., Immunology Today 4:72 (1983)、Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96.Alan R. Liss, Inc. 1985を参照されたい）。一本鎖抗体を産生するための技法（米国特許第４，９４６，７７８号明細書）を、本発明のポリペプチドに対する抗体の産生に適応させることができる。また、トランスジェニックマウス、または他の生物、例えば他の哺乳動物を使用して、霊長類化またはヒト化抗体を発現させてもよい。あるいは、ファージディスプレイ技術を使用して、選択抗原と特異的に結合する抗体およびヘテロマーＦａｂ断片を同定することができる（例えば、McCafferty et al., supra、Marks et al., Biotechnology, 10:779-783, (1992)を参照されたい）。
【００５８】
非ヒト抗体を霊長類化またはヒト化する方法は、当技術分野において周知である。一般に、霊長類化またはヒト化抗体は、非霊長類または非ヒトである源から導入された１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非霊長類または非ヒトアミノ酸残基は、移入残基と呼ばれることが多く、それらは、通常は移入可変ドメインから採取される。ヒト化は、本質的には、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（例えば、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)、Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988)、Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照されたい）に従って、齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列で置換することによって行うことができる。したがって、そのようなヒト化抗体は、インタクトヒト可変ドメインより実質的に少ない可変ドメインが非ヒト種からの対応する配列によって置換されている、キメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）である。実際のところ、典型的に、霊長類化またはヒト化抗体は、結合特異性を付与するために、一部の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）残基および場合により一部のフレームワーク（「ＦＲ」）残基が元の種（例えば、齧歯類抗体）の類似部位からの残基によって置換されている、霊長類またはヒト抗体である。
【００５９】
「キメラ抗体」は、（ａ）定常領域またはその一部分が変更、置き換えまたは交換され、その結果、抗原結合部位（可変領域）が、異なるもしくは変更されたクラス、エフェクター機能および／もしくは種の定常領域に連結されている、または新たな特性をそのキメラ抗体、例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子および薬物に付与する全く異なる分子に連結されている、あるいは（ｂ）可変領域またはその一部分が、異なるまたは変更された抗原特異性を有する可変領域で変更されている、置き換えられている、またはそのような可変領域と交換されている、抗体分子である。
【００６０】
本発明の抗体または抗原結合分子は、他のタンパク質との融合タンパク質と化学的にコンジュゲートしている、またはそのような融合タンパク質として発現される、１つまたは複数の免疫グロブリン鎖をさらに含む。抗体または抗原結合分子は、二重特異性抗体も含む。二重特異性または二機能性抗体は、２つの異なる重／軽鎖対と２つの異なる結合部位とを有する人工ハイブリッド抗体である。本発明の他の抗原結合断片または抗体部分は、二価ｓｃＦｖ（ダイアボディ）、抗体分子が２つの異なるエピトープを認識する二重特異性ｓｃＦｖ抗体、シングル結合ドメイン（ｄＡｂ）、およびミニボディを含む。
【００６１】
本明細書に記載する様々な抗体または抗原結合断片は、インタクト抗体の酵素的もしくは化学的修飾によって生成することができ、または組換えＤＮＡ方法論を使用して新たに合成することができ（例えば、一本鎖Ｆｖ）、またはファージディスプレイライブラリーを使用して同定することができる（例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990を参照されたい）。例えば、ミニボディは、当技術分野において、例えばVaughan and Sollazzo, Comb Chem High Throughput Screen. 4:417-30 2001に記載されている方法を使用して作製することができる。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結をはじめとする様々な方法によって産生させることができる。例えば、Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990)、Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)を参照されたい。一本鎖抗体は、ファージディスプレイライブラリーまたはリボースディスプレイライブラリー、遺伝子シャッフルライブラリー（gene shuffled libraries）を使用して同定することができる。そのようなライブラリーは、合成の、半合成のまたはネイティブの、免疫正常な源から構築することができる。
【００６２】
用語「抗原結合分子」または「非抗体リガンド」は、アドネクチン、アビマー、一本鎖ポリペプチド結合分子、および抗体様結合ペプチド模倣体を含むがこれらに限定されない、非免疫グロブリンタンパク質足場を使用する抗体模倣体を指す。
【００６３】
用語「可変領域」または「Ｖ領域」は同義語として、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含む重鎖または軽鎖を指す。内在性可変領域は、免疫グロブリン重鎖Ｖ−Ｄ−Ｊ遺伝子または軽鎖Ｖ−Ｊ遺伝子によってコードされる。Ｖ領域は、天然に存在するか、組換え、または合成でありうる。
【００６４】
本明細書で使用する場合、用語「可変セグメント」または「Ｖセグメント」は同義語として、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３を含む可変領域の部分配列を指す。内在性Ｖセグメントは、免疫グロブリンＶ遺伝子によってコードされる。Ｖセグメントは、天然に存在するか、組換え、または合成でありうる。
【００６５】
本明細書で使用する場合、用語「Ｊセグメント」は、ＣＤＲ３のＣ末端部分とＦＲ４とを含む、コードされた可変領域の部分配列を指す。内在性Ｊセグメントは、免疫グロブリンＪ遺伝子によってコードされる。Ｊセグメントは、天然に存在するか、組換え、または合成でありうる。
【００６６】
「ヒト化」抗体は、非ヒト抗体の反応性（例えば、結合特異性、活性）を保持するがヒトにおいて免疫原性が低い抗体である。このヒト化抗体は、例えば、非ヒトＣＤＲ領域を保持し、該抗体の残りの部分をヒト対応物で置き換えることによって得ることができる。例えば、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)、Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988)、Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)、Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991)、Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994)を参照されたい。
【００６７】
用語「対応するヒト生殖系列配列」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン可変領域配列によってコードされる他のすべての公知可変領域アミノ酸配列と比較して最高と判定されるアミノ酸配列同一性を参照可変領域アミノ酸配列または部分配列と共有するヒト可変領域アミノ酸配列もしくは部分配列をコードする核酸配列を指す。対応するヒト生殖系列配列は、参照可変領域アミノ酸配列とのアミノ酸配列同一性が評価した他のすべての可変領域アミノ酸配列と比較して最も高い、ヒト可変領域アミノ酸配列または部分配列を指すこともある。対応するヒト生殖系列配列は、フレームワーク領域のみ、相補性決定領域のみ、フレームワークと相補性決定領域、可変セグメント（上で定義した通り）、または可変領域を含む配列もしくは部分配列の他の組合せでありうる。配列同一性は、本明細書に記載する方法、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮまたは当技術分野において公知の別のアラインメントアルゴリズムを使用する２配列のアラインメントを使用して、決定することができる。対応するヒト生殖系列核酸またはアミノ酸配列は、参照可変領域核酸またはアミノ酸配列と少なくとも約９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有することができる。対応するヒト生殖系列配列は、例えば、公的に利用できる国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース（ＩＭＧＴ）（ワールドワイドウェブのｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／で）およびＶ−ｂａｓｅ（ワールドワイドウェブのｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋで）によって決定することができる。
【００６８】
抗原（例えば、タンパク質）と抗体、抗体断片または抗体由来結合剤との相互作用を説明する文脈で使用するときの「特異的に結合する」または「選択的に結合する」という句は、タンパク質および他の生体物質の異種集団中の、例えば、生体試料、例えば血液、血清、血漿または組織試料中の、抗原の存在を決定する結合反応を指す。したがって、ある特定の指定イムノアッセイ条件下で、特定の結合特異性を有する抗体または結合剤は、特定の抗原とバックグラウンドの少なくとも２倍結合し、その試料中に存在する他の抗原と有意な量で実質的に結合しない。一実施形態では、指定イムノアッセイ条件下で、特定の結合特異性を有する抗体または結合剤は、特定の抗原とバックグラウンドの少なくとも十（１０）倍結合し、その試料中に存在する他の抗原と有意な量で実質的に結合しない。そのような条件下での抗体または結合剤との特異的結合は、特定のタンパク質（例えば、ヒトＧＩＴＲ）に対するその特異性のために選択された抗体または薬剤を必要としうる。本明細書で使用する場合、特異的結合は、ヒトＧＩＴＲと選択的に結合する、抗体、その断片、および結合分子を含むが、例えばマウスＧＩＴＲ分子またはＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーと交差反応する抗体を含まない。一部の実施形態では、非ヒト霊長類ＧＩＴＲ（例えば、カニクイザルＧＩＴＲ）と交差反応する抗体または抗体断片が選択される。
【００６９】
様々なイムノアッセイ形式を使用して、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性の抗体を選択することができるだろう。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応性の抗体を選択するために日常的に使用されている（特異的免疫反応性を判定するために使用することができるイムノアッセイ形式および条件の説明については、例えばHarlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998)を参照されたい）。典型的に、特異的または選択的結合反応は、バックグラウンドシグナルの少なくとも２倍のシグナル、より典型的には、バックグラウンドの少なくとも１０〜１００倍超のシグナルを生じさせることになる。
【００７０】
用語「平衡解離定数（ＫＤ、Ｍ）」は、結合速度定数（ｋａ、時間−１、Ｍ−１）で割った解離速度定数（ｋｄ、時間−１）を指す。平衡解離定数は、当技術分野において公知の任意の方法を使用して測定することができる。本発明の抗体は、一般に、約１０−７または１０−８Ｍ未満、例えば、約１０−９または１０−１０未満、一部の実施形態では、約１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍまたは１０−１３Ｍ未満の平衡解離定数を有することになる。一部の実施形態では、単離された抗体または抗体断片は、約１ｎＭ以下の平衡解離定数（ＫＤ）でヒトＧＩＴＲと結合する。一部の実施形態では、抗体または抗体断片は、約１ｎＭ未満であるＫＤでヒトＧＩＴＲと結合する。一部の実施形態では、抗体または抗体断片は、約０．５ｎＭ〜約１．０ｎＭの範囲であるＫＤでヒトＧＩＴＲと結合する。
【００７１】
本明細書で使用する場合、用語「抗原結合領域」は、分子とＧＩＴＲ間の特異的結合の原因となる、本発明のＧＩＴＲ結合分子のドメインを指す。抗原結合領域は、少なくとも１つの抗体重鎖可変領域および少なくとも１つの抗体軽鎖可変領域を含む。本発明の各ＧＩＴＲ結合分子には少なくとも１つのそのような抗原結合領域が存在し、該抗原結合領域の各々は、互いに同一であるか、または互いに異なることができる。一部の実施形態では、本発明のＧＩＴＲ結合分子の抗原結合領域の少なくとも１つは、ＧＩＴＲのアゴニストとして作用する。
【００７２】
用語「抗体アゴニスト」または「アゴニスト」は同義語として、完全なまたは部分的な受容体媒介応答を誘導するように受容体を活性化することができる抗体を指す。例えば、ＧＩＴＲのアゴニストはＧＩＴＲと結合し、ＧＩＴＲ媒介分子内シグナル伝達を誘導する（例えば、ＮＦ−κＢ発現活性化を増加させる）。抗体アゴニストは、ネイティブリガンド、ＧＩＴＲ−Ｌ、と同様に、ＧＩＴＲによるシグナル伝達を刺激する。ＧＩＴＲ−ＬのＧＩＴＲとの結合は、ＩκＢの分解に起因してＮＦκＢ活性化を誘導する。一部の実施形態では、ＧＩＴＲ抗体アゴニストを、ＧＩＴＲと結合してＴ細胞（例えば、ＣＤ８＋ＣＴＬもしくはＣＤ４＋Ｔｈ細胞）増殖、生存、細胞傷害活性および／もしくはサイトカイン産生（例えば、ＩＦＮγ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＴＮＦα）を誘導するその能力によって同定することができ、または本明細書に別様に記載するように同定することができる。
【００７３】
用語「ＧＩＴＲ」または「グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体」または「腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１８」または「ＴＮＦＲＳＦ１８」は同義語として、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーであるＩ型膜貫通タンパク質を指す。ＧＩＴＲは、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋上で、ならびに活性化エフェクターＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上で、高レベルで発現される。ＧＩＴＲの核酸およびアミノ酸配列は公知であり、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００４１９５．２→ＮＰ＿００４１８６．１（アイソフォーム１前駆体）、配列番号１：
0006731403.tif 000002
ＮＭ＿１４８９０１．１→ＮＰ＿６８３６９９．１（アイソフォーム２前駆体）、配列番号２：
0006731403.tif 000003
およびＮＭ＿１４８９０２．１→ＮＰ＿６８３７００．１（アイソフォーム３前駆体）、配列番号３：
0006731403.tif 000004
で公開されている。ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００５０９２→ＮＰ＿００５０８３．２も参照されたい。構造的には、ＧＩＴＲアミノ酸配列は、３つのシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）を含む細胞外ドメイン（ＥＣＤ）であるシグナルペプチドを有するＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーであるＩ型膜貫通タンパク質であり、その全長にわたってＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＰ＿００４１８６．１（配列番号１）、ＮＰ＿６８３６９９．１（配列番号２）、ＮＰ＿６８３７００．１（配列番号３）またはＮＰ＿００５０８３．２のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。構造的には、ＧＩＴＲ核酸配列は、その全長にわたってＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００４１９５．２、ＮＭ＿１４８９０１．１、ＮＭ＿１４８９０２．１、ＮＭ＿００５０９２または配列番号１〜４の核酸配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。機能的には、齧歯類ＧＩＴＲのアゴニスト作用（agonism）は、少なくとも一時的に、ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の抑制活性を阻害する。ＧＩＴＲアゴニスト作用は、活性化エフェクターＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫活性、例えば、増殖活性、生存活性、サイトカイン産生活性および細胞傷害活性をさらに強化する。例えば、Nocentini, et al., Eur J Immunol (2007) 37:1165-1169、Expert Opin Ther Patents (2007) 17(5):567-757、Shevach and Stephens, Nature Reviews Immunology (2006) 6:613-618を参照されたい。
【００７４】
本発明のポリペプチドの「活性」は、そのネイティブ細胞または組織におけるポリペプチドの構造機能、調節機能または生化学的機能を指す。ポリペプチドの活性の例は、直接的活性と間接的活性の両方を含む。ＧＩＴＲアゴニスト作用の例示的活性としては、ＮＦ−κＢの活性の増加、活性化エフェクターＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖活性、生存活性、サイトカイン（例えば、ＩＦＮγ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＴＮＦα）産生活性および細胞傷害活性の増加をもたらす、細胞内シグナル伝達が挙げられる。治療的には、ＧＩＴＲのアゴニスト作用は、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍および抗ウイルスＴ細胞応答を増強する。
【００７５】
用語「単離された」は、核酸またはタンパク質に適用されているとき、天然の状態ではその核酸またはタンパク質と会合している他の細胞成分が、その核酸またはタンパク質に本質的にないことを示す。その核酸またはタンパク質は、好ましくは、均質な状態である。その核酸またはタンパク質は、乾燥または水溶液のどちらかでありうる。純度および均質性は、典型的に、分析化学技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーを使用して判定される。調製物中に存在する主な化学種であるタンパク質は、実質的に精製されている。特に、単離された遺伝子は、その遺伝子に隣接しており、かつ目的の遺伝子以外のタンパク質をコードする、オープンリーディングフレームから分離されている。用語「精製された」は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルにおいて本質的に１つのバンドを生じさせることを示す。詳細には、この用語は、核酸またはタンパク質が、少なくとも純度８５％、より好ましくは少なくとも純度９５％、最も好ましくは少なくとも純度９９％であることを意味する。
【００７６】
用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、一本鎖または二本鎖形態のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）およびそれらのポリマーを指す。特別な制限がない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様に代謝される、公知の天然ヌクレオチド類似体を含有する核酸を包含する。別段の指示がない限り、特定の核酸配列は、明確に示す配列ばかりでなく、その保存的に修飾されたバリアント（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰおよび相補配列も暗に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの第３の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生じさせることによって達成することができるだろう（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)、Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)、およびRossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。
【００７７】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書では同義語として使用している。これらの用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用されるばかりでなく、１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的模倣体である、アミノ酸ポリマーにも適用される。
【００７８】
用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸はもちろん、天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体も指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝コードによってコードされているもの、ならびに後で修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメートおよびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を有する化合物、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基と結合しているα−炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが天然に存在するアミノ酸と同様に機能する、化合物を指す。
【００７９】
「保存的に修飾されたバリアント」は、アミノ酸配列と核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾されたバリアントは、同一のもしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列を指すか、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には本質的に同一の配列を指す。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一の核酸が何らかの所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって指定されているあらゆる位置で、そのコドンを、コードするポリペプチドを変更せずに、記載する対応するコドンのいずれかに変更することができる。そのような核酸バリエーションは、保存的に修飾されたバリエーションの一種である、「サイレントバリエーション」である。ポリペプチドをコードする本明細書におけるあらゆる核酸配列は、核酸のあるあらゆる可能なサイレントバリエーションも記述する。核酸中の各コドン（通常はメチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常はトリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を修飾して機能的に同一の分子を生じさせることができることは、当業者には理解されるであろう。したがって、記載する各配列には、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレントバリエーションが潜在する。
【００８０】
アミノ酸配列について、コードされた配列内の単一のアミノ酸またはわずかなパーセンテージのアミノ酸を変更、付加または欠失させる、核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列への個々の置換、欠失または付加が、その変更によってアミノ酸が化学的に類似したアミノ酸で置換されることになる、「保存的に修飾されたバリアント」であることは、当業者には理解されるであろう。機能的に類似したアミノ酸をもたらす保存的置換表は、当技術分野において周知である。そのような保存的に修飾されたバリアントは、本発明の多型バリアント、種間相同体および対立遺伝子に加えて存在し、本発明の多型バリアント、種間相同体および対立遺伝子を除外しない。
【００８１】
次の８群の各々は、互いに保存的置換になるアミノ酸を含有する：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照されたい）。
【００８２】
「配列同一性パーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたって最適にアラインメントされた２配列を比較することによって決定され、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列の一部は、２配列の最適アラインメントのための、付加または欠失を含まない、参照配列（例えば、本発明のポリペプチド）と比較して、付加または欠失（すなわちギャップ）を含むことがある。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に出現する位置の数を判定してマッチ位置の数を得、そのマッチ位置数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、その結果に１００をかけて配列同一性パーセンテージを得ることによって算出される。
【００８３】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列に関して、用語「同一の」または「同一性」パーセントは、同じ配列である２つ以上の配列または部分配列を指す。２つの配列は、下記の配列比較アルゴリズムの１つを使用してまたは手動アラインメントおよび目視検査によって測定して、比較ウィンドウまたは指定領域にわたって比較し、最大に一致するようにアラインメントしたときに、同じであるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの特定のパーセンテージ（すなわち、特定の領域にわたって、または特定されていないときには参照配列の配列全体にわたって、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性）を有する場合、「実質的に同一」である。本発明は、本明細書において例示するポリペプチドまたはポリヌクレオチド（例えば、配列番号６〜１０、１２、１４、５９および６１のいずれか１つで例示される可変領域、配列番号１６〜１７のいずれか１つで例示される可変セグメント、配列番号２２〜３４のいずれか１つで例示されるＣＤＲ、配列番号３５〜５０のいずれか１つで例示されるＦＲ、ならびに配列番号５１〜５８および６０のいずれか１つで例示される核酸配列）とそれぞれ実質的に同一である、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを提供する。場合により、同一性は、少なくとも約１５、２５もしくは５０ヌクレオチドの長さである領域にわたって、またはより好ましくは１００〜５００もしくは１０００ヌクレオチド以上の長さである領域にわたって、または参照配列の全長にわたって存在する。アミノ酸配列に関しては、同一性または実質的同一性は、少なくとも５、１０、１５もしくは２０アミノ酸の長さ、場合により少なくとも約２５、３０、３５、４０、５０、７５もしくは１００アミノ酸の長さ、場合により少なくとも約１５０、２００もしくは２５０アミノ酸の長さである領域にわたって、または参照配列の全長にわたって存在しうる。より短いアミノ酸配列、例えば、２０アミノ酸以下のアミノ酸配列に関しては、１つまたは２つのアミノ酸残基が、本明細書において定義する保存的置換に従って保存的に置換されているとき、実質的同一性が存在する。
【００８４】
配列比較のために、典型的に、１つの配列が、試験配列を比較する参照配列としての役割を果す。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、部分配列座標を必要に応じて指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトプログラムパラメータを使用することができ、または代替パラメータを指定することができる。すると、配列比較アルゴリズムが、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを算出する。
【００８５】
本明細書で使用する場合の「比較ウィンドウ」は、ある配列と同じ連続する位置数の参照配列とがそれら２配列の最適なアラインメント後に比較されうる、２０〜６００、通常は約５０〜約２００、より通常は約１００〜約１５０からなる群から選択される連続する位置数のいずれか１つのセグメントへの言及を含む。比較のための配列アラインメント方法は、当技術分野において周知である。比較のための最適な配列アラインメントは、例えば、Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482cの局所相同性アルゴリズムによって、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）によって、または手動アラインメントおよび目視検査（例えば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)を参照されたい）によって行うことができる。
【００８６】
配列同一性および配列類似性パーセントの決定に好適であるアルゴリズムの２つの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムであり、これらは、Altschul et al.(1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402、およびAltschul et al.(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410に、それぞれ記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、米国国立生物学情報センター（National Center for Biotechnology Information）から公的に入手できる。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントしたときマッチするまたは何らか正の値の閾値スコアＴを満たす、クエリ配列中の長さＷの短いワードを特定することによって、高スコアの配列対（ＨＳＰ）を先ず特定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschul et al., supra）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシードとしての役割を果す。ワードヒットは、累積アラインメントスコアを増加することができる限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列についてはパラメータＭ（マッチする残基対についての報酬スコア、常に＞０）およびＮ（ミスマッチの残基についてのペナルティスコア、常に＜０）を使用して算出される。アミノ酸配列については、累積スコアを算出するためにスコア行列が使用される。各方向のワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアがその最大達成値からＸ量低下すると、１つもしくは複数の負のスコアの残基アラインメントの累積に起因して累積スコアがゼロ以下になると、またはどちらかの配列の末端に達すると、停止される。これらのＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸが、そのアラインメントの感度および速度を決める。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列用のＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長３、および期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。
【００８７】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２配列間の類似性の統計解析も行う（例えば、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって与えられる類似性の１つの尺度は、小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、こては、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のマッチが偶然に起こる確率の指標となる。例えば、核酸は、試験核酸と参照核酸の比較で最小和確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、参照配列に類似していると見なされる。
【００８８】
２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることが示すことは、下で説明するように、第１の核酸によってコードされたポリペプチドが、第２の核酸によってコードされたポリペプチドに対して産生された抗体と免疫学的に交差反応性であるということである。したがって、あるポリペプチドと第２のポリペプチドとは、例えば、これら２つのペプチドが保存的置換によってしか異ならない場合、典型的には実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であることが示すもう１つのことは、２つの分子またはそれらの補体が、下で説明するように、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズするということである。２つの核酸配列が実質的に同一であることが示すさらにもう１つのことは、同じプライマーを使用して配列を増幅することができるということである。
【００８９】
抗原結合領域が本発明のＧＩＴＲ結合分子内でどのように接続されているのかを説明する文脈で使用するときの用語「連結する」は、領域を物理的につなぐためのあらゆる可能な手段を包含する。多数の抗原結合領域が化学結合、例えば、共有結合（例えば、ペプチド結合もしくはジスルフィド結合）または非共有結合によってつながれていることが多く、これらの結合は、直接結合（すなわち、２つの抗原結合領域間にリンカーがない）または間接的結合（すなわち、２つ以上の抗原結合領域間に少なくとも１つのリンカー分子が用いられている）でありうる。
【００９０】
用語「対象」、「患者」および「個体」は同義語として、哺乳動物、例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類を指す。哺乳動物は、実験哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスターでありうる。一部の実施形態では、哺乳動物は、農業用動物（例えば、ウマ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ラクダ科動物）、または家庭用哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ）でありうる。
【００９１】
本明細書で使用する場合、何らかの疾患もしくは障害を「処置する」、「処置すること」、または何らかの疾患もしくは障害の「処置」という用語は、一実施形態では、疾患または障害を改善すること（すなわち、疾患またはその臨床症状の少なくとも１つの発現を遅らせること、または阻止すること、または低減させること）を指す。別の実施形態では、「処置する」、「処置すること」または「処置」は、患者が認識できないことがあるものを含む、少なくとも１つの物理的パラメータを軽減することまたは改善することを指す。さらに別の実施形態では、「処置する」、「処置すること」または「処置」は、疾患または障害を、物理的に（例えば、認識可能な症状の安定化）、生理的に（例えば、物理的パラメータの安定化）モジュレートすることのどちらか、または両方を指す。さらに別の実施形態では、「処置する」、「処置すること」または「処置」は、疾患または障害の発症または発現または進行を予防することまたは遅延することを指す。
【００９２】
用語「治療的上許容される量」または「治療有効用量」は同義語として、所望の結果（すなわち、腫瘍サイズの低減、腫瘍成長の阻害、転移の予防、ウイルス、細菌、真菌または寄生虫感染症の阻害または予防）を達成するのに十分な量を指す。一部の実施形態では、治療上許容される量は、望ましくない副作用を誘導せず、望ましくない副作用の原因にもならない。治療的上許容される量は、先ず低用量を投与し、その後、所望の効果が達成されるまで漸増させることによって決定することができる。本発明のＧＩＴＲ作動性抗体の「予防有効投与量」および「治療有効投与量」は、がんまたは感染性疾患に関連する症状を含む疾患症状の発症を予防することまたは該疾患症状の重症度の減少をもたらすことがそれぞれできる。
【００９３】
用語「併用投与」は、個体の血液中の２つの活性薬剤の同時存在を指す。併用投与される活性薬剤は、同時、または逐次的に送達されうる。
【００９４】
本明細書で使用する場合、「から本質的になる」という句は、方法または組成物に含まれる活性医薬物質（pharmaceutical agent）の属または種はもちろん、方法または組成物の意図した目的のためのあらゆる不活性担体または賦形剤も指す。一部の実施形態では、「から本質的になる」という句は、本発明のアゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体以外の１つまたは複数のさらなる活性薬剤を含むことを明確に除外する。一部の実施形態では、「から本質的になる」という句は、本発明のアゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体以外の１つまたは複数のさらなる活性薬剤および第２の併用投与薬剤を含むことを明確に除外する。
【００９５】
用語「がん関連抗原」または「腫瘍関連抗原」または「腫瘍特異的マーカー」または「腫瘍マーカー」は同義語として、正常な細胞と比較してがん細胞の表面で優先的に発現される分子（典型的にタンパク質、炭水化物または脂質）であって、がん細胞への薬理学的薬剤の優先的標的化に有用である分子を指す。多くの場合、がん関連抗原は、正常な細胞と比較してがん細胞において、例えば、正常な細胞と比較して１倍過剰発現、２倍過剰発現、３倍以上過剰発現またはそれ超過剰発現される細胞表面分子である。多くの場合、がん関連抗原は、がん細胞において不適切に合成される細胞表面分子、例えば、正常な細胞上で発現される分子と比較して欠失、付加または変異を含有する分子である。多くの場合、がん関連抗原は、がん細胞の細胞表面で排他的に発現されることになり、正常な細胞の表面では合成されることにも発現されることにもならない。例示的細胞表面腫瘍マーカーとしては、乳がんについてのタンパク質ｃ−ｅｒｂＢ−２およびヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）、前立腺がんについてのＰＳＭＡ、ならびに乳がん、卵巣がんおよび結腸直腸がんを含む非常に多くのがんにおける炭水化物ムチンが挙げられる。
【００９６】
本明細書で使用する場合、抗原結合部分、例えばＦａｂに関して、「第１の」、「第２の」、「第３の」および「第４の」という用語は、各部分が１つより多くあるとき区別の利便性のために使用している。これらの用語の使用は、別段の記述がない限り、抗体の特定の順序または配向を付与することを意図したものではない。
【００９７】
用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」の使用は、文脈による別段の明確な指示がない限り、複数の言及対象を含む。
【００９８】
アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体
本発明は、ＧＩＴＲと結合してＧＩＴＲによるシグナル伝達を刺激する、および／または免疫応答増強をｉｎ  ｖｉｖｏで誘導する、抗体、抗体断片、および抗原結合分子を提供する。抗体、抗体断片、および抗原結合分子は、標的抗原に対するＣＤ４＋Ｔヘルパー（Ｔｈ）および／またはＣＤ８＋細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の強化に使用される。それらは、有効な免疫応答によって進行を逆転させるまたは阻害することができる病状（がんおよび感染性疾患を含む）の処置にも使用される。
【００９９】
本発明の抗体、抗体断片および抗原結合分子は、ヒト患者における使用に好適な特性を示し、例えば、それらは、ヒトにおける使用の免疫原性の問題についてのリスクが低く（それらは、結合特異性決定領域（ＢＳＤ）、特に少なくともＣＤＲ３、を除いて、ヒト生殖系列核酸配列によってコードされる）、ＧＩＴＲに対して高い親和性を有し（例えば、ＫＤは少なくとも５ｎＭ未満である）、ＴＮＦＲスーパーファミリーの他のメンバーと交差反応せず、ならびに低用量で（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで５ｎＭ未満の濃度で）ＧＩＴＲシグナル伝達を作動させる。他の活性および特徴も本明細書を通して示す。
【０１００】
したがって、本発明は、ＧＩＴＲのアゴニストである、抗体、抗体断片、および抗原結合分子を提供する。提供する抗ＧＩＴＲ抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、元のまたは参照モノクローナル抗体、例えば下の表１および表２に記載する抗体に由来する重鎖および軽鎖のＣＤＲ３内の最小結合配列決定因子（ＢＳＤ）を含有する。重鎖および軽鎖可変領域（ＣＤＲおよびＦＲ）の残りの配列、例えば、ＶセグメントおよびＪセグメントは、対応するヒト生殖系列および親和性成熟アミノ酸配列からのものである。Ｖセグメントは、ヒトＶセグメントライブラリーから選択することができる。さらなる配列の精密化を親和性成熟または当技術分野において公知の他の方法によって遂行して、本発明の抗体、抗体断片、または抗原結合分子の結合活性または活性を最適化することができる。
【０１０１】
別の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体または抗体断片の重鎖および軽鎖は、例えばヒトＶセグメントライブラリーから選択される、対応するヒト生殖系列配列からのヒトＶセグメント（ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３）と、元のモノクローナル抗体（例えば、表１および表２に記載の抗体）からのＣＤＲ３−ＦＲ４配列セグメントとを含有する。ＣＤＲ３−ＦＲ４配列セグメントは、配列セグメントを対応するヒト生殖系列配列で置き換えることによって、および／または親和性成熟によって、さらに精密化することができる。例えば、元のモノクローナル抗体のＣＤＲからのＢＳＤを保持しつつ、そのＢＳＤの周囲のＦＲ４および／またはＣＤＲ３配列を対応するヒト生殖系列配列で置き換えることができる。
【０１０２】
一部の実施形態では、重鎖Ｖセグメントの対応するヒト生殖系列配列は、ＶＨ３  ３−１３／３０：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＲＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫ（配列番号８９）である。一実施形態では、配列番号８９の最後のアミノ酸、リジン（「Ｋ」）は、アルギニン（「Ｒ」）で置換される。一部の実施形態では、重鎖Ｊセグメントの対応するヒト生殖系列配列は、ＪＨ４である。一部の実施形態では、重鎖Ｊセグメントは、ヒト生殖系列ＪＨ４部分配列ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号９０）を含む。ヒト生殖系列ＪＨ４からの完全長Ｊセグメントは、ＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号９１）である。可変領域遺伝子には、免疫グロブリン可変領域遺伝子についての標準命名法に従って言及する。現行の免疫グロブリン遺伝子情報は、ワールドワイドウェブを通して、例えば、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）、Ｖ−ｂａｓｅおよびＰｕｂＭｅｄデータベースで入手可能である。Lefranc, Exp Clin Immunogenet. 2001;18(2):100-16、Lefranc, Exp Clin Immunogenet. 2001;18(3):161-74、Exp Clin Immunogenet. 2001;18(4):242-54、およびGiudicelli, et al., Nucleic Acids Res. 2005 Jan 1;33(Database issue):D256-61も参照されたい。
【０１０３】
一部の実施形態では、軽鎖Ｖセグメントの対応するヒト生殖系列配列は、ＶＫＩＩＩ  Ｌ１６／Ａ２７：ＥＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＶＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＮＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＴＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰ（配列番号９２）である。一部の実施形態では、軽鎖Ｊセグメントの対応するヒト生殖系列配列は、ＪＫ２である。一部の実施形態では、軽鎖Ｊセグメントは、ヒト生殖系列Ｊｋ２部分配列ＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号９３）を含む。ヒト生殖系列Ｊｋ２からの完全長Ｊセグメントは、ＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号９４）である。
【０１０４】
一部の実施形態では、重鎖Ｖセグメントは、アミノ酸配列（Ｅ／Ｑ）ＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱ（Ｐ／Ｓ）ＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＬＳＳＹＧＶＤＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷ（Ｌ／Ｖ）ＧＶＩＷＧＧＧＧＴＹＹ（Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｓ）Ｓ（Ｌ／Ｖ）Ｍ（Ａ／Ｇ）ＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡ（Ｋ／Ｒ）（Ｈ／Ｎ）ＡＹＧＨＤＧＧＦＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１６）と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。
【０１０５】
一部の実施形態では、軽鎖Ｖセグメントは、アミノ酸配列ＥＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＶＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳ（Ｅ／Ｑ）ＳＶＳＳＮ（Ｌ／Ｖ）ＡＷＹＱＱ（Ｋ／Ｒ）ＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＮＲＡＴＧＩＰ（Ｄ／Ａ）ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＧＱＳＹＳＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１７）と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。
【０１０６】
一部の実施形態では、ｉ）重鎖ＣＤＲ３は、アミノ酸配列ＨＡＹＧＨＤＧＧＦＡＭＤＹ（配列番号２９）またはＮＡＹＧＨＤＧＧＦＡＭＤＹ（配列番号１０９）を含み、ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ３可変領域は、アミノ酸配列ＧＱＳＹＳＹＰＦＴ（配列番号３４）またはＳＹＳＹＰＦ（配列番号８３）を含む。
【０１０７】
一部の実施形態では、本発明の抗体または抗体断片は、アミノ酸配列ＳＹＧＶＤ（配列番号２２）またはＧＦＳＬＳＳＹ（配列番号８４）を含むＣＤＲ１と、アミノ酸配列ＶＩＷＧＧＧＧＴＹＹ（Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｓ）Ｓ（Ｌ／Ｖ）Ｍ（Ａ／Ｇ）（配列番号２８）またはＷＧＧＧＧ（配列番号８０）を含むＣＤＲ２と、ＨＡＹＧＨＤＧＧＦＡＭＤＹ（配列番号２９）またはＮＡＹＧＨＤＧＧＦＡＭＤＹ（配列番号１０９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む、重鎖可変領域を含む。
【０１０８】
一部の実施形態では、本発明の抗体または抗体断片は、アミノ酸配列ＲＡＳ（Ｅ／Ｑ）ＳＶＳＳＮ（Ｌ／Ｖ）Ａ（配列番号３２）またはＳ（Ｅ／Ｑ）ＳＶＳＳＮ（配列番号８７）を含むＣＤＲ１と、アミノ酸配列ＧＡＳＮＲＡＴ（配列番号３３）またはＧＡＳ（配列番号８２）を含むＣＤＲ２と、ＧＱＳＹＳＹＰＦＴ（配列番号３４）またはＳＹＳＹＰＦ（配列番号８３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む、軽鎖可変領域を含む。
【０１０９】
一部の実施形態では、本発明の抗体または抗体断片は、アミノ酸配列ＳＹＧＶＤ（配列番号２２）またはＧＦＳＬＳＳＹ（配列番号８４）を含むＣＤＲ１と、アミノ酸配列ＶＩＷＧＧＧＧＴＹＹ（Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｓ）Ｓ（Ｌ／Ｖ）Ｍ（Ａ／Ｇ）（配列番号２８）またはＷＧＧＧＧ（配列番号８０）を含むＣＤＲ２と、ＨＡＹＧＨＤＧＧＦＡＭＤＹ（配列番号２９）またはＮＡＹＧＨＤＧＧＦＡＭＤＹ（配列番号１０９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む、重鎖可変領域を含む。本発明のそのような抗体または抗体断片は、アミノ酸配列ＲＡＳ（Ｅ／Ｑ）ＳＶＳＳＮ（Ｌ／Ｖ）Ａ（配列番号３２）またはＳ（Ｅ／Ｑ）ＳＶＳＳＮ（配列番号８７）を含むＣＤＲ１と、アミノ酸配列ＧＡＳＮＲＡＴ（配列番号３３）またはＧＡＳ（配列番号８２）を含むＣＤＲ２と、ＧＱＳＹＳＹＰＦＴ（配列番号３４）またはＳＹＳＹＰＦ（配列番号８３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む、軽鎖可変領域をさらに含む。
【０１１０】
一部の実施形態では、本発明の抗体または抗体断片は、アミノ酸配列ＳＹＧＶＤ（配列番号２２）またはＧＦＳＬＲＳＹ（配列番号７９）を含むＣＤＲ１と、アミノ酸配列ＶＩＷＧＧＧＧＴＮＹＮＳＡＬＭＡ（配列番号６２）またはＷＧＧＧＧ（配列番号８０）を含むＣＤＲ２と、ＨＡＹＧＨＤＧＧＦＡＭＤＹ（配列番号２９）またはＮＡＹＧＨＤＧＧＦＡＭＤＹ（配列番号１０９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３と含む、重鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、抗体または抗体断片はヒト化される。
【０１１１】
一部の実施形態では、本発明の抗体または抗体断片は、アミノ酸配列ＫＡＳＥＮＶＤＴＦＶＳ（配列番号６３）またはＳＥＮＶＤＴＦ（配列番号８１）を含むＣＤＲ１と、アミノ酸配列ＧＡＳＮＲＹＴ（配列番号６４）またはＧＡＳ（配列番号８２）を含むＣＤＲ２と、ＧＱＳＹＳＹＰＦＴ（配列番号３４）またはＳＹＳＹＰＦ（配列番号８３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む、軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、抗体または抗体断片はヒト化される。
【０１１２】
一部の実施形態では、本発明の抗体または抗体断片は、アミノ酸配列ＳＹＧＶＤ（配列番号２２）またはＧＦＳＬＲＳＹ（配列番号７９）を含むＣＤＲ１と、アミノ酸配列ＶＩＷＧＧＧＧＴＮＹＮＳＡＬＭＡ（配列番号６２）またはＷＧＧＧＧ（配列番号８０）を含むＣＤＲ２と、ＨＡＹＧＨＤＧＧＦＡＭＤＹ（配列番号２９）またはＮＡＹＧＨＤＧＧＦＡＭＤＹ（配列番号１０９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３と含む、重鎖可変領域を含む。そのような抗体または抗体断片は、アミノ酸配列ＫＡＳＥＮＶＤＴＦＶＳ（配列番号６３）またはＳＥＮＶＤＴＦ（配列番号８１）を含むＣＤＲ１と、アミノ酸配列ＧＡＳＮＲＹＴ（配列番号６４）またはＧＡＳ（配列番号８２）を含むＣＤＲ２と、ＧＱＳＹＳＹＰＦＴ（配列番号３４）またはＳＹＳＹＰＦ（配列番号８３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む、軽鎖可変領域をさらに含む。一部の実施形態では、抗体または抗体断片はヒト化される。
【０１１３】
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、（Ｅ／Ｑ）ＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱ（Ｐ／Ｓ）ＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＬＳ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＦＲ１と、ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷ（Ｌ／Ｖ）Ｇ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＦＲ２と、ＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡ（Ｋ／Ｒ）（配列番号４１）のアミノ酸配列を含むＦＲ３と、ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号４２）のアミノ酸配列を含むＦＲ４とを含む。一部の実施形態では、重鎖可変領域は、ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＬＳ（配列番号３５）およびＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＬＳ（配列番号３６）から選択されるアミノ酸配列を含むＦＲ１と、ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧ（配列番号３８）およびＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＧ（配列番号３９）から選択されるアミノ酸配列を含むＦＲ２と、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＦＲ３と、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＦＲ４とを含む。これらの同定されたアミノ酸配列は、１つもしくは複数の置換アミノ酸（例えば、親和性成熟からのもの）、または１つもしくは２つの保存的に置換されたアミノ酸を有することもある。
【０１１４】
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、ＥＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＶＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣ（配列番号４３）のアミノ酸配列を含むＦＲ１と、ＷＹＱＱ（Ｋ／Ｒ）ＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹ（配列番号４６）のアミノ酸配列を含むＦＲ２と、ＧＩＰ（Ａ／Ｄ）ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣ（配列番号４９）のアミノ酸配列を含むＦＲ３と、配列番号５０のアミノ酸配列を含むＦＲ４とを含む。一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号４３のアミノ酸配列を含むＦＲ１と、ＷＹＱＱＲＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹ（配列番号４４）およびＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹ（配列番号４５）から選択されるアミノ酸配列を含むＦＲ２と、ＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣ（配列番号４７）およびＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣ（配列番号４８）から選択されるアミノ酸配列を含むＦＲ３と、ＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号５０）のアミノ酸配列を含むＦＲ４とを含む。これらの同定されたアミノ酸配列は、１つもしくは複数の置換アミノ酸（例えば、親和性成熟からのもの）、または１つもしくは２つの保存的に置換されたアミノ酸を有することもある。
【０１１５】
それらの全長にわたって、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体の可変領域は、一般に、対応するヒト生殖系列可変領域アミノ酸配列と少なくとも約８５％、例えば、少なくとも約８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の全可変領域（例えば、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４）アミノ酸配列同一性を有することになる。例えば、抗ＧＩＴＲ抗体の重鎖は、ヒト生殖系列可変領域ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＲＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫ−ＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号８９および９１）（ＶＨ３  ３−１３／３０＋ＣＤＲ３＋ＪＨ４；ハイフンは、長さが可変的でありうるＣＤＲ３を表す）と少なくとも約８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有することができる。一実施形態では、配列番号８９の最後のアミノ酸、リジン（Ｋ）は、アルギニン（Ｒ）で置換される。抗ＧＩＴＲ抗体の軽鎖は、ヒト生殖系列可変領域ＥＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＶＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＮＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＴＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣ−ＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号９８および９４）（ＶＫＩＩＩ  Ｌ１６／Ａ２７＋ＣＤＲ３＋ＪＫ２；ハイフンは、長さが可変的でありうるＣＤＲ３を表す）と少なくとも約８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有することができる。一部の実施形態では、フレームワーク領域内のアミノ酸のみが付加、欠失または置換される。一部の実施形態では、配列同一異性比較は、ＣＤＲ３を除外する。
【０１１６】
【表１−１】
0006731403.tif 000005
【０１１７】
【表１−２】
0006731403.tif 000006
【０１１８】
【表１−３】
0006731403.tif 000007
【０１１９】
【表１−４】
0006731403.tif 000008
【０１２０】
【表１−５】
0006731403.tif 000009
【０１２１】
【表１−６】
0006731403.tif 000010
【０１２２】
【表１−７】
0006731403.tif 000011
【０１２３】
【表１−８】
0006731403.tif 000012
【０１２４】
【表１−９】
0006731403.tif 000013
【０１２５】
【表１−１０】
0006731403.tif 000014
【０１２６】
【表１−１１】
0006731403.tif 000015
【０１２７】
【表１−１２】
0006731403.tif 000016
【０１２８】
【表１−１３】
0006731403.tif 000017
【０１２９】
【表１−１４】
0006731403.tif 000018
【０１３０】
【表１−１５】
0006731403.tif 000019
【０１３１】
表１に収載した抗体のＣＤＲは、本明細書に記載するものを含む、当技術分野において公知の、周知ナンバリングシステムによって決定することができる。表２には、（１）Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（「カバット」ナンバリングスキーム）、ＮＩＨ公開番号９１−３２４２に記載されているナンバリングシステムの使用および（２）Chothia（Al-Lazikani et al., (1997) “Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins,” J.Mol.Biol. 273:927-948）によって定義されるＣＤＲを収載する。
【０１３２】
【表２−１】
0006731403.tif 000020
【０１３３】
【表２−２】
0006731403.tif 000021
【０１３４】
一部の実施形態では、ＧＩＴＲ（例えば、配列番号１、細胞プロセッシングを受けた配列番号１）と結合する本発明の抗ＧＩＴＲ抗体または抗体断片は：ｉ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号２２を含み、重鎖ＣＤＲ２が配列番号２３を含み、重鎖ＣＤＲ３が配列番号２９を含み、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号３０を含み、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３３を含み、軽鎖ＣＤＲ３が配列番号３４を含む、抗体、抗体断片、または抗原結合分子；ｉｉ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号２２を含み、重鎖ＣＤＲ２が配列番号２４を含み、重鎖ＣＤＲ３が配列番号２９を含み、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号３１を含み、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３３を含み、軽鎖ＣＤＲ３が配列番号３４を含む、抗体、抗体断片、または抗原結合分子；ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号２２を含み、重鎖ＣＤＲ２が配列番号２５を含み、重鎖ＣＤＲ３が配列番号２９を含み、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号３０を含み、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３３を含み、軽鎖ＣＤＲ３が配列番号３４を含む、抗体、抗体断片、または抗原結合分子；ｉｖ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号２２を含み、重鎖ＣＤＲ２が配列番号２６を含み、重鎖ＣＤＲ３が配列番号２９を含み、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号３０を含み、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３３を含み、軽鎖ＣＤＲ３が配列番号３４を含む、抗体、抗体断片、または抗原結合分子；ｖ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号２２を含み、重鎖ＣＤＲ２が配列番号２７を含み、重鎖ＣＤＲ３が配列番号２９を含み、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号３０を含み、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３３を含み、軽鎖ＣＤＲ３が配列番号３４を含む、抗体、抗体断片、または抗原結合分子；およびｖｉ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号２２を含み、重鎖ＣＤＲ２が配列番号２５を含み、重鎖ＣＤＲ３が配列番号１０９を含み、軽鎖ＣＤＲ１が配列番号３０を含み、軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３３を含み、軽鎖ＣＤＲ３が配列番号３４を含む、抗体、抗体断片、または抗原結合分子のうちのいずれか１つから選択される。一部の実施形態では、抗体または抗体断片はヒト化される。特定の実施形態では、抗体または抗体断片は、ヒト定常領域を含む。一部の実施形態では、抗体または抗体断片は、ＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む。ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、グリコシル化される。一部の実施形態では、抗体または抗体断片は修飾される、または修飾細胞で発現され、そのような修飾は、抗体または抗体断片のＦｃＲエフェクター機能の増加をもたらす。ある特定の実施形態では、抗体または抗原断片は、Ｔｅｆｆ：Ｔｒｅｇ比の上昇をｉｎ  ｖｉｖｏで誘導する。一部の実施形態では、抗体または抗原断片は、免疫応答増強をｉｎ  ｖｉｖｏで誘導する。一部の実施形態では、抗体または抗体断片は、第２の抗体または抗体断片と架橋された場合、配列番号１、配列番号２または配列番号３のアゴニストである。
【０１３５】
一部の実施形態では、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体または抗体断片は、配列番号１６の重鎖可変領域と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領域を含み、かつ配列番号１７の軽鎖可変領域と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。
【０１３６】
一部の実施形態では、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体または抗体断片は、配列番号６の重鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領域を含み、かつ配列番号７の軽鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。
【０１３７】
一部の実施形態では、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体または抗体断片は、配列番号８の重鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領域を含み、かつ配列番号９の軽鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。
【０１３８】
一部の実施形態では、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体または抗体断片は、配列番号１０の重鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領域を含み、かつ配列番号７の軽鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。
【０１３９】
一部の実施形態では、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体または抗体断片は、配列番号１２の重鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領域を含み、かつ配列番号７の軽鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。
【０１４０】
一部の実施形態では、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体または抗体断片は、配列番号１４の重鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する重鎖ポリペプチドを含み、かつ配列番号７の軽鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖ポリペプチドを含む。
【０１４１】
一部の実施形態では、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体または抗体断片は、配列番号９９の重鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領域を含み、かつ配列番号７の軽鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。
【０１４２】
一部の実施形態では、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体または抗体断片は、配列番号１０５の重鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領域を含み、かつ配列番号７の軽鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。
【０１４３】
一部の実施形態では、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体または抗体断片は、配列番号６１の重鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する重鎖ポリペプチドを含み、かつ配列番号５９の軽鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖ポリペプチドを含む。
【０１４４】
それらの全長にわたって、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体は、一般に、ヒトＩｇＧ１／カッパ定常領域アミノ酸配列と少なくとも約８５％、例えば、少なくとも約８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の全定常領域（例えば、ＩｇＧ１）アミノ酸配列同一性を有することになる。例えば、抗ＧＩＴＲ抗体の重鎖は、ヒトＩｇＧ１定常領域ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号２０）と少なくとも約８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有することができる。一実施形態では、太字のロイシン／ロイシン残基は、アラニン／アラニンで置換される。一実施形態では、最後のアミノ酸、リジン（Ｋ）は、アルギニン（Ｒ）で置換される。抗ＧＩＴＲ抗体の軽鎖は、ヒトカッパ軽鎖定常領域ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号２１）と少なくとも約８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有することができる。一部の実施形態では、定常領域内のアミノ酸は、付加、欠失または置換される。
【０１４５】
一部の実施形態では、そのような抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体である。ＶＨ、ＶＬ、完全長軽鎖、および完全長重鎖配列（アミノ酸配列、およびアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）を「混合し、マッチし」て、本発明の他のＧＩＴＲ結合抗体を作成することができる。そのような「混合し、マッチし」たＧＩＴＲ結合抗体を、当技術分野において公知の結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、および本実施例セクションに記載する他のアッセイ）を使用して試験して、活性を確認することができる。鎖を混合し、マッチする場合、特定のＶＨ／ＶＬ対合からのＶＨ配列は、構造的に類似したＶＨ配列で置き換えられると予想される。同様に、特定の完全長重鎖／完全長軽鎖対合からの完全長重鎖配列は、構造的に類似した完全長重鎖配列で置き換えられると予想される。同様に、特定のＶＨ／ＶＬ対合からのＶＬ配列は、構造的に類似したＶＬ配列で置き換えられると予想される。同様に、特定の完全長重鎖／完全長軽鎖対合からの完全長軽鎖配列は、構造的に類似した完全長軽鎖配列で置き換えられると予想される。したがって、一態様では、本発明は、配列番号６、８、１０、１２、１４、９９および１０５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号７および９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを有し、ＧＩＴＲと特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体または抗体断片を提供する。
【０１４６】
一部の実施形態では、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体または抗体断片は、配列番号６５、配列番号６９、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号１００および配列番号１０６のいずれかから選択される重鎖配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する重鎖ポリペプチドを含み、かつ配列番号６６または配列番号７０の軽鎖と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖ポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体または抗体断片は、配列番号６５、配列番号６９、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号１００および配列番号１０６のいずれかから選択される重鎖ポリペプチドを含み、かつ配列番号６６または配列番号７０の軽鎖ポリペプチドを含む。
【０１４７】
長さが２０アミノ酸未満の同定されたアミノ酸配列については、所望の特異的結合および／またはアゴニスト活性をなお保持しながら、１つまたは２つの保存的アミノ酸残基置換を許容することができる。
【０１４８】
本発明の抗ＧＩＴＲ抗体および抗体断片は、一般に、約１０−８Ｍもしくは１０−９Ｍ未満、例えば、または約１０−１０Ｍもしくは１０−１１Ｍ未満、および一部の実施形態では、約１０−１２Ｍもしくは１０−１３Ｍ未満の平衡解離定数（ＫＤ）で、１（配列番号１）、アイソフォーム２（配列番号２）およびアイソフォーム３（配列番号３）を含む、ＧＩＴＲに結合することになる。
【０１４９】
同じエピトープと結合する抗体
本発明は、ヒトＧＩＴＲのシステインリッチドメイン１（「ＣＲＤ１」、配列番号４：ＣＧＰＧＲＬＬＬＧＴＧＴＤＡＲＣＣＲＶＨＴＴＲＣＣＲＤＹＰＧＥＥＣＣＳＥＷＤＣ）とシステインリッチドメイン２（「ＣＲＤ２」、配列番号５：ＭＣＶＱＰＥＦＨＣＧＤＰＣＣＴＴＣＲＨＨＰＣＰＰＧＱＧＶＱＳＱＧＫＦＳＦＧＦＱＣ）とを含むエピトープと結合する抗体および抗体断片を提供し、抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、ｈＧＩＴＲのアゴニストであり、ならびに抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、場合により、インタクトなまたは増加されたＦｃＲエフェクター機能を有する。一部の実施形態では、抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、ヒトＧＩＴＲの配列番号８８を含むエピトープと結合する。一部の実施形態では、エピトープは、配列番号８８の中の残基を含む。一部の実施形態では、そのような抗体および抗体断片がｈＧＩＴＲのアゴニストである場合、エピトープは、ヒトＧＩＴＲの残基３４〜７２および７８の中のアミノ酸残基を含む。
【０１５０】
本発明は、表１に記載したＧＩＴＲ結合抗体が結合するのと同じエピトープと結合する抗体および抗体断片も提供する。したがって、さらなる抗体および抗体断片は、ＧＩＴＲ結合アッセイにおいて本発明の他の抗体と交差競合する（例えば、他の抗体の結合を、統計的に有意に、競合的に阻害する）それらの能力に基づいて同定することができる。試験抗体が、本発明の抗体および抗体断片のＧＩＴＲタンパク質（例えば、ヒトＧＩＴＲ）との結合を阻害できることは、試験抗体が、その抗体または抗体断片とｈＧＩＴＲとの結合について競合することができることを実証する。非限定的理論に従って、そのような抗体は、それが競合する抗体または抗体断片と同じまたは関連した（例えば、構造的に類似したまたは空間的に近接している）、ＧＩＴＲタンパク質上のエピトープと結合することができるだろう。ある特定の実施形態では、本発明の抗体または抗体断片とｈＧＩＴＲ上の同じエピトープと結合する抗体は、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体である。そのようなヒトまたはヒト化モノクローナル抗体は、本明細書に記載するように調製および単離することができる。
【０１５１】
改変および修飾抗体
出発抗体からの特性変化を有しうる修飾抗体または抗体断片を改変するための出発物質として、本明細書（例えば、表１）に示すＣＤＲおよび／またはＶＨおよび／またはＶＬ配列の１つまたは複数を有する抗体を使用して、本発明の抗体または抗体断片をさらに調製することができる。抗体または抗体断片は、一方または両方の可変領域（すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ）内の、例えば、１つもしくは複数のＣＤＲ領域内の、および／または１つもしくは複数のフレームワーク領域内の、１つまたは複数の残基を修飾することによって、改変することができる。加えて、または代替的に、抗体または抗体断片は、定常領域内の残基を、例えばその抗体のエフェクター機能を変化させるように修飾することによって、改変することができる。
【０１５２】
行うことができる１つのタイプの可変領域改変は、ＣＤＲグラフティングである。抗体は、主として、６つの重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）内に位置するアミノ酸残基によって、標的抗原と相互作用する。このために、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲ外の配列より個々の抗体間で多様性が高い。ＣＤＲ配列は、ほとんどの抗体−抗原相互作用に関与しているため、異なる特性を有する異なる抗体からのフレームワーク配列にグラフトされた特異的抗体からのＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することによって、その特異的抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である（例えば、Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332:323-327、Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522-525、Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad., U.S.A. 86:10029-10033、Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号明細書、ならびにＱｕｅｅｎらの米国特許第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６２号および同第６，１８０，３７０号明細補を参照されたい）。
【０１５３】
したがって、本発明の別の実施形態は、配列番号２２、７９および８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列と、配列番号２３、２４、２５、２６、２７、６２および８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列と、配列番号２９、３４および１０９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３配列とをそれぞれ有する重鎖可変領域、および配列番号３０、３１、６３、８１、８５および８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列と、配列番号３３、６４および８２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列と、配列番号３４および８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３配列とをそれぞれ有する軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片に関する。したがって、そのような抗体は、モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ  ＣＤＲ配列を含有するが、これらの抗体とは異なるフレームワーク配列を含有することもある。ある特定の実施形態では、単離された抗体または抗体断片は、この段落中の対応する配列と少なくとも約８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む。
【０１５４】
そのようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公開ＤＮＡデータベースまたは公開参考文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子についての生殖系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベース（インターネットでｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅにおいて入手可能）、ならびにKabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242、Tomlinson, I. M., et al., 1992 J. fol. Biol 227:776-798、およびCox, J. P. L. et al., 1994 Eur.J Immunol.24:827-836において見つけることができる。
【０１５５】
本発明の抗体に使用するためのフレームワーク配列の例は、本発明の選択された抗体によって使用されるフレームワーク配列、例えば、本発明のモノクローナル抗体によって使用されるコンセンサス配列および／またはフレームワーク配列に構造的に類似しているものである。ＶＨ  ＣＤＲ１、２および３配列、ならびにＶＬ  ＣＤＲ１、２および３配列を、フレームワーク配列が由来する生殖系列免疫グロブリン遺伝子に関して見いだされるものと同一の配列を有するフレームワーク領域にグラフトすることができ、またはＣＤＲ配列を、生殖系列配列と比較して１つもしくは複数の変異を含有するフレームワーク領域にグラフトすることができる。例えば、ある特定の場合、抗体の抗原結合能力を維持または強化するようにフレームワーク領域内の残基を変異させることは有益であることが判明している（例えば、Ｑｕｅｅｎらの米国特許第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６２号および同第６，１８０，３７０号明細書を参照されたい）。
【０１５６】
もう１つのタイプの可変領域修飾は、ＶＨおよび／またはＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤ２および／またはＣＤＲ３内のアミノ酸残基を、目的の抗体の１つまたは複数の結合特性（例えば、親和性）を向上させる結果となるように変異させることであり、これは、「親和性成熟」として公知である。部位特異的変異誘発またはＰＣＲ媒介変異誘発を行って変異を導入することができ、抗体結合または目的の他の機能的特性に対する効果を、本明細書に記載のおよび本実施例において提供するようなｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ、ならびに／または当技術分野において公知の代替もしくはさらなるアッセイで評価することができる。保存的修飾を導入することができる。変異は、アミノ酸置換、付加または欠失でありうる。さらに、典型的に、ＣＤＲ領域内の１、２、３、４または５つ以下の残基が変更される。
【０１５７】
本発明の改変抗体または抗体断片は、ＶＨおよび／ＶＬ内のフレームワーク残基に、例えば抗体の特性を向上させるように、修飾が加えられたものを含む。典型的に、そのようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を減少させるために行われる。例えば、１つのアプローチは、１つまたは複数のフレームワーク残基を対応する生殖系列配列に「逆変異させる」アプローチである。より具体的には、体細胞変異を受けた抗体は、その抗体が由来する生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含有しうる。そのような残基は、抗体フレームワーク配列とその抗体が由来する生殖系列配列とを比較することによって同定することができる。フレームワーク領域配列をそれらの生殖系列立体配置に戻すために、例えば部位特異的変異誘発によって、体細胞変異を生殖系列配列に逆変異させることができる。そのような、「逆変異」抗体も、本発明に包含されることが意図される。
【０１５８】
もう１つのタイプのフレームワーク修飾は、抗体の潜在的免疫原性を低下させる結果となるようにＴ細胞エピトープを除去するための、フレームワーク領域内のまたはさらには１つもしくは複数のＣＤＲ領域内の１つもしくは複数の残基の変異を含む。このアプローチは、「脱免疫化」とも呼ばれ、Ｃａｒｒらによって米国特許出願公開第２００３０１５３０４３号明細書にさらに詳細に記載されている。
【０１５９】
存在する場合、抗ＧＩＴＲ抗体または抗体断片の定常領域は、それぞれに見合った任意のタイプまたはサブタイプであることができ、および本方法によって処置される対象の種（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、または他の哺乳動物、例えば、農業用哺乳動物（例えば、ウマ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ラクダ科動物）、家庭用哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ）もしくは齧歯動物（例えば、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ））からのものであるように選択することができる。一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体は、ヒト化抗体またはＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（登録商標）抗体を生じさせるように改変される。一部の実施形態では、定常領域アイソタイプは、ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４である。ある特定の実施形態では、定常領域アイソタイプは、ＩｇＧ１である。
【０１６０】
フレームワークまたはＣＤＲ領域内になされる修飾に加えて、またはそのような修飾の代わりに、本発明の抗体または抗体断片は、概して血清半減期、補体結合、Ｆｃ領域結合および／または抗原依存性細胞傷害作用（cellular cytotoxicity）などの抗体の１つまたは複数の機能的特性を変更させるために、Ｆｃ領域内に修飾を含むように改変されることがある。さらに、かさねて抗体または抗体断片の１つまたは複数の機能的特性を変更させるために、本発明の抗体または抗体断片は、化学的に修飾されるか（例えば、１つもしくは複数の化学的部分を抗体に結合させることができ）またはそのグリコシル化を変更させるように修飾されうる。
【０１６１】
一実施形態では、ＣＨ１のヒンジ領域は、該ヒンジ領域のシステイン残基の数を変更するように、例えば、増加または減少させるように修飾される。このアプローチは、Ｂｏｄｍｅｒらによって米国特許第５，６７７，４２５号明細書に記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域内のシステイン残基の数を変更して、例えば、軽鎖および重鎖の組み立てを助長する、または抗体もしくは抗体断片の安定性を増加もしくは減少させる。
【０１６２】
別の実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域は、抗体の生物学的半減期を変化させるように変異される。より具体的には、抗体が、ネイティブＦｃ−ヒンジドメインＳｐＡ結合と比較して減少されたブドウ球菌（Staphylococcyl）プロテインＡ（ＳｐＡ）結合を有するように、Ｆｃ−ヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面領域に１つまたは複数のアミノ酸変異が導入される。このアプローチは、Ｗａｒｄらによって米国特許第６，１６５，７４５号明細書にさらに詳細に記載されている。
【０１６３】
別の実施形態では、抗体は、その生物学的半減期を増加させるように修飾される。様々なアプローチが可能である。例えば、Ｗａｒｄの米国特許第６，２７７，３７５号明細書に記載されているように、次の変異の１つまたは複数を導入することができる：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。あるいは、生物学的半減期を増加させるために、Ｐｒｅｓｔａらによって米国特許第５，８６９，０４６号および同第６，１２１，０２２号明細書に記載されているように、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから得られるサルベージ受容体結合エピトープをＣＨ１またはＣＬ領域内に含有するように抗体を変化させることができる。
【０１６４】
さらに他の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置き換えて抗体のエフェクター機能を変化させることによって、Ｆｃ領域が変更される。例えば、抗体が、親抗体の抗原結合性を保持するがエフェクターリガンドに対する親和性の変化を有するように、１つまたは複数のアミノ酸を異なるアミノ酸残基で置き換えることができる。親和性が変化されるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）、または補体のＣ１成分でありうる。このアプローチは、米国特許第５，６２４，８２１号および同第５，６４８，２６０号明細書に、両方ともＷｉｎｔｅｒらによって、さらに詳細に記載されている。
【０１６５】
別の実施形態では、抗体がＣ１ｑ結合の変化および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低減もしくは消失を有するように、アミノ酸残基から選択された１つまたは複数のアミノ酸を異なるアミノ酸残基で置き換えることができる。このアプローチは、Ｉｄｕｓｏｇｉｅらによって米国特許第６，１９４，５５１号明細書にさらに詳細に記載されている。
【０１６６】
そのような変異を含有する抗体は、低減された抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）もしくは補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を媒介する、またはＡＤＣＣもしくはＣＤＣを媒介しない。一部の実施形態では、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸残基Ｌ２３４およびＬ２３５は、Ａｌａ２３４およびＡｌａ２３５に置換される。一部の実施形態では、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸残基Ｎ２６７は、Ａｌａ２６７に置換される。
【０１６７】
別の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸残基は、補体を結合する抗体の能力を変化させる結果となるように変更される。このアプローチは、さらにＢｏｄｍｅｒらによってＰＣＴ国際公開第９４／２９３５１号パンフレットに記載されている。
【０１６８】
さらに別の実施形態では、Ｆｃ領域は、１つまたは複数のアミノ酸を修飾することによって、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力を増加させるように、および／またはＦｃγ受容体に対する抗体の親和性を増加させるように修飾される。このアプローチは、さらにＰｒｅｓｔａによってＰＣＴ国際公開第００／４２０７２号パンフレットに記載されている。さらに、ヒトＩｇＧ１上のＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに対する結合部位がマッピングされ、結合が改善されたバリアントが記載されている（Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604を参照されたい）。
【０１６９】
さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化が修飾される。例えば、非グリコシル化抗体を作製することができる（すなわち、この抗体にはグリコシル化がない）。グリコシル化を、例えば、抗体の「抗原」に対する親和性を増加させるように、変化させることができる。そのような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の１つまたは複数のグリコシル化部位を変化させることによって遂行することができる。例えば、１つまたは複数の可変領域フレームワークグリコシル化部位の排除をもたらす１つまたは複数のアミノ酸置換を行って、その結果、その部位でのグリコシル化を排除することができる。そのような非グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増加させることができうる。そのようなアプローチは、Ｃｏらによって米国特許第５，７１４，３５０号および同第６，３５０，８６１号明細書にさらに詳細に記載されている。
【０１７０】
加えて、または代替的に、グリコシル化のタイプが変化した抗体、例えば、フコシル残基の量が低減された低フコシル化抗体またはバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造が増加された抗体を作製することができる。そのようなグリコシル化パターンの変化は、抗体のＡＤＣＣ能力を増加させることが実証されている。そのような炭水化物修飾は、例えば、グリコシル化機構が変化した宿主細胞において抗体を発現させることによって遂行することができる。グリコシル化機構が変化した細胞は当技術分野において記載されており、そのような細胞を宿主細胞として使用して、該細胞において本発明の組換え抗体を発現させて、その結果、グリコシル化が変化した抗体を産生することができる。例えば、Ｈａｎｇらによる欧州特許第１，１７６，１９５号明細書には、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が機能的に破壊された細胞株であって、したがって、そのような細胞株において発現される抗体が低フコシル化を示す、細胞株が記載されている。ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ国際公開第０３／０３５８３５号パンフレットには、Ａｎｓ（２９７）結合炭水化物にフコースを結合させる能力が低下したバリアントＣＨＯ細胞株、Ｌｅｃｌ３細胞が記載されており、これもまた、その宿主細胞において発現される抗体は低フコシル化となる（Shields, R.L.et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照されたい）。ＵｍａｎａらによるＰＣＴ国際公開第９９／５４３４２号パンフレットには、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように改変された細胞株であって、この改変された細胞株において発現される抗体が、バイセクティングＧｌｃＮａｃ構造の増加を示し、その結果、抗体のＡＤＣＣ活性が増加されることになる、細胞株が記載されている（Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180も参照されたい）。
【０１７１】
代替フレームワークまたは足場への抗原結合ドメインのグラフティング
結果として得られるポリペプチドが、ＧＩＴＲと特異的に結合する少なくとも１つの結合領域を含むのであれば、多種多様な抗体／免疫グロブリンフレームワークまたは足場を利用することができる。そのようなフレームワークまたは足場は、５つの主要イディオタイプのヒト免疫グロブリンまたはそれらの断片を含み、かつ他の動物種の免疫グロブリン、好ましくはヒト化態様を有するものを含む。単一重鎖抗体、例えば、ラクダ科動物において同定されたものは、この関連で特に興味深い。新規フレームワーク、足場および断片は、当業者によって発見および開発され続けている。
【０１７２】
一態様では、本発明は、本発明のＣＤＲをグラフトすることができる非免疫グロブリン足場を使用する、非免疫グロブリンベースの抗体の作成に関する。標的ＧＩＴＲタンパク質（例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＧＩＴＲ）に対して特異的な結合領域を含むのであれば、既知のまたは未来の非免疫グロブリンフレームワークおよび足場を利用することができるだろう。既知の非免疫グロブリンフレームワークまたは足場としては、フィブロネクチン（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、アンキリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ  ＡＧ、Ｚｕｒｉｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｌｔｄ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、およびＡｂｌｙｎｘ  ｎｖ、Ｚｗｉｊｎａａｒｄｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）、リポカリン（Ｐｉｅｒｉｓ  Ｐｒｏｔｅｏｌａｂ  ＡＧ、Ｆｒｅｉｓｉｎｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、小モジュラー免疫薬（Ｔｒｕｂｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）、マキシボディ（Ａｖｉｄｉａ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）、プロテインＡ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ  ＡＧ、Ｓｗｅｄｅｎ）、およびアフィリン（ガンマ−クリスタリンまたはユビキチン）（Ｓｃｉｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ＧｍｂＨ、Ｈａｌｌｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７３】
フィブロネクチン足場は、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（例えば、１０番目のフィブロネクチンＩＩＩ型モジュール（１０Ｆｎ３ドメイン））に基づく。フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインは、２つのベータシート間に分布している７または８本のベータ鎖を有し、該ベータ鎖は、それら自体が互いに密集してタンパク質のコアを形成しており、およびドメインは、（ＣＤＲに類似した）ループをさらに有し、該ループは、ベータ鎖を互いに接続しており、溶媒に露出している。ベータシートサンドイッチの各縁部にはそのようなループが少なくとも３つあり、縁部は、ベータシートの方向に対して垂直のタンパク質の境界である（米国特許第６，８１８，４１８号明細書を参照されたい）。これらのフィブロネクチンベースの足場は、免疫グロブリンではないが、その折り畳み構造全体は、重鎖可変領域である最小機能性抗体断片（ラクダおよびラマＩｇＧの場合は全抗原認識ユニットを含む）のものに密接に関連している。この構造のため、非免疫グロブリン抗体は、抗体のものと性質および親和性の点で類似している抗原結合特性を模倣する。ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗体の親和性成熟過程に類似しているｉｎ  ｖｉｔｒｏでのループランダム化およびシャフリング戦略にこれらの足場を使用することができる。これらのフィブロネクチンベースの分子は、標準的なクローニング技術を使用して分子のループ領域を本発明のＣＤＲで置き換えることができる足場として使用することができる。
【０１７４】
アンキリン技術は、異なる標的との結合のために使用することができる可変領域を有する足場としてアンキリン由来反復モジュールを有するタンパク質を使用することに基づく。アンキリン反復モジュールは、２つの逆平行のαヘリックスとβターンからなる３３アミノ酸ポリペプチドである。可変領域の結合は、ほとんどの場合、リボソームディスプレイを使用することによって最適化される。
【０１７５】
アビマーは、ＬＲＰ−１などの天然Ａドメイン含有タンパク質に由来する。これらのドメインは、本質的にはタンパク質間相互作用に使用され、ヒトの場合、２５０を超えるタンパク質が構造的にＡドメインに基づく。アビマーは、アミノ酸リンカーによって連結された多数の異なる「Ａドメイン」単量体（２〜１０）からなる。例えば、米国特許出願公開第２００４０１７５７５６号、同第２００５００５３９７３号、同第２００５００４８５１２号および同第２００６０００８８４４号明細書に記載されている方法論を使用して、標的抗原と結合することができるアビマーを作成することができる。
【０１７６】
アフィボディアフィニティーリガンドは、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインのうちの１つのドメインの足場に基づく３ヘリックスバンドルで構成されている、小さい単純タンパク質である。プロテインＡは、細菌、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）からの表面タンパク質である。この足場ドメインは５８のアミノ酸からなり、そのうちの１３を無作為に選んで、多数のリガンドバリアントを有するアフィボディライブラリーを作成する（例えば、米国特許第５，８３１，０１２号明細書を参照されたい）。アフィボディ分子は抗体を模倣し、それらは、１５０ｋＤａである抗体の分子量と比較して、６ｋＤａの分子量を有する。その小さいサイズにもかかわらず、アフィボディ分子の結合部位は、抗体のものに類似している。
【０１７７】
アンチカリンは、Ｐｉｅｒｉｓ  ＰｒｏｔｅｏＬａｂ  ＡＧ社によって開発された製品である。アンチカリンは、化学的感受性または不溶性化合物の生理的輸送または貯蔵に通常は関与する小さい頑強なタンパク質の広範囲にわたる群である、リポカリンから誘導される。数種の天然リポカリンがヒト組織または体液中に存在する。そのタンパク質構造は、免疫グロブリンを想起させるものであり、堅固なフレームワークの上部に超可変ループがある。しかし、抗体またはそれらの組換え断片とは対照的に、リポカリンは、１６０〜１８０アミノ酸残基を有する単一のポリペプチド鎖で構成されており、単一免疫グロブリンドメインよりほんのわずかに大きい。結合ポケットを構成する４ループのセットは、顕著な構造的可塑性を示し、様々な側鎖を許容する。それ故、その結合部位は、独自のプロセスで再形成されて、高い親和性および特異性で異なる形状の所定の標的分子を認識することができる。リポカリンファミリーの１つのタンパク質である、オオモンシロチョウ（Pieris Brassicae）のビリン結合タンパク質（ＢＢＰ）は、４ループのセットの変異誘発によるアンチカリンの開発に使用されている。アンチカリンを記載している特許出願の一例は、ＰＣＴ国際公開第１９９９１６８７３号パンフレットにある。
【０１７８】
アフィリン分子は、タンパク質および小分子に対する特異的親和性のために設計される、小さい非免疫グロブリンタンパク質である。各々が異なるヒト由来足場タンパク質に基づく２つのライブラリーから、新たなアフィリン分子を非常に迅速に選択することができる。アフィリン分子は、免疫グロブリンタンパク質との構造的相同性を一切示さない。現在、２つのアフィリン足場が利用されており、その一方は、ヒトの眼の水晶体構造タンパク質であるガンマクリスタリンであり、他方は、「ユビキチン」スーパーファミリータンパク質である。両方のヒト足場は、非常に小さく、高温安定性を示し、ｐＨ変化および変性剤に対してほぼ耐性である。この高い安定性は、主として、これらのタンパク質の拡張ベータシート構造に起因する。ガンマクリスタリン由来タンパク質の例は、国際公開第２００１０４１４４号パンフレットに記載されており、「ユビキチン様」タンパク質の例は、国際公開第２００４１０６３６８号パンフレットに記載されている。
【０１７９】
タンパク質エピトープ模倣体（ＰＥＭ）は、タンパク質間相互作用に関与する主要二次構造である、タンパク質のベータ−ヘパリン二次構造を模倣する、中型で環状のペプチド様分子（ＭＷ  １〜２ｋＤａ）である。
【０１８０】
ヒトまたはヒト化抗体
本発明は、ＧＩＴＲタンパク質（例えば、ヒトＧＩＴＲ）と特異的に結合する改変ヒト抗体を提供する。キメラ、霊長類化またはヒト化抗体と比較して、本発明のヒトＧＩＴＲ結合抗体は、ヒト対象に投与されたとき、さらに低減された抗原性を有する。
【０１８１】
ヒトＧＩＴＲ結合抗体は、当技術分野において公知である方法を使用して作成することができる。例えば、Ｈｕｍａｎｅｅｒｅｄ（登録商標）技術プラットフォーム（ＫａｌｏＢｉｏｓ、Ｓｏｕｔ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）を使用して、非ヒト抗体を改変ヒト抗体に変換した。米国特許出願公開第２００５０００８６２５号明細書には、抗体内の非ヒト抗体可変領域をヒト可変領域で置き換えるが、非ヒト抗体のものと比較して同じ結合特徴を維持するまたはより良好な結合特徴を提供する、ｉｎ  ｖｉｖｏ方法が記載されている。この方法は、非ヒト参照抗体の可変領域の完全ヒト抗体でのエピトープに誘導された置き換えに依存する。結果として得られるヒト抗体は、一般に、参照非ヒト抗体とは構造上無関係であるが、その参照抗体と同じ抗原上の同じエピトープと結合する。
【０１８２】
本発明の抗ＧＩＴＲ抗体は、参照抗体の特異性および親和性を保持する上にヒト生殖系列Ｖ領域配列と実質的なアミノ酸配列同一性を有するＶ領域配列を有する、改変ヒト抗体に基づく。米国特許出願公開第２００５／０２５５５５２号明細書および米国特許出願公開第２００６／０１３４０９８号明細書を参照されたい（両方の特許文献は、本明細書中での参照により本明細書に組み入れられている）。この改善方法は、参照抗体の可変領域から抗原結合特異性を決定するために必要な最小配列情報を同定し、ヒト部分Ｖ領域遺伝子配列のライブラリーにその情報を移動させ、ヒト抗体Ｖ領域のエピトープに焦点を合わせたライブラリーを作成する。微生物に基づく分泌系を使用して、抗体Ｆａｂ断片としてライブラリーのメンバーを発現させることができ、例えばコロニーリフト結合アッセイを使用して、そのライブラリーを抗原結合Ｆａｂについてスクリーニングする。例えば、米国特許出願公開第２００７／００２０６８５号明細書を参照されたい。陽性クローンをさらに特性決定し、最も高い親和性を有するものを同定することができる。結果として得られる改変ヒトＦａｂは、親の参照抗ＧＩＴＲ抗体の結合特異性を保持し、典型的に、抗原に対して親抗体と比較して同等以上の親和性を有し、ヒト生殖系列抗体Ｖ領域と比較して高い配列同一性を有するＶ領域を有する。
【０１８３】
エピトープに焦点を合わせたライブラリーを作成するために必要な最小結合特異性決定因子（ＢＳＤ）は、典型的に、重鎖ＣＤＲ３（「ＣＤＲＨ３」）内の配列および軽鎖ＣＤＲ３（「ＣＤＲＬ３」）内の配列によって代表される。ＢＳＤは、ＣＤＲ３の一部分を含むこともあり、またはＣＤＲ３の全長を含みうる。ＢＳＤは、連続するアミノ酸残基で構成されるか、または連続していないアミノ酸残基で構成されうる。場合によっては、エピトープに焦点を合わせたライブラリーは、ＢＳＤを含有する参照抗体からの特有のＣＤＲ３−ＦＲ４領域に連結されたヒトＶセグメント配列とヒト生殖系列Ｊセグメント配列とから構築される（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２５５５５２号明細書を参照されたい）。あるいは、最初に参照抗体Ｖセグメントの一部だけがヒト配列のライブラリーによって置き換えられる逐次カセット置き換えによって、ヒトＶセグメントライブラリーを作成することができる。次いで、残りの参照抗体アミノ酸配列に関して結合を支持する同定されたヒト「カセット」を第２のライブラリースクリーニングで組み換えて、完全ヒトＶセグメントを作成する（米国特許出願公開第２００６／０１３４０９８号明細書を参照されたい）。
【０１８４】
それぞれの場合、参照抗体からの特異性決定因子を含有する、対の重鎖ＣＤＲ３セグメントと軽鎖ＣＤＲ３セグメント、ＣＤＲ３−ＦＲ４セグメントまたはＪセグメントが結合特異性を制約するために使用され、ライブラリーから得られる抗原結合因子は参照抗体のエピトープ特異性を保持する。ライブラリー構築中にさらなる成熟変化を各鎖のＣＤＲ３領域に導入して、最適な結合反応速度を有する抗体を同定することができる。結果として得られる改変ヒト抗体は、ヒト生殖系列ライブラリーに由来するＶセグメント配列を有し、ＣＤＲ３領域内からの短いＢＳＤ配列を保持し、ヒト生殖系列フレームワーク４（ＦＲ４）領域を有する。
【０１８５】
ラクダ科動物抗体
新世界メンバー、例えばラマ種（例えば、アルパカ（Lama paccos）、ラマ（Lama glama）、およびビクーニャ（Lama vicugna））を含む、ラクダおよびヒトコブラクダ（フタコブラクダ（Camelus bactrianus）およびヒトコブラクダ（Calelus dromaderius））ファミリーは、サイズ、構造の複雑さ、およびヒト対象に対する抗原性に関して特性決定されている。自然界で見られるときのこの哺乳動物ファミリーのある特定のＩｇＧ抗体は、軽鎖を欠いており、したがって、他の動物からの抗体についての、２本の重鎖と２本の軽鎖を有する典型的な４本鎖四次構造とは、構造的に異なる。国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１４号（１９９４年３月３日に発行された国際公開第９４／０４６７８号）パンフレットを参照されたい。
【０１８６】
ＶＨＨとして同定された小さい単一可変ドメインであるラクダ科動物抗体の領域は、結果として「ラクダ科動物ナノボディ」として公知の低分子量抗体由来タンパク質となる、標的に対して高い親和性を有する小タンパク質を生じさせる遺伝子操作によって、得ることができる。１９９８年６月２日発行の米国特許第５，７５９，８０８号明細書を参照されたい。Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Chem 279: 1256-1261、Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424: 783-788、Pleschberger, M. et al. 2003 Bioconjugate Chem 14: 440-448、Cortez-Retamozo, V. et al. 2002 Int J Cancer 89: 456-62、およびLauwereys, M. et al. 1998 EMBO J 17: 3512-3520も参照されたい。ラクダ科動物抗体および抗体断片の改変ライブラリーは、例えばＡｂｌｙｎｘ、Ｇｈｅｎｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍから市販されている。非ヒト起源の他の抗体と同様に、ラクダ科動物抗体のアミノ酸配列を組換えにより変更して、ヒト配列により酷似している配列を得ることができる、すなわち、ナノボディを「ヒト化」することができる。このようにして、ラクダ科動物抗体のヒトに対する天然の低い抗原性をさらに低下させることができる。
【０１８７】
ラクダ科動物ナノボディは、ヒトＩｇＧ分子のもののおおよそ１０分の１の分子量を有し、そのタンパク質は、ほんの数ナノメートルの物理的直径を有する。この小さいサイズの１つの帰結は、より大きい抗体タンパク質には機能的に気付かれない抗原部位に結合するラクダ科動物ナノボディの能力であり、すなわち、ラクダ科動物ナノボディは、そうでなければ隠れている抗原を古典的免疫学的技法を使用して検出する試薬として有用であり、および可能性のある治療剤として有用である。したがって、小さいサイズのさらにもう１つの帰結は、ラクダ科動物ナノボディが、標的タンパク質の溝または狭い間隙内の特異的部位への結合の結果として標的タンパク質を阻害することができ、したがって、古典的抗体の機能より古典的低分子量薬の機能に酷似している能力で機能することができることである。
【０１８８】
さらに、この低分子量および小型サイズによって、極めて熱安定性であり、極端なｐＨに対しておよびタンパク質消化に対して安定性であり、ならびに抗原性が低い、ラクダ科動物ナノボディが得られる。もう１つの帰結は、ラクダ科動物ナノボディが、循環系から組織に容易に移動し、さらには血液脳関門を横断すること、そして神経組織を冒す障害を処置できることである。ナノボディは、血液脳関門を横断する薬物輸送をさらに助長することができる。２００４年８月１９日発行の米国特許出願公開第２００４０１６１７３８号明細書を参照されたい。ヒトに対する低い免疫原性を併せ持つこれらの特色は、大きな治療上の可能性を示す。さらに、これらの分子を大腸菌（E. coli）などの原核細胞において発現させることができ、これらの分子は、バクテリオファージとの融合タンパク質として発現され、機能性である。
【０１８９】
したがって、本発明の特色は、ＧＩＴＲに対して高い親和性を有するラクダ科動物抗体またはナノボディである。本明細書におけるある特定の実施形態では、ラクダ科動物抗体またはナノボディは、ラクダ科動物において天然に産生される、すなわち、他の抗体について本明細書に記載する技法を使用するＧＩＴＲまたはそのペプチド断片での免疫処置後にラクダ科動物によって産生される。あるいは、ＧＩＴＲ結合ラクダ科動物ナノボディを改変する、すなわち、選択、例えば、本明細書の実施例に記載するような標的としてのＧＩＴＲを用いるパニング手順を使用する適切に変異誘発されたラクダ科動物ナノボディタンパク質のファージディスプレイのライブラリーからの選択によって生成する。改変されたナノボディを、遺伝子操作によって、レシピエント対象において４５分〜２週間の半減期を有するようにさらにカスタマイズすることができる。特定の実施形態では、ラクダ科動物またはナノボディは、例えば国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１４号パンフレット記載されているように、本発明のヒト抗体の重鎖または軽鎖のＣＤＲ配列をナノボディまたはシングルドメイン抗体フレームワーク配列にグラフトすることによって得られる。一部の実施形態では、本発明は、下で説明する方法に従って、多価ラクダ科動物抗体またはナノボディを提供する。
【０１９０】
多価抗体
別の態様では、本発明のＧＩＴＲ結合抗体またはその断片を含む（単一特異性、二重特異性または多重特異性）多価分子を提供する。本発明の抗体またはその抗原結合領域を誘導体化して、または別の機能性分子、例えば別のペプチドもしくはタンパク質（例えば、別の抗体もしくは受容体リガンド）に連結させて、少なくとも２つの異なる結合部位（同じ標的部位もしくは分子であってもよく、または異なる標的部位もしくは分子であってもよい）と結合する多価分子を生成することができる。一部の実施形態では、本発明の抗体を誘導体化して、または１つより多くの他の機能性分子に（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合性会合によって、もしくは別のやり方で）機能的に連結させて、同じ標的分子上の同じまたは異なる結合部位である２つ以上の異なる結合部位と結合する多価分子を生成する。ある特定の実施形態では、多価結合部位は同じものである。一部の実施形態では、本発明の抗体を誘導体化して、または１つより多くの他の機能性分子に連結させて、少なくとも２つの標的分子上の２つ以上の異なる結合部位に結合する多重特異性分子を生成する。そのような多重特異性分子も、本明細書において使用する用語「二重特異性」または「多重特異性」によって包含されることが意図される。本発明の二重特異性分子を作成するために、本発明の抗体を１つまたは複数の他の結合分子、例えば、別の抗体、抗体断片、ペプチドまたは結合模倣体に（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合性会合によって、もしくは別のやり方で）機能的に連結させることができ、その結果、多価分子が得られる。本発明は、ＧＩＴＲに対する少なくとも第１の結合特異性と第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性とを備えている二重特異性分子を含む。例えば、第２の標的エピトープは、第１の標的エピトープとは異なる、ＧＩＴＲの別のエピトープである。加えて、分子が多重特異性である本発明については、一部の実施形態において、分子は、第１および第２の標的エピトープに加えて、第３の結合特異性部をさらに含む。
【０１９１】
一実施形態では、本発明の二重特異性分子は、結合特異性部として、少なくとも１つの抗体またはその抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２もしくは一本鎖Ｆｖを含む）を含む。抗体は、軽鎖もしくは重鎖二量体、またはその任意の最小断片、例えば、ＦｖもしくはＬａｄｎｅｒら米国特許第４，９４６，７７８号明細書に記載されているような一本鎖構築物であってもよい。
【０１９２】
ダイアボディは、短すぎて同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にすることができないリンカーによって接続されている、ＶＨおよびＶＬドメインが単一ポリペプチド鎖上で発現される二価の二重特異性分子である。ＶＨおよびＶＬドメインは、別の鎖の相補ドメインと対合することによって、２つの抗原結合部位を生成する（例えば、Holliger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448、Poljak et al., 1994 Structure 2:1121-1123を参照されたい）。構造ＶＨＡ−ＶＬＢおよびＶＨＢ−ＶＬＡ（ＶＨ−ＶＬ立体配置）またはＶＬＡ−ＶＨＢおよびＶＬＢ−ＶＨＡ（ＶＬ−ＶＨ立体配置）のどちらかを有する２本のポリペプチド鎖を発現させることによって、ダイアボディを生成することができる。それらの大部分は、細菌において可溶性形態で発現させることができる。一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）は、２つのダイアボディ形成性ポリペプチド鎖をおおよそ１５アミノ酸残基のリンカーで接続することによって生成される（Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(3-4):128-30、Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36を参照されたい）。ｓｃＤｂは、細菌において可溶性の活性単量体形態で発現させることができる（Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(34): 128-30、Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36、Pluckthun and Pack, 1997 Immunotechnology, 3(2): 83-105、Ridgway et al., 1996 Protein Eng., 9(7):617-21を参照されたい）。ダイアボディをＦｃに融合させて「ジダイアボディ」を作成することができる（Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279(4):2856-65を参照されたい）。
【０１９３】
本発明の二重特異性分子に利用することができる他の抗体は、マウス、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体である。
【０１９４】
本発明の二重特異性および／または多価分子は、当技術分野において公知の方法を使用して、成分結合特異性部をコンジュゲートさせることによって調製することができる。例えば、二重特異性および／または多価分子の各々の結合特異性部を別々に作成し、その後、互いにコンジュゲートさせる。結合特異性部がタンパク質またはペプチドである場合、様々なカップリング剤または架橋剤を共有コンジュゲートのために使用することができる。架橋剤の例としては、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオ酢酸（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）、および４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スルホスクシンイミジル（スルホ−ＳＭＣＣ）が挙げられる（例えば、Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686、Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648を参照されたい）。他の方法としては、Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78,118-132、Brennan et al., 1985 Science 229:81-83、およびGlennie et al., 1987 J. Immunol.139: 2367-2375に記載されているものが挙げられる。コンジュゲート剤は、ＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣであり、これらは両方ともＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から入手することができる。
【０１９５】
結合特異性部が抗体である場合、２本の重鎖の定常ドメインヒンジ領域のスルフヒドリル結合によってそれらを結合させることができる。特定の実施形態では、ヒンジ領域は、結合前に、奇数のスルフヒドリル残基、例えば１つ、を含有するように修飾される。
【０１９６】
あるいは、結合特異性部を同じベクターにコードさせ、同じ宿主細胞において発現させ、組み立てることができる。この方法は、二重特異性および／または多価分子がｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２、またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合、特に有用である。本発明の二重特異性および／または多価分子は、１つの一本鎖抗体と結合決定因子とを含む一本鎖分子か、または２つの結合決定因子を含む一本鎖二重特異性分子でありうる。二重特異性分子は、少なくとも２つの一本鎖分子を含みうる。二重特異性分子を調製する方法は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号明細書、米国特許第５，４５５，０３０号明細書、米国特許第４，８８１，１７５号明細書、米国特許第５，１３２，４０５号明細書、米国特許第５，０９１，５１３号明細書、米国特許第５，４７６，７８６号明細書、米国特許第５，０１３，６５３号明細書、米国特許第５，２５８，４９８号明細書、および米国特許第５，４８２，８５８明細書に記載されている。
【０１９７】
二重特異性および／または多価分子のそれらの特異的標的への結合は、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＥＡ）、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ（例えば、成長阻害）、またはウェスタンブロットアッセイによって確認することができる。これらのアッセイの各々は、一般に、特に目的のタンパク質−抗体複合体の存在を、その目的の複合体に特異的な標識された試薬（例えば、抗体）を利用することによって検出する。
【０１９８】
半減期が延長された抗体
本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期が延長された、ＧＩＴＲタンパク質と特異的に結合する抗体および抗体断片を提供する。
【０１９９】
多くの因子がタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期に影響を及ぼしうる。例えば、腎臓濾過、肝臓での代謝、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）による分解、および免疫原性応答（例えば、抗体によるタンパク質中和、ならびにマクロファージおよび樹状細胞による取り込み）。様々な戦略を使用して、本発明の抗体の半減期を延長することができる。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ｒｅＣＯＤＥ  ＰＥＧ、抗体足場、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミン結合リガンド、および炭水化物シールドへの化学的連結によって；血清タンパク質、例えば、アルブミン、ＩｇＧ、ＦｃＲｎと結合して移動させるタンパク質との遺伝子融合によって；血清タンパク質と結合する他の結合部分、例えば、ナノボディ、Ｆａｂ、ＤＡＲＰｉｎ、アビマー、アフィボディおよびアンチカリンとの（遺伝子もしくは化学的）カップリングによって；ｒＰＥＧ、アルブミン、アルブミンのドメイン、アルブミン結合タンパク質およびＦｃとの遺伝子融合によって、またはナノ担体、徐放製剤もしくは医療機器への組み込みによって。
【０２００】
抗体の血清循環をｉｎ  ｖｉｖｏで延長するために、高分子量ＰＥＧなどの不活性ポリマー分子を抗体またはその断片に、多官能性リンカーを用いてまたは用いずに、抗体のＮ末端もしくはＣ末端へのＰＥＧの部位特異的結合によって、またはリジン残基上に存在するイプシロン−アミノ基を介して結合させることができる。抗体をＰＥＧ化するために、典型的に、抗体またはその断片とポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えば、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体とを、１つまたは複数のＰＥＧ基が抗体または抗体断片に結合される条件下で反応させる。ＰＥＧ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）を用いるアシル化反応またはアルキル化反応によって行われる。本明細書で使用する場合、用語「ポリエチレングリコール」は、他のタンパク質、例えば、モノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−もしくはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドを誘導体化するために使用されてきた、あらゆる形態のＰＥＧを包含することを意図したものである。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ化される抗体は、非グリコシル化抗体である。生物学的活性の損失をほとんどもたらさない直鎖状または分岐状ポリマー誘導体化が使用されることになる。コンジュゲート度をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析によって厳密にモニターして、ＰＥＧ分子の抗体への適切なコンジュゲートを保証することができる。未反応ＰＥＧは、サイズ排除によってまたはイオン交換クロマトグラフィーによって抗体−ＰＥＧコンジュゲートから分離することができる。ＰＥＧ誘導体化抗体は、当業者に周知の方法を使用して、例えば、本明細書に記載するイムノアッセイによって、結合活性についてはもちろんｉｎ  ｖｉｖｏ有効性についても試験することができる。タンパク質をＰＥＧ化する方法は当技術分野において公知であり、それらの方法を本発明の抗体に適用することができる。例えば、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａらの欧州特許第０１５４３１６号明細書およびＩｓｈｉｋａｗａらの欧州特許第０４０１３８４号明細書を参照されたい。
【０２０１】
他の改良ＰＥＧ化技術は、ｔＲＮＡシンセターゼとｔＲＮＡとを含む再構成系によって、化学的に規定される側鎖を生合成タンパク質に組み込む、再構成化学的直交配向操作技術（reconstituting chemically orthogonal directed engineering technology、ＲｅＣＯＤＥ  ＰＥＧ）を含む。この技術は、大腸菌（E. coli）、酵母および哺乳動物細胞における生合成タンパク質への３０個より多くのアミノ酸の組み込みを可能にする。ｔＲＮＡは、アンバーコドンが位置するあらゆる場所に非ネイティブアミノ酸を組み込み、その結果、終止コドンからのアンバーは、化学的に規定されるアミノ酸の組み込みのシグナルを伝達するものに変換される。
【０２０２】
組換えＰＥＧ化技術（ｒＰＥＧ）も血清半減期延長に使用することができる。この技術は、３００〜６００アミノ酸不定形タンパク質テールを既存の医薬タンパク質（pharmaceutical protein）に遺伝子的に融合させることを含む。そのような不定形タンパク質鎖の見かけの分子量は、その実際の分子量より約１５倍大きいため、そのタンパク質の血清半減期は大幅に増加される。化学的結合および再精製を必要とする旧来のＰＥＧ化とは対照的に、製造工程が大いに単純化され、生成物は均質である。
【０２０３】
ポリシアル化は、もう１つの技術であり、これは、天然ポリマーポリシアル酸（ＰＳＡ）を使用して、治療用ペプチドおよびタンパク質の活性寿命を延長し、安定性を向上させる。ＰＳＡは、シアル酸（糖）のポリマーである。タンパク質および治療用ペプチド薬送達に使用した場合、ポリシアル酸は、結合によって保護的微小環境を提供する。このポリシアル酸は、循環中の治療用タンパク質の活性寿命を増加させ、治療用タンパク質が免疫系によって認識されるのを防ぐ。ＰＳＡポリマーは、ヒトの体内に自然に見られる。ＰＳＡポリマーは、特定の細菌によって採用され、それらの細菌は、それらの壁をＰＳＡポリマーで覆うように何百万年にもわたって進化した。これらの天然にポリシアル化された細菌は、それ故、分子擬態によって身体の防御系の裏をかくことができた。自然界の究極のステルス技術であるＰＳＡをそのような細菌から大量にかつ所定の物理的特徴で容易に産生させることができる。細菌ＰＳＡは、ヒトの体内のＰＳＡと化学的に同一であるので、タンパク質とカップリングしたときでさえ完全に非免疫原性である。
【０２０４】
もう１つの技術は、抗体に連結されたヒドロキシエチルデンプン（「ＨＥＳ」）誘導体の使用を含む。ＨＥＳは、ワキシートウモロコシデンプンに由来する変性天然ポリマーであり、身体の酵素によって代謝されうる。ＨＥＳ溶液は、不足血液量を代替するために、および血液のレオロジー特性を向上させるために、通常は投与される。抗体のＨＥＳ化は、分子の安定性を増加させることによって、および腎クリアランスを低下させ、その結果、生物学的活性を増加させることによって、循環半減期の延長を可能にする。ＨＥＳの分子量などの様々なパラメータを変動させることによって、広範なＨＥＳ抗体結合体をカスタマイズすることができる。
【０２０５】
１つまたは複数のアミノ酸修飾（すなわち、置換、挿入または欠失）をＩｇＧ定常領域、またはそのＦｃＲｎ結合断片（好ましくは、ＦｃもしくはヒンジＦｃドメイン断片）を導入して、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期が増加した抗体を作成することもできる。例えば、国際公開第９８／２３２８９号パンフレット、国際公開第９７／３４６３１号パンフレット、および米国特許第６，２７７，３７５号明細書を参照されたい。
【０２０６】
さらに、抗体をアルブミンとコンジュゲートさせて、よりｉｎ  ｖｉｖｏ安定性が高いまたはより長いｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有する抗体または抗体断片を作製することができる。これらの技法は当技術分野で周知であり、例えば、国際公開第９３／１５１９９号、同第９３／１５２００号および同第０１／７７１３７号パンフレット、ならびに欧州特許第４１３，６２２号明細書を参照されたい。
【０２０７】
半減期を増加させる戦略は、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の増加が所望されるナノボディ、フィブロネクチンベースの結合因子および他の抗体またはタンパク質に特に有用である。
【０２０８】
抗体コンジュゲート
本発明は、異種タンパク質またはポリペプチド（またはそれらの断片）に（好ましくは、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０または少なくとも１００アミノ酸のポリペプチドに）組換えで融合されたまたは化学的にコンジュゲートされた（共有コンジュゲートと非共有コンジュゲートの両方を含む）ＧＩＴＲタンパク質と特異的に結合して融合タンパク質を生成する、抗体またはその断片を提供する。詳細には、本発明は、本明細書に記載する抗体の抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ＶＨドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ、ＶＬドメインまたはＶＬ  ＣＤＲ）と異種タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドとを含む融合タンパク質を提供する。タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを抗体または抗体断片に融合するまたはコンジュゲートさせる方法は当技術分野において公知である。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号、同第５，６２２，９２９号、同第５，３５９，０４６号、同第５，３４９，０５３号、同第５，４４７，８５１号および同第５，１１２，９４６号明細書、欧州特許第３０７，４３４号および同第３６７，１６６号明細書、国際公開第９６／０４３８８号および同第９１／０６５７０号パンフレット、Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539、Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5600、およびVil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341を参照されたい。
【０２０９】
遺伝子シャフリング、モチーフシャフリング、エクソンシャフリングおよび／またはコドンシャフリング（総称して「ＤＮＡシャフリング」と呼ぶ）技術によってさらなる融合タンパク質を作成することができうる。ＤＮＡシャフリングを利用して、本発明の抗体またはそれらの断片（例えば、より高い親和性およびより低い解離速度を有する抗体またはそれらの断片）の活性を変化させてもよい。一般に、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号および同第５，８３７，４５８号明細書、Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33、Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82、Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76、およびLorenzo and Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308-313を参照されたい（これらの特許および出版物の各々は、その全体が参照により本明細書に組み入れられている）。抗体もしくはそれらの断片、またはコードされた抗体もしくはそれらの断片は、組換え前にエラープローンＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入または他の方法によるランダム変異誘発に付すことによって変化させることができるだろう。ＧＩＴＲタンパク質と特異的に結合する抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチドを、１つまたは複数の異種分子の１つまたは複数の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断片などと組み換えてもよい。
【０２１０】
さらに、抗体またはそれらの断片をペプチドなどのマーカー配列に融合させて、精製を助長することができる。好ましい実施形態では、マーカーアミノ酸配列は、数ある中でもｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ、９１３１１）に備えられているタグなどの、ヘキサ−ヒスチジン（ＨＨＨＨＨＨ配列番号１１）ペプチドであり、これらの多くが市販されている。例えば、Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824に記載されているように、ヘキサ−ヒスチジン（配列番号１１）は、融合タンパク質の簡便な精製をもたらす。精製に有用な他のポリペプチドタグとしては、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応するヘマグルチニン（「ＨＡ」）タグ（Wilson et al., 1984, Cell 37:767）、および「ＦＬＡＧ」タグが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１１】
他の実施形態では、診断剤または検出可能な薬剤とコンジュゲートされた本発明の抗体またはそれらの断片。そのような抗体は、特定の治療の有効性の判定などの、臨床試験手順の一部としての疾患または障害の発症、発現、進行および／または重症度のモニタリングまたは予後予測に有用でありうる。そのような診断および検出は、検出可能な物質に抗体をカップリングすることによって遂行することができ、そのような検出可能な物質としては、様々な酵素、例えば、これらに限定されるものではないが、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼ；補欠分子族、例えば、これらに限定されるものではないが、ストレプトアビジン／ビオチン（streptavidinlbiotin）およびアビジン／ビオチン；蛍光物質、例えば、これらに限定されるものではないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリン；発光物質、例えば、これに限定されるものではないが、ルミノール；生物発光物質、例えば、これらに限定されるものではないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリン；放射性物質、例えば、これらに限定されるものではないが、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉおよび１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎおよび１１１Ｉｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎおよび１１７Ｔｉｎ；ならびに様々な陽電子放出断層撮影を使用する陽電子放出金属；ならびに非放射性常磁性金属イオンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１２】
本発明は、所与の生物学的効果または応答を修飾する治療用部分または薬物部分にコンジュゲートされた抗体またはその断片、および治療用部分に結合された抗体またはそれらの断片の使用をさらに包含する。治療用部分または薬物部分は、古典的化学療法剤に限定されると見なすべきではない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質、ペプチドまたはポリペプチドであってもよい。そのようなタンパク質としては、例えば、毒素、例えばアブリン、リシンＡ、緑膿菌（pseudomonas）外毒素、コレラ毒素もしくはジフテリア毒素；タンパク質、例えば、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトーシス剤、抗血管新生剤；または例えばリンホカインなどの生物学的応答修飾物質を挙げることができるだろう。治療用部分、例えば、細胞毒、例えば細胞分裂停止もしくは細胞破壊剤、治療剤または放射性金属、例えばアルファ放射体に、抗体またはその断片をコンジュゲートさせてもよい。細胞毒または細胞傷害性薬剤は、細胞に有害であるあらゆる薬剤を含む。
【０２１３】
例えば、抗体を治療用部分、例えば、放射性金属イオン、例えばアルファ放出体、例えば２１３Ｂｉにコンジュゲートさせることができ、または放射性金属イオン（１３１Ｉｎ、１３１ＬＵ、１３１Ｙ、１３１Ｈｏ、１３１Ｓｍを含むがこれらに限定されない）をポリペプチドにコンジュゲートさせるのに有用な大環状キレート剤にコンジュゲートさせることができる。ある特定の実施形態では、大環状キレート剤は、リンカー分子を介して抗体に結合させることができる１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）である。そのようなリンカー分子は、例えば、グリシンリンカー、例えばＧＧＧＧＳ（配列番号１５）（これは、場合により反復されていることがあり、例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１８）または他のリンカーを含み、当技術分野において一般に公知であり、Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4(10):2483-90、Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10(4):553-7、およびZimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50に記載されており、参考文献の各々は、それら全体が参照により組み込まれている。
【０２１４】
治療用部分を抗体にコンジュゲートさせる技法は周知であり、例えば、Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al.(eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)、Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery”, in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al.(eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)、Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al.(eds.), pp. 475-506 (1985)、“Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al.(eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)、およびThorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58を参照されたい。
【０２１５】
抗体を固体支持体に結合させてもよく、これらは、標的抗原のイムノアッセイまたは精製に特に有用である。そのような固体支持体としては、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１６】
アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体をコードするポリヌクレオチド
抗ＧＩＴＲ抗体、抗原結合分子、およびそれらの断片は、組換え発現、化学合成、および抗体四量体の酵素的消化を含むがこれらに限定されない、当技術分野において公知の任意の手段によって産生させることができる一方で、完全長モノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマまたは組換え産生によって得ることができる。組換え発現は、当技術分野において公知の任意の適切な宿主細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞などからでありうる。
【０２１７】
本発明は、本明細書に記載する抗体をコードするポリヌクレオチド、例えば、本明細書に記載の相補性決定領域を含む重鎖または軽鎖可変領域またはセグメントをコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。一部の実施形態では、重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号１０１および配列番号１０７から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５２、配列番号５４および配列番号１０２から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を有する配列を含む。
【０２１８】
一部の実施形態では、重鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号６７のポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を有する。一部の実施形態では、軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号６８のポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を有する。
【０２１９】
一部の実施形態では、重鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号７２のポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を有する。一部の実施形態では、軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号７３の選択されたポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を有する。
【０２２０】
一部の実施形態では、重鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号７４のポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を有する。一部の実施形態では、軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号６８のポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一異を有する。
【０２２１】
一部の実施形態では、重鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号７６のポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を有する。一部の実施形態では、軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号６８のポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を有する。
【０２２２】
一部の実施形態では、重鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号７８のポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を有する。一部の実施形態では、軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号６８のポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を有する。
【０２２３】
一部の実施形態では、重鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１０３からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を有する。一部の実施形態では、軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１０４のポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を有する。
【０２２４】
一部の実施形態では、重鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１０８のポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を有する。一部の実施形態では、軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１０４のポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を有する。
【０２２５】
一部の実施形態では、重鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号６０のポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を有する。一部の実施形態では、軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５８のポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を有する。
【０２２６】
本発明のポリヌクレオチドは、抗ＧＩＴＲ抗体の可変領域配列のみをコードすることができる。それらは、抗体の可変領域と定常領域の両方をコードすることもできる。ポリヌクレオチド配列の一部は、例示マウス抗ＧＩＴＲ抗体のうちの１つの重鎖と軽鎖の両方の可変領域を含むポリペプチドをコードする。一部の他のポリヌクレオチドは、マウス抗体のうちの１つの重鎖および軽鎖の可変領域とそれぞれ実質的に同一である２つのポリペプチドセグメントをコードする。
【０２２７】
ポリヌクレオチド配列をデノボ固相ＤＮＡ合成によって産生させることができ、または抗ＧＩＴＲ抗体もしくはその結合断片をコードする既存の配列（例えば、本明細書に記載の配列）のＰＣＲ変異誘発によって産生させることができる。核酸の直接化学合成は、当技術分野において公知の方法、例えば、Narang et al., Meth.Enzymol.68:90, 1979のホスホトリエステル法、Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979のホスホジエステル法、Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981のジエチルホスホロアミダイト法、米国特許第４，４５８，０６６号明細書の固体支持体法によって、遂行することができる。ＰＣＲによるポリヌクレオチド配列への変異の導入は、例えば、PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A.Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992、PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al.(Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990、Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991、およびEckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991に記載されているように行うことができる。
【０２２８】
本発明では、上に記載した抗ＧＩＴＲ抗体を産生させるための発現ベクターおよび宿主細胞も提供する。様々な発現ベクターを利用して、抗ＧＩＴＲ抗体鎖、断片または結合断片をコードするポリヌクレオチドを発現させることができる。ウイルスベースの発現ベクターと非ウイルス発現ベクターの両方を哺乳動物宿主細胞における抗体の産生に使用することができる。非ウイルスベクターおよびシステムは、プラスミド、エピソームベクター（典型的に、タンパク質またはＲＮＡを発現するための発現カセットを有する）、およびヒト人工染色体を含む（例えば、Harrington et al., Nat Genet 15:345, 1997を参照されたい）。例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞における抗ＧＩＴＲポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に有用な非ウイルスベクターは、ｐＴｈｉｏＨｉｓ  Ａ、ＢおよびＣ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓ  Ａ、ＢおよびＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＭＰＳＶベクター、ならびに他のタンパク質を発現させるための当技術分野において公知の他の非常に多くのベクターを含む。有用なウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０に基づくベクター、パピローマウイルス、ＨＢＰエプスタイン・バーウイルス、ワクシニアウイルスベクター、およびセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）を含む。Brent et al., supra、Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995、およびRosenfeld et al., Cell 68:143, 1992を参照されたい。
【０２２９】
発現ベクターの選択は、ベクターが発現されることになる意図した宿主細胞に依存する。通常は、発現ベクターは、プロモーターおよび他の調節配列（例えば、エンハンサー）を含有し、これらは、抗ＧＩＴＲ抗体鎖または断片をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、誘導性プロモーターは、誘導条件下以外での挿入配列の発現を防止するために用いられる。誘導性プロモーターとしては、例えば、アラビアラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモーターまたは熱ショックプロモーターが挙げられる。形質転換生物の培養物を、発現産物が宿主細胞によってよりよく許容されるコード配列に集団を偏らせることなく、非誘導条件下で拡大増殖させることができる。プロモーターに加えて、他の調節エレメントも、抗ＧＩＴＲ抗体鎖または断片の効率的発現のために必要とされるまたは所望されることがある。これらのエレメントは、通常は、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接リボソーム結合部位または他の配列を含む。加えて、細胞系に適しているエンハンサーを使用に含めることによって発現の効率を上げることができるだろう（例えば、Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994、およびBittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987を参照されたい）。例えば、ＳＶ４０エンハンサーまたはＣＭＶエンハンサーを使用して、哺乳動物宿主細胞における発現を増加させることができうる。
【０２３０】
発現ベクターは、挿入抗ＧＩＴＲ抗体配列によってコードされているポリペプチドを有する融合タンパク質を形成するための分泌シグナル配列位置も提供することができるだろう。より多くの場合、挿入抗ＧＩＴＲ抗体配列は、ベクターに含める前にシグナル配列に連結される。抗ＧＩＴＲ抗体軽鎖および重鎖可変ドメインをコードする配列を受け入れるために使用されることになるベクターは、定常領域またはその一部分もコードすることがある。そのようなベクターは、定常領域を有する融合タンパク質としての可変領域の発現を可能にすることによって、インタクト抗体またはその断片の産生をもたらす。典型的に、そのような定常領域はヒトのものである。
【０２３１】
抗ＧＩＴＲ抗体鎖を保有し、発現する宿主細胞は、原核性、または真核性のいずれかでありうる。大腸菌（E. coli）は、本発明のポリヌクレオチドのクローニングおよび発現に有用な１つの原核生物宿主である。使用に好適な他の微生物宿主としては、桿菌、例えば枯草菌（Bacillus subtilis）、および他の腸内細菌科（enterobacteriaceae）、例えば、サルモネラ属（Salmonella）、セラチア属（Serratia）および様々なシュードモナス属（Pseudomonas）種が挙げられる。これらの原核生物宿主の場合、その宿主細胞と適合性の発現制御配列（例えば、複製起点）を典型的に含有する発現ベクターも作製することができる。加えて、任意の数の様々な周知のプロモーター、例えば、ラクトースプロモーターシステム、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム、ベータ−ラクタマーゼプロモーターシステム、またはファージラムダからのプロモーターシステムが存在することになる。プロモーターは、典型的に、発現を、場合によりオペレーター配列で、制御し、ならびに転写および翻訳の開始および完了のためのリボソーム結合部位配列などを有する。酵母などの他の微生物を利用して、本発明の抗ＧＩＴＲポリペプチドを発現させることもできる。バキュロウイルスベクターと組み合わせた昆虫細胞を使用することもできる。
【０２３２】
一部の好ましい実施形態では、哺乳動物宿主細胞が、本発明の抗ＧＩＴＲポリペプチドを発現および産生させるために使用される。例えば、それらは、内在性免疫グロブリン遺伝子を発現するハイブリドーマ細胞株（例えば、本実施例に記載の骨髄腫ハイブリドーマクローン）、または外来性発現ベクターを保有する哺乳類細胞株（例えば、下で例示するＳＰ２／０骨髄腫細胞）のいずれかでありうる。これらは、あらゆる正常な死ぬべき運命の、または正常な、または異常な不死の動物またはヒト細胞を含む。例えば、インタクト免疫グロブリンを分泌することができる多数の好適な宿主細胞株が開発されており、そのような細胞株としては、ＣＨＯ細胞株、様々なＣｏｓ細胞株、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞株、形質転換Ｂ細胞およびハイブリドーマが挙げられる。ポリペプチドを発現させるための哺乳動物組織細胞培養の使用は、一般に、例えば、Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987において論じされている。哺乳動物宿主細胞のための発現ベクターは、発現制御配列、例えば、複製起点、プロモーター、およびエンハンサー（例えば、Queen et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986を参照されたい）、ならびに必要なプロセッシング情報部位、例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列を含むことができる。これらの発現ベクターは、哺乳動物遺伝子にまたは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターを通常は含有する。好適なプロモーターは、構成的、細胞型特異的、病期特異的、および／またはモジュレート可能もしくは調節可能でありうる。有用なプロモーターとしては、メタロチオネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰ  ｐｏｌＩＩＩプロモーター、構成的ＭＰＳＶプロモーター、テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモーター（例えば、ヒト最初期ＣＭＶプロモーター）、構成的ＣＭＶプロモーター、および当技術分野において公知のプロモーターとエンハンサーの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３３】
目的のポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを導入する方法は、細胞宿主のタイプによって変る。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは一般に原核細胞に用いられるが、他の細胞にはリン酸カルシウム処置またはエレクトロポレーションを使用することができるだろう（一般に、Sambrook et al., supraを参照されたい）。他の方法としては、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム処置、リポソーム媒介形質転換、インジェクションおよびマイクロインジェクション、バリスティック法、ビロソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質ＶＰ２２との融合（Elliot and O'Hare, Cell 88:223, 1997）、薬剤増進ＤＮＡ取り込み、およびｅｘ  ｖｉｖｏ形質導入が挙げられる。組換えタンパク質の長期、高収率産生のために、多くの場合、安定的発現が所望されるであろう。例えば、抗ＧＩＴＲ抗体鎖または結合断片を安定的に発現する細胞株を、ウイルス複製起点または内在性発現エレメントと選択マーカー遺伝子とを含有する本発明の発現ベクターを使用して調製することができる。ベクターの導入後、細胞を富化培地中で１〜２日間放置して成長させた後、培地を選択培地に切り替える。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与することであり、その存在によって、選択培地において導入配列をうまく発現する細胞の成長が可能になる。安定的にトランスフェクトされた耐性細胞を、その細胞型に適している組織培養技術を使用して増殖させることができる。
【０２３４】
アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体を同定するためのアッセイ
アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体を同定するためのアッセイは当技術分野において公知であり、本明細書に記載されている。アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体は、ＧＩＴＲと結合し、ＧＩＴＲによる細胞内シグナル伝達を促進し、誘導し、刺激する。
【０２３５】
抗ＧＩＴＲ抗体のＧＩＴＲとの結合は、当技術分野において公知の任意の方法を使用して判定することができる。例えば、ＧＩＴＲとの結合は、限定ではないがＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ）およびフローサイトメトリーを含む、公知の技術を使用して判定することができる。
【０２３６】
ＧＩＴＲによる細胞内シグナル伝達は、当技術分野において公知の任意の方法を使用して測定することができる。例えば、ＧＩＴＲによる活性化は、ＮＦκＢおよびＭＡＰＫシグナル伝達を促進する。ＮＦκＢおよびＭＡＰＫ活性化を測定する方法は、当技術分野において標準的である（例えば、レポーター遺伝子アッセイの使用、ＮＦκＢタンパク質の核移行、ＭＡＰＫタンパク質のリン酸化状態）。ＧＩＴＲによる活性化は、Ｔ細胞受容体による活性化の存在下で（例えば、一次抗原または標的抗原の存在下で）活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を促進する共刺激シグナルである。細胞の増殖を測定する方法は、当技術分野において標準的である（例えば、３Ｈ−チミジン取り込みアッセイ、ＣＦＳＥ標識）。ＧＩＴＲによるシグナル伝達はまた、Ｔ細胞受容体による活性化の存在下で活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を共刺激して、サイトカインを産生させる。ＧＩＴＲによるシグナル伝達はまた、活性化ＮＫ細胞を共刺激して、サイトカインを産生させる。サイトカインは、Ｔｈ１型サイトカイン（例えば、インターフェロン−γ、ＩＬ−２およびＴＮＦ）およびＴＨ２型サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３）のどちらかまたは両方であることができる。サイトカイン産生を測定する方法は、当技術分野において周知である（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ）。ＧＩＴＲによる活性化は、アポトーシスも誘導しうる。細胞のアポトーシスを測定する方法は、当技術分野において標準的である（例えば、アネキシンＶ染色）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを行う場合、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体と接触した試験細胞または試験細胞からの培養上清を、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体と接触したことがない対照細胞または対照細胞からの上清と比較することができる。
【０２３７】
本抗体のＧＩＴＲアゴニスト機能性をｉｎ  ｖｉｖｏで測定することもできる。好ましいアゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体には、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化するおよび拡大増殖させる能力がある。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ活性化および増殖は、当技術分野において公知の任意の方法を使用して、例えば、フローサイトメトリーによって測定することができる。好ましいアゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体は、腫瘍増殖の阻害または腫瘍退縮の促進に治療上有用でありうる。腫瘍増殖、またはその阻害は、当技術分野において公知の任意の方法（例えば、目視検査、カリパス、重量、ＭＲＩを含む撮像技術）を使用して測定することができる。好ましいアゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体は、感染性疾患、例えば、細菌、真菌、ウイルスまたは寄生虫感染症の原因因子の防止、低減、阻害または排除に治療上有用でありうる。Ｔ細胞応答を増強する点または疾患の重症度を低下させる点でのアゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体の有効性は、治療有効量の抗体を対象に投与し、抗体の投与前後の対象を比較することによって、判定することができる。Ｔ細胞応答を増強する点または疾患の重症度を低下させる点でのアゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体の有効性は、治療有効量の抗体を試験対象に投与し、試験対象と抗体を投与していない対照対象とを比較することによって、判定することもできる。
【０２３８】
アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体を含む組成物
本発明は、医薬的に許容される担体と共に製剤化された本抗ＧＩＴＲ抗体または抗原結合分子を含む医薬組成物を提供する。場合により、医薬組成物は、所与の障害の処置または予防に好適である１種または複数の他の治療剤をさらに含有する。医薬的に許容される担体は、組成物を強化もしくは安定化する、または組成物の調製を助長する。医薬的に許容される担体としては、生理的に適合性である、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などが挙げられる。
【０２３９】
本発明の医薬組成物は、当技術分野において公知の様々な方法によって投与することができる。投与経路および／または方式は、所望される結果によって変る。静脈内、筋肉内、腹腔内もしくは皮下的である投与、または標的部位の近位に投与される投与が好ましい。医薬的に許容される担体は、（例えば、注射または注入による）静脈内、筋肉内、皮下、非経口、鼻腔内、吸入、脊髄または表皮投与に好適であると予想される。投与経路に依存して、活性化合物、例えば、本発明の抗体または抗原結合断片または多価分子（例えば、単一特異性、二重特異性もしくは多重特異性分子）は、その化合物を不活性化しうる酸の作用および他の自然条件からその化合物を保護するための物質でコーティングされることがある。
【０２４０】
単独でのまたは他の好適な成分との組合せでの抗体またはその断片を、吸入によって投与されるエアロゾル製剤にすることができる（すなわち、それらを「噴霧する」ことができる）。エアロゾル製剤を、加圧された許容可能な噴射剤（propellant）、例えばジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などに入れることができる。
【０２４１】
一部の実施形態では、組成物は、無菌であり、流体である。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合は必要粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えばマンニトールまたはソルビトール、および塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチン、を組成物に含めることによってもたらすことができる。ある特定の実施形態では、組成物を、保存のために、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を使用して凍結乾燥形態で調製することができる。
【０２４２】
本発明の医薬組成物は、当技術分野において周知の日常的に実施されている方法に従って調製することができる。医薬的に許容される担体は、一つには投与される特定の組成物によって決まり、その組成物を投与するために使用される特定の方法によっても決まる。したがって、本発明の医薬組成物には多種多様な好適な製剤がある。抗体の製剤化ならびに適切な投与およびスケジューリングの決定に適用可能な方法は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., University of the Sciences in Philadelphia, Eds., Lippincott Williams & Wilkins (2005)において、およびMartindale: The Complete Drug Reference, Sweetman, 2005, London: Pharmaceutical Press.において、およびMartindale, Martindale: The Extra Pharmacopoeia, 31st Edition., 1996, Amer Pharmaceutical Assn, and Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978において見つけることができ、これらの参考文献の各々は、本明細書中での参照により本明細書に組み入れられている。医薬組成物はＧＭＰ条件下で製造することが好ましい。典型的に、抗ＧＩＴＲ抗体の治療有効用量または治療上効果的な用量が本発明の医薬組成物に用いられる。抗ＧＩＴＲ抗体は、当業者に公知の従来の方法によって医薬的に許容される剤形に製剤化される。投与計画は、所望の応答（例えば、治療応答）をもたらすように調整される。治療または予防有効用量を決定する場合、低用量を投与し、その後、望ましくない副作用をほとんどまたは全く伴わずに所望の応答が達成されるまで、漸増させることができる。例えば、単一のボーラスを投与してもよく、いくつかに分割された用量を、時間を掛けて投与してもよく、または治療状況の緊急の要求による指示に応じて比例的に低減もしくは増加させてもよい。投与の容易さおよび投薬量の均一性のため単位剤形での非経口組成物の製剤化が特に有利である。本明細書で使用する場合の単位剤形は、処置すべき対象に対する単位投薬量として適している物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要医薬担体と共同で所望の治療効果を生じさせるように計算された所定量の活性化合物を含有する。
【０２４３】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルを変動させて、特定の患者、組成物および投与方式に対する所望の治療応答を達成するのに有効であり、患者にとって毒性でない、活性成分の量を得ることができる。選択される投薬量レベルは、様々な薬物動態因子に依存し、そのような因子には、利用される本発明の特定の組成物またはそれらのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与の回数、利用される特定の化合物の排泄率、処置の継続期間、利用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または材料、処置を受ける患者の年齢、性別、体重、状態、総体的な健康および過去の病歴、ならびにこれらに類する因子が含まれる。
【０２４４】
第２の薬剤との共製剤
一部の実施形態では、薬理学的組成物は、抗ＧＩＴＲ抗体または抗原結合分子と第２の薬理学的薬剤との混合物を含む。本抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体または抗原結合分子との混合物に含めるための例示的な第２の薬剤としては、限定ではないが、一次抗原または標的抗原、腫瘍細胞の免疫原性を増加させる薬剤、共阻害性シグナルを阻害または抑制する薬剤が挙げられる。
【０２４５】
本発明の抗ＧＩＴＲ抗体または抗原結合分子は、一次抗原または標的抗原と共製剤化する（すなわち、混合物として提供するまたは混合物で調製する）ことができる。標的抗原またはワクチンは、処置すべき病状に依存することになる。例えば、標的抗原は、腫瘍細胞、細菌細胞、真菌、ウイルスまたは寄生虫からのものでありうる。標的抗原は、必要に応じて、ペプチド、ポリペプチド、細胞またはポリヌクレオチドの形態であることができる。
【０２４６】
一実施形態では、標的抗原は、ウイルスからのものであり、該ウイルスは、例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、単純ヘルペスＩ型（ＨＳＶ  Ｉ）、単純ヘルペスＩＩ型（ＨＳＶ  ＩＩ）、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス（echinovirus）、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ  Ｉ）およびヒト免疫不全ウイルスＩＩ型（ＨＩＶ  ＩＩ）、任意のピコルナウイルス科（picornaviridae）、エンテロウイルス、カリシウイルス科（caliciviridae）、ノーウォークウイルス群のいずれか、トガウイルス、例えばアルファウイルス、フラビウイルス、コロナウイルス、狂犬病ウイルス、マールブルグウイルス、エボラウイルス、パラインフルエンザウイルス、オルソミクソウイルス、ブンヤウイルス、アレナウイルス、レオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩ型、サル免疫不全ウルス、レンチウイルス、ポリオーマウイルス、パルボウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ヒトヘルペスウイルス６、オナガザルヘルペスウイルス１（Ｂウイルス）、ならびにポックスウイルスからなる群から選択される。
【０２４７】
一実施形態では、標的抗原は、細菌からのものであり、該細菌は、例えば、ナイセリア属種（Neisseria spp）、連鎖球菌属種（Streptococcus spp）、ミュータンス菌（S. mutans）、ヘモフィルス属種（Haemophilus spp.）、モラクセラ属種（Moraxella spp）、ボルデテラ属種（Bordetella spp）、マイコバクテリウム属種（Mycobacterium spp）、レジオネラ属種（Legionella spp）、大腸菌属種（Escherichia spp）、ビブリオ属種（Vibrio spp）、エルシニア属種（Yersinia spp）、カンピロバクター属種（Campylobacter spp）、サルモネラ属種（Salmonella spp）、リステリア属種（Listeria spp.）、ヘリコバクター属種（Helicobacter spp）、シュードモナス属種（Pseudomonas spp）、ブドウ球菌属種（Staphylococcus spp.）、腸球菌属種（Enterococcus spp）、クロストリジウム属種（Clostridium spp.）、バチルス属種（Bacillus spp）、コリネバクテリウム属種（Corynebacterium spp.）、ボレリア属種（Borrelia spp.）、エーリキア属種（Ehrlichia spp）、リケッチア属種（Rickettsia spp）、クラミジア属種（Chlamydia spp.）、レプトスピラ属種（Leptospira spp.）、トレポネーマ属種（Treponema spp.）からなる群から選択される。
【０２４８】
一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体または抗原結合分子は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）との混合物で共製剤化される。ＴＡＡは、単離されたポリペプチドまたはペプチドであるか、インタクト細胞の一部、または腫瘍溶解物の一部でありうる。ＴＡＡは、ポリヌクレオチド、例えば、裸のプラスミド、または１つもしくは複数のＴＡＡをコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターでありうる。公知のＴＡＡの例としては、限定ではないが、黒色腫関連抗原（黒色腫に関連するＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＴＲＰ−２、メラノソーム膜糖タンパク質ｇｐ１００、ｇｐ７５およびＭＵＣ−１（ムチン−１））；例えば卵巣、黒色腫または結腸がんに関連しうるＣＥＡ（がん胎児抗原）；卵巣癌によって発現される葉酸受容体アルファ；骨髄腫を含むがこれに限定されない多くの異なる腫瘍によって発現される遊離ヒト絨毛性ゴナドトロピンベータ（ｈＣＧβ）サブユニット；乳がんに関連するＨＥＲ−２／ｎｅｕ；小細胞肺がんに関連する脳脊髄炎抗原ＨｕＤ；神経芽細胞腫に関連するチロシンヒドロキシラーゼ；前立腺がんに関連する前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）；卵巣がんに関連するＣＡ１２５が挙げられ、Ｂ細胞リンパ腫のイディオタイプ決定因子は、（イディオタイプ特異的体液性免疫応答に起因する）腫瘍特異的免疫を生じさせることができる。さらに、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の抗原は、ウイルス誘導ヒト成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）に対して特異的なＣＴＬ応答および抗腫瘍免疫を誘導することが証明されている。例えば、Haupt, et al., Experimental Biology and Medicine (2002) 227:227-237、Ohashi, et al., Journal of Virology (2000) 74(20):9610-9616を参照されたい。他のＴＡＡは公知であり、抗ＧＩＴＲ抗体との共製剤化に使用される。
【０２４９】
一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体または抗原結合分子は、患者からの自家腫瘍細胞と、または別の患者からの同じ組織型の同種異形腫瘍細胞と共製剤化される。腫瘍細胞は、インタクト細胞、腫瘍細胞溶解物、アポトーシス腫瘍細胞または全腫瘍ｍＲＮＡの形態でありうる。患者における腫瘍細胞の免疫原性を強化または増強するポリペプチドを発現するように腫瘍細胞にトランスフェクトすることができ、例えば、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を発現するようにトランスフェクトすることができる。腫瘍細胞は、限定ではないが上皮がんまたは上皮癌ならびに肉腫およびリンパ腫を含む、任意のがん性組織からのものでありうる。一部の実施形態では、がんは、黒色腫、卵巣がん、腎がん、結腸直腸がん、前立腺、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を含む肺がん、乳がん、神経膠腫、線維肉腫、血液がん、または頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）である。例えば、Pardee, et al, Immunotherapy (2009) 1(2):249-264、およびその中で論じられている参考文献を参照されたい。一実施形態では、腫瘍細胞は、例えば、膵臓がん、黒色腫、乳がん、肺がん、気管支がん、結腸直腸がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、膀胱がん、脳または中枢神経系のがん、末梢神経系のがん、食道がん、子宮頸がん、子宮または子宮内膜がん、口腔または咽頭がん、肝臓がん、腎臓がん、精巣がん、胆道がん、小腸または虫垂がん、唾液腺がん、甲状腺がん、副腎がん、骨肉腫、軟骨肉腫、および血液組織のがんからのものである。
【０２５０】
一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体または抗原結合分子は、細胞傷害性薬剤と共製剤化される。例えば、抗ＧＩＴＲ抗体または抗原結合分子は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）と結合して該Ｔｒｅｇを低減または枯渇させるアゴニスト抗体または抗原結合分子と共製剤化される。例示的Ｔｒｅｇ細胞枯渇抗体または抗原結合分子は、ＣＤ２５またはＣＣＲ４と結合する。Expert Opin Ther Patents (2007) 17(5):567-575、およびその中で論じられている参考文献を参照されたい。
【０２５１】
一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体または抗原結合分子は、共阻害性シグナルの阻害剤と共製剤化される。例示的阻害剤としては、ＣＴＬＡ−４の阻害剤、およびＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１（例えば、Ｂ７−Ｈ１）相互作用の阻害剤が挙げられる。一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体は、ＣＴＬＡ−４と結合してＣＴＬＡ−４を阻害する抗体と、共製剤化される。一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体は、ＴＩＭ３と結合してＴＩＭ３を阻害する抗体と、共製剤化される。一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体は、ＬＡＧ３と結合してＬＡＧ３を阻害する抗体と、共製剤化される。一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体は、ＰＤ−１と結合してＰＤ−１を阻害する抗体と、共製剤化される。一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体は、Ｂ７−Ｈ１と結合してＢ７−Ｈ１を阻害する抗体と共製剤化される。例えば、Expert Opin Ther Patents (2007) 17(5):567-575、およびMelero, et al., Clin Cancer Res (2009) 15(5):1507-1509、ならびにそれらの中で論じられている参考文献を参照されたい。ある特定の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体または抗原結合分子と共阻害性シグナルの阻害剤とを含む二重特異性分子を含む製剤。一部の実施形態では、製剤は、抗ＧＩＴＲ抗体または抗原結合分子とＣＴＬＡ４の阻害剤とを含む二重特異性分子を含む。一部の実施形態では、製剤は、抗ＧＩＴＲ抗体または抗原結合分子とＴＩＭ３の阻害剤とを含む二重特異性分子を含む。一部の実施形態では、製剤は、抗ＧＩＴＲ抗体または抗原結合分子とＬＡＧ３の阻害剤とを含む二重特異性分子を含む。一部の実施形態では、製剤は、抗ＧＩＴＲ抗体または抗原結合分子とＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の阻害剤とを含む二重特異性分子を含む。一部の実施形態では、製剤は、抗ＧＩＴＲ抗体または抗原結合分子と阻害剤Ｂ７Ｈ１とを含む二重特異性分子を含む。
【０２５２】
ＰＤ−１阻害剤
一実施形態では、ＧＩＴＲアゴニストは、例えば国際公開第２０１５／０２６６８４号パンフレットに記載されているような、ＰＤ−１阻害剤と組み合わせて使用される。一部の実施形態では、ＰＤ−１阻害剤は、ニボルマブ、ペムブロリズマブまたはピディリズマブから選択される抗ＰＤ−１抗体である。
【０２５３】
一部の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブである。ニボルマブの別名は、ＭＤＸ−１１０６、ＭＤＸ−１１０６−０４、ＯＮＯ−４５３８、またはＢＭＳ−９３６５５８を含む。一部の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブ（ＣＡＳ登録番号９４６４１４−９４−４）である。ニボルマブは、ＰＤ１を特異的にブロックする完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ＰＤ１と特異的に結合する、ニボルマブ（クローン５Ｃ４）および他のヒトモノクローナル抗体は、米国特許第８，００８，４４９号明細書および国際公開第２００６／１２１１６８号パンフレットに開示されている。一実施形態では、ＰＤ−１の阻害剤は、ニボルマブであり、そこに開示されている配列（またはそれらと実質的に同一のもしくは類似している配列、例えば、特定されている配列と少なくとも８５％、９０％、９５％以上同一の配列）を有している。
【０２５４】
一部の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ペムブロリズマブである。ペムブロリズマブ（ランブロリズマブ、ＭＫ−３４７５、ＭＫ０３４７５、ＳＣＨ−９００４７５またはＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）とも呼ばれる；Ｍｅｒｃｋ）は、ＰＤ−１と結合するヒト化ＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ペムブロリズマブおよび他のヒト化抗ＰＤ−１抗体は、Hamid, O. et al. (2013) New England Journal of Medicine 369 (2): 134-44、米国特許第８，３５４，５０９号明細書および国際公開第２００９／１１４３３５号パンフレットに開示されている。
【０２５５】
一実施形態では、ＰＤ−１の阻害剤は、例えば米国特許第８，３５４，５０９号明細書および国際公開第２００９／１１４３３５号パンフレットに開示されている、ならびにそこに開示されている配列（またはそれらと実質的に同一のもしくは類似している配列、例えば、特定されている配列と少なくとも８５％、９０％、９５％以上同一の配列）を有する、ペムブロリズマブである。
【０２５６】
一部の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ピディリズマブである。ピディリズマブ（ＣＴ−０１１；Ｃｕｒｅ  Ｔｅｃｈ）は、ＰＤ１と結合するヒト化ＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体である。ピディリズマブおよび他のヒト化抗ＰＤ−１モノクローナル抗体は、国際公開第２００９／１０１６１１号パンフレットに開示されている。他の抗ＰＤ１抗体としては、ＡＭＰ  ５１４（アンプリミューン）、特に、例えば、米抗特許第８，６０９，０８９号明細書、米国特許出願公開第２０１００２８３３０号明細書および／または米国特許出願公開第２０１２１０１１４６４９号明細書に開示されている抗ＰＤ１抗体が挙げられる。
【０２５７】
一部の実施形態では、ＰＤ−１阻害剤は、イムノアドヘシン（例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のＦｃ領域）と融合しているＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２の細胞外またはＰＤ−１結合部分を含む、イムノアドヘシン）である。一部の実施形態では、ＰＤ−１阻害剤は、ＡＭＰ−２２４（Ｂ７−ＤＣＩｇ；アンプリミューン；例えば、国際公開第２０１０／０２７８２７号および同第２０１１／０６６３４２号パンフレットに開示されている）であり、ＰＤ−１とＢ７−Ｈ１との相互作用をブロックするＰＤ−Ｌ２融合可溶性受容体である。
【０２５８】
一実施形態では、組合せは、抗ＧＩＴＲ抗体分子、例えば本明細書に記載のものと、例えば国際公開第２０１５／１１２９００号パンフレットに開示されており、そこに開示されている配列（またはそれらと実質的に同一のもしくは類似している配列、例えば、特定されている配列と少なくとも８５％、９０％、９５％以上同一の配列）を有する、抗ＰＤ−１抗体とを含む。
【０２５９】
ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２阻害剤
一部の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、抗体分子である。一部の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ−４７３６、ＭＳＢ−００１０７１８Ｃ、またはＭＤＸ−１１０５から選択される。
【０２６０】
一部の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＭＳＢ００１０７１８Ｃである。ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（Ａ０９−２４６−２とも呼ばれる；Ｍｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏ）は、ＰＤ−Ｌ１と結合するモノクローナル抗体である。ペムブロリズマブおよび他のヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、国際公開第２０１３／０７９１７４号パフレットに開示されており、そこに開示されている配列（またはそれらと実質的に同一のもしくは類似している配列、例えば、特定されている配列と少なくとも８５％、９０％、９５％以上同一の配列）を有している。
【０２６１】
一部の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０である。ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０抗体は、国際公開第２０１０／０７７６３４号パンフレットに開示されており（重鎖および軽鎖可変領域配列はそれぞれ配列番号２０および２１で示されている）、そこに開示されている配列（またはそれらと実質的に同一のもしくは類似している配列、例えば、特定されている配列と少なくとも８５％、９０％、９５％以上同一の配列）を有する、抗ＰＤ−Ｌ１である。
【０２６２】
一部の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、ＭＤＸ−１１０５である。ＢＭＳ−９３６５５９としても公知のＭＤＸ−１１０５は、国際公開第２００７／００５８７４号パフレットに開示されており、そこに開示されている配列（またはそれらと実質的に同一のもしくは類似している配列、例えば、特定されている配列と少なくとも８５％、９０％、９５％以上同一の配列）を有する、抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。
【０２６３】
一実施形態では、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、ＭＤＰＬ３２８０Ａ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）である。ＭＤＰＬ３２８０Ａは、ＰＤ−Ｌ１と結合するヒトＦｃ最適化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。ＭＤＰＬ３２８０Ａ、およびＰＤ−Ｌ１に対する他のヒトモノクローナル抗体は、米国特許第７，９４３，７４３号明細書および米国特許出願公開第２０１２００３９９０６号明細書に開示されている。
【０２６４】
他の実施形態では、ＰＤ−Ｌ２阻害剤は、ＡＭＰ−２２４である。ＡＭＰ−２２４は、ＰＤ１とＢ７−Ｈ１との相互作用をブロックするＰＬ−Ｌ２  Ｆｃ融合可溶性受容体（Ｂ７−ＤＣＩｇ；アンプリミューン；例えば、国際公開第２０１０／０２７８２７号および同第２０１１／０６６３４２号パンフレットに開示されている）である。
【０２６５】
ＬＡＧ−３阻害剤
一実施形態では、本明細書に記載する組合せは、ＬＡＧ３−阻害剤を含む。一部の実施形態では、組合せは、がん、例えば、本明細書に記載するがん、例えば、固形腫瘍または血液悪性疾患を処置するために使用される。一部の実施形態では、抗ＬＡＧ−３抗体は、ＢＭＳ−９８６０１６である。ＢＭＳ−９８６０１６（ＢＭＳ９８６０１６とも呼ばれる；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）は、ＬＡＧ−３と結合するモノクローナル抗体である。ＢＭＳ−９８６０１６および他のヒト化抗ＬＡＧ−３抗体は、米国特許出願公開第２０１１／０１５０８９２号明細書、国際公開第２０１０／０１９５７０号および同第２０１４／００８２１８号パンフレットに開示されている。一部の実施形態では、抗ＬＡＧ−３抗体は、国際公開第２０１５／１３８９２０号パンフレットに開示されているヒト化抗ＬＡＧ３抗体である。
【０２６６】
ＴＩＭ−３阻害剤
一実施形態では、本明細書に記載する組合せは、ＴＩＭ−３阻害剤を含む。一部の実施形態では、組合せは、がん、例えば、本明細書に記載するがん、例えば、固形腫瘍または血液悪性疾患を処置するために使用される。例示的抗ＴＩＭ−３抗体は、米国特許第８，５５２，１５６号明細書、国際公開第２０１１／１５５６０７号パンフレット、欧州特許第２５８１１１３号明細書および米国特許出願公開第２０１４／０４４７２８号明細書に開示されている。一部の実施形態では、抗ＴＩＭ３は、国際公開第２０１５／１１７００２号パンフレットに開示されているヒト化ＡＢＴＩＭ３  ｍＡｂである。
【０２６７】
ＣＴＬＡ−４阻害剤
一実施形態では、本明細書に記載する組合せは、ＣＴＬＡ−４阻害剤を含む。一部の実施形態では、組合せは、がん、例えば、本明細書に記載するがん、例えば、固形腫瘍または血液悪性疾患を処置するために使用される。
【０２６８】
例示的抗ＣＴＬＡ４抗体としては、トレメリムマブ（以前はチシリムマブ、ＣＰ−６７５，２０６として知られていた、Ｐｆｉｚｅｒから入手できるＩｇＧ２モノクローナル抗体）、およびイピリムマブ（ＭＤＸ−０１０としても公知のＣＴＬＡ−４抗体、ＣＡＳ番号４７７２０２−００−９）が挙げられる。他の例示的抗ＣＴＬＡ−４抗体は、例えば、米国特許第５，８１１，０９７号明細書に開示されている。
【０２６９】
抗ＧＩＴＲ抗体または抗原結合分子を１種または複数の免疫賦活剤と共製剤化することもできる。例えば、一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体は、免疫賦活性サイトカイン、例えば、ＩＬ−７、ＩＬ−１２またはＩＬ−１５と共製剤化される。あるいは、抗ＧＩＴＲ抗体または抗原結合分子を第２の免疫賦活性抗体と共製剤化することができる。例えば、抗ＧＩＴＲ抗体または抗原結合分子を、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーの別のメンバーのアゴニスト抗体または抗原結合分子と、共製剤化することもできる。例示的な第２の免疫賦活性標的としては、限定ではないが、ＴＮＦＲＳＦ４腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー４（ＯＸ４０としても公知）または腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー９（ＴＮＦＲＳＦ９、４−１ＢＢもしくはＣＤ１３７としても公知）が挙げられる。例えば、Expert Opin Ther Patents (2007) 17(5):567-575、Pardee, et al, Immunotherapy (2009) 1(2):249-264、およびMelero, et al., Clin Cancer Res (2009) 15(5):1507-1509、ならびにそれらの中で論じられている参考文献を参照されたい。
【０２７０】
抗ＧＩＴＲ抗体または抗原結合分子を化学療法剤と共製剤化することもできる。選択される薬剤は、処置すべき状態、例えば、がんまたは感染性疾患、例えば、細菌感染症、真菌感染症、ウイルス感染症もしくは寄生虫感染症に依存することになる。抗ＧＩＴＲ抗体または抗原結合分子を、処置することになる病状を処置するための当業者に公知の化学療法薬と共製剤化することができる。化学療法剤、例えば、がんおよび感染性疾患の処置のための化学療法剤は、当技術分野において公知であり、例えば、Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11th Ed., Brunton, Lazo and Parker, Eds., McGraw-Hill (2006)、2010 Physicians’ Desk Reference (PDR), 64th Edition, Thomson PDRに記載されている。
【０２７１】
一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体または抗原結合分子を抗悪性腫瘍剤と共製剤化することができる。抗ＧＩＴＲ抗体を有する組成物に混合するために使用される例示的抗悪性腫瘍剤としては、アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード系、エチレンイミン系およびメチルメラミン系、メチルヒドラジン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソウレア系、トリアゼン系および白金配位錯体系）、代謝拮抗薬（例えば、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体）、天然産物（例えば、ビンカアルカロイド系、タキサン系、エピポドフィロトキシン系、カンプトテシン系、抗生物質、およびアントラセンジオン系）が挙げられる。一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体または抗原結合分子は、代謝拮抗薬抗悪性腫瘍剤、例えば、葉酸類似体（例えば、メトトレキサート、ペメトレキセド、トリメテレキサート）、ピリミジン類似体（例えば、５−フルオロウラシル、カペシタビン、シタラビン、ゲムシタビン）、プリン類似体（例えば、メルカプトプリン、ペントスタチン、クラドリビン、フルダラビン（cladribine fludarabine））、またはこれらの混合物と共製剤化される。一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体または抗原結合分子は、アルキル化剤抗悪性腫瘍剤、例えば、ナイトロジェンマスタード系（例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル）、エチレンイミン系（例えば、アルトレタミン）およびメチルメラミン系（例えば、チオテパ）、メチルヒドラジン誘導体系（例えば、プロカルバジン）、アルキルスルホネート（例えば、ブスルファン）、ニトロソウレア系（例えば、カルムスチン、ストレプトゾシン）、トリアゼン系（例えば、ダカルバジン、テモゾロミド）ならびに白金配位錯体系（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン）と共製剤化される。
【０２７２】
一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体または抗原結合分子を抗ウイルス剤と共製剤化することができる。例示的抗ウイルス剤としては、限定ではないが、抗ヘルペスウイルス剤（例えば、アシクロビル、シドホビル、ファムシクロビル、ホスカルネット、チオビル、ホミビルセン、ガンシクロビル、イドクスウリジン、ペンシクロビル、トリフルリジン、バラシクロビル、バルガンシクロビル（valgenciclovir）、レシキモド）、抗インフルエンザ剤（例えば、アマンタジン、オセルタミビル、リマンタジン、ザナミビル、ペラミビル、Ｅ−１１８９５８）、抗肝炎剤（例えば、アデホビル（adeforvir）ジピボキシル、インターフェロン−アルファ、リマンタジン、エンテカビル、クレブジン、エムトリシタビン、テルビブジン、テノホビル、ビラミジン、ＢＩＬＮ  ２０６１、ＮＭ２８３）および他の抗ウイルス剤（例えば、リバビリン、イミキモド、マリバビル、ｓＩＣＡＭ−１、プレコナリル）が挙げられる。抗ウイルス剤は、抗レトロウイルス剤でありうる。例示的抗レトロウイルス剤としては、限定ではないが、ジドブジン、ジダノシン、スタブジン、ザルシタビン、ラミブジン、アバカビル、テノホビル、エムトリシタビン、ネビラピン、エファビレンツ、デラビルジン、サキナビル、インジナビル、リトナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、ロピナビル、アタザナビル、ホスアンプレナビルおよびエンフビルチドが挙げられる。
【０２７３】
一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体または抗原結合分子を抗菌剤と共製剤化することができる。例示的抗菌剤としては、限定ではないが、スルホンアミド系（例えば、スルファニルアミド、スルファジアジン、スルファメトキサゾール、スルフィソキサゾール、スルファセタミド）、スルファセタミド、キノロン系（例えば、ナリジクス酸、シノキサシン、ノルフロキサシン、シプロフロキサシン、オフロキサシン、スパルフロキサシン、フレロキサシン、ペフロキサシン（perloxacin）、レボフロキサシン、ガレノキサシンおよびゲミフロキサシン）、メテナミン、ニトロフラントイン、ペニシリン系（例えば、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、メチシリン、オキサシリン（methicilin oxacillin）、クロキサシリン、ジクロキサシリン、ナフシリン、アンピリシン、アモキシシリン、カルベニシリン、チカルシリン、メズロシリンおよびピペラシリン）、セファロスポリン系（例えば、セファゾリン、セファレキシン、セファドロキシル、セフォキシチン、セファクロル、セフプロジル、セフロキシム、セフロキシムアキセチル（cefuroxime acetil）、ロラカルベフ、セフォテタン、セフォラニド、セフォタキシム、セフポドキシムプロキセチル、セフチブテン、セフジニル、セフジトレンピボキシル（cefditoren pivorxil）、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフォペラゾン、セフタジジムおよびセフェピム（cefepine））、カルバペネム系（例えば、イミペネム、アズトレオナム）、およびアミノグリコシド系（例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン（toramycin）、ネチルマイシンおよびアミカシン）が挙げられる。
【０２７４】
一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体または抗原結合分子を抗寄生虫剤と共製剤化することができる。例示的抗寄生虫剤としては、限定ではないが、抗マラリア剤（例えば、クロロキン、メフロキン、キニン、キニジンおよびプリマキンを含むキノリン系；ピリメタミンを含むジアミノピリミジン系；スルファドキシン、テトラサイクリン系、アトバコン、およびプログアニル）；ならびにアンホテリシン、クロロキン、エフロルニチン、エメチン、フマギリン、８−ヒドロキシキノリン系、メラルソプロール、メトロニダゾール、ミルテホシン、ニフルチモックス、ニタゾキサニド、パロモマイシン、ペンタミジン、スチボグルコン酸ナトリウムおよびスラミンをはじめとする抗原虫剤が挙げられる。
【０２７５】
一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体または抗原結合分子を抗真菌剤と共製剤化することができる。例示的抗真菌剤としては、限定ではないが、ポリエン系（例えば、ナタマイシン、リモシジン、フィリピン、ニスタチン、アンホテリシンＢ、カンジシンおよびハマイシン）、イミダゾール系（例えば、ミコナゾール、ケトコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、ビホナゾール、ブトコナゾール、フェンチコナゾール、イソコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール、チオコナゾール）、トリアゾール系（例えば、フルコナゾール、イトラコナゾール、イサブコナゾール、ラブコナゾール、ポサコナゾール、ボリコナゾール、テルコナゾール）、チアゾール系（例えば、アバファンギン）、アリルアミン系（例えば、テルビナフィン、アモロルフィン、ナフチフィン、ブテナフィン）、エキノキャンディン系（例えば、アニデュラファンギン、カスポファンギン、ミカファンギン）、安息香酸、シクロピロクス、トルナフタート、ウンデシレン酸、フルシトシンまたは５−フルオロシトシン、グリセオフルビン、およびハロプロジンが挙げられる。
【０２７６】
キット
本発明の抗ＧＩＴＲ組成物をキットで提供することができる。抗ＧＩＴＲ抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、一般に、バイアルまたは容器内にある。必要に応じて、抗体は、液体形態または乾燥（凍結乾燥）形態であることができる。キットは、本明細書に記載の本発明の抗ＧＩＴＲ抗体、抗体断片、または抗原結合分子を含むことができ、場合により第２または第３の薬剤も含有することができる。一部の実施形態では、キットは、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体、抗体断片、または抗原結合分子、および医薬的に許容される希釈剤を含有する。抗ＧＩＴＲ抗体、抗体断片、または抗原結合分子を第２または第３の薬剤と同じ製剤または別々の製剤で（例えば、混合物として、または別々の容器で）キットに備えさせることができる。キットは、１回または複数回分の用量を提供する、抗ＧＩＴＲ抗体、抗体断片、または抗原結合分子のアリコートを含有することができる。複数回投与用のアリコートを備えさせる場合、用量は均一であってもよく、または用量を変動させてもよい。変動投与計画は、必要に応じて、漸増または漸減することになりうる。抗ＧＩＴＲ抗体、抗体断片、または抗原結合分子の投薬量と、第２の薬剤の投薬量は、独立して、均一であるか、または変わることもある。
【０２７７】
一部の実施形態では、キットは、標的抗原をさらに含有する。標的抗原またはワクチンは、処置すべき病状に依存することになる。例えば、標的抗原は、腫瘍細胞、細菌細胞、真菌、寄生虫またはウイルスからのものであることがある。標的抗原は、必要に応じて、ペプチド、ポリペプチド、細胞、ポリヌクレオチド（例えば、裸のプラスミドまたはウイルスベクター）の形態であることができる。一部の実施形態では、標的抗原は、腫瘍関連抗原である。例示的標的抗原は本明細書中で論じており、当技術分野において公知の他のものも使用される。
【０２７８】
一部の実施形態では、キットは、細胞傷害性薬剤をさらに含有する。例えば、キットは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）と結合してＴｒｅｇを低減または枯渇させるアゴニスト抗体または抗原結合分子を含有することができる。例示的Ｔｒｅｇ細胞枯渇抗体または抗原結合分子は、ＣＤ２５またはＣＣＲ４と結合する。Expert Opin Ther Patents (2007) 17(5):567-575、およびその中で論じられている参考文献を参照されたい。
【０２７９】
一部の実施形態では、キットは、共阻害性シグナルの阻害剤をさらに含有する。例示的阻害剤としては、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３の阻害剤、および／またはＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１（例えば、Ｂ７−Ｈ１）相互作用の阻害剤が挙げられる。一部の実施形態では、キットは、ＣＴＬＡ−４と結合してＣＴＬＡ−４を阻害する抗体をさらに含有する。一部の実施形態では、キットは、ＬＡＧ３と結合してＬＡＧ３を阻害する抗体をさらに含有する。一部の実施形態では、キットは、ＴＩＭ３と結合してＴＩＭ３を阻害する抗体をさらに含有する。一部の実施形態では、キットは、ＰＤ−１と結合してＰＤ−１を阻害する抗体をさらに含有する。一部の実施形態では、キットは、Ｂ７−Ｈ１と結合してＢ７−Ｈ１を阻害する抗体をさらに含有する。例えば、Expert Opin Ther Patents (2007) 17(5):567-575、およびMelero, et al., Clin Cancer Res (2009) 15(5):1507-1509、ならびにそれらの中で論じられている参考文献を参照されたい。
【０２８０】
一部の実施形態では、キットは、１種または複数の免疫賦活剤をさらに含有する。例えば、一部の実施形態では、キットは、免疫賦活性サイトカイン、例えば、ＩＬ−７、ＩＬ−１２またはＩＬ−１５を含有する。あるいは、キットは、第２の免疫賦活性抗体を含有することができる。例えば、キットは、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーの別のメンバーのアゴニスト抗体または抗原結合分子を含有することができる。例示的な第２の免疫賦活性標的としては、限定ではないが、ＴＮＦＲＳＦ４腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー４（ＯＸ４０としても公知）または腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー９（ＴＮＦＲＳＦ９、４−１ＢＢもしくはＣＤ１３７としても公知）が挙げられる。例えば、Expert Opin Ther Patents (2007) 17(5):567-575、Pardee, et al, Immunotherapy (2009) 1(2):249-264、およびMelero, et al., Clin Cancer Res (2009) 15(5):1507-1509、ならびにそれらの中で論じられている参考文献を参照されたい。
【０２８１】
一部の実施形態では、キットは、化学療法剤をさらに含有する。選択される薬剤は、処置すべき状態、例えば、がんまたは感染性疾患、例えば、細菌感染症、真菌感染症、ウイルス感染症もしくは寄生虫感染症に依存することになる。例示的化学療法剤としては、当技術分野において公知のおよび本明細書に記載するあらゆる抗悪性腫瘍、抗ウイルス、抗菌、抗寄生虫および抗真菌剤が挙げられる。
【０２８２】
Ｔ細胞応答を強化する方法
処置または予防を受けることになる状態
本発明の抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体および抗体断片は、それを必要とする患者のＣＤ４＋ＴヘルパーおよびＣＤ８＋細胞溶解性Ｔ細胞応答の増強に使用される。したがって、抗体は、患者のＴ細胞応答の強化または増強に、例えば、免疫応答の強化または増強で緩和されうる疾患の軽減、好転、阻害または予防もたらすために使用される。一態様では、本発明は、それを必要とする個体のＴ細胞応答を強化する方法であって、本明細書に記載の治療有効量の本発明の抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体または抗体断片を個体に投与することを含む、方法を提供する。本発明は、一態様では、個体のＴ細胞応答の強化に使用するための、抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体または抗体断片も提供する。さらなる態様では、本発明は、個体のＴ細胞応答の強化に使用するための、そのような抗体または抗体断片を含む組成物を提供する。
【０２８３】
処置を受けることになる状態は、がんおよび感染性疾患を含む。治療目的の場合、患者は、がんまたは腫瘍または感染性疾患、例えば、細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生虫感染症を有することがある。予防目的の場合、患者は、がんから寛解した状態にあることもあり、または細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生虫感染症に曝露されることを予期していることもある。抗体は、一次抗原または標的抗原、例えばワクチンに対する免疫応答を強化または促進またはブーストするためのアジュバントとしても役立つことができる。
【０２８４】
一部の実施形態では、患者は、がんを有する、がんを有する疑いがある、またはがんから寛解した状態にある。抗ＧＩＴＲ抗体での処置を受けることになるがんは、通常、本明細書に記載の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現する。処置を受けることになるがんは、限定ではないが、上皮がんまたは上皮癌、ならびに肉腫およびリンパ腫を含む。一部の実施形態では、がんは、黒色腫、卵巣がん、腎がん、結腸直腸がん、前立腺、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を含む肺がん、乳がん、神経膠腫、または線維肉腫である。例えば、Pardee, et al, Immunotherapy (2009) 1(2):249-264、およびその中で論じられている参考文献を参照されたい。一実施形態では、がんのタイプは、膵臓がん、黒色腫、乳がん、肺がん、気管支がん、結腸直腸がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、膀胱がん、脳または中枢神経系のがん、末梢神経系のがん、食道がん、子宮頸がん、子宮または子宮内膜がん、口腔または咽頭がん、肝臓がん、腎臓がん、精巣がん、胆道がん、小腸または虫垂がん、唾液腺がん、甲状腺がん、副腎がん、骨肉腫、軟骨肉腫、血液組織のがん、および頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）からなる群から選択される。
【０２８５】
一態様では、本発明は、それを必要とする個体における腫瘍関連抗原を発現するがんの腫瘍成長を処置する方法であって、本明細書に記載の治療有効量の本発明の抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体または抗体断片を個体に投与することを含む、方法を提供する。本発明は、個体における腫瘍関連抗原を発現するがんの腫瘍成長の処置に使用するための、本発明の抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体または抗体断片をさらに提供する。本発明は、個体における腫瘍関連抗原を発現するがんの腫瘍成長の低減、阻害または予防に使用するための、本発明の抗体または抗体断片を含む組成物をさらに提供する。
【０２８６】
一部の実施形態では、個体のがんの診断または予後予測を助長する方法であって、個体の腫瘍内または周辺でのＧＩＴＲの発現の検出に本発明の抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体または抗体断片を使用することを含む、方法。
【０２８７】
一部の実施形態では、患者は、感染性疾患、例えば、細菌、ウイルス、真菌または寄生虫感染症を有する。抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体は、例えばフィラリア症およびリーシュマニア症において、寄生虫の低減、阻害および／または予防に使用される。
【０２８８】
一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体は、肝炎ウイルス感染症、例えば慢性Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）感染症、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）感染症またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症を限定ではないが含む、ウイルス感染症の処置に使用される。一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体は、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、単純ヘルペスＩ型（ＨＳＶ  Ｉ）、単純ヘルペスＩＩ型（ＨＳＶ  ＩＩ）、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ  Ｉ）およびヒト免疫不全ウイルスＩＩ型（ＨＩＶ  ＩＩ）、任意のピコルナウイルス科（picornaviridae）、エンテロウイルス、カリシウイルス科（caliciviridae）、ノーウォークウイルス群のいずれか、トガウイルス、例えばアルファウイルス、フラビウイルス、コロナウイルス、狂犬病ウイルス、マールブルグウイルス、エボラウイルス、パラインフルエンザウイルス、オルソミクソウイルス、ブンヤウイルス、アレナウイルス、レオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩ型、サル免疫不全ウルス、レンチウイルス、ポリオーマウイルス、パルボウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ヒトヘルペスウイルス６、オナガザルヘルペスウイルス１（Ｂウイルス）、ならびにポックスウイルスからなる群から選択されるウイルスの感染症の処置に使用される。
【０２８９】
一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体は、ナイセリア属種（Neisseria spp）、連鎖球菌属種（Streptococcus spp）、ミュータンス菌（S. mutans）、ヘモフィルス属種（Haemophilus spp.）、モラクセラ属種（Moraxella spp）、ボルデテラ属種（Bordetella spp）、マイコバクテリウム属種（Mycobacterium spp）、レジオネラ属種（Legionella spp）、大腸菌属種（Escherichia spp）、ビブリオ属種（Vibrio spp）、エルシニア属種（Yersinia spp）、カンピロバクター属種（Campylobacter spp）、サルモネラ属種（Salmonella spp）、リステリア属種（Listeria spp.）、ヘリコバクター属種（Helicobacter spp）、シュードモナス属種（Pseudomonas spp）、ブドウ球菌属種（Staphylococcus spp.）、腸球菌属種（Enterococcus spp）、クロストリジウム属種（Clostridium spp.）、バチルス属種（Bacillus spp）、コリネバクテリウム属種（Corynebacterium spp.）、ボレリア属種（Borrelia spp.）、エーリキア属種（Ehrlichia spp）、リケッチア属種（Rickettsia spp）、クラミジア属種（Chlamydia spp.）、レプトスピラ属種（Leptospira spp.）、トレポネーマ属種（Treponema spp.）の感染症を限定ではないが含む、細菌感染症の処置に使用される。
【０２９０】
抗ＧＩＴＲ抗体の投与
医師または獣医は、医薬組成物に用いる本発明の抗体または抗体断片の用量を、所望の治療効果を達成するために必要なものより低いレベルで開始し、その所望の効果が達成されるまで投薬量を徐々に増加させることができる。一般に、本発明の組成物の有効用量は、処置すべき具体的な疾患または状態、投与手段、標的部位、患者の生理状態、患者がヒトであるのか、動物であるのか、投与する他の医薬品、および処置が予防的であるのか、治療的であるのかを含む、多くの異なる因子によって変る。処置投薬量を滴定させて、安全性および有効性を最適化する必要がある。抗体に関する投与については、投薬量は、宿主体重１ｋｇ当り、約０．０００１〜１００ｍｇ、さらに通常は０．０１〜５ｍｇの範囲である。例えば、投薬量は、体重１ｋｇ当り１ｍｇ、または体重１ｋｇ当り１０ｍｇ、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内でありうる。投与は、必要または所望に応じて、１日１回、週１回、隔週、月１回、またはそれより多くても、少なくてもよい。例示的な処置投与計画は、週１回、２週間に１回、または月１回、または３〜６カ月に１回の投与を伴う。
【０２９１】
一部の実施形態では、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体、抗体断片、または抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドが投与される。薬剤が核酸である実施形態では、典型的な投薬量は、体重１ｋｇ当り約０．１ｍｇから体重１ｋｇ当り１００ｍｇまでで体重１ｋｇ当り１００ｍｇを含む範囲、例えば、体重１ｋｇ当り約１ｍｇ〜体重１ｋｇ当り約５０ｍｇの間の範囲でありうる。一部の実施形態では、体重１ｋｇ当り約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０または５０ｍｇ。
【０２９２】
抗体または抗体断片を単回用量または分割用量で投与することができる。抗体または抗体断片は、通常は、複数の機会に投与される。単回投薬間の間隔は、必要または要望に応じて、毎週、隔週、毎月または毎年であることがある。間隔は、患者の抗ＧＩＴＲ抗体または抗体断片の血中レベルの測定による指示に応じて、不規則であることもある。一部の方法において、投薬量は、１〜１０００μｇ／ｍｌおよび一部の方法では２５〜３００μｇ／ｍｌの血漿抗体または抗体断片濃度を達成するように調整される。あるいは、抗体または抗体断片を徐放製剤として投与することができ、その場合のほうが必要とされる投薬頻度は少ない。投薬量および頻度は、患者における抗体または抗体断片の半減期によって変る。一般に、ヒト化抗体は、キメラ抗体および非ヒト抗体のものより長い半減期を示す。投薬量および投与頻度は、処置が予防的であるのか、治療的であるのかによって変わりうる。予防的用途では、比較的低い用量が長期間にわたって比較的低頻度で投与される。一部の患者は、残りの人生にわたって処置を受け続ける。治療的用途では、疾患の進行が低減または停止されるまで、好ましくは、患者が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで、比較的短い間隔での比較的高い用量が必要とされることもある。その後、予防投与計画を患者に施すことができる。
【０２９３】
第２の薬剤との併用投与
一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、第２または第３の薬理学的薬剤と併用投与される。抗ＧＩＴＲ抗体、抗体断片、または抗原結合分子と、第２のまたは薬剤を、混合物として投与することができ、または別々の製剤で投与することができる。抗ＧＩＴＲ抗体、抗体断片、または抗原結合分子と、第２のまたは薬剤を、同時にまたは逐次的に投与することができる。抗ＧＩＴＲ抗体、抗体断片、または抗原結合分子と、第２のまたは薬剤を、必要に応じて、同じ投与経路によってまたは異なる投与経路によって投与することができる。本抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体、抗体断片、または抗原結合分子との併用投与のための例示的第２の薬剤および第３の薬剤としては、限定ではないが、一次抗原または標的抗原、腫瘍細胞の免疫原性を増加させる薬剤、共阻害性シグナルを阻害または抑制する薬剤が挙げられる。抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体、抗体断片、または抗原結合分子を、処置することになる病状を処置するために使用される化学療法剤と併用投与して、例えば、その化学療法剤の有効性を向上させること、または標的抗原に対する免疫応答をさらに強化することもできる。抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、指定の病状を処置するための確立された手順、例えば、放射線または外科手術、との併用治療にも使用される。
【０２９４】
本発明の抗ＧＩＴＲ抗体、抗体断片、または抗原結合分子を、一次抗原または標的抗原と併用投与することができる。標的抗原またはワクチンは、処置すべき病状に依存することになる。例えば、標的抗原は、腫瘍細胞、細菌細胞、真菌、ウイルスまたは寄生虫からのものでありうる。標的抗原は、必要に応じて、ペプチド、ポリペプチド、細胞またはポリヌクレオチドの形態であることができる。
【０２９５】
一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、ウイルスからの標的抗原と併用投与され、そのようなウイルスは、例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、単純ヘルペスＩ型（ＨＳＶ  Ｉ）、単純ヘルペスＩＩ型（ＨＳＶ  ＩＩ）、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ  Ｉ）およびヒト免疫不全ウイルスＩＩ型（ＨＩＶ  ＩＩ）、任意のピコルナウイルス科（picornaviridae）、エンテロウイルス、カリシウイルス科（caliciviridae）、ノーウォークウイルス群のいずれか、トガウイルス、例えばアルファウイルス、フラビウイルス、コロナウイルス、狂犬病ウイルス、マールブルグウイルス、エボラウイルス、パラインフルエンザウイルス、オルソミクソウイルス、ブンヤウイルス、アレナウイルス、レオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩ型、サル免疫不全ウルス、レンチウイルス、ポリオーマウイルス、パルボウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ヒトヘルペスウイルス６、オナガザルヘルペスウイルス１（Ｂウイルス）、ならびにポックスウイルスからなる群から選択される。
【０２９６】
一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、細菌からの標的抗原と併用投与され、そのような細菌は、例えば、ナイセリア属種（Neisseria spp）、連鎖球菌属種（Streptococcus spp）、ミュータンス菌（S. mutans）、ヘモフィルス属種（Haemophilus spp.）、モラクセラ属種（Moraxella spp）、ボルデテラ属種（Bordetella spp）、マイコバクテリウム属種（Mycobacterium spp）、レジオネラ属種（Legionella spp）、大腸菌属種（Escherichia spp）、ビブリオ属種（Vibrio spp）、エルシニア属種（Yersinia spp）、カンピロバクター属種（Campylobacter spp）、サルモネラ属種（Salmonella spp）、リステリア属種（Listeria spp.）、ヘリコバクター属種（Helicobacter spp）、シュードモナス属種（Pseudomonas spp）、ブドウ球菌属種（Staphylococcus spp.）、腸球菌属種（Enterococcus spp）、クロストリジウム属種（Clostridium spp.）、バチルス属種（Bacillus spp）、コリネバクテリウム属種（Corynebacterium spp.）、ボレリア属種（Borrelia spp.）、エーリキア属種（Ehrlichia spp）、リケッチア属種（Rickettsia spp）、クラミジア属種（Chlamydia spp.）、レプトスピラ属種（Leptospira spp.）、トレポネーマ属種（Treponema spp.）からなる群から選択される。
【０２９７】
一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）と併用投与される。ＴＡＡは、単離されたポリペプチドまたはペプチドであることができ、インタクト細胞の一部、または腫瘍溶解物の一部であることができる。例示的ＴＡＡは、上で論じており、当技術分野において公知の他のものも使用される。
【０２９８】
一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、患者からの自家腫瘍細胞と、または別の患者からの同じ組織型の同種異形腫瘍細胞と併用投与される。腫瘍細胞は、インタクト細胞、腫瘍細胞溶解物、アポトーシス腫瘍細胞または全腫瘍ｍＲＮＡの形態でありうる。患者における腫瘍細胞の免疫原性を強化または増強するポリペプチドを発現するように腫瘍細胞にトランスフェクトすることができ、例えば、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を発現するようにトランスフェクトすることができる。腫瘍細胞は、限定ではないが上皮がんまたは上皮癌ならびに肉腫およびリンパ腫を含む、任意のがん性組織からのものでありうる。一部の実施形態では、がんは、黒色腫、卵巣がん、腎がん、結腸直腸がん、前立腺、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を含む肺がん）、乳がん、神経膠腫、または線維肉腫である。例えば、Pardee, et al, Immunotherapy (2009) 1(2):249-264、およびその中で論じられている参考文献を参照されたい。一実施形態では、腫瘍細胞は、例えば、膵臓がん、黒色腫、乳がん、肺がん、気管支がん、結腸直腸がん、前立腺がん、胃がん、卵巣がん、膀胱がん、脳または中枢神経系のがん、末梢神経系のがん、食道がん、子宮頸がん、子宮または子宮内膜がん、口腔または咽頭がん、肝臓がん、腎臓がん、精巣がん、胆道がん、小腸または虫垂がん、唾液腺がん、甲状腺がん、副腎がん、骨肉腫、軟骨肉腫、血液組織のがん、および頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）からのものである。
【０２９９】
一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、細胞傷害性薬剤と併用投与される。例えば、抗ＧＩＴＲ抗体または抗原結合分子は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）と結合してＴｒｅｇを低減または枯渇させるアゴニスト抗体または抗原結合分子と併用投与される。例示的Ｔｒｅｇ細胞枯渇抗体または抗原結合分子は、ＣＤ２５またはＣＣＲ４と結合する。Expert Opin Ther Patents (2007) 17(5):567-575、およびその中で論じられている参考文献を参照されたい。
【０３００】
一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体、抗体断片、または抗原結合分子は、共阻害性シグナルの阻害剤と併用投与される。例示的阻害剤としては、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３の阻害剤、および／またはＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１（例えば、Ｂ７−Ｈ１）相互作用の阻害剤が挙げられる。一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体は、ＣＴＬＡ−４と結合してＣＴＬＡ−４を阻害する抗体と、併用投与される。一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体は、ＴＩＭ３と結合してＴＩＭ３を阻害する抗体と、併用投与される。一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体は、ＬＡＧ３と結合してＬＡＧ３を阻害する抗体と、併用投与される。一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体は、ＰＤ−１と結合してＰＤ−１を阻害する抗体と、併用投与される。一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体は、Ｂ７−Ｈ１と結合してＢ７−Ｈ１を阻害する抗体と、併用投与される。例えば、Expert Opin Ther Patents (2007) 17(5):567-575、およびMelero, et al., Clin Cancer Res (2009) 15(5):1507-1509、ならびにそれらの中で論じられている参考文献を参照されたい。
【０３０１】
抗ＧＩＴＲ抗体、抗体断片、または抗原結合分子を１種または複数の免疫賦活剤と併用投与することもできる。例えば、一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体または抗体断片は、免疫賦活性サイトカイン、例えば、ＩＬ−７、ＩＬ−１２またはＩＬ−１５と併用投与される。あるいは、抗ＧＩＴＲ抗体、抗体断片、または抗原結合分子を第２の免疫賦活性抗体と併用投与することができる。例えば、抗ＧＩＴＲ抗体、抗体断片、または抗原結合分子を、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーの別のメンバーのアゴニスト抗体、抗体断片、または抗原結合分子と、併用投与することもできる。例示的な第２の免疫賦活性標的としては、限定ではないが、ＴＮＦＲＳＦ４腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー４（ＯＸ４０としても公知）または腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー９（ＴＮＦＲＳＦ９、４−１ＢＢもしくはＣＤ１３７としても公知）が挙げられる。例えば、Expert Opin Ther Patents (2007) 17(5):567-575、Pardee, et al, Immunotherapy (2009) 1(2):249-264、およびMelero, et al., Clin Cancer Res (2009) 15(5):1507-1509、ならびにそれらの中で論じられている参考文献を参照されたい。
【０３０２】
抗ＧＩＴＲ抗体、抗体断片、または抗原結合分子を化学療法剤と併用投与することもできる。選択される薬剤は、処置すべき状態、例えば、がんまたは感染性疾患、例えば、細菌感染症、真菌感染症、ウイルス感染症もしくは寄生虫感染症に依存することになる。抗ＧＩＴＲ抗体、抗体断片、または抗原結合分子を、処置することになる病状を処置するための当業者に公知の化学療法剤と併用投与することができる。例示的化学療法剤は、上で論じており、当技術分野において公知の他のものも使用される。
【図面の簡単な説明】
【０３０３】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｄ。本発明のＧＩＴＲ  ｍＡｂのエピトープマッピングを示す図である。図１Ａは、Ｆｃ−ＧＩＴＲ融合（上および中間のトレース）およびＨＩＳ−ＧＩＴＲ融合（下のトレース）融合タンパク質にならびにＭＡＢ１親Ａｂを使用する、水素／重水素交換結合質量分析（ＨＤＸＭＳ）の結果を示す。ナンバリングは、ネイティブＧＩＴＲシグナルペプチド（ＡＡ  １〜２６）配列の除去を表す。図１Ｂは、ヒトＧＩＴＲの細胞外ドメイン（ｈＧＩＴＲ  ＥＣＤ）を使用して調製したＮ末端欠失構築物の概略図を示す。図１Ｃは、ＭＡＢ４およびＭＡＢ５のｈＧＩＴＲ  ＥＣＤ構築物との結合の結果を示す。ヒトＧＩＴＲ（ｈＧＩＴＲ）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）からのシステインリッチドメイン１（ＣＲＤ１）のＮ末端欠失は、ＭＡＢ４およびＭＡＢ５のｈＧＩＴＲとの結合を妨害する。同様の結果がＭＡＢ７について得られた（データの図示なし）。図１Ｄは、アラニンスキャニング変異誘発の結果を示す。ＭＡＢ７は、ＧＩＴＲ変異体Ｅ７８Ａを除いて、すべての変異タンパク質と結合した。ＦｏｒｔｅＢｉｏ（商標）結合分析を行い、結果によって、ｈＧＩＴＲＥ７８Ａ変異タンパク質とのＭＡＢ７結合の減少も確認された（データの図示なし）。結果は、ＣＲＤ１を含みかつＥ７８（配列番号８８：ＲＰＴＧＧＰＧＣＧＰＧＲＬＬＧＴＧＴＤＡＲＣＣＲＶＨＴＴＲＣＣＲＤＹＰＧＥＥＣＣＳＥＷＤＣＭＣＶＱＰＥＦＨＣＧＤ）を含むＧＩＴＲのＥＣＤの領域を、ＭＡＢ１およびＭＡＢ７（親ｍＡｂ）への結合に関与する領域および潜在的エピトープとして意味づける。
【図１−２】図１Ａ〜１Ｄ。本発明のＧＩＴＲ  ｍＡｂのエピトープマッピングを示す図である。図１Ａは、Ｆｃ−ＧＩＴＲ融合（上および中間のトレース）およびＨＩＳ−ＧＩＴＲ融合（下のトレース）融合タンパク質にならびにＭＡＢ１親Ａｂを使用する、水素／重水素交換結合質量分析（ＨＤＸＭＳ）の結果を示す。ナンバリングは、ネイティブＧＩＴＲシグナルペプチド（ＡＡ  １〜２６）配列の除去を表す。図１Ｂは、ヒトＧＩＴＲの細胞外ドメイン（ｈＧＩＴＲ  ＥＣＤ）を使用して調製したＮ末端欠失構築物の概略図を示す。図１Ｃは、ＭＡＢ４およびＭＡＢ５のｈＧＩＴＲ  ＥＣＤ構築物との結合の結果を示す。ヒトＧＩＴＲ（ｈＧＩＴＲ）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）からのシステインリッチドメイン１（ＣＲＤ１）のＮ末端欠失は、ＭＡＢ４およびＭＡＢ５のｈＧＩＴＲとの結合を妨害する。同様の結果がＭＡＢ７について得られた（データの図示なし）。図１Ｄは、アラニンスキャニング変異誘発の結果を示す。ＭＡＢ７は、ＧＩＴＲ変異体Ｅ７８Ａを除いて、すべての変異タンパク質と結合した。ＦｏｒｔｅＢｉｏ（商標）結合分析を行い、結果によって、ｈＧＩＴＲＥ７８Ａ変異タンパク質とのＭＡＢ７結合の減少も確認された（データの図示なし）。結果は、ＣＲＤ１を含みかつＥ７８（配列番号８８：ＲＰＴＧＧＰＧＣＧＰＧＲＬＬＧＴＧＴＤＡＲＣＣＲＶＨＴＴＲＣＣＲＤＹＰＧＥＥＣＣＳＥＷＤＣＭＣＶＱＰＥＦＨＣＧＤ）を含むＧＩＴＲのＥＣＤの領域を、ＭＡＢ１およびＭＡＢ７（親ｍＡｂ）への結合に関与する領域および潜在的エピトープとして意味づける。
【図１−３】図１Ａ〜１Ｄ。本発明のＧＩＴＲ  ｍＡｂのエピトープマッピングを示す図である。図１Ａは、Ｆｃ−ＧＩＴＲ融合（上および中間のトレース）およびＨＩＳ−ＧＩＴＲ融合（下のトレース）融合タンパク質にならびにＭＡＢ１親Ａｂを使用する、水素／重水素交換結合質量分析（ＨＤＸＭＳ）の結果を示す。ナンバリングは、ネイティブＧＩＴＲシグナルペプチド（ＡＡ  １〜２６）配列の除去を表す。図１Ｂは、ヒトＧＩＴＲの細胞外ドメイン（ｈＧＩＴＲ  ＥＣＤ）を使用して調製したＮ末端欠失構築物の概略図を示す。図１Ｃは、ＭＡＢ４およびＭＡＢ５のｈＧＩＴＲ  ＥＣＤ構築物との結合の結果を示す。ヒトＧＩＴＲ（ｈＧＩＴＲ）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）からのシステインリッチドメイン１（ＣＲＤ１）のＮ末端欠失は、ＭＡＢ４およびＭＡＢ５のｈＧＩＴＲとの結合を妨害する。同様の結果がＭＡＢ７について得られた（データの図示なし）。図１Ｄは、アラニンスキャニング変異誘発の結果を示す。ＭＡＢ７は、ＧＩＴＲ変異体Ｅ７８Ａを除いて、すべての変異タンパク質と結合した。ＦｏｒｔｅＢｉｏ（商標）結合分析を行い、結果によって、ｈＧＩＴＲＥ７８Ａ変異タンパク質とのＭＡＢ７結合の減少も確認された（データの図示なし）。結果は、ＣＲＤ１を含みかつＥ７８（配列番号８８：ＲＰＴＧＧＰＧＣＧＰＧＲＬＬＧＴＧＴＤＡＲＣＣＲＶＨＴＴＲＣＣＲＤＹＰＧＥＥＣＣＳＥＷＤＣＭＣＶＱＰＥＦＨＣＧＤ）を含むＧＩＴＲのＥＣＤの領域を、ＭＡＢ１およびＭＡＢ７（親ｍＡｂ）への結合に関与する領域および潜在的エピトープとして意味づける。
【図２−１】図２Ａ〜２Ｅ。抗ＧＩＴＲ  ＭＡＢ抗体の結合実験の結果を示す図である。図２Ａおよび２Ｂは、ＭＡＢ４およびＭＡＢ５が、ＥＬＩＳＡアッセイによって判定して、ヒトおよびカニクイザルからのＧＩＴＲと特異的に結合する（２Ａ）が、齧歯類からのＧＩＴＲとはしない（２Ｂ）ことを示す。図２Ｃは、ＥＬＩＳＡアッセイによってＭＡＢ７がヒトおよびカニクイザルＧＩＴＲに結合するがマウスＧＩＴＲに結合しない同様のプロファイルを共有することを示す。図２Ｄは、ＦＡＣＳ競合分析によって判定してＭＡＢ７がＧＩＴＲ−リガンドと結合について競合することを示す。図２Ｅは、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体（例えば、ＭＡＢ４、ＭＡＢ５）がＴＮＦ受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）の他のメンバーと結合しないことを証明するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。Ｐｒｏｔａｇｅｎ（商標）チップアッセイによっても、抗体が他のオフターゲットタンパク質と結合しないことが確認された（図示なし）。
【図２−２】図２Ａ〜２Ｅ。抗ＧＩＴＲ  ＭＡＢ抗体の結合実験の結果を示す図である。図２Ａおよび２Ｂは、ＭＡＢ４およびＭＡＢ５が、ＥＬＩＳＡアッセイによって判定して、ヒトおよびカニクイザルからのＧＩＴＲと特異的に結合する（２Ａ）が、齧歯類からのＧＩＴＲとはしない（２Ｂ）ことを示す。図２Ｃは、ＥＬＩＳＡアッセイによってＭＡＢ７がヒトおよびカニクイザルＧＩＴＲに結合するがマウスＧＩＴＲに結合しない同様のプロファイルを共有することを示す。図２Ｄは、ＦＡＣＳ競合分析によって判定してＭＡＢ７がＧＩＴＲ−リガンドと結合について競合することを示す。図２Ｅは、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体（例えば、ＭＡＢ４、ＭＡＢ５）がＴＮＦ受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）の他のメンバーと結合しないことを証明するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。Ｐｒｏｔａｇｅｎ（商標）チップアッセイによっても、抗体が他のオフターゲットタンパク質と結合しないことが確認された（図示なし）。
【図３】図３Ａ〜３Ｄ。ＧＩＴＲを発現するように改変された２９３細胞における細胞内シグナル伝達を示す図である。図３Ａは、組換えヒトＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲ−Ｌ）が、ヒトＧＩＴＲを過剰発現するように安定的にトランスフェクトされた２９３細胞において細胞内シグナル伝達を活性化することを示す。図３Ｂは、モノクローナル抗体ＭＡＢ４およびＭＡＢ５が、抗体が架橋されたとき、ヒトＧＩＴＲを過剰発現するようにトランスフェクトされた２９３細胞において細胞内シグナル伝達をＧＩＴＲ−Ｌと同程度に活性化する（ＧＩＴＲＬのＥＣ５０は約６５ｎＭであり、対して、架橋剤の存在下でのアゴニスト抗体のＥＣ５０は約２．５ｎＭである）ことを示す。図３Ｃは、ＭＡＢ７およびＭＡＢ８も、ヒトＧＩＴＲおよびＮＦκＢ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子が安定的にトランスフェクトされた２９３細胞において架橋ＭＡＢ４と同様にＮＦκＢ活性化を促進するので、架橋ＭＡＢ抗体が細胞における細胞内シグナル伝達を活性化することを示す。図３Ｄは、カニクイザルＧＩＴＲおよびＮＦκＢ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子が安定的にトランスフェクトされた２９３細胞において、架橋ＭＡＢ４およびＭＡＢ５がＮＦκＢ活性化を促進することを示す。同様の活性化が架橋ＭＡＢ７でも見られた（データの図示なし）。
【図４】図４Ａ〜４Ｃ。Ｔ細胞に対するＭＡＢ７のｉｎ  ｖｉｔｒｏ共刺激活性がＴ細胞活性化に依存することを示す図である。抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ２８（ＣＤ２８．２）および抗ＧＩＴＲ  ｍＡｂをビーズ上で（１：１：３比で）架橋し、その後、ＰＢＭＣとともにインキュベートした。図４Ａは、ＭＡＢ７が、ＣＤ４＋Ｔ細胞の共活性化因子であり、ＣＤ４＋Ｔ細胞においてＴ細胞の増殖を刺激することを示す。図４Ｂは、ＭＡＢ７が、ＣＤ８＋Ｔ細胞の共活性化因子であり、ＣＤ８＋Ｔ細胞においてＴ細胞の増殖を刺激することを示す。図４Ｃは、サイトカイン産生、例えば、ＴＣＲ係合後のＩＦＮγ産生が、ＭＡＢ７と関連して増加されることを示す。同様の結果がＭＡＢ４および５について見られた（データの図示なし）。
【図５】図５Ａ〜Ｄ。様々なレベルのＧＩＴＲ発現細胞におけるＭＡＢ７についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣ活性を示す図である。図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃおよび図５Ｄは、各々、様々なＧＩＴＲ発現レベルを有する対照またはＭＡＢ７抗体を使用するＡＤＣＣ活性の結果を示す。ＭＡＢ７は、ＦｃｇＲＩＩＩａによるシグナル伝達を誘導することができ、ＧＩＴＲシグナル伝達レベルが増加されると活性化が増加される。
【図６】図６Ａ〜６Ｄ。ＧＩＴＲがｈＧＩＴＲ−ｈＧＩＴＲＬノックインマウスにおいて機能性であることを示す図である。脾細胞をｈＧＩＴＲ−ｈＧＩＴＲＬノックインマウスから単離し、刺激せずにまたはａＣＤ３およびａＣＤ８抗体で刺激しながら４８時間培養し、その後、３０分間、対照または様々な濃度のＭＡＢ７をパルスし、その後、固定し、フルオロフォアコンジュゲート抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。図６Ａは、ｈＧＩＴＲの発現が刺激したＣＤ８＋Ｔ細胞で上方調節されることを証明する結果を示す。図６Ｂは、ＭＡＢ７がマウスＣＤ８＋Ｔ細胞上で発現されたｈＧＩＴＲと結合することができることを証明する、ｈＦｃ染色によるＴ細胞への抗ｈＧＩＴＲ抗体結合の結果を示す。図６Ｃおよび６Ｄは、細胞内ｐＩＫＫ染色（６Ｃ）およびＴ細胞活性化（６Ｄ）によって証明されるように、刺激したＣＤ８＋Ｔ細胞へのＭＡＢ７結合が、Ｔ細胞活性化の増加と相関することを示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５。
【図７】図７Ａ〜７Ｃ。ＭＡＢ７がｉｎ  ｖｉｖｏで機能性であることを示す図である。Ｃｏｌｏｎ２６腫瘍が確定されたｈＧＩＴＲ−ｈＧＩＴＲＬダブルノックインマウスを単回用量のビヒクル（ｎ＝８／時点）またはＭＡＢ７（ｎ＝１０／時点）抗体で処置した。図７Ａは、週に２回の腫瘍測定の結果および方程式（Ｌ×Ｗ２）／２を使用して算出した腫瘍体積の結果を示す。示すデータは、第十五（１５）日時点群からのものである。図７Ｂおよび７Ｃは、全血からの結果を示し、図７Ｃおよび７Ｄは、腫瘍を投与３日後に採取し、フローサイトメトリーによって免疫細胞での細胞表面ｈＧＩＴＲ発現について分析したことからの結果を示す。（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．００００５）。
【図８】図８Ａ〜８Ｅ。ＭＡＢ７がｉｎ  ｖｉｖｏでＣｏｌｏｎ２６腫瘍に対する抗腫瘍免疫応答を惹起することを示す図である。Ｃｏｌｏｎ２６腫瘍が確定されたｈＧＩＴＲ−ｈＧＩＴＲＬダブルノックインマウスを単回用量のビヒクル（ｎ＝８／時点）またはＭＡＢ７（ｎ＝１０／時点）で処置した。図８Ａは、投与３日後の調節性Ｔ細胞の結果を示す。図８Ｂ〜８Ｃは、投与１５日後の腫瘍の処置レベルに従って腫瘍部位に存在するリンパ球（８Ｂ）および活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞（８Ｃ）の結果を示す。ビヒクル処置群とＭＡＢ７処置群間の腫瘍サイズの有意差を説明するために細胞の絶対数を腫瘍サイズに正規化した。図８Ｄは、全腫瘍内活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇと比較してＴｅｆｆ／Ｔｒｅｇ比を生成することによって決定した、処置動物において得たＴｅｆｆ／Ｔｒｅｇ比を示す。図８Ｅは、Ｃｏｌｏｎ２６腫瘍細胞とｅｘ−ｖｉｖｏでインキュベートした精製ＣＤ８＋Ｔ細胞からの、ＩＦＮｇ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用してＣＴＬ応答を測定する脾細胞アッセイの結果を示す。（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．０００５）。
【図９】図９Ａ〜９Ｃ。マウス代替ＧＩＴＲ抗体であるＤＴＡ−１での処置後にＣｏｌｏｎ２６腫瘍はもちろん脾臓においてもＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＰＤ−１発現が上方調節されることを示す図である。フローサイトメトリーによって、２用量のＤＴＡ−１後の全腫瘍または全脾臓の単一細胞懸濁液の特性を明らかにした。図９Ａは、全ＣＤ１９−ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージとして評価したＰＤ−１陽性細胞の結果を示す。図９Ｂは、腫瘍体積１ｍｍ３当りのＰＤ−１＋ＣＤ１９−ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数によって腫瘍サイズに正規化したＰＤ−１陽性細胞の結果を示す。図９Ｃは、Ｃｏｌｏｎ２６腫瘍を有するマウスの脾臓においてＤＴＡ−１での処置後にＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＰＤ−１発現の結果が上方調節されることを示す。ＰＤ−１陽性細胞を全ＣＤ１９−ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージとして評価した。（＊ｐ＜０．０５および＊＊＊＊ｐ＜０．０００５）。
【図１０】抗ＧＩＴＲと抗ＰＤ−１の組合せがアイソタイプ対照と比較して生存優位性を付与することを示す図である。抗ＧＩＴＲ（ＩｇＧ２ａ−ＤＴＡ−１）および抗ＰＤ−１（ＲＭＰ１−１４）を個別に用いてまたは組み合わせて処置したＣｏｌｏｎ２６マウスにおける結果をアイソタイプ対照と比較して示す。
【図１１】アイソタイプ対照Ａｂでの処置と比較して、Ｃｏｌｏｎ２６腫瘍が確定されたマウスにおける抗ＧＩＴＲでの処置後、抗ＰＤ−１での処置後、および抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１組合せでの処置後のＬＡＧ３（第１の縦列）、ＴＩＭ３（中央の縦列）およびＰＤ１（右の縦列）の発現を示す図である。抗ＧＩＴＲ（ＩｇＧ２ａ−ＤＴＡ−１）および抗ＰＤ−１（ＲＭＰ１−１４）を個別に用いてまたは組み合わせて処置したＣｏｌｏｎ２６マウスにおける結果をアイソタイプ対照と比較して示す。上の横列は、腫瘍試料における結果を実証し、下の横列は、脾臓試料における結果を実証する。Ｃｏｌｏｎ２６腫瘍のＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＬＡＧ３、ＴＩＭ３およびＰＤ１発現は、ａ−ＧＩＴＲおよびａ−ＰＤ１での処置後に上方調節され、Ｃｏｌｏｎ２６腫瘍のＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＰＤ−１発現は、抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１の併用での処置後に上方調節される。
【実施例】
【０３０４】
例証
ＧＩＴＲアゴニスト抗体ＭＡＢ２、ＭＡＢ３、ＭＡＢ４、ＭＡＢ５、ＭＡＢ６、ＭＡＢ７およびＭＡＢ８の作成
マウスモノクローナルＧＩＴＲアゴニスト抗体ＭＡＢ１をヒト生殖系列抗体とより大きい配列相同性を有するように改変することによって、ヒト抗体ＭＡＢ２、ＭＡＢ３、ＭＡＢ４、ＭＡＢ５、ＭＡＢ６、ＭＡＢ７およびＭＡＢ８を作成した。ＭＡＢ２、ＭＡＢ３、ＭＡＢ４、ＭＡＢ５、ＭＡＢ６、ＭＡＢ７およびＭＡＢ８は、親マウス抗体であるＭＡＢ１のエピトープ特異性、親和性およびカニクイザルマカクＧＩＴＲ交差反応性を保持する。ＭＡＢ２、ＭＡＢ３、ＭＡＢ４、ＭＡＢ５、ＭＡＢ６、ＭＡＢ７およびＭＡＢ８は、元のマウス抗体よりはるかに高いヒト生殖系列配列との相同性を有し、したがって、ヒト免疫系によってよりよく許容されるはずである。
【０３０５】
ＫａｌｏＢｉｏｓを通して（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ（ワールドワイドウェブのｋａｌｏｂｉｏｓ．ｃｏｍにおいて））入手できるＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（登録商標）技術プラットフォームを使用して、マウスモノクローナルＭＡＢ１を、そのタンパク質配列をヒト生殖系列配列に近づけてその免疫原性を低下させるように改変した。Ｈｕｍａｎｅｅｒｅｄ（登録商標）抗体はヒト抗体に非常に近く、Ｖ領域配列は、ヒト生殖系列配列との高い相同性を有するが、親または参照抗体の特異性および親和性をなお保持する（米国特許出願公開第２００５／０２５５５５２号および同第２００６／０１３４０９８号明細書）。このプロセスは、先ず、参照Ｆａｂの重鎖および軽鎖可変領域内の最小抗原結合特異性決定因子（ＢＳＤ）（典型的に、重鎖ＣＤＲ３および軽鎖ＣＤＲ３内の配列）を同定する。これらの重鎖および軽鎖ＢＳＤは、その過程で構築されるすべてのライブラリーにおいて維持されるので、各ライブラリーはエピトープに焦点を合わせたものであり、結果として得られるＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（登録商標）抗体は、元のマウス抗体のエピトープ特異性を保持する。
【０３０６】
次に、全鎖ライブラリー（軽鎖もしくは重鎖可変領域全体がヒト配列のライブラリーで置き換えられているライブラリー）および／またはカセットライブラリー（マウスＦａｂの重鎖もしくは軽鎖可変領域の一部分がヒト配列のライブラリーで置き換えられているライブラリー）を作成する。細菌分泌系を使用して、抗体Ｆａｂ断片のライブラリーのメンバーを発現させ、コロニーリフト結合アッセイ（ＣＬＢＡ）を使用して、そのライブラリーを抗原に結合するＦａｂについてスクリーニングする。陽性クローンをさらに特性決定し、最も高い親和性を有するものを同定する。次いで、残りのマウス配列に関して結合を支持する同定されたヒトカセットを最終ライブラリースクリーニングに組み込んで、完全ヒトＶ領域を作成する。
【０３０７】
結果として得られるＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（登録商標）抗体Ｆａｂは、ヒトライブラリーに由来するＶセグメント配列を有し、ＣＤＲ３領域内で同定される短いＢＳＤ配列を保持し、ヒト生殖系列フレームワーク４領域を有する。これらのＦａｂを、重鎖および軽鎖の可変領域のＩｇＧ発現ベクターへのクローニングによって、完全ＩｇＧに変換する。このプロセスで作成されるＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（登録商標）抗体は、親マウス抗体の結合特異性を保持し、典型的に、抗原に対してその親抗体のものと同等以上の高い親和性を有し、タンパク質レベルで配列同一性がヒト生殖系列抗体遺伝子と比較して高いＶ領域を有する。
【０３０８】
方法
マウス抗ＧＩＴＲ  ｍＡｂ  ＭＡＢ１の作成
複数部位での反復免疫（ＲＩＭＭＳ）（McIntyre GD. Hybridoma 1997）を必要とする手順を使用してＢｃｌ−２トランスジェニックマウス（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇｎ（ｂｃｌ−２）２２  ｗｅｈｉ株）にヒトＧＩＴＲのＮ末端領域（ａａ  ２６〜１６１）で免疫し、その後、高力価マウスからハイブリドーマを産生させた。ｈＧＩＴＲに対するサンドイッチＥＬＩＳＡおよびＮＦκＢレポーター遺伝子アッセイを使用して、ＭＡＢ１を分泌するハイブリドーマを同定し、選択して、ｈＧＩＴＲ結合およびアゴニスト活性を確認した。
【０３０９】
マウスＶ領域のクローニング
標準的な方法を使用してハイブリドーマ細胞株から得たＲＮＡから、ＲＴ−ＰＣＲによって、マウスモノクローナルＭＡＢ１からの可変領域ＤＮＡを増幅した。ＨＶ３（５’−ＧＧＧＴＣＴＡＧＡＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＴＣＴＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴＣＴＴＣ−３’（配列番号９５））およびＨＣｃｏｎｓｔａｎｔ（５’−ＧＣＧＴＣＴＡＧＡＡＹＣＴＣＣＡＣＡＣＡＣＡＧＧＲＲＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣ−３’（配列番号９６））を用いて、ＭＡＢ１  ｃＤＮＡから重鎖可変領域から増幅した。ＬＶ３（５’−ＧＧＧＴＣＴＡＧＡＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＷＣＡＣＡＫＷＣＴＣＡＧＧＴＣＴＴＴＲＴＡ−３’（配列番号９７））およびＬＣｃｏｎｓｔａｎｔ（５’−ＧＣＧＴＣＴＡＧＡＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧ−３’（配列番号１９））を用いて、同じｃＤＮＡから軽鎖可変領域を増幅した。可変重鎖および軽鎖産物をｐｃＤＮＡ３．１ベクターに挿入し、配列を検証した。その重および軽ベクターをＰＣＲのテンプレートとして使用して、ＫａｌｏＢｉｏｓベクターへのクローニングのために制限酵素部位を：ＫＢ１２９２−Ｈｉｓ（Ｃ末端可動性リンカーとＣＨ１上のアミノ酸配列ＡＡＧＡＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号１３）の６−Ｈｉｓタグ（配列番号１１）とをコードするＫＢ１２９２の修飾バージョン）へのＶｈのクローニングのためにＮｃｏＩ（５’）およびＮｈｅＩ（３）に、ＫＢ１２６９へのＶｋのクローニングのためにＮｃｏＩ（５’）およびＢｓｉＷＩ（３’）に、組み込んだ。次いで、ＢｓｓＨＩＩおよびＣｌａＩでの制限消化ならびにライゲーションによって、これらの別々の重鎖および軽鎖ベクターを組み合わせて単一の２シストロン性ＫａｌｏＢｉｏｓ  Ｆａｂ発現ベクターにした。大腸菌（E. coli）においてこれらのベクターからＦａｂ断片を発現させた。このＦａｂをｈＧＩＴＲ−抗原結合について試験し、このＦａｂをＭＡＢ１ｒＦａｂと呼ぶ。
【０３１０】
Ｆａｂ精製
ＫａｌｏＢｉｏｓ発現ベクターを使用して大腸菌（E. coli）からの分泌によりＦａｂ断片を発現させた。細胞を２ｘＹＴ培地で約０．６のＯＤ５００まで増殖させた。１００μＭまでＩＰＴＧを添加し、４時間、３３℃で振盪することによって、発現を誘導した。浸透圧溶解、および標準的な方法に従ってＮｉ−ＮＴＡカラム（ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラム；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅカタログ番号１７−５２４７−０１）を使用する精製によって、ペリプラズム画分から組立てられたＦａｂを得た。５００ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液中でＦａｂを溶離し、カルシウムおよびマグネシウムを含有しないＰＢＳ  ｐＨ７．４に対して十分に透析した。
【０３１１】
ライブラリー構築
ＢＳＤ−ＦＲ４のヒトＧＩＴＲ結合を支持する相補的ヒトＣＤＲを同定する複雑さを制限するために、親マウスＶセグメントの一部分だけをヒト配列によって置き換えるカセットライブラリーアプローチを使った。元のマウスＭＡＢ１  Ｖｋは、ヒト生殖系列ＶｋＩＩＩに最も近いため、ＶｋＩＩＩ生殖系列を含有する２つのＫａｌｏＢｉｏｓ（ＫＢ１４２３およびＫＢ１４２４）の混合物をＶｋカセットライブラリーの作製に使用した。ＶＨ３生殖系列（ＫＢ１４１３およびＫＢ１４１４）を含有するＫａｌｏＢｉｏｓライブラリーを使用してＶｈカセットライブラリーを構築した。２タイプのカセットをオーバーラップＰＣＲによって構築した：上述の生殖系列制限ＫａｌｏＢｉｏｓライブラリーを使用して、ＦＲ１内のヒト配列を含有するフロントエンドカセット（８Ｃ１ＶＫ３ＦＥ−０１、およびＭＡＢ１ＶＨ３ＦＥ−０１）と、ＣＤＲ１と、ＦＲ２と、ＦＲ３内のヒト配列を含有するＦＲ３カセット（ＭＡＢ１ＶＫ３ＦＲ３−０１、およびＭＡＢ１ＶＨ３ＦＲ３−０１）とを増幅させた。各ＶｈカセットライブラリーをベクターＫＢ１２９２−ＨｉｓのＮｃｏＩ（５’）およびＫｐｎ（３’）にクローニングし、各ＶｋカセットライブラリーをベクターＫＢ１２９６−Ｂ（ＦＲ４にサイレントＨｉｎｄＩＩＩ部位が付加された、Ｋａｌｏ  ＢｉｏｓベクターＫＢ１２９６の修飾バージョン）のＮｃｏＩ（５）およびＨｉｎｄＩＩＩ（３’）にクローニングした。次いで、得られたＶｈまたはＶｋプラスミドライブラリーを、ＢｓｓＨＩＩおよびＣｌａＩでの消化およびその後のライゲーションによって、最適化参照Ｆａｂ（ＭＡＢ１  ｏｐＶＫまたはＭＡＢ１  ｏｐＶＨ）からの相補鎖と組み合わせて（例えば、Ｖｈフロントエンドライブラリーを最適化参照Ｖｋベクターと組み合わせて）、完全Ｆａｂを発現する２シストロン性ベクターのライブラリーを作成した。
【０３１２】
いずれのＶＨ３フロントエンドクローンもヒトＧＩＴＲに高親和性で結合しなかったので、第２のＶＨ３フロントエンドライブラリー（ＭＡＢ１ＶＨ３ＦＥ−０２）を構築した。このライブラリーは、ＦＲ１内のヒト配列と、ＦＲ２と、親マウス残基または選択されたヒト生殖系列残基のどちらかをあらゆる位置にコードするＣＤＲ２のコレクションとを含有する。このライブラリーのＦＲ３領域配列は、ＶＨ３ＦＲ３ライブラリー（ＭＡＢ１ＶＨ３ＦＲ３−０１）から選択された６つのクローンからのものであった。
【０３１３】
ＶＫフロントエンドおよびＶＫＦＲ３カセットライブラリーからのクローンと、親マウスまたは選択ヒト生殖系列残基をあらゆる位置にコードする変異原性ＶＫ  ＣＤＲ２とを組み合わせることによって、最終Ｖｋ完全鎖ライブラリー（ＭＡＢ１ＶＫ３ＦＣＬ−０１）を構築した。得られたＶｋ完全鎖ライブラリーをＫＢ１２９６ｂのＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングした。このＶＫ完全鎖ライブラリーを多数の選択ＶＨ３ＦＲ３ライブラリークローンと対合させて機能性Ｆａｂを発現させ、ＣＬＢＳによってスクリーニングした。抗原特異的クローンをヒトＧＩＴＲ特異的ＥＬＩＳＡによって確認し、抗原親和性力価測定ＥＬＩＳＡ（antigen affinity titration ELISA）によってランク付けした。親マウス残基またはヒト残基のどちらかを各々の位置に含有するＣＤＲ２配列のコレクションを有する第２のＶＨ３フロントエンドライブラリー（ＭＡＢ１ＶＨ３ＦＥ−０２）からの選択クローンを使用して、ＶＨ３完全鎖ライブラリー（ＭＡＢ１ＶＨ３ＦｃＬ−０１）を作成した。このＶＨ完全鎖ライブラリーをＫＢ１２９２−ｈｉｓのＮｃｏＩおよびＫｐｎＩ部位にクローニングした。最終完全鎖ヒトＦａｂ発現ライブラリーを生じさせるために、選択ＶＫ完全鎖クローンをＢｓｓＨＩＩおよびＣｌａＩ部位でＶＨ完全鎖ライブラリーと組み合わせた。
【０３１４】
一般的ＥＬＩＳＡ
ヒトＧＩＴＲとヒトＦｃの組換え融合タンパク質（ｈＧＩＴＲ−ｈＦｃ）をすべてのＥＬＩＳＡアッセイに使用した。典型的に、ＰＢＳ  ＰＨ７．４で希釈したｈＧＩＴＲ−ｈＦｃ抗原を２００ｎｇ／ウェルで９６ウェルマイクロタイタープレートに４℃で一晩のインキュベーションによって結合させた。ＰＢＳＴで３回すすいだ後、プレートをＰＢＳ中の１％ＢＳＡの溶液で１時間、３７℃でブロックし、その後、ＰＢＳＴで１回すすいだ。その後、Ｆａｂ含有細胞培地または希釈した精製Ｆａｂ（５０μＬ）を各ウェルに添加した。３７℃での１時間のインキュベーションまたは４℃での一晩のインキュベーションの後、プレートをＰＢＳＴで３回すすいだ。ＰＢＳＴ（５０μＬ）で１：５０００希釈した抗ヒト−カッパ鎖ＨＲＰ結合体（Ｓｉｇｍａ  ＃Ａ７１６４）を各ウェルに添加し、プレートを４５分間、室温でインキュベートした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、その後、１００μＬのＳｕｒｅＢｌｕｅ  ＴＭＢ基質（ＫＰＬ  ＃５２−００−０３）を各ウェルに添加し、そのプレートを約１０分間、室温でインキュベートした。プレートを分光光度計において６５０ｎｍで読み取った。
【０３１５】
親和性力価測定ＥＬＩＳＡ
選択Ｆａｂ産生クローンの抗原結合を評価するために、親和性力価測定ＥＬＩＳＡを開発した。このアッセイは、２つの連続ＥＬＩＳＡステップを組み合わせる：第１のものは、ヤギ抗ヒトＦａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ  ＃１０９−００５−０９７）捕捉およびヤギ抗ヒトカッパ（Ｓｉｇｍａ  ＃Ａ７１６４）検出を使用して、細胞培養培地中のＦａｂ濃度を測定して、第２の抗原力価測定ＥＬＩＳＡで使用するＦａｂの量を正規化する；通常の抗原特異的ＥＬＩＳＡである第２のＥＬＩＳＡは、同じ量の出発Ｆａｂで抗原結合希釈曲線を生成する。異なるクローンの希釈曲線を比較することにより、高親和性クローンを同定する。
【０３１６】
コロニーリフト結合ＥＬＩＳＡ（ＣＬＢＡ）
ＰＢＳ  ｐＨ７．４中２．０ｇ／ｍＬのｈＧＩＴＲ−ｈＦｃでコーティングされたニトロセルロース繊維を使用して、本質的には（米国特許出願公開第２００５／０２５５５５２号および同第２００６／０１３４０９８号明細書）に記載されているように、Ｆａｂ断片のＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（登録商標）抗体ライブラリーのスクリーニングを行った。抗原でコーティングされた繊維に結合したＦａｂを、ＰＢＳＴで１：５０００希釈したヤギ抗ヒトカッパ鎖ＨＲＰコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ  ＃Ａ７１６４）を使用して検出し、ＥＣＬ  ｐｌｕｓウェスタンブロッティング検出システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＃ＲＰＮ２１３２）でブロットを現像した。
【０３１７】
ＭＡＢ４の糖化部位の除去
ＭＡＢ４重鎖のＦＲ３とＣＤＲ３の接合部の糖化部位「ＫＨ」を、リジンのアルギニンでの置き換え、またはリジンのアルギニンでのおよびヒスチジンのアスパラギンでの置き換えによって除去した。ＤＮＡテンプレートとしてｐ５０Ｈプラスミドを使用するＰＣＲベース変異誘発によって、ＫＨのＲＨへの変換およびＫＨのＲＮへの変換を果した。リバースプライマー（ＴＣＴＧＧＣＧＣＡＧＴＡＡＴＡＣＡＣＧＧＣＣ、配列番号１１０）は、リジンの代わりにアルギニンを組み込んでおり、フォワードプライマー（ＮＮＫＧＣＣＴＡＴＧＧＣＣＡＴＧＡＴＧＧＣＧ、配列番号１１１）は、ヒスチジン部位に縮重ＮＮＫトリヌクレオチドを有した。５０μｌの反応体積中、１００ｎｇのテンプレート、０．２μＭの各プライマー、２００μＭのｄＮＴＰ、および２．５ＵのｐｆｕＵｌｔｒａＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）で、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ条件は、９４℃３分間、１サイクル；９４℃１５秒間、５２℃２０秒間そして６５℃５分間、３０サイクル；そして最後に、７２℃で５分間、１サイクルであった。ＤｐｎＩ（２Ｕ）をＰＣＲ反応に添加し、３７℃で３０分間インキュベートして、テンプレートｐ５０Ｈを除去した。増幅されたＭＡＢ４重鎖バリアントを１％ＳＹＢＲゲルによって分離し、Ｑｉａｇｅｎゲル精製キットを使用して精製した。ゲル精製ＰＣＲ産物をＴ４  ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼで処置し、ライゲーションし、アンピリシン選択下でＤＨ５α化学的コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。
【０３１８】
フォワード（ＧＣＣＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧ、配列番号１１２）およびリバース（ＧＧＣＡＡＡＣＡＡＣＡＧＡＴＧＧＣＴＧＧ、配列番号１１３）プライマーをＧｏＴａｑＣｌｅａｒプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従って使用するコロニーＰＣＲによって、ＭＡＢ７およびＭＡＢ８重鎖を提供するクローンを選択した。ＰＣＲ条件は、９４℃３分間、１サイクル；９４℃１０秒間、５５℃３０秒間、７２℃４５秒間、２５回；そして最後に、５分間７２℃で１サイクルであった。試料をエキソヌクレアーゼＩおよびエビアルカリホスファターゼとともに３７℃で３０分間そして８０℃で１５分間インキュベートすることによって、シークエンシングのためにＰＣＲ反応物を浄化した。ＰＣＲ試料をシークエンシングし、Ｃｌｏｎｅ  Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアを使用して結果を分析した。
【０３１９】
抗体産生および精製
産生抗体ＭＡＢ２、ＭＡＢ３、ＭＡＢ４、ＭＡＢ５、ＭＡＢ６、ＭＡＢ７およびＭＡＢ８（ＩｇＧ１カッパ）は、２９３ｆｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃５１−００３１）を製造業者のプロトコルに従って使用する２９３Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞への次の通りのベクターのコトランスフェクションによって産生させた。
ＭＡＢ２  −  ｐ３５Ｈ  ＋  ｐ３５カッパ
ＭＡＢ３  −  ｐ３８Ｈ  ＋  ｐ３８カッパ
ＭＡＢ４  −  ｐ５０Ｈ  ＋  ｐ３５カッパ
ＭＡＢ５  −  ｐ５１Ｈ  ＋  ｐ３５カッパ
ＭＡＢ６  −  ｐ５６Ｈ  ＋  ｐ３５カッパ
ＭＡＢ７  −  ｐＭＡＢ７Ｈ  ＋  ｐ３５カッパ
ＭＡＢ８  −  ｐＭＡＢ８Ｈ  ＋  ｐ３５カッパ
【０３２０】
５ｍＬ  ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＃１７−０４０３−０３）を使用して２９３  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞上清から抗体を精製した。ＩｇＧ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ  ＃２１００４）を使用して抗体を溶離し、透析によって緩衝液をＰＢＳに交換した。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーをＡＫＴＡ−ＦＰＬＣ液体クロマトグラフィーシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で行った。
【０３２１】
特異性ＥＬＩＳＡ
特異性ＥＬＩＳＡのために、ＴＮＦＲＳＦファミリーのメンバーを発現する細菌から粗細胞溶解物を製造した。プレートへの非特異的結合を防止するために、細菌溶解物１ｍＬ当り５０μＬの５％ＢＳＡを添加した。細菌溶解物を含有するＴＮＦＲＳＦを１ウェル当り１００μＬの溶解物／ＢＳＡで用いてＨｉｓＧｒａｂ  Ｎｉｃｋｅｌ  ９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  ＃１５１４２）をコーティングし、１時間、室温でインキュベートした。その後、プレートをＰＢＳＴで３回すすぎ、次いでＭＡＢをＰＢＳ中１０％ＦＢＳ中、０．５μｇ／ｍｌに希釈し、１００μＬを各ウェルに添加した。そのプレートを１時間室温でインキュベートし、その後、ＰＢＳＴで３回すすいだ。ＨＲＰにコンジュゲートさせた抗ヒトカッパ抗体（Ｓｉｇｍａ  ＃Ａ７１６４）を、１：１  ＰＢＳＴ：（ＰＢＳ中１０％ＦＢＳ）で１：５０００希釈し、１００μＬを各ウェルに添加した。プレートを１時間室温でインキュベートし、その後、ＰＢＳＴで３回洗浄した。１００μＬのＳｕｒｅＢｌｕｅ  ＴＭＢ基質を各ウェルに添加し、そのプレートを約１０分間室温でインキュベートした後、１００μＬ／ウェルの２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させた。そのプレートを分光光度計において４５０ｎｍで読み取った。
【０３２２】
ＥＬＩＳＡ（ＧＩＴＲ結合、種交差反応性、アラニンスキャニング）
１ウェル当り５０ｎｇのラット、マウス、ヒトまたはカニクイザルＧＩＴＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をコーティングして一晩４℃でインキュベートした３８４ウェルプレートを使用して、ＭＡＢと様々な種からのＧＩＴＲ、様々なアラニン変異体構築物またはＧＩＴＲ細胞外ドメインとの結合を評価した。プレートをＰＢＳ中の１％ＢＳＡの溶液で１時間、室温でブロックし、その後、ＰＢＳＴで３回すすいだ。その後、ＭＡＢをＰＢＳ中０．５μｇ／ｍＬまたは１μｇ／ｍＬに希釈し、２０μＬを各ウェルに添加した。そのプレートを１時間室温でインキュベートし、その後、ＰＢＳＴで３回洗浄した。ＨＲＰにコンジュゲートさせた、抗ヒトカッパ抗体（Ｓｉｇｍａ  ＃Ａ７１６４）、抗ヒトガンマ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  １０９−０３６−０９８）、ヤギ抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  １１５−０３５−０７１）をブロッキング緩衝液（２５μＬ）で１：５０００希釈して各ウェルに添加した、またはブロッキング緩衝液で１：１０００希釈したｈｒｐコンジュゲートＨＩＳ抗体（ＱＩＡＧＥＮ  １０１４９９２）を添加した。そのプレートを１時間室温でインキュベートし、その後、ＰＢＳＴで６回洗浄した。２５μＬのＳｕｒｅＢｌｕｅ  ＴＭＢ（ＫＰＬ  ５２−００−０２）基質を各ウェルに添加し、プレートを約１０分間、室温でインキュベートした。プレートを分光光度計において６５０ｎｍで読み取った。
【０３２３】
細胞株、細胞細胞株
２９３−ｈＧＩＴＲ−ＮＦκＢレポーター遺伝子細胞株を産生させるために、ＮＦκＢ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子およびヒトＧＩＴＲ（またはカニクイザルＧＩＴＲ）を２９３細胞に安定的にトランスフェクトした。これらの細胞におけるＧＩＴＲシグナル伝達経路の活性化を、ＧＩＴＲ−Ｌまたはアゴニスト抗体との２４時間のインキュベーション後にそれらの細胞内に導入されたルシフェラーゼのレベルを測定することによって判定した。架橋Ａｂの効果を評価するために、それらを過剰なＦ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＦｃγ断片特異的抗体またはプロテインＡとともにインキュベートし、その後、レポーター遺伝子アッセイで使用した。
【０３２４】
ヒト免疫細胞で見られるレベルのＧＩＴＲを発現するクローンＤａｕｄｉ細胞株を産生させた。
【０３２５】
カニクイザルＰＢＭＣを調製し、ＭＡＢを使用してＧＩＴＲ結合を判定した。簡単に言うと、カニクイザル血液を５０ｍＬコニカルチューブ（Ｆａｌｃｏｎ、＃３５２０９８）に移し、その後、ＰＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、＃ＳＨ３０２５６．０１）で１：２希釈し、混合した。希釈血を１８ｍＬの９０％Ｆｉｃｏｌｌ  Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（ＰＢＳで希釈したＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＃１７−１４４０−０３）の上に注意深く積層し、ベンチトップ遠心分離機において２，０００ｘｇで３０分間、室温で、破壊することなく回転させた。Ｆｉｃｏｌｌの上に広がったＰＢＭＣ層を乱すことなく、注意深く血漿層を除去した。その後、ＰＢＭＣを注意深く回収し、単離されたＰＢＭＣに、コニカルチューブ内のその体積が４５ｍＬになるまでＰＢＳを添加し、その後、ベンチトップ遠心分離機において３００ｘｇで１５分間、室温で回転させた。上清を注意深く吸引し、４ｍＬの１ｘＢＤ  Ｌｙｓｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ  ＃５５５８９９）を添加し、試料を穏やかにボルテックスした。室温の暗所で３分間インキュベートした後、４０ｍＬのＰＢＳを各試料に添加し、それらをベンチトップ遠心分離機において２００ｘｇで１０分間、室温で回転させた。上清を注意深く吸引し、ペレットを４５ｍＬのＰＢＳ中で２回洗浄した後、ベンチトップ遠心分離機において２００ｘｇで１０分間、室温で回転させた。得られたペレットを濾過し、ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン（Ｈｙｃｌｏｎｅ  ＃ＳＶ３００８２．０１）を補足したＣＴＬ  Ｔｅｓｔ培地（ＣＴＬＴ−００５）に、１×１０６細胞／ｍＬで再懸濁させた。１００μＬの精製カニクイザルＰＢＭＣを９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃３７９９）に播種した。ＰＢＭＣを活性化するために、ＳＰ３４−２／ＣＤ２８．２抗体とコンジュゲートしたＭ−２８０トシル基活性化ダイナビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃１４２．０４）１００μＬを各ウェルに添加した。３：１比のＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ：ＰＢＭＣを使用し、プレートを３７℃組織培養インキュベーターで４８時間インキュベートした。第０日染色のために、２００μＬのＰＢＭＣを９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃３７９９）に播種した。４８時間刺激した試料について、１００μＬの上清を注意深く除去し、ウェルの残存内容物を注意深く再懸濁させ、２００μＬをＦＡＣＳ染色プレートに移した。
【０３２６】
ＦＡＣＳ
細胞を２００μＬの冷ＰＢＳに再懸濁させたプレートを準備した。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ固定可能染色剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃Ｌ２３１０５）を５０μＬのＤＭＳＯで再構成し、１μＬの再構成染色剤を１ｍＬの冷ＰＢＳに対して添加し、細胞ペレットを直ちに１００μＬのＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  ＰＢＳ溶液に再懸濁させ、光から保護して氷上で３０分間インキュベートし、その後、洗浄し、２μｇ／ｍＬのＭＡＢ７またはアイソタイプヒトＩｇＧ１対照抗体を含有する１００μＬの冷ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させ、光から保護して氷上で３０分間、プレートをインキュベートした。続いて洗浄および１００μＬの抗体カクテル（ＦＡＣＳ緩衝液（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  ＃１０９−１１６−０９８）中のＰｅｒＣＰ  Ｃｙ５．５抗ヒトＣＤ３（ＢＤ  ＃５５２８５２）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００抗ヒトＣＤ４（ＢＤ  ＃５６０８３６）、Ｖ４５０抗ヒトＣＤ８（ＢＤ  ＃５６１４２６）、ＰＥ−Ｃｙ７抗ヒトＣＤ２５（ＢＤ  ＃５６１４０５）およびＰＥ抗ヒト）への再懸濁を行い、その後、光から保護して氷上で３０分間プレートをインキュベートし、その後、ベンチトップ遠心分離機において３，２００ＲＰＭで１分間、４℃で回転させた。その後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液中で洗浄し、１００μＬのＢＤ  ＣｙｔｏＦｉｘ（ＢＤ  ＃５５４６５５）に再懸濁させ、光から保護して１５分間、室温でプレートをインキュベートし、その後、２回洗浄し、１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。プレートをフォイル（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、＃５３８６１９）で覆い、読み取りの準備が整うまで４℃で保存した。ＦＡＣＳ読み取り当日、ベンチトップ遠心分離機において３，２００ＲＰＭで１分間プレートを回転させ、５０μＬのＣＭＬラテックスビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃Ｃ３７２５９）、ＦＡＣＳ緩衝液中４×１０５／ｍＬ、を各ウェルに添加した。プレートをＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターで読み取り、ＦｌｏｗＪｏを使用してデータを分析した。
【０３２７】
トランスジェニックマウス
マウスＧＩＴＲの全コード配列（エクソンおよびイントロン）をヒトＧＩＴＲ  ｃＤＮＡ配列で置き換えることによって、ｈＧＩＴＲノックインマウスを産生させた。開始コドンの上流かつ終止コドンの下流の非翻訳配列は、マウスゲノムからのものである。ＢＡＬＢ／ｃ由来相同アームを有する標的化ベクターを用いて標準的技術によりＢＡＬＢ／ｃ  ＥＳ細胞において遺伝子標的化を行った。いくつかのＥＳ細胞クローンをＰＣＲによって同定し、正確なヒトｃＤＮＡノックインを含有することをサザンブロッティングによって確認した。標準的なマウス発生学技法に従って、陽性ＥＳ細胞クローンを胚盤胞に注射し、それらを偽妊娠レシピエント里親に移入して、キメラ子孫を得た。雄キメラマウスと、生殖系列でＣｒｅリコンビナーゼを発現するＢＡＬＢ／ｃ雌とを交配させて、ネオマイシン耐性カセットに隣接するｌｏｘＰを切除した。１つのクローンは、標的ＥＳ細胞の生殖系列伝達を示す白い子孫をもたらした。ｌｏｘＰ隣接カセットの切除をＰＣＲ遺伝子型判定によって確認した。ＢＡＬＢ／ｃ  ｗｔマウスの後続の繁殖ステップによってＣｒｅリコンビナーゼは除去された。
【０３２８】
マウスのエクソン１のコード部分をヒトＧＩＴＲＬ  ｃＤＮＡ配列で置き換え、続いてウシ成長ホルモンポリＡシグナルで置き換えることによって、ｈＧＩＴＲノックインマウスを産生させた。すべてのＥＳ細胞研究およびマウス発生学を上記の手順と同様に行った。２つの樹立系統を２世代にわたって交雑させてホモ接合ダブルノックインマウスを生じさせることによって、ｈＧＩＴＲ−ｈＧＩＴＲＬダブルノックインマウスを産生させた。
【０３２９】
機能アッセイ
ＭＡＢの機能活性をＮＦκＢレポーター遺伝子アッセイでアゴニスト活性について試験した。ＭＡＢをＰＢＳ中６μｇ／ｍＬに希釈し、３倍過剰のＦ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＦｃγ特異的架橋剤の存在／非存在下、３０分間、室温でインキュベートした。あるいは、ＭＡＢをＰＢＳ中６μｇ／ｍＬに希釈し、２倍過剰のプロテインＡの存在／非存在下、３０分間、室温でインキュベートした。インキュベートした１０μＬのＭＡＢを、その後、３８４ウェル白色透明底アッセイプレートに添加した。ｈＧＩＴＲおよびＮＦκＢレポーター遺伝子が安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞株を５×１０５細胞／ｍＬに希釈し、２０μＬの細胞懸濁液を各ウェルに添加した。プレートを３７℃組織培養インキュベーターで２４時間インキュベートした。３０μＬのＣｅｌｌ  Ｂｒｉｇｈｔ  Ｇｌｏを各ウェルに添加し、そのプレートをＡｃｑｕｅｓｔで発光について読み取った。
【０３３０】
リガンド結合をブロックするＭＡＢの能力を、ＨＥＫ２９３  ＮＦκＢレポーター親細胞を使用して評価し、ｈＧＩＴＲ安定細胞を競合結合アッセイおよびＦＡＣＳ分析に使用した。簡単に言うと、回収した細胞を、１ｍＬ当り１×１０６細胞、１ウェル当り１００μＬで、９６ウェル丸底ＦＡＣＳプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種し、その後、１ウェル当り２００μＬの冷ＦＡＣＳ緩衝液（１Ｘ  ＰＢＳ＋１％ＦＢＳ−ＨＩ＋０．１％アジ化ナトリウム）に再懸濁させた。１ウェル当り１００μＬでＦＡＣＳ緩衝液中２７０ｎＭ〜１．５２ｐＭのヒトＧＩＴＲリガンド滴定液を調製した。光から保護して氷上で１時間、プレートをインキュベートし、細胞を洗浄し、その後、４ｎＭアイソタイプ対照を調製し、またはＭＡＢ溶液を調製し、適切なウェルに１ウェル当り１００μＬで添加し、光から保護して氷上で１時間、プレートをインキュベートし、細胞を洗浄し、その後、ＦＡＣＳ緩衝液中１：１００希釈で調製したＰＥコンジュゲートヤギ抗ヒト検出抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を１ウェル当り１００μＬで添加し、光から保護して氷上で３０分間、プレートをインキュベートした。その後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液中で洗浄し、細胞を１ウェル当り１００μＬのＢＤ  ＣｙｔｏＦｉｘ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で固定し、光から保護して氷上でさらに１５分間インキュベートした。固定された細胞を２回洗浄し、１ウェル当り１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液の最終体積で再懸濁させ、１週間以内にＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で試料を分析した。
【０３３１】
ＭＡＢのアゴニスト活性は、初代Ｔ細胞からの増殖およびサイトカイン分泌によって、内在性レベルのＧＩＴＲを発現する初代Ｔ細胞でも見ることができた。Ｍ−２８０トシル基活性化ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１４２．０４）上に製造業者の説明書にしたがってＭＡＢをコンジュゲートさせた。一部の実験では、アゴニストＣＤ３（ＯＫＴ３）およびＣＤ２８（ＣＤ２８．２）抗体もビーズにコンジュゲートさせた。１×１０５個の精製したてのＣＦＳＥ標識ヒトＰＢＭＣを、９６ウェル丸底組織培養プレート中の１０μＬのＣＴＬ  Ｔｅｓｔ培地（ＣＴＬ  ＃ＣＴＬＷ−０１０）に播種した。その後、１００μＬのＭＡＢコンジュゲートビーズを、Ｔ細胞１：ビーズ１の比で添加した。その後、プレートを３７℃組織培養インキュベーターで３日間インキュベートした。ＭＳＤマルチプレックスアッセイを製造業者の説明書に従って使用して、培地中の分泌サイトカインレベルを測定した。抗ＣＤ４、抗ＣＤ８ａ、抗ＣＤ２５、抗ＧＩＴＲ抗体およびＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色剤で細胞を染色し、染色後、細胞を固定し、フローサイトメーターで読み取った。各ＣＤ４およびＣＤ８細胞の増殖を、ＣＦＳＥ染色によって評価し、カウントビーズを添加した後、ＦＡＣＳ読み取りを行って、試料を正規化することができた。
【０３３２】
ＩＦＮｇを検出するＥＬＩＳｐｏｔ法を使用して、ＭＡＢのＴ細胞に対する共刺激活性も測定した。簡単に言うと、７０％エタノールで２分間コーティングし、続いてＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中のＩＦＮｇモノクローナル抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ  ３３２１−３）５０ｕｇとともに一晩インキュベートすることによって、ＥＬＩＬＳＰＯＴプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＭＳＩＰＳ４５１０）を準備した。精製ＣＤ８＋Ｔ細胞をビヒクルまたはＭＡＢ７処置マウスの脾臓から投与１５日後に単離した。コーティングされたＥＬＩＳＰＯＴプレートに、Ｔ細胞を、ＣＴＬ培地（ＣＴＬ  Ｔｅｓｔ培地（ＣＴＬ  ＣＴＬＴ−００５）、１ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  ＭＴ２５−０６０−Ｃｌ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  ＭＴ２５−００５−Ｃｌ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  ＭＴ２５−０００−Ｃｌ）、１００ｕＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  ＭＴ２５−０２５−Ｃｌ）、６６ｕＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ  ２１９８５−０２３）、１００Ｕ／ｍＬ  Ｐｔｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ  １０３７８０１６））中、０．２５×１０６細胞で播種した。Ｃｏｌｏｎ２６細胞を３７℃で４８時間、１０％ＣｏｎＡ  ｓｕｐ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ３５４１１５）で処置してＭＨＣクラスＩＩ発現を上方調節し、ＣＴＬ培地で洗浄した後、Ｔ細胞を添加した。Ｃｏｌｏｎ２６腫瘍細胞（２０，０００／ウェル）をＣＴＬに添加し、３７℃で２４〜４８時間インキュベートした。その後、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳで洗浄し、１０ｕｇのビオチン化抗ＩＦＮｇ  Ｍａｂ（Ｍａｂｔｅｃｈ  Ｒ４−６Ａ２−ｂｉｏｔｉｎ）を各ウェルに添加し、２時間、３７℃でインキュベートした。その後、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳで洗浄し、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ  ＰＫ６１００）を各ウェルに添加し、１時間、室温でインキュベートした。その後、細胞を０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳで洗浄し、製造業者のプロトコルに従って調製したＡＥＣ基質（Ｓｉｇｍａ  Ａ６９２６）を各ウェルに添加し、４分間、室温でインキュベートした。その後、プレートを水道水ですすぎ、乾燥させ、暗所で２４時間保存した後、読み取った。
【０３３３】
ＡＤＣＣを誘導するＭＡＢの能力を、レポーターアッセイを使用して測定した。９６ウェル白色プレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｆ６１７８）において、２×１０３ｈＧＩＴＲ−Ｄａｕｄｉ細胞を４×１０４Ｊｕｒｋａｔ−Ｖ１５８細胞（ヒトＦｃｇＲＩＩＩａのＶ１５８バリアントおよびＮＦＡＴレポーターを安定的に発現する）とともに、Ｄａｕｄｉ細胞１対Ｊｕｒｋａｔ細胞２０の比で、５０ｕＬ  ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ中でインキュベートした。同体積のＭＡＢをウェルに添加し、プレートを３時間、３７℃組織培養インキュベーターでインキュベートした。インキュベーション後、６０ｕＬのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏを各ウェルに添加し、そのプレートをルミノメーターで読み取った。
【０３３４】
マウスから単離した脾臓を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ脾細胞アッセイを行った。簡単に言うと、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ  Ｏｃｔｏ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １３０−０９５−９３７）でｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ  Ｃチューブ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １３０−０９６−３３４）を使用する、５％ＢＳＡ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １３０−０９１−３７６）を含有するＡｕｔｏＭＡＣＳ  Ｒｉｎｓｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １３０−０９１−２２２）５ｍＬ中での自動均質化によって、マウスからの脾臓を解離させた。均質化物を０．７０ｕＭ細孔経セルストレーナー（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ２２３６３５４８）によって濾し、１０ｍＭ  ＡｕｔｏＭＡＣＳ緩衝液で洗浄した。脾細胞をＲＰＭＩ（ＨｙＣｌｏｎｅ  ＳＨ３００２７．０２）＋１０％ヒト血清（Ｃｅｌｌｇｒｏ  ３５−０６０．Ｃ１）＋１ｘＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／Ｌ−Ｇｌｕｔ（Ｇｉｂｃｏ  １５  １４０−１１２）に再懸濁させ、９６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３７９９）に１００，０００細胞／ウェルで播種した。Ｔ細胞刺激のために、０．４ｕｇ／ｍＬの抗マウスＣＤ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  １６−００３１−８６）および０．８ｕｇ／ｍＬの抗マウスＣＤ２８（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  １３−０２８１−８６）抗体を適切なウェルに添加した。４８時間後、細胞を直ちに分析するか、または細胞を対照もしくは治療用抗体で３０分間〜９６時間パルスし、フルオロフォアコンジュゲート抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。
【０３３５】
フローサイトメトリー：表面マーカーについて、細胞を抗ＣＤ１９（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５６２２９１）、抗ＣＤ８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  １００７２５）、抗ＣＤ４（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２５−００４１）、抗ＣＤ６９（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５６１２３８）、抗ｈＧＩＴＲ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １３０−０９２−８９５）および抗ｈＩｇＧ（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ａ−１０６３１）抗体で、３０分間、４Ｃで染色した。細胞内染色のために、細胞表面抗体とのインキュベーション後、細胞を洗浄し、固定し、製造業者のプロトコルに従ってＦＯＸＰ３  Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍ緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ４２１４０３）で透過性化し、抗リン酸化ＩＫＫａ／ｂ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ２６９７）または抗ＦＯＸＰ３抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ５０−４７７４−４２）とともに３０分間、４Ｃでインキュベートした。ＢＤ  ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＢＤ  ＬＳＦＦｏｒｔｅｓｓａサイトメーターで細胞を読み取り、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ  Ｉｎｃ．）を使用して流量データを分析した。
【０３３６】
単一細胞懸濁液を腫瘍および脾臓から生成し、フローサイトメトリーによる分析のために染色した。例えば、次の抗体を使用して細胞マーカーを評価した：ａ−ＣＤ８−ＢＵＶ３９５（クローン５３−６．７、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５６３７８６）、ａ−ＣＤ１９−ＡＰＣ−Ｃｙ７（クローン６Ｄ５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  １１５５３０）、ａ−ＣＤ３−ＰｅｒＣｐ（クローン１４５−２Ｃ１１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ５５３０６７）、ａ−ＰＤ−１−ＰＥ−Ｃｙ７（クローンＲＭＰ１−３０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  １０９１１０）。ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａサイトメーターでフローサイトメトリーを実行した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ  ＬＬＣ）を使用してサイトメトリーデータを分析した。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用してグラフを作成し、統計を実行した。すべてのデータを平均±標準偏差（ＳＤ）として示した。両側９５％信頼区画でスチューデントＴ検定を使用して群比較を行った。すべての統計学的評価について、有意水準をｐ＜０．０５に設定した。別段の記述がない限り、ビヒクル対象群と比較した有意性を報告する。
【０３３７】
ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍モデル。Ｃｏｌｏｎ２６マウス結腸癌細胞株は、米国国立がん研究所のがん治療・診断部（the Division of Cancer Treatment and Diagnosis at the National Cancer Institute）から入手した（バイアル：０５０７２３８）。１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  １００９９−１４１）と１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ  １５６３０−０８０）と１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ  １１３６０−０７０）とを補足したＲＰＭＩ  １６４０培地（ＨｙＣｌｏｎｅ  ＳＨ３００２７．０２）で、マウスＣｏｌｏｎ２６癌細胞を培養した。８〜１０週齢雌ｈＧＩＴＲ−ｈＧＩＴＲＬノックインマウスの側腹部に１００ｕＬのＲＰＭＩ中の０．５×１０６  Ｃｏｌｏｎ２６細胞を皮下注射した。デジタルカリパスを使用して腫瘍を測定し、方程式（Ｌ×Ｗ２）／２を使用して腫瘍体積を算出した。腫瘍が１８０ｍｍ３の平均サイズに達したら、マウスを無作為に選び、ビヒクル（ＰＢＳ）の単回腹腔内注射または２００ｕＬ  ＰＢＳ中の治療用抗体（１５ｍｇ／ｋｇ）の単回腹腔内注射を投与した。治療抗体の投薬の７日後にマウスを屠殺し、フローサイトメトリーによる分析のために腫瘍を採取した。すべての動物実験は、ＩＡＣＵＣ承認プロトコルを使用してＡＡＡＬＡＣ公認施設で行った。統計解析は、Ｐｒｉｓｍソフトウェアで、両側９５％信頼区画でのスチューデントｔ検定、またはチューキー補正を伴う一元配置ＡＮＯＶＡを使用して行った。
【０３３８】
代替マウスＧＩＴＲ  Ｃｏｌｏｎ２６モデル試験。Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ雌６〜８週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスを実験動物として使用した。移植のために、細胞をハンクス１ｘ平衡塩類溶液（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｃａｔ＃  ＳＨ３００３０．０２）に再懸濁させ、２８ｇ針を使用して右下側腹部に皮下注射（注射体積１００ｍｌ）で移植した。移植後、マウスを腫瘍体積に従って無作為に選んだ。５ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ２ａ−ＤＴＡ−１またはマウスＩｇＧ２ａアイソタイプ対照を皮下注射によってマウスに投与した。ラット抗マウスＧＩＴＲ抗体であるクローンＤＴＡ−１（坂口志文（S. Sakaguchi）、京都大学、京都、日本）を修飾して、ＤＴＡ−１可変領域配列をマウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃ領域に融合させてＩｇＧ２ａ−ＤＴＡ−１を作成することによって、マウスキメラＩｇＧ２ａを作成した。
【０３３９】
組合せ治療。代替抗ＰＤ−１抗体（ラット、ＩｇＧ２ａ  ＲＭＰ１−１４、Ｂｉｏｌｅｇａｎｄ）と組み合わせて代替抗ＧＩＴＲ抗体（マウスＩｇＧ２ａ−ＤＴＡ−１）のｉｎ  ｖｉｖｏ活性を評価するために、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ）からの雌６〜８週齢ＢＡＬＢ／ｃＪマウスの右腋窩上部に１００ｕＬの体積の５×１０５  Ｃｌｏｎ２６細胞を皮下移植した。移植のために、Ｃｏｌｏｎ２６細胞を、Ｌｏｎｚａからのカルシウムおよびマグネシウム不含のダルベッコＰＢＳ（１７−５１２Ｆ）に懸濁させた。移植１０日後に１１５ｍｍ３±７の平均±ＳＥＭ腫瘍体積を有するマウスを研究に登録した。無作為に４群（ｎ＝１０〜１６／群）の１つに割り当てた後、表６に記載するようにアイソタイプ（群１）、ＲＭＰ１−１４（１０ｇ／ｋｇ、群２）、ＩｇＧ２ａ−ＤＴＡ−１（５ｍｇ／ｋｇ、群３）、またはＲＭＰ１−１４とＩｇＧ２ａ−ＤＴＡの組合せ（それぞれ１０ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇ、群４）を２週間にわたって週１回、同時にマウスに投与した。第０日は、無作為割当て日と定義する。アイソタイプ対象群は、５ｍｇ／ｋｇのｍＩｇＧ２ａ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）および１０ｍｇ／ｋｇのラットＩｇＧ２ａ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を含有した。ＩｇＧ２ａ−ＤＴＡおよびそのアイソタイプ対照（ｍＩｇＧ２ａ）を５ｍ／ｋｇで皮下注射によって投与した。ＲＭＰ１−１４およびそのアイソタイプ対照（ｒＩｇＧ２ａ）を腹腔内注射によって投与した。投与体積は、すべての処置について１０ｍｇ／ｍＬであった。体重および腫瘍体積を週に２〜３回収集した。腫瘍体積が１２００ｍｍ３以上になるエンドポイントに達したら個々の動物を点数化した。カプラン・マイヤー生存分析によって評価して、エンドポイントまでの時間（ＴＴＥ）の中央値の変化に基づいて、抗腫瘍活性を報告した。
【０３４０】
組合せ治療。抗ＧＩＴＲの投与または抗ＰＤ−１と組み合わせた抗ＧＩＴＲの投与後の共刺激分子の発現を評価するために、１用量のＧＩＴＲ（クローンＩｇＧ２ａ−ＤＴＡ−１）もしくは抗ＰＤ１（クローンＲＭＰ１−１４）または組合せでの抗ＧＩＴＲ＋ＰＤ１後にフローサイトメトリーによって全腫瘍および脾臓の単一細胞懸濁液の特性を明らかにした。ｍＩｇＧ２ａを対照として使用した。ＬＡＧ３、ＴＩＭ３およびＰＤ−１陽性細胞を、腫瘍および脾臓中の全ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージとして評価した。Ｐ値は、ｔ検定で算出した。＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．００５。
【０３４１】
結果
マウスおよび参照Ｖ領域アミノ酸配列
ＭＡＢ１を発現するハイブリドーマ細胞からのＲＴ−ＰＣＲ産物をシークエンシングし、この配列を、主として（９５％以上）、ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ  ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計を使用してタンパク質レベルで検証した。次いで、ＭＡＢ１の重鎖および軽鎖可変領域をＫａｌｏＢｉｏｓベクターにクローニングして、参照Ｆａｂ  ＭＡＢ１ｒＦａｂを作成した。この参照Ｆａｂの作成のためのＫａｌｏＢｉｏｓベクターへのクローニングを可能にするためにＭＡＢ１中の第１のアミノ酸をアスパラギン（Ｎ）からグルタミン酸（Ｅ）残基に変更しなければならず、それ故、ＭＡＢ１ｒＦａｂは、第１のＶＫ位にグルタミン酸を有する。Ｆａｂ  ＭＡＢ１ｒＦａｂは、ヒト定常領域と融合したＭＡＢ１からのインタクトマウスＶ領域を有する。ＭＡＢ１ｒＦａｂに加えて、最適化ＦａｂであるＭＡＢ１ｏｐＦａｂを構築した。ＭＡＢ１ｒＦａｂのいくつかのフレームワークアミノ酸残基を、ＭＡＢ１ｏｐＦａｂのヒト生殖系列残基に変更した。
【０３４２】
参照および最適化参照Ｆａｂ親和性分析
最適化参照ＭＡＢ１ｏｐＦａｂのＦＲ１およびＦＲ３に組み込まれたヒト生殖系列残基は、ヒトＶセグメントレパートリーを増幅させるために使用されるＰＣＲプライマーによって特定されたものであり、したがって、Ｈｕｍａｎｅｅｒｅｄ（登録商標）抗体Ｖ領域ライブラリーのすべてのメンバーに存在する。ヒト生殖系列への何らかの変更がＦａｂ結合特性を変化させるか否かを評価するために最適化参照Ｆａｂを構築する。ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｄ  ＯＫシステム、およびビオチン化ｈＧＩＴＲ−ｈＦｃでコーティングされたＳｔｒｉｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｈｉｇｈ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒを使用して、ＭＡＢ１ｒＦａｂ、ＭＡＢ１ｏｐＦａｂの親和性定数（Ｋａ（１／Ｍｓ）、Ｋｄ（１／ｓ）およびＫＤ（Ｍ））をアッセイした。ＭＡＢ１ｒＦａｂと比較して、ＭＡＢ１ｏｐＦａｂは、非常に類似したＫｄを有したが、Ｋａに関して５倍の向上を有し、これは、ＭＡＢ１ｒＦａｂのアミノ酸変更が許容されることを示す。
【０３４３】
Ｈｕｍａｎｅｅｒｅｄ（登録商標）抗体Ｆａｂのライブラリー構築および選択
ＶＨ３およびＶＫＩＩＩに制限された生殖系列ファミリーの、重鎖および軽鎖フロントエンドおよびＦＲ３カセットライブラリーを生成し、ＣＬＢＡによってスクリーニングした。ＶＫについては、ヒトＧＩＴＲとの結合を支持するクローンが、ＶＫフロントエンド（ＭＡＢ１ＶＫ３ＦＥ−０１）およびＦＲ３（ＭＡＢ１ＶＫ３ＦＲ３−０１）カセットライブラリー両方から同定された。ＶＨについては、ヒトＧＩＴＲとの結合を支持するクローンがＦＲ３カセットライブラリー（ＭＡＢ１ＶＨ３ＦＲ３−０１）から同定されが、ＶＨ３フロントエンドライブラリー（ＭＡＢ１ＶＨ３ＦＥ−０１）からはされなかった。ＶｋフロントエンドおよびＦＲ３カセットライブラリーのメンバーの大多数はＣＬＢＡで陽性であったので、これら２つのライブラリーの全レパートリーを使用して、親マウスまたは選択ヒト生殖系列（ＶＫＩＩＩ  Ｌ−１６）残基のどちらかをあらゆる位置にコードする変異原性ＶＫ  ＣＤＲ２を用いるオーバーラッピングＰＣＲによってＶｋ完全鎖ライブラリー（ＭＡＢ１ＶＫ３ＦｃＬ−０１）を構築した。多数のｈＧＩＴＲ陽性クローンをＣＬＢＡによってＶＨ３ＦＲ３ライブラリー（ＭＡＢ１ＶＨ３ＦＲ３−０１）から同定し、ヒトＧＩＴＲ特異的ＥＬＩＳＡによって確認した。それらのうちの６つを使用してＶＫ完全鎖ライブラリー（ＭＡＢ１Ｖｋ３ＦｃＬ−０１）と対合させて、機能的Ｆａｂ発現およびこのライブラリーのスクリーニングを可能にした。
【０３４４】
高親和性でｈＧＩＴＲに結合するクローンがＶＨフロントエンドライブラリー（ＭＡＢ１ＶＨ３ＦＥ−０１）から同定されなかったので、その後、第２のＶＨ３フロントエンドライブラリー（ＭＡＢ１ＶＨ３ＦＥ−０２）を構築した。このライブラリーは、親マウス残基またはヒト生殖系列（ＶＨ３  ３〜３０）残基のどちらかを、６つの選択ＶＨＦＲ３クローンからのＣＤＲ１およびＦＲ３配列の各位置に有する。多くのｈＧＩＴＲ結合因子が、ＶＫ完全鎖ライブラリー（ＭＡＢ１Ｖｋ３ＦｃＬ−０１）と第２のＶＨフロントエンドライブラリー（ＭＡＢ１ＶＨ３ＦＥ−０２）の両方から同定された。これらのクローンを、Ｆａｂ含有細胞上清でのヒトＧＩＴＲ特異的ＥＬＩＳＡアッセイによって確認し、ｈＧＩＴＲ親和性力価測定ＥＬＩＳＡによってランク順に並べた。
【０３４５】
ｈＧＩＴＲ親和性力価測定ＥＬＩＳＡに基づいて、４つのＶＫ完全鎖クローンをＶＫ完全鎖ライブラリー（ＭＡＢ１ＶＫ３ＦｃＬ０１）から選択し、６つのクローンをＭＡＢ１ＶＨ３ＦＥ−０２ライブラリーから選択した。６つのＶＨクローンを骨格として使用して、ＭＡＢ１マウス残基または最も近い生殖系列（ＶＨ３  ３〜３０）残基のどちらかをＣＤＲ２内の各位置に有するＶＨ完全鎖ライブラリーを構築した。このＶＨ完全鎖レパートリーを４つのＶＫ完全鎖クローンと対合させて、最終ヒト完全鎖Ｆａｂライブラリーを形成した。ＣＬＢＡによって多くのｈＧＩＴＲ結合クローンを同定し、Ｆａｂ源としてそれぞれの培養上清を使用してＥＬＩＳＡによって確認した。５つのヒト完全鎖Ｆａｂクローン（ＭＡＢ２、ＭＡＢ３、ＭＡＢ４、ＭＡＢ５およびＭＡＢ６）をＤＮＡ配列分析およびｈＧＩＴＲ親和性力価測定ＥＬＩＳＡの結果に基づいて選択した。
【０３４６】
ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｒ分析を使用するＧＩＴＲ抗原に対するＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（登録商標）抗体Ｆａｂの親和性試験
５つのヒト完全鎖Ｆａｂ（ＭＡＢ２、ＭＡＢ３、ＭＡＢ４、ＭＡＢ５およびＭＡＢ６）を発現させ、精製した。その後、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｄシステムを使用して、これらのヒトＦａｂの結合反応速度を最適化参照Ｆａｂ（ＭＡＢ１ｏｐＦａｂ）の反応速度と比較した（数値データを表３にまとめる）。
【０３４７】
【表３】
0006731403.tif 000022
【０３４８】
抗体ＭＡＢ２、ＭＡＢ３、ＭＡＢ４、ＭＡＢ５、ＭＡＢ６のアミノ酸配列、およびヒト生殖系列配列との同一性パーセンテージ
５つのＦａｂ（ＭＡＢ２、ＭＡＢ３、ＭＡＢ４、ＭＡＢ５、ＭＡＢ６）の可変領域アミノ酸配列を表１に示す。ＶｈおよびＶｋアミノ酸配列を単一生殖系列配列（それぞれ、ＶＫＩＩＩ  Ｌ１６／Ａ２７およびＶＨ３  ３〜３０；表４）に対してアラインすることによって、５つのＦａｂのヒト生殖系列配列との同一性パーセントを決定した。ＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ３内の残基は、各鎖の算出から省いた。
【０３４９】
【表４】
0006731403.tif 000023
【０３５０】
ヒトＧＩＴＲ抗原エピトープの保存
抗原エピトープ保存を間接競合ＥＬＩＳＡによって評価した。５つすべてのＦａｂが親マウス抗体ＭＡＢ１のヒトＧＩＴＲとの結合をブロックし、これは、これらのヒトＦａｂが元のマウス抗体のエピトープ特異性を保持することを示す。
【０３５１】
ＥＬＩＳＡによるＭＡＢ４およびＭＡＢ５の抗原特異性の分析
親マウス抗体ＭＡＢ１の抗原特異性がＩｇＧｓ、ＭＡＢ２、ＭＡＢ３、ＭＡＢ４およびＭＡＢ５において保持されるかどうかを試験するために、抗体のヒトＴＮＦＲのパネルとの結合をＥＬＩＳＡアッセイで試験した。ＭＡＢ４およびＭＡＢ５に関する１つのそのようなアッセイの結果（図２Ｃ）は、ＭＡＢ４およびＭＡＢ５が、マウス抗体ＭＡＢ１と同様の、ＧＩＴＲに対する高い特異性を保持することを示す。同様の結果がＭＡＢ２、ＭＡＢ３およびＭＡＢ６に関して得られた。
【０３５２】
ＥＬＩＳＡにおける齧歯類ＧＩＴＲタンパク質ではなくヒトおよびカニクイザルマカクＧＩＴＲタンパク質との抗体結合
親マウス抗体ＭＡＢ１は、ヒトおよびカニクイザルＧＩＴＲタンパク質と結合するが、齧歯類ＧＩＴＲタンパク質とはしない。図２Ａ〜Ｂは、ＭＡＢ１同様、抗体ＭＡＢ４およびＭＡＢ５がヒトＧＩＴＲとカニクイザルＧＩＴＲの両方に同様に結合できたが、齧歯類ＧＩＴＲにはできなかったことを示す。同様の結果がＭＡＢ６、７および８に関して見られた。
【０３５３】
ＧＩＴＲアゴニスト抗体ＭＡＢ４およびＭＡＢ５のヒトＧＩＴＲ（ｈＧＩＴＲ）およびカニクイザルＧＩＴＲ（ｃＧＩＴＲ）に対する結合親和性をＢｉａｃｏｒｅ分析によって判定した。表５を参照されたい。モノクローナル抗体ＭＡＢ４およびＭＡＢ５は、ナノモル未満の結合親和性（ＫＤ）でヒトＧＩＴＲと結合する。抗体ＭＡＢ４およびＭＡＢ５は、ナノモルの結合親和性でカニクイザルＧＩＴＲと結合し、この親和性は、ヒトＧＩＴＲに対する結合親和性より約２〜３倍低い。本発明の抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体は、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、ＢｉａｃｏｒｅおよびＰｒｏｔａｇｅｎ（商標）チップアッセイをはじめとする多数の生化学アッセイにおいて、ヒトおよびカニクイザルＧＩＴＲと選択的に結合する。
【０３５４】
【表５】
0006731403.tif 000024
【０３５５】
モノクローナル抗体ＭＡＢ７は、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞とはもちろん、カニクイザルＣＤ４＋Ｔ細胞とも結合する。単離されたカニクイザルまたはヒトＰＢＭＣのＦＡＣＳ分析は、ＭＡＢ７が、単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞に結合することを実証した。加えて、ＦＡＣＳ実験は、ＰＢＭＣ（ＣＤ４＋Ｔ細胞）のＣＤ３／ＣＤ２８活性化後のＧＩＴＲ（ＭＡＢ７の結合による）およびＣＤ２５の上方調節を実証した。（データの図示なし）。
【０３５６】
抗体の、レポーター遺伝子アッセイおよび細胞アッセイにおける、機能活性
抗体をレポーター遺伝子アッセイで機能活性についてアッセイした（図３）。ＭＡＢ４、ＭＡＢ５、ＭＡＢ７およびＭＡＢ８  ＩｇＧの各々は、架橋させたとき、ＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲ−Ｌ）と同様のレベルでＮＦκＢ活性を誘導する。図３Ａ〜Ｄを参照されたい。同様の結果がＭＡＢ２、ＭＡＢ３およびＭＡＢ６で得られた（データの図示なし）。
【０３５７】
ＭＡＢ７は、ヒトＧＩＴＲを発現する安定した細胞株への結合について、ヒトＧＩＴＲリガンドと競合する。競合アッセイを値ごとに３セットずつ行った。ＦＡＣＳ競合分析は、リガンド結合の阻害を実証した。図２Ｄを参照されたい。
【０３５８】
内在性ＧＩＴＲに関する機能活性を確認するために、抗体をビーズにコンジュゲートさせ、精製ＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣとともにインキュベートした。ＭＡＢ７は、アイソタイプ対照抗体と比較してＣＤ４＋Ｔ細胞（図４Ａ）とＣＤ８＋Ｔ細胞（図４Ｂ）両方の増殖の増加を誘導した。ＩＦＮγ（図４Ｃ）、ＴＮＦα、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３をはじめとする、いくつかのサイトカインの分泌の増加も伴った（図示なし）。同様の結果がＭＡＢ４、ＭＡＢ５でも見られた（図示なし）。本発明者らは、ＭＡＢ７によって誘導される増殖およびＩＦＮγ産生の増加が、ビーズ上の抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８アゴニスト抗体の存在に依存することを証明することができた。これらの共刺激性抗体を省いた場合、ＭＡＢには、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対しても、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対してもアゴニスト効果がなかった。同様の結果がＭＡＢ２、ＭＡＢ３、ＭＡＢ４、ＭＡＢ５およびＭＡＢ６に関して得られた。
【０３５９】
ＭＡＢ７は、高レベルのＧＩＴＲが存在する場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＦｃｇＲＩＩＩａシグナル伝達を誘導する能力を実証する（ＡＤＣＣ活性と相関関係があることを示す）ことも判明した。ＭＡＢ７または対照ＡｂとともにインキュベートしたＤａｕｄｉ−ｈＧＩＴＲ細胞、およびＪｕｒｋａｔ−Ｖ１５８細胞株は、ＭＡＢ７がｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＦｃｇＲＩＩＩａシグナル伝達を誘導できること、ＦｃＲＩＩＩａシグナル伝達を誘導するＭＡＢ７のこの能力が、Ｄａｕｄｉ細胞の表面で発現される受容体レベルと相関する（すなわち、受容体レベルが高いほど、ＲｃｇＲＩＩＩａシグナル伝達誘導が大きい）ことを示した。図５を参照されたい。
【０３６０】
ｈＧＩＴＲは、Ｔ細胞上で発現され、ｈＧＩＴＲ−ｈＧＩＴＲＬノックインマウスにおいて機能性である。脾細胞を野生型またはｈＧＩＴＲ−ｈＧＩＴＲＬノックインマウスから単離し、刺激せずに、またはａ−ＣＤ３およびａ−ＣＤ２８抗体を使用して刺激しながら、２４、４８、７２または９６時間培養した。その後、細胞をフルオロフォアコンジュゲート抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析して、ヒトＧＩＴＲが発現されること、および共刺激が野生型またはトランスジェニックマウスのＧＩＴＲ発現プロファイルの増加をもたすことを実証した。ｈＧＩＴＲ−ｈＧＩＴＲＬノックインマウスから単離した脾細胞は、培養中に共刺激に応答してＧＩＴＲ発現を誘導することを実証する（図６Ａ）。ＭＡＢ７は、ＣＤ８＋細胞上で発現されたｈＧＩＴＲに有効に結合し（図６Ｂ）、刺激されたＴ細胞とのＭＡＢ７の結合は、ｐＩＫＫ染色（図６Ｃ）およびＴ細胞活性化マーカーＣＤ２５＋（図６Ｄ）によって測定して、Ｔ細胞活性化の増加と相関する。
【０３６１】
ＭＡＢ７は、ｉｎ  ｖｉｖｏで機能性である。Ｃｏｌｏｎ２６腫瘍が確定されたｈＧＩＴＲ−ｈＧＩＴＲＬダブルノックインマウスを単回用量のビヒクル（ｎ＝８／時点）またはＭＡＢ７（ｎ＝１０／時点）抗体で、上で説明したように処置した。腫瘍を週に２回測定し、方程式（Ｌ×Ｗ２）／２を使用して腫瘍体積を算出した。ＭＡＢ処置動物は、Ｃｏｌｏｎ２６腫瘍の成長遅延を実証した。処置３日後に、全血（図７Ｂ〜７Ｃ）および腫瘍（図７Ｄ〜７Ｅ）を採取し、フローサイトメトリーによって免疫細胞での細胞表面ｈＧＩＴＲ発現について分析した。結果は、血液と腫瘍の両方において調節性Ｔ細胞とＴヘルパー細胞の両方について処置群からのｈＧＩＴＲの減少をもたらす、ｈＧＩＴＲ占有および排出を示唆する（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．００００５）。
【０３６２】
ＭＡＢ７は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＣｏｌｏｎ２６腫瘍に対する抗腫瘍免疫応答を惹起する。Ｃｏｌｏｎ２６腫瘍が確定されたｈＧＩＴＲ−ｈＧＩＴＲＬダブルノックインマウスを単回用量のビヒクル（ｎ＝８／時点）またはＭＡＢ７（ｎ＝１０／時点）で処置した。図８Ａは、Ｔｒｅｇが処置動物において低減されることを実証する、投与３日後の結果を示す。図８Ｂ〜８Ｃは、処置後の腫瘍部位に存在するリンパ球（８Ｂ）および活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞（８Ｃ）の増加を実証する、投与１５日後の結果を示す。ビヒクル処置群とＭＡＢ７処置群間の腫瘍サイズの有意差を説明するために細胞の絶対数を腫瘍サイズに正規化した。ＭＡＢ７の結果は、処置が、全腫瘍内活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞によって判定して、ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇと比較して処置動物におけるＴｅｆｆ／Ｔｒｅｇ比の増加をもたらすことを示唆している。図８Ｄを参照されたい。加えて、ｅｘ  ｖｉｖｏでＣｏｌｏｎ２６腫瘍細胞とともにインキュベートした精製ＣＤ８＋Ｔ細胞からの脾細胞アッセイの結果、およびＩＦＮｇ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用するＣＴＬ応答の測定結果は、ＭＡＢ７処置動物からのＣＤ８＋Ｔ細胞における腫瘍特異的ＩＦＮｇ応答の増加を示唆している。（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．０００５）。図８Ｅを参照されたい。
【０３６３】
抗ｍＧＩＴＲ  Ａｂでのマウスの処置は、腫瘍および脾臓におけるＰＤ−１発現を上方調節する。Ｃｏｌｏｎ２６腫瘍が確定されたマウスを２用量の対照またはマウス抗ｍＧＩＴＲ抗体で処置した。図９Ａ９Ｃは、代替ＧＩＴＲ抗体であるＩｇＧ２ａ−ＤＴＡ−１での処置後にＣｏｌｏｎ２６腫瘍はもちろん脾臓においてもＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＰＤ−１発現が上方調節されることを実証する結果を示す。
【０３６４】
ＧＩＴＲとＰＤ−１の組合せは、アイソタイプ対照と比較して生存優位性をもたらす。抗ＧＩＴＲ（ＤＴＡ−１）および抗ＰＤ−１（ＲＭＰ１−１４）を、Ｃｏｌｏｎ２６腫瘍が確定されたマウスに、単独でおよび組み合わせて投与した。図１０を参照されたい。組合せ投与は、アイソタイプ対照と比較して有意な生存優位性を示す（＊＊＊ｐ＜０．０００５  ゲイハン・ブレスロウ・ウィルコクソン検定を使用するペアワイズ比較）。抗ｍＧＩＴＲ（ＩｇＧ２ａ−ＤＴＡ−１）単剤は、アイソタイプ対照と比較して有意な生存優位性を示す（＊＊＊ｐ＜０．０５  ゲイハン・ブレスロウ・ウィルコクソン検定を使用するペアワイズ比較）。データは、ＩｇＧ２ａ−ＤＴＡ−１とＲＭＰ１−１４の組合せが、アイソタイプ対照処置と比較して統計的に有意な生存優位性をもたらすことを示しており、中央値ＴＴＥは、アイソタイプ処置群についての２２日と比較して（中央値ＴＴＥに達しない）４２日より大きい（ｐ＜０．０００５）。注目すべきこととして、３／１０の動物は完全退縮（ＣＲ）を達成し、２／１０の動物は、不変（stable disease, ＳＤ）を達成した。ＩｇＧ２ａ−ＤＴＡ−１単剤治療は、３０．５日の中央値ＴＴＥ（ｐ＜０．０５）をもたらし、３／１０の動物が不変（ＳＤ）を達成した。ＲＭＰ１−１４処置群の中央値生存期間は２４日であり、これは、アイソタイプ処置群とは統計的に有意に異なった。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用してカプラン・マイヤーグラフを作成し、統計を行った。ゲイハン・ブレスロウ・ウィルコクソン検定を使用して群比較をペアワイズ比較として行った。すべての統計学的評価について、有意水準をｐ＜０．０５に設定した。ビヒクル対象群と比較した有意性を報告する。不変は、腫瘍体積の変化が１０％以下である３回の連続する腫瘍体積測定と定義する。
【０３６５】
【表６】
0006731403.tif 000025
【０３６６】
抗ＧＩＴＲの投与後、または抗ＰＤ−１と組み合わせた抗ＧＩＴＲの投与後に腫瘍における共刺激分子の発現を評価した。図１１を参照されたい。１用量の抗ＧＩＴＲもしくは抗ＰＤ１または組合せでの抗ＧＩＴＲ＋ＰＤ１後にフローサイトメトリーによって特性を明らかにした全腫瘍および脾臓の単一細胞懸濁液の結果は、ＧＩＴＲでの処置、ＰＤ−１での処置および組合せでの処置後のＣｏｌｏｎ２６腫瘍のＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＬＡＧ３、ＴＩＭ３およびＰＤ−１発現の増加を実証した。単回組合せ用量は、脾臓ＣＤ８＋細胞におけるＰＤ−１発現の上方調節を実証した。
【０３６７】
参照による組み入れ
本明細書において言及するすべての出版物、特許および寄託番号は、個々の出版物または特許の各々が参照により組み入れられていると具体的にかつ個々に示されているかのごとく、それら全体が参照により本明細書に組み入れられている。
【０３６８】
均等物
主題発明の特定の実施形態を論じたが、上記明細書は、説明的なものであり、限定的なものではない。本明細書および下記特許請求の範囲を再考することで、本発明の多くの変形形態が当業者に明らかになる。本発明の全範囲は、本特許請求の範囲を等価物の全範囲と併せて参照することによって、および本明細書をそのような変形形態と併せて参照することによって、決定されると予想される。
本発明は、以下の態様を含み得る。
［１］
配列番号１と結合する、単離された抗体もしくは抗体断片、またはその抗原結合分子で
あって、
（ａ）ｉ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号２２を含み、
ｉｉ）重鎖ＣＤＲ２が、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６
および配列番号２７のいずれか１つから選択される配列を含み、
ｉｉ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号２９または配列番号１０９を含む、
重鎖可変領域と、
（ｂ）ｉ）軽鎖ＣＤＲ１が配列番号３０または配列番号３１を含み、
ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３３を含み、
ｉｉｉ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号３４を含む、
軽鎖可変領域と
を含む、抗体、抗体断片、または抗原結合分子。
［２］
前記重鎖可変領域が、配列番号１６と少なくとも９５％の配列同一性を有し、前記軽鎖
可変領域が、配列番号１７と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１に記載の
抗体、その抗体断片、または抗原結合分子。
［３］
重鎖ＦＲ４が、ヒト生殖系列ＦＲ４である、請求項１に記載の抗体、抗体断片、または
抗原結合分子。
［４］
前記重鎖ＦＲ４が、配列番号４２である、請求項３に記載の抗体、抗体断片、または抗
原結合分子。
［５］
軽鎖ＦＲ４が、ヒト生殖系列ＦＲ４である、請求項１に記載の抗体、抗体断片、または
抗原結合分子。
［６］
前記軽鎖ＦＲ４が、配列番号５０である、請求項５に記載の抗体または抗体断片。
［７］
ｉ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号２２を含み、
ｉｉ）重鎖ＣＤＲ２が配列番号２３を含み、
ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号２９を含み、
ｉｖ）軽鎖ＣＤＲ１が配列番号３０を含み、
ｖ）軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３３を含み、
ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号３４を含む、
請求項１に記載の抗体、抗体断片、または抗原結合分子。
［８］
ｉ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号２２を含み、
ｉｉ）重鎖ＣＤＲ２が配列番号２４を含み、
ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号２９を含み、
ｉｖ）軽鎖ＣＤＲ１が配列番号３１を含み、
ｖ）軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３３を含み、
ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号３４を含む、
請求項１に記載の抗体、抗体断片、または抗原結合分子。
［９］
ｉ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号２２を含み、
ｉｉ）重鎖ＣＤＲ２が配列番号２５を含み、
ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号２９を含み、
ｉｖ）軽鎖ＣＤＲ１が配列番号３０を含み、
ｖ）軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３３を含み、
ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号３４を含む、
請求項１に記載の抗体、抗体断片、または抗原結合分子。
［１０］
ｉ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号２２を含み、
ｉｉ）重鎖ＣＤＲ２が配列番号２６を含み、
ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号２９を含み、
ｉｖ）軽鎖ＣＤＲ１が配列番号３０を含み、
ｖ）軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３３を含み、
ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号３４を含む、
請求項１に記載の抗体、抗体断片、または抗原結合分子。
［１１］
ｉ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号２２を含み、
ｉｉ）重鎖ＣＤＲ２が配列番号２７を含み、
ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号２９を含み、
ｉｖ）軽鎖ＣＤＲ１が配列番号３０を含み、
ｖ）軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３３を含み、
ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号３４を含む、
請求項１に記載の抗体、抗体断片、または抗原結合分子。
［１２］
ｉ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号２２を含み、
ｉｉ）重鎖ＣＤＲ２が配列番号２５を含み、
ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号１０９を含み、
ｉｖ）軽鎖ＣＤＲ１が配列番号３０を含み、
ｖ）軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３３を含み、
ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号３４を含む、
請求項１に記載の抗体、抗体断片、または抗原結合分子。
［１３］
前記抗体または抗体断片が、配列番号１６を含む重鎖と配列番号１７を含む軽鎖とを含
む、請求項２に記載の抗体、抗体断片、または抗原結合分子。
［１４］
前記抗体または抗体断片が、配列番号１６を含む重鎖と配列番号１７を含む軽鎖とを含
む単離された抗体またはその抗原結合断片と競合する、請求項１に記載の抗体、抗体断片
、または抗原結合分子。
［１５］
前記単離された抗体、抗体断片、または抗原結合分子が、配列番号６、配列番号８、配
列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号９９および配列番号１０５のいずれ
かから選択される配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号７または配列番号９を含む軽
鎖可変ドメインとを含む、請求項１に記載の単離された抗体。
［１６］
前記単離された抗体、抗体断片、または抗原結合分子が、
ｉ）配列番号６を含む重鎖可変ドメイン、および配列番号７を含む軽鎖可変ドメイン、
ｉｉ）配列番号８を含む重鎖可変ドメイン、および配列番号９を含む軽鎖可変ドメイン、
ｉｉｉ）配列番号１０を含む重鎖可変ドメイン、および配列番号７を含む軽鎖可変ドメイ
ン、
ｉｖ）配列番号１２を含む重鎖可変ドメイン、および配列番号７を含む軽鎖可変ドメイン
、
ｖ）配列番号１４を含む重鎖可変ドメイン、および配列番号７を含む軽鎖可変ドメイン、
ｖｉ）配列番号９９を含む重鎖可変ドメイン、および配列番号７を含む軽鎖可変ドメイン
、
ｖｉｉ）配列番号１０５を含む重鎖可変ドメイン、および配列番号７を含む軽鎖可変ドメ
イン
のいずれか１つを含む、請求項１５に記載の単離された抗体。
［１７］
ヒト化される、請求項１に記載の抗体、抗体断片、または抗原結合分子。
［１８］
Ｆａｂ’断片を含む、請求項１に記載の抗体、抗体断片、または抗原結合分子。
［１９］
前記抗体または抗体断片がＩｇＧ  Ｆｃを含む、請求項１に記載の抗体、抗体断片、ま
たは抗原結合分子。
［２０］
一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含む、請求項１に記載の抗体、抗体断片、または抗原結合分
子。
［２１］
ヒト定常領域を含む、請求項１に記載の抗体、抗体断片、または抗原結合分子。
［２２］
前記単離された抗体、抗体断片、または抗原結合分子が、配列番号６５、配列番号６９
、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号１００および配列番号１０６の
いずれかから選択される配列を含む重鎖と、配列番号６６または配列番号７０を含む軽鎖
とを含む、請求項２１に記載の単離された抗体。
［２３］
前記抗体または抗体断片が、第２の抗体または抗体断片と架橋され、前記抗体、抗体断
片、または抗原結合分子が、配列番号１、配列番号２または配列番号３のアゴニストであ
る、請求項１に記載の抗体、抗体断片、または抗原結合分子。
［２４］
配列番号１と結合する、単離された抗体もしくは抗体断片、またはその抗原結合分子で
あって、
Ａ．ｉ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号２２を含み、
ｉｉ）重鎖ＣＤＲ２が配列番号２３を含み、
ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号２９を含み、
ｉｖ）軽鎖ＣＤＲ１が配列番号３０を含み、
ｖ）軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３３を含み、
ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号３４を含む、
抗体、抗体断片、または抗原結合分子；
Ｂ．ｉ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号２２を含み、
ｉｉ）重鎖ＣＤＲ２が配列番号２４を含み、
ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号２９を含み、
ｉｖ）軽鎖ＣＤＲ１が配列番号３１を含み、
ｖ）軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３３を含み、
ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号３４を含む、
抗体、抗体断片、または抗原結合分子；
Ｃ．ｉ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号２２を含み、
ｉｉ）重鎖ＣＤＲ２が配列番号２５を含み、
ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号２９を含み、
ｉｖ）軽鎖ＣＤＲ１が配列番号３０を含み、
ｖ）軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３３を含み、
ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号３４を含む、
抗体、抗体断片、または抗原結合分子；
Ｄ．ｉ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号２２を含み、
ｉｉ）重鎖ＣＤＲ２が配列番号２６を含み、
ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号２９を含み、
ｉｖ）軽鎖ＣＤＲ１が配列番号３０を含み、
ｖ）軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３３を含み、
ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号３４を含む、
抗体、抗体断片、または抗原結合分子；
Ｅ．ｉ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号２２を含み、
ｉｉ）重鎖ＣＤＲ２が配列番号２７を含み、
ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号２９を含み、
ｉｖ）軽鎖ＣＤＲ１が配列番号３０を含み、
ｖ）軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３３を含み、
ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号３４を含む、
抗体、抗体断片、または抗原結合分子；ならびに
Ｆ．ｉ）重鎖ＣＤＲ１が配列番号２２を含み、
ｉｉ）重鎖ＣＤＲ２が配列番号２５を含み、
ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号１０９を含み、
ｉｖ）軽鎖ＣＤＲ１が配列番号３０を含み、
ｖ）軽鎖ＣＤＲ２が配列番号３３を含み、
ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号３４を含む、
抗体、抗体断片、または抗原結合分子
のいずれか１つから選択される、単離された抗体もしくは抗体断片、またはその抗原結合
分子。
［２５］
ヒト化される、請求項２４に記載の抗体、抗体断片、または抗原結合分子。
［２６］
Ｆａｂ’断片を含む、請求項２４に記載の抗体、抗体断片、または抗原結合分子。
［２７］
前記抗体または抗体断片がＩｇＧ  Ｆｃを含む、請求項２４に記載の抗体、抗体断片、
または抗原結合分子。
［２８］
一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含む、請求項２４に記載の抗体、抗体断片、または抗原結合
分子。
［２９］
ヒト定常領域を含む、請求項２４に記載の抗体、抗体断片、または抗原結合分子。
［３０］
前記単離された抗体、抗体断片、または抗原結合分子が、配列番号６５、配列番号６９
、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号１００および配列番号１０６の
いずれかから選択される配列を含む重鎖と、配列番号６６または配列番号７０を含む軽鎖
とを含む、請求項２９に記載の単離された抗体。
［３１］
前記抗体または抗体断片が、第２の抗体または抗体断片と架橋され、前記抗体、抗体断
片、または抗原結合分子が、配列番号１、配列番号２または配列番号３のアゴニストであ
る、請求項２４に記載の抗体、抗体断片、または抗原結合分子。
［３２］
前記抗体または抗体断片がグリコシル化される、請求項１に記載の抗体、抗体断片、ま
たは抗原結合分子。
［３３］
前記抗体が修飾され、または修飾細胞において発現され、そのような修飾が、前記抗体
、抗体断片、または抗原結合分子のＦｃＲエフェクター機能の増加をもたらす、請求項１
に記載の抗体、抗体断片、または抗原結合分子。
［３４］
前記抗体または抗体断片がグリコシル化される、請求項２４に記載の抗体、抗体断片、
または抗原結合分子。
［３５］
前記抗体が修飾され、または修飾細胞において発現され、そのような修飾が、前記抗体
、抗体断片、または抗原結合分子のＦｃＲエフェクター機能の増加をもたらす、請求項２
４に記載の抗体、抗体断片、または抗原結合分子。
［３６］
前記抗体または抗体断片が、Ｔｅｆｆ：Ｔｒｅｇ比の上昇をｉｎ  ｖｉｖｏで誘導する
、請求項１から３５のいずれか一項に記載の抗体、抗体断片、または抗原結合分子。
［３７］
前記抗体または抗体断片が、免疫応答増強をｉｎ  ｖｉｖｏで誘導する、請求項１から
３５のいずれか一項に記載の抗体、抗体断片、または抗原結合分子。
［３８］
前記抗体が、非ヒト霊長類ＧＩＴＲと交差反応し、齧歯類ＧＩＴＲと交差反応しない、
請求項１から３１のいずれか一項に記載の抗体、抗体断片、または抗原結合分子。
［３９］
請求項１から３５のいずれか一項に記載の抗体、抗体断片、または抗原結合分子をコー
ドする、ポリヌクレオチド。
［４０］
請求項１から３５のいずれか一項に記載の単離された抗体、抗体断片、または抗原結合
分子と医薬的に許容される担体とを含む組成物。
［４１］
腫瘍関連抗原を標的にする結合分子、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３もしくはＴＩＭ３のアンタ
ゴニスト、またはＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の阻害剤をさらに含む、請求項４０に記
載の組成物。
［４２］
請求項１から３５のいずれか一項に記載の抗体、抗体断片、または抗原結合分子を含む
、キット。
［４３］
それを必要とする個体のＴ細胞応答を強化する方法であって、請求項１から３５のいず
れか一項に記載の、治療有効量の単離された抗体、抗体断片、または抗原結合分子を前記
個体に投与することを含む、方法。
［４４］
前記抗体、抗体断片、または抗原結合分子が、抗原、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３もしくはＴ
ＩＭ３のアンタゴニスト、またはＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の阻害剤と併用投与され
る、請求項４３に記載の方法。
［４５］
前記抗体、抗体断片、または抗原結合分子が、化学療法剤または細胞毒と併用投与され
る、請求項４３に記載の方法。
［４６］
前記Ｔ細胞応答が、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）Ｔ細胞応答である、請求
項４３に記載の方法。
［４７］
前記個体が、腫瘍関連抗原を発現するがんを有する、請求項４３に記載の方法。
［４８］
前記抗体、抗体断片、または抗原結合分子が、前記個体からのがん細胞と併用投与され
る、請求項４７に記載の方法。
［４９］
前記がんが、黒色腫、卵巣がん、結腸直腸がん、前立腺、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ
）、乳がんおよび頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）からなる群から選択される、請求項４
７に記載の方法。
［５０］
前記Ｔ細胞応答が、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）応答である、請求項４３に記載の
方法。
［５１］
それを必要とする個体における腫瘍関連抗原を発現するがんの腫瘍成長を処置する方法
であって、請求項１から３５のいずれか一項に記載の、治療有効量の単離された抗体、抗
体断片、または抗原結合分子を前記個体に投与することを含む、方法。
［５２］
前記抗体、抗体断片、または抗原結合分子が、腫瘍関連抗原と併用投与される、請求項
５１に記載の方法。
［５３］
前記抗体、抗体断片、または抗原結合分子が、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３もしくはＴＩＭ３
のアンタゴニスト、またはＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の阻害剤と併用投与される、請
求項５１に記載の方法。
［５４］
前記抗体または抗体断片が、化学療法剤または細胞毒と併用投与される、請求項５１に
記載の方法。
［５５］
前記抗体または抗体断片が、前記個体からのがん細胞と併用投与される、請求項５１に
記載の方法。
［５６］
前記がんが、黒色腫、卵巣がん、結腸直腸がん、前立腺、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ
）、リンパ腫、乳がんおよび頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）からなる群から選択される
、請求項５１に記載の方法。
［５７］
それを必要とする個体のＴ細胞応答の強化に使用するための、請求項１から３５のいず
れか一項に記載の単離された抗体、抗体断片、または抗原結合分子。
［５８］
それを必要とする個体における腫瘍成長の処置に使用するための、請求項１から３５の
いずれか一項に記載の単離された抗体、抗体断片、または抗原結合分子。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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