(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲルと、
前記ゲル中に配置された、蛍光試薬で染色された複数の細胞と、
前記複数の細胞が物質に反応したときに前記蛍光試薬から発せられる蛍光を検出する光検出器と、
を備え、
前記複数の細胞が前記光検出器に対して垂直方向に積層し、
前記複数の細胞が前記物質の受容体を発現しており、
前記物質と前記受容体が結合すると、前記蛍光が発せられる、
検出装置。
【請求項２】
前記複数の細胞が、前記ゲル中に分散している、請求項１に記載の検出装置。
【請求項３】
前記複数の細胞が、細胞スフェロイドを形成している、請求項１に記載の検出装置。
【請求項４】
前記ゲルがコラーゲンを含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の検出装置。
【請求項５】
前記ゲルにおいて前記物質が透過可能である、請求項１から４のいずれか１項に記載の検出装置。
【請求項６】
培養容器をさらに備え、
前記ゲルが前記培養容器中に配置される、
請求項１から５のいずれか１項に記載の検出装置。
【請求項７】
前記ゲルを複数備え、前記複数のゲルにおいて、異なる種類の細胞が保持されている、請求項１から６のいずれか１項に記載の検出装置。
【請求項８】
前記光検出器が撮像素子を備える、請求項１から７のいずれか１項に記載の検出装置。
【請求項９】
前記物質がにおい物質であり、前記複数の細胞が前記におい物質の受容体を発現している、請求項１から８のいずれか１項に記載の検出装置。
【請求項１０】
前記物質が薬物又は農薬である、請求項１から８のいずれか１項に記載の検出装置。
【請求項１１】
前記蛍光試薬がカルシウム指示薬である、請求項１から１０のいずれか１項に記載の検出装置。
【請求項１２】
前記培養容器内の溶液の温度を制御する温度制御装置をさらに備える、請求項６に記載の検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞技術に関し、検出装置及び細胞含有物体に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞は、細胞外の物質と反応すると、膜電位が変化したり、細胞内のイオン濃度が変化したり、応答物質を生成したりする。したがって、リガンド等の物質に対する細胞の応答反応が生じるか否かを検出することにより、当該応答反応が生じた際は、リガンド等の物質が存在していると判定することが可能である。そのため、物質を検出するために細胞を用いる試みがなされている。また、薬物等の物質に対する細胞の応答反応を検出することにより、当該応答反応が生じた際は、薬物等の物質が細胞に対して作用すると判定することが可能である。そのため、薬物のスクリーニングのために細胞を用いる試みもなされている（例えば、特許文献１から３参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第５１２７７８３号公報
【特許文献２】特許第５６０３８５０号公報
【特許文献３】特許第５６９６９５３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
細胞外の物質に対する細胞の応答反応は、蛍光試薬等によって可視化される。しかし、細胞内で蛍光試薬が発する蛍光の強度は微弱であり、蛍光の検出には高感度の検出装置が必要である。そこで、本発明は、細胞内の蛍光を容易に検出可能な検出装置、細胞含有物体、細胞含有物体の製造方法、細胞含有物体のアレイ、及び細胞含有物体のアレイの製造方法を提供することを目的の一つとする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の態様によれば、ゲルと、ゲル中に配置された、蛍光試薬で染色された複数の細胞と、複数の細胞が物質に反応したときに蛍光試薬から発せられる蛍光を検出する光検出器と、を備える、検出装置が提供される。【０００６】
上記の検出装置において、複数の細胞が、ゲル中に分散していてもよい。【０００７】
上記の検出装置において、複数の細胞が、細胞スフェロイドを形成していてもよい。【０００８】
上記の検出装置において、ゲルが立体形状を有していてもよい。【０００９】
上記の検出装置において、ゲルが円柱形状を有していてもよい。【００１０】
上記の検出装置において、ゲルがコラーゲンを含んでいてもよい。【００１１】
上記の検出装置において、ゲルにおいて物質が透過可能であってもよい。【００１２】
上記の検出装置において、ゲルが光検出器上に配置されていてもよい。【００１３】
上記の検出装置が、培養容器をさらに備え、ゲルが培養容器中に配置されてもよい。【００１４】
上記の検出装置が、ゲルを複数備えていてもよい。【００１５】
上記の検出装置において、複数のゲルにおいて、異なる種類の細胞が保持されていてもよい。【００１６】
上記の検出装置において、異なる種類の細胞が、異なる種類の蛍光試薬で染色されていてもよい。【００１７】
上記の検出装置において、複数のゲルにおいて、異なる種類の受容体を発現している細胞が保持されていてもよい。【００１８】
上記の検出装置において、異なる種類の受容体を発現している細胞が、異なる種類の蛍光試薬で染色されていてもよい。【００１９】
また、本発明の態様によれば、蛍光試薬で染色された複数の細胞からなる細胞スフェロイドと、細胞スフェロイドが物質に反応したときに蛍光試薬から発せられる蛍光を検出する光検出器と、を備える、検出装置が提供される。【００２０】
上記の検出装置が、培養容器をさらに備え、細胞スフェロイドが培養容器中に配置されてもよい。【００２１】
上記の検出装置において、培養容器に溶液が入れられてもよい。溶液が培養液であってもよい。【００２２】
上記の検出装置において、培養容器が光検出器上に配置されてもよい。【００２３】
上記の検出装置において、光検出器が撮像素子を備えていてもよい。撮像素子が固体撮像素子であってもよい。固体撮像素子がＣＭＯＳイメージセンサであってもよい。【００２４】
上記の検出装置において、物質がにおい物質であり、複数の細胞がにおい物質の受容体を発現していてもよい。【００２５】
上記の検出装置において、物質が薬物又は農薬であってもよい。【００２６】
上記の検出装置において、蛍光試薬がカルシウム指示薬であってもよい。【００２７】
上記の検出装置が、培養容器内の溶液を灌流させる灌流装置をさらに備えていてもよい。【００２８】
上記の検出装置が、溶液の温度を制御する温度制御装置をさらに備えていてもよい。【００２９】
また、本発明の態様によれば、ゲルと、ゲル中に配置された、蛍光試薬で染色された複数の細胞と、を備える、細胞含有物体が提供される。【００３０】
上記の細胞含有物体において、複数の細胞が、ゲル中に分散していてもよい。【００３１】
上記の細胞含有物体において、複数の細胞が、細胞スフェロイドを形成していてもよい。【００３２】
上記の細胞含有物体において、ゲルが立体形状を有していてもよい。【００３３】
上記の細胞含有物体において、ゲルが円柱形状を有していてもよい。【００３４】
上記の細胞含有物体において、ゲルがコラーゲンを含んでいてもよい。【００３５】
上記の細胞含有物体において、複数の細胞が受容体を発現していてもよい。【００３６】
上記の細胞含有物体において、受容体がにおい物質の受容体であってもよい。【００３７】
上記の細胞含有物体において、蛍光試薬がカルシウム指示薬であってもよい。【００３８】
また、本発明の態様によれば、蛍光試薬で染色された複数の細胞を含む溶液をモールドに入れることと、溶液をゲルにすることと、ゲルとモールドとを分離し、ゲルと、ゲル中に配置された、蛍光試薬で染色された複数の細胞と、を備える、細胞含有物体を得ることと、を含む、細胞含有物体の製造方法が提供される。【００３９】
上記の細胞含有物体の製造方法において、複数の細胞が、ゲル中に分散していてもよい。【００４０】
上記の細胞含有物体の製造方法において、複数の細胞が、細胞スフェロイドを形成していてもよい。【００４１】
上記の細胞含有物体の製造方法において、ゲルが立体形状を有していてもよい。【００４２】
上記の細胞含有物体の製造方法において、ゲルが円柱形状を有していてもよい。【００４３】
上記の細胞含有物体の製造方法において、ゲルがコラーゲンを含んでいてもよい。【００４４】
上記の細胞含有物体の製造方法において、複数の細胞が受容体を発現していてもよい。【００４５】
上記の細胞含有物体の製造方法において、受容体がにおい物質の受容体であってもよい。【００４６】
上記の細胞含有物体の製造方法において、蛍光試薬がカルシウム指示薬であってもよい。【００４７】
また、本発明の態様によれば、複数のゲルと、複数のゲルのそれぞれの中に配置された、蛍光試薬で染色された複数の細胞と、を備える、細胞含有物体のアレイが提供される。【００４８】
上記の細胞含有物体のアレイにおいて、複数の細胞が、ゲル中に分散していてもよい。【００４９】
上記の細胞含有物体のアレイにおいて、複数の細胞が、細胞スフェロイドを形成していてもよい。【００５０】
上記の細胞含有物体のアレイにおいて、複数のゲルのそれぞれが立体形状を有していてもよい。【００５１】
上記の細胞含有物体のアレイにおいて、複数のゲルのそれぞれが円柱形状を有していてもよい。【００５２】
上記の細胞含有物体のアレイにおいて、複数のゲルのそれぞれがコラーゲンを含んでいてもよい。【００５３】
上記の細胞含有物体のアレイにおいて、複数のゲルにおいて、異なる種類の細胞が保持されていいてもよい。【００５４】
上記の細胞含有物体のアレイにおいて、異なる種類の細胞が、異なる種類の蛍光試薬で染色されていてもよい。【００５５】
上記の細胞含有物体のアレイにおいて、複数のゲルにおいて、異なる種類の受容体を発現している細胞が保持されていてもよい。【００５６】
上記の細胞含有物体のアレイにおいて、異なる種類の受容体を発現している細胞が、異なる種類の蛍光試薬で染色されていてもよい。【００５７】
上記の細胞含有物体のアレイにおいて、異なる種類の受容体のそれぞれが、におい物質の受容体であってもよい。【００５８】
上記の細胞含有物体のアレイにおいて、異なる種類の蛍光試薬が、異なる波長帯域の蛍光を発してもよい。【００５９】
上記の細胞含有物体のアレイにおいて、異なる種類の蛍光試薬のそれぞれが、カルシウム指示薬であってもよい。【００６０】
また、本発明の態様によれば、第１の種類の蛍光試薬で染色された第１の種類の細胞を含む第１の溶液をモールドに入れることと、第１のフォトマスクを用いて第１の溶液の一部を第１のゲルにすることと、第２の種類の蛍光試薬で染色された第２の種類の細胞を含む第２の溶液をモールドに入れることと、第２のフォトマスクを用いて第２の溶液の一部を第２のゲルにすることと、を含む、細胞含有物体のアレイの製造方法が提供される。【００６１】
上記の細胞含有物体のアレイの製造方法において、第１のゲル中に第１の種類の細胞が分散していてもよい。【００６２】
上記の細胞含有物体のアレイの製造方法において、第１のゲル中で第１の種類の細胞が細胞スフェロイドを形成していてもよい。【００６３】
上記の細胞含有物体のアレイの製造方法において、第２のゲル中に第２の種類の細胞が分散していてもよい。【００６４】
上記の細胞含有物体のアレイの製造方法において、第２のゲル中で第２の種類の細胞が細胞スフェロイドを形成していてもよい。【００６５】
上記の細胞含有物体のアレイの製造方法において、第１及び第２のゲルが立体形状を有していてもよい。【００６６】
上記の細胞含有物体のアレイの製造方法において、第１及び第２のゲルが円柱形状を有していてもよい。【００６７】
上記の細胞含有物体のアレイの製造方法において、第１及び第２のゲルがコラーゲンを含んでいてもよい。【００６８】
上記の細胞含有物体のアレイの製造方法において、第１及び第２の種類の細胞が異なる種類の受容体を発現していてもよい。【００６９】
上記の細胞含有物体のアレイの製造方法において、異なる種類の受容体のそれぞれが、におい物質の受容体であってもよい。【００７０】
上記の細胞含有物体のアレイの製造方法において、第１及び第２の種類の蛍光試薬が異なる波長帯域の蛍光を発してもよい。【００７１】
上記の細胞含有物体のアレイの製造方法において、第１及び第２の種類の蛍光試薬が、カルシウム指示薬であってもよい。
【発明の効果】
【００７２】
本発明によれば、細胞内の蛍光を容易に検出可能な検出装置、細胞含有物体、細胞含有物体の製造方法、細胞含有物体のアレイ、及び細胞含有物体のアレイの製造方法を提供可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】第１実施形態に係る検出装置の模式図である。
【図２】第１実施形態に係る細胞含有物体のアレイの模式図である。
【図３】第１実施形態に係る検出装置の模式図である。
【図４】第１実施形態に係る細胞の模式図である。
【図５】第１実施形態に係る細胞含有物体のアレイの製造工程を示す模式図である。
【図６】第１実施形態に係る細胞含有物体のアレイの製造工程を示す模式図である。
【図７】第１実施形態に係る細胞含有物体のアレイの製造工程を示す模式図である。
【図８】第１実施形態に係る細胞含有物体のアレイの製造工程を示す模式図である。
【図９】第１実施形態に係る細胞含有物体のアレイの製造工程を示す模式図である。
【図１０】第１実施形態に係る細胞含有物体のアレイの製造工程を示す模式図である。
【図１１】第１実施形態に係る細胞含有物体のアレイの製造工程を示す模式図である。
【図１２】第１実施形態に係る細胞含有物体のアレイの製造工程を示す模式図である。
【図１３】第１実施形態に係る細胞含有物体のアレイの製造工程を示す模式図である。
【図１４】第１実施形態の実施例に係る円柱状のゲルの明視野画像である。
【図１５】第１実施形態の実施例に係る円柱状のゲルの直径の分布を示すグラフである。
【図１６】第１実施形態の実施例に係る円柱状のゲルの３次元画像である。
【図１７】第１実施形態の実施例に係る円柱状のゲルの高さの分布を示すグラフである。
【図１８】第１実施形態の実施例に係る円柱状のゲルの明視野画像及び蛍光画像である。
【図１９】第１実施形態の実施例に係る円柱状のゲルの蛍光画像である。
【図２０】第１実施形態の実施例に係る円柱状のゲルの高さと蛍光強度の関係を示すグラフである。
【図２１】第１実施形態の実施例に係るにおい物質を添加後の時間経過と蛍光強度の関係を示すグラフである。
【図２２】第１実施形態の実施例に係るにおい物質の濃度と蛍光強度の関係を示すグラフである。
【図２３】図２３（ａ）は、第１実施形態の実施例に係るＵＶ照射により形成されたゲルの明視野画像である。図２３（ｂ）は、第１実施形態の実施例に係るＵＶ照射により形成されたゲルの明視野画像と蛍光画像の合成画像である。細胞は、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭとＥｔｈｉｄｉｕｍ  Ｈｏｍｏｄｉｍｅｒで染色した。Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭは生細胞の細胞膜を透過し、緑色蛍光を発する。Ｅｔｈｉｄｉｕｍ  Ｈｏｍｏｄｉｍｅｒは、死細胞の膜損傷部分を透過し、赤色蛍光を発する。図２３のオリジナルのカラー画像においては、大多数の細胞が緑色蛍光を発しており、細胞が生きていることが確認された。
【図２４】図２４（ａ）は、第１実施形態の実施例に係るＵＶ照射により形成されたゲルの明視野画像である。図２４（ｂ）は、第１実施形態の実施例に係るＵＶ照射により形成されたゲルであって、異なる蛍光試薬で染色された細胞を含むゲルの蛍光画像である。図２４（ｃ）は、異なる蛍光試薬で染色された細胞を含むゲルの位置と、蛍光強度と、を示すグラフである。
【図２５】第２実施形態に係る検出装置の模式図である。
【図２６】第２実施形態に係る検出装置の模式図である。
【図２７】第２実施形態の実施例に係るスフェロイドの画像である。
【図２８】図２８（ａ）は、第２実施形態の実施例に係るスフェロイドの明視野画像である。図２８（ｂ）は、第２実施形態の実施例に係るスフェロイドの蛍光画像である。図２８（ｃ）は、第２実施形態の実施例に係るスフェロイドの明視野画像と蛍光画像の合成画像である。図２８（ｄ）は、図２８（ｂ）のＡ−Ａ'破線における蛍光強度を示すグラフである。
【図２９】図２９（ａ）は、第２実施形態の実施例に係るシングルセルの蛍光画像である。図２９（ｂ）は、第２実施形態の実施例に係るスフェロイドの蛍光画像である。図２９（ｃ）は、第２実施形態の実施例に係るシングルセル及びスフェロイドが発した蛍光の強度を示すグラフである。
【図３０】図３０（ａ）は、第２実施形態の実施例に係る共焦点顕微鏡を用いたスフェロイドのオイゲノール添加前の蛍光画像である。図３０（ｂ）は、第２実施形態の実施例に係る共焦点顕微鏡を用いたスフェロイドのオイゲノール添加後の蛍光画像である。図３０（ｃ）は、第２実施形態の実施例に係るオイゲノール添加前後の蛍光強度を示すグラフである。図３０（ｄ）は、ＣＭＯＳイメージセンサを用いたスフェロイドの明視野画像である。図３０（ｅ）は、ＣＭＯＳイメージセンサを用い、バイナリ化されたスフェロイドの蛍光画像である。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
以下に本発明の実施の形態を説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号で表している。ただし、図面は模式的なものである。したがって、具体的な寸法等は以下の説明を照らし合わせて判断するべきものである。また、図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることはもちろんである。
【００７５】
（第１実施形態）
第１実施形態に係る検出装置は、図１に示すように、ゲル１１と、ゲル１１中に配置された、蛍光試薬で染色された複数の細胞１と、複数の細胞１が物質に反応したときに蛍光試薬から発せられる蛍光を検出する光検出器２と、を備える。
【００７６】
複数の細胞１は、ゲル１１中に分散していてもよい。あるいは、複数の細胞１は、細胞スフェロイドを形成していてもよい。細胞スフェロイドとは、複数の細胞からなる細胞塊である。細胞スフェロイドにおいては、細胞どうしが接着している。複数の細胞１と反応する物質は、例えばリガンドであり、におい物質である。複数の細胞１のそれぞれの細胞は、特定のにおい物質と結合するにおい物質受容体を発現している。におい物質受容体は、嗅覚受容体ともいい、Ｇタンパク質共役受容体ファミリーに属する。細胞は、例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞等のほ乳類の細胞であるが、特に限定されない。細胞は嗅覚受容細胞であってもよいし、遺伝子工学的に特定の受容体を発現させた細胞であってもよい。
【００７７】
細胞は、細胞が物質と反応したときに蛍光を発する蛍光試薬を取り込んでいる。細胞が取り込んでいる蛍光試薬は、例えばカルシウム指示薬である。におい物質と細胞のにおい物質受容体とが結合すると、細胞内でシグナルが伝達され、カルシウムイオン濃度が上昇する。カルシウム指示薬は、カルシウムイオン濃度の上昇に応じて、蛍光を発する。このように、蛍光試薬は、細胞が物質と反応した際に生じる細胞内の化学反応を可視化可能である。カルシウム指示薬の例としては、Ｆｕrａ２−ＡＭ、Ｆｌｕｏ−３−ＡＭ、Ｆｌｕｏ−４−ＡＭ、及びＦｌｕｏ−８−ＡＭが挙げられる。
【００７８】
蛍光試薬は、カルシウム指示薬に限定されない。蛍光試薬は、膜電位感受性蛍光試薬や、神経伝達物質感受性蛍光試薬であってもよい。膜電位感受性蛍光試薬は、細胞が物質と反応した際に生じる膜電位の変化に応じて蛍光を発する。膜電位感受性蛍光試薬の例としては、ｄｉ−４−ＡＮＥＰＰＳ及びＤｉＢＡＣ４が挙げられる。神経伝達物質感受性蛍光試薬は、細胞が物質と反応した際に細胞内で産生されるグルタミン酸等の神経伝達物質に応じて蛍光を発する。神経伝達物質感受性蛍光試薬の例としては、ＥＯＳ（ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｓｅｎｓｏｒ）が挙げられる。
【００７９】
複数の細胞１を内包するゲル１１は、例えば円柱形状等の任意の立体形状を有する。ゲル１１は、例えばハイドロゲルである。ゲル１１の材料としては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、アガー、アルギン酸、及びポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）等が使用可能である。ゲル１１の材料は、細胞と反応する物質がゲル１１内を透過可能であれば、特に限定されない。また、ゲル１１は、培養液の栄養成分等の培養成分を透過可能であってもよい。複数の細胞１と、ゲル１１と、は、細胞含有物体を構成している。
【００８０】
図２に示すように、複数の細胞１を含むゲル１１は、例えば、複数の細胞１で生じる蛍光が透過可能な透明基板２１上に配置されている。透明基板２１上には、１個のゲル１１が配置されてもよいし、複数個のゲル１１が配置されてもよい。複数個のゲル１１は、アレイ状に配置されていてもよい。透明基板２１の表面は、ゲル１１の材料と同じ材料でコーティングされていてもよい。これにより、ゲル１１の透明基板２１への接着性が向上する。
【００８１】
動物は、一つのにおい物質に反応して一つのにおいを認識するのではなく、複数のにおい物質の組み合わせのパターンに応じて一つのにおいを認識すると報告されている。したがって、検出装置が複数のゲル１１を備える場合、複数のゲル１１において、異なる種類の細胞が保持されていてもよい。異なる種類の細胞においては、例えば、異なる種類の受容体が発現していてもよい。
【００８２】
検出装置において、例えば、第１のにおい物質と反応する複数の細胞を保持するゲルと、第２のにおい物質と反応する複数の細胞を保持するゲルと、第３のにおい物質と反応する複数の細胞を保持するゲルと、が配置されていてもよい。蛍光が発せられたゲルの位置から、におい物質の種類を特定してもよい。また、蛍光が発せられたゲルの位置の組み合わせから、においの種類を特定してもよい。あるいは、異なる種類の細胞を、異なる種類の蛍光試薬で染色することにより、蛍光の波長帯域や色から、におい物質の種類を特定してもよい。また、蛍光の波長帯域や色の組み合わせから、においの種類を特定してもよい。
【００８３】
図１に示すように、透明基板２１上には、枠２２が配置されていてもよい。この場合、透明基板２１及び枠２２は、培養容器を構成する。枠２２は、例えば、ジメチルポリシロキサン（ＰＤＭＳ）からなるが、特に限定されない。複数の細胞１を含むゲル１１は、透明基板２１及び枠２２が形成する培養容器内に配置される。また、透明基板２１及び枠２２が形成する培養容器内には、培養液や緩衝液等の溶液２３が入れられてもよい。枠２２内に溶液を入れることにより、ゲル１１の水分の蒸発を防いだり、複数の細胞１に栄養分を供給したりすることが可能である。
【００８４】
透明基板２１及び枠２２が形成する培養容器は、光検出器２上に配置される。そのため、複数の細胞１を含むゲル１１は、光検出器２上に配置される。光検出器２と透明基板２１との間には、鏡筒３１が配置されていてもよい。鏡筒３１内に、複数の細胞１で生じた蛍光を並行光にするレンズ３２と、レンズ３２を透過した蛍光を光検出器２上に収束させるレンズ３３と、が配置されていてもよい。
【００８５】
光検出器２上には、複数の細胞１で生じた蛍光を透過させ、当該蛍光とは波長帯域が異なる光を透過させないバンドパスフィルタ３４が配置されていてもよい。
【００８６】
光検出器２は、例えば、回路基板３上に配置されている。光検出器２は、固体撮像素子等の撮像素子を備えていてもよい。固体撮像素子としては、ＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｍｅｔａｌ  Ｏｘｉｄｅ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）イメージセンサ及びＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ−Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ）イメージセンサ等が使用可能である。小型の光検出器２を用いることにより、第１実施形態に係る検出装置を小型にすることが可能である。
【００８７】
光検出器２には、処理装置が接続されていてもよい。処理装置は、例えば、予め取得された蛍光強度と、におい物質の濃度と、の関係を用いて、光検出器２で検出された蛍光の強度に基づき、におい物質の濃度を算出してもよい。
【００８８】
第１実施形態に係る検出装置は、複数の細胞１に向けて励起光を発する励起光光源４と、複数の細胞１に向けて白色光等の励起光以外の波長を含む光を発する光源５と、をさらに備えていてもよい。励起光光源４は、複数の細胞１を構成する細胞に取り込まれた蛍光試薬に対応する励起波長を有する励起光を発する。励起光光源４が励起光を発しているときは、光検出器２で、複数の細胞１が発した蛍光の画像を撮像することが可能である。また、光源５が白色光を発しているときは、光検出器２で、複数の細胞１の形状の明視野画像や暗視野画像等の画像を撮像することが可能である。
【００８９】
図３に示すように、複数の細胞１を含むゲル１１は、レンズ等を介さずに光検出器２上に配置されてもよい。複数の細胞１を含むゲル１１の周囲を満たす溶液２３は、モーターポンプ等の灌流装置７１で灌流されてもよい。また、溶液２３の温度は、ヒーター等の温度制御装置７２で制御されてもよい。複数の細胞１を含むゲル１１が配置される培養容器は、気体を透過させ、液体を透過させない半透膜７３で覆われていてもよい。これにより、二酸化酸素及び酸素等の細胞培養に必要な成分を溶液２３に供給しつつ、溶液２３の蒸発を防止することが可能である。
【００９０】
１個の細胞や単層に培養された細胞内で生じる蛍光の強度は弱いため、従来技術では、光検出器で検出するのが困難である場合があったり、持ち運びが容易ではない大型の光検出器が必要な場合があったりする。これに対し、第１実施形態に係る検出装置においては、ゲル１１中で複数の細胞１が三次元に配置されており、複数の細胞１が光検出器２に対して垂直方向に積層している。そのため、ゲル１１中の複数の細胞１が発する蛍光が重畳するため、単層に培養されている細胞が発する蛍光と比較して強度の強い蛍光が光検出器２に到達する。よって、物質に対する細胞の応答反応を、ＣＭＯＳイメージセンサ等の感度の弱い光検出器２でも正確に検出することが可能である。また、高感度の大型の光検出器を用いる必要が必ずしもないため、第１実施形態に係る検出装置は、持ち運びが可能な程度に小型にすることが可能である。
【００９１】
また、第１実施形態に係る検出装置においては、複数の細胞１がゲル１１内に保持されている。ゲル１１は透明基板２１に容易に接着可能である。そのため、透明基板２１に対してゲル１１を固定することができるため、ゲル１１周囲の溶液２３を交換したり、溶液２３に細胞と反応する物質を滴下したりしても、複数の細胞１の位置や向きが光検出器２に対して変化することを抑制可能である。そのため、蛍光測定時に再現性を向上させることが可能である。
【００９２】
次に、複数の細胞１を含むゲル１１の製造方法を説明する。細胞に、匂い物質の受容体をコードするＤＮＡを組み込んだプラスミドを導入し、図４に示すように、細胞１２に匂い物質の受容体１３を発現させる。次に、例えばコラーゲン溶液等のゲル原料溶液に細胞を懸濁し、細胞懸濁液を得る。
【００９３】
図５に示すように、複数のウェル５２ａ、５２ｂ、５２ｃ・・・が設けられたモールド５１を用意する。複数のウェル５２ａ、５２ｂ、５２ｃ・・・のそれぞれの内径及び深さは、作製しようとするゲルの直径及び高さに基づいて設計される。モールド５１は、例えばジメチルポリシロキサン（ＰＤＭＳ）からなるが、特に限定されない。モールド５１の表面は、ゲルが抜けやすくなるよう、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等でコーティングされていてもよい。次に、モールド５１のウェル５２ａ、５２ｂ、５２ｃ・・・のそれぞれに、細胞懸濁液１４を充填する。
【００９４】
図６及び図７に示すように、ゲル原料溶液のゲル材料と同じゲル材料がコーティングされた透明基板２１を用意し、モールド５１のウェル５２ａ、５２ｂ、５２ｃ・・・が設けられた側の表面を透明基板２１の表面に密着させる。その後、モールド５１のウェル５２ａ、５２ｂ、５２ｃ・・・内で、複数の細胞１２を培養する。複数の細胞１２は、分散した状態で培養してもよい。あるいは、複数の細胞１２に細胞スフェロイド１を形成させてもよい。なお、ウェル５２ａ、５２ｂ、５２ｃ・・・内で、それぞれ異なる種類の細胞を培養してもよい。さらに、ゲル原料溶液をゲル１１にゲル化するために、ゲル原料溶液を加熱する。加熱温度は例えば３７℃であり、加熱時間は例えば１５分である。
【００９５】
図８に示すように、例えば、モールド５１の周囲に培養液や緩衝液等の溶液２３を入れる。これにより、透明基板２１からモールド５１を剥がしやすくなる。その後、図９に示すように、特に限定されないが、ピンセット６１等でモールド５１を引き上げると、図１０に示すように、透明基板２１上に、複数の細胞１を含むゲル１１が残る。
【００９６】
あるいは、図１１に示すように、一つのウェル１５２が設けられたモールド１５１を用意し、ウェル１５２にＰＥＧＤＡのような光照射によりゲル化するゲル化剤を含む細胞懸濁液１４を充填する。細胞懸濁液１４は、第１の種類の蛍光試薬で染色された第１の種類の細胞を含んでいる。図１２に示すように、透明基板２１を用意し、モールド１５１のウェル１５２が設けられた側の表面を透明基板２１の表面に密着させる。その後、モールド１５１のウェル１５２内で、第１の種類の細胞１２を培養する。任意で、細胞スフェロイドを形成させてもよい。さらに、第１のフォトマスク８１等を介して、ＵＶ照射装置等の光源８２から光を照射し、細胞懸濁液１４の一部をゲル化する。
【００９７】
その後、光を照射されずにゲル化しなかった細胞懸濁液１４を除去することにより、透明基板２１上に、第１の種類の複数の細胞を含む複数のゲルが配置される。また、モールド１５１のウェル１５２に第１の種類の細胞とは異なる第２の種類の細胞を含む細胞懸濁液を充填する。第２の種類の細胞は、第１の種類の蛍光試薬とは異なる第２の種類の蛍光試薬で染色されている。次に、図１３に示すように、第１のフォトマスク８１とは開口パターンが異なる第２のフォトマスク８３を用いて細胞懸濁液の一部をゲル化する。その後、光を照射されずにゲル化しなかった細胞懸濁液を除去することにより、透明基板２１上に、第２の種類の複数の細胞を含む複数のゲルが配置される。以後、同様の方法を繰り返して、透明基板２１上にそれぞれ異なる種類の細胞を含む複数のゲルを配置してもよい。
【００９８】
（第１実施形態の実施例）
遺伝子工学的に嗅覚受容体であるｍＯＲ−ＥＧを発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用意した。細胞は、カルシウム指示薬であるＦｌｕｏ−８  ＡＭ（ＡＡＴ  Ｂｉｏｑｕｅｓｔ社）で染色した。また、Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ  ＴｙｐｅＩ−Ａ（新田ゼラチン社）、１０倍Ｈａｎｋｓ  ｂｕｆｆｅｒ、再構成用緩衝液を８：１：１の割合で混合し、コラーゲンを２．４ｍｇ／ｍＬの濃度で含むコラーゲン溶液を用意した。さらに、直径２００μｍ、深さ２００μｍのウェルのアレイが設けられたＰＤＭＳからなるモールドを用意した。モールドの表面を、１％ＢＳＡで３０分間コーティングした。細胞を１０８細胞／ｍＬの濃度になるよう、コラーゲン溶液に懸濁し、細胞懸濁液を得た。得られた細胞懸濁液をモールドのウェルに入れ、モールドのウェルが設けられた面をガラスプレートの枠内に貼りつけた。ウェル内で細胞を３時間培養した。その後、コラーゲン溶液をゲル化するために、コラーゲン溶液を３７℃で３０分間から４０分間加熱した。ゲルが形成された後、枠内に培養液を入れ、モールドをガラスプレートの表面から剥がした。
【００９９】
図１４に示すように、倒立顕微鏡で、ガラスプレート上に円柱状のゲルがアレイ状に配置されていることを確認した。画像解析により、同じ形状のウェルから形成された複数の円柱状のゲルの直径の分布を調べたところ、図１５に示すように、直径はほぼ均一であった。また、図１６に示すように、形状解析レーザー顕微鏡（ＶＫ−Ｘ２１、キーエンス社）で円柱状のゲルを観察し、同じ形状のウェルから形成された複数の円柱状のゲルの高さの分布を調べたところ、図１７に示すように、高さはほぼ均一であった。
【０１００】
次に、におい物質としてオイゲノールを用意した。オイゲノールの化学式を下記に示す。オイゲノールは、一般に、シナモンから抽出され、香辛料や香水に使用されている。オイゲノールを５０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して、におい物質溶液を得た。
【化１】
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【０１０１】
ＣＭＯＳイメージセンサを用いて図１と同様の構造を有する検出装置を作製した。なお、ウェルの深さが異なるモールドを用いて、直径が同じであり、高さが異なる複数の円柱状のゲルを用意した。バックグラウンドノイズの計測のために、におい物質溶液を培養液に滴下する前に、複数の細胞に励起光を照射し、ＣＭＯＳイメージセンサで蛍光画像を撮像した。次に、におい物質溶液の濃度を適当に希釈し、液面の高さが変わらないように、半量の培養液を吸い取った後に、同量のにおい物質溶液を培養液に滴下した。その後、複数の細胞に励起光を照射し、ＣＭＯＳイメージセンサで蛍光画像を撮像した。さらに、におい物質溶液を滴下した前後の蛍光画像の差分の画像を、バックグランドノイズがキャンセルされた補正蛍光画像として得た。得られた明視野画像と補正蛍光画像を図１８に示す。明視野画像においては、円柱状のゲルの輪郭が観察された。また、補正蛍光画像においては、カルセインが発した蛍光が観察された。
【０１０２】
また、図１９及び図２０に示すように、円柱状のゲルの高さが高くなるほど、ＣＭＯＳイメージセンサで検出される蛍光強度が強くなることが確認された。これは、ゲルの高さが高くなるほど、ゲルに含まれる細胞の数も増えるため、細胞内で生じる蛍光の強度が重畳されたためであると考えられる。また、培養液ににおい物質溶液を滴下してからの蛍光強度の時間変化を観察したところ、図２１に示すように、数十秒以内に蛍光強度の上昇が確認された。したがって、実施例に係る検出装置は、応答性が良好であり、におい物質をリアルタイムに検出可能であることが示された。
【０１０３】
さらに、におい物質溶液におけるにおい物質の濃度を変化させたところ、図２２に示すように、におい物質の濃度が高いほど、蛍光強度が強くなることが観察された。したがって、予めにおい物質の濃度と、蛍光強度と、の関係を取得すれば、検出装置で観察された蛍光の強度から、におい物質の濃度を算出可能であることが示された。
【０１０４】
また、ＰＤＭＳを含む細胞懸濁液を用意し、複数の円形の開口が設けられたフォトマスクを用いて細胞懸濁液をゲル化したところ、図２３に示すように、円柱状のゲルが得られた。隣あうゲルにおいて、異なる種類の蛍光試薬で染色された細胞を含ませたところ、図２４に示すように、それぞれのゲルから異なる波長帯域の蛍光が発せられることが確認された。
【０１０５】
（第２実施形態）
第１実施形態では複数の細胞がゲル中に保持されている例を示した。これに対し、複数の細胞が細胞スフェロイドを形成している場合、細胞スフェロイドは必ずしもゲル中に保持されていなくともよい。例えば、図２５に示す第２実施形態に係る検出装置においては、複数の細胞１からなる細胞スフェロイドは、溶液２３中に直接入れられてもよい。図２５においても、透明基板２１及び枠２２が、培養容器を構成しており、複数の細胞１からなる細胞スフェロイドと、培養液や緩衝液等の溶液２３と、は、透明基板２１及び枠２２が形成する培養容器内に入れられている。図２６に示すように、第２実施形態に係る検出装置において、におい物質等の物質１５が溶液２３に入ると、複数の細胞１からなる細胞スフェロイドが物質１５に反応して、蛍光を発する。
【０１０６】
第２実施形態に係る検出装置のその他の構成要素は、第１実施形態と同様である。
【０１０７】
（第２実施形態の実施例）
ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、シグマ・アルドリッチ）に１０体積％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｂｉｏｓｅｒａ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン（関東化学又は和光純薬）、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（関東化学又は和光純薬）を加え、培養液を調整した。また、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、シグマ・アルドリッチ）、及びにおい物質であるオイゲノールを用意した。
【０１０８】
オイゲノールを検出するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、リポフェクタミン３０００又は２０００（登録商標、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、嗅覚受容体であるｍＯＲ−ＥＧ、Ｇタンパク質αサブユニットであるＧα１５、受容体トランスポータータンパク質であるＲＴＰ１、及びシグナル増幅分子であるＲｉｃ−８を発現するよう、形質転換した。培地１ｍＬあたり添加された遺伝子の量は、ｐＭＥ１８Ｓ−Ｒｈｏ−ｍＯＲ−ＥＧが１．５μｇ（リポフェクタミン３０００使用時）又は１．４５μｇ（リポフェクタミン２０００使用時）、ｐＭＥ１８Ｓ−Ｇａ１５が１．０μｇ（リポフェクタミン３０００使用時）又は０．８７μｇ（リポフェクタミン２０００使用時）、ｐＭＥ１８Ｓ−ＲＴＰ１が０．５μｇ（リポフェクタミン３０００使用時）又は０．５８μｇ（リポフェクタミン２０００使用時）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ３−Ｍｙｒ−Ｒｉｃ−８Ａが０．５μｇ（リポフェクタミン３０００使用時）又は０．２９μｇ（リポフェクタミン２０００使用時）であった。
【０１０９】
接着培養された形質転換された細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ溶液で３７℃、５分間処理し、細胞を培養器から遊離させた。さらに、培養液を追加して細胞を懸濁し、２Ｇで５分間遠心した。遠心後、細胞を培養液で再度懸濁し、直径２００μｍ及び深さ２００μｍのウェルがアレイ状に設けられた、ＰＤＭＳからなる培養器の各ウェルに懸濁液を滴下した。その後、３時間培養して形質転換された細胞からなる細胞スフェロイドを形成した。細胞スフェロイドの明視野画像を図２７に示す。さらに、細胞スフェロイドをカルシウム指示薬であるカルセイン−ＡＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）又はＦｌｕｏ−８−ＡＭ（ＡＡＴ  ｂｉｏｑｕｅｓｔ）で染色した。
【０１１０】
３Ｄプリンター（ＡＧＩＬＩＳＴＡ−３１００、キーエンス）を用いて、図２５と同様の構造を有する数ｃｍ四方の検出装置を作製した。検出装置には、ＣＭＯＳイメージセンサ（ＷＡＴ−０１Ｕ２、Ｗａｔｅｃ）、白色光源（ＯＳＷ４ＸＭＥ３Ｃ１Ｅ、ＯｐｔｏＳｕｐｐｌｙ）、及び青色励起光原（ＯＥＨＢ２２０、ＯｐｔｏＳｕｐｐｌｙ）を配置した。ピペットで培養器から捕集した細胞スフェロイドを検出装置の培養容器内の培養液内に入れた。スフェロイドの明視野画像を撮像する際には、ピンホールを介して白色光をスフェロイドに照射した。培養液にオイゲノールを入れ、スフェロイドの蛍光画像を撮像する際には、青色励起光を細胞スフェロイドに照射し、緑色波長帯域の色を抽出した。
【０１１１】
図２８（ａ）に細胞スフェロイドの明視野画像を、図２８（ｂ）に細胞スフェロイドの蛍光画像を、図２８（ｃ）に明視野画像と蛍光画像の合成画像を示す。また、図２８（ｄ）に、図２８（ｃ）のＡ−Ａ'破線における蛍光強度の分布グラフを示す。ＣＭＯＳイメージセンサを用いて、細胞スフェロイド内の蛍光反応を検出可能であることが示された。さらに、図２９に示すように、１個の細胞（シングルセル）が発した蛍光の強度と比較して、細胞スフェロイドが発した蛍光の強度は、約４倍強かった。したがって、細胞スフェロイドが、検出装置の感度を向上させることが示された。
【０１１２】
また、共焦点顕微鏡を用いて計測したところ、図３０（ａ）から（ｃ）に示すように、培養液にオイゲノールを添加する前と比較して、培養液に２ｍｍｏｌ／Ｌのオイゲノールを添加した後、細胞スフェロイドが発する蛍光の強度が２倍以上上昇した。図３０（ｄ）は、ＣＭＯＳイメージセンサで撮像した細胞スフェロイドの明視野画像を示し、図３０（ｅ）は、細胞スフェロイドの蛍光画像を画像処理ソフトであるイメージＪでバイナリ化した画像を示す。本実施例の結果から、ＣＭＯＳイメージセンサを用いる検出装置が、細胞スフェロイドの嗅覚受容体と、におい物質であるオイゲノールと、の反応の検出に利用可能であることが示された。
【０１１３】
（その他の実施の形態）
上記のように本発明を実施の形態によって記載したが、この開示の一部をなす記述及び図面はこの発明を限定するものであると理解するべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施の形態、実施例及び運用技術が明らかになるはずである。例えば、実施形態においては、細胞が反応する物質の例としてにおい物質を挙げたが、物質はこれに限定されない。物質は、様々なリガンド、イオン、あるいは細胞膜透過物質であってもよい。これらの物質による細胞内の応答反応に起因して発せられる蛍光を検出することにより、これららの物質の存在を検出することが可能である。
【０１１４】
また、細胞が反応する物質は、医薬品等の薬物や農薬であってもよい。薬物や農薬に対する細胞の応答反応に起因して発せられる蛍光を検出することにより、薬物や農薬が細胞に影響を与えるか否かを検証したり、スクリーニングしたりすることが可能である。このように、本発明はここでは記載していない様々な実施の形態等を包含するということを理解すべきである。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
実施形態に係る検出装置は、特に限定されないが、食品混入物の検出、医療、及び環境測定等に利用可能である。
【符号の説明】
【０１１６】
１・・・細胞、２・・・光検出器、３・・・回路基板、４・・・励起光光源、５・・・光源、１１・・・ゲル、１２・・・細胞、１３・・・受容体、１４・・・細胞懸濁液、１５・・・物質、２１・・・透明基板、２２・・・枠、２３・・・溶液、３１・・・鏡筒、３２、３３・・・レンズ、３４・・・バンドパスフィルタ、５１、１５１・・・モールド、５２、１５２・・・ウェル、６１・・・ピンセット、７１・・・灌流装置、７２・・・温度制御装置、７３・・・半透膜、８１、８３・・・フォトマスク、８２・・・光源
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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