(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスペルギルス属の微生物から分離したペクチナーゼと、トリコデルマ属の微生物から分離したペクチナーゼとを用いて、人参のサポニンを転換させることによって、下記化学式１で示すコンパウンドＫおよび下記化学式２で示すコンパウンドＹを製造する方法。
［化学式１］
【化１】
0006805246.tif 000005
［化学式２］
【化２】
0006805246.tif 000006
【請求項２】
前記方法は、以下の段階を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法：
（１）基質である人参のサポニンを水性溶媒または水性溶媒と有機溶媒との混合液中に溶解させ、酵素としてアスペルギルス属の微生物から分離したペクチナーゼと、トリコデルマ属の微生物から分離したペクチナーゼとを添加して、加温状態の水浴槽上で撹拌しながら反応させ、コンパウンドＫおよびコンパウンドＹが含まれた反応液を得る段階；
（２）前記の基質が完全消失したら、前記（１）の反応液中の酵素を不活性化させて反応を終了させる段階；および
（３）前記（２）の段階後の反応液に酢酸エチルを添加して抽出した後に濃縮させて、コンパウンドＫおよびコンパウンドＹを分離する段階。
【請求項３】
前記基質である人参のサポニンは、ジンセノサイドＲｂ１、Ｒｂ２、Ｒｃ、Ｒｄまたはこれらの混合物中から選択される一種以上であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記アスペルギルス属の微生物は、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルスアクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルスルチュエンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ）およびアスペルギルスオリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）からなる群より選択される一種以上であって、
前記トリコデルマ属の微生物は、トリコデルマアグレシバム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｇｇｒｅｓｓｉｖｕｍ）、トリコデルマハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマリーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）およびトリコデルマビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）からなる群より選択される一種以上であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記アスペルギルス属から分離したペクチナーゼと、トリコデルマ属から分離したペクチナーゼとは、同時にまたは順次的に添加されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記酵素の全体量は、基質の量に対して１０〜４００重量％に該当することを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記（１）の酵素の反応は、３５〜６０℃の温度で行われることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記（１）の酵素の反応は、２４〜９６時間反応することを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記水性溶媒または水性溶媒と有機溶媒との混合液は、ｐＨが３〜６の範囲であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人参のサポニンから、本来人参内に微量に存在するコンパウンドＫおよびコンパウンドＹを選択的に製造する方法に関し、さらに詳細には、人参から得られるサポニンに特定の酵素を処理して、上記サポニンを構造転換させることによって所望する目標化合物、すなわちコンパウンドＫおよびコンパウンドＹを高収率に収得することのできる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人参サポニンは他の植物から発見されるサポニンとは異なる特異な化学構造を有しており、これによって薬理効能も特異なため、人参（ｇｉｎｓｅｎｇ）配糖体（ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）という意味で“ジンセノサイド（ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ）”とも呼ばれる。人参サポニンの具体的な種類としては、パナキサジオール系であるジンセノサイドＲｂ１、Ｒｂ２、Ｒｃ、Ｒｄ、コンパウンドＫ、コンパウンドＭｃ、コンパウンドＯなど、およびパナキサトリオール系であるジンセノサイドＲｅ、Ｒｆ、Ｒｇ１、Ｒｇ３、Ｒｇ５、Ｒｈ１、Ｒｈ２などがあって、これら人参サポニンはそれぞれ異なる効能を表す。
【０００３】
［反応式１］
【化１】
0006805246.tif 000002
【０００４】
上記の反応式１に示すように、特にパナキサジオール系サポニンであるジンセノサイドＲｂ１、Ｒｂ２、Ｒｃなどは微生物代謝によって他の人参サポニンに転換され得るため、人参サポニンから他の種類の特定の人参サポニンに転換させる方法として酵素を用いる方法が以前から使用されている。
【０００５】
しかしながら、従来の酵素を用いる転換反応は、基質に対する酵素の非特異性が大きいため用いられるサポニン基質対比極めて多い量の酵素を使用せざるを得ず、また、生成される所望する人参サポニンの収率が極めて低かった。
【０００６】
人参サポニンを収得する従来の方法は、所望する特定の人参サポニンだけに転換させるのではなく、転換された多様な人参サポニンを抽出などを通じて収得した後、これを精製して、所望する人参サポニンのみを分離することを技術的解決策としている。
【０００７】
ところが、このような従来方法は、純粋な特定の人参サポニンを収得するために精製による追加的な費用、時間などが所要されるため、人参サポニンの販売価が上昇せざるを得ず、これによって関連製品に人参サポニンを多量に適用するには限界がある。
【０００８】
特に、コンパウンドＫの場合には人参サポニンから転換される化合物の経路において最後に生成される化合物に該当するため、中間代謝体を全て反応させることのできる多様な酵素が必要となって、さらに反応中間に生成される代謝産物により代謝体と酵素間の反応性が落ちるようになる。それのみならず、中間代謝体間の反応液内の固まる現象によって収率が低くなる問題が発生する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】大韓民国公開特許第１０−２０１０−０１０７８６５号（２０１０年１０月０６日公開）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従来の方法により特定の人参サポニンを収得するためには費用が多くかかるのみならず、所望する人参サポニンを大量に入手することが困難であった。したがって、目標人参サポニンを大量に生産することができ、かつ費用を節減することのできる製造方法を開発する必要性が存在した。
【００１１】
それゆえ、本発明は所望する特定の人参サポニンを高収率に収得することができ、かつ実施が容易な人参サポニンの転換方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記の目的を達成するため、本発明は、アスペルギルス属から分離したペクチナーゼ、ナリンギナーゼ、セルラーゼおよびヘミセルラーゼからなる群より選択される一種以上と、トリコデルマ属から分離したペクチナーゼおよびセルラーゼからなる群より選択される一種以上とを用いて、人参のサポニンを転換させることによって、コンパウンドＫおよびコンパウンドＹを高収率で製造する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明による人参サポニンへの転換方法を用いることによって、所望する人参サポニンを高収率で容易に収得することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、人参サポニンへの転換反応後に生成されるコンパウンドＫおよびコンパウンドＹをシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって確認した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、酵素的方法によって人参サポニンから、下記の化学式１で示すコンパウンＫおよび下記の化学式２で示すコンパウンドＹを選択的に製造する方法に関する。
【００１６】
［化学式１］
【化２】
0006805246.tif 000003
【００１７】
［化学式２］
【化３】
0006805246.tif 000004
【００１８】
本発明の方法によると、微生物由来の酵素を用いることによって、人参のサポニン、具体的には人参のパナキサジオール系のサポニン、さらに具体的にはジンセノサイドＲｂ１、Ｒｂ２、Ｒｃ、Ｒｄまたはこれらの混合物から、所望する人参サポニンへの転換が効率的に行われるようにして、高収率にコンパウンドＫおよびコンパウンドＹを収得することができる。
【００１９】
具体的には、本発明において用いられる酵素は、好ましくはアスペルギルス属の微生物およびトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の微生物から得られるものであって、好ましくはアスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルスアクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルスルチュエンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ）およびアスペルギルスオリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）からなる群より選択される一種以上のアスペルギルス属の微生物、およびトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の微生物は、トリコデルマアグレシバム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｇｇｒｅｓｓｉｖｕｍ）、トリコデルマハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマリーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）およびトリコデルマビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）からなる群より選択される一種以上のトリコデルマ属の微生物から得られるものであって、最も好ましくはアスペルギルスアクレアタスおよびトリコデルマリーゼイから得られるものである。
【００２０】
さらに、本発明において用いられる酵素は、上記の微生物から分離したナリンギナーゼ、ヘミセルラーゼ、ベータ−グルカナーゼ、ラクターゼ、セルラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ペクチナーゼであることができ、好ましくはペクチナーゼ、ナリンギナーゼ、ヘミセルラーゼまたはセルラーゼである。
【００２１】
大部分が同一な作用を行う同じ種類の酵素であっても、酵素が由来した微生物の種によって具体的に酵素が基質内で作用する部位が相違して基質特異性に差が生じる。したがって、本発明においては、最も好ましくはアスペルギルスアクレアタスから得られるペクチナーゼ、ナリンギナーゼ、セルラーゼおよびヘミセルラーゼからなる群より選択される一種以上と、トリコデルマリーゼイから得られるペクチナーゼ、セルラーゼまたはこれらの混合物からなる群より選択される一種以上とを同時に用いることである。
【００２２】
本発明においては、人参のサポニンを溶媒に０．０１〜２０重量％の量で溶解させた後、上記酵素を用いて酵素的方法によって、サポニンを所望する人参サポニンに転換させる。このとき用いられる溶媒としては、酵素の活性を阻止しないものを使用するのが好ましく、例えば、水または緩衝溶液のような水性溶媒、あるいは水または緩衝溶液のような水性溶媒と有機溶媒との混合液を使用することができる。具体的にこのとき用いられる緩衝溶液としては酢酸、クエン酸、リン酸またはクエン酸−リン酸などであり、有機溶媒としてはアセトニトリル、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノールなどである。好ましくは、用いられる溶媒としてはｐＨ範囲が２．５〜７．５、より好ましくは３〜６、さらに好ましくは３．５〜５．５である。
【００２３】
本発明の方法において、用いられる酵素の全体量は使用する基質の量に対して、１〜５００重量％の量で添加されるのが好ましく、より好ましくは１０〜４００重量％、さらに好ましくは１０〜２００重量％の量で添加される。
【００２４】
反応温度は、酵素の不活性化が行われない温度条件でなければならないが、好ましくは３０〜６０℃、より好ましくは３５〜６０℃、さらに好ましくは４０〜５５℃の範囲で温度を維持することである。
【００２５】
さらに、反応時間も酵素の活性が維持される期間であれば特に制限を受けないが、１〜１２０時間、好ましくは１〜９６時間、より好ましくは２４〜９６時間、さらに好ましくは２４〜７２時間撹拌しながら反応させることである。
【００２６】
酵素反応は、二つの酵素を基質に同時に添加するか、一つの酵素を先に反応させた後、残りの酵素を後に投入する順次的方式で遂行することもできる。
【００２７】
以降、沸騰水浴槽における加熱のような公知の方法を用い、酵素を不活性化することによってコンパウンドＫおよびコンパウンドＹが多量含有された反応液を得ることができる。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明を実施例によってさらに詳細に説明する。但し、次の実施例で本発明の範疇が限定されるものではない。
【００２９】
［参考例１］人参精製サポニンの製造
紅参、白参、水参、尾参あるいはこれらの人参の葉、人参の花、人参の実２ｋｇにエタノール２０リットル（Ｌ）を入れ、３回還流抽出した後、１５℃で６日間沈積させた。その後、ろ過布ろ過と遠心分離を通じて残渣とろ液を分離し、分離されたろ液を減圧濃縮して得られたエキスを水に懸濁した後に、エーテル１Ｌで５回抽出して色素を除去し、水層を１−ブタノール１Ｌで３回抽出した。これから得られた総１−ブタノール層を５％ＫＯＨで処理した後に蒸留水で洗浄し、減圧濃縮して１−ブタノールエキスを収得し、これを少量のメタノールに溶かした後、大量の酢酸エチルに加えて、生成された沈殿物を乾燥させることによって、人参精製サポニン（ジンセノサイドＲｂ１、Ｒｂ２、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｇ１、Ｒｆなどを含む）４０〜８０ｇを収得した。
【００３０】
［実施例１］酵素反応を通じたコンパウンドＫおよびコンパウンドＹの製造
上記参考例１の人参精製サポニン（ジンセノサイドＲｂ１、Ｒｂ２、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｇ１、Ｒｆなどを含む）１０ｇを水１Ｌに入れて溶解した。
その後、上記混合液にアスペルギルスアクレアタスから分離したペクチナーゼとトリコデルマリーゼイから分離したペクチナーゼとを同時に添加し、このとき上記の酵素はそれぞれ基質対比１００重量％ずつ添加して、３０℃で７２時間反応させた。薄層クロマトグラフィーによって周期的に確認して基質が完全に消失されると、沸騰水浴槽で１０分間加熱して酵素を不活性化させて反応を終了させた。最後に、反応液に酢酸エチルを１：１の比率（反応液に対する体積比）で入れて３回抽出した後に濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９：１）によって、図１に示すようにコンパウンドＫおよびコンパウンドＹを分離した。
【００３１】
使用した参考例１の人参サポニン１０ｇには、２．６６ｇのジンセノサイドＲｂ１、０．７３ｇのジンセノサイドＲｂ２、１．２３ｇのジンセノサイドＲｃおよび０．３８ｇのジンセノサイドＲｄが存在した。コンパウンドＫは、ジンセノサイドＲｂ１、ジンセノサイドＲｃおよびジンセノサイドＲｄから９５％以上の収率で転換し、コンパウンドＹは、ジンセノサイドＲｂ２から９５％以上の収率で転換した。
【図１】
0006805246.tif 000007