(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４又は配列番号９のアミノ酸配列を含むキャプシドをコードする核酸を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、異種核酸配列を更に含む、ＡＡＶベクター。
【請求項２】
異種核酸配列が、宿主細胞におけるその発現を指令する調節配列に作動可能に連結される、請求項１のＡＡＶベクター。
【請求項３】
異種核酸配列に、１つ以上の逆位末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接する、請求項１又は２のＡＡＶベクター。
【請求項４】
キャプシドが、配列番号５の核酸配列によってコードされる、請求項１〜３のいずれか１項のＡＡＶベクター。
【請求項５】
異種核酸配列が、メチルマロニルＣｏＡムターゼ酵素をコードする、請求項１〜４のいずれか１項のＡＡＶベクター。
【請求項６】
異種核酸配列が、神経成長因子（ＮＧＦ）シグナルペプチド及び副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）を含むポリペプチドをコードする、請求項１〜４のいずれか１項のＡＡＶベクター。
【請求項７】
ポリペプチドが、配列番号１及び配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項６のＡＡＶベクター。
【請求項８】
配列番号３の核酸配列を含む、請求項６又は７のＡＡＶベクター。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項のＡＡＶベクター及び医薬的に許容可能な担体を含む、組成物。
【請求項１０】
哺乳動物の唾液腺への投与用に製剤化された、請求項６〜８のいずれか１項のベクターを含む、哺乳動物における副甲状腺機能低下症の治療剤。
【請求項１１】
請求項５のベクターを含む、哺乳動物におけるメチルマロン酸血症（ＭＭＡ）の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、２０１５年５月１２日出願の米国仮特許出願第６２／１６０，５２２号及び２０１６年５月４日出願の米国仮特許出願第６２，３３１，６９９号（参照により組み込まれる）の利益を主張する。
【０００２】
配列表
本明細書と同時提出されるヌクレオチド／アミノ酸の配列表が、参照により、本明細書中にその全体が組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ＡＡＶはパルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ  ｆａｍｉｌｙ）のメンバーであり、約５，０００ヌクレオチド未満の、直鎖状の一本鎖ＤＮＡゲノムを含む。ＡＡＶは、効率的な複製のために、ヘルパーウイルス（即ち、アデノウイルス又はヘルペスウイルス）との共感染、又はヘルパー遺伝子の発現を必要とする。治療用核酸の投与のために用いられるＡＡＶベクターは、典型的には、ＤＮＡ複製及びパッケージングのための認識シグナルを含有する末端反復配列（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔｓ）（ＩＴＲ）のみが残るように、およそ９６％の親ゲノムが欠失されている。これにより、ウイルス遺伝子の発現に起因する免疫学的な又は毒性の副作用が無くされる。更に、所望であれば、産生細胞に、特定のＡＡＶタンパク質を送達することにより、ＡＡＶ  ＩＴＲを含むＡＡＶベクターを、細胞ゲノムの特定領域に組み込むことが可能になる（例、米国特許第６，３４２，３９０号及び第６，８２１，５１１号を参照）。組み込まれたＡＡＶゲノムを含む宿主細胞は、細胞増殖の変化や形態の変化を示さない（例えば、米国特許第４，７９７，３６８号参照）。
【０００４】
ＡＡＶ  ＩＴＲは、非構造的な複製（Ｒｅｐ）タンパク質及び構造的なキャプシド（Ｃａｐ）タンパク質（ウイルス粒子タンパク質（ＶＰ）としても知られている）の固有のコードヌクレオチド配列に隣接する。末端の１４５ヌクレオチドは自己相補的であり、Ｔ字型ヘアピンを形成する、エネルギー的に安定な分子内二重鎖が形成され得るように構成される。これらのヘアピン構造は、細胞のＤＮＡポリメラーゼ複合体のためのプライマーとして機能することにより、ウイルスＤＮＡ複製のための起点としての役割を果たす。Ｒｅｐ遺伝子は、Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０をコードする。Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８は、ｐ５プロモーターから転写され、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０は、ｐ１９プロモーターから転写される。Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８タンパク質は、ＡＡＶ末端の解離を可能にするために、生産的複製の間にヘリカーゼ及びニッカーゼの役割を果たす多機能ＤＮＡ結合タンパク質である（例、Ｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，６１：４４７−５７（１９９０）参照）。これらのタンパク質はまた、内在性ＡＡＶプロモーター及びヘルパーウイルス内のプロモーターからの転写を調節する（例、Ｐｅｒｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：１０７９−１０８８（１９９７）参照）。他のＲｅｐタンパク質は、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８の機能を修飾する。ｃａｐ遺伝子は、キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３をコードする。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから転写される。
【０００５】
ＡＡＶベクターの、分裂細胞及び非分裂細胞に感染し、長期の導入遺伝子発現を確立する能力、及び病原性の欠如により、ＡＡＶベクターの、遺伝子治療用途における使用が注目されている。
【０００６】
結合実験における交差競合の欠如は、各ＡＡＶ血清型が、独特な、細胞への進入のメカニズムを有することを示唆する。異なる血清型由来のキャプシドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の比較により、一連の保存及び発散配列（ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が同定され、後者の大部分はウイルス粒子の外側に存在するが、これはＡＡＶ血清型間の組織親和性（ｔｉｓｓｕｅ  ｔｒｏｐｉｓｍ）の変化を説明する。
【０００７】
異なる宿主範囲及び改善された免疫学的特性を有する新規ＡＡＶ分離株が望まれている。
【０００８】
副甲状腺機能低下症は、現在の補充療法が無力な、低レベル血中カルシウム及び高レベル血中リンに繋がるホルモン欠乏症候群である。
【０００９】
副甲状腺機能低下症のための新たな治療法が望まれている。
【発明の概要】
【００１０】
発明の要旨
本発明は、配列番号４又は配列番号９のアミノ酸配列を含むキャプシドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、異種核酸配列を更に含む、ＡＡＶベクターを提供する。一態様においては、異種核酸配列は、ＮＧＦ−ＰＴＨ融合ポリペプチド又はメチルマロニルＣｏＡムターゼ酵素をコードする。
【００１１】
本発明は、神経成長因子（ＮＧＦ）シグナルペプチド及び副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）を含むポリペプチドであって、配列番号１及び配列番号２のアミノ酸配列を含み得るか、実質的にそれから成り得るか、又はそれから成り得るポリペプチドを提供する。本発明は、該ポリペプチドをコードする核酸、該核酸を含むベクター、及び該ポリペプチド、核酸又はベクターを含む組成物も提供する。
【００１２】
本発明は、哺乳動物における副甲状腺機能低下症を治療する方法であって、哺乳動物に、該ポリペプチド、核酸、ベクター又は組成物を投与することを含み、それによって哺乳動物における副甲状腺機能低下症を治療する、方法を提供する。
【００１３】
本発明は、哺乳動物におけるメチルマロン酸血症（methylmalonic acidaemia）（ＭＭＡ）を治療する方法であって、メチルマロニルＣｏＡムターゼ酵素をコードする異種核酸配列を含むＡＡＶベクターを投与することを含む、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、各群における、３匹の別個のマウス中の右耳下唾液腺におけるカニューレ挿入による、ＡＡＶ２  ＣＭＶ−ルシフェラーゼ粒子又はＡＡＶ４４．９ＣＭＶ−ＣＲＥ粒子の投与１ヶ月後のマウスの、ルシフェラーゼ発現（ＲＬＵ）を示すグラフである。
【図２】図２は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４４．９、又はコントロールＧＦＰのカニューレ注入（ｃａｎｎｕｌａｔｅｄ）マウス由来血清と５時間インキュベーションした、ＰＴＨ受容体及びホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子をドライブするＣＲＥＢ応答エレメント（ＣＲＥ）プロモーターで安定にトランスフェクションした２９３細胞におけるルシフェラーゼ発現（ｐｇ／ｍＬ）を示すグラフである。
【図３】図３は、メチルマロニルＣｏＡムターゼ酵素をコードするＡＡＶ４４．９ベクターの肝臓への経皮投与の前後の、メチルマロニルＣｏＡムターゼ酵素が欠損した新生マウスにおける血漿メチルマロン酸レベル（μＭ）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明者らは、「４４−９」と名付けられたＡＡＶ分離株を生成し、特性解析した。ＡＡＶ４４．９は、唾液腺細胞、肝細胞、及び神経細胞（例、皮質、嗅球、及び脳幹の細胞及び小脳のプルキンエ細胞）を含む多くの細胞種において高い遺伝子導入活性を有する。
【００１６】
ＡＡＶ４４−９のキャプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸配列は、最も詳細に報告された、分離株ＡＡＶｒｈ８のキャプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸配列（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８（１２）：６３８１−６３８８（２００４）参照）とは、いくつかの位置（そのうち２つは可変ドメイン３におけるセリン残基である）で異なる。特に、ＡＡＶ４４−９のキャプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸配列（配列番号４）は、最も詳細に報告された分離株ＡＡＶｒｈ８のキャプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸配列（配列番号６）と比較して、１７９位、４７３位及び４８３位で異なる。
【００１７】
キャプシドタンパク質中アミノ酸の突然変異誘発の研究は、いくつかの突然変異、具体的には可変領域におけるセリン及びスレオニン残基の存在が、ベクターの遺伝子導入活性の阻害効果を有することを示唆している。報告により、これらのアミノ酸は、粒子の表面電荷を増加させ、それらをリソソームにおける分解に向けて標的化し、他の非荷電アミノ酸との置換が、形質導入活性を改善し得ることが示されている。
【００１８】
以前の研究を考慮すると、ＡＡＶｒｈ８のキャプシドタンパク質ＶＰ１と比較して、ＡＡＶ４４．９のキャプシドタンパク質ＶＰ１の可変ドメイン３（配列番号４の４７３位及び４８３位）に、更なるセリン残基が含まれることからすれば、ＡＡＶ４４−９が、多くの細胞種において、高い遺伝子導入活性を有することは予想外であった。
【００１９】
一態様においては、本発明は、ＡＡＶ４４−９のキャプシドタンパク質ＶＰ１に対応する、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、実質的にそれから成るか、又はそれから成る、ポリペプチドを提供する。
【００２０】
別の態様においては、本発明は、ＡＡＶ４４−９のキャプシドタンパク質ＶＰ１に対応し、４７０位のセリンの、アスパラギンとの置換を有する、配列番号９のアミノ酸配列を含むか、実質的にそれから成るか、又はそれから成る、ポリペプチドを提供する。いかなる特定の理論によっても束縛されることを望まないが、該置換は、突然変異キャプシドタンパク質を含むＡＡＶ４４−９の形質導入及び結合親和性を変化させると考えられている。所望の置換は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）及び２つの相補的ＰＣＲプライマーを使用することによって達成された。フォワードプライマーは、核酸配列
【００２１】
【化１】
0006805174.tif 000002
【００２２】
（配列番号１０）を有する。 
【００２３】
変異体ポリペプチドを製造するためのアミノ酸配列の改変は、当業者に公知の様々な手段によって行われ得る。例えば、アミノ酸置換が、合成時に、ポリペプチドに簡便に導入され得る。或いは、発現ベクターに、改変部位を含む合成オリゴヌクレオチドを連結することにより、部位特異的突然変異が導入され得る。或いは、オリゴヌクレオチドを標的とした、部位特異的突然変異誘発法が用いられ得る。
【００２４】
天然に存在する、任意の特定のアミノ酸に対して、保存的又中立的な置換をもたらす合成アミノ酸及び天然に存在するアミノ酸を選択することは、当業者のスキルの範囲内である。当業者は、望ましくは、側鎖の疎水性又は極性、側鎖の一般的なサイズ及び生理的条件下で酸性又は塩基性の性質を有する側鎖のｐＫ値を考慮することに加えて、任意の特定のアミノ酸置換がなされる状況を考慮する。例えば、リジン、アルギニン、及びヒスチジンに、頻繁に、好適に互いが置換され、アルギニン及びヒスチジンにより頻繁に置換される。当該技術分野において公知の通り、これは、３つのアミノ酸の全てが塩基性側鎖を有するが、リジン及びアルギニンの側鎖のｐＫ値が、ヒスチジン（約６）よりも、互いに対しての方がはるかに僅差（約１０及び１２）なためである。同様に、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンに、頻繁に、好適に互いが置換される（但し、グリシンは、高い頻度で、該グループの他のメンバーへ適切に置換されない）。これは、これらのアミノ酸の各々が、ポリペプチドに取り込まれる場合、比較的疎水性であるが、グリシンのα炭素の欠如により、ファイ及びプサイの回転角（α炭素の周り）が相当構造的に自由になるので、グリシニル残基が、他のアミノ酸に互いが置換される場合に頻繁には生じない、立体構造又は二次構造における変化を引き起こし得るからである。頻繁に、好適に互いが置換される、他のアミノ酸の群としては、グルタミン酸及びアスパラギン酸から成る群；フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンから成る群；セリン、スレオニン、及び場合によりチロシンから成る群が挙げられるが、これらに限定されない。更に、当業者は、合成アミノ酸を、天然に存在するアミノ酸と容易にグループ化し得る。
【００２５】
当業者は、例えば、ポリペプチドの抗ウイルス機能にとって重要ではないアミノ酸を置換又は変異させることによって、突然変異体又は変異体を生成できる。理想的には、最適な活性を保持するために、ペプチドの電子的又は構造的環境を改変しない突然変異が生成される。例えば、ポリペプチドの三次元構造の折り畳み又は安定性に関与しないアミノ酸残基は、突然変異のための候補残基である。
【００２６】
所望であれば、本発明のポリペプチドは、例えば、本発明のタンパク質のグリコシル化、アミド化、カルボキシル化、若しくはリン酸化により、又は酸付加塩、アミド、エステル、特にＣ末端エステル及びＮ−アシル誘導体の生成により修飾され得る。ポリペプチドはまた、当該技術分野における公知の方法に従って、他の部分との、共有結合又は非共有結合の複合体を形成することによって、タンパク質誘導体を生成するように改変され得る。共有的に結合した複合体は、化学的部分を、タンパク質を含むアミノ酸の側鎖上又はＮ若しくはＣ末端の官能基に連結することによって調製され得る。望ましくは、かかる修飾及びコンジュゲーション（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）は、ポリペプチドの活性に悪影響を及ぼさない。
【００２７】
ポリペプチドは、多くの従来技術のいずれかによって調製され得る。ポリペプチドは、組換え体ソースから単離又は精製され得る。例えば、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片が、周知の分子遺伝学的手法を用いて、適切なベクターにサブクローニングされ得る。該断片は転写され得、その後ポリペプチドはインビトロで翻訳され得る。市販のキットも用いられ得る。必要に応じて、ポリメラーゼ連鎖反応が、核酸の操作において用いられ得る。
【００２８】
ポリペプチドはまた、当該技術分野における公知の方法に従って、自動ペプチド合成機を用いて合成され得る。或いは、ポリペプチドは、当業者に周知の標準的なペプチド合成技術を用いて合成され得る。特に、ポリペプチドは、固相合成の手順を用いて合成され得る。所望であれば、これは、自動ペプチド合成機を用いて行われ得る。ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）又は９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノ酸保護基の除去及びポリペプチドの樹脂からの分離は、例えば、低温での酸処理によって達成され得る。次いで、非ペプチド性有機化合物を除去するため、タンパク質含有混合物が、例えばジエチルエーテルで抽出され得、合成されたポリペプチドが、（例、約２５％ｗ／ｖ酢酸で）樹脂粉末から抽出され得る。ポリペプチドの合成後、任意の不完全なタンパク質、ポリペプチド、ペプチド又は遊離アミノ酸を除去するために、必要に応じて、（例、ＨＰＬＣを用いて）更なる精製が行われ得る。合成されたポリペプチドに対して、その同一性を確認するために、アミノ酸分析及び／又はＨＰＬＣ分析が行われ得る。本発明による他の用途のためには、当業者に公知のような、化学的コンジュゲーション（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）によって、又は遺伝学的手段によってのいずれかで、ポリペプチドを、より大きな融合タンパク質の一部として製造することが好ましい場合がある。これに関して、本発明は、融合タンパク質の単離、精製、解析又は安定性を助長する等のために、ポリペプチド及び任意の所望の特性又は機能を有する１つ以上の他のタンパク質（複数可）を含む融合タンパク質も提供する。
【００２９】
本発明は、本発明のポリペプチド又はその変異体をコードする核酸も提供する。一実施形態においては、核酸は、配列番号５の核酸配列（該配列は、ＡＡＶ４４−９から単離された複数のＤＮＡ断片を含む）を含むか、実質的にそれから成るか、又はそれから成る。核酸（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びｃＤＮＡ等）は、組換え産生及び商業的合成を含むが、これに限定されない任意の好適な状況（ｍａｔｔｅｒ）で産生され得る。これに関して、核酸配列は、合成の、組換えの、単離された及び／又は精製されたものであり得る。
【００３０】
本発明は、核酸を含むベクターを提供する。核酸は、任意の好適なベクターに挿入され得る。ベクターの選択及びそれらを構築するための方法は、当該技術分野において一般的に知られており、一般的な参考技術文献に記載されている。
【００３１】
好適なベクターとしては、増殖及び増幅のため、若しくは発現のため、又はその両方のために設計されたものが挙げられる。好適なベクターの例としては、例えば、プラスミド、プラスミド−リポソーム複合体、ＣＥＬｉｄベクター（例、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．，８（８）：ｅ６９８７９．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００６９８７９（２０１３））、並びにパルボウイルスベースのベクター（即ち、ＡＡＶベクター）、レトロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベースのベクター、アデノウイルスベースのベクター、及びポックスウイルスベクター（例）といったウイルスベクターが挙げられる。これらの発現コンストラクトのいずれもが、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて調製され得る。
【００３２】
本発明の一態様においては、ベクターは、ＡＡＶベクター等のウイルスベクターである。ベクターは、ポリペプチドをコードする核酸に加えて、宿主（例、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ネコ、イヌ、ウサギ、ブタ、ウシ、ウマ、又は霊長類（例、ヒト）等の哺乳動物）における送達及び発現のための１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の核酸配列を含み得る。
【００３３】
特定の実施形態においては、本発明は、該ポリペプチドを含むキャプシドを含むＡＡＶベクターであって、異種核酸配列を更に含む、ＡＡＶベクターを提供する。一実施形態においては、ＡＡＶベクターは、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３タンパク質を含むキャプシドを含み、ＶＰ１タンパク質は、配列番号４又は配列番号９のアミノ酸配列を含むか、実質的にそれから成るか、又はそれから成り、且つ、ＡＡＶは、異種核酸配列を更に含む。異種核酸配列には、１つ以上の逆位末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接し得る。一実施形態においては、ＡＡＶベクターは、配列番号５の核酸配列（該配列は、ＡＡＶ４４−９から単離された複数のＤＮＡ断片を含む）を含むか、実質的にそれから成るか、又はそれから成る。
【００３４】
異種核酸配列は、該異種核酸配列に隣接するベクター配列に対して異種である核酸配列を指す。異種核酸配列は、目的のポリペプチド、タンパク質又は他の産物をコードし得る。異種核酸配列は、宿主細胞において転写、翻訳及び／又は発現を可能にする様態で、調節的要素に作動可能に連結される。
【００３５】
異種核酸配列としては、発現に際して検出可能なシグナルを生成するレポーター配列が挙げられ得る。かかるレポーター配列としては、限定されないが、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、膜結合タンパク質（例えば、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質、及び当該技術分野において周知の他のもの（それらに対する高親和性抗体が、存在するか、又は従来の手段によって産生され得る）、及び例えば、ヘマグルチニン又はＭｙｃ由来の抗原タグドメインに適切に融合された膜結合タンパク質を含む融合タンパク質を含む）をコードする核酸配列が挙げられる。
【００３６】
これらのコード配列は、それらの発現をドライブする調節エレメントが結合すると、酵素的、放射線的、比色的、蛍光的又は他の分光学的なアッセイ、蛍光活性化細胞選別アッセイ並びに、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び免疫組織化学を含む免疫学的アッセイを含む従来手段により検出可能なシグナルを生成する。例えば、配列がＬａｃＺ遺伝子である場合、シグナルを伴うベクターの存在は、ベータ−ガラクトシダーゼ活性についてのアッセイによって検出される。配列が緑色蛍光タンパク質又はルシフェラーゼをコードする場合、シグナルを伴うベクターは、ルミノメーターにおいて、色又は光の生成によって視覚的に測定され得る。
【００３７】
異種核酸配列は、また、タンパク質、ペプチド、ＲＮＡ、酵素、ドミナントネガティブ突然変異体、又は触媒性ＲＮＡ等の、生物学及び医学において有用な産物をコードする非レポーター配列であり得る。望ましいＲＮＡ分子としては、ｔＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボソーマルＲＮＡ、触媒性ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、小ヘアピンＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡ、及びアンチセンスＲＮＡが挙げられる。有用なＲＮＡ配列の一例は、処理された宿主中の標的核酸配列の発現を阻害又は消滅させる配列である。典型的には、好適な標的配列としては、腫瘍性標的及びウイルス性疾患が挙げられる。
【００３８】
異種核酸配列は、正常遺伝子が正常レベル未満で発現する欠陥又は機能的遺伝子産物が発現しない欠陥を含み得る、遺伝子の欠陥を修復又は改善するために使用され得る。例えば、異種核酸配列は、宿主細胞において発現する治療用タンパク質又はポリペプチド（例、ＰＴＨ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ酵素（例、ＧｅｎｅＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０００２４６）、又はレチノスキシン）をコードし得る。
【００３９】
好適な異種核酸配列は、当業者によって容易に選択され得る。異種核酸配列の選択は、本発明の制約であるとは考えられない。特に、異種核酸配列は、本明細書に記載される通りのＮＧＦ−ＰＴＨ融合ポリペプチド、メチルマロニルＣｏＡムターゼ酵素、レチノスキシン、アクアポリン１、アクアポリン５、凝固因子ＩＸ、Ｘａ、インスリン、Ｅｘ４、ヒト成長ホルモン、アルファ１抗トリプシン、ｂｍｐ６アンタゴニスト、列記された内在性遺伝子及び／又は抗体の発現を調節できるＣＲＳＰＲｉ又はＣＲＩＳＰＲａガイドＲＮＡ、改変Ｃａｓをコードする核酸配列であり得る。一実施形態においては、異種核酸配列は、配列番号３の核酸配列を含む。
【００４０】
異種核酸配列は、１つ以上のポリペプチドをコードし得、該１つ以上のポリペプチドは、配列番号１１の、改変された重鎖リーダー配列、凝固因子ＩＸのリーダー配列、ＰＴＨのリーダー配列、ヒト成長ホルモンのリーダー配列（例、最初の６アミノ酸を欠くリーダー配列）、ガウシア（ｇｕａｓｓｉａ）のリーダー配列及びインスリンのリーダー配列、配列番号１２のＡｐｐＳ４合成酵母リーダー配列、又はＮＧＦシグナルペプチド（例、配列番号１のＮＧＦシグナルペプチド）等のシグナルペプチド／リーダーペプチドを含む。一実施形態においては、異種核酸配列は、ＰＴＨ及び配列番号１１の、改変された重鎖リーダー配列、凝固因子ＩＸのリーダー配列、ＰＴＨのリーダー配列、ヒト成長ホルモンのリーダー配列（例、最初の６アミノ酸を欠くリーダー配列）、ガウシア（ｇｕａｓｓｉａ）のリーダー配列、及びインスリンのリーダー配列、又は配列番号１２のＡｐｐＳ４合成酵母リーダー配列等のシグナルペプチド／リーダーペプチドを含む、融合ポリペプチドをコードする（例、ＮＧＦ−ＰＴＨ融合ポリペプチドのＮＧＦシグナルペプチドが、異なるシグナルペプチドと置換される）。
【００４１】
異種核酸配列（例、本明細書に記載のＮＧＦ−ＰＴＨ融合ポリペプチドをコードする）には、１つ以上の逆位末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接し得る。
【００４２】
ベクター（例、ＡＡＶベクター）は、複数（２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０個）の異種核酸配列を含み得る。例えば、複数のサブユニットタンパク質によって引き起こされる遺伝子異常を修復又は改善するために、複数の異種核酸配列が用いられ得る。特定の状況においては、タンパク質の各サブユニットをコードするために、又は種々のペプチド又はタンパク質をコードするために、種々の異種核酸配列が用いられ得る。これは、タンパク質サブユニットをコードする核酸のサイズが大きい（例、免疫グロブリン、血小板由来増殖因子、又はジストロフィンタンパク質についての）場合に望ましい。細胞が複数サブユニットのタンパク質を産生するために、細胞を、異なるサブユニットの各々を含有する組換えウイルスに感染させる。或いは、タンパク質の異なるサブユニットが、同一の核酸配列によってコードされ得る。この場合、単一の異種核酸配列は、サブユニットの各々をコードする核酸を、各サブユニットについての核酸が、内部リボザイム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって隔てられた状態で含む。これは、サブユニットの各々をコードする核酸のサイズが小さい（例、サブユニット及びＩＲＥＳをコードする核酸の全サイズが５キロ塩基未満である）場合に望ましい。ＩＲＥＳの代替物として、翻訳後のイベントにおいて自己切断する２Ａペプチドをコードする配列により、該核酸が隔てられ得る。この２Ａペプチドは、ＩＲＥＳよりも顕著に小さく、それは、間隔が制限要因である場合の使用に十分好適になる。より頻繁には、異種核酸配列が大きいか、複数サブユニットから成るか、又は２つの異種核酸配列が同時送達される場合、所望の異種核酸配列（複数可）又はサブユニットを有するｒＡＡＶが共投与され、それらが、インビボでコンカテマー化して単一のベクターゲノムを形成することが可能になる。かかる実施形態においては、第１のＡＡＶベクターが、単一の異種核酸配列を発現させる発現カセットを有し得、第２のＡＡＶベクターが、宿主細胞における共発現のための、異なる異種核酸配列を発現させる発現カセットを有し得る。しかし、選択された異種核酸配列は、任意の生物学的に活性な産物又は他の産物（例、研究に望ましい産物）をコードし得る。
【００４３】
望ましくは、ベクター（例、ＡＡＶベクター）は、ベクターがＤＮＡであるかＲＮＡであるかを適宜考慮に入れ、中にベクターが導入される宿主の種類（例、細菌、真菌、植物又は動物）に特異的な、転写開始及び翻訳開始コドン並びに終止コドン等の調節配列を含む。好ましくは、ベクターは、宿主の属に特異的な調節配列を含む。最も好ましくは、ベクターは、宿主の種に特異的な調節配列を含む。
【００４４】
ベクター（例、ＡＡＶベクター）は、好ましくは、宿主細胞において核酸配列（複数可）の発現をもたらすプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、転写ターミネーター、及び内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）等の発現制御配列を含む。例示的な発現制御配列は、当該技術分野において公知であり、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．（１９９０）に記載されている。
【００４５】
多様な異なるソースに由来する構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）、誘導性及び抑制性プロモーターを含む多数のプロモーターが、当該技術分野において周知である。プロモーターの代表的なソースとしては、例えば、ウイルス、哺乳動物、昆虫、植物、酵母及び細菌が挙げられ、これらのソースに由来する好適なプロモーターは、例えば、ＡＴＣＣ等の寄託機関及び他の商業的若しくは個人的なソースに由来する、公に入手可能な配列に基づいて、容易に利用可能であるか、又は、合成によって作製され得る。プロモーターは１方向性（即ち、１方向に転写を開始する）又は２方向性（即ち、３’又は５’方向のいずれにも転写を開始する）であり得る。プロモーターの非限定的な例としては、例えば、Ｔ７細菌発現系、ｐＢＡＤ（ａｒａＡ）細菌発現系、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターとしては、例えば、Ｔｅｔ系（米国特許第５，４６４，７５８号及び第５，８１４，６１８号）、エクジソン誘導系（Ｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９３：３３４６−３３５１（１９９６））、Ｔ−ＲＥＸ（商標）系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＬＡＣＳＷＩＴＣＨ（商標）系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）及びＣｒｅ−ＥＲＴタモキシフェン誘導性リコンビナーゼ系（Ｉｎｄｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２７：４３２４−４３２７（１９９９）；Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２８：ｅ９９（２０００）；米国特許第７，１１２，７１５号；及びＫｒａｍｅｒ  ＆  Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３０８：１２３−１４４（２００５））が挙げられる。
【００４６】
本明細書で用いられる場合、用語「エンハンサー」は、例えば、それが作動可能に連結される核酸配列の転写を増加させるＤＮＡ配列を指す。エンハンサーは、核酸配列のコード領域から数キロ塩基離れて配置され得、調節因子の結合、ＤＮＡメチル化のパターン、又はＤＮＡ構造の変化を調節し得る。種々の異なるソース由来の多数のエンハンサーが、当該技術分野において周知であり、クローニングされたポリヌクレオチドとして又はその内部で（例、ＡＴＣＣ等の寄託機関及び他の商業的又は個別のソースから）入手可能である。（一般的に用いられるＣＭＶプロモーター等の）プロモーターを含む多くのポリヌクレオチドは、エンハンサー配列も含む。エンハンサーは、コード配列の上流、内部、又は下流に配置され得る。例えば、ポリぺプチドをコードする核酸は、ＣＭＶエンハンサー／ニワトリβアクチンプロモーター（ＣＡＧプロモーターとも呼ばれる）に作動可能に連結され得る（例、Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１０８：１９３−１９９（１９９１）；Ｄａｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９６：２２９６−２３００（１９９９）；及びＳｏｎｄｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１５：４８１−４９１（２００７）を参照）。
【００４７】
本発明者らは、神経成長因子（ＮＧＦ）のシグナルペプチド及び副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）を含む融合ポリペプチドを生成して特性解析した。ＮＧＦ及びＰＴＨは、哺乳動物（例、マウス、ラット、又はヒト）のであり得る。一実施形態においては、融合ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列（ＮＧＦシグナルペプチドに対応する）及び配列番号２のアミノ酸配列（ＰＴＨ１〜８４に対応する）を含む。従って、一態様においては、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列及び配列番号２のアミノ酸配列を含むか、実質的にそれらから成るか、又はそれらから成るポリペプチドを提供する。
【００４８】
ＮＧＦ−ＰＴＨ融合ポリペプチドは、１つ以上のリンカー配列を更に含み得る。複数のグリシン残基、複数のセリン残基、又はそれらの組み合わせを含むリンカーを含むが、これらに限定されない、任意の好適なリンカー配列が用いられ得る。
【００４９】
本明細書に記載される通り、変異体ポリペプチドを製造するためのアミノ酸配列の改変は、当業者に公知の様々な手段によって行われ得る。
【００５０】
ＮＧＦ−ＰＴＨポリペプチドは、本明細書に記載される通りの、多くの従来技術のいずれかによって調製され得る。
【００５１】
本発明は、ＮＧＦ−ＰＴＨポリペプチド又はその変異体をコードする核酸も提供する。核酸（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びｃＤＮＡ等）は、組換え産生及び商業的合成を含むが、これに限定されない任意の好適な状況で産生され得る。これに関して、核酸配列は、合成の、組換えの、単離された及び／又は精製されたものであり得る。一実施形態においては、ポリペプチドをコードする核酸は、配列番号７及び８の核酸配列を含む。
【００５２】
本発明は、核酸を含むベクターを提供する。該核酸は、本明細書に記載される通りの任意の好適なベクターに挿入され得る。本発明の一態様においては、ベクターは、ＡＡＶベクター等のウイルスベクターである。一実施形態においては、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、又はｒｈ１０である。別の実施形態においては、ベクターは、本明細書に記載のＡＡＶ４４．９ベクターである。
【００５３】
ＮＧＦ−ＰＴＨ融合ポリペプチドをコードする核酸に加えて、又はそれの代替として、ベクターは、本明細書に記載される通りの、宿主における送達及び発現のための１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の異種核酸配列を含み得る。
【００５４】
本発明は、本発明のポリペプチド、核酸、又はベクターの１つ以上及び医薬的に許容可能な（例、生理学的に許容可能な）担体を含むか、実質的にそれらから成るか、又はそれらから成る、組成物を提供する。組成物が本発明のポリペプチド、核酸、又はベクターの１つ以上及び医薬的に許容可能な担体から実質的に成る場合、組成物に実質的に影響を与えない追加の成分（例、アジュバント、緩衝剤、安定化剤、抗炎症剤、可溶化剤、防腐剤など）が含められ得る。組成物が本発明のポリペプチド、核酸、又はベクターの１つ以上及び医薬的に許容可能な担体からなる場合、組成物は更なる成分を何ら含まない。
【００５５】
任意の好適な担体が本発明の関係の範囲内で用いられ得、かかる担体は当該技術分野において周知である。担体の選択は、組成物が投与され得る特定の部位及び組成物を投与するために用いられる特定の方法によって、ある程度決定される。組成物は、必要に応じて、本明細書に記載のベクター以外は滅菌的であり得る。組成物は、保存のために凍結又は凍結乾燥され得、使用前に好適な滅菌担体中で再構成され得る。組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（２００１）（例）に記載の従来技術に従って生成され得る。
【００５６】
組成物に好適な製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、及び静菌剤を含有し得る水性及び非水性溶液、等張滅菌溶液、及び懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、及び防腐剤を含み得る水性及び非水性滅菌懸濁液が挙げられる。製剤は、アンプル及びバイアル等の単位用量又は複数用量の密封容器で提供され得、使用直前の滅菌液体担体（例えば、水）の添加のみを必要とする凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ））状態で保存され得る。即時溶液及び懸濁液は、前述の種類の滅菌粉末、顆粒及び錠剤から調製され得る。好ましくは、担体は緩衝生理食塩水溶液である。より好ましくは、ポリペプチド、核酸、又はベクターは、投与前に、損傷からポリペプチド、核酸、又はベクターを保護するように製剤化された組成物で投与される。例えば、組成物は、ガラス製品、シリンジ、又は針等の、ポリペプチド、核酸、又はベクターを調製、保存、又は投与するために用いられるデバイスでのポリペプチド、核酸、又はベクターの損失を減少させるように製剤化され得る。組成物は、ポリペプチド、核酸、又はベクターの光感受性及び／又は温度感受性を低下させるように製剤化され得る。この目的のために、組成物は、好ましくは、例えば上記のもの等の、医薬的に許容可能な液体担体、及びポリソルベート８０、Ｌ−アルギニン、ポリビニルピロリドン、トレハロース及びこれらの組み合わせからなる群より選択される安定化剤を含む。かかる組成物の使用は、ポリペプチド、核酸、又はベクターの棚寿命を延長し、投与を容易にし、本発明の方法の効率を増加させる。ポリペプチド、核酸、又はベクター含有組成物のための製剤は、例えば、Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌ．，６（２）：１７４−１７８（２００３）及びＷｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１２：１７１−１７８（２００５））に更に記載されている。
【００５７】
組成物はまた、形質導入効率を増強するように製剤化され得る。更に、当業者は、１つ以上の本発明のポリペプチド、核酸、又はベクターが、他の治療剤又は生物学的活性剤を含む組成物中に存在し得ることを理解する。例えば、イブプロフェン又はステロイド等の、炎症を制御する因子が、１つ以上の本発明のポリペプチド、核酸、又はベクターのインビボ投与に伴う腫脹及び炎症を軽減するための組成物の一部であり得る。抗生物質、即ち殺菌剤及び防カビ剤が、既存の感染症を治療し、及び／又は遺伝子導入手順に関連する感染等の将来の感染リスクを低下させるために、存在し得る。
【００５８】
宿主に組成物を送達するために、任意の投与経路が用いられ得る。実際に、組成物を投与するために、１超の経路が用いられ得るが、特定の経路は、別の経路よりも迅速且つ効果的な反応をもたらし得る。組成物は、経口、エアロゾル、経皮、非経口（例、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、腹腔内及び髄腔内）、直腸及び膣内の投与によって投与され得る。
【００５９】
組成物は、スポンジ、生体適合性網状組織、機械的リザーバ、又は機械的インプラント等の制御性放出又は持続的放出を可能にするデバイス中、又はデバイス上で（ｉｎ  ｏｒ  ｏｎ）投与され得る。インプラント（例、米国特許第５，４４３，５０５号参照）、移植可能なデバイス（例、機械的リザーバ若しくはインプラント又はポリマー組成物を含むデバイス）等のデバイス（例、米国特許第４，８６３，４５７号参照）は、ポリペプチド、核酸、又はベクターの投与に特に有用である。組成物はまた、例えばゲルフォーム、ヒアルロン酸、ゼラチン、コンドロイチン硫酸、ポリリン酸エステル、ビス−２−ヒドロキシエチル−テレフタレート（ＢＨＥＴ）及び／又はポリ乳酸−グリコール酸等、を含む持続放出製剤（例、米国特許第５，３７８，４７５号参照）の形態で投与され得る。
【００６０】
宿主に投与される組成物中の本発明のポリペプチド、核酸、又はベクターの１つ以上の用量は、宿主のサイズ（質量）、任意の副作用の程度、及び特定の投与経路等を含む多くの要因によって決まる。好ましくは、本発明の方法は、本明細書に記載の本発明のポリペプチド、核酸、又はベクターの１つ以上を含む組成物の「治療有効量」を投与することを含む。「治療有効量」は、所要の投与量で所要の期間に、所望の治療結果を達成するのに有効な量を指す。治療有効量は、個体の年齢、性別、及び体重、並びに個体において所望の応答を誘発するポリペプチド、核酸、又はベクターの能力等の要因によって変動し得る。別の実施形態においては、本発明の方法は、本発明のポリペプチド、核酸、又はベクターの１つ以上を含む組成物の「予防有効量」を投与することを含み得る。「予防有効量」は、所要の投与量で所要の期間に、所望の予防結果を達成するのに有効な量を指す。特定の治療効果又は予防効果を達成するために必要な、組成物中のベクターの用量は、典型的には、細胞あたりのベクターゲノムコピー（ｇｃ／細胞）又は体重のキログラムあたりのベクターゲノムコピー（ｇｃ／ｋｇ）の単位で投与される。当業者は、当該技術分野において周知であるこれら及び他の要因に基づいて、特定の疾患又は障害を有する患者を治療するための、適切なポリペプチド、核酸、又はベクターの用量範囲を容易に決定し得る。
【００６１】
一実施形態においては、組成物は、宿主に１回投与される。別の実施形態においては、細胞の組成物への十分な曝露を確実にするために、治療期間中に組成物を複数回投与すること、及び／又は筋肉内及び皮下（例）の複数の投与経路を用いることが適切であり得る。例えば、組成物は、宿主に、治療期間中に２回以上（例、２、３、４、５、６、６、８、９又は１０回以上）投与され得る。組成物は、１つ以上の更なる薬剤と組み合わせて投与され得る。
【００６２】
一実施形態においては、ＮＧＦ−ＰＴＨ融合ポリペプチド、核酸、ベクター、又は組成物は、副甲状腺機能低下症を治療するために、宿主（例、哺乳動物）に投与される。
【００６３】
別の実施形態においては、Ｂ１２代謝障害を治療する（例、改善する）ために、メチルマロニルＣｏＡムターゼ酵素をコードするベクター（例、本明細書に記載される通りのＡＡＶ４４．９ベクター）又は該ベクターを含む組成物が、宿主（例、哺乳動物）に投与される。特に、メチルマロニルＣｏＡムターゼ酵素をコードするＡＡＶ４４．９ベクターが、肝臓に投与（例、経皮的に投与）され得、循環メチルマロン酸レベルの有意な減少及びメチルマロン酸血症（ＭＭＡ）の治療がもたらされる。
【００６４】
更に、眼における網膜症を治療するために、宿主（例、哺乳動物）に、レチノスキシンをコードするベクター（例、ＡＡＶ４４．９ベクター）が投与され得る。
【００６５】
以下の実施例は、本発明を更に説明するが、当然に、決してその範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【００６６】
実施例１
本実施例は、ＡＡＶ４４．９分離株の生成を説明する。
【００６７】
発現をドライブするための機能的プロモーターを含有するＡＡＶ４４−９のキャプシドＯＲＦを、ＰＣＲ増幅してウイルスＤＮＡのプールにし（ｗａｓ  ＰＣＲ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ａ  ｐｏｏｌ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ）、次いでプラスミドベクターにクローニングした。組換えベクターの作製に有用とするために、このプラスミドを、他のＡＡＶ分離株由来の部分を含有する他の２つのプラスミド：ウイルスゲノムの複製に必要なタンパク質をコードするＡＡＶ１２由来のプラスミド（ｒｅｐ２６）及び目的の遺伝子（異種核酸配列）に隣接する、ＡＡＶ２由来の複製起点を有するプラスミドと組み合わせた。
【００６８】
ＡＡＶ５、ＢＡＡＶ及びＡＡＡＶ等のいくつかのＡＡＶは、固有のＩＴＲ及びｒｅｐタンパク質を有し、また、ｒｅｐとｃａｐとの間の相互作用を裏付ける研究があるので、それらがＡＡＶ４４−９キャプシドタンパク質と共に機能しない可能性がある。また、キャプシドＯＲＦ内には、ＡＡＰと呼ばれるタンパク質を産生する、更なる内部ＯＲＦがあり、効率的なキャプシド集合に必要であると報告されている。これらを理由に、このキメラウイルスアプローチが機能するか否か不確実であった。
【００６９】
ウイルスの複製起点として機能し、パッケージングに必要なＩＴＲを、ウイルスゲノムから取り出し、目的の遺伝子（異種核酸配列）に付加した。更に、組換えを防ぎ、ベクター収量を改善するために、複製タンパク質のＯＲＦをキャプシドＯＲＦから分離した。
【００７０】
実施例２
本実施例は、目下遺伝子導入のために効率的に標的化されていない細胞への、遺伝子導入ベクターとしての、ＡＡＶ４４．９分離株の使用を実例で示す。
【００７１】
（ａ）インビトロとインビボとの比較
【００７２】
ＡＡＶ４４．９キャプシドをコードする核酸を用いて、ＣＭＶ−Ｌｕｃレポーター遺伝子カセットを有する組換えベクターを生成した。ウイルス生産量は、試験した他のＡＡＶ型と同等か、又はそれより優れていた。
【００７３】
２９３Ｔ及びＣＯＳ等の組織培養細胞におけるｒＡＡＶ４４．９  ＣＭＶ−Ｌｕｃの生物学的活性（ルシフェラーゼ活性の生成）は低かった。しかし、インビボでの腹腔内投与（５×１０９ウイルス粒子）は、確固とした、そして迅速なルシフェラーゼ発現（ＲＬＵ）をもたらした。
【００７４】
（ｂ）ＡＡＶ４４．９で唾液腺に形質導入する
【００７５】
２×１０１０個のＡＡＶ  ＣＭＶ−Ｌｕｃ粒子（ＡＡＶ２又はＡＡＶ４４．９）を、マウスの右耳下唾液腺内のカニューレ挿入により投与した。１ヶ月後、Ｌｕｃ活性をＸｅｎｏｇｅｎイメージングによって測定した。ＡＡＶ４４．９は、ＡＡＶ２と比較した場合、遺伝子導入能力の増大を示した。
【００７６】
同様の実験において、２×１０１１個のＣＭＶ  ＣＲＥ粒子（ＡＡＶ２又はＡＡＶ４４．９）を、ｔｏｍａｔｏ−ｆｌｏｘｅｄ膜ＧＦＰトランスジェニックマウス（ｔｏｍａｔｏ−ｆｌｏｘｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ＧＦＰ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ）の右耳下唾液腺内カニューレ挿入によって投与した。１ヶ月後、共焦点顕微鏡イメージングにより、形質導入は、ｔｏｍａｔｏ標識細胞ではなく緑色細胞として観察された。図１から明らかな通り、ＡＡＶ４４．９は、ＡＡＶ２と比較した場合、遺伝子導入能力の増大を示した。
【００７７】
（ｃ）ＡＡＶ４４．９でＣＮＳの細胞に形質導入する
【００７８】
マウスＣＮＳ中に、４×１０１０のｓｃＡＡＶ  ＣＭＶ−ＧＦＰ粒子を注射した。ＡＡＶ４４．９での形質導入は脳全体に分布した。陽性細胞は、脳室内注射後に、皮質、嗅球、及び脳幹、及び小脳のプルキンエ細胞において観察された。
【００７９】
実施例３
本実施例は、配列番号３のＣＭＶ  ＮＧＦ−ＰＴＨ遺伝子カセットを含有するＡＡＶベクターの、単回耳下唾液腺カニューレ注入後の、ＮＧＦ−ＰＴＨ融合ポリペプチドの内分泌放出を実証する。
【００８０】
ＡＡＶ投与の９ヶ月後、ＰＴＨ分泌を、ＰＴＨの生物学的アッセイによって定量した。簡単に述べると、ＰＴＨ受容体及びホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子をドライブするＣＲＥＢ応答エレメント（ＣＲＥ）プロモーターで安定にトランスフェクションされた２９３細胞を、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４４．９、又はコントロールＧＦＰのカニューレ注入マウス由来の血清と共に５時間インキュベーションした。ルシフェラーゼ発現を、未処理マウス由来の血清中に添加したＰＴＨの標準曲線を用いてｐｇ／ｍｌに変換し、結果を図２に示した。
【００８１】
ＡＡＶ４４．９ベクターは、唾液腺からの長期発現を指令することができた。特に、治療レベルの、生物学的に活性なホルモンが、８ヶ月超にわたって産生された。実際に、３．５６ｎｇ／ｍＬ±１．０３２のＰＴＨ循環レベル（正常な循環レベルの１０００倍である）が、マウス中にもたらされた。これは、一過的な発現のみを示す以前の研究（例、Ａｄｒｉａａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２２：８４−９２（２０１１）参照）とは差がある。
【００８２】
従って、ＡＡＶ４４．９ベクターは唾液腺に首尾よく送達され得、異種核酸配列が、副甲状腺機能低下症の治療（例）のために発現し得る。
【００８３】
実施例４
本実施例は、ＡＡＶ４４．９ベクターが肝臓への送達に用いられ得ることを実証する。
【００８４】
メチルマロニルＣｏＡムターゼ酵素をコードするＡＡＶ４４．９ベクターを、メチルマロニルＣｏＡムターゼ酵素が欠損した（Ｂ１２代謝の障害をもたらす）新生マウスの肝臓に経皮的に送達した。図３に示す通り、送達後に、循環メチルマロン酸レベルの有意な低下が観察された。
【００８５】
従って、ＡＡＶ４４．９ベクターが、首尾よく肝臓に送達され得、異種核酸配列が、肝臓障害のメチルマロン酸血症（ＭＭＡ）の治療のために（例）発現する。
【００８６】
刊行物、特許出願及び特許を含む、本明細書中に引用した全ての参考文献は、それぞれの参考文献が参照によって組み込まれることが個々に且つ具体的に示されているのと同程度及びその全体が本明細書中に記載されているのと同程度まで、参照によって本明細書中に組み込まれる。
【００８７】
本発明の説明に関して（特に、以下の特許請求の範囲に関して）、用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び「少なくとも１つの」並びに同様の指示対象の使用は、本明細書中に特記しないか文脈と明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方をカバーすると解釈すべきである。１つ以上の事項の列記の後での用語「少なくとも１つの」の使用（例えば、「Ａ及びＢのうち少なくとも１つの」）は、本明細書中に特記しないか又は文脈と明らかに矛盾しない限り、列記した事項から選択された１つの事項（Ａ若しくはＢ）又は列記した事項のうち２つ以上の任意の組み合わせ（Ａ及びＢ）を意味すると解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特記しない限り、オープンエンドの用語（即ち、「〜を含むがそれらに限定されない」を意味する）と解釈すべきである。本明細書中の値の範囲の記述は、本明細書中に特記しない限り、その範囲内に入る各個別の値に個々に言及する省略方法として働くことのみを意図しており、各個別の値は、それが本明細書中に個々に記述されているかのように本明細書中に組み込まれる。本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中に特記しないか又は特に文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施できる。本明細書中に提供される任意の及び全ての例又は例示的語句（例、「等（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）の使用は、本発明をよりよく説明することのみを意図しており、特段特許請求されない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書中の全ての語句は、特許請求されていない任意の要素を本発明の実施に必須のものとして示していると解釈すべきではない。
【００８８】
発明を実施するための、発明者が知る最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態が本明細書中に記載されている。これらの好ましい実施形態のバリエーションは、上述の説明を読めば当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者がかかるバリエーションを適宜使用することを予期しており、本発明者らは、本明細書中に具体的に記載されたのとは異なる方法で本発明が実施されることを意図している。従って、本発明は、適用法によって許容される通り、本明細書中に添付した特許請求の範囲に記載される主題の全ての改変及び均等物を含む。更に、その全ての可能なバリエーションでの上記要素の任意の組合せが、本明細書中に特記しない限り又は特に文脈と明らかに矛盾しない限り、本発明によって包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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