(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、乳酸またはその塩を製造するためのプロセス：
（ａ）種培養を得るために、耐熱性のＢａｃｉｌｌｕｓ（バチルス）属の細菌を培養する工程；
（ｂ）工程（ａ）から得られた種培養を、好気的条件下において初期の炭素源を含む発酵槽へと植えつけることによって、細菌の細胞数を増加させる工程；
（ｃ）乳酸またはその塩を得るために、微好気的条件下において、上記発酵槽内において工程（ｂ）から得られた種培養を発酵させる工程；
上記工程（ｂ）は、上記炭素源の濃度を増加させるために、互いに独立した以下のいずれかの条件下における、上記炭素源の少なくとも一回の追加を含む：
発酵槽内における上記炭素源の上記濃度が、上記初期の濃度に比べて５０％以下へと減少するとき；
上記工程（ｂ）が、少なくとも３分の１の時間行われるとき；
発酵槽内における細菌細胞の光学密度（ＯＤ）が、少なくとも１０倍に増加するとき。
【請求項２】
工程（ｂ）における上記炭素源の上記追加は、上記発酵槽内における上記炭素源の濃度を、上記初期の濃度に比べて７５％以上へと増加させる、請求項１に記載の乳酸またはその塩を製造するためのプロセス。
【請求項３】
工程（ｂ）における上記炭素源の上記追加は、上記発酵槽内における上記炭素源の上記濃度が、上記初期の濃度に比べて、２５％以下へと減少する条件下において実行される、請求項１または２に記載の乳酸またはその塩を製造するためのプロセス。
【請求項４】
上記炭素源の上記追加は、上記工程（ｂ）が少なくとも２分の１の時間行われる条件下において実行される、請求項１または２に記載の乳酸またはその塩を製造するためのプロセス。
【請求項５】
上記炭素源の上記追加は、上記発酵槽内における細菌細胞の光学密度（ＯＤ）が１０倍から５０倍へと増加する条件下において実行される、請求項１または２に記載の乳酸またはその塩を製造するためのプロセス。
【請求項６】
工程（ｂ）における上記初期の炭素源の上記濃度は、１０ｇ／Ｌから２０ｇ／Ｌの範囲内である、請求項１に記載の乳酸またはその塩を製造するためのプロセス。
【請求項７】
工程（ｂ）における上記初期の炭素源の上記濃度は、１５ｇ／Ｌである、請求項１または６に記載の乳酸またはその塩を製造するためのプロセス。
【請求項８】
上記プロセスは、４５℃から６０℃の範囲内の温度で行われる、請求項１に記載の乳酸またはその塩を製造するためのプロセス。
【請求項９】
上記プロセスは、４８℃から５２℃の範囲内の温度で行われる、請求項８に記載の乳酸またはその塩を製造するためのプロセス。
【請求項１０】
上記工程（ａ）における上記耐熱性のＢａｃｉｌｌｕｓ（バチルス）属の細菌は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ（バチルス  アシディプロデュセンス）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ（バチルス  コアギュランス）、またはこれらの細菌の混合物から選択される、請求項１に記載の乳酸またはその塩を製造するためのプロセス。
【請求項１１】
上記工程（ａ）は、２時間から５時間行われる、請求項１または１０に記載の乳酸またはその塩を製造するためのプロセス。
【請求項１２】
上記工程（ａ）は、３時間から４時間行われる、請求項１１に記載の乳酸またはその塩を製造するためのプロセス。
【請求項１３】
上記工程（ｂ）は、２時間から５時間行われる、請求項１に記載の乳酸またはその塩を製造するためのプロセス。
【請求項１４】
上記工程（ｂ）は、３時間から４時間行われる、請求項１３に記載の乳酸またはその塩を製造するためのプロセス。
【請求項１５】
上記工程（ｂ）は、４時間行われる、請求項１４に記載の乳酸またはその塩を製造するためのプロセス。
【請求項１６】
上記工程（ｃ）は、上記炭素源の少なくとも一回の追加をさらに含む、請求項１に記載の乳酸またはその塩を製造するためのプロセス。
【請求項１７】
工程（ｃ）の上記炭素源の上記濃度は、１００ｇ／Ｌから２００ｇ／Ｌの範囲内である、請求項１または１６に記載の乳酸またはその塩を製造するためのプロセス。
【請求項１８】
工程（ｃ）の上記炭素源の上記濃度は、１００ｇ／Ｌである、請求項１７に記載の乳酸またはその塩を製造するためのプロセス。
【請求項１９】
上記工程（ｃ）は、塩基性溶液を使用することによって、ｐＨ６からｐＨ７となるように調整される、請求項１に記載の乳酸またはその塩を製造するためのプロセス。
【請求項２０】
上記工程（ｃ）は、塩基性溶液を使用することによって、ｐＨ６．５となるように調整される、請求項１９に記載の乳酸またはその塩を製造するためのプロセス。
【請求項２１】
前記塩基性溶液は、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化アンモニウム（ＮＨ４ＯＨ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、またはこれらの混合物から選択される、請求項１９に記載の乳酸またはその塩を製造するためのプロセス。
【請求項２２】
上記塩基性溶液は、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムである、請求項２１に記載の乳酸またはその塩を製造するためのプロセス。
【請求項２３】
上記塩基性溶液は、水酸化ナトリウムである、請求項２２に記載の乳酸またはその塩を製造するためのプロセス。
【請求項２４】
上記炭素源は、発酵性の糖である、請求項１に記載の乳酸またはその塩を製造するためのプロセス。
【請求項２５】
上記発酵性の糖は、単糖、二糖、三糖、またはこれらの混合物から選択される、請求項２４に記載の乳酸またはその塩を製造するためのプロセス。
【請求項２６】
上記単糖は、グルコース、フルクトース、ガラクトース、またはこれらの混合物から選択される、請求項２４に記載の乳酸またはその塩を製造するためのプロセス。
【請求項２７】
上記二糖は、スクロース、ラクトース、マルトース、セロビオース、またはこれらの混合物から選択される、請求項２４に記載の乳酸またはその塩を製造するためのプロセス。
【請求項２８】
上記三糖は、ラフィノース、イソマルトトリオース、マルトトリオース、ニゲロトリオース、ケストース、またはこれらの混合物から選択される、請求項２４に記載の乳酸またはその塩を製造するためのプロセス。
【請求項２９】
上記発酵性の糖はグルコースである、請求項２４に記載の乳酸またはその塩を製造するためのプロセス。
【請求項３０】
上記発酵槽はさらに混合器を含む、請求項１に記載の乳酸またはその塩を製造するためのプロセス。
【請求項３１】
上記混合器は、１５０ｒｐｍから４５０ｒｐｍの範囲内の速度を有する、請求項３０に記載の乳酸またはその塩を製造するためのプロセス。
【請求項３２】
上記混合器は、３００ｒｐｍの速度を有する、請求項３１に記載の乳酸またはその塩を製造するためのプロセス。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔本発明の概要〕
本発明は、耐熱性のＢａｃｉｌｌｕｓ（バチルス）細菌を用いた、発酵による乳酸またはその塩を製造するためのプロセスに関し、上記プロセスは、以下の工程を含む：
（ａ）種培養を得るために、耐熱性のＢａｃｉｌｌｕｓ（バチルス）属の細菌を培養する工程；
（ｂ）工程（ａ）から得られた種培養を、好気的条件下において、初期の炭素源を含む発酵槽へと植えつけることによって、細菌の細胞数を増加させる工程；
（ｃ）乳酸またはその塩を得るために、微好気的条件下において、上記発酵槽内において工程（ｂ）から得られた種培養を発酵させる工程；
上記工程（ｂ）は、上記炭素源の濃度を増加させるために、互いに独立した以下のいずれかの条件下における、上記炭素源の少なくとも一回の追加を含む：
発酵槽内における上記炭素源の上記濃度が、上記初期の濃度に比べて５０％以下へと減少するとき；
上記工程（ｂ）が、少なくとも３分の１の時間行われるとき；
発酵槽内における細菌細胞の光学密度（ＯＤ）が、少なくとも１０倍に増加するとき。
【０００２】
〔本発明の技術分野〕
本発明は、乳酸を製造することのできる発酵プロセスおよび細菌に関連する、バイオテクノロジーの分野に属する。
【０００３】
〔本発明の背景〕
乳酸がプラスチック産業、食品および製薬産業、および化粧品産業において広く用いられていることは、よく知られている。プラスチック産業のために、特にポリ乳酸またはポリ（乳酸‐コ‐グリコール酸）といったポリエステルの製造のために、乳酸は広く用いられている。乳酸から製造されたポリマーには、生物分解性および生物学的適合性という利点がある。上記ポリマーは、織物の繊維、フィルム、腸線縫合糸梱包、および医学における足場といった多くの用途に用いることができる。
【０００４】
現在、化学合成およびバイオテクノロジーといった、乳酸のいくつかを製造するためのプロセスが存在する。バイオテクノロジーは、キャッサバ、トウモロコシ、小麦、またはサトウキビといった、微生物による発酵によって再生可能な資源の利用を含む、いくつかの利点を有する。その上、微生物による発酵は、乳酸を高い光学的純度で製造することができる。
【０００５】
ほとんどの乳酸製造は、グルコース、スクロース、マルトースといった糖、またはデンプンもしくはセルロースといった他の炭水化物の発酵であり、乳酸を製造することのできる微生物は、細菌および真菌の両方である。
【０００６】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ（ラクトバチルス）、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ（ロイコノストック）、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ストレプトコッカス）属の細菌は、嫌気的条件下において、乳酸を製造することがよく知られており、真菌により製造された乳酸よりも、エネルギーの節約、およびより高い収率につながる。しかしながら、上記細菌の属は、気難しい（ｆａｓｔｉｄｉｏｕｓ）細菌であり、ビタミンおよび必須アミノ酸を成長に必要とする。その上、上記細菌の属は、デンプンを糖へと変換する酵素を製造することができず、発酵の前に、デンプンを糖へと変換する前処理工程が必要である。これは、製造コストを増加させる。
【０００７】
乳酸からのポリマー製造の一つの問題は、高い製造コストである。より低い製造コスト、高い収率、および高い生産性を有する乳酸製造プロセスを開発することが必要である。加えて、高い率で成長および増殖することができるロバストな微生物を製造する目的で、微生物および培養工程を開発する試みが、いくつか存在している。
【０００８】
乳酸の製造コストを減少させる試みの一つは、乳酸製造における耐熱性のＢａｃｉｌｌｕｓ（バチルス）細菌の利用といった、製造工程の減少である。これは、通常、乳酸製造の原材料は、発酵の前に前処理プロセスが必要だからである。そのような炭素源の物理的、化学的、および栄養学的性質に依存して、機械的処理、熱処理、化学的処理、または酵素処理を含む、いくつかの前処理を用いることができる。上記前処理プロセスは、一般的に、約５０℃から約１００℃の範囲内の高い温度で実行される。一般的な細菌は、上記の温度では成長することができない。したがって、そのような炭素源を乳酸製造に用いる前に、温度を室温まで減少させるための、追加の工程が必要となる。これにより、製造プロセスが複雑になり、かつより高い製造コストを招いていた。
【０００９】
したがって、Ｏｕｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，（Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２０１２，  １６８，  ２３８７−２３９７）、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２０１１，  １０２，  ８１５２‐８１５８）、およびＵＳ８１１９３７６に開示されているように、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ（バチルス  コアギュランス）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ（バチルス  アシディプロデュセンス）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（バチルス  ステアロテルモフィルス）（バチルス  ステアロテルモフィルス）およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（バチルス  リケニホルミス）（バチルス  リケニホルミス）といった、耐熱性のＢａｃｉｌｌｕｓ（バチルス）細菌を用いた、乳酸を製造するためのプロセスの開発が成されてきた。しかしながら、上記文献に開示されている乳酸の製造は、結局低い生産性および低い収率をもたらすことがわかり、このことが工業的スケールにおける乳酸製造のための制限であった。
【００１０】
乳酸の製造コストを減少させる一つの試みは、発酵により得られた乳酸の精製工程を撤廃することである。中和剤は、一つの重要な要素である。一般的に、乳酸の製造に用いられる炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）は、副生成物として、乳酸カルシウムを生成する。したがって、乳酸カルシウムを乳酸へと変換するために、硫酸（Ｈ２ＳＯ４）といった酸性溶液を用いることによる、酸性化工程がさらに必要である。このことは、製造プロセスを複雑にし、かつ高い製造コストに寄与する。その上、上記プロセスにおいては、望ましくない副生成物である、硫酸カルシウム（ＣａＳＯ４）が生じ、特に工業的スケールでの製造においては、上記物質を除去する問題につながる。
【００１１】
ＵＳ５００２８８１  およびＷＯ２００６１２４６３３は、乳酸製造における発酵の間、中和剤として水酸化アンモニウム（ＮＨ４ＯＨ）を用いることを開示する。しかしながら、水酸化アンモニウムは揮発性の化合物であり、操作員の健康にとって有害であり得る。それに加えて、水酸化アンモニウムは弱酸である；よって。ｐＨを調整するために、多くの量を用いることが必要であり、このことは、結果として分離および精製を困難にする。
【００１２】
Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ，（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２０１３，  １３２，  ３８−４４）、Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ，（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２０１０，  １０１，  ７５７０−７５７６）は、乳酸製造における発酵の間、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）および水酸化カルシウム（ＫＯＨ）といった強塩基を用いることを開示する。しかしながら、上記塩基の使用は、細菌細胞に対して負の効果を引き起こし、低い生産性および低い収率をもたらすことがわかった。
【００１３】
上述した理由から、本発明は、高い生産性および高い収率を提供するために、発酵による乳酸およびその塩を製造するためのプロセスを改善することをめざし、上記プロセスは、容易に実行することができ、複雑な工程を減少させる。
【００１４】
〔発明の詳細な説明〕
定義
本願において用いられる技術的用語または科学的用語は、別に言及しない限り、当業者によって理解される定義を有する。
【００１５】
本願で述べるいかなる道具、装置、方法、または化合物も、本発明において特に用いられる道具、装置、方法、または化合物であると別に解説し言及しない限り、当業者によって一般的に操作され、または用いられる道具、装置、方法、または化合物を意味する。
【００１６】
請求項または明細書における「含む」と共に使用される単数名詞または単数代名詞の使用は、「１つ」、かつまた「１つ以上」、「少なくとも１つ」、および「１つおよび１より大きい」を意味する。
【００１７】
本願全体を通じて、用語「約」は、本願において示すいずれの値も、変わる、または逸脱する可能性があることを示す。そのような変更または逸脱は、装置、方法、または装置もしくは方法を実施する個々の操作員の誤りによる。これらの変更または逸脱は、物理的性質の変化によって引き起こされた。
【００１８】
「微好気的条件」は、いかなる気体をさらに追加することなく、空気が制限されるよう制御されている条件を意味し、空気または不活性ガスの現存の空中からの排出を含む。
【００１９】
「炭素源の濃度」は、特に言及しない限り、特定の時間の発酵槽内といった、システム内の炭素源の濃度を意味する。
【００２０】
これから先、発明の実施形態を、本発明の範囲を限定することを目的とせずに示す。
【００２１】
本発明は、耐熱性のＢａｃｉｌｌｕｓ（バチルス）細菌を用いた、発酵による乳酸またはその塩を製造するためのプロセスに関する。上記プロセスは、以下の工程を含む：
（ａ）種培養を得るために、耐熱性のＢａｃｉｌｌｕｓ（バチルス）属の細菌を培養する工程；
（ｂ）工程（ａ）から得られた種培養を、好気的条件下において、初期の炭素源を含む発酵槽へと植えつけることによって、細菌の細胞数を増加させる工程；
（ｃ）乳酸またはその塩を得るために、微好気的条件下において、上記発酵槽内において工程（ｂ）から得られた種培養を発酵させる工程；
上記工程（ｂ）は、炭素源の濃度を増加させるために、互いに独立した以下のいずれかの条件下における、上記炭素源の少なくとも一回の追加を含む：
発酵槽内における上記炭素源の上記濃度が、上記初期の濃度に比べて５０％以下へと減少するとき；
上記工程（ｂ）が、少なくとも３分の１の時間行われるとき；
発酵槽内における細菌細胞の光学密度（ＯＤ）が、少なくとも１０倍に増加するとき。
【００２２】
一実施形態において、上記条件のいずれかにおける工程（ｂ）における炭素源の追加は、発酵槽内における炭素源の濃度を、初期の濃度に比べて７５％以上へと増加させる。上記炭素源の追加は、結果として初期の濃度よりも高い濃度となる追加を含む。
【００２３】
好ましくは、炭素源の追加は、炭素源の濃度が初期の濃度に比べて、２５％以下へと減少する条件下において実行される。
【００２４】
好ましくは、炭素源の追加は、工程（ｂ）が少なくとも２分の１の時間行われる条件下において実行される。
【００２５】
好ましくは、炭素源の追加は、発酵槽内における細菌細胞の光学密度（ＯＤ）が少なくとも１０倍から５０倍へと増加する条件下において実行される。
【００２６】
一実施形態において、工程（ｂ）における上記初期の炭素源の上記濃度は、１０ｇ／Ｌから２０ｇ／Ｌの範囲内であり得、好ましくは約１５ｇ／Ｌである。
【００２７】
一実施形態において、上記の乳酸またはその塩を製造するためのプロセスは、約４５℃から約６０℃の範囲内の温度で行われ得、好ましくは約４８℃から５２℃の温度で行われる。
【００２８】
一実施形態において、工程（ａ）における耐熱性のＢａｃｉｌｌｕｓ（バチルス）属の細菌は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ（バチルス  アシディプロデュセンス）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ（バチルス  コアギュランス）、またはこれらの細菌の混合物から選択される。
【００２９】
一実施形態において、工程（ａ）における細菌細胞の初期光学密度は、約０．２０から０．７０であり、好ましくは、０．２０から０．４０である。
【００３０】
一実施形態において、工程（ａ）は、約２時間から５時間行われ、好ましくは約３時間から４時間行われる。
【００３１】
一実施形態において、細菌培養培地は、酵母抽出物、ペプトン抽出物、牛肉抽出物、およびマメ抽出物から選択され得る、窒素源を含み得る。
【００３２】
一実施形態において、細菌培養培地および培養細胞増加培地は、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、および無水リン酸アンモニウムから選択され得る、無機窒素源を含み得る。窒素源として上記無機化合物を使用することは、それらが安く、入手可能で、かつ質を調整し得ることから、工業的スケールにおける乳酸製造において利益がある。
【００３３】
一実施形態において、工程（ｂ）は、約２時間から５時間行われ得、好ましくは、約３時間から４時間、かつ最も好ましくは約４時間行われ得る。
【００３４】
一実施形態において、工程（ｃ）は、少なくとも一回の追加の炭素源をさらに含む。
【００３５】
一実施形態において、工程（ｃ）の炭素源の濃度は、約１００ｇ／Ｌから２００ｇ／Ｌの範囲内であり、好ましくは約１００ｇ／Ｌである。
【００３６】
一実施形態において、工程（ｃ）は、塩基性溶液を使用することによって、ｐＨ６からｐＨ７となるように調整され、好ましくは塩基性溶液を使用することによって、ｐＨ６．５となるように調整される。
【００３７】
一実施形態において、塩基性溶液は、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化アンモニウム（ＮＨ４ＯＨ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、またはこれらの混合物から選択され得、好ましくは水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムから選択され得、かつ最も好ましくは水酸化ナトリウムである。
【００３８】
一実施形態において、乳酸またはその塩の製造に用いられる炭素源は、発酵性糖である。
【００３９】
発酵性糖は、自然に見つかるいかなる糖、または糖を含む物質に由来するいかなる糖でもあり得る。上記糖は、修飾、または無修飾であり得る。
【００４０】
発酵性糖は、単糖、二糖、三糖、またはそれらの混合物から選択され得るが、これらに限定されない。
【００４１】
一実施形態において、単糖は、グルコース、フルクトース、ガラクトース、またはそれらの混合物から選択され得る。
【００４２】
一実施形態において、二糖は、スクロース、ラクトース、マルトース、セロビオース、またはそれらの混合物から選択され得る。
【００４３】
一実施形態において、三糖は、ラフィノース、イソマルトトリオース、マルトトリオース、ニゲロトリオース、ケストース、またはそれらの混合物から選択され得る。
【００４４】
好ましくは、発酵性糖はグルコースである。
【００４５】
一実施形態において、工程（ｂ）および／または工程（ｃ）における発酵槽はさらに混合器を含む。
【００４６】
一実施形態において、混合器は、約１５０ｒｐｍ〜４５０ｒｐｍの範囲内の速度を有し、好ましくは３００ｒｐｍの速度を有する。
【００４７】
一実施形態において、工程（ｂ）における好気的条件から工程（ｃ）における微好気的条件への発酵槽の条件の変化は、工程（ｂ）からの残存する空気が消費されるように曝気を止めることによって、または工程（ｃ）において発酵の間窒素を追加することで空気を置き換えることによって、実行され得る。
【００４８】
一実施形態において、工程（ｃ）における発酵は、バッチ、セミバッチ、または連続式において実行され得る。
【００４９】
他の実施形態において、上記乳酸またはその塩の製造は、工程（ｃ）から得られた混合物を分離および精製する工程をさらに含む。
【００５０】
分離および精製は、遠心分離、ろ過、膜ろ過、フロキュレーション、抽出、蒸留、結晶化、ろ過、イオン交換樹脂、または電気透析から選ばれ得るが、これらに限定されない。
【００５１】
以下は、本発明に係る性質の試験であり、試験において用いられる方法および装置は、一般に用いられている方法であり、かつ本発明の範囲を限定する意図ではない。
【００５２】
グルコースおよび乳酸を、４５℃付近の温度において、Ｂｉｏｒａｄ，  Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈイオン排除有機酸（３００  ｍｍ  ｘ  ７．８  ｍｍ）を装備したＳｈｉｍａｄｚｕ、および標準シグナルと比較したシグナルを検出するために、反射指数検出器であるＳｈｉｍａｄｚｕ−ＲＩＤ−１０Ａを用いた、高速液体クロマトグラフィーによって分析する。
【００５３】
培養および発酵の間の細菌の光学密度（ＯＤ）を、波長６００ｎｍにおいて分光測光によって分析する。
【００５４】
収率は、製造された乳酸の量の、発酵の間に用いた炭素源の量に対する比率から計算する。
【００５５】
製造された乳酸の量、および発酵工程の後と細菌細胞を増加させる工程の後との間の細菌の光学密度の違いから計算される、製造された乳酸の細菌細胞ごとの収率（Ｙｐ／ｘ）は、乳酸製造における細菌細胞の有効性を表す。
【００５６】
以下の実施例は、本発明の範囲を限定せずに、本発明を説明するために提出する。
【００５７】
以下の実施例において、特に言及しない限り、細菌の培養のため、および細菌細胞を増加させるための培地は、以下の組成（１リットル毎）を有する：１０ｇグルコース、１５ｇ酵母抽出物、４ｇ塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）、５ｇ水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）２）、および２０ｍＬ塩溶液。
【００５８】
＜細菌細胞を増加させる工程における炭素源の複数回の追加＞
乳酸およびその塩の製造における細菌細胞を増加させる工程における炭素源の複数回の追加の効果を研究するために、細菌細胞を増加させる工程において炭素源を追加しないサンプルを、本発明に係る乳酸の製造方法と比較するために用いた。
【００５９】
＜比較例（細菌細胞を増加させる工程において炭素源を追加しない）＞
細菌の培養は、細菌培養培地を含むフラスコに、耐熱性のＢａｃｉｌｌｕｓ（バチルス）属を追加することによって行い、細菌の初期濃度は容積で約１％であり、初期光学密度は、約０．３〜０．４であった。サンプルを、約５０℃の温度において、約２５０ｒｐｍで３時間遠心分離し、種培養を得る。それから、種培養を、２．５Ｌの培養培地を含む５Ｌの発酵槽へと追加することによって、細菌細胞を増加させる。上記の培養培地は、初期グルコース濃度が約１５ｇ／Ｌであり、かつｐＨを約６．５へと調整するために水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）２）を含む。細菌細胞を増加させる工程は、温度約５０℃において約３時間、１ｖｖｍの曝気および３００ｒｐｍの混合下において実行する。それから曝気を止め、および約１Ｌの３５０ｇ／Ｌグルコース溶液を、発酵工程のはじめに初期グルコース濃度１００ｇ／Ｌを達成するために、発酵槽の中に追加する。発酵は、微好気的条件下において約５０℃の温度で、かつ約３００ｒｐｍの混合速度で、ｐＨを約６．５に調整するために、表１の様々な塩基性溶液を用いることによって操作する。発酵は、グルコースが検出されなくなるまで実行する。それから、生成物を、約１０，０００ｒｐｍにおいて約５分間遠心分離する。得られた生成物について、製造された乳酸および発酵の間の細菌の光学密度を分析する。
【００６０】
＜本発明に係る実施例＞
耐熱性のＢａｃｉｌｌｕｓ（バチルス）属を、細菌の初期濃度が容積で約１％、かつ初期光学密度約０．３０〜０．４０で、細菌培養培地を含むフラスコに追加する。サンプルを、約２５０ｒｐｍにおいて３時間、約５０℃の温度において遠心分離し、種培養を得る。それから、２．５Ｌの培養培地を含む５Ｌの発酵槽に種培養を追加することによって、細菌細胞を増加させる。上記の培養培地は、初期グルコース濃度が約１５ｇ／Ｌであり、かつｐＨを６．５へと調整するために水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）２）を含む。細菌細胞を増加させる工程を、温度約５０℃において約２時間、１ｖｖｍの曝気および３００ｒｐｍの混合下において実行する。それから、約０．５Ｌの９０ｇ／Ｌグルコース溶液を追加した。細菌細胞を増加させる工程を、さらに２時間操作した。それから、発酵は、微好気的条件下において約５０℃の温度で、かつ約３００ｒｐｍの混合速度で、ｐＨを約６．５に調整するために、表１の様々な塩基性溶液を用いることによって行った。発酵は、グルコースが検出されなくなるまで実行する。それから、生成物を、約１０，０００ｒｐｍにおいて約５分間遠心分離する。得られた生成物について、製造された乳酸および発酵の間の細菌の光学密度を分析する。
【００６１】
表１から、それぞれＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ（バチルス  アシディプロデュセンス）株を用いた乳酸製造である、実施例Ａ１、Ａ２、Ａ３を比較例１ａ、２ａ、および３ａと比較するとき、少なくとも一回の炭素源の追加を含む細菌細胞を増加させる工程が、より高い生産性をもたらすことが分かる。その上、本発明に係る乳酸製造は、強酸である水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウム溶液を、発酵の間ｐＨを調整するために用いることができ、かつ高い乳酸収率を引き起こすことがわかる。
【００６２】
なおその上に、それぞれＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ（バチルス  コアギュランス）株を用いた乳酸製造である、実施例Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３を比較例１ｂ、２ｂ、および３ｂと比較するとき、少なくとも一回の炭素源の追加を含む細菌細胞を増加させる工程が、結果としてより高い生産性につながることが観察され得る。このことは、炭素源を利用する効率が上がったことを示す。
【００６３】
したがって、上記の結果に関して、本発明に係る乳酸製造は、本発明の目的に示したように、耐熱性のＢａｃｉｌｌｕｓ（バチルス）属によって乳酸製造の効率を高めることができ、容易に実行することができ、かつ複雑な工程を減少することができるとまとめることができる。
【００６４】
表１：様々な条件における耐熱性のＢａｃｉｌｌｕｓ（バチルス）属による乳酸細菌製造
【００６５】
【表１】
0006778918.tif 000002
〔本発明の最良の形態〕
本発明の最良の形態は、詳細な説明中に開示した。