(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分離試薬と検出試薬を含むα−フェトプロテイン変異体ＡＦＰ−Ｌ３を分離検出するための、分離試薬及び検出試薬の組み合わせであって、
前記分離試薬は、レクチンを結合した磁性粒子と溶離液とを含み、
前記レクチンを結合した磁性粒子は、被検サンプルにおけるＡＦＰ−Ｌ３と特異的に結合するためのものであり、
前記レクチンはレンズマメレクチン又はコンカナバリンであり、
前記磁性粒子は、磁性粒子表面に高分子成分が被覆されており、前記高分子成分は樹脂であり、
前記レクチンは、前記磁性粒子を被覆する前記高分子成分に結合しており、
前記検出試薬は、抗α−フェトプロテイン抗体が被覆された磁性粒子及び酵素標記された抗α−フェトプロテイン抗体を含み、
前記抗α−フェトプロテイン抗体はα−フェトプロテインに対するモノクローナル抗体であり、
前記分離試薬及び検出試薬の組み合わせは、カードに収納して提供されており、
前記カードは、サンプル孔、前記レクチンを結合した磁性粒子を収納した試薬槽、前記溶離液を収納した試薬槽、前記抗α−フェトプロテイン抗体が被覆された磁性粒子を収納した試薬槽、前記酵素標記された抗α−フェトプロテイン抗体を収納した試薬槽、及び反応孔を含むことを特徴とする、分離試薬及び検出試薬の組み合わせ。
【請求項２】
前記分離試薬はさらに保護液を含み、及び／又は、前記検出試薬はさらに緩衝液を含むことを特徴とする請求項１に記載の分離試薬及び検出試薬の組み合わせ。
【請求項３】
前記分離試薬及び／又は前記検出試薬はさらに洗浄液を含むことを特徴とする請求項１又は２のいずれか１項に記載の分離試薬及び検出試薬の組み合わせ。
【請求項４】
請求項１−３のいずれか１項に記載の分離試薬及び検出試薬の組み合わせを含むことを特徴とするα−フェトプロテイン変異体の分離検出キット。
【請求項５】
α−フェトプロテイン変異体の分離検出システムであって、
液体から磁性粒子を分離する磁気分離モジュールと、
α−フェトプロテイン変異体の含有量とα−フェトプロテインの含有量を検出する検出モジュールと、
α−フェトプロテインに対するα−フェトプロテイン変異体の比を計算するデータ処理モジュールと、
請求項１−３のいずれか１項に記載の分離試薬及び検出試薬の組み合わせ又は請求項４に記載のキットと、を備え、
前記磁気分離モジュールは、前記分離試薬及び検出試薬の組み合わせにおける分離試薬と組み合わせて、α−フェトプロテイン変異体を分離するものであり、
前記検出モジュールは、前記分離試薬及び検出試薬の組み合わせにおける検出試薬と組み合わせて、α−フェトプロテイン変異体の含有量とα−フェトプロテインの含有量を検出するものである、
分離検出システム。
【請求項６】
α−フェトプロテインの含有量を測定する場合、前記磁気分離モジュールを分離試薬と組み合わせず、被検サンプルにおけるα−フェトプロテインの含有量を検出し、
α−フェトプロテイン変異体の含有量を測定する場合、前記磁気分離モジュールで被検サンプルにおけるα−フェトプロテイン変異体を分離し、前記検出モジュールで被検サンプルにおけるα−フェトプロテイン変異体の含有量を検出し、
α−フェトプロテイン変異体が占める百分率を測定する場合、前記磁気分離モジュールで被検サンプルにおけるα−フェトプロテイン変異体を分離し、前記検出モジュールで被検サンプルにおけるα−フェトプロテイン変異体の含有量とα−フェトプロテインの含有量を検出し、前記データ処理モジュールでα−フェトプロテイン変異体が占める百分率を計算することを特徴とする請求項５に記載の分離検出システム。
【請求項７】
請求項１−３のいずれか１項に記載の分離試薬及び検出試薬の組み合わせ、請求項４に記載のキット、あるいは、請求項５又は６に記載の分離検出システムを用いた、α−フェトプロテイン変異体の分離検出方法。
【請求項８】
請求項１−３のいずれか１項に記載の分離試薬及び検出試薬の組み合わせ、請求項４に記載のキット、あるいは、請求項５又は６に記載の分離検出システムを用いてサンプルにおけるα−フェトプロテイン変異体を分離・検出するα−フェトプロテイン変異体の分離検出方法であって、
レクチンで標記された磁性粒子を、前記サンプルと接触させることによってα−フェトプロテイン変異体ＡＦＰ−Ｌ３と結合する分離ステップと、
前記磁性粒子を分離してα−フェトプロテイン変異体ＡＦＰ−Ｌ３を溶離する溶離ステップと、
ＡＦＰに対する免疫測定方法によってα−フェトプロテイン変異体ＡＦＰ−Ｌ３を検出する検出ステップと、を含み、
前記ＡＦＰに対する免疫測定方法は磁性粒子化学発光方法であることを特徴とする分離検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α−フェトプロテイン変異体の分離検出用組成物、システム、方法及び応用に関し、さらに、α−フェトプロテイン変異体の分離検出キットに関し、医療機器及び体外診断の分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ＨＣＣ）は世界的に４位と考えられる悪性腫瘍であり、肝細胞癌は、毎年、約２５００００名の患者の死亡を引き起こし、その発病メカニズムについては、今までも不明であり、臨床的に悪性度が高く、消化管悪性腫瘍のうち、その死亡率が第３位である。したがって、早期発見と早期治療は肝細胞癌患者の生存率を向上させるのに大切なことである。しかしながら、ほとんどの患者は診断される時に中期や末期まで発展して、最適な治療チャンスが失われてしまう。肝細胞癌の危険因子は、Ｂ型肝炎ウイルスとＣ型肝炎ウイルスによる慢性肝炎と肝硬変を含む。効果的に治療するために行われる肝細胞癌のスクリーニングと検出の臨床上の効率が早期診断に依存する。ＨＣＣは腫瘍病因学の重要なタイプであり、肝硬変、ウイルス性肝炎、発がん性化学物質や環境要因等に起因する慢性肝損傷でＨＣＣを誘発する可能性がある。ＨＣＣは悪性度が高く、再発及び転移が発生しやすく、予後が悪く、且つ早期診断しにくく、最適な治療期間が失われやすい。
【０００３】
α−フェトプロテイン（ａｌｐｈａｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＡＦＰ）は糖タンパク質の１種であり、現在、血液中のＡＦＰ含有量を検出することは肝細胞癌を診断するための一般的な手段である。ＡＦＰは哺乳動物の胎生期において肝実質細胞と卵黄嚢細胞から合成するものであり、内胚葉由来の胃腸粘膜細胞からも少量合成が可能である。一般的に、ＡＦＰは主に胎児循環に存在し、胎児の発育・成熟に伴って、ＡＦＰの合成が徐々に減少する。新生児の出産時の血清中のＡＦＰ濃度が１０〜１００ｎｇ／ｍｌに達し、出産してから１年間後、成人のような正常レベル（２０ｎｇ／ｍｌ未満）に低下する。新生児のＡＦＰが大幅に上昇すると、新生児肝炎、先天性胆道閉鎖症又はＡＦＰを分泌可能な胚性悪性腫瘍に罹患することが示される。ＡＦＰは、早期肝癌診断指標として、肝疾患や肝硬変疾患に罹った患者でも陽性結果がかなりの比率を占めるという欠点がある。かなりの数の慢性肝疾患患者ではＡＦＰの若干増加（２０〜２００ｎｇ／ｍ１）が見られ、肝硬変患者では１１．７−４４％がＡＦＰ陽性を示す。従って、良性肝疾患と悪性肝腫瘍を区別する際に、ＡＦＰの早期肝癌スクリーニング指標としての価値は大幅に下がる。
【０００４】
ＡＦＰ変異体の糖鎖の構造の多数はまだ不明である。今のところ、いわゆるＡＦＰ変異体は実際にレンズマメレクチン（ＬＣＡ）と結合したＡＦＰ−Ｌ３であると考えられる。１９９９年の第四回全国肝癌学術会議で、ＡＦＰ−Ｌ３は原発性肝細胞癌の臨床診断基準における肝細胞癌マーカーの１つとされている。２０１１年の『中国肝癌診療規範』では、ＡＦＰ−Ｌ３を肝細胞癌を診断するための特異的指標としている。長年にわたり、ＡＦＰ−Ｌ３はα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）単独より特異性の高い原発性肝細胞癌指標として認められている。
【０００５】
ＡＦＰ−Ｌ３は患者肝臓における癌細胞から生成する唯一なタンパク質である。カナダと米国の複数施設で行われた二重盲検方法を用いたプロスペクティブ長期臨床試験では、ＡＦＰ−Ｌ３を用いた肝細胞癌検出方法が研究された。その結果、ＡＦＰ−Ｌ３が上昇する（１５％以上）患者は、以降の２１ヶ月では肝細胞癌に罹るリスクが７倍上がる。既存の『肝細胞癌腫瘍学実践マニュアル』によれば、これら患者の肝細胞癌発生率が極端に増加する。
【０００６】
ＡＦＰ変異体検出の臨床的意義：
１）肝細胞癌と良性肝疾患を区別する。原発性肝細胞癌患者は一般的にＡＦＰが上昇するものの、多数の良性肝臓疾患もＡＦＰ上昇を伴うため、ＡＦＰ検出結果だけによっては良性肝疾患と悪性病変が区別しにくいことがある。このため、ＡＦＰ変異体検出は良好な臨床的意義を示し、特に、ＡＦＰ含有量が３０−４００ｎｇ／ｍｌの患者にとっては有用である。Ｓａｔｏ等は３６１名のケースについてプロスペクティブ研究（Ｅａｒｌｙ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｐｒｏ  ｌｅｓ  ｏｆ  ａｌｐｈａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ．Ｓａｔｏ、Ｙ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３２８、１８０２−１８０６、１９９３）を行い、具体的には、３６１名の慢性Ｂ型肝炎やＣ型肝炎に罹った患者のＡＦＰ−Ｌ３％を検出し且つ３５ヶ月にわたってフォローアップした。研究期間において、ＡＦＰ−Ｌ３％が基準値より高い３３名の患者のうち、２４名（７３％）は肝癌まで発展してしまう。ＡＦＰ−Ｌ３％は肝癌患者と肝硬変患者を区別する指標として有用であるとともに、画像診断より３−１８ヶ月早い予測指標でもある。
２）肝細胞癌術後のモニタリング。肝細胞癌の切除術を受けると、血清中のＡＦＰ含有量が低下し、その低下速度が体内のＡＦＰ残留量及び半減期によるが、一般的には２ヶ月内で陰性になり、陰性になるとＡＦＰ変異体も消える。ＡＦＰは著しく低下するが陰性にならず、変異体には有意的な変化がない場合、手術が徹底的ではなく、縁部の残留、血管腫瘍栓、衛星結節や転移等が存在する可能性があることを示す。また、ＡＦＰの全含有量に占めるＡＦＰ変異体の百分率が２５％以下に低下し、ＡＦＰと変異体の濃度が比較的に安定することは、患者の肝炎又は肝硬変による可能性がある。
３）胚の発育異常及び胎児の先天性疾患。普通、妊娠期において母体血清中のＡＦＰと胚中のＡＦＰがバランスを取った状態であるが、一旦胎児の奇形や胎盤関門の異常が発生したら、胎児血清が羊水に滲入し又は羊水が母体血清に滲入して、母体羊水や血清のＡＦＰを急激に向上させる可能性がある。ところが、ＡＦＰの総量だけを測定することは局限性がある。実験によれば、神経管欠損、無脳症や脊椎披裂等、肝芽腫、胆道閉鎖症、性腺腫瘍、悪性奇形腫等の場合にもＡＦＰ及び／又はＡＦＰ変異体の陽性を示す可能性がある。
【０００７】
従来、ＡＦＰ変異体用の検出方法としては、フィトアグルチンアフィニティークロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、アフィニティーブロッティング法、交叉親和性免疫電気泳動法等があり、これら方法のいずれもＡＦＰ−Ｌ３タンパク質を直接分離して定量的に推算することができ、最終検出方法に応じて、以下に大別される。
クマシーブリリアントブルー法：電気泳動後のサンプルをクマシーブリリアントブルーで直接染色し、溶離してピークバンドを観察する。この方法はシンプルである一方、干渉因子が多く、感度が約１０００ｎｇ／ｍｌである。
【０００８】
酵素標記法：ペルオキシダーゼで標記された抗体と電気泳動後のサンプルを一緒にインキュベーションし、リンスした後、ジアミノベンジジンで発色させる。検出感度は、５０ｎｇ／ｍｌに向上する。
イムノゴールド銀染色法：電気泳動後のサンプルを黄色ブドウ球菌プロテインＡ２コロイド金とともに直接インキュベーションし、次に銀発色液で発色させる。得られたピークバンドは明瞭で、感度は３２ｎｇ／ｍｌに達する。
オートラジオグラフィー法：中国では、従来の一般的な検出方法であって、感度が３１ｎｇ／ｍｌに達する。その原理としては、レクチン含有ゲルにおいてサンプルに分離電気泳動を行い、次にヨウ素１２５マーカーを含有するＡＦＰを添加して電気泳動を行い、その後、抗ＡＦＰ抗体のゲルに加えて二次電気泳動を行い、電気泳動が終了した後、ゲルを乾燥させて、Ｘ線フィルムを被覆して露光させて、現像する。実験操作は複雑であり、現在、国内の少数の臨床実験室しかＡＦＰ変異体を測定できず、ＡＦＰ変異体の臨床測定による要件を満たす都市が少なく、さらに関連試薬は中国製のものがなかった。
【０００９】
また、従来、中国では、ＡＦＰ−Ｌ３を分離する方法として、主に遠心管分離方法が使用されている。該方法は、アガロース結合ＬＣＡを用いて、遠心方法によりＡＦＰ−Ｌ３を分離し、次にＡＦＰ検出試薬で検出する。遠心管分離方法は、中国で食品医薬品局により承認されるＡＦＰ−Ｌ３百分率検出への応用に適用する唯一な方法である。
【００１０】
α−フェトプロテイン変異体が占める百分率の従来の測定法は、手動操作工程が多くて、ステップが煩瑣で、必要な関連装置が多く、時間がかかり、さらに自動化が実現できず、従って、ハイスループットのサンプル検出ができないだけではなく、手動操作による影響が大きく、検出結果のばらつきが生じる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従来技術の欠陥を克服するために、本発明は、α−フェトプロテイン変異体の分離検出用組成物、システム、方法及び応用を提供し、血液サンプルにおけるα−フェトプロテイン変異体の含有量とα−フェトプロテインの含有量を検出することによって、α−フェトプロテイン変異体の百分率を取得する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明で提供したα−フェトプロテイン変異体ＡＦＰ−Ｌ３の分離検出用組成物は、分離試薬と検出試薬を含み、前記分離試薬は、レクチンを結合した磁性粒子と溶離液とを含み、前記レクチンを結合した磁性粒子は、被検サンプルにおけるＡＦＰ−Ｌ３と特異的に結合するためのものであり、前記検出試薬は、抗α−フェトプロテイン抗体が被覆された磁性粒子と酵素標記された抗α−フェトプロテイン抗体を含む。
【００１３】
一好適な実施形態において、前記抗α−フェトプロテイン抗体はα−フェトプロテインに対するモノクローナル抗体である。より好ましい実施形態において、前記抗α−フェトプロテイン抗体は、Ｓｉｇｍａ社製の製品番号Ａ８４５２の抗α−フェトプロテインモノクローナル抗体、又はＳｉｇｍａ社製の製品番号ＨＰＡ０２３６００の抗α−フェトプロテイン抗体である。
【００１４】
一好適な実施形態において、前記分離試薬はさらに、分離試薬の安定性及び分離効率を向上させるための保護液を含む。好ましくは、前記保護液は０．０２Ｍ  ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ（ｐＨ７．４）及び０．１Ｍ  Ｄ−マンノシドである。
【００１５】
一好適な実施形態において、前記検出試薬はさらに、検出試薬の安定性、検出感度及び検出特異性を向上させるための緩衝液を含む。好ましくは、前記緩衝液は０．０２Ｍ  ＰＢＳ、１０％子ウシ血清、０．１％ｐｒｏｃｌｉｎ−３００である。
【００１６】
一好適な実施形態において、前記分離試薬及び／又は検出試薬はさらに、結合効率を向上させ、非特異的吸着を低下させて、分離と検出の感度を向上させるための洗浄液を含む。好ましくは、前記分離試薬洗浄液は２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌと０．５Ｍ  Ｄ−マンノシドであり、前記検出試薬洗浄液はＰＢＳ（ｐＨ７．４）で調製した１％ツイーン２０溶液である。
【００１７】
一好適な実施形態において、前記レクチンを結合した磁性粒子は、前記レクチンとしてレンズマメレクチン及び／又はコンカナバリンを含む。
【００１８】
一好適な実施形態において、前記レクチンを結合した磁性粒子では、前記磁性粒子表面に被覆される高分子成分はシリサイド、多糖類、タンパク質、セルロース又は樹脂を含む。
【００１９】
一好適な実施形態において、前記分離検出用組成物はカード又はストリップとして提供する。
【００２０】
本発明はさらに、上記分離検出用組成物を含むα−フェトプロテイン変異体の分離検出キットを提供する。
【００２１】
本発明はさらに、
液体から磁性粒子を分離し、分離試薬及び検出試薬と組み合わせて使用する磁気分離モジュールと、
α−フェトプロテイン変異体の含有量とα−フェトプロテインの含有量を検出する検出モジュールと、
α−フェトプロテインに対するα−フェトプロテイン変異体の比を計算するデータ処理モジュールと、
上記分離検出用組成物又は上記キットのいずれかとを、
含むα−フェトプロテイン変異体の分離検出システムを提供する。
【００２２】
前記磁気分離モジュールは、前記分離検出用組成物における分離試薬と組み合わせて、α−フェトプロテイン変異体を分離するものである。
【００２３】
前記検出モジュールは、前記分離検出用組成物における検出試薬と組み合わせて、α−フェトプロテイン変異体の含有量とα−フェトプロテインの含有量を検出するものである。
【００２４】
一好適な実施形態において、α−フェトプロテインの含有量を測定する場合、前記磁気分離モジュールを分離試薬と組み合わせず、前記検出装置で被検サンプルにおけるα−フェトプロテインの含有量を検出する。
α−フェトプロテイン変異体の含有量を測定する場合、前記磁気分離モジュールで、分離試薬と組み合わせて被検サンプルにおけるα−フェトプロテイン変異体を分離し、前記検出モジュールで被検サンプルにおけるα−フェトプロテイン変異体の含有量を検出する。
α−フェトプロテイン変異体が占める百分率を測定する場合、前記磁気分離モジュールで被検サンプルにおけるα−フェトプロテイン変異体を分離し、前記検出モジュールで被検サンプルにおけるα−フェトプロテイン変異体の含有量とα−フェトプロテインの含有量とをそれぞれ検出し、前記データ処理モジュールでα−フェトプロテイン変異体が占める百分率、すなわちα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）の全量に占めるα−フェトプロテイン変異体（ＡＦＰ−Ｌ３）の百分率（ＡＦＰ−Ｌ３％）を計算する。
【００２５】
本発明はさらに、α−フェトプロテイン変異体の分離検出方法、及び上記分離検出用組成物又は上記分離検出システムの、α−フェトプロテイン変異体の分離検出への応用を提供する。
【００２６】
一好適な実施形態において、前記α−フェトプロテイン変異体の分離検出方法は、
レクチンが標記された磁性粒子とサンプルにおけるα−フェトプロテイン変異体ＡＦＰ−Ｌ３を結合するという分離方法によって、α−フェトプロテイン変異体ＡＦＰ−Ｌ３をα−フェトプロテインから分離し、分離したα−フェトプロテイン変異体ＡＦＰ−Ｌ３を検出するステップと、次に、磁性粒子分離及び適当な溶離方法によって分離したα−フェトプロテイン変異体ＡＦＰ−Ｌ３を得て、ＡＦＰに対する免疫測定方法によって、分離したサンプルに対してＡＦＰ検出を行い、ＡＦＰの検出結果、すなわちＡＦＰ−Ｌ３の検出結果を取得するステップと、を含む。
【００２７】
好適な構成では、前記レクチンが標記された磁性粒子は、レンズマメレクチン（ＬＣＡ）が標記されたアガロース被覆磁性粒子であり、α−フェトプロテイン変異体と結合できるアガロース被覆常磁性粒子である。
【００２８】
一好適な実施形態において、前記ＡＦＰに対する免疫測定方法は磁性粒子化学発光方法である。
【発明の効果】
【００２９】
従来技術に比べて、本発明の有益な効果は以下のとおりである。操作者がサンプル投入等の簡単な操作だけで、３０分間内で検出を完成でき、さらに、該方法は、検出によって血液サンプルに含まれるα−フェトプロテインの含有量とα−フェトプロテイン変異体の含有量を直接に定量的に計算するとともにＡＦＰ−Ｌ３％を取得することができ、該方法は簡便で、迅速に検出でき、結果が正確であり、感度が高く、且つ自動化が実現でき、肝癌の予防、診断、治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明に係るα−フェトプロテイン変異体の分離検出用組成物をカードとして提供する場合の模式図である。図１において、１、サンプル孔；２、レクチンを結合した磁性粒子を収納した試薬槽；３、溶離液を収納した試薬槽；４、抗α−フェトプロテイン抗体が被覆された磁性粒子を収納した試薬槽；５、酵素標記された抗α−フェトプロテイン抗体を収納した試薬槽；６、反応孔；７、試薬カード。
【図２】本発明に係るα−フェトプロテイン変異体の分離検出システムの模式図である。
【図３】本発明に係るα−フェトプロテイン変異体の分離検出システムの一実施形態の模式図である。図３において、１、サンプル孔；２、レクチンを結合した磁性粒子を予め収納した試薬槽；３、ＡＦＰ−Ｌ３洗浄液を予め収納した試薬槽；４、ＡＦＰ−Ｌ３溶離液を予め収納した試薬槽；５、抗α−フェトプロテイン抗体１（ａｎｔｉ−ＡＦＰ−１）が被覆された磁性粒子を予め収納した試薬槽；６、反応孔；７、酵素標記された抗α−フェトプロテイン抗体（ａｎｔｉ−ＡＦＰ−２）を予め収納した試薬槽；８、ＡＦＰ洗浄液を予め収納した試薬槽；９、ルミノール基質を予め収納した試薬槽；１０、試薬カード。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、図面と実施例をもって、本発明を更に詳細に説明する。なお、以下の実施例は本発明を解釈するものに過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【００３２】
実施例１
【００３３】
本発明で提供したα−フェトプロテイン変異体の分離検出用組成物は、分離試薬と検出試薬を含み、α−フェトプロテイン変異体が占める百分率を検出するものである。
【００３４】
分離試薬は、レクチンを結合した磁性粒子と溶離液とを含み、レクチンを結合した磁性粒子は被検サンプルにおけるＡＦＰ−Ｌ３と特異的に結合するためのものであり、検出試薬は、抗α−フェトプロテイン抗体が被覆された磁性粒子と酵素標記された抗α−フェトプロテイン抗体を含む。上記試薬の主成分及び製造方法は以下のとおりである。
【００３５】
レクチンを結合した磁性粒子において、前記レクチンとして、レンズマメレクチン（ＬＣＡ）、コンカナバリン、又は、レンズマメレクチンとコンカナバリンの組み合わせが使用される。
【００３６】
磁性粒子には、エポキシ樹脂が被覆されたサイズ１ミクロンの活性化四酸化三鉄超常磁性ナノ粒子（以下、磁性粒子と略称）とＳｉｇｍａ社製のレンズマメレクチン（ＬＣＡ）が使用される。
【００３７】
１．レクチンと磁性粒子は以下のステップにより結合される。
（１）ＬＣＡ  ２ｍｇを秤量して、結合緩衝液（０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．３、０．５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ）７．５ｍＬに溶解し、洗浄した磁性粒子１．５ｇと混合して、１０ｍＬの栓付き試験管に入れて上下を逆にして均一に混合する（室温で２ｈ混合する）。
（２）結合緩衝液１０ｍＬで洗浄して未結合ＬＣＡを除去する。洗浄液におけるＬＣＡ含有量を測定し、測定したＬＣＡ含有量に基づいて計算した結合率は９８％であった。
（３）０．２ｍｏｌ／Ｌグリシンで残りの活性化サイドをシールさせる。
（４）０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ  ４、０．５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ含有）１０ｍＬと０．１ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ  ８、０．５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ含有）１０ｍＬで順に３回洗浄し、次に、０．１％ＢＳＡと０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−ＢＳＡ）で１回洗浄し、４℃で保存して置く。
【００３８】
上記エポキシ樹脂が被覆された磁性粒子の代わりとして、ケイ化チタン、ポリスチレン、デキストラン、アガロース、スルホンアミド樹脂、牛血清アルブミン、ビオチン等の材料が被覆された磁性粒子を使用してもよい。
【００３９】
２．α−フェトプロテイン抗体が被覆された磁性粒子：
【００４０】
α−フェトプロテイン抗体について、Ｓｉｇｍａ社製の製品番号Ａ８４５２の抗α−フェトプロテインモノクローナル抗体を抗α−フェトプロテイン抗体１（ａｎｔｉ−ＡＦＰ−１）として使用する。α−フェトプロテイン抗体が被覆された磁性粒子の製造方法は、以下のとおりです。
（１）磁性粒子の活性化ステップ
ａ．磁性粒子５０ｍｌ（１０％Ｗ／Ｖ）を吸い取り、
ｂ．等体積の５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液で磁性粒子を洗浄し、
ｃ．等体積の１００ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液で磁性粒子を再懸濁させ、
ｄ．活性化試薬であるカルボジイミド（ＥＤＣ）を、最終濃度が０．０４ｇ／ｍｌとなるように加え、
ｅ．室温で振とうさせて１ｈ活性化させる。
（２）抗α−フェトプロテイン抗体１（ａｎｔｉ−ＡＦＰ−１）の磁性粒子への被覆ステップ
ａ．活性化終了後、磁場を印加して上澄み液を捨て、
ｂ．１０倍体積の５０ｍＭ  ＭＥＳで活性化後の磁性粒子を洗浄し、
ｃ．抗α−フェトプロテイン抗体１  ０．２ｍｇを加え、
ｄ．室温で振とうさせて３ｈ反応させる。
（３）抗α−フェトプロテイン抗体１（ａｎｔｉ−ＡＦＰ−１）の磁性粒子への被覆を停止するステップ
ａ．反応終了後、磁場を印加して上澄み液を捨て、
ｂ．１０倍体積被覆停止液を加え、
ｃ．常温で振とうさせて３ｈ反応させる。
（４）抗α−フェトプロテイン抗体１（ａｎｔｉ−ＡＦＰ−１）磁性粒子を洗浄して保存するステップ
ａ．反応終了後、磁場を印加して上澄み液を捨て、
ｂ．１０倍体積の、０．０２Ｍ  ＰＢＳ、０．５％ツイーン−２０、１００ｍＭ  ＮａＣｌを主成分とする被覆洗浄液を加えて、繰り返して４回洗浄するステップと、
ｃ．１０倍体積の磁性粒子ストック溶液（ｐＨ７．４、０．０２Ｍ  ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、２％蔗糖、０．２％ツイーン−２０、０．２％ＰＣ−３００）を加えて抗α−フェトプロテイン抗体１（ａｎｔｉ−ＡＦＰ−１）磁性粒子を保存するステップと、を含む。
【００４１】
３．酵素標記された抗α−フェトプロテイン抗体：
Ｓｉｇｍａ社製のペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）をＳｉｇｍａ製の製品番号ＨＰＡ０２３６００の抗α−フェトプロテイン抗体と結合して抗α−フェトプロテイン抗体２（ａｎｔｉ−ＡＦＰ−２）とする。酵素標記された抗α−フェトプロテイン抗体の製造方法は、以下のとおりです。
（１）酵素酸化（全工程で遮光する）ステップ
ａ．ＨＲＰ  ５ｍｇを秤量し、ｄｄＨ２Ｏ  ２５０μｌを加えて溶解し、
ｂ．ＮａＩＯ４  ５ｍｇを秤量し、ｄｄＨ２Ｏ  ２５０μｌを加えて溶解し、２０ｍｇ／ｍＬの濃度に調製し、
ｃ．ＨＲＰ溶液にＮａＩＯ４溶液を１滴ずつ添加しながら、撹拌し、
ｄ．混合した溶液を４℃で、３０分間静置し、
ｅ．エチレングリコール５ｍｌをｄｄＨ２Ｏ  ２５μｌに溶解して、上記混合溶液に１滴ずつ滴下しながら、撹拌し、
ｆ．室温で３０分間静置し、
ｇ．酵素酸化工程を完了し、ＨＲＰの最終濃度を１０ｍｇ／ｍｌにする。
（２）抗α−フェトプロテイン抗体２（ａｎｔｉ−ＡＦＰ−２）の用意及び標記（遮光）ステップ
ａ．抗α−フェトプロテイン抗体の濃度を５ｍｇ／ｍｌ程度（タンパク質濃度が低すぎると、ＰＥＧ２００００で濃縮させる）に調整し、ｐＨ９．５程度の５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣＢ（１ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３と１ｍｏｌ／Ｌ  Ｎａ２ＣＯ３を１０：１の比率で混合し、使用前に蒸留水で２０倍希釈する）で透析してグリセリン又は不純物（例えばＴｒｉｓ）を除去し、４℃で透析外液を３回交換して一晩透析し、
ｂ．抗α−フェトプロテイン抗体２（ａｎｔｉ−ＡＦＰ−２）とＨＲＰを１：４で混合して、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣＢ（ｐＨ９．５）において６時間以上透析し、最初の２時間で透析外液を１回交換し、
ｃ．調製したばかりの５ｍｇ／ｍｌＮａＢＨ４溶液０．２ｍｌで反応を停止し、均一に混合させて、４℃で２時間静置し、半時間ごとに１回振とうさせ、
ｄ．ｐＨ７．２の１０ｍＭ  ＰＢＳ（０．０１ｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４とＮａＨ２ＰＯ４ストック溶液を予備調製し、所望のｐＨ値に基づいて両方を均一に混合してＰＢＳ緩衝液を調製する）を用いて、透析外液を１回交換して一晩透析する。
（３）個包装ステップ
０．０２Ｍ  ＰＢＳ、１０％ウシ胎仔血清、３％蔗糖、０．２％ツイーン−２０等を主成分とする１０％ウシ胎仔血清含有緩衝液を用いて、ステップ（２）で得られたＨＲＰ酵素で標記された抗α−フェトプロテイン抗体２（ａｎｔｉ−ＡＦＰ−２）を１ｍｇ／ｍｌ（初期抗体濃度で換算した値）になるまで希釈し、個包装して４℃で保存する。
【００４２】
４．本実施例に係るレクチンを結合した磁性粒子を用いて、以下のようにα−フェトプロテイン変異体を分離する。
（１）濃度１％のレクチンを結合した磁性粒子５０ｕｌと被検血清サンプル２００ｕｌを同一管に投入して、均一に混合し、５分間静置し、
（２）磁石を用いて管の底部で磁性粒子を吸着させ、次に、上澄みを吸い取って捨て、
（３）磁石を外して、ＡＦＰ−Ｌ３洗浄液（０．０２Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．０）、０．５％ツイーン−２０）５００ｕｌを管内に投入して均一に混合し、磁性粒子を完全に懸濁させ、
（４）磁石を用いて管の底部で磁性粒子を吸着させ、次に、上澄みを吸い取って捨てる。
（５）ステップ（３）、（４）を２回繰り返して、磁性粒子を洗浄し、
（６）磁石を外して、ＡＦＰ−Ｌ３溶離液（０．０２Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．０）、５Ｍ  Ｄ−マンノシド；又は、α−メチル−Ｄ−マンノシド５００ｍｍ、０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ  ３００を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ２０ｍｍ、ＮａＣｌ  １５０ｍｍ、ｐＨ７．４緩衝液）２００ｕｌを管内に投入して均一に混合し、磁性粒子を完全に懸濁させて、１０分間静置し、
（７）磁石を用いて管の底部で磁性粒子を吸着させて、α−フェトプロテイン変異体ＡＦＰ−Ｌ３分離液体として上澄みを得る。
【００４３】
５．本実施例における抗α−フェトプロテイン抗体１（ａｎｔｉ−ＡＦＰ−１）が被覆された磁性粒子とＨＲＰ酵素で標記された抗α−フェトプロテイン抗体２（ａｎｔｉ−ＡＦＰ−２）を用いてＡＦＰを検出するステップを以下のように行う。
（１）濃度１％の抗α−フェトプロテイン抗体１（ａｎｔｉ−ＡＦＰ−１）が被覆された磁性粒子５０ｕｌと、被検サンプル５０ｕｌを同時に検出管に投入し、次に、１０００倍希釈したＨＲＰ酵素で標記された抗α−フェトプロテイン抗体２（ａｎｔｉ−ＡＦＰ−２）５０ｕｌを加えて、均一に混合し、３７℃で５分間インキュベートし、
（２）磁石を用いて管の底部で磁性粒子を吸着させて、次に、上澄みを吸い取って捨て、
（３）磁石を外して、ＡＦＰ洗浄液（０．０２Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．０）、０．５％ツイーン−２０）５００ｕｌを管内に加えて、均一に混合し、磁性粒子を完全に懸濁させ、
（４）磁石を用いて管の底部で磁性粒子を吸着させて、次に、上澄みを吸い取って捨て、
（５）ステップ（３）、（４）を２回繰り返して、磁性粒子を洗浄し、
（６）磁石を外して、管内にミノール基質１００ｕｌを加えて、均一に混合し、磁性粒子を完全に懸濁させ、３７℃で１分間インキュベートし、
（７）化学発光測定装置において発光信号強度を測定し、標準品曲線によってサンプルにおけるＡＦＰの含有量を算出する。
【００４４】
６．本実施例では、ＡＦＰ−Ｌ３の検出ステップを以下のように行う。
（１）濃度１％のレクチンを結合した磁性粒子５０ｕｌと被検血清サンプル２００ｕｌを同時に管に投入して、均一に混合し、５分間静置し、
（２）磁石を用いて管の底部で磁性粒子を吸着させて、次に、上澄みを吸い取って捨て、
（３）磁石を外して、ＡＦＰ−Ｌ３洗浄液（０．０２Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．０）、０．５％ツイーン−２０）５００ｕｌを管に投入し、均一に混合し、磁性粒子を完全に懸濁させ、
（４）磁石を用いて管の底部で磁性粒子を吸着させて、次に、上澄みを吸い取って捨て、
（５）ステップ（３）、（４）を２回繰り返して、磁性粒子を洗浄し、
（６）磁石を外して、ＡＦＰ−Ｌ３溶離液（０．０２Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．０）、５Ｍ  Ｄ−マンノシド；又は、α−メチル−Ｄ−マンノシド５００ｍｍと０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ  ３００を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ２０ｍｍ、ＮａＣｌ  １５０ｍｍ緩衝液（ｐＨ７．４））２００ｕｌを管内に投入して、均一に混合し、磁性粒子を完全に懸濁させ、１０分間静置し、
（７）磁石を用いて管の底部で磁性粒子を吸着させて、α−フェトプロテイン変異体ＡＦＰ−Ｌ３分離液体として上澄みを得、
（８）別の新しい検出管に、濃度１％の抗α−フェトプロテイン抗体１（ａｎｔｉ−ＡＦＰ−１）が被覆された磁性粒子５０ｕｌと、（７）で得られた分離液体５０ｕｌを投入し、次に、１０００倍希釈したＨＲＰ酵素で標記された抗α−フェトプロテイン抗体２（ａｎｔｉ−ＡＦＰ−２）５０ｕｌを加えて、均一に混合し、３７℃で５分間インキュベートし、
（９）磁石を用いて管の底部で磁性粒子を吸着させて、次に、上澄みを吸い取って捨て、
（１０）磁石を外して、ＡＦＰ洗浄液（０．０２Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．０）、０．５％ツイーン−２０）５００ｕｌを管内に加えて、均一に混合し、磁性粒子を完全に懸濁させ、
（１１）磁石を用いて管の底部で磁性粒子を吸着させて、次に、上澄みを吸い取って捨て、
（１２）ステップ（３）、（４）を２回繰り返して、磁性粒子を洗浄し、
（１３）磁石を外して、ルミノール基質１００ｕｌを管に投入して、均一に混合し、磁性粒子を完全に懸濁させ、３７℃で１分間インキュベートし、
（１４）化学発光測定装置において発光信号強度を測定し、標準品曲線により検出サンプルにおけるα−フェトプロテイン変異体ＡＦＰ−Ｌ３の含有量を算出する。
【００４５】
７．本実施例では、以下のようにα−フェトプロテイン変異体が占める百分率（ＡＦＰ−Ｌ３％）を検出する。
（１）上記の５に示すように、サンプルにおけるα−フェトプロテインＡＦＰ含有量を検出する。
（２）上記の６に示すように、サンプルにおけるα−フェトプロテイン変異体ＡＦＰ−Ｌ３含有量を検出する。
（３）（２）で算出したα−フェトプロテイン変異体ＡＦＰ−Ｌ３の含有量をα−フェトプロテインＡＦＰの含有量で割って、α−フェトプロテイン変異体が占める百分率（ＡＦＰ−Ｌ３％）を取得する。
【００４６】
本実施例に記載の分離検出用組成物を用いるＡＦＰ含有量の検出。
【００４７】
Ｒｏｃｈｅ社製のＡＦＰ検出キット（電気化学発光法）を対照群として、ＡＦＰ含有量の検出結果の精度を比較する。ＡＦＰ含有量のｃｕｔｏｆｆ値が２０μｇ／Ｌであり、２０ｎｇ／ｍｌより高いと、陽性結果になり、２０ｎｇ／ｍｌより低いと、陰性結果になる。検出結果は表１に示される：
【００４８】
【表１】
0006655622.tif 000002
【００４９】
検出結果から明らかなように、検出された４５２個のサンプルのうち、本実施例の感度と特異性は１００％に達する。
【００５０】
本実施例に記載の分離検出用組成物を用いるＡＦＰ−Ｌ３百分率の検出。
【００５１】
北京熱景生物社製の製品登録証番号がＣＦＤＳＭ（準）（  Ｃｈｉｎａ  ｆｏｏｄ  ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ｓａｆｅｔｙ  ｍａｃｈｉｎｅｒｙ  （ｓｔａｎｄａｒｄ））自２０１４第３４０１６４６号のα−フェトプロテイン変異体分離管を用いて、Ｒｏｃｈｅ社製のＡＦＰ検出キット（電気化学発光法）を対照群とし、ＡＦＰ−Ｌ３百分率の検出結果の精度を比較した。ＡＦＰ−Ｌ３百分率のｃｕｔｏｆｆ値は１０％である。検出結果は表２に示される。
【００５２】
【表２】
0006655622.tif 000003
【００５３】
対照群と比較した結果：対象群検出においてＡＦＰ−Ｌ３百分率が陽性を示すサンプル１０７個は本実施例にてもＡＦＰ−Ｌ３百分率が陽性を示す；対象群検出においてＡＦＰ−Ｌ３百分率が陰性のサンプル１７２個は、本実施例にて１６９個が陰性であり、他の３つのサンプルについて臨床にて診断した結果、患者が早期原発性肝細胞癌に罹患したことを見出した。検出結果から明らかなように、本実施例に記載の分離検出用組成物は対照群に比べて検出性能が向上する。その理由として、ＡＦＰ−Ｌ３タンパク質の分離効率を向上させることによって、サンプルにおけるＡＦＰ−Ｌ３百分率をより正確に検出できるためである。
【００５４】
実施例２
【００５５】
本発明で提供したα−フェトプロテイン変異体の分離検出用組成物は、実施例１で提供したα−フェトプロテイン変異体の分離検出用組成物において、分離試薬がさらに保護液を含んでもよく、検出試薬がさらに緩衝液を含んでもよい。
【００５６】
分離試薬と検出試薬はそれぞれ洗浄液を含んでもよい。
【００５７】
上記試薬の主成分は以下のとおりである。
【００５８】
保護液：０．０２Ｍ  ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ（ｐＨ７．４）、０．１Ｍ  Ｄ−マンノシド；
緩衝液：０．０２Ｍ  ＰＢＳ、１０％子ウシ血清、０．１％ｐｒｏｃｌｉｎ−３００；
分離試薬洗浄液：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５Ｍ  Ｄ−マンノシド；
検出試薬洗浄液：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で調製した１％ツイーン２０溶液。
【００５９】
上記Ｄ−マンノシドの代わりとして、フコース、果糖、蔗糖、トレハロース等の糖類物質が使用されてもよい。
【００６０】
実施例３
【００６１】
本発明で提供したα−フェトプロテイン変異体の分離検出システムは、α−フェトプロテイン変異体が占める百分率を検出するものであり、図２に示されるように、α−フェトプロテイン変異体を分離する磁気分離モジュールと、α−フェトプロテイン変異体の含有量とα−フェトプロテインの含有量を検出する検出モジュールと、α−フェトプロテインに対するα−フェトプロテイン変異体の比を計算するデータ処理モジュールとを備える。好ましくは、検出分離システムはさらにサンプリングモジュールを備えてもよく、データ処理モジュールはさらに、光信号読み取り装置（好ましくは浜松ホトニクス株式会社製の型番Ｈ１０６８２−１１０の光子カウントプローブ又は型番Ｒ１１６６の光電子増倍管を採用する）を備えてもよい。
【００６２】
試薬カードは実施例１に記載の分離検出用組成物を含み、分離検出用組成物は試薬カードにおける複数の試薬槽のそれぞれに予め収納されて反応に用いられ、それぞれの試薬は少なくとも１つの試薬槽に対応する。試薬カードは、サンプル孔、分離試薬槽、検出試薬槽及び反応孔を含み、本実施例の試薬カードは、図３に示されるように、以下のように構成されている。
【００６３】
１、サンプル孔；２、レクチンを結合した磁性粒子を予め収納した試薬槽；３、ＡＦＰ−Ｌ３洗浄液を予め収納した試薬槽；４、ＡＦＰ−Ｌ３溶離液を予め収納した試薬槽；５、抗α−フェトプロテイン抗体１（ａｎｔｉ−ＡＦＰ−１）が被覆された磁性粒子を予め収納した試薬槽；６、反応孔；７、酵素標記された抗α−フェトプロテイン抗体（ａｎｔｉ−ＡＦＰ−２）を予め収納した試薬槽；８、ＡＦＰ洗浄液を予め収納した試薬槽；９、ルミノール基質を予め収納した試薬槽。
【００６４】
孔ｂ、ｃ、ｄは共に磁気分離モジュールを構成し、それらの孔におけるの試薬全体でα−フェトプロテイン変異体の分離を完成できる。孔ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉは共に検出モジュールを構成し、それらの孔におけるの試薬全体でサンプルにおけるＡＦＰ濃度の検出を完成できる。
【００６５】
検出モジュールは、単独でサンプルにおけるＡＦＰ含有量が測定できるが、分離モジュールと検出モジュールを組み合わせると、サンプルにおけるα−フェトプロテイン変異体ＡＦＰ−Ｌ３の分離及びＡＦＰ−Ｌ３の含有量の測定も可能であり、さらに、ＡＦＰ−Ｌ３含有量をＡＦＰ含有量で割るとα−フェトプロテイン変異体が占める比を取得できる。
【００６６】
本実施例に記載の方法によって被検サンプルを検出し、検出結果を表３に示す。
【００６７】
【表３】
0006655622.tif 000004
【００６８】
実験結果から明らかなように、本発明は、原発性肝細胞癌に対する検出陽性率が９２％に達し、健康な人に対する特異性が１００％に達し、肝硬変や肝炎に対する特異性がそれぞれ９５％と９７％に達し、その他の癌に対する特異性が０％である。
【００６９】
実施例４
【００７０】
実施例３で提供したα−フェトプロテイン変異体の分離検出システムにおいて、さらに検出設定モジュールを含み、検出設定モジュールは、α−フェトプロテイン含有量測定ユニット、α−フェトプロテイン変異体含有量測定ユニット及びα−フェトプロテイン変異体が占める百分率の測定ユニットを含む。
【００７１】
α−フェトプロテイン含有量測定ユニットを利用する場合、前記磁気分離モジュールは被検サンプルの処理に関与せず、前記検出装置は被検サンプルにおけるα−フェトプロテインの含有量を検出する。
【００７２】
α−フェトプロテイン変異体含有量測定ユニットを利用する場合、前記磁気分離モジュールは被検サンプルにおけるα−フェトプロテイン変異体を分離し、前記検出モジュールは被検サンプルにおけるα−フェトプロテイン変異体の含有量を検出する。
【００７３】
α−フェトプロテイン変異体が占める百分率の測定ユニットを利用する場合、前記磁気分離モジュールは被検サンプルにおけるα−フェトプロテイン変異体を分離し、前記検出モジュールは被検サンプルにおけるα−フェトプロテイン変異体の含有量とα−フェトプロテインの含有量を検出し、前記データ処理モジュールはα−フェトプロテイン変異体が占める百分率を計算する。
【００７４】
実施例５
【００７５】
実施例３又は４で提供したα−フェトプロテイン変異体の分離検出システムにおいて、実施例１に記載の分離検出用組成物の代わりとして実施例２に記載の分離検出組成物を使用する。
【００７６】
実施例６
【００７７】
本発明で提供したα−フェトプロテイン変異体の分離検出方法において、上記分離検出システムを用いて、α−フェトプロテイン変異体が占める百分率を検出する。当該分離検出方法は、下記のステップを備える。
（１）サンプル投入ステップ
溶血のない血清、血漿又は全血のサンプルを分離検出システムに加え、又は上記試薬カードで提供したサンプル孔に加えるステップ。
（２）α−フェトプロテイン変異体を分離するステップ
サンプルを、レクチンを結合した磁性粒子を収納した反応容器に投入して、均一に混合し、磁気分離モジュールで磁性粒子を濃縮させて、液体を捨て、磁性粒子を濃縮させた反応容器に溶離液を投入して均一に混合し、磁気分離モジュールによって磁性粒子を濃縮させて、α−フェトプロテイン変異体溶離液を得るステップ。
（３）反応してインキュベートするステップ
α−フェトプロテイン変異体溶離液をα−フェトプロテインモノクローナル抗体が被覆された磁性粒子を収納した反応容器に投入するとともに、酵素標記された抗α−フェトプロテイン抗体を加え、インキュベートするステップ。
（４）濃縮・洗浄ステップ
磁気分離モジュールで磁性粒子を濃縮させて液体を捨て、反応容器に洗液を加えて均一に混合し、次に、磁気分離モジュールで磁性粒子を濃縮させて、液体を捨てるステップ。
（５）発色ステップ
濃縮で得られた磁性粒子をルミノール基質に加えて、データ処理モジュールによってα−フェトプロテイン変異体の濃度を取得するステップ。
（６）α−フェトプロテインの濃度を取得するステップ
（２）と同時に、サンプルを反応容器に加えて、次に、α−フェトプロテインモノクローナル抗体が被覆された磁性粒子を加えて均一に混合し、ステップ（３）−（５）を繰り返してα−フェトプロテインの濃度を取得するステップ。
（７）データ処理モジュールによって、α−フェトプロテイン変異体が占める百分率を取得するステップ。
【００７８】
実施例７
【００７９】
実施例６で提供したα−フェトプロテイン変異体の分離検出方法によって行い、ステップ（１）とステップ（６）だけを含み、α−フェトプロテインの濃度を直接測定できる。
【００８０】
実施例８
【００８１】
本発明で提供したα−フェトプロテイン変異体の分離検出方法は、上記分離検出システムを用いて、α−フェトプロテイン変異体が占める百分率を検出する。当該分離検出方法は、下記のステップを備える。
（１）サンプル投入ステップ
溶血のない血清、プラズマ又は全血のサンプルを分離検出システムに加え、又は上記試薬カードで提供したサンプル孔に加えるステップ。
（２）α−フェトプロテイン変異体を分離するステップ
サンプルを、レクチンを結合した磁性粒子を収納した試薬槽に投入し、均一に混合し、
磁気分離モジュールで磁性粒子を濃縮させて、液体を捨て、
濃縮させて得られた磁性粒子を洗浄液を収納した試薬槽に投入し、均一に混合し、
洗浄した磁性粒子を、溶離液を収納した試薬槽に加えて、均一に混合し、磁気分離モジュールによって磁性粒子を濃縮させて、α−フェトプロテイン変異体溶離液を得るステップ。
（３）反応・インキュベートステップ
α−フェトプロテイン変異体溶離液をα−フェトプロテインモノクローナル抗体が被覆された磁性粒子を収納した試薬槽に投入するとともに、その他の試薬槽に予め収納した酵素標記された抗α−フェトプロテイン抗体を加えてインキュベートするステップ。
（４）濃縮ステップ
磁気分離モジュールで磁性粒子を濃縮させて、液体を捨てるステップ。
（５）洗浄ステップ
濃縮させて得られた磁性粒子を、洗浄液を収納した試薬槽に投入して、均一に混合し、ステップ（４）を繰り返すステップ。
（６）発色ステップ
濃縮させて得られた磁性粒子を、その他の試薬槽に予め収納したルミノール基質に加えて、データ処理モジュールによってα−フェトプロテイン変異体の濃度を取得するステップ。
（７）（２）と同時に、システムによってサンプルをα−フェトプロテインモノクローナル抗体が被覆された磁性粒子を収納した試薬槽に加え、ステップ（３）−（６）を繰り返してα−フェトプロテインの濃度を取得するステップ。
（８）データ処理モジュールによって、α−フェトプロテイン変異体が占める百分率を取得するステップ。
【００８２】
データ処理モジュールによるα−フェトプロテイン変異体が占める百分率を計算するロジック：装置は、サンプル番号に基づいて判断し、同一サンプルのα−フェトプロテインの濃度とα−フェトプロテイン変異体の濃度を取得し、次にＡＦＰ−Ｌ３のＡＦＰに占める百分率を計算し、さらにＡＦＰ−Ｌ３含有量を算出する。その結果、ＡＦＰ−Ｌ３％である。
【００８３】
上記説明は本発明の好適な実施例を説明したが、本明細書に開示された形態に制限されないことが理解すべきであり、その他の実施例を排除するためのものではなく、各種のその他の組み合わせ、修正や置換に適用でき、さらに、本明細書に記載の発明の構想範囲を脱逸せずに、上記示唆や関連分野の技術又は知識に基づいて変化することができる。当業者が本発明の主旨や範囲を脱逸せずに想到し得る変形や変化はすべて、本発明に添付した請求の請求による保護範囲に属する。
【図１】
0006655622.tif 000005
【図２】
0006655622.tif 000006
【図３】
0006655622.tif 000007