(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
内部が空洞になった筒状体であって、上部に外気を吸気するための吸気口を有すると共に下部に排気用の排気口を有し生体試料を収容する収容容器と、該収容容器内の上部に設けられて低温液化ガスを貯留するともに周壁が雰囲気を冷却する冷却面となっている貯留冷却器と、前記収容容器内であって前記貯留冷却器の下方に設けられて前記生体試料が載置される生体試料載置部とを備え、前記貯留冷却器の外壁面によって冷却された前記収容容器内の雰囲気ガスにより前記生体試料載置部に載置された生体試料を凍結するようにしたことを特徴とする生体試料の凍結装置。
【請求項２】
前記貯留冷却器は、低温液化ガスを貯留する貯留部と、該貯留部の上端部から外方に張出すフランジ部とを有し、
前記貯留冷却器は、前記フランジ部を前記収容容器で支持することで前記収容容器に設置されており、前記フランジ部と前記収容容器との間に前記貯留冷却器の重さで縮むバネを介在させて、該バネの縮み量によって前記貯留冷却器に貯留されている低温液化ガスの量を確認できるようにしたことを特徴とする請求項１記載の生体試料の凍結装置。
【請求項３】
前記貯留冷却器によって冷却された冷気を前記生体試料載置部に誘導するための整流部材を備えたことを特徴とする請求項１又は２に記載の生体試料の凍結装置。
【請求項４】
前記生体試料載置部に載置される生体試料が、細胞シート、培養皮膚、三次元の細胞構造体から選ばれる一つ又は複数であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の生体試料の凍結装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、iPS細胞などの実用化において活用が期待されている、高次構造体としてのシート状生体試料を高品質に凍結するための生体試料の凍結装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
シート状の生体試料を低温雰囲気で凍結する技術として、液化窒素等の低温液化ガスの蒸発低温ガスによる凍結方法がある。
例えば、特許文献１には、低温液化ガスを貯留した低温液化ガス容器内の気相部でシートの試料を凍結する方法が記載されている。具体的には、シート状の試料は低温液化ガスを貯留した低温液化ガス容器内の、低温液化ガス液面上方に配置された通気性があり、かつ熱伝導性が良好な載置部に載置され、蒸発により生じた低温ガスで凍結される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１４−１５８５９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１に開示されたものは、シート状の試料が低温液化ガス液面上方に配置されることから、液面から飛散した低温液化ガスの飛沫が載置部に載置されている試料容器にかかり、試料を封じた蓋と容器の隙間から低温液化ガスが内部に侵入することが考えられる。液化窒素等の低温液化ガスはクリーン度を担保することが難しいことから、低温液化ガスの侵入により内部の試料が汚染される可能性がある。
また、低温液化ガスが試料を封じた容器内部に侵入すると、低温液化ガスが昇温して気化したときの内圧上昇により容器の蓋が外れるおそれもある。
【０００５】
本発明は、低温液化ガスの飛沫が試料の容器に付着することがなく生体試料の汚染の危険がなく生体試料を凍結することができる生体試料の凍結装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（１）本発明に係る生体試料の凍結装置は、内部が空洞になった筒状体であって、上部に外気を吸気するための吸気口を有すると共に下部に排気用の排気口を有し生体試料を収容する収容容器と、該収容容器内の上部に設けられて低温液化ガスを貯留するともに周壁が雰囲気を冷却する冷却面となっている貯留冷却器と、前記収容容器内であって前記貯留冷却器の下方に設けられて前記生体試料が載置される生体試料載置部とを備え、前記貯留冷却器の外壁面によって冷却された前記収容容器内の雰囲気ガスにより前記生体試料載置部に載置された生体試料を凍結するようにしたことを特徴とするものである。
【０００７】
（２）また、上記（１）に記載のものにおいて、前記貯留冷却器は、低温液化ガスを貯留する貯留部と、該貯留部の上端部から外方に張出すフランジ部とを有し、
前記貯留冷却器は、前記フランジ部を前記収容容器で支持することで前記収容容器に設置されており、前記フランジ部と前記収容容器との間に前記貯留冷却器の重さで縮むバネを介在させて、該バネの縮み量によって前記貯留冷却器に貯留されている低温液化ガスの量を確認できるようにしたことを特徴とするものである。
【０００８】
（３）また、上記（１）又は（２）に記載のものにおいて、前記貯留冷却器によって冷却された冷気を前記生体試料載置部に誘導するための整流部材を備えたことを特徴とするものである。
【０００９】
（４）また、上記（１）乃至（３）のいずれかに記載のものにおいて、前記生体試料載置部に載置される生体試料が、細胞シート、培養皮膚、三次元の細胞構造体から選ばれる一つ又は複数であることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明においては、内部が空洞になった筒状体であって、上部に外気を吸気するための吸気口を有すると共に下部に排気用の排気口を有し生体試料を収容する収容容器と、該収容容器内の上部に設けられて低温液化ガスを貯留するともに周壁が雰囲気を冷却する冷却面となっている貯留冷却器と、前記収容容器内であって前記貯留冷却器の下方に設けられて前記生体試料が載置される生体試料載置部とを備え、前記貯留冷却器の外壁面によって冷却された前記収容容器内の雰囲気ガスにより前記生体試料載置部に載置された生体試料を凍結するようにしたことにより、貯留冷却器の外壁で冷却された大気を利用しているので、低温液化ガスの飛沫が試料にかかることによる汚染等の悪影響を防ぐことができる。
また、低温液化ガスの液面制御のような複雑な機構や、透明材料も不要である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の実施の形態１に係る生体試料の凍結装置の説明図であり、図１（ａ）が側面図、図１（ｂ）が平面図である。
【図２】図１に示した生体試料の凍結装置を構成する収容容器の説明図であり、図２（ａ）が側面図、図２（ｂ）が平面図である。
【図３】図１に示した生体試料の凍結装置を構成する貯留冷却器の説明図であり、図２（ａ）が側面図、図２（ｂ）が平面図である。
【図４】図３に示した貯留冷却器の他の態様の説明図である。
【図５】図３に示した貯留冷却器の他の態様の説明図であり、図５（ａ）が側面図、図５（ｂ）が底面図である。
【図６】図１に示した生体試料の凍結装置を構成する貯留冷却器の支持構造の他の態様の説明図である（その１）。
【図７】図１に示した生体試料の凍結装置を構成する貯留冷却器の支持構造の他の態様の説明図である（その２）。
【図８】図１に示した生体試料の凍結装置を構成する生体試料載置部の説明図であって、図８（ａ）が側面図、図８（ｂ）が平面図である。
【図９】本発明の実施の形態２に係る生体試料の凍結装置の説明図であり、図９（ａ）が側面図、図９（ｂ）が平面図である。
【図１０】図９に示した生体試料の凍結装置を構成する整流部材の説明図であって、図１０（ａ）が側面図、図１０（ｂ）が平面図である。
【図１１】本発明の実施の形態２に係る生体試料の凍結装置の他の態様の説明図であり、図１１（ａ）が側面図、図１１（ｂ）が平面図である。
【図１２】図１１に示した生体試料の凍結装置を構成する整流部材の説明図であって、図１２（ａ）が側面図、図１２（ｂ）が平面図である。
【図１３】本発明の実施の形態２に係る生体試料の凍結装置の他の態様の説明図であり、図１３（ａ）が側面図、図１３（ｂ）が平面図である。
【図１４】図１３に示した生体試料の凍結装置を構成する整流部材の説明図であって、図１４（ａ）が側面図、図１４（ｂ）が平面図である。
【図１５】本発明の実施の形態２に係る生体試料の凍結装置の他の態様の説明図であり、図１５（ａ）が側面図、図１５（ｂ）が平面図である。
【図１６】図１５に示した生体試料の凍結装置を構成する整流部材の説明図であって、図１６（ａ）が側面図、図１６（ｂ）が平面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
［実施の形態１］
生体試料の凍結装置１は、図１に示すように、収容容器３と、収容容器３内に設置される貯留冷却器５と、収容容器３内に設けられて生体試料が載置される生体試料載置部７とを備えている。
以下、各構成を詳細に説明する。
【００１３】
＜収容容器＞
収容容器３は、図２に示すように、内部が空洞になった筒状体であって、上部に外気を吸気するための吸気口９を有すると共に下部に排気用の排気口１１を有している。
図２に示す例は、全体の形状が円筒体であり、上端部には内側に張出す内向きフランジ部１３が形成されており、内向きフランジ部１３が貯留冷却器５の載置部となる。
吸気口９は、収容容器３の上部周面に、周方向に複数設けられた開口によって構成されている。
排気口１１は、収容容器３の下部に複数設けられ、排気口１１の間が収容容器３を設置面に載置する脚部１５となっている。
【００１４】
吸気口９の合計開口面積と、排気口１１の合計開口面積の比率は、冷却対象試料や装置の形状等に応じて任意に設定できるが、吸気口合計開口面積＜排気口合計開口面積の場合、吸気量が過量となり収容空間温度が高くなる方向へ向かう。逆に、吸気口合計開口面積＞排気口合計開口面積の場合、収容空間温度は低下するが収容空間内のガスの流れがなくなる傾向となるので、伝熱効率が低下することになる。これらを総合的に勘案すると、吸気口合計開口面積＞排気口合計開口面積の方が試料の冷却には適切である。なお、吸気口合計開口面積：排気口合計開口面積＝2:1〜20:1が好ましい。
なお、吸気口９及び排気口１１の、開口の高さは、5〜50mmが好ましい。５ｍｍ未満となると開口部でのせん断力により充分な吸排気が困難となることがあり、５０ｍｍを超えると収容容器３の内外の圧力差が小さくなり円滑な吸排気が困難となることがあるためである。
また、吸気口９及び排気口１１の、開口の幅は収容容器３の周長の1/5以上が好ましい。
【００１５】
収容容器３の材質は、ステンレス合金やアルミ合金、銅合金など極低温で利用できる金属、もしくは高密度ポリエチレンやポリプロピレンなどの樹脂でもよい。
【００１６】
なお、収容容器３の形状は、円筒形状に限らず、四角筒などの角型の筒体でもよく、また壁面は鉛直でなく傾斜面や曲面であっても構わない。
【００１７】
＜貯留冷却器＞
貯留冷却器５は、収容容器３内の上部に設置されて低温液化ガス１６を貯留するともに周壁、すなわち周側壁及び底面が雰囲気を冷却する冷却面となっているものである。
貯留冷却器５の形状は、図３に示す例では、低温液化ガス１６を貯留する貯留部１７が有底の円筒形状であり、貯留部１７の上端面は閉じた蓋体１９となっており、外方に張出すフランジ部１９ａを有している。フランジ部１９ａが、収容容器３の上端部に設けられた内向きフランジ部１３に載置される。蓋体１９又は貯留部１７の上部には、低温液化ガス１６を貯留部１７に注入するための注入口（図示なし）あるいは注入具（図示なし）を設けるようにする。
なお、貯留部１７は円筒形である必要はなく、角形でも構わない。また、収容容器３の平面形状と同形状である必要もない。
【００１８】
貯留冷却器５の材質は、ステンレス合金やアルミ合金、銅合金など極低温で利用できる金属で、熱伝導率の高い材料が望ましい。
もっとも、蓋体１９は雰囲気を冷却するのに寄与しないので、上部からの伝熱による液化ガスの無駄な蒸発を抑える意味で熱伝導率の小さな材料で形成するのが好ましい。
また、蓋体１９は、上面から低温液化ガス１６の有無を確認できるようにするために、透明部材で形成してもよい。
貯留冷却器５の高さは10mm以上とし、好ましくは50〜100mmとする。
【００１９】
なお、図４に示すように、貯留冷却器５のフランジ部１９ａに開口２１を設けると共に収容容器３の内向きフランジ部１３に吸気口９を設けることで、収容容器３の上面からの吸気が可能になる。この場合も貯留冷却器５の周壁面で冷やされた外気が収容容器３の内部を下降し、周囲の外気が吸気口９から引き込まれることによって継続的に対象試料が冷却される。吸気口９と排気口１１の面積比は上述したのと同様である。
【００２０】
また、図５に示すように、貯留冷却器５の外周面に雰囲気ガスとの接触面積を増やすための伝熱フィン２３を設けてもよい。伝熱フィン２３は、厚みを0.2〜5mmとし、好ましくは0.5〜2.0mmとする。
伝熱フィン２３を設けることで、効率的に熱交換することができ、吸気ガスの温度を低下させることができる。
【００２１】
貯留冷却器５内の低温液化ガス１６は蒸発するため、その量が徐々に減少するため、貯留されている低温液化ガス１６が枯渇しないように管理するのが望ましい。もっとも、本実施の形態の凍結装置１はシンプルな冷却機構であるため、貯留冷却器５内の低温液化ガス１６の管理は、その量を厳密に把握する必要はなく、低温液化ガス１６が枯渇しなければよいというレベルなので、センサーなどの液面制御機構は不要である。そのため、試料の凍結に必要な一定量を供給・貯留するだけでも事足りる。
【００２２】
もっとも貯留冷却器５内の低温液化ガス１６の量を外部から確認できるのが好ましいので、そのための機構の一例を図６、図７に示す。
図６に示すように、収容容器３の内向きフランジ部１３の周方向に３か所以上の位置に、ガイド軸２５と、ガイド軸２５が挿通されるバネ２７を設け、貯留冷却器５のフランジ部１９ａに挿通穴２９を設けて、ガイド軸２５を挿通穴２９に挿通して、フランジ部１９ａをバネ２７によって支持するようにする。
【００２３】
このような機構にすることで、図６に示すように、貯留冷却器５内の低温液化ガス１６が充分な量以上の時には、貯留冷却器５の重さでバネ２７が縮められ、貯留冷却器５のフランジ部１９ａが収容容器３の内向きフランジ部１３に当接する。
他方、貯留冷却器５に低温液化ガス１６が充填されていないとき、あるいは充填量が不充分なときは、図７に示すように、貯留冷却器５がバネ２７の力で浮き上がり、貯留冷却器５のフランジ部１９ａと収容容器３の内向きフランジ部１３との間に隙間が生ずる。このため、外部から容易に貯留冷却器５内に低温液化ガス１６が充分あるかどうかを目視確認することができる。
【００２４】
上記のような目視確認ができるようにするには、貯留冷却器５内の低温液化ガス１６の量がどの程度少なくなったら、貯留冷却器５が浮き上がるようにするかを決定して、その時の貯留冷却器５の重量との関係でバネ２７のバネ力を適宜調整すればよい。
なお、貯留冷却器５のフランジ部１９ａと収容容器３の内向きフランジ部１３との間にセンサーを設置して、両者が離れたことをセンサーから信号として発信して該信号を受信することで、例えばブザー音を鳴らしたり、あるいは表示等で確認したりできるようにしてもよい。
【００２５】
＜生体試料載置部＞
生体試料載置部７は、収容容器３内であって貯留冷却器５の下方に設けられて生体試料が載置されるものであり、支持脚部３１と試料載置面３３とを有している。
試料載置面３３の構造は、網形式やパンチング形式など良通気構造とするか、アルミ合金や銅合金などの良伝熱材料で挟み込むことでもよい。
パンチング形式の場合、穴径1〜20mmで開口率10〜75%とし、穴径2〜10mm、開口率25〜50%が好ましい。
網形式の場合、線径0.1〜5mmの、線ピッチ1〜20mmの網で、アルミ合金や銅合金など熱伝導率の高い材料が好ましいが、ステンレス鋼や樹脂でもよい。載置面の大きさは試料の1〜10倍で、1〜1.5倍とするのが好ましい。
【００２６】
試料載置面３３との接触による生体試料の汚染の心配がある場合には、生体試料を薄い材料で密着包装してもよい。
収納容器３内の低温ガス温度は、貯留冷却器５に近いほど低く、貯留冷却器５から離れるほど高くなるため、試料載置面３３と貯留冷却器５との距離は、試料載置面３３の位置が試料に適した低温ガス温度となるように、適宜設定すればよい。例えば、試料載置面３３と貯留冷却器５との距離の例としては、5mm〜200mm、好ましくは10mm〜50mmとする。
なお、試料載置面３３から貯留冷却器５までの距離は固定でもよいが、可変できる構造でもよい。距離が固定の場合には、試料ごとに位置を変更できるように、高さ方向に一定の間隔ごとに試料載置面３３を支持する部品を備えるようにしてもよい。支持部品は1〜30mmごとに設置できるようにするとよい。
【００２７】
以上のように構成された本実施の形態によれば、貯留冷却器５の外壁で冷却された雰囲気（大気）を利用するので、低温液化ガス１６の飛沫が試料にかかることによる汚染等の悪影響を防ぐことができる。低温液化ガス１６の液面制御のような複雑な機構や、液面位置を確認するために容器を透明材料で形成する必要もない。
また、バネ２７を利用して貯留冷却器５を収容容器３に装着することにより、貯留冷却器５内の液面量の目視の他、バネ２７の縮み量で貯留冷却器５内の残低温液化ガス１６の量を把握することができる。
【００２８】
なお、凍結対象となる生体試料は、凍結保存が必要な生体由来や生物であれば特に限定されず、卵子、精子、受精卵などの生殖細胞、培養細胞、iPS細胞やES細胞等の幹細胞といった細胞、微生物等が例示される。また、生体試料の形態も、細胞の懸濁液、培養皮膚等の細胞シート、三次元の細胞構造体、等任意である。特に本凍結装置１は、凍結による破損がおこりやすく、他の形態の生体試料に比べて穏やかな冷却条件が必要な、細胞シート、三次元の細胞構造体の凍結に、より適している。
【００２９】
［実施の形態２］
本実施の形態に係る生体試料の凍結装置３４は、実施の形態１のものに、貯留冷却器５によって冷却された冷気を生体試料載置部７に誘導するための整流部材を備えたものであり、図１０〜図１６に基づいて説明する。
図９は装置全体を示し、図１０は整流部材３５を示しているが、図９において実施の形態１と同一部分には同一の符号を付してある。
【００３０】
図１０に示すように、整流部材３５は、下方に向かって縮径するリング状からなる部材であり、外周上端部を収容容器３の内壁に当接させて保持させ、生体試料載置部７の試料載置面３３を囲むように設置される。これによって、貯留冷却器５によって冷却された冷気が、収容容器３の内壁面に沿って下方に逃げるのを防止して、冷気を試料載置面３３に導くことができる。
【００３１】
図１１に示す生体試料の凍結装置３４は、図１２に示すように、整流部材３７の高さを図１０に示したものよりも高くして、開口部を試料載置面３３の中心に向けたものである。なお、試料載置面３３に複数の生体試料を載置した場合には、開口部を複数設けて、各生体試料に向けて冷気を誘導するようにすればよい。
【００３２】
図１３に示す生体試料の凍結装置３４の整流部材３９は、図１４に示すように、図１０に示したものに、底部４１を設け、底部４１に複数の開口穴４３（パンチング穴）を設けたものである。複数の開口穴４３から生体試料の全体に向けて冷気を誘導する。
【００３３】
図１５、図１６に示す例は、図１０に示したものに、底部４１を設け、底部４１に複数のスリット４７を設けたものである（整流部材４５）。複数のスリット４７から生体試料の全体に向けて冷気を誘導する。
【００３４】
図９〜図１６に示した整流部材（３５、３７、３９、４５）は、いずれも冷気を効果的に試料と熱交換させるための対策である。材質はステンレス合金やアルミ合金、銅合金など極低温で利用できる金属、もしくは高密度ポリエチレンやポリプロピレンなどの樹脂でもよい。
【符号の説明】
【００３５】
１  生体試料の凍結装置（実施の形態１）
３  収容容器
５  貯留冷却器
７  生体試料載置部
９  吸気口
１１  排気口
１３  内向きフランジ部
１５  脚部
１６  低温液化ガス
１７  貯留部
１９  蓋体
１９ａ  フランジ部
２１  開口
２３  伝熱フィン
２５  ガイド軸
２７  バネ
２９  挿通穴
３１  支持脚部
３３  試料載置面
３４  生体試料の凍結装置（実施の形態２）
３５  整流部材（図９、図１０）
３７  整流部材（図１１、図１２）
３９  整流部材（図１３、図１４）
４１  底部
４３  開口穴
４５  整流部材（図１５、図１６）
４７  スリット
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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