(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プログラム細胞死因子１（ＰＤ−１）と結合できる抗体又はその抗原結合断片であって、
前記抗体又はその抗原結合断片は、配列番号：３３のアミノ酸配列で表される重鎖可変領域、および配列番号：３４のアミノ酸配列で表される軽鎖可変領域を含む、抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
請求項１に記載された抗体又はその抗原結合断片をコードする分離された核酸分子。
【請求項３】
請求項２に記載された核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項４】
請求項３に記載された発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項５】
請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片を産生する方法であって、
前記抗体又はその抗原結合断片を産生できる条件で請求項４に記載された宿主細胞を培養し、このように産生された前記抗体又はその抗原結合断片を回収することを含む、抗体又はその抗原結合断片を産生する方法。
【請求項６】
治療剤とカップリングされた請求項１に記載された抗体又はその抗原結合断片を含み、
前記治療剤は、毒素、放射性同位体、薬物又は細胞毒性薬である、免疫抱合体。
【請求項７】
請求項１に記載された抗体又はその抗原結合断片、及び薬学的に許容されるベクターを含む薬物組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオメディカルの分野に属し、高親和力でＰＤ−１と特異的に結合する抗体又はその機能性断片に関する。また、本発明の抗体又はその機能性断片をコードする核酸分子、本発明の抗体又はその機能性断片を発現させるための発現ベクターと宿主細胞、および、本発明の抗体又はその機能性断片の生産方法をさらに提供する。本発明は、本発明の抗体又はその機能性断片の免疫抱合体および薬物組成物、並びに、本発明の抗体又はその機能性断片を使用して複数種の疾患（がん、感染症、および炎症性疾患を含む）を治療する方法をさらに提供する。
【背景技術】
【０００２】
プログラム細胞死因子１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  １、ＰＤ−１）はＣＤ２８ファミリーのメンバーであり、活性化Ｔ細胞とＢ細胞の表面において発現される免疫抑制性受容体でもある（Ｙａｏ，Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ，２０１３，１２（２）：１３０−１４６）。当該受容体とそのリガンドＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２との結合は、免疫Ｔ細胞が関与する免疫応答を効果的に低減させることができる。腫瘍細胞は、ＰＤ−Ｌ１を過剰発現することにより、有機体内の免疫監視から逃げる（ＯｋａｚａｋｉとＨｏｎｊｏ，ＰＤ−１  ａｎｄ  ＰＤ−１  ｌｉｇａｎｄｓ：ｆｒｏｍ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｔｏ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００７，１９（７）：８１３−８２４  ２００７）。ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の相互作用を遮断すれば、ＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞の活性を顕著に高めて、腫瘍細胞を殺傷することができる。
【０００３】
ＰＤ−１は主にＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞および活性化された単核細胞の表面に発現され、主にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）又はＢ細胞受容体（ＢＣＲ）信号に誘導されて発現されるものであり、ＴＮＦによりこれらの細胞表面でのＰＤ−１の発現増強ができる（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｓａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ＰＤ−１  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ａｎｄ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ，２０１０，２３６：２１９−２４２）。ヒトＰＤ−１は遺伝子Ｐｄｃｄ１によりコードされ、２ｑ３７．３に位置し、全長が９．６ｋｂであり、５つのエクソンと４つのイントロンとからなり、その上流に６６３ｂｐのプロモータが含まれている。ＰＤ−１の分子構造は細胞外領域、膜貫通領域および細胞内領域からなり、細胞外領域のアミノ酸配列はＣＴＬＡ−４と２４％の相同性を有し、ＣＤ２８と２８％の相同性を有し、その遺伝子は主に７つのモノヌクレオチド多形性部位を有する。細胞外領域は一つの免疫グロブリン可変領域ＩｇＶドメインを含み、細胞内領域はチロシンに基づく二つのシグナル伝達モチーフであるＩＴＩＭ（免疫受容体チロシン抑制作用モチーフ）およびＩＴＳＭ（免疫受容体チロシン変換作用モチーフ）を含む。Ｔ細胞が活性化された後、ＰＤ−１は主にＩＴＳＭモチーフによりチロシンホスホリパーゼＳＨＰ２を集め、ＣＤ３ζ、ＰＫＣθおよびＺＡＰ７０等のエフェクタ分子の脱リン酸化を引き起こす。
【０００４】
ＰＤ−１リガンドとしては、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２という二つのものがある。ＰＤ−Ｌ１はＢ７Ｈ１又はＣＤ２７４とも称され、ＰＤ−Ｌ２はＢ７ＤＣ又はＣＤ２７３と称される。ＰＤ−Ｌ遺伝子はヒト染色体の９ｐ２４．２部位に位置し、大きさが４２ｋｂである。これらのリガンドはＢ７−１、Ｂ７−２およびＩＣＯＳＬと２１〜２７％のアミノ酸配列相同性および構造類似性を有し、いずれも一つの免疫グロブリン様可変領域ドメイン、一つの定常領域様ドメイン、一つの膜貫通領域、および一つの短い細胞質尾部を含み、ＰＤ−Ｌ１の細胞質尾部はＰＤ−Ｌ２よりも保守的である。ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−Ｌ２は異なる細胞群体において発現され（Ｓｈｉｍａｕｃｈｉ，Ｋａｂａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｕｇｍｅｎｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ−１  ｉｎ  ｂｏｔｈ  ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ＣＤ４＋  Ｔ−ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ／ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，２００７，１２１（１２）：２５８５−２５９０）、これらの細胞は非造血組織および各腫瘍タイプを含む。ＰＤ−Ｌ１は主にＴ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、間葉系幹細胞および骨髄由来の肥満細胞において発現される。ＰＤ−Ｌ１は、非骨髄由来の細胞、例えば血管内皮細胞、上皮細胞、骨格筋細胞、肝細胞、腎細管上皮細胞、膵島細胞、脳星状細胞、および例えば黒色腫、肝臓がん、胃がん、腎細胞がんといった各種の非リンパ系腫瘍においても発現され、免疫学的特別部位例えば胎盤、目の細胞においても発現される。これから分かるように、ＰＤ−Ｌ１は、自己反応性Ｔ細胞とＢ細胞および免疫寛容を調節する面では一定の普遍性があり、そして末梢組織のＴ細胞とＢ細胞応答に役立っている。しかし、ＰＤ−Ｌ２の発現領域に非常に限りがあり、マクロファージと樹状細胞のみにおいて存在し、主に免疫提示に役立つものであると考えられている。
【０００５】
Ｔ細胞の活性化を調節し制御するためにＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１を相互に作用させることは、腫瘍とウイルス感染において多く検証されている。ＰＤ−Ｌ１は、肺がん細胞、肝臓がん細胞、卵巣がん細胞、子宮頸がん細胞、皮膚がん細胞、膀胱がん細胞、結腸がん細胞、乳腺がん細胞、神経膠腫細胞、腎臓がん細胞、胃がん細胞、食道がん細胞、口腔扁平細胞がん細胞、および頭頸部がん細胞を含む複数種の腫瘍細胞の表面において発現される。また、これらのがんの周囲でＰＤ−Ｌ１を発現する大量のＣＤ８＋Ｔ細胞をも発見した。臨床統計により、腫瘍細胞でのＰＤ−Ｌ１の高い発現レベルは、がん患者の不良な予後に関わることが分かった（ＯｋａｚａｋｉとＨｏｎｊｏ  ２００７，同上）。
【０００６】
複数種の遅発性と急性ウイルスもＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１信号により人体の免疫監視から逃げる。例えば、ＨＩＶ感染者体内のＰＤ−１の発現レベルはＴ細胞の枯渇程度と密接な関連があり、そしてＡＩＤＳ疾患の進行のマークの一つとしてもよい（Ｔｒａｂａｔｔｏｎｉ，Ｓａｒｅｓｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂ７−Ｈ１  ｉｓ  ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ＨＩＶ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ，２００３，１０１（７）：２５１４−２５２０）。この現象は同様に慢性Ｂ型肝炎患者にも適用される（Ｅｖａｎｓ，Ｒｉｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ  １  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ：Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｅ−ａｎｔｉｇｅｎ  ｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２００８，４８（３）：７５９−７６９）。動物実験により、ＰＤ−１遺伝子ノックアウトマウスは正常マウスよりもウイルス感染を効果的に抑え、ＨＢＶ特異性Ｔ細胞をＨＢＶ遺伝子改変動物に移し替えると、肝炎を引き起こしてしまうことが分かった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明はプログラム細胞死因子１（ＰＤ−１）と結合できる抗ＰＤ−１抗体およびその機能性断片に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一方、本発明の抗体又はその機能性断片機能する断片は、配列番号：１、２、３、７、８、９、１３、１４、１５のアミノ酸配列又はあらゆる前記配列の変異体から選ばれる重鎖ＣＤＲ、および／又は、配列番号：４、５、６、１０、１１、１２、１６、１７、１８のアミノ酸配列又はあらゆる前記配列の変異体から選ばれる軽鎖ＣＤＲを含む。
【０００９】
いくつかの好ましい実施形態では、前記抗体又はその機能性断片の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列は、下記の各アミノ酸配列又はその変異体の組の一つから選ばれる。
【表１】
0006681327.tif 000002
および／又は、その軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列は下記の各アミノ酸配列又はその変異体群の一つから選ばれる。
【表２】
0006681327.tif 000003
いくつかの好ましい実施形態では、本発明の抗体又はその機能性断片の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列は下記の各アミノ酸配列又はその変異体群の一つから選ばれる。
【表３】
0006681327.tif 000004
【００１０】
いくつかの実施の形態では、本発明の抗体又はその機能性断片は、配列番号：１９、２１、２３のアミノ酸配列又はあらゆる前記配列の変異体から選ばれる重鎖可変領域、および／又は、配列番号：２０、２２、２４のアミノ酸配列又はあらゆる前記配列の変異体から選ばれる軽鎖可変領域を含む。
【００１１】
一つの好ましい実施形態では、前記重鎖可変領域は配列番号：１９又はその変異体であり、前記軽鎖可変領域は配列番号：２０又はその変異体である。
【００１２】
もう一つの好ましい実施形態では、前記重鎖可変領域は配列番号：２１又はその変異体であり、前記軽鎖可変領域は配列番号：２２又はその変異体である。
【００１３】
さらなる一つの好ましい実施の形態では、前記重鎖可変領域は配列番号：２３又はその変異体であり、前記軽鎖可変領域は配列番号：２４又はその変異体である。
【００１４】
本発明の抗体又はその機能性断片はキメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト型抗体であってもよい。
【００１５】
本発明の抗体又はその機能性断片はヒト化のものであってもよい。ヒト化抗体を調製する方法は当業者が周知するものである。例えば、本発明のＣＤＲ配列をヒト抗体可変領域に移し替えることにより、本発明のヒト化抗ＰＤ−１抗体を調製することができる。前記ヒト化抗体は抗抗体反応（ＡＡＲ）およびヒト抗マウス抗体反応（ＨＡＭＡ）を生じず、抗抗体で中和されることにより迅速に除去されることがなく、また免疫作用、例えばＡＤＣＣおよびＣＤＣ作用を有している。
【００１６】
いくつかの好ましい実施の形態では、本発明のヒト化ＰＤ−１抗体又はその機能性断片は配列番号：３３、３５、３６のアミノ酸配列又はあらゆる前記配列の変異体から選ばれる重鎖可変領域、および／又は、配列番号：３４、３７のアミノ酸配列又はあらゆる前記配列の変異体から選ばれる軽鎖可変領域を含む。
【００１７】
本発明のヒト化抗体又はその機能性断片の一つの好ましい実施の形態では、前記重鎖可変領域は配列番号：３３又はその変異体であり、前記軽鎖可変領域は配列番号：３４又はその変異体である。
【００１８】
本発明のヒト化抗体又はその機能性断片のもう一つの好ましい実施の形態では、前記重鎖可変領域は配列番号：３５又はその変異体であり、前記軽鎖可変領域は配列番号：３４又はその変異体である。
【００１９】
本発明のヒト化抗体又はその機能性断片のもう一つの好ましい実施の形態では、前記重鎖可変領域は配列番号：３６又はその変異体であり、前記軽鎖可変領域は配列番号：３４又はその変異体である。
【００２０】
本発明のヒト化抗体又はその機能性断片のさらなる一つの好ましい実施の形態では、前記重鎖可変領域は配列番号：３５又はその変異体であり、前記軽鎖可変領域は配列番号：３７又はその変異体である。
【００２１】
本発明は、本発明の抗体又は機能性断片をコードする分離された核酸分子をさらに提供する。一つの好ましい実施の形態では、前記核酸分子は配列番号：２５−３０、３８−４２で示されるヌクレオチド配列又はその組合せを含む。
【００２２】
本発明は、前記核酸分子を含む発現ベクターおよび前記発現ベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。
【００２３】
本発明は、前記抗体又はその機能性断片を産生できる条件で本発明の上記宿主細胞を培養し、このように産生された前記抗体又はその機能性断片を回収することを含む抗ＰＤ−１抗体又はその機能性断片を産生する方法を提供する。
【００２４】
他方、本発明は治療剤と抱合する本発明の抗体又はその機能性断片を含む免疫抱合体に関する。前記治療剤としては好ましくは毒素、放射性同位体、薬物又は細胞毒性薬である。
【００２５】
本発明はさらに、本発明の抗体又はその機能性断片および薬用可能なベクターを含む薬物組成物に関する。
【００２６】
他方、本発明は、ＰＤ−１の活性を取り除き、抑制し又は低減することにより、疾患や病症を予防し又は治療するための方法において、この需要のある対象に治療有効量の本発明の抗体又はその機能性断片、核酸、発現ベクター、宿主細胞、免疫抱合体又は薬物組成物を投薬することを含む方法を提供する。そのうち、前記疾患や病症はがん、感染症又は炎症性疾患から選ばれ、前記がんは、好ましくは黒色腫、腎臓がん、前立腺がん、乳がん、結腸がん、肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚又は眼内悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域がん、胃がん、睾丸がん、子宮がん、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膣がん、陰門がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、急性骨髄性白血病と、慢性骨髄性白血病と、急性リンパ球性白血病と、慢性リンパ球性白血病とを含む慢性又は急性白血病、小児期固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎細胞がん又は尿管がん、腎盂がん、中枢神経系の贅生、原発性中枢神経系リンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストに誘発されたがんを含む環境に誘発されたがん、および前記のがんの組合せから選ばれる。前記の感染症は、好ましくはＨＩＶ、インフルエンザ、疱疹、ランブル鞭毛虫症、マラリア、リーシュマニア症、肝炎ウイルス（Ａ型、Ｂ型およびＣ型），疱疹ウイルス（例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ−１、ＨＡＶ−６、ＨＳＶ−ＩＩとＣＭＶ、エプスタイン・バーウイルス），アデノウイルス，インフルエンザウイルス，フラビウイルス，エコーウイルス，ライノウイルス，コクサッキーウイルス，コロナウイルス，呼吸器合胞体ウイルス，ムンプスウイルス，ロタウイルス，麻疹ウイルス，風疹ウイルス，パルボウイルス，ワクシニアウイルス，ＨＴＬＶウイルス，デング熱ウイルス，乳頭腫ウイルス，軟属腫ウイルス，ポリオウイルス，狂犬病ウイルス，ＪＣウイルス，アルボウイルス脳炎ウイルスというウイルスによる病原性感染症、クラミジア，リケッチア，マイコバクテリア，葡萄球菌，連鎖球菌，肺炎球菌，髄膜炎菌とｃｏｎｏｃｏｃｃｉ，クレブシエラ菌，プロテウス菌，セラチア菌，シュードモナス菌，レジオネラ菌，ジフテリア菌，サルモネラ菌，桿菌，コレラ菌，破傷風菌，ボツリヌス中毒菌，炭疽菌，ペスト菌，レプトスピラ菌，ライム病菌という細菌による病原性感染症、カンジダ（カンジダ・アルビカンス、カンジダ・クルセイ、カンジダ・グラブラタ、カンジダ・トロピカリス等），クリプトコックス・ネオフォルマンス，アスペルギルス（アスペルギルス・フミガーツス、黒色アスペルギルス等），ケカビ目属（ケカビ属、アブシディア属、リゾープス属），スポロトリクム・シェンキー，皮膚炎出芽酵母，ブラジル・パラコクシジオイデス，コクシジオイデス・イミティス，ヒストプラスマ・カプスラーツムという真菌による病原性感染症、および、赤痢アメーバ，大腸バランチジウム，ネグレリア・フォーレリ，アカントアメーバ，ランブル鞭毛虫，クリプトスポリジウム，ニューモシスティス・カリニ，三日熱マラリア原虫，バベシア・ミクロチ，トリパノソーマ・ブルーセイ，クルーズ・トリパノソーマ，ドノバン・リーシュマニア，トキソプラズマ原虫，ニッポストロンジラス・ブラジリエンシスという寄生虫による病原性感染症から選ばれ、前記炎症性疾患は、好ましくは急性散在性脳脊髄炎、アジソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、関節炎、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、セリアック病、シャーガス病、クローン病、皮膚筋炎、１型糖尿病、グッドパスチャー症候群、移植片対宿主病、グレーブス病、ギラン−バレー症候群、橋本病、高ＩｇＥ症候群、特発性血小板減少性紫斑病、紅斑性狼瘡、多発性硬化症、重症筋無力、天疱瘡、悪性貧血、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、関節リウマチ、シェーグレン症候群、側頭動脈炎、血管炎、およびヴェグナー肉芽腫症から選ばれる。
【００２７】
本発明は、本発明の抗体又はその機能性断片、核酸、発現ベクター、宿主細胞、免疫抱合体又は薬物組成物の、疾患や病症を治療するための薬物の調製への用途をさらに提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１はＳＤＳ−ＰＡＧＥによるヒト由来（ｈｕ）およびカニクイザル由来（ｃｙｎｏ）のＰＤ−１細胞外ドメインの蛋白質の大きさを示すものである。
【図２】図２はフローサイトメトリーにより測定されたビオチンで標識されたｒｈ−ＰＤ−Ｌ１とヒトＴ細胞との結合を示すものである。
【図３】図３はフローサイトメトリーにより測定されたＰＤ−Ｌ１対照、クローン１、１０、１１、５５および６４が細胞表面のＰＤ−１とリガンドＰＤ−Ｌ１との結合を阻害することを示すものである。
【図４】図４は対照抗体、クローン１、１０、１１、５５および６４とＰＤ−１および他のＣＤ２８ファミリーメンバー（ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８）との結合を示すものである。
【図５】図５はＴ細胞に対するキメラ抗体の外部刺激を検出する破傷風毒素刺激実験を示すものである。
【図６】図６はＣＤ８＋細胞因子検出キットにより検出されたヒト化抗体クローン３８、３９、４１および４８（（ｃｏｎＩｇＧ４）を対照とする）ＩＬ２の分泌レベルを示すものである。
【図７】図７は樹状細胞と組み換えされたＭＤ−ＭＡＢ−４５３細胞とをともに３日培養した後、抽出されたＴ細胞と本発明のヒト化抗ＰＤ−１抗体クローン３８、３９、４１および４８（（ｃｏｎＩｇＧ４）を対照とする）とを加えてともに３日培養して得たＧＦＰ蛍光値を示すものである。
【図８Ａ−Ｃ】図８Ａ−Ｃは本発明のヒト化抗体とヒト由来、カニクイザル由来およびマウス由来ＰＤ−１蛋白質との結合を示すものである。
【図９】図９はヒト（ｈｕｍａｎ）、カニクイザル（Ｃｙｎｏ）およびマウス（ｍｏｕｓｅ）ＰＤ−１配列の対比を示すものであり、そのうち、マウスＰＤ−１蛋白質とヒトおよびカニクイザルＰＤ−１蛋白質との主な異なる領域はフレームで標示される。
【図１０】図１０はヒト化抗体で外部からＴ細胞を刺激して増殖させる実験−破傷風抗原の記憶応答実験の結果を示すものである。
【図１１】図１１はヒト化抗体で外部からＴ細胞を刺激して増殖させる実験−ウイルスポリペプチド抗原の記憶応答実験の結果を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
別途定義されていない限り、本明細書に用いられるすべての科学技術用語は当業者が理解するものと同じ意味を有する。本分野での定義および用語については、専門家は、具体的には、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参考にすることができる。アミノ酸残基の略語は本分野で用いられる２０個の常用Ｌ−アミノ酸の一つを表す標準的３文字および／又は１文字コードである。
【００３０】
本発明は、プログラム細胞死因子１（ＰＤ−１）と結合できる抗ＰＤ−１抗体およびその機能性断片を提供する。本発明の抗体又はその機能性断片は、高親和力でＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断できること、高特異性でＰＤ−１と結合できるが、他のＣＤ２８ファミリーのメンバー（例えば、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８）と結合しないこと、および、腫瘍特異性Ｔ細胞を活性化させて、腫瘍細胞を殺傷し、ＣＤ８＋の固形腫瘍組織への進入を促進し、ＩＦＮγ等の免疫エフェクタのレベルを大きく増加させることという特徴の少なくとも一つを有する。
【００３１】
本発明は、ヒト化抗ＰＤ−１抗体およびその機能性断片をさらに提供する。前記ヒト化抗体は、免疫マウスによるマウス由来抗体をコンピュータシミュレーションにより設計し、ファージディスプレイ技術と組み合わせて得られたものであり、そしてその異なる種のＰＤ−１蛋白質との結合特性に基づいて、その結合エピトープも同定された。本発明にかかるヒト化抗ＰＤ−１抗体およびその機能性断片は上記の抗ＰＤ−１抗体およびその機能性断片の有利な特徴を有する以外、マウス由来ＰＤ−１蛋白質と相互に作用することなく、高親和力でヒト又はカニクイザルＰＤ−１蛋白質と結合する。
【００３２】
前記抗体又はその機能性断片の配列の変異体を得るために、実質的に抗体の活性に影響しない前提で、当業者は本発明の配列に対して一つ又はそれ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個、あるいはそれ以上）のアミノ酸を取り替え、添加しおよび／又は欠失させることができる。それらはいずれも本発明が保護しようとする範囲に含まれるものと見なされている。例えば、可変領域にて類似特性を有するアミノ酸を取り替える。本発明にかかる変異体の配列はその由来配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の一致性を有することができる。本発明にかかる配列一致性は配列分析ソフトウェアを用いて測定することができる。例えば、デフォルトパラメータのコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰ又はＴＢＬＡＳＴＮを用いる。
【００３３】
本発明の抗体は全長のもの（例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体）であってもよく、又は抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２又はｓｃＦｖ断片）のみを含んでもよく、又は機能に影響するために修飾されてもよい。本発明は修飾されたグリコシル化抗ＰＤ−１抗体を含む。いくつかの応用では、意図しないグリコシル化部位を除去するために修飾を行うのは有用であってもよく、又は、例えば抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）機能の抗体を増強するために、オリゴ糖にフコース部分が存在しない。他のいくつかの応用では、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を変えるために、ガラクトシル化修飾を行ってもよい。
【００３４】
本明細書に用いられる用語「機能性断片」は、特に抗体断片例えばＦｖ、ｓｃＦｖ（ｓｃが一本鎖を表す）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ−Ｆｃ断片又は二重抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、あるいは化学修飾又はリポソームにドープされることにより半減期を増加できるあらゆる断片を言い、前記化学修飾においては、例えば、ポリ（アルキレン）グリコール例えばポリエチレングリコール（「ポリエチレングリコール化、ＰＥＧ化」）（Ｆｖ−ＰＥＧ、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ、Ｆａｂ−ＰＥＧ、Ｆ（ａｂ’）２−ＰＥＧ又はＦａｂ’−ＰＥＧのポリエチレングリコール化断片と称される）（「ＰＥＧ」がポリエチレングリコールである）を添加し、前記断片はＥＧＦＲ結合活性を有する。好ましくは、前記機能性断片は、その由来抗体の重又は軽可変鎖の一部の配列から構成され又はそれらを含み、前記一部の配列はその由来抗体と同じ結合特異性および十分な親和力を保つに足り、ＰＤ−１については、好ましくは少なくともその由来抗体の親和力の１／１００に等しく、より好ましい形態では、少なくとも１／１０に等しい。このような機能性断片は少なくとも５つのアミノ酸を含み、好ましくはその由来の抗体配列の１０、１５、２５、５０および１００個の連続的なアミノ酸を含む。
【００３５】
当業者は、本発明にかかる抗ＰＤ−１抗体をコードするＤＮＡ分子をベクターにクローニングして、宿主細胞の形質転換を行うことができる。このため、本発明は、本発明にかかる抗ＰＤ−１抗体をコードするＤＮＡ分子を含む組み換えＤＮＡベクターをさらに提供する。
【００３６】
好ましくは、前記組み換えＤＮＡベクターは発現ベクターであり、当業者は前記抗体のＤＮＡ分子を発現ベクターにクローニングして、宿主細胞の形質転換を行い、発現を誘導することにより抗体を得る。本発明の発現ベクターはコードされた抗ＰＤ−１抗体の重鎖可変領域、軽鎖可変領域および／又は定常領域のＤＮＡ配列を含む。しかし、一つは重鎖可変領域と定常領域を含み、もう一つは軽鎖可変領域と定常領域を含む二種の発現ベクターをそれぞれ構築し、それらを用いて哺乳動物への同時トランスフェクションを行なってもよい。一つの好ましい実施の形態では、前記発現ベクターは、プロモータ、分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列、および、選別用の少なくとも一種の薬剤耐性遺伝子をさらに含む。
【００３７】
本発明にかかる宿主細胞は原核宿主細胞、真核宿主細胞又はファージであってもよい。前記原核宿主細胞は大腸菌、枯草菌、ストレプトミセス又はプロテウス・ミラビリス等であってもよい。前記真核宿主細胞は、例えばピキア・パストリス，サッカロマイセス・セレヴィシエ，分裂酵母，トリコデルマ等の真菌、例えばツマジロクサヨトウ等の昆虫の細胞、例えばタバコ等の植物の細胞、例えばＢＨＫ細胞，ＣＨＯ細胞，ＣＯＳ細胞，骨髄腫細胞等の哺乳動物細胞であってもよい。いくつかの実施の形態では、本発明にかかる宿主細胞は好ましくは哺乳動物細胞であり、より好ましくはＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞又はＣＯＳ細胞である。
【００３８】
本明細書に用いられる用語「薬物組成物」は、ある特定の目的を実現するために組み合せられた少なくとも一種の薬物および任意の薬用可能なベクター又は補助材料の組合せを表す。いくつかの実施の形態では、前記薬物組成物は、本発明の目的を実現するためにともに作用できれば、時間的および／又は空間的に分離された組合せを含む。例えば、前記薬物組成物に含まれる成分（例えば、本発明による抗体、核酸分子、核酸分子組合せおよび／又は抱合体）は全体として対象に投薬されてもよく、又は別々に対象に投薬されてもよい。前記薬物組成物に含まれる成分は別々に対象に投薬される場合、前記成分は同時に又は順に対象に投薬されてもよい。好ましくは、前記薬用可能なベクターは水、緩衝水溶液、等張食塩溶液、例えばＰＢＳ（リン酸塩緩衝液）、ブドウ糖、マンニトール、右旋性ブドウ糖、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、炭酸マグネシウム、０．３％のグリセリン、ヒアルロン酸、エタノール、又は、ポリアルキレングリコール例えばポリプロピレングリコール、トリグリセリド等である。用いられる薬用可能なベクターのタイプは、特に本発明による組成物は経口投薬、経鼻投薬、皮内投薬、皮下投薬、筋肉内投薬又は静脈投薬のいずれのために調合されるものであるかに依存している。本発明による組成物は、添加剤として湿潤剤、乳化剤又は緩衝液物質を含んでもよい。
【００３９】
本発明による薬物組成物はあらゆる適切な手段で投薬でき、例えば、経口投薬、経鼻投薬、皮内投薬、皮下投薬、筋肉内投薬又は静脈投薬のいずれでもよい。
【００４０】
関連の面では、本発明は、抗ＰＤ−１抗体と第二治療剤との組合せである薬物組成物を提供する。一つの実施の形態では、前記第二治療剤は有利に抗ＰＤ−１抗体と組み合せる任意の試薬である。有利に抗ＰＤ−１抗体と組み合せ得る例示的な試薬は、ＰＤ−１の活性を抑制する他の試薬（他の抗体又はその抗原結合断片、ペプチド阻害剤、小分子拮抗剤等を含む）および／又はＰＤ−１の上流又は下流シグナル伝達に干渉する試薬を含むが、これらに限定されるものではない。
【００４１】
本明細書に用いられる用語「ＰＤ−１の活性を取り除き、抑制し又は低減することにより、疾患や病症を予防し又は治療する」は、ＰＤ−１の発現による又はＰＤ−１の発現を症状／特徴とする疾患や病症を表すことを旨とする。いくつかの実施の形態では、前記疾患や病症はがん又は感染症から選ばれる。前記がんは、肺がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膀胱がん、結腸がん、乳腺がん、神経膠腫、腎臓がん、胃がん、食道がん、口腔扁平細胞がんおよび頭頸部がんを含むが、これらに限定されるものではない。前記感染症は、ＨＩＶウイルス感染およびＢ型肝炎ウイルス感染を含むが、これらに限定されるものではない。
【００４２】
本明細書に用いられる「治療有効量」は、投薬対象に対して良好な効果を示すに足る投薬量を言う。実際の投薬量および投薬の速度と時間は、被治療者の自分の状況および重症度に依存している。治療の処方（例えば、投薬量の決定等）は、最終的に一般医および他の医者の責任であり、それに基づいて決定され、一般的には、治療される疾患、患者自分の状況、送達部位、投薬方法、および、医者にとって既知の他の要因が考えられている。
【００４３】
本明細書に用いられる用語「対象」は哺乳動物例えば人類をいうが、他の動物、例えば野生動物（例えば、アオサギ、コウノトリ、ツル等）、家畜（例えば、アヒル、ガチョウ等）又は実験動物（例えば、オランウータン、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモット等）であってもよい。
【００４４】
本発明のいくつかの好ましい実施の形態と側面を証明してさらに解釈するために、下記実施例を提供するが、その範囲を制限するものとして理解されるべきではない。
実施例実施例１．ヒトＰＤ１細胞外ドメインの真核発現プラスミドへのクローニング
【００４５】
Ｔｒｉｚｏｌ  ＲＮＡ抽出キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、ヒト末梢血球（北京市赤十字血液センター）から総ＲＮＡを抽出し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの逆転写キットを使用してｃＤＮＡを得、当該ｃＤＮＡをテンプレートとし、上流プライマーを５’−ＧＴＡＣＧＣＴＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＴＣＣＣＡＣＡＧＧＣ−‘３（配列番号．３１）にし、下流プライマーを５’−ＧＡＴＣＣＴＣＧＡＧＣＣＡＣＣＡＧＧＧＴＴＴＧＧＡＡＣＴＧ−‘３（配列番号．３２）にして、ＰＤ１細胞外断片に対してＰＣＲ増幅を行う。増幅生成物はＮｈｅ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉにより二重酵素切断された後、ｐＣＤＮＡ３．１の真核発現プラスミド系にクローニングする。このプラスミドで２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）へのトランスフェクションを行なった３日後、上澄み液を収集して培養し、ｈ−ＰＤ１を純化する。このようにして、カニクイザルの末梢血球からも総ＲＮＡを抽出し、それによるｃＤＮＡを真核発現系にクローニングした。
【００４６】
図１に示されるように、グリコシル化等の修飾のため、ヒト由来（ｈｕ）およびカニクイザル由来（ｃｙｎｏ）のＰＤ−１細胞外ドメインの蛋白質の大きさは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてクーマシーブリリアントブルーで染色した後、５０Ｋダルトン前後として示された。
実施例２．細胞にけるＰＤ−１とリガンドＰＤ−Ｌ１との結合の検出１．Ｔ細胞のヒト末梢血球からの分離
【００４７】
末梢血球（北京血液研究所）懸濁液をナイロンウールカラム（北京海徳生物技術公司）に通過させると、Ｂ細胞、プラズマ細胞、単核細胞および若干の補助細胞は選択的にナイロンウールに粘着した一方、大部分のＴ細胞はナイロンウールカラムを通過したことにより、Ｔ細胞を大量に含む群体を得る。その操作を簡単に説明すると、５０ｍｌのガラス注射器からピストンを除去し、注射器ヘッドにクリップ付きホースを外嵌する。ナイロンウールを梳いて注射器内に充填する。注射器をホルダに固定し、ナイロンウールを前処理するために、３７℃のＲＰＭＩ細胞培養液を注入する。バルブを閉じた３０分後、バルブを開けて細胞培養液を排出する。分離しようとする細胞液を予め加熱されたＲＰＭＩ培養液により適切な濃度、即ち約５．００×１０７個の細胞／ｍｌに希釈する。ナイロンウールカラムを浸漬するように、細胞液を注射器内に注入する。注射器に蓋を締めて、３７℃で１時間インキュベートする。下口を開けて徐々に放流し（１ドロップ／ｍｉｎ）、遠心管に収集する。１０００×ｇで１０分間遠心して、所望のＴリンパ球を得た。
２．ビオチンによるｒｈ−ＰＤ−Ｌ１組み換え蛋白質に対する標識
【００４８】
義翹神州生物公司から購入された１００μｇのｒｈ−ＰＤ−Ｌ１組み換え蛋白質とＤＭＳＯに溶解したビオチンであるアミノカプロン酸−ＮＨＳ（Ｔｈｅｒｍｏ）とを１：４のモル比で混合し、室温で１時間静置し、ビオチンで標識されたｒｈ−ＰＤ−Ｌ１と遊離ビオチンを分離するために、反応混合物をＧ２５ゲルカラム（Ｔｈｅｒｍｏ）に通過させる。３．ビオチンで標識されたｒｈ−ＰＤ−Ｌ１とヒトＴ細胞との結合
【００４９】
異なる濃度のビオチンで標識されたｒｈ−ＰＤ−Ｌ１組み換え蛋白質と１０５の分離されたＴ細胞とを混合し、４℃で１５分間培養する。ＰＢＳで３回洗浄した後、０．２μｇ／ｍｌになるまでストレプトアビジンであるアロフィコシアニン（Ｔｈｅｒｍｏ）（ＳＡ−ＡＰＣ）を加え、そして４℃で２０分間培養する。ＰＢＳで３回洗浄した後、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｄｉｃｋｓｏｎ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメトリーにて６６０ｎｍで検出する。図２に示される結果から、ビオチンで標識されたＰＤ−Ｌ１蛋白質はＴ細胞と結合できることがわかった。
実施例３．抗ｒｈ−ＰＤ−１抗体の調製１．動物の免疫
【００５０】
濃度１ｍｇ／ｍｌのｒｈ−ＰＤ−１組み換え蛋白質１０ｕｇを抗原として等量の免疫アジュバント（フロインドアジュバント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））と混合し、生後６週間の雌性ＦＶＢマウス３匹に対して皮下免疫を行う。初回の免疫を行なった後、週毎に同じ投薬量の追加免疫を一回行う。
２．細胞の融合
【００５１】
最終回の追加免疫を行なった後、マウスの高股のリンパ節を取って生理食塩水において粉砕して、Ｂ細胞を大量に含む懸濁液を取り、従来の方法に従って電気トランスフェクション（ＢＴＸ社の電気トランスフェクション装置のハンドブックを参照）を行なってＳＰ２／０細胞と融合させる。融合細胞を、ＨＡＴを含むＲＰＭＩ−１６４０完全培地（Ｓｉｇｍａ）にて５％のＣＯ２、３７℃という条件で培養する。
実施例４．リガンドと受容体の遮断実験
【００５２】
２００００種のモノクローナルハイブリドーマ細胞から、酵素標識（Ｅｌｉｓａ）反応により、分泌した抗体がＰＤ−１蛋白質と結合できる１２２０種のクローンを選別する。この１２２０種の抗体のうち、五種の抗体はビオチンで標識されたＰＤ−Ｌ１とＴ細胞におけるＰＤ−１受容体との結合を多かれ少なかれ抑制できる。
【００５３】
上記五種の抗体（１ｕｇ／ｍｌ）をビオチンで標識されたｒｈ−ＰＤ−Ｌ１（濃度）３１２ｎｇ／ｍｌと混合し、室温で２０分間培養する。そして、混合物と分離されたＴ細胞とを４℃で１５分間培養し、生理食塩水で３回洗浄した後、０．２μｇ／ｍｌのＳＡ−ＡＰＣを加えて４℃で１５分間培養する。生理食塩水で３回洗浄した後、ｒｈ−ＰＤ−Ｌ１とＴ細胞表面のＰＤ−１受容体との結合を抑制できるか否かを検証するために、サンプルをＢＤ社のフローサイトメトリーにより検出する。
【００５４】
図３から分かるように、クローン１、１０、１１は細胞表面のＰＤ−１とリガンドＰＤ−Ｌ１との結合を阻害できる。一方、クローン５５および６４では、結合がわずかに抑制された。
実施例５．他のＣＤ２８ファミリー蛋白質との結合
【００５５】
クローン１、１０、１１、５５および６４の候補抗体の結合特異性をさらに検証するために、１μｇ／ｍｌのｒｈ−ＰＤ−１又は他のＣＤ２８ファミリーメンバー蛋白質ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８（Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）を９６ウェル酵素標識プレートにおける０．０５ＭｐＨ９炭酸塩被覆緩衝液に置き、４℃で一夜静置する。翌日、ウェル内の溶液を捨て、洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．５％  ＴＷＥＥＮ）で３回洗浄する。そして、３％のＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を加えて２０分間遮断する。洗浄緩衝液で３回洗浄した後、１μｇ／ｍｌの候補抗体１００ｕｌを加え、室温で１時間培養した後、洗浄緩衝液で３回洗い流し、洗浄緩衝液を用いて１：１００００倍でＨＲＰ架橋ヒツジ抗マウス抗体（Ｊｓｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を希釈し、室温で１時間培養し、洗浄緩衝液で３回洗浄した後、５０μｌのＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）基質溶液を加えて顕色させ、室温で１０分間反応させた後、０．５Ｍの硫酸溶液２５ｕｌにより反応を終了し、４５０ｎｍでの吸光度を読み取る。
【００５６】
図４から分かるように、すべてのテストされた候補抗体はｒｈ−ＰＤ−１を識別して結合したが、いずれも他のＣＤ２８ファミリーのメンバーを識別しなかった。
実施例６．候補抗体の可変領域配列
【００５７】
候補ハイブリドーマ細胞を全量１０７個に培養し、１０００ｒｐｍで１０分間遠心して細胞を収集し、そしてＴｒｉｚｏｌキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により総ＲＮＡを抽出する。前記ＲＮＡをテンプレートとして第一鎖ｃＤＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）を合成した後、第一鎖ｃＤＮＡを後続テンプレートとして、ハイブリドーマ細胞に対応する可変領域ＤＮＡ配列を増幅させる。増幅反応に用いられるプライマー配列は抗体可変領域の第一フレームワーク領域および定常領域と相補している（Ｌａｒｒｉｃｋ，Ｊ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３２，１２１−１２８およびＣｏｌｏｍａ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１１，１５２−１５６者ら）。５０μｌの反応系に、それぞれｃＤＮＡ１μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液５μｌ、上流と下流プライマーの各々１μｌ（２５ｐｍｏｌ）、ｄＮＴＰ１μｌ、２５ｍｍｏｌＰＬのＭｇＣｌ２１μｌ、およびＨ２Ｏ３９μｌを加え、９５℃で１０ｍｉｎ予備変性させ、Ｔａｑ酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１μｌを加え、温度サイクルによりＰＣＲ増幅を行う。反応条件としては、９４℃で１ｍｉｎ変性させ、５８℃で１ｍｉｎアニーリングし、７２℃で１１５ｍｉｎ延伸させるというサイクルを合計３０回行い、そして７２℃で１０ｍｉｎ保温することである。
【００５８】
増幅生成物に対して配列決定を行なって得たハイブリドーマクローン１、１０および１１の重鎖と軽鎖可変領域配列は以下のとおりである。
0006681327.tif 000005
0006681327.tif 000006
0006681327.tif 000007
実施例７．キメラ抗体発現ベクターの構築
【００５９】
ヒト血球（北京血液研究所）から重鎖定常領域Ｆｃ断片および軽鎖ｋ／£定常領域をクローニングし、ｐＣＤＮＡ３．１プラスミド（Ｗａｌｌｓ  ＭＡ，Ｈｓｉａｏ  ＨおよびＨａｒｒｉｓ  ＬＪ（１９９３），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．１２  ２９２１−２９２９を参照）に連結させて組み換えを行う。実施例６にかかる重鎖および軽鎖配列断片はＧｅｎｓｃｒｉｐｔ社による合成のものであり、重鎖はＸｈｏ  ＩおよびＡｇｅ  Ｉにより酵素切断され、軽鎖断片はＳｍａ  ＩおよびＤｒａ  ＩＩＩにより酵素切断された後、対応するように組み換えされたｐＣＤＮＡ３．１プラスミドに連結させ、そして配列決定によりクローンのＤＮＡ配列を確定する。後続の実験材料はいずれもこのシリーズのプラスミドで細胞へのトランスフェクションを行なってから、純化して得られたものである。
実施例８．キメラ抗体によるＴ細胞機能への外部刺激実験−破傷風毒素刺激試験
【００６０】
新鮮に調製されたＰＢＭＣを９６ウェルフラットプレートに敷き、一夜培養した後、異なる濃度の抗体および１００ｎｇ／ｍｌの破傷風毒素（ＴＴ）（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加える。三日後に上澄み液を取り、そしてＲ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ社のＩＦＮγキットを使用してＥｌｉｓａにより上澄み液におけるＩＦＮγの含有量を検出する。図５の結果から分かるように、ＰＤ−１信号を遮断した後、ＴＴに刺激されて活性化した免疫細胞が分泌した細胞因子は大きく増加した。また、候補抗体の力価は出願番号：２００９８０１４７０５９．０におけるＢｉｏｌｅｇｅｎｄ社から購入されたＥＨ１２．２Ｈ７よりも高い。
実施例９．異なる抗体の軽鎖と重鎖の交換後のＰＤ−１との相互作用
【００６１】
抗体１、１０の軽鎖と重鎖を相互に新たに組み合せて、Ｈ１Ｌ１０（重鎖１と軽鎖１０）およびＨ１０Ｌ１（重鎖１０と軽鎖１）を得る。実施例７に記載されるように、新たに組み合せられた抗体を得、そして元の抗体１（重鎖１、軽鎖１）および元の抗体１０（重鎖１０、軽鎖１０）とともにＥｌｉｓａ実験を行い、産生されたＥＣ５０の結果は下表に示される。
【表４】
0006681327.tif 000008
結果から、新たに組み合せられて産生された抗体は依然として効率的にＰＤ−１蛋白質と結合できることが分かった。実施例１０．抗体のヒト化組み換え
【００６２】
上記によるハイブリドーマ細胞が分泌した抗体の可変領域配列に基づいて、ヒト化組み換えを行う。簡単に言えば、ヒト化組み換え過程は、Ａ）各ハイブリドーマ細胞が分泌した抗体の遺伝子配列をヒト胎児系抗体の遺伝子配列と対比して、相同性の高い配列を見出すこと、Ｂ）ＨＬＡ−ＤＲとの親和性を分析して検討し、親和力の低いヒト胎児系フレームワーク配列を選択すること、および、Ｃ）コンピュータシミュレーション技術を利用して、分子ドッキングにより可変領域およびその周辺のフレームワークアミノ酸配列を分析し、その三次元的な結合方式を検討することを含む。静電力、ファン・デル・ワールス力、親疎水性およびエントロピーを計算することにより、各ハイブリドーマ細胞が分泌した抗体の遺伝子配列のうちＰＤ−１と作用できスペースフレームを維持する肝心なアミノ酸個体を分析し、それを選択されたヒト胎児系遺伝子フレームワークにグラフトし、これに基づいて、保つ必要があるフレームワーク領域のアミノ酸部位を標示し、ランダムプライマーを合成し、ファージライブラリーを作成し、ヒト化抗体ライブラリーを選別する（Ｐｉｎｉ，Ａ．等，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）．Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  ａ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ：ＨＵＭＡＮ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＷＩＴＨ  ＳＵＢＮＡＮＯＭＯＬＡＲ  ＡＦＦＩＮＩＴＹ  ＡＧＡＩＮＳＴ  Ａ  ＭＡＲＫＥＲ  ＯＦ  ＡＮＧＩＯＧＥＮＥＳＩＳ  ＥＬＵＴＥＤ  ＦＲＯＭ  Ａ  ＴＷＯ−ＤＩＭＥＮＳＩＯＮＡＬ  ＧＥＬ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７３（３４）：２１７６９−２１７７６）。これに基づいて、下記複数のヒト化抗体が得られた。下記クローンが含まれ、そのうち３８、３９および４１の軽鎖配列が同様であり、３９と４８の重鎖配列が同様である。
３８重鎖
0006681327.tif 000009
３８軽鎖
0006681327.tif 000010
３９重鎖
0006681327.tif 000011
３９軽鎖
0006681327.tif 000012
４１重鎖
0006681327.tif 000013
４１軽鎖
0006681327.tif 000014
４８重鎖
0006681327.tif 000015
４８軽鎖 
0006681327.tif 000016
実施例１１．Ｔ細胞に対するヒト型抗体の外部刺激
【００６３】
新鮮に調製されたＰＢＭＣ（北京血液研究所）を９６ウェルフラットプレートに敷き、一夜培養した後、１０μｇ／ｍｌの抗体および１００ｎｇ／ｍｌの破傷風毒素（ＴＴ）を加え、３日培養した後に上澄み液を収集し、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のＬｕｍｉｎｅｘ装置およびＥＭＤ社のＣＤ８＋細胞因子検出キットで、ヒト型抗体クローン３８、３９、４１および４８（（ｃｏｎＩｇＧ４）を対照とする）ＩＬ２の分泌レベルを検出する。結果（図６を参照）から、ヒト型抗体はいずれもＴ細胞の機能を刺激できることが分かった。
実施例１２．Ｔ細胞に対するヒト型抗体の外部刺激に起因した腫瘍細胞に対する殺傷の可能性
【００６４】
ＰＤ−Ｌ１蛋白質を発現するスローウイルス（Ｑｉａｇｅｎ）でＭＤ−ＭＡＢ−４５３細胞に感染させて、ＰＤ−Ｌ１を安定的に発現するＭＤ−ＭＡＢ−４５３細胞系を得、これに基づいて、さらにＧＦＰ遺伝子を導入し、ＧＦＰ蛋白質を安定的に発現させる。新鮮なヒト末梢血球から樹状細胞（ＤＣ）を抽出し、９６ウェルプレートにおいて、この細胞を３００個／ウェルとして上記の組み換えられたＭＤ−ＭＡＢ−４５３細胞（３００個／ウェル）とともに３日培養した後、抽出されたＴ細胞（１０００個／ウェル）および１０μｇ／ｍｌのヒト型抗ＰＤ−１抗体クローン３８、３９、４１および４８（（ｃｏｎＩｇＧ４）を対照とする）を加え、さらにともに３日培養し、ＧＦＰ蛍光値を読み取る。結果（図７を参照）から、ヒト型抗体はいずれもＴ細胞を刺激して腫瘍細胞を殺傷させたことが分かった。
実施例１３．ヒト化抗体と異なる種のＰＤ−１蛋白質との結合
【００６５】
１μｇ／ｍｌの上記ヒト由来ＰＤ−１、カニクイザルＰＤ−１およびマウス由来ＰＤ−１（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌより購入）をｐＨ９の炭酸塩被覆緩衝液０．０５Ｍに希釈し、４℃で一夜静置する。翌日、ウェル内の溶液を捨て、洗浄緩衝液で３回洗浄する。そして、３％のＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を加えて２０分間遮断する。洗浄緩衝液で３回洗浄した後に希釈された異なる濃度の候補抗体１００μｌを加え、室温で１時間培養した後に洗浄緩衝液で３回洗い流し、洗浄緩衝液を用いて１：１００００倍でＨＲＰ抱合ヒツジ抗ヒト抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を希釈して室温で１時間培養し、洗浄緩衝液で３回洗い流した後、５０μｌのＴＭＢ基質溶液を加えて顕色させ、室温で１０分間反応させた後、０．５Ｍの硫酸溶液２５μｌにより反応を終了し、４５０ｎｍでの吸光度を読み取る。結果（図８Ａ、Ｂ、Ｃ）から、各クローンは類似した親和力でヒト又はカニクイザルＰＤ−１蛋白質と結合したが、いずれもマウス由来ＰＤ−１蛋白質と相互に作用しなかった。
【００６６】
ヒト、カニクイザルおよびマウスＰＤ−１配列を対比する（図９を参照して、そのうち、マウスＰＤ−１とヒトおよびカニクイザルＰＤ−１蛋白質との主な異なる領域はフレームで標示される）。実験から、ＰＤ−１蛋白質に対する候補抗体のエピトープはこのいくつかの領域に存在していることが実証された。
実施例１４．ヒト化抗体で外部からＴ細胞を刺激して増殖させる実験−破傷風抗原の記憶応答実験
【００６７】
新鮮に調製されたＰＢＭＣ（北京血液研究所）を９６ウェルフラットプレートに敷き、一夜培養した後にＣＦＳＥで標識し、１０ｕｇ／ｍｌのヒト化抗体（３８、３９、４１および４８）および１００ｎｇ／ｍｌの破傷風毒素（ＴＴ）（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加える。６、８および１０日後に、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を用いて、ＣＳＦＥの希釈倍数によりＴ細胞の増値に対して定量分析を行う。図１０の結果から、対照となるＩｇＧに比べて、ＰＤ−１信号を遮断しＴＴによる刺激を誘導して活性化させた免疫細胞はさらに分裂し増殖したことが分かった。
実施例１５．ヒト化抗体で外部からＴ細胞を刺激して増殖させる実験−ウイルスポリペプチド抗原の記憶応答実験
【００６８】
新鮮に調製されたＰＢＭＣ（北京血液研究所）を９６ウェルフラットプレートに敷き、一夜培養した後にＣＦＳＥで標識し、濃度１０ｕｇ／ｍｌのヒト化抗体（３８、３９、４１および４８）および１ｕｇ／ｍｌのＣＥＦポリペプチド混合物（ＣＭＶ、ＥＢＶおよびＩｎｆｌｕｅｎｚａ）を加える。６、８および１０日後に、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を用いて、ＣＳＦＥの希釈倍数によりＴ細胞の増値に対して定量分析を行う。図１１の結果から、参照となるＩｇＧに比べて、ＰＤ−１信号を遮断しＣＥＦ混合ポリペプチドによる刺激を誘導して活性化させた免疫細胞はさらに分裂し増殖したことが分かった。
【図１】
0006681327.tif 000017
【図２】
0006681327.tif 000018
【図３】
0006681327.tif 000019
【図４】
0006681327.tif 000020
【図５】
0006681327.tif 000021
【図６】
0006681327.tif 000022
【図７】
0006681327.tif 000023
【図８Ａ】
0006681327.tif 000024
【図８Ｂ】
0006681327.tif 000025
【図８Ｃ】
0006681327.tif 000026
【図９】
0006681327.tif 000027
【図１０】
0006681327.tif 000028
【図１１】
0006681327.tif 000029
【配列表】
0006681327000001.app