(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンゴ未成熟果実から抽出されるリンゴポリフェノールを有効成分とする、
カルボニル化タンパク質の産生を抑制することによる
皮膚の黄ぐすみ発生抑制剤。
【請求項２】
リンゴポリフェノールの含有量が、０．０００５〜０．１質量％である、
請求項１に記載の皮膚の黄ぐすみ発生抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアクロレイン誘導体とタンパク質、核酸などといった生体分子間の反応を抑制するアクロレイン誘導体活性抑制剤であり、その薬剤を含有する皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に生体内で生成されるアクロレイン、マロンジアルデヒド、４−ヒドロキシ−２−ノネナールといったα，β−不飽和脂肪族アルデヒド化合物は反応性が高く、生体に対して強い有害性を有し多様な症状又は疾患に関係していることが知られる。その生成経路として生体脂質の過酸化反応や塩基性生理活性物質の酵素反応などが挙げられる（非特許文献１、２）。アクロレイン（ＣＨ２＝ＣＨＣＨＯ）は生体内で生じるこのようなアルデヒド化合物の中で最も単純な構造であるが、マロンジアルデヒドや４−ヒドロキシ−２−ノネナールなどもアクロレインと同様の生体内反応を示すことがわかっている。従って、本発明では、このようなアルデヒド化合物を「アクロレイン誘導体」と総称し、アクロレイン誘導体と生体内分子との反応を抑制する物質を「活性抑制剤」と称する。
【０００３】
アクロレイン誘導体の生体に対する有害性の一例として、動脈硬化症の発症過程や脳卒中患者の血中でアクロレイン又はアクロレインの付加体が増加することが確認されている（非特許文献３、４）。またアクロレイン誘導体は生体内のあらゆる組織のタンパク質と非特異的、非酵素的に反応しカルボニル化させることも知られている（非特許文献５）。このようなカルボニル化タンパク質は内臓や脳、皮膚中など生体内の至る箇所にその存在が確認されており、カルボニル化タンパク質もまた、多様な疾患や症状に関与することが報告されている。
【０００４】
その一例として、皮膚においては真皮や角層細胞内にカルボニル化タンパク質の存在が認められている。真皮におけるカルボニル化タンパク質の過剰な蓄積は、光学的透過性の低下による皮膚色変化（黄ぐすみ）や光線性弾力線維症の重症化によるシワ形成を亢進する（非特許文献６、７）。また角層内におけるカルボニル化タンパク質の過剰な蓄積は皮膚色変化（黄ぐすみ）を引き起こすとともに、角層内の水分保持機能を低下させる（特許文献１）。視覚的な皮膚の透明感はこのような黄ぐすみによって低下することが知られており、皮膚透明感が低下した皮膚では皮膚水分量やキメの低下が起こる可能性が示されている（非特許文献８）。さらにアトピー性皮膚炎患者や乾癬患者の角層細胞にはカルボニル化タンパク質の過剰蓄積が報告されている（非特許文献９）。
【０００５】
また、アクロレイン誘導体はタンパク質のみならず核酸とも反応して付加体を形成し、核酸にダメージを与えることにより、変異原性を示す懸念が示唆されている（非特許文献１０、１１）。
【０００６】
このようにアクロレイン誘導体は種々の生体分子に作用し、生体機能を著しく低下させ老化を亢進させる。そのためアクロレイン誘導体の生成抑制、反応阻害、活性抑制が実現できれば多様な疾患、老化などの予防、緩和に大きな役割を果たすと考えられる。
【０００７】
アクロレイン誘導体から生体を守る検討においては、アクロレイン誘導体の生成を阻害する発明がすでになされている（特許文献２、３）。しかしこれらによってもアクロレイン誘導体の生成は完全に抑えられるものではないため、アクロレイン誘導体の活性を抑制する薬剤の開発が切望されている。
【０００８】
これに係る検討については、アクロレインと化学合成されたアミノ酸誘導体の反応を阻害する各種薬剤の発明がなされている（特許文献４、５）。しかしそのような薬剤が生体細胞内においても効果を示すかは不明であり、アクロレイン誘導体の活性を抑制し実際的な生体分子との反応を阻害できる薬剤の開発が望まれていた。この課題解決に向けて鋭意検討を重ねた結果、発明者らは本発明に至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第４５２６８３９号
【特許文献２】特開２００２−２８１９９９号公報
【特許文献３】特開２００２−１３８０１３号公報
【特許文献４】特許第４９４４３７２号
【特許文献５】特許第５０６３９４７号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．２０００  Ｊｕｎ  １５；２８（１２）：１６８５−９６．
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ．２００３  Ａｐｒ；３１（２）：３７１−４．
【非特許文献３】Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．２０１０  Ａｕｇ；２１１（２）：４７５−９
【非特許文献４】Ｍｏｌ  Ｎｕｔｒ  Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓ．２０１１  Ｓｅｐ；５５（９）：１３３２−４１
【非特許文献５】ＹＡＫＵＧＡＫＵ  ＺＡＳＳＨＩ  １３３（１０）１０５５−１０６３（２０１３）
【非特許文献６】Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｓｃｉ．２０１１  Ｏｃｔ；６４（１）：４５−５２．
【非特許文献７】Ａｒｃｈ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｒｅｓ．２００１  Ｊｕｌ；２９３（７）：３６３−７．
【非特許文献８】Ｊ．Ｓｏｃ．Ｃｏｓｍｅｔ．Ｃｈｅｍ．Ｊｐｎ．３９（３）２０１−２０８（２００５）
【非特許文献９】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｍａｔｏｌｏｇｙ  ２０１０；３７：６９３−６９８
【非特許文献１０】Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．２００９  Ｍａｙ；２２（５）：７９８−８０６
【非特許文献１１】Ｍｏｌ  Ｎｕｔｒ  Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓ．２０１１  Ｓｅｐ；５５（９）：１２９１−３００
【非特許文献１２】歯科医学，２０００，６３（１）：２３−３２
【非特許文献１３】株式会社アクシム、肌の弾力の測定について（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｄ−ａ．ｃｏ．ｊｐ／ｕｐｆｉｌｅ／ｐｄｆ＿１２７３８９１４９９．ｐｄｆ？ｎｏｃａｃｈｅ＝１３９１８３０９１０）
【非特許文献１４】Ｊ．Ｓｏｃ．Ｃｏｓｍｅｔ．Ｃｈｅｍ．Ｊａｐａｎ，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．１，５５−５７  （１９８９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、生体内においてアクロレイン誘導体の活性を低下させ、アクロレイン誘導体が生体に及ぼす様々な負の作用を改善、緩和する薬剤を提供すること及び、その薬剤を含有する医薬品又は医薬部外品又は化粧品等の皮膚外用剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するため、本発明者らが鋭意研究を重ねた結果、バラ科植物果実抽出物、特にリンゴ果実抽出物がアクロレイン誘導体の活性を著しく低下させ、細胞内タンパク質などの生体分子との反応を著しく抑制する作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の効果】
【００１３】
本発明ではバラ科植物果実抽出物、特にリンゴ果実抽出物にアクロレイン誘導体の活性を抑制する効果が認められた。したがって本発明のアクロレイン誘導体活性抑制剤及びその薬剤を配合した皮膚外用剤は、アクロレイン誘導体と生体分子の反応により症状が進行する脳卒中や動脈硬化などの血管疾患及び全身組織の老化（例えば皮膚においてはシワ形成や皮膚水分量低下、くすみの亢進など）に対し予防又は改善効果が期待できる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
バラ科植物果実にはイチゴ、リンゴ、ナシ、ビワ、カリンなどが挙げられるが、本発明のアクロレイン誘導体活性抑制剤はバラ科植物果実抽出物、中でもリンゴ果実抽出物であることが好ましい。
【００１５】
リンゴ果実抽出物において、リンゴ（Ｍａｌｕｓ  ｐｕｍｉｌａ）の品種にはふじ、王林、紅玉、陸奥、津軽、旭、デリシャス、ジョナゴールド、陽光などが挙げられる。リンゴ果実の抽出部位は、全果、果肉、果皮、種など特に限定されない。さらに前記果実は成熟果、未成熟果（幼果）などの成熟状態を問わないが、特に未成熟果（幼果）が望ましく、１個あたりの重量が５〜２０ｇ程度の時期に摘果されたものが特に望ましい。前記の抽出部位、及び成熟状態の抽出物を１種又は２種以上組み合わせて用いても良い。
【００１６】
リンゴ果実抽出物は、市販のリンゴ果実抽出物を用いても良いし、リンゴ果実から抽出しても良く、特に制限されない。抽出する方法についても、特に制限されず、従来公知の方法を採用できる。具体的には、以下のようであって良い。例えば、リンゴ果実を破砕、搾汁して果汁を得、それに含まれるペクチンなどの不溶性成分などを酵素分解及び濾過により除去して清澄果汁を得る。又はリンゴ果実をアルコール（エタノール、メタノール等）と混合して破砕し、そのまま浸漬及び圧搾、又は加熱還流しながら抽出し、次いで減圧濃縮によりアルコールを除去した後、遠心分離及びろ過、又は有機溶媒（ヘキサン、クロロホルム等）による分配、ろ過を行い、抽出物を得る方法などが挙げられる。抽出溶媒は、特に制限されない。
【００１７】
本発明に係る抽出物の各種皮膚外用剤に対する配合量は、皮膚外用剤の実施形態、皮膚外用剤の使用形態等に応じて変動させることができるので特に制限されない。例えば０．００００５〜１質量％、より好ましくは０．０００５〜０．１質量％である。なお、これらの値は乾燥物としての質量比である。
【００１８】
本発明のアクロレイン誘導体活性抑制剤を皮膚外用剤として用いる場合、バラ科植物果実抽出物を水溶性の溶剤に溶解したのち、水で希釈した水溶液として塗付することもできるし、医薬品または医薬部外品または化粧品として一般に使われているような形状として塗付することもできる。
【００１９】
本発明に係る皮膚外用剤の形態は特に限定されない。例えば、クリーム、乳液、化粧水、パック剤、洗顔料、ゾル、ゲル、パウダー、スプレー、固形など各種形態で適用できる。
【００２０】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２１】
（１）薬剤によるアクロレイン活性抑制
［各種素材含有試料及びアクロレイン溶液の調製］
リンゴ果実抽出物は、アップルフェノンＣ‐１００（アサヒフードアンドヘルスケア製リンゴポリフェノール）をサンプルとして用いた。また比較素材として、高い抗酸化力を有することが知られているＬ（＋）−アスコルビン酸（和光純薬製）、及びその誘導体であるリン酸アスコルビルマグネシウム（アイ・ティー・オー製）を用いた。
これら３素材をそれぞれ純水に１％となるように溶解し、これを段階希釈して各種濃度のサンプル溶液を調製した。アクロレイン試薬としては、Ａｃｒｏｌｅｉｎ  Ｍｏｎｏｍｅｒ（東京化成工業製）を用い、これを純水に０．００５％となるように溶解した。
【００２２】
［アクロレイン検出試薬の調製］
カルボニル基検出試薬である４−Ｈｙｄｒａｚｉｎｏ−７−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｚａｎ  Ｈｙｄｒａｚｉｎｅ（ＮＢＤ−Ｈ；東京化成工業）をＮ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（ＤＭＦ；和光純薬）で２５ｍＭとなるように溶解した。その後Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ＴＦＡ；ナカライテスク）を０．０５％含有する純水で、前記ＮＢＤ−Ｈ含有ＤＭＦ溶液を０．２５ｍＭに希釈した。
【００２３】
［各種素材のアクロレイン活性抑制能評価］
９６穴プレートの各ウェルに、上記の素材含有溶液２５μＬ及びアクロレイン含有溶液を５０μＬ添加し、１分間プレートシェイクした。その後、ウェル内の溶液の蒸発を防ぐためプレート表面をシールで密閉した状態で３７℃、２時間インキュベートした。その後、シールを剥がし、前述のアクロレイン検出試薬を各ウェルに２５μＬ添加し、１分間プレートシェイクした。その後プレートを常温、暗所にて３０分間静置したのち、マイクロプレートリーダーにて蛍光強度を測定した（励起波長：４７０ｎｍ、蛍光波長：５５０ｎｍ）。実験結果を図１に示す。
【００２４】
［データ処理］
３素材において、それぞれ素材を添加していない条件における蛍光強度値をアクロレイン残存率１００％とした。アクロレインの残存率は、この蛍光強度値で素材添加時の蛍光強度値を除すことにより算出した。図１のグラフに示したアクロレイン失活率は１００％からアクロレイン残存率の差をとることで算出した。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】各種素材のアクロレイン活性抑制能評価結果を示したグラフである。
【００２６】
図１の結果から、リンゴ果実抽出物は高い抗酸化力を有するＬ（＋）−アスコルビン酸及びリン酸アスコルビルマグネシウムと比較して種々の分子と反応性を示すアルデヒド基と強く反応し、アクロレインを失活させる効果が著しく高いことが示唆された。
【実施例２】
【００２７】
（２）アクロレイン処理した生体細胞での薬剤によるカルボニル化タンパク質産生抑制
［リンゴ果実抽出物及びアクロレイン含有培養液の調製］
リンゴ果実抽出物としてはアップルフェノンＣ−１００（アサヒフードアンドヘルスケア製リンゴポリフェノール）、アクロレイン試薬としてはＡｃｒｏｌｅｉｎ  Ｍｏｎｏｍｅｒ（東京化成工業製）を用いた。５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ変法イーグル培地「ニッスイ」（ＤＭＥＭ、日水製薬製）に、アクロレインを終濃度０．０００５％となるよう添加した。このアクロレイン含有培地にリンゴ果実抽出物を各種濃度で溶解し、リンゴ果実抽出物及びアクロレイン含有培養液を作製した。
【００２８】
［不死化ヒト表皮細胞株の培養とリンゴ果実抽出物及びアクロレイン含有培養液での培養］
不死化ヒト表皮細胞株ＨａＣａＴを９６穴プレートに５×１０４／ｗｅｌｌで播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて２４時間培養した。培養液を廃棄し、細胞をＰＢＳ（−）液で洗浄後、前記リンゴ果実抽出物及びアクロレイン含有培地を各ウェルに１００μＬ添加し、さらに２４時間培養した。
【００２９】
［細胞内のカルボニル化タンパク質量評価］
前記の培養液を廃棄し、細胞をＰＢＳ（−）液で洗浄後、−２０℃の冷メタノールを各ウェルに１００μＬ添加し−２０℃で５分間冷却し細胞を固定した。メタノールを廃棄し、細胞をＰＢＳ（−）液で洗浄後、２０μＭＦＴＳＣを含有する０．１Ｍ  ＭＥＳ−Ｎａ（ｐＨ５．５）を各ウェルに１００μＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて１時間静置した。ウェル内の溶液を廃棄し、各ウェルに１００μＬのＰＢＳ（−）液を添加し、マイクロプレートリーダーで蛍光測定した（励起波長：４９２ｎｍ、蛍光波長：５１６ｎｍ）。
【００３０】
［細胞内の総タンパク質量評価］
ウェル内の溶液を破棄し、各ウェルに０．５％オクチルフェノールエトキシレート（和光純薬）溶液を５０μＬ添加し、細胞内タンパク質を溶解した。その後ＴａＫａＲａ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）の調製液をウェルに５０μＬ添加し３７℃で１０分インキュベートし、マイクロプレートリーダーで吸光度を測定した（吸光波長：５５０ｎｍ）。ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、ＳＩＧＭＡ）換算でタンパク量を算出した。実験データをまとめたものを表１に示す。
【００３１】
［データ処理］
表１はアクロレイン及び各種濃度のリンゴ果実抽出物をＨａＣａＴ細胞に作用させたときの細胞内の総タンパク質量平均値の比（ｒａｔｉｏ％）とｔ検定値（ｐ）を示す。表２はアクロレイン及び各種濃度のリンゴ果実抽出物をＨａＣａＴ細胞に作用させたときの細胞内の総タンパク質量におけるカルボニル化タンパク質量平均値の割合の比（ｒａｔｉｏ％）とｔ検定値（ｐ）を示す。すなわち、前述の［細胞内のカルボニル化タンパク質量評価］で得た値を［細胞内の総タンパク質量評価］で得た値で除した値の比である。群間における有意差の有無については表１と同様なスチューデントのｔ検定値（ｐ）を用いて判定し、ｐ＜０．０５を有意差あり（＊）とした。
【００３２】
【表１】
0006681064.tif 000002
【００３３】
【表２】
0006681064.tif 000003
【００３４】
表１の結果から、今回検討した濃度においてアクロレイン及びリンゴ果実抽出物を作用させた細胞に毒性は生じなかった。さらに表２に示したように、リンゴ果実抽出物は細胞内の総タンパク量に占めるカルボニル化タンパク質の割合を有意に低下させる結果であった。
【００３５】
以上の結果から、リンゴ果実抽出物はアクロレイン誘導体の活性を著しく抑制する効果を有し、アクロレイン誘導体に起因する細胞内タンパク質のカルボニル化反応を有意に阻害する効果を示した。すなわち、リンゴ果実抽出物は生体に対し高い安全性を担保できる濃度において、アクロレイン誘導体と種々の生体分子との反応を阻害する効果が極めて高い薬剤であることが示唆された。したがってこの薬剤を含有する皮膚外用剤においても同様の効果が期待できると考えられる。
【００３６】
以下に本発明を利用した皮膚外用剤の処方例を挙げる。
【実施例３】
【００３７】
（皮膚外用剤の調製）
以下の実施例３および比較例３における表内の配合量は特に断らない限り質量％を示す。
皮膚用クリームの調製（表３、実施例３）
（１）流動パラフィン                                        ６．０（質量％）
（２）ミリスチン酸イソプロピル                              ３．０
（３）シクロペンタシロキサン                                ２．５
（４）ジメチコン                                            ２．０
（５）ベヘニルアルコール                                    ３．４
（６）ワセリン                                              ２．０
（７）ステアリン酸ソルビタン                                １．５
（８）セテス−２０                                          ３．４
（９）トコフェロール                                        ０．０２
（１０）クエン酸                                            ０．０５
（１１）１，３−ブチレングリコール                          １．０
（１２）メチルパラベン                                      ０．１５
（１３）プロピルパラベン                                    ０．０７
（１４）ジプロピレングリコール                              １．９
（１５）リンゴ未成熟果実抽出物                              ０．００３
（１６）精製水                                                残部
【００３８】
（製造方法）
上記原料（１）〜（９）を混合し、遮光し、８０℃で加熱撹拌した。・・・油相
他方、（１０）〜（１６）を混合し、８０℃で加熱撹拌した。・・・水相
遮光した状態で８０℃で油相を撹拌しながら、水相を添加し、ホモジナイザーで均一に乳化した。全行程は、遮光して行うのが望ましく、また、遮光して保存することが望ましい。リンゴ未成熟果実抽出物は着色しやすいので遮光下としたが、遮光せず行うことも可である。
【００３９】
（比較用クリーム（表３、比較例３）の調製）
前述の皮膚用クリームの調製と、リンゴ未成熟果実抽出物を加えないことを除けば全く同様にして、比較用クリーム（表３、比較例３）を製造した。製造時と保存時の遮光も、実施例と全く同様にした。
【００４０】
（皮膚外用剤の効果確認試験）
２０代から５０代までのボランティア女性によって、実施例３と比較例３（対照群）とで、あまり年代に偏りのない評価パネルを実施例１５人（平均年齢３５歳）、比較例１４人（平均年齢３６歳）で構成した。
【００４１】
調製した実施例３のクリームと比較例３のクリームを両目下部に塗った以外は普段と同じ化粧をし、普段と同じ生活を８週間行った。ただし、意図的な日光浴など、紫外線に激しく晒される行動は避けた。
【００４２】
肌のハリについて、試験前後に目下部肌の反発力を測定し、ヒステリシス曲線で囲まれる面積を比較した（非特許文献１２、１３）。
肌のキメについて、試験後にテープストリッピング法（非特許文献１４）で両目下部の角層最外層を採取し、前後の状態変化を調べた。
パネルには、試験の目的を説明し、日光浴を避けるなどの注意事項を周知したが、各メンバーが実施例に相当するか比較例に相当するかは明かさなかった。
【００４３】
肌のハリと弾力について明確に区別することは困難であるが、最低限の微細押しこみ量に対する反発力をハリとして測定した。ヒステリシス曲線で囲まれる面積が小さいほどハリがあると判断される。
各人について、試験前後の面積比を求め、平均を出した。
【００４４】
肌のキメの評価は以下の様に行った。
角層標本の観察面積は２．４平方ｃｍとした。
一標本当り、重なり合っていない角層細胞のうち、大きい方から５個の細胞を選び、その面積の総和を測定した。各人について、試験前後の総和の比を計算した。一般に、角層面積が大きいほどキメがよいと判断される。
【００４５】
結果を表３に示した。
実施例３と比較例３で、肌特性のハリとキメについて改善効果が認められた。また、何ら負の差異は認められなかった。
【００４６】
【表３】
0006681064.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明のアクロレイン誘導体活性抑制剤は、生体に対し高い安全性を担保できる濃度においてアクロレイン誘導体と種々の生体分子との反応を抑制することを可能とする。これを皮膚外用剤に応用することで皮膚のハリやキメ等の改善効果が期待でき、また食品等に応用すれば動脈硬化や脳卒中等の様々な疾患に対しても効果が期待できる。従って本薬剤はアクロレイン誘導体が関与する症状、疾患の改善に幅広く利用できるものと期待される。
【図１】
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