(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
３ヒドロキシ酪酸生産性のハロモナス菌を果菜汁に添加して好気発酵させる好気発酵工程と、前記好気発酵工程で得られた発酵液を嫌気発酵させる嫌気発酵工程とを順に行い、
前記好気発酵工程は、前記果菜汁に含まれる糖質のほぼ全量が資化されるまで実行され、
前記嫌気発酵工程は、前記好気発酵工程により生成したポリ３ヒドロキシ酪酸のほぼ全量が３ヒドロキシ酪酸に分解されるまで実行され、
前記ハロモナス菌が、ハロモナス・エスピー（ＨａＩｏｍｏｎａｓｓｐ．）ＫＭ−１株（ＦＥＲＭＢＰ−１０９９５）である発酵飲料の製造方法。
【請求項２】
前記果菜汁が、オレンジ、ブドウ、リンゴ、バナナ、マンゴー、グレープフルーツより選ばれる果実およびサトウキビからなる群から選ばれる少なくとも一種の果菜の搾汁である請求項１に記載の発酵飲料の製造方法。
【請求項３】
前記好気発酵工程は、２０℃〜４０℃、ｐＨ７〜１０の条件下で実行されるとともに、前記嫌気発酵工程はｐＨ７〜１０の条件下で実行される請求項１又は２に記載の発酵飲料の製造方法。
【請求項４】
前記嫌気発酵工程により得られた発酵液から前記ハロモナス菌を分離除去する分離除去工程を備える請求項１〜３のいずれか一項に記載の発酵飲料の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の発酵飲料の製造方法により製造された発酵飲料。
【請求項６】
３ヒドロキシ酪酸および果菜汁を含有するとともに、前記果菜汁に含有される糖質を３ヒドロキシ酪酸生産性のハロモナス菌により発酵した場合に生成する発酵生成物を含有し、
糖質及びポリ３ヒドロキシ酪酸を含有しない発酵飲料。
【請求項７】
前記果菜汁がオレンジ、ブドウ、リンゴ、バナナ、マンゴー、グレープフルーツより選ばれる果実の搾汁であり、前記発酵生成物として酢酸及び乳酸の少なくとも一方を含有する請求項６に記載の発酵飲料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵飲料およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
３ヒドロキシ酪酸やその塩（以下３ＨＢと称する）は、もともと人の体内に存在する物質であるため生体親和性が高く、糖質に代わる画期的なエネルギー源として期待されている。例えば、ココナツオイルに多く含まれる中鎖脂肪酸の摂取および体内での代謝により生成される３ＨＢが、脳や体内において糖質をうまく利用できないアルツハイマー病、糖尿病の患者の症状を改善させる効果を持つことが知られている。また３ＨＢは体内において糖質よりも速やかにエネルギーに変換されること、細胞への脂肪や糖の吸収を抑制する効果を有することからダイエット・健康食品分野への応用が期待できる。
【０００３】
３ＨＢの製造方法として、各種微生物にポリ３ヒドロキシ酪酸（以下ＰＨＢと称する）を生産させたのち、得られたＰＨＢを酵素等により分解する方法が知られている（特許文献１）。また、このような微生物としてハロモナス菌が、好気条件でＰＨＢを蓄積し、嫌気条件に移行することでＰＨＢを分解して生成した３ＨＢを培養液中に分泌産生することが見出されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１０−１６８５９５号公報
【特許文献２】特開２０１３−０８１４０３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、これらの方法は、いずれも３ＨＢを単離するのに煩雑な工程を要することから、工業的には、いまだ改善の余地があった。
そこで、微生物により生産される３ＨＢを、より効率よく人が摂取可能な形態として提供できる技術が求められており、また、人が３ＨＢを摂取した場合に、３ＨＢがそのまま人体に有効に作用するとは限らず、３ＨＢを人体により有効に作用させられる形態で提供することがさらに求められる。
【０００６】
したがって、本発明は上記実状に鑑み、３ＨＢを、人に有効に作用させられる形態で提供できるように生産することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の発酵飲料の製造方法の特徴構成は、３ヒドロキシ酪酸生産性のハロモナス菌を果菜汁に添加して好気発酵させる好気発酵工程と、前記好気発酵工程で得られた発酵液を嫌気発酵させる嫌気発酵工程とを順に行い、
前記好気発酵工程は、前記果菜汁に含まれる糖質のほぼ全量が資化されるまで実行され、
前記嫌気発酵工程は、前記好気発酵工程により生成したポリ３ヒドロキシ酪酸のほぼ全量が３ヒドロキシ酪酸に分解されるまで実行され、
前記ハロモナス菌が、ハロモナス・エスピー（ＨａＩｏｍｏｎａｓｓｐ．）ＫＭ−１株（ＦＥＲＭＢＰ−１０９９５）である点にある。
【０００８】
すなわち、果菜汁に３ＨＢ生産性のハロモナス菌を添加し、好気発酵させる好気発酵工程を行った後、さらに嫌気発酵させる嫌気発酵工程を行う。このようにして得られた発酵飲料は、３ＨＢ生産性のハロモナス菌により、果菜汁に含まれる糖質が３ＨＢを含む発酵生成物に変換されており、３ＨＢを含有するとともに、たとえば乳酸、酢酸等の発酵生成物を含有するものとなっている。また、このような発酵を経て得られる発酵飲料は、糖質を有機酸に変換してなる以外に種々の有効成分を微量成分として生成している場合があり、このような成分のそれぞれについてその構造、効能、有効量、各成分同士の相互作用等を解析することは通常困難であるし、明らかにすることができないものの、３ＨＢを含有するとともに、たとえば乳酸、酢酸等の発酵生成物を含有する発酵飲料となっていることが明らかであり、３ＨＢによる効能が期待できることも明らかである。また、ハロモナス菌由来の微量成分が発酵成分として含まれているから、３ＨＢをそのまま果菜汁に加え糖質を有機酸に変換した飲料に比べて、複雑な味覚、効能を期待できる付加価値の高い発酵飲料となる。
また、好気発酵工程において生産されたＰＨＢは嫌気発酵工程において３ＨＢに変換され発酵液中に溶出する。そのため、嫌気発酵工程は、３ＨＢの原料となるＰＨＢの存在する範囲で行えば、効率の良い３ＨＢ生産に寄与できる。つまり、ＰＨＢの生成状況と、３ＨＢの生成状況を知ることにより、発酵液中の糖質を十分に減少させて３ＨＢとして発酵飲料中に含有させることができるようになる。
また、ＫＭ−１株は糖質を資化して種々の有機酸を生成することが知られている微生物であり、糖質を好気発酵する際にＰＨＢを体内に蓄積する性質を有することが知られている。さらにＫＭ−１株は体内に蓄積したＰＨＢを嫌気条件下で３ＨＢとして体外に排出することも知られており、発酵条件の管理により容易に３ＨＢを溶液中に取り出すことができるようになる。したがってＫＭ−１株を用いて、好気発酵後、嫌気発酵することにより製造された発酵飲料は、発酵液中により確実性高く３ＨＢを含有するとともに、種々の発酵生成物を含有するものとなっている。
【０００９】
なお、本発明において嫌気発酵という場合、酸素供給を断った状態で発酵を行うことを指すものとし、ハロモナス菌として通性嫌気性菌を採用するような場合、わずかに酸素の残存するいわゆる微好気状態での発酵も含めて嫌気発酵と称するものであり、微生物学的にいう絶対嫌気状態のみを指すものではない。
また、果菜汁としては、オレンジ、ブドウ、リンゴ、バナナ、マンゴー、グレープフルーツ、サトウキビなどの果実、野菜、穀物（これらを総称して果菜と称するものとする）を原料とすることができるが、その他の果菜由来の果菜汁も用いることができ、上記例示のものに限られるものではない。
【００１０】
また、前記果菜汁が、オレンジ、ブドウ、リンゴ、バナナ、マンゴー、グレープフルーツより選ばれる果実およびサトウキビからなる群から選ばれる少なくとも一種の果菜の搾汁であってもよい。
【００１１】
すなわち、発酵飲料の原料として、オレンジ、ブドウ、リンゴ、バナナ、マンゴー、グレープフルーツ、サトウキビのジュースを用いることができ、それぞれの果菜汁風味の発酵飲料とすることができることが確認されている。
【００１４】
また、前記好気発酵工程は、２０℃〜４０℃、ｐＨ７〜１０の条件下で実行されるとともに、前記嫌気発酵工程はｐＨ７〜１０の条件下で実行されてもよい。
【００１５】
３ＨＢ生産性のハロモナス菌は、２０℃〜４０℃、ｐＨ７〜１０条件下で好気発酵することにより、ＰＨＢを体内に効率よく蓄積し、ｐＨ７〜１０の条件下で嫌気発酵を行うことにより体内に蓄積したＰＨＢが３ＨＢに分解される。そのため、このような条件を選択することにより効率よく３ＨＢを生産することができる。
【００１８】
前記嫌気発酵工程により得られた発酵液から前記ハロモナス菌を分離除去する分離除去工程を備えていてもよい。
【００１９】
すなわち、嫌気発酵工程ののち、不要となるハロモナス菌は分離除去されるから、発酵飲料のハロモナス菌による過発酵を防ぎ、発酵飲料としての品質の安定化を図ることができる。
【００２０】
また本発明の発酵飲料の特徴構成は、上記発酵飲料の製造方法により製造された発酵飲料である点にある。
【００２１】
すなわち、果菜汁に３ＨＢ生産性のハロモナス菌を添加し、好気発酵させる好気発酵工程を行った後、さらに嫌気発酵させる嫌気発酵工程を行う。このようにして得られた発酵飲料は、３ＨＢ生産性のハロモナス菌により、果菜汁に含まれる糖質が３ＨＢを含む有機酸に変換されており、３ＨＢを含有するとともに、種々の発酵生成物を含有するものとなっている。また、このような発酵を経て得られる発酵飲料は、糖質を有機酸に変換してなる以外に種々の有効成分を微量成分として生成している場合があり、このような成分のそれぞれについてその構造、効能、有効量、各成分同士の相互作用等を解析することは通常困難であるし、明らかにすることができないものの、３ＨＢを含有するとともに、たとえば乳酸、酢酸等の発酵生成物を含有する発酵飲料となっていることが明らかであり、３ＨＢによる効能が期待できることも明らかである。また、ハロモナス菌由来の微量成分が発酵成分として含まれているから、３ＨＢをそのまま果菜汁に加え、糖質を有機酸に変換した飲料に比べて、複雑な味覚、効能を期待できる付加価値の高い発酵飲料となる。
【００２２】
また本発明の発酵飲料の特徴構成は、３ヒドロキシ酪酸および果菜汁を含有するとともに、前記果菜汁に含有される糖質を３ヒドロキシ酪酸生産性のハロモナス菌により発酵した場合に生成する発酵生成物を含有し、
糖質及びポリ３ヒドロキシ酪酸を含有しない点にある。 
【００２３】
すなわち、この発酵飲料は、３ヒドロキシ酪酸および果菜汁を含有するとともに、前記果菜汁に含有される糖質を３ヒドロキシ酪酸生産性のハロモナス菌により発酵した場合に生成する発酵生成物を含有する。この発酵生成物としては、たとえば、果菜汁に含有される糖質が３ヒドロキシ酪酸生産性のハロモナス菌により発酵生成された有機酸、すなわち、果菜汁に含有される糖質由来の有機酸が挙げられる。したがって、これら発酵生成物、３ヒドロキシ酪酸及び果菜汁を含有する発酵飲料は、ハロモナス菌由来の微量成分により、３ＨＢをそのまま果菜汁に加え糖質を有機酸に変換した飲料に比べて、複雑な味覚、効能を期待できる付加価値の高い発酵飲料となる。
また、糖質を含有したほうが風味、栄養の観点で望ましい場合は、好気発酵を早めに終了することで果菜汁由来の糖質を残すこともできるし、嫌気発酵終了後に改めて任意の糖質を添加してもよいが、３ＨＢが、脳や体内において糖質をうまく利用できないアルツハイマー病、糖尿病の患者の症状を改善させる効果を持つことが知られており、この症状の改善効果は糖質が共存しない環境でより効果的に発揮されるため、特に、たとえば糖尿病患者に対しては、グルコースを含有しない飲料を与えた方がよい。
【００２４】
前記果菜汁がオレンジ、ブドウ、リンゴ、バナナ、マンゴー、グレープフルーツより選ばれる果実の搾汁である場合、前記発酵生成物として酢酸及び乳酸の少なくとも一方を含有していてもよい。
【００２５】
先の発酵飲料の製造方法において各発酵工程において副生された発酵生成物としては酢酸、乳酸、ピルビン酸等の有機酸が知られている。そのため、３ヒドロキシ酪酸および果菜汁と相性の良い成分として、当該発酵生成物としての酢酸や乳酸を発酵飲料の味覚の調整などに用いることができる。
【発明の効果】
【００２８】
したがって、３ＨＢを、人に有効に作用させられる可能性のある発酵飲料の形態で提供できるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】発酵飲料の製造フロー図
【図２】実施例１の発酵経過と成分組成の関係を示すグラフ
【図３】実施例２の発酵経過と成分組成の関係を示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下に、本発明の実施形態にかかる発酵飲料およびその製造方法を説明する。尚、以下に好適な実施形態を記すが、これら実施形態はそれぞれ、本発明をより具体的に例示するために記載されたものであって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において種々変更が可能であり、本発明は、以下の記載に限定されるものではない。
【００３１】
〔発酵飲料の製造方法〕
本発明の実施形態にかかる発酵飲料の製造方法は、果菜汁に３ＨＢ生産性のハロモナス菌を添加して発酵プロセスを行い、得られた発酵液からハロモナス菌を分離除去するものである。
【００３２】
より具体的には、たとえば、オレンジ、ブドウ、リンゴ、バナナ、マンゴー、グレープフルーツ、サトウキビからなる群から選ばれる少なくとも一種の果実の搾汁に、３ＨＢ生産性のハロモナス菌を添加し発酵プロセスを行う。なお、必要に応じて、発酵補助剤（無機塩類、リン、窒素源など）を添加する。果菜汁に含有される糖質だけでは不足する場合は、発酵原料に糖質を添加してもよい。
【００３３】
ハロモナス菌としては、ハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓｓｐ．）ＫＭ−１株（ＦＥＲＭＢＰ−１０９９５）等、３ＨＢ生産性の微生物が有効に用いられるが、これに限らず３ＨＢを生産可能なものを用いることができる。なお、上記ＫＭ−１株を用いると、３ＨＢを菌体外部に単量体として生産させることが容易なので分離抽出等の工程を経ることなく発酵飲料を得られる利点があり好適である。
【００３４】
発酵プロセスは、発酵容器内で、まず撹拌通気しつつ好気発酵工程を行う。これにより、ハロモナス菌により果菜汁に含まれる糖質を資化させ、ＰＨＢを生産させることができ、ハロモナス菌体内にＰＨＢを蓄積するとともに、発酵生成物としてたとえば乳酸、酢酸等の有機酸や種々の微量成分を発酵液中に放出する。次に、果菜汁に含まれる糖類がほぼ完全に消費されたころに、発酵容器内への通気を停止して嫌気発酵工程を行う。これにより、ハロモナス菌は体内に蓄積したＰＨＢを分解消費して発酵液中に３ＨＢを放出する。その結果、果菜汁から糖質を除去して３ＨＢおよび発酵生成物を含有させた発酵液が得られる。この発酵液は、果菜汁由来の糖質を各種の有機酸に変換した、人の飲用に好適な組成となっており、含有する３ＨＢを好適に摂取可能な発酵飲料となっている。
【００３５】
なお、発酵液の発酵の程度は必要に応じて変更することができ、糖質を残してもよいし、別途３ＨＢや任意の糖質を追加添加することもできる。また、好気発酵、嫌気発酵の程度は、経験的に得られた発酵時間で適切な切替時期を管理することもできるし、発酵液の組成または３ＨＢ生成にともなうｐＨ変化をモニタリングして糖質の消費量や有機酸の生成量に基づいて切り替えることもできる。
【００３６】
得られた発酵液中には、ハロモナス菌が生育しているので、これを分離除去するほうが望ましい場合は分離除去工程を行うことで、ハロモナス菌を含まない発酵飲料を得ることができる。発酵液からハロモナス菌を分離除去するには、遠心分離もしくは膜分離を行うことが好適である。このような膜分離を行うには、精密ろ過膜（ＭＦ膜）を用いた連続ろ過方式を採用することができる。
こうして得られた発酵液は、ｐＨがアルカリ性のため３ＨＢは塩の状態で存在する。３ＨＢを酸の状態としたほうが風味等の観点で望ましい場合は、塩酸等でｐＨを３〜４程度として飲料に供することもできる。ｐＨを酸性にした場合に混濁夾雑物が発生した場合は、上記遠心分離、膜分離等の方法で除去してもよい。また、ハロモナス菌を除去する前にｐＨを３〜４程度とし、混濁夾雑物とハロモナス菌を同時に遠心分離、膜分離等の方法で除去してもよい。
また、発酵液には培地およびｐＨ制御に由来する塩がたとえば０．１〜１．０Ｍ程度の範囲で含まれる。これを除去したほうが好ましい場合は、電気透析などの脱塩装置で除去することができる。
【００３７】
〔ＫＭ−１株〕
本発明に係る発酵飲料の製造方法で用いるハロモナス菌は、
（ｉ）無機塩と単一若しくは複数の有機炭素源を含む培地にて好気的に増殖し、３ＨＢ又はその塩を菌体外の培地中に生産させることを特徴とするハロモナス菌
もしくは
（ｉｉ）無機塩と単一若しくは複数の有機炭素源を含む培地にて好気的に増殖し、ＰＨＢを自らの菌体内にて蓄積した後、嫌気条件下で３ＨＢ又はその塩を菌体外の培養液に分泌産生することを特徴とするハロモナス菌
に該当する。
このようなハロモナス菌は、酸化的代謝も嫌気的代謝も使い分けることができ、遊離酸素の存在の有無にかかわらず生存が可能で、且つ、遊離酸素の存在下のほうが生育し易い傾向となる、所謂、通性嫌気性菌の性質を有する菌体である。
上述のハロモナス菌は、０．１〜１．０Ｍの塩濃度を適とする好塩性を有し、時には塩を含まない培地においても生育する細菌である。そして、上述のハロモナス菌は、通常はｐＨ５〜１２程度の培地にて生育する。
上述の（ｉｉ）のハロモナス菌として、例えば、ハロモナス・エスピー（ＨａＩｏｍｏｎａｓｓｐ．）ＫＭ−１株が挙げられる。ハロモナス・エスピーＫＭ−１株は、平成１９年７月１０日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に受託番号ＦＥＲＭＰ−２１３１６として寄託されている。また、この菌株は、現在国際寄託に移管されており、その受託番号はＦＥＲＭＢＰ−１０９９５である。当該ハロモナス・エスピーＫＭ−１株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子は、ＤＤＢＪにＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｕｍｂｅｒＡＢ４７７０１５として登録されている。
ちなみに、上述したようなハロモナス菌の生育特性等に鑑みて、本発明に係る発酵飲料の製造方法において用いるハロモナス菌として、ハロモナス・エスピーＫＭ−１株以外に、ハロモナス・パンテラリエンシス（ＨａＩｏｍｏｎａｓｐａｎｔｅＩＩｅｒｉｅｎｓｉｓ＝ＡＴＣＣ７００２７３）、ハロモナス・カンピサリス（ＨａＩｏｍｏｎａｓｃａｍｐｉｓａＩｉｓ＝ＡＴＣＣ７００５９７）等も挙げることができる。
【００３８】
ＫＭ−１株の育成に用いる培地は、無機塩と及び有機炭素源を含有する。培地のｐＨは特に限定されないが、上述したハロモナス菌の生育条件を満たすｐＨであることが好ましく、具体的にはｐＨ５〜１２程度にすればよい。より好ましくはｐＨ７〜９の培地である。アルカリ性の培地を用いれば、他の菌のコンタミネーションをより効果的に防止することができ、また分泌された３ＨＢがクロトン酸へ変化するのを抑制するので好ましい。
【００３９】
また、培養温度は、１０℃〜５０℃さらに好ましくは、２０℃〜４０℃とすることが好ましく、この温度域ではＫＭ−１株を活性の高い状態を維持して育成することができる。
【００４０】
培地に配合する無機塩は、特に限定されることは無く、例えばリン酸塩、硝酸塩、炭酸塩、硫酸塩、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛、銅、コバルト等の金属塩が挙げられる。
例えば、ナトリウムを無機塩として用いる場合は、ＮａＣｌ、ＮａＮＯ3、ＮａＨＣＯ3、Ｎａ2ＣＯ3等を用いればよい。これらの無機塩は、上述のハロモナス菌にとって窒素源やリン源となるような化合物を用いることが好ましい。
窒素源は、硝酸塩、亜硝酸塩、アンモニウム塩、尿素等を用いればよく、特に限定はされないが、例えばＮａＮＯ3、ＮａＮＯ2、ＮＨ4Ｃｌ、尿素等の化合物を用いればよい。これらの中でも尿素が特に好ましい。
窒素源の使用量は、菌体の生育に影響を及ぼすことなく、本発明の３ＨＢ又はその塩の生産目的が達成される範囲において適宜設定すればよく、具体的には、培養初期の培地１００ｍＬ当たり通常であれば硝酸塩として５００ｍｇ程度以上とすればよく、より好ましくは１０００ｍｇ程度以上、更に好ましくは１２５０ｍｇ程度以上である。
なお、窒素源として尿素を用いる場合には、培養初期の培地１００ｍＬ当たり、２００ｍｇ以上とすればよいが、より好ましくは４００〜７００ｍｇ程度とすることにより、３ＨＢ又はその塩をより高効率に産生させることも可能である。
リン源は、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩等を用いればよく、特に限定はされないが、例えばＫ2ＨＰＯ4、ＫＨ2ＰＯ4等の化合物を用いればよい。
リン源の使用量も、上記の窒素源の使用量と同様の観点から適宜設定すればよく、具体的には、リン酸二水素塩として培地１００ｍＬ当たり通常は５０〜４００ｍｇ程度とすればよく、より好ましくは１００〜２００ｍｇ程度である。
これらの無機塩は単一で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
その他の化合物等も含めた無機塩は、総量で通常は０．１〜２．５Ｍ程度となる濃度で用いればよく、好ましくは０．２〜１．０Ｍ程度、より好ましくは０．２〜０．５Ｍ程度である。
培地の有機炭素源は、オレンジ、ブドウ、リンゴ、バナナ、マンゴー、グレープフルーツ、サトウキビのジュースに含まれる糖質等を用いることができる。
【００４１】
〔実施例１〕オレンジ果汁を用いた発酵飲料製造試験
グルコース濃度約２０ｇ／Ｌの濃縮還元オレンジジュース１５００ｍＬに対して、無機塩類及び窒素源としての尿素を加えて仕込原料液とした。
【００４２】
無機塩類
炭酸水素ナトリウム  ：３．７８ｇ
炭酸ナトリウム      ：１．５９ｇ
リン酸水素２カリウム：３．０  ｇ
窒素源
尿素                ：９．１５ｇ
【００４３】
仕込原料液１５００ｍＬに対して、ＯＤ＝２０のＫＭ−１株培養液２０ｍＬを添加し、３Ｌスケールのジャーファーメンター１に収容した。ジャーファーメンター１には、撹拌装置２、通気装置３を備えるとともに、発酵液を取り出す取り出し部４と追加の仕込み原料液を供給する供給部５、ｐＨ調整剤添加部６等を備える（図１参照）。また、図１の装置においては、取り出し部４より取り出された発酵液は、膜分離装置７を経て菌体を濾過された後、ろ過液を発酵飲料としてタンク８に回収可能に構成されている。
【００４４】
ジャーファーメンター１に収容した仕込原料液を、３３℃通気（７５０ｍＬ／分）、撹拌（６００ｒｐｍ上限）条件下で好気発酵を行わせた。最終的に得られる発酵液のｐＨは２０％炭酸ナトリウム水溶液により８．３に維持し、溶存酸素濃度は好気発酵の終了時に５０％を維持するように調整し、好気発酵を行った（経過時間０時間から好気発酵終了２２．５時間まで）。
【００４５】
次に同じジャーファーメンター１内で続けて嫌気発酵を行った。嫌気発酵は、上記ジャーファーメンター１にて、上記好気発酵条件中、通気を停止し、攪拌を９０ｒｐｍとして、ｐＨの維持値を９．２としたものである（経過時間２２．５時間から嫌気発酵終了２６．５時間まで）。
【００４６】
好気発酵、嫌気発酵を通じて発酵液の組成は図２のように推移した。各成分量はＨＰＬＣにより求めた。すなわち、好気発酵が進行するにしたがって、オレンジジュース中のグルコースが消費されていることがわかる（経過時間０時間から１５時間まで）。この時３ＨＢ濃度は増加しておらず、ＫＭ−１株はＰＨＢを生産し体内に蓄積している段階であることがわかる。また、この時、糖質の減少に伴い、クエン酸が同時に減少し、逆に、酢酸、乳酸の濃度が上昇することが確認されている。また、ピルビン酸の生成も確認されている。ピルビン酸濃度が高いことが望まれる場合は、ピルビン酸含有量の高いジュースとすることもできる。オレンジ果汁中の糖質が全量有機酸に変換されていると思われる２２．５時間経過時点で嫌気発酵に切り替えると、３ＨＢの濃度が上昇し始めていることから、ＫＭ−１株は、嫌気培養条件にて、体内に蓄積されたＰＨＢを分解して３ＨＢとして体外に放出していることがわかる。これにより、発酵液はオレンジ果汁に対して３ＨＢを含有するとともに、糖質代謝生成物としての酢酸及び乳酸を含有するものとなっている。なお、ＰＨＢは嫌気発酵中新たに生産されるわけではないので、ＫＭ−１株がすでに体内に蓄積しているＰＨＢを３ＨＢに分解されるまで嫌気発酵を行えばよい（経過時間２２．５時間から２６．５時間まで）。すなわち、嫌気発酵が終了した発酵液中にはほぼＰＨＢが存在しない状態となっていることが確認されている。また、嫌気発酵が終了した発酵液中には、グルコースおよびクエン酸が存在しない状態となっていることも確認されている。なお、これらの好気発酵、嫌気発酵の過程で生成するその他の微量成分等の組成変動は不明である（詳細に解明することは実質的に不可能である）が、人体に有益であり、すぐれた味の発酵飲料が得られていることが確認できた。ここで、得られた発酵液中には約０．６％の３ＨＢが含まれており、グルコース及びクエン酸がほとんど含まれていないことが明らかになり、人体に作用する際、３ＨＢが有効量含まれるとともに、優先的に消費される環境が整っていることが明らかになった。そのため、脳や体内において糖質をうまく利用できないアルツハイマー病、糖尿病の患者の症状を改善させる効果や、細胞への脂肪や糖の吸収を抑制してダイエット・健康食品分野への応用が期待できる。
【００４７】
〔実施例２〕サトウキビ搾汁を用いた発酵飲料製造試験
スクロース濃度１０％のサトウキビ搾汁１５００ｍLに対して無機塩類及び窒素源としての尿素を加えて仕込原料液とした。
【００４８】
無機塩類
炭酸水素ナトリウム  ：３．７８ｇ
炭酸ナトリウム      ：１．５９ｇ
リン酸水素２カリウム：３．０  ｇ
窒素源
尿素                ：７.５ｇ
【００４９】
仕込原料液１５００ｍＬに対して、ＯＤ＝２０のＫＭ−１株培養液２０ｍＬを添加し、３Ｌスケールのジャーファーメンター１に収容した（図１参照）。ジャーファーメンター１に収容した仕込原料液を、３３℃通気（７５０ｍＬ／分）、撹拌（６００ｒｐｍ上限）条件下で好気発酵を行わせた。最終的に得られる発酵液のｐＨは２０％炭酸ナトリウム水溶液により８．３に維持し、溶存酸素濃度は好気発酵の終了時に５０％を維持するように調整し、好気発酵を行った（経過時間０時間から好気発酵終了２７時間まで）。
【００５０】
次に同じジャーファーメンター１内で続けて嫌気発酵を行った。嫌気発酵は、上記ジャーファーメンター１にて、上記好気発酵条件中、通気を停止し、攪拌を９０ｒｐｍとして、ｐＨの維持値を９．２としたものである（経過時間２７時間から嫌気発酵終了３６時間まで）。
【００５１】
好気発酵、嫌気発酵を通じて発酵液の組成は図３のように推移した。各成分量はＨＰＬＣにより求めた。すなわち、好気発酵が進むにしたがって、サトウキビ搾汁に含まれるスクロース量は次第に減少する（経過時間０時間から好気発酵終了２２．５時間まで）。この時３ＨＢ濃度は増加しておらず、ＫＭ−１株はＰＨＢを生産し体内に蓄積している段階であることがわかる。糖質が全量有機酸に変換されていると思われる２７時間経過時点で嫌気発酵に切り替えると、３ＨＢの濃度が上昇し始めていることから、ＫＭ−１株は、嫌気培養条件にて、体内に蓄積されたＰＨＢを分解して３ＨＢとして体外に放出していることがわかる。これにより、発酵液はサトウキビ搾汁に対して３ＨＢを含有するとともに、糖質代謝生成物を含有するものとなっている。なお、ＰＨＢは嫌気発酵中新たに生産されるわけではないので、ＫＭ−１株がすでに体内に蓄積しているＰＨＢを３ＨＢに分解されるまで嫌気発酵を行えばよい（経過時間２７時間から３６時間まで）。すなわち、嫌気発酵が終了した発酵液中にはほぼＰＨＢが存在しない状態となっていることが確認されている。また、嫌気発酵が終了した発酵液中には、スクロースが存在しない状態となっていることも確認されている。なお、これらの好気発酵、嫌気発酵の過程で生成するその他の微量成分等の組成変動は不明である（詳細に解明することは実質的に不可能である）が、人体に有益であり、すぐれた味の発酵飲料が得られていることが確認できた。ここで、得られた発酵液中には約２．３％の３ＨＢが含まれており、人体に作用する際、３ＨＢが有効量含まれるとともに、優先的に消費される環境が整っていることが明らかになった。そのため、オレンジ果汁由来の発酵飲料と同様に、脳や体内において糖質をうまく利用できないアルツハイマー病、糖尿病の患者の症状を改善させる効果や、細胞への脂肪や糖の吸収を抑制してダイエット・健康食品分野への応用が期待できる。
【００５２】
〔別実施形態〕
先の実施形態ではオレンジ果汁、サトウキビ搾汁由来の発酵飲料を例示したが、ブドウ、リンゴ、バナナ、マンゴー、グレープフルーツ等の果菜汁を用いても同様に３ＨＢ含有の発酵飲料を製造できることが確認されており、その他の果菜汁一般に同様の発酵工程を行えることは明らかであるので、発酵原料液の種類は問わないものとする。なお、果菜汁を原料とすれば、人の飲用に好適な味覚を実現できるので好ましい。また、不溶固形成分濃度の低い（透明度の高い）果汁（ブドウ、リンゴ等）であれば、濾過操作等が簡便かつ十分に行いやすい点で好ましい。また、オレンジ、グレープフルーツ等の果汁は、元来の酸味を生かした発酵飲料とすることができ得る点から好ましい。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明によれば、３ＨＢを、人に有効に作用させられる形態で提供できるように生産することができ、細胞への脂肪や糖の吸収を抑制する効果を有することからダイエット・健康食品分野への応用が期待できる。
【符号の説明】
【００５４】
１          ：ジャーファーメンター
２          ：撹拌装置
３          ：通気装置
４          ：取り出し部
５          ：供給部
６          ：ｐＨ調整剤添加部
７          ：膜分離装置
８          ：タンク
【図１】
0006726468.tif 000002
【図２】
0006726468.tif 000003
【図３】
0006726468.tif 000004