(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シグナル配列と、ゴルジ体指向性プロ配列と、式［Ｘ−Ｙ］ｎを有するポリペプチドとを含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物であって、式中、各Ｘが独立して不在であるかまたはリンカーであり、各Ｙが独立してヒトアミロイドベータペプチドであり、かつｎが端点を含んで２〜８の整数である、発現構築物。
【請求項２】
前記シグナル配列が、天然起源の酵母タンパク質のシグナル配列と同一である、請求項１に記載の発現構築物。
【請求項３】
前記シグナル配列が、酵母接合因子アルファシグナル配列または酵母キラートキシンＫ１、分泌酸性ホスファターゼ、インベルターゼ（スクラーゼ）、もしくはＰｓｔ１のシグナル配列である、請求項２に記載の発現構築物。
【請求項４】
前記ゴルジ体指向性プロ配列が、酵母接合因子アルファプロ配列または酵母ＫＥＸ２、カルボキシペプチダーゼＹ、Ｐｅｐ４、もしくはＰｒｂ１のプロ配列である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の発現構築物。
【請求項５】
前記プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の発現構築物。
【請求項６】
前記誘導性プロモーターが、ＧＡＬ１−１０、ＧＡＬ１、ＧＡＬＬ、ＧＡＬＳ、ＧＰＤ、ＡＤＨ、ＴＥＦ、ＣＹＣ１、ＭＲＰ７、ＭＥＴ２５、ＴＥＴ、ＶＰ１６、またはＶＰ１６−ＥＲである、請求項５に記載の発現構築物。
【請求項７】
（i）各ヒトアミロイドベータタンパク質が、野生型Ａβ３８、野生型Ａβ３９、野生型Ａβ４０、野生型Ａβ４１、野生型Ａβ４２、野生型Ａβ４３、野生型Ａβ４８、および野生型Ａβ４９からなる群から独立して選択される、または
（ii）各ヒトアミロイドベータタンパク質が、Ａβ３８、Ａβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２、Ａβ４３、Ａβ４８、およびＡβ４９からなる群から独立して選択され、かつ、Ａ２Ｔ、Ａ２Ｖ、Ｈ６Ｒ、Ｄ７Ｎ、Ｅ１１Ｋ、Ｆ２０Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ｅ２２Ｇ、Ｅ２２Ｑ、Ｅ２２Ｋ、Ｅ２２欠失、Ｄ２３Ｎ、Ｉ３１Ｅ、Ｅ２２Ｇ／Ｉ３１Ｅ、Ａ４２Ｔ、およびＡ４２Ｖからなる群から選択される突然変異を含む、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の発現構築物。
【請求項８】
前記ポリペプチドが少なくとも４つのアミロイドベータペプチドを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の発現構築物。
【請求項９】
各アミロイドベータペプチドが、同一のアミノ酸配列を含むか、または前記ポリペプチドが、異なるアミノ酸配列を有する少なくとも２つのアミロイドベータペプチドを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の発現構築物。
【請求項１０】
（i）前記ポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１のアミノ酸配列を含む、かつ／または
（ii）エピソームプラスミドもしくは組込みプラスミドである、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の発現構築物。
【請求項１１】
前記組込みプラスミドが、ｐＡＧ３０３、ｐＡＧ３０４、ｐＡＧ３０５、ｐＡＧ３０６、ｐＲＳ３０３、ｐＲＳ３０４、ｐＲＳ３０５、ｐＲＳ３０６、またはこれらの誘導体である、請求項１０に記載の発現構築物。
【請求項１２】
酵母細胞中の前記核酸の発現および前記ポリペプチドの産生により、該細胞の増殖または生存能力の低下がもたらされる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の発現構築物を含む酵母細胞。
【請求項１３】
（i）前記核酸の発現および前記ポリペプチドの産生により、前記細胞が生存不能となる、
（ii）前記発現構築物が、エピソーム性であるか、もしくは前記酵母細胞のゲノムに組み込まれている、
（iii）酵母が、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ウバエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｅ）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア・クルイベリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）菌種、カンジダ・ウティリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、カンジダ・カカオイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃａｃａｏｉ）、ジオトリチュム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）菌種、もしくはジオトリチュム・フェルメンタンス（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）である、
（iv）薬剤排出もしくは細胞透過性に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子が破壊されている、かつ／または
（v）前記酵母細胞が、ガラクトース以外の炭素源でＧＡＬプロモーターからの発現を可能にする、
請求項１２に記載の酵母細胞。
【請求項１４】
薬剤排出または細胞透過性に関与するタンパク質をコードする前記少なくとも１つの遺伝子が、ＰＤＲ１、ＰＤＲ３、ＰＤＲ５、ＳＮＱ２、またはＥＲＧ６である、請求項１３に記載の酵母細胞。
【請求項１５】
転写活性化ドメインおよび調節ドメインに融合されているＧａｌ４  ＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項１３に記載の酵母細胞。
【請求項１６】
前記融合タンパク質が、エストロゲンまたはその類似体の存在下で転写を活性化する、請求項１５に記載の酵母細胞。
【請求項１７】
Ｇａｌ４−ＥＲ−ＶＰ１６融合タンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項１３、１５、および１６のいずれか一項に記載の酵母細胞。
【請求項１８】
細胞中で毒性を誘導する方法であって、
請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の細胞を提供する工程と、
該細胞に対して毒性である前記核酸の発現レベルを該細胞中で誘導する工程と、を含む、方法。
【請求項１９】
アミロイドベータ誘導性毒性を予防または抑制する化合物を特定する方法であって、
候補薬剤の存在下で、かつ、該候補薬剤の不在下において前記細胞中で毒性を誘導するのに十分であるレベルでの前記核酸の発現を可能にする条件下で、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の細胞を培養する工程と、
前記候補薬剤の存在下で、細胞増殖または生存能力を測定する工程と、
前記候補薬剤の存在下で測定された細胞増殖または生存能力を、前記候補薬剤の不在下での細胞増殖または生存能力と比較する工程と、を含み、
細胞増殖または生存能力が、前記候補薬剤の不在下でのものと比較して前記候補薬剤の存在下で上昇する場合に、前記候補薬剤が、アミロイドベータ誘導性毒性を予防または抑制する化合物として特定される、方法。
【請求項２０】
アミロイドベータ誘導性毒性の遺伝子サプレッサーまたはエンハンサーを特定する方法であって、
遺伝子を過剰発現するように遺伝子改変されている、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の細胞を提供する工程と、
前記遺伝子の過剰発現の不在下において前記細胞中で毒性を誘導するのに十分であるレベルでの前記タンパク質の発現を可能にする条件下で、前記細胞を培養する工程と、
前記遺伝子の過剰発現の存在下において、細胞増殖または生存能力を測定する工程と、
前記遺伝子の過剰発現の存在下で測定された細胞増殖または生存能力を、前記遺伝子の過剰発現の不在下での細胞増殖または生存能力と比較する工程と、を含み、
（ｉ）細胞増殖または生存能力が、前記遺伝子の過剰発現の不在下でのものと比較して前記遺伝子の過剰発現の存在下で上昇している場合には、前記遺伝子が、アミロイドベータ誘導性毒性の遺伝子サプレッサーとして特定され、（ｉｉ）細胞増殖または生存能力が、前記遺伝子の過剰発現の不在下のものと比較して前記遺伝子の過剰発現の存在下で低下している場合には、前記遺伝子が、アミロイドベータ誘導性毒性の遺伝子エンハンサーとして特定される、方法。
【請求項２１】
アミロイドベータ誘導性毒性の遺伝子サプレッサーまたはエンハンサーを特定する方法であって、
細胞の内因性遺伝子が破壊されている、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の細胞を提供する工程と、
前記内因性遺伝子の破壊の不在下において前記細胞中で毒性を誘導するに十分であるレベルでの前記タンパク質の発現を可能にする条件下で、前記細胞を培養する工程と、
前記内因性遺伝子の破壊の存在下で、細胞増殖または生存能力を測定する工程と、
前記内因性遺伝子の破壊の存在下で測定された細胞増殖または生存能力を、前記内因性遺伝子の破壊の不在下での細胞増殖または生存能力と比較する工程と、を含み、
（ｉ）細胞増殖または生存能力が、前記内因性遺伝子の破壊の不在下でのものと比較して、前記内因性遺伝子の破壊の存在下で上昇している場合には、前記遺伝子が、アミロイドベータ誘導性毒性の遺伝子エンハンサーとして特定され、（ｉｉ）細胞増殖または生存能力が、前記内因性遺伝子の破壊の不在下のものと比較して、前記内因性遺伝子の破壊の存在下で低下している場合には、前記遺伝子が、アミロイドベータ誘導性毒性の遺伝子サプレッサーとして特定される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質化学ならびに細胞および分子生物学に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
アルツハイマー病は、神経原線維変化およびアミロイドベータペプチドを含有する斑によって特徴付けられる神経変性疾患である。アルツハイマー病の患者は、進行性痴呆および人格障害を示す。アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のタンパク質分解切断は、３８〜４９個のアミノ酸の範囲に及ぶ（例えば、３８〜４３個のアミノ酸）長さを有するアミロイドベータペプチドの生成をもたらす。アミロイドベータ１〜４２のペプチドは、特に自己凝集化する傾向があり、アルツハイマー病の発症に強く結びついている。
【発明の概要】
【０００３】
概要
本発明は、少なくとも一部は、シグナル配列と、ゴルジ体指向性プロ配列と、ヒトアミロイドベータタンパク質とを含有するポリペプチドをコードする酵母発現構築物が、酵母細胞中で発現されるとき、著しい毒性をもたらし得るとの発見に基づいている。本発明は、少なくとも一部は、選択されたシグナル配列と、ヒトアミロイドベータタンパク質とを含有するポリペプチドをコードする哺乳動物発現構築物が、哺乳動物細胞中で発現されるとき、著しい毒性をもたらし得るとの発見に基ついている。この発見は、アミロイドベータ誘導性毒性を調節する化合物または遺伝因子を特定するためにアミロイドベータ発現細胞を用いる、スクリーニングアッセイの実行を可能にする。このようなスクリーニングによって特定された化合物は、アルツハイマー病などの神経変性疾患の治療または予防に使用することができる。
【０００４】
シグナル配列と、ゴルジ体指向性プロ配列と、ヒトアミロイドベータタンパク質とを含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、発現構築物が本明細書に記載される。
【０００５】
シグナル配列と、ゴルジ体指向性プロ配列と、式［Ｘ−Ｙ］ｎを有するポリペプチドであって、式中、各Ｘが、独立して、不在であるかまたはリンカーであり、各Ｙが、独立して、ヒトアミロイドベータペプチドであり、ｎが２〜８の整数（端点２と８を含む）である、ポリペプチドと、を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、発現構築物も本明細書に提供される。
【０００６】
シグナル配列は、それを含有するポリペプチドが細胞内の小胞体を標的化することを可能にする。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、この発現構築物によってコードされたポリペプチドのアミノ末端に位置する。シグナル配列は、天然起源のシグナル配列と同一とすることができるか、または人工（非天然起源の）シグナル配列とすることができる。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、天然起源の酵母タンパク質のシグナル配列と同一である。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、酵母接合因子アルファシグナル配列である。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、酵母キラートキシンＫ１のシグナル配列、分泌された酸性ホスファターゼ、インベルターゼもしくはスクラーゼ、またはプロトプラスト分泌タンパク質１（Ｐｓｔ１）である。
【０００７】
ゴルジ体指向性プロ配列は、これを含有するポリペプチドの、ゴルジ体への輸送を可能にする。ゴルジ体指向性プロ配列は、天然起源のゴルジ体指向性プロ配列と同一とすることができるか、または人工（非天然起源の）ゴルジ体指向性プロ配列とすることができる。いくつかの実施形態では、ゴルジ体指向性プロ配列は、天然起源の酵母タンパク質のゴルジ体指向性プロ配列と同一である。いくつかの実施形態では、ゴルジ体指向性プロ配列は、酵母接合因子アルファプロ配列である。いくつかの実施形態では、ゴルジ体指向性プロ配列は、酵母ＫＥＸ２のプロ配列、カルボキシペプチダーゼＹ、Ｐｅｐ４、またはＰｒｂ１である。
【０００８】
本明細書で互換的に使用される、用語「ヒトアミロイドベータタンパク質」および「ヒトアミロイドベータペプチド」は、そのアミノ酸配列が、天然起源の野生型アミロイドベータペプチドならびに天然起源の変異体アミロイドベータペプチドと同一であるタンパク質を含む。野生型アミロイドベータペプチドは、アミロイドβ１〜３８（Ａβ３８）、アミロイドβ１〜３９（Ａβ３９）、アミロイドβ１〜４０（Ａβ４０）、アミロイドβ１〜４１（Ａβ４１）、アミロイドβ１〜４２（Ａβ４２）、アミロイドβ１〜４３（Ａβ４３）、アミロイドβ１〜４８（Ａβ４８）、およびアミロイドβ１〜４９（Ａβ４９）を含む。アミロイドベータ突然変異は、Ａ２Ｔ、Ａ２Ｖ、Ｈ６Ｒ、Ｄ７Ｎ、Ｅ１１Ｋ、Ｆ２０Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ｅ２２Ｇ、Ｅ２２Ｑ、Ｅ２２Ｋ、Ｅ２２欠失、Ｄ２３Ｎ、Ｉ３１Ｅ、Ｅ２２Ｇ／Ｉ３１Ｅ、Ａ４２Ｔ、およびＡ４２Ｖを含む。これらの突然変異は、任意に、アミロイドベータペプチド１〜３８、１〜３９、１〜４０、１〜４１、１〜４２、１〜４３、１〜４８、および１〜４９のうちのいずれに存在してもよい。
【０００９】
代替的な実施形態では、ヒトアミロイドベータタンパク質の変異体を使用することができる。「変異体ヒトアミロイドベータンパク質」は、天然起源のアミロイドベータペプチドとは、最大１０個のアミノ酸で（置換、欠失、および／または挿入を介して）異なり（例えば、５個以下のアミノ酸で異なり、４個以下のアミノ酸で異なり、３個以下のアミノ酸で異なり、２個以下のアミノ酸で異なり、または１個のアミノ酸で異なる）、本明細書に記載される融合ポリペプチドで発現されるとき、細胞の増殖または生存能力の低下を引き起こすための能力を保持する。
【００１０】
本明細書に記載される発現構築物は、任意に、酵母細胞のゲノムに組み込まれ得る。例えば、発現構築物は、ｐＡＧ３０３、ｐＡＧ３０４、ｐＡＧ３０５、ｐＡＧ３０６、ｐＲＳ３０３、ｐＲＳ３０４、ｐＲＳ３０５、ｐＲＳ３０６、またはこれらの誘導体などの、組込みプラスミドとすることができる。
【００１１】
本明細書に記載される発現構築物は、任意に、エピソームプラスミドとすることができる。
【００１２】
プロモーターは、ＧＡＬ１−１０、ＧＡＬ１、ＧＡＬＬ、ＧＡＬＳ、ＧＰＤ、ＡＤＨ、ＴＥＦ、ＣＹＣ１、ＭＲＰ７、ＭＥＴ２５、ＴＥＴ、ＶＰ１６、またはＶＰ１６−ＥＲなどの誘導性プロモーターとすることができる。あるいは、このプロモーターは、構成的活性型プロモーターとすることができる。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される発現構築物によってコードされるポリペプチドは、複数のヒトアミロイドベータペプチドを含むことができる。本明細書に記載される発現構築物によってコードされるポリペプチドは、任意に、２、３、４、５、６、７、８つ、またはそれよりも多くのヒトアミロイドベータペプチドを含有することができる。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、少なくとも２つのヒトアミロイドベータペプチドを含む。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、少なくとも４つのヒトアミロイドベータペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ヒトアミロイドベータペプチドのそれぞれは、同一のアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、このポリペプチドは、異なるアミノ酸配列を有する、少なくとも２つのヒトアミロイドベータペプチドを含む。
【００１４】
本明細書に記載される発現構築物によってコードされるポリペプチドは、任意に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１のアミノ酸配列を含むか、またはこれらからなる。
【００１５】
本明細書に記載される発現構築物を含む酵母細胞も開示され、この細胞中の核酸の発現およびポリペプチドの産生は、細胞の増殖または生存能力の低下をもたらす。いくつかの実施形態では、核酸の発現およびポリペプチドの産生は、細胞を生存不能にする。
【００１６】
酵母細胞は、１つ以上の（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つ）の発現構築物のコピー（例えば、組込みまたはエピソームコピー）を有することができる。
【００１７】
いくつかの実施形態では、酵母は、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ウバエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｅ）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア・クルイベリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）菌種、カンジダ・ウティリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、カンジダ・カカオイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃａｃａｏｉ）、ジオトリチュム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）菌種、またはジオトリチュム・フェルメンタンス（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）である。
【００１８】
いくつかの実施形態では、薬剤排出または細胞透過性に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子が、酵母細胞中で破壊される。例えば、遺伝子ＰＤＲ１、ＰＤＲ３、ＰＤＲ５、ＳＮＱ２、またはＥＲＧ６のうちの１つ以上が、酵母細胞中で破壊され得る。
【００１９】
シグナル配列と、ヒトアミロイドベータタンパク質とを含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、発現構築物も開示され、このシグナル配列は、インスリンシグナル配列（例えば、ヒトインスリンシグナル配列）またはトリプシンシグナル配列（例えば、ヒトトリプシンシグナル配列）である。いくつかの実施形態では、ヒトアミロイドベータタンパク質は、シグナル配列に直接融合される。
【００２０】
本発明は、シグナル配列と、式［Ｘ−Ｙ］ｎを有するポリペプチドであって、式中、各Ｘが、独立して、不在であるかまたはリンカーであり、各Ｙが、独立して、ヒトアミロイドベータペプチドであり、ｎが２〜８の整数（端点を含む）である、ポリペプチドと、を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、発現構築物を更に提供し、シグナル配列は、インスリンシグナル配列（例えば、ヒトインスリンシグナル配列）またはトリプシンシグナル配列（例えば、ヒトトリプシンシグナル配列）である。
【００２１】
本明細書に記載される発現構築物によってコードされるポリペプチドは、任意に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３のアミノ酸配列を含むか、またはこれらからなることができる。
【００２２】
いくつかの実施形態では、発現構築物は、プラスミドまたはウイルスベクターである。
【００２３】
シグナル配列と、ヒトアミロイドベータタンパク質とを含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたたプロモーターを含む、発現構築物も開示され、シグナル列は、インスリンシグナル配列（例えば、ヒトインスリンシグナル配列）またはトリプシンシグナル配列（例えば、ヒトトリプシンシグナル配列）であり、細胞中のこの核酸の発現およびこのポリペプチドの産生は、細胞の増殖または生存能力の低下をもたらす。いくつかの実施形態では、この核酸の発現およびこのポリペプチドの産生は、細胞を生存不能にする。いくつかの実施形態では、この細胞は、神経細胞である。いくつかの実施形態では、この細胞は、２９３Ｔ細胞である。
【００２４】
細胞中で毒性を誘導する方法も開示され、これは、本明細書に記載される酵母または哺乳動物細胞を提供することと、細胞に対して毒性である、細胞中の核酸の誘導的または構成的発現レベルを可能にすることと、による。
【００２５】
アミロイドベータ誘導性毒性を予防または抑制する化合物を特定する方法も開示され、これは、本明細書に記載される酵母または哺乳動物細胞を、候補薬剤の存在下で、かつ候補薬剤不在下において細胞中で毒性を誘導するに十分であるレベルでの核酸の発現を可能にする条件下で培養することと、候補薬剤の存在下で細胞増殖または生存能力を測定することと、候補薬剤の存在下で測定された細胞増殖または生存能力を、候補薬剤の不在下での細胞増殖または生存能力と比較することと、により、細胞増殖または生存能力が、候補薬剤の不在下におけるものと比較して、候補薬剤の存在下で上昇する場合には、候補薬剤が、アミロイドベータ誘導性毒性を予防または抑制する化合物として特定される。
【００２６】
アミロイドベータ誘導性毒性の遺伝子サプレッサーまたはエンハンサーを特定する方法も開示され、これは、本明細書に記載される酵母または哺乳動物細胞を提供することであって、この細胞が、遺伝子を過剰発現するように遺伝子改変されている、提供することと、この遺伝子の過剰発現の不在下において細胞中で毒性を誘導するのに十分であるレベルでのこのタンパク質の発現を可能にする条件下で細胞を培養することと、この遺伝子の過剰発現の存在下で細胞増殖または生存能力を測定することと、この遺伝子の過剰発現の存在下で測定された細胞増殖または生存能力を、この遺伝子の過剰発現の不在下のものと比較することと、により、（ｉ）この遺伝子の過剰発現の存在下で測定された細胞増殖または生存能力が、この遺伝子の過剰発現の不在下でのものと比較して上昇している場合には、この遺伝子がアミロイドベータ誘導性毒性の遺伝子サプレッサーとして特定され、（ｉｉ）この遺伝子の過剰発現の存在下で測定された細胞増殖または生存能力が、この遺伝子の過剰発現の不在下でのものと比較して低下している場合には、この遺伝子が、アミロイドベータ誘導性毒性の遺伝子エンハンサーとして特定される。
【００２７】
アミロイドベータ誘導性毒性の遺伝子サプレッサーまたはエンハンサーを特定する方法も開示され、これは、本明細書に記載される酵母または哺乳動物細胞を提供することであって、この細胞の内因性遺伝子が破壊されている、提供することと、この内因性遺伝子の破壊の不在下において細胞中で毒性を誘導するに十分なレベルでのこのタンパク質の発現を可能にする条件下で細胞を培養することと、この内因性遺伝子の破壊の存在下で細胞増殖または生存能力を測定することと、この内因性遺伝子の破壊の存在下において測定された細胞増殖または生存能力を、この内因性遺伝子の破壊の不在下でのものと比較することと、により、（ｉ）この内因性遺伝子の破壊の存在下で測定された細胞増殖または生存能力が、この内因性遺伝子の破壊の不在下でのものと比較して上昇している場合には、この遺伝子がアミロイドベータ誘導性毒性の遺伝子エンハンサーとして特定され、（ｉｉ）この内因性遺伝子の破壊の存在下で測定された細胞増殖または生存能力が、この内因性遺伝子の過破壊の不在下でのものと比較して低下している場合には、この遺伝子が、アミロイドベータ誘導性毒性の遺伝子サプレッサーとして特定される。
【００２８】
特に明記しない限り、本明細書に使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様なまたは同等な方法および材料は、本発明の実行または試験において使用することが可能ではあるが、好ましい方法および材料が以下に説明される。本明細書に言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体が、参照によって組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含む本出願が統制する。加えて、材料、方法、および実施例は、例示的なものにすぎず、限定することを意図するものではない。
【００２９】
[本発明1001]
シグナル配列と、ゴルジ体指向性プロ配列と、ヒトアミロイドベータタンパク質とを含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、発現構築物。
[本発明1002]
シグナル配列と、ゴルジ体指向性プロ配列と、式［Ｘ−Ｙ］ｎを有するポリペプチドとを含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物であって、式中、各Ｘが独立して不在であるかまたはリンカーであり、各Ｙが独立してヒトアミロイドベータペプチドであり、かつｎが端点を含んで2〜8の整数である、発現構築物。
[本発明1003]
前記シグナル配列が、天然起源の酵母タンパク質のシグナル配列と同一である、本発明1001または1002の発現構築物。
[本発明1004]
前記シグナル配列が、酵母接合因子アルファシグナル配列である、本発明1003の発現構築物。
[本発明1005]
前記シグナル配列が、酵母キラートキシンＫ1、分泌酸性ホスファターゼ、インベルターゼ（スクラーゼ）、またはＰｓｔ1のシグナル配列である、本発明1003の発現構築物。
[本発明1006]
前記ゴルジ体指向性プロ配列が、酵母接合因子アルファプロ配列である、本発明1001〜1005のいずれかの発現構築物。
[本発明1007]
前記ゴルジ体指向性プロ配列が、酵母ＫＥＸ2、カルボキシペプチダーゼＹ、Ｐｅｐ4、またはＰｒｂ1のプロ配列である、本発明1001〜1005のいずれかの発現構築物。
[本発明1008]
前記プロモーターが誘導性プロモーターである、本発明1001〜1007のいずれかの発現構築物。
[本発明1009]
前記誘導性プロモーターが、ＧＡＬ1−10、ＧＡＬ1、ＧＡＬＬ、ＧＡＬＳ、ＧＰＤ、ＡＤＨ、ＴＥＦ、ＣＹＣ1、ＭＲＰ7、ＭＥＴ25、ＴＥＴ、ＶＰ16、またはＶＰ16−ＥＲである、本発明1008の発現構築物。
[本発明1010]
各ヒトアミロイドベータタンパク質が、野生型Ａβ38、野生型Ａβ39、野生型Ａβ40、野生型Ａβ41、野生型Ａβ42、野生型Ａβ43、野生型Ａβ48、および野生型Ａβ49からなる群から独立して選択される、本発明1001〜1009のいずれかの発現構築物。
[本発明1011]
各ヒトアミロイドベータタンパク質が、Ａβ38、Ａβ39、Ａβ40、Ａβ41、Ａβ42、Ａβ43、Ａβ48、およびＡβ49からなる群から独立して選択され、かつ、Ａ2Ｔ、Ａ2Ｖ、Ｈ6Ｒ、Ｄ7Ｎ、Ｅ11Ｋ、Ｆ20Ｅ、Ａ21Ｇ、Ｅ22Ｇ、Ｅ22Ｑ、Ｅ22Ｋ、Ｅ22欠失、Ｄ23Ｎ、Ｉ31Ｅ、Ｅ22Ｇ／Ｉ31Ｅ、Ａ42Ｔ、およびＡ42Ｖからなる群から選択される突然変異を含む、本発明1001〜1009のいずれかの発現構築物。
[本発明1012]
前記ヒトアミロイドベータタンパク質が野生型Ａβ42である、本発明1001〜1009のいずれかの発現構築物。
[本発明1013]
前記ポリペプチドが複数のアミロイドベータタンパク質を含む、本発明1001〜1012のいずれかの発現構築物。
[本発明1014]
前記ポリペプチドが少なくとも2つのアミロイドベータタンパク質を含む、本発明1012の発現構築物。
[本発明1015]
前記ポリペプチドが少なくとも4つのアミロイドベータタンパク質を含む、本発明1013または1014の発現構築物。
[本発明1016]
各アミロイドベータタンパク質が、同一のアミノ酸配列を含む、本発明1013〜1015のいずれかの発現構築物。
[本発明1017]
前記ポリペプチドが、異なるアミノ酸配列を有する少なくとも2つのアミロイドベータタンパク質を含む、本発明1013〜1015のいずれかの発現構築物。
[本発明1018]
前記ポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：51、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：53、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：55、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：57、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：59、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：61、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：63、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：65、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：67、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：69、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：71、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：73、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：75、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：77、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：79、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：81、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：83、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：101のアミノ酸配列を含む、本発明1001の発現構築物。
[本発明1019]
エピソームプラスミドまたは組込みプラスミドである、本発明1001〜1018のいずれかの発現構築物。
[本発明1020]
前記組込みプラスミドが、ｐＡＧ303、ｐＡＧ304、ｐＡＧ305、ｐＡＧ306、ｐＲＳ303、ｐＲＳ304、ｐＲＳ305、ｐＲＳ306、またはこれらの誘導体である、本発明1019の発現構築物。
[本発明1021]
酵母細胞中の前記核酸の発現および前記ポリペプチドの産生により、該細胞の増殖または生存能力の低下がもたらされる、本発明1001〜1020のいずれかの発現構築物を含む酵母細胞。
[本発明1022]
前記核酸の発現および前記ポリペプチドの産生により、前記細胞が生存不能となる、本発明1021の酵母細胞。
[本発明1023]
前記発現構築物が、エピソーム性であるか、または前記酵母細胞のゲノムに組み込まれている、本発明1021または1022の酵母細胞。
[本発明1024]
酵母が、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ウバエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｅ）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア・クルイベリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）菌種、カンジダ・ウティリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、カンジダ・カカオイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃａｃａｏｉ）、ジオトリチュム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）菌種、またはジオトリチュム・フェルメンタンス（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）である、本発明1021〜1023のいずれかの酵母細胞。
[本発明1025]
薬剤排出または細胞透過性に関与するタンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子が破壊されている、本発明1021〜1024のいずれかの酵母細胞。
[本発明1026]
前記少なくとも1つの遺伝子が、ＰＤＲ1、ＰＤＲ3、ＰＤＲ5、ＳＮＱ2、またはＥＲＧ6である、本発明1025の酵母細胞。
[本発明1027]
シグナル配列とヒトアミロイドベータタンパク質とを含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物であって、該シグナル配列がインスリンシグナル配列またはトリプシンシグナル配列である、発現構築物。
[本発明1028]
シグナル配列と式［Ｘ−Ｙ］ｎを有するポリペプチドとを含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物であって、式中、各Ｘが独立して不在であるかまたはリンカーであり、各Ｙが独立してヒトアミロイドベータペプチドであり、かつｎが端点を含んで2〜8の整数であり、該シグナル配列がインスリンシグナル配列またはトリプシンシグナル配列である、発現構築物。
[本発明1029]
前記シグナル配列がインスリンシグナル配列である、本発明1027または1028の発現構築物。
[本発明1030]
前記インスリンシグナル配列がヒトインスリンシグナル配列である、本発明1029の発現構築物。
[本発明1031]
前記シグナル配列がトリプシンシグナル配列である、本発明1027または1028の発現構築物。
[本発明1032]
前記トリプシンシグナル配列がヒトトリプシンシグナル配列である、本発明1031の発現構築物。
[本発明1033]
前記ヒトアミロイドベータタンパク質が前記シグナル配列に直接融合されている、本発明1027または1029〜1032のいずれかの発現構築物。
[本発明1034]
各ヒトアミロイドベータタンパク質が、野生型Ａβ38、野生型Ａβ39、野生型Ａβ40、野生型Ａβ41、野生型Ａβ42、野生型Ａβ43、野生型Ａβ48、および野生型Ａβ49からなる群から独立して選択される、本発明1027〜1033のいずれかの発現構築物。
[本発明1035]
各ヒトアミロイドベータタンパク質が、Ａβ38、Ａβ39、Ａβ40、Ａβ41、Ａβ42、Ａβ43、Ａβ48、およびＡβ49からなる群から独立して選択され、かつ、Ａ2Ｔ、Ａ2Ｖ、Ｈ6Ｒ、Ｄ7Ｎ、Ｅ11Ｋ、Ｆ20Ｅ、Ａ21Ｇ、Ｅ22Ｇ、Ｅ22Ｑ、Ｅ22Ｋ、Ｅ22欠失、Ｄ23Ｎ、Ｉ31Ｅ、Ｅ22Ｇ／Ｉ31Ｅ、Ａ42Ｔ、およびＡ42Ｖからなる群から選択される突然変異を含む、本発明1027〜1033のいずれかの発現構築物。
[本発明1036]
前記ヒトアミロイドベータタンパク質が野生型Ａβ42である、本発明1027〜1033のいずれかの発現構築物。
[本発明1037]
前記ポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：93、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：95、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：103のアミノ酸配列を含む、本発明1027の発現構築物。
[本発明1038]
前記発現構築物がプラスミドまたはウイルスベクターである、本発明1027〜1037のいずれかの発現構築物。
[本発明1039]
前記ポリペプチドが複数のアミロイドベータタンパク質を含む、本発明1027〜1038のいずれかの発現構築物。
[本発明1040]
前記ポリペプチドが少なくとも2つのアミロイドベータタンパク質を含む、本発明1039の発現構築物。
[本発明1041]
前記ポリペプチドが少なくとも4つのアミロイドベータタンパク質を含む、本発明1039または1040の発現。
[本発明1042]
各アミロイドベータタンパク質が、同一のアミノ酸配列を含む、本発明1039〜1041のいずれかの発現構築物。
[本発明1043]
前記ポリペプチドが、異なるアミノ酸配列を有する少なくとも2つのアミロイドベータタンパク質を含む、本発明1039〜1041のいずれかの発現構築物。
[本発明1044]
哺乳動物細胞中の前記核酸の発現および前記ポリペプチドの産生により、該細胞の増殖または生存能力の低下がもたらされる、本発明1027〜1043のいずれかの発現構築物を含む哺乳動物細胞。
[本発明1045]
前記核酸の発現および前記ポリペプチドの産生により、前記細胞が生存不能となる、本発明1044の哺乳動物細胞。
[本発明1046]
前記細胞が神経細胞である、本発明1044または1045の哺乳動物細胞。
[本発明1047]
細胞中で毒性を誘導する方法であって、
本発明1021〜1026または本発明1044〜1046のいずれかの細胞を提供する工程と、
該細胞に対して毒性である前記核酸の発現レベルを該細胞中で誘導する工程と、を含む、方法。
[本発明1048]
アミロイドベータ誘導性毒性を予防または抑制する化合物を特定する方法であって、
候補薬剤の存在下で、かつ、該候補薬剤の不在下において前記細胞中で毒性を誘導するのに十分であるレベルでの前記核酸の発現を可能にする条件下で、本発明1021〜1026または本発明1044〜1046のいずれかの細胞を培養する工程と、
前記候補薬剤の存在下で、細胞増殖または生存能力を測定する工程と、
前記候補薬剤の存在下で測定された細胞増殖または生存能力を、前記候補薬剤の不在下での細胞増殖または生存能力と比較する工程と、を含み、
細胞増殖または生存能力が、前記候補薬剤の不在下でのものと比較して前記候補薬剤の存在下で上昇する場合に、前記候補薬剤が、アミロイドベータ誘導性毒性を予防または抑制する化合物として特定される、方法。
[本発明1049]
アミロイドベータ誘導性毒性の遺伝子サプレッサーまたはエンハンサーを特定する方法であって、
遺伝子を過剰発現するように遺伝子改変されている、本発明1021〜1026または本発明1044〜1046のいずれかの細胞を提供する工程と、
前記遺伝子の過剰発現の不在下において前記細胞中で毒性を誘導するのに十分であるレベルでの前記タンパク質の発現を可能にする条件下で、前記細胞を培養する工程と、
前記遺伝子の過剰発現の存在下において、細胞増殖または生存能力を測定する工程と、
前記遺伝子の過剰発現の存在下で測定された細胞増殖または生存能力を、前記遺伝子の過剰発現の不在下での細胞増殖または生存能力と比較する工程と、を含み、
（ｉ）細胞増殖または生存能力が、前記遺伝子の過剰発現の不在下でのものと比較して前記遺伝子の過剰発現の存在下で上昇している場合には、前記遺伝子が、アミロイドベータ誘導性毒性の遺伝子サプレッサーとして特定され、（ｉｉ）細胞増殖または生存能力が、前記遺伝子の過剰発現の不在下のものと比較して前記遺伝子の過剰発現の存在下で低下している場合には、前記遺伝子が、アミロイドベータ誘導性毒性の遺伝子エンハンサーとして特定される、方法。
[本発明1050]
アミロイドベータ誘導性毒性の遺伝子サプレッサーまたはエンハンサーを特定する方法であって、
細胞の内因性遺伝子が破壊されている、本発明1021〜1026または本発明1044〜1046のいずれかの細胞を提供する工程と、
前記内因性遺伝子の破壊の不在下において前記細胞中で毒性を誘導するに十分であるレベルでの前記タンパク質の発現を可能にする条件下で、前記細胞を培養する工程と、
前記内因性遺伝子の破壊の存在下で、細胞増殖または生存能力を測定する工程と、
前記内因性遺伝子の破壊の存在下で測定された細胞増殖または生存能力を、前記内因性遺伝子の破壊の不在下での細胞増殖または生存能力と比較する工程と、を含み、
（ｉ）細胞増殖または生存能力が、前記内因性遺伝子の破壊の不在下でのものと比較して、前記内因性遺伝子の破壊の存在下で上昇している場合には、前記遺伝子が、アミロイドベータ誘導性毒性の遺伝子エンハンサーとして特定され、（ｉｉ）細胞増殖または生存能力が、前記内因性遺伝子の破壊の不在下のものと比較して、前記内因性遺伝子の破壊の存在下で低下している場合には、前記遺伝子が、アミロイドベータ誘導性毒性の遺伝子サプレッサーとして特定される、方法。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１Ａは、単一の構築物中にＡβ４２の４つのコピーを含有する、酵母Ａβ４２発現構築物「Ｍａｔα−Ａβ４２＿４Ｘ」を示す。図１Ｂは、Ａβ４２またはＡβ４０の異なる数のコピーを含有する酵母発現構築物を示す。
【図２】「ｐＡＧ４２５Ｇａｌ−ＭａｔＡβ＿４Ｘ」発現ベクターのマップを示す。
【図３】Ａβ４２またはＡβ４０の異なる数のコピーを含有する構築物の発現の結果から生じた酵母毒性を示す一連の写真である。
【図４】様々なＡβ４２変異体の４つのコピーを含有する構築物の発現の結果から生じた酵母毒性を示す一連の写真である。
【図５】ヒトインスリン（Ｉｎｓ）、ヒトトリプシン（Ｔｒｙｐ）、ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ヒト胎盤分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、またはＡβ４２に融合された海洋カイアシ類のメトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｌｏｎｇａ）のメトリディアルシフェラーゼ（ｍＬｕｃ）のシグナル配列を含有する、哺乳動物Ａβ４２発現構築物を示す。
【図６】「ｐＣＭＶ−Ｉｎｓ−Ａベータ」発現ベクターのマップを示す。
【図７】ヒトインスリン（Ｉｎｓ）、ヒトトリプシン（Ｔｒｙｐ）、ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ヒト胎盤分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、またはＡβ４２に融合された海洋カイアシ類のメトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｌｏｎｇａ）のメトリディアルシフェラーゼ（ｍＬｕｃ）のシグナル配列を含有する、哺乳動物Ａβ４２発現構築物によるトランスフェクション後４８時間（図７Ａ）および７２時間（図７Ｂ）の、２９３Ｔ細胞の細胞溶解物および上清中に存在するヒトＡβ４２の量を示すグラフである。
【図８】インスリンシグナル配列に融合されたＡβ４２もしくはＡβ４０を発現する構築物、または挿入される導入遺伝子を含まないベクター対照によるトランスフェクション後４８時間の、トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の上清中のアデニル酸キナーゼ（細胞損傷／死の指標）の存在を示すグラフである。
【図９】「ｐＬＶ−ｈＳｙｎ−Ａベータ＿ｓｐＩｎｓ」発現ベクターのマップを示す。
【図１０】図１０Ａは、ヒトＡβ４２またはＡβ４０を発現するレンチウイルス構築物による感染後の、ラットの胚皮質ニューロンの細胞溶解物および上清中に存在するヒトＡβ４２またはＡβ４０の量を示すグラフである。図１０Ｂは、ヒトＡβ４２またはＡβ４０を発現するレンチウイルス構築物による感染後の、ＡＴＰレベルを測定することによって決定された、ラットの胚皮質ニューロンの細胞毒性を示すグラフである。
【図１１Ａ】ＧＦＰ発現構築物および指示されたレンチウイルスＡβ構築物によって感染させた生ラット皮質ニューロンの一連の画像である。ＧＦＰ発現構築物でのみ感染された細胞は、対照として機能した（「ＧＦＰのみ」）。上部パネルは、発現構築物および実験プロトコルの模式図を示す。
【図１１Ｂ】指示されたレンチウイルスＡβ構築物またはＧＦＰ（「ＧＦＰのみ」）で感染させたＭａｐ２染色ラットの皮質ニューロンを示す一連の画像である。上部パネルは、発現構築物および実験プロトコルの模式図を示す。
【図１２】２つのアミノ酸リンカーによって連結されたＡβ４２の４つのコピーを含有する、ポリ−Ａβ４２「ｐＬＩＸ４０２−Ｉｎｓ−Ａβ４２−４Ｘ」発現ベクターのマップを示す。ポリ−Ａβは、インスリンシグナルペプチドにＮ末端で連結されている。導入遺伝子の発現は、テトラサイクリン（ドキシサイクリン）誘導性プロモーターによって駆動される。同様な発現ベクターを、Ａβ４０−４Ｘ、Ａβ４０−６ｘ、Ａβ４０−８Ｘ、Ａβ４２＿Ａｒｃｔｉｃ−４Ｘ（「４Ｘ＿Ａｒｃ」とも称される）、Ａβ４２−６Ｘ、およびＡβ４２−８Ｘについても生成した。
【図１３】ポリ−Ａβ４２の発現が、哺乳動物細胞中で細胞毒性を引き起こすことを示す。図１３Ａは、ヒトインスリン（Ｉｎｓ）のシグナル配列を含有する、ドキシサイクリン誘導性ポリ−Ａβ４２発現構築物を示す。図１３Ｂは、哺乳動物ポリ−Ａβ発現構築物を示す。図１３Ｃは、指示されたポリ−Ａβ発現構築物の、２９３Ｔ細胞中のドキシサイクリン誘導発現に及ぼす細胞毒性作用を示すグラフである。図１３Ｄは、誘導後９６時間の２９３Ｔ細胞の細胞上清中に存在するＡβ４２の量を示すグラフである。
【図１４】ポリ−Ａβ発現が、ラット皮質ニューロンにおいて毒性であることを示す。上部パネルは、実験プロトコルの模式図を示す。底部パネルは、指示されたポリ−Ａβ４２またはポリ−Ａβ４０発現構築物を発現するレンチウイルス構築物による感染後の、ＡＴＰレベルを測定することによって決定された、ラットの胚皮質ニューロンの細胞毒性を示すグラフである。
【図１５】損傷細胞から放出されたアデニル酸キナーゼを測定することによって決定された、Ａβ媒介細胞毒性に及ぼすクリオキノールの効果を示すグラフである。
【図１６】図１６Ａは、酵母のポリ−Ａβ−４Ｘ（４つのタンデムＡβペプチド）発現構築物を示す。図１６Ｂは、指示されたポリ−Ａβ−４Ｘ発現構築物の発現の結果から生じた酵母毒性を示す一連の写真、および増殖の定量を示すグラフである。Ｇｌｃはグルコースであり、Ｇａｌはガラクトースである。＊＊＊は、０．００１以下のＰ値を示す。
【図１７】哺乳動物細胞（２９３Ｔ）中の他の天然起源のＡβペプチド断片によって引き起こされた毒性に対する、Ａβ４３媒介毒性の比較を示す。図１７Ａは、哺乳動物モデルにおけるＡβペプチドのためのＣＭＶプロモーター駆動発現系および細胞毒性のエンドポイント測定を示す。図１７Ｂは、異なるＡβペプチドのための哺乳動物発現構築物を示す。図１７Ｃは、指示されたＡβペプチドの発現によって引き起こされた２９３Ｔ細胞中の細胞毒性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
詳細な説明
本明細書に記載される発現構築物およびアミロイドベータ発現細胞は、アミロイドベータ誘導性毒性を調節する化合物または遺伝因子を特定するために使用することができる。このようなスクリーニングによって特定された化合物は、アルツハイマー病などの神経変性疾患の治療または予防に使用することができる。
【００３２】
タンパク質および核酸
アミロイドベータ誘導性毒性を予防または抑制する候補化合物およびアミロイドベータ誘導性毒性の遺伝子サプレッサーまたはエンハンサーを特定するための組成物および方法が、本明細書に記載される。本明細書に記載される組成物および方法で使用される酵母発現構築物は、シグナル配列と、ゴルジ体指向性プロ配列と、ヒトアミロイドベータタンパク質（すなわち、ヒトアミロイドベータペプチド）とを含有する。本明細書に記載される組成物および方法で使用される哺乳動物発現構築物は、選択されたシグナル配列と、ヒトアミロイドベータタンパク質とを含有する。
【００３３】
本発明は、シグナル配列と、ゴルジ体指向性プロ配列と、式［Ｘ−Ｙ］ｎを有するポリペプチドであって、式中、各Ｘが、独立して、不在であるかまたはリンカーであり、各Ｙが、独立して、ヒトアミロイドベータペプチドであり、ｎが２〜２０の整数（端点を含む）である、ポリペプチドとを含むポリペプチドをコードする核酸を提供する。
【００３４】
本発明は、シグナル配列と、式［Ｘ−Ｙ］ｎを有するポリペプチドであって、式中、各Ｘが、独立して、不在であるかまたはリンカーであり、各Ｙが、独立して、ヒトアミロイドベータペプチドであり、ｎが２〜２０の整数（端点を含む）である、ポリペプチドとを含むポリペプチドをコードする核酸を提供し、シグナル配列は、インスリンシグナル配列（例えば、ヒトインスリンシグナル配列）またはトリプシンシグナル配列（例えば、ヒトトリプシンシグナル配列）である。
【００３５】
「ヒトアミロイドベータ」とは、ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のタンパク質分解処理を通して誘導され、かつアミロイド病理に関連する、ヒトアミロイドベータペプチドと同一のアミノ酸配列を指す。用語アミロイドベータ（Ａβ）は、天然起源の野生型アミロイドベータペプチドならびに天然起源の変異体アミロイドベータペプチドを含む。本明細書で使用される用語「ヒトアミロイドベータタンパク質」は、組換え法によって合成的に生成されたタンパク質を包含する。野生型アミロイドベータペプチドは、Ａβ３８、Ａβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２、Ａβ４３、Ａβ４８、およびＡβ４９を含み、Ａβに続く数字は、アミロイド前駆体タンパク質からのタンパク質分解処理後の、アミノ酸の数によって画定されるペプチドの長さを示す。アミロイドベータ突然変異は、Ａ２Ｔ、Ａ２Ｖ、Ｈ６Ｒ（Ｅｎｇｌｉｓｈ変異）、Ｄ７Ｎ（Ｔｏｔｔｏｒｉ変異）、Ｅ１１Ｋ（Ｌｅｕｖｅｎ変異）、Ｆ２０Ｅ、Ａ２１Ｇ（Ｆｌｅｍｉｓｈ変異）、Ｅ２２Ｇ（Ａｒｃｔｉｃ変異）、Ｅ２２Ｑ（Ｄｕｔｃｈ変異）、Ｅ２２Ｋ（Ｉｔａｌｉａｎ変異）、Ｅ２２欠失、Ｄ２３Ｎ（Ｉｏｗａ変異）、Ｉ３１Ｅ、Ｅ２２Ｇ／Ｉ３１Ｅ、Ａ４２Ｔ、およびＡ４２Ｖを含む。これらの突然変異において、最初の文字は、天然起源のアミノ酸を表し、中間の数字は、Ａβペプチド（１〜４２）におけるアミノ酸の位置を表し、番号が付けられた位置に続く最後の文字は、野生型ペプチドが変異されているアミノ酸を表す。突然変異「Ｅ２２欠失」は、アミノ酸のグルタミン酸（Ｅ）が、２２位で欠失されているＡβペプチドを表し、Ｅ２２Ｇ／Ｉ３１Ｅは、アミノ酸のグルタミン酸（Ｅ）およびイソロイシン（Ｉ）の両方が、それぞれグリシン（Ｇ）およびグルタミン酸（Ｅ）で置き換えられているＡβペプチドを表す。これらの突然変異は、天然起源のアミロイドベータペプチドＡβ３８、Ａβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２、Ａβ４３、Ａβ４８、およびＡβ４９、またはこれらの合成誘導体のいずれかに存在し得る。
【００３６】
本明細書に記載されるアミロイドベータペプチドの骨格鎖として用いられるヒトアミロイドベータのアミノ酸１〜４３は、以下の通りである。
0006655557.tif 000002
他の実施形態では、ヒトアミロイドベータのアミノ酸１〜４８は、本明細書に記載されるアミロイドベータペプチドの骨格鎖として用いられる。ヒトアミロイドベータのアミノ酸１〜４８は、以下の通りである。
0006655557.tif 000003
他の実施形態では、ヒトアミロイドベータのアミノ酸１〜４９は、本明細書に記載されるアミロイドベータペプチドの骨格鎖として用いられる。ヒトアミロイドベータのアミノ酸１〜４９は、以下の通りである。
0006655557.tif 000004
【００３７】
本明細書で使用される用語「シグナル配列」とは、ポリペプチド内に存在し、ポリペプチドが細胞内の小胞体を標的化することを可能にするペプチド配列を指す。実施例に記載される例示のシグナル配列は、酵母接合因子アルファシグナル配列（酵母発現構築物に対して）およびヒトインスリンならびにヒトトリプシンシグナル配列（哺乳動物発現構築物に対して）である。酵母発現構築物中に使用することができる追加のシグナル配列の例としては、キラートキシンＫ１分泌酸性ホスファターゼ、インベルターゼ（スクラーゼ）、およびＰｓｔ１のシグナル配列が含まれる。哺乳動物発現構築物中に使用することができる追加のシグナル配列の例としては、ヒト血清アルブミン、オレキシン、ヒトプレプロ副甲状腺ホルモン、ソマトスタチン、シャドー、脳由来神経栄養因子、ニューロペプチドＹ、血管作動性腸管ペプチド、エンケファリン、コレシストキニン、ニューロテンシン、プロ甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、ニューロペプチドＷ、ソマトリベリン、およびソマトトロピンのシグナル配列が含まれる。シグナル配列は、例えば、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｊ  Ｍｅｍｂｒ  Ｂｉｏｌ．１５５（３）：１８９−９７、Ｈａｇｕｅｎａｕｅｒ−Ｔｓａｐｉｓ（１９９２）Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６（５）：５７３−９、およびＰｏｏｌ（２００５）Ｍｏｌ  Ｍｅｍｂｒ  Ｂｉｏｌ．２２（１−２）：３−１５で考察されている。
【００３８】
シグナル配列およびヒトアミロイドベータタンパク質を含有するポリペプチドは、任意に、１つ以上の異種配列を含有してもよい。融合タンパク質の異種配列は、任意に、リンカー、免疫グロブリン要素、二量体化ドメイン、標的ドメイン、安定化ドメイン、または精製ドメインとすることができる。あるいは、アミロイドベータタンパク質は、検出タンパク質などの異種配列と融合することができる。例示の検出タンパク質としては、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、または黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）；酵素、例えば、β−ガラクトシダーゼまたはアルカリホスファターゼ（ＡＰ）；およびエピトープ、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはヘマグルチニン（ＨＡ）が含まれる。例示として、アミロイドベータタンパク質は、アミロイドベータタンパク質のＮ−またはＣ−末端もしくは他の部分でＧＦＰと融合することができる。これらの融合タンパク質は、組換え酵母細胞中のアミロイドベータタンパク質の迅速かつ容易な検出および特定のための方法を提供する。
【００３９】
本明細書で使用される用語「リンカー」とは、２つのポリペプチド部分を連結するアミノ酸の配列を指す。リンカーの例示的な、非限定的機能としては、２つのタンパク質ドメイン間の柔軟性のある成分または空間形成領域の導入、タンパク質分解処理部位の導入（例えば、タンパク質分解切断部位）、または親和性タグの作成が挙げられ得る。リンカーは、任意の好適な長さであってもよく、例えば、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０個、またはそれよりも多くのアミノ酸を含んでもよい。  いくつかの実施形態では、リンカーは、本明細書に記載されるような、スペーサペプチドである。いくつかの実施形態では、スペーサペプチドは、酵母接合因子アルファ１遺伝子からのものである。例えば、いくつかの実施形態では、リンカーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４〜４９またはこれらの断片から選択されるアミノ酸配列を含んでもよい。
【００４０】
いくつかの実施形態では、シグナル配列およびヒトアミロイドベータペプチドを含有するポリペプチドは、複数のヒトアミロイドベータペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、シグナル配列と、ゴルジ体指向性プロ配列と、ヒトアミロイドベータペプチドとを含有するポリペプチドは、複数のヒトアミロイドベータペプチドを含んでもよい。本明細書に記載される発現構築物によってコードされるポリペプチドは、任意に、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０個、またはそれよりも多くのヒトアミロイドベータペプチドを含有することができる。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、少なくとも２つのヒトアミロイドベータペプチドを含む。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、少なくとも４つのヒトアミロイドベータペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ヒトアミロイドベータペプチドのそれぞれは、同一のアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ヒトアミロイドベータペプチドのそれぞれは、Ａβ４２である。他の実施形態では、このポリペプチドは、異なるアミノ酸配列を有する、少なくとも２つのヒトアミロイドベータペプチドを含む。例えば、いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、Ａβ４２およびＡβ４３を含む。
【００４１】
細胞がアミロイドベータタンパク質を発現するように、アミロイドベータタンパク質をコードする核酸を調製し、細胞中に導入する方法も本明細書に記載される。用語「アミロイドベータ核酸」は、本明細書に記載されるアミロイドベータタンパク質のいずれかをコードする配列を含有する核酸を包含する。例示のアミロイドベータ核酸として、Ａβ４２またはＡβ４３をコードするものが含まれる。
【００４２】
用語「核酸」は、一般に、少なくとも１つの核酸塩基、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ中で見られる天然起源のプリンまたはピリミジン塩基を含有する、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの誘導体もしくは模倣物の少なくとも１つの分子または鎖を指す。一般に、用語「核酸」は、少なくとも１つの一本鎖分子を指すが、特定の実施形態では、少なくとも１つの一本鎖分子に対して部分的に、実質的にまたは完全に相補的である少なくとも１つの追加の鎖も包含する。したがって、核酸は、１つ以上の相補的鎖（複数可）または分子の鎖を含む特定の配列の「補体（複数可）」を含む、少なくとも１つの２本鎖分子または少なくとも１つの３本鎖分子を包含してもよい。
【００４３】
実施例は、いくつかの例示的な酵母発現構築物の使用を記載する。以下は、いくつかの追加の例示の酵母発現構築物である。
【００４４】
Ｍａｔα−Ａβ４２＿４Ｘ＿ＮＣ（非切断型、プレプロおよびＡβの４つのコピーが連結されている）ヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）
0006655557.tif 000005
【００４５】
Ｍａｔα−Ａβ４２＿４Ｘ＿ＮＣ（非切断型、プレプロおよびＡβの４つのコピーが連結されている）アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）
0006655557.tif 000006
【００４６】
Ｍａｔα−Ａβ４２＿４Ｘ＿Ｃｌｉｎｋｅｄ（プレプロ切断型、Ａβ連結）ヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）
0006655557.tif 000007
【００４７】
Ｍａｔα−Ａβ４２＿４Ｘ＿Ｃｌｉｎｋｅｄ（プレプロ切断型、Ａβ連結）アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）
0006655557.tif 000008
【００４８】
Ｍａｔα−Ａβ４２＿４Ｘ＿Ｃｌｉｎｋｅｄ２ヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）
0006655557.tif 000009
【００４９】
Ｍａｔα−Ａβ４２＿４Ｘ＿Ｃｌｉｎｋｅｄ２アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）
0006655557.tif 000010
【００５０】
Ｍａｔα−Ａβ４０＿１Ｘヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）
0006655557.tif 000011
【００５１】
Ｍａｔα−Ａβ４０＿１Ｘアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）
0006655557.tif 000012
【００５２】
Ｍａｔα−Ａβ４０＿２Ｘヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）
0006655557.tif 000013
【００５３】
Ｍａｔα−Ａβ４０＿２Ｘアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）
0006655557.tif 000014
【００５４】
Ｍａｔα−Ａβ４２＿２Ｘ−Ａβ４０＿２Ｘヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）
0006655557.tif 000015
【００５５】
Ｍａｔα−Ａβ４２＿２Ｘ−Ａβ４０＿２Ｘアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）
0006655557.tif 000016
【００５６】
Ｍａｔα−Ａβ４２＿２Ｘ−Ａβ４０ｓｃｒ＿２Ｘヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）
0006655557.tif 000017
【００５７】
Ｍａｔα−Ａβ４２＿２Ｘ−Ａβ４０ｓｃｒ＿２Ｘアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）
0006655557.tif 000018
【００５８】
実施例は、いくつかの例示的な哺乳動物発現構築物の使用を記載する。以下は、いくつかの追加の例示の哺乳動物発現構築物である。
【００５９】
Ｉｎｓ−Ａβ４２＿Ａｒｃ＿１Ｘヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）
0006655557.tif 000019
【００６０】
Ｉｎｓ−Ａβ４２＿Ａｒｃ＿１Ｘアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）
0006655557.tif 000020
【００６１】
Ｉｎｓ−Ａβ４２＿Ｆ２０Ｅ＿１Ｘヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）
0006655557.tif 000021
【００６２】
Ｉｎｓ−Ａβ４２＿Ｆ２０Ｅ＿１Ｘアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）
0006655557.tif 000022
【００６３】
Ｉｎｓ−Ａβ４２＿Ｉ３１Ｅ＿１Ｘヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）
0006655557.tif 000023
【００６４】
Ｉｎｓ−Ａβ４２＿Ｉ３１Ｅ＿１Ｘアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）
0006655557.tif 000024
【００６５】
Ｉｎｓ−Ａβ４２＿Ａｒｃ＿Ｉ３１Ｅ＿１Ｘヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）
0006655557.tif 000025
【００６６】
Ｉｎｓ−Ａβ４２＿Ａｒｃ＿Ｉ３１Ｅ＿１Ｘアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）
0006655557.tif 000026
【００６７】
Ｔｒｙｐ−Ａβ４０＿１Ｘヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）
0006655557.tif 000027
【００６８】
Ｔｒｙｐ−Ａβ４０＿１Ｘアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）
0006655557.tif 000028
【００６９】
ＳＥＡＰ−Ａβ４０＿１Ｘヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）
0006655557.tif 000029
【００７０】
ＳＥＡＰ−Ａβ４０＿１Ｘアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）
0006655557.tif 000030
【００７１】
ｍＬｕｃ−Ａβ４０＿１Ｘアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）
0006655557.tif 000031
【００７２】
ｍＬｕｃ−Ａβ４０＿１Ｘアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）
0006655557.tif 000032
【００７３】
ＡＰＰ−Ａβ４０＿１Ｘヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）
0006655557.tif 000033
【００７４】
ＡＰＰ−Ａβ４０＿１Ｘアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）
0006655557.tif 000034
【００７５】
ＮＳＰ−Ａβ４０＿１Ｘヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）
0006655557.tif 000035
【００７６】
ＮＳＰ−Ａβ４０＿１Ｘアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）
0006655557.tif 000036
【００７７】
Ｉｎｓ−Ａβ４２＿４Ｘヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）
0006655557.tif 000037
【００７８】
Ｉｎｓ−Ａβ４２＿４Ｘアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）
0006655557.tif 000038
【００７９】
Ｉｎｓ−Ａβ４２＿Ａｒｃ＿４Ｘヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）
0006655557.tif 000039
【００８０】
Ｉｎｓ−Ａβ４２＿Ａｒｃ＿４Ｘアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）
0006655557.tif 000040
【００８１】
Ｉｎｓ−Ａβ４２＿６Ｘヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）
0006655557.tif 000041
【００８２】
Ｉｎｓ−Ａβ４２＿６Ｘアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）
0006655557.tif 000042
【００８３】
Ｉｎｓ−Ａβ４０＿４Ｘヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）
0006655557.tif 000043
【００８４】
Ｉｎｓ−Ａβ４０＿４Ｘアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）
0006655557.tif 000044
【００８５】
Ｉｎｓ−Ａβ４０＿６Ｘヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）
0006655557.tif 000045
【００８６】
Ｉｎｓ−Ａβ４０＿６Ｘアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）
0006655557.tif 000046
【００８７】
酵母発現構築物、細胞、およびスクリーニングアッセイ
本明細書に記載される組成物および方法で使用することができる酵母としては、サッカロミセス・セレヴィシエ、サッカロミセス・ウバエ、サッカロミセス・クルイベリ、シゾサッカロマイセス・ポンベ、クルイベロミセス・ラクティス、ハンセヌラ・ポリモルファ、ピチア・パストリス、ピチア・メタノリカ、ピチア・クルイベリ、ヤロウイア・リポリティカ、カンジダ菌種、カンジダ・ウティリス、カンジダ・カカオイ、ジオトリチュム菌種、またはジオトリチュム・フェルメンタンスが含まれるが、これらに限定されない。本明細書の論議のほとんどは、異常に切断されたタンパク質を異所性発現するサッカロミセス・セレヴィシエに関するが、これは、単に例示的な目的にすぎない。他の酵母株が、Ｓ．セレヴィシエに代わることができる。
【００８８】
本開示のある特定の態様は、候補治療薬（例えば、医薬品、化学薬剤、または遺伝子薬剤）を特定するためのスクリーニング法に関する。本明細書に記載される方法は、任意に、ＥＲＧ６遺伝子、ＰＤＲ１遺伝子、ＰＤＲ３遺伝子、ＰＤＲ５遺伝子、ＳＮＱ２遺伝子、ならびに／または膜排出ポンプに影響を及ぼすおよび／もしくは薬剤の透過性を増加させる任意の他の遺伝子において突然変異を担持する、酵母株で行うことができる。
【００８９】
本明細書に記載されるポリペプチドをコードする核酸は、プラスミド、線状核酸分子、人工染色体、およびエピソームベクターが含まれるが、これらに限定されない核酸ベクターを用いて、酵母細胞中にトランスフェクトされ得る。
【００９０】
酵母細胞中の組換えプラスミド発現および複製に使用される３つの周知の系として、組込みプラスミド、低コピー数ＡＲＳ−ＣＥＮプラスミド、および高コピー数２μプラスミドが含まれる。Ｐｌａｓｍｉｄ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅｄ．Ｋ．Ｇ．Ｈａｒｄｙ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３のＳｉｋｏｒｓｋｉ，"Ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ"、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＩＩ  Ｕｎｉｔ  １３．４，Ｅｄｓ．，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４のＹｅａｓｔ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｓを参照されたい。
【００９１】
組込みプラスミドの例はＹＩｐであり、これは、ハプロイドゲノム当たり１つのコピーで維持され、メンデルの法則で遺伝される。このようなプラスミドは、目的の遺伝子、細菌の複製起点、および選択可能な遺伝子（通常、抗生物質耐性マーカー）を含有し、細菌中で生成される。精製されたベクターは、選択可能な遺伝子中で直線化され、コンピテント酵母細胞を形質転換するために使用される。
【００９２】
低コピー数ＡＲＳ−ＣＥＮプラスミドの例は、ＹＣｐであり、これは、自律複製配列（ＡＲＳ１）、および動原体配列（ＣＥＮ４）を含有する。これらのプラスミドは、通常、細胞当たり１〜２個のコピー数で存在する。ＣＥＮ配列の除去は、ＹＲｐプラスミドを産生し、これは、通常、細胞当たり１００〜２００個のコピー数で存在する。しかしながら、このプラスミドは、有糸分裂および減数分裂の両方で不安定である。
【００９３】
高コピー数２μプラスミドの例は、ＹＥｐであり、これは、約１ｋｂの長さの配列（２μ配列と命名）を含有する。この２μ配列は、より高いプラスミドコピー数を生じる酵母レプリコンとして作用する。しかしながら、これらのプラスミドは不安定であり、維持のための選択を必要とする。コピー数は、プラスミド上で選択遺伝子を不活性化されたプロモーターに作動可能に連結させることによって増加される。
【００９４】
多種多様なプラスミドを、本明細書に記載される組成物および方法で使用することができる。一実施形態では、プラスミドは、組込みプラスミド（例えば、ｐＡＧ３０３、ｐＡＧ３０４、ｐＡＧ３０５、ｐＡＧ３０６、ｐＲＳ３０３、ｐＲＳ３０４、ｐＲＳ３０５、ｐＲＳ３０６、またはこれらの誘導体）である。例えば、Ａｌｂｅｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）"Ａ  ｓｕｉｔｅ  ｏｆ  Ｇａｔｅｗａｙ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ"Ｙｅａｓｔ  ２４（１０）：９１３−１９を参照されたい。他の実施形態では、このプラスミドは、エピソームプラスミド（例えば、ｐ４２６ＧＰＤ、ｐ４１６ＧＰＤ、ｐ４２６ＴＥＦ、ｐ４２３ＧＰＤ、ｐ４２５ＧＰＤ、ｐ４２４ＧＰＤ、またはｐ４２６ＧＡＬ）である。
【００９５】
使用されるプラスミドの型に無関係に、酵母細胞は、通常、化学的方法（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に、Ｒｏｓｅらによって１９９０年に記載されている方法）によって形質転換される。細胞は、通常、酢酸リチウムで処理され、ＤＮＡ１μｇ当たり約１０４のコロニー形成単位（形質転換細胞）の形質転換効率を達成する。カットする選択可能なマーカーが、変異した（通常、点変異または小欠失）宿主遺伝子と組み換わり、機能を回復するように、酵母は相同組換えを実行する。形質転換細胞は、次いで選択培地上で単離される。当然のことながら、核酸を酵母細胞中に導入するための任意の好適な手段を使用することができる。
【００９６】
本明細書に記載される酵母ベクター（プラスミド）は、通常、酵母複製起点、抗生物質耐性遺伝子、細菌複製起点（細菌細胞中の増殖のための）、マルチプルクローニングサイト、および酵母細胞中での維持のための酵母栄養遺伝子を含有する。栄養遺伝子（または栄養要求性マーカー）は、ほとんどの場合、以下のうちの１つである。１）ＴＲＰ１（ホスホリボシルアントラニレート異性体）、２）ＵＲＡ３（オロチジン−５'−ホスフェートデカルボキシラーゼ）、３）ＬＥＵ２（３−イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ）、４）ＨＩＳ３（イミダゾールグリセロホスフェートデヒドロゲナーゼまたはＩＧＰデヒドロゲナーゼ）、または５）ＬＹＳ２（α−アミノアジペート−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ）。
【００９７】
本明細書に記載される酵母ベクター（プラスミド）は、プロモーター配列も含有してよい。「プロモーター」は、転写の開始および速度が制御される核酸配列の領域である、コントロール配列である。これは、特異的な転写核酸配列を開始するために、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子などの調節タンパク質および分子が結合し得る遺伝子要素を含有してもよい。語句「作動可能に連結された」および「作動可能に位置付けられた」とは、この配列の転写開始および／または発現を制御するために、プロモーターが核酸配列に対して正確な機能的な位置および／または向きにあることを意味する。
【００９８】
プロモーターは、これがコードセグメントおよび／またはエクソンの上流に位置する５'非コード配列を単離することによって得ることができるために、自然に核酸と関連するものであり得る。このようなプロモーターは、「内因性」と称することができる。あるいは、プロモーターは、組換え体または異種プロモーターであってもよく、これらは、その自然環境において、通常、核酸とは関連しないプロモーターを指す。このようなプロモーターは、他の遺伝子のプロモーターおよび「天然起源」ではないプロモーターを含んでもよい。使用されるプロモーターは、構成的または誘導性のいずれであってもよい。
【００９９】
例えば、様々な酵母特異的プロモーター（要素）が、酵母細胞中のＲＮＡの発現を調節するために使用されてもよい。誘導性酵母プロモーターの例として、ＧＡＬ１−１０、ＧＡＬ１、ＧＡＬＬ、ＧＡＬＳ、ＴＥＴ、ＶＰ１６、およびＶＰ１６−ＥＲが含まれる。抑圧性酵母プロモーターの例として、Ｍｅｔ２５が含まれる。構成的酵母プロモーターの例として、グリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼプロモーター（ＧＰＤ）、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（ＡＤＨ）、翻訳−伸長因子−１アルファプロモーター（ＴＥＦ）、シトクロムｃ−オキシダーゼプロモーター（ＣＹＣ１）、およびＭＲＰ７が含まれる。グルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）を含む、グルココルチコイドホルモンによって誘導可能なプロモーターを含有する酵母の発現ベクターを自律的に複製することも記載されている（Ｐｉｃａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。これらおよび他の例は、Ｍｕｍｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５、Ｒｏｎｉｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７、Ｇａｏ，２０００に記載されており、これら全ては、参照により本明細書に組み込まれる。アルファ因子、アルコールオキシダーゼ、およびＰＧＨなどの構成的または誘導性プロモーターを含有する、更に他の酵母ベクターが使用されてもよい。査読のために、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．およびＧｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７を参照されたい。
【０１００】
いくつかの実施形態では、ガラクトース以外の炭素源でＧＡＬプロモーターからの発現、例えば誘導性発現を可能にする酵母菌株が用いられる。いくつかの実施形態では、菌株は、Ｇａｌ４  ＤＮＡ結合ドメインが、転写活性化ドメインおよび調節ドメインに融合されている融合タンパク質をコードする組込みまたはエピソーム（例えば、プラスミド由来の）遺伝子を担持する。この融合タンパク質は、転写を活性化するためのその能力が、小分子の調節ドメインの結合によって調節されていることを特徴とする。例えば、いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、小分子の不在下においては転写を活性化しないが、一方、小分子の存在下においては、融合タンパク質は転写を活性化する。例示の小分子としては、例えば、ステロイドホルモンが含まれ、対応する調節ドメインは、小分子に対する受容体の少なくとも一部を含む。例えば、小分子は、エストロゲン（例えば、エストラジオール）、またはその類似体（例えば、タモキシフェン）であってもよく、対応する調節ドメインは、エストロゲン受容体（ＥＲ）の少なくとも一部を含む。例示の活性化ドメインとしては、単純疱疹ウイルスタンパク質ＶＰ１６の活性化ドメインなどのウイルスタンパク質活性化ドメインが含まれる。いくつかの実施形態では、菌株は、Ｇａｌ４−ＥＲ−ＶＰ１６をコードする、組込みまたはエピソーム（例えばプラスミド由来の）遺伝子を担持する。培地中のエストロゲン受容体リガンド、例えばエストラジオールの存在は、ガラクトース以外の炭素源でのＧＡＬプロモーターからの発現を可能にする。目的の分子、例えば、アミロイドベータペプチドを、条件付きで、例えば、ガラクトースまたは他の炭素源を含有する培地上で発現させるための多数の方法が存在する。
【０１０１】
本開示のある特定の態様は、アミロイドベータ誘導性毒性を調節する候補薬物（薬剤または化合物）もしくは遺伝因子をスクリーニングする方法を提供する。核酸、ポリペプチド、小分子化合物、およびペプチド模倣物を含む種々のタイプの候補薬物が、本明細書に記載された方法によってスクリーニングすることができる。場合によっては、酵母細胞を、遺伝子をコードする核酸構築物と接触させることによって、遺伝子薬剤をスクリーニングすることができる。例えばアミロイドベータ誘導性毒性を調節する遺伝子を特定するために、様々な遺伝子を発現するｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングしてもよい。
【０１０２】
例えば、特定された薬物は、アミロイドベータ誘導性毒性を調節することができる。したがって、正確な作用機序に関わらず、本明細書に記載されるスクリーニング法によって特定された薬物は、アルツハイマー病に対して治療利益を与えることが期待される。
【０１０３】
本開示のある特定の態様は、アミロイドベータ誘導性毒性を調節する化合物または遺伝子を特定する方法を提供する。酵母の最強の態様の１つは、毒性を軽減する潜在性を有する遺伝子、ペプチド、および他の化合物を特定することができる大量処理スクリーニングを実行する可能性である。多数の化合物を、様々な増殖条件下において、かつ様々な遺伝的背景においてスクリーニングすることができる。毒性スクリーニングは、アミロイドベータと相互作用する化合物を選択することのみならず、それら自体は細胞毒性ではなく、いまだ特定されていない上流または下流標的も選択することの利点を有する。
【０１０４】
ある特定の実施形態では、候補薬物は、合成または天然化合物の多数のライブラリーからスクリーニングすることができる。一例は、ヒトが使用することができる化合物のＦＤＡ承認ライブラリーである。加えて、化合物ライブラリーは、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｔｒｅｖｉｌｌｅｔ，Ｃｏｒｎｗａｌｌ，  ＵＫ）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）、Ｍｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ（Ｎｅｗ  Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＣＴ）、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、ＡＫｏｓ  Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ＧｍｂＨ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ａｍｂｉｎｔｅｒ（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）、Ａｓｉｎｅｘ（Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕｓｓｉａ）、Ａｕｒｏｒａ（Ｇｒａｚ，Ａｕｓｔｒｉａ）、ＢｉｏＦｏｃｕｓ  ＤＰＩ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、Ｂｉｏｎｅｔ（Ｃａｍｅｌｆｏｒｄ，ＵＫ）、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ，（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＣｈｅｍＤｉｖ，（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｌｏｃｋ  Ｌｔ，（Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕｓｓｉａ）、ＣｈｅｍＳｔａｒ（Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕｓｓｉａ）、Ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｌｔｄ  Ｏｂｎｉｎｓｋ，  Ｒｕｓｓｉａ）、Ｅｎａｍｉｎｅ  Ｋｉｅｖ，  Ｕｋｒａｉｎｅ）、  Ｅｖｏｔｅｃ  Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｉｎｄｏｆｉｎｅ（Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏｕｇｈ，ＮＪ）、Ｉｎｔｅｒｂｉｏｓｃｒｅｅｎ  Ｍｏｓｃｏｗ，  Ｒｕｓｓｉａ）、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ（Ｍｏｎｔｌｕｃｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）、Ｌｉｆｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．（Ｏｒａｎｇｅ，ＣＴ）、Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｔｄ．（Ｍｏｓｃｏｗ，  Ｒｕｓｓｉａ）、Ｏｔａｖａ，（Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＯＮ）、ＰｈａｒｍＥｘ  Ｌｔｄ．（Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕｓｓｉａ）、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ（Ｍｏｎｍｏｕｔｈ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ，ＮＪ）、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ（Ｃｅｎｔｅｒ  Ｏｓｓｉｐｅｅ，ＮＨ）、Ｓｐｅｃｓ（Ｄｅｌｆｔ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、ＴｉｍＴｅｃ（Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ），Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．（Ｎｏｒｔｈ  Ｙｏｒｋ  ＯＮ）、ＵｋｒＯｒｇＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｋｉｅｖ，Ｕｋｒａｉｎｅ）、Ｖｉｔａｓ−Ｍ，（Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕｓｓｉａ）、Ｚｅｌｉｎｓｋｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，（Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕｓｓｉａ）、およびＢｉｃｏｌｌ（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）が含まれるが、これらに限定されない多数の企業から市販されている。コンビナトリアルライブラリーも利用可能であり、調製することができる。細菌、真菌、植物、および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーは、市販されており、または当該技術分野において周知の方法によって容易に調製することができる。動物、細菌、真菌、葉および樹皮を含む植物源、ならびに海洋試料などの天然供給源から単離された化合物は、潜在的に有用な医薬物質の存在に対する候補化合物としてアッセイされ得ることが提案される。スクリーニングされる医薬物質は、化学組成物または人工化合物から誘導または合成され得ることも理解されるであろう。いくつかの市販のライブラリーをスクリーニングにおいて使用することができる。
【０１０５】
別の実施形態は、遺伝子スクリーニングに関する。例えば、アミロイドベータ誘導性毒性の遺伝子外サプレッサーまたはエンハンサーを見出すために、ゲノムライブラリーおよび破壊ライブラリーを、スクリーニングすることができる。酵母ゲノムは小型であり、良好な網羅のために、各タイプの１０，０００個の形質転換体で十分のはずである。
【０１０６】
別の実施形態は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を用いるスクリーニングアッセイを意図する。ＦＲＥＴは、ドナー蛍光体が、アクセプター蛍光体にごく近接する（１０〜６０Ａ）場合に、かつ第１の放射波長が第２の励起波長に重なり合う場合に発生する（Ｋｅｎｗｏｒｔｈｙ  ＡＫ  ｅｔ  ａｌ．，２００１．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２４：２８９−９６）。ＦＲＥＴは、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）および黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）融合タンパク質が、同一の複合体の実際に一部である場合に発生するはずである。
【０１０７】
アミロイドベータタンパク質は、それぞれＣＦＰおよびＹＦＰに融合され、ＧＡＬ１−１０プロモーターの調節下で、酵母ゲノム中に組み込まれることができる。細胞は、発現を誘導するために、ガラクトース中で増殖される。誘導の際に、細胞は融合タンパク質を生成し、この融合タンパク質は凝集し、ＣＦＰおよびＹＦＰを互いにすぐ近くに寄せる。凝集体中のタンパク質は密集されているために、ＣＦＰとＹＦＰとの間の距離は、ＦＲＥＴが発生するために必要である１００Ａの臨界値未満である。この場合、ＣＦＰの発光によって放出されるエネルギーは、ＹＦＰを励起し、次にＹＦＰが、その特徴的な波長で発光するであろう。ＦＲＥＴベースのスクリーニングは、凝集を生じさせない状態でタンパク質を維持することによって、ＣＦＰおよびＹＦＰの相互作用を破壊することができる薬物、遺伝子、または他の因子を含む候補化合物を特定するために使用することができる。
【０１０８】
一実施形態は、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）分析を用いるスクリーニングアッセイを意図する。ＦＡＣＳは、蛍光標識／タグ付き部分の存在に対して、個々の細胞を走査する手段を提供する。この方法は、生細胞または固定細胞のいずれかに対して、迅速で、信頼性の高い、定量的、かつマルチパラメータの分析を提供するためのその能力において特有である。例えば、アミロイドベータタンパク質は、適切に標識され、上に述べた個々の酵母細胞の他の遺伝的または増殖条件の結果としてのタンパク質凝集の分析および定量のための有用なツールを提供することができる。
【０１０９】
スクリーニング（例えば、化合物についてのおよび／または遺伝子サプレッサーもしくはエンハンサーについての）は、様々な異なる条件下で実行することができる。例えば、様々な異なる培養基を用いることができる。培養基は、異なる炭素源、例えば、グルコース、グリセロール、ガラクトース、ラフィノース等の異なる糖を含有することができる。いくつかの実施形態では、２つ、３つ、またはそれよりも多くの異なる培養条件（例えば、異なる炭素源を含有する培養基）を用いて、複数回のスクリーニングが実施され、少なくとも２つの異なる培養条件下で「ヒットする」ものとして特定された化合物または遺伝子が特定される。いくつかの実施形態では、スクリーニングは、２つ以上の異なる培養条件下で（例えば、異なる炭素源を含有する培養基を用いて）実施され、異なる培養条件（例えば、異なる炭素源）は、異なるレベルのミトコンドリア呼吸をもたらす。例えば、グルコース、グリセロール、またはガラクトースを含有する培養基を用いる増殖は、異なるレベルのミトコンドリア呼吸をもたらす。グルコース中では、酵母細胞は発酵し、全てのグルコースがエタノールに変換されるまで、呼吸は低いままである。ガラクトース中では、呼吸は、適度に活性状態である。グリセロール中では、酵母細胞は、増殖のために呼吸に完全に依存する状態にある。いくつかの実施形態では、スクリーニングは、炭素源としてグルコース、ガラクトース、またはグリセロールを含有する培地を用いて並行して実施される。
【０１１０】
ある特定の実施形態は、酵母系で特定されたこれらの潜在的薬剤を、他のモデル系で更に試験する方法を提供する。モデル系としては、寄生虫、ハエ、哺乳動物細胞、およびインビボ動物モデルが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１１】
哺乳動物発現構築物、細胞、およびスクリーニングアッセイ
アミロイドベータ核酸は、プラスミド、線状核酸分子、人工染色体、およびウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない核酸ベクターを用いて、哺乳動物細胞中にトランスフェクトすることができる。ベクターは、本明細書に記載されるアミロイドベータ核酸のいずれかを導入遺伝子として含有することができる。
【０１１２】
構築物（複数可）を含有するベクターまたは核酸分子が発現用に調製されると、様々な好適な手段、すなわち、形質転換、トランスフェクション、接合、原形質融合、電気穿孔法、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿法、直接マイクロインジェクション等のいずれかによって、ＤＮＡ構築物（複数可）が適切な宿主細胞中に導入され得る。ベクターがウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）である場合、ベクターは、直接感染によって、細胞に送達させることができる。好ましくは、ベクターは宿主ゲノムに安定して組み込まれ。安定して組み込まれた核酸（例えば、ベクター）を含有する細胞系を生成する方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹ  Ｖｏｌ．１，２，３（１９８９）を参照されたい）。簡単に言うと、核酸でトランスフェクトされた細胞は、例えば、Ｇ４１８、ネオマイシン、またはハイグロマイシンＢを含む抗生物質に対して、宿主を用いて選択されることができる。一般に、トランスフェクトされた核酸は、好適な抗生物質耐性遺伝子を含有するか、または好適な抗生物質耐性遺伝子を含有するベクターでコトランスフェクトされる。したがって、抗生物質耐性遺伝子をコードする安定して組み込まれた核酸を含有する細胞およびそれらの子孫のみが、抗生物質中で増殖される場合に、生存するであろう。
【０１１３】
アミロイドベータは、誘導性プロモーターの制御下で発現され得る。誘導物質の適用後にアミロイドベータの誘導を評価するための方法としては、アミロイドベータに特異的な抗体またはＲＴ−ＰＣＲを用いるウェスタンブロッティングまたはアミロイドベータのｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロッティング法が含まれる。このような方法は当業者には周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｖｏｌ．１，２，３（１９８９）に詳細に記載されている。アミロイドベータの発現は、誘導後、例えば約１時間（例えば、約３０分、約９０分、約２時間、約３時間、約４時間、約６時間、約８時間、約１２時間、約１２時間、約１６時間、約２０時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間以上）で検出することができる。いくつかの実施形態では、誘導後、発現における変化を経時的に判定（評価）することができる。例えば、誘導前（すなわち、誘導物質が添加される前）のアミロイドベータの発現の量は、誘導後の様々な時点で（例えば、１、４、８、および１２時間；４、８、１２、および１６時間；８、１２、１６、および２０時間；１２、２４、３６、および４８時間）細胞によるアミロイドベータの発現と比較することができる。
【０１１４】
誘導物質の好適な出発濃度は、約０．００１μＭ（例えば、約０．０１μＭ、約０．１μＭ、約１．０μＭ、約１０．０μＭ、約１００μＭ）である。誘導剤の濃度は、特定の実験に対して最適化することができ、例えば、細胞系、導入遺伝子、または細胞が増殖される培養条件（例えば、低血清条件）に依存することができることが理解される。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターの制御下で、アミロイドベータをコードする核酸ベクターを含有する哺乳動物細胞（例えば、哺乳動物神経細胞）は、非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、またはモルモット）におけるものである。ベクターは、哺乳動物細胞（例えば、神経細胞）にエクスビボで導入されることができ、すなわち、細胞は、インビトロでトランスフェクトされ、その後、哺乳動物に埋め込まれるか、または他の方法で送達され得る（例えば、外科的に移植される）。あるいは、非ヒトトランスジェニック動物が確立されることが可能であり、核酸ベクターは、当該技術分野において既知の様々な技術を用いる（例えば、Ｍａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００１）Ｅｘｐ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１１、およびＨｏｆｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｍｏｕｓｅ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．，Ｖｏｌ．２９（２００２）を参照されたい）。
【０１１６】
誘導性プロモーターが使用されるこれらの実施形態では、動物におけるアミロイドベータの誘導は、動物に適切な量の誘導物質を投与することによって達成することができる。誘導物質は、食物または水の一部として（すなわち、食物中または水中で）哺乳類に送達することができるか、または静脈内または非経口的に（例えば、皮下注射）で投与することができる。動物モデルにおける誘導剤の好適な投与量および導入遺伝子の誘導を検出するための方法は、例えば、Ｔｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １１：９９−１０７、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６２（５）：１６９３−１７０７、およびＺａｂａｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４：２７９９−２８０４に記載されている。
【０１１７】
上で述べた哺乳動物細胞のインビトロまたはインビボ実施形態のいずれかは、以下のスクリーニング法で使用することができることが理解される。
【０１１８】
本開示のある特定の態様は、哺乳動物神経細胞中のアミロイドベータの過剰発現の結果として生じる細胞毒性を予防または抑制する「候補薬剤」（例えば、化合物または薬物）をスクリーニングし、特定する方法を提供する。したがって、本明細書で言及される「候補薬剤」は、哺乳動物神経細胞中のアミロイドベータの過剰発現の結果として生じる細胞毒性を低減し、妨害し、または削減する（すなわち、予防または抑制する）可能性を有する任意の物質である。
【０１１９】
核酸、ポリペプチド、小分子化合物、大分子化合物、ペプチド模倣物、または本明細書に記載される任意の他の化合物（例えば、以下の「化合物」を参照）が含まれるが、これらに限定されない、様々な種類の候補薬剤が、本明細書に記載される方法によってスクリーニングされ得る。場合によっては、候補薬剤は、哺乳動物神経細胞中のアミロイドベータの過剰発現の結果として生じる細胞毒性を低減し、妨害し、または削減する遺伝子薬剤である。例えば、本明細書に記載される疾患のための可能性のある治療用遺伝子を特定するために、様々な遺伝子に関するコード配列を含有するｃＤＮＡライブラリーがスクリーニングされ得る。あるいは、哺乳動物細胞中のアミロイドベータ発現の結果として生じる細胞毒性に寄与する遺伝的要素を特定するようにスクリーニングが実施されることが可能である。例えば、１つ以上の遺伝子の不在下で細胞毒性のレベルまたは量を決定することができるように、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのライブラリーがスクリーニングされてもよい。別の例では、スクリーニングアッセイを実施する前に、哺乳動物神経細胞が突然変異誘発され、１つ以上の遺伝子を不活性化することができる。これらの例では、遺伝子の不在下（突然変異による不活性化またはサイレンシングを通しての）における細胞中のアミロイドベータ誘導性細胞毒性のレベルの低下は、この遺伝子が、アミロイドベータ誘導性細胞毒性に寄与することを示す。したがって、遺伝子を標的化するｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、アルツハイマー病を治療する上で有用であるとすることができる。
【０１２０】
アミロイドベータの過剰発現の結果として生じる細胞毒性を予防または抑制することが可能な薬剤を特定するためのスクリーニング法は、下記のステップを伴うことができる。（ｉ）細胞を、候補薬剤の存在下で、かつ候補薬剤不在下において細胞中で毒性を誘導するに十分であるレベルでのアミロイドベータをコードする核酸の発現を可能にする条件下で培養することと、（ｉｉ）候補薬剤の存在下で、細胞の生存能力を測定することと、（ｉｉｉ）候補薬剤の存在下で測定された細胞の生存能力を、候補薬剤の不在下での細胞の生存能力と比較することと、であり、細胞の生存能力が、候補薬剤の不在下におけるものと比較して、候補薬剤の存在下で大きい場合には、候補薬剤が、アミロイドベータ誘導性毒性を予防または抑制する化合物として特定される。
【０１２１】
スクリーニングアッセイは、アミロイドベータをコードする安定して組み込まれた核酸を含有する哺乳動物細胞を伴うことができる（任意に、誘導性プロモーターの制御下にある）。細胞は任意の哺乳動物細胞とすることができるが、好ましくは、細胞は神経細胞（例えば、一次神経細胞、またはＰＣ１２、Ｈ４、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、Ｎｅｕｒｏ−２ａ、ＳＶＧ  ｐ１２、ＣＣＦ−ＳＴＴＧ１、ＳＷ１０８８、ＳＷ１７８３、ＬＮ−１８、Ａ１７２、Ｕ−１３８  ＭＧ、Ｔ９８Ｇ、Ｕ−８７  ＭＧ、Ｕ−１１８  ＭＧ、Ｈｓ６８３、Ｍ０５９Ｋ、Ｍ０５９Ｊ、Ｈ４、ＬＮ−２２９、Ｄａｏｙ、またはＰＦＳＫ−１などの神経細胞系）である。追加の細胞系は、アメリカ培養細胞系保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓｓ，ＶＡで入手可能である。
【０１２２】
細胞は、化合物の２つ以上の濃度で処理することができ、ここでは、例えば、濃度依存性またはＥＣ５０が決定されるべきである。アッセイのための候補化合物の好適な濃度としては、例えば、約０．０１μＭ〜１ｍＭの作用剤（例えば、約０．０１μＭ〜０．１μＭ、約０．１μＭ〜１μＭ、約１μＭ〜１０μＭ、約１０〜１ｍＭ、または約１００μＭ〜１ｍＭ）が含まれる。
【０１２３】
アミロイドベータ誘導性細胞毒性を予防または抑制するための薬剤の有効性を評価する方法は定量的、半定量的、または定性的とすることができる。したがって、例えば、薬剤の活性は、離散値として測定することができる。薬剤の有効性の定量的測定の例は、５０％有効濃度、またはＥＣ５０値であり、これは、この薬剤の最大応答の半分を与える薬剤（例えば、化合物）のモル濃度である。あるいは、薬剤の有効性は、当該技術分野において既知の様々な半定量的／定性的システムを用いて判定することができる。したがって、哺乳動物細胞中のアミロイドベータ誘導性細胞毒性を予防または抑制するための薬剤の有効性は、例えば、（ａ）「優秀」、「良好」、「概ね良好」、「概ね不良」、および／もしくは「不良」のうちの１つ以上、（ｂ）「非常に高い」、「高い」、「平均的」、「低い」、および／もしくは「非常に低い」のうちの１つ以上、または（ｃ）「＋＋＋＋＋」、「＋＋＋＋」、「＋＋＋」、「＋＋」、「＋」、［＋／−」、および／もしくは「−」のうちの１つ以上として表すことができる。
【０１２４】
方法は、哺乳動物細胞中のアミロイドベータ誘導性細胞毒性を予防または抑制することにおける薬剤（例えば、本明細書に記載されるもののいずれかなどの化合物）の有効性を決定することを含む。細胞は、一般に、固体支持マトリックス（例えば、プラスチック組織培養プレート、またはマルチウェル（９６または３８６ウェル）組織培養プレート）上に播種され、適切な培地で増殖される。次いで、細胞を、一般に、例えば、１０μＭ〜０．１μＭの範囲の候補薬剤段階希釈物と接触させる。多くの場合、対照化合物（例えば、既知の濃度の既知の阻害薬）もまた、内部標準として細胞のセットに添加される。多くの場合、細胞のセットは、その中に化合物が供給される担体、緩衝液、または溶媒の存在下で増殖される。細胞は、試験化合物の存在下または不在下で、種々の時間にわたって、例えば、１〜３日間（１日間、２日間、３日間、４日間、１週間、２週間）増殖され、その後、プレート上に残っている細胞の数またはプレート上に残っている細胞の生存能力について試験する。薬剤の存在下または不在下におけるアミロイドベータ誘導性細胞毒性の程度を検出する（例えば、決定または測定する）方法は、無数にあり、当業者に周知である。これらの方法は、例えば、細胞中のＡＴＰ濃度を測定することを含むことができる。細胞中に存在するＡＴＰの量は、その集団中の生細胞の数に比例する。一例では、ＡＴＰ濃度は、例えば、ルシフェラーゼ／ルシフェリンを用いることによって、酵素的に決定することができる。これらの酵素は、ＡＴＰ加水分解を必要とする反応において光シグナルを生成する。したがって、試料中により多くのＡＴＰが存在すれば、より多くの光が生成される。この方法では、初めに細胞が収集され、溶解される。細胞溶解物は、次いで、ルシフェラーゼ／ルシフェリンと一緒にインキュベートされ、試料から生成されたＡＴＰ依存性の光を、照度計（例えば、Ｔｕｒｎｅｒ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍ  ＴＤ−２０／２０照度計、Ｔｕｒｎｅｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて検出および／または定量することができる。この場合、アミロイドベータ誘導性細胞毒性を予防または抑制することでの所与の薬剤の有効性を決定するために、化合物の存在下において誘導された細胞から生成された光シグナルの量は、薬剤の不在下において誘導された細胞から生成された光シグナルのものと比較することができる。薬剤の不在下において培養された細胞のものと比較して、薬剤の存在下において培養された細胞の溶解物からより多くの光シグナルが生成される場合、これは、この化合物が細胞毒性を予防または抑制することを示す。この方法の更なる例は、実施例に記載されている。
【０１２５】
アミロイドベータ誘導性細胞毒性を予防または抑制することでの薬剤の有効性を決定するための他の好適な方法としては、例えば、薬剤の不在下または存在下における一定期間の誘導後に残存する細胞の数を計数することを含む。この方法では、細胞はプレートからトリプシン化され、染料（例えば、トリパンブルー）で染色され、顕微鏡または機械的細胞計数器（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｚ１（商標）シリーズＣＯＵＬＴＥＲ  ＣＯＵＮＴＥＲ（登録商標）Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｃｏｕｎｔｅｒ）を用いて計数されることが可能である。トリパンブルーのような染料は、死細胞または死滅しつつある細胞だけに取り込まれるために、この方法は、集団中の生存細胞と非生存細胞との間の識別（すなわち、青色または白色の細胞）を可能にする。処置後の薬剤（例えば、本明細書に記載される組成物のいずれか１つ）によるアミロイドベータ誘導性細胞毒性の予防または抑制を決定するための別の方法は、代謝アッセイ、例えば、ＭＴＴ代謝アッセイ（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）である。ＭＴＴジフェニルテトラゾリウムブロマイドは、ミトコンドリア呼吸鎖に属するスクシネートデヒドロゲナーゼ系によって、ホルマザン結晶に切断されるテトラゾリウム塩（黄色がかった）であり、生細胞でのみ活性である。ミトコンドリアスクシネートデヒドロゲナーゼは、電子カップリング試薬の存在下で、ＭＴＴ結晶を紫色ホルマザンに還元する。化合物による細胞の処理後に、細胞は、ＭＴＴ試薬に曝され、より多くの生細胞がウェル中に存在するならば、より多くのホルマザン染料が生成される。ホルマザン染料の量は、例えば、分光光度計を用いて測定することができる。
【０１２６】
細胞中の細胞毒性（例えば、哺乳動物細胞中のアミロイドベータの過剰発現の結果として生じる細胞毒性）の薬剤（例えば、本明細書に記載される化合物または組成物）による予防または抑制を試験する他の通常使用される方法としては、細胞中のＤＮＡ合成のモニタリングが含まれる。例えば、薬剤の存在下または不在下において増殖された誘導細胞は、細胞分裂の際に細胞のＤＮＡ中に組み込まれるヌクレオチド類似体によっても処置される。このようなヌクレオチド類似体の例としては、例えば、ＢｒｄＵまたは３Ｈ−チミジンが含まれる。それぞれの場合に、誘導細胞（所定の薬剤の存在下または不在下において増殖された）中に組み込まれた標識の量が定量され、標識の組み込みの量は、細胞の集団中で増殖された細胞の量に正比例する。薬剤の存在下または不在下において誘導細胞中に組み込まれた標識の量は、非誘導細胞中に組み込まれた標識の量に正規化することができる。薬剤で処理されていない誘導細胞のものと比較して、薬剤によって処理された誘導細胞セット中のより多くのシグナル（すなわち、より多くのＤＮＡ合成）は、この薬剤が、アミロイドベータ誘導性細胞毒性を予防または抑制することを示す。
【０１２７】
薬剤によるアミロイドベータ誘導性細胞毒性の予防または抑制を判定するための他の好適な方法は、細胞中のアポトーシスの検出を含む。アポトーシスを検出または測定するこのような方法としては、例えば、ＤＮＡ断片化、カスパーゼ活性化、またはアネキシンＶ発現を監視することが含まれる。
【０１２８】
本明細書に記載されるスクリーニング法は、アルツハイマー病を治療する上で有用な化合物を特定するために、二次的な、または細胞ベースのスクリーニングとして用いることもできることを理解されたい。例えば、このスクリーニング法は、例えば、化合物が、初めに、別の系（例えば、酵母）においてアミロイドベータ誘導性毒性を阻害する能力に基づいて選択される一次スクリーニング後に使用することができる。
【０１２９】
スクリーニングアッセイは、複数の反応の迅速な調製、処理、および分析を可能にする任意のフォーマットで実施することができる。これは、例えば、マルチウェルアッセイプレート（例えば、９６ウェルまたは３８６ウェル）において可能である。様々な薬剤の原液を、手動でまたはロボット制御で生成することができ、全ての後続のピペッティング、希釈、混合、分配、洗浄、インキュベーション、試料読取、データ収集、および分析は、市販の分析ソフトウェア、ロボット工学、およびアッセイから発生したシグナルを検出することが可能な検出機器を用いてロボット制御で行うことができる。このような検出器の例としては、分光光度計、照度計、蛍光測定器、および放射性同位体崩壊を測定する装置が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３０】
化合物
本明細書に記載される方法のいずれかを用いて、スクリーニングされ、または特定される化合物は、様々な化学的部類を含むことができるが、通常は、５０〜２，５００ダルトンの範囲の分子量を有する小分子である。これらの化合物は、タンパク質との構造的相互作用（例えば、水素結合）に必要な官能基を含むことができ、通常、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシル、またはカルボキシル基を含み、化学官能基の少なくとも２つを含むことが好ましい。これらの化合物は、多くの場合、上記官能基の１つ以上で置換された、循環式炭素または複素環式構造および／もしくは芳香族またはポリ芳香族構造（例えば、プリンコア）を含む。
【０１３１】
代替的な実施形態では、化合物は、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド）、アミノ酸、アミノ酸類似体、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、これらの誘導体または構造類似体、ポリヌクレオチド、核酸アプタマー、およびポリヌクレオチド類似体が含まれるが、これらに限定されない、生体分子も含むことができる。
【０１３２】
化合物は、化合物ライブラリー、天然物ライブラリー、および無作為なペプチド、オリゴヌクレオチド、または有機分子から構成されるコンビナトリアルライブラリーを含む、多数の潜在源から特定することができる。化合物ライブラリーは、多様な化学構造物からなり、その一部は、既知の化合物の類似体、または他の薬物発見スクリーニングにおいて「ヒット」または「リード」として特定された化合物の類似体であり、一方他のものは、天然物から誘導され、更に他のものは、非直接的有機合成化学に起因する。天然物ライブラリーは、微生物、動物、植物、または海洋生物のコレクションであり、これらは、（１）土壌、植物、または海洋微生物からのブロスの発酵および抽出、もしくは（２）植物または海洋生物の抽出によって、スクリーニング用の混合物を生成するために使用される。天然物ライブラリーは、ポリペプチド、非リボソームペプチド、およびそれらの変異体（非天然型）を含む。査読のために、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：６３−６８（１９９８）を参照されたい。コンビナトリアルライブラリーは、多数のペプチド、オリゴヌクレオチド、または有機化合物から混合物として構成される。これらのライブラリーは、従来の自動化合成法、ＰＣＲ、クローニング、または独自の合成法によって、比較的容易に調製される。特に興味深いものは、非ペプチドコンビナトリアルライブラリーである。更に他の関心のライブラリーとしては、ペプチド、タンパク質、ペプチド模倣物、多重並行合成物コレクション、組換え体、およびポリペプチドライブラリーを含む。コンビナトリアル化学およびそれらから生成されるライブラリーの査読のために、Ｍｙｅｒｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７０１−７０７（１９９７）を参照されたい。
【０１３３】
本明細書の様々なライブラリーの使用を通しての試験化合物の特定は、アミロイドベータ誘導性毒性および／またはアミロイドベータ誘導性凝集を予防または抑制するように「ヒット」または「リード」する能力を最適化するために、「ヒット」または「リード」された試験化合物の引き続いての変更を可能にする。
【０１３４】
上記で特定された化合物は、任意の化学的または生物学的方法によって合成することができる。上記で特定された化合物はまた、純粋とすることもでき、または１つ以上の追加の成分（複数可）を含有する組成物（例えば、薬学的組成物）中にあってもよく、アッセイで、生理学的に、または薬学的に許容される希釈剤または担体（以下を参照）中で調製することができる。
【０１３５】
薬学的組成物および治療の方法
細胞中のアミロイドベータ誘導性毒性またはアミロイドベータ凝集体の形成を予防または抑制することが見出された化合物は、例えば、アルツハイマー病などの神経変性疾患を治療するための対象への投与のために、薬学的組成物として製剤化することができる。
【０１３６】
薬学的組成物は、通常、薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」としては、生理学的適合性である、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗かび薬、等張性および吸収遅延剤等が含まれる。組成物は、薬学的に許容される塩、例えば、酸添加塩または塩基添加塩（例えば、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９，１９７７を参照されたい）を含むことができる。
【０１３７】
この化合物は、標準法に従って、製剤化することができる。薬学的製剤は、十分に確立された技術であり、例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（２０００）（ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２）、Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，７ｔｈ  Ｅｄ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９９）（ＩＳＢＮ：０６８３３０５７２７）、およびＫｉｂｂｅ（ｅｄ．），Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，３ｒｄ  ｅｄ．（２０００）（ＩＳＢＮ：０９１７３３０９６Ｘ）に更に記載されている。
【０１３８】
一実施形態では、細胞中のアミロイドベータ誘導性毒性および／またはアミロイドベータ凝集体形成を予防または抑制する化合物は、塩化ナトリウム、リン酸二塩基ナトリウム七水和物、リン酸一塩基ナトリウム、および安定剤などの賦形剤材料で製剤化することができる。これは、好適な濃度で、例えば、緩衝液中に提供することができ、２〜８℃で保管することができる。
【０１３９】
薬学的組成物は、種々の形態であってもよい。これらとしては、例えば、液体溶液（例えば、注射可能かつ輸注可能な溶液）、分散液または懸濁液、錠剤、カプセル剤、ピル、粉剤、リポソーム、および坐剤などの、液体、半固体、固体剤形が含まれる。好ましい形態は、目的とする投与方法および治療的用途に応じることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される薬剤のための組成物は、注射可能または輸注可能な溶液の形態である。
【０１４０】
このような組成物は、非経口モード（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内注射）によって投与することができる。本明細書で使用される語句「非経口投与」および「非経口的に投与される」は、通常、注射による、腸内および局所投与以外の投与方法を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊椎内、硬膜外、大脳内、頭蓋内、頚動脈内、および胸骨内注射ならびに輸注が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４１】
組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高濃度での安定な保管に好適な他の規則構造として製剤化することができる。無菌注射可能溶液は、本明細書に記載される薬剤を、必要に応じて、上記に列挙された１つの成分または成分の組み合わせと共に、適切な溶媒中に必要な量で組み込み、その後、無菌濾過することによって、調製することができる。一般に、分散液は、化合物を、塩基性分散媒および上記に列挙されたものからの必要な他の成分を含有する無菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。無菌注射可能溶液の調製用の無菌粉末の場合には、調製の好ましい方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これらは、化合物の粉末に加えて、前に無菌濾過されたその溶液からの任意の追加的な所望の成分をもたらす。例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、溶液の適切な流動性を維持することができる。注射可能組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアレート塩およびゼラチンを組成物中に含むことによってもたらすことが可能である。
【０１４２】
ある特定の実施形態では、化合物は、化合物を急激な放出から保護する担体と共に調製することができ、例えば、移植片を含む制御放出製剤、およびマイクロカプセル化送達システムである。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性の、生体追適合性ポリマーを使用することができる。このような製剤の調製のための多くの方法が特許取得され、または一般的に知られている。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８を参照されたい。
【０１４３】
細胞中でアミロイドベータ誘導性毒性および／またはアミロイドベータ凝集体形成を予防または抑制するものとして特定された化合物は、例えば、その安定化および／または循環、例えば、血液、血清、または他の組織における保持を、少なくとも１．５、２、５、１０、または５０倍まで改善する部分で修飾されることが可能である。この修飾化合物は、これが、例えば、アルツハイマー病などの神経変性疾患を有する対象において細胞中に発生し得る目的の治療部位（例えば、凝集体アミロイドベータの位置）に達しているかどうかを判定するよう評価することができる（例えば、化合物の標識形態を用いることによって）。
【０１４４】
例えば、化合物は、ポリアルキレンオキシドまたはポリエチレオキシドなどの、ポリマー、例えば実質的に非抗原性ポリマーと結合することができる。好適なポリマーは、重量によって実質的に異なる。約２００〜約３５，０００ダルトン（または約１，０００〜約１５，０００、および２，０００〜約１２，５００）の範囲の数平均分子量を有するポリマーを使用することができる。例えば、化合物は、水溶性ポリマー、例えば、親水性ポリビニルポリマー、例えば、ポイリビニルアルコールまたはポリビニルピロリドンに縫合され得る。このようなポリマーの非限定的な羅列としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコールなどのポリアルキレンオキシドポリマー、ポリエチレンかポリオール、これらのコポリマーならびにこれらのブロックコポリマー（但し、ブロックコポリマーの水溶性が維持されていることを条件とする）が含まれる。追加の有用なポリマーとしては、ポリエチレン、ポリプロピレン、およびポリエチレンならびにポリプロピレンのブロックコポリマー（プルロニック）などのポリアルキレン；ポリメタクリレート；カルボマー；および分岐した、または分岐していない多糖類が含まれる。
【０１４５】
化合物が、第２の薬剤（例えば、アルツハイマー病の任意の追加の治療薬）と組み合わせて用いられる場合、２つの薬剤は、別々に、または一緒に製剤化されてもよい。例えば、それぞれの薬学的組成物が、例えば、投与の直前に混合され、一緒に投与されることもでき、または別々に、例えば、同時にまたは異なる時間に、投与されることもできる。
【０１４６】
本明細書に記載されるように特定された化合物は、アミロイドベータ媒介性毒性および／またはアミロイドベータ凝集体、例えば、アミロイドベータオリゴマーおよび／またはダイマーの形成、沈着、蓄積、または存続に関連する障害のリスクにさらされているまたはこの疾患を有する対象（例えば、ヒト対象）を治療するために使用することができる。ある特定の実施形態では、この障害は、アルツハイマー病、ダウン症候群、脆弱Ｘ症候群、または全身性アミロイドーシスである。このような疾患の危険にさらされている、またはこのような疾患を有する個人を特定する方法は、当該技術分野において既知である。例えば、アルツハイマー病は、例えば、患者病列（例えば、記憶喪失）、臨床的観察、神経学的特徴および神経心理学的特徴の存在、ならびに前述のものの原因であり得る他の病態の不在に基づいて、診断することができる。コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、単一光子放射断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、または陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）などの撮像技術を使用することができる。診断は、脳物質の死後検査によって確認することができる。アルツハイマー病の診断についての例示の基準は、精神疾患の診断・統計の手引き（ＤＳＭ）−ＩＶ（２０００年編集）またはＤＳＭ−Ｖおよび国立神経疾患・脳卒中研究所（ＮＩＮＣＤＳ）−アルツハイマー病および関連疾患境界（ＡＤＲＤＡ）基準（Ｍｃｋｈａｎｎ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．１９８４）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ３４（７）：９３９−４４），例えば、更新版（Ｄｕｂｏｉｓ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．２００７）Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ  ６（８）：７３４−４６）。様々なバイオマーカー、例えばアミロイドベータまたはタウタンパク質（例えば、全タウタンパク質およびリン酸化タウ）についての脳脊髄液（ＣＳＦ）の分析および／またはアミロイドベータ沈着物に結合する標識化合物（例えば、１１Ｃピッツバーグ化合物Ｂ（１１Ｃ−ＰＩＢ）または１８Ｆ−ＡＶ−４５（フロルベタピルＦ１８）による撮影法（例えば、ＰＥＴ撮影法）は、ＡＤの発病を予測するために、例えば、将来的にアルツハイマー病に進行するかなりの可能性を有する個人を特定するために使用することができる（例えば、今後２年以内）。このような撮影法はまた、本明細書で特定された化合物のインビボ効果を判定するために、本発明において使用してもよい。いくつかの実施形態では、対象は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）である、プレセニリン１、またはプレセニリン２をコードする遺伝子中に突然変異を有する。いくつかの実施形態では、この突然変異は、Ａβ４２の生成を増加させるか、またはＡβ４２のＡβ４０に対する比を変更する。いくつかの実施形態では、対象は、アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）遺伝子のε４対立遺伝子の少なくとも１つのコピーを有する。
【０１４７】
ダウン症候群は、トリソミー２１の存在に基づいて診断することができる。
【０１４８】
脆弱Ｘ症候群は、ＦＭＲＰをコードする、ＦＭＲ１遺伝子によってコードされるタンパク質を発現しそこなうことをもたらす、Ｘ染色体上の三塩基遺伝子配列（ＣＧＧ）の伸長によって引き起こされる。これは、遺伝子試験からの確定診断による、特徴的なシグナルおよび症状の存在に基づいて疑われてもよい。
【０１４９】
したがって、アミロイドベータ媒介性疾患の危険にさらされている対象を試験するための方法および組成物が、本明細書に記載される。例えば、アルツハイマー病を発症する危険に曝されているおよび／または彼または彼女が、アルツハイマー病を発症することを示唆する調光を有する個人は、本明細書に記載される化合物および方法で治療され得る。
【０１５０】
本明細書で使用される用語「治療」は、疾患、疾患の症状または疾患に向かう素因を治し、癒し、緩和し、変更させ、和らげ、軽減し、改善し、または影響を与える（対象に有益な方法で）という目的で、治療用化合物の患者への適用または投与、もしくは疾患（または他の医学的に認識される障害もしくは症状）あるいは疾患に向かう素因（例えば、疾患に関連する１つ以上の危険因子）を有する対象（例えば、「患者」と称され得るヒト対象）への適用または投与として定義される。いくつかの実施形態では、治療は予防的であり、すなわち、これは、対象が疾患を発症する可能性を遅延させ、予防し、または低減すること、もしくは対象が疾患を発症するはずである重症度を低減することを意図して、疾患を発症していない対象（および疾患を発症する素因を有しても、または有さなくともよい）対象に施される。化合物は、更にまたは二者選択的に、試験、研究、または診断の目的で、対象に投与されてもよく、および／または、例えば、試験、研究、診断の目的で、あるいは治療のために単離された組織、細胞、または細胞系を対象に引き続いて投与することを意図して、患者からの組織、細胞、または細胞系と接触させてもよい。
【０１５１】
以下は、本発明の実施の例である。これらは、本発明の範囲を多少なりとも限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１５２】
実施例１：酵母細胞に対するアミロイドベータ発現構築物
酵母中の接合因子アルファ１遺伝子は、プレプロ−アルファ因子と呼ばれる、１６５個のアミノ酸の前駆体タンパク質をコードする。プレプロ−アルファ因子は、１９個のアミノ酸のシグナルペプチドと、６４個のアミノ酸のプロ領域と、アルファ因子配列の４個のタンデムリピートからなり、それぞれは、特徴的なタンパク質分解切断部位を有するスペーサペプチドを前に置く。前駆体タンパク質は、成熟した１３個のアミノ酸の長さのペプチドフェロモンであるアルファ因子を生成するために、細胞の分泌経路において、一連の連続的かつ画定された翻訳後酵素的修飾およびタンパク質分解処理ステップを受ける。新生プレプロ−アルファポリペプチドは、ＥＲの内腔中に転位され、ここで、シグナル配列が、シグナルペプチダーゼによって切断され、プロ−アルファ因子を生成する。ＥＲ内腔において、Ｎ−結合炭水化物が、プロ領域内の３つの特異的グリコシル化部位に添加され、これは、ＥＲからゴルジ体へのプロ−アルファ因子の輸送にとって必要不可欠であるステップである。更なる炭水化物修飾が、最終タンパク質分解処理ステップの前に、ゴルジ体中で起こる。これらの３つのタンパク質分解処理のうちの第１のものは、スペーサリピート
0006655557.tif 000047
のそれぞれのＮ末端において、Ｌｙｓ−Ａｒｇ（ＫＲ）残基のカルボキシル側で切断するＫＥＸ２エンドペプチダーゼによる。第２のタンパク質分解処理ステップは、二塩基性ＫＲ残基が、ＫＥＸ１カルボキシペプチダーゼＢ（ＣｏｘｙＰｄａｓｅＢ）により、アルファ因子のＣ末端から除去されるときに生じる。最後に、スペーサ（ＥＡＥＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）またはＥＡＥＡＥＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）またはＥＡＤＡＥＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９））の残りのアミノ酸が、ＳＴＥＢ３コード化ジペプチジルアミノペプチダーゼ（ＤＡＰダーゼＡ）によって、アルファ因子のＮ末端から切断される。成熟したアルファ因子は、次いで、細胞外培地中に分泌される。
【０１５３】
ヒトＡβ４２コード配列を接合因子アルファ１プレプロ配列中に挿入し、ここで、１３個のアミノ酸の長さのアルファ因子ペプチドがＡβ４２配列に置き換えられ、プレプロ−アルファ因子の全ての他の配列成分はそのまま残した（図１Ａ）。構築物を、接合因子アルファ１プレプロ配列骨格に基づき、かつ（ｉ）Ａβ４２の１つの（１Ｘ）、２つの（２Ｘ）、４つの（４Ｘ）、６つの（６Ｘ）、または８つ（８Ｘ）コピー、（ｉｉ）Ａβ４０の４つの（４Ｘ）または６つの（６Ｘ）コピーもしくはスクランブルしたＡβ４２の４つの（４Ｘ）コピー（図１Ｂ）を含有するように調製した。発現構築物によってコードされる融合ポリペプチドのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、以下の通りである。
【０１５４】
Ｍａｔα−Ａβ４２＿１Ｘヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）
0006655557.tif 000048
【０１５５】
Ｍａｔα−Ａβ４２＿１Ｘアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）
0006655557.tif 000049
【０１５６】
Ｍａｔα−Ａβ４２＿２Ｘヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２）
0006655557.tif 000050
【０１５７】
Ｍａｔα−Ａβ４２＿２Ｘアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）
0006655557.tif 000051
【０１５８】
Ｍａｔα−Ａβ４２＿４Ｘヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）
0006655557.tif 000052
【０１５９】
Ｍａｔα−Ａβ４２＿４Ｘアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５）
0006655557.tif 000053
【０１６０】
Ｍａｔα−Ａβ４２＿６Ｘヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６）
0006655557.tif 000054
【０１６１】
Ｍａｔα−Ａβ４２＿６Ｘアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７）
0006655557.tif 000055
【０１６２】
Ｍａｔα−Ａβ４２＿８Ｘヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８）
0006655557.tif 000056
【０１６３】
Ｍａｔα−Ａβ４２＿８Ｘアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）
0006655557.tif 000057
【０１６４】
Ｍａｔα−Ａβ４０＿４Ｘヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０）
0006655557.tif 000058
【０１６５】
Ｍａｔα−Ａβ４０＿４Ｘアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１）
0006655557.tif 000059
【０１６６】
Ｍａｔα−Ａβ４０＿６Ｘヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）
0006655557.tif 000060
【０１６７】
Ｍａｔα−Ａβ４０＿６Ｘアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３）
0006655557.tif 000061
【０１６８】
様々なＡβ４２変異体の４つのコピー（４Ｘ）を含有する、以下の酵母発現構築物も調製した。
【０１６９】
Ｍａｔα−Ａβ４２＿４Ｘ＿Ｅｎｇｌｉｓｈ変異ヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）
0006655557.tif 000062
【０１７０】
Ｍａｔα−Ａβ４２＿４Ｘ＿Ｅｎｇｌｉｓｈ変異アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５）
0006655557.tif 000063
【０１７１】
Ｍａｔα−Ａβ４２＿４Ｘ＿Ｆ２０Ｅヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）
0006655557.tif 000064
【０１７２】
Ｍａｔα−Ａβ４２＿４Ｘ＿Ｆ２０Ｅアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７）
0006655557.tif 000065
【０１７３】
Ｍａｔα−Ａβ４２＿４Ｘ＿Ｆｌｅｍｉｓｈ変異ヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８）
0006655557.tif 000066
【０１７４】
Ｍａｔα−Ａβ４２＿４Ｘ＿Ｆｌｅｍｉｓｈ変異アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９）
0006655557.tif 000067
【０１７５】
Ｍａｔα−Ａβ４２＿４Ｘ＿Ｄｕｔｃｈ変異ヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０）
0006655557.tif 000068
【０１７６】
Ｍａｔα−Ａβ４２＿４Ｘ＿Ｄｕｔｃｈ変異アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１）
0006655557.tif 000069
【０１７７】
Ｍａｔα−Ａβ４２＿４Ｘ＿Ｉｔａｌｉａｎ変異ヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２）
0006655557.tif 000070
【０１７８】
Ｍａｔα−Ａβ４２＿４Ｘ＿Ｉｔａｌｉａｎ変異アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３）
0006655557.tif 000071
【０１７９】
Ｍａｔα−Ａβ４２＿４Ｘ＿Ａｒｃｔｉｃ変異ヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４）
0006655557.tif 000072
【０１８０】
Ｍａｔα−Ａβ４２＿４Ｘ＿Ａｒｃｔｉｃ変異アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５）
0006655557.tif 000073
【０１８１】
Ｍａｔα−Ａβ４２＿４Ｘ＿Ｅ２２Ｇ（Ａｒｃｔｉｃ）／Ｉ３１Ｅヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６）
0006655557.tif 000074
【０１８２】
Ｍａｔα−Ａβ４２＿４Ｘ＿Ｅ２２Ｇ／Ｉ３１Ｅアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）
0006655557.tif 000075
【０１８３】
Ｍａｔα−Ａβ４２＿４Ｘ＿Ｅ２２欠失ヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８）
0006655557.tif 000076
【０１８４】
Ｍａｔα−Ａβ４２＿４Ｘ＿Ｅ２２欠失アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）
0006655557.tif 000077
【０１８５】
Ｍａｔα−Ａβ４２＿４Ｘ＿Ｉｏｗａ変異ヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０）
0006655557.tif 000078
【０１８６】
Ｍａｔα−Ａβ４２＿４Ｘ＿Ｉｏｗａ変異アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１）
0006655557.tif 000079
【０１８７】
Ｍａｔα−Ａβ４２＿４Ｘ＿Ｔｏｔｔｏｒｉ変異ヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２）
0006655557.tif 000080
【０１８８】
Ｍａｔα−Ａβ４２＿４Ｘ＿Ｔｏｔｔｏｒｉ変異アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３）
0006655557.tif 000081
【０１８９】
Ａβ配列を、酵母における発現のために、コドン最適化した。Ａβ発現構築物は、メタプレプロ−Ａβ４２配列のＧａｔｅｗａｙクローニングのための５'および３'末端におけるａｔｔＢ  Ｇａｔｅｗａｙフランキング領域（それぞれ、ヌクレオチド
0006655557.tif 000082
）からなる。構築物全体を、ｐＵＣ５７−Ｋａｎプラスミド中に合成し、ＧａｔｅｗａｙエントリーベクターｐＤＯＮＲ２２１中にクローニングした。次いで、これらの構築物を、Ｇａｔｅｗａｙ  ＬＲクローニング（Ａｌｂｅｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａ  ｓｕｉｔｅ  ｏｆ  Ｇａｔｅｗａｙ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，"Ｙｅａｓｔ  ２４−９１３（２００７））によって、ｐＡＧ４２５Ｇａｌ発現ベクター中に導入した。ＧＡＬ１プロモーターは、ガラクトース誘導性条件下において、Ａβ融合導入遺伝子の発現を可能にする。ベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でのベクターの増幅のためのアンピシリン耐性遺伝子と、ロイシンを欠如する培地上での形質転換酵母細胞の選択のためのロイシン栄養要求性マーカー（ＬＥＵ２）とを有する（図２）。
【０１９０】
ガラクトース誘導性緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含有する発現ベクター、あるいは酵母接合因子アルファシグナル配列／ヒトアミロイドベータ１〜４２（Ａβ４２）または１〜４０（Ａβ４０）もしくはスクランブルされたＡβ４２融合ポリペプチドをコードするガラクトース誘導性発現プラスミドのいずれかで形質転換された酵母細胞を、グルコースまたはガラクトース含有合成培地上で増殖させ、増殖を判定した。形質転換細胞を、ロイシンを欠如する培地上で選択した。個々の形質転換体を、２％のラフィノースを炭素源として含み、ロイシンを欠如する完全合成培地（ＣＳＭ）中で一晩増殖させた。細胞濃度（ＯＤ６００）を、９６ウェル中でＯＤ０．５または１に調整した。次いで、細胞を５倍段階希釈し、グルコース（非誘導性）およびガラクトース（誘導性）を含有するＳＤ培地上にスポットした。プレートを、３０℃で２日間（グルコース）、または３〜４日間（ガラクトース）インキュベートした。
【０１９１】
実験および対照の形質転換体は、グルコース含有培地（非誘導性）上で十分に同程度に増殖したが、一方ガラクトース含有培地（誘導性）中のアミロイドベータ発現は、用量数依存的様式で大幅に阻害された（図３）。２μ高コピー発現プラスミド上の単一コピーＡβ４２（１Ｘ）の発現は毒性ではなかったが、一方、同一の発現プラスミド上の増加したＡβ４２コピー数（２、４、６、および８つのコピー）は、用量依存的様式で、形質転換細胞中で毒性をもたらした（図３）。Ａβ４０（４および６つのコピー）の発現は、Ａβ４２の同様なコピー数のものと比べて、重大な毒性を示さなかった（図３）。Ａβ４２のアミノ酸配列が無作為にスクランブルされた、スクランブルＡβ４２の対照発現構築物（４つのコピー）は、重大な毒性を示さなかった（図３）。
【０１９２】
酵母細胞を、Ａβ中に異なる突然変異を担持する（４つのコピー）ガラクトース誘導性発現ベクター（ｐＡＧ４２５Ｇａｌ）で形質転換した。これらの中には、９個の疾患関連突然変異：Ｅｎｇｌｉｓｈ変異（Ｈ６Ｒ）、Ｔｏｔｔｏｒｉ変異（Ｄ７Ｎ）、Ｆｌｅｍｉｓｈ変異（Ａ２１Ｇ）、Ｄｕｔｃｈ変異（Ｅ２２Ｑ）、Ｉｔａｌｉａｎ変異（Ｅ２２Ｋ）、Ａｒｃｔｉｃ変異（Ｅ２２Ｇ）、Ｅ２２欠失、Ｉｏｗａ変異（Ｄ２３Ｎ）、および「野生型」ならびに２つの無毒化突然変異：Ｆ２０ＥおよびＡｒｃｔｉｃ変異Ｉ３１Ｅが存在した。形質転換酵母細胞の増殖を、誘導性（ガラクトース）および非誘導性（グルコース）条件下で試験した。異なるＡβ突然変異が、ガラクトース誘導下での発現の際に、様々な程度で発生した（図４）。例えば、Ａｒｃｔｉｃ変異、Ｅ２２欠失、およびＤｕｔｃｈ突然変異は、著しい毒性を発生したが、一方Ａｒｃｔｉｃ変異Ｉ３１ＥおよびＦ２０Ｅ突然変異は、大幅に低い量の毒性を発生した（図４）。
【０１９３】
実施例２：哺乳動物細胞に対するアミロイドベータ発現構築物
ヒトＡβ配列を、いくつかの真核分泌タンパク質のシグナル配列のＣ末端で融合させた。シグナル配列は、ヒトインスリン（Ｉｎｓ）、ヒトトリプシン（Ｔｒｙｐ）、ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ヒト胎盤分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、および海洋カイアシ類のメトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｌｏｎｇａ）のメトリディアルシフェラーゼ（ｍＬｕｃ）であった。Ａβペプチドを、配列間にいかなるリンカーもなく、これらのシグナルペプチドに融合させた（図５）。細胞質発現については、いかなる分泌シグナルも有さないヒトＡβペプチドも、同様な発現ベクター中に構築した（図５中の「シグナル配列無し」と記入）。
【０１９４】
発現構築物によってコードされる融合ポリペプチドのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、以下の通りである。
【０１９５】
ＳＥＡＰ−Ａβ４２＿１Ｘヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６）
0006655557.tif 000083
【０１９６】
ＳＥＡＰ−Ａβ４２＿１Ｘアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７）
0006655557.tif 000084
【０１９７】
ｍＬｕｃ−Ａβ４２＿１Ｘアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８）
0006655557.tif 000085
【０１９８】
ｍＬｕｃ−Ａβ４２＿１Ｘアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９）
0006655557.tif 000086
【０１９９】
ＡＰＰ−Ａβ４２＿１Ｘヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９０）
0006655557.tif 000087
【０２００】
ＡＰＰ−Ａβ４２＿１Ｘアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９１）
0006655557.tif 000088
【０２０１】
Ｉｎｓ−Ａβ４２＿１Ｘヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２）
0006655557.tif 000089
【０２０２】
Ｉｎｓ−Ａβ４２＿１Ｘアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３）
0006655557.tif 000090
【０２０３】
Ｔｒｙｐ−Ａβ４２＿１Ｘヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９４）
0006655557.tif 000091
【０２０４】
Ｔｒｙｐ−Ａβ４２＿１Ｘアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５）
0006655557.tif 000092
【０２０５】
ＮＳＰ−Ａβ４２＿１Ｘヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６）
0006655557.tif 000093
【０２０６】
ＮＳＰ−Ａβ４２＿１Ｘアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７）
0006655557.tif 000094
【０２０７】
以下のＡβ４０をコードする哺乳動物発現構築物も調製した。
【０２０８】
Ｉｎｓ−Ａβ４０＿１Ｘヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８）
0006655557.tif 000095
【０２０９】
Ｉｎｓ−Ａβ４０＿１Ｘアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９）
0006655557.tif 000096
【０２１０】
異なるシグナルペプチド配列に融合させたヒトＡβ配列を、ＰＣＲ増幅し、ｐ３ＸＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１３ベクター中にクローニングした。ｐ３ＸＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１３発現ベクターは、哺乳動物細胞中の融合タンパク質の一過性発現のための６．３ｋｂのプラスミドである。ベクターの不可欠な部分であるプレプロ−トリプシンリーダーシグナル配列を、クイックチェンジ突然変異誘発によって欠失させた。マルチプルクローニングサイトの５'からのこのプレプロ−トリプシン配列の欠失は、ペプチドのＮ末端において様々なシグナル配列に融合されたＡβのクローニングに、このベクターを使用することを可能にする。このベクターは、マルチプルクローニング領域の下流の３つの隣接するＦＬＡＧエピトープをコードする。Ｃ末端に終止コドンを有するＡβ配列を、ＦｌａｇタグがＡβに融合しないように、ＥｃｏＲ１およびＢｇｌＩＩ制限部位を用いて挿入した。導入遺伝子の上流のヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター調節領域は、Ａβ構築物の転写を駆動する（図６）。ベクターはまた、Ｇ４１８などのアミノ配糖体に対して耐性を付与するアミノ配糖体ホスホトランスフェラーゼＩＩ遺伝子（Ｎｅｏ）の力によって安定なトランスフェクタントの選択を可能にした。これは、哺乳動物細胞および大腸菌のためのシャトルベクターであり、この中で、プラスミドは、ベクター骨格中のアンピシリン耐性遺伝子（ＡｍｐＲ）のために、維持されかつ増幅される。
【０２１１】
構築物を、ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）６トランスフェクション試薬を用いて、製造元の説明書に従って、２９３Ｔ細胞中に一過的にトランスフェクトした。２９３Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ培地中で、付着培養で慣例的に増殖させ、５％ＣＯ２の条件で３７℃でインキュベートした。発現ベクターのトランスフェクションについては、細胞を、６ウェル培養プレートの各ウェル中に、約９０％の集密度（約１．２×１０５細胞／ｍｌ）に播種した。トランスフェクション前に、使用済み培地を、１ｍｌの無血清または低血清培地（ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ、またはＤＭＥＭ＋１％ＦＢＳ）に交換した。６ウェルプレートの単一ウェルにおける細胞の各トランスフェクションについては、１μｇの発現構築物を使用した。トランスフェクション時に、細胞を、５％ＣＯ２の条件で３７℃において最長９６時間までインキュベートした。
【０２１２】
トランスフェクション後４８時間および７２時間に上清を採集し、細胞をＲＩＰＡ緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．２５％のデオキシコレート、１０％のグリセロール、２５ｍＭのＮａＦ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００、０．５ｍＭのＰＭＳＦ、プロテアーゼ阻害カクテル）中で溶解した。細胞溶解物の上清および可溶性分画から組換え体Ａβを検出し、定量するために、ヒトＡβ４２の検出に特異的なＥＬＩＳＡキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＫＨＢ３４４１）を使用する、固相サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いた。シグナルペプチドの２つ（ＩｎｓおよびＴｒｙｐ）は、２９３Ｔ細胞の上清中に病理生物学的に関連のあるＡβ濃度を分泌することで有効であった（図７Ａ〜７Ｂ）。
【０２１３】
トランスフェクト細胞の細胞毒性を、ＴＯＸＩＬＩＧＨＴ（商標）バイオアッセイキット（Ｌｏｎｚａ）によって、製造元の説明書に従って測定した。ＴＯＸＩＬＩＧＨＴ（商標）アッセイは、損傷した、または死滅しつつある細胞からのアデニル酸キナーゼの放出を測定するように設計された、生物発光の非破壊的細胞毒性アッセイである。アデニル酸キナーゼは、全ての真核細胞において遍在する。これは、細胞が損傷される場合、または細胞が死滅する場合に、培養基中に放出される。ＡＤＰを酵素活性によってリン酸化してＡＴＰを形成し、得られたＡＴＰを、生物発光のホタルルシフェラーゼ反応を用いて測定する。上清中のアデニル酸キナーゼの量は、細胞崩壊に定量的に比例し、ＴＯＸＩＬＩＧＨＴ（商標）試薬によって放射された光の強度により測定される。インスリンシグナルペプチドに融合されたＡβ４２もしくはＡβ４０のいずれかを担持する構築物、またはいかなる挿入される導入遺伝子も含まないベクター対照を、細胞をトランスフェクトするために用いた。トランスフェクトされた細胞からの上清を、トランスフェクション後４８、７２、または９６時間で採取し、Ａβ媒介細胞毒性を測定した。Ａβ４２に融合されたインスリンシグナルペプチドをコードする構築物は、細胞毒性を特に強く誘導した（図８）。
【０２１４】
実施例３：ラット胚皮質ニューロン中のアミロイドベータ発現
ラット胚皮質ニューロンを、Ａβを発現させるために用いた。レンチウイルス構築物を生成するために、発現ベクターを、挿入されたインスリンシグナルペプチド−Ａβ融合ポリペプチド導入遺伝子の上流のヒトシナプシン１プロモーターで使用した（図９）。コードされた融合ポリペプチドは、ニューロンの分泌経路において処理され、Ａβを細胞外環境に放出する。
【０２１５】
ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）トランスフェクション試薬を用いて、製造元の説明書に従って、ｐＬＶ−Ａβ構築物を、ｐｓＰＡＸ２パッケージングベクターおよびｐＭＤ２．Ｇエンベロープベクターと共に、２９３Ｔ細胞中でトランスフェクトし、Ａβ導入遺伝子を含有するレンチウイルスを生成した。ＬＥＮＴＩ−Ｘ（商標）Ｍａｘｉ精製キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、製造元によって提供されたプロトコルに従って、このウイルスを、トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の上清から精製した。ウイルス力価を、Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐ２４ＥＬＩＳＡキット（Ｃｅｌｌ  ＢｉｏＬａｂｓ）を使用することによって決定した。
【０２１６】
ラット胚皮質を、マウス胚（Ｅ１８）脳から切除し、ニューロンを付着性単層培養中で濃縮させた。これらの皮質ニューロンを、Ａβ導入遺伝子または対照遺伝子（同一のベクター骨格中のＲＦＰ）を担持するレンチウイルス調製物で感染させた。感染された培養物を採取し、感染後２１日目に、Ａβ特異的ＥＬＩＳＡによって、上清および細胞溶解物中のＡβの量を定量した（図１０Ａ）。感染されたニューロンの対応する細胞毒性を、細胞生存率についてのＶＩＡＬＩＧＨＴ（商標）アッセイ（Ｌｏｎｚａ）を用いて、ＡＴＰレベルを定量することによって測定した。ラット胚皮質ニューロンの分泌経路におけるヒトＡβの発現は、重大な細胞毒性を引き起こした（図１０Ｂ）。
【０２１７】
ラット胚皮質ニューロンを、これらの細胞の分泌経路中で野生型ヒトＡβ４２または様々な突然変異（すなわち、Ｆ２０Ｅ、Ａｒｃｔｉｃ変異（Ｅ２２Ｇ）、Ｉ３１Ｅ、およびＥ２２Ｇ／Ｉ３１Ｅ）を発現するレンチウイルス構築物（図９に図示）で感染させた場合、異なる毒性が観察され、これらの突然変異によって引き起こされた異なる細胞毒性作用は、酵母におけるものと似ている（実施例１を参照）。ヒトＡβ４２のＡｒｃｔｉｃ変異（Ｅ２２Ｇ）は、野生型ヒトＡβ４２と比べてより大きな毒性作用を有した。３つの突然変異−Ｆ２０Ｅ、Ｉ３１Ｅ、およびＥ２２Ｇ／Ｉ３１Ｅ−は、野生型ヒトＡβ４２またはヒトＡβ４２のＡｒｃｔｉｃ変異のいずれと比べてもより少ない細胞毒性作用を及ぼした。
【０２１８】
実施例４：ニューロン培養物中のアミロイドベータ誘導性細胞毒性
ラット皮質ニューロンを、ドキシサイクリン誘導性レンチウイルスＧＦＰ構築物で感染させた。感染後２日目に、細胞を、ニューロン特異的（シナプシンプロモーター）レンチウイルスＡベータ構築物（すなわち、Ａβ４０、Ａβ４２、および様々な突然変異）で再度感染させた。二重感染させた細胞を、感染後７日目に、ドキシサイクリンで処理し、ＧＦＰを発現させた。初めの感染の２１日後に、生ニューロンを、蛍光顕微鏡で可視化し、導入遺伝子から発現されたＡβの存在下においてＧＦＰを発現するニューロンを可視化することによって、ニューロン生存に及ぼす異なるＡβ変異体の作用および形態を観察した。野生型ヒトＡβ４２およびＡβ４２＿Ａｒｃｔｉｃ（Ｅ２２Ｇ）突然変異は、ニューロン死を引き起こし、神経突起伸長および構造に悪影響を及ぼし、これらは、ＧＦＰ染色された生ニューロンの顕微鏡観察によって検出された（図１１Ａ）。Ａβ４２＿Ｉ３１ＥおよびＡβ４２＿Ａｒｃ／Ｉ３１Ｅ突然変異の両方共に、野生型Ａβ４２およびＡＢ４２＿Ａｒｃｔｉｃ（Ｅ２２Ｇ）ウイルス構築物と同一の感染多重度（ＭＯＩ）で感染されたラット皮質ニューロンにおいて、低減された細胞毒性を示し、かつニューロンおよび神経突起の形態的変形を示さなかった。
【０２１９】
同様な観察を、ニューロン特異的（シナプシンプロモーター）レンチウイルスＡβ構築物で感染させたラット皮質ニューロンの免疫組織化学的分析によっても行った。感染後２１日目に、ニューロンを、ニューロン特異的微小管関連タンパク質２（Ｍａｐ２）一次抗体（ラットポリクローナル、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）およびＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）（赤色フルオロフォア結合）二次抗体（ヤギ抗ウサギポリクローナル、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色した。ニューロン細胞および形態を可視化し、蛍光顕微鏡を用いて、異なるＡβ突然変異の影響を観察した。上で述べた生ニューロンから得られた結果と同様に、野生型Ａβ４２およびＡβ４２＿Ａｒｃｔｉｃ（Ｅ２２Ｇ）突然変異は、重大な細胞毒性を引き起こし、大規模なニューロン損失および神経突起構造ならびに伸長を変形させた（図１１Ｂ）。生ニューロンの撮像による観察と更に同様に、Ａβ４２＿Ｉ３１ＥおよびＡβ４２＿Ａｒｃ／Ｉ３１Ｅ突然変異は、低減された細胞毒性を示し、ニューロン形態に及ぼす重要な影響を有さなかった（図１１Ｂ）。
【０２２０】
実施例５：哺乳動物細胞中のポリ−Ａβ発現
酵母細胞中のポリ−Ａβ（Ａβ４０またはＡβ４２＿１Ｘ／４Ｘ／６Ｘ／８Ｘ）発現構築物と同様に（実施例１を参照）、ポリ−Ａβ毒性モデルを、哺乳動物細胞において開発した。Ｎ末端シグナルペプチドに結合された、染色体に組み込まれたテトラサイクリン（ドキシサイクリン）誘導性ポリ−Ａβ導入遺伝子（Ａβ４２−４Ｘ、Ａβ４２−６Ｘ、Ａβ４０−４Ｘ、Ａβ４０−６Ｘ、およびＡβ４２−Ａｒｃｔｉｃ−４Ｘ）を有する安定な細胞系を生成した（図１３Ａ〜１３Ｂ）。これらの発現構築物は、ｐＬｉｘ４０２レンチウイルスプラスミドを用いて生成した（図１２）。ポリ−Ａβ構築物を、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）トランスフェクション試薬を用いて、レンチウイルスパッケージングプラスミドｐｓＰＡＸおよびウイルスエンベロープ発現プラスミドｍＭＤ２．Ｇと共に、２９３Ｔ細胞中に個々にトランスフェクトし、ポリ−Ａβ導入遺伝子を含有するレンチウイルスを生成した。トランスフェクション後２日目および３日目に、ウイルスをトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の上清から採集し、その後、ＬＥＮＴＩ−Ｘ（商標）Ｍａｘｉ精製キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、製造元の説明書に従って精製し、濃縮した。
【０２２１】
ポリ−Ａβ構築物に対する発現導入遺伝子を担持する安定な細胞系を生成するために、２９３Ｔ細胞を、レトロウイルスベクターを哺乳動物細胞中に導入するために用いられるＰＯＬＹＢＲＥＮＥ（登録商標）感染試薬（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて感染させた。次いで、感染細胞を、プロマイシン（２〜１０μｇ／ｍｌ）を用いて選択した。導入遺伝子を担持する感染細胞は、この選択圧で生存するが、一方、導入遺伝子を有さない対照細胞は、２〜３日で死滅する。選択された細胞のアリコートを、液体窒素中で凍結させるか、または更なる用途のために、維持し、増殖させた。
【０２２２】
これらの安定な細胞系からのＡβペプチドの発現を、ドキシサイクリン誘導後７２〜９６時間に、培養上清中で測定した（図１３Ｄ）。毒性を、ドキシサイクリン誘導後７２〜９６時間に、実施例２に記載される通りに、ＴＯＸＩＬＩＧＨＴ（商標）細胞毒性アッセイ（Ｌｏｎｚａ）を用いて測定した。これらの安定な系は、導入遺伝子のドキシサイクリン誘導時の損傷細胞からの細胞培養上清中のアデニル酸キナーゼ放出によって決定される、Ａβペプチド媒介細胞毒性作用（Ａβ４２−６Ｘ≧Ａβ４２−Ａｒｃｔｉｃ−４Ｘ＞Ａβ４２−４Ｘ＞Ａβ４０−６Ｘ≧Ａβ４０−４Ｘ）を立証した（図１３Ｃ）。
【０２２３】
実施例６：ニューロン細胞中のポリ−Ａβ発現
ラット胚皮質ニューロンを、レンチウイルスポリ−Ａβ発現構築物で感染させ、ポリ−Ａβ毒性をモデル化した。実施例５に記載したテトラサイクリン（ドキシサイクリン）誘導性ポリ−Ａβ（Ａβ４２−４Ｘ、Ａβ４２−６Ｘ、Ａβ４０−４Ｘ、Ａβ４０−６Ｘ、およびＡβ４２−Ａｒｃｔｉｃ−４Ｘ）ウイルス構築物を用いて、ラット皮質ニューロン中でポリ−Ａβ構築物を発現させた。各発現構築物において、ポリ−Ａβコード配列を、Ｎ末端インスリンシグナルペプチドに連結させる。ポリ−Ａβ発現プラスミドを、レンチウイルス粒子中にパッケージ化し、これは、実施例３に記載されるように、２９３Ｔ細胞によって生成された。
【０２２４】
実施例３に記載されるように、ラット皮質ニューロンを、ラットの胚（Ｅ１８）脳から切除した皮質から富化し、付着性単層培養中で濃縮させた。異なるＭＯＩにおける精製レンチウイルス調製物を用いて、これらの皮質ニューロンを感染させて、ポリ−Ａβ導入遺伝子を発現させた。感染後３日目に、ドキシサイクリン（２μｇ／ｍｌ）を感染培養物に添加することによって、ポリ−Ａβの発現を誘導した。感染ニューロンの生存能力を、ドキシサイクリン誘導後３週間で、細胞生存能力についてのＶＩＡＬＩＧＨＴ（商標）アッセイ（Ｌｏｎｚａ）を用いて、ＡＴＰレベルを定量することによって測定し、ポリ−Ａβ発現構築物の細胞毒性を決定した。ラット胚皮質ニューロンの分泌経路におけるヒトＡβ４２−４Ｘ−ＷＴまたはＡβ４２−４Ｘ−Ａｒｃｔｉｃの発現は、Ａβ４０−４Ｘと比較して、重大な細胞毒性を引き起こした（図１４）。
【０２２５】
実施例７：哺乳動物細胞中の小分子化合物によるＡβ毒性の救済
２９３Ｔ細胞中の細胞毒性モデルを用いて、Ａβ媒介毒性を軽減するための小分子化合物の効果を試験した。Ａβ４２またはＡβ４０発現構築物を、一過的にトランスフェクトし、トランスフェクション後１２時間に、小分子を異なる用量で添加した。トランスフェクション後９６時間に、細胞毒性を、ＴＯＸＬＩＧＨＴ（商標）バイオアッセイキット（Ｌｏｎｚａ）によって、損傷細胞から放出されたアデニル酸キナーゼにより、異なる化合物投与量において測定した。毒性軽減の化合物媒介効果の一例は、クリオキノール（ＣＱ）によるものであって、これは、Ａβ媒介毒性を２〜５μＭの濃度で救済した（図１５）。同様なアッセイを、テトラサイクリン（ドキシサイクリン）誘導性ポリ−Ａβ発現構築物を担持するウイルス感染された安定な２９３Ｔ細胞を用いても実施し、ポリ−Ａβ発現構築物によって引き起こされた細胞毒性を救済する化合物を特定した。
【０２２６】
実施例８：Ａβ４３発現構築物は、酵母細胞に対して毒性である
ガラクトース誘導性ＧＡＬ１プロモーターの制御下において、ポリ−Ａβ発現構築物を用いて、Ａβ４３を、タンデムポリペプチド（６〜８個のアミノ酸リンカーによって連結された４つのタンデムＡβペプチド）として、酵母Ｓ．セレヴィシエ中で発現させた。分泌経路における導入遺伝子の直接発現のために、Ａβポリペプチドコード配列は、Ｎ末端において、接合因子αプレ−プロシグナル配列に連結される（図１６Ａ）。
【０２２７】
Ａβ４３の４つのコピー（４Ｘ）を含有する酵母発現構築物は、以下のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を有した。
【０２２８】
Ｍａｔα−Ａβ４３＿４Ｘヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００）
0006655557.tif 000097
【０２２９】
Ｍａｔα−Ａβ４３＿４Ｘアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１）
0006655557.tif 000098
【０２３０】
酵母細胞に対するＡβ４３の毒性を、Ａβ４２、Ａβ４０、Ａβ４８、またはＡβ４９を発現する同様なポリ−Ａβ発現構築物のものと比較した。その中で、Ａβ４２のアミノ酸配列が無作為にスクランブルされているＡβスクランブル構築物は、対照タンデムペプチドとして機能し、ＧＦＰ構築物は、ベクター対照として機能した。導入遺伝子を、ロイシン栄養要求性の選択下で、エピソームプラスミド（２ミクロン）から発現させた。形質転換酵母の増殖を、ロイシンを欠如し、かつ導入遺伝子の誘導のためのガラクトースを含有する合成寒天培地上で測定した。形質転換菌株はまた、導入遺伝子発現の誘導無しの増殖の尺度として、グルコースを含む同様な培地上で増殖させた。ＩｍａｇｅＪスポットアッセイ定量マクロを用いて、固体培地上の酵母増殖を定量した。Ａβ４３は、酵母中で発現される場合、他のＡβペプチドをはるかに超える細胞毒性であった（図１６Ｂ）。相対的毒性は、Ａβ４３＞Ａβ４９≧Ａβ４８≧Ａβ４２＞Ａβ４０であった。
【０２３１】
実施例９：Ａβ４３発現構築物は、哺乳動物細胞に対して毒性である
Ａβ４３ペプチドを哺乳動物細胞中で発現させるために、インスリンシグナルペプチドをＡβ４３ペプチドコード配列のＮ末端に融合させることによって、発現構築物を生成した（図１７Ａおよび１７Ｂ）。
【０２３２】
Ａβ４３をコードする哺乳動物発現構築物は、以下のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を有した。
【０２３３】
Ｉｎｓ−Ａβ４３＿１Ｘヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２）
0006655557.tif 000099
【０２３４】
Ｉｎｓ−Ａβ４３＿１Ｘアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３）
0006655557.tif 000100
【０２３５】
上で述べたように、発現構築物を、ｐＣＭＶベクターを用いて、ＣＭＶプロモーター下において発現させる（実施例２および図６を参照）。哺乳動物細胞中のＡβ４３の細胞毒性作用を、発現構築物を一過的にトランスフェクトし、トランスフェクション後９６時間に、損傷細胞から放出されたアデニル酸キナーゼを測定することによって、２９３Ｔ細胞中で試験した。細胞毒性を、ＴＯＸＩＬＩＧＨＴ（商標）バイオアッセイキット（Ｌｏｎｚａ）を用いて、製造元の説明書に従って測定した（実施例２を参照）。実施例８に記載された酵母細胞からの結果と同様に、Ａβ４３は、Ａβ４２、Ａβ４８、Ａβ４９、またはＡβ４０と比べて、はるかに超える細胞毒性を示した（図１７Ｃ）。
【０２３６】
他の実施形態
本発明が、その詳細な説明と共に説明されてきたが、前述の説明は例示することを意図するものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことが理解されるべきである。群の１つ以上の構成員間に「または」を含む請求項または説明は、別段の意図が示されるか、または文脈上明らかでない限り、群構成員の１つ、２つ以上、または全てが、所定の生成物またはプロセスにおいて存在し、使用され、ないしは別の方法で関連するならば、条件を満たすものとみなされることが理解されるべきである。本発明は、群の１つの構成員が、厳密に所定の生成物またはプロセスにおいて存在し、使用され、ないしは別の方法で関連する実施形態を含む。本発明は、グループ構成員の２つ以上、または全てが、所定の生成物またはプロセスにおいて存在し、使用され、ないしは別の方法で関連する実施形態も含む。更に、別途明記しない限り、または矛盾もしくは不一致が生じることが当業者に明らかでない限り、１つ以上の列挙された請求項からの１つ以上の制限、要素、条項、記述用語等が、同一の基本請求項（または、関連する、任意の他の請求項）に従属する別の特許請求の範囲に導入される全ての実施形態を包含し、このような実施形態は、追加項目を構成することも、または出願時の内容を超えることはないことが理解されるべきである。要素がリストとして提示される場合、要素の各部分群もまた開示され、いかなる１つ以上の要素（複数可）も群から除外されることも可能であり、このような部分群または得られたリストは、本明細書に明示的に開示され、追加項目を構成することも、または出願時の内容を超えることはないことが理解されるべきである。一般に、本発明、または本発明の態様が、特定の要素、特徴等を含むものとみなされる場合、本発明のある特定の実施形態または本発明の態様は、このような要素、特徴等からなるか、または本質的になることを理解されたい。本発明の任意の実施形態は、追加項目を構成することなく、または出願時の内容を超えることなく、特許請求の範囲から明示的に除外され得ることも理解されたい。本発明の他の態様、利点、および変更は、以下に記載される特許請求の範囲内にある。
【図１】
0006655557.tif 000101
【図２】
0006655557.tif 000102
【図３】
0006655557.tif 000103
【図４】
0006655557.tif 000104
【図５】
0006655557.tif 000105
【図６】
0006655557.tif 000106
【図７】
0006655557.tif 000107
【図８】
0006655557.tif 000108
【図９】
0006655557.tif 000109
【図１０】
0006655557.tif 000110
【図１１Ａ】
0006655557.tif 000111
【図１１Ｂ】
0006655557.tif 000112
【図１２】
0006655557.tif 000113
【図１３】
0006655557.tif 000114
【図１４】
0006655557.tif 000115
【図１５】
0006655557.tif 000116
【図１６】
0006655557.tif 000117
【図１７】
0006655557.tif 000118
【配列表】
0006655557000001.app