(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも３つの結合特異性を含む結合分子であって、
（ａ）第１の結合特異性は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）小型表面抗原に対するものであり；
（ｂ）（ｉ）第２および第３の結合特異性はそれぞれＣＤ３およびＣＤ２８に対するものであり；
ならびに
（ｃ）各結合特異性が、
（ｉ）それぞれが免疫グロブリンドメインに含まれている、３つのＣＤＲの第１のセットと３つのＣＤＲの第２のセットからなる６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットによってもたらされ、
前記第１の結合特異性は、配列番号１〜６に記載のアミノ酸配列をそれぞれ含む６つのＣＤＲのセットによってもたらされ、前記第２の結合特異性は、配列番号１９〜２４のアミノ酸配列をそれぞれ含む６つのＣＤＲのセットによってもたらされ、前記第３の結合特異性は、配列番号２５〜３０の配列をそれぞれ含む６つのＣＤＲのセットによってもたらされ、
以下の（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、または（Ｖ）の構造を有する、少なくとも３つの結合特異性を含む結合分子。
【化１】
0006726676.tif 000009
【化２】
0006726676.tif 000010
【化３】
0006726676.tif 000011
【化４】
0006726676.tif 000012
【請求項２】
請求項１の結合分子をコードしている核酸。
【請求項３】
請求項１で定義されている１つ以上の結合分子および／または請求項２で定義されている１つ以上の核酸を含んでいるかまたはそれらからなる医薬組成物。
【請求項４】
前記１つ以上の結合分子および／または核酸だけが、前記医薬組成物に含まれている薬学的に活性な成分である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
ＨＢＶ感染および／または前記ＨＢＶ感染に起因する症状を治療または予防するための請求項３または４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ＨＢＶ感染に起因する症状が肝硬変、肝細胞癌、および肝臓癌から選択され、前記肝臓癌が１つ以上のＨＢＶ表面抗原の発現によって特徴付けられる、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
インビトロまたはエキソビボ免疫エフェクター細胞であって、
（ａ）前記免疫エフェクター細胞の表面抗原に結合する請求項１に記載の結合分子を有する、および／または
（ｂ）請求項２に記載の核酸によって形質が導入されている、
免疫エフェクター細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも３つの結合特異性を含む結合分子に関し、ここで、（ａ）第１の特異性は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）小型表面抗原、ＨＢＶ中型表面抗原およびＨＢＶ大型表面抗原から選択されるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）表面抗原に対するものであり；（ｂ）（ｉ）第２および第３の特異性はそれぞれＣＤ３およびＣＤ２８に対するものであるか、または（ｉｉ）第２および第３の特異性は、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、４−１ＢＢおよびＮＫＧ２Ｄに対する特異性から選択され、ならびに、（ｃ）各結合特異性は１つ以上の結合部位によってもたらされ、ここで各結合部位はそれぞれ独立して、（ｉ）６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）のセット（ここで前記６つのＣＤＲのセットはそれぞれが免疫グロブリンドメインに含まれている３つのＣＤＲの第１のセットと３つのＣＤＲの第２のセットからなる）、または、（ｉｉ）免疫グロブリンドメインに含まれる３つのＣＤＲのセット、によって提供される。
【０００２】
本明細書では、特許出願や製造者のマニュアルを含むいくつかの文献が引用されている。これら文献の開示は、本発明の特許性に関連がないと考えられても、その全体が参照することにより本出願に組み込まれる。より詳細には、参照した全ての文献が、あたかも個々の文献のそれぞれが具体的にかつ個別に参照により組み込まれたと示されるのと同程度に、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
約３．５億人の人々が慢性的にＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に感染している。ＨＢＶ感染は肝硬変および肝細胞癌（ＨＣＣ）を引き起こす場合があり、これらによって年間約百万人の犠牲者が出ている（ゲイネム（Ｇａｎｅｍ）ら、Ｂ型肝炎ウイルス感染−自然な生長および臨床結果（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ  ｈｉｓｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ）；３５０：１１１８−２９（２００４））。ＨＢＶの感染は現在、成人患者の約５％および新生児の約９０％において制御不能である。そのような場合、ＨＢＶ感染は慢性化する。考えられる原因としては細胞免疫応答が不十分であることが挙げられる。ＨＢＶ感染の治療に使用されている現在入手可能な抗ウイルス剤は、ウイルスの複製を阻害するものである。しかし、共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）が感染した肝細胞の核に残り、患者が投薬をやめるやいなやＨＢＶ感染の再活性化を引き起こすことがある。したがって、感染を完全に治癒するためには前記ｃｃｃＤＮＡを保有するＨＢＶ感染細胞の排除が不可欠となる（プロッツァー（Ｐｒｏｔｚｅｒ）ら、ネイチャー・レビューズ・イムノロジー（Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ）１２：２０１３−２１３（２０１２））。
【０００４】
しかし、そのようなＨＢＶ感染細胞の細胞傷害性排除（細胞傷害性Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞による）は起こらないかまたは十分に起こらない。
【０００５】
ＨＢＶのｃｃｃＤＮＡを保有する感染細胞はその表面にウイルス表面タンパク質を提示する。ウイルスが細胞内小胞に放出されてもいくつかのＨＢＶ表面タンパク質が小胞体の細胞内膜に組み込まれたままであるため、このような現象が起こると推定される。小胞輸送プロセスの過程において、前記細胞内膜は細胞膜と融合することがあり、その結果、感染細胞の表面にＨＢＶ表面タンパク質が提示される。
【０００６】
ボーネ（Ｂｏｈｎｅ）ら（Ｂ型肝炎ウイルス表面タンパク質に再指向されたＴ細胞による感染肝細胞の排除（Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｅｌｉｍｉｎａｔｅ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．胃腸病学（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）、１３４：２３９−２４７（２００８））およびクレーブス（Ｋｒｅｂｓ）ら（Ｂ型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質を結合するキメラ抗原受容体を発現するＴ細胞のマウスにおけるウイルス複製の制御（Ｔ  ｃｅｌｌｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｈａｔ  Ｂｉｎｄｓ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  Ｖｉｒｕｓ  Ｅｎｖｅｌｏｐｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ．）胃腸病学（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）（２０１３））は、キメラ抗原受容体は、レトロウイルスを介して送達されてＴ細胞の表面に発現した場合に、ヒト一次Ｔ細胞およびマウスＴ細胞がＨＢＶ小型表面抗原を提示している肝細胞を認識し、かつ、複製中のＨＢＶ細胞を溶解できるようにすることを報告している。
【０００７】
欧州特許第２５２４６９９号Ａ１には三機能性抗体が記載されている。これらの抗体は「機能的Ｆｃ部を有し」、「異なるサブクラスの免疫グロブリン重鎖から構成されねばならない」。一方、ホルニッグ（Ｈｏｒｎｉｇ）とファーバー・シュヴァルツ（Ｆａｒｂｅｒ−Ｓｃｈｗａｒｚ）は「抗体工学（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」（パトリック・シャンヌ（Ｐａｔｒｉｃｋ  Ｃｈａｎｎｅｓ）編、ヒューマナ・プレス、２０１２）の４０章において、Ｆｃ部を持たないｓｃＦｖ構築物について述べている。
【０００８】
リャオ（Ｌｉａｏ）ら（腫瘍学レポート（Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｓ）３、６３７−６４４（１９９６））は、ヌードマウスにおいてヒト肝癌異種移植片を溶解するためにエフェクター細胞を再標的化する二重特異性モノクローナル抗体について記載している。記載されている二重特異的抗体は２つのハイブリドーマの融合体から産生される。この融合体は、２つの個別の抗体の重鎖／軽鎖の組み合わせを発現するハイブリドーマ細胞株を形成し、これにより２つの異なる重鎖が対合する可能性だけでなく、同一の重鎖が対合する可能性があり、単一特異性親抗体と二重特異的抗体の無作為な混合物が産生され得る。二重特異的抗体は重鎖および軽鎖を含み、二量体化してＩｇ分子を形成する。
【０００９】
従来技術の観点からみると技術的課題は、ＨＢＶ感染ならびに肝硬変または肝細胞癌のようなＨＢＶ感染によって引き起こされる症状を治療する、代替のまたは改良された手段および方法を提供することであると理解される。解決すべき技術的課題は、ＨＢＶ感染を治癒する方法の提供においても見られる。細胞生物学の観点から述べると技術的課題は、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを保有する細胞を根絶する手段および方法の提供であることが理解される。この技術的課題は添付の請求項によって解決される。
【発明の概要】
【００１０】
従って本発明は第１の側面において、少なくとも３つの結合特異性を含む結合分子に関し、ここで、（ａ）第１の特異性は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）小型表面抗原、ＨＢＶ中型表面抗原およびＨＢＶ大型表面抗原から選択されるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）表面抗原に対するものであり；（ｂ）（ｉ）第２および第３の特異性はそれぞれＣＤ３およびＣＤ２８に対するものであるか、または（ｉｉ）第２および第３の特異性は、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、４−１ＢＢおよびＮＫＧ２Ｄに対する特異性から選択され、ならびに、（ｃ）各結合特異性は、１つ以上の結合部位によってもたらされ、ここで各結合部位はそれぞれ独立して、（ｉ）６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）のセット（ここで前記６つのＣＤＲのセットはそれぞれが免疫グロブリンドメインに含まれている３つのＣＤＲの第１のセットと３つのＣＤＲの第２のセットからなる）、または、（ｉｉ）免疫グロブリンドメインに含まれる３つのＣＤＲのセット、によって提供される。
【００１１】
「ＨＢＶ表面抗原」はまた、「ＨＢｓ」または「ＨＢｓＡｇ」と略される。
【００１２】
本発明による結合分子の結合能力は、「結合特異性」という用語を用いることによって機能的に定義される。前記結合特異性をもたらしている構造要素は「結合部位」と呼ばれる。ここで言う各特異性については、本発明の結合分子中に、所与の特異性をもたらしている１つまたは複数の結合部位が存在することが想定される。本発明の結合分子に、複数の結合部位によって所与の結合特異性が与えられるという意味において、構造と機能に同等の所与の結合特異性をもたらしている結合部位に指向性が生じていることと理解され、ここで機能とは、抗原が結合する所与のエピトープを認識する機能である。しかし、このことは、所与の結合特異性が複数の結合部位によってもたらされる態様を排除するものではなく、複数の結合部位が同じ抗原に結合するものである場合、抗原の異なるエピトープを介して結合する。これは、一般的に、たとえ全体的には同じ抗原に結合する能力を有しているとしても、それぞれの結合部位には構造的な差異があることを意味している。
【００１３】
所与の結合特異性をもたらしている結合部位の正確な数により、この数は例えば１、２、３および４つであり、好ましくは２つであるが、全体の結合特性が調節または最適化され得る。典型的には、所与の特異性をもたらしている結合部位の数を増やすことで、結合動態ならびに結合熱力学が改善される場合がある。
【００１４】
結合部位の総数は、当技術分野では「結合価」とも呼ばれている。従って、三重特異的な結合分子が必要とされている場合、その分子は少なくとも３価であるが、本発明による結合分子は４価、５価、６価、７価または８価であってもよいと理解される。しかし、結合価がより高い結合分子もまた想定される。９価もしくは１０価の結合分子、またはより高い結合価を有する結合分子を使用することで、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを保有する細胞を根絶することができると予想される。
【００１５】
結合分子が少なくとも三重特異的であるためには、各結合特異性が厳密に一つの結合部位によって構成されていれば十分である。したがって、本発明の三重特異的結合分子は３価の分子であってもよい。一般に、１つ、２つまたは３つの結合特異性が、それぞれ、２つの結合部位でもたらされている三重特異的分子が好ましい。１つ、２つまたは３つの結合特異性が、それぞれ、３つの結合部位でもたらされている三重特異的分子も好ましい。
【００１６】
また、３つの結合特異性が、それぞれ異なる数の結合部位によってもたらされる可能性もある。１つの結合特異性が他の２つよりも多くの結合部位によって構成されるか、または２つの結合特異性が３つ目の結合特異性よりも多くの結合部位によって構成されることが好ましい場合があり得る。
【００１７】
第１の側面の項目（ｃ）（ｉ）から明らかなように、６つのＣＤＲのセットは、所与の結合部位の好ましい実施形態である。当技術分野でよく知られているように、６つのＣＤＲのセットは、それぞれ３つのＣＤＲからなる第１および第２のセットを含む。３つのＣＤＲからなるこれら２つのセットは、同じポリペプチド鎖上に位置する場合も、または異なるポリペプチド鎖上に位置する場合もあり、それによって異なる分子構造を生じる。また、本発明による所与の結合分子内において、結合部位の一部は所与の結合部位を構成する６つのＣＤＲの全てが単一のポリペプチド鎖上に位置するようなもので、他の結合部位は所与の結合部位を構成する３つのＣＤＲの第１および第２のセットが別々のポリペプチド上に位置するようなものであるものも想定される。別々のポリペプチドは、単に形式的に異なるだけで、他の点では、特にアミノ酸配列に関しては、同一であってもよい。あるいは、別々のポリペプチドは、それらのアミノ酸配列の点で互いに区別することができてもよい。
【００１８】
一般的に言えば、また、これは以下の好ましい態様の考察からも明らかであるが、本発明による結合分子は、主に、１つのポリペプチドによって形成される結合部位を示し得る。しかしこれは、結合分子全体が単一のポリペプチド鎖からなるという要件にはならないと理解される。一方、本発明は、すべての結合部位が２本のポリペプチド鎖によって形成される結合分子にも及ぶ。同様に、後者の記述は、結合分子全体が２本のポリペプチド鎖のみからなるという要件にはならない。代わりに、結合分子は、２本以上のポリペプチド鎖、例えば３本もしくは４本または４本より多くのポリペプチド鎖から構成されていてもよい。最終的に、前述したように、および下記の構造（ＩＩＩ）によって例示されるように、本発明の結合分子を含む結合部位の一部は、それぞれが２本のポリペプチド鎖によって形成されるようなものであり、結合部位のその他の部分が単一のポリペプチド鎖によって形成されるようなものであってよい。
【００１９】
項目（ｂ）（ｉｉ）に関しては、第２および第３の特異性は互いに異なり、それによって、少なくとも三重特異的な結合分子を生じると理解される。
【００２０】
項目（ｃ）（ｉ）が考慮される場合、６つのＣＤＲの要件から、１つの結合部位を形成するためには２つの免疫グロブリンドメインが必要であることが明らかである。これは、３つのＣＤＲからなる結合部位を生じるのに単一の免疫グロブリンドメインで十分な項目（ｃ）（ｉｉ）とは異なる。これは、単一ドメイン結合部位としても知られている。
【００２１】
「相補性決定領域」という用語は「ＣＤＲ」と略され、当該分野で確立された意味を持つ。ＣＤＲは通常、約３〜約２５残基のアミノ酸の短いサブ配列であり、抗原のエピトープを特異的に認識する能力を抗体に付与する。一般に、抗体軽鎖の可変ドメインは３つのＣＤＲを備え、抗体重鎖の可変ドメインも３つのＣＤＲを備える。特段の指定がない限り、結合部位を規定する６つのＣＤＲは、通常、重鎖のＣＤＲ１、重鎖のＣＤＲ２、重鎖のＣＤＲ３、軽鎖のＣＤＲ１、軽鎖のＣＤＲ２、軽鎖のＣＤＲ３の順序で構成されている。ＣＤＲは通常、免疫グロブリンドメインの一部であるが、本発明においてはその点は求められていない。必要なのは前記複数のＣＤＲを含むアミノ酸配列であり、生理学的条件の下で折り畳まれた際に前記アミノ酸配列が前記複数のＣＤＲを空間的に近接させ、同種抗原の認識能力を保持することである。前述の空間的な近接および抗原結合を認識する能力は、前に開示した主な態様で使用されているように「抗原に結合するよう構成された」という用語で表される。「免疫グロブリンドメイン」という用語は当該分野で知られており、通常７０〜１００残基のアミノ酸の配列を指し、７〜９個の逆並行β鎖による二層サンドイッチの三次元構造を想定している。特定の態様および図面を規定している構造では、楕円を使って単一の免疫グロブリンドメインを示している。
【００２２】
通常、６つのＣＤＲのセットが結合部位を規定する。そうでなく、そしてラクダ科動物および軟骨魚の抗体から知られているように、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）のセットが結合部位を規定する場合もある。当技術分野で知られているように、また必須ではないが、ＣＤＲ３が天然に存在する免疫グロブリン可変ドメインよりも尽きだしたペプチドループからなる３つのＣＤＲのセットが好ましい。
【００２３】
「抗原」という用語は当該分野で確立された意味を有する。この用語は、免疫グロブリンドメインに一般的に存在する６つのＣＤＲのセットによって特異的に認識され、結合される分子を指す。前記ＣＤＲに認識され結合される抗原の特定の部分はエピトープとしても知られている。
【００２４】
ＨＢＶ  Ｓ／Ｍ／Ｌ表面タンパク質は、ＨＢＶの外被（エンベロープ）の小型、中型、および大型表面タンパク質である（スティッブ（Ｓｔｉｂｂｅ）Ｗ、およびＷ．Ｈ．ゲルリヒ（Ｇｅｒｌｉｃｈ）、Ｂ型肝炎表面抗原の微量タンパク質および主要タンパク質の構造関係（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｍｉｎｏｒ  ａｎｄ  ｍａｊｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）、ウイルス学ジャーナル（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ）、１９８３  ４６：６２６−６２８）。
【００２５】
３つのＨＢＶ表面抗原は１つの読み枠から転写・翻訳されるもので、Ｎ末端部分の長さが互いに異なる。従って、大型表面抗原は中型表面抗原にも小型表面抗原にも存在しない部分を含み、中型表面抗原は、大型抗原には含まれているが小型抗原には含まれていない部分を含む。小型抗原は中型抗原および大型抗原両方のＣ末端部分に含まれる配列からなる。
【００２６】
大型のＨＢＶ表面抗原は２通りの方法で細胞質膜に挿入できる。Ｎ末端またはＣ末端のどちらか一方が細胞外に位置してもよい。ＨＢＶ感染細胞内ではどちらの配置も見られる。言い換えると大型のＨＢＶ表面抗原のＮ末端は、ＥＲ膜の細胞質側または管腔側のいずれかに位置する場合があり、その結果、ＨＢＶ粒子の外被および感染した肝細胞の原形質膜においてこれらの形態でも存在し得る。
【００２７】
驚くべきことに、（ｂ）による第２および第３の特異性を三重特異的分子に組み合わせると、２つの二重特異性分子を組み合わせるよりも、免疫エフェクター細胞の活性化が有意に高まる。実施例を参照のこと。
【００２８】
さらに好ましい態様において、ＨＢＶ表面抗原に対する結合特異性をもたらしている結合部位は、（ａ）前記ＨＢＶ小型表面抗原中に位置しているか、（ｂ）前記ＨＢＶ小型表面抗原に含まれない前記ＨＢＶ大型表面抗原の部分中に位置しているか、または（ｃ）前記ＨＢＶ小型表面抗原と構造が異なる前記ＨＢＶ大型表面抗原の部分中に位置している、エピトープに結合する。
【００２９】
項目（ａ）はＨＢＶ小型表面抗原に含まれるエピトープを指す。前述した小型、中型、および大型ＨＢＶ表面抗原の関係から、小型抗原の配列全体は中型および大型抗原に含まれる。一般に、小型表面抗原によって発現される三次元エピトープは中型表面抗原および／または大型表面抗原によっても発現されるが、必ずしもそうではない。
【００３０】
項目（ｂ）によると、前記ＨＢＶ大型表面抗原の前記部分は前記ＨＢＶ中型表面抗原にも含まれないことが好ましい。項目（ｃ）に関する「構造が異なる（ｖａｒｙｉｎｇ  ｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」とは、前記ＨＢＶ小型表面抗原の配列の一部分にあたる配列を含むか、またはそれらからなる前記ＨＢＶ大型表面抗原のエピトープを含み、ここで前記エピトープが前記ＨＢＶ小型表面抗原に発現していないことと理解される。項目（ｃ）によると、前記エピトープは、前記ＨＢＶ大型表面抗原の前記ＨＢＶ中型表面抗原とも構造が異なる部分にあることがさらに好ましい。
【００３１】
前記項目（ａ）、つまり前記第１の抗原が前記ＨＢＶ小型表面抗原であることが、本発明のすべての側面および態様との関連で特に好ましい。
【００３２】
項目（ｂ）および（ｃ）によると、ポリペプチドまたは結合分子はそれぞれ、ＨＢＶの大型表面抗原を特異的に認識する。
【００３３】
第２および第３の特異性は、免疫エフェクター細胞によって発現される表面抗原、具体的には、ＮＫ細胞および／またはＣＴＬ特異的によって発現される表面抗原に対するものであることが好ましい。免疫エフェクター細胞はＨＢＶ感染細胞に再指向化される細胞である。前記ＨＢＶ感染細胞はその表面に前述のＨＢＶ表面抗原を発現している。
【００３４】
特に、第２のおよび第３の特異性のいずれもがＣＴＬに対するものであること、またはいずれもがＮＫ細胞に対するものであることが好ましい。
【００３５】
ＣＤ３（ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ３）Ｔ細胞共受容体はタンパク質複合体であり、４つの異なる鎖からなる。哺乳動物では、複合体はＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖および２つのＣＤ３ε鎖を含む。結合特異性は、これらの鎖のいずれかに向けられ得る。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）およびζ鎖として知られる分子と会合し、Ｔリンパ球において活性化シグナルを生成する。ＴＣＲ、ζ鎖、およびＣＤ３分子は共にＴＣＲ複合体を構成する。
【００３６】
好ましい態様においてＣＤ３は、ＣＤ３−Ｔ細胞受容体複合体の一部分であるＣＤ３イプシロン鎖を表す（ボルスト  Ｊ（Ｂｏｒｓｔ、Ｊ）ら、ヒトＴ３／Ｔ−細胞受容体複合体のデルタ鎖およびイプシロン鎖は異なるポリペプチドである（Ｔｈｅ  ｄｅｌｔａ−  ａｎｄ  ｅｐｓｉｌｏｎ−ｃｈａｉｎｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  Ｔ３／Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｒｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）、ネイチャー  １９８４．  ３１２：４５５−４５８）。本発明のＣＤ３に対する結合特異性は、前記ＣＤ３イプシロン鎖に対するものであることが好ましい。
【００３７】
ＣＤ２８は主要なＴ細胞共刺激受容体である（レスラウアー  Ｗ（Ｌｅｓｓｌａｕｅｒ、Ｗ）ら、Ｔ９０／４４（９．３抗原）、ヒトＴ細胞活性化機能を持つ細胞表面分子、欧州免疫学雑誌  １９８６．  １６：１２８９−１２９６）。
【００３８】
４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）は活性化したＴ細胞およびＮＫ細胞の共刺激受容体である（クウォンＢ．Ｓ．（Ｋｗｏｎ、Ｂ．Ｓ．）ら、２つの誘導性Ｔ細胞遺伝子のｃＤＮＡ配列、米国科学アカデミー紀要、米国、１９８９  ８６：１９６３〜１９６７）。
【００３９】
ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩａ）はＮＫ細胞、活性化した細胞傷害性Ｔ細胞のサブセット、および骨髄単球系の細胞型で発現する低親和性Ｆｃ受容体であり、ＩｇＧ分子のＦｃドメインに結合する（ラニアＬ．Ｌ．（Ｌａｎｉｅｒ、Ｌ．Ｌ．）ら、ＩｇＧに対するＦｃ受容体を発現する細胞傷害性ＣＤ３+Ｔリンパ球に特有のサブセットの機能特性（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｓｕｂｓｅｔ  ｏｆ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ＣＤ３+  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｔｈａｔ  ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ＩｇＧ）（ＣＤ１６／Ｌｅｕ−１１抗原）実験医学ジャーナル（Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．）１９８５、１６２：２０８９〜２１０６）。
【００４０】
ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）はＮＫ細胞で発現する細胞接着分子である（ラニアＬ．Ｌ．（Ｌａｎｉｅｒ、Ｌ．Ｌ．）ら、Ｌｅｕ−１９（ＣＤ５６）白血球分化抗原および神経細胞接着因子の同一性（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｅｕ−１９  （ＣＤ５６）  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｎｄ  ｎｅｕｒａｌ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）実験医学ジャーナル（Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．）１９８９、１６９：２２３３〜２２３８）。
【００４１】
ＮＫＧ２ＤはＮＫ細胞で発現する活性化受容体である（ホーチンスＪ（Ｈｏｕｃｈｉｎｓ、Ｊ．）ら、ヒトナチュラルキラー細胞にＩＩ型内在性膜タンパク質をコードする近縁ｃＤＮＡクローンファミリーであるＮＫＧ２のＤＮＡ配列解析（ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＮＫＧ２，ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｉｎｔｅｇｒａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ）１９９１、実験医学ジャーナル（Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．）１７３：１０１７〜１０２０）。
【００４２】
ＮＫｐ３０（ＮＣＲ３）はＮＫ細胞によって発現する活性型受容体である（ペンデ  Ｄ（Ｐｅｎｄｅ、Ｄ．）ら、ヒトナチュラルキラー細胞によって媒介される自然細胞傷害性に関係して誘発する新たなトリガー受容体であるＮＫｐ３０の同定および分子的特徴（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＫｐ３０，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｍｉｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ）２０００．実験医学ジャーナル  １９２：３３７−３４６）。
【００４３】
ＮＫｐ４６（ＮＣＲ１）は、ＮＫ細胞によって発現する活性型受容体である（ペシノ（Ｐｅｓｓｉｎｏ）ら、ＮＫｐ４６の分子クローニング：天然の細胞傷害性の誘発に関与する免疫グロブリンスーパーファミリーの新規メンバー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ＮＫｐ４６：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．）、１９９８．実験医学ジャーナル  １８８：９５３−９６０）。
【００４４】
ＣＤ３、ＣＤ２８および４−１ＢＢはＣＴＬの表面に発現する。本発明のポリペプチドがこれら表面抗原のいずれかと結合するには、ＣＴＬの刺激または共刺激が必要となる。
【００４５】
ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６および４−１ＢＢはＮＫ細胞の表面に発現する。本発明のポリペプチドがこれら表面抗原のいずれかと結合するには、ＮＫ細胞の刺激または共刺激が必要となる。
【００４６】
ヒトＣＴＬに関しては、ＣＤ３およびＣＤ２８を優先する。ヒトＮＫ細胞に関しては、ＣＤ１６およびＣＤ５６を優先する。
【００４７】
前述の表面抗原は当該分野で確立された名称で呼ばれる（ケネスマーフィー（Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｍｕｒｐｈｙ）、ジェンウェイの免疫生物学（Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ）第７版、ガーランドサイエンス（Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、ウィリアムＥ．ポール（Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅ．  Ｐａｕｌ）、基礎免疫学（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）第７版、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンスも参照のこと）。
【００４８】
本発明による結合、具体的にはＣＤＲと抗原との間の結合は、特異的であることが特に好ましい。本発明で使用される「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｂｉｎｄ）」および「特異的結合（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ）」（「特異的に相互作用する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ）」と同義）という用語は、これらの結合部位が、標的抗原のエピトープまたはエピトープに類似した構造と交差反応を起こさない、または本質的に交差反応を起こさないことを意味する。調査対象となっている分子パネルの交差反応性は、例えば、標準的な条件における前記分子パネルと目的のエピトープとの結合ならびにいくつかのある程度（構造的におよび／または機能的に）近似のエピトープとの結合を評価することによって試験してもよい。似たような状況において（例えばタンパク質構造の特定のモチーフで）、目的のエピトープに結合するが、その他のエピトープとは結合しないまたは本質的に結合しない分子のみが目的のエピトープに対して特異的であるとみなされる。
【００４９】
慢性的なＨＢＶ感染は免疫寛容状態を特徴とする。より具体的には、患者のＣＴＬおよびＮＫ細胞が機能しても感染細胞の完全な根絶、ＨＢＶ複製の完全な制御、またはＨＢＶの完全な排除が起こらない状態である。本発明の結合分子は、一方でＨＢＶ表面抗原を特異的に認識し、他方で免疫エフェクター細胞表面抗原を認識する。この結合分子は、免疫エフェクター細胞に人工的な特異性を付与すると理解される。実際に、ＣＴＬおよびＮＫ細胞は、本発明の結合分子によって再標的化され、ＨＢＶ感染細胞に取り込まれてＨＢＶ感染細胞を死滅させる。
【００５０】
一方における本発明の結合分子のＨＢＶ感染細胞への結合および他方の免疫エフェクター細胞の取り込みはどのような順序で行われてもよく、同時に行われてもよい。
【００５１】
具体的には、本発明の結合分子を注入または経口投与形態で全身的に使用すると、そのポリペプチドがＨＢＶに感染した標的細胞またはＨＢＶ抗原を発現している標的細胞に結合し、前記標的細胞に前記免疫エフェクター細胞を取り込ませられるようにすることが意図される。
【００５２】
とはいえ、本発明の結合分子を免疫エフェクター細胞（または前記エフェクター細胞を含む末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の個体群）と接触させて、前記エフェクター細胞に前記結合分子を負荷させるようにすることも想定される。そのようなエフェクター細胞（またはそのように負荷されたエフェクター細胞を含むＰＢＭＣ群）をその後、ＨＢＶ感染またはＨＢＶ感染に関連し、下記に定義される症状を患っている患者に投与することができる。そのような投与は静脈内投与、例えば総肝動脈内投与であってもよい。前記免疫エフェクター細胞の表面抗原に結合している本発明による結合分子を含む免疫エフェクター細胞も本発明の一側面である。この側面は以下により詳しく開示する。
【００５３】
このような死滅は、特に免疫細胞から分泌された抗ウイルス免疫伝達物質（例えばサイトカイン）と協働してＨＢＶ感染の根絶、ＨＢＶ感染の継続的な制御、またはＨＢＶ表面抗原を発現している腫瘍細胞の排除をもたらす。
【００５４】
本発明の結合分子の性能の好ましい指標としては、細胞培養におけるＴ細胞媒介性細胞毒性、Ｔ細胞の肝臓への補充、肝臓の炎症反応、血清中のウイルス力価の低下、血清に含まれるウイルス抗原ＨＢｓＡｇおよび／またはＨＢｅＡｇの減少、肝臓におけるウイルス複製の低下、および感染細胞数の減少が挙げられる。
【００５５】
これらの特性はそれぞれ、当該分野で確立されている方法によって測定することができる。
【００５６】
さらに説明すると、肝臓へのＴ細胞の補充は、ＲＴ−ＰＣＲにより、１種以上のＴ細胞マーカー遺伝子ｍＲＮＡ、特にＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＦＮγおよびＩＰ−１０（ＣＸＣＬ１０）の肝臓におけるレベルを測定することによって定量することができる。本発明によれば、これらのマーカー遺伝子は、陰性対照と比較して有意に高く誘導され、そのレベルは、２倍〜１０００倍以上、好ましくは２倍以上、好ましくは５倍以上好ましくは１０倍以上、好ましくは２５倍以上、好ましくは５０倍以上、好ましくは１００倍以上、好ましくは５００倍以上、好ましくは７５０倍以上、好ましくは１０００倍以上に達する場合がある。
【００５７】
本発明によれば、細胞培養におけるＴ細胞媒介性細胞傷害性は５％〜１００％の範囲であり、好ましくは５％超、好ましくは１０％超、好ましくは２０％超、好ましくは３０％超、好ましくは４０％超、好ましくは５０％超、好ましくは７５％超、好ましくは１００％である。
【００５８】
インビボでのＴ細胞媒介性細胞傷害性は、例えば、切除した肝細胞によって放出される肝臓トランスアミナーゼ（好ましくはアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）および／またはアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ））を測定することによって評価することができる。正常なヒトのＡＬＴレベルは、１リットルあたり４０国際単位（Ｕ／Ｌ）未満であり、免疫エフェクター細胞の標的化によって効率的な細胞傷害性があると、５０Ｕ／Ｌ〜５０００Ｕ／Ｌのレベルに達する場合がある。レベルは、好ましくは５０Ｕ／Ｌ超、好ましくは１００Ｕ／Ｌ超、好ましくは２００Ｕ／Ｌ超、好ましくは３００Ｕ／Ｌ超、好ましくは４００Ｕ／Ｌ超、好ましくは５００Ｕ／Ｌ超、好ましくは７５０Ｕ／Ｌ超、好ましくは１０００Ｕ／Ｌ超である。
【００５９】
本発明によれば、肝臓の炎症応答はＨＥ染色によって決定することができる。ＨＥは、ヘマトキシリンおよびエオシンの略で、病理学の標準的な染色技術であり、青色、紫色、赤色、桃色および橙色の色調で細胞構造を可視化することができる。この方法では、浸潤している免疫エフェクターを可視化し、陰性対照との比較で定量することができる。数は、本発明によれば、未処理対照と比較して５倍〜５０００倍の範囲であり、好ましくは５倍超、好ましくは１０倍超、好ましくは２０倍超、好ましくは５０倍超、好ましくは１００倍超、好ましくは２５０倍超、好ましくは５００倍超、好ましくは１０００倍超である。
【００６０】
肝臓から採取した生検のＣＤ３染色および／または本発明の三重特異的結合分子に関する染色により、それぞれ、Ｔ細胞および再指向化Ｔ細胞の特異的な浸潤が明らかになる。この方法では、再指向化ＣＤ３+Ｔ細胞を可視化し、陰性対照との比較で定量することができる。数は、本発明によれば、未処理対照と比較して５倍〜５０００倍の範囲であり、好ましくは５倍超、好ましくは１０倍超、好ましくは２０倍超、好ましくは５０倍超、好ましくは１００倍超、好ましくは２５０倍超、好ましくは５００倍超、好ましくは１０００倍超である。
【００６１】
ウイルス複製は、血清および肝臓組織試料についてのＰＣＲおよび／またはサザンブロッティングで定量することができる。本発明の結合分子をＨＢＶ感染対象に使用すると、血清中のウイルス力価が低下する。本発明によれば、有効量の結合分子を使用した後に、血清中のウイルス力価が、９０％以下に、好ましくは８０％以下に、好ましくは７０％以下に、好ましくは６０％以下に、好ましくは５０％以下に、好ましくは４０％以下に、好ましくは３０％以下に、好ましくは２０％以下に、好ましくは１０％以下に低下するか、検出限界を下回る低下（１ｍｌあたりＨＢＶ  ＤＮＡのコピー数が５０）が達成されることが想定される。例えば、ＨＢＶトランスジェニックマウスでは１ｍｌ当たり最大１０9コピーのレベルに達する血清ＨＢＶ  ＤＮＡを、再指向化されたＴ細胞による処置で１０7コピー／ｍｌに低下させることができるクレーブス（Ｋｒｅｂｓ）ら（Ｂ型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質を結合するキメラ抗原受容体を発現するＴ細胞のマウスにおけるウイルス複製の制御（Ｔ  ｃｅｌｌｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｈａｔ  Ｂｉｎｄｓ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  Ｖｉｒｕｓ  Ｅｎｖｅｌｏｐｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ．）胃腸病学（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）（２０１３））。
【００６２】
それでもなお感染している細胞の数は、肝臓切片をＨＢｅＡｇ、ＨＢｃＡｇまたはＨＢｓＡｇについて染色することで決定することができる。未処理対照と比較した本発明によるＨＢＶ複製細胞の減少は、最小５％〜最大１００％の範囲であり、好ましくは５％超、好ましくは１０％超、好ましくは２０％超、好ましくは３０％超、好ましくは５０％超、好ましくは７０％超、好ましくは９０％超、好ましくは１００％である。
【００６３】
「ウイルス力価（Ｖｉｒａｌ  ｔｉｔｅｒ）」（ウイルス負荷（ｖｉｒａｌ  ｌｏａｄ）、ウイルス負担（ｖｉｒａｌ  ｂｕｒｄｅｎ）としても知られている）は、当技術分野でよく知られている用語であり、所与の生物学的試料に含まれているウイルスの量を示す。ウイルスの量は様々な指標によって示され、そのような指標の例としては、ウイルス核酸の量；ウイルスの有無（沈降勾配遠心分離法によって決定される完全なビリオンなど）およびサブウイルス粒子の有無（ＨＢｓＡｇまたはＢ型肝炎表面抗原粒子など、ＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイによって決定される）が挙げられるが、これらには限定されない。一般に、血液や尿のような液体試料の場合、ウイルスの量はミリリットルなどの単位液体量当たりで決定される。組織試料のような固体試料については、ウイルスの量は、グラムなどの重量単位ごとに決定される。ウイルスの量を測定するための方法は、当技術分野で知られている。現在、日常的なテストは、例えば、Ｂ型肝炎ウイルスに関して（例えばウイルス負荷）、定性的および定量的ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇ測定に利用可能である。
【００６４】
「有効量」は、前述した目的を達成するのに十分な薬剤の量を指す。具体的には、本発明による結合分子の量は、治療されるＢ型肝炎ウイルス感染対象におけるウイルス力価のレベルを低下させるのに有効な量である。有効量は１回以上の投与で投与することができる。有効量は、使用目的（インビトロまたはインビボ）、または処置される対象および疾患状態、例えば対象の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与様式によって変わる場合があり、当業者はこれを容易に決定することができる。
【００６５】
例えば、核酸検査（ＮＡＴ）を使用してウイルス負荷を定量するための多種多様な分子ベースの試験方法がある。増幅用の出発材料によって、これらの分子的な方法を分類することができる。インビトロにおけるＤＮＡ合成反応であるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法は、ＤＮＡ試料、ポリメラーゼ、緩衝液、プライマー、およびヌクレオチドを使用して、血液サンプル中のＨＩＶを増殖させる方法である。その後、化学反応によりウイルスを標識化する。マーカーを測定し、ウイルスの量を算出する。ＰＣＲは、組み込まれたＤＮＡを定量するために使用される方法である。
【００６６】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、ウイルス転写産物を定量するために使用できるＰＣＲの変異形態である。ＲＮＡをこの方法の出発材料として使用し、逆転写酵素（ＲＴ）を用いて二本鎖ＤＮＡに変換する。
【００６７】
慢性Ｂ型肝炎の治療目標は、ＨＢＶ感染の「機能的」治癒であり、現在利用可能な抗ウイルス剤では達成されていない。さらに先に述べたように、機能的治癒の主な障害は、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡの複雑な安定性および機能障害を起こしている抗ＨＢＶ免疫応答である。本発明におけるＨＢＶの機能的治癒は、１ｍｌ当たりのＨＢＶゲノムの数が１０００００未満であること、好ましくは１００００未満、より好ましくは１０００、１００または１０未満であることを意味する。特に、検出限界を下回る完全な撲滅または減少が好ましい。
【００６８】
本発明による結合分子が免疫エフェクター細胞に特化した特異性を与えるとすれば、免疫エフェクター細胞の天然固有の特異性またはそれらへの抗原の提示は重要でなくなる。そのため、候補エフェクター細胞の大きなプールを再標的化できるようになる。さらに、本発明の結合分子は、少なくともモノクローナル抗体に相当する生物学的利用能および半減期を有する。
【００６９】
第１の側面の好ましい態様において、前記少なくとも３つの結合特異性は、（ａ）３つの特異性であるか；または（ｂ）４つの特異性を有し、この第４の特異性は肝細胞に関するものである。
【００７０】
三重特異的結合分子である結合分子が好ましい。言い換えれば、厳密に３つの結合特異性が存在する結合分子である。第４の特異性を有する結合分子という選択は、特定の細胞、特に肝細胞への標的化に有利であり得る。この点では、肝細胞の好ましいマーカーはＮＴＣＰである。ＮＴＣＰは、当技術分野ではＨＢＶ侵入媒介性受容体として知られている。
【００７１】
さらに好ましい態様において前記分子は、（ａ）ポリペプチドの多量体であるか；または（ｂ）ポリペプチドである。この好ましい態様の項目（ｂ）は、単一のポリペプチドからなる結合分子を定義すると理解される。
【００７２】
「ポリペプチド」という用語は、Ｎ末端を１つとＣ末端を１つ有する１本鎖を形成するアミノ酸の縮合重合体である分子を定義する。構成アミノ酸は天然に存在する２０種のタンパク新生アミノ酸を含む。好ましくは、前記ポリペプチドは前記天然に存在するタンパク新生アミノ酸のみからなる。とはいえこの用語は、前記天然に存在するタンパク新生アミノ酸に加えて、α−アミノ酸、β−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、セレノシステイン、セレノメチオニン、ヒドロキシプロリン、ピロールリジンおよびオルニチンから選択される天然に存在しないアミノ酸を２０％、１０％、５％、２％、または１％まで含む分子にも適用される。さらに、１つ以上、例えば２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸がリン酸化されていてもよいと理解される。リン酸化され得るアミノ酸としては特に、セリン、トレオニン、およびチロシンが挙げられる。また、グリコシル化のような当該分野で知られている他の翻訳後修飾を受けていてもよい。グリコシル化としては、通常アスパラギンに起こるＮ−結合型グリコシル化および通常セリンまたはトレオニン残基に起こるＯ−結合型グリコシル化が挙げられる。Ｎ末端および／またはＣ末端は、Ｎ末端用のアセチルおよびＣ末端用のアミンを含む保護基によって保護されていてもよい。前記ポリペプチドに含まれるアミノ酸間の結合型はアミド（ＣＯＮＨ）結合に限定される。「アミド結合」という用語は所定のアミノ酸のα−カルボキシル基を後続のアミノ酸のα−アミノ基に結合するペプチド結合を含む。「アミド結合」は、ポリペプチドの主鎖に含まれないアミド結合であるイソペプチド結合も含む。例えば、α−アミノ基の代わりに、リシンの側鎖アミノ基を含んでも良い。同様に、α−カルボキシル基の代わりに、グルタミン酸またはアスパラギン酸の側鎖カルボキシル基を含んでも良い。１つ以上、例えば２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のイソペプチド結合の発現が考えられる。しかしながら、構成アミノ酸がペプチド結合のみによって互いに結合しているポリペプチドが好ましい。
【００７３】
一般に、ポリペプチドにおけるアミノ酸の数に上限はない。配列表に例示されたポリペプチド配列から分かるように、本発明のポリペプチドは通常数百個のアミノ酸を含み、好ましくは２５０〜１０００、４００〜９００、または７００〜８００個のアミノ酸を含む。一般的に、一方のペプチドと他方のポリペプチドは区別され、ペプチドに含まれるアミノ酸は３０個以下であり、ポリペプチドには３０個を上回るアミノ酸が含まれる。
【００７４】
本発明による「多量体」という用語は、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体および八量体を含む。
【００７５】
最も広義の形態では、多量体を構成する各ポリペプチドに関して少なくとも３つ必要とされる特異性の位置に制限はない。各ポリペプチドが、１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上の結合部位によりもたらされる正確に１つの結合特異性を生じる構成ポリペプチドを使用することが考えられるが、構成ポリペプチドのそれぞれが、２つまたは３つの特異性、２つの特異性を有する構成ポリペプチドであることが特に好ましい。
【００７６】
本発明の結合分子が、好ましくは三重特異的結合分子である本発明の結合分子が、ポリペプチドの多量体、好ましくは二量体または四量体である場合、（ａ）各ポリペプチドが二重特異的ポリペプチドであるか、または（ｂ）各ポリペプチドが、単一特異的、二重特異的および三重特異的ポリペプチドから独立して選択されることが好ましい。
【００７７】
言うまでもなく、この好ましい態様は、本発明の第１の側面の最も広義の条件を満たす構築物のみを包含する。例えば、２つの単一特異性ポリペプチドの二量体は、「三重特異的」という要件を満たさないため、この好ましい態様には包含されない。
【００７８】
上で説明した一方の結合特異性と他方の結合部位との区別に沿って、単一特異性ポリペプチドは１価、２価、３価、４価であってもよいし、４価以上であってもよいことが理解される。同様に、二重特異的ポリペプチドは、２価、３価、４価であってもよいし、４価以上であってもよい。最後に、三重特異的ポリペプチドは、３価、４価、または４価以上であってよい。前述のように、結合部位は、同じポリペプチド上に位置する２つの免疫グロブリンドメインによってもたらされる場合があるが、異なるポリペプチド上に位置する２つの免疫グロブリンドメインによってもたらされる場合もある。したがって、本発明による結合分子がポリペプチドの多量体である場合、結合分子の結合価の数は、合わせると、すべての構成ポリペプチドの結合価の数を超える可能性がある。結合分子の結合価の総数と全ての構成ポリペプチドによりもらされる累積結合価の差は、構成ポリペプチドが、異なるポリペプチド鎖上に位置する２つの免疫グロブリンドメインによって形成される結合部位の数であることによって生じる。
【００７９】
さらに以下で一例として開示する構造（ＩＩＩ）を見ると、この分子の結合部位の総数は５であり、そのうちの４つは、各対が単一のポリペプチド鎖上に位置している免疫グロブリンドメインの対によって形成されており、残る１つは異なるポリペプチド鎖上に位置する一対の免疫グロブリンドメインによって形成されている。構造（ＩＩＩ）中のポリペプチドの総数は２である。
【００８０】
多量体化またはオリゴマー化のメカニズムに関しては、ポリペプチドは共有結合的および／または非共有結合的に連結され得ることに留意されたい。例えば、結合分子が２つのポリペプチドの二量体である場合、前記ポリペプチドは主に、１つ以上の共有結合によって連結されていてもよく、前記共有結合はジスルフィド結合であることが好ましい。あるいは、２つのポリペプチドは主に、非共有的相互作用によって連結されていてもよい。同様に、２つのポリペプチドが共有結合および非共有結合の両方によって連結している場合も考えられる。同様に、より高次の多量体を考えた場合、共有的な相互作用のみが、多量体を一緒に、非共有的相互作用のみを、または共有結合と非共有結合の組合せを保持し得ることが理解される。共有結合および非共有結合の組合せとは、多量体に含まれる所与の二量体相互作用について、共有結合のみ、もしくは非共有結合のみ、または共有結合と非共有結合の両方の組合せが存在するようなものであり得る。
【００８１】
「多量体化」および「オリゴマー化」という用語は（同じ意味で使用される）、二量体化を含む。
【００８２】
以下でさらに詳細に説明するように、特定の例では、また、本発明の特定の好ましい結合分子については、非共有結合よりも共有結合の方が好ましい場合もあり、その逆もあり得る。
【００８３】
本発明が多量体に関する場合、構成ポリペプチドはさらに、二量体化領域または多量体化領域を含む。前記二量体化または多量体化領域によって、共有的におよび／または非共有的に、二量体化または多量体化し得る。
【００８４】
特に好ましい態様では、本発明の２つのポリペプチドを連結する前記二量体化領域は、ＩｇＧ重鎖のヒンジ領域からなるか、または抗体重鎖の二量化を担うシステイン残基を含む。二量体化および多量体化のために利用され得るさらに天然に存在するジスルフィド結合は、重鎖の第１の定常ドメインと軽鎖の定常ドメインのそれぞれのＣ末端との間のものである。
【００８５】
前記二量化領域が、長さが３２アミノ酸の部分配列、いわゆる重鎖のヒンジ領域（ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＦＥＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰ、配列番号４３〜４６を参照）からなり、重鎖の二量化に使用される２つのシステイン残基（上記配列の下線部）を含むことが好ましい。天抗体中のＩｇＧ重鎖定常ドメインとＩｇＧ軽鎖定常ドメインとの間の分子間ジスルフィド結合を仲介するＩｇＧ重鎖ヒンジ領域内の１つのシステイン残基を、異常なジスルフィド架橋を防止するために、セリンに変えておくことが好ましい。
【００８６】
非共有的な二量体化に適した二量体化ドメインは、当該技術分野において知られており、ロイシンジッパーを含むものである（例えば、デ・クルイフ（ｄｅＫｒｕｉｆ）およびログテンバーグ（Ｌｏｇｔｅｎｂｅｒｇ）、半合成抗体ファージディスプレイライブラリーに由来するロイシンジッパー二量体型２価二重特異的ｓｃＦｖ抗体（Ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒ  ｄｉｍｅｒｉｚｅｄ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｄ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｃＦｖ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｅｍｉ−ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙｌｉｂｒａｒｙ．）、生物化学雑誌（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．）１９９６、２７１：７６３０−７６３４）。二量体化の引き金となる別の選択肢としては、免疫グロブリンドメイン同士の間に天然に存在する相互作用がある。これらの相互作用は、例えば、ＩｇＧ分子においては重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインの間に、重鎖の第１の定常ドメインと軽鎖の第１の定常ドメインとの間に、対応する重鎖の第２の定常ドメインと対応する重鎖の第３の定常ドメインとの間に生じる。
【００８７】
さらに好ましい態様では、構成ポリペプチドはさらにスペーサー領域を含み、前記スペーサー領域は好ましくはＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインを含む。構成ポリペプチドがｓｃＦｖ断片を含んでいる場合、前記スペーサー領域は、第１のｓｃＦｖ断片と第２のｓｃＦｖ断片との間に位置し得る。
【００８８】
ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメイン、特にＩｇＧ由来のＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインを含むか、またはそれらからなるスペーサー領域が有利である。利点としては、生産細胞からの単離が効率的になる点が挙げられる。さらに、そのようなスペーサー領域がプロテインＡと結合する能力が、次いで試薬からの精製を行う手段となる。
【００８９】
一方の前記ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインおよび他方の前記二量体化領域のどちらも、ＩｇＧの対応する領域から提供されてもよく、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ２分子、さらに好ましくはヒトＩｇＧ１またはｌｇＧ２（ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２）分子の対応する領域から提供されてもよい。ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインを提供するｈＩｇＧ１分子の好ましいサブ配列は配列番号４３〜４６に見ることができる。配列番号５０および５１は、非共有的二量体化、より具体的には、ロイシンジッパーによる二量体化、の態様に用いられることが好ましい。好ましくは（およびこれは前述の配列に当てはまるが）、ｈＩｇＧ１の一部、具体的には前記ＣＨ２ドメインの複数の位置に、Ｆｃ受容体への結合を低減させるために突然変異を誘発した（さらに下方に記載の配列では太字イタリック体で示した）。より一般的には、Ｆｃ領域、具体的にはＣＨ2ドメインおよび／またはＣＨ3ドメインの１つ以上の位置を変異させてＦｃ受容体への結合の低減を起こしてもよい。そのような手法は当該分野で知られており、例えば、アーマー（Ａｒｍｏｕｒ）ら、Ｆｃγ受容体Ｉ結合活性と単球惹起活性を欠く組換えヒトＩｇＧ分子（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｌａｃｋｉｎｇ  Ｆｃｇａｍｍａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｉ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ）欧州免疫学雑誌  １９９９．２９：２６１３〜２６２４、およびシールズ（Ｓｈｉｅｌｄｓ）ら、ヒトＩｇＧ１とＦｃガンマＲＩ、ＦｃガンマＲＩＩ、ＦｃガンマＲＩＩＩ、およびＦｃＲｎとの結合部位に関する高分解能マッピングならびにＦｃガンマＲとの結合能が高まったＩｇＧ１変異体の設計（Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  ｆｏｒ  Ｆｃ  ｇａｍｍａ  ＲＩ、Ｆｃ  ｇａｍｍａ  ＲＩＩ、Ｆｃ  ｇａｍｍａ  ＲＩＩＩ、ａｎｄ  ＦｃＲｎ  ａｎｄ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ＩｇＧ１  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｆｃ  ｇａｍｍａ  Ｒ．）生物化学雑誌、２００１．２７６：６５９１−６６０４に記載されている。抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）の誘発は本発明において好ましくないため、これらの手法が有利である。
【００９０】
言い換えると、抗体Ｆｃ断片、好ましくは先に定義したように改変したもの、を使用してスペーサー領域および二量体化領域を構築することができる。「Ｆｃ断片」という用語は当業者に知られており、パパインによる切断によって得られた、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むＩｇＧの断片を定義する。
【００９１】
前記第１のｓｃＦｖ断片と前記スペーサー領域との間および／または前記スペーサー領域と前記第２のｓｃＦｖ断片との間に、リンカー配列が存在する場合がある。本明細書の前段で開示したリンカー配列が好ましい。配列表に含まれるその好ましい配列（具体的には配列番号４３〜４６の配列）から分かるように、そのようなリンカー配列はグリシンまたはグリシンおよびセリンからなってよい。
【００９２】
「ＣＨ２ドメイン」および「ＣＨ３ドメイン」という用語は当該分野で確立された意味を有する。それらの用語は、抗体重鎖の第２の定常ドメインおよび第３の定常ドメインを指す。
【００９３】
添付の図１および２に示されるような好ましい分子構造に目を向けると、二量体化および多量体化はそれぞれ好ましくは以下のように起こる。フォーマットＢ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｌ、ＭおよびＯに見られるような同一のポリペプチド鎖のホモ二量体化は、好ましくは、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインの分子間ジスルフィド結合の形成を介して行われる。フォーマットＣに見られる様な、異なるアミノ酸配列のポリペプチド鎖のヘテロ二量化にも同じことが当てはまる。フォーマットＢおよびＣでは、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインが非共有相互作用を介して二量体の安定性に寄与している。フォーマットＧ、Ｈ、ＮおよびＯでは、ＣκドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然に存在する分子間ジスルフィド架橋が、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとの間の非共有的相互作用のように、二量体化に寄与する共有結合として機能している。これら２つの機構のうち、前者は、二量化およびフォーマットＤ、ＬおよびＭにも寄与する。
【００９４】
フォーマットＡ、Ｅ、ＦおよびＫのような異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドのヘテロ二量体化を目的とする場合、両親媒性コイルドコイル二量体化ドメインとしても知られている、前述したロイシンジッパードメインが好ましい。そのような二量体化ドメインの例は、デ・クルイフおよびログテンバーグ、生物化学雑誌、２７１、７６３０−７６３４（１９９６）およびアーンド（Ａｒｎｄｔ）ら、生物化学雑誌、３１２、２２１−２２８（２００１）に記載されている。フォーマットＡおよびＥでは、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインが二量化に寄与する。フォーマットＦでは、ＣκとＣＨ１ドメインとの間の分子間ジスルフィド架橋、ならびに、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとの間の非共有的相互作用が二量化に寄与している。
【００９５】
さらに好ましい態様では、前記ポリペプチドの１つ、１つ以上、または全てが、１つ以上のｓｃＦｖ分子からなるか、またはそれを含む。この態様は、構造（ＶＩＩ）のような（ｓｃＦｖ）2分子ならびに（ｓｃＦｖ）3分子と呼ばれるタンデムｓｃＦｖ分子にも及ぶ。
【００９６】
この好ましい態様によって、本発明の結合分子に含まれるポリペプチドの好ましい構成要素が定義される。ポリペプチドは、それらの好ましい構成分子からなるもの、またはそれらを含むもののいずれかであってよい。例えば、ポリペプチドが単一の結合特異性を生じるために使用される場合、それはｓｃＦｖ分子からなるポリペプチドを使用することによって達成され得る。一方、２つの結合特異性を提供するポリペプチドを使用する場合、これは２つのｓｃＦｖ分子を含むポリペプチドまたはディアボディーによって達成され得る。
【００９７】
「ｓｃＦｖ」という用語は当該分野でよく確立されている。この略称は抗体の「単鎖可変領域」を表し、抗原のエピトープを特異的に認識し結合することができるポリペプチドを定義する。前述のように、３個のＣＤＲが抗体の軽鎖（ＶL）の可変ドメインに含まれ、３個のＣＤＲが抗体の重鎖（ＶH）の可変ドメインに含まれる。ＶＬとＶＨが共有結合していない場合、それらはＦｖ断片を構成する。一方、ｓｃＦｖでは、２つの可変ドメインがペプチドリンカーによって互いに連結されている。得られた融合構築物は単鎖ポリペプチドであり、これにより、ｓｃＦｖ分子の発現が容易になる。
【００９８】
「ＶHドメイン」および「ＶLドメイン」という用語も当該分野でよく確立されている用語である。したがって、「ＶHドメイン」は免疫グロブリンの重鎖（ＶH）の可変領域を指し、「ＶLドメイン」は免疫グロブリンの軽鎖（ＶL）の可変領域を指す。一般に、ＶHおよびＶLドメインはそれぞれ３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００９９】
また、「ディアボディー」、「トリアボディー」および「テトラボディー」という用語は、当技術分野で知られており、２つ、３つまたは４つのＦｖ断片を含む一本鎖構築物に関する。一般に、ディアボディー、トリアボディーおよびテトラボディーは、２つ、３つまたは４つのポリペプチド鎖を含む。これらが互いに連結していて、一本のポリペプチドが得られる場合がある。組換え抗体構築物の概要は、リトル（Ｌｉｔｔｌｅ）ら、今日の免疫学（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ）、２１、３６４−３７０（２０００）に見られる。
【０１００】
ｓｃＦｖの可変領域同士を結合するには、またはｓｃＦｖを二量体／多量体形成領域および／またはスペーサー領域に結合させるには、または以下に定義したようにＦｃに結合させるには、ペプチドリンカーを使用することが好ましい。同様に、上述の概説に例示されているように、ディアボディー、トリアボディーおよびテトラボディーの構築に短いペプチドリンカーを使用してもよい。
【０１０１】
通常、ペプチドリンカーの長さはアミノ酸３〜３０個分で、好ましくは、アミノ酸５〜２５個分または１０〜２０個分の長さである。好ましいリンカーは、それらが連結するドメインまたはポリペプチド（連結によって連続した一本鎖ポリペプチドが産生される）の構造および／または機能と干渉しない、または実質的に干渉しないものである。リンカーの例としては、好ましい本発明のポリペプチドにおいてＣＴＬのＶH／ＶLドメインまたはＮＫ特異的ｓｃＦｖのＶH／ＶLドメインを連結する（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3（配列番号４７）リンカーなどのグリシンに富むリンカー、および好ましい本発明のポリペプチドにおいてＨＢＶ表面抗原に特異的なｓｃＦｖのＶH／ＶLドメインを連結するために使用されるＹｏｌリンカー（配列番号４８；ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＶ、セルリー（Ｓｅｌｌｒｉｅ）ら、生化学および分子生物学ジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｖｏｌ．４０、Ｎｏ．６、２００７年１１月、ｐ．８７５〜８８０に記載）などがある。（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）4リンカー（配列番号４９）もまた、ＨＢＶ表面抗原に特異的なｓｃＦｖのＶH／ＶLドメインまたは本発明の結合分子のその他の構成要素を連結するために使用することができる。
【０１０２】
ポリペプチドの多量体であるそのような結合分子に関連するさらなる好ましい態様では、前記多量体は好ましくは二量体または四量体であり、前記結合分子は好ましくは三重特異的結合分子であり、結合部位のうちの１つ、１つ以上、もしくは全てが、前記２つのポリペプチドによって生じる。
【０１０３】
この好ましい実施形態の構造上の背景については先に説明した。特に、この好ましい態様は、異なるポリペプチド鎖上に位置する結合部位を構成する３つのＣＤＲの２つのセットを提供する２つの免疫グロブリンドメインを提供する。
【０１０４】
特に好ましい態様では、前記結合分子はＦｖ断片、Ｆａｂ断片、ディアボディー、トリアボディー、テトラボディー；または免疫グロブリンＧ分子を含み、これは必要に応じて、改変されたＦｃ部分を含む。
【０１０５】
この特に好ましい態様に関連して使用される用語は、その分野において確立した意味を有する。具体的には、「Ｆｖ断片」という用語は、２つの免疫グロブリンドメインの非共有結合複合体を指し、前記免疫グロブリンドメインは、軽鎖の可変ドメインおよび重鎖の可変ドメインである。
【０１０６】
構造的観点から見ると、Ｆｖ断片はＦａｂ断片に含まれ、ここでＦａｂ断片はさらに、抗体の軽鎖ＣＬの定常ドメインおよび重鎖ＣＨ１の第１の定常ドメインを含む。まとめると、Ｆａｂ断片は、４つの免疫グロブリンドメインを含み、前記４つの免疫グロブリンドメインのうちの２つ、すなわちＶLドメインおよびＶHドメインは、一緒になって結合部位を形成する。Ｆａｂ断片は、抗体をパパインで切断することによって、抗体から得ることができる。
【０１０７】
本発明の結合分子が特定の位置にＦｖ断片を含む場合、この特定の位置には、軽鎖の定常ドメインや重鎖の定常ドメイン１が隣接した場所に存在しないことが理解され、一方で、問題となっている位置にＦａｂ断片が存在し得ることに注意する。同様に、Ｆａｂ断片の要件は、問題となっている位置にＣＨ２およびＣＨ３ドメインが存在する例を除外する。この文脈における「隣接する」とは、天然に存在する抗体に見出されるような近接を指す。
【０１０８】
列挙した免疫グロブリンＧ分子のＦｃ部分の修飾には、Ｆｃ受容体への結合を減少させるか、または無効にする修飾が含まれる（下記参照のこと）。
【０１０９】
本発明の結合分子がＦｃ部分を完全に欠損していることが好ましい。Ｆｃ部分が存在することも好ましく、この場合、前記Ｆｃ部分が前述したように修飾されているか、またはさらに、Ｆｃ部分がＮ−グリコシル化されないように修飾されている。最後に、天然のＦｃ部分も使用することができる。
【０１１０】
Ｆｃ結合の低減および／または補体活性化の低下をもたらす修飾は、ｈＩｇＧ１由来ＦｃのｈＩｇＧ２またはｈＩｇＧ４由来Ｆｃへの置換である。
【０１１１】
「抗体」という用語は本明細書で使用する場合、当該分野で確立された意味を持ち、好ましくはモノクローナル抗体を指す。モノクローナル抗体は例えば、ケーラーおよびミルスタイン、ネイチャー２５６（１９７５）、４９５、およびガルフレ（Ｇａｌｆｒｅ）、酵素学の方法（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ）７３（１９８１）、３によって最初に記載されたマウス骨髄腫細胞と免疫化した哺乳類由来の脾臓細胞の融合を含む技術に、当該分野で開発された変更を加えた技術によって調製することができる。さらに、前述のＨＢＶ表面タンパク質に指向化された抗体またはそれらの断片は、例えば、ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）（１９８８）「抗体：実験の手引き（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」コールド・スプリング・ハーバー研究所出版局、に記載の方法を使用して得ることができる。キメラ抗体の産生は例えば、国際公開第８９／０９６２２号に記載されている。本発明において使用されるさらなる抗体の供給源は、いわゆる異種抗体である。マウスでヒト抗体を生産するなどの異種抗体を産生する一般的な原則は例えば、国際公開第９１／１０７４１号、国際公開第９４／０２６０２号、国際公開第９６／３４０９６号および国際公開第９６／３３７３５号に記載されている。本発明おいて使用される抗体またはそれらの対応する免疫グロブリン鎖は、当該分野で知られている標準的な技術（例えば、アミノ酸の欠失、挿入、置換、付加、および／または組換えおよび／または当該分野で知られているその他の修飾）を単独でまたは組み合わせて使用することによってさらに修飾することができる。そのような修飾をＤＮＡまたは免疫グロブリン鎖のアミノ酸配列の基礎をなすポリペプチド配列に導入する方法は当業者によく知られている。例えば、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  クローニング）：実験の手引き（Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）コールド・スプリング・ハーバー実験所出版局、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９を参照されたい。ポリペプチドの修飾には、グリコシル化のような翻訳後修飾も含まれる。
【０１１２】
ポリペプチドの多量体であり、各ポリペプチドが二重特異的ポリペプチドである本発明の結合分子に関する好ましい態様では、各二重特異的ポリペプチドの第１の特異性は、第１の側面に従って定義される第１の特異性であり、また、各ポリペプチドの第２の特異性は、ＣＤ３またはＣＤ２８のいずれかに対するものである。
【０１１３】
したがって、いずれもがＨＢＶ表面抗原に結合する能力を有し、ＣＴＬ表面マーカーに対する特異性に関しては互いが異なる構成的二重特異的ポリペプチドが好ましいと理解される。
【０１１４】
この点で、特に好ましい結合分子は、ポリペプチドの二量体および四量体である。二重特異的２価ポリペプチドの二量体からなる二量体のグループの中では、非共有的二量体が好ましい。
【０１１５】
特に好ましい二量体は、構造（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）のものであり、特に好ましい四量体は構造（ＩＶ）のものである。
【化１】
0006726676.tif 000002
【化２】
0006726676.tif 000003
【化３】
0006726676.tif 000004
【化４】
0006726676.tif 000005
【０１１６】
「鎖Ａ」および「鎖Ｂ」は、異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを示す。「鎖Ａ」および「鎖Ａ’」は、同一のアミノ酸配列を有する異なるポリペプチドを示す。特異性を各結合部位の近くに示す。当該技術分野において一般的であるように、用語「抗」は「α」と略記される。
【０１１７】
構造（Ｉ）は、２つの二重特異的２価ポリペプチドからなる非共有的二量体である。構造（Ｉ）を図１に「フォーマットＡ」として示した。
【０１１８】
構造（ＩＩ）は２つのポリペプチドの共有二量体であり、ここで、「鎖Ａ」と呼ばれるポリペプチドは二重特異的２価ポリペプチドであり、「鎖Ｂ」と呼ばれるポリペプチドは二重特異的３価ポリペプチドである。構造（ＩＩ）を図１の「フォーマットＣ」に示す。
【０１１９】
我々は、構造（ＩＩＩ）を、２つの免疫グロブリンドメインによってもたらされる４つの結合部位を有し、前記２つの免疫グロブリンドメインは同じポリペプチド鎖上に位置し、２つの免疫グロブリンドメインから形成される５つ目の結合部位が異なるポリペプチド鎖上に位置するものとして記載した。実施例に、本発明の構造（ＩＩＩ）結合分子のデータを含めた。
【０１２０】
構造（ＩＶ）を図１の「フォーマットＤ」に示す。実施例には、本発明の構造（ＩＶ）結合分子のデータを含めた。
【０１２１】
本発明の結合分子のさらに好ましい態様では、前記結合分子は三重特異的結合分子であり、各ポリペプチドが三重特異的結合分子であることが好ましい。
【０１２２】
言い換えれば、各構成ポリペプチドは、既に、本発明の第１の側面による３つの特異性を含むものである。三重特異的ポリペプチドの多量体、好ましくは二量体を使用して、結合特性を微調整または最適化することができる。
【０１２３】
この点に関して特に好ましいのは、同一ポリペプチドの二量体であり、構造（Ｖ）を有するものが最も好ましい。
【化５】
0006726676.tif 000006
構造（Ｖ）を、図１の「フォーマットＢ」に示す。
【０１２４】
本発明はまた、結合部位が、別個のポリペプチド鎖上に位置する免疫グロブリンドメインによって主に形成される結合分子を提供する。一例としては、構造（ＶＩ）を有する結合分子が上げられる。
【化６】
0006726676.tif 000007
構造（ＶＩ）はトリアボディーである。構造（ＶＩ）は、図２の「フォーマットＪ」に示した。
【０１２５】
構造（ＶＩ）の結合分子の機能を提供するためには、異なるトポロジーを使用することもできる。したがって、本発明は、さらに好ましい態様において、構造（ＶＩＩ）を有する結合分子にも及ぶ。
【化７】
0006726676.tif 000008
【０１２６】
構造（ＶＩＩ）は、１つのポリペプチドからなる。これは、先に開示した（ｓｃＦｖ）3構造をもたらす。構造（ＶＩＩ）を図２の「フォーマットＩ」に示した。
【０１２７】
本発明の好ましい実施形態を図１に示す。抗原は説明のために示しているものであり、抗原は本発明による結合分子の一部ではないと理解される。本発明によるさらなる分子構造を図２に示す。
【０１２８】
前述した第１の特異性は、好ましくは６つのＣＤＲのセットによってもたらされ、６つのＣＤＲのセットは、好ましくは配列番号１〜６、７〜１２または１３〜１８のセットである。
【０１２９】
本発明の結合分子に関し、先に定義したＣＤ３に対する第２の特異性は、好ましくは、配列番号１９〜２４の配列を有する６つのＣＤＲのセットによってもたらされる。
【０１３０】
本発明の結合分子に関し、先に定義したＣＤ２８に対する第３の特異性は、好ましくは、配列番号２５〜３０の配列を有する６つのＣＤＲのセットによってもたらされる。
【０１３１】
第２および第３の特異性がＣＤ１６、ＣＤ５６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、４−１ＢＢおよびＮＫＧ２Ｄに対する特異性から選択される場合、第２の特異性がＣＤ１６に対するもので、第３の特異性がＣＤ５６に対するものであることが好ましい。これに対応する６つのＣＤＲの好ましいセットは、それぞれ、配列番号３１〜３６および３７〜４２である。
【０１３２】
配列表に使用されているＣ８、５Ｆ９、５Ａ１９、ＯＫＴ３、９．３、Ａ９およびＮＣＡＭ２９．２は各ＣＤＲの由来となった抗体を指し、それぞれ、好ましい抗ＨＢｓ抗体、第２の異なる抗ＨＢｓ抗体、抗ＨＢＶ大型表面抗原抗体、抗ヒトＣＤ３抗体、抗ヒトＣＤ２８抗体、抗ヒトＣＤ１６抗体、および抗ヒトＣＤ５６抗体を指す。「ＨＢｓ」はＨＢＶ小型表面抗原を指す。
【０１３３】
二重特異的２価ポリペプチドを使用する場合、前記ポリペプチドは、配列番号４３〜４６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、または配列番号４３〜４６のうちのいずれか１つと少なくとも８０％の相同性を示すアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなることが特に好ましい。ただし、少なくとも８０％の同一性を示す前記アミノ酸配列のＣＤＲが、配列番号４３〜４６のうちのいずれか１つに含まれるＣＤＲと同一であることが条件である。配列番号４３において、最後の３つの残基「ＧＮＳ」は欠失させることができる。
【０１３４】
配列同一性の好ましいレベルには、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％が含まれる。配列同一性を決定する手段および方法は当該分野でよく知られている。一対の配列の同一性を決定する好ましいアルゴリズムには例えば、マックギニスおよびメイデン（ＭｃＧｉｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｍａｄｄｅｎ）、核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）３２、Ｗ２０〜Ｗ２５（２００４））に記載されている、基礎的な局所配列相同性検索ツール（Ｔｈｅ  ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ））がある。
【０１３５】
所与の配列（本件では配列番号４３〜４６の配列）における前記ＣＤＲの位置は、当該分野で確立された方法によって決定することができる。当該分野で確立された公知の方法としては、コチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）、カバット（Ｋａｂａｔ）およびルフラン（ＬｅＦｒａｎｃ）／ＩＭＧＴのそれぞれのシステムが挙げられる。相反する表示がない場合、前段で定義した特に好ましい態様によるＣＤＲは前段で定義したものであると理解される。すなわち、配列番号１〜６、７〜１２または１３〜１８の配列を有する第１のセット、および配列番号１９〜２４、２５〜３０、３１〜３６または３７〜４２の配列を有する第２のセットである。本明細書に添付の配列表に含まれる配列から分かるように、これら特定のＣＤＲ配列（さらに下方に転載した配列の下線部）は実際に配列番号４３〜４６の配列に含まれている。
【０１３６】
配列番号１〜６の配列はＣＤＲを定義し、配列番号３７〜４０の配列はＨＢＶの小型表面抗原に含まれる特定のエピトープに結合可能な二重特異的ポリペプチドを定義する。このエピトープは、感染細胞およびビリオンそれぞれの表面に露出したａ−決定因子に位置する。「ａ−決定因子」という用語は、防御的な液性免疫応答を誘発する主要なエピトープが位置している、ＨＢＶの小型表面抗原中の領域を示すのに使用される。これらのＣＤＲならびに配列番号４３〜４６のポリペプチドは、すべてのＨＢＶ血清型に使用可能であるという利点を有する。
【０１３７】
第２の側面において本発明は、結合分子を構成するポリペプチドをコードする核酸のセットを提供し、この結合分子はポリペプチドの多量体である。前記第２の側面は、あるいは、「単一の」ポリペプチドである結合分子をコードする核酸に関する。ポリペプチドの好ましい態様が、対応する前記核酸の好ましい態様をもたらす。
【０１３８】
「核酸」という用語は当該分野で確立された意味を有するが、特に限定されない。好ましくは、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのようなＤＮＡならびにｍＲＮＡのようなＲＮＡである。好ましくはないが、ヌクレオチド誘導体の使用も想定され、ヌクレオチド誘導体としては、２’メチルヌクレオチドのような２’誘導化ヌクレオチド、ペプチド核酸中に生じるペプチドヌクレオチドなどが挙げられる。
【０１３９】
さらなる側面において、本発明は、第１の側面の１つ以上の結合分子および／または第２の側面の１つ以上の核酸を含むかまたはそれらからなる医薬組成物を提供する。
【０１４０】
医薬組成物は、薬学上許容可能な担体、賦形剤および／または希釈剤をさらに含んでよい。好適な医薬担体、賦形剤および／または希釈剤は当該分野でよく知られており、リン酸緩衝生理食塩水、水、水中油型乳剤などの乳剤、様々な種類の湿潤剤、滅菌溶液などを含む。このような担体を含む組成物は、よく知られている標準的な方法によって製剤化することができる。これらの医薬組成物は好適な投与量を対象に投与することができる。好適な組成物の投与は例えば、静脈内、皮下または経口投与などの異なる方法で実施可能であり、これらの３つの選択肢が好ましく、さらに腹腔内、筋内、局所、皮内、鼻腔内または気管支内投与により実施可能である。経口投与用の製剤には錠剤およびシロップが含まれる。特に好ましくは、前記投与は注入により行われる。組成物は例えば、微粒子銃送達によって外部のまたは内部の標的部位に直接投与してもよい。投与計画は主治医および臨床的要因により決定される。医療業界ではよく知られているように、任意の患者への用量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与される具体的な化合物、性別、投与の時間および経路、総体的な健康状態、および他の併用される薬剤などの多くの要因によって決まる。タンパク質性の医薬活性物質が体重１キログラム当たりの投与量に１ｎｇ〜１０ｍｇ含まれていてもよい。しかし、特に前述の要因を考慮して、この例示した範囲を下回るまたは上回る投与量も予想される。その投与計画が持続点滴である場合にも、体重１キログラム当たり毎分１μｇ〜１０ｍｇの範囲内でなければならない。
【０１４１】
静脈内投与が特に好ましい。
【０１４２】
さらなる側面において本発明は、ＨＢＶ感染および／または前記ＨＢＶ感染に起因する症状を治療または予防する方法において使用される、１つ以上の本発明の結合分子、核酸、および／または医薬組成物を提供し、ここで前記ＨＢＶ感染に起因する症状は肝硬変、肝細胞癌、および肝臓癌から選択され、前記肝臓癌は１つ以上のＨＢＶ表面抗原の発現によって特徴付けられる。前記肝細胞癌は、好ましくは、これまでに定義したＨＢＶ表面抗原の１つ以上を発現していることを特徴とする。
【０１４３】
さらなる側面において本発明は、ＨＢＶ感染および／または前記ＨＢＶ感染に起因する症状を治療または予防する方法を提供し、前記ＨＢＶ感染に起因する症状は肝硬変および肝細胞癌から選択され、前記方法は、治療上有効量または予防量それぞれの、１つ以上の本発明の結合分子、核酸、および／または医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む。前記肝細胞癌は、好ましくは、これまでに定義したＨＢＶ表面抗原の１つ以上を発現していることを特徴とする。
【０１４４】
一態様では、治療方法および前記治療方法のそれぞれで使用するための前記医薬組成物、前記結合分子および／または核酸は、先に挙げた結合分子および／または核酸が、この方法に含まれるかまたは使用される薬学的に活性な唯一の成分である。
【０１４５】
とはいえ、併用療法において１つ以上のさらなる医薬的に活性な薬剤を組み入れることも慎重に想定される。そのようなさらなる医薬的に活性な薬剤は、インターフェロンまたは他の免疫調節剤（例えば、インターフェロンアルファ２ａまたは２ｂ、インターフェロンラムダなど）、ヌクレオシド／ヌクレオチド類似体のような直接作用する抗ウイルス剤（例えば、ラミブジン（エピビル−ＨＢＶ、ゼフィックスまたはヘプトジン）、アデホビルジピボキシル（ヘプセラ、プレベオン（Ｐｒｅｖｅｏｎ））、エンティカビル（バラクルード、Ｅｎｔａｌｉｖ）、テルビブジン（タイゼカ（Ｔｙｚｅｋａ）、セビボ）、テノホビル（ビリアード））、侵入阻害剤（例えば、ミルクルデックス（Ｍｙｒｃｌｕｄｅｘ）−Ｂなど）、他の抗ウイルス剤、またはインターロイキン−２のようなサイトカインから選択することができる。
【０１４６】
したがって、前記医薬組成物においては、また、治療方法および前記治療方法で使用するための前記結合分子では、先に挙げた結合分子、さらには前段で定義した１つ以上の特定の薬学的に活性な成分が、含まれるかまたは使用される薬学的に活性な唯一の成分であることが想定される。
【０１４７】
あるいは、さらなる薬学的に活性な成分を含めてもよい。結合分子（例えば、乳タンパク質、栄養素または塩溶液などのタンパク質）の安定性を高める追加の成分または薬学的に活性な成分を添加して、生物学的利用能および／または半減期を改善することができる。
【０１４８】
さらなる側面において、本発明は、ＨＢＶ感染細胞を死滅させるインビトロ方法を提供し、前記方法は前記ＨＢＶ感染細胞を（ｉ）免疫エフェクター細胞および（ｉｉ）１つ以上の本発明の結合分子とともに培養することを含む。
【０１４９】
インビトロ方法の好ましい態様において、前記免疫エフェクター細胞は、（ｉ）末梢血単核細胞に含まれる、または（ｉｉ）ＮＫ細胞および／またはＣＴＬであるか、またはそれらを含む。
【０１５０】
さらなる側面において本発明は、インビトロまたはエキソビボ免疫エフェクター細胞を提供し、この免疫エフェクター細胞は、（ａ）前記免疫エフェクター細胞の表面抗原に結合する第１の側面の結合分子を有する、および／または（ｂ）第２の側面の１つ以上の核酸で形質転換、形質移入、もしくは形質導入されている、免疫エフェクター細胞である。好ましい免疫エフェクター細胞および免疫エフェクター細胞によって発現される好ましい表面抗原は前段で定義した通りである。そのような免疫エフェクター細胞は、ＨＢＶ感染、肝硬変または肝細胞癌を患う患者への投与に有用である。したがって、それ自体の表面抗原および／または本発明の結合分子に結合している免疫エフェクター細胞を含むか、またはそれからなる医薬組成物も提供される。ＨＢＶ感染、肝硬変または肝細胞癌の治療または予防に使用される、それ自体の表面抗原および／または本発明の結合分子に結合している免疫エフェクター細胞も提供する。
【０１５１】
本発明は、あまり好ましくない特定の態様にも及ぶものである。したがって、但し書きによってより広義の態様から除外することができる。
【０１５２】
本発明によればあまり好ましくはないものとして、第１および第２のポリペプチドからなる三重特異的および４価の結合分子が挙げられる。ここで、前記第１および第２のポリペプチドは、それぞれ、二重特異的２価であり、前記ポリペプチドの第１の特異性は、ＨＢＶ小型表面抗原；ＨＢＶ中型表面抗原；およびＨＢＶ大型表面抗原に対するものであり、第２の特異性はそれぞれＣＤ３およびＣＤ２８に対するものである。
【０１５３】
この点で、さらに好ましくはないものとして、第１および第２のポリペプチドからなる三重特異的および４価の結合分子が挙げられる。前記第１および第２のポリペプチドは、それぞれ、二重特異的２価であり、前記第１および第２のポリペプチドが非共有的に互いに結合しており、ここで、第１の特異性は、ＨＢＶ小型表面抗原；ＨＢＶ中型表面抗原；およびＨＢＶ大型表面抗原に対するものであり、第２の特異性はそれぞれＣＤ３およびＣＤ２８に対するものである。
【０１５４】
特に好ましくはないものとして、第１および第２のポリペプチドからなる三重特異的および４価の結合分子が挙げられる。前記第１および第２のポリペプチドは、それぞれ、二重特異的２価であり、ここで、前記第１および第２のポリペプチドとの間には少なくとも１つの共有結合が、好ましくは、前記第１のポリペプチドのＣｙｓ残基と第２のポリペプチドのＣｙｓ残基との間にジスルフィド架橋があり、ここで、第１の特異性は、ＨＢＶ小型表面抗原；ＨＢＶ中型表面抗原；およびＨＢＶ大型表面抗原に対するものであり、第２の特異性はそれぞれＣＤ３およびＣＤ２８に対するものである。
【０１５５】
特に好ましくはないものとして、第１および第２のポリペプチドからなる三重特異的および４価の結合分子が挙げられる。前記第１および第２のポリペプチドは、それぞれ、二重特異的２価であり、前記第１および第２との間には２つのジスルフィド結合があり、ここで、第１の特異性は、ＨＢＶ小型表面抗原；ＨＢＶ中型表面抗原；およびＨＢＶ大型表面抗原に対するものであり、第２の特異性はそれぞれＣＤ３およびＣＤ２８に対するものである。
【０１５６】
上記で定義したあまり好ましくない実施形態のそれぞれに関して、第１および第２のポリペプチド上の結合部位がｓｃＦｖ断片によってもたらされることは特に好ましくない。さらに、前述したあまり好ましくない態様のうちのいずれかに関しては、結合部位を提供する２つのｓｃＦｖ断片の間にＣＨ２およびＣＨ３ドメインが存在する前記第１および第２ポリペプチドの両方が存在する態様が特に好ましくない。
【０１５７】
従って、第１および第２のポリペプチドからなる三重特異的および４価の結合分子が特に好ましくない。ここで、前記第１および第２のポリペプチドは、それぞれ、二重特異的２価であり、ここで、前記第１および第２のポリペプチドの間には２つのジスルフィド結合があり、一方のポリペプチドの第１の特異性は、ＨＢＶ小型表面抗原；ＨＢＶ中型表面抗原；およびＨＢＶ大型表面抗原に対するものであり、第２の特異性はそれぞれＣＤ３およびＣＤ２８に対するものであり、ここで、第１および第２の両方のポリペプチドにおいて、結合部位をもたらしている２つのｓｃＦｖ断片の間にＣＨ２およびＣＨ３ドメインが存在する。
【０１５８】
従って、一例を挙げると、本発明はまた、少なくとも３つの結合特異性を含む結合分子に関し、ここで、（ａ）第１の特異性は、ＨＢＶ小型表面抗原、ＨＢＶ中型表面抗原およびＨＢＶ大型表面抗原から選択されるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）表面抗原に対するものであり；（ｂ）（ｉ）第２および第３の特異性はそれぞれＣＤ３およびＣＤ２８に対するものであるか、または（ｉｉ）第２および第３の特異性は、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、４−１ＢＢおよびＮＫＧ２Ｄに対する特異性から選択され、ならびに、（ｃ）各結合特異性は、（ｉ）それぞれが免疫グロブリンドメインに含まれている、３つのＣＤＲの第１のセットと３つのＣＤＲの第２のセットからなる６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）のセット、または、（ｉｉ）免疫グロブリンドメインに含まれる３つのＣＤＲのセット、によってそれぞれ独立して提供される１つ以上の結合部位によって提供され；ただし、第１および第２のポリペプチドからなる三重特異的結合分子および４価の結合分子であって、前記第１および第２のポリペプチドがそれぞれ、二重特異的２価であり、ここで、前記第１および第２のポリペプチドの間には２つのジスルフィド結合があり、一方のポリペプチドの第１の特異性は、ＨＢＶ小型表面抗原；ＨＢＶ中型表面抗原；およびＨＢＶ大型表面抗原に対するものであり、第２の特異性はそれぞれＣＤ３およびＣＤ２８に対するものであり、ここで、第１および第２の両方のポリペプチドにおいて、結合部位をもたらしている２つのｓｃＦｖ断片の間にＣＨ２およびＣＨ３ドメインが存在する結合分子は除外される。
【０１５９】
本明細書において、特に特許請求の範囲において特徴付けられる態様に関して、従属請求項に記載された各態様は、従属請求項が依存する各請求項の（独立請求項または従属請求項の）各態様と組み合わされる。例えば、３つの選択肢Ａ、ＢおよびＣを挙げている独立請求項１、３つの選択肢Ｄ、ＥおよびＦを挙げている従属請求項２、および３つの選択肢Ｇ、ＨおよびＩを挙げ、請求項１および２に従属している請求項３の場合、そうでないことが明記されていない限り、本明細書が、組み合わせＡ、Ｄ、Ｇ；Ａ、Ｄ、Ｈ；Ａ、Ｄ、Ｉ；Ａ、Ｅ、Ｇ；Ａ、Ｅ、Ｈ；Ａ、Ｅ、Ｉ；Ａ、Ｆ、Ｇ；Ａ、Ｆ、Ｈ；Ａ、Ｆ、Ｉ；Ｂ、Ｄ、Ｇ；Ｂ、Ｄ、Ｈ；Ｂ、Ｄ、Ｉ；Ｂ、Ｅ、Ｇ；Ｂ、Ｅ、Ｈ；Ｂ、Ｅ、Ｉ；Ｂ、Ｆ、Ｇ；Ｂ、Ｆ、Ｈ；Ｂ、Ｆ、Ｉ；Ｃ、Ｄ、Ｇ；Ｃ、Ｄ、Ｈ；Ｃ、Ｄ、Ｉ；Ｃ、Ｅ、Ｇ；Ｃ、Ｅ、Ｈ；Ｃ、Ｅ、Ｉ；Ｃ、Ｆ、Ｇ；Ｃ、Ｆ、Ｈ；Ｃ、Ｆ、Ｉ、に対応する態様をも明白に開示していることを理解されたい。
【０１６０】
同様に、独立請求項および／または従属請求項に選択肢が挙げられていない場合にも、従属請求項が複数の先行する請求項を参照する場合には、それによって包含される対象の任意の組合せが明示的に開示されると考えられる。例えば、独立請求項１、請求項１を参照している従属請求項２、および請求項２および請求項１の両方を参照している従属請求項３の場合、請求項３、２および１の対象の組み合わせと同様に、請求項３および請求項１の対象の組合せも明らかにかつ明確に開示されているとみなされる。請求項１〜３のいずれか１項に従属する従属請求項４が存在する場合、請求項４と請求項１の対象の組み合わせ、請求項４、２、１の対象の組み合わせ、請求項４、３、１の対象の組み合わせ、並びに請求項４、３、２、１の対象の組み合わせが明らかにかつ明確に開示されるものと見なされる。
【０１６１】
本明細書では配列も開示する。
SEQ ID NO 1
C8 HC CDR1
Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Ala
SEQ ID NO 2
C8 HC CDR2
Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr
SEQ ID NO 3
C8 HC CDR3
Ala Lys Pro Pro Gly Arg Gln Glu Tyr Tyr Gly Ser Ser Ile Tyr Tyr Phe Pro Leu Gly Asn
SEQ ID NO 4
C8 LC CDR1
Asn Ile Gly Ser Lys Ser
SEQ ID NO 5
C8 LC CDR2
Asp Asp Ser
SEQ ID NO 6
C8 LC CDR3
Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Leu Val Val
SEQ ID NO 7
5F9 HC CDR1
Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr Ala
SEQ ID NO 8
5F9 HC CDR2
Ile Asn Ser Asp Gly Arg Ser Thr
SEQ ID NO 9
5F9 HC CDR3
Ala Arg Thr Phe Tyr Ala Asp Tyr
SEQ ID NO 10
5F9 LC CDR1
Gln Asn Val Asp Thr Thr
SEQ ID NO 11
5F9 LC CDR2
Trp Ala Ser
SEQ ID NO 12
5F9 LC CDR3
Gln Gln Tyr Ser Ile Phe Pro Tyr Thr
SEQ ID NO 13
5A19 HC CDR1
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
SEQ ID NO 14
5A19 HC CDR2
Val Ser Ser Asp Gly Ser Tyr Ala
SEQ ID NO 15
5A19 HC CDR3
Ala Ser Phe Asn Trp Asp Val Ala Tyr
SEQ ID NO 16
5A19 LC CDR1
Gln Ser Leu Leu Asn Thr Arg Thr Arg Lys Ser Tyr
SEQ ID NO 17
5A19 LC CDR2
Trp Ala Ser
SEQ ID NO 18
5A19 LC CDR3
Lys Gln Ser Tyr Ser Leu Tyr Thr
SEQ ID NO 19
OKT3 HC CDR1
Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr
SEQ ID NO 20
OKT3 HC CDR2
Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr
SEQ ID NO 21
OKT3 HC CDR3
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr
SEQ ID NO 22
OKT3 LC CDR1
Ser Ser Val Ser Tyr
SEQ ID NO 23
OKT3 LC CDR2
Asp Thr Ser
SEQ ID NO 24
OKT3 LC CDR3
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
SEQ ID NO 25
9.3 HC CDR1
Gly Phe Ser Leu Ser Asp Tyr Gly
SEQ ID NO 26
9.3 HC CDR2
Ile Trp Ala Gly Gly Gly Thr
SEQ ID NO 27
9.3 HC CDR3
Ala Arg Asp Lys Gly Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr
SEQ ID NO 28
9.3 LC CDR1
Glu Ser Val Glu Tyr Tyr Val Thr Ser Leu
SEQ ID NO 29
9.3 LC CDR2
Ala Ala Ser
SEQ ID NO 30
9.3 LC CDR3
Gln Gln Ser Arg Lys Val Pro Tyr Thr
SEQ ID NO 31
A9 HC CDR1
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp
SEQ ID NO 32
A9 HC CDR2
Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr
SEQ ID NO 33
A9 HC CDR3
Ala Arg Ser Ala Ser Trp Tyr Phe Asp Val
SEQ ID NO 34
A9 LC CDR1
Thr Gly Thr Val Thr Thr Ser Asn Tyr
SEQ ID NO 35
A9 LC CDR2
His Thr Asn
SEQ ID NO 36
A9 LC CDR3
Ala Leu Trp Tyr Asn Asn His Trp Val
SEQ ID NO 37
NCAM29.2 HC CDR1
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly
SEQ ID NO 38
NCAM29.2 HC CDR2
Ile Ser Ser Gly Ser Tyr Ala Ile
SEQ ID NO 39
NCAM29.2 HC CDR3
Val Arg Gly Arg Arg Leu Gly Glu Gly Tyr Ala Met Asp Tyr
SEQ ID NO 40
NCAM29.2 LC CDR1
Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr
SEQ ID NO 41
NCAM29.2 LC CDR2
Trp Ala Ser
SEQ ID NO 42
NCAM29.2 LC CDR3
Gln Gln Tyr Ser Ser Trp Thr
SEQ ID NO 43
C8-hIgG1Fcmut-OKT3
MDFEVQIFSFLLISASVIMSRMAEVQLVESGGGLLQPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTALYYCAKPPGRQEYYGSSIYYFPLGNWGQGTLVTVSSASTKGPKLEEGEFSEARVQSALTQPASVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDLVVFGGGTKLTVLGNSGGGGSGGGGSGGGGSASEPKSSDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKGLASSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKDPGWSHPQFEKSRGGGGQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGNSGGGGSGGGGSGGGGSASQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINGNS
SEQ ID NO 44
C8- hIgG1Fcmut-9.3
MDFEVQIFSFLLISASVIMSRMAEVQLVESGGGLLQPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTALYYCAKPPGRQEYYGSSIYYFPLGNWGQGTLVTVSSASTKGPKLEEGEFSEARVQSALTQPASVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDLVVFGGGTKLTVLGNSGGGGSGGGGSGGGGSASEPKSSDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKGLASSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKDPGWSHPQFEKSSGGGGQVQLQESGPGLVTPSQSLSITCTVSGFSLSDYGVHWVRQSPGQGLEWLGVIWAGGGTNYNSALMSRKSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTAVYYCARDKGYSYYYSMDYWGQGTTVTVSSRGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYYVTSLMQWYQQKPGQPPKLLIFAASNVESGVPARFSGSGSGTNFSLNIHPVDEDDVAMYFCQQSRKVPYTFGGGTKLEIKR
SEQ ID NO 45
C8- hIgG1Fcmut-A9
MDFEVQIFSFLLISASVIMSRMAEVQLVESGGGLLQPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTALYYCAKPPGRQEYYGSSIYYFPLGNWGQGTLVTVSSASTKGPKLEEGEFSEARVQSALTQPASVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDLVVFGGGTKLTVLGNSGGGGSGGGGSGGGGSASEPKSSDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKGLASSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKDPGWSHPQFEKSRGGGGQVQLQQSGAELVRPGTSVKISCKASGYTFTNYWLGWVKQRPGHGLEWIGDIYPGGGYTNYNEKFKGKATVTADTSSRTAYVQVRSLTSEDSAVYFCARSASWYFDVWGAGTTVTVSSGNSGGGGSGGGGSGGGGSASQAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSNTGTVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGHTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYNNHWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO 46
C8- hIgG1Fcmut-NCAM29.2
MDFEVQIFSFLLISASVIMSRMAEVQLVESGGGLLQPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTALYYCAKPPGRQEYYGSSIYYFPLGNWGQGTLVTVSSASTKGPKLEEGEFSEARVQSALTQPASVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDLVVFGGGTKLTVLGNSGGGGSGGGGSGGGGSASEPKSSDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKGLASSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKDPGWSHPQFEKSSGGGDVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSYAIYYADTVKGRFTISRDNPENTLFLQMTSLRSEDSAMYYCVRGRRLGEGYAMDYWGQGTSVTVSSGNSGGGGSGGGGSGGGGSASDIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRKSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYSSWTFGGGTKLEIKR
SEQ ID NO 47
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
SEQ ID NO 48
Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg Val
SEQ ID NO 49
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
SEQ ID NO 50
C8-hIgG1Fcmut-OKT3 with Jun leucine zipper dimerization domain (bold face italics underlined)
MDFEVQIFSFLLISASVIMSRMAEVQLVESGGGLLQPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTALYYCAKPPGRQEYYGSSIYYFPLGNWGQGTLVTVSSASTKGPKLEEGEFSEARVQSALTQPASVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDLVVFGGGTKLTVLGNSGGGGSGGGGSGGGGSASRIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMNYSSEPKSSDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKGLASSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKDPGWSHPQFEKSRGGGGQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGNSGGGGSGGGGSGGGGSASQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINGNS
SEQ ID NO 51
C8- hIgG1Fcmut-9.3 with Fos leucine zipper dimerization domain (bold face italics underlined)
MDFEVQIFSFLLISASVIMSRMAEVQLVESGGGLLQPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTALYYCAKPPGRQEYYGSSIYYFPLGNWGQGTLVTVSSASTKGPKLEEGEFSEARVQSALTQPASVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDLVVFGGGTKLTVLGNSGGGGSGGGGSGGGGSASLTDTLQAETDQLEDKKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAYSSEPKSSDKTHTCPPCPAPPAAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKGLASSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKDPGWSHPQFEKSSGGGGQVQLQESGPGLVTPSQSLSITCTVSGFSLSDYGVHWVRQSPGQGLEWLGVIWAGGGTNYNSALMSRKSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTAVYYCARDKGYSYYYSMDYWGQGTTVTVSSRGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYYVTSLMQWYQQKPGQPPKLLIFAASNVESGVPARFSGSGSGTNFSLNIHPVDEDDVAMYFCQQSRKVPYTFGGGTKLEIKR
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１】本発明の好ましい三重特異的結合分子を示す。
【図２】本発明の好ましい三重特異的結合分子を示す。
【図３】Ｔ細胞は、５価および８価の三重特異的抗体によって活性化される。Ｔ細胞を、二重および三重特異的抗体の存在下、固定化したＨＢｓＡｇ上で４８時間培養し、それによるＩＦＮγ分泌を測定した。ＣＤ３活性化二重特異的抗体（ｂｓＡｂαＣＤ３）を単独で処理するのと比較して、ＣＤ３活性化二重特異的抗体（ｂｓＡｂαＣＤ３）とＣＤ２８活性化二重特異的抗体（ｂｓＡｂαＣＤ２８）を併用すると、抗原存在下でのＩＦＮγの分泌が増加した。五価（ＴｒｉＭＡＢ）および八価（ＯＫＴＡ）三重特異的抗体構築物を処理すると、インターフェロンが有意に多く分泌され、中でも、ＴｒｉＭＡｂが最も効果の高い構築物であった。ＣＤ２８活性化抗体の単独処置および未処理の対照ＰＢＭＣでは、ＩＦＮγレベルの上昇が見られなかった。
【図４】図４Ａ：Ｔ細胞は、５価および８価の三重特異的抗体によって活性化され、細胞毒性をもつようになる。（Ａ）二重特異的抗体および三重特異的抗体の存在下、固定化したＨＢｓＡｇ上で４８時間培養したＴ細胞の細胞毒性活性を示すＬＡＭＰ−１転座を決定した。ＣＤ３活性化二重特異的抗体（ｂｓＡｂαＣＤ３）を単独で処理するのと比較して、ＣＤ３活性化二重特異的抗体（ｂｓＡｂαＣＤ３）とＣＤ２８活性化二重特異的抗体（ｂｓＡｂαＣＤ２８）を併用すると、抗原の存在下での脱顆粒マーカーＬＡＭＰ−１の転座が高まった。五価（ＴｒｉＭＡＢ）および八価（ＯＫＴＡ）三重特異的抗体構築物を処理すると、細胞毒性活性レベルが有意に高まり、中でも、ＴｒｉＭＡｂが最も効果の高い構築物で、ＣＤ８＋Ｔ細胞の８３％が脱顆粒した。ＣＤ２８活性化抗体の単独処置および未処理の対照では、ＬＡＭＰ−１の転座は見られなかった。  図４Ｂ：Ｔ細胞は、５価および８価の三重特異的抗体によって活性化され、細胞毒性をもつようになる。（Ｂ）細胞毒性活性を示すグランザイムＢの発現。ＴｒｉＭＡＢおよびＯＫＴＡ三重特異的抗体構築物によって、有意に高いレベルの細胞毒性活性が誘導され、中でも、ＴｒｉＭＡｂが最も効果の高い構築物で、ＣＤ８+Ｔ細胞の９５％においてグランザイムＢの発現を誘導した。
【図５】健常ドナー由来のナイーブＴ細胞は、ＴｒｉＭＡｂによって活性化される。ＴｒｉＭＡｂ存在下でＨＢｓＡｇ陽性標的細胞（Ｈｕｈ７Ｓ）またはＨＢｓＡｇ陰性標的細胞（Ｈｕｈ７）と共培養した場合の、健常ドナー由来ＰＢＭＣにおけるＩＦＮγの分泌。ＴｒｉＭＡｂを添加し、標的細胞がＨＢｓＡｇを発現した場合にのみ、ＩＦＮγの分泌によって決定されるＴ細胞の活性化が検出された。
【図６】健常ドナー由来のナイーブＴ細胞を活性化して、ＴｒｉＭＡｂによってＨＢｓＡｇ陽性標的細胞を死滅させる。健常ドナー由来のＰＢＭＣを、ＨＢｓＡｇ陽性標的細胞（Ｈｕｈ７Ｓ）およびＨＢｓＡｇ陰性標的細胞（Ｈｕｈ７）と共培養した。ＴｒｉＭＡｂ細胞の添加後、細胞生存率を経時的に、エクセリジェンス（ＸＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ）アッセイによって３回測定した。ＰＢＭＣ対照では、細胞をＨｕｈ７Ｓ細胞と共培養したが、抗体を添加しなかった。ＴｒｉＭＡｂを添加し、標的細胞がＨＢｓＡｇを発現した場合にのみ、抗体を添加した２４時間後に、特異的な死滅が観察された。
【図７】図７Ａ：中和抗ＨＢｓ抗体は、ＴｒｉＭＡｂによるＴ細胞の活性化と競合する。中和αＨＢｓ抗体を含むヒト血清存在下における、ＴｒｉＭＡｂ処理ＰＭＢＣとＨＢｓＡｇ陽性Ｈｕｈ７（Ｈｕｈ７Ｓ）細胞の共培養。０％：Ａｂ含有血清を含まない共培養；５０％：ＦＣＳの半分をＡｂ含有ヒト血清に置き換え、αＨＢｓ濃度が１１７．５ＩＵ／Ｌとなった共培養；１００％：ＦＣＳをＡｂ含有血清に置き換え、αＨＢｓ濃度を２３５ＩＵ／Ｌとした共培養。中和抗体を添加しない場合、Ｔ細胞は活性化されてＩＦＮγや他のサイトカインを分泌した。  図７Ｂ：中和抗ＨＢｓ抗体は、ＴｒｉＭＡｂによるＴ細胞の活性化と競合する。中和αＨＢｓ抗体を含むヒト血清存在下における、ＴｒｉＭＡｂ処理ＰＭＢＣとＨＢｓＡｇ陽性Ｈｕｈ７（Ｈｕｈ７Ｓ）細胞の共培養。０％：Ａｂ含有血清を含まない共培養；５０％：ＦＣＳの半分をＡｂ含有ヒト血清に置き換え、αＨＢｓ濃度が１１７．５ＩＵ／Ｌとなった共培養；１００％：ＦＣＳをＡｂ含有血清に置き換え、αＨＢｓ濃度を２３５ＩＵ／Ｌとした共培養。Ｔ細胞が活性化され、典型的な時間経過で標的細胞を死滅させ、７２時間以内に細胞生存率が５０％に低下した。中和抗体はＴｒｉＭＡｂ活性と競合し、Ｔ細胞活性化および細胞傷害性の部分的または完全な喪失をもたらした。
【図８】慢性Ｂ型肝炎患者由来のＰＢＭＣは、ＴｒｉＭＡｂによって活性化された場合、ＨＢｓＡｇ陽性標的細胞を死滅させる。慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）患者由来のＰＢＭＣと、ＨＢＳＡｇ陰性（Ｈｕｈ７）およびＨＢｓＡｇ陽性標的細胞（Ｈｕｈ７Ｓ）の共培養。ＴｒｉＭＡｂ細胞の添加後、各時点での細胞生存率をエクセリジェンス・アッセイによって３回測定した。ＰＢＭＣ対照では、細胞をＨｕｈ７Ｓ細胞と共培養したが、抗体は添加しなかった。ＴｒｉＭＡｂを添加し、標的細胞がＨＢｓＡｇを発現した場合にのみ、特異的死滅が、抗体を添加して２４〜３０時間後から始まったことが観察された。
【図９】慢性Ｂ型肝炎患者由来のＰＢＭＣはＴｒｉＭＡｂによって活性化される。ＴｒｉＭＡｂ存在下でＨＢｓＡｇ陽性（Ｈｕｈ７Ｓ）または陰性（Ｈｕｈ７）標的細胞と共培養した慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）患者由来ＰＢＭＣのＩＦＮγ−分泌。ＴｒｉＭＡｂを添加し、標的細胞がＨＢｓＡｇを発現する場合にのみ、ＩＦＮγの分泌によって決定されるＴ細胞の活性化が検出された。
【実施例】
【０１６３】
実施例は本発明を説明するものである。
実施例１
材料および方法
【０１６４】
三重特異的抗体のクローニングおよび産生
ＶHおよびＶκ／Ｖλサブタイプのすべてをカバーするプライマーセットを使用して、逆転写したｍＲＮＡのＰＣＲ増幅により各ハイブリドーマから抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）および抗ＣＤ２８（９．３）の可変重鎖および可変軽鎖をコードする相補ＤＮＡを得た。ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（インビトロジェン、ライフテクノロジーズ）に連結し、配列を決定した。抗ＨＢｓＡｇ  ｓｃＦｖ  Ｃ８を、Ｂ型ワクチン由来Ｂ細胞のｃＤＮＡライブラリーからファージディスプレイ技術によって選抜し、コドン最適化した。５’側および３’側に適切な制限部位を有するプライマーを使用して、前述の抗体をコードしている可変重鎖および可変軽鎖のｃＤＮＡからグリシン−セリンリンカーを用いてｓｃＦｖを構築した。５価の分子を得るには、ＯＫＴ３および９．３  ｓｃＦｖを抗体５Ｆ９のＦａｂ断片のＣ末端に融合させ、一方、ｓｃＦｖ  Ｃ８の２つの実体をそのＮ末端に付加した。８価の分子を得るには、４つのｓｃＦｖ  Ｃ８ドメインおよびＯＫＴ３および９．３の２つのドメインを、それぞれ、ＩｇＧ様分子に連結した。
【０１６５】
Ｃ８  ｓｃＦｖのコード配列を、前述の５’グリシン−セリンリンカーの５’末端にクローニングした。完全なｓｃＦｖ−リンカー−ｈＩｇＧ１Ｆｃ−リンカー−ｓｃＦｖ配列を哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）（インビトロジェン）にサブクローニングした。マキシプレップでプラスミドＤＮＡを調整し、ｐｅｑＦＥＣＴトランスフェクション試薬（ペックラボ）を用いてＨＥＫ２９３細胞を形質転換した。０．８〜１．０ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を使用して安定な形質転換体を選抜し、増殖させた。ＨＥＫ形質転換体の上清を回収し、ＥＬＩＳＡによって分泌された三重特異的抗体の濃度を分析し、また、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ特異的ペルオキシダーゼ標識抗体を使用したウェスタンブロット法によって分泌された抗体の完全性を分析した。
【０１６６】
Ｈｕｈ７Ｓ細胞の細胞培養条件および生成
ＨｕＨ７肝癌細胞（ナカバヤシら、１９８２、合成培地における分化型ヒト肝癌細胞株の成長（Ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍ）、癌研究（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）４２：３８５８〜３８６３）およびＨＥＫ２９３細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、およびＬ−グルタミン（２ｍｍｏｌ／Ｌ）（すべてギブコ、ライフテクノロジー）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で維持した。
【０１６７】
Ｈｕｈ７Ｓ細胞を生成するために、フュージーン（ＦｕＧｅｎｅ）遺伝子導入試薬（プロメガ）を用いて、Ｈｕｈ−７細胞に、ＨＢＶ遺伝子型Ｄサブタイプａｙｗ１のＨＢＶ小型表面抗原をコードするプラスミドと抗生物質耐性遺伝子を導入した。抗生物質による選抜後、単細胞のクローンを単離し、２４ウェルプレートで生育させた。ＨＢｓＡｇを最も多く分泌するクローンを選抜し、これを使用して、標的細胞として使用する細胞株Ｈｕｈ７−Ｓを樹立した。
【０１６８】
ＰＢＭＣの単離
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＬＳＭ  １０７７リンパ球分離培地（ＰＡＡ）を用いた密度勾配遠心分離により、ヘパリン処理した全血から単離した。２５ｍｌの血液を１３ｍｌのＬＳＭ  １０７７上に層状に加えた。室温で、２０分間２０００ｒｐｍで遠心分離した後（破損せず）、ＰＢＭＣを回収し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、Ｌ−グルタミン（２ｍｍｏｌ／ｌ）（全てギブコ製）を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地で培養した。３７℃、５％  ＣＯ2の条件で一晩放置した後、ＰＢＭＣを共培養実験に使用した。
【０１６９】
固定化したＨＢｓＡｇを使ったＰＢＭＣの培養
ＰＢＳに溶解した組換えＨＢｓＡｇ（５μｇ／ｍｌ）、１００μｌを９６ウェルプレートに移し、４℃で一晩コーティングした。翌日、ＨＢｓＡｇ溶液をデカントし、プレートをリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。ＨＢｓＡｇでコーティングしたプレートに、ＰＢＭＣを１ウェル当たり１×１０5個の密度で移し、上清を含む三重特異的抗体１００μＬと混合した。固定化ＨＢｓＡｇを含まないウェルを陰性対照とした。プレートに結合させたＨＢｓＡｇ上でＰＢＭＣを４８時間培養した後、上清を回収し、その後の分析のために細胞を採取した。ヒトＩＦＮ−γエライザマックス（ＥＬＩＳＡ  ＭＡＸ（登録商標））ＴＭ（バイオレジェンド（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ））を用いたＥＬＩＳＡによって、上清では、エフェクターＴ細胞の活性化に起因するサイトカイン分泌が検出された。細胞をＬＡＭＰ−１およびグランザイムＢに対する抗体で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。全ての実験は３回実施した。
【０１７０】
ＨＢＶ陽性標的細胞と再指向化エフェクター細胞の共培養
Ｈｕｈ７標的細胞またはＨｕｈ７Ｓ標的細胞を９６ウェルプレート中、最高培養密度で培養した。１００μＬの培地に１×１０5個のＰＢＭＣ細胞を入れ、これを１ウェルごとに加えた。三重特異的抗体を含むＨＥＫ上清を１００μＬずつ各ウェルに加えた。ＣＤ３とＣＤ２８の活性化の相乗効果を判定するために、二重特異的抗体上清を５０μＬずつ各ウェルに加えた。未処理の標的細胞を、エフェクター細胞のみ（抗体を加えずに）でインキュベートしたものを陰性対照として使用した。９６時間後または１２０時間後に、上清を回収してＩＦＮγの分泌をＥＬＩＳＡによって分析した（前段を参照のこと）。
【０１７１】
細胞傷害性を決定するために、ＨＢｓＡｇを発現しているＨｕｈ７Ｓ細胞を、エクセリジェンスＲＡＴＣシステム（ＡＣＥＡ、バイオサイエンス社）とコンフルエントになるまで９６ウェルＥプレートで培養した。新たに単離したＰＢＭＣと１００μＬの抗体を含む上清を、１セットあたり３つずつのウェルに加えた。非トランスジェニックＨｕｈ７細胞を特異的な対照とし、抗体を含まないＨｕｈ７Ｓ細胞と共培養したＰＢＭＣを陰性対照として用いた。標的細胞の生存率を、エクセリジェンスＲＡＴＣシステムを用いてリアルタイムで１２０時間モニターした。
【０１７２】
慢性Ｂ型肝炎患者由来ＣＴＬを活性化する三重特異的構築物の効力を決定するために、慢性患者からＰＢＭＣを単離し、実験に使用した。
【０１７３】
実施例２
ＨＢｓＡｇに対する５価および８価の三重特異的抗体構築物によるＣＴＬの活性化
実験の第１ラウンドでは、ＣＴＬ表面抗原であるＣＤ３およびＣＤ２８ならびにＨＢＶ小型表面抗原に対する５価および８価の三重特異的抗体構築物の活性を評価した。細胞培養皿のプラスチック表面を、組換えＨＢｓＡｇでコーティングした。コーティングしたウェルに、免疫エフェクター細胞、すなわち健常ドナーから単離されたＰＢＭＣ、および二重特異的および三重特異的抗体構築物を加えた。非特異的な免疫細胞の活性化を評価するために、陰性対照として、ＰＢＭＣをＨＢｓＡｇでコーティングしたウェル中、二重または三重特異的抗体構築物を加えずに培養した。
【０１７４】
これらの実験では、ＣＤ３活性化二重特異的構築物の存在下で共培養した場合、最大５０００ｐｇ／ｍｌまでの炎症誘発性サイトカインであるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）の分泌によって判定される細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）特異的な活性化が示された（図３）。この効果はさらに、相乗効果を生むＣＤ３特異的およびＣＤ２８特異的構築物の同時投与によって高まったが、ＣＤ２８活性化構築物同士を使った場合にはＴ細胞は活性化されなかった。
【０１７５】
予想外なことに、ＣＤ３およびＣＤ２８の刺激ドメインと共刺激ドメインを三重特異的分子に組み合わせると、ＩＦＮγ分泌によって決定されたような２つの二重特異的構築物（図３）の組み合わせよりもＣＴＬの活性化が有意に高まった。これは、三重特異的抗体構築物によって活性化された大部分の細胞における細胞傷害性小胞の脱顆粒およびグランザイムＢの発現を示すＬＡＭＰ−１転座の染色後に、免疫細胞の細胞傷害性をフローサイトメトリーで分析したときに確認された（図４ＡおよびＢ）。
【０１７６】
したがって、５価構築物が最も効果的であり、免疫細胞の８０〜９５％において細胞傷害性機能を誘導することができた（図４）。ＰＢＭＣのおよそ７０％がＴ細胞であるが、それらの大部分はナイーブであるので、ＣＴＬの活性化はＴＣＲ複合体の強力な活性化を必要とする。
【０１７７】
実施例３
三重特異的抗体構築物によるＣＴＬ活性化に際した、ＨＢｓＡｇ陽性肝細胞の特異的な死滅
第２ラウンドの実験では、ＣＴＬ表面抗原のＣＤ３およびＣＤ２８ならびにＨＢＶ小型表面抗原を指向する三重特異的抗体構築物が、ＨＢｓＡｇ発現細胞を特異的に死滅させる能力を評価した。標的細胞としては、安定的に遺伝子が導入され、ＨＢＶ表面抗原を産生するＨｕｈ７肝細胞腫細胞株（Ｈｕｈ７Ｓ細胞）を使用した。ＨＢＶタンパク質の発現を確立した後、これらの標的細胞を、免疫エフェクター細胞、つまり健常提供者から単離されたＰＢＭＣと、５価の三重特異的抗体構築物と共に共培養した。陰性対照として、本発明者らは、ＨＢｓＡｇ含有上清と共にプレインキュベートしたＨＢＶ陰性標的細胞の共培養を分析した。この対照は、ＨＢＶ陰性標的細胞の表面におけるＨＢＶ粒子の非特異的な結合によるエフェクター細胞の活性化を除外するために用いられた。さらに、ＨＢＶ陽性標的細胞を、三重特異的抗体構築物の非存在下で免疫エフェクター細胞と共培養して、非特異的な、バックグラウンドの細胞毒性を評価した。
【０１７８】
これらの実験では、Ｈｕｈ７Ｓ細胞と共培養したときにはＣＴＬの特異的な活性化が認められたが、ＣＤ３およびＣＤ−２８活性化５価三重特異的構築物の存在下ではＨｕｈ７細胞は活性化しなかった。ＣＴＬの活性化は、最大２ｎｇ／ｍｌまでの炎症性サイトカインであるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）の分泌によって判断した。三重特異的分子の非存在下では、ＣＴＬの活性化は観察されなかった（図５）。
【０１７９】
さらに、抗体構築物を添加しないでインキュベートしたＨｕＨ７細胞または対照と比較したときに、Ｈｕｈ７Ｓ標的細胞の生存率が９０％未満に低下することから分かるように、三重特異的構築物は、ＨＢｓＡｇ産生ＨｕＨ７肝細胞腫細胞株の特異的な細胞傷害的死滅を仲介した（図６）。
【０１８０】
ＣＴＬの活性化がＨＢｓＡｇ特異的であることをさらに証明するために、中和抗ＨＢｓ抗体を含むヒト血清との競合アッセイを行った（図７）。１１７．５ＩＵ／Ｌの抗ＨＢｓを添加した場合には、ＣＴＬ活性化と標的細胞の死滅には部分的な競合しか見られなかったが、細胞を死滅させる効果は２３５ＩＵ／Ｌの濃度の抗ＨＢｓで完全に消失した。
【０１８１】
実施例４
慢性Ｂ型肝炎患者由来Ｔ細胞の再指向化と活性化
ＣＴＬ機能を活性化する三重特異的抗体構築物の能力を慢性Ｂ型肝炎患者で分析するために、高ウイルス血症のＢ型肝炎ウイルスキャリアの患者からＰＢＭＣを単離した。安定的に遺伝子が導入され、ＨＢＶ表面抗原（Ｈｕｈ７Ｓ細胞）を産生するＨｕｈ７肝細胞腫細胞株を標的細胞として使用した。これらの標的細胞を、５価の三重特異的抗体構築物の存在下および非存在下で、Ｂ型肝炎患者から単離されたＰＢＭＣと共培養した。陰性対照としては、ＨＢＶ陰性標的細胞との共培養を分析した。
【０１８２】
これらの実験では、ＣＤ３およびＣＤ２８活性化５価三重特異的構築物によるＨｕｈ７Ｓ細胞の特異的な死滅は認められたが、慢性Ｂ型肝炎患者由来ＰＢＭＣにおいて活性化されたＣＴＬによるＨｕｈ７細胞の特異的な死滅は認められなかった（図８）。三重特異的抗体構築物の非存在下では細胞の死滅は認められず、このことは、手法の特異性と、患者由来のＰＢＭＣでは自発的なＣＴＬ活性が欠如していることを示している。特異的ＣＴＬ活性化は、炎症誘発性サイトカインのインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）の分泌によって確認した（図９）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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