(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における免疫応答を誘導するための方法における使用のための、
配列番号１に対して少なくとも90％の同一性を有する配列を含むM72抗原と、3DMPL及びQS-21を含むアジュバントとを含む第１の免疫原性組成物；並びに
配列番号１に対して少なくとも90％の同一性を有する配列を含むM72抗原を含む第２の免疫原性組成物であって、
前記方法が、第１の免疫原性組成物の被験体への投与、次いで、第２の免疫原性組成物の被験体への投与を含み、被験体は5年間以内にM72抗原を含む免疫原性組成物の合計3回用量を受け、被験体は第１の組成物の2回用量及び第２の組成物の1回用量を受け、第１の組成物の最後の投与と第２の組成物の投与との間の時間間隔が3ヶ月〜5年である、
前記免疫原性組成物。
【請求項２】
第１の組成物の最後の投与と第２の組成物の投与との間の時間間隔が3ヶ月〜24ヶ月、3〜18ヶ月、3〜14ヶ月、3〜10ヶ月、3〜9ヶ月又は3〜8ヶ月である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
第１の組成物の最後の投与と第２の組成物の投与との間の時間間隔が4〜14ヶ月又は4〜9ヶ月である、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
第１の組成物の最後の投与と第２の組成物の投与との間の時間間隔が4〜8ヶ月である、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
M72抗原が配列番号１の残基2〜723を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項６】
M72抗原が配列番号２を含む、請求項５記載の組成物。
【請求項７】
第１及び/又は第２の免疫原性組成物が1μg〜100μgのM72抗原を含む、請求項１〜６のいずれか１項記載の組成物。
【請求項８】
第２の免疫原性組成物が第２のアジュバントを含み、第２のアジュバントがTLR4アゴニスト及び免疫学的に活性なサポニンを含む、請求項１〜７のいずれか１項記載の組成物。
【請求項９】
第１のアジュバント及び存在する場合には第２のアジュバントがリポソーム製剤として提供される、請求項１〜８のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１０】
第２の免疫原性組成物中のM72抗原の量が、第１の免疫原性組成物中のものの5/4〜1/10である、請求項１〜９のいずれか１項記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫応答を誘導するための方法、特に、後の投与が遅延される、アジュバント化免疫原性組成物の少なくとも2回の投与を含む、免疫化のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチン接種は、感染症を防止するための最も有効な方法の1つである。しかしながら、抗原の単回投与は、最適な免疫および/または長期的な応答を提供するのに十分ではないことが多い。特定の病原体に対する強力かつ持続的な免疫を確立するための手法としては、ワクチンへのアジュバントの添加および/または反復的ワクチン接種、すなわち、1つ以上のさらなる用量の抗原の投与による免疫応答の上昇が挙げられる。そのようなさらなる投与を、同じワクチン(同種追加免疫）または異なるワクチン(異種追加免疫)を用いて実施することができる。同種追加免疫のための最も一般的な手法は、同じワクチンを投与するだけでなく、早い方の投与と同じ用量でそれを投与することでもある。
【０００３】
結核(TB)は、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)および他のマイコバクテリウム種による感染によって引き起こされる慢性感染症である。それは発展途上国における主要な疾患であり、ならびに世界の先進地域における深刻な問題である。
【０００４】
タンパク質抗原Mtb72fおよびM72(例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願WO2006/117240およびWO2012/080369に記載されている)またはその断片もしくは誘導体は、結核の処置または防止にとって潜在的に有益なタンパク質抗原である。以前の調査は、リポソーム製剤中の免疫刺激剤3-O-脱アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL)およびQS21と共に、ならびに10μgのM72、25μgの3D-MPLおよび25μgのQS21を用いる0、1ヶ月のスケジュールで、ヒトにおいて投与されるM72をもたらした(Leroux-Roelsら、Vaccine 2013 31 2196-2206、Montoyaら、J. Clin. Immunol. 2013 33(8): 1360-1375)。
【０００５】
M72抗原を用いる候補ワクチンは、現在、TB流行国で生活する18〜50歳の成人において、プラセボと比較した場合の、肺TBに対する2用量の予防効果を評価するための第IIB相試験(ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01755598)にある。
【０００６】
高度に有効であり、安全であり、費用効果的であり、持続的であり、広範囲の交差反応性免疫応答を誘導する、結核などの疾患に対して免疫する新規方法が依然として必要である。
【発明の概要】
【０００７】
ここで、驚くべきことに、アジュバント化M72ワクチンを用いる免疫化の多用量方法において、後の用量(追加用量)を前の用量(初回用量)と比較して遅延させた場合、免疫化がより有効であることがわかった。用いられたアジュバントは、TLR4アゴニストである3D-MPL、および免疫学的に活性なサポニン画分であるQS21を含んでいた。
【０００８】
したがって、本発明の第1の態様において、第1のアジュバントがTLRアゴニストおよび/または免疫学的に活性なサポニンを含み、第1および第2の投与の間の間隔が2ヶ月〜5年である、M72関連抗原および第1のアジュバントを含む第1の免疫原性組成物の被験体への投与、次いで、M72関連抗原を含む第2の免疫原性組成物の被験体への投与を含む、被験体における免疫応答を誘導するための方法が提供される。
【０００９】
必要に応じて、第2の免疫原性組成物は、第2のアジュバントがTLRアゴニストおよび/または免疫学的に活性なサポニンを含む、第2のアジュバントを含む。好適には、第2のアジュバントは、TLRアゴニストおよび/または免疫学的に活性なサポニンを含み、第1のアジュバントと共通してこれらの2つの成分の少なくとも1つを有する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】標準レジメおよび遅延レジメにおける、M72を投与したマウスに由来するCD4 T細胞応答を示す図である。
【図２】標準レジメおよび遅延レジメにおける、M72を投与したマウスに由来するCD8 T細胞応答を示す図である。
【図３】標準レジメおよび遅延レジメにおける、M72を投与したマウスに由来するCD4 T細胞サイトカインプロファイルを示す図である。
【図４】標準レジメおよび遅延レジメにおける、M72を投与したマウスに由来するCD8 T細胞サイトカインプロファイルを示す図である。
【図５】標準レジメおよび遅延レジメにおける、M72を投与したマウスに由来する抗M72血清学を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
配列番号の簡単な説明
配列番号1：M72のポリペプチド配列
配列番号2：2個のN末端His残基を有するM72タンパク質のポリペプチド配列
配列番号3：Mtb72fのポリペプチド配列。
【００１２】
詳細な説明
結核(TB)は、結核菌および他のマイコバクテリウム種による感染によって引き起こされる慢性感染症である。それは発展途上国における主要な疾患であり、ならびに世界の先進地域における深刻な問題である。20億を超える人々がTB桿菌に感染していると考えられ、毎年、約900万人が新しく感染し、150万人が死亡している(World Health Organisation Tuberculosis Facts 2014)。TB桿菌に感染した人の10%が活動型TBを発症し、活動型TBを有するそれぞれの人は、年に平均で10〜15人の他人を感染させている。
【００１３】
結核菌は、呼吸器経路により個体に感染する。肺胞マクロファージは細菌を飲み込むが、それは、酸性リソソームとのファゴソーム融合を阻害することによって生存および増殖することができる。CD4+およびCD8+ T細胞を含む複雑な免疫応答が続いて起こり、最終的には肉芽腫の形成をもたらす。病原体としての結核菌の成功の中心となるのは、単離されているが、根絶されてはいない細菌が、長期間持続し、活動型TBの後の発症に対して個体を脆弱にし得るという事実である。
【００１４】
感染した個体の5%未満が、感染後1年目に活動型TBを発症する。肉芽腫は数十年持続することができ、酸素および栄養素が枯渇した休眠状態で生きた結核菌を含有すると考えられる。しかしながら、最近では、休眠状態にある細菌の大部分は身体中に広がった非マクロファージ細胞型に位置することが示唆されている(Lochtら、Expert Opin. Biol. Ther. 2007 7(11):1665-1677)。活動性TBの発症は、例えば、免疫抑制事象の結果として、宿主の自然免疫と病原体とのバランスが変化するときに起こる(Anderson P Trends in Microbiology 2007 15(1):7-13; Ehlers S Infection 2009 37(2):87-95)。
【００１５】
潜伏性TBと活動性TBとのバランスを説明する力学仮説も提唱されている(Cardana P-J Inflammation & Allergy - Drug Targets 2006 6:27-39; Cardana P-J Infection 2009 37(2):80-86)。
【００１６】
感染はかなりの期間にわたって無症状性であり得るが、活動性疾患は、疲労、体重減少、発熱および持続性の咳をもたらす、肺の急性炎症として最も一般的に現れる。未処置の場合、典型的には、重篤な合併症および死亡の結果となる。
【００１７】
結核は一般に、長期的な抗生物質療法を用いて制御することができるが、そのような処置は疾患の拡散を防止するには十分ではない。活動的に感染した個体は、大部分は無症状であるが、しばらくの間は伝染性であり得る。さらに、処置レジメンの遵守が重要であるが、患者の行動をモニタリングするのは難しい。いくらかの患者は処置過程を完了せず、無効な処置および薬物耐性の発生をもたらし得る。
【００１８】
多剤耐性TB(MDR-TB)は、第一選択の薬剤に応答することができない形態である。全てのTB事例の3.3%がMDR-TBであり、毎年、440,000の新しいMDR-TB事例が生じていると見積もられている。広範囲薬剤耐性TB(XDR-TB)は、第二選択の薬剤に対する耐性が第一選択の薬剤に対する耐性に加えて生じる場合に生じる。実質的に治療不可能なXDR-TBが、58カ国において確認されている(World Health Organisation Tuberculosis Facts 2010)。
【００１９】
抗生物質処置の全過程が完了する場合であっても、結核菌による感染を、感染した個体から根絶させることはできず、再活性化することができる潜伏感染として残り得る。結核の拡散を制御するために、有効なワクチン接種プログラムおよび疾患の正確で素早い診断が最も重要である。
【００２０】
現在、弱毒化生細菌を用いるワクチン接種が、防御免疫を誘導するために最も広く用いられている方法である。この目的のために用いられる最も一般的なマイコバクテリウムは、60年以上前に初めて開発されたマイコバクテリウム・ボビス(M.bovis)の無毒株であるカルメット・ゲラン桿菌(BCG)である。それはTB流行地域で誕生時に投与される。しかしながら、BCGの安全性および有効性は論争の種であり、子供における重篤な疾患兆候に対して保護するが、疾患に対するBCGの有効性は変動し得る。さらに、米国などのいくつかの国は、一般人にこの薬剤をワクチン接種していない。
【００２１】
マイコバクテリウム感染の初期段階中に強く発現されるいくつかのタンパク質は、動物ワクチン接種モデルにおいて予防効果を提供することが示されている。しかしながら、感染の初期段階中に高度に発現される抗原を用いるワクチン接種は、より後の段階の感染に対処するための最適な免疫応答を提供することができない。潜伏感染中の十分な制御には、その時点で発現される特定の抗原に特異的であるT細胞が必要であり得る。休止中の持続的細菌を直接標的とする曝露後ワクチンは、TB再活性化に対して防御するのに役立ち、それによって、TB制御を促進するか、またはさらには感染の消失も可能にし得る。したがって、潜伏性TBを標的とするワクチンは、地球規模のTB感染率を有意かつ経済的に減少させることができる。
【００２２】
後期段階の抗原に基づくサブユニットワクチンを、初期段階の抗原と組み合わせて用いて、多面的ワクチンを提供することもできる。あるいは、初期および/または後期段階の抗原を用いて、BCGワクチン接種を補完および改良することができる(BCG応答を上昇させることによるか、または進化した組換えBCG株の開発による)。
【００２３】
Mtb72fおよびM72は、結核の処置または防止にとって潜在的に有益なタンパク質抗原である。Mtb72fはいくつかの動物モデルにおいて防御を提供することが示されている(例えば、Brandtら、Infect. Immun. 2004 72(11):6622-6632; Skeikyら、J. Immunol. 2004 172:7618-7628; Tsenovaら、Infect. Immun. 2006 74(4):2392-2401を参照されたい)。Mtb72fはまた、臨床試験の主題でもあった(Von Eschenら、2009 Human Vaccines 5(7):475-482)。M72は、Mtb72fと比較してセリンからアラニンへの単一の突然変異を含む改良された抗原であり、改善された安定性特性をもたらす。M72関連抗原もまた、潜伏性TBモデルにおいて価値があることが示されている(参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願WO2006/117240)。以前の臨床試験は、リポソーム製剤中の免疫刺激剤3-O-脱アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL)およびQS21と共に、ならびに10μgのM72、25μgの3D-MPLおよび25μgのQS21を用いる0、1ヶ月のスケジュールで、ヒトにおいて投与されるM72をもたらした(例えば、Leroux-Roelsら、Vaccine 2013 31 2196-2206、Montoyaら、J. Clin. Immunol. 2013 33(8): 1360-1375を参照されたい)。
【００２４】
M72抗原を用いる候補ワクチンは、現在、TB流行国で生活する18〜50歳の成人において、プラセボと比較した場合の、肺TBに対する2用量の予防効果を評価するための第IIB相試験(ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01755598)にある。それにもかかわらず、改良されたワクチン接種手法が依然として必要である。
【００２５】
第1の態様において、第1のアジュバントがTLRアゴニストおよび/または免疫学的に活性なサポニンを含み、第1および第2の投与の間の間隔が2ヶ月〜5年である、M72関連抗原および第1のアジュバントを含む第1の免疫原性組成物の被験体への投与、次いで、M72関連抗原を含む第2の免疫原性組成物の被験体への投与を含む、被験体における免疫応答を誘導するための方法が提供される。
【００２６】
本明細書で用いられる場合、第1の組成物の投与、「次いで」第2の組成物の投与は、第1の組成物の投与と第2の組成物の投与との間の時間間隔が経過したことを示す。
【００２７】
また、被験体において免疫応答を誘導するための方法における使用のための、M72関連抗原と、TLRアゴニストおよび/または免疫学的に活性なサポニンを含む第1のアジュバントとを含む第1の免疫原性組成物であって、前記方法が、第1の免疫原性組成物の被験体への投与、次いで、M72関連抗原を含む第2の免疫原性組成物の被験体への投与を含み、第1および第2の投与の間の間隔が2ヶ月〜5年である、前記組成物が提供される。
【００２８】
同様に、被験体において免疫応答を誘導するための方法における使用のための、M72関連抗原を含む第2の免疫原性組成物であって、前記方法が、M72関連抗原と、TLRアゴニストおよび/または免疫学的に活性なサポニンを含む第1のアジュバントとを含む第1の免疫原性組成物の被験体への投与、次いで、第2の免疫原性組成物の被験体への投与を含み、第1および第2の投与の間の間隔が2ヶ月〜5年である、前記組成物が提供される。
【００２９】
さらに、被験体において免疫応答を誘導する方法における使用のための医薬の製造における、M72関連抗原と、TLRアゴニストおよび/または免疫学的に活性なサポニンを含む第1のアジュバントとを含む第1の免疫原性組成物の使用であって、前記方法が、第1の免疫原性組成物の投与、次いで、M72関連抗原を含む第2の免疫原性組成物の被験体への投与を含み、第1および第2の投与の間の間隔が2ヶ月〜5年である、前記使用が提供される。
【００３０】
さらに、被験体において免疫応答を誘導する方法における使用のための医薬の製造における、第2の免疫原性組成物の使用であって、前記方法が、M72関連抗原と、TLRアゴニストおよび/または免疫学的に活性なサポニンを含む第1のアジュバントとを含む第1の免疫原性組成物の被験体への投与、次いで、M72関連抗原を含む第2の免疫原性組成物の被験体への投与を含み、第1および第2の投与の間の間隔が2ヶ月〜5年である、前記使用が提供される。
【００３１】
必要に応じて、第2の免疫原性組成物は、TLRアゴニストおよび/または免疫学的に活性なサポニンを含む第2のアジュバントを含む。好適には、第2のアジュバントは、TLRアゴニストおよび/または免疫学的に活性なサポニンを含み、第1のアジュバントと共通するこれらの2つの成分の少なくとも1つを有する。
【００３２】
好適には、被験体はヒトである。
【００３３】
典型的には、本発明の方法の目的は、防御免疫応答を誘導する、すなわち、関連する病原体に対して被験体を免疫する、またはワクチン接種することである。したがって、本発明を、結核菌により感染などの、マイコバクテリアによる感染の予防、処置(治療)または改善のために適用することができる。特に、本発明を、
-  感染していない被験体、もしくはあるいは、潜伏感染を有する被験体に投与することなどによる、感染もしくは再活性化に起因する活動性結核の予防；
-  感染していない被験体に投与することなどによる、潜伏性結核の予防；
-  潜伏性結核の処置；
-  例えば、数ヶ月、数年もしくは無期限の期間による、結核の再活性化の防止もしくは遅延、特に、TB再活性化の遅延；または
-  活動性結核の処置
の目的のために提供することができる。
【００３４】
用語「活動性感染」とは、疾患症状および/または病変を示す、好適には、疾患症状を示す、感染、例えば、結核菌による感染を指す。
【００３５】
用語「非活動性感染」、「休眠感染」または「潜伏感染」または「潜伏性結核」とは、疾患症状および/または病変を示さない、好適には、疾患症状を示さない感染、例えば、結核菌による感染を指す。潜伏感染を有する被験体は、好適には、例えば、PPDまたはT細胞に基づくアッセイにより、感染について陽性を示すが、活動性感染と関連する疾患症状および/または病変を示していない。
【００３６】
用語「一次結核症」とは、臨床的疾患、例えば、感染、例えば、結核菌による感染の直後の、疾患症状の兆候を指す。Harrison’s Principles of Internal Medicine, Chapter 150, pp. 953-966 (第16版、Braunwaldら(編)、2005)を参照されたい。
【００３７】
用語「二次結核症」または「初感染後の結核」とは、休眠、非活動性または潜伏感染、例えば、結核菌による感染の再活性化を指す。Harrison’s Principles of Internal Medicine, Chapter 150, pp. 953-966 (第16版、Braunwaldら(編)、2005)を参照されたい。
【００３８】
用語「結核再活性化」とは、感染検査について陽性を示す(例えば、ツベルクリン皮膚検査において、好適には、in vitroでのT細胞に基づくアッセイにおいて)が、見かけの疾患症状を有さない個体における疾患症状のより後の兆候を指す。好適には、個体は感染に対して再曝露されていない。陽性の診断試験は、個体が感染しているが、その個体が、結核を非活動状態または潜伏状態にするために十分に処置された、活動性疾患症状を以前に示していても、または示していなくてもよいことを示す。
【００３９】
好適には、免疫原性組成物は、感染していないか、または結核菌による感染などのマイコバクテリアによる潜伏感染を有する被験体に投与される。
【００４０】
いくつかの実施形態においては、被験体は、BCGを以前にワクチン接種されている。
【００４１】
いくつかの実施形態においては、被験体は、結核菌に以前に感染している。
【００４２】
本発明において有用な抗原
本明細書で用いられる用語「M72関連抗原」とは、配列番号1に提供されるM72タンパク質またはその免疫原性誘導体を指す。本明細書で用いられる用語「誘導体」とは、参照配列と比較して改変された抗原を指す。免疫原性誘導体は、参照配列と十分に類似し、参照配列の免疫原性特性を保持し、参照配列に対して生じる免疫応答を依然として可能にすることができる。誘導体は、例えば、改変型の参照配列を含んでもよく、またはあるいは、改変型の参照配列からなっていてもよい。
【００４３】
M72関連抗原は、例えば、1200個未満のアミノ酸残基、特に、1000個未満のアミノ酸残基、特に、800個未満のアミノ酸残基などの、1500個未満のアミノ酸残基を含有してもよい。
【００４４】
T細胞エピトープは、T細胞(例えば、CD4+またはCD8+ T細胞)により認識されるアミノ酸の短い連続伸長物である。T細胞エピトープの同定を、当業者には公知であるエピトープマッピング実験により達成することができる(例えば、Paul, Fundamental Immunology、第3版、243-247 (1993); Beiβbarthら、Bioinformatics 2005 21(Suppl. 1):i29-i37を参照されたい)。ヒトなどの、多様な非近交系集団においては、異なるHLA型は、特定のエピトープが集団の全てのメンバーによって認識されないことを意味する。結核におけるT細胞応答の決定的な関与の結果として、免疫応答の認識および規模のレベルを最大化するために、M72の免疫原性誘導体は、望ましくは、大部分(または、好適には、全て)の無傷のT細胞エピトープを含有するものである。
【００４５】
当業者であれば、単一のアミノ酸または小さい割合のアミノ酸を変化させる、付加する、または欠失させるM72タンパク質に対する個々の置換、欠失または付加が、変化があるアミノ酸の、機能的に類似するアミノ酸との置換または免疫原性機能に実質的に影響しない残基の置換/欠失/付加をもたらす「免疫原性誘導体」であることを認識できる。
【００４６】
機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は、当業界で周知である。一般に、そのような保存的置換は、以下に特定されるアミノ酸群の1つに含まれるが、いくつかの状況では、抗原の免疫原性特性に実質的に影響しない多の置換も可能である。以下の8つの群はそれぞれ、典型的には互いに保存的置換であるアミノ酸：
1)アラニン(A)、グリシン(G)；
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)；
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q)；
4)アルギニン(R)、リジン(K)；
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V)；
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)；
7)セリン(S)、トレオニン(T)；および
8)システイン(C)、メチオニン(M)
を含有する(例えば、Creighton、Proteins 1984を参照されたい)。
【００４７】
好適には、そのような置換は、エピトープの領域中に存在せず、したがって、抗原の免疫原性特性に対する有意な影響を有さない。
【００４８】
免疫原性誘導体はまた、さらなるアミノ酸が参照配列と比較して挿入されたものを含んでもよい。好適には、そのような挿入は、エピトープの領域中に存在せず、したがって、抗原の免疫原性特性に対する有意な影響を有さない。挿入の一例は、問題の抗原の発現および/または精製を補助するためのヒスチジン残基の短い伸長物(例えば、2〜6個の残基)を含む。
【００４９】
免疫原性誘導体は、アミノ酸が参照配列と比較して欠失したものを含む。好適には、そのような欠失は、エピトープの領域中に存在せず、したがって、抗原の免疫原性特性に対する有意な影響を有さない。
【００５０】
当業者であれば、特定の免疫原性誘導体が置換、欠失および付加(またはその任意の組合せ)を含んでもよいことを認識できる。
【００５１】
2つ以上のポリペプチド配列の文脈における用語「同一の」または「同一性」パーセンテージとは、以下の配列比較アルゴリズムの1つを用いて、または手動のアラインメントおよび目視検査により測定された場合、比較ウィンドウ、または指定の領域にわたって最大の一致について比較し、整列させたとき、同じであるか、または同じである特定のパーセンテージ(すなわち、特定の領域にわたる70%の同一性、必要に応じて、75%、80%、85%、90%、95%、98%または99%の同一性)のアミノ酸残基を有する2つ以上の配列またはサブ配列を指す。この定義はまた、試験配列の相補体も指す。必要に応じて、同一性は、少なくとも600アミノ酸または少なくとも700アミノ酸などの、少なくとも500アミノ酸長である領域にわたって存在する。好適には、比較は、参照配列の全長に対応するウィンドウにわたって実施される(誘導体配列とは反対である)。
【００５２】
配列比較のために、1つの配列は、試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて、サブ配列の座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを用いるか、または代替パラメータを指定することができる。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列と比較した試験配列に関する配列同一性パーセンテージを算出する。
【００５３】
本明細書で用いられる「比較ウィンドウ」とは、2つの配列を最適に整列させた後、配列を同じ数の連続する位置の参照配列と比較することができるセグメントを指す。比較のための配列のアラインメントの方法は、当業界で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントを、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の部分的相同性アルゴリズムにより、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Pearson & Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA  85:2444 (1988)の類似性検索法により、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI中のGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA)により、または手動のアラインメントおよび目視検査(例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubelら(編)、1995 supplement)を参照されたい)により行うことができる。
【００５４】
有用なアルゴリズムの一例は、PILEUPである。PILEUPは、関係および配列同一性パーセントを示すためのプログレッシブペアワイズアラインメントを用いて関連配列群から複数の配列アラインメントを作出するものである。それはまた、アラインメントを作出するために用いられるクラスタリング関係を示すツリーまたはデンドログラムをプロットする。PILEUPは、Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987)のプログレッシブアラインメント法の単純化を用いる。用いられる方法は、Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989)により記載された方法と類似する。このプログラムは、それぞれ、最大で5,000ヌクレオチドまたはアミノ酸の長さの、300個の配列まで整列させることができる。複数のアラインメント手順は、2つの最も類似する配列のペアワイズアラインメントから始まり、2つの整列された配列のクラスターを生成する。次いで、このクラスターを、次の最も関連する配列または整列された配列のクラスターと整列させる。配列の2つのクラスターを、2つの個々の配列のペアワイズアラインメントの単純な伸長によって整列させる。最終的なアラインメントは、一連のプログレッシブペアワイズアラインメントによって達成される。このプログラムは、配列比較の領域について特定の配列およびそのアミノ酸座標を指定することにより、およびプログラムパラメータを指定することにより実行される。PILEUPを用いて、参照配列を多の試験配列と比較して、以下のパラメータ：デフォルトギャップ重量(3.00)、デフォルトギャップ長さ重量(0.10)、および加重末端ギャップを用いて配列同一性パーセントの関係を決定する。PILEUPを、GCG配列分析ソフトウェアパッケージ、例えば、バージョン7.0(Devereauxら、Nuc. Acids Res. 12:387-395 (1984))から取得することができる。
【００５５】
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するのに好適なアルゴリズムの別の例は、それぞれ、Altschulら、Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)およびAltschulら、J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)に記載されている、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムである。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov/のウェブサイト)を介して公共的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列させた場合、いくつかの正の値の閾値スコアTと一致するか、またはそれを満たす、問合せ配列中の短いワード長Wを同定することによって、高スコア配列対(HSP)を最初に同定することを含む。Tは、近隣ワードスコア閾値と呼ばれる(Altschulら、上掲)。これらの初期の近隣ワードヒットは、それらを含有するより長いHSPを見出すための検索を開始するための種として作用する。ワードヒットは、累積アラインメントスコアを増大させることができる限り、それぞれの配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータM(一致する残基の対に関するリワードスコア；常に0より大きい)およびN(不一致の残基に関するペナルティスコア；常に0より小さい)を用いて算出する。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを用いて、累積スコアを算出する。累積アラインメントスコアが、その最大達成値から量X下落する場合、それぞれの方向でのワードヒットの伸長を停止させる；累積スコアは1つ以上の負のスコアリングの残基アラインメントの蓄積のため、0以下になる；またはいずれかの配列の末端に達する。BLASTアルゴリズムパラメータW、TおよびXは、アラインメントの感度および速度を決定づける。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列用)は、デフォルトとして、11のワード長(W)、10の期待値(E)、M=5、N=-4および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列については、BLASTPプログラムは、デフォルトとして、3のワード長、および10の期待値(E)、およびBLOSUM62スコアリングマトリックス(Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989))、50のアラインメント(B)、10の期待値(E)、M=5、N=-4および両鎖の比較を用いる。
【００５６】
BLASTアルゴリズムはまた、2つの配列間の類似性の統計分析も実施する(例えば、Karlin & Altschul, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA  90:5873-5787 (1993)を参照されたい)。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の1つの尺度は、2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然に生じる確率の指標を提供する最小和確率(P(N))である。例えば、核酸は、試験核酸と参照核酸との比較における最小和確率が約0.2未満、より好ましくは、約0.01未満、最も好ましくは、約0.001未満である場合、参照配列と類似すると考えられる。
【００５７】
任意の事象において、ポリペプチド配列の免疫原性誘導体は、参照配列と本質的に同じ活性を有する。本質的に同じ活性とは、リンパ球増殖による細胞の活性化、培養上清中でのサイトカインの産生(ELISA、CBAなどにより測定される)または細胞内および細胞外染色(例えば、CD3、CD4、CD8、IL2、TNF-アルファ、IFN-ガンマ、CD40L、CD69などの免疫マーカーに特異的な抗体を用いる)、次いで、フローサイトメーターを用いる分析によるTおよびB細胞応答の特徴付けを測定する、特定の抗原を用いるPBMCまたは全血のin vitro再刺激アッセイ(例えば、最大で1日、1日〜1週間または1〜2週間などの、数時間から最大で2週間の期間にわたる再刺激)における参照配列の少なくとも50%、好適には、少なくとも75%、特に、少なくとも90%の活性を意味する。好適には、本質的に同じ活性とは、T細胞増殖および/またはIFN-ガンマ産生アッセイにおける参照配列の少なくとも50%、好適には、少なくとも75%、特に、少なくとも90%の活性を意味する。
【００５８】
M72タンパク質の特定の誘導体は、N末端に追加のHis残基(例えば、配列番号2に提供されるような2個のHis残基；またはニッケル親和性精製のために用いることができる、5個もしくは特に、6個のHis残基のポリヒスリジンタグ)を有するものを含む。M72中で突然変異された元のセリン残基を含有するMtb72f(配列番号3)は、N末端に追加のHis残基(例えば、2個のHis残基；またはニッケル親和性精製のために用いることができる、5個もしくは特に、6個のHis残基のポリヒスチジンタグ)を有するMtb72fタンパク質であるため、M72のさらなる誘導体である。
【００５９】
好適には、M72関連抗原は、配列番号1に対する少なくとも70%、例えば、少なくとも80%、特に、少なくとも90%、特に、少なくとも95%、例えば、少なくとも98%、例えば、少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、例えば、それからなる。
【００６０】
典型的なM72関連抗原は、少数の欠失、挿入および/または置換を有する配列番号1または2の免疫原性誘導体を含む、例えば、それからなる。例は、0〜5個の位置での最大5個の残基の欠失、0〜5個の位置での最大5個の残基の挿入および最大20個の残基の置換を有するものである。
【００６１】
M72の他の免疫原性誘導体は、少なくとも300アミノ酸長、例えば、少なくとも350アミノ酸長、例えば、少なくとも400アミノ酸長、例えば、少なくとも500アミノ酸長、例えば、少なくとも600アミノ酸長または少なくとも700アミノ酸長である、配列番号1または2の断片を含む、例えば、それからなるものである。M72は2つの個々の抗原に由来する融合タンパク質であるため、少なくとも300残基の任意の断片は、完全長配列に由来する複数のエピトープを含む(Skeikyら、J. Immunol. 2004 172:7618-7628; Skeiky Infect. Immun. 1999 67(8):3998-4007; Dillon Infect. Immun. 1999 67(6):2941-2950)。いくつかの実施形態においては、M72の免疫原性誘導体は、Mtb39Aに由来する少なくとも300個の残基を含む。
【００６２】
特定の実施形態においては、M72関連抗原は、配列番号1の残基2〜723を含む、例えば、配列番号1または2を含む(またはからなる)。
【００６３】
M72関連抗原を、以前に記載された方法(WO2006/117240)またはそれと類似する方法によって調製することができる。
【００６４】
免疫原性組成物は、1つ以上のさらなる抗原性成分を含んでもよい。さらなる抗原性成分は、結核の防止および治療の分野においてM72関連抗原により求められる免疫応答を強化または補完することを意図してもよいか、またはさらなる抗原を他の病原体と関連させ、便宜上の理由からM72関連抗原と一緒の投与を意図される。いくつかの抗原性成分が製剤内に存在する場合、これらのものを、個々のポリペプチドまたは融合タンパク質の形態で提供することができる。いくつかの状況では、さらなる抗原性成分を、ポリヌクレオチド(または複数のポリヌクレオチド)として提供することができる。
【００６５】
抗原は、M72抗原などの結核菌抗原、例えば、米国特許第8,470,338号として特許され、本発明における使用のための好適なタンパク質を記載する目的で参照により組み込まれるWO2006/117240に記載された抗原である。
【００６６】
典型的には、ヒトへの投与のために、第1および第2の免疫原性組成物は、1μg〜100μg、例えば、1μg〜50μgのM72関連抗原を含む。好適には、第1の免疫原性組成物は、1μg〜50μg (5μg〜50μgなど)、特に、1μg〜20μg(5μg〜20μgなど)、特に、約10μgまたは正確に10μgのM72関連抗原を含有する。
【００６７】
いくつかの実施形態においては、第2の免疫原性組成物は、第1の免疫原性組成物と同じ量のM72関連抗原を含有する。例えば、第2の免疫原性組成物は、1μg〜50μg(5μg〜50μgなど)、特に、1μg〜20μg(5μg〜20μgなど)、特に、約10μgまたは正確に10μgのM72関連抗原を含有する。
【００６８】
他の実施形態においては、第2の免疫原性組成物は、第1の免疫原性組成物と比較して減少した量のM72関連抗原を含有する。例えば、第2の免疫原性組成物は、1μg〜40μg(2μg〜40μgなど)、特に、1μg〜16μg(2μg〜16μgなど)、特に、10μg未満(1〜8μgなど)のM72関連抗原を含有する。
【００６９】
一実施形態においては、第2の免疫原性組成物中の少ない方の量のM72関連抗原は、第1の免疫原性組成物中の量よりも少なくとも10%少ない、例えば、少なくとも25%少ない、例えば、少なくとも2倍少ない、例えば、少なくとも3倍少ない、例えば、少なくとも4倍少ない、例えば、少なくとも5倍少ない、例えば、少なくとも6倍少ない、例えば、少なくとも7倍少ない、例えば、少なくとも8倍少ない、例えば、少なくとも9倍少ない、例えば、少なくとも10倍少ない。
【００７０】
第2の免疫原性組成物中のM72関連抗原の量は、典型的には、第1の免疫原性組成物中のものの5/4(すなわち、125%)〜1/10(すなわち、10%)である。
【００７１】
本発明の一実施形態においては、第1および第2の免疫原性組成物は、同じM72関連抗原を含有する。
【００７２】
いくつかの実施形態においては、第1および第2の免疫原性組成物中の全ての抗原は同じである。
【００７３】
本発明の方法における使用のためのアジュバント
上記のように、本発明の一態様において、第1のアジュバントはTLRアゴニストおよび/または免疫学的に活性なサポニンを含む。
【００７４】
かくして、一実施形態において、第1のアジュバントはTLRアゴニストを含む。別の実施形態においては、第1のアジュバントは免疫学的に活性なサポニンを含む。さらに別の実施形態においては、第1のアジュバントはTLRアゴニストおよび免疫学的に活性なサポニンを含む。
【００７５】
別の態様において、第1のアジュバントおよび第2のアジュバントは、TLRアゴニストおよび/または免疫学的に活性なサポニンを含み、一般に、これらの2つの成分の少なくとも1つを有する。
【００７６】
かくして、一実施形態においては、第1のアジュバントおよび第2のアジュバントは、両方ともTLRアゴニストを含む。別の実施形態においては、第1のアジュバントおよび第2のアジュバントは、両方とも免疫学的に活性なサポニンを含む。さらに別の実施形態においては、第1のアジュバントおよび第2のアジュバントは、両方ともTLRアゴニストおよび免疫学的に活性なサポニンを含む。
【００７７】
一実施形態においては、第1のアジュバントおよび第2のアジュバントは、同じ成分からなる。かくして、そのような実施形態においては、両アジュバントの成分は同じであるが、必ずしも同じ相対比率にはない。例えば、第1のアジュバントおよび第2のアジュバントは両方とも、リポソーム製剤中のTLRアゴニストおよびサポニンからなってもよいが、TLRアゴニストとサポニンとの比は、第1のアジュバント中では5:1および第2のアジュバント中では1:1、第1のアジュバント中では4:1および第2のアジュバント中では1:1、第1のアジュバント中では3:1および第2のアジュバント中では2:1、第1のアジュバント中では1:1および第2のアジュバント中では1:1であってもよい。
【００７８】
別の実施形態においては、第1のアジュバントおよび第2のアジュバントは、同じ成分からなり、これらの成分の相対比率は同じである。しかしながら、そのような実施形態においては、アジュバント成分の相対比率は同じであるが、これらの成分の絶対量は第1および第2の免疫原性組成物間で異なってもよい。例えば、第2のアジュバント中の全成分の絶対量は、例えば、第1のアジュバント中の全成分の絶対量の1/5であってもよい。
【００７９】
上記のように、一実施形態においては、第2のアジュバントは、第1のアジュバントよりも少ない量の共通成分(すなわち、より少ない量のTLRアゴニストまたはより少ない量のサポニンまたはより少ない量の両方)を含有する。
【００８０】
一実施形態においては、第2のアジュバント中の少ない方の量の共通成分は、第1のアジュバント中よりも少なくとも10%少ない、例えば、少なくとも25%少ない、例えば、少なくとも2倍少ない、例えば、少なくとも3倍少ない、例えば、少なくとも4倍少ない、例えば、少なくとも5倍少ない、例えば、少なくとも6倍少ない、例えば、少なくとも7倍少ない、例えば、少なくとも8倍少ない、例えば、少なくとも9倍少ない、例えば、少なくとも10倍少ない、例えば、少なくとも15倍少ない、例えば、少なくとも20倍少ない量である。
【００８１】
別の実施形態においては、第2のアジュバント中の少ない方の量の共通成分は、第1のアジュバント中よりも2〜50倍少ない、例えば、2〜20倍少ない、例えば、2〜15倍少ない、例えば、2〜10倍少ない、例えば、3〜7倍少ない、例えば、4〜6倍少ない量である。
【００８２】
第2の免疫原性組成物中の共通アジュバント成分(全共通アジュバント成分など)の量は、典型的には、第1の免疫原性組成物中のものの5/4(すなわち、125%)〜1/10(すなわち、10%)である。
【００８３】
上記のように、一実施形態においては、第1のアジュバントおよび第2のアジュバントは、TLR(Toll様受容体)アゴニストを含む。アジュバントにおけるTLRアゴニストの使用は当業界で周知であり、例えば、Lahiriら(2008) Vaccine 26:6777により概説されている。アジュバント効果を達成するために刺激することができるTLRとしては、TLR2、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8およびTLR9が挙げられる。TLR2、TLR4、TLR7およびTLR8アゴニスト、特に、TLR4アゴニストが好ましい。
【００８４】
好適なTLR4アゴニストは、モノホスホリルリピドA(MPL)および3-O-脱アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL)などのリポ多糖を含む。米国特許第4,436,727号は、MPLおよびその製造を開示する。米国特許第4,912,094号および再審査証明書B1 4,912,094は、3D-MPLおよびその製造のための方法を開示する。別のTLR4アゴニストは、グルコピラノシルリピドアジュバント(GLA)、合成リピドA様分子である(例えば、Foxら(2012) Clin. Vaccine Immunol 19:1633を参照されたい)。さらなる実施形態においては、TLR4アゴニストは、構造においてMPLおよび3D-MPLと類似する、合成二糖分子などの合成TLR4アゴニストであってもよいか、または例えば、WO9850399、WO0134617、WO0212258、W03065806、WO04062599、WO06016997、WO0612425、WO03066065、およびWO0190129に開示されるアミノアルキルグルコサミニドホスフェート(AGP)などの、合成単糖分子であってもよい。そのような分子もまた、リピドA模倣体として科学文献および特許文献に記載されている。リピドA模倣体は、好適には、リピドAといくつかの機能的および/または構造的活性を共有し、一態様においては、TLR4受容体によって認識される。本明細書に記載されるAGPは、当業界ではリピドA模倣体と呼ばれることもある。好ましい実施形態においては、TLR4アゴニストは、3D-MPLである。3-O-脱アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL)などのTLR4アゴニスト、およびワクチンにおけるアジュバントとしてのその使用は、例えば、WO 96/33739およびWO2007/068907に記載されており、Alvingら(2012) Curr Opin in Immunol 24:310に概説されている。
【００８５】
本発明の方法のさらなる実施形態においては、第1のアジュバントおよび第2のアジュバントは、QS21などの免疫学的に活性なサポニン画分などの免疫学的に活性なサポニンを含む。
【００８６】
サポニンを含むアジュバントは、当業界で記載されている。サポニンは、Lacaille-DuboisおよびWagner (1996)、「A review of the biological and pharmacological activities of saponins」、Phytomedicine vol 2:363に記載されている。サポニンは、ワクチンにおけるアジュバントとして公知である。例えば、Quil A(南米の樹木キラヤ・サポナリア・モリナ(Quillaja Saponaria Molina)の樹皮に由来する)は、アジュバント活性を有するとDalsgaardら、1974 (「Saponin adjuvants」、Archiv. fur die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, 243)によって記載された。Quil Aと関連する毒性なしにアジュバント活性を保持するQuil Aの精製画分がHPLCによって単離されている(Kensilら(1991) J. Immunol. 146: 431)。Quil A画分はまた、米国特許第5,057,540号および「Saponins as vaccine adjuvants」、Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2):1-55にも記載されている。
【００８７】
本発明における使用にとって好適な、2つのそのような画分は、QS7およびQS21(QA-7およびQA-21としても知られる)である。QS21は、本発明における使用のための好ましい免疫学的に活性なサポニン画分である。QS21はKensil (2000) In O’Hagan: Vaccine Adjuvants: preparation methods and research protocols. Homana Press, Totowa, New Jersey, Chapter 15で概説されている。QS21およびQS7などのQuil Aの画分を含む粒子状アジュバント系は、例えば、WO96/33739、WO96/11711およびWO2007/068907に記載されている。
【００８８】
他の成分に加えて、アジュバントは、好ましくはステロールを含む。ステロールの存在は、サポニンを含む組成物の反応原性をさらに低下させることができる。例えば、EP0822831を参照されたい。好適なステロールとしては、ベータ-シトステロール、スティグマステロール、エルゴステロール、エルゴカルシフェロールおよびコレステロールが挙げられる。コレステロールが特に好適である。好適には、免疫学的に活性なサポニン画分はQS21であり、QS21：ステロールの比は、1:100〜1:1 w/w、例えば、1:10〜1:1 w/w、例えば、1:5〜1:1 w/wである。
【００８９】
本発明の方法の好ましい実施形態においては、TLR4アゴニストは3D-MPLであり、免疫学的に活性なサポニンはQS21である。
【００９０】
いくつかの実施形態においては、アジュバントは、例えば、スクアレン、アルファ-トコフェロールおよび界面活性剤を含む水中油乳濁液の形態(例えば、WO95/17210を参照されたい)またはリポソームの形態で提供される。リポソームでの提供が好ましい。
【００９１】
本明細書で用いられる場合の用語「リポソーム」とは、水性内部を封入する単層または多層(特に、形成される脂質膜の数に応じて、2、3、4、5、6、7、8、9または10層)の脂質構造を指す。リポソームおよびリポソーム製剤は、当業界で周知である。リポソーム提供物は、例えば、WO96/33739およびWO2007/068907に記載されている。リポソームを形成することができる脂質としては、脂肪または脂肪様特性を有する全ての物質が挙げられる。リポソーム中の脂質を構成することができる脂質を、グリセリド、グリセロリン脂質、グリセロホスフィノ脂質、グリセロホスホノ脂質、スルホリピド、スフィンゴ脂質、リン脂質、イソプレノリド、ステロイド、ステアリン、ステロール、アルケオリピド、合成カチオン性脂質および炭水化物含有脂質を含む群から選択することができる。本発明の特定の実施形態においては、リポソームはリン脂質を含む。好適なリン脂質としては、(限定されるものではないが)ホスファチジルコリンの合成における中間体であるホスホコリン(PC)；天然リン脂質誘導体：卵白ホスホコリン、卵白ホスホコリン、大豆ホスホコリン、水素化大豆ホスホコリン、天然リン脂質としてのスフィンゴミエリン；および合成リン脂質誘導体：ホスホコリン(ジデカノイル-L-a-ホスファチジルコリン[DDPC]、ジラウロイルホスファチジルコリン[DLPC]、ジミリストイルホスファチジルコリン[DMPC]、ジパルミトイルホスファチジルコリン[DPPC]、ジステアロイルホスファチジルコリン[DSPC]、ジオレオイルホスファチジルコリン[DOPC]、1-パルミトイル,2-オレオイルホスファチジルコリン[POPC]、ジエライドイルホスファチジルコリン[DEPC]、ホスホグリセロール(1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセロール[DMPG]、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセロール[DPPG]、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセロール[DSPG]、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセロール[POPG])、ホスファチジン酸(1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジン酸[DMPA]、ジパルミトイルホスファチジン酸[DPPA]、ジステアロイル-ホスファチジン酸[DSPA])、ホスホエタノールアミン(1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン[DMPE]、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン[DPPE]、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン[DSPE]、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン[DOPE])、ホスホセリン、ポリエチレングリコール[PEG]リン脂質が挙げられる。
【００９２】
リポソームのサイズは、リン脂質の組成およびその調製のために用いられる方法に応じて、30nm〜数μmで変化してもよい。本発明の特定の実施形態においては、リポソームのサイズは、50nm〜500nmの範囲にあり、さらなる実施形態においては、50nm〜200nmである。動的レーザー光散乱は、当業者には周知のリポソームのサイズを測定するために用いられる方法である。
【００９３】
特に好適な実施形態においては、本発明において用いられるリポソームは、DOPCおよびステロール、特に、コレステロールを含む。かくして、特定の実施形態においては、本発明の組成物は、DOPCおよびステロール、特に、コレステロールを含むリポソームの形態の、本明細書に記載の任意の量のQS21を含む。
【００９４】
好ましくは、第1のアジュバントおよび第2のアジュバントは、リポソーム製剤中に3D-MPLおよびQS21を含む。
【００９５】
一実施形態においては、第1のアジュバントは、リポソーム製剤中に12.5〜75マイクログラムの3D-MPLと12.5〜75マイクログラムのQS21を含み、第2のアジュバントは、リポソーム製剤中に12.5〜75マイクログラムの3D-MPLと12.5〜75マイクログラムのQS21を含む。
【００９６】
別の実施形態においては、第1のアジュバントは、リポソーム製剤中に12.5〜37.5、例えば、20〜30マイクログラム(例えば、約または正確に25マイクログラム)の3D-MPLと、12.5〜37.5、例えば、20〜30マイクログラム(例えば、約または正確に25マイクログラム)のQS21を含み、第2のアジュバントは、12.5〜37.5、例えば、20〜30マイクログラム(例えば、約または正確に25マイクログラム)の3D-MPLと、12.5〜37.5、例えば、20〜30マイクログラム(例えば、約または正確に25マイクログラム)のQS21を含む。好適には、第1および第2のアジュバントにおいて、3D-MPLの量は、QS21の量と同じである。
【００９７】
別の実施形態においては、第1のアジュバントは、リポソーム製剤中に12.5〜37.5、例えば、20〜30マイクログラム(例えば、約または正確に25マイクログラム)の3D-MPLと、12.5〜37.5、例えば、20〜30マイクログラム(例えば、約または正確に25マイクログラム)のQS21を含み、第2のアジュバントは、2.5〜7.5、例えば、5マイクログラムの3D-MPLと、2.5〜7.5、例えば、5マイクログラムのQS21を含む。
【００９８】
別の実施形態においては、第1のアジュバントは、リポソーム製剤中に12.5〜37.5、例えば、20〜30マイクログラム(例えば、約または正確に25マイクログラム)の3D-MPLと、12.5〜37.5、例えば、20〜30マイクログラム(例えば、約または正確に25マイクログラム)のQS21を含み、第2のアジュバントは、リポソーム製剤中に減少した量の3D-MPLまたはQS21、例えば、2.5〜20、例えば、2.5〜10マイクログラム(例えば、約または正確に5マイクログラム)の3D-MPLと、例えば、2.5〜20、例えば、2.5〜10マイクログラム(例えば、約または正確に5マイクログラム)のQS21を含む。好適には、第1および第2のアジュバントにおいて、3D-MPLの量は、QS21の量と同じである。
【００９９】
非経口投与のためには、細胞の変形または溶解を回避するために溶液は生理学的に等張性である(すなわち、製薬上許容し得る浸透圧を有する)べきであることが周知である。製薬上許容し得る浸透圧は、一般に、溶液がほぼ等張性であるか、または軽度に高張性である浸透圧を有することを意味する。好適には、本発明の免疫原性組成物は、250〜750mOsm/kgの範囲の浸透圧を有する、例えば、浸透圧は、250〜550mOsm/kgの範囲、例えば、280〜500mOsm/kgの範囲にあってもよい。浸透圧は、市販の浸透圧計、例えば、Advanced Instruments Inc.(USA)から入手可能なAdvanced(登録商標)Model 2020の使用などにより、当業界で公知の技術にしたがって測定することができる。「等張剤」は、生理学的に許容され、製剤と接触する細胞膜を横断する正味の水の流動を防止するために製剤(例えば、本発明の免疫原性組成物)に好適な等張性を付与する化合物である。100mM以上の塩化ナトリウムを含有する水性アジュバント組成物、例えば、WO2005/112991およびWO2008/142133中のアジュバント系A(ASA)またはWO2007/068907に開示されたリポソームアジュバントが公知である。
【０１００】
いくつかの実施形態においては、組成物のために用いられる等張剤は塩である。しかしながら、他の実施形態においては、組成物は非イオン性等張剤を含み、組成物中の塩化ナトリウムの濃度またはイオン強度は100mM未満、例えば、80mM未満、例えば、30mM未満、例えば、10mM未満または5mM未満である。好ましい実施形態においては、非イオン性等張剤は、ソルビトールなどのポリオールである。ソルビトールの濃度は、例えば、約3%〜約15%(w/v)、例えば、約4%〜約10%(w/v)であってもよい。等張剤が塩またはポリオールである、免疫学的に活性なサポニン画分およびTLR4アゴニストを含むアジュバントは、参照により本明細書に組み込まれるWO2012/080369に記載されている。
【０１０１】
さらなる実施形態においては、第1のアジュバントおよび/または第2のアジュバントは、アルミニウムを含まない。
【０１０２】
免疫原性組成物のpHは、非経口投与にとって好適であるべきである。典型的には、pHは7.0〜9.0、特に、7.25〜8.75、例えば、7.5〜8.5、特に、pH7.75〜8.25の範囲にある。約8.0のpHが特に興味深い。
【０１０３】
免疫化レジメ、標的集団および投与様式
一実施形態においては、被験体は、2年間またはあるいは、5年間以内にM72抗原を含む免疫原性組成物の2回用量を受ける。第2の実施形態においては、被験体は、2年間またはあるいは、5年間以内にM72抗原を含む免疫原性組成物の3回用量を受ける。
【０１０４】
被験体が5年間以内にM72抗原を含む免疫原性組成物の2回用量を受ける場合、これは第1の免疫原性組成物および第2の免疫原性組成物である。一実施形態においては、第1の組成物の投与と第2の組成物の投与との間の時間間隔は、2ヶ月〜5年、例えば、3ヶ月〜5年、例えば、3ヶ月〜24ヶ月、例えば、3〜18ヶ月、例えば、3〜14ヶ月である。いくつかの実施形態においては、第1の組成物の投与と第2の組成物の投与との間の時間間隔は、3〜10ヶ月、例えば、3〜9ヶ月、例えば、3〜8ヶ月である。いくつかの実施形態においては、第1の組成物の投与と第2の組成物の投与との間の時間間隔は、4〜14ヶ月、例えば、4〜9ヶ月、例えば、4〜8ヶ月である。
【０１０５】
被験体が5年間以内にM72抗原を含む免疫原性組成物の3回用量を受ける場合、これは、(a)第1の免疫原性組成物の2回用量および第2の免疫原性組成物の1回用量であってよいか、または(b)第1の免疫原性組成物の1回用量および第2の免疫原性組成物の2回用量であってもよい。
【０１０６】
(a)の一実施形態においては、第1の組成物の初回投与と第2の組成物の投与の間の時間間隔は、3ヶ月〜5年、例えば、3ヶ月〜24ヶ月、例えば、3〜18ヶ月、例えば、3〜14ヶ月である。いくつかの実施形態においては、第1の組成物の初回投与と第2の組成物の投与の間の時間間隔は、3〜10ヶ月、例えば、3〜9ヶ月、例えば、3〜8ヶ月である。いくつかの実施形態においては、第1の組成物の初回投与と第2の組成物の投与の間の時間間隔は、4〜14ヶ月、例えば、4〜9ヶ月、例えば、4〜8ヶ月である。(a)の別の実施形態においては、第1の組成物の最後の投与と第2の組成物の投与の間の時間間隔は、2ヶ月〜5年、例えば、3〜5年、例えば、3ヶ月〜24ヶ月、例えば、3〜18ヶ月、例えば、3〜14ヶ月である。いくつかの実施形態においては、第1の組成物の最後の投与と第2の組成物の投与の間の時間間隔は、3〜10ヶ月、例えば、3〜9ヶ月、例えば、3〜8ヶ月である。いくつかの実施形態においては、第1の組成物の最後の投与と第2の組成物の投与の間の時間間隔は、4〜14ヶ月、例えば、4〜9ヶ月、例えば、4〜8ヶ月である。
【０１０７】
(b)の一実施形態においては、第1の組成物の投与と第2の組成物の最後の投与の間の時間間隔は、3ヶ月〜5年、例えば、3ヶ月〜24ヶ月、例えば、3〜18ヶ月、例えば、3〜14ヶ月である。いくつかの実施形態においては、第1の組成物の投与と第2の組成物の最後の投与の間の時間間隔は、3〜10ヶ月、例えば、3〜9ヶ月、例えば、3〜8ヶ月である。いくつかの実施形態においては、第1の組成物の投与と第2の組成物の最後の投与の間の時間間隔は、4〜14ヶ月、例えば、4〜9ヶ月、例えば、4〜8ヶ月である。(b)の別の実施形態においては、第1の組成物の投与と第2の組成物の初回投与の間の時間間隔は、2ヶ月〜5年、例えば、3ヶ月〜5年、例えば、3ヶ月〜24ヶ月、例えば、3〜18ヶ月、例えば、3〜14ヶ月である。いくつかの実施形態においては、第1の組成物の投与と第2の組成物の最後の投与の間の時間間隔は、3〜10ヶ月、例えば、3〜9ヶ月、例えば、3〜8ヶ月である。いくつかの実施形態においては、第1の組成物の投与と第2の組成物の最後の投与の間の時間間隔は、4〜14ヶ月、例えば、4〜9ヶ月、例えば、4〜8ヶ月である。
【０１０８】
被験体が第1の組成物を2回投与される場合、第1の組成物の初回投与と第1の組成物のさらなる投与の間の時間間隔は、2週間〜2ヶ月であってもよい。
【０１０９】
被験体が第2の組成物を2回投与される場合、第2の組成物の初回投与と第2の組成物のさらなる投与の間の時間間隔は、3ヶ月〜5年、例えば、3ヶ月〜24ヶ月、例えば、6〜14ヶ月であってもよい。
【０１１０】
さらなる実施形態においては、第2の組成物は、例えば、再発年の追加として、例えば、1〜5年以上与えることができる。一実施形態においては、第2の組成物の投与後、少なくとも12ヶ月、少なくとも13ヶ月、少なくとも14ヶ月、少なくとも15ヶ月、少なくとも16ヶ月、少なくとも17ヶ月、少なくとも18ヶ月、少なくとも19ヶ月、または少なくとも20ヶ月以上の時間間隔で、第2の組成物を1以上のさらなる時間、投与する。
【０１１１】
本発明の方法を用いて処置される被験体は、任意の年齢であってもよい。本発明の一態様において、被験体はヒトである。
【０１１２】
一実施形態においては、被験体はヒト成人(典型的には、18〜60歳)である。
【０１１３】
第1および第2の組成物は、筋肉内または皮下投与などの非経口投与を含む様々な好適な経路を介して投与することができる。
【０１１４】
1つの特定の実施形態においては、第2の組成物は皮内投与される。本明細書で用いられる用語「皮内」とは、ヒト皮膚の真皮および/または表皮への抗原の適用を指すことが意図される。免疫原性組成物の皮内適用を、限定されるものではないが、短針デバイス(約0.2〜約0.6mmの長さである微小針を含むデバイス)を用いる送達または皮膚パッチを用いる送達などの、当業者には公知の任意の皮膚方法を用いることによって実施することができる。本明細書に記載の皮膚ワクチンと共に使用するための好適なデバイスとしては、米国特許第4,886,499号、第5,190,521号、第5,328,483号、第5,527,288号、第4,270,537号、第5,015,235号、第5,141,496号、第5,417,662号、および欧州特許第1092444号に記載のものなどの短針デバイスが挙げられる。皮膚ワクチンを、WO99/34850に記載のものなどの、皮膚への針の有効貫通長を制限するデバイスによって投与することもできる。また、液体ジェット注入器または針を介して液体ワクチンを真皮に送達するジェット注入デバイスも好適である。また、皮膚の外層から真皮に向かって粉末形態のワクチンを加速するために圧縮気体を用いる弾道粉末/粒子送達デバイスも好適である。皮膚パッチは、一般的には、固体基質を含むバックプレートを含む。パッチは、本発明において用いられる抗原およびアジュバントを真皮または表皮に送達する。特定の実施形態においては、本発明において有用なパッチは、複数のマイクロインジェクションを含む。マイクロインジェクションは、角質層、表皮および/または真皮の貫通ならびに表皮または真皮への抗原およびアジュバントの送達にとって好適な任意の形状のものであってもよい。特定の実施形態においては、マイクロインジェクションは、生分解性であり、生分解性ポリマーを含む。
【０１１５】
本発明において用いられる免疫原性組成物を、抗原とアジュバントとを混合することによって作製することができる。抗原を、凍結乾燥形態で、または液体製剤中に提供することができる。それぞれの組成物について、抗原を含む第1の容器と、アジュバントを含む第2の容器とを含むキットを提供することができる。
【０１１６】
好適には、本発明による免疫原性組成物は、0.05ml〜1ml、例えば、0.1〜0.5mlのヒト用量、特に、約0.5ml、または0.7mlの用量を有する。第2の免疫原性組成物の容量を、例えば、0.05ml〜0.5ml、例えば、0.1〜0.2mlに減少させてもよい。用いられる組成物の容量は、送達経路に依存してもよく、より少ない用量が皮内経路により与えられる。
【０１１７】
以下、本発明の実施形態を示す。
（１）被験体における免疫応答を誘導するための方法であって、
(i)M72関連抗原と、TLRアゴニストおよび/または免疫学的に活性なサポニンを含む第1のアジュバントとを含む第1の免疫原性組成物の被験体への投与；次いで、
(ii)M72関連抗原を含む第2の免疫原性組成物の被験体への投与
を含み、第1および第2の投与の間の間隔が2ヶ月〜5年である、前記方法。
（２）被験体における免疫応答を誘導するための方法における使用のための、M72関連抗原と、TLRアゴニストおよび/または免疫学的に活性なサポニンを含む第1のアジュバントとを含む第1の免疫原性組成物であって、前記方法が、第1の免疫原性組成物の被験体への投与、次いで、M72関連抗原を含む第2の免疫原性組成物の被験体への投与を含み、第1および第2の投与の間の間隔が2ヶ月〜5年である、前記免疫原性組成物。
（３）被験体における免疫応答を誘導するための方法における使用のための、M72関連抗原を含む第2の免疫原性組成物であって、前記方法が、M72関連抗原と、TLRアゴニストおよび/または免疫学的に活性なサポニンを含む第1のアジュバントとを含む第1の免疫原性組成物の被験体への投与、次いで、第2の免疫原性組成物の被験体への投与を含み、第1および第2の投与の間の間隔が2ヶ月〜5年である、前記免疫原性組成物。
（４）被験体における免疫応答を誘導する方法における使用のための医薬の製造における、M72関連抗原と、TLRアゴニストおよび/または免疫学的に活性なサポニンを含む第1のアジュバントとを含む第1の免疫原性組成物の使用であって、前記方法が、第1の免疫原性組成物の被験体への投与、次いで、M72関連抗原を含む第2の免疫原性組成物の被験体への投与を含み、第1および第2の投与の間の間隔が2ヶ月〜5年である、前記使用。
（５）被験体における免疫応答を誘導する方法における使用のための医薬の製造における、第2の免疫原性組成物の使用であって、前記方法が、M72関連抗原と、TLRアゴニストおよび/または免疫学的に活性なサポニンを含む第1のアジュバントとを含む第1の免疫原性組成物の被験体への投与、次いで、M72関連抗原を含む第2の免疫原性組成物の被験体への投与を含み、第1および第2の投与の間の間隔が2ヶ月〜5年である、前記使用。
（６）被験体が合計2用量を5年以内に受ける、（１）〜（５）のいずれか１に記載の方法、組成物または使用。
（７）被験体が合計2用量を2年以内に受ける、（１）〜（５）のいずれか１に記載の方法、組成物または使用。
（８）第1の組成物の投与と、第2の組成物の投与との間の時間間隔が、3ヶ月〜5年、例えば、3ヶ月〜24ヶ月、3〜18ヶ月、3〜14ヶ月、3〜10ヶ月、3〜9ヶ月または3〜8ヶ月である、（１）〜（７）のいずれか１に記載の方法、組成物または使用。
（９）第1の組成物の投与と、第2の組成物の投与との間の時間間隔が、4〜14ヶ月、4〜9ヶ月、または4〜8ヶ月である、（１）〜（７）のいずれか１に記載の方法、組成物または使用。
（１０）被験体が合計3用量を5年以内に受ける、（１）〜（５）のいずれか１に記載の方法、組成物または使用。
（１１）被験体が合計3用量を2年以内に受ける、（１）〜（５）のいずれか１に記載の方法、組成物または使用。
（１２）被験体が2用量の第1の組成物および1用量の第2の組成物を受ける、（１０）または（１１）に記載の方法、組成物または使用。
（１３）第1の組成物の初回投与と、第2の組成物の投与との間の時間間隔が、3ヶ月〜5年、例えば、3ヶ月〜24ヶ月、3〜18ヶ月、3〜14ヶ月、3〜10ヶ月、3〜9ヶ月または3〜8ヶ月である、（１２）に記載の方法、組成物または使用。
（１４）第1の組成物の初回投与と、第2の組成物の投与との間の時間間隔が、4〜14ヶ月、4〜9ヶ月または4〜8ヶ月である、（１２）に記載の方法、組成物または使用。
（１５）第1の組成物の最後の投与と、第2の組成物の投与との間の時間間隔が、3ヶ月〜5年、例えば、3ヶ月〜24ヶ月、3〜18ヶ月、3〜14ヶ月、3〜10ヶ月、3〜9ヶ月または3〜8ヶ月である、（１２）〜（１４）のいずれか１に記載の方法、組成物または使用。
（１６）第1の組成物の最後の投与と、第2の組成物の投与との間の時間間隔が、4〜14ヶ月、4〜9ヶ月または4〜8ヶ月である、（１２）〜（１４）のいずれか１に記載の方法、組成物または使用。
（１７）被験体が1用量の第1の組成物および2用量の第2の組成物を受ける、（１０）または（１１）に記載の方法、組成物または使用。
（１８）第1の組成物の投与と、第2の組成物の最後の投与との間の時間間隔が、3ヶ月〜5年、例えば、3ヶ月〜24ヶ月、3〜18ヶ月、3〜14ヶ月、3〜10ヶ月、3〜9ヶ月または3〜8ヶ月である、（１７）に記載の方法、組成物または使用。
（１９）第1の組成物の投与と、第2の組成物の最後の投与との間の時間間隔が、4〜14ヶ月、4〜9ヶ月または4〜8ヶ月である、（１７）に記載の方法、組成物または使用。
（２０）第1の組成物の投与と、第2の組成物の初回投与との間の時間間隔が、3ヶ月〜5年、例えば、3ヶ月〜24ヶ月、3〜18ヶ月、3〜14ヶ月、3〜10ヶ月、3〜9ヶ月または3〜8ヶ月である、（１７）〜（１９）のいずれか１に記載の方法、組成物または使用。
（２１）第1の組成物の投与と、第2の組成物の初回投与との間の時間間隔が、4〜14ヶ月、4〜9ヶ月または4〜8ヶ月である、（１７）〜（１９）のいずれか１に記載の方法、組成物または使用。
（２２）M72関連抗原が、配列番号1に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を含む、（１）〜（２１）のいずれか１に記載の方法、組成物または使用。
（２３）M72関連抗原が、配列番号1の残基2〜723を含む、（２２）に記載の方法、組成物または使用。
（２４）M72関連抗原が、配列番号1を含む、（２３）に記載の方法、組成物または使用。
（２５）M72関連抗原が、配列番号2を含む、（２３）に記載の方法、組成物または使用。
（２６）M72関連抗原が、配列番号2からなる、（２３）に記載の方法、組成物または使用。
（２７）M72関連抗原が、少なくとも300アミノ酸長である配列番号1の断片を含む、（１）〜（２２）のいずれか１に記載の方法、組成物または使用。
（２８）M72関連抗原が、1500個未満のアミノ酸残基、例えば、1200個未満のアミノ酸残基、特に、1000個未満のアミノ酸残基、特に、800個未満のアミノ酸残基を含有する、（１）〜（２７）のいずれか１に記載の方法、組成物または使用。
（２９）第1および第2の免疫原性組成物中のM72関連抗原の量が同じである、（１）〜（２８）のいずれか１に記載の方法、組成物または使用。
（３０）第2の免疫原性組成物が、第1の免疫原性組成物と比較して少ない量のM72関連抗原を含有する、（１）〜（２９）のいずれか１に記載の方法、組成物または使用。
（３１）第1および/または第2の免疫原性組成物が1μg〜100μgのM72関連抗原を含む、（１）〜（３０）のいずれか１に記載の方法、組成物または使用。
（３２）第1の免疫原性組成物が、5μg〜50μgのM72関連抗原を含む、（１）〜（３１）のいずれか１に記載の方法、組成物または使用。
（３３）第1の免疫原性組成物が、5μg〜20μgのM72関連抗原を含む、（３２）に記載の方法、組成物または使用。
（３４）第2の免疫原性組成物が、5μg〜50μgのM72関連抗原を含む、（１）〜（３３）のいずれか１に記載の方法、組成物または使用。
（３５）第2の免疫原性組成物が、5μg〜20μgのM72関連抗原を含む、（３４）に記載の方法、組成物または使用。
（３６）第2の免疫原性組成物が、1μg〜8μgのM72関連抗原を含む、（１）〜（３５）のいずれか１に記載の方法、組成物または使用。
（３７）第1および第2の免疫原性組成物が同じM72関連抗原を含有する、（１）〜（３６）のいずれか１に記載の方法、組成物または使用。
（３８）第1および/または第2の免疫原性組成物が、1つ以上のさらなる抗原性成分を含む、（１）〜（３７）のいずれか１に記載の方法、組成物または使用。
（３９）第1および第2の免疫原性組成物中の全ての抗原が同じである、（１）〜（３８）のいずれか１に記載の方法、組成物または使用。
（４０）第1および/または第2の免疫原性組成物が合計で1μg〜100μgのタンパク質抗原を含む、（１）〜（３９）のいずれか１に記載の方法、組成物または使用。
（４１）第1の組成物がTLR4アゴニストを含む、（１）〜（４０）のいずれか１に記載の方法、組成物または使用。
（４２）TLR4アゴニストが3D-MPLである、（４１）に記載の方法、組成物または使用。
（４３）第1の組成物が免疫学的に活性なサポニンを含む、（１）〜（４２）のいずれか１に記載の方法、組成物または使用。
（４４）免疫学的に活性なサポニンがQS21である、（４３）に記載の方法、組成物または使用。
（４５）第2の免疫原性組成物が第2のアジュバントを含み、第2のアジュバントがTLRアゴニストおよび/または免疫学的に活性なサポニンを含む、（１）〜（４４）のいずれか１に記載の方法、組成物または使用。
（４６）第2のアジュバントがTLRアゴニストおよび/または免疫学的に活性なサポニンを含み、第1のアジュバントと共通するこれらの2つの成分のうちの少なくとも1つを有する、（４５）に記載の方法、組成物または使用。
（４７）第2の組成物がTLR4アゴニストを含む、（１）〜（４６）のいずれか１に記載の方法、組成物または使用。
（４８）TLR4アゴニストが3D-MPLである、（４７）に記載の方法、組成物または使用。
（４９）第2の組成物が免疫学的に活性なサポニンを含む、（１）〜（４８）のいずれか１に記載の方法、組成物または使用。
（５０）免疫学的に活性なサポニンがQS21である、（４９）に記載の方法、組成物または使用。
（５１）第1および第2のアジュバントが異なる相対比率の同じ成分からなる、（４５）〜（５０）のいずれか１に記載の方法、組成物または使用。
（５２）第1および第2のアジュバントが同じ相対比率の同じ成分からなる、（４５）〜（５０）のいずれか１に記載の方法、組成物または使用。
（５３）第1および第2のアジュバントが同じ量の同じ成分からなる、（４５）〜（５０）のいずれか１に記載の方法、組成物または使用。
（５４）第2のアジュバントが、第1のアジュバントと比較して少ない量の少なくとも1つの共通成分を含む、（４５）〜（５０）のいずれか１に記載の方法、組成物または使用。
（５５）第2のアジュバントが第1のアジュバントと比較して少ない量の全共通成分を含む、（５４）に記載の方法、組成物または使用。
（５６）第1(および存在する場合)および第2のアジュバントがリポソーム製剤として提供される、（１）〜（５５）のいずれか１に記載の方法、組成物または使用。
（５７）第1のアジュバントが、リポソーム製剤中に12.5〜75マイクログラムの3D-MPLと、12.5〜75マイクログラムのQS21とを含む、（１）〜（５５）のいずれか１に記載の方法、組成物または使用。
（５８）第1のアジュバントが、リポソーム製剤中に12.5〜37.5マイクログラム、例えば、20〜30マイクログラム(例えば、約または正確に25マイクログラム)の3D-MPLと、12.5〜37.5マイクログラム、例えば、20〜30マイクログラム(例えば、約または正確に25マイクログラム)のQS21を含む、（５７）に記載の方法、組成物または使用。
（５９）第2のアジュバント(存在する場合)が、リポソーム製剤中に12.5〜75マイクログラムの3D-MPLと、12.5〜75マイクログラムのQS21とを含む、（１）〜（５８）のいずれか１に記載の方法、組成物または使用。
（６０）第2のアジュバントが、リポソーム製剤中に12.5〜37.5マイクログラム、例えば、20〜30マイクログラム(例えば、約または正確に25マイクログラム)の3D-MPLと、12.5〜37.5マイクログラム、例えば、20〜30マイクログラム(例えば、約または正確に25マイクログラム)のQS21とを含む、（５９）に記載の方法、組成物または使用。
（６１）第2のアジュバント(存在する場合)が、リポソーム製剤中に2.5〜7.5、例えば、5マイクログラムの3D-MPLと、2.5〜7.5、例えば、5マイクログラムのQS21とを含む、（１）〜（５８）のいずれか１に記載の方法、組成物または使用。
（６２）第1および第2の免疫原性組成物が同じである、（１）〜（６０）のいずれか１に記載の方法、組成物または使用。
（６３）第2の免疫原性組成物中のM72関連抗原の量が、第1の免疫原性組成物中のものの5/4〜1/10である、（１）〜（６１）のいずれか１に記載の方法、組成物または使用。
（６４）第2の免疫原性組成物中のアジュバント成分の量が、第1の免疫原性組成物中のものの5/4〜1/10である、（１）〜（６１）または（６３）のいずれか１に記載の方法、組成物または使用。
（６５）マイコバクテリアによる感染、例えば、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)による感染の予防、処置または改善のための、（１）〜（６１）または（６４）のいずれか１に記載の方法、組成物または使用。
（６６）活動性結核の処置；感染していない被験体、もしくは、あるいは潜伏感染を有する被験体に投与することなどによる、感染もしくは再活性化に起因する活動性結核の予防；潜伏性結核の処置；感染していない被験体に投与することなどによる、潜伏性結核の予防；または例えば、数ヶ月間、数年間もしくは無期限の結核の再活性化の防止もしくは遅延、特に、TB再活性化の遅延、のための、（６５）に記載の方法、組成物または使用。
（６７）被験体がヒトである、（１）〜（６５）のいずれか１に記載の方法、組成物または使用。
（６８）免疫原性組成物が筋肉内投与される、（１）〜（６７）のいずれか１に記載の方法、組成物または使用。
特許出願および登録された特許を含む、特許出願中の全ての参考文献の教示は、参照により本明細書に完全に組み込まれる。ある特定の要素を「含む」と定義される組成物または方法またはプロセスは、これらの要素からなる組成物、方法またはプロセス(それぞれ)を包含することが理解される。本発明を、以下の非限定的実施例を参照することによりさらに説明する。
【実施例】
【０１１８】
〔実施例１〕
M72およびアジュバントAS01を用いるワクチン接種
結核抗原M72 2-his(配列番号2)の用量の遅延および減少の影響を、マウスモデルにおいて調査した。
【０１１９】
材料および方法
動物モデル
メスのマウスC57BL/6JOlaHsd、6週齢、1群あたり12匹のマウスに、以下の表に示されるように、0〜14日目および28または98日目に50μlを用いて筋肉内経路によって注入した。
0006655549.tif 000002
【０１２０】
AS01Eアジュバントは、リポソームを用いる製剤中に免疫刺激剤3D-MPL(登録商標)(GlaxoSmithKline Biologicals、Montana、USA)およびQS21(それぞれ2.5μg)を含有していた。アジュバントバッファーを用いて希釈を実施した。
【０１２１】
読出し：
全血ICS
21日目〜II後7日(G1-7)；
35日目〜III後7日(G1-3)；
105日目〜III後77日(G1-3)およびIII後7日(G4-7)
血清抗M72 IgTot
28日目〜II後14日(G1-7)
42日目〜III後14日(G1-3)
112日目〜III後84日(G1-3)およびIII後14日(G4-7)。
【０１２２】
十分な容量を得るために、群あたり3匹のマウスの4つのプールの全血を、21、35および105日目に収集した。個々の血清を28、42および112日目に収集した。
【０１２３】
マウスを個別に同定して、ICSおよび血清学についてPIIおよびPIIIの結果を連結した。
【０１２４】
読出しの説明
細胞免疫応答-細胞内サイトカイン染色(ICS)
白血球単離
各時点で、血液を各マウスから収集した後、プールした(3匹のマウスの5つのプール)。血液を、ヘパリン(1/10)を含有するRPMI/添加物(グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸および2-メルカプトエタノールを添加したRPMI1640)を含有するチューブ中に収集した。10倍容量の溶解バッファーを全血に添加し、チューブを室温(RT)で10minインキュベートした。遠心分離(335g、RTで10min)後、ペレットをRPMI/添加物中に収獲し、濾過(セルストレーナー100μm)した。細胞を再度ペレット化し(335g、RTで10min)、完全培地(グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸および2-メルカプトエタノール、および5%熱不活化ウシ胎仔血清を添加したRPMI1640)中に再懸濁した。
【０１２５】
新鮮な白血球のin vitroでの刺激
白血球を、ウェルあたり約100万個の細胞で丸底96ウェルプレート中に播種した。次いで、白血球を、M72配列を包含する1μg/mlのペプチドを用いて、または用いずに、1μg/mlの抗CD28抗体(クローン9C10)(MFR4.B)および抗CD49d抗体(クローン37.51)で6時間(37℃、5%CO2)刺激した。刺激の2時間後、完全培地中に1/200希釈されたブレフェルジンAをさらに4時間添加した。次いで、プレートを4℃に一晩移した。
【０１２６】
ICS
細胞を染色し、5色ICSアッセイを用いて分析した。
【０１２７】
細胞をV底96ウェルプレートに移し、200μlの流動バッファー(PBS 1X、1%FCS)で洗浄した後、189g、4℃で5min遠心分離し、1/50に希釈された抗CD16/32抗体(クローン2.4G2)を含有する50μlの流動バッファー中に、4℃で10min、細胞を再懸濁した。次いで、抗CD4-V450(クローンRM4-5、1/50希釈)抗体および抗CD8-PerCp-Cy5.5(クローン53-6.7、1/50希釈)抗体ならびにLive&Death PO(1/500希釈)を含有する50μlの流動バッファーを、4℃で30min添加した。細胞を遠心分離(189g、4℃で5min)し、200μlの流動バッファーで洗浄した。
【０１２８】
200μlのCytofix/Cytoperm溶液(Becton Dickinsonの市販バッファー)を4℃で20min添加することにより、白血球を固定および透過処理した。細胞を遠心分離(189g、4℃で5min)し、200μlのPerm/Washバッファー(蒸留水中で1:10に希釈されたBecton Dickinsonの市販バッファー)で洗浄した。追加の遠心分離工程の後、細胞を50μlのPerm/Washバッファー中で、抗IL2-FITC抗体(クローンJES6-5H4、1/400希釈)、抗IFN-γ-APC抗体(クローンXMG1.2、1/50希釈)および抗TNF-α-PE抗体(クローンMP6-XT22、1/700希釈)で、4℃で1時間染色した。細胞を、220μlのBD Stabilizing Faxative溶液中に再懸濁したPerm/Washバッファーで2回洗浄した。染色された細胞を、LSRIIおよびFlowJoソフトウェアを用いるフローサイトメトリーにより分析した。
【０１２９】
体液性応答-Elisaによる抗M72 Ig tot血清学
96ウェルElisaプレートを、PBS中、0.25μg/mlの組換え抗原M72で被覆し、4℃で一晩インキュベートした。II後およびIII後のワクチン接種されたマウスからの血清を、PBS(0.2%)-BSA中、1/10000に希釈した後、ウェル1から12まで2倍連続希釈を行い、インキュベートした。標準および対照材料の連続希釈液を用いて、試験した血清の抗M72抗体標準力価を算出し、試験の妥当性を確保した。プレートを、各インキュベーション工程の後にPBS 0.1% tween20バッファーで洗浄した。次いで、マウスIgに特異的なビオチン化ヤギ抗体を添加し、抗原-抗体複合体を、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ複合体およびペルオキシダーゼ基質オルト-フェニレンジアミンジヒドロクロリド/H2O2とのインキュベーションにより示す。光密度(O.D.)を490〜620nmで記録した。それぞれ個々のマウス血清の抗M72抗体力価を、回帰モデルを用いてELISAの標準曲線から決定し、ELISA単位(EU)/mlで表す。次いで、幾何平均力価(GMT)を、各群のマウスについて算出する。
【０１３０】
結果
T細胞応答
A. M72特異的CD4 TおよびCD8 T細胞応答の動力学
CD4 TおよびCD8 T細胞応答に対する分画および/または遅延第3用量の潜在的な利益を評価するために、マウスを、検出可能なCD8 T細胞応答を誘導しながら、CD4 T細胞応答の動的範囲にあるように、現在の試験における0.25μgの最大用量のM72で免疫した。
【０１３１】
図1に示されるように、同等の上昇が全用量、用量の1/5および1/25を受けている群において7PIIから7PIIIまで観察されたため、標準スケジュール(D0-D14-D28)における分画第3用量の投与はCD4 T細胞応答の改善を提供しなかった。
【０１３２】
しかしながら、プール間のM72特異的CD4 T細胞応答のいくらかの変動性にもかかわらず、標準スケジュールと比較した場合、遅延第3用量の0.25μgのM72の7日後により大きい上昇が観察された。さらに、遅延および分画第3用量または遅延および非アジュバント化第3用量を受けているマウスにおけるM72特異的CD4 T細胞応答のレベルは、標準スケジュールにおいて全用量で免疫された群において観察されたレベルと同等であった。これは、CD4 T細胞応答のレベルに関して遅延スケジュールの利益を示唆する。
【０１３３】
低レベルのM72特異的CD8 T細胞応答が、標準スケジュールにおいて0.25μgのM72用量を受けたマウスにおいて検出され、第3の免疫化用量はM72特異的CD8 T細胞応答を上昇させることができなかった(図2)。
【０１３４】
M72特異的CD8 T細胞応答の減少が、標準スケジュールにおいて分画第3用量を受けたマウスにおいて観察された。これは、CD8 T細胞応答がマウスを免疫するのに用いられるM72タンパク質の用量範囲によって大きく影響され、より高用量のM72(1μgまたは8μg)が0.1μgまたは0.25μgのM72よりも高レベルの応答を誘導したという以前のデータ(示さない)と一致している。
【０１３５】
0.25μgの遅延第3用量のM72を受けたマウスにおいては、M72特異的CD8 T細胞応答の上昇が試験した全てのプールにおいて7PIIから7PIIIまで見られた。しかしながら、CD8 T細胞応答の中央値は、全ての群が2用量の0.25μgのM72/AS01Eを受けたという事実にもかかわらず、7PII(0.231〜0.817)での群間で変動性を示した。
【０１３６】
B. M72特異的CD4およびCD8 T細胞応答のサイトカインプロファイル
7PIIおよび7PIIIの両方で標準スケジュールにおいて全用量、1/5の用量および1/25の用量を受けている群において、類似するCD4 Tサイトカイン発現プロファイルが観察された。M72特異的CD4 T細胞応答は、2回の免疫の後に3倍(IL2/IFNg/TNFa)および2倍(IFNg/TNFa)を含んでいた。第3の免疫化用量は、多機能CD4 Th1細胞の進行を支援することができず、その代わりに、2倍(IL2/IFNg)および1倍(IFNgのみ)産生するCD4 T細胞を増加させた(図3)。
【０１３７】
M72特異的CD4 T細胞応答の多くはIL2/IFNg/TNFaおよびINFg/TNFaを産生するCD4 T細胞から構成されるため、遅延第3用量の投与は多機能CD4 Th1細胞の進行を支援すると考えられる(図3)。低レベルのIL2/IFNg/TNFaおよび高レベルのIFNgのみを産生するCD4 T細胞が、遅延および非アジュバント化第3用量を受けたマウスにおいて観察されたため、AS01は多機能T細胞の進行をさらに増強させた。
【０１３８】
遅延および分画第3用量を受けているマウスにおけるM72特異的CD4 T細胞応答のレベルがベンチマークについて観察されるものと類似する場合であっても、サイトカインプロファイルはわずかに異なり、全体として、これらのデータは、遅延免疫化スケジュールにおける多機能CD4 Th1細胞の進行の改善を示唆する。
【０１３９】
多機能CD4 T細胞の規模および質は、マウスにおける防御と相関することが示された(Derrickら、2011 Vaccine 29:2902-2909)。
【０１４０】
7PIIおよび7PIIIの両方において全群にわたって類似するM72特異的CD8 T細胞サイトカインプロファイルが観察された(図4)。M72特異的CD8 T細胞応答の多くは、2倍(IFNg/TNFa)および1倍(IFNgのみ)を産生するCD8 T細胞から構成されていた。非常に低レベルのIL2/INFg/TNFaおよびTNFaを産生するCD8 T細胞も検出された。
【０１４１】
抗体応答
A. 抗M72 Ig tot血清学
図5に示されるように、標準スケジュールにおいて全用量、1/5用量および1/25用量を受けている群において、14PIIと14PIIIの間で抗M72血清学応答の上昇が観察された。用量範囲効果の傾向が、最も高いM72特異的血清学応答を与える最も高い用量について観察された。応答の持続性は、84PIIIでのより低い血清学応答により示されるように、時間と共に低下した。
【０１４２】
遅延した3回目の免疫化を受けたマウスにおいて、より高い規模の応答が観察された。AS01Eの存在下および非存在下で同様のレベルのM72特異的Igが見られたが、これは、遅延した3回目の免疫化の後に高い血清学応答を誘導するには、M72だけで十分であることを示唆している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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