(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染性ＲＮＡウイルスを生成するための方法であって、以下のステップ：
ａ）ＲＮＡウイルスの全ゲノムの５’位にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター、ならびに任意に３’位にターミネーターおよびＲＮＡポリアデニル化配列を導入するステップ；
ｂ）ステップａ）で調製された全ウイルスゲノムを増幅して、少なくとも２つの重複ｃＤＮＡフラグメントを産生するステップ；
ｃ）前記ｃＤＮＡフラグメントを宿主細胞にトランスフェクトするステップ；
ｄ）ステップｃ）の前記宿主細胞をインキュベートするステップ；ならびに
ｅ）前記インキュベートした宿主細胞から感染性ＲＮＡウイルスを回収するステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記ウイルスはプラス一本鎖ＲＮＡウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プラス一本鎖ＲＮＡウイルスはフラビウイルス、アルファウイルスおよびエンテロウイルスからなる群から選択されるウイルスである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記フラビウイルスは、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）、デングウイルス（ＤＥＮＶ）、黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）、およびダニ媒介脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）からなる群から選択され；
前記アルファウイルスはチクングニアであり；
前記エンテロウイルスはコクサッキーである、
請求項３に記載の方法。
【請求項５】
５’位のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの前記プロモーターはヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ｐＣＭＶ）であり；および／または
前記任意のターミネーターおよびＲＮＡポリアデニル化配列はそれぞれ肝炎デルタリボザイムおよびサルウイルス４０ポリアデニル化シグナル（ＨＤＲ／ＳＶ４０ｐＡ）である、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップｂ）は２〜１５の重複ｃＤＮＡフラグメントの産生を許容する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記宿主細胞はＳＷ１３細胞株およびＢＨＫ−２１細胞株、ＨＥＫ２９３細胞株およびＶｅｒｏ細胞株からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ステップｃ）は、ステップｂ）で得られた前記ｃＤＮＡフラグメントそれ自体を直接トランスフェクトするステップであり、かつ
前記ステップｃ）はステップｂ）の直後に行われる
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップｃ）は、ステップｂ）で得られたｃＤＮＡフラグメントを含むプラスミドまたはベクターをトランスフェクトするステップであって、各ｃＤＮＡフラグメントは個々に
別々のプラスミドまたはベクター中にあるステップである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法は、ステップｂ）の後かつステップｃ）の前に、前記重複ｃＤＮＡフラグメントを精製するステップｂ’）をさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
インキュベーションのステップｄ）は３〜９日間続く、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップｃ）のトランスフェクトしたｃＤＮＡフラグメントは、インキュベーションステップｄ）中に前記宿主細胞内で自発的に組換わる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
逆遺伝学的解析のための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項１４】
前記感染性ＲＮＡウイルスの安全輸送のための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全長ｃＤＮＡの構築、クローニングおよびそうした全長ｃＤＮＡの増殖の必要性を完全に排除する、感染性ＲＮＡウイルスを迅速に生成するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
感染性ウイルスの産生をそれらのゲノムのＤＮＡコピーから可能にする分子法の開発は、「逆遺伝学」の発展、すなわち、ウイルスの生物学的特性に対する特定の突然変異の影響に関する研究の発展を可能にすることにより、ＲＮＡウイルスの生活環および病態発現機序に関する我々の知識を著しく向上させてきた。
【０００３】
しかしながら、感染性ｃＤＮＡクローンの構築のための現在の方法は、細菌内に望ましくない突然変異または不安定／有毒なクローンを伴うことが多い、予測不可能で面倒なプロセスである。
【０００４】
このため、ＲＮＡウイルスを生成するための代替法に大きな興味が湧いている。代替宿主、低コピー数プラスミド、コスミドベクター、細菌人工染色体、改変プロモーターまたは潜在的な（ｃｒｙｐｔｉｃ）細菌プロモーター活性を抑制した改変ウイルスゲノム配列の使用などの様々な方法論的な改良が、提唱されてきた。
【０００５】
さらに無菌のアプローチも、たとえば１９９５年にはＧｒｉｔｓｕｎおよびＧｏｕｌｄによりダニ媒介脳炎（ＴＢＥＶ：Ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）を用いて、ならびに２０１３年にはＥｄｍｏｎｄｓらおよびＳｉｒｉｄｅｃｈａｄｉｌｏｋらによりそれぞれウエストナイルウイルス（ＷＮＶ：Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ  ｖｉｒｕｓ）およびデングウイルス（ＤＥＮＶ：Ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ）を用いて開発された。
【０００６】
それらは大きな進歩の代表であったけれども、これらの方法は研究対象の各ウイルスについて相当の最適化を必要とし、統一的な方法論的プロセスを提供していない。
【０００７】
したがって、感染性ＲＮＡウイルスを生成するための、効率的で精密かつ迅速な代替法に対する長年にわたる切実な要求が満たされていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、各々ＲＮＡウイルスのゲノムの一部を包含する重複ｃＤＮＡフラグメントから、全長ｃＤＮＡまたはそうした全長ｃＤＮＡを含むプラスミドもしくはベクターの使用なしに複製ウイルスを得ることができることを示した。
【０００９】
こうして本発明者らは、各々ウイルスゲノムの一部を包含する重複二本鎖ＤＮＡフラグメントにより、ｉｎ  ｃｅｌｌｕｌｏで完全なウイルスゲノムのＤＮＡコピーの自発的な組換えおよび合成が可能になることに光を当てた。
【００１０】
したがって、第１の態様では、本発明は、感染性ＲＮＡウイルスを生成するための方法であって、以下のステップ：
ａ）ＲＮＡウイルスの全ゲノムの５’位にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター、ならびに任意に３’位にターミネーターおよびＲＮＡポリアデニル化配列を導入するステップ；
ｂ）少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、４つ、５つまたは６つの重複ｃＤＮＡフラグメントにおいて、前記プロモーター、ならびに任意に前記ターミネーターおよびＲＮＡポリアデニル化配列を含む、ステップａ）で調製された全ウイルスゲノムを増幅するステップ；
ｃ）前記ｃＤＮＡフラグメントを宿主細胞にトランスフェクトするステップ；
ｄ）ステップｃ）の宿主細胞をインキュベートするステップ；ならびに
ｅ）前記インキュベートした宿主細胞から感染性ＲＮＡウイルスを回収するステップ
を含む方法に関する。
【００１１】
第２の態様では、本発明は、本明細書に開示された感染性ＲＮＡウイルスを生成するための方法の使用、および／または逆遺伝学的解析のための、前記方法に従って得られたＲＮＡウイルスの使用に関する。
【００１２】
第３の態様では、本発明は、本明細書に開示された感染性ＲＮＡウイルスを生成するための方法の使用、および／または感染性ＲＮＡウイルスの安全かつ効率的な輸送のための、前記方法に従って得られたＲＮＡウイルスの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】感染性プラス一本鎖ＲＮＡウイルスをレスキューするための一般的戦略５’および３’でそれぞれヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ｐＣＭＶ）と、肝炎デルタリボザイム、その後のサルウイルス４０ポリアデニル化シグナル（ＨＤＲ／ＳＶ４０ｐＡ）とに挟まれた、図に模式的に示した全ウイルスゲノム（フラビウイルス）を、３つの重複ｃＤＮＡフラグメントにおいてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物の許容細胞へのトランスフェクションにより、３〜９日後に感染性ウイルスの回収が可能になった。水平な青い矢印は、３つの重複ｃＤＮＡフラグメントを生成するのに使用したプライマーを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明者らは、各々ウイルスゲノムの一部を包含する重複二本鎖ＤＮＡフラグメントにより、トランスフェクション後に完全なウイルスゲノムのＤＮＡコピーの自発的な組換えおよび合成が可能になることを見出した。この驚くべき発見に基づき、本発明者らは、細菌への全長ｃＤＮＡのクローニングおよび増殖を必要としない感染性ＲＮＡウイルスを生成するための新規なアプローチを開発した。
【００１５】
したがって第１の態様では、本発明は、以下のステップ：
ａ）ＲＮＡウイルスの全ゲノムの５’位にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター、ならびに任意に３’位にターミネーターおよびＲＮＡポリアデニル化配列を導入するステップ；
ｂ）少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、４つ、５つまたは６つの重複ｃＤＮＡフラグメントにおいて、前記プロモーター、ならびに任意に前記ターミネーターおよびＲＮＡポリアデニル化配列を含む、ステップａ）で調製された全ウイルスゲノムを増幅するステップ；
ｃ）前記ｃＤＮＡフラグメントを宿主細胞にトランスフェクトするステップ；
ｄ）ステップｃ）の宿主細胞をインキュベートするステップ；ならびに
ｅ）前記インキュベートした宿主細胞から感染性ＲＮＡウイルスを回収するステップ
を含む感染性ＲＮＡウイルスを生成するための方法に関する。
【００１６】
本発明者らは、自身の徹底的な研究に基づき：
−  全ウイルスゲノムを包含する全長ｃＤＮＡを構築すること；および／または
−  そうした全長ｃＤＮＡを含むプラスミドもしくはベクターの使用；および／または
−  宿主細胞へのトランスフェクション前に全長ｃＤＮＡもしくは全ウイルスゲノムを再構築する必要性；および／または
−  非天然の組換えもしくは制限酵素部位を組み込むなどウイルスゲノムを改変すること；および／または
−  ヘルパーウイルスもしくは他のウイルスタンパク質の使用
から解放する方法を開発することにより技術的偏見を克服した。
【００１７】
したがって、「感染性サブゲノム単位複製配列」または「ＩＳＡ（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ  Ａｍｐｌｉｃｏｎ）」とも呼ばれる本発明の方法は、既存の感染性クローン、ウイルスＲＮＡまたは新規合成されたＤＮＡゲノム配列を含む種々の初期供給源を出発物質としてウイルスの配列を完全に制御し、数日以内に感染性ＲＮＡウイルスの産生を促進することができる非常に簡便な手順である。従来技術で開示された他の無菌のアプローチと異なり、本発明の方法は、ｃＤＮＡフラグメントの調製以外に任意の追加ステップを必要としない。構築物のアセンブリは、トランスフェクションの前にギブソンアセンブリまたは環状ポリメラーゼ伸長クローニング（ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ）によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで行わず、ｉｎ  ｃｅｌｌｕｌｏで直接起こる組換えプロセスで行うことで、この方法は非常に容易になり、短縮する。
【００１８】
本明細書で使用する場合、「感染性ＲＮＡウイルスの生成」という表現は、本発明の方法による野生型形態または遺伝子改変形態のＲＮＡウイルスの産生をいう。「感染性ウイルス」という用語は、複製する能力を有する、すなわち宿主細胞でウイルスゲノムを増幅すること、細胞内でのウイルスゲノムのパッケージングおよび／または細胞からの感染性ウイルス粒子の放出ができるウイルスをいう。ウイルスが病原性でもあるいは非病原性でもよく、なお感染性であり得ることは、注目に値する。
【００１９】
本明細書で使用する場合、「非天然の組換え部位」という表現は、Ｃｒｅ−ＬｏｘまたはＦＬＰ−ＦＲＴ組換えシステムを例示することができる、部位特異的な組換えを許容する配列をいう。制限酵素部位とは、ＮｏｔＩまたはＡｌｕＩエンドヌクレアーゼを例示することができる制限酵素による二本鎖ＤＮＡの部位特異的切断を許容する配列をいう。
【００２０】
好ましくは、本方法が生成しようとする感染性ＲＮＡウイルス（本明細書では「標的ウイルス」とも呼ばれる）は、プラスまたはマイナス一本鎖ＲＮＡウイルスである。一層好ましくは、前記ウイルスは、プラス一本鎖ＲＮＡウイルスである。一層好ましくは、前記ウイルスは、フラビウイルス、アルファウイルスおよびエンテロウイルスからなる群から選択される。
【００２１】
フラビウイルスの非限定的なリストは、デングウイルス（ＤＥＮＶ）、黄熱病ウイルス（ＹＦＶ：Ｙｅｌｌｏｗ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、セントルイス脳炎（ＳＬＥＶ：Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ：Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓｅｓ）、マレー渓谷脳炎（ＭＶＥＶ：Ｍｕｒｒａｙ  Ｖａｌｌｅｙ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）、ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）、ロシオ（ＲＯＣＶ：Ｒｏｃｉｏ）、ダニ媒介脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）、オムスク出血熱（ＯＭＳＫＶ：Ｏｍｓｋ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒ）、キャサヌール（Ｋｙａｓａｎｒ  Ｆｏｒｒｅｓｔ）森林病（ＫＦＤＶ：Ｋｙａｓａｎｕｒ  Ｆｏｒｅｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ポワッサン（ＰＯＷＶ：Ｐｏｗａｓｓａｎ）を含む。好ましくは、前記フラビウイルスは：
−  日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）；たとえば遺伝子型Ｉ株（ＪＥＶ  Ｉ）または遺伝子型ＩＩＩ株（ＪＥＶ  ＩＩＩ）、
−  ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）、たとえば遺伝子型２株；
−  デングウイルス（ＤＥＮＶ）、たとえば血清型４株；
−  黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）、たとえば南アメリカ野生型株；および
−  ダニ媒介脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）、たとえば極東サブタイプ株
からなる群から選択される。
【００２２】
一層好ましくは、前記フラビウイルスはデングウイルスである。
【００２３】
アルファウイルスの非限定的なリストは、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫ：Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ  ｖｉｒｕｓ）、東部ウマ脳炎（ＥＥＥ：Ｅａｓｔｅｒｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）、西部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ：Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、マヤロウイルス（ＭＡＹ：Ｍａｙａｒｏ  ｖｉｒｕｓ）、オニョンニョンウイルス（ＯＮＮ：Ｏ’ｎｙｏｎｇ’ｎｙｏｎｇ  ｖｉｒｕｓ）、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、バーマフォレストウイルス、ロスリバーウイルス、ウナウイルス、トナテ（Ｔｏｎａｔｅ）ウイルスを含む。好ましくは、前記アルファウイルスはチクングニアウイルスである。
【００２４】
エンテロウイルスの非限定的なリストは、コクサッキー、エコーウイルス、ポリオウイルスおよびライノウイルスを含む。好ましくは、前記エンテロウイルスはコクサッキーであり、一層好ましくはコクサッキーＢウイルスである。
【００２５】
あるいは、前記ウイルスは一本鎖マイナス鎖ＲＮＡウイルスである。一層好ましくは、前記ウイルスは、パラミクソウイルス、アレナウイルス、フィロウイルス、ラブドウイルス、ブニアウイルスまたはインフルエンザウイルスである。
【００２６】
本発明の方法は、ＲＮＡウイルスの全ゲノムの５’位にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを導入するステップａ）を含む。任意に、前記ステップａ）は、ＲＮＡウイルスの全ゲノムの３’位にターミネーターおよびＲＮＡポリアデニル化配列の導入をさらに含む。
【００２７】
アルファウイルスゲノムなどの標的ウイルスのゲノムがポリアデニル化されるときに、ステップａ）がＲＮＡウイルスの全ゲノムの５’位にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター、ならびに３’位にターミネーターおよびＲＮＡポリアデニル化配列を導入するステップであることは、注目に値する。
【００２８】
第１のｃＤＮＡフラグメントの５’末端に、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター、ならびに最後のｃＤＮＡフラグメントの３’末端にリボザイム配列およびＲＮＡポリ−アデニル化のシグナル配列を含ませることにより、ｃＤＮＡフラグメントが、標準の５’および３’末端を有する全長ＲＮＡゲノムとして転写される。
【００２９】
好ましくは、５’位のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの前記プロモーターは、配列番号１に示したヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ｐＣＭＶ）である。好ましくは、前記ターミネーターおよびＲＮＡポリアデニル化配列は、それぞれ肝炎デルタリボザイムおよびサルウイルス４０ポリアデニル化シグナル（ＨＤＲ／ＳＶ４０ｐＡ）である。ＨＤＲ／ＳＶ４０ｐＡの配列は、配列番号２に示す。
【００３０】
したがって、ステップａ）は、５’および３’でそれぞれヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ｐＣＭＶ）（配列番号１）と、肝炎デルタリボザイム、その後のサルウイルス４０ポリアデニル化シグナル（ＨＤＲ／ＳＶ４０ｐＡ）（配列番号２）とに挟まれた、生成しようとする感染性ＲＮＡウイルスの完全なウイルスゲノムを用意する。
【００３１】
本発明の方法は、いくつかの重複ｃＤＮＡフラグメントで全ウイルスゲノムを増幅するステップｂ）を含む。
【００３２】
ステップｂ）では、全ウイルスゲノムは、ステップａ）で調製された、すなわち前記プロモーターならびに任意に前記ターミネーターおよびＲＮＡポリアデニル化配列を含む、全ウイルスゲノムに相当する。
【００３３】
本明細書で使用する場合、「単位複製配列」または「ＤＮＡサブゲノムフラグメント」または「サブゲノム単位複製配列」とも呼ばれる「重複ｃＤＮＡフラグメント」、「ｃＤＮＡフラグメント」という表現は、ＲＮＡウイルスのウイルスゲノムの一部のみを包含する二本鎖ＤＮＡフラグメントである。こうしたフラグメントは「サブゲノムフラグメント」に相当する。本発明者らは、こうしたフラグメントが細胞内にトランスフェクトされたとき、驚いたことにｉｎ  ｃｅｌｌｕｌｏで自発的に組換わり、全ウイルスゲノムを再構成することを明らかにした。前記組換えは、ウイルスゲノムが、追加の非天然の組換え部位を組み込むために遺伝子改変されていない場合でも起こる。言い換えれば、前記組換えは野生型ウイルスゲノムを用いて起こる。
【００３４】
本発明によるｃＤＮＡフラグメントは：
−  たとえばＰＣＲによる増幅によって得られたＤＮＡフラグメント；だけでなく
−  新規に得られたＤＮＡフラグメント
を包含する。
【００３５】
典型的には、前記ｃＤＮＡフラグメントは感染性でもあるいは非感染性でもよい。
【００３６】
本明細書で使用する場合、「全長ｃＤＮＡ」という表現は、１つの断片にウイルスの全ウイルスゲノムを含むＤＮＡをいう。
【００３７】
本明細書で使用する場合、「全ウイルスゲノムの一部を包含するｃＤＮＡフラグメント」という表現は、全ウイルスゲノムの一部を含むＤＮＡフラグメントをいう。典型的には、本発明によるｃＤＮＡフラグメントは、トランスフェクション時に細胞内で自発的に組換わり、５’末端でＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターに、ならびに３’末端で終結配列およびＲＮＡポリ−アデニル化のシグナル配列に、挟まれた全ウイルスゲノムのＤＮＡコピーを構成する。この構築物は、細胞機構により標準の５’および３’末端を有する全長ＲＮＡゲノムとして転写される。
【００３８】
一方、「全ウイルスゲノムを包含する全長ｃＤＮＡ」は、ウイルスゲノムの全体をコードする単一のｃＤＮＡである。
【００３９】
好ましくは、本発明の方法のステップｂ）は、２〜１５の重複ｃＤＮＡフラグメント、好ましくは３つ、４つ、５つまたは６つの重複ｃＤＮＡフラグメントの産生を可能にする。典型的には、前記ｃＤＮＡフラグメントは約２ｋｂ〜約６ｋｂ、好ましくは約４ｋｂであり、ｃＤＮＡフラグメントは各々、７０〜１００ｂｐの重複領域を有する。
【００４０】
好ましくは、ステップｂ）の前記重複ｃＤＮＡフラグメントは：
−  ＰＣＲにより増幅されなかった感染性クローンのフラグメント；
−  ＰＣＲにより増幅された感染性クローンのフラグメント；
−  ＰＣＲにより増幅されなかった非感染性クローンのフラグメント；
−  ＰＣＲにより増幅された非感染性クローンのフラグメント；
−  ＰＣＲにより増幅されなかった新規に合成されたフラグメント；
−  ＰＣＲにより増幅された新規に合成されたフラグメント；および
−  ウイルスゲノムから逆転写ＰＣＲにより得られたフラグメント
である。
【００４１】
好ましい実施形態では、前記重複ｃＤＮＡフラグメントは、生成しようとする標的ウイルスに応じて、以下の通り表に開示されたプライマーによって得ることができる：
【００４２】
【表１】
0006747983.tif 000002
【００４３】
前記プライマーは、ＰＣＲにより重複ｃＤＮＡフラグメントを得るのに有用である。
【００４４】
したがって、一実施形態では、本発明の方法のステップｂ）は、ステップａ）で調製された全ウイルスゲノムを：
−  前記感染性ＲＮＡウイルスがＪＥＶ  Ｉである場合、配列番号３〜配列番号８に示したプライマーを用い３つの重複ｃＤＮＡフラグメントにおいて、もしくは配列番号３９〜５０に示したプライマーを用い６つの重複ｃＤＮＡフラグメントにおいて；または
−  前記感染性ウイルスＲＮＡがＪＥＶ  ＩＩである場合、配列番号９〜配列番号１４に示したプライマーを用い３つの重複ｃＤＮＡフラグメントにおいて；または
−  前記感染性ＲＮＡウイルスがＷＮＶである場合、配列番号１５〜配列番号２０に示したプライマーを用い３つの重複ｃＤＮＡフラグメントにおいて；または
−  前記感染性ＲＮＡウイルスがＴＢＥＶである場合、配列番号２１〜配列番号２６に示したプライマーを用い３つの重複ｃＤＮＡフラグメントにおいて；または
−  前記感染性ＲＮＡウイルスがＹＦＶである場合、配列番号２７〜配列番号３２に示したプライマーを用い３つの重複ｃＤＮＡフラグメントにおいて；または
−  前記感染性ＲＮＡウイルスがＤＥＮＶ−４である場合、配列番号３３〜配列番号３８に示したプライマーを用い３つの重複ｃＤＮＡフラグメントにおいて；または
−  前記感染性ＲＮＡウイルスがＣＨＩＫＶである場合、配列番号５１〜配列番号５６に示したプライマーを用い３つの重複ｃＤＮＡフラグメントにおいて；または
−  前記感染性ＲＮＡウイルスがＣＶ−Ｂ３である場合、配列番号５７〜配列番号６２に示したプライマーを用い３つの重複ｃＤＮＡフラグメントにおいて
増幅するステップである。
【００４５】
本発明の方法は、前記ｃＤＮＡフラグメントを宿主細胞にトランスフェクトするステップｃ）を含む。
【００４６】
本明細書で使用する場合、「トランスフェクション」という用語は、真核細胞もしくは原核細胞または生体への核酸（ＤＮＡまたははＲＮＡ）の導入をいう。外来の核酸を取り込んだ細胞は、「宿主細胞」または「トランスフェクト細胞」という。トランスフェクションは、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、ポリブレン介在トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染および遺伝子銃を含む当該技術分野において公知の種々の手段により達成することができる。
【００４７】
好ましくは、ステップｃ）の宿主細胞は、感染性ウイルスの回収を可能にする許容細胞である。典型的には、本発明の方法に利用される許容細胞は、ｃＤＮＡフラグメントのトランスフェクション時に、ウイルス粒子の産生を含むウイルスの完全な複製サイクルを実現することができる細胞である。好ましくは、前記宿主細胞は、ＳＷ１３細胞株、ＢＨＫ−２１細胞株、ＨＥＫ２９３細胞株およびＶｅｒｏ細胞株からなる群から選択される。
【００４８】
好ましい実施形態では、ステップｃ）は、ステップｂ）で得られたｃＤＮＡフラグメントそれ自体を直接トランスフェクトするステップであり、ステップｃ）は、ステップｂ）の直後に行われる。この特定の実施形態では、ｃＤＮＡフラグメントそれ自体は、宿主細胞にトランスフェクトされる。前記フラグメントは、ｉｎ  ｃｅｌｌｕｌｏで自発的に組換わり、５’末端でＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターに、ならびに３’末端で終結配列およびＲＮＡポリ−アデニル化のシグナル配列に、挟まれた全ウイルスゲノムのＤＮＡコピーになる。既に述べたように、本発明の方法はそのように、全ウイルスゲノムを包含する全長ｃＤＮＡをトランスフェクトすることから解放するため、技術的偏見を克服する。加えて本方法は、そのような前記全長ｃＤＮＡを含むプラスミドもしくはベクターの使用、および／または宿主細胞へのトランスフェクション前に完全なｃＤＮＡもしくは全ウイルスゲノムを再構築する必要性がない。一方、本方法は、各々ウイルスゲノムの一部を含む重複ｃＤＮＡフラグメントのトランスフェクションに依存する。ＲＮＡウイルスの全ゲノムを包含する重複二本鎖ＤＮＡフラグメントの許容細胞へのトランスフェクションにより、ｉｎ  ｃｅｌｌｕｌｏで完全なウイルスゲノムのＤＮＡコピーの組換えおよび合成が可能になる。
【００４９】
代替の実施形態では、ステップｃ）は、各々ステップｂ）で得られたｃＤＮＡフラグメントを含むプラスミドをトランスフェクトするステップであって、各ｃＤＮＡフラグメントが個々に別々のプラスミドまたはベクターに組み込まれているステップである。この実施形態では、各ｃＤＮＡフラグメントは、個々に別々のプラスミドまたはベクターに組み込まれている。各プラスミドまたはベクターは、ｃＤＮＡの単一のフラグメントを含む。この実施形態では、全ウイルスゲノムはトランスフェクション後に再構成される。
【００５０】
一実施形態では、本発明の方法は、ステップｂ）の後かつ重複ｃＤＮＡフラグメントの精製のステップｃ）の前にさらなるステップｂ’）を含む。前記精製は、任意の公知の技術により、好ましくはクロマトグラフィーカラムを通して行うことができる。
【００５１】
本発明の方法は、好ましくは３〜９日間続く、宿主細胞をインキュベートするステップｄ）を含む。前記インキュベーションステップ中、トランスフェクトしたｃＤＮＡフラグメントは、宿主細胞において自発的に組換わり、５’末端でＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターに、ならびに３’末端で終結配列およびＲＮＡポリ−アデニル化のシグナル配列に、挟まれた全ウイルスゲノムのＤＮＡコピーを構成する。この構築物は、細胞機構により標準の５’および３’末端を有する全長ＲＮＡゲノムとして転写される。
【００５２】
代替の実施形態では、本発明は、感染性ＲＮＡウイルスをｉｎ  ｖｉｖｏで生成するための方法に関する。
【００５３】
この実施形態では、前記方法は、以下のステップ：
ａ）ＲＮＡウイルスの全ゲノムの５’位にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター、ならびに任意に３’位にターミネーターおよびＲＮＡポリアデニル化配列を導入するステップ；
ｂ）少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、４つ、５つまたは６つの重複ｃＤＮＡフラグメントにおいて、前記プロモーター、ならびに任意に前記ターミネーターおよびＲＮＡポリアデニル化配列を含む、ステップａ）で調製された全ウイルスゲノムを増幅するステップ；
ｃ’）前記ｃＤＮＡフラグメントを動物モデルに接種するステップ；
ｅ’）前記動物から得られた生物学的サンプルから感染性ＲＮＡウイルスを回収するステップ
を含む。
【００５４】
前に開示された技術データはすべてここに適用することができる。
【００５５】
本明細書で使用する場合、「動物モデル」という表現は、従属栄養性の多細胞真核生物、好ましくは哺乳動物、一層好ましくは非ヒト哺乳動物である。好ましい実施形態では、前記動物モデルは齧歯動物、一層好ましくはマウスである。
【００５６】
本明細書で使用する場合、「生物学的サンプル」という用語は、本明細書で使用する場合、動物モデルから得られた任意の生物学的サンプルをいう。本発明の方法では、サンプルは、任意の体液を含んでもよい。試験サンプルの例として、血液、血清、血漿、乳頭吸引液、尿、唾液が挙げられる。あるいは、前記生物学的サンプルは、前記動物モデルから得られた組織である。好ましくは、前記生物学的サンプルは、脂肪組織、メサンギウム組織、肝臓組織、膵臓組織、筋肉組織、血管組織、神経組織ならびに脳および脾臓組織からなる群から選択される。一層好ましくは、前記生物学的サンプルは、脳および脾臓組織である。
【００５７】
本明細書で使用する場合、「個体」という用語は動物をいい、いくつかの実施形態では哺乳動物、いくつかの実施形態ではヒトをいう。
【００５８】
典型的には、「前記ｃＤＮＡフラグメントを動物モデルへ接種」するステップｃ’）とは、ｃＤＮＡフラグメントが動物モデルへ投与されるステップに関連する、ステップをいう。言い換えれば、前記ステップは好ましくは、動物モデル内または前記モデルの細胞内にｃＤＮＡフラグメントを導入することを可能にする。ｃＤＮＡフラグメントは、種々の手段、以下に限定されるものではないが、経口手段、皮内手段、点眼手段、舌下手段、口腔内手段、筋肉内手段、静脈内手段、動脈内手段、経鼻手段、腹腔内手段、頭蓋内手段、脳室内手段、脳内手段、膣内手段、子宮内手段、直腸手段、非経口手段を用いて被検体または細胞に送達しても、あるいは投与してもよい。好ましくは、ステップｃ’）は、腹腔内注射、皮内注射または脳内注射により行われる。
【００５９】
第２の態様では、本発明は、本明細書に開示された感染性ＲＮＡウイルスを生成するための方法の使用、および／または逆遺伝学的解析のため前記方法に従って得られたＲＮＡウイルスの使用に関する。
【００６０】
本発明の方法は、ＲＮＡウイルスに関する大きな逆遺伝学的実験計画を作成する可能性がある。本発明の方法はさらに、実験手順から回収されたウイルスの特徴を特異的に調節する能力も有する。加えて、ＤＮＡサブゲノムフラグメントはＰＣＲにより都合よく得られるため、本方法は、ウイルスＲＮＡを出発材料としたときにウイルス集団の遺伝的多様性を保存する可能性がある。たとえば様々な実験の選択条件下に適応したウイルスの選択を容易にするため、人工のウイルスの不均一性を惹起するのにＥｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲをさらに使用してもよく、逆に、産生されるウイルスのクローン性の度合いを制御するため、忠実度の高いポリメラーゼおよびクローン増幅鋳型を使用してもよい。
【００６１】
前に開示された技術データはすべてここに適用することができる。
【００６２】
第３の態様では、本発明は、本明細書に開示された感染性ＲＮＡウイルスを生成するための方法の使用、および／または感染性ＲＮＡウイルスの安全かつ効率的な輸送のための、前記方法に従って得られたＲＮＡウイルスの使用に関する。実際に、本発明の方法は、たとえば科学施設間でのＲＮＡウイルスの交換の安全および保護を劇的に改善する。実際に、前記交換は、簡便な非感染性ＤＮＡサブゲノムフラグメントの室温での別々の輸送形態をとってもよい。次いで受け取る研究所が、前記フラグメントを組み合わせてトランスフェクトすることができる。したがって本方法は、感染性ウイルス株の迅速、簡便かつ安全な回収を可能にする。
【００６３】
前に開示された技術データはすべてここに適用することができる。
【００６４】
以下の例は、本発明の種々の実施形態を説明する目的で提供するものであり、任意の形式で本発明を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００６５】
実施例１：ＩＳＡ法
方法
細胞、ウイルス、感染性クローンおよび抗体
ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ−２１）細胞を、７％熱失活ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＳ；５０００Ｕ／ｍＬおよび５０００μｇ／ｍｌ；ライフテクノロジーズ）と共に最小必須培地（ライフテクノロジーズ）中、３７℃、５％ＣＯ２で増殖させた。ヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ−２９３）細胞およびアフリカミドリザル腎臓（ＶｅｒｏＥ６）細胞を、１％の非必須アミノ酸（ライフテクノロジーズ）を補充したＢＨＫ−２１細胞と同じ培地中、３７℃、５％ＣＯ２で増殖させた。ヒト副腎癌（ＳＷ１３）細胞を、１０％ＦＢＳおよび１％ＰＳと共にＲＰＭＩ１６４０培地（ライフテクノロジーズ）中、３７℃、５％ＣＯ２で増殖させた。
【００６６】
ＪＥＶ遺伝子型Ｉ株ＪＥＶ＿ＣＮＳ７６９＿Ｌａｏｓ＿２００９（ＫＣ１９６１１５）は、ラオス（Ｌａｏｓ）１６の患者の脳脊髄液から２００９年６月に単離され；ヒト血清から２００９年に単離されたＹＦＶ株ＢＯＬ  ８８／１９９９（ＫＦ９０７５０４）は、国立熱帯病センター（ＣＥＮＥＴＲＯＰ：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｔｒｏｐｉｃａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ）、サンタクルーズ（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ）、ボリビア（Ｂｏｌｉｖｉａ）から好意により提供され；ヒト血清から単離されたＤＥＮＶ−４株Ｄａｋ  ＨＤ  ３４  ４６０（ＫＦ９０７５０３）は、生体防御・新興感染症センター、シーリーワクチン開発センター（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｄｅｆｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ−Ｓｅａｌｙ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）（テキサス大学医学部（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｒａｎｃｈ）、ガルベストン（Ｇａｌｖｅｓｔｏｎ）、テキサス州、米国）のロバート  Ｂ  テッシュ（Ｒｏｂｅｒｔ  Ｂ  Ｔｅｓｈ）から好意により提供され；株ｒｐ９（ＤＱ６４８５９７）に由来するＪＥＶ遺伝子型ＩＩＩの感染性クローンは、生物医学研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、中央研究院（Ａｃａｄｅｍｉａ  Ｓｉｎｉｃａ）、台北、台湾のイ−リン−リン（Ｙｉ−Ｌｉｎｇ  Ｌｉｎ）から好意により提供され；ＷＮＶの感染性クローンは株Ｏｕｇａｎｄａ  １９３７（Ｍ１２２９４）由来し；ＴＢＥＶの感染性クローンは、株Ｏｓｈｉｍａ  ５．１０（ＡＢ０６２０６３）に由来し；ＣＶ−Ｂ３の感染性クローンは、株２６７９（ＫＪ４８９４１４）に由来した。ＪＥＶ特異的免疫血清（ＪＥＶに対するワクチン接種後に得る）およびモノクローナルＤＥＮＶ特異抗体１７を使用して直接免疫蛍光法アッセイを実施した。
【００６７】
ｃＤＮＡフラグメントの調製
５’および３’でそれぞれヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ｐＣＭＶ）（配列番号１）と、肝炎デルタリボザイム、その後のサルウイルス４０ポリアデニル化シグナル（ＨＤＲ／ＳＶ４０ｐＡ）（配列番号２）とに挟まれた完全なゲノムを、約４．８ｋｂ、３．０ｋｂおよび４．３ｋｂの３つの重複ＤＮＡフラグメント（ＣＨＩＫＶでは４．８ｋｂ、２．９ｋｂおよび５．２ｋｂ、ＴＢＥＶでは４．８ｋｂ、４．１ｋｂおよび３．４ｋｂ、ならびにＣＶ−Ｂ３では２．９ｋｂ、２．８ｋｂおよび２．７ｋｂ）においてＰＣＲにより増幅した（下の表１を参照）。
【００６８】
ＷＮＶ、ＴＢＥＶ、ＪＥＶ  ＩＩＩおよびＣＨＩＫＶでは、ＤＮＡフラグメントを、感染性クローンを用いてＰＣＲにより得た（ＪＥＶ  ＩＩＩでは、突然変異をフュージョンＰＣＲを用いて修正した）。
【００６９】
ＪＥＶ  Ｉ（すべてのＤＮＡフラグメント）、ＤＥＮＶ−４（第１および第３のフラグメント）およびＹＦＶ（第１および第３のフラグメント）では、ＤＮＡフラグメントを新規に合成し（ジェンスクリプト（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ））、ＰＣＲにより増幅した。単位複製配列は、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙキット（ライフテクノロジーズ）を用いて作製した。
【００７０】
混合物（最終容量：５０μＬ）は、４５μＬのスーパーミックス、１ｎｇ／μＬのＤＮＡ鋳型２μＬ（感染性クローンまたは合成ＤＮＡフラグメント）および２００ｎＭの各プライマーからなった。ＤＥＮＶ−４およびＹＦＶでは、第２のＤＮＡフラグメントを、清澄にした細胞上清からＲＴ−ＰＣＲにより得た。核酸は、製造者の指示に従いＥＺ１ウイルスＭｉｎｉキットｖ２を用いてＥＺ１  Ｂｉｏｒｏｂｏｔ（どちらもキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））で抽出し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  Ｈｉｆｉキット（ライフテクノロジーズ）を用いて増幅した。混合物（最終容量：５０μＬ）は、２５μＬのＲｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ、２μＬの核酸抽出物、１００ｎＭの各プライマー、１μＬのＥｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘおよび２０μＬのヌクレアーゼフリー水を含んでいた。アッセイは、Ｂｉｏｍｅｔｒａ  Ｔ−ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｇｒａｄｉｅｎｔサーモサイクラーを用いて以下の条件で行った：９４℃２分間、続いて９４℃１５秒間、６４℃３０秒間、６８℃５分間の４０サイクル、およびＲＴ−ＰＣＲのための５０℃３０分間の予備ステップ。ＰＣＲ産物の大きさは、ゲル電気泳動により検証し、製造者の指示に従いＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５ｍＬキット（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））を用いて精製した。プラスミドＤＮＡを鋳型として使用した場合、トランスフェクション前に制限酵素Ｄｐｎ１（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））を用いた消化ステップにより、鋳型の完全な除去を確実なものにした。この追加ステップの効率を制御するため、本発明者らは、対照として２つのｃＤＮＡフラグメントのみ（第１および第２、最終１μｇ）をトランスフェクトした（下記を参照）。これらの対照は、感染性ウイルスをまったく産生しなかった。
【００７１】
【表２】
0006747983.tif 000003
【００７２】
細胞トランスフェクション
ＰＣＲにより増幅されたすべてのｃＤＮＡフラグメントの最終１μｇの等モルの混合物（ｍｉｘ）、あるいはＣＶ−Ｂ３の１μｇの感染性クローンを、６００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ライフテクノロジーズ）中、１２μｌのリポフェクタミン２０００（ライフテクノロジーズ）とインキュベートした。製造者の指示に従い、この混合物を、抗生物質を含まない１ｍＬの培地を含む、サブコンフルエントの細胞の１２．５ｃｍ２培養フラスコに加えた。インキュベーションの４時間後、細胞上清を除去し、細胞を２回洗浄し（ＨＢＳＳ；ライフテクノロジーズ）、３ｍＬの新鮮培地を加えた。細胞上清を、著しい細胞変性効果（ＣＰＥ：ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）が観察されたとき（細胞型およびウイルス増殖速度に応じて３〜９日）、または非細胞変性ウイルスではトランスフェクションの９日後、採取し、遠心分離により清澄にし、アリコートに分け、−８０℃で保存した。次いで各ウイルスを、ＤＥＮＶ−４およびＹＦＶを除いて同じ細胞型を用いて４回継代した。ＤＥＮＶ−４およびＹＦＶでは、それぞれＶｅｒｏＥ６およびＨＥＫ−２９３を使用した。継代は、６６６μＬの培地を含む１２．５ｃｍ２培養フラスコ中、３３３μＬの清澄にした細胞上清を細胞に接種することにより行った。インキュベーションの２時間後、細胞を２回洗浄し（ＨＢＳＳ）、３ｍＬの新鮮培地を加えた。細胞上清を２〜６日後に採取し、遠心分離により清澄にし、アリコートに分け、−８０℃で保存した。清澄にした細胞上清（ウイルス原液）を使用してウイルスＲＮＡの定量、ＴＣＩＤ５０アッセイ、直接免疫蛍光アッセイおよび全ゲノムシーケンシングを行った。
【００７３】
リアルタイムＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲアッセイ
感染性ウイルスの産生を評価し、および陽性検出がｃＤＮＡ混入の結果でなかったことを確認するため、逆転写酵素を用いてあるいは用いずにＡｃｃｅｓｓ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｃｏｒｅ  Ｒｅａｇｅｎｔキット（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を使用してウイルスＲＮＡを定量し、検出されたｃＤＮＡの量と比較した。ＲＮＡは、製造者の指示に従いＥＺ１  ｍｉｎｉウイルス２．０キットおよびＥＺ１  Ｂｉｏｒｏｂｏｔ（どちらもキアゲン）を用いて抽出した。混合物（最終容量：２５μＬ）は、標準量のＡＭＶ／Ｔｆｌ  ５Ｘ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ、０．５μＭの各プライマー、０．５μＬのｄＮＴＰ  Ｍｉｘ、０．５ｍＭのＭｇＳＯ４、０．５μＬのＡＭＶ逆転写酵素（ＲＴ−ＰＣＲの場合のみ）、０．５μＬのＴｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ、１５．５μＬのヌクレアーゼフリー水および２μＬの抽出核酸を含んでいた。アッセイは、以下の条件でＣＦＸ９６  Ｔｏｕｃｈ（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ））を用いて行った：５０℃１５分間、９５℃２分間、続いて９５℃１５秒間、６０℃４０秒間の４５サイクル。データ収集は、６０℃のステップ中に行った。リアルタイムＰＣＲアッセイとリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイとにより得られたサイクル閾値（ｃｔ）間の相違を使用して、ウイルスＲＮＡ産生を評価した。さらに、線量検出限界（任意単位；ＡＵ：ａｒｂｉｔｒａｒｙ  ｕｎｉｔ）で表したウイルスＲＮＡの量を、標準曲線から算出した（培養ウイルスの細胞上清由来の核酸を標準として使用した；５つの核酸抽出物をプールし、１０μｌアリコートを−８０℃で保存した）。
【００７４】
５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０：Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｏｓｅ  ５０）アッセイ
測定ごとに、１ウェル当たり１００μＬの培地中に２０，０００個のＢＨＫ−２１細胞を含む９６ウェルプレート培養物（接種直前に加えた）を、清澄にした細胞培養上清の５０μＬの１０倍希釈系列に接種した。各列には、６つのウェルの同じ希釈物および２つの陰性対照があった。このプレートを７日間インキュベートし、各ウェルのＣＰＥの有無について判断した。ＴＣＩＤ５０／ｍＬの決定は、リード（Ｒｅｅｄ）およびミュンヒ１８（Ｍｕｅｎｃｈ１８）の方法を用いて行った。
【００７５】
直接免疫蛍光アッセイ（ｄＩＦＡ：Ｄｉｒｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎｏ−Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｓｓａｙ）
直接ＩＦＡは、清澄にした細胞上清を使用する前に、それぞれ２日および６日感染させた、ＪＥＶ  ＩおよびＪＥＶ  ＩＩＩ用のＳＷ１３細胞と、ＶｅｒｏＥ６細胞との１２．５ｃｍ２培養フラスコを用いて行った（上記：ウイルスの継代を参照）。上清を除去し、細胞を２回洗浄し（ＨＢＳＳ；インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、トリプシン処理し、採取して新鮮培地で希釈した（１／５）。１５０μＬのこの細胞懸濁物の細胞遠心分離（３分、９００ｒｐｍ；サイトスピン（Ｃｙｔｏｓｐｉｎ）後、サーモサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））、スライドを乾燥させ、固定のため冷アセトンに２０分浸し、乾燥させ、適切に希釈したＪＥＶ特異的免疫血清（上記を参照）またはモノクローナルＤＥＮＶ特異抗体と３７℃で３０分インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、蒸留水で１回洗浄し、乾燥させ、適切に希釈したＦＩＴＣコンジュゲート二次抗体およびエバンスブルー対比染色物と３７℃で３０分インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、蒸留水で１回洗浄し、乾燥させ、セットして蛍光顕微鏡を用いて判定した。
【００７６】
全長ゲノムの配列解析
Ｉｏｎ  ＰＧＭ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ１９（ライフテクノロジーズ）を用いて完全なゲノムシーケンシングを実施し、ＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ  ６ソフトウェアを用いて解析を行った。最初にウイルス上清を清澄にし、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ＨＣ＞９９％（ノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ））で３７℃にて一晩処理した。ＥＺ１  ｍｉｎｉウイルス２．０キットおよびＥＺ１  Ｂｉｏｒｏｂｏｔ（どちらもキアゲン）を用いてＲＮＡ抽出（ＲＮＡキャリアは使用せず；上記を参照）後、以前記載されたように２０（ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ２０）核酸のランダム増幅を行った。増幅したＤＮＡは、製造者の指示に従いＩｏｎ  ＰＧＭシーケンサーを用いて解析した。得られたリードを：最初にクオリティスコア（ｑｕａｌｉｔｙ  ｓｃｏｒｅ）を用いて、次いでランダム増幅中に使用したプライマーを除去することにより、最後に５’および３’末端（ｅｘｔｒｅｍｉｔｙ）で６ヌクレオチドを系統的に除去することにより、トリムした。２９ヌクレオチドを超える長さを有するリードのみを使用し、リファレンスとして使用した最初のゲノム配列にマップした。各位置ごとの突然変異頻度（突然変異を有するウイルスゲノムの比率）は単純に、リファレンスと比較した突然変異を有するリード数をその部位のリードの総数で割ったものとして計算した。
【００７７】
結果
本発明者らは、クローニング、細菌のｃＤＮＡの増殖またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＲＮＡ転写の必要なしにゲノムＤＮＡ材料からの感染性ＲＮＡウイルスの回収を容易にする簡便で多用途の逆遺伝学を開発した。それらの作業仮説は、ＲＮＡウイルスの全ゲノムを包含する重複二本鎖ＤＮＡフラグメントを許容細胞にトランスフェクトすると、完全なウイルスゲノムのＤＮＡコピーの組換えおよび合成が自発的に可能になるというものであった。最初の（５’）ＤＮＡフラグメントの５’末端に、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター、および最後の（３’）ＤＮＡフラグメントの３’末端にリボザイム配列およびＲＮＡポリ−アデニル化のシグナル配列を含ませることにより、本発明者らは、このゲノムＤＮＡコピーが、効率的に核から運ばれると考えられる標準の５’および３’末端を有する全長ＲＮＡゲノムとして転写されるであろうと予測した（細胞質コンパートメント内で複製するウイルスの場合）。
【００７８】
本発明者らは最初に、この仮定を、主要なフラビウイルスの進化系統を代表する６種のフラビウイルス（すなわち、感染細胞の細胞質内で複製するプラス極性の一本鎖ＲＮＡゲノムを有する節足動物媒介性エンベロープウイルス）：２種の日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ；遺伝子型Ｉ（ＪＥＶ  Ｉ）および遺伝子型ＩＩＩ（ＪＥＶ  ＩＩＩ））、１種の遺伝子型２ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）、１種の血清型４デングウイルス（ＤＥＮＶ−４）、黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）の１種の野生株、および１種の極東サブタイプダニ媒介脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）で試験した（表１）。
【００７９】
全ゲノムは、各々７０〜１００ｂｐの重複領域を有する約４ｋｂの３つのＤＮＡフラグメントにおいてＰＣＲにより増幅した。最初および最後のフラグメントを、５’および３’でそれぞれヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ｐＣＭＶ）と、肝炎デルタリボザイム、その後のサルウイルス４０ポリアデニル化シグナル（ＨＤＲ／ＳＶ４０ｐＡ）とで挟んだ（図１）。ＰＣＲ産物をカラム精製し、すべてのフラグメントの１μｇの等モルの混合物（ｍｉｘ）を、フラビウイルスの感染性ゲノムの効率的な回収を確実にするＳＷ１３および／またはＢＨＫ−２１細胞株にトランスフェクトした。これらの感染性培養物由来の細胞上清培地を、ＪＥＶ  Ｉ、ＪＥＶ  ＩＩＩ、ＴＢＥＶおよびＷＮＶの単離を可能にする同じ細胞型を用いて４回連続継代した。より要求の厳しいウイルスでは、追加の許容細胞（たとえば、ＤＥＮＶ−４：ＶｅｒｏＥ６細胞；ＹＦＶ：ＨＥＫ−２９３細胞）で継代することにより単離を達成できた。４回の連続継代後のウイルス複製は、以下の基準の組み合わせを用いてウイルスごとに実証した：
（ｉ）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法を用いた細胞上清培地におけるウイルスゲノムの産生、
（ｉｉ）ＴＣＩＤ５０アッセイを用いた細胞上清培地における感染性粒子の産生、
（ｉｉｉ）細胞変性効果（ＣＰＥ）の検出、
（ｉｖ）直接免疫蛍光アッセイによるウイルス抗原の検出、および
（ｖ）次世代シーケンシング（ＮＧＳ：ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）法を用いた完全なウイルスゲノムシーケンシング。
【００８０】
さらに本方法の頑健性、柔軟性および多用途性を以下の通り検証した。第１に、本発明者らは、大きさを小さくし、トランスフェクションのために組み合わせる重複フラグメントの数を増やした。これは、約２ｋｂの最大６つの重複単位複製配列を使用したときにＩＳＡ法により感染性ウイルスが生成されたＪＥＶ  Ｉの場合で例証した。第２に、本発明者らは、異なる科に属するプラス極性の一本鎖ＲＮＡゲノムを有するウイルス：チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ、エンベロープウイルス、トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ））およびコクサッキーウイルスＢ３（ＣＶ−Ｂ３、非エンベロープウイルス、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ））にＩＳＡ法を適用した。やはり、ＨＥＫ−２９３細胞（ＣＨＩＫＶ）またはＢＧＭ細胞（ＣＶ−Ｂ３）におけるトランスフェクションおよび４継代後、感染性ウイルスを単離することができた（下の表２）。さらに、本発明者らは、プラスミド含有感染性ゲノムのトランスフェクション後に得られたＣＶ−Ｂ３を対照として使用したところ、感染力および配列データの面で同様の結果を得た（表２）。
【００８１】
【表３】
0006747983.tif 000004
【００８２】
本研究において産生された様々なウイルスの概要：株の種名、第１（Ｉ）、第２（ＩＩ）および第３（ＩＩＩ）のフラグメントの産生のために鋳型として使用した初期材料の起源（ＤＮＳ、新規合成；Ｉ．Ｃ．、感染性クローン；またはウイルスＲＮＡ）、トランスフェクションおよび継代のために使用した細胞株、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲおよびＴＣＩＤ５０アッセイによる４代継代の細胞上清におけるウイルスＲＮＡの量および感染価の相対定量、細胞変性効果（ＣＰＥ）の有無および直接免疫蛍光アッセイ（ｄＩＦＡ）によるウイルス抗原の調査。完全なウイルスゲノム配列は、ＮＧＳ技術を用いて得た。ｄＮおよびｄＳはそれぞれ、非同義部位あたりの非同義置換数および同義部位あたりの同義置換数に相当する。＊６つの重複フラグメントのトランスフェクションにより得られた結果。¶ＣＶ−Ｂ３プラスミド含有感染性クローンを直接トランスフェクトすることにより得られた結果。Ｎ／ＡおよびＡＵはそれぞれ入手不可および任意単位を意味する。
【００８３】
第３に、本発明者らは、数日で遺伝子改変ウイルスを生成するＩＳＡ法の能力を実証した。これは、不完全なＪＥＶ  ＩＩＩ感染性クローンのフラグメントの１つにおけるフレームシフト突然変異（１９１５ｄｅｌ）のＰＣＲを用いた修正、および対応するウイルスのその後の回収（補足法（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ））により例証した。本発明者らはさらに、遺伝子型ＩおよびＩＩＩのＪＥＶの第１のＤＮＡフラグメント（構造タンパク質をコードする）を交換することによりキメラウイルスを産生することができた。第１の２つのフラグメントにおける重複領域の１１個のミスマッチにも関わらず、トランスフェクションの結果、遺伝子型間（ｉｎｔｅｒｇｅｎｏｔｙｐｉｃ）ＪＥＶ  Ｉ／ＪＥＶ  ＩＩＩおよびＪＥＶ  ＩＩＩ／ＪＥＶ  Ｉキメラが産生された。４代継代で作った完全なゲノム配列の、ＮＧＳを用いた解析から、遺伝的浮動（配列変化の割合）は中程度である（固定された突然変異を考慮すると、部位あたり１．４５Ｅ−０３〜９．００Ｅ−０５置換の範囲）ことが示された。非同義突然変異が大部分であること、異なるＪＥＶ株間で共有された突然変異が存在すること（７／８５）、および突然変異がゲノム（ホットスポットおよび高度に保存された領域の両方を有する）に沿って非ランダム分布であること（１０％を超える頻度で）は、細胞培養条件への適応を示した。
【００８４】
突然変異率は、単離に使用した細胞によって異なり、予想通り、培養適応株に由来するウイルスより低継代株に由来するウイルスで高かった。結論として、ＩＳＡ方法は、既存の感染性クローン、ウイルスＲＮＡまたは新規合成されたＤＮＡゲノム配列を含む種々の初期供給源を出発物質としてウイルスの配列を完全に制御し、数日以内に感染性遺伝子改変ＲＮＡウイルスの産生を促進する非常に簡便な手順である。この技術はさらに、以前に考えられなかった規模でＲＮＡウイルスに関する大きな逆遺伝学的実験計画を作成する可能性がある。本発明の方法はさらに、実験手順から回収されたウイルスの特徴を特異的に調節する能力も有する。加えて、ＤＮＡサブゲノムフラグメントはＰＣＲにより都合よく得られるため、この方法は、ウイルスＲＮＡを出発材料としたときにウイルス集団の遺伝的多様性１３（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ１３）を保存する可能性がある。たとえば様々な実験の選択条件下に適合したウイルス１５（ｖｉｒｕｓｅｓ１５）の選択を容易にするため、人工のウイルスの不均一性を惹起するのにＥｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲをさらに使用してもよく、逆に、産生されるウイルスのクローン性の度合いを制御するため、忠実度の高いポリメラーゼおよびクローン増幅鋳型を使用してもよい。
【００８５】
最後に、本発明の方法は、その後受け取る研究所が組み合わせてトランスフェクトすることができる簡便な非感染性（ｏｎ−ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ）ＤＮＡサブゲノムフラグメントの室温での別々の輸送により、科学施設間の将来のＲＮＡウイルスの交換の安全および保護に大変革を起こす可能性があり、感染性ウイルス株の迅速、簡便かつ安全な回収を可能にする。
【００８６】
実施例２：個々に別々のプラスミド中のｃＤＮＡフラグメントを用いたＩＳＡ法
本発明者らはさらに、ステップｃ）が、ステップｂ）で得られたｃＤＮＡフラグメントを含むプラスミドまたはベクターのトランスフェクションステップであって、各ｃＤＮＡフラグメントは個々に別々のプラスミドまたはベクター中にあるステップである特定の実施形態においてＩＳＡ法を例証した。
【００８７】
この実験は、ＰＣＲ増幅後にＩＳＡ法により感染性ウイルスを回収するのに以前使用したのと同じ日本脳炎ウイルスゲノム（遺伝子型Ｉ、ラオス株）のフラグメントを含む３つのプラスミドを用いて行った。
【００８８】
３つのプラスミドを、制限酵素Ｆｓｅ  Ｉを用いた消化により直線化し、前もってＰＣＲ増幅せずに等モル量（最終１μｇ）でＳＷ１３細胞に直接トランスフェクトした。９日および１継代後、ウイルスを成功裏に培養から回収した。
【００８９】
実施例３：ＩＳＡ法のｉｎ  ｖｉｖｏ応用
ＲＮＡウイルスの全ゲノムを包含し、かつ５’および３’でそれぞれＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターおよびターミネーター／ＲＮＡポリアデニル化シグナルに挟まれた重複フラグメントを本発明の方法を用いて調製した。
【００９０】
これらのＤＮＡフラグメントを生きた動物に直接接種し、いくつかの動物サンプルから感染性ウイルスを回収した。さらに、動物の臨床サーベイランス（症状の出現および著しい体重減少）により、典型的な感染の徴候が観察された。
【００９１】
ａ）実験１：ダニ媒介脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ；フラビウイルス）
本発明者らは、ダニ媒介脳炎ウイルスの野生株（Ｏｓｈｉｍａ  ５．１０株（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０６２０６３））を使用した。本発明者らは、本発明の方法をＤＮＡ重複フラグメントに適用した。
【００９２】
５週齢Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ雌マウスに３つのＤＮＡ重複フラグメントを接種した。
【００９３】
ウイルス感染の臨床経過を、
（ｉ）疾患の臨床症状（震え、猫背、ダーティーアイ（ｄｉｒｔｙ  ｅｙｅｓ）、片または四肢不全麻痺、片または四肢麻痺）；および
（ｉｉ）Ｆａｂｒｉｔｕｓ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｉｃｋ−Ｂｏｒｎｅ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  Ｖｉｒｕｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｌａｒｇｅ−Ｓｃａｌｅ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｃｏｄｏｎ  Ｒｅ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ．ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  １１（３）により記載されたのとちょうど同じようなマウスの体重に従ってモニターした。
【００９４】
接種の１４日後、脳および脾臓を屠殺したマウスから採取した。
【００９５】
脳および脾臓をすりつぶし、遠心した。得られた上清を使用して感染性ウイルスの存在を評価した。
【００９６】
感染性ウイルスの存在は、分子法（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）および古典的細胞培養法（感染性ウイルスの単離）を用いて評価した。
【００９７】
２〜５μｇの範囲の初期量のＤＮＡ、および２つの異なる接種経路（腹腔内注射および皮内注射）を用いて、感染性ウイルスが脳および脾臓の両方から検出された。さらに疾患の臨床症状（著しい体重減少および症状）も観察した。
【００９８】
ｂ）実験２：哺乳マウスの脳内接種
本発明者らは、ダニ媒介脳炎ウイルスの野生株（Ｏｓｈｉｍａ  ５．１０株（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０６２０６３））および日本脳炎（ＪＥＶ＿ＣＮＳ７６９＿Ｌａｏｓ＿２００９（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＣ１９６１１５））を使用した。本発明者らは、本発明の方法を使用してＤＮＡ重複フラグメントを生成した。
【００９９】
ＤＮＡ重複フラグメントは、ＰＢＳで希釈して使用するか、またはトランスフェクション試薬と混合した。
【０１００】
哺乳ＯＦ１マウスは、ＤＮＡ重複フラグメントの脳内注射により接種した。ウイルス感染の臨床経過を、疾患の臨床症状（震え、嗜眠）に従ってモニターした。接種の６〜１２日後、屠殺したマウスから脳を採取した。脳をすりつぶし、遠心した。得られた上清を使用して感染性ウイルスの存在を評価した。
【０１０１】
感染性ウイルスの存在は、分子法（リアルタイム  ＲＴ−ＰＣＲ）および古典的細胞培養法（感染性ウイルスの単離）を用いて評価した。
【０１０２】
２μｇのＤＮＡを用いて、トランスフェクション試薬を添加してあるいは添加せずに両方のウイルス（ＴＢＥＶおよびＪＥＶ）について、脳内の感染性ウイルスが検出された。さらに疾患の臨床症状も観察された。
【図１】
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【配列表】
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