(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）タワードメインまたは（ｉｉ）ピンドメインもしくは１Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメインに含む第一のシステイン残基および／または第一の非天然アミノ酸が、それぞれ、（ｉ）ピンドメインもしくは１Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメインまたは（ｉｉ）タワードメイン内の第二のシステイン残基および／または第二の非天然アミノ酸に連結した、修飾されたＤＮＡ依存性ＡＴＰａｓｅ（Ｄｄａ）ヘリカーゼであって、
ポリヌクレオチドから解離するヘリカーゼの能力は、前記第一および／もしくは第二のシステイン残基ならびに／または前記第一および／もしくは第二の非天然アミノ酸を含まない非修飾ヘリカーゼと比較して低下しており、ポリヌクレオチドの移動を制御するその能力を保持しているヘリカーゼ。
【請求項２】
請求項１に記載のヘリカーゼであって、
（ａ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｄ２６０〜Ｐ２７４およびＮ２９２〜Ａ３８９）ならびに／もしくは（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ８６〜Ｅ１０２）ならびに／もしくは（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ８５およびＶ１０３〜Ｋ１７７）に導入されている配列番号８の変種；
（ｂ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｇ２９５〜Ｎ３０９およびＦ３１６〜Ｙ４２１）ならびに／もしくは（ｉｉ）ピンドメイン（Ｙ８５〜Ｌ１１２）ならびに／もしくは（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｉ８４およびＲ１１３〜Ｙ２１１）に導入されている配列番号９の変種；
（ｃ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｖ３２８〜Ｐ３４２およびＮ３６０〜Ｙ４４８）ならびに／もしくは（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ１４８〜Ｎ１６５）ならびに／もしくは（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ１４７およびＳ１６６〜Ｖ２４０）に導入されている配列番号１０の変種；
（ｄ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ａ２６１〜Ｔ２７５およびＴ２８５〜Ｙ３７０）ならびに／もしくは（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｇ９１〜Ｅ１０７）ならびに／もしくは（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ９０およびＥ１０８〜Ｈ１７３）に導入されている配列番号１１の変種；
（ｅ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｇ２９４〜Ｉ３０７およびＴ３１４〜Ｙ４０７）ならびに／もしくは（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｇ１１６〜Ｔ１３５）ならびに／もしくは（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ１１５およびＮ１３６〜Ｖ２０５）に導入されている配列番号１２の変種；
（ｆ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｖ２８８〜Ｅ３０１およびＮ３０７〜Ｎ３９３）ならびに／もしくは（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｇ９７〜Ｐ１１３）ならびに／もしくは（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ９６およびＦ１１４〜Ｖ１９４）に導入されている配列番号１３の変種；
（ｇ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｓ２５０〜Ｐ２６４およびＥ２７８〜Ｓ３７１）ならびに／もしくは（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ７８〜Ｅ９５）ならびに／もしくは（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ７７およびＶ９６〜Ｖ１６６）に導入されている配列番号１４の変種；
（ｈ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｋ２５５〜Ｐ２６９およびＴ２８４〜Ｓ３８０）ならびに／もしくは（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ８２〜Ｋ９８）ならびに／もしくは（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｍ８１およびＬ９９〜Ｍ１７１）に導入されている配列番号１５の変種；
（ｉ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｄ２４２〜Ｐ２５６およびＴ２７１〜Ｓ３６６）ならびに／もしくは（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ６９〜Ｋ８５）ならびに／もしくは（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｍ６８およびＭ８６〜Ｍ１５８）に導入されている配列番号１６の変種；
（ｊ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｔ２６３〜Ｐ２７７およびＮ２９５〜Ｐ３９２）ならびに／もしくは（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ８８〜Ｋ１０７）ならびに／もしくは（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ８７およびＡ１０８〜Ｍ１８１）に導入されている配列番号１７の変種；
（ｋ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｄ２６３〜Ｐ２７７およびＮ２９５〜Ａ３９１）ならびに／もしくは（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ８８〜Ｋ１０７）ならびに／もしくは（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ８７およびＡ１０８〜Ｍ１８１）に導入されている配列番号１８の変種；
（ｌ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ａ２５８〜Ｐ２７２およびＮ２９０〜Ｐ３８６）ならびに／もしくは（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ８６〜Ｇ１０２）ならびに／もしくは（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ８５およびＴ１０３〜Ｋ１７６）に導入されている配列番号１９の変種；
（ｍ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｌ２６６〜Ｐ２８０およびＮ２９８〜Ａ３９２）ならびに／もしくは（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ９２〜Ｄ１０８）ならびに／もしくは（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ９１およびＶ１０９〜Ｍ１８３）に導入されている配列番号２０の変種；
（ｎ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｄ２６２〜Ｐ２７６およびＮ２９４〜Ａ３９２）ならびに／もしくは（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ８８〜Ｅ１０４）ならびに／もしくは（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ８７およびＭ１０５〜Ｍ１７９）に導入されている配列番号２１の変種；
（ｏ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｄ２６１〜Ｐ２７５およびＮ２９３〜Ａ３８９）ならびに／もしくは（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ８７〜Ｅ１０３）ならびに／もしくは（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ８６およびＶ１０４〜Ｋ１７８）に導入されている配列番号２２の変種；または
（ｐ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｅ２６１〜Ｐ２７５およびＴ２９３−Ａ３９０）ならびに／もしくは（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ８７〜Ｅ１０３）ならびに／もしくは（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ８６およびＶ１０４〜Ｍ１７８）に導入されている配列番号２３の変種を含み、任意に、前記ヘリカーゼは、
（１）（ｉ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＡ３６０Ｃ；（ｉｉ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＫ３５８Ｃ；（ｉｉｉ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＡ３６０Ｃ；（ｉｖ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＥ３６１Ｃ；（ｖ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＫ３６４Ｃ；（ｖｉ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＬ３５４Ｃ；（ｖｉｉ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＫ３５８Ｃ；（ｖｉｉｉ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＬ３５４Ｃ；（ｉｘ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＥ３６１Ｃ；（ｘ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＫ３６４Ｃ；（ｘｉ）Ｌ９７Ｃおよび／またはＬ３５４Ｃ；（ｘｉｉ）Ｌ９７Ｃおよび／またはＫ３５８Ｃ；（ｘｉｉｉ）Ｌ９７Ｃおよび／またはＡ３６０Ｃ；（ｘｉｖ）Ｌ９７Ｃおよび／またはＥ３６１Ｃ；（ｘｖ）Ｌ９７Ｃおよび／またはＫ３６４Ｃ；（ｘｖｉ）Ｋ１２３Ｃおよび／またはＬ３５４Ｃ；（ｘｖｉｉ）Ｋ１２３Ｃおよび／またはＫ３５８Ｃ；（ｘｖｉｉｉ）Ｋ１２３Ｃおよび／またはＡ３６０Ｃ；（ｘｉｘ）Ｋ１２３Ｃおよび／またはＥ３６１Ｃ；（ｘｘ）Ｋ１２３Ｃおよび／またはＫ３６４Ｃ；（ｘｘｉ）Ｎ１５５Ｃおよび／またはＬ３５４Ｃ；（ｘｘｉｉ）Ｎ１５５Ｃおよび／またはＫ３５８Ｃ；（ｘｘｉｉｉ）Ｎ１５５Ｃおよび／またはＡ３６０Ｃ；（ｘｘｉｖ）Ｎ１５５Ｃおよび／またはＥ３６１Ｃ；（ｘｘｖ）Ｎ１５５Ｃおよび／またはＫ３６４Ｃ；（ｘｘｖｉ）（ｉ）から（ｘｘｖ）のいずれかおよびＧ３５７Ｃ；（ｘｘｖｉｉ）（ｉ）から（ｘｘｖ）のいずれかおよびＱ１００Ｃ；（ｘｘｖｉｉｉ）（ｉ）から（ｘｘｖ）のいずれかおよびＩ１２７Ｃ；（ｘｘｉｘ）（ｉ）から（ｘｘｖ）のいずれかおよびＱ１００ＣおよびＩ１２７Ｃ；（ｘｘｘ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＦ３７７Ｃ；（ｘｘｘｉ）Ｎ９５Ｃ；（ｘｘｘｉｉ）Ｔ９１Ｃ；（ｘｘｘｉｉｉ）Ｙ９２Ｌ、Ｅ９４Ｙ、Ｙ３５０Ｎ、Ａ３６０ＣおよびＹ３６３Ｎ；（ｘｘｘｉｖ）Ｅ９４ＹおよびＡ３６０Ｃ；（ｘｘｘｖ）Ａ３６０Ｃ；（ｘｘｘｖｉ）Ｙ９２Ｌ、Ｅ９４Ｃ、Ｙ３５０Ｎ、Ａ３６０ＹおよびＹ３６３Ｎ；（ｘｘｘｖｉｉ）Ｙ９２Ｌ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｙ；（ｘｘｘｖｉｉｉ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＡ３６０ＣおよびＦ２７６Ａ；（ｘｘｘｉｘ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＬ３５６Ｃ；（ｘｌ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＥ３５６Ｃ；（ｘｌｉ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＧ３５７Ｃ；（ｘｌｉｉ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＡ３６０Ｃ；（ｘｌｉｉｉ）Ｎ９５Ｃおよび／またはＷ３７８Ｃ；（ｘｌｉｖ）Ｔ９１Ｃおよび／またはＳ３８２Ｃ；（ｘｌｖ）Ｔ９１Ｃおよび／またはＷ３７８Ｃ；（ｘｌｖｉ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＮ３５３Ｃ；（ｘｌｖｉｉ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＳ３８２Ｃ；（ｘｌｖｉｉｉ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＫ３８１Ｃ；（ｘｌｉｘ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＤ３７９Ｃ；（ｌ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＳ３７５Ｃ；（ｌｉ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＷ３７８Ｃ；（ｌｉｉ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＷ３７４Ｃ；（ｌｉｉｉ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＮ３５３Ｃ；（ｌｉｖ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＳ３８２Ｃ；（ｌｖ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＫ３８１Ｃ；（ｌｖｉ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＤ３７９Ｃ；（ｌｖｉｉ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＳ３７５Ｃ；（ｌｖｉｉｉ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＷ３７８Ｃ；（ｌｉｘ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＷ３７４Ｃ；（ｌｘ）Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｙ；（ｌｘｉ）Ｅ９４Ｃ、Ｇ３５７ＣおよびＡ３６０Ｃまたは（ｌｘｉｉ）Ｔ２Ｃ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
を含む配列番号８の変種； 
（２）配列番号８における（ｉ）から（ｘｘｉｘ）のいずれかに定義のものに対応する位置にシステイン残基を含む配列番号９から２３のいずれか１つの変種、または
（３）４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）がシステインの代わりに特異的位置の１つまたは複数に導入されている（１）もしくは（２）の変種
を含む、請求項１に記載のヘリカーゼ。
【請求項３】
請求項１または２に記載のヘリカーゼであって、
（Ａ）前記ヘリカーゼは、
（１）Ｅ９３の欠失および／もしくはＥ９５の欠失を含む配列番号８の変種；もしくは
配列番号８中のＥ９３に対応する位置の欠失および／もしくは配列番号８中のＥ９５に対応する位置の欠失を含む配列番号９から２３のいずれか１つの変種；ならびに／または
（２）Ｔ２７８からＳ２８７の位置の任意の数の欠失を含む配列番号８の変種；もしくは
Ｔ２７８からＳ２８７に対応する位置の任意の数の欠失を含む配列番号９から２３のいずれか１つの変種を含み；
（Ｂ）前記フックドメインおよび／または前記２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメインは、さらに、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸を含み、任意に、前記ヘリカーゼは、
（ａ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が前記フックドメイン（残基Ｌ２７５〜Ｆ２９１）ならびに／もしくは前記２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１７８〜Ｔ２５９およびＬ３９０〜Ｖ４３９）にさらに導入されている配列番号８の変種；
（ｂ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が前記フックドメイン（残基Ａ３１０〜Ｌ３１５）ならびに／もしくは前記２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ２１２〜Ｅ２９４およびＧ４２２〜Ｓ６７８）にさらに導入されている配列番号９の変種；
（ｃ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が前記フックドメイン（残基Ｖ３４３〜Ｌ３５９）ならびに／もしくは前記２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ２４１〜Ｎ３２７およびＡ４４９〜Ｇ４９６）にさらに導入されている配列番号１０の変種；
（ｄ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が前記フックドメイン（残基Ｗ２７６〜Ｌ２８４）ならびに／もしくは前記２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１７４〜Ｄ２６０およびＡ３７１〜Ｖ４２１）にさらに導入されている配列番号１１の変種；
（ｅ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が前記フックドメイン（残基Ｒ３０８〜Ｙ３１３）ならびに／もしくは前記２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ２０６〜Ｋ２９３およびＩ４０８〜Ｌ５００）にさらに導入されている配列番号１２の変種；
（ｆ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が前記フックドメイン（残基Ｍ３０２〜Ｗ３０６）ならびに／もしくは前記２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１９５〜Ｄ２８７およびＶ３９４〜Ｑ４５０）にさらに導入されている配列番号１３の変種；
（ｇ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が前記フックドメイン（残基Ｖ２６５〜Ｉ２７７）ならびに／もしくは前記２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１６７〜Ｔ２４９およびＬ３７２〜Ｎ４２１）にさらに導入されている配列番号１４の変種；
（ｈ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が前記フックドメイン（残基Ｖ２７０〜Ｆ２８３）ならびに／もしくは前記２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１７２〜Ｔ２５４およびＬ３８１〜Ｋ４３４）にさらに導入されている配列番号１５の変種；
（ｉ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が前記フックドメイン（残基Ｖ２５７〜Ｆ２７０）ならびに／もしくは前記２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１５９〜Ｔ２４１およびＬ３６７〜Ｋ４２０）にさらに導入されている配列番号１６の変種；
（ｊ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が前記フックドメイン（残基Ｌ２７８〜Ｙ２９４）ならびに／もしくは前記２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１８２〜Ｔ２６２およびＬ３９３〜Ｖ４４３）にさらに導入されている配列番号１７の変種；
（ｋ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が前記フックドメイン（残基Ｌ２７８〜Ｙ２９４）ならびに／もしくは前記２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１８２〜Ｔ２６２およびＬ３９２〜Ｖ４４２）にさらに導入されている配列番号１８の変種；
（ｌ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が前記フックドメイン（残基Ｌ２７３〜Ｆ２８９）ならびに／もしくは前記２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１７７〜Ｎ２５７およびＬ３８７〜Ｖ４３８）にさらに導入されている配列番号１９の変種；
（ｍ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が前記フックドメイン（残基Ｌ２８１〜Ｆ２９７）ならびに／もしくは前記２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１８４〜Ｔ２６５およびＬ３９３〜Ｉ４４２）にさらに導入されている配列番号２０の変種；
（ｎ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が前記フックドメイン（残基Ｈ２７７〜Ｆ２９３）ならびに／もしくは前記２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１８０〜Ｔ２６１およびＬ３９３〜Ｖ４４２）にさらに導入されている配列番号２１の変種；
（ｏ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が前記フックドメイン（残基Ｌ２７６〜Ｆ２９２）ならびに／もしくは前記２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１７９〜Ｔ２６０およびＬ３９０〜Ｉ４３９）にさらに導入されている配列番号２２の変種； 
（ｐ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が前記フックドメイン（残基Ｌ２７６〜Ｆ２９２）ならびに／もしくは前記２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１７９〜Ｔ２６０およびＬ３９１〜Ｖ４４１）にさらに導入されている配列番号２３の変種； 
（ｑ）（ｉ）Ｉ１８１Ｃ；（ｉｉ）Ｙ２７９Ｃ；（ｉｉｉ）Ｉ２８１Ｃ；および（ｉｖ）Ｅ２８８Ｃの１つまたは複数を含む配列番号８の変種であって、任意にＦａｚがシステインの代わりに特異的位置の１つまたは複数に導入されており；または
（ｒ）配列番号８における（ｉ）から（ｉｖ）に定義のものに対応する１つまたは複数の位置（複数可）にシステイン残基を含む配列番号９から２３のいずれか１つの変種を含み、任意に、Ｆａｚがシステインの代わりに特異的位置の１つまたは複数に導入されている、ヘリカーゼ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のヘリカーゼであって、ヘリカーゼは、
（ａ）表面負電荷を低減するようにさらに修飾されており、任意に、
（ｉ）１つまたは複数の表面負電荷が、１つもしくは複数の負に荷電したアミノ酸を１つまたは複数の正に荷電したアミノ酸、無電荷アミノ酸、非極性アミノ酸および／もしくは芳香族アミノ酸で置換することによって、または１つもしくは複数の正に荷電したアミノ酸を１つまたは複数の負に荷電したアミノ酸に隣接して導入することによって中和されており、および/または
（ｉｉ）ヘリカーゼは、配列番号８の変種を含み、前記１つまたは複数の負に荷電したアミノ酸がＤ５、Ｅ８、Ｅ２３、Ｅ４７、Ｄ１６７、Ｅ１７２、Ｄ２０２およびＤ２１２の１つまたは複数であり、および／または
（ｂ）１つまたは複数の天然システイン残基の除去によってさらに修飾されており、任意に、
（ｉ）１つまたは複数のシステイン残基が置換によって除去されており、任意に、前記１つまたは複数のシステイン残基がアラニン、セリンまたはバリンで置換されており、および／または
（ｉｉ）ヘリカーゼは、
（１）配列番号８の変種を含み、前記１つまたは複数の天然システイン残基がＣ１０９、Ｃ１１４、Ｃ１３６、Ｃ１７１およびＣ４１２の１つまたは複数であり；
（２）配列番号９から２３のいずれか１つの変種を含み、前記１つまたは複数の天然システイン残基が配列番号８中のＣ１０９、Ｃ１１４、Ｃ１３６、Ｃ１７１およびＣ４１２の１つまたは複数に対応する、
ヘリカーゼ。
【請求項５】
前記第一のシステイン残基および／または前記第一の非天然アミノ酸が前記タワードメイン内にあり、任意に、前記ヘリカーゼは、請求項２に記載のいずれかのタワードメイン変種または請求項２に記載のいずれかの変異を含む、請求項１に記載のＤｄａヘリカーゼ。
【請求項６】
前記少なくとも１つの非天然アミノ酸が４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）、４−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、３−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、４−アセトアセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−アリル−Ｌ−チロシン、３−（フェニルセラニル）−Ｌ−アラニン、Ｏ−２−プロピン−１−イル−Ｌ−チロシン、４−（ジヒドロキシボリル）−Ｌ−フェニルアラニン、４−［（エチルスルファニル）カルボニル］−Ｌ−フェニルアラニン、（２Ｓ）−２−アミノ−３−｛４−［（プロパン−２−イルスルファニル）カルボニル］フェニル｝プロパン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−３−｛４−［（２−アミノ−３−スルファニルプロパノイル）アミノ］フェニル｝プロパン酸、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、４−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、３−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、４−フルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、４−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン、４−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−（トリフルオロメチル）チロシン、４−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、３−ヒドロキシ−Ｌ−チロシン、３−アミノ−Ｌ−チロシン、３−ヨード−Ｌ−チロシン、４−イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、３−（２−ナフチル）−Ｌ−アラニン、４−フェニル−Ｌ−フェニルアラニン、（２Ｓ）−２−アミノ−３−（ナフタレン−２−イルアミノ）プロパン酸、６−（メチルスルファニル）ノルロイシン、６−オキソ−Ｌ−リシン、Ｄ−チロシン、（２Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸、（２Ｒ）−２−アンモニオオクタノエート３−（２，２’−ビピリジン−５−イル）−Ｄ−アラニン、２−アミノ−３−（８−ヒドロキシ−３−キノリル）プロパン酸、４−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｓ−（２−ニトロベンジル）システイン、（２Ｒ）−２−アミノ−３−［（２−ニトロベンジル）スルファニル］プロパン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−３−［（２−ニトロベンジル）オキシ］プロパン酸、Ｏ−（４，５−ジメトキシ−２−ニトロベンジル）−Ｌ−セリン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−（｛［（２−ニトロベンジル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシン、２−ニトロフェニルアラニン、４−［（Ｅ）−フェニルジアゼニル］−Ｌ−フェニルアラニン、４−［３−（トリフルオロメチル）−３Ｈ−ジアジレン−３−イル］−Ｄ−フェニルアラニン、２−アミノ−３−［［５−（ジメチルアミノ）−１−ナフチル］スルホニルアミノ］プロパン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−４−（７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）ブタン酸、（２Ｓ）−３−［（６−アセチルナフタレン−２−イル）アミノ］−２−アミノプロパン酸、４−（カルボキシメチル）フェニルアラニン、３−ニトロ−Ｌ−チロシン、Ｏ−スルホ−Ｌ−チロシン、（２Ｒ）−６−アセトアミド−２−アンモニオヘキサノエート、１−メチルヒスチジン、２−アミノノナン酸、２−アミノデカン酸、Ｌ−ホモシステイン、５−スルファニルノルバリン、６−スルファニル−Ｌ−ノルロイシン、５−（メチルスルファニル）−Ｌ−ノルバリン、Ｎ６−｛［（２Ｒ，３Ｒ）−３−メチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピロール−２−イル］カルボニル｝−Ｌ−リシン、Ｎ６−［（ベンジルオキシ）カルボニル］リシン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−［（シクロペンチルカルボニル）アミノ］ヘキサン酸、Ｎ６−［（シクロペンチルオキシ）カルボニル］−Ｌ−リシン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（２Ｒ）−テトラヒドロフラン−２−イルカルボニル］アミノ｝ヘキサン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−８−［（２Ｒ，３Ｓ）−３−エチニルテトラヒドロフラン−２−イル］−８−オキソオクタン酸、Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リシン、（２Ｓ）−２−ヒドロキシ−６−（｛［（２−メチル−２−プロパニル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｎ６−［（アリルオキシ）カルボニル］リシン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−（｛［（２−アジドベンジル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｎ６−Ｌ−プロリル−Ｌ−リシン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（プロパ−２−イン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸およびＮ６−［（２−アジドエトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシンから選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
【請求項７】
（ａ）Ｄｄａヘリカーゼ由来のピンドメインおよび１Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメインを含み、Ｄｄａヘリカーゼ由来の任意の他のドメインを含まないポリペプチドであって、前記ピンドメインおよび／または前記１Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメインは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むように修飾されており、任意に、前記ポリペプチドは、請求項２に記載のピンドメインおよび１Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメインのいずれかの変種ならびに請求項２に記載のいずれかのピンドメインおよび／または１Ａドメイン変異、または
（ｂ）Ｄｄａヘリカーゼ由来の２Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメイン、タワードメインおよびフックドメインを含み、Ｄｄａヘリカーゼ由来の任意の他のドメインを含まないポリペプチドであって、前記タワードメインは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むように修飾されており、任意に、前記ポリペプチドは、請求項２に記載のタワードメインのいずれかの変種または請求項２に記載のいずれかのタワードメイン変異
を含む、ポリペプチド。
【請求項８】
請求項７（ｂ）に記載のポリペプチドに共有結合的に付着している請求項７（ａ）に記載のポリペプチドを含むヘリカーゼであって、ピンドメインおよび／または１Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメイン内の少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は、親和性分子、リンカー分子、システイン連結、またはＦａｚ連結によってタワードメイン内の少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸に連結されており、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する、前記ヘリカーゼ。
【請求項９】
ポリヌクレオチドの移動を制御する方法であって、前記ポリヌクレオチドを請求項１〜６および８のいずれか一項に記載のヘリカーゼに接触させるステップおよびそれにより前記ポリヌクレオチドの移動を制御するステップを含み、任意に、前記方法は、膜貫通ポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御するためである、前記方法。
【請求項１０】
標的ポリヌクレオチドを特性決定する方法であって、
（ａ）前記標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアおよび請求項１〜６および８のいずれか一項に記載のヘリカーゼに、前記ヘリカーゼが前記ポアを通る前記標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように接触させるステップ；ならびに
（ｂ）前記ポリヌクレオチドが前記ポアに対して移動する際に１つまたは複数の測定値を取るステップであって、前記測定値が前記標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を示し、それにより前記標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップ
を含む方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、
（ａ）前記１つまたは複数の特性が、（ｉ）前記標的ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）前記標的ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）前記標的ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）前記標的ポリヌクレオチドの二次構造および（ｖ）前記標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否か、から選択され、任意に、前記標的ポリヌクレオチドがメチル化によって、酸化によって、損傷によって、１つまたは複数のタンパク質でまたは１つまたは複数の標識、タグもしくはスペーサーで修飾されており、
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドの前記１つまたは複数の特性が電気的測定および／または光学的測定によって測定され、任意に、前記電気的測定が電流測定、インピーダンス測定、トンネル測定または電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）測定であり、ここで、前記方法は、
（１）前記標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアおよびＤｄａヘリカーゼに接触させて、前記ヘリカーゼが前記ポアを通る前記標的ポリヌクレオチドの移動を制御するようにするステップ；および
（２）前記ポリヌクレオチドが前記ポアに関して移動するときに前記ポアを通過する電流を測定するステップであって、前記電流が前記標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を示し、それにより前記標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップを含み、
（ｃ）前記方法は、前記ポアに電圧を印加して、前記ポアと前記ヘリカーゼとの複合体を形成するステップをさらに含み、
（ｄ）前記ポリヌクレオチドの少なくとも一部が２本鎖であり、および／または
（ｅ）前記ポアが、膜貫通タンパク質ポアまたはソリッドステートポアであり、任意に、前記膜貫通タンパク質ポアが、ヘモリジン（hemolysin）、ロイコシジン（leukocidin）、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ポリン（porin）Ａ（ＭｓｐＡ）、ＭｓｐＢ、ＭｓｐＣ、ＭｓｐＤ、外膜ポリン（porin）Ｆ（ＯｍｐＦ）、外膜ポリン（porin）Ｇ（ＯｍｐＧ）、外膜ホスホリパーゼＡ、ナイセリア（Neisseria）オートトランスポーターリポタンパク質（ＮａｌＰ）およびＷＺＡ由来であり、任意に、前記膜貫通タンパク質が、
（１）配列番号２に示す８個の同一のサブユニットから形成されている、または
（２）８個のサブユニットの１つもしくは複数が配列全体にわたるアミノ酸同一性に基づいて配列番号２に対して少なくとも５０％の相同性を有し、ポア活性を保持しているその変種である、または
（３）配列番号４に示す７個の同一サブユニットから形成されているα−ヘモリジンである、または
（４）７個のサブユニットの１つまたは複数が配列全体にわたるアミノ酸同一性に基づいて配列番号４に対して少なくとも５０％の相同性を有し、ポア活性を保持しているその変種である、
前記方法。
【請求項１２】
ポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するための請求項１〜６および８のいずれか一項に記載のヘリカーゼの使用。
【請求項１３】
（ａ）ポアおよび（ｂ）請求項１から６および８のいずれか１項に記載のＤｄａヘリカーゼを含む、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのキットであって、任意に、両親媒性膜を含むチップをさらに含む、前記キット。
【請求項１４】
（ａ）Ａ３６０Ｋ；（ｂ）Ｙ９２Ｌおよび／もしくはＡ３６０Ｙ；（ｃ）Ｙ９２Ｌ、Ｙ３５０ＮおよびＹ３６３Ｎ；（ｄ）Ｙ９２Ｌおよび／もしくはＹ３６３Ｎまたは（ｅ）Ｙ９２Ｌを含む配列番号８の変種を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のヘリカーゼであって、ポリヌクレオチドの移動を制御するその能力を保持しているヘリカーゼ。
【請求項１５】
１つ以上のヘリカーゼのシリーズに連結され、ポリヌクレオチドに付着している、請求項１〜６、８および１３のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的ポリヌクレオチドを特性決定する新規方法に関する。方法は、ポアおよびＤＮＡ依存性ＡＴＰａｓｅ（Ｄｄａ）ヘリカーゼを使用する。ヘリカーゼは、ポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御する。本発明は、ポリヌクレオチドの移動を制御するために使用でき、ポリヌクレオチドを配列決定するために特に有用である修飾Ｄｄａヘリカーゼにも関する。
【背景技術】
【０００２】
迅速で安価なポリヌクレオチド（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）配列決定および同定技術が、幅広い応用にわたって現在必要である。既存の技術は、主にそれらが、大量のポリヌクレオチドを生成するための増幅技術に依存し、シグナル検出のために多量の専門的な蛍光化学物質を必要とするために、遅く高価である。
【０００３】
膜貫通ポア（ナノポア）は、ポリマーおよび種々の小分子のための直接的、電気的バイオセンサーとして大きな将来性を有する。特に、将来性のあるＤＮＡ配列決定技術としてナノポアが近年注目されている。
【０００４】
電位がナノポア全体に印加される場合、ヌクレオチドなどの分析物が一定時間バレルに一過的に存在する場合に電流が変化する。ヌクレオチドのナノポア検出は、既知のサインおよび持続時間での電流変化をもたらす。「鎖配列決定」法では、１本のポリヌクレオチド鎖がポアを通り、ヌクレオチドのアイデンティティが得られる。鎖配列決定は、ポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御するためのヘリカーゼなどのヌクレオチドハンドリングタンパク質の使用を含み得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、Ｄｄａヘリカーゼが、特に電圧などの電位が印加された場合にポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御できることを実証した。ヘリカーゼは、印加された電圧から生じる場とは反対にまたは沿って制御された段階的様式で標的ポリヌクレオチドを移動できる。
【０００６】
本発明者らは、ポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御する改善された能力を有する特異的Ｄｄａ変異体も驚くべきことに同定した。そのような変異体は、（ｉ）タワードメインおよび／または（ｉｉ）ピンドメインおよび／または（ｉｉｉ）１Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメイン中に１つまたは複数の修飾を典型的には含む。
【０００７】
したがって本発明は、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメインおよび／または（ｉｉ）ピンドメインおよび／または（ｉｉｉ）１Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメインに導入されているＤｄａヘリカーゼであって、ポリヌクレオチドの移動を制御するその能力を保持しているヘリカーゼを提供する。
【０００８】
本発明は：
−  少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸がフックドメインおよび／または２Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメインに導入されており、ポリヌクレオチドの移動を制御するその能力を保持しているＤｄａヘリカーゼ；
−  その表面負電荷を低減するように修飾されており、ポリヌクレオチドの移動を制御するその能力を保持しているＤｄａヘリカーゼ；
−  Ｄｄａヘリカーゼ由来のピンドメインおよび１Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメインを含み、Ｄｄａヘリカーゼ由来の任意の他のドメインを含まず、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸がピンドメインおよび／または１Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメインに導入されている第一のポリペプチド；
−  Ｄｄａヘリカーゼ由来の２Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメイン、タワードメインおよびフックドメインを含み、Ｄｄａヘリカーゼ由来の任意の他のドメインを含まず、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸がタワードメインに導入されている第二のポリペプチド；
−  本発明の第二のポリペプチドに共有結合的に付着している本発明の第一のポリペプチドを含み、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有するヘリカーゼ；
−  Ｄｄａヘリカーゼまたは本発明のヘリカーゼおよび追加的ポリヌクレオチド結合成分を含む構築物であって、ヘリカーゼがポリヌクレオチド結合成分に付着しており、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する構築物；
−  本発明のヘリカーゼ、本発明のポリペプチドまたは本発明の構築物をコードしている配列を含むポリヌクレオチド；
−  プロモーターに作動可能に連結した本発明のポリヌクレオチドを含むベクター；
−  本発明のベクターを含む宿主細胞；
−  本発明のポリヌクレオチドを発現するステップ、本発明のベクターを細胞にトランスフェクトするステップまたは本発明の宿主細胞を培養するステップを含む、本発明のヘリカーゼ、本発明のポリペプチドまたは本発明の構築物を作製する方法；ポリヌクレオチドの移動を制御する方法であって、ポリヌクレオチドをＤｄａヘリカーゼまたは本発明の構築物と接触させるステップおよびそれによりポリヌクレオチドの移動を制御するステップを含む方法；
−  標的ポリヌクレオチドを特性決定する方法であって、（ａ）標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアおよびＤｄａヘリカーゼまたは本発明の構築物と、ヘリカーゼがポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように接触させるステップ、ならびに（ｂ）ポリヌクレオチドがポアに対して移動する際に１つまたは複数の測定値を取るステップであって、測定値が標的ポリヌクレオチドの特性の１つまたは複数を示し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップを含む方法；
−  標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーを形成する方法であって、（ａ）ポアと（ｂ）Ｄｄａヘリカーゼまたは本発明の構築物との間の複合体を形成するステップ、およびそれにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーを形成するステップを含む方法；
−  （ａ）ポアと（ｂ）Ｄｄａヘリカーゼまたは本発明の構築物との間の複合体を含む標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサー；
−  ポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するためのＤｄａヘリカーゼまたは本発明の構築物の使用；
−  （ａ）ポアおよび（ｂ）Ｄｄａヘリカーゼまたは本発明の構築物を含む、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのキット；
−  （ａ）複数のポアおよび（ｂ）複数のＤｄａヘリカーゼまたは複数の本発明の構築物を含む試料中の標的ポリヌクレオチドを特性決定するための装置；ならびに
−  ポリヌクレオチドに付着している２つ以上のヘリカーゼのシリーズであって、少なくとも１つが本発明のＤｄａヘリカーゼである２つ以上のヘリカーゼのシリーズ
も提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ヘリカーゼ（Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃを有する配列番号８））がラムダＤＮＡ構築物（０．２ｎＭ、その３’末端で配列番号６２に付着されている配列番号６１の５’末端に付着されている４個のｉＳｐＣ３スペーサーにその３’末端で付着されている配列番号６０、この構築物の配列番号６１領域は配列番号６３（３’コレステロールテザーを有する）にハイブリダイズされている）のナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２））を通る移行を制御した場合の電流トレース例（ｙ軸標識＝電流（ｐＡ、２０から１２０）、ｘ軸標識＝時間（ｓ、３５００から８０００））を示すグラフである。
【図２】図１の電流トレースに示したヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の領域を拡大して示すグラフである（ｙ軸標識＝電流（ｐＡ、上トレース２０から８０、下トレース２０から６０）ｘ軸標識＝時間（ｓ、上トレース２９９５から３０２０、下トレース８１４０から８１７０）上および下トレース）。Ａ）はヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の初期を示し、Ｂ）はヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の終期を示す。
【図３】直鎖状（Ａ）または環状（Ｂ）１本鎖ＤＮＡへのヘリカーゼ結合を検査するための蛍光アッセイを示す図である。（Ａ）は、直鎖状１本鎖ＤＮＡに結合するＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃを有する配列番号８）ヘリカーゼの能力をアッセイするために使用された通例の蛍光基質を示す。４４ｎｔ  １本鎖ＤＮＡ基質（最終１ｎＭ、配列番号６４、Ｗと標識）は、配列番号６４中の位置３７のチミン塩基に付着しているカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を有する（Ｘと標識された丸）。ヘリカーゼ（Ｙと標識）が緩衝液（２５ｍＭリン酸カリウム、１５１．５ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中のＤＮＡ基質に結合すると、蛍光異方性（溶液中のＤＮＡ基質の反転頻度の速度に関連する性質）が増加した。異方性における増加に影響を与えるために必要なヘリカーゼの量が少ないほど、ＤＮＡとヘリカーゼとの間の結合親和性は堅固である。酵素がＤＮＡ基質に結合していない状況１では、より早い反転頻度および低い異方性が示される一方で、酵素がＤＮＡ基質に結合している状況２では、より遅い反転頻度および高い異方性を示した（これは、大きなタンパク質分子のＤＮＡへの結合での質量増加に起因する）。Ｚと標識した黒色バーはヘリカーゼ濃度の増加に対応している（バーが太くなるほどヘリカーゼ濃度が高い）。（Ｂ）は、環状１本鎖ＤＮＡに結合するＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃを有する配列番号８）ヘリカーゼの能力をアッセイするために使用した通例の蛍光基質を示す。７５ｎｔ環状１本鎖ＤＮＡ基質（最終１ｎＭ、配列番号６５、Ｖと標識）は、配列番号６５中のチミン塩基の１つに付着しているカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を有する（Ｘと標識された丸）。ヘリカーゼ（Ｙと標識）が緩衝液（２５ｍＭリン酸カリウム、１５１．５ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中のオリゴヌクレオチドに結合すると、蛍光異方性（溶液中のオリゴヌクレオチドの反転頻度の速度に関連する性質）が増加した。異方性における増加に影響を与えるために必要なヘリカーゼの量が少ないほど、ＤＮＡとヘリカーゼとの間の結合親和性は堅固である。酵素がＤＮＡ基質に結合していない状況１では、より早い反転頻度および低い異方性が示される一方で、酵素がＤＮＡ基質に結合している状況２では、より遅い反転頻度および高い異方性を示した（これは、大きなタンパク質分子のＤＮＡへの結合での質量増加に起因する）。Ｚと標識した黒色バーはヘリカーゼ濃度の増加に対応している（バーが太くなるほどヘリカーゼ濃度が高い）。
【図４】Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃを有する配列番号８）（ｙ軸標識＝異方性（ブランク減算、５０から２００）、ｘ軸標識＝Ｔ４  Ｄｄａ濃度（ｎＭ、０．０１から１０００））の量を増加させて６０分間のインキュベーション期間の最後に、直鎖状および環状１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号６４または６５）の異方性における変化を示すグラフである。黒丸でのデータは、直鎖状ｓｓＤＮＡ構築物に対応する。空四角でのデータは、環状ｓｓＤＮＡ構築物に対応する。
【図５】６０分間のインキュベーション後に直鎖状または環状１本鎖ＤＮＡに結合しているＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃを有する配列番号８）についての平衡解離定数（Ｋｄ）を示すグラフである。グラフは、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して図４に示すデータを通じて一相解離結合曲線をフィッティングすることを通じて得られた（ｙ軸標識＝解離定数Ｋｄ（ｎＭ、０から１２）ｘ軸標識＝参照番号、参照番号１は直鎖状１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドに対応し、参照番号２は環状１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドに対応する）。
【図６】ヘリカーゼ（ＴｒｗＣ  Ｃｂａ（配列番号６６））がナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２））を通るＤＮＡ（０．２ｎＭ、その最後が配列番号６８の５’末端に付着される４個の５−ニトロインドールにその３’末端で付着される配列番号６１の５’末端に付着される４個のｉＳｐＣ３スペーサーにその３’末端で付着した配列番号６７、付加的に配列番号６３は配列番号６１にハイブリダイズされている）の移行を制御した場合の電流トレース例（ｙ軸標識＝電流（ｐＡ、上のトレース５０から２００、下のトレース５５から７５）、ｘ軸標識＝時間（ｓ、上のトレース１１４２０から１１６２０、下のトレース１１５２４から１１５２７））を示すグラフである。上のトレースは２つのヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を示し、下のトレースは上のレベルでＸと標識された領域の拡大を示す。ヘリカーゼがナノポアを通してＤＮＡを移動させる際に、検出される電流レベルは、ａからｋと標識された。ＴｒｗＣ  Ｃｂａがナノポアを通る移行を制御した場合、ＤＮＡは後ろに下がり、したがってｂ、ｃ、ｈおよびｉに対応するレベルが数回観察された。
【図７】ヘリカーゼ（Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃを有する配列番号８））がナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２））を通るＤＮＡ（０．２ｎＭ、その最後が配列番号６８の５’末端に付着されている４個の５−ニトロインドールにその３’末端で付着される配列番号６１の５’末端に付着される４個のｉＳｐＣ３スペーサーにその３’末端で付着した配列番号６７、付加的に配列番号６３は配列番号６１にハイブリダイズされている）の移行を制御した場合の電流トレース例（ｙ軸標識＝電流（ｐＡ、上のトレース５０から２５０、下のトレース５５から７５）、ｘ軸標識＝時間（ｓ、上のトレース３００から７００、下のトレース５７２から５７７））を示すグラフである。上のトレースは３つのヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を示し、下のトレースは上のレベルでＸと標識された領域の拡大を示す。ヘリカーゼがナノポアを通してＤＮＡを移動させる際に、検出される電流レベルは、ａからｋと標識された。Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃを有する配列番号８）がナノポアを通る移行を制御した場合、ＤＮＡは後ろに下がらず、したがってａからｉに対応する単一の電流レベルが観察された。
【図８】実施例１および４において使用されたラムダＤＮＡ構築物の図である。配列番号６０（Ａと標識）は、４個のｉＳｐＣ３スペーサー（Ｂと標識）にその３’末端で付着される。４個のｉＳｐＣ３スペーサーは、配列番号６１（Ｃと標識）の５’末端に付着される。配列番号６１は、その５’末端で配列番号６２（Ｅと標識）に付着される４個のｉＳｐＣ３スペーサー（Ｄと標識）に付着される。配列番号６１は、配列番号６３（Ｆと標識、３’コレステロールテザーを有する）にハイブリダイズされる。領域Ｅと標識した２つの別々のセクションを図中で領域１（灰色実線として示す）および領域２（灰色破線として示す）として強調し、実施例４において参照する。
【図９】ヘリカーゼ（Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ（変異Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａおよびさらに（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２を有する配列番号８））がＭｓｐＡナノポアを通るＤＮＡ（０．１ｎＭ、配列番号６９の５’末端に付着される４個の５−ニトロインドールスペーサーにその３’末端で付着される配列番号６１の５’末端に付着される４個のｉＳｐＣ３スペーサーにその３’末端で付着した配列番号６７、この構築物の配列番号６１領域は、配列番号６３（３’コレステロールテザーを有する）にハイブリダイズされる）の移行を制御した場合の電流トレース例（両トレースは、次の軸標識ｙ軸標識＝電流（ｐＡ）、ｘ軸標識＝時間（ｓ）を有する）を示すグラフである。両トレースは、複数のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を示した。
【図１０】ヘリカーゼ（Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１１４Ａ／Ｃ１７１Ａ／Ｃ４２１Ｄ（変異Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１１４Ａ／Ｃ１７１Ａ／Ｃ４２１Ｄおよびさらに（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２を有する配列番号８））がＭｓｐＡナノポアを通るＤＮＡ（０．１ｎＭ、配列番号６９の５’末端に付着される４個の５−ニトロインドールスペーサーにその３’末端で付着される配列番号６１の５’末端に付着される４個のｉＳｐＣ３スペーサーにその３’末端で付着した配列番号６７、この構築物の配列番号６１領域は、配列番号６３（３’コレステロールテザーを有する）にハイブリダイズされる）の移行を制御する場合の電流トレース例（両トレースは、次の軸標識を有するｙ軸標識＝電流（ｐＡ）、ｘ軸標識＝時間（ｓ））を示すグラフである。両トレースは、複数のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を示した。
【図１１】６時間５分の実験実行の経過の際に変異体Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃについてのヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動速度がどのように変化したかを示すグラフである（ｙ軸標識＝１秒あたりの事象、ｘ軸標識＝時間（時間））。星印（＊）で標識されるグラフ中のバーは、ナノポアを通るラムダＤＮＡ構築物の領域２（図８に示す）のヘリカーゼ制御移動速度に対応し、星印を伴わないものはナノポアを通るラムダＤＮＡ構築物の領域１（図８に示す）のヘリカーゼ制御移動速度に対応する。１秒あたりの事象をナノポアを通るＤＮＡ移動の移行の速度の測定値として実施例において使用した。
【図１２】６時間５分の実験実行の経過の際に変異体Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１１４Ａ／Ｃ１７１Ａ／Ｃ４２１Ｄについてのヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動速度がどのように変化したかを示すグラフである（ｙ軸標識＝１秒あたりの事象、ｘ軸標識＝時間（時間））。星印（＊）で標識されるグラフ中のバーは、ナノポアを通るラムダＤＮＡ構築物の領域２（図８に示す）のヘリカーゼ制御移動速度に対応し、星印を伴わないものはナノポアを通るラムダＤＮＡ構築物の領域１（図８に示す）のヘリカーゼ制御移動速度に対応する。１秒あたりの事象をナノポアを通るＤＮＡ移動の移行の速度の測定値として実施例において使用した。
【図１３】６時間５分の実験実行の経過の際に変異体Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａについてのヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動速度がどのように変化したかを示すグラフである（ｙ軸標識＝１秒あたりの事象、ｘ軸標識＝時間（時間））。星印（＊）で標識されるグラフ中のバーは、ナノポアを通るラムダＤＮＡ構築物の領域２（図８に示す）のヘリカーゼ制御移動速度に対応し、星印を伴わないものはナノポアを通るラムダＤＮＡ構築物の領域１（図８に示す）のヘリカーゼ制御移動速度に対応する。１秒あたりの事象をナノポアを通るＤＮＡ移動の移行の速度の測定値として実施例において使用した。
【図１４】実施例５において使用したＤＮＡ構築物の図である。標識Ａは、配列番号７０（Ｂと標識）に３’末端で付着された２５個のｉＳｐＣ３スペーサーに対応する。標識Ｂは、その３’末端で４個のｉＳｐ１８スペーサーに付着される（Ｃと標識）。４個のｉＳｐ１８スペーサーは、配列番号６１の５’末端に付着される（Ｄと標識）。配列番号６１は、配列番号７１（Ｆと標識）にその５’末端で付着される４個の５−ニトロインドール（Ｅと標識）に付着される。配列番号６１は、配列番号６３（Ｇと標識）にハイブリダイズされる。配列番号６３は、６個のｉＳｐ１８スペーサー、２つのチミンおよびその３’末端に付着した３’コレステロールＴＥＧを有する。
【図１５】ヘリカーゼ（Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａ（変異Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａを有する配列番号８））がＭｓｐＡナノポアを通るＤＮＡ構築物Ｚ（図８に示す）の移行を制御する場合の電流トレース例（ｙ軸標識＝電流（ｐＡ、１０から１２０）、ｘ軸標識＝時間（ｓ、２１０．５から２８７））を示すグラフである。
【図１６】図１５の電流トレースに示すヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の領域の拡大を示すグラフである（ｙ軸標識＝電流（ｐＡ、上のトレース２０から９５、中央のトレース２８．３から７２．７および下のトレース２０から９５）、ｘ軸標識＝時間（ｓ、上のトレース２１１．３から２１４．４、中央のトレース２１２．９から２１３．７および下のトレース２８３．２から２８６．２）。Ａ）は、ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の初期を示し、Ｂ）は、トレースＡの領域の拡大を示し、Ｃ）は、ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の終期を示す。
【図１７】実施例６において使用したＤＮＡ構築物Ｘの図である。ＤＮＡ構築物Ｘのセクションａは、配列番号７０（ｂと標識）の５’末端に付着される２５個のｉＳｐＣ３スペーサーに対応する。セクションｂは、ヘリカーゼ酵素Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０ＣまたはＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ（実験に依存する）が結合する（ｃと標識）構築物Ｘの領域である。セクションｂの長さは、２つの酵素のフットプリント（結合領域）に対応する、例えばそれは、２つの酵素をこの領域に結合させるために十分な長さであった。セクションｄは、４個のｉＳｐ１８スペーサーに対応する。セクションｅは、配列番号６１に対応する。セクションｆは、４個の５’−ニトロインドールに対応する。セクションｇは、配列番号７２に対応する（鎖のこのセクションは、ＤＮＡ構築物Ｘの領域３と称される）。セクションｈ（黒点によって示される）は、配列番号７３の５’末端に付着される４個のｉＳｐＣ３スペーサーに対応する（ｉと標識、ＤＮＡ構築物Ｘの領域４と称される）。セクションｊは、配列番号７４に対応し、セクションｋは５’コレステロールＴＥＧに付着される配列番号７５に対応する。領域３と４とは、それらがナノポアを通って移行する際に異なる特性を生じることから、識別可能である。さらに、セクションｈスペーサー（４個のｉＳｐＣ３スペーサー）は、領域３から領域４への転移の同定を補助する電流トレース中の電流スパイクを産生した。
【図１８】ヘリカーゼＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃを有する配列番号２４）がＤＮＡ構築物Ｘ（詳細は図１７を参照されたい）のＭｓｐＡナノポアを通る移行を制御する場合のプロット例を示す図である。ｘ軸は、移動指数に対応し、ｙ軸は電流（ｐＡ）に対応する。ポアを通って移動した各ＤＮＡ鎖について電流は時間の関数として測定された。移動しているＤＮＡは、測定される電流レベルに段階的変化を生じた。観察された電流レベルを各ステップについての平均電流を得るためにフィットさせ、増大移動指数点を割り当てた。移動指数に対する平均電流は、したがって元の電流シグナルに密接に近似され、移行されるＤＮＡを特性決定するために使用された。プロットＡおよびＢは、それぞれヘリカーゼの制御下でナノポアを通って移動する単一のＤＮＡ鎖を示した、標識された領域３および４は、ＤＮＡ構築物Ｘの領域３および４の移行に対応した（図１７を参照されたい）。トレースＡは、構築物Ｘが単一のＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃヘリカーゼの制御下でポアを通って移行された場合に観察された移動指数を示す。トレースＢは、構築物Ｘが２つのＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃヘリカーゼの制御下でポアを通って移行される場合に観察された移動指数を示す。領域３および４領域がおよそ同じ長さであったことから、各領域について観察された移動指数は、移動指数中におよそ同じ数の点を有したことが予測される。プロットＡは、領域３と比較した場合に領域４についての移動指数に顕著に低減した数の点を示し、したがって、領域３よりも領域４からはあまり情報が得られなかった。しかし、プロットＢ（構築物Ｘの移動が２つのＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃヘリカーゼによって制御された場合）は、領域４の移動指数においてより多い点を示し、領域３とおよそ同じ量の情報が領域４から導かれたことを示唆した。構築物Ｘの移動を制御するために２つのヘリカーゼを使用することは、単一のヘリカーゼが移動を制御する場合よりもさらに多くの情報が領域４から導かれ、改善された移動を提供した。
【図１９】ヘリカーゼＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃを有する配列番号２４）がＭｓｐＡナノポアを通るＤＮＡ構築物Ｘ（詳細は図１７を参照されたい）の移行を制御する場合のプロット例を示す図である。ｘ軸は、移動指数に対応し（移動指数の記載について図１８の図説明文を参照されたい）、ｙ軸は電流（ｐＡ）に対応する。プロットＡおよびＢは、ヘリカーゼの制御下でナノポアを通って移動する単一のＤＮＡ鎖をそれぞれ示した、標識された領域３および４は、ＤＮＡ構築物Ｘの領域３および４の移行に対応した（図１７を参照されたい）。トレースＡは、構築物Ｘが単一のＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃの制御下でポアを通って移行される場合に観察された移動指数を示す。トレースＢは、構築物Ｘが２つのＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃヘリカーゼの制御下でポアを通って移行された場合に観察された移動指数を示す。領域３および４領域がおよそ同じ長さであることから、各領域について観察された移動指数は、移動指数中におよそ同じ数の点を有したことが予測される。プロットＡは、領域３と比較した場合に領域４についての移動指数に顕著に低減した数の点を示し、したがって、領域３よりも領域４からはあまり情報が得られなかった。しかし、プロットＢ（構築物Ｘの移動が２つのＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃヘリカーゼによって制御された場合）は、移動指数の両方のセクションにおいておよそ同じ数の点を示し、したがって領域３とおよそ同じ量の情報が領域４から導かれた。構築物Ｘの移動を制御するために２つのヘリカーゼを使用することは、単一のヘリカーゼが移動を制御した場合よりもより多くの情報が領域４から導かれ、改善された移動を提供した。
【図２０】実施例７および８において使用されたＤＮＡ構築物Ｚを示す図である。ＤＮＡ構築物Ｚのセクションｍは４０個のｉＳｐＣ３スペーサーに対応し、配列番号７６（ｎと標識）の５’末端に付着されている。セクションｎは、ヘリカーゼ酵素Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０ＣまたはＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａが結合する構築物Ｚの領域である。セクションｎの長さは、１つの酵素のフットプリント（結合領域）に対応し、例えば１つの酵素をこの領域に結合させるために十分な長さであった。ｄと標識されたセクションは、４個のｉＳｐ１８スペーサーに対応する。セクションｏは、配列番号７７に対応し、このセクションの一部は、ヘリカーゼ酵素Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａが結合する構築物Ｚの領域であった。セクションｐは、配列番号７８に対応する（鎖のこのセクションの一部は、ＤＮＡ構築物Ｚの領域５と称された）。セクションｈ（黒点によって示される）は、４個のｉＳｐＣ３スペーサーに対応し、配列番号７９（ｑと標識）の５’末端に付着される。セクションｒは、配列番号７８の相補性配列に対応する（ｒと標識、ＤＮＡ構築物Ｚの領域６と称された）。セクションｓは、配列番号７４に対応する。セクションｋは、５’コレステロールＴＥＧ（ｌと標識）に付着される配列番号７５に対応する。セクションｔは、配列番号８０に対応する。領域５と６との間を識別することは、それらがナノポアを通って移行する際に異なる特性を産生することから可能であった。さらにセクションｈスペーサー（４個のｉＳｐＣ３スペーサー）は、領域５から領域６への転移の同定を補助する電流スパイクを電流トレースに産生した。
【図２１】ヘリカーゼＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ（セクション（Ａ）、変異Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃを有する配列番号２４）またはヘリカーゼＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０ＣおよびＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａ（セクション（Ｂ））のいずれかがＭｓｐＡナノポアを通るＤＮＡ構築物Ｚ（図２０）の移行を制御する場合のプロット例を示す図である。ｘ軸は、移動指数に対応し、ｙ軸は電流（ｐＡ）に対応する。ポアを通って移動する各ＤＮＡ鎖について電流を時間の関数として測定した。移動しているＤＮＡは、測定される電流レベルに段階的変化を生じた。観察された電流レベルを各ステップについての平均電流を得るためにフィットさせ、増大移動指数点を割り当てた。移動指数に対する平均電流は、したがって元の電流シグナルに密接に近似され、移行されるＤＮＡを特性決定するために使用された。プロットＡおよびＢは、ヘリカーゼの制御下でナノポアを通って移動する単一のＤＮＡ鎖を示し、標識された領域５および６は、ＤＮＡ構築物Ｚ（図２０を参照されたい）の領域５および６の移行に対応した。トレースＡは、構築物Ｚが単一のＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃヘリカーゼの制御下でポアを通って移行された場合に観察された移動指数を示す。トレースＢは、構築物ＺがＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０ＣおよびＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａの両方の制御下でポアを通って移行された場合に観察された移動指数を示す。領域５および６領域がおよそ同じ長さであったことから、各領域について観察された移動指数は、移動指数中におよそ同じ数の点を有したことが予測される。プロットＡは、領域５と比較した場合に領域６についての移動指数に顕著に低減した数の点を示し、したがって、領域５よりも領域６からはあまり情報が得られなかった。しかし、プロットＢ（構築物Ｚの移動がＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０ＣおよびＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａの両方によって制御された場合）は、領域６の移動指数においてより多い点を示し、領域５とおよそ同じ量の情報が領域６から導かれたことを示唆した。構築物Ｚの移動を制御するために２つの異なるヘリカーゼを使用することは、単一のヘリカーゼが移動を制御した場合よりもさらに多くの情報が領域６から導かれ、改善された移動を提供した。
【図２２】単一のヘリカーゼＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａ（セクション（ａ）、変異Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａを有する配列番号２４）または２つのＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａヘリカーゼ（セクション（ｂ））のいずれかがＤＮＡ構築物Ｚ（図２０）のＭｓｐＡナノポアを通る移行を制御するために使用された場合のプロット例を示す図である。ｘ軸は、移動指数に対応し、ｙ軸は電流（ｐＡ）に対応する。ポアを通って移動する各ＤＮＡ鎖について電流を時間の関数として測定した。移動しているＤＮＡは、測定される電流レベルに段階的変化を生じた。観察された電流レベルを各ステップについての平均電流を得るためにフィットさせ、増大移動指数点を割り当てた。移動指数に対する平均電流は、したがって元の電流シグナルに密接に近似され、移行されるＤＮＡを特性決定するために使用された。プロット（Ａ）および（Ｂ）は、１つまたは２つのいずれかのヘリカーゼの制御下でナノポアを通って移動する単一のＤＮＡ鎖を示し、標識された領域５および６は、ＤＮＡ構築物Ｚ（図２０を参照されたい）の領域５および６の移行に対応した。トレースＡは、構築物Ｚが単一のＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａヘリカーゼの制御下でポアを通って移行される場合に観察された移動指数を示す。トレースＢは、構築物Ｚが２つのＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａヘリカーゼの制御下でポアを通って移行された場合に観察された移動指数を示す。領域５および６領域がおよそ同じ長さであったことから、各領域について観察された移動指数は、移動指数中におよそ同じ数の点を有したことが予測される。プロットＡは、領域５と比較した場合に領域６についての移動指数に顕著に低減した数の点を示し、したがって、領域５よりも領域６からはあまり情報が得られなかった。しかし、プロットＢ（構築物Ｚの移動が２つのＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａヘリカーゼによって制御された場合）は、領域６の移動指数においてより多い点を示し、領域５とおよそ同じ量の情報が領域６から導かれたことを示唆した。したがって構築物Ｚの移動を制御するために２つのヘリカーゼを使用することは、単一のヘリカーゼが移動を制御する場合よりもさらに多くの情報が領域６から導かれ、改善された移動を提供した。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
配列表の記載
配列番号１は、ＭＳ−Ｂ１変異ＭｓｐＡ単量体をコードするコドン最適化ポリヌクレチド配列を示す。この変異体は、シグナル配列を欠失しており、次の変異：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋを含む。
【００１１】
配列番号２は、ＭｓｐＡ単量体のＭＳ−Ｂ１変異体の成熟形態のアミノ酸配列を示す。この変異体は、シグナル配列を欠失しており、以下の変異：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋを含む。
【００１２】
配列番号３は、α−ヘモリジン−Ｅ１１１Ｎ／Ｋ１４７Ｎ（α−ＨＬ−ＮＮ；Stoddartら、PNAS、2009;106(19):7702-7707）の１つの単量体をコードするポリヌクレオチド配列を示す。
【００１３】
配列番号４は、α−ＨＬ−ＮＮの１つの単量体のアミノ酸配列を示す。
【００１４】
配列番号５から７は、ＭｓｐＢ、ＣおよびＤのアミノ酸配列を示す。
【００１５】
配列番号８から２３は、表１および２に示すＤｄａヘリカーゼのアミノ酸配列を示す。
【００１６】
配列番号２４は好ましいＨｈＨドメインのアミノ酸配列を示す。
【００１７】
配列番号２５はｇｐ３２遺伝子によってコードされる、バクテリオファージＲＢ６９由来ｓｓｂのアミノ酸配列を示す。
【００１８】
配列番号２６はｇｐ２．５遺伝子によってコードされるバクテリオファージＴ７由来ｓｓｂのアミノ酸配列を示す。
【００１９】
配列番号２７はヘルペスウイルス１由来ＵＬ４２前進性因子のアミノ酸配列を示す。
【００２０】
配列番号２８はＰＣＮＡのサブユニット１のアミノ酸配列を示す。
【００２１】
配列番号２９はＰＣＮＡのサブユニット２のアミノ酸配列を示す。
【００２２】
配列番号３０はＰＣＮＡのサブユニット３のアミノ酸配列を示す。
【００２３】
配列番号３１はＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を示す。
【００２４】
配列番号３２はヘルペスウイルス１由来ＵＬ４２前進性因子のアミノ酸配列（１から３１９）を示す。
【００２５】
配列番号３３はバクテリオファージＲＢ６９由来ｓｓｂのアミノ酸配列、すなわちＣ末端が欠失している（ｇｐ３２ＲＢ６９ＣＤ）配列番号２５を示す。
【００２６】
配列番号３４はバクテリオファージＴ７（ｇｐ２．５Ｔ７−Ｒ２１１Ｄｅｌ）由来のｓｓｂのアミノ酸配列（１から２１０）を示す。全長タンパク質は配列番号９６において示されている。
【００２７】
配列番号３５はＨｅｌ３０８Ｈｌａの第５ドメインのアミノ酸配列を示す。
【００２８】
配列番号３６はＨｅｌ３０８Ｈｖｏの第５ドメインのアミノ酸配列を示す。
【００２９】
配列番号３７は（ＨｈＨ）２ドメインのアミノ酸配列を示す。
【００３０】
配列番号３８は（ＨｈＨ）２−（ＨｈＨ）２ドメインのアミノ酸配列を示す。
【００３１】
配列番号３９はヒトミトコンドリアＳＳＢ（ＨｓｍｔＳＳＢ）のアミノ酸配列を示す。
【００３２】
配列番号４０はＰｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ由来ｐ５タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００３３】
配列番号４１は大腸菌（E. coli）由来野生型ＳＳＢのアミノ酸配列を示す。
【００３４】
配列番号４２は、ｇｐ３２遺伝子によってコードされるバクテリオファージＴ４由来ｓｓｂのアミノ酸配列を示す。
【００３５】
配列番号４３はＥｃｏＳＳＢ−ＣｔｅｒＡｌａのアミノ酸配列を示す。
【００３６】
配列番号４４はＥｃｏＳＳＢ−ＣｔｅｒＮＧＧＮのアミノ酸配列を示す。
【００３７】
配列番号４５はＥｃｏＳＳＢ−Ｑ１５２ｄｅｌのアミノ酸配列を示す。
【００３８】
配列番号４６はＥｃｏＳＳＢ−Ｇ１１７ｄｅｌのアミノ酸配列を示す。
【００３９】
配列番号４７はトポイソメラーゼＶ  Ｍｋａ（メタノピュルス・カンドレリ（Methanopyrus Kandleri））のアミノ酸配列を示す。
【００４０】
配列番号４８はトポイソメラーゼＶ  Ｍｋａ（メタノピュルス・カンドレリ（Methanopyrus Kandleri））のドメインＨ−Ｌのアミノ酸配列を示す。
【００４１】
配列番号４９は変異体Ｓ（大腸菌（Escherichia coli））のアミノ酸配列を示す。
【００４２】
配列番号５０はＳｓｏ７ｄ（スルホロブス・ソルファタリカス（Sufolobus solfataricus））のアミノ酸配列を示す。
【００４３】
配列番号５１はＳｓｏ１０ｂ１（スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）Ｐ２）のアミノ酸配列を示す。
【００４４】
配列番号５２はＳｓｏ１０ｂ２（スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）Ｐ２）のアミノ酸配列を示す。
【００４５】
配列番号５３はトリプトファンリプレッサー（大腸菌（Escherichia coli））のアミノ酸配列を示す。
【００４６】
配列番号５４はラムダリプレッサー（腸内細菌（Enterobacteria）ファージラムダ）のアミノ酸配列を示す。
【００４７】
配列番号５５はＣｒｅｎ７（ヒストン・クレンアーキア（Histone crenarchaea）Ｃｒｅｎ７  Ｓｓｏ）のアミノ酸配列を示す。
【００４８】
配列番号５６はヒトヒストン（ヒト（Homo sapiens））のアミノ酸配列を示す。
【００４９】
配列番号５７はｄｓｂＡ（腸内細菌ファージＴ４）のアミノ酸配列を示す。
【００５０】
配列番号５８はＲａｄ５１（ヒト（Homo sapiens））のアミノ酸配列を示す。
【００５１】
配列番号５９はＰＣＮＡスライディングクランプ（sliding clamp）（シトロミクロビウム・バチオマリヌム（Citromicrobium bathyomarinum)ＪＬ３５４）のアミノ酸配列を示す。
【００５２】
配列番号６０は、実施例１において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。配列番号６０は、配列番号６１の５’末端に付着されている４個のｉＳｐＣ３スペーサーにその３’末端で付着されている。
【００５３】
配列番号６１は、実施例１、３、４および６において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。
【００５４】
配列番号６２は、実施例１において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。配列番号６２は、配列番号６１の３’末端に付着されている３つのｉＳｐＣ３スペーサーにその５’末端で付着されている。
【００５５】
配列番号６３は、配列の３’末端に２つのチミン残基および３’コレステロールＴＥＧに付着されている６個のｉＳｐ１８スペーサーを有する、実施例１において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。
【００５６】
配列番号６４は、実施例２において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。配列は、配列中の位置３７でチミンに付着しているカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を有する。
【００５７】
配列番号６５は、実施例２において使用される環状ポリヌクレオチド配列を示す。配列は、配列中の１個のチミンに付着しているカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を有する。
【００５８】
配列番号６６は、Ｔｒｗｃ  Ｃｂａヘリカーゼについてのアミノ酸配列を示す。
【００５９】
配列番号６７は、実施例３および４において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。
【００６０】
配列番号６８は、実施例３において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。配列番号６８は、配列番号６１の３’末端に付着されている４個の５−ニトロインドールにその５’末端で付着されている。
【００６１】
配列番号６９は、実施例４において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。
【００６２】
配列番号７０は、実施例５および６において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。
【００６３】
配列番号７１は、実施例５において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。
【００６４】
配列番号７２は、実施例６において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。
【００６５】
配列番号７３は、実施例６において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。
【００６６】
配列番号７４は、実施例６、７および８において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。
【００６７】
配列番号７５は、実施例６、７および８において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。
【００６８】
配列番号７６は、実施例７および８において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。
【００６９】
配列番号７７は、実施例７および８において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。
【００７０】
配列番号７８は、実施例７および８において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。
【００７１】
配列番号７９は、実施例７および８において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。
【００７２】
配列番号８０は、実施例７および８において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。
【００７３】
発明の詳細な記載
本開示の生成物および方法のさまざまな応用が当技術分野における具体的な必要性に適合され得ることは理解される。本明細書で用いられる用語は本発明の詳細な実施形態を記載する目的のためのみであり、限定されることを意図しないことも理解される。
【００７４】
付加的に、本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が他を明確に記す場合を除いて複数の参照物を含む。したがって例えば、「ヘリカーゼ（a helicase）」を参照することは「ヘリカーゼ（helicases）」を含み、「修飾（a modification）」を参照することは２つ以上のそのような修飾を含み、「膜貫通タンパク質ポア（a transmembrane protein pore）」を参照することは２つ以上のそのようなポアを含む、など。
【００７５】
本明細書に引用する全ての刊行物、特許および特許出願は（上記または下記に関わらず）それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００７６】
修飾Ｄｄａヘリカーゼ
本発明は、修飾Ｄｄａヘリカーゼを提供する。１つまたは複数の特異的修飾は、下により詳細に考察される。修飾（複数可）は、修飾ヘリカーゼがポリヌクレオチドにより長く結合し続けるようにする。修飾ヘリカーゼは、ポリヌクレオチドの移動を制御するその能力を保持している。換言すると、修飾ヘリカーゼは、ポリヌクレオチドの移動をいまだ制御できる。ヘリカーゼがポリヌクレオチドの移動を制御できる程度は、下により詳細に考察される修飾によって典型的には変更される。
【００７７】
本発明のＤｄａヘリカーゼは、修飾される。修飾ヘリカーゼは、対応する野生型ヘリカーゼまたは天然ヘリカーゼと比較して典型的には修飾されている。本発明のヘリカーゼは、人工または非天然である。
【００７８】
ポリヌクレオチドに結合および解離するヘリカーゼの能力は、当技術分野において公知の任意の方法を使用して決定できる。好適な結合／解離アッセイは、これだけに限らないが、未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、蛍光偏光測定、熱量測定および表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）など）を含む。ポリヌクレオチドから解離するヘリカーゼの能力は、ヘリカーゼがポリヌクレオチドの移動を制御できる時間を測定することによって当然決定できる。これも当技術分野において公知の任意の方法を使用して決定できる。ポリヌクレオチドの移動を制御するヘリカーゼの能力は、下に記載のものなどのナノポア系において典型的にはアッセイされる。ポリヌクレオチドの移動を制御するヘリカーゼの能力は、実施例において記載のとおり決定できる。
【００７９】
本発明の修飾ヘリカーゼは、鎖配列決定法の際にポリヌクレオチドの移動を制御するための有用な手段である。Ｄｄａヘリカーゼは、少なくとも２つの活性様式の操作（ヘリカーゼが移動を促進するために必要な全ての構成成分、例えばＡＴＰおよびＭｇ２＋と共に提供される場合）で、および１つの不活性様式の操作（ヘリカーゼが移動を促進するために必要な構成成分と共に提供されない場合）でＤＮＡの移動を制御できる。移動を促進するために必要な全ての構成成分と共に提供される場合、Ｄｄａヘリカーゼは、ＤＮＡに沿って５’−３’方向で移動するが、ナノポア中のＤＮＡの方向は（ＤＮＡのどちらの末端が捕捉されたかに依存する）、酵素が印加された場とは反対にナノポアの外へＤＮＡを移動させるように、または印加された場でナノポア中にＤＮＡを移動させるようにのいずれかで使用され得る。ＤＮＡの３’末端が捕捉される場合、ヘリカーゼは電圧によって印加された場とは反対の方向に働き、通したＤＮＡをナノポアの外側、ｃｉｓチャンバー内に引く。しかし、ＤＮＡがナノポア中で５’が下で捕捉される場合、ヘリカーゼは電圧によって印加される場の方向に働き、通したＤＮＡをナノポア中、ｔｒａｎｓチャンバー中に押す。Ｄｄａヘリカーゼが移動を促進するために必要な構成成分と共には提供されない場合、それはＤＮＡに結合でき、印加された場によってポア内に引かれた場合に、ＤＮＡの移動を遅くするブレーキとして作用できる。不活性様式では、ＤＮＡが３’または５’のどちらが下で捕捉されるかは問題ではなく、ブレーキとして作用する酵素と共にＤＮＡをナノポア中、トランス側に向けて引くのは印加された場である。不活性様式では、ヘリカーゼによるＤＮＡの移動制御は、ラチェッティング、スライディングおよびブレーキングを含む多数の方法で記載され得る。
【００８０】
ポリヌクレオチド、特に、５００ヌクレオチド以上のものを配列決定することにおいて生じる問題は、ポリヌクレオチドの移行を制御する分子モーターがポリヌクレオチドから離される場合があることである。これは、ポリヌクレオチドが印加された場の方向に急速かつ制御されない様式でポアを通って引かれるようにする。本発明の修飾ヘリカーゼは、配列決定されているポリヌクレオチドから解離または離されにくい。修飾ヘリカーゼは、ナノポアを通るポリヌクレオチドの移動をそれらが制御することからポリヌクレオチドの読み取り長さの増大を提供できる。本発明の修飾ヘリカーゼの制御下でポリヌクレオチド全体をナノポアを通して移動させる能力は、その配列などのポリヌクレオチドの特性を改善された確度でおよび公知の方法を超える速度で推定できるようにする。鎖長が長くなるにつれてこれはより重要になり、分子モーターは前進性の改善を必要とする。発明の修飾ヘリカーゼは、５００ヌクレオチド以上、例えば１０００ヌクレオチド、５０００、１００００、２００００、５００００、１０００００またはそれ以上の標的ポリヌクレオチドの移動を制御することにおいて特に有効である。
【００８１】
付加的に本発明による修飾ヘリカーゼを使用することは、低濃度のヘリカーゼが使用され得ることを意味する。例えば実施例３では、１ｎＭの本発明の修飾ヘリカーゼが使用される。対照的に実施例３では、本発明の修飾Ｄｄａヘリカーゼではない１μＭのＴｒｗＣ  Ｃｂａが使用される。
【００８２】
本発明の修飾ヘリカーゼは、等温ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための有用な手段でもある。そのような方法においては、２本鎖ＤＮＡの鎖は典型的には最初に本発明のヘリカーゼによって分離され、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）−結合タンパク質によってコートされる。第二ステップでは、２個の配列特異的プライマーが、典型的にはＤＮＡ鋳型の各辺縁にハイブリダイズする。次いでＤＮＡポリメラーゼは鋳型にアニールしたプライマーを、２本鎖ＤＮＡを産生するように伸長するために使用でき、２個の新たに合成されたＤＮＡ産生物は、次いで本発明のヘリカーゼによって基質として使用され、次の回の反応に入ることができる。したがって鎖反応が同時に進行し、選択された標的配列の指数関数的増幅が生じる。
【００８３】
修飾ヘリカーゼは、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する。ポリヌクレオチドの移動を制御するヘリカーゼの能力は、当技術分野において公知の任意の方法を使用してアッセイできる。例えばヘリカーゼは、ポリヌクレオチドに接触されてよく、ポリヌクレオチドの位置は、標準的方法を使用して決定され得る。ポリヌクレオチドの移動を制御する修飾ヘリカーゼの能力は、下に記載のものなどのナノポア系において、具体的には実施例において記載のとおり典型的にはアッセイされる。
【００８４】
本発明の修飾ヘリカーゼは、単離、実質的に単離、精製または実質的に精製されていてよい。ヘリカーゼは、それが脂質、ポリヌクレオチド、ポア単量体または他のタンパク質などの任意の他の構成成分を完全に含まない場合に単離または精製されている。ヘリカーゼは、その目的の使用を妨害しない担体または希釈剤と混合されている場合に実質的に単離されている。例えばヘリカーゼは、１０％未満、５％未満、２％未満または１％未満の脂質、ポリヌクレオチド、ポア単量体または他のタンパク質などの他の構成成分を含む形態で存在する場合に実質的に単離または実質的に精製されている。
【００８５】
任意のＤｄａヘリカーゼは、本発明により修飾されてよい。好ましいＤｄａヘリカーゼは下に考察される。
【００８６】
Ｄｄａヘリカーゼは、次の５個のドメイン：１Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメイン、２Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメイン、タワードメイン、ピンドメインおよびフックドメインを典型的には含む（Xiaoping He et al., 2012, Structure; 20: 1189-1200）。ドメインは、タンパク質モデリング、結晶状態でのタンパク質のＸ−線回折測定（Rupp B (2009)を使用して同定され得る。 Biomolecular Crystallography: Principles、Practice and Application to Structural Biology. New York: Garland Science.）、溶液におけるタンパク質の核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法（Mark Rance; Cavanagh、John; Wayne J. Fairbrother; Arthur W. Hunt III; Skelton、NNicholas J. (2007). Protein NMR spectroscopy: principles and practice (2nd ed.). Boston: Academic Press.）または凍結水和状態におけるタンパク質のクリオ電子顕微鏡（van Heel M、Gowen B、Matadeen R、Orlova EV、Finn R、Pape T、Cohen D、Stark H、Schmidt R、Schatz M、Patwardhan A (2000). ”Single-particle electron cryo-microscopy: towards atomic resolution.”. Q Rev Biophys. 33: 307-69）を使用して同定できる。上に述べた方法によって決定されたタンパク質の構造情報は、タンパク質バンク（ＰＤＢ）データベースから公開で入手可能である。
【００８７】
タンパク質モデリングは、相同体においてタンパク質構造がタンパク質配列よりも保存されているという事実を活用する。それにより、タンパク質の原子分解モデルを作成することは、クエリー配列の構造に類似していると考えられる１つまたは複数のタンパク質構造の同定に依存する。タンパク質モデルを構築するための「鋳型」として使用するための好適なタンパク質構造が存在するかどうかを評価するために、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）データベースの検索を実施する。タンパク質構造は、クエリー配列と合理的なレベルの配列同一性を共有している場合に好適な鋳型であると考えられる。そのような鋳型が存在する場合、次いで鋳型配列はクエリー配列と「配列比較」される、すなわちクエリー配列中の残基が鋳型残基に位置付けられる。配列の配列比較および鋳型構造は、次いでクエリー配列の構造モデルを作成するために使用される。そのためタンパク質モデルの品質は、配列の配列比較および鋳型構造の品質に依存する。
【００８８】
タワードメインおよび／またはピンドメインおよび／または１Ａドメイン中の修飾
一実施形態では本発明のＤｄａヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基（すなわち１つまたは複数のシステイン残基）および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸（すなわち１つまたは複数の非天然アミノ酸）が（ｉ）タワードメインおよび／または（ｉｉ）ピンドメインおよび／または（ｉｉｉ）１Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメインに導入されているものであって、ポリヌクレオチドの移動を制御するその能力を保持しているものである。少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は、タワードメイン、ピンドメイン、１Ａドメイン、タワードメインおよびピンドメイン、タワードメインおよび１Ａドメインまたはタワードメイン、ピンドメインおよび１Ａドメインに導入されてよい。
【００８９】
本発明のＤｄａヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメインならびに（ｉｉ）ピンドメインおよび／または１Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメインのそれぞれ、すなわちタワードメインおよびピンドメインに、タワードメインおよび１Ａドメインまたはタワードメイン、ピンドメインおよび１Ａドメインに導入されたもので好ましくはある。
【００９０】
任意の数のシステイン残基および／または非天然アミノ酸が各ドメインに導入され得る。例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれ以上のシステイン残基が導入されてよく、および／または１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれ以上の非天然アミノ酸が導入されてよい。１つまたは複数のシステイン残基だけが導入されてよい。１つまたは複数の非天然アミノ酸だけが導入されてよい。１つまたは複数のシステイン残基と１つまたは複数の非天然アミノ酸との組合せは導入されてよい。
【００９１】
少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は（ａｒｅ／ｉｓ）、置換によって好ましくは導入される。これを行うための方法は、当技術分野において公知である。
【００９２】
これらの修飾は、ポリヌクレオチドへの結合についてヘリカーゼを妨げない。これらの修飾は、ヘリカーゼから解離するまたは離されるポリヌクレオチドの能力を減少させる。換言すると１つまたは複数の修飾は、ポリヌクレオチド鎖からの離脱を妨げることによってＤｄａヘリカーゼの前進性を増大させる。酵素の熱安定性も１つまたは複数の修飾によって典型的には増大され、鎖配列決定法において有益である改善された構造的安定性をもたらす。
【００９３】
非天然アミノ酸は、Ｄｄａヘリカーゼ中に天然で見出されないアミノである。非天然アミノ酸は、好ましくはヒスチジン、アラニン、イソロイシン、アルギニン、ロイシン、アスパラギン、リシン、アスパラギン酸、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニン、グルタミン、トリプトファン、グリシン、バリン、プロリン、セリンまたはチロシンではない。非天然アミノ酸は、より好ましくは前述の２０個のアミノ酸のいずれでも、セレノシステインでもない。
【００９４】
本発明における使用のための好ましい非天然アミノ酸は、これだけに限らないが、４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）、４−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、３−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、４−アセトアセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−アリル−Ｌ−チロシン、３−（フェニルセラニル）−Ｌ−アラニン、Ｏ−２−プロピン−１−イル−Ｌ−チロシン、４−（ジヒドロキシボリル）−Ｌ−フェニルアラニン、４−［（エチルスルファニル）カルボニル］−Ｌ−フェニルアラニン、（２Ｓ）−２−アミノ−３−｛４−［（プロパン−２−イルスルファニル）カルボニル］フェニル｝プロパン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−３−｛４−［（２−アミノ−３−スルファニルプロパノイル）アミノ］フェニル｝プロパン酸、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、４−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、３−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、４−フルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、４−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン、４−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−（トリフルオロメチル）チロシン、４−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、３−ヒドロキシ−Ｌ−チロシン、３−アミノ−Ｌ−チロシン、３−ヨード−Ｌ−チロシン、４−イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、３−（２−ナフチル）−Ｌ−アラニン、４−フェニル−Ｌ−フェニルアラニン、（２Ｓ）−２−アミノ−３−（ナフタレン−２−イルアミノ）プロパン酸、６−（メチルスルファニル）ノルロイシン、６−オキソ−Ｌ−リシン、Ｄ−チロシン、（２Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸、（２Ｒ）−２−アンモニオオクタノエート３−（２，２’−ビピリジン−５−イル）−Ｄ−アラニン、２−アミノ−３−（８−ヒドロキシ−３−キノリル）プロパン酸、４−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｓ−（２−ニトロベンジル）システイン、（２Ｒ）−２−アミノ−３−［（２−ニトロベンジル）スルファニル］プロパン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−３−［（２−ニトロベンジル）オキシ］プロパン酸、Ｏ−（４，５−ジメトキシ−２−ニトロベンジル）−Ｌ−セリン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−（｛［（２−ニトロベンジル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシン、２−ニトロフェニルアラニン、４−［（Ｅ）−フェニルジアゼニル］−Ｌ−フェニルアラニン、４−［３−（トリフルオロメチル）−３Ｈ−ジアジレン−３−イル］−Ｄ−フェニルアラニン、２−アミノ−３−［［５−（ジメチルアミノ）−１−ナフチル］スルホニルアミノ］プロパン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−４−（７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）ブタン酸、（２Ｓ）−３−［（６−アセチルナフタレン−２−イル）アミノ］−２−アミノプロパン酸、４−（カルボキシメチル）フェニルアラニン、３−ニトロ−Ｌ−チロシン、Ｏ−スルホ−Ｌ−チロシン、（２Ｒ）−６−アセトアミド−２−アンモニオヘキサノエート、１−メチルヒスチジン、２−アミノノナン酸、２−アミノデカン酸、Ｌ−ホモシステイン、５−スルファニルノルバリン、６−スルファニル−Ｌ−ノルロイシン、５−（メチルスルファニル）−Ｌ−ノルバリン、Ｎ６−｛［（２Ｒ，３Ｒ）−３−メチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピロール−２−イル］カルボニル｝−Ｌ−リシン、Ｎ６−［（ベンジルオキシ）カルボニル］リシン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−［（シクロペンチルカルボニル）アミノ］ヘキサン酸、Ｎ６−［（シクロペンチルオキシ）カルボニル］−Ｌ−リシン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（２Ｒ）−テトラヒドロフラン−２−イルカルボニル］アミノ｝ヘキサン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−８−［（２Ｒ，３Ｓ）−３−エチニルテトラヒドロフラン−２−イル］−８−オキソオクタン酸、Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リシン、（２Ｓ）−２−ヒドロキシ−６−（｛［（２−メチル−２−プロパニル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｎ６−［（アリルオキシ）カルボニル］リシン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−（｛［（２−アジドベンジル）オキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸、Ｎ６−Ｌ−プロリル−Ｌ−リシン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（プロパ−２−イン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸およびＮ６−［（２−アジドエトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシンを含む。最も好ましい非天然アミノ酸は、４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）である。
【００９５】
下の表１は、本発明により修飾され得る好ましいＤｄａヘリカーゼを要約する。
【００９６】
【表１−１】
0006677640.tif 000002
【００９７】
【表１−２】
0006677640.tif 000003
【００９８】
【表１−３】
0006677640.tif 000004
【００９９】
下の表２（２つの部分に分かれている）は、各Ｄｄａ相同体（配列番号８から２３）において各ドメインを作っている残基を同定する。
【０１００】
【表２】
0006677640.tif 000005
【０１０１】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｄ２６０〜Ｐ２７４およびＮ２９２〜Ａ３８９）ならびに／または（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ８６〜Ｅ１０２）ならびに／または（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ８５およびＶ１０３〜Ｋ１７７）に導入されている配列番号８の変種を好ましくは含む。少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は、タワードメインの残基Ｎ２９２〜Ａ３８９に好ましくは導入されている。
【０１０２】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｇ２９５〜Ｎ３０９およびＦ３１６〜Ｙ４２１）ならびに／または（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｙ８５〜Ｌ１１２）ならびに／または（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｉ８４およびＲ１１３〜Ｙ２１１）に導入されている配列番号９の変種を好ましくは含む。少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は、タワードメインの残基Ｆ３１６〜Ｙ４２１に好ましくは導入されている。
【０１０３】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｖ３２８〜Ｐ３４２およびＮ３６０〜Ｙ４４８）ならびに／または（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ１４８〜Ｎ１６５）ならびに／または（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ１４７およびＳ１６６〜Ｖ２４０）に導入されている配列番号１０の変種を好ましくは含む。少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は、タワードメインの残基Ｎ３６０〜Ｙ４４８に好ましくは導入されている。
【０１０４】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ａ２６１〜Ｔ２７５およびＴ２８５〜Ｙ３７０）ならびに／または（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｇ９１〜Ｅ１０７）ならびに／または（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ９０およびＥ１０８〜Ｈ１７３）に導入されている配列番号１１の変種を好ましくは含む。少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は、タワードメインの残基Ｔ２８５〜Ｙ３７０に好ましくは導入されている。
【０１０５】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｇ２９４〜Ｉ３０７およびＴ３１４〜Ｙ４０７）ならびに／または（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｇ１１６〜Ｔ１３５）ならびに／または（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ１１５およびＮ１３６〜Ｖ２０５）に導入されている配列番号１２の変種を好ましくは含む。少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は、タワードメインの残基Ｔ３１４〜Ｙ４０７に好ましくは導入されている。
【０１０６】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｖ２８８〜Ｅ３０１およびＮ３０７〜Ｎ３９３）ならびに／または（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｇ９７〜Ｐ１１３）ならびに／または（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ９６およびＦ１１４〜Ｖ１９４）に導入されている配列番号１３の変種を好ましくは含む。少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は、タワードメインの残基Ｎ３０７〜Ｎ３９３に好ましくは導入されている。
【０１０７】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｓ２５０〜Ｐ２６４およびＥ２７８〜Ｓ３７１）ならびに／または（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ７８〜Ｅ９５）ならびに／または（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ７７およびＶ９６〜Ｖ１６６）に導入されている配列番号１４の変種を好ましくは含む。少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は、タワードメインの残基Ｅ２７８〜Ｓ３７１に好ましくは導入されている。
【０１０８】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｋ２５５〜Ｐ２６９およびＴ２８４〜Ｓ３８０）ならびに／または（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ８２〜Ｋ９８）ならびに／または（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｍ８１およびＬ９９〜Ｍ１７１）に導入されている配列番号１５の変種を好ましくは含む。少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は、タワードメインの残基Ｔ２８４〜Ｓ３８０に好ましくは導入されている。
【０１０９】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｄ２４２〜Ｐ２５６およびＴ２７１〜Ｓ３６６）ならびに／または（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ６９〜Ｋ８５）ならびに／または（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｍ６８およびＭ８６〜Ｍ１５８）に導入されている配列番号１６の変種を好ましくは含む。少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は、タワードメインの残基Ｔ２７１〜Ｓ３６６に好ましくは導入されている。
【０１１０】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｔ２６３〜Ｐ２７７およびＮ２９５〜Ｐ３９２）ならびに／または（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ８８〜Ｋ１０７）ならびに／または（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ８７およびＡ１０８〜Ｍ１８１）に導入されている配列番号１７の変種を好ましくは含む。少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は、タワードメインの残基Ｎ２９５〜Ｐ３９２に好ましくは導入されている。
【０１１１】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｄ２６３〜Ｐ２７７およびＮ２９５〜Ａ３９１）ならびに／または（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ８８〜Ｋ１０７）ならびに／または（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ８７およびＡ１０８〜Ｍ１８１）に導入されている配列番号１８の変種を好ましくは含む。少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は、タワードメインの残基Ｎ２９５〜Ａ３９１に好ましくは導入されている。
【０１１２】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ａ２５８〜Ｐ２７２およびＮ２９０〜Ｐ３８６）ならびに／または（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ８６〜Ｇ１０２）ならびに／または（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ８５およびＴ１０３〜Ｋ１７６）に導入されている配列番号１９の変種を好ましくは含む。少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は、タワードメインの残基Ｎ２９０〜Ｐ３８６に好ましくは導入されている。
【０１１３】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｌ２６６〜Ｐ２８０およびＮ２９８〜Ａ３９２）ならびに／または（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ９２〜Ｄ１０８）ならびに／または（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ９１およびＶ１０９〜Ｍ１８３）に導入されている配列番号２０の変種を好ましくは含む。少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は、タワードメインの残基Ｎ２９８〜Ａ３９２に好ましくは導入されている。
【０１１４】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｄ２６２〜Ｐ２７６およびＮ２９４〜Ａ３９２）ならびに／または（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ８８〜Ｅ１０４）ならびに／または（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ８７およびＭ１０５〜Ｍ１７９）に導入されている配列番号２１の変種を好ましくは含む。少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は、タワードメインの残基Ｎ２９４〜Ａ３９２に好ましくは導入されている。
【０１１５】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｄ２６１〜Ｐ２７５およびＮ２９３〜Ａ３８９）ならびに／または（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ８７〜Ｅ１０３）ならびに／または（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ８６およびＶ１０４〜Ｋ１７８）に導入されている配列番号２２の変種を好ましくは含む。少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は、タワードメインの残基Ｎ２９３〜Ａ３８９に好ましくは導入されている。
【０１１６】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｅ２６１〜Ｐ２７５およびＴ２９３〜Ａ３９０）ならびに／または（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ８７〜Ｅ１０３）ならびに／または（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ８６およびＶ１０４〜Ｍ１７８）に導入されている配列番号２３の変種を好ましくは含む。少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は、タワードメインの残基Ｔ２９３〜Ａ３９０に好ましくは導入されている。
【０１１７】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメインおよび（ｉｉ）ピンドメインおよび／または１Ａドメインのそれぞれに導入されている配列番号８から２３のいずれか１つの変種を好ましくは含む。本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン、（ｉｉ）ピンドメインおよび（ｉｉｉ）１Ａドメインのそれぞれに導入されている配列番号８から２３のいずれか１つの変種をより好ましくは含む。任意の数および組合せのシステイン残基および非天然アミノ酸が上に考察したとおり導入され得る。
【０１１８】
本発明のヘリカーゼは、（ｉ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＡ３６０Ｃ；（ｉｉ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＫ３５８Ｃ；（ｉｉｉ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＡ３６０Ｃ；（ｉｖ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＥ３６１Ｃ；（ｖ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＫ３６４Ｃ；（ｖｉ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＬ３５４Ｃ；（ｖｉｉ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＫ３５８Ｃ；（ｖｉｉｉ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＬ３５４Ｃ；（ｉｘ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＥ３６１Ｃ；（ｘ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＫ３６４Ｃ；（ｘｉ）Ｌ９７Ｃおよび／またはＬ３５４Ｃ；（ｘｉｉ）Ｌ９７Ｃおよび／またはＫ３５８Ｃ；（ｘｉｉｉ）Ｌ９７Ｃおよび／またはＡ３６０Ｃ；（ｘｉｖ）Ｌ９７Ｃおよび／またはＥ３６１Ｃ；（ｘｖ）Ｌ９７Ｃおよび／またはＫ３６４Ｃ；（ｘｖｉ）Ｋ１２３Ｃおよび／またはＬ３５４Ｃ；（ｘｖｉｉ）Ｋ１２３Ｃおよび／またはＫ３５８Ｃ；（ｘｖｉｉｉ）Ｋ１２３Ｃおよび／またはＡ３６０Ｃ；（ｘｉｘ）Ｋ１２３Ｃおよび／またはＥ３６１Ｃ；（ｘｘ）Ｋ１２３Ｃおよび／またはＫ３６４Ｃ；（ｘｘｉ）Ｎ１５５Ｃおよび／またはＬ３５４Ｃ；（ｘｘｉｉ）Ｎ１５５Ｃおよび／またはＫ３５８Ｃ；（ｘｘｉｉｉ）Ｎ１５５Ｃおよび／またはＡ３６０Ｃ；（ｘｘｉｖ）Ｎ１５５Ｃおよび／またはＥ３６１Ｃ；（ｘｘｖ）Ｎ１５５Ｃおよび／またはＫ３６４Ｃ；（ｘｘｖｉ）（ｉ）から（ｘｘｖ）のいずれかおよびＧ３５７Ｃ；（ｘｘｖｉｉ）（ｉ）から（ｘｘｖ）のいずれかおよびＱ１００Ｃ；（ｘｘｖｉｉｉ）（ｉ）から（ｘｘｖ）のいずれかおよびＩ１２７Ｃ；（ｘｘｉｘ）（ｉ）から（ｘｘｖ）のいずれかおよびＱ１００ＣおよびＩ１２７Ｃ；（ｘｘｘ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＦ３７７Ｃ；（ｘｘｘｉ）Ｎ９５Ｃ；（ｘｘｘｉｉ）Ｔ９１Ｃ；（ｘｘｘｉｉｉ）Ｙ９２Ｌ、Ｅ９４Ｙ、Ｙ３５０Ｎ、Ａ３６０ＣおよびＹ３６３Ｎ；（ｘｘｘｉｖ）Ｅ９４ＹおよびＡ３６０Ｃ；（ｘｘｘｖ）Ａ３６０Ｃ；（ｘｘｘｖｉ）Ｙ９２Ｌ、Ｅ９４Ｃ、Ｙ３５０Ｎ、Ａ３６０ＹおよびＹ３６３Ｎ；（ｘｘｘｖｉｉ）Ｙ９２Ｌ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｙ；（ｘｘｘｖｉｉｉ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＡ３６０ＣおよびＦ２７６Ａ；（ｘｘｘｉｘ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＬ３５６Ｃ；（ｘｌ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＥ３５６Ｃ；（ｘｌｉ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＧ３５７Ｃ；（ｘｌｉｉ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＡ３６０Ｃ；（ｘｌｉｉｉ）Ｎ９５Ｃおよび／またはＷ３７８Ｃ；（ｘｌｉｖ）Ｔ９１Ｃおよび／またはＳ３８２Ｃ；（ｘｌｖ）Ｔ９１Ｃおよび／またはＷ３７８Ｃ；（ｘｌｖｉ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＮ３５３Ｃ；（ｘｌｖｉｉ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＳ３８２Ｃ；（ｘｌｖｉｉｉ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＫ３８１Ｃ；（ｘｌｉｘ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＤ３７９Ｃ；（ｌ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＳ３７５Ｃ；（ｌｉ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＷ３７８Ｃ；（ｌｉｉ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＷ３７４Ｃ；（ｌｉｉｉ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＮ３５３Ｃ；（ｌｉｖ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＳ３８２Ｃ；（ｌｖ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＫ３８１Ｃ；（ｌｖｉ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＤ３７９Ｃ；（ｌｖｉｉ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＳ３７５Ｃ；（ｌｖｉｉｉ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＷ３７８Ｃ；（ｌｉｘ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＷ３７４Ｃ；（ｌｘ）Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｙ；（ｌｘｉ）Ｅ９４Ｃ、Ｇ３５７ＣおよびＡ３６０Ｃまたは（ｌｘｉｉ）Ｔ２Ｃ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃを含んでいる（またはそれだけを含んでいる）配列番号８の変種を好ましくは含む。（ｉ）から（ｌｘｉｉ）のいずれか１つにおいて、および／またはは、好ましくはおよびである。
【０１１９】
本発明のヘリカーゼは、（ｉ）から（ｌｘｉｉ）のいずれかに定義の配列番号８中のものに対応する位置にシステイン残基を含む配列番号９から２３のいずれか１つの変種を好ましくは含む。配列番号８中のものに対応する配列番号９から２３のいずれか１つの位置は、下の配列番号８から２３の配列比較を使用して同定され得る。本発明のヘリカーゼは、（ａ）Ｄ９９Ｃおよび／またはＬ３４１Ｃ、（ｂ）Ｑ９８Ｃおよび／もしくはＬ３４１Ｃまたは（ｄ）Ｑ９８Ｃおよび／またはＡ３４０Ｃを含む（またはそれだけを含む）配列番号１１の変種を好ましくは含む。本発明のヘリカーゼは、Ｄ９０Ｃおよび／またはＡ３４９Ｃを含む（またはそれだけを含む）配列番号１５の変種を好ましくは含む。本発明のヘリカーゼは、Ｄ９６Ｃおよび／またはＡ３６２Ｃを含む（またはそれだけを含む）配列番号２１の変種を好ましくは含む。
【０１２０】
本発明のヘリカーゼは、Ｆａｚがシステインの代わりに特異的位置の１つまたは複数に導入されている（ｉ）から（ｌｘｉｉ）のいずれか１つに定義の配列番号８から２３のいずれか１つの変種を好ましくは含む。Ｆａｚは、システインの代わりに各特異的位置に導入されてよい。本発明のヘリカーゼは、（ｉ）Ｅ９４Ｆａｚおよび／またはＡ３６０Ｃ；（ｉｉ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＡ３６０Ｆａｚ；（ｉｉｉ）Ｅ９４Ｆａｚおよび／またはＡ３６０Ｆａｚ；（ｉｖ）Ｙ９２Ｌ、Ｅ９４Ｙ、Ｙ３５０Ｎ、Ａ３６０ＦａｚおよびＹ３６３Ｎ；（ｖ）Ａ３６０Ｆａｚ；（ｖｉ）Ｅ９４ＹおよびＡ３６０Ｆａｚ；（ｖｉｉ）Ｙ９２Ｌ、Ｅ９４Ｆａｚ、Ｙ３５０Ｎ、Ａ３６０ＹおよびＹ３６３Ｎ；（ｖｉｉｉ）Ｙ９２Ｌ、Ｅ９４ＦａｚおよびＡ３６０Ｙ；（ｉｘ）Ｅ９４ＦａｚおよびＡ３６０Ｙ；および（ｘ）Ｅ９４Ｃ、Ｇ３５７ＦａｚおよびＡ３６０Ｃを含む（またはそれだけを含む）配列番号８の変種を好ましくは含む。
【０１２１】
本発明のヘリカーゼは、ピンドメインからの１つまたは複数の単一アミノ酸欠失を好ましくはさらに含む。１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれ以上などの任意の数の単一アミノ酸欠失が作られてよい。ヘリカーゼは、Ｅ９３の欠失、Ｅ９５の欠失またはＥ９３およびＥ９５の欠失を含む配列番号８の変種をより好ましくは含む。ヘリカーゼは（ａ）Ｅ９４Ｃ、Ｎ９５の欠失およびＡ３６０Ｃ；（ｂ）Ｅ９３の欠失、Ｅ９４の欠失、Ｎ９５の欠失およびＡ３６０Ｃ；（ｃ）Ｅ９３の欠失、Ｅ９４Ｃ、Ｎ９５の欠失およびＡ３６０Ｃまたは（ｄ）Ｅ９３Ｃ、Ｎ９５の欠失およびＡ３６０Ｃを含む（またはそれだけを含む）配列番号８の変種をより好ましくは含む。本発明のヘリカーゼは、配列番号８中のＥ９３に対応する位置の欠失、配列番号８中のＥ９５に対応する位置の欠失、配列番号８中のＥ９３およびＥ９５に対応する位置の欠失を含む配列番号９から２３のいずれか１つの変種を好ましくは含む。
【０１２２】
本発明のヘリカーゼは、フックドメインからの１つまたは複数の単一アミノ酸欠失を好ましくはさらに含む。１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれ以上などの任意の数の単一アミノ酸欠失が作られてよい。ヘリカーゼは、位置Ｔ２７８からＳ２８７の任意の数の欠失を含む配列番号８の変種をより好ましくは含む。ヘリカーゼは、（ａ）Ｅ９４Ｃ、Ｙ２７９からＫ２８４の欠失およびＡ３６０Ｃ、（ｂ）Ｅ９４Ｃ、Ｔ２７８、Ｙ２７９、Ｖ２８６およびＳ２８７の欠失ならびにＡ３６０Ｃ、（ｃ）Ｅ９４Ｃ、Ｉ２８１およびＫ２８４の欠失ならびに単一のＧでの置き換え、ならびにＡ３６０Ｃ、（ｄ）Ｅ９４Ｃ、Ｋ２８０およびＰ２８４５の欠失、Ｅ９４Ｃならびに単一のＧでの置き換えならびにＡ３６０Ｃ、または（ｅ）Ｙ２７９からＫ２８４の欠失、Ｅ９４Ｃ、Ｆ２７６ＡおよびＡ２３０Ｃを含む配列番号８の変種をより好ましくは含む。本発明のヘリカーゼは、配列番号８中の位置２７８から２８７に対応する任意の数の欠失を含む配列番号９から２３のいずれか１つの変種を好ましくは含む。
【０１２３】
本発明のヘリカーゼは、ピンドメインからの１つまたは複数の単一アミノ酸欠失およびフックドメインからの１つまたは複数の単一アミノ酸欠失を好ましくはさらに含む。
【０１２４】
本発明のヘリカーゼは、好ましくは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸がフックドメインならびに／または２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメインにさらに導入されているものである。任意の数および組合せのシステイン残基および非天然アミノ酸が上に考察したとおり、タワー、ピンおよび１Ａドメインに導入されてよい。
【０１２５】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸がフックドメイン（残基Ｌ２７５〜Ｆ２９１）ならびに／または２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１７８〜Ｔ２５９およびＬ３９０〜Ｖ４３９）にさらに導入されている配列番号８の変種を好ましくは含む。
【０１２６】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸がフックドメイン（残基Ａ３１０〜Ｌ３１５）ならびに／または２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ２１２〜Ｅ２９４およびＧ４２２〜Ｓ６７８）にさらに導入されている配列番号９の変種を好ましくは含む。
【０１２７】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸がフックドメイン（残基Ｖ３４３〜Ｌ３５９）ならびに／または２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ２４１〜Ｎ３２７およびＡ４４９〜Ｇ４９６）にさらに導入されている配列番号１０の変種を好ましくは含む。
【０１２８】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸がフックドメイン（残基Ｗ２７６〜Ｌ２８４）ならびに／または２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１７４〜Ｄ２６０およびＡ３７１〜Ｖ４２１）にさらに導入されている配列番号１１の変種を好ましくは含む。
【０１２９】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸がフックドメイン（残基Ｒ３０８〜Ｙ３１３）ならびに／または２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ２０６〜Ｋ２９３およびＩ４０８〜Ｌ５００）にさらに導入されている配列番号１２の変種を好ましくは含む。
【０１３０】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸がフックドメイン（残基Ｍ３０２〜Ｗ３０６）ならびに／または２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１９５〜Ｄ２８７およびＶ３９４〜Ｑ４５０）にさらに導入されている配列番号１３の変種を好ましくは含む。
【０１３１】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸がフックドメイン（残基Ｖ２６５〜Ｉ２７７）ならびに／または２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１６７〜Ｔ２４９およびＬ３７２〜Ｎ４２１）にさらに導入されている配列番号１４の変種を好ましくは含む。
【０１３２】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸がフックドメイン（残基Ｖ２７０〜Ｆ２８３）ならびに／または２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１７２〜Ｔ２５４およびＬ３８１〜Ｋ４３４）にさらに導入されている配列番号１５の変種を好ましくは含む。
【０１３３】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸がフックドメイン（残基Ｖ２５７〜Ｆ２７０）ならびに／または２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１５９〜Ｔ２４１およびＬ３６７〜Ｋ４２０）にさらに導入されている配列番号１６の変種を好ましくは含む。
【０１３４】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸がフックドメイン（残基Ｌ２７８〜Ｙ２９４）ならびに／または２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１８２〜Ｔ２６２およびＬ３９３〜Ｖ４４３）にさらに導入されている配列番号１７の変種を好ましくは含む。
【０１３５】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸がフックドメイン（残基Ｌ２７８〜Ｙ２９４）ならびに／または２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１８２〜Ｔ２６２およびＬ３９２〜Ｖ４４２）にさらに導入されている配列番号１８の変種を好ましくは含む。
【０１３６】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸がフックドメイン（残基Ｌ２７３〜Ｆ２８９）ならびに／または２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１７７〜Ｎ２５７およびＬ３８７〜Ｖ４３８）にさらに導入されている配列番号１９の変種を好ましくは含む。
【０１３７】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸がフックドメイン（残基Ｌ２８１〜Ｆ２９７）ならびに／または２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１８４〜Ｔ２６５およびＬ３９３〜Ｉ４４２）にさらに導入されている配列番号２０の変種を好ましくは含む。
【０１３８】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸がフックドメイン（残基Ｈ２７７〜Ｆ２９３）ならびに／または２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１８０〜Ｔ２６１およびＬ３９３〜Ｖ４４２）にさらに導入されている配列番号２１の変種を好ましくは含む。
【０１３９】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸がフックドメイン（残基Ｌ２７６〜Ｆ２９２）ならびに／または２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１７９〜Ｔ２６０およびＬ３９０〜Ｉ４３９）にさらに導入されている配列番号２２の変種を好ましくは含む。
【０１４０】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸がフックドメイン（残基Ｌ２７６〜Ｆ２９２）ならびに／または２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１７９〜Ｔ２６０およびＬ３９１〜Ｖ４４１）にさらに導入されている配列番号２３の変種を好ましくは含む。
【０１４１】
本発明のヘリカーゼは、（ｉ）Ｉ１８１Ｃ；（ｉｉ）Ｙ２７９Ｃ；（ｉｉｉ）Ｉ２８１Ｃ；および（ｉｖ）Ｅ２８８Ｃの１つまたは複数を含む配列番号８の変種を好ましくは含む。ヘリカーゼは、（ｉ）；（ｉｉ）；（ｉｉｉ）；（ｉｖ）；（ｉ）および（ｉｉ）；（ｉ）および（ｉｉｉ）；（ｉ）および（ｉｖ）；（ｉｉ）および（ｉｉｉ）；（ｉｉ）および（ｉｖ）；（ｉｉｉ）および（ｉｖ）；または（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）などの（ｉ）から（ｉｖ）の任意の組合せを含み得る。ヘリカーゼは、（ａ）Ｅ９４Ｃ、Ｉ２８１ＣおよびＡ３６０Ｃまたは（ｂ）Ｅ９４Ｃ、Ｉ２８１Ｃ、Ｇ３５７ＣおよびＡ３６０Ｃを含む（またはそれだけを含む）配列番号８の変種をより好ましくは含む。本発明のヘリカーゼは、（ｉ）から（ｉｖ）、（ａ）および（ｂ）に定義の配列番号８のものに対応する１つまたは複数の位置（複数可）にシステイン残基を含む配列番号９から２３のいずれか１つの変種を好ましくは含む。ヘリカーゼは、Ｆａｚが１つまたは複数の特異的位置（または各特異的位置）にシステインの代わりに導入されているこれらの変種のいずれかを含み得る。
【０１４２】
本発明のヘリカーゼは、その表面負電荷を低減するためにさらに修飾される。表面残基は、上に開示のＤｄａドメインと同じ方法で同定され得る。表面負電荷は、典型的には、アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）などの表面の負に荷電したアミノ酸である。
【０１４３】
ヘリカーゼは、１つまたは複数の負に荷電したアミノ酸を１つもしくは複数の正に荷電したアミノ酸、無電荷アミノ酸、非極性アミノ酸および／もしくは芳香族アミノ酸で置換することによって、または１つもしくは複数の正に荷電したアミノ酸を、好ましくは１つもしくは複数の負に荷電したアミノ酸に隣接して導入することによって１つまたは複数の表面負電荷を中和するように好ましくは修飾される。好適な正に荷電したアミノ酸は、これだけに限らないが、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）を含む。無電荷アミノ酸は、正味電荷を有さない。好適な無電荷アミノ酸は、これだけに限らないが、システイン（Ｃ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）を含む。非極性アミノ酸は、非極性側鎖を有する。好適な非極性アミノ酸は、これだけに限らないが、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、プロリン（Ｐ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）およびバリン（Ｖ）を含む。芳香族アミノ酸は、芳香族側鎖を有する。好適な芳香族アミノ酸は、これだけに限らないが、ヒスチジン（Ｈ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）およびチロシン（Ｙ）を含む。
【０１４４】
好ましい置換は、これだけに限らないが、ＥのＲでの置換、ＥのＫでの置換、ＥのＮでの置換、ＤのＫでの置換およびＤのＲでの置換を含む。
【０１４５】
本発明のヘリカーゼは、配列番号８の変種を好ましくは含み、１つまたは複数の負に荷電したアミノ酸は、Ｄ５、Ｅ８、Ｅ２３、Ｅ４７、Ｄ１６７、Ｅ１７２、Ｄ２０２、Ｄ２１２およびＥ２７３の１つまたは複数である。それらの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個または８個などの任意の数のこれらのアミノ酸は、中和されてよい。任意の組合せが中和され得る。本発明のヘリカーゼは、配列番号９から２３のいずれか１つの変種、および配列番号８中のＤ５、Ｅ８、Ｅ２３、Ｅ４７、Ｄ１６７、Ｅ１７２、Ｄ２０２、Ｄ２１２およびＥ２７３の１つまたは複数に対応する１つまたは複数の負に荷電したアミノ酸を好ましくは含む。配列番号８中のＤ５、Ｅ８、Ｅ２３、Ｅ４７、Ｄ１６７、Ｅ１７２、Ｄ２０２、Ｄ２１２およびＥ２７３に対応する配列番号９から２３中のアミノ酸は、下の配列比較を使用して決定され得る。本発明のヘリカーゼは、（ａ）Ｅ９４Ｃ、Ｅ２７３ＧおよびＡ３６０Ｃまたは（ｂ）Ｅ９４Ｃ、Ｅ２７３Ｇ、Ｎ２９２ＧおよびＡ３６０Ｃを含む（またはそれだけを含む）配列番号８の変種を好ましくは含む。
【０１４６】
本発明のヘリカーゼは、１つまたは複数の天然システイン残基の除去によって好ましくはさらに修飾される。任意の数の天然システイン残基は、除去され得る。配列番号９から２３のそれぞれにおけるシステイン残基の数は、表１（＃Ｃとして）において示されている。１つまたは複数のシステイン残基は、好ましくは置換によって除去される。１つまたは複数のシステイン残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）またはバリン（Ｖ）で好ましくは置換される。本発明のヘリカーゼは、配列番号８の変種を好ましくは含み、１つまたは複数の天然システイン残基はＣ１０９、Ｃ１１４、Ｃ１３６、Ｃ１７１およびＣ４１２の１つまたは複数である。これらのシステイン残基の任意の数および組合せは、除去され得る。例えば配列番号８の変種は｛Ｃ１０９｝；｛Ｃ１１４｝；｛Ｃ１３６｝；｛Ｃ１７１｝；｛Ｃ４１２｝；｛Ｃ１０９およびＣ１１４｝；｛Ｃ１０９およびＣ１３６｝；｛Ｃ１０９およびＣ１７１｝；｛Ｃ１０９およびＣ４１２｝；｛Ｃ１１４およびＣ１３６｝；｛Ｃ１１４およびＣ１７１｝；｛Ｃ１１４およびＣ４１２｝；｛Ｃ１３６およびＣ１７１｝；｛Ｃ１３６およびＣ４１２｝；｛Ｃ１７１およびＣ４１２｝；｛Ｃ１０９、Ｃ１１４およびＣ１３６｝；｛Ｃ１０９、Ｃ１１４およびＣ１７１｝；｛Ｃ１０９、Ｃ１１４およびＣ４１２｝；｛Ｃ１０９、Ｃ１３６およびＣ１７１｝；｛Ｃ１０９、Ｃ１３６およびＣ４１２｝；｛Ｃ１０９、Ｃ１７１およびＣ４１２｝；｛Ｃ１１４、Ｃ１３６およびＣ１７１｝；｛Ｃ１１４、Ｃ１３６およびＣ４１２｝；｛Ｃ１１４、Ｃ１７１およびＣ４１２｝；｛Ｃ１３６、Ｃ１７１およびＣ４１２｝；｛Ｃ１０９、Ｃ１１４、Ｃ１３６およびＣ１７１｝；｛Ｃ１０９、Ｃ１１４、Ｃ１３６およびＣ４１２｝；｛Ｃ１０９、Ｃ１１４、Ｃ１７１およびＣ４１２｝；｛Ｃ１０９、Ｃ１３６、Ｃ１７１およびＣ４１２｝；｛Ｃ１１４、Ｃ１３６、Ｃ１７１およびＣ４１２｝；または｛Ｃ１０９、Ｃ１１４、Ｃ１３６、Ｃ１７１およびＣ４１２｝を含み得る。
【０１４７】
本発明のヘリカーゼは、好ましくは、少なくとも１つのシステイン残基（すなわち１つまたは複数のシステイン残基）および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸（すなわち１つまたは複数の非天然アミノ酸）がタワードメインだけに導入されたものである。好適な修飾は上に考察されている。
【０１４８】
本発明のヘリカーゼは、次の変異：
−  Ｅ９３ＣおよびＫ３６４Ｃ；
−  Ｅ９４ＣおよびＫ３６４Ｃ；
−  Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｌ９７ＣおよびＥ３６１Ｃ；
−  Ｌ９７ＣおよびＥ３６１ＣおよびＣ４１２Ａ；
−  Ｋ１２３ＣおよびＥ３６１Ｃ；
−  Ｋ１２３Ｃ、Ｅ３６１ＣおよびＣ４１２Ａ；
−  Ｎ１５５ＣおよびＫ３５８Ｃ；
−  Ｎ１５５Ｃ、Ｋ３５８ＣおよびＣ４１２Ａ；
−  Ｎ１５５ＣおよびＬ３５４Ｃ；
−  Ｎ１５５Ｃ、Ｌ３５４ＣおよびＣ４１２Ａ；
−  ｄｅｌｔａＥ９３、Ｅ９４Ｃ、ｄｅｌｔａＮ９５およびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、ｄｅｌｔａＮ９５およびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｑ１００Ｃ、Ｉ１２７ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｌ３５４Ｃ；
−  Ｇ３５７Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｇ３５７ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｙ２７９ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｉ２８１ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｙ２７９ＦａｚおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｙ２７９ＣおよびＧ３５７Ｃ；
−  Ｉ２８１ＣおよびＧ３５７Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｙ２７９Ｃ、Ｇ３５７ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｉ２８１Ｃ、Ｇ３５７ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ８Ｒ、Ｅ４７Ｋ、Ｅ９４Ｃ、Ｄ２０２ＫおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｄ５Ｋ、Ｅ２３Ｎ、Ｅ９４Ｃ、Ｄ１６７Ｋ、Ｅ１７２Ｒ、Ｄ２１２ＲおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｄ５Ｋ、Ｅ８Ｒ、Ｅ２３Ｎ、Ｅ４７Ｋ、Ｅ９４Ｃ、Ｄ１６７Ｋ、Ｅ１７２Ｒ、Ｄ２０２Ｋ、Ｄ２１２ＲおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｃ１１４Ａ、Ｃ１７１Ａ、Ａ３６０ＣおよびＣ４１２Ｄ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｃ１１４Ａ、Ｃ１７１Ａ、Ａ３６０ＣおよびＣ４１２Ｓ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｃ１０９Ａ、Ｃ１３６ＡおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｃ１３６Ａ、Ｃ１７１Ａ、Ａ３６０ＣおよびＣ４１２Ｓ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｃ１０９Ｖ、Ｃ１１４Ｖ、Ｃ１７１Ａ、Ａ３６０ＣおよびＣ４１２Ｓ；
−  Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｃ１３６Ａ、Ｇ１５３Ｃ、Ｃ１７１Ａ、Ｅ３６１ＣおよびＣ４１２Ａ；
−  Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｃ１３６Ａ、Ｇ１５３Ｃ、Ｃ１７１Ａ、Ｅ３６１ＣおよびＣ４１２Ｄ；
−  Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｃ１３６Ａ、Ｇ１５３Ｃ、Ｃ１７１Ａ、Ｅ３６１ＣおよびＣ４１２Ｓ；
−  Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｃ１３６Ａ、Ｇ１５３Ｃ、Ｃ１７１Ａ、Ｋ３５８ＣおよびＣ４１２Ａ；
−  Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｃ１３６Ａ、Ｇ１５３Ｃ、Ｃ１７１Ａ、Ｋ３５８ＣおよびＣ４１２Ｄ
−  Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｃ１３６Ａ、Ｇ１５３Ｃ、Ｃ１７１Ａ、Ｋ３５８ＣおよびＣ４１２Ｓ；
−  Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｃ１３６Ａ、Ｎ１５５Ｃ、Ｃ１７１Ａ、Ｋ３５８ＣおよびＣ４１２Ａ；
−  Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｃ１３６Ａ、Ｎ１５５Ｃ、Ｃ１７１Ａ、Ｋ３５８ＣおよびＣ４１２Ｄ；
−  Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｃ１３６Ａ、Ｎ１５５Ｃ、Ｃ１７１Ａ、Ｋ３５８ＣおよびＣ４１２Ｓ；
−  Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｃ１３６Ａ、Ｎ１５５Ｃ、Ｃ１７１Ａ、Ｌ３５４ＣおよびＣ４１２Ａ；
−  Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｃ１３６Ａ、Ｎ１５５Ｃ、Ｃ１７１Ａ、Ｌ３５４ＣおよびＣ４１２Ｄ；
−  Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｃ１３６Ａ、Ｎ１５５Ｃ、Ｃ１７１Ａ、Ｌ３５４ＣおよびＣ４１２Ｓ；
−  Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｋ１２３Ｃ、Ｃ１３６Ａ、Ｃ１７１Ａ、Ｅ３６１ＣおよびＣ４１２Ａ；
−  Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｋ１２３Ｃ、Ｃ１３６Ａ、Ｃ１７１Ａ、Ｅ３６１ＣおよびＣ４１２Ｄ；
−  Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｋ１２３Ｃ、Ｃ１３６Ａ、Ｃ１７１Ａ、Ｅ３６１ＣおよびＣ４１２Ｓ；
−  Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｋ１２３Ｃ、Ｃ１３６Ａ、Ｃ１７１Ａ、Ｋ３５８ＣおよびＣ４１２Ａ；
−  Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｋ１２３Ｃ、Ｃ１３６Ａ、Ｃ１７１Ａ、Ｋ３５８ＣおよびＣ４１２Ｄ；
−  Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｋ１２３Ｃ、Ｃ１３６Ａ、Ｃ１７１Ａ、Ｋ３５８ＣおよびＣ４１２Ｓ；
−  Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｃ１３６Ａ、Ｇ１５３Ｃ、Ｃ１７１Ａ、Ｅ３６１ＣおよびＣ４１２Ａ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｃ１３６Ａ、Ｃ１７１Ａ、Ａ３６０ＣおよびＣ４１２Ｄ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ｖ、Ｃ１３６Ａ、Ｃ１７１Ａ、Ａ３６０ＣおよびＣ４１２Ｄ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｃ１０９Ｖ、Ｃ１１４Ａ、Ｃ１３６Ａ、Ｃ１７１Ａ、Ａ３６０ＣおよびＣ４１２Ｄ；
−  Ｌ９７Ｃ、Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｃ１３６Ａ、Ｃ１７１Ａ、Ｅ３６１ＣおよびＣ４１２Ａ；
−  Ｌ９７Ｃ、Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｃ１３６Ａ、Ｃ１７１Ａ、Ｅ３６１ＣおよびＣ４１２Ｄ；または
−  Ｌ９７Ｃ、Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｃ１３６Ａ、Ｃ１７１Ａ、Ｅ３６１ＣおよびＣ４１２Ｓ
を含んでいる（またはそれだけを含んでいる）配列番号８の変種を好ましくは含む。
【０１４９】
フックドメインおよび／または２Ａドメイン中の修飾
一実施形態では本発明のＤｄａヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸がフックドメインおよび／または２Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメインに導入されているものであって、ポリヌクレオチドの移動を制御するその能力を保持しているものである。少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は、フックドメインおよび２Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメインに好ましくは導入されている。
【０１５０】
任意の数のシステイン残基および／または非天然アミノ酸が各ドメインに導入され得る。例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれ以上のシステイン残基が導入されてよく、および／または１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれ以上の非天然アミノ酸が導入されてよい。１つまたは複数のシステイン残基だけが導入されてよい。１つまたは複数の非天然アミノ酸だけが導入されてよい。１つまたは複数のシステイン残基と１つまたは複数の非天然アミノ酸との組合せが導入されてよい。
【０１５１】
少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は、置換によって好ましくは導入される。これを行うための方法は、当技術分野において公知である。フックドメインおよび／または２Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメインの好適な修飾は、上に考察されている。
【０１５２】
本発明のヘリカーゼは、好ましくは（ａ）Ｙ２７９Ｃ、Ｉ１８１Ｃ、Ｅ２８８Ｃ、Ｙ２７９ＣおよびＩ１８１Ｃ、（ｂ）Ｙ２７９ＣおよびＥ２８８Ｃ、（ｃ）Ｉ１８１ＣおよびＥ２８８Ｃまたは（ｄ）Ｙ２７９Ｃ、Ｉ１８１ＣおよびＥ２８８Ｃを含む（またはそれだけを含む）配列番号８の変種である。本発明のヘリカーゼは、（ａ）から（ｄ）に定義の配列番号８中のものに対応する１つまたは複数の位置（複数可）に変異を含む配列番号９から２３のいずれか１つの変種を好ましくは含む。
【０１５３】
表面修飾
一実施形態ではＤｄａヘリカーゼは、その表面負電荷を低減するように修飾され、ヘリカーゼは、ポリヌクレオチドの移動を制御するその能力を保持している。好適な修飾は、上に考察されている。任意の数の表面負電荷は、中和されてよい。
【０１５４】
本発明のヘリカーゼは、次の変異：
−  Ｅ２７３Ｇ；
−  Ｅ８Ｒ、Ｅ４７ＫおよびＤ２０２Ｋ；
−  Ｄ５Ｋ、Ｅ２３Ｎ、Ｄ１６７Ｋ、Ｅ１７２ＲおよびＤ２１２Ｒ；
−  Ｄ５Ｋ、Ｅ８Ｒ、Ｅ２３Ｎ、Ｅ４７Ｋ、Ｄ１６７Ｋ、Ｅ１７２Ｒ、Ｄ２０２ＫおよびＤ２１２Ｒ
を含む（またはそれだけを含む）配列番号８の変種を好ましくは含む。
【０１５５】
他の修飾ヘリカーゼ
一実施形態では本発明のＤｄａヘリカーゼは：
−  Ａ３６０Ｋ；
−  Ｙ９２Ｌおよび／またはＡ３６０Ｙ；
−  Ｙ９２Ｌ、Ｙ３５０ＮおよびＹ３６３Ｎ；
−  Ｙ９２Ｌおよび／またはＹ３６３Ｎ；または
−  Ｙ９２Ｌ
を含む（またはそれだけを含む）配列番号８の変種を好ましくは含む。
【０１５６】
他の修飾
上に考察の特異的変異に加えて配列番号８の変種は、１つまたは複数の次の変異：
−  Ｋ３８Ａ；
−  Ｈ６４Ｎ；
−  Ｈ６４Ｋ；
−  Ｈ６４Ｑ；
−  Ｈ６４Ｓ；
−  Ｈ６４Ｗ；
−  Ｔ８０Ｋ；
−  Ｔ８０Ｎ；
−  Ｈ８２Ａ；
−  Ｈ８２Ｆ；
−  Ｈ８２Ｑ；
−  Ｈ８２Ｒ；
−  Ｈ８２Ｗ；
−  Ｈ８２Ｙ；
−  Ｓ８３Ｋ；
−  Ｓ８３Ｎ；
−  Ｓ８３Ｔ；
−  Ｎ８８Ｈ；
−  Ｎ８８Ｑ；
−  Ｐ８９Ａ；
−  Ｐ８９Ｆ；
−  Ｐ８９Ｓ；
−  Ｐ８９Ｔ；
−  Ｐ８９Ｗ；
−  Ｐ８９Ｙ；
−  Ｔ９１Ｆ；
−  Ｔ９１Ｎ；
−  Ｔ９１Ｑ；
−  Ｔ９１Ｗ；
−  Ｖ９６Ｅ；
−  Ｖ９６Ｆ；
−  Ｖ９６Ｌ
−  Ｖ９６Ｑ；
−  Ｖ９６Ｒ；
−  Ｖ９６Ｗ；
−  Ｖ９６Ｙ；
−  Ｆ９８Ａ
−  Ｆ９８Ｌ；
−  Ｆ９８Ｖ；
−  Ｆ９８Ｗ；
−  Ｆ９８Ｙ；
−  Ｖ１５０Ａ；
−  Ｖ１５０Ｆ；
−  Ｖ１５０Ｉ；
−  Ｖ１５０Ｋ；
−  Ｖ１５０Ｌ；
−  Ｖ１５０Ｓ；
−  Ｖ１５０Ｔ；
−  Ｖ１５０Ｗ；
−  Ｖ１５０Ｙ；
−  Ｆ２４０Ｗ；
−  Ｆ２４０Ｙ；
−  Ｎ２４２Ｋ；
−  Ｐ２７４Ｇ；
−  Ｆ２７６Ａ；
−  Ｆ２７６Ｉ；
−  Ｆ２７６Ｍ；
−  Ｆ２７６Ｖ；
−  Ｆ２７６Ｗ；
−  Ｆ２７６Ｙ；
−  Ｖ２８６Ｆ；
−  Ｖ２８６Ｗ；
−  Ｖ２８６Ｙ；
−  Ｓ２８７Ｆ；
−  Ｓ２８７Ｗ；
−  Ｓ２８７Ｙ；
−  Ｆ２９１Ｇ；
−  Ｎ２９２Ｆ；
−  Ｎ２９２Ｇ；
−  Ｎ２９２Ｐ；
−  Ｎ２９２Ｙ；
−  Ｎ２９３Ｆ；
−  Ｎ２９３Ｋ；
−  Ｎ２９３Ｑ；
−  Ｎ２９３Ｙ；
−  Ｇ２９４Ｙ；
−  Ｇ２９４Ｆ；
−  Ｋ３６４Ａ；
−  Ｗ３７８Ａ；
−  Ｔ３９４Ｋ；
−  Ｔ３９４Ｎ；
−  Ｈ３９６Ｑ；
−  Ｈ３９６Ｓ；
−  Ｈ３９６Ｗ；
−  Ｙ４１５Ｆ；
−  Ｙ４１５Ｋ；
−  Ｙ４１５Ｍ；または
−  Ｙ４１５Ｗ
を変種を含んでよい（またはそれだけを含んでよい）。
【０１５７】
本発明のヘリカーゼは：
−  Ｋ３８Ａ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｈ６４Ｋ；Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｈ６４Ｎ；Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｈ６４Ｑ；Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｈ６４Ｓ；Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｈ６４Ｗ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｔ８０Ｋ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｔ８０Ｋ、Ｓ８３Ｋ、Ｅ９４Ｃ、Ｎ２４２Ｋ、Ｎ２９３ＫおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｔ８０Ｋ、Ｓ８３Ｋ、Ｅ９４Ｃ、Ｎ２４２Ｋ、Ｎ２９３Ｋ、Ａ３６０ＣおよびＴ３９４Ｋ；
−  Ｔ８０Ｋ、Ｓ８３Ｋ、Ｅ９４Ｃ、Ｎ２９３ＫおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｔ８０Ｋ、Ｓ８３Ｋ、Ｅ９４Ｃ、Ａ３６０ＣおよびＴ３９４Ｋ；
−  Ｔ８０Ｋ、Ｓ８３Ｋ、Ｅ９４Ｃ、Ａ３６０ＣおよびＴ３９４Ｎ；
−  Ｔ８０Ｋ、Ｅ９４Ｃ、Ｎ２４２ＫおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｔ８０Ｋ、Ｅ９４Ｃ、Ｎ２４２Ｋ、Ｎ２９３ＫおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｔ８０Ｋ、Ｅ９４Ｃ、Ｎ２９３ＫおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｔ８０Ｎ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｈ８２Ａ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｈ８２Ａ、Ｐ８９Ａ、Ｅ９４Ｃ、Ｆ９８ＡおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｈ８２Ｆ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｈ８２Ｑ、Ｅ９４Ｃ、Ａ３６０Ｃ；
−  Ｈ８２Ｒ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｈ８２Ｗ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｈ８２Ｗ、Ｐ８９Ｗ、Ｅ９４Ｃ、Ｆ９８ＷおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｈ８２Ｙ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｓ８３Ｋ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｓ８３Ｋ、Ｔ８０Ｋ、Ｅ９４Ｃ、Ａ３６０ＣおよびＴ３９４Ｋ；
−  Ｓ８３Ｎ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｓ８３Ｔ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｎ８８Ｈ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｎ８８Ｑ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｐ８９Ａ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｐ８９Ａ、Ｆ９８Ｗ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｐ８９Ａ、Ｅ９４Ｃ、Ｆ９８ＹおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｐ８９Ａ、Ｅ９４Ｃ、Ｆ９８ＡおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｐ８９Ｆ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｐ８９Ｓ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｐ８９Ｔ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｐ８９Ｗ、Ｅ９４Ｃ、Ｆ９８ＷおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｐ８９Ｙ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｔ９１Ｆ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｔ９１Ｎ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｔ９１Ｑ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｔ９１Ｗ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｖ９６ＥおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｖ９６ＦおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｖ９６ＬおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｖ９６ＱおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｖ９６ＲおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｖ９６ＷおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｖ９６ＹおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｆ９８ＡおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｆ９８ＬおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｆ９８ＶおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｆ９８ＹおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ；Ｆ９８ＷおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｖ１５０ＡおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｖ１５０ＦおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｖ１５０ＩおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｖ１５０ＫおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｖ１５０ＬおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｖ１５０ＳおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｖ１５０ＴおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｖ１５０ＷおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｖ１５０ＹおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｆ２４０ＹおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｆ２４０ＷおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｎ２４２ＫおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｎ２４２Ｋ、Ｎ２９３ＫおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｐ２７４ＧおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｌ２７５ＧおよびＡ３６０Ｃ
−  Ｅ９４Ｃ、Ｆ２７６ＡおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｆ２７６ＩおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｆ２７６ＭおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｆ２７６ＶおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｆ２７６ＷおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｆ２７６ＹおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｖ２８６ＦおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｖ２８６ＷおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｖ２８６ＹおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｓ２８７ＦおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｓ２８７ＷおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｓ２８７ＹおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｆ２９１ＧおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｎ２９２ＦおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｎ２９２ＧおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｎ２９２ＰおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｎ２９２ＹおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｎ２９３ＦおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｎ２９３ＫおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｎ２９３ＱおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｎ２９３ＹおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｇ２９４ＦおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｇ２９４ＹおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ａ３６ＣおよびＫ３６４Ａ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ａ３６０Ｃ、Ｗ３７８Ａ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ａ３６０ＣおよびＴ３９４Ｋ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ａ３６０ＣおよびＨ３９６Ｑ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ａ３６０ＣおよびＨ３９６Ｓ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ａ３６０ＣおよびＨ３９６Ｗ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ａ３６０ＣおよびＹ４１５Ｆ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ａ３６０ＣおよびＹ４１５Ｋ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ａ３６０ＣおよびＹ４１５Ｍ；または
−  Ｅ９４Ｃ、Ａ３６０ＣおよびＹ４１５Ｗ
を含む（またはそれだけを含む）配列番号８の変種を好ましくは含む。
【０１５８】
本発明のヘリカーゼは、（ａ）Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａ、（ｂ）Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａ  Ｗ３７８Ａおよびさらに（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２（すなわちＭ１の欠失ならびにさらにＧ１およびＧ２付加）、（ｃ）Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｗ３７８Ａまたは（ｄ）Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｗ３７８Ａおよびさらに（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２（すなわちＭ１の欠失ならびにさらにＧ１およびＧ２付加）を含む（またはそれだけを含む）配列番号８の変種を好ましくは含む。
【０１５９】
変種
Ｄｄａヘリカーゼの変種は、野生型ヘリカーゼのものから変化しており、ポリヌクレオチド結合活性を保持しているアミノ酸配列を有する酵素である。具体的には配列番号８から２３のいずれか１つの変種は、配列番号８から２３のいずれか１つのものから変化しており、ポリヌクレオチド結合活性を保持しているアミノ酸配列を有する酵素である。ポリヌクレオチド結合活性は、当技術分野において公知の任意の方法を使用して決定できる。好適な方法は、これだけに限らないが、蛍光偏光測定、トリプトファン蛍光および電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を含む。例えば１本鎖ポリヌクレオチドに結合する変種の能力は、実施例に記載のとおり決定できる。
【０１６０】
変種はヘリカーゼ活性を保持している。これは、種々の方法において測定できる。例えばポリヌクレオチドに沿って移行させる変種の能力は電気生理化学、蛍光アッセイまたはＡＴＰ加水分解を使用して測定され得る。
【０１６１】
変種は、ヘリカーゼをコードするポリヌクレオチドの操作を促進するならびに／または高塩濃度および／もしくは室温でのその活性を促進する修飾を含む場合がある。
【０１６２】
配列番号８から２３のいずれか１つのアミノ酸配列全長にわたって、変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列に好ましくは少なくとも２０％相同性である。より好ましくは変種ポリペプチドは、配列番号８から２３のいずれか１つのアミノ酸配列に配列全体にわたるアミノ酸同一性に基づいて少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同性である。１００個またはそれ以上、例えば１５０個、２００個、３００個、４００個または５００個またはそれ以上の近接アミノ酸のストレッチにわたって少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％、アミノ酸同一性がある（「高い相同性」）。相同性は、下に記載の通り決定される。変種は、配列番号２および４を参照して下に考察する任意の方法で野生型配列とは異なっていてよい。具体的には上に考察の特異的修飾に加えて配列番号８から２３のいずれか１つの変種は、下に考察の１つまたは複数の置換、１つまたは複数の欠失および／または１つまたは複数の付加を含んでよい。
【０１６３】
配列番号８から２３のいずれか１つの好ましい変種は、アミノ（Ｎ）末端におよび／またはカルボキシ（Ｃ）末端にＦａｚなどの非天然アミノ酸を有する。配列番号８から２３のいずれか１つの好ましい変種は、アミノ（Ｎ）末端および／またはカルボキシ（Ｃ）末端にシステイン残基を有する。配列番号８から２３のいずれか１つの好ましい変種は、システイン残基をアミノ（Ｎ）端に、およびＦａｚなどの非天然アミノ酸をカルボキシ（Ｃ）末端にまたは逆に有する。
【０１６４】
配列番号８の好ましい変種は、次の修飾Ｅ５４Ｇ、Ｄ１５１Ｅ、Ｉ１９６ＮおよびＧ３５７Ａの全てなどの１つまたは複数を含有する。
【０１６５】
配列番号８から２３のいずれか１つの最も好ましい変種は（本発明の修飾に加えて）欠失され、２つのグリシン残基（ＧＧ）で置き換えられたＮ末端メチオニン（Ｍ）を有する。実施例では、これは（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２として示される。例えば、配列番号８の好ましい変種は：
−  Ｅ９４Ｃ、Ａ３６０Ｃおよびさらに（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２；ならびに
−  Ｅ９４Ｃ、Ｃ１０９Ａ、Ｃ１３６Ａ、Ａ３６０Ｃおよびさらに（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２
を含む（またはそれだけを含む）。
【０１６６】
Ｄｄａヘリカーゼ断片
本発明は、本発明のヘリカーゼを産生するために使用され得るＤｄａヘリカーゼの断片も提供する。第一の実施形態ではポリペプチドは、Ｄｄａヘリカーゼ由来のピンドメインおよび１Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメインを含み、Ｄｄａヘリカーゼ由来の任意の他のドメインを含まず、ここで少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は、ピンドメインおよび／または１Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメインに導入されている。ドメインが由来する場合がある好ましいヘリカーゼは、配列番号８から２３のいずれかを含み得る。これらのヘリカーゼの関連ドメインは、上の表２に定義されている。ピンドメインおよび／または１Ａドメインは、本発明のヘリカーゼについて上に考察の任意の方法で修飾され得る。具体的にはポリペプチドは、上に定義のピンドメインおよび１Ａドメインのいずれかの変種ならびに上に定義のピンドメインおよび／または１Ａドメイン変異を含んでよい。
【０１６７】
第二の実施形態ではポリペプチドは、Ｄｄａヘリカーゼ由来の２Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメイン、タワードメインおよびフックドメインを含み、Ｄｄａヘリカーゼ由来の任意の他のドメインを含まず、ここで少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は、タワードメインに導入されている。ドメインが由来する場合がある好ましいヘリカーゼは、配列番号８から２３のいずれかを含んでよい。これらのヘリカーゼの関連ドメインは、上の表２に定義されている。タワードメインは、本発明のヘリカーゼについて上に考察の任意の方法で修飾され得る。具体的にはポリペプチドは、上に定義のタワーのいずれかの変種および上に定義のいずれかのタワー変異を含んでよい。
【０１６８】
上に考察の特異的修飾に加えて本発明のポリペプチドは、配列番号２および４を参照して下に考察の１つまたは複数の置換、１つまたは複数の欠失および／または１つまたは複数の付加を含んでよい。
【０１６９】
本発明は、第二の実施形態のポリペプチドに共有結合的に付着している第一の実施形態のポリペプチドを含むヘリカーゼであって、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有するヘリカーゼも提供する。ポリヌクレオチドの移動を制御するヘリカーゼの能力は、上に考察したとおり決定され得る。
【０１７０】
非接続
好ましい一実施形態では、本発明の修飾Ｄｄａヘリカーゼ中の導入されたシステインおよび／または非天然アミノ酸は、いずれも互いに繋がれていない。
【０１７１】
２つ以上の導入されたシステインおよび／または非天然アミノ酸を繋ぐステップ
別の好ましい実施形態では、本発明の修飾Ｄｄａヘリカーゼ中の２つ以上の導入されたシステインおよび／または非天然アミノ酸は、互いに繋がれている。これは、典型的にはポリヌクレオチドから解離する本発明のヘリカーゼの能力を低減する。
【０１７２】
２つ以上の導入されたシステインおよび／または非天然アミノ酸の任意の数および組合せは、互いに繋がれていてよい。例えば３個、４個、５個、６個、７個、８個またはそれ以上のシステインおよび／または非天然アミノ酸は、互いに繋がれてよい。１つまたは複数のシステインは、１つまたは複数のシステインに繋がれてよい。１つまたは複数のシステインは、Ｆａｚなどの１つまたは複数の非天然アミノ酸に繋がれてよい。Ｆａｚなどの１つまたは複数の非天然アミノ酸は、Ｆａｚなどの１つまたは複数の非天然アミノ酸に繋がれてよい。
【０１７３】
２つ以上のシステインおよび／または非天然アミノ酸は、任意の方法で繋がれてよい。接続は、一過的、例えば非共有結合であってよい。一過的接続でさえヘリカーゼからのポリヌクレオチドの解離を低減する。
【０１７４】
２つ以上のシステインおよび／または非天然アミノ酸は、親和性分子によって好ましくは繋がれている。好適な親和性分子は、当技術分野において公知である。親和性分子は、好ましくは、（ａ）相補的ポリヌクレオチド（国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３２号（ＷＯ２０１０／０８６６０２として公開）、（ｂ）抗体またはその断片および相補的エピトープ（Biochemistry 6thEd、W.H. Freeman and co (2007) pp953-954）、（ｃ）ペプチドジッパー（OSheaら、Science 254 (5031): 539-544）、（ｄ）β−シート増強により相互作用できる（Remaut and Waksman Trends Biochem. Sci. (2006) 31 436-444）、（ｅ）水素結合、ｐｉ−スタッキングまたは塩橋形成できる、（ｆ）ロタキサン（Xiang Ma and He Tian Chem. Soc. Rev.、2010,39、70-80）、（ｇ）アプタマーおよび相補的タンパク質（James、W. in Encyclopedia of Analytical Chemistry、R.A. Meyers (Ed.) pp. 4848-4871 John Wiley & Sons Ltd、Chichester、2000）または（ｈ）ハーフキレーター（half-chelator）（Hammersteinら J Biol Chem. 2011 April 22; 286(16): 14324-14334）である。（ｅ）に関して水素結合は電気陰性原子に結合したプロトンと別の電気陰性原子との間に生じる。ｐｉ−スタッキングは、環の平面が平行である場合に互いにスタックできる２つの芳香族環を必要とする。塩橋は、それらの電子をいくつかの原子に非局在化できる基の間、例えばアスパラギン酸とアルギニンとの間にある。
【０１７５】
２つ以上の部分は、ヘキサｈｉｓタグまたはＮｉ−ＮＴＡによって一過的に繋がれる場合がある。
【０１７６】
２つ以上のシステインおよび／または非天然アミノ酸は、好ましくは持続的に繋がれている。本発明の内容では、ヘリカーゼが使用されている間に破壊されないまたは−Ｓ−Ｓ−結合を開くための還元を使用するなどの、使用者の部分への介入なしには破壊されない場合に接続は永久的である。
【０１７７】
２つ以上のシステインおよび／または非天然アミノ酸は、好ましくは共有結合的に付着される。２つ以上のシステインおよび／または非天然アミノ酸は、当技術分野において公知の任意の方法を使用して共有結合的に付着されてよい。
【０１７８】
２つ以上のシステインおよび／または非天然アミノ酸は、システイン、スレオニン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸およびグルタミンなどのそれらの天然に存在するアミノ酸を介して共有結合的に付着されてよい。天然に存在するアミノ酸は、付着を促進するために修飾されてよい。例えば天然に存在するアミノ酸は、アシル化、リン酸化、グリコシル化またはファルネシル化によって修飾されてよい。他の好適な修飾は、当技術分野において公知である。天然に存在するアミノ酸への修飾は、翻訳後修飾であってよい。２つ以上のシステインおよび／または非天然アミノ酸は、それらの配列に導入されたアミノ酸を介して付着されてよい。そのようなアミノ酸は、好ましくは置換によって導入される。導入されるアミノ酸は、システインまたは付着を促進する非天然アミノ酸であってよい。好適な非天然アミノ酸は、これだけに限らないが、４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）、Liu C. C. and Schultz P. G.、Annu. Rev. Biochem.、2010、79、413-444の図１に含まれている１〜７１と番号付けられたアミノ酸のいずれか１つまたは下に列挙するアミノ酸のいずれか１つを含む。導入されるアミノ酸は、上に考察したとおり修飾されてよい。
【０１７９】
好ましい実施形態では、２つ以上のシステインおよび／または非天然アミノ酸は、リンカーを使用して繋がれている。リンカー分子は、下により詳細に考察される。接続の１つの好適な方法は、システイン連結である。これは下でより詳細に考察される。２つ以上のシステインおよび／または非天然アミノ酸は、１つまたは複数、２つまたは３つなどのリンカーを使用して好ましくは繋がれている。１つまたは複数のリンカーは、上に考察したとおり開口部のサイズを低減するまたは閉じるように設計されてよい。１つまたは複数のリンカーが上に考察したとおり開口部を閉じるために使用される場合、１つまたは複数のリンカーの少なくとも部分は、ヘリカーゼに結合した際にポリヌクレオチドと平行ではないように好ましくは方向付けられる。より好ましくは全てのリンカーは、この様式で方向付けられる。１つまたは複数のリンカーが上に考察したとおり開口部を閉じるために使用される場合、１つまたは複数のリンカーの少なくとも部分は、好ましくはヘリカーゼに結合した際にポリヌクレオチドと平行ではない方向で開口部に交差している。より好ましくは全てのリンカーがこの様式で開口部に交差している。これらの実施形態では１つまたは複数のリンカーの少なくとも部分は、ポリヌクレオチドに垂直であってよい。そのような方向は、ポリヌクレオチドが開口部を通ってヘリカーゼから解離できないように開口部を効果的に閉じる。
【０１８０】
各リンカーは、２個、３個または４個の機能末端などの２個以上の機能末端を有する場合がある。リンカーにおける末端の好適な立体配置は当技術分野において十分公知である。
【０１８１】
１つまたは複数のリンカーの１つまたは複数の末端は、好ましくはヘリカーゼに共有結合的に付着している。一方の末端が共有結合的に付着されている場合、１つまたは複数のリンカーは、上に考察したとおり２つ以上のシステインおよび／または非天然アミノ酸を一過的に繋いでよい。両方または全ての末端が共有結合的に付着されている場合、１つまたは複数のリンカーは、２つ以上のシステインおよび／または非天然アミノ酸を持続的に繋ぐ。
【０１８２】
１つまたは複数のリンカーは、好ましくはアミノ酸配列および／または化学的架橋剤である。
【０１８３】
ペプチドリンカーなどの好適なアミノ酸リンカーは、当技術分野において公知である。アミノ酸またはペプチドリンカーの長さ、可動性および親水性は、開口部のサイズを低減するが、ヘリカーゼの機能を妨害しないように典型的には設計される。好ましい可動性ペプチドリンカーは４、６、８、１０または１６などの２から２０のセリンおよび／またはグリシンアミノ酸のストレッチである。より好ましい可動性リンカーは（ＳＧ）１、（ＳＧ）２、（ＳＧ）３、（ＳＧ）４、（ＳＧ）５、（ＳＧ）８、（ＳＧ）１０、（ＳＧ）１５または（ＳＧ）２０を含み、式中Ｓはセリンであり、Ｇはグリシンである。好ましい硬いリンカーは、４、６、８、１６または２４などの２から３０のプロリンアミノ酸のストレッチである。より好ましい硬いリンカーは（Ｐ）１２を含み、式中Ｐはプロリンである。リンカーのアミノ酸配列は、好ましくはポリヌクレオチド結合成分を含む。そのような成分およびそれらの使用に関連する有利点は、下に考察される。
【０１８４】
好適な化学的架橋剤は、当技術分野において十分公知である。好適な化学的架橋剤は、これだけに限らないが、次の官能基: マレイミド、活性エステル、サクシニミド、アジド、アルキン（ジベンゾシクロオクチノール（ＤＩＢＯまたはＤＢＣＯ）、ジフルオロシクロアルカンおよび直鎖アルカンなど）、ホスフィン（無痕跡および無痕跡でないシュタウディンガーライゲーションにおいて使用されるものなど）、ハロアセチル（ヨードアセトアミドなど）、ホスゲン型試薬、スルホニルクロリド試薬、イソチオシアン酸、ハロゲン化アシル、ヒドラジン、ジスルフィド、ビニルスルホン、アジリジンおよび光反応性試薬（アリールアジド、ジアジリジンなど）を含むものを含む。
【０１８５】
システイン／マレイミドなど、アミノ酸と官能基との間の反応は自発的であってよく、またはアジドと直鎖状アルキンを連結するためのＣｕ（Ｉ）など、他の試薬を必要としてよい。
【０１８６】
リンカーは、必要な距離にわたって伸びる任意の分子を含んでよい。リンカーは、炭素１個（ホスゲン型リンカー）から多数のオングストロームに長さが変化できる。直鎖状分子の例に含まれるのは、これだけに限らないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリペプチド、多糖、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、飽和および不飽和炭化水素、ポリアミドである。これらのリンカーは不活性または反応性であってよく、具体的にはそれらは、規定の位置で化学的に切断可能であってよい、またはフルオロフォアもしくはリガンドでそれ自体が修飾されてよい。リンカーは、好ましくはジチオスレイトール（dithiothreitol）（ＤＴＴ）に抵抗性である。
【０１８７】
好ましい架橋剤は、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル３−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロパノエート、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−（ピリジン−２−イルジスルファニル）ブタノエートおよび２，５−ジオキソピロリジン−１−イル８−（ピリジン−２−イルジスルファニル）オクタノエート、ジ−マレイミドＰＥＧ  １ｋ、ジ−マレイミドＰＥＧ  ３．４ｋ、ジ−マレイミドＰＥＧ  ５ｋ、ジ−マレイミドＰＥＧ  １０ｋ、ビス（マレイミド）エタン（ＢＭＯＥ）、ビス−マレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、１，４−ビス−マレイミドブタン（ＢＭＢ）、１，４ビス−マレイミジル−２，３−ジヒドロキシブタン（ＢＭＤＢ）、ＢＭ［ＰＥＯ］２（１，８−ビス−マレイミドジエチレングリコール）、ＢＭ［ＰＥＯ］３（１，１１−ビス−マレイミドトリエチレングリコール）、トリス［２−マレイミドエチル］アミン（ＴＭＥＡ）、ＤＴＭＥジチオビスマレイミドエタン、ビスマレイミドＰＥＧ３、ビスマレイミドＰＥＧ１１、ＤＢＣＯ−マレイミド、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−マレイミド、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨ２、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨＳ、ＤＢＣＯ−ＮＨＳ、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ−ＤＢＣＯ  ２．８ｋＤａ、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ−ＤＢＣＯ  ４．０ｋＤａ、ＤＢＣＯ−１５原子−ＤＢＣＯ、ＤＢＣＯ−２６原子−ＤＢＣＯ、ＤＢＣＯ−３５原子−ＤＢＣＯ、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−Ｓ−Ｓ−ＰＥＧ３−ビオチン、ＤＢＣＯ−Ｓ−Ｓ−ＰＥＧ３−ビオチン、ＤＢＣＯ−Ｓ−Ｓ−ＰＥＧ１１−ビオチン、（サクシニジミル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）およびマレイミド−ＰＥＧ（２ｋＤａ）−マレイミド（アルファ、オメガ−ビス−マレイミドポリ（エチレングリコール））を含む。最も好ましい架橋剤は、マレイミド−プロピル−ＳＲＤＦＷＲＳ−（１，２−ジアミノエタン）−プロピル−マレイミドである。
【０１８８】
１つまたは複数のリンカーは、切断可能であってよい。これは下でより詳細に考察される。
【０１８９】
２つ以上のシステインおよび／または非天然アミノ酸は、互いに特異的である２つの異なるリンカーを使用して繋がれてよい。リンカーの１つは、一部に付着されており、他方は別の一部に付着されている。リンカーは、本発明の修飾ヘリカーゼを形成するように反応するはずである。２つ以上のシステインおよび／または非天然アミノ酸は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３２号（ＷＯ２０１０／０８６６０２として公開）に記載のハイブリダイゼーションリンカーを使用して繋がれてよい。具体的には２つ以上のシステインおよび／または非天然アミノ酸は、ハイブリダイズ可能な領域および共有結合を形成できる基をそれぞれ含む２つ以上のリンカーを使用して繋がれてよい。リンカー中のハイブリダイズ可能な領域は、２つ以上のシステインおよび／または非天然アミノ酸とハイブリダイズし、連結する。連結したシステインおよび／または非天然アミノ酸は、次いで基の間の共有結合の形成を介してカップルする。国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３２号（ＷＯ２０１０／０８６６０２として公開）に開示の任意の特異的リンカーは、本発明により使用できる。
【０１９０】
２つ以上のシステインおよび／または非天然アミノ酸は、修飾されてよく、次いで２つの修飾に特異的である化学的架橋剤を使用して付着され得る。上に考察の任意の架橋剤は使用され得る。
【０１９１】
リンカーは、標識されてよい。好適な標識は、これだけに限らないが、蛍光分子（Ｃｙ３またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５５５など）、放射性同位元素、例えば  １２５Ｉ、３５Ｓ、酵素、抗体、抗原、ポリヌクレオチドおよび、ビオチンなどのリガンドを含む。そのような標識は、リンカーの量を定量できるようにする。標識は、ビオチンなどの切断可能な精製タグ、またはタンパク質自体には存在しないがトリプシン消化によって遊離されるペプチドなどの同定方法において明らかになる特異的配列であってもよい。
【０１９２】
２つ以上のシステインを繋ぐ好ましい方法は、システイン連結を介する。これは、二機能性化学的架橋剤により、または末端に存在するシステイン残基を有するアミノ酸リンカーにより調節できる。
【０１９３】
任意の二機能性リンカーの長さ、反応性、特異性、硬さおよび溶解度は、開口部のサイズが十分に低減され、ヘリカーゼの機能が保持されることを確実にするように設計される場合がある。好適なリンカーは、１，４−ビス（マレイミド）ブタン（ＢＭＢ）またはビス（マレイミド）ヘキサンなどのビスマレイミド架橋剤を含む。特異的部位での付着が好ましい場合に、表面の利用可能なシステイン残基への二機能性リンカーの結合は制御することが困難である場合があり、基質結合または活性に影響を与える場合があることから、二機能性リンカーを引き戻すものは、さらなる表面の利用可能なシステイン残基を含まないヘリカーゼの必要性である。ヘリカーゼがいくつかの利用可能なシステイン残基を含有する場合は、修飾がヘリカーゼのフォールディングまたは活性に影響を与えないことを確実にしながら、それらを除去するためにヘリカーゼの修飾が必要である場合がある。これは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）において考察されている。システイン残基の反応性は隣接残基の、例えばペプチドリンカー上の修飾によって増強できる。例えば近接するアルギニン、ヒスチジンまたはリシン残基の塩基性基は、システインチオール基のｐＫａをさらに反応性のＳ−基のものに変化させる。システイン残基の反応性は、５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ｄＴＮＢ）などのチオール保護基によって保護できる。これらは、リンカーが付着する前にヘリカーゼの１つまたは複数のシステイン残基と反応できる。表面の利用可能なシステインの選択的脱保護は、ビーズに固定した還元試薬（例えば固定化トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、ＴＣＥＰ）を使用して可能である。システイン連結は、下により詳細に考察される。
【０１９４】
Ｆａｚ連結を介する付着の別の好ましい方法。これは、二機能性化学的リンカーによって、または末端に存在するＦａｚ残基を有するポリペプチドリンカーによって調節されてよい。
【０１９５】
本発明の他の修飾ヘリカーゼ
本発明は（ｉ）タワードメインと（ｉｉ）ピンドメインおよび／または１Ａドメインとの間の誘引を増加するように修飾されているＤｄａヘリカーゼも提供する。任意の公知の化学的修飾は、本発明により作られ得る。
【０１９６】
具体的には本発明は、少なくとも１つの荷電アミノ酸が（ｉ）タワードメインおよび／または（ｉｉ）ピンドメインおよび／または（ｉｉｉ）１Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメインに導入されているＤｄａヘリカーゼであって、ポリヌクレオチドの移動を制御するその能力を保持しているＤｄａヘリカーゼを提供する。ポリヌクレオチドの移動を制御するヘリカーゼの能力は、上に考察したとおり測定され得る。本発明は、少なくとも１つの荷電アミノ酸が（ｉ）タワードメインおよび（ｉｉ）ピンドメインおよび／または１Ａドメインに導入されているＤｄａヘリカーゼを好ましくは提供する。
【０１９７】
少なくとも１つの荷電アミノ酸は、負に荷電または正に荷電していてよい。少なくとも１つの荷電アミノ酸は、ヘリカーゼ中で相互作用する任意のアミノ酸（複数可）とは好ましくは逆に荷電している。例えば、少なくとも１つの正に荷電したアミノ酸は、ピンドメイン中の負に荷電したアミノ酸と相互作用する位置でタワードメインに導入されてよい。少なくとも１つの荷電アミノ酸は、野生型（すなわち未修飾）ヘリカーゼ中で荷電していない位置で典型的には導入される。少なくとも１つの荷電アミノ酸は、ヘリカーゼ中の少なくとも１つの逆に荷電したアミノ酸を置き換えるために使用されてよい。例えば正に荷電したアミノ酸は、負に荷電したアミノ酸を置き換えるために使用されてよい。
【０１９８】
好適な荷電アミノ酸は、上に考察されている。少なくとも１つの荷電アミノ酸は、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｄ）などの中性であってよい。代替的に少なくとも１つの荷電アミノ酸は、人工または非天然であってよい。任意の数の荷電アミノ酸は、各ドメインに導入されてよい。例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれ以上の荷電アミノ酸は、各ドメインに導入されてよい。
【０１９９】
ヘリカーゼは、次の位置：（ｉ）９３；（ｉｉ）３５４；（ｉｉｉ）３６０；（ｉｖ）３６１；（ｖ）９４；（ｖｉ）９７；（ｖｉｉ）１５５；（ｖｉｉｉ）３５７；（ｉｘ）１００；および（ｘ）１２７の１つまたは複数に正に荷電したアミノ酸を含む配列番号８の変種を好ましくは含む。ヘリカーゼは、次の位置：（ｉ）３５４；（ｉｉ）３５８；（ｉｉｉ）３６０；（ｉｖ）３６４；（ｖ）９７；（ｖｉ）１２３；（ｖｉｉ）１５５；（ｖｉｉｉ）；３５７；（ｉｘ）１００；および（ｘ）１２７の１つまたは複数に負に荷電したアミノ酸を含む配列番号８の変種を好ましくは含む。ヘリカーゼは、配列番号８における（ｉ）から（ｘ）のいずれかに定義のものに対応する位置に正に荷電したアミノ酸または負に荷電したアミノ酸を含む配列番号９から２３のいずれか１つの変種を好ましくは含む。配列番号８におけるものに対応する配列番号９から２３のいずれか１つの位置は、下の配列番号８から２３の配列比較を使用して同定され得る。
【０２００】
ヘリカーゼは、次の位置：（ｉ）９３および３５４；（ｉｉ）９３および３５８；（ｉｉｉ）９３および３６０；（ｉｖ）９３および３６１；（ｖ）９３および３６４；（ｖｉ）９４および３５４；（ｖｉｉ）９４および３５８；（ｖｉｉｉ）９４および３６０；（ｉｘ）９４および３６１；（ｘ）９４および３６４；（ｘｉ）９７および３５４；（ｘｉｉ）９７および３５８；（ｘｉｉｉ）９７および３６０；（ｘｉｖ）９７および３６１；（ｘｖ）９７および３６４；（ｘｖｉ）１２３および３５４；（ｘｖｉｉ）１２３および３５８；（ｘｖｉｉｉ）１２３および３６０；（ｘｉｘ）１２３および３６１；（ｘｘ）１２３および３６４；（ｘｘｉ）１５５および３５４；（ｘｘｉｉ）１５５および３５８；（ｘｘｉｉｉ）１５５および３６０；（ｘｘｉｖ）１５５および３６１；（ｘｘｖ）１５５および３６４に逆に荷電しているアミノ酸を含むように少なくとも１つの荷電アミノ酸の導入によって修飾されている配列番号８の変種を好ましくは含む。本発明のヘリカーゼは、（ｉ）から（ｘｘｖ）のいずれかに定義の配列番号８中のものに対応する位置に逆に荷電したアミノ酸を含む配列番号９から２３のいずれか１つの変種を好ましくは含む。
【０２０１】
本発明は（ｉ）少なくとも１つの荷電アミノ酸がタワードメインに導入されており、（ｉｉ）少なくとも１つの逆に荷電したアミノ酸がピンドメインおよび／または１Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメインに導入されているＤｄａヘリカーゼであって、ポリヌクレオチドの移動を制御するその能力を保持しているＤｄａヘリカーゼも提供する。少なくとも１つの荷電アミノ酸は負に荷電していてよく、少なくとも１つの逆に荷電したアミノ酸は正に荷電していよく、逆も同様である。好適な荷電アミノ酸は、上に考察されている。任意の数の荷電アミノ酸および任意の数の逆に荷電したアミノ酸は、導入されてよい。例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個もしくはそれ以上の荷電アミノ酸は、導入されてよく、および／または１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個もしくはそれ以上の逆に荷電したアミノ酸は導入されてよい。
【０２０２】
荷電アミノ酸は、野生型ヘリカーゼでは荷電していない位置に典型的には導入される。一方または両方の荷電アミノ酸は、ヘリカーゼ中の荷電アミノ酸を置き換えるために使用され得る。例えば正に荷電したアミノ酸は、負に荷電したアミノ酸を置き換えるために使用され得る。荷電アミノ酸は、上に考察の（ｉ）タワードメインおよび（ｉｉ）ピンドメインおよび／または１Ａドメイン中の任意の位置に導入されてよい。逆に荷電したアミノ酸は、それらが生じたヘリカーゼと相互作用するように典型的には導入される。ヘリカーゼは、逆に荷電したアミノ酸が次の位置：（ｉ）９７および３５４；（ｉｉ）９７および３６０；（ｉｉｉ）１５５および３５４；または（ｉｖ）１５５および３６０に導入されている配列番号の変種８を好ましくは含む。本発明のヘリカーゼは、（ｉ）から（ｉｖ）のいずれかに定義の配列番号８のものに対応する位置に逆に荷電したアミノ酸を含む配列番号９から２３のいずれか１つの変種を好ましくは含む。
【０２０３】
構築物
本発明は、Ｄｄａヘリカーゼまたは本発明の修飾Ｄｄａヘリカーゼおよび追加的ポリヌクレオチド結合成分を含む構築物であって、ヘリカーゼがポリヌクレオチド結合成分に付着されており、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する構築物も提供する。構築物は、人工または非天然であってよい。
【０２０４】
本発明の構築物は、鎖配列決定法の際にポリヌクレオチドの移動を制御するための有用な手段である。本発明の構築物は、本発明の修飾ヘリカーゼよりも配列決定されているポリヌクレオチドから離されにくい。構築物は、それがナノポアを通るポリヌクレオチドの移行を制御することから、ポリヌクレオチドのさらに長い読み取り長を提供できる。
【０２０５】
特異的ポリヌクレオチド配列に結合する標的化構築物も設計できる。下により詳細に考察されるとおりポリヌクレオチド結合成分は、特異的ポリヌクレオチド配列に結合でき、それにより構築物のヘリカーゼ部分を特異的配列に標的化できる。
【０２０６】
構築物は、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する。これは、上に考察したとおり決定できる。
【０２０７】
本発明の構築物は、単離、実質的に単離、精製または実質的に精製されていてよい。構築物は、それが脂質、ポリヌクレオチドまたはポア単量体などの任意の他の構成成分を完全に含まない場合に単離または精製されている。構築物は、その目的の使用を妨害しない担体または希釈剤と混合されている場合に実質的に単離されている。例えば構築物は、１０％未満、５％未満、２％未満または１％未満の脂質、ポリヌクレオチドまたはポア単量体などの他の構成成分を含む形態で存在する場合に実質的に単離または実質的に精製されている。
【０２０８】
Ｄｄａヘリカーゼは、任意のＤｄａヘリカーゼであってよい。好ましいＤｄａヘリカーゼは、これだけに限らないが、配列番号８から２３のいずれか１つおよびその変種を含む。変種は、上に定義されている。変種は、アミノ酸同一性に基づいて配列番号８から２３のいずれか１つに好ましくは少なくとも２０％相同性である。構築物中のＤｄａヘリカーゼは、本発明の修飾Ｄｄａヘリカーゼを参照して上に考察の特異的修飾（複数可）を含む必要はない（すなわち本発明により修飾されている必要はない）。例えば構築物は、配列番号８から２３のいずれか１つに示す配列またはその変種を含むＤｄａヘリカーゼを含んでよく、ここで：
−  システイン残基および非天然アミノ酸は、変種のタワードメイン、ピンドメインおよび１Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメインに導入されていない；
−  変種は、ピンドメイン由来の１つまたは複数の単一アミノ酸欠失を含んでいない；
−  システイン残基および非天然アミノ酸は、フックドメインおよび２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメインに導入されていない；
−  変種は、その表面負電荷を低減するように修飾されない；
−  変種は、１つまたは複数の天然システイン残基の除去によって修飾されない；
−  システイン残基および非天然アミノ酸は、タワードメインだけでは導入されていない；または
−  荷電アミノ酸は、変種のタワードメイン、ピンドメインおよび１Ａドメインに導入されていない。
【０２０９】
ヘリカーゼは、好ましくは本発明の修飾Ｄｄａヘリカーゼである。本発明の任意のヘリカーゼは、本発明の構築物中に存在してよい。
【０２１０】
ヘリカーゼは、好ましくは共有結合的に追加的ポリヌクレオチド結合成分に付着している。ヘリカーゼは、２個または３個などの１個以上の点で成分に付着していてよい。
【０２１１】
ヘリカーゼは、当技術分野において公知の任意の方法を使用して成分に共有結合的に付着できる。好適な方法は、２つ以上の部分を繋ぐことを参照して上に考察されている。
【０２１２】
ヘリカーゼおよび成分は、別々に産生され、次いで一緒に付着されてよい。２つの構成成分は、任意の立体配置で付着されてよい。例えばそれらは、それらの末端（すなわちアミノまたはカルボキシ末端）アミノ酸を介して付着してよい。好適な立体配置は、これだけに限らないが、成分のアミノ末端がヘリカーゼのカルボキシ末端に付着しているおよびその逆を含む。代替的に２つの構成成分は、それらの配列内のアミノ酸を介して付着され得る。例えば成分は、ヘリカーゼのループ領域中の１つまたは複数のアミノ酸に付着する場合がある。好ましい実施形態では成分の末端アミノ酸は、ヘリカーゼのループ領域中の１つまたは複数のアミノ酸に付着する。
【０２１３】
好ましい実施形態ではヘリカーゼは、例えば上に考察した１つまたは複数のリンカー分子を介して、成分に化学的に付着する。別の好ましい実施形態ではヘリカーゼは、成分に遺伝子的に融合される。構築物全体が１本のポリヌクレオチド配列から発現される場合にヘリカーゼは、遺伝子的に成分に融合されている。ヘリカーゼおよび成分のコード配列は、構築物をコードしている１本のポリヌクレオチド配列を形成するために任意の方法で組み合わされてよい。核酸結合タンパク質へのポアの遺伝子的融合は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）において考察されている。
【０２１４】
ヘリカーゼおよび成分は、任意の立体配置で遺伝的に融合され得る。ヘリカーゼおよび成分は、それらの末端アミノ酸を介して融合され得る。例えば成分のアミノ末端はヘリカーゼのカルボキシ末端に融合でき、逆も同様である。成分のアミノ酸配列は、ヘリカーゼのアミノ酸配列にインフレームで好ましくは付加される。換言すると成分は、ヘリカーゼの配列内に好ましくは挿入される。そのような実施形態ではヘリカーゼおよび成分は、２つの点で、すなわち成分のアミノおよびカルボキシ末端アミノ酸を介して典型的には付着される。成分がヘリカーゼの配列内に挿入される場合、成分のアミノおよびカルボキシ末端アミノ酸が近接近にあり、ヘリカーゼまたはその変種の配列内の隣接アミノ酸にそれぞれ付着していることは好ましい。好ましい実施形態では成分は、ヘリカーゼのループ領域に挿入される。
【０２１５】
ヘリカーゼは、成分に直接付着され得る。ヘリカーゼは、上に考察したとおり２つまたは３つなどの１つまたは複数のリンカーを使用して成分に好ましくは付着される。１つまたは複数のリンカーは、成分の移動性を限定するように設計され得る。ヘリカーゼおよび／または成分は、上に考察したとおり１つまたは複数のリンカーの付着を促進するように修飾され得る。
【０２１６】
切断可能なリンカーは、非付着構成成分からの構築物の分離への補助として使用でき、合成反応をさらに制御するために使用できる。例えばヘテロ二機能性リンカーは、ヘリカーゼと反応できるが、成分とはできない。ヘリカーゼタンパク質を表面に結合するためにリンカーの遊離末端が使用できる場合、最初の反応由来の未反応ヘリカーゼは混合物から除去され得る。続いてリンカーは、成分と反応する基を露出させるために切断され得る。付加的に、一連の連結反応に続いて、条件は最初にヘリカーゼへの反応のために、次いでリンカーの切断後の成分への反応のために最適化され得る。第二の反応は、リンカーが既に付着している領域に限定されることから、成分との正確な反応部位に向けてさらに方向付けられる。
【０２１７】
ヘリカーゼは、ヘリカーゼ／架橋剤複合体が成分に共有結合的に付着する前に、二機能性架橋剤に共有結合的に付着されてよい。代替的に成分は、二機能性架橋剤／成分複合体がヘリカーゼに付着する前に、二機能性架橋剤に共有結合的に付着してよい。ヘリカーゼおよび成分は、化学的架橋剤に同時に共有結合的に付着してよい。
【０２１８】
ヘリカーゼの成分への付着の好ましい方法は、上に記載のとおりシステイン連結およびＦａｚ連結である。好ましい実施形態では反応性システインは、成分に遺伝子的に付着しているペプチドリンカー上に存在する。これは、成分から他の利用可能なシステイン残基を除去するために追加的修飾が必ずしも必要ではないことを意味する。
【０２１９】
ヘリカーゼまたは成分のそれ自体への交差結合は、リンカーの濃度をヘリカーゼおよび／または成分の大過剰に維持することによって妨げることができる。代替的に「鍵と鍵穴」配置は、２つのリンカーが使用される場合に使用できる。各リンカーの一方の末端だけが長いリンカーを形成するために併せて反応でき、リンカーの他方の末端は構築物の異なる部分（すなわちヘリカーゼまたは成分）とそれぞれ反応する。これは下でより詳細に考察される。
【０２２０】
付着の部位は、構築物がポリヌクレオチドと接触する場合に、ヘリカーゼおよび成分の両方がポリヌクレオチドに結合でき、その移動を制御できるように選択される。
【０２２１】
付着は、ヘリカーゼおよび成分のポリヌクレオチド結合活性を使用して促進され得る。例えば相補的ポリヌクレオチドは、ヘリカーゼおよび成分を、それらがハイブリダイズすることから、併せて運ぶために使用できる。ヘリカーゼは一方のポリヌクレオチドに結合でき、成分は相補的ポリヌクレオチドに結合できる。次いで２つのポリヌクレオチドは、相互にハイブリダイズできるようになる。これは、ヘリカーゼを成分と密接に接触するようにして、連結反応をさらに効率的にする。これは、標的ポリヌクレオチドの移動を制御するための正確な方向で２つ以上のヘリカーゼを付着させるために特に有益である。使用できる相補的ポリヌクレオチドの一例は、下に示されている。
【０２２２】
【化１】
0006677640.tif 000006
【０２２３】
ヘリカーゼ−Ｐｈｉ２９構築物に関して、下のＤＮＡは使用され得る。
【０２２４】
【化２】
0006677640.tif 000007
【０２２５】
構築物の精製を容易にするためにタグが構築物に付加され得る。これらのタグは、次いでそれらの除去が必要である場合に、化学的にまたは酵素的に切断除去され得る。フルオロフォアまたはクロモフォアも含まれる場合があり、これらも切断可能であってよい。
【０２２６】
構築物を精製するための簡単な方法は、各タンパク質（すなわちヘリカーゼおよび成分）上に、ヘキサ−Ｈｉｓ−タグおよびＳｔｒｅｐ−タグ（登録商標）などの異なる精製タグを含むことである。２つのタンパク質が互いに異なる場合、この方法は特に有用である。２つのタグの使用は、両方のタグを含む分子種だけが容易に精製されるようにする。
【０２２７】
２つのタンパク質が２つの異なるタグを有さない場合、他の方法が使用できる。例えば遊離表面システインを有するタンパク質または構築物を形成するために反応していない付着リンカーを有するタンパク質は、例えばマレイミドリンカーに対するヨードアセトアミドレジンを使用して除去され得る。
【０２２８】
本発明の構築物は、未反応タンパク質から異なるＤＮＡ前進性特徴に基づいても精製され得る。具体的には本発明の構築物は、未反応タンパク質からポリヌクレオチドに対する親和性の増大、既に結合したポリヌクレオチドから離れる可能性の低減および／またはナノポアを通るポリヌクレオチドの移行を制御するときのポリヌクレオチドの読み取り長さの増大に基づいて精製され得る。
【０２２９】
特異的ポリヌクレオチド配列に結合する標的化構築物も設計され得る。下により詳細に考察されるとおりポリヌクレオチド結合成分は、特異的ポリヌクレオチド配列に結合でき、それにより構築物のヘリカーゼ部分を特異的配列に標的化する。
【０２３０】
ポリヌクレオチド結合成分
本発明の構築物は、ポリヌクレオチド結合成分を含む。ポリヌクレオチド結合成分は、ポリヌクレオチドに結合できるポリペプチドである。成分は、規定のポリヌクレオチド配列に好ましくは特異的結合できる。換言すると成分は、特異的ポリヌクレオチド配列に好ましくは結合するが、少なくとも１０分の１の結合を異なる配列に、またはより好ましくは少なくとも１００分の１の結合を異なる配列に、または最も好ましくは少なくとも１０００分の１の結合を異なる配列に示す。異なる配列は無作為配列であってよい。いくつかの実施形態では成分は、特異的ポリヌクレオチド配列に結合するが、異なる配列への結合は測定できない。特異的配列に結合する成分は、そのような配列に標的化される構築物を設計するために使用され得る。
【０２３１】
成分は、典型的にはポリヌクレオチドの少なくとも１つの特徴と相互作用および改変する。成分は、個々のヌクレオチドまたは、ジまたはトリヌクレオチドなどのヌクレオチドの短い鎖を形成するように切断することによってポリヌクレオチドを修飾できる。成分は、ポリヌクレオチドを特異的位置に方向付けるまたは移動させること、すなわちその移動を制御することによってそれを修飾できる。
【０２３２】
核酸などのポリヌクレオチドは、２個以上のヌクレオチドを含む巨大分子である。ポリヌクレオチドまたは核酸は、任意のヌクレオチドの任意の組合せを含み得る。ヌクレオチドは、天然に存在するものまたは人工的であってよい。標的ポリヌクレオチド中の１つまたは複数のヌクレオチドは、酸化またはメチル化され得る。標的ポリヌクレオチド中の１つまたは複数のヌクレオチドは、損傷をうけ得る。例えばポリヌクレオチドは、ピリミジン二量体を含む場合がある。そのような二量体は、紫外光による障害に典型的には関連し、皮膚メラノーマの主原因である。標的ポリヌクレオチド中の１つまたは複数のヌクレオチドは、例えば標識またはタグで、修飾され得る。好適な標識は、上に記載されている。標的ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のスペーサーを含み得る。
【０２３３】
ヌクレオチドは、典型的には、核酸塩基、糖および少なくとも１つのリン酸基を含有する。核酸塩基は典型的には複素環である。核酸塩基は、これだけに限らないがプリンおよびピリミジンならびにより具体的にはアデニン、グアニン、チミン、ウラシルおよびシトシンを含む。糖は典型的には五炭糖である。ヌクレオチド糖は、これだけに限らないがリボースおよびデオキシリボースを含む。ヌクレオチドは、典型的にはリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである。ヌクレオチドは典型的には一リン酸、二リン酸または三リン酸を含有する。リン酸は、ヌクレオチドの５’または３’側に付着できる。
【０２３４】
ヌクレオチドは、これだけに限らないがアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、５−メチルシチジンモノホスフェート、５−メチルシチジンジホスフェート、５−メチルシチジントリホスフェート、５−ヒドロキシメチルシチジンモノホスフェート、５−ヒドロキシメチルシチジンジホスフェート、５−ヒドロキシメチルシチジントリホスフェート、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）およびデオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）を含む。ヌクレオチドは、好ましくはＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰおよびｄＵＭＰから選択される。
【０２３５】
ヌクレオチドは、塩基を持たない場合がある（すなわち核酸塩基を欠失している）。ヌクレオチドは、核酸塩基および糖も欠失している場合がある（すなわちＣ３スペーサーである）。
【０２３６】
ポリヌクレオチド中のヌクレオチドは、任意の様式で相互に付着されてよい。ヌクレオチドは、核酸においてと同様にそれらの糖およびリン酸基により典型的には付着されている。ヌクレオチドは、ピリミジン二量体においてと同様にそれらの核酸塩基を介して繋がれてよい。
【０２３７】
ポリヌクレオチドは、１本鎖または２本鎖であってよい。ポリヌクレオチドの少なくとも一部は、好ましくは２本鎖である。
【０２３８】
ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）などの核酸であってよい。標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの１本鎖にハイブリダイズしたＲＮＡの１本鎖を含む場合がある。ポリヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはヌクレオチド側鎖を有する他の合成ポリマーなどの当技術分野において公知の任意の合成核酸であってよい。
【０２３９】
成分の三次構造が公知であることは好ましい。成分の三次元構造の知識は、本発明の構築物におけるその機能を促進するために成分に修飾を作製できるようにする。
【０２４０】
成分は、任意のサイズであってよく、任意の構造を有してよい。例えば成分は、二量体または三量体などのオリゴマーである場合がある。成分は、好ましくは１つの単量体から形成された小さな球状ポリペプチドである。そのような成分は操作が容易であり、ポリヌクレオチドの移動を制御するヘリカーゼの能力を、特にヘリカーゼの配列に融合または挿入された場合に、干渉しにくい。
【０２４１】
成分のアミノおよびカルボキシ末端は、好ましくは近接近にある。成分のアミノおよびカルボキシ末端は、成分の同じ面により好ましくは存在する。そのような実施形態は、ヘリカーゼの配列中への成分の挿入を促進する。例えば成分のアミノおよびカルボキシ末端が近接近にある場合、それぞれはヘリカーゼの配列中の隣接アミノ酸への遺伝子的融合によって付着され得る。
【０２４２】
成分の活性部位の位置および機能が公知であることも好ましい。これは、成分の活性を消滅させる活性部位に修飾が作製されることを防ぐ。これは成分がヘリカーゼに付着できるようにし、成分はポリヌクレオチドに結合し、その移動を制御する。成分がポリヌクレオチドに結合および方向付けられる方法の知識は、有効な構築物を設計できるようにする。
【０２４３】
本発明の構築物は鎖配列決定法において有用である。成分は、鎖配列決定法およびヌクレオチドの識別に適合性である緩衝液バックグラウンドにおいてポリヌクレオチドに好ましくは結合する。成分は、１００ｍＭから２Ｍなどの通常の生理学的レベルを大幅に上回る塩濃度において少なくとも残存活性を好ましくは有する。成分は、高塩濃度でのその活性を増大させるためにより好ましくは修飾される。成分は、その前進性、安定性および有効期間を改善するために修飾されてもよい。
【０２４４】
好適な修飾は、好塩性、中度好塩性細菌、好熱性および中等度好熱性生物などの好極限性細菌（extremphile）、ならびに中温性または好熱性エキソヌクレアーゼの耐塩性、安定性および温度依存性を変更するための定向進化手法由来のポリヌクレオチド結合成分の特性決定から決定され得る。
【０２４５】
ポリヌクレオチド結合成分は、ヘリックス−ヘアピン−ヘリックス（helix-hairpin-helix）（ＨｈＨ）ドメイン、真核生物１本鎖結合タンパク質（single-stranded binding protein）（ＳＳＢ）、細菌性ＳＳＢ、古細菌ＳＳＢ、ウイルス性ＳＳＢ、２本鎖結合タンパク質、スライディングクランプ、前進性因子（processivity factor）、ＤＮＡ結合ループ、複製開始タンパク質、テロメア結合タンパク質、リプレッサー、亜鉛フィンガーおよび増殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen）（ＰＣＮＡ）から独立に選択される１つまたは複数のドメインを好ましくは含む。
【０２４６】
ヘリックス−ヘアピン−ヘリックス（ＨｈＨ）ドメインは、ＤＮＡに配列非特異的様式で結合するポリペプチドモチーフである。それらは、ポリメラーゼに融合された場合に塩安定性および前進性を付与し、それらの熱安定性を増大させることが示されている。好適なドメインは、メタノピュルス・カンドレリ（Methanopyrus kandleri）由来のトポイソメラーゼＶ（配列番号４７）由来のドメインＨ（残基６９６〜７５１）およびドメインＨＩ（残基６９６〜８０２）を含む。下の考察のとおり、ポリヌクレオチド結合成分は、配列番号４８に示す配列番号４７のドメインＨ〜Ｌであってよい。メタノピュルス・カンドレリ（Methanopyrus kandleri）由来のトポイソメラーゼＶは、下に考察の２本鎖結合タンパク質の一例である。
【０２４７】
ＨｈＨドメインは、配列番号２４もしくは３７もしくは３８に示す配列またはその変種を好ましくは含む。このドメインは、本発明の構築物において使用された場合にヘリカーゼの前進性および耐塩性を増大させる。配列番号２４もしくは３７もしくは３８の変種は、配列番号２４または３７または３８のものから変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持しているタンパク質である。これは、上に記載のとおり測定され得る。変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列全体にわたって、配列番号２４または３７または３８に少なくとも５０％相同性（またはヘリカーゼと関連して上に考察した任意の％相同性）を典型的には有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持している。変種はヘリカーゼと関連して上にまたはポアと関連して下に考察したいずれの方法においても配列番号２４または３７または３８と異なっていてよい。変種は、上に考察したとおりヘリカーゼへの付着を促進するために１つもしくは複数の置換システイン残基および／または１つもしくは複数の置換Ｆａｚ残基を好ましくは含む。
【０２４８】
ＳＳＢは、高親和性で配列非特異的様式で１本鎖ＤＮＡに結合する。それらは、全ての生き物に種々の形態で存在し、単量体または多量体としてＤＮＡに結合する。アミノ酸配列の配列比較およびアルゴリズム（Ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖモデルなど）を使用して、ＳＳＢはそれらの配列相同に従って分類され得る。Ｐｆａｍファミリー、ＰＦ００４３６は、全てが公知のＳＳＢに配列類似性を示すタンパク質を含む。ＳＳＢのこの群は、次いでタンパク質の構造分類（Structural Classification of Proteins）（ＳＣＯＰ）に従ってさらに分類され得る。ＳＳＢは、次の系列に分けられる：クラス；全てのベータタンパク質、フォールド；ＯＢ−フォールド、スーパーファミリー：核酸結合タンパク質、ファミリー；１本鎖ＤＮＡ結合ドメイン、ＳＳＢ。このファミリー内でＳＳＢは、各サブファミリー内でしばしば特性決定されるいくつかの型の分子種を含むサブファミリーに分類され得る。
【０２４９】
ＳＳＢは、ヒト、マウス、ラット、真菌、原虫または植物など由来の真核生物由来、細菌および古細菌などの原核生物由来またはウイルス由来であってよい。
【０２５０】
真核性ＳＳＢは、複製タンパク質Ａ（ＲＰＡ）として公知である。多くの場合それらは、さまざまなサイズの単位から形成されたヘテ三量体である。大きな単位（例えばサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＲＰＡ７０）のいくつかは安定であり、単量体形態でｓｓＤＮＡに結合する。
【０２５１】
細菌性ＳＳＢは安定なホモ四量体（例えば大腸菌（E.coli）、マイコバクテリウム・スメグマチス（Mycobacterium smegmatis）およびヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori））またはホモ二量体（例えばディノコッカス・ラディオデュランス（Deinococcus radiodurans）およびサーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima））としてＤＮＡに結合する。古細菌ゲノム由来のＳＳＢは、真核ＲＰＡと関連すると考えられている。クレン古細菌門スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）によってコードされるＳＳＢなどのそのいくつかは、ホモ四量体である。他の大部分の種由来のＳＳＢは、真核生物由来の複製タンパク質に密接に関連しており、ＲＰＡと称される。これらの種のいくつかにおいて、それらは単量体であることが示されている（メタノコッカス・ジャンナスキイ（Methanococcus jannaschii）およびメタノサーモバクター・サーモオートトロフィクカム（Methanothermobacter thermoautotrophicum））。さらに、アーケオグロブス・フルギダス（Archaeoglobus fulgidus）およびメタノコッコイデス・ブルトニイ（Methanococcoides burtonii）を含む古細菌の他の種は、ＲＰＡに配列類似性を有する２つのオープンリーディングフレームをそれぞれ含有すると考えられている。タンパク質レベルでの証拠はなく、それらのＤＮＡ結合能力またはオリゴマー状態に関する公表されたデータもない。しかし、これらの各遺伝子中の２つのオリゴヌクレオチド／オリゴ糖（oligonucleotide/oligosaccharide）（ＯＢ）フォールドの存在（Ｍ．ブルトニイ（M.burtonii）ＯＲＦの１つの場合にはＯＢフォールド３個）はそれらも１本鎖ＤＮＡに結合することを示唆している。
【０２５２】
ウイルス性ＳＳＢは、単量体としてＤＮＡに結合する。このことおよびそれらの比較的小さなサイズは、それらを、例えば可動性ペプチドリンカーを介して他のタンパク質に遺伝子的に融合しやすくする。代替的にＳＳＢは、別々に発現され、化学的方法（例えばシステイン、非天然アミノ酸）によって他のタンパク質に付着される場合がある。これは下でより詳細に考察される。
【０２５３】
ＳＳＢは、好ましくは（ｉ）正味の負電荷を有さないカルボキシ末端（Ｃ末端）領域を含むＳＳＢ（ｉｉ）Ｃ末端領域の正味の負電荷を減少させる１つまたは複数の修飾をそのＣ末端領域に含む修飾ＳＳＢのいずれかである。そのようなＳＳＢは、膜貫通ポアを遮断せず、したがって標的ポリヌクレオチドの特性決定を可能にする。
【０２５４】
正味の負電荷を有さないＣ末端領域を含むＳＳＢの例は、これだけに限らないが、ヒトミトコンドリアＳＳＢ（ＨｓｍｔＳＳＢ；配列番号３９、ヒト複製タンパク質Ａ  ７０ｋＤａサブユニット、ヒト複製タンパク質Ａ  １４ｋＤａサブユニット、オキシトリカ・ノバ（Oxytricha nova）由来テロメア末端結合タンパク質アルファサブユニット、オキシトリカ・ノバ（Oxytricha nova）由来テロメア末端結合タンパク質ベータサブユニットのコアドメイン、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）由来のテロメアタンパク質１（Ｐｏｔ１）の保護、ヒトＰｏｔ１、マウスまたはラット由来ＢＲＣＡ２のＯＢ−フォールドドメイン、ｐｈｉ２９由来のｐ５タンパク質（配列番号４０）またはこれらのタンパク質のいずれかの変種を含む。変種は、野生型タンパク質から変化したアミノ酸配列を有し、１本鎖ポリヌクレオチド結合活性を保持しているタンパク質である。ポリヌクレオチド結合活性は、当技術分野において公知の任意の方法を使用して決定できる（上に記載のとおり）。例えば、１本鎖ポリヌクレオチドに結合する変種の能力は、実施例に記載のとおり決定され得る。
【０２５５】
配列番号３９または４０の変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列全体にわたって、配列番号３９または４０に少なくとも５０％相同性（またはヘリカーゼと関連して上に考察した任意の％相同性）を典型的には有し、１本鎖ポリヌクレオチド結合活性を保持している。変種はヘリカーゼと関連して上に考察したいずれの方法においても配列番号３９または４０と異なっていてよい。具体的には変種は、表５および６に示す１つまたは複数の保存的置換を有する場合がある。
【０２５６】
正味の負電荷を減少させる１つまたは複数の修飾をそれらのＣ末端領域に必要とするＳＳＢの例は、これだけに限らないが、大腸菌（E. coli）のＳＳＢ（ＥｃｏＳＳＢ；配列番号４１、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）のＳＳＢ、ディノコッカス・ラディオデュランス（Deinococcus radiodurans）のＳＳＢ、サーマス・サーモフィラルス（Thermus thermophiles）のＳＳＢ、スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）由来ＳＳＢ、ヒト複製タンパク質Ａ  ３２ｋＤａサブユニット（ＲＰＡ３２）断片、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来ＣＤＣ１３  ＳＳＢ、大腸菌（E. coli）由来プライモソーム複製タンパク質Ｎ（Primosomal replication protein N）（ＰｒｉＢ）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由来ＰｒｉＢ、仮説タンパク質Ａｔ４ｇ２８４４０、Ｔ４由来ＳＳＢ（ｇｐ３２；配列番号４２）、ＲＢ６９由来ＳＳＢ（ｇｐ３２；配列番号２５）、Ｔ７由来ＳＳＢ（ｇｐ２．５；配列番号２６）またはこれらの任意のタンパク質の変種を含む。したがって本発明の方法において使用されるＳＳＢは、これらのタンパク質のいずれかに由来してよい。
【０２５７】
Ｃ末端領域中の１つまたは複数の修飾に加えて、方法において使用されるＳＳＢはＣ末端領域の外側にあるまたはＣ末端領域の正味の負電荷を減少させない追加的修飾を含んでよい。換言すると本発明の方法において使用されるＳＳＢは、野生型タンパク質の変種に由来する。変種は、野生型タンパク質のものから変化しているアミノ酸配列を有し、１本鎖ポリヌクレオチド結合活性を保持しているタンパク質である。ポリヌクレオチド結合活性は、上に考察したとおり決定され得る。
【０２５８】
本発明において使用されるＳＳＢは、配列番号２５、２６、４１または４２の変種に由来してよい。換言すると配列番号２５、２６、４１または４２の変種は、本発明において使用されるＳＳＢのための出発点として使用できるが、実際に使用されるＳＳＢは、Ｃ末端領域の正味の負電荷を減少させる１つまたは複数の修飾をそのＣ末端領域にさらに含む。配列番号２５、２６、４１または４２の変種は、配列番号２５、２６、４１または４２にアミノ酸同一性に基づいてその配列全体にわたって少なくとも５０％相同性（またはヘリカーゼと関連して上に考察した任意の％相同性）を典型的には有し、１本鎖ポリヌクレオチド結合活性を保持している。変種はヘリカーゼと関連して上に考察したいずれの方法においても配列番号２５、２６、４１または４２と異なっていてよい。具体的には変種は、表５および６に示す１つまたは複数の保存的置換を有してよい。
【０２５９】
通常のタンパク質ＮからＣへの命名法に従ってＳＳＢのＣ末端領域を同定することは容易である。ＳＳＢのＣ末端領域は、ＳＳＢのＣ末端の最後の３分の１などの好ましくはＳＳＢのＣ末端の最後の約３分の１である。ＳＳＢのＣ末端領域は、より好ましくはＳＳＢのＣ末端の最後の４分の１、５分の１または８分の１などのＳＳＢのＣ末端の最後の約４分の１、５分の１または８分の１である。ＳＳＢの最後の３分の１、４分の１、５分の１または８分の１は、アミノ酸の数を単位としてまたはＳＳＢタンパク質の一次構造の実際の長さを単位として測定されてよい。ＮからＣ方向での種々のアミノ酸の長さは、当技術分野において公知である。
【０２６０】
Ｃ末端領域は、好ましくはＳＳＢのＣ末端の最後の約１０から最後の約６０アミノ酸である。Ｃ末端領域は、より好ましくはＳＳＢのＣ末端の最後の約１５、最後の約２０、最後の約２５、最後の約３０、最後の約３５、最後の約４０、最後の約４５、最後の約５０または最後の約５５アミノ酸である。
【０２６１】
Ｃ末端領域は、グリシンおよび／またはプロリンのリッチ領域を典型的には含む。このプロリン／グリシンリッチ領域は、Ｃ末端領域に可動性を与え、Ｃ末端領域を同定するために使用され得る。
【０２６２】
正味の負電荷を減少させるために好適な修飾は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２４号（ＷＯ２０１４／０１３２５９として公開）に開示されている。ＳＳＢは、この国際出願において開示の任意のＳＳＢであってよい。
【０２６３】
修飾ＳＳＢは、配列番号３３、３４、４３から４６に示されるものから選択される配列を最も好ましくは含む。
【０２６４】
２本鎖結合タンパク質は高親和性で２本鎖ＤＮＡに結合する。好適な２本鎖結合タンパク質は、これだけに限らないがミューテーターＳ（ＭｕｔＳ；ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿４１７２１３．１；配列番号４９）、Ｓｓｏ７ｄ（スルホロブス・ソルファタリカス（Sufolobus solfataricus）Ｐ２；ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿３４３８８９．１；配列番号５０；Nucleic Acids Research、2004、Vol 32、No. 3、1197-1207）、Ｓｓｏ１０ｂ１（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿３４２４４６．１；配列番号５１）、Ｓｓｏ１０ｂ２（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿３４２４４８．１；配列番号５２）トリプトファンリプレッサー（Ｔｒｐリプレッサー；ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿２９１００６．１；配列番号５３）、ラムダリプレッサー（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０４０６２８．１；配列番号５４）、Ｃｒｅｎ７（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿３４２４５９．１；配列番号５５）、主なヒストンクラスＨ１／Ｈ５、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０６６４０３．２；配列番号５６）、ｄｓｂＡ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０４９８５８．１；配列番号５７）、Ｒａｄ５１（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００２８６６．２；配列番号５８）、スライディングクランプおよびトポイソメラーゼＶ  Ｍｋａ（配列番号４７）またはこれらのタンパク質のいずれかの変種を含む。配列番号４７、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７または５８の変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列全体にわたって、配列番号４７、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７または５８に少なくとも５０％相同性（またはヘリカーゼと関連して上に考察した任意の％相同性）を典型的には有し、１本鎖ポリヌクレオチド結合活性を保持している。変種は、ヘリカーゼと関連して上に考察したいずれの方法においても配列番号４７、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７または５８と異なっていてよい。具体的には変種は、表５および６に示す１つまたは複数の保存的置換を有する場合がある。大部分のポリメラーゼは、スライディングクランプと相互作用することにより前進性を達成している。一般にこれらは、ｄｓＤＮＡの周囲を囲む多量体タンパク質（ホモ二量体またはホモ三量体）である。これらのスライディングクランプは、ＡＴＰ依存性プロセスでそれらをＤＮＡヘリックスの周囲に会合させるためにアクセサリータンパク質（クランプローダー）を必要とする。それらもＤＮＡと直接接触せず、形態的テザーとして作用する。スライディングクランプがポリメラーゼドメインを介する特異的様式で同族ポリメラーゼと相互作用することから、この断片はヘリカーゼのスライディングクランプへの動員刺激のためにヘリカーゼに融合され得る。この相互作用は共有結合の作製によってさらに安定化され得る（システインまたは非天然アミノ酸の導入）。
【０２６５】
ＤＮＡスライディングクランプに関して前進性因子は、それらの同族ポリメラーゼをＤＮＡに固着させるウイルス性タンパク質であり、作製される断片の長さの劇的な増大を導く。それらは、単量体（単純ヘルペスウイルス（Herpes simplex virus）１由来ＵＬ４２についての場合）または多量体（サイトメガロウイルス（Cytomegalovirus）由来ＵＬ４４は二量体である）であってよく、それらはＤＮＡ鎖周囲に閉じた環を形成せず、それらはＤＮＡに直接接触する。ＵＬ４２は、その対応するポリメラーゼの速度を低減することなく前進性を増大させることが示されており、それがＳＳＢとは異なるモードでＤＮＡと相互作用することを示唆している。ＵＬ４２は、配列番号２７もしくは配列番号３２に示す配列またはその変種を好ましくは含む。配列番号２７または３２の変種は、配列番号２７または３２のものから変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持しているタンパク質である。これは、上に記載のとおり測定され得る。変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列全体にわたって、配列番号２７または３２に少なくとも５０％相同性（またはヘリカーゼと関連して上に考察した任意の％相同性）を典型的には有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持している。変種はヘリカーゼと関連して上にまたはポアと関連して下に考察したいずれの方法においても配列番号２７または配列番号３２と異なっていてよい。変種は、上に考察したとおりヘリカーゼへの付着を促進するために１つもしくは複数の置換システイン残基および／または１つもしくは複数の置換Ｆａｚ残基を好ましくは含む。
【０２６６】
ＵＬ４２をヘリカーゼに付着させることは、遺伝子的融合または化学的付着（システイン、非天然アミノ酸）を介して行われ得る。ＵＬ４２に結合しているポリメラーゼポリペプチドが結晶構造において観察できることから、これらの３５アミノ酸（残基１２００〜１２３５）はヘリカーゼのＣ末端に融合でき、このポリペプチドと前進性因子との間の天然の親和性は複合体を形成するために使用される。相互作用は、共有結合相互作用（システインまたは非天然アミノ酸）を導入することによって安定化され得る。選択肢の１つは、ポリペプチド相互作用部位近くに位置付けられている天然ＵＬ４２システイン（Ｃ３００）を利用し、ポリメラーゼポリペプチドに点変異（例えばＬ１２３４Ｃ）を導入することである。
【０２６７】
ポリメラーゼ前進性を増大する報告された方法は、大腸菌（E.coli）チオレドキシン（Ｔｒｘ）とバクテリオファージＴ７ＤＮＡポリメラーゼのチオレドキシン結合ドメイン（ＴＢＤ）（残基２５８〜３３３）との間の相互作用を活用することである。ＴｒｘからＴＢＤへの結合は、ＤＮＡに結合するものへのコンホメーション変化をポリペプチドに生じさせる。ＴＢＤは、ＤＮＡ鎖上に固定され、ポリメラーゼオフ速度を限定し、それにより前進性を増大させると考えられている。キメラポリメラーゼは、ＴＢＤを非前進性ポリメラーゼに転移することによって作製され、重合された断片長の１０００倍増加を生じる。ＴＢＤを任意の他のクラスのタンパク質に付着させる試みはなかったが、ＴＢＤとＴｒｘとの間の共有結合は操作され、相互作用を安定化するために使用できる。
【０２６８】
いくつかのヘリカーゼは、前進性を達成するためにアクセサリータンパク質をｉｎ−ｖｉｖｏで使用する（例えば大腸菌（E.coli）Ｒｅｐヘリカーゼに関して、ファージΦｘ１７４由来ｃｉｓＡおよびファージＭ１３由来ｇｅｎｅ  ＩＩタンパク質）。これらのタンパク質のいくつかは、１つより多いヘリカーゼと相互作用することが示されている（例えばＭｕｔＬは同程度ではないがＵｖｒＤおよびＲｅｐの両方に作用する）。これらのタンパク質は内在性ＤＮＡ結合能力を有し、それらのいくつかは特異的ＤＮＡ配列を認識する。いくつかのこれらのアクセサリータンパク質のそれら自体を特異的ＤＮＡ配列に共有結合的に付着させる能力は、ヘリカーゼ活性についての一連の開始点を作出するためにも使用できる。
【０２６９】
染色体の末端を保護するタンパク質は、テロメアｓｓＤＮＡ配列に高特異性の様式で結合する。この能力は、そのまままたは配列特異性を消滅させる点変異を使用することによってのいずれかで活用され得る。
【０２７０】
小さなＤＮＡ結合モチーフ（ヘリックス−ターン−ヘリックスなど）は、特異的ＤＮＡ配列を認識する。バクテリオファージ４３４リプレッサーの場合、６２残基断片が操作され、ＤＮＡ結合能力および特異性を保持していることが示されている。
【０２７１】
真核生物タンパク質における豊富なモチーフ、亜鉛フィンガーは特異的様式でＤＮＡに結合するおよそ３０アミノ酸からなる。典型的には各亜鉛フィンガーは３個のＤＮＡ塩基だけを認識するが、マルチプルフィンガーはより長い配列を認識するために連結されてよい。
【０２７２】
増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）は、ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡを引き上げるおよび下げる非常に堅固なクランプ（ドーナツ）を形成する。クレン古細菌門（crenarchaeota）由来ＰＣＮＡは、ヘテロ三量体になることが特有であり、それにより１つのサブユニットを機能化し、活性を保持することが可能である。そのサブユニットは、配列番号２８、２９および３０に示されている。ＰＣＮＡは、好ましくは配列番号２８、２９および３０に示す配列またはその変種を含む三量体である。ＰＣＮＡスライディングクランプ（ＮＣＢＩ参照配列：ＺＰ＿０６８６３０５０．１；配列番号５９）は二量体を形成する。ＰＣＮＡは、好ましくは配列番号５９またはその変種を含む二量体である。変種は、配列番号２８、２９、３０または５９から変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持しているタンパク質である。これは、上に記載のとおり測定され得る。変種は、アミノ酸同一性に基づいてそれぞれその配列全体にわたって配列番号２８、２９および３０に少なくとも５０％相同性を有する配列を含む典型的には三量体または、配列番号５９に少なくとも５０％相同性（またはヘリカーゼと関連して上に考察した任意の％相同性）を有する配列を含む二量体であり、ポリヌクレオチド結合活性を保持している。変種はヘリカーゼと関連して上にまたはポアと関連して下に考察したいずれの方法においても配列番号２８、２９、３０または５９と異なっている配列を含んでよい。変種は、上に考察したとおりヘリカーゼへの付着を促進するために１つもしくは複数の置換システイン残基および／または１つもしくは複数の置換Ｆａｚ残基を好ましくは含む。好ましい実施形態では、クレン古細菌門（crenarchaeota）由来ＰＣＮＡのサブユニット１および２（すなわち配列番号２８および２９またはその変種）は、遺伝子的に融合されるなど付着し、得られたタンパク質は本発明の構築物を形成するようにヘリカーゼに付着される。構築物の使用の際にサブユニット３（すなわち配列番号３０またはその変種）は、構築物がポリヌクレオチドに結合すると、ＰＣＮＡクランプ（またはドーナツ）を完了するために付加される場合がある。好ましい実施形態では、ＰＣＮＡスライディングクランプ（すなわち配列番号５９またはその変種）の１つの単量体は、遺伝子的に融合されているなど、本発明の構築物を形成するようにヘリカーゼに付着されている。構築物の使用の際に第二の単量体（すなわち配列番号５９またはその変種）は、構築物がポリヌクレオチドに結合すると、ＰＣＮＡクランプ（またはドーナツ）を完了するために付加される場合がある。
【０２７３】
ポリヌクレオチド結合モチーフは、下の表３に示すもののいずれかから選択されてよい。
【０２７４】
【表３−１】
0006677640.tif 000008
【０２７５】
【表３−２】
0006677640.tif 000009
【０２７６】
【表３−３】
0006677640.tif 000010
【０２７７】
【表３−４】
0006677640.tif 000011
【０２７８】
【表３−５】
0006677640.tif 000012
【０２７９】
ポリヌクレオチド結合成分は、ポリヌクレオチド結合酵素に好ましくは由来する。ポリヌクレオチド結合酵素は、ポリヌクレオチドに結合でき、ポリヌクレオチドの少なくとも１つの特徴と相互作用し、修飾するポリペプチドである。酵素は、個々のヌクレオチドまたは、ジまたはトリヌクレオチドなどのヌクレオチドの短い鎖を形成するように切断することによってポリヌクレオチドを修飾できる。酵素は、ポリヌクレオチドを特異的位置に方向付けるまたは移動させることによってそれを修飾できる。ポリヌクレオチド結合成分は、ポリヌクレオチドに結合でき、その移動を制御できる限り酵素活性を示す必要はない。例えば成分は、その酵素活性を除去するように修飾されている酵素由来であってよく、またはそれが酵素として作用することを妨げる条件下で使用されてよい。
【０２８０】
ポリヌクレオチド結合成分は、好ましくは核酸分解酵素由来である。酵素は、より好ましくは酵素分類（ＥＣ）群３．１．１１、３．１．１３、３．１．１４、３．１．１５、３．１．１６、３．１．２１、３．１．２２、３．１．２５、３．１．２６、３．１．２７、３．１．３０および３．１．３１のいずれかのメンバー由来である。酵素は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）に開示のもののいずれかであってよい。
【０２８１】
好ましい酵素は、エキソヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、ヘリカーゼおよび、ジャイレースなどのトポイソメラーゼである。好適なエキソヌクレアーゼは、これだけに限らないが、大腸菌（E. coli）由来エキソヌクレアーゼＩ、大腸菌（E. coli）由来エキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素、Ｔ．サーモフィラス（T. thermophilus）由来ＲｅｃＪおよびバクテリオファージラムダエキソヌクレアーゼ、ＴａｔＤエキソヌクレアーゼならびにそれらの変種を含む。
【０２８２】
ポリメラーゼは、好ましくは成分分類（ＥＣ）群２．７．７．６、２．７．７．７、２．７．７．１９、２．７．７．４８および２．７．７．４９のいずれかのメンバーである。ポリメラーゼは、好ましくはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。ポリメラーゼは、ＰｙｒｏＰｈａｇｅ（登録商標）３１７３  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｃｉｇｅｎ（登録商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから商業的に入手できる）、ＳＤポリメラーゼ（Ｂｉｏｒｏｎ（登録商標）から商業的に入手できる）またはその変種であってよい。ポリヌクレオチド結合成分は、好ましくはＰｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号３１）由来である。成分は、配列番号１０１に示される配列またはその変種を含んでよい。配列番号３１の変種は、配列番号３１のものから変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持している酵素である。これは、上に記載のとおり測定され得る。変種は、ポリヌクレオチドの結合を促進するならびに／または高塩濃度および／もしくは室温での活性を促進する修飾を含む場合がある。
【０２８３】
配列番号３１のアミノ酸配列の全長にわたって変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列に好ましくは少なくとも５０％相同性である。より好ましくは変種ポリペプチドは、アミノ酸同一性に基づいて配列の全長にわたって配列番号３１のアミノ酸配列に少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同性であってよい。少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性が２００以上のストレッチ、例えば２３０、２５０、２７０または２８０以上の連続するアミノ酸にわたってあり得る（「高い相同性」）。相同性は下に記載のとおり決定される。変種は配列番号２および４を参照して下に考察したいずれの方法においても野生型配列と異なっていてよい。
【０２８４】
ヘリカーゼは、上に考察したもののいずれであってもよい。ヘリカーゼ二量体および多量体は下に詳細に考察される。ポリヌクレオチド結合成分は、ヘリカーゼ由来のポリヌクレオチド結合ドメインであってよい。例えばポリヌクレオチド結合成分は、配列番号３５または３６に示す配列またはその変種を好ましくは含む。配列番号３５または３６の変種は、配列番号３５または３６のものから変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持しているタンパク質である。これは、上に記載のとおり測定され得る。変種は、ポリヌクレオチドの結合を促進するならびに／または高塩濃度および／もしくは室温での活性を促進する修飾を含む場合がある。
【０２８５】
配列番号３５または３６のアミノ酸配列の全長にわたって変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列に好ましくは少なくとも５０％相同性である。より好ましくは変種ポリペプチドは、アミノ酸同一性に基づいて配列番号３５または３６のアミノ酸配列の配列の全長にわたって少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同性であってよい。少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性が４０以上のストレッチ、例えば５０、６０、７０または８０以上の連続するアミノ酸にわたってあり得る（「高い相同性」）。相同性は下に記載のとおり決定される。変種は配列番号２および４を参照して下に考察したいずれの方法においても野生型配列と異なっていてよい。
【０２８６】
トポイソメラーゼは、好ましくは成分分類（ＥＣ）群５．９９．１．２および５．９９．１．３のいずれかのメンバーである。
【０２８７】
ポリヌクレオチド結合成分は、上に考察したいずれの酵素であってもよい。
【０２８８】
成分は、明示用標識（revealing label）で標識されてよい。標識は、上に記載のもののいずれであってもよい。
【０２８９】
成分は、大腸菌（E. coli）、Ｔ．サーモフィルス（T. thermophilus）またはバクテリオファージ、などの任意の成分産生生物から単離され得る、または合成的もしくは組換え的手段によって作製できる。例えば成分は、下に記載のとおりｉｎ  ｖｉｔｒｏ 翻訳および転写によって合成できる。成分は、下に記載のとおり大規模に産生されてよく、精製が続く。
【０２９０】
ヘリカーゼオリゴマー
上の考察から明らかであるとおり、ポリヌクレオチド結合成分は、ヘリカーゼに好ましくは由来する。例えばそれは、ヘリカーゼ由来ポリヌクレオチドドメインであってよい。成分は、１つまたは複数のヘリカーゼをより好ましくは含む。ヘリカーゼは、本発明のヘリカーゼおよび本発明により修飾されていないヘリカーゼを含む、本発明の構築物を参照して上に考察の任意のものであってよい。そのような実施形態では、当然のことながら本発明の構築物は、共に付着した２つ以上のヘリカーゼを含む。少なくとも１つのヘリカーゼは、好ましくは本発明により修飾される。構築物は、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上のヘリカーゼを含んで良い。換言すると本発明の構築物は、ヘリカーゼ二量体、ヘリカーゼ三量体、ヘリカーゼ四量体、ヘリカーゼ五量体などを含んでよい。
【０２９１】
２つ以上のヘリカーゼは、任意の方向で互いに付着していてよい。同一または類似のヘリカーゼは、各ヘリカーゼ中の同一のアミノ酸位置または空間的に近接しているアミノ酸位置を介して付着してよい。これは、「ヘッドトゥーヘッド」編成と呼ばれる。代替的に同一または類似のヘリカーゼは、各ヘリカーゼの反対または異なる側の位置を介して付着してよい。これは、「ヘッドトゥーテール」編成と呼ばれる。３つの同一のまたは類似のヘリカーゼを含むヘリカーゼ三量体は、ヘッドトゥーヘッドおよびヘッドトゥーテール編成の両方を含む場合がある。
【０２９２】
２つ以上のヘリカーゼは、互いに異なっていてよい（すなわち構築物はヘテロ二量体、三量体、四量体または五量体などである）。例えば本発明の構築物は（ａ）本発明の１つもしくは複数のヘリカーゼおよび本発明により修飾されていない１つもしくは複数のヘリカーゼ；（ｂ）本発明の２つ以上の異なるヘリカーゼ；または（ｃ）本発明により修飾されていない２つ以上のヘリカーゼ、を含んでよい。構築物は、同じＤｄａヘリカーゼの２つの異なる変種を含んでよい。例えば構築物は、各変種において異なる位置に導入された１つまたは複数のシステイン残基またはＦａｚ残基を有する、上に考察したヘリカーゼの内の１つの２つの変種を含む場合がある。この場合ヘリカーゼは、ヘッドトゥーテール編成であってよい。
【０２９３】
ヘテロ二量体は、２つの可能な方法で形成されてもよい。第一は、上に考察したホモ二機能性リンカーの使用を含む。ヘリカーゼ変種の１つは、１つのリンカーがタンパク質の１分子に付着されるように大過剰量のリンカーで修飾されてよい。このリンカー修飾変種は、次いで未修飾タンパク質、潜在的ホモ二量体、および他のヘリカーゼ変種と反応する未反応リンカーから精製されてよい。得られた二量体は、次いで他の分子種から精製されてよい。
【０２９４】
第二は、ヘテロ二機能性リンカーの使用を含む。例えばヘリカーゼ変種の１つは、一方の末端にマレイミドまたはヨードアセトアミド官能基および他方の末端にシクロオクチン官能基（ＤＩＢＯ）を含有する第一のＰＥＧリンカーで修飾されてよい。この一例は下に示される：
【０２９５】
【化３】
0006677640.tif 000013
【０２９６】
第二のヘリカーゼ変種は、一方の末端にマレイミドまたはヨードアセトアミド官能基および他方の末端にアジド官能基を含有する第二のＰＥＧリンカーで修飾されてよい。一例を下に示す：
【０２９７】
【化４】
0006677640.tif 000014
【０２９８】
２つの異なるリンカーを有する２つのヘリカーゼ変種は、次いで精製され、二量体を作製するために合わせてクリック（銅フリークリックケミストリーを使用する）されてよい。銅フリークリックケミストリーは、その望ましい特徴によりこれらの応用において使用されている。例えばそれは、迅速、清潔およびタンパク質に無毒である。しかし他の好適な生体直交型化学は、これだけに限らないが、シュタウディンガー化学、ヒドラジンまたはヒドラジド／アルデヒドまたはケトン試薬（ＨｙＮｉｃ＋４ＦＢ化学、全てのＳｏｌｕｌｉｎｋ（商標）試薬を含む）、ディール・アルダー試薬対およびボロン酸／サリチルヒドロキサム酸試薬を含む。
【０２９９】
同じヘリカーゼの２つの異なる変種を連結するこれらの２つの方法は、２つの異なるヘリカーゼの二量体およびヘリカーゼポリメラーゼ二量体などのヘリカーゼと成分とが互いに異なっている上に考察した構築物のいずれについても有効である。
【０３００】
類似の方法がさまざまなＦａｚ変種を連結するために使用され得る。１つのＦａｚ変種は、１つのリンカーがタンパク質の１つの分子に付着されるように大過剰量のリンカーで修飾されてよい。このリンカー修飾Ｆａｚ変種は、次いで未修飾タンパク質、潜在的ホモ二量体、および第二のＦａｚ変種と反応する未反応リンカーから精製されてよい。得られた二量体は、次いで他の分子種から精製されてよい。
【０３０１】
ヘテロ二量体は、同じヘリカーゼまたは異なるヘリカーゼのシステイン変種とＦａｚ変種とを連結することによっても作製できる。一方の末端にマレイミドまたはヨードアセトアミド官能性および他方の末端にＤＢＣＯ官能性を有するヘテロ二機能性ＰＥＧリンカーは、この変異体の組合せにおいて使用できる。そのようなリンカーの一例は、下に示されている（ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−マレイミド）：
【０３０２】
【化５】
0006677640.tif 000015
【０３０３】
リンカーの長さは、２つの官能基間のＰＥＧ単位の数を変えることによって変更できる。
【０３０４】
ヘリカーゼヘテロ三量体は、３種の異なる型のヘリカーゼを含んでよい。３個より多いヘリカーゼを含むオリゴマーについても同様である。構築物中の２つ以上のヘリカーゼは、配列番号８から２３のいずれか１つの異なる変種などの同じヘリカーゼの異なる変種であってよい。異なる変種は、異なる位置を介する付着を促進するために異なる位置で修飾されてよい。ヘテロ三量体は、したがってヘッドトゥーテールおよびヘッドトゥーヘッド編成である場合がある。
【０３０５】
本発明の構築物中の２つ以上のヘリカーゼは、互いに同じであってよい（すなわち構築物はホモ二量体、三量体、四量体または五量体などである）。そのような実施形態ではヘリカーゼは、各ヘリカーゼ中の同じ位置を使用して好ましくは付着している。ヘリカーゼは、したがってヘッドトゥーヘッドで付着している。ヘリカーゼは、同じ位置でヘリカーゼに置換されているシステイン残基またはＦａｚ残基を使用して連結されてよい。同一のヘリカーゼ変種中のシステイン残基は、マレイミドまたはヨードアセトアミドなどのチオール反応性基を含有するホモ二機能性リンカーを使用して連結されてよい。これらの官能基は、次の例のとおりポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖の末端にあってよい：
【０３０６】
【化６】
0006677640.tif 000016
【０３０７】
リンカーの長さは、必要とされる応用に合わせて変更できる。例えばｎは、２、３、４、８、１１、１２、１６またはそれ以上であってよい。ＰＥＧリンカーは、水溶性などの好都合な特徴を有することから好適である。他の非ＰＥＧリンカーもシステイン連結において使用できる。
【０３０８】
同様の手法を使用することによって同一のＦａｚ変種は、ホモ二量体に作製され得る。ＤＩＢＯ官能基を有するホモ二機能性リンカーは、Ｃｕ２＋フリークリック化学を使用してホモ二量体を作製するために、同じＦａｚ変種の２分子を連結するために使用できる。リンカーの一例は下に示されている：
【０３０９】
【化７】
0006677640.tif 000017
【０３１０】
ＰＥＧリンカーの長さは、２、４、８、１２、１６またはそれ以上のＰＥＧ単位を含んで変化してよい。そのようなリンカーは、定量を容易にするために蛍光タグを組み込んで作製されてもよい。そのような蛍光タグは、マレイミドリンカーにも組み込まれ得る。
【０３１１】
２つ以上のシステイン残基または非天然アミノ酸が本発明によるヘリカーゼに導入され、別々のヘリカーゼモノマー中の別々のシステインまたは非天然アミノ酸が合わせて付着されている場合に、ホモ二量体またはより長いホモオリゴマーは、ヘッドトゥーテール編成に調製されてもよい。例えばホモオリゴマーは、Ｙ２７９ＣおよびＧ３５７Ｃを含む配列番号８の変種から形成されてよく、１つのモノマー中の２７９のＣは、別のモノマー中の３５７のＣに付着されてよい。同様にホモオリゴマーは、Ｉ２８１ＣおよびＧ３５７Ｃを含む配列番号８の変種から形成されてよく、１つのモノマー中の２８１のＣは、別のモノマー中の３５７のＣに付着されてよい。同様のことが、ＦａｚがＣの代わりにこれらの位置に導入される場合に真である。そのようなＣおよびＦａｚ変異体は、シリーズのまたは一続きの（trains of）ヘリカーゼが作製されるようにする。
【０３１２】
ポリヌクレオチド配列
本発明は本発明のヘリカーゼ、本発明のポリペプチドまたは本発明の構築物をコードする配列を含むポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、そのような配列からなってよい。ポリヌクレオチドは、上に考察の任意のものであってよい。
【０３１３】
本明細書に記載の任意のタンパク質は、当技術分野において公知の方法を使用して発現され得る。ポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準的方法を使用して単離および複製され得る。染色体ＤＮＡは、メタノコッコイデス・ブルトニイ（Methanococcoides burtonii）などのヘリカーゼ産生生物からおよび／または大腸菌（E. coli）などのＳＳＢ産生生物から抽出され得る。目的の配列をコードしている遺伝子は、特異的プライマーを伴うＰＣＲを使用して増幅され得る。増幅された配列は、次いでクローニングベクターなどの組換え複製可能ベクターに組み込まれてよい。ベクターは、適合性の宿主細胞においてポリヌクレオチドを複製するために使用され得る。したがってポリヌクレオチド配列は、目的の配列をコードしているポリヌクレオチドを複製可能ベクターに導入し、ベクターを適合性の宿主細胞に導入し、ベクターの複製をもたらす条件下で宿主細胞を増殖させることによって作製され得る。ベクターは宿主細胞から回収され得る。ポリヌクレオチドのクローニングのために好適な宿主細胞は、当技術分野において公知であり、下により詳細に記載される。
【０３１４】
ポリヌクレオチド配列は、好適な発現ベクターにクローニングされてよい。発現ベクターではポリヌクレオチド配列は、典型的には、宿主細胞によるコード配列の発現をもたらすことができる制御配列に作動可能に連結される。そのような発現ベクターは構築物を発現するために使用され得る。
【０３１５】
用語「作動可能に連結する」は、記載される構成成分がそれらが意図する様式で機能する関係の近位にあることを指す。コード配列に「作動可能に連結される」制御配列は、コード配列の発現が制御配列と適合性である条件下で達成されるような方法でライゲーションされる。同じまたは異なるポリヌクレオチドの複数のコピーは、ベクターに導入されてよい。
【０３１６】
発現ベクターは、次いで好適な宿主細胞に導入されてよい。それにより構築物は、構築物をコードしているポリヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、ベクターを適合性の細菌宿主細胞に導入し、ポリヌクレオチド配列の発現をもたらす条件下で宿主細胞を増殖させることによって産生され得る。
【０３１７】
ベクターは、複製開始点、場合により前記ポリヌクレオチド配列の発現のためのプロモーターおよび場合によりプロモーターのレギュレーターと共に提供される例えば、プラスミド、ウイルスまたはファージベクターであってよい。ベクターは、１つまたは複数の選択可能マーカー遺伝子、例えばアンピリシン耐性遺伝子を含有してよい。プロモーターおよび他の発現調節シグナルは、発現ベクターが設計された宿主細胞に適合性であるように選択されてよい。Ｔ７、ｔｒｃ、ｌａｃ、ａｒａまたはλＬプロモーターは典型的には使用される。
【０３１８】
宿主細胞は、典型的には高いレベルで構築物を発現する。ポリヌクレオチド配列で形質転換される宿主細胞は、細胞を形質転換するために使用される発現ベクターに適合性であるように選ばれる。宿主細胞は、典型的には細菌性、好ましくは大腸菌（E. coli）である。λＤＥ３溶原菌を有する任意の細胞、例えばＲｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓ、Ｃ４１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＪＭ１０９（ＤＥ３）、Ｂ８３４（ＤＥ３）、ＴＵＮＥＲ、ＯｒｉｇａｍｉおよびＯｒｉｇａｍｉ  Ｂは、Ｔ７プロモーターを含むベクターを発現できる。
【０３１９】
シリーズ
本発明は、ポリヌクレオチドに付着した（または結合した）２つ以上のヘリカーゼのシリーズであって、２つ以上のヘリカーゼの少なくとも１つが本発明のＤｄａヘリカーゼであるヘリカーゼのシリーズも提供する。シリーズは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれ以上などのヘリカーゼなどの任意の数のヘリカーゼを含んでよい。任意の数のヘリカーゼは、本発明のＤｄａヘリカーゼであってよい。２つ以上のヘリカーゼの全ては、好ましくは本発明のＤｄａヘリカーゼである。本発明の１つまたは複数のＤｄａヘリカーゼは、上に考察の任意のものであってよい。
【０３２０】
２つ以上のヘリカーゼは、同じヘリカーゼであってよく、または異なるヘリカーゼであってよい。例えばシリーズが２つ以上の本発明のＤｄａヘリカーゼを含む場合、本発明のＤｄａヘリカーゼは同じであってよくまたは異なっていてよい。
【０３２１】
シリーズは、任意の数および任意の組合せの本発明のＤｄａヘリカーゼを含んでよい。２つ以上のヘリカーゼのシリーズは、少なくとも２つの本発明のＤｄａヘリカーゼを好ましくは含む。シリーズは、それぞれが（ｉ）Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ、（ｉｉ）Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃおよびさらに（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２（すなわちＭ１の欠失ならびにさらにＧ１およびＧ２付加）、（ｉｉｉ）Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ、（ｉｖ）Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａおよびさらに（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２（すなわちＭ１の欠失ならびにさらにＧ１およびＧ２付加）、（ｖ）Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａ、（ｖｉ）Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａおよびさらに（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２（すなわちＭ１の欠失ならびにさらにＧ１およびＧ２付加）、（ｖｉｉ）Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｗ３７８Ａまたは（ｖｉｉｉ）Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｗ３７８Ａおよびさらに（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２（すなわちＭ１の欠失およびさらにＧ１およびＧ２の付加）を含む（またはそれだけを含む）配列番号８の変種を含む２つ以上のＤｄａヘリカーゼを含んでよい。シリーズ中の１つの本発明のＤｄａヘリカーゼは、（ｉ）から（ｉｖ）の１つを含む（またはそれだけを含む）配列番号８の変種を好ましくは含み、シリーズ中の別の本発明のＤｄａヘリカーゼは、好ましくは（ｖ）から（ｖｉｉｉ）の１つを含む（またはそれだけを含む）配列番号８の変種を含む。
【０３２２】
本発明の１つまたは複数のＤｄａヘリカーゼに加えて、シリーズは本発明の一部ではない１つまたは複数のヘリカーゼを含んでよい。１つまたは複数のヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ、ＴｒａＩヘリカーゼもしくはＴｒｗＣヘリカーゼなどのＲｅｃＤヘリカーゼ、ＸＰＤヘリカーゼまたはＤｄａヘリカーゼであってよい、または由来してよい。１つまたは複数のヘリカーゼは、ヘリカーゼ、修飾ヘリカーゼまたは国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５２５７９号（ＷＯ２０１３／０５７４９５として公開）；第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１３／０９８５６２として公開）；第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７３号（ＷＯ２０１３／０９８５６１として公開）；第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２５号（ＷＯ２０１４／０１３２６０として公開）；第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２４号（ＷＯ２０１４／０１３２５９として公開）および第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２８号（ＷＯ２０１４／０１３２６２として公開）；ならびに英国特許第１３１８４６４．３号、２０１３年１０月１８日出願において開示のヘリカーゼ構築物のいずれであってもよい。具体的には１つまたは複数のヘリカーゼは、少なくとも１つのコンホメーション状態でポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離できる、ポリヌクレオチド結合ドメイン中の開口部のサイズを低減するように好ましくは修飾される。これは、ＷＯ２０１４／０１３２６０に開示されている。
【０３２３】
シリーズ中の２つ以上のヘリカーゼは、互いに離れていてよい。シリーズ中の２つ以上のヘリカーゼは、ポアを通ってポリヌクレオチドが移動する際に、膜貫通ポアによって互いに引き寄せられ得る。シリーズ中の２つ以上のヘリカーゼは、互いに接触できる。
【０３２４】
２つ以上のヘリカーゼは、ポリヌクレオチドを介する場合を除いて好ましくは互いに付着されない。２つ以上のヘリカーゼは、好ましくは互いに共有結合的に付着されない。
【０３２５】
２つ以上のヘリカーゼは、互いに付着できる、または共有結合的に付着できる。ヘリカーゼは、任意の順序で、任意の方法を使用して付着され得る。付着されたヘリカーゼのシリーズは、一続き（train）と呼ばれる場合がある。
【０３２６】
本発明のシリーズが付着できる／結合できるポリヌクレオチドは、下により詳細に考察される。
【０３２７】
本発明の方法
本発明は、標的ポリヌクレオチドの移動を制御する方法を提供する。方法は、標的ポリヌクレオチドを本発明のＤｄａヘリカーゼ、修飾ヘリカーゼまたは本発明の構築物と接触させ、それによりポリヌクレオチドの移動を制御するステップを含む。方法は、好ましくはポアに電位が印加されて実行される。下により詳細に考察されるとおり、印加された電位は、ポアとヘリカーゼまたは構築物との複合体の形成を典型的には生じる。印加された電位は、電圧電位であってよい。代替的に印加された電位は、化学電位であってよい。この一例は、両親媒性層全体に塩勾配を用いている。塩勾配は、Holdenら、J Am Chem Soc. 2007 Jul 11;129(27):8650-5に開示されている。
【０３２８】
本発明は標的ポリヌクレオチドを特性決定する方法も提供する。方法は、
（ａ）標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアおよび本発明のＤｄａヘリカーゼ、修飾ヘリカーゼまたは本発明の構築物に接触させて、ヘリカーゼまたは構築物がポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するステップを含む。方法は、（ｂ）ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときに１つまたは複数の測定値を取るステップであって、測定値が標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性の指標であり、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップも含む。
【０３２９】
本発明の全ての方法ではヘリカーゼは、本発明の修飾Ｄｄａヘリカーゼおよび本発明により修飾されていないＤｄａヘリカーゼを含む、本発明の構築物を参照して上に考察の任意のものであってよい。
【０３３０】
任意の数の本発明のＤｄａヘリカーゼがこれらの方法において使用され得る。例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれ以上のヘリカーゼが使用され得る。２つ以上の本発明のＤｄａヘリカーゼが使用される場合、それらは同じまたは異なっていてよい。好適な数および組合せは、本発明のシリーズを参照して上に考察されている。これらは、本発明の方法に等しく適用される。
【０３３１】
２つ以上のヘリカーゼが使用される場合、それらは互いに付着されてよい。２つ以上のヘリカーゼは、互いに共有結合的に付着されてよい。ヘリカーゼは、任意の順序で任意の方法を使用して付着されてよい。本発明における使用のために好ましいヘリカーゼ構築物は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２５号（ＷＯ２０１４／０１３２６０として公開）；第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２４号（ＷＯ２０１４／０１３２５９として公開）および第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２８号（ＷＯ２０１４／０１３２６２として公開）；ならびに英国出願第１３１８４６４．３号、２０１３年１０月１８日出願に記載されている。
【０３３２】
２つ以上のヘリカーゼが使用される場合、それらはポリヌクレオチドを介する場合を除いて好ましくは互いに付着されない。２つ以上のヘリカーゼは、より好ましくは互いに共有結合的に付着されない。
【０３３３】
ステップ（ａ）および（ｂ）は、上に考察したとおり好ましくはポアに電位が印加されて実行される。いくつかの場合では、ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときにポアを通る電流が標的ポリヌクレオチドの配列を決定するために使用される。これは、鎖配列決定法である。
【０３３４】
本発明の方法は、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためである。ポリヌクレオチドは上に定義されている。
【０３３５】
標的ポリヌクレオチドの全体または部分だけは、本方法を用いて特性付けられ得る。標的ポリヌクレオチドは、任意の長さであってよい。例えばポリヌクレオチドは、長さ少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００または少なくとも５００ヌクレオチド対であってよい。ポリヌクレオチドは、１０００ヌクレオチド対以上、長さ５０００ヌクレオチド対以上または長さ１０００００ヌクレオチド対以上であってよい。
【０３３６】
標的ポリヌクレオチドは、任意の好適な試料中に存在する。本発明は、標的ポリヌクレオチドを含有することが公知であるまたは含有すると考えられる試料について典型的には実行される。代替的に本発明は、１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドの同一性を確認するために試料中でのその存在が公知であるまたは期待される試料について実行され得る。
【０３３７】
試料は生物学的試料であってよい。本発明は、任意の生物または微生物から得られたまたは抽出された試料についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで実行されてよい。生物または微生物は典型的には古細菌のもの、原核性または真核性であり、典型的には五界：植物界、動物界、菌界、モネラ界および原生生物界の１つに属する。本発明は、任意のウイルスから得られたまたは抽出された試料についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで実行されてよい。試料は、好ましくは液体試料である。試料は典型的には、患者の体液を含む。試料は尿、リンパ液、唾液、粘液または羊水であってよいが、好ましくは血液、血漿または血清である。典型的には試料は、ヒト由来であるが、代替的に、ウマ、ウシ、ヒツジまたはブタなどの商業的に飼育される動物由来などの別の哺乳動物由来であってもよく、代替的にネコまたはイヌなどの愛玩動物であってもよい。代替的に植物由来の試料は、穀類、マメ、果実または野菜などの商品作物（例えばコムギ、オオムギ、カラスムギ、セイヨウアブラナ、トウモロコシ、ダイズ、イネ、バナナ、リンゴ、トマト、ジャガイモ、ブドウ、タバコ、マメ、レンズマメ、サトウキビ、ココア、ワタ）から典型的には得られる。
【０３３８】
試料は、非生物学的試料であってよい。非生物学的試料は、好ましくは液体試料である。非生物学的試料の例は、手術用液（surgical fluids）、水（飲料水、海水または河川水など）および検査室検査のための試薬を含む。
【０３３９】
試料は、典型的にはアッセイされる前に例えば遠心分離によってまたは、不要の分子または細胞（赤血球細胞など）をろ過して除く膜を通すことによって処理される。試料は採取されてから直ちに測定されてよい。試料は、典型的にはアッセイの前に好ましくは−７０℃より低くで、保存されてもよい。
【０３４０】
膜貫通ポアは、ある程度膜を超える構造である。それは印加された電位によって駆動された水和イオンが膜を超えてまたは膜内に流れるようにする。膜貫通ポアは、典型的には膜全体を超え、それにより水和イオンは膜の一方の側から膜の他方の側へ流れられる。しかし膜貫通ポアは、膜を超えている必要はない。それは、一方の端で閉じていてもよい。例えばポアは、水和イオンが膜に沿ってまたは膜内に流れ得る穴であってもよい。
【０３４１】
任意の膜貫通ポアが本発明において使用され得る。ポアは、生物学的または人工であってよい。好適なポアは、これだけに限らないが、タンパク質ポア、ポリヌクレオチドポアおよびソリッドステートポアを含む。
【０３４２】
任意の膜が本発明により用いられ得る。好適な膜は、当技術分野において周知である。膜は、好ましくは両親媒性層である。両親媒性層は、少なくとも１つの親水性の部分および少なくとも１つの親油性または疎水性の部分の両方を有するリン脂質などの両親媒性分子から形成される層である。両親媒性分子は合成または天然に存在するものでよい。天然に存在しない両親媒性物質、および単層を形成する両親媒性物質は当技術分野において公知であり、例えばブロックコポリマー（Gonzalez-Perezら、Langmuir、2009、25、10447-10450）を含む。ブロック共重合体は、２つ以上の単量体サブユニットが１本のポリマー鎖を作るように併せて重合されている重合体材料である。ブロック共重合体は、典型的には各単量体サブユニットによって寄与される特徴を有する。しかし、ブロック共重合体は、個々のサブユニットから形成されたポリマーが有さない特有の特徴を有する場合がある。ブロック共重合は、単量体サブユニットの１つが疎水性（すなわち親油性）である一方で他のサブユニット（複数可）が水性媒体中では親水性であるように操作されてよい。この場合ブロック共重合体は、両親媒性特徴を有する場合があり、生物学的膜を模倣する構造を形成できる。ブロック共重合体は、ジブロック（２個の単量体サブユニットからなる）であってよいが、両親媒性物質として振る舞うさらに複雑な配置を形成するために２個より多い単量体サブユニットから構築されてもよい。共重合体はトリブロック、テトラブトックまたはペンタブロック共重合体であってもよい。
【０３４３】
両親媒性層は、単層または二重層であってよい。両親媒性層は、典型的には平面状脂質二重層または支持された二重層である。
【０３４４】
両親媒性層は典型的には、脂質二重層である。脂質二重層は細胞膜のモデルであり、さまざまな実験研究のための優れたプラットフォームとして役立つ。例えば、脂質二重層は、単一チャネル記録による膜タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ調査のために用いられ得る。代替的に脂質二重層は、さまざまな物質の存在を検出するためのバイオセンサーとして用いられ得る。脂質二重層は、任意の脂質二重層であってよい。好適な脂質二重層は、これだけに限らないが平面状脂質二重層、支持された二重層またはリポソームを含む。脂質二重層は好ましくは平面状脂質二重層である。好適な脂質二重層は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６３号（ＷＯ２００８／１０２１２１として公開）、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号（ＷＯ２００９／０７７７３４として公開）および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１０５７号（ＷＯ２００６／１００４８４として公開）に開示されている。
【０３４５】
脂質二重層を形成するための方法は、当技術分野において公知である。好適な方法は実施例に開示する。脂質二重層は、脂質単層が水溶液／空気界面にその界面に垂直である開口部のいずれかの端を通って運ばれる、モンタルおよびミューラーの方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA.、1972;69:3561-3566）によって一般的には形成される。
【０３４６】
モンタルおよびミューラーの方法は、タンパク質ポア挿入のために好適である良質な脂質二重層を形成する対費用効果が高くて比較的簡単な方法であることから一般的である。二重層形成の他の一般的方法は、チップディッピング、ペインティング二重層およびリポソーム二重層のパッチクランピングを含む。
【０３４７】
好ましい実施形態では、脂質二重層は国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号（ＷＯ２００９／０７７７３４として公開）に記載のとおり形成される。
【０３４８】
別の好ましい実施形態では、膜は、ソリッドステート層である。ソリッドステート層は生物由来ではない。換言すると、ソリッドステート層は、生物または細胞などの生物学的環境由来でなく、またはそれから単離されず、生物学的に入手可能な構造の合成的に製造されたバージョンでもない。ソリッドステート層は、これだけに限らないがミクロ電子材料、Ｓｉ３Ｎ４、Ａ１２０３およびＳｉＯなどの絶縁材料、ポリアミドなどの有機および無機ポリマー、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）などのプラスチックまたは２要素添加硬化シリコンゴム（two-component addition-cure silicone rubber）などのエラストマーならびにガラスを含む有機材料ならびに無機材料の両方から形成され得る。ソリッドステート層は、グラフェン（graphene）などの一原子層からまたは数原子厚だけである層から形成され得る。好適なグラフェン（graphene）層は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１０６３７号（ＷＯ２００９／０３５６４７として公開）に開示されている。
【０３４９】
方法は、（ｉ）ポアを含む人工両親媒性層、（ｉｉ）ポアを含む単離された天然に存在する脂質二重層、または（ｉｉｉ）挿入されたポアを有する細胞を用いて典型的には実行される。方法は、人工脂質二重層などの人工両親媒性層を用いて典型的には実行される。両親媒性層は、ポアに加えて他の膜貫通タンパク質および／または膜内タンパク質ならびに他の分子を含んでもよい。好適な装置および条件は、下に考察される。本発明の方法は、典型的にはｉｎ  ｖｉｔｒｏで実行される。
【０３５０】
ポリヌクレオチドは、膜にカップリングされ得る。これは、任意の公知の方法を用いてされ得る。膜が脂質二重層などの両親媒性層である場合は（下に詳細に考察されるとおり）、ポリヌクレオチドは、膜に存在するポリペプチドまたは膜に存在する疎水性アンカーを介して膜に好ましくはカップリングされる。疎水性アンカーは、好ましくは脂質、脂肪酸、ステロール、カーボンナノチューブまたはアミノ酸である。
【０３５１】
ポリヌクレオチドは膜に直接カップリングされ得る。ポリヌクレオチドは好ましくは膜にリンカーを介してカップリングされる。好ましいリンカーは、これだけに限らないがポリヌクレオチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリペプチドなどのポリマーを含む。ポリヌクレオチドが膜に直接カップリングされる場合、膜とヘリカーゼとの間の距離のためにポリヌクレオチドの末端まで特性決定が継続できないことから、いくらかのデータが失われる。リンカーが用いられる場合、ポリヌクレオチドは完了まで処理され得る。リンカーが用いられる場合、リンカーはポリヌクレオチドの任意の位置に付着され得る。リンカーは、テールポリマーでポリヌクレオチドに典型的には付着される。
【０３５２】
カップリングは、安定または一過的であってよい。ある種の応用に関してカップリングの一過的な性質は好ましい。安定カップリング分子がポリヌクレオチドの５’末端または３’末端のいずれかに直接付着された場合、膜とヘリカーゼ活性部位との間の距離のためにポリヌクレオチドの末端まで特性決定が継続できないことから、いくらかのデータが失われる。カップリングが一過的である場合、カップリングされた端は無作為に膜から遊離し、ポリヌクレオチドは完了まで処理され得る。安定なまたは一過的連結を膜と形成する化学基は、下により詳細に考察される。ポリヌクレオチドは、コレステロール（cholesterol）または脂肪酸アシル鎖を用いて脂質二重層などの両親媒性層に一過的にカップリングされ得る。ヘキサデカン酸などの長さ６から３０までの炭素原子を有する任意の脂肪酸アシル鎖は用いられ得る。
【０３５３】
好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、両親媒性層にカップリングされる。合成脂質二重層へのポリヌクレオチドのカップリングは、種々の異なるテザーリング戦略で既に実行されている。これらを下の表４に要約する。
【０３５４】
【表４】
0006677640.tif 000018
【０３５５】
ポリヌクレオチドは、合成反応において修飾ホスホラミダイトを用いて官能基化されることができ、チオール、コレステロール（cholesterol）、脂質およびビオチン基などの反応基の付加に容易に適合される。これらのさまざまな付着化学物質は、ポリヌクレオチドに一連の付着選択肢をもたらす。さまざまな各修飾基は、わずかに異なる方法でポリヌクレオチドを繋ぎ止め、カップリングは常に永久的ではなく、膜へのさまざまな残存時間をポリヌクレオチドにもたらす。一過的カップリングの有利点は、上に考察される。
【０３５６】
ポリヌクレオチドのカップリングは、反応基がポリヌクレオチドに付加され得る限り多数の他の手段によっても達成され得る。ＤＮＡのいずれかの端への反応基の付加は既に報告されている。チオール基はポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰγＳを用いてｓｓＤＮＡの５’に付加され得る(Grant,G.P.およびP.Z.Qin (2007) "A facile method for attaching nitroxide spin labels at the 5' terminus of nucleic acids." Nucleic Acids Res 35(10):e77)。ビオチン、チオールおよびフルオロフォア（fluorophore）などの化学基のより多様な選択は、修飾オリゴヌクレオチドをｓｓＤＮＡの３’に組み込むためにターミナルトランスフェラーゼを用いて付加され得る(Kumar,A.,P.Tchenら、(1988)."Nonradioactive labeling of synthetic oligonucleotide probes with terminal deoxynucleotidyl transferase." Anal Biochem 169(2):376-82)。
【０３５７】
代替的に反応基は、膜に既にカップリングされたものに相補的なＤＮＡの短片の付加のために考慮される場合があり、付着はハイブリダイゼーションを介して達成され得る。ｓｓＤＮＡの短片のライゲーションは、Ｔ４ＲＮＡリガーゼＩを用いて報告されている(Troutt,A.B.,M.G.McHeyzer-Williamsら、(1992)."Ligation-anchored PCR: a simple amplification technique with single-sided specificity." Proc Natl Acad Sci U S A 89(20):9823-5)。代替的にｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡのいずれかは、天然ｄｓＤＮＡにライゲーションされることができ、次いで２本鎖は熱的または化学的変性によって分離された。天然ｄｓＤＮＡについて、ｓｓＤＮＡの１片を二重鎖の１つもしくは両方の端に、またはｄｓＤＮＡを１つまたは両方の端へのいずれかで付加できる。次いで、二重鎖が融解される際に、ｓｓＤＮＡが５’末端、３’末端もしくは両端でのライゲーションもしくは修飾のために用いられ、ｄｓＤＮＡがライゲーションのために用いられた場合、各一重鎖は５’または３’修飾のいずれかを有する。ポリヌクレオチドが合成鎖である場合、カップリング化学はポリペプチドの化学合成の際に組み込まれ得る。ここ例えばポリヌクレオチドは、付着された反応基を有するプライマーを用いて合成され得る。
【０３５８】
ゲノムＤＮＡのセクションの増幅のための一般的技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いている。本明細書では、２個の合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＤＮＡの同じセクションの多数の複製物が作製される場合があり、各複製物について二重鎖中の各鎖の５’は合成ポリヌクレオチドである。コレステロール（cholesterol）、チオール（thiol）、ビオチン（biotin）または脂質などの反応基を有するアンチセンスプライマーを用いるステップによって、増幅された標的ＤＮＡの各複製物は、カップリングのための反応基を含有する。
【０３５９】
膜貫通ポアは、好ましくは膜貫通タンパク質ポアである。膜貫通タンパク質ポアは、分析物などの水和イオンが膜の一方の側から膜の他方の側へ流れるようにするポリペプチドまたはポリペプチドの集積物である。本発明では膜貫通タンパク質ポアは、水和イオンが印加された電位によって膜の一方の側から他方へ流れるように駆動されるようにするポアを形成できる。膜貫通タンパク質ポアは、ヌクレオチドなどの分析物が膜（脂質二重層など）の一方の側から他方へ流れるように好ましくはする。膜貫通タンパク質ポアは、ＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチドがポアを通って移動されることを可能にする。
【０３６０】
膜貫通タンパク質ポアは、単量体またはオリゴマーであってよい。ポアは、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個または少なくとも９個のサブユニットなどの、いくつかの反復サブユニットから好ましくはできている。ポアは、６個、７個、８個または９個のサブユニットから好ましくはできている。ポアは、好ましくは六量体、七量体、八量体または九量体ポアである。ポアは、ホモオリゴマーまたはヘテロオリゴマーであってよい。
【０３６１】
膜貫通タンパク質ポアは、イオンが通って流れることができるバレルまたはチャネルを典型的には含む。ポアのサブユニットは、典型的には中央軸を取り囲み、膜貫通βバレルもしくはチャネルまたは膜貫通αヘリックス束もしくはチャネルに鎖を供する。
【０３６２】
膜貫通タンパク質ポアのバレルまたはチャネルは、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸などの分析物との相互作用を促進するアミノ酸を典型的には含む。これらのアミノ酸は、バレルまたはチャネルの狭窄部付近に好ましくは位置する。膜貫通タンパク質ポアは、アルギニン、リシンもしくはヒスチジンなどの１つもしくは複数の正に荷電したアミノ酸またはチロシンもしくはトリプトファンなどの芳香族アミノ酸を典型的には含む。これらのアミノ酸は、ポアとヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸との間の相互作用を典型的には促進する。
【０３６３】
本発明による使用のための膜貫通タンパク質ポアは、β−バレルポアまたはα−ヘリックス束ポアから生じ得る。β−バレルポアは、β−鎖から形成されるバレルまたはチャネルを含む。好適なβ−バレルポアは、これだけに限らないが、α−ヘモリジン（hemolysin）、炭疽毒素およびロイコシジン（leukocidin）などのβ−毒素、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ポリン（porin）（Ｍｓｐ）、例えばＭｓｐＡ、ＭｓｐＢ、ＭｓｐＣまたはＭｓｐＤ、外膜ポリン（porin）Ｆ（ＯｍｐＦ）、外膜ポリン（porin）Ｇ（ＯｍｐＧ）、外膜ホスホリパーゼＡおよびナイセリア（Neisseria）オートトランスポーターリポタンパク質（ＮａｌＰ）などの細菌の外膜タンパク質／ポリン（porin）を含む。α−ヘリックス束ポアは、α−ヘリックスから形成されたバレルまたはチャネルを含む。好適なα−ヘリックス束ポアは、これだけに限らないが内膜タンパク質ならびに、ＷＺＡおよびＣｌｙＡ毒などのα外膜タンパク質を含む。膜貫通ポアは、Ｍｓｐ由来またはα−ヘモリジン（α−ＨＬ）由来である場合がある。
【０３６４】
膜貫通タンパク質ポアは、好ましくはＭｓｐに由来し、好ましくはＭｓｐＡに由来する。そのようなポアはオリゴマーであり、典型的にはＭｓｐ由来の７、８、９または１０個の単量体を含む。ポアは、同一の単量体を含むＭｓｐ由来のホモオリゴマーポアであってよい。代替的にポアは、少なくとも１個の他とは異なる単量体を含むＭｓｐ由来のヘテロオリゴマーポアであってもよい。好ましくはポアは、ＭｓｐＡまたはその相同体もしくはパラログ由来である。
【０３６５】
Ｍｓｐ由来の単量体は典型的には、配列番号２に示す配列またはその変種を含む。配列番号２はＭｓｐＡ単量体のＭＳ−（Ｂ１）８変異体である。それは次の変異：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋを含む。配列番号２の変種は、配列番号２のものから変化し、ポアを形成する能力を保持しているアミノ酸配列を有するポリペプチドである。ポアを形成する変種の能力は、当技術分野において公知の任意の方法を用いてアッセイされ得る。例えば変種は、他の適切なサブユニットと共に両親媒性層に挿入されることができ、ポアを形成するためにオリゴマー化するその能力は測定され得る。サブユニットを両親媒性層などの膜に挿入するための方法は、当技術分野において公知である。例えばサブユニットは、脂質二重層に拡散し、脂質二重層に結合するステップおよび機能的状態に会合するステップによって挿入されるように脂質二重層を含有する溶液中に精製された形態で懸濁され得る。代替的にサブユニットは、M.A.Holden,H.Bayley.J.Am.Chem.Soc.2005、127、6502-6503および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１０５７号（ＷＯ２００６／１００４８４として公開）に記載の「ピックアンドプレース」法を用いて膜に直接挿入され得る。
【０３６６】
配列番号２のアミノ酸配列の全長にわたって変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列に好ましくは少なくとも５０％相同である。より好ましくは変種は、配列全体にわたって配列番号２のアミノ酸配列にアミノ酸同一性に基づいて少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同である。少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性が１００以上（例えば１２５、１５０、１７５もしくは２００またはそれ以上）のストレッチの連続アミノ酸にわたってある場合がある（「高い相同性」）。
【０３６７】
相同性を決定するために当技術分野における標準的方法が用いられ得る。例えばＵＷＧＣＧパッケージは、相同性を算出するために用いられ得るＢＥＳＴＦＩＴプログラム（例えばその初期設定で用いられる）を提供する（Devereuxら、(1984) Nucleic Acids Research 12、387-395頁）。ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムは、相同性を算出するためまたは配列を列挙するために（等価残基または対応する配列を同定するステップなど（典型的にはその初期設定で））用いられ得る、例えばAltschul S.F.(1993)J Mol Evol 36:290-300；Altschul,S.Fら、(1990) J Mol Biol 215:403-10に記載のとおり。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウエアは、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公開で入手可能である。
【０３６８】
配列番号２は、ＭｓｐＡ単量体のＭＳ−（Ｂ１）８変異体である。変種は、ＭｓｐＡと比較してＭｓｐＢ、ＣまたはＤ単量体中の任意の変異を含み得る。ＭｓｐＢ、ＣおよびＤの成熟形態は配列番号５から７に示される。詳細には変種は、ＭｓｐＢに存在する次の置換：Ａ１３８Ｐを含む場合がある。変種は、ＭｓｐＣに存在する次の置換：Ａ９６Ｇ、Ｎ１０２ＥおよびＡ１３８Ｐの１つまたは複数を含む場合がある。変種はＭｓｐＤに存在する次の置換：Ｇ１の欠失、Ｌ２Ｖ、Ｅ５Ｑ、Ｌ８Ｖ、Ｄ１３Ｇ、Ｗ２１Ａ、Ｄ２２Ｅ、Ｋ４７Ｔ、Ｉ４９Ｈ、Ｉ６８Ｖ、Ｄ９１Ｇ、Ａ９６Ｑ、Ｎ１０２Ｄ、Ｓ１０３Ｔ、Ｖ１０４Ｉ、Ｓ１３６ＫおよびＧ１４１Ａの１つまたは複数を含む場合がある。変種は、ＭｓｐＢ、ＣおよびＤ由来の１つまたは複数の変異および置換の組合せを含み得る。変種は、好ましくは変異Ｌ８８Ｎを含む。配列番号２の変種は、ＭＳ−（Ｂ１）８の全変異に加えて変異Ｌ８８Ｎを有し、ＭＳ−（Ｂ２）８と称される。本発明において用いられるポアは、好ましくはＭＳ−（Ｂ２）８である。さらに好ましい変種は、変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを含む。配列番号２の変種は変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６ＲをＭＳ−（Ｂ１）８の全ての変異に加えて含み、ＭＳ−（Ｂ２Ｃ）８と称される。本発明において使用されるポアは、好ましくはＭＳ−（Ｂ２）８またはＭＳ−（Ｂ２Ｃ）８である。
【０３６９】
アミノ酸置換は、上に考察したものに加えて配列番号２のアミノ酸配列に作出され得る（例えば１、２、３、４、５、１０、２０または３０置換まで）。保存的置換は、アミノ酸を同様の化学構造、同様の化学的特性または同様の側鎖容積を有する他のアミノ酸で置き換える。導入されるアミノ酸は、それらが置き換えるアミノ酸と同様の極性、親水性、疎水性、塩基性度、酸性度、中性度または電荷を有してよい。代替的に保存的置換は、既存の芳香族または脂肪族アミノ酸の代わりに芳香族または脂肪族である別のアミノ酸を導入する場合がある。保存的アミノ酸変更は、当技術分野において周知であり、下の表５に定義のとおり２０種の主なアミノ酸の特性に従って選択され得る。アミノ酸が同様の極性を有する場合、これは表６におけるアミノ酸側鎖についてのハイドロパシースケールを参照することによっても決定され得る。
【０３７０】
【表５】
0006677640.tif 000019
【０３７１】
【表６】
0006677640.tif 000020
【０３７２】
配列番号２のアミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸残基は、上に記載のポリペプチドから追加的に欠失され得る。１、２、３、４、５、１０、２０または３０残基までまたはそれ以上が欠失され得る。
【０３７３】
変種は、配列番号２の断片を含み得る。そのような断片は、ポア形成活性を保持する。断片は、長さ少なくとも５０、１００、１５０または２００アミノ酸であってよい。そのような断片は、ポアを生成するために用いられ得る。断片は、配列番号２のポア形成ドメインを好ましくは含む。断片は、配列番号２の残基８８、９０、９１、１０５、１１８および１３４の１つを含まなければならない。典型的には断片は、配列番号２の残基８８、９０、９１、１０５、１１８および１３４の全てを含む。
【０３７４】
１つまたは複数のアミノ酸は、上に記載のポリペプチドに代替的または追加的に付加され得る。伸長は、配列番号２のアミノ酸配列またはそのポリペプチド変種もしくは断片のアミノ末端またはカルボキシ末端に与えられ得る。伸長は極めて短い（例えば長さ１から１０アミノ酸）場合がある。代替的に伸長はより長くても（例えば５０または１００アミノ酸まで）よい。担体タンパク質は、本発明によるアミノ酸配列に融合され得る。他の融合タンパク質は、下により詳細に考察される。
【０３７５】
上に考察したとおり変種は、配列番号２から変更され、ポアを形成する能力を保持しているアミノ酸配列を有するポリペプチドである。変種は、ポア形成に関与する配列番号２の領域を典型的には含有する。β−バレルを含有するＭｓｐのポア形成能力は、各サブユニットのβシートによって与えられる。配列番号２の変種は、β−シートを形成する配列番号２中の領域を典型的には含む。１つまたは複数の修飾が、得られる変種がポアを形成する能力を保持する限り、β−シートを形成する配列番号２の領域に作出され得る。配列番号２の変種は、置換、付加または欠失などの１つまたは複数の修飾をα−ヘリックスおよび／またはループ領域内に好ましくは含む。
【０３７６】
Ｍｓｐ由来の単量体は、それらの同定または精製を支援するために、例えばヒスチジン残基（ｈｉｓｔタグ）、アスパラギン酸残基（ａｓｐタグ）、ストレプトアビジンタグもしくはフラッグタグの付加によって、または（細胞からのそれらの分泌を促進するためのシグナル配列の付加によってポリペプチドが天然でそのような配列を含有しない場合に）修飾され得る。遺伝子タグを導入するための別法は、ポア上の天然のまたは操作された位置にタグを化学的に反応させることである。この例は、ポアの外側に操作されたシステインにゲルシフト試薬を反応させることである。これは、ヘモリジンヘテロ−オリゴマーを分離するステップのための方法として実証されている(Chem Biol.1997 Jul;4(7):497-505)。
【０３７７】
Ｍｓｐ由来の単量体は、明示標識（revealing label）で標識され得る。明示標識は、ポアが検出されるようにする任意の好適な標識であってよい。好適な標識は、上に記載されている。
【０３７８】
Ｍｓｐ由来の単量体は、Ｄ−アミノ酸を用いても生成され得る。例えばＭｓｐ由来の単量体は、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸との混合物を含み得る。これは、そのようなタンパク質またはペプチドを生成するための当技術分野における従来法である。
【０３７９】
Ｍｓｐ由来の単量体は、ヌクレオチド識別を促進するために１つまたは複数の特異的修飾を含有する。Ｍｓｐ由来の単量体は、他の非特異的な修飾をそれらがポア形成を干渉しない限り含有できる。多数の非特異的側鎖修飾が当技術分野において公知であり、Ｍｓｐ由来の単量体の側鎖に作出され得る。そのような修飾は、例えばアルデヒドとの反応に続くＮａＢＨ４での還元によるアミノ酸の還元的アルキル化、メチルアセトイミデート（methylacetimidate）でのアミジン化または無水酢酸でのアシル化を含む。
【０３８０】
Ｍｓｐ由来の単量体は、当技術分野において公知の標準的方法を用いて生成され得る。Ｍｓｐ由来の単量体は、合成的にまたは組換え手段によって作出され得る。例えばポアはｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳および転写（ＩＶＴＴ）によって合成され得る。ポアを生成するための好適な方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号（ＷＯ２０１０／００４２７３として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）または第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）に考察されている。ポアを膜に挿入するための方法は考察されている。
【０３８１】
膜貫通タンパク質ポアは、好ましくはα−ヘモリジン（α−ＨＬ）由来でもある。野生型α−ＨＬポアは、７個の同一単量体またはサブユニットから形成される（すなわち七量体である）。α−ヘモリジン−ＮＮの１個の単量体またはサブユニットの配列は配列番号４に示されている。膜貫通タンパク質ポアは、配列番号４に示す配列またはその変種をそれぞれ含む７個の単量体を好ましくは含む。配列番号４のアミノ酸１、７から２１、３１から３４、４５から５１、６３から６６、７２、９２から９７、１０４から１１１、１２４から１３６、１４９から１５３、１６０から１６４、１７３から２０６、２１０から２１３、２１７、２１８、２２３から２２８、２３６から２４２、２６２から２６５、２７２から２７４、２８７から２９０および２９４はループ領域を形成する。配列番号４の残基１１３および１４７はα−ＨＬのバレルまたはチャネルの狭窄の一部を形成する。
【０３８２】
そのような実施形態では、配列番号４に示す配列またはその変種をそれぞれ含む７個のタンパク質または単量体を含むポアは、本発明の方法において好ましくは用いられる。７個のタンパク質は、同じ（ホモ七量体）または異なっていて（ヘテロ七量体）よい。
【０３８３】
配列番号４の変種は、配列番号４のものから変化したアミノ酸配列を有し、ポア形成能力を保持しているタンパク質である。ポアを形成する変種の能力は、当技術分野において公知の任意の方法を用いてアッセイされ得る。例えば変種は、他の適切なサブユニットと共に脂質二重層などの両親媒性層に挿入されることができ、ポアを形成するためにオリゴマー化するその能力は決定され得る。サブユニットを脂質二重層などの両親媒性層に挿入するための方法は当技術分野において公知である。好適な方法は上に考察されている。
【０３８４】
変種は、ヘリカーゼまたは構築物への共有結合付着または相互作用を促進する修飾を含み得る。変種は、ヘリカーゼまたは構築物への付着を促進する１つまたは複数の反応性システイン残基を好ましくは含む。例えば変種は、配列番号４の位置８、９、１７、１８、１９、４４、４５、５０、５１、２３７、２３９および２８７ならびに／またはアミノ末端もしくはカルボキシ末端の１つまたは複数にシステインを含み得る。好ましい変種は、配列番号４の位置８、９、１７、２３７、２３９および２８７の残基のシステインでの置換を含む（Ａ８Ｃ、Ｔ９Ｃ、Ｎ１７Ｃ、Ｋ２３７Ｃ、Ｓ２３９ＣまたはＥ２８７Ｃ）。変種は、好ましくは国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号（ＷＯ２０１０／００４２７３として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）、または第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）に記載の変種のいずれか１つである。
【０３８５】
変種は、ヌクレオチドとの任意の相互作用を促進する修飾も含み得る。
【０３８６】
変種は、生物（例えば細菌ブドウ球菌（Staphylococcus））によって天然で発現される天然に存在する変種であってよい。代替的に変種は、大腸菌（Escherichia coli）などの細菌によってｉｎ  ｖｉｔｒｏでまたは組換え的に発現されてもよい。変種は、組換え技術によって生成される天然に存在しない変種も含む。配列番号４のアミノ酸配列の全長にわたって変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列に好ましくは少なくとも５０％相同である。より好ましくは変種ポリペプチドは、配列全体にわたって配列番号４のアミノ酸配列にアミノ酸同一性に基づいて少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同である。少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性が２００以上（例えば２３０、２５０、２７０もしくは２８０またはそれ以上）のストレッチの連続アミノ酸にわたってある場合がある（「高い相同性」）。相同性は上に考察のとおり決定され得る。
【０３８７】
アミノ酸置換は、上に考察したものに加えて配列番号４のアミノ酸配列に作出され得る（例えば１、２、３、４、５、１０、２０または３０置換まで）。保存的置換は、上に考察の通り作出され得る。
【０３８８】
配列番号４のアミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸残基は、上に記載のポリペプチドから追加的に欠失され得る。１、２、３、４、５、１０、２０または３０残基までまたはそれ以上が欠失され得る。
【０３８９】
変種は、配列番号４の断片であり得る。そのような断片はポア形成能力を保持する。断片は、長さ少なくとも５０、１００、２００または２５０アミノ酸であってよい。断片は、配列番号４のポア形成ドメインを好ましくは含む。断片は典型的には配列番号４の残基１１９、１２１、１３５、１１３および１３９を含む。
【０３９０】
１つまたは複数のアミノ酸は、上に記載のポリペプチドに代替的にまたは追加的に付加され得る。伸長は、配列番号４のアミノ酸配列またはその変種もしくは断片のアミノ末端またはカルボキシ末端に与えられ得る。伸長は極めて短い（例えば長さ１から１０アミノ酸）場合がある。代替的に伸長は、より長くても（例えば５０または１００アミノ酸まで）良い。担体タンパク質は、ポアまたは変種に融合されてもよい。
【０３９１】
上に考察したとおり、配列番号４の変種は、配列番号４のものから変更され、ポアを形成する能力を保持しているアミノ酸配列を有するサブユニットである。変種は、ポア形成に関与する配列番号４の領域を典型的には含有する。β−バレルを含有するα−ＨＬのポア形成能力は、各サブユニットのβシートによって与えられる。配列番号４の変種は、β鎖を形成する配列番号４の領域を典型的には含む。β鎖を形成する配列番号４のアミノ酸は上に考察されている。１つまたは複数の修飾が、得られる変種がポアを形成する能力を保持する限りβ−鎖を形成する配列番号４の領域に作出され得る。配列番号４のβ鎖領域に作られ得る具体的な修飾は、上に考察されている。
【０３９２】
配列番号４の変種は、置換、付加または欠失などの１つまたは複数の修飾をα−ヘリックスおよび／またはループ領域内に好ましくは含む。α−ヘリックスおよびループを形成するアミノ酸は、上に考察されている。
【０３９３】
変種は、上に考察のとおり、その同定または精製を支援するために修飾され得る。
【０３９４】
α−ＨＬ由来のポアは、Ｍｓｐ由来のポアに関連して上に考察のとおり作出され得る。
【０３９５】
いくつかの実施形態では膜貫通タンパク質ポアは、化学的に修飾される。ポアは、任意の方法および任意の部位で化学的に修飾され得る。膜貫通タンパク質ポアは、１つもしくは複数のシステインへの分子の付着（システイン連結）、１つもしくは複数のリシンへの分子の付着、１つもしくは複数の非天然アミノ酸への分子の付着、エピトープの酵素修飾または末端の修飾によって好ましくは化学的に修飾される。そのような修飾を実行するための好適な方法は、当技術分野において周知である。膜貫通タンパク質ポアは、任意の分子の付着によって化学的に修飾され得る。例えばポアは、色素またはフルオロフォアの付着によって化学的に修飾され得る。
【０３９６】
ポア中の任意の数の単量体は、化学的に修飾され得る。１つまたは複数（２、３、４、５、６、７、８、９または１０個など）の単量体は、上に考察のとおり好ましくは化学的に修飾される。
【０３９７】
システイン残基の反応性は、隣接残基の修飾によって増強され得る。例えば近接アルギニン、ヒスチジンまたはリシン残基の塩基性基は、システインチオール基のｐＫａをより反応性のＳ−基のものに変化させる。システイン残基の反応性は、ｄＴＮＢなどのチオール保護基によって保護され得る。これらは、リンカーが付着する前にポアの１つまたは複数のシステイン残基と反応できる。
【０３９８】
（ポアが化学的に修飾される）分子は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号（ＷＯ２０１０／００４２７３として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）または第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）に開示のとおりポアに直接付着され得るか、またはリンカーを介して付着され得る。
【０３９９】
ヘリカーゼまたは構築物は、ポアに共有結合的に付着されていてもよい。ヘリカーゼまたは構築物は、好ましくはポアに共有結合的に付着されていない。ポアおよびヘリカーゼまたは構築物への電圧の印加は、典型的には標的ポリヌクレオチドを配列決定できるセンサーの形成を生じる。これは、下により詳細に考察される。
【０４００】
本明細書に記載の任意のタンパク質、すなわちヘリカーゼ、膜貫通タンパク質ポアまたは構築物は、それらの同定または精製を支援するために、例えばヒスチジン残基（ｈｉｓタグ）、アスパラギン酸残基（ａｓｐタグ）、ストレプトアビジンタグ、フラッグタグ、ＳＵＭＯタグ、ＧＳＴタグもしくはＭＢＰタグの付加によって、または、それらの細胞からの分泌を促進するために（ポリペプチドが天然でそのような配列を含有していない場合に）シグナル配列の付加によって修飾され得る。遺伝子タグを導入するための別法は、ヘリカーゼ、ポアまたは構築物上の天然のまたは操作された位置にタグを化学的に反応させることである。この例は、ポアの外側の操作されたシステインにゲルシフト試薬を反応させることである。これは、ヘモリジンヘテロ−オリゴマーを分離するステップのための方法として実証されている（Chem Biol.1997 Jul;4(7):497-505）。
【０４０１】
ヘリカーゼ、ポアまたは構築物は明示標識（revealing label）で標識され得る。明示標識は、ポアが検出されるようにする任意の好適な標識であってよい。好適な標識は、これだけに限らないが蛍光分子、放射性同位元素（例えば125I、35S）、酵素、抗体、抗原、ポリヌクレオチドおよびリガンド（ビオチンなど）を含む。
【０４０２】
タンパク質は、合成的にまたは組換え手段によって作出され得る。例えばヘリカーゼ、ポアまたは構築物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳および転写（ＩＶＴＴ）によって合成され得る。ヘリカーゼ、ポアまたは構築物のアミノ酸配列は、天然に存在しないアミノ酸を含むようにまたはタンパク質の安定性を増大させるように修飾され得る。タンパク質が合成的手段によって生成される場合、そのようなアミノ酸は、生成の際に導入され得る。ヘリカーゼ、ポアまたは構築物は、合成的にまたは組換え生成のいずれかに続いて変更され得る。
【０４０３】
ヘリカーゼ、ポアまたは構築物は、Ｄ−アミノ酸を用いても生成し得る。例えばポアまたは構築物は、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸との混合物を含み得る。これは、そのようなタンパク質またはペプチドを生成するための当技術分野における従来法である。
【０４０４】
ヘリカーゼ、ポアまたは構築物は、他の非特異的修飾もそれらがポア形成またはヘリカーゼまたは構築物機能を干渉しない限り含有できる。多数の非特異的側鎖修飾が当技術分野において公知であり、タンパク質（複数可）の側鎖に作出され得る。そのような修飾は、例えばアルデヒドとの反応に続くＮａＢＨ４での還元によるアミノ酸の還元的アルキル化、メチルアセトイミデート（methylacetimidate）でのアミジン化または無水酢酸でのアシル化を含む。
【０４０５】
ヘリカーゼ、ポアおよび構築物は、当技術分野において公知の標準的方法を用いて生成され得る。ヘリカーゼ、ポアまたは構築物をコードするポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準的方法を用いて得られ、複製され得る。ヘリカーゼ、ポアまたは構築物をコードするポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準的技術を用いて細菌宿主細胞において発現され得る。ヘリカーゼ、ポアおよび／または構築物は、組換え発現ベクターからのポリペプチドの原位置での発現によって細胞において生成され得る。場合により発現ベクターは、ポリペプチドの発現を制御するために誘導性プロモーターを保持する。これらの方法は、Sambrook,J.and Russell,D.(2001).Molecular Cloning:A Laboratory Manual、3rd Edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NYに記載されている。
【０４０６】
ヘリカーゼ、ポアおよび／または構築物は、大規模に生成されることができ、タンパク質生成生物または組換え発現からの任意のタンパク質液体クロマトグラフィー系による精製が続く。典型的なタンパク質液体クロマトグラフィー系は、ＦＰＬＣ、ＡＫＴＡ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｉｏ−Ｃａｄ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＢｉｏＬｏｇｉｃ  ｓｙｓｔｅｍおよびＧｉｌｓｏｎ  ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍを含む。
【０４０７】
本発明の方法は、標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を測定するステップを含む。方法は、標的ポリヌクレオチドの２つ、３つ、４つまたは５つ以上の特性を測定するステップを含み得る。１つまたは複数の特性は、好ましくは（ｉ）標的ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）標的ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）標的ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）標的ポリヌクレオチドの二次構造および（ｖ）標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否か、から選択される。（ｉ）から（ｖ）の任意の組合せは本発明により測定され得る。
【０４０８】
（ｉ）に関して、ポリヌクレオチドの長さは、例えば標的ポリヌクレオチドとポアとの間の相互作用の数または標的ポリヌクレオチドとポアとの間の相互作用の持続時間を測定することによって測定され得る。
【０４０９】
（ｉｉ）に関して、ポリヌクレオチドの同一性は、多数の方法において測定され得る。ポリヌクレオチドの同一性は、標的ポリヌクレオチドの配列の測定を伴ってまたは標的ポリヌクレオチドの配列の測定を伴わずに測定され得る。前者は、簡単であり、ポリヌクレオチドは配列決定され、それにより同定される。後者は、いくつかの方法で行われ得る。例えばポリヌクレオチド中の具体的なモチーフの存在は（ポリヌクレオチドの残りの配列を測定するステップを伴わずに）測定され得る。代替的に、方法における具体的な電気的および／または光学的シグナルの測定は、標的ポリヌクレオチドを具体的な供給源由来であるとして同定できる。
【０４１０】
（ｉｉｉ）に関して、ポリヌクレオチドの配列は、以前記載されたとおり決定され得る。好適な配列決定方法、詳細には電気的測定を用いるものは、Stoddart Dら、Proc Natl Acad Sci、12;106(19):7702-7、Lieberman KRら、J Am Chem Soc.2010;132(50):17961-72および国際出願第ＷＯ２０００／２８３１２号に記載されている。
【０４１１】
（ｉｖ）に関して、二次構造は、種々の方法において測定され得る。例えば方法が電気的測定を含む場合、二次構造は残存時間における変化またはポアを通って流れる電流における変化を用いて測定され得る。これは、１本鎖と２本鎖のポリヌクレオチドの領域を区別できるようにする。
【０４１２】
（ｖ）に関して、任意の修飾の存在または非存在は、測定され得る。方法は、好ましくは標的ポリヌクレオチドが、メチル化によって、酸化によって、損傷によって、１つまたは複数のタンパク質でまたは１つまたは複数の標識、タグもしくはスペーサーで修飾されているかどうかを決定するステップを含む。具体的な修飾は、下に記載の方法を用いて測定され得るポアとの特異的な相互作用を生じる。例えばメチルシトシンは、各ヌクレオチドとのその相互作用の際にポアを通って流れる電流に基づいてシトシンから区別され得る。
【０４１３】
種々の異なる種類の測定が作出されてよい。これは、非限定的に:電気的測定および光学的測定を含む。可能性のある電気的測定は、電流測定：インピーダンス測定、トンネル測定（Ivanov APら、Nano Lett.2011 Jan 12;11(1):279-85）およびＦＥＴ測定（国際出願第ＷＯ２００５／１２４８８８号）を含む。光学的測定は、電気的測定(Soni GVら、Rev Sci Instrum. 2010 Jan;81(1):014301)と組み合わされ得る。測定は、ポアを通って流れるイオン電流の測定などの膜貫通電流測定であってよい。
【０４１４】
電気的測定は、Stoddart Dら、Proc Natl Acad Sci、12;106(19):7702-7、Lieberman KRら、J Am Chem Soc.2010;132(50):17961-72および国際出願第ＷＯ−２０００／２８３１２号に記載の標準的単一チャネル記録機器を用いて作出され得る。代替的に電気的測定は、例えば国際出願第ＷＯ−２００９／０７７７３４号および国際出願第ＷＯ−２０１１／０６７５５９号に記載のマルチチャネル系を用いても作出され得る。
【０４１５】
好ましい実施形態では、方法は、
（ａ）標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアおよび本発明のヘリカーゼまたは本発明の構築物と、標的ポリヌクレオチドがポアを通って移動し、ヘリカーゼまたは構築物がポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように接触させるステップ、ならびに
（ｂ）ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときにポアを通る電流を測定するステップであって、電流が標的ポリヌクレオチドの特性の１つまたは複数を示し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップ
を含む。
【０４１６】
方法は、ポアが膜内に存在している膜／ポア系を調べるのに好適である任意の装置を用いて実行され得る。方法は、膜貫通ポアセンシングに好適である任意の装置を用いて実行され得る。例えば装置は、水性溶液および、チャンバーを２つのセクションに分離する障壁を含むチャンバーを含む。障壁は典型的にはポアを含有する膜が形成される開口部を有する。代替的に障壁は、ポアが存在する膜を形成する。
【０４１７】
方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６２号（ＷＯ２００８／１０２１２０）に記載の装置を用いて実行され得る。
【０４１８】
方法は、ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときにポアを通る電流を測定するステップを含んでよい。したがって装置は、電位を印加でき、膜およびポアを通る電気シグナルを測定できる電気回路も含む。方法は、パッチクランプまたは電圧クランプを用いても実行され得る。方法は、電圧クランプの使用を好ましくは含む。
【０４１９】
本発明の方法は、ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときにポアを通過する電流の測定を含み得る。膜貫通タンパク質ポアを通るイオン電流を測定するための好適な条件は、当技術分野において公知であり、実施例で開示される。方法は、膜およびポア全体に印加される電圧と共に典型的には実行される。用いられる電圧は典型的には、＋２Ｖから−２Ｖまで、典型的には−４００ｍＶから＋４００ｍＶまでである。好ましくは用いられる電圧は、−４００ｍＶ、−３００ｍＶ、−２００ｍＶ、−１５０ｍＶ、−１００ｍＶ、−５０ｍＶ、−２０ｍＶおよび０ｍＶから選択される下限値および＋１０ｍＶ、＋２０ｍＶ、＋５０ｍＶ、＋１００ｍＶ、＋１５０ｍＶ、＋２００ｍＶ、＋３００ｍＶおよび＋４００ｍＶから独立に選択される上限値を含む範囲内である。用いられる電圧は、より好ましくは１００ｍＶから２４０ｍＶまでの範囲内、最も好ましくは１２０ｍＶから２２０ｍＶまでの範囲内である。印加される電位を増加させることによってポアによるさまざまなヌクレオチド間の識別を向上させることは可能である。
【０４２０】
方法は、金属塩（例えばアルカリ金属塩）、ハロゲン化塩（例えばアルカリ金属塩化物塩などの塩化物塩）などの任意の電荷担体の存在下で典型的には実行される。電荷担体は、イオン液体または有機塩、例えばテトラメチル塩化アンモニウム、トリメチルフェニル塩化アンモニウム、フェニルトリメチル塩化アンモニウムもしくは１−エチル−３メチルイミダゾリウムクロリド（1-ethyl-3-methyl imidazolium chloride）を含み得る。上に考察した例示的装置では、塩はチャンバー中の水性溶液中に存在する。塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）またはフェロシアン化カリウムとフェリシアン化カリウムとの混合物が典型的には使用される。ＫＣｌ、ＮａＣｌおよびフェロシアン化カリウムとフェリシアン化カリウムとの混合物は 好ましい。塩濃度は飽和であってよい。塩濃度は、３Ｍ以下があり得、典型的には０．１から２．５Ｍまで、０．３から１．９Ｍまで、０．５から１．８Ｍまで、０．７から１．７Ｍまで、０．９から１．６Ｍまでまたは１Ｍから１．４Ｍまでである。塩濃度は、好ましくは１５０ｍＭから１Ｍまでである。Ｈｅｌ３０８、ＸＰＤ、ＲｅｃＤおよびＴｒａＩヘリカーゼは、高塩濃度下で驚くべきことに作用する。方法は、少なくとも０．４Ｍ、少なくとも０．５Ｍ、少なくとも０．６Ｍ、少なくとも０．８Ｍ、少なくとも１．０Ｍ、少なくとも１．５Ｍ、少なくとも２．０Ｍ、少なくとも２．５Ｍまたは少なくとも３．０Ｍなどの少なくとも０．３Ｍの塩濃度を用いて好ましくは実行される。高塩濃度は、高い信号対雑音比を提供し、通常の電流変動のバックグラウンドに対してヌクレオチドの存在を示す電流が同定されることを可能にする。
【０４２１】
方法は、緩衝剤の存在下で典型的には実行される。上に考察した例示的装置では、緩衝剤はチャンバー中の水性溶液に存在する。任意の緩衝剤が本発明の方法において用いられ得る。典型的には緩衝液は、リン酸緩衝液である。他の好適な緩衝液は、これだけに限らないが、ＨＥＰＥＳおよびＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を含む。方法は、４．０から１２．０まで、４．５から１０．０まで、５．０から９．０まで、５．５から８．８まで、６．０から８．７までまたは７．０から８．８までまたは７．５から８．５までのｐＨで典型的には実行される。用いられるｐＨは好ましくは約７．５である。
【０４２２】
方法は、０ｏＣから１００ｏＣまで、１５ｏＣから９５ｏＣまで、１６ｏＣから９０ｏＣまで、１７ｏＣから８５ｏＣまで、１８ｏＣから８０ｏＣまで、１９ｏＣから７０ｏＣまでまたは２０ｏＣから６０ｏＣまでで実行され得る。方法は典型的には室温で実行される。方法は、約３７℃などの酵素機能を支持する温度で場合により実行される。
【０４２３】
方法は、遊離ヌクレオチドまたは遊離ヌクレオチド類似物および／またはヘリカーゼもしくは構築物の作用を促進する酵素補因子の存在下で実行されてもよい。方法は、遊離ヌクレオチドまたは遊離ヌクレオチド類似物の非存在下でおよび酵素補因子の非存在下で実行されてもよい。遊離ヌクレオチドは、上に考察した個々のヌクレオチドの任意の１つまたは複数であってよい。遊離ヌクレオチドは、これだけに限らないがアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）およびデオキシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）を含む。遊離ヌクレオチドは、好ましくはＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰまたはｄＣＭＰから選択される。遊離ヌクレオチドは、好ましくはアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）である。酵素補因子は、ヘリカーゼまたは構築物を機能させる因子である。酵素補因子は、好ましくは二価金属カチオンである。二価金属カチオンは好ましくはＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋またはＣｏ２＋である。酵素補因子は、最も好ましくはＭｇ２＋である。
【０４２４】
標的ポリヌクレオチドは、ヘリカーゼまたは構築物およびポアと任意の順序で接触され得る。標的ポリヌクレオチドがヘリカーゼまたは構築物およびポアと接触される場合、標的ポリヌクレオチドは最初にヘリカーゼまたは構築物と複合体を形成することは好ましい。ポアに電圧が印加される場合、標的ポリヌクレオチド／ヘリカーゼまたは構築物複合体は次いでポアと複合体を形成し、ポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御する。
【０４２５】
他の方法
本発明は、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーの形成方法も提供する。方法は、ポアとＤｄａヘリカーゼ、本発明のヘリカーゼまたは本発明の構築物との間に複合体を形成するステップを含む。ヘリカーゼは、本発明のヘリカーゼおよび本発明により修飾されていないヘリカーゼを含む、本発明の構築物を参照して上に考察の任意のものであってよい。本発明のシリーズおよび方法を参照して上に考察の任意の数および組合せの本発明のＤｄａヘリカーゼが使用されてよい。
【０４２６】
複合体は、ポアとヘリカーゼまたは構築物とを標的ポリヌクレオチドの存在下で接触させ、次いで、ポアに電位を印加するステップによって形成され得る。印加される電位は、上に記載のとおり化学電位または電圧電位であってよい。代替的に複合体は、ポアをヘリカーゼまたは構築物に共有結合的に付着するステップによっても形成され得る。共有結合付着のための方法は、当技術分野において公知であり、例えば国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）および第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）において開示されている。複合体は、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーである。方法は、Ｍｓｐ由来のポアと本発明のヘリカーゼまたは本発明の構築物との複合体を形成するステップを好ましくは含む。本発明の方法を参照して上に考察した任意の実施形態は、この方法に等しく適用される。本発明は、本発明の方法を使用して産生されるセンサーも提供する。
【０４２７】
キット
本発明は、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのキットも提供する。キットは、（ａ）ポアおよび（ｂ）本発明のＤｄａヘリカーゼ、ヘリカーゼまたは本発明の構築物を含む。本発明の方法に関連して上に考察された任意の実施形態は、キットに等しく適用する。ヘリカーゼは、本発明のヘリカーゼおよび本発明により修飾されていないヘリカーゼを含む、本発明の構築物を参照して上に考察の任意のものであってよい。キットは、本発明のシリーズおよび方法を参照して上に考察の任意の数および組合せの本発明のＤｄａヘリカーゼを含んでよい。
【０４２８】
キットは、脂質二重層などの両親媒性層を形成するために必要なリン脂質などの膜の構成成分をさらに含んでよい。
【０４２９】
本発明のキットは、上に述べた任意の実施形態が実行されるようにする１つまたは複数の他の試薬または器具を追加的に含んでよい。そのような試薬または器具は、次の：好適な緩衝剤（複数可）（水性溶液）、対象から試料を得るための手段（容器もしくは、針を含む器具など）、ポリヌクレオチドを増幅および／もしくは発現するための手段、上に定義の膜または電圧もしくはパッチクランプ装置、の１つまたは複数を含む。試薬は、液体試料が試薬を再懸濁するように乾燥状態でキット中に存在する場合がある。キットは、キットが本発明の方法において用いられ得るようにする説明書、またはいずれの患者に方法が用いられ得るかに関する詳細も場合により含む場合がある。キットは、場合によりヌクレオチドを含み得る。
【０４３０】
装置
本発明は、標的ポリヌクレオチドを特性決定するための装置も提供する。装置は、複数のポアおよび複数の本発明のＤｄａヘリカーゼ、複数の本発明のヘリカーゼまたは複数の本発明の構築物を含む。装置は、本発明の方法を実行するための説明書を好ましくはさらに含む。装置は、アレイまたはチップなどのポリヌクレオチド分析のための任意の従来装置であってよい。本発明の方法に関連して上に考察された任意の実施形態は、本発明の装置に等しく適用可能である。ヘリカーゼは、本発明のヘリカーゼおよび本発明により修飾されていないヘリカーゼを含む、本発明の構築物を参照して上に考察の任意のものであってよい。装置は、本発明のシリーズおよび方法を参照して上に考察の任意の数および組合せの本発明のＤｄａヘリカーゼを含んでよい。
【０４３１】
装置は、本発明の方法を実行するために好ましくはセットアップされている。
【０４３２】
装置は、好ましくは：
複数のポアを支持でき、ポアおよびヘリカーゼまたは構築物を用いてポリヌクレオチド特性決定を実施するために作動可能であるセンサーデバイス；ならびに
特性決定を実施するための材料の送達のための少なくとも１つのポート；
を含む。
【０４３３】
代替的に装置は、好ましくは：
複数のポアを支持でき、ポアおよびヘリカーゼまたは構築物を用いてポリヌクレオチド特性決定を実施するために作動可能であるセンサーデバイス；ならびに
特性決定を実施するための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバー；
を含む。
【０４３４】
装置は、
膜および複数のポアを支持でき、ポアおよびヘリカーゼまたは構築物を用いてポリヌクレオチド特性決定を実施するために作動可能であるセンサーデバイス；
特性決定を実施するための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバー；
少なくとも１つのリザーバーからセンサーデバイスに材料を制御可能に供給するように構成された流体系；および
各試料を受けるための１つまたは複数の容器をより好ましくは含み、
流体系は、１つまたは複数の容器からセンサーデバイスに試料を選択的に供給するように構成されている。装置は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号（ＷＯ２００９／０７７７３４として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００７８９号（ＷＯ２０１０／１２２２９３として公開）、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／００２２０６号（ＷＯ２０１１／０６７５５９として公開）または国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／２５６７９号（ＷＯ００／２８３１２として公開）において記載の任意のものであってよい。
【０４３５】
本発明のヘリカーゼを産生する方法
本発明は、本発明の修飾ヘリカーゼを産生する方法も提供する。方法は、Ｄｄａヘリカーゼを提供するステップおよび本発明の修飾ヘリカーゼを形成するようにヘリカーゼを修飾するステップを含む。
【０４３６】
方法は、ヘリカーゼがポリヌクレオチドの移動を制御できるかどうかを決定するステップを好ましくはさらに含む。これを行うためのアッセイは、上に記載されている。ポリヌクレオチドの移動が制御され得る場合、ヘリカーゼは正しく修飾されており、本発明のヘリカーゼが産生されている。ポリヌクレオチドの移動が制御され得ない場合、本発明のヘリカーゼは産生されていない。 
【０４３７】
本発明の構築物を産生する方法
本発明は、本発明の構築物を産生する方法も提供する。方法は、本発明のＤｄａヘリカーゼまたはヘリカーゼを追加的ポリヌクレオチド結合成分に付着、好ましくは共有結合的に付着させるステップを含む。上に考察した任意のヘリカーゼおよび成分が方法において使用できる。共有結合的付着の部位および方法は上に考察したとおり選択される。
【０４３８】
方法は、構築物がポリヌクレオチドの移動を制御できるかどうかを決定するステップを好ましくはさらに含む。これを行うためのアッセイは、上に記載されている。ポリヌクレオチドの移動が制御され得る場合、ヘリカーゼおよび成分は正しく付着され、本発明の構築物が産生されている。ポリヌクレオチドの移動が制御され得ない場合、本発明の構築物は産生されていない。
【０４３９】
次の実施例は、本発明を例示する。
実施例
【実施例１】
【０４４０】
本実施例は、Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃおよびさらに（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２を有する配列番号８）が単一ＭｓｐＡナノポア（ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡ（ＭｓｐＡ−Ｂ２Ｃ）（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２）を通るインタクトなＤＮＡ鎖の移動をどのように制御するかを記載する。
【０４４１】
材料および方法
実験を設定する前に、ラムダＤＮＡ構築物（配列番号６２の５’末端に付着される４個のｉＳＰＣ３スペーサーにその３’末端で付着される配列番号６１の５’末端に付着される４個のｉＳｐＣ３スペーサーにその３’末端で付着される配列番号６０、この構築物の配列番号６１領域は配列番号６３（３’コレステロールテザーを有する）にハイブリダイズされる構築物の図に関して図８を参照されたい）およびＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃを合わせて１５分間、２３℃、緩衝液（２０ｍＭ  ＣＡＰＳ、ｐＨ１０．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、２ｍＭ  ＤＴＴ）中で予備インキュベートした。
【０４４２】
電気的測定は、緩衝液（６００ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム、７５ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、２５ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８）中のブロックコ−ポリマー中に挿入された単一ＭｓｐＡナノポア（ＭｓｐＡ−Ｂ２Ｃ）から２０℃（実験系を冷却プレート上に置くことによる）で取得された。ブロックコ−ポリマー中に挿入された単一ポアを達成した後、次いで緩衝液（１ｍＬ、６００ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム、７５ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、２５ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８）を過剰なＭｓｐＡナノポア（ＭｓｐＡ−Ｂ２Ｃ）を除去するために系を通して流し、最後に実験緩衝液を系に流した（２ｍＬ  ９６０ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム、３ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、１ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８）。ＭｇＣｌ２（最終濃度１０ｍＭ）、ＡＴＰ（最終濃度１ｍＭ）を緩衝液（９６０ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム、３ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、１ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８）と共に混合し、次いでラムダＤＮＡ構築物（最終濃度０．２ｎＭ）、Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ（最終濃度１０ｎＭ）緩衝液（２０ｍＭ  ＣＡＰＳ、ｐＨ１０．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、２ｍＭ  ＤＴＴ）予備混合物に加えた。次いで予備混合物を単一ナノポア実験系に加えた。実験を電位反転工程（＋１００ｍＶ、２秒間、次いで０Ｖ、２秒間、次いで−１２０ｍＶ、１４５００秒間、ｃｉｓ側に印加）に従って４時間実行し、ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動をモニターした。
【０４４３】
結果および考察
ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動をラムダＤＮＡ構築物について観察した、ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の例を図１に示す。ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動は５１７０秒間長であり、ナノポアを通るおよそ３０ｋＢのラムダ構築物の移行に対応する。図２は、ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の初期（ａ）および終期（ｂ）の領域を拡大して示す。
【実施例２】
【０４４４】
本実施例は、Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃが直鎖状（配列番号６４）および環状（配列番号６５）１本鎖ＤＮＡの両方に堅固な結合をどのように示すかを記載する。酵素の堅固な結合は、蛍光異方性に基づくアッセイを使用して測定した。
【０４４５】
材料および方法
２種の通例の蛍光基質を直鎖状（配列番号６４）および環状（配列番号６５）１本鎖ＤＮＡに結合するＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃヘリカーゼの能力を評価するために使用した。４４ｎｔ直鎖状１本鎖ＤＮＡ基質（最終１ｎＭ、配列番号６４）は、配列番号６４中の位置３７のチミン塩基に付着しているカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を有する。７５ｎｔ環状１本鎖ＤＮＡ基質（最終１ｎＭ、配列番号６５）は、配列番号６５中のチミン塩基に付着しているカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を有する。ヘリカーゼが緩衝液（２５ｍＭリン酸カリウム、１５１．５ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中のいずれかの蛍光基質に結合すると、蛍光異方性（溶液中のＤＮＡ基質の反転頻度の速度に関連する性質）が増加した。異方性における増加に影響を与えるために必要なヘリカーゼの量が少ないほど、ＤＮＡとヘリカーゼとの間の結合親和性は堅固である（図３）。
【０４４６】
Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃを結合緩衝液（２５ｍＭリン酸カリウム、１５１．５ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に緩衝液交換し、次いで０．０２ｎＭから７５０ｎＭの濃度範囲に系列希釈した。次いで各試料濃度を直鎖状または環状１本鎖ＤＮＡ（１ｎＭの配列番号６４または６５）と混合し、０．０１ｎＭから３７５ｎＭのＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃの最終濃度範囲にし、２５℃、６０分間にわたって蛍光異方性を評価した。
【０４４７】
結果および考察
図４および５は、直鎖状および環状１本鎖ＤＮＡ結合実験について回収された蛍光結合アッセイデータを示す。図４は、６０分間のインキュベーション期間の最後にＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃの量の増加に伴う直鎖状および環状１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号６４または６５）の異方性における変化を示す。図５は、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して図４に示すデータを通じて一相解離結合曲線をフィッティングすることを通じて得られた、６０分間のインキュベーション後の直鎖状または環状１本鎖ＤＮＡへのＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ結合についての平衡解離定数（Ｋｄ）を示す（ｙ軸標識＝解離定数Ｋｄ（ｎＭ）、ｘ軸標識＝参照番号、参照番号１は直鎖状１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドに対応し、参照番号２は環状１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドに対応する）。
【０４４８】
Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃヘリカーゼが環状および直鎖状１本鎖ＤＮＡの両方に堅固な結合親和性（１５ｎＭ以下の結合親和性）を示すことが見出された（図４および５を参照されたい）。
【実施例３】
【０４４９】
本実施例は、Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃのヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動をＴｒｗＣ  Ｃｂａ（配列番号６６）のものと比較した。両方のヘリカーゼは、ポリヌクレオチドに沿って５’から３’方向に移動する。ポリヌクレオチドの５’末端（ヘリカーゼが移動するところから離れた末端）がポアによって捕捉される場合、ヘリカーゼは印加された電位から生じる場の方向に働き、通したポリヌクレオチドをポア中およびｔｒａｎｓチャンバー中に移動させる。Ｔ４  Ｄｄａは、ＤＮＡ後退を伴わずに（すなわち、ポアと比較してその３’末端に向けて）滑らかにナノポアを通るＤＮＡの移行を制御することが観察され、一方ＴｒｗＣ  Ｃｂａは、ＤＮＡの移行を制御した場合に、状態間でＤＮＡの後退を生じた。本実施例では、後退はポアと比較して後ろへのＤＮＡ移行を含有する（すなわち本実施例では、その５’へおよびその３’末端から離れて）。この現象は、英国特許第１３１８４６４．３号および第１４０４７１８．７号においてスリッピングと称された。
【０４５０】
材料および方法
実験を設定する前に、ＤＮＡ鎖（２０ｎＭ  ３ｕＬ、その最後が配列番号６８の５’末端に付着される４個の５−ニトロインドールにその３’末端で付着される配列番号６１の５’末端に付着される４個のｉＳｐＣ３スペーサーにその３’末端で付着される配列番号６７、付加的に配列番号６３は配列番号６１にハイブリダイズされる）およびＴｒｗＣ  Ｃｂａ（配列番号６６、２２．５μＬの１３．３μＭ）を合わせて、１時間にわたって、室温、緩衝液（５０ｍＭ  ＣＡＰＳ、ｐＨ１０．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）中で予備インキュベートした。別のチューブで３ｕＬのＭｇＣｌ２（１Ｍ）および３ｕＬのｄＴＴＰ（１００ｍＭ）を２６０μＬの緩衝液（９６０ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、１ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）および２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ８．０）と混合した。１時間の予備インキュベーション後、ＤＮＡ酵素混合物をＭｇＣｌ２／ｄＴＴＰ混合物に加え、試薬の次のとおりの最終濃度をもたらした−緩衝液（９６０ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、１ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）および２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ８．０）中にＤＮＡ鎖（０．２ｎＭ）、ＴｒｗＣ  Ｃｂａ（配列番号６６、１μＭ）、ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）、ｄＴＴＰ（１ｍＭ）。
【０４５１】
実験を設定する前に、ＤＮＡ鎖（０．２ｕＬの３００ｎＭ、その最後が配列番号６８の５’末端に付着される４個の５−ニトロインドールにその３’末端で付着される配列番号６１の５’末端に付着される４個のｉＳｐＣ３スペーサーにその３’末端で付着される配列番号６７、付加的に配列番号６３は配列番号６１にハイブリダイズされる）およびＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ（０．１ｕＬの３３００ｎＭ）を合わせて、１５分間、室温で予備インキュベートした。別のチューブでＭｇＣｌ２（３ｕＬ、１Ｍ）およびＡＴＰ  （３ｕＬ  １００ｍＭ）を２９４ｕＬの緩衝液（９６０ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、１ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）および２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ８．０）と混合した。１５分間の予備インキュベーション後、ＤＮＡ酵素混合物をＭｇＣｌ２／ＡＴＰ混合物に加え、試薬の次のとおりの最終濃度をもたらした−緩衝液（９６０ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、１ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）および２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ８．０）中にＤＮＡ鎖（０．２ｎＭ）、Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ（１ｎＭ）、ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）、ＡＴＰ（１ｍＭ）。
【０４５２】
電気的測定は、緩衝液（６００ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム、７５ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、２５ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８）中のブロックコ−ポリマー中に挿入された単一ＭｓｐＡナノポア（ＭｓｐＡ−Ｂ２Ｃ）から２０℃（実験系を冷却プレート上に置くことによる）で取得された。ブロックコ−ポリマー中に挿入された単一ポアを達成した後、次いで緩衝液（３ｍＬ、９６０ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム、３ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、１ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８）を過剰なＭｓｐＡナノポア（ＭｓｐＡ−Ｂ２Ｃ）を除去するために系を通して流した。次いでＴｒｗＣ  Ｃｂａ（配列番号６６）またはＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ予備混合物のいずれかを単一ナノポア実験系に加えた。各実験を−１２０ｍＶ）の保持電位で６時間実行し、ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動をモニターした。
【０４５３】
結果および考察
図６および７は、ＴｒｗＣ  Ｃｂａ（配列番号６６）およびＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃそれぞれについてのヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を示す。図６の上のトレースは、２つのＴｒｗＣ  Ｃｂａ（配列番号６６）ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動（１および２と標識）を示し、下のセクションは領域Ｘの拡大を示す。図７の上のトレースは、３つのＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を示し（１，２および３と標識）、下のセクションは、領域Ｘの拡大を示す。Ｔｒｗｃ  Ｃｂａヘリカーゼは、ナノポアを通るＤＮＡ鎖の移動を制御し、ＤＮＡが移行すると電流が変化した。下のトレースでは多数の電流レベルは、ポアを通ってＤＮＡ鎖のセクションが移行する場合に産生される持続電流レベルに対応してａからｋと標識した。図６における領域Ｘの拡大から、ＤＮＡが後ろに下がり、それによりｂ、ｃ、ｈおよびｉに対応するレベルが数回観察されたことは明らかであった。一方図７の下のトレースは、ナノポアを通るＤＮＡの移動をＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃヘリカーゼが、後退が観察されず、ａからｋの持続電流レベルに対応する単一の電流レベルが観察されるように制御したことを示す。ＤＮＡ鎖を後退させない酵素を有することは、このことが、酵素が鎖に沿って一方方向に移動した場合に電流における変化をＤＮＡ鎖の配列により容易に位置付けたことを意味することから有利である。これは、ＴｒｗＣ  Ｃｂａ（配列番号６６）と比較した場合にＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０ＣをＤＮＡ移行のための改善された酵素にした。
【実施例４】
【０４５４】
本実施例は、Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ、Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ（変異Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａおよびさらに（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２を有する配列番号８）ならびにＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１１４Ａ／Ｃ１７１Ａ／Ｃ４２１Ｄ（変異Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１１４Ａ／Ｃ１７１Ａ／Ｃ４２１Ｄおよびさらに（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２を有する配列番号８）が単一ＭｓｐＡナノポアを通るインタクトなＤＮＡ鎖の移動をどのように制御するかを記載する。ラムダＤＮＡ構築物の領域１および領域２の両方のヘリカーゼ制御する移動速度（図８に示す）は、Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０ＣおよびＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１１４Ａ／Ｃ１７１Ａ／Ｃ４２１Ｄについて経時的な減少が観察された。しかしＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａは、実験実行全体にわたって移動の速度が高く、適正に一定のままであり、比較において改善されたヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を示した。
【０４５５】
材料および方法
実験を設定する前に、緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５）中のＤＮＡ構築物Ｘ（５．２μＬ、２５ｎＭ、配列番号６９の５’末端に付着される４個の５−ニトロインドールスペーサーにその３’末端で付着される配列番号６１の５’末端に付着される４個のｉＳｐＣ３スペーサーにその３’末端で付着した配列番号６７、この構築物の配列番号６１領域は配列番号６３（３’コレステロールテザーを有する）にハイブリダイズされ、Ａと標識した領域が配列番号６７に対応し、Ｅと標識した領域が配列番号６９に対応することを除いて図８に示すものと類似の構築物である）を緩衝液（２５３ｍＭ  ＫＣｌ、５０ｍＭリン酸カリウム  ｐＨ８．０  ２ｍＭ  ＥＤＴＡ中の５．２μＬ、２５０ｎＭ）中のＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ、Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６ＡまたはＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１１４Ａ／Ｃ１７１Ａ／Ｃ４２１Ｄのいずれかと５分間、周囲温度で、予備インキュベートした。次いでＴＭＡＤ（２．６μＬ、５００μＭ）をＤＮＡ／酵素予備混合物に加え、さらに５分間、インキュベートした。最後に緩衝液（１２４１．５μＬ、２５ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）および１５０ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８．０）、ＭｇＣｌ２（１３μＬ、１Ｍ）ならびにＡＴＰ（３２．５μＬ、１００ｍＭ）を予備混合物に加えた。
【０４５６】
電気的測定は、緩衝液（２５ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、１５０ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ））中のブロックコ−ポリマー中に挿入された単一ＭｓｐＡナノポアから２８℃のペルチェ温度で取得した。ブロックコ−ポリマーに挿入された単一ポアを達成した後、次いで緩衝液（２ｍＬ、２５ｍＭリン酸カリウム  ｐＨ８．０、１５０ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）および１５０ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ））を過剰なＭｓｐＡナノポアを除去するために系を通して流した。次いで酵素（Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ、Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６ＡまたはＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１１４Ａ／Ｃ１７１Ａ／Ｃ４２１Ｄのいずれか（最終濃度１ｎＭ））、ＤＮＡ（最終濃度０．１ｎＭ）、燃料（ＭｇＣｌ２  最終濃度１０ｎＭ、ＡＴＰ  最終濃度２．５ｍＭ）予備混合物を単一ナノポア実験系に加えた。各実験を印加された電位−１２０ｍＶでの毎時間の電位フリックを伴って１２０ｍＶの保持電位で６時間実行し、ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動をモニターした。
【０４５７】
結果および考察
ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動をＤＮＡ構築物Ｘについて、全ての変異体ヘリカーゼを調査して観察した（Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ、Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６ＡまたはＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１１４Ａ／Ｃ１７１Ａ／Ｃ４２１Ｄ）。Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６ＡおよびＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１１４Ａ／Ｃ１７１Ａ／Ｃ４２１Ｄヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の例を図９および１０にそれぞれ示す。
【０４５８】
ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動速度をラムダＤＮＡ構築物Ｘの領域１および領域２の両方を通じてモニターした。Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０ＣおよびＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１１４Ａ／Ｃ１７１Ａ／Ｃ４２１Ｄについて、１秒あたりのヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の数が領域１および２の両方について７時間の実行時間にわたって漸進的に減少したことが見出された（Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃについて図１１を、およびＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１１４Ａ／Ｃ１７１Ａ／Ｃ４２１Ｄについて図１２を参照されたい）。しかしＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６変異体ヘリカーゼは、領域１および領域２の両方について７時間の実験実行にわたって１秒あたりのヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の数におけるわずかな減少が観察されただけであった（図１３を参照されたい）。したがってＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ変異体は、実験実行全体にわたって移動の速度が高く適正のままであったことから改善されたヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を示した。これは、経時的な速度における漸進的な低減を示すＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃと比較して処理量を増加させる。
【実施例５】
【０４５９】
本実施例はＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａ（変異Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａおよびさらに（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２を有する配列番号８）ヘリカーゼが、単一ＭｓｐＡナノポアを通るインタクトなＤＮＡ構築物Ｚ鎖（図１４に示す）の移動をどのように制御できるかを記載する。
【０４６０】
材料および方法
実験を設定する前に、ＤＮＡ構築物Ｚ（構築物および配列の図について図８を参照されたい、１．２μＬ）およびＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａ（２．８４μＬ）を緩衝液（１５１ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム  ｐＨ８、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％グリセロール）中で合わせて、５分間、２３℃で予備インキュベートした。ＴＭＡＤ（５００μＭ、０．９２μＬ）をＤＮＡ酵素混合物に加え、２３℃でさらに５分間インキュベートした。最後に緩衝液（２８２μＬ、５００ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム  ｐＨ８）、ＡＴＰ（最終濃度２ｍＭ）およびＭｇＣＬ２（最終濃度２ｍＭ）を混合物に加えた。
【０４６１】
電気的測定を緩衝液（５００ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ８）中のブロックコ−ポリマーに挿入されたＭｓｐＡナノポアを使用して実施例１に記載の通り取得した。予備混合物を単一のナノポア実験系に加え、実験を−１２０ｍＶの保持電位、６時間（２秒間＋６０ｍＶに電位を反転させて）で実行し、ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動をモニターした。
【０４６２】
結果および考察
ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動をＤＮＡ構築物Ｚについて観察し、ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の例を図１５に示す。図１６は、ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の初期をトレース（Ａ）に示し、トレースＡの領域の拡大をトレース（Ｂ）に示し、ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の終期をトレース（Ｃ）に示す。
【実施例６】
【０４６３】
本実施例は、ＭｓｐＡナノポアを通るＤＮＡ構築物Ｘ（図１７に示す）の移動を制御するために、単一のＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０ＣまたはＴａ  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃの使用を２つのＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃを有する配列番号２４）または２つのＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃを有する配列番号２４）ヘリカーゼと比較した。移動が単一のヘリカーゼによって制御された場合と比較して、２つのヘリカーゼがナノポアを通る構築物の移動を制御するために使用される場合、改善された移動が観察された。
【０４６４】
材料および方法
実験を設定する前に、ＤＮＡ構築物Ｘ（構築物Ｘにおいて使用された図および配列について図１７を参照されたい、ナノポア系に加えられた最終濃度０．１ｎＭ）をＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ（ナノポア系に加えられた最終濃度１ｎＭ、変異Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃを有する配列番号２４）またはＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ（ナノポア系に加えた最終濃度１ｎＭ、変異Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃを有する配列番号２４、緩衝液（２５３ｍＭ  ＫＣｌ、５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ８．０、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に提供された）と共に室温、５分間、予備インキュベートした。５分後、ＴＭＡＤ（ナノポア系に加えられた最終濃度１μＭ）を予備混合物に加え、混合物をさらに５分間インキュベートした。最後にＭｇＣｌ２（最終予備混合物濃度２ｍＭ）、ＡＴＰ（最終予備混合物濃度２ｍＭ）および緩衝液（２５ｍＭリン酸カリウムおよび５００ｍＭ  ＫＣｌ  ｐＨ８．０）を予備混合物に加えた。
【０４６５】
電気的測定は、緩衝液（２５ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、１５０ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８．０）中のブロックコ−ポリマー中に挿入された単一ＭｓｐＡナノポアから取得した。ブロックコ−ポリマー中に挿入された単一ポアを達成後、次いで緩衝液（２ｍＬ、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ８．０、１５０ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）および１５０ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ））を過剰なＭｓｐＡナノポアを除去するために系を通して流した。次いで酵素（Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０ＣまたはＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ、最終濃度１ｎＭ）、ＤＮＡ構築物Ｘ（最終濃度０．１ｎＭ）、燃料（ＭｇＣｌ２  最終濃度２ｍＭ、ＡＴＰ  最終濃度２ｍＭ）予備混合物（合計３００μＬ）を単一ナノポア実験系に流し、実験を１２０ｍＶの保持電位で６時間実行し、ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動をモニターした。
【０４６６】
結果
ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動をＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０ＣおよびＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ（それぞれ図１８Ａおよび１８Ｂを参照されたい）を使用してＤＮＡ構築物Ｘ（図１７）について観察した。単一の酵素がＤＮＡ構築物Ｘに結合した場合（図１８Ａに示す移動指数）、次いでナノポアを通るヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を領域３および４について観察した（図１８を参照されたい）。領域３は、図１８Ａにプロットされた領域について移動指数が観察可能であった制御された様式でポアを通って移動した（移動指数の記載についての凡例は図１８の図を参照されたい）。しかし、領域４がナノポアを通って移行する場合、図１８Ａにプロットされた移動指数は領域３について産生されたものよりもとても少ない点（many less point）を示した。領域３および４がおよそ同じ長さであったことから、各領域について観察された移動指数は、およそ同じ数の点を有していたと期待される。これは、単一の酵素（Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ）によってもたらされた領域４の移動制御があまり点を生じず、したがって領域３と比較して領域４についてあまり情報が得られなかったことを意味している。領域４がナノポアを通って移行された場合に（例えばＤＮＡは、領域４のセクションに沿って滑った）酵素移動が安定していないことから、ＤＮＡ配列のセクションが失われたことを意味し、あまり情報が得られなかった。
【０４６７】
本実施例では、ヘリカーゼは、ポリヌクレオチドに沿って５’から３’方向に移動する。ポリヌクレオチドの５’末端（ヘリカーゼが移動するところから離れた末端）がポアによって捕捉される場合、ヘリカーゼは印加された電位から生じる場の方向に働き、通されたポリヌクレオチドをポア中およびｔｒａｎｓチャンバー中に移動させる。本実施例では、前方へのスリッピングは、ポアと比較して少なくとも４個の連続したヌクレオチドおよび典型的には１０個より多い連続したヌクレオチド前方への（すなわち本実施例では３’に向けた、および５’末端から離れた）ＤＮＡ移動を含む。前方へのスリッピングは、１００個またはそれ以上の連続したヌクレオチド前方への移動を含み、これは各鎖において１回より多く生じる場合がある。この現象は、英国特許第１４０６１５１．９号においてスキッピングおよびスリッピングと称された。
【０４６８】
図１８Ｂは、酵素の「シリーズ」、この場合２つのＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ酵素を使用してＤＮＡ構築物Ｘ（領域３および４）の移動が制御された場合に産生される移動指数を示している。ＤＮＡ構築物Ｘの領域３の移動指数は、単一の酵素について観察されたものと同様であった。しかし２つの酵素の制御下でナノポアを通って領域４が移行する場合、ＤＮＡ移動指数は単一のＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃヘリカーゼが移動を制御する場合に観察されたものとは顕著に異なっていた。移動が２つのＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ酵素を使用して制御された場合に、両方の領域がおよそ同じ数の点を有して、領域３についてと同様の移動指数が領域４について観察された。これは、「シリーズ」中の２つのＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ酵素が移動を制御するために使用された場合に、改善されたヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動が観察されたことを例示した。これは、領域３と同様の量の情報が領域４について得られたためであり、一方、単一の酵素を使用して制御された移動は、領域４について領域３よりもあまり情報が生じなかった。シリーズのヘリカーゼがＤＮＡのさらに安定した移動を生じたことから、より多い情報が得られた（例えば４と標識したＤＮＡ領域のより遅い移動またはより少ない前方へのスリッピング）。これは、Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ酵素のシリーズがＤＮＡの鎖の配列決定を改善するために使用され得ることを意味している。
【０４６９】
同じ実験をナノポアを通るＤＮＡ構築物Ｘの移動を制御するためにヘリカーゼＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃを使用して実行した。図１９Ａは、移動が単一のＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ酵素によって制御される場合の構築物Ｘについての移動指数を示し、図１９Ｂは、移動が２つのＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃヘリカーゼによって制御される場合の移動指数を示す。Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃについて観察されたとおり、２つのＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃヘリカーゼのシリーズは、ＤＮＡの領域２の移動が２つの酵素によって制御された場合に、移動指数においてより多くの点が観察されるようにし、この領域の改善された移動を示した（より遅い移動またはより少ない前方へのスリッピング）。これは、Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ酵素のシリーズがＤＮＡの鎖の配列決定を改善するために使用され得ることを意味している。
【０４７０】
図１７に示し、記載するＤＮＡ構築物Ｘは、２つの酵素が結合できるｂと標識されるセクションを有する。セクションｂの長さが１つの酵素を結合させるために十分なだけである対照実験（１０−１２Ｔ結合部位）をＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０ＣおよびＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃの両方について実行した。対照実験では、領域４がナノポアを通って移行する際に、単一の酵素だけが構築物に結合し、ナノポアを通る鎖の移動を制御した改善された移動での鎖は検出されなかった。比較して、２つの酵素がＤＮＡに結合できた上の実験では、単一の酵素だけが結合したことにより、本発明者らはあまり移動しないいくつかの鎖を観察したが、１つだけよりもむしろ２つの酵素によって制御されたＤＮＡ移行に対応する改善された移動指数を有する鎖を同定することも可能であった。
【実施例７】
【０４７１】
本実施例は、ＭｓｐＡナノポアを通るＤＮＡ構築物Ｚ（図２０に示す）の移動を制御するために単一のＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０ＣまたはＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０ＣおよびＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａ（変異Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａを有する配列番号２４）の両方の使用を比較した。Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０ＣおよびＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａは、両方とも、適切な燃料と共に供給されるとＤＮＡに沿って移動する活性ヘリカーゼである。これら２つの異なるヘリカーゼがナノポアを通る構築物の移動を制御するために使用された場合、移動が単一のヘリカーゼ（Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ）によって制御された場合と比較して、改善された移動が観察された。
【０４７２】
材料および方法
予め結合した両方の酵素（図２１Ｂデータを参照されたい）または予め結合したＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃだけ（対照実験、図２１Ａデータを参照されたい）のいずれかを有するＤＮＡ構築物Ｚ（ナノポア系に加えた最終濃度０．１ｎＭ）を緩衝液（ナノポア系に加えられた最終濃度は５００ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ８．０であった）、ＡＴＰ（ナノポア系に加えられる最終濃度、２ｍＭ）およびＭｇＣＬ２（ナノポア系に加えられる最終濃度２ｍＭ）に加えた。これは、次いでナノポア系に加えられた予備混合物（合計容量１５０μＬ）であった。
【０４７３】
電気的測定は、緩衝液（２５ｍＭリン酸カリウム、７５ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、２５ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、６００ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．０）中のブロックコ−ポリマー中に挿入された単一ＭｓｐＡナノポアから取得した。ブロックコ−ポリマー中に挿入された単一ポアを達成後、次いで緩衝液（２ｍＬ、２５ｍＭリン酸カリウム．７５ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）および２５ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、６００ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．０）を過剰なＭｓｐＡナノポアを除去するために系を通して流した。次いで構築物Ｚに予め結合した酵素（単一のＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ（対照）またはＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０ＣおよびＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａのいずれか）、燃料（ＭｇＣｌ２およびＡＴＰ）予備混合物（合計１５０μＬ）を単一ナノポア実験系に流し、実験を−１２０ｍＶの保持電位で６時間実行し（２秒間、＋６０ｍＶへの電位の反転を有する）、ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動をモニターした。
【０４７４】
結果
Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃだけ（対照実験、図２１Ａ）またはＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０ＣおよびＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａの両方による（図２２Ｂ）制御された移行に対応するヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を観察した。図２１セクションＡに示すトレースは、ヘリカーゼＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０ＣだけがＭｓｐＡナノポアを通るＤＮＡ構築物Ｚ（図２０を参照されたい）の移行を制御する場合の移動指数プロット例を示した。領域５がナノポアを通って移行する場合に、領域５についての移動指数を観察することが可能であった。しかしこの図は、領域６についての移動指数が領域５についてよりも少ない点を有することを示し、それがナノポアを通って移行する場合にＤＮＡ構築物Ｙのこの領域についてあまり情報が得られなかったことを示唆していた。これは、あまり安定していない（例えば６と標識したＤＮＡ領域のさらなる前方へのスリッピング）ＤＮＡ移動を生じ、ＤＮＡ配列のセクションが失われた。
【０４７５】
図２１Ｂは、Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０ＣおよびＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８ＡがＭｓｐＡナノポアを通るＤＮＡ構築物Ｚ（図２０を参照されたい）の移行を制御する場合の移動指数を示す。領域５がＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０ＣおよびＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａの制御の下でナノポアを通って移行する場合、移動指数を観察することができた。さらに領域６がナノポアを通って移行する場合、移動はＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０ＣおよびＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａの両方によって再度制御された。領域６が２つの酵素（Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０ＣおよびＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａ）の制御下でナノポアを通って移行する場合、次いでＤＮＡ移動は、単一のＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃヘリカーゼがこの領域の移動を制御する場合に観察されるものとは顕著に異なっていた（図２１Ａセクション６を参照されたい）。この図は、ヘリカーゼ移動がＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０ＣおよびＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａを使用して制御された場合の領域６についての移動指数を示し、ヘリカーゼ移動が単一の酵素Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃによって制御された場合の領域６についてよりも多数の点を有し、２つの異なる酵素の制御下でナノポアを通って移行する場合ＤＮＡ構築物Ｚのこの領域についてさらに多数の情報が得られたこと、およびＤＮＡ移動がさらに安定していたこと（例えば６と標識したＤＮＡ領域のより遅い移動または少ない前方へのスリッピング）を示唆していた。これは、Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０ＣとＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａ酵素との組合せが、ＤＮＡの鎖の改善された配列決定のために使用されたことを意味した。
【実施例８】
【０４７６】
本実施例は、ＭｓｐＡナノポアを通るＤＮＡ構築物Ｚ（図２０に示す）の移動を制御するための単一のＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａまたは２つのＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａヘリカーゼ（変異Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａを有する配列番号２４）のいずれかの使用を比較した。Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａは、適切な燃料と共に供給された場合にＤＮＡに沿って移動する活性ヘリカーゼである。２つのヘリカーゼ（Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａ）がナノポアを通る構築物の移動を制御するために使用された場合、次に単一のヘリカーゼ（Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａ）によって制御された場合と比較して改善された移動が観察された。
【０４７７】
材料および方法
予め結合した２つのＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａヘリカーゼ（図２１Ｂデータを参照されたい）または予め結合した単一のＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａ（対照実験、図２１Ａデータを参照されたい）のいずれかを有するＤＮＡ構築物Ｚ（ナノポア系に加えられた最終濃度０．１ｎＭ）を緩衝液（ナノポア系に加えられた最終濃度は５００ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ８．０であった）、ＡＴＰ（ナノポア系に加えられた最終濃度２ｍＭ）およびＭｇＣＬ２（ナノポア系に加えられた最終濃度２ｍＭ）に加えた。これは、次いでナノポア系に加えられる予備混合物であった（合計容量１５０μＬ）。
【０４７８】
予め結合した単一のＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａ（対照実験として）または予め結合した２つのＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａヘリカーゼのいずれかと共にＤＮＡ構築物Ｚをナノポア系に加えられたことを除いて、電気的測定を上の実施例７に記載のとおり単一のＭｓｐＡナノポアから取得した。
【０４７９】
結果
Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａだけ（対照実験、図２２Ａ）または２つのＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａヘリカーゼ（図２２Ｂ）による制御された移行に対応するヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を観察した。図２２セクションＡに示すトレースは、単一のヘリカーゼＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８ＡだけがＭｓｐＡナノポアを通るＤＮＡ構築物Ｚ（図２０を参照されたい）の移行を制御する場合の移動指数プロット例を示した。領域５がナノポアを通って移行する場合に、領域５についての移動指数を観察することが可能であった。しかしこの図は、領域６についての移動指数が領域５についてよりも少ない点を有することを示し、それがナノポアを通って移行する場合にＤＮＡ構築物Ｚのこの領域についてあまり情報が得られなかったことを示唆していた。これは、あまり安定していない（例えば６と標識したＤＮＡ領域のさらなる前方へのスリッピング）ＤＮＡ移動を生じ、ＤＮＡ配列のセクションが失われた。
【０４８０】
図２２Ｂは、２つのＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８ＡヘリカーゼがＭｓｐＡナノポアを通るＤＮＡ構築物Ｚ（図２０を参照されたい）の移行を制御する場合の移動指数を示す。領域５が２つのＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａヘリカーゼの制御下でナノポアを通って移行する場合、移動指数を観察することが可能であった。さらに領域６がナノポアを通って移行する場合、移動は、再度２つのＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａヘリカーゼによって制御された。領域６が２つの酵素（２つのＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａヘリカーゼ）の制御下でナノポアを通って移行する場合、次いでＤＮＡ移動は、単一のＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａヘリカーゼが領域６の移動を制御する場合に観察されるものとは顕著に異なっていた（図２２Ａセクション６を参照されたい）。この図は、ヘリカーゼ移動が２つのＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａヘリカーゼを使用して制御される場合の領域６についての移動指数を示し、ヘリカーゼ移動が単一の酵素Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａによって制御される場合よりも多い点を有し、これは、単一のＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａヘリカーゼの制御下で構築物Ｚの領域６について観察されたものよりも、より多くの情報が２つの酵素の制御下でナノポアを通って移行する場合にＤＮＡ構築物Ｚのこの領域について得られたことを示唆した。さらにＤＮＡ移行が２つのＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａヘリカーゼによって制御された場合に観察されたＤＮＡ移動はさらに安定していた（例えば８と標識したＤＮＡ領域のより遅い移動または少ない前方へのスリッピング）。これは、２つのＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａ酵素の使用がＤＮＡの鎖の改善された配列決定を生じることを意味する。
【０４８１】
本発明の好ましいＤｄａヘリカーゼの配列比較（配列番号８から２３）
【０４８２】
【化８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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