(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
退行性骨格筋疾患の治療に使用するためのカンナビジオール（ＣＢＤ）を含む組成物。
【請求項２】
前記退行性骨格筋疾患がデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ＣＢＤの用量が１日当たり１〜１０００ｍｇ／ｋｇである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
１つまたは複数の賦形剤を更に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、退行性骨格筋疾患の治療におけるカンナビノイドの使用に関する。具体的には、退行性骨格筋疾患はデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）である。
【０００２】
好ましくは、カンナビノイドは、カンナビジオール（ＣＢＤ）、カンナビジバリン（ＣＢＤＶ）、およびテトラヒドロカンナビバリン（ＴＨＣＶ）のうちの１つまたは複数である。
【背景技術】
【０００３】
骨格筋形成は、筋芽細胞を増殖して筋管に分化させる多数の遺伝子の発現における協調的変化を必要とする厳密に調節された過程である（Ｓｈｉｅｈ，２０１３）。この過程は様々なミオパシー、とりわけデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）に変化し、骨格筋前駆細胞（衛星）の再生能力が失われる。成熟した機能的な筋管へのこれらの分化能力の低下は、慢性変性による進行性筋力低下を引き起こす。
【０００４】
内在性カンナビノイド系によって生じる多数の機能が存在するが、骨格筋細胞再生および分化におけるその機能についてはほとんど知られていない。最近、内在性カンナビノイド２−ＡＧが、ＣＢ１依存性の機序を介してマウスおよびヒトの筋芽細胞の分化を阻害することが分かった（Ｉａｎｎｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）。
【０００５】
骨格筋の発達は、高度に制御された多因子過程であり、この過程は、細胞周期から離れて筋芽細胞の増殖を引き起こし、続いて融合して大きい多核化筋芽細胞の秩序配列になり、更に成熟筋線維に分化する多数の遺伝子の協調的調節を伴う（Ｉａｎｎｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。
【０００６】
様々なクラスのイオンチャンネルの発現および機能的活性化の変化が筋芽細胞から筋管への移行と関係していると思われる（Ｃｏｏｐｅｒ，２００１）。
【０００７】
マウスＣ２Ｃ１２細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏの骨格筋形成の実験モデルに使用することができ、この方法を使用して骨格筋細胞分化過程に与える化合物の潜在的効果を判定することができる。
【０００８】
ヒト衛星細胞を使用する更なるモデルもまた、細胞分化を検討するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験として使用することができる。衛星細胞は、分化した骨格筋細胞をもたらすことができる骨格筋細胞の前駆体である。活性化すると衛星細胞は再び細胞周期に入って増殖し、筋芽細胞に分化することができる。
【０００９】
筋細胞は、筋組織中に見出される細胞の種類である。これらは、筋形成として知られている過程において筋芽細胞から発達して筋を形成する長い管状の細胞である。様々な特性を有する様々な特殊な形態の筋芽細胞、すなわち心臓細胞、骨格細胞、および平滑筋細胞が存在する。
【００１０】
幾つかの異なる型の退行性骨格筋疾患が存在し、そのうちでデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）が非常に一般的である。他の型の退行性骨格筋疾患には、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、先天性筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィー、エメリ・ドレヒュス型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、筋緊張性ジストロフィー、および眼咽頭筋ジストロフィーが挙げられる。
【００１１】
ＤＭＤは、一般には男児のみに発症し（ごく稀な例外を除く）、小児が歩き始めるときに臨床的に明確になる。１０歳までにその小児は歩行のためにブレースを必要とする可能性があり、１２歳までに大部分の患者は歩くことができなくなる。
【００１２】
ＤＭＤ患者の寿命は１５〜５１歳の範囲にある。１９９０年代初頭、研究者は、それが存在しない場合にＤＭＤを引き起こす、タンパク質ジストロフィンの遺伝子を同定した。ジストロフィンの量がこの疾患の重症度と相関する（すなわち、存在するジストロフィンの量が少ないほど表現型は重症である）。
【００１３】
この遺伝子はＸ染色体上に存在するため、この障害は主に男性で発症し、およびキャリアである女性はより軽い症状を呈する。この遺伝子の散発性の突然変異はしばしば起こり、症例の三分の一を占める。症例の残りの三分の二は劣性様式で遺伝的に受け継がれる。
【００１４】
ジストロフィンは、幾つかの他のタンパク質成分と関係する複雑な構造体の一部である。「ジストロフィン−糖タンパク質複合体」は、各細胞の外膜（筋鞘）を貫通して、各細胞を取り囲む組織の外郭構造（細胞外マトリックス）に筋細胞内の構造躯体（細胞骨格）を固定することを促進する。この集合体の欠陥が原因で、筋肉の収縮が筋細胞の外膜の断裂と、結果としての筋力低下および筋消耗とを引き起こす。
【００１５】
糖質コルチコイド、より正確にはプレドニゾンおよびデフラザコートがＤＭＤの主な薬物治療である。これらは２０年超にわたって使用されており、筋力の増加が示されている唯一の薬物療法である。
【００１６】
糖質コルチコイドは、抗炎症剤かつ免疫抑制剤であるため、これらの化合物の長期間の使用は多くの有害な副作用をもたらす可能性がある。免疫抑制は、糖質コルチコイドの長期使用者にとって大きい問題であり、これは患者の免疫系が機能しにくくなって患者を重篤な感染症に罹りやすくすることを意味し得る。加えて、創傷の治癒は一定量の炎症を必要とし、これが糖質コルチコイド療法中に遅れる可能性がある。
【００１７】
糖質コルチコイドは血糖も上昇させ、次にそれが糖尿病を発症させる可能性がある。カルシウム吸収が抑制され、骨粗鬆症が起こることがある。また、長期の糖質コルチコイド療法により筋の委縮が起こる可能性もある。
【００１８】
ＤＭＤなどの退行性骨格筋疾患を治療するには、衛星細胞の筋芽細胞への分化および筋芽細胞の筋管への分化を可能にする薬物療法が重要である。ＣＢ１活性化はまた、筋芽細胞の増殖、したがってまた内在性カンナビノイドを刺激することが知られている。それは、この内在性カンナビノイドが「いつ」および「どこで」作用し、細胞周期および細胞可塑性に影響を及ぼすことにより筋肉の形成を阻害しかつ刺激し得るかによって決まる。
【００１９】
植物性カンナビノイドは、ＣＢ１受容体に直接的または間接的に作用して、その活性化の影響を弱めることができる。植物性カンナビノイドはまた炎症反応、例えばＤＭＤで起こる炎症反応を弱めることができる。これらの炎症反応は、正常に機能しない筋分化の結果を著しく悪化させ、したがってＤＭＤ患者の平均余命を減少させる。加えて、植物性カンナビノイドは、内在性カンナビノイドの不活性化を阻害する可能性がある。
【００２０】
植物性カンナビノイド、具体的には植物性カンナビノイドであるＣＢＤおよびＣＢＤＶは、衛星細胞の筋芽細胞への分化および筋芽細胞の筋管への分化を可能にする点で効果的である。それらの化合物はＣＢ１活性化合物ではないため、これは驚くべきことである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明の第１の態様によれば、退行性骨格筋疾患の治療に使用するための、植物性カンナビノイドであるカンナビジオール（ＣＢＤ）、カンナビジバリン（ＣＢＤＶ）、およびテトラヒドロカンナビバリン（ＴＨＣＶ）のうちの１つまたはそれらの組合せが提供される。
【００２２】
一実施形態では、その植物性カンナビノイドはＣＢＤである。
【００２３】
更なる実施形態では、その植物性カンナビノイドはＣＢＤＶである。
【００２４】
代替の実施形態では、その植物性カンナビノイドはＴＨＣＶである。
【００２５】
更なる実施形態では、その植物性カンナビノイドは更に、ＴＨＣＶ、およびＣＢＤ、および／またはＣＢＤＶの組合せである。
【００２６】
好ましくは、退行性骨格筋疾患はデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）である。
【００２７】
好ましくは、植物性カンナビノイドの用量は１日当たり１〜１０００ｍｇ／ｋｇである。
【００２８】
更なる実施形態では、植物性カンナビノイドであるカンナビジオール（ＣＢＤ）、カンナビジバリン（ＣＢＤＶ）、およびテトラヒドロカンナビバリン（ＴＨＣＶ）のうちの１つまたはそれらの組合せと、１つまたは複数の賦形剤とを含む医薬製剤が提供される。
【００２９】
本発明の第２の態様によれば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）に罹患している患者を治療する方法が提供され、この方法は、植物性カンナビノイドであるカンナビジオール（ＣＢＤ）、カンナビジバリン（ＣＢＤＶ）、およびテトラヒドロカンナビバリン（ＴＨＣＶ）のうちの１つまたはそれらの組合せを、それを必要とする患者に投与することを含む。
【００３０】
本発明の実施形態を、添付図面を参照して以下で更に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】Ｃ２Ｃ１２細胞分化に与える１および３μＭのＣＢＤＡ、ＣＢＧ、およびＴＨＣＶの効果を示す。
【図２】Ｃ２Ｃ１２細胞分化に与える１および３μＭのＣＢＤおよびＣＢＤＶの効果を示す。
【図３】Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞をＣＢＤに短期間暴露する効果を示す。
【図４】衛星細胞分化に与えるＣＢＤ、ＣＢＤＶ、およびＴＨＣＶの効果を示す。
【図５】ＣＢＤ、ＣＢＤＶ、およびＴＨＣＶで４日間処理した衛星細胞の代表的な位相コントラスト画像を示す。
【図６】ＣＢＤ、ＣＢＤＶ、およびＴＨＣＶで４日間処理した衛星細胞の代表的な位相コントラスト画像を示す。
【図７】１６週間後のＭＤＸマウスの体質量の変化を示す。
【図８】リアルタイムＰＣＲによるＤＭＤ遺伝子マーカーの発現を示す。
【図９】ＣＤ８炎症細胞の数を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
図の説明文を下記でより詳細に説明する。
【００３３】
図１：Ｃ２Ｃ１２細胞を表示濃度のＤＭ＋ＣＢＤＡ（Ａ）、ＣＢＧ（Ｂ）、またはＴＨＣＶ（Ｃ）に２４時間暴露した後、ミオゲニン（Ｍｙｏｇ）およびトロポニン（Ｔｎｎｔ−１）ｍＲＮＡの発現レベルをｑＰＣＲによって定量化した。各バーは、少なくとも４回の別々の実験の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。＊は、それぞれのビヒクルグループ（白色のカラム）に対するｐ≦０．０５である。
【００３４】
図２：Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を表示濃度のＤＭ＋ＣＢＤ（Ａ）およびＣＢＤＶ（Ｂ）に２４時間暴露した後、ミオゲニン（Ｍｙｏｇ）およびトロポニン（Ｔｎｎｔ−１）ｍＲＮＡの発現レベルをｑＰＣＲによって定量化した。各バーは、少なくとも４回の別々の実験の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。＊は、それぞれのビヒクルグループ（白色のカラム）に対するｐ≦０．０５である。（Ｃ）１μＭのＣＢＤで処理したＣ２Ｃ１２細胞を分化させたときのＭｙＨＣタンパク質レベルのウェスタンブロット分析。ＭｙＨＣタンパク質のおよその分子質量（ＫＤａで表した）を示す代表的なブロット（上部）、およびαチューブリンのＯＤ値に正規化されたＭｙＨＣの平均ＯＤ値の数量化（下部）である。＊は、それぞれのビヒクルグループ（ＧＭ）に対するｐ≦０．０５である。各データポイントは、少なくとも４回の独立した測定に基づく。
【００３５】
図３：ＤＭ＋１μＭ  ＣＢＤに１０分間暴露した筋芽細胞におけるミオゲニン（Ｍｙｏｇ）およびトロポニン（Ｔｎｎｔ−１）ｍＲＮＡの発現レベルを定量化し、次いでＣＢＤなしのＤＭ中で続いて３時間および２４時間保持した。
【００３６】
図４：衛星細胞分化に与えるＣＢＤ、ＣＢＤＶ、およびＴＨＣＶの効果。ＳＣをＤＭ＋ＣＢＤ（淡い灰色のカラム）、ＣＢＤＶ（濃い灰色のカラム）、およびＴＨＣＶ（白色のカラム）に５日間暴露した後、ミオゲニン（Ｍｙｏｇ）、トロポニン（Ｔｎｎｔ−１）、およびミオシン重鎖（ＭｙＨＣ）ｍＲＮＡの発現レベルをｑＰＣＲによって定量化した。各バーは、少なくとも４回の別々の実験の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。＊は、それぞれのビヒクルグループ（白色のカラム）に対するｐ≦０．０５である。
【００３７】
図５：ＣＢＤ（１μＭ）、ＣＢＤＶ（３μＭ）、およびＴＨＣＶ（３μＭ）で処理した衛星細胞の代表的な位相コントラスト画像。細胞を植物性カンナビノイドの存在下または不在下でＤＭに４日間暴露した画像が撮影された。
【００３８】
図６：ＣＢＤ（１μＭ）、ＣＢＤＶ（３μＭ）、およびＴＨＣＶ（３μＭ）で処理した衛星細胞の代表的な位相コントラスト画像。細胞を植物性カンナビノイドの存在下または不在下でＤＭに５日間暴露した画像が撮影された。
【００３９】
図７：４週間後、ビヒクルのみのコホートの総体質量は、ＣＢＤで処理したｍｄｘマウスより有意に大きく、およびビヒクルとＣＢＤとの両方がＤＦＺで処理したマウスより有意に大きかった（１５週目にビヒクル＝３１．１７ｇ、ＣＢＤ＝２９．４２ｇ、ＤＦＸ＝２６．２６ｇ、５．６％および１５．８％の差、ｐ＜０．０５）。
【００４０】
図８：４週目に腓腹筋を回収し、相対的な遺伝子発現を測定した。（ａ）サーチュイン−１（Ｓｉｒｔ１）は、ＣＢＤコホートのみにおいて有意に上向き調節される（８４．９％、ｎ＝９、ｐ＜０．０５）。（ｂ）ＰＧＣ１ａは、ＣＢＤコホートのみにおいて有意に上向き調節される（１２５．８％、ｎ＝９、ｐ＜０．００１）。（ｃ）ミトコンドリアにコードされたＮＡＤＨ脱水素酵素２（ＭＴ−ＮＤ２）は、ＣＢＤコホートのみにおいて有意に上向き調節される（２５３．２％、ｎ＝４、ｐ＜０．０５）。
【００４１】
図９：４週目に脾臓を回収し、ＣＤ８陽性細胞を分析した。ＣＤ８集団の総比率はＤＦＺによって影響されなかったが、そのＣＤ８集団の総比率は１０．９％（ビヒクル）から８．７％（ＣＢＤ）に有意に減少し、１９．７％の差（ｎ＝９、ｐ＜０．００１）であった。
【００４２】
定義
本発明を説明するために使用される幾つかの用語の定義を下記に詳述する。
【００４３】
本出願において説明されるカンナビノイドを、それらの省略形と共に下記に列挙する。
【００４４】
【表１】
0006655076.tif 000002
【００４５】
上記の表は網羅的ではなく、参照のために本出願において特定されるカンナビノイドを単に詳述するに過ぎない。これまでに６０種類を超える様々なカンナビノイドが同定されており、それらのカンナビノイドは、異なるグループ、すなわち植物性カンナビノイド、内在性カンナビノイド、および合成カンナビノイド（これは新規なカンナビノイド、または合成的に作られた植物性カンナビノイドもしくは内在性カンナビノイドであることができる）に分けることができる。
【００４６】
「植物性カンナビノイド」は、天然由来のカンナビノイドであり、大麻植物中に見出すことができる。植物性カンナビノイドは、植物から単離して高度に精製された抽出物を生成することもでき、または合成的に複製することもできる。
【００４７】
「高度に精製されたカンナビノイド」は、大麻植物から抽出され、かつその高度に精製されたカンナビノイドの純度が９８％（ｗ／ｗ）以上になるようにカンナビノイドと一緒に共抽出される他のカンナビノイドおよび非カンナビノイド成分が除去される程度まで精製されたカンナビノイドと定義される。
【００４８】
「合成カンナビノイド」は、カンナビノイドの構造またはカンナビノイドに類似した構造を有し、かつ植物によるのではなく化学的手段を使用して製造される化合物である。
【００４９】
植物性カンナビノイドは、そのカンナビノイドを抽出するために使用される方法に応じて中性（脱炭酸形態）またはカルボン酸の形態のいずれかとして得ることができる。例えばカルボン酸の形態を加熱することにより、そのカルボン酸の形態の大部分を脱炭酸して中性の形態にすることが知られている。
【００５０】
下記の実施例１は、筋芽細胞分化のマウスモデルにおける植物性カンナビノイドＣＢＤ、ＣＢＤＶ、ＣＢＤＡ、ＴＨＣＶ、およびＣＢＧの使用について述べる。
【００５１】
実施例２は、次にヒト衛星細胞のモデルにおけるＣＢＤ、ＣＢＤＶ、およびＴＨＣＶの使用について述べる。
【００５２】
実施例３は、ＤＭＤの哺乳動物モデルのｉｎ  ｖｉｖｏでの検討におけるＣＢＤの使用について述べる。
【００５３】
本明細書中で提供されるデータは、驚くべきことにＣＢＤＡおよびＣＢＧではなく、植物性カンナビノイドのＣＢＤ、ＣＢＤＶ、およびＴＨＣＶが、ＤＭＤなどの不可逆的な退行性骨格筋疾患を治療する新しい薬理学的機会を与え得ることを実証する。なぜなら、後者はすべて３つの異なるマーカーの分化を刺激し得るからである。
【実施例】
【００５４】
実施例１：マウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞の分化に与える植物性カンナビノイドの効果
材料および方法
細胞培養および試薬
マウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、５０Ｕ／ｍＬのペニシリン＋５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および１％のＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｍｉｌａｎ、Ｉｔａｌｙ）を追加したダルベッコ変法イーグル培地から構成される成長培地（ＧＭ）中で、空気９５％／ＣＯ２５％の加湿雰囲気で３７℃において繁殖させた。
【００５５】
Ｃ２Ｃ１２はマウス筋芽細胞株である。これらの細胞は分化する能力があり、筋芽細胞および骨芽細胞の分化を研究し、様々なタンパク質を発現させ、かつ機構的経路を調べるための有用なツールである。
【００５６】
Ｃ２Ｃ１２細胞を、より低い濃度（１０％から０．１％まで）のＦＢＳ（その上に５μｇ／ｍＬのインスリンおよび５μｇ／ｍＬのトランスフェリンを添加した分化培地（ＤＭ））に２４〜７２時間暴露して増殖させることにより、それらの分化を誘発させて筋管にした。
【００５７】
細胞生存
Ｃ２Ｃ１２細胞を、２４ウェルのプラスチックプレートに密度２×１０３細胞／ｃｍ２で播種した。塗布の１日後、その培養培地にスタチン（単独または植物性カンナビノイドの存在下で）を２４時間加えた。細胞の生存を３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物（ＭＴＴ、５ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）還元アッセイにより評価し、生きている細胞のミトコンドリアによるＭＴＴ還元時のホルマザン塩の形成を分光光度法により５９５ｎｍにおいて検出した。
【００５８】
ウェスタンブロット分析
細胞を冷ＰＢＳ中で２回洗浄し、溶解溶液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１％ＳＤＳ、およびプロテアーゼ阻害剤）で溶解した。ライゼート（５０〜６０μｇ）をレムリＳＤＳローディングバッファー中で５分間煮沸し、８％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離した。フィルターをマウス抗ＭｙＨＣ（１：１０００希釈、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と一緒に４℃で一晩インキュベートした。
【００５９】
抗チューブリン抗体（１：５０００希釈、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して同等のタンパク質量を調べた。反応性バンドを化学発光（ＥＣＬ−ｐｌｕｓ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって検出した。画像をＣｈｅｍｉＤｏｃ装置上でＱｕａｎｔｉｔｙ  ｏｎｅソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｓｅｇｒａｔｅ、Ｉｔａｌｙ）により分析した。
【００６０】
ｍＲＮＡの抽出および定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析
ＴＲＩ−Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｍｉｌａｎ、Ｉｔａｌｙ）を使用することによって全ＲＮＡを天然組織から単離し、製造業者の取扱説明書に従ってＤＮａｓｅ−Ｉ（１Ｕ／μＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と反応させ、次いで分光光度分析によって定量した。
【００６１】
海馬の両側を分析した。ＲＮＡの最終準備は、２６０／２８０ｎｍの読取り値の比が＞１．７である場合にＤＮＡおよびタンパク質を含まないとみなした。精製されたｍＲＮＡを逆転写酵素（酵素ＶＩＬＯ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｍｉｌａｎ、Ｉｔａｌｙ）を使用して逆転写した。定量リアルタイムＰＣＲはＣＦＸ３８４リアルタイムで行った。
【００６２】
ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ検出法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｓｅｇｒａｔｅ、ＭＩ、Ｉｔａｌｙ）を使用した特異的プライマーによるＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｓｅｇｒａｔｅ、ＭＩ、Ｉｔａｌｙ）。試料は、汚染またはプライマー二量体の形成を制御するために、１回のアッセイの実行において各プライマー対の非鋳型対照ブランクを含む４組が同時に増幅され、各実験グループについてｃｔ値（サイクル閾値）が決定された。
【００６３】
ハウスキーピング遺伝子（リボソームタンパク質Ｓ１６）が、２−ｄＣｔ式を用いてｃｔ値を正規化するための内部対照として使用され、グループ間のｍＲＮＡ含有量の違いは、前述（Ｉａｎｎｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）と同様に２−ｄｄｃｔとして表された。
【００６４】
材料
この実施例では、高度に精製された植物性カンナビノイドＣＢＤ、ＣＢＤＶ、ＣＢＤＡ、ＴＨＣＶ、およびＣＢＧがテストされた。
【００６５】
統計値
データは、所与の実験数（ｎ）の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表される。データセットは、適合するスチューデントのｔ検定を使用して、または必要に応じて一元配置分散分析、続いてニューマン・コイル検定を使用して比較された。統計的有意差は、ｐが＜０．０５である場合に受容された。
【００６６】
結果
筋芽細胞分化に与える植物性カンナビノイドの潜在効果についての情報を得るために、Ｃ２Ｃ１２細胞を、様々な植物性カンナビノイドの存在下または不在下のＤＭ中において２４〜４８時間分化するように誘導した。
【００６７】
次いでｑＰＣＲ分析を利用して、発生学的に調節されるカノニカル骨格マーカーＭｙｏｇおよびＴｎｎｔ−１の発現レベルを評価した。
【００６８】
図１Ａおよび図１Ｂに示すようにＣＢＤＡ（１および３μＭ）またはＣＢＧ（３μＭ）の存在下で分化させた筋芽細胞のＭｙｏｇおよびＴｎｎｔ−１  ｍＲＮＡの発現レベルは有意に低下した。一方、ＴＨＣＶ（１および３μＭ）は、有意な効果をもたらさなかった（図１Ｃ）。
【００６９】
これとは対照的にＣＢＤ（１μＭ）およびＣＢＤＶ（１および３μＭ）は、ＭｙｏｇおよびＴｎｎｔ−１  ｍＲＮＡの発現の有意な増加によって示されるように筋芽細胞の分化を促進した（図２Ａおよび図２Ｂ）。
【００７０】
筋管形成に与えるＣＢＤ  １μＭの効果は、ウェスタンブロット分析によって確かめられた。細胞をＤＭ＋１μＭ  ＣＢＤに７２時間暴露することにより、ミオシン重鎖（ＭｙＨＣ）タンパク質の発現は、対照条件と比較して有意に増加した（図２Ｃ）。
【００７１】
１μＭのＣＢＤへの短期間暴露のＣ２Ｃ１２細胞分化に与える潜在効果もテストされた。
【００７２】
塗布の翌日、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を１μＭのＣＢＤの存在下または不在下でＤＭに１０分間暴露した。その後、ＤＭを更新し、細胞を洗浄してからそれらをＤＭ（薬物なし）に３および２４時間暴露した。ｑＰＣＲ分析は、この３時間後および２４時間後の両方でＣＢＤ  １μＭに暴露したＣ２Ｃ１２細胞が、ＭｙｏｇおよびＴｎｎｔ−１の両方で有意に高い転写レベルを有することを示した（図３）。これらの結果は、ＣＢＤへの短時間の暴露が筋芽細胞の分化過程を促進させるのに十分であることを示す。
【００７３】
結論
これらのデータは、植物性カンナビノイドＣＢＤ、ＣＢＤＶ、およびＴＨＣＶが骨格筋細胞の分化を調節し得ることを初めて示した。
【００７４】
具体的には、植物性カンナビノイドＣＢＤおよびＣＢＤＶは、図２Ａおよび２Ｂに示すように筋芽細胞分化の統計的に有意な増加（その他のカンナビノイドとは対照的に）をもたらした。
【００７５】
それは、これらの特定の植物性カンナビノイドまたはそれらの組合せが、分化過程の変質と、それに続く骨格筋組織の変性とによって引き起こされる慢性または退行性骨格筋疾患、例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィーを含めたジストロフィーの治療または予防に有用であることを証明し得ることを意味する。
【００７６】
実施例２：ヒト衛星細胞の分化に与える植物性カンナビノイドの効果
材料および方法
細胞培養および試薬
初代ヒト衛星細胞（ＳＣ）をＩｎｎｏｐｒｏｔ  Ｉｎｃ（Ｂｉｚｋａｉａ−Ｓｐａｉｎ）から購入し、必須および非必須アミノ酸、ビタミン類、有機および無機成分、ホルモン類、成長因子、微量元素、および低濃度のウシ胎児血清（５％）を含有する成長培地（ＧＭ）（Ｉｎｎｏｐｒｏｔ  Ｉｎｃ／Ｂｉｚｋａｉａ−Ｓｐａｉｎ）中で、空気９５％／ＣＯ２５％の加湿雰囲気において３７℃で繁殖させた。
【００７７】
衛星細胞を、より低い濃度（１０％から０．１％まで）のＦＢＳ（その上に５μｇ／ｍＬのインスリンおよび５μｇ／ｍＬのトランスフェリンを添加した分化培地（ＤＭ））に４〜５日間暴露して増殖させることにより、それらの分化を誘発して筋管にした。
【００７８】
ｍＲＮＡの抽出および定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析
実施例１で述べたものと同様である。
【００７９】
材料
この実施例では、高度に精製された植物性カンナビノイドＣＢＤ、ＣＢＤＶ、およびＴＨＣＶがテストされた。
【００８０】
統計値
実施例１で述べたものと同様である。
【００８１】
結果
ヒト骨格筋前駆細胞の分化に与えるカンナビノイドＣＢＤ、ＣＢＤＶ、およびＴＨＣＶの効果を更に調べるためにｑＰＣＲ分析が使用された。
【００８２】
具体的には、ミオゲニン（Ｍｙｏｇ）、トロポニン（Ｔｎｎｔ−１）、およびミオシン重鎖（ＭｙＨＣ）の転写レベルを測定することによって骨格筋細胞の分化を定量した。これらのすべてが筋管形成に必要とされる筋特異的マーカーであることは広く認められている。
【００８３】
ｑＰＣＲ分析は、ＳＣを１μＭのＣＢＤ、３μＭのＣＢＤＶ、または３μＭのＴＨＣＶの存在下で分化培地に暴露して５日後、Ｍｙｏｇ、Ｔｎｎｔ−１、およびＭｙＨＣなどのカノニカル骨格筋分化マーカーの転写レベルが有意に増加することを明らかにした（図４）。
【００８４】
初代ヒト衛星細胞の分化がまた、通常の光学顕微鏡法によって位相コントラスト様式で試験された。図５および６にそれぞれ示すように、１μＭのＣＢＤ、３μＭのＣＢＤＶ、および３μＭのＴＨＣＶの存在下でＤＭに４および５日間暴露した後、ＳＣの分化はビヒクル（ＤＭＳＯ）で処理した対照グループと比較して明白な形態学的相違を示した。具体的には、植物性カンナビノイドの存在下でインキュベートして５日後、細胞はより融合したと思われ、成熟筋管のサイズはより大きくなった。
【００８５】
この後者の相違は、ＴＨＣＶで処理した細胞ではより明白である（図６）。
【００８６】
初代ヒト骨格筋前駆細胞に見出されるこれらの効果は、マウスＣ２Ｃ１２細胞で観察される効果よりもはるかに顕著である（実施例１）。
【００８７】
結論
データは、ＣＢＤ、ＣＢＤＶ、またはＴＨＣＶへの暴露が前駆細胞の筋管への分化を増進させるのに貢献することを示す。
【００８８】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）などの退行性骨格筋障害において、骨格筋前駆（衛星）細胞の再生能力の減損および成熟した機能性筋管に分化する能力の低下は、慢性変性による進行性筋力低下を引き起こす。植物性カンナビノイドＣＢＤ、ＣＢＤＶ、およびＴＨＣＶはすべて（カンナビノイドＣＢＤＡおよびＣＢＧとは対照的に）、ヒト骨格筋前駆細胞の分化を増進させるのに有効であることは明らかであり、したがって、そのような状態を有する患者の治療の選択肢と考えるべきである。
【００８９】
実施例３：ＤＭＤの哺乳動物モデルにおけるカンナビジオール（ＣＢＤ）の効果
材料および方法
動物：
ｍｄｘマウスを英国内務省規則（Ｈｏｍｅ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）に従って飼育し保管した。６週齢の時点で雌性ｍｄｘマウスのグループ（対照はｎ＝１８、デフラザコートはｎ＝１８、ＣＢＤはｎ＝１９）を、飲料水に溶かした３．５％Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ／水（ｖ／ｖ）に順応させた。
【００９０】
対照グループは、この検討の継続期間にわたり３．５％Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒで維持された。デフラザコート（ＤＦＺ）グループは、２週間にわたり３．５％Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒで維持され、次いで１６週間にわたり３．５％Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒに溶かした１．２ｍｇ／ｋｇ／日のＤＦＺで維持された（ｎ＝８）。
【００９１】
ＣＢＤグループは、３．５％Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒに７日間順応させた。７日目から、３日間にわたり３．５％Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒに７５ｍｇ／ｋｇ／日のＣＢＤが追加され、次いで１６週間にわたりＣＢＤを１２０ｍｇ／ｋｇ／日に増加した（ｎ＝８）。
【００９２】
マウスおよび瓶を週に２回計量して体質量および消費量を監視した。マウスはグループ単位で保管され、したがって平均消費量が計算される。
【００９３】
リアルタイムＰＣＲ：
４週目に腓腹筋を回収し、相対的な遺伝子発現を測定した。
【００９４】
ＣＢＤで処理した後の細胞からＲＮＡを抽出した。対照ＲＮＡは対照グループから抽出された（ＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）。各試料からの２μｇのＲＮＡを、オリゴｄＴプライマー（ｒｔ  ｎａｎｏｓｃｒｉｐｔ２、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎ）を使用して逆転写させた。
【００９５】
安定な内在性対照遺伝子（Ｐａｋ１ｌｉｐ１、Ｈｔａｔｆｓ１）を、マウスＧｅＮｏｒｍ  Ｋｉｔ  ｑｂａｓｅ＋ソフトウェア（Ｐｒｉｍｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎ）を使用して同定した。
【００９６】
リアルタイムＰＣＲは、ＡＢ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ上でＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して行った。すべてのリアルタイムＰＣＲ実験は次の反応条件、すなわち初期は９５℃で１０分間、続いて９５℃で１５秒間および６０℃で１分間の４０サイクル、続いて融解曲線の分析で行った。
【００９７】
遺伝子発現の相対的レベルは標準曲線法を使用して求められ、内在性対照の平均を基準にして表される。
【００９８】
炎症マーカー：
４週目に脾臓を回収し、ＣＤ８陽性細胞を分析した。
【００９９】
結果：
図７は、この検討の１６週間にわたるマウスの体重を詳述する。図に見られるようにビヒクルグループとＣＢＤグループとの間の総体質量は４週目まで差がなかったが、デフラザコートグループは有意に軽くなった（８．９％、ｐ＜０．０５）。
【０１００】
４週の終了後、ビヒクルのみのコホートの総体質量はＣＢＤ処理ｍｄｘマウスよりも有意に大きく、およびビヒクルとＣＢＤとの両方がデフラザコート処理マウスよりも有意に大きかった（１５週目にビヒクル＝３１．１７ｇ、ＣＢＤ＝２９．４２ｇ、ＤＦＸ＝２６．２６ｇ、５．６％および１５．８％の差、ｐ＜０．０５）。
【０１０１】
図８は、４週目の腓腹筋のリアルタイムＰＣＲおよびその相対的遺伝子発現を詳述する。図８（ａ）は、ＣＢＤコホートのみにおいてサーチュイン−１（Ｓｉｒｔ１）が有意に上向き調節されることを示す（８４．９％、ｎ＝９、ｐ＜０．０５）。
【０１０２】
図８（ｂ）は、ＣＢＤコホートのみにおいてＰＧＣ１αが有意に上向き調節されることを示す（１２５．８％、ｎ＝９、ｐ＜０．００１）。
【０１０３】
図８（ｃ）は、ＣＢＤコホートのみにおいてミトコンドリアにコードされたＮＡＤＨ脱水素酵素２（ＭＴ−ＮＤ２）が有意に上向き調節されることを示す（２５３．２％、ｎ＝４、ｐ＜０．０５）。
【０１０４】
図９は、この動物の脾臓中のＣＤ８陽性細胞のレベルを明らかにする。ＣＤ８集団の総比率はデフラザコートによって影響を受けなかったが、ＣＤ８集団の総比率は１０．９％（ビヒクル）から８．７％（ＣＢＤ）に有意に減少し、１９．７％の差（ｎ＝９、ｐ＜０．００１）であることが分かる。
【０１０５】
結論：
上記ｉｎ  ｖｉｖｏのデータは、ＣＢＤがＤＭＤを治療し得ることを実証する。
【０１０６】
ＤＭＤのマウスモデルからのリアルタイムＰＣＲデータは、３つすべての遺伝子、Ｓｉｒｔ−１、ＰＧＣ１α、およびＮＤ２が上向き調節されることを実証する。これらの遺伝子は、下記のようにＤＭＤの重要なマーカーである。
【０１０７】
サーチュイン−１（Ｓｉｒｔ−１）は、ヒトおよび他の哺乳動物中で見出され、食料およびエネルギーが乏しいときに細胞を保護することにより、生存の促進に役立つ遺伝子である。
【０１０８】
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ、すなわち活性化補助因子１α（ＰＧＣ１α）は、ＣＢＤが骨格筋細胞における酸化代謝および脈管形成表現型を増進させることが初めて実証されたエネルギー代謝に関与する遺伝子を調節する転写活性化補助因子である。
【０１０９】
ミトコンドリアにコードされたＮＡＤＨ脱水素酵素２（ＭＴ−ＮＤ２）は、代謝に関係する遺伝子である。
【０１１０】
ＣＢＤで処理したＤＭＤマウスにおけるこれらのすべての遺伝子の統計的に有意な増加は、筋肉の増加をもたらす遺伝子の上向き調節をＣＢＤが促進し得ることを示唆し、したがってＤＭＤの有用な治療であることを示唆する。
【０１１１】
また、ＣＢＤによる炎症マーカーの減少は、この治療がＤＭＤなどの疾患の治療に役立つ抗炎症作用を更にもたらすことを示唆する。
【０１１２】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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