(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
３−ケトステロイドの対応する３−ヒドロキシステロイドへの、少なくとも立体特異的酵素的還元を触媒する３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３α−ＨＳＤＨ）であって、これにおいて該酵素が、配列番号４に対し少なくとも９０％の配列同一性を持ち、
ａ）  単一変異体
Ｒ３４Ｘ１および
Ｌ６８Ｘ２、および
ｂ）  二重変異体
Ｒ３４Ｘ１／Ｌ６８Ｘ２
［式中、Ｘ１はＮ、Ｃ、またはＳを表し；
Ｘ２は、Ａ、Ｃ、Ｋ、Ｓ、またはＶを表す］、および
ｃ）  ３〜１０個のヒスチジン基を含む基によりＣ−末端で延長された付加変異体、および
ｄ）  ａ）およびｂ）のそれぞれによる変異体であって、いずれの場合もさらに、１〜１０個のヒスチジン基を含む基によりＣ−末端で延長されたおよび／または１〜１０個のヒスチジン基を含む基によりＮ−末端で延長された該変異体、および
ｅ）  １〜１０個のヒスチジン基によりＣ−末端で延長された二重変異体Ｒ３４Ｌ／Ｌ６８Ｘ２、
［式中、Ｘ２は、Ａ、Ｃ、Ｋ、Ｓ、またはＶを表す］
から選択され、
配列番号４の配列を有する３α−ＨＳＤＨに比較して、以下の特性プロフィールｉ）〜iii）の１つ以上を示す、該３α−ＨＳＤＨ：
ｉ）  デヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）についての、ＮＡＤＨを補因子として用いるＤＨＣＡの酵素的還元における、増大された比活性（Ｖｍａｘ［Ｕ／ｍｇ］）；
ii）  ＤＨＣＡによる基質阻害の低減；
iii）  ＮＡＤＨについての、ＮＡＤＨを補因子として用いるＤＨＣＡの酵素的還元における増大された比活性（Ｖｍａｘ［Ｕ／ｍｇ］）。
【請求項２】
３−ケトステロイドの対応する３−ヒドロキシステロイドへの、少なくとも立体特異的酵素的還元を触媒する３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３α−ＨＳＤＨ）であって、これにおいて該酵素が、配列番号４に対し少なくとも９０％の配列同一性を持ち、
二重変異体
ａ）Ｌ６８Ｘ２／Ｔ１８８Ｘ３、
［式中、Ｘ２は、Ａ、Ｃ、Ｋ、Ｓ、またはＶを表し；かつ
Ｘ３は、Ａ、またはＳを表す］および
ｂ）  ａ）による変異体であって、１〜１０個のヒスチジン基を含む基によりＮ−末端で延長された該変異体、
から選択され、
配列番号４の配列を有する３α−ＨＳＤＨに比較して、以下の特性プロフィールｉ）およびii）の１つ以上を示す、該３α−ＨＳＤＨ：
ｉ）  デヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）についての、ＮＡＤＨを補因子として用いるＤＨＣＡの酵素的還元における増大された比活性（Ｖｍａｘ［Ｕ／ｍｇ］）;
ii）  ＮＡＤＨについての、ＮＡＤＨを補因子として用いるＤＨＣＡの酵素的還元における増大された比活性（Ｖｍａｘ［Ｕ／ｍｇ］）。
【請求項３】
Ｘ２がＡを表す、請求項２に記載の３α−ＨＳＤＨ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の３α−ＨＳＤＨをコードする、ヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項５】
少なくとも１つの調節配列の制御下にある、請求項４に記載の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、発現カセット。
【請求項６】
請求項５に記載の少なくとも１つの発現カセットを含む、発現ベクター。
【請求項７】
請求項４に記載の少なくとも１つのヌクレオチド配列、または請求項５に記載の少なくとも１つの発現カセット、または請求項６に記載の少なくとも１つの発現ベクターをもつ、組換え微生物。
【請求項８】
さらに、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（ＨＳＤＨ）および補因子再生に適するデヒドロゲナーゼから選択される、少なくとも１つのさらなる酵素のコーディング配列をもつ、請求項７に記載の組換え微生物。
【請求項９】
さらなるＨＳＤＨが、７β−ＨＳＤＨ（ＮＡＤＰＨ−および／またはＮＡＤＨ−依存性）から選択され；かつ
前記デヒドロゲナーゼが、ＮＡＤＰＨ再生酵素およびＮＡＤＨ再生酵素から選択される、請求項８に記載の組換え微生物。
【請求項１０】
前記ＮＡＤＰＨ再生酵素が、ＮＡＤＰＨデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、およびＮＡＤＰＨ再生ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）、ＮＡＤＰＨ再生グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、ＮＡＤＰＨ再生グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ−６−ＰＤＨ）、およびＮＡＤＰＨ再生亜リン酸デヒドロゲナーゼ（ＰｔＤＨ）から選択され、
前記ＮＡＤＨ再生酵素が、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＨ再生アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、ＮＡＤＨ再生ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）、ＮＡＤＨ再生グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、ＮＡＤＨ再生グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）、およびＮＡＤＨ再生亜リン酸デヒドロゲナーゼ（ＰｔＤＨ）から選択される、請求項９に記載の組換え微生物。
【請求項１１】
７α−ＨＳＤＨノックアウト株である、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の組換え微生物。
【請求項１２】
３α−ヒドロキシステロイドの酵素的または微生物的合成のためのプロセスであって、これにおいて対応する３−ケトステロイドが、請求項１〜３のいずれか１項に記載された３α−ＨＳＤＨの存在下に、または請求項７〜１１のいずれか１項に記載された前記３α−ＨＳＤＨを発現する組換え微生物の存在下に還元され、かつ任意で、少なくとも１つの生成された還元産物が反応混合物から単離される、プロセス。
【請求項１３】
３−ケトステロイドが、デヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）、およびその誘導体から選択される、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１４】
還元が、ＮＡＤＰＨおよび／またはＮＡＤＨの存在下で行なわれる、請求項１２または１３に記載のプロセス。
【請求項１５】
（ａ）消費されたＮＡＤＰＨが、ＮＡＤＰＨ再生酵素との共役により再生され、または、
（ｂ）消費されたＮＡＤＨが、ＮＡＤＨ再生酵素との共役より再生され、または、
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の両方が実施される、
請求項１４に記載のプロセス。
【請求項１６】
ＮＡＤＰＨ再生酵素が：
ａ）  少なくともギ酸のＣＯ２への酵素的酸化を触媒する、ＮＡＤ＋依存性ＦＤＨの変異体を含むＦＤＨであり、これにおいて前記変異体が、未変異酵素に比較して、補因子としてさらにＮＡＤＰ＋を受容する、該ＦＤＨs；および
ｂ）  ＧＤＨs
から選択される、請求項１５に記載のプロセス。
【請求項１７】
式（１）：
【化１】
0006694871.tif 000036
［式中、Ｒは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｈ、アルカリ金属イオン、またはＮ（Ｒ３）４＋を表し、ここで、基Ｒ３は、同じかまたは異なり、かつＨまたはＣ１−Ｃ６アルキルを表し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で置き換えられ、ここで、Ｒ１およびＲ２は、互いに独立してＣ１−Ｃ６アルキル基を表す］
のウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）の調製のためのプロセスであって、これにおいて、
ａ）任意に、式（２）：
【化２】
0006694871.tif 000037
［式中、Ｒは、上記に示した意味を有し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは、上記に定義されたような酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で置き換えられる］のコール酸（ＣＡ）が、式（３）：
【化３】
0006694871.tif 000038
［式中、Ｒは、上記に示した意味を有し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは、上記に定義されたような酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で置き換えられる］のデヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）へ化学的に酸化され；
ｂ）ＤＨＣＡは、請求項１〜３のいずれか１項における定義においてクレームされた、少なくとも１つの３α−ＨＳＤＨ変異体の存在下に、および少なくとも１つの７β−ＨＳＤＨの存在下に、対応する式（５）：
【化４】
0006694871.tif 000039
［式中、Ｒは、上記に示した意味を有し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは、上記に定義されたような酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で置き換えられる］の１２−ケト−ウルソデオキシコール酸（１２−ケト−ＵＤＣＡ）へ、還元され、その後
ｃ）式（５）の１２−ケト−ＵＤＣＡがＵＤＣＡへ化学的に還元され；そして
ｄ）任意で、反応産物がさらに精製される、プロセス。
【請求項１８】
式（１）：
【化５】
0006694871.tif 000040
［式中、Ｒは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｈ、アルカリ金属イオン、またはＮ（Ｒ３）４＋を表し、ここで、基Ｒ３は、同じかまたは異なり、かつＨまたはＣ１−Ｃ６アルキルを表し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは、酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で置き換えられ、ここで、Ｒ１およびＲ２は、互いに独立してＣ１−Ｃ６アルキル基を表す］
のウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）の調製のためのプロセスであって、これにおいて、
ａ）任意に、式（２）：
【化６】
0006694871.tif 000041
［式中、Ｒは、上記に示した意味を有し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは、上記に定義されたような酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で置き換えられる］のコール酸（ＣＡ）が、式（３）：
【化７】
0006694871.tif 000042
［式中、Ｒは、上記に示した意味を有し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは、上記に定義されたような酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で置き換えられる］のデヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）へ化学的に酸化され；
ｂ）ＤＨＣＡは、配列番号４に対し少なくとも９０％の配列同一性を持つ少なくとも１つの３α−ＨＳＤＨであって、
ｉ）  単一変異体
Ｒ３４Ｘ１および
Ｌ６８Ｘ２、および
ii）  二重変異体
Ｒ３４Ｘ１／Ｌ６８Ｘ２
［式中、Ｘ１はＮ、Ｃ、またはＳを表し；
Ｘ２は、Ａ、Ｃ、Ｋ、Ｓ、またはＶを表す］、および
iii）  ３〜１０個のヒスチジン基を含む基によりＣ−末端で延長された付加変異体、および
iv）  １〜１０個のヒスチジン基によりＣ−末端で延長された二重変異体Ｒ３４Ｌ／Ｌ６８Ｘ２、および
v）  単一変異体
Ｐ１８５Ｘ１および
Ｔ１８８Ｘ３、および
vi）  二重変異体
Ｐ１８５Ｘ１／Ｔ１８８Ｘ３
［式中、Ｘ１はＡを表し；かつ
Ｘ３は、Ａ、Ｇ、またはＳを表す］、および
vii）  二重変異体
Ｌ６８Ｘ２／Ｔ１８８Ｘ３
［式中、Ｘ２は、Ａ、Ｃ、Ｋ、Ｓ、またはＶを表し；かつ
Ｘ３は、ＡまたはＳを表す］、および
viii）  ｉ）、ii）、v）、vi）、およびvii）のそれぞれによる変異体であって、いずれの場合もさらに、１〜１０個のヒスチジン基を含む基によりＣ−末端で延長されたおよび／または１〜１０個のヒスチジン基を含む基によりＮ−末端で延長された該変異体、から選択される、少なくとも１つの３α−ＨＳＤＨ、並びに、少なくとも１つの７β−ＨＳＤＨの存在下に、式（５）：
【化８】
0006694871.tif 000043
［式中、Ｒは、上記に示した意味を有し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは、上記に定義されたようなアミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で置き換えられる］の対応する１２−ケト−ウルソデオキシコール酸（１２−ケト−ＵＤＣＡ）へ、還元され、その後
ｃ）式（５）の１２−ケト−ＵＤＣＡがＵＤＣＡへ化学的に還元され；そして
ｄ）任意で、反応産物がさらに精製される、該プロセス。
【請求項１９】
前記vii）の二重変異体のＸ２がＡを表す、請求項１８に記載のプロセス。
【請求項２０】
少なくとも工程ｂ）が、請求項７〜１１のいずれか１項に記載された組換え微生物の存在下に行われる、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２１】
工程ｂ）における、少なくとも１つの３α−ＨＳＤＨおよび少なくとも１つの７β−ＨＳＤＨの存在下での還元が、同じかまたは異なる補因子再生系と共役される、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２２】
前記Ｃ１−Ｃ６アルキルがメチルまたはエチルである、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３α−ＨＳＤＨ）変異体、特にＣｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ（以前はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉと称された）の３α−ＨＳＤＨ、これらの酵素変異体をコードする配列、酵素変異体の調製のためのプロセス、およびコール酸化合物の酵素的変換における、特にウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）の調製におけるそれらの使用に関し；また本発明の主題は、酵素変異体を用いたＵＤＣＡ合成のための新規プロセス；および組換え体、多重改変微生物を用いたＵＤＣＡの調製である。
【背景技術】
【０００２】
胆汁酸は、脂肪、脂肪酸、および疎水性ビタミンの消化および吸収に必要な生体分子である。ヒトでは少量しか検出されない胆汁酸は、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡと称される）である。最近、コレステロール含有性胆石の溶解において、治療上の重要性が非常に高まってきた。この化合物は、化学的または酵素的工程により、トン量で工業的に製造される。ＵＤＣＡの合成のための重要な前駆物質は、１２−ケトウルソデオキシコール酸であり、これはＷｏｌｆｆ−Ｋｉｓｈｎｅｒ還元によりＵＤＣＡへ変換され得る。１２−ケトウルソデオキシコール酸合成のための文献に記載された経路は、コール酸（３α，７α，１２α−トリヒドロキシ−５β−コラン酸）から出発し、それは７α−および１２α−ＨＳＤＨによって触媒される２つの酸化工程と、７β−ＨＳＤＨにより触媒される１つの還元工程とにより調製され得る（非特許文献１、２）。更なる経路は、７−ケトリトコール酸から出発し、これは７−ケト基を立体選択的に還元することによりＵＤＣＡへ変換され得；この工程もまた、有利には７β−ＨＳＤＨにより触媒される酵素的触媒作用によって行なわれる（非特許文献３、４）。さらなる有利な合成経路は、デヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）から出発し、これは、２つの還元工程により１２−ケトウルソデオキシコール酸へ変換され得；これらの２つの工程は、２つの立体選択的ＨＳＤＨ（３α−ＨＳＤＨおよび７β−ＨＳＤＨ）により触媒され得る（非特許文献５、６）。
【０００３】
Ｃ．ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ由来の酵素は、非常に適した７β−ＨＳＤＨであることが証明されている。Ｃ．ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ由来のこの酵素の遺伝子配列は現在公知であり、それ故、該酵素は第一に、クローニング後の組換えによって取得可能とされ得；第二に、タンパク質工学法によりこの酵素の変異体を産生し、したがって任意で、場合に応じてより有利な酵素変異体を見出すことが可能である。
【０００４】
Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ由来の酵素は、非常に適した３α−ＨＳＤＨであることが証明されている。この酵素の遺伝子配列は現在公知であり、それ故該酵素は、第一に、クローニング後の組換えによって取得可能とされ得；第二に、タンパク質工学法によりこの酵素の変異体を産生して、したがって任意で、場合に応じさらに有利な酵素変異体を見出すことが可能である。
【０００５】
活性物質ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）およびそのジアステレオマーであるケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）は、とりわけ胆石問題の治療薬として長年にわたり使用されてきた。この２つの化合物は、７位のＣ原子におけるヒドロキシル基の配位のみにおいて異なる（ＵＤＣＡ：β−配位、ＣＤＣＡ：α−配位）。ＵＤＣＡの製造のため、先行技術では種々の方法が記載されており、これらのプロセスは純粋に化学的手段によるか、または化学的プロセス工程と酵素的プロセス工程との組合せとして行われる。いずれの場合も、出発点はコール酸（ＣＡ）か、またはコール酸から出発して調製されるＣＤＣＡである。
【０００６】
したがって、ＵＤＣＡ調製のための伝統的な化学的方法は、以下のように概略的に示し得る：
【０００７】
【化１】
0006694871.tif 000002
【０００８】
重大な欠点は、とりわけ以下のことである：化学的酸化は選択的でないため、カルボキシル基と３α−および７α−ヒドロキシ基とが、エステル化により保護されねばならない。
【０００９】
酵素１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（１２α−ＨＳＤＨ）の使用に基づく代替えの化学的／酵素的方法は、以下のように示すことができ、かつ例えば本出願者による特許文献１に記載されている。
【００１０】
【化２】
0006694871.tif 000003
【００１１】
ここで、１２α−ＨＳＤＨはＣＡを選択的に酸化して、１２−ケト−ＣＤＣＡを生じる。伝統的な化学的方法によって必要とされる２つの保護工程を、ここでは省き得る。
【００１２】
さらに、Ｍｏｎｔｉ, Ｄら（非特許文献７）は、代替えの酵素的／化学的プロセスを開示しており、それは以下のように概略的に示し得る：
【００１３】
【化３】
0006694871.tif 000004
【００１４】
ＣＡは、まず、Ｂｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＡＣＴＴ  ２５２８５（非特許文献８）由来の７α−ＨＳＤＨと、１２α−ＨＳＤＨとにより酸化されて、７，１２−ジケト−ＬＣＡを生じる。これら２つの酵素は、いずれの場合もＮＡＤＨ依存性である。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｂｓｏｎｕｍ  ＡＴＣＣ  ２７５５５（ＤＳＭ  ５９９）（非特許文献９）由来の７β−ＨＳＤＨ（ＮＡＤＰＨ依存性）による還元の後、結果として１２−ケト−ＵＤＣＡを生じる。Ｗｏｌｆｆ−Ｋｉｓｈｎｅｒ還元が、最終産物を生じる。このプロセスの欠点は、触媒反応の平衡状態に起因して完全な変換が不可能であること、および変換の最初の段階では２つの異なる酵素を使用しなければならず、このことがプロセスのコストを増加させることである。補因子再生には、ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ；ＮＡＤ＋の再生用）およびグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧｌｃＤＨまたはＧＤＨ；ＮＡＤＰＨの再生用）が使用される。その反応において使用される補因子再生の不都合は、生成する同時反応物を反応混合物から除去することが非常に困難であり、そのため反応平衡を有利に影響させることができず、そのことが出発原料の不完全な変換をもたらすことである。
【００１５】
Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ  ＡＴＣＣ  ２５９８６（ＤＳＭ  ３９７９；以前はＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）株由来の７β−ＨＳＤＨは、ＨｙｒａｎｏおよびＭａｓｕｄａにより１９８２年に記載された（非特許文献１０）。この酵素の配列情報は、開示されなかった。ゲル濾過により測定された分子量は、４５，０００Ｄａとされた（Ｈｉｒａｎｏ、１０５９頁、左欄参照）。さらに、７−オキソ基の７β−ヒドロキシ基への還元は、前記酵素については観察できなかった（Ｈｉｒａｎｏ、１０６１頁、議論第１パラグラフ参照）。したがって当業者には、Ｈｉｒａｎｏらにより記載された酵素が、デヒドロコール酸（本明細書ではＤＨＣＡと称される）の７位における還元を触媒して３，１２−ジケト−７β−ＣＡを生じるのには適さないことが理解され得る。
【００１６】
本発明者らの先の国際特許出願（特許文献２）は、Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ  ＡＴＣＣ  ２５９８６由来の新規な７β−ＨＳＤＨを記載しており、これはとりわけ、約２８〜３２ｋＤａの分子量（ＳＤＳゲル電気泳動により測定）と、約５３〜６０ｋＤａの分子量（特にＳＤＳ無しなどの、非変性条件下でのゲル濾過により測定）と、および７−ケト−ＬＣＡの７−カルボニル基を７β−ヒドロキシ基へ立体選択的に還元する能力とを有する。
【００１７】
さらに、特許文献２は、ＵＤＣＡ調製のためのプロセスを提供しており、これは以下のように概略的に示し得る：
【００１８】
【化４】
0006694871.tif 000005
【００１９】
かくて、ＣＡは従来の化学的経路によって、単純な方法で酸化される。ＤＨＣＡは、酵素ペア７β−ＨＳＤＨおよび３α−ＨＳＤＨにより、個別に交互に、またはワンポットで還元されて、１２−ケト−ＵＤＣＡを生じる。それ故ＵＤＣＡは、Ｗｏｌｆｆ−Ｋｉｓｈｎｅｒ還元と組合せて、ＣＡから出発してわずか３工程で合成され得る。７β−ＨＳＤＨ酵素は補因子ＮＡＤＰＨに依存するのに対し、３α−ＨＳＤＨ酵素は補因子ＮＡＤＨを必要とする。同じ補因子に依存するか、または依存性が拡張された（例えば、補因子ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対する）酵素ペアが利用可能であることは、それにより補因子再生を単純化し得るため有利となる。
【００２０】
特許文献３は、Ｃ．ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ配列のアミノ酸基３６〜４２の配列領域におけるＣ．ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ由来の新規７β−ＨＳＤＨ変異体と、ＵＤＣＡ調製のための生体触媒プロセス、特にまた、７β−ＨＳＤＨと３α−ＨＳＤＨとが基質上で一緒に作用する新規なホールセルプロセスとを記載する。
【００２１】
特許文献４は、新規なノックアウト株を記載しており、これは、望ましくない７α−ＨＳＤＨ酵素活性を標的化された様式でオフに切り換えることが可能なため、ＵＤＣＡの調製に特に適している。
【００２２】
Ｈｗａｎｇらは、非特許文献１１において、Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ由来の３α−ＨＳＤＨの特定の単一変異体（Ｐ１８５Ａ、Ｇ、またはＷ；Ｔ１８８Ａ、Ｓ、またはＷ）および二重変異体（Ｗ１７３Ｆ／Ｐ１８５Ｗ、およびＷ１７３Ｆ／Ｔ１８８Ｗ）を記載する。Ｎ−Ｈｉｓタグをもつこれらの変異体は、基質アンドロステロンのＮＡＤ依存性の酸化用に推薦されている。他の基質は議論されていない。
【００２３】
本発明の課題は、さらに改良された３α−ＨＳＤＨを供給することである。特に、
ＤＨＣＡの３位の立体特異的還元によるＵＤＣＡの酵素的もしくは微生物的調製のためになおさらに有利に使用され得、かつ特に、基質および／または補因子について改善された活性を有し、および／または基質阻害が低減され、および／または補因子利用が改変された（特異性が増大、改変されるか、または依存性が拡張された）酵素変異体を提供することを意図したものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２４】
【特許文献１】PCT/EP2009/002190
【特許文献２】PCT/EP2010/068576
【特許文献３】WO 2012/080504
【特許文献４】WO 2011/147957
【非特許文献】
【００２５】
【非特許文献１】Bovara R et al. (1996) A new enzymatic route to the synthesis of 12-ketoursodeoxycholic acid. Biotechnol. Lett. 18:305-308.
【非特許文献２】Monti D et al. (2009) One-pot multienzymatic synthesis of 12-ketoursodeoxycholic acid: Subtle cofactor specificities rule the reaction equilibria of five biocatalysts working in a row. Adv. Synth. Catal. 351:1303-1311.
【非特許文献３】Higashi S et al. (1979) Conversion of 7-ketolithocholic acid to ursodeoxycholic acid by human intestinal anaerobic microorganisms: Interchangeability of chenodeoxycholic acid and ursodeoxycholic acid. Gastroenterologia Japonica 14:417-424
【非特許文献４】Liu L et al. (2011) Identification, cloning, heterologous expression, and characterization of a NADPH-dependent 7 beta-hydroxysteroid dehydrogenase from Collinsella aerofaciens. Appl. Microbiol. Biotechnol. 90:127-135.
【非特許文献５】Carrea G et al. (1992) Enzymatic synthesis of 12-ketoursodeoxycholic acid from dehydrocholic acid in a membrane reactor. Biotechnol. Lett. 14:1131-1135
【非特許文献６】Liu L et al. (2013) One-step synthesis of 12-ketoursodeoxycholic acid from dehydrocholic acid using a multienzymatic system. Appl. Microbiol. Biotechnol. 97:633-639
【非特許文献７】Monti, D., et al., (One-Pot Multienzymatic Synthesis of 12-Ketoursodeoxycholic Acid: Subtle Cofactor Specificities Rule the Reaction Equilibria of Five Biocatalysts Working in a Row. Advanced Synthesis & Catalysis, 2009.
【非特許文献８】Zhu, D., et al., Enzymatic enantioselective reduction of -ketoesters by a thermostable 7 -hydroxysteroid dehydrogenase from Bacteroides fragilis. Tetrahedron, 2006. 62(18): p. 4535-4539
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【非特許文献１０】Hirano, S. and N. Masuda, Characterization of NADP-dependent 7 beta-hydroxysteroid dehydrogenases from Peptostreptococcus productus and Eubacterium aerofaciens. Appl Environ Microbiol, 1982. 43(5): p. 1057-63
【非特許文献１１】PLOS ONE (2013), 8, 5, e63594
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２６】
驚くべきことに上記の課題は、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ属の好気性細菌、特にＣｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ株に由来する、３α−ＨＳＤＨの改良された変異体を産生して特性評価することにより、およびそれらをコール酸化合物の変換、特にＵＤＣＡの製造において使用することにより解決できた。
【００２７】
本発明により、構造上および相同性の観点に基づき、補酵素結合のためあるいは基質認識のために役割を果たすかもしれない配列領域を定義することが試みられてきた。このことは、結果として、突然変異誘発によりこれらの領域中のアミノ酸を標的化された様式で改変して、かかる構造的改変によって酵素特性を改変するようにする可能性をもたらす。したがって、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉの３α−ＨＳＤＨの場合には、「ロスマンフォールド（Ｒｏｓｓｍａｎｎ  ｆｏｌｄ）」として公知のものが、約８〜６８付近のアミノ酸領域において補酵素結合に役割を果たす。本発明により、現在、この補酵素結合領域におけるアミノ酸を改変して、酵素がＮＡＤＨの代わりにＮＡＤＰＨを受容するようにすることが特に試みられてきた。６８位のアミノ酸ロイシンをアラニンで置き換える試みを通じて、驚くべきことに、３α−ＨＳＤＨ変異体が著しく高い活性をもつことが判明した。このことはその後また、その全てが６８位に変異をもつ複数のさらなる変異体が野生型酵素よりも高い活性を示したことに関しては確認された。均一までに精製され、かつ対応する精製された野生型酵素に比較された酵素変異体であっても、著しく高い比酵素活性を示した。
【００２８】
改善された活性は、比活性の増大、言い換えれば、変異体３α−ＨＳＤＨ［Ｒ３４Ｎ］、３α−ＨＳＤＨ ［Ｒ３４Ｃ］、３α−ＨＳＤＨ［Ｌ６８Ａ］、３α−ＨＳＤＨ ［Ｌ６８Ｃ］、３α−ＨＳＤＨ［Ｌ６８Ｋ］、３α−ＨＳＤＨ ［Ｌ６８Ｓ］、および二重変異体３α−ＨＳＤＨ［Ｒ３４Ｎ/Ｌ６８Ａ］のタンパク質の量に基づく活性値により、明らかに同定され得る。アミノ酸の交換は、スペルによって示され；例えばＲ３４Ｎは、位置３４のアルギニン（Ｒ）がアスパラギン（Ｎ）により置き換えられたことを意味する。Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉから取得され得る３α−ＨＳＤＨ、またはＣ−末端にヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ）タグが付されたこの酵素は、野生型酵素と称される。
【００２９】
さらに、驚くべきことに、基質ＣＤＣＡおよび／またはＮＡＤＨに関して、単一変異体、例えば３α−ＨＳＤＨ［Ｔ１８８Ａ］、３α−ＨＳＤＨ ［Ｔ１８８Ｓ］、および、二重変異体例えば３α−ＨＳＤＨ ［Ｌ６８Ａ/Ｔ１８８Ａ］または３α−ＨＳＤＨ ［Ｌ６８Ａ/Ｔ１８８Ｓ］において、著しく改善された比活性が検出された。
【００３０】
さらに、上記の課題は、本明細書に記載された３α−ＨＳＤＨおよび７β−ＨＳＤＨ変異体により触媒される、同時かまたは任意の順序で起こり得る２つの還元性の成分工程を経由する、ＤＨＣＡの１２−ケト−ＵＤＣＡへの酵素的変換と、および双方の還元性の成分工程からの使用ずみの補因子を再生する、デヒドロゲナーゼの使用による補因子再生とを含む、生体触媒的（微生物的および／または酵素的）プロセスを提供することにより解決された。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１ａ】Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓの７β−ＨＳＤＨのアミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。
【図１ｂ】図１ａのアミノ酸配列をコードする核酸配列（配列番号１）を示す図である。
【図１ｃ】Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉの３α−ＨＳＤＨのアミノ酸配列（配列番号４）を示す図である。
【図１ｄ】図１ｃのアミノ酸配列をコードする核酸配列（配列番号３）を示す図である。
【図２ａ】Ｈｉｓタグ配列ＬＥＨＨＨＨＨＨによってＣ−末端が延長された、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉの３α−ＨＳＤＨのアミノ酸配列を示す図である。
【図２ｂ】それに由来する変異体３α−ＨＳＤＨ［Ｒ３４Ｎ］を示す図である。
【図２ｃ】それに由来する変異体３α−ＨＳＤＨ［Ｌ６８Ａ］を示す図である。
【図２ｄ】それに由来する変異体３α−ＨＳＤＨ［Ｒ３４Ｎ／Ｌ６８Ａ］を示す図である。
【図３】Ｈｉｓタグをもつ精製された３α−ＨＳＤＨのミカエリス−メンテン動力学を、基質ＤＨＣＡについて（上図）及び補因子（ＮＡＤＨ）について（下図）それぞれ示す図である。
【図４】アラニン変異体［Ｌ６８Ａ］のミカエリス−メンテン動力学を、基質ＤＨＣＡについて（上図）及び補因子（ＮＡＤＨ）について（下図）示す図である。
【図５】３α−ＨＳＤＨ［Ｒ３４Ｎ／Ｌ６８Ａ］（左図）および３α−ＨＳＤＨ［Ｌ６８Ａ］（右図）、ならびにＬＢ中でのフラスコ振盪発酵における発現後のＳＤＳゲルを示す図である。アプライされた可溶性分画は、無細胞粗抽出物である。３α−ＨＳＤＨは、約２７．４ｋＤａのサイズを有する。約１０μｇのタンパク質をアプライした。凡例：１＝精製された３α−ＨＳＤＨ［Ｒ３４Ｎ／Ｌ６８Ａ］；２＝粗抽出物３α−ＨＳＤＨ［Ｒ３４Ｎ／Ｌ６８Ａ］；３＝精製された３α−ＨＳＤＨ［Ｌ６８Ａ］；４＝粗抽出物３α−ＨＳＤＨ［Ｌ６８Ａ］
【図６】二重変異体［Ｒ３４Ｎ／Ｌ６８Ａ］のミカエリス−メンテン動力学を、基質ＤＨＣＡについて（上図）及び補因子（ＮＡＤＨ）について（下図）示す図である。
【図７】野生型酵素、変異体Ｌ６８Ａ、および二重変異体Ｒ３４Ｎ／Ｌ６８Ａの動力学定数の比較を示す図である（基質ＤＨＣＡ：左図、および補酵素ＮＡＤＨ：右図）。
【図８】いずれの場合も粗抽出物を用いて記録された、野生型３α−ＨＳＤＨの基質ＤＨＣＡについてのミカエリス−メンテン動力学を示す図である。点を用いた曲線は、Ｈｉｓタグのない酵素についての基質濃度に対する反応速度の依存性を、三角を用いた曲線は、Ｃ−末端Ｈｉｓタグをもつ酵素について示す。
【図９】３ｘＨｉｓおよび９ｘＨｉｓタグ（左図）、ならびに標準的な６ｘＨｉｓタグをもつ（右図）、３α−ＨＳＤＨのＳＤＳゲルを示す図である。発現は、ＬＢ中で、振盪フラスコ発酵において行なわれた。アプライされた可溶性分画は、無細胞粗抽出物および精製されたタンパク質である。３α−ＨＳＤＨ  ３ｘＨｉｓは、約２７．１ｋＤａのサイズを、６ｘＨｉｓは約２７．５ｋＤａのサイズを、また９ｘＨｉｓは約２７．９ｋＤａのサイズを有する。約１０μｇのタンパク質をアプライした。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明の具体的な実施形態
本発明は特に、以下の具体的な実施形態に関する：
１．  ３−ケトステロイドの対応する３−ヒドロキシステロイドへの（例えば、３，１２−ジケト−７β−ＣＡまたはＤＨＣＡの、１２−ケト−ＵＤＣＡまたは７，１２−ジケト−３α−ＣＡ（７，１２−ジケト−ＬＣＡ）への、特にＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨ、とりわけＮＡＤＨの化学量論的消費下での）少なくとも立体特異的酵素的還元を触媒する３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３α−ＨＳＤＨ）であって、これにおいて該酵素が、配列番号４の位置３４および／または６８において、あるいは、配列番号４に対し少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または９９．５％などの配列同一性をもってそれから派生したアミノ酸配列の対応する配列位置において、変異を含み；および／またはＣ−末端に２５個までの、特に１５、１４、１３、１２、１１、または１０個までの同じか若しくは異なる（タンパク質構成）アミノ酸基による、とりわけ１〜１０個、例えば３〜９個の塩基性アミノ酸基、例えばリジン、アルギニン、または特にヒスチジン（例えば３ｘＨｉｓ、６ｘＨｉｓ、または９ｘＨｉｓ）による鎖延長を含み；ヒスチジン残基は、Ｃ−末端に直接、または任意の１〜１０個、特に１〜３個のアミノ酸基を含むリンカー基を介して結合されることが可能である、上記酵素。例として挙げ得るのは：ＬＥＨＨＨ、ＬＥＨＨＨＨＨＨ、およびＬＥＨＨＨＨＨＨＨＨＨである。主題はさらに、上記の変異体の１つ以上に加えて、またはそれに代わるものとして、２５個までの同じかまたは異なるアミノ酸基によるＮ−末端鎖伸長を含む３α−ＨＳＤＨである。これらは、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、または１０個の同じかまたは異なる（タンパク質構成）アミノ酸残基により、特に１〜１０個、例えば３〜９個の塩基性アミノ酸基、例えばリジン、アルギニン、または特にヒスチジン（例えば３ｘＨｉｓ、６ｘＨｉｓ、または９ｘＨｉｓ）により延長され；ヒスチジン残基は、Ｎ−末端に直接、または任意の１〜１０個のアミノ酸基を含むリンカー基を介して結合されることが可能である。例として挙げ得るのは：ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨ−である。
【００３３】
例えば、好ましい３α−ＨＳＤＨは、位置３４および／または６８に変異を含み、かつ任意でさらにＮ−末端またはＣ−末端が延長され；あるいはそれらはＮ−末端またはＣ−末端のみが延長され；いずれの場合も、本明細書に詳細に定義された通りである。
【００３４】
さらに、本発明は天然の、配列番号４による未変異酵素を含み、これは上記に記載されたようにＮ−またはＣ−末端のみが改変されている。
【００３５】
２．  ３−ケトステロイドの対応する３−ヒドロキシステロイドへの、少なくとも立体特異的酵素的還元を触媒し、かつ配列番号４におけるアミノ酸変異により改変されるアミノ酸配列を有する３α−ＨＳＤＨであって、該アミノ酸配列変異が：
ａ．  Ｒ３４Ｘ１および／若しくは
ｂ．  Ｌ６８Ｘ２
［式中、Ｘ１は、アルギニン（Ｒ）以外のアミノ酸基、特にタンパク質構成アミノ酸基、とりわけ任意の比活性を増大し、および／または基質阻害を低減し、および／または補因子利用もしくは補因子依存性を改変するアミノ酸、特に天然アミノ酸を表し；かつ
Ｘ２は、ロイシン（Ｌ）以外のタンパク質構成アミノ酸基、特に任意の比活性を増大し、および／または基質阻害を低減し、および／または補因子利用もしくは補因子依存性を改変するアミノ酸、とりわけ天然アミノ酸を表す］；
ｃ）  １〜１０個のヒスチジン（Ｈ）残基を含む鎖によりＣ−末端が延長される付加変異体であり；例えばヒスチジン残基は、Ｃ末端に直接、または１〜１０個、とりわけ１〜３個のアミノ酸基を含むリンカー基を介して結合されることが可能である；
ｄ）  １〜１０個のヒスチジン（Ｈ）残基によりＮ−末端が延長される付加変異体であり；例えばヒスチジン残基は、Ｎ末端に直接、または１〜１０個のアミノ酸基を含むリンカー基を介して結合されることが可能である；
を含む単一または多重変異から選択され、
変異した、すなわち改変されたアミノ酸配列が、配列番号４に対し８０％〜１００％未満の、例えば８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または９９．５％の配列同一性を有する、上記酵素。
【００３６】
３．  ａ）  単一変異体
Ｒ３４Ｘ１および
Ｌ６８Ｘ２および
ｂ）  二重変異体
Ｒ３４Ｘ１／Ｌ６８Ｘ２
［式中、Ｘ１はＮ、Ｃ、Ｓ、またはＬを表し；
Ｘ２は、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｋ、Ｓ、またはＶを表し、
これにおいて特に好ましいＸ１、Ｘ２の組合せは；Ｘ１＝Ｎおよび／またはＸ２＝Ａを含む］
ｃ）  １〜１０個のヒスチジン残基を含むペプチド鎖によりＣ−末端が延長される付加変異体であり；例えばヒスチジン残基は、Ｃ−末端に直接、または１〜１０個、特に１〜３個のアミノ酸基を含むリンカー基を介して結合されることが可能である；
ｄ）  １〜１０個のヒスチジン残基を含むペプチド鎖によりＮ−末端が延長される付加変異体であり；例えばヒスチジン残基は、Ｎ−末端に直接、または１〜１０個のアミノ酸基を含むリンカー基を介して結合されることが可能である；および
ｅ）  ａ）および／またはｂ）による変異体であって、いずれの場合もｃ）および／またはｄ）による、特にｃ）またはｄ）による付加変異をさらに含む該変異体、
から選択される、前記３α−ＨＳＤＨ。
【００３７】
適切な変異体の非限定的例は、
以下を含む単一変異体：［Ｒ３４Ｎ］、［Ｒ３４Ｃ］、［Ｒ３４Ｓ］、［Ｒ３４Ｌ］、［Ｌ６８Ａ］、［Ｉ６８Ｃ］、［Ｌ６８Ｋ］、［Ｌ６８Ｓ］、［Ｌ６８Ｖ］、および［Ｌ６８Ｇ］、
以下を含む二重変異体：［Ｒ３４Ｎ／Ｌ６８Ａ］
であり、いずれの場合も、Ｈｉｓタグなしと、Ｃ−末端および／またはＮ−末端Ｈｉｓタグありとの双方がある。
【００３８】
４．  配列番号４をもつ天然の未変異３α−ＨＳＤＨに比較して、以下の特性プロフィールを示す、前記３α−ＨＳＤＨ。：    ａ．  デヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）についての、ＮＡＤＨを補因子として用いるＤＨＣＡの酵素的還元における増大された比活性（Ｖｍａｘ［Ｕ／ｍｇ］）であって；これにおいて、例えば、未変異酵素に比較して、補因子ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下での比活性（Ｕ／ｍｇ）が少なくとも１、５、１０、５０、または１００％まで、しかし特に少なくとも１倍、とりわけ２〜１００倍、または３〜２０倍、または５〜１０倍増大されること、
ｂ．  ＤＨＣＡによる基質阻害の低減、例えば、＞１０ｍＭからの範囲、例えば１１〜２００ｍＭ、１２〜１５０ｍＭ、１５〜１００ｍＭにＫｉ値をもつこと、
ｃ．  これらの特性ａ）およびｂ）が、個別に、または任意の組合せ、すなわち、ａ）のみ、ｂ）のみ、ｃ）のみ、ａ）とｂ）、ａ）とｃ）、またはｂ）とｃ）で存在可能なこと、
【００３９】
５．  ３−ケトステロイドの対応する３−ヒドロキシステロイドへの（例えば、３，１２−ジケト−７β−ＣＡまたはＤＨＣＡの、１２−ケト−ＵＤＣＡまたは７，１２−ジケト−３α−ＣＡ（７，１２−ジケト−ＬＣＡ）への、特にＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨの化学量論的消費による、とりわけＮＡＤＨの化学量論的消費による、少なくとも立体特異的酵素的還元を触媒する３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３α−ＨＳＤＨ）であって、これにおいて該酵素が、配列番号４の位置１８８および／または位置１８５、および任意で位置６８において、あるいは、配列番号４に対し例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または９９．５％などの配列同一性をもつアミノ酸配列の対応する配列位置において、変異を含み；および／または、該酵素は、１５，１４、１３、１２、１１、または１０個までの同じかまたは異なる（タンパク質構成）アミノ酸基による、特に１〜１０個、例えば３〜９個の塩基性アミノ酸基、例えばリジン、アルギニン、またはとりわけヒスチジン（例えば３ｘＨｉｓ、６ｘＨｉｓ、または９ｘＨｉｓ）によるＣ−末端鎖伸長を含み；ヒスチジン残基は、Ｃ−末端に直接、または任意の１〜３個のアミノ酸基を含むリンカー基を介して結合されることが可能である。例として挙げ得るのは：ＬＥＨＨＨ、ＬＥＨＨＨＨＨＨ、およびＬＥＨＨＨＨＨＨＨＨＨである。主題はさらに、上記の変異の１つ以上に加えて、またはそれに代わるものとして、２５個までの同じかまたは異なるアミノ酸基によるＮ−末端鎖伸長を含む。これらは、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、または１０個の同じかまたは異なる（タンパク質構成）アミノ酸基により、とりわけ１〜１０個、例えば３〜９個の塩基性アミノ酸基、例えばリジン、アルギニン、またはとりわけヒスチジン（例えば３ｘＨｉｓ、６ｘＨｉｓ、または９ｘＨｉｓ）により延長され；ヒスチジン残基は、Ｎ−末端に直接、または任意の１〜１０個のアミノ酸基を含むリンカー基を介して結合されることが可能である。例として挙げ得るのは：ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨ−である。
【００４０】
例えば、好ましい３α−ＨＳＤＨは、それぞれ位置１８８および／または１８５に、かつ任意で位置６８に変異を含み、かつ任意でさらにＮ−末端またはＣ−末端が延長され；あるいはそれらはＮ−末端またはＣ−末端が延長されるのみであり；いずれの場合も、本明細書に詳細に定義される通りである。
【００４１】
６．  ３−ケトステロイドの対応する３−ヒドロキシステロイドへの少なくとも立体特異的酵素的還元を触媒し、かつ配列番号４におけるアミノ酸変異により改変されるアミノ酸配列を含んでおり、該アミノ酸配列変異が：
ａ）  Ｐ１８５Ｘ１および／若しくは
ｂ）  Ｔ１８８Ｘ３
並びに任意でさらに、
ｃ）  Ｌ６８Ｘ２
［式中、Ｘ１は、プロリン（Ｐ）以外の（タンパク質構成）アミノ酸基を表し；
Ｘ２は、ロイシン（Ｌ）以外の（タンパク質構成）アミノ酸基を表し；
Ｘ３は、スレオニン（Ｔ）以外の（タンパク質構成）アミノ酸基を表す］；
ｄ）  任意でさらに、１〜１０個のヒスチジン（Ｈ）残基を含むＣ−末端伸長をもつこと；および／若しくは任意でさらに、１〜１０個のヒスチジン（Ｈ）残基を含むＮ−末端伸長をもつこと、
を含む単一または多重変異から選択され、
これにおいて、変異した、すなわち改変されたアミノ酸配列が、配列番号４に対し８０％〜１００％未満の、例えば８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または９９．５％の配列同一性を有する、３α−ＨＳＤＨ。
【００４２】
７．  ａ）  単一変異体
Ｐ１８５Ｘ１
Ｔ１８８Ｘ３
ｂ）  二重変異体
Ｐ１８５Ｘ１／Ｔ１８８Ｘ３；
Ｌ６８Ｘ２／Ｔ１８８Ｘ３；
Ｌ６８Ｘ２／Ｔ１８５Ｘ１；
［式中、Ｘ１はＡ、Ｔ、Ｓ、Ｇ、またはＶ，特にＡを表し；
Ｘ２は、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｋ、Ｓ、またはＶ、特にＡを表し；かつ
Ｘ３は、Ａ、Ｇ、Ｗ、Ｓ、またはＶ、特にＡまたはＳを表す］
ｃ）  任意でさらに、１〜１０個のヒスチジン残基を含むＣ−末端伸長をもつもの、例えばヒスチジン残基が、Ｃ末端に直接、または１〜１０個のアミノ酸基を含むリンカー基を介して結合されることが可能であるもの；
および；および／または
ｄ）  任意でさらに、１〜１０個のヒスチジン残基を含むＮ−末端伸長をもつもの、例えばヒスチジン残基が、Ｎ末端に直接、または１〜１０個のアミノ酸基を含むリンカー基を介して結合されることが可能であるもの；
および
ｅ）  ａ）およびｂ）による変異であって、いずれの場合もｃ）および／またはｄ）による、とりわけｃ）またはｄ）による付加変異をさらに含むもの、
から選択される、上記実施形態５および６の１つによる３α−ＨＳＤＨ。
【００４３】
特に挙げられるべきであるのは、二重変異体Ｐ１８５Ｘ１／Ｔ１８８Ｘ３；Ｌ６８Ｘ２／Ｔ１８８Ｘ３；Ｌ６８Ｘ２／Ｔ１８５Ｘ１であり；上記に定義された通りのＮ−またはＣ−末端伸長をもたないか、またはもつものである。
【００４４】
適切な変異体の非限定的例は：
以下を含む単一変異体：［Ｔ１８８Ａ］、［Ｔ１８８Ｓ］、［Ｔ１８８Ｇ］、［Ｔ１８８Ｖ］、［Ｔ１８８Ｗ］、［Ｐ１８５Ａ］、［Ｐ１８５Ｔ］、［Ｐ１８５Ｓ］、［Ｐ１８５Ｇ］、［Ｐ１８５Ｖ］、Ｐ１８５Ａ］，
以下を含む二重変異体：［Ｌ６８Ａ／Ｔ１８８Ａ］および［Ｌ６８Ａ／Ｔ１８８Ｓ］、
であり、
いずれの場合も、Ｈｉｓタグなしと、Ｃ−末端および／またはＮ−末端Ｈｉｓタグありとの双方がある。
【００４５】
８．  配列番号４をもつ天然の未変異３α−ＨＳＤＨに比較して、以下の特性プロフィール：
ａ．  デヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）についての、ＮＡＤＨを補因子として用いるＤＨＣＡの酵素的還元における増大された比活性（Ｖｍａｘ［Ｕ／ｍｇ］）であって；これにおいて、例えば、未変異酵素に比較して、補因子ＮＡＤＨの存在下での比活性（Ｕ／ｍｇ）が少なくとも１、５、１０、５０、または１００％まで、しかし特に少なくとも１倍、とりわけ２〜１００倍、または３〜２０倍、または５〜１０倍増大されること、
ｂ．  ＤＨＣＡによる基質阻害の低減、例えば、＞１０ｍＭから、例えば１１〜２００ｍＭ、１２〜１５０ｍＭ、１５〜１００ｍＭの範囲のＫｉ値をもつこと、
ｃ．  ＮＡＤＨについての、ＮＡＤＨを補因子として用いるＤＨＣＡの酵素的還元における増大された比活性（Ｖｍａｘ［Ｕ／ｍｇ］）であって；これにおいて、例えば、未変異酵素に比較して、ＤＨＣＡの存在下での比活性（Ｕ／ｍｇ）が少なくとも１、５、１０、５０、または１００％まで、しかし特に少なくとも１倍、とりわけ２〜１００倍、または３〜２０倍、または５〜１０倍増大されること、
を示し、
これらの特性ａ）〜ｃ）が、個別に、または任意の組合せ、すなわち、ａ）のみ、ｂ）のみ、ｃ）のみ、ａ）とｂ）、ａ）とｃ）、またはｂ）とｃ）で存在可能である、
実施形態５〜７の１つによる３α−ＨＳＤＨ。
【００４６】
９．  先行する実施形態の１つによる３α−ＨＳＤＨをコードする、ヌクレオチド配列。
挙げられ得る例は、以下の核酸配列：
ａ）  ＧＤＨと、実施形態１〜８の１つによる３α−ＨＳＤＨ変異体と、および任意で７β−ＨＳＤＨとを同時にコードする核酸配列、
ｂ）  ＧＤＨと、実施形態１〜８の１つによる３α−ＨＳＤＨ変異体と、および任意で７β−ＨＳＤＨを含む融合タンパク質をコードする核酸配列、
から選択される核酸配列であり、
これにおいて、コーディング配列は、互いに独立して、構成物中に単独で、または重複して、例えば２、３、４、５、または６〜１０コピーなどで存在し得る。したがって、個々の発現産物の活性に存在するいずれの差異も、適切なコピー数を選択することにより補償され得る。
【００４７】
１０．  少なくとも１つの調節配列の制御下にある、実施形態９による少なくとも１つのヌクレオチド配列と、任意で、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、とりわけ７β−ＨＳＤＨ、および補因子再生に適したデヒドロゲナーゼ、例えばＦＤＨ、ＧＤＨ、ＡＤＨ、Ｇ−６−ＰＤＨ、ＰＤＨ、から選択される少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、または３つ）のさらなる酵素のためのコーディング配列とを含む、発現カセット。特に、発現カセット中に存在する酵素は、異なるがしかし好ましくは同一の補因子ペア、例えばＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ、またはＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨ補因子ペアを利用し得る。
【００４８】
１１．  実施形態１０による少なくとも１つの発現カセットを含む、発現ベクター。
【００４９】
１２．  実施形態９による少なくとも１つのヌクレオチド配列、または実施形態１０に記載の少なくとも１つの発現カセット、または実施形態１１に記載の少なくとも１つの発現ベクターをもつ、組換え微生物。
【００５０】
１３．  任意でさらに、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（ＨＳＤＨ）および補因子再生に適するデヒドロゲナーゼから選択される、少なくとも１つのさらなる酵素のコーディング配列をもつ、実施形態１２に記載の組換え微生物。
【００５１】
１４．  さらなるＨＳＤＨが、７β−ＨＳＤＨから選択され；かつ
デヒドロゲナーゼが、ＮＡＤＰＨ再生酵素、例えばＮＡＤＰＨデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、およびＮＡＤＰＨ−再生ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）、およびまたグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ−６−ＰＤＨ）、または亜リン酸デヒドロゲナーゼ（ＰｔＤＨ）か、あるいはＮＡＤＨ再生酵素、例えばＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＨ−再生ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）、ＮＡＤＨ再生アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、ＮＡＤＨ再生グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）、ＮＡＤＨ再生亜リン酸デヒドロゲナーゼ（ＰｔＤＨ）、およびＮＡＤＨ再生グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）から選択される、実施形態１３による組換え微生物。
【００５２】
挙げられ得る例は、本発明の３α−ＨＳＤＨ変異体と、本明細書に記載のＧＤＨと、および任意で本明細書に記載の７β−ＨＳＤＨとを同時に発現可能な組換え微生物である。
【００５３】
３α−ＨＳＤＨ変異体、ＧＤＨまたはその変異体、および７β−ＨＳＤＨのコーディング配列、および１つ以上の（異なる）発現構築物をもつ組換え微生物。本発明の主題は、それ故、３α−ＨＳＤＨ変異体、ＧＤＨまたはその変異体、および７β−ＨＳＤＨまたはその変異体のコーディング配列を、１以上のコピー、例えば２，３、４、５、または６〜１０コピーでもつ単一のプラスミド系で改変される（例えば、形質転換される）組換え微生物である。それ故本発明の主題はまた、７β−ＨＳＤＨまたはその変異体、ＧＤＨまたはその変異体、および３α−ＨＳＤＨまたはその変異体を、１以上のコピー、例えば２，３、４、５、または６〜１０コピーでもつ単一のプラスミド系で改変される（例えば、形質転換される）組換え微生物である。しかしながら、酵素（７β−ＨＳＤＨ、ＧＤＨ、および３α−ＨＳＤＨ、またはそれらの変異体）は、互いに適合する２つまたは３つの別個のプラスミド上に１つ以上のコピーで存在してもよい。単一プラスミド系およびマルチコピープラスミドの調製のために適したベースのベクターは、当業者には公知である。単一プラスミド系の例としては、例えばｐＥＴ２１ａが、またマルチコピープラスミドには、例えばＮｏｖａｇｅｎから市販のＤｕｅｔベクターである、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１、ｐＥＴＤｕｅｔ−１、ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１、ｐＲＳＦＤｕｅｔ−１、およびｐＣＯＬＡＤｕｅｔ−１などが挙げられる。かかるベクターは、他のベクターおよび微生物宿主株と適合性があり、例えば、Ｎｏｖａｇｅｎからの「Ｕｓｅｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ」ＴＢ３４０  Ｒｅｖ．Ｅ０３０５に見出し得る。
【００５４】
プラスミド系を産生するのに最適な酵素の組合せは、当業者により本発明の教示を考慮して、過度の負担なく実施され得る。したがって例えば、当業者は、例えば、各場合に使用されるＨＳＤＨ酵素の補因子特異性の機能として、上述のデヒドロゲナーゼ、とりわけＧＤＨおよびその各々の変異体から選択される、補因子再生に最も適した酵素を選択し得る。
【００５５】
さらに、変換のための選択された酵素を２つ以上のプラスミドに分配すること、およびかくて調製されたプラスミドを用いて２つ以上の異なる組換え微生物を調製し、さらにそれらを本発明の生体触媒的変換のために一緒に用いることが可能である。プラスミドの調製に使用されるそれぞれの酵素の組合せは、本明細書では、特にまた、類似した補因子利用の要求によっても行なわれ得る。したがって例えば、第１の微生物は、７β−ＨＳＤＨまたはその変異体とＧＤＨとをコードする配列をもつプラスミドで改変され得る。第２の微生物は、対照的に３α−ＨＳＤＨまたはその変異体のコーディング配列と、ＧＤＨのコーディング配列とをもつプラスミドで改変され得る。両酵素のペアは、それらが同じ補因子ペアを再生可能なように選択され得る。次いで両微生物は、本発明の生体触媒的変換のために同時に使用され得る。
【００５６】
２つの別個の生体触媒（組換え微生物）の使用は、合成のための全酵素がそれにおいて発現される１つの生体触媒のみの使用に対し、２つの本質的な利点を有し得る：
ａ）  双方の生体触媒は、互いに別個に、遺伝的に改変されかつ最適化され得る。特に、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの再生のいずれかに対し最適化された、種々の補因子再生酵素の使用が可能である。
ｂ）  生体触媒を、異なる割合で生体触媒反応に用いることが可能である。これにより、たとえ全ての生体触媒が既に調製された後であっても、生体触媒作用中の多酵素プロセスの個々の反応速度を保証できる。
【００５７】
１５．  ７α−ＨＳＤＨノックアウト株である、実施形態１２〜１４の１つによる組換え微生物であって、これにおいて、該株が、例えばＷＯ  ２０１１／１４７９５７に記載される通りである、上記株。
【００５８】
１６．  ３α−ヒドロキシステロイドの酵素的または微生物的合成のためのプロセスであって、これにおいて対応する３−ケトステロイドが、実施形態１〜８の１つにおける定義による３α−ＨＳＤＨの存在下に、または実施形態１２〜１５の１つによるこの３α−ＨＳＤＨを発現する組換え微生物の存在下に還元され、かつ任意で、少なくとも１つの生成された還元産物が反応混合物から単離される、該プロセス。
【００５９】
１７．  ３−ケトステロイドが、デヒドロコール酸（ＵＤＣＡ）、その誘導体、例えば、特に、該酸の塩、アミド、またはアルキルエステルから選択される、実施形態１６によるプロセス。
【００６０】
１８．  還元が、ＮＡＤＰＨおよび／またはＮＡＤＨの存在下、および特にＮＡＤＰＨおよび／またはＮＡＤＨを消費して行なわれる、実施形態１６または１７によるプロセス。
【００６１】
１９．  消費されたＮＡＤＰＨが、ＮＡＤＰＨ再生酵素との共役により再生され、これにおいて後者が、とりわけＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、およびＮＡＤＰＨ再生ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）、およびＮＡＤＰＨ再生グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）から選択され、これにおいてＮＡＤＰＨ再生酵素が任意で組換え微生物により発現され；および／または、消費されたＮＡＤＨが、ＮＡＤＨ再生酵素との共役より再生され、これにおいて後者が、とりわけＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＨ−再生ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）、ＮＡＤＨ再生アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、ＮＡＤＨ再生グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）、ＮＡＤＨ再生亜リン酸デヒドロゲナーゼ（ＰｔＤＨ）、およびＮＡＤＨ−再生グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）から選択され、これにおいてＮＡＤＨ再生酵素が任意で組換え微生物において発現される、実施形態１８によるプロセス。
【００６２】
２０．  ＮＡＤＰＨ再生酵素が：
ａ．  ギ酸のＣＯ２への少なくとも酵素的酸化を触媒する、ＮＡＤ＋依存性ＦＤＨの変異体を含むＦＤＨであり、これにおいて該変異体が、未変異酵素に比較して、補因子としてさらにＮＡＤＰ＋を受容する、該ＦＤＨ；および
ｂ．  ＧＤＨ
から選択される、実施形態１９によるプロセス。
【００６３】
２１．  式（１）：
【００６４】
【化５】
0006694871.tif 000006
【００６５】
［式中、Ｒは、アルキル、Ｈ、アルキル金属イオン、またはＮ（Ｒ３）４＋を表し、ここで、基Ｒ３は、同じかまたは異なり、かつＨまたはアルキルを表し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で置き換えられ、ここで、Ｒ１およびＲ２は、互いに独立してアルキル基を表す］
のウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）の調製のためのプロセスであって、これにおいて、
ａ）  任意に、式（２）：
【００６６】
【化６】
0006694871.tif 000007
【００６７】
［式中、Ｒは、上記に示した意味を有し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは、上記に定義されたようなアミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で置き換えられる］のコール酸（ＣＡ）が、式（３）：
【００６８】
【化７】
0006694871.tif 000008
【００６９】
［式中、Ｒは、上記に示した意味を有し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは、上記に定義されたような酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で置き換えられる］のデヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）へ化学的に酸化され；
ｂ）ＤＨＣＡは、請求項１〜８の１つにおける定義による少なくとも１つの３α−ＨＳＤＨ変異体（単離された酵素として存在するか、または対応する組換え微生物により発現される）の存在下に、および少なくとも１つの７β−ＨＳＤＨ（単離された酵素として存在するか、または対応する組換え微生物により発現される）の存在下に、対応する式（５）：
【００７０】
【化８】
0006694871.tif 000009
【００７１】
［式中、Ｒは、上記に示した意味を有し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは、上記に定義されたような酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で、とりわけＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨの存在下に、かつＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨを消費して、置き換えられる］
の１２−ケト−ウルソデオキシコール酸（１２−ケト−ＵＤＣＡ）へ還元され、その後
ｃ）式（５）の１２−ケト−ＵＤＣＡがＵＤＣＡへ化学的に還元され；そして
ｄ）任意で、反応産物がさらに精製される、上記プロセス。
【００７２】
２２．  少なくとも工程ｂ）が、実施形態１２〜１５の１つによる組換え微生物の存在下に行われる、実施形態２１によるプロセス。
【００７３】
２３．  工程ｂ）が、同じかまたは異なる補因子再生系と共役される、実施形態２１または２２によるプロセス。
【００７４】
２４．  式（１）：
【００７５】
【化９】
0006694871.tif 000010
【００７６】
［式中、Ｒは、アルキル、Ｈ、アルキル金属イオン、またはＮ（Ｒ３）４＋を表し、ここで、基Ｒ３は、同じかまたは異なり、かつＨまたはアルキルを表し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは、上記に定義されたような酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で置き換えられる］
のＵＤＣＡの調製のためのプロセスであって、これにおいて、
ａ）任意に、式（２）：
【００７７】
【化１０】
0006694871.tif 000011
【００７８】
［式中、Ｒは、上記に示した意味を有し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは、上記に定義されたような酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で置き換えられる］のコール酸（ＣＡ）が、式（３）：
【００７９】
【化１１】
0006694871.tif 000012
【００８０】
［式中、Ｒは、上記に示した意味を有し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは、上記に定義されたような酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で置き換えられる］のＤＨＣＡへ化学的に酸化され；
ｂ）ＤＨＣＡは、少なくとも１つの７β−ＨＳＤＨの存在下、および少なくとも１つの３α−ＨＳＤＨの存在下に、式（５）：
【００８１】
【化１２】
0006694871.tif 000013
【００８２】
［式中、Ｒは、上記に示した意味を有し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは、上記に定義されたような酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で、とりわけＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨの存在下、および、ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨを消費して、置き換えられる］
の対応する１２−ケト−ＵＤＣＡへ還元され、その後
ｃ）式（５）の１２−ケト−ＵＤＣＡがＵＤＣＡへ化学的に還元され；そして
ｄ）任意で、反応産物がさらに精製され；
ここで、工程ｂ）の変換が、実施形態１２〜１５の１つによる組換え微生物の存在下、例えば実施形態１２〜１５の１つによる１以上の異なる組換え微生物のホールセルの存在下に行われ、これにおいて、微生物が変換および補因子再生に必要な酵素を本明細書に詳述された方法で含む、上記プロセス。
【００８３】
本発明との関連においては、プロセス工程ｂ）は、異なる方法で構成され得る。両酵素（７β−ＨＳＤＨ変異体および３α−ＨＳＤＨ）は、同時に存在してもよく（例えば、単離された両酵素を用いるｏｎｅ−ｔｏｐ反応か、または両酵素を発現する１以上の対応する組換え微生物が存在する）、あるいはまた、部分反応が任意の所望の順序で進行してもよい（最初は７β−ＨＳＤＨ変異体に触媒される還元、そして次に３α−ＨＳＤＨに触媒される還元；または最初は３α−ＨＳＤＨに触媒される還元、そして次に７β−ＨＳＤＨ変異体に触媒される還元）。
【００８４】
工程ｂ）は、さらに、ＮＡＤＰＨがＮＡＤＰＨ再生ＧＤＨによりグルコースを消費して再生される補因子再生系と共役され得、あるいは消費されたＮＡＤＨがＮＡＤＨ再生ＧＤＨ、ＡＤＨ、またはＦＤＨにより再生される補因子再生系と共役され得る。
【００８５】
２５．実施形態１６〜２４の１つによるプロセスを実施するためのバイオリアクタは、とりわけ少なくとも１つの酵素７β−ＨＳＤＨ、ＦＤＨ、および／または３α−ＨＳＤＨ、またはそれらの変異体；あるいは７β−ＨＳＤＨ、ＧＤＨ、および／または３α−ＨＳＤＨ、またはそれらの変異体を含む。
【００８６】
本発明は、本明細書に記載された具体的な実施形態に限定されない。むしろ、本発明の教示は、当業者に、過度の努力なしに本発明のさらなる発展を提供できるようにする。したがって例えば、当業者はさらなる酵素変異体を標的化された方法で発生させ、所望の特性プロフィール（改良された補因子依存性および／または安定性、低減された基質阻害）のためにこれらを選別および最適化し；あるいは、さらに適した野生型酵素（７β−および３α−ＨＳＤＨ、ＦＤＨ、ＧＤＨ、ＡＤＨなど）を単離して、それらを本発明に従って使用することも可能である。さらに当業者は、例えば用いたＨＳＤＨ、例えば特に７β−ＨＳＤＨおよび３α−ＨＳＤＨ、またはそれらの変異体の特性プロフィール（特に補因子依存性）に基づき、補因子再生に使用可能な適切なデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ、ＦＨＤ、ＡＤＨなど）およびその変異体を選択し、かつ選択された酵素を１つ以上の発現構築物またはベクターへ分布させ、それにより、必要であれば１つ以上の組換え微生物を産生し得、このことが次に最適化されたホールセルベースの調製プロセスを可能にする。
【００８７】
本発明のさらなる展開
１．一般的な定義および用いた略語
別に指定しない限り、用語「７β−ＨＳＤＨ」は、ＤＨＣＡまたは７，１２−ジケト−３α−ＣＡ（７，１２−ジケト−ＬＣＡ）の３，１２−ジケト−７β−ＣＡまたは１２−ケト−ＵＤＣＡへの、特にＮＡＤＰＨの化学量論的消費による、少なくとも立体特異的および／または位置特異的な還元、および任意に、対応する逆反応を触媒するデヒドロゲナーゼ酵素を指す。本発明との関連においては、該酵素は、天然かまたは組換えにより産生される酵素であってよい。酵素は原則的に、細胞性不純物、例えばタンパク質不純物との混合物として存在してもよいが、しかし純粋な形態で存在することが好ましい。適切な検出法は、例えば以下の実験のセクションにおいて記載されるか、または文献から公知である（例えば、Characterization of NADP-dependent 7 beta-hydroxysteroid dehydrogenases from Peptostreptococcus productus and Eubacterium aerofaciens. S Hirano and N Masuda. Appl Environ Microbiol. 1982）。この活性をもつ酵素は、ＥＣ番号１．１．１．２０１に分類される。適切な酵素は、例えばＣｏｌｉｎｓｅｌｌｅａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓから単離され得る。
【００８８】
別に指定しない限り、用語「３α−ＨＳＤＨ」は、３，１２−ジケト−７β−ＣＡまたはＤＨＣＡの、１２−ケト−ＵＤＣＡまたは７，１２−ジケト−３α−ＣＡ（７，１２−ジケト−ＬＣＡ）への、特にＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨの化学量論的消費による、少なくとも立体特異的および／または位置特異的な還元、および任意に、対応する逆反応を触媒するデヒドロゲナーゼ酵素を指す。適切な検出法は、例えば以下の実験のセクションにおいて記載されるか、または文献から公知である。適切な酵素は、例えばＣｏｍａｎｏｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ（すなわち、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）（例えばＡＴＣＣ１１９９６）から得られ得る。ＮＡＤＰＨ依存性３α−ＨＳＤＨは、例えばげっ歯類由来のものが公知であり、同様に使用可能である（Cloning and sequencing of the cDNA for rat liver 3 alpha-hydroxysteroid/dihydrodiol dehydrogenase, J E Pawlowski, M Huizinga and T M Penning, May 15, 1991 The Journal of Biological Chemistry, 266, 8820-8825）。この活性をもつ酵素は、ＥＣ番号１．１．１．５０に分類される。
【００８９】
別に指定しない限り、用語「ＧＤＨ」は、β−Ｄ−グルコースのＤ−グルコノ−１，５−ラクトンへの、ＮＡＤ＋および／またはＮＡＤＰ＋の化学量論的消費による、少なくとも酸化、および任意に、対応する逆反応を触媒するデヒドロゲナーゼ酵素を指す。適切な酵素は、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍから得られ得る。この活性をもつ酵素は、ＥＣ番号１．１．１．４７に分類される。
【００９０】
別に指定しない限り、用語「ＦＤＨ」は、ギ酸（または対応するギ酸塩）の二酸化炭素への、ＮＡＤ＋および／またはＮＡＤＰ＋の化学量論的消費による、少なくとも酸化、および任意に、対応する逆反応を触媒するデヒドロゲナーゼ酵素を指す。適切な検出方法は、例えば、以下の実験部分において記載されるか、または文献からである。適切な酵素は、例えばＣａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ、またはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖａｃｃａｅから得られ得る。この活性をもつ酵素は、ＥＣ番号１．２．１．２に分類される。
【００９１】
本発明によれば、「純粋な形態」または「純粋な」もしくは「本質的に純粋」な酵素は、本発明により、通常のタンパク質検出法、例えばビウレット法またはＬｏｗｒｙらにより記載されたタンパク質検出（R.K. Scopes, Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin (1982)における記載を参照）などにより測定された全タンパク質含量に基づき、８０ｗｔ．％を超え、好ましくは９０ｗｔ．％を超え、とりわけ９５ｗｔ．％を超え、特に９９ｗｔ．％を超える純度をもつ酵素であると理解される。
【００９２】
「レドックス等価物」は、電子供与体または電子受容体として使用可能な低分子量有機化合物、例えばニコチンアミド誘導体、例えばＮＡＤ＋およびＮＡＤＨ＋、およびそれぞれその還元型であるＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨを意味するものと理解される。「レドックス等価物」および「補因子」は、本発明に関しては同義語として使用される。それ故本発明では、「補因子」はまた「レドックス対応補因子」、すなわち還元型および酸化型で存在し得る補因子としても記載され得る。
【００９３】
「消費された」補因子は、基質の所定の還元または酸化反応の過程において、それぞれ対応する酸化型または還元型へ変換される、還元型または酸化型の補因子を意味するものと理解される。再生は、反応中に生成された酸化または還元された補因子を、それぞれその還元または酸化された出発型へ戻し変換して、これが再び基質の変換に利用されるようにする。
【００９４】
本発明によれば、「改変された補因子利用」は、基準との比較における定性的または定量的変化を意味するものと理解される。特に、改変された補因子利用は、アミノ酸配列の変異を実施することにより観察され得る。この改変は次に、未変異の出発酵素との比較において識別できる。ここで、特定の補因子に関する活性は、変異を実施することにより増大もしくは低減されるか、または完全に阻止され得る。しかしながら、改変された補因子利用はまた、単一の補因子に対する特異性に代えて、第１の補因子とは異なる少なくとも１つのさらなる第２の補因子が今や使用可能となるような変更も含む（すなわち、拡張された補因子利用が存在する）。しかしながら逆に、２つの異なる補因子を使用する元々存在する能力はまた、これらの補因子の１つのみについて特異性が増大されるか、あるいはこれらの補因子の１つのみについて低減または完全に除去されるように改変され得る。したがって例えば、補因子ＮＡＤ（ＮＡＤＨ）に依存性である酵素は、補因子利用の変更の結果として、今やＮＡＤ（ＮＡＤＨ）および補因子ＮＡＤＰ（ＮＡＤＰＨ）の双方に依存でき、あるいは元のＮＡＤ（ＮＡＤＨ）に対する依存性がＮＡＤＰ（ＮＡＤＰＨ）に対する依存性へ完全に変更されるか、またその逆も可能である。
【００９５】
別に指定しない限り、「ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ依存性」または「ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨ依存性」という表現は、本発明に従って幅広く解釈されるべきである。これらの表現は、「特異的な」依存性、すなわちもっぱらＮＡＤ＋／ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨに対する依存性のみならず、本発明に従って使用される酵素の両補因子に対する依存性、すなわちＮＡＤ＋／ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨの依存性も含む。
【００９６】
同じことが、用いた表現「ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ受容性」および「ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨ受容性」についても適用される。
【００９７】
別に指定しない限り、「ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ再生」および「ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨ再生」という表現は、本発明に従って広範囲に解釈されるべきである。これらの表現には、「特異的な」、すなわち消費された補因子ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ、および／またはＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨを専用に再生する能力のみならず、しかしまた双方の補因子、すなわちＮＡＤ＋／ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨを再生する能力も含まれる。
【００９８】
「タンパク質構成」アミノ酸は、特に（一文字コード）：Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｐ、Ｍ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、およびＨを含む。
【００９９】
本発明によれば「固定化」は、本発明により使用される生体触媒、例えば７β−ＨＳＤＨの、固体担体物質、すなわち周囲の液体媒体には本質的に不溶性の担体物質への、共有または非共有結合を意味するものと理解される。本発明によれば、本発明により使用される組換え微生物などのホールセルもまた、かかる担体によって固定化され得る。
【０１００】
「未変異酵素に比較して低減される基質阻害」は、特定の基質に対し未変異酵素において観察される基質阻害剤が、もはや観察できないこと、すなわちもはや本質的に測定できないこと、またはより高い基質濃度においてのみ開始すること、すなわちＫｉ値が増大することを意味する。
【０１０１】
本発明によるＮ−またはＣ−末端伸長は、約１５〜２５個のタンパク質構成アミノ酸基を含み、これらは末端アミノ酸基に対し、任意で可逆的に、例えばタンパク質分解酵素切断部位を介して結合される。好ましい残基は、例えば３、６、または９個の連続したヒスチジン残基を延長配列中にもつ、それ自体公知のいわゆる「Ｈｉｓタグ」を含む。
【０１０２】
「コール酸化合物」は、本発明によれば、炭素骨格、特にコール酸のステロイド構造をもち、かつ環の位置７および任意に環の位置３および／または１２において、ケトおよび／またはヒドロキシルおよび／またはアシルオキシ基が存在する化合物を意味するものと理解される。
【０１０３】
特別なタイプの化合物、例えば「コール酸化合物」または「ウルソデオキシコール酸化合物」は、特にまた、基礎となる出発化合物（例えばコール酸またはウルソデオキシコール酸）の誘導体も意味するものと理解される。
【０１０４】
かかる誘導体は、「塩」、例えば化合物のアルカリ金属塩、例えばリチウム、ナトリウム、およびカリウム塩、およびアンモニウム塩を含み；かつここでアンモニウム塩には、ＮＨ４＋塩または、少なくとも１つの水素原子がＣ１−Ｃ６アルキル基で置き換えられ得るアンモニウム塩が含まれる。典型的なアルキル基は、とりわけ、メチル、エチル、ｎ−またはｉ−プロピル、ｎ−、ｓｅｃ−、またはｔｅｒｔ−ブチルなどのＣ１−Ｃ４アルキル基、およびｎ−ペンチルおよびｎ−ヘキシル、ならびにそれらの一回または複数回分枝類似体である。
【０１０５】
本発明の化合物の「アルキルエステル」は、特に低級アルキルエステル、例えばＣ１−Ｃ６アルキルエステルである。限定しない例としては、メチル、エチル、ｎ−もしくはｉ−プロピル、ｎ−、ｓｅｃ−、もしくはｔｅｒｔ−ブチルエステル、またはより長鎖のエステル、例えばｎ−ペンチルおよびｎ−ヘキシルエステル、ならびにそれらの一回または複数回の分枝類似体が挙げられる。
【０１０６】
「アミド」は、特に、本発明による酸と、アンモニアとの、または一級もしくは二級モノアミドとの反応産物である。かかるアミドは、例えばモノ−またはジ−Ｃ１−Ｃ６アルキルモノアミンであり、これにおいてアルキル基は、互いに独立して任意に、例えばカルボキシル、ヒドロキシル、ハロゲン（例えばＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、ニトロ、およびスルホネート基によりさらに置換され得る。
【０１０７】
本発明による「アシル基」は、特に、２〜４個の炭素原子をもつ非芳香族基、例えばアセチル、プロピオニル、およびブチリル、ならびに任意に置換された単核芳香環をもつ芳香族基であり、これにおいて、適切な置換基は、例えばヒドロキシル、ハロゲン（例えばＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、ニトロ、およびＣ１−Ｃ６アルキル基、例えばベンゾイルまたはトルオイルから選択される。
【０１０８】
本発明により適用および／または産生されるヒドロキシステロイド化合物、例えばコール酸、ウルソデオキシコール酸、１２−ケト−ケノデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、および７−ケト−リトコール酸は、立体異性的に純粋な形態か、または他の立体異性体と混合して、本発明の存在において使用されるか、またはそれらから得られ得る。しかしながら好ましくは、適用および／または産生される化合物は、本質的に立体異性的に純粋な形態で使用および／または単離される。
【０１０９】
基本的な化学化合物の構造式、その化学名、および略語は、以下の表において一覧される：
【０１１０】
【表１】
0006694871.tif 000014
【０１１１】
【表２】
0006694871.tif 000015
【０１１２】
【表３】
0006694871.tif 000016
【０１１３】
２．  タンパク質
本発明は、７β−ＨＳＤＨ、ＦＤＨ、ＧＤＨ、または３α−ＨＳＤＨ活性をもつ具体的に開示されたタンパク質または酵素、および／またはそれらの変異体に限定されず、むしろそれらの機能的等価物にも及ぶ。
【０１１４】
具体的に開示された酵素の「機能的等価物」または類似体は、本出願では、前者とは異なるが、なお所望の生物活性、例えば７β−ＨＳＤＨ活性を保持するポリペプチドである。
【０１１５】
したがって例えば、「機能的等価物」という表現は、用いた７β−ＨＳＤＨ、ＦＤＨ、ＧＤＨ、または３α−ＨＳＤＨ活性試験において、本明細書に定義されたアミノ酸配列を含む出発酵素よりも、少なくとも１％まで、例えば少なくとも１０％または２０％、例えば少なくとも５０％または７５％または９０％高いか低い活性をもつ酵素を意味するものと理解される。
【０１１６】
機能的等価物はさらに、好ましくはｐＨ４〜１１の間で安定であり、かつ有利にはｐＨ６〜１０、例えば、とりわけ８．５〜９．５の範囲内に最適ｐＨを、また１５℃〜８０℃、または２０℃〜７０℃、例えば約４５〜６０℃、または５０〜５５℃の範囲内に最適温度をもつ。
【０１１７】
７β−ＨＳＤＨ活性は、種々の公知の試験により検出され得る。これらに限定されるものではないが、試験は、実験のセクションにおいて記載されたような標準的な条件下で、参考基質、例えばＣＡまたはＤＨＣＡを用いる試験が挙げられる。
【０１１８】
ＦＨＤ、ＧＤＨ、７β−ＨＳＤＨ、または３α−ＨＳＤＨ活性を測定するための試験は、同様にそれ自体が公知である。
【０１１９】
「機能的等価物」という表現は、本発明によれば、特にまた、前述のアミノ酸配列の少なくとも１つの配列位置において、具体的に言及されたものとは異なるアミノ酸をもちながらも、前述の生物活性の１つを保持する「変異体」を意味するものとも理解される。それ故、「機能的等価物」は、１つ以上の、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のアミノ酸の付加、置換、欠失、および／または逆位によって得られた変異体を含み、前述の改変は、それらが本発明の特性プロフィールをもつ変異体をもたらす限り任意の配列位置において起こり得る。機能的等価物は、特にまた、変異体と未改変ポリペプチドとの間で反応性のパターンが定性面で一致する場合、すなわち、例えば同じ基質が異なる速度で変換される場合にも存在する。適切なアミノ酸置換の例は、以下の表に要約される：
【０１２０】
【表４】
0006694871.tif 000017
【０１２１】
上記の意味での「機能的等価物」はまた、上記記載のポリペプチドの「前駆体」、ならびにポリペプチドの「機能的誘導体」および「塩」でもある。
【０１２２】
これに関連して、「前駆体」は、所望の生物活性をもつかまたはもたない、ポリペプチドの天然または合成の前駆体である。
【０１２３】
「塩」という表現は、本発明のタンパク質分子の、カルボキシル基の塩のみならず、またアミノ基の酸付加塩も意味するものと理解される。カルボキシル基の塩は、それ自体が公知の方法で調製可能であり、また無機塩、例えばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄、および亜鉛の塩、ならびに有機塩基、例えばアミド、例えばトリエタノールアミン、アルギニン、リジン、ピペリジンなどとの塩を含む。酸付加塩、例えば、塩酸または硫酸などの無機酸との塩、ならびに、酢酸およびシュウ酸などの有機酸との塩もまた、同様に本発明の対象である。
【０１２４】
本発明のポリペプチドの「機能性誘導体」はまた、公知の技術を用いて、機能性アミノ酸側基上において、またはそのＮ−もしくはＣ−末端において産生され得る。かかる誘導体は、例えばカルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアまたは第一級もしくは第二級アミノ基との反応によって取得可能な、カルボキシル基のアミド；アシル基との反応により調製される、遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体；またはアシル基との反応により調製される、Ｏ−アシル誘導体遊離ヒドロキシル基を含む。
【０１２５】
当然ながら、「機能的等価物」はまた、他の生物体から利用可能なポリペプチド、および天然産の変異体も含む。例えば、配列比較を用いて相同配列領域を領域決定し、同等の酵素が本発明の具体的な要件に基づき確立され得る。
【０１２６】
同様に「機能的等価物」は、例えば、所望の生物学的機能をもつ、本発明のポリペプチドのフラグメント、好ましくは個々のドメイン、または配列モチーフを含む。
【０１２７】
「機能的等価物」はさらに、融合タンパク質であり、これは、前述のポリペプチド配列の１つまたはそれに由来する機能的等価物、およびそれとは機能的に異なる少なくとも１つの別の異種配列を、機能性Ｎ−またはＣ−末端結合において有する（すなわち、融合タンパク質部分の有意な相互の機能的障害はない）。かかる異種配列の非限定的例は、例えばシグナルペプチド、ヒスチジンアンカー、または酵素である。
【０１２８】
本発明による「機能的等価物」はまた、具体的に開示されたタンパク質の相同体を含む。これらは、具体的に開示されたアミノ酸配列の１つに対し、Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad, Sci. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448のアルゴリズムによって計算された、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、とりわけ少なくとも８５％、例えば９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の相同性（または同一性）をもつ。本発明による相同ポリペプチドのパーセント相同性または同一性は、特に、本明細書において具体的に記載されたアミノ酸配列の１つの全長に対する、アミノ酸基のパーセント同一性を意味する。
【０１２９】
パーセント同一性のデータはまた、ＢＬＡＳＴアラインメント、アルゴリズムｂｌａｓｔｐ（タンパク質−タンパク質ＢＬＡＳＴ）の使用により、または以下に明記されるＣｌｕｓｔａｌ設定を用いることにより決定され得る。
【０１３０】
タンパク質のグリコシル化の可能性がある場合、本発明による「機能的等価物」は、上記で特定したタイプのタンパク質の脱グリコシル化またはグリコシル化型、およびグリコシル化パターンの変更により得られた改変型を含む。
【０１３１】
本発明によるタンパク質またはポリペプチドの相同体は、突然変異誘発により、例えば点突然変異、タンパク質の延長またはトランケーションにより産生され得る。
【０１３２】
本発明によるタンパク質の相同体は、トランケーション変異体などの、変異体のコンビナトリアルライブラリのスクリーニングにより同定され得る。例えば、タンパク質変異体の変化に富むライブラリが、核酸レベルでのコンビナトリアルな突然変異誘発により、例えば合成オリゴヌクレオチド混合物の酵素的連結により生成され得る。縮重オリゴヌクレオチド配列から可能性のある相同体のライブラリを生成するために使用可能な、数多くのプロセスがある。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動ＤＮＡシンセサイザにおいて実施され得、そして合成遺伝子は次に、適切な発現ベクターへ連結され得る。縮重遺伝子セットの使用により、可能性のあるタンパク質配列の所望のセットをコードする、全ての配列を１つの混合中に提供することが可能となる。縮重オリゴヌクレオチドの合成法は、当業者に公知である（例えば、 Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11:477）。
【０１３３】
先行技術においては、点突然変異またはトランケーションにより生成されたコンビナトリアルライブラリの遺伝子産物をスクリーンするための、また選択された特性をもつ遺伝子産物用のｃＤＮＡライブラリをスクリーンするための、多様な技術が知られている。これらの技術は、本発明による相同体のコンビナトリアル突然変異誘発により生成された遺伝子ライブラリの、迅速なスクリーニングに適用され得る。ハイスループット分析を受けた大きい遺伝子ライブラリのスクリーニングに最も頻繁に使用される技術は、複製可能な発現ベクターへ遺伝子ライブラリをクローニングすること、得られたベクターライブラリを用いて適切な細胞を形質転換すること、および、その下での所望の活性の検出がその産物が検出された遺伝子をコードするベクターの分離を促進する条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現することを含む。ライブラリ中の機能的変異体の頻度を拡大する技術、再帰的アンサンブル突然変異誘発（ＲＥＭ）をスクリーニングテストと組合せて、相同体を同定するために使用できる（Arkin and Yourvan (1992) PNAS 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331）。
【０１３４】
本発明はさらに、本明細書において特に参照される、本出願者のＷＯ２０１１/０６４４０４に記載されたような、Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ  ＡＴＣＣ  ２５９８６由来の７β−ＨＳＤＨ野生型の使用も含む。
【０１３５】
この７β−ＨＳＤＨは、Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ  ＤＳＭ  ３９７９から取得可能であり、特に、少なくとも１つの以下の特性により、例えば２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つ、あるいはかかる全ての特性により特性評価される：
ａ）分子量（ＳＤＳゲル電気泳動）：約２８〜３２ｋＤａ、特に約２９〜３１ｋＤａ、または約３０ｋＤａ；
ｂ）分子量（未変性条件下、例えば特にＳＤＳなしでのゲル濾過）：約５３〜６０ｋＤａ、特に約５５〜５７ｋＤａ、例えば５６．１ｋＤａ。このことは、Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ  ＤＳＭ  ３９７９  ７β−ＨＳＤＨの二量体の性質を立証する；
ｃ）７−ケト−ＬＣＡの７−カルボニル基の７β−ヒドロキシ基への立体選択的還元；
ｄ）ｐＨ８．５〜１０．５、特に９〜１０の範囲における、ＵＤＣＡの酸化のための最適ｐＨ；
ｅ）ｐＨ３．５〜６．５、特にｐＨ４〜６の範囲における、ＤＨＣＡおよび７−ケト−ＬＣＡの還元のための最適ｐＨ；
ｆ）以下の表からの、そこに列記された少なくとも１つの基質／補因子についての、少なくとも１つの動的パラメータ；以下の表において、いずれの場合も具体的に挙げた値から±２０％、特に±１０％、±５％、±３％、±２％、または±１％の付近の範囲。
【０１３６】
【表５】
0006694871.tif 000018
【０１３７】
ｇ）原核生物Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ  ＤＳＭ  ３９７９  ７β−ＨＳＤＨの、モルモット（Ｃａｖｉａ  Ｐｏｒｃｅｌｌｕｓ）、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、およびハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｕｌｕｓ）を含む、動物の１１β−ＨＳＤＨ亜群との系統発生学的な配列関係。
【０１３８】
例えば、この７β−ＨＳＤＨは、以下の特性または特性の組合せを示す：ａ）；ｂ）；ａ）およびｂ）；ａ）および／またはｂ）およびｃ）；ａ）および／またはｂ）およびｃ）およびｄ）；ａ）および／またはｂ）およびｃ）およびｄ）およびｅ）；ａ）および／またはｂ）およびｃ）およびｄ）およびｅ）およびｆ）。
【０１３９】
かかる７β−ＨＳＤＨまたはそれから派生する機能的等価物は、さらに、
ａ．  ７−ケトステロイドを、対応する７β−ヒドロキシステロイドへ立体特異的に還元すること；および／または
ｂ．  ７位にケト基を、および少なくとも１つのさらなるケト基をステロイド骨格上に含むケトステロイドを、対応する７β−ヒドロキシステロイドを生じるべく、例えば特に、デヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）を、対応する３，１２−ジケト−７β−コール酸を生じるべく、７位において、位置特異的にヒドロキシル化すること、触媒作用を及ぼすこと、および、例えばＮＡＤＰＨ依存性であること、
によって特徴づけられる。
【０１４０】
かかる７β−ＨＳＤＨは、特に、配列番号２（寄託番号  ＮＯ：ＺＰ ０１７７３０６１）によるアミノ酸配列、またはこの配列に対し少なくとも６０％、例えば少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、または９０％、例えば少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または９９．５％の同一性の程度をもってそれから派生した配列を有し；任意で、以下の特性の１つまたは特性の組合せ：上記の定義による、ａ）；ｂ）；ａ）およびｂ）；ａ）および／またはｂ）およびｃ）；ａ）および／またはｂ）およびｃ）およびｄ）；ａ）および／またはｂ）およびｃ）およびｄ）およびｅ）；ａ）および／またはｂ）およびｃ）およびｄ）およびｅ）およびｆ）、によりさらに特徴づけられる。
【０１４１】
３．核酸および構築物
３．１  核酸
本発明はまた、７β−ＨＳＤＨ、ＦＤＨ、ＧＤＨ、および／または３α−ＨＳＤＨ活性をもつ酵素、及びその変異体をコードする、核酸配列も対象とする。
【０１４２】
本発明はまた、本明細書に記載された具体的な配列に対し一定程度の同一性をもつ核酸にも関する。
【０１４３】
２つの核酸間の「同一性」は、いずれの場合も核酸の全長に対するヌクレオチドの同一性、特にＩｎｆｏｒｍａｘ社（ＵＳＡ）からのＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ｓｕｉｔｅ  ７．１ソフトウェアを利用して、Ｃｌｕｓｔａｌ法（Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr;5(2):151-1）を適用することにより、以下のパラメータを設定して比較することにより計算される同一性を意味するものと理解される：
マルチプルアラインメントパラメータ：
ギャップオープニングペナルティ  １０
ギャップエクステンションペナルティ  １０
ギャップセパレーションペナルティ範囲  ８
ギャップセパレーションペナルティ  オフ
アラインメント遅延のための％同一性  ４０
残基特異的ギャップ  オフ
親水性残基ギャップ  オフ
トランジション重み付け  ０
ペアワイズアラインメントパラメータ：
ＦＡＳＴアルゴリズム  オン
ｋ−ｔｕｐｌｅサイズ  １
ギャップペナルティ  ３
ウィンドウサイズ  ５
ベストダイアゴナル数  ５
【０１４４】
これに代えて、同一性はまた、Chenna, Ramu, Sugawara, Hideaki, Koike, Tadashi, Lopez, Rodrigo, Gibson, Toby J, Higgins, Desmond G, Thompson, Julie D. Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. (2003) Nucleic Acids Res 31 (13):3497-500, インターネットアドレス: http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html#
に従い、かつ以下のパラメータを用いて決定し得る：
ＤＮＡギャップオープンペナルティ  １５．０
ＤＮＡギャップエクステンションペナルティ  ６．６６
ＤＮＡマトリック  アイデンティティ
タンパク質ギャップオープンペナルティ  １０．０
タンパク質ギャップエクステンションペナルティ  ０．２
タンパク質マトリックス  Ｇｏｎｎｅｔ
タンパク質／ＤＮＡ  ＥＮＤＧＡＰ  −１
タンパク質／ＤＮＡ  ＧＡＰＤＩＳＴ  ４
【０１４５】
本明細書に述べられた全ての核酸配列（例えばｃＤＮＡおよびｍＲＮＡなどの、一本鎖および二本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ配列）は、ヌクレオチド構成単位から出発する化学合成により、例えば二重らせんの、個々の重複する相補的核酸構成単位のフラグメント縮合により、それ自体が公知の方法で産生され得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、ホスホアミド法（Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pages 896-897）に従い、公知の方法で化学的に合成され得る。ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片によるおよび連結反応による、合成オリゴヌクレオチドのアセンブリおよびギャップ充填、ならびに一般クローニング法は、Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている。
【０１４６】
発明の対象はまた、任意の上記のポリペプチドをそれらの機能的等価物においてコードする核酸配列（例えばｃＤＮＡおよびｍＲＮＡなどの、一本鎖および二本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ配列）であり、これらは例えば人工のヌクレオチド類似体を用いて調製され得る。
【０１４７】
本発明は、本発明のポリペプチドもしくはタンパク質、またはその生物活性部分をコードする単離された核酸分子と、および、例えば本発明のコード核酸の同定もしくは増幅のためのハイブリダイゼーションプローブもしくはプライマーとしての用途に使用され得る核酸フラグメントとの双方に関する。
【０１４８】
本発明の核酸分子はさらに、コード遺伝子領域の３´および／または５´末端からの非翻訳配列を含み得る。
【０１４９】
本発明はさらに、具体的に記載されたヌクレオチド配列またはその断片に対し、相補性である核酸分子を含む。
【０１５０】
本発明のヌクレオチド配列は、他の細胞タイプおよび生物体における相同配列の同定および／またはクローニングのために使用可能な、プローブおよびプライマーの産生を可能にする。かかるプローブおよびプライマーは、通常、「ストリンジェント」な条件下（以下を参照）で、本発明の核酸配列のセンス鎖の、または対応するアンチセンス鎖の、少なくとも約１２、好ましくは少なくとも約２５、例えば約４０、５０、または７５個の連続したヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含む。
【０１５１】
「単離された」核酸分子は、該核酸の天然の供給源に存在する他の核酸分子から分離され、またさらに、それが組換え技術により産生される場合には、他の細胞性物質もしくは培地を本質的に含まないか、またはそれが化学合成される場合には、化学的前駆体または他の化学物質を含まなくてもよい。
【０１５２】
本発明の核酸分子は、標準的な分子生物学の技術と、および本発明により提供された配列情報とにより単離してもよい。例えばｃＤＮＡは、具体的に開示された完全な配列またはそのセグメントの１つをハイブリダイゼーションプローブとして用いること、および標準的なハイブリダイゼーション技術（例えば、Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載されたような）を用ることにより、適当なｃＤＮＡライブラリから単離してもよい。さらに、開示された任意の配列またはその断片の１つを含む核酸分子は、この配列に基づき構築されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応により単離してもよい。この方法で増幅された核酸は、適当なベクター内へクローン化されて、ＤＮＡ配列分析により特性評価され得る。さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは、標準的な合成法により、例えば自動ＤＮＡシンセサイザを用いて産生可能である。
【０１５３】
本発明の核酸配列またはその誘導体、相同体、またはこれらの配列の一部は、他の細菌から、例えば通常のハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ技術を用いて、例えばゲノムまたはｃＤＮＡライブラリを介して単離してもよい。これらのＤＮＡ配列は、標準的な条件下で、本発明の配列とハイブリダイズする。
【０１５４】
「ハイブリダイズすること」は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが、標準的な条件下で、ほぼ完全に相補的な配列に結合する能力を意味するものと理解されるが、これらの条件下では、非相補的な相手との間の非特異的結合は起こらない。このため、配列は９０〜１００％の相補性であり得る。相補的配列が互いに特異的に結合する特性は、例えば、ノーザンもしくはサザンブロット技術において、またはＰＣＲもしくはＴＲ−ＰＣＲにおけるプライマー結合において活用される。
【０１５５】
ハイブリダイゼーションには、保存領域の短いオリゴヌクレオチドが有利に使用される。しかしながら、本発明の核酸のより長いフラグメントまたは完全配列を、ハイブリダイゼーションに使用することもできる。用いる核酸（オリゴヌクレオチド、より長いフラグメント、または完全配列）に依存して、あるいはどの核酸型、ＤＮＡまたはＲＮＡ、がハイブリダイゼーションに使用されるかに依存して、これらの標準的な条件は異なってくる。したがって例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの融点は、同じ長さのＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのものよりも約１０℃低い。
【０１５６】
核酸に依存して、標準的な条件は、例えば０．１〜５ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）の間の濃度をもつ緩衝水溶液中では４２〜５８℃の間、またはさらに、５０％ホルムアミドの存在下では、例えば５ｘＳＳＣ、５０％ホルムアミド中では例えば４２℃の温度を意味するものと理解される。有利には、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのためのハイブリダイゼーション条件は、０．１ｘＳＳＣ、および約２０℃〜４５℃の間、好ましくは約３０℃〜４５℃の間の温度である。ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドについては、ハイブリダイゼーション条件は、有利には０．１ｘＳＳＣ、および約３０℃〜５５℃の間、好ましくは約４５℃〜５５℃の間の温度である。ハイブリダイゼーションについて示されたこれらの温度は、例として、ホルムアミド不在下で、約１００ヌクレオチド長と、５０％のＧ＋Ｃ含量とをもつ核酸について計算された融解温度の値である。ＤＮＡハイブリダイゼーションのための実験条件は、関連する遺伝学の専門家の教科書、例えばSambrook et al., “Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989に記載されており、また当業者に公知の式を用いて、例えば核酸の長さ、ハイブリッドのタイプ、またはＧ＋Ｃ含量の関数として計算され得る。当業者は、ハイブリダイゼーションについてのさらなる情報を以下の教科書から得てもよい：Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
【０１５７】
「ハイブリダイゼーション」は、特にストリンジェントな条件下で起こり得る。かかるハイブリダイゼーション条件は、例えばSambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., in: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pages 9.31-9.57、または Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.に記載されている。
【０１５８】
「ストリンジェント」なハイブリダイゼーション条件とは、特に以下の：５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１０％デキストラン硫酸、および２０ｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡからなる溶液中での、４２℃で一晩のインキュベーションと、それに続く０．１ｘＳＳＣを用いた６５℃におけるフィルタの洗浄工程、を意味するものとして理解される。
【０１５９】
本発明の対象はまた、具体的に開示されたかまたは誘導可能な核酸配列の誘導体である。
【０１６０】
それ故、本発明のさらなる核酸配列は、例えば、配列番号１、３、または１０から派生され得、かつそれらとは単一または数個のヌクレオチドの付加、置換、挿入、または欠失により異なるが、なお所望の特性プロフィールをもつポリペプチドをコードする。
【０１６１】
また本発明に含まれるのは、「サイレント」変異を含むか、または特定の起源生物または宿主生物のコドン利用により、具体的に挙げた配列と比較して改変された、核酸配列であり、その天然産変異体、例えばスプライス変異体またはアレル変異体も同様である。
【０１６２】
別の対象は、保存的ヌクレオチド置換（すなわち、当該アミノ酸が、同じ電荷、サイズ、極性および／または溶解度のアミノ酸で置き換えられる）により得られる配列である。
【０１６３】
本発明の対象はまた、具体的に開示された核酸から配列多型により派生された分子である。これらの遺伝的多型は、自然変動の結果として集団内の個体間に存在し得る。これらの自然変動は、通常、遺伝子のヌクレオチド配列中に１〜５％の変動を引き起こす。
【０１６４】
本発明の核酸配列の誘導体、および配列番号１、３、または１０をもつものは、例えば、演繹されたアミノ酸レベルにおいて、全配列領域に対し少なくとも６０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％の相同性、非常に特別に好ましくは少なくとも９０％の相同性を有するアレル変異体を意味するものと理解される（アミノ酸レベルにおける相同性についは、ポリペプチドに関する上記のコメントを参照）。有利には、相同性は配列の部分領域にわたり、高くなってもよい。
【０１６５】
さらに、誘導体はまた、本発明の核酸配列の、特に配列番号１、３、または１０の相同体、例えば真菌もしくは細菌相同体、トランケートされた配列、またはコードおよび非コードＤＮＡ配列の一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを意味するものと理解される。したがって例えば、配列番号１、３、または１０の相同体は、配列番号１、３、または１０において特定された全ＤＮＡ領域にわたり、ＤＮＡレベルで少なくとも４０％、好ましくは少なくとも６０％、特に好ましくは少なくとも７０％、非常に特別に好ましくは少なくとも８０％の相同性をもつ。
【０１６６】
さらに、誘導体は、例えばプロモーターとの融合体を意味するものと理解される。示したヌクレオチド配列の上流に位置するプロモーターは、少なくとも１つのヌクレオチド置換、少なくとも１つの挿入、逆位、および／または欠失により改変されていてもよいが、しかしプロモーターの機能性および有効性が損なわれることはない。さらに、プロモーターの有効性は、それらの配列を改変することにより増大されてもよく、あるいはプロモーターは他種の生物体由来のプロモーターを含むより活性の高いプロモーターで完全に置き換えられてもよい。
【０１６７】
さらに、当業者は機能性変異体を産生するためのプロセスを熟知している。
【０１６８】
用いた技術に依存して、当業者は、完全にランダムかまたはより特定的な変異を、遺伝子または非コード核酸領域（例えば発現を調節するのに重要な領域）内へ導入し、次いで遺伝子ライブラリを産生し得る。このために必要な分子生物学的方法は、当業者には公知であり、かつ例えば、Sambrook and Russell, Molecular Cloning. 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001に記載されている。
【０１６９】
遺伝子を改変するため、およびそれ故、それらによりコードされたタンパク質を改変するための方法は、当業者には長年にわたり熟知されており、例えば以下の通りである：
−遺伝子の単一または数個のヌクレオチドが特異的に置換される、部位特異的突然変異誘発（Trower MK (Ed.) 1996; In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey）、
−遺伝子の任意の所望の位置において任意の所望のアミノ酸のためのコドンが置換または付加される、飽和突然変異（Kegler-Ebo DM, Docktor CM, DiMaio D (1994) Nucleic Acids Res 22:1593; Barettino D, Feigenbutz M, Valcarel R, Stunnenberg HG (1994) Nucleic Acids Res 22:541; Barik S (1995) Mol Biotechnol 3:1）、
−不適切に動作するＤＮＡポリメラーゼによりヌクレオチド配列が変異される、エラープローンポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Eckert KA, Kunkel TA (1990) Nucleic Acids Res 18:3739）、
−例えば、欠陥のあるＤＮＡ修復メカニズムのためヌクレオチド配列の変異率の増加が起こる、突然変異誘発株における遺伝子の継代（Greener A, Callahan M, Jerpseth B (1996) An efficient random mutagenesis technique using an E.coli mutator strain. In: Trower MK (Ed.) In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey）、または
−密に関連した遺伝子のプールが形成され消化されて、フラグメントがポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として使用され、これにおいて最終的に完全長のモザイク遺伝子が、反復する鎖分離および再アニーリングにより産生される、ＤＮＡシャフリング（Stemmer WPC (1994) Nature 370:389; Stemmer WPC (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:10747）。
【０１７０】
いわゆる定向進化（特に、Reetz MT and Jaeger K-E (1999), Topics Curr Chem 200:31; Zhao H, Moore JC, Volkov AA, Arnold FH (1999), Methods for optimizing industrial enzymes by directed evolution, In: Demain AL, Davies JE (Ed.) Manual of industrial microbiology and biotechnology. American Society for Microbiologyに記載）を用いて、当業者はまた機能性変異体を、標的化された方法で、かつまた大規模に産生できる。ここで、それぞれのタンパク質の遺伝子ライブラリが最初の工程で生成され、これらの遺伝子ライブラリは、例えば上記で特定された方法を用いてセットアップされ得る。遺伝子ライブラリは、適当な方法で、例えば、細菌によるかまたはファージディスプレイシステムにより発現される。
【０１７１】
所望の特性に大部分一致する特性をもつ機能性変異を発現する、宿主生物体の関連遺伝子は、さらなる突然変異サイクルに供され得る。突然変異および選別もしくはスクリーニングの工程は、存在する機能性変異体が所望の特性を充分な程度に示すまで、繰り返し反復され得る。この反復性のアプローチにより、限られた数の突然変異、例えば１〜５個の突然変異が段階的に産生され得、関連する酵素特性に対するそれらの影響が評価および選別され得る。選別された変異体は、次に、同じ方法で更なる突然変異工程に供され得る。この方法で、調べるべき個々の変異体の数を有意に減らすことが可能である。
【０１７２】
本発明による結果はまた、当該酵素の構造および配列について重要な情報をもたらし、この酵素が、所望の改変された特性をもつさらなる酵素を、標的化された方法で産生するのに必要である。特に、いわゆる「ホットスポット」、すなわち標的化された突然変異の導入により酵素特性を改変するのに適する可能性のある配列部分、を規定できる。
【０１７３】
３．２  構築物
本発明の対象はさらに、調節核酸配列の遺伝子制御下に、本発明の少なくとも１つのポリペプチドをコードする核酸配列を含有する、発現構築物；およびこれらの発現構築物の少なくとも１つを含むベクターである。
【０１７４】
本発明によれば、「発現ユニット」は、発現活性をもつ核酸を意味するものと理解され、これは、本明細書で定義されたようなプロモーターを含み、かつこれは、発現されるべき核酸または遺伝子との機能的連結の後、前記核酸または前記遺伝子の発現、すなわち転写および翻訳を調節する。このことが、本明細書において、発現ユニットが「調節核酸配列」とも称される理由である。プロモーターに加えて、例えばエンハンサーなどのさらなる調節エレメントも存在し得る。
【０１７５】
本発明によれば、「発現カセット」または「発現構築物」は、発現されるべき核酸または発現されるべき遺伝子に、機能的に連結された発現ユニットを意味するものと理解される。それ故、発現ユニットとは対照的に、発現カセットは転写および翻訳を調節する核酸配列のみならず、転写および翻訳の結果タンパク質として発現されるべき核酸配列も含む。
【０１７６】
本発明に関しては、用語「発現」または「過剰発現」は、対応するＤＮＡによってその酵素がコードされている微生物体における、１つ以上の酵素の細胞内活性の産生または増大を記載する。この目的を達成するためには、例えば、遺伝子が生物体内へ導入されるか、既存の遺伝子が異なる遺伝子で置き換えられるか、遺伝子もしくは複数の遺伝子のコピー数が増大されるか、強力なプロモーターが使用されるか、または高い活性をもつ対応する酵素をコードする遺伝子の使用が可能であり、かつ任意でこれらの方策を組合せてもよい。
【０１７７】
好ましくは、本発明によるかかる構築物は、プロモーターを上流に、すなわち特定のコーディング配列の５´末端に、およびターミネーター配列を下流に、すなわち３´末端に、並びに任意で、さらなる通常の調節エレメントを含み、いずれの場合もこれらはコーディング配列に動作的に連結される。
【０１７８】
本発明によれば、「プロモーター」、「プロモーター活性をもつ核酸」、または「プロモーター配列」は、転写されるべき核酸との機能的連結において、前記核酸の転写を調節する核酸を意味するものと理解される。
【０１７９】
これに関連して、「機能的」または「動作的」な連結とは、例えば、プロモーター活性をもつ核酸の１つと、転写されるべき核酸配列と、および任意でさらなる調節エレメント、例えば核酸の転写を保証する核酸配列、および例えばターミネーターとが、それぞれの調節エレメントが核酸配列の転写において意図された通りにその機能を果たすことが可能なような様式で、連続的に配置されることを意味するものと理解される。これについては、化学的意味での直接的な結合が絶対に必要というわけではない。例えばエンハンサー配列などの遺伝子調節配列はまた、標的配列に対するそれらの機能をより離れた位置から、または別のＤＮＡ分子からでも及ぼし得る。転写されるべき核酸配列がプロモーター配列の後ろに（すなわちその３´末端に）位置して、２つの配列が互いに共有結合されるようにする配列が好ましい。これに関連して、プロモーター配列と、組換えにより発現されるべき核酸配列との間の距離は、２００塩基対未満、または１００塩基対未満、または５０塩基対未満でよい。
【０１８０】
プロモーターおよびターミネーターの他に挙げられるさらなる調節エレメントの例は、標的化配列、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、選択マーカー、増幅シグナル、複製開始点などである。適当な調節配列は、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている。
【０１８１】
本発明による核酸構築物は、特に、配列番号１、３、または１０、あるいはその誘導体および相同体、およびそれらから派生され得る核酸配列を含み、これらは有利には、遺伝子発現を制御するため、例えば増大するための１つ以上の調節シグナルに、動作的または機能的に連結されている。
【０１８２】
こうした調節配列に加えて、これらの配列の天然の調節がなお実際の構造遺伝子の上流に存在し、かつ任意で、天然の調節がオフにされて遺伝子の発現が増大されるように遺伝的に改変されていてもよい。しかしながら核酸構築物はまた、より単純なデザインを有してもよく、すなわち、何ら追加の調節シグナルもコーディング配列の上流には挿入されず、かつ天然のプロモーターはその調節とともに除去されていない。代わりに、天然の調節配列は、調節がもはや起こらず遺伝子発現が増大するように突然変異される。
【０１８３】
好ましい核酸構築物は、有利にはまた、プロモーターへ機能的に連結され、かつ核酸配列の増大された発現を可能にする、１つ以上の前述の「エンハンサー」配列も含む。さらなる有利な配列、例えばさらなる調節エレメントまたはターミネーターもまた、ＤＮＡ配列の３´末端において挿入され得る。本発明の核酸は、構築物中に１つ以上のコピーで存在し得る。構築物はさらに、任意で構築物を選択するためのさらなるマーカー、例えば抗生物質耐性または栄養要求性を補充する遺伝子を含有してもよい。
【０１８４】
適切な調節配列の例は、グラム陰性菌において有利に使用される、ｃｏｓ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ｔｅｔ、ｔｒｐ−ｔｅｔ、ｌｐｐ、ｌａｃ、ｌｐｐ−ｌａｃ、ｌａｃＩｑ、Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ、ｒｈａＰ（ｒｈａＰＢＡＤ）ＳＰ６、ラムダ−ＰＲ−などのプロモーター中に、またはラムダ-ＰＬ プロモーター中に存在する。他の有利な調節配列は、例えばグラム陽性菌プロモーター、ａｍｙおよび ＳＰＯ２中に、酵母または真菌プロモーター ＡＤＣ１、 ＭＦａｌｐｈａ、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ、ＴＥＦ、ｒｐ２８ およびＡＤＨ中に存在する。人工的なプロモーターもまた、調節目的に使用され得る。
【０１８５】
宿主生物体における発現のためには、核酸構築物は有利には、宿主における遺伝子の最適な発現を可能にする、例えばプラスミドまたはファージなどのベクター内へ挿入される。プラスミドおよびファージに加えて、ベクターはまた当業者には公知の全ての他のベクター、例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、バキュロウイルス、およびアデノウィルスなどのウイルス、トランスポゾン、ＩＳエレメント、ファスミド、コスミド、および直鎖もしくは環状ＤＮＡを意味するものと理解される。これらのベクターは、宿主生物体内で自律的に複製するか、または染色体的に複製され得る。これらのベクターは、本発明のさらなる発展を構成する。
【０１８６】
適切なプラスミドの例は、例えば大腸菌におけるｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＨＥ１９．２、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ−ＩＩＩ１１３−Ｂ１, λｇｔ１１、または ｐＢｄＣＩ、ストレプトマイセスにおけるｐＩＪ１０１、ｐＩＪ３６４、ｐＩＪ７０２、またはｐＩＪ３６１、バチルスにおけるｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４、またはｐＢＤ２１４、コリネバクテリウムにおけるｐＳＡ７７、またはｐＡＪ６６７、真菌におけるｐＡＬＳ１、ｐＩＬ２、または ｐＢＢ１１６、酵母における２ａｌｐｈａＭ、ｐＡＧ−１、ＹＥｐ６、ＹＥｐ１３、またはｐＥＭＢＬＹｅ２３、あるいは植物におけるｐＬＧＶ２３、ｐＧＨｌａｃ＋、ｐＢＩＮ１９、ｐＡＫ２００４、またはｐＤＨ５１である。列挙されたプラスミドは、可能なプラスミドを小規模に選んだものである。さらなるプラスミドが当業者には周知であり、例えば、書籍Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) に見出し得る。
【０１８７】
ベクターのさらなる実施形態においては、本発明の核酸構築物または本発明の核酸を含むベクターはまた、有利には、直鎖ＤＮＡの形態で微生物内へ導入され、かつ異種組換えまたは同種組換えにより、宿主生物のゲノム内へインテグレートされ得る。この直鎖ＤＮＡは、直鎖化されたベクター、例えばプラスミドから、または単に本発明の核酸構築物もしくは核酸のみから構成され得る。
【０１８８】
生物体において異種遺伝子を最適に発現するためには、該生物体において使用される特異的な「コドン使用」に従って核酸配列を改変することが有利である。「コドン使用」は、当該生物体の他の既知の遺伝子のコンピュータ分析を用いて容易に決定できる。
【０１８９】
本発明による発現カセットは、適当なプロモーターを、適当なコードヌクレオチド配列へ、およびターミネーターまたはポリアデニル化シグナルへ融合することにより産生される。一般的な組換えおよびクローニング技術が、このために使用され、例えば、T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) において、および T.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) において、および Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) において記載されている。
【０１９０】
適当な宿主生物体における発現目的には、組換え核酸構築物または遺伝子構築物は、有利には、宿主における遺伝子の最適発現を可能にする宿主特異的ベクター内へ挿入される。ベクターは、当業者に周知であり、例えば、”Cloning Vectors” (Pouwels P. H. et al., Eds., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) に見出し得る。
【０１９１】
４．  微生物
状況に応じて、用語「微生物」は、出発（野生型）微生物、もしくは遺伝的に改変された組換え微生物、または双方を意味するものと理解される。
【０１９２】
本発明のベクターにより、組換え微生物を調製することが可能であり、これらは例えば、本発明の少なくとも１つのベクターを用いて形質転換され、かつ本発明のポリペプチドを産生するために使用され得る。有利には、本発明による上記記載の組換え構築物は、適当な宿主系内へ導入され、かつそこで発現される。これに関連して、当業者には周知の熟知されたクローニングおよびトランスフェクション法、例えば共沈、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクションなどが、好ましくは前記核酸を特定の発現系において発現させるために使用される。適当な系は、例えば、Current Protocols in Molecular Biology,  F. Ausubel et al., Eds., Wiley Interscience, New York 1997, または Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edn., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 に記載されている。タンパク質の異種発現のための細菌の発現系についての概説はまた、例えば、Terpe, K. Appl. Microbiol. Biotechnol. (2006) 72: 211-222 により提供されている。
【０１９３】
本発明の核酸または核酸構築物のための組換え宿主生物は、原則的には全ての原核生物または真核生物である。宿主生物としては、細菌、真菌、または酵母などの微生物を用いることが有利である。グラム陽性またはグラム陰性細菌、好ましくは、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ、またはＮｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ科の細菌、特に好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、 Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、または Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌を用いることが有利である。非常に好ましいのは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉの属および種である。さらなる有利な細菌は、アルファプロテオバクテリア、ベータプロテオバクテリア、またはガンマプロテオバクテリアの群においてさらに見出し得る。
【０１９４】
本明細書では、本発明の宿主生物体または複数の宿主生物体は、好ましくは、本明細書に記載され、かつ上記に定義された通りの７β−ＨＳＤＨ活性をもつ酵素をコードする、少なくとも１つの核酸配列、核酸構築物、またはベクターを含む。
【０１９５】
宿主生物体に依存して、本発明のプロセスにおいて使用される生物体は、当業者に公知の方法で増殖または培養される。原則として微生物は、通常は糖の形態にある炭素源、通常は酵母抽出物などの有機窒素源または硫酸アンモニウムなどの塩の形態にある、窒素源、鉄、マンガン、およびマグネシウムの塩などの微量元素、および任意にビタミンを含む液体培地中で、０℃と１００℃の間、好ましくは１０℃と６０℃の間の温度において、酸素を通気して増殖される。液体培地のｐＨは一定に保持されてもよく、すなわち培養中に調節されるか、またはされなくてもよい。培養は、バッチ式、半バッチ式、または連続式に実施され得る。栄養物は、発酵開始時に与えられるか、または半連続的または連続的に与えられてもよい。
【０１９６】
５．ＵＤＣＡの産生
第１工程：ＣＡのＤＨＣＡへの化学的変換
ＣＡのヒドロキシル基は、クロム酸または酸性溶液（例えばＨ２ＳＯ４）中のクロム酸塩を用いて、従来の化学的経路により、それ自体が公知の方法でカルボニル基へ酸化される。この結果としてＤＨＣＡを生じる。
【０１９７】
第２工程：ＤＨＣＡの１２−ケト−ＵＤＣＡへの酵素的または微生物的変換
ＤＨＣＡは水溶液中で、３α−ＨＳＤＨおよび７β−ＨＳＤＨまたはそれらの変異体により、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨの存在下に特異的に還元されて、１２−ケト−ＵＤＣＡを生じる。補因子ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨは、ＡＤＨまたはＦＤＨまたはＧＤＨまたはそれらの変異体により、それぞれイソプロパノールまたはギ酸ナトリウムまたはグルコースから再生され得る。反応は穏やかな条件下で進行する。例えば、反応はｐＨ＝６〜９、特に約ｐＨ＝８において、また約１０〜３０、１５〜２５、または約２３℃において行なわれ得る。
【０１９８】
微生物変換工程の場合、必要な酵素活性／複数の酵素活性を発現する組換え微生物は、変換されるべき基質（ＤＨＣＡ）の存在下に、適当な液体培地中で、嫌気的または好気的に培養され得る。適当な培養条件は、それ自体当業者には公知である。それらは、例えば５〜１０、６〜９のｐＨ範囲、１０〜６０、または１５〜４５、または２５〜４０℃の範囲の温度、または３７℃における変換を含む。適当な培地は、例えば、以下に記載されるＬＢおよびＴＢ培地を含む。これにおいて、変換時間は、例えばバッチ式もしくは連続式で、または他の通常のプロセスの変形（上記記載）で行なわれ得る。これに関連して、変換時間は、例えば、数分から数時間または数日の範囲内であり、また例えば１時間〜４８時間に達し得る。酵素活性が連続的に発現されない場合には、任意に、標的細胞密度が例えば約ＯＤ６００＝０．５〜１．０に達した後に、適当なインデューサーを添加することによりこれを開始してもよい。
【０１９９】
発酵の操作、培地への添加、酵素固定化、および価値ある物質の分離に関しては、可能な微生物産生プロセスのさらに適切な改変を、以下の「酵素および変異体の産生」に関するセクションにも見出し得る。
【０２００】
第３工程：１２−ケト−ＵＤＣＡのＵＤＣＡへの化学的変換
１２−ケト−ＵＤＣＡの１２−カルボニル基は、Ｗｏｌｆｆ−Ｋｉｓｃｈｎｅｒ還元により、それ自体公知の方法で除去され、これにより１２−ケト−ＵＤＣＡからＵＤＣＡが産生される。この反応において、カルボニルがまずヒドラジンと反応して、ヒドラゾンを生じる。その後ヒドラゾンは、塩基（例えばＫＯＨ）の存在下で２００℃に加熱され；このプロセスの間に窒素が除去されてＵＤＣＡを生じる。
【０２０１】
６．酵素および変異体の組換え体産生
本発明の対象はさらに、本発明のポリペプチド、またはその機能的、生物学的な活性フラグメントの組換え体産生のための方法であり、これにおいて、ポリペプチド産生微生物が培養され、ポリペプチドの発現が任意に誘導され、そしてポリペプチドが培養物から単離される。所望であれば、ポリペプチドはまたこの方法で、工業規模でも製造され得る。
【０２０２】
本発明により産生された微生物は、連続的に、あるいはバッチ法、流加培養法、または反復流加培養法によって非連続的に増殖され得る。公知の方法についての概要は、Ｃｈｍｉｅｌによる教科書(Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess Engineering 1. Introduction to Bioprocess Technology] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) またはＳｔｏｒｈａｓによる教科書(Bioreaktoren and periphere Einrichtungen [Bioreactors and Peripheral Units] (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994)).に見出し得る。
【０２０３】
用いるべき培地は、当該株の要求性を適切に満たさねばならない。種々の微生物のための培地の記載は、American Society for Bacteriologyのマニュアル"Manual of Methods for General Bacteriology" (Washington D. C., USA, 1981) に見出される。
【０２０４】
本発明に従って使用可能なこれらの培地は、通常、１つ以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン、および／または微量元素を含む。
【０２０５】
好ましい炭素源は、単糖、二糖、または多糖類などの糖である。非常に良好な炭素源の例は、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、サッカロース、ラフィノース、デンプン、またはセルロースである。糖はまた、糖蜜、または精糖の別の副産物などの、複合化合物を介して培地へ添加されてもよい。また種々の炭素源の混合物を添加することも有利であり得る。他の可能な炭素源は、例えば大豆油、ヒマワリ油、落花生油、およびヤシ油などの油脂、例えばパルミチン酸、ステアリン酸、またはリノール酸などの脂肪酸、例えばグリセロール、メタノール、またはエタノールなどのアルコール、および例えば酢酸、または乳酸などの有機酸である。
【０２０６】
窒素源は、通常、有機もしくは無機窒素化合物、またはこれらの化合物を含む物質である。窒素源の例は、アンモニアガス、または、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、もしくは硝酸アンモニウムなどのアンモニウム塩、硝酸塩、尿素、アミノ酸、または、コーンスティープリカー、大豆粉、大豆タンパク質、酵母抽出物、肉エキスなどの複合窒素源を含む。窒素源は、単独で、または混合物として使用できる。
【０２０７】
培地中に存在し得る無機塩化合物は、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅、および鉄の、塩化物、リン酸塩、または硫酸塩を含む。
【０２０８】
例えば硫酸塩、亜硫酸塩、ジチオナイト、テトラチオナイト、チオ硫酸塩、硫化物などの無機硫黄含有化合物が、しかしまたメルカプタンおよびチオールなどの有機硫黄化合物も、硫黄源として使用され得る。
【０２０９】
リン酸、リン酸二水素カリウム、もしくはリン酸水素二カリウム、または対応するナトリウム含有塩が、リン源として使用され得る。
【０２１０】
金属イオン封鎖剤は、溶液中に金属イオンを保持する目的で、培地に添加され得る。特に適した金属イオン封鎖剤は、カテコールまたはプロトカテキュエートなどのジヒドロキシフェノール、またはクエン酸などの有機酸を含む。
【０２１１】
通常、本発明に従って使用される発酵培地はまた、ビタミンまたは増殖プロモーターなどの他の増殖因子を含有し、これらは例えばビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸、およびピリドキシンを含む。増殖因子および塩は、しばしば、酵母抽出物、糖蜜、コーンスティープリカーなどの複合培地成分から取得される。さらに、適当な前駆体を培地に添加してもよい。培地中の化合物の正確な組成は、当該実験に強く依存し、かつそれぞれの事例につき個々に決定される。培地の最適化についての情報は、教科書"Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Eds. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) pp.53-73, ISBN 0 19 963577 3) に見出し得る。増殖培地はまた、例えばＳｔａｎｄａｒｄ  １（Ｍｅｒｋ）またはＢＨＩ（Ｂｒａｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ，ＤＩＦＣＯ）などの商用供給業者からも取得可能である。
【０２１２】
全ての培地成分は、熱（１．５ｂａｒおよび１２１℃で２０分間）によるか、または濾過滅菌により滅菌される。成分は一緒に、または必要であれば別個に滅菌され得る。全ての培地成分は、培養の開始時に存在してもよく、あるいは所望のように連続的にまたはバッチ式に添加してもよい。
【０２１３】
培養の温度は、通常１５℃と４５℃の間、好ましくは２５℃〜４０℃の間であり、実験の間一定に保持されるか、または変更されてもよい。培地のｐＨは、５〜８．５の範囲でなければならず、好ましくは７．０付近である。培養のためのｐＨは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、もしくはアンモニア水などの塩基性化合物、またはリン酸もしくは硫酸などの酸性化合物の添加により、培養中にコントロールされ得る。発泡をコントロールするため、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を使用してもよい。プラスミドの安定性を維持するため、例えば抗生物質などの選択的に作用する物質を培地に添加してもよい。好気性の条件を維持する目的で、酸素または酸素含有ガス混合物、例えば周囲の空気が培養物へ通される。培養温度は、通常、２０℃から４５℃である。培養は、所望の産生物が最大に生成されるまで継続される。この目標は、通常１０時間〜１６０時間以内に達成される。
【０２１４】
その後、発酵ブロスはさらに処理される。必要に応じ、全てのまたはいくらかのバイオマスが、例えば遠心分離、濾過、デカンテーション、またはこれらの方法の組合せなどの分離法により、完全にまたは部分的に発酵ブロスから除去されるか、あるいは前記ブロス中に完全に放置されてもよい。
【０２１５】
ポリペプチドが培地中に分泌されない場合には、細胞はまた破壊され、産生物はライセートから公知のタンパク質単離法により取得してもよい。細胞は、任意に、高周波超音波により、例えばフレンチプレッサーセルにおける高圧により、オスモリシスにより、界面活性剤、溶解酵素、または有機溶媒の作用により、ホモジナイザーにより、または上述の方法のいくつかの組合せにより破壊され得る。
【０２１６】
ポリペプチドは、Ｑセファロースクロマトグラフィーなどの分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、イオン交換クロマトグラフィー、および疎水性クロマトグラフィーなどの、既知のクロマトグラフ技術を用いて、およびまた限外濾過、結晶化、塩析、透析、および未変性ゲル電気泳動などの、他の通常の方法を用いて精製され得る。適当な方法は、例えば、Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden [Biochemical Working Methods], Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York、または、Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlinに記載されている。
【０２１７】
組換えタンパク質の単離には、ベクター系またはオリゴヌクレオチドを使用することが有利であり得、これらは特定のヌクレオチド配列によりｃＤＮＡを延長し、それ故例えば精製をより簡単にするために役立つ、改変されたポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする。適切なかかる改変は、例えば「タグ」として知られるものであり、これらは例えば、ヘキサヒスチジンアンカーとして知られる改変などのアンカーとして、または抗体により抗原として認識され得るエピトープとして作用する（例えば、Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Pressに記載）。これらのアンカーは、タンパク質を固体担体、例えばクロマトグラフィーカラム内へ充填可能なポリマーマトリックスなどへ付着させるため、あるいはタンパク質をマイクロタイタープレートまたは任意の他の担体へ付着させるのに役立ち得る。
【０２１８】
同時に、これらのアンカーはまた、タンパク質の同定にも使用できる。タンパク質を同定するためには、蛍光色素などの通常のマーカー、基質との反応後に検出可能な反応産物を生成する酵素マーカー、または放射性マーカーが、単独で、またはアンカーと組合せて、タンパク質の誘導体化のためにさらに使用できる。
【０２１９】
７．酵素固定
本明細書に記載の方法において、本発明の酵素は遊離で、または固定された形態で使用されてもよい。固定された酵素とは、不活性な担体上に固定された酵素を意味するものと理解される。適当な担体材料、およびその上に固定された酵素は、ＥＰ−Ａ−１１４９８４９、ＥＰ−Ａ−１ ０６９ １８３およびＤＥ−ＯＳ １００１９３７７３から、およびそれらに引用された参考文献から公知である。これに関し、これらの文書の開示は、その記載全体が参照される。適当な担体材料は、例えば粘土、カオリナイトなどの粘土鉱物、珪藻土、パーライト、シリカ、アルミナ、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、セルロース粉末、陰イオン交換物質、ポリスチレンなどの合成ポリマー、アクリル樹脂、フェノールホルムアルデヒド樹脂、ポリウレタン、ならびにポリエチレンおよびポリプロピレンなどのポリオレフィンを含む。担体材料は、通常、担持された酵素の調製のために、微粉化された粒子の形態で使用され、多孔性の形態であることが好ましい。担体材料の粒径は、通常、５ｍｍ以下、とりわけ２ｍｍ以下である（粒度曲線）。同様に、デヒドロゲナーゼをホールセル触媒として使って、遊離または固定された形態を選択してもよい。担体材料は、例えばアルギン酸カルシウム、およびカラギーナンである。酵素、およびまた細胞も、グルタールアルデヒドを用いて直接架橋され得る（ＣＬＥＡへの架橋）。対応する、およびさらなる固定化プロセスは、例えば、J. Lalonde and A. Margolin “Immobilization of Enzymes” in K. Drauz and H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol.III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheim に記載されている。
【０２２０】
実験についての部分：
別段の定めがない限り、本発明の範囲内で行なわれるクローニング工程、例えば制限酵素切断、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡフラグメントの精製、ニトロセルロースおよびナイロン膜への核酸の移行、ＤＮＡフラグメントの連結、微生物の形質転換、微生物の培養、ファージの増殖、及び組換えＤＮＡの配列分析は、Sambrook et al. (1989)に記載されたように行われ得る。
【０２２１】
Ａ．  一般的情報
材料：
Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ  ＤＳＭ  ３９７９（ＡＴＣＣ  ２５９８６、以前の名称Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）のゲノムＤＮＡは、Deutschen Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) から入手した。
Ｃ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉのゲノムＤＮＡは、Deutsche Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) から入手可能であり、あるいはＣ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ株からそれ自体公知の方法を用いて単離され得る。
【０２２２】
ＵＤＣＡおよび７−ケト−ＬＣＡは、それ自体が公知の出発化合物であり、文献に記載されている。全ての他の化学物質は、Ｓｉｇｍａ−ＡｋｄｒｉｃｈおよびＦｌｕｋａ（ドイツ）から入手された。全ての制限酵素、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｌｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ、およびイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）は、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ（ドイツ）から入手された。
【０２２３】
培地：
培地１リットル当たりトリプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇを含む、ＬＢ培地
培地１リットル当たりトリプトン１２ｇ、酵母抽出物２４ｇ、グリセロール４ｍｌ、１０％ＫＰｉ緩衝液（１１．５５ｇＫＨ２ＰＯ４、６２．７ｇＫ２ＨＰＯ４、全量をＨ２Ｏで５００ｍｌとする）を含む、ＴＢ培地
Wilms et al., BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, 2001 VOL. 73, NO. 2, 95-103に従って改変された、最少培地
【０２２４】
配列：
図２は、野生型７β−ＨＳＤＨ酵素および変異体のアミノ酸配列を示す；しかしながらいずれの場合もすべてＣ−末端にヘキサヒスチジンタグが与えられている。この方法で、全ての酵素が単離されかつ特性評価された。
【０２２５】
実施例１：組換え３α−ＨＳＤＨの産生
Ａ）プラスミド形質転換：
市販の発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）は、制限酵素Ｎｃｏｌ／Ｅｃｏ３１１およびＸｈｏｌの切断部位を介してそれぞれの３α−ＨＳＤＨ遺伝子がその中へクローニングされており、これを組換え３α−ＨＳＤＨ酵素（野生型および変異酵素）の発現に使用した。発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）は、ＨＳＤＨ遺伝子をクローニングする場合、連続した６個のヒスチジン分子をコードする遺伝子配列を、直接ＨＳＤＨに結合可能である。発現後、この配列（ヘキサヒスチジンタグまたはＨｉｓ−ｔａｇと称される）は、ＨＳＤＨタンパク質のＣ−末端に現れる。元の、または野生型のＨＳＤＨ遺伝子は、細菌Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉに起源し、それぞれの３α−ＨＳＤＨ遺伝子を含むプラスミドはｐＥＴ２８ａ（＋） ３α−ＨＳＤＨと称される。ｐＥＴ２８ａ（＋） ３α−ＨＳＤＨプラスミドを形質転換するためには、５μｇのライゲーション混合物を１００μｌのコンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）Δ７α−ＨＳＤＨ大腸菌細胞で処理し、Ｈａｎａｈａｎ（J. Mol. Biol. (1983), vol. 166, pp. 557）により記載されたように形質転換を実施し、同じ工程を野生型遺伝子を含むプラスミドで、および変異したＨＳＤＨ遺伝子を含むプラスミドで実施した。大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ７α−ＨＳＤＨは、このような状況下では常用されており、この株では７α−ＨＳＤＨの遺伝子が欠失されていることで識別される。この研究に使用した大腸菌株の正確な特性評価は、表１に準じる。
【０２２６】
【表６】
0006694871.tif 000019
【０２２７】
Ｂ）発現および細胞増殖：
発現には、発現構築物（ｐＥＴ２８ａ（＋） ３α−ＨＳＤＨプラスミド）を含む大腸菌株を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地（リットル当たりトリプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇ）中で、２５℃で２０時間増殖させた。細胞を遠心分離（５０００ｘｇ、３０分間、４℃）により収穫した。
【０２２８】
Ｃ）培養抽出物を得ること：
ペレットを破砕緩衝液（１０ｍＭ  イミダゾール、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）中に再懸濁し、細胞１ｇ（湿質量）当たり４ｍｌの緩衝液を添加した。細胞を次に、Ｓｏｎｏｐｕｌｓ  ＨＤ２０７０ソニケータ（Bandelin, Berlin, Germany）を用いて、一定に冷却しながら１分間（出力３０Ｗ、ワーキングインタバル５０％、および１分間ブレイク）の音波処理により破砕した。破砕を３回反復した。細胞懸濁液を遠心分離し（１８０００ｘｇ、３０分間、４℃）、上清が無細胞粗抽出物を称された。
【０２２９】
Ｄ）酵素の精製：
Ｈｉｓタグは、この配列が特定のクロマトグラフ材料（２価のニッケルイオンが担持された、ＮＴＡ（Ｎｉ−ニトリロトリアセテート）修飾担体材料、例えば「Ｈｉｓ  Ｐｕｒ  Ｎｉ−ＮＴＡ」（Nimagen B. V., Nijmegen, The Netherlands））により、高い特異性をもって結合されることから、ＨＳＤＨタンパク質の非常に簡単な精製を可能にする。この目的を達成するため、この材料を含む予め破砕緩衝液（３〜５カラム体積）で平衡化された滴下カラムに、無細胞粗抽出物をアプライした。弱く結合しているタンパク質を、３〜５カラム体積の洗浄緩衝液（２０ｍＭ  イミダゾール、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）を用いて洗浄することにより除去した。Ｈｉｓタグ−３α−ＨＳＤＨタンパク質を、イミダゾールを含有する溶離緩衝液（２５０ｍＭ  イミダゾール、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）で溶出した。このプロセスは室温で行なった。存在していたイミダゾールは、緩衝液交換により除去された。
【０２３０】
タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄにより記載された方法によって測定した（１００μｌの試料を９００μｌのＢｒａｄｆｏｒｄ試薬と混合し、暗中で少なくとも１５分間インキュベートし、次いで５９５ｎｍにおいてウシ血清アルブミンで立証された校正曲線に対して定量試験した）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）分析を行うため、ゲルをクマシーブリリアントブルーで染色した。
【０２３１】
Ｅ）活性測定：
３α−ＨＳＤＨおよび変異体の活性は、光度アッセイを用いて測定し、これにおいて３４０ｎｍにおける吸収の低下を３０秒間にわたり測定した。反応溶液は、全体積１ｍｌ中に：８７４μｌの５０ｍＭ  リン酸カリウム（ＫＰｉ）緩衝液、ｐＨ８．０；１００μｌの１００ｍＭ  デヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）溶液（５０ｍＭ  ＫＰｉ、ｐＨ８．０中に溶解されたＤＨＣＡ）；１０μｌの酵素溶液（任意に希釈）；１６μｌの１２．５ｍＭ  ＮＡＤＰＨ溶液（蒸留水中に溶解）を含んでいた。以下において、活性は単位（Ｕ）で特定され、１Ｕは１μＭｏｌのＮＡＤＨ／ｍｉｎの減少に対応する。
【０２３２】
実施例２：アミノ酸位置３４における３α−ＨＳＤＨ変異体の産生、及びその特性評価
Ａ）プライマー：
表２において特定された突然変異誘発プライマーを用いて、３α−ＨＳＤＨの位置特異的突然変異誘発を実施した。３α−ＨＳＤＨの遺伝子配列に基づき、プライマーを、それらが所望のアミノ酸交換をもたらすように選択した。
以下のプライマーを変異体の産生に使用した：
【０２３３】
【表７】
0006694871.tif 000020
【０２３４】
Ｂ）ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）ＰＣＲ：
標的化されたアミノ酸交換は、「ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）ＰＣＲ」法を用いて達成され得る。この目的を達成するため、以下のＰＣＲ反応を実施した（反応混合物は表３参照）：まず、９５℃で２分間の最初の変性工程を行い、その後２０サイクルの、変性（９５℃で３０秒間）、プライマーハイブリダイゼーション（６０〜６８℃で１分間）、および伸長（６８℃で１１分間）を実施した。行なわれた最後の工程は、６８℃で１０分間の最終伸長であり、その後、４℃に冷却することによりポリメラーゼ連鎖反応を終了した。用いた鋳型は、３α−ＨＳＤＨ（野生型）をもつｐＥＴ２８ａベクターであった。
【０２３５】
【表８】
0006694871.tif 000021
【０２３６】
標的化された様式でのタンパク質配列中のアミノ酸交換を可能にする目的で、当該遺伝子のＤＮＡ配列を、位置特異的突然変異誘発に供する。この目的を達成するためには、互いに相補的であり、かつ所望の変異をその配列に含むプライマーが使用される。用いた鋳型は、変異されるべき遺伝子を含有するＮ６−アデニン−メチル化二本鎖プラスミドＤＮＡである。Ｎ６−アデニン−メチル化プラスミドＤＮＡは、例えば大腸菌ＤＨ５αなどのｄａｍ＋大腸菌株から単離される。
【０２３７】
ポリメラーゼ連鎖反応は、上記に記載されたように実施される。ここで、プライマーは鋳型に相補的に伸長され、所望の変異を有し、かつ鎖切断を有するプラスミドを生じる。他のＰＣＲ反応とは対照的に、新たに生成されたＤＮＡ分子はＰＣＲ反応のための鋳型として機能できないため、ＤＮＡ収量の増加はここでは直線的にすぎない。
【０２３８】
ＰＣＲ反応の終了後、ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（(Analytik Jena AG, Jena, Germany）により精製し、親のメチル化されたＮ６−アデニンを、制限酵素ｄｐｎｌにより消化した。この酵素の特殊性は、Ｎ６−アデニン−メチル化ＤＮＡを非特異的に制限するが新たに生成された非メチル化ＤＮＡは制限しないことである。制限は、１μｌのｄｐｎｌをＰＣＲ反応混合物に添加すること、および混合物を３７℃で少なくとも２時間または一晩インキュベートすることにより起こる。この混合物７．５μｌを、１００μｌのケミカルコンピテントなＤＨ５α細胞の形質転換に適用した。
【０２３９】
Ｃ）酵素変異体の活性データ：
位置３４において突然変異誘発された変異体の活性測定（実施例１参照）は、以下の表４に示したデータを示した。
【０２４０】
【表９】
0006694871.tif 000022
【０２４１】
最高の変異体（［Ｒ３４Ｎ］）は、約３倍まで改善された活性を示す。
【０２４２】
実施例３：アミノ酸位置６８における３α−ＨＳＤＨ変異体の産生、及びその特性評価
以下のテキストは、位置６８のアスパラギン酸がいくつかの別のアミノ酸と交換された３α−ＨＳＤＨ変異体を記載する。有利な変異体は、ミカエリス−メンテン動力学によりパラメータＫＭおよびＶｍａｘを測定することにより、それらの動力学によって詳細に特徴評価される。変異体と野生型酵素との比較を可能にするため、野生型酵素を前述と同様に精製して、その動力学の面で特性評価した。
【０２４３】
Ａ）野生型酵素のミカエリス−メンテン動力学
変異体の改変を動力学定数について明確に立証するため、野生型酵素を精製して、以下のテキストにおいて特徴評価した。
【０２４４】
Ｈｉｓタグをもつ精製された酵素のデータを、図３および表５に示す。
【０２４５】
【表１０】
0006694871.tif 000023
【０２４６】
Ａ）変異体の構築のためのプライマー
表６に列記された突然変異誘発プライマーを、３α−ＨＳＤＨの位置特異的突然変異誘発に使用した。３α−ＨＳＤＨの遺伝子配列に基づき、プライマーを、それらが所望のアミノ酸交換をもたらすように選択した。
【０２４７】
以下のプライマーを変異体の産生に使用した：
【０２４８】
【表１１】
0006694871.tif 000024
【０２４９】
Ｂ）ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）ＰＣＲ：
位置６８におけるアスパラギン酸の標的化された交換は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）ＰＣＲにより、実施例２Ｂに記載されたように実施した。
【０２５０】
Ｃ）酵素変異体の活性値：
位置６８において突然変異誘発された変異体の光度活性測定（実施例１参照）は、以下の表７に列記されたデータを示した。
【０２５１】
【表１２】
0006694871.tif 000025
【０２５２】
Ｄ）ミカエリス−メンテン動力学
最良の変異体（３α−ＨＳＤＨ［Ｌ６８Ａ］）を精製し（１Ｄ参照）、その動力学パラメータＶｍａｘおよびＫＭを測定した。図４は、動力学の経過のダイヤグラムを示し、それから導き出された動力学が表８に列記されている。
【０２５３】
【表１３】
0006694871.tif 000026
【０２５４】
表７から、最大速度を野生型酵素（以下の３Ｅ参照）に対し約２倍まで増大することができたことが見て取れる。変異体のＫＭ値は、野生型酵素の値と同程度の大きさにある。
【０２５５】
実施例４：いくつかの位置にアミノ酸交換を含む３α−ＨＳＤＨ変異体の産生、およびその特性評価
実施例２および３に記載された個々の変異体の他に、突然変異を有利に組み合わせることも可能である。例として、位置３４および６８が同時に改変された二重変異体が産生された。ここで、位置３４における最良のアミノ酸交換（［Ｒ３４Ｎ］）が、位置６８における最良の交換（［Ｌ６８Ａ］）と組合わされた。
【０２５６】
Ａ）二重変異体の産生および活性値
二重変異体を得る方法、および活性試験は、実施例２Ｂおよび２Ｃに記載されたような方法に従った。表９は、粗抽出物中の二重変異体の活性を野生型酵素の活性と比較してまとめたものである。
【０２５７】
【表１４】
0006694871.tif 000027
【０２５８】
Ｂ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による発現調節
異種発現の発現性能を評価できるようにするため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。図５は、変異体３α−ＨＳＤＨ［Ｒ３４Ｎ／Ｌ６８Ａ］および［Ｌ６８Ａ］のＳＤＳゲルを示す。変異体のサイズは約２７．４ｋＤａであった。図は、３α−ＨＳＤＨが、ＳＤＳゲルではそのサイズに応じて移動しないことを示している。それは常に、マーカーの２５ｋＤａバンドの幾分下に移動する。
【０２５９】
Ｃ）ミカエリス−メンテン動力学
変異体３α−ＨＳＤＨ［Ｒ３４Ｎ／Ｌ６８Ａ］を精製し、精製された酵素について動力学パラメータＶｍａｘおよびＫＭを測定した。図６は、ミカエリス−メンテン動力学のダイヤグラムを示す。
【０２６０】
Ｄ）二重変異体の活性値
表１０は、ミカエリス−メンテン動力学に基づき確立された二重変異体について活性値をまとめたものである。
【０２６１】
【表１５】
0006694871.tif 000028
【０２６２】
二重変異体の最大活性を、野生型に対し約２５％まで増大することができた。ＫＭ値は、劇的に改善された：１３４μＭの値が野生型酵素について測定されたのに対し、変異体は８０μＭのＫＭ値を示す
【０２６３】
Ｅ）変異体（［Ｌ６８Ａ］）および二重変異体（［Ｒ３４Ｎ／Ｌ６８Ａ］）の、野生型とのミカエリス−メンテン動力学の比較の要約
それぞれの変異体の経過のダイヤグラムを、図７に示したように野生型と比較した。ここでは、Ｈｉｓタグで既に改変された野生型酵素を比較のために使用した。単一変異体（Ｌ６８Ａ）は、改善された活性（ＤＨＣＡで）を示す一方で、過剰基質阻害がわずかにより顕著であることが明らかである。２つの位置の組合せは、結果として、低い基質濃度（ＤＨＣＡ）では完全に野生型のような活性があるわけではない変異体を生じたが、二重変異体は、高い基質濃度、すなわち適用するのに重要な範囲では、野生型酵素よりも著しく高い活性をもつ。
【０２６４】
実施例５：ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ）タグの影響
野生型酵素の活性をＨｉｓタグがあるなしで比較した場合、活性が明らかに互いに異なることが注目された。差異はさらに、ミカエリス−メンテン動力学の比較において明らかとなった（図８）。表１１は、ＫＭおよびＶｍａｘ値の比較概要を示す。Ｈｉｓタグなしの酵素の精製は非常に困難であることから、比較は、未精製酵素（粗抽出物）について記録した。しかしながら、動力学の相対的な経過、およびそれ故Ｈｉｓタグの影響についての所見が、精製された酵素を用いる場合に変化することは予想されていない。
【０２６５】
【表１６】
0006694871.tif 000029
【０２６６】
図８および表１１の値は、酵素が少なくともＣ−末端では、活性を失うことなくＨｉｓタグが与えられ得ることを示す。野生型酵素の特徴は、基質に対し高い親和性をもち、かつわずか約１ｍＭでその最大活性に達する一方で、ＤＨＣＡがさらに増加した後は活性が激しく低下することである（図８、黒色の点）。タグのない酵素では、わずかに約１０〜２０％の残留活性がある。対照的に、酵素のＨｉｓタグ変異体は、著しく異なる挙動を示す。ＤＨＣＡ濃度が増加すると、低いＤＨＣＡ濃度範囲では活性はそれほど激しく増加せず、すなわち親和性は幾分減少するが、この酵素はもはや著しい過剰基質阻害を示さない。したがってタグ付きの酵素は、タグ付きでない酵素よりも、特に、高いＤＨＣＡ濃度において行われる調製用の用途にはより良好な特性をもつ。
【０２６７】
実施例６：ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグの長さの影響
Ｈｉｓタグがあるなしの野生型酵素の活性を比較した場合、活性が明らかに互いに異なることが注目された。６ｘＨｉｓタグの影響をさらに明らかに証明するため、Ｃ−末端に３ｘＨｉｓタグをもつ、および９ｘＨｉｓタグをもつ３α−ＨＳＤＨ変異体を、Ｑｕｉｃｋ−Ｃｈａｎｇｅ（登録商標）ＰＣＲにより産生した。発現（２５℃、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧ、２０時間）の後、タンパク質を精製し、発現および精製をＳＤＳゲルにより調べた。添付の図９はＳＤＳゲルを示し、以下の表１２は種々の変異体の動力学定数を示す。
【０２６８】
【表１７】
0006694871.tif 000030
【０２６９】
表１２に示した動力学定数は、Ｃ−末端のヒスチジン残基が触媒特性に影響するという仮説を裏付ける。表から、親和性が、Ｈｉｓタグの長さの増加とともに増すことが非常に明らかに見て取れる。９個のヒスチジンのテイルをもつ酵素変異体は、Ｃ−末端に３個のヒスチジンをもつ変異体よりも１４倍良好なＫＭ値を示す。さらに、触媒効率（Ｋｃａｔ／ＫＭ）は、それがヒスチジン鎖長の増加とともに増すこと；９個のヒスチジンを持つ変異体は、３個だけのヒスチジンをもつ変異体よりも１９倍高い効率をもつことを示している。
【０２７０】
実施例７：位置Ｐ１８５、Ｔ１８８、および任意でさらにＬ６８における、さらなる３α−ＨＳＤＨ単一および二重変異体の産生および特性評価
Ａ）プライマー：
表１３において特定された突然変異誘発プライマーを、３α−ＨＳＤＨの位置特異的突然変異誘発に使用した。３α−ＨＳＤＨの遺伝子配列に基づき、プライマーをそれらが所望のアミノ酸交換をもたらすように選択した。
【０２７１】
以下のプライマーペアを、変異体の産生に使用した：
【０２７２】
【表１８】
0006694871.tif 000031
【０２７３】
上記記載の突然変異誘発プライマー（表６参照）を、位置Ｌ６８における変突変異に使用した。
【０２７４】
Ｂ）Ｑｕｉｋ−Ｃｈａｎｇｅ（登録商標）ＰＣＲ：
標的化されたアミノ酸基交換は、実施例２Ｂと同様に実施した。この目的を達成するため、Ｎ−末端ヘキサヒスチジンダグをもつプラスミドｐＥＴ２８ａ（＋）３α−ＨＳＤＨ（Ｎ−Ｈｉｓ）中の、およびまたＣ−末端ヘキサヒスチジンタグをもつプラスミドｐＥＴ２８ａ（＋）３α−ＨＳＤＨ（Ｃ−Ｈｉｓ）中の、３α−ＨＳＤＨの野生型遺伝子を、Ｑｕｉｋ−Ｃｈａｎｇｅ（登録商標）ＰＣＲにより改変して、以下の表１４および１５に示した変異体が産生されるようにした。
【０２７５】
培養および発現に続き、細胞を収穫し、無細胞粗抽出物の比活性を１０ｍＭ  ＤＨＣＡの基質濃度において測定した。粗抽出物酵素を用いた活性測定が最も有望であった酵素変異体を、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーにより精製し、その動力学定数を１０μＭ〜２０ｍＭの異なるＤＨＣＡ濃度を用いた測定によって決定した。加えて、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによる発現調査を全ての変異体について行なった。
【０２７６】
１０ｍＭ  ＤＨＣＡにおけるその活性に関して、対応する野生型酵素に比較して最も有望であった候補は：
Ｎ−末端ヘキサヒスチジンタグをもつＴ１８８Ａ、Ｔ１８８Ｓ、Ｔ１８８Ｇ、Ｐ１８５Ａ、Ｌ６８Ａ、Ｔ１８８Ｓ/Ｌ６８Ａ、Ｔ１８８Ａ/Ｌ６８Ａ、Ｐ１８５Ａ/Ｔ１８８Ａ、およびＣ−末端ヘキサヒスチジンタグをもつＴ１８８Ａ、Ｌ６８Ａであった。
【０２７７】
ここで得られた結果は、以下のテキストにおいて明記される。
【０２７８】
［Ｔ１８８Ａ］Ｎ−末端ヘキサヒスチジンタグ
０．５ｍＭ  ＤＨＣＡにおいて最高の比活性に達した後、活性はなお再び低下し始めることが明らかになる。野生型と同様、酵素は著しい過剰基質阻害を特徴とする。約４．５ｍＭのＤＨＣＡにおいて、タンパク質はなお約５０％の、また２０ｍＭにおいて約２０％の残留活性を有する。漸近的経過が成立する。
【０２７９】
［Ｔ１８８Ｓ］Ｎ−末端ヘキサヒスチジンタグ
０．５ｍＭの基質濃度における最大比活性に続き、過剰基質阻害が観察される。２０ｍＭ  ＤＨＣＡの基質濃度において、酵素は２０％を超える残留活性をここで保持する。
【０２８０】
［Ｔ１８８Ｇ］Ｎ−末端ヘキサヒスチジンタグ
ここでは、何ら顕著な過剰基質阻害は観察されない。しかしながら、他の酵素変異体に比較して、活性は相対的に低く（約１０％）、最大活性は２５Ｕ／ｍｇにおいて達成される。高い基質濃度（＞５ｍＭ）では、活性はこれまでに記載された他の変異体とほぼ等しい。動力学定数は、経過ダイヤグラムを用いて測定した。
【０２８１】
［Ｐ１８５Ａ］Ｎ−末端ヘキサヒスチジンタグ
再度、０．２５ｍＭのＤＨＣＡ基質濃度において最大比活性が達成された後、著しい過剰基質阻害が観察された。１０ｍＭの基質濃度において、残留活性はなお５％である。
【０２８２】
［Ｌ６８Ａ］Ｎ−末端ヘキサヒスチジンタグ
[Hwang et al., 2013] により同定された、上記記載の位置Ｔ１８８およびＰ１８５に加えて、３α−ＨＳＤＨ  Ｌ６８Ａが比較を目的として産生された。他の２つとは対照的に、位置６８はタンパク質のＮ−末端領域にある。３つの位置は全て、これらのアミノ酸が補酵素とリンケージを形成するという事実を共有しており、このことが、何故この変異体もまたＮ−末端Ｈｉｓタグを用いて産生されたか、かつ生化学的特徴評価に含まれたのかの理由である。この目的を達成するため、プラスミドｐＥＴ２８ａ（＋）３α−ＨＳＤＨ（Ｎ−Ｈｉｓ）を、Ｑｕｉｃｋ−Ｃｈａｎｇｅ（登録商標）ＰＣＲにより改変して、所望の変異体が産生されるようにした。培養および発現の後、タンパク質をＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーにより精製し、比活性を測定して動力学定数を決定した。再度、ＤＨＣＡ基質濃度を１０μＭ〜１０ｍＭの間で変化させ、その間のＮＡＤＨ濃度は一定して０．２ｍＭであった。
【０２８３】
基質濃度０．１ｍＭ  ＤＨＣＡにおいて最大比活性が達成された後、顕著な過剰基質阻害が観察された。基質濃度１ｍＭ  ＤＨＣＡでは、残留活性はここで約１５％に達し、また１０ｍＭでは残留活性は約８％に達する。
【０２８４】
以下の二重変異体を産生するため、いずれの場合も既存の変異体をＱｕｉｃｋ−Ｃｈａｎｇｅ（登録商標）ＰＣＲにより上記記載のように再度改変し、発現させ、精製し、そしてそのパラメータを測定した。
【０２８５】
［Ｌ６８Ａ／Ｔ１８８Ａ］Ｎ−末端ヘキサヒスチジンタグ
基質濃度０．５ｍＭ  ＤＨＣＡにおいて最大比活性に達した後、あまり顕著ではない過剰基質阻害が観察された。基質濃度１ｍＭでは、残留活性はなお約８５％であり、１０ｍＭではなお２０％を超えた。これは、比較すれば２つの単一変異体の場合よりも多い。
【０２８６】
［Ｌ６８Ａ／Ｔ１８８Ｓ］Ｎ−末端ヘキサヒスチジンタグ
０．５ｍＭにおいて最大比活性に達した後、活性の低下が観察された。これは顕著な過剰基質阻害に帰すことができる。曲線の経過は対応する単一変異体のものと同様である。基質濃度１０ｍＭでは、約２０％の残留活性がなお観察される。
【０２８７】
［Ｐ１８５Ａ／Ｔ１８８Ａ］Ｎ−末端ヘキサヒスチジンタグ
基質濃度０．５ｍＭ  ＤＨＣＡにおいて最大比活性に達した後、過剰基質阻害が観察された。基質濃度１０ｍＭでは、酵素の残留活性はなお約３０％である。全体に、曲線の経過および基質阻害は、対応する単一変異体の場合よりも低くさほど顕著ではないが、活性は著しく低い。
【０２８８】
Ｃ）このセクションにおいて産生された酵素変異体の活性データの編集
変異体の光度活性測定（実施例１に類似）、およびその動力学定数は、以下の表１４および１５に編集される。
【０２８９】
【表１９】
0006694871.tif 000032
【０２９０】
【表２０】
0006694871.tif 000033
【０２９１】
要約すれば、産生された変異体は、対応する野生型酵素に比較して、基質ＤＨＣＡおよび／またはＮＡＤＨについて、その触媒活性および／または親和性および効率において改善を示すと言える。
【０２９２】
特に列挙されるべきＮ−末端Ｈｉｓタグ変異体は、基質ＤＨＣＡおよび基質ＮＡＤＨの双方について、［Ｔ１８８Ａ］、［Ｔ１８８Ｓ］、［Ｌ６８Ａ］、［Ｐ１８５Ａ］、［Ｌ６８Ａ／Ｔ１８８Ｓ］、［Ｌ６８Ａ／Ｔ１８８Ａ］である。
【０２９３】
特に列挙されるべきＣ−末端Ｈｉｓタグ変異体は、［Ｔ１８８Ａ］および［Ｌ６８Ａ］である。
【０２９４】
本明細書で用いた配列
【０２９５】
【表２１】
0006694871.tif 000034
【０２９６】
【表２２】
0006694871.tif 000035
【０２９７】
本明細書に述べた刊行物の開示が特に参照される。
【図１ａ】
0006694871.tif 000044
【図１ｂ】
0006694871.tif 000045
【図１ｃ】
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【図１ｄ】
0006694871.tif 000047
【図２ａ】
0006694871.tif 000048
【図２ｂ】
0006694871.tif 000049
【図２ｃ】
0006694871.tif 000050
【図２ｄ】
0006694871.tif 000051
【図３】
0006694871.tif 000052
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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