(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブロックコポリマーから形成される生分解性ポリマーナノ粒子であって、該ブロックコポリマーが、
（ａ）親水性−疎水性ブロックコポリマーで化学的に修飾されたポリ（乳酸）（ＰＬＡ）であって、該親水性−疎水性ブロックコポリマーが、ポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）を含み、該生分解性ポリマーナノ粒子が、テトラブロックコポリマーＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ、またはペンタブロックコポリマーＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ−ＰＬＡから形成されている、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）と、
（ｂ）アミノ酸配列ＦＳＲＳＬＨＳＬＬ（配列番号１）を含む抗癌ペプチド、または実質的にＦＳＲＳＬＨＳＬＬを組み込む任意のポリペプチドであって、ＦＳＲＳＬＨＳＬＬが、ＤまたはＬ−立体配置のいずれかにある、ポリペプチドと
を含む、生分解性ポリマーナノ粒子。
【請求項２】
前記ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）が、約４，０００〜９０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲の平均分子量を有する、請求項１に記載の生分解性ポリマーナノ粒子。
【請求項３】
前記ポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコール−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）が、約４，０００ｇ／ｍｏｌ〜１５，０００ｇ／ｍｏｌの範囲の平均分子量を有する、請求項１に記載の生分解性ポリマーナノ粒子。
【請求項４】
前記ＰＬＡが、共有結合を用いて親水性−疎水性ブロックコポリマーで化学的に修飾されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の生分解性ポリマーナノ粒子。
【請求項５】
前記生分解性ポリマーナノ粒子の大きさが、１０〜２００ｎｍの範囲である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の生分解性ポリマーナノ粒子。
【請求項６】
前記生分解性ポリマーナノ粒子が、乳化剤を含まない、請求項１〜５のいずれか一項に記載の生分解性ポリマーナノ粒子。
【請求項７】
前記生分解性ポリマーナノ粒子が、約０．５重量％〜５重量％の外部の乳化剤をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の生分解性ポリマーナノ粒子。
【請求項８】
前記ポリ（乳酸）ブロックの平均分子量が、約４，０００〜９０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲であり、前記ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックの平均分子量が、約４，０００ｇ／ｍｏｌ〜１５，０００ｇ／ｍｏｌの範囲であり、前記生分解性ポリマーナノ粒子が、約０．５重量％〜５重量％の外部の乳化剤をさらに含む、請求項１に記載の生分解性ポリマーナノ粒子。
【請求項９】
前記ポリ（乳酸）ブロックの平均分子量が、約１６，０００ｇ／ｍｏｌ以下であり、前記ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックの平均分子量が、約４，０００ｇ／ｍｏｌ〜１５，０００ｇ／ｍｏｌの範囲であり、前記生分解性ポリマーナノ粒子が、乳化剤を含まない、請求項１に記載の生分解性ポリマーナノ粒子。
【請求項１０】
治療薬をさらに含み、該治療薬が、前記生分解性ポリマーナノ粒子上にカプセル封入されるか、表面複合体化されるか、または吸着され、該治療薬が、有機小分子、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗生物質、低分子量分子、化学療法薬、薬物、金属イオン、色素、放射性同位体、コントラスト剤、および造影剤から成る群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の生分解性ポリマーナノ粒子。
【請求項１１】
前記抗癌ペプチドが、疎水性ポリマーで化学的に修飾されている、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の生分解性ポリマーナノ粒子。
【請求項１２】
前記抗癌ペプチドが、タンパク質形質導入ドメインに連結されており、必要に応じて、該タンパク質形質導入ドメインが、ポリアルギニンである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の生分解性ポリマーナノ粒子。
【請求項１３】
ビタミン、小分子薬、リガンド、アミン、ペプチド断片、抗体、およびアプタマーから成る群から選択される標的成分をさらに含み、必要に応じて、該ビタミンが葉酸である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の生分解性ポリマーナノ粒子。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の生分解性ポリマーナノ粒子と、少なくとも１つの薬剤的に許容される担体とを含む医薬組成物であって、必要に応じて、該医薬組成物が、静脈内注射、筋肉内注射、または経口経路のいずれかによる対象中の送達に適している、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年４月２３日に出願されたインド特許出願第１２４９／ＤＥＬ／２０１２号ならびに２０１２年１０月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／７１４，９９４号の利益を主張するものである。これらの出願のそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、ナノテクノロジーの分野、特に、生分解性ポリマーナノ粒子の生成に関する。本発明はまた、治療薬および／または標的薬剤を輸送することができる生分解性ポリマーナノ粒子を生成する方法に関する。これらの生分解性ポリマーナノ粒子は、治療、診断、およびセラノスティクスにおける非常に大きな可能性を有する。
【背景技術】
【０００３】
分子標的療法は、癌治療における従来の化学療法薬の特異性の欠如を克服する有望な手段として登場した。癌治療において合成ペプチド薬は、従来のタンパク質と比較して高い特異性、安定性、および合成の容易さを示す。しかしながら、これらの抗癌ペプチドの標的部位への送達は、酵素分解、免疫原性、および血液中での短い寿命等の要因による大きな問題を引き起こす。抗癌薬の標的化された送達は、送達系が、その体積または血液循環中での活性度の損失を最小限に抑えて体内の障壁の透過を通して所望の腫瘍組織に達し、選択的に腫瘍細胞を死滅させることが可能であれば、より効果的であろう。これは、薬物の細胞内濃度を高め、同時に用量制限毒性を減少させることにより、患者の生存率および生活の質を改善するであろう。ペプチド薬物の送達のための戦略の１つは、薬物を細胞基質内への直接送達するためにペプチドを細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）と複合体化することに関する。しかしながら、ＣＰＰとの複合体化は、ペプチド薬物の費用を増加し、その効果および安定性を減少させ、時には毒性を増加させ得る。ＮｕＢＣＰ−９およびＢａｘ−ＢＨ３等のいくつかのペプチド治療薬は、癌性細胞への選択的結合を示し、アポトーシスを開始する。残念ながら、ペプチド治療薬の遊離薬物製剤は、ペプチドの大量の使用およびペプチドの頻繁な投与を必要とし、そのため費用が増加し、治療に不都合である。
【０００４】
治療用ペプチドを含む治療薬を癌性細胞の細胞基質内に効果的に送達することが可能な送達系に対する差し迫った必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
生分解性ブロックコポリマー、その生分解性ブロックコポリマーから形成されるナノ粒子、その調製のためのプロセス、その組成物、治療薬および標的薬剤を含む種々の物質のための担体としてのその用途、ならびに疾患の治療のための方法を本明細書に提供する。これらのポリマーナノ粒子は、非毒性および生分解性であり、調節可能な大きさを有し、カプセル封入薬物のインビボ半減期を上昇させることができる。
【０００６】
本発明の１つの態様は、親水性−疎水性ブロックコポリマーで化学的に修飾されたポリ（乳酸）（ＰＬＡ）から本質的に成るブロックコポリマーから形成される生分解性ポリマーナノ粒子であり、その親水性−疎水性ブロックコポリマーは、ポリ（メタクリル酸メチル）−ポリ（メチルアクリル酸）（ＰＭＭＡ−ＰＭＡＡ）、ポリ（スチレン−ポリアクリル）酸（ＰＳ−ＰＡＡ）、ポリ（アクリル酸）−ポリ（ビニルピリジン）（ＰＡＡ−ＰＶＰ）、ポリ（アクリル酸）−ポリ（Ｎ，Ｎ−メタクリル酸ジメチルアミノエチル）（ＰＡＡ−ＰＤＭＡＥＭＡ）、ポリ（エチレングリコール）−ポリ（ブチレングリコール）（ＰＥＧ−ＰＢＧ）、およびポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）から本質的に成るブロックコポリマーから選択される。
【０００７】
１つの実施形態において、生分解性ポリマーナノ粒子は、ブロックコポリマーＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧから形成される。
【０００８】
いくつかの実施形態において、生分解性ポリマーナノ粒子のポリ（乳酸）（ＰＬＡ）成分は、約４，０００ｇ／ｍｏｌ〜９０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。いくつかの実施形態において、生分解性ポリマーナノ粒子のポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）成分は、約４，０００ｇ／ｍｏｌ〜１５，０００ｇ／ｍｏｌの範囲の平均分子量を有する。
【０００９】
別の実施形態において、生分解性ナノ粒子は、ブロックコポリマーＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ−ＰＬＡから形成される。
【００１０】
いくつかの実施形態において、ＰＬＡは、共有結合を用いて親水性−疎水性ブロックコポリマーで化学的に修飾される。
【００１１】
いくつかの実施形態において、生分解性ポリマーナノ粒子の大きさは、３０〜１２０ｎｍの範囲である。
【００１２】
いくつかの実施形態において、生分解性ポリマーナノ粒子は、乳化剤を実質的に含まないか、または約０．５重量％〜５重量％の外部の乳化剤をさらに含むかのいずれかである。
【００１３】
ある実施形態において、ポリ（乳酸）ブロックの平均分子量は、約４，０００ｇ／ｍｏｌ〜９０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲であり、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックの平均分子量は、約４，０００ｇ／ｍｏｌ〜１５，０００ｇ／ｍｏｌの範囲であり、外部の乳化剤は、約０．５重量％〜５重量％である。
【００１４】
別の実施形態において、ポリ（乳酸）ブロックの平均分子量は約１６，０００ｇ／ｍｏｌ以下であり、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックの平均分子量は約４，０００ｇ／ｍｏｌ〜１５，０００ｇ／ｍｏｌの範囲であり、組成物は乳化剤を実質的に含まない。
【００１５】
いくつかの実施形態において、生分解性ポリマーナノ粒子は、治療薬をさらに含む。治療薬は、生分解性ポリマーナノ粒子上でカプセル封入されるか、表面で複合体化されるか、または吸着されてもよい。治療薬は、有機小分子、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗生物質、低分子量分子、化学療法薬、薬物、金属イオン、色素、放射性同位体、コントラスト剤、および造影剤を含む群から選択され得る。
【００１６】
さらなる実施形態において、治療薬は、抗癌ペプチドである。ある実施形態において、抗癌ペプチドは、ＦＳＲＳＬＨＳＬＬ（配列番号１）または実質的にＦＳＲＳＬＨＳＬＬ（配列番号１）を組み込む任意のポリペプチドのいずれかであり、そのＦＳＲＳＬＨＳＬＬ（配列番号１）は、ＤまたはＬ−立体配置のいずれかにある。別の実施形態において、抗癌ペプチドは、疎水性ポリマーで化学的に修飾される。１つの実施形態において、抗癌ペプチドは、ポリ（乳酸）で化学的に修飾されたＦＳＲＳＬＨＳＬＬ（配列番号１）である。
【００１７】
他の実施形態において、抗癌ペプチドは、ＣＱＲＲＫＮ（配列番号２）またはＡＱＡＲＲＫＮ（配列番号４）のいずれかといったＭＵＣ１−ＣＤドメインからの配列または修飾配列を含む。
【００１８】
他の実施形態において、ＭＵＣ１−ＣＤからの配列または修飾配列を含む抗癌ペプチドは、ポリアルギニン等のタンパク質形質導入ドメインに連結し得る。いくつかの実施形態において、ポリアルギニンは、９個のアルギニン残基から成る。
【００１９】
さらなる実施形態において、治療薬は、化学療法薬であり、パクリタキセル、ドキソルビシン、ピモジド、ピリメタミン、インデノイソキノリン、またはノル−インデノイソキノリンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
別の実施形態において、治療薬は、インスリンである。
【００２１】
いくつかの実施形態において、生分解性ポリマーナノ粒子は、ビタミン、小分子薬物、リガンド、アミン、ペプチド断片、抗体、およびアプタマーから成る群から選択される標的成分をさらに含む。特定の実施形態において、標的成分は葉酸である。
【００２２】
本発明の別の態様は、生分解性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスを提供し、
ａ．ポリ−乳酸（ＰＬＡ）および親水性−疎水性ブロックコポリマーを有機溶媒中で溶解し、溶液を得ることと、
ｂ．カルボジイミドカップリング剤および塩基を溶液に添加し、反応混合物を得ることと、
ｃ．反応混合物を撹拌し、親水性−疎水性ブロックコポリマーで化学的に修飾されたＰＬＡのブロックコポリマーを得ることと、
ｄ．ステップ（ｃ）からのブロックコポリマーを有機溶媒中で溶解および均質化し、均質化された混合物を得ることと、
ｅ．均質化された混合物を水相に添加し、エマルションを得ることと、
ｆ．エマルションを撹拌し、生分解性ポリマーナノ粒子を得ることと、を含む。
【００２３】
ある実施形態において、プロセスは任意に、生分解性ポリマーナノ粒子を水で洗浄するステップと、生分解性ポリマーナノ粒子を乾燥するステップとを含む。
【００２４】
さらなる実施形態において、プロセスは、３０〜１２０ｎｍの範囲の大きさを有する生分解性ポリマーナノ粒子をもたらす。
【００２５】
別の実施形態において、プロセスは任意に、ステップ（ａ）において乳化剤を添加することを含む。
【００２６】
本発明のさらなる態様は、治療薬をさらに含む生分解性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスを提供し、そのプロセスは、
ａ．上述の生分解性ポリマーナノ粒子を有する治療薬を有機溶媒中で均質化し、一次エマルションを得ることと、
ｂ．ステップ（ａ）の一次エマルションを水相中でさらに乳化し、二次エマルションを得ることと、
ｃ．二次エマルションを撹拌し、治療薬をさらに含むポリマーナノ粒子を得ることと、を含む。
【００２７】
ある実施形態において、プロセスは任意に、治療薬を含む生分解性ポリマーナノ粒子を水で洗浄するステップと、生分解性ポリマーナノ粒子を乾燥するステップとを含む。
【００２８】
いくつかの実施形態において、プロセスは、有機小分子、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗生物質、低分子量分子、化学療法薬、薬物、金属イオン、色素、放射性同位体、コントラスト剤、および造影剤から成る群から選択される治療薬の組み込みを含む。さらなる実施形態において、治療薬は抗癌ペプチドであり、その抗癌ペプチドは、ＦＳＲＳＬＨＳＬＬ（配列番号１）または実質的にＦＳＲＳＬＨＳＬＬ（配列番号１）を組み込む任意のポリペプチドであり、ＦＳＲＳＬＨＳＬＬ（配列番号１）は、ＤまたはＬ−立体配置のいずれかにある。特定の実施形態において、抗癌ペプチドは、疎水性ポリマーで化学的に修飾される。１つの実施形態は、ポリ（乳酸）で化学的に修飾された抗癌ペプチドＦＳＲＳＬＨＳＬＬ（配列番号１）である。
【００２９】
他の実施形態において、抗癌ペプチドは、ＣＱＲＲＫＮ（配列番号２）またはＡＱＡＲＲＫＮ（配列番号４）のいずれかといったＭＵＣ１−ＣＤドメインからの配列または修飾配列である。
【００３０】
他の実施形態において、ＭＵＣ１−ＣＤからの配列または修飾配列を含む抗癌ペプチドは、ポリアルギニン等のタンパク質形質導入ドメインに連結し得る。いくつかの実施形態において、ポリアルギニンは、９個のアルギニン残基から成る。
【００３１】
さらなる実施形態において、治療薬は、化学療法薬であり、パクリタキセル、ドキソルビシン、ピモジド、ピリメタミン、インデノイソキノリン、またはノル−インデノイソキノリン挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
本発明のさらなる態様は、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーを含む生分解性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスであり、生分解性ポリマーナノ粒子は遊離または修飾治療薬をさらに含み、そのプロセスは、
ａ．治療薬をＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子で有機溶媒中にて均質化し、一次エマルションを得ることと、
ｂ．ステップ（ａ）の一次エマルションを水相中でさらに乳化し、二次エマルションを得ることと、
ｃ．二次エマルションを撹拌し、遊離または修飾治療薬を含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧの生分解性ポリマーナノ粒子を得ることと、を含む。
【００３３】
ある実施形態において、ＰＬＡの分子量は、約３，０００ｇ／ｍｏｌ〜１０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲である。別の実施形態において、ＰＬＡの分子量は、約４，０００ｇ／ｍｏｌ〜９０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲である。
【００３４】
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ親水性−疎水性ブロックコポリマーの分子量は、約４，０００ｇ／ｍｏｌ〜１５，０００ｇ／ｍｏｌの範囲である。
【００３５】
さらなる実施形態において、治療薬は、疎水性ポリマーと共有結合している。ある実施形態において、治療薬は、ポリ（乳酸）と共有結合している。
【００３６】
本明細書に提供される本発明の別の態様は、本出願のプロセスにより得たＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子である。
【００３７】
別の態様は、少なくとも１つの治療薬をさらに含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧの生分解性ポリマーナノ粒子を、それを必要とする対象に投与することを含む、疾患を治療するための方法である。
【００３８】
いくつかの実施形態において、疾患は癌であり、治療薬は、抗癌ペプチドまたは化学療法薬のいずれかである。いくつかの実施形態において、癌は乳癌であり、抗癌ペプチドはＣＱＲＲＫＮ（配列番号２）またはＡＱＡＲＲＫＮ（配列番号４）等のＭＵＣ１−ＣＤドメインからの配列または修飾配列である。
【００３９】
他の実施形態において、ＭＵＣ１−ＣＤからの配列または修飾配列を含む抗癌ペプチドは、ポリアルギニン等のタンパク質形質導入ドメインに連結し得る。いくつかの実施形態において、ポリアルギニンは、９個のアルギニン残基から成る。
【００４０】
特定の実施形態において、疾患は糖尿病であり、治療薬はインスリンである。
【００４１】
本発明の追加の態様は、本発明の生分解性ポリマーナノ粒子および少なくとも１つの薬剤的に許容される担体を含む医薬組成物である。
【００４２】
１つの実施形態において、医薬組成物は、静脈内注射、筋肉内注射、または経口経路のいずれかによる対象中の送達に適している。
【００４３】
さらなる態様は、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）のセグメントおよびポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）のセグメントから本質的に成るブロックコポリマーである。
【００４４】
別の態様は、疎水性ポリマーと共有結合している治療薬を含む複合体である。いくつかの実施形態において、治療薬は、ポリ（乳酸）と共有結合している。いくつかの実施形態において、治療薬は、ペプチド、タンパク質、およびポリペプチドからなる群から選択される。
【００４５】
本明細書に提供される別の態様は、ポリ（乳酸）と共有結合している治療薬を含む複合体を調製するためのプロセスであり、そのプロセスは、カルボジイミドカップリング剤およびヒドロキシ誘導体の存在下で、治療薬とポリ（乳）酸との反応を含む。
【００４６】
さらなる態様は、ポリ（乳酸）と共有結合している少なくとも１つの治療薬をさらに含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧの生分解性ポリマーナノ粒子を、それを必要とする対象に投与することを含む、疾患を治療するための方法である。
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
親水性−疎水性ブロックコポリマーで化学的に修飾されたポリ（乳酸）（ＰＬＡ）から本質的に成るブロックコポリマーから形成される生分解性ポリマーナノ粒子であって、前記親水性−疎水性ブロックコポリマーが、ポリ（メタクリル酸メチル）−ポリ（メチルアクリル酸）（ＰＭＭＡ−ＰＭＡＡ）、ポリ（スチレン−ポリアクリル）酸（ＰＳ−ＰＡＡ）、ポリ（アクリル酸）−ポリ（ビニルピリジン）（ＰＡＡ−ＰＶＰ）、ポリ（アクリル酸）−ポリ（Ｎ，Ｎ−メタクリル酸ジメチルアミノエチル）（ＰＡＡ−ＰＤＭＡＥＭＡ）、ポリ（エチレングリコール）−ポリ（ブチレングリコール）（ＰＥＧ−ＰＢＧ）、およびポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）から本質的に成るブロックコポリマーから選択される、生分解性ポリマーナノ粒子。
（項目２）
前記生分解性ナノ粒子が、テトラブロックコポリマーＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧから形成される、項目１に記載の生分解性ポリマーナノ粒子。
（項目３）
前記ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）が、約４，０００〜９０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲の平均分子量を有する、項目１または２に記載の生分解性ポリマーナノ粒子。
（項目４）
前記ポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコール−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）が、約４，０００ｇ／ｍｏｌ〜１５，０００ｇ／ｍｏｌの範囲の平均分子量を有する、項目２に記載の生分解性ポリマーナノ粒子。
（項目５）
前記生分解性ナノ粒子が、前記ペンタブロックコポリマーＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ−ＰＬＡから形成される、項目１に記載の生分解性ポリマーナノ粒子。
（項目６）
前記ＰＬＡが、共有結合を用いて親水性−疎水性ブロックコポリマーで化学的に修飾されている、項目１〜５のいずれか１項に記載の生分解性ポリマーナノ粒子。
（項目７）
前記生分解性ポリマーナノ粒子の大きさが、約３０〜１２０ｎｍの範囲である、項目１〜６のいずれか１項に記載の生分解性ポリマーナノ粒子。
（項目８）
前記生分解性ポリマーナノ粒子が、乳化剤を実質的に含まない、項目１〜７のいずれか１項に記載の生分解性ポリマーナノ粒子。
（項目９）
前記生分解性ポリマーナノ粒子が、約０．５重量％〜５重量％の外部の乳化剤をさらに含む、項目１〜７のいずれか１項に記載の生分解性ポリマーナノ粒子。
（項目１０）
前記ポリ（乳酸）ブロックの平均分子量が、約４，０００〜９０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲であり、前記ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックの平均分子量が、約４，０００ｇ／ｍｏｌ〜１５，０００ｇ／ｍｏｌの範囲であり、前記外部の乳化剤が、約０．５重量％〜５重量％である、項目１または２に記載の生分解性ポリマーナノ粒子。
（項目１１）
前記ポリ（乳酸）ブロックの平均分子量が、約１６，０００ｇ／ｍｏｌ以下であり、前記ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックの平均分子量が、約４，０００ｇ／ｍｏｌ〜１５，０００ｇ／ｍｏｌの範囲であり、前記組成物が、乳化剤を実質的に含まない、項目１または２に記載の生分解性ポリマーナノ粒子。
（項目１２）
治療薬をさらに含む、項目１〜１１のいずれか１項に記載の生分解性ポリマーナノ粒子。
（項目１３）
前記治療薬が、前記生分解性ポリマーナノ粒子上にカプセル封入されるか、表面複合体化されるか、または吸着される、項目１２に記載の生分解性ポリマーナノ粒子。
（項目１４）
前記治療薬が、有機小分子、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗生物質、低分子量分子、化学療法薬、薬物、金属イオン、色素、放射性同位体、コントラスト剤、および造影剤を含む群から選択される、項目１３に記載の生分解性ポリマーナノ粒子。
（項目１５）
前記ペプチドが、抗癌ペプチドである、項目１４に記載の生分解性ポリマーナノ粒子。
（項目１６）
前記抗癌ペプチドが、ＦＳＲＳＬＨＳＬＬまたは実質的に前記ＦＳＲＳＬＨＳＬＬを組み込む任意のポリペプチドのいずれかであり、前記ＦＳＲＳＬＨＳＬＬが、ＤまたはＬ−立体配置のいずれかにある、項目１５に記載の生分解性ポリマーナノ粒子。
（項目１７）
前記抗癌ペプチドが、疎水性ポリマーで化学的に修飾される、項目１５または１６に記載の生分解性ポリマーナノ粒子。
（項目１８）
前記抗癌ペプチドが、ＦＳＲＳＬＨＳＬＬまたは実質的に前記ＦＳＲＳＬＨＳＬＬを組み込む任意のポリペプチドのいずれかであり、前記ＦＳＲＳＬＨＳＬＬがＤまたはＬ−立体配置のいずれかにあり、前記疎水性ポリマーがポリ（乳酸）である、項目１７に記載の生分解性ポリマーナノ粒子。
（項目１９）
前記抗癌ペプチドが、ＭＵＣ１−ＣＤドメインからの配列であるＣＱＲＲＫＮである、項目１５に記載の生分解性ポリマーナノ粒子。
（項目２０）
前記抗癌ペプチドが、ＭＵＣ１−ＣＤドメインからの修飾配列であるＡＱＡＲＲＫＮである、項目１５に記載の生分解性ポリマーナノ粒子。
（項目２１）
前記抗癌ペプチドが、タンパク質形質導入ドメインに連結される、項目１９または２０に記載の方法。
（項目２２）
前記タンパク質形質導入ドメインが、ポリアルギニンである、項目２１に記載の方法。（項目２３）
前記治療薬が化学療法薬である、項目１４に記載の生分解性ポリマーナノ粒子。
（項目２４）
前記化学療法薬が、パクリタキセル、ドキソルビシン、ピモジド、ピリメタミン、インデノイソキノリン、またはノル−インデノイソキノリンから成る群から選択される、項目２３に記載の生分解性ポリマーナノ粒子。
（項目２５）
前記ペプチドがインスリンである、項目１４に記載の生分解性ポリマーナノ粒子。
（項目２６）
ビタミン、小分子薬、リガンド、アミン、ペプチド断片、抗体、およびアプタマーから成る群から選択される標的成分をさらに含む、項目１〜１１に記載の生分解性ポリマーナノ粒子。
（項目２７）
前記ビタミンが葉酸である、項目２６に記載の生分解性ポリマーナノ粒子。
（項目２８）
生分解性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスであって、
ａ．有機溶媒中でポリ（乳酸）（ＰＬＡ）および親水性−疎水性ブロックコポリマーを溶解し、溶液を得ることと、
ｂ．カルボジイミドカップリング剤および塩基を前記溶液に添加し、反応混合物を得ることと、
ｃ．前記反応混合物を撹拌し、前記親水性−疎水性ブロックコポリマーで化学的に修飾されたＰＬＡのブロックコポリマーを得ることと、
ｄ．ステップ（ｃ）からの前記ブロックコポリマーを有機溶媒中で溶解し、および均質化し、均質化された混合物を得ることと、
ｅ．前記均質化された混合物を水相に添加し、エマルションを得ることと、
ｆ．前記エマルションを撹拌し、生分解性ポリマーナノ粒子を得ることと、を含む、プロセス。
（項目２９）
前記プロセスが、前記生分解性ポリマーナノ粒子を水で洗浄するステップと、前記生分解性ポリマーナノ粒子を乾燥するステップとを任意に含む、項目２８に記載のプロセス。
（項目３０）
前記生分解性ポリマーナノ粒子が、約３０〜１２０ｎｍの範囲の大きさを有する、項目２８または２９に記載のプロセス。
（項目３１）
ステップ（ａ）が、任意に乳化剤を添加することを含む、項目２８〜３０のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目３２）
項目１〜１１のいずれか１項に記載の生分解性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスであって、前記生分解性ポリマーナノ粒子が、治療薬をさらに含み、
ａ．項目１〜１１のいずれか１項に記載の前記生分解性ポリマーナノ粒子を有する治療薬を有機溶媒中で均質化し、一次エマルションを得ることと、
ｂ．ステップ（ａ）の前記一次エマルションを水相中でさらに乳化し、二次エマルションを得ることと、
ｃ．前記二次エマルションを撹拌し、治療薬をさらに含む前記ポリマーナノ粒子を得ることと、を含む、プロセス。
（項目３３）
前記プロセスが、前記治療薬をさらに含む前記生分解性ポリマーナノ粒子を水で洗浄するステップと、前記治療薬をさらに含む前記生分解性ポリマーナノ粒子を乾燥するステップとを任意に含む、項目３２に記載のプロセス。
（項目３４）
前記治療薬が、有機小分子、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗生物質、低分子量分子、化学療法薬、薬物、金属イオン、色素、放射性同位体、コントラスト剤、および造影剤から成る群から選択される、項目３２または３３に記載のプロセス。
（項目３５）
前記ペプチドが抗癌ペプチドである、項目３４に記載のプロセス。
（項目３６）
前記抗癌ペプチドが、ＦＳＲＳＬＨＳＬＬまたは実質的に前記ＦＳＲＳＬＨＳＬＬを組み込む任意のポリペプチドのいずれかであり、前記ＦＳＲＳＬＨＳＬＬが、ＤまたはＬ−立体配置のいずれかにある、項目３５に記載のプロセス。
（項目３７）
前記抗癌ペプチドが、疎水性ポリマーで化学的に修飾される、項目３５に記載のプロセス。
（項目３８）
前記抗癌ペプチドが、ＦＳＲＳＬＨＳＬＬまたは実質的に前記ＦＳＲＳＬＨＳＬＬを組み込む任意のポリペプチドのいずれかであり、前記ＦＳＲＳＬＨＳＬＬがＤまたはＬ−立体配置のいずれかにあり、前記疎水性ポリマーがポリ（乳酸）である、項目３７に記載のプロセス。
（項目３９）
前記抗癌ペプチドが、ＭＵＣ１−ＣＤドメインからの配列であるＣＱＲＲＫＮである、項目３５に記載のプロセス。
（項目４０）
前記抗癌ペプチドが、前記ＭＵＣ１−ＣＤドメインからの修飾配列であるＡＱＡＲＲＫＮである、項目３５に記載のプロセス。
（項目４１）
前記抗癌ペプチドが、タンパク質形質導入ドメインに連結する、項目３９または４０に記載の方法。
（項目４２）
前記タンパク質形質導入ドメインが、ポリアルギニンである、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記治療薬が化学療法薬である、項目３４に記載のプロセス。
（項目４４）
前記化学療法薬が、パクリタキセル、ドキソルビシン、ピモジド、ピリメタミン、インデノイソキノリン、またはノル−インデノイソキノリンから選択される、項目４３に記載のプロセス。
（項目４５）
ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーを含む生分解性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスであって、前記生分解性ポリマーナノ粒子が、治療薬をさらに含み、
ａ．前記治療薬をＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーの前記生分解性ポリマーナノ粒子で有機溶媒中にて均質化し、一次エマルションを得ることと、
ｂ．ステップ（ａ）の前記一次エマルションを水相中でさらに乳化し、二次エマルションを得ることと、
ｃ．前記二次エマルションを撹拌し、前記遊離または修飾治療薬を含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧの前記生分解性ポリマーナノ粒子を得ることと、を含む、プロセス。
（項目４６）
前記ＰＬＡの分子量が、約３，０００ｇ／ｍｏｌ〜１０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲である、項目４５に記載のプロセス。
（項目４７）
前記ＰＬＡの分子量が、約４，０００ｇ／ｍｏｌ〜９０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲である、項目４５に記載のプロセス。
（項目４８）
前記ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ親水性−疎水性ブロックコポリマーの分子量が、約４，０００ｇ／ｍｏｌ〜１５，０００ｇ／ｍｏｌの範囲である、項目４５〜４７のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目４９）
前記治療薬が、疎水性ポリマーと共有結合している、項目４５に記載のプロセス。
（項目５０）
前記疎水性ポリマーが、ポリ（乳酸）である、項目４９に記載のプロセス。
（項目５１）
項目４５に記載のプロセスによって得られた、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子。
（項目５２）
疾患を治療するための方法であって、少なくとも１つの治療薬をさらに含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧの生分解性ポリマーナノ粒子を、その方法を必要とする対象に投与することを含む、方法。
（項目５３）
前記疾患が癌であり、前記治療薬が抗癌ペプチドである、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記疾患が癌であり、前記治療薬が化学療法薬である、項目５２に記載の方法。
（項目５５）
前記疾患が糖尿病であり、前記治療薬がインスリンである、項目５１に記載の方法。
（項目５６）
前記癌が乳癌であり、前記抗癌ペプチドが、ＭＵＣ１−ＣＤドメインからの配列であるＣＱＲＲＫＮ、または前記ＭＵＣ１−ＣＤドメインからの修飾配列であるＡＱＡＲＲＫＮのいずれかである、項目５３に記載の方法。
（項目５７）
前記抗癌ペプチドが、タンパク質形質導入ドメインに連結する、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記タンパク質形質導入ドメインが、ポリアルギニンである、項目５７に記載の方法。（項目５９）
項目１〜２７のいずれか１項に記載の生分解性ポリマーナノ粒子および少なくとも１つの薬剤的に許容される担体を含む、医薬組成物。
（項目６０）
前記医薬組成物が、静脈内注射、筋肉内注射、または経口経路のいずれかによる対象中の送達に適している、項目５９に記載の医薬組成物。
（項目６１）
ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）のセグメントおよびポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）のセグメントから本質的に成る、ブロックコポリマー。
（項目６２）
疎水性ポリマーと共有結合している治療薬を含む複合体。
（項目６３）
前記疎水性ポリマーが、ポリ（乳酸）である、項目６２に記載の複合体。
（項目６４）
前記治療薬が、ペプチド、タンパク質、およびポリペプチドから成る群から選択される、項目６２または６３に記載の複合体。
（項目６５）
ポリ（乳酸）と共有結合している治療薬を含む複合体を調製するためのプロセスであって、カルボジイミドカップリング剤およびヒドロキシ誘導体の存在下で、前記治療薬とポリ（乳）酸との反応を含む、プロセス。
（項目６６）
疾患を治療するための方法であって、ポリ（乳酸）と共有結合している少なくとも１つの治療薬をさらに含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧの生分解性ポリマーナノ粒子を、その方法を必要とする対象に投与することを含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
以下の図は、本明細書の一部を成し、本発明の態様をさらに例示することを意図する。本発明は、本明細書にある特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせてその図を参照することにより、より良く理解され得る。
【００４８】
【図１】ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーのポリマーナノ粒子の概略図を提供する。
【図２】ＰＬＡ、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ、およびＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子のＦＴＩＲスペクトルを提供する。
【図３】（図３Ａ）１，１００ｇ／ｍｏｌのＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧのブロックコポリマーから合成されたＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子の核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルを示す。（図３Ｂ）４，４００ｇ／ｍｏｌのＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧのブロックコポリマーから合成されたＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子の核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルを示す。（図３Ｃ）８，４００ｇ／ｍｏｌのＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧのブロックコポリマーから合成されたＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子の核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルを示す。
【図４】ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧポリマーナノ粒子の透過電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）画像を示す。
【図５】ＭＣＦ−７細胞中に蛍光色素であるローダミンＢをカプセル封入するＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子の細胞内在化を示す。
【図６Ａ】２５℃で異なるコポリマーを用いて合成されたＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子からのカプセル封入されたＬ−ＰＬＢＣＬ２Ｐ９の経時的なインビトロ放出を示す。
【図６Ｂ】ＭＣＦ−７細胞株中のＬ−ＰＬＢＣＬ２Ｐ９薬物放出を負荷した、異なるブロックコポリマーを用いて合成されたＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子の効果および細胞増殖を示す。
【図７Ａ】一次ＨＵＶＥＣ細胞株上の抗癌ペプチド、Ｌ−ＰＬＢＣＬ２Ｐ９を負荷したＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子の効果を示す。
【図７Ｂ】細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を用いた薬物送達と比較した、ＭＣＦ−７細胞増殖における抗癌ペプチドＬ−ＰＬＢＣＬ２Ｐ９を負荷したＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子の送達の効果を示す。
【図８】（図８Ａ）１５０ｍｇ／ｋｇ（体重）の用量で単純ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子で治療したＢＡＬＢ／ｃマウスのヘモグロビンを示す。（図８Ｂ）１５０ｍｇ／ｋｇ（体重）の用量で単純ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子で治療したＢＡＬＢ／ｃマウス中の好中球およびリンパ球数を示す。（図８Ｃ）１５０ｍｇ／ｋｇ（体重）の用量で単純ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子で治療したＢＡＬＢ／ｃマウスの血中血球容積、ＭＣＶ（平均赤血球容積）、ＭＣＨ（平均赤血球ヘモグロビン量）、およびＭＣＨＣ（平均赤血球ヘモグロビン濃度）を示す。
【図９】（図９Ａ）１５０ｍｇ／ｋｇ（体重）の用量で単純ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子で治療したＢＡＬＢ／ｃマウスのアスパラギン酸トランスアミナーゼおよびアラニントランスアミナーゼのレベルを示す。（図９Ｂ）１５０ｍｇ／ｋｇ（体重）の用量で単純ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子で治療したＢＡＬＢ／ｃマウスのアルカリホスファターゼのレベルを示す。（図９Ｃ）１５０ｍｇ／ｋｇ（体重）の用量で単純ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子で治療したＢＡＬＢ／ｃマウスの尿素および血中尿素窒素（ＢＵＮ）のレベルを示す。
【図１０】単純ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子を注射したＢＡＬＢ／ｃマウスの脳、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、および肺の組織病理学を示す。
【図１１Ａ】Ｌ−ＰＬＢＣＬ２Ｐ９カプセル封入ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子（８，８００ｇ／ｍｏｌ）で治療したエールリッヒ腹水癌（ＥＡＴ）マウスの腫瘍退縮を示す。
【図１１Ｂ】Ｌ−ＰＬＢＣＬ２Ｐ９カプセル封入ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子（８，８００ｇ／ｍｏｌ）で治療したエールリッヒ腹水癌（ＥＡＴ）マウスの腫瘍退縮を示す。
【図１２】（図１２Ａ）１日目のエールリッヒ腹水癌（ＥＡＴ）マウスを示す。（図１２Ｂ）ＰＬ−ＢＣＬ２Ｐ９カプセル封入ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子（８，８００ｇ／ｍｏｌ）で治療したＥＡＴマウスの２１日目の腫瘍成長抑制を示す。（図１２Ｃ）２１日目の未治療の対照マウスを示す。
【図１３】糖尿病ウサギの血糖値の制御におけるインスリン負荷ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子の効果を示す。
【図１４】ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子からのポリアルギニン配列（ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＣＱＣＲＲＫＮ（配列番号３））に連結するＭＵＣ１細胞質ドメインペプチドの放出データを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
ナノ粒子は、ナノカプセルまたはナノ球体を生成することができる。ナノ粒子中へのタンパク質負荷は、吸着プロセスまたはカプセル封入プロセスのいずれかによって行われ得る（Ｓｐａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ；Ｗｏｒｌｄ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：７６）。受動的および能動的標的化計画の両方を用いることによって、ナノ粒子は、正常細胞における毒性を回避しながら癌細胞における薬物の細胞内濃度を高めることができる。ナノ粒子が特定の受容体に結合して細胞内に進入する際、それらは通常、受容体媒介性エンドサイトーシスを介してエンドソームで覆われ、それにより、主要な薬物耐性機序の１つであるＰ−糖タンパク質の認識を迂回する（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００８，１４：１３１０−１３１６）。ナノ粒子は、オプソニン作用および食作用によって身体から除去される（Ｓｏｓｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒｓ：Ｎｅｗ  Ｅｎｄｅａｖｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ；Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐａｔｅｎｔｓ  ｏｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１：４３−５９）。ナノ担体に基づくシステムは、改善した細胞内透過、局所的送達、早期分解に対する薬物の保護、制御された薬物動態および薬物組織分布特性、低い必要用量、および費用対効果の利点を有する効果的な薬物送達のために使用され得る（Ｆａｒｏｋｈｚａｄ  ＯＣ，Ｃｈｅｎｇ  Ｊ，Ｔｅｐｌｙ  ＢＡ，Ｓｈｅｒｉｆｉ  Ｉ，Ｊｏｎ  Ｓ，Ｋａｎｔｏｆｆ  ＰＷ；Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−ａｐｔａｍｅｒ  ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００６，１０３（１６）：６３１５−２０；Ｆｏｎｓｅｃａ  Ｃ，Ｓｉｍｏｅｓ  Ｓ，Ｇａｓｐａｒ  ＲＥ，Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ−ｌｏａｄｅｄ  ＰＬＧＡ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ：ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２００２；８３（２）：２７３−８６；Ｈｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１１，６（７）：１２５７−１２７２）。
【００５０】
ナノ粒子の取り込みは、その小さい寸法に間接的に比例する。その小さい大きさのため、ポリマーナノ粒子は、細網内皮系（ＲＥＳ）による認識および取り込みを逃れることが分かっており、このため、血液中を長時間循環することができる（Ｂｏｒｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．７：１０５５−１０５８）。ナノ粒子はまた、固形腫瘍の漏出性脈管構造のような病的部位で血管外遊出することができ、受動的標的化機構をもたらす。より速い可溶化速度に繋がるより大きな表面積のため、ナノサイズの構造は通常、より高い血漿濃度および曲線下面積（ＡＵＣ）値を示す。小さい粒径は、宿主防御機構を逃れるのに役立ち、血液循環時間を上昇させる。ナノ粒径は、薬物放出に影響する。より大きな粒子は、系中への薬物のより緩徐な拡散を有する。より小さい粒子は、より大きい表面積を提供するが、速い薬物放出をもたらす。より小さい粒子は、貯蔵およびナノ粒子分散の輸送の間に凝集する傾向がある。よって、ナノ粒子の小さい大きさと最大安定性との折衷が望ましい。薬物送達系において使用されるナノ粒子の大きさは、その毛細血管中への急速な漏出を防ぐのに十分大きいが、肝臓および脾臓等の網内系中に留まっている固定マクロファージによる捕捉を逃れるのに十分小さくなければならない。
【００５１】
そのサイズに加えて、ナノ粒子の表面特性もまた、循環中の寿命および運命の決定における重要な要因である。ナノ粒子は、理想的に、マクロファージ捕捉を逃れるために親水性表面を有するべきである。親水性および疎水性ドメインを有するブロックコポリマーから形成されたナノ粒子は、これらの基準を満たす。制御されたポリマー分解もまた、疾患状態への薬剤送達のレベルを上昇させる効果がある。ポリマー分解はまた、粒径の影響を受ける場合がある。分解速度は、インビトロの粒径の増大と共に増大する（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ；Ｓｕｎｄａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ；ｄｏｉ：１０．１０８８／１４６８−６９９６／１１／１／０１４１０４）。
【００５２】
ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）は、組織工学、医療材料、および薬物担体に関する申請に対して米国のＦＤＡによって認可されており、ポリ（乳酸）−ポリ（エチレングリコール）ＰＬＡ−ＰＥＧに基づく薬物送達系は、当該技術分野において既知である。米国第２００６／０１６５９８７Ａ１号は、ポリ（エステル）−ポリ（エチレン）マルチブロックコポリマーおよびナノ球体に強剛性を与える任意の成分を含み、薬学的化合物を組み込む、ステルス性のポリマー生分解性ナノ球体を記載している。米国第２００８／００８１０７５Ａ１号は、グラフト高分子および１つ以上のブロックコポリマーから自己組織化した、機能的内部コアおよび親水性外部シェルを有する新規の混合ミセル構造を記載している。米国第２０１０／０００４３９８Ａ１号は、相間領域を持つコア／シェル立体配置のポリマーナノ粒子およびそれを生成するためのプロセスを記載している。
【００５３】
しかしながら、これらのポリマーナノ粒子は本質的に、ナノ粒子の安定性のために約１％〜２％の乳化剤の使用を必要とする。乳化剤は、培地中の分散粒子を安定化させる。ＰＶＡ、ＰＥＧ、Ｔｗｅｅｎ  ８０、およびＴｗｅｅｎ  ２０は、一般的な乳化剤の一部である。しかしながら、乳化剤の使用は、乳化剤の浸出が対象に対する毒性となり得るため、インビボ用途の懸念の理由となる（Ｓａｆｅｔｙ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｎ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌｓ（ＰＥＧＳ）ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｓ  ｕｓｅｄ  ｉｎ  ｃｏｓｍｅｔｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，２００５  Ｏｃｔ．１５；２１４（１−２）：１−３８）。乳化剤の使用はまた、ナノ粒子の質量を増加させ、それにより薬物負荷を減少させ、より多い投薬量の必要性を引き起こす。ナノ粒子薬物担体システムにおいて依然として広く存在する他の不利益は、不十分な経口での生物学的利用能、循環における不安定性、不適当な組織分布、および毒性である。上記の不利益を伴わずに治療用ペプチドを含む治療薬を癌性細胞の細胞基質内に効果的に送達することができる送達系に対する緊急の必要性が存在する。
【００５４】
インビボでの薬物の半減期を上昇させる、調節可能な大きさを有する非毒性、生分解性のポリマーナノ粒子を含む、効果的な治療用送達系を本明細書に提供する。当業者であれば、本明細書に記載の発明は、具体的に記載されるもの以外の変化および修正を受けることに気付くであろう。本明細書に記載の発明が、すべてのそのような変化および修正を含むことを理解されたい。本発明はまた、本明細書において、個々にもしくはまとめて参照されるか、または示されるすべてのそのようなステップ、特徴、組成物、および化合物、ならびにそのステップまたは特徴のうちの任意の２つ以上の任意の、およびすべての組み合わせを含む。
定義
【００５５】
便宜上、本発明のさらなる説明の前に、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲において用いるある特定の用語をここにまとめる。これらの定義は、残りの開示を考慮して解釈し、当業者によって理解されるように理解されるべきである。別途定義されない限り、本明細書で用いられるすべての技術および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書全体を通して使用される用語は、別途特定の事例において制限されない限り、以下のように定義される。
【００５６】
「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という冠詞は、その冠詞の文法上の目的語の１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。
【００５７】
「含む」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有すること」、「〜を特徴とする」、およびそれらの文法的同等物は、包括的、開放的な意義において使用され、追加の構成要素が含まれ得ることを意味する。「〜だけから成る」と解釈されるとは意図されない。
【００５８】
本明細書に使用される場合、「〜から成る」およびその文法的同等物は、特許請求の範囲において特定されない任意の構成要素、ステップ、または成分を排除する。
【００５９】
本明細書に使用される場合、「約」または「およそ」という用語は通常、所与の値または範囲の２０％以内、より好ましくは１０％以内、および最も好ましくはさらに５％以内を意味する。
【００６０】
本明細書に使用される場合、「生分解性」という用語は、酵素的および非酵素的破壊の両方、またはポリマー構造の分解を指す。
【００６１】
本明細書に使用される場合、「ナノ粒子」という用語は、直径１０ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲内の粒子を指し、直径は、粒子と同じ容積を有する完全な球体の直径を指す。「ナノ粒子」という用語は、「ナノ粒子（複数可）」と同義に使用される。場合によっては、粒子の直径は、約１〜１０００ｎｍ、１０〜５００ｎｍ、または３０〜１２０ｎｍの範囲である。
【００６２】
場合によっては、粒子の集団が存在してもよい。本明細書に使用される場合、ナノ粒子の直径は、特定の集団における分布の平均である。
【００６３】
本明細書に使用される場合、「ポリマー」という用語は、当該技術分野において用いられるその通常の意味、すなわち、共有結合によって結合される１つ以上の反復単位（モノマー）を含む分子構造として用いられる。反復単位は、すべてが同じであり得るか、または場合によっては、ポリマー内に存在する反復単位のうちの２種類以上が存在し得る。
【００６４】
「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、その変異形、およびそれらの誘導体等のポリヌクレオチドを指す。
【００６５】
本明細書に使用される場合、「治療薬」および「薬物」という用語は、同義に使用され、本質的に薬剤的もしくは生物学的に活性な化合物または種だけではなく、それらの活性化合物または種のうちの１つ以上を含む材料、ならびに複合体、修飾体、および薬理学的に活性な断片、ならびにそれらの抗体誘導体を包含することも意図される。
【００６６】
「標的成分」または「標的薬剤」は、標的化される細胞の表面に選択的に結合する分子である。例えば、標的成分は、特定の種類の細胞上で発見されるか、または標的細胞上で他の細胞よりも高い頻度で発現される、細胞表面受容体に結合するリガンドである。
【００６７】
標的薬剤または治療薬は、ペプチドまたはタンパク質である。「タンパク質」および「ペプチド」は、当該技術分野において周知の用語であり、本明細書に使用される場合、これらの用語は、当該技術分野におけるその通常の意味で用いられる。概して、ペプチドは、約１００個未満のアミノ酸長であるが、最大３００個のアミノ酸を含むことができるアミノ酸配列である。タンパク質は、概して、少なくとも１００個のアミノ酸の分子であると考えられる。アミノ酸は、ＤまたはＬ−立体配置にあり得る。タンパク質は、例えば、タンパク質薬物、抗体、組換え抗体、組換えタンパク質、酵素等であり得る。場合によっては、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸のうちの１つ以上は、例えば、炭水化物基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、複合体化のためのリンカー等の化学物質の添加、機能化、または環化、副次的環化、ならびにペプチドおよびタンパク質により有利な特性を与えることが意図される多数の他の修飾のいずれかといった他の修飾によって、修飾され得る。他の事例において、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸のうちの１つ以上は、１つ以上の天然に生じないアミノ酸による置換によって修飾され得る。ペプチドまたはタンパク質は、ファージライブラリー、酵母ライブラリー、またはインビトロ組み合わせライブラリー等の組み合わせライブラリーから選択され得る。
【００６８】
本明細書に使用される場合、「抗体」という用語は、任意の種からの分子と接触する免疫グロブリン可変領域によって示される結合親和性と同様であるか、またはそれよりも大きい結合親和性を所与の抗原に与える二次または三次構造類似性を有するアミノ酸配列または分子を組み込む任意の分子を指す。抗体という用語は、限定することなく、２つの重鎖および２つの軽鎖から成る自然抗体、軽鎖、重鎖、もしくはその両方の断片、可変ドメイン断片、重鎖もしくは軽鎖のみの抗体、またはこれらのドメインの任意の改変された組み合わせに由来する結合分子を含み、単一特異性または二重特異性かどうか、また造影剤もしくは化学療法薬分子等の二次診断用または治療的成分と複合体化するかどうかは問わない。本用語は、限定することなく、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ラマ、ラクダ、ヒト、または任意の他の脊椎動物種に由来するかは問わない、結合成分に由来する免疫グロブリン可変領域を含む。本用語は、発見方法（ハイブリドーマ由来、ヒト化、ファージ由来、酵母由来、コンビナトリアルディスプレイ由来、もしくは当該技術分野で既知の任意の類似の誘導方法）、または生成方法（細菌、酵母、哺乳類細胞培養、もしくは遺伝子導入動物、もしくは当該技術分野で既知の任意の類似の生成方法）にかかわらず、任意のそのような免疫グロブリン可変領域結合成分を指す。
【００６９】
本発明は、ブロックコポリマーで構成されている非毒性、安全、生分解性ポリマーナノ粒子およびそれを調製するためのプロセスを提供する。本発明の生分解性ポリマーナノ粒子は、親水性−疎水性ブロックコポリマーで化学的に修飾されたポリ（乳酸）（ＰＬＡ）から本質的に成るブロックコポリマーから形成され、その親水性−疎水性ブロックコポリマーは、ポリ（メタクリル酸メチル）−ポリ（メチルアクリル酸）（ＰＭＭＡ−ＰＭＡＡ）、ポリ（スチレン）−ポリ（アクリル酸）（ＰＳ−ＰＡＡ）、ポリ（アクリル酸）−ポリ（ビニルピリジン）（ＰＡＡ−ＰＶＰ）、ポリ（アクリル酸）−ポリ（Ｎ，Ｎ−メタクリル酸ジメチルアミノエチル）（ＰＡＡ−ＰＤＭＡＥＭＡ）、ポリ（エチレングリコール）−ポリ（ブチレングリコール）（ＰＥＧ−ＰＢＧ）、およびポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）から選択される。
【００７０】
本発明は、本発明の生分解性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスを提供する。結果として生じるナノ粒子は、非毒性、安全、および生分解性であるだけではなく、インビボで安定しており、高い貯蔵安定性を有し、医療分野におけるナノ担体系または薬物送達系で安全に使用することができる。実際に、本発明のナノ粒子は、送達可能薬物または治療薬のインビボでの半減期を上昇させる。本発明はまた、効果的および標的化される薬物送達ナノ担体系の形成する、生分解性ポリマーナノ粒子上の効果的な薬物負荷のためのプロセスを提供し、それは活性薬剤の早期分解を防ぎ、癌治療における用途に対する強い可能性を有する。
【００７１】
また、医療および他の分野における用途のための生分解性ポリマーナノ粒子を含む組成物も提供し、それはナノ粒子の担体系またはリザーバーまたはデポーを用いる。本発明のナノ粒子は、予後の、治療の、診断の、またはセラノスティクスの組成物において広範囲に使用されてもよい。好適には、本発明のナノ粒子は、薬物および薬剤送達のために、ならびにヒトまたは動物における疾患診断および医用画像のために使用される。このため、本発明は、本明細書に記載されるように治療薬をさらに含むナノ粒子を使用する疾患の治療のための方法を提供する。本発明のナノ粒子はまた、リザーバーもしくはデポーが必要とされる場合、バイオセンサーとして、固定化酵素のための薬剤としてなど、化学または生体反応等の他の用途において使用され得る。
【００７２】
本発明者らが、いかなる乳化剤または安定剤も用いずに生分解性ポリマーナノ粒子を生成することを試みた際、予想外の驚くべき結果が得られた。そのプロセスによって得られた生分解性ポリマーナノ粒子は、安全、安定、および非毒性である。ある実施形態において、ブロックコポリマーＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧは、ポリ−乳酸（ＰＬＡ）マトリックスと共有結合しており、ブロックコポリマーをマトリックスの一部、すなわちナノ粒子送達系にする。対照的に、先行技術において、乳化剤（例えば、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）は、ナノ粒子マトリックスの一部ではなく、ゆえに浸出する（図１）。先行技術のナノ粒子とは対照的に、本明細書に提供されるナノ粒子から培地中への乳化剤の浸出はない。
【００７３】
本プロセスによって得られたナノ粒子は、インビボで浸出し得る追加の乳化剤がないため、非毒性および安全である。乳化剤がないこと、または減少されることはまた、より高い薬物対ポリマー比を有するナノ粒子をもたらす。これらのナノ粒子は、当該技術分野に存在するポリマーナノ粒子と比較して、より高い安定性および増加した貯蔵保存期間を有する。本発明のポリマーナノ粒子は、分解生成物が身体から容易に排泄され得るように生分解性に調製される。分解はまた、ナノ粒子中にカプセル封入された内容物を身体内の部位で放出できるようにするための方法を提供する。
【００７４】
ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）は、疎水性ポリマーであり、本発明のポリマーナノ粒子の合成に好ましいポリマーである。しかしながら、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）およびポリ乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）のブロックコポリマーもまた使用され得る。疎水性ポリマーはまた、生物学的に由来するか、またはバイオポリマーであってもよい。
【００７５】
用いられるＰＬＡの分子量は概して、約４，０００ｇ／ｍｏｌ〜９０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲である。ＰＬＡの平均分子量はまた、約６０，０００ｇ／ｍｏｌであってもよい。
【００７６】
ポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）、ポリ（メタクリル酸メチル）−ポリ（メチルアクリル酸）（ＰＭＭＡ−ＰＭＡＡ）、ポリ（スチレン）−ポリ（アクリル酸）（ＰＳ−ＰＡＡ）、ポリ（アクリル酸）−ポリ（ビニルピリジン）（ＰＡＡ−ＰＶＰ）、ポリ（アクリル酸）−ポリ（Ｎ，Ｎ−メタクリル酸ジメチルアミノエチル）（ＰＡＡ−ＰＤＭＡＥＭＡ）、ポリ（エチレングリコール）−ポリ（ブチレングリコール）（ＰＥＧ−ＰＢＧ）、ならびにＰＧ−ＰＲ（アジピン酸、ピメリン酸、およびセベシン酸（ｓｅｂｅｃｉｃａｃｉｄ）を含むポリエステル（ＰＲ）を有するポリグリセロール（ＰＧ）およびそのコポリマー）のようなブロックコポリマーは、本発明において使用され得る親水性または親水性−疎水性コポリマーであり、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ等のＡＢＡ型ブロックコポリマー、ＰＰＧ−ＰＥＧ−ＰＰＧ等のＢＡＢブロックコポリマー、（ＡＢ）ｎ型交互マルチブロックコポリマー、およびランダムマルチブロックコポリマーを含む。ブロックコポリマーは、２、３、またはそれを超える数のはっきりと異なるブロックを有し得る。ＰＥＧは、親水性、マクロファージに対する抗食作用、および免疫認識への耐性を与えるため、好ましい成分である。
【００７７】
いくつかの実施形態において、親水性−疎水性ブロックコポリマーの平均分子量（Ｍｎ）は概して、１，０００〜２０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲である。さらなる実施形態において、親水性−疎水性ブロックコポリマーの平均分子量（Ｍｎ）は、約４，０００ｇ／ｍｏｌ〜１５，０００ｇ／ｍｏｌである。場合によっては、親水性−疎水性ブロックコポリマーの平均分子量（Ｍｎ）は、４，４００ｇ／ｍｏｌ、８，４００ｇ／ｍｏｌ、または１４，６００ｇ／ｍｏｌである。
【００７８】
本発明のブロックコポリマーは、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）のセグメントおよびポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）のセグメントから本質的に成り得る。
【００７９】
本発明の特定の生分解性ポリマーナノ粒子は、ブロックコポリマーポリ（乳酸）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）から形成される。
【００８０】
本発明の別の特定の生分解性ポリマーナノ粒子は、ブロックコポリマーポリ（乳酸）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（乳酸）（ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ−ＰＬＡ）から形成される。
【００８１】
本発明の生分解性ポリマーは、ＰＬＡ共有結合を用いて親水性−疎水性ブロックコポリマーで化学的に修飾されることによって形成可能である。
【００８２】
本発明の生分解性ポリマーナノ粒子は、約３０〜１２０ｎｍの範囲の大きさを有する。
【００８３】
ある実施形態において、本発明の生分解性ポリマーは、乳化剤を実質的に含まないか、または約０．５重量％〜５重量％の量の外部の乳化剤を含み得る。
【００８４】
ある実施形態において、本発明の生分解性ポリマーナノ粒子は、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧであり、ポリ（乳酸）ブロックの平均分子量は約６０，０００ｇ／ｍｏｌであり、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックの平均重量は約８，４００または約１４，６００ｇ／ｍｏｌであり、外部の乳化剤は約０．５重量％〜５重量％である。
【００８５】
別の実施形態において、本発明の生分解性ポリマーナノ粒子はＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧであり、ポリ（乳酸）ブロックの平均分子量はおよそ１６，０００ｇ／ｍｏｌ以下であり、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックの平均重量は約８，４００ｇ／ｍｏｌまたは約１４，６００ｇ／ｍｏｌであり、その組成物は、乳化剤を実質的に含まない。
【００８６】
本発明において、本明細書で調製されるナノ粒子の調製において有用な有機溶媒は、好適に、アセトニトリル（Ｃ２Ｈ３Ｎ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；Ｃ３Ｈ７ＮＯ）、アセトン（（ＣＨ３）２ＣＯ）、およびジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）である。
【００８７】
本発明の生分解性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスは、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）および親水性−疎水性ブロックコポリマーを有機溶媒中で溶解し、溶液を得ることと、カルボジイミドカップリング剤および塩基をその溶液に添加し、反応混合物を得ることと、その反応混合物を撹拌し、親水性−疎水性ブロックコポリマーで化学的に修飾されたＰＬＡのブロックコポリマーを得ることと、前のステップからのブロックコポリマーを有機溶媒中で溶解および均質化し、均質化された混合物を得ることと、均質化された混合物を水相に添加し、エマルションを得ることと、そのエマルションを撹拌し、ポリマーナノ粒子を得ることと、を含む。
【００８８】
カルボジイミドカップリング剤は、当該技術分野において周知である。好適なカルボジイミドカップリング剤には、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ−（３−ジエチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）、およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８９】
カップリング反応は通常、トリアルキルアミン、ピリジン、または４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）等の触媒および／または補助塩基の存在下で行われる。
【００９０】
カップリング反応は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）等のヒドロキシ誘導体と組み合わせても行われ得る。他のヒドロキシ誘導体には、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、６−クロロ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（Ｃｌ−ＨＯＢｔ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９１】
上述のプロセスは、生分解性ポリマーナノ粒子を水で洗浄する追加のステップと、ポリマー生分解性ポリマーナノ粒子を乾燥する追加のステップと、を任意に含んでもよい。プロセスはまた、乳化剤を添加する最初のステップを任意に含んでもよい。このプロセスから結果として生じるナノ粒子は、３０〜１２０ｎｍの範囲の大きさを有し得る。
【００９２】
特定のプロセスにおいて、ＰＬＡおよびコポリマーＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧを有機溶媒中で溶解し、ポリマー溶液を得る。この溶液に、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボイミド（ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｍｉｄｅ）（ＤＣＣ）を、続いて４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を−４℃〜０℃で添加する。この溶液を２５０〜３００ｒｐｍで、−４０℃〜０℃の範囲の低温で２０〜２８時間かけて撹拌してもよい。ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧのナノ粒子は、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧに共有結合するＰＬＡを有し、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧマトリックスを形成する。ナノ粒子をジエチルエーテル、メタノール、またはエタノールといった有機溶媒によって沈殿させ、濾過、超遠心分離、または限外濾過を含む、当該技術分野における従来の方法によって溶液から分離する。ナノ粒子を２℃〜８℃の範囲の温度で保管する。
【００９３】
本発明のプロセスは、本プロセスにおいて乳化剤を全く使用しない、または最小限の乳化剤を使用するように、追加の凍結ステップまたはデコイタンパク質の使用を必要としない追加の利点を提供する。本発明は、２５℃〜３０℃環境室温条件下で容易に行われ、所望の小粒径を得るために過剰なせん断を必要としない。
【００９４】
本発明のナノ粒子の一例のＦＴＩＲスペクトルを図２に提供する。そのナノ粒子のＮＭＲスペクトルを図３Ａ、３Ｂ、および３Ｃに提供する。ナノ粒子は、図４Ａおよび４ＢのＴＥＭ画像に示されるように立体配置中で実質的に球状であるが、しかしながら、ナノ粒子は、膨張または収縮に応じて非球状立体配置を採用しうる。ナノ粒子は、自然状態で両親媒性である。ナノ粒子のゼータ電位およびＰＤＩ（多分散性指数）を表２に提供する。本発明のナノ粒子の貯蔵安定性は、任意の遊離乳化剤をプロセスに追加しないため、従来の乳化剤ベースの系と比較して優れており、ＰＥＧ成分を含むブロックコポリマーは、全体のＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧマトリックスと共有結合している。ナノ粒子の貯蔵保存期間は、６〜１８カ月の範囲である。
【００９５】
本発明のナノ粒子は、透過電子顕微鏡を用いて測定されるように３０〜１２０ｎｍの範囲の寸法を有する（図４）。好適な実施形態において、本発明のナノ粒子の直径は、直径２００ｎｍ未満であり、およびより好適には、直径約１００ｎｍ未満である。ある特定のそのような実施形態において、本発明のナノ粒子は、直径約１０〜２００ｎｍの範囲、約２０〜１５０ｎｍの範囲、または約３０〜１２０ｎｍの範囲である。
【００９６】
本発明のナノ粒子は、活性薬剤または物質を特定の部位に送達することができる（図５）。本発明のＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子の粒径および放出特性は、ポリマーマトリックス中のＰＬＡまたはＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧの分子量を変化させることによって制御することができる。活性薬剤または物質の放出は、１２時間〜６０日間制御することができ、それは当該技術分野において利用可能な従来のＰＬＡ−ＰＥＧ系を上回る改善である（図６Ａ）。ナノ粒子の薬物負荷容量もまた、ナノ粒子のポリマーマトリックス中のブロックコポリマーの平均分子量を変化させることによって制御することができる。ナノ粒子の薬物負荷容量は、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーのブロック長の増加に伴ってした（表３）。
【００９７】
ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーで構成されているポリマーナノ粒子は自然状態で両親媒性であるため、疎水性および親水性薬物の両方をナノ粒子に負荷することができる。本発明のナノ粒子は、乳化剤を含まないか、または乳化剤の最小限の使用のため、高い薬物負荷容量を持ち、負荷用量および治療の頻度を減少させる。活性薬剤または物質のナノ粒子に対する比率は、乳化剤の重量が総製剤重量の５０％を増加し得るため、乳化剤を用いる従来の系と比較して本発明のナノ粒子において高い（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，１５  Ｊｕｎｅ
２０１１，Ｖｏｌｕｍｅ  ４１１，Ｉｓｓｕｅｓ  １−２，Ｐａｇｅｓ  １７８−１８７；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０１０，３８７：２５３−２６２）。ナノ粒子は、減少された毒性に加えて、単一および低用量の薬物送達の実現を補助する。活性薬剤のＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧのナノ担体系に対する重量割合は、ナノ粒子に対して２〜２０％の範囲である。ナノ粒子のより高い薬物負荷は、低減された投薬レベルで有効量が投与され得るため、薬物用量の必要量を減少させる。ナノ粒子の総負荷容量を妨害することなく、負荷した物質の長時間活性を有するポリマーナノ粒子中の増強された内部負荷は、非常に将来性のある治療の効果的な送達をもたらす。図７Ｂは、一次ＨＵＶＥＣ細胞株における、ナノ粒子製剤中に負荷した、本明細書において「Ｌ−ＰＬＢＣＬ２Ｐ９」（アミノ酸配列ＦＳＲＳＬＨＳＬＬ（配列番号１）のＬ−立体配置）とも称される抗癌ペプチドＬ−ＮｕＢＣＰ−９の効果を遊離ペプチド薬物製剤および従来の細胞透過性ペプチド複合体化薬物製剤と比較して示す。
【００９８】
本発明のＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子は、インビトロ細胞株試験およびインビボマウスモデル試験によって確認されるように非毒性である。１５０ｍｇ／ｋｇ（体重）の用量でＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子で治療されたマウスにおいて評価された血液学的パラメーターは、対照群と比べて全血球数、赤血球数、白血球数、好中球、およびリンパ球レベルに関して有意な変化は示さなかった（図８）。肝臓および腎機能に関して評価された生化学的パラメーターは、対照とナノ粒子治療群との間において、総タンパク質、アルブミン、およびグロブリンレベルに関して有意な変化を示さなかった。肝臓酵素、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）のレベルは、図９Ａおよび９Ｂに示されるように、対照群と比較してＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子治療群において、有意には上昇しなかった。尿素および血中尿素窒素（ＢＵＮ）のレベルに関して、対照と比較してＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子で治療したマウスにおいて有意な変化はなかった（図９Ｃ）。ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子を注射されたマウスの臓器、脳、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、および肺の組織病理学を図１０に示す。
【００９９】
本発明のナノ粒子は、１つ以上の物質をカプセル封入する、および／または吸着することができる。物質はまた、生分解性ナノ粒子のブロックコポリマーと直接複合体化してもよい。本発明の物質には、有機小分子、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＳｉＲＮＡ、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、アミン、抗体およびその変異形、抗生物質、低分子量分子、化学療法薬、薬物もしくは治療薬、金属イオン、色素、放射性同位体、コントラスト剤、ならびに／または造影剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１００】
カプセル封入され得る好適な分子は、治療薬である。タンパク質もしくはペプチドまたはそれらの断片、インスリン等、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｃｉｎ）、パクリタキシル（ｐａｃｌｉｔａｘｉｌ）、ゲムセタビン（ｇｅｍｃｅｔａｂｉｎ）、ドセタキセル等といった疎水性薬物、アンホテリシンＢ、イソニアジド（ＩＮＨ）等といった抗生物質、および核酸が治療薬に含まれる。治療薬はまた、パクリタキセル、ドキソルビシンピモジド、ピリメタミン、インデノイソキノリン、またはノル−インデノイソキノリン等の化学療法薬を含む。
【０１０１】
治療薬は、天然および非天然（合成）アミノ酸を含み得る。非限定的な例として、二環式化合物および環状ペプチド模倣薬等のペプチド模倣薬を含む。
【０１０２】
Ｌ形態またはＬ−立体配置の治療用ペプチドは、経済的に安価に製造することができるが、それらは、それらのＤ形態と比較してインビボ系において急速に分解することが知られているため、薬物適用における不利益を有することが分かっている。しかしながら、本発明のナノ粒子によるそのようなＬ−ペプチドのカプセル封入は、インビボ試験において確認されるように、ナノ粒子の核内へのカプセル封入のため、循環中の分解をもたらさない（図１１、１２、および１３）。
【０１０３】
抗癌薬物を負荷したナノ粒子の標的化された送達は、当該技術分野において普及している遊離薬物製剤と比較して実現することができる。本発明のナノ粒子はまた、ナノ粒子の表面上の標的成分を含む１つ以上の物質と表面複合体化されるか、生体複合体化（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）されるか、または吸着され得る。標的成分は、ナノ粒子を腫瘍または疾患部位に局所化させ、治療薬を放出させる。標的成分は、リンカー分子と結合するか、または会合することができる。標的分子には、抗体分子、成長受容体リガンド、ビタミン、ペプチド、ハプテン、アプタマー、および当業者に既知の他の標的分子が挙げられるが、これらに限定されない。薬物分子および造影分子は、直接またはリンカー分子を介してナノ粒子の表面上で標的成分に結合し得る。
【０１０４】
標的成分の特定の、非限定的な例として、ビタミン、リガンド、アミン、ペプチド断片、抗体、アプタマー、トランスフェリン、抗体もしくはその断片、シアリルルイスＸ抗原、ヒアルロン酸、マンノース誘導体、グルコース誘導体、細胞特異的レクチン、ガラプチン、ガレクチン、ラクトシルセラミド、ステロイド誘導体、ＲＧＤ配列、ＥＧＦ、ＥＧＦ結合ペプチド、ウロキナーゼ受容体結合ペプチド、トロンボスポンジン由来ペプチド、アルブミン誘導体、および／またはコンビナトリアルケミストリーに由来する分子が挙げられる。
【０１０５】
さらに、本発明のナノ粒子は、目的とする他の分子と表面機能化および／または複合体化され得る。葉酸といった低分子量小分子、前立腺膜特異的抗原（ＰＳＭＡ）、抗体、アプタマー、細胞表面で受容体もしくは抗原に結合する分子等は、ブロックコポリマーＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧまたはポリマーマトリックスのＰＥＧ成分に共有結合され得る。本発明の好適な実施形態において、マトリックスは、ポリマーおよび物質を含む。場合によっては、物質または標的成分は、ポリマーマトリックスの表面と共有結合し得る。治療薬は、ポリマーマトリックスの表面と会合するか、またはナノ粒子のポリマーマトリックスの至る所でカプセル封入され得る。複合体化されたナノ粒子の細胞取り込みは、単純なナノ粒子と比較して高い。
【０１０６】
本発明のナノ粒子は、多機能ナノ粒子として機能するように、当該技術分野で周知の方法を介してナノ粒子の表面に結合した１つ以上の薬剤を含んでもよく、また１つ以上の薬剤をカプセル封入してもよい。本発明のナノ粒子は、腫瘍の標的化、腫瘍の治療、および腫瘍の造影を一体化システムに結びつけることができる多機能ナノ粒子として機能することができ、癌との闘いにおいて有用な集学的アプローチを提供する。多機能ナノ粒子は、類似のもしくは異なる作用機序、類似のもしくは異なる作用部位、または類似のもしくは異なる機能を持つ１つ以上の活性薬剤を有し得る。
【０１０７】
ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子中への物質のカプセル封入は、エマルジョン沈殿法によって調製される。本発明のプロセスを用いて調製されたＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧポリマーナノ粒子は、有機溶媒を含む有機溶媒中で溶解される。ポリマーの１０〜２０重量％の重量範囲で、物質をポリマー溶液に添加する。次いで、ポリマー溶液を水相に液滴で添加し、溶媒を蒸発させ、かつナノ粒子を安定化させるために室温で１０〜１２時間かけて撹拌した。物質負荷ナノ粒子を遠心分離によって収集し、乾燥し、２℃〜８℃でさらなる使用まで保管する。物質負荷ポリマーナノ粒子の調製のプロセスにおいて、糖、アミノ酸、メチルセルロース等の他の添加剤を水相に添加してもよい。
【０１０８】
本発明のナノ粒子の物質負荷容量は高く、表３に示されるように、ほぼ約７０〜９０％に達する。本発明のＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧベースのナノ担体系は、早期分解を防ぎ、抗癌ペプチドを癌細胞に効果的かつ標的化して送達する。ＮｕＢＣＰ−９、Ｂａｘ
ＢＨ３等の治療用ペプチドを核中にカプセル封入する表面葉状（Ｓｕｒｆａｃｅ  ｆｏｌｉａｔｅｄ）生分解性ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子は、いかなる細胞透過性ペプチドの使用も伴わずに、癌細胞の細胞基質中に効果的に送達され得る。Ｌ−ＰＬＢＣＬ２Ｐ９負荷ナノ粒子によって誘発されるＭＣＦ−７細胞株を用いたインビトロ試験は、ＸＴＴアッセイ（図７Ｂ）ならびにインビボ試験（図１１および１２）によって評価されるように、４８〜７２時間で完全な細胞の死滅を示した。図７Ｂはまた、ＭＣＦ−７細胞株における遊離薬物製剤と比較した薬物の持続放出および効率的な送達に対するナノ粒子の効果も示す。
【０１０９】
好適な実施形態において、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子中への物質のより高い負荷は、活性薬剤を低分子量ＰＬＡと結合させることによって実現される。物質は、ヒドロキシ誘導体と組み合わせてカルボジイミドカップリング試薬との反応によって低分子量ＰＬＡと共有結合される。一例として、カルボジイミドカップリング剤は、エチル−ジメチルアミノプロピルカルボジイミドであり、ヒドロキシ誘導体は、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド（ＥＤＣ／ＮＨＳ）化学である。ＰＬＡの分子量は、約３，０００〜１０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲である。ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子中への疎水性および親水性薬物の両方のより高い負荷が達成される（実施例５、表４および５）。カプセル封入されたＰＬＡ−薬物を有するナノ粒子は、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を用いずに細胞基質中に送達された。
【０１１０】
ナノ粒子形成のための特定のプロセスおよび医薬組成物における用途を、参照目的で本明細書に提供する。これらのプロセスおよび用途は、当業者には明らかである様々な方法を通して実施され得る。
【０１１１】
本発明の別の実施形態は、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子の調製のためのプロセスを提供し、そのプロセスは、（ａ）ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧコポリマーおよびポリ（乳酸）（ＰＬＡ）を有機溶媒中で溶解し、溶液を得ることと、（ｂ）Ｎ，Ｎ，−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）および４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）を−４℃〜０℃の範囲の温度でその溶液に添加し、反応混合物を得ることと、（ｃ）その反応混合物を２５０〜４００ｒｐｍで、−４℃〜０℃の範囲の室温で２０〜２８時間かけて撹拌し、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーを得ることと、（ｄ）そのＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーを有機溶媒中で、２５０〜４００ｒｐｍで溶解および均質化し、均質化された混合物を得ることと、（ｅ）その均質化された混合物を水相に添加し、エマルションを得ることと、（ｆ）そのエマルションを２５℃〜３０℃で、２５０〜４００ｒｐｍで１０〜１２時間かけて撹拌し、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーのナノ粒子を得ることと、を含む。
【０１１２】
本発明の別の実施形態において、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子の調製のためのプロセスが提供され、そのプロセスは、（ａ）ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧコポリマーおよびポリ（乳酸）（ＰＬＡ）を有機溶媒中で溶解し、溶液を得ることと、（ｂ）Ｎ，Ｎ，−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）および４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）を−４℃〜０℃の範囲の温度でその溶液に添加し、反応混合物を得ることと、（ｃ）その反応混合物を２５０〜４００ｒｐｍで、−４℃〜０℃の範囲の室温で２０〜２８時間かけて撹拌し、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーを得ることと、（ｄ）そのＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーを有機溶媒中で、２５０〜４００ｒｐｍで溶解および均質化し、均質化された混合物を得ることと、（ｅ）その均質化された混合物を水相に添加し、エマルションを得ることと、（ｆ）そのエマルションを２５℃〜３０℃で、２５０〜４００ｒｐｍで１０〜１２時間かけて撹拌し、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーのナノ粒子を得ることと、を含み、そのプロセスは、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーのナノ粒子を水で洗浄するステップと、従来の方法でナノ粒子を乾燥するステップと、を任意に含む。
【０１１３】
本発明の別の実施形態において、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子の調製のためのプロセスが提供され、そのプロセスは、を含むｓ（ａ）ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧコポリマーおよびポリ−乳酸（ＰＬＡ）を有機溶媒中で溶解し、溶液を得ることと、（ｂ）Ｎ，Ｎ，−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）および４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）を−４℃〜０℃の範囲の温度でその溶液に添加し、反応混合物を得ることと、（ｃ）その反応混合物を２５０〜４００ｒｐｍで、−４℃〜０℃の範囲の室温で２０〜２８時間かけて撹拌し、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーを得ることと、（ｄ）そのＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーを有機溶媒中で、２５０〜４００ｒｐｍで溶解および均質化し、均質化された混合物を得ることと、（ｅ）その均質化された混合物を水相に添加し、エマルションを得ることと、（ｆ）そのエマルションを２５℃〜３０℃で、２５０〜４００ｒｐｍで１０〜１２時間かけて撹拌し、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーのナノ粒子を得ることと、を含み、ナノ粒子の大きさは、３０〜１２０ｎｍの範囲である。
【０１１４】
本発明のさらに別の実施形態において、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子の調製のためのプロセスが提供され、そのプロセスは、（ａ）ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧコポリマーおよびポリ−乳酸（ＰＬＡ）を有機溶媒中で溶解し、溶液を得ることと、（ｂ）Ｎ，Ｎ，−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）および４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）を−４℃〜０℃の範囲の温度でその溶液に添加し、反応混合物を得ることと、（ｃ）その反応混合物を２５０〜４００ｒｐｍで、−４℃〜０℃の範囲の室温で２０〜２８時間かけて撹拌し、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーを得ることと、（ｄ）そのＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーを有機溶媒中で、２５０〜４００ｒｐｍで溶解および均質化し、均質化された混合物を得ることと、（ｅ）その均質化された混合物を水相に添加し、エマルションを得ることと、（ｆ）そのエマルションを２５℃〜３０℃で、２５０〜４００ｒｐｍで１０〜１２時間かけて撹拌し、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーのナノ粒子を得ることと、を含み、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧコポリマーの分子量は、１，０００ｇ／ｍｏｌ〜１０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲である。
【０１１５】
本発明のさらなる実施形態において、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子の調製のためのプロセスが提供され、そのプロセスは、（ａ）ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧコポリマーおよびポリ（乳酸）（ＰＬＡ）を有機溶媒中で溶解し、溶液を得ることと、（ｂ）Ｎ，Ｎ，−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）および４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）を−４℃〜０℃の範囲の温度でその溶液に添加し、反応混合物を得ることと、（ｃ）その反応混合物を２５０〜４００ｒｐｍで、−４℃〜０℃の範囲の室温で２０〜２８時間かけて撹拌し、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーを得ることと、（ｄ）そのＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーを有機溶媒中で、２５０〜４００ｒｐｍで溶解および均質化し、均質化された混合物を得ることと、（ｅ）その均質化された混合物を水相に添加し、エマルションを得ることと、（ｆ）そのエマルションを２５℃〜３０℃で、２５０〜４００ｒｐｍで１０〜１２時間かけて撹拌し、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーのナノ粒子を得ることと、を含み、ＰＬＡの分子量は、１０，０００ｇ／ｍｏｌ〜６０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲である。
【０１１６】
本発明のさらなる実施形態において、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子の調製のためのプロセスが提供され、そのプロセスは、（ａ）ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧコポリマーおよびポリ（乳酸）（ＰＬＡ）を有機溶媒中で溶解し、溶液を得ることと、（ｂ）Ｎ，Ｎ，−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）および４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）を−４℃〜０℃の範囲の温度でその溶液に添加し、反応混合物を得ることと、（ｃ）その反応混合物を２５０〜４００ｒｐｍで、−４℃〜０℃の範囲の室温で２０〜２８時間かけて撹拌し、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーを得ることと、（ｄ）そのＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーを有機溶媒中で、２５０〜４００ｒｐｍで溶解および均質化し、均質化された混合物を得ることと、（ｅ）その均質化された混合物を水相に添加し、エマルションを得ることと、（ｆ）そのエマルションを２５℃〜３０℃で、２５０〜４００ｒｐｍで１０〜１２時間かけて撹拌し、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーのナノ粒子を得ることと、を含み、ステップ（ａ）の溶液は、任意に乳化剤等の添加剤を含む。
【０１１７】
本発明の別の実施形態は、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子の調製のためのプロセスによって得られたＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子を提供し、そのプロセスは、（ａ）ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧコポリマーおよびポリ（乳酸）（ＰＬＡ）を有機溶媒中で溶解し、溶液を得ることと、（ｂ）Ｎ，Ｎ，−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）および４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）を−４℃〜０℃の範囲の温度でその溶液に添加し、反応混合物を得ることと、（ｃ）その反応混合物を２５０〜４００ｒｐｍで、−４℃〜０℃の範囲の室温で２０〜２８時間かけて撹拌し、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーを得ることと、（ｄ）そのＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーを有機溶媒中で、２５０〜４００ｒｐｍで溶解および均質化し、均質化された混合物を得ることと、（ｅ）その均質化された混合物を水相に添加し、エマルションを得ることと、（ｆ）そのエマルションを２５℃〜３０℃で、２５０〜４００ｒｐｍで１０〜１２時間かけて撹拌し、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーのナノ粒子を得ることと、を含む。
【０１１８】
本発明の別の実施形態は、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子の調製のためのプロセスによって得られたＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子を含む組成物を提供し、そのプロセスは、（ａ）ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧコポリマーおよびポリ（乳酸）（ＰＬＡ）を有機溶媒中で溶解し、溶液を得ることと、（ｂ）Ｎ，Ｎ，−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）および４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）を−４℃〜０℃の範囲の温度でその溶液に添加し、反応混合物を得ることと、（ｃ）その反応混合物を２５０〜４００ｒｐｍで、−４℃〜０℃の範囲の室温で２０〜２８時間かけて撹拌し、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーを得ることと、（ｄ）そのＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーを有機溶媒中で、２５０〜４００ｒｐｍで溶解および均質化し、均質化された混合物を得ることと、（ｅ）その均質化された混合物を水相に添加し、エマルションを得ることと、（ｆ）そのエマルションを２５℃〜３０℃で、２５０〜４００ｒｐｍで１０〜１２時間かけて撹拌し、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーのナノ粒子を得ることと、を含む。
【０１１９】
本発明の特定の実施形態は、少なくとも１つの物質を含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスを提供し、そのプロセスは、（ａ）２５０〜４００ｒｐｍで、有機溶媒中で溶解されたＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーのポリマーナノ粒子を有する物質を均質化し、一次エマルションを得ることと、（ｂ）その一次エマルションを水相において２５０〜４００ｒｐｍで乳化し、二次エマルションを得ることと、（ｃ）その二次エマルションを２５℃〜３０℃で、２５０〜４００ｒｐｍで１０〜１２時間かけて撹拌し、物質を含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧのナノ粒子を得ることと、を含む。
【０１２０】
本発明の別の実施形態において、少なくとも１つの物質を含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスが提供され、そのプロセスは、（ａ）２５０〜４００ｒｐｍで、有機溶媒中で溶解されたＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーのポリマーナノ粒子を有する物質を均質化し、一次エマルションを得ることと、（ｂ）その一次エマルションを水相において２５０〜４００ｒｐｍで乳化し、二次エマルションを得ることと、（ｃ）その二次エマルションを２５℃〜３０℃で、２５０〜４００ｒｐｍで１０〜１２時間かけて撹拌し、物質を含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧのナノ粒子を得ることと、を含み、そのプロセスは、物質を含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーのナノ粒子を水で洗浄するステップと、従来の方法でナノ粒子を乾燥するステップと、を任意に含む。
【０１２１】
本発明の別の実施形態において、少なくとも１つの物質を含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスが提供され、そのプロセスは、（ａ）２５０〜４００ｒｐｍで、有機溶媒中で溶解されたＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーのポリマーナノ粒子を有する物質を均質化し、一次エマルションを得ることと、（ｂ）その一次エマルションを水相において２５０〜４００ｒｐｍで乳化し、二次エマルションを得ることと、（ｃ）その二次エマルションを２５℃〜３０℃で、２５０〜４００ｒｐｍで１０〜１２時間かけて撹拌し、物質を含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧのナノ粒子を得ることと、を含み、物質は、有機小分子、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗生物質、低分子量分子、薬理学的に活性な分子、薬物、金属イオン、色素、放射性同位体、コントラスト剤、造影剤、および標的成分から成る群から選択される。
【０１２２】
本発明の別の実施形態において、少なくとも１つの物質を含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスが提供され、そのプロセスは、（ａ）２５０〜４００ｒｐｍで、有機溶媒中で溶解されたＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーのポリマーナノ粒子を有する物質を均質化し、一次エマルションを得ることと、（ｂ）その一次エマルションを水相において２５０〜４００ｒｐｍで乳化し、二次エマルションを得ることと、（ｃ）その二次エマルションを２５℃〜３０℃で、２５０〜４００ｒｐｍで１０〜１２時間かけて撹拌し、物質を含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧのナノ粒子を得ることと、を含み、その物質は、ビタミン、リガンド、アミン、ペプチド断片、抗体、およびアプタマーから成る群から選択される標的成分である。
【０１２３】
本発明の別の実施形態において、少なくとも１つの物質を含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスが提供され、そのプロセスは、（ａ）２５０〜４００ｒｐｍで、有機溶媒中で溶解されたＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーのポリマーナノ粒子を有する物質を均質化し、一次エマルションを得ることと、（ｂ）その一次エマルションを水相において２５０〜４００ｒｐｍで乳化し、二次エマルションを得ることと、（ｃ）その二次エマルションを２５℃〜３０℃で、２５０〜４００ｒｐｍで１０〜１２時間かけて撹拌し、物質を含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧのナノ粒子を得ることと、を含み、物質は、ＰＬＡに結合する。
【０１２４】
本発明の別の実施形態において、少なくとも１つの物質を含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスが提供され、そのプロセスは、（ａ）２５０〜４００ｒｐｍで、有機溶媒中で溶解されたＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーのポリマーナノ粒子を有する物質を均質化し、一次エマルションを得ることと、（ｂ）その一次エマルションを水相において２５０〜４００ｒｐｍで乳化し、二次エマルションを得ることと、（ｃ）その二次エマルションを２５℃〜３０℃で、２５０〜４００ｒｐｍで１０〜１２時間かけて撹拌し、物質を含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧのナノ粒子を得ることと、を含み、物質は、３，０００ｇ／ｍｏｌ〜１０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲の分子量のＰＬＡに結合する。
【０１２５】
本発明の別の実施形態は、（ａ）２５０〜４００ｒｐｍで、有機溶媒中で溶解されたＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーのポリマーナノ粒子を有する物質を均質化し、一次エマルションを得ることと、（ｂ）その一次エマルションを水相において２５０〜４００ｒｐｍで乳化し、二次エマルションを得ることと、（ｃ）その二次エマルションを２５℃〜３０℃で、２５０〜４００ｒｐｍで１０〜１２時間かけて撹拌し、物質を含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧのナノ粒子を得ることと、を含むプロセスによって得られた少なくとも１つの物質を含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧの生分解性ポリマーナノ粒子を提供する。
【０１２６】
本発明の別の実施形態は、（ａ）２５０〜４００ｒｐｍで、有機溶媒中で溶解されたＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーのポリマーナノ粒子を有する物質を均質化し、一次エマルションを得ることと、（ｂ）その一次エマルションを水相において２５０〜４００ｒｐｍで乳化し、二次エマルションを得ることと、（ｃ）その二次エマルションを２５℃〜３０℃で、２５０〜４００ｒｐｍで１０〜１２時間かけて撹拌し、物質を含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧのナノ粒子を得ることと、を含む、プロセスから得られた少なくとも１つの物質を含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧの生分解性ポリマーナノ粒子を含む組成物を提供する。
【０１２７】
本発明の別の実施形態において、（ａ）２５０〜４００ｒｐｍで、有機溶媒中で溶解されたＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーのポリマーナノ粒子を有する物質を均質化し、一次エマルションを得ることと、（ｂ）その一次エマルションを水相において２５０〜４００ｒｐｍで乳化し、二次エマルションを得ることと、（ｃ）その二次エマルションを２５℃〜３０℃で、２５０〜４００ｒｐｍで１０〜１２時間かけて撹拌し、物質を含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧのナノ粒子を得ることと、を含む、プロセスから得られた少なくとも１つの物質を含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧの生分解性ポリマーナノ粒子を含む組成物が提供され、その組成物は、任意に、保存剤、抗酸化剤、増粘剤、キレート剤、等張剤、着香剤、甘味剤、着色剤、可溶化剤、染料、香味料、結合剤、軟化剤、フィラー、潤滑剤、および保存剤から成る群から選択される、少なくとも１つの薬学的賦形剤を含む。
【０１２８】
本発明さらに別の態様は、少なくとも１つの治療薬をさらに含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧの生分解性ポリマーナノ粒子を、それを必要とする対象に投与することを含む、疾患を治療するための方法を提供する。
【０１２９】
別の態様において、本発明は、薬物の製造のための少なくとも１つの物質を含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーで構成されている生分解性ポリマーナノ粒子の用途を提供する。
【０１３０】
また、本明細書に提供されるナノ粒子および薬剤的に許容される担体もしくは賦形剤を含む、医薬組成物または製剤も本明細書に提供される。
【０１３１】
好適な薬学的製剤は、例えば、活性成分（複数可）の約０．１％〜約９９．９％、好ましくは約１％〜約６０％を含有し得る。経腸または非経口投与用の薬学的製剤は、例えば、糖コーティング錠剤、錠剤、カプセル、もしくは坐剤等の単位剤形のもの、またはアンプルである。別途指示されない場合、これらは、それ自体が既知の手法において、例えば、従来の混合、造粒、糖コーティング、溶解、または凍結乾燥プロセスの方法によって、調製される。各剤形の個々の用量に含まれている併用パートナーの単位含有量は、必須有効量が多量の投薬単位の投与によって達しうるため、それ自体が有効量を構成する必要はないことが理解されよう。
【０１３２】
医薬組成物は、活性成分として、１つ以上の薬剤的に許容される担体（賦形剤）と組み合わせて本発明のナノ粒子のうちの１つ以上を含有し得る。本発明の組成物の作製において、活性成分は通常、賦形剤と混合されるか、賦形剤によって希釈されるか、または例えば、カプセル、小袋、紙、もしくは他の容器の形態のそのような担体内に封入される。賦形剤が希釈剤として役立つ場合、それは、活性成分のビヒクル、担体、もしくは培地として作用する固体、半固体、または液体材料であり得る。このため、組成物は、例えば、活性化合物の最大１０重量％を含有する、錠剤、丸剤、粉末、トローチ剤、小袋、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁液、エマルション、溶液、シロップ剤、エアロゾル（固体として、または液体培地中で）、軟膏、軟および硬ゼラチンカプセル、坐剤、滅菌注射剤、および滅菌パッケージ化粉末の形態であり得る。
【０１３３】
好適な賦形剤のいくつかの例には、ラクトース（例えば、ラクトース一水和物）、右旋糖、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、デンプン（例えば、デンプングリコール酸ナトリウム）、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、コロイド状二酸化ケイ素、結晶セルロース、ポリビニルピロリドン（例えば、ポビドン）、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、およびヒドロキシプロピルセルロースが挙げられる。本製剤は、タルク、マグネシウムステアリン酸塩、および鉱物油等の平滑剤、湿潤剤、乳化および懸濁剤、メチル−およびプロピルヒドロキシ−安息香酸塩等の保存剤、甘味剤、および着香剤をさらに含み得る。
【０１３４】
本発明の化合物および組成物が経口または注射による投与のために組み込まれ得る液体形態には、水性溶液、好適に着香シロップ、水性もしくは油性懸濁液、および綿実油、胡麻油、ヤシ油、もしくは落花生油等の食用油を用いた着香エマルション、ならびにエリキシル剤、および類似の薬学的ビヒクルが挙げられる。
【０１３５】
本主題は、それらのある特定の好ましい実施形態を参照してかなり詳細に記載されているが、他の実施形態も可能である。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨と範囲は、そこに含まれるその好ましい実施形態の説明に制限されるべきではない。
【実施例】
【０１３６】
本開示はここで、実施例を用いて例示され、それは本開示の作業を例示することを意図し、本開示の範囲における制限的ないかなる限定も意図しない。別途定義されない限り、本明細書で用いられるすべての技術用語および科学用語は、本開示がそこに属する当業者に通常理解されるものと同じ意味を有する。開示される方法および組成の実施に際して、本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料を用いることができるが、例示的な方法、装置、および材料を本明細書に記載する。
実施例１
ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーのポリマーナノ粒子の調製
【０１３７】
ポリ（乳酸）（Ｍｗ．約４５，０００〜６０，０００ｇ／ｍｏｌ）、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ（表１）、および組織培養試薬をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。すべての試薬は分析グレードかまたはそれ以上であり、別途明記されない限り、容認されているように使用した。細胞株をＮＣＣＳ  Ｐｕｎｅ，Ｉｎｄｉａから入手した。Ｎｕｒ−９ペプチドを９５％の純度でカスタム合成した。
ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの調製
【０１３８】
６０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する５ｇｍのポリ（乳酸）（ＰＬＡ）を２５０ｍｌ丸底フラスコ内で１００ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２（ジクロロメタン）中に溶解した。この溶液に、０．７ｇのＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧポリマー（分子量範囲１１００〜８４００Ｍｎ）を添加した。この溶液を０℃で１０〜１２時間かけて撹拌した。この反応混合物に、５ｍｌの１％Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボイミド（ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｍｉｄｅ）（ＤＣＣ）溶液を添加し、続いて、５ｍｌの０．１％４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を−４℃〜０℃／サブゼロ温度でゆっくりと添加した。この反応混合物を次の２４時間撹拌し、その後、ジエチルエーテルでのＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの沈殿ならびにＷｈａｔｍａｎ濾紙Ｎｏ．１を用いた濾過が続く。そのようにして得たこのＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマー沈殿物を低真空下で乾燥し、さらなる使用まで２℃〜８℃で保管した。
ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子の調製
【０１３９】
ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子をエマルション沈殿法によって調製した。上述のプロセスによって得た１００ｍｇのＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧコポリマーを別々に有機溶媒、例えば、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、またはジクロロメタン中で溶解し、ポリマー溶液を得た。
【０１４０】
このポリマー溶液の液滴を２０ｍｌの蒸留水の水相に添加することによってナノ粒子を調製した。この溶液を、磁気を用いて１０〜１２時間かけて室温で撹拌し、残りの溶媒を蒸発させ、かつナノ粒子を安定化させた。次いで、ナノ粒子を２５，０００ｒｐｍで１０分かけて遠心分離することにより収集し、蒸留水を用いて３度洗浄した。ナノ粒子をさらに凍結乾燥し、さらなる使用まで２℃〜８℃で保管した。
ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーのポリマーナノ粒子の特徴付け
【０１４１】
上述のプロセスによって得たナノ粒子の形状は、図４Ａ〜Ｂに示される透過電子顕微鏡画像に見られるように本質的に球状である。ＴＥＭ画像によって粒径範囲の判定が可能となり、それは約３０〜１２０ｎｍであった。ナノ粒子の流体力学半径を、動的光散乱（ＤＬＳ）機器を用いて測定し、それは１１０〜１２０ｎｍの範囲であった（表２）。
【０１４２】
ブロックコポリマーＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧの分子量の範囲を用いて合成されたＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子の特性を表２に示す。ＰＬＡ、ＰＬＡ−ＰＥＧ、ブロックコポリマーＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ、およびポリマーナノ粒子ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧのＦＴＩＲスペクトルを図２Ａに示す。ＦＴＩＲは、これらの種の間の違いに反応しにくいことを証明した。そのため、ＮＭＲを用いてさらなる特徴付けを行った。
【０１４３】
ブロックコポリマーＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧの異なる分子量を用いて得たＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子のＮＭＲスペクトルを図３Ａ〜Ｃに示す。図中において、約５．１の化学シフトを有するプロトンは、ＰＬＡのエステルプロトンを表し、約３．５の化学シフトを有するプロトンは、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧのエーテルプロトンを表す。スペクトル中の両方のプロトンの存在は、ＰＬＡのＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧとの複合体化を確信させる。
実施例２
物質をカプセル封入したナノ粒子の調製
薬物カプセル封入ポリマーナノ粒子の調製
【０１４４】
本発明のナノ粒子は、自然状態で両親媒性であり、ドキソルビシンのような疎水性薬物および抗癌９量体ペプチド（Ｌ−ＮｕＢＣＰ−９またはＬ−ＰＬＢＣＬ２Ｐ９、ＦＳＲＳＬＨＳＬＬ（配列番号１）のＬ−立体配置）、１６量体ＢＨ３ドメイン等の親水性薬物の両方を負荷することができる。
【０１４５】
実施例１のプロセスを用いて調整した１００ｇのＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子を、５ｍｌのアセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；Ｃ３Ｈ７ＮＯ）、アセトン、またはジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）といった有機溶媒中で溶解する。
【０１４６】
１〜５ｍｇの薬物物質、Ｌ−ＰＬＢＣＬ２Ｐ９（ＦＳＲＳＬＨＳＬＬ（配列番号１）のＬ−立体配置）を水性溶液中で溶解し、上記のポリマー溶液に添加した。物質は通常、ポリマーの約１０〜２０％重量の重量範囲で用いられる。この溶液を２５０−４００ｒｐｍで１０〜１５秒の短時間で超音波処理し、微細な一次エマルションを生成する。
【０１４７】
この微細な一次エマルションをシリンジ／マイクロピペットを用いて２０ｍｌの蒸留水の水相に液滴で添加し、溶媒を蒸発させ、かつナノ粒子を安定化させるために２５０〜４００ｒｐｍで、磁気を用いて１０〜１２時間かけて２５℃〜３０℃で撹拌する。水相は、糖添加物をさらに含む。結果として生じるナノ粒子懸濁液を、残りの有機溶媒を蒸発させるように開放され、覆われていない条件下で一晩かけて撹拌した。Ｌ−ＰＬＢＣＬ２Ｐ９カプセル封入ポリマーナノ粒子を、１０分間の遠心分離によって１０，０００ｇ、または１５分間の限外濾過によって３０００ｇ収集する（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ、１００，０００ＮＭＷＬのＵｌｔｒａｃｅｌ膜、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）。ナノ粒子を蒸留水中で再懸濁し、３回洗浄し、凍結乾燥する。これらを２℃〜８℃でさらなる使用まで保管した。このポリマーナノ粒子は高度に安定しており、ステルス特徴を有さない。
異なる重量のコポリマーを用いて調整されたポリマーナノ粒子の負荷効果の比較
【０１４８】
ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧポリマーナノ粒子を、上述のプロセスを使用し、異なる分子量のＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧポリマーを用いて調整した。ピレン負荷ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧポリマーナノ粒子を、異なる分子量のＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧポリマーを用いて合成されたＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧコポリマーを用いて調製した。ピレンをＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの２〜２０％重量の範囲で使用し、蛍光色素負荷ナノ粒子を調製した。ナノ粒子の物質負荷能力は、ナノ粒子の合成に用いたＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧポリマーの分子量によって異なった。表３は、異なる分子量のブロックコポリマーを用いて生成されたポリマーナノ粒子によってカプセル封入された造影分子の割合を提供する。
蛍光色素、ローダミンの細胞内部移行
【０１４９】
上述のプロセスを用いて、ローダミン負荷ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧポリマーナノ粒子を調製した。ローダミンをＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの２〜２０重量％の範囲で使用し、蛍光色素負荷ナノ粒子を調製した。
１×１０５ＭＣＦ−７細胞を最初に蒔き、カバーガラスフラスコ上で６０％コンフルエンスまで成長させた。次いで、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有する１０ｍｌのＤＭＥＭ培地中で２４時間かけて培養した。次いで、その成長した培地を吸引し、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。ローダミン負荷ナノ粒子をカバーガラスに付着させた細胞に添加し、３７℃で１２時間かけてインキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、カバーガラスを取り外した。これを続いてＰＢＳ溶液で洗浄し、最後に室温で２０分間かけて４％パラホルムアルデヒドで固定した。固定剤を除去した後、細胞を洗浄し、細胞を５分間かけてＤＡＰＩ（蛍光染色着色核細胞）で染色し、次いで、流れる水道水で１分間漱いだ。次いで、カバーガラスを共焦点蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｆｌｕｏｖｉｅｗ  ＦＶ１０００  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，Ｊａｐａｎ）を使用して分析した。ＭＣＦ−７細胞中のナノ粒子の細胞内部移行を、共焦点レーザー顕微鏡（ＣＬＳＭ）と併せて蛍光色素（ローダミンＢ）負荷ナノ粒子を使用することによって確認した（図５）。
実施例３
標的成分を用いた薬物カプセル封入ポリマーナノ粒子の調製
【０１５０】
それぞれ−ＣＯＯＨまたは−ＮＨ２官能基をもたらすアミンまたはアミノ酸といった様々な小分子が、本発明のポリマーナノ粒子上の標的成分として生体分子の複合体化に使用され得る。
ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ−リジンの調製
【０１５１】
ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧコポリマーをアミノ酸、リジンと複合体化し、−ＮＨ２基を持たせた。５ｇのＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧおよび０．０５ｇのリジンを２５０ｍｌＲＢフラスコ内で１００ｍｌのアセトニトリル／ジクロロメタン（１：１）中で溶解し、−４〜０℃で撹拌できるようにした。この溶液に、１％Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボイミド（ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｍｉｄｅ）（ＤＣＣ）溶液を添加し、続いて、０．１％４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を０℃でゆっくりと添加した。この反応混合物を２４時間かけて撹拌し、その後、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ−リジンをジエチルエーテルで沈殿させ、Ｗｈａｔｍａｎ濾紙Ｎｏ．１を通して濾過した。沈殿物を低真空下で乾燥し、２℃〜８℃でさらなる使用まで保持した。
ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ−リジンからのナノ粒子の調製
【０１５２】
ナノ粒子調製のため、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ−リジンコポリマー（１００ｍｇ）をアセトニトリル（またはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）もしくはジクロロメタン）中で溶解した。次いで、薬物（ポリマーの約１０〜２０重量％）をその溶液に添加し、１５秒の短時間の超音波処理を用いて一次エマルション生成した。結果として生じた一次エマルションを蒸留水（２０ｍｌ）の水相に液滴で添加し、溶媒を蒸発させ、かつナノ粒子を安定化させるために磁気を用いて室温で１０〜１２時間かけて撹拌した。２５，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により形成されたナノ粒子を収集し、蒸留水を用いて３回洗浄し、凍結乾燥し、続いて、さらなる使用のため２−８℃で貯蔵した。
ナノ粒子と葉酸（ＦＡ）との生体複合体化（Ｂｉｏ−ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）
【０１５３】
２０ｍｇの凍結乾燥させたＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子をｍｉｌｌｉＱ水中で溶解し、Ｎ−（３−ジエチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）（５０μｌ、４００ｍＭ）およびＮ−ヒドロキシスクシンアミド（ＮＨＳ）（５０μｌ、１００ｍＭ）で処置し、その混合物を２０分かけて穏やかに振盪した。この後、１０ｍＭの葉酸溶液を添加し、その溶液を３０分かけて穏やかに振盪し、続いてアミコンフィルターを用いて濾過し、濾液中に残った未反応ＦＡを除去した。ナノ粒子と複合体化させた葉酸を凍結乾燥し、続いて−２０℃で貯蔵した。
実施例４
ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧポリマーナノ粒子の送達可能性の評価
ポリマーナノ粒子ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧによるカプセル封入薬物のインビトロ放出
【０１５４】
１０ｍｌのリン酸緩衝食塩水およびローダミンＢ複合体化Ｌ−ＰＬＢＣＬ２Ｐ９（薬物）をカプセル封入した１０ｍｇのＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子を含有する混合物を２００ｒｐｍで、３７℃で撹拌した。混合物の上清試料を６日間かけて異なる時間間隔で２５，０００ｒｐｍでの遠心分離によって収集した。各遠心分離後、ナノ粒子を新しい緩衝液中で再懸濁した。２ｍｌの上清を、ＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ，ＵＳＡ）を使用したタンパク質評価に供し、５６２ｎｍでの分光測定で薬物放出の量を評価した。薬物放出を標準検量線の方法を用いて計算した。ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧポリマーナノ粒子による薬物の放出が、従来のＰＬＡナノ粒子よりも優れて制御され得ることが観察された（図６Ａ）。
ＸＴＴ（ナトリウム２，３，−ビス（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−５−［（フェニルアミノ）−カルボニル］−２Ｈ−テトラゾリウム内塩）アッセイ
【０１５５】
ＸＴＴ（ナトリウム２，３，−ビス（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−５−［（フェニルアミノ）−カルボニル］−２Ｈ−テトラゾリウム内塩）アッセイを使用して一次ＨＵＶＥＣ細胞株およびＭＣＦ−７細胞株における細胞生存率を評価した（図６Ｂ、７Ａ、および７Ｂ）。
【０１５６】
合計１×１０４ＭＣＦ−７細胞を９６ウェルプレートの各ウェル上に播種し、２４時間かけて培養した。２４時間後、各プレート内の細胞を５μＭのＬ−ＰＬＢＣＬ２Ｐ９ペプチドを含有する本発明のポリマーナノ粒子またはいかなるペプチドも含まない対照ナノ粒子で処置した。また細胞を別々にいかなる細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）も伴わない同じ濃度のＬ−ＰＬＢＣＬ２Ｐ９ペプチドで処置した。１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、および９６時間の異なる時間間隔でナノ粒子を有する細胞をインキュベートした。インキュベーション後、抗癌ペプチドＬ−ＰＬＢＣＬ２Ｐ９を負荷したＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子を含有する培地を新しい培地と交換し、１０μｌの再構成ＸＴＴ混合物キット試薬を各ウェルに添加した。４時間かけて培養した後、試料の吸光度をマイクロタイタープレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用して４５０ｎｍで測定した。無治療対照の生存細胞の割合として細胞の増殖を決定し、３組で分析した。図６Ｂは、時間との関連で、ＭＣＦ−７細胞株の細胞生存率におけるＬ−ＰＬＢＣＬ２Ｐ９負荷ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子の効果を示す。図７Ａは、時間との関連で、一次ＨＵＶＥＣ細胞株の細胞生存率における薬物Ｌ−ＰＬＢＣＬ２Ｐ９負荷ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子の効果を示す。
実施例５
ナノ粒子中のより高い治療負荷を実現するためのペプチド薬物の修飾
【０１５７】
疎水性ならびに親水性治療薬のより高い負荷を、薬物成分を低分子量ＰＬＡで共有結合修飾することによって実現した。ペプチド薬物をエチル−ジメチルアミノプロピルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシ−スクシンイミド（ＥＤＣ／ＮＨＳ）化学を使用して低分子量のＰＬＡを用いて修飾した。成分を結合するために用いたＰＬＡの平均分子量は通常、約３，０００〜１０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲である。
【０１５８】
５，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する１ｇのＰＬＡを１０ｍｌのアセトニトリル中で溶解した。この溶液に、ジクロロメタン中の５００μｌのＮ−（３−ジエチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ；４００ｍＭ）およびジクロロメタン中の５００μｌのＮ−ヒドロキシスクシンアミド（ＮＨＳ；１００ｍＭ）を添加した。この混合物を２時間かけて穏やかに振盪し、続いて、ＰＬＡをジエチルエーテルで沈殿させた。このＰＬＡを「活性化」ＰＬＡと名付けた。１ｍｍｏｌの活性化ＰＬＡをアセトニトリル中で溶解し、この溶液に、１ｍｍｏｌのペプチド薬物Ｌ−ＰＬＢＣＬ２Ｐ９を添加し、この反応混合物を再度穏やかに３０分間振盪した。次いで、この混合物をジエチルエーテルで沈殿させ、低真空下で乾燥し、続いて、−２０℃でさらなる使用まで貯蔵した。
【０１５９】
ポリマーナノ粒子の薬物負荷容量は、ナノ粒子の調製に用いたブロックコポリマーの重量の増加に伴って増加した。表４および５に示されるように、ナノ粒子の薬物負荷容量もまた、薬物をポリマーナノ粒子に負荷する前に、低分子量ＰＬＡを治療薬（すなわち、Ｌ−ＰＬＢＣＬ２Ｐ９）と複合体化することによって著しく増加する。本発明のナノ粒子の薬物負荷容量の増加は、５％〜１０％である。
実施例６
ナノ粒子の安全性および毒性を評価するためのインビボ試験
【０１６０】
実施例１に示されるプロセスを使用して調製されたＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧポリマーナノ粒子の毒性および安全性を評価するための試験をＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて行った。
血液学的パラメーター
【０１６１】
ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子を１５０ｍｇ／ｋｇ（体重）の単一用量で動物群に静脈内に注射し、２１日間にかけて７日間の間隔で対照群およびナノ粒子治療群における血液学的パラメーターを評価した。対照群はナノ粒子を受容しなかった。
【０１６２】
図８に見られるように、対照群とナノ粒子治療群との間に全血球数（ＣＢＣ）、赤血球（ＲＢＣ）数、白血球（ＷＢＣ）数、好中球、リンパ球、血中血球容積、ＭＣＶ（平均赤血球容積）、ＭＣＨ（平均赤血球ヘモグロビン量）、およびＭＣＨＣ（平均赤血球ヘモグロビン濃度）における有意な変化はなかった。
肝臓および腎臓機能に対する生化学血液アッセイ
【０１６３】
ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子を１５０ｍｇ／ｋｇ（体重）の単一用量で動物群に静脈内に注射し、２１日間にかけて７日間の間隔で対照群およびナノ粒子治療群における血液学的パラメーターを評価した。
【０１６４】
対照群と治療群の間に総タンパク質、アルブミン、およびグロブリンレベルにおける有意な変化はなかった。図９に見られるように、肝臓酵素、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）のレベルは、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子治療群において有意には上昇しなかった。尿素および血中尿素窒素（ＢＵＮ）は、腎機能の良い指標である。図９に見られるように、対照と比較して治療されたマウスの尿素およびＢＵＮレベルにおいて有意な変化はなかった。
ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子で治療したマウスの臓器の組織病理学
【０１６５】
ＢＡＬＢ／ｃマウスを１５０ｍｇ／ｋｇ（体重）の単回用量で、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子で治療した。２１日後、動物を屠殺し、臓器組織の組織学的検査を実施し、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子またはその分解生成物によって引き起こされた毒性による任意の組織損傷、炎症、または病変を評価した。図１０に示されるように、ナノ粒子治療動物の脳、心臓、肝臓、脾臓、肺、および腎臓において明白な病理組織学的な異常または病変は観察されなかった。
実施例７
インビボでのナノ担体系としてのＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子の効果
【０１６６】
ナノ担体系としてのナノ粒子の効果を評価するためにＢＡＬＢ／ｃ型の系統のエールリッヒ腹水癌（ＥＡＴ）モデルの遺伝子導入マウスを用いた。２０ｇの体重を有する動物を本試験に使用した（図１２ａ）。
【０１６７】
抗癌ペプチド薬物、Ｌ−ＰＬＢＣＬ２Ｐ９をＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧポリマーナノ粒子に負荷した。マウスに、実施例２において調製したように、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ中にカプセル封入された、２００−１０００μｇのペプチドの用量で抗癌ペプチド、Ｌ−ＰＬＢＣＬ２Ｐ９を含むポリマーナノ粒子の腹腔内製剤を与えた。動物に与えられた抗癌ペプチドの総重量は、３００μｇ〜６００μｇ／マウスであった。製剤の投与頻度は、２１日間にわたり隔週であり、動物は６０日間観察下におかれた。
【０１６８】
Ｌ−ＰＬＢＣＬ２Ｐ９を負荷したナノ粒子の投与後、６０日間にわたってマウスにおいて腫瘍成長抑制が観察された（図１１）。Ｌ−ＰＬＢＣＬ２Ｐ９負荷ナノ粒子で治療されたマウスは、対照群（図１２ｃ）と比較して腫瘍を完治した（図１２ｂ）ことが分かった。対照群は、任意の治療薬を含まない単純なナノ粒子を受容していた。
糖尿病ウサギにおける非経口デポーとしてのインスリン負荷ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子の評価
インスリンのＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子へのカプセル封入
【０１６９】
二重エマルション溶媒蒸発法によってＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子にカプセル封入されたインスリンを調製した。ナノ粒子調製において、１ｇのＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧコポリマーをアセトニトリル中で溶解した。インスリン（５００Ｉ．Ｕ．）を溶液に添加し、１５秒の短時間の超音波処理を用いて一次エマルション生成した。結果として生じた一次エマルションを３０ｍｌの水相に液滴で添加し、溶媒を蒸発させ、かつナノ粒子を安定化させるために磁気を用いて室温で６〜８時間かけて撹拌した。１０分間の２１，０００ｒｐｍでの遠心分離によりナノ粒子を収集し、蒸留水を用いて３回洗浄した。インスリン負荷ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子を凍結乾燥し、４℃でさらなる使用まで保管した。
インビボ試験
【０１７０】
糖尿病ウサギに５０Ｉ．Ｕ．／ｋｇ（体重）の単回用量のインスリン負荷ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子を皮下に投与し、１０日間監視した。
【０１７１】
５０Ｉ．Ｕ．／ｋｇ（体重）のインスリン用量を与えられた動物において、血糖値は、血糖値の漸進的な上昇が観察された後、最大８日間、１２０〜１５０ｍｇ／ｄｌで維持された。薬物負荷ポリマーナノ粒子は、注射の部位でデポーを形成し、緩徐な分解および拡散により、持続的な様式で封入されているインスリンを放出する。グルコースレベルは、８日後であっても最初の糖尿病レベル（５００ｍｇ／ｄｌ）には戻らず、１週間を超えて生理活性インスリンを保持し、持続的な様式で放出するポリマーナノ粒子の能力を示す（図１３）。
ＭＵＣ１負荷ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子の評価：
ポリマーナノ粒子ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧによるカプセル封入されたＭＵＣ１のインビトロ放出
【０１７２】
１０ｍｌのリン酸緩衝食塩水およびポリアルギニンタンパク質形質導入ドメイン（Ａｃ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＣＱＣＲＲＫＮ−ＮＨ２（配列番号３））に連結するＭＵＣ１細胞質ドメインペプチドと複合体化されたローダミンＢをカプセル封入する１０ｍｇのＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子を含有する混合物を２００ｒｐｍで、３７℃で撹拌した。混合物の上清試料を６日間かけて異なる時間間隔で２５，０００ｒｐｍでの遠心分離によって収集した。各遠心分離後、ナノ粒子を新しい緩衝液中で再懸濁した。２ｍｌの上清を、ＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ，ＵＳＡ）を使用したタンパク質評価に供し、５６２ｎｍでの分光測定で薬物放出の量を評価した。薬物放出を標準検量線の方法を用いて計算した。ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧポリマーナノ粒子による薬物の放出が、最大６０日間制御され得ることが観察された（図１４）。
ＸＴＴ（ナトリウム２，３，−ビス（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−５−［（フェニルアミノ）−カルボニル］−２Ｈ−テトラゾリウム内塩）アッセイ
【０１７３】
ＸＴＴ（ナトリウム２，３，−ビス（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−５−［（フェニルアミノ）−カルボニル］−２Ｈ−テトラゾリウム内塩）アッセイを使用して一次ＨＵＶＥＣ細胞株およびＭＣＦ−７細胞株における細胞生存率を評価した（表６）。
【０１７４】
合計１×１０４ＭＣＦ−７細胞を９６ウェルプレートの各ウェル上に播種し、２４時間かけて培養した。２４時間後、プレート内の細胞を、ポリアルギニン配列（ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＣＱＣＲＲＫＮ（配列番号３））に連結する２０もしくは３０μＭいずれかのＭＵＣ１−細胞質ドメインペプチドを含有する本発明のポリマーナノ粒子で、またはいかなるペプチドも含まない対照ナノ粒子で処置した。１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、および９６時間の異なる時間間隔でナノ粒子を有する細胞をインキュベートした。インキュベーション後、ＭＵＣ１−細胞質ドメインペプチド負荷したＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子を含有する培地を、新しい培地と交換し、１０μｌの再構成ＸＴＴ混合物キット試薬を各ウェルに添加した。４時間かけて培養した後、試料の吸光度をマイクロタイタープレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用して４５０ｎｍで測定した。無治療対照の生存細胞の割合として細胞の増殖を決定し、３組で分析した。表６は、ホルモン依存性乳癌細胞株、ＭＣＦ−７の細胞生存率におけるＭＵＣ１−細胞質ドメインペプチド負荷ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子の効果を示す。
【０１７５】
当業者であれば、単なる慣例に過ぎない実験を用いて、本明細書に記載の本発明の具体的な実施形態の同等物を理解するか、または確認することができるであろう。そのような同等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【０１７６】
表の一覧
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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