(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳がん幹細胞のスフィア形成を阻害することを特徴とする抗がん剤であって、MICAL3タンパク質の発現を阻害するsiRNAもしくはshRNA、又はMICAL3タンパク質に対する抗体である、抗がん剤。
【請求項２】
乳がん幹細胞のスフィア形成を阻害することを特徴とする抗がん剤であって、Numbタンパク質の発現を阻害するsiRNAもしくはshRNA、又はNumbタンパク質に対する抗体である、抗がん剤。
【請求項３】
乳がん幹細胞にMICAL3タンパク質またはそのモノオキシゲナーゼ活性を有する断片をコードするDNAを導入することによって得られる、MICAL3タンパク質またはそのモノオキシゲナーゼ活性を有する断片を過剰発現する、スフィア形成能の上昇した単離された乳がん幹細胞。
【請求項４】
抗がん剤のスクリーニング方法であって、
単離された乳がん幹細胞でMICAL3タンパク質の発現を上昇させ、
MICAL3タンパク質の発現が上昇した細胞を候補薬剤と接触させ、
候補薬剤の非存在下と比較した該細胞のスフィア形成能の低下の有無を検出する
ことを含む、上記スクリーニング方法。
【請求項５】
MICAL3タンパク質の発現の上昇がセマフォリン3A刺激、又はMICAL3タンパク質もしくはそのモノオキシゲナーゼ活性を有する断片をコードするDNAの導入によるものである、請求項４記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
更にヒト乳がん細胞を移植した異種移植モデルにおける造腫瘍能の候補薬剤による阻害を確認することを含む、請求項４又は５記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規抗がん剤、及び抗がん剤のスクリーニング方法に関し、より詳細には、がん幹細胞のスフィア形成を阻害することを特徴とする抗がん剤、及びMICAL3過剰発現細胞系を用いたスフィア形成能の阻害等を指標とするスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
増殖因子のシグナル伝達は、生命現象の様々な局面で重要な役割を果たすのみならず、がんをはじめとする疾病の発症と進展においても重要な役割を担っていることはよく知られている。近年、がん幹細胞説が唱えられ、乳がんなど固形がんにおいても、がん幹細胞様の細胞からがん組織が構築されていると考えられるようになった。そして、ヒトES細胞やiPS細胞ならびに正常の神経幹細胞などの組織幹細胞の増殖や維持のみならず、がん幹細胞の維持にも増殖因子が重要であることがわかってきた。
【０００３】
正常の組織幹細胞を解析する際、培養皿中で幹細胞の性質を保ったまま培養できる手法として、スフィア培養が広く用いられている（非特許文献１）。通常、神経組織や乳腺組織などの上皮組織の細胞を一定以下の密度にすると、ほとんどの分化した細胞は死滅するが、幹細胞とその娘細胞である一部の前駆細胞は生きながらえる。これを増殖因子の入った培地で培養すると、一個の幹細胞から分裂した細胞塊「スフィア」を形成してくる。通常、幹細胞の培養は、増殖因子として上皮成長因子(EGF)と塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)に、いくつかのホルモンを加えたカクテルを添加して行われている。例えば乳がん幹細胞によるスフィア（マンモスフィア）の形成・培養のためには、EGF、bFGF、及びB27（登録商標）サプリメントを含む培地が適しているとして用いられている（非特許文献２及び３）。
【０００４】
本発明者等のグループは、ヒト乳がんの臨床検体由来のがん細胞を用いて、増殖因子のカクテルではなく、単独の増殖因子によって、スフィア培養可能な系を確立している。この方法は、EGF受容体(EGFR)/HER/ErbBファミリー分子のうち、HER3/ErbB3に結合する増殖因子であるヘレグリン（Heregulin：HRG）を用い、これ単独でスフィア培養ができるというものである。そして、がん幹細胞様の性質をもつ細胞のみが、スフィアを形成するということが示された（非特許文献４）。
【０００５】
一方、がんの治療において、近年では分子標的治療という考え方が広がってきている。例えば、成人女性に多くみられる乳がんは、現在では細胞表面の受容体の有無等に基づいて、いくつかのサブタイプに分類され、それによって治療の選択も異なるようになってきている。このうち、HER2（Human epidermal growth factor receptor 2）陽性の乳がんは、抗HER2抗体であるトラスツズマブ等の投与により、良好な治療効果があることが報告されている。従って、乳がんの治療には、その患者の乳がんのサブタイプによって、外科的手術、放射線治療の他に、ホルモン療法、抗がん剤療法、トラスツズマブ等の抗HER2療法等が選択されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Okano, H. Journal of neuroscience research 69, 698-707 (2002)
【非特許文献２】Dontu G. et al., Genes Dev. 17: 1253-1270, (2003)
【非特許文献３】Ginestier C. et al., Cell Stem Cell 1: 555-567, (2007)
【非特許文献４】Hinohara, K., et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109, 6584-6589 (2012)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
医学の発展により、早期に発見された乳がんでは生存率は非常に高くなっているが、乳がんはリンパ節等に転移しやすく、また再発の可能性もある。
【０００８】
また、乳がんのサブタイプによって、その増殖能力に違いがあるため、またがん幹細胞自体は増殖能が低いため、増殖能の高い細胞を標的とする療法では効果が十分でない場合があり、その結果再発につながる可能性が高くなる。
【０００９】
従って、初発がんの治療だけでなく、がんの転移・再発を防ぎ、根治するためには、がん幹細胞を標的とし、がん幹細胞を死滅させる治療を行わなければならない。しかし、このような治療のために有効な治療薬は、現時点ではまだ得られていない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記した通り、本発明者等は、乳がん培養細胞系であるMCF7細胞を使用して、ヘレグリンの刺激によってスフィア形成させる系を確立している。この系において、重要な転写因子としてNFκBに着目し、それによって発現が制御されると考えられるタンパク質を網羅的に解析した。
【００１１】
その結果、これまでがん幹細胞との関連については報告されていないMICAL3タンパク質の発現が上昇することを確認した。この結果に基づき、本発明者等は、神経細胞においてセマフォリン3Aをリガンドとするパスウェイにおける役割が報告されているMICAL3タンパク質のがん幹細胞における機能を詳細に解析した。
【００１２】
その結果、驚くべきことに、乳がん幹細胞において、セマフォリン3Aの刺激によってMICAL3の活性が上昇し、かつがん幹細胞によるスフィア形成が促進されることを見出した。同時に、MICAL3の発現、並びにその発現上昇に基づいて生じる細胞内の変化を遮断することで、スフィア形成を抑制し、結果的に抗がん効果が得られることを見出した。更に、スフィア形成能が低い細胞系においても、そのスフィア形成能を高めることで、より抗がん剤の候補薬剤の検出に適したスクリーニング系を確立することができた。
【００１３】
すなわち、本発明は以下を提供するものである。
１．がん幹細胞のスフィア形成を阻害することを特徴とする抗がん剤であって、MICAL3タンパク質の発現、CRMP2タンパク質の二量体化若しくはリン酸化、及び／又はNumbタンパク質の発現を阻害することを特徴とする、抗がん剤。
２．MICAL3タンパク質又はNumbタンパク質の発現を阻害するsiRNAもしくはshRNA、又はMICAL3タンパク質又はNumbタンパク質に対する抗体である、上記１記載の抗がん剤。
３．セマフォリン3A刺激、またはMICAL3の過剰発現によってがん幹細胞のスフィア形成能を高める方法。
４．がん幹細胞にMICAL3タンパク質またはそのモノオキシゲナーゼ活性を有する断片をコードするDNAを導入することによって得られる、MICAL3タンパク質またはそのモノオキシゲナーゼ活性を有する断片を過剰発現する、スフィア形成能の上昇した単離されたがん幹細胞。
５．抗がん剤のスクリーニング方法であって、
単離されたがん幹細胞でMICAL3タンパク質の発現を上昇させ、
MICAL3タンパク質の発現が上昇した細胞を候補薬剤と接触させ、
候補薬剤の非存在下と比較した該細胞のスフィア形成能の低下の有無を検出する
ことを含む、上記スクリーニング方法。
６．抗がん剤のスクリーニング方法であって、
単離されたがん幹細胞でMICAL3タンパク質の発現を上昇させ、
MICAL3タンパク質の発現が上昇した細胞を候補薬剤と接触させ、
候補薬剤の非存在下と比較した該細胞におけるCRMP2の二量体形成及び／又はリン酸化の減少を検出する
ことを含む、上記スクリーニング方法。
７．MICAL3タンパク質の発現の上昇がセマフォリン3A刺激、又はMICAL3タンパク質もしくはそのモノオキシゲナーゼ活性を有する断片をコードするDNAの導入によるものである、上記５又は６記載のスクリーニング方法。
８．更にヒトがん細胞を移植した異種移植モデルにおける造腫瘍能の候補薬剤による阻害を確認することを含む、上記５〜７のいずれか記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、増殖能の低いがん幹細胞のスフィア形成を阻害する新たな抗がん剤の提供が可能となった。また、本発明のスクリーニング方法を用いれば、同様のメカニズムで抗がん作用を有する更なる薬剤の提供も可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Ａ：HRG-PI3 キナーゼパスウェイの模式図を示す。Ｂ：ヘレグリン(HRG)の刺激により発現が上昇するタンパク質のスクリーニングのためのプロセスを示す。乳がん細胞株MCF7細胞を、血清飢餓状態で１４時間培養後、LY294002(1μM)もしくはDHMEQ(1μg/ml)で処理し、その２時間後にヘレグリン(100ng/ml)にて細胞を刺激した。その後、１時間おきに１６時間後まで細胞を回収して全RNAを抽出し、時系列DNAマイクロアレイ解析を行った。
【図２】ヘレグリン刺激後のMICAL3のmRNA発現の時系列パターンを示す。D：DHMEQ処理のみ、H：HRG刺激のみ、HD：HRG刺激＋DHMEQ処理、HLY：HRG刺激＋LY294002処理、LY：LY294002処理のみ、N：無刺激＋無処理。縦軸は、DNAマイクロアレイ解析にて得られた発現値、横軸はHRG刺激後の時間を示す。
【図３】セマフォリン3A添加によるMCF7細胞のスフィア形成能の上昇を示す。データは、平均値±標準偏差(SD)で表す。
【図４】セマフォリン3Aによって誘導されるMCF7細胞のスフィア形成能がMICAL3のノックダウンにより低下することを示す。Ａ：siRNAの存在によるMICAL3のmRNAの発現量の低下（定量リアルタイム(qRT)-PCR）、並びに抗MICAL3抗体（Santa Cruz）を用いたMICAL3のノックダウンの確認（ウェスタンブロット）を示す。Ｂ：セマフォリン3A 200ng/mlの添加によって誘導されるMCF7細胞のスフィア形成がMICAL3を標的とするsiRNAによって阻害されることを示す。データは、平均値±標準偏差(SD)で表す。
【図５】MICAL3のノックダウンにより、各種乳がん細胞株のスフィア形成能が低下することを示す。Ａ：MCF7細胞（ルミナルタイプ）、Ｂ：BT474細胞（ルミナルタイプ）、Ｃ：BT20細胞（ベーサルタイプ）、Ｄ：MM436細胞（ベーサルタイプ）。細胞は、スフィア培養培地(SCM)(bFGF+EGF+B27)中、もしくはダルベッコ改変イーグル培地／栄養混合物F-12 (DMEM/F-12)中にHRG (200ng/ml)を添加した培地中で培養した。４〜７日後、スフィアの直径が>75μmのものを数えた。データは、平均値±標準偏差(SD)で表す。定量値の比較は、対照siRNAに対してstudent testにて行った。p<0.01-0.05 (*), p<0.001-0.01 (**) もしくはp<0.001(***) を有意とした。
【図６】MICAL3に対するsiRNA（#09及び#11）を用いたMICAL3のノックダウンにより、乳がん臨床検体由来の初代培養細胞のスフィア形成能が低下することを示す。Ａ：患者No.50（ルミナルＡタイプ）、Ｂ：患者No.76（トリプルネガティブタイプ）。細胞は、スフィア培養培地(SCM)(bFGF+EGF+B27)中で培養した。データは、平均値±標準偏差(SD)で表す。定量値の比較は、対照siRNAの存在下でSCM中で培養した場合に対してstudent testにて行った。p<0.01-0.05 (*), p<0.001-0.01 (**) もしくはp<0.001(***) を有意とした。NTは、SCM未添加で培養した場合の結果を示す。
【図７】乳がん臨床検体由来の異種移植(PDX)モデルにおいて、MICAL3のノックダウンにより造腫瘍能(tumor initiating ability)が低下することを示す。
【図８】MICAL3タンパク質のドメイン構造を示す。MICAL3（NP_056056）はN末にモノオキシゲナーゼドメインを、C末にRab結合ドメインを有している。以下の実験では、MICAL3-WT(BAG10388)、モノオキシゲナーゼドメイン中のアミノ酸配列GXGXXG（配列番号１１）のグリシンをトリプトファンに置換した変異体MICAL3-3G3W（アミノ酸配列WXWXXW（配列番号１２）を有する）、及びRab結合ドメインを欠失したMICAL3-N1を用いる。
【図９】MCF7細胞においてMICAL3を過剰発現させるとスフィア形成能が上昇し、3G3W変異体を発現させるとスフィア形成能が阻害されることを示す。データは、平均値±標準偏差(SD)で表す。定量値の比較は、対照ベクターEGFP-C1に対してstudent testにて行った。p<0.01-0.05 (*), p<0.001-0.01 (**) もしくはp<0.001(***) を有意とした。
【図１０】セマフォリン3A刺激によるCRMP2の二量体形成、及びshMICAL3（#01及び#02）を用いたMICAL3のノックダウンによる二量体形成の抑制を示す。セマフォリン3A刺激後のMCF7細胞のライセートを抽出し、抗CRMP2抗体(IBL)にてウエスタンブロットを行った。
【図１１】セマフォリン3A刺激によるNumb発現の上昇、及びsiMICAL3（#09及び#11）を用いたMICAL3のノックダウンによるNumbの発現上昇の抑制を示す。セマフォリン3A刺激後のMCF7細胞のライセートを抽出し、抗Numb抗体にてウエスタンブロットを行った。
【図１２】SCM又はセマフォリン3Aによって誘導されるMCF7細胞のスフィア形成能がNumbのノックダウンにより低下することを示す。
【図１３】本発明者等が見出した新たなシグナル伝達パスウェイを模式図で示す。セマフォリン3A刺激によって活性が上昇するMICAL3は、そのモノオキシゲナーゼ活性を介して乳がん細胞のスフィア形成能並びに造腫瘍能を上昇させる。MICAL3の発現上昇により、モノオキシゲナーゼ活性依存性にCRMP2が二量体化を起こし、微小管の脱重合をおこし、更に、MICAL3依存性に、非対称細胞分裂に重要な役割を果たすNumbの発現が上昇する。MICAL3は、セマフォリン3A刺激によらないスフィア形成や、造腫瘍能にも関与するため、がん幹細胞の維持に普遍的に関与すると考えられる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
ヘレグリン（HRG）は、HER3/ErbB3に結合する増殖因子である。増殖因子が結合すると受容体がホモ二量体もしくはヘテロ二量体を形成し、細胞内チロシンキナーゼが活性化してシグナル伝達を行う。HER2/HER3のヘテロ二量体は、PI-3 キナーゼ-Aktパスウエイを活性化することが知られており、AktによってNFκBが活性化される（図１Ａ）。本発明者等は、HRGは、PI-3 キナーゼ-Akt-NFκBパスウェイの活性化を介して、スフェア形成を誘導することを見出している。
【００１７】
増殖因子により制御される遺伝子発現は、時間経過にともない、様々な発現パターンを示す。そこで本発明者等は、HRG刺激により様々な発現パターンをとりうる遺伝子を網羅的に同定するため、乳がん細胞をHRG刺激した後、１時間おきに16時間までRNAを取り出し、DNAマイクロアレイ解析を行った。同時に、PI-3 キナーゼ阻害剤LY294002あるいはNFκB阻害剤DHMEQ（デヒドロキシメチルエポキシキノマイシン）で処理した後にHRG刺激を行った細胞からもRNAを取り出した。得られたデータから、HRG刺激により発現上昇するが、阻害剤処理によってこの発現上昇が抑制される遺伝子群を抽出した（図１Ｂ）。
【００１８】
解析の結果、HRG刺激によって発現の上昇した遺伝子は、5時間までに発現が上昇した252遺伝子、及び0-16時間を通して発現が上昇した592遺伝子であり、合わせて635遺伝子であった。
【００１９】
上記の遺伝子のうち、本発明者等は、MICAL3（microtubule associated monoxygenase, calponin and LIM domain containing 3）に注目した。MICAL3は、NCBI参照配列NP_056056.2を有するアミノ酸2002個からなるタンパク質であり、N-末端にモノオキシゲナーゼドメイン（NCBI参照配列NP_056056.2における2〜494アミノ酸）を有するマルチドメインのシグナル伝達タンパク質として知られ、また形質膜への小胞融合に関与するいくつかのタンパク質と相互作用すること、更に細胞骨格の解離への関与等も知られている。
【００２０】
主に神経細胞において、セマフォリン3Aの刺激により、MICAL1のN末のモノオキシゲナーゼが活性化し、それによってCRMP2（コラプシン反応媒介タンパク質（collapsin response mediator protein 2））が二量体化することが報告されている（Science Signaling, vo. 4, ra26. doi: 10.1126/scisignal.2001127）。MICAL3のC末には、Rabタンパク質が結合し、小胞体を介した輸送に関わっている。
【００２１】
一方、セマフォリン3Aは、神経軸索の反発性因子であり、神経軸索末端に存在する受容体に結合すると、軸索が反発してセマフォリン濃度の低い方向へ軸索を導くことが知られている。セマフォリンシグナリングの細胞生物学的な機能は細胞骨格の再構成と細胞接着の調節であると考えられてきた。神経系においては神経回路形成や軸索伸長制御における役割が知られている。
【００２２】
本発明は、がん幹細胞のスフィア形成を阻害することを特徴とする抗がん剤であって、MICAL3タンパク質の発現、CRMP2タンパク質の二量体化若しくはリン酸化、及び／又はNumbタンパク質の発現を阻害することを特徴とする、抗がん剤を提供する。がん幹細胞としては、乳がん幹細胞、肝がん幹細胞、大腸がん幹細胞、肺がん幹細胞等が挙げられ、特に限定するものではない。本発明において好適ながん幹細胞の一態様は、乳がん幹細胞である。
【００２３】
本発明の抗がん剤は、がん幹細胞のスフィア形成を阻害することを特徴とする。従って、増殖能の高い細胞を標的とする抗がん剤と異なるメカニズムで作用するため、従来の抗がん剤では効果が十分でないがんに対して効果を発揮する。従って、本発明の抗がん剤は、単独で使用することもできるが、異なるメカニズムの抗がん剤及び抗がん治療と組み合わせて使用することができる。
【００２４】
従って、本発明の抗がん剤は、単独又は他の有効成分と組み合わせて、医薬組成物の形態とすることができる。本発明の抗がん剤又は医薬組成物は、局所投与又は全身投与することができ、投与形態を限定するものではないが、例えば乳がん治療の場合には、患部若しくは患部の近辺に注射又は注入により投与することが好ましい。医薬組成物には、本発明の抗がん剤及び他の有効成分の他に、投与形態に応じて、当分野で通常使用される担体、賦形剤、緩衝剤、安定化剤等を含めることができる。本発明の抗がん剤の投与量は、患者の体重、年齢、疾患の重篤度等に応じて変動するものであり、特に限定するものではないが、例えば0.0001〜1mg/kg体重の範囲で１日１回〜数回、２日毎、３日毎、１週間毎、２週間毎、毎月、２カ月毎、３カ月毎に投与することが可能である。
【００２５】
尚、本発明の抗がん剤は、生体内にスフィア形成を阻害するものであるが、例えばin vitroにおいて人為的に生じさせるスフィア形成を阻害することもできる。スフィア形成を人為的に生じさせるものとして、当業者に知られているスフィア培養培地(SCM)中での培養、ヘレグリンでの刺激、及び本発明者等が見出したセマフォリン3Aでの刺激等が挙げられるが、本発明の抗がん剤はこれらの培養又は刺激によって生じたスフィア形成を有意に阻害することができる。
【００２６】
本発明者等が見出した新たな抗がん剤は、例えばMICAL3タンパク質又はNumbタンパク質の発現を阻害するsiRNAもしくはshRNA、又はMICAL3タンパク質又はNumbタンパク質に対する抗体である。
【００２７】
上記の通り、MICAL3は、NCBI参照配列NP_056056.2を有するアミノ酸2002個からなるタンパク質であり、mRNA配列はNCBI参照配列NM_015241を有する（9471bp）。また、Numbタンパク質は、NCBI参照配列NP_001005743.1を有する651アミノ酸の配列であり、mRNAはNCBI参照配列NM_001005743.1を有する（3647bp）。当業者であれば、容易に入手できるこれらの配列情報に基づいて、これらのタンパク質の発現を阻害するsiRNA及びshRNA、及び抗体を、容易に合成することができる。あるいはまた、特定の標的タンパク質の発現を抑制又は阻害するsiRNA及びshRNA、及び抗体は、例えばDharmacon、Invitrogen等の供給業者から市販品を入手することもできる。
【００２８】
siRNA及びshRNAは、RNA干渉と呼ばれるメカニズムにより、特定のmRNAを標的として、その翻訳を阻止することが知られている。標的配列の塩基数は特に限定されず、15〜500塩基の範囲で選択され得る。siRNAは、短鎖二本鎖RNA分子であり、shRNAは、生体内でダイサーによってプロセシングされてsiRNAを生成することができるヘアピン型RNAである。siRNA及びshRNAは、例えばリポフェクタミン等のトランスフェクション試薬と共に、in vitro又はin vivoで細胞内に導入することができる。あるいはまた、siRNA及びshRNAは、細胞内でこれらを生成することができるようにDNAの形態でベクターに組み込んで細胞内に導入することができる。
【００２９】
当業者であれば、siRNA及びshRNAの設計及び選択は、標的配列の情報等に基づいて容易に得ることができる。従って、特に限定するものではないが、例えば本発明者等が実施例において使用したものとして、MICAL3に対するsiRNAとして、配列番号１及び／又は２に示すヌクレオチド配列を標的として設計されるsiRNA、shRNAとして配列番号３〜１０に示すヌクレオチド配列を有するDNAの導入によって生体／細胞内で生じるshRNA、Numbに対するsiRNAとして配列番号１３〜１６に示すヌクレオチド配列を有するsiRNAを挙げることができる。
【００３０】
MICAL3タンパク質又はNumbタンパク質に対する抗体は、当分野において通常使用されている方法によって、MICAL3タンパク質又はNumbタンパク質を抗原として作製することができる。抗体は、ヒト化抗体又はヒト抗体とすることができるが、ヒト抗体であることがより好ましい。
【００３１】
MICAL3の発現もしくは活性の阻害のためには、特にMICAL3のモノオキシゲナーゼドメインを標的とすることが好ましい。
【００３２】
CRMP2は、NCBI参照配列NP_001184222を有するアミノ酸677個からなるタンパク質であり、mRNA配列はNCBI参照配列NM_001197293を有する（4655bp）。CRMP2タンパク質の二量体化若しくはリン酸化を阻害する薬剤も、がん幹細胞のスフィア形成を阻害することができる本発明の抗がん剤である。CRMP2タンパク質の二量体化若しくはリン酸化は、例えばMICAL3に対するsiRNA及びshRNAによって阻害される。
【００３３】
本発明は、新たな抗がん剤のスクリーニング方法をも提供するものであり、そのためには、スクリーニングのためにより適した細胞系を提供する必要がある。スフィア形成を指標として抗がん剤のスクリーニングを行うためには、使用する細胞系が適切なスフィア形成能を有する必要がある。しかしながら、例えば乳がん細胞系のMCF7細胞のスフィア形成能は他の細胞系と比較して低く、検出するためにはサンプル中の細胞数を多くしたり、インキュベーション時間を長くしたりする必要があった。従って本発明はまた、セマフォリン3A刺激、またはMICAL3の過剰発現によってがん幹細胞のスフィア形成能を高める方法を提供する。
【００３４】
本発明はまた、がん幹細胞にMICAL3タンパク質またはそのモノオキシゲナーゼ活性を有する断片をコードするDNAを導入することによって得られる、MICAL3タンパク質またはそのモノオキシゲナーゼ活性を有する断片を過剰発現する、スフィア形成能の上昇した単離されたがん幹細胞を提供する。抗がん剤のスクリーニングのために適したがん幹細胞のスフィア形成能は、例えば5,000個/mlの濃度のがん幹細胞を例えば５〜７日間培養して、10〜100個／ml程度のスフィア（例えば直径が>50μm、>75μm、又は>100μmとして）の形成が観察されるものであれば良い。スフィア形成能は、培養開始時点で単一の細胞から形成されるスフィアを形成するものであり、スフィア形成を観察可能な系であれば上記の範囲に限定されるものではない。
【００３５】
本発明は更に、抗がん剤のスクリーニング方法であって、
単離されたがん幹細胞でMICAL3タンパク質の発現を上昇させ、
MICAL3タンパク質の発現が上昇した細胞を候補薬剤と接触させ、
候補薬剤の非存在下と比較した該細胞のスフィア形成能の低下の有無を検出する
ことを含む、上記スクリーニング方法を提供する。
【００３６】
本発明は更に、抗がん剤のスクリーニング方法であって、
単離されたがん幹細胞でMICAL3タンパク質の発現を上昇させ、
MICAL3タンパク質の発現が上昇した細胞を候補薬剤と接触させ、
候補薬剤の非存在下と比較した該細胞におけるCRMP2の二量体形成及び／又はリン酸化の減少を検出する
ことを含む、上記スクリーニング方法を提供する。
【００３７】
上記のスクリーニング方法において、MICAL3タンパク質の発現の上昇は、例えばスフィア培養培地(SCM)中での培養、ヘレグリンでの刺激、セマフォリン3A刺激、又はMICAL3タンパク質もしくはそのモノオキシゲナーゼ活性を有する断片をコードするDNAの導入によって実現することができる。
【００３８】
CRMP2の二量体の形成は、例えばCRMP2単量体のそれぞれに蛍光タンパク質を結合させ、それらの二量体形成の有無による蛍光の変動を検出することによって確認することができる。
【００３９】
細胞のスフィア形成能の低下、及び細胞におけるCRMP2の二量体形成及び／又はリン酸化の減少は、細胞と薬剤との相対的な比率、培養時間、MICAL3タンパク質の発現の度合い等によって変動するものであり、またin vitroのスクリーニング方法においては完全な阻害である必要はない。従って、候補薬剤の非存在下と比較して10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50%以上の低下又は減少であれば良い。
【００４０】
上記のスクリーニング方法は更に、ヒトがん細胞を移植した異種移植モデルにおける造腫瘍能（tumor initiating ability）の候補薬剤による阻害を確認することを含むものとすることができる。スフィア形成は、がん幹細胞からの腫瘍形成の可能性を示唆するものであるが、必ずしもがん化するものではない。スフィア形成は、in vitroの実験系であるので、in vivoの異種移植モデルを用いた限界希釈アッセイ（limiting dilution assay (LDA)）を行って、造腫瘍能を測定することが重要である。従って、候補薬剤が抗がん剤として有効であることを確認する上で、異種移植モデルを用いた造腫瘍能の阻害の検出は有用である。
【００４１】
異種移植モデルとしては、特に限定するものではないが、免疫不全状態のマウス、ラット、ハムスター、モルモット等を使用することができ、例えば免疫不全NSGマウス（チャールズリバー社）等を挙げることができる。特に限定するものではないが、例えば乳がん臨床検体由来異種移植(patient derived xenograft, PDX)モデルを好適に使用することができる。
【００４２】
本発明者等が想定する新たなパスウェイを、図１３に模式的に示す。セマフォリン3A（sema）がその受容体であるニューロピリン-1（NP-1）やプレキシンA（PlexA）に結合することで、MICAL3のモノオキシゲナーゼ活性が上昇し、MICAL3はそのC末端を介してPlexAに結合し、N末端のモノオキシゲナーゼドメインによるCRMP2の酸化反応を触媒し、それによってCRMP2の二量体化が生じる。CRMP2の二量体化及びリン酸化が、次いでNumbの発現上昇につながる。
【００４３】
MICAL3は、モノオキシゲナーゼ活性を用いて、乳がん細胞のスフィア形成能並びに造腫瘍能を上昇させる。セマフォリン3A刺激により、MICAL3 モノオキシゲナーゼの活性が上昇し、このモノオキシゲナーゼ活性依存性にCRMP2が二量体化を起こし、またセマフォリン刺激により、MICAL3依存性に、非対称分裂に重要な役割を果たすNumbの発現が上昇する。
【００４４】
MICAL3は、セマフォリン3A刺激によらないスフィア形成や、造腫瘍能にも重要であることから、上記のメカニズムは、がん幹細胞の維持に普遍的に関与すると考えられる。
【実施例】
【００４５】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４６】
［実施例１  HRG-PI3 キナーゼパスウエイの時系列解析］
乳がん細胞株MCF7細胞（American Type Culture Collection (ATCC)より入手）を、血清飢餓状態で１４時間培養後、ホスファチジルイノシトール (PI)3 キナーゼの阻害剤であるLY294002(1μM)、もしくはNFkBの阻害剤であるDHMEQ(1μg/ml)で処理して、または無処理のまま更に２時間培養した後、ヘレグリン（Heregulin(HRG)）(R&D Systems Inc.)(100ng/ml)にて細胞を刺激した。その後、１時間おきに１６時間後まで細胞を回収して全RNAを抽出し、DNAマイクロアレイ解析を行った（図１）。
【００４７】
RNAは、TRIzol試薬(Life technologies)を用いて回収した。全RNA 100ngをLow Input Quick Amp labeling kit(Agilent Technologies)を用いて、シアニン(Cyanine)3-CTPでラベルした。ハイブリダイゼーションは、遺伝子発現ハイブリダイゼーションキット（Gene Expression Hybridization Kit） (Agilent Technologies)を用い、4x180K Agilent 全ヒトゲノムオリゴDNAカスタムマイクロアレイ（Whole Human genome Oligo DNA Custom Microarray）(G4862A, Agilent Technologies)を用いて行った。
【００４８】
解析の結果、ヘレグリン刺激によって発現の上昇した遺伝子は、5時間までに発現が上昇した252遺伝子、及び0-16時間を通して発現が上昇した592遺伝子であり、合わせて635遺伝子であった（データは示さない）。これらの遺伝子のそれぞれについて、乳癌の病理学的悪性度（グレード）との相関、再発リスクとの相関等を解析した。
【００４９】
見出された遺伝子の中で、本発明者等はMICAL3に着目した。図２に示すように、ヘレグリン刺激によってMICAL3の発現量は上昇し、この発現上昇はLY294002及びDHMEQの双方によって阻害された。このことは、図１Ａに示すHRG-PI3 キナーゼパスウエイにおいて、MICAL3の発現が、PI3Kの下流にあり、かつNFkBよりも下流であることを示唆する。MICAL3の発現が高いがん患者において予後がより悪い傾向があることは、インターネットを介して利用できるPrognoscan（http://www.abren.net/PrognoScan/）においても確認することができた（データは示さない）。
【００５０】
［実施例２  セマフォリン3Aによるスフィア形成誘導］
MCF7細胞を5,000個/mlの濃度にして、24-ウェルウルトラローアタッチメントプレートにまいた。この低濃度の細胞でできてきたスフィアは、単一の細胞由来である。細胞は、ダルベッコ改変イーグル培地／栄養混合物F-12 (DMEM/F-12)中にセマフォリン3A (R&D Systems Inc.)(200ng/ml)を添加した培地中で培養した。４〜７日後、直径が>75μmのスフィアを計数した。
【００５１】
その結果、図３に示すように、MCF7細胞にセマフォリン３Aを添加すると、スフィアの形成が促進された。グラフの縦軸は、播種した細胞数5,000に対して、形成したスフィアの数をパーセンテージで示したスフィア形成効率である。
【００５２】
［実施例３  MICAL3ノックダウンによるスフィア形成阻害］
MCF7細胞を5x105個/ウェルの濃度で6-ウェルプレートにまいた。これに、MICAL3 siRNAとして、以下の配列：
配列番号１：CCAAGAGAAUGAACGGAUA
及び
配列番号２：CCGUACAGCCAUCGACUUA
を標的とする二本鎖RNA(Dharmacon GE Healthcare, Cat.No., LU-024432-00-0002, ON-TARGETplus Human MICAL3 (57553) siRNA J-024432-09 及び J-024432-11)を混合して用い、LipofectamineTM RNAi MAXトランスフェクション試薬(Life technologies)と共にウェルに添加して24時間培養した。尚、対照siRNAとして、Cat.No., D-001810-01-05, ON-TARGETplus Non-targeting siRNA #1を用いた。
【００５３】
図４Ａ上図は、定量リアルタイム(qRT)-PCRにてMICAL3のmRNAの量を測定して、MICAL3のノックダウンを確認した結果を示す。細胞から全RNAをTRIzol（登録商標）試薬（Life technologies）で抽出し、高性能cDNA逆転写キット（High Capacity cDNA Reverse Transcription kit）(Applied Biosystemes)を用いてcDNAを作製し、Taqman プローブ（Taqman probes）(Applied Biosystems)を用いて、mRNAの定量を行った。この結果から、対照siRNAをトランスフェクションした細胞と比較して、MICAL3 siRNAをトランスフェクションした細胞では、MICAL3のmRNAの発現が低下していることがわかった。
【００５４】
また、抗MICAL3抗体（Santa Cruz）を用いて、MICAL3のノックダウンを確認した結果も示す（図４Ａ下図）。MCF7細胞を、RIPAバッファー(Pierce)にホスファターゼインヒビターカクテル（Phosphatase inhibitor cocktail）(Nacalai Tesque)とプロテアーゼインヒビターカクテル（Protease inhibitor cocktail）(Nacalai Tesque)を含む溶解バッファーを用いて可溶化した。タンパク質をSDS-PAGEにて泳動したのち、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜に転写し、５％のスキムミルクにてブロッキングしたのち、抗MICAL3抗体（1:1000、Santa Cruz）と対照の抗アクチン抗体（Millipore）を用いてウエスタンブロットを行った。この結果から、対照siRNAをトランスフェクションした細胞と比較して、MICAL3 siRNAをトランスフェクションした細胞では、MICAL3タンパク質の発現も低下していることがわかった。
【００５５】
図４Ｂは、siRNAによるMICAL3のノックダウンによりスフィア形成能が低下することを示す。細胞は、5,000個/mlの濃度にして、24-ウェルウルトラローアタッチメントプレートにまいて、ダルベッコ改変イーグル培地／栄養混合物F-12 (DMEM/F-12)中にセマフォリン3A (R&D Systems Inc.)(200ng/ml)を添加した培地中で培養した。４〜７日後、スフィアの直径が>75μmのものを計数した。
【００５６】
図４Ｂの結果から、MICAL3の発現が抑制されると、MCF7細胞のスフィア形成が大きく低下することが明らかとなった。
【００５７】
［実施例４  種々の乳がん細胞株におけるMICAL3ノックダウンによるスフィア形成阻害］
実施例３と同様の実験を、各種乳がん細胞株を用いて行った。細胞株として、ルミナルタイプの細胞株MCF7細胞及びBT474細胞、ベーサルタイプのBT20細胞及びMM436細胞（いずれもAmerican Type Culture Collection (ATCC)より入手）を使用した。
【００５８】
実施例３と同様にして、各細胞を、5,000個/mlの濃度にして、24-ウェルウルトラローアタッチメントプレートにまき、ダルベッコ改変イーグル培地／栄養混合物F-12 (DMEM/F-12)中に、20 ng/mlの上皮成長因子(EGF)(Millipore)、20ng/mlの塩基性線維芽細胞増殖因子 (bFGF)(Pepro Tech)、B27 サプリメント(GIBCO)、ヘパリン（Stem Cell Technologies）を添加したスフィア培養培地(SCM)(bFGF+EGF+B27)中で培養、もしくはダルベッコ改変イーグル培地／栄養混合物F-12 (DMEM/F-12)中にHRG (200ng/ml)を添加した培地中で培養した。４〜７日後、スフィアの直径が>75μmのものを計数した。
【００５９】
その結果、図５に示すように、いずれの細胞株においても、対照siRNAをトランスフェクションした場合にはほとんど変化がないのに対して、MICAL3 siRNAをトランスフェクションした場合にはスフィア形成が有意に抑制されることが明らかとなった。
【００６０】
［実施例５  乳がん臨床検体由来の初代培養細胞からのスフィア形成阻害］
乳がん患者の臨床検体（No.50及びNo.76）由来の初代培養細胞を用いて、実施例３及び４と同様の効果が得られることを確認した。
【００６１】
臨床検体の初代培養は、以下のように行った。腫瘍組織は、3mm3にカットし、Accumax(Innova Technologies Inc.)を用いて10分間分散させた。機械的に分散させるシステム（Medimachine, Becton Dickinson）を用いて、シングルセルにまで細胞を分散させた。シングルセル分散液は、100mmのセルストレーナー(BD Falcon)に通し、Ca2+,Mg2+-不含リン酸緩衝生理食塩水(PBS)にて洗った。血球マーカーを発現しない（Lineage negative）乳がん細胞を分離するため、ビオチンコンジュゲート抗体混合物にて処理した。この抗体混合物には、MACS（登録商標）細胞分離キット（MACS lineage kit）として、以下の抗体が含まれる：CD2、CD3、CD11b、CD14、CD15、CD56、CD16、CD19、CD123、CD235a（Miltenyi Biotec)、CD31（eBioscience）、CD140b(Biolegend)。分離した乳がん細胞は、無血清ヒト乳房上皮細胞増殖培地（serum-free human mammary epithelial cell growth medium）(HuMEC、GIBCO)にて培養した。
【００６２】
細胞を5x105個/ウェルの濃度で6-ウェルプレートにまき、実施例３と同じRNAi duplex(Dharmacon GE Healthcare)とLipofectamine（登録商標） RNAiMAX トランスフェクション試薬(Life technologies)を添加して培養してRNAiをトランスフェクションし、解析まで２４時間培養した。尚、本実施例では、siRNA #09 (Dharmacon GE Healthcare, Cat.No., LU-024432-00-0002, ON-TARGETplus Human MICAL3 (57553) siRNA J-024432-09) 及び #11(同 J-024432-11)を別個に使用した。
【００６３】
初代培養細胞は、5,000個/mlの濃度にして、24-ウェルウルトラローアタッチメントプレートにまき、スフィア培養培地(SCM)(bFGF+EGF+B27)中で培養した。４〜７日後、スフィアの直径が>75μmのものを計数した。
【００６４】
その結果、図６に示すように、ルミナルＡタイプ（No.50）及びトリプルネガティブタイプ（No.76）のいずれの細胞株においても、対照siRNAをトランスフェクションした場合にはほとんど変化がないのに対して、MICAL3 siRNAをトランスフェクションした場合にはスフィア培養培地(SCM)中での培養によって誘導されるスフィア形成が有意に抑制されることが明らかとなった。
【００６５】
［実施例６  乳がん臨床検体由来異種移植(patient derived xenograft, PDX)モデルにおける抗がん効果の確認］
乳がん臨床検体由来異種移植(PDX)モデルを用い、MICAL3のノックダウンにより移植細胞の造腫瘍能(tumor initiating ability)が低下することを確認した。
【００６６】
レンチウイルスを用いたshRNA導入システムは、以下のように作製した。CSII-EF-MCS-IRES2-Venus ベクター(筑波理化学研究所の三好浩之博士より供与)に、MICAL3を標的とするshRNA（shRNA 1（配列番号３及び４）及びshRNA 2（配列番号５及び６））を合成して組み込んだ。対照として、対照shRNA 1（配列番号７及び８）及び対照shRNA 2（配列番号９及び１０）を組み込んだ。
MICAL3 shRNA 1 フォワード：GATCCCCGATGTGCGCTGGACTCGTATAACGTGTGCTGTCCGTTATATGAGTCCAGTGCACGTCTTTTTGGAAAT（配列番号３）
MICAL3 shRNA 1 リバース：CTAGATTTCCAAAAAGACGTGCACTGGACTCATATCACGGACAGCACACGTTATACGAGTCCAGCGCACATCGGG（配列番号４）
MICAL3 shRNA 2 フォワード：GATCCCCGGGAGTTCCTCCGACATGGAAACGTGTGCTGTCCGTTTTCATGTTGGAGGAGCTCCCTTTTTGGAAAT（配列番号５）
MICAL3 shRNA 2 リバース：CTAGATTTCCAAAAAGGGAGCTCCTCCAACATGAAGACGGACAGCACACGTTTCCATGTCGGAGGAACTCCCGGG（配列番号６）
対照shRNA 1 フォワード：GATCCCCGTGTGCTTTGTAGGGTTCTACGTGTGCTGTCCGTAGAATCCTACAAAGCGCGCTTTTTGGAAAT（配列番号７）
対照shRNA 1 リバース：CTAGATTTCCAAAAAGCGCGCTTTGTAGGATTCGACGGACAGCACACGTAGAACCCTACAAAGCACACGGG（配列番号８）
対照shRNA 2 フォワード：GATCCCCTTCTCTGAGCGTGTCGCGTACGTGTGCTGTCCGTACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTGGAAAT（配列番号９）
対照shRNA 2 リバース：CTAGATTTCCAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTACGGACAGCACACGTACGCGACACGCTCAGAGAAGGG（配列番号１０）
【００６７】
得られた各レンチウイルスプラスミドDNA(1000ng/μl)を、パッケージングプラスミド (pCMV-VSV-G-RSV-RevとpCAGHIVgp)と共に、リポフェクタミン(Invirtogen)を用いてHEK293T細胞（パッケージング細胞）にトランスフェクションし、レンチウイルスを回収した。
【００６８】
shRNAを用いてMICAL3をノックダウンした乳がん臨床検体由来細胞と対照のshRNAを導入した細胞を限界希釈して、103〜105個を8週齢の免疫不全NSGマウス（チャールスリバー社）に移植した。マウスはイソフルラン(Abbott Japan)にて麻酔し、細胞を50μlのマトリゲル（登録商標）(BD Biosciences)に混合し、乳腺皮下部に移植した。8週間経過後、形成した腫瘍の数を計測した。図７中の表は、各群5匹のマウスを使用した場合の腫瘍形成の有無を示したものである。表に示す通り、MICAL3をノックダウンした細胞は、造腫瘍能が低下していた。また、対照shRNAをトランスフェクションしたマウスでは触診にて腫瘍の形成が確認されたが、MICAL3 shRNA 1をトランスフェクションしてMICAL3をノックダウンしたマウスでは腫瘍が確認されなかった。
【００６９】
［実施例７  MICAL3の過剰発現によるスフィア形成の上昇］
図８にMICAL3タンパク質のドメイン構造を示す。MICAL3（NP_056056）はN末にモノオキシゲナーゼドメインを持ち、モノオキシゲナーゼドメイン中のGXGXXG（93-98アミノ酸、配列番号１１）のグリシンをトリプトファンに置換した変異体3G3W（配列番号１２）は、モノオキシゲナーゼ活性を失っている。
【００７０】
MICAL3-WT(BAG10388)は、MICAL-3タンパク質の合成部分配列としてGenBankにBAG10388として登録されている1918アミノ酸のタンパク質である。図８に示すような、MICAL3-WT、変異体MICAL3-3G3W、及びRab結合ドメインを欠失したMICAL3-N1を発現ベクターに組み込んだ（Dr. Akhmanovaより供与を受けた。Iiya Grigoriev et al., Current Biology vol. 21,  Issue 11, p967-974, 2011を参照されたい）。
【００７１】
MCF7細胞を6ウェルプレートに3x105個/ウェルの濃度でまき、一晩培養した。上記で得られたベクターを用いて、MCF7細胞でMICAL3の野生型もしくは変異体タンパク質を一過性に過剰発現させるために、1.8μg プラスミドDNA（発現ベクター）、4.5μl ポリフェクトトランスフェクション試薬（Polyfect Transfection Reagent）（QIAGEN）と100μl RPMI1640培地を混合し、室温で15分間インキュベートし、細胞の培地に添加した後、48時間培養した。尚、対照ベクターとして、EGFP-C1（Dr. Akhmanovaより供与を受けた。）を使用した。
【００７２】
培養後の細胞を、5,000個/mlの濃度にして、24-ウェルウルトラローアタッチメントプレートにまき、スフィア培養培地(SCM)(bFGF+EGF+B27)中で培養した。４〜７日後、スフィアの直径が>75μmのものを計数した。
【００７３】
その結果、図９に示すように、スフィア培養培地(SCM)中での培養により、SCMなし（NT）と比較して、スフィア形成が観察されるが、MICAL3-WTを過剰発現させるとMCF細胞のスフィア形成能が大きく上昇した。この効果は、モノオキシゲナーゼドメインに変異を有するMICAL3-3G3Wの過剰発現ではみられなかった。一方、C末ドメインの欠損変異体(MICAL-WT-N1)を過剰発現させた場合には、野生型MICAL3と同程度にスフィア形成能を上昇させた。
【００７４】
［実施例８  MICAL3のノックダウンによるCRMP2の二量体形成抑制］
MCF7細胞をセマフォリン3A(200ng/ml)により刺激した後、細胞のライセートを抽出し、抗CRMP2抗体(IBL)、リン酸化CRMP2抗体(ECM Biosciences)にて、ウエスタンブロットを行った。その結果、セマフォリン3A刺激によりCRMP2が二量体を形成し、かつS522のリン酸化も上昇することが見出された（データは示さない）。実施例６で使用したshRNAを用いてMICAL3をノックダウンすると、CRMP2の二量体形成が抑制された（図１０）。
【００７５】
［実施例９  セマフォリン3A刺激によるNumbの発現上昇］
実施例３と同様にして、MICAL3 siRNA又は対照siRNAをトランスフェクションしたMCF7細胞をセマフォリン3A(200ng/ml)で刺激した後、細胞のライセートを抽出し、抗Numb抗体（Abcam）にてウエスタンブロットを行った。
【００７６】
その結果、図１１に示すように、セマフォリン3A刺激により、siRNAをトランスフェクションしない細胞、及び対照siRNAをトランスフェクションした細胞ではNumbの発現が上昇するのに対して、MICAL3 siRNAをトランスフェクションした細胞では、セマフォリン刺激によるNumBの発現上昇は観察されなかった。
【００７７】
［実施例１０  Numbノックダウンによるスフィア形成能の低下］
実施例３と同様にして、MCF7細胞に以下の配列を有するsiRNA：
Numb siRNA #01：NUMBHSS112687(3_RNAI)
Forword: UCUUAGCCAGAAGAUGUCACCCUUU（配列番号１３）
Reverse: AAAGGGUGACAUCUUCUGGCUAAGA（配列番号１４）
及び
Numb siRNA #02：NUMBHSS112689(3_RNAI)
Forword: GAGAAAGAAGGAUGUUUAGAGGCCA（配列番号１５）
Reverse: UGGAACAUAAACAUCCUUCUUUCUC（配列番号１６）
（Invitrogen Stealth RNAi(TM) siRNA (https://www.lifetechnologies.com/jp/ja/home/life-science/rnai/synthetic-rnai-analysis/stealth-rnai-technology.html)）をトランスフェクションし、Numbをノックダウンした。尚、対照siRNAとして、Stealth RNAiTM siRNA Negative Control LO GC (Cat. No. 12935-200)を用いた。
【００７８】
siRNAをトランスフェクションした細胞及びトランスフェクションしていないMCF7細胞をスフィア培養培地（SCM）とセマフォリン3A刺激（200ng/ml）の両方の条件で培養し、スフィア形成能を調べた。
【００７９】
その結果、図１２に示すように、いずれの場合も、siRNAによるNumbのノックダウンにより、スフィア形成が抑制された。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
従来の抗がん治療は増殖能の高い細胞を標的とするものであり、また、例えば乳がんでは特定のサブタイプの乳がんのみに有効な抗がん剤が使用されてきた。本発明により、がん幹細胞を標的とする新たな抗がん剤が提供され、従来の治療と組み合わせることでより効果的な治療が可能となるだけでなく、がんの転移や再発を効果的に予防することが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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