(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞を培養して細胞塊を得る培養工程と、
前記細胞塊を１５ｃｍ／ｓｅｃ以上１５０ｃｍ／ｓｅｃ以下の速度で、各々の開口寸法が３０μｍ以上８０μｍ以下である複数の貫通孔を有するメッシュ状の膜に通すことにより、前記細胞塊を分割する分割工程と、
を含む多能性幹細胞の継代方法。
【請求項２】
前記培養工程において、前記多能性幹細胞を、高分子化合物を含有する培養液中で培養する、請求項１に記載の継代方法。
【請求項３】
前記分割工程において、分割後の細胞塊の円相当直径の平均値を３０μｍ以上７５μｍ以下とする、請求項１または請求項２に記載の継代方法。
【請求項４】
前記多能性幹細胞がＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の継代方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、多能性幹細胞の継代方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多能性幹細胞の継代方法に関する技術として、例えば、以下の技術が知られている。例えば、国際公開第２０１３／０７７４２３号には、平均直径が約２００μｍ〜約３００μｍである均一なサイズの多能性幹細胞の細胞塊をメッシュに通して分割する継代方法が記載されている。また、国際公開第２０１３／０７７４２３号には、メッシュの孔径を５０μｍ程度として、分割後の細胞塊の直径を約８０μｍ〜約１２０μｍとすることが記載されている。【０００３】
また、国際公開第２０１４／１３６５８１号には、継代用フィルタ部のメッシュを通過する多能性幹細胞を含む液体の流速を毎分９０ｍＬ〜３００ｍＬとすることが記載されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
例えば、肝疾患や心疾患などを、細胞移植によって治療するためには、１×１０９個以上の分化細胞の移植がひとりの患者に必要であると考えられている。これを実現するためには、多能性幹細胞の大量培養技術の開発が不可欠となる。【０００５】
例えば、多能性幹細胞の培養においては、細胞を培養することによって生じる細胞塊（スフェア）のサイズが過大となると、細胞塊同士が接着融合し、細胞が分化を開始したり、細胞塊の中心部の細胞が壊死したりするといった問題が生じ得る。従って、細胞塊のサイズが過大となることを防止するために、細胞の培養期間中の適切な時期に、細胞塊を分割する分割処理が必須となる。【０００６】
上記の国際公開第２０１３／０７７４２３号および国際公開第２０１４／１３６５８１号に記載のように、所定のサイズにまで成長した細胞塊をメッシュに通して分割する継代方法によれば、従来の酵素処理による継代方法と比較して、継代後における細胞の生存率の向上を図ることができる。しかしながら、例えば１００リットル規模の大量培養を実現しようとした場合、国際公開第２０１４／１３６５８１号に記載のように、メッシュを通過する多能性幹細胞を含む液体の流速を毎分９０ｍＬ〜３００ｍＬとした場合、処理に膨大な時間を要し、細胞の均質性を保つことが困難となる。一方、メッシュを通過する多能性幹細胞を含む液体の流速を大きくした場合および小さくした場合の双方について、多能性幹細胞に与えるダメージを考慮する必要がある。【０００７】
本開示は、大量培養に適した多能性幹細胞の継代方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示に係る第１の態様は、多能性幹細胞の継代方法であって、多能性幹細胞を培養して細胞塊を得る培養工程と、細胞塊を１５ｃｍ／ｓｅｃ以上１５０ｃｍ／ｓｅｃ以下の速度で、各々の開口寸法が３０μｍ以上８０μｍ以下である複数の貫通孔を有するメッシュ状の膜に通すことにより、細胞塊を分割する分割工程と、を含む。【０００９】
培養工程において、多能性幹細胞を、高分子化合物を含有する培養液中で培養してもよい。分割工程において、分割後の細胞塊の円相当直径の平均値を３０μｍ以上７５μｍ以下とすることが好ましい。多能性幹細胞がＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞であってもよい。
【発明の効果】
【００１０】
本開示の上記態様によれば、大量培養に適した多能性幹細胞の継代方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】本開示の例示的実施形態に係る分割装置の構成を示す断面図である。
【図１Ｂ】本開示の例示的実施形態に係るメッシュの構成を示す平面図である
【図２Ａ】分割直後における細胞塊の状態を示す顕微鏡写真である。
【図２Ｂ】分割後１時間経過後の細胞塊の状態を示す顕微鏡写真である。
【図２Ｃ】分割後２時間経過後の細胞塊の状態を示す顕微鏡写真である。
【図２Ｄ】分割後３時間経過後の細胞塊の状態を示す顕微鏡写真である。
【図２Ｅ】分割後４時間経過後の細胞塊の状態を示す顕微鏡写真である。
【図２Ｆ】分割後２４時間経過後の細胞塊の状態を示す顕微鏡写真である。
【図３】本開示の例示的実施形態に係る細胞培養装置の構成を示す図である。
【図４】本開示の例示的実施形態に係る細胞培養装置が培養開始処理を実施する場合における、細胞および培地等の流れを示す図である。
【図５】本開示の例示的実施形態に係る細胞培養装置が培地交換処理を実施する場合における細胞および培地等の流れを示す図である。
【図６】本開示の例示的実施形態に係る細胞培養装置が分割処理を実施する場合における細胞および培地等の流れを示す図である。
【図７】本開示の例示的実施形態に係る細胞培養装置が凍結処理を実施する場合における細胞および培地等の流れを示す図である。
【図８】本開示の例示的実施形態に係る細胞培養プログラムにおける処理の流れを示すフローチャートである。
【図９】メッシュ（４）に通過速度１００ｃｍ／ｓで通過させて継代した後のスフェア像である。
【図１０】メッシュ（６）に通過速度１８０ｃｍ／ｓで通過させて継代した後のスフェア像である。
【図１１】メッシュ（１）に通過速度１５ｃｍ／ｓで通過させて継代した後のスフェア像である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本開示の例示的実施形態を、図面を参照しつつ説明する。なお、各図面において同一または等価な構成要素および部分には同一の参照符号を付与している。
【００１３】
本開示の例示的実施形態に係る多能性幹細胞の継代方法は、多能性幹細胞を培養して細胞塊を得る培養工程と、細胞塊を１５ｃｍ／ｓｅｃ以上１５０ｃｍ／ｓｅｃ以下の速度で、各々の開口寸法が３０μｍ以上８０μｍ以下である複数の貫通孔を有するメッシュ状の膜に通すことにより、細胞塊を分割する分割工程と、を含む。
【００１４】
［多能性幹細胞］
本例示的実施形態に適用可能な多能性幹細胞は、未分化状態を保持したまま増殖できる「自己複製能」と三胚葉系列すべてに分化できる「多分化能」とを有する未分化細胞であれば特に制限されない。多能性幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（embryonic stem cell；ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell；ｉＰＳ細胞）、胚性生殖細胞（embryonic germ cell；ＥＧ細胞）、胚性癌細胞（embryonal carcinoma cell；ＥＣ細胞）、多能性成体前駆細胞（multipotent adult progenitor cell；ＭＡＰ細胞）、成体多能性幹細胞（adult pluripotent stem cell；ＡＰＳ細胞）、Ｍｕｓｅ細胞（multi-lineage differentiating stress enduring cell）などが挙げられる。本例示的実施形態に適用する多能性幹細胞としては、ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞が好ましい。
【００１５】
多能性幹細胞の由来となる動物は特に制限されない。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ウシ、ウマ、ブタなどが挙げられる。多能性幹細胞の由来となる動物（つまりドナー）は、その多能性幹細胞又はその多能性幹細胞から分化誘導された細胞が移植される動物（つまりレシピエント）と同種の動物が好ましい。多能性幹細胞の樹立は、公知のいずれの方法で行ってもよい。
【００１６】
多能性幹細胞が未分化状態を維持しているか否かは、公知の方法で確認しうる。例えば、未分化マーカーの発現をフローサイトメトリー又は免疫染色により確認する方法、免疫不全マウスの皮下にインジェクションしてテラトーマ形成を確認する方法などが挙げられる。
【００１７】
［多能性幹細胞の培養］
以下に、本開示の例示的実施形態に係る培養工程について説明する。本例示的実施形態において、多能性幹細胞は、浮遊培養により増殖されることが好ましい。具体的には、培養容器に、多能性幹細胞を培地とともに充填して、多能性幹細胞の細胞塊の円相当直径の平均値が例えば、２００μｍ〜３００μｍとなるまで浮遊培養する。なお、円相当直径とは、抽出した細胞塊の各々の輪郭線によって画定される領域を、同じ面積を有する円とみなした場合の円の直径をいう。細胞塊の円相当直径の平均値を３００μｍ以下とすることで、細胞が分泌するサイトカイン等が形成する微小環境による分化誘導を抑制することができる。また、細胞塊の中心部で起こる細胞の壊死を抑制し、生細胞の回収率の低下を抑制できる。一方、細胞塊の円相当直径の平均値を２００μｍ以上とすることで、細胞の回収率を一定以上とすることができる。なお、培養工程において得る細胞塊のサイズは、分化誘導の抑制、細胞の壊死、細胞の回収率などを勘案して適宜変更することが可能である。
【００１８】
本例示的実施形態に適用する培地は、特に制限されず、幹細胞培養に用いられる公知のあらゆる培地が挙げられる。具体的には、ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）、ＤＭＥＭ：Ｆ−１２（Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12）、ＥＭＥＭ（Eagle's minimal essential medium）、ＢＭＥ（Basal Medium Eagle）、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ１０４、ＭＣＤＢ１５３、１９９、Ｌ１５、ｍＴｅＳＲ１、ＴｅＳＲ２、Ｅ８（Nature Protocols 7: 2029-2040, 2012）、及びこれらの培地に細胞増殖因子を添加した培地などが挙げられる。
【００１９】
培地には、一般的に添加される各種の成分、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質；アスコルビン酸、レチノイン酸等のビタミン又はビタミン誘導体；グルコース等の糖源；アミノ酸；亜セレン酸ナトリウム、塩化ナトリウム等の無機塩；トランスフェリン等のタンパク質；インスリン等のホルモン；ＴＧＦ−β（transforming growth factor-β）、ＥＧＦ（epidermal growth factor）等のサイトカイン：成長因子；分化抑制因子；２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール等の抗酸化剤；などを添加してもよい。上記成分は、培養期間全体に亘って濃度を所期の範囲に保つために、多能性幹細胞の培養中に培地に補充してもよい。培地は、抗原性物質や感染源などが多能性幹細胞に混入することを抑制する観点から、血清及び血清代替物を含まないことが好ましい。培地のｐＨは、例えばｐＨ７．０〜８．０であり、好ましくはｐＨ７．３〜７．４である。
【００２０】
本例示的実施形態における培養工程においては、適宜、培地交換を行うことが好ましい。一連の培養工程に用いる培地は、同一組成でなくてもよい。多能性幹細胞を未分化状態に維持することができるかぎり、異なる組成の培地に置き換えながら培養を継続してもよい。
【００２１】
浮遊培養用の培地としては、細胞塊の移動と細胞塊同士の密着を防ぐため、培地が適度な粘性を有することが望ましい。ここで、適度な粘性とは、培地交換を妨げないで細胞塊同士の接着が起こらない程度の粘性を意味する。
【００２２】
培地に粘性を付与する手段は特に限定されないが、例えば、水溶性高分子を適当な濃度で培地に添加することにより実施されうる。水溶性高分子としては、培地に適度な粘性を付与しうるものであって、粘性を付与しうる濃度範囲において、細胞に悪影響を及ぼさない（細胞毒性がない）ものであれば、如何なる水溶性高分子も使用することができる。例えば、セルロース、アガロースなどの多糖、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルエチルセルロース、ヒドロキシプロピルエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、ジヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルヒドロキシプロピルセルロースなどの多糖のエーテル、ポリアクリルアミド、ポリエチレンオキシド、ポリビニルピロリドン、エチレングリコール／プロピレングリコール共重合体、ポリエチレンイミンポリビニルメチルエーテル、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、マレイン酸共重合体などの合成高分子、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、デキストラン、アルギン酸、カラゲーナン、デンプンなどの生体高分子、あるいはそれらを模倣した人工高分子（例えば、エラスチン様ペプチドなど）が挙げられる。これら水溶性高分子は単独で用いてもよいし、何種類かの水溶性高分子の混合物として用いることもできる。また、これら水溶性高分子の共重合体を用いてもよい。好ましくは、メチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、又はそれらの混合物である、より好ましくはメチルセルロースである。
【００２３】
例えば、粘性を付与するためにメチルセルロースを培地に添加する場合、メチルセルロースの濃度としては、０．２５ｗ／ｖ％より高く、０．５ｗ／ｖ％より低い濃度が好ましい。好ましくは、メチルセルロースの濃度は、０．２６ｗ／ｖ％〜０．３ｗ／ｖ％であり、特に好ましくは、０．２８ｗ／ｖ％である。メチルセルロースの濃度を上記の範囲とすることで、分割工程において、細胞塊の分割に用いられるメッシュ状の膜に対する透過性を維持しつつ増粘作用を得、メッシュ状の膜の局所的な閉塞を防ぎ、速度のばらつきを抑制することができる。その適度な粘性は動粘度に代表される。例えば２５℃、せん断速度が１００ｓ−１における粘度が１．０ｍＰａ・ｓ〜１５ｍＰａ・ｓ、さらに好ましくは１．０ｍＰａ・ｓ〜７．５ｍＰａ・ｓである。他の水溶性高分子を用いる場合でも、当業者は前述された適度な粘性を得るために、他の水溶性高分子の濃度を適宜選択することができる。尚、せん断速度１００ｓ−１における粘度の評価は、粘度測定装置（アントンパール社製のＭＣＲ３０１、２５ｍｍコーンプレート、０．０９８ｍｍギャップ）を用いて、評価条件はインターバル設定１にて行った。
【００２４】
培地に粘性を付与するかわりに、浮遊培養の培地中に不定形な構造体を均一に形成し、培地の粘度を実質的に高めること無く細胞の沈降を抑制することも好ましい。このような構造体を形成し得る材料として、高分子化合物が挙げられ、好ましくはアニオン性の官能基を有する高分子化合物が挙げられる。アニオン性の官能基としては、カルボキシ基、スルホ基、リン酸基及びそれらの塩が挙げられ、カルボキシ基またはその塩が好ましい。高分子化合物の好ましい具体例としては、特に制限されるものではないが、単糖類（例えば、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトース等）が１０個以上重合した多糖類が挙げられ、より好ましくは、アニオン性の官能基を有する酸性多糖類が挙げられる。より具体的には、ヒアルロン酸、ジェランガム、脱アシル化ジェランガム、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、ザンタンガム、ヘキスロン酸、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、ラムナン硫酸及びそれらの塩からなる群より１種又は２種以上から構成されるものが例示される。多糖類は、好ましくは、ヒアルロン酸、ジェランガム、脱アシル化ジェランガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン又はそれらの塩であり、低濃度の使用で細胞及び細胞塊を浮遊させることができ、かつ細胞の回収のしやすさを考慮すると、最も好ましくは、脱アシル化ジェランガムである。
【００２５】
脱アシル化ジェランガムは、液体培地と混合した際に、液体培地中の金属イオン（例えば、カルシウムイオン）を取り込み、金属イオンを介した不定形な構造体を形成し、細胞を浮遊させる。脱アシル化ジェランガムを含んで調製される培地組成物の粘度は、せん断速度１０００ｓ−１における粘度が８ｍＰａ・ｓ以下であり、好ましくは４ｍＰａ・ｓ以下であり、細胞の回収のしやすさを考慮すると、より好ましくは１．０ｍＰａ・ｓ以上、２ｍＰａ・ｓ以下である。尚、せん断速度１０００ｓ−１における粘度の評価は、粘度測定装置（アントンパール社製のＭＣＲ３０１、２５ｍｍコーンプレート、０．０９８ｍｍギャップ）を用いて、評価条件はインターバル設定１にて行った。
【００２６】
培養は、付着培養した多能性幹細胞を酵素処理により解離し、培養容器中に、例えば、約１×１０５〜５×１０６細胞／ｍｌ、好ましくは、約２×１０５〜２×１０６細胞／ｍｌの細胞密度となるように播種し、約１％〜１０％、好ましくは約２％〜５％ＣＯ２濃度の雰囲気下、約３０℃〜４０℃、好ましくは約３７℃で、１〜７日間、好ましくは３〜６日間、より好ましくは４〜５日間行われる。培養期間中に、好ましくは１、２日毎に培養容器中の培地が新鮮な培地と交換される。
【００２７】
例えば、ヒトＥＳ細胞を培養する場合、約２４時間に１回分裂するので、浮遊培養開始時の多能性幹細胞の細胞塊の円相当直径を約８０μｍとすると、４、５日間の培養によって細胞塊は、２００μｍ〜３００μｍにまで成長すると考えられる。
【００２８】
［多能性幹細胞の継代］
以下に、多能性幹細胞の継代を行う際に実施される本開示の例示的実施形態に係る分割工程について説明する。分割工程では、上記の培養工程にて円相当直径の平均値が２００μｍ〜３００μｍとなるまで成長した多能性幹細胞の細胞塊が、より小さいサイズの細胞塊に分割される。
【００２９】
図１Ａは、分割工程において使用される分割装置４００の構成を示す断面図である。分割装置４００は、メッシュ４０１およびケース４０２を含んで構成されている。
【００３０】
ケース４０２は、流入口４１１および流出口４１２を有する。メッシュ４０１は、ケース４０２の内部の流入口４１１と流出口４１２との間に設けられている。すなわち、流入口４１１と流出口４１２とがメッシュ４０１によって隔てられている。
【００３１】
図１Ｂは、メッシュ４０１の構成を示す平面図である。メッシュ４０１は、例えば、ナイロンやポリエチレンテレフタレートなどの合成樹脂またはステンレスなどの金属で構成される繊維部材を格子状に編んで構成される。すなわち、メッシュ４０１は、複数の貫通孔４２０を有するメッシュ状の膜である。図１Ｂに示すように、メッシュ４０１を構成する縦糸と横糸とを同じ間隔で編み込むと、貫通孔４２０の形状は正方形となる。
【００３２】
分割工程において、多能性幹細胞の細胞塊を、培地とともに分割装置４００の流入口４１１から流入させ、流出口４１２から流出させる。流入口４１１から流入した多能性幹細胞の細胞塊は、メッシュ４０１を通過するときに、より小さいサイズの細胞塊に分割される。多能性幹細胞の細胞塊がメッシュ４０１を通過する速度は、１５ｃｍ／ｓｅｃ以上１５０ｃｍ／ｓｅｃ以下とする。多能性幹細胞の細胞塊がメッシュ４０１を通過する速度を１５ｃｍ／ｓｅｃ以上とすることで、分割工程において、例えば１００リットル規模の大量培養にも適用可能な処理能力を実現できる。例えば、分割装置４００の流路の、細胞塊の流通方向と直交する方向の断面積を１０ｃｍ２とした場合、１秒当たりの分割処理量を１５０ｃｍ３以上とすることができる。例えば、１００リットル規模の大量培養を行った場合でも、分割処理を１０分程度で完了させることが可能であり、細胞の均質性を保つことが可能となる。また、多能性幹細胞の細胞塊がメッシュ４０１を通過する速度を１５ｃｍ／ｓｅｃ以上１５０ｃｍ／ｓｅｃ以下とすることで、分割による細胞へのダメージを抑制することが可能である。多能性幹細胞の細胞塊がメッシュ４０１を通過する速度は、処理能力および細胞へのダメージ緩和の観点から、より好ましくは、３０ｃｍ／ｓｅｃ以上１２０ｃｍ／ｓｅｃ以下であり、更に好ましくは、５０ｃｍ／ｓｅｃ以上１００ｃｍ／ｓｅｃ以下である。
【００３３】
メッシュ４０１の貫通孔４２０の開口寸法は、３０μｍ以上８０μｍ以下とすることが好ましく、より好ましくは４０μｍ以上７０μｍ以下であり、典型的には５０μｍである。開口寸法とは、貫通孔４２０の形状が図１Ｂに示すように正方形である場合、その正方形の一辺の長さを意味し、貫通孔４２０の形状が円形である場合には、その円の直径を意味する。貫通孔４２０の開口寸法を上記の範囲とすることで、メッシュ４０１の通過時に細胞塊に与えるダメージを抑制しつつ細胞塊の分割を効果的に行うことができる。更に、分割後における細胞塊のサイズにおいて、後述する好ましい分布を得ることができる。
【００３４】
分割後における細胞塊の円相当直径の平均値は、３０μｍ以上７５μｍ以下であることが好ましい。ここで、分割後における細胞塊の円相当直径の平均値は、以下のようにして計測される。メッシュ４０１を通過することによって分割された細胞塊を顕微鏡観察で例えば無作為に３００個抽出し、抽出した細胞塊の各々の円相当直径を計測し、計測した円相当直径の平均値を算出する。細胞塊の円相当直径の計測は、細胞塊を分割した後、１時間が経過する前に完了させることが好ましい。
【００３５】
ここで、図２Ａ〜図２Ｆは、それぞれ、分割直後、分割後１時間経過後、分割後２時間経過後、分割後３時間経過後、分割後４時間経過後、分割後２４時間経過後の細胞塊の状態を示す顕微鏡写真である。図２Ａおよび図２Ｂに示すように、分割後１時間が経過するまでの期間においては、細胞塊の状態は、分割直後の状態を維持する。一方、図２Ｃ〜図２Ｆに示すように、分割後２時間を経過すると、時間経過とともに、細胞塊の表面から死細胞であるシングルセルが離脱し、シングルセルの数が増大する。従って、分割後１時間が経過する前に細胞塊のサイズの計測を完了させることで、分割直後における細胞塊の統計情報として適切な情報を得ることができる。
【００３６】
本例示的実施形態に係る分割工程において分割された細胞塊のうち円相当直径が３０μｍ以上４０μｍ未満の細胞塊の個数をＸとする。また、本例示的実施形態に係る分割工程において分割された細胞塊のうち円相当直径が４０μｍ以上３００μｍ未満の細胞塊の個数をＹとする。この場合において、分割後の細胞塊の円相当直径の分布が、下記の式（１）を満たすことが好ましい。
１＜Ｘ／Ｙ＜３  ・・・（１）
【００３７】
円相当直径が３０μｍ以上４０μｍ未満の細胞塊は、分割によるダメージが比較的大きいと考えられるが、このようなダメージが比較的大きい細胞は、ダメージからの回復に寄与する蛋白質の分泌を盛んに行うものと考えられる。この蛋白質は、自己の細胞のみならず他の細胞のダメージ回復にも寄与すると考えられる。一方、円相当直径が４０μｍ以上３００μｍ未満の細胞塊は、分割によるダメージが比較的小さいと考えられ、分割後における生存率は比較的高いと考えられる。従って、分割後の細胞塊の円相当直径の分布が、上記の（１）式を満たすことで、継代後（すなわち分割後）における細胞の増殖率を最大化することができると考えられる。
【００３８】
メッシュ４０１の貫通孔４２０の開口寸法を３０μｍ以上８０μｍ以下とし、多能性幹細胞の細胞塊がメッシュ４０１を通過する速度を１５ｃｍ／ｓｅｃ以上１５０ｃｍ／ｓｅｃ以下とすることで、分割後における細胞塊の円相当直径の平均値を、３０μｍ以上７５μｍ以下とし且つ分割後の細胞塊の円相当直径の分布において上記の（１）式を満たすように制御することが容易となる。従って、多能性幹細胞に対するダメージを抑制しつつ効率的に細胞塊の分割をすることができ、多能性幹細胞の大量培養に好適である。
【００３９】
以下に、上記した本開示の例示的実施形態に係る培養工程および分割工程における各処理を閉鎖系に行うことができる本開示の例示的実施形態に係る細胞培養装置について説明する。
【００４０】
図３は、本開示の例示的実施形態に係る細胞培養装置１０の構成を示す図である。細胞培養装置１０は、細胞供給部１００、培地供給部１１０、希釈液供給部１２０および凍結液供給部１３０を備える。また、細胞培養装置１０は、培養容器２０、貯留容器３０、分割処理部４０、廃液回収容器１６および凍結部１７を備える。
【００４１】
細胞培養装置１０は、細胞供給部１００から供給される細胞を、培地供給部１１０から供給される培地（培養液）とともに培養容器２０内に収容し、培養容器２０内において細胞を培地中に浮遊させた状態で培養する。
【００４２】
＜細胞供給部＞
細胞供給部１００は、細胞培養装置１０による培養の対象となる細胞を凍結させた状態で収容する細胞収容部１０１と、細胞収容部１０１に収容された細胞を、配管ｃ１を含んで構成される流路Ｆ３に送出するポンプＰ１とを有する。また、細胞供給部１００は、細胞収容部１０１と配管ｃ１とを接続する配管の、ポンプＰ１の下流側に設けられた開閉バルブＶ１を有する。細胞収容部１０１に収容された細胞は、ポンプＰ１が駆動され、開閉バルブＶ１が開状態とされることにより流路Ｆ３に送出される。
【００４３】
＜培地供給部＞
培地供給部１１０は、細胞の培養に使用する培地（培養液）を収容する培地収容部１１１および１１４と、培地収容部１１１および１１４にそれぞれ収容された培地を、流路Ｆ３に送出するポンプＰ２およびＰ３と、ポンプＰ２およびＰ３からそれぞれ送出された培地を除菌するためのフィルタ１１３および１１６とを有する。また、培地供給部１１０は、培地収容部１１１と配管ｃ１とを接続する配管の、フィルタ１１３の下流側に設けられた開閉バルブＶ２と、培地収容部１１４と配管ｃ１とを接続する配管の、フィルタ１１６の下流側に設けられた開閉バルブＶ３とを有する。このように、本例示的実施形態に係る培地供給部１１０は、培地収容部１１１、ポンプＰ２、フィルタ１１３および開閉バルブＶ２を含む第１の系統と、培地収容部１１４、ポンプＰ３、フィルタ１１６および開閉バルブＶ３を含む第２の系統と、からなる２系統の培地供給機能を備えており、互いに異なる２種類の培地が供給可能である。なお、培地供給部１１０における系統の数は、細胞の培養プロトコル等に応じて適宜増減することが可能である。すなわち、培地供給部１１０を、３種類以上の培地を供給可能とする構成としてもよいし、１種類の培地を供給可能とする構成としてもよい。培地収容部１１１に収容された培地は、ポンプＰ２が駆動され、開閉バルブＶ２が開状態とされることにより流路Ｆ３に送出される。培地収容部１１４に収容された培地は、ポンプＰ３が駆動され、開閉バルブＶ３が開状態とされることにより流路Ｆ３に送出される。
【００４４】
＜希釈液供給部＞
希釈液供給部１２０は、細胞の培養過程において適宜実施される希釈処理に用いられる希釈液を収容する希釈液収容部１２１と、希釈液収容部１２１に収容された希釈液を、流路Ｆ３に送出するポンプＰ４と、ポンプＰ４から送出された希釈液を除菌するためのフィルタ１２３とを有する。また、希釈液供給部１２０は、希釈液収容部１２１と配管ｃ１とを接続する配管の、フィルタ１２３の下流側に設けられた開閉バルブＶ４を有する。希釈液収容部１２１に収容された希釈液は、ポンプＰ４が駆動され、開閉バルブＶ４が開状態とされることにより流路Ｆ３に送出される。
【００４５】
＜凍結液供給部＞
凍結液供給部１３０は、培養された細胞を凍結部１７において凍結保存する場合に用いられる凍結液を収容する凍結液収容部１３１と、凍結液収容部１３１に収容された凍結液を、流路Ｆ３に送出するポンプＰ５と、ポンプＰ５から送出された凍結液を除菌するためのフィルタ１３３とを有する。また、凍結液供給部１３０は、凍結液収容部１３１、ポンプＰ５およびフィルタ１３３を接続する配管の、フィルタ１３３の下流側に設けられた開閉バルブＶ５を含む。凍結液収容部１３１に収容された凍結液は、ポンプＰ５が駆動され、開閉バルブＶ５が開状態となることにより流路Ｆ３に送出される。なお、培養された細胞を凍結保存する必要がない場合には、細胞培養装置１０において凍結液供給部１３０を省略することが可能である。
【００４６】
＜培養容器＞
培養容器２０は、細胞供給部１００から供給される細胞を、培地供給部１１０から供給される培地とともに収容し、収容された細胞を培養するための容器である。培養容器２０の形態は、特に限定されず、例えば、ガラス製またはステンレス製の容器やプラスチック製のバッグの形態を有する容器を使用することが可能である。培養容器２０は、細胞および培地を培養容器２０内に流入させるための流入口２１と、培養容器２０に収容された細胞および培地を培養容器２０の外部に流出させるための流出口２２と、を有する。
【００４７】
培養容器２０は、例えば、温度３０℃〜４０℃（好ましくは３７℃）且つＣＯ２濃度２％〜１０％（好ましくは５％）に制御され且つ密閉されたインキュベータ２４内に収容される。インキュベータ２４は、培養容器２０内に培地とともに収容された細胞に酸素（Ｏ２）および二酸化炭素（ＣＯ２）を供給するためのガス供給機構２５を備える。また、インキュベータ２４は、培養容器２０内の圧力を調整する圧力調整機構２６を備える。圧力調整機構２６は、培養容器２０内にエアーを導入することにより培養容器２０内の雰囲気を加圧し、または、培養容器２０内の雰囲気を外部に排出することにより培養容器２０内の雰囲気を大気に解放する。圧力調整機構２６は、培養容器２０内の圧力を、後述する循環流路Ｆ１内の圧力よりも高めることにより、培養容器２０内に収容された細胞および培地を循環流路Ｆ１内に流出させる。
【００４８】
＜循環流路＞
細胞培養装置１０は、培養容器２０の流出口２２と流入口２１とを接続する配管ａ１〜ａ７を含んで構成される循環流路Ｆ１を有する。培養容器２０に収容された細胞および培地は、培養過程において、循環流路Ｆ１内を循環する。循環流路Ｆ１内を流れる細胞および培地は、流入口２１を経由して培養容器２０内へ流入し、培養容器２０の内部に収容された細胞および培地は、流出口２２を経由して循環流路Ｆ１内に流出する。
【００４９】
培養容器２０の流入口２１に接続された循環流路Ｆ１を構成する配管ａ７には開閉バルブＶ１１が設けられ、培養容器２０の流出口２２に接続された循環流路Ｆ１を構成する配管ａ１には開閉バルブＶ１２が設けられている。開閉バルブＶ１１は、循環流路Ｆ１から培養容器２０内に細胞および培地を流入させる場合に開状態とされ、それ以外の場合には閉状態とされる。開閉バルブＶ１２は、培養容器２０内から循環流路Ｆ１内に細胞および培地を流出させる場合に開状態とされ、それ以外の場合には閉状態とされる。
【００５０】
細胞供給部１００、培地供給部１１０、希釈液供給部１２０および凍結液供給部１３０に接続された配管ｃ１によって構成される流路Ｆ３は、接続部位Ｘ３において循環流路Ｆ１に接続されている。すなわち、細胞収容部１０１に収容された細胞、培地収容部１１１および１１４にそれぞれ収容された培地、希釈液収容部１２１に収容された希釈液および凍結液収容部１３１に収容された凍結液は、流路Ｆ３および接続部位Ｘ３を経由して循環流路Ｆ１内に供給される。
【００５１】
流路Ｆ３を構成する配管ｃ１には、接続部位Ｘ３の近傍において開閉バルブＶ６が設けられている。開閉バルブＶ６は、細胞供給部１００、培地供給部１１０、希釈液供給部１２０および凍結液供給部１３０からそれぞれ、細胞、培地、希釈液および凍結液を循環流路Ｆ１内に供給する場合に開状態とされ、それ以外の場合は閉状態とされる。
【００５２】
＜貯留容器＞
貯留容器３０は、循環流路Ｆ１内、すなわち、循環流路Ｆ１の途中に設けられている。貯留容器３０は、循環流路Ｆ１内を流れる細胞、培地、希釈液および凍結液を一時的に貯留するための容器であり、培養期間中に実施される後述する培養開始処理、培地交換処理、分割処理および凍結処理において使用される。貯留容器３０の形態は、特に限定されず、例えば、ガラス製またはステンレス製の容器、プラスチック製のバッグの形態を有する容器を使用することが可能である。
【００５３】
貯留容器３０は、循環流路Ｆ１内を流れる細胞、培地、希釈液および凍結液を貯留容器３０内に流入させるための流入口３１と、貯留容器３０に収容された細胞、培地、希釈液および凍結液を循環流路Ｆ１内に流出させるための流出口３２を有する。貯留容器３０の流入口３１は、循環流路Ｆ１を構成する配管ａ１、ａ２およびａ３によって培養容器２０の流出口２２に接続されている。貯留容器３０の流出口３２は、循環流路Ｆ１を構成する配管ａ４、ａ５、ａ６およびａ７によって培養容器２０の流入口２１に接続されている。また、本例示的実施形態においては、循環流路Ｆ１と流路Ｆ３とが接続される接続部位Ｘ３が貯留容器３０の流入口３１の近傍に配置されているが、循環流路Ｆ１と流路Ｆ３との接続位置は、循環流路Ｆ１内におけるあらゆる位置に配置することが可能である。
【００５４】
循環流路Ｆ１を構成する配管ａ２には、貯留容器３０の流入口３１の近傍において開閉バルブＶ１３が設けられている。開閉バルブＶ１３は、循環流路Ｆ１から貯留容器３０内に細胞および培地等を流入させる場合に開状態とされ、それ以外の場合には閉状態とされる。また、循環流路Ｆ１を構成する配管ａ５には、貯留容器３０の流出口３２の近傍において開閉バルブＶ１４が設けられている。開閉バルブＶ１４は、貯留容器３０内から循環流路Ｆ１内に細胞および培地等を培養容器２０、分割処理部４０および凍結部１７に移送する場合に開状態とされ、それ以外の場合には閉状態とされる。
【００５５】
貯留容器３０は、貯留容器３０内の圧力を調整する圧力調整機構３３を備える。圧力調整機構３３は、貯留容器３０内にエアーを導入することにより貯留容器３０内の雰囲気を加圧し、または、貯留容器３０内の雰囲気を外部に排出することにより貯留容器３０内の雰囲気を大気に解放する。圧力調整機構３３は、貯留容器３０内の圧力を循環流路Ｆ１内の圧力よりも高めることにより、貯留容器３０内に貯留された細胞、培地、希釈液および凍結液を、流出口３２から循環流路Ｆ１内に流出させる。
【００５６】
細胞培養装置１０は、循環流路Ｆ１内における、貯留容器３０の流出口３２と培養容器２０の流入口２１との間に位置する接続部位Ｘ１と、循環流路Ｆ１内における、貯留容器３０の流入口３１と培養容器２０の流出口２２との間に位置する接続部位Ｘ２と、を接続する配管ｂ１およびｂ２を含んで構成される流路Ｆ２を有する。循環流路Ｆ１内を流れる細胞および培地等は、接続部位Ｘ１を経由して流路Ｆ２内に流入することが可能である。また、流路Ｆ２内を流れる細胞および培地等は、接続部位Ｘ２を経由して循環流路Ｆ１内に流入することが可能である。
【００５７】
＜分割処理部＞
分割処理部４０は、流路Ｆ２内、すなわち、流路Ｆ２の途中に設けられている。分割処理部４０は、培養容器２０内において、図１Ａに示す上記の分割装置４００を備える。分割処理部４０は、循環流路Ｆ１から接続部位Ｘ１を経由して流路Ｆ２内に流入する細胞塊を分割装置４００において分割する。分割処理が施された細胞は、接続部位Ｘ２を経由して循環流路Ｆ１内に流出する。
【００５８】
分割処理部４０は、分割装置４００の流入口４１１（図１Ａ参照）に接続された送液部４５０を備える。送液部４５０は、細胞塊を含む培地を分割装置４００に送出するための送液機構を有する。送液部４５０は、筒状容器内に収容された液体をピストンによって押し出す所謂シリンジポンプの形態を有するものであってもよい。多能性幹細胞の細胞塊が分割装置４００のメッシュ４０１を通過する速度は、送液部４５０によって制御される。送液部４５０は、多能性幹細胞の細胞塊が分割装置４００のメッシュ４０１を通過する速度が、１５ｃｍ／ｓｅｃ以上１５０ｃｍ／ｓｅｃ以下の範囲内の一定の速度で送液を行う。
【００５９】
流路Ｆ２を構成する、分割処理部４０の上流側に配置される配管ｂ１には、接続部位Ｘ１の近傍において開閉バルブＶ２１が設けられている。開閉バルブＶ２１は、貯留容器３０から分割処理部４０に細胞等を移送する場合に開状態とされ、それ以外の場合には閉状態とされる。一方、流路Ｆ２を構成する、分割処理部４０の下流側に配置される配管ｂ２には、接続部位Ｘ２の近傍に開閉バルブＶ２２が設けられている。開閉バルブＶ２２は、分割処理部４０によって分割処理が施された細胞を循環流路Ｆ１内に流出させる場合に開状態とされ、それ以外の場合には閉状態とされる。
【００６０】
循環流路Ｆ１を構成する配管ａ１には、接続部位Ｘ２の近傍であって接続部位Ｘ２の上流側に開閉バルブＶ１５が設けられている。開閉バルブＶ１５は、培養容器２０から貯留容器３０に細胞および培地等を移送する場合に開状態とされ、それ以外の場合は閉状態とされる。
【００６１】
＜廃液回収容器＞
細胞培養装置１０は、循環流路Ｆ１内における、貯留容器３０の流出口３２と培養容器２０の流入口２１との間であって、接続部位Ｘ１よりも上流側（貯留容器３０寄り）に位置する接続部位Ｘ４において、循環流路Ｆ１に接続された配管ｄ１を含んで構成される流路Ｆ４を有する。流路Ｆ４の端部には、廃液回収容器１６が設けられている。廃液回収容器１６は、循環流路Ｆ１から接続部位Ｘ４を経由して流路Ｆ４内に流入する廃液を回収するための容器である。廃液回収容器１６に回収される廃液には、使用済みの培地、使用済みの希釈液、細胞供給部１００から凍結状態で供給される細胞に随伴する凍結液等が含まれる。廃液回収容器１６の形態は、特に限定されず、例えば、ガラス製またはステンレス製の容器、プラスチック製のバッグの形態を有する容器を使用することが可能である。
【００６２】
流路Ｆ４を構成する配管ｄ１には、接続部位Ｘ４の近傍において開閉バルブＶ３１が設けられている。開閉バルブＶ３１は、貯留容器３０から流出する廃液を廃液回収容器１６内に回収する場合に開状態とされ、それ以外の場合には閉状態とされる。
【００６３】
＜凍結部＞
細胞培養装置１０は、接続部位Ｘ１において、循環流路Ｆ１に接続された配管ｅ１を含んで構成される流路Ｆ５を有する。流路Ｆ５の端部には、凍結部１７が設けられている。凍結部１７は、循環流路Ｆ１から接続部位Ｘ１を経由して流路Ｆ５内に流入する細胞を凍結液供給部１３０から供給される凍結液とともに収容する保存容器１７ａを有する。保存容器１７ａは、例えば、バイアル、クライオチューブまたはバッグの形態を有するものであってもよい。凍結部１７は、保存容器１７ａに収容された細胞および凍結液を凍結させるフリーザを含んで構成され得る。また、凍結部１７は、液体窒素を充填したタンクを備えていてもよく、タンク内に保存容器１７ａを収容し得るように構成されていてもよい。また、凍結部１７は、例えば、太陽日酸社製のクライオライブラリー（登録商標）システムを含んで構成されていてもよい。流路Ｆ５を構成する配管ｅ１には、接続部位Ｘ１の近傍において開閉バルブＶ４１が設けられている。開閉バルブＶ４１は、貯留容器３０から凍結部１７に細胞および凍結液を移送する場合に開状態とされ、それ以外の場合には閉状態とされる。なお、流路Ｆ５と循環流路Ｆ１との接続位置は、貯留容器３０の流出口３２と培養容器２０の流入口２１との間であれば、いかなる位置であってもよい。また、細胞を凍結保存する必要がない場合には、凍結部１７を省略することが可能である。
【００６４】
＜制御部＞
制御部１８は、ポンプＰ１〜Ｐ５、開閉バルブＶ１〜Ｖ５、Ｖ１１〜Ｖ１６、Ｖ２１、Ｖ２２、Ｖ３１およびＶ４１、ガス供給機構２５、圧力調整機構２６、３３および４３の動作を統括的に制御する。これにより、所定の細胞培養プロトコルに沿った細胞の培養が、人手を介在させることなく、自動で実施される。なお、図３において、制御部１８と、制御部１８によって制御される上記の各構成要素との間の電気的な接続配線は、図面の煩雑さを回避する観点から図示を省略している。
【００６５】
以下に、本例示的実施形態に係る細胞培養装置１０において実施され得る処理の一例を示す。細胞培養装置１０は、例えば、以下に例示する培養開始処理、培地交換処理、分割処理および凍結処理を実施する。なお、以下に説明する培養開始処理、培地交換処理、分割処理および凍結処理は、制御部１８が、開閉バルブＶ１〜Ｖ５、Ｖ１１〜Ｖ１６、Ｖ２１、Ｖ２２、Ｖ３１およびＶ４１、ポンプＰ１〜Ｐ５、圧力調整機構２６、３３および４３の動作を制御することにより実現される。
【００６６】
＜培養開始処理＞
細胞培養装置１０は、細胞収容部１０１に収容された細胞を、培地収容部１１１および１１４に収容された培地とともに培養容器２０内に収容して細胞培養を開始する培養開始処理を以下のようにして実施する。図４は、細胞培養装置１０が培養開始処理を実施する場合における、細胞および培地等の流れを示す図である。なお、図４において、細胞および培地等の流れと、以下に示す各処理ステップとの対応が示されている。
【００６７】
ステップＳ１において、開閉バルブＶ１、Ｖ４およびＶ６が開状態とされ、ポンプＰ１およびＰ４が駆動される。これにより、細胞収容部１０１において凍結状態で収容された細胞および希釈液収容部１２１に収容された希釈液が、流路Ｆ３および循環流路Ｆ１を経由して貯留容器３０内に流入する。
【００６８】
ステップＳ２において、貯留容器３０内に貯留された細胞、細胞に随伴する凍結液および希釈液を含む混合物から凍結液および希釈液を除去する濃縮処理が実施される。上記の濃縮処理は、例えば、貯留容器３０内に希釈液とともに収容された細胞を、貯留容器３０内において沈降させ（自然沈降）、希釈液および凍結液を含む上澄み液を除去することにより行われる。具体的には、細胞を貯留容器３０内において沈降させた後、開閉バルブＶ１４を短期間開状態とする。これにより、貯留容器３０内に上澄み液を残しつつ細胞を貯留容器３０から流出させ、配管ａ５内に滞留させる。その後、開閉バルブＶ１４を閉状態とし、開閉バルブＶ３１を開状態とする。これにより貯留容器３０内に残存する希釈液および凍結液を含む廃液が貯留容器３０の流出口３２から流出し、流路Ｆ４を経由して廃液回収容器１６に回収される。なお、貯留容器３０から配管ａ５への細胞の移送および貯留容器３０から廃液回収容器１６への希釈液および凍結液の移送は、圧力調整機構３３によって貯留容器３０内の雰囲気を加圧することによって行われる。
【００６９】
ステップＳ３において、開閉バルブＶ２、Ｖ３およびＶ６が開状態とされ、ポンプＰ２およびＰ３が駆動される。これにより、培地収容部１１１および１１４に収容された培地Ａおよび培地Ｂが、流路Ｆ３および循環流路Ｆ１を経由して貯留容器３０内に流入する。その後、開閉バルブＶ１４が開状態とされ、培地Ａおよび培地Ｂからなる混合培地は、貯留容器３０から流出し、配管ａ５内に滞留している細胞と合流する。
【００７０】
ステップＳ４において、開閉バルブＶ１４、Ｖ１６およびＶ２１が開状態とされる。また、圧力調整機構３３によって貯留容器３０内の雰囲気が加圧される。これにより、配管ａ５内に滞留する細胞および培地が接続部位Ｘ１を経由して流路Ｆ２内に流入し、分割処理部４０内に流入する。分割処理部４０内に流入した細胞は、分割装置４００内において分割処理が施される。なお、ここでの分割処理は、凍結状態とされた細胞を破砕する目的で行われる。
【００７１】
ステップＳ５において、開閉バルブＶ２２およびＶ１３が開状態とされ、分割処理が施された細胞が、培地とともに接続部位Ｘ２を経由して循環流路Ｆ１内に流出し、貯留容器３０内に移送される。
【００７２】
ステップＳ６において、開閉バルブＶ１４、Ｖ１６およびＶ１１が開状態とされる。また、圧力調整機構３３によって貯留容器３０内の雰囲気が加圧される。これにより、貯留容器３０内に貯留された細胞および培地が、循環流路Ｆ１を経由して培養容器２０内に流入する。以上のステップＳ１〜Ｓ６の処理を経ることにより、培養開始処理が完了する。なお、上記の例では、濃縮処理および新たな培地の供給を分割処理前に実施しているが、濃縮処理および新たな培地の供給を分割処理後に実施してもよい。
【００７３】
＜培地交換処理＞
細胞培養においては、細胞から分泌される代謝物などによって培地が変質する。そのため、培養期間内における適切な時期に、培養容器２０内における使用済みの培地を、新たな培地に交換する培地交換処理が必要とされる。本例示的実施形態に係る細胞培養装置１０は、上記の培地交換処理を、以下のようにして実施する。図５は、細胞培養装置１０が培地交換処理を実施する場合における細胞および培地等の流れを示す図である。なお、図５において、細胞および培地等の流れと、以下に示す各処理ステップとの対応が示されている。
【００７４】
ステップＳ１１において、開閉バルブＶ１２、Ｖ１５およびＶ１３が開状態とされる。また、圧力調整機構２６によって培養容器２０内の雰囲気が加圧される。これにより、培養容器２０内に収容された細胞および使用済みの培地が、循環流路Ｆ１内に流出し、貯留容器３０内に移送される。
【００７５】
ステップＳ１２において、貯留容器３０内に貯留された細胞および使用済みの培地を含む混合物から使用済みの培地を除去する濃縮処理が実施される。濃縮処理は、上記した培養開始処理のステップＳ２における処理と同様の手順で行われる。濃縮処理により、使用済みの培地は廃液回収容器１６内に回収され、細胞は、配管ａ５内に滞留する。なお、細胞の沈降を促進させるために、希釈液を貯留容器３０内に導入してもよい。
【００７６】
ステップＳ１３において、開閉バルブＶ２、Ｖ３およびＶ６が開状態とされ、ポンプＰ２およびＰ３が駆動される。これにより、培地収容部１１１および１１４に収容された新たな培地Ａおよび新たな培地Ｂが、流路Ｆ３および循環流路Ｆ１を経由して貯留容器３０内に流入する。その後、開閉バルブＶ１４が開状態とされ、培地Ａおよび培地Ｂを含む新たな培地は、貯留容器３０から流出し、配管ａ５内に滞留している細胞と合流する。
【００７７】
ステップＳ１４において、開閉バルブＶ１４、Ｖ１６およびＶ１１が開状態とされる。また、圧力調整機構３３によって貯留容器３０内の雰囲気が加圧される。これにより、配管ａ５内に滞留する細胞および新たな培地が培養容器２０内に流入する。培養容器２０内に収容された細胞は、新たな培地によって培養される。以上のステップＳ１１〜Ｓ１４の処理を経ることにより、培地交換処理が完了する。
【００７８】
＜分割処理＞
多能性幹細胞の培養においては、細胞を培養することによって生じる細胞塊（スフェア）のサイズが過大となると、細胞塊同士が接着融合し、細胞が分化を開始したり、細胞塊の中心部の細胞が壊死したりするといった問題が生じ得る。従って、細胞塊のサイズが過大となることを防止するために、培養期間中の適切な時期に、細胞塊を分割する分割処理が必要となる場合がある。本例示的実施形態に係る細胞培養装置１０は、上記の分割処理を、以下のようにして実施する。図６は、細胞培養装置１０が分割処理を実施する場合における細胞および培地等の流れを示す図である。なお、図６において、細胞および培地等の流れと、以下に示す各処理ステップとの対応が示されている。
【００７９】
ステップＳ２１において、開閉バルブＶ１２、Ｖ１５およびＶ１３が開状態とされる。また、圧力調整機構２６によって培養容器２０内の雰囲気が加圧され、培養容器２０内に生じた細胞塊および使用済みの培地が、循環流路Ｆ１内に流出し、貯留容器３０内に移送される。
【００８０】
ステップＳ２２において、貯留容器３０内に貯留された細胞塊および使用済みの培地を含む混合物から使用済みの培地を除去する濃縮処理が実施される。濃縮処理は、上記した培養開始処理のステップＳ２における処理と同様の手順で行われる。濃縮処理により、使用済みの培地は廃液回収容器１６内に回収され、細胞塊は、配管ａ５内に滞留する。なお、細胞の沈降を促進させるために、希釈液を貯留容器３０内に導入してもよい。
【００８１】
ステップＳ２３において、開閉バルブＶ２、Ｖ３およびＶ６が開状態とされ、ポンプＰ２およびＰ３が駆動される。これにより、培地収容部１１１および１１４に収容された新たな培地Ａおよび新たな培地Ｂが、流路Ｆ３および循環流路Ｆ１を経由して貯留容器３０内に流入する。その後、開閉バルブＶ１４が開状態とされ、培地Ａおよび培地Ｂを含む新たな培地は、貯留容器３０から流出し、配管ａ５内に滞留している細胞塊と合流する。
【００８２】
ステップＳ２４において、開閉バルブＶ１４、Ｖ１６およびＶ２１が開状態とされる。また、圧力調整機構３３によって貯留容器３０内の雰囲気が加圧される。これにより、配管ａ５内に滞留する細胞塊および培地が接続部位Ｘ１を経由して流路Ｆ２内に流入し、分割処理部４０内に流入する。分割処理部４０内に流入した細胞は、分割装置４００によって分割される。多能性幹細胞の細胞塊が分割装置４００のメッシュ４０１を通過する速度は、送液部４５０によって制御される。送液部４５０は、多能性幹細胞の細胞塊が分割装置４００のメッシュ４０１を通過する速度が１５ｃｍ／ｓｅｃ以上１５０ｃｍ／ｓｅｃ以下の範囲内における一定の速度で送液を行う。
【００８３】
ステップＳ２５において、開閉バルブＶ２２およびＶ１３が開状態とされ、分割処理が施された細胞が、培地とともに接続部位Ｘ２を経由して循環流路Ｆ１内に流出し、貯留容器３０内に移送される。
【００８４】
ステップＳ２６において、開閉バルブＶ１４、Ｖ１６およびＶ１１が開状態とされる。また、圧力調整機構３３によって貯留容器３０内の雰囲気が加圧される。これにより、貯留容器３０内に貯留された分割処理が施された細胞および新たな培地が、培養容器２０内に流入する。培養容器２０内において、分割処理が施された細胞の培養が継続される。以上のステップＳ２１〜Ｓ２６の処理を経ることにより、分割処理が完了する。すなわち、細胞の継代が完了する。
【００８５】
なお、上記の例では、濃縮処理および新たな培地の供給を分割処理前に実施しているが、濃縮処理および新たな培地の供給を分割処理後に実施してもよい。
【００８６】
＜凍結処理＞
培養された細胞を回収して保存する場合、細胞を保存容器内に回収して凍結保存することが一般的である。本例示的実施形態に係る細胞培養装置１０は、培養された細胞を回収して凍結させる凍結処理を、以下のようにして実施する。図７は、細胞培養装置１０が凍結処理を実施する場合における細胞および培地等の流れを示す図である。なお、図７において、細胞および培地等の流れと、以下に示す各処理ステップとの対応が示されている。
【００８７】
ステップＳ４１において、開閉バルブＶ１２、Ｖ１５およびＶ１３が開状態とされる。また、圧力調整機構２６によって培養容器２０内の雰囲気が加圧される。これにより、培養容器２０内に収容された細胞および使用済みの培地が循環流路Ｆ１内に流出し、貯留容器３０内に移送される。
【００８８】
ステップＳ４２において、貯留容器３０内に貯留された細胞および使用済みの培地を含む混合物から使用済みの培地を除去する濃縮処理が実施される。濃縮処理は、上記した培養開始処理のステップＳ２における処理と同様の手順で行われる。濃縮処理により、使用済みの培地は廃液回収容器１６内に回収され、細胞は、配管ａ５内に滞留する。なお、細胞の沈降を促進させるために、希釈液を貯留容器３０内に導入してもよい。
【００８９】
ステップＳ４３において、開閉バルブＶ５およびＶ６が開状態とされ、ポンプＰ５が駆動される。これにより、凍結液収容部１３１に収容された凍結液が、流路Ｆ３および循環流路Ｆ１を経由して貯留容器３０内に流入する。その後、開閉バルブＶ１４が開状態とされ、凍結液は、貯留容器３０から流出し、配管ａ５内に滞留している細胞と合流する。
【００９０】
ステップＳ４４において、開閉バルブＶ１４、Ｖ１６およびＶ４１が開状態とされる。また、圧力調整機構３３によって貯留容器３０内の雰囲気が加圧される。これにより、配管ａ５内に滞留する細胞および凍結液が流路Ｆ５を経由して凍結部１７の保存容器１７ａ内に収容される。凍結部１７は、保存容器１７ａ内に収容された細胞を凍結液とともに凍結させる。以上のステップＳ４１〜Ｓ４４の処理を経ることにより、凍結処理が完了する。
【００９１】
なお、細胞を凍結保存する方法として、例えば、特許第４７０５４７３号に記載の方法を適用してもよい。この方法では、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、プロピレングリコール、アセトアミド及び培地を所定量含む媒体中で、細胞を急速凍結させる工程、を含む。また、特許第４２２３９６１号に記載の方法を適用してもよい。この方法は、所定濃度の、ジメチルスルホキシド、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール、およびポリビニルピロリドンからなる群から選ばれる少なくとも一つを凍結保護剤として含有する凍結保存液を利用した細胞の凍結保存方法であって、細胞を凍結保存液に懸濁する工程と、所定の冷却速度で凍結保存液を−８０℃以下まで冷却し凍結させる冷却工程と、凍結保存液を-８０℃以下で保存する保存工程を含む。
【００９２】
なお、上記の培養開始処理、培地交換処理および分割処理においては培地供給部１１０から２種類の培地Ａおよび培地Ｂを供給する場合を例示しているが、使用する培地の種類は、細胞の培養プロトコルに応じて適宜変更することが可能である。すなわち、使用する培地は、培養プロトコルに応じて１種類であってもよいし、３種類以上であってもよい。
【００９３】
＜細胞培養処理＞
細胞培養装置１０は、制御部１８が以下に例示する細胞培養処理プログラムを実行することにより、細胞培養を、人手を介在させることなく自動で行うことが可能である。図８は、制御部１８が実行する細胞培養プログラムにおける処理の流れを示すフローチャートである。
【００９４】
ステップＳ１０１において、制御部１８は、上記の培養開始処理を実行することにより、細胞供給部１００から供給される細胞および培地供給部１１０から供給される培地を培養容器２０内に収容し、細胞培養を開始する。
【００９５】
ステップＳ１０２において、制御部１８は、細胞培養を開始してから所定期間経過後に、上記の培地交換処理（１回目）を実施することにより、培養容器２０内の使用済みの培地を、培地収容部１１１および１１４に収容された新たな培地に交換し、細胞培養を継続する。
【００９６】
ステップＳ１０３において、制御部１８は、１回目の培地交換処理を実施してから所定期間経過後に、上記の培地交換処理（２回目）を実施することにより、培養容器２０内の使用済みの培地を、培地収容部１１１内および１１４内に収容された新たな培地に交換し、細胞培養を継続する。
【００９７】
ステップＳ１０４において、制御部１８は、２回目の培地交換処理を実施してから所定期間経過後に、上記の分割処理を実施することにより、細胞塊を分割して細胞培養を継続する。
【００９８】
ステップＳ１０５において、制御部１８は、上記のステップＳ１０２〜Ｓ１０４における処理を１サイクルとする培養サイクルのサイクル数が、所定数に達したか否かを判定する。制御部１８は、培養サイクルのサイクル数が所定数に達していないと判定した場合には、処理をステップＳ１０２に戻す。一方、制御部１８は、培養サイクルのサイクル数が所定のサイクル数に達したと判定した場合には、処理をステップＳ１０６に進める。培養サイクルの進行とともに、細胞の培養スケールは増大する。
【００９９】
ステップＳ１０６において、制御部１８は、上記の凍結処理を実施することによって培養された細胞を凍結部１７の保存容器１７ａ内に収容して凍結保存する
【０１００】
なお、上記の例では、培養サイクルの１サイクル内において、培地交換処理を２回実施しているが、培養サイクルの１サイクル内における培地交換処理の実施回数は、適宜変更することが可能である。
【０１０１】
以上のように、本例示的実施形態に係る細胞培養装置１０は、培養容器２０の流入口２１と流出口２２とを接続する循環流路Ｆ１を有する。また、細胞培養装置１０は、循環流路Ｆ１内に設けられた貯留容器３０を有する。貯留容器３０は、培養容器２０の流出口２２に接続された流入口３１および培養容器２０の流入口２１に接続された流出口３２を有する。貯留容器３０は、上記の培養開始処理、培地交換処理、分割処理および凍結処理において実施される濃縮処理等の用に供される。また、細胞培養装置１０は、貯留容器３０の流出口３２と培養容器２０の流入口２１との間に位置する循環流路Ｆ１内の接続部位Ｘ１と、貯留容器３０の流入口３１と培養容器２０の流出口２２との間に位置する循環流路Ｆ１内の接続部位Ｘ２と、を接続する流路Ｆ２を有する。細胞培養装置１０は、流路Ｆ２内に設けられ、接続部位Ｘ１を経由して循環流路Ｆ１から流入する細胞塊を分割し、分割した細胞塊を、接続部位Ｘ２を経由して循環流路Ｆ１内に流出させる分割処理部４０を有する。また、細胞培養装置１０は、循環流路Ｆ１内に培地を供給する培地供給部１１０を有する。
【０１０２】
細胞培養装置１０を上記のように構成することで、培地交換処理や分割処理等の細胞培養において必要とされる一連の処理を閉鎖系において連続的に実施することが可能となる。これにより、均質な細胞の大量生産が可能となる。本例示的実施形態に係る細胞培養装置１０によれば、培養開始処理から凍結処理までの細胞培養に必要な一連の処理を人手を介在させることなく行うことが可能である。
【０１０３】
なお、本例示的実施形態に係る細胞培養装置１０は、制御部１８が、開閉バルブＶ１〜Ｖ５、Ｖ１１〜Ｖ１６、Ｖ２１、Ｖ２２、Ｖ３１およびＶ４１、ポンプＰ１〜Ｐ５、圧力調整機構２６、３３および４３の動作を制御することにより、培養開始処理から凍結処理までを自動化する場合を例示したが、この態様に限定されるものではない。開閉バルブＶ１〜Ｖ５、Ｖ１１〜Ｖ１６、Ｖ２１、Ｖ２２、Ｖ３１およびＶ４１、ポンプＰ１〜Ｐ５、圧力調整機構２６、３３および４３を、ユーザが手動で操作してもよい。
【実施例】
【０１０４】
以下、実施例により発明の例示的実施形態を詳細に説明するが、発明の例示的実施形態は、実施例に限定されない。【０１０５】
下記において、物質濃度に関し「Ｍ」はモル濃度を表し、１Ｍ＝１ｍｏｌ／Ｌである。【０１０６】
下記において、「ＰＢＳ」とは、リン酸緩衝液（phosphate buffered saline）を意味し、「ＩＭＤＭ」とは、イスコフ改変ダルベッコ培地（Iscove's Modified Dulbecco's Medium）を意味する。【０１０７】
下記において、「スフェア」とは、球状の細胞塊を意味する。【０１０８】
＜材料＞
［ヒト人工多能性幹細胞株（ｈｉＰＳ細胞株）］
・２５３Ｇ１。株式会社ｉＰＳポータル（日本国京都府京都市上京区河原町通今出川下る梶井町４４８番地５）より分譲。【０１０９】
［基本培地及び培地添加剤］
・ＴｅＳＲ−Ｅ８、STEMCELL Technologies社の型番ST-05940。
・３％メチルセルロース液（ＩＭＤＭ中。メチルセルロース濃度はｗ／ｖ％）、R&D Systems社の型番HSC001。
・１０ｍＭ  Ｙ−２７６３２液。Ｙ−２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤、Sigma-Aldrichの型番Y0503）をダルベッコＰＢＳ（Ｃａ，Ｍｇ不含）に溶解させた溶液。【０１１０】
［培地］
・培地１：ＴｅＳＲ−Ｅ８  ４５０ｍＬに３％メチルセルロース液５０ｍＬを加えてよく撹拌し、１０ｍＭ  Ｙ−２７６３２液を、Ｙ−２７６３２の終濃度が１０μＭとなる量加え調製した。
・培地２：ＴｅＳＲ−Ｅ８  ４５０ｍＬに３％メチルセルロース液５０ｍＬを加えてよく撹拌し調製した。【０１１１】
［培養ディッシュ及び遠心チューブ］
・Ultra-Low Attachment Plate、Corning社の型番Costar3471。６ウェル、蓋付き。
・１５ｍＬ遠心チューブ、Thermo Scientific社の型番339650。
・５０ｍＬ遠心チューブ、Thermo Scientific社の型番339652。【０１１２】
［継代用メッシュ］
・メッシュ（１）：Sysmex社のPartec CellTrics型番06-04-004-2325。
・メッシュ（２）：Sysmex社のPartec CellTrics型番06-04-004-2326。
・メッシュ（３）：ベクトン・ディッキンソン社のセルストレーナー型番352340。
・メッシュ（４）：Sysmex社のPartec CellTrics型番06-04-004-2327。
・メッシュ（５）：ベクトン・ディッキンソン社のセルストレーナー型番352350。
・メッシュ（６）：ベクトン・ディッキンソン社のセルストレーナー型番352360。【０１１３】
メッシュ（１）〜（６）を位相差顕微鏡（オリンパス社のＩＸ７３）により倍率２０倍で観察し、メッシュの開口寸法を開口の２辺を計測してそれらの平均により求めた。メッシュの開口寸法は下記のとおりであった。
・メッシュ（１）：開口寸法  ２５．７μｍ
・メッシュ（２）：開口寸法  ３５．９μｍ
・メッシュ（３）：開口寸法  ４０．５μｍ
・メッシュ（４）：開口寸法  ４３．３μｍ
・メッシュ（５）：開口寸法  ７３．１μｍ
・メッシュ（６）：開口寸法１００．１μｍ【０１１４】
継代用メッシュはすべて、オートクレーブによる滅菌処理をして継代操作に供した。【０１１５】
＜実施例：ｈｉＰＳ細胞の培養と継代＞
［ｈｉＰＳ細胞の培養］
ｈｉＰＳ細胞株２５３Ｇ１を、６ウェル培養ディッシュと培地２を用い、インキュベータ中、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で、培地を交換しながら５日間浮遊培養し、スフェアを形成した。【０１１６】
［ｈｉＰＳ細胞の継代］
５日間の浮遊培養後、６ウェル培養ディッシュをインキュベータから取り出し、円を描くようにウェルを動かして、ウェルの中央にスフェアを集め、１５ｍＬ遠心チューブに培地ごと移した。予め３７℃に加温したＴｅＳＲ−Ｅ８ ３ｍＬをウェルに入れ、ウェルに残ったスフェアを集め、さらに１５ｍＬ遠心チューブに移した。【０１１７】
１５ｍＬ遠心チューブを遠心処理（５０ｒｐｍ、２分間）して上清を除いた後、予め３７℃に加温した培地１を入れ、スフェアを培地１に再懸濁した。スフェア懸濁液を、培地１（液温３７℃）を入れた別の１５ｍＬ遠心チューブに移し、細胞濃度５×１０５／ｍＬのスフェア浮遊液を調製した。【０１１８】
シリンジ（テルモ社の型番SS50-LZ）の口とシリコンチューブの一端とをルアーロックタイプのチューブコネクターを介して接続し、シリコンチューブの他端とピペット用チップ（Greiner Bio-One社の型番607160、先端内径１．５ｍｍ）とをチューブコネクターを介して接続した。スフェア浮遊液をシリンジに移し、シリンジをシリンジポンプ（Harvard社の型番PHD-2000）に装填した。【０１１９】
１５ｍＬ遠心チューブ又は５０ｍＬ遠心チューブの口に、メッシュ（１）〜（６）をそれぞれ装着した。スフェア浮遊液を収容したシリンジに繋がっているピペット用チップの先端をメッシュに押し当て、シリンジポンプを作動させスフェア浮遊液を押し出し、スフェア浮遊液をメッシュに通し、スフェアを分割した。スフェア浮遊液のメッシュ通過速度は、シリンジポンプにより流量制御を行うことで変化させた。【０１２０】
［継代後の培養］
メッシュを通過させた後のスフェア浮遊液を、６ウェル培養ディッシュに播種し、インキュベータ中、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。【０１２１】
継代後の培養１日目（即ち、メッシュ通過から２４時間後）に、６ウェル培養ディッシュをインキュベータから取り出し、円を描くようにウェルを動かして、ウェルの中央にスフェアを集め、１５ｍＬ遠心チューブに移した。予め３７℃に加温したＴｅＳＲ−Ｅ８ ３ｍＬをウェルに入れ、ウェルに残ったスフェアを集め、さらに１５ｍＬ遠心チューブに移した。【０１２２】
１５ｍＬ遠心チューブを遠心処理（５０ｒｐｍ、２分間）して上清を除いた後、予め３７℃に加温した培地２を交換前の培地と等量入れてスフェアを再懸濁し、培地交換を行った。スフェア懸濁液をウェルに戻し、インキュベータ中、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養を継続した。【０１２３】
上記と同様の操作を、継代後の培養３日目（即ち、メッシュ通過から７２時間後）にも実施し、培地交換を行った。【０１２４】
＜継代の評価＞
［継代前のスフェアの大きさ］
上述の［ｈｉＰＳ細胞の継代］において継代のために調製したスフェア懸濁液の一部をウェルに戻し、平面上でウェルを縦及び横に動かして、スフェアをウェル内で均一に分散させた。ウェル内のスフェアを位相差顕微鏡（オリンパス社のＩＸ７３）により観察し、倍率１０倍の顕微鏡画像を撮影した。無作為に選んだ３００個のスフェア像を解析し、個々のスフェア像の面積から円相当直径を求め、３００個の平均を求めた。円相当直径の平均は２６３．４μｍであった。【０１２５】
［継代後のスフェアの大きさ及び形状］
継代１時間後（即ち、メッシュ通過から１時間後）に、６ウェル培養ディッシュをインキュベータから取り出し、平面上でウェルを縦及び横に動かして、スフェアをウェル内で均一に分散させた。ウェル内のスフェアを位相差顕微鏡（オリンパス社のＩＸ７３）により観察し、倍率１０倍の顕微鏡画像を撮影した。無作為に選んだ３００個のスフェア像を解析し、個々のスフェア像の面積から円相当直径を求め、３００個の平均を求めた。また、下記のとおり円相当直径によりスフェアを分類し、ＸとＹの比「Ｘ／Ｙ」を求めた。
Ｘ：円相当直径が３０μｍ以上４０μｍ未満のスフェアの個数。
Ｙ：円相当直径が４０μｍ以上３００μｍ未満のスフェアの個数。【０１２６】
スフェアの顕微鏡画像から、スフェアの形状を下記のとおり分類した。
分類Ａ：スフェアの輪郭がはっきりしており、輪郭がなめらかで、スフェアが球形である。
分類Ｄ：スフェアの輪郭がはっきりしておらず、輪郭に凹凸があり、スフェアが不規則な形状である。
分類Ｅ：継代によってスフェアが過度に分割され、スフェアの大きさが不適当なまでに小さくなっている。【０１２７】
図９は、メッシュ（４）に速度１００ｃｍ／ｓで通過させて継代した後のスフェア像であり、スフェアの形状の分類Ａの典型例である。
図１０は、メッシュ（６）に速度１８０ｃｍ／ｓで通過させて継代した後のスフェア像であり、スフェアの形状の分類Ｄの典型例である。
図１１は、メッシュ（１）に速度１５ｃｍ／ｓで通過させて継代した後のスフェア像であり、スフェアの形状の分類Ｅの典型例である。【０１２８】
［継代時の細胞回収率、継代５日後の細胞増殖率］
継代操作を開始する直前と、継代１時間後（即ち、メッシュ通過から１時間後）と、継代後の培養５日目（即ち、メッシュ通過から１２０時間後）に、６ウェル培養ディッシュをインキュベータから取り出し、平面上でウェルを縦及び横に動かして、スフェアをウェル内で均一に分散させた。１ｍＬチューブにスフェア分散液を３００μＬとり、７００μＬのＴｅＳＲ−Ｅ８を加えて遠心処理（４０００ｒｐｍ、３分間）して上清を取り除いた。次いで、３００μＬのTrypLE Select（トリプシン様酵素、Gibco社の型番12563）を添加し、ボルテックスミキサーで撹拌し、３７℃で３分間静置後に再度ボルテックスミキサーで撹拌し、細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液を細胞計数装置（ChemoMetec社のNC-200）にかけて細胞数を測定し、下記の式（２）により細胞回収率を算出し、下記の式（３）により継代５日後の細胞増殖率を算出した。【０１２９】
式（２）：継代時の細胞回収率＝継代１時間後の細胞数÷継代前の細胞数
式（３）：継代５日後の細胞増殖率＝継代５日後の細胞数÷継代１時間後の細胞数【０１３０】
［総合判定］
分類Ｇ１：Ｘ／Ｙが１超３未満であり、スフェアの形状が分類Ａであり、継代時の細胞回収率が０．４０以上であり、継代５日後の細胞増殖率が３．０以上である。
分類Ｇ２：Ｘ／Ｙが３を超えること以外は、分類Ｇ１と同じである。
分類ＮＧ：分類Ｇ１及び分類Ｇ２に当てはまらない。【０１３１】
【表１】
0006653753.tif 000002
【０１３２】
【表２】
0006653753.tif 000003
【０１３３】
【表３】
0006653753.tif 000004
【０１３４】
【表４】
0006653753.tif 000005
【０１３５】
【表５】
0006653753.tif 000006
【０１３６】
【表６】
0006653753.tif 000007
【０１３７】
表１〜表６に示すとおり、多能性幹細胞のスフェアを開口寸法が３０μｍ〜８０μｍの範囲のメッシュに通過速度１５ｃｍ／ｓ〜１５０ｃｍ／ｓの範囲で通過させることにより、多能性幹細胞に対するダメージを抑制しつつ効率的に細胞塊の分割をすることができた。すなわち、本開示の例示的実施形態に係る多能性幹細胞の継代方法は、大量培養に適した継代方法であるといえる。【０１３８】
日本出願２０１６−０９３３００の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。【０１３９】
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
【図１Ａ】
0006653753.tif 000008
【図１Ｂ】
0006653753.tif 000009
【図２Ａ】
0006653753.tif 000010
【図２Ｂ】
0006653753.tif 000011
【図２Ｃ】
0006653753.tif 000012
【図２Ｄ】
0006653753.tif 000013
【図２Ｅ】
0006653753.tif 000014
【図２Ｆ】
0006653753.tif 000015
【図３】
0006653753.tif 000016
【図４】
0006653753.tif 000017
【図５】
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【図６】
0006653753.tif 000019
【図７】
0006653753.tif 000020
【図８】
0006653753.tif 000021
【図９】
0006653753.tif 000022
【図１０】
0006653753.tif 000023
【図１１】
0006653753.tif 000024