(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
全身投与によりヒト対象におけるミオスタチン遺伝子の発現を調整するための、ミオスタチン低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）コンジュゲートを含む医薬組成物であって、ここで、
該ｓｉＮＡコンジュゲートが、親油性部分とミオスタチン遺伝子を標的とするｓｉＮＡ分子とを含み、ｓｉＮＡ分子が親油性部分に連結されており、かつＲＮＡ干渉を媒介し、
該ｓｉＮＡ分子がアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む二本鎖分子であり、該アンチセンス鎖がセンス鎖に対して相補的であり、前記アンチセンス鎖およびセンス鎖がそれぞれ独立して１５〜３０ヌクレオチドの長さであり、前記ｓｉＮＡ分子がアンチセンス鎖およびセンス鎖の一方または両方の鎖において１つまたは複数の３’オーバーハングヌクレオチドを含み、前記ｓｉＮＡ分子が１つまたは複数の化学修飾ヌクレオチドを含み、前記親油性部分がｓｉＮＡ分子のセンス鎖の３’末端、ｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５’末端、またはｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖の３’末端のいずれかに付加されている、医薬組成物。
【請求項２】
該ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖が、
５’−ＡＵＧＧＣＡＡＡＧＡＡＣＡＡＡＵＡＡＵ−３’（配列番号１）、
５’−ＧＧＣＡＡＡＧＡＡＣＡＡＡＵＡＡＵＡＵ−３’（配列番号２）または
５’−ＵＵＵＧＧＡＡＧＡＵＧＡＣＧＡＵＵＡＵ−３’（配列番号４）
のいずれかに相補的な配列を有する少なくとも１５ヌクレオチドを含む、
請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
該ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖が、
５’−ＡＵＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＵＵＧＣＣＡＵ−３’（配列番号１８）、
５’−ＡＵＡＵＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＵＵＧＣＣ−３’（配列番号１９）または
５’−ＡＵＡＡＵＣＧＵＣＡＵＣＵＵＣＣＡＡＡ−３’（配列番号２１）
の少なくとも１５ヌクレオチド配列を含む、
請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ｓｉＮＡ分子が、
５’−ＡＵＧＧＣＡＡＡＧＡＡＣＡＡＡＵＡＡＵ−３’（配列番号１）および
５’−ＡＵＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＵＵＧＣＣＡＵ−３’（配列番号１８）、
５’−ＧＧＣＡＡＡＧＡＡＣＡＡＡＵＡＡＵＡＵ−３’（配列番号２）および
５’−ＡＵＡＵＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＵＵＧＣＣ−３’（配列番号１９）、または
５’−ＵＵＵＧＧＡＡＧＡＵＧＡＣＧＡＵＵＡＵ−３’（配列番号４）および
５’−ＡＵＡＡＵＣＧＵＣＡＵＣＵＵＣＣＡＡＡ−３’（配列番号２１）
のいずれかを含む、請求項２または３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記親油性部分が、コレステロールである、請求項１から４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記親油性部分が、前記ｓｉＮＡ分子の３’末端に付加される、請求項１から５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記ｓｉＮＡ分子が、その３’末端にキャップを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
全身投与により対象における筋肉量を増強するための、請求項１から７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
全身投与により対象における筋肉の性能を増強するための、請求項１から７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
対象における筋骨格系疾患もしくは障害、または筋肉が悪影響を及ぼされる状態をもたらす疾患もしくは障害の処置に用いられる、請求項１から９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年１１月１１日に提出された米国仮特許出願第６１／９０２，３５８号明細書の利益を主張し、これらの全内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表の参照
配列表テキストファイルは、本明細書と同時に、３７ＣＦＲ§１．５２（ｅ）（５）に従ってＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出される。配列表は、ファイル名が「Ａ２０３８−７２１９ＷＯ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｌｉｓｔｉｎｇ」であり、２０１４年１１月１０日に作成し、サイズが２４，７７３バイトである。配列表は、本明細書の一部であり、本明細書において参照によってその全体が組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、真菌、植物および動物において見られる進化的に保存された転写後遺伝子サイレンシングの細胞機構であり、配列特異的な方法で遺伝子発現を阻害するために小さいＲＮＡ分子を使用する。ＲＮＡｉは、細胞質において短い二本鎖ＲＮＡ分子により開始されるＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）によって制御される。短い二本鎖ＲＮＡは、結合ＲＮＡに対して相補的である標的ｍＲＮＡを切断する、ＲＩＳＣの触媒成分であるアルゴノート２（Ａｇｏ２）と相互作用をする。２本のＲＮＡ鎖の一方（ガイド鎖として知られている）はＡｇｏ２タンパク質と結合して、遺伝子サイレンシングを指示する一方、他方の鎖（パッセンジャー鎖として知られている）は、ＲＩＳＣ活性化の間に分解される。例えば、（非特許文献１）；（非特許文献２）；（非特許文献３）；（非特許文献４）；および（非特許文献５）を参照されたい。また一本鎖の低分子干渉（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）ＲＮＡは、Ａｇｏ２に結合して、切断活性を支持することが示されている（例えば、（非特許文献６）を参照）。
【０００４】
ＲＮＡｉ機構は、既知の配列の任意のｍＲＮＡを壊すために利用することができる。これにより、それを産生した任意の遺伝子の抑制（ノックダウン）が可能になり、結果的に標的タンパク質の合成を防止する。ＲＮＡｉ機構による遺伝子発現の調節は、従来の小分子制御により到達できないものを含む、治療的に関連する生化学的経路を調節するために使用することができる。
【０００５】
ＲＮＡｉ分子に取り込まれたヌクレオチドの化学修飾は、ヌクレアーゼ安定性などの物理的および生物学的特性の改善（例えば、（非特許文献７）を参照）、免疫刺激の低減（例えば、（非特許文献８）を参照）、結合の増強（例えば、（非特許文献９）を参照）、ならびに細胞取込みおよび細胞質への送達を改善するための親油性の増強をもたらす。従って、化学修飾は、ＲＮＡ化合物の効力を増大させて、より少ない投与量を可能にし、毒性の可能性を低減し、全体的な治療コストを低減する可能性を有する。
【０００６】
近年、オリゴヌクレオチドの設計および化学修飾のタイプ／パターンの進歩により、ヌクレアーゼ媒介性の分解に対する抵抗性が増加し、薬物動態が改善され、遺伝子特異性が増加し、かつ免疫賦活性応答が低減した分子がもたらされた（非特許文献１０）。これらの大きな進歩にもかかわらず、様々な範囲の組織へのｓｉＲＮＡ送達は、インビボにおいて大きな障壁のままである。インビボにおけるｓｉＲＮＡ送達が、局所的な送達によって眼、肺、脳、腫瘍、および筋肉において実現されている一方（それぞれ、眼内、鼻内、髄腔内、腫瘍内、および筋肉内注射によって）、この送達方法は、その侵襲性の性質により標的検証研究に適しているだけで、臨床療法として妥当性が限られる（（非特許文献１１）；（非特許文献１２）；（非特許文献１３）；（非特許文献１４）；（非特許文献１５））。好適な全身性送達系は、関心対象のある組織に達するのに不可欠である。多数の研究により、カチオン脂質およびポリマー、コレステロールコンジュゲート、細胞浸透性ペプチド、組換えウイルスベクター、小分子担体、抗体連結ｓｉＲＮＡ、ならびにターゲティングリガンドを含む様々な方法を通して、インビボにおける全身性および標的全身性ｓｉＲＮＡ送達が実証された（（非特許文献１６）；（非特許文献１７）；（非特許文献１８）；（非特許文献１９）；（非特許文献２０）；（非特許文献２１）；（非特許文献２２）；（非特許文献２３））。しかしながら、全身性ｓｉＲＮＡ送達は、肝臓、腫瘍、脾臓、および空腸などの特定の組織に制限されたままである（（非特許文献２４）；（非特許文献２５）；（非特許文献１２）、上記；（非特許文献２６）；（非特許文献２７）；（非特許文献２３）、上記）。
【０００７】
ミオスタチンは、骨格筋分化および成長の阻害剤である。発生の間、それは、筋発生の阻害剤となるが、成人期の間、その主な役割は、衛星細胞の活性化および自己複製をネガティブに調節することである。ミオスタチンは、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーであり、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体を通して異化の刺激薬として作用して、ＳＭＡＤ２／３／ＦＯＸＯ／ＮＦ−κＢシグナル伝達および筋線維萎縮を誘発する（（非特許文献２８）；（非特許文献２９））。ミオスタチンノックアウトマウスおよびミオスタチン阻害の他のマウスモデルは、様々な筋肉疾患モデルにおいて筋肉量／強度の増加および筋萎縮表現型の減衰／逆転を示す（（非特許文献３０）；（非特許文献３１）；（非特許文献３２）；（非特許文献３３）；（非特許文献３４））。ミオスタチンを標的にする低分子干渉ＲＮＡは、癌などの悪液質誘発性の疾患、心疾患、慢性閉塞性肺疾患、サルコペニア（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）、慢性腎疾患、および代謝性疾患における、さらにインスリン抵抗性の障害における筋ジストロフィー、筋萎縮症に及ぶ多くの既存の筋肉障害において多数の治療上の適用を有し得る（（非特許文献３５）；（非特許文献３６）；（非特許文献３７）；（非特許文献３８））。
【０００８】
現在まで、筋肉への全身的なｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の送達は成功が限られており、ほとんどの報告は、局所的な注射による筋肉ターゲティングを強調するものであった（（非特許文献３９）；（非特許文献４０）；（非特許文献４１）；（非特許文献４２））。いくつかの研究は、筋細胞中へのｓｉＲＮＡまたはプラスミドベクターの移入を改善するために、筋肉内（ＩＭ）注射と共に、さらにエレクトロポレーションを使用した（（非特許文献４３）；（非特許文献１１）、上記；（非特許文献４４））。しかしながら、ＩＭ注射は、痛み、局所的な筋肉損傷および炎症を引き起こす長年の歴史を有し、これは、さらに、治療上の適用のそれらの有用性を最低にする（（非特許文献４５））。ＩＭ送達に対する改善として、「局所的」静脈送達筋肉系のモデルが開発され、これは、ラット、イヌ、およびサルにおける筋肉にルシフェラーゼｐＤＮＡベクターの「高圧」流体力学的注射液を送達するために、肢の筋肉中の注射溶液を一時的に単離するための止血帯の使用を伴う（（非特許文献４６））。それは、肢における複数の筋群への送達の成功および複数回投薬することができることを示したが、送達効率が低く、また、それはなお高度の注射能力を必要とする侵襲性の技術である。
【０００９】
近年、担体ポリマー、アテロコラーゲンの使用は、核酸（ｓｉＲＮＡ、ＡＳＯ、およびプラスミド）ならびに負に荷電しているタンパク質の送達に使用された。最近の研究は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）のモデルにおける筋肉へのアテロコラーゲン／ｓｉＲＮＡ複合体の局所的および全身性送達の両方を示す（（非特許文献４７）；（非特許文献４８）；（非特許文献４９））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｚａｍｏｒｅ  ａｎｄ  Ｈａｌｅｙ，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９：１５１９−１５２４
【非特許文献２】Ｖａｕｇｈｎ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｅｎｓｓｅｎ，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９：１５２５−１５２６
【非特許文献３】Ｚａｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１：２５−３３
【非特許文献４】Ｂａｓｓ，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４２８−４２９
【非特許文献５】Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４９４−４９８
【非特許文献６】Ｌｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｃｅｌｌ  １５０：８８３−８９４
【非特許文献７】Ｄａｍｈａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ，１３：８４２−８５５
【非特許文献８】Ｓｉｏｕｄ，２００６，ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１２：１６７−１７６
【非特許文献９】Ｋｏｌｌｅｒ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３４：４４６７−４４７６
【非特許文献１０】Ｌａｒｅｓ，Ｍ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．２０１０，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５８：５７０−９
【非特許文献１１】Ｇｏｌｚｉｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：２４６−５１
【非特許文献１２】Ｌｉａｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，２０１０，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５：ｅ１２８６０
【非特許文献１３】Ｒｅｉｃｈ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．９：２１０−６
【非特許文献１４】Ｔａｎ，Ｐ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：５９−６６
【非特許文献１５】Ｚｈａｎｇ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１０６７７−８４
【非特許文献１６】Ｆｒａｎｋ−Ｋａｍｅｎｅｔｓｋｙ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０５：１１９１５−２０
【非特許文献１７】Ｋｈｏｕｒｙ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．５４：１８６７−７７
【非特許文献１８】Ｋｉｍ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６５：２１７７−８５
【非特許文献１９】Ｋｏｎｄｏ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．３：９５１
【非特許文献２０】Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，Ｄ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１００２−７
【非特許文献２１】Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２：ｅ１４９
【非特許文献２２】Ｓｏｎｇ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：７０９−１７
【非特許文献２３】Ｗｏｌｆｒｕｍ，Ｃ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：１１４９−５７
【非特許文献２４】Ａｂｒａｍｓ，Ｍ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１８：１７１−８０
【非特許文献２５】Ｃｈｉｅｎ，Ｐ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：３２１−８
【非特許文献２６】Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｄ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２７：７６１−６
【非特許文献２７】Ｔａｄｉｎ−Ｓｔｒａｐｐｓ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．５２：１０８４−９７
【非特許文献２８】Ｓａｒｔｏｒｉ，Ｒ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９６：Ｃ１２４８−５７
【非特許文献２９】Ｓｔｉｔｔ，Ｔ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １４：３９５−４０３
【非特許文献３０】Ａｋｐａｎ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｂｅｓ．（Ｌｏｎｄ）３３：１２６５−７３
【非特許文献３１】Ｈｅｉｎｅｋｅ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １２１：４１９−２５
【非特許文献３２】Ｌｉｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２９１：７０１−６
【非特許文献３３】Ｚｈａｎｇ，Ｌ．２０１１，Ｆａｓｅｂ  Ｊ．２５：１６５３−６３
【非特許文献３４】Ｚｈｏｕ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｃｅｌｌ  １４２：５３１−４３
【非特許文献３５】Ａｓｐ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １２６：７５６−６３
【非特許文献３６】Ｂａｉｌｅｙ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１７：１３８８−９４
【非特許文献３７】Ｅｎｇｅｌｅｎ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．７：１７９３−７
【非特許文献３８】Ｒｕｅｇｇ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．５１：３７３−９５
【非特許文献３９】Ｇｅｂｓｋｉ，Ｂ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１２：１８０１−１１
【非特許文献４０】Ｇｕｅｓｓ，Ｍ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｓｋｅｌｅｔ．Ｍｕｓｃｌｅ  ３：１９
【非特許文献４１】Ｌａｗｓ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０５：６６２−８
【非特許文献４２】Ｔａｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．８２：３２２−３２
【非特許文献４３】Ｅｅｆｔｉｎｇ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１８：８６１−９
【非特許文献４４】Ｋｉｓｈｉｄａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．６：１０５−１０
【非特許文献４５】ＭｃＭａｈｏｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：１２８３−９０
【非特許文献４６】Ｈａｇｓｔｒｏｍ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１０：３８６−９８
【非特許文献４７】Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，２０１３，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８：ｅ６４７１９
【非特許文献４８】Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｄｅｖ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．５３：４８−５４
【非特許文献４９】Ｋｉｎｏｕｃｈｉ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１５：１１２６−３０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
筋肉萎縮性疾患、筋ジストロフィー、およびＩＩ型糖尿病などの様々な筋肉障害の将来の治療で使用される可能性を有し得る、筋肉に核酸を容易にかつ非侵襲的に送達することができる療法を開発する必要性が引き続きある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、ＲＮＡ干渉を媒介し、ミオスタチンの発現を低減することができる小核酸分子を対象に送達するための方法を提供する。本発明の小核酸分子は、より詳細には、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子と本明細書において呼ばれる。開示される方法に従って送達されるｓｉＮＡ分子は、ミオスタチン遺伝子を標的にし、コレステロールなどの親油性部分にコンジュゲートされる（すなわちミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲート）。それらの作用部位（例えばミオスタチンを発現する筋細胞）に送達されると、ミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートは、ミオスタチン遺伝子の破壊を引き起こすことによってミオスタチン遺伝子発現を阻害または下方制御するように作用する。ミオスタチン遺伝子の発現を低減し、さらには、ミオスタチンタンパク質のレベルを低減することによって、本発明の方法は、筋肉量および／または機能を増強する可能性を有する。従って、開示される方法の使用は、例えば、筋骨格系疾患／障害ならびに神経変性疾患／障害、サルコペニア、悪液質、肥満、ＩＩ型糖尿病、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、および癌など、筋肉が悪影響を及ぼされる状態をもたらす疾患／障害を治療するために必要とされる。本発明の方法はまた、例えば、ウシ、ブタ、および家禽を含むが、これらに限定されない家畜において筋肉量および／または機能を増強するのにも有用である。
【００１３】
本発明の実施形態は、ミオスタチン遺伝子を標的にする低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子またはその医薬組成物を対象の筋肉に送達する方法であって、前記ｓｉＮＡのコンジュゲートを前記対象に全身的に投与するステップを含み、前記コンジュゲートが、親油性部分（例えばコレステロール）に連結されたｓｉＮＡ分子を含む方法に関する。従って、本発明は、全身投与を介して、ミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートまたはその医薬組成物を対象の筋肉に送達する方法に関する。対象に全身的に投与されるミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートは、ミオスタチンを発現する筋肉に送達される。筋肉に送達されると、ミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートは、ＲＮＡ干渉メカニズムによってミオスタチン発現を低減する。従って、本発明は、ミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートまたはその医薬組成物を対象の筋肉に送達する方法であって、前記筋肉におけるミオスタチン発現を調整する（例えば、阻害または下方制御する）のに有効な量で、ミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートを前記対象に全身的に投与するステップを含み、前記ミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートが、親油性部分（例えばコレステロール）に連結されている、前記対象によって発現されるミオスタチン遺伝子を標的にするｓｉＮＡ分子を含み、前記ミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートがＲＮＡ干渉を媒介する、方法に関する。
【００１４】
本発明の実施形態は、対象におけるミオスタチン遺伝子のインビボにおける発現を調整する（例えば阻害または下方制御する）方法であって、全身投与によって、有効量のミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートまたはその医薬組成物を前記対象に導入するステップを含み、ｓｉＮＡコンジュゲートが、親油性部分（例えばコレステロール）に連結されている、前記対象によって発現されるミオスタチン遺伝子を標的にするｓｉＮＡ分子を含み、ｓｉＮＡコンジュゲートがＲＮＡ干渉を媒介する、方法に関する。別の実施形態は、対象におけるミオスタチン遺伝子のインビボにおける発現を調整する（例えば阻害または下方制御する）方法であって、全身投与によって前記対象にｓｉＮＡコンジュゲートを導入することにより、有効量のミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートまたはその医薬組成物を前記対象の筋肉に送達するステップを含み、ｓｉＮＡコンジュゲートが、親油性部分（例えばコレステロール）に連結されている、前記対象によって発現されるミオスタチン遺伝子を標的にするｓｉＮＡ分子を含み、ｓｉＮＡコンジュゲートがＲＮＡ干渉を媒介する、方法に関する。従って、本発明は、対象におけるミオスタチン遺伝子のインビボにおける発現を調整する方法であって、有効量のｓｉＮＡコンジュゲートまたはその医薬組成物を前記対象に全身的に投与するステップを含み、ｓｉＮＡコンジュゲートが、親油性部分に連結されている、前記対象によって発現されるミオスタチン遺伝子を標的にするｓｉＮＡ分子を含み、前記ｓｉＮＡコンジュゲートがＲＮＡ干渉を媒介する、方法に関する。対象に全身的に投与されるミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートは、ミオスタチンを発現する筋肉に送達され、ＲＮＡ干渉メカニズムによって、筋肉におけるミオスタチン遺伝子の発現を阻害または下方制御する。
【００１５】
本発明のさらなる態様は、対象（すなわちヒトまたは動物）によって発現されるミオスタチン遺伝子のインビボにおける発現を調整するために使用されるミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートを含む。別の実施形態は、前記コンジュゲートまたはその医薬組成物の前記対象への全身投与を含む、対象によって発現されるミオスタチン遺伝子のインビボにおける発現を調整するための医薬の製造のための、ミオスタチン遺伝子を標的にするｓｉＮＡ分子および親油性部分（例えばコレステロール）を含むコンジュゲートの使用に関する。
【００１６】
本発明の別の実施形態は、対象における筋肉量を増強するための方法であって、全身投与によって、有効量のミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートまたはその医薬組成物を前記対象に導入することによって前記対象におけるミオスタチンレベルを低減するステップを含み、ｓｉＮＡコンジュゲートが、親油性部分（例えばコレステロール）に連結されている、前記対象によって発現されるミオスタチン遺伝子を標的にするｓｉＮＡ分子を含み、ｓｉＮＡコンジュゲートがＲＮＡ干渉を媒介する、方法を提供する。別の実施形態は、対象における筋肉量を増強するための方法であって、全身投与によって前記対象にｓｉＮＡコンジュゲートを導入することによって有効量のミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートまたはその医薬組成物を前記対象の筋肉に送達することにより、前記対象におけるミオスタチンレベルを低減するステップを含み、ｓｉＮＡコンジュゲートが、親油性部分（例えばコレステロール）に連結されている、前記対象によって発現されるミオスタチン遺伝子を標的にするｓｉＮＡ分子を含み、ｓｉＮＡコンジュゲートがＲＮＡ干渉を媒介する、方法に関する。本明細書において使用される句「ミオスタチンレベルを低減する」は、ミオスタチン遺伝子の発現を低減することまたはミオスタチンタンパク質レベルを低減することを指す。対象に全身的に投与されるミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートは、ミオスタチンを発現する筋肉に送達され、ＲＮＡ干渉メカニズムによって、筋肉におけるミオスタチン遺伝子の発現を阻害または下方制御する。ミオスタチン発現の減少は、対象の筋肉量の増加をもたらす。「筋肉増強」および「筋肉を増強する」という用語は、本明細書において交換可能であることが意図され、過形成の誘導（筋線維数の増加）、肥大の誘導（筋線維直径の増加）、またはその両方を含むが、これらに限定されない。増加は、１型および／または２型筋線維におけるものとすることができる。本発明の本態様は、本明細書において記載されるミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートまたはその医薬組成物を全身的に送達するによって、損傷した筋骨組織の再生を、それを必要とする対象において行う方法にさらに関する。
【００１７】
本発明のさらなる態様は、対象における筋肉量の増強および／または損傷した筋骨組織の再生に使用するためのミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートを含む。別の実施形態は、前記コンジュゲートまたはその医薬組成物の前記対象への全身投与を含む、対象において筋肉量を増強し、および／または損傷した筋骨組織を再生するための医薬の製造のための、親油性部分（例えばコレステロール）に連結されている、ミオスタチン遺伝子を標的にするｓｉＮＡ分子を含むコンジュゲートの使用に関する。
【００１８】
本発明の別の実施形態は、対象における筋肉の性能を増強するための方法であって、全身投与によって、有効量のミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートまたはその医薬組成物を前記対象に導入することによって前記対象におけるミオスタチンレベルを低減するステップを含み、ｓｉＮＡコンジュゲートが、親油性部分（例えばコレステロール）に連結されている、前記対象によって発現されるミオスタチン遺伝子を標的にするｓｉＮＡ分子を含み、ｓｉＮＡコンジュゲートがＲＮＡ干渉を媒介する、方法を提供する。別の実施形態は、対象における筋肉の性能を増強するための方法であって、全身投与によって、前記対象にｓｉＮＡコンジュゲートを導入することによって有効量のミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートまたはその医薬組成物を前記対象の筋肉に送達することにより、前記対象におけるミオスタチンレベルを低減するステップを含み、ｓｉＮＡコンジュゲートが、親油性部分（例えばコレステロール）に連結されている、前記対象によって発現されるミオスタチン遺伝子を標的にするｓｉＮＡ分子を含み、ｓｉＮＡコンジュゲートがＲＮＡ干渉を媒介する、方法に関する。対象に全身的に投与されるミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートは、ミオスタチンを発現する筋肉に送達され、ＲＮＡ干渉メカニズムによって、筋肉におけるミオスタチン遺伝子の発現を阻害または下方制御する。ミオスタチン発現の減少は、対象における筋肉の性能の増加をもたらす。「筋肉の性能の増強」は、萎縮の減少、筋肉耐久性の増加、および全体的な筋肉強度の増加（例えば収縮力の増加）のうちの１つまたは複数を含むが、これらに限定されない。本発明のさらなる態様は、対象において筋肉の性能を増強するのに使用するためのミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートを含む。
【００１９】
本発明の別の実施形態は、筋骨格系疾患もしくは障害、および／または筋肉が悪影響を及ぼされる状態をもたらす疾患もしくは障害（例えば筋力低下、筋萎縮症）の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、全身投与によって、有効量のミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートまたはその医薬組成物を前記対象に導入することによって前記対象におけるミオスタチンレベルを低減するステップを含み、ｓｉＮＡコンジュゲートが、親油性部分（例えばコレステロール）に連結されている、前記対象によって発現されるミオスタチン遺伝子を標的にするｓｉＮＡ分子を含み、ｓｉＮＡコンジュゲートがＲＮＡ干渉を媒介する、方法に関する。本発明のさらなる実施形態は、筋骨格系疾患もしくは障害、および／または筋肉が悪影響を及ぼされる状態をもたらす疾患もしくは障害（例えば筋力低下、筋萎縮症）の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、全身投与によって、有効量のミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートまたはその医薬組成物を前記対象の筋肉に送達することによって前記対象におけるミオスタチンレベルを低減するステップを含み、ｓｉＮＡコンジュゲートが、親油性部分（例えばコレステロール）に連結されている、前記対象によって発現されるミオスタチン遺伝子を標的にするｓｉＮＡ分子を含み、ｓｉＮＡコンジュゲートがＲＮＡ干渉を媒介する、方法に関する。対象に全身的に投与されるミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートは、ミオスタチンを発現する筋肉に送達され、ＲＮＡ干渉メカニズムによって、筋肉におけるミオスタチン遺伝子の発現を阻害または下方制御する。ミオスタチン発現における減少は、対象における筋肉量の増加および／または筋肉の性能の増強をもたらす。
【００２０】
本発明のさらなる態様は、筋骨格系疾患もしくは障害、および／または筋肉が対象において悪影響を及ぼされる状態をもたらす疾患もしくは障害を治療するのに使用するためのミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートを含む。別の実施形態は、前記対象への前記コンジュゲートまたはその医薬組成物の全身投与を含む、対象における筋骨格系疾患もしくは障害、および／または筋肉が悪影響を及ぼされる状態をもたらす疾患もしくは障害を治療するための医薬の製造のための、親油性部分（例えばコレステロール）に連結されている、ミオスタチン遺伝子を標的にするｓｉＮＡ分子を含むコンジュゲートの使用に関する。
【００２１】
本発明の方法は、核酸分子を全身的に投与することができる対象に対して実行することができる。本明細書において使用される用語「対象」は、ヒトおよび非ヒト動物を含むことが意図される。非ヒト動物は、脊椎動物、例えば、非ヒト霊長動物、ヒツジ、イヌ、ネコ、雌ウシ、ウマ、ニワトリ、両生動物、および爬虫類動物などの哺乳動物および非哺乳動物を全て含む。一実施形態では、本発明の方法が、哺乳動物に対して実行される。別の実施形態では、本発明の方法が、家畜に対して実行される。別の実施形態では、本発明の方法が、ヒトに対して実行される。さらなる実施形態では、ヒトが、筋骨格系疾患と診断される。用語「対象」はまた、卵内に含有されるニワトリの胚を含む、胚を含むように意図される。
【００２２】
本発明の実施形態は、ミオスタチン遺伝子を標的にするｓｉＮＡ分子および親油性部分（例えばコレステロール）を含むコンジュゲートに関する。本発明のミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートは、前記対象への前記コンジュゲートまたはその医薬組成物の全身投与を含む療法による対象の治療の方法において使用されてもよい。別の実施形態は、前記コンジュゲートまたはその医薬組成物の前記対象への全身投与を含む、対象を治療するための医薬の製造のための、ミオスタチン遺伝子を標的にするｓｉＮＡ分子および親油性部分（例えばコレステロール）を含むコンジュゲートの使用に関する。
【００２３】
本発明の実施形態は、療法による対象の治療の方法において使用するための、ミオスタチン遺伝子を標的にするｓｉＮＡ分子および親油性部分（例えばコレステロール）を含むコンジュゲートであって、全身投与のための製剤されるコンジュゲートに関する。さらなる実施形態は、対象を治療するための医薬の製造のための、ミオスタチン遺伝子を標的にするｓｉＮＡ分子および親油性部分（例えばコレステロール）を含むコンジュゲートの使用であって、コンジュゲートが、全身投与のための製剤される使用に関する。
【００２４】
開示される方法によって送達される本発明のミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートは、親油性部分に連結されたミオスタチンｓｉＮＡ分子を含む。本発明の方法によって送達されるミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートは、リポソームを形成する脂質製剤と共に製剤されない。特定の理論によって束縛されることを望むものではないが、ミオスタチンｓｉＮＡ分子への親油性部分の付加は、ｓｉＮＡ分子の親油性を増加させ、筋細胞中へのｓｉＮＡ分子の移行を増強すると考えられる。ミオスタチンｓｉＮＡ分子に連結することができる親油性部分の例は、コレステロール、オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、リノール酸、オレイル、レチニル、コレステリル残基、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジンを含むが、これらに限定されない。好ましい親油性部分は、コレステロールである。
【００２５】
親油性部分は、ｓｉＮＡ分子の末端（例えばｓｉＮＡ分子のセンス鎖の３’もしくは５’末端）への連結を通してまたはｓｉＮＡ分子の内部にあるヌクレオチドへの連結を通して、ミオスタチンｓｉＮＡ分子に付加される。一実施形態では、親油性部分が、二本鎖ミオスタチンｓｉＮＡ分子のパッセンジャー鎖（センス鎖）の３’末端に付加される。一実施形態では、親油性部分が、二本鎖ミオスタチンｓｉＮＡ分子のパッセンジャー鎖の５’末端に付加される。さらなる実施形態では、親油性部分が、ミオスタチンｓｉＮＡ分子のガイド鎖（アンチセンス鎖）の３’末端に付加される。さらなる実施形態では、ミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートが、２つ以上の付加された親油性部分（例えば、パッセンジャー鎖の３’および５’末端の両方に付加された親油性部分；ガイド鎖の３’末端およびパッセンジャー鎖の５’末端に付加された親油性部分）を含有する。本発明の本態様では、親油性部分を同じまたは異なるものとすることができる。
【００２６】
本発明は、ミオスタチン遺伝子の発現を調整するのに有用な、親油性部分が付加され、本明細書において記載されるミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートを形成することができるｓｉＮＡ分子をさらに提供する。本発明の方法によって送達されるミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートのｓｉＮＡ部分は、一本鎖または二本鎖低分子干渉核酸分子とすることができ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、および短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を含むが、これらに限定されない、様々なオリゴヌクレオチド形態をとることができる。一実施形態では、ミオスタチンｓｉＮＡ分子が、センスおよびアンチセンス鎖を含む二本鎖ｓｉＮＡ分子である。アンチセンス鎖は、ミオスタチン標的ＲＮＡ配列の一部に相補的である配列を含み、センス鎖は、アンチセンス鎖の少なくとも一部に相補的である。本発明の方法によって送達される二本鎖ミオスタチンｓｉＮＡ分子は、対称または非対称とすることができる。別の態様では、ミオスタチンｓｉＮＡ分子が、一本鎖ｓｉＮＡ分子であり、一本のオリゴヌクレオチド鎖（アンチセンス鎖）が、ミオスタチン標的ＲＮＡ配列の少なくとも一部に相補的である配列を含む。本発明の方法によって送達されるミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートのｓｉＮＡ部分は、ＲＮＡ干渉メカニズムを介して対象におけるミオスタチン遺伝子発現を阻害する。
【００２７】
本明細書において記載されるミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートは、ヒト、ウシ、イノシシ（ｓｗｉｎｅ）、家禽、およびげっ歯動物を含むが、これらに限定されない多くの動物種のいずれかに由来することができるミオスタチン遺伝子に向けられる。一実施形態では、ミオスタチン遺伝子が、ヒトミオスタチンＲＮＡである。別の実施形態では、ミオスタチン遺伝子が、ウシミオスタチンＲＮＡである。別の実施形態では、ミオスタチン遺伝子が、イノシシミオスタチンＲＮＡである。さらなる実施形態では、ミオスタチン遺伝子が、家禽ミオスタチンＲＮＡ（例えばニワトリ、シチメンチョウ）である。さらなる実施形態では、ミオスタチン遺伝子が、げっ歯動物ミオスタチンＲＮＡ（例えばマウス）である。
【００２８】
ある実施形態では、本発明の方法によって送達されるミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートのｓｉＮＡ部分のｓｉＮＡ分子が、ミオスタチン遺伝子配列に対して配列相補性を有する、少なくとも１５ヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含む。他の実施形態では、本発明の方法によって送達されるｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖が、約１５〜３０ヌクレオチドの長さである。さらなる実施形態では、本発明の方法によって送達される二本鎖ｓｉＮＡ分子が、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、独立して、約１５〜３０ヌクレオチドの長さである。
【００２９】
一実施形態では、本発明のｓｉＮＡコンジュゲートのｓｉＮＡ部分が、ミオスタチン遺伝子の発現を調整する二本鎖ｓｉＮＡ分子であり、ｓｉＮＡ分子が、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖が、独立して、約１５〜３０ヌクレオチドの長さであり、アンチセンス鎖が、
５’−ＡＵＧＧＣＡＡＡＧＡＡＣＡＡＡＵＡＡＵ−３’（配列番号１）、
５’−ＧＧＣＡＡＡＧＡＡＣＡＡＡＵＡＡＵＡＵ−３’（配列番号２）、
５’−ＡＣＵＣＣＡＧＡＡＵＡＧＡＡＧＣＣＡＵ−３’（配列番号３）、または
５’−ＵＵＵＧＧＡＡＧＡＵＧＡＣＧＡＵＵＡＵ−３’（配列番号４）
のいずれかに相補的な配列を有する少なくとも１５のヌクレオチドを含む。一実施形態では、「少なくとも１５のヌクレオチド」が、１５の隣接するヌクレオチドである。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本発明のミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートのｓｉＮＡ分子部分のアンチセンス鎖が、
５’−ＡＵＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＵＵＧＣＣＡＵ−３’（配列番号１８）、
５’−ＡＵＡＵＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＵＵＧＣＣ−３’（配列番号１９）、
５’−ＡＵＧＧＣＵＵＣＵＡＵＵＣＵＧＧＡＧＵ−３’（配列番号２０）、または
５’−ＡＵＡＡＵＣＧＵＣＡＵＣＵＵＣＣＡＡＡ−３’（配列番号２１）
のいずれかに対して配列同一性を有する少なくとも１５のヌクレオチドを含む。一実施形態では、「少なくとも１５のヌクレオチド」が、１５の隣接するヌクレオチドである。従って、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖は、配列番号１８〜２１のいずれかの少なくとも１５ヌクレオチド配列を含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、本発明のミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートのｓｉＮＡ分子部分のセンス鎖が、
５’−ＡＵＧＧＣＡＡＡＧＡＡＣＡＡＡＵＡＡＵ−３’（配列番号１）、
５’−ＧＧＣＡＡＡＧＡＡＣＡＡＡＵＡＡＵＡＵ−３’（配列番号２）、
５’−ＡＣＵＣＣＡＧＡＡＵＡＧＡＡＧＣＣＡＵ−３’（配列番号３）、または
５’−ＵＵＵＧＧＡＡＧＡＵＧＡＣＧＡＵＵＡＵ−３’（配列番号４）
のいずれかに対して配列同一性を有する少なくとも１５のヌクレオチドを含む。一実施形態では、「少なくとも１５のヌクレオチド」が、１５の隣接するヌクレオチドである。従って、ｓｉＮＡ分子のセンス鎖は、配列番号１〜４のいずれかの少なくとも１５ヌクレオチド配列を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態では、本発明のミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートのｓｉＮＡ分子部分が、配列番号１および１８の両方または配列番号２および１９の両方または配列番号３および２０の両方または配列番号４および２１の両方のうちの少なくとも１５ヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、ミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートのｓｉＮＡ分子部分が、下記の二本鎖分子のいずれかを含む：
５’−ＡＵＧＧＣＡＡＡＧＡＡＣＡＡＡＵＡＡＵ−３’（配列番号１）および
５’−ＡＵＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＵＵＧＣＣＡＵ−３’（配列番号１８）、
５’−ＧＧＣＡＡＡＧＡＡＣＡＡＡＵＡＡＵＡＵ−３’（配列番号２）および
５’−ＡＵＡＵＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＵＵＧＣＣ−３’（配列番号１９）、
５’−ＡＣＵＣＣＡＧＡＡＵＡＧＡＡＧＣＣＡＵ−３’（配列番号３）および
５’−ＡＵＧＧＣＵＵＣＵＡＵＵＣＵＧＧＡＧＵ−３’（配列番号２０）、または
５’−ＵＵＵＧＧＡＡＧＡＵＧＡＣＧＡＵＵＡＵ−３’（配列番号４）および
５’−ＡＵＡＡＵＣＧＵＣＡＵＣＵＵＣＣＡＡＡ−３’（配列番号２１）。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態では、ｓｉＮＡ分子が、親油性部分に連結される。別の実施形態では、親油性部分が、コレステロールである。別の実施形態では、親油性部分が、ｓｉＮＡ分子の３’末端に付加される。別の実施形態では、親油性部分が、ｓｉＮＡ分子の５’末端に付加される。別の実施形態では、親油性部分が、ｓｉＮＡ分子の３’および５’末端のそれぞれに付加される。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートのｓｉＮＡ分子部分のヌクレオチドが全て、未修飾である。他の実施形態では、本発明の方法によって送達されるｓｉＮＡ分子が、化学修飾された分子の一方または両方の鎖において１つまたは複数のヌクレオチドをさらに含む。修飾には、核酸糖修飾、塩基修飾、骨格（ヌクレオシド間結合）修飾、非ヌクレオチド修飾、および／またはこれらの任意の組み合わせが含まれる。ある場合には、プリンおよびピリミジンヌクレオチドは差別的に修飾される。例えば、プリンおよびピリミジンヌクレオチドは、２’炭素部分において差別的に修飾され得る（すなわち、少なくとも１つのプリンは、２’炭素部分において、同じまたは異なる鎖中の少なくとも１つのピリミジンとは異なる修飾を有する）。ある場合には、プリンは、一方または両方の鎖において非修飾であるが、一方または両方の鎖のピリミジンは修飾される。いくつかの他の場合には、ピリミジンは一方または両方の鎖において非修飾であるが、一方または両方の鎖のプリンは修飾される。ある場合には、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、または２’−Ｏ−アルキルヌクレオチドである。ある場合には、一方または両方の鎖におけるピリミジンヌクレオチドの少なくとも５つ以上が、全て２’−デオキシ−２’−フルオロまたは全て２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチドである。ある場合には、一方または両方の鎖におけるプリンヌクレオチドの少なくとも５つ以上が、全て２’−デオキシ−２’−フルオロまたは全て２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。ｓｉＮＡ分子が本明細書に記載される１つまたは複数の修飾を含む特定の場合には、ガイド（アンチセンス）鎖の５’末端の第１位、第２位、および第３位のヌクレオチドは修飾されない。ある実施形態では、本発明の方法によって送達されるｓｉＮＡ分子が、１つまたは複数の修飾されたヌクレオシド間連結基を含む。ある実施形態では、各ヌクレオシド間連結基は独立して、ホスホジエステルまたはホスホロチオアート連結基である。
【００３５】
ある実施形態では、本発明のミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートのｓｉＮＡ分子部分が、鎖の一方または両方において１、２、３または４個のヌクレオチドの３’オーバーハングを有する。他の実施形態では、二本鎖ｓｉＮＡ分子にはオーバーハングがない（すなわち、平滑末端を有する）。好ましくは、ｓｉＮＡ分子は、センスおよびアンチセンス鎖の両方の上に２個のヌクレオチドの３’オーバーハングを有する。オーバーハングは、修飾することができるまたは未修飾とすることができる。オーバーハングにおける修飾ヌクレオチドの例は、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、または２’−デオキシヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。アンチセンス鎖におけるオーバーハングヌクレオチドは、ミオスタチン標的配列におけるヌクレオチドに相補的であるヌクレオチドを含むことができる。同様に、センス鎖におけるオーバーハングは、ミオスタチン標的配列中に存在するヌクレオチドを含むことができる。ある場合では、ｓｉＮＡ分子は、２’−Ｏ−アルキル（例えば２’−Ｏ−メチル）ヌクレオチドである、アンチセンス鎖上の２個の３’オーバーハングヌクレオチドおよび２’−デオキシヌクレオチドであるセンス鎖上の２個の３’オーバーハングヌクレオチドを有する。他の場合では、ｓｉＮＡ分子は、アンチセンス鎖およびセンス鎖の両方の上に２’−Ｏ−アルキル（例えば２’−Ｏ−メチル）ヌクレオチドである２個の３’オーバーハングヌクレオチドを有する。ある実施形態では、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルウリジンヌクレオチドである。ある場合では、３’オーバーハングは、さらに、オーバーハングのヌクレオチド間に１つまたは複数のホスホロチオエート連結を含む。
【００３６】
いくつかの実施形態では、本発明のミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートのｓｉＮＡ分子部分が、１つまたは複数の末端キャップ（本明細書では「キャップ」とも呼ばれる）を有する。キャップは、アンチセンス鎖（ガイド鎖）の３’末端（３’キャップ）、センス鎖（パッセンジャー鎖）の５’末端（５’キャップ）、および／またはセンス鎖（パッセンジャー鎖）の３’末端（３’キャップ）に存在してもよい。親油性部分は、末端のキャップを含有するｓｉＮＡ分子の同じ末端に付加されてもよい。
【００３７】
いくつかの実施形態では、本発明のミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートのｓｉＮＡ分子部分が、アンチセンス鎖の５’末端でリン酸化される。リン酸基は、ホスフェート、ジホスフェート、またはトリホスフェートとすることができる。
【００３８】
本発明の本態様のある実施形態では、本発明のミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートのｓｉＮＡ部分が、二本鎖ｓｉＮＡ分子であり、アンチセンスおよび／またはセンス鎖が、表３において提供される配列番号５〜１２から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。さらなる実施形態では、本発明のミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートのｓｉＮＡ部分が、下記の二本鎖分子のいずれかを含む：配列番号５および６、配列番号７および８、配列番号９および１０、または配列番号１１および１２。
【００３９】
本発明はさらに、任意選択で薬学的に許容可能な担体または希釈剤と共に、本明細書に記載されるミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートを含む組成物を提供する。本発明の方法は、薬学的に許容可能な担体または希釈剤と共に、本明細書において記載されるミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートを含む組成物の送達を含み、前記組成物が、全身投与のために製剤される。
【００４０】
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の詳細な説明および添付図面を参照すれば明らかになるであろう。さらに、本明細書に記載される任意の方法または組成物は、本明細書に記載される任意の他の方法または組成物に関して実施可能であり、異なる実施形態は結合され得ると考えられる。
【００４１】
さらに、特許、特許出願および他の文献は、本発明の種々の態様を記載し、より具体的に説明するために本明細書全体を通して引用される。本明細書で引用されるこれらの参考文献はそれぞれ、図面を含むその全体が参照によって本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】Ｍｓｔｎ−コレステロールコンジュゲートのインビボにおけるスクリーニングである。４つのＭｓｔｎ−コレステロールｓｉＲＮＡ（●）、ＰＢＳ（○）、およびプラセボ５非ターゲティングコントロール（●）を、ｉ．ｖ．注射によって１５ｍｐｋの用量でＣＤ−１マウス（ｎ＝５）においてスクリーニングした。（Ａ）Ｍｓｔｎ  ｍＲＮＡ発現は、注射３日後に、腓腹筋において、ＰＢＳと比べたΔΔＣｔ計算値に基づいて決定した。（Ｂ）Ｍｓｔｎタンパク質レベルは、投薬の３日後に血清において測定した。＊＊＊、Ｐ＜０．００１（一元配置ＡＮＯＶＡによって）。
【図２】Ｍｓｔｎ−コレステロールｓｉＲＮＡによるミオスタチンｍＲＮＡノックダウン（ＫＤ）のインビボにおける用量漸増法および持続時間である。Ｍｓｔｎ：１１６９コレステロール（「Ｍｓｔｎ−ｃｈｏｌ」）ｓｉＲＮＡは、ｉ．ｖ．注射によって、ＰＢＳおよびプラセボ５非ターゲティングコントロール（５０ｍｐｋ）に加えて、５、１５、および５０ｍｐｋでＣＤ−１マウス（ｎ＝５）において試験した。Ｍｓｔｎ  ｍＲＮＡ発現は、注射後３、７、および２１日目に、腓腹筋（Ａ）、三頭筋（Ｂ）、およびＥＤＬ（Ｃ）において、ＰＢＳと比べたΔΔＣｔ計算値に基づいて決定した。（Ｄ）血清Ｍｓｔｎタンパク質レベルは、示される時点で測定した。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１（一元配置ＡＮＯＶＡによって）。
【図３】長期的なミオスタチンノックダウン（ＫＤ）が、筋肉のサイズの増加に至る。Ｍｓｔｎ：１１６９−コレステロールｓｉＲＮＡ（５０ｍｐｋ）を、ＰＢＳおよびプラセボ５非ターゲティングコントロールに加えて、ＣＤ−１マウス（ｎ＝１２）に静脈内注射した。（Ａ）Ｍｓｔｎ  ｍＲＮＡレベルは、注射後２１日目に、腓腹筋、ＥＤＬ、四頭筋、三頭筋、および脊柱僧帽筋（ｓｐｉｎｏｔｒａｐｅｚｉｕｓ  ｍｕｓｃｌｅ）において、ＰＢＳと比べたΔΔＣｔ計算値に基づいて決定した。（Ｂ）研究の期間に決定した血清Ｍｓｔｎタンパク質レベル。（Ｃ）研究の期間にモニターし、特注のＭＡＴＬＡＢおよびＤｅｆｉｎｉｅｎｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  ＸＤのソフトウェアアルゴリズムを使用して一連の１０枚のマイクロＣＴ画像から定量化した脚の筋肉のサイズ（最大横断面積）。（Ｄ）２１日目の安静にした脚および運動させた脚（インサイチュ筋肉機能アッセイにおいて使用）の腓腹筋重量。（Ｅ）腓腹筋の平均線維横断面積。（Ｆ）腓腹筋における筋線維の平均総数。（Ｇ）腓腹筋における筋線維のサイズ度数分布。（Ｈ）研究の期間に決定した体重測定値。（Ｉ）２０日目のｑＮＭＲ（ＥｃｈｏＭＲＩ）による体組成分析。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１（一元配置ＡＮＯＶＡ（ａ〜ｂ）または二元配置ＡＮＯＶＡ（ｃ〜ｈ）によって）。
【図４】筋疲労曲線の例である。疲労曲線は、筋疲労の３つの段階：初期疲労、後期疲労、および非疲労段階を示す。「初期疲労」は、Ｆｍａｘ−Ｆ０によって示され、典型的にＩＩｂ型線維を表し、ＩＩｂ型線維は、エネルギー源としてクレアチンリン酸を使用する。この段階に、「後期疲労」（Ｆ０−Ｆｍｉｎ）が続き、典型的にＩＩａ／ｘ型線維を表し、ＩＩａ／ｘ型線維は、エネルギー源としてグリコーゲンを使用する。疲労曲線の最終段階は、「非疲労」段階（Ｆｍｉｎ）であり、これは、Ｉ型線維を示し、Ｉ型線維は、エネルギー源として脂肪酸を使用する。
【図５】長期的なミオスタチンノックダウンが、筋肉の機能の変化に至る。Ｍｓｔｎ：１１６９ｓｉＲＮＡ−コレステロールコンジュゲートまたはプラセボ５０−コレステロール非ターゲティングｓｉＲＮＡコントロール（５０ｍｐｋ）を、ＣＤ−１マウス（ｎ＝１２）に静脈内注射した。筋疲労曲線、筋力（Ａ）、または比筋力（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒｃｅ）（Ｂ）を、２１日目／２２日目に実行したインサイチュ筋肉機能アッセイから作成した（合計ｎ＝９）。示される疲労曲線から計算した機能パラメーターを、（Ａ）および（Ｂ）においてそれぞれの曲線の下にプロットする。塗りつぶされたバーは、Ｍｓｔｎ  ｓｉＲＮＡ−コレステロールコンジュゲートおよびプラセボ５−コレステロール治療の間の、特定のパラメーターにおける統計的に有意な変化を示す。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１（一元配置ＡＮＯＶＡ（ａ〜ｂ）または二元配置ＡＮＯＶＡ（ｃ〜ｈ）によって）。
【図６】プラセボ５−ｃｈｏｌおよびＭｓｔｎ：１１６９ｓｉＲＮＡコンジュゲートについての様々なパラメーターに対して標準化した心臓重量測定値である。Ｍｓｔｎ：１１６９ｓｉＲＮＡコンジュゲート（５０ｍｐｋ）を、ＰＢＳおよびプラセボ５コレステロールコンジュゲート非ターゲティングコントロールに加えて、ＣＤ−１マウス（ｎ＝１２）に静脈内注射した。心肥大のサインについて評価するために、Ｍｓｔｎノックダウンの２１日後に、心臓を計量し、様々なパラメーター（すなわち脛骨の長さ、体重、除脂肪量（ｌｅａｎ  ｍａｓｓ）、および筋肉横断面積（ＣＳＡ））に対して標準化した。塗りつぶされたバーは、Ｍｓｔｎ  ｓｉＲＮＡ−コレステロールコンジュゲートおよびプラセボ５−コレステロール治療の間の、特定のパラメーターにおける統計的に有意な変化を示す。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１（一元配置ＡＮＯＶＡ（ａ〜ｂ）または二元配置ＡＮＯＶＡ（ｃ〜ｈ）によって）。
【図７】Ｃｔｎｎｂ１−ｃｈｏｌコンジュゲートである。（Ａ）ＷＴ、ＬＤＬＲ−／−、およびＡｐｏＥ−／−マウスにおけるＣｔｎｎｂ１−ｃｈｏｌコンジュゲートの効能についてのインビボにおける比較。Ｃｔｎｎｂ１−ｃｈｏｌ  ｓｉＲＮＡは、ｉ．ｖ．注射によって１４ｍｐｋの用量でＣＤ−１マウス（ｎ＝３または４）においてスクリーニングした。Ｃｔｎｎｂ１  ｍＲＮＡ発現は、注射３日後に、腓腹筋において、ＰＢＳと比べたΔΔＣｔ計算値に基づいて決定した。＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１（一元配置ＡＮＯＶＡによって）（Ｂ）パッセンジャー鎖の３’または５’末端に単一のコレステロールを付加したＣｔｎｎｂ１−ｃｈｏｌ  ｓｉＲＮＡを、ｉ．ｖ．注射によって、１５ｍｐｋの用量で、ＣＤ−１マウス（ｎ＝５）においてスクリーニングした。Ｃｔｎｎｂ１  ｍＲＮＡ発現を、ＰＢＳおよびプラセボ５非ターゲティングコントロール（３’ｃｈｏｌ）と比較した。ｍＲＮＡ発現は、注射３日後に、腓腹筋において、ＰＢＳと比べたΔΔＣｔ計算値に基づいて決定した。＊＊＊、Ｐ＜０．００１（一元配置ＡＮＯＶＡによって）。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
Ａ．用語および定義
以下の専門用語および定義は、本出願において使用される際に適用される。
【００４４】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、内容が他に明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」への言及は２つ以上の細胞の組み合わせを含む、などである。
【００４５】
任意の濃度範囲、百分率の範囲、比率の範囲または整数範囲は、他に記載されない限り、記載される範囲内の任意の整数の値、および適切な場合にはその分数（例えば、整数の１０分の１および１００分の１）を含むと理解されるべきである。
【００４６】
「約（Ａｂｏｕｔ）」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、数に関連して本明細書で使用される場合、他に規定されない限り、あるいは文脈から他に明らかでない限り、一般的にその数のいずれかの方向（それよりも大きい、またはそれよりも小さい）の５％の範囲内に入る数を含む（このような数が可能な値の１００％を超える場合を除く）と解釈される。範囲が規定される場合、他に規定されない限り、あるいは文脈から他に明らかでない限り、端点はその範囲内に含まれる。
【００４７】
「２’修飾ヌクレオチド」、「２’置換ヌクレオチド」または糖部分の「２’位置」に修飾を有するヌクレオチドという語句は、本明細書で使用される場合、一般的に、糖成分の２’炭素位置にＨまたはＯＨ以外である置換基を含むヌクレオチドを指す。２’修飾ヌクレオチドには、糖環の２つの炭素原子を接続する架橋が糖環の２’炭素および別の炭素を接続する二環式ヌクレオチド；ならびにアリル、アミノ、アジド、チオ、Ｏ−アリル、ＯＣ１〜１０アルキル、−ＯＣＦ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３、２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、またはＯ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）（ここで、各ＲｍおよびＲｎは独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換Ｃ１〜１０アルキルである）などの非架橋２’置換基を有するヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。２’修飾ヌクレオチドはさらに、例えば、糖の他の位置および／または核酸塩基に他の修飾を含み得る。「３’修飾ヌクレオチド」、「３’置換ヌクレオチド」または糖部分の「３’位置」に修飾を有するヌクレオチドという語句は、一般的に、糖成分の３’炭素位置に修飾（置換基を含む）を含むヌクレオチドを指す。
【００４８】
「脱塩基」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。この用語は、一般的に、糖部分の１’位置において、核酸塩基を有さないか、あるいは核酸塩基の代わりに水素原子（Ｈ）または他の非核酸塩基化学基を有する糖部分を指す。例えば、Ａｄａｍｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，９９８，２０３号明細書を参照されたい。一実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は脱塩基部分を含有することができ、ここで、脱塩基部分はリボース、デオキシリボース、またはジデオキシリボース糖である。
【００４９】
「非環式ヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。この用語は、一般的に、非環式リボース糖を有する、例えば、リボースの炭素／炭素結合または炭素／酸素結合のいずれかが独立して、または一緒に、ヌクレオチドに存在しない任意のヌクレオチドを指す。
【００５０】
炭素原子の数が指定されていなければ、「アルキル」という用語は、１〜１０個の炭素原子を含有する分枝状または直鎖の飽和脂肪族炭化水素基を指す。アルキル基は、特定の数の炭素原子を有することができる。例えば、「Ｃ１〜Ｃ１０アルキル」または「Ｃ１〜１０アルキル」などの場合のＣ１〜Ｃ１０は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の炭素を線状または分枝状の配列で有する基を含むと定義される。例えば、「Ｃ１〜Ｃ１０アルキル」は、特に、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｉ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなどを含む。「シクロアルキル」という用語は、指定された数の炭素原子を有する単環式飽和脂肪族炭化水素基を意味する。例えば、「シクロアルキル」は、シクロプロピル、メチル−シクロプロピル、２，２−ジメチル−シクロブチル、２−エチル−シクロペンチル、シクロヘキシルなどを含む。
【００５１】
「アンチセンス領域」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。本発明の方法によって送達されるｓｉＮＡ分子に関して、この用語は、ミオスタチンＲＮＡに対する相補性を有するｓｉＮＡ分子のヌクレオチド配列を指す。さらに、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は、ｓｉＮＡ分子のセンス領域に対する相補性を有する核酸配列を含む。一実施形態では、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は、アンチセンス鎖またはガイド鎖と呼ばれる。
【００５２】
「生分解性」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。この用語は、一般的に、生物系における分解、例えば、酵素分解または化学分解を指す。
【００５３】
「生物系」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。この用語は、一般的に、ヒトまたは動物を含むがこれらに限定されない生物学的起源からの精製または未精製形態の材料を指し、この系は、ＲＮＡｉ活性に必要とされる成分を含む。従って、この語句は、例えば、細胞、組織、対象、もしくは生物体、またはこれらの抽出物を含む。またこの用語は、生物学的起源から再構成された材料も含む。
【００５４】
「平滑末端」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。本発明の核酸分子に関して、この用語は、オーバーハングヌクレオチドを有さない二本鎖ｓｉＮＡ分子の末端を指す。本発明のｓｉＮＡ二本鎖分子は、二本鎖の一方または両方の末端、例えば、アンチセンス鎖の５’端部、センス鎖の５’端部に位置する末端、または二本鎖の両末端などに平滑末端を含むことができる。
【００５５】
「キャップ」（本明細書では「末端キャップ」とも呼ばれる）という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。本発明の例示的な核酸分子に関して、この用語は、本発明の核酸分子の１つまたは複数の末端に取り込まれた化学修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドであり得る部分を指す。これらの末端修飾はエキソヌクレアーゼ分解から核酸分子を保護することができ、核酸分子の細胞内の送達および／または局在化に役立つことができる。キャップは、本発明の核酸分子の鎖の５’末端（５’キャップ）または３’末端（３’キャップ）に存在することができ、あるいは両方の末端に存在することができる。例えば、キャップは、本発明の核酸分子のセンス鎖の５’末端、３’末端、ならびに／または５’および３’末端に存在することができる。さらに、キャップは、本発明の核酸分子のアンチセンス鎖の３’末端に存在することができる。非限定的な例では、５’キャップは、ＬＮＡ；グリセリル；逆位デオキシ脱塩基残基（部分）；４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド；炭素環式ヌクレオチド；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオアート結合；スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−セコヌクレオチド；非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；非環式３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド；３’−３’−逆位ヌクレオチド部分；３’−３’−逆位脱塩基部分；３’−２’−逆位ヌクレオチド部分；３’−２’−逆位脱塩基部分；１，４−ブタンジオールリン酸；３’−ホスホルアミダート；ヘキシルリン酸；アミノヘキシルリン酸；３’−リン酸；３’−ホスホロチオアート；ホスホロジチオアート；または架橋もしくは非架橋メチルホスホナート部分を含むが、これらに限定されない。３’キャップの非限定的な例としては、ＬＮＡ；グリセリル；逆位デオキシ脱塩基残基（部分）；４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド；４’−チオヌクレオチド；炭素環式ヌクレオチド；５’−アミノ−アルキルリン酸；１，３−ジアミノ−２−プロピルリン酸；３−アミノプロピルリン酸；６−アミノヘキシルリン酸；１，２−アミノドデシルリン酸；ヒドロキシプロピルリン酸；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオアート；スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−逆位ヌクレオチド部分；５’−５’−逆位脱塩基部分；５’−ホスホルアミダート；５’−ホスホロチオアート；１，４−ブタンジオールリン酸；５’−アミノ；架橋および／または非架橋５’−ホスホルアミダート；ホスホロチオアートおよび／またはホスホロジチオアート；架橋または非架橋メチルホスホナート；ならびに５’−メルカプト部分が挙げられるが、これらに限定されない（さらなる詳細については、参照によって本明細書中に援用されるＢｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｉｙｅｒ，１９９３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９，１９２５を参照）。一実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、ビニルリン酸５’末端キャップを含有し、ここで、糖環の炭素５は、以下の置換基（＝ＣＨ）−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２を含有する。
【００５６】
「細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。この用語は、本明細書において、その通常の生物学的意味で使用され、多細胞生物全体を指すのではなく、例えば具体的には、ヒトを指さない。細胞は、生物体、例えば、鳥類、植物および哺乳類（例えば、ヒト、雌ウシ、ヒツジ、類人猿、サル、ブタ、イヌ、およびネコなど）内に存在し得る。細胞は体細胞起源または生殖系細胞起源、全能性または多能性、分裂細胞または非分裂細胞であり得る。また細胞は、配偶子もしくは胚、幹細胞、または完全分化細胞に由来することもでき、あるいはこれらを含むこともできる。細胞は筋肉細胞であり得る。
【００５７】
「化学修飾ヌクレオチド」、「修飾ヌクレオチド」、または本明細書に記載されるミオスタチンｓｉＮＡ分子内のヌクレオチドに関して使用される場合の「化学修飾」という語句は、当該技術分野において一般的に知られているような非修飾（または天然）ヌクレオチドの複素環塩基部分、糖および／またはリン酸の化学構造における修飾（すなわち、天然に存在するＲＮＡまたはＤＮＡヌクレオチドと比べて少なくとも１つの修飾）を含有するヌクレオチドを指す。ある実施形態では、これら用語は、特定の生物系において天然に存在するＲＮＡの特定の形態、例えば２’−Ｏ−メチル修飾またはイノシン修飾を指すことができる。修飾ヌクレオチドは、脱塩基ヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオチドは、修飾糖環または糖代替物（ｓｕｇａｒ  ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）を有するヌクレオチドを含む。修飾複素環塩基部分は、本明細書で定義されるような普遍的な塩基、疎水性塩基、乱雑な（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）塩基、サイズ拡大（ｓｉｚｅ−ｅｘｐａｎｄｅｄ）塩基、およびフッ素化塩基を含むが限定はされない。これらの核酸塩基のいくつかは、本明細書において提供されるｓｉＮＡ分子の結合親和性を増大させるために特に有用である。これらには、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含む）が含まれる。修飾ヌクレオシド間結合は、天然に存在するヌクレオシド間結合以外の任意のヌクレオシド間結合を指す。修飾ヌクレオチドの非限定的な例は、本明細書および米国特許出願第１２／０６４，０１４号明細書（米国特許出願公開第２００９０１７６７２５号明細書として公開）に記載されている。
【００５８】
「相補性」または「相補的な」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。これらの用語は、一般的に、従来のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋか、あるいは本明細書に記載される他の非従来型の結合による、１つの核酸配列と別の核酸配列との間の水素結合の形成または存在を指す。本発明の方法によって送達される核酸分子に関して、核酸分子とその相補的配列との結合自由エネルギーは、核酸の関連機能（例えば、ＲＮＡｉ活性）が進行するのに十分である。核酸分子の結合自由エネルギーの決定は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，ＣＳＨ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．ＬＩＩ  ｐｐ．１２３−１３３；Ｆｒｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：９３７３−９３７７；Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：３７８３−３７８５を参照）。完全に相補的とは、核酸配列の全ての隣接残基が第２の核酸配列中の同数の連続残基と水素結合し得ることを意味する。部分的な相補性は、核酸分子内に、種々のミスマッチまたは非塩基対合ヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超えるミスマッチ、非ヌクレオチドリンカー、または非塩基対合ヌクレオチド）を含むことができ、これにより、核酸分子のセンス鎖もしくはセンス領域とアンチセンス鎖もしくはアンチセンス領域との間に、または核酸分子のアンチセンス鎖もしくはアンチセンス領域と対応する標的核酸分子との間に、バルジ、ループ、またはオーバーハングがもたらされ得る。このような部分的な相補性は、包含されるヌクレオチドの総数に応じて、非塩基対合ヌクレオチドの数によって決定される相補性％、例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％などによって表すことができる。このような部分的な相補性は、核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ）がその機能（例えば、配列特異的ＲＮＡｉを媒介する能力）を保持する範囲内で可能である。
【００５９】
「組成物」または「製剤」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているそれらの意味を指す。これらの用語は、一般的に、薬学的に許容可能な担体または希釈剤中で、細胞または対象（例えば、ヒトを含む）の投与（例えば、全身投与）に適した形態であるような組成物または製剤を指す。適切な形態は、使用または侵入経路、例えば、経口、経皮、吸入、または注射にある程度依存する。このような形態は、組成物または製剤が標的細胞（すなわち、負に帯電した核酸の送達が望ましい細胞）に到達するのを妨害してはならない。例えば、血流中に注入された組成物は可溶性でなければならない。他の因子は当該技術分野において既知であり、毒性などの検討事項、および組成物または製剤がその効果を発揮するのを防止する形態が含まれる。本明細書で使用される場合、医薬品製剤には、人間および獣医学的な使用のための製剤が含まれる。「薬学的に許容可能な組成物」または「薬学的に許容可能な製剤」は、本発明の核酸分子の、その所望の活性に最も適した身体の場所への有効な分配を可能にする組成物または製剤を指すことができる。
【００６０】
「コンジュゲート」という用語は、本発明の方法によって送達されるｓｉＮＡ分子に結合した原子または原子群を指す。一般的に、コンジュゲート基は、それが結合した分子の１つまたは複数の特性（薬力学、薬物動態、結合、吸収、細胞分布、細胞取込み、電荷およびクリアランスを含むが、これらに限定されない）を変化させる。コンジュゲート基は、化学分野において日常的に使用され、直接、または任意選択的な連結部分または連結基を介して、親化合物（例えば、ｓｉＮＡ分子など）へ連結される。本発明の方法において使用されるｓｉＮＡコンジュゲートは、コレステロールなどの親油性部分に連結されている、ミオスタチンＲＮＡを標的にするｓｉＮＡ分子を含む。ある実施形態では、親油性部分が、ミオスタチンｓｉＮＡ分子の３’もしくは５’末端ヌクレオチドにまたは内部ヌクレオチドに付加される。本明細書で使用される場合、「コンジュゲート連結基」は、親油性部分をミオスタチンｓｉＮＡ分子に付加するのに使用される任意の原子または原子群を指す。当該技術分野において知られているものなどの連結基または二官能性連結部分は、本発明に適している。
【００６１】
「検出する」または「測定する」という用語は、活性、応答または効果と関連して本明細書で使用される場合、このような活性、応答、または効果を検出または測定するための試験が実施されることを示す。このような検出および／または測定は、ゼロの値を含み得る。従って、検出または測定のための試験が、非活性（ゼロの活性）という知見をもたらしても、活性を検出または測定するステップはそれでも実施されている。
【００６２】
「有効な量」という語句は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。この用語は、一般的に、研究者、獣医、医師または他の臨床医によって探求される細胞、組織、系、動物またはヒトの意図される生物学的応答を誘発し得る分子、化合物または組成物の量を指す（例えば、筋組織または血清において測定されるように、ミオスタチンタンパク質レベルの低下）。「治療的に有効な量」は、一般に、医学的応答を誘発するであろう分子、化合物、または組成物の量を指し、疾患または障害に関連する測定可能なパラメーターが少なくとも２５％低下する場合に所与の臨床治療が有効であると考えられるとすると、その疾患または障害の治療のための薬物の治療的に有効な量は、そのパラメーターの少なくとも２５％の低下をもたらすために必要な量である。
【００６３】
「発現」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。この用語は、一般的に、遺伝子が最終的にタンパク質をもたらすプロセスを指す。発現は、転写、スプライシング、転写後修飾および翻訳を含むが、これらに限定されない。
【００６４】
「遺伝子」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。この用語は、一般的に、ポリペプチドの生成に必要な部分長または全長コード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列を指す。また遺伝子は、核酸配列のＵＴＲまたは非コード領域も含むことができる。また遺伝子は、機能性ＲＮＡ（ｆＲＮＡ）またはノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、例えば、スモールテンポラル（ｓｍａｌｌ  ｔｅｍｐｏｒａｌ）ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびこれらの前駆体ＲＮＡなどもコード化することができる。このようなノンコーディングＲＮＡは、機能性または調節性細胞プロセスに関与するｆＲＮＡまたはｎｃＲＮＡの活性の調節において、ｓｉＮＡ媒介のＲＮＡ干渉のための標的核酸分子としての機能を果たすことができる。従って、疾患につながる異常なｆＲＮＡまたはｎｃＲＮＡ活性は、本発明の方法によるミオスタチン指向性ｓｉＮＡ分子の送達によって調節され得る。また、ｆＲＮＡおよびｎｃＲＮＡを標的化するｓｉＮＡ分子は、遺伝子刷り込み、転写、翻訳、または核酸プロセシング（例えば、アミノ基転移、メチル化など）などの細胞プロセスに介在することによって、対象、生物体または細胞の遺伝子型または表現型を操作または変更するために使用することもできる。「遺伝子」という用語は、本発明の方法によって送達されるｓｉＮＡ分子が直接（すなわち、ｓｉＮＡ分子が、その遺伝子に対して部分的または完全相補性を有するアンチセンス鎖を含む）または間接的（すなわち、ｓｉＮＡ分子が、その遺伝子の発現または活性経路内の遺伝子に対して部分的または完全相補性を有するアンチセンス鎖を含む）に標的化される遺伝子を参照する場合に使用することができる。
【００６５】
「ヘテロアリール」という用語は、本明細書で使用される場合、各環に７個までの原子を有する安定した単環式または二環式環を表し、少なくとも１つの環は芳香族であり、Ｏ、ＮおよびＳからなる群から選択される１〜４個のへテロ原子を含有する。この定義の範囲内のヘテロアリール基には、アクリジニル、カルバゾリル、シンノリニル、キノキサリニル、ピラゾリル、インドリル、ベンゾトリアゾリル、フラニル、チエニル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、ベンゾイミダゾロニル、ベンゾオキサゾロニル、キノリニル、イソキノリニル、ジヒドロイソインドロニル、イミダゾピリジニル、イソインドロニル、インダゾリル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、イソオキサゾリル、インドリル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリジニル、ピリミジニル、ピロリル、テトラヒドロキノリンが含まれるが、これらに限定されない。また「ヘテロアリール」は、任意の窒素含有ヘテロアリールのＮ−オキシド誘導体も含むと理解される。ヘテロアリール置換基が二環式であり、一方の環が非芳香族であるか、あるいはヘテロ原子を含有しない場合、接続はそれぞれ、芳香族環によるか、あるいはヘテロ原子含有環によることが理解される。
【００６６】
「複素環」という用語は、本明細書で使用される場合、Ｏ、ＮおよびＳからなる群から選択される１〜４個のへテロ原子を含有する３員〜１０員芳香族または非芳香族複素環を意味することが意図され、二環式基を含む。「複素環」は、上記のヘテロアリールならびにそのジヒドロおよびテトラヒドロ類似体を含む。「複素環」のさらなる例としては、以下の：アゼチジニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾフラザニル、ベンゾピラゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチオフェニル、ベンゾオキサゾリル、カルバゾリル、カルボリニル、シンノリニル、フラニル、イミダゾリル、インドリニル、インドリル、インドラジニル、インダゾリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、ナフトピリジニル、オキサジアゾリル、オキソオキサゾリジニル、オキサゾリル、オキサゾリン、オキソピペラジニル、オキソピロリジニル、オキソモルホリニル、イソオキサゾリン、オキセタニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリドピリジニル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノキサリニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロイソキノリニル、テトラゾリル、テトラゾロピリジル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、１，４−ジオキサニル、ヘキサヒドロアゼピニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピリジン−２−オニル、ピロリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ジヒドロベンゾイミダゾリル、ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロベンゾチオフェニル、ジヒドロベンゾオキサゾリル、ジヒドロフラニル、ジヒドロイミダゾリル、ジヒドロインドリル、ジヒドロイソオキサゾリル、ジヒドロイソチアゾリル、ジヒドロオキサジアゾリル、ジヒドロオキサゾリル、ジヒドロピラジニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロピリミジニル、ジヒドロピロリル、ジヒドロキノリニル、ジヒドロテトラゾリル、ジヒドロチアジアゾリル、ジヒドロチアゾリル、ジヒドロチエニル、ジヒドロトリアゾリル、ジヒドロアゼチジニル、ジオキシドチオモルホリニル、メチレンジオキシベンゾイル、テトラヒドロフラニル、およびテトラヒドロチエニル、ならびにこれらのＮ−オキシドが挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロシクリル置換基の接続は、炭素原子またはヘテロ原子によって生じ得る。
【００６７】
「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」などのその任意の形態）、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（および「有する（ｈａｓ）」または「有する（ｈａｖｅ）」などのその任意の形態）、または「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（およびその任意の形態（「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」））という用語は包括的およびオープンエンドであり、記載されていない付加的な要素または方法ステップを排除しない。
【００６８】
「阻害する」、「下方制御する」、または「低減する」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。本発明の方法によって送達されるｓｉＮＡ分子に関して、この用語は、一般的に、遺伝子の発現、または１つもしくは複数のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットをコードするＲＮＡ分子のレベル、または１つもしくは複数のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットの活性が、ｓｉＮＡが存在しない場合に観察されるレベルよりも低くなることを指す。下方制御は、ＲＮＡｉに媒介される切断などの転写後サイレンシングと関連することができる。
【００６９】
「間欠性」または「間欠的」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。これら用語は、一般的に、規則的または不規則的な間隔で定期的に停止および開始することを指す。
【００７０】
「ヌクレオシド間結合」、「ヌクレオシド間リンカー」、「ヌクレオシド間連結基」、「ヌクレオチド間結合」、「ヌクレオチド間リンカー」または「ヌクレオチド間連結基」という用語は本明細書では互換的に使用され、当該技術分野において知られているように、２つのヌクレオシド（すなわち、複素環塩基部分および糖部分）単位の間の任意のリンカーまたは結合を指し、例えば、リン酸、リン酸の類似体、ホスホン酸、グアニジウム、ヒドロキシルアミン、ヒドロキシルヒドラジニル、アミド、カルバミン酸、アルキル、および置換されアルキル結合を含むが、これらに限定されない。ヌクレオシド間結合は、核酸分子の骨格を構成する。１つの態様では、ｓｉＮＡ分子のヌクレオチドは、第１のヌクレオチドの糖の３’炭素と、第２のヌクレオチドの糖部分との間の結合（本明細書では、３’ヌクレオシド間結合と称される）を通して、連続したヌクレオチドに連結され得る。３’−５’ヌクレオシド間結合は、本明細書で使用される場合、２つの連続したヌクレオシド単位を連結するヌクレオシド間結合を指し、ここで、結合は、第１のヌクレオシドの糖部分の３’炭素と、第２のヌクレオシドの糖部分の５’炭素との間である。別の態様では、ｓｉＮＡ分子のヌクレオチドは、第１のヌクレオチドの糖の２’炭素と、第２のヌクレオチドの糖部分との間の結合（本明細書では、２’ヌクレオシド間結合と称される）を通して、連続したヌクレオチドに連結され得る。２’−５’ヌクレオシド間結合は、本明細書で使用される場合、２つの連続したヌクレオシド単位を連結するヌクレオシド間結合を指し、ここで、結合は、第１のヌクレオシドの糖部分の２’炭素と、第２のヌクレオシドの糖部分の５’炭素との間である。
【００７１】
「リンカー」または「スペーサー」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているそれらの意味を指す。一般に、それらは、構成成分を連結または結合する任意の分子を指す。本発明の場合には、リンカーまたはスペーサーは、ミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートを形成するために親油性分子にミオスタチンｓｉＮＡ分子を結合するために使用されてもよい。リンカーは、核酸または非核酸ベースのリンカーであり得る。「生分解性リンカー」という用語は、ｓｉＮＡ分子を親油性部分に接続するように設計され、生物系における分解の影響を受けやすい任意選択のリンカー分子を指す。
【００７２】
動物に関しての「家畜」という用語は、食品、繊維、および労働力などの産物を産生するために農業環境において育てられる、家畜化された動物、半家畜化された動物、または捕獲された野生動物を指す。家畜動物は、ウシ、ブタ、家禽（例えばニワトリ、シチメンチョウ）、ヒツジ、バイソン、ヤギ、およびその他同種のものを含む。
【００７３】
「定量吸入器」または「ＭＤＩ」という語句は、缶、缶を覆う固定キャップ、およびキャップ内に位置する製剤計量バルブを含むユニットを指す。ＭＤＩシステムは、適切なチャネリングデバイスを含む。適切なチャネリングデバイスは、例えば、バルブアクチュエータおよび円筒形または円錐形状の通路を含み、これを通して、薬剤は、充満されたキャニスターから計量バルブによって患者の鼻または口へ送達されることが可能である（マウスピースアクチュエータなど）。
【００７４】
「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。この用語は、一般的に、ＲＮＡ切断、翻訳抑制／阻害または異質染色質サイレンシングのいずれかによって標的メッセンジャーＲＮＡの発現を制御する低分子ノンコーディングＲＮＡを指す（例えば、Ａｍｂｒｏｓ，２００４，Ｎａｔｕｒｅ，４３１，３５０−３５５；Ｂａｒｔｅｌ，２００４，Ｃｅｌｌ，１１６，２８１−２９７；Ｃｕｌｌｅｎ，２００４，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．，１０２，３−９；Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，５，５２２−５３１；Ｙｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｇｅｎｅ，３４２，２５−２８；およびＳｅｔｈｕｐａｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，ＲＮＡ，１２：１９２−１９７を参照）。ＲＮＡ干渉の現象は、ｍｉＲＮＡの内因的に誘発される遺伝子サイレンシング効果を含む。本明細書で使用される場合、「マイクロＲＮＡ模倣物」は、マイクロＲＮＡの配列と少なくとも部分的に同一である配列を有するｓｉＮＡ分子を指す。ある実施形態では、マイクロＲＮＡ模倣物は、マイクロＲＮＡのマイクロＲＮＡシード領域を含む。ある実施形態では、マイクロＲＮＡ模倣物は、２つ以上の標的核酸の翻訳を調節する。
【００７５】
「調節する」または「調節」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。本発明の方法によって送達される核酸分子に関して、この用語は、遺伝子の発現、または１つもしくは複数のＲＮＡ分子（コーディングまたはノンコーディング）のレベル、または１つもしくは複数のＲＮＡ分子もしくはタンパク質もしくはタンパク質サブユニットの活性を、調節をもたらす分子の非存在下で観察されるよりも発現レベルまたは活性が大きくまたは小さくなるように、上方制御または下方制御する場合を指す。例えば、「調節する」という用語は、例えば遺伝子発現について、いくつかの実施形態では阻害を指すことができ、他の実施形態では増強または上方制御を指すことができる。
【００７６】
「筋細胞」または「筋組織」という語句は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているそれらの意味を指す。それらは、任意の種類の筋肉に由来する細胞または細胞群を指す（例えば消化管、膀胱、血管、または心組織由来の例えば骨格筋および平滑筋）。筋芽細胞、筋細胞、筋管、心筋細胞、および心筋芽細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｂｌａｓｔ）などのそのような筋細胞は、分化していても、未分化であってもよい。
【００７７】
本明細書において使用される「ミオスタチンｓｉＮＡ分子」または「ミオスタチンｓｉＮＡ」という語句は、ミオスタチン遺伝子を標的にするｓｉＮＡ分子を指す。本明細書において使用される「ミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲート」という語句は、ミオスタチン遺伝子を標的にし、親油性部分に連結されるｓｉＮＡ分子を指す。
【００７８】
「非塩基対合」という語句は、二本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖またはセンス領域と、アンチセンス鎖またはアンチセンス領域との間で塩基対合されていないヌクレオチドを指す。非塩基対合ヌクレオチドは、例えば、ミスマッチ、オーバーハング、および一本鎖ループを含むことができるが、限定されない。
【００７９】
「非ヌクレオチド」という用語は、例えば、限定されないが脱塩基部分またはアルキル鎖などの、１つまたは複数のヌクレオチド単位の代わりにポリヌクレオチド鎖に取り込むことができる任意の基または化合物を指す。この基または化合物は、一般的に認識されるヌクレオチド塩基（例えば、アデノシン、グアニン、シトシン、ウラシルまたはチミンなど）を含有せず、従って１’位に核酸塩基がないという点で「脱塩基」である。
【００８０】
「核酸塩基」という用語は、本明細書では、ヌクレオチドの複素環塩基部分を指すために使用される。核酸塩基は天然に存在していてもよく、あるいは修飾されてもよい。ある実施形態では、核酸塩基は、別の核酸の塩基と水素結合をすることができる任意の原子または原子群を含み得る。
【００８１】
「ヌクレオチド」という用語は、当該技術分野において一般的に認識されるように使用される。ヌクレオチドは、一般的に、複素環塩基部分（すなわち、核酸塩基）、糖、およびヌクレオシド間結合（例えば、リン酸）を含む。塩基は、当該技術分野において周知であるように、天然塩基（標準）、修飾塩基、または塩基類似体であり得る。このような塩基は、一般的に、ヌクレオチド糖部分の１’位に位置する。さらに、ヌクレオチドは、糖、ヌクレオシド間結合、および／または塩基部分において修飾されていなくても修飾されていてもよい（互換的に、ヌクレオチド類似体、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、非標準ヌクレオチドなどとも称される；例えば、米国特許出願第１２／０６４，０１４号明細書（米国特許出願公開第２００９０１７６７２５号明細書として公開）を参照）。天然に存在するヌクレオシド間結合は、３’から５’へのホスホジエステル結合（本明細書では、３’−５’ホスホジエステル結合とも称される）を指す。
【００８２】
「オーバーハング」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。本発明の方法によって送達される例示的な二本鎖核酸分子に関して、この用語は、一般的に、二本鎖核酸分子の２本の鎖の間で塩基対合されていないヌクレオチド配列の末端部分を指す。オーバーハングは、存在する場合には、通常ｓｉＮＡ二本鎖の一方または両方の鎖の３’末端にある。
【００８３】
「薬学的に許容可能な担体または希釈剤」という語句は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。この語句は、一般的に、動物などの対象への投与で使用するのに適した任意の物質を指す。ある実施形態では、薬学的に許容可能な担体または希釈剤は、無菌生理食塩水である。ある実施形態では、このような無菌生理食塩水は、医薬品グレードの生理食塩水である。
【００８４】
「ホスホロチオアート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）」という用語は、酸素原子の代わりに１つまたは複数の硫黄原子を含むヌクレオシド間リン酸結合を指す。従って、ホスホロチオアートという用語は、ホスホロチオアートおよびホスホロジチオアートヌクレオシド間結合の両方を指す。
【００８５】
「リボヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。この用語は、一般的に、β−Ｄ−リボフラノース部分の第２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを指す。
【００８６】
「ＲＮＡ」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。一般的に、ＲＮＡという用語は、少なくとも１つのリボフラノシド部分を含む分子を指す。この用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離ＲＮＡ、例えば、部分精製ＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え産生ＲＮＡ、ならびに１つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または変更によって天然に存在するＲＮＡとは異なる改変ＲＮＡを含むことができる。このような改変は、例えば、ｓｉＮＡ分子の末端への、あるいは内部での（例えばＲＮＡの１つまたは複数のヌクレオチドにおける）、非ヌクレオチド材料の付加を含むことができる。本発明の核酸分子内のヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオチドまたは化学的に合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドも含むことができる。これらの改変ＲＮＡは、類似体または天然に存在するＲＮＡの類似体と呼ばれることもある。
【００８７】
「ＲＮＡ干渉」という語句または「ＲＮＡｉ」という用語は、通常、特異的標的ＲＮＡの破壊を引き起こすことによって細胞における遺伝子発現を阻害または下方制御する、当該技術分野において一般的に知られている生物学的プロセスを指し、配列特異的核酸分子（例えば、低分子干渉核酸分子）によって媒介される（例えば、Ｚａｍｏｒｅ  ａｎｄ  Ｈａｌｅｙ，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９，１５１９−１５２４；Ｖａｕｇｈｎ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｅｎｓｓｅｎ，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９，１５２５−１５２６；Ｚａｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３；Ｂａｓｓ，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４２８−４２９；Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４−４９８；およびＫｒｅｕｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，国際ＰＣＴ公開国際公開第００／４４８９５号パンフレット；Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，国際ＰＣＴ公開国際公開第０１／３６６４６号パンフレット；Ｆｉｒｅ，国際ＰＣＴ公開国際公開第９９／３２６１９号パンフレット；Ｐｌａｅｔｉｎｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，国際ＰＣＴ公開国際公開第００／０１８４６号パンフレット；Ｍｅｌｌｏ  ａｎｄ  Ｆｉｒｅ，国際ＰＣＴ公開国際公開第０１／２９０５８号パンフレット；Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ−Ｄｅｐａｉｌｌｅｔｔｅ，国際ＰＣＴ公開国際公開第９９／０７４０９号パンフレット；およびＬｉ  ｅｔ  ａｌ．，国際ＰＣＴ公開国際公開第００／４４９１４号パンフレット；Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８−１８１９；Ｖｏｌｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３−１８３７；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５−２２１８；およびＨａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２−２２３７；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ  ａｎｄ  Ｚａｍｏｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２０５６−６０；ＭｃＭａｎｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，ＲＮＡ，８，８４２−８５０；Ｒｅｉｎｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｇｅｎｅ＆Ｄｅｖ．，１６，１６１６−１６２６；およびＲｅｉｎｈａｒｔ＆Ｂａｒｔｅｌ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３１を参照）。さらに、ＲＮＡｉという用語は、転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、転写阻害、またはエピジェネティクスなどの配列特異的なＲＮＡ干渉を記述するために使用される他の用語と均等であることを意味する。例えば、本発明のｓｉＮＡ分子を用いて、転写後レベルまたは転写前レベルのいずれかにおいて遺伝子をエピジェネティックにサイレンシングすることができる。非限定的な例では、本発明の方法によって送達されるｓｉＮＡ分子による遺伝子発現のエピジェネティックな調節は、遺伝子発現を変更するためのクロマチン構造またはメチル化パターンのｓｉＮＡ媒介の修飾に起因し得る（例えば、Ｖｅｒｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３，６７２−６７６；Ｐａｌ−Ｂｈａｄｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３，６６９−６７２；Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８−１８１９；Ｖｏｌｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３−１８３７；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５−２２１８；およびＨａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２−２２３７を参照）。本発明の方法によって送達されるｓｉＮＡ分子による遺伝子発現の調節は、ＲＩＳＣによるＲＮＡ（コーディングまたはノンコーディングＲＮＡのいずれか）のｓｉＮＡ媒介の切断に起因し得る。
【００８８】
「センス領域」という語句は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。本明細書に記載されるｓｉＮＡ分子に関して、この用語は、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域に対する相補性を有するｓｉＮＡ分子のヌクレオチド配列を指す。さらに、ｓｉＮＡ分子のセンス領域は、標的核酸配列との相同性または配列同一性を有する核酸配列を含むことができる。一実施形態では、ｓｉＮＡ分子のセンス領域は、センス鎖またはパッセンジャー鎖とも呼ばれる。
【００８９】
「低分子干渉核酸」、「ｓｉＮＡ」、「ｓｉＮＡ分子」、「低分子干渉ＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」、「低分子干渉核酸分子」「低分子干渉オリゴヌクレオチド分子」または「化学修飾された低分子干渉核酸分子」という語句は、配列特異的な形でＲＮＡ干渉（「ＲＮＡｉ」）を媒介することによって遺伝子発現またはウィルス複製を阻害または下方制御することができる任意の核酸分子を指す。これらの用語は、個々の核酸分子、複数のこのような核酸分子、またはこのような核酸分子のプールをいずれも指すことができる。ｓｉＮＡは、自己相補的なセンスおよびアンチセンス鎖または領域を含む対称または非対称の二本鎖核酸分子でよく、ここで、アンチセンス鎖／領域は、標的核酸分子中のヌクレオチド配列またはその一部に対して相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス鎖／領域は、標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を含む。対称二本鎖は、同じ数のヌクレオチドをそれぞれが含むセンスおよびアンチセンス領域を含むｓｉＮＡ分子を指す。非対称二本鎖は、アンチセンス領域と、アンチセンス領域と塩基対合して二本鎖を形成するために十分に相補的なヌクレオチドをセンス領域が有する範囲で、アンチセンス領域よりも少ないヌクレオチドを含むセンス領域とを含むｓｉＮＡ分子を指す。例えば、非対称二本鎖ｓｉＮＡ分子は、細胞内またはインビトロ系でＲＮＡｉを媒介するのに十分な長さ（例えば、約１５〜約３０）を有するアンチセンス領域と、アンチセンス領域に相補的である約３〜約２５ヌクレオチドを有するセンス領域とを含むことができる。例として、非対称二本鎖ヘアピンｓｉＮＡ分子は、約４〜約１２ヌクレオチドを含むループ領域を含むこともできる。非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子のループ部分は、本明細書に記載されるようなヌクレオチド、非ヌクレオチド、リンカー分子、またはコンジュゲート分子を含むことができる。またｓｉＮＡ分子は、標的核酸分子内のヌクレオチド配列の一部に相補的なヌクレオチド配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含むこともできる（例えば、このようなｓｉＮＡ分子が標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列がｓｉＮＡ分子内に存在することを必要としない場合）。一本鎖ｓｉＮＡ分子は、ＲＮＡｉ機構によって機能するＲＮＡｉ分子である。
【００９０】
「対象」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。本明細書において使用されるように、用語は、一般に、記載されるｓｉＮＡコンジュゲートおよびその組成物を投与することができる生物体を指す。用語「対象」は、ヒトおよび非ヒト動物を含むことが意図される。非ヒト動物は、脊椎動物、例えば、非ヒト霊長動物、ヒツジ、イヌ、ネコ、雌ウシ、ウマ、ニワトリ、両生動物、ウサギ、ハムスター、モルモット、家畜、および爬虫類動物などの哺乳動物および非哺乳動物を全て含む。対象は、本発明の方法に従ってｓｉＮＡコンジュゲートの投与に適した候補として以前に同定された生物体とすることができる。例えば、対象は、筋骨格系疾患と診断されたヒトなどの哺乳動物とすることができ、本明細書において記載されるｓｉＮＡコンジュゲートによる治療が、陽性の臨床上の転帰をもたらす可能性を有すると考えられる。用語「対象」はまた、卵内に含有されるニワトリの胚を含む、胚を含むように意図される。
【００９１】
「糖部分」という用語は、天然または修飾された糖環または糖代替物を意味する。
【００９２】
「糖代替物」という用語は、一般的に、天然に存在するヌクレオチドのフラノース環を置き換えることができる構造を指す。ある実施形態では、糖代替物は、非フラノース（または４’置換されたフラノース）環または環系または開放系である。このような構造は、６員環などの天然フラノース環に対する単純な変化を含むか、あるいはペプチド核酸において使用される非環系と同様、より複雑であってもよい。糖代替物には、モルホリノ、シクロヘキセニルおよびシクロヘキシトールが含まれるが限定されない。糖代替物基を有するほとんどのヌクレオチドにおいて、複素環塩基部分は、一般的に、ハイブリダイゼーションが可能であるように保持される。
【００９３】
「全身投与」という語句は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。この用語は、一般的に、インビボにおいて血流中の薬物の全身性の吸収または蓄積の後、全身にわたる分配をもたらす方法で分子、薬物、薬剤、または化合物を投与する方法または技術を指す。全身投与は、胚内投与を含む。
【００９４】
「標的」細胞タンパク質、ペプチド、またはポリペプチド、またはポリヌクレオチドもしくは核酸（例えば、「標的ＤＮＡ」、「標的ＲＮＡ」、「標的核酸」など）という用語は、本明細書で使用される場合、それぞれ、ｓｉＮＡ分子がその発現を阻害または下方制御可能であり得るタンパク質または核酸を指す。ある実施形態では、標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ、ｐｒｉ−マイクロＲＮＡ、ｐｒｅ−マイクロＲＮＡ、成熟マイクロＲＮＡ、プロモーター指向性（ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）ＲＮＡ、または天然アンチセンス転写物である。本明細書で使用される場合、「標的ｍＲＮＡ」は、タンパク質をコードする事前選択されたＲＮＡ分子を指す。本明細書で使用される場合、「標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡ」は、ｍＲＮＡに完全にはプロセッシングされていない事前選択ＲＮＡ転写物を指す。特に、ｐｒｅ−ＲＮＡは、１つまたは複数のイントロンを含む。本明細書で使用される場合、「標的マイクロＲＮＡ」は、１つまたは複数のタンパク質またはこのようなノンコーディング分子の前駆体の発現を調節する、約１８〜３０核酸塩基の長さの事前選択ノンコーディングＲＮＡ分子を指す。本明細書で使用される場合、「標的ノンコーディングＲＮＡ」は、タンパク質を産生するように翻訳されない事前選択ＲＮＡ分子を指す。特定のノンコーディングＲＮＡは、発現の制御に関与する。
【００９５】
「標的部位」、「標的配列」および「標的核酸部位」という語句は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。この用語は、一般的に、例えば、標的配列に対して相補的である配列をそのアンチセンス領域内に含有するｓｉＮＡ分子によって媒介される切断のために「標的化される」標的核酸（例えば、ＲＮＡ）内の配列を指す。
【００９６】
「普遍的な塩基」という語句は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。普遍的な塩基という用語は、一般的に、天然ＤＮＡ／ＲＮＡ塩基のそれぞれと、これらをほとんどまたは全く区別することなく塩基対を形成するヌクレオチド塩基類似体を指す。普遍的な塩基の非限定的な例としては、当該技術分野で知られているように、Ｃ−フェニル、Ｃ−ナフチルおよび他の芳香族誘導体、イノシン、アゾールカルボキサミド、ならびにニトロアゾール誘導体、例えば３−ニトロピロール、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、および６−ニトロインドールなどが挙げられる（例えば、Ｌｏａｋｅｓ，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２９，２４３７−２４４７を参照）。
【００９７】
「上方制御」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。本明細書に記載される核酸分子に関して、この用語は、遺伝子の発現、または１つもしくは複数のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットをコードするＲＮＡ分子もしくは均等なＲＮＡ分子のレベル、または１つもしくは複数のＲＮＡ、タンパク質もしくはタンパク質サブユニットの活性のいずれかが、本発明の核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ）が存在しない場合に観察されるレベルよりも高くなることを指す。特定の場合には、ｓｉＮＡ分子による遺伝子発現の上方制御または促進は、不活性または減弱化分子の存在下で観察されるレベルよりも高い。他の場合には、ｓｉＮＡ分子による遺伝子発現の上方制御または促進は、例えば、スクランブル配列またはミスマッチを有するｓｉＮＡ分子の存在下で観察されるレベルよりも高い。さらに他の場合には、本発明の核酸分子による遺伝子発現の上方制御または促進は、核酸分子の非存在下よりも存在下の方が大きい。いくつかの例では、遺伝子発現の上方制御または促進は、上方制御すべき対象の遺伝子の発現を下方制御、阻害、またはサイレンシングする、コーディングまたはノンコーディングＲＮＡ標的のＲＮＡｉ媒介切断またはサイレンシングなどの、ＲＮＡ媒介の遺伝子サイレンシングの阻害に関連する。遺伝子発現の下方制御は、例えば、負のフィードバックまたは拮抗作用などを介してコーディングＲＮＡまたはそのコード化タンパク質によって誘発され得る。遺伝子発現の下方制御は、例えば、翻訳阻害、クロマチン構造、メチル化、ＲＩＳＣに媒介されるＲＮＡ切断、または翻訳阻害を介して遺伝子の発現をサイレンシングすることによって、例えば、対象の遺伝子に対する調節制御を有するノンコーディングＲＮＡによって誘発され得る。従って、対象の遺伝子を下方制御、抑制、またはサイレンシングする標的の阻害または下方制御は、治療用途に向けて対象の遺伝子の発現を上方制御するために使用することができる。
【００９８】
「ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、当該技術分野において一般的に認められているその意味を指す。ベクターという用語は、一般的に、１つまたは複数の核酸分子を送達するために使用される任意の核酸および／またはウィルスベースの発現系または技術を指す。
【００９９】
Ｂ．ミオスタチンｓｉＮＡ分子
ミオスタチンは、筋肉成長の調節に関与する既知の増殖因子である。特に、ミオスタチンは、増殖因子のＴＧＦ−βファミリーのメンバーであり、筋発生の強力な負の調節因子である。ミオスタチンについてのノックアウトマウスは、全身にわたって筋肉量を大幅に増加させ、通常のマウスよりもおよそ３０％体重が重く、筋線維過形成および肥大により、個々の筋肉の重量において２〜３倍の増加を示す。ミオスタチンにおける自然の突然変異は、Ｂｅｌｇｉａｎ  ＢｌｕｅおよびＰｉｅｄｍｏｎｔｅｓｅのウシの品種など、「筋肉倍増（ｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｓｃｌｅｄ）」表現型の原因となるとして同定された。ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ，Ａ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：８３−９２；ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ，Ａ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１２４５７−１２４６１；Ｋａｍｂａｄｕｒ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：９１０−９１６；Ｇｒｏｂｅｔ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１７：７１−７４）を参照されたい。
【０１００】
本発明の方法によって送達されるｓｉＮＡ分子は、ミオスタチン遺伝子を標的にするように設計される。ｓｉＮＡ分子は、例えばヒト、ウシ、ブタ、家禽、またはマウスを含む、多くの適した動物に由来するミオスタチン遺伝子配列に向けられてもよい。例えば、本発明の方法によって送達されるミオスタチンｓｉＮＡ分子は、表１において示されるミオスタチンｍＲＮＡを標的にするように設計されてもよい。
【０１０１】
【表１】
0006672156.tif 000002
【０１０２】
本発明は、ミオスタチン遺伝子を標的にする一本鎖または二本鎖ｓｉＮＡ分子、その親油性コンジュゲート、およびインビボにおいてそれを送達し、使用する方法を特徴づけ、前記送達されたｓｉＮＡ分子がＲＮＡ干渉を媒介することができる。ミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートのｓｉＮＡ部分のアンチセンス鎖（またはガイド鎖）は、ミオスタチン標的核酸に対して相補的である。コンジュゲートのｓｉＮＡ分子部分は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を含むがこれらに限定されない、異なるオリゴヌクレオチド形態をとることができる。ある実施形態では、ｓｉＮＡ分子が、一本鎖である。他の実施形態では、ｓｉＮＡ分子が、二本鎖分子であり、前記二本鎖分子が、アンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。ミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲート内に含まれるミオスタチンｓｉＮＡ分子は、ミオスタチン標的核酸の発現を調整する。一実施形態では、ｓｉＮＡ分子が、ミオスタチン標的核酸の発現を阻害または低減する。一態様では、ミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートのｓｉＮＡ分子部分が、一本鎖であり、一本のオリゴヌクレオチド鎖が、ミオスタチン遺伝子発現に関連するミオスタチン核酸の少なくとも１つの部分に対して相補的である配列を含む。本開示の目的のために、一本鎖ｓｉＮＡ分子の一本鎖はアンチセンス鎖と称される。
【０１０３】
別の態様では、ミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートのｓｉＮＡ分子部分が、二本鎖ｓｉＮＡ分子であり、二本鎖ｓｉＮＡ分子が、センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖を含む。アンチセンス鎖は、ミオスタチン遺伝子発現に関連するミオスタチン標的核酸の少なくとも一部に対して相補的である配列を含み、センス鎖は、アンチセンス鎖に対して相補的である。二本鎖ｓｉＮＡ分子は、対称でも非対称でもよく、かつ相補的である２本の異なる別々の鎖、すなわち２つの一本鎖オリゴヌクレオチドを含むこともでき、あるいは２つの相補的な部分、例えば、センス領域およびアンチセンス領域（これに関連して、本明細書ではそれぞれセンス鎖およびアンチセンス鎖とも呼ばれるであろう）が塩基対合され、例えば短いヘアピンポリヌクレオチドをもたらす１つまたは複数の一本鎖「ヘアピン」領域（すなわち、ループ）によって共有結合された１つの一本鎖オリゴヌクレオチドを含むこともできる。リンカーは、ポリヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーであり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは非ヌクレオチドリンカーである。いくつかの実施形態では、ヘアピンｓｉＮＡ分子は１つまたは複数のループモチーフを含有しており、ｓｉＮＡ分子のループ部分の少なくとも１つは生分解性である。例えば、短ヘアピンｓｉＮＡ分子は、インビボでのｓｉＮＡ分子のループ部分の分解が、３’末端オーバーハング、例えば、１、２、３または４ヌクレオチドを含む３’末端ヌクレオチドオーバーハングなどを有する二本鎖ｓｉＮＡ分子を生じることができるように設計することができる。
【０１０４】
記載されるコンジュゲートのｓｉＮＡ分子部分のアンチセンス鎖は、ミオスタチン標的核酸配列の一部に対して相補的である。いくつかの実施形態では、標的核酸は、ミオスタチン標的ｍＲＮＡ、ミオスタチン標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、ミオスタチン標的マイクロＲＮＡ、およびミオスタチン標的ノンコーディングＲＮＡから選択される。ある実施形態では、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖は、ミオスタチン標的核酸配列に対して１００％の相補性である領域を含み、１００％の相補性の領域は少なくとも１０核酸塩基である。ある実施形態では、１００％の相補性の領域は少なくとも１５核酸塩基である。ある実施形態では、１００％の相補性の領域は少なくとも２０核酸塩基である。ある実施形態では、１００％の相補性の領域は少なくとも２５核酸塩基である。ある実施形態では、１００％の相補性の領域は少なくとも３０核酸塩基である。ある実施形態では、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖は、ミオスタチン標的核酸配列に対して少なくとも８５％相補的である。ある実施形態では、アンチセンス鎖は、ミオスタチン標的核酸配列に対して少なくとも９０％相補的である。ある実施形態では、アンチセンス鎖は、ミオスタチン標的核酸配列に対して少なくとも９５％相補的である。ある実施形態では、アンチセンス鎖は、ミオスタチン標的核酸配列に対して少なくとも９８％相補的である。ある実施形態では、アンチセンス鎖は、ミオスタチン標的核酸配列に対して１００％相補的である。相補的なヌクレオチドは、隣接ヌクレオチドであってもそうでなくてもよい。一実施形態では、相補的なヌクレオチドは隣接ヌクレオチドである。
【０１０５】
ある実施形態では、本発明の方法に従ってインビボにおいて投与されるミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートのｓｉＮＡ分子部分が、ミオスタチン標的核酸のヌクレオチド配列に対して相補的であるアンチセンス鎖中に、約１５〜約３０の間（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）のヌクレオチドを有する。ある実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、ミオスタチン標的配列に対する配列相補性を有する少なくとも１５のヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含む。ある実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、ミオスタチン標的配列に対する配列相補性を有する少なくとも１８のヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含む。ある実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、ミオスタチン標的配列に対する配列相補性を有する少なくとも１９のヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含む。ある実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、ミオスタチン標的配列に対する配列相補性を有する少なくとも２０のヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含む。ある実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、ミオスタチン標的配列に対する配列相補性を有する少なくとも２１のヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含む。本発明のこの態様の特定の実施形態では、相補的なヌクレオチドは隣接ヌクレオチドである。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートに含まれる二本鎖ｓｉＮＡ分子が、オーバーハング領域はいずれも除外して、ｓｉＮＡ分子のセンス鎖またはセンス領域とアンチセンス鎖またはアンチセンス領域との間に完全な相補性を有する。
【０１０７】
さらに他の実施形態では、二本鎖ｓｉＮＡ分子はｓｉＮＡ分子のセンス鎖またはセンス領域とアンチセンス鎖またはアンチセンス領域との間に、部分的な相補性（すなわち、１００％未満の相補性）を有する。従って、いくつかの実施形態では、二本鎖核酸分子は、他方の鎖（例えば、アンチセンス鎖）のヌクレオチドに対して相補的である一方の鎖（例えば、センス鎖）中に約１５〜約３０の間（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）のヌクレオチドを有する。ある実施形態では、二本鎖ｓｉＮＡ分子は、分子のアンチセンス領域のヌクレオチドに対して相補的であるセンス領域に１７ヌクレオチドを有する。ある実施形態では、二本鎖ｓｉＮＡ分子は、分子のアンチセンス領域のヌクレオチドに対して相補的であるセンス領域に１８ヌクレオチドを有する。ある実施形態では、二本鎖ｓｉＮＡ分子は、分子のアンチセンス領域のヌクレオチドに対して相補的であるセンス領域に１９ヌクレオチドを有する。ある実施形態では、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子は、分子のアンチセンス領域のヌクレオチドに対して相補的であるセンス領域に２０ヌクレオチドを有する。本発明のこの態様の特定の実施形態では、鎖間の相補的なヌクレオチドは隣接ヌクレオチドである。
【０１０８】
対称であるｓｉＮＡ分子について、各鎖、センス（パッセンジャー）鎖およびアンチセンス（ガイド）鎖は、独立して、約１５〜約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドの長さである。一般的に、対称ｓｉＮＡ分子の各鎖は、約１９〜２４（例えば、約１９、２０、２１、２２、２３または２４）ヌクレオチドの長さである。ある実施形態では、対称ｓｉＮＡ分子の各鎖は、１９ヌクレオチドの長さである。ある実施形態では、対称ｓｉＮＡ分子の各鎖は、２０ヌクレオチドの長さである。ある実施形態では、対称ｓｉＮＡ分子の各鎖は、２１ヌクレオチドの長さである。ある実施形態では、対称ｓｉＮＡ分子の各鎖は、２２ヌクレオチドの長さである。
【０１０９】
非対称のｓｉＮＡ分子について、分子のアンチセンス鎖は、約１５〜約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドの長さであり、センス領域は、約３〜約２５（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５）ヌクレオチドの長さである。一般的に、非対称ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖は、約１９〜２４（例えば、約１９、２０、２１、２２、２３または２４）ヌクレオチドの長さである。一実施形態では、非対称ｓｉＮＡ分子のセンス鎖は、約１９〜２４（例えば、約１９、２０、２１、２２、２３または２４）ヌクレオチドの長さである。
【０１１０】
さらに他の実施形態では、本明細書において記載されるミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートに含まれるｓｉＮＡ分子はヘアピンｓｉＮＡ分子を含み、ｓｉＮＡ分子は、約２５〜約７０（例えば、約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、４０、４５、５０、５５、６０、６５、または７０）ヌクレオチドの長さである。
【０１１１】
ある実施形態では、本明細書に記載されるミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートで構成されるｓｉＮＡ分子は、ミオスタチン関連マイクロＲＮＡのシード領域と完全または部分的に同一であるヌクレオチド部分を含むヌクレオチド配列を有するマイクロＲＮＡ模倣物である。ある実施形態では、マイクロＲＮＡ模倣物のヌクレオチド配列は、ミオスタチン関連マイクロＲＮＡのシード領域と１００％同一であるヌクレオチド部分を有する。ある実施形態では、マイクロＲＮＡ模倣物のヌクレオチド配列は、ミオスタチン関連マイクロＲＮＡのシード領域と少なくとも７５％（例えば、約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）同一であるヌクレオチド部分を有する。ある実施形態では、ミオスタチン関連マイクロＲＮＡ模倣物のヌクレオチド配列は、ミオスタチン関連マイクロＲＮＡのシード領域と７５％同一であるヌクレオチド部分を有する。ある実施形態では、マイクロＲＮＡ模倣物のヌクレオチド配列は、ミオスタチン関連マイクロＲＮＡのシード領域と８０％同一であるヌクレオチド部分を有する。ある実施形態では、マイクロＲＮＡ模倣物のヌクレオチド配列は、ミオスタチン関連マイクロＲＮＡのシード領域と９０％同一であるヌクレオチド部分を有する。ある実施形態では、マイクロＲＮＡ模倣物のヌクレオチド配列は、ミオスタチン関連マイクロＲＮＡのシード領域と９５％同一であるヌクレオチド部分を有する。
【０１１２】
他の実施形態では、本明細書に記載されるミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲート内に含まれるｓｉＮＡ分子は、１つまたは複数のヌクレオチド欠失、置換、ミスマッチおよび／または付加（ミオスタチン標的部位配列に関して、あるいは二本鎖ｓｉＮＡ分子の鎖間に）を含有することができるが、ただし、ｓｉＮＡ分子がその活性、例えばＲＮＡｉを媒介する活性を保持することを条件とする。非限定的な例では、欠失、置換、ミスマッチおよび／または付加は、ループもしくはバルジ、またはゆらぎもしくは他の代替（非Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）塩基対をもたらし得る。従って、いくつかの実施形態では、例えば、二本鎖核酸ｓｉＮＡ分子は、他方の鎖または領域（例えば、アンチセンス鎖）とミスマッチであるかまたは塩基対合されない一方の鎖または領域（例えば、センス鎖）中に、１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、または６）のヌクレオチドを有する。ある実施形態では、ｓｉＮＡ分子は、３個以下のミスマッチを含有する。ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖がミオスタチン標的配列に対するミスマッチを含有する場合、ミスマッチ領域は、相補性の隣接領域の中心に位置しないことが好ましい。
【０１１３】
ある実施形態では、本明細書に記載されるコンジュゲートで構成されるｓｉＮＡ分子は、約１〜約４（例えば、約１、２、３または４）のヌクレオチドのオーバーハングを含む。オーバーハング中のヌクレオチドは、同一のヌクレオチドでも異なるヌクレオチドでもよい。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、二本鎖ｓｉＮＡ分子の一方または両方の鎖の３’端部（または３’末端）において生じる。例えば、二本鎖ｓｉＮＡ分子は、アンチセンス鎖／領域の３’末端、センス鎖／領域の３’末端、またはアンチセンス鎖／領域およびセンス鎖／領域の両方の３’末端において、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドオーバーハングを含むことができる。オーバーハングヌクレオチドは、修飾されていてもされていなくてもよい。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、ｓｉＮＡ分子のオーバーハング部分を構成するヌクレオチドはミオスタチン標的核酸配列に基づいた配列を含み、アンチセンス鎖／領域のオーバーハング部分を構成するヌクレオチドは、ミオスタチン標的ポリヌクレオチド配列内のヌクレオチドに相補的であり、および／またはセンス鎖／領域のオーバーハング部分を構成するヌクレオチドは、ミオスタチン標的ポリヌクレオチド配列からのヌクレオチドを含む。従って、いくつかの実施形態では、オーバーハングは、ミオスタチン標的ポリヌクレオチド配列の一部に対して相補的である２ヌクレオチドオーバーハングを含む。しかしながら、他の実施形態では、オーバーハングは、ミオスタチン標的核酸配列の一部に対して相補的でない２ヌクレオチドオーバーハングを含む。ある実施形態では、オーバーハングは、ミオスタチン標的核酸配列の一部に対して相補的でない３’−ＵＵオーバーハングを含む。他の実施形態では、オーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端のＵＵオーバーハングと、センス鎖の３’末端のＴＴオーバーハングとを含む。
【０１１５】
３’末端ヌクレオチドオーバーハングを有する本明細書に記載されるｓｉＮＡ分子の実施形態のいずれにおいても、オーバーハングは、任意選択で、１つまたは複数の核酸糖、塩基、または骨格位置において化学修飾される。二本鎖ｓｉＮＡ分子のオーバーハング部分の修飾ヌクレオチドの代表的であるが非限定的な例としては、２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル）、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノ（ＦＡＮＡ）、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、普遍的な塩基、非環式、または５−Ｃ−メチルヌクレオチドが挙げられる。より好ましい実施形態では、オーバーハングヌクレオチドはそれぞれ独立して、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシ−２−フルオロヌクレオチド、または２’−デオキシリボヌクレオチドである。いくつかの例では、オーバーハングヌクレオチドは、１つまたは複数のホスホロチオアート結合によって連結される。
【０１１６】
さらに他の実施形態では、本明細書に記載されるミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲート内に含まれるｓｉＮＡ分子は、平滑末端を有する（すなわち、ヌクレオチドオーバーハングがない）二本鎖核酸分子を含み、分子の両末端が平滑であるか、あるいは末端の一方が平滑である。いくつかの実施形態では、ｓｉＮＡ分子は１つの平滑末端を含み、この場合、例えば、アンチセンス鎖の５’末端およびセンス鎖の３’末端がオーバーハングヌクレオチドを有さないか、あるいはアンチセンス鎖の３’末端およびセンス鎖の５’末端がオーバーハングヌクレオチドを有さない。他の実施形態では、ｓｉＮＡ分子は２つの平滑末端を含み、この場合、例えば、アンチセンス鎖の３’末端およびセンス鎖の５’末端、ならびにアンチセンス鎖の５’末端およびセンス鎖の３’末端がオーバーハングヌクレオチドを有さない。
【０１１７】
本明細書に記載されるミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲート内に含まれるｓｉＮＡ分子の実施形態または態様のいずれにおいても、センス鎖および／またはアンチセンス鎖はさらに、本明細書に記載されるかあるいは当該技術分野において知られているようなキャップを有する。キャップは、アンチセンス鎖の３’末端、センス鎖の５’末端、および／またはセンス鎖の３’末端に存在し得る。ヘアピンｓｉＮＡ分子の場合、キャップは、ポリヌクレオチドの３’末端に存在し得る。いくつかの実施形態では、キャップは、二本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖の一方または両方の末端にある。他の実施形態では、キャップは、アンチセンス（ガイド）鎖の３’末端にある。他の実施形態では、キャップは、センス鎖の３’末端およびセンス鎖の５’末端にある。このような末端キャップの代表的であるが非限定的な例としては、逆位脱塩基ヌクレオチドおよびその誘導体（例えば、逆位デオキシ脱塩基ヌクレオチド、テトラ−Ｎ−アセチルガラクトサミンアミノヘキシルホスファート逆位脱塩基ヌクレオチド、逆位ヌクレオチド部分、グリセリル修飾、アルキルまたはシクロアルキル基、複素環または当該技術分野において一般的に知られている任意の他のキャップが挙げられる。
【０１１８】
本明細書に記載されるｓｉＮＡ分子の実施形態はいずれも、５’リン酸末端を有することができる。いくつかの実施形態では、ｓｉＮＡ分子は末端リン酸を含まない。
【０１１９】
ある実施形態では、本明細書に記載されるミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲート内に含まれる二本鎖ｓｉＮＡ分子は、約３〜約３０（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）の塩基対を含む。一般的に、ｓｉＮＡ分子の二本鎖構造は１５〜３０の間の塩基対、より一般的には１８〜２５の間の塩基対、さらにより一般的には１９〜２４の間の塩基対、最も一般的には１９〜２１の間の塩基対の長さである。一実施形態では、二本鎖ｓｉＮＡ分子は１９塩基対を含む。一実施形態では、二本鎖ｓｉＮＡ分子は２０塩基対を含む。一実施形態では、二本鎖ｓｉＮＡ分子は２１塩基対を含む。二本鎖ｓｉＮＡ分子は非対称または対称であり得る。本発明のこの態様の他の実施形態では、ｓｉＮＡ二本鎖分子はヘアピン構造である。
【０１２０】
任意のｓｉＮＡ分子は、１つまたは複数の化学修飾ヌクレオチドを含むことができる。修飾は、安定性、活性、毒性、免疫応答（例えば、インターフェロン応答、炎症性もしくは炎症促進性のサイトカイン応答、またはＴｏｌｌ様受容体応答の刺激の阻害）、および／または生物学的利用能などのインビトロまたはインビボ特性を改善するために使用することができる。本明細書に開示される種々の化学修飾ｓｉＮＡモチーフは、非修飾または最小限に修飾された活性ｓｉＲＮＡと実質的に類似したＲＮＡｉ活性を保持する可能性がある（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２０：６８７７−６８８８を参照）が、同時に、治療用途における使用に適したヌクレアーゼ抵抗性および薬物動態特性を提供する。
【０１２１】
本発明の方法によって使用されるミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートで構成されるｓｉＮＡ分子の特定の実施形態では、アンチセンスおよび／またはセンス鎖中に存在する任意の（例えば、１つ、複数または全ての）ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドであり得る（例えば、１つのヌクレオチドが修飾される、いくつかのヌクレオチド（すなわち、複数または１つよりも多い）が修飾される、あるいは分子の全てのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである）。修飾には、糖修飾、塩基修飾、骨格（ヌクレオシド間結合）修飾、非ヌクレオチド修飾、および／またはこれらの任意の組み合わせが含まれる。
【０１２２】
本明細書に記載されるコンジュゲートのｓｉＮＡ分子部分における使用に適した化学修飾の非限定的な例は、米国特許第８，２０２，９７９号明細書および米国特許出願第１０／９８１，９６６号明細書および米国特許出願第１２／０６４，０１４号明細書（それぞれ米国特許出願公開第２００５０２６６４２２号明細書および米国特許出願公開第２００９０１７６７２５号明細書として公開）ならびにそこに引用される参考文献に開示されており、糖、塩基、および骨格修飾、非ヌクレオチド修飾、および／またはこれらの任意の組み合わせが含まれる。これらの米国特許および特許出願は、ｓｉＮＡ分子と共に使用するのに適した化学修飾を記述するための参考文献として本明細書に援用される。
【０１２３】
単一のｓｉＮＡ分子内に存在するヌクレオチドの化学修飾は同一でも異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、ｓｉＮＡ分子の少なくとも１つの鎖は、少なくとも１つの化学修飾を有する。他の実施形態では、各鎖は、糖、塩基、または骨格（すなわち、ヌクレオチド間結合）修飾などの、同一でも異なっていてもよい少なくとも１つの化学修飾を有する。他の実施形態では、ｓｉＮＡ分子は、少なくとも２、３、４、５、またはそれを超える化学修飾を含有する。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、本発明の方法に従って投与されるミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲート内に含まれるｓｉＮＡ分子は、化学修飾により部分的に修飾される（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、または５９のヌクレオチドが修飾される）。いくつかの実施形態では、ｓｉＮＡ分子は、アンチセンス鎖の５’修飾ヌクレオチドを除いて、少なくとも約８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、または６０の、修飾ヌクレオチドであるヌクレオチドを含む。他の実施形態では、ｓｉＮＡ分子は、化学修飾により完全に修飾され（１００％修飾）、すなわち、ｓｉＮＡ分子は、リボヌクレオチドを含有しない。いくつかの実施形態では、ｓｉＮＡ分子のセンス鎖中のヌクレオチドの１つまたは複数が修飾される。いくつかのまたは他の実施形態では、アンチセンス鎖の５’修飾ヌクレオチドを除いて、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖中のヌクレオチドの１つまたは複数が修飾される。いくつかの実施形態では、ｓｉＮＡ分子の一方または両方の鎖において独立して、ヌクレオチド位置の１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）が修飾される。
【０１２５】
ｓｉＮＡ分子内に含有される修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチドの糖部分の２’炭素および／または糖部分の３’炭素における修飾を有するものを含む。本発明のある特定の実施形態では、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドは、当該技術分野において一般的に認識されるように、２’−デオキシ−２−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル）ヌクレオチド、２’−メトキシエトキシまたはロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドである。
【０１２６】
本発明のさらに他の実施形態では、少なくとも１つのヌクレオチドは、リボ様ノーザン（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ）またはＡ型ヘリックス立体配置を有する（例えば、Ｓａｅｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  ｅｄ．，１９８４を参照）。ノーザン立体配置を有するヌクレオチドの非限定的な例としては、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ、４’−Ｃ−メチレン−（Ｄ−リボフラノシル）ヌクレオチドｓ）；２’−メトキシエトキシ（ＭＯＥ）ヌクレオチド；２’−メチル−チオ−エチルヌクレオチド；２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド；２’−デオキシ−２’−クロロヌクレオチド；２’−アジドヌクレオチド；２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド；２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド；２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド；４’−チオヌクレオチド；および２’−Ｏ−メチルヌクレオチドが挙げられる。種々の実施形態では、二本鎖ｓｉＮＡ分子中に存在するピリミジンヌクレオチドの大多数（例えば、５０％よりも多い）は糖修飾を含む。同じおよび／または他の実施形態のいくつかにおいて、二本鎖ｓｉＮＡ分子中に存在するプリンヌクレオチドの大多数（例えば、５０％よりも多い）は糖修飾を含む。
【０１２７】
ある場合には、ｓｉＮＡ分子のプリンおよびピリミジンヌクレオチドは差別的に修飾される。１つの例では、プリンおよびピリミジンヌクレオチドは、糖部分の２’炭素において差別的に修飾され得る（すなわち、少なくとも１つのプリンは、糖部分の２’炭素において、同じまたは異なる鎖中の少なくとも１つのピリミジンとは異なる修飾を有する）。ある実施形態では、プリンは、一方または両方の鎖において非修飾であるが、一方または両方の鎖のピリミジンは修飾される。いくつかの他の場合には、ピリミジンは一方または両方の鎖において非修飾であるが、一方または両方の鎖のプリンは修飾される。ｓｉＮＡ分子が本明細書に記載される１つまたは複数の修飾を含む特定の場合には、アンチセンス（ガイド）鎖の５’末端の第２位および第３位のヌクレオチドは修飾されない。
【０１２８】
ｓｉＮＡ分子のいくつかの実施形態では、アンチセンス鎖中のピリミジンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルまたは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、アンチセンス鎖中に存在するプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドまたは２’−デオキシヌクレオチドである。ある実施形態では、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖の相補的な領域中のピリミジンヌクレオチドの全てが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。ある実施形態では、アンチセンス鎖の相補的な領域中のプリンの全てが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。
【０１２９】
ｓｉＮＡ分子の他の実施形態では、センス鎖中のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、センス鎖中に存在するプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルまたは２’−デオキシプリンヌクレオチドである。本発明の特定の実施形態では、センス鎖の相補的な領域中のピリミジンヌクレオチドの全てが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。ある実施形態では、センス鎖の相補的な領域中のプリンヌクレオチドの全てが２’−デオキシプリンヌクレオチドである。
【０１３０】
ある実施形態では、センス鎖の相補的な領域中のピリミジンヌクレオチドの全てが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、アンチセンス鎖の相補的な領域中のピリミジンヌクレオチドの全てが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、センス鎖の相補的な領域中のプリンヌクレオチドの全てが２’−デオキシプリンヌクレオチドであり、アンチセンス鎖の相補的な領域中のプリンの全てが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、ｓｉＮＡ分子の一方または両方の鎖中のピリミジンヌクレオチドの少なくとも５個以上が２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、一方または両方の鎖中のピリミジンヌクレオチド少なくとも５個以上が２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、一方または両方の鎖中のプリンヌクレオチドの少なくとも５個以上が２’−デオキシ−２’−フルオロプリンヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、一方または両方の鎖中のプリンヌクレオチドの少なくとも５個以上が２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。
【０１３２】
ある実施形態では、ｓｉＮＡ分子は、１つまたは複数の修飾ヌクレオシド間連結基を含む。修飾ヌクレオシド間連結基は、２’ヌクレオシド間連結基（例えば、ホスホジエステルおよびホスホロチオアート２’−５’ヌクレオシド間結合）を含むがこれらの限定されないホスホジエステル３’−５’ヌクレオシド間連結基以外の連結基である。ある実施形態では、各ヌクレオシド間連結基は独立して、２’または３’ホスホジエステルまたはホスホロチオアートヌクレオシド間連結基である。ある実施形態では、ｓｉＮＡ分子のいずれかまたは両方の鎖の最５’−ヌクレオシド間連結基は、ホスホロチオアート連結基である。ある実施形態では、ｓｉＮＡ分子は、３〜１２の隣接ホスホロチオアート連結基を含み、このホスホロチオアート連結基は、２’または３’ヌクレオシド間連結基のいずれかである。ある実施形態では、ｓｉＮＡ分子は６〜８の隣接ホスホロチオアート連結基を含み、このホスホロチオアート連結基は、２’または３’ヌクレオシド間連結基のいずれかである。ある実施形態では、ｓｉＮＡ分子のアンチセンスおよび／またはセンス鎖の３’末端は、ホスホロチオアート連結基を含む。ある実施形態では、ｓｉＮＡ分子は、アンチセンスおよび／またはセンス鎖の３’末端に６〜８の隣接ホスホロチオアート連結基を含み、このホスホロチオアート連結基は、２’または３’ヌクレオシド間連結基のいずれかである。
【０１３３】
引用される参考文献のものを含む上記の修飾のいずれかまたはその組み合わせは、本発明の方法および使用に従って投与されるミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲート内に含まれるｓｉＮＡ分子のいずれかに適用され得る。
【０１３４】
ミオスタチンｓｉＮＡ分子は、当業者に知られているいくつかの技術を用いて得ることができる。例えば、ｓｉＮＡ分子は、当該技術分野において知られているプロトコルを用いて化学的に合成することができる（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２１１，３−１９；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，国際ＰＣＴ公開国際公開第９９／５４４５９号パンフレット；Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４；Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，７４，５９；Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．，６１，３３−４５；Ｂｒｅｎｎａｎ，米国特許第６，００１，３１１号明細書；Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，７８４５；およびＳｃａｒｉｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，５４３３において記載される）。当該技術分野において記載されているオリゴヌクレオチドの合成は、５’末端のジメトキシトリチル、および３’−または２’末端のホスホラミダイトなどの、一般的な核酸保護およびカップリング基を使用する。
【０１３５】
ある実施形態では、ｓｉＮＡ分子は、例えば、米国特許第６，９９５，２５９号明細書、米国特許第６，６８６，４６３号明細書、米国特許第６，６７３，９１８号明細書、米国特許第６，６４９，７５１号明細書、米国特許第６，９８９，４４２号明細書、および米国特許第７，２０５，３９９号明細書に記載される方法に従って、合成、脱保護、および分析される。非限定的な合成例では、３９４  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成機において、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドについては２．５分のカップリングステップ、および２’−デオキシヌクレオチドまたは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドについては４５秒のカップリングステップによる０．２μｍｏｌスケールのプロトコルを用いて小規模の合成が実行される。
【０１３６】
あるいは、ｓｉＮＡ分子は別々に合成され、例えば、ライゲーション（例えば、Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６，９９２３；Ｄｒａｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，国際ＰＣＴ公開国際公開第９３／２３５６９号パンフレット；Ｓｈａｂａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９，４２４７；Ｂｅｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１６，９５１；およびＢｅｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．８，２０４）によって、あるいは合成および／または脱保護後のハイブリダイゼーションによって、合成後に結合されてもよい。
【０１３７】
Ｃ．ミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲート
本発明は、ＲＮＡ干渉を媒介し、ミオスタチンのインビボにおける発現を低減することができるミオスタチンｓｉＮＡ分子および対象にミオスタチンｓｉＮＡ分子を送達するための方法を提供し、本明細書において開示される方法に従って送達されるｓｉＮＡ分子が、コレステロールなどの親油性部分に連結される。親油性部分連結ミオスタチンｓｉＮＡ分子は、本明細書においてミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートと呼ばれる。一実施形態では、本発明の方法によって送達されるミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートは、リポソーム（例えば脂質ナノ粒子）を形成する脂質製剤内で製剤されない。あらゆる特定の理論によって束縛されることを望むものではないが、親油性部分の付加は、ミオスタチンｓｉＮＡ分子の親油性を増加させ、筋細胞中へのｓｉＮＡ分子の移行を増強すると考えられる。
【０１３８】
ミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートを形成するためにミオスタチンｓｉＮＡ分子に連結することができる親油性部分の例は、コレステロール、オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、リノール酸、オレイル、レチニル、コレステリル残基、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジンを含むが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、連結される親油性部分が、コレステロールである。
【０１３９】
ある実施形態では、親油性部分が、ｓｉＮＡ分子に直接付加される。これらの実施形態では、親油性部分が、本発明の目的のために、ｓｉＮＡ分子に「連結される」または「コンジュゲートされる」となお見なされる。ある実施形態では、親油性部分が、従来のリンカーまたはスペーサー分子によってｓｉＮＡ分子に付加される。リンカーまたはスペーサーは、核酸または非核酸リンカー／スペーサーとすることができる。多くのリンカー分子が、市販で入手可能である。適したリンカーは、直鎖状または分岐鎖炭素リンカー、複素環式炭素リンカー、またはペプチドリンカーを含むが、これらに限定されない。リンカーまたはスペーサー分子は、一般に、合わせられている分子に結合するか、またはそれらの間でいくらかの最小限の距離もしくは他の空間的関係を保つ以外に、特異的な生物学的活性を有していないが、ペプチドスペーサーの構成アミノ酸は、フォールディング、実効電荷、または疎水性など、分子のいくつかの特性に影響を及ぼすように選択されてもよい。
【０１４０】
リンカー／スペーサーは、生分解性の核酸リンカーとすることができる。核酸ベースの生分解性リンカー分子の安定性は、様々な化学的性質、例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ならびに２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−アミノ、２’−Ｏ−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−Ｏ−アリル、および他の２’修飾または塩基修飾ヌクレオチドなどの化学修飾ヌクレオチドの組み合わせを使用することによって調整することができる。生分解性核酸リンカー分子は、２量体、３量体、４量体またはそれよりも長い核酸分子、例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドであってもよく、あるいはリンベースの結合、例えばホスホラミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）またはホスホジエステル結合を有する単一のヌクレオチドを含むこともできる。また生分解性核酸リンカー分子は、核酸骨格、核酸糖、または核酸塩基修飾を含むこともできる。
【０１４１】
親油性部分は、ｓｉＮＡ分子の末端（例えばｓｉＮＡ分子のオリゴヌクレオチド鎖の３’もしくは５’末端）への付加を通してまたはｓｉＮＡ分子の内部にあるヌクレオチドへの連結を通して、ミオスタチンｓｉＮＡ分子に付加される。一実施形態では、親油性部分が、二本鎖ミオスタチンｓｉＮＡ分子のパッセンジャー鎖（センス鎖）の３’末端に付加される。一実施形態では、親油性部分が、二本鎖ミオスタチンｓｉＮＡ分子のパッセンジャー鎖の５’末端に付加される。さらなる実施形態では、親油性部分が、ミオスタチンｓｉＮＡ分子のガイド鎖（アンチセンス鎖）の３’末端に付加される。さらなる実施形態では、親油性部分が、ミオスタチンｓｉＮＡ分子のガイド鎖（アンチセンス鎖）の５’末端に付加される。さらなる実施形態では、ミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートが、２つ以上の付加された親油性部分（例えば、パッセンジャー鎖の３’および５’末端の両方に付加された親油性部分；ガイド鎖の３’末端およびパッセンジャー鎖の５’末端に付加された親油性部分）を含有する。本発明の本態様では、親油性部分を同じまたは異なるものとすることができる。
【０１４２】
ある実施形態では、ミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートが、親油基へのミオスタチンｓｉＮＡ分子の全てまたは一部を化学的にコンジュゲートすることによって調製される。化学的に分子をコンジュゲートする手段は、当業者によく知られている。そのような手段は、付加される部分の構造によって変わるであろうが、当業者に容易に確かめられる。
【０１４３】
本発明は、キットの形態をしたミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートをさらに提供する。本キットは容器を含み得る。一実施形態では、キットが、全身投与についての説明書と共に１つまたは複数のミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートを含有する。キットは、薬学的に許容可能な担体または希釈剤内にミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートを含んでいてもよい。本キットはさらに賦形剤を含み得る。
【０１４４】
Ｄ．使用
本明細書において記載されるミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートを全身的に投与するための方法は、ＲＮＡｉ干渉メカニズムによって（例えばミオスタチンｍＲＮＡを分解することによって）ミオスタチン標的核酸（例えばミオスタチン標的遺伝子）のインビボにおける発現および／または活性を調整および／または調節する（例えば阻害する、下方制御する）のに有用である。ミオスタチン標的核酸のインビボにおける発現の調整は、筋肉量の増加および／または筋肉の性能の増強をもたらす。方法は、１つまたは複数の筋骨格系疾患状態を治療するための治療レジメンにおいて、さらに有用であってもよい。一実施形態では、疾患の阻害は、対象の疾患の進行を直接測定することによって評価され得る。これは、疾患に関連する状態の変化または回復の観察を通して推測することもできる。本発明の方法は、予防として使用されるさらなる可能性を有する。従って、本明細書において記載されるミオスタチンｓｉＮＡ分子コンジュゲートおよび医薬組成物の使用は、ミオスタチン遺伝子発現の制御に関連する病状を回復させる、治療する、予防する、および／または治癒させる可能性を有する。ミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートは、筋肉量を増加させ、および／または筋肉の性能を増強するために美容のための適用においておよび／または獣医学の目的のために使用される可能性をさらに有する。
【０１４５】
本発明の実施形態では、本明細書において記載されるミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートが全身的に投与される対象が、筋骨格系疾患または障害を患っている。一実施形態では、筋骨格系疾患または障害が、筋萎縮症を引き起こすまたはもたらす状態を含む。筋萎縮症は、コルチゾール、デキサメタゾン、ベータメタゾン、プレドニゾン、メチルプレドニソロン、またはプレドニゾロンなどのグルココルチコイドによる治療に起因し得る。筋萎縮症はまた、神経外傷による脱神経の結果または変性、代謝性、もしくは炎症性ニューロパシーの結果とすることもできる。例えば、筋萎縮症は、成人性運動ニューロン疾患、ギラン−バレー症候群、乳児脊髄性筋萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、若年性脊髄性筋萎縮症、多巣性伝導ブロックを有する自己免疫性運動ニューロパシー、脳卒中または脊髄損傷による麻痺、外傷による骨格の固定、長期床上安静、随意の不活動、不随意性の不活動、および代謝性ストレスまたは栄養不足の結果とすることができる。筋萎縮症は、例えば筋緊張症を含むミオパシー；ネマリンミオパシー、マルチ／ミニコアミオパシー、および筋細管（中心核）ミオパシーを含む先天性ミオパシー；ミトコンドリア性ミオパシー；家族性周期性四肢麻痺；炎症性筋疾患；グリコーゲンまたは脂質の蓄積症によって引き起こされるなどの代謝性ミオパシー；皮膚筋炎；多発筋炎；封入体筋炎；骨化性筋炎；横紋筋融解症およびミオグロビン尿症の結果とすることができる。ミオパシーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（良性偽肥大性筋ジストロフィーとしても知られている）、筋緊張性ジストロフィー、肩甲上腕および顔面肩甲上腕筋ジストロフィー、エメリ−ドレフュス型筋ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、福山型先天性筋ジストロフィー、または遺伝性末梢性ミオパシーなどの筋ジストロフィー症候群によって引き起こされてもよい。
【０１４６】
筋骨格系疾患もしくは障害、または筋骨格系疾患もしくは障害をもたらす状態のさらなる例は、サルコペニア、皮膚萎縮症、筋消耗、脳萎縮、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、肺気腫、骨粗鬆症、変形性関節症、免疫学的不全、高血圧、認知症、ハンチントン病、アルツハイマー病、白内障、加齢性黄斑変性症、癌、脳卒中、虚弱、記憶喪失、腎機能障害、代謝障害（ＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム、高血糖症、肥満、甲状腺障害を含む）、悪液質（関節リウマチに関連する悪液質および癌に関連する悪液質を含む）、急性および／または慢性腎疾患または不全、肝臓疾患（例えば線維症、肝硬変など）癌（横紋筋肉腫、前立腺癌、乳癌、肝細胞がん、および胃腸癌を含む）、パーキンソン病；貧血、環境毒素または薬物に対する暴露、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、絶食、良性先天性ヒポトニア、セントラルコア病、熱傷、慢性閉塞性肺疾患、敗血症、鬱血性心不全、老化または年齢関連性の状態、ならびに宇宙旅行または無重力環境において費やされた時間を含む。
【０１４７】
ミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートおよびその医薬品製剤は、単独で対象に投与することもでき、あるいは筋骨格系疾患、障害、状態、および形質を予防または治療するための既知の治療薬、治療、または手順を含む１つまたは複数の他の療法と組み合わせて使用することもできる。組み合わせは、医薬組成物の形態で使用するために便利に提供されることが可能であり、医薬組成物は、ミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲート、薬学的に許容可能な希釈剤または担体、および１つまたは複数の付加的な治療薬を含む組み合わせを含む。あるいは、このような組み合わせの個々の成分は、別々のまたは結合された医薬品製剤において順次または同時に投与することができる。
【０１４８】
標準的な医療（例えば筋ジストロフィーのためのコルチコステロイド）との本発明の方法の組み合わせは、新規な療法との組み合わせがあるように、特に企図される。例えば、遺伝的筋ジストロフィーの治療のために、本発明の方法は、フォリスタチン投与と合わせられ、その遺伝病を直すための同時のまたは付随する治療が続いてもよい。遺伝病を直すことは、例えば、サルコグリカン欠乏症においてサルコグリカンを補充すること、デュシェンヌ筋ジストロフィーなどの障害を直すまたはジストロフィンを補充すること、ＩＧＦ−１または突然変異体ＳＯＤ１干渉戦略によりＡＬＳ患者を治療することを含んでいてもよい。本発明の方法による治療について企図される障害において、かなりの量の筋肉が失われ得ることを考慮すれば、筋肉の救出は、続く遺伝子修正のための土台（保存されたまたは再生された筋肉）をもたらすであろう。この点で、筋肉を増強し、筋肉サイズを増加させるためにミオスタチンを阻害し、次いで、第２の治療を提供することが考えられる。筋ジストロフィーのためのそのような第２の治療は、ＩＧＦ−１、エキソンスキッピング、カルパイン阻害、ジストロフィンアップレギュレーション、およびジストログリカン発現であってもよい。ミオスタチン阻害は、筋肉前駆細胞（衛星細胞、幹細胞）と協力して、より多くのこれらの細胞が組織中に組み込まれるのを可能にし得る。
【０１４９】
Ｅ．医薬組成物
本発明のミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートは、好ましくは、当該技術分野において既知の技術に従って、対象に全身的に投与する前に医薬組成物として処方される。医薬組成物は、少なくとも無菌であり、発熱物質を含有しないものとして特徴付けられる。医薬組成物の調製方法は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１７ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９８５）に記載されるように当該技術分野の技能の範囲内である。
【０１５０】
ミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートの医薬組成物はさらに、従来の医薬賦形剤および／または添加剤を含む。適切な医薬賦形剤には、防腐剤、香味剤、安定剤、酸化防止剤、浸透圧調整剤、緩衝液、およびｐＨ調整剤が含まれる。適切な添加剤には、生理学的に生体適合性の緩衝液（例えば、トリメチルアミン塩酸塩）、キレート剤（例えば、ＤＴＰＡまたはＤＴＰＡ−ビスアミドなど）、もしくはカルシウムキレート錯体（例えば、カルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミド）の添加、または任意選択で、カルシウムもしくはナトリウム塩（例えば、塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウムまたは乳酸カルシウム）の添加が含まれる。さらに、酸化防止剤および懸濁化剤を使用することができる。
【０１５１】
経口使用が意図される組成物は、医薬組成物の製造のための当技術分野において知られている方法、とりわけ、オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物の製造のための当技術分野において知られている方法によって調製されてもよい。例えば、ｓｉＲＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドの経口送達は、分解からそれらを保護し、腸のパイエル板におけるＭ細胞にそれらを向ける生分解性粒子内にｓｉＲＮＡをカプセル化することを通して実現された（Ａｋｈｔａｒ，Ｓ．，２００９，Ｊ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ．１７：４９１−４９５を参照）。経口組成物は、薬学的に簡潔で味のよい調製物を提供するために、１つまたは複数のそのような甘味料、調味料、着色料、または防腐剤を含有することができる。錠剤は、錠剤の製造に適した無毒性の薬学的に許容可能な賦形剤と混合された活性成分を含有する。これらの賦形剤は、例えば、不活性希釈剤（例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムなど）、顆粒化および崩壊剤（例えば、コーンスターチ、またはアルギン酸）、結合剤（例えば、デンプン、ゼラチンまたはアカシア）、ならびに潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルク）であり得る。錠剤は、コーティングされていなくてもよく、あるいは既知の技術によってコーティングされてもよい。いくつかの場合には、このようなコーティングは、胃腸管内での崩壊および吸収を遅延し、それにより、より長い期間にわたる持続作用を提供するために、既知の技術によって調製することができる。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの時間遅延材料を使用することができる。
【０１５２】
また経口使用のための製剤は、活性成分が不活性固体希釈剤（例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンなど）と混合された硬ゼラチンカプセルとして、あるいは活性成分が水または油媒体（例えば、ピーナッツ油、流動パラフィンまたはオリーブ油など）と混合された軟ゼラチンカプセルとして提供することができる。
【０１５３】
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した賦形剤との混合物中に活性材料を含有する。このような賦形剤は、懸濁化剤、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロプロピル−メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガムおよびアカシアガムであり、分散または湿潤剤は、天然に存在するホスファチド（例えば、レシチン）、またはアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンステアラート）、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトールから誘導される部分エステルとの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレアート）、またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール無水物から誘導される部分エステルとの縮合生成物（例えば、ポリエチレンソルビタンモノオレアート）であり得る。また水性懸濁液は、１つまたは複数の防腐剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルまたはｎ−プロピル）、１つまたは複数の着色剤、１つまたは複数の香味剤、および１つまたは複数の甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリンなど）を含有することもできる。
【０１５４】
油性懸濁液は、活性成分を植物油（例えば、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油またはココナッツ油）または鉱油（例えば、流動パラフィン）中に懸濁させることによって処方することができる。油性懸濁液は、増粘剤、例えば、蜜ろう、固形パラフィンまたはセチルアルコールを含有することができる。甘味剤および香味剤は、美味の経口調製物を提供するために添加され得る。これらの組成物は、アスコルビン酸などの酸化防止剤の添加によって保存され得る。
【０１５５】
本発明の医薬組成物は、水中油エマルションの形態でもあり得る。油相は、植物油または鉱油またはこれらの混合物であり得る。適切な乳化剤は、天然に存在するガム（例えば、アカシアガムまたはトラガカントガム）、天然に存在するホスファチド（例えば、大豆、レシチン、ならびに脂肪酸およびヘキシトール無水物から誘導されるエステルまたは部分エステル、例えばソルビタンモノオレアート）、および前記部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）であり得る。エマルションは、甘味剤および香味剤を含有することもできる。
【０１５６】
シロップおよびエリキシル剤は、甘味剤、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、グルコースまたはスクロースと共に処方することができる。このような製剤は、粘滑薬、防腐剤、ならびに香味および着色剤を含有することもできる。医薬組成物は、無菌の注射可能な水性または油性懸濁液の形態であり得る。この懸濁液は、上記のような適切な分散または湿潤剤および懸濁化剤を用いて既知の技術に従って処方することができる。また無菌の注射可能な調製物は、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液として、無毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の無菌の注射可能な溶液または懸濁液であり得る。使用することができる許容可能な媒体および溶媒としては、水、リンゲル溶液および等張性塩化ナトリウム溶液がある。さらに、無菌の不揮発性油は、溶媒または懸濁媒体として従来通りに使用される。この目的で、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の低刺激性の不揮発性油を使用することができる。さらに、注射剤の調製においてオレイン酸などの脂肪酸の使用が見出される。
【０１５７】
ミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートは、例えば薬物の直腸投与のための坐薬の形態をとることができる。これらの組成物は、常温で固体であるが直腸温度では液体であり、従って直腸内で溶融して薬物を放出し得る適切な非刺激性賦形剤と、薬物とを混合することによって調製することができる。このような材料には、ココアバターおよびポリエチレングリコールが含まれる。
【０１５８】
本明細書に記載されるミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートは、静脈内投与のために無菌媒体中で処方することができる。分子は、使用される媒体および濃度に応じて、媒体中に懸濁または溶解され得る。有利に、局所麻酔薬、防腐剤および緩衝剤などの補助剤が媒体中に溶解され得る。
【０１５９】
他の実施形態では、肺送達で使用するために本明細書で提供されるミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲート製剤はさらに、１つまたは複数の界面活性剤を含む。本発明の組成物の取込みを増強するために適切な界面活性剤または界面活性剤成分には、とりわけ、サーファクタントタンパク質Ａ、サーファクタントタンパク質Ｂ、サーファクタントタンパク質Ｃ、サーファクタントタンパク質Ｄおよびサーファクタントタンパク質Ｅ、二飽和ホスファチジルコリン（ジパルミトイル以外）、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン；ホスファチジン酸、ユビキノン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルコリン、パルミトイル−リゾホスファチジルコリン、デヒドロエピアンドロステロン、ドリコール、スルファチジン酸（ｓｕｌｆａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ）、グリセロール−３−リン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸、グリセロール、グリセロ（ｇｌｙｃｅｒｏ）−３−ホスホコリン、ジヒドロキシアセトン、パルミタート、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）ジアシルグリセロール、ＣＤＰコリン、コリン、および／またはコリンリン酸の合成および天然ならびに完全および切断型；ならびに、界面活性剤の成分、オメガ−３脂肪酸、ポリエン酸（ｐｏｌｙｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ポリエン酸（ｐｏｌｙｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、レシチン、パルミチン酸、エチレンまたはプロピレンオキシドの非イオン性ブロックコポリマー、ポリオキシプロピレン、モノマーおよびポリマー、ポリオキシエチレン、モノマーおよびポリマー、デキストランおよび／またはアルカノイル側鎖を有するポリ（ビニルアミン）、Ｂｒｉｊ  ３５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および合成界面活性剤  ＡＬＥＣ、Ｅｘｏｓｕｒｆ、ＳｕｒｖａｎおよびＡｔｏｖａｑｕｏｎｅのための天然担体媒体である天然および人工層状体（ｌａｍｅｌｌａｒ  ｂｏｄｉｅｓ）が含まれる。これらの界面活性剤は、製剤中の単一の界面活性剤または多成分界面活性剤の一部として、あるいは本明細書中の医薬組成物の核酸成分の５’および／または３’末端への共有結合付加として使用することができる。
【０１６０】
一実施形態では、ミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートは、吸入器またはネブライザーによって投与されるエアロゾルまたは噴霧乾燥製剤の吸入などにより、関連の肺組織への核酸分子の急速な局所的取込みを提供する、肺送達による投与のために処方することができる。微粉化した核酸組成物の呼吸性乾燥粒子を含有する固体微粒子組成物は、乾燥または凍結乾燥した核酸組成物を粉砕し、次に微粉化した組成物を例えば４００メッシュのスクリーンに通過させて、大きい凝集体を破壊または分離除去することによって調製することができる。ｓｉＮＡコンジュゲート組成物を含む固体微粒子組成物は、任意選択で、エアロゾルの形成を容易にする役割を果たす分散剤、および他の治療化合物を含有することができる。適切な分散剤は、任意の適切な比率（例えば、１対１の重量比）で核酸化合物とブレンドすることができるラクトースである。
【０１６１】
本明細書に記載されるｓｉＮＡコンジュゲートを含むスプレー組成物は、例えば、適切な液化噴射剤の使用により加圧パック（例えば、定量吸入器など）から送達される、水溶液または懸濁液またはエアロゾルとして処方することができる。一実施形態では、吸入に適したエアロゾル組成物は懸濁液または溶液のいずれかでよく、一般的に、ｓｉＮＡコンジュゲートと、フルオロカーボンまたは水素含有クロロフルオロカーボンまたはこれらの混合物、特にヒドロフルオロアルカン（特に、１，１，１，２−テトラフルオロエタン、１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロ−ｎ−プロパンまたはこれらの混合物）などの適切な噴射剤とを含有する。エアロゾル組成物は、任意選択で、界面活性剤などの当該技術分野において周知の付加的な製剤賦形剤を含有することができる。非限定的な例としては、オレイン酸、レシチンまたはオリゴ乳酸または誘導体、例えば国際公開第９４／２１２２９号パンフレットおよび国際公開第９８／３４５９６号パンフレットに記載されているものなど、および共溶媒、例えばエタノールが挙げられる。一実施形態では、医薬エアロゾル製剤は、ｓｉＮＡコンジュゲートと、噴射剤としてのフルオロカーボンまたは水素含有クロロフルオロカーボンまたはこれらの混合物とを含み、任意選択で、界面活性剤および／または共溶媒と組み合わせられる。
【０１６２】
エアロゾル製剤は、適切な緩衝剤の添加により緩衝され得る。
【０１６３】
エアロゾル製剤は、製剤が無菌で調製されていない場合の防腐剤を含む、任意選択の添加剤を含むことができる。非限定的な例としては、ヒドロキシ安息香酸メチル、酸化防止剤、香味剤、揮発性油、緩衝剤および乳化剤、ならびに他の製剤界面活性剤が挙げられる。一実施形態では、分解を低減し、より安全な生体適合性の非液体微粒子懸濁組成物を提供するために、フルオロカーボンまたはペルフルオロカーボン担体が使用される。別の実施形態では、ネブライザーを含むデバイスが、静菌性であるフルオロケミカルを含むｓｉＮＡコンジュゲート組成物を送達し、それにより、互換性のデバイスにおける微生物の増殖の可能性が低減される。
【０１６４】
吸入器または吸入具において使用するための例えばゼラチンの、ミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲート組成物を含むカプセルおよびカートリッジは、本発明の化合物とラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤との吸入のための粉末混合物を含有するように処方することができる。一実施形態では、各カプセルまたはカートリッジは、ｓｉＮＡコンジュゲートと、１つまたは複数の賦形剤とを含有する。別の実施形態では、ｓｉＮＡコンジュゲートは、ラクトースなどの賦形剤を含まずに調製することができる。
【０１６５】
ｓｉＮＡコンジュゲートは、国際公開第０５／０４４３５４号パンフレットに記載および説明されるものなどの流体ディスペンサーからの送達のための流体製剤として処方することもできる。
【０１６６】
Ｆ．投与
ミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートおよびその医薬組成物は、全身投与の様々な形態のいずれかによって対象に導入される。本発明の目的のために、全身投与は、当該技術分野において一般的に知られているように、肺（吸入、噴霧化など）、静脈内、皮下、カテーテル法、鼻咽頭、または経口／胃腸投与を含むことができる。本発明の投与方法のさらなる非限定的な例としては、頬側、舌下、非経口（すなわち、静脈内、腹腔内、皮下、または筋肉内）、局所直腸投与または他の局所投与が挙げられる。血流中のミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートの吸収または蓄積の後、全身にわたる分配をもたらす。一実施形態では、ミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートおよびその医薬組成物が、ガス注入および吸入によって投与することができる。一実施形態では、ミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートおよびその医薬組成物は、ボーラス注射によって静脈内または腹腔内に投与される（例えば、米国特許第５，２８６，６３４号明細書を参照）。別の実施形態では、ミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートおよびその医薬組成物が、皮下に投与される。さらなる実施形態では、ミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートおよびその医薬組成物が、卵中に含有されている一方で、トリ胚に卵内投与される。ｓｉＮＡコンジュゲートは、卵の任意の適したコンパートメント（例えば尿膜腔液、卵黄嚢、羊膜、気嚢、または胚の中）に投与されてもよい。
【０１６７】
治療用途のために、薬学的に有効な用量のミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートまたは医薬組成物は、対象に全身的に投与される。薬学的に有効な用量は、発生を予防する、阻害する、または病状を治療（症状をある程度、好ましくは症状の全てを改善）するのに必要とされる用量である。当業者は、例えば、対象のサイズおよび体重、疾患の進行または侵入の程度、対象の年齢、健康、および性別ならびに全身投与経路などの因子を考慮に入れることによって、所与の対象に全身的に投与すべきミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートの治療的に有効な用量を容易に決定することができる。一般的に、負帯電ポリマーの効力に応じて、０．１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の間の活性成分が投与される。最適な投与スケジュールは、患者の体内の薬物蓄積の測定から算出することができる。ミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートは、単回投与または複数回投与で投与することができる。
【０１６８】
一実施形態では、本明細書において記載されるｓｉＮＡコンジュゲートが、約０．１〜約５００ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）の用量で対象に全身的に送達される。別の実施形態では、ｓｉＮＡコンジュゲートが、約１〜約２００ｍｐｋの用量で送達される。別の実施形態では、ｓｉＮＡコンジュゲートが、約１〜約１００ｍｐｋの用量で送達される。別の実施形態では、ｓｉＮＡコンジュゲートが、約５〜約６０ｍｐｋの用量で送達される。別の実施形態では、ｓｉＮＡコンジュゲートが、約１０〜約５０ｍｐｋの用量で送達される。
【０１６９】
ミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートは、月１回、週１回、１日１回（ＱＤ）投与することができる。例えば、１日２回（ＢＩＤ）、１日３回（ＴＩＤ）、２週間ごとに１回など、毎月、毎週または毎日複数回の投与に分割することもできる。従って、投与は単回投与により達成されてもよく、あるいは分割された投与で達成されてもよい。当業者は、測定された体液または組織内の薬物の滞留時間および濃度に基づいて、投与のための反復率を容易に推定することができる。
【０１７０】
さらに、投与は、連続的（例えば、毎日）または間欠的であり得る。例えば、ミオスタチンｓｉＮＡコンジュゲートの間欠投与は、週に１〜６日の投与、周期的な投与（例えば、連続した２〜８週間の毎日の投与、次いで最大１週間までの投与を伴わない休止期間）、あるいは１日おきの投与であり得る。
【０１７１】
エアロゾル組成物は、呼吸可能なサイズの粒子、例えば、吸入の際に鼻、口および喉頭を通過し、かつ気管支および肺胞を通るために十分に小さいサイズの粒子を含む製剤として、呼吸器系に投与することができる。一般的に、呼吸可能な粒子のサイズは約０．５〜１０ミクロンの範囲である。一実施形態では、微粒子の範囲は、１〜５ミクロンであり得る。別の実施形態では、微粒子の範囲は、２〜３ミクロンであり得る。エアロゾル中に含まれる呼吸可能なサイズでない粒子は喉に蓄積して嚥下される傾向にあり、従って、エアロゾル中の呼吸可能でない粒子の量は最小限にされる。経鼻投与の場合、鼻腔内の保持を保証するために１０〜５００ｕｍの範囲の粒径が好ましい。
【実施例】
【０１７２】
提供される実施例は、本発明のさらなる理解を補助することが意図される。使用される特定の材料、種および条件は、本発明の説明となるものであり、その妥当な範囲を限定しないことが意図される。特定の出発材料および試薬は市販されているか、あるいは化学、科学または特許文献において知られている。
【０１７３】
実施例１：Ｍｔｓｎ  ｓｉＲＮＡ
ｓｉＲＮＡ合成  −  ｓｉＲＮＡは、以前に記載されたものと同様の方法によって合成した（Ｗｉｎｃｏｔｔ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：２６７７−８４）。それぞれのオリゴヌクレオチド二重鎖について、個々の相補的センスおよびアンチセンス鎖は、市販で入手可能な自動化オリゴシンセサイザー（ｏｌｉｇｏｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を使用し、制御された多孔性ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）上でなどの固体支持体上で最初に合成した。所望の配列の第１の（３’）ヌクレオチド単位が予め装填された固体担体を入手し、オリゴシンセサイザー用の適切なカラムに入れた。第１のヌクレオチドは、コハク酸結合によって固体担体に連結され、５’末端ヒドロキシル基において適切な酸感受性保護基（トリチル、ジメトキシトリチル）を含有した。固相のオリゴ合成（ｏｌｉｇｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）は、当該技術分野において一般的に知られている合成手順を使用した。所望のオリゴマー配列の伸長は４段階のサイクルを経た：１）５’−トリチル保護基の酸性脱保護；２）Ｓ−エチル−テトラゾールなどの活性化剤の存在下、５’−トリチル（またはジメトキシトリチル）保護ホスホラミダイトとしての次のヌクレオチド単位のカップリング；３）ヨウ素などの酸化剤によるＰ（ＩＩＩ）亜リン酸トリエステルのＰ（Ｖ）リン酸トリエステルへの酸化；および４）無水酢酸などのアシル化剤を用いたエステル化による、残存している任意の未反応アルコール基のキャップ形成。使用したホスホラミダイトは、天然に存在するヌクレオチド単位に由来するか、あるいはこれらのヌクレオチドの化学修飾型に由来した。オリゴヌクレオチド合成サイクルは、最後（５’）のヌクレオチド単位が延長したオリゴマーに導入されるまで続けた。最終サイクルの後、５’−トリチル保護基は、固体担体上にある間に、オリゴヌクレオチドから除去されてもされなくてもよい。いくつかの場合には、酸性溶液による処理によって５’末端トリチルを最初に除去した。
【０１７４】
この脱保護の後、オリゴヌクレオチドを担体から切断し、リン酸におけるシアノエチル保護基を除去し、ヌクレオチド塩基におけるアシル保護基を脱保護するために、メチルアミン水などの適切な塩基で固体担体を処理した。各鎖を固体担体から切断した後、逆相（Ｃ１８）またはイオン交換（ＳＡＸ）樹脂によるクロマトグラフィで各鎖を精製した。通常、オリゴヌクレオチドは、塩化ナトリウムなどの無機塩のグラジエントによりＳＡＸ樹脂から溶出させた。透析または接線流ろ過によって精製サンプルから塩を除去した。
【０１７５】
逆相ＨＰＬＣ、ＳＡＸ  ＨＰＬＣおよびキャピラリーゲル電気泳動を含む適切な方法によって、各精製オリゴヌクレオチドを純度について分析した。オリゴヌクレオチドの同一性は、ＥＳＩまたはＭＡＬＤＩなどのイオン化技術を用いる質量分析により確認した。各オリゴヌクレオチドの収率は、理論的に誘導される吸光係数を用いるＵＶ（２６０ｎｍ）によって評価した。
【０１７６】
対応するセンスおよびアンチセンス鎖は、等モル量の各材料を混合することによりアニールした。各鎖の適切な量は、ＵＶ（２６０ｎｍ）測定および理論的な吸光係数によって近似した。アニールプロセスの後、ＲＰ−ＨＰＬＣまたはＳＡＸなどの適切なクロマトグラフ法により、二本鎖形成の程度、および任意の過剰な一本鎖材料の存在を評価した。適切な場合には、残存する過剰な一本鎖を完全にアニールするために、２つの鎖の一方を付加的な量で用いてサンプルを調整した。最終の二本鎖材料は、さらなる生化学的または生物学的試験のための送達の前に凍結乾燥した。
【０１７７】
細胞および試薬  −  マウス肝癌Ｈｅｐａ  １−６細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｃａｔ＃ＣＲＬ−１８３０）から入手した。細胞は、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ＃１１３６００７０に調整し、１０％ウシ胎児血清を補ったＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ，Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  ｗｉｔｈ  Ｇｌｕｔａｍａｘ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ＃１０５６６０２４）中で成長させた。ストレプトマイシンおよびペニシリンを、それぞれ１００μｇ／ｍＬおよび１００Ｕ／ｍＬで培地に追加した。細胞は、５％ＣＯ２の存在下で３７℃で培養した。
【０１７８】
ルシフェラーゼレポーター構築物の生成  −  ｓｉＲＮＡは、ｐｓｉＣＨＥＣＫ２二重ルシフェラーゼレポーター系を使用してスクリーニングした。使用したルシフェラーゼレポータープラスミドは、ｐｓｉＣＨＥＣＫ２ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ＃Ｃ８０２１）に由来した。デノボ合成を通して、マウスミオスタチン（ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ  ＲｅｆＳｅｑ  ＮＭ＿０１０８３４）の完全長転写物を、ベクターのＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ部位の中にクローニングした。
【０１７９】
ｓｉＲＮＡのインビトロにおけるスクリーニング  −  Ｈｅｐａ１−６細胞を１ウェル当たり１０，０００細胞の密度で９６ウェルプレート中に接種し、３７℃でインキュベートした。２４時間後、細胞に、リポフェクタミン２０００試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃１１６６８０１９）を使用して、ｓｉＲＮＡおよびＭＳＴＮルシフェラーゼレポータープラスミドを同時形質移入した。最初のスクリーニングは、それぞれ１０ｎＭおよび０．６ｎｇ／μＬの最終濃度でｓｉＲＮＡをＭＳＴＮプラスミドと共に同時形質移入することによって実行した。細胞を３７℃でインキュベートし、トランスフェクションの２４時間後に培養培地を新鮮な培地と交換した。さらに２４時間のインキュベーション後、レポーターレニラルシフェラーゼおよびコントロールホタルルシフェラーゼ活性を、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ＃Ｅ２９４０）を使用して測定した。それぞれのウェルのレニラルシフェラーゼ活性は、同じ細胞からのホタルルシフェラーゼ活性によって割り、様々なウェルにわたる様々なトランスフェクション効率について標準化した。Ｍｓｔｎ  ｓｉＲＮＡによって産生された、標準化されたルシフェラーゼ活性は、非ターゲティングコントロールｓｉＮＡによって生成された、標準化されたルシフェラーゼ活性でさらに割り、レポーター発現のノックダウンパーセント（％ＫＤ）を計算した。ＩＣ５０の計算は全て、Ｒ．２．９．２ソフトウェアを用いて実施した。単純なリガンド結合のためのＳ字形用量−反応（可変スロープ）式を用いてデータを分析した。
【０１８０】
結果  −  マウスＭｓｔｎ  ｍＲＮＡ配列を標的にする４つの特有の非コンジュゲートｓｉＲＮＡおよび非ターゲティングコントロールｓｉＲＮＡを合成した。４つのＭｓｔｎ  ｓｉＲＮＡの標的ヌクレオチド配列を表２ａ（「標的配列」）に示す。
【０１８１】
【表２】
0006672156.tif 000003
【０１８２】
【表３】
0006672156.tif 000004
【０１８３】
Ｍｓｔｎ  ｓｉＲＮＡおよび非ターゲティングコントロールｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を表３に示す。表３の二本鎖ｓｉＲＮＡ分子は、センス鎖（パッセンジャー鎖としても知られている）およびアンチセンス鎖（ガイド鎖としても知られている）を含有し、各鎖は２１ヌクレオチド（第１位（５’）〜第２１位（３’））で構成され、内部および末端化学修飾ヌクレオチドの両方を含有する。それぞれのｓｉＲＮＡ分子の名称は、第１列に提供され、分子が標的にされるマウスＭｓｔｎ  ｍＲＮＡ領域に対応する。表３の第２列の「鎖」は、示される行の特定の配列が二本鎖のセンス（Ｓ）であるかアンチセンス（Ａ／Ｓ）鎖であるかを示す。表３の第３列の「５’−第１位ヌクレオチド」は、示されるｓｉＲＮＡ分子のセンスおよびアンチセンス鎖の第１位を記述し、それぞれ、５’キャップ成分の付いたヌクレオチドで構成される。５’−第１位ヌクレオチドのそれぞれの化学構造は以下の表６ａに提供される。ｓｉＲＮＡ分子のセンスおよびアンチセンス鎖のそれぞれの第２〜２０位にわたるヌクレオチド配列は表３の第４列に記載されており、個々のヌクレオチドは、セミコロンによって隔てられている。第４列に示される各ヌクレオチドの化学構造は以下の表６ｂに提供される。表３の第５列の「ヌクレオチド位置２１−３’」はｓｉＲＮＡのセンスまたはアンチセンス鎖の最３’ヌクレオチドを表し、それぞれ、「ｏｍｅＵ−ｉＢ」または「ｏｍｅＵＳｕｐ」によって表される（構造については以下の表６ｃを参照）。表３のｓｉＲＮＡ分子の各鎖（第１〜２１位）の配列番号は第６列に提供される。表３の各ｓｉＲＮＡ分子は、分子の両末端に２つのヌクレオチドから構成される３’オーバーハングを有する。
【０１８４】
【表４】
0006672156.tif 000005
【０１８５】
それぞれのｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ）を、Ｍｓｔｎルシフェラーゼレポータープラスミド（０．６ｎｇ／μｌ）と共に細胞中に同時形質移入し、ルシフェラーゼ活性は、ｍＲＮＡノックダウン（ＫＤ）を反映するものとして４８時間後に測定した。４つのｓｉＲＮＡは、最低９０％のＭｓｔｎ  ｍＲＮＡノックダウンおよび０．０１６ｎＭ未満のＩＣ５０値を示す（表４を参照）。
【０１８６】
【表５】
0006672156.tif 000006
【０１８７】
実施例２：Ｍｔｓｎ  ｓｉＲＮＡコレステロールコンジュゲート
コレステロールコンジュゲーション  −  単一のコレステロール要素を、表３に記載されるそれぞれのｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖の３’末端に付加した。３’末端上にコレステロール単位を有するオリゴヌクレオチドの調製のために、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護第一級アルコールも含有するあらかじめ負荷されたコハク酸コレステロールを有するデオキシシチジリル（ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｙｌｙｌ）−デオキシグアノシン（ＣｐＧ）（構造については以下表６ｄを参照）は、対応するオリゴヌクレオチド配列の合成のために使用した（実施例１を参照）。典型的に、最後の５’−ＤＭＴ保護基は、オリゴ合成の間に除去した。次いで、オリゴヌクレオチドは、メチルアミン水などの塩基性溶液による処理によってＣｐＧから切断し、Ｃ１８などの逆相樹脂を有するクロマトグラフィによって精製した。この精製オリゴは、所望のオリゴヌクレオチド二重鎖を調製するために、その対応する相補鎖にアニールさせた。
【０１８８】
動物  −  雌のＣＤ−１マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから入手し、研究時８〜９週齢であった。マウスは、１２時間の明暗サイクルで維持し、適宜、水および標準固形飼料食餌（ｎｏ．５００１；ＬａｂＤｉｅｔ）を摂取した。コントロールおよび実験コレステロールコンジュゲートｓｉＲＮＡを、示される投薬量で尾静脈注射によってマウスに投与した。動物研究は全て、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって承認されるプロトコルを使用して、Ｍｅｒｃｋ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｉｎ  ａｎ  ＡＡＡＬＡＣ−ａｃｃｒｅｄｉｔｅｄ  Ｗｅｓｔ  Ｐｏｉｎｔ，ＰＡ  ａｎｉｍａｌ  ｆａｃｉｌｉｔｙで行った。
【０１８９】
定量的リアルタイムＰＣＲ分析  −  マウスを屠殺し、組織をＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でホモジナイズし、１−ブロモ−２−クロロプロパン（Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ）中に抽出し、全ＲＮＡは、ＭａｇＭａｘ  ＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して単離した。ＲＮＡ（１２５ｎｇ）は、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃４３６８８１３）を使用して逆転写した。Ｔａｑｍａｎ  ｑＰＣＲ分析は、ＡＢＩ  ７９００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを使用し、ＴａｑＭａｎ  Ｆａｓｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃４４４４５５５）を使用して実行した。Ｔａｑｍａｎプローブおよびプライマーは全て、あらかじめ検証されたセットとしてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した：ｍｏｕｓｅ  ＰＰＩＢ  Ａｓｓａｙ  ＩＤ  Ｍｍ００４７８２９５＿ｍ１；ｍｏｕｓｅ  Ｍｓｔｎ  Ａｓｓａｙ  ＩＤ  Ｍｍ０１２５４５５９＿ｍ１。Ｔａｑｍａｎデータ分析は、以前に記載されるように、ＡＢＩ  ７９００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍで実行した（Ｔａｄｉｎ−Ｓｔｒａｐｐｓ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．５２：１０８４−１０９７）。
【０１９０】
ミオスタチンタンパク質の血清分析  −  血液は、尾静脈収集によって収集し、血清は、特定の時点で収集し、ＧＤＦ−８／Ｍｙｏｓｔａｔｉｎ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ、Ｃａｔ＃ＤＧＤＦ８０）を使用して分析した。簡潔に言えば、血清サンプルは、最終的な活性化血清サンプルをアッセイ前にキャリブレーター希釈剤中でさらに１：２に希釈した以外は、メーカープロトコルに記載されるように活性化した。
【０１９１】
結果  −  ＣＤ−１マウスにおけるインビボ効能研究は、それぞれがセンス（パッセンジャー）鎖の最３’ヌクレオチドで単一のコレステロール要素にコンジュゲートされる表３の４つのＭｓｔｎ  ｓｉＲＮＡ分子を使用して実行した。マウスに、１５ｍｐｋ  ｓｉＲＮＡを静脈内注射し、Ｍｓｔｎ  ｍＲＮＡノックダウンを７２時間後に腓腹筋において評価した（図１Ａおよび１Ｂ）。Ｍｓｔｎ発現の低下は、とりわけＭｓｔｎ：１１６９およびＭｓｔｎ：１１６７コレステロールコンジュゲートで見られた。Ｍｓｔｎ：１１６９コレステロールコンジュゲートを、追跡調査によるｓｉＲＮＡの最適化および機能研究における使用のために選択した。
【０１９２】
Ｍｓｔｎ：１１６９コレステロールコンジュゲートの効力および効能について検査するために、マウスを、５、１５、および５０ｍｐｋでのコンジュゲートの単回注射により治療した。Ｍｓｔｎ  ｍＲＮＡおよび循環タンパク質レベルを、様々な時点で測定した（図２）。Ｍｓｔｎ：１１６９コレステロールによる治療は、腓腹筋（図２Ａ）、三頭筋（図２Ｂ）、およびＥＤＬ（図２Ｃ）筋肉においてＭｓｔｎ  ｍＲＮＡの投与依存的なノックダウンを引き起こし、５ｍｐｋおよび５０ｍｐｋ用量の間で効力における８倍を超える差を示した。最大のノックダウン（ＫＤ）は、７日目に５０ｍｐｋ用量で観察され、３つの筋肉全てにおいて９０〜９５％のｍＲＮＡノックダウンおよび循環タンパク質レベルの７５％のノックダウンを示した（図２Ｄ）。５０ｍｐｋ  ｓｉＲＮＡによるＭｓｔｎ遺伝子サイレンシングは、混合繊維状筋肉である腓腹筋、三頭筋、および脊柱僧帽筋（データを示さず）においてならびに主にＩＩ型の繊維状筋肉であるＥＤＬ筋肉において８８〜９５％のＫＤがあった。Ｍｓｔｎ  ｍＲＮＡノックダウン効果は、ヒラメ筋において、この筋肉における低いＭｓｔｎ  ｍＲＮＡレベルにより、決定することができなかった（データを示さず）。Ｍｓｔｎ  ｓｉＲＮＡはまた、サイレンシングの持続時間の延長も示し、５０ｍｐｋ投薬後、２１日間、９０〜９５％のｍＲＮＡ  ＫＤおよび６５％の血清Ｍｓｔｎタンパク質レベルを維持する。それぞれ血清ＡＬＴ／ＡＳＴおよび筋肉クレアチンホスホキナーゼをモニターすることによって決定されるように、検査した全ての用量で肝毒性および筋肉損傷の証拠はなかった（データを示さず）。
【０１９３】
実施例３：長期Ｍｓｔｎノックダウンは、筋肉サイズを増加させ、筋疲労プロファイルを改変する
体組成  −  動物の体組成は、除脂肪量／体脂肪量を決定するために、ＥｃｈｏＭＲＩ機器（Ｅｃｈｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）を使用し、定量的磁気共鳴分光法によって測定した。測定は、ｓｉＲＮＡ投薬の開始の２０日後に行った。
【０１９４】
マイクロＣＴ画像処理およびデータ分析  −  ＬａＴｈｅｔａ  ｍｉｃｒｏ−ＣＴ（ＬａＴｈｅｔａ  ＬＣＴ−１００Ａ（商標）、Ａｌｏｋａ、Ｅｃｈｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）を使用して、階層状の１０枚の切片を、膝および腓骨−脛骨接合部の間でスキャンした。画像は、下腿における全筋肉のうち最大横断面積（ＣＳＡ）を見つけるために、以前に記載されるように分析した（Ｗｅｂｅｒ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２：２０８７−９８）。マウスは、ｓｉＲＮＡ投薬を基準にして−１日目にスキャンし、３、７、１４、および２１日目にもスキャンした。
【０１９５】
インサイチュ筋肉機能アッセイ  −  以前に記載される（Ｗｅｂｅｒ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．、上記を参照）特注で作ったインサイチュアッセイ系を、ｓｉＲＮＡ投薬の２１日後に実行した。簡潔に言えば、麻酔をかけた動物のアキレス腱を、複合サーボモーター／力トランスデューサーユニットのレバーに接続した。下腿の筋肉を刺激して収縮させるために、電気インパルスを坐骨神経を介して加え、一方、結果として生じる力を記録した。１００Ｈｚでの０．１ミリ秒の持続時間の４ｍＡ方形波を含有する５０ミリ秒の長さの連続テタヌス刺激を、３００秒間０．８Ｈｚの周波数で反復させた。０．１Ｎの一定のベースラインテンションを刺激の間に回復させた。インサイチュアッセイの終了後、後肢の筋肉を、計量および組織学的検査のために収集した。
【０１９６】
最大筋力（Ｆｍａｘ）、中間筋力（Ｆｏ）、最小筋力（Ｆｍｉｎ）、初期疲労筋力（Ｆｍａｘ−Ｆｏ）、後期疲労筋力（Ｆｏ−Ｆｍｉｎ）、初期疲労（Ｓ１）および後期疲労（Ｓ２）の最大の傾き、ならびに初期（τ１）および後期疲労（τ２）筋力の時定数を含む疲労包絡線を表すいくつかのパラメーターを、二重Ｓ字形曲線フィットから抽出した。
【０１９７】
脛骨長の測定  −  マウスを屠殺した後に、それぞれの後肢を一晩、７０％エタノール中で保存した。翌日、脚を筋肉および組織から取り外し、長さをデジタルキャリパーを使用して測定した。
【０１９８】
筋繊維のサイズおよび数の定量化  −  筋線維細胞のサイズを検出するために、ラミニン染色を、ｓｉＲＮＡ／コントロール治療の２１日後に腓腹筋に対して実行した。腓腹筋の最も広い領域を通って作製した横断面を、一晩、１０％ホルマリン中で固定した。筋肉をパラフィン包埋し、標準的な方法によって薄片を作った（５μｍ）。ＢｉｏＧｅｎｅｘ  ＥＺ−Ｒｅｔｒｉｅｖｅｒ  Ｍｉｃｒｏｗａｖｅを使用し、１０分間、１０３℃で、クエン酸バッファー（ＥＺＡＲ１、ＢｉｏＧｅｎｘ＃ＨＪ５２１−ＸＡＫ）を使用して切片を熱誘発抗原賦活化にかけた。ＰＢＳ洗浄後、切片を、１：１００希釈のポリクローナルウサギ抗ラミニン抗体（Ａｂｃａｍ、ｃａｔ＃ａｂ１１５７５）と１時間室温でインキュベートした。ヤギ抗ウサギＡ５５５免疫蛍光二次抗体を、さらにＰＢＳ洗浄した後に加え（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃Ａ２１４２９）、スライドを、Ｄａｐｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃Ｐ３６９３５）と共にＰｒｏｌｏｎｇＧｏｌｄを使用してマウントした。画像は、Ｈａｍａｍａｔｓｕ  ＯＲＣＡ−Ｒ２  ｃａｍｅｒａおよびｃｅｌｌＳｅｎｓ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  １．７  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用して、ＢＸ−６３  Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ上で取り込んだ。筋線維面積および線維の総数は、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して、筋肉横断面上で定量化した。焦点の合っていない領域は、画像の細分化前に分析から排除した。多重解像度アルゴリズムは、残りの筋肉切片における筋線維および筋内膜を抽出するために使用した。線維面積は、１２００〜７０００細胞数／マウスの１グループ当たり１２匹のマウスから決定した。平均線維サイズおよび筋線維のサイズ度数分布を示す。
【０１９９】
結果  −  Ｍｓｔｎが筋肉の成長において主な阻害性の役割を有することが知られているため、筋肉量および機能に対するＭｓｔｎサイレンシングの効果を検査した。最大のＭｓｔｎノックダウンを実現するために、マウスを、単回ｉ．ｖ．５０ｍｐｋ用量のＭｓｔｎ：１１６９−ｓｉＲＮＡコレステロールコンジュゲート（上記実施例１および２を参照）またはコントロールにより治療した。２１日後、Ｍｓｔｎ  ｓｉＲＮＡコンジュゲートにより治療したマウスは、腓腹筋、ＥＤＬ、四頭筋、三頭筋、および脊柱僧帽筋において８５〜９０％のＭｓｔｎ  ｍＲＮＡノックダウンを示した（図３Ａ）。そのうえ、Ｍｓｔｎタンパク質の循環レベルは、２１日目の終わりまで＞６５％の低下で持続した（図３Ｂ）。筋肉サイズは、投薬の３、７、１４、および２０日後にマイクロＣＴによってマウスの両方の後肢においてモニターした。足底屈筋群を代表するそれぞれの脚についての最大横断面積（ＣＳＡ）を、特注のＭＡＴＬＡＢおよびＤｅｆｉｎｉｅｎｓ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ  ＸＤのソフトウェアアルゴリズムを使用して、一連の１０枚の切片を定量化することによって決定した。定量化の結果は、投薬の開始の早くも３日後の全身性Ｍｓｔｎ  ｓｉＲＮＡコレステロール治療による筋肉のサイズの著しい増加および２１日目までの脚の筋肉のサイズの２０％までの増加を示す（図３Ｃ）。このデータは、２１／２２日目の腓腹筋の重量によって支持され、これはまた、コントロールマウスと比較して、Ｍｓｔｎ−ｃｈｏｌ治療によって、安静にしたおよび運動させた腓腹筋の両方の重量の約２０％の増加も示す（図３Ｄ）。腓腹筋の横断面のラミニン免疫蛍光染色は、平均線維横断面積が増加したことを示し、一方、線維の総数は、Ｍｓｔｎ−ｃｈｏｌ治療の影響を受けなかった（図３Ｅ、平均線維面積；図３Ｆ、平均線維数；図３Ｇ、サイズの度数分布）。Ｍｓｔｎ  ｓｉＲＮＡコレステロールコンジュゲートにより治療したマウスにおいて観察される筋肉サイズの著しい増加に加えて、体重測定値はまた、２０日目までにおよそ１０％の増加も示す（図３Ｈ）。体組成分析は、定量的ＮＭＲによって決定されるように、体重のこの増加が、除脂肪量の増加に起因することを明らかにする（図３Ｉ）。
【０２００】
ＭｓｔｎのｓｉＲＮＡ媒介性の遺伝子サイレンシングの結果として骨格筋の強度および繊維状組成に対する潜在的変化を評価するために、運動に対する筋疲労応答を、反復等尺性収縮を電気刺激によって誘発するインサイツ筋肉機能アッセイにおいてアッセイした。骨格筋が、様々な収縮特性および特異なエネルギー源使用法を示す様々な繊維型から構成されるため、筋肉の性能の変化は、以前に記載されるように、筋疲労曲線におけるいくつかの機能的なパラメーターの変化によって決定することができる（Ｗｅｂｅｒ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，２０１２、上記）。簡潔に言えば、疲労曲線は、筋疲労の３つの段階：初期疲労、後期疲労、および非疲労段階を示す（図４）。「初期疲労」は、Ｆｍａｘ−Ｆ０によって示され、ＩＩｂ型線維を表し、ＩＩｂ型線維は、強く、速く、非常に急速に疲労し、エネルギー源としてクレアチンリン酸を使用する。この段階に、ＩＩａ／ｘ型線維を主として表す「後期疲労」（Ｆ０−Ｆｍｉｎ）が続き、ＩＩａ／ｘ型線維は、強く、速く、より疲労抵抗性であり、エネルギー源としてグリコーゲンを使用する。疲労曲線の最終段階は、Ｉ型線維が目立つ「非疲労」段階（Ｆｍｉｎ）であり、Ｉ型線維は、弱く、遅く、非疲労性であり、エネルギー源として脂肪酸を使用する。
【０２０１】
Ｍｓｔｎノックダウンは、ＦｍａｘおよびＦ０の増加をもたらすが、Ｆｍａｘ−Ｆ０が変わらないため、「初期疲労」段階は影響を受けない（図５Ａ）。Ｆｍｉｎの有意な変化はないが、Ｆ０−Ｆｍｉｎは増加し、収縮力の増加を表す「後期疲労」の増加を示唆する。このデータは、Ｍｓｔｎノックダウンが、線維のサイズ、数量、および／または強度の潜在的な増加により、ＩＩａ／ｘ型線維の変化をもたらすことを示唆する。そのうえ、疲労段階のタイミング（τ１、τ２、Ｓ１、Ｓ２）に関連するパラメーターのいずれにおいても変化がなく、燃料利用率および使用法は影響を受けないことを示唆する。
【０２０２】
筋肉の質に対する変化を決定するために、「比筋力」を、横断面積（ＣＳＡ）に対する筋肉収縮力の標準化によって計算した（図５Ｂ）。Ｍｓｔｎノックダウンに応じた比筋力または任意のさらなる機能的パラメーターにおいて有意差はなく、筋肉の質に対する影響がないことを示唆した。
【０２０３】
骨格筋に加えて、心臓もまた、程度は低いが、Ｍｓｔｎを発現することが報告された（Ｓｈａｒｍａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１８０：１−９）。そのため、心臓を、潜在的Ｍｓｔｎノックダウンについて検査した。定量的ＰＣＲは、心臓において非常に低いＭｓｔｎ  ｍＲＮＡ発現を示し（Ｃｔ値、３２〜３５、データを示さず）、そのため、ｍＲＮＡノックダウンを決定することができなかった。げっ歯動物Ｍｓｔｎノックアウトモデルにおけるまたは小分子または中和抗体によるＭｓｔｎ阻害に応じた心臓サイズの変化についての多くの報告があるが、観察は様々であり、いくつかは心肥大を報告し、他の報告は心臓サイズが変わらないことを報告する（Ａｒｔａｚａ，Ｊ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１９４：６３−７６；Ｍｏｒｉｓｓｅｔｔｅ，Ｍ．Ｒ．，２００６，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９９：１５−２４；Ｒｏｄｇｅｒｓ，Ｂ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５８７：４８７３−８６；Ｗｈｉｔｔｅｍｏｒｅ，Ｌ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３００：９６５−７１）。２１日間のＭｓｔｎノックダウン後の心肥大のサインを入手するために、心臓を、計量し、様々なパラメーターに対して標準化した（図６）。Ｍｓｔｎノックダウンは、心臓重量の著しい増加をもたらした。心臓重量を、変わらないことが予想されるパラメーターである脛骨の長さに対して標準化した場合、Ｍｓｔｎ  ｓｉＲＮＡ−コレステロールにより治療したマウスは、心臓重量の著しい増加を示し続ける。しかしながら、心臓重量を体重（ＢＷ）または除脂肪量に対して標準化した場合、心肥大は、もはや観察されず、心臓サイズの増加が、Ｍｓｔｎノックダウンから結果として生じるＢＷの増加に対して代償性のものであることを示唆する。
【０２０４】
実施例４：筋肉におけるコレステロールコンジュゲートの取込みのメカニズム
ｓｉＲＮＡ合成  −  ｓｉＲＮＡは、上記実施例１において記載されるように合成した。この実施例において使用される２つのＣｔｎｎｂ１  ｓｉＲＮＡの配列を表５に示す（５’〜３’方向）。非ターゲティングコントロールｓｉＲＮＡもまた、使用した（上記実施例１および２の「プラセボ５」を参照）。それぞれの列の内容は、上記表３に提供されるものと同じである。
【０２０５】
【表６】
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【０２０６】
動物  −  雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型ＬＤＬ受容体−／−およびＡｐｏＥ−／−マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手し（それぞれＳｔｏｃｋ＃００２２０７、００２０５２）、研究時２５〜２７週齢であった。雌のＣＤ−１マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから入手し、研究時８〜９週齢であった。マウスは全て、１２時間の明暗サイクルで維持し、適宜、水および標準固形飼料食餌（ｎｏ．５００１；ＬａｂＤｉｅｔ）を摂取した。コントロールおよび実験コレステロールコンジュゲートｓｉＲＮＡを、示される投薬量で尾静脈注射によってマウスに投与した。血液は、採取時に心臓穿刺によって収集した。組織サンプルは、投薬後に特定の時点で収集した。動物研究は全て、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって承認されるプロトコルを使用して、Ｍｅｒｃｋ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｉｎ  ａｎ  ＡＡＡＬＡＣ−ａｃｃｒｅｄｉｔｅｄ  Ｗｅｓｔ  Ｐｏｉｎｔ，ＰＡ  ａｎｉｍａｌ  ｆａｃｉｌｉｔｙで行った。
【０２０７】
結果  −  筋肉におけるコレステロールコンジュゲートの取込みの潜在的なメカニズムおよびリポタンパク質粒子とのコンジュゲートの関連が取込みに必要とされるかどうかを検査するために、パッセンジャー鎖の３’または５’末端に付加された単一のコレステロール要素を有するＣｔｎｎｂ１  ｓｉＲＮＡ分子の効能を、野生型、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）−／−、およびＡｐｏＥ−／−マウスにおいて検査した。マウスは、１４ｍｐｋでのＣｔｎｎｂ１：１７９７［３’Ｃｈｏｌ］ｓｉＲＮＡの単回ｉ．ｖ．注射により治療し、Ｃｔｎｎｂ１  ｍＲＮＡを、７２時間後に腓腹筋において測定した（図７Ａ）。最大６０％のｍＲＮＡノックダウンが、ｗｔマウスにおいて観察された。ＡｐｏＥ−／−マウスにおいてｍＲＮＡ  ＫＤの低下があり（５０％のＫＤ）、ＬＤＬＲ−／−マウスにおいてＫＤの低減の傾向がある。データは、Ｃｔｎｎｂ１コレステロールコンジュゲートの取込みが、筋肉においてＬＤＬ受容体を通してまたは任意のＡｐｏＥ含有リポタンパク質を介して部分的にだけ媒介されることを示唆する。
【０２０８】
パッセンジャー鎖上のコレステロールの位置がコレステロールコンジュゲートの効能にとって本質的かどうかを決定するために、パッセンジャー鎖の３’または５’末端上にコレステロールを有するＣｔｎｎｂ１−ｃｈｏｌコンジュゲートをインビボにおいて検査した（図７Ｂ）。ＣＤ−１マウスを、１５ｍｐｋの一方のバージョンのＣｔｎｎｂ１−ｃｈｏｌにより治療し、３’位にコレステロールを有するＰＢＳコントロールおよびプラセボ５−ｃｈｏｌと比較した。Ｃｔｎｎｂ１  ｍＲＮＡレベルは、注射の７２時間後に腓腹筋において検査した。データは、筋肉において非常に効果的なコレステロールコンジュゲートを作成するために両方の位置を使用することができることを示唆する。
【０２０９】
実施例５：本明細書において例証されるｓｉＲＮＡ分子を生成するために使用される化学修飾ヌクレオチドの化学構造
【０２１０】
【表７】
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【０２１１】
【表８】
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【０２１２】
【表９】
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【０２１３】
【表１０】
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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