(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）患者から得られた試料中のＣＤ４５ＲＡＲＯ  ＮＫ細胞の存在をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出することを含む、患者における血液がんを診断するための方法。
【請求項２】
血液がんは、白血病、リンパ腫及び骨髄腫からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
血液がんは、成熟した（周辺）Ｂ細胞新生物である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記血液がんが、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫；  Ｂ−細胞前リンパ球性白血病；  リンパ球性リンパ腫；  脾臓辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（＋／−絨毛リンパ球）、節性辺縁帯リンパ腫（＋／−単球様Ｂ細胞）、及び粘膜関連リンパ組織の節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＭＡＬＴ）タイプなどの辺縁帯リンパ腫；  有毛細胞白血病；  形質細胞性骨髄腫／プラズマ細胞腫；  濾胞性リンパ腫、濾胞中心（ｆｏｌｌｉｃｌｅ  ｃｅｎｔｅｒ）；  マントル細胞リンパ腫；（縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、及び原発性滲出液リンパ腫を含む）びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫；  及びバーキットリンパ腫／バーキット細胞白血病からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
血液がんが多発性骨髄腫（ＭＭ）、及び非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症（Waldenstrom's macroglobulinemia：ＷＭ）又はＢ細胞リンパ腫、及び、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記血液がんがＢ細胞新生物、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ／ＮＫ細胞新生物、未分化大細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ−リンパ芽球性白血病／リンパ腫前駆体、Ｔリンパ芽球性白血病／リンパ腫前駆体、バーキットリンパ腫、成人Ｔ細胞リンパ腫／白血病（ＨＴＬＶ１＋）、原発性ＣＮＳリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、多型移植後  リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、真性組織球性リンパ腫（true histiocytic lymphoma）、及び芽球性ＮＫ細胞リンパ腫からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
白血病は、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、及び小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
試料は、血液試料又は骨髄試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＣＤ４５ＲＡＲＯ  ＮＫ細胞の存在を検出することからなるステップは、他の細胞からＮＫ細胞を区別するのに適している結合パートナーのセット、及びＣＤ４５ＲＡに特異的な指向を有する少なくとも一つの特異的結合パートナーとＣＤ４５ＲＯに特異的な指向を有する少なくとも一つの特異的結合パートナーのセットの使用を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
さらにＣＤ４５ＲＡＲＯ  ＮＫ細胞上の少なくとも一つの表現型マーカーの存在を検出する工程をさらに含み、ここで該少なくとも一つの表現型マーカーの存在は、血液がんの性質を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０の表現型マーカー検出からなるステップを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
表現型マーカーが、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ１ｅ、ＣＤ２、ＣＤ３ｄｅｌｔａ、ＣＤ３ｅｐｓｉｌｏｎ、ＣＤ３ｇａｍｍａ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８ａｌｐｈａ、ＣＤ８ｂｅｔａ、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤｗｌ２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５ｕ、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤｗｌ７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４２ｄ、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｒ、ＣＤ４６、ＣＤ４７Ｒ、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、  ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６０ａ、ＣＤ６０ｂ、ＣＤ６０ｃ、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６５、ＣＤ６５ｓ、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ６６ｆ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７５ｓ、ＣＤ７７、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９２、ＣＤｗ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１０１、ＣＤ１０２、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ１０８、ＣＤ１０９、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１２、ＣＤｗｌ１３、ＣＤ１１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１１８、ＣＤｗｌ１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤｗｌ２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤｗｌ２５、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤｗｌ２８ａ、ＣＤｗｌ２８ｂ、ＣＤ１２９、ＣＤ１３０、ＣＤ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤｗｌ３６、ＣＤｗｌ３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１３９、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤｗｌ４５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤｗｌ４９、ＣＤ１５０、ＣＤ１５１、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６ａ、ＣＤ１５６ｂ、ＣＤｗｌ５６Ｃ、ＣＤ１５７、ＣＤ１５８、ＣＤ１５９ａ、ＣＤ１５９ｃ、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１６２、ＣＤ１６２Ｒ、ＣＤ１６３、ＣＤ１６４、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６、ＣＤ１６７ａ、ＣＤ１６８、ＣＤ１６９、ＣＤ１７０、ＣＤ１７１、ＣＤ１７２ａ、ＣＤ１７２ｂ、ＣＤ１７２ｇ、ＣＤ１７３、ＣＤ１７４、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７６、ＣＤ１７７、ＣＤ１７８、ＣＤ１７９ａ、ＣＤ１７９ｂ、ＣＤ１８０、ＣＤ１８１、ＣＤ１８２、ＣＤ１８３、ＣＤ１８４、ＣＤ１８５、ＣＤｗｌ８６、ＣＤ１９１、ＣＤ１９２、ＣＤ１９３、ＣＤ１９５、ＣＤ１９６、ＣＤ１９７、ＣＤ���ｌ９８、ＣＤｗｌ９９、ＣＤｗｌ９７、ＣＤ２００、ＣＤ２０１、ＣＤ２０２ｂ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ２０４、ＣＤ２０５、ＣＤ２０６、ＣＤ２０７、ＣＤ２０８、ＣＤ２０９、ＣＤｗ２１０、ＣＤ２１２、ＣＤ２１３ａｌ、ＣＤ２１３ａ２、ＣＤｗ２１７、ＣＤｗ２１８ａ、ＣＤｗ２１８ｂ、ＣＤ２２０、ＣＤ２２１、ＣＤ２２２、ＣＤ２２３、ＣＤ２２４、ＣＤ２２５、ＣＤ２２６、ＣＤ２２７、ＣＤ２２８、ＣＤ２２９、ＣＤ２３０、ＣＤ２３１、ＣＤ２３２、ＣＤ２３３、ＣＤ２３４、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２３５ｂ、ＣＤ２３５ａｂ、ＣＤ２３６、ＣＤ２３６Ｒ、ＣＤ２３８、ＣＤ２３９、ＣＤ２４０ＣＥ、ＣＤ２４０Ｄ、ＣＤ２４０ＤＣＥ、ＣＤ２４１、ＣＤ２４２、ＣＤ２４３、ＣＤ２４４、ＣＤ２４５、ＣＤ２４６、ＣＤ２４７、ＣＤ２４８、ＣＤ２４９、ＣＤ２５２  ＣＤ２５３、ＣＤ２５４、ＣＤ２５６、ＣＤ２５７、ＣＤ２５８、ＣＤ２６１、ＣＤ２６２、ＣＤ２６３、ＣＤ２６４、ＣＤ２６５、ＣＤ２６６、ＣＤ２６７、ＣＤ２６８、ＣＤ２６９、ＣＤ２７１、ＣＤ２７２、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ２７５、ＣＤ２７６、ＣＤ２７７、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＣＤ２８０、ＣＤ２８１、ＣＤ２８２、ＣＤ２８３、ＣＤ２８４、ＣＤ２８９、ＣＤ２９２、ＣＤｗ２９３、ＣＤ２９４、ＣＤ２９５、ＣＤ２９６、ＣＤ２９７、ＣＤ２９８、ＣＤ２９９、ＣＤ３００ａ、ＣＤ３００ｃ、ＣＤ３００ｅ、ＣＤ３０１、ＣＤ３０２、ＣＤ３０３、ＣＤ３０４、ＣＤ３０５、ＣＤ３０６、ＣＤ３０７、ＣＤ３０９、ＣＤ３１２、ＣＤ３１４、ＣＤ３１５、ＣＤ３１６、ＣＤ３１７、ＣＤ３１８、ＣＤ３１９、ＣＤ３２０、ＣＤ３２１、ＣＤ３２２、ＣＤ３２４、ＣＤｗ３２５、ＣＤ３２６、ＣＤｗ３２７、ＣＤｗ３２８、ＣＤｗ３２９、ＣＤ３３１、ＣＤ３３２、ＣＤ３３３、ＣＤ３３４、ＣＤ３３５、ＣＤ３３６、ＣＤ３３７、ＣＤｗ３３８、及びＣＤ３３９からなる群から選択されたＣＤ分子である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ｉ）患者からの血液試料中のＣＤ４５ＲＡＲＯ  ＮＫ細胞の存在を検出するステップ、及びｉｉ）ＣＤ４５ＲＡＲＯ  ＮＫ細胞の存在が、血液試料中に検出されないかどうかをモニタリングするステップを含む、血液がんを患う患者における治療の有効性のモニタリングを補助する方法。
【請求項１４】
血液がんを患っているかどうかを同定するために患者から得られた試料中のＣＤ４５ＲＡＲＯ  ＮＫ細胞の存在を検出し、その結果血液がんがあると同定された患者を、化学療法剤、標的がん治療、免疫療法剤又は放射線療法剤で治療することにおいて使用するための診断キットであって、該キットが、他の細胞からＮＫ細胞を区別するのに適している結合パートナーのセット、及びＣＤ４５ＲＡに特異的な指向を有する少なくとも一つの特異的結合パートナーとＣＤ４５ＲＯに特異的な指向を有する少なくとも一つの特異的結合パートナーのセットを含む、上記診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液癌を診断するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、リンパ球系列のメンバーであり、自然免疫系に属する。彼らは天然に細胞毒性を示し、サイトカインを生成する１，２。末梢血中のヒトＮＫ細胞の大部分は、ＣＤ３−ＣＤ５６ｄｉｍであり、一方少数がＣＤ３−ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ表現型を示す。後者の集団は、サイトカイン産生に寄与する一方、ＣＤ５６ｄｉｍ細胞は主に細胞傷害活性を示す３。対照的にＣＤ３−ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ細胞はリンパ節や扁桃腺において過半数を占めている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの証拠がＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ細胞はＣＤ５６ｄｉｍの前駆体であることを示しており、これはｉｎ  ｖｉｖｏでの場合とすることができる４。また、ＣＤ１６の発現は、ＮＫ細胞の発達が、この経路：ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＣＤ１６−  →  ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＣＤ１６ｄｉｍ  →  ＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６ｄｉｍ  →  ＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６＋をたどることを示唆している。さらなるマーカーは、これらの集団内に追加サブセットを識別することができる５,６。対照的に、ｉｎ  ｖｉｖｏでの活性化ＮＫ細胞の同定は厳密に調べるのがより困難である。長期持続発現は不明であるが、ＣＤ６９の発現は、ＮＫ細胞の刺激後に増加し、ヒトを含めた活性化の真正なマーカーと考えられている７。マウスでは、長期的な刺激後のＣＤ６９の安定した発現が論じられている：マウスＣＭＶ感染後のＣＤ６９発現が一過性である８のに対し、ＩＬ−１５処置後は安定している９。
【０００３】
ＮＫ細胞は、ＭＨＣ−Ｉ発現をダウンレギュレートして細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）による認識を回避する主要組織適合性複合体Ｉ（ＭＨＣ−Ｉ）の発現の変化を有する細胞（形質転換又はウイルス感染細胞を含む）を標的として、それらの標的に遭遇した後に活性化される。「自己細胞欠落自己仮説」は、ＭＨＣ−Ｉ発現に基づいて、ＮＫ細胞が、他の健康からの標的細胞を区別することを提案している。ＮＫ細胞の活性化は、活性化および抑制性受容体の両方によって媒介される複雑なシグナル伝達機構に依存する。メインのＮＫ細胞抑制性受容体は、ヒトではＨＬＡと呼ばれるＭＨＣ−Ｉ複合体を認識し、ＨＬＡ−Ｅを認識するＮＫＧ２Ａ、及び自己の古典的クラスＩ分子ＨＬＡ−Ａ、−Ｂおよび−Ｃを認識するキラー細胞免疫グロブリン様受容体（Killer cell immunoglobulin(Ig)-like receptor：ＫＩＲ）を含む。活性化ＮＫ細胞受容体は、細胞へのストレスおよび／または非自己リガンドを認識する、すなわち、ストレス誘導性リガンドＵＬ１６結合タンパク質（ＵＬＢＰ）とＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列（ＭＩＣ）は、活性化レセプターＮＫＧ２Ｄによって認識される２。
【０００４】
ＮＫ細胞は血液由来の癌細胞を認識し、排除する。しかしながら、これらの腫瘍細胞は、免疫回避のために異なるメカニズムが見出し１０，１１、これらの患者のかなりの数が長期生存を制限される。これらの患者を治療するためのいくつかの選択肢は、免疫療法に関連させることができる新規化学物質があげられる１２。ＮＫ細胞のＫＩＲ媒介性阻害をブロックすることができる抗ＫＩＲを使用して、最初の臨床試験は、最近公開された７。これは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の同等の患者集団での報告に比べて毒性がないと好意的に全体的なおよび無再発生存率を示している。この療法に対する興味深い代替法は、臨床グレードの生産が効率的であることが証明されたため、同種異系ＮＫ細胞を使用する１３及び造血細胞移植は安全と思われる後Ｋ細胞媒介性治療を行う方法がある１４−１６。しかし、ＮＫ細胞は、さまざまな生理活性を維持する異なるサブセットがあり、均一な集団ではない。また、異なるパターンでのＮＫ細胞の活性化は（例えば、サイトカインｖｓ標的細胞）異なる転写パターン由来である１７。より高い抗腫瘍活性を有する集団を同定し、増殖のために選択し、及び／又は患者への注入のためにそれらを選択することは関心が高い。
【０００５】
タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）の分化、分裂周期、細胞増殖や癌化などの細胞プロセス調節する１８。ＣＤ４５は、特に造血細胞で発現されるＰＴＰＲＣ遺伝子によってコードされるＰＴＰである１９。ＣＤ４５は、受容体複合体の構成要素との直接的な相互作用によって、または様々なＳｒｃファミリーキナーゼ（ＳＦＫ）（すなわちＬｃｋ）を脱リン酸化し、活性化することにより、受容体シグナル伝達を調節する２０。しかし、ＪＡＫキナーゼ阻害することによって２１、またはＳｒｃの活性化残基を脱リン酸化することによって２０、サイトカイン受容体のシグナル伝達を阻害することができる。ＣＤ４５活性は、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）表現型で、その欠乏の結果、マウス２２−２４と人間２５，２６の両方で、効率的な免疫応答に重要である。これは、このホスファターゼの高発現とその複雑な制御を説明することができる。
【０００６】
ＣＤ４５の発現は、細胞の成熟と共に増加する２７。ＣＤ４５ファミリーは、単一の複雑な遺伝子に由来するいくつかのメンバーを含む２７。ナイーブＴリンパ球は、通常、長いＣＤ４５ＲＡアイソフォームに対して陽性である。活性化記憶Ｔ細胞はＣＤ４５ＲＯ（ＣＤ４５ｍＲＮＡ前駆体の活性化によって誘発される選択的スプライシングによって最短ＣＤ４５アイソフォーム）を発現する２７−３０。ＣＤ４５ＲＯの発現は、メモリーＮＫ細胞を識別することが示唆されている３１。
【０００７】
ＣＤ４５の機能のほとんどの研究は、Ｔ細胞でされてきた。ＣＤ４５は積極的に、ＳＦＫｓの阻害部位を脱リン酸化する能力を介してこれらの細胞の活性化を調節し、サイトカインおよびケモカインの産生を誘導することが一般的に認められているが、ＮＫ細胞上のその機能についてはあまり知られていない。しかし、ＣＤ４５欠損マウス由来のＮＫ細胞はインビトロでの細胞毒性をほんのわずかであるが損なわれている３２〜４。また、ＴおよびＢ細胞とは対照的に、ＣＤ４５欠損ＮＫ細胞は、複数のリン酸化たんぱく質の基底レベルのリン酸化の増加を示し、これは、ＳＦＫｓの活性化チロシン残基を含む、ＮＫ細胞で複数の基質を脱リン酸化することを示唆している３４。ｉｎ  ｖｉｖｏでの研究は、ＣＤ４５欠損ＮＫ細胞は、脱顆粒を含むすべての免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）依存性ＮＫ細胞機能の機能障害によってサイトメガロウイルス感染からマウスを保護しないことを示している３５。上に引用した結果のほとんどは、マウスモデルにおいて得られたものであるが、人間のスケッチを反映するものではなかった。したがって、活性化の種類や強さに依存する可能性があるヒトＮＫ細胞におけるＣＤ４５の役割は、未解決の問題である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、血液癌を診断するための方法に関する。特に、本発明は、特許請求の範囲によって定義される。
【０００９】
ＮＫ細胞リンパ球系統は、抗腫瘍免疫応答において重要な役割を果たしている。完全な成熟ＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６＋集団は、この機能へ関連性の高い細胞溶解活性を示したが、それの原因となる細胞についてはほとんど知られていない。リンパ球系統の主要なマーカーの一つは、休止Ｔ細胞が発現するｓｈｏｒｔＣＤ４５ＲＯアイソフォームとエフェクター／メモリーＴ細胞が発現するｌａｒｇｅＣＤ４５ＲＡアイソフォームの２つの主要なアイソフォームで存在するホスファターゼＣＤ４５である。ここで、本発明者らは、健康なドナーからのＮＫ細胞は、ほとんどＣＤ４５ＲＡｈｉｇｈＲＯ−であるのに対し、それらの３％は、ＣＤ４５ＲＡｄｉｍＲＯ−で、これはＨＳＣ同種移植患者で１０倍以上豊富で、主に未成熟な細胞に相当することを発見した。血液癌患者も彼らの完全な成熟したＮＫ細胞区画内で発見されたこの集団の５倍の増加を示している。しかし、これらの細胞は、高い脱顆粒活性を示さない。これらの患者からのいくつかのＮＫ細胞は、ＣＤ４５ＲＯの発現が生じ、ＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６ｄｉｍに属する、少数のＣＤ４５ＲＡｈｉｇｈＲＯ−細胞と、およびＣＤ４５ＲＡ発現を失っていない細胞の大部分：ＣＤ４５ＲＡＲＯ細胞を生成する。この集団は、完全な成熟区画に属し、抗腫瘍ＮＫ細胞を表す。これは、ＣＤ４５ＲＡＲＯ細胞が：ｉ）すぐ、脱顆粒していること、ｉｉ）高サイズ（ＦＳ）および粒度（ＳＳ）を示すこと、ｉｉｉ）高代謝（ＣＤ７１＋）を示すこと、およびｉｖ）増殖している（Ｋｉ−６７＋）に基づく。これらの細胞は抗腫瘍機能を実行することが決定的な証拠は、それらがヒト白血病患者においてインビボでトロゴサイトーシス（ｔｒｏｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）を実行したという事実によって導きだされる。血液または骨髄中ＣＤ４５ＲＡＲＯＮＫ細胞の存在は、血液由来癌患者を識別し、診断ツールとして使用することができる。
【００１０】
従って、本発明は、ｉ）患者から得られた試料中のＣＤ４５ＲＡＲＯ  ＮＫ細胞の存在を検出すること；並びにｉｉ）ＣＤ４５ＲＡＲＯ  ＮＫ細胞試料中に検出された時、患者が血液癌に罹患していると結論することを含む、患者における血液学的癌を診断するための方法である。
【００１１】
本明細書で使用する用語「血液癌」または「血液由来癌」は、当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、通常は血液細胞または骨髄細胞から発生する癌を意味する。
【００１２】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、白血病、リンパ腫および骨髄腫からなる群から選択される血液癌を診断するのに特に適している。
【００１３】
いくつかの実施形態では、リンパ腫などの血液学的癌は成熟（末梢）Ｂ細胞新生物である。特定の実施形態では、成熟Ｂ細胞新生物は、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫Ｂ細胞前リンパ球性白血病。リンパ球性リンパ腫；脾臓辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（＋／−絨毛リンパ球）などの辺縁帯リンパ腫；節性辺縁帯リンパ腫（＋／−単球様Ｂ細胞）および粘膜関連リンパ組織の節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＭＡＬＴ）タイプ；有毛細胞白血病；形質細胞性骨髄腫／プラズマ細胞腫；濾胞性リンパ腫、濾胞中心（Follicular lymphoma, follicle center）；マントル細胞リンパ腫；大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、および原発性滲出液リンパ腫を含む）；およびバーキットリンパ腫／バーキット細胞白血病からなる群から選択される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、リンパ腫のような血液癌は多発性骨髄腫（ＭＭ）、および非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症（Waldenstrom's macroglobulinemia：WM）またはＢ細胞リンパ腫及び拡散大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）をからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）は二つのカテゴリー、アグレッシブ(aggressive)  ＮＨＬまたは無痛性（indolent）ＮＨＬのいずれに該当する。アグレッシブＮＨＬは急速に成長して、比較的迅速に被験者の死につながる可能性がある。未治療の生存期間は数ヶ月あるいは数週間で測定することができる。アグレッシブＮＨＬの例としては、Ｂ細胞新生物、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ／ＮＫ細胞新生物、未分化大細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性白血病／リンパ腫、前駆Ｔリンパ芽球性白血病／リンパ腫バーキットリンパ腫、成人Ｔ細胞リンパ腫／白血病（ＨＴＬＶ１＋）、原発性ＣＮＳリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、多形移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、真性組織球性リンパ腫（true histiocytic lymphoma：悪性組織球増殖症）、及び芽球性ＮＫ細胞リンパ腫を含む。アグレッシブＮＨＬの最も一般的なタイプは、びまん性大細胞リンパ腫である。無痛性ＮＨＬは遅い成長しており、疾患が進行した段階に進行するまで、ほとんどの被験者のための明らかな症状が表れない。無痛性ＮＨＬの被験者の未治療の生存率は、年間で測定することができる。非限定的な例としては、濾胞性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫（たとえば節外性辺縁帯リンパ腫（ＭＡＬＴリンパ腫組織とも呼ばれる粘膜関連リンパ）、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（単球様Ｂ細胞リンパ腫）、脾臓周辺帯リンパ腫））、およびリンパ性リンパ腫（ワルデンストレームマクログロブリン血症）を含む。いくつかの例において組織学的形質転換が発生してもよい、例えば、被験者における無痛性ＮＨＬはアグレッシブＮＨＬに変換してもよい。
【００１５】
いくつかの実施形態では、白血病などの血液癌は急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、および小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）なる群から選択されます。急性リンパ性白血病は、急性リンパ芽球性白血病として知られており、本明細書において互換的に使用されてもよいです。両方の用語は、骨髄中の白血球、リンパ球、から始まる癌のタイプを記述する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、試料は血液試料であるか、または骨髄試料である。
【００１７】
本明細書で使用する用語「血液サンプル」は、当該分野におけるその一般的な意味は、典型的には、患者から得られた全血試料を意味する。いくつかの実施形態において、血液試料は、ＰＢＭＣサンプルである。本明細書で使用する用語「ＰＢＭＣ」または「末梢血単核細胞」または「未分画ＰＢＭＣ」は、全ＰＢＭＣを指し、すなわち、所与のサブについて富化されていない円形の核を有する白血球を指す。典型的には、ＰＢＭＣサンプルは（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫ  Ｔ細胞とＤＣ前駆体を含む）非接着ＰＢＭＣを含有する選択工程に供されていてもよい。本発明のＰＢＭＣサンプルは、したがって、リンパ球（Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞）を含む。典型的に、これらの細胞を、血液の層を分離するフィコール（Ficoll）、親水性多糖を用いて、プラズマの下層セルリングを形成させて、全血から抽出することができる。さらに、ＰＢＭＣは、赤血球を優先的に溶解する低張溶解緩衝液を用いて全血から抽出することができる。このような手順は、当業者に知られている。ＮＫ細胞は陰性枯渇法またはＦＡＣＳソーティング方法によって、パーコール（Percoll）密度勾配によって調製することができる。これらの細胞は、アビジン−ビオチン系を用いてカラム免疫吸着によって、または抗体でグラフトされたマイクロビーズを用いて免疫選択によって単離することができる。必要に応じてプラスチック付着法と組み合わせて、これらの異なる技術の組み合わせを使用することも可能である。
【００１８】
本明細書で使用される用語「骨髄サンプル」は、当該技術分野におけるその一般的な意味を有します。用語「骨髄サンプル」は吸引により骨髄腔を引き出される骨髄吸引物を含み、これに限定しないが、骨髄吸引および骨髄生検を含む。
【００１９】
本明細書で使用する用語「ＮＫ細胞」は、当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を指す。当業者は容易に、例えば、特定の表現型マーカー（例えば、ＣＤ５６）の発現および種々のサイトカインの種類や細胞毒性を誘導する能力を発現する能力を決定することによってＮＫ細胞を同定することができる。
【００２０】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、試料（例えば、ＰＢＭＣサンプル）中のＮＫ細胞の集団を単離することからなるステップを含む。ＮＫ細胞を単離するための方法は当技術分野で周知である。ＮＫ細胞は、非標的細胞の枯渇によって分離されている（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞．．．）。非標的細胞は、系統特異的抗原に対するビオチン標識抗体のカクテルとマイクロビーズのカクテルで間接的かつ磁気的に標識される。標識されていないＮＫ細胞はカラムに素通りし、一方磁気標識された非標的細胞は、ＭＡＣＳセパレーターの磁場にＭＡＣＳカラム内でそれらを保持することにより枯渇される。濃縮されたＮＫ細胞の純度は、フローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡により評価することができる。
【００２１】
本明細書で使用する用語「ＣＤ４５ＲＡＲＯ  ＮＫ細胞」は両方のマーカーＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯを発現するＮＫ細胞のサブセットを指す。
【００２２】
本明細書で使用する用語「ＣＤ４５」は、当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、特に造血細胞で発現されるＰＴＰＲＣ遺伝子によってコードされるタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）を意味する１９。ＣＤ４５すなわちＬｃｋの（ＳＦ）受容体複合体の構成要素との直接的な相互作用によって、または種々のＳｒｃファミリーキナーゼを活性化し、脱リン酸化による受容体シグナル伝達を調節する２０。しかし、ＪＡＫキナーゼを阻害することによって、またはＳｒｃの活性化残基を脱リン酸化することにより、サイトカイン受容体のシグナル伝達を阻害することができる２０。典型的には、ＣＤ４５の二つのアイソフォーム：ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯを区別することが可能である。用語「ＣＤ４５ＲＡ」はＣＤ４５遺伝子のエキソン４が発現していないＣＤ４５アイソフォームを指す。用語「ＣＤ４５ＲＯ」は、ＣＤ４５遺伝子のエキソン４、５、および６が発現されないＣＤ４５アイソフォームを指す。
【００２３】
典型的には、患者の血液サンプル中ＣＤ４５ＲＡＲＯ  ＮＫ細胞の存在は、いくつかの特定の細胞表面マーカーの存在および／または非存在を検出することからなる。細胞表面（例えば、ＮＫ細胞の表面）に特異的表面マーカーの発現を検出するための標準的な方法は、当技術分野において周知である。典型的には、ＣＤ４５ＲＡＲＯ  ＮＫ細胞の存在を検出することからなるステップは、他の細胞からＮＫ細胞を区別するのに適している結合パートナーのセットと、ＣＤ４５ＲＡに特異的な指向を有する少なくとも一つの特異的（differential）結合パートナーとＣＤ４５ＲＯ特異的な指向を有する少なくとも一つの特異的（differential）結合パートナーのセットの使用を含む。
【００２４】
本明細書で使用する用語「表面マーカーに特異的な指向を有する結合パートナー」は、表面マーカーに特異的な指向の「高親和性で前記表面マーカー（例えばＣＤ４ＲＡまたはＣＤ４５Ｒ０）を結合することができる任意の分子（天然または天然でない）を意味する。結合パートナーは限定されないが、抗体、アプタマー、およびペプチドが含まれる。結合パートナーは、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る抗体、好ましくはモノクローナル（例えば、Kit Milteny社製ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯ抗体）であってもよい。いくつかの実施形態では、結合パートナーは、アプタマーのセットであってもよい。
【００２５】
本発明のポリクローナル抗体またはその断片は、例えば、とりわけ、ブタ、ウシ、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、およびマウスから選択された宿主動物に適切な抗原またはエピトープを投与することにより、公知の方法に従って得ることができる。当技術分野で公知の種々のアジュバントは、抗体産生を増強するために使用することができる。本発明の実施に有用な抗体は、ポリクローナルであってもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。本発明のモノクローナル抗体またはその断片は、培養中の連続細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技術を用いて調製単離することができる。産生および単離のための技術としては、元々のハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術およびＥＢＶハイブリドーマ技術に限定されない。  
【００２６】
いくつかの実施形態では、結合パートナーはアプタマーであってもよい。アプタマーは、分子認識の用語で抗体の代替を表す分子のクラスである。アプタマーは、高い親和性および特異性で、事実上の標的分子の任意のクラスを認識する能力を有するオリゴヌクレオチドまたはオリゴペプチド配列である。このようなリガンドは、ランダム配列ライブラリーの指数関数的濃縮（ＳＥＬＥＸ）によってリガンドの系統的進化を通して単離することができる。ランダム配列ライブラリーは、ＤＮＡまたはＲＮＡのコンビナトリアル化学合成によって得ることができる。このライブラリーでは、各メンバーは、独特の配列の、最終的に化学的に修飾された、線状のオリゴマーである。ペプチドアプタマーは、２ハイブリッドの方法によってコンビナトリアルライブラリーから選択され、大腸菌チオレドキシンＡなどのプラットフォームタンパク質によって提示された立体配座的に制限された抗体可変領域、から構成されている。
【００２７】
そのような抗体またはアプタマーのような本発明の結合パートナーは、典型的には、検出可能な分子または物質、好ましくは蛍光分子、または放射性分子または当技術分野で公知の任意の他のラベルで標識される。ラベルは、一般的に（直接的または間接的に）シグナルを提供する当該技術分野で知られている。本明細書で使用される、用語「標識」は、抗体またはアプタマーに関して、フルオロフォア［例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはフィコエリトリン（ＰＥ）またはインドシアニン（Ｃｙ５）］）または放射性物質をカップリング（すなわち、物理的に連結）による抗体またはアプタマーの直接標識を包含することが意図されてだけでなく、検出可能な物質との反応性によるプローブまたは抗体の間接標識を含む。本発明の抗体またはアプタマーは、当技術分野で公知の任意の方法によって放射性分子で標識することができる。例えば、放射性分子が含まれるが、I１２３、I１２４、I１１１、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８のようなシンチグラフィー研究用の放射性原子限定されるものではない。いくつかの実施形態では、抗体は、既にフルオロフォアに結合される（例えば、ＦＩＴＣコンジュゲートおよび／またはＰＥ結合）。
【００２８】
上記アッセイは、典型的には、固体支持体への結合パートナー（すなわち抗体またはアプタマー）の結合を伴う。固体表面は、結合パートナーでコーティングされたマイクロタイタープレートでありうる。ＮＫ細胞サンプルのインキュベーションの後、特異的結合パートナーに結合したＮＫ細胞は一般的なＮＫ細胞マーカーに対する抗体を用いて検出することができる。また、固体表面は、活性化ビーズ、磁気反応性ビーズなどのビーズであってもよい。さらに、ビーズには、異なる材料、これらに限定されないが、ガラス、プラスチック、ポリスチレン、及びアクリルで作られていてもよい。また、ビーズは、好ましくは蛍光で標識されている。好ましい実施形態では、蛍光ビーズは、ベクトン・ディッキンソンＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（サンノゼ、カリフォルニア州）から入手可能なＴｒｕＣｏｕｎｔ（登録商標）チューブに含まれる。
【００２９】
本発明によれば、フローサイトメトリーの方法はＣＤ４５ＲＡＲＯ  ＮＫ細胞を検出するための好ましい方法である。前記方法は当技術分野で周知である。例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）は、したがって、使用されてもよい。典型的には、例えば、ここに以下の実施例に記載のようなＦＡＣＳ法が使用される。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、さらに少なくとも一つのＣＤ４５ＲＡＲＯ  ＮＫ細胞上の表現型のマーカーの存在を検出する工程を含み；ここで少なくとも一つの表現型マーカーの存在は、血液がんの性質を示す。
【００３１】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の表現型マーカーを検出するステップを含む。
【００３２】
いくつかの実施形態では、表現型マーカーはＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ１ｅ、ＣＤ２、ＣＤ３ｄｅｌｔａ、ＣＤ３ｅｐｓｉｌｏｎ、ＣＤ３ｇａｍｍａ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８ａｌｐｈａ、ＣＤ８ｂｅｔａ、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤｗｌ２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５ｕ、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤｗｌ７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、  ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４２ｄ、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｒ、ＣＤ４６、ＣＤ４７Ｒ、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、  ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６０ａ、ＣＤ６０ｂ、ＣＤ６０ｃ、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６５、ＣＤ６５ｓ、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、  ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ６６ｆ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７５ｓ、ＣＤ７７、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、  ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９２、ＣＤｗ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１０１、ＣＤ１０２、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ１０８、ＣＤ１０９、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１２、  ＣＤｗ１１３、ＣＤ１１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１１８、ＣＤｗ１１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤｗ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤｗｌ２５、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤｗｌ２８ａ、ＣＤｗｌ２８ｂ、ＣＤ１２９、ＣＤ１３０、ＣＤ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤｗｌ３６、ＣＤｗｌ３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１３９、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤｗｌ４５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤｗｌ４９、ＣＤ１５０、ＣＤ１５１、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６ａ、ＣＤ１５６ｂ、ＣＤｗｌ５６Ｃ、ＣＤ１５７、ＣＤ１５８、ＣＤ１５９ａ、ＣＤ１５９ｃ、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１６２、ＣＤ１６２Ｒ、ＣＤ１６３、ＣＤ１６４、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６、ＣＤ１６７ａ、ＣＤ１６８、ＣＤ１６９、ＣＤ１７０、ＣＤ１７１、ＣＤ１７２ａ、ＣＤ１７２ｂ、ＣＤ１７２ｇ、ＣＤ１７３、ＣＤ１７４、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７６、ＣＤ１７７、ＣＤ１７８、ＣＤ１７９ａ、ＣＤ１７９ｂ、ＣＤ１８０、ＣＤ１８１、ＣＤ１８２、ＣＤ１８３、ＣＤ１８４、ＣＤ１８５、ＣＤｗｌ８６、ＣＤ１９１、ＣＤ１９２、ＣＤ１９３、ＣＤ１９５、��Ｄ１９６、ＣＤ１９７、ＣＤｗｌ９８、ＣＤｗｌ９９、ＣＤｗｌ９７、  ＣＤ２００、ＣＤ２０１、ＣＤ２０２ｂ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ２０４、ＣＤ２０５、ＣＤ２０６、ＣＤ２０７、ＣＤ２０８、ＣＤ２０９、ＣＤｗ２１０、ＣＤ２１２、ＣＤ２１３ａｌ、ＣＤ２１３ａ２、ＣＤｗ２１７、ＣＤｗ２１８ａ、ＣＤｗ２１８ｂ、ＣＤ２２０、ＣＤ２２１、ＣＤ２２２、ＣＤ２２３、ＣＤ２２４、ＣＤ２２５、ＣＤ２２６、ＣＤ２２７、ＣＤ２２８、ＣＤ２２９、ＣＤ２３０、ＣＤ２３１、ＣＤ２３２、ＣＤ２３３、ＣＤ２３４、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２３５ｂ、ＣＤ２３５ａｂ、ＣＤ２３６、ＣＤ２３６Ｒ、ＣＤ２３８、ＣＤ２３９、ＣＤ２４０ＣＥ、ＣＤ２４０Ｄ、ＣＤ２４０ＤＣＥ、ＣＤ２４１、ＣＤ２４２、ＣＤ２４３、ＣＤ２４４、ＣＤ２４５、ＣＤ２４６、ＣＤ２４７、ＣＤ２４８、ＣＤ２４９、ＣＤ２５２  ＣＤ２５３、ＣＤ２５４、ＣＤ２５６、ＣＤ２５７、ＣＤ２５８、ＣＤ２６１、ＣＤ２６２、ＣＤ２６３、ＣＤ２６４、ＣＤ２６５、ＣＤ２６６、ＣＤ２６７、ＣＤ２６８、ＣＤ２６９、ＣＤ２７１、ＣＤ２７２、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ２７５、ＣＤ２７６、ＣＤ２７７、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＣＤ２８０、ＣＤ２８１、ＣＤ２８２、ＣＤ２８３、ＣＤ２８４、ＣＤ２８９、ＣＤ２９２、ＣＤｗ２９３、ＣＤ２９４、ＣＤ２９５、ＣＤ２９６、ＣＤ２９７、ＣＤ２９８、ＣＤ２９９、ＣＤ３００ａ、ＣＤ３００ｃ、ＣＤ３００ｅ、ＣＤ３０１、ＣＤ３０２、ＣＤ３０３、ＣＤ３０４、ＣＤ３０５、ＣＤ３０６、ＣＤ３０７、ＣＤ３０９、ＣＤ３１２、ＣＤ３１４、ＣＤ３１５、ＣＤ３１６、ＣＤ３１７、ＣＤ３１８、ＣＤ３１９、ＣＤ３２０、ＣＤ３２１、ＣＤ３２２、ＣＤ３２４、ＣＤｗ３２５、ＣＤ３２６、ＣＤｗ３２７、ＣＤｗ３２８、ＣＤｗ３２９、ＣＤ３３１、ＣＤ３３２、ＣＤ３３３、ＣＤ３３４、ＣＤ３３５、ＣＤ３３６、ＣＤ３３７、ＣＤｗ３３８、およびＣＤ３３９からなる群から選択されたＣＤ分子である。
【００３３】
典型的に、ＣＤ５、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ１０３、Ｐａｘ−５、カッパ、ラムダ、ＣＤ２００、細胞質カッパまたは細胞質ラムダからなる群から選択される少なくとも一つの表現型マーカーの存在は、血液癌は、Ｂ細胞から生じることを示す。たとえば、表Ａは、Ｂ細胞から生じる血液癌の典型的な表現型マーカーを示している。
【表１】
0006805137.tif 000002
【００３４】
典型的に、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＴＣＲα-β、ＴＣＲγ-δ、およびＣＤ３からなる群から選択される少なくとも一つの表現型マーカーの存在は、血液癌がＴ細胞に由来することを示す。
【００３５】
典型的には、のＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３、ＣＤ１４（ＭＯ２）、ＣＤ１４（ＭＹ４）、ＣＤ１５、ＣＤ３３、ＣＤ４１、ＣＤ６１、ＣＤ６４、ＣＤ１１７、ＣＤ２３５ａおよびミエロペルオキシダーゼからなる群から選択される少なくとも一つの表現型マーカーの存在は、血液癌が骨髄細胞に由来することを示す。
【００３６】
典型的には、表現型マーカーの検出は、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯのために行ったように同じプロトコルに従って行われます。したがって、細胞選別（ＦＡＣＳ）を活性化表現型マーカー及び蛍光の存在を決定するために使用することができる結合パートナーのパネルを用いることが好ましい。
【００３７】
患者が血液癌に罹患していると診断されると、医師は、最も正確な治療を患者に投与するための選択肢を取ることができる。典型的には、治療は、化学療法、放射線療法、および免疫療法を含む。
【００３８】
従って、本発明はまた、以下の工程を含む、必要とする対象における血液学的癌を治療する方法に関する：
（i）本発明の方法に従った方法を実行することにより、血液癌を有する被験体を同定すること、
（ii）血液癌を有する対象を、化学療法剤、標的癌治療、免疫療法剤または放射線療法剤で治療すること。
【００３９】
いくつかの実施形態では、一度血液癌に罹患していると診断された患者は、化学療法剤と共に投与される。「化学療法剤」という用語は、腫瘍増殖を阻害するのに有効である化学化合物を指す。化学療法剤の例には、チオテパ（thiotepa）やシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）などのアルキル化剤；  ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン等のアルキルスルホン酸塩；  ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、およびウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）などのアジリジン；  アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド（ｔｒｉｅｔｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリエチレンチオホスホラミド（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈａｏｒａｒｎｉｄｅ）とトリメチローロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含むエチレンイミンおよびメチルアメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）；（特にブラタシンとブラタシノンである）アセトゲニン；  （合成アナログトポテカンを含む）カンプトテシン；  ブリオスタチン；  カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）；  （そのアドゼレシン、カルゼレシンとビゼレシン（ｂｉｚｅｌｅｓｉｎ）合成類似体を含む）ＣＣ−１０６５；  （特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８である）クリプトフィシン；  ドラスタチン；  デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９とＣＢＩ−ＴＭＩを含む）；  エレウテロビン；  パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；  サルコジクチン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；  スポンギスタチン；  クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラヌスオタチン（ｅｓｔｒａｒｎｕｓｔｉｎｅ）、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；  カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソ尿素；  エンジイン抗生物質などの抗生物質（例えばカリケアマイシン、特にカリケアマイシン（１１およびカリケアマイシン  ２１１、例えば、Agnew Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186 (1994)参照）；ダイネミシンＡ含むダイネミシン；  エスペラミシン；  ならびにネオカルチノスタチン発色団および関連色素タンパク質エネジイン抗生物質クロモモフォア（ｃｈｒｏｍｏｍｏｐｈｏｒｅｓ）、アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎｓ）、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カニノマイシン（ｃａｎｎｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソ���ビシン、シアノモルフォリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンとデオキシドキソルビシン（ｄｅｏｘｙｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）を含む）、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダナルビシン（ｉｄａｎｒｂｉｃｉｎ）、マーセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガランシン（ｎｏｇａｌａｒｎｙｃｉｎ）、オリボマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎｓ）、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ステレプトミグリン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｇｒｉｎ）、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；  メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの抗代謝産物；  デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、トリメトレキセートなどの葉酸類似体；  フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）、チオグアニンなどのプリン類似体；  アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵなどのピリミジン類似体；  カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；  アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤；  ｆｒｏｌｉｎｉｃ酸などの葉酸補充液；  アセグラトン；  アルドホスファルニド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｒｎｉｄｅ）グリコシド；  アミノレブリン酸；  アムサクリン；  ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；  ビサントレン；  エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；  デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；  デメコルチン；  ジアジクオン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；  エルフォルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；  エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ）アセテート；  エポチロン；  エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕｃｉｄ）；  硝酸ガリウム；  ヒドロキシウレア；  レンチナン；  ロニダミン；  メイタンシンおよびアンサマイトシンのようなメイタンシノイド；  ミトグアゾン；  ミトキサントロン；  モピダモール（ｍｏｐｉｄａｍｏｌ）；  ニトラクリン（ｎｉｔｒａｃｒｉｎｅ）；  ペントスタチン；  フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；  ピラルビシン；  ポドフィリニック（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ）酸；  ２−エチルヒドラザイド；  プロカルバジン；  ＰＳＫ（登録商標）；  ラゾキサン（ｒａｚｏｘａｎｅ）；  リゾキシン；  シゾフィラン；  スピロゲナニウム（ｓｐｉｒｏｇｅｎｎａｎｉｕｍ）；  テヌアゾン酸；  トリアジコン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；  ２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアルニン（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉｅｔｈｙｌａｒｎｉｎｅ）；トリコテセン（特にＴ−２トキシン、ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ  Ａ、ｒｏｒｉｄｉｎＡ及びａｎｇｕｉｄｉｎｅ）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；  ｍｉｔｏｂｒｏｍｔｏｌ；ミトラクトール、ピポブロマン、��ａｃｙｔｏｓｉｎｅ；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；  シクロホスファミド；  チオテパ；  タキソイド、例えばパクリタキセル（タキソール（登録商標）、Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N］。）およびドセタキセル（タキソテール（登録商標）、Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；  クロラムブシル；  ゲムシタビン；  ６−チオグアニン；  メルカプトプリン；  メトトレキサート；  例えば、シスプラチンやカルボプラチンなどの白金類似体；  ビンブラスチン；  白金；  エトポシド（ＶＰ−１６）；  イホスファミド；  マイトマイシンＣ；  ミトキサントロン；  ビンクリスチン；  ビノレルビン；  ナベルビン；  ノバントロン；  テニポシド；  ダウノマイシン；  アミノプテリン；  ゼローダ；  イバンドロネート；  ＣＰＴ−１  １；  トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ  ２０００；  ジフルオロメチルオルニチン（difluoromethylornithine）（ＤＭＦＯ）；  レチノイン酸；  カペシタビン；  そして上記のいずれかの薬理学的に許容されるその塩、酸、または誘導体。また、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、４（５）−イミダゾールを阻害するアロマターゼ、４−ヒドロキシ、トリオキシフェン（ｔｒｉｏｘｉｆｅｎｅ）、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ  １１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含めた抗エストロゲン；並びにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンなどの抗アンドロゲンなどの腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤；及び薬理学的に許容されるその塩、酸、または誘導体はこの定義に含まれる。
【００４０】
いくつかの実施形態では、一旦血液癌に罹患していると診断された患者は、標的癌治療で投与される。標的癌治療は、癌の増殖、進行、および普及に関与している特定の分子（「分子標的」）に干渉することにより、癌の増殖と拡散を阻止する薬物または他の物質である。標的癌治療は時には「分子標的薬」、「分子標的治療薬」、「精密薬」または類似の名前と呼ばれている。いくつかの実施形態では、標的治療は、チロシンキナーゼ阻害剤を患者に投与することから成る。用語「チロシンキナーゼ阻害剤」は、受容体および／または非受容体チロシンキナーゼのような選択的または非選択的阻害剤として作用する治療薬または薬物の種々のいずれかを意味する。チロシンキナーゼ阻害剤及び関連化合物は、当技術分野で知られており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開２００７／０２５４２９５に記載されている。当業者には理解されるように、チロシンキナーゼ阻害剤に関連する化合物は、このチロシンキナーゼ阻害剤と同じ効果が得られる、例えば、シグナル伝達経路のチロシンキナーゼの別のメンバーに作用し、このチロシンキナーゼのチロシンキナーゼ阻害剤と同じ効果が得られる。本発明の実施形態の方法での使用に適したチロシンキナーゼ阻害剤と関連化合物は、限定されないが、ダサチニブ（ＢＭＳ−３５４８２５）、ＰＰ２、ＢＥＺ２３５、サラカチニブ（ｓａｒａｋａｔｉｎｉｂ）、ゲフィチニブ（イレッサ）、スニチニブ（スーテント；ＳＵ１１２４８）、エルロチニブ（タルセバ；ＯＳＩ−１７７４）、ラパチニブ（ＧＷ５７２０１６；  ＧＷ２０１６）、カネルチニブ（ＣＩ１０３３）、ｓｅｍａｘｉｎｉｂ（ＳＵ５４１６）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）、ソラフェニブ（ＢＡＹ  ４３−９００６）、イマチニブ（グリベック、ＳＴＩ５７１）、レフルノミド（ＳＵ１０１）、バンデタニブ（Ｚａｃｔｉｍａ；ＺＤ６４７４）、ＭＫ−２２０６（８−［４−アミノシクロブチル）フェニル］−９−フェニル−１，２，４−トリアゾロ［３，４−ｆ］の［１，６］ナフチリジン３（２Ｈ）−オン塩酸塩）、その誘導体、そのアナログ、およびそれらの組み合わせを含む。さらに本発明での使用に適したチロシンキナーゼ阻害剤と関連化合物は、例えば、米国特許公開２００７／０２５４２９５、米国特許番号５６１８８２９、５６３９７５７、５７２８８６８、５８０４３９６、６１００２５４、６１２７３７４、６２４５７５９、６３０６８７４、６３１３１３８、６３１６４４４、６３２９３８０、６３４４４５９、６４２０３８２、６４７９５１２、６４９８１６５、６５４４９８８、６５６２８１８、６５８６４２３、６５８６４２４、６７４０６６５、６７９４３９３、６８７５７６７、６９２７２９３、および６９５８３４０に記載され、これらのすべてはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤は、経口投与され、それは少なくとも一つの第Ｉ相臨床試験の対象、より好ましくは、少なくとも一つの第ＩＩ相臨床、さらにより好ましくは少なくとも１つＩＩＩ臨床試験のそして最も好ましくは、少なくとも一つの血液または腫瘍学的適応症のためにＦＤＡによって承認対象となって��る小分子キナーゼ阻害剤である。そのような阻害剤の例は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、カネルチニブ、ＢＭＳ−５９９６２６（ＡＣ−４８０）、ネラチニブ、ＫＲ−６３３、ＣＥＰ−１１９８１、イマチニブ、イロチニブ（ｉｌｏｔｉｎｉｂ）、ダサチニブ、ＡＺＭ−４７５２７１、ＣＰ−７２４７１４、ＴＡＫ−１６５、スニチニブ、バタラニブ、ＣＰ−５４７６３２、バンデタニブ、ボスチニブ、レスタウルチニブ、Ｔａｎｄｕｔｉｎｉｂ、ミドスタウリン、エンザスタウリン、ＡＥＥ−７８８、パゾパニブ、アキシチニブ、Ｍｏｔａｓｅｎｉｂ、ＯＳＩ−９３０、セジラニブ、ＫＲＮ−９５１、Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ、セリシクリブ、ＳＮＳ−０３２、ＰＤ−０３３２９９１、ＭＫＣ−Ｉ（ＲＯ−３１７４５３；  Ｒ−４４０）、ソラフェニブ、ＡＢＴ−８６９、Ｂｒｉｖａｎｉｂ（ＢＭＳ−５８２６６４）、ＳＵ−１４８１３、Ｔｅｌａｔｉｎｉｂ、ＳＵ−６６６８、（ＴＳＵ−６８）  、Ｌ−２１６４９、ＭＬＮ−８０５４、ＡＥＷ−５４１、およびＰＤ−０３２５９０１を含むが、これらに限定されない。
【００４１】
いくつかの実施形態では、一度血液癌に罹患していると診断された患者は、免疫療法剤と共に投与されます。本明細書で使用される用語「免疫療法剤」は、癌細胞に対する身体の免疫応答を間接的または直接的に増強、刺激しまたは増大する化合物、組成物または治療を意味し、及び／あるいは他の抗癌療法の副作用を減少させる化合物、組成物または治療を意味する。免疫療法は、このように癌細胞に対する免疫系の応答を直接または間接的に刺激または増強し、および／または他の抗がん剤によって引き起こされた副作用を軽減する治療である。免疫療法はまた、免疫療法、生物学的療法、生物学的応答調節療法および生物療法などの当技術分野において言及されています。当技術分野で公知の一般的な免疫療法剤の例としては、サイトカイン、癌ワクチン、モノクローナル抗体および非サイトカインアジュバントを含むがこれに限定されない。あるいは免疫療法治療は、一定量の（Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、Ｂ細胞などの）免疫細胞を患者に投与することからなり得る。
【００４２】
免疫療法剤は非特異的であり得る、すなわち一般的に免疫システムを向上させ、がん細胞の成長及び／又は癌細胞の広がりと戦うことに、人体がより効果的になる、あるいは、それらは特異的であり得る、すなわち、癌細胞自身を標的とし、免疫治療レジメンは非特異的および特異的免疫療法剤の使用を組み合わせてもよい。
【００４３】
非特異的な免疫療法剤は、免疫システムを刺激又は間接的に向上させる。非特異的免疫療法剤は、がんの治療のための主治療のみに用いられるだけでなく、主治療に加えて、非特異的免疫療法剤が、他の治療剤（たとえば、癌ワクチン）の効果を高めるアジュバントとして機能しうる。非特異的な免疫療法剤はまた、この後者の状況において、他の療法の副作用を低減するため、例えば特定の化学療法剤によって誘発される骨髄抑制を低減させるために機能しうる。非特異的免疫療法剤は、キーとなる免疫系細胞に作用し、サイトカインおよび免疫グロブリンの産生増加などの二次応答を引き起こす可能性がある。あるいは、薬剤は、それ自体がサイトカインを含むことができる。非特異的な免疫療法剤は、一般に、サイトカインまたは非サイトカインアジュバントとして分類される。
【００４４】
多くのサイトカインは、免疫系を増強するように設計された一般的な非特異的免疫療法として、または他の治療を設けアジュバントとしてのいずれかの癌の治療に応用されている。適切なサイトカインとしては、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子を含むが、これらに限定されない。
【００４５】
本発明によって企図されるインターフェロン（ＩＦＮ）は、共通のＩＦＮのタイプのＩＦＮ−アルファ（ＩＦＮ−α）、ＩＦＮ−ベータ（ＩＦＮ−β）及びＩＦＮ−ガンマ（ＩＦＮ−γ）が含まれる。ＩＦＮはがん細胞に直接作用し、例えば、その増殖を遅くすることにより、より正常なふるまいをする細胞への分化を促進し、および／または抗原の生産を増加させ、免疫システムの癌細胞の認識及び破壊を容易にする。ＩＦＮはまた、癌細胞に対して間接的に作用すし、例えば、新脈管形成を減速することにより、免疫系を増強および／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞およびマクロファージを刺激する。組換えＩＦＮ−アルファはロフェロン（Roche Pharmaceuticals）とイントロンＡ（Schering Corporation）として市販されている。
【００４６】
本発明によって企図されるインターロイキンは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１１およびＩＬ−１２を含む。市販の組換えインターロイキンの例としては、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）（ＩＬ−２；カイロン社）及びＮｅｕｍｅｇａ（登録商標）（ＩＬ−１２；ワイエス医薬品）が挙げられる。ザイモジェネティクス社（ワシントン州シアトル）は現在、本発明の組合せで使用することが意図されているＩＬ−２１の組換体をテストしている。
【００４７】
本発明によって企図されるコロニー刺激因子（ＣＳＦ）は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦまたはフィルグラスチム）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦまたはサルグラモスチム）、およびエリスロポエチン（エポエチンアルファ、ダルベポエチン）を含む。一つ以上の成長因子を用いた治療は、従来の化学療法を受けている患者に新しい血液細胞の生成を刺激するのを助けることができる。したがって、ＣＳＦでの処置は、化学療法に関連する副作用を減少させるのに役立つことができ、使用される化学療法剤のより高い用量を可能にすることができる。様々な組換えコロニー刺激因子は、市販されている、たとえば、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）（Ｇ−ＣＳＦ；  Ａｍｇｅｎ社）、ニューラスタ（ｐｅｌｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ；  Ａｍｇｅｎ社）、Ｌｅｕｋｉｎｅ（ＧＭ−ＣＳＦ；  Ｂｅｒｌｅｘ）、プロクリット（エリスロポエチン；オーソ・バイオテック）、エポゲン（エリスロポエチン；  Ａｍｇｅｎ社）、Ａｒｎｅｓｐ（ｅｒｙｔｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）がある。
【００４８】
特異的または非特異的な標的を有することに加えて、免疫療法剤は、活性であること、すなわち身体自体の免疫応答を刺激する、またはそれらが受動的であることができ、すなわち、身体の外部で生成された免疫系の成分を含む。
【００４９】
受動的な特異的免疫療法は、典型的には、癌細胞の表面上に見出される特定の抗原に特異的であるか、または、特定の細胞増殖因子に特異的である１つまたはそれ以上のモノクローナル抗体の使用を含む。モノクローナル抗体は、多くの方法で癌の治療に使用することができ、例えば、癌の特定のタイプに対する対象の免疫応答を増強し、血管形成における増殖因子のような、特定の細胞増殖因子を標的とすることによって癌細胞の増殖を妨害し、または化学療法剤、放射性粒子または毒素のような薬剤にリンクまたは結合した場合、癌細胞への他の抗癌剤の送達を増強することによって使用してもよい。
【００５０】
現在、本発明の組み合わせに含めるのに適している癌免疫療法剤として使用されるモノクローナル抗体としては、限定されないが、リツキシマブ（リツキサン（登録商標））、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））、イブリツモマブチウキセタン（ゼバリン（登録商標））、トシツモマブ（ベキサール（登録商標））、セツキシマブ（Ｃ−２２５、アービタックス（登録商標））、ベバシズマブ（アバスチン）、ゲムツズマブ・オゾガミシン（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標））、アレムツズマブ（キャンパス（登録商標））、およびＢＬ２２が含まれる。他の例には、抗ＣＴＬＡ４抗体（例えばイピリムマブ）、抗ＰＤＬ抗体、抗ＰＤＬＬ抗体、抗ＴＩＭＰ３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗Ｂ７Ｈ３抗体、抗Ｂ７Ｈ４抗体または抗Ｂ７Ｈ６抗体が含まれる。いくつかの実施形態において、抗体は、Ｂ細胞枯渇抗体を含む。典型的なＢ細胞枯渇抗体としては、これに限定されるものではないが、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体［例えばリツキシマブ（Ｒｏｃｈｅ社）、イブリツモマブチウキセタン（バイエル・シエーリング）、トシツモマブ（グラクソ・スミスクライン）、ＡＭＥ−１３３Ｖ（アプライドモレキュラーエボリューション）、オクレリズマブ（ロシュ）、オファツムマブ（ＨＵＭＡＸ−ＣＤ２０、Ｇｅｍｎａｂ）、ＴＲＵ−０１５（Ｔｒｕｂｉｏｎ）及びＩＭＭＵ−１０６（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）］；抗ＣＤ２２抗体［例えばエプラツズマブ、レナードら、臨床癌研究（Ｚ００４）１０：５３Ｚ７−５３３４］；抗ＣＤ７９Ａ抗体；抗ＣＤ２７抗体；または抗ＣＤ１９抗体（例えば、米国特許第７１０９３０４）；抗ＢＡＦＦ−Ｒ抗体（例えばベリムマブ、グラクソ・スミスクライン）、抗APRIL抗体（例えば、抗ヒトAPRIL抗体、ＰｒｏＳｃｉ  ＩＮＣ）、および抗ＩＬ−６抗体［例えば、以前De Benedetti et al., J Immunol (2001) 166: 4334-4340及びSuzuki et al., Europ J of Immunol (1992) 22 (8) 1989-1993に記載されている：これらの文献は参照により本明細書に完全に組み込まれる］が含まれる。
【００５１】
免疫療法の治療は、特に、同種移植の造血幹細胞ＨＳＣで同種移植片を構成することができる。Nicholas P. Restifo, Mark E. Dudley and Steven A. Rosenberg “Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response, Nature Reviews Immunology, Volume 12, April 2012によって記載されているように免疫療法の治療はまた、養子免疫療法で構成されてもよい。養子免疫療法は、患者の循環リンパ球、ＮＫ細胞は、インビトロで増幅され、患者に再投与される。活性化リンパ球またはＮＫ細胞は、最も好ましくは、以前の血液または腫瘍試料から単離され、インビトロで活性化（または“増殖”）された患者自身の細胞である。
【００５２】
いくつかの実施形態では、一度血液癌に罹患していると診断された患者は、放射線療法剤と共に投与されます。本明細書で使用する用語「放射線療法剤」は、これに限定するものではないが、癌を治療または改善するのに有効であることが当業者に知られている任意の放射線療法剤を意味することが意図される。例えば、放射線治療剤は、近接照射療法または放射性核種療法で投与されるような薬剤であり得る。このような方法は、必要に応じてさらに、１つまたは複数の追加の癌治療、これらに限定されないが、化学療法、および／または他の放射線治療するのを含むがことができる。
【００５３】
本発明のさらなる態様は、i）患者からの血液試料中のＣＤ４５ＲＡＲＯ  ＮＫ細胞の存在を検出し、及びii）ＣＤ４５ＲＡＲＯ  ＮＫ細胞の存在が、血液試料中に検出されない時、患者の治療が効率的であると結論することを含む、血液癌を患う患者における治療の有効性をモニタリングするための方法に関する。
【００５４】
典型的には、患者は、上記のように治療して投与される。
【００５５】
本発明はさらに、以下の図面及び実施例により説明する。しかしながら、これらの実施例および図面は、本発明の範囲を限定すると決して解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】血液悪性腫瘍および健康なドナー  患者は異なるＮＫ細胞サブセットプロファイルを有す。Ａ）健康なドナーおよび多発性骨髄腫（ＭＭ）患者の血液サンプル（ｂｓ）から、又はＭＭ患者の骨髄（ｂｍｓ）からのＰＢＭＣを染色した。異なるＣＤ４５アイソフォームを発現するＮＫ細胞の割合は、パネルに示される。Ｂ）ＭＭ患者の血液サンプル由来の（ＣＤ４５アイソフォームの発現に基づく）異なるＮＫ細胞サブセットのＦＳとＳＳ値および成熟度（ＣＤ５６／ＣＤ１６発現）。Ｃ）健康なドナーおよび血液癌患者におけるこれらのＮＫ細胞集団の割合。バーは、それぞれの病状のための少なくとも４つの異なる個体の平均±ＳＤを示す。ＨＤ、健康なドナー；  ＭＭ、多発性骨髄腫；  Ｂ−ＣＬＬ、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病；  ＢＣＬ、Ｂ細胞リンパ腫；ＡＭＬ、急性骨髄性白血病；  ｂｓ、血液サンプル；ｂｍｓ、骨髄サンプル。Ｄ）ＮＫ成熟の異なる段階（ＣＤ５６／１６発現）での、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＡＲＯ、ＣＤ４５ＲＡのｄｉｍとＣＤ４５ＲＡｄｉｍＲＯの割合。各点は、ドナーを表す。平均値±ＳＤも示す。
【００５７】
【図２】ＣＭＶ＋患者および血液癌の患者は異なるＮＫ細胞サブセットプロファイルを有する。Ａ）腎臓移植後のＣＭＶ感染の再活性化している患者（ＣＭＶ＋）または再活性化していない患者（ＣＭＶｎｅｇ）からＰＢＭＣを精製し、ＮＫ細胞の割合を算出した。Ｂ）成熟（ＣＤ５６／ＣＤ１６）の異なる段階でのＮＫ細胞の割合の存在量（パーセンテージ）は（Ａ）に記載のサンプルで分析した。Ｃ）各ＮＫ細胞サブセットの割合（ＣＤ４５アイソフォーム／  ＣＤ６９）が示される。（Ｂ）および（Ｃ）のバーは、それぞれの病状のための少なくとも４つの個体の平均±ＳＤを表す。
【００５８】
【図３】ＣＤ６９、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯは異なるＮＫ細胞サブセットを識別する。Ａ）健康なドナー（ＨＤ）と異なる血液学的悪性腫瘍を有する患者からＰＢＭＣを精製し、ＣＤ６９＋の百分率及びＮＫ細胞の成熟度（ＣＤ５６／ＣＤ１６）の異なる段階における細胞を計算した。バーは、それぞれの病状のための少なくとも４つの個体の平均±ＳＤを表す。Ｂ）異なる血液悪性腫瘍と健康なドナー（ＨＤ）患者からのＰＢＭＣにおいてＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ６９を発現する又は発現しないＮＫ細胞の割合が示される。バーは、各医療条件のために、少なくとも４人の平均±ＳＤを表す。Ｃ〜Ｄ）異なる血液由来の癌の患者の血液（ｂｓ）又は骨髄サンプル（ｂｍｓ）からのＮＫ細胞におけるＣＤ４５ＲＯまたはＣＤ４５ＲＡｖｓＣＤ６９の発現を示すグラフ。健康なドナーからの骨髄サンプルは、分析のために利用できなかった。
【００５９】
【図４】ＣＤ４５ＲＯは異なるＮＫ細胞集団を識別する。健康なドナー（ＨＤ）及び異なる血液悪性腫瘍を有する患者からＰＢＭＣを精製した。Ａ）ＮＫ細胞の百万当たり各ＮＫ細胞サブセット（ＣＤ４５／ＣＤ６９の発現）のＣＤ１０７ａ＋細胞の数。バーは、各医療条件のために、少なくとも４人の平均±ＳＤを表す。Ｂ）６つの異なるサブセット（ＣＤ４５／ＣＤ６９）におけるＣＤ１０７ａ＋ＮＫ細胞の割合。Ｃ）上のパネル：ＭＭまたはＡＭＬ患者の骨髄サンプル（ｂｍｓ）から単離された異なるＮＫ細胞サブセットにおける、ＣＤ１０７ａ＋細胞の割合（比較のため、対応する血液試料（ｂｓ）の割合を示す）にもパーセンテージを示す。下のパネル：  Ｋ５６２腫瘍細胞を標的にする曝露後の異なるＮＫ細胞サブセットのＣＤ  １０７ａ＋細胞のパーセンテージを示す（図７に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイ）。Ｄ〜Ｅ）健康なドナー（ＨＤ）又はＢ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）患者の血液サンプルからの六つの異なるＮＫ細胞サブセット（ＣＤ４５／ＣＤ６９）におけるＣＤ７１またはＫｉ−６７を発現するＮＫ細胞のパーセンテージ。バーは、各医療条件のために、少なくとも４人の平均±ＳＤを表す。
【００６０】
【図５】ＣＤ４５ＲＡＲＯ細胞は、腫瘍細胞のトロゴサイトシス（ｔｒｏｇｏｃｙｔｏｓｉｓを）を行う。ＢＣＬ（Ａ）またはＡＭＬ（Ｂ）を有する患者由来のＰＢＭＣを精製し、異なる抗体で染色した。この実験では、ＮＫ細胞集団は、ＣＤ５６＋ＮＫＰ４６＋細胞に対応する。ＣＤ４５ＲＡ／ＲＯに関する各ＮＫ細胞サブセットの細胞の割合は、図に示されている。
【００６１】
【図６】血液悪性腫瘍患者と健康なドナーは異なるＮＫ細胞サブセットプロファイルを有する。Ａ）健康なドナー及び多発性骨髄腫（ＭＭ）を伴う患者の血液サンプル（ｂｓ）からのＰＢＭＣ、ＭＭ患者の骨髄（ＢＭＳ）からのサンプル、あるいは他の血液疾患を有する患者のサンプルを、抗ＣＤ１９（Ｂ細胞）、抗ＣＤ３（Ｔ細胞、ＣＤ３＋ＣＤ５６−）および抗ＣＤ５６（ＮＫ細胞、ＣＤ５６＋ＣＤ３−）を用いてＦＡＣＳ分析のために染色して異なるリンパ球集団を同定し；抗ＣＤ１６を用いて、成熟の異なる段階におけるＮＫ細胞サブセットを同定し；そして抗ＣＤ４５ＲＡ及び抗Ｃｄ４５ＲＯ抗体を用いて染色した。異なるＣＤ４５アイソフォームを発現するＮＫ細胞のパーセンテージは、パネルに示されている。Ｂ）健康なドナーおよび血液癌の患者でのＣＤ４５ＲＡおよびＲＯの発現に基づく、異なるＮＫ細胞集団の割合。集団は、図１Ａの4分割に対応しています：左上（ＣＤ４５ＲＡ）、左下（ＣＤ４５ＲＡｄｉｍ）、右上（ＣＤ４５ＲＡＲＯ）及び右下（ＣＤ４５ＲＡｄｉｍＲＯ）。バーは、健康なドナーの血液（左パネル）または骨髄（右パネル）のサンプルと比較したスチューデントｔ検定における、各医療条件の平均±ＳＤを示す：＊はｐ  ＜０．０１；  ＊＊はｐ  ＜０．００１；  ＊＊＊はｐ  ＜０．０００１。ＨＤ、健康なドナー；  ＭＭ、多発性骨髄腫；  Ｂ−ＣＬＬ、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病；ＢＣＬ、Ｂ細胞リンパ腫；ＡＭＬ、急性骨髄性白血病；ｂｓ、血液サンプル；ｂｍｓ、骨髄サンプル。
【００６２】
【図７】ＣＤ４５ＲＡＲＯ  ＮＫ細胞の機能解析図。Ａ）ＭＭ患者の血液試料由来のＮＫ細胞サブセット（ＣＤ４５アイソフォームの発現に基づく）のＦＳとＳＳ値。Ｂ〜Ｃ）代表的なＢＣＬ患者における異なるＮＫ細胞サブセットにおけるＣＤ７１およびＫｉ６７の発現。Ｄ〜Ｅ）異なる血液由来の癌の患者の血液（ｂｓ）または骨髄サンプル（ｂｍｓ）由来のＮＫ細胞におけるＣＤ４５ＲＯまたはＣＤ４５ＲＡｖｓＣＤ６９の発現を示す代表的グラフ。
【００６３】
【図８】ＣＤ４５ＲＡＲＯは、脱顆粒するＮＫ細胞を識別する。健康なドナー（ＨＤ）及び異なる血液悪性腫瘍を有する患者由来のＰＢＭＣを精製する。Ａ）ＮＫ細胞の百万当たりの、各ＮＫ細胞のサブセット（ＣＤ４５ＲＡ／ＲＯ発現）におけるＣＤ１０７ａ＋細胞の数。バーは、各医療条件の平均±ＳＤを表す（健康なドナーのサンプルと比較したスチューデントｔ検定における）。Ｂ）４つの異なるサブセットにおけるＣＤ１０７ａ＋ＮＫ細胞のパーセンテージ。Ｃ）上部パネル：ＭＭまたはＡＭＬ患者の骨髄サンプル（ｂｍｓ）から単離された異なるＮＫ細胞サブセットにおけるＣＤ１０７ａ＋細胞の割合（対応する血液試料（ＢＳ）のパーセンテージも比較のため示す）；下のパネル：Ｋ５６２腫瘍細胞を標的に暴露した後の、異なるＮＫ細胞サブセットにおけるＣＤ１０７ａ＋細胞の割合（インビトロ細胞毒性アッセイにおいて）。ＰＢＭＣはエフェクター：ターゲットが１０：１の割合においてターゲットＫ５６２腫瘍細胞と４時間インキュベートされた。
【００６４】
【図９】補足図１  ＮＫ細胞サブセットは、血液由来の癌を有する患者において変調される。異なる血液学的悪性腫瘍の患者からのＰＢＭＣはＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６およびＣＤ１６に対する抗体で染色し、図３のように分析された。異なるＣＤ４５アイソフォームを発現するＮＫ細胞のパーセンテージは、グラフに示されている。Ｂ−ＣＬＬ、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病；ＢＣＬ、Ｂ細胞リンパ腫；ＡＭＬ、急性骨髄性白血病；ｂｓ、血液サンプル；ｂｍｓ、骨髄サンプル。
【００６５】
【図１０】補足図２  ＣＤ４５ＲＡdim細胞は、インビトロ活性化後のＣＤ６９の発現を得る。血液サンプルから単離したＰＢＭＣはターゲットＫ５６２腫瘍細胞と、エフェクター：ターゲットが１０：１の割合で、４時間インキュベートされた。ＰＢＭＣを、インビトロ細胞毒性アッセイの終了時に（ａｆｔｅｒ）、またはアッセイの前に（ｂｅｆｏｒｅ）ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６９に対する抗体を用いてｅｘ  ｖｉｖｏで標識した。各ＮＫ細胞サブセットの細胞の割合（ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ６９の発現に基づく）が示されている。Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、またはＢ細胞リンパ腫（ＢＣＬ）を有する２人の患者からの代表的なデータ。
【００６６】
【図１１】補足図３  ＣＤ４５ＲＡＲＯ細胞は、Ｂ−ＣＬＬ患者の腫瘍細胞上トロゴサイトシス（ｔｒｏｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）を行う。Ｂ−ＣＬＬ患者由来のＰＢＭＣを精製し、異なる抗体で染色した。この実験では、ＮＫ細胞集団は、ＣＤ５６＋ＮＫＰ４６＋細胞に対応する。ＣＤ４５ＲＡ／ＲＯに関する各ＮＫ細胞サブセットの細胞の割合は、図に示されている。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００６７】
材料＆方法
細胞培養
Ｋ５６２細胞株（ＡＴＴＣ  ＣＣＬ  ２４３）は、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ  ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）培地）；１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）中で対数増殖に維持した。細胞は、５％ＣＯ２の加湿チャンバー内で３７℃で培養し、１週間に２回１：１０で継代した。骨髄および末梢血試料は、インフォームドコンセントの後に別の血液疾患を有する患者及び、健康なドナーから得た。細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ）を用いて密度勾配遠心分離により精製しました。プライマリー細胞は、加湿大気中、３７℃で５％ＣＯ２を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ  ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）培地）；１０％ＦＢＳ中で培養した。
【００６８】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の精製
ＰＢＭＣはHistopaque - 1077（シグマ）を使用して回収した。簡潔には、３−６ｍｌのＲＰＭＩで１：２希釈した血液または１：３希釈した骨髄サンプルを５ｍｌのHistopaqueの上に添加しました。細胞は３０分間中断せずに１６００ｒｐｍで、２０℃で遠心分離された。単核細胞は、中間の白い輪から収集しました。ＲＰＭＩで洗浄した後、細胞を１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で補充した完全ＲＰＭＩ培地に懸濁した。
【００６９】
患者／健康なドナーの選択
異なる血液癌を有する患者からのデータ及び試料は、患者のインフォームドコンセントの後、フランスＣＨＵモンペリエ、腫瘍学および臨床血液学部門で収集した。患者は “Comites de Protection des Personnes Sud Mediterranee I (ref 1324)”及び ID-RCB: 2011-A00924-37によって承認された二つの独立した臨床プログラムに登録された。
【００７０】
細胞表面マーカーの多色染色
ＰＢＭＣは、７ＡＡＤ（ベックマン）で染色して生細胞を識別し、細胞表面マーカーに対する抗体である、次の抗ＣＤ２５−ＦＩＴＣ、−ＣＤ４５ＲＯ−ＦＩＴＣ、−ＣＤ６９−ＰＥ、−ＣＤ１３８−ＰＥ、−ＣＤ６２Ｌ−ＰＥ、−ＣＤ１９−ＰＥ、−ＣＤ３−ＰＥ、−ＣＤ１９−ＥＣＤ、−ＣＤ３８−ＥＣＤ、−ＣＤ５６−ＰＥＣｙ７、−ＣＤ５６−ＡＰＣ、−ＣＤ３−ＡＰＣ、−ＣＤ４５−ＡＰＣ  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０、−ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０、−ＣＤ１６  ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ、−ＣＤ５７−ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ、−ＣＤ４５−ＫｒｏｍｅＯｒａｎｇｅ、−ＣＤ１６  ＫｒｏｍｅＯｒａｎｇｅ（ベックマン）、−ＣＤ１５８ｂ−ＦＩＴＣ、−ＣＤ１５８ａ−ＰＥ、−ＣＤ１０７ａ−ＨＶ５００、−ＫＩ−６７−Ｖ４５０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）及び−ＣＤ７１−ＡＰＣ（ＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ）抗体で、細胞フェノタイピングのため染色した。簡単に述べると、１×１０６細胞を３７℃で３０分間ＰＢＳ／２％ＦＢＳ中で異なる抗体と共にインキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、２００〜２５０μｌＰＢＳ／２％ＦＢＳに懸濁し、染色はＧａｌｌｉｏｓフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ）とＫａｌｕｚａソフトウェアを用いて分析した。
【００７１】
生存可能なリンパ球は、ＦＳＣ／ＳＳＣおよび７ＡＡＤ染色を用いてゲートした。Ｂリンパ球（ＣＤ１９＋）、Ｔリンパ球（ＣＤ３＋ＣＤ５６−）およびＮＫ細胞（ＣＤ５６＋ＣＤ３−）はＣＤ１９、ＣＤ３またはＣＤ５６の発現に基づいて識別した。ＮＫ細胞は、その後、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯの発現に基づいて、４つの異なる集団に分離した。ＣＤ４５ＲＡ＋ＲＯ−（ＣＤ４５ＲＡ）、ＣＤ４５ＲＡ＋ＲＯ＋（ＣＤ４５ＲＡＲＯ）、ＣＤ４５ＲＡｄｉｍＲＯ＋（ＣＤ４５ＲＡｄｉｍ）、ＣＤ４５ＲＡｄｉｍＲＯ＋（ＣＤ４５ＲＡｄｉｍＲＯ）。これらの異なる集団は、その後、ＣＤ１６、ＣＤ６９、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ５７及びＣＤ１０７ａの発現および細胞サイズ／粒度（ＦＳＣ／ＳＳＣ）について分析した。
【００７２】
インビトロＣＤ１０７ａの脱顆粒アッセイ
ＰＢＭＣの精製およびＮＫ細胞の定量化後、３００万個の細胞を、３７℃で4時間、最終５００μ１（１０％ＦＢＳおよび１０ｕ／ｍｌのＩＬ２を含むＲＰＭＩグルタマックス）体積中、１０：１の：エフェクター（ＮＫ細胞）：ターゲットの比率でターゲットＫ５６２細胞とインキュベートした。培地は、１．５μｌの抗ＣＤ１０７ａは抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、フランクリンレイクス、ニュージャージー州）及びＣＤ１０７ａ分解を防止するため１μｌのモネンシンを含んだ。その後、細胞を、抗ＣＤ４５ＲＯ−ＦＩＴＣ、−ＣＤ６９−ＰＥ、−ＣＤ１９−ＥＣＤ、−７ＡＡＤ、−ＣＤ５６−ＰＥＣｙ７、−ＣＤ３−ＡＰＣ、−ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０、−ＣＤ１０７ａ−ＨＶ５００及び−ＣＤ１６−ＫＯ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ベックマン）を含む抗体カクテル５０μ１に再懸濁された。いくつかの実験では、ＰＢＭＣを標的細胞にも暴露する前に、抗ＣＤ６９及び−ＣＤ４５ＲＡ抗体と共にインキュベートした。サンプルは、Ｋａｌｕｚａソフトウェアを用いた、ベックマンコールターＦＡＣＳ  Ｇａｌｌｉｏｓで分析した。イベントは、最初にリンパ球を識別するために、前方および側方散乱（ＳＳＣ）でゲートしました。ＣＤ３に対するＣＤ５６の二変量プロットは、１０，０００以上のＮＫ細胞を取得するために使用した。
【００７３】
細胞表面や細胞内マーカーのための多色染色
ＰＢＭＣの精製後、１００万個の細胞は、１５分間、室温で１０％正常ヒト血清とのインキュベーションによりプレブロックされ、それから５０μ１の細胞表面マーカーに対するＰＡＮＥＬのＫｉ−６７抗体カクテル（抗ＣＤ４５ＲＯ−ＦＩＴＣ、−ＣＤ６９−ＰＥ、−ＣＤ１９−ＥＣＤ、−ＣＤ３−ＰＥ−Ｃｙ５．５を、−ＣＤ５６−ＡＰＣ、−ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０、−Ｋｉ−６７及び−ＣＤ１６−ＫＯ抗体）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ベックマン）で染色した。細胞を、染色緩衝液で２回洗浄し、２０分間４℃で２５０μ１ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液に再懸濁した。細胞をＢＤ  Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ溶液で２回洗浄した。次に、細胞を暗所で４℃で３０分間、図で説明したように、細胞内マーカーに対する抗体のカクテルを含む５０μ１ＢＤ  Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ溶液中で固定及び透過処理をした。細胞をＢＤ  Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ溶液で２回洗浄し、染色緩衝液に再懸濁した。その後Ｋａｌｕｚａソフトウェアを使用したベックマンコールターＦＡＣＳ  Ｇａｌｌｉｏｓフローサイトメトリー分析を行った。イベントは、最初にリンパ球を識別するために、前方および側方散乱（ＳＳＣ）でゲートしました。ＣＤ３に対するＣＤ５６の二変量プロットは、１０，０００以上のＮＫ細胞を取得するために使用した。
【００７４】
ＥＢＶ細胞培養：
Ｋ５６２細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２４３）、およびリンパ芽球様ＥＢＶ細胞株ＰＬＨ（ＩＨＷ番号：９０４７）は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Gibco）ＲＰＭＩ  １６４０培地（Gibco（登録商標） ＧｌｕｔａＭＡＸTM 培地）中で対数増殖で維持した）。細胞は、空気中５％のＣＯ２の加湿チャンバー内で３７℃で培養し、および１週間に２回１：１０に継代した。
【００７５】
純粋な単一のＮＫ細胞の同定
一次ＣＤ５６＋ＮＫ細胞は、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社、オーバーン、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてＢ細胞リンパ腫の患者のＰＢＭＣから濃縮し、精製した。フローサイトメトリーによるＣＤ５６＋ＮＫ細胞の純度（ＣＤ５６＋ＣＤ３−の％）は、＞９０％であった。精製されたＣＤ５６＋ＮＫ細胞は抗ＣＤ３３５（ＮＫｐ４６の）−ＰＥで染色され、正式に抗ＣＤ４５ＲＡ−ＦＩＴＣ、−ＣＤ４５ＲＯ−ＡＰＣ及び−ＣＤ１９−ＶｉｏＢｌｕｅでＮＫ細胞を同定した（ｔｒｏｇｏｃｙｔｏｓｉｓ可能なＮＫ細胞の検出）。精製し、染色されたＮＫ細胞は、ＤＥＰアレイTMシステム（シリコンバイオシステムズ、メナリーニ）で分析されている。この新技術により、単一細胞を検出し列挙し、そして単一写真を撮ることができた。
【００７６】
ＤＥＰＡｒｒａｙ（登録商標）プロトコール
製造業者の説明書および（Ｌｉａｎｉｄｏｕら、２０１３）に記載されるように細胞選別実験を行った。簡単に言えば、精製され染色されたＮＫ細胞を緩衝溶液中に回収するため、ＤＥＰＡｒｒａｙカートリッジを手動で、１４μｌのサンプルと８００μｌの緩衝溶液をセットした。ＤＥＰＡｒｒａｙシステムにカートリッジをロードした後、サンプルの〜９．２６μｌは自動的に細胞が自発的に個々の細胞がトラップされている１６０００電気ケージから成るあらかじめプログラムされた電界に編成されたカートリッジのマイクロチャンバー内にシステムによって注入された。画像は、４つの蛍光フィルタキューブ（ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＡＰＣおよびＤＡＰＩ／ヘキスト／ＶｉｏＢｌｕｅ／ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ）ごとにマイクロチャンバーの表面積全体を覆うフレームと明視野画像を捕捉した。キャプチャされた画像をデジタル処理してオペレータによって目的の細胞の選択を可能にするソフトウェアモジュールに提示された。
【００７７】
インビトロＮＫ細胞刺激プロトコル
ＰＢＭＣ  １．１０６細胞／ｍｌを、高用量ＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、又はＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）及びＩＬ−１５（５ｎｇ／ｍｌ、ミルテニー）と共にリンパ芽球様ＥＢＶ細胞株ＰＬＨで、１０日又は２０日間刺激した。
【００７８】
統計
図面に示される全ての実験は、少なくともそれぞれの６人の悪性腫瘍患者と同じ数の健康なドナーからのサンプルを用いて行った。
【００７９】
結果：
ＣＤ４５は、成熟ヒトＮＫ細胞のマーカーである
高ＣＤ４５の発現は、他のリンパ球の種類（２６）のようにヒトＮＫ細胞でも細胞成熟のマーカーであるかどうかを決定するために、我々は、ＰＢＭＣから誘導されたヒトのリンパ球（Ｔ、ＢおよびＮＫ細胞）の３種類でＣＤ４５の発現を解析した。Ｂ及びＴ細胞がＣＤ４５発現の匹敵するレベルで、比較的均一な集団を示しました。ＣＤ５６bright（従って比較的未熟な）ＮＫ細胞はＣＤ４５がリンパ球の成熟のマーカーであるという概念と一致して、低い総ＣＤ４５発現を示した。非常に少数がＣＤ４５ＲＯを発現したのに対し、ほとんどのＮＫ細胞およびＢ細胞は、ＣＤ４５ＲＡを発現した。対照的に、多数のＴ細胞集団は、ＣＤ４５ＲＯ代わりにＣＤ４５ＲＡを発現した。
【００８０】
私たちは、その後、既知のＮＫ細胞マーカーとの総ＣＤ４５発現の関連性を分析した。ＮＫ細胞におけるＣＤ４５発現はＫＩＲ、ＣＤ１５８ａ及びＣＤ１５８ｂ及びＣＤ１６の発現（ＮＫ細胞成熟のマーカー（１４、３４））と関連していた。逆に、ＣＤ４５の発現は、ＣＤ２５（細胞増殖マーカー）に対して陽性の細胞中で低かった。ＣＤ４５陽性細胞はまた、ＣＤ４５陰性細胞よりも、ＮＫ細胞の細胞溶解活性（３５）に関連付けられているより頻繁にＣＤ６９を発現した。これらの結果は、ＮＫ細胞において、総ＣＤ４５の発現は主にＣＤ１６とのＫＩＲなどのＮＫ細胞成熟マーカーの高い発現、ならびにＣＤ５６およびＣＤ２５の低発現（未成熟ＮＫ細胞のマーカー）に関連していることを示している。
【００８１】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの異なるＣＤ４５アイソフォームの発現：健康なドナー
以前の結果は、ＮＫ細胞は、Ｔ細胞と比較して、ほとんどＣＤ４５ＲＯを発現しないことを示している。健康なドナーからのＮＫ細胞の細胞表面マーカーの発現の詳細な分析は、ＮＫ細胞の大部分がＣＤ４５ＲＡＣＤ６９−細胞とわずか５％がＣＤ６９を発現したことを示した。低いＣＤ４５ＲＡ発現（ＣＤ４５ＲＡdim）のＮＫ細胞の４％中、わずか１％が、ＣＤ６９＋であった。さらに、ＣＤ５６およびＣＤ１６の発現に基づいて、ＣＤ４５ＲＡ＋ＲＯ-（ＣＤ４５ＲＡ）が完全に成熟した細胞と考えられる一方、ＣＤ４５ＲＡｄｉｍＲＯ-（ＣＤ４５ＲＡｄｉｍ）細胞は一貫して未熟な集団であることがわかった。非常に少数のＣＤ４５ＲＡ＋ＲＯ＋（ＣＤ４５ＲＡＲＯ）細胞がＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６＋である一方、ＣＤ５６ｄｉｍＲＯ＋（ＣＤ４５ＲＡｄｉｍＲＯ）細胞はＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６ｄｉｍであることがわかった。これらの結果は、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯの発現は健康なドナーにおけるＮＫ細胞の成熟と関連していることを示唆している。
【００８２】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの異なるＣＤ４５アイソフォームの発現：同種移植患者
我々は、次に、ＮＫ細胞集団をドナーの造血幹細胞から再構成した人に同種移植患者におけるＮＫ細胞のプロファイルを調べた。これらの患者では、ＣＤ４５ＲＯおよび／またはＣＤ４５ＲＡｄｉｍＮＫ細胞は、健常対照よりも豊富であり、両方のマーカーがグラフ中にプロットされた時、彗星様の形状を生成する。期待通り、同種移植患者から血液試料中において、未成熟ＮＫ細胞の数が、ＣＤ５６とＣＤ１６-であり、彼らはデノボで作製されたＮＫ細胞であり、活性化後ＣＤ５６発現を獲得したＣＤ５６bright細胞はないことを示唆する。ｉｎ  ｖｉｖｏでの成熟中にＣＤ５６bright細胞はパーフォリンを産生するＣＤ５６ｄｉｍＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ５７−細胞になり、一方サイトカインに応答して、高ＩＦＮ−γ産生を維持する（１２、３６）。それからＣＤ５６ｄｉｍＣＤ６２Ｌ−ＣＤ５７＋細胞はサイトカインに低い応答性と高い細胞傷害能を示す（１２、３７）。実際に、ＣＤ１６の発現とは独立して、同種移植患者で、ＣＤ６２Ｌの発現は、ＣＤ５６bright細胞の方が、ＣＤ５６ｄｉｍ細胞より高かった。そしてＣＤ５７発現の密度が、ＣＤ５６ｄｉｍ細胞の方が、ＣＤ５６bright細胞の方がより高かった。また、同種移植患者からのすべてのＮＫ細胞集団は、健常ドナーと比較して、ＣＤ４５ＲＡｄｉｍ、及びＣＤ４５ＲＯ細胞に濃縮されていた。しかし、ＣＤ４５ＲＡｄｉｍ細胞のパーセンテージは健康なドナーで観察されるように、より成熟したＮＫ細胞サブセットにおいて、より減少した。
【００８３】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの異なるＣＤ４５アイソフォームの発現：血液悪性腫瘍の患者
先に説明した患者は、異なる血液癌の治療として、骨髄移植をした。すべてのこれらの患者では、ＣＤ４５ＲＯおよび／またはＣＤ４５ＲＡｄｉｍＮＫ細胞は、健常対照よりも豊富だった。特に、いくつかのＣＤ４５ＲＡ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋でもあった。そこで我々は、ＣＤ４５ＲＡ発現の減少を伴う未成熟ＮＫ細胞の集団に加えて、いくつかのＮＫ細胞は、標的腫瘍細胞によって活性化されている可能性があるという仮説を立てた。そこで我々は、異なる血液悪性腫瘍を有する患者のＮＫ細胞のプロファイルを調べた。
【００８４】
以前に健康なドナーについて記載されたように、ＮＫ細胞は、主に成熟したＣＤ４５ＲＡ細胞であり、特に未成熟ＮＫ細胞サブセットに見出されるＣＤ４５ＲＡｄｉｍ細胞をほとんど伴わない。ＣＤ４５ＲＡＲＯ細胞は全ＮＫ細胞のおよそ０．２％程度を占めた（図１上のパネル）。多発性骨髄腫（ＭＭ）患者からの血液サンプルは４倍以上のＣＤ４５ＲＡｄｉｍ細胞と、驚くべきことに、一般的にＣＤ４５ＲＡ発現が維持されたＣＤ４５ＲＯ細胞を約５％含んでいた（図３Ａ中央パネル）。ＭＭは、骨髄中の腫瘍細胞の蓄積によって特徴付けられているので、我々はまた、腫瘍細胞との緊密な接触にあるべき骨髄ＮＫ細胞は、多くのＮＫ細胞を循環させるよりも活性化されたかどうかを調べた。その結果、これは、ＣＤ４５ＲＡｄｉｍおよびＣＤ４５ＲＯ細胞のパーセンテージは血液と骨髄サンプルで同様であるケースではなかった（図１のＡ、中段、下段のパネル）。
【００８５】
また、ＭＭ患者からのＮＫ細胞のサブセットは、サイズ（ＦＳ）が大きく、高い粒度（ＳＳ）でした（図１Ｂ）。この集団は、ＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６＋サブセットにほぼ独占的に属するＣＤ４５ＲＡＲＯ細胞に主に対応していた（図１Ａ及び図１Ｂ下のパネル）。これらＣＤ４５ＲＡＲＯ細胞の大きなサイズ（ＦＳ）および粒度（ＳＳ）は、サイズと粒度がわずかＣＤ４５ＲＡｄｉｍＲＯ細胞（主にＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６ｄｉｍ）でも増加したものの、彼らは、他のＮＫサブセットに比べて高い代謝活性を有することを示唆している（ＩＢ）。逆に、ＣＤ４５ＲＡｄｉｍ細胞は、低ＦＳとＳＳの値を持っており、明らかに未熟な画分に濃縮された。
【００８６】
ＣＤ４５ＲＡｄｉｍおよびＣＤ４５ＲＯ集団における同様の増加は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）及びＢ細胞リンパ腫（ＢＣＬ）のような他の血液癌を有する患者からの血液サンプルにおいても観察された（補足図１）。要約すると、健常対照と比較して、血液悪性腫瘍の患者からのすべての分析されたサンプルで、ＣＤ４５ＲＡ集団は減少し、ＣＤ４５ＲＡｄｉｍ、ＣＤ４５ＲＡｄｉｍＲＯとＣ４５ＲＡＲＯ細胞分画は増加した（図１Ｃ）。
【００８７】
最後に、我々は、血液のがんを有する患者と健康なドナーをからの試料中の４つのＮＫ細胞の発達段階で異なるＣＤ４５アイソフォームの発現を定量化した（ＣＤ５６／ＣＤ１６の発現に基づき）（図１Ｄ）。健康なドナーにおいて、未成熟画分には１５％のＣＤ４５ＲＡｄｉｍ細胞が含まれており、一方この集団は、ＮＫ細胞の完全に成熟したサブセットに、基本的には存在しなかった。しかし、ＣＤ４５ＲＡＲＯ細胞は、もっぱら、成熟区画に見出された。（腫瘍タイプとは独立して）血液癌を有する全ての患者においてＣＤ４５ＲＡｄｉｍＲＯ細胞は成熟ＮＫ細胞区画において増加した。ＣＤ４５ＲＡｄｉｍＲＯ細胞は未成熟の区画で増加し、ＣＤ４５ＲＡＲＯ細胞は、特に、最も成熟したＮＫ細胞のサブセットで強く増加した。事実、血液癌を有する患者由来のＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６＋ＮＫ細胞サブセットにおけるＣＤ４５ＲＡｄｉｍ及びＣＤ４５ＲＡＲＯ集団の強い増加は、明らかに健康なドナーからそれらを区別できるものであり、診断ツールとして使用することができる。
【００８８】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの異なるＣＤ４５アイソフォームの発現：ＣＭＶ−再活性化を伴う患者
我々は、ウイルス感染のような、ＮＫ細胞の活性化をもたらす他の条件が、類似の表現型を生じさせることができるかどうかを検討した。そこで我々は、腎移植後のＣＭＶ感染の再活性化のある（ＣＭＶ＋）または、ない（ＣＭＶｎｅｇ）患者からのＰＢＭＣ試料を分析した。ＣＭＶの再活性化は、ＮＫ細胞の総数の増加を誘導した（図２Ａ）。また、ＣＭＶ＋患者は、ＣＭＶｎｅｇ患者に比べ、ＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６ｄｉｍ細胞の増加を示し、同時にＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔサブセットの減少を示した（図２Ｂ）これらの変化の理由は、上述したように、私たちに明らかではないが、例えばＣＭＶ誘導性のＮＫ細胞の成熟（３８）、またはＣＭＶ感染細胞内の異なるＮＫ細胞マーカーの発現に及ぼす影響など、さまざまな要因に起因する可能性があり、以前脱落膜（decidual）ＮＫ細胞として記載されている（３９）。これらの変化は、ＣＤ４５アイソフォームの発現パターンの小さな変動、主にＣＤ６９およびＣＤ４５ＲＯも発現するＣＤ４５ＲＡｄｉｍの増加に付随していた（図２Ｃ）。これらの結果は、ウイルスによって活性化されたＮＫ細胞におけるＣＤ４５アイソフォームの発現パターンは血液癌と異なることを示している。とりわけ、ＣＤ４５ＲＡＲＯ細胞は、血液癌を有する患者からの試料中に主に存在しているのに対し、同種移植またはウイルス感染患者のわずかな割合しか示さない。
【００８９】
ＣＤ４５アイソフォーム及びＣＤ６９発現の関係
ＣＤ６９の発現は、ＮＫ細胞の刺激後に増加し、生体内を含め（６）、ＮＫ細胞活性化（１７）の真正なマーカーと考えられている。健康なドナーにおいて、ＣＤ６９は、主に、完全に成熟したＣＤ５６dimＣＤ１６＋細胞で発現していた（図３Ａ）、一方、血液癌の患者において、ＣＤ６９＋細胞は他のＮＫ細胞サブセットにおいても検出した（図３Ａ）。実際、このような患者では、ＣＤ６９の発現は、健康なドナーと比較して、それらの成熟とか関係なく、全てＮＫサブセットに観察された（図３Ｂ）。患者における異なるＣＤ４５集団におけるＣＤ６９発現の分析は、健常対照と比較して、ＣＤ６９およびＣＤ４５ＲＯを共発現するＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＡｄｉｍは多くの量の存在があることを示した（図３Ｂ及びＣ）。ＣＤ４５ＲＯ＋細胞は、主にＣＤ６９＋であったが（図３Ｃ）。しかし、逆は真ではなく、大半のＣＤ６９＋細胞はＣＤ４５ＲＯでなかった。健常ドナーのＣＤ４５ＲＯ＋細胞の非常に少ない量は、この集団のいずれかの意味のある分析を排除しました。
【００９０】
健康なドナーでは、ＣＤ４５ＲＡｄｉｍ細胞は、主にＣＤ６９-であった（図３Ｂ及びＤ）。ＣＤ４５ＲＡｄｉｍ細胞は有意に患者において増加し、多くはまた、ＣＤ６９＋であった。しかし、ＣＤ４５ＲＡ発現の減少は、必ずしもＣＤ６９発現の増加と関連していなかった。実際には、患者のサンプルは、特にＣＤ４５ＲＡｄｉｍＣＤ６９-とＣＤ４５ＲＡ  ＣＤ６９＋に富み、低い範囲で、ＣＤ４５ＲＡでｄｉｍＣＤ６９＋細胞に富んでいた。ＡＭＬ患者からの血液サンプルは入手できなかったので、我々は、骨髄（ｂｍ）のサンプルを使用し、同様の結果を得た（図３Ｃ及びＤ）。ＭＭ患者からの骨髄が同様のパターンを示しました。残念ながら、我々は、健康なドナーからの骨髄サンプルを分析することができなかったので、我々はしっかりと血液学的悪性腫瘍及び健常ドナーの患者から骨髄サンプルにおけるＮＫ細胞のプロファイルは、血液サンプルのように、異なっていることを結論付けることはできない。しかし、ＮＫ細胞集団は、ＭＭを有する患者からの血液および骨髄試料で類似している知見は、血液中に見られる健康なドナー〜患者間の差はまた、骨髄中に存在することを示唆している。
【００９１】
結論として、患者は、全てのＮＫ細胞サブセットにおけるＣＤ６９発現の増加を示したが、ＣＤ６９＋細胞の相対的な割合は、ＣＤ４５ＲＡｄｉｍ細胞よりもＣＤ４５ＲＡ細胞で高かった（図３Ｂ）。これらのデータは、ＣＤ４５ＲＡのダウンレギュレーションおよびＣＤ４５ＲＯのアップレギュレーション一緒にＣＤ６９のアップレギュレーションは、ＮＫ細胞の活性化と互換性があることを示唆し（図３Ａ）、一方ＣＤ４５ＲＡｄｉｍ細胞は大半が未熟集団（ＣＤ５６brightおよびＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６dim）であった。この見は、ＣＤ４５ＲＡ発現の損失及びＣＤ６９発現の獲得は、２つの異なる生理学的プロセスを特定し、これら２つの集団は、異なる機能を持っているかもしれないことを示唆する。逆に、異なるＮＫ細胞サブセットにおけるＣＤ６９発現は、ＣＤ４５のアイソフォームの発現と比較し、血液学的悪性腫瘍の患者の識別を改善しなかった。
【００９２】
異なるＣＤ４５アイソフォームの発現は、ｅｘ  ｖｉｖｏで異なるＮＫ細胞機能を同定する  
異なるＮＫ細胞サブセットの機能を同定するために、最初に我々は、抗ＣＤ１０７ａの抗体でＰＢＭＣのｅｘ  ｖｉｖｏ染色を行い、細胞の脱顆粒を評価した（図４Ａ）。健康なドナーにおいては、約４０×１０３細胞／百万ＮＫ細胞のＣＤ１０７ａ＋であった。これらの細胞の大部分は、ＣＤ６９＋または−のいずれかであるＣＤ４５ＲＡであり、ＣＤ４５ＲＯ＋細胞を含んでいた。驚くべきことに、すべてのＣＤ４５ＲＡＲＯおよびＣＤ４５ＲＡｄｉｍＲＯ細胞のほとんどは、ＣＤ１０７ａ＋であった（図４Ｂ）。全体的に、ＣＤ１０７ａの発現は、ＣＤ６９−細胞よりもＣＤ６９＋細胞の中でより多く観察され、ＣＤ４５ＲＡのダウンレギュレーションは、ＣＤ１０７ａ発現に関連していなかった。  
【００９３】
血液癌を有する患者由来のＮＫ細胞はＣＤ１０７ａ＋の大きな増加を示した（図４Ａ）、特にＣＤ６９＋および／またはＣＤ４５ＲＯ＋サブセットにおいて、特にこれらの患者において増加していた。また、ＣＤ１０７ａ＋細胞の割合は、ＣＤ６９−よりもＣＤ６９＋で高かった、一方、ＣＤ４５ＲＡ発現の減少は増加した脱顆粒と関連していなかった（図４Ｂ）。健康なドナーと同様に、ＣＤ４５ＲＡＲＯ  ＣＤ６９＋及び、低い割合であるが、ＣＤ４５ＲＡｄｉｍＲＯ  ＣＤ６９＋画分は、大半が脱顆粒した細胞を含んでいた。これは、循環するＮＫ細胞を除くものではなかった、なぜなら、同様の結果がＭＭとＡＭＬ患者の骨髄サンプル由来のＮＫ細胞についても得られたからである（図４Ｃ、上パネル）。
【００９４】
我々は、次に、細胞にトランスフェリンからの鉄の送達のために必要とされるトランスフェリン受容体タンパク質１（ＴｆＲｌまたはＣＤ７１）の発現を評価した。鉄は、酸素輸送、エネルギー代謝およびＤＮＡ合成のような基本的な生化学的活性のための補因子であるので、ＣＤ７１の発現は、高度に代謝細胞において増加する（４０）。ＣＤ４５ＲＡＲＯ細胞の高い代謝活性と一致して（図４Ｂ）、ＣＤ７１の発現は、健常対照者と血液悪性腫瘍患者の両方のＣＤ４５ＲＯ＋細胞においてより高かった（図４Ｄ）。また、これらの細胞のほとんどはまた、増殖マーカーのＫｉ−６７を発現した（図４Ｅ）。ＣＤ７１およびＫｉ−６７の発現も、ＣＤ６９-サブセットより、ＣＤ６９＋サブセットで適度に高かった。
【００９５】
結論として我々の結果は、ＣＤ４５ＲＯ＋細胞（特にＣＤ４５ＲＡも発現する場合）、ＣＤ６９発現を得、より大きくより高い粒状性と代謝を有し（図４Ｄ）、増殖し（図４Ｅ）、および脱顆粒した（図４Ｂ）。これらの知見は、ＣＤ４５ＲＡＲＯ細胞、おそらくＣＤ４５ＲＡｄｉｍＲＯ細胞が、腫瘍細胞を認識し、脱顆粒するＮＫ細胞であることを示す一方、ＣＤ４５ＲＡＲＯ  ＣＤ１０７ａ＋細胞は、主にＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６＋  画分に属し、ＣＤ４５ＲＡｄｉｍＲＯ  ＣＤ１０７ａ＋細胞は、主にＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６ｄｉｍ細胞であることを示す。
【００９６】
血液癌の患者から他のＮＫ細胞サブセットは、インビトロでＫ５６２細胞に対する細胞溶解活性を示す
血液癌の患者から他のＮＫ細胞サブセットは、脱顆粒における固有の欠陥を持っているかどうかを調べるために、我々は、Ｋ５６２標的細胞と共に健康なドナーまたは患者からのＰＢＭＣをインキュベートした。健康なドナーには、ｅｘ  ｖｉｖｏですでに高かった、脱顆粒するＣＤ４５ＲＯ＋細胞の数は、ほぼ１００％に増加した。ＣＤ１０７ａ＋細胞の割合は、特にＣＤ４５ＲＡｄｉｍサブセットとＣＤ６９＋サブセットで増加していた。同様に、血液悪性腫瘍の患者からのすべてのＮＫ細胞集団はまた、脱顆粒する能力、特にＣＤ４５ＲＡｄｉｍ細胞を脱顆粒する能力を特に保持していた。
【００９７】
しかし、我々の分析では、４時間標的細胞とのインキュベーション後、ＣＤ６９および／またはＣＤ４５アイソフォームの発現が変更された可能性があるので、脱顆粒したＣＤ６９-またはＣＤ４５ＲＡｄｉｍ細胞の割合を低く見積もることができた。私たちは、このようにして、最初にＰＢＭＣを抗ＣＤ６９及び−ＣＤ４５ＲＡ抗体と共にインキュベートし、基底ＮＫ細胞の表現型を決定し、そしてその後、我々は、Ｋ５６２細胞への曝露後の、ＣＤ  １０７ａの発現を分析した（補足図２）。実際に、標的細胞との接触前のＮＫ細胞のプロファイルは、ｅｘ  ｖｉｖｏで観察された表現型と類似しており、これは効率的なアプローチであったことを示す。標的細胞とｉｎ  ｖｉｔｒｏインキュベーション後（４時間）、ＣＤ６９＋細胞の数が急速にＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＡｄｉｍの両方の集団で増加した（両方のサブセットで約１００％増）。しかし、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＡｄｉｍ細胞の全体的な割合は、この時間の間に安定なままであった（補足図２）。我々は、健康なドナーからのＣＤ６９-ＮＫ細胞の脱顆粒は図７Ａに示したより高かったことがわかった（図７Ｃ）。活性化された細胞は、おそらく同時にＣＤ６９とＣＤ１０７ａの発現を得た。これは、その細胞の大部分が脱顆粒化していた、血液癌を有する患者由来のＮＫ細胞が、最初ＣＤ６９−細胞であったことからもより明らかであった。標的細胞への暴露後のＣＤ６９発現を獲得したＣＤ４５ＲＡｄｉｍ細胞は、主にＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６ｄｉｍと完全に成熟したＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６＋であった。要するに、ＣＤ４５ＲＡｄｉｍ細胞はまた、少なくともＣＤ６９およびＣＤ１０７ａ発現を得て、刺激に応答することができる。
【００９８】
ＣＤ４５ＲＡＲＯ  ＮＫ細胞は、インビボでトロゴサイトーシスを行った
ＣＤ４５ＲＡＲＯ細胞がインビボで抗腫瘍活性を実行したかどうかを調べるために、これらの細胞が、腫瘍標的に対してトロゴサイトーシスを実行したか調べた。トロゴサイトーシスは、リンパ球が相互作用する細胞からの表面分子を抽出し、それらを自分自身の表面上に発現し、Ｂリンパ芽球性白血病（Ｂ  ＡＬＬ）のｅｘ  ｖｉｖｏで観察されているプロセスのことである。この実験では、我々は他の細胞型のマーカーを研究しているので、我々は、ＮＫ細胞を識別するために、二重標識を使用し、ＣＤ５６＋ＮＫＰ４６＋細胞にゲートした。我々は、ＢＣＬ患者由来のＮＫ細胞の１４％は、それらの膜（図５Ａ）におけるＢＣＬマーカーＣＤ１９を発現することを観察した。この値は、ＣＤ４５ＲＡＲＯ集団だと、５２％に増加し、それが他の集団においてははるかに低かった。集団は主にＣＤ４５ＲＡｄｉｍＲＯだが、ＮＫ細胞はまた、骨髄性マーカーＣＤ１４を低いレベルの発現で得た。しかし、両方のマーカーについて陽性に染色されたＮＫ細胞は非常にまれであった。これは、二つの異なるＮＫ細胞集団はトロゴサイトーシスを実行し、ＣＤ４５ＲＡＲＯは腫瘍細胞にそれをしていたことを示唆した。私たちは、別のＣＤ１９＋疾患：Ｂ−ＣＬＬにおいて類似した結果を観察した（補足図３）。ＮＫ細胞は、すべての腫瘍において、ＣＤ１９を得なかったことを除外するために、我々は、ＡＭＬ患者からのＮＫ細胞を調べた（図５Ｂ）。ＮＫ細胞の約１０％は、ＡＭＬマーカーＣＤ１４を発現し、わずか３％が、すべてのＮＫ細胞集団で発現したＣＤ１９を発現した。これとは対照的に、ＣＤ４５ＲＡＲＯの９０％は、ＣＤ１４を発現し、ＡＭＬ患者のＣＤ１４+集団において大規模なトロゴサイトーシスを実行していることを示した。要約すると、我々のデータは、ＮＫ細胞は、腫瘍細胞上でトロゴサイトーシスを行い、およびＣＤ４５ＲＡＲＯ集団がその原因であることを示した。したがって、ＣＤ４５ＲＡＲＯ  ＮＫ細胞の使用は、血液癌患者（この集団が存在する場合）および疾患の種類（膜に発現マーカー）を同定するための診断ツールとして使用することができる。
【００９９】
ＣＤ４５ＲＡＲＯ集団の表現型の特徴
ＣＤ４５ＲＡＲＯ細胞は、ＣＤ５６＋ＣＤ１６＋サブセットに属し、主に成熟マーカーＣＤ５７を発現しているものの、半分がＣＤ６７Ｌを共発現した。ＣＤ４５ＲＡＲＯ集団は、ＫＩＲを発現する細胞をより高い割合で含んでいるものの、それはＣＤ１５８ｅのみ統計的に有意であった。Ｇｚｍｂ＋細胞の割合は、他のサブセットと同様であったが、このサイトカインの細胞内レベルは低かった。これは、生産の欠損または細胞内貯蔵を空にした最近の脱顆粒によるものである可能性がある。ＣＤ４５ＲＡＲＯ細胞はまた、受容体サブファミリーＢ、メンバー１（ＫＬＲＢｌ）または天然の細胞毒性レセプター（ＮＣＲ）ＮＫｐ４６のと活性化ＮＫＧ２Ｄ受容体のわずかに高いレベルのようなＣＤ  １６１  ／キラー細胞レクチン別の成熟マーカーのＣＤ４５ＲＡよりも同様のレベルで発現した。しかし、彼らは、ＣＤ９４糖タンパク質とおそらく、抑制性ＮＫ受容体ＮＫＧ２Ａを低いレベルを示した。要約すると、ＣＤ４５ＲＡＲＯ細胞は、主に成熟細胞のＮＫ受容体を発現する完全に成熟したＮＫ細胞である。
【０１００】
ＣＤ４５ＲＡＲＯ集団の代謝特性評価
活性化リンパ球は、一般に、そのサイズを大きくし(Skak et al., 2008; Zarcone et al., 1987)、高度に代謝的に活性な細胞になる(Sanchez-Martinez et al., 2015; Sanchez-Martinez et al., 2014)。セリン／スレオニンキナーゼｍＴＯＲは、おそらくＮＫ細胞の活性化後、代謝シフトおよび細胞骨格組織とリンクする。我々は、より大きなサイズ（ＦＳ）で、高い粒度（ＳＳ）を有し、ＣＤ４５ＲＡＲＯ細胞に対応するＭＭ患者からのＮＫ細胞のサブセットを観察した（図７Ａ）。これは、それらが、他のＮＫサブセットと比較してより高い代謝活性を有している活性化した細胞であることを示唆した。したがって、我々は、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）リンパ芽球細胞株ＰＬＨと共にそれらをインキュベートすることによりインビトロでＮＫ細胞を活性化した。ＮＫ細胞の生存を支持するために、我々は、低濃度の、二つのＮＫ細胞活性化サイトカイン：ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−１５（５ｎｇ／ｍｌ）を添加した(Anel et al., 2012)。我々は、長期の活性化を反映するために最大２０日間、ＮＫ細胞をインキュベートした。以前の報告（(Skak et al., 2008; Zarcone et al., 1987)と一致して、１０日間の活性化は、２０日目でより適切であったサイズ（ＦＣＳ）および粒度（ＳＳＣ）の増加を誘導した。
【０１０１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの活性化の３日後に、ＮＫ細胞は、ＣＤ４５ＲＡを失い始めた。実際にＣＤ４５ＲＡＲＯ集団が現れたのか、あるいは細胞がＣＤ４５ＲＯを得、ＣＤ４５ＲＡを失ったのかは疑問が残った。最初の活性化の１０日後、ほとんどの細胞がＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４５ＲＯ＋であった。しかし、２０日目でＣＤ４５ＲＡＲＯ集団は、培養中に現れた。これは、アクセサリー細胞の存在を否定するものではない。なぜなら、サイトカインとの長期的な活性化は同様のパターンを生成したからである、要約すると、ＣＤ４５ＲＡＲＯ  ＮＫ細胞はまた、長い活性化の後に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで存在する。次に、私たちは、患者ＣＤ４５ＲＡＲＯ集団のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの活性化を評価した。サイトカイン誘導活性化を三日間行うと、ＣＤ４５のアイソフォームの発現に強い転位が誘導され、個々の集団の存在を評価することは不可能だった。これらの結果は、さらにＣＤ４５ＲＡＲＯ細胞は、少なくともｉｎ  ｖｉｔｒｏで、彼らのＣＤ４５表現型を変化させることが示唆された。
【０１０２】
我々は、次に、細胞にトランスフェリンからの鉄の送達のために必要とされるトランスフェリン受容体タンパク質１（ＴｆＲｌまたはＣＤ７１）の発現を評価した。鉄は、酸素輸送、エネルギー代謝およびＤＮＡ合成（(Wang and Pantopoulos, 2011)などの基本的な生化学的活性のための補因子であるため、ＣＤ７１の発現は、アクティブな代謝細胞内で増加する。ＣＤ４５ＲＡＲＯ細胞の高いＦＳとＳＳによって示唆される優れた代謝活性と一致して、ＣＤ７１の発現は健常対照者と血液悪性腫瘍の患者の両方において、ＣＤ４５ＲＯ＋細胞の方が高かった（図７Ｂ）。また、これらの細胞のほとんどはまた、増殖マーカーのＫｉ−６７を発現した（図７Ｃ）。要約すると、ＣＤ４５ＲＡＲＯ細胞は増殖中、高度な代謝細胞のＮＫのサブセットを表す。
【０１０３】
ＣＤ６９発現はＮＫ細胞刺激後増加し、ex  vivo(Vey et al., 2012)を含むとは、ＮＫ細胞の活性化(Elpek et al., 2010)の真正なマーカーと考えられている。患者における異なるＣＤ４５集団におけるＣＤ６９発現の分析は、ＣＤ４５ＲＯ＋細胞は主にＣＤ６９＋であることを示した（図７Ｄ）；しかし、反対に、ほとんどのＣＤ６９＋細胞はＣＤ４５ＲＯではなかった。ＣＤ４５ＲＯ＋細胞は健常ドナーにおいて非常に少なく、この集団のいずれかの意味のある分析することができなかった。
【０１０４】
健康なドナーでは、ＣＤ４５ＲＡｄｉｍ細胞は、主にＣＤ６９−だった（図７Ｅ）。ＣＤ４５ＲＡｄｉｍ細胞は有意に患者において増加し、多くはまた、ＣＤ６９＋であった。しかし、ＣＤ４５ＲＡ発現の減少は、必ずしもＣＤ６９発現の増加と関連していなかった。実際、患者のサンプルは、特にＣＤ４５ＲＡｄｉｍＣＤ６９−とＣＤ４５ＲＡ  ＣＤ６９＋細胞が豊富であり、わずかではあるが、ＣＤ４５ＲＡｄｉｍＣＤ６９＋が豊富だった。この知見は、ＣＤ４５ＲＡの損失およびＣＤ６９発現の獲得は、２つの異なる生理学的プロセスを特定し、これら２つの集団は、異なる機能を持っているかもしれないことを示唆している。
【０１０５】
ＣＤ４５ＲＡＲＯ集団の機能解析
異なるＮＫ細胞サブセットの機能を同定するために、最初に我々は、抗ＣＤ１０７ａの抗体を用いたＰＢＭＣのｅｘ  ｖｉｖｏでの染色によって細胞の脱顆粒を評価した（図８Ａ）。健康なドナーにおいて、１％程度のＮＫ細胞はＣＤ１０７ａ＋だった。これらの細胞のほとんどは、ＣＤ４５ＲＡであり、少数がＣＤ４５ＲＯ＋細胞であった。驚くべきことに、ほとんどのＣＤ４５ＲＡＲＯおよびＣＤ４５ＲＡｄｉｍＲＯ細胞の半分がＣＤ１０７ａ＋であった（図８Ｂ）。
【０１０６】
血液癌を有する患者由来のＮＫ細胞はＣＤ１０７ａ＋細胞の大きな増加を示し、特にこれらの患者において特異的に増加するＣＤ４５ＲＯ＋サブセットで増加した（図８Ａ）。ＣＤ４５ＲＡ発現の減少は、増加した脱顆粒と関連していなかった（図８Ｂ）。健康なドナーと同様に、ＣＤ４５ＲＡＲＯと、より低い程度ではあるが、ＣＤ４５ＲＡｄｉｍＲＯ画分で、脱顆粒した細胞をおもに含んでいた（図８Ｂ）。これら２つの集団のＣＤ１０７ａ−ＭＦＩの中央値は、主にＣＤ４５ＲＯ−集団に比べて増加した。同様の結果は、ＭＭおよびＡＭＬ（図８Ｂおよび８Ｃ上のパネル）患者の骨髄サンプル由来のＮＫ細胞についても得られたので、これは、ＮＫ細胞を循環の否定するものでなかった。対照的に、ＣＤ４５ＲＡＲＯ細胞は低いＧｚｍＢ含量を示しました。ＣＤ４５ＲＡＲＯ細胞は、最近、ｉｎ  ｖｉｖｏで脱顆粒したというのが、我々の見解である。
【０１０７】
ＣＤ４５ＲＡＲＯ細胞は、標的細胞としてＫ５６２を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析の後に、より高い脱顆粒率を示し続けた（図８Ｃ下のパネル）が、他の集団は有意に脱顆粒を増加させた。興味深いことに、異なるＣＤ４５  ＮＫ細胞サブセットは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイで４時間後に変化しなかった。これとｉｎ  ｖｉｔｒｏでの活性化の結果は、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯの発現が、短時間で安定しているが、長期的な活性化の後に変化しうることを示している。
【０１０８】
討論：
新規のヒトＮＫ細胞集団の同定は、それらの生理学を理解するため、および診療所での治療的使用を改善するために重要である。ここでは、異なったＮＫ細胞集団の同定はまた、宿主の生理学的状態に関する貴重な情報を与えることができることを示している。実際、ＣＤ４５ＲＡｄｉｍ及びＣＤ４５ＲＯ＋細胞が成熟した区画内の多く存在することは、明らかに血液悪性腫瘍の患者を識別する。そこで我々は、これらの特定のＮＫ細胞集団は、標的腫瘍細胞を除去すると減少するはずであるので、それらの検出は、血液癌の診断ツールとして使用することができ、また、抗腫瘍治療の有効性を評価すると仮定している。
【０１０９】
宿主免疫系が損なわれる場合白血病が向上する（４１、４２）。その他には、我々はいくつかのマウスモデルにおいて、血液由来腫瘍を根絶するための完全に機能するＮＫ細胞の必要性を示しており（４３−４８）、ＮＫ細胞の浸潤はいくつかの癌で良好な予後と関連していることを示した（４９−５１）。アロ反応性（同種抗原反応性）ＮＫ細胞の使用は、新たな癌治療、特異的に、造血起源の腫瘍のための癌治療を提示しうる。実際、主にＮＫ細胞アロ反応性に基づく、移植片対宿主（ＧｖＨ）方向のＫＩＲ−ＫＩＲリガンドの非互換性は、臨床で無関係な臍帯血幹細胞移植（ＵＣＢＴ）後の成果を改善する（５２、５３）。また、ＮＫ細胞は：ｉ）はＧｖＨ病（ＧＶＨＤ）の原因ではなくｉｉ）「分化」細胞として注入することができるので、長い時間患者の体内で生き残るために必要はなく；ｉiｉ）おそらく、ＢおよびＴ細胞、マクロファージや、より重要なのは、多形核細胞に対する免疫調節効果によって（５４）、日和見感染症（５２）から保護する。我々は、その分析のための有効な方法がないため、インビボでのＮＫ細胞活性化の評価は困難である。ＣＤ６９の発現は、日常的に使用されている（６、１７）。しかしながら、我々の結果は、ＣＤ６９発現が、ＮＫ細胞の抗腫瘍活性の最も重要な成分であると考えられている、脱顆粒、および細胞溶解活性を意味するものではないことを示している（１２）。逆に、私たちの研究は、ＣＤ４５ＲＯの発現が、血液悪性腫瘍の患者で脱顆粒しているＮＫ細胞サブセットを識別することを示している。我々は、腫瘍抗原に対するモノクローナル抗体のような、ＮＫ細胞活性をも伴う効率的な抗腫瘍治療は、これらのＮＫ細胞集団を増やすと考えている。
【０１１０】
また、臨床においてアロ反応性ＮＫ細胞の標準的な使用をする前に最も重要な未解決問題は、臨床的に効率的な抗腫瘍活性を示す細胞の十分な数の移植である。この目的のために、異なるＮＫ細胞集団およびそれらの細胞溶解活性を同定することは重要である。ここで、我々は、ＣＤ４５のアイソフォームの発現は、この課題を容易にし、脱顆粒がＣＤ４５ＲＡＲＯ集団において増強されることを示している。したがって、自家ＮＫ細胞の増殖中ＣＤ４５ＲＯ＋サブセットを増加させるプロトコルは、より良い臨床結果を与えると思われる。
【０１１１】
ＣＤ４５活性は、二量体化によって調節され、細胞膜での自発的なＣＤ４５のホモ二量体は、その活性を阻害する（５５）。ＣＤ４５細胞外ドメインの大きさは、ＣＤ４５の二量体化の程度、したがって自己阻害に反比例する（５５）。ＣＤ４５ＲＡのような、より大きなＣＤ４５アイソフォームは、あまり効率的に二量体化せず、したがって、ＣＤ４５ＲＯ（１９）のような小さいアイソフォームよりＴＣＲシグナル伝達を促進すると思われる。しかしながら、ＣＤ４５の活性はまた、細胞膜局在で、したがって、その細胞外領域に依存する（１９、５６）。少なくともＴ細胞において、高すぎるＣＤ４５活性が、Ｓｒｃのキナーゼで活性化残基の脱リン酸化につながるのに対して、低すぎるＣＤ４５活性は、阻害残基のリン酸化を残す可能性がある。したがって、ＣＤ４５活性が特定のウィンドウ内に残り（２６）、特定のＣＤ４５のアイソフォームの量が最終的な活性を調節することが、効率的なＮＫ細胞の活性化のために重要である。我々はＣＤ４５ＲＡＲＯ  ＮＫ細胞は、最大の細胞溶解活性を示すことを見出し、これはＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯ両方のアイソフォームの発現が、ＮＫ細胞にそれらの細胞溶解活性を増強するための効率的なシグナリングのためのＣＤ４５活性の適切なレベルを与えるかもしれないことを示唆している。これは、ＣＤ４５は、ＮＫ細胞の完全な細胞毒性活性のために必要とされる、マウスにおけるインビボでの結果と一致している（５７）。しかし、ＣＤ４５は、インビトロにおけるＮＫ細胞の細胞毒性のために必要とされていない（３１−３３）。一致して、我々はまた、インビトロで異なるＣＤ４５アイソフォームを発現する他のＮＫ細胞サブセットにおいて、細胞傷害活性を示すことを観察した。
【０１１２】
また、別のＣＤ４５アイソフォームの発現は、ＣＤ４５リガンドの認識を変化させる。例えば、異なるＣＤ４５アイソフォーム上のＯ−グリカンの存在量および種類は、ガレクチン１（５８）に対する細胞の感受性を調節する。腫瘍細胞によって豊富に産生されるガレクチン１は、Ｔ細胞媒介性細胞傷害性応答をブロックし（５９）、胸腺細胞およびＴ細胞のアポトーシスを誘導する（５８）。抗腫瘍ＮＫ細胞は、ガレクチン−１に対する耐性、またはＣＤ４５ＲＯの発現を介して、他のリガンドに対する耐性に基づいて選択されることが可能である。実際、Ｏ−グリカンは主にＣＤ４５細胞外ドメインに結合するので、短いＣＤ４５アイソフォームを発現する細胞は、ＣＤ４５ＲＯのように、比較的少数のＯ−グリカンを持つことになるので、ガレクチン１に対してより耐性になる。
【０１１３】
ｅｘ  ｖｉｖｏで、我々は健康なドナーからの末梢血試料中のＣＤ４５ＲＯを発現する非常に少数のＮＫ細胞を発見した。これは、（３０）で示唆されているようにＣＤ４５ＲＯの発現は、メモリーＮＫ細胞を同定する場合は特に、驚くべきことです。この知見は、メモリーＮＫ細胞の量は、血液サンプル中の非常に低い可能性があること、またはＣＤ４５ＲＯはメモリーＮＫ細胞のマーカーではないかもしれないことを示唆しています。また、ＮＫ細胞におけるＣＤ４５ＲＯ発現は、具体的にｅｘ  ｖｉｖｏでサンプル処理中に失われた可能性がある。我々は、ＮＫ細胞は、他のリンパ球のタイプよりも総ＣＤ４５（図１）のわずかに高いレベルで発現するので、その可能性は低いと思っている。実際に、我々は、ＣＤ４５ＲＯは主にエフェクターＮＫ細胞と関連していることを見出した。しかしながら、異なるほとんどのＴ細胞集団で観察されたものから、ＣＤ４５ＲＡダウンレギュレーションは、ＮＫ細胞の活性化のために必要とされていない。これは、ＮＫ細胞における異なるＣＤ４５アイソフォームの発現は、Ｔ細胞とは異なる役割を果たしていることを示唆している。
【０１１４】
参考文献：
本出願を通して、種々の参考文献は、本発明が属する技術分野の状態を記載する。これらの参考文献の開示は、本開示中に参考として援用される。 
1.  A. Velardi, Role of KIRs and KIR ligands in hematopoietic transplantation. Curr Opin Immunol 20, 581-587 (2008).
2.  L. L. Lanier, Up on the tightrope: natural killer cell activation and inhibition. Nat Immunol 9, 495-502 (2008).
3.  C. Baier, A. Fino, C. Sanchez, L. Farnault, P. Rihet, B. Kahn-Perles, R. T. Costello, Natural Killer Cells Modulation in Hematological Malignancies. Frontiers in immunology 4, 459 (2013).
4.  M. Villalba, M. G. Rathore, N. Lopez-Royuela, E. Krzywinska, J. Garaude, N. Allende-Vega, From tumor cell metabolism to tumor immune escape. Int J Biochem Cell Biol 45, 106-113 (2013).
5.  M. Villalba, N. Lopez-Royuela, E. Krzywinska, M. G. Rathore, R. A. Hipskind, H. Haouas, N. Allende-Vega, Chemical metabolic inhibitors for the treatment of blood-borne cancers. Anti-cancer agents in medicinal chemistry 14, 223-232 (2014).
6.  N. Vey, J. H. Bourhis, N. Boissel, D. Bordessoule, T. Prebet, A. Charbonnier, A. Etienne, P. Andre, F. Romagne, D. Benson, H. Dombret, D. Olive, A phase 1 trial of the anti-inhibitory KIR mAb IPH2101 for AML in complete remission. Blood 120, 4317-4323 (2012).
7.  D. H. McKenna, Jr., D. Sumstad, N. Bostrom, D. M. Kadidlo, S. Fautsch, S. McNearney, R. Dewaard, P. B. McGlave, D. J. Weisdorf, J. E. Wagner, J. McCullough, J. S. Miller, Good manufacturing practices production of natural killer cells for immunotherapy: a six-year single-institution experience. Transfusion 47, 520-528 (2007).
8.  J. S. Miller, Y. Soignier, A. Panoskaltsis-Mortari, S. A. McNearney, G. H. Yun, S. K. Fautsch, D. McKenna, C. Le, T. E. Defor, L. J. Burns, P. J. Orchard, B. R. Blazar, J. E. Wagner, A. Slungaard, D. J. Weisdorf, I. J. Okazaki, P. B. McGlave, Successful adoptive transfer and in vivo expansion of human haploidentical NK cells in patients with cancer. Blood 105, 3051-3057 (2005).
9.  L. Ruggeri, A. Mancusi, E. Burchielli, F. Aversa, M. F. Martelli, A. Velardi, Natural killer cell alloreactivity in allogeneic hematopoietic transplantation. Curr Opin Oncol 19, 142-147 (2007).
10.  J. E. Rubnitz, H. Inaba, R. C. Ribeiro, S. Pounds, B. Rooney, T. Bell, C. H. Pui, W. Leung, NKAML: a pilot study to determine the safety and feasibility of haploidentical natural killer cell transplantation in childhood acute myeloid leukemia. J Clin Oncol 28, 955-959 (2010).
11.  D. Sanchez-Martinez, E. Krzywinska, M. G. Rathore, A. Saumet, A. Cornillon, N. Lopez-Royuela, L. Martinez-Lostao, A. Ramirez-Labrada, Z. Y. Lu, J. F. Rossi, D. Fernandez-Orth, S. Escorza, A. Anel, C. H. Lecellier, J. Pardo, M. Villalba, All-trans retinoic acid (ATRA) induces miR-23a expression, decreases CTSC expression and granzyme B activity leading to impaired NK cell cytotoxicity. Int J Biochem Cell Biol 49, 42-52 (2014).
12.  Y. T. Bryceson, S. C. Chiang, S. Darmanin, C. Fauriat, H. Schlums, J. Theorell, S. M. Wood, Molecular mechanisms of natural killer cell activation. Journal of innate immunity 3, 216-226 (2011).
13.  C. I. Domaica, M. B. Fuertes, I. Uriarte, M. V. Girart, J. Sardanons, D. I. Comas, D. Di Giovanni, M. I. Gaillard, L. Bezrodnik, N. W. Zwirner, Human natural killer cell maturation defect supports in vivo CD56(bright) to CD56(dim) lineage development. PLoS One 7, e51677 (2012).
14.  L. Moretta, Dissecting CD56dim human NK cells. Blood 116, 3689-3691 (2010).
15.  A. G. Freud, J. Yu, M. A. Caligiuri, Human natural killer cell development in secondary lymphoid tissues. Seminars in immunology 26, 132-137 (2014).
16.  L. A. Fogel, M. M. Sun, T. L. Geurs, L. N. Carayannopoulos, A. R. French, Markers of nonselective and specific NK cell activation. J Immunol 190, 6269-6276 (2013).
17.  K. G. Elpek, M. P. Rubinstein, A. Bellemare-Pelletier, A. W. Goldrath, S. J. Turley, Mature natural killer cells with phenotypic and functional alterations accumulate upon sustained stimulation with IL-15/IL-15Ralpha complexes. Proc Natl Acad Sci U S A 107, 21647-21652 (2010).
18.  R. Kaplan, B. Morse, K. Huebner, C. Croce, R. Howk, M. Ravera, G. Ricca, M. Jaye, J. Schlessinger, Cloning of three human tyrosine phosphatases reveals a multigene family of receptor-linked protein-tyrosine-phosphatases expressed in brain. Proc Natl Acad Sci U S A 87, 7000-7004 (1990).
19.  I. Rhee, A. Veillette, Protein tyrosine phosphatases in lymphocyte activation and autoimmunity. Nat Immunol 13, 439-447 (2012).
20.  J. Irie-Sasaki, T. Sasaki, W. Matsumoto, A. Opavsky, M. Cheng, G. Welstead, E. Griffiths, C. Krawczyk, C. D. Richardson, K. Aitken, N. Iscove, G. Koretzky, P. Johnson, P. Liu, D. M. Rothstein, J. M. Penninger, CD45 is a JAK phosphatase and negatively regulates cytokine receptor signalling. Nature 409, 349-354 (2001).
21.  K. Kishihara, J. Penninger, V. A. Wallace, T. M. Kundig, K. Kawai, A. Wakeham, E. Timms, K. Pfeffer, P. S. Ohashi, M. L. Thomas, et al., Normal B lymphocyte development but impaired T cell maturation in CD45-exon6 protein tyrosine phosphatase-deficient mice. Cell 74, 143-156 (1993).
22.  K. F. Byth, L. A. Conroy, S. Howlett, A. J. Smith, J. May, D. R. Alexander, N. Holmes, CD45-null transgenic mice reveal a positive regulatory role for CD45 in early thymocyte development, in the selection of CD4+CD8+ thymocytes, and B cell maturation. J Exp Med 183, 1707-1718 (1996).
23.  P. J. Mee, M. Turner, M. A. Basson, P. S. Costello, R. Zamoyska, V. L. Tybulewicz, Greatly reduced efficiency of both positive and negative selection of thymocytes in CD45 tyrosine phosphatase-deficient mice. Eur J Immunol 29, 2923-2933 (1999).
24.  C. Kung, J. T. Pingel, M. Heikinheimo, T. Klemola, K. Varkila, L. I. Yoo, K. Vuopala, M. Poyhonen, M. Uhari, M. Rogers, S. H. Speck, T. Chatila, M. L. Thomas, Mutations in the tyrosine phosphatase CD45 gene in a child with severe combined immunodeficiency disease. Nat Med 6, 343-345 (2000).
25.  E. Z. Tchilian, D. L. Wallace, R. S. Wells, D. R. Flower, G. Morgan, P. C. Beverley, A deletion in the gene encoding the CD45 antigen in a patient with SCID. J Immunol 166, 1308-1313 (2001).
26.  M. L. Hermiston, J. Zikherman, J. W. Zhu, CD45, CD148, and Lyp/Pep: critical phosphatases regulating Src family kinase signaling networks in immune cells. Immunol Rev 228, 288-311 (2009).
27.  H. S. Warren, L. J. Skipsey, Loss of activation-induced CD45RO with maintenance of CD45RA expression during prolonged culture of T cells and NK cells. Immunology 74, 78-85 (1991).
28.  M. D. Roth, Interleukin 2 induces the expression of CD45RO and the memory phenotype by CD45RA+ peripheral blood lymphocytes. J Exp Med 179, 857-864 (1994).
29.  K. W. Lynch, A. Weiss, A model system for activation-induced alternative splicing of CD45 pre-mRNA in T cells implicates protein kinase C and Ras. Mol Cell Biol 20, 70-80 (2000).
30.  X. Fu, Y. Liu, L. Li, Q. Li, D. Qiao, H. Wang, S. Lao, Y. Fan, C. Wu, Human natural killer cells expressing the memory-associated marker CD45RO from tuberculous pleurisy respond more strongly and rapidly than CD45RO- natural killer cells following stimulation with interleukin-12. Immunology 134, 41-49 (2011).
31.  N. D. Huntington, Y. Xu, S. L. Nutt, D. M. Tarlinton, A requirement for CD45 distinguishes Ly49D-mediated cytokine and chemokine production from killing in primary natural killer cells. J Exp Med 201, 1421-1433 (2005).
32.  D. G. Hesslein, R. Takaki, M. L. Hermiston, A. Weiss, L. L. Lanier, Dysregulation of signaling pathways in CD45-deficient NK cells leads to differentially regulated cytotoxicity and cytokine production. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 7012-7017 (2006).
33.  L. H. Mason, J. Willette-Brown, L. S. Taylor, D. W. McVicar, Regulation of Ly49D/DAP12 signal transduction by Src-family kinases and CD45. J Immunol 176, 6615-6623 (2006).
34.  V. Beziat, B. Descours, C. Parizot, P. Debre, V. Vieillard, NK cell terminal differentiation: correlated stepwise decrease of NKG2A and acquisition of KIRs. PLoS One 5, e11966 (2010).
35.  J. Clausen, B. Vergeiner, M. Enk, A. L. Petzer, G. Gastl, E. Gunsilius, Functional significance of the activation-associated receptors CD25 and CD69 on human NK-cells and NK-like T-cells. Immunobiology 207, 85-93 (2003).
36.  K. Juelke, M. Killig, M. Luetke-Eversloh, E. Parente, J. Gruen, B. Morandi, G. Ferlazzo, A. Thiel, I. Schmitt-Knosalla, C. Romagnani, CD62L expression identifies a unique subset of polyfunctional CD56dim NK cells. Blood 116, 1299-1307 (2010).
37.  S. Lopez-Verges, J. M. Milush, S. Pandey, V. A. York, J. Arakawa-Hoyt, H. Pircher, P. J. Norris, D. F. Nixon, L. L. Lanier, CD57 defines a functionally distinct population of mature NK cells in the human CD56dimCD16+ NK-cell subset. Blood 116, 3865-3874 (2010).
38.  M. Della Chiesa, L. Muccio, A. Moretta, CMV induces rapid NK cell maturation in HSCT recipients. Immunology letters 155, 11-13 (2013).
39.  J. Siewiera, H. El Costa, J. Tabiasco, A. Berrebi, G. Cartron, P. Le Bouteiller, N. Jabrane-Ferrat, Human cytomegalovirus infection elicits new decidual natural killer cell effector functions. PLoS pathogens 9, e1003257 (2013).
40.  J. Wang, K. Pantopoulos, Regulation of cellular iron metabolism. Biochem J 434, 365-381 (2011).
41.  J. Garaude, S. Kaminski, S. Charni, J. I. Aguilo, C. Jacquet, M. Plays, J. Hernandez, F. Rodriguez, R. A. Hipskind, A. Anel, M. Villalba, Impaired anti-leukemic immune response in PKCtheta-deficient mice. Mol Immunol 45, 3463-3469 (2008).
42.  S. Kaminski, O. Adjali, C. Jacquet, J. Garaude, A. Keriel, A. Lassaux, R. Hipskind, M. Sitbon, N. Taylor, M. Villalba, The protooncogene Vav1 regulates murine leukemia virus-induced T-cell leukemogenesis. Oncoimmunology 1, 600-608 (2012).
43.  K. Karre, H. G. Ljunggren, G. Piontek, R. Kiessling, Selective rejection of H-2-deficient lymphoma variants suggests alternative immune defence strategy. Nature 319, 675-678 (1986).
44.  M. F. van den Broek, D. Kagi, R. M. Zinkernagel, H. Hengartner, Perforin dependence of natural killer cell-mediated tumor control in vivo. Eur J Immunol 25, 3514-3516 (1995).
45.  J. Pardo, S. Balkow, A. Anel, M. M. Simon, Granzymes are essential for natural killer cell-mediated and perf-facilitated tumor control. Eur J Immunol 32, 2881-2887 (2002).
46.  J. I. Aguilo, J. Garaude, J. Pardo, M. Villalba, A. Anel, Protein kinase C-theta is required for NK cell activation and in vivo control of tumor progression. J Immunol 182, 1972-1981 (2009).
47.  S. Charni, J. I. Aguilo, J. Garaude, G. de Bettignies, C. Jacquet, R. A. Hipskind, D. Singer, A. Anel, M. Villalba, ERK5 Knockdown generates mouse leukemia cells with low MHC class i levels that activate NK cells and block tumorigenesis. J Immunol 182, 3398-3405 (2009).
48.  S. Charni, G. de Bettignies, M. G. Rathore, J. I. Aguilo, P. J. van den Elsen, D. Haouzi, R. A. Hipskind, J. A. Enriquez, M. Sanchez-Beato, J. Pardo, A. Anel, M. Villalba, Oxidative phosphorylation induces de novo expression of the MHC class I in tumor cells through the ERK5 pathway. J Immunol 185, 3498-3503 (2010).
49.  L. Senovilla, E. Vacchelli, J. Galon, S. Adjemian, A. Eggermont, W. H. Fridman, C. Sautes-Fridman, Y. Ma, E. Tartour, L. Zitvogel, G. Kroemer, L. Galluzzi, Trial watch: Prognostic and predictive value of the immune infiltrate in cancer. Oncoimmunology 1, 1323-1343 (2012).
50.  E. Mamessier, L. C. Pradel, M. L. Thibult, C. Drevet, A. Zouine, J. Jacquemier, G. Houvenaeghel, F. Bertucci, D. Birnbaum, D. Olive, Peripheral blood NK cells from breast cancer patients are tumor-induced composite subsets. J Immunol 190, 2424-2436 (2013).
51.  E. Mamessier, F. Bertucci, R. Sabatier, D. Birnbaum, D. Olive, "Stealth" tumors: Breast cancer cells shun NK-cells anti-tumor immunity. Oncoimmunology 1, 366-368 (2012).
52.  R. Willemze, C. A. Rodrigues, M. Labopin, G. Sanz, G. Michel, G. Socie, B. Rio, A. Sirvent, M. Renaud, L. Madero, M. Mohty, C. Ferra, F. Garnier, P. Loiseau, J. Garcia, L. Lecchi, G. Kogler, Y. Beguin, C. Navarrete, T. Devos, I. Ionescu, K. Boudjedir, A. L. Herr, E. Gluckman, V. Rocha, KIR-ligand incompatibility in the graft-versus-host direction improves outcomes after umbilical cord blood transplantation for acute leukemia. Leukemia 23, 492-500 (2009).
53.  M. Stern, L. Ruggeri, A. Mancusi, M. E. Bernardo, C. de Angelis, C. Bucher, F. Locatelli, F. Aversa, A. Velardi, Survival after T cell-depleted haploidentical stem cell transplantation is improved using the mother as donor. Blood 112, 2990-2995 (2008).
54.  N. Bhatnagar, H. S. Hong, J. K. Krishnaswamy, A. Haghikia, G. M. Behrens, R. E. Schmidt, R. Jacobs, Cytokine-activated NK cells inhibit PMN apoptosis and preserve their functional capacity. Blood 116, 1308-1316 (2010).
55.  Z. Xu, A. Weiss, Negative regulation of CD45 by differential homodimerization of the alternatively spliced isoforms. Nat Immunol 3, 764-771 (2002).
56.  T. Mustelin, T. Vang, N. Bottini, Protein tyrosine phosphatases and the immune response. Nat Rev Immunol 5, 43-57 (2005).
57.  D. G. Hesslein, E. H. Palacios, J. C. Sun, J. N. Beilke, S. R. Watson, A. Weiss, L. L. Lanier, Differential requirements for CD45 in NK-cell function reveal distinct roles for Syk-family kinases. Blood 117, 3087-3095 (2011).
58.  L. A. Earl, S. Bi, L. G. Baum, N- and O-glycans modulate galectin-1 binding, CD45 signaling, and T cell death. J Biol Chem 285, 2232-2244 (2010).
59.  K. Ito, K. Stannard, E. Gabutero, A. M. Clark, S. Y. Neo, S. Onturk, H. Blanchard, S. J. Ralph, Galectin-1 as a potent target for cancer therapy: role in the tumor microenvironment. Cancer metastasis reviews 31, 763-778 (2012).
【図１Ａ】
0006805137.tif 000003
【図１Ｂ】
0006805137.tif 000004
【図１Ｃ】
0006805137.tif 000005
【図１Ｄ−１】
0006805137.tif 000006
【図１Ｄ−２】
0006805137.tif 000007
【図２Ａ】
0006805137.tif 000008
【図２Ｂ】
0006805137.tif 000009
【図２Ｃ】
0006805137.tif 000010
【図３Ａ】
0006805137.tif 000011
【図３Ｂ】
0006805137.tif 000012
【図３Ｃ−Ｄ】
0006805137.tif 000013
【図４Ａ】
0006805137.tif 000014
【図４Ｂ】
0006805137.tif 000015
【図４Ｃ】
0006805137.tif 000016
【図４Ｄ】
0006805137.tif 000017
【図４Ｅ】
0006805137.tif 000018
【図５Ａ】
0006805137.tif 000019
【図５Ｂ】
0006805137.tif 000020
【図６Ａ】
0006805137.tif 000021
【図６Ｂ−１】
0006805137.tif 000022
【図６Ｂ−２】
0006805137.tif 000023
【図７Ａ】
0006805137.tif 000024
【図７Ｂ−Ｃ】
0006805137.tif 000025
【図７Ｄ−Ｅ】
0006805137.tif 000026
【図８Ａ−Ｂ】
0006805137.tif 000027
【図８Ｃ】
0006805137.tif 000028
【図９】
0006805137.tif 000029
【図１０】
0006805137.tif 000030
【図１１】
0006805137.tif 000031