(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）１つ以上の鉄ナノ粒子と、
（ｂ）過酸化水素と
を含む、口腔疾患を防止および／または治療するための組成物。
【請求項２】
前記１つ以上の鉄ナノ粒子は、マトリックス分解酵素、過酸化物生成酵素、および、それらの組み合わせからなる群から選択される酵素にコンジュゲートされているナノ粒子を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
マトリックス分解酵素、過酸化物生成酵素、および、それらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の酵素にコンジュゲートされている１つ以上の鉄ナノ粒子を含む、口腔疾患を防止および／または治療するための組成物。
【請求項４】
前記口腔疾患は齲蝕を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記１つ以上の鉄ナノ粒子は、直径が約１ｎｍ〜約１，０００ｎｍのナノ粒子を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
フッ化物、銅、リン酸カルシウム、または、それらの組み合わせをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記ナノ粒子は金属でドープされている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記金属は、マンガン、コバルト、カルシウム、ニッケル、銅、マグネシウム、ストロンチウム、バリウム、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、亜鉛、アルミニウム、イットリウム、ジルコニウム、ニオブ、モリブデン、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、ハフニウム、タンタル、タングステン、レニウム、オスミウム、イリジウム、白金、銅、および、それらの組み合わせからなる群から選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記１つ以上の鉄ナノ粒子は、ポリマーコーティングを有するナノ粒子を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ポリマーコーティングは、生体ポリマー、デキストラン、キトサン、または、それらの組み合わせを含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記１つ以上の鉄ナノ粒子は、ポリマーコーティングを有さないナノ粒子を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
バイオフィルム関連疾患を防止および／または治療するための配合物を製造するための組成物の使用であって、
前記組成物は、マトリックス分解酵素、過酸化物生成酵素、および、それらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の酵素にコンジュゲートされているナノ粒子を含む、１つ以上の鉄ナノ粒子と、
フッ化物、銅、リン酸カルシウム、過酸化水素、過炭酸ナトリウム、および、それらの組み合わせからなる群から選択される化合物とを含む、使用。
【請求項１３】
前記組成物は、有効量の過酸化水素をさらに含む、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記組成物は、有効量のフッ化物をさらに含む、請求項１２に記載の使用。
【請求項１５】
前記１つ以上の鉄ナノ粒子は、ポリマーコーティングを有するナノ粒子を含む、請求項１２に記載の使用。
【請求項１６】
前記１つ以上の鉄ナノ粒子は、ポリマーコーティングを有さないナノ粒子を含む、請求項１２に記載の使用。
【請求項１７】
前記過酸化水素は、過酸化水素を約０．１％〜約３．０％の濃度で含む溶液中に存在する、請求項１３に記載の使用。
【請求項１８】
前記過酸化水素は、過酸化水素を約０．１％〜約１．０％の濃度で含む溶液中に存在する、請求項１３に記載の使用。
【請求項１９】
前記組成物内の前記鉄ナノ粒子の濃度は、約０．０１〜約１．０ｍｇ／ｍｌである、請求項１２に記載の使用。
【請求項２０】
前記バイオフィルム関連疾患は、齲蝕、粘膜感染症、口腔疾患、尿路感染症、カテーテル感染症、中耳炎、創傷、移植医療デバイスの感染症、骨疾患、ヒト感染症、および、それらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１２に記載の使用。
【請求項２１】
歯またはアパタイトの脱灰を防止するための配合物を製造するための組成物の使用であって、
前記組成物は、バイオフィルムを有する歯のエナメル質表面またはアパタイト表面に結合かつ／または鉄を放出してエナメル質またはアパタイトの溶解を阻害する１つ以上の鉄ナノ粒子を含み、
前記アパタイト表面は骨表面であり、
前記組成物は、フッ化物、銅、リン酸カルシウム、過酸化水素、過炭酸ナトリウム、および、それらの組み合わせからなる群から選択される化合物を更に含む、使用。
【請求項２２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物を含む、口腔ケア製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[関連出願の相互参照]
本出願は、２０１５年２月１３日に出願された米国仮出願第６２/１１５，９６８号の優先権を主張するものであり、参照によりその全体を本明細書に援用する、
【背景技術】
【０００２】
バイオフィルムは、表面に強固に付着し、自己生成した三次元（３Ｄ）細胞外マトリックス中に包まれる微生物の構造化共同体である。バイオフィルムは生体表面や非生体表面上に形成され、自然環境および工業環境中に存在することができる。例えば、バイオフィルムは、冷却塔、プール、スパなどの人工の水関連システムを汚染し得る。工業環境では、バイオフィルムは配管の内部表面に発生して目詰まりや腐食の原因となることがある。バイオフィルムはまた、埋め込まれた医療チューブ内および医療デバイス内や、人体内（粘膜表面）に形成され、患者の感染症を引き起こす可能性がある。同様に、バイオフィルムは口腔内で発生して齲蝕などの口腔疾患を引き起こす可能性がある。このようなバイオフィルムの細胞外マトリックスは、エキソポリサッカライド（ＥＰＳ）などのポリマー物質を含む。微生物が産生するマトリックスはバイオフィルムを構築するための実質的な足場を提供することができる。さらに、マトリックスは微生物の拡散を妨げつつ微生物の付着および凝集を促進するため、バイオフィルムの処理や表面からの除去は極めて困難となる。
【０００３】
口腔に関して、マトリックスのコアを形成するＥＰＳは齲蝕原性（すなわち齲蝕発生性）バイオフィルム（歯垢とも呼ばれる）の主要な構成要素である。ＥＰＳ豊富なこの細胞外マトリックスは、バイオフィルム中に高酸性のミクロ環境を作る一助となる拡散を阻害するだけでなく、高粘着性・高接着性のバイオフィルムの形成を促進する。このような高酸性度は、齲蝕原性フローラの生存および成長を促進し、また高分子細胞外マトリックスの産生をさらに誘導し得るため、隣接する歯エナメル質の酸溶解を促進しつつ、確実に病原性バイオフィルムを蓄積させる。この細胞外マトリックスはまた、抗体、抗生物質および免疫細胞（これらは、高密度の細胞外マトリックスを通過して細胞外マトリックスに埋め込まれた微生物を殺すことができない）によって口腔内および人体内の微生物バイオフィルムや、生体材料（インプラント、医療デバイスなど）上の微生物バイオフィルムを排除することを困難とする一因である。さらに、ＥＰＳ豊富な細胞外マトリックスの酸性ｐＨは、一部の抗生物質の有効性を低下させる可能性がある。
【０００４】
齲蝕原性バイオフィルムを抑制するためのある種のアプローチは、マトリックスの破壊を標的とせず、クロルヘキシジン（ＣＨＸ）などの標準的な殺菌剤に限定されている。ＣＨＸは浮遊性のストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）を殺すことができるものの、バイオフィルムに対しては有効性が低く、また、歯石の形成や歯の着色などの悪影響があるため毎日の治療用途には適さない。また、化学剤や生物剤は歯や舌の変色、口腔粘膜の落屑および痛み、不快な味、毒性などのいくつかの欠点を有する可能性があり、複雑な口腔フローラの不均衡も引き起こす可能性もある。
【０００５】
ある種の抗菌性ナノ粒子が口腔バイオフィルムを破壊し得るアプローチとして検討されている。しかし、その多くはＣＨＸと同様の制限がある。銀ナノ粒子および銅ナノ粒子などの金属ナノ粒子は広範な抗菌活性を示す。しかしながら、これらの薬剤はマトリックスを標的とせず、酸性のミクロ環境下では十分機能しない可能性があり、抗バイオフィルム効果は制限される。口腔バイオフィルムを抑制するための有効な治療法の開発は、口内に局所的に導入した薬剤が保持性や生物活性が欠如することの影響も受ける。そのため、マトリクッスの分解と、埋め込まれた細菌（口腔内に発生し得るものを含むが、これらに限定されない）の殺菌とを同時に行うことによって一般のバイオフィルムを効果的に処理することができる組成物を提供する必要性があった。
【発明の概要】
【０００６】
本開示の主題は、（１）バイオフィルムの処理および／または排除、（２）バイオフィルム形成の防止、（３）バイオフィルムの細胞外マトリックスの分解、（４）バイオフィルム内での細菌の生存および増殖の阻害、および／または、（５）歯またはアパタイトの脱灰の防止、のための酸化鉄ナノ粒子組成物およびその配合物を提供する。
【０００７】
ある実施形態では、本開示は、１つ以上の鉄ナノ粒子および過酸化水素を含む、バイオフィルム関連疾患（口腔疾患など）を防止および／または治療するための組成物を提供する。ある実施形態では、１つ以上の鉄ナノ粒子は、１つ以上の酵素にコンジュゲートされる。例えば、限定されず、１つ以上の鉄ナノ粒子は、マトリックス分解酵素および／または過酸化物生成酵素にコンジュゲートされる。ある実施形態では、口腔疾患は齲蝕である。ある実施形態では、１つ以上の鉄ナノ粒子は、約１ｎｍ〜約１，０００ｎｍの直径を有することができる。ある実施形態では、１つ以上の鉄ナノ粒子はポリマーコーティングを有する。ある実施形態では、１つ以上の鉄ナノ粒子はポリマーコーティングを有さない。
【０００８】
本開示はさらに、１つ以上の鉄ナノ粒子および過酸化水素を含む、バイオフィルムを防止および／または処理するための組成物を提供する。ある実施形態では、１つ以上の鉄ナノ粒子は、１つ以上のマトリックス分解酵素および／または過酸化物生成酵素にコンジュゲートされる。ある実施形態では、１つ以上の鉄ナノ粒子は、約１ｎｍ〜約１，０００ｎｍの直径を有することができる。ある実施形態では、組成物はさらにフッ化物を含む。ある実施形態では、１つ以上のナノ粒子は、マンガン、コバルト、カルシウム、ニッケル、マグネシウム、ストロンチウム、バリウム、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、亜鉛、アルミニウム、イットリウム、ジルコニウム、ニオブ、モリブデン、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、ハフニウム、タンタル、タングステン、レニウム、オスミウム、イリジウム、白金、銅、または、それらの組合せなどの金属でドープされるが、これらに限定されない。ある実施形態では、１つ以上の鉄ナノ粒子は、ポリマーコーティングを有するか、またはポリマーコーティングを有しない。ある実施形態では、ポリマーコーティングはデキストランを含む。ある実施形態では、バイオフィルムは、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａｓ）、エシェリヒア・コリー（Ｅ．ｃｏｌｉ）、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）、バチリス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、カンジタ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、または、それらの組み合わせによって生成される。バイオフィルムは、歯の表面、粘膜表面、医療デバイス、工業材料、船舶材料（ｎａｖａｌ  ｍａｔｅｒｉａｌ）、皮膚、歯の内部（例えば、歯内管）、肺（例えば、嚢胞性線維症）、または、尿路に存在し得る。
【０００９】
本開示は、１つ以上の鉄ナノ粒子を含む組成物の有効量を対象に投与するステップを含む、口腔疾患を防止、排除および／または治療する方法を提供する。ある実施形態では、組成物中の鉄ナノ粒子の濃度は、約０．１〜約１．０ｍｇ／ｍｌである。ある実施形態では、本方法は、対象に有効量の過酸化水素を投与するステップをさらに含むことができる。ある実施形態では、過酸化水素は、約０．１％〜約３．０％の濃度の過酸化水素を含む溶液で投与される。ある実施形態では、本方法は、対象に有効量のフッ化物を投与するステップをさらに含むことができる。ある実施形態では、１つ以上の鉄ナノ粒子は、マトリックス分解酵素および／または過酸化物生成酵素にコンジュゲートされる。ある実施形態では、組成物は、フッ化物、過酸化水素、リン酸カルシウム、銅、過炭酸ナトリウム、または、それらの組み合わせをさらに含むことができる。ある実施形態では、１つ以上の鉄ナノ粒子は、約１ｎｍ〜約１，０００ｎｍの直径を有することができる。ある実施形態では、１つ以上の鉄ナノ粒子は、ポリマーコーティングを有するか、またはポリマーコーティングを有しない。ある実施形態では、１つ以上の鉄ナノ粒子はポリマーコーティングを有する。
【００１０】
本開示は、バイオフィルムを有する表面を、１つ以上の鉄ナノ粒子を含む有効量の組成物と接触させるステップを含む、バイオフィルムを防止、排除および／または処理する方法を提供する。ある実施形態では、バイオフィルムは、歯の表面、粘膜組織表面、軟組織表面、皮膚、アパタイト表面、インプラント表面、医療デバイス表面、工業材表面、船舶（ｎａｖａｌ  ｖｅｓｓｅｌ）表面、ウォータークラフト表面、船体、またはパイプ表面に存在する。ある実施形態では、本方法は、表面を過酸化水素含有溶液と接触させるステップをさらに含むことができ、１つ以上の鉄ナノ粒子は、過酸化水素を触媒して．バイオフィルムマトリックスを分解かつ／または埋め込まれた細菌を殺菌することができる１つ以上のフリーラジカルが形成される。ある実施形態では、１つ以上のフリーラジカルは、同時に、バイオフィルムマトリックスを分解し、埋め込まれた細菌を殺菌する。
【００１１】
ある実施形態では、バイオフィルム中の細菌増殖を防止する方法は、バイオフィルムを有する表面を１つ以上の鉄ナノ粒子を含む有効量の組成物と接触させるステップを含み、１つ以上の鉄ナノ粒子は当該表面に結合し、鉄を放出してバイオフィルム内の細菌の増殖を阻害する。本開示はさらに、表面上でバイオフィルムの形成を防止する方法を提供する。ある実施形態では、表面上でバイオフィルムの形成を防止する方法は、１つ以上の鉄ナノ粒子を含む有効量の組成物でバイオフィルム発生のリスクがある表面を処理するステップを含むことができる。ある実施形態では、表面は、１つ以上の鉄ナノ粒子を含む有効量の組成物でコーティングすることができる。ある実施形態では、組成物は、１つ以上の鉄ナノ粒子および過酸化水素および／または過炭酸ナトリウムを含むことができる。例えば、限定されないが、そのようなリスクのある表面には、歯の表面、粘膜表面、インプラントの表面、デバイスの表面、および、パイプの表面が含まれる。
【００１２】
本開示の主題は、歯またはヒドロキシアパタイト（ＨＡ）の脱灰を防止する方法をさらに提供する。ある実施形態では、歯の脱灰を防止する方法は、バイオフィルムを有する歯エナメル質またはアパタイト（例えば骨）表面を、１つ以上の鉄ナノ粒子を含む有効量の組成物と接触させるステップを含むことができる。ある実施形態では、１つ以上の鉄ナノ粒子は表面に結合してエナメル質またはアパタイトの溶解を阻害かつ／または防止する。
【００１３】
本開示は、１つ以上の鉄ナノ粒子を有する組成物を含む第１の容器と、過酸化水素溶液を含む第２の容器とを含む、バイオフィルムを防止および／または処理するためのキットを提供する。ある実施形態では、キットは、１つ以上の鉄ナノ粒子および過酸化水素を有する組成物を含む容器を含むことができ、過酸化水素は不活性化および／または複合体化され、口腔内でまたは水と接触したときに活性化および／または放出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、触媒性ナノ粒子（ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ；ＣＡＴ−ＮＰ）によるＨ２Ｏ２の活性化によるｉｎ  ｓｉｔｕでのバイオフィルムの排除／破壊の提案モデルの模式図を示す。
【図２】図２は、バイオフィルム内の３次元（３Ｄ）細胞外マトリックスおよび酸性ｐＨニッチの画像を示す。図２Ａは、成熟バイオフィルム内のＥＰＳマトリックス（赤色）および細菌（緑色）を示す。図２Ｂは、バクテリアを保持し、区画化構造体を形成しているＥＰＳを示す細胞マトリックス構造組織の拡大図を示す。図２Ｃは、高酸性のミクロ環境（ドット領域）を有するｉｎｔａｃｔなバイオフィルムのｉｎ  ｓｉｔｕでのｐＨ画像を示す。
【図３】図３は、本開示の非限定的な実施形態に従って調製および特性解析した酸化鉄ナノ粒子（ＩＯ−ＮＰ）のＴＥＭ画像を示す。スケールバーは５００ｎｍである。
【図４】図４Ａ〜４Ｃは、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）によって特性解析したストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）バイオフィルム上のＩＯ―ＮＰ保持の画像を示す。図４ＡはＩＯ−ＮＰで処理したバイオフィルムの形態を示す。図４Ｂは、バイオフィルムに結合したＩＯ−ＮＰの拡大図を示す。図４Ｃはバイオフィルム上のＩＯ−ＮＰ（ピンク）分布を示すＳＥＭ画像の元素分析を示す。
【図５】図５Ａ〜５Ｂは、０．５％Ｈ２Ｏ２と組み合わせたＩＯ−ＮＰによる殺菌およびマトリックス分解のグラフを示す。図５Ａはバイオフィルム内のストレプトコッカス・ミュータンスの効果的な殺菌のグラフを示す。図５ＢはＥＰＳマトリックス分解のグラフを示す。
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｃは、低ｐＨ下での細菌阻害、ＩＯ−ＮＰからの鉄放出およびフリーラジカル生成のグラフを示す。図６Ａは、グルコースを含む培地中、低ｐＨ下でＩＯ−ＮＰが細菌生存を阻害することを示すグラフを示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、３７℃で低ｐＨ（５．５未満）下でのＩＯ−ＮＰからの鉄放出を示すグラフである。
【図６Ｃ】図６Ｃは、低ｐＨ（ｐＨ４〜５）でＩＯ−ＮＰがＨ２Ｏ２を触媒してフリーラジカルを迅速に生成することを示すグラフである。
【図７】図７Ａ〜７Ｃは、ＩＯ−ＮＰが酸性条件下でヒドロキシアパタイト（ＨＡ）の脱灰を減少させることを示す画像を示す。図７Ａは未処理ＨＡビーズの画像である。図７Ｂは酸性緩衝液（ｐＨ４．５）中のＨＡビーズの画像である。図７Ｃは酸性緩衝液中でＩＯ−ＮＰを有するＨＡビーズの画像であって、ＨＡの酸溶解に対するＩＯ−ＮＰの保護効果を示す。
【図８】図８Ａ〜８Ｅは、触媒性ナノ粒子（ＣＡＴ−ＮＰ）の特性解析および触媒活性を示す。図８Ａ〜８ＢはＴＥＭによるＣＡＴ−ＮＰの画像を示す。図８ＣはＣＡＴ−ＮＰのサイズ分布（２１３．３±２６．５ｎｍ）を示すグラフである。図８Ｄは３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）法によって測定したＣＡＴ−ＮＰ活性のグラフである。図８ＥはＡＭＰＬＥＸ（登録商標）ＵｌｔｒａＲｅｄ（５６８／５８１ｎｍで励起／発光）によって測定したＣＡＴ−ＮＰ活性のグラフである。データは平均±ｓ．ｄ．で示す。
【図９】図９Ａ〜図９Ｂは、例示的な実験デザインおよびインビトロでの唾液被覆ハイドロキシアパタイト（ｓａｌｉｖａ−ｃｏａｔｅｄ  ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ；ｓＨＡ）バイオフィルムモデルを示す。図９Ａは例示的なバイオフィルム実験設計および局所処理レジメンを示す。図９Ｂは２４ウェルプレート内のｓＨＡディスクの垂直配置およびｓＨＡディスク表面上のバイオフィルムの形成を示す。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｆは、バイオフィルム内のＣＡＴ−ＮＰの保持および触媒活性を示す。図１０Ａは結合したＣＡＴ−ＮＰ（矢印）を有するバイオフィルムの形態を示す。図１０Ａ１は図１０Ａ中の選択された領域内のＣＡＴ−ＮＰの拡大図を示す。図１０Ａ２はバイオフィルム上の鉄（ピンク）の分布を示すＳＥＭ／ＥＤＳ画像を示す。図１０Ｂは、ＩＣＰ−ＭＳで鉄量を測定して測定した、バイオフィルム内の結合ＣＡＴ−ＮＰの量を示すグラフを示す。図１０Ｃは、バイオフィルム（ＥＰＳ（赤色）、細菌（緑色）、ＣＡＴ−ＮＰ（白色）は共焦点顕微鏡で観察したものである）内のＣＡＴ−ＮＰの空間分布を示す。図１０Ｄは、バイオフィルムの厚さ全体のＣＡＴ−ＮＰの直交方向分布を示すグラフを示す。図１０Ｅは、バイオフィルム内のＣＡＴ−ＮＰの触媒活性を示すグラフである（挿入図：ＣＡＴ−ＮＰ処理バイオフィルムのＨ２Ｏ２およびＴＭＢへの暴露前後の画像（青色はｉｎ  ｓｉｔｕでのＨ２Ｏ２触媒作用を介したフリーラジカル生成を示す））。
【図１１】図１１は、別のペルオキシダーゼ基質（３，３’−ジアミノベンジジン；ＤＡＢ）を用いたバイオフィルム内の結合ＣＡＴ−ＮＰの活性を示す画像を示す。茶色はＨ２Ｏ２触媒作用を介したフリーラジカル生成を示す。
【図１２】図１２は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）反応によって測定した、様々なｐＨ値におけるバイオフィルム内の結合ＣＡＴ−ＮＰの触媒活性を示すグラフである。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜１３Ｄは、ＣＡＴ−ＮＰおよびＨ２Ｏ２の組み合わせによって達成される殺菌、ＥＰＳ分解およびバイオフィルム破壊を示す。図１３Ａは、Ｈ２Ｏ２暴露から５分後のＣＡＴ−ＮＰ処理バイオフィルム内のストレプトコッカス・ミュータンスの生存率を示すグラフである。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、Ｈ２Ｏ２曝露３０分後のバイオフィルム内のＥＰＳ分解を示すグラフである。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、ＧｔｆＢから産生される不溶性グルカンおよびＧｔｆＤから産生される可溶性グルカンの分解を示すグラフである。
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、ＣＡＴ−ＮＰ＋Ｈ２Ｏ２による局所処置後のバイオフィルム破壊の挙動を示す共焦点顕微鏡画像を示す。バイオフィルムをＣＡＴ−ＮＰで局所処置し、その後直ちにＨ２Ｏ２に暴露（ＣＡＴ−ＮＰ＋Ｈ２Ｏ２）または酢酸ナトリウム緩衝液に暴露（ＣＡＴ−ＮＰ単独）した（１日２回）。ＣＡＴ−ＮＰの非存在下でＨ２Ｏ２処理したバイオフィルムについては、バイオフィルムを酢酸ナトリウム緩衝液で処理し、その後直ちにＨ２Ｏ２暴露した。対照群は緩衝液のみで処理したバイオフィルムとした。細菌細胞をＳＹＴＯ９（緑色）で染色し、ＥＰＳをＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７（赤色）で標識した。データは平均±ｓ．ｄ．で示す。＊Ｐ≦０．００１（ｖｓ対照）。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｂは、様々な濃度のＨ２Ｏ２を用いたＣＡＴ−ＮＰの抗バイオフィルム活性を示すグラフを示す。図１４Ａは生存細胞の総数（コロニー形成単位、ＣＦＵ）を計数することによって測定した抗菌活性を示すグラフである。図１４Ｂはバイオフィルムのバイオマス（乾燥重量）の減少を示すグラフである。データは平均±ｓ．ｄ．で示す。
【図１５】図１５Ａ〜図１５Ｃは、処理バイオフィルム内の細菌およびＥＰＳの生体容積（ｂｉｏｖｏｌｕｍｅ）の定量分析を示す。図１５Ａは、ＣＯＭＳＴＡＴによる、４３時間の時点での処理バイオフィルム内の細菌の生体容積のグラフを示す。図１５Ｂは、ＣＯＭＳＴＡＴによる、４３時間の時点での処理バイオフィルム内のＥＰＳの生体容積のグラフを示す。図１５Ｃは、ＣＯＭＳＴＡＴによる、４３時間の時点での処理バイオフィルム内の細菌およびＥＰＳの生体容積の定量分析を示す表である。データは平均±ｓ．ｄ．で示す。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｂは、齲蝕病変発生に対するＣＡＴ−ＮＰ／Ｈ２Ｏ２処理による保護を示す画像およびグラフを示す。図１６Ａは、述べたとおりに処置したラットの歯の画像を示す。緑色の矢印はエナメル質領域が脱灰されて白くなった初期の病変形成を示し、青色の矢印はエナメル質領域が白色不透明または損傷を受けた中程度の齲蝕病変を示す。一部の領域ではエナメル質が侵食され、最も重篤な齲蝕病変（赤色の矢印）であるキャビテーションが生じた。図１６Ｂは、Ｋｅｙｅｓのスコアリング・システムのＬａｒｓｏｎ改良に従って齲蝕病変重症度のステージおよび程度として記録したスコアを示すグラフを示す：初期の病変（表面エナメル質が白色）；中程度の病変（エナメル質が白色不透明）；広範囲の病変（キャビテーションが起こり、エナメル質が侵食されて下の象牙質が露出している状態）。データは平均±ｓ．ｄ．で示す。＊Ｐ≦０．００１（ｖｓ対照）；＊＊Ｐ≦０．０５（ｖｓ対照）；δは未検出を示す。
【図１７】図１７は、ＣＡＴ−ＮＰおよび／またはＨ２Ｏ２で処置した動物の歯肉組織および口蓋組織の組織病理画像を示すものであり、細胞毒性効果は示されず、３週間の局所処置後の細胞異常は全くない。
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｃは、ＣＡＴ−ＮＰ処理によるｓＨＡ酸溶解の減少の画像、グラフおよび図を示す。図１８Ａは、未処理ｓＨＡビーズ（直径８０μｍ）、酸性緩衝液（ｐＨ４．５）中のｓＨＡビーズ、および、酸性緩衝液中のＣＡＴ−ＮＰを有するｓＨＡビーズの画像を示す。図１８Ｂは酸溶解後のｓＨＡの残存量を示す例示的グラフを示す。図１８Ｃは、ｐＨ４またはｐＨ７でのインキュベーション後にＣＡＴ−ＮＰから放出された鉄の量を示す例示的なグラフを示す。データは、平均±ｓ．ｄ．で示す。
【図１９】図１９Ａ〜図１９Ｂは、修飾ＣＡＴ−ＮＰの触媒活性の比較を示すグラフを示す図である。図１９Ａは、同量の様々なタイプのＣＡＴ−ＮＰ（ＣＡＴ−ＮＰ、デキストラン被覆ＣＡＴ−ＮＰ、および、デキストランで被覆され、かつ、マンガン（Ｍｎ）でドープされたＣＡＴ−ＮＰ）の触媒活性（ＴＭＢ法による）のキネティクスを示すグラフである。図１９Ｂは、修飾ＣＡＴ−ＮＰの触媒活性と比較したＣＡＴ−ＮＰの触媒活性を示すグラフを示す。データ（未修飾ＣＡＴ−ＮＰに対する活性）は平均±ｓ．ｄ．で表し、修飾により触媒活性が増強されることを明確に示している。
【図２０】図２０はＩＯ−ＮＰの有効性を最適化し得る修飾を示す。
【図２１】図２１は、ルミノールからの光の発生により示されるデキストラン被覆ＩＯ−ＮＰによるＨ２Ｏ２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ触媒作用を示す画像である。
【図２２】図２２Ａ〜２２Ｂは、バイオフィルムに結合したＩＯ−ＮＰの触媒活性を示す。図２２ＡはＨ２Ｏ２およびＴＭＢへの暴露前後のＩＯ−ＮＰ処理バイオフィルムを示す画像であり、青色は、Ｈ２Ｏ２触媒作用を介したｉｎ  ｓｉｔｕでのＲＯＳ生成を示す。図２２ＢはＯＤ６５２で測定した発生フリーラジカルの量を示すグラフである。
【図２３】図２３Ａ〜２３Ｂは、酸化鉄ナノ粒子と２４時間インキュベートした後の細胞生存率を示す。図２３Ａは酸化鉄ナノ粒子と２４時間インキュベートした後のＢＪ５ｔａ細胞の細胞生存率を示すグラフである。図２３Ｂは酸化鉄ナノ粒子と２４時間インキュベートした後のＨｅｐＧ２細胞の細胞生存率を示すグラフである。データは細胞に対して毒性作用を示さない。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本開示の主題は、バイオフィルムの排除、バイオフィルム形成の阻止、マトリックス分解および／またはバイオフィルム内の微生物の生存および増殖の阻害のための酸化鉄ナノ粒子（ＩＯ−ＮＰ）組成物およびその配合物を提供する。本開示の主題は、口腔疾患の治療ならびに工業用途および他の医療用途のための本開示の組成物および配合物の使用方法をさらに提供する。
【００１６】
本明細書中において「バイオフィルム」は、細胞外マトリックスと、１つ以上の微生物、例えば、限定されないが、細菌（バクテリア）、真菌、藻類、原生動物とを含み、表面に付着する。例えば、限定されないが、このような表面には、歯、粘膜、アパタイト、骨、非生物（例えば、インプラント、義歯、パイプなど）の表面が含まれ得る。バイオフィルムは、生体表面または非生体表面上上に形成され、自然環境および工業環境中に存在することができる。
【００１７】
本開示の組成物および／または配合物によって防止、排除および／または処理することができるバイオフィルムには、口腔内、例えば、歯の表面、歯肉／歯周組織などの粘膜／軟組織の表面、および歯の管の内部（例えば、歯内管）に存在するバイオフィルムが含まれるが、これらに限定されない。ある実施形態では、本開示の組成物および／または配合物によって防止、排除および／または処理することができるバイオフィルムには、尿路、肺、胃腸管、慢性創傷上および／または慢性創傷内のバイオフィルムが含まれ、表面（インプラントなど）や、医療デバイスおよび医療ライン、例えば、カテーテル、医療機器および医療用チューブの内部に存在する。バイオフィルムの更なる非限定的な例には、工業装置および工業材料、例えば、水、下水、オイルなどの物質のためのパイプ内に存在するバイオフィルムが含まれる。ある実施形態では、本開示の組成物および／または配合物は、船舶および他のウォータークラフトの船体の処理または洗浄に使用され得る。
【００１８】
本明細書において「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容誤差範囲内を意味し、値がどのように測定ないし決定されるか（すなわち、測定システムの限界）に部分的に依存する。例えば、「約」は、所定の値の最大２０％、最大１０％、最大５％、および／または、１％までの範囲を意味し得る。
【００１９】
上述したように、本開示の組成物は、バイオフィルム中の細菌などの１つ以上の微生物の成長を低減させ、かつ／または当該微生物の生存を阻害するために使用することができる。例えば、限定されないが、細菌には、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｂｒｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス・サングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、ストレプトコッカス・ゴルドニ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、ストレプトコッカス・オラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ミチス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ）、アクチノマイセス・オドントリティカス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃｕｓ）、アクチノマイセス・ビスコーカス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｓｃｏｓｕｓ）、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）、ラクトバチルスｓｐｐ．（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ.）、ポルフィロモナスジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、プレボテラ・インテルメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、バクテロイデス・フォーサイス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｏｒｓｙｔｈｕｓ）、トレポネーマ・デンティコーラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、カンピロバクター・レクタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｒｅｃｔｕｓ）、オイコネラ・コロデンス（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ  ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ）、ベイロネラｓｐｐ．（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ.）、ミクロモナス・ミクロス（Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ  ｍｉｃｒｏｓ）、ポルフィロモナス・カンジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｎｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、フェモリラス・アクチノミセテムコミタンス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ)、アクチノマイセスｓｐｐ．（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ.）、バチリスｓｐｐ．（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ.）、マイクロバクテリウムｓｐｐ．（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ.）、フソバクテリウムｓｐｐ．（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ.）、ストレプトコッカスｓｐｐ．（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ.）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌｅｃｔｉａｅ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アシネトバクターｓｐｐ．（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ.）、エンテロコッカスｓｐｐ．（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ.）、プレボテーラｓｐｐ．（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ポルフィロモナスｓｐｐ．（Ｐｏｒｐ��ｙｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ.）、クロストリジウムｓｐｐ.（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ.）、ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、ポルフィロモナス・カンジンジバリス（Ｐ．ｃａｎｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、カンジタ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、エシェリヒア・コリー（Ｅ．ｃｏｌｉ）、および／または、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａｓ）が含まれ得る。ある実施形態では、細菌はＳ．ｍｕｔａｎｓであり、これは，口腔内、例えば歯の表面上に見出されるバイオフィルム内に存在する。
【００２０】
酸化鉄ナノ粒子（Ｉｒｏｎ  Ｏｘｉｄｅ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ；ＩＯ−ＮＰ）およびＩＯ−ＮＰ組成物
本開示の主題は、バイオフィルムを処理および／または排除および／またはバイオフィルム形成を防止するための、１つ以上のＩＯ−ＮＰ（本明細書では触媒ナノ粒子、ＣＡＴ−ＮＰおよびＭＮＰともいう）を含む組成物を提供する。例えば、限定されないが、本明細書に開示される組成物は、存在するバイオフィルム、例えば既に表面上に存在するバイオフィルムを処理するために使用することができる。ある実施形態では、本開示の組成物は、例えば、開示された組成物で表面をコーティングすることによって、バイオフィルムの発生および／または形成を防止するために使用することができる。
【００２１】
本明細書に開示されるように、本開示のＩＯ−ＮＰは、歯表面に結合し、また、バイオフィルム内に浸透・保持されてバイオフィルムの細胞外マトリックスを破壊して、バイオフィルム内に埋め込まれた細菌の増殖の減少および／または殺菌をすることができる、例えば、限定されないが、開示される主題のＩＯ−ＮＰは、バイオフィルム内に鉄を放出してバイオフィルム内の細菌の増殖を減少することができる。ある実施形態では、ＩＯ−ＮＰは、バイオフィルムの酸性ミクロ環境中で鉄を放出する。例えば、限定されないが、ＩＯ−ＮＰは、ｐＨ約５．５以下、ｐＨ約４．５以下またはｐＨ約４．０以下で鉄を放出することができる。ある実施形態では、ＩＯ−ＮＰはｐＨ約７で鉄を顕著に放出しない。
【００２２】
ある実施形態では、本開示のＩＯ−ＮＰは、酸化鉄から製造されたナノ粒子とすることができる。例えば、限定されないが、ＩＯ−ＮＰは、Ｆｅ３Ｏ４、Ｆｅ２Ｏ３、酸化鉄を含むナノ材料、または、その組み合わせから製造することができる。ある実施形態では、ＩＯ−ＮＰは、約０．０１〜約１０．０ｍｇ／ｍｌの鉄濃度を有することができる。例えば、限定するものではないが、ＩＯ−ＮＰは、約０．０１〜約９．０ｍｇ／ｍｌ、約０．０１〜約８．０ｍｇ／ｍｌ、約０．０１〜約７．０ｍｇ／ｍｌ、約０．０１〜約６．０ｍｇ／ｍｌ、約０．０１〜約５．０ｍｇ／ｍｌ、約０．０１〜約４．０ｍｇ／ｍｌ、約０．０１〜約３．０ｍｇ／ｍｌ、約１．０〜約２．０ｍｇ／ｍｌ、約２．０〜約１０．０ｍｇ／ｍｌ、約３．０〜約１０．０ｍｇ／ｍｌ、約４．０〜約１０．０ｍｇ／ｍｌ、約５．０〜約１０．０ｍｇ／ｍｌ、約６．０〜約１０．０ｍｇ／ｍｌ、約７．０〜約１０．０ｍｇ／ｍｌ、約８．０〜約１０．０ｍｇ／ｍｌまたは約９．０〜約１０．０ｍｇ／ｍｌの鉄濃度を有することができる。ある実施形態では、ＩＯ−ＮＰは、約５．０〜約６．０ｍｇ／ｍｌの鉄濃度を有することができる。
【００２３】
ある実施形態では、本開示のＩＯ−ＮＰはポリマーコーティングを含まない。ある実施形態では、本開示のＩＯ−ＮＰはポリマーコーティングを含むことができ、例えば、限定されないが、ポリマーコーティングは、キトサン、ポリ（アクリル酸）、デキストラン、ポリ（オリゴ（エチレングリコール）メタクリレート−ｃｏ−メタクリル酸）、ポリグリシジルメタクリレート、ポリ（ビニルアルコール）、ジオール、カテコール／ドーパミン、ヒドロキサム酸、ホスフィンオキシド、シラン、および、当業者に知られている他のコーティングを含むことができる。ある実施形態では、ポリマーコーティングは、デキストランまたは修飾デキストランとすることができる。例えば、限定されないが、デキストランは架橋、アミノ化、カルボキシル化、またはジエチルアミノエチル部分で修飾することができる。本開示のＩＯ−ＮＰとして使用することができる市販のデキストラン被覆酸化鉄ナノ粒子の非限定的な例には、Ｆｅｒｉｄｅｘ（登録商標）、Ｃｏｍｂｉｄｅｘ（登録商標）およびＦｅｒａｈｅｍｅ（登録商標）が挙げられる。ある実施形態では、本開示のＩＯ−ＮＰのコーティングに使用されるデキストランは、約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、例えば、約１ｋＤａ〜約９０ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約８０ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約７０ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約６０ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約４０ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約３０ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約２０ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約１０ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約５ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約３０ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約６０ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約７０ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約８０ｋＤａ〜約１００ｋＤａまたは約９０ｋＤａ〜約１００ｋＤａの分子量を有することができる。
【００２４】
ある実施形態では、本開示のＩＯ−ＮＰは、例えば、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による測定で、約１ナノメートル（ｎｍ）〜約１，０００ｎｍの直径を有することができる。例えば、限定されないが、ＩＯ−ＮＰは、約１ｎｍ〜約９００ｎｍ、約１ｎｍ〜約８００ｎｍ、約１ｎｍ〜約７００ｎｍ、約１ｎｍ〜約６００ｎｍ、約１ｎｍ〜約５００ｎｍ、約１ｎｍ〜約４００ｎｍ、約１ｎｍ〜約３００ｎｍ、約１ｎｍ〜約２００ｎｍ、約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、約１ｎｍ〜約７５ｎｍ、約１ｎｍ〜約５０ｎｍ、約１ｎｍ〜約２５ｎｍ、約２５ｎｍ〜約９００ｎｍ、約７５ｎｍ〜約９００ｎｍ、約１００ｎｍ〜約９００ｎｍ、約２００ｎｍ〜約９００ｎｍ、約３００ｎｍ〜約９００ｎｍ、約４００ｎｍ〜約９００ｎｍ、約５００ｎｍ〜約９００ｎｍ、約６００ｎｍ〜約９００ｎｍ、約７００ｎｍ〜約９００ｎｍまたは約８００ｎｍ〜約９００ｎｍである。ある実施形態では、ＩＯ−ＮＰは約２００ｎｍ〜約３００ｎｍの直径を有することができる。ある実施形態では、ＩＯ−ＮＰは約１８５ｎｍ〜約２４０ｎｍ、例えば、約２１３ｎｍの直径を有することができる。
【００２５】
ある実施形態では、本開示のＩＯ−ＮＰは約１ｎｍ〜約１，０００ｎｍの流体力学直径を有することができる。例えば、限定されないが、ＩＯ−ＮＰは、約１０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約１５ｎｍ〜約１００ｎｍ、約２０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約２５ｎｍ〜約１００ｎｍ、約３０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約３５ｎｍ〜約１００ｎｍ、約４０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約４５ｎｍ〜約１００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約５５ｎｍ〜約１００ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約６５ｎｍ〜約１００ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約７５ｎｍ〜約１００ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約８５ｎｍ〜約１００ｎｍ、約９０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約９５ｎｍ〜約１００ｎｍ、約５ｎｍ〜約９５ｎｍ、約５ｎｍ〜約９０ｎｍ、約５ｎｍ〜約８５ｎｍ、約５ｎｍ〜約８０ｎｍ、約５ｎｍ〜約７５ｎｍ、約５ｎｍ〜約７０ｎｍ、約５ｎｍ〜約６５ｎｍ、約５ｎｍ〜約６０ｎｍ、約５ｎｍ〜約５５ｎｍ、約５ｎｍ〜約５０ｎｍ、約５ｎｍ〜約４５ｎｍ、約５ｎｍ〜約４０ｎｍ、約５ｎｍ〜約３５ｎｍ、約５ｎｍ〜約３０ｎｍ、約５ｎｍ〜約２５ｎｍ、約５ｎｍ〜約２０ｎｍ、約５ｎｍ〜約１５ｎｍ、または約５ｎｍ〜約１０ｎｍの範囲内である。ある実施形態では、ＩＯ−ＮＰは約３０ｎｍ〜約５０ｎｍの流体力学直径を有することができる。
【００２６】
ある実施形態では、本開示のＩＯ−ＮＰ、例えばＩＯ−ＮＰのコアは、金属（例えば金属塩として）でドープすることができる。例えば、限定するものではないが、金属は、マンガン（Ｍｎ）、コバルト（Ｃｏ）、ニッケル（Ｎｉ）、マグネシウム（Ｍｇ）、ストロンチウム（Ｓｒ）、バリウム（Ｂａ）、スカンジウム（Ｓｃ）、チタン（Ｔｉ）、バナジウム（Ｖ）、クロム（Ｃｒ）、銅（Ｃｕ）、亜鉛（Ｚｎ）、アルミニウム（Ａｌ）、イットリウム（Ｙ）、ジルコニウム（Ｚｒ）、ニオブ（Ｎｂ）、モリブデン（Ｍｏ）、ルテニウム（Ｒｕ）、ロジウム（Ｒｈ）、パラジウム（Ｐｄ）、ハフニウム（Ｈｆ）、タンタル（Ｔａ）、タングステン（Ｗ）、レニウム（Ｒｅ）、オスミウム（Ｏｓ）、イリジウム（Ｉｒ）、白金（Ｐｔ）、銅（Ｃｕ）またはそれらの組み合わせである。ある実施形態では、金属はＭｎＣｌ２、ＣｏＣｌ２、ＮｉＣｌ２、ＭｇＣｌ２などの塩として存在することができるが、これらに限定されない。ある実施形態では、本開示のＩＯ−ＮＰは、リン酸カルシウムなどのカルシウム（Ｃａ）などのアルカリ土類金属でドープすることができるが、これに限定されない。ある実施形態では、ドーピング金属は、約１重量％〜約５０重量％、例えば、約１重量％〜約４０重量％、約１重量％〜約３０重量％、約１重量％〜約２０重量％、約１重量％〜約１０重量％、約１重量％〜約５重量％、約５重量％〜約５０重量％、約１０重量％〜約５０重量％、約２０重量％〜約５０重量％、約３０重量％〜約５０重量％、または約４０重量％〜約５０重量％の量でＩＯ−ＮＰ中に（例えば、ＩＯ−ＮＰのコア内に）存在することができる。ある実施形態では、金属でドープされたＩＯ−ＮＰは、約０．０１〜約１０．０ｍｇ／ｍｌ、例えば、約０．０１〜約９．０ｍｇ／ｍｌ、約０．０１〜約８．０ｍｇ／ｍｌ、約０．０１〜約７．０ｍｇ／ｍｌ、約０．０１〜約６．０ｍｇ／ｍｌ、約０．０１〜約５．０ｍｇ／ｍｌ、約０．０１〜約４．０ｍｇ／ｍｌ、約０．０１〜約３．０ｍｇ／ｍｌ、約１．０〜約２．０ｍｇ／ｍｌ、約２．０〜約１０．０ｍｇ／ｍｌ、約３．０〜約１０．０ｍｇ／ｍｌ、約４．０〜約１０．０ｍｇ／ｍｌ、約５．０〜約１０．０ｍｇ／ｍｌ、約６．０〜約１０．０ｍｇ／ｍｌ、約７．０〜約１０．０ｍｇ／ｍｌ、約８．０〜約１０．０ｍｇ／ｍｌ、または約９．０〜約１０．０ｍｇ／ｍｌのドーピング金属濃度を有することができる。ある実施形態では、金属でドープされたＩＯ−ＮＰは、約５．０〜約６．０ｍｇ／ｍｌのドーピング金属濃度を有することができる。
【００２７】
ある実施形態では、本開示のＩＯ−ＮＰは１つ以上のマトリックス分解酵素および／または過酸化物生成酵素にコンジュゲートすることができる。例えば、限定されないが、ＩＯ−ＮＰとコンジュゲートした酵素は、バイオフィルムマトリックス内の成分、例えばグルカンおよびフルクタンを分解してグルコースおよびフルクトースを生成し、Ｈ２Ｏ２をバイオフィルム内に放出することができる。そして、ＩＯ−ＮＰは、Ｈ２Ｏ２を触媒してマトリックス分解および／または殺菌のためのフリーラジカルを生成することができる。さらに、マトリックス分解酵素はバイオフィルムマトリックス分解に役立ち得る。適切な酵素の非限定的な例としては、デキストラナーゼ、ムタナーゼ、グルコース／フルクトース／ガラクトース−オキシダーゼおよびそれらの組み合わせが挙げられる。マトリックス分解酵素の更なる非限定的な例には、ＤＮＡｓｅ、ヌクレアーゼ、ディスパーシン、グリコシドヒドロラーゼ、プロテアーゼ、ズブチリシン、および、グルカノヒドロラーゼが含まれる。当技術分野で公知の任意の技術を用いて酵素をＩＯ−ＮＰにコンジュゲートすることができる。ある実施形態では、酵素は、酵素の帯電基へのＩＯ−ＮＰの静電的付着によりＩＯ−ＮＰにコンジュゲートすることができる。代替的にまたは追加的に、グルタルアルデヒドまたはカルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを用いて酵素をポリマー被覆ＩＯ−ＮＰにコンジュゲートしてＩＯ−ＮＰを活性化した後、活性化されたＩＯ−ＮＰを酵素のアミン基に架橋することができる。
【００２８】
本開示は、本明細書に記載の１つ以上のＩＯ−ＮＰ、例えば、ＩＯ−ＮＰおよび／または酵素にコンジュゲートされたＩＯ−ＮＰとＨ２Ｏ２とを含む組成物をさらに提供する。ある実施形態では、組成物中に存在するＩＯ−ＮＰはポリマーコーティング、例えばデキストランを有する。ある実施形態では、組成物中に存在するＩＯ−ＮＰはポリマーコーティングを有さない。ある実施形態では、組成物中に存在するＨ２Ｏ２は、過炭酸ナトリウムのような他の化学物質から生成され得る。例えば、限定するものではないが、本開示の組成物は過炭酸ナトリウムを含むことができ、過炭酸ナトリウムがＨ２Ｏ２を生成する。
【００２９】
ある実施形態では、組成物は、約０．０１％〜約３．０％（ｖ／ｖ）の濃度でＨ２Ｏ２を含むことができる。ある実施形態では、組成物は、約０．０５％〜約３．０％、５％、０．１％〜約０．２５％、約０．１％〜約０．５％、約０．１％〜約０．７５％、約０．１％〜約１．０％、約０．１％〜約１．５％、約０．１％〜約１．７５％、約０．１％〜約２．０％、約０．１％〜約２．２５％、約０．１％〜約２．５％、または約０．１％〜約２．７５％の濃度でＨ２Ｏ２を含むことができる。ある実施形態では、１つ以上のＩＯ−ＮＰはＨ２Ｏ２を触媒して、バイオフィルムの細胞外マトリックスの分解および／または消化し、かつ／または細菌を殺菌することができる１つ以上のフリーラジカルを形成する。例えば、限定されないが、１つ以上のフリーラジカルは、バイオフィルムの細胞外マトリックスを分解すると同時に細菌を殺菌することができる。ある実施形態では、ＩＯ−ＮＰはＨ２Ｏ２を触媒してフリーラジカル、例えば、限定するものではないが、ヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）を生成することができる。
【００３０】
ある実施形態では、本開示の組成物は、サイズ（例えば、直径）および組成が異なるＩＯ−ＮＰを含むことができる。例えば、限定するものではないが、本開示の組成物は、ポリマーコーティングを有するＩＯ−ＮＰと、ポリマーコーティングを有さないＩＯ−ＮＰとの混合物を含むことができる。ある実施形態では、本開示の組成物は、異なるポリマーコーティングを有するＩＯ−ＮＰの混合物を含むことができ、例えば、組成物内の１つ以上のＩＯ−ＮＰはデキストランコーティングを有することができ、組成物内の１つ以上のＩＯ−ＮＰは変性デキストランコーティングを有することができる。代替的または追加的に、ある実施形態では、本開示の組成物は、組成が異なるＩＯ−ＮＰを含み得る。例えば、本開示の組成物は、様々な金属、例えばＭｇおよび／またはＭｎでドープされたＩＯ−ＮＰの混合物を含むことができる。
【００３１】
配合物および製品
本開示の主題は、開示されたＩＯ−ＮＰ組成物、例えば、１つ以上のＩＯ−ＮＰを含む組成物および／または１つ以上のＩＯ−ＮＰおよびＨ２Ｏ２を含む組成物を組み込んだ配合物をさらに提供する。例えば、限定するものではないが、配合物には、組成物を口腔内に送達するための口腔ケア製品および製品、および、組成物を医療デバイス、船舶材料および／または船舶または工業材料に送達するための市販の製品が含まれる。ある実施形態では、組成物は、医療デバイス（例えば、医療用チューブ、カテーテル）製造用材料、口腔用補綴物（例えば、義歯、インプラント）製造用材料、および、工業材料（例えば、パイプ、船体）製造用材料に組み込むことができる。ある実施形態では、本開示の配合物は局所的に適用することができ、例えば、治療として慢性創傷または皮膚疾患に適用することができる。ある実施形態では、本開示の配合物は、工業材料または船体の１つ以上の表面をコーティングするためのスプレーおよび／または塗料として使用することができる。
【００３２】
ある実施形態では、本開示の組成物および／または配合物は、上述のＩＯ−ＮＰを、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、例えば、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約４ｍｇ／ｍｌ、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約０．７５ｍｇ／ｍｌ、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約０．５ｍｇ／ｍｌ、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約０．１ｍｇ／ｍｌ、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約０．０５ｍｇ／ｍｌ、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、または約４ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの濃度で含むことができる。ある実施形態では、本開示の配合物および／または組成物はＩＯ−ＮＰを約０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で含むことができる。
【００３３】
ある実施形態では、本開示の配合物は、上述の組成物と、フッ化物、例えばフッ化ナトリウムとを含むことができる。ある実施形態では、フッ化物は、約１０ｐｐｍ（ｐａｒｔｓ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ）〜約５，０００ｐｐｍ、例えば、約１００ｐｐｍ〜約４，５００ｐｐｍ、約１００ｐｐｍ〜約４，０００ｐｐｍ、約１００ｐｐｍ〜約３，５００ｐｐｍ、約１００ｐｐｍ〜約３，０００ｐｐｍ、約１００ｐｐｍ〜約２，５００ｐｐｍ、約１００ｐｐｍ〜約２，０００ｐｐｍ、約１００ｐｐｍ〜約１，５００ｐｐｍ、約１００ｐｐｍ〜約１，０００ｐｐｍ、約１００ｐｐｍ〜約５００ｐｐｍ、または約２００ｐｐｍ〜約４００ｐｐｍの濃度で、本開示の配合物中に存在することができる。ある実施形態では、フッ化物は約２００ｐｐｍ〜約３００ｐｐｍ、例えば、約２５０ｐｐｍの濃度で存在する。ある実施形態では、フッ化物は約５，０００ｐｐｍの濃度で存在する。
【００３４】
ある実施形態では、本開示のＩＯ−ＮＰ組成物、例えば酵素にコンジュゲートした１つ以上のＩＯ−ＮＰを含む組成物は、当該組成物を口腔に送達するための配合物に組み込むことができる。例えば、限定されるものではないが、組成物を液体配合物またはゲル配合物、スプレーに組み込むことができる。ある実施形態では、液体配合物は担体を含むことができ、例えば、限定されないが、生理食塩水、デキストロース、水、等張食塩水、植物油または鉱油などの油、油性エステル、エチルアルコールなどのアルコールである。ある実施形態では、液体配合物は、懸濁剤、分散または湿潤剤、乳化剤、粘滑剤、保存剤、緩衝剤、塩、着香剤、着色剤、甘味剤、増粘剤を含む、１つ以上の他の成分をさらに含むことができる。ある実施形態では、本開示のＩＯ−ＮＰ組成物は口腔ケア製品に組み込むことができる。口腔ケア製品の非限定的な例には、練り歯磨き、口内洗浄剤、歯美白製品、研磨性歯磨ジェル、義歯洗浄剤、非研磨性歯磨ジェル、義歯洗浄剤または浸漬液、義歯接着剤またはセメント、ゲル、エマルジョン、ワニス、修復材料（例えば、セラミック、樹脂など）、歯科充填材、口腔ゲルストリップ製品、チューインガム、キャンデー、および、飲料が含まれる。口腔用途が意図される配合物は当技術分野で公知の任意の方法に従って調製することができる。
【００３５】
ある実施形態では、本開示のＩＯ−ＮＰ組成物は、当該組成物を医療デバイスまたは工業材料に送達するための配合物に組み込むことができる。例えば、組成物は上述したように液体配合物に組み込むことができる。ある実施形態では、組成物は、様々なｐＨ値およびイオン強度を有する希釈剤（例えば、トリス、クエン酸塩、酢酸塩またはリン酸塩緩衝液）；ＴＷＥＥＮ（商標）またはポリソルベートなどの可溶化剤；チメロサール、パラベン、ベンジルアルコニウムクロライドまたはベンジルアルコールなどの保存剤；アスコルビン酸またはメタ重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；および、リジンまたはグリシンなどの他の成分を含む、潤滑剤、軟膏、クリームまたはゲルに組み込むことができる。代替的にまたは追加的に、カテーテルまたはチューブの表面および／またはその内部のバイオフィルムの形成を防止するために、カテーテルまたは医療用チューブ材料に本開示のＩＯ−ＮＰ組成物を含浸させることができる。
【００３６】
使用方法
本開示の主題は、開示された組成物および／または配合物を使用する方法をさらに提供する。本開示の方法は、バイオフィルムおよび／またはバイオフィルム関連感染症を治療および／または防止するために使用することができる。例えば、限定するものではないが、本開示の組成物または配合物の投与は、バイオフィルムの形成を阻害し、バイオフィルムの更なる蓄積を阻害し、存在するバイオフィルムの破壊または分解を促進し、および／または存在するバイオフィルムを弱体化する。例えば、限定するものではないが、本開示の組成物および／または配合物は、口腔疾患を促進するバイオフィルムを処理するために使用することができる。口腔疾患には、口腔または関連する医学的状態に影響を及ぼす疾患および障害が含まれ得るが、これらに限定されない。例えば、口腔疾患には、齲蝕や、歯肉炎、成人歯周炎、早期発症性歯周炎、インプラント周囲炎および歯内感染症などの歯周病が含まれるが、これらに限定されない。
【００３７】
ある実施形態では、本開示の組成物または配合物は、例えば、義歯の口内炎および口腔カンジダ症を含む、バイオフィルム関連粘膜感染症を治療および／または防止するために使用することができる。ある実施形態では、開示される主題の方法は、限定するものではないが、齲蝕、粘膜感染症、口腔疾患、尿路感染症、カテーテル感染症、中耳炎、創傷、人工関節および人工弁などの移植医療デバイスの感染症、および、ヒト感染症などを含む、バイオフィルム関連疾患などの疾患または障害を治療および／または防止するために使用することができる。
【００３８】
本明細書において「治療」（および「治療する」などのその文法的変形）は、治療対象の個体の自然経過を変えようとする臨床的介入を意味し、予防のためにまたは疾患の治療過程中に行うことができる。治療の望ましい効果には、疾患の発生または再発の防止、症状の緩和、疾患の直接的または間接的な病理学的影響の減少、疾患の進行速度の低下または疾患状態の改善が含まれるが、これらに限定されない。ある実施形態では、本開示の組成物および配合物は、疾患の発症を遅延させるために、または疾患の進行を遅らせるために使用することができる。ある実施形態では、治療は、存在するバイオフィルムの排除、除去および／または低減を指し得る。ある実施形態では、防止とは、表面上のバイオフィルムの発生または形成を妨げることを指し得る。
【００３９】
本明細書において交換可能に使用される「個体」、「患者」または「対象」は哺乳動物を指す。哺乳動物には、限定されないが、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒトや、サルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）が含まれる。ある実施形態では、個体または対象はヒトである。
【００４０】
ある実施形態では、対象における口腔疾患の防止および治療、および／または、バイオフィルムの防止および治療をする方法は、有効量の本開示の組成物および／または配合物を対象に投与するステップを含み得る。ある実施形態では、この方法は、ＩＯ−ＮＰおよび／または酵素にコンジュゲートしたＩＯ−ＮＰを含む組成物または配合物を対象に投与するステップを含む。ある実施形態では、本開示の組成物および／または配合物は、限定されないが、約１０分未満、約９分未満、約８分未満、約７分未満、約６分未満、約５分未満、約４分未満、約３分未満、約２分未満または約１分未満などの期間の短い時間間隔で対象に投与することができる。
【００４１】
本明細書で使用される「有効量」は、必要な用量および期間において、所望の治療または予防結果を達成するのに有効な量を指す。疾患の防止または治療のために、本開示の組成物または製剤の適切な量（例えば有効量）は、治療または防止対象の疾患のタイプ、疾患の重篤度および経過に依存する。投薬レジメンは最適な治療レスポンスが得られるように調節され得る。
【００４２】
ある実施形態では、上記方法は、過酸化水素を含む溶液の投与などにより、対象に過酸化水素の投与するステップをさらに含むことができる。代替的または追加的に、過酸化水素はＩＯ−ＮＰを含む組成物および／または配合物中に存在することができる。例えば、限定するものではないが、過酸化水素は、過炭酸ナトリウムを使用して、ゲル様製品、例えば練り歯磨きに配合することができ、ゲル様製品はさらに１つ以上のＩＯ−ＮＰを含む。ある実施形態では、過炭酸ナトリウムは、組成物および／または配合物内に存在して、水の存在下でまたは口内に入れたときに過酸化水素を放出することができる。このような組成物および／または配合物は、水溶液と接触したときに、または口内に入れたときに組成物および／または配合物から過酸化水素を放出させることができ、それにより、過酸化水素とＩＯ−ＮＰとの反応をｉｎ  ｓｉｔｕで発生させることができる。
【００４３】
ある実施形態では、溶液、組成物および／または配合物は、約０．１％〜約０．２５％、約０．１％〜約０．５％、約０．１％〜約０．７５％、約０．１％〜約１．０％、約０．１％〜約１．５％、約０．１％〜約１．７５％、約０．１％〜約２．０％、約０．１％〜約２．２５％、約０．１％〜約２．５％、約０．１％〜約２．７５％または約０．１％〜約３．０％の濃度で過酸化水素を含むことができる。ある実施形態では、溶液、組成物および／または配合物は、約０．１％〜約１．０％の濃度で過酸化水素を含むことができる。ある実施形態では、溶液、組成物および／または配合物は、約０．１％〜約０．５％の濃度で過酸化水素を含むことができる。
【００４４】
ある実施形態では、上記方法は、有効量のフッ化物を投与するステップをさらに含むことができる。ある実施形態では、フッ化物は、ＩＯ−ＮＰおよび／または過酸化水素を含む組成物および／または配合物中に存在し得る。例えば、限定されるものではないが、フッ化物は、上述したように、ゲル様製品中に配合することができ、ゲル様製品中はさらに１つ以上のＩＯ−ＮＰおよび／または過酸化水素を含む。ある実施形態では、フッ化物は、約１０ｐｐｍ（ｐａｒｔｓ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ）〜約１０，０００ｐｐｍ（例えば、約５，０００ｐｐｍ）の濃度で、本開示の組成物および／または配合物中に存在し得る。
【００４５】
ある実施形態では、本開示の組成物または配合物は、１回のまたは一連の治療にわたって対象に投与することができる。ある実施形態では、複数に分割して毎日投与してもよく、または治療状況の緊急性によって用量を比例的に減少させてもよい。例えば、限定するものではないが、本明細書に開示される組成物および配合物は、毎日２回、毎日１回、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、６日に１回、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、毎月に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、６ヶ月に１回または１年に１回、対象に投与することができる。ある実施形態では、本開示の組成物または配合物、例えば、マトリックス分解酵素および／または過酸化物生成酵素にコンジュゲートされた１つ以上のＩＯ−ＮＰおよび／または１つ以上のＩＯ−ＮＰを含む組成物を毎日２回対象に投与することができる。ある実施形態では、１つ以上のＩＯ−ＮＰを、例えば口内洗浄配合物に含む組成物を、毎日１回または２回対象に投与し、続いて、Ｈ２Ｏ２を、毎日１回または２回、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、６日に１回、または週に１回投与することができる。ある実施形態では、１つ以上のＩＯ−ＮＰ、および、Ｈ２Ｏ２を生成する過炭酸ナトリウムを含む組成物を、例えばゲル系配合物で、対象に、毎日１回または２回、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、６日に１回、または週に１回投与することができる。
【００４６】
本開示はさらに、バイオフィルム内の細菌増殖の防止方法を提供する。ある実施形態では、本方法は、バイオフィルムを有する表面を、１つ以上の鉄ナノ粒子を含む有効量の本明細書に開示する組成物および／または配合物と接触させるステップを含むことができる。ある実施形態では、１つ以上の鉄ナノ粒子は表面に結合して鉄を放出し、バイオフィルム内の細菌の増殖を阻害する。
【００４７】
本開示はさらに、表面上でバイオフィルムの形成を防止する方法を提供する。ある実施形態では、表面上でバイオフィルムの形成を防止する方法は、バイオフィルムが発達する「リスクのある」表面を、１つ以上の鉄ナノ粒子を含む、有効量の本明細書に開示される組成物および／または配合物で処理するステップを含む。ある実施形態では、本方法は「リスクのある」表面をＨ２Ｏ２と接触させるステップをさらに含むことができる。例えば、限定されるものではないが、１つ以上の鉄ナノ粒子を含む有効量の本明細書に開示される組成物および／または配合物を、スプレーまたは塗装などによって表面にコーティングすることができる。バイオフィルムが発達する「リスクのある」表面には、限定されないが、アパタイト表面、例えば、骨および歯の表面、歯内管、インプラント表面、医療デバイス表面、例えば、カテーテルおよび機器、ならびに、工業材表面および船舶表面（ｎａｖａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ）、例えば、パイプ表面および船体表面が含まれる。ある実施形態では、表面は、医療デバイスや工業材料および／または船舶材料の内面および／または外面であり得る。
【００４８】
本開示の主題は、歯の脱灰を防止する方法をさらに提供する。ある実施形態では、脱灰を防止する方法は、バイオフィルムを有する歯エナメル質またはアパタイト（例えば、骨）表面を、１つ以上の鉄ナノ粒子を含む有効量の組成物と接触させるステップを含むことができる。ある実施形態では、１つ以上の鉄ナノ粒子は、表面に結合してエナメル質またはアパタイトの溶解を阻害および／または防止する。
【００４９】
本明細書に開示される主題はさらに、医療デバイスまたは料および／または船舶材料の表面上において、バイオフィルムを処理および排除し、かつ／またはバイオフィルムの形成を防止する方法を提供する。ある実施形態では、本方法は、医療デバイス、例えば、カテーテル、インプラント、人工関節、チューブ、移植デバイス、または、工業材料および／または船舶材料、例えばパイプ、容器、リアクタ、タービンまたは船体を、本明細書中に開示される組成物または配合物と接触させるステップを含むことができる。ある実施形態では、上記方法は、医療デバイスまたは工業材料の表面を、酵素にコンジュゲートされたＩＯ−ＮＰまたはＩＯ−ＮＰを含む組成物または配合物と接触させるステップを含むことができる。ある実施形態では、上記方法は、医療デバイスまたは工業材料の表面をＨ２Ｏ２と接触させるステップをさらに含むことができる。ある実施形態では、本開示の組成物または配合物を医療デバイスまたは工業材料および／または船舶材料を製造するための材料に組み込み、医療デバイスまたは工業材料および／または船舶材料の表面上のバイオフィルムの形成を防止、最小化および／または低減することができる。
【００５０】
キット
本明細書に開示される主題は、上記のバイオフィルムの処理および／または防止のためのキットをさらに提供する。例えば、限定するものではないが、本開示のキットは、本明細書に開示される１つ以上の組成物または配合物を、例えば、１つ以上の容器内に含むことができる。
【００５１】
ある実施形態では、キットは、本明細書に記載された１つ以上の組成物または配合物を含む容器と、当該容器上のまたは当該容器と関連付けられたラベルまたは添付文書とを含むことができる。ある実施形態では、本明細書に開示される主題のキットは、本開示の主題のＩＯ−ＮＰ組成物または配合物を含む容器を含むことができる。ある実施形態では、本発明の主題のキットは、本明細書に開示された主題のＩＯ−ＮＰ組成物または配合物を含む第１の容器と、過酸化水素を含む第２の容器とを含むことができる。ある実施形態では、キットは、投薬レジメンなどの使用説明書をさらに含むことができる。適切な容器の非限定的な例には、ボトル、バイアル、溶液バッグなどが含まれる。容器は、ガラスやプラスチックなどの様々な材料で形成することができる。
【００５２】
以下の実施例は、本発明をより完全に説明するために提供されるが、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【００５３】
実施例１
バイオフィルムは微生物が表面上に蓄積するにつれて発達し、エキソポリサッカリド（ＥＰＳ）などのポリマー物質を含む細胞外マトリックス内に封入された構造化集団を形成する。細胞外マトリックスは空間的・微環境的な不均一性を作り、またバイオフィルム内に拡散制限バリアを提供することにより、病原体の増殖および抗菌剤に対する防御を局所的にモジュレートする。そのため、マトリックスはバイオフィルムおよびバイオフィルム関連疾患の処理／治療に対する薬剤有効性を実質的に阻害する。
【００５４】
複雑な口腔マイクロバイオーム内では、ストレプトコッカス・ミュータンス（ｓ．ｍｕｔａｎｓ）が常に最も多く存在する生物であるとは限らないが、ストレプトコッカス・ミュータンスは、スクロースに頻繁に曝されると、薄膜で被覆された歯の上において、薄膜および細菌表面上のＥＰＳ合成を介する齲蝕原性バイオフィルムの形成を迅速に指揮することができる。ｉｎ  ｓｉｔｕで形成されたＥＰＳは、空間的に不均一な拡散を制限するマトリックスを形成しながら、歯上への微生物の局所的な蓄積を促進する。並行して、糖がマトリックスに埋め込まれた細菌によって発酵し、高酸性のミクロ環境が作り出される（図１）。齲蝕原性（酸耐性および酸産生）フローラが繁殖しつつ、低ｐＨのニッチがＥＰＳ合成を誘導する。その結果、局所的な酸性によって連続的なバイオフィルムの付着と、隣接歯のエナメル質の酸溶解が起こり、齲蝕が発症する。さらに、細胞外マトリックスにより形取られた局所的な細菌クラスターは抗菌剤に対して抵抗性となり、バイオフィルムの排除が極めて困難となる。マトリックスは薬物の有効性を阻害しつつ保護的な疾患発症環境を作り出すため、これらのプロセスは他のバイオフィルムおよび関連する感染症を代表するものである。
【００５５】
バイオフィルムおよび微生物（例えば、ＥＰＳ細胞外マトリックス内に取り込まれた微生物）を効果的に排除するためには、酸性環境内で、抗バイオフィルム剤を局所的に保持し、マトリックス構築物を破壊し、存在するマトリックスおよび／または標的の埋め込まれた細菌を分解する必要があろう。同時に、エナメル質の酸溶解は局所的に阻止されるべきである。本実施例は、病原性口腔バイオフィルムを排除するための、ペルオキシダーゼ様活性などの生体模倣特性（Gao et al, Nature Nanotech, 2007）を有する酸化鉄ナノ粒子（ＩＯ−ＮＰ；本明細書ではＭＮＰおよびＣＡＴ−ＮＰともいう）を含む抗バイオフィルム剤を開示する。ＩＯ−ＮＰは、そのナノ触媒特性、生物活性および安全性のために、生物医学およびグリーンケミストリーの多くの分野において注目を集めている。さらに、ＩＯ−ＮＰは経済的であり（低コスト、製造容易）、環境に安全である（Hudson et al., Green Chemistry, 2014）。また、臨床用途のＦＤＡ承認を受けた最初のナノ物質の１つでもある。
【００５６】
この実施例の抗バイオフィルム組成物は、Ｈ２Ｏ２と相乗作用して齲蝕原性バイオフィルムを効果的に破壊する生体模倣性（触媒性）およびｐＨ応答性を有する生体適合性ＩＯ−ＮＰを使用するものであり、ＩＯ−ＮＰを、低ｐＨでＥＰＳ細胞外マトリックスを分解できると共にバイオフィルム内の細菌を効果的に殺すことができるＨ２Ｏ２と併用したバイオフィルム排除のための刺激的で革新的なアプローチを提供する（図１および図２）。
【００５７】
ＩＯ−ＮＰは、非常に低コストでスケールアップすることができる簡単かつ適切な手法によって、容易に入手可能な材料を用いて合成することができる。ＩＯ−ＮＰは従来の水熱法（Gao et al., Nanoscale, 2014）によって生成した。簡潔に説明すると、塩化第二鉄（ＦｅＣｌ３）および酢酸ナトリウムをオートクレーブ反応器中でエチレングリコールと混合し、一定時間２００℃でインキュベートする。その後、さらに適用するために、生成したＩＯ−ＮＰを収集する。図３は、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）下で視覚化した上記の方法によって生成されたＩＯ−ＮＰを示す。
【００５８】
Ｈ２Ｏ２と組み合わせたＩＯ−ＮＰの有効性を試験するために、十分に確立されたバイオフィルム形成性・酸生成性・マトリックス生成性の口腔内病原体であるストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）を用いて、唾液被覆ヒドロキシアパタイト（ｓａｌｉｖａ  ｃｏａｔｅｄ  ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ；ｓＨＡ）表面（歯のエナメル様物質）上に成熟バイオフィルムを形成した。潜在的な臨床的治療レジメンをシミュレートするために、短時間（１分または５分）、低ｐＨ（４．５〜６．５）の低用量のＨ２Ｏ２（≦０．５％）と組み合わせたＩＯ−ＮＰの局所適用を１日２回行った。ＩＯ−ＮＰはｓＨＡに効果的に結合することができ、短時間の局所曝露にもかかわらず、バイオフィルム内に保持された（図４）。
【００５９】
図５Ａに示されるように、Ｈ２Ｏ２と組み合わせたＩＯ−ＮＰの局所適用は、対照と比較してバイオフィルム内に埋め込まれたＳ．ｍｕｔａｎｓを有意に殺菌(＞６−ｌｏｇの減少)し、Ｈ２Ｏ２単独に対しては＞４−ｌｏｇの減少を示し、生存細菌集団のほぼ全体を排除した。さらに、Ｈ２Ｏ２と組み合わせたＩＯ−ＮＰは、齲蝕原性バイオフィルムマトリックスの主要なＥＰＳ成分である細胞外グルカンの分解を劇的に増加させることができ（図５Ｂ）、これは、バイオフィルムの構造的完全性を効果的に破壊し得る（Xiao et al., PLoS Pathog, 2012）。これらのデータは、多くの臨床用途で広く使用されている安価で容易に入手可能な「グリーンケミカル物質」であるＨ２Ｏ２の抗菌効力および抗バイオフィルム活性を劇的に高めるＩＯ−ＮＰの可能性を実証している。
【００６０】
低ｐＨで効果的であることに加えて、ＩＯ−ＮＰはまた、低ｐＨで培地中の細菌の生存を阻害する能力を有する。図６Ａに示すように、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの増殖は、中性ｐＨでの細菌増殖と比較して、ＩＯ−ＮＰを用いた酸性ｐＨ（ｐＨ５）で明らかに阻害された。さらに、生理的温度（３７℃）、低ｐＨ（ｐＨ４．５）でＩＯ−ＮＰから鉄が放出され（図６Ｂ）、これは、酸性ｐＨでの細菌増殖に対するＩＯ−ＮＰの阻害メカニズムを説明し得る。さらに、図６Ｃに示すように、ＩＯ−ＮＰはＨ２Ｏ２を触媒してフリーラジカルの生成を劇的に増加させる（図６Ｃ）。これらのデータは、Ｈ２Ｏ２と組み合わせたＩＯ−ＮＰが、病原性口腔バイオフィルム内に見出される酸性ミクロ環境下でフリーラジカルを生成し得るという証拠となる。
【００６１】
図７に示すように、ＩＯ−ＮＰはまた、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）ビーズの酸溶解を同時にブロックすることができる。ＨＡビーズは、未処理ＨＡビーズと比較して、酸性緩衝液中でのインキュベーション後にほぼ完全に溶解した（図７Ａ〜Ｂ）。これとは全く対照的に、ＨＡビーズの酸溶解はＩＯ−ＮＰの存在下で大きく阻害され、これは、歯エナメル質の脱灰を防止するために、本開示の抗バイオフィルム組成物が使用できる可能性を示している（図７Ｃ）。これらのデータは、本開示の抗バイオフィルム組成物が理想的な抗バイオフィルム／齲蝕治療アプローチであり得ることを示す。これは、酸性ミクロ環境下での脱灰を防ぎつつ、マトリックスの破壊を促進し、かつバイオフィルム内で抗菌作用を有する包括的な多機能戦略を統合する。特定の理論に拘束されることなく、上記抗バイオフィルム剤には以下の５つの生物学的特徴がある。すなわち、（１）ＩＯ−ＮＰ（すなわち、ＭＮＰ）はバイオフィルム形成のリスクのある表面である歯薄膜に効果的に結合し、短時間の局所曝露後でもバイオフィルム内に保持されること；（２）ＩＯ−ＮＰはｐＨ応答性であり、細菌増殖を抑制する鉄を酸性ｐＨで放出すること；（３）ＩＯ−ＮＰはＨ２Ｏ２を触媒してマトリックス成分を効率的に分解するフリーラジカルを生成すること；（４）ＩＯ−ＮＰはバイオフィルム内に埋め込まれた細菌を迅速に殺菌することができること；および、（５）アパタイトの脱灰を防止すること、である（図１）。
【００６２】
本開示のＩＯ−ＮＰ−Ｈ２Ｏ２アプローチは、バイオフィルム除去のための非常に有効な戦略を提供することができる。ＩＯ−ＮＰは、病原性口腔バイオフィルムを抑制するための現在の化学的治療法よりも有利かつ効果的であり得る。第１に、ＩＯ−ＮＰは、短時間の局所曝露後であってもバイオフィルム内に結合・保持できる。第２に、ＩＯ−ＮＰは、低濃度（０．１〜０．５％）のＨ２Ｏ２を迅速に触媒して、バイオフィルム・マトリックスの破壊および埋め込まれた細菌の殺菌効力を高めるフリーラジカルを生成し、臨床治療で典型的に使用されるＨ２Ｏ２の量を効果的に減少させることができる（最大１０％）。第３に、ＩＯ−ＮＰにより開始される生物活性が酸性条件下で（正確に最も必要とされるときに）最も効果的となる、ｐＨ応答性プロセスであることである。第４に、歯エナメル質および骨の脱灰の防止に重要である、ハイドロキシアパタイトの酸溶解を減少させることができることである。さらに、ＩＯ−ＮＰは、ｉｎ  ｓｉｔｕでのＨ２Ｏ２触媒作用により歯の表面からのステイン除去を促進し得る。ＩＯ−ＮＰおよびＨ２Ｏ２は、非常に低コストで大規模に容易に合成することができる、ＦＤＡにより承認された持続可能な材料であるため、練り歯磨きやマウスウォッシュを含む、様々な口腔ケア製品に組み込むことができる。細胞外マトリックスや微生物殺菌の抵抗性は他のヒト疾患および産業関連問題に関連するバイオフィルムの全てではないにしても大部分に内在するものであるため、ＩＯ−ＮＰ−Ｈ２Ｏ２の使用は広範な適用性を有する。
【００６３】
実施例２
口内へはアクセスが容易であるため、口腔バイオフィルムはバイオフィルム抑制の新しい概念を探索するための優れたモデルとなる。歯に形成された病原性バイオフィルムは、ＥＰＳ豊富なマトリックスの発達過程全体において、Ｓ．ｍｕｔａｎｓなどの毒性種が如何にして表面上に蓄積・保持されるかの例である（Koo et al., J Dent Res, 2013）。マトリックスに埋め込まれた病原体はｐＨ値が４．５付近の高酸性のミクロ環境を生成し、エナメル質−アパタイトの酸溶解をもたらし、齲蝕として知られる歯腐食プロセスの発症および進行をもたらし得る（Koo et al., J Dent Res, 2013; Fejerskov et al., J Dent Res, 1992)。これらの病理学的状態を模倣する実験モデルを用いることにより、本実施例は、触媒ナノ粒子（ＣＡＴ−ＮＰ）の抗バイオフィルムメカニズムおよびＣＡＴ−ＮＰのＨ２Ｏ２活性化有効性を実証する。本実施例はまた、Ｈ２Ｏ２と組み合わせたＣＡＴ−ＮＰがバイオフィルム関連口腔疾患の発症を防止する有効性を示す。
【００６４】
バイオフィルム内の鉄ナノ粒子の効果的な保持および鉄ナノ粒子のｉｎ  ｓｉｔｕの活性は、インビボでの鉄ナノ粒子の生物学的有効性に寄与する（Hannig and Hannig, Nature Nanotechnol, 2010; Allaker and Memarzadeh, Int J. Antimicrob Agents, 2014）。ＣＡＴ−ＮＰが短期曝露（５分または１０分）の局所処置後にバイオフィルム内に保持されているかどうかを調べるために以下の実験を行った。下記のとおりソルボサーマル法によりＣＡＴ−ＮＰを合成した（Gao et al., Nat Nanotechnol, 2007; Deng et al., Angew Chem Int Edit, 2005も参照）。この方法を用いて直径２１３±２６ｎｍの内在性ペルオキシダーゼ様活性を有するナノ粒子を生成した（図８）。簡潔に説明すると、０．８２ｇのＦｅＣｌ３を４０ｍｌのエチレングリコールに溶解して透明な溶液を得た。次いで、３．６ｇのＮａＡｃを３０分間激しく撹拌しながら溶液に添加した。この混合物をテフロン（登録商標）で裏打ちされたステンレス鋼製オートクレーブ（５０ｍｌ）に移し、２００℃で１２時間インキュベートした。室温に冷却した後、沈殿物を回収し、エタノールで数回リンスし、次いで６０℃で３時間乾燥させた。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ；Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＸＬ−３０フィールド、１５ｋＶ）および透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ；ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｈ７６５０、１２０ｋＶ）を用いて合成したナノ粒子の特性解析を行った。鉄ナノ粒子のペルオキシダーゼ様活性を、２０μｇのＣＡＴ−ＮＰ、１％のＨ２Ｏ２および１００μｇのＴＭＢを含む５００μｌ  ＮａＯＡｃ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ４．５）の混合物中で試験した。生成した青色は６５２ｎｍの吸光度で分光光度計により記録した。これらの条件はバイオフィルム上のＣＡＴ−ＮＰの活性のアッセイにも使用した。ＣＡＴ−ＮＰの活性を確認するために、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）およびＡＭＰＬＥＸ（登録商標）ＵｌｔｒａＲｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；５６８／５８１ｎｍ）の２つの追加の基質も同じ反応条件下で使用した。化学物質および材料は、別段の指定がない限り、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社のものを使用した。
【００６５】
十分に確立されたバイオフィルム形成性・酸生成性・マトリックス生成性の口腔内病原体であるストレプトコッカス・ミュータンスを用いて、バイオフィルムを唾液被覆ヒドロキシアパタイト（ｓＨＡ）表面（歯エナメル質様物質）上に形成した（図９）。ヒドロキシアパタイトディスク（表面積２．７±０．２ｃｍ２）はＣｌａｒｋｓｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙから購入し、細菌株ストレプトコッカス・ミュータンスＵＡ１５９はＡＴＣＣから購入した。このバイオフィルム法は、唾液被覆ハイドロキシアパタイト（ｓＨＡ）ディスクモデルに基づく（Xiao et al., PLoS Pathog. 2012; Klein et al., J Vis Exp. 2011; Falsetta et al., Infect Immun., 2014; Koo et al., J Bacteriol, 2010; Koo et al., J Antimicrob Chemother, 2003を参照）。ハイドロキシアパタイトディスクをフィルター滅菌した浄化全唾液でコーティングし、歯の自由な平滑表面を模倣するように設計されたカスタムメイドのワイヤーディスクホルダーを用いて２４ウェルプレートに垂直に懸濁した（図９）（Klein et al., J Vis Exp. 2011）。ストレプトコッカス・ミュータンスＵＡ１５９細胞を、１％スクロースを含有する限外濾過（１０−ｋＤａカットオフ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）トリプトン−酵母抽出物（ＵＦＹＴＥ）ブロス中、３７℃、５％ＣＯ２で、中間指数増殖期まで増殖させた。各ｓＨＡディスクを、ストレプトコッカス．ミュータンス（１０５ＣＦＵ  ／ｍｌ）の規定された微生物集団を有する接種材料を含む１％（ｗ／ｖ）スクロースを含む２．８ｍｌのＵＦＹＴＥ培地に入れ、３７℃、５％ＣＯ２で１９時間インキュベートした。実験期間（４３時間）が終了するまで、培地を新鮮な培地と１日２回交換した（１９時間目および２９時間目）。特定の時点（１９時間、２９時間および４３時間）で、バイオフィルムを収集し、共焦点蛍光イメージング、微生物学的分析および生化学的分析によって分析した（Xiao et al., PLoS Pathog. 2012; Klein et al., J Vis Exp.2011; Falsetta et al., Infect Immun., 2014; Koo et al., J Bacteriol, 2010; Koo et al., J Antimicrob Chemother, 2003）。
【００６６】
病原性の状態を模倣するために、スクロースの存在下でバイオフィルムを形成する。スクロースは、エキソポリサッカライド（ＥＰＳ）合成および酸生成（ｐＨ値はこのバイオフィルムモデルにおいて４．５〜５．０に達し、ヒトの病変部位におけるプラークのｐＨと一致する）の基質を提供する（Koo et al., J Dent Res. 2013）。走査型電子顕微鏡法（図１０Ａ１）、エネルギー分散型分光法（ＥＤＳ）（図１０Ａ２）、および、誘導結合プラズマ発光分析法（ＩＣＰ−ＯＥＳ）（図１０Ｂ）はすべて、ＣＡＴ−ＮＰがバイオフィルムに結合することを示した。バイオフィルムへのＣＡＴ−ＮＰの最大結合は、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で達成された（図１０Ｂ）。
【００６７】
バイオフィルム内のＣＡＴ−ＮＰ結合の定量的評価は誘導結合プラズマ発光分析法（ＩＣＰ−ＯＥＳ）を用いて行った。簡潔に説明すると、特定の時点において、室温で５分または１０分間、０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．５）中のＣＡＴ−ＮＰ（０ｍｇ／ｍｌ、０．１２５ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌまたは２ｍｇ／ｍｌ）でバイオフィルムを処理した（図９）。バイオフィルムをｓＨＡディスクから取り出し、標準的な水浴超音波処理、その後のプローブ音波処理によってホモジナイズした（Xiao et al., PLoS Pathog, 2012）。懸濁液を遠心分離し、バイオフィルムペレットを水で２回洗浄して非結合物質を除去した。次いでペレットを６０℃で一晩、２５０μｌの王水（ＨＣｌ／ＨＮＯ３＝３：１）で溶解した（Naha et al., J Mater. Chem. Biol. Med., 2014）。次いで、４．７５ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水を加え、サンプルの鉄含有量をＩＣＰ−ＯＥＳによりについて分析した。別個の実験でｉｎｔａｃｔなバイオフィルムを環境制御型ＳＥＭで検査し、同じＳＥＭ上でエネルギー分散分光法（ＥＤＳ）によって鉄の量を分析した。
【００６８】
ｉｎｔａｃｔなバイオフィルムの３次元アーキテクチャ内のＣＡＴ−ＮＰの保持および空間分布を決定するために、多光子共焦点顕微鏡法およびコンピュータ分析を用いた（Xiao et al., PLoS Pathog. 2012; Klein et al., J Vis Exp, 2011; Koo et al., J Bacteriol, 2010）。１μＭのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７標識デキストランコンジュゲート（１０ｋＤａ；６４７／６６８ｎｍ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてエキソポリサッカライド（ＥＰＳ）（赤色）を標識し、細菌（緑色）を２．５μＭのＳＹＴＯ  ９（４８５／４９８ｎｍ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．）で染色した。ＣＡＴ−ＮＰ（白色）は、多光子共焦点顕微鏡法を用いて、それらの固有の非線形光学特性により検出した（Xiao et al., PLoS Pathog, 2012; Klein et al., J Vis Exp, 2011; Liao et al., Adv Funct Mater, 2013; Koo et al., J Bacteriol, 2010; Liao et al., Adv Funct Mater, 2013）。画像化は２０×ＬＰｌａｎ  Ｎ（開口数１．０５）の水浸対物レンズを備えたＬｅｉｃａ  ＳＰ５多光子共焦点顕微鏡を用いて行った。励起波長は７８０ｎｍであり、ＳＹＴＯ  ９の検出に使用した発光波長フィルタは４９５／５４０  ＯｌｙＭＰＦＣ１フィルタであり、また、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７の検出に使用したフィルタはＨＱ６５５／４０Ｍ−２ｐフィルタである。ＣＡＴ−ＮＰの励起波長は９１０ｎｍであり、これは、ＳＹＴＯ  ９またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７を励起しない。ソフトウェアを用いて共焦点画像を分析し、ｉｎｔａｃｔなバイオフィルム内のＥＰＳ、細菌細胞およびＣＡＴ−ＮＰを同時に可視化および定量化した。Ａｍｉｒａ  ５．０．２ソフトウェア・プラットフォーム（Ｍｅｒｃｕｒｙ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｃｈｅｌｍｓｆｏｒｄ，ＭＳ）を使用して、バイオフィルム内の各成分（ＥＰＳ、細菌およびＣＡＴ−ＮＰ）の三次元レンダリングを作成し、三次元アーキテクチャを視覚化した。ＣＯＭＳＴＡＴおよびＩｍａｇｅＪを使用して従来のとおりに定量分析した（Xiao et al., PLoS Pathog. 2012; Klein et al., J Vis Exp. 2011; Koo et al., J Bacteriol, 2010）。
【００６９】
図１０Ｃに示すように、ｉｎ  ｓｉｔｕイメージングにより、ＣＡＴ−ＮＰが局所処理後にバイオフィルム構造全体に効果的に保持されることが明らかとなった。バイオフィルムの厚さ全体（トップからボトムまで）の定量分析により、ＥＰＳおよび細菌バイオマスの両方が最も多い２５〜１５０μｍの深さの位置にナノ粒子の大部分が見出されたことが示された（図１０Ｄ）。
【００７０】
バイオフィルムに結合したＣＡＴ−ＮＰが酸性ｐＨ（ｐＨ４．５）でＨ２Ｏ２を迅速に触媒してｉｎ  ｓｉｔｕでフリーラジカルを生成できるかどうかを調べるために、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を用いた比色法を用いた（Gao et al., Nat Nanotechnol. 2007）。バイオフィルムに結合したナノ粒子は、Ｈ２Ｏ２の存在下でＴＭＢ（ペルオキシダーゼ基質として働く）の反応を触媒し、フリーラジカル生成の結果として青色を生成した（図１０Ｅ）。青色は６５２ｎｍで最大吸光度を有する。ＣＡＴ−ＮＰで処理したバイオフィルムにペルオキシダーゼ様活性が存在するかさらに確認するために、さらなるペルオキシダーゼ基質（ジアゾ−アミノベンゼン）を用いて実験を繰り返した（図１１）。
【００７１】
バイオフィルム内に吸着したＣＡＴ−ＮＰ量と一致して、試験条件下、０．５〜２．０ｍｇ／ｍｌの濃度において最大触媒活性が達成された（図１０Ｅ）。ＣＡＴ−ＮＰによるＨ２Ｏ２触媒作用はｐＨに依存する（Gao et al., Nat Nanotechnol, 2007）。したがって、バイオフィルムに結合したＣＡＴ−ＮＰのペルオキシダーゼ様活性をｐＨ値４．５〜６．５の範囲の緩衝液中で測定した。図１０Ｆに示すように、バイオフィルムに結合したＣＡＴ−ＮＰは、酸性ｐＨ（４．５〜５．５）でより大きい触媒効率を発揮し、これは病理学的条件で見出されるｐＨ値と一致する（Mercier et al., J Antimicrob Chemother, 2002; Poschet et al. Trends Mol Med, 2002; Fejerskov et al., J Dent Res, 1992）。これらのデータは、短時間の局所適用後に、ＣＡＴ−ＮＰがバイオフィルム内に保持され、ｉｎ  ｓｉｔｕでＨ２Ｏ２のｐＨ応答性触媒作用を示したことを示す。
【００７２】
ＣＡＴ−ＮＰ介在型のＨ２Ｏ２触媒作用およびｉｎ  ｓｉｔｕでのフリーラジカルの生成が、バイオフィルム内に埋め込まれた細菌を殺菌し、またＥＰＳマトリックスを分解することができるかどうかを調べるために、以下の実験を行った。ＣＡＴ−ＮＰ／Ｈ２Ｏ２コンビネーションの抗バイオフィルム有効性を評価するために下記４つの処理液を調製した：対照（０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．５）、ＣＡＴ−ＮＰ単独（０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．５中、０．５ｍｇ／ｍｌ）、１％Ｈ２Ｏ２（０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．５）、ＣＡＴ−ＮＰ＋Ｈ２Ｏ２（０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．５中、１％Ｈ２Ｏ２と０．５ｍｇ／ｍｌのＣＡＴ−ＮＰ）。ＣＡＴ−ＮＰ（０．５ｍｇ／ｍｌ）で処理したバイオフィルムを直ちにＨ２Ｏ２（０．１〜１％、ｖ／ｖ）に暴露し、生存細胞数およびＥＰＳ含量を決定した（図１３Ａおよび図１４）。
【００７３】
ｓＨＡディスクおよびバイオフィルムを各溶液で５分間または１０分間局所処置し、滅菌生理食塩水（０．８９％ＮａＣｌ）で３回洗浄して非結合物質を除去し、次いで培地に移した（図９）。最初の処理を唾液薄膜形成（ｓＨＡ）の直後に施し、処理ｓＨＡディスクをストレプトコッカス．ミュータンスを含む培地（１０５  ＣＦＵ／ｍｌ）に移した。バイオフィルムをｓＨＡディスク上に６時間形成させ、その時点で二回目の処理を施した。翌日、バイオフィルムを１日２回（１９時間目および２９時間目に）処理した。実験期間（４３時間）の終わりに、各バイオフィルム中の生存細胞の総数を、形成されたコロニーの数を数えることによって評価した（Koo et al., J Bacteriol, 2010; Klein et al., J Vis Exp, 2011; Koo et al., J Antimicrob Chemother, 2003）。ＣＦＵおよび乾燥重量を評価するため、バイオフィルムをｓＨＡディスクから除去し、最大回収可能生菌カウントを得つつ、細菌細胞を死滅させない標準的な超音波処理によってホモジナイズした。均質化されたバイオフィルム懸濁液のアリコートを連続希釈し、血液寒天プレート上に播種し、４８時間のインキュベーション後に、コロニーを目視で計数した。残りのバイオフィルム懸濁液をＭｉｌｌｉ−Ｑ水で２回洗浄し、（予め秤量したフォイル製ボート内で）２時間オーブン乾燥し、秤量した。
【００７４】
図１３Ａおよび図１４に示すように、バイオフィルム内のストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）に対する非常に強い殺生物効果があり、５分で＞９９．９％の細菌が死滅した。１％Ｈ２Ｏ２曝露と組み合わせたＣＡＴ−ＮＰは、対照バイオフィルムまたはＨ２Ｏ２を含まないＣＡＴ−ＮＰ処理バイオフィルムと比較して、生存細胞の数が＞５−ｌｏｇ減少した（図１３Ａ）。図１３Ａに示されるように、ＣＡＴ−ＮＰおよびＨ２Ｏ２の組み合わせは、Ｈ２Ｏ２単独よりも、ストレプトコッカス．ミュータンスの殺菌に対して＞５，０００倍効果があり、これは、ＣＡＴ−ＮＰとＨ２Ｏ２との間に殺菌効力を増強する明らかな相乗効果があることを示している。
【００７５】
Ｈ２Ｏ２触媒作用により生成したフリーラジカルがインビトロで多糖類を分解することもできることを考慮し（Gao et al., Nanoscale, 2014）、Ｈ２Ｏ２暴露後、ＣＡＴ−ＮＰ処理バイオフィルム中のＥＰＳ量を分析した。ＥＰＳ分解の評価のために、精製グルコシルトランスフェラーゼ（ＧｔｆＢまたはＧｔｆＤ）によって産生された１００μｇの（不溶性または可溶性）グルカン（Koo et al., Antimicrob Agents Chemother, 2002）を各処理溶液（０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．５）と混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。グルカンは以下のように製造した。各Ｇｔｆ酵素（１０Ｕ）をスクロース基質緩衝液（１００ｍＭスクロース、２０μＭデキストラン  ９，０００、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．０ｍＭ  ＫＰＯ４，１．０ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ６．５）と混合し、３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーション後、産生されたグルカンを遠心分離によって集め、洗浄し、総量を標準的なフェノール−硫酸比色アッセイにより求めた（Koo et al., J Antimicrob Chemother, 2003; Koo et al., Antimicrob Agents Chemother, 2002）。１００μｇのグルカンを各処理溶液（０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．５中、３００μｌの総反応容量）と混合し、振盪しながら３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、Ｓｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ比色分析によって還元糖の量を決定した。
【００７６】
図１３Ｂに示すように、不溶性ＥＰＳの量と、また、それほどではないが可溶性ＥＰＳの量は、ＣＡＴ−ＮＰおよびＨ２Ｏ２の存在下では、対照と比較して、あるいはＨ２Ｏ２またはＣＡＴ−ＮＰ単独での処理と比較して、有意に減少した。不溶性ＥＰＳは主にα１，３結合型グルカンで構成され、可溶性ＥＰＳは主にα１，６結合型グルカンであり、両者が産生される（Bowen and Koo, Caries Res, 2011）。そのため、ＧｔｆＢ（α１，３結合グルカンを合成）およびＧｔｆＤ（α１，６結合型グルカンを合成）によって産生された精製細胞外グルカンがＨ２Ｏ２の存在下または非存在下でＣＡＴ−ＮＰとのインキュベーション後に分解されるかどうかをさらに分析した。図１３Ｃは両方のグルカン（特にＧｔｆＢ由来のもの）が分解されたことを示し、これはＣＡＴ−ＮＰ／Ｈ２Ｏ２処理後に当該多糖類から放出されたグルコースの量を測定して決定した。対照的に、Ｈ２Ｏ２単独またはＣＡＴ−ＮＰ単独ではいずれもグルカンを切断することができず、バイオフィルム内でＥＰＳを減少させることができないという観察と一致した。グルカンまたは同等の多糖類は他のバイオフィルムの多くのマトリックスのコアを形成するため（Flemming and Wingender, Nat Rev Microbiol, 2010; Koo et al., J Dent Res. 2013）不溶性ＥＰＳの分解は非常に関係しており、また、齲蝕および他のバイオフィルム関連疾患に関連している（Hall-Stoodley et al., Nat Rev Microbiol, 2004; Flemming and Wingender, Nat Rev Microbiol, 2010; Lebeaux et al., Microbiol Mol Biol Rev, 2014; Koo et al., J Dent Res, 2013; Bowen and Koo, Caries Res, 2011）。まとめると、このインビトロ・データは、ＣＡＴ−ＮＰとＨ２Ｏ２との組み合わせは有害なバイオフィルムを有意に抑制できることを示唆している。
【００７７】
ＣＡＴ−ＮＰがバイオフィルム内に保持され、Ｈ２Ｏ２をｉｎ  ｓｉｔｕで触媒してバイオフィルム破壊を促進することが示されたことから、１日２回、ＣＡＴ−ＮＰ（０．５ｍｇ／ｍｌ）で局所処置した直後にＨ２Ｏ２（１％、ｗ／ｖ）に暴露する（ＣＡＴ−ＮＰ／Ｈ２Ｏ２）、臨床的に実現可能な併用療法が開発された。Ｈ２Ｏ２と組み合わせたＣＡＴ−ＮＰによってバイオフィルムが破壊され得るか否かを評価するために、この治療レジメンをまずインビトロで試験した。共焦点顕微鏡によるイメージングによって、ＣＡＴ−ＮＰ／Ｈ２Ｏ２による処理が細菌細胞（緑色）の蓄積およびＥＰＳ−マトリックス（赤色）の発達の両方を害することが明らかとなった（図１３Ｄおよび図１５）。対照的に、ＣＡＴ−ＮＰまたはＨ２Ｏ２単独による局所処理では、これらの薬剤を併用した場合の相乗的増強と一致して、インビトロでは抗バイオフィルム効果が制限された。
【００７８】
実施例３
齲蝕のげっ歯類モデルを使用して、ＣＡＴ−ＮＰ／Ｈ２Ｏ２のインビボでの有効性を試験し、またＣＡＴ−ＮＰ／Ｈ２Ｏ２がインビボで齲蝕の発症および重症度を抑制できるかどうかを決定した（Bowen, Odontology, 2013; Falsetta et al., Infect Immun, 2014; Horev et al., ACS Nano, 2015）。
【００７９】
簡単に説明すると、十分に確立された齲蝕のげっ歯類モデルで動物実験を行った（Bowen, Odontology, 2013; Falsetta et al., Infect Immun, 2014; Horev, ACS Nano, 2015; Koo et al., J Dent Res, 2005）。すなわち、１５日齢のＳｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットをＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）からダムと共に購入し、ストレプトコッカス．ミュータンスの感染についてスクリーニングした。接種前にストレプトコッカス．ミュータンスに感染していた全ての動物を研究から排除した。次いで、動物を、ストレプトコッカス．ミュータンスＵＡ１５９の活発増殖（対数中期）培養物を用いて口腔感染させ、感染を口腔スワブでチェックした。感染させた動物をランダムに４つの処置群（１２匹／群）に分け、歯をカスタムメイドのアプリケータを用いて１日２回局所的に処置した。処置群は下記の通りである：（１）対照（０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．５）、（２）ＣＡＴ−ＮＰ単独（０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．５中、０．５ｍｇ／ｍｌ）、（３）１％Ｈ２Ｏ２（０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．５）、（４）ＣＡＴ−ＮＰ＋Ｈ２Ｏ２（０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．５中、１％Ｈ２Ｏ２と０．５ｍｇ／ｍｌのＣＡＴ−ＮＰ）。臨床使用をシミュレートするために、薬剤は、短時間（３０秒）で、３週間毎日２回、局所適用した（経口；各ラット１００μＬ）。
【００８０】
各群には、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈの齲蝕原性食餌２０００および５％スクロース水を自由に与えた。実験は３週間続けた。すべての動物の体重を毎週測定し、また身体の外観を毎日記録した。すべての動物は実験群の間で等しく体重が増加し、また実験期間中の状態は良好であった。実験期間の終わりに、動物を屠殺し、顎を外科的に除去し、切り裂いた。全ての顎から肉を除去し、ＫｅｙｅｓのシステムのＬａｒｓｏｎ改良に従って齲蝕を評価するために歯を準備した（Larson, Animal models in cariology: symposium and workshop proceedings special supplement of microbiology abstracts, 1981; Bowen, Odontology, 2013; Falsetta et al., Infect Immun, 2014; Horev,  ACS Nano, 2015を参照）。顎の齲蝕スコアの決定は、キャリブレートされた１人の試験官によって行われた。さらに、歯肉組織および口蓋組織の両方を採取し、組織病理学的分析のためにヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）染色処理した。
【００８１】
この動物モデルでは、歯は、エナメル質脱灰の最初の領域（図１６Ａ、緑色の矢印）からさらに破壊（青色の矢印）に進んで齲蝕病変（ヒトで観察されるものに類似）を発症し、キャビテーションにより特徴付けられる最も重篤な病変（赤色の矢印）が生じた。齲蝕の発症に対するＣＡＴ−ＮＰ／Ｈ２Ｏ２処理の効果は顕著であった。定量的齲蝕スコアリング分析により、ＣＡＴ−ＮＰ／Ｈ２Ｏ２は、病変の発現および重症度の両方をビヒクル対照に対して有意に軽減し（図１６Ｂ）、また広範なエナメル質の損傷を完全にブロックし、それによりキャビテーションの発症を防止することが明らかとなった。対照的に、Ｈ２Ｏ２単独での処置は有意な効果がなかったが、ＣＡＴ−ＮＰ単独での処置は、齲蝕病変の重篤度をビヒクル対照と比較して若干低減させた（図１６Ａおよび図１６Ｂ）。ＣＡＴ−ＮＰ／Ｈ２Ｏ２の優れた齲蝕防止効果は、臨床関連モデルにおけるインビボ有効性の強力な証拠を提供する。さらに、ＣＡＴ−ＮＰ／Ｈ２Ｏ２を局所適用したラットでは有害な影響は観察されなかった。特に、ＣＡＴ−ＮＰ／Ｈ２Ｏ２処置動物由来の歯肉組織および口蓋組織の組織病理学的分析は、未処置（またはビヒクル処置）動物と比較した場合、増殖の変化、炎症反応および／または壊死などの細胞毒性作用の兆候を示さなかった（図１７）。
【００８２】
上に示したとおり、ＣＡＴ−ＮＰ単独の処置は齲蝕病変の重篤度をある程度低下させた。特定の理論に縛られることなく、鉄イオンが、鉄イオンの抗菌効果に加えて、エナメル質の脱灰プロセスを妨害することによって齲蝕を抑制すると思われる（Rosalen et al., Arch Oral Biol, 1996; Pecharki et al., Caries Res, 2005; Delbem et al., Caries Res, 2012; Ribeiro et al., Braz Oral Res, 2012）。酸性ｐＨ（４．５）でインキュベートした場合、鉄イオンは数分以内でＣＡＴ−ＮＰから迅速に放出することができるが、ｐＨ７．０では放出されない（図１８Ａ）。
【００８３】
ＣＡＴ−ＮＰが酸性ｐＨで鉄を放出することによってアパタイトの酸溶解を低減させることができるかどうかを調べるために、以下の唾液被覆ＨＡビーズ酸溶解アッセイおよび鉄放出アッセイを使用した。ハイドロキシアパタイト（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）ビーズを濾過滅菌した浄化全唾液でコーティングして唾液被覆ハイドロキシアパタイト（ｓＨＡ）を得た（Koo et al., Antimicrob Agents Chemother, 2002; Gregoire et al., Appl Environ Microbiol, 2011; Ambatipudi et al., J Proteome Res, 2010）。ｓＨＡ酸溶解アッセイのために、１０ｍｇのｓＨＡビーズを０．５ｍｇ／ｍｌのＣＡＴ−ＮＰを含有する０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ４．５）１ｍｌ中、２時間室温で振盪しながらインキュベートした。次いで、上清を除去し、ｓＨＡビーズを１ｍｌの新しい酸性ＮａＯＡｃ緩衝液に再懸濁し、上記のとおりインキュベートした。このプロセスを６回繰り返した。同じ手順をＣＡＴ−ＮＰを含まないｓＨＡビーズ（対照）で行った。酸溶解の直前および直後のｓＨＡのアリコートを採取し、光学顕微鏡（ＯＭ）およびＳＥＭにより分析した。並行して、残りのｓＨＡビーズを遠心分離によって収集し、オーブン乾燥し、その乾燥重量を測定するために秤量した。ＣＡＴ−ＮＰで処理したｓＨＡの残りの乾燥重量を対照群と比較して、ＣＡＴ−ＮＰの脱灰減少効率を評価した。鉄放出アッセイのために、０．５ｍｇ／ｍｌのＣＡＴ−ＮＰを０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．５）中、室温で０分間、３分間、５分間、１０分間、３０分間、６０分間、１２０分間インキュベートした。混合物を１０，０００ｇで５分間遠心分離し、上清を回収して、鉄濃度をＩｒｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を製造元のプロトコールに従って測定した。対照として、０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ７）中で放出された鉄の量を上記と同じ手順を用いて測定した。
【００８４】
図１８Ｂおよび図１８Ｃは、ＣＡＴ−ＮＰの存在下または非存在下で、酸性酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）中でインキュベートし、次いでＳＥＭで調べ、酸インキュベーション後に残留した唾被覆ヒドロキシアパタイト（ｓＨＡ）ビーズの量を分析して測定した唾被覆ヒドロキシアパタイト（ｓＨＡ）ビーズのグラフを示す。図１８Ｂに示すように、ＣＡＴ−ＮＰで処理しなかったｓＨＡビーズは、ほとんど完全に溶解した。対照的に、ｓＨＡの酸溶解はＣＡＴ−ＮＰの存在下で減少した（図１８Ｂ）。これらの知見は、ＣＡＴ−ＮＰが、アパタイトの酸溶解を低減させることによる齲蝕防止の更なる機序を提供し得ることを示唆している。上記実験データの統計解析はＳＡＳ９．５（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を用いて行った（Falsetta et al., Infect Immun, 2014）。
【００８５】
抗菌性ナノ粒子などの現在の治療アプローチは、主として細菌の活性阻害や細菌の死滅に焦点を当てており、バイオフィルムによって引き起こされる感染に対するそれらの有効性を制限し得る保護性バイオフィルム・マトリックスや酸性ミクロ環境の存在に対処していない（Lebeaux et al., Microbiol Mol Biol Rev, 2014; Allaker and Memarzadeh, Int J Antimicrob Agents, 2014)。
【００８６】
本開示は、臨床的に意義のあるｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいてバイオフィルム関連疾患に対抗するためにナノ粒子がどのように利用され得るかに関する証拠を提示する。図１は生体適合性・ｐＨ応答性戦略をまとめたものであり以下の４つの主要な特徴を有する。すなわち、（１）短時間の局所暴露後にＣＡＴ−ＮＰが三次元バイオフィルム構造内に保持され、（２）ＣＡＴ−ＮＰは酸性ｐＨでＨ２Ｏ２を速やかに触媒してｉｎ  ｓｉｔｕでフリーラジカルを生成し、（３）同時にフリーラジカルはＥＰＳを分解し、（４）バイオフィルム内に埋め込まれた細菌を殺菌することである。さらに、ＣＡＴ−ＮＰは、酸性ｐＨで、アパタイトの脱灰を低下させる鉄イオンを放出し、これはバイオフィルム関連骨疾患に対して潜在的な価値があり得る（Katsarelis et al., J Dent Res, 2015; Arciola et al, Adv Exp Med Biol, 2015）。ＣＡＴ−ＮＰは、インビボで正常組織に影響を与えずに、一般的なバイオフィルム関連疾患の発症を抑制し得る。Ｃａｔ−ＮＰは大規模かつ低コストで合成できる一方、ＣＡＴ−ＮＰ化学の柔軟性は、触媒性能をさらに向上させることができる更なるナノクリスタルコアの開発につながり得る（図１９）。したがって、このアプローチは、口腔疾患および他のヒト感染症、ならびに、工業における生物生着および海の生物付着に対して局所使用するナノ触媒ベースの抗バイオフィルム治療剤を開発するための実現可能な新しいプラットフォームとなる可能性がある。
【００８７】
実施例４
この実施例では、ＩＯ−ＮＰ合成化学の柔軟性を利用してＩＯ−ＮＰの保持、触媒活性および脱灰ブロック効果をさらに向上させ、その結果、インビトロでのバイオフィルム抑制に対するＩＯ−ＮＰ／Ｈ２Ｏ２システムの有効性を最適化する。
【００８８】
ナノ粒子によるＨ２Ｏ２触媒作用の速度およびレベルを高めるために様々な金属塩（ＭｎＣｌ２など）をＩＯ−ＮＰ構造に組み込むことができる。さらに、ＩＯ−ＮＰは、歯／バイオフィルム界面およびバイオフィルム内のＩＯ−ＮＰの保持を高める目的で、生体適合性デキストランのバリエーションでコーティングすることができる。非晶質リン酸カルシウムをＩＯ−ＮＰに添加して、酸性ｐＨでのエナメル質脱灰に対する効果を改善することができる。最適化されたＩＯ−ＮＰの有効性はインビトロで評価することができ、また（現行のＩＯ−ＮＰに対して）最も有効なナノ粒子をさらなる評価のために選択することができる。
【００８９】
この実施例では、（保持強化のための）デキストランの表面コーティングおよび（触媒作用強化のための）様々なドーパント材料を有する新規ナノクリスタルコアの小さなライブラリーを製造した。以下に論じるデータは、かかる改変が可能であり、本開示の治療アプローチの有効性を高め得ることを実証する。様々なＩＯ−ＮＰ配合物およびドープＩＯ−ＮＰ配合物を下記表１に示す。表１に示すデキストラン被覆酸化鉄ナノ粒子は、従来のとおり合成した（Naha et al., J Mater Chem Biol Med, 2014）。簡単に説明すると、１２．５ｇのデキストラン（分子量：１０，０００）を２５ｍｌの脱イオン水に溶解した。得られた溶液を氷浴に入れ、攪拌しながら３０分間窒素ガスでパージして、フラスコから酸素を完全に除去した。各配合物について、９８０ｍｇの塩化第二鉄および３６０ｍｇの塩化第一鉄をデキストラン溶液に添加した。シリンジポンプを用いて、１５ｍｌの濃縮水酸化アンモニウムを６時間かけてデキストラン−鉄溶液に添加した。次いで、ナノ粒子懸濁液を９０℃に１時間加熱し、次いで室温で一晩攪拌した。得られたナノ粒子懸濁液を２０ｋ  ｒｃｆで３０分間遠心分離して凝集物を除去した。ＩＯ−ＮＰ含有上清を集め、１５ｍｌに濃縮し、１００ｋＤａ  ＭＷダイアフィルトレーションカラムを用いてクエン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。様々な分子量の非修飾デキストラン（１ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａおよび４０ｋＤａ）で被覆したＩＯ−ＮＰを合成した。
【００９０】
表１：デキストラン被覆ＩＯ−ＮＰ配合物およびドープＩＯ−ＮＰ配合物の合成および特性評価
【表１】
0006785234.tif 000002
【００９１】
新しく開発したナノ粒子は新規なものであるが、これらは、生体適合性が高く、また既にＭＲＩ造影剤として臨床的に認可されている材料をベースとしている（Fan et al., Wires Nanomed Nanobi, 2013）。ドーパント金属はＩＯ−ＮＰの触媒活性を高めることが示され（例えば、ＭｎＣｌ２）、体内に見出される。さらに、ナノ粒子は大規模に合成することができ、最終生成物は非常に手頃である。したがって、開示されたシステムの臨床用途の可能性は大きい。
【００９２】
酸化鉄ナノ粒子は、Ｆｅｒｉｄｅｘ、ＣｏｍｂｉｄｅｘおよびＦｅｒａｈｅｍｅなど、患者での使用が認可されているデキストラン被覆酸化鉄ナノ粒子をベースとしている（Wang, Quantitative imaging in medicine and surgery, 2011）。これらの酸化鉄ナノ粒子は、無害の天然物質（すなわち、鉄および糖分子）に分解するため、生体適合性が高いと見なされている（Tassa et al., Accounts of chemical research, 2011; Koo et al., Journal of bacteriology, 2010）。プラットフォームを改善・最適化するために、コーティング、コアのドーピング、および、リン酸カルシウム含有、の３つの修飾を行うことの効果を調査できる（図２０）。
【００９３】
コーティングがＩＯ−ＮＰの活性に及ぼす効果を調べるために、デキストラン被覆酸化鉄ナノ粒子を上記のように合成することができる（Naha et al., J Mater Chem Biol Med, 2014）。様々な分子量の未修飾デキストラン（１ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａおよび４０ｋＤａ）または修飾デキストラン（例えば、アミノ化、架橋、カルボキシおよびジエチルアミノエチル）被覆ＩＯ−ＮＰを合成する。 また、臨床的に利用可能な製剤であるＦｅｒａｈｅｍｅも研究する。デキストランコーティングの種類を変化させると、Ｈ２Ｏ２のナノ粒子表面へのアクセス性が変化し、これは触媒性能を変化させ得る。ＩＯ−ＮＰコーティングがＨ２Ｏ２の触媒作用に及ぼす効果を前述のＴＭＢアッセイを用いて測定した。図１９Ｂ（薄灰色のバー）は、デキストラン被覆酸化鉄が過酸化水素の活性化を触媒すること、および、デキストランは被覆を有していないＩＯ−ＮＰに最も近い触媒活性を提供する生体適合性コーティングであることを示している。さらに、様々なタイプのデキストランコーティングが歯／バイオフィルム界面およびＥＰＳ豊富な齲蝕原性バイオフィルム内でのＩＯ−ＮＰ保持を高め得る。従前の研究により、歯薄膜上に存在するストレプトコッカス・ミュータンス由来のグルコシルトランスフェラーゼ（Ｇｔｆｓ）によるＥＰＳ合成に外因性デキストランがプライマーとして使用され得、バイオフィルムの発生に、触媒活性に影響を及ぼすことなく（Gao et al., Nat Nanotechnol, 2007）、マトリックスに組み込まれ得ることが示されている（Xiao et al., PLoS pathogens, 2012; Bowen and Koo, Caries research, 2006; Koo et al., Journal of dental research, 2013）。さらに、グルカン同士の接着相互作用を介して保持が増強され得る（図２１）（Xiao et al., PLoS pathogens, 2012; Bowen and Koo, Caries research, 2011; Koo et al., Journal of dental research, 2013; Banas and Vickerman, Critical reviews in oral biology and medicine: an official publication of the American Association of Oral Biologists, 2003）。
【００９４】
ＩＯ−ＮＰコアの金属ドーピング効果を調べるために、以下の方法を用いることができる。ＭｎＣｌ２、ＣｏＣｌ２およびＮｉＣｌ２（１％、５％、１０％および２０％、またはそれ以上）などの様々な割合のドーパント金属塩をコアに含有させて合成を行う。ドーパント金属の添加は触媒性能を向上させる戦略である（Mohamed et al., Mat Sci Eng R, 2012; Bin Asif et al., Nanoscale research letters, 2014; Wang et al., Journal of Molecular Catalysis a-Chemical, 2013）。２０％Ｍｎドープデキストラン被覆ＩＯ−ＮＰを合成し、誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）によりＭｎの含有量を確認した。図１９Ｂは、過酸化水素の活性化速度が未ドープのＩＯ−ＮＰと比較して４．７倍増加したことを示す。このプロセスにより、元のＩＯ−ＮＰ、例えばドープされたコアを有さないＩＯ−ＮＰと比較して、大幅に改善された触媒性能を有するコアを開発することができる。
【００９５】
ＩＯ−ＮＰは、ナノ粒子の脱灰ブロック効果を向上させ（かつ場合によっては再石灰化を促進する）ために、添加剤としてのリン酸カルシウムを含有させて修飾することができる。ＩＯ−ＮＰ溶液を硝酸カルシウムと混合し、次いでリン酸カリウムを１．６７：１のＣａ：Ｐ比で滴下することにより、リン酸カルシウムをＩＯ−ＮＰに含有させることができる（Sun et al., J Res Natl Inst Stan, 2010; Liou et al., Biomaterials, 2004）。リン酸カルシウムに対するＩＯ−ＮＰの比率を変更することによってバリエーションを合成することができる。脱灰ブロック、ＩＯ−ＮＰ保持およびＨ２Ｏ２触媒作用に対するリン酸カルシウムの効果を調べることができる。あるいは、上記のドーピング法によって、または逆マイクロエマルジョン合成法（Kong et al., Curr Appl Phys, 2005）を使用してカルシウムを含有させることができる。また、リン酸カルシウムを含有させることがナノ粒子の触媒活性に著しく悪影響を与える場合、リン酸カルシウムナノ粒子（ＣＰ−ＮＰ）を別途作製しておき、ＩＯ−ＮＰおよびＣＰ−ＮＰの混合物を適用することができる。これらのＩＯ−ＮＰは、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、ＦＥＩ  Ｔｅｃｎａｉ  Ｔ１２）、動的光散乱（ＤＬＳ）によるサイズの特性解析、またゼータ電位（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ＺＳ９０、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）の特性解析ができ、濃度はＩＣＰ−ＭＳを用いて決定することができる（Naha et al., J Mater Chem, 2014）。これらの分析により、ナノ粒子の標準化されたサイズおよび濃度が保証される。これらの様々なパラメーターの最適化は後述するアッセイを用いて行うことができ、最良の特徴（例えば、リン酸カルシウムを含む改変されたコーティングを有するドープコア）を組み合わせたＩＯ−ＮＰを合成することができる。
【００９６】
以下の方法を用いて修飾ＩＯ−ＮＰの触媒活性および生物活性を評価することができる。ナノ粒子がＨ２Ｏ２活性化触媒として機能する能力は、ルミノールアッセイを用いた経時的な発光強度の測定により評価される。簡潔に説明すると、ナノ粒子を過酸化水素およびルミノールと最大１０分間混合する。過酸化水素は酸化鉄ナノ粒子表面上で反応して、ルミノールを活性化させて光を生成するラジカルを生成する（Triantis et al., Chem Eng J, 2008）。図２１はルミノールアッセイからのデータを示す。最良の触媒は最も強い発光を生じる。ルミノールアッセイはまた、基質として３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を使用する確立された比色法で補完される。ＴＭＢはＩＯ−ＮＰによって触媒されるフリーラジカルと反応した後、６５２ｎｍに特異的な吸収を有する青色を経時で生成する（Gao et al., Nat Nanotechnol, 2007）。全てのナノ粒子を同じ条件下（すなわち、上で使用したように０．５ｍｇ／ｍｌおよび０．５％Ｈ２Ｏ２）で試験して、触媒速度および触媒レベルに関して活性を比較する。スクリーニングは吸着緩衝液（唾液のイオン強度を模倣する）および浄化ヒト全唾液（生物学的環境をシミュレートするため）で行う（Horev et al., ACS nano, 2015）。その後選択されるリードナノ粒子候補について、最小の用量で最大の有効性を達成するために、様々なＩＯ−ＮＰおよびＨ２Ｏ２濃度の組み合わせを試験することができる。
【００９７】
ＩＯ−ＮＰ保持アッセイには、以下の方法を用いることができる。バイオフィルム内のナノ粒子の保持は、唾液被覆ヒドロキシアパタイトバイオフィルムモデルを用いて評価される。臨床治療レジメンをシミュレートするために、各ＩＯ−ＮＰ（０．５ｍｇ／ｍｌ）の短時間の暴露（１分または５分）を１日２回する局所適用が使用される。局所処理されたバイオフィルムを洗浄して、未結合または緩く結合したＩＯ−ＮＰを除去する。次いで、バイオフィルムを除去し、ホモジナイズする（Bowen and Koo, Caries research, 2011; Koo et al., J Antimicrob Chemoth, 2003）。バイオフィルム内に保持されているＩＯ−ＮＰの量は、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）（Naha et al., J Mater Chem B, 2014）によってバイオフィルムの鉄含有量を分析することによって決定される。バイオフィルム内に結合したＩＯ−ＮＰが活性であることを確認するために、比色分析（ＴＭＢ）アッセイ（Gao et al., Nat Nanotechnol, 2007）でＨ２Ｏ２（０．５％）の触媒活性を測定する（図２２）。
【００９８】
Ｈ２Ｏ２存在下でのＩＯ−ＮＰの殺菌効果は、上記と同じバイオフィルムモデルおよび局所処置を用いて評価することができる。ＩＯ−ＮＰ処理したバイオフィルムをＨ２Ｏ２に暴露し、ストレプトコッカス・ミュータンスの乾燥重量および全生存細胞を標準的な培養法およびｑＰＣＲベースの方法を用いて決定する（Cury and Koo, Analytical biochemistry, 2007; Klein et al., Mol Oral Microbiol, 2012）。このモデルでは、最大７２個のバイオフィルムを１回の実験で同時に形成することができるため、新規開発ＩＯ−ＮＰのスクリーニングが容易となる。
【００９９】
さらに、Ｈ２Ｏ２の存在下で酸化的切断によりグルカンを分解するＩＯ−ＮＰの能力は以下の方法によって決定することができる。簡潔に説明すると、不溶性グルカンおよび可溶性グルカン（ストレプトコッカス・ミュータンスのＧｔｆｓによって産生されるもの）を使用する。１００μｇの不溶性グルカンまたは可溶性グルカンを同じ条件でＩＯ−ＮＰおよびＨ２Ｏ２とともにインキュベートし、それらの活性を比較し、標準的な比色法を使用して分解生成物の量を測定することができる（Koo et al., J Antimicrob Chemoth, 2003; Kopec et al., Glycobiology, 1997）。
【０１００】
ＩＯ−ＮＰの存在下または非存在下で唾液被覆ＨＡビーズおよび唾液被覆歯エナメル質（ｓＴＥ）スラブの酸溶解量を測定することによって、ナノ粒子の脱灰ブロック効果を分析することができる。簡単に説明すると、ｓＨＡビーズまたはｓＴＥスラブを３７℃で４時間、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）中でインキュベートする。ｓＨＡビーズを遠心分離し、３回洗浄して溶解アパタイトを除去し、カルシウムおよびリン酸の量をＩＣＰ−ＭＳおよび比色アッセイを用いて測定する（Naha et al., J Mater Chem B, 2014）。残ったｓＨＡビーズ（非溶解）を収集して乾燥重量を測定する。ＳＴＥスラブ（処理後）を高度に標準化された表面微小硬度（ｓｕｒｆａｃｅ  ｍｉｃｒｏｈａｒｄｎｅｓｓ；ＳＭＨ）法を用いて脱灰量について分析する（Arthur et al., Journal of oral diseases, 2014; Hara et al., Caries research, 2005; Zero et al., Journal of dental research, 1992; Hara et al., European journal of oral sciences, 2014; Cury et al., Caries research, 1997）。簡単に説明すると、電動式マイクロメータ・ステージに接続した硬度計を用いてエナメル質のＳＭＨを測定する。負荷５０ｇ、滞留時間１１秒のヌープダイヤモンドを使用する。エナメル質のＳＭＨは、ベースライン（処置前）および処置後で専用画像解析システムを使用して窪みの長さ（μｍ）を測定することによって決定し、ＳＭＨ変化率（％）として算出する。ＳＭＨ変化率（％）は脱灰レベルと直接関連する。
【０１０１】
生体適合性のインビトロ評価をするために、以下の方法を用いることができる。このシステムは、生体適合性でかつ臨床的使用が承認されているＩＯ−ＮＰおよびＨ２Ｏ２を含むことができる。さらに、使用濃度は臨床現場で現在使用されている濃度よりも低く、ＩＯ−ＮＰとバイスタンダー組織との接触は、処置が短期的・局所的であるため最小限である。インビボデータは、ＩＯ−ＮＰ／Ｈ２Ｏ２コンビネーションの１日２回の暴露は細胞毒性効果を引き起こさないことを示した。しかしながら、最適化されたナノ粒子（Ｈ２Ｏ２有りまたはＨ２Ｏ２無し）の潜在的な細胞傷害性は、哺乳類細胞の生存率に影響を与えないように、口腔（歯肉および粘膜）の上皮細胞および線維芽細胞を用いて評価することができる。簡単に説明すると、生体適合性は、これらの細胞をナノ粒子単独でまたはＨ２Ｏ２と組み合わせて最大１０分間（局所曝露を模倣するために）曝露することによって評価することができる。標準的なプロトコールを用いて、ＩＯ−ＮＰ濃度（１０〜１，０００μｇ／ｍｌ）およびＨ２Ｏ２（０．５〜１％ｖ／ｖ）の範囲を評価し、またＭＴＳまたはＭＴＴアッセイを実施して細胞生存率を決定する（Naha et al., J Mater Chem B, 2014）。このアッセイは、顕微鏡下の細胞の定性的観察によって補完することができる。細胞をＩＯ−ＮＰで１０分間インキュベートした後、経時的に追跡し、細胞の生存率を２４時間、７２時間および１６８時間の時点で測定する、タイムフレーム１〜１０分の範囲のインキュベーションおよびパルスチェイス実験を行うことができる。図２３は、デキストラン被覆ＩＯ−ＮＰの生体適合性を示す。包括的スクリーニングにより、齲蝕原性バイオフィルムの抑制および齲蝕防止のための最も効果的で生体適合性のあるＩＯ−ＮＰを確実に選択することができる。
【０１０２】
ＩＯ−ＮＰ合成の柔軟性を利用することによって、触媒活性および生物活性を向上するためにＩＯ−ＮＰ特性のさらなる最適化を実施することができる。Ｈ２Ｏ２の活性化を触媒することができる様々な新規ナノ粒子を合成することができる。未触媒の速度よりも１，０００倍速い速度で過酸化水素を活性化する触媒を同定することができる。また、それらの触媒特性について研究するために様々なドープ酸化鉄ナノ粒子を作製することができる（Cormode et al., Contrast Media Mol Imaging, 2014; Naha et al., J Mater Chem B, 2014）。困難が生じた場合には、様々なドーパント金属塩比、様々なドーパント金属（例えば、Ｍｇ、Ｃａ）、様々なコーティング（ドーパミンまたはリン酸塩ベースのリガンドなど）を使用することによってＩＯ−ＮＰの合成を変更することができる。
【０１０３】
本開示は、言及された目的および利点ならびにその中に内在する利点を達成するために十分に適合される。上述の特定の実施形態は例示のみを目的とする。本開示は、異なる方法であるが、本明細書の教示の利益を有する当業者に明らかな均等な方法で改変、実施され得るからである。さらに、添付の特許請求の範囲に記載されたもの以外に、本明細書に示された構成または設計の詳細に制限は意図されていない。したがって、上で開示した特定の例示的な実施形態は、変更または改変することができ、そのようなすべての変形は、本開示の範囲および趣旨内にあると考えられることは明らかである。
【０１０４】
様々な刊行物、特許および特許出願が本明細書に引用されており、その内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ−４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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