(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
転写リプレッサー結合部位を含むプロモーターを含むＮＦ−ＹＣ４遺伝子を含む植物細胞中のタンパク質含有量の増加方法であって、前記方法は転写リプレッサーがＮＦ−ＹＣ４遺伝子の転写を防止できないように該転写リプレッサー結合部位を修飾して、前記植物細胞中のタンパク質含有量を増加させる前記方法。
【請求項２】
更に、前記植物細胞由来の植物細胞の集まり、植物組織、植物器官または植物を作成することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記植物細胞は植物細胞の集まり、植物組織、植物器官または植物の一部である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記植物は作物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記作物はダイズ、イネまたはトウモロコシである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記植物は単子葉植物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記植物は双子葉植物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記転写リプレッサー結合部位を欠失により修飾する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記転写リプレッサー結合部位はＥＲＦモチーフ、ＲＡＶ１モチーフ、またはＥＲＦモチーフ及びＲＡＶ１モチーフの両方を含む、請求項１、２、３または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記植物細胞はイネ細胞であり、（ｉ）２つのＥＲＦモチーフを欠失させ、（ｉｉ）ＲＡＦｌモチーフを欠失させ、または（ｉｉｉ）ＲＡＶ１モチーフ及びＥＲＦモチーフを欠失させる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記植物細胞はダイズ細胞であり、（ｉ）２つのＲＡＶ１モチーフを欠失させ、または（ｉｉ）ＲＡＶ１モチーフ及びＥＲＦモチーフを欠失させる、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ＴＡＬＥＮＳを用いてＥＲＦモチーフを欠失させ、ＲＡＶ１モチーフを欠失させ、またはＥＲＦモチーフ及びＲＡＶ１モチーフの両方を欠失させる、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いてＥＲＦモチーフを欠失させ、ＲＡＶ１モチーフを欠失させ、またはＥＲＦモチーフ及びＲＡＶ１モチーフの両方を欠失させる、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
請求項２または３に記載の方法に従って得た植物である生物を第２植物と交雑させて子孫植物を生産し、高いタンパク質含有量を有する子孫植物を選択して、高いタンパク質含有量を有する植物を生産することを含む高いタンパク質含有量を有する植物の生産方法。
【請求項１５】
前記転写リプレッサー結合部位はＥＲＦモチーフ、ＲＡＶ１モチーフ、またはＥＲＦ１モチーフ及びＲＡＶ１モチーフの両方を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記植物細胞はイネ細胞であり、（ｉ）２つのＥＲＦモチーフを欠失させ、（ｉｉ）ＲＡＦｌモチーフを欠失させ、または（ｉｉｉ）ＲＡＶ１モチーフ及びＥＲＦモチーフを欠失させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記植物細胞はダイズ細胞であり、（ｉ）２つのＲＡＶ１モチーフを欠失させ、または（ｉｉ）ＲＡＶ１モチーフ及びＥＲＦモチーフを欠失させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
ＴＡＬＥＮＳを用いてＥＲＦモチーフを欠失させ、ＲＡＶ１モチーフを欠失させ、またはＥＲＦモチーフ及びＲＡＶ１モチーフの両方を欠失させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いてＥＲＦモチーフを欠失させ、ＲＡＶ１モチーフを欠失させ、またはＥＲＦモチーフ及びＲＡＶ１モチーフの両方を欠失させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法は更に、選択した子孫植物を第２植物と交雑させて戻し交雑子孫植物を生産し、高いタンパク質含有量を有する第１戻し交雑子孫植物を選択して、選択した戻し交雑子孫植物を生産し、交雑及び選択を３回以上繰り返して、高いタンパク質含有量を有する戻し交雑子孫植物を生産することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
ＮＦ−ＹＣ４遺伝子が転写リプレッサーがＮＦ−ＹＣ４の転写を防止できないように修飾されている転写リプレッサー結合部位を含むプロモーターを含む植物細胞、植物細胞の集まり、植物組織、植物器官または植物であって、ＮＦ−ＹＣ４遺伝子が修飾されていない転写リプレッサー結合部位を含むプロモーターを含む対応する植物細胞、植物細胞の集まり、植物組織、植物器官または植物と比較して高いタンパク質含有量を有する前記植物細胞、植物細胞の集まり、植物組織、植物器官または植物。
【請求項２２】
ハイブリッド植物である、請求項２１に記載の植物。
【請求項２３】
ＮＦ−ＹＣ４遺伝子が転写リプレッサーがＮＦ−ＹＣ４の転写を防止できないように修飾されている転写リプレッサー結合部位を含むプロモーターを含む種子であって、ＮＦ−ＹＣ４遺伝子が修飾されていない転写リプレッサー結合部位を含むプロモーターを含む対応する種子と比較して高いタンパク質含有量を有する前記種子。
【請求項２４】
転写リプレッサー結合部位を含むプロモーターを含むＮＦ−ＹＣ４遺伝子を含む植物細胞または植物中の病原体または有害生物に対する抵抗性の増加方法であって、前記方法は転写リプレッサーがＮＦ−ＹＣ４遺伝子の転写を防止できないように病原体または有害生物に感染するリスクがある植物細胞または植物中のＮＦ−ＹＣ４遺伝子のプロモーター中の該転写リプレッサー結合部位を修飾して、前記植物細胞または植物中の病原体または有害生物に対する抵抗性を増加させる前記方法。
【請求項２５】
更に、前記植物細胞から植物を再生することを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記方法は更に、配列番号１６に記載されているアミノ酸配列を有するＱｕａ−Ｑｕｉｎｅ  Ｓｔａｒｃｈ（ＱＱＳ）ポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを植物細胞または植物に導入し、そこで発現させることを含み、前記ヌクレオチド配列はプロモーターに機能しうる形で連結されている、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
更に、前記植物細胞から植物を再生することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記転写リプレッサー結合部位はＥＲＦモチーフ、ＲＡＶ１モチーフ、またはＥＲＦモチーフ及びＲＡＶ１モチーフの両方を含む、請求項２４または２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記植物細胞または植物はイネ細胞またはイネ植物であり、（ｉ）２つのＥＲＦモチーフを欠失させ、（ｉｉ）ＲＡＦ１モチーフを欠失させ、または（ｉｉｉ）ＲＡＶ１モチーフ及びＥＲＦモチーフを欠失させる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記植物細胞または植物はダイズ細胞またはダイズ植物であり、（ｉ）２つのＲＡＶ１モチーフを欠失させ、または（ｉｉ）ＲＡＶ１モチーフ及びＥＲＦモチーフを欠失させる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
ＴＡＬＥＮＳを用いてＥＲＦモチーフを欠失させ、ＲＡＶ１モチーフを欠失させ、またはＥＲＦモチーフ及びＲＡＶ１モチーフの両方を欠失させる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いてＥＲＦモチーフを欠失させ、ＲＡＶ１モチーフを欠失させ、またはＥＲＦモチーフ及びＲＡＶ１モチーフの両方を欠失させる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記病原体は細菌またはウイルスであり、前記有害生物はアブラムシである、請求項２４または２６に記載の方法。
【請求項３４】
前記植物は作物である、請求項２４または２６に記載の方法。
【請求項３５】
前記作物はダイズである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記植物は双子葉植物である、請求項２４または２６に記載の方法。
【請求項３７】
請求項２４、２５、２６または２７に記載の方法に従って得た植物を第２植物と交雑させて子孫植物を生産し、病原体または有害生物に対して高い抵抗性を有する子孫植物を選択して、病原体または有害生物に対して高い抵抗性を有する植物を生産することを含む病原体または有害生物に対して高い抵抗性を有する植物の生産方法。
【請求項３８】
前記転写リプレッサー結合部位はＥＲＦモチーフ、ＲＡＶ１モチーフ、またはＥＲＦモチーフ及びＲＡＶ１モチーフの両方を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記植物細胞または植物はイネ細胞またはイネ植物であり、（ｉ）２つのＥＲＦモチーフを欠失させ、（ｉｉ）ＲＡＦｌモチーフを欠失させ、または（ｉｉｉ）ＲＡＶ１モチーフ及びＥＲＦモチーフを欠失させる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記植物細胞または植物はダイズ細胞またはダイズ植物であり、（ｉ）２つのＲＡＶ１モチーフを欠失させ、または（ｉｉ）ＲＡＶ１モチーフ及びＥＲＦモチーフを欠失させる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
ＴＡＬＥＮＳを用いてＥＲＦモチーフを欠失させ、ＲＡＶ１モチーフを欠失させ、またはＥＲＦモチーフ及びＲＡＶ１モチーフの両方を欠失させる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いてＥＲＦモチーフを欠失させ、ＲＡＶ１モチーフを欠失させ、またはＥＲＦモチーフ及びＲＡＶ１モチーフの両方を欠失させる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記方法は更に、選択した子孫植物を第２植物と交雑して戻し交雑子孫植物を生産し、病原体または有害生物に対して高い抵抗性を有する第１戻し交雑子孫植物を選択して、選択した戻し交雑子孫植物を生産し、交雑及び選択を３回以上繰り返して、病原体または有害生物に対して高い抵抗性を有する戻し交雑子孫植物を生産することを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
ＮＦ−ＹＣ４遺伝子が転写リプレッサーがＮＦ−ＹＣ４の転写を防止できないように修飾されている転写リプレッサー結合部位を含むプロモーターを含む植物であって、前記植物中の病原体または有害生物に対する抵抗性が高められている前記植物。
【請求項４５】
植物の野生型はＱＱＳを含まず、発現せず、その中に配列番号１６に記載されているアミノ酸配列を有するＱＱＳポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが導入され、そこで発現されており、前記ヌクレオチド配列はプロモーターに機能しうる形で連結されている、請求項４４に記載の植物。
【請求項４６】
ＮＦ−ＹＣ４遺伝子が転写リプレッサーがＮＦ−ＹＣ４の転写を防止できないように修飾されている転写リプレッサー結合部位を含むプロモーターを含む種子であって、前記種子中の病原体または有害生物に対する抵抗性が高められている前記種子。
【請求項４７】
種子の野生型はＱＱＳを含まず、発現せず、その中に配列番号１６に記載されているアミノ酸配列を有するＱＱＳポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが導入され、そこで発現されており、前記ヌクレオチド配列はプロモーターに機能しうる形で連結されている、請求項４６に記載の種子。
【請求項４８】
ＮＦ−ＹＣ４遺伝子が転写リプレッサーがＮＦ−ＹＣ４の転写を防止できないように修飾されている転写リプレッサー結合部位を含むプロモーターを含むハイブリッド植物であって、前記ハイブリッド植物中の病原体または有害生物に対する抵抗性が高められている前記ハイブリッド植物。
【請求項４９】
ハイブリッド植物の野生型はＱＱＳを含まず、発現せず、その中に配列番号１６に記載されているアミノ酸配列を有するＱＱＳポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが導入され、そこで発現されており、前記ヌクレオチド配列はプロモーターに機能しうる形で連結されている、請求項４８に記載のハイブリッド植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真核細胞中のタンパク質含有量の増加、植物のストレス、例えば非生物的（例えば、塩、干ばつ及び汚染）または生物的（例えば、病原体及び有害生物）ストレスに対する抵抗性の増加、転写リプレッサーが遺伝子ＮＦ−ＹＣ４、ＱＱＳ、ＴＡＬＥＮＳ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の転写を防止できないように修飾された転写リプレッサー結合部位を有するプロモーター、組織培養、植物の交雑及び戻し交雑、ハイブリッド植物、再生可能細胞、及び種子に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質欠乏は発展途上世界の至る所で重要な健康問題である。少ないタンパク質摂取量は毎年数億人の小児における精神遅滞、発育阻害、疾患感受性、消耗病及び／または死の原因となっている（Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒら，ＰｌｏＳ  ｏｎｅ，７：ｅ３５９０７（２０１２）；Ｇｏｍｅｓら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓ．，８７：３５６８−３５７５（２００９））。
【０００３】
植物はヒト食事タンパク質の６０％以上を与える（Ｙｏｕｎｇら，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，５９：１２０３Ｓ−１２１２Ｓ（１９９４））。特に動物の使用が等量のタンパク質を生成するために約１００倍以上の水及び１１倍以上のエネルギーを必要とするときには、主要作物のタンパク質含有量の増加はタンパク質欠乏の緩和を助け（Ｐｉｍｅｎｔｅｌら，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，７８：６６０５−６６３５（２００３））、動物のタンパク質含有量の増加はしばしばタンパク質品質または収量の低下を伴う（Ｂｅｌｌａｌｏｕｉら，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１：１１０−１１８（２０１０）；Ｗｅｎｅｆｒｉｄａら，Ｊ．Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，６１：１１７０２−１１７１０（２０１３））。
【０００４】
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＱＱＳ（Ａｔ３ｇ３０７２０，Ｑｕａ−Ｑｕｉｎｅ  Ｓｔａｒｃｈ）オーファン遺伝子はアラビドプシス中のタンパク質含有量を調節する。野生型（ＷＴ）対照系統に形態学的に類似しているが、デンプンレベルの点で異なるシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）デンプンシンターゼ３（Ａｔｓｓ３）変異体（Ｚｈａｎｇら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１３８：６６３−６７４（２００５））は、ＷＴ中に存在するＱＱＳ転写物の量の５倍以上を有している（Ｌｉら，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，５８：４８５−４９８（２００９））。アラビドプシスにおいてＱＱＳを過剰発現させると総タンパク質含有量は増加し、葉中の総デンプン含有量は減少するのに対して、ＱＱＳのダウンレギュレーションは反対の効果を有する（Ｌｉら，Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｊ．，１３：１７７−１８７（２０１５）；前掲のＬｉら（２００９））。導入遺伝子としてＱＱＳを発現させると、他の植物、例えばダイズではタンパク質含有量が増加する（品種ウィリアムズ８２；前掲のＬｉら（２０１４）；前掲のＬｉら（２００９））。
【０００５】
ＱＱＳ発現は各種の発生的、環境的及び遺伝的摂動に密接に関連していることが判明している（例えば、Ａｒｅｎｄｓｅｅら，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｔｐｌａｎｔｓ．２０１４．０７．００３（２０１４）；前掲のＬｉら（２００９）；及び前掲のＬｉら（２０１５）を参照されたい）。しかしながら、摂動におけるその役割は解明されていない。例えば、ＰＥＮ３（摂動抵抗性３（Ａｔｌｇ５９８７０，ＰＥＮ３，ＡＢＣ結合カセットトランスポーター遺伝子）は真菌及び卵菌類病原体に対して非宿主抵抗性を付与する。ＱＱＳはｐｅｎ３ノックアウト（ＫＯ）変異体においてアップレギュレートされる唯一の遺伝子であると報告されている；しかしながら、ＱＱＳは感染及び非感染変異体においてアップレジュレートされる（Ｓｔｅｉｎら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１８（３）：７３１−７４６（２００６））。別の例として、２つのシンタキシン、すなわちＳＹＰ１２１（Ａｔ３ｇ１１８２０，ＰＥＮ１）及びＳＹＰ１２２（Ａｔ３ｇ５２４００）はうどんこ病に対して抵抗性を付与する。これらの遺伝子をノックアウトすると、これらの病原体に対する感受性が高まる；ＱＱＳは両方においてアップレギュレートされる唯一の遺伝子であると報告されている（Ｚｈａｎｇら（２００８））。対照的に、ＰＥＮ３及びＥＸＬ１は幾つかの病原体に露出後アップレギュレートされるのに対して、ＱＱＳは幾つかの病原体、例えばシュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）による感染に応答してダウンレギュレートされる（Ｋｗｏｎら，Ｐｌａｎｔａ，２３６（３）：８８７−９００（２０１２）；及びＴｈｉｌｍｏｎｙら，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，４６（１）：３４−５３（２００６））。報告によれば、アラビドプシス植物にジャガイモ疫病菌（Ｐｈｙｔｏｐｔｈｅｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）を接種すると、ＱＱＳは接種後６時間目にダウンレギュレートされ、その後接種後１２時間及び２４時間目にアップレギュレートされた（Ｓｃｈｅｅｌら，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  ＩＤ“Ｅ−ＧＥＯＤ−５６１６”，ＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓ）。
【０００６】
よって、上記を考慮して、本発明の目的は、ＱＱＳと相互作用する遺伝子を同定することである。アラビドプシスでは、ＱＱＳは核因子Ｙ，サブユニットＣ４（ＮＦ−ＹＣ４，Ａｔ５ｇ６３４７０）と相互作用する。別の目的は、こうして同定された遺伝子を操作するための材料及び方法を提供することである。実施形態では、前記遺伝子を操作すると、タンパク質含有量の増加及び／または炭水化物含有量の減少が生ずる。更に別の目的は、植物の病原体または有害生物に対する抵抗性を増加させるための材料及び方法を提供することである。これらの目的及び他の目的、並びに本発明の要件は本明細書中の詳細説明から明らかであろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒら，ＰｌｏＳ  ｏｎｅ，７：ｅ３５９０７（２０１２）
【非特許文献２】Ｇｏｍｅｓら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓ．，８７：３５６８−３５７５（２００９）
【非特許文献３】Ｙｏｕｎｇら，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，５９：１２０３Ｓ−１２１２Ｓ（１９９４）
【非特許文献４】Ｐｉｍｅｎｔｅｌら，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，７８：６６０５−６６３５（２００３）
【非特許文献５】Ｂｅｌｌａｌｏｕｉら，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１：１１０−１１８（２０１０）
【非特許文献６】Ｗｅｎｅｆｒｉｄａら，Ｊ．Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，６１：１１７０２−１１７１０（２０１３）
【非特許文献７】Ｚｈａｎｇら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１３８：６６３−６７４（２００５）
【非特許文献８】Ｌｉら，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，５８：４８５−４９８（２００９）
【非特許文献９】Ｌｉら，Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｊ．，１３：１７７−１８７（２０１５）
【非特許文献１０】Ａｒｅｎｄｓｅｅら，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｔｐｌａｎｔｓ．２０１４．０７．００３（２０１４）
【非特許文献１１】Ｓｔｅｉｎら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１８（３）：７３１−７４６（２００６）
【非特許文献１２】Ｋｗｏｎら，Ｐｌａｎｔａ，２３６（３）：８８７−９００（２０１２）
【非特許文献１３】Ｔｈｉｌｍｏｎｙら，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，４６（１）：３４−５３（２００６）
【非特許文献１４】Ｓｃｈｅｅｌら，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  ＩＤ“Ｅ−ＧＥＯＤ−５６１６”，ＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓ
【発明の概要】
【０００８】
転写リプレッサー結合部位を含むプロモーターを含むＮＦ−ＹＣ４遺伝子を含む真核細胞中のタンパク質含有量の増加方法を提供する。方法は、転写リプレッサーがＮＦ−ＹＣ４の転写を防止できないように転写リプレッサー結合部位を修飾することを含む。真核細胞中のタンパク質含有量は増加する。よって、方法は更に、高いタンパク質含有量について選択することを含み得る。方法は更に、真核細胞から細胞の集まり、組織、器官または生物を作成することを含み得る。真核細胞は細胞の集まり、組織、器官または生物の一部であり得る。生物は植物、例えばダイズ、イネ、トウモロコシ等のような作物であり得る。植物は単子葉植物または双子葉植物であり得る。転写リプレッサー結合部位は欠失により修飾され得る。転写リプレッサー結合部位はＥＲＦモチーフ、ＲＡＶ１モチーフ、またはＥＲＦモチーフ及びＲＡＶ１モチーフの両方を含み得、これらから本質的に構成され得、またはこれらから構成され得る。真核細胞はイネ細胞であり得、（ｉ）２つのＥＲＦモチーフが欠失されており、（ｉｉ）ＲＡＦ１モチーフが欠失されており、または（ｉｉｉ）ＲＡＶ１モチーフ及びＥＲＦモチーフが欠失されている。真核細胞はダイズ細胞であり得、（ｉ）２つのＲＡＶ１モチーフが欠失されており、または（ｉｉ）ＲＡＶ１モチーフ及びＥＲＦモチーフが欠失されている。ＥＲＦモチーフ、ＲＡＶ１モチーフ、またはＥＲＦモチーフ及びＲＡＶ１モチーフの両方はＴＡＬＥＮＳまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いて欠失させ得る。
【０００９】
高いタンパク質含有量を有する植物の生産方法をも提供する。方法は、上記方法に従って得た植物を第２の植物と交雑させて子孫植物を生産し、高いタンパク質含有量を有する子孫植物を選択することを含む。方法は更に、選択した子孫植物を第２の植物と交雑させて戻し交雑子孫植物を生産し、高いタンパク質含有量を有する第１戻し交雑子孫植物を選択して選択した戻し交雑子孫植物を生産し、交雑及び選択を３回以上繰り返して高いタンパク質含有量を有する戻し交雑子孫植物を生産することを含み得る。
【００１０】
ＮＦ−ＹＣ４遺伝子が転写リプレッサーがＮＦ−ＹＣ４の転写を防止できないように修飾されている転写リプレッサー結合部位を含むプロモーターを含む細胞、細胞の集まり、組織、器官または生物も提供する。細胞、細胞の集まり、組織、器官または生物は、ＮＦ−ＹＣ４遺伝子が修飾されていない転写リプレッサー結合部位を含むプロモーターを含む対応する細胞、細胞の集まり、組織、器官または生物と比較して高いタンパク質含有量を有する。実施形態では、生物は植物またはそのハイブリッドであり得る。上記した植物またはそのハイブリッドの種子も提供する。別の実施形態では、生物は非ヒト動物、例えばウシ、ブタ、ニワトリ、七面鳥、ヒツジ及びバイソンのような家畜動物であり得る。
【００１１】
更に、転写リプレッサー結合部位を含むプロモーターを含むＮＦ−ＹＣ４遺伝子を含む植物細胞または植物中の病原体または有害生物に対する抵抗性の増加方法を提供する。方法は、転写リプレッサーがＮＦ−ＹＣ４遺伝子の転写を防止できるように病原体または有害生物に感染するリスクのある植物細胞または植物中のＮＦ−ＹＣ４遺伝子のプロモーターの転写リプレッサー結合部位を修飾することを含む。植物細胞または植物において病原体または有害生物に対する抵抗性が増加する；よって、方法は更に、病原体または有害生物に対する高い抵抗性について選択することを含み得る。方法は更に、配列番号１６に記載されているアミノ酸配列を有するＱｕａ−Ｑｕｉｎｅ  Ｓｔａｒｃｈ（ＱＱＳ）ポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを植物または植物細胞に導入し、そこで発現させることを含み得、前記ヌクレオチド配列はプロモーターに機能しうる形で連結されている。方法は更に、植物細胞から植物またはその一部を再生せることを含み得る。転写リプレッサー結合部位はＥＲＦモチーフ、ＲＡＶ１モチーフ、またはＥＲＦモチーフ及びＲＡＶ１モチーフの両方を含み得る。植物細胞または植物はイネ細胞またはイネ植物であり得、（ｉ）２つのＥＲＦモチーフが欠失されており、（ｉｉ）ＲＡＦ１モチーフが欠失されており、または（ｉｉｉ）ＲＡＶ１モチーフ及びＥＲＦモチーフが欠失されている。植物細胞または植物はダイズ細胞またはダイズ植物であり得、（ｉ）２つのＲＡＶ１モチーフが欠失されており、（ｉｉ）ＲＡＶ１モチーフ及びＥＲＦモチーフが欠失されている。ＥＲＦモチーフ、ＲＡＶ１モチーフ、またはＥＲＦモチーフ及びＲＡＶ１モチーフの両方はＴＡＬＥＮＳまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いて欠失させ得る。病原体は細菌またはウイルスであり得る。有害生物はアブラムシであり得る。植物は作物、例えばダイズであり得る。植物は双子葉植物であり得る。
【００１２】
更になお、病原体または有害生物に対して高い抵抗性を有する植物の生産方法も提供する。方法は、上記に従って得た植物を第２の植物と交雑させて子孫植物を生産し、植物病原体または有害生物に対して高い抵抗性を有する子孫植物を選択することを含む。方法は更に、選択した子孫植物を第２の植物と交雑させて戻し交雑子孫植物を生産し、病原体または有害生物に対して高い抵抗性を有する第１戻し交雑子孫植物を選択して選択した戻し交雑子孫植物を生産し、交雑及び選択を３回以上繰り返して病原体または有害生物に対して高い抵抗性を有する戻し交雑子孫植物を生産することを含み得る。
【００１３】
更にもっと、病原体または有害生物に対して高い抵抗性を有する植物を提供する。植物は転写リプレッサー結合部位を含むプロモーターを含むＮＦ−ＹＣ４遺伝子を含む。転写リプレッサー結合部位は、転写リプレッサーがＮＦ−ＹＣ４の転写を防止できないように修飾されている。植物の実施形態では、ＱＱＳを含まず、発現しない野生型に配列番号１６に記載されているアミノ酸配列を有するＱＱＳポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを導入し、発現させる。ヌクレオチド配列はプロモーターに対して機能しうる形で連結されている。
【００１４】
上記植物の種子及び植物のハイブリッドも提供する。ハイブリッド植物の種子も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】ＱＱＳを発現するベクターのマップである。
【図１Ｂ】アラビドプシス由来のＮＦ−ＹＣ４を発現するベクターのマップである。
【図１Ｃ】ダイズ由来のＮＦ−ＹＣ４を発現するベクターのマップである。
【図１Ｄ】イネ由来のＮＦ−ＹＣ４を発現するベクターのマップである。
【図１Ｅ】トウモロコシ由来のＮＦ−ＹＣ４を発現するベクターのマップである。
【図２】図２Ａは、以下のように本発明に関連する配列を示す。イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）のＮＦ−ＹＣ４遺伝子（Ｏｓ０３ｇｌ４６６９）のプロモーター領域を配列番号１として示し、ここでＲＡＶ１モチーフ（リバース）を太字で、ＲＡＶ１（リバース）及びＥＲＦ（フォワード）モチーフを下線付き太字で、ＥＲＦモチーフ（リバース）をイタリック体太字で示す。
【００１６】
ＲＡＶ１（リバース）モチーフ（ＴＧＴＴＧ；配列番号１中の太字を参照されたい）が欠失されているイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）のＮＦ−ＹＣ４遺伝子のプロモーター領域を配列番号２として示し、ここでＲＡＶ１（リバース）及びＥＲＦ（フォワード）モチーフを下線付き太字で、ＥＲＦモチーフ（リバース）をイタリック体太字で示す。
【００１７】
図２Ｂは、以下のように本発明に関連する配列を示す。
ＲＡＶ１（リバース）モチーフ及びＥＲＦ（フォワード）モチーフ（ＴＧＴＴＧＡＣＴ；配列番号１中の下線付き太字を参照されたい）の重複配列が欠失されているイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）のＮＦ−ＹＣ４遺伝子のプロモーター領域を配列番号３として示し、ここでＲＡＶ１モチーフ（リバース）を太字で、ＥＲＦモチーフ（リバース）をイタリック体太字で示す。
【００１８】
２つのＥＲＦモチーフ（リバース）（
【化１】
0006785235.tif 000002
［配列番号５］；配列番号１中の太字イタリック体の２つのＥＲＦを参照されたい）及び介在配列を含む１１１ｂｐセグメントが欠失されているイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）のＮＦ−ＹＣ４遺伝子のプロモーター領域を配列番号４として示し、ここでＲＡＶ１モチーフ（リバース）を太字で、ＲＡＶ１（リバース）及びＥＲＦ（フォワード）モチーフを下線付き太字で示す。
【００１９】
図２Ｃは、以下のように本発明に関連する配列を示す。
２つのＥＲＦモチーフ（リバース）、ＲＡＶ１（リバース）及びＥＲＦ（フォワード）モチーフ、及び介在配列（
【化２】
0006785235.tif 000003
［配列番号７］；配列番号１中のイタリック体太字の２つのＥＲＦモチーフ（リバース）、下線付き太字のＲＡＶ１（リバース）及びＥＲＦ（フォワード）モチーフ及び介在配列を参照されたい）を含む１９０ｂｐセグメントが欠失されているイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）のＮＦ−ＹＣ４遺伝子のプロモーター領域を配列番号６として示し、ここでＲＡＶ１モチーフ（リバース）を太字で示す。
【００２０】
ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）のＮＦ−ＹＣ４遺伝子（Ｇｌｙｍａ０６ｇｌ７７８０）のプロモーター領域を配列番号８として示し、ここでＥＲＦモチーフ（リバース）をイタリック体太字で、ＲＡＶ１モチーフ（リバース）を太字で、ＲＡＶ１モチーフ（フォワード）を下線付き太字で示す。
【００２１】
図２Ｄは、以下のように本発明に関連する配列を示す。
ＥＲＦモチーフ（リバース）、ＲＡＶ１モチーフ（フォワード）及び介在配列（
【化３】
0006785235.tif 000004
［配列番号１０］；配列番号８中のイタリック体太字及び下線付き太字を参照されたい）が欠失されているダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）のＮＦ−ＹＣ４遺伝子のプロモーター領域を配列番号９として示し、ここでＥＲＦモチーフ（リバース）をイタリック体太字で、ＲＡＶ１モチーフ（リバース）を太字で示す。
【００２２】
ＥＲＦモチーフ（リバース）、ＲＡＶ１モチーフ（リバース）及び介在配列（
【化４】
0006785235.tif 000005
［配列番号１２］；配列番号８中のイタリック体太字及び太字を参照されたい）が欠失されているダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）のＮＦ−ＹＣ４遺伝子のプロモーター領域を配列番号１１として示し、ここでＥＲＦモチーフ（リバース）をイタリック体太字で、ＲＡＶ１モチーフ（リバース）を太字で、ＲＡＶ１モチーフ（フォワード）を下線付き太字で示す。
【００２３】
図２Ｅは、以下のように本発明に関連する配列を示す。
２つのＲＡＶ１モチーフ及び介在配列（
【化５】
0006785235.tif 000006
［配列番号１４］；配列番号８中の太字を参照されたい）が欠失されているダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）のＮＦ−ＹＣ４遺伝子のプロモーター領域を配列番号１３として示し、ここでＥＲＦモチーフ（リバース）をイタリック体太字で、ＲＡＶ１モチーフ（リバース）を太字で、ＲＡＶ１モチーフ（フォワード）を下線付き太字で示す。
【００２４】
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）Ｑｕａ−Ｑｕｉｎｅ  Ｓｔａｒｃｈ（ＱＱＳ）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１５として示す。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＱＱＳタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１６として示す。ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）のＮＦ−ＹＣ４由来のＲＡＶ１−Ａモチーフと配列
【化６】
0006785235.tif 000007
を有するＷボックスモチーフ間のヌクレオチド配列を配列番号１７として示す。
【００２５】
フォワードプライマーＧｍＮＦ−ＹＣ４Ｆｄ：
【化７】
0006785235.tif 000008
を配列番号１８として示す。
【００２６】
リバースプライマーＧｍＮＦ−ＹＣ４Ｒｅｖ：
【化８】
0006785235.tif 000009
を配列番号１９として示す。
【００２７】
図２Ｆは、以下のように本発明に関連する配列を示す。
トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）のＮＦ−ＹＣ４遺伝子のプロモーター領域を配列番号２０として示し、ここで２つのＲＡＶ１モチーフ（フォワード）を太字で示す。
【図３−１】進化的に多様種の真核生物由来のＮＦ−ＹＣ遺伝子の系統樹。
【図３−２】進化的に多様種の真核生物由来のＮＦ−ＹＣ遺伝子の系統樹。
【図４Ａ】ＱＱＳを発現するダイズエリート系統及びそのそれぞれの分離同胞対照対Ｆ３世代における種子タンパク質（％／１３％の水分を有する新鮮重量のｇ）の棒グラフである。それぞれの分離同胞対照と比較した種子タンパク質の増加％を変異体バーの上部に示す。ａ＝ＱＱＳ−Ｅウィリアムズ８２形質転換体由来のＱＱＳ遺伝子を欠く分離同胞；ｂ＝ＱＱＳ−Ｅウィリアムズ８２形質転換体；ｃ＝ＩＡエリート系統またはウィリアムズ８２とＱＱＳ−Ｅウィリアムズ８２の交雑種由来のＱＱＳ遺伝子を欠く分離同胞対照；ｄ＝ＩＡエリート系統とＱＱＳ−Ｅウィリアムズ８２の交雑種由来のＱＱＳ−Ｅ変異体。ＱＱＳ−Ｅと対照を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊＊Ｐ＜０．０１。
【図４Ｂ】ＱＱＳを発現するダイズエリート系統及びそのそれぞれの分離同胞対照対Ｆ３世代における種子油（％／１３％の水分を有する新鮮重量のｇ）の棒グラフである。ａ＝ＱＱＳ−Ｅウィリアムズ８２形質転換体由来のＱＱＳ遺伝子を欠く分離同胞；ｂ＝ＱＱＳ−Ｅウィリアムズ８２形質転換体；ｃ＝ＩＡエリート系統またはウィリアムズ８２とＱＱＳ−Ｅウィリアムズ８２の交雑種由来のＱＱＳ遺伝子を欠く分離同胞対照；ｄ＝ＩＡエリート系統またはウィリアムズ８２とＱＱＳ−Ｅウィリアムズ８２の交雑種由来のＱＱＳ−Ｅ変異体。ＱＱＳ−Ｅと対照を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５。＊＊Ｐ＜０．０１。
【図４Ｃ】ＱＱＳを発現するダイズエリート系統及びそのそれぞれの分離同胞対照対Ｆ３世代における種子繊維（％／１３％の水分を有する新鮮重量のｇ）の棒グラフである。ａ＝ＱＱＳ−Ｅウィリアムズ８２形質転換体由来のＱＱＳ遺伝子を欠く分離同胞；ｂ＝ＱＱＳ−Ｅウィリアムズ８２形質転換体；ｃ＝ＩＡエリート系統またはウィリアムズ８２とＱＱＳ−Ｅウィリアムズ８２の交雑種由来のＱＱＳ遺伝子を欠く分離同胞対照；ｄ＝ＩＡエリート系統またはウィリアムズ８２とＱＱＳ−Ｅウィリアムズ８２の交雑種由来のＱＱＳ−Ｅ変異体。ＱＱＳ−Ｅと対照を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５。＊Ｐ＜０．０１。
【図５Ａ】ＱＱＳを発現するイネ（品種キタアケ）（ＱＱＳ−Ｅ）及びその野生型同胞（同胞）対葉タンパク質（乾燥重量％）の棒グラフである。すべてのデータは平均値±ＳＥ，ｎ＝３を示す。ＱＱＳ−Ｅと対照を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊＊Ｐ＜０．０１。
【図５Ｂ】ＱＱＳを発現するイネ（品種キタアケ）（ＱＱＳ−Ｅ）及びその野生型同胞（同胞）対種子タンパク質（乾燥重量％）の棒グラフである。すべてのデータは平均値±ＳＥ，ｎ＝３を示す。ＱＱＳ−Ｅと対照を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊＊Ｐ＜０．０１。
【図６】餌食＋つり餌の空ベクター（ＢＫ＋ＡＤ）、ＱＱＳ−餌食＋つり餌の空ベクター（ＢＫ＋ＱＱＳ）、ＡｔＮＦ−ＹＣ４−つり餌＋餌食の空ベクター（ＡｔＮＦ−ＹＣ４＋ＡＤ）、及びＡｔＮＦ−ＹＣ４−つり餌＋ＱＱＳ−餌食（ＡｔＮＦ−ＹＣ４＋ＱＱＳ）対レポーター遺伝子相対発現の棒グラフである。＊Ｐ＜０．０５。＊＊Ｐ＜０．０１。
【図７Ａ】ＮＦ−ＹＣ４を過剰発現するアラビドプシス（ＡｔＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ）及び野生型アラビドプシス（ＷＴ）対葉デンプン（ｍｇ／ｇ新鮮重量）の棒グラフである。棒グラフ中のすべてのデータは平均値±ＳＥ，ｎ＝３を示す。ＷＴ及びＡｔＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ系統中のデンプン組成を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５。
【図７Ｂ】ＮＦ−ＹＣ４を過剰発現するアラビドプシス（ＡｔＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ）及び野生型アラビドプシス（ＷＴ）対葉タンパク質（ｍｇ／ｇ新鮮重量）の棒グラフである。棒グラフ中のすべてのデータは平均値±ＳＥ，ｎ＝３を示す。ＷＴ及びＡｔＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ系統中のタンパク質組成を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊＊Ｐ＜０．０１。
【図８】対照（ｐＳｏｙ−ＬＵＣＦｕｌｌ）と比較した、ダイズＮＦ−ＹＣ４のプロモーター領域中の転写リプレッサーモチーフが欠失されている（ｐＳｏｙ−ＬＵＣ  ＤＥＬ１、ｐＳｏｙ−ＬＵＣ  ＤＥＬ２及びｐＳｏｙ−ＬＵＣ  ＤＥＬ３）タバコ由来のＬＵＣ（ルシフェラーゼ）活性対相対ＬＵＣ活性のグラフである。データは平均値±ＳＥＭ，ｎ＝３を表す。欠失を有するプロモーター及び完全長プロモーターにより駆動されるＬＵＣ活性を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５。エラーバーは標準誤差を示す。
【図９】対照（ＯｓＮＦ−ＹＣ４ｐｒｏＦｕｌｌ）と比較した、イネＮＦ−ＹＣ４のプロモーター領域中の転写リプレッサーモチーフが欠失されている（ＯｓＮＦ−ＹＣ４ｐｒｏ１、Ｏｓ−ＮＦ−ＹＣ４ｐｒｏ２及びＯｓ−ＮＦ−ＹＣ４ｐｒｏ３）タバコ由来のＬＵＣ活性対相対ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）活性のグラフである。データは平均値±ＳＥＭ，ｎ＝３を表す。欠失を有するプロモーター及び完全長プロモーターにより駆動されるＬＵＣ活性を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５。エラーバーは標準誤差を示す。
【図１０Ａ】１０個のアラビドプシス植物あたりの平均フォーカス数（ウイルス接種から１２０時間目（ｈａｉ）の±標準誤差）についての変異体対対照のグラフである。対照及びＱＱＳまたはＮＦ−ＹＣ４変異体中のフォーカス数を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５。＊＊＜０．０１。＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１０Ｂ】平均フォーカスサイズ（ｍｍ２）（ウイルス接種から１２０ｈａｉの±標準誤差（ｎ＝４０））についての変異体対対照のグラフである。対照及びＱＱＳまたはＮＦ−ＹＣ４変異体中のフォーカス数を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１１】Ｐｓｔ  ＤＣ３０００及びΔＣＥＬについてのアラビドプシス植物中の接種から０日目（０ｄｐｉ）及び４日目（４ｄｐｉ）対細菌数（ｌｏｇ１０（ＣＦＵ／ｃｍ２））のグラフである。エラーバーは標準誤差を示す。対照及びＱＱＳまたはＮＦ−ＹＣ４変異体中の細菌数を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊＊Ｐ＜０．０１。＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１２Ａ】細菌数（ＣＦＵ＊１０４／ｃｍ２）についてのダイズ系統のグラフである。エラーバーは標準誤差を示す。対照及びＱＱＳ−ＥまたはＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ変異体中の細菌数を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊＊Ｐ＜０．０１。（ＥＶ＝空ベクター）
【図１２Ｂ】相対的発現レベルについてのＮＦ−ＹＣ４−ＯＥダイズ系統のグラフである。エラーバーは標準誤差を示す。＊＊Ｐ＜０．０１。（ＥＶ＝空ベクター）
【図１３】ダイズ遺伝子型ＱＱＳ−Ｅ  １６−６（ＱＱＳを発現する系統１６−６）、ＱＱＳ−Ｅ  ３２−６（ＱＱＳを発現する系統３２−６）、対照、ＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ  Ｌ１（ＮＦ−ＹＣ４を過剰発現する系統１）及びＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ  Ｌ２（ＮＦ−ＹＣ４を過剰発現する系統２）対植物あたりのアブラムシの平均数のグラフである。エラーバーは標準誤差を示す。対照及びＱＱＳ−ＥまたはＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ変異体中のアブラムシ数を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５。＊＊Ｐ＜０．０１。（ＥＶ＝空ベクター）
【図１４Ａ】同胞対照と比較した、ＮＦ−ＹＣ４を過剰発現する形質転換ダイズ（ＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ）の形質転換事象（１、２、３及び４；各数は異なる形質転換事象を示す）対タンパク質含有量のグラフである。エラーバーは標準誤差を示す。ＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ変異体及び同胞対照中のタンパク質含有量を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５。＊＊Ｐ＜０．０１。
【図１４Ｂ】同胞対照と比較した、ＮＦ−ＹＣ４を過剰発現する形質転換ダイズ（ＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ）の形質転換事象（１、２、３及び４；各数は異なる形質転換事象を示す）対油含有量のグラフである。エラーバーは標準誤差を示す。ＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ変異体及び同胞対照中の油含有量を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５。
【図１４Ｃ】同胞対照と比較した、ＮＦ−ＹＣ４を過剰発現する形質転換ダイズ（ＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ）の形質転換事象（１、２、３及び４；各数は異なる形質転換事象を示す）対タンパク質＋油含有量のグラフである。エラーバーは標準誤差を示す。ＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ変異体及び同胞対照中のタンパク質＋油含有量を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５。＊＊Ｐ＜０．０１。
【図１４Ｄ】同胞対照と比較した、ＮＦ−ＹＣ４を過剰発現する形質転換ダイズ（ＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ）の形質転換事象（１、２、３及び４；各数は異なる形質転換事象を示す）対種子繊維（％／１３％の水分を有する新鮮重量）のグラフである。エラーバーは標準誤差を示す。ＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ変異体及び同胞対照中の繊維含有量を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊＊Ｐ＜０．０１。
【図１４Ｅ】同胞対照と比較した、ＮＦ−ＹＣ４を過剰発現する形質転換ダイズ（ＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ）の形質転換事象（１、２、３及び４；各数は異なる形質転換事象を示す）対植物あたりの種子重量（ｇ／植物）のグラフである。エラーバーは標準誤差を示す。ＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ変異体及び同胞対照中の植物あたりの種子重量を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した。
【図１５Ａ】同胞対照と比較した、アラビドプシスＮＦ−ＹＣ４を過剰発現する形質転換トウモロコシ（ＡｔＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ）対核タンパク質（乾燥重量％）のグラフである。エラーバーは標準誤差を示す。ＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ変異体及び同胞対照中のタンパク質含有量を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊＊Ｐ＜０．０１。
【図１５Ｂ】同胞対照と比較した、アラビドプシスＮＦ−ＹＣ４を過剰発現する形質転換トウモロコシ（ＡｔＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ）対核油（乾燥重量％）のグラフである。エラーバーは標準誤差を示す。ＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ変異体及び同胞対照中の油含有量を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した。
【図１５Ｃ】同胞対照と比較した、アラビドプシスＮＦ−ＹＣ４を過剰発現する形質転換トウモロコシ（ＡｔＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ）対核デンプン（乾燥重量％）のグラフである。エラーバーは標準誤差を示す。ＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ変異体及び同胞対照中のデンプン含有量を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊＊Ｐ＜０．０１。
【図１６Ａ】野生型と比較した、イネＮＦ−ＹＣ４を過剰発現する形質転換イネ（ＯｓＮＦ−ＹＣ４−１−ＯＥ）対種子デンプン（ｍｇ／ｇ新鮮重量）のグラフである。エラーバーは標準誤差を示す。ＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ変異体及び対照中の種子デンプン含有量を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊＊Ｐ＜０．０１。
【図１６Ｂ】野生型と比較した、イネＮＦ−ＹＣ４を過剰発現する形質転換イネ（ＯｓＮＦ−ＹＣ４−１−ＯＥ）対種子タンパク質（ｍｇ／ｇ新鮮重量）のグラフである。エラーバーは標準誤差を示す。ＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ変異体及び対照中の種子タンパク質含有量を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊＊Ｐ＜０．０１。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、少なくとも部分的にＱＱＳと相互作用する遺伝子の発見に基づいている。この遺伝子はＮＦ−ＹＣ４として公知の転写調節因子である。遺伝子は真核生物種に保存されており、アラビドプシスからダイズ、イネやトウモロコシのような主要作物種の多様な植物種中に存在している。アラビドプシスにおけるＮＦ−ＹＣ４の過剰発現はＱＱＳ過剰発現に似ている；タンパク質含有量は増加し、炭水化物含有量は減少する。よって、本発明は、ＱＱＳと相互作用する遺伝子（本明細書では「インタラクター遺伝子」とも称される）、例えばＮＦ−ＹＣ、特にＮＦ−ＹＣ４（別名には、ＭＬＥ２．１０、ＭＬＥ２＿１０及び核因子Ｙ，サブユニットＣが含まれるが、これらに限定されない）を操作するための材料及び方法を提供する。実施形態では、遺伝子を操作すると、タンパク質含有量の増加及び／または炭水化物含有量の減少及び／または病原体または有害生物に対する抵抗性の増加が生ずる。遺伝子の操作は、例えば転写リプレッサー結合モチーフ（または、２つ以上の部位／モチーフが存在するならば２つ以上の部位／モチーフ；この場合同一方法または異なる方法で変異され得る）を含む転写リプレッサー結合部位の欠失（または、挿入、置換、反転等）による変異を含み得る。転写リプレッサー結合部位は、例えばそこに存在する１つ以上の転写リプレッサー結合モチーフの変異、例えば欠失により操作され得る。「修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」、「修飾する（ｍｏｄｉｆｙ）」、「修飾する（ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ）」及び「修飾した（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）」は前記操作を記載するために本明細書中で使用され得る。
【００２９】
ＮＦ−ＹＣはＮＦ−Ｙ転写因子複合体の一部である。ＮＦ−Ｙは３つのサブユニット、すなわちＮＦ−ＹＡ、ＮＦ−ＹＢ及びＮＦ−ＹＣから構成されている。３つのサブユニットの各々は進化的に保存された領域を含む。保存領域はＮＦ−ＹＡサブユニットのＣ末端にあり、ＮＦ−ＹＣサブユニットのＮ末端にあり、及びＮＦ−ＹＢサブユニット中の中央に位置している。ＮＦ−ＹＡ及びＮＦ−ＹＣサブユニットは、活性化ドメイン機能を含み、ある程度の保存を示すグルタミンリッチ領域を有する。ＮＦ−Ｙは、１つがＮＦ−ＹＡサブユニット中に、もう１つがＮＦ−ＹＣサブユニット中にある２つの転写活性化ドメインを含むことは判明している。約６５アミノ酸長のヒストン型折りたたみモチーフ（ＨＦＭ）がＮＦ−ＹＢ及びＮＦ−ＹＣサブユニット中に存在している。ＮＦ−ＹＢ及びＮＦ−ＹＣサブユニットは強固なダイマーを形成し、これらはＮＦ−ＹＡサブユニットと結合する。生じたトリマーはＤＮＡに結合し得る。
【００３０】
植物転写因子はＡＰ２／ＥＲＦと称されるスーパーファミリーを含む。ＡＰ２／ＥＲＦスーパーファミリーは、約６０〜７０アミノ酸から構成され、ＤＮＡ結合に関与するＡＰ２／ＥＲＦドメインにより規定される。スーパーファミリーは３つのファミリー、すなわちＡＰ２ファミリー、ＥＲＦファミリー及びＲＡＶファミリーを含む。タンパク質のＡＰ２ファミリーは２つの反復ＡＰ２／ＥＲＦドメインを含み、タンパク質のＥＲＦファミリーは１つのＡＰ２／ＥＲＦドメインを含み、タンパク質のＲＡＶファミリーは１つのＡＰ２／ＥＲＦドメイン及び他の植物特異的転写因子中に保存されているＤＮＡ結合ドメインであるＢ３ドメインを含む。追加情報はＰｌａｎｔ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｄａｔａｂａｓｅ（Ｐｌａｎｔ  ＴＦＤＢ）ウェブサイトから入手可能である。
【００３１】
ＮＦ−ＹＣ４のプロモーター領域中に存在する転写リプレッサー結合モチーフの例はＲＡＶ１により結合されるものである。ＲＡＶ１モチーフの配列はＣＡＡＣＡである。ＲＡＶ１は、モノマーとしてＣＡＡＣＡを有するモチーフ及びＣＡＣＣＴＧを有するモチーフから構成される２つの部分からなる標的に結合する。２つのモチーフは２−８ヌクレオチドにより分離され、相互に別々に配向され得る（Ｋａｇａｙａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２７：４７０−４７８（１９９９））。上記したように、ＲＡＶ１は単一のＡＰ２／ＥＲＦ及びＢ３ドメイン含有転写因子である。別名には、Ａｔｌｇｌ３２６０、ＥＤＦ４、エチレン応答性ＤＮＡ結合因子４、エチレン応答性転写因子ＲＡＶ１、ＡＢ１３／ＶＰ１  １に関連するタンパク質、ＡＢ１３／ＶＰ１  １に関連するタンパク質、Ｔ６Ｊ４＿２及びＴ６Ｊ４．２が含まれるが、これらに限定されない。追加情報はｉＨＯＰ（タンパク質にハイパーリンクさせた情報）ウェブサイト及びＰｌａｎｔ  ＴＦＤＢウェブサイトから入手可能である。ＲＡＶ１は次の呼称を有する：ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ９ＺＷＭ９，ＰＤＢ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １ＷＩＤ、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ８３７８８６、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿１７２７８４、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＮＭ＿１０１１９７、ＮＣＢＩ  ＵｎｉＧｅｎｅ  ８３７８８６、ＮＣＢＩアクセッション番号ＢＡＡ３４２５０及びＡＡＧ０９５５４。ＲＡＶ１のホモログには、ＡＴ３Ｇ２５７３０（シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ））、ＴＥＭ１（シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ））、ＲＡＶ２（シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ））、Ｏｓ０１ｇ０６９３４００（イネ（Ｏｒｚｙａ ｓａｔｉｖａ）ジャポニカ米）、及びＯｓ０５ｇ０５４９８００（イネ（Ｏｒｚｙａ ｓａｔｉｖａ）ジャポニカ米））が含まれる。ＵｎｉＰｒｏｔ、ＰＤＢ及びＮＣＢＩから入手可能な前述の配列／構造情報のすべてが参照により本明細書に組み入れられる。
【００３２】
ＮＦ−ＹＣ４のプロモーター領域中に存在する転写リプレッサー結合モチーフの別の例は、ＥＲＦ（エチレン応答性因子）により結合されるもの、より具体的には「Ｗボツクス」モチーフ（例えば、ＥＲＦ３遺伝子のプロモーター中に存在する；本明細書中でＥＲＦモチーフと称されることがある）である。Ｗボックスモチーフの配列はＴＧＡＣＹ（ここで、Ｙ＝ＣまたはＴ）である。上記したように、ＥＲＦは単一ＡＰ２／ＥＲＦドメイン含有転写因子である。追加情報はＰｌａｎｔ  ＴＦＤＢウェブサイトから入手可能である。アラビドプシス及びイネ中のＥＲＦ遺伝子ファミリーのゲノムワイドな分析の検討のためには、それに関する教示内容について参照により本明細書に組み入れるＮａｋａｎｏら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１４０（２）：４１１−４３２（２００６）を参照されたい。
【００３３】
よって、上記にてらして、本発明は、ＮＦ−ＹＣ４遺伝子を含む真核細胞中のタンパク質含有量の増加方法を提供する。ＮＦ−ＹＣ４遺伝子は転写リプレッサー結合部位を含むプロモーターを含む。高いタンパク質含有量を有する植物の生産方法も提供する。更に、植物細胞または植物、特に病原体または有害生物に感染するリスクのある植物におけるストレス、例えば非生物的ストレス（例えば、塩、干ばつ、汚染）または生物的ストレス、例えば病原体または有害生物に対する抵抗性を増加させる方法を提供する。植物はＮＦ−ＹＣ４遺伝子を含み、該遺伝子は転写リプレッサー結合部位を含むプロモーターを含む。なお更に、病原体または有害生物に対して高い抵抗性を有する植物の生産方法を提供する。
【００３４】
上記方法は転写リプレッサー結合部位を操作または修飾することを含み、そうすると転写リプレッサーはＮＦ−ＹＣ４の転写を防止できない。転写リプレッサー結合部位はＥＲＦモチーフ及び／またはＲＡＶ１モチーフを含み、本質的にこれらから構成され、またはこれらから構成され、両モチーフの一方または両方は欠失のように操作または修飾され得、例えばＴＡＬＥＮＳまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いて欠失され得る。２つ以上のモチーフを操作または修飾する場合、これらは同一の方法または別々に操作または修飾され得る。方法は、全プロモーターの別のプロモーター、例えば構成プロモーターとの置換を包含しない。
【００３５】
ＮＦ−ＹＣ４遺伝子は真核ＮＦ−ＹＣ４遺伝子、例えば動物由来のＮＦ−ＹＣ４遺伝子、真菌由来のＮＦ−ＹＣ４遺伝子、藻類由来のＮＦ−ＹＣ４遺伝子、または植物由来のＮＦ−ＹＣ４遺伝子であり得る。ＮＦ−ＹＣ４遺伝子の例には、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）（ＣＤＳはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＣ７９７１４３．１として入手可能である）、タルウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）（ＣＤＳはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＱ９１８２９６．１として入手可能である）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）（Ｇｅｎｅ  ＩＤ  ８３６４６６；ＴＡＩＲ  ＡＴ５Ｇ６３４７０（ＡＴ５Ｇ６３４７０．１及びＡＴ５Ｇ６３４７０．２）；ゲノム配列はＮＣ＿００３０７６．８（２５４１５７０１．２５４１７１１７，補体）、ＣＤＳはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１２５７４２．５及びＮＭ＿００１０３７０５３．１）として入手可能である））、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）（Ｇｌｙｍａ０６ｇ１７７８０及びＧｌｙｍａ０４ｇ３７２９１）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）（Ｏｓ３ｇ１４６６９、Ｏｓ０２ｇ０７４５０及びＯｓ０６ｇ４５６４０）、及びトウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）（ＧｒｍＺｍ２ｇ０８９８１２）が含まれるが、これらに限定されない。別の遺伝子はコナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）（Ｃｒｅ１２．ｇ５５６４００；Ｃｒｅ１２．ｇ５５６４００．ｔ１．３）でも同定されている。方法の実施形態では、ＮＦ−ＹＣ４遺伝子のコード領域は操作または修飾されない。方法の別の実施形態では、ＮＦ−ＹＣ４遺伝子のコード領域は、更にタンパク質含有量を増加させるために操作または修飾、例えば操作または修飾（例えば、挿入、欠失、置換、反転、またはＮまたはＣ末端での短小化）される。
【００３６】
（ホモログ、オルトログ及びパラログを含めた）他のＮＦ−ＹＣ４遺伝子は当業界で公知の方法により同定され得る。例えば、遺伝子は本明細書中に同定されているＮＦ−ＹＣ４遺伝子とアミノ酸配列同一性を有している保存ドメインについてデーターベースを検索することにより同定され得る。遺伝コードの縮重により、かなりばらつきのあるヌクレオチド配列を非常に類似しているかまたは同一のアミノ酸配列を有するタンパク質に翻訳することができる。ＭＥＧＡＬＩＧＮ（ＤＮＡＳｔａｒ，Ｉｎｃ．，ウィスコンシン州マディソン）のようなプログラムは各種方法、例えばクラスタル分析（Ｈｉｇｇｉｎら，Ｇｅｎｅ，７３：２３７−２４４（１９８８））に従って２つ以上の配列間のアラインメントを作成することができる。他のアラインメントアルゴリズム及びプログラムには、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ及びＥＮＴＲＥＺ（ＮＣＢＩ；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．，３６：２９０−３００（１９９３）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））が含まれる。ＧＣＧプログラム（米国特許Ｎｏ．６，２６２，３３３）、及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６，“Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９６）に記載されているアラインメントのための他の技術も参照されたい。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムは配列アラインメント中のギャップを許す；アルゴリズムはＭＡＳＰＡＲコンピュータ及びＭＰＳＲＣＨソフトウェアを用いて実施し得る。配列をアラインさせるためにＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈアラインメント方法を用いるＧＡＰプログラムも使用され得る。加えてまたは代えて、２つ以上の関連転写因子の過剰発現またはノックアウト時の転写プロフィールを比較し得る。手動方法も類似領域及び保存ドメインを同定するために使用され得、三次構造の比較を含み得る。一旦同定されれば、遺伝子は当業界で公知の方法に従ってクローン化され得る。
【００３７】
他のＮＦ−ＹＣ４遺伝子もストリンジェントまたは高ストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションにより同定され得る。ストリンジェンシーは各種要因、例えばハイブリダイゼーション時の温度、塩濃度及び組成、有機及び無機添加剤、溶媒等、及び洗浄液により影響される（例えば、前掲のＳａｍｂｒｏｏｋら；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ編，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（１９８５）を参照されたい）。ハイブリダイゼーションアッセイ、例えばサザンブロット、ノーザンロット、液中ハイブリダイセーション等を使用し得る（例えば，前掲のＳａｍｂｒｏｏｋらを参照されたい）。
【００３８】
本明細書中に記載されている配列に関して、配列同一性のパーセンテージは約５５％〜１００％の範囲であり得る。ＮＦ−ＹＣ４遺伝子が広範囲の真核生物で高度に保存されているとすると、配列同一性、特にアミノ酸レベルでの配列同一性のパーセンテージは約６０％〜１００％、例えば約６５％〜１００％、約７０％〜１００％、約７５％〜１００％、約８０％〜１００％、約８５％〜１００％、約９０％〜１００％、または約９５％〜１００％の範囲であり得、例えば約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％であり得る。
【００３９】
操作または修飾させようとするＮＦ−ＹＣ４の領域はプロモーター領域である。より具体的には、転写リプレッサーが結合している転写リプレッサー結合部位は、転写リプレッサーの結合部位への結合を防止または抑制するために例えば変異、具体的には欠失（または、挿入、置換、反転等）により操作または修飾され、これにより真核生物、例えば植物の生化学的組成が変更される。特に、転写リプレッサー結合部位モチーフが操作または修飾される。例えば貯蔵産物の組成、例えばタンパク質、炭水化物及び脂質を変更させ得る。より具体的には、タンパク質含有量を増加させ得、及び／または炭水化物含有量を減少させ得る。
【００４０】
イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）のＮＦ−ＹＣ４遺伝子（Ｏｓ０３ｇ１４６６９）のプロモーター領域を配列番号１（図２Ａを参照されたい）として示す。ＲＡＶ１モチーフ（リバース）を太字で示し、ＲＡＶ１（リバース）及びＥＲＦ（フォワード）モチーフを下線付き太字で示し、ＥＲＦモチーフ（リバース）をイタリック体太字で示す。
【００４１】
ＲＡＶ１（リバース）モチーフ（ＴＧＴＴＧ；配列番号１中の太字を参照されたい）が欠失されているイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）のＮＦ−ＹＣ４遺伝子のプロモーター領域を配列番号２（図２Ａを参照されたい）として示す。ＲＡＶ１（リバース）及びＥＲＦ（フォワード）モチーフを下線付き太字で示し、ＥＲＦモチーフ（リバース）はイタリック体太字で示す。
【００４２】
ＲＡＶ１（リバース）モチーフ及びＥＲＦ（フォワード）モチーフの重複配列（ＴＧＴＴＧＡＣＴ；配列番号１中の下線付き太字を参照されたい）が欠失されているイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）のＮＦ−ＹＣ４遺伝子のプロモーター領域を配列番号３（図２Ｂを参照されたい）として示す。ＲＡＶ１モチーフ（リバース）を太字で示し、ＥＲＦモチーフ（リバース）をイタリック体太字で示す。
【００４３】
２つのＥＲＦモチーフ（リバース）（
【００４４】
【化９】
0006785235.tif 000010
［配列番号５；配列番号１中太字イタリック体の２つのＥＲＦ及び介在配列を参照されたい）を含有している１１１ｂｐセグメントが欠失されているイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）のＮＦ−ＹＣ４遺伝子のプロモーター領域を配列番号４（図２Ｂを参照されたい）として示す。ＲＡＶ１モチーフ（リバース）を太字で示し、ＲＡＶ１（リバース）及びＥＲＦ（フォワード）モチーフを下線付き太字で示す。
【００４５】
２つのＥＲＦモチーフ（リバース）、ＲＡＶ１（リバース）及びＥＲＦ（フォワード）モチーフ、及び介在配列（
【００４６】
【化１０】
0006785235.tif 000011
［配列番号７］；配列番号１中イタリック体太字の２つのＥＲＦモチーフ（リバース）、下線付き太字のＲＡＶ１（リバース）及びＥＲＦ（フォワード）モチーフ、及び介在配列を参照されたい）を含有している１９０ｂｐセグメントが欠失されているイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）のＮＦ−ＹＣ４遺伝子のプロモーター領域を配列番号６（図２Ｃを参照されたい）として示す。ＲＡＶ１モチーフ（リバース）を太字で示す。
【００４７】
イネ細胞またはイネ植物を伴う方法の実施形態では、（ｉ）２つのＥＲＦモチーフを欠失させ得、（ｉｉ）ＲＡＦ１モチーフを欠失させ得、または（ｉｉｉ）ＲＡＶ１モチーフ及びＥＲＦモチーフを欠失させ得る。
【００４８】
ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）のＮＦ−ＹＣ４遺伝子（Ｇｌｙｍａ０６ｇ１７７８０）のプロモーター領域を配列番号８（図２Ｃを参照されたい）として示す。ＥＲＦモチーフ（リバース）をイタリック体太字で示し、ＲＡＶ１モチーフ（リバース）を太字で示し、ＲＡＶ１モチーフ（フォワード）を下線付き太字で示す。
【００４９】
ＥＲＦモチーフ（リバース）、ＲＡＶ１モチーフ（フォワード）及び介在配列（
【００５０】
【化１１】
0006785235.tif 000012
［配列番号１０］；配列番号８中イタリック体太字及び下線付き太字を参照されたい）が欠失されているダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）のＮＦ−ＹＣ４遺伝子のプロモーター領域を配列番号９（図２Ｄを参照されたい）として示す。ＥＲＦモチーフ（リバース）をイタリック体太字で示し、ＲＡＶ１モチーフ（リバース）を太字で示す。
【００５１】
ＥＲＦモチーフ（リバース）、ＲＡＶ１モチーフ（リバース）及び介在配列（
【００５２】
【化１２】
0006785235.tif 000013
［配列番号１２］；配列番号８中イタリック体太字及び太字を参照されたい）が欠失されているダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）のＮＦ−ＹＣ４遺伝子のプロモーター領域を配列番号１１（図２Ｄを参照されたい）として示す。ＥＲＦモチーフ（リバース）をイタリック体太字で示し、ＲＡＶ１モチーフ（リバース）を太字で示し、ＲＡＶ１モチーフ（フォワード）を下線付き太字で示す。
【００５３】
２つのＲＡＶ１モチーフ及び介在配列（
【００５４】
【化１３】
0006785235.tif 000014
［配列番号１４］；配列番号８中太字を参照されたい）が欠失されているダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）のＮＦ−ＹＣ４遺伝子のプロモーター領域を配列番号１３（図２Ｅを参照されたい）として示す。ＥＲＦモチーフ（リバース）をイタリック体太字で示し、ＲＡＶ１モチーフ（リバース）を太字で示し、ＲＡＶ１モチーフ（フォワード）を下線付き太字で示す。
【００５５】
ダイズ細胞またはダイズ植物を伴う方法の実施形態では、（ｉ）２つのＲＡＶ１モチーフを欠失させ得、または（ｉｉ）ＲＡＶ１モチーフ及びＥＲＦモチーフを欠失させ得る。
【００５６】
トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）のＮＦ−ＹＣ４遺伝子プロモーター領域を配列番号２０として示す。２つのＲＡＶ１モチーフ（フォワード）を太字で示す。トウモロコシ細胞またはトウモロコシ植物を伴う方法の実施形態では、ＲＡＶ１モチーフの一方または両方を欠失させ得る。
【００５７】
領域は当業界で公知の適当な手法により修飾され得る。例えば、位置指定または位置特異的突然変異誘発、最適化指向性進化、遺伝子部位飽和突然変異誘発（ＧＳＳＭ）、合成ライゲーション再集合（ＳＬＲ）、エラープローンＰＣＲ、シャッフリング、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発、アッセンブリーＰＣＲ、セクシャルＰＣＲ突然変異誘発、インビボ突然変異誘発、カセット突然変異誘発、再起的アンサンブル突然変異誘発、指数関数的アンサンブル突然変異誘発、遺伝子再集合、ＳＬＲ組換え、再帰的配列組換え、ホスホロチオエート修復ＤＮＡ突然変異誘発、ウラシル含有鋳型を用いる突然変異誘発、ギャップ二重螺旋突然変異誘発、ポイントミスマッチ修復による突然変異誘発、修復欠損宿主株突然変異誘発、化学的突然変異誘発、放射線突然変異誘発、欠失突然変異誘発、制限選択突然変異誘発、制限−精製突然変異誘発、人工遺伝子合成、アンサンブル突然変異誘発、キメラ核酸マルチマー作成、または他の標的化突然変異誘発技術、例えばメガヌクレアーゼ、トランスポゾン、リコンビナーゼ、化学ＤＮＡカッター、及びジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＲＮＡガイド人工ヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）のようなプログラマブルヌクレアーゼ、及び細菌性ＩＩ型集まって規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）−Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）獲得免疫系を用いる遺伝子工学。ＺＦＮ（アミノ末端のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）、及びカルボキシル末端のＦｏｋＩまたは他のヌクレアーゼドメイン）、ＴＡＬＥＮ（アミノ末端の転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、及びカルボキシル末端のＦｏｋＩまたは他のヌクレアーゼドメイン）、ＲＧＥＮ及びＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを用いる遺伝子工学により、染色体ＤＮＡを位置特異的に切断することにより培養細胞、植物及び動物中において標的化遺伝子修復が可能になり、内在性ＤＮＡ修復システムをトリガーし、標的ゲノム修復が生ずる。検討のために、これに関する教示内容のために参照により本明細書に組み入れるＫｉｍら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），１５：３２１−３３４（Ｍａｙ  ２０１４）を参照されたい。作物を遺伝的に改善するための人工ヌクレアーゼの使用についてはここに引用されている（及び参照により組み入れられる）参考文献１７８−１８０、及び特定の栄養素を有する家畜を高栄養化にしたり、家畜を耐病性とするための人工ヌクレアーゼの使用についてはここに引用されている（及び参照により組み入れられる）参考文献３２及び１６８も参照されたい。
【００５８】
ＲＧＥＮ及び他のヌクレアーゼのオフターゲット効果を最小限にしたり、避けることができる。例えば、ゲノム中の他の場所に高度に相同性の配列を欠くユニークな標的部位を選択することが重要である。そのような部位はコンピューターアルゴリズムを使用してＴＡＬＥＮを検索することにより同定され得る。加えて、本明細書中に以下に述べるようにウェブベースプログラムがＴＡＬＥＮ及びＲＧＥＮに対して利用し得る。ＲＧＥＮに対するヌクレアーゼ発現レベルを最適化することも重要である。５’末端に２つの追加グアニンを有する修飾ガイドＲＮＡまたは短小化ｓｇＲＮＡのいずれかを使用すると、オフターゲット変異が減る。プログラマブルヌクレアーゼを導入すべくプラスミドに対して組換えタンパク質を使用すると、細胞中での組換えタンパク質の急速な分解のためにオフターゲット変異が減る。最後に、ＤＮＡに一本鎖切断を導入するＤＮＡニッキング酵素（「ニッカーゼ」）はオフターゲット変異を最小限とし得る。
【００５９】
実施形態では、ＴＡＬＥＮを使用する（例えば、参照により全体、特にｐ．５０，ｌ．１４〜ｐ．５８，ｌ．４、ｐ．６４，ｌ．２〜ｐ．６６，ｌ．２９、及び図１−３及び１０−１６を本明細書に組み入れる米国特許出願公開Ｎｏ．２０１１／０２０１１１８、を参照されたい；参照により全体を本明細書に組み入れる米国特許Ｎｏ．８，５８６，３６３も参照されたい；参照により全体を本明細書に組み入れる米国特許出願公開Ｎｏ．２０１４／３３５６１８も参照されたい；参照により全体を本明細書に組み入れる米国特許出願公開Ｎｏ．２０１４／３３５５９２も参照されたい；両方とも参照により全体を本明細書に組み入れる米国特許出願Ｎｏ．２０１３／０１２２５８１及び米国特許Ｎｏ．８，６９７，８５３も参照されたい；両方とも参照により全体を本明細書に組み入れる米国特許出願公開Ｎｏ．２０１２／２１４２２８及び米国特許Ｎｏ．８，４５０，４７１も参照されたい；両方とも参照により全体を本明細書に組み入れる米国特許出願公開Ｎｏ．２０１２／１７８１６９及び米国特許Ｎｏ．８，４４０，４３２も参照されたい；両方とも参照により全体を本明細書に組み入れる米国特許出願公開Ｎｏ．２０１２／１７８１３１及び国特許Ｎｏ．８，４４０，４３１も参照されたい；両方とも参照により全体を本明細書に組み入れる米国特許出願公開Ｎｏ．２０１１／０３０１０７３及び米国特許Ｎｏ．８５８６５２６も参照されたい；参照により全体を本明細書に組み入れる米国特許出願公開Ｎｏ．２０１４／０８７４２６；両方とも参照により全体を本明細書に組み入れる米国特許出願公開Ｎｏ．２０１４／００７３０１５及び米国特許Ｎｏ．８，７４８，１３４も参照されたい）。ＴＡＬＥＮは所与のＤＮＡ配列のほとんどを標的化するように設計され得るので、ＴＡＬＥＮは他のタイプのヌクレアーゼに比してきわめて重大な利点を与えるが、５’末端にチミンを有する標的配列の選択はメチル化シトシンを有する標的配列を避けたり、またはシトシンを認識するＨｉｓ−Ａｓｐ  ＲＶＤリピートをチミンを認識し、メチル化シトシンを認識するであろうＡｓｎ−Ｇｌｙ  ＲＶＤリピートで置換するので推奨される。ＴＡＬエフェクターは適当なＴＡＬエフェクターであり得る。例えば、天然ＴＡＬエフェクター（すなわち、野生型ＴＡＬエフェクターまたは天然変異体ＴＡＬエフェクター）、または人工ＴＡＬエフェクター（例えば、変異させた天然ＴＡＬエフェクターまたは合成ＴＡＬエフェクター）を使用し得る。ＴＡＬエフェクターの例は、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）種細菌またはラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）種細菌由来のＡｖｒＸａ７である（例えば、参照により全体を組み入れる国際特許出願公開ＷＯ  ２０１３／１０１８７７を参照されたい）。エンドヌクレアーゼはＤＮＡの両鎖を切断し、切断部位のＤＮＡ配列を修飾させ得る。構築物のサイズは〜３ｋｂ×２である。標的部位の特異性決定長さは約３０ｂｐ〜約４０ｂｐである。望ましくは、標的部位はチミンから始まり、アデニンで終わる。ＴＡＬＥＮを設計するためにオンラインリソース、例えばＥ−ＴＡＬＥＮ、ゲノムエンジニアリングリソース、ＴＡＬＥ（Ｎ）活性を予測するためのスコアリングア���ゴリズム、ＴｏｏｌＧｅｎ  ＴＡＬＥＮ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ及びＺｉＦｉＴ  Ｔａｒｇｅｔｅｒソフトウェアを使用することができる；Ａｄｄｇｅｎｅ及びＴＡＬＥＮライブラリーリソースも参照されたい。ＴＡＬＥＮは商業供給業者、例えばＣｅｌｌｅｃｔｉｓ  Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＴｏｏｌＧｅｎ及びＴｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓから得ることができる。
【００６０】
よって、実施形態では、本発明は、転写リプレッサー結合部位を含むプロモーターを含むＮＦ−ＹＣ４遺伝子を含む真核細胞中のタンパク質含有量を増加させる方法を提供する。方法は、転写リプレッサーがＮＦ−ＹＣ４遺伝子の転写を防止できないようにＮＦ−ＹＣ４遺伝子中の転写リプレッサー結合部位を修飾することを含む。方法は、第１の転写アクチベーター様（ＴＡＬ）エフェクターエンドヌクレアーゼモノマー及び第２のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼモノマーを細胞に導入することを含む。モノマーは適当な方法により、例えば細胞に第１または第２のモノマーをエンコードする核酸をトランスフェクトすることにより及び／または第１または第２のモノマーをタンパク質として細胞に機械的に注入することにより細胞に導入され得る。タンパク質としてデリバリーするとき、細菌ＩＩＩ型分泌装置またはエレクトロポレーションを使用することができる。各ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼモノマーはエンドヌクレアーゼドメイン、例えばＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメインのような非特異的エンドヌクレアーゼドメイン、及び複数のＴＡＬエフェクター反復配列を含むＴＡＬエフェクタードメインを含む。第１のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼモノマーの複数のＴＡＬエフェクター反復配列（例えば、１５以上のＤＮＡ結合リピート、例えば各々がＮＦ−ＹＣ４プロモーター領域中の塩基対の認識を決定し、ＮＦ−ＹＣ４プロモーター領域中の１つの塩基対の認識に関与する反復可変二残基（ＲＶＤ）からなるＤＮＡ結合リピート）は一緒に、ＮＦ−ＹＣ４遺伝子のプロモーター領域中の第１の特異的ヌクレオチド配列に結合する。第２のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼモノマーの複数のＴＡＬエフェクター反復配列（例えば、１５以上のＤＮＡ結合リピート、例えば各々がＮＦ−ＹＣ４プロモーター領域中の塩基対の認識を決定し、ＮＦ−ＹＣ４プロモーター領域中の１つの塩基対の認識に関与するＲＶＤを含むＤＮＡ結合リピート）は一緒に、ＮＦ−ＹＣ４遺伝子のプロモーター領域中の第２の特異的ヌクレオチド配列に結合する。第１の特異的ヌクレオチド配列及び第２の特異的ヌクレオチド配列は異なり、スペーサー配列、例えば約１２〜３０ヌクレオチド長、例えば１８ヌクレオチドであるスペーサー配列により分離されている。第１の特異的ヌクレオチド配列及び第２の特異的ヌクレオチド配列は、ＮＦ−ＹＣ４遺伝子のプロモーター領域中の転写リプレッサー結合部位が例えば欠失により修飾されるように選択される。転写リプレッサー結合部位はＥＲＦモチーフまたはＲＡＶ１モチーフを含み得る；これに関して、２つ以上のＥＲＦモチーフ、２つ以上のＲＡＶ１モチーフ、またはＥＲＦとＲＡＶ１モチーフの組合せが例えば欠失により修飾され得る。第１のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼモノマーのＴＡＬエフェクタードメインが第１の特異的ヌクレオチド配列に結合し、第２のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼモノマーのＴＡＬエフェクタードメインが第２の特異的ヌクレオチド配列に結合したとき、第１のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼモノマーのエンドヌクレアーゼドメイン及び第２のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼモノマーのエンドヌクレアーゼドメインは細胞またばその子孫内の標的ＤＮＡ配列を切断するダイマーを形成する。方法は更に、標的ＤＮＡ配列と核酸間で相同組換えが生ずるように標的ＤＮＡ配列の少なくとも一部に対して相同な配列を含む核酸を細胞に与えることを含み得る。真核細胞中のタンパク質含有量は増加し、よって方法は更に高いタンパク質含有量について選択することを含む。
【００６１】
真核細胞は細胞の集まり、組織、器官または生物の一部であり得る。細胞または細胞の集まり、またはその子孫の場合、方法は更にそれ由来の遺伝的に修飾した組織、器官、または生物を作成することを含み得る。生物は植物、例えばダイズ、イネまたはトウモロコシのような作物、単子葉植物、双子葉植物、藻類、例えばクラミドモナスの種のような鞭毛虫類であり得る。実施形態では、生物はダイズ、イネまたはトウモロコシである。植物を当業界で公知であり、本明細書中に記載されている方法に従って交雑させ、戻り交雑させ、高いタンパク質含有量について選択し得る。
【００６２】
別の実施形態では、本発明は、転写リプレッサー結合部位を含むプロモーターを含むＮＦ−ＹＣ４遺伝子を含む植物細胞中の病原体または有害生物に対する抵抗性の増加方法を提供する。病原体は細菌、ウイルス、真菌または種子植物であり、有害生物は昆虫、ネコブカビ類、ダニまたは線虫であり得、そのすべての例が当業界で公知であり、本明細書中に記載されている。実施形態では、病原体は細菌またはウイルスであり、有害生物はアブラムシである。方法は、転写リプレッサーがＮＦ−ＹＣ４遺伝子の転写を防止できないようにＮＦ−ＹＣ４遺伝子中の転写リプレッサー結合部位を修飾することを含む。方法は、第１の転写アクチベーター様（ＴＡＬ）エフェクターエンドヌクレアーゼモノマー及び第２のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼモノマーを細胞に導入することを含む。モノマーを細胞に適当な方法により、例えば細胞に第１または第２モノマーをエンコードする核酸をトランスフェクトすることにより、及び／または第１または第２モノマーをタンパク質として細胞に機械的に注入することにより導入され得る。タンパク質としてデリバリーするときには、細菌ＩＩＩ型分泌装置またはエレクトロポレーションを使用することができる。各ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼモノマーはエンドヌクレアーゼドメイン、例えばＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメインのような非特異的エンドヌクレアーゼドメイン、及び複数のＴＡＬエフェクター反復配列を含むＴＡＬエフェクタードメインを含む。第１のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼモノマーの複数のＴＡＬエフェクター反復配列（例えば、１５以上のＤＮＡ結合リピート、例えば各々がＮＦ−ＹＣ４プロモーター領域中の塩基対の認識を決定し、ＮＦ−ＹＣ４プロモーター領域中の１つの塩基対の認識に関与する反復可変二残基（ＲＶＤ）を含むＤＮＡ結合リピート）は一緒に、ＮＦ−ＹＣ４遺伝子のプロモーター領域中の第１の特異的ヌクレオチド配列に結合する。第２のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼモノマーの複数のＴＡＬエフェクター反復配列（例えば、１５以上のＤＮＡ結合リピート、例えば各々がＮＦ−ＹＣ４プロモーター領域中の塩基対の認識を決定し、ＮＦ−ＹＣ４プロモーター領域中の１つの塩基対の認識に関与するＲＶＤを含むＤＮＡ結合リピート）は一緒に、ＮＦ−ＹＣ４遺伝子のプロモーター領域中の第２の特異的ヌクレオチド配列に結合する。第１の特異的ヌクレオチド配列及び第２の特異的ヌクレオチド配列は異なり、スペーサー配列、例えば約１２〜３０ヌクレオチド長、例えば１８ヌクレオチドのスペーサー配列により分離されている。ＮＦ−ＹＣ４遺伝子のプロモーター領域中の転写リプレッサー結合部位を例えば欠失により修飾し得るように第１の特異的ヌクレオチド配列及び第２の特異的ヌクレオチド配列を選択する。転写リプレッサー結合部位はＥＲＦモチーフまたはＲＡＶ１モチーフを含み得る；この点で、２つ以上のＥＲＦモチーフ、２つ以上のＲＡＶ１モチーフ、またはＥＲＦとＲＡＶ１モチーフの組合せを例えば欠失により修飾させ得る。第１のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼモノマーのＴＡＬエフェクタードメインが第１の特異的ヌクレオチド配列に結合し、第２のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼモノマーのＴＡＬエフェクタードメインが第２の特異的ヌクレオチド配列に結合すると、第１のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼモノマーのエンドヌクレアーゼドメイン及び第２のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼモノマーのエンドヌクレアーゼドメインは細胞またはその子孫内の標的ＤＮＡ配列を切断するダイマーを形成する。方法は更に、標的ＤＮＡ配列と核酸の間で相同組換えが生ずるように標的ＤＮＡ配列の少なくとも一部に対して相同な配列を含む核酸を植物細胞に与えることを含み得る。植物細胞中の病原体または有害生物に対する抵抗性が増加し、よって方法は更に病原体または有害生物に対する高い抵抗性について選択することを含み得る。
【００６３】
方法は更に、配列番号１６に記載されているアミノ酸配列を有するＱｕａ−Ｑｕｉｎｅ  Ｓｔａｒｃｈ（ＱＱＳ）ポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを植物細胞に導入し、そこで発現させることを含み得、前記ヌクレオチド配列はプロモーターに機能しうる形で連結している。
【００６４】
植物細胞は細胞の集まり、組織、器官または生物の一部であり得る。細胞または細胞の集まり、またはその子孫の場合、方法は更にそこから遺伝的に修飾させた組織、器官または植物を作成することを含み得る。植物は、例えばダイズ、イネまたはトウモロコシのような作物、単子葉植物、または双子葉植物であり得る。植物を当業界で公知であり、本明細書中に記載されている方法に従って交雑させ、戻り交雑させ、病原体または有害生物に対する高い抵抗性について選択し得る。
【００６５】
別の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを使用する。標的特異性ｃｒＲＮＡ及び標的非依存性トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）と複合体を形成して、活性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、すなわち二重ＲＮＡ−Ｃａｓ９を形成する。エンドヌクレアーゼは、ｃｒＲＮＡ中の２０ｂｐガイド配列及びプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ；５’−ＮＧＧ−３’または５’−ＮＡＧ−３’）から構成される２３ｂｐ標的ＤＮＡ配列を切断する。適当なＣａｓ９、例えば化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９を使用し得る。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ／ＲＧＥＮは設計及び作成しやすいので、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓはＴＡＬＥＮに比してきわめて重大な利点を与え得る。しかしながら、ＲＧＥＮ標的部位はＣａｓ９により認識されるＰＡＭ配列（すなわち、５’−Ｘ２０ＮＧＧ−３’または５’−Ｘ２０ＮＡＧ−３’、ここでＸ２０は２０ｂｐ  ｃｒＲＮＡ配列に相当する）の要件により限定され、標的配列中に５’グアニンを存在させるかまたはガイドＲＮＡの５’末端に１つまたは２つ以上のグアニン塩基を付加させることが推奨される。構築物のサイズは典型的にはおよそ４．２ｋｂ（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９）＋０．１ｋｂ（ｓｇＲＮＡ）である。標的部位の特異性を決定する長さは典型的には２２ｂｐ（２３ｂｐの全長に対して）である。望ましくは、標的部位はＮＧＧまたはＮＡＧで終わる（すなわち、上記したＰＡＭ）。オンラインリソース、例えばＥ−ＣＲＩＳＰ、ゲノムエンジニアリングリソース、ＲＧＥＮツール及びＺｉＦｉＴ  Ｔａｒｇｅｔｅｒソフトウェアを使用し得る；Ａｄｄｇｅｎｅも参照されたい。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのコンポーネントは商業供給業者、例えばＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＴｏｏｌＧｅｎ及びＴｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓから入手できる。
【００６６】
よって、別の実施形態では、本発明は、転写リプレッサー結合部位を含むプロモーターを含むＮＦ−ＹＣ４遺伝子を含む真核細胞中のタンパク質含有量の増加方法を提供する。方法は、転写リプレッサーがＮＦ−ＹＣ４遺伝子の転写を防止できないようにＮＦ−ＹＣ４遺伝子中の転写リプレッサー結合部位を修飾することを含む。方法は、細胞中に二重ＲＮＡ−Ｃａｓ９、すなわち標的特異性ｃｒＲＮＡ及び標的非依存性トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）と複合体化することにより形成される活性ＤＮＡエンドヌクレアーゼを導入することを含む。エンドヌクレアーゼは、ｃｒＲＮＡ中の２０ｂｐガイド配列及びプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ；５’−ＮＧＧ−３’または５’−ＮＡＧ−３’）から構成される２３ｂｐ標的ＤＮＡ配列（例えば、配列番号６及び７、及び本明細書中の実施例１８を参照されたい）を切断する。適当なＣａｓ９、例えば化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９を使用し得る。植物の胚性カルスはアグロバクテリウム媒介遺伝子移入により形質転換され得る。一次トランスジェニック系統を部位特異的ＤＮＡ変化についてスクリーニングし、同定し得、欠失した配列を有する変異体を同定するためにＰＣＲジェノタイピングを使用し得る。真核細胞中のタンパク質含有量は増加し、よって方法は更に高いタンパク質含有量について選択することを含み得る。
【００６７】
真核細胞は細胞の集まり、組織、器官または生物の一部であり得る。細胞または細胞の集まり、またはその子孫の場合、方法は更にそこから遺伝的に修飾した組織、器官、または生物を作成することを含み得る。生物は植物、例えばダイズ、イネまたはトウモロコシのような作物、単子葉植物、双子葉植物、藻類、例えばクラミドモナス種のような単細胞鞭毛虫類であり得る。実施形態では、生物はダイズ、イネまたはトウモロコシである。植物は当業界で公知であり、本明細書中に記載されている方法に従って交雑させ、戻り交雑させ、高いタンパク質含有量について選択し得る。
【００６８】
別の実施形態では、本発明は、転写リプレッサー結合部位を含むプロモーターを含むＮＦ−ＹＣ４遺伝子を含む植物細胞中の病原体または有害生物に対する抵抗性の増加方法を提供する。病原体は細菌、ウイルス、真菌または種子植物であり得、有害生物は昆虫、ネコブカビ類、ダニまたは線虫であり得、そのすべての例は当業界で公知であり、本明細書中に記載されている。実施形態では、病原体は細菌またはウイルスであり、有害生物はアブラムシである。方法は、転写リプレッサーがＮＦ−ＹＣ４遺伝子の転写を防止できないようにＮＦ−ＹＣ４遺伝子中の転写リプレッサー結合部位を修飾することを含む。方法は、に二重ＲＮＡ−Ｃａｓ９、すなわち標的特異性ｃｒＲＮＡ及び標的非依存性トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）と複合体化することにより形成される活性ＤＮＡエンドヌクレアーゼを細胞中に導入することを含む。エンドヌクレアーゼは、ｃｒＲＮＡ中の２０ｂｐガイド配列及びプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ；５’−ＮＧＧ−３’または５’−ＮＡＧ−３’）から構成される２３ｂｐ標的ＤＮＡ配列を切断する。適当なＣａｓ９、例えば化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来Ｃａｓ９を使用し得る。植物細胞中の病原体または有害生物に対する抵抗性が増加し、よって方法は更に病原体または有害生物に対する高い抵抗性について選択することを含む。
【００６９】
方法は更に、配列番号１６に記載されているアミノ酸配列を有するＱｕｉｎｅ  Ｓｔａｒｃｈ（ＱＱＳ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを植物細胞または植物に導入し、そこで発現させることを含み得、前記ヌクレオチド配列は機能しうる形でプロモーターに連結されている。
【００７０】
植物細胞は細胞の集まり、組織、器官または生物の一部であり得る。細胞または細胞の集まり、またはその子孫の場合、方法は更にそこから遺伝的に修飾させた組織、器官、または生物を作成することを含み得る。植物はダイズ、イネまたはトウモロコシのような作物、単子葉植物、または双子葉植物であり得る。植物は当業界で公知であり、本明細書中に記載されている方法に従って交雑させ、戻り交雑させ、病原体または有害生物に対する高い抵抗性について選択し得る。
【００７１】
プログラマブルヌクレアーゼ及び／または相同鋳型、例えばターゲッティングベクターまたは一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）は当業界で公知の適当な方法を用いて標的細胞にデリバリーされる。その方法には、例えばプラスミドＤＮＡ、インビトロ転写ｍＲＮＡ、ウイルスベクターまたは精製タンパク質の培養細胞、胚または全生物ヘのデリバリーが含まれる。プログラマブルヌクレアーゼは多くの場合エレクトロポレーションまたはプラスミドＤＮＡのリポソームトランスフェクションにより細胞系統に導入される。インビトロ転写したｍＲＮＡは多くの場合１細胞期胚にミクロ注入される。非統合ウイルスベクター、例えばインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）がインビトロ及びインビボで使用され得る。しかしながら、ＩＤＬＶは望ましくない組換え事象をもたらす恐れがある高度に相同のＴＡＬＥリピートの存在のためにＴＡＬＥＮと非適合であり得る。タンパク質の使用は外来ＤＮＡの望ましくない取り込みを避け、コドン最適化及びプロモーターの選択についての懸念を除去し、新しいヌクレアーゼを構築するためにＣａｓ９のデノボ精製を必要としないのでＲＧＥＮにとって便利であり得る。
【００７２】
ＴＡＬ切断ドメイン融合タンパク質の細胞膜への転移は、アンテナペディアの三重ヘリックス（Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，６：６２９−６３４（１９９６）；Ｄｅｒｏｓｓｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１０４４４（１９９４））のようなペプチド配列、またはシグナルペプチドＫ−ＦＧＦ（Ｌｉｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：１４２５５−１４２５８（１９９５））のようなシグナルペプチドの疎水性ドメインの使用により助長され得る。他のペプチドには、ＨＩＶのｔａｔタンパク質の１１アミノ酸ペプチド、ｐ１６タンパク質のアミノ酸８４−１０３に相当する２０残基ペプチド配列（Ｆａｈｒａｃｕｓら，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，６：８４（１９９６））、ＨＳＶ由来のＶＰ２２転移ドメイン（Ｅｌｌｉｏｔら，Ｃｅｌｌ，８８：２２３−２３３（１９９７））、及び二元毒素（Ａｒｏｒａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：３３３４−３３４１（１９９３）；Ｐｅｒｅｌｌｅら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６１：５１４７−５１５６（１９９３）；Ｓｔｅｎｎａｒｋら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１１３：１０２５−１０３２（１９９１）；Ｄｏｎｎｅｌｌｙら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９０：３５３０−３５３４（１９９３）；Ｃａｒｂｏｎｅｔｔｉら，Ａｂｓｔｒ．Ａｎｎ．Ｍｅｅｔ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，９５：２９５（１９９５）；Ｓｅｂｏら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６３：３８５１−３８５７（１９９５）；Ｋｌｉｍｐｅｌら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８９：１０２７７−１０２８１（１９９２）；及びＮｏｖａｋら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：１７１８６−１７１９３（１９９２））が含まれる。ペプチド配列はＴＡＬ切断融合タンパク質と融合され得る。場合により、ペプチドリンカーのようなリンカーを使用し得る。
【００７３】
病原体または有害生物に感染するリスクのある植物細胞または植物中の病原体または有害生物に対する抵抗性の増加方法は更に、Ｑｕａ−Ｑｕｉｎｅ  Ｓｔａｒｃｈ（ＱＱＳ）ポリペプチド（配列番号１６）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを植物に導入し、そこで発現させることを含み得る。ヌクレオチド配列は機能しうる形でプロモーターに連結されている。よって、実施形態では、方法は更に、（ａ）植物細胞を配列番号１６のアミノ酸配列を有するＱＱＳポリペプチドをエンコードし、機能しうる形でプロモーターに連結されているヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを用いて形質転換し、（ｂ）形質転換植物細胞からトランスジェニック植物を再生し、（ｃ）ＱＱＳを欠き、同様の条件下で生長させた同一種の非形質転換植物と比較して病原体または有害生物に対して高い抵抗性を示すトランスジェニック植物由来の形質転換植物を同定し、選択することを含む。
【００７４】
ＱＱＳは当業界で公知の適当な方法を用いて植物中で発現され得る（例えば、これに関する教示のために、参照により本明細書に組み入れる２０１５年１０月１３日に発行された米国特許Ｎｏ．９，１５７，０９１を参照されたい；例えば、参照しやすいように、実施例１及び２、及び詳細説明、このパラグラフ及び次の２つのパラグラフにおいて再現されている部分を参照されたい）。例えば、ＱＱＳは導入遺伝子としてエレクトロポレーション、微粒子銃、（米国特許Ｎｏ．９，１５７，０９１の実施例１及び２に例示されている）アグロバクテリウム媒介形質転換、及びプロトプラストの直接接触を用いて植物に導入され得る。形質転換／トランスフェクション（及び、ＤＮＡの植物または真菌への導入のために使用される他の技術）、及び単子葉植物及び双子葉植物の再生は慣例通りである。使用する具体的方法は、形質転換またはトランスフェクトしようとする植物または真菌のタイプに部分的に依存する。例えば、多数のプロトコルが、特にその全体を参照により本明細書に組み入れるＫａｎ  Ｗａｎｇ編，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｃｅｙ発行のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，第２版，１及び２巻，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙに記載されている。そのようなプロトコルには、フローラルディップ形質転換方法、並びに葉外植片、子葉片及び根片の形質転換方法、及びバレルクローバー、タバコ、オオムギ、トウモロコシ、イネ（インディカ米及びジャポニカ米）、ライ麦、モロコシ、コムギ、カノーラ、ワタ、カラシ、ヒマワリ、アルファルファ、ヒヨコマメ、クローバー、エンドウ、ピーナッツ、キマメ、ムラサキツメクサ、ダイズ、テパリービーン、タロイモ、キャべツ、キュウリ、ナス、レタス、トマト、ニンジン、キャッサバ、ジャガイモ、サツマイモ、ヤマノイモ、ギョウギシバ、ホソムギ、スイッチグラス、ウシノケグサ、芝草、アメリカンエルム、コルクガシ、ユーカリノキ、パイン、ポプラ、ゴムノキ、バナナ、柑橘類、コーヒー、パパイヤ、パイナップル、サトウキビ、アメリカグリ、リンゴ、ブルーベリー、グレープワイン、イチゴ、クルミ、カーネーション、菊、ラン、ペチュニア、バラ、朝鮮人参、アサ、ケシ及びキノコの形質転換のための特殊プロトコルが含まれる。穀類のアグロバクテリウム媒介形質転換の他の方法は、特にその全体を参照により本明細書に組み入れるＳｈｒａｗａｔら，Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｊ．，４（６）：５７５−６０３（Ｎｏｖ．２００６）に記載されている。マメ科植物の形質転換の他の方法は、特にその全体を参照により本明細書に組み入れるＳｏｍｅｒｓら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１３１（３）：８９２−８９９（Ｍａｒｃｈ  ２００３）に記載されている。イネの形質転換のために有用な方法は、両方とも特にその全体を参照により本明細書に組み入れるＧｉｒｉら，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｄｖ．，１８（８）：６５３−６８３（Ｄｅｃ．２０００）及びＨｉｅｉら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３５（１−２）：２０５−２１８（Ｓｅｐｔ．１９９７）に記載されている。両方とも特にその全体を参照により本明細書に組み入れるＶａｓｉｌ��，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，１１１：３４９−３５８（１９９９）及びＪｏｎｅｓら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１（１）：５（Ｓｅｐｔ．５，２００５）は、コムギの形質転換のために有用な方法を記載している。オオムギにおける直接ＤＮＡ取り込みの使用は、特にＬａｚｚｅｒｉ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，４９：９５−１０６（１９９６）に記載されている。イチゴを形質転換するためのバイオリアクターシステムにおける一時的浸漬は、特にその全体を参照により本明細書に組み入れるＨａｎｈｉｎｅｖａら，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．．７：１１（２００７）に記載されている。色素体、例えば葉緑体、特にタバコ中の葉緑体への導入遺伝子の導入は、特にその全体を参照により本明細書に組み入れるＤａｎｉｅｌｌら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２３（５）：２３８−２４５（Ｍａｙ  ２００５）に記載されている。この点について、Ｌｕｔｚら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１４５（４）：１２０１−１２１０（２００７）（特にその全体を参照により本明細書に組み入れる）は、高等植物中の色素体ゲノムを形質転換するためのベクターを選択する際のガイダンスを与える。種特異的葉緑体ベクターの体細胞胚形成は、例えばダイズ、ニンジン及びワタのような植物においても適用されている。ビートの形質転換のために有用な他の方法は、特にその全体を参照により本明細書に組み入れるＧｏｌｏｖｋｏら，Ｔｓｉｔｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，３９（３）：３０−３６（Ｍａｙ−Ｊｕｎｅ  ２００５）に記載されている。
【００７５】
ＱＱＳのコードドメイン配列（ＣＤＳ）をエンコードするヌクレオチド配列は、植物における発現のためにベクターまたはカセット（本明細書ではベクターと総称する）に取り込まれ得る。植物細胞の安定な形質転換またはトランスジェニック植物の作成のために適した多数の発現ベクターが記載されている（例えば、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８９）；及びＧｅｌｖｉｎら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｏｒｗｅｌｌ，ＭＡ（１９９０）を参照されたい）。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のＴｉプラスミドまたはバイナリーアグロバクテリウムベクター（Ｂｅｖａｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２：８７１１−８７２１（１９８４））が単子葉植物及び双子葉植物を形質転換するために使用され得る。非Ｔｉベクター、例えばウイルスベクターはＤＮＡを植物細胞、組織、胚及び植物に移入させるために使用され得る。非Ｔｉベクターは、リポソーム媒介形質転換、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介形質転換、ウイルストランスフェクション、マイクロインジェクション、真空浸潤法、植物プロトプラストのエレクトロポレーション、微粒子銃、炭化ケイ素ホイスカ等を使用して導入され得る。例えば、Ａｍｍｉｒａｔｏら，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ−Ｃｒｏｐ  Ｓｐｅｃｉｅｓ，ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．（１９８４）；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら，Ｎａｔｕｒｅ，３３８：２７４−２７６（１９８９）；Ｆｒｏｍｍら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：８３３−８３９（１９９０）；及びＶａｓｉｌら，Ｂｉｏｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：４２９−４３４（１９９０）を参照されたい。
【００７６】
植物形質転換／トランスフェクションベクターは、コード配列に加えて１つ以上の５’及び３’転写制御配列を含む。転写制御配列はプロモーター、転写開始部位、転写終結部位、ポリアデニル化シグナル及び３’ターミネーター領域（例えば、ジャガイモのＰＩ−ＩＩターミネーター領域、オクトピンシンターゼ３’ターミネーター領域、またはノパリンシンターゼ３’ターミネーター領域）を含み得る。慣用の核処理したイントロンが存在する場合、１つ以上のＲＮＡプロセッシングシグナル、例えばイントロンスプライス部位も含まれ得る。適当なプロモーターを使用し得る。この点で、ＱＱＳプロモーターを使用し得る。或いは、非ＱＱＳプロモーターを使用し得る。プロモーターは、例えば構成的、合成（例えば、ハイブリッド）、誘導性、発生学的に調節されている、環境的に調節されている、ホルモンにより調節されている、化学的に調節されている、細胞特異的または組織特異的（例えば、種子特異的）であり得る。構成的プロモーターには、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター及びオクトピンシンターゼプロモーターが含まれる。環境的に調節されている誘導プロモーターには、例えば光により誘導されるプロモーターが含まれる。ナピンプロモーター、ファセオリンプロモーター及びＤＣ３プロモーターは種子特異的プロモーターの例であり、デュアルプロモーター、２Ａ１１プロモーター及びトマトポリガラクツローゼプロモーターは果実特異的プロモーターの例であり、ＰＴＡ２９、ＰＴＡ２６及びＰＴＡ１３は花粉特異的プロモーターの例である。ｐＢＡＮプロモーターはアラビドプシスにおける種皮プロモーターであり、ｐ２６、ｐ６３及びｐ６３ｔｒはアラビドプシス由来の初期種子プロモーターである（例えば、米国特許出願公開Ｎｏ．２００９／００３１４５０を参照されたい）。根特異的プロモーターの例は米国特許Ｎｏｓ．５，６１８，９８８、５，８３７，８４８及び５，９０５，１８６に記載されている。他のプロモーターは、オーキシン、サイトカイン、ジベレリン、ジャスモン酸メチル、サリチル酸、熱、光等により誘導される。
【００７７】
方法の実施は、当業界で公知であり、文献及び本明細書中に記載されている慣用の技術を用いる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版及び第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９及び２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８７）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ、特に３４巻，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ”；Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、第３版，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９８）；及びＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ、特に１１９巻，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”を参照されたい。
【００７８】
ＤＮＡ構築物を宿主植物のゲノムに導入するために使用される一般的技術については、例えばＷｅｉｓｓｂａｃｈ  ＆  Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＶＩＩＩ，ｐ．４２１−４６３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８８）、及びＧｒｉｅｒｓｏｎ  ＆  Ｃｏｒｅｙ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版，Ｂｌａｃｋｉｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ（１９８８）を参照されたい。例えば、ＤＮＡ構築物はエレクトロポレーション及び植物細胞プロトプラストのマイクロインジェクションのような技術を用いて植物細胞のゲノムＤＮＡに直接導入され得、或いはＤＮＡ構築物はＤＮＡ粒子衝撃（例えば、Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３２７：７０−７３（１９８７）を参照されたい）のような微粒子銃法を用いて植物組織に直接導入され得る。或いは、ＤＮＡ構築物は適当なＴ−ＤＮＡ隣接領域と組み合わされ、慣用のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）宿主ベクターに導入され得る。武装解除及びバイナリーベクターの使用を含めたアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）媒介形質転換技術は文献（例えば、Ｈｏｒｓｃｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３３：４９６７−４９８（１９８４）、及びＦｒａｌｅｙら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８０：４８０３（１９８３）を参照されたい）に記載されている。細胞をバイナリーＴ  ＤＮＡベクター（Ｂｅｖａｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２：８７１１−８７２１（１９８４））または同時培養手順（Ｈｏｒｓｃｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７：１２２９−１２３１（１９８５））を用いて細菌に感染させたとき、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）宿主のビルレンス機能は構築物及び隣接マーカーを植物細胞ＤＮＡに挿入させる。一般的に、アグロバクテリウム形質転換システムは双子葉植物を改変するために使用される（Ｂｅｖａｎら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，１６：３５７−３８４（１９８２）；Ｒｏｇｅｒｓら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１１８：６２７−６４１（１９８６））。アグロバクテリウム形質転換システムは単子葉植物を形質転換するためにも使用され得る（Ｈｅｒｎａｌｓｔｅｅｎら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，３：３０３９−３０４１（１９８４）；Ｈｏｏｙｋａｓｓ−Ｖａｎ  Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３１１：７６３−７６４（１９８４）；Ｇｒｉｍｓｌｅｙら，Ｎａｔｕｒｅ，３２５：１６７７−１６７９（１９８７）；Ｂｏｕｌｔｏｎら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１２：３１−４０（１９８９）；及びＧｏｕｌｄら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９５：４２６−４３４（１９９１））。
【００７９】
代替の遺伝子移入及び形質転換方法には、裸のＤＮＡのカルシウム媒介、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介、またはエレクトロポレーション媒介取り込みによるプロトプラスト形質転換（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら，ＥＭＢＯ  Ｊ，３：２７１７−２７２２（１９８４）；Ｐｏｔｒｙｋｕｓら，Ｍｏｌｅｃ．ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９：１６９−１７７（１９８５）；Ｆｒｏｍｍら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８２：５８２４−５８２８（１９８５）；及びＳｈｉｍａｍｏｔｏ，Ｎａｔｕｒｅ，３３８：２７４−２７６（１９８９））、及び植物組織のエレクトロポレーション（Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，４：１４９５−１５０５（１９９２））が含まれるが、これらに限定されない。植物細胞形質転換のための追加方法には、マイクロインジェクション、炭化ケイ素ＤＮＡ取り込み（Ｋａｅｐｐｌｅｒら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ，９：４１５−４１８（１９９０））、及び微粒子銃（Ｋｌｅｉｎら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８５：４３０５−４３０９（１９８８）；及びＧｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，２：６０３−６１８（１９９０））が含まれる。
【００８０】
形質転換細胞（または、細胞の集まり、カルス、組織、器官または生物、例えば植物）は、細胞を特定の形質、例えばマーカー遺伝子の発現、高いタンパク質含有量、または病原体または有害生物に対して高い抵抗性について選択するかまたはスクリーニングすることにより同定され、単離され得る。そのようなスクリーニング及び選択手法は当業界で公知である。加えて、形質転換体を同定するために物理的及び生化学的方法を使用し得る。これらには、サザンブロット、ＰＣＲ増幅、ノーザンブロット、ＳＩ  ＲＮａｓｅプロテクション、プライマー伸長、ＲＴ−ＰＣＲ、酵素アッセイ、タンパク質ゲル電気泳動、ウェスタンブロット、免疫沈降、酵素結合免疫アッセイ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、酵素染色及び免疫染色が含まれる。
【００８１】
形質転換細胞、例えば形質転換植物細胞を培養して、形質転換された遺伝子型、よって所望の表現型を有する全植物を再生することができる。再生技術は、所望のヌクレオチド配列と一緒に導入した組織培地中の特定の植物ホルモンの操作に依存し、典型的には殺生物剤及び／または除草剤マーカーに依存している（例えば、Ｅｖａｎｓら，“Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，ｐ．１２４−１７６，Ｍａｃｍｉｌｌｉａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８３）；Ｂｉｎｄｉｎｇ，Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ，ｐ．２１−７３，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８５）；及びＫｌｅｅら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．，３８：４６７−４８６（１９８７）を参照されたい）。
【００８２】
操作または修飾されたプロモーターを有するＮＦ−ＹＣ４、望ましくはタンパク質生産量、または病原体または有害生物に対する抵抗性を増加させるものが単離され、同一の種であるか、同一の属であるが異なる種であるか、または異なる科に由来するか、または他の系統発生レベルの別の真核生物、例えば別の植物に移入され得る。操作または修飾された転写リプレッサー結合部位を有するＮＦ−ＹＣ４は標準の育種技術及び戻し交雑を用いて別の真核生物、例えば別の植物に導入され得る。例えば、操作または修飾されたプロモーターを有するＮＦ−ＹＣ４を有する植物を操作または修飾されたプロモーターを有するＮＦ−ＹＣ４を欠く植物と交雑させ得、生じた世代を交雑させ得、高いタンパク質生産量、または病原体または有害生物に対して高い抵抗性を示す植物を選択し得る。従って、操作または修飾されたプロモーターを有するＮＦ−ＹＣ４を有する植物を修飾されたプロモーターを有するＮＦ−ＹＣ４を持たない、または操作または修飾されたプロモーターを有する別の遺伝子を持つ植物と交雑させたら、ハイブリッド種子を収穫し、栽植し、ハイブリッド植物またはその一部を得ることができる。操作または修飾されたプロモーターを有するＮＦ−ＹＣ４を有し、組織培養を受けることができる植物は当業界で公知の組織培養方法を用いる組織培養及び植物の再生のための細胞のソースであり得る。類似の育種技術を非ヒト動物に対して使用し得る。
【００８３】
真核細胞は細胞の集まり、組織、器官または生物の一部であり得る。１つの実施形態では、生物は植物、例えば作物、需根作物または園芸作物であり得る。作物の例には、ダイズ、イネ、トウモロコシ、コムギ、キビ、オオムギ、アルファルファ、トマト、リンゴ、セイヨウナシ、イチゴ、オレンジ、スイカ、コショウ、ニンジン、ジャガイモ、テンサイ、ヤムイモ、レタス、ホウレンソウ、ヒマワリ及びナタネ；顕花植物、例えばペチュニア、バラ及び菊；球果植物及び松の木（例えば、マツ、モミ及びトウヒ）；ファイトレメディエーションで使用される植物（例えば、重金属蓄積植物）、及び実験目的で使用される植物（例えば、アラビドプシス）が含まれる。植物は単子葉植物または双子葉植物であり得る。単子葉植物の例には、アブラヤシ、サトウキビ、バナナ、スーダングラス、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、オオムギ、エンバク、イネ、キビ及びモロコシが含まれるが、これらに限定されない。双子葉植物の例には、ベニバナ、アルファルファ、ダイズ、コーヒー、アマランス、ナタネ、ラッカセイ及びヒマワリが含まれるが、これらに限定されない。双子葉植物の目には、モクレン目、シキミ目、クスノキ目、コショウ目、ウマノスズクサ目、スイレン目、キンポウゲ目、ケシ目、サラセニア目、ヤマグルマ目、マクサク目、トチュウ目、レイトネリア目、ヤマモモ目、ブナ目、モクマオウ目、ナデシコ目、バティス目、タデ目、イソマツ目、ビワモドキ目、ツバキ目、アオイ目、イラクサ目、サガリバナ目、スミレ目、ヤナギ目、フウチョウソウ目、ツツジ目、イワウメ目、カキノキ目、サクラソウ目、バラ目、マメ目、カワゴケソウ目、アリノトウグサ目、フトモモ目、ミズキ目、ヤマモガシ目、ビャクダン目、ラフレシア目、ニシキギ目、トウダイグサ目、クロウメモドキ目、ムクロジ目、クルミ目、フウロソウ目、ヒメハギ目、アンブレラ目、リンドウ目、ハナシノブ目、シソ目、オオバコ目、ゴマノハグサ目、キキョウ目、アカネ目、マツムシソウ目及びキク目が含まれる。双子葉植物の属には、オオカミナスビ属、アルセオダフネ属、カシュナットノキ属、ラッカセイ属、アカハダクスノキ属、アブラナ属、ベニバナ属、アオツヅラフジ属、ハズ属、キュウリ属、ミカン属、スイカ属、トウガラシ属、ニチニチソウ属、ココヤシ属、コーヒーノキ属、カボチャ属、ニンジン属、ドゥグエティア属、ハナビシソウ属、イチジク属、オランダイチゴ属、ヤエムグラ属、フジ属、ワタ属、ヒマワリ属、パラゴムノキ属、ヒヨス属、アキノノゲシ属、ランドルフィア属、アマ属、ハマビワ属、トマト属、ルピナス属、イモノキ属、マジョラム属、リンゴ属、ウマゴヤシ属、タバコ属、オリーブ属、キク属、ケシ属、ワニナシ属、ファセオルス属、カイノキ属、エンドウ属、ナシ属、サクラ属、ダイコン属、トウゴマ属、キオン属、ツヅラフジ属、ハスノハカズラ属、シロガラシ属、ナス属、カカオ属、シャジクソウ属、フェヌグリーク属、ソラマメ属、ツルニチニチソウ属、ブドウ属及びササゲ属が含まれる。単子葉植物の目には、オモダカ目、トチカガミ目、イバラモ目、ホンゴウソウ目、ツユクサ目、ホシクサ目、サンアソウ目、イネ目、イグサ目、カヤツリグサ目、ガマ目、パイナップル目、ショウガ目、ヤシ目、パナマソウ目、タコノキ目、サトイモ目、ユリ目及びラン目が含まれる。単子葉植物の属には、ネギ属、メリケンカルカヤ属、スズメガヤ属、アスパラガス属、カラスムギ属、ギョウギシバ属、アブラヤシ属、ウシノケグサ属、フェストロリウム属、ワスレグサ属、オオムギ属、アオウキクサ属、ドクムギ属、バショウ属、イネ属、キビ属、チカラシバ属、アワガエリ属、イチゴツナギ属、ライムギ属、モロコシ属、コムギ属及びトウモロコシ属が含まれる。他の植物には、裸子植物類、例えばマツ目、イチョウ目、ソテツ目及びグネツム目、例えばモミ及びマツのようなモミ属、コウヨウザン属、トウヒ属、マツ属及びトガサワラ属が含まれる。別の実施形態では、生物は藻類、例えばクラミドモナス種のような単細胞鞭毛虫類であり得る。さらに別の実施形態では、生物は非ヒト動物、例えばウシ、ブタ、ニワトリ、七面鳥、ヒツジ及びバイソンのような家畜動物であり得る。
【００８４】
病原体は細菌、ウイルス、真菌または種子植物であり得る。有害生物は昆虫（例えば、アブラムシ）、ネコブカビ、ダニまたは線虫であり得る。実施形態では、病原体は細菌またはウイルスであり、有害生物はアブラムシである。
【００８５】
細菌は植物細菌であり得る。その例には、フイルミクテス、アクチノバクテリウム、またはプロテオバクテリウムが含まれるが、これらに限定されない。プロテオバクテリウムは、アルファプロテオバクテリウム、ベータプロテオバクテリウム、またはガンマプロテオバクテリウムであり得る。アルファプロテオバクテリウムは、アグロバクテリアム、スフインゴモナス、またはカンジダタス・リベリバクターであり得る。ベータプロテオバクテリウムは、アシドボラクス、バークホルデリア、ラルストニア、またはキシロフィラスであり得る。ガンマプロテオバクテリウムは、エンテロバクター科、シュードモナス科、またはキサントモナス科であり得る。エンテロバクター科は、ブレネリア、ディケヤー、エンテロバクター、エルウィニア、エウィンゲラ、パントエア、ペクトバクテリウム、カンジダタス・フロモバクター、サムソニアまたはセラチアであり得る。シュードモナス科は、シュードモナスであり得る。キサントモナス科は、キサントモナスまたはキシレラであり得る。細菌は、クラビバクター、カートバクテリウム、ラサイバクター、レイフソニア、ノカルディア、ロドコッカス、ストレプトマイセス、バシラス、クロストリジウム、スピロプラズマ、カンジダタス・フィトプラズマ、またはミクロバクテリウムであり得る。細菌の具体例には、クラビバクター・ミシガンエンシス（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ）またはその亜種、カートバクテリウム・フラクムファシエンス（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｃｃｕｍｆａｃｉｅｎｓ）、ラサイバクター・ラサイー（Ｒａｔｈａｙｉｂａｃｔｅｒ ｒａｔｈａｙｉ）、ラサイバクター・トリティシー（Ｒａｔｈａｙｉｂａｃｔｅｒ ｔｒｉｔｉｃｉ）、ラサイバクター・トキシカス（Ｒａｔｈａｙｉｂａｃｔｅｒ ｔｏｘｉｃｕｓ）、レイフソニア・キシリ（Ｌｅｉｆｓｏｎｉａ ｘｙｌｉ）またはその亜種、ロドコッカス・ファシアンス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｓｃｉａｎｓ）、スフィゴモナス・スベリファシエンス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｕｂｅｒｉｆａｃｉｅｎｓ）、スフィゴモナス・メロニス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｍｅｌｏｎｉｓ）、アグロバクテリウム・ビティス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、アグロバクテリウム・ルビー（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｕｂｉ）、アクロバクテリウム・ラリームーレイ（Ａｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｒｒｙｍｏｏｒｅｉ）、アシドボラクス・アベナエ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ）、アシドボラクス・アベナエ・シトルリー（Ａ．ａｖｅｎａｅ ｃｉｔｒｕｌｌｉ）、アシドボラクス・アベナエ・アベナエ（Ａ．ａｖｅｎａｅ ａｖｅｎａｅ）、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）、バークホルデリア・グラディォリ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｇｌａｄｉｏｌｉ）、バークホルデリア・アンドロポゴニス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎｉｓ）、バークホルデリア・カリオフィリ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｉ）、バークホルデリア・グラマエ（Ｂｕ���ｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｇｌｕｍａｅ）、バークホルデリア・プランタリイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｌａｎｔａｒｉｉ）、ディケヤ・ダダンティイ（Ｄｉｃｋｅｙａ ｄａｄａｎｔｉｉ）、ディケヤ・ソラニ（Ｄｉｃｋｅｙａ ｓｏｌａｎｉ）、エルウィニア・アミロボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ）、ラルストニア・ソラナセアラム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）、ラルストニア・シジジイ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｙｚｙｇｉｉ）、カンジダタス・フロモバクター・フラガリエ（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｈｌｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｆｒａｇａｒｉａｅ）、カンジダタス・リベリバクター・アシアティクス（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ ａｓｉａｔｉｃｕｓ）、ペクトバクテリウム・カロトボラム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ）、ペクトバクテリウム・アトロセプチカム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）、シュードモナス・サバスタノイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｖａｓｔａｎｏｉ）、シュードモナス・マルギナリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｒｇｉｎａｌｉｓ）、シュードモナス・ビリディフラバ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｖｉｒｉｄｉｆｌａｖａ）、キサントモナス・アルボリコーラ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｒｂｏｒｉｃｏｌａ）、キサントモナス・アキソノポディス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ）、キサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、キサントモナス・ホートラム（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｈｏｒｔｏｒｕｍ）、キサントモナス・オリザエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ）、キサントモナス・アキソノポディス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ）、キサントモナス・トランスルーセンス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ）、キサントモナス・バシコーラ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｖａｓｉｃｏｌａ）、またはキシレラ・ファスティディオーサ（Ｘｙｌｅｌｌａ ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ）が含まれるが、これらに限定されない。Ｍａｎｓｆｉｅｌｄら（Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌ．，１３：６１４−６２９（２０１２））によれば、トップの細菌性植物病原体は、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）病原型、ラルストニア・ソラナセアラム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、キサントモナス・オリザエ・病原型オリザエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚｅ  ｐｖ．ｏｒｙｚｅ）、キサントモナス・キャンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）病原型、キサントモナス・アキソノポディス・病原型マニホチス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ  ｐｖ．ｍａｎｉｈｏｔｉｓ）、エルウィニア・アミロボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ）、キシレラ・ファスティディオーサ（Ｘｙｌｅｌｌａ ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ）、ディケヤ・ダダンティイ（Ｄｉｃｋｅｙａ ｄａｄａｎｔｉｉ）、��ィケヤ・ソラニ（Ｄｉｃｋｅｙａ ｓｏｌａｎｉ）、ペクトバクテリウム・カロトボラム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ）、及びペクトバクテリウム・アトロセプチカム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）である。
【００８６】
真菌は植物真菌であり得る。その例には、子のう菌類、例えばフザリウム種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）（フザリウム立ち枯れ病の原因菌）、フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、ティエラビオプシス種（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ  ｓｐｐ．）（胴枯れ病、黒根腐病及び微粒菌核病の原因菌）、バーティシリウム種（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｐ．）、マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）（イネイモチ病及び芝の灰色斑点病の原因菌）、マグナポルテ・オリザエ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ）、スクレオチニア・スクレロチオルム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）（白かび病）及びうどんこ病が含まれるが、これらに限定されない。他の例には、担子菌類、例えばウスチラゴ種（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｓｐｐ．）、ウスチラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ）、リゾクトニア種（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｐｐ．）、リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）、ファコプソラ・パキリジ（Ｐｈａｋｏｓｐｏｒａ ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉ）（ダイズさび病菌）、プッチニア種（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｓｐｐ．）（実質的にすべての穀粒及び栽培牧草のさび病の原因菌）、及びアルミラリア種（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｓｐｐ．）（「ナラタケ」種；樹木及び生産に適するキノコ類の毒性病原体）が含まれる。Ｄｅａｎら（Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌ．，１３：４１４−４３０（２０１２））によれば、トップテンの植物真菌病原体は、マグナポルテ・オリザエ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ）、ボトリティス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）、プッチニア種（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｓｐｐ．）、フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、ブルメリア・グラミニス（Ｂｌｕｍｅｒｉａ ｇｒａｍｉｎｉｓ）、ミコスファエレラ・グラミニコラ（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、コレトトリカム種（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｓｐｐ．）、ウスチラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ）、及びメラムプソラ・リニ（Ｍｅｌａｍｐｓｏｒａ ｌｉｎｉ）である。Ｋａｍｏｕｎら（Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌ．，１６：４１３−４３４（２０１５））によれば、トップテンの卵菌類は、フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）（葉枯れ病）、ヒアロペロノスポラ・アラビドプシス（Ｈｙａｌｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｄｉｓ）（ベト病）、フィトフトラ・ラモルム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｒａｍｏｒｕｍ）（サドンオークデス及びラモルム病）、フィトフトラ・ソジャ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｏｊａｅ）（茎根腐敗病）、フィトフトラ・カプシシ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｐｓｉｃｉ）（焼枯れ病、茎果実腐敗病及び各種他の病気）、プラスモパラ・ビチコラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａ）（べと病）、フィトフトラ・シ���ナモミ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃｉｎｎａｍｏｍｉ）（根腐れ病及び枝枯れ病）、フィトフトラ・パラシティカ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐａｒｓｉｔｉｃａ）（根茎腐敗病及び各種他の病気）、ピシウム・ウルティマム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｕｌｔｉｍｕｍ）（立ち枯れ病及び根腐れ病）、及びアルブゴ・カンディダ（Ａｌｂｕｇｏ Ｃａｎｄｉｄａ）（白銹病）である。
【００８７】
種子植物はネナシカズラ、ヤドリキセ、またはストライガであり得る。前記植物は他の植物に半寄生または寄生し得る。
【００８８】
ウイルスは植物ウイルスであり得る。ウイルスは汁液を介して、昆虫により、線虫により、ネコブカビにより、ダニにより、種子により、または花粉により伝染し得る。その例には、アルファモウイルス（例えば、ブロモウイルス科）、アルファクリプトウイルス（例えば、パルティティウイルス科）、バドナウイルス、ベータクリプトウイルス（例えば、パルティティウイルス科）、ビジェミニウイルス（例えば、ジェミニウイルス科）、ブロモウイルス（例えば、ブロモウイルス科）、ビモウイルス（例えば、ポティウイルス科）、カピロウイルス、カーラウイルス、カーモウイルス（例えば、トンブスウイルス科）、カリモウイルス、クロステロウイルス、コモウイルス（例えば、コモウイルス科）、ククモウイルス（例えば、ブロモウイルス科）、サイトラブドウイルス（例えば、ラブドウイルス科）、ダイアンソウイルス、エナモウイルス、ファバウイルス（例えば、コモウイルス科）、ククモウイルス（例えば、ブロモウイルス科）、サイトラブドウイルス（例えば、ラブドウイルス科）、ダイアンソウイルス、エナモウイルス、ファバウイルス（例えば、コモウイルス科）、フィジーウイルス（例えば、レオウイルス科）、フロウイルス、ホルデイウイルス、ハイブリジェミニウイルス（例えば、ジェミニウルス科）、イダエオウイルス、アイラーウイルス（例えば、ブロモウイルス科）、イポモウイルス（例えば、ポティウイルス科）、ルテオウイルス、マクロモウイルス、マクルラウイルス、マラフィウイルス、モノジェミニウイルス（例えば、ジェミニウイルス科）、ナナウイルス、ノロウイルス、ネポウイルス（例えば、コモウイルス科）、ヌクレオラブドウイルス（例えば、ラブドウイルス科）、オリザウイルス（例えば、レオウイルス科）、ウルミアウイルス、フィトレオウイルス（例えば、レオウイルス科）、ポテクスウイルス、ポティウイルス（例えば、ポティウイルス科）、リモウイルス（例えば、ポティウイルス科）、セキウイルス（例えば、セキウイルス科）、ソベモウイルス、テヌイウイルス、タバモウイルス、トブラウイルス、トンブスウイルス（例えば、トンブスウイルス科）、トスポウイルス（例えば、ブニヤウイルス科）、トリコウイルス、チモウイルス、アンブラウイルス、割り当てられていないポチウイルス（例えば、ポティウイルス科）、割り当てられていないラブドウイルス（例えば、ラブドウイルス科）、ヴァリコサウイルス、ワイカウイルス（例えば、セキウイルス科）、及び分類されていないウイルスの属のメンバーが含まれるが、これらに限定されない。ウイルスの他の例には、カンキツトリステザウイルス、オオムギ黄化萎縮ウイルス、ジャガイモ葉捲病ウイルス及びトマト矮化病ウイルスが含まれるが、これらに限定されない。Ｓｃｈｏｌｔｈｏｆら（Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌ．，１２：９３８−９５４（２０１１））によれば、トップテンの植物ウイルスは、タバコモザイクウイルス、トマト黄化壊疽ウイルス、トマト黄化葉巻ウイルス、キュウリモザイクウイルス、ジャガイモウイルスＹ、カリフラワーモザイクウイルス、アフリカキャッサバモザイクウイルス、プラムポックスウイルス、ブロムモザイクウイルス及びジャガイモウイルスＸであ���。
【００８９】
汁液を介して伝染するウイルスの例には、タバコモザイクウイルス、ジャガイモウイルスＸ、ジャガイモウイルスＹ及びキュウリモザイクウイルスが含まれるが、これらに限定されない。
【００９０】
昆虫により伝染するウイルスの例には、ラブドウイルス科、レオウイルス科、ポティウイルス、ククモウイルス、ルテオウイルス、ベゴモウルス、トスポウイルス、コモウイルス、ソベモウイルス、トマト黄化葉巻ウイルス、トマト・プソイド・カーリー・トップウイルス、トマト黄化壊疽ウイルス及びレタス伝染性黄斑ウイルスが含まれるが、これらに限定されない。昆虫はアブラムシ、コナジラミ、ホッパー、アザミウマ、または甲虫であり得る。アブラムシはポティウイルス、ククモウイルス及びルテオウイルスを伝搬させ得る。コナジラミはベゴモウイルス、トマト黄化葉巻ウイルス及びレタス伝染性黄斑ウイルスを伝搬させ得る。ホッパーはラブドウイルス科、レオウイルス科及びトマト・ブソイド・カーリー・トップウイルスを伝搬させ得る。アザミウマはトスポウイルス及びトマト黄化壊疽ウイルスを伝搬させ得る。甲虫はコモウイルス及びソベモウイルスを伝搬させ得る。
【００９１】
線虫は、例えばネポウイルス、トブラウルス、タバコ輪点ウイルス及びタバコラットルウイルスを伝搬させ得る。Ｊｏｎｅｓら（Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌ．，１４：９４６−９６１（２０１３））によれば、トップテンの線虫はネコブ線虫（すなわち、ネコブセンチュウ種（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｓｐｐ．））、シスト線虫類（すなわち、シストセンチュウ種（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ｓｐｐ．）及びシストセンチュウ種（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ  ｓｐｐ．））、根腐れ線虫類（すなわち、ネグサレセンチュウ種（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ  ｓｐｐ．））、根潜り線虫（すなわち、バナナネモグリセンチュウ（Ｒａｄｏｐｈｏｌｕｓ ｓｉｍｉｌｉｓ））、ナミクキセンチュウ（Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｄｉｐｓａｃｉ）、マツ材線虫（すなわち、マツノザイセンチュウ（Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ））、腎臓形線虫（すなわち、ニセフクロセンチュウ（Ｒｏｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ））、ブドウオオハリセンチュウ（Ｘｉｐｈｉｎｅｍａ ｉｎｄｅｘ）、ニセネコブセンチュウ（Ｎａｃｏｂｂｕｓ ａｂｅｒｒａｎｓ）、及びイネシンガレセンチュウ（Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｏｉｄｅｓ ｂｅｓｓｅｙｉ）である。
【００９２】
ネコブカビ類は、例えばブニヤウイルス、ビモウイルス、フロウイルス、ペクルウイルス、ポモウイルス、オオムギ縞萎縮ウイルス及びビート壊疽性葉脈黄化ウイルスを伝搬させ得る。
【００９３】
ダニ類は、リモウイルス、トリティモウイルス及びコムギ縞萎縮ウイルスを伝搬させ得る。
【００９４】
種子は、例えばホルディウイルス、インゲンモザイクウイルス及びオオムギ斑葉モザイクウイルスを伝搬させ得る。
【００９５】
外来性ＤＮＡを安定的にトランスジェニック植物に取り込み、操作可能であると確認されたら、該ＤＮＡを有性交雑により他の植物に導入し得る。よって、高いタンパク質含有量、または病原体または有害生物に対して高い抵抗性を有する植物の生産方法も提供される。方法は、上記に従って得た植物を第２の植物と交雑させて子孫植物を生産し、高いタンパク質含有量、または病原体または有害生物に対して高い抵抗性を有する子孫植物を選択することを含む。方法は更に、選択した子孫植物を第２の植物と交雑させて戻し交雑子孫植物を生産し、高いタンパク質含有量、または病原体または有害生物に対して高い抵抗性を有する第１戻し交雑子孫植物を選択して選択した戻し交雑子孫植物を生産し、交雑及び選択を３回以上繰り返して高いタンパク質含有量、または病原体または有害生物に対して高い抵抗性を有する戻し交雑子孫植物を生産することを含み得る。栄養、無性及び有性生殖する藻類、及び非ヒト動物において使用するために類似の手順が使用または適応され得る。
【００９６】
ＮＦ−ＹＣ４遺伝子が転写リプレッサーがＮＦ−ＹＣ４の転写を防止できないように操作または修飾されている転写リプレッサー結合部位を含むプロモーターを含む細胞、細胞の集まり、組織、器官または生物も提供される。細胞、細胞の集まり、組織、器官または生物は、ＮＦ−ＹＣ４遺伝子が操作も修飾もされていない転写リプレッサー結合部位を含むプロモーターを含む対応する細胞、細胞の集まり、組織、器官または生物と比較して高いタンパク質含有量を有する。実施形態では、生物は植物または藻類、例えば単細胞鞭毛虫であり得る。別の実施形態では、生物は非ヒト動物、例えばウシ、ブタ、ニワトリ、七面鳥、ヒツジ及びバイソンのような家畜動物であり得る。
【００９７】
上記植物の種子、及びハイブリッド植物のような上記生物のハイブリッドも提供される。藻類の栄養、無性及び有性生殖、及び非ヒト動物の受精卵から生ずる対応する構造物のようなハイブリッド植物の種子も提供される。他の子孫、クローン、細胞株及び細胞も提供される。
【実施例】
【００９８】
以下の実施例は本発明を説明するために役立つ。これらの実施例は特許請求されている発明の範囲を限定すると意図されない。
【００９９】
［実施例１］
本実施例は、３５Ｓ：：ＱＱＳ及び３５Ｓ：：ＡｔＮＦ−ＹＣ４融合構築物の作成及び形質転換を説明する。
【０１００】
３５Ｓ：：ＱＱＳ及び３５Ｓ：：ＡｔＮＦ−ＹＣ４融合構築物を、増幅させた完全長コード配列を上記（前掲のＬｉら（２０１５））したバイナリーベクターｐＢ２ＧＷ７にクローニングすることにより作成した。簡単に説明すると、ＱＱＳコードドメイン配列（ＣＤＳ）またはアラビドプシス由来のＮＦ−ＹＣ４  ＣＤＳ（ＡｔＮＦ−ＹＣ４）を、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）由来のノパリンシンターゼ由来のＰｎｏｓ（ｎｏｓプロモーター）及びＴｎｏｓ（ｎｏｓターネーター）の制御下でＢａｒ遺伝子（ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を含有しているベクターｐＢ２ＧＷ７（ベクターのマップである図ｌａ及びｌｂを参照されたい）に挿入した。このベクター上のＣＤＳをｐ３５Ｓ（カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター）によりコントロールし、Ｔ３５Ｓ（ＣａＭＶ  ３５Ｓ）により終止させた。ＬＢとＲＢ間の領域のみ植物に導入して、トランスジェニック植物を作成した。
【０１０１】
構築物を、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）生態型コロンビア（Ｃｏｌ−０）に形質転換するためにアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株ＧＶ３１０１に導入し、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）品種ウイリアムズ８２（前掲のＬｉら（２０１５））、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）品種キタアケ及びトウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）系統Ｂ１０４に形質転換するためにアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株ＥＨＡ１０１に導入した。
【０１０２】
ＱＱＳを発現する形質転換体（ＱＱＳ−Ｅ）をＱＱＳ遺伝子の存在について前述（前掲のＬｉら（２０１５））したようにＢＡＲ選択、次いでポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析に基づいて同定した。
【０１０３】
ダイズＱＱＳ−Ｅウイリアムズ８２を圃場においてアイオワダイズエリート系統（ＩＡ１０２２、ＩＡ２０７９、ＩＡ２１０２、ＩＡ２０５３及びＩＡ３０２２）と交雑させるために花粉ドナーとして使用した（ウイリアムズ８２を対照として使用した）。Ｆｌ世代を温室内のポットにおいて３植物／ポットで２７／２０℃で明期１６時間及び暗期８時間の管理環境下で生育させた。Ｆ２世代をアイオワ州エイムズの圃場に栽植した。ＱＱＳ−Ｅ変異体をＱＱＳ遺伝子の存在についてＢＡＲ選択、次いでＰＣＲ分析に基づいて同定した。除草剤に対して抵抗性を持たず、ＱＱＳを発現しない分離野生型（ＷＴ）植物を同胞対照として使用した。
【０１０４】
イネ植物を生育チャンバにおいて２８／２５℃で明期１６時間及び暗期８時間の管理環境下で生育させた。Ｔ３世代植物を分析した。同様に、植物を除草剤及びＰＣＲ分析により試験して、形質転換体及びＷＴ同胞対照を同定した。
【０１０５】
トウモロコシ植物をアイオワ州エイムズの圃場において生育させた。植物をＢ１０４と戻し交雑した。同様に、植物を除草剤及びＰＣＲ分析により試験して、形質転換体及びＷＴ同胞対照を同定した。
【０１０６】
アラビドプシスを前述したように形質転換し、生育させ、収穫した。前掲のＬｉら（２００９）を参照されたい。
【０１０７】
［実施例２］
本実施例は、植物組成の分析を説明する。
【０１０８】
葉の組成（デンプン染色及びタンパク質の定量）を生育チャンバに栽植してから２０日後（ＤＡＰ）のアラビドプシスの実生シュートにおいて、３０ＤＡＰの植物からの一次分げつのイネ二番葉（止葉の次）において調べた。レプリケートあたり３植物（デンプンの場合）または５植物（タンパク質の場合）でＴ２系統（アラビドプシス）及びＴ３系統（イネ）から相互独立して３個のレプリケートを分析した。明期の終了時に葉を収穫した。アラビドプシス、イネ及びダイズについて各植物の種子を収穫した。葉及び種子タンパク質定量のために、植物材料を７１℃で焼いた。測定毎に乾燥葉／種子組織（０．０７ｇ）を使用した。全タンパク質含有量を測定した。全窒素をＬＥＣＯ  ＣＨＮ−２０００（ＬＥＣＯ，ミズーリ州セントジョセフ）を用いて測定し、タンパク質含有量に換算した（前掲のＬｉら（２０１５））。
【０１０９】
アラビドプシスの全地上部分をＩ２／ＫＩで染色し、イネの一次分げつの二番葉（止葉の次）の中間部分を集め、小片（長さ約１〜１．５ｃｍ）に切断した。
【０１１０】
ダイズ及びトウモロコシ種子（ダイズの場合タンパク質、油及び繊維；トウモロコシの場合タンパク質、油及びデンプン）をＢｒｕｉｎｓ  Ｇｒａｉｎ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  Ｓ／Ｎ  １０６１１０（独国ミュンヘン）を用いて近赤外線分光法により分析した。約６０ｇの種子／植物を試験し、系統毎に３個の生物学的レプリケートとした。
【０１１１】
［実施例３］
本実施例は、酵母ツーハイブレッドアッセイを説明する。
【０１１２】
Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，カリフォルニア州マウンテンビュー）を使用して、３日齢黄化実生を用いて構築したアラビドープシス・コロンビアｃＤＮＡライブラリー（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ／ｓｅｒｖｌｅｔｓ／ＴａｉｒＯｂｊｅｃｔ？ｔｙｐｅ＝ｌｉｂｒａｒｙ＆ｉｄ＝２３）を用いてＱＱＳ相互作用タンパク質を同定した。相互酵母ツーハイブリッドアッセイのために、ＱＱＳ及びＡｔＮＦ−ＹＣ４をそれぞれｐＧＢＫＴ７（つり餌ベクター）及びｐＧＡＤＴ７（餌食ベクター）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にクローン化した。
【０１１３】
［実施例４］
本実施例は、二分子蛍光補完（ＢｉＦＣ）アッセイを説明する。
【０１１４】
ＱＱＳ及びＡｔＮＦ−ＹＣ４をそれぞれｎＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）のＮ末端）及びｃＹＦＰ（ＹＦＰのＣ末端）のＮ末端にインフレームで融合した。ＱＱＳ−ｎＹＦＰ及びＡｔＮＦ−ＹＣ４−ｃＹＦＰ構築物を用いて形質転換したアグロバクテリウム株ＧＶ３１０１をタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｃｕｍ）に共浸潤させた。浸潤から４８時間後に再構成ＹＦＰシグナルをＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ  ＩＩ蛍光顕微鏡を用いて観察した。
【０１１５】
［実施例５］
本実施例は、ＨＩＳ−ＭＢＰタグ付き組換え体ＮＦ−Ｙの精製を説明する。
【０１１６】
ＡｔＮＦ−ＹＣ４遺伝子（または、他のＮＦ−Ｙ遺伝子または遺伝子断片）を含有する大腸菌形質転換体を０．９０のＯＤ６００まで０．６Ｌのルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地において３７℃で増殖させた後、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を０．０７５ｍＭの最終濃度まで添加した。１２℃で２０時間インキュベートした後、誘導細胞を５，０００×ｇで５分間遠心することにより収集した。Ｈｉｓ−ＭＢＰタグ付き（すなわち、６×ヒスチジン−マルトース結合タンパク質タグ付き）タンパク質をＮｉセファロース６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ペンシルベニア州ピッツバーグ）アフィニティークロマトグラフィーを用いて未変性条件下４℃で精製した。細胞ペレットを１５ｍｌの結合緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，ｐＨ８．０，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，及び３０ｍＭ  イミダゾール）中に再懸濁した。細胞を断続的音波処理により溶解した。１０，０００×ｇで２０分間遠心した後、樹脂を清澄化ライゼートに添加した。４℃で３０分間振とうした後、ライゼート−樹脂混合物をカラムに充填した。樹脂を洗浄緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，ｐＨ８．０，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，及び６０ｍＭ  イミダゾール）を用いて洗浄した。結合タンパク質を溶出緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，ｐＨ８．０，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，及び２５０ｍＭ  イミダゾール）を用いてカラムから溶出させた。溶出させたタンパク質をＰＢＳ緩衝液（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ，２．７ｍＭ  ＫＣｌ，１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、及び１．８ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．３）に対して２回透析した。タンパク質濃度をＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ミズーリ州セントルイス）により標準としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて測定した。
【０１１７】
［実施例６］
本実施例は、ＧＳＴタグ付きＱＱＳの発現及び精製を説明する。
【０１１８】
ＱＱＳ遺伝子を発現する大腸菌形質転換体を０．９のＯＤ６００まで１．２Ｌのルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地において３７℃で増殖させた後、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を０．０７５ｍＭの最終濃度まで添加した。１２℃で２０時間インキュベートした後、誘導細胞を５，０００×ｇで５分間遠心することにより収集した。ＧＳＴタグ付き（すなわち、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタグ付き）ＱＱＳの精製をグルタチオンセファロース４Ｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）アフィニティークロマトグラフィーを用いて未変性条件下４℃で実施した。細胞ペレットを１５ｍｌのＰＢＳ緩衝液（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ，２．７ｍＭ  ＫＣｌ，１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，及び１．８ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．３）中に再懸濁し、細胞を断続的音波処理により溶解させた。１０，０００×ｇで２０分間遠心した後、樹脂を清澄化ライゼートに添加した。４℃で３０分間振とうした後、ライゼート−樹脂混合物をカラムに充填した。樹脂をＰＢＳで洗浄した。結合タンパク質を溶離緩衝液（５０ｍＭ  トリスＨＣｌ，１０ｍＭ  還元グルタチオン，５ｍＭ  ＤＴＴ，ｐＨ８．０）を用いてカラムから溶出させた。溶出させたタンパク質をＰＢＳ緩衝液に対して２回透析した。タンパク質濃度をＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により標準としてＢＳＡを用いて測定した。
【０１１９】
［実施例７］
本実施例は、プルダウンアッセイを説明する。
【０１２０】
精製Ｈｉｓ−ＭＢＰタグ付きタンパク質（５μｇ）を１ｍｌの１％  ＮＰ−４０、１ｍＭ  ＤＴＴ及び０．５μｇ／μｌ  ＢＳＡを含有するＰＢＳ緩衝液中でビーズ固定化ＧＳＴ−ＱＱＳ融合タンパク質（１０μｇ）と混合した。混合物を４℃で２時間インキュベートした。Ｈｉｓ−ＭＢＰタグ付きンパク質とインキョベートする際にビーズ上に固定化したＧＳＴタンパク質をネガティブ対照として使用した。ビーズを遠心により回収し、１ｍｌのＰＢＳ緩衝液で６回洗浄し、５０μｌのＳＤＳ−サンプル緩衝液中に再懸濁した。１５μｌの生じたサンプルを１２％  ゲルを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した後、イムノブロッティング及びＭＢＰに対する抗血清を用いる分析を行った。
【０１２１】
［実施例８］
本実施例は、統計的設計及び分析を説明する。
【０１２２】
植物を生育させ、収集し、完全乱塊法または完全無作為化法で分析した。定性または定量分析を各独立トランスジェニック系統及び各対照からの最低３つの生物学的測定を用いて実施した。組成分析のために、植物サンプルに乱数を割り当て、遺伝子型を指定することなく順不同に測定するために分析施設に送った。
【０１２３】
データを平均値±ＳＥとして表す。２組の独立サンプルを等分散と仮定してスチューデントのｔ検定（両側）を用いて比較した（ｎ＝３）。Ｐ＜０．０５は有意と見なした（＊）。Ｐ＜０．０１は非常に有意と見なした（＊＊）。
【０１２４】
［実施例９］
本実施例は、系統発生的推定を説明する。
【０１２５】
配列を、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びキイロタマホコリカビ（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）のタンパク質配列に対してＰＦ００８０８．１８  ＰＦａｍドメイン（ヒストン折りたたみ様ドメイン）のＨＭＭＥＲ  ３．０（Ｆｉｎｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３９：Ｗ２９−３７（２０１１））検索（ｈｍｍｓｅａｒｃｈ）を用いて可能性あるＮＦ−Ｙ遺伝子として選択した。ツリーをＰｈｙＭＬパッケージ（Ｇｕｉｎｄｏｎら，Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５２：６９６−７０４（２００３））（パラメーター’−ａ  ｅ−ｆ  ｍ’で）を用いて構築し、Ａｒｃｈａｅｏｐｔｅｒｙｘ（サイト．ｇｏｏｇｌｅ．ｃｏｍ／ｓｉｔｅ／ｃｍｚｍａｓｅｋ／ｈｏｍｅ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ａｒｃｈａｅｏｐｔｅｒｙｘ）で可視化した。ＮＦ−ＹＣ４配列を示す図２ａ〜ｃ、及び進化的に多様な種由来のＮＦ−ＹＣ４遺伝子の系統ツリーである図３を参照されたい。
【０１２６】
［実施例１０］
本実施例は、ＱＱＳ導入遺伝子が種々の種子タンパク質含有量を有するエリートダイズ系統中のタンパク質含有量及び炭水化物含有量に影響を与えることを立証する；よって、ＱＱＳの効果はダイズ系統ウイリアムズ８２に限定されない。
【０１２７】
ＱＱＳ導入遺伝子を種々の種子タンパク質含有量を有するエリートダイズ系統に花粉ドナーとしてのＱＱＳを発現する（ＱＱＳ−Ｅ）ウイリアムズ８２ダイズと交雑させることにより導入した。ＱＱＳ導入遺伝子を含むこれらの交雑種のＦ２及びＦ３世代の自家受粉子孫は、形態、発生、種子サイズ、種子形状、種子重量、及び植物あたりの種子収量の点でそれぞれの分離同胞に類似していた。種子組成（Ｆ３世代）を近赤外線分光法（ＮＩＲＳ）により分析した。
【０１２８】
ＱＱＳを発現させると、系統中の初期タンパク質レベルに関係なく各エリート系統中の種子タンパク質含有量が増加した（図４Ａ）。種子タンパク質含有量を、ＱＱＳを発現するダイズエリート系統及びそのそれぞれの分離同胞対照対Ｆ３世代の種子タンパク質（％／１３％の水分を有する新鮮重量のｇ）の棒グラフである図４Ａに示す。それぞれの分離同胞対照と比較した種子タンパク質の増加パーセントを変異体バーの上部に示す。ａ＝ＱＱＳ−Ｅウイリアムズ８２形質転換体由来のＱＱＳ遺伝子を欠く分離同胞；ｂ＝ＱＱＳ−Ｅウイリアムズ８２形質転換体；ｃ＝ＩＡエリート系統またはウイリアムズ８２とＱＱＳ−Ｅウイリアムズ８２の交雑種由来のＱＱＳ遺伝子を欠く分離同胞対照；ｄ＝ＩＡエリート系統とＱＱＳ−Ｅウイリアムズ８２の交雑種由来のＱＱＳ−Ｅ変異体。ＱＱＳ−Ｅと対照を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊＊Ｐ＜０．０１。具体的には、ＱＱＳを発現させると、種子タンパク質含有量がそれぞれの分離同胞と比較して低タンパク質系統ＩＡ１０２２では９％、中間タンパク質系統ＩＡ２０７９及びＩＡ２１０２では６〜７％、高タンパク質系統ＩＡ２０５３及びＩＡ３０２２では７〜１１％増加した。
【０１２９】
図４Ｂは、ＱＱＳを発現するダイズエリート系統及びそのそれぞれの分離同胞対照対Ｆ３世代の種子油（％／１３％の水分を有する新鮮重量のｇ）の棒グラフである。ａ＝ＱＱＳ−Ｅウイリアムズ８２形質転換体由来のＱＱＳ遺伝子を欠く分離同胞；ｂ＝ＱＱＳ−Ｅウイリアムズ８２形質転換体；ｃ＝ＩＡエリート系統またはウイリアムズ８２とＱＱＳ−Ｅウイリアムズ８２の交雑種由来のＱＱＳ遺伝子を欠く分離同胞対照；ｄ＝ＩＡエリート系統またはウイリアムズ８２とＱＱＳ−Ｅウイリアムズ８２の交雑種由来のＱＱＳ−Ｅ変異体。ＱＱＳ−Ｅと対照を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５。＊＊Ｐ＜０．０１
【０１３０】
図４Ｃは、ＱＱＳを発現するダイズエリート系統及びそのそれぞれの分離同胞対照対Ｆ３世代の種子繊維（％／１３％の水分を有する新鮮重量のｇ）の棒グラフである。ａ＝ＱＱＳ−Ｅウイリアムズ８２形質転換体由来のＱＱＳ遺伝子を欠く分離同胞；ｂ＝ＱＱＳ−Ｅウイリアムズ８２形質転換体；ｃ＝ＩＡエリート系統またはウイリアムズ８２とＱＱＳ−Ｅウイリアムズ８２の交雑種由来のＱＱＳ遺伝子を欠く分離同胞対照；ｄ＝ＩＡエリート系統またはウイリアムズ８２とＱＱＳ−Ｅウイリアムズ８２の交雑種由来のＱＱＳ−Ｅ変異体。ＱＱＳ−Ｅと対照を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５。＊＊Ｐ＜０．０１。
【０１３１】
［実施例１１］
本実施例は、ＱＱＳ導入遺伝子がイネ及びトウモロコシ中のタンパク質含有量に影響を与えることを立証する。
【０１３２】
ＱＱＳ導入遺伝子をイネ（品種キタアケ；ベクターのマップである図１Ａを参照されたい）に導入した。イネ植物を生育チャンバにおいて完全乱塊法で生育させた。３つの独立の形質転換事象由来のＴ３植物の葉及び成熟Ｔ４種子を３通りで分析した。ＱＱＳ遺伝子を発現するイネ植物（ＱＱＳ−Ｅ）の独立トランスジェニック系統及びその種子は、そのそれぞれの野生型（ＷＴ）同胞対照に外観及び発生的に類似していた。しかしながら、３つの独立トランスジェニック系統においてＱＱＳ遺伝子を発現させると、ＱＱＳを発現する葉（ＱＱＳ−Ｅ）及びその野生型同胞（同胞）中のデンプン含有量は減少し、葉中のタンパク質含有量は増加した（ＱＱＳを発現するイネ（品種キタアケ）（ＱＱＳ−Ｅ）及びその野生型同胞（同胞）対葉タンパク質（乾燥重量％）の棒グラフである図５Ａを参照されたい；すべてのデータは平均値±ＳＥ，ｎ＝３を示す；ＱＱＳ−Ｅと対照を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した；＊＊Ｐ＜０．０１）。３つのトランスジェニック系統での成熟イネ種子中の平均タンパク質増加は２０％である（ＱＱＳを発現するイネ（品種キタアケ）（ＱＱＳ−Ｅ）及びその野生型同胞（同胞）対種子タンパク質（乾燥重量％）の棒グラフである図５Ｂを参照されたい；すべてのデータは平均値±ＳＥＭ，ｎ＝３を示す；ＱＱＳ−Ｅと対照を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した；＊＊Ｐ＜０．０１）。
【０１３３】
ＱＱＳ導入遺伝子をトウモロコシに導入し、圃場で生育させた。ＱＱＳ発現トウモロコシナス中の核タンパク質（乾燥重量％）は、同胞対照（参照により本明細書に組み入れるＬｉら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，１１２（４７）：１４７３４−１４７３９（２０１５）を参照されたい）と比較して約１０％〜約２０％増加した。
【０１３４】
［実施例１２］
本実施例は、ＱＱＳと相互作用する遺伝子を同定するための、アラビドプシス実生由来のｃＤＮＡライブフリーに対してつり餌としてＱＱＳを用いる酵母ツーハイブリッドスクリーニングを説明する。
【０１３５】
アラビドプシス実生由来のｃＤＮＡライブラリーに対してつり餌としてＱＱＳを用いる酵母ツーハイブリッドスクリーニングは、ＱＱＳと相互作用する遺伝子としてアラビドプシス核因子ＹＣ４（ＡｔＮＦ−ＹＣ４）を同定した。相互酵母ツーハイブリッドアッセイはＱＱＳとＡｔＮＦ−ＹＣ４の相互作用と一致している；つり餌上のＡｔＮＦ−ＹＣ４はオートシグナルを有し、ＱＱＳ−餌食＋ＡｔＮＦ−ＹＣ４−つり餌シグナルはＡｔＮＦ−ＹＣ４−つり餌よりも高い。ＱＱＳとＡｔＮＦ−ＹＣ４の相互作用は更に酵母ツーハイブリッド一ペアワイズ相互研究により確認された（図６）。図６は、餌食＋つり餌の空ベクター（ＢＫ＋ＡＤ）、ＱＱＳ−餌食＋つり餌の空ベクター（ＢＫ＋ＱＱＳ）、ＡｔＮＦ−ＹＣ４−つり餌＋餌食の空ベクター（ＡｔＮＦ−ＹＣ４＋ＡＤ）、及びＡｔＮＦ−ＹＣ４−つり餌＋ＱＱＳ−餌食（ＡｔＮＦ−ＹＣ４＋ＱＱＳ）プラスレポーター遺伝子相対発現の棒グラフである。＊Ｐ＜０．０５。＊＊Ｐ＜０．０１。統計分析は、ＡｔＮＦ−ＹＣ４−つり餌＋ＱＱＳ−餌食発現がＡｔＮＦ−ＹＣ４−つり餌よりも高い（＊Ｐ＜０．０５）ことを示している。タバコ葉での二分子蛍光補完アッセイは、ＱＱＳ及びＡｔＮＦ−ＹＣ４は細胞質ゾル及び核と相互作用することを示した；ＹＦＰシグナルはＱＱＳとＡｔＮＦ−ＹＣ４相互作用なしに検出されなかった。
【０１３６】
［実施例１３］
本実施例は、ＱＱＳ結合のために必要なＡｔＮＦ−ＹＣ４中の領域を同定するために精製組換えＡｔＮＦ−ＹＣ４−ＧＳＴ融合タンパク質を用いるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）プルダウンアッセイを説明する。
【０１３７】
ＧＳＴと融合したＡｔＮＦ−ＹＣ４の各種領域（すなわち、完全長、アミノ酸１−７２、アミノ酸７３−１６２、アミノ酸１６３−２５０、アミノ酸１−１６２及びアミノ酸７３−２５０）を含有するタンパク質を発現させた。融合タンパク質をプルダウンアッセイにおいて使用した。分析は、ＱＱＳがＡｔＮＦ−ＹＣ４のアミノ酸７３からアミノ酸１６２の領域中のアミノ酸に結合していることを示した。この領域はヒストン折りたたみ様ドメインの位置に相当する。タバコ葉における二分子蛍光補完アッセイは、ＱＱＳ及びＮＦ−ＹＣ４が細胞質ゾル及び核と相互作用することを示した。核に局在化する相互作用をポジティブ対照として使用した。ＧＳＴプルダウンアッセイはＱＱＳとダイズ及びイネＮＦ−ＹＣ４ホモログ間の相互作用も示した。
【０１３８】
［実施例１４］
本実施例は、ＱＱＳが通常ヒストン折りたたみ様ドメインタンパク質に結合するかどうかを調べるための精製組換えアラビドプシス核因子ＹＢ７（ＡｔＮＦ−ＹＢ７）−ＧＳＴ融合タンパク質を用いるＧＳＴプルダウンアッセイを説明する。
【０１３９】
ＡｔＮＦ−ＹＢ７はヒストン折りたたみ様ドメインを含み、ＡｔＮＦ−ＹＣ４と複合体を形成すると予測される（Ｈａｃｋｅｎｂｅｒｇら、Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ，５：８７６−８８８（２０１２））。しかしなから、ＡｔＮＦ−ＹＢ７はＧＳＴプルダウンアッセイにおいてＱＱＳにより結合せず、ＱＱＳはある特徴的要件を有するヒストン折りたたみ様ドメインを有するタンパク質と結合することを示す。
【０１４０】
［実施例１５］
本実施例は、タバコ葉におけるＱＱＳ及びＡｔＮＦ−ＹＣ４のインビボ共発現を説明する。
【０１４１】
ＱＱＳ及びＡｔＮＦ−ＹＣ４をタバコ葉においてインビボで共発現させた。ＱＱＳ−ＮＦ−ＹＣ４複合体は細胞質ゾル及び核中で検出された。これらのデーター（ベクターマップについては図ｌａ及びｌｂを参照されたい）から、主に細胞質ゾルＱＱＳ（前掲のＬｉら（２００９））及びＮＦ−ＹＣ（Ｋａｈｌｅら，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２５：５３３９−５３５４（２００５））は細胞質ゾル中で結合し、核に移動することが示唆され、これはＮＦ−ＹＢが細胞質中でＮＦ−ＹＣに結合し、ＮＦ−ＹＢ−ＮＦ−ＹＣ複合体が核に移動するモデルに類似している。
【０１４２】
［実施例１６］
本実施例は、ＱＱＳとＡｔＮＦ−ＹＣ４のアミノ酸７３−１６２に類似のアミノ酸配列を有するイネ及びダイズタンパク質との相互作用を説明する。
【０１４３】
ＡｔＮＦ−ＹＣ４のアミノ酸７３−１６２に類似のアミノ酸配列を有するイネ及びダイズタンパク質を、１０個の各種真核生物種（真核生物の進化的に様々な種由来ＮＦ−ＹＣ遺伝子の系統ツリーであり、イネ、ダイズ及びアラビドプシスの分析を示す図３を参照されたい）のゲノムからのタンパク質コード遺伝子中のすべてのＮＦ−Ｙヒストン折りたたみ様ドメインを系統発生分析することにより選択した。ＱＱＳとダイズ（Ｇｌｙｍａ０６ｇｌ７７８０及びＧｌｙｍａ０４ｇ３７２９１）及びイネ（Ｏｓ３ｇｌ４６６９、Ｏｓ２ｇ０７４５０及びＯｓ６ｇ４５６４０）ホモログの物理的相互作用をＧＳＴプルダウンアッセイにより試験した。ＱＱＳはすべてのホモログと相互作用した。これらの所見は、ＮＦ−ＹＣ４との相互作用を介してダイズ及びイネに高タンパク質表現型を付与するＱＱＳの発現に一致している。
【０１４４】
［実施例１７］
本実施例は、アラビドプシスにおけるＡｔＮＦ−ＹＣ４及びＯｓＮＦ−ＹＣ４の過剰発現を説明する。
【０１４５】
ＡｔＮＦ−ＹＣ４（Ａｔ＝シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ））導入遺伝子をアラビドプシスにおいて過剰発現させた。３つの独立の形質転換事象由来の２０日齢のＴ２植物の実生を分析した。ＡｔＮＦ−ＹＣ４を過剰発現すると、葉中のデンプン含有量は約１６％減少し（ＮＦ−ＹＣ４を過剰発現するアラビドプシス（ＡｔＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ）及び野生型アラビドプシス（ＷＴ）対葉デンプン（ｍｇ／ｇ新鮮重量）の棒グラフである図７Ａを参照されたい；棒グラフ中のすべてのデータは平均値±ＳＥ，ｎ＝３である；ＷＴ及びＡｔＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ系統中のデンプン組成を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した；＊Ｐ＜０．０５）、葉中のタンパク質含有量はおおよそ１７％増加した（ＮＦ−ＹＣ４を過剰発現するアラビドプシス（ＡｔＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ）及び野生型アラビドプシス（ＷＴ）対葉タンパク質（ｍｇ／ｇ乾燥重量）の棒グラフである図７Ｂを参照されたい；棒グラフ中のすべてのデータは平均値±ＳＥ，ｎ＝３を示す；ＷＴ及びＡｔＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ系統中のタンパク質組成を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した；＊＊Ｐ＜０．０１）。
【０１４６】
これらのデータから、ＱＱＳがＡｔＮＦ−ＹＣ４と共に作用して窒素及び炭素の配分を変更すると示唆される。ＱＱＳはＮＦ−ＹＣ４に結合し、生じた複合体は核に移動し、ＮＦ−ＹＣ４関連ＮＦ−Ｙ複合体により抑制され、活性化される遺伝子の転写を変化させると考えられる。発現におけるこれらの変化により、タンパク質含有量が増加し、デンプン含有量が減少する。
【０１４７】
ＯｓＮＦ−ＹＣ４（Ｏｓ＝イネ（Ｏｒｚｙａ ｓａｔｉｖａ）；Ｏｓ３ｇｌ４６６９）導入遺伝子もアラビドプシスにおいて過剰発現させた。イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）由来のＮＦ−ＹＣ４  ＣＤＳを、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）由来のノパリンシンターゼ由来のＰｎｏｓ（ｎｏｓプロモーター）及びＴｎｏｓ（ｎｏｓターミネーター）の制御下でＢａｒ遺伝子（ホスホィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を含むベクターｐＢ２ＧＷ７に挿入した。このベクター上のＯｓＮＦ−ＹＣ４はｐ３５Ｓ（カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター）によりコントロールされ、Ｔ３５Ｓ（ＣａＭＶ  ３５Ｓ）で終わる。ＬＢとＲＢ間の領域のみをアラビドプシス植物に導入して、トランスジェニックアラビドプシスＯｓＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ植物を作成した（ベクターのマップである図１Ｄを参照されたい）。ＯｓＮＦ−ＹＣ４を過剰発現させると、葉中のデンプン含有量はアラビドプシスＷＴと比較して〜１６％減少した。タンパク質含有量を分析している。
【０１４８】
［実施例１８］
本実施例は、ＮＦ−ＹＣ４遺伝子のプロモーター領域中の同定されたリプレッサーモチーフの標的化除去を説明する。
【０１４９】
ＮＦ−ＹＣ４遺伝子のプロモーター領域中のＲＡＶＩの結合モチーフ、具体的にはＲＡＶＩ−Ａを同定した。ＲＡＶ１−Ａモチーフは配列ＣＡＡＣＡを有する（ＲＡＶＩの検討のために、例えばＫａｇａｙａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２７：４７０−４７８（１９９９）を参照されたい）。“Ｗボックス”もＮＦ−ＹＣ４遺伝子のプロモーター領域中で同定された（ＥＲＦ３遺伝子のプロモーター領域中のＷボックスの検討のために、例えばＮｉｓｈｉｕｃｈｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９：５５３５５−５５３６１（２００４）を参照されたい）。Ｗボックスモチーフは配列ＴＧＡＣＹ（ここで、Ｙ＝ＣまたはＴ）を有する。前記モチーフは植物ｃｉｓ作用調節ＤＮＡエレメント（ＰＬＡＣＥ）データーベース：１９９９（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２７（１）：２９７−３００（１９９９））において同定された；前記モチーフはＳＩＧＮＡＬ  ＳＣＡＮ（Ｐｒｅｓｔｒｉｄｇｅ，ＣＡＢＩＯＳ，７：２０３−２０６（１９９１）；ワールドワイドウェブのｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ＰＬＡＣＥ／ｓｉｇｎａｌｓｃａｎ．ｈｔｍｌで利用可能である）を用いて同定された。モチーフはＰｌａｎｔｃａｒｅ（ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｐｓｂ．ｕｇｅｎｔ．ｂｅ／ｗｅｂｔｏｏｌｓ／ｐｌａｎｔｃａｒｅ／ｈｔｍｌ）を用いても見つけられ得る。ダイズ及びイネのＮＦ−ＹＣ４遺伝子のプロモーター領域中のリプレッサーモチーフを欠失させた。ダイズに関しては、具体的にはＲＡＶＩ−ＡモチーフとＷボックスモチーフ間の領域（すなわち、配列
【０１５０】
【化１４】
0006785235.tif 000015
［配列番号１７］；図２Ｅを参照されたい）を有するｎｔｓ  ３６０−３９１）を欠失させた。イネに関しては、具体的にはＲＡＶ１−Ａモチーフ（すなわち、ＣＡＡＣＡの配列を有するｎｔｓ２５０−２５４）を欠失させた。変異プロモーターを有する構築物及び完全長プロモーターを有する構築物を別々にレポーター遺伝子としてのルシフェラーゼと融合させた。バイナリーベクター上の各構築物を別々にアグロバクテリウムＧＶ３１０１に形質転換した後、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）に形質転換した（Ｌｅｕｚｉｎｇｅｒら，Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．，７７（２０１３））。ベンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の推奨発生段階、及びアグロバクテリウム増殖及び浸潤濃度を使用した。組換えルシフェラーゼタンパク質を一時的に発現させた。アグロバクテリウム浸潤させたタバコ葉におけるルシフェラーゼ発現を定量した。構築物あたり３植物で少なくとも３個のレプリケートを含めた。ダイズ由来のＮＦ−ＹＣ４遺伝子由来のリプレッサーモチーフを除去すると、２／３レプリケートでルシフェラーゼの発現が増加した。同様に、イネ由来のＮＦ−ＹＣ４遺伝子由来のリプレッサーモチーフを除去すると、２／３レプリケートでルシフェラーゼの発現が増加した。総合的に、ダイズ由来のＮＦ−ＹＣ４遺伝子及びイネ由来のＮＦ−ＹＣ４遺伝子の場合３個すべてのレプリケートの全ルシフェラーゼ発現が増加した。
【０１５１】
別の実験では、転写リプレッサーモチーフを除去すべくＯｓＮＦ−ＹＣ４のプロモーター領域に対して３つの別々の変異を生じさせた。「ｐｒｏｌ」変異では、１１６４ｂｐ上流の“ＲＡＶＩ”モチーフ（配列番号２及び図２Ａを参照されたい）を欠失させた。“ｐｒｏ２”変異では、９８２ｂｐ上流の“ＲＡＶＩ”モチーフ及び９７９ｂｐ上流の“Ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ＥＲＦ”モチーフ（配列番号３及び図２Ｂを参照されたい）を欠失させた。“ｐｒｏ３”変異では、ＲＡＶＩモチーフ及び介在配列（配列番号４及び図２Ｂを参照されたい）を欠失させた。対照“ｐｒｏ  Ｆｕｌｌ”は完全長プロモーター領域、すなわち開始コドンの１，４４８ｂｐ上流（配列番号１及び図２Ａを参照されたい）を含んでいた。プロモーター領域を上記したようにルシフェラーゼコード領域と融合し、アグロバクテリウムに形質転換した後、タバコに形質転換した。結果を図９に示す。
【０１５２】
図９は、対照（ＯｓＮＦ−ＹＣ４ｐｒｏＦｕｌｌ）と比較した、イネＮＦ−ＹＣ４のプロモーター領域中の転写リプレッサーモチーフが欠失されている（ＯｓＮＦ−ＹＣ４ｐｒｏｌ、Ｏｓ−ＮＦ−ＹＣ４ｐｒｏ２及びＯｓ−ＮＦ−ＹＣ４ｐｒｏ３）タバコ由来のＬＵＣ活性対相対的ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）活性のグラフである。データは平均値±ＳＥＭ，ｎ＝３を表す。欠失を有するプロモーター及び完全長プロモーターより駆動されるＬＵＣ活性を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５。エラーバーは標準誤差を示す。
【０１５３】
示すように、プロモーター領域中の転写リプレッサーモチーフが除去されている場合にはＮＦ−ＹＣ４発現がアップレギュレートされる。２つのＥＲＦモチーフの欠失は、１つのＲＡＶＩモチーフの欠失、または１つのＲＡＶＩモチーフと１つのＥＲＦモチーフの組合せ欠失よりも高い効果を有していた。
【０１５４】
さらに別の実験では、転写リプレッサーモチーフを除去すべくＧｍＮＦ−ＹＣ４のプロモーター領域に対して３つの別々の変異を生じさせた。“ｐｒｏｌ”変異では、ＥＲＦモチーフ（リバース）、ＲＡＶＩモチーフ（フォワード）及び介在配列を欠失させた（配列番号９及び図２Ｄを参照されたい）。“ｐｒｏ２”変異では、ＥＲＦモチーフ（リバース）、ＲＡＶＩモチーフ（リバース）及び介在配列を欠失させた（配列番号１１及び図２Ｄを参照されたい）のに対して、“ｐｒｏ３”変異では、２つのＲＡＶＩモチーフ及び介在配列を欠失させた（配列番号１３及び図２Ｅを参照されたい）。対照“ｐｒｏＦｕｌｌ”は完全長プロモーター領域、すなわち開始コドンの１，４４８ｂｐ上流（配列番号８及び図２Ｃを参照されたい）を含んでいた。プロモーター領域を上記したようにルシフェラーゼコード領域と融合し、アグロバクテリウムに形質転換した後、タバコに形質転換した。結果を図８に示す。
【０１５５】
図８は、対照（ｐＳｏｙ−ＬＵＣＦｕｌｌ）と比較した、ダイズＮＦ−ＹＣ４のプロモーター領域中の転写リプレッサーモチーフが欠失されている（ｐＳｏｙ−ＬＵＣ  ＤＥＬＩ、ｐＳｏｙ−ＬＵＣ  ＤＥＬ２及びｐＳｏｙ−ＬＵＣ  ＤＥＬ３）タバコ由来のＬＵＣ（ルシフェラーゼ）活性対相対的ＬＵＣ活性のグラフである。データは平均値±ＳＥＭ，ｎ＝３を表す。欠失を有するプロモーター及び完全長プロモーターより駆動されるＬＵＣ活性を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５。エラーバーは標準誤差を示す。示すように、プロモーター領域中の転写リプレッサーモチーフが除去されている場合にはＮＦ−ＹＣ４発現がアップレギュレートされる。ＲＡＶ１モチーフの両方の欠失は、１つのＲＡＶＩモチーフと１つのＥＲＦモチーフの組合せ欠失よりも高い効果を有していた。
【０１５６】
さらに別の実験では、イネＴ０植物（キタアケ）をＯｓＮＦ−ＹＣ４のプロモーター領域に変異を導入するように標的化したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構築物で形質転換した。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９技術の使用はイネにおける標的化遺伝子編集のために複数のステップを伴った。ＯｓＮＦ−ＹＣ４中の標的配列（配列番号６及び７を参照されたい）を選択し、ヌクレアーゼ（すなわち、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡ）を発現するプラスミドを設計し、構築し、胚発生カルスをアグロバクテリウム媒介遺伝子移入により形質転換し、初代トランスジェニック系統を部位特異的ＤＮＡ変化についてスクリーニングし、同定し、ＰＣＲ遺伝子型決定を使用して、欠失した配列を有する変異体を同定した。１９個以上のへテロ接合変異を有する変異体植物（Ｔ０）を同定した。Ｔ０植物をホモ接合及びＴ−ＤＮＡの分離を有する子孫に自己交雑した。Ｔｌ種子を収集する。ホモ接合変異を有し、Ｔ−ＤＮＡ挿入を含まない変異体を選択する。
【０１５７】
［実施例１９］
本実施例は、転写リプレッサー結合部位を含み得る領域を同定するためのＮＦ−ＹＣ４遺伝子のプロモーター領域のスクリーニングを説明する。
【０１５８】
キタアケ葉のゲノムＤＮＡを、変異したＯｓＮＦ−ＹＣ４プロモーター構築物を作成するためにＰＣＲのためのテンプレートとして使用する。ＮＦ−ＹＣ４遺伝子のプロモーター領域（出発コドンの上流１ｋｂ領域）を（出発コドンの上流の）位置−１０００ｂｐから始めて１００ｂｐセグメントを順次欠失することにより変異させる。プロモーターの中央（すなわち、位置−９００ｂｐから−１００ｂｐ）に１００ｂｐ欠失を有する変異ＮＦ−ＹＣ４プロモーターを二重ジョイントＰＣＲ（Ｙｕら，Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ．Ｂｉｏｌ．，４１：９７３−９８１（２００４））により構築する。
【０１５９】
変異プロモーターを有する複数の構築物及び完全長プロモーターを有する１つの構築物を別々にリポート遺伝子としてのルシフェラーゼに融合する。バイナリーベクター上の各構築物を別々にアグロバクテリウムＧＶ３１０１に形質転換した後、バンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）に形質転換した（前掲のＬｅｕｚｉｎｇｅｒら（２０１３））。バンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）及びアグロバクテリウム生育の推奨される発生段階、及び浸潤濃度を使用する。組換えルシフェラーゼタンパク質を一時的に発現させる。どの欠失が完全長プロモーターと比較して高い発現が生ずるかを同定するために、ルシフェラーゼ発現をアグロバクテリウム浸潤させたタバコ葉において定量する。高い発現を有するプロモーターを転写リプレッサー結合部位を含むように提案する。構築物あたり３植物で少なくとも３個のレプリケートを含める。
【０１６０】
［実施例２０］
本実施例は、植物防御に関与する遺伝子の発現に対するＱＱＳの過剰発現及び過小発現の影響を説明する。
【０１６１】
全ＲＮＡをプールした葉サンプルからＴＲＩｚｏｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カリフォルニア州カールスバッド）を用いて抽出した。ＲＮＡを更に、ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙミニキット（ＱＩＡＧＥＮ，カリフォルニア州バレンシア）及びＤＮＡ汚染を除去するためのＤＮＡｓｅ  Ｉ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カリフォルニア州カールスバッド）処理を用いて精製した。
【０１６２】
２００ｂｐ短インサートライブラリーを構築した。トランスクリプトーム配列決定をＶ３試薬（９１エアエンドシーケンシング）を用いるＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２０００システムで実施した。アダプターを有するリード、５％以上の未知ヌクレオチドを有するリード、及び≦１０のクオリティーを有する２０％以上の塩基を有するリードを除去することにより低クオリティリードを取り除いた。クリーンにしたリードをＴｏｐＨａｔを用いてＰｈｙｔｏｚｏｍｅバージョン８．０（ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ．ｎｅｔ）で参照シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）に対してアラインした。マップされたリードをｈｔｓｅｑ−ｃｏｕｎｔ（ｈｕｂｅｒ．ｅｍｂｌ．ｄｅ／ｕｓｅｒｓ／ａｎｄｅｒｓ／ＨＴＳｅｑ／ｄｏｃ／ｃｏｕｎｔ．ｈｔｍｌ）によりカウントした。
【０１６３】
ＱＱＳ  ＲＮＡｉ（ＱＱＳをダウンレギュレートする）、ＱＱＳ  ＯＥ（ＱＱＳを過剰発現する）及び野生型Ｃｏｌ−０アラビドプシス植物のＲＮＡ−Ｓｅｑデータの分析は、表１に示すように植物防御関連マーカー遺伝子は野生型アラビドプシスに比して混乱した転写レベルを有していたことを示した。
【０１６４】
【表１】
0006785235.tif 000016
【０１６５】
パターンは３つの群に分類され得る。第１群は両変異体において低い発現を示す１つの遺伝子、すなわち細菌感染により大きく活性化され、基礎的防御の誘導に関与するＷＲＫＹ４７である（Ｔｒｕｍａｎら，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，４６（１）：１４−３３（２００６））。第２群は両変異体において高い発現を示す４つの遺伝子からなる。４つの遺伝子は、ジャスモネート（ＪＡ）調節植物応答の主要代謝酵素であるＪＭＴ（Ｓｅｏら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９８（８）：４７８８−４７９３（２００１））、ジャスモネートとエチレン（ＥＴ）シグナリング間の拮抗をモジュレートするＪＡ応答性転写因子であるＭＹＣ２（Ｃｈｉｃｏら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，２６（５）：１９６７−１９８０（２０１４）；Ｓｏｎｇら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，２６（１）：２６３−２７９（２０１４）；及びＺｈａｎｇら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，２６（３）：１１０５−１１１７（２０１４））、コルのＪＡによる活性化に応じてアントシアニン生合成を活性化するＪＡ応答性転写因子であるＰＡＰ１（Ｓｈａｎら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．，６０（１３）：３８４９−３８６０（２００９））、及び植物内でのカロース沈着を誘導するＥＴ応答性転写因子であるＲＡＢ２−６（Ａｌｉら，ＢＭＣ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．，１３：４７（２０１３））である。第３群は、ＱＱＳをダウンレギュレートする変異体では低い発現、及びＱＱＳを過剰発現する変異体では高い発現を示す３つの遺伝子からなる。３つの遺伝子は、ＳＡ誘導免疫を調節するＮＰＲ依存性基礎的防御負調節因子であるＷＲＫＹ３８（Ｃａｉｌｌａｕｄら，ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ．，１１（１２）：ｅｌ００１７３２（２０１３）；Ｋｉｍら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，２０（９）：２３５７−２３７１（２００８）；Ｐｒｅら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１４７（３）：１３４７−１３５７（２００８）；及び前掲のＳｅｏら（２００１））、ＮＰＲｌ調節タンパク質、及びＰＲ１病原性関連タンパク質１である。
【０１６６】
［実施例２１］
本実施例は、ＮＦ−ＹＣ４またはＱＱＳを過剰発現するトランスジェニックシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎ）植物ではウイルス感染が減少したことを立証する。
【０１６７】
カブモザイクウイルスを有する緑色蛍光タンパク質（ＴｕＭＶ−ＧＦＰ）接種アッセイを、若干のマイナーな変更を加えて既報（Ｙａｎｇら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，２０（４）：３５８−３７０（２００７））されているように実施した。凍結したＴｕＭＶ−ＧＦＰ感染カブ（Ｓｅｖｅｎ  Ｔｏｐ）葉を２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２，１：６ｗｔ／ｖｏｌ）中で粉砕し、Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，カリフォルニア州サンディエゴ）を介して濾過して接種材料を得た。接種材料の力価を調節して、うまく分離されたＧＦＰ位を得た。
【０１６８】
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎ）植物を明期１０時間、２２℃で７週間生育させて、大きなロゼット葉を発生させた。ロゼット葉にカーボランダムを振りかけ、コットンスティックアプリケーターを用いてＴｕＭＶ−ＧＦＰをこすりつけて接種した。接種から１２０時間後（ｈａｉ）、接種したロゼット葉上のＧＦＰフォーカスをＵＶ照射（１００Ｗ  ブラックライト長波ＵＶランプ；ＵＶＰ，カリフォルニア州アップランド）下でカウントした。各系統は１０個のランダムに選択した植物の３個の生物学的レプリケートを有していた。系統毎に１０個の植物の平均フォーカス数を計算し、系統間のフォーカス数の有意差をスチューデントのｔ検定（Ｐ＜０．０１または０．０５）を用いて計算した。
【０１６９】
遺伝子型毎に、４０個のシングルＧＦＰフォーカスをランダムに選択し、Ｚｅｉｓｓ  Ｓｔｅｍｉ  ＳＶ１１蛍光解剖顕微鏡上でＺｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＣａｍ  ＭＲｃ５デジタルカメラを用いて撮影した（Ｈｅｗｅｚｉら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，２０（１１）：３０８０−３０９３（２００８））。次いで、デジタルファイルをＺｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎソフトウェアを用いて加工した。撮影したＧＦＰフォーカスの各々をＩｍａｇｅＪ測定ツール（ＮＩＨ）を用いて加工し、Ｓｔｅｍｉ  ＳＶ１１からの元の画像の正しいスケーリングに対して補正した。ＧＦＰフォーカスの全面積をｍｍ２として計算した。各系統のＧＦＰフォーカスの個々の測定値を用いて試験した系統毎に平均フォーカスサイズを計算した。系統間のサイズの有意差をスチューデントのｔ検定（Ｐ＜０．０１または０．０５）により調べた。
【０１７０】
ＱＱＳ及びＮＦ−ＹＣ４の異なる遺伝的背景を有するシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎ）植物にＴｕＭＶ−ＧＦＰを接種した。接種から５日目にＧＦＰフォーカス（数はＴｕＭＶの感染プロセスを開始させる能力を示す）をカウントし、ＧＦＰフォーカスのサイズ（サイズはＴｕＭＶの植物内での増殖能力を示す）を測定した。変化したＱＱＳ発現及びＱＱＳインタラクタＮＦ−ＹＣ４の変化した発現を有するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）Ｃｏｌ−０系統をすべての感染アッセイで使用した。使用した系統は、ＡｔＱＱＳ  ＲＮＡｉ（ＱＱＳをダウンレギュレートする）、ＡｔＱＱＳ  ＯＥ（ＱＱＳを過剰発現する）及びＡｔＮＦ−ＹＣ４  ＯＥ（ＮＦ−ＹＣ４を過剰発現する）に対してＣｏｌ−０（幾つかのトライコーム，形質転換体に対する対照）、及びＡｔＱＱＳ  ＫＯ及びＡｔＮＦ−ＹＣ４  ＫＯに対してＣｏｌ−０（トライコーム，Ｔ−ＤＮＡノックアウト（ＫＯ）変異体に対する対照）であった。
【０１７１】
図１０Ａ（変異体対対照の１０個のアラビドプシス植物あたりの平均フォーカス数についてのグラフ（ウイルス接種から１２０時間後（ｈａｉ）の±標準誤差；対照及びＱＱＳまたはＮＦ−ＹＣ４変異体中のフォーカス数を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１）、及び図１０Ｂ（変異体対対照の平均フォーカスサイズ（ｍｍ２）についてのグラフ（ウイルス接種から１２０ｈａｉの±標準誤差（ｎ＝４０）；対照及びＱＱＳまたはＮＦ−ＹＣ４変異体中のフォーカス数を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した；＊＊＊Ｐ＜０．００１）に示すように、ＡｔＮＦ−ＹＣ４  ＯＥ植物は対照よりも有意に少ない、約８８％少ないＧＦＰフォーカス数を有していた。対照的に、ＡｔＮＦ−ＹＣ４  ＫＯ植物は対照よりも僅かに多い、約１６．５％多いフォーカス数を有していた；小さいが、スチューデントのｔ検定は差が有意であったことを示唆した。同様に、ＡｔＱＱＳ  ＯＥ植物は対照植物に比して２１．７％少ないフォーカスを有したのに対して、ＡｔＱＱＳ  ＲＮＡｉ植物は対照植物よりも１２．２％多いフォーカスを有し、ＡｔＱＱＳ  ＫＯ植物は対照よりも４５．９％多いフォーカスを有していた。これらの結果は、ＡｔＱＱＳまたはＡｔＮＦ−ＹＣ４を過剰発現するとウイルス感染開始が損なわれ、ＡｔＱＱＳまたはＡｔＮＦ−ＹＣ４をサイレンシングまたはノックアウトするとウイルス感染開始が促進されたことを示した。ＹＣ４過剰発現はウイルス感染を殆ど阻止した。
【０１７２】
フォーカスサイズの変化は類似の傾向を有していた。ＡｔＮＦ−ＹＣ４  ＫＯ、ＡｔＱＱＳ  ＫＯ及びＡｔＱＱＳサイレンシングした植物中のフォーカスはそれぞれ対照よりも２７．８％、５２．５％及び５１．９％大きく、ＡｔＮＦ−ＹＣ４  ＯＥ及びＡｔＱＱＳ  ＯＥ植物中のフォーカスはそれぞれ対照よりも５１％及び３２％小さかった。
【０１７３】
これらの結果は、ＡｔＮＦ−ＹＣ４またはＡｔＱＱＳを過剰発現するとウイルス増殖が損なわれ、ＡｔＮＦ−ＹＣ４またはＡｔＱＱＳをサイレンシングまたはノックアウトするとウイルス増殖が促進されることを示した。アッセイは、ＱＱＳ及びそのインステラクタのＮＦ−ＹＣ４が感染開始を遅らし、植物内でのウイルス増殖を低下させることを示している。よって、各々の過剰発現はウイルスに対する植物抵抗性を増加させるので、これらは植物免疫応答の正調節因子である。
【０１７４】
［実施例２２］
本実施例は、ＮＦ−ＹＣ４またはＱＱＳを過剰発現するトランスジェニックシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎ）植物では細菌増殖が減少したことを立証する。
【０１７５】
シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎ）植物を生育チャンバにおいて明期１０時間及び暗期１４時間、２２℃で４〜５週間生育させた。シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）を洗浄し、接種緩衝液（１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．０５％  Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７）中に再懸濁した。植物に１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬに調節した細菌レベルで細菌接種材料をスプレーした（Ｋａｔａｇｉｒｉら，Ｔｈｅ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ−Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｂｏｏｋ／Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔｓ，１，ｅ００３９．ｈｔｔｐ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１９９／ｔａｂ．００３９（２００２））。葉ディスクをコルクボーラー（内径０．５ｃｍ）を用いて切断し、５００μｌの接種緩衝液中に完全にホモジナイジングすることにより植物内での細菌レベルを測定した。生じた細菌を含有する懸濁液を希釈し、適切な抗生物質を含むＫＢプレートで平板培養した。
【０１７６】
実施例２１にリストされているシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎ）植物の同一組においてＰｓｔ  ＤＣ３０００及びＡＣＥＬ株の植物内での細菌増殖を試験した。Ｐｓｔ  ＤＣ３０００はシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎ）植物を確実に感染させる細菌性病原体であり、一方複数のエフェクター遺伝子に変異を有する変異Ｐｓｔ  ＤＣ３０００株であるΔＣＥＬは植物内でゆっくり増殖する非毒性株である。Ｐｓｔ  ＤＣ３０００は４日で約１，０００倍増殖するのに対して、ΔＣＥＬは約１０倍しか増殖しない。ＡｔＮＦ−ＹＣ４またはＡｔＱＱＳを過剰発現する植物では、Ｐｓｔ  ＤＣ３０００の増殖はそれぞれ８８％及び６３％の減少で大きく損なわれた。対照的に、ＡｔＱＱＳまたはＡｔＮＦ−ＹＣ４  ＲＮＡｉ及びＫＯ系統では、Ｐｓｔ  ＤＣ３０００の増殖が約３０％増加した。ＡｔＱＱＳ  ＲＮＡｉ植物でのＰｓｔ  ＤＣ３０００の高い増殖は非常に有意であったのに対して、ＡｔＱＱＳまたはＡｔＮＦ−ＹＣ４  ＫＯ系統ではｐ＝０．０５のレベルで有意でなかった。
【０１７７】
一方、ＡｔＱＱＳまたはＡｔＮＦ−ＹＣ４  ＲＮＡｉまたはＫＯ系統でのΔＣＥＬの増殖は約２．６倍の増加で強く強化されたことはかなり自明であった。ΔＣＥＬの増殖変化はＡｔＱＱＳまたはＡｔＮＦ−ＹＣ４過剰発現植物では同様に有意でなかった。概して、異なる遺伝的背景を有するシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎ）植物における両方の細菌株の変化した増殖に関するデーターは、ＡｔＮＦ−ＹＣ４またはＡｔＱＱＳを過剰発現させると植物免疫応答が強化されて、確実に感染性の細菌性病原体の毒性は弱くなり、ゆっくり増殖するのに対して、ＡｔＮＦ−ＹＣ４またはＡｔＱＱＳをサイレンシングまたはノックアウトすると植物免疫応答が損なわれて、非毒性細菌性病原体はうまく増殖する。よって、これらのデータは一貫して、ＡｔＮＦ−ＹＣ４及びＡｔＱＱＳが植物免疫応答の正調節因子であることを示唆している。
【０１７８】
結果を図１１に要約する。図１１は、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物に接種してから０日目（０ｄｐｉ）及び４日目（４ｄｐｉ）のＰｓｔ  ＤＣ３０００及びΔＣＥＬ対細菌数（ｌｏｇ１０（ＣＦＵ／ｃｍ２））のグラフである。初期接種材料を１０８ＣＦＵ／ｍＬに均一に調節した。エラーバーは標準誤差を示す。対照及びＱＱＳまたはＮＦ−ＹＣ４変異体中の細菌数を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊＊Ｐ＜０．０１。＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【０１７９】
［実施例２３］
本実施例は、ＮＦ−ＹＣ４を過剰発現する、またはＱＱＳを発現するトランスジェニックダイズ植物では細菌増殖が低下したことを立証する。
【０１８０】
ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）由来のＮＦ−ＹＣ４  ＣＤＳ（ＧｍＮＦ−ＹＣ４）を、Ｂａｒ遺伝子（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を含むベクターｐＢ２ＧＷ７にタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）由来のノパリンシンターゼ由来のＰｎｏｓ（ｎｏｓプロモーター）及びＴｎｏｓ（ｎｏｓターミネーター）の制御下で挿入した（ベクターのマップである図１Ｃを参照されたい）。このベクター上のＧｍＮＦ−ＹＣ４をｐ３５Ｓ（カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター）によりコントロールし、Ｔ３５Ｓ（ＣａＭＶ  ３５Ｓ）により終止させた。ＬＢとＲＢ間の領域のみを植物に導入して、トランスジェニック植物を作成した。
【０１８１】
ＡｔＱＱＳを発現する安定なトランスジェニックダイズ系統（ＡｔＱＱＳ  Ｅ；実施例１、及びベクターＱＱＳ−ＯＥ−ｐＢ２ＧＷ７のマップについては図１Ａを参照されたい）、またはＧｍＮＦ−ＹＣ４を過剰発現する安定なトランスジェニックダイズ系統（Ｇｌｙｍａ０６ｇｌ７７８０；ＧｍＮＦ−ＹＣ４  ＯＥ）を作成し、生育チャンバにおいて明期１４時間及び暗期１０時間、２２℃で生育させた。葉ＤＮＡをＰＣＲスクリーニングすることによりＱＱＳ  Ｅのダイズ変異体植物、ＧｍＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ及び空ベクター対照を選択した。２３日齢ダイズの第１の三出葉を接種のために使用した。新しく培養したシュードモナス・サバスタニ病原型グリシネ（Ｐ．ｓａｖａｓｔａｎｏｉ  ｐｖ．ｇｌｙｃｉｎｅａ）Ｒａｃｅ  ４（ＰｓｇＲ４）を接種緩衝液（実施例２２を参照されたい）中におおよそ１０７ＣＦＵ／ｍＬの最終濃度まで懸濁した。各三出葉の小葉を針で刺した後、５μＬの接種材料を各傷上に置いた（１０／小葉）。接種から１０日目に植物内での細菌レベルを上記したように測定した。
【０１８２】
Ｐｓｇは、ダイズにダイズ生産に対する大きな恐怖と見なされる斑点細菌病を引き起こす。ＰｓｇＲ４は殆どすべての商業的ダイズ品種に感染し得るので、これは最も毒性の株の１つである。対照として空ベクターを有するダイズ系統を用いると、ダイズＧｍＮＦ−ＹＣ４  ＯＥ系統及びダイズＡｔＱＱＳ−Ｅ系統ではＰｓｇＲ４は非常にゆっくり、それぞれ６２．４％及び５５．３％少なく増殖する。ＧｍＮＦ−ＹＣ４を過剰発現する、またはＡｔＱＱＳを発現するダイズ系統におけるＰｓｇＲ４の損なわれた細菌増殖はＧｍＮＦ−ＹＣ４及びＡｔＱＱＳがダイズ免疫応答を強化することを示し、これはＮＦ−ＹＣ４及びＱＱＳが植物免疫応答の正調節因子であるという上記データと一致する。
【０１８３】
結果を図１２Ａに要約する。図１２Ａは、ダイズ系統の細菌数（ＣＦＵ＊１０４／ｃｍ２）についてのグラフである。初期接種材料を１０７ＣＦＵ／ｍＬに均一に調節した。エラーバーは標準誤差を示す。対照及びＱＱＳ−ＥまたはＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ変異体間中の細菌数を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊＊Ｐ＜０．０１。（ＥＶ＝空ベクター）
【０１８４】
ＧｍＮＦ−ＹＣ４がトランスジェニックダイズ系統において過剰発現したことを確認するために、ＧｍＮＦ−ＹＣ４の発現レベルを定量リアルタイムＰＣＲを用いて調べた。約１００ｍｇのダイズ葉を製造業者の説明書に従ってＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いるＲＮＡ単離のために使用した。ｃＤＮＡ合成のために２μｇのＲＮＡ及びＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（Ｒ）ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）をｃＤＮＡ及び遺伝子特異的プライマー（ＧｍＮＦ−ＹＣ４Ｆｄ：
【０１８５】
【化１５】
0006785235.tif 000017
［配列番号１８］、及びＧｍＮＦ−ＹＣ４Ｒｅｖ：
【０１８６】
【化１６】
0006785235.tif 000018
［配列番号１９］を用いて実施した。各ｃＤＮＡをｉＱ（ＴＭ）ＳＹＢＲ（Ｒ）  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）及びｉＣｙｃｌｅｒリアルタイムＰＣＲシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて定量ＰＣＲにより増幅させた。ＧｍＡＣＴＩＮ発現を各サンプル中の発現値を正規化するために使用し、相対発現値をモックサンプルに対して比較Ｃｔ方法（２−ΔΔＣｔ）を用いて測定した。
【０１８７】
ＧｍＡＣＴＩＮ（Ｇｌｙｍａ  １５ｇ０５０２００）を参照遺伝子として使用した（Ｌｉｕら，Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ．，２７（８）：８２４−８３４（２０１４））。ＧｍＮＦ−ＹＣ４  ＯＥ系統におけるＧｍＮＦ−ＹＣ４の発現レベルはダイズ対照系統における発現よりも４．４７倍高かった。
【０１８８】
結果を図１２Ｂに要約する。図１２Ｂは、ＮＦ−ＹＣ４−ＯＥダイズ系統の相対発現レベルについてのグラフである。エラーバーは標準誤差を示す。＊＊Ｐ＜０．０１。（ＥＶ＝空ベクター）。
【０１８９】
［実施例２４］
本実施例は、ＮＦ−ＹＣ４を過剰発現する、またはＱＱＳを発現するトランスジェニックダイズ植物ではアブラムシが減少したことを立証する。
【０１９０】
トランスジェニックダイズ植物を実施例２３に記載されているように作成した。ダイズ種子を２５℃、明期１６時間及び暗期８時間の光周期で栽植した。栽植から１８日後に植物を感染させた。感染から７日後、植物あたりのアブラムシの平均数を調べた。結果を図１３に示す。
【０１９１】
図１３は、ダイズ遺伝子型ＱＱＳ−Ｅ  １６−６（ＱＱＳを発現する系統１６−６）、ＱＱＳ−Ｅ  ３２−６（ＱＱＳを発現する系統３２−６）、対照、ＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ  ＬＩ（ＮＦ−ＹＣ４を過剰発現する系統１）、及びＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ  Ｌ２（ＮＦ−ＹＣ４を過剰発現する系統２）対植物あたりのアブラムシの平均数のグラフである。エラーバーは標準誤差を示す。対照及びＱＱＳ−ＥまたはＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ変異体中のアブラムシ数を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５。＊＊Ｐ＜０．０１。（ＥＶ＝空ベクター）。示すように、ＱＱＳを発現する、またはＮＦ−ＹＣ４を過剰発現するダイズ植物では、植物あたりのアブラムシの平均数は対照と比較して約２０％〜約３０％減少した。
【０１９２】
［実施例２５］
本実施例は、ＮＦ−ＹＣ４を過剰発現するトランスジェニックダイズ植物の種子中のタンパク質またはタンパク質＋油含有量が増加したことを立証する。
【０１９３】
ＮＦ−ＹＣ４を過剰発現するトランスジェニックダイズ植物（ウイリアムズ８２）を実施例２３に記載されているように作成し、圃場で生育させた。Ｔ２種子を実施例２に記載されているようにＮＩＲＳを用いて分析した。データを図１４Ａ〜１４Ｅに示す。
【０１９４】
図１４Ａは、同胞対照と比較した、ＮＦ−ＹＣ４を過剰発現する形質転換ダイズ（ＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ）の形質転換事象（１、２、３及び４；各数字は異なる形質転換事象を示す）対タンパク質含有量のグラフである。エラーバーは標準誤差を示す。ＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ変異体及び同胞対照中のタンパク質含有量を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５。＊＊Ｐ＜０．０１。示すように、ＮＦ−ＹＣ４を過剰発現するダイズ植物では、タンパク質は対照と比較して約６％〜約１２％増加した。
【０１９５】
図１４Ｂは、同胞対照と比較した、ＮＦ−ＹＣ４を過剰発現する形質転換ダイズ（ＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ）の形質転換事象（１、２、３及び４；各数字は異なる形質転換事象を示す）対油含有量のグラフである。エラーバーは標準誤差を示す。ＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ変異体及び同胞対照中の油含有量を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５。示すように、ＮＦ−ＹＣ４を過剰発現するダイズ植物中の油は対照と比較して類似しているか、または減少した。
【０１９６】
図１４Ｃは、同胞対照と比較した、ＮＦ−ＹＣ４を過剰発現する形質転換ダイズ（ＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ）の形質転換事象（１、２、３及び４；各数字は異なる形質転換事象を示す）対タンパク質＋油含有量のグラフである。エラーバーは標準誤差を示す。ＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ変異体及び同胞対照中のタンパク質＋油含有量を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５。＊＊Ｐ＜０．０１。示すように、ＮＦ−ＹＣ４を過剰発現するダイズ植物中のタンパク質＋油含有量は対照と比較して約５％〜約７％増加した。
【０１９７】
図１４Ｄは、同胞対照と比較した、ＮＦ−ＹＣ４を過剰発現する形質転換ダイズ（ＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ）の形質転換事象（１、２、３及び４；各数字は異なる形質転換事象を示す）対種子繊維（％／１３％の水分を有する新鮮重量）のグラフである。エラーバーは標準誤差を示す。ＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ変異体及び同胞対照中の繊維含有量を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊＊Ｐ＜０．０１。示すように、ＮＦ−ＹＣ４を過剰発現するダイズ植物中の種子繊維は対照と比較して約３．４％〜約５．６％減少した。
【０１９８】
図１４Ｅは、同胞対照と比較した、ＮＦ−ＹＣ４を過剰発現する形質転換ダイズ（ＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ）の形質転換事象（１、２、３及び４；各数字は異なる形質転換事象を示す）対種子重量／植物（グラム／植物）のグラフである。エラーバーは標準誤差を示す。ＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ変異体及び同胞対照中の種子重量／植物を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した。示すように、ＮＦ−ＹＣ４を過剰発現するダイズ植物における種子重量／植物は対照に類似していた。
【０１９９】
［実施例２６］
本実施例は、ＮＦ−ＹＣ４を過剰発現するトランスジェニックトウモロコシ植物の種子中のタンパク質含有量が増加したことを立証する。
【０２００】
ＮＦ−ＹＣ４を過剰発現するトランスジェニックトウモロコシ植物を作成し、圃場で生育させた。実施例１からの構築物をアグロバクテリウム媒介形質転換によりトウモロコシに導入した。戻し交雑種２（ＢＣ２；Ｂ１０４へのＢ１０４背景戻し交雑種）種子を実施例２に記載されているようにＮＩＲＳを用いて分析した。データを図１５Ａ〜１５Ｃに示す。
【０２０１】
図１５Ａは、同胞対照と比較した、アラビドプシスＮＦ−ＹＣ４を過剰発現する形質転換トウモロコシ（ＡｔＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ）対核タンパク質（乾燥重量％）のグラフである。エラーバーは標準誤差を示す。ＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ変異体及び同胞対照中のタンパク質含有量を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊＊Ｐ＜０．０１。示すように、核タンパク質は対照と比較して約１７％増加した。
【０２０２】
図１５Ｂは、同胞対照と比較した、アラビドプシスＮＦ−ＹＣ４を過剰発現する形質転換トウモロコシ（ＡｔＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ）対核油（乾燥重量％）のグラフである。エラーバーは標準誤差を示す。ＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ変異体及び同胞対照中の油含有量を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した。示すように、核油は対照に類似していた。
【０２０３】
図１５Ｃは、同胞対照と比較した、アラビドプシスＮＦ−ＹＣ４を過剰発現する形質転換トウモロコシ（ＡｔＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ）対核デンプン（乾燥重量％）のグラフである。エラーバーは標準誤差を示す。ＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ変異体及び同胞対照中のデンプン含有量を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊＊Ｐ＜０．０１。示すように、核デンプンは対照と比較して約２．２％減少した。
【０２０４】
［実施例２７］
本実施例は、ＮＦ−ＹＣ４を過剰発現するトランスジェニックイネ植物の種子中のタンパク質含有量が増加したことを立証する。
【０２０５】
ＮＦ−ＹＣ４を過剰発現するトランスジェニックイネ植物を作成し、生育チャンバにおいて生育させた。実施例１７からの構築物（ｐＢ２ＧＷ７−ＯｓＮＦ−ＹＣ４）をアグロバクテリウム媒介形質転換によりイネに導入した。データを図１６Ａ及び１６Ｂに示す。
【０２０６】
図１６Ａは、野生型と比較した、イネＮＦ−ＹＣ４を過剰発現する形質転換イネ（ＯｓＮＦ−ＹＣ４−１−ＯＥ）対種子デンプン（ｍｇ／ｇ乾燥重量）のグラフである。エラーバーは標準誤差を示す。ＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ変異体及び対照中の種子デンプン含有量を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊＊Ｐ＜０．０１。示すように、種子デンプンは約６％減少した。
【０２０７】
図１６Ｂは、野生型と比較した、イネＮＦ−ＹＣ４を過剰発現する形質転換イネ（ＯｓＮＦ−ＹＣ４−１−ＯＥ）対種子タンパク質（ｍｇ／ｇ乾燥重量）のグラフである。エラーバーは標準誤差を示す。ＮＦ−ＹＣ４−ＯＥ変異体及び対照中の種子タンパク質含有量を比較するためにスチューデントのｔ検定を使用した。＊＊Ｐ＜０．０１。示すように、種子タンパク質は約３７％増加した。
【０２０８】
明細書中に挙げられているすべての特許明細書、特許出願公開明細書、雑誌論文、教科書及び他の刊行物は開示内容に関わる当業者のレベルを示している。前記刊行物のすべては、各刊行物が具体的かつ個別に参照により組み入れられると示されているのと同程度に参照により本明細書に組み入れられる。
【０２０９】
本明細書中に例示的に説明した本発明は、本明細書中に具体的に開示されていない要素または限定なしで適当に実施され得る。よって、例えば、用語「からなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「本質的に構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」及び「構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は他の２つの用語のいずれかと置換され得る。同様に、単数形“ａ”、“ａｎ”及び“ｔｈｅ”は、文脈上他の意味であることが明白な場合を除き複数形を含む。よって、例えば、「方法」に対する言及は、本明細書中に記載されている及び／または開示内容を読んだとき当業者に明白となるであろうタイプの１つ以上の方法及び／またはステップを含む。
【０２１０】
使用されてきた用語及び表現は非限定的説明の用語として使用されている。これに関連して、ある用語が「定義」のもとで定義されており、さもなければ「詳細説明」中の他のところで定義、記載または検討されている場合、これらの定義、記載及び検討のすべてが該用語に帰すると意図される。前記用語及び表現の使用において示され、記載されている要件、またはその一部の均等物を排除するとも意図されない。更に、小見出し、例えば「定義」が「詳細説明」中で使用されているが、その使用は単に参照を容易にするためであり、１つのセクションでなされている開示内容をそのセクションのみに限定すると意図されない；むしろ、１つの小見出しでなされている開示内容はありとあらゆる他の小見出しでなされている開示内容を構成すると意図される。
【０２１１】
各種変更が特許請求の範囲の範囲内で可能であると認識されている。よって、本発明を好ましい実施形態及び任意の要件の関連で具体的に開示してきたが、当業者は本明細書中に開示されている概念の変更及び改変を用い得ることを理解されるべきである。前記変更及び改変は本明細書で特許請求されている発明の範囲内であると見なされる。
【図１Ａ】
0006785235.tif 000019
【図１Ｂ】
0006785235.tif 000020
【図１Ｃ】
0006785235.tif 000021
【図１Ｄ】
0006785235.tif 000022
【図１Ｅ】
0006785235.tif 000023
【図２Ａ】
0006785235.tif 000024
【図２Ｂ】
0006785235.tif 000025
【図２Ｃ】
0006785235.tif 000026
【図２Ｄ】
0006785235.tif 000027
【図２Ｅ】
0006785235.tif 000028
【図２Ｆ】
0006785235.tif 000029
【図３−１】
0006785235.tif 000030
【図３−２】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【配列表】
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