(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的タンパク質に対する特異的認識空間を有する分子インプリントポリマーを製造するための方法であって、
上記標的タンパク質を構成する分子の反応性基（１）を介して、末端にビニルモノマー基を有し且つ末端以外の部分に切断性基（１）を有する機能性モノマー（Ｉ）を複数結合させる工程（ここで、上記切断性基（１）は、ジスルフィド結合基、イミノ結合基、ボロン酸ｃｉｓジオールエステル基、またはカルボン酸エステル基を示す）；
上記標的タンパク質を構成する分子の反応性基（２）を介して、末端にビニルモノマー基を有し且つ末端以外の部分に切断性基（２）を有する機能性モノマー（ＩＩ）を複数結合させる工程（ここで、上記切断性基（２）は、ジスルフィド結合基、イミノ結合基、ボロン酸ｃｉｓジオールエステル基、またはカルボン酸エステル基であって、上記切断性基（１）とは異なる基を示す）；
基材上に自己組織化単分子膜を形成する工程；
上記自己組織化単分子膜の表面へ、上記標的タンパク質を結合させる工程；
ビニルモノマーを添加し、上記機能性モノマー（Ｉ）および上記機能性モノマー（ＩＩ）のビニルモノマー基と共重合させる工程；
少なくとも上記切断性基（１）および切断性基（２）を切断することにより、上記標的タンパク質を除去する工程；
上記切断性基（１）を切断することにより生成する基に、上記反応性基（１）と相互作用するポストインプリンティング化合物を複数結合させるか、または、上記切断性基（２）を切断することにより生成する基に、上記反応性基（２）と相互作用するポストインプリンティング化合物を複数結合させる工程；および、
上記切断性基（１）を切断することにより生成する基または上記切断性基（２）を切断することにより生成する基であって、上記ポストインプリンティング化合物を結合させなかった基に、蛍光レポーター化合物を複数結合させる工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
上記反応性基（１）または反応性基（２）としてアミノ基を利用し、当該アミノ基に２−イミノチオランを反応させることによりチオール基を導入し、当該チオール基に上記機能性モノマー（Ｉ）または機能性モノマー（ＩＩ）を結合させる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
特異的認識空間に挿入される標的タンパク質を構成するアミノ酸残基の反応性基（１）または反応性基（２）と相互作用するポストインプリンティング化合物が特異的認識空間内に複数導入されており、且つ、
蛍光レポーター化合物が特異的認識空間内に複数導入されていることを特徴とする、標的タンパク質に対する特異的認識空間を有する分子インプリントポリマー。
【請求項４】
ベース基板、表面プラズモン共鳴光を発生し得る金属からなる金属層、消光抑制層をこの順で含み、
上記ベース基板、金属層および消光抑制層の表面には複数の凹部からなる周期構造が形成されており、
上記周期構造上に、請求項３に記載の分子インプリントポリマーが形成されていることを特徴とするプラズモニックチップ。
【請求項５】
直径２ｍｍ以上、６ｍｍ以下の円形孔を通過可能な形状を有する請求項４に記載のプラズモニックチップ。
【請求項６】
試料中における上記標的タンパク質を検出する方法であって、
請求項３に記載の分子インプリントポリマー、または請求項４もしくは請求項５に記載のプラズモニックチップの分子インプリントポリマーと、上記試料を接触させる工程、および、
上記分子インプリントポリマーと上記試料との接触による蛍光強度の変化を測定する工程を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的タンパク質に対する選択性と感度が極めて高い特異的認識空間を有する分子インプリントポリマーを製造するための方法、標的タンパク質に対する選択性と感度が極めて高い特異的認識空間を有する分子インプリントポリマー、当該分子インプリントポリマーを含むプラズモニックチップ、および、当該分子インプリントポリマーを用いて標的タンパク質を検出する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体内では、様々な情報伝達物質が細胞間における情報の伝達などを媒介し、生体の恒常性維持に寄与している。情報伝達物質としては、カルシウムイオンや一酸化窒素といった無機化合物やホルモンなどの低分子有機化合物の他、高分子化合物であるタンパク質もある。また、がんマーカーに代表されるように、ある特定の疾患の進行に伴って増加する生体因子が存在し、例えばそのような生体因子の血中濃度を測定し、特定の疾患の有無や進行度合いを診断することが行われている。さらに、感染症などにおいては、その病原因子に特異的な抗体が増加する。よって、生体試料におけるタンパク質などの生体内分子の有無や量を検出することは、非常に有用である。
【０００３】
生体内分子の主な検出法としてはＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）が挙げられる。ＥＬＩＳＡは、検出すべき生体内分子に特異的な抗体を固定化し、試料を添加した後、抗体に結合した生体内分子に酵素標識した二次抗体を結合させ、抗体−標的生体内分子−酵素標識抗体の複合体を検出する方法である。その他、金微小電極を自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）で修飾し、その表面に抗コルチゾール抗体を結合させたセンサーが開発されている（非特許文献１，２）。何れにせよ、従来は、生体内分子の検出にあたり抗体や酵素を用いるのが主流であった。
【０００４】
しかし抗体や酵素には、その製造や単離に高コストがかかり、また、不安定であることから保存が難しく、製品化に難があるといった問題がある。
【０００５】
そこで、生体がもつ緻密な分子認識能を模倣した人工分子認識材料創製法である分子インプリンティング法（ＭＩ法）が注目を集めている。ＭＩ法は、検出すべき標的分子の存在下でモノマーを重合させ、得られたポリマーから標的分子を除去することにより、標的分子に特異的な認識空間を形成することを基本とする。また、かかる特異的認識空間の内部または近辺に蛍光レポーター化合物を導入し、特異的認識空間と標的分子との相互作用に伴う蛍光強度の変化により標的分子を検出する技術もある。
【０００６】
例えば特許文献１には、分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）膜の特異的認識空間内またはその付近にレポーター分子を結合させている。その製造方法として、標的分子と活性化レポーター分子との複合体と特異的認識空間とを相互作用させ、特異的認識空間またはその近辺にレポーター分子を結合させる方法が記載されている。しかし、蛍光化合物などのレポーター分子が特異的認識空間の内部に存在する場合と外部に存在する場合とでは、標的分子の検出感度が大きく異なる。
【０００７】
そこで本発明者らは、蛍光レポーター化合物をＭＩＰ膜の特異的認識空間の内部に結合させる技術を開発してきた。
【０００８】
例えば非特許文献３には、標的タンパク質であるリゾチームと相互作用する（｛［２−（２−メタクリルアミド）エチルジチオ］エチルカルバモイル｝メトキシ）酢酸（ＭＤＴＡ）をモノマーの一つとして用い、リゾチームの存在下で共重合することにより特異的認識空間内にチオール基を導入し、当該チオール基を介して蛍光レポーター化合物を導入する技術が開示されている。
【０００９】
また、非特許文献４には、ＭＩＰ膜の特異的認識空間外の反応性基を選択的にブロックした後、特異的認識空間内の反応性基に蛍光レポーター化合物を結合させる技術が開示されている。
【００１０】
さらに非特許文献５には、特異的認識空間内に蛍光分子を一つだけ導入する技術が開示されている。
【００１１】
また、本発明者らは、メタクリル酸など標的分子に特異的かつ可逆的に結合する分子と、ポルフィリン亜鉛錯体など標的分子と相互作用するものであって脱着または交換可能な分子を有する、シンコニジンなどの標的分子の分子認識ポリマーを開発している（特許文献２）。
【００１２】
また、通常の蛍光顕微鏡を用いて蛍光の変化を観察する場合、特に蛍光の変化により夾雑物の多い生体試料などを分析する場合には、より高感度な測定が必要とされる。そこで、表面プラズモン共鳴を利用して、蛍光を増強する技術が開発されている（特許文献３など）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開２００７−５２０７００号公報
【特許文献２】国際公開第２００５／１０８４４３号パンフレット
【特許文献３】特開２００８−２８６７７８号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｓｕｎｉｌ  Ｋ．Ａｒｙａら，Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ，２０１０，２５（１０），ｐｐ．２２９６−２３０１
【非特許文献２】Ｃｒｕｚ  ＡＦら，Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ，２０１４，６２，ｐｐ．２４９−２５４
【非特許文献３】Ｈｉｒｏｂｕｍｉ  Ｓｕｎａｙａｍａ，Ｔｏｓｈｉｆｕｍｉ  Ｔａｋｅｕｃｈｉ，ＡＣＳ  Ａｐｐｌ．Ｍａｔｅｒ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，２０１４，６，ｐｐ．２０００３−２０００９
【非特許文献４】Ｈｉｒｏｂｕｍｉ  Ｓｕｎａｙａｍａ，Ｔｏｏｒｕ  Ｏｏｙａ，Ｔｏｓｈｉｆｕｍｉ  Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ，２０１４，５０，ｐｐ．１３４７−１３４９
【非特許文献５】Ｓｕｇａ，Ｙ．，Ｓｕｎａｙａｍａ，Ｈ．，Ｏｏｙａ，Ｔ．，Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｔ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ，２０１３，４９，ｐｐ．８４５０−８４５２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
上述したように、ＭＩＰ膜の特異的認識空間の内部に蛍光レポーター化合物を結合させる技術は開発されている。しかし、標的分子に対する選択性や感度をより一層向上させることが求められている。
【００１６】
そこで本発明は、標的タンパク質に対する選択性と感度が極めて高い特異的認識空間を有する分子インプリントポリマーを製造するための方法、標的タンパク質に対する選択性と感度が極めて高い特異的認識空間を有する分子インプリントポリマー、当該分子インプリントポリマーを含むプラズモニックチップ、および、当該分子インプリントポリマーを用いて標的タンパク質を検出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、標的タンパク質を構成するアミノ酸残基の反応性基を介して異なる切断性基を有する２種の機能性モノマーをそれぞれ複数結合させた上で、基材上で共重合することにより分子インプリントポリマーを作製した後、切断性基の切断により生じる２種の官能基の一方に、利用したアミノ酸残基の反応性基と相互作用する基を有するポストインプリンティング化合物を複数結合させれば、分子インプリントポリマーの特異的認識空間の標的タンパク質に対する選択性と親和性が顕著に向上することを見出した。また、切断性基の切断により生じる他方の官能基に複数の蛍光レポーター化合物を結合させ、特異的認識空間内のみに正確に導入することで、標的タンパク質の検出感度が顕著に高まることも見出して、本発明を完成した。
【００１８】
以下、本発明を示す。
【００１９】
［１］  標的タンパク質に対する特異的認識空間を有する分子インプリントポリマーを製造するための方法であって、
上記標的タンパク質を構成する分子の反応性基（１）を介して、末端にビニルモノマー基を有し且つ末端以外の部分に切断性基（１）を有する機能性モノマー（Ｉ）を複数結合させる工程（ここで、上記切断性基（１）は、ジスルフィド結合基、イミノ結合基、ボロン酸ｃｉｓジオールエステル基、またはカルボン酸エステル基を示す）；
上記標的タンパク質を構成する分子の反応性基（２）を介して、末端にビニルモノマー基を有し且つ末端以外の部分に切断性基（２）を有する機能性モノマー（ＩＩ）を複数結合させる工程（ここで、上記切断性基（２）は、ジスルフィド結合基、イミノ結合基、ボロン酸ｃｉｓジオールエステル基、またはカルボン酸エステル基であって、上記切断性基（１）とは異なる基を示す）；
基材上に自己組織化単分子膜を形成する工程；
上記自己組織化単分子膜の表面へ、上記標的タンパク質を結合させる工程；
ビニルモノマーを添加し、上記機能性モノマー（Ｉ）および上記機能性モノマー（ＩＩ）のビニルモノマー基と共重合させる工程；
少なくとも上記切断性基（１）および切断性基（２）を切断することにより、上記標的タンパク質を除去する工程；
上記切断性基（１）を切断することにより生成する基に、上記反応性基（１）と相互作用するポストインプリンティング化合物を複数結合させるか、または、上記切断性基（２）を切断することにより生成する基に、上記反応性基（２）と相互作用するポストインプリンティング化合物を複数結合させる工程；および、
上記切断性基（１）を切断することにより生成する基または上記切断性基（２）を切断することにより生成する基であって、上記ポストインプリンティング化合物を結合させなかった基に、蛍光レポーター化合物を複数結合させる工程を含むことを特徴とする方法。
【００２０】
［２］  上記反応性基（１）または反応性基（２）としてアミノ基を利用し、当該アミノ基に２−イミノチオランを反応させることによりチオール基を導入し、当該チオール基に上記機能性モノマー（Ｉ）または機能性モノマー（ＩＩ）を結合させる上記［１］に記載の方法。
【００２１】
［３］  特異的認識空間に挿入される標的タンパク質を構成するアミノ酸残基の反応性基（１）または反応性基（２）と相互作用するポストインプリンティング化合物が特異的認識空間内に複数導入されており、且つ、
蛍光レポーター化合物が特異的認識空間内に複数導入されていることを特徴とする分子インプリントポリマー。
【００２２】
［４］  ベース基板、表面プラズモン共鳴光を発生し得る金属からなる金属層、消光抑制層をこの順で含み、
上記ベース基板、金属層および消光抑制層の表面には複数の凹部からなる周期構造が形成されており、
上記周期構造上に、上記［３］に記載の分子インプリントポリマーが形成されていることを特徴とするプラズモニックチップ。
【００２３】
［５］  直径２ｍｍ以上、６ｍｍ以下の円形孔を通過可能な形状を有する上記［４］に記載のプラズモニックチップ。
【００２４】
［６］  試料中における上記標的タンパク質を検出する方法であって、
上記［３］に記載の分子インプリントポリマー、または上記［４］もしくは［５］に記載のプラズモニックチップの分子インプリントポリマーと、上記試料を接触させる工程、および、
上記分子インプリントポリマーと上記試料との接触による蛍光強度の変化を測定する工程を含むことを特徴とする方法。
【発明の効果】
【００２５】
本発明に係る分子インプリントポリマーは、標的タンパク質の高次構造に対応した形状の特異的認識空間を有するのみならず、当該特異的認識空間内には、標的タンパク質を構成する分子の反応性基に対応する位置に、この反応性基と相互作用可能なポストインプリンティング化合物が複数存在する。また、当該特異的認識空間内には、複数の蛍光レポーター化合物が導入されている。よって、本発明に係る分子インプリントポリマーは、従来の分子インプリントポリマーに比べて標的タンパク質に対する選択性と親和性が非常に高く、且つ標的タンパク質の検出感度が極めて高いという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、分子インプリント膜の特異的認識空間内において、標的タンパク質のリジン残基に対応する位置にカルボキシ基または水酸基を導入した場合における、表面プラズモン共鳴測定法による標的タンパク質の検出結果を示すグラフである。
【図２】図２は、架橋度を変更して作製した分子インプリント膜を用いた表面プラズモン共鳴測定法による標的タンパク質の検出結果を示すグラフである。
【図３】図３は、標的タンパク質に対する分子インプリント膜の選択性を試験するために、標的タンパク質であるα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）に加え、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の表面プラズモン共鳴測定法による検出結果を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明に係る分子インプリント膜を用いた水晶振動子マイクロバランス法による標的タンパク質の検出結果を示すグラフである。
【図５】図５は、標的タンパク質であるα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、１００倍希釈血清中のα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、および対照タンパク質であるヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を、本発明に係る分子インプリント膜を用い、蛍光強度変化により検出した結果を示すグラフである。
【図６】図６は、特異的認識空間内において蛍光レポーター化合物の導入量を変更して作製した分子インプリント膜を用い、標的タンパク質を蛍光強度変化により検出した結果を示すグラフである。
【図７】図７は、標的タンパク質であるα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、１００倍希釈血清中のα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、およびウシ血清アルブミンと共存するα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）を、本発明に係る分子インプリント膜を用い、蛍光強度変化により検出した結果を示すグラフである。
【図８】図８は、標的タンパク質に対する分子インプリント膜の選択性を試験するために、標的タンパク質であるα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）に加え、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を蛍光強度変化により検出した結果を示すグラフである。
【図９】図９は、Ａｇベースのプラズモニック基板の走査型プローブ顕微鏡による観察画像である。
【図１０】図１０は、プラズモニックチップによる蛍光増強効果を確認した実験の結果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、蛍光化合物であるＣｙ３．５を導入した分子インプリント膜を有するプラズモニックチップを用い、ＨＳＡ濃度と蛍光強度の変化との関係を測定した実験の結果を示すグラフである。
【図１２】図１２は、蛍光化合物であるＣｙ５を導入した分子インプリント膜を有するプラズモニックチップを用い、ＨＳＡ濃度と蛍光強度の変化との関係を測定した実験の結果を示すグラフである。
【図１３】図１３は、蛍光化合物であるＣｙ３．５とＣｙ５を導入した分子インプリント膜を有するプラズモニックチップを用い、ＨＳＡ濃度と蛍光強度の変化との関係を測定した実験の結果を示すグラフである。（１）はＣｙ３−Ｃｙ５用蛍光フィルター用いた結果を示し、（２）はＣｙ３用蛍光フィルターを用いた結果を示す。
【図１４】図１４は、ビオチン導入プラズモニックチップを用い、その周期構造内と周期構造外で蛍光を測定した結果である。
【図１５】図１５は、ビオチン導入プラズモニックチップを用い、その周期構造内と周期構造外で測定された蛍光強度を比較するためのグラフである。
【図１６】図１６は、本発明に係るプラズモニックチップを使用可能な小型自動分注・反応・計測装置の一例を示す写真である。
【図１７】図１７は、蛍光化合物であるＡｌｅｘａ６４７と消光剤であるＢＨＱ−３を導入した分子インプリント膜を有するプラズモニックチップを用い、ＡＦＰ濃度と蛍光強度の変化との関係を測定した実験の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、先ず、本発明に係る分子インプリントポリマーを製造する方法を説明する。但し、以下に示す例はあくまで代表例であって、本発明は以下の記載に限定されるものではない。
【００２８】
１．分子インプリントポリマーの製造方法
（１−１）  標的タンパク質への機能性モノマー（Ｉ）の結合工程
本発明では、ジスルフィド基など選択的な切断が可能な切断性基を介して標的タンパク質にビニルモノマー基を導入したり、鋳型化合物である標的タンパク質を基材上に形成した自己組織化単分子膜に結合させる。本工程では、標的タンパク質を構成する分子の反応性基（１）を介して、末端にビニルモノマー基を有し且つ末端以外の部分に切断性基（１）を有する機能性モノマー（Ｉ）を複数結合させる。
【００２９】
本工程で利用する反応性基（１）を含む分子としては、標的タンパク質を構成するものであり且つ所定の反応性基を有する分子であれば特に制限されないが、例えば、アミノ酸残基や、糖鎖を構成する糖残基を挙げることができる。反応性基（１）としては、例えば、リシン残基やＮ末端のアミノ基；アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、Ｃ末端のカルボキシ基；システイン残基のチオール基；セリン残基、トレオニン残基、糖鎖の水酸基；チロシン残基のフェノール性水酸基などを挙げることができる。
【００３０】
反応性基（１）は、機能性モノマー（Ｉ）との反応の前に活性化しておいてもよい。例えば、カルボキシ基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ニトロフェノール、ペンタフルオロフェノールなどを用いて事前に活性エステル化しておいてもよい。
【００３１】
また、反応性基（１）に、上記反応性基を有するリンカーを反応させておいてもよい。即ち、本発明において「反応性基（１）を介して機能性モノマー（Ｉ）を結合させる」とは、反応性基（１）に、当該反応性基（１）との反応性を示し且つ機能性モノマー（Ｉ）中に存在する基を直接結合させてもよいし、リンカー基を介して反応性基（１）と当該基を結合させてもよいことを意味する。例えば、後記の実施例のように２−イミノチオランを用いれば、標的タンパク質のアミノ基と容易に反応し、チオール基を導入することができる。２−イミノチオランは、アミノ基の塩基性を損なわないので、標的タンパク質の変性を最小限に抑えることができる。この導入チオール基に、機能性モノマー（Ｉ）を結合させてもよい。
【００３２】
タンパク質を構成するアミノ酸残基は、タンパク質の高次構造の形成や維持に関与していることがある。また、本発明では、次工程において、反応性基（１）と同種の反応性基を介して機能性モノマー（ＩＩ）を結合させることもある。よって、本工程において利用する反応性基（１）の量を調整する必要がある。具体的には、機能性モノマー（Ｉ）の使用量や、機能性モノマー（Ｉ）を導入するためのリンカー基導入試薬の使用量を調整したり、反応温度や反応時間などを調整することが好ましい。また、反応の前後において標的タンパク質の高次構造の維持を円偏光二色性スペクトル（ＣＤスペクトル）で確認することが好ましい。さらに、機能性モノマー（Ｉ）の導入数や、機能性モノマー（Ｉ）を結合させるためのリンカー基導入試薬の導入数は、マススペクトルで確認することができる。
【００３３】
本工程で用いる機能性モノマー（Ｉ）は、反応性基（１）またはリンカー基を介して導入された反応性基とビニルモノマー基とが、切断性基（１）を有するリンカー基により結合されている構造を有する。
【００３４】
機能性モノマー（Ｉ）は、具体的には、例えば以下の構造を有する。
Ｗ1−Ｘ1−Ｙ1−Ｚ1−Ｑ1・・・  （Ｉ）
【００３５】
上記式中、Ｗ1はビニルモノマー基を示す。ビニルモノマー基は、分子インプリントポリマーを形成するための他のビニルモノマーと共重合が可能であるものであれば特に制限されないが、例えば、ビニル基、メチルビニル基（ＣＨ3−ＣＨ＝ＣＨ−）、クロロビニル基（Ｃｌ−ＣＨ＝ＣＨ−）、アクリル酸エステル基（ＣＨ2＝ＣＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）、メタクリル酸エステル基（ＣＨ3−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）を挙げることができる。
【００３６】
Ｘ1およびＺ1は、独立して、単結合またはリンカー基を示す。リンカー基としては、例えば、Ｃ1-6アルキレン基、アミノ基（−ＮＨ−）、エーテル基（−Ｏ−）、カルボニル基（−Ｃ（＝Ｏ）−）、エステル基（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−または−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−）、アミド基（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−）、スルホキシド基（−Ｓ（＝Ｏ）−）、スルホニル基（−Ｓ（＝Ｏ）2−）、およびこれら２以上が結合した基を挙げることができる。２以上の上記基が結合して上記リンカー基が構成されている場合、当該結合数としては、５以下または４以下が好ましく、３以下または２がより好ましい。
【００３７】
Ｙ1は、ジスルフィド結合基、イミノ結合基、ボロン酸ｃｉｓジオールエステル基、またはカルボン酸エステル基から選択される切断性基（１）を示す。これら切断性基は、水素結合など非共有結合に比べて比較的安定であり、重合反応時にも安定的に維持され、特異的認識空間の形成に寄与する一方で、比較的切断され易いことから、重合反応後における鋳型化合物の除去が容易である。上記切断性基は、例えば、還元剤、比較的低温での加熱、比較的穏和な条件での加水分解、光照射などで切断することができる。例えばカルボン酸エステル基は、タンパク質を構成するアミド結合よりも切断され易く、比較的穏和な条件での加水分解により選択的に切断することができ、また、カルボン酸エステル基の中でもｏ−ニトロベンジルエステル基は、光照射でも選択的な切断が可能である。
【００３８】
Ｑ1は、反応性基（１）、または反応性基（１）と反応させたリンカー基導入試薬中の反応性基（以下、「反応性基（１）等」という）と反応して共有結合を形成するための反応性基である。例えば、反応性基（１）等がアミノ基である場合は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ニトロフェノール、ペンタフルオロフェノールなどを用いた活性エステル基；ＮＨＳカルバメートなどのカルバミン酸活性エステル基；イミンを形成するためのアルデヒド基；イソシアネート基；イソチオシアネート基；エポキシ基；マレイミド基などを挙げることができる。反応性基（１）等がカルボキシ基である場合、水酸基やアミノ基を挙げることができる。この場合、当該カルボキシ基は活性化しておくことが好ましい。反応性基（１）等がチオール基である場合、マレイミド基やアクリル酸エステル基など、電子不足の不飽和炭素基；ヨードアセトアミド基；ピリジルジスルフィド基；ラジカル付加系クリックケミストリーのためのアルケン（ビニルスルホン）・アルキン基；ネイティブ・ケミカル・ライゲーション法のためのチオエステル基を挙げることができる。反応性基（１）等が水酸基またはフェノール性水酸基である場合、活性エステル基を挙げることができる。特に糖鎖中のｃｉｓジオール基に対しては、フェニルボロン酸基などのボロン酸基を用いることもできる。
【００３９】
反応性基（１）等と機能性モノマー（Ｉ）との反応は、当業者公知の条件により行うことができる。例えば、標的タンパク質中のアミノ基と機能性モノマー（Ｉ）のカルボキシ基との反応は、アミド結合を形成するための脱水縮合剤を用いたり、或いは、機能性モノマー（Ｉ）のカルボキシ基が活性エステル化されている場合には、適切な溶媒中、標的タンパク質と機能性モノマー（Ｉ）を混合するのみでも反応は進行する。
【００４０】
本工程において、目的化合物の精製は、限外濾過など一般的なタンパク質の精製で用いられる方法により行えばよい。標的タンパク質への機能性モノマーの結合やその数は、マススペクトルで確認することができる。
【００４１】
（１−２）  標的タンパク質への機能性モノマー（ＩＩ）の結合工程
本工程では、標的タンパク質を構成する分子の反応性基（２）を介して、末端にビニルモノマー基を有し且つ末端以外の部分に切断性基（２）を有する機能性モノマー（ＩＩ）を複数結合させる。
【００４２】
本工程は、上記工程１−１と同様に実施することができる。また、本工程で利用する反応性基（２）は、上記工程１−１で利用する反応性基（１）と同一であっても異なっていてもよい。同一である場合には、標的タンパク質に対する機能性モノマー（Ｉ）、機能性モノマー（ＩＩ）、リンカー基導入試薬などの使用量を調整し、機能性モノマー（Ｉ）および機能性モノマー（ＩＩ）がそれぞれ適量導入されるようにする。
【００４３】
但し、本工程で用いる切断性基（２）は、切断性基（１）とは異なるものを用いる。即ち、機能性モノマー（ＩＩ）としては、例えば以下の構造を有する化合物を用いる。
Ｗ2−Ｘ2−Ｙ2−Ｚ2−Ｑ2・・・  （ＩＩ）
［式中、Ｗ2、Ｘ2、Ｙ2およびＺ2は、それぞれＷ1、Ｘ1、Ｙ1およびＺ1と同義を示すが、Ｙ2は、ジスルフィド結合基、イミノ結合基、ボロン酸ｃｉｓジオールエステル基、またはカルボン酸エステル基であって、切断性基（１）とは異なる基を示し、Ｑ2は、反応性基（２）、または反応性基（２）と反応させたリンカー基導入試薬中の反応性基と反応して共有結合を形成するための反応性基を示す。］
【００４４】
切断性基（１）と切断性基（２）として互いに異なるものを用いることにより、これらを切断した場合に特異的認識空間内に残留する官能基も互いに異なるものとなる。即ち、ジスルフィド結合基の切断によりチオール基が、イミノ結合基の切断によりアミノ基またはアルデヒド基が、ボロン酸ｃｉｓジオールエステル基の切断によりボロン酸基または水酸基が、カルボン酸エステル基の切断によりカルボキシ基または水酸基が残る。それら異なる官能基へ、反応性基（１）または反応性基（２）と相互作用するポストインプリンティング化合物と蛍光レポーター化合物をそれぞれ結合させることにより、本発明に係る分子インプリントポリマーが得られる。
【００４５】
（１−３）  自己組織化単分子膜の形成工程
本工程では、基材上に自己組織化単分子膜（ＳＡＭ：Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）を形成する。ＳＡＭは、基材へ化学結合していると共に、基材上に分子が分子間力により密に且つ規則的に整列していることから、安定で均一である。
【００４６】
ＳＡＭを形成する基材としては、基板や粒子などを利用することができる。基材の材質としては、金属やガラスなど、ＳＡＭを形成できるものであれば特に制限されない。ＳＡＭを形成するための基材を構成する金属としては、金が汎用されているが、銀、銅、白金、パラジウムなども用いることができる。また、ガラス基板やテフロン（登録商標）基板上にこれら金属の薄膜を形成したものも金属基板として利用可能である。また、後記の表面プラズモン共鳴測定法や水晶振動子マイクロバランス法などの測定方法に適した金属基板が市販されているので、かかる市販金属基板を用いてもよい。
【００４７】
ＳＡＭを形成するための分子としては、通常、金属基材表面と結合可能なチオール基または酢酸チオエステル基を一方の端部に有し、他端には、機能性モノマー（Ｉ）および機能性モノマー（ＩＩ）を結合させた標的タンパク質を結合させるための反応性基を有する炭素数８以上の直鎖アルカンを用いることができる。標的タンパク質を結合させるための反応性基としては、例えば、ピリジルジスルフィド基など、標的タンパク質を構成する分子の反応性基（３）、または反応性基（３）と反応させたリンカー基導入試薬中の反応性基（以下、「反応性基（３）等」という）と反応して共有結合を形成するための反応性基を挙げることができる。切断性基（３）としては、ジスルフィド結合基、イミノ結合基、ボロン酸ｃｉｓジオールエステル基、またはカルボン酸エステル基を挙げることができる。また、分子−分子間の特異的な相互作用を利用して標的タンパク質を結合させる場合には、上記反応性基として標的タンパク質のアフィニティーリガンドを用いてもよい。かかる分子−分子間の特異的相互作用としては、例えば、ビオチン−アビジンまたはストレプトアビジン間相互作用、ヘパリン−血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）間相互作用、抗原−抗体間相互作用などを挙げることができる。或いは、上記直鎖アルキルチオール化合物が酸化的に縮合したジスルフィド化合物を用いることもできる。また、強固なＳＡＭを形成すべく長鎖部分が同一または類似するものである範囲で、標的タンパク質を導入するための反応性基以外の官能基を有する分子を併用してもよい。他の官能基としては、例えば、ビニルモノマーの重合開始作用を有する基を挙げることができる。
【００４８】
金属基材上へのＳＡＭの形成は、常法に従えばよい。例えば、ＳＡＭ形成分子をエタノールなどに溶解し、得られた溶液に金属基材を常温で３０分間以上４８時間程度浸漬すれば、当該分子がチオエーテル結合を介して金属基材表面に結合し、且つ分子間力により配向しつつ密に集合し、ＳＡＭが形成される。或いは、上記工程１−１に例示したリンカー基を介して、ＳＡＭ形成分子を段階的に延長していってもよい。その場合には、標的タンパク質を結合するための反応性基を最終末端に導入するようにする。次いで、過剰のＳＡ
Ｍ形成分子を洗浄により除去した後、乾燥すればよい。
【００４９】
また、ガラス基材を用いる場合には、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）などのシランカップリング剤で表面にアミノ基などの反応性基を導入することにより、ＳＡＭの形成が可能である。
【００５０】
（１−４）  標的タンパク質の結合工程
本工程では、上記工程１−３で基材上に形成されたＳＡＭの末端の反応性基を利用して、標的タンパク質をＳＡＭの表面に結合させる。
【００５１】
本工程において、標的タンパク質を構成する分子の反応性基（３）等を介して標的タンパク質をＳＡＭの表面に結合させる場合には、ＳＡＭの末端反応性基と標的タンパク質との間には、切断性基（３）を介在させる。即ち、ＳＡＭの表面へ、標的タンパク質を構成する分子の反応性基（３）と切断性基（３）を介して機能性モノマー（Ｉ）および機能性モノマー（ＩＩ）を結合させた上記標的タンパク質を結合させる。切断性基（３）により、後記の工程１−６においてポリマーからの標的タンパク質の除去が可能になる。切断性基（３）は、ＳＡＭと標的タンパク質との間のリンカー基中に含まれていてもよいが、ＳＡＭ末端の反応性基と標的タンパク質の反応性基（３）との反応の結果形成されるものであってもよい。例えば、ＳＡＭの末端にチオール基または活性チオール基を導入し、また、標的タンパク質のシステイン由来のチオール基や、リンカー基導入試薬により導入されたチオール基とを反応させれば、切断性基であるジスルフィド結合が形成される。
【００５２】
切断性基（３）は、ジスルフィド結合基、イミノ結合基、ボロン酸ｃｉｓジオールエステル基、またはカルボン酸エステル基から選択され、切断性基（１）または切断性基（２）と同一であってもよいし異なっていてもよい。
【００５３】
本工程の反応条件は、当業者であれば、ＳＡＭの末端反応性基と標的タンパク質の反応性基（３）の種類などにより、適宜選択することができる。例えば、ピリジルジスルフィド基などＳＡＭ表面の反応性基と標的タンパク質に導入されたチオール基との反応は容易であり、溶媒中、上記工程１−３で基材上に形成したＳＡＭと標的タンパク質に導入されたチオール基とを接触させるのみで反応は進行する。
【００５４】
或いは、本工程において、分子−分子間の特異的相互作用を利用して標的タンパク質をＳＡＭの表面に結合させる場合には、例えば、当該相互作用が有効となるような緩衝液中でＳＡＭと標的タンパク質を接触させればよい。
【００５５】
反応の進行は、例えば、基材として表面プラズモン共鳴測定法や水晶振動子マイクロバランス法などのための金属基板を使用した場合には、それぞれ表面プラズモン共鳴測定法と水晶振動子マイクロバランス法により確認することができる。
【００５６】
反応終了後、目的化合物の精製は、基板を洗浄することにより行えばよい。
【００５７】
本工程は、少なくともＳＡＭ形成工程１−３の後に実施する必要はあるが、機能性モノマー（Ｉ）の結合工程１−１および機能性モノマー（ＩＩ）の結合工程１−２との実施順序は任意である。また、工程１−１および工程１−２は、標的タンパク質へのリンカー基導入試薬によるリンカー基および反応性基の導入反応と、機能性モノマー（Ｉ）または機能性モノマー（ＩＩ）の結合反応を分け、間に他工程を実施してもよい。例えば後記の実施例では、先ず標的タンパク質に２−イミノチオランを反応させることによりリンカー基と反応性基を導入し、一方の機能性モノマーを標的タンパク質の反応性基へ直接結合させた後に、当該標的タンパク質を基材上のＳＡＭに結合させ、さらに上記リンカー基の末端反応性基へ他方の機能性モノマーを結合させている。
【００５８】
（１−５）  共重合工程
本工程では、標的タンパク質が結合したＳＡＭが形成された基材にビニルモノマーを添加し、鋳型化合物である標的タンパク質に結合させた機能性モノマー（Ｉ）および機能性モノマー（ＩＩ）中のビニルモノマー基と共重合させることにより、標的タンパク質を含むポリマーを形成する。
【００５９】
添加するビニルモノマーは、機能性モノマー中のビニルモノマー基と共重合可能なビニル基構造を有するものであれば特に制限されず、適宜選択することができるが、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを好適に用いることができる。２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンはリン脂質と類似した構造を有し、そのポリマーは生体への親和性に優れるため、血液などの生体試料の分析に適しているという利点がある。その他、非特異的吸着の低減の観点から、メトキシポリエチレングリコールメタクリレートなどのＰＥＧビニルモノマーも用い得る。
【００６０】
また、ビニルモノマーに加えて、架橋剤を併用してもよい。架橋剤により共重合体が架橋され、標的タンパク質に対する特異的認識空間の選択性が向上する可能性がある。一方、過剰に架橋すると、形成される架橋鎖と標的タンパク質との親和性の問題や、標的タンパク質が特異的認識空間内に挿入され難くなるなどしてかえって選択性が低下するおそれがあり得るので、架橋剤の種類や使用量、反応条件は調整する必要がある。架橋剤としては、２以上のビニルモノマー基がリンカー基により結合された化合物を挙げることができる。また、架橋剤の使用量に関しては、モノマーと架橋剤の合計モル数に対する架橋剤のモル数の割合を１％以上、５０％以下とすることができる。当該割合としては４０％以下がより好ましく、３０％以下がさらに好ましく、２５％以下がよりさらに好ましい。
【００６１】
重合条件は、常法に従って設定すればよい。例えば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンは水溶性であるので、水系溶媒に、少なくとも上記工程１−１〜１−４を経て標的タンパク質が結合した基材と２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを添加し、重合開始剤（ＳＡＭ表面に結合させたものでもよい）により重合を開始すればよい。反応液には、リビングラジカル重合を行うため、１価の銅化合物や、２価の銅化合物とアスコルビン酸などの還元剤との組み合わせを添加してもよい。重合温度は常温、さらには０℃以上１２０℃以下程度でよく、重合時間は１０分間以上５０時間以下程度とすることができる。具体的な重合条件は、重合が十分でないと形成された特異的認識空間の標的タンパク質への選択性が低下するおそれがあり得る一方で、過剰に重合させると次工程で鋳型化合物である標的タンパク質を除去できなくなるおそれがあり得るので、予備実験などで決定してもよい。
【００６２】
重合反応後は、余分な試薬を除去するため、使用した溶媒などでよく洗浄することが好ましい。
【００６３】
（１−６）  鋳型化合物である標的タンパク質の除去工程
本工程では、少なくとも、鋳型化合物である標的タンパク質とポリマーを結合している切断性基（１）および切断性基（２）を切断することにより、標的タンパク質を除去する。その結果、ポリマー中には、除去された標的タンパク質に特異的な認識空間が形成される。標的タンパク質を構成する分子の反応性基（３）と切断性基（３）を介して標的タンパク質をＳＡＭの表面に結合させた場合には、ＳＡＭから標的タンパク質を除去するために当該切断性基（３）も切断する。分子−分子間の特異的相互作用を利用して標的タンパク質をＳＡＭの表面に結合させた場合には、切断性基（１）と切断性基（２）の切断に加え、当該分子−分子間相互作用が解消されるよう、高濃度塩溶液や高ｐＨまたは低ｐＨの緩衝液を作用させればよい。
【００６４】
切断性基（１）〜（３）は、ジスルフィド結合基、イミノ結合基、ボロン酸ｃｉｓジオールエステル基、またはカルボン酸エステル基から選択されるものであり、これら切断性基の切断条件は当業者にとり公知である。例えば、ジスルフィド基の切断は、還元により行うことができる。例えば、常温下、適切な溶媒中、上記工程１−５を経た基材と還元剤を接触させればよい。還元剤としては、例えば、トリス（２−カルボキシエチルホスフィン）（ＴＣＥＰ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリブチルホスフィン（ＴＢＰ）を挙げることができる。還元反応後、基材を洗浄することが好ましい。
【００６５】
上記切断反応により、鋳型化合物である標的タンパク質が除去され、特異的認識空間が
形成された分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）が得られる。当該特異的認識空間内には、少なくとも切断性基（１）と切断性基（２）の切断により生じた官能基が存在する。切断性基（１）と切断性基（２）は異なるので、特異的認識空間内には少なくとも２種の官能基が存在する。
【００６６】
（１−７）  ポストインプリンティング化合物の結合工程
本工程では、上記１−６工程により生成する特異的認識空間内の２種の官能基の一方に、標的タンパク質の反応性基と相互作用するポストインプリンティング化合物を複数結合させる。即ち、切断性基（１）を切断することにより生成する官能基に、反応性基（１）と相互作用するポストインプリンティング化合物を複数結合させるか、または、切断性基（２）を切断することにより生成する基に、反応性基（２）と相互作用するポストインプリンティング化合物を複数結合させる。特異的認識空間内に結合したポストインプリンティング化合物は、標的タンパク質が特異的認識空間内に挿入された場合、当該標的タンパク質の反応性基（１）または反応性基（２）と相互作用する。その結果、特異的認識空間の標的タンパク質に対する親和性や選択性が向上する。また、標的タンパク質とＳＡＭを結合している切断性基（３）を切断することにより生成する官能基に、反応性基（３）と相互作用するポストインプリンティング化合物を結合させてもよい。
【００６７】
例えば、標的タンパク質のアミノ基を介して、標的タンパク質と機能性モノマー（Ｉ）およびＳＡＭを結合させ、切断性基（１）および切断性基（３）の切断により生成する官能基に、カルボキシ基などアミノ基と相互作用する基を有するポストインプリンティング化合物を結合させた場合には、当該ポストインプリンティング化合物の位置は、特異的認識空間に挿入される標的タンパク質のアミノ基の位置に対応する。その結果、特異的認識空間内のカルボキシ基と標的タンパク質のアミノ基が相互作用するため、本発明に係るＭＩＰの標的タンパク質に対する選択性と親和性が向上する。
【００６８】
ポストインプリンティング化合物は、反応性基（１）または反応性基（２）と相互作用する官能基の他、切断性基（１）または切断性基（２）の切断により生成する官能基と結合可能な反応性基を有する。これら基は上記工程１−１で例示したようなリンカー基で結合されていてもよいが、当該リンカー基が長過ぎると反応性基（１）または反応性基（２）の位置に基づく効果が低減するおそれがあり得るので、当該リンカー基としてはＣ1-4アルキレン基が好ましく、Ｃ1-2アルキレン基がより好ましい。
【００６９】
ポストインプリンティング化合物は、特異的認識空間内に複数結合させるために、鋳型化合物である標的タンパク質に結合させた機能性モノマー（Ｉ）または機能性モノマー（ＩＩ）の数に対して、十分量用いることが好ましい。
【００７０】
切断性基（１）または切断性基（２）の切断により生成する官能基とポストインプリンティング化合物との反応は、当業者公知の条件により行うことができる。例えば、後記の実施例のように、標的タンパク質の反応性基（１）としてアミノ基を介して、切断性基（１）としてジスルフィド結合を有する機能性モノマー（Ｉ）を導入した場合には、当該切断性基（１）の切断により特異的認識空間内にチオール基が生成する。よって、カルボキシ基に加えてピリジルジスルフィド基などの活性チオール基を有するポストインプリンティング化合物であれば、溶媒中、ＭＩＰと混合するのみで、特異的認識空間内のチオール基に結合させることができる。勿論、当業者であれば、切断性基（１）または切断性基（２）の切断により生成する官能基に応じて、脱水縮合剤を用いるなどすることは可能である。
【００７１】
（１−８）  蛍光レポーター化合物の結合工程
本工程では、上記工程１−７においてポストインプリンティング化合物を結合させなかった上記切断性基（１）を切断することにより生成する官能基または上記切断性基（２）を切断することにより生成する官能基に、蛍光レポーター化合物を複数結合させる。これら官能基は特異的認識空間の内部に存在するため、蛍光レポーター化合物も特異的認識空間の内部に結合することになる。蛍光レポーター化合物が特異的認識空間の内部に複数存在する場合、標的タンパク質の挿入の有無により蛍光強度が変化するので、試料中における標的タンパク質の有無やその濃度を容易に測定することが可能になり、標的タンパク質に対する検出感度は顕著に向上する。
【００７２】
本発明では、機能性モノマー（Ｉ）の切断性基（１）と機能性モノマー（ＩＩ）の切断性基（２）とは異なるものを用いるため、これら切断性基の切断により生じる官能基は異なるものとなる。よって、これら官能基それぞれに上記工程１−７でポストインプリンティング化合物を結合させ、本工程で蛍光レポーター化合物を結合させることは容易であり、上記工程１−７と本工程での反応の特別な制御は必要でない。
【００７３】
蛍光レポーター化合物は適宜選択すればよいが、少なくとも特異的認識空間内への標的タンパク質の挿入が妨げられない程度の大きさを有するものである必要がある。また、十分な蛍光特性を有するものが好ましい。例えば、バックグラウンドの低い長波長可視領域に蛍光特性を有するＣｙａｎｉｎｅ５（Ｃｙ５）を用いることができる。
【００７４】
また、蛍光レポーター化合物は、１種のみ単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。例えば、２種の蛍光レポーター化合物を使用し、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を利用することが考えられる。また、蛍光レポーター化合物と消光化合物とを組み合わせ、標的タンパク質の存在による蛍光強度の変化を測定することも考えられる。
【００７５】
特異的認識空間内に結合させるべき蛍光レポーター化合物は、特異的認識空間内に複数結合させるために、鋳型化合物である標的タンパク質に結合させた機能性モノマー（Ｉ）または機能性モノマー（ＩＩ）の数に対して、十分量用いることが好ましい。
【００７６】
２．分子インプリントポリマー
以上で説明した本発明方法により製造される本発明に係る分子インプリントポリマーは、標的タンパク質に対する特異的認識空間を有し、また上記工程１−７における説明のとおり、特異的認識空間に挿入される標的タンパク質を構成する分子の反応性基と相互作用するポストインプリンティング化合物が特異的認識空間内に複数存在している。その結果、標的タンパク質に対する選択性と親和性が向上している。
【００７７】
また、上記工程１−８により特異的認識空間内に蛍光レポーター化合物が複数結合した分子インプリントポリマーは、蛍光強度により試料中の標的タンパク質の有無や量を測定可能である点で利便性と検出感度が高い。
【００７８】
本発明に係る分子インプリントポリマーの形態は、標的タンパク質を特異的認識空間内に選択的に取り込むことができるものであれば特に制限されないが、例えば、膜状とすることができる。
【００７９】
なお、本発明において「特異的認識空間」とは、標的タンパク質の三次元構造と類似した形状の空間であり、標的タンパク質を特異的かつ可逆的に取り込むことが可能な空間をいう。
【００８０】
３．標的タンパク質の検出方法
以下、本発明に係る分子インプリントポリマーを用いた試料中における標的タンパク質の検出方法につき説明する。
【００８１】
本発明に係る標的タンパク質の検出方法は、本発明に係る分子インプリントポリマーと試料を接触させる工程（接触工程）、および、上記分子インプリントポリマーと上記試料との接触による蛍光強度の変化を測定する工程（測定工程）を含む。
【００８２】
測定すべき試料は、標的タンパク質の存在または不存在を確認すべきもの、また、標的タンパク質の量を測定すべきものであれば、特に制限されない。例えば、ヒトまたは動物の血液、尿、唾液などを挙げることができる。また、生体試料をある程度精製したものを試料としてもよい。例えば、血清や血漿を試料としてもよい。なお、ここでいう「量」には、「濃度」も含まれるものとする。
【００８３】
試料は、溶媒で希釈してもよい。使用する溶媒は、試料中に含まれる程度の量の標的タンパク質を溶解できるものであれば特に制限されない。例えば、検出すべき標的タンパク質を適度に溶解できる緩衝液を用いることができる。
【００８４】
本発明の分子インプリントポリマーと試料とを接触させるには、例えば、溶媒中、分子インプリントポリマーが存在する容器や流路に試料、または溶媒と試料の混合物を導入すればよい。その際の温度は、測定結果が温度により異なることがあり得るので、例えば２０℃以上３０℃以下、特に２５℃など、一定にすることが好ましい。また、浸漬時間は、対象となる標的タンパク質が特異的認識空間へ十分に取り込まれるよう十分な時間とし、例えば、５分間以上、５時間以下程度とすることができる。
【００８５】
本発明に係る標的タンパク質の検出方法では、分子インプリントポリマーと試料との接触による蛍光強度の変化を測定することにより、標的タンパク質の存在の有無または量を求める。即ち、先ず、試料の不存在下で、分子インプリントポリマーの蛍光強度を測定する。次に、分子インプリントポリマーと試料を十分に接触させた後、同様の条件により蛍光強度を測定する。これら蛍光強度の測定値の変化を測定することにより、試料中における標的タンパク質の有無や量を求めることが可能である。
【００８６】
４．プラズモニックチップ
本発明に係る分子インプリントポリマーをプラズモニックチップの周期構造上に形成した場合には、標的タンパク質の検出感度がより一層向上し得る。プラズモニックチップとは、表面に波長オーダーの周期構造が形成された金属層を含み、入射光をチップ界面に結合させて増強電場として局在化させることができ、チップに結合した蛍光レポーター化合物などの蛍光を増強させることにより、標的タンパク質などの高検出感度を実現するものである。
【００８７】
本発明に係るプラズモニックチップは、ベース基板、表面プラズモン共鳴光を発生し得る金属からなる金属層、消光抑制層をこの順で含み、当該ベース基板、金属層および消光抑制層の表面には複数の凹部からなる周期構造が形成されており、当該周期構造上に、本発明に係る分子インプリントポリマーが形成されていることを特徴とする。プラズモニックチップは、界面に対する照射光により発生する表面プラズモンポラリトン波の波長の整数倍が周期構造の周期と一致または略一致する場合に、蛍光を増強することができる。
【００８８】
ベース基板の素材は、観察光に対して透明であることが好ましく、例えば、ガラスや透明無色プラスチックを用いることができる。また、上記金属層と消光抑制層は十分に薄く、ベース基板の表面に形成された周期構造を消光抑制層に反映させることが可能であるため、ベース基板に周期構造を形成すればよい。かかる周期構造は、型を用いるなどして容易に形成可能である。
【００８９】
金属層は、表面プラズモン共鳴光を発生し得る金属からなる。かかる金属としては、金、銀、銅、白金、ニッケルなどの遷移金属を挙げることができる。金属層の厚さは適宜調整すればよいが、例えば、１０ｎｍ以上、５００ｎｍ以下とすることができる。
【００９０】
消光抑制層は、金属による蛍光の消光を抑制すべく、蛍光レポーター化合物から金属層への励起エネルギー移動の消光距離を保つためのものであり、照射光や蛍光を吸収しない透明な素材で構成する。消光抑制層の素材としては、例えば、シリカ、ポリカーボネート、ポリメタクリル酸メチルなどを用いることができる。消光抑制層の厚さは、金属層を構成する金属に応じ、蛍光の消光を抑制できる範囲で適宜調整すればよい。例えば、金属層が銀で構成されている場合は２０ｎｍ以上、５０ｎｍ以下とし、金で構成されている場合は４０ｎｍ以上、７０ｎｍ以下とすればよい。
【００９１】
ベース基板、金属層および消光抑制層の表面は、複数の凹部からなる周期構造を有する。かかる周期構造は、上述したようにベース基板に形成してその形状を金属層および消光抑制層に反映させてもよいし、常法により金属層および消光抑制層の表面に直接形成してもよい。後者の場合には、周期構造の凹部の形状や位置は、ベース基板、金属層および消光抑制層において一致させる。
【００９２】
周期構造の周期は、観察すべき蛍光の波長の整数倍または略整数倍となるようにする。例えば１０ｎｍ以上、８００ｎｍ以下とすることができ、１００ｎｍ以上、６００ｎｍ以下が好ましい。周期構造の高さ若しくは深さは、４ｎｍ以上、４００ｎｍ以下とすることができる。周期構造の形状は適宜選択すればよいが、例えば、鋸歯状溝、正弦波状溝、矩形状溝などの溝状とすることができる。また、かかる溝を互いに直交する方向に重ね合わせた矩形凹部としてもよい。
【００９３】
本発明に係るプラズモニックチップは、上記の周期構造上に、本発明に係る分子インプリントポリマーが形成されている。当該分子インプリントポリマー中の特異的認識空間における標的タンパク質の存在または不存在により蛍光強度が変化する場合、表面プラズモン共鳴により蛍光強度が増強され、その変化が大きくなる。よって、本発明に係るプラズモニックチップを用いて標的タンパク質を検出することにより、その感度はより一層改善される。
【００９４】
本発明に係るプラズモニックチップの大きさは、測定条件などに応じて適宜調整すればよいが、例えば、直径２ｍｍ以上、６ｍｍ以下の円形孔を通過可能な形状とした場合には、ピペットチップに挿入可能になり、ピペットチップを使った測定が可能になる。例えば、本発明に係るプラズモニックチップをピペットチップに挿入した場合、標的タンパク質の存在の有無や濃度を測定すべき試料溶液を吸い取ることにより分子インプリントポリマーと試料溶液とを接触させることができるが、その際、試料溶液の必要量を極めて少なくすることができる。また、本発明に係るプラズモニックチップをピペットチップに挿入した場合には、多数の試料を効率的に分析できるような自動測定への適用が可能になり得る。例えば、少なくとも、ピペットチップを保持するラック、ＸＹＺ方向に駆動可能なピペッター、ピペットチップ内の反応溶液の温度を制御するインキュベータ、蛍光測定部を備える自動測定装置に適用することができる。そのような自動測定を可能にする小型自動分注・反応・計測装置の一例を図１６に示す。
【００９５】
十分に小さなプラズモニックチップであれば、図１６に示すようなピペットチップの中に挿入可能である。例えば、図１６に示す装置では、プラズモニックチップを事前に挿入したピペットチップをチップラックに置いておき、試料を入れた試験管などを試料ラックに置いておく。測定時には、ピペッターが自動的にチップラックに移動してピペットチップを装着し、次いで試料ラックに移動して所定量の試料を吸い上げた後、インキュベート部分に移動して所定時間反応させる。その他の反応や洗浄操作が必要である場合は、反応溶液を排出した後、試料ラックの試薬溶液や洗浄液を吸い上げて、同様の操作をすればよい。次に、測定部に移動して、蛍光強度を測定する。測定後はピペットチップを外して廃棄し、次の測定に移ればよい。このような自動装置を用いることにより、ＥＬＩＳＡなど酵素を用いる方法に比べ、血液試料など多数の試料を迅速かつ簡便に検査することが可能になる。
【実施例】
【００９６】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００９７】
実施例１：  オキシム型機能性モノマー（ＦＭ１）の合成
（１）  Ｎ−Ｂｏｃ−エチレンジアミン（化合物１）の合成
【００９８】
【化１】
0006653884.tif 000002
【００９９】
エチレンジアミン（３．５ｍＬ，５０ｍｍｏｌ，９．４ｅｑ）をジクロロメタン（４０ｍＬ）に溶解し、（Ｂｏｃ）2Ｏ（１．０９８ｇ，５．３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解した溶液を氷冷下で滴下した。１．５時間後にアイスバスを外し、さらに室温で０．５時間撹拌後、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）にて原料である（Ｂｏｃ）2Ｏのスポット（Ｒｆ＝０．８，ジクロロメタン，アニスアルデヒド）の消失と目的化合物１と思われるスポット（Ｒｆ＝０．２５，ＭｅＯＨ，ニンヒドリン）の出現を確認したことから反応終了とした。溶媒をエバポレーターによって減圧留去した後、残渣に飽和Ｎａ2ＣＯ3水溶液を加えて分散させたものをジクロロメタンで抽出した。有機層を無水ＭｇＳＯ4で脱水した後、エバポレーターによって溶媒を減圧留去した。さらに残渣に純水を加えて副生成物の（２−Ｂｏｃ−アミノエチル）カルバミン酸  ｔ−ブチルエステルを析出させ、メンブレンフィルター（孔径：０．２２μｍ）を用いて濾過することによりこれを除去した。この水溶液に飽和Ｎａ2ＣＯ3水溶液を加えて塩基性にした後、ジクロロメタンで抽出し、無水ＭｇＳＯ4で脱水した後、エバポレーターによって溶媒を減圧留去することでオイル状の目的化合物１を得た。1Ｈ−ＮＭＲより生成物の精製を確認した。
収量：７７１．２ｍｇ，収率：９０．９％
1H-NMR（300Hz，CDCl3）δ＝4.86（br，1H，C(=O)-NH），3.20-3.14（q，2H，NHCH2CH2），2.82-2.78（t，2H，CH2NH2），1.45（s，9H，C(CH3) 3）
【０１００】
（２）  Ｎ−メタクリロイル−Ｎ’−Ｂｏｃ−エチレンジアミン（化合物２）の合成
【０１０１】
【化２】
0006653884.tif 000003
【０１０２】
メタクリル酸（１．１７ｍＬ，１３．８３ｍｍｏｌ，１．５ｅｑ）と１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）（３．２５ｍＬ，１８．４４ｍｍｏｌ，２ｅｑ）をジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解し、３０分間撹拌した後、化合物１（１．４８ｇ，９．２２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解させた溶液を、窒素雰囲気、氷冷下で滴下した。滴下終了後、室温下で６時間撹拌し、ＴＬＣにて目的化合物２と思われるスポット（Ｒｆ＝０．５１，ＡｃＯＥｔ，ＵＶ−ニンヒドリン）を確認し、また、化合物１のスポット（Ｒｆ＝０，ＡｃＯＥｔ，ニンヒドリン）が消失したことから反応終了とした。反応溶液を、飽和食塩水、飽和クエン酸水溶液、飽和ＮａＨＣＯ3水溶液で３回ずつ洗浄し、有機層を無水ＭｇＳＯ4で脱水した後、エバポレーターによって減圧留去した。目的化合物２と思われるスポット（Ｒｆ＝０．４１，ヘキサン：ＡｃＯＥｔ＝１：１，ＵＶ−ニンヒドリン）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／ＡｃＯＥｔ＝５０／５０→０／１００）によって分離し、溶媒を減圧留去することで白色固体である目的化合物２を得た。1Ｈ−ＮＭＲより生成物の精製を確認した。
収量：１．６２７ｇ，収率：７７．３％
1H-NMR（300Hz，CDCl3）δ＝6.68（br，1H，CH2=C(CH3)-C(=O)-NH），5.76，5.33（s，2H，H2C=C(CH3)），4.90（br，1H，NH-Boc），3.44-3.32（m，4H，NHCH2CH2NH），1.97（s，3H，CH2=C(CH3)），1.44（s，9H，C(CH3)3）
【０１０３】
（３）  Ｎ−メタクリロイルエチレンジアミン塩酸塩（化合物３）の合成
【０１０４】
【化３】
0006653884.tif 000004
【０１０５】
化合物２（１．６２７ｇ，７．１３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解し、４Ｎ  ＨＣｌ／ジオキサン（９．３３ｍＬ，３５．６５ｍｍｏｌ，５ｅｑ）をジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解させた溶液を氷冷下で滴下した。滴下終了後、室温下で１２時間反応した時点のＴＬＣにて化合物２のスポット（Ｒｆ＝０．４１，ＡｃＯＥｔ，ＵＶ−ニンヒドリン）の消失および目的化合物３と思われるスポット（Ｒｆ＝０，ＡｃＯＥｔ，ＵＶ−ニンヒドリン）を確認したことから、反応終了とした、反応液を減圧濃縮し、得られた固体をジクロロメタンに再分散させた後、桐山ロートによる濾過にて回収した固体を真空乾燥させることで白色固体である目的化合物３を得た。1Ｈ−ＮＭＲより生成物の精製を確認した。
収量：１．１４６ｇ，収率：９８．０％
1H-NMR（300Hz，D2O）δ=5.54，5.29（s，2H，H2C=C(CH3)），3.44（t，2H，C(=O)-NHCH2），3.20（t，2H，CH2NH2），2.82，2.76（t，4H，CH2SSCH2），1.76（s，3H，CH3）
【０１０６】
（４）  Ｎ−Ｂｏｃ−アミノオキシ酢酸（化合物Ａ）の合成
【０１０７】
【化４】
0006653884.tif 000005
【０１０８】
アミノオキシ酢酸１／２塩酸塩（１．０９ｇ，１０ｍｍｏｌ，１．５ｅｑ）とＮａＨＣＯ3（８４０ｍｇ，１０ｍｍｏｌ，１．５ｅｑ）を純水（１０ｍＬ）中で混合し、ここに（Ｂｏｃ）2Ｏ（１．４５ｇ，６．６ｍｍｏｌ）をジオキサン（２０ｍＬ）に溶解させた溶液を滴下した。室温下で撹拌し、２４時間後におけるＴＬＣ（展開液：ＡｃＯＥｔ／ヘキサン＝７／３（ｖ／ｖ））にて、原料化合物のスポット（Ｒｆ＝０．５，アニスアルデヒド）の消失と、生成物と思われるスポット（Ｒｆ＝０．３７５，アニスアルデヒド）の出現を確認したことから反応終了とした。溶媒を減圧留去した後、純水と１Ｍ  ＨＣｌを加えてｐＨを１〜２に調整し、ＡｃＯＥｔで抽出した。無水ＭｇＳＯ4で脱水した後、エバポレーターによって溶媒を減圧留去することで白色固体である目的化合物Ａを得た。1Ｈ−ＮＭＲより生成物の精製を確認した。
収量：１．０２３ｇ（５．３５ｍｍｏｌ），収率：８１．０％
1H-NMR（300Hz，CDCl3）δ＝7.74（s，1H，O-NH-Boc），4.50（s，2H，O-CH2），1.51（s，9H，(CH3)3）
【０１０９】
（５）  Ｎ−（Ｎ’−Ｂｏｃ−アミノオキシ酢酸）アクリルアミド（化合物４）の合成
【０１１０】
【化５】
0006653884.tif 000006
【０１１１】
化合物Ａ（１．１５ｇ，６ｍｍｏｌ，１．５ｅｑ）とＥＤＣ（６．４ｍＬ，１２ｍｍｏｌ，３ｅｑ）をジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解し、３０分間撹拌した。ここに化合物３（６５６ｍｇ，４ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（ＴＥＡ）（１．６７ｍＬ，１２ｍｍｏｌ，３ｅｑ）をジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解させた溶液を室温下で滴下した。６時間後、ＴＬＣ（展開液：ＡｃＯＥｔ）にて生成物と思われるスポット（Ｒｆ＝０．３４，ＵＶ−ニンヒドリン）の出現を確認したが、化合物３のスポット（Ｒｆ＝０，ＵＶ−ニンヒドリン）が残存していたことから、さらにＥＤＣ（３．２ｍＬ，６ｍｍｏｌ）を添加し、室温下で撹拌した。２４時間後、ＴＬＣに変化が見られなかったことから反応終了とした。反応溶液を飽和食塩水、飽和クエン酸水溶液、飽和ＮａＨＣＯ3水溶液で３回ずつ洗浄し、有機層を無水ＭｇＳＯ4で脱水した後、エバポレーターによって溶媒を減圧留去した。目的化合物４と思われるスポット（Ｒｆ＝０．２９，ＡｃＯＥｔ，ＵＶ−ニンヒドリン）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ＡｃＯＥｔ）によって分離し、溶媒を減圧留去することで透明の高粘性オイル状生成物を得た。1Ｈ−ＮＭＲより目的化合物４の精製を確認した。
収量：２８１ｍｇ（０．９３ｍｍｏｌ），収率：２３．３％
1H-NMR（300Hz，CDCl3）δ＝8.321（s，1H，CH2NHC=O），7.90（s，1H，O-NH-Boc），6.86（s，1H，CH2＝C(CH3)C(=O)NH），5.79-5.35（s，2H，CH2＝C(CH3)），4.34（s，2H，O-CH2)，3.51（s，4H，NHCH2CH2NH），1.98（s，3H，CH2＝C(CH3)），1.48(s，9H，(CH3)3)
【０１１２】
（６）  Ｎ−アミノオキシ酢酸アクリルアミド塩酸塩（化合物５）の合成
【０１１３】
【化６】
0006653884.tif 000007
【０１１４】
化合物４（２８１ｍｇ，０．９３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解し、ここに４Ｎ  ＨＣｌ／ジオキサン（０．７５ｍＬ，３ｍｍｏｌ，３．２３ｅｑ）をジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解させた溶液を氷冷下で滴下した。滴下終了後、室温下で撹拌して１２時間反応させ、ＴＬＣにて原料のスポット（Ｒｆ＝０．２５，ＡｃＯＥｔ，ＵＶ−ニンヒドリン）の消失と、化合物５と思われるスポット（Ｒｆ＝０，ＡｃＯＥｔ，ＵＶ−ニンヒドリン）を確認したことから、反応終了とした。溶媒を減圧留去し、得られた固体をジクロロメタンに再分散させ、桐山ロートによる濾過にて回収した固体を真空乾燥することで白色固体である目的化合物５を得た。1Ｈ−ＮＭＲより生成物の精製を確認した。
収量：２１６．９ｍｇ（０．９１ｍｍｏｌ），収率：９８．１％
1H-NMR（300Hz，D2O）δ=5.50-5.27（s，2H，CH2＝C(CH3)），4.36（s，2H，O-CH2)，3.26（s，4H，NHCH2CH2NH），1.73（s，3H，CH2＝C(CH3)）
【０１１５】
（７）  ２，３，４，６−テトラヒドロキシ−５−（ピリジルジスルファニル）ヘキサナール（化合物Ｂ）の合成
【０１１６】
【化７】
0006653884.tif 000008
【０１１７】
５−チオ−Ｄ−グルコース（３９２ｍｇ，２ｍｍｏｌ)と２，２’−ジピリジルジスルフィド（４．４１ｇ，２０ｍｍｏｌ，１０ｅｑ）をピリジン（２５ｍＬ）に溶解し、６０℃で撹拌した。２４時間反応させた時点で、ＴＬＣ（展開液：ＡｃＯＥｔ）はＲｆ＝０（ＵＶ，アニスアルデヒド（黒））、０．２５（ＵＶ，アニスアルデヒド（赤紫））、０．５（ＵＶ，アニスアルデヒド（黄））、０．６２（ＵＶ，アニスアルデヒド（黄））の４スポットを示し、それぞれ５−チオ−Ｄ−グルコース、生成物、ピリジン／副生成物、２，２’−ジピリジルジスルフィドに対応する。原料のスポットが色濃く残存していたため、さらに２日間反応を継続した。７２時間前後において原点のスポットの濃さに変化が見られなくなったため、反応終了とし、エバポレーターにより溶媒のピリジンを除去することで赤褐色のオイルを得た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ＡｃＯＥｔ）によりＲｆ＝０．２５のフラクションを分離し、エバポレーターにより溶媒を留去したところ、白色固体とオレンジ色のオイル状物質の混合物が得られたため、ジクロロメタンを用いて桐山ロートによる濾過を行うことで白色固体のみを回収した。1Ｈ−ＮＭＲおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳより生成物の精製を確認した。
収量：３３６ｍｇ（１．１ｍｍｏｌ），収率：５５．０％
1H-NMR（300Hz，DMSO-d6）δ=8.43-7.22（4H，pyridyl），5.95-4.07（5H，OH，CHO），4.02-3.20（6H，glucose）
1H-NMR（300Hz，D2O）δ=8.26-7.13（4H，pyridyl），5.31-5.29，4.08-3.64，3.16-2.96（6H，glucose）
MALDI-TOF-MS（matrix：DHB）：m/z＝306.16[M+H+]，328.16[M+Na+]，633.31[2M+Na+]
【０１１８】
（８）  オキシム型機能性モノマー（ＦＭ１）の合成
【０１１９】
【化８】
0006653884.tif 000009
【０１２０】
化合物５（３０９．５ｍｇ，１．３０２ｍｍｏｌ，１．５ｅｑ）と化合物Ｂ（２６５．２ｍｇ，０．８６８ｍｍｏｌ）をピリジン（４０ｍＬ）と水（５ｍＬ）の混合溶媒に溶解し、室温で撹拌した。反応開始時のＴＬＣ（展開液：ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ＝１０／１）は、Ｒｆ＝０（ＵＶ，アニスアルデヒド（黒））、０．５５（ＵＶ，アニスアルデヒド（赤紫））、０．６４（ＵＶ，アニスアルデヒド（白））を示した。１２時間後、Ｒｆ＝０．２（ＵＶ，アニスアルデヒド（赤紫））に新たなスポットを確認した。反応溶媒をエバポレーターによって減圧留去することで黄色のオイルを得た。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ＝９／１（ｖ／ｖ））を用いてＲｆ＝０．２のフラクションを分離回収し、溶媒を減圧留去することで白色固体の目的化合物６（ＦＭ１）を得た。1Ｈ−ＮＭＲおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳより生成物の精製を確認した。
収量：３６４．７ｍｇ（０．７４６ｍｍｏｌ），収率：８６．０％
1H-NMR（300Hz，CD3OD）δ=8.43-7.25（4H，pyridyl），7.60（m，1H，ON=CH-），5.70-5.36（s，2H，CH2C(CH3)-），4.47（s，2H，C(=O)CH2ON），6.82，5.06，4.34-3.80，3.20（m，6H，glucose），3.30（s，4H，NHCH2CH2NH），1.92（s，3H，CH2C(CH3)C(=O)）
MALDI-TOF-MS（matrix：DHB）m/z=511.67（M+Na+)
【０１２１】
実施例２：  ジスルフィド型機能性モノマー（ＦＭ２）の合成
（１）  ヒドロキシエチル  ピリジル  ジスルフィド（化合物７）の合成
【０１２２】
【化９】
0006653884.tif 000010
【０１２３】
アルドリチオール−２（１．２１ｇ，６．０ｍｍｏｌ）をメタノール（１０ｍＬ）に溶解し、酢酸（１３０μＬ）を加えた。そこに、メルカプトエタノール（３００μＬ，４．４ｍｍｏｌ）をメタノール（２ｍＬ）に溶解させた溶液を滴下し、室温で３０分間撹拌した。滴下終了後、室温で一晩反応させた。撹拌を止め、減圧留去により黄色のオイルが得られた。カラム（ＡｃＯＥｔ/ヘキサン＝５０／５０（ｖ／ｖ））によりＲｆ＝０．３３のフラクションを回収し、溶媒を除去することで黄色オイル状の目的化合物７を得た。
収量：６１７．９ｍｇ（３．３ｍｍｏｌ），収率：７５％
1H-NMR（300Hz，CDCl3）δ＝8.52（d，1H，pyridyl），7.61（t，1H，pyridyl），7.41（d，1H，pyridyl），7.16（t，1H，pyridyl），3.81（t，2H，-CH2-），2.96（t，2H，-CH2-）
【０１２４】
（２）  メタクリロイルヒドロキシエチル  ピリジル  ジスルフィド（化合物８）の合成
【０１２５】
【化１０】
0006653884.tif 000011
【０１２６】
化合物７（６１７．９ｍｇ，３．３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解させた溶液にＴＥＡ（９８０μＬ，７．０ｍｍｏｌ）を加え、混合物をアイスバスで冷却した。そこに、メタクリロイルクロライド（３８６μＬ，４．０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２ｍＬ）に溶解させた溶液を、撹拌しながら滴下した。混合溶液を室温で３時間撹拌し、飽和食塩水と純水で分液し有機層を回収した。これを無水Ｎａ2ＳＯ4で脱水し、減圧濃縮することで茶色のオイルが得られた。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ＡｃＯＥｔ／ヘキサン＝２／８（ｖ／ｖ））によりＲｆ＝０．３３のフラクションを回収し、溶媒を除去することで黄色のオイル状の目的化合物８を得た。
収量：５５３．８ｍｇ（２．１７ｍｍｏｌ），収率：６５．８％
1H-NMR（300Hz，CDCl3）δ＝8.48（d，1H，pyridinyl），7.69（m，2H，pyridinyl），7.10（m，1H，pyridinyl），6.13（s，1H，vinyl），5.59（s，1H，vinyl），4.40（t，2H，-CH2-），3.09（t，2H，-CH2-），1.96（s，3H，methyl）
【０１２７】
（３）  ３−（メタクリロイルエチルジチオ）プロピオン酸（化合物９）の合成
【０１２８】
【化１１】
0006653884.tif 000012
【０１２９】
ジクロロメタン（１０ｍＬ）に化合物８（５５３．８ｍｇ，２．１７ｍｍｏｌ）を溶解し、室温で撹拌した。その後、３−メルカプトプロピオン酸（２６１μＬ，３．００ｍｍｏｌ）を反応溶液に加え、室温で４時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ＡｃＯＥｔ／ヘキサン＝１／１（ｖ／ｖ））により目的化合物９を分離した。
収量：２９６．６ｍｇ（１．１９ｍｍｏｌ），収率：５４．７％
1H-NMR（300Hz，CDCl3）δ＝6.14（s，1H，vinyl），5.59（s，1H，vinyl），4.41（t，2H，-CH2-），2.97（m，4H，-CH2-CH2-），2.79（t，2H，-CH2-），1.95（s，3H，methyl）
【０１３０】
（４）  ジスルフィド型機能性モノマー（ＦＭ２）の合成
【０１３１】
【化１２】
0006653884.tif 000013
【０１３２】
化合物９（１３７．５ｍｇ，０．５５ｍｍｏｌ）とスルホ−ＮＨＳ（１０８ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）をジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）（３ｍＬ）に溶解し、そこにジシクロヘキシルカルボジイミド（１４７ｍｇ，０．７ｍｍｏｌ）を加えた。反応溶液を室温で２４時間撹拌し、４℃まで冷却することで生成した沈殿を濾過した。溶媒を減圧留去した後、得られた残留物にＡｃＯＥｔ／ヘキサン＝１／１（ｖ／ｖ）を加え、生じた沈殿物を濾過することで白色固体の目的化合物（ＦＭ２）を得た。
収量：９３．１ｍｇ（０．２１ｍｍｏｌ），収率：４１．５％
1H-NMR（300Hz，DMSO-d6）δ＝6.05（s，1H，vinyl），5.70（s，1H，vinyl），4.34（t，2H，-CH2-），3.94（d，1H，-CH-），3.12-2.98（m，8H，-CH2- etc. ），1.88（s，3H，methyl）
【０１３３】
実施例３：  ポストインプリンティング試薬の合成
（１）  ３−ピリジルジチオプロピオン酸（Ｐ１）の合成
【０１３４】
【化１３】
0006653884.tif 000014
【０１３５】
アルドリチオール−２（４０４．６ｍｇ，１．８４ｍｍｏｌ）をエタノール（５ｍＬ）に溶解し、酢酸（５０μＬ）を添加した。そこに、３−メルカプトプロピオン酸（１０４μＬ，１．２ｍｍｏｌ）をエタノール（２ｍＬ）に溶解した溶液を滴下しながら、室温で３０分間撹拌した。滴下終了後、室温でさらに一晩撹拌し続けた。溶媒を減圧留去することで黄色いオイルが得られた。これをカラム（溶離液：ＡｃＯＥｔ／ヘキサン＝２／３⇒１／１（ｖ／ｖ））により分離した。
収量：２３３．２ｍｇ（１．０８ｍｍｏｌ），収率：９０％
1H-NMR（300Hz，CDCl3）δ＝8.47（d，1H，pyridyl），7.67（m，2H，pyridyl），7.18（m，1H，pyridyl），3.08（t，2H，-CH2-），2.79（t，2H，-CH2-）
【０１３６】
（２）  ３−ピリジルジチオエチルアミン（Ｐ２）の合成
【０１３７】
【化１４】
0006653884.tif 000015
【０１３８】
アルドリチオール−２（２．２１ｇ，１０．０ｍｍｏｌ）をメタノール（２０ｍＬ）に溶解し、酢酸（８００μＬ）を添加した。反応容器内の気相をアルゴンガスで置換した後、２−アミノエタンチオール塩酸塩（０．５７ｇ，５．０ｍｍｏｌ）をメタノール（１０ｍＬ）に溶解した溶液を滴下しながら、室温で３０分間撹拌した。滴下終了後、アルゴンガス雰囲気下、室温でさらに２４時間撹拌し続けた。溶媒を減圧留去し、得られた残渣にジエチルエーテルを加え洗浄した。これをメタノール（５ｍＬ）に溶解し、そこにジエチルエーテル（２５ｍＬ）を加えて生じた沈殿を回収した。これを純水に溶解し、１Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨを９に調整した後にＡｃＯＥｔで抽出した。抽出液を無水ＮａＳＯ4で脱水した後に溶媒を減圧留去することで目的化合物Ｐ２を得た。なお、当該化合物Ｐ２は、タンパク質中のアスパラギン酸残基やグルタミン酸残基の側鎖カルボキシ基などの酸性基と相互作用可能なアミノ基を特異的認識空間に導入するためのポストインプリンティング化合物として利用可能である。
収量：３０１ｍｇ（２．７４ｍｍｏｌ），収率：５４．７％
1H-NMR（300Hz，D2O）δ＝8.40（d，1H，pyridinyl），7.99（t，1H，pyridinyl），7.84（d，1H，pyridinyl），7.41（t，1H，pyridinyl），3.22（t，2H，-CH2-），2.97（t，2H，-CH2-）
【０１３９】
実施例４：  タンパク質修飾およびタンパク質インプリンティング・ポストインプリンティング修飾による特異的認識空間の形成
（１）  ＡＦＰへのチオール基の導入
【０１４０】
【化１５】
0006653884.tif 000016
【０１４１】
基材へのタンパク質の固定化とオキシム型機能性モノマーの導入点として、２−イミノチオラン（２−ＩＴ）を用いてチオール基をタンパク質に導入した。また、導入されたチオール基を５，５’−ジチオビス（ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）を用いて定量した。
【０１４２】
１．７９ｍｇ／ｍＬのα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）の水溶液（１００ｍＭ  ＰＢＳ，ｐＨ７．４，０．１％アジ化ナトリウム）へ、ＡＦＰに対して１００ｅｑとなるように２−イミノチオラン溶液（１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ８．０））を添加し、４℃で２４時間反応させた。反応後、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）を用いた限外濾過（ｍｉｌｉｐｏｒｅ製「アミコンウルトラ−０．５」，ＭＷＣＯ：３０ｋＤａ，６０００ｒｐｍ，２０分間×５セット，遠心分離機：ＴＯＭＹ社製「ｓｕｐｒｅｍａ（登録商標）２１」）により反応溶液を精製した。
【０１４３】
その後、精製したＡＦＰ溶液の濃度を算出するために、未修飾のＡＦＰを用いてＵＶ測定から得られた２８０ｎｍの波長における吸光度から検量線を作成した。濃度算出後、ＵＶセル中で１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）を用いてＡＦＰが１μＭ、ＤＴＮＢが２０μＭになるように混合し、ＵＶ測定を行った。ここで、限外濾過後の濾液中に２−ＩＴが含まれていないことをＤＴＮＢを用いて確認することで、反応溶液中の２−ＩＴが全て除去されていることを確認した。具体的には、ＡＦＰに導入されたチオール基とＤＴＮＢとの反応により生成する２−ニトロ−５−メルカプト安息香酸の吸収ピークである４１２ｎｍの吸光度を用いて検量線を作成し、チオール基の濃度を求め、チオール基の濃度をＡＦＰ濃度で除してチオール基導入個数を算出することにより、ＡＦＰ複合体１分子あたり約５個のチオール基が導入されていることを確認した。以降の実験では、１分子に対してチオール基が約５個導入された当該ＡＦＰ複合体（５Ｔ−ＡＦＰ）を用いた。但し、模式的に示す化学反応式には、５個のチオール基は記載していない。また、タンパク質に対する２−ＩＴの使用量を変更することにより、チオール基の導入数は調整可能である。
【０１４４】
（２）  チオール基導入ＡＦＰ（５Ｔ−ＡＦＰ）へのジスルフィド型機能性モノマー（ＦＭ２）の導入
【０１４５】
【化１６】
0006653884.tif 000017
【０１４６】
１分子あたり約５個のチオール基が導入された５Ｔ−ＡＦＰ（３．８２μＭ，２００μＬ）にＦＭ２を５ｅｑ添加し、４℃で２４時間反応させた。反応後、限外濾過（ｍｉｌｉｐｏｒｅ社製「アミコンウルトラ−０．５」，ＭＷＣＯ：３０ｋＤａ，６０００ｒｐｍ，２０分間×５セット，遠心分離機：ＴＯＭＹ社製「ｓｕｐｒｅｍａ（登録商標）２１」）により未反応のＦＭ２を除去した。精製したタンパク質をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（マトリックス：０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル／水＝５０／５０の混合溶媒中のシナピン酸，Ｍｅｔｈｏｄ：ＩｇＧ  ｌｉｎｅｒ）による質量測定とＣＤスペクトル測定から評価した。また、ＦＭ２修飾ＡＦＰの濃度はＵＶ測定から作成したＡＦＰの検量線を用いて算出し、ＣＤスペクトルは未修飾のＡＦＰとＦＭ２修飾ＡＦＰ（ｉｎ  １０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４））の濃度を０．０４μＭに調整し、表１に示した条件で測定した。
【０１４７】
【表１】
0006653884.tif 000018
【０１４８】
分析の結果、５Ｔ−ＡＦＰ１分子に対してＦＭ２が４．１５個、すなわち３〜５個導入されていると算出された。また、ＣＤスペクトルにより、ＦＭ２の導入後もＡＦＰの二次構造は保持されていることが確認された。
【０１４９】
（３）  ＳＰＲ金基板表面への重合官能基およびタンパク質固定化用基修飾
【０１５０】
【化１７】
0006653884.tif 000019
【０１５１】
ＳＰＲ金基板（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製「ＳＩＡ  Ｋｉｔ  Ａｕ」）をＵＶ−Ｏ3処理した後、直ちにビス［２−（２−ブロモイソブチリルオキシ）ウンデシル］ジスルフィドと（１１−メルカプトウンデシル）テトラ（エチレングリコール）をそれぞれ０．５ｍＭずつ、合計１ｍＭ含むエタノール溶液に、３０℃で２４時間浸漬し、金基板上に混合自己組織化単分子膜を形成させた。この基板をエタノールと水で洗浄した後、Ｎ2ブローで乾燥した。続いて５ｍＭ  ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸−ＮＨＳエステルのジクロロメタン溶液に、３０℃で２４時間浸漬し、基板上にタンパク質固定化用基としてピリジルジスルフィド基を導入した。
【０１５２】
（４）  ＳＰＲ金基板上へのＦＭ２修飾ＡＦＰの固定化とオキシム型機能性モノマー（ＦＭ１）の導入
【０１５３】
【化１８】
0006653884.tif 000020
【０１５４】
ＳＰＲによる分子間相互作用解析装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製「Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００」）を用いて、以下の測定条件により、基板上へのＦＭ２修飾ＡＦＰの固定化をモニタリングした。
【０１５５】
測定用セルを装着した状態では固定化を行うことが困難であったため、実際に基板作製を行う場合は１０μｇ／ｍＬのＦＭ２修飾ＡＦＰ溶液を基板上に２００μＬ滴下し、２５℃で１０分間静置することで、基板上へのＦＭ２修飾ＡＦＰの固定化を行なった。ＦＭ２修飾ＡＦＰの固定化後、１ｍＭ  オキシム型機能性モノマー（ＦＭ１）水溶液に２５℃で２４時間浸漬し、基板上で鋳型分子を合成した。その後、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）で基板をリンスし、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）中４℃で保存した。
【０１５６】
測定条件
ランニングバッファー：  １０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）
ＦＭ２修飾ＡＦＰ溶液濃度：  １０μｇ／ｍＬ（濃縮したＦＭ２修飾ＡＦＰ溶液を１０ｍＭリン酸バッファーで希釈）
流速：  ５μＬ／ｍｉｎ
接触時間：  ５分間
インジェクションボリューム：  ２５μＬ
設定温度：  ２５℃
【０１５７】
実験を３回行ったところ、３回ともＲＵ値が２４０増加したことがみられ、ＦＭ２修飾ＡＦＰが基板上に固定化されていることが確認された。
【０１５８】
（５）  特異的認識空間の形成
【０１５９】
【化１９】
0006653884.tif 000021
【０１６０】
表２に示した組成のプレポリマー溶液を用いて、表面開始原子移動ラジカル重合法（ＳＩ−ＡＴＲＰ）によりポリマー合成を行った。詳しい実験操作を以下に示す。重合時間は１時間、温度は４０℃で行った。また、架橋剤比率（コモノマーと架橋剤の合計モル数に対する架橋剤のモル数）を１０％または２０％として２種類のポリマーを合成した。
【０１６１】
【表２】
0006653884.tif 000022
【０１６２】
テフロン（登録商標）セルを装着したＳＰＲ基板を重合用の２０ｍＬスクリュー瓶に入れ、セプタムで封をした。別の２０ｍＬスクリュー瓶中、表２の各組成を有するプレポリマー溶液を作製し、凍結脱気法により溶存酸素を除去した。ＳＰＲ基板の入ったスクリュー瓶を真空引きし、直ちに脱気した１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）に溶解したアスコルビン酸（１００μＬ）を２．５ｍＬディスポーザブルシリンジを用いてプレポリマー溶液に添加し、そのままプレポリマー溶液を吸引し、重合用スクリュー瓶にプレポリマー溶液（１０ｍＬ）を添加した。グリスをセプタム上部と側面に塗布し、４０℃の恒温槽（ＥＹＥＬＡ社製「ＵＮＩＴＨＲＥＭＯ  ＳＨＡＫＥＲ  ＮＴＳ−１２００」）で振とうすることで重合を開始した。
【０１６３】
重合後、基板を純水で洗浄し、ポリマー内部に残存するＣｕイオンを除去するために１Ｍ  ＥＤＴＡ−４ＮＡ水溶液に２５℃で２４時間浸漬した。その後、基板を純水で洗浄し、Ｎ2ブローで乾燥した。続いて、基板をＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００に設置し、トリス−（２−カルボキシエチルホスフィン）（ＴＣＥＰ）水溶液をインジェクションすることで還元による鋳型分子の除去を行い、ＳＰＲにより鋳型分子の除去を確認した。ＳＰＲの測定条件を以下に示す。
【０１６４】
測定条件
ランニングバッファー：  １０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）
還元剤溶液：  ２０ｍＭ  ＴＣＥＰ水溶液
流速：  ２０μＬ／ｍｉｎ
接触時間：  １０分間
インジェクションボリューム：  ２００μＬ
設定温度：  ２５℃
【０１６５】
還元剤（ＴＣＥＰ）をインジェクションした後、バッファーに置換したところＲＵ値が２００減少したことから、鋳型分子が除去されていることが確認された。また、鋳型分子固定化時におけるＲＵ値変化である＋２４０と比較すると、鋳型分子の除去率が８３．３％であると算出された。重合時間が短くポリマー膜が薄いことから、鋳型分子の除去が効率良く進行したと考えられる。
【０１６６】
鋳型分子除去後、以下に示すピリジルジスルフィド誘導体を用いたジスルフィド交換反応により、ＡＦＰのアミノ基との相互作用部位としてカルボキシ基を導入し、または、比較のため水酸基を導入した。
【０１６７】
【化２０】
0006653884.tif 000023
【０１６８】
反応は、５ｍＭ  ３−ピリジルジチオプロピオン酸水溶液または５ｍＭ  ３−ピリジルジチオエタノール水溶液（５０％メタノール，ｖ／ｖ）を、ＳＰＲ測定セルを装着した基板上に２００μＬ滴下し、カバーガラスで封をした状態で２５℃、２４時間浸漬することで行った。反応後、基板を純水で洗浄し、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）中、４℃で保存した。
【０１６９】
参考例１：  選択性試験
上記実施例４で製造された分子インプリント膜のＡＦＰに対する選択性を確認するために、以下の条件でＳＰＲ測定を行った。また、対照タンパク質としてヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）についても同様に測定を行った。なお、ＨＳＡの分子質量は６６．５ｋＤａ、等電点（ＰＩ）は４．７であり、ＡＦＰとのアミノ酸配列同一性は６６％である。
【０１７０】
測定手法
（ｉ）  ランニングバッファー（１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４））でベースラインを安定化
（ｉｉ）  タンパク質溶液をインジェクション（５分間）
（ｉｉｉ）  ランニングバッファーをインジェクション（５分間）
（ｉｖ）  以下、上記（ｉｉ）と（ｉｉｉ）を繰り返し
測定条件
ランニングバッファー：  １０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）
流速：  ２０μＬ／ｍｉｎ
接触時間：  ５分間
インジェクションボリューム：  １００μＬ
タンパク質濃度：  １０，２０，５０，１００，１５０，２００ｎｇ／ｍＬ
（ｉｎ  １０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４））
設定温度：  ２５℃
【０１７１】
架橋剤比率が１０％であるＭＩＰ１０を用い、相互作用部位としてカルボキシ基または水酸基を導入した場合の比較結果を図１に示す。
【０１７２】
図１に示すとおり、特異的認識空間内の特定位置に水酸基を導入した場合に比べ、カルボキシ基を導入した場合には、ＡＦＰに対する感度が顕著に向上した。かかる結果から、ポストインプリンティング修飾による相互作用部位の導入がポリマーのタンパク質認識能に影響を与え、また認識空間内に配置された相互作用部位の電気的特性がタンパク質認識において重要な役割を果たすことが示唆された。
【０１７３】
また、相互作用部位としてカルボキシ基を導入した各架橋剤比率の分子インプリント膜のＡＦＰ結合実験の結果を図２に示す。
【０１７４】
図２のとおり、各ＭＩＰ膜間で結合量自体に大きな差は見られなかった。これは、重合時間が１時間と短く、ポリマー薄膜の厚さが数十ｎｍに過ぎないために、認識空間へのアクセシビリティーに違いがないことに由来すると考えられる。また今回の測定条件では検出限界は２０ｎｇ／ｍＬであった。
【０１７５】
さらに、ＡＦＰとＨＳＡに対する選択性を比較した結果を図３に示す。ＭＩＰ１０とＭＩＰ２０はＨＳＡよりもＡＦＰ結合量が大きく、ＭＩ法によりＡＦＰに対して親和性の高い認識空間が構築されていると考えられる。
【０１７６】
実施例５：  ＱＣＭ−Ｄ金基板上へのＡＦＰインプリントポリマーの作製
（１）  ＱＣＭ−Ｄ金基板表面への重合官能基およびタンパク質固定化用基修飾
水晶振動子センサーを用いたＱＣＭ−Ｄ（Ｑｕａｒｔｚ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ  ｗｉｔｈ  Ｄｉｓｓｉｐａｔｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）法のため、ＱＣＭ−Ｄ金基板上へＡＦＰインプリントポリマーを作製した。
【０１７７】
先ず、ＱＣＭ−Ｄ金基板（ｑｓｅｎｃｅ社製「ＱＳＸ３０１  ＡＵ  １０３４２Ａ」）をＵＶ−Ｏ3処理した後、直ちにＱＣＭ−Ｄ用テフロン（登録商標）セルを装着し、ビス［２−（２−ブロモイソブチリルオキシ）ウンデシル］ジスルフィドと（１１−メルカプトウンデシル）テトラ（エチレングリコール）をそれぞれ０．５ｍＭずつ、合計１ｍＭ含むエタノール溶液（５００μＬ）をセルに滴下した。カバーガラスとパラフィルムで封をし、３０℃で２４時間浸漬することで金基板上に混合自己組織化単分子膜を形成させた。この基板をエタノールと水で洗浄した後、Ｎ2ブローで乾燥した。続いて５ｍＭ  ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸−ＮＨＳエステルのジクロロメタン溶液（５００μＬ）をセルに滴下し、カバーガラスとビニルテープで封をした後に３０℃で２４時間浸漬することで、基板上にタンパク質固定化部位としてピリジルジスルフィド基を導入した。
【０１７８】
（２）  ＱＣＭ−Ｄ金基板上へのＦＭ２修飾ＡＦＰの固定化とオキシム型機能性モノマー（ＦＭ１）の導入
以下の測定手法・条件により、ＱＣＭ−Ｄオープンモジュールを用いて基板上へＦＭ２修飾ＡＦＰを固定化し、その進行状況をモニタリングした。
【０１７９】
測定手法・条件
設定温度：  ２５℃
オーバートーン次数：  ９
（ｉ）  １０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）２００μＬをセルに滴下し、ベースラインを安定化
（ｉｉ）  濃縮したＦＭ２修飾ＡＦＰ溶液を、そのセル内濃度が１０μｇ／ｍＬになるようにセルに１０μＬ添加
（ｉｉｉ）  シグナルが安定したところでセル上の溶液を吸引し、直ちに１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）２００μＬをセルに滴下する操作を３回繰り返し、セル上の余分なＦＭ２修飾ＡＦＰを除去
【０１８０】
ＦＭ２修飾ＡＦＰ溶液のインジェクションから３時間前後でＦ値の減少が停滞し、基板上のＦＭ２修飾ＡＦＰ溶液をバッファーに置換した後のＦ値が−６Ｈｚであったことから、基板上にＦＭ２修飾ＡＦＰが固定化されていることを確認した。また、上記Ｆ値から、Ｓａｕｅｒｂｒｅｙの式により質量換算すると、基板上に固定化されたＦＭ２修飾ＡＦＰの量は３７．０５ｎｇであった。
【０１８１】
（３）  特異的認識空間の形成
上記表２に示した組成のプレポリマー溶液を用いて、ＳＩ−ＡＴＲＰによりポリマー合成を行った。詳しい実験操作を以下に示す。重合時間は１時間、温度は４０℃で行った。また、架橋剤比率は１０％とした。
【０１８２】
テフロン（登録商標）セルを装着したＱＣＭ−Ｄ基板を重合用の５０ｍＬスクリュー瓶に入れ、セプタムで封をした。別の２０ｍＬスクリュー瓶中、表２の各組成を有するプレポリマー溶液を作製し、凍結脱気法により溶存酸素を除去した。ＱＣＭ−Ｄ基板の入ったスクリュー瓶を真空引きし、直ちに脱気した１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）に溶解したアスコルビン酸（１００μＬ）を２．５ｍＬディスポーザブルシリンジを用いてプレポリマー溶液に添加し、そのままプレポリマー溶液を吸引し、重合用スクリュー瓶にプレポリマー溶液（２ｍＬ）を添加した。グリスをセプタム上部と側面に塗布し、４０℃の恒温槽（ＥＹＥＬＡ社製「ＵＮＩＴＨＲＥＭＯ  ＳＨＡＫＥＲ  ＮＴＳ−１２００」）で振とうすることで重合を開始した。
【０１８３】
重合後、基板を純水で洗浄し、ポリマー内部に残存するＣｕイオンを除去するために１Ｍ  ＥＤＴＡ−４Ｎａ水溶液に２５℃で２４時間浸漬した。その後、基板を純水で洗浄し、Ｎ2ブローで乾燥した。続いて、基板をＱＣＭ−Ｄフローモジュールに設置し、トリス−（２−カルボキシエチルホスフィン）（ＴＣＥＰ）水溶液をインジェクションすることで還元による鋳型分子の除去を行い、水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）法により鋳型分子の除去を確認した。ＱＣＭ法の測定条件を以下に示す。
【０１８４】
測定条件
ランニングバッファー：  １０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）
還元剤溶液：  ２０ｍＭ  ＴＣＥＰ水溶液
流速：  ２５μＬ／ｍｉｎ
インジェクションボリューム：  ２．２５ｍＬ
設定温度：  ２５℃
オーバートーン次数：９
【０１８５】
還元剤（ＴＣＥＰ）溶液をインジェクションしたところ、Ｆ値の増加が確認された。還元剤溶液をバッファーに置換した後のＦ値が５．５Ｈｚ（＝３４．０ｎｇ）であったことから、鋳型分子の除去率は９１．７％と算出された。重合時間が短くポリマー膜が薄いことから、鋳型分子の除去が効率良く進行したと考えられる。
鋳型分子除去後、ピリジルジスルフィド誘導体を用いたジスルフィド交換反応により、ＡＦＰとの相互作用部位としてカルボキシ基を導入した。反応は、５ｍＭ  ３−ピリジルジチオプロピオン酸水溶液に基板を２５℃で２４時間浸漬することで行った。反応後、基板を純水で洗浄し、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）中、４℃で保存した。
【０１８６】
（４）  ＡＦＰ認識空間への蛍光レポーター化合物導入
相互作用部位導入後の基板を１ｍＭ  Ｃｙ５−ＮＨＳエステルのＤＭＳＯ溶液に２５℃で１２時間浸漬し、アルコキシアミン基とのカップリングにより蛍光レポーター化合物であるＣｙ５をＡＦＰ認識空間に導入した。
【０１８７】
参考例２：  ＱＣＭ−Ｄ測定によるポリマーの特性評価
上記実施例５で製造された分子インプリント膜のＡＦＰ結合能について、ＱＣＭ−Ｄフローモジュールを用いて、以下の測定手法・条件によりＡＦＰ再結合実験を行った。
【０１８８】
測定手法
（ｉ）  ランニングバッファー（１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４））でベースラインを安定化
（ｉｉ）  タンパク質溶液をインジェクション（５分間）
（ｉｉｉ）  ランニングバッファーをインジェクション（５分間）
（ｉｖ）  以下、上記（ｉｉ）と（ｉｉｉ）を繰り返し
【０１８９】
測定条件
ランニングバッファー：  １０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）
流速：  ２５μＬ／ｍｉｎ
接触時間：  ５分間
インジェクションボリューム：  １２５μＬ
設定温度：  ２５℃
オーバートーン次数：９
タンパク質濃度：０．１，０．２，０．５，１．０，２．０，５．０，１０μｇ／ｍＬ
（ｉｎ  １０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４））
【０１９０】
架橋剤比率が１０％のＭＩＰ膜（ＭＩＰ１０）を用い、ＱＣＭ−Ｄ測定により得られたＦ値を図４（１）に、Ｄ値を図４（２）に示す。
【０１９１】
Ｆ値の減少から、ＭＩＰ膜へのＡＦＰの吸着が確認でき、本実施例の測定条件では検出限界が２５０ｎｇ／ｍＬであった。また、Ｄ値に関して、ＭＩＰ膜へのＡＦＰの吸着によって微増した。これは、ＭＩＰ膜へのＡＦＰの吸着によって、ＡＦＰ自身の粘性・弾性の値がポリマーの粘性・弾性（Ｄ値）も変化として表れたと考えられる。
【０１９２】
実施例６：  蛍光顕微鏡観察によるポリマーの特性評価
ＱＣＭ−Ｄウィンドウモジュールに、上記実施例５で得たＭＩＰ膜形成基板を設置し、以下の条件下、蛍光顕微鏡によってＡＦＰの吸着に伴う基板の蛍光変化を観察した。また、対照タンパク質としてヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）についても同様に測定を行った。さらに、リン酸バッファーの代わりに１００希釈血清を用い、同様に実験を行った。
【０１９３】
測定条件・操作
ランニングバッファー：  １０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）
流速：  ２５μＬ／ｍｉｎ
接触時間：  ５分間
インジェクションボリューム：  １２５μＬ
タンパク質濃度：  １０，２０，５０，１００，１５０，２００ｎｇ／ｍＬ
（ｉｎ  １０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４））
（ｉ）  ＱＣＭ−Ｄウィンドウモジュールに基板を設置し、ランニングバッファーをインジェクションし、初期蛍光（Ｉ0）を測定
（ｉｉ）  ＡＦＰ溶液を５分間インジェクション
（ｉｉｉ）  ランニングバッファーを５分間インジェクションしてリンスした後、蛍光を測定
【０１９４】
蛍光顕微鏡条件
対物レンズ：  倍率１０×，Ｎ．Ａ．０．３０
蛍光フィルター：  Ｅｘｃｉｔｅｒ：６００〜６５０ｎｍ，Ｅｍｉｔｔｅｒ：６７５〜７２５ｎｍ
露光時間：  ０．１ｓｅｃ
【０１９５】
データ処理方法
（ｉ）  測定開始前のバッファーで満たされた状態下、金基板上で５つエリアを選択し、そのエリアの平均蛍光強度の平均値をＩin（ｔ＝０）、基板上の金ではない淵の部分で５つエリアを選択し、そのエリアの平均蛍光強度の平均値をＩout（ｔ＝０）として得た
（ｉｉ）  各タンパク質溶液をインジェクションし、バッファーでリンスした後の金基板上で５つエリアを選択しそのエリアの平均蛍光強度の平均値をＩin（ｔ）、基板上の金ではない淵の部分で５つエリアを選択しそのエリアの平均蛍光強度の平均値をＩout（ｔ）として得た
（ｉｉｉ）  測定毎のずれを補正するために、以下の式に従って測定毎の平均蛍光強度を算出した
Ｉreal（ｔ）＝［Ｉin（ｔ）／Ｉout（ｔ）］×Ｉout（ｔ＝０）
（ｉｖ）  以下の式から相対蛍光強度変化を算出する。
［Ｉreal（ｔ）−Ｉreal（ｔ＝０）］／Ｉreal（ｔ＝０）
【０１９６】
コモノマーに対する架橋剤比率が１０％のＭＩＰ膜（ＭＩＰ１０）を用いて得られた結果を図５に示す。図５中、「Ｉ」はＩreal（ｔ）に対応し、「Ｉ0」はＩreal（ｔ＝０）に対応している。
【０１９７】
図５のとおり、インジェクションするタンパク質濃度の増加とともに蛍光強度の減少が確認されたことから、ポストインプリンティング修飾により特異的認識空間内に蛍光レポーター化合物を導入することで、タンパク質吸着挙動を蛍光強度により検出できることが明らかとなった。また、本発明に係るＭＩＰ膜は、ＨＳＡよりもＡＦＰをインジェクションした場合に大きな蛍光強度の変化を示し、ＡＦＰ以外の物質を含む１００倍希釈血清中においてもＡＦＰを認識可能であった。さらに、上記参考例１のとおりＳＰＲ測定法によるＡＦＰ検出限界は２０ｎｇ／ｍＬ、上記参考例２のとおりＱＣＭ−Ｄ測定法によるＡＦＰ検出限界は２５０ｎｇ／ｍＬであったのに対して、蛍光強度による測定でのＡＦＰは１ｎｇ／ｍＬと、ＳＰＲ測定法の２０倍、ＱＣＭ−Ｄ測定法の２５０倍であり、蛍光強度による測定では検出感度が顕著に向上し、十分臨床応用可能な感度を示すことが明らかとなった。
【０１９８】
実施例７：  蛍光レポーター化合物導入量と検出感度との関係の検証
ＡＦＰに導入されたチオール基はＵＶ−ｖｉｓ測定から５つであることが分かっている。このうち１つが基板上への複合体の固定化に使用されているため、Ｃｙ５導入点は４箇所である。そこで、上記実施例５（４）において、Ｃｙ５−ＮＨＳエステルのＤＭＳＯ溶液の代わりに、Ｃｙ５−ＮＨＳエステル：Ａｃ−ＮＨＳエステル＝１：３，２：２，４：０の混合ＤＭＳＯ溶液を用い、ＱＣＭ−Ｄ金基板上に、ＡＦＰ特異的認識空間内に蛍光レポーター化合物Ｃｙ５が導入されたＡＦＰインプリントポリマーを形成した。溶液中におけるＣｙ５−ＮＨＳエステルとＡｃ−ＮＨＳエステルの濃度は、合計で１ｍＭとなるようにした。
【０１９９】
蛍光顕微鏡の対物レンズの倍率を４倍とし、観察エリアを５箇所から３箇所にした以外は上記実施例７と同様にして、相対蛍光強度変化を算出した。各基板におけるＩ0の値を表３に、タンパク質濃度と相対蛍光強度変化との関係を図６に示す。
【０２００】
【表３】
0006653884.tif 000024
【０２０１】
表３と図６に示す結果より、Ｃｙ５導入比率が高いものほどＩ0の値が大きく、また検出感度が優れているという結果になった。この結果は、蛍光レポーター化合物の多点導入により蛍光強度そのものが大きくなり、タンパク質吸着に伴う蛍光強度変化が大きくなることで検出感度が向上したことを示しているといえる。
【０２０２】
実施例８：  不純物を含む試料中での対象タンパク質の検出
測定試料として、ＡＦＰのみを含む水溶液の他、不純物を含む試料として１００倍希釈血清にＡＦＰを溶解した溶液と、ＡＦＰに加えて１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む溶液についても、上記実施例７と同様に蛍光強度変化を算出した。結果を図７に示す。
【０２０３】
図７に示す結果のとおり、１００倍希釈血清下では、本発明に係るＭＩＰ膜のＡＦＰに対する感度はほとんど変わらない。また、ＢＳＡ存在下では、感度は低下するものの、ＡＦＰの検出は十分に可能であった。
【０２０４】
実施例９：  選択性の確認
本発明に係るＭＩＰ膜のＡＦＰに対する選択性を確認するために、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）溶液についても上記実施例７と同様に蛍光強度変化を算出した。結果を図８に示す。
【０２０５】
図８のとおり、本発明に係るＭＩＰ膜へのＰＳＡの結合による蛍光強度変化は、ＡＦＰに比べて遥かに小さく、特異的認識空間への結合量が少ないという結果であった。その理由としては、本発明に係るＭＩＰ膜のＡＦＰ特異的認識空間がＰＳＡを認識しなかったことや、ＰＳＡが特異的認識空間内に担持されなかったためであると考えられる。
【０２０６】
参考例３：  プラズモニック基板上へのＨＳＡインプリントポリマーの作製
（１）  機能性モノマーとしてのアクリル酸ピロリジルの合成
【０２０７】
【化２１】
0006653884.tif 000025
【０２０８】
Ｎ−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピロリジン（５６１．６ｍｇ，３．０ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ，７８４μＬ，４．５ｍｍｏｌ）をジクロロメタンに溶解させ、そこに滴下ロートを用いて塩化アクリル（３６３μＬ，４．５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液を加えた。氷冷下で１時間撹拌した後、さらに室温で１２時間撹拌した。反応後、反応溶液を飽和ＮａＨＣＯ3水溶液と飽和クエン酸水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水し、溶媒をエバポレーターにて減圧留去した後、オートカラム（ＹＡＭＡＺＥＮ社製，溶離液：ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ＝１／１）にて精製を行い、透明オイル状の中間体を得た。1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ−ＣＤＣｌ3）で中間体の合成を確認した。
収量：５７７．６ｍｇ（２．３９ｍｍｏｌ），  収率：７９．８％
【０２０９】
得られた中間体（５７７ｍｇ，２．３９ｍｍｏｌ）をジクロロメタンに溶解させ、氷冷下（０℃）で撹拌した。そこに４．０Ｍ  ＨＣｌ／ジオキサン（４．０ｍＬ，８．００ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液を加え、そのまま一晩撹拌した。反応溶液中に生じた沈殿物を桐山濾過にて回収し、真空乾燥させることで白色固体状の目的物３を得た。1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ−ＣＤＣｌ3）で目的物の合成を確認した。
収量：３８９．１ｍｇ（２．１９ｍｍｏｌ），  収率：９１．７％
【０２１０】
（２）  ３−（２−ピリジル）−ジチオプロピオン酸の合成
【０２１１】
【化２２】
0006653884.tif 000026
【０２１２】
２，２’−ジピリジルジスルフィド（４０４．６ｍｇ，１．８４ｍｍｏｌ）と酢酸（５０μＬ）をエタノールに溶解させ、そこに３−メルカプトプロピオン酸（１０４μＬ，１．２ｍｍｏｌ，エタノール溶液）を約３０分かけて添加した。その後、室温にて一晩撹拌して、溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル／ヘキサン＝２／３→１／１（ｖ／ｖ））にて精製した。1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ−ＣＤＣｌ3）で目的物の合成を確認した。
収量：２３３．２ｍｇ（１．０８ｍｍｏｌ），  収率：９０％
【０２１３】
（３）  ピリジルチオエチルアミン塩酸塩の合成
【０２１４】
【化２３】
0006653884.tif 000027
【０２１５】
２，２’−ジピリジルジスルフィド（２．２１ｇ，１０．０ｍｍｏｌ）と酢酸（０．８ｍＬ）をメタノール（２０ｍＬ）に溶解させ、そこに２−アミノエタンチオール塩酸塩（０．５７ｇ，５．０ｍｍｏｌ，１０ｍＬメタノール溶液）を３０分かけて加えた。添加後、反応液を２４時間室温にて撹拌した。反応後、反応液をエバポレーターにて減圧留去し、残渣をジエチルエーテルにて２回洗浄した。洗浄後、少量のメタノール（５ｍＬ）に再溶解させ、過剰量（２５ｍＬ）のジエチルエーテルを加えることで目的物を沈殿させた。この操作を２回行った。得られた沈殿をＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解させ、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨを９に調整し、酢酸エチルにて４回抽出した。有機層を回収し、無水硫酸ナトリウムで脱水した後、溶媒を減圧留去して目的物を得た。1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ−ＣＤＣｌ3）で目的物の合成を確認した。
収量：３０１ｍｇ（２．７４ｍｍｏｌ），  収率：５４．７％
【０２１６】
（４）  プラズモニックチップの作製
無リン酸洗浄剤（「ｄｅｃｏｎ（登録商標）」ＡＲＢＲＯＷＮ社製）の５ｖｏｌ％溶液、純水、純水、エタノールを順に用いて、ガラス基板をそれぞれ１０分間ずつ超音波洗浄した。超音波洗浄後、エタノールでリンスし、ドライヤーで乾燥させた。純水：エタノール：１ｍｏｌ／Ｌ酢酸＝５０：２５：２５（容量基準）の混合溶液に３−メタクリロイルプロピルトリメトキシシランを溶解した１ｖｏｌ％溶液に、超音波洗浄したガラス基板を浸漬させ、４０℃で１時間反応させた。メタクリロイル化ガラス基板をエタノールでリンスし、ドライヤーで乾燥させた。
【０２１７】
メタクリロイル化したガラス基板の上からＵＶ硬化性樹脂を滴下し、石英ガラス製のモールド１（２５×２５ｍｍ，周期構造：４×４ｍｍ，周期：５００ｎｍ，溝深さ：３０ｎｍ，凹凸比：０．５）、或いはモールド２（４．３×９．８ｍｍ，周期構造：３×３ｍｍ，周期：４８０ｎｍ，溝深さ：２７ｎｍ，凹凸比：０．５５）を上から被せた。続いてＵＶを照射し、光ナノインプリント法により周期構造を作製した後、エタノールで３分間超音波洗浄し、真空下で乾燥させた。
【０２１８】
周期構造がインプリントされたガラス基板を、Ａｒ雰囲気下、室温でｒｆスパッタを行った。Ａｇベースのプラズモニックチップは、３ｎｍ程度のＴｉ、１４５±１５ｎｍのＡｇ、３ｎｍ程度のＴｉ、最後に消光抑制層として２０ｎｍ程度のＳｉＯ2を成膜した。Ａｕベースのプラズモニックチップは、３ｎｍ程度のＴｉ、１５０±１５ｎｍのＡｕ層を成膜した。図９はモールド２で作製したＡｇベースのプラズモニックチップの走査型プローブ顕微鏡による観察画像である。
【０２１９】
（５）  プラズモニックチップ上へのＨＳＡインプリントポリマーの作製
モールド１で周期構造を形成し、チタンと金をスパッタしたプラズモニックチップ（以下、「Ｔｉ／Ａｕプラズモニックチップ」という）をＤＭＦと純水で洗浄後、２０分間ＵＶ−Ｏ3処理した。次に、シリコンシートを貼り付け、２．５ｍＭビス［２−（２−ブロモイソブチリルオキシ）ウンデシル］ジスルフィドと５ｍＭ  １１−アミノ−１−ウンデカンチオール塩酸塩の混合ＤＭＦ溶液（ＳＡＭのモル比：Ｂｒ／ＮＨ2＝１／１）（１００μＬ）を滴下し、２５℃、２４時間反応させることでＭｉｘｅｄ  ＳＡＭを作製した。反応後、ＤＭＦと純水で洗浄し、Ｎ2ガスによって乾燥させた。
【０２２０】
Ｍｉｘｅｄ  ＳＡＭ形成Ｔｉ／Ａｕプラズモニックチップ上に、５ｍＭ  ＤＩＥＡ，５ｍＭ  ＥＤＣ・ＨＣｌ，５ｍＭ  ３−（２−ピリジル）−ジチオプロピオン酸の混合ＤＭＦ溶液（１００μＬ）を滴下し、室温で２時間反応させた後、ＤＭＦで洗浄することで、ジスルフィドを導入した。
【０２２１】
ジスルフィドを導入したＴｉ／Ａｕプラズモニックチップ上に、５ｍＭチオグリコール酸水溶液（１００μＬ）を滴下し、室温で２時間反応させることでジスルフィド交換反応によりカルボン酸を導入した。反応後、純水で洗浄した。
【０２２２】
カルボン酸を導入したＴｉ／Ａｕプラズモニックチップ上に、５ｍＭ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド，５ｍＭ  ＤＩＥＡ，５ｍＭ  ＥＤＣ・ＨＣｌの混合ＤＭＦ溶液（１００μＬ）を滴下し、室温で２時間反応させて、活性エステルを導入した。反応後、ＤＭＦで洗浄した。
【０２２３】
活性エステルを導入したＴｉ／Ａｕプラズモニックチップ上に、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の１００μｇ／ｍＬリン酸緩衝液溶液（ｐＨ７．４，１００μＬ）を滴下し、室温で１時間反応させることで、ＨＳＡを固定化した。反応後、純水で洗浄した。
【０２２４】
ＨＳＡ固定化Ｔｉ／Ａｕプラズモニックチップに２ｍＭアクリル酸ピロリジル，３０ｍＭ  ＭＰＣ，８ｍＭ  ＭＢＡＡ，０．５ｍＭ  ＣｕＢｒ2，１ｍＭ  ２，２’−ビピリジル混合水溶液（１２０μＬ）を滴下し、脱気窒素置換を行った。０．２５ｍＭ  Ｌ−アスコルビン酸水溶液（３０μＬ）を滴下し、表面開始アクチベーターによる原子移動ラジカル重合（ＳＩ−ＡＧＥＴ−ＡＴＲＰ）を開始し、２５℃で１時間反応させた。プレポリマー溶液の組成を表４に示す。重合後、純水で洗浄した。次いで、２００ｍＭ  ＥＤＴＡ−４Ｎａ溶液を滴下し、室温で一晩反応させることにより銅（Ｃｕ2+）を除去した。
【０２２５】
【表４】
0006653884.tif 000028
【０２２６】
銅除去後のＴｉ／Ａｕプラズモニックチップ上に、５ｍＭ  トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン水溶液（１００μＬ）を滴下し、室温で２時間反応させることでジスルフィド結合を還元した。反応後、純水で洗浄した。
【０２２７】
還元したＴｉ／Ａｕプラズモニックチップ上に、３３０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．３３ｗｔ％  ＳＤＳ混合水溶液（１００μＬ）を滴下し、室温で２時間静置することでＨＳＡを除去した。静置後、純水で洗浄した。
【０２２８】
ＨＳＡ−ＭＩＰ上に、５ｍＭ  ピリジルチオエチルアミン塩酸塩の水溶液を滴下し、室温で２時間反応させ、ジスルフィド交換反応により１級アミンを導入した。反応後純水で洗浄した。
【０２２９】
ＨＳＡ−ＭＩＰ薄膜内のＨＳＡ鋳型空間内に蛍光分子を導入する場合は、以下の操作を行った。１級アミンを導入したＨＳＡ−ＭＩＰに、５ｍＭ  Ｃｙ３．５−ＮＨＳ  ＤＭＦ溶液、５ｍＭ  Ｃｙ５−ＮＨＳ  ＤＭＦ溶液、或いは２．５ｍＭ  Ｃｙ３．５−ＮＨＳと２．５ｍＭ  Ｃｙ５−ＮＨＳの混合ＤＭＦ溶液をそれぞれ滴下し、室温で１時間反応させた。反応後、ＤＭＦで洗浄した。
【０２３０】
参考例４：  プラズモニックチップにおける周期構造による蛍光増強効果
参考例３で作製したＨＳＡ−ＭＩＰプラズモニックチップに、０ｎＭ，５０ｎＭ，１００ｎＭ，２００ｎＭ，４００ｎＭまたは８００ｎＭのＣｙ５ラベル化ＨＳＡ溶液（１０ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ７．４）を５０μＬ滴下し、１０分間反応させた。Ｃｙ５ラベル化ＨＳＡについては、Ｃｙ５ラベル化キットを用い、定法により作製した。反応後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４，１００μＬ）で３回リンスした。次いで、以下の条件下、蛍光顕微鏡で測定し、プラズモニックチップの周期構造による蛍光増強効果について評価した。
【０２３１】
蛍光顕微鏡：  ＩＸ−７３（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）
カメラ：  Ｕ−ＨＧＬＧＰＳ（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）
対物レンズ：  ×１０
露光時間  ０．５秒
Ｃｙ５用蛍光フィルター：  Ｅｘｃｉｔｅｒ：６０８〜６４８ｎｍ，Ｅｍｉｔｔｅｒ：６７２〜７１２ｎｍ
【０２３２】
結果を図１０に示す。図１０に示すように、Ｃｙ５−ＨＳＡの濃度とともに蛍光強度は上昇する様子が観察され、周期構造内と周期構造外でその蛍光強度を比較したところ、周期構造内では蛍光強度は約６．５倍大きく、周期構造による蛍光増強効果が確認された。
【０２３３】
よって、プラズモニックチップの特異的認識空間内へ、さらに標的タンパク質であるＨＳＡと相互作用可能なポストインプリンティング化合物を挿入すれば、より一層高感度での測定が可能になることが予想される。
【０２３４】
参考例５：  ポストインプリンティング修飾法により蛍光物質を導入したＨＳＡ−ＭＩＰプラズモニックチップでのＨＳＡ蛍光検出
（１）  Ｃｙ３．５導入ＨＳＡ−ＭＩＰでのＨＳＡ蛍光検出
蛍光分子としてＣｙ３．５を導入したＨＳＡ−ＭＩＰと、濃度３．１２５ｎＭ，６．２５ｎＭ，１２．５ｎＭ，２５ｎＭまたは５０ｎＭのＨＳＡの１０ｍＭリン酸緩衝液溶液（ｐＨ７．４，５０μＬ）溶液をそれぞれ２０分間反応させた後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）でリンスし、下記条件下、蛍光顕微鏡で測定した。
【０２３５】
蛍光顕微鏡：  ＩＸ−７３（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）
カメラ：  Ｕ−ＨＧＬＧＰＳ（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）
対物レンズ：  ×１０
露光時間：  ０．１秒
Ｃｙ３用蛍光フィルター：  Ｅｘｃｉｔｅｒ：５１１〜５５１ｎｍ，Ｅｍｉｔｔｅｒ：５７３〜６１３ｎｍ
【０２３６】
結果を図１１に示す。図１１に示すように、ＨＳＡ濃度上昇と共に相対蛍光強度は減少し、Ｃｙ３．５を導入したＨＳＡ−ＭＩＰプラズモニックチップにてＨＳＡの結合情報を蛍光強度変化として読み出すことが可能であることが実証された。
【０２３７】
（２）  Ｃｙ５導入ＨＳＡ−ＭＩＰでのＨＳＡ蛍光検出
蛍光分子としてＣｙ５を導入したＨＳＡ−ＭＩＰと、濃度３．１２５ｎＭ，６．２５ｎＭ，１２．５ｎＭ，２５ｎＭまたは５０ｎＭのＨＳＡの１０ｍＭリン酸緩衝液溶液（ｐＨ７．４，５０μＬ）溶液をそれぞれ２０分間反応させた後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）でリンスし、下記条件下、蛍光顕微鏡で測定した。
【０２３８】
蛍光顕微鏡：  ＩＸ−７３（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）
カメラ：  Ｕ−ＨＧＬＧＰＳ（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）
対物レンズ：  ×１０
露光時間：  ０．１秒
Ｃｙ５用蛍光フィルター：  Ｅｘｃｉｔｅｒ：６０８〜６４８ｎｍ，Ｅｍｉｔｔｅｒ：６７２〜７１２ｎｍ
【０２３９】
結果を図１２に示す。図１２に示すように、ＨＳＡ濃度上昇と共に相対蛍光強度は減少し、Ｃｙ５を導入したＨＳＡ−ＭＩＰプラズモニックチップにてＨＳＡの結合情報を蛍光強度変化として読み出すことが可能であることが実証された。
【０２４０】
（３）  Ｃｙ３．５＋Ｃｙ５導入ＨＳＡ−ＭＩＰでのＨＳＡ蛍光検出
蛍光分子としてＣｙ３．５とＣｙ５を導入したＨＳＡ−ＭＩＰと、濃度３．１２５ｎＭ，６．２５ｎＭ，１２．５ｎＭ，２５ｎＭまたは５０  ｎＭのＨＳＡの１０ｍＭリン酸緩衝液溶液（ｐＨ７．４，５０μＬ）をそれぞれ２０分間反応させた後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）でリンスし、下記条件下、蛍光顕微鏡で測定した。
【０２４１】
蛍光顕微鏡：  ＩＸ−７３（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）
カメラ：  Ｕ−ＨＧＬＧＰＳ（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）
対物レンズ：  ×１０
露光時間：  ０．１秒
Ｃｙ３用蛍光フィルター：  Ｅｘｃｉｔｅｒ：５１１〜５５１ｎｍ，Ｅｍｉｔｔｅｒ：５７３〜６１３ｎｍ
Ｃｙ３−Ｃｙ５用蛍光フィルター：  Ｅｘｃｉｔｅｒ：５１１〜５５１ｎｍ，Ｅｍｉｔｔｅｒ：６７２〜７１２ｎｍ
【０２４２】
Ｃｙ３−Ｃｙ５用蛍光フィルター用いた結果を図１３（１）に、Ｃｙ３用蛍光フィルターを用いた結果を図１３（２）に示す。図１３に示すように、Ｃｙ３−Ｃｙ５用フィルターで観察した場合にはＨＳＡの濃度とともに相対蛍光強度は減少し、逆にＣｙ３用フィルターで観察した場合にはＨＳＡの濃度とともに相対蛍光強度は上昇した。この結果は、ＨＳＡ鋳型空間内においてＣｙ３．５とＣｙ５との間で蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を起こっていたが、ＨＳＡと相互作用することにより解消され、Ｃｙ３．５の蛍光強度が上昇し、Ｃｙ５側の蛍光強度は減少したものと考えられる。このように、Ｃｙ３．５とＣｙ５を導入したＨＳＡ−ＭＩＰプラズモニックチップにてＨＳＡの結合情報を蛍光強度変化として読み出すことが可能であることが実証された。
【０２４３】
参考例６：  ボロン酸との結合により前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を配向固定化した分子インプリントポリマーの作製
（１）  機能性モノマーの合成
【０２４４】
【化２４】
0006653884.tif 000029
【０２４５】
（１−１）  Ｎ−Ｂｏｃ−エチレンジアミンの合成
二炭酸  ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（２．０ｇ，９．０８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶解させ、エチレンジアミン（７．０ｍＬ，１００ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解させた溶液に、氷冷下で攪拌しながら１時間かけて滴下し、室温で一晩攪拌した。ＴＬＣにて二炭酸  ジ−ｔｅｒｔ−ブチルのスポット（Ｒｆ＝０．８，展開溶媒：ジクロロメタン，アニスアルデヒドで発色）の消失および生成物のスポット（Ｒｆ＝０．３，展開溶媒：メタノール，ニンヒドリンで発色）を確認し、反応終了とした。反応溶液を減圧留去し、残渣に水を加えてジ−Ｂｏｃ−エチレンジアミンを析出させメンブレンフィルター（孔径：０．２２μｍ）を用いて濾別した。炭酸ナトリウムを用いて溶液を塩基性にした後、ジクロロメタンで抽出した。有機層を飽和炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した。ＴＬＣのスポットは１つ（Ｒｆ＝０．３，展開溶媒：メタノール，ニンヒドリンで発色）になった。溶媒を減圧留去し、真空乾燥を行うことで無色のオイル状の生成物を得た。1Ｈ−ＮＭＲにて目的物であることを確認した。
収量：８８２ｍｇ，  収率：６０．５％
【０２４６】
（１−２）  ２−メタクリロイルアミノエチルカルバミン酸  ｔｅｒｔ−ブチルエステルの合成
メタクリル酸（５５６μＬ，６．６ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（１３７１ｍｇ，７．１５ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１２４０μＬ，７．１５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解した。Ｎ−Ｂｏｃ−エチレンジアミン（８８２ｍｇ）をジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解した溶液を、氷冷および窒素雰囲気下で加え、２時間攪拌したのち室温で一晩攪拌した。目的物のスポット（Ｒｆ＝０．６２，展開溶媒：メタノール，ニンヒドリン発色とＵＶを使用）を確認して反応を終了とした。反応溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、クエン酸水溶液、および飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。このときＴＬＣのスポットは２つ（Ｒｆ＝０．６２と０．２５，展開溶媒：メタノール，ニンヒドリン発色とＵＶを使用）であった。溶液を減圧留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィ−（オートカラム，溶離液：酢酸エチル／ジクロロメタン＝１／１⇒１／０）にて精製を行い、白色固体状の目的物を得た。1Ｈ−ＮＭＲにより目的物であることを確認した。
収量：９３８ｍｇ，  収率：７４．９％
【０２４７】
（１−３）  ２−メタクリロイルアミノエチルカルバミン酸塩酸塩の合成
２−メタクリロイルアミノエチルカルバミン酸  ｔｅｒｔ−ブチルエステル（９３８ｍｇ，４．１２ｍｍｏｌ）をジクロロメタンに溶解し、氷冷下で攪拌しながら４．０Ｍ  ＨＣｌ／ジオキサン（４ｅｑ，４．１３ｍＬ，１６．５２ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩攪拌した。目的物のスポット（Ｒｆ＝０，展開溶媒：酢酸エチル，ニンヒドリン発色とＵＶを使用）の出現、また原料のスポット（Ｒｆ＝０．４５，展開溶媒：酢酸エチル，ニンヒドリン発色とＵＶを使用）の消失を確認し、反応終了とした。生成した白色の沈殿をジエチルエーテルで洗浄した。1Ｈ−ＮＭＲにより目的物であることを確認した。
収量：６２８ｍｇ，  収率：９２％
【０２４８】
（１−４）  ４−［２−（Ｎ−メタクリルアミド）エチルアミノメチル］安息香酸の合成
２−メタクリロイルアミノエチルカルバミン酸塩酸塩（１３０ｍｇ，１ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（２８０μＬ，２ｍｍｏｌ）をメタノール（５ｍＬ）に溶解し、氷冷下で攪拌しながら４−ホルミル安息香酸（１５０ｍｇ，１ｍｍｏｌ）を加え、氷冷下で２時間、室温で一晩攪拌した。ＴＬＣにて反応生成物である４−［２−（Ｎ−メタクリルイミド）エチルアミノメチル］安息香酸のスポットを確認した（Ｒｆ＝０．５６，展開溶媒：ジクロロメタン／メタノール＝１／１，ニンヒドリン発色とＵＶを使用）。氷冷下で反応溶液に還元剤として水素化ホウ素ナトリウム（３８ｍｇ，１ｍｍｏｌ）を加え、２時間攪拌した。ＴＬＣで目的物のスポット（Ｒｆ＝０．５５，展開溶媒：メタノール，ニンヒドリン発色とＵＶを使用）を確認した。また、未反応の４−［２−（Ｎ−メタクリルイミド）エチルアミノメチル］安息香酸のスポット（Ｒｆ＝０．６７，展開溶媒：メタノール，ニンヒドリン発色とＵＶを使用）を確認したので水素化ホウ素ナトリウム（２０ｍｇ，０．５３ｍｍｏｌ）を追加し、さらに２時間攪拌した。還元前の化合物のスポットの消失を確認し、反応溶液に純水を加えて反応を停止した。反応後の溶液を減圧濃縮し、得られた残渣をジクロロメタンで洗浄した。残渣をＭｅＯＨに溶解しシリカゲルカラムクロマトグラフィー（オートカラム，溶離液：メタノール／ジクロロメタン＝１／３⇒１／１）にて精製し、白色固体を得た。1Ｈ−ＮＭＲにより目的物であることを確認した。
収量：１０１．３ｍｇ，  収率：３８．６％
【０２４９】
（２）  リンカー分子であるＯ−（２−カルボキシエチル）−Ｏ’−（２−ピリジルジチオエチル）ヘプタエチレングリコールの合成
【０２５０】
【化２５】
0006653884.tif 000030
【０２５１】
２，２’−ジピリジルジスルフィド（１３７ｍｇ，３ｅｑ）と酢酸（４０μＬ）をメタノールに溶解させ、そこに、溶解させたＯ−（２−カルボキシエチル）−Ｏ’−（２−メルカプトエチル）ヘプタエチレングリコール（１００ｍｇ，０．２０８ｍｍｏｌ）をメタノールに溶解させた溶液を滴下し、室温で一晩撹拌した。溶液は透明から黄色に変化した。溶媒を減圧留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（オープンカラム，溶離液：酢酸エチル／ヘキサン＝１／１⇒酢酸エチル⇒酢酸エチル／メタノール＝４／１）にて精製を行い、無色のオイル状の物質を得た。1Ｈ−ＮＭＲにより目的物であることを確認した。
収量：４８ｍｇ，  収率：４０％
【０２５２】
（３）ガラス基板上へのＰＳＡインプリント薄膜の合成
ガラス基板（０．５×１０ｍｍ）をピラニア溶液に５分間浸漬し、エタノールで洗浄後１％  ３−アミノプロピルトリエトキシシラン溶液（溶媒：エタノール／水＝９５／５）に１時間浸漬させた。基板をエタノールで洗浄した後、ホットプレートを用いて１１０℃で１５分間焼成した。
【０２５３】
１．５ｍＭリンカー分子，３ｍＭ  Ｂｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ６−ＣＯＯＨ，０．１Ｍ  ＥＤＣ・ＨＣｌ，および０．１Ｍ  ＤＩＥＡをジクロロメタン（２ｍＬ）に溶解し、ＡＰＴＥＳ修飾したガラス基板を２５℃で１２時間浸漬した。その後、２０ｍＭ  ＨＣｌ／ジオキサンのジクロロメタン溶液に浸漬し、２５℃で３時間静置して脱保護した。飽和炭酸ナトリウム水溶液で基板を洗浄した。１０ｍＭ  ４−ブロモイソブタン酸，０．１Ｍ  ＥＤＣ・ＨＣｌ，および０．１Ｍ  ＤＩＥＡを含むジクロロメタン溶液に１２時間浸漬した。１０ｍＭ  シスタミン塩酸塩水溶液に基板を２５℃で２時間浸漬し、ジスルフィド交換反応によりアミノ基を導入した。１０ｍＭ  ４−カルボキシ−３−フルオロフェニルボロン酸と１０ｍＭ  ＤＭＴ−ＭＭを含むエタノール溶液に浸漬し、ボロン酸で表面修飾した基板を作製した。
【０２５４】
上述した手順でボロン酸と重合開始基を導入したガラス基板に、１μｇ／ｍＬ  ＰＳＡの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）溶液を滴下し、室温で１時間静置することで基板にＰＳＡを固定化した。次いで、表５に示した組成のプレポリマー溶液を用いて、４０℃で１時間、基板上で重合反応を行った。
【０２５５】
【表５】
0006653884.tif 000031
【０２５６】
重合後、１Ｍ  ＥＤＴＡ−４Ｎａ水溶液に１時間浸漬した。次いで、１０ｍＭ  トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン溶液に２５℃で１２時間浸漬し、リンカーのジスルフィド結合を還元し、純水で基板を洗浄した。３３０ｍＭ塩化ナトリウムと０．５ｗｔ％  ＳＤＳを含む水溶液に１５分間浸漬し、リンスして基板を洗浄した。
洗浄後、１ｍＭ  Ｃｙ５−マレイミドのＤＭＦ溶液に基板を３０分間浸漬した後、ＤＭＦと純水で洗浄することにより、基板の特異的認識空間内に蛍光分子を導入した。
以上のとおり、標的タンパク質に含まれる糖鎖を利用して標的タンパク質をＳＡＭ表面に結合させても、分子インプリントポリマーの作製が可能であることが明らかとなった。
【０２５７】
参考例７：  特異的リガンドであるヘパリンを介して血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）を配向固定化した分子インプリントポリマーの作製
（１）  チオール誘導体化ヘパリンの合成
高分子量ヘパリン（平均で約５．５６μｍｏｌ）を酢酸水溶液（１ｍＬ）に溶解し、ｐ−アミノチオフェノール（３．４８ｍｇ，２７．８μｍｏｌ，５ｅｑ．）および還元剤として２−ピコリンボラン（５．７ｍｇ，２７．８μｍｏｌ，５ｅｑ．）を４０〜７０μＬのメタノールに溶解させた溶液を加え、室温で２４〜４８時間激しく攪拌した。反応溶液をジクロロメタンで３回洗浄することにより、ｐ−アミノチオフェノール、２−ピコリンボランおよび副生成物を除去し、水相を凍結乾燥して３６．９６ｍｇの白色粉末を得た。分画分子量（ＭＷＣＯ）１００００および５０００のフィルタで限外ろ過して、分子量分布がＭｗ：６０００〜１００００とＭｗ：１００００〜１２０００のチオール誘導体化高分子量ヘパリンを得た。
【０２５８】
（２）  金基板上へのＶＥＧＦ１６５−インプリント薄膜の合成
金基板をエタノールと純水でリンスし、Ｎ2ガスで乾燥後、２０分間ＵＶ−Ｏ3処理して基板を洗浄した。その後、直ちに０．５ｍＭ  １１−スルファニロウンデカ−１−イル  ２−ブロモ−２−メチルプロピオネートおよび０．５ｍＭ  （１１−メルカプトウンデシル）テトラ（エチレングリコール）の混合エタノール溶液（１ｍＬ）３０℃で２４時間浸漬させ、金基板上にｍｉｘｅｄ  ＳＡＭを形成した。ｍｉｘｅｄ  ＳＡＭを形成した基板は、エタノールと純水でリンスし、Ｎ2ガスで乾燥後、遮光下真空中で保存した。
【０２５９】
Ｍｉｘｅｄ  ＳＡＭ膜を形成させた金基板を５ｍＭのＭＡＬ−ｄＰＥＧ４−ＮＨＳの乾燥ジクロロメタン溶液（１ｍＬ）に浸漬させて、Ｎ2雰囲気下、遮光して２５℃にて１８時間マレイミド基の導入を行った。反応終了後、ジクロロメタンとエタノールでリンスし、Ｎ2ガスで乾燥させ、使用前まで真空下で遮光して保存した。
【０２６０】
マレイミド基を導入した金基板にシリコンフレームをかぶせ、チオール化されたヘパリンの濃度が約４０μＭとなるよう高分子量ヘパリンを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して溶液を調製し、シリコンフレーム内に１００μＬ注入し、２５℃で２時間インキュベートしてヘパリンの固定化を行った。その後、１００μＬの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）でセル内を３回洗浄した。
【０２６１】
低分子のチオール化合物である２−｛２−［２−（２−メルカプトエトキシ）エトキシ］エトキシ｝エタノールを用いて、基板上に未反応で残存するマレイミド基をキャッピングした。２−｛２−［２−（２−メルカプトエトキシ）エトキシ］エトキシ｝エタノールを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して作製した濃度５００μＭの溶液（１００μＬ）をテフロンセルないしシリコンフレーム内に注入し、２５℃で１時間インキュベートした。その後、１００μＬの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）でセル内を３回洗浄した。
【０２６２】
次に、セル内を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で置換した後、ＶＥＧＦ１６５ストック溶液（濃度：１００μｇ／ｍＬ，溶媒：０．１ｗｔ％エンドトキシンフリーＨＳＡまたはＢＳＡを含む殺菌水）を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１０倍に希釈して濃度を１０μｇ／ｍＬとし、テフロンセル中に１００μＬ入れて２５℃で２時間インキュベートすることにより、ＶＥＧＦ１６５を固定化した。その後、１００μＬの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。
【０２６３】
ＶＥＧＦ１６５固定化基板に、表面開始アクチベーターによる原子移動ラジカル重合（ＳＩ−ＡＧＥＴ−ＡＴＲＰ）によりポリマーを作製した。具体的には、表６に示すプレポリマー溶液組成のうちＬ−アスコルビン酸以外を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（１２０μＬ）に溶解させて、別容器でフリーズポンプソーにより脱気しておいた。また、Ｌ−アスコルビン酸溶液も調製し、別容器でフリーズポンプソーにより脱気しておいた。
【０２６４】
【表６】
0006653884.tif 000032
【０２６５】
純水をなじませておいたＶＥＧＦ１６５固定化基板をシュレンクフラスコ内に固定し、５回脱気窒素置換を行った。置換後のシュレンクフラスコ内に、アスコルビン酸を含まないプレポリマー溶液とＬ−アスコルビン酸溶液をこの順でシリンジにより注入し、再度シュレンクフラスコ内を５回脱気窒素置換し、真空にした。Ｌ−アスコルビン酸溶液の注入前後で溶液の色が水色から茶色に変わったことから、重合が開始したと考えられる。重合反応はインキュベータ内で２５℃で４時間行った。
【０２６６】
重合終了後、テフロンセルから基板を取り出して純水で洗浄し、１ＭのＥＤＴＡ  ４Ｎａ水溶液（１ｍＬ）に一晩浸漬させ残存銅（Ｃｕ2+）を除去した。さらに、２Ｍ塩化ナトリウム水溶液（１ｍＬ）に６時間、続けて０．５ｗｔ％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００水溶液に３時間浸漬して、タンパク質を除去した。その後、純水で洗浄しＮ2ガスで乾燥させた。
以上のとおり、分子−分子間相互作用を利用して標的タンパク質をＳＡＭ表面に結合させても、分子インプリントポリマーの作製が可能であることが明らかとなった。
【０２６７】
参考例８：  プラズモニックチップを用いた蛍光測定と増強効果
上記参考例３（４）でモールド２を用いて作製したＡｇベースのプラズモニックチップ（５×１０×０．５ｍｍ）を２０分間ＵＶ−Ｏ3処理した後、２ｗｔ％の３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）と１ｗｔ％酢酸を含む水溶液（１０μＬ）を滴下し、４０℃で１．５時間反応させた。反応後、純水とエタノールをかけ流して洗浄し、８０℃ホットプレート上で２時間焼成した。このアミノ化プラズモニック微小反応板上に１０ｍＭビオチン−ＮＨＳと１０ｍＭ  ＤＭＡＰのＤＭＳＯ溶液（１０μＬ）を滴下し、カバーガラスをかけ、２５℃で１時間反応させた後、ＤＭＳＯで洗浄して反応板上にビオチンを導入した。
【０２６８】
ビオチン導入プラズモニック微小反応板を反応内蔵チップにセットし、蛍光顕微鏡用ユニットを取り付けた小型自動分注・反応・計測装置（システム・インスツルメンツ社製，図１６）により蛍光測定を行った。蛍光顕微鏡用ユニットの構成は以下の通りである。
【０２６９】
カメラ：  ＺＹＬＡ（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）
対物レンズ：  ×５
露光時間：  ０．１秒
Ｃｙ５用蛍光フィルター：  Ｅｘｃｉｔｅｒ：６０８〜６４８ｎｍ，Ｅｍｉｔｔｅｒ：６７２〜７１２ｎｍ
【０２７０】
まず、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（１００μＬ）をピペットに吸い上げてブロッキングし、次いで１５０μＬのＰＢＳで４回洗浄した後、蛍光強度Ｆ0を測定した。次いで、Ｃｙ５ラベル化ストレプトアビジンを１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液に溶解した濃度１００ｎｇ／ｍＬ（１．８８ｎＭ）の溶液（１００μＬ）をピペットに吸い上げて５分間インキュベーションした後、１５０μＬのＰＢＳで４回洗浄し、蛍光強度Ｆを測定した。結果を図１４と図１５に示す。
【０２７１】
図１４に示すように、反応内蔵チップによるプラズモニック反応板の蛍光測定が可能であり、また周期構造内では周期構造外に比べて蛍光強度が強く、明るいことが確認された。プラズモニックチップ３枚について同様の実験を行い、周期構造内と周期構造外でその蛍光強度を比較したところ、図１５に示すように周期構造内では蛍光強度は約９倍大きく、周期構造による蛍光増強効果が確認された。
【０２７２】
参考例９：  プラズモニックチップを用いた蛍光測定
（１）  シランカップリング反応によるチップ表面へのＮＨ2基とＳＨ基の導入
Ｔｉ／Ａｇ／Ａｕ／Ｔｉ／ＳｉＯ2プラズモニックチップをエタノールと純水で洗浄した。厚さ０．２ｍｍのシリコンシートをプラズモニックチップの大きさに合わせて切り、中央に直径７ｍｍ程度の穴を空けたものをプラズモニックチップの周期構造内が見えるように貼り付けた。次に０．１ｗｔ％  ３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）および０．１ｗｔ％  （３−メルカプトプロピル）トリメトキシシランを含む水溶液（１００μＬ）を中央部の穴に滴下し、２５℃で１時間反応させた。反応後、純水で洗浄した。
【０２７３】
（２）  縮合反応によるチップ表面へのＢｒ基の導入
上記（１）で得られた表面ＮＨ2，ＳＨ化プラズモニックチップ上のシリコンシートの穴の中に、５ｍＭ  ２−ブロモイソブチリックアシッド（１ｅｑ），７．５ｍＭ  ４−（４と６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロライド  ｎ水和物（ＤＭＴ−ＭＭ）（１．５ｅｑ）の混合水溶液（１００μＬ）をピペットマンにて滴下し、２５℃で１時間反応させた。反応後、純水で洗浄した。
【０２７４】
（３）  マレイミドとチオールのカップリング反応によるＰＥＧリンカーの導入
上記（２）で得られた表面Ｂｒ，ＮＨ2化プラズモニックチップ上のシリコンシートの穴の中に、２ｍＭ  ＭＡＬ−ｄＰＥＧ（登録商標）4−ＮＨＳエステル水溶液（１００μＬ）をピペットマンにて滴下し、２５℃で１時間反応させた。反応後、純水で洗浄した。
【０２７５】
（４）  アミンカップリング反応によるジスルフィドの導入
上記（３）で得られた表面Ｂｒ，ＮＨＳエステル化プラズモニックチップ上のシリコンシートの穴の中に、１ｍＭピリジルチジオエチルアミン塩酸塩水溶液（１００μＬ）をピペットマンにて滴下し、２５℃で１時間反応させた。反応後、純水で洗浄した。
【０２７６】
（５）  ジスルフィド交換反応によるチオール化ＡＦＰの導入
上記（４）で得られた表面Ｂｒ，ジスルフィド化プラズモニックチップ上のシリコンシートの穴の中に、１００ｎＭチオール−ＡＦＰ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）溶液（１００μＬ）をピペットマンにて滴下し、２５℃で１時間反応させた。反応後、純水で洗浄した。
【０２７７】
（６）  ジスルフィド交換によるＡＦＰのキャッピング
上記（５）で得られた表面Ｂｒ，チオール−ＡＦＰ化プラズモニックチップ上のシリコンシートの穴の中に、５ｍＭヒドロキシエチルピリジルジスルフィド水溶液をピペットマンにて滴下し、２５℃で１時間反応させた。反応後、純水で洗浄した。
【０２７８】
（７）  表面開始ＡＧＥＴ  ＡＴＲＰによるポリマー薄膜の作製
上記（６）で得られた表面Ｂｒ，ＡＦＰ化プラズモニックチップを、ＮＳ共通摺合三角フラスコ（５０ｍＬ，２４／４０のセプタム用）内に入れ、２ｍＭピロリジルアクリレート、３０ｍＭ  ＭＰＣ、８ｍＭ  ＭＢＡＡ、０．５ｍＭ  ＣｕＢｒ2および１ｍＭ  ２，２’−ビピリジルの混合水溶液（１２０μＬ）をシリコンシート内の穴に滴下させ、セプタムでふたをし、脱気窒素置換を５回行った。０．２５ｍＭ  Ｌ−アスコルビン酸水溶液（３０μＬ）をシリンジにて滴下し、脱気窒素置換を５回行い、ＳＩ−ＡＧＥＴ−ＡＴＲＰを開始した。重合は２５℃で１時間行った。重合後、チップを純水で洗浄し、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ−４Ｎａ水溶液をピペットマンにて滴下し、２５℃で１時間静置して銅を除去した。プレポリマー溶液の組成を表７に示す。
【０２７９】
【表７】
0006653884.tif 000033
【０２８０】
（８）  ＭＩＰ内からのＴｈｉｏｌ−ＡＦＰの除去
上記（７）で得られたポリマー薄膜作製プラズモニックチップ上のシリコンシートの穴の中に５０ｍＭ  ＴＣＥＰ−１００ｍＭ酢酸バッファ（ｐＨ５．０）溶液（１００μＬ）を滴下し、２５℃で６時間反応させた。反応後、純水で洗浄した。さらに、還元したポリマー薄膜作製プラズモニックチップ上のシリコンシートの穴の中に、３３０ｍＭ  ＮａＣｌと０．３３ｗｔ％  ＳＤＳの混合水溶液（１００μＬ）を滴下し、２５℃で１時間静置した。１時間後、純水で洗浄した。
【０２８１】
（９）  ジスルフィド交換によるＮＨ2基の導入
上記（８）で得られたＡＦＰ−ＭＩＰ修飾プラズモニックチップ上のシリコンシートの穴の中に、１ｍＭピリジルジチオエチルアミン塩酸塩水溶液（１００μＬ）をピペットマンにて滴下し、２５℃で１時間反応させた。反応後、純水で洗浄した。
【０２８２】
（１０）  アミンカップリング反応によるＡｌｅｘａ６４７とＢＨＱ−３の導入
上記（９）で得られた表面ＮＨ2基導入ＡＦＰ−ＭＩＰ修飾プラズモニックチップ上のシリコンシートの穴の中に、蛍光レポーター化合物であるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７  ＮＨＳエステルを２０μＭと、消光剤であるＢＨＱ−３カルボン酸を５μＭ含む７．５％ＤＭＳＯ  １０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）溶液（１００μＬ）をピペットマンにて滴下し、２５℃で１時間反応させた。反応後、純水で洗浄した。
【０２８３】
（１１）  ＡＦＰ結合実験
上記（１０）で得られたＡＦＰ−ＭＩＰ修飾プラズモニックチップ上のシリコンシートの穴の中に、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４，３０μＬ）を滴下し、丸型カバーガラスを被せ、蛍光顕微鏡にてＢａｃｋｇｒｏｕｎｄ測定を行った（測定値：Ｆ0）。続いて、濃度６２．５ｐＭ、１２５ｐＭ、２５０ｐＭ、５００ｐＭまたは１０００ｐＭのＡＦＰの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）溶液（２０μＬ）をそれぞれ２０分間反応させ、以下の条件で蛍光強度を測定した（測定値：Ｆ）。
【０２８４】
蛍光顕微鏡：  ＩＸ−７３（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）
カメラ：  Ｕ−ＨＧＬＧＰＳ（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）
対物レンズ：  ×１０
露光時間  ：プラズモニックチップ０．５秒
Ｃｙ５用蛍光フィルタ：  Ｅｘｃｉｔｅｒ：６０８−６４８  ｎｍ，Ｅｍｉｔｔｅｒ：６７２〜７１２ｎｍ
【０２８５】
測定結果を図１７に示す。図１７に示す結果の通り、ＡＰＦ濃度が０の場合は消光剤であるＢＨＱ−３により蛍光化合物Ａｌｅｘａ６４７の蛍光が消されてしまっているが、ＡＦＰがＭＩＰ膜に結合することによって、ＡＦＰ濃度依存的にＡｌｅｘａ６４７の蛍光が回復して蛍光強度が高まった。このように、ＭＩＰの特異的認識空間内に消光剤と蛍光レポーター化合物を結合させることにより、標的タンパク質の定量が可能であることが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
0006653884.tif 000036
【図４】
0006653884.tif 000037
【図５】
0006653884.tif 000038
【図６】
0006653884.tif 000039
【図７】
0006653884.tif 000040
【図８】
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【図９】
0006653884.tif 000042
【図１０】
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【図１１】
0006653884.tif 000044
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
0006653884.tif 000047
【図１５】
0006653884.tif 000048
【図１６】
0006653884.tif 000049
【図１７】
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