(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞を富化した細胞集団の増殖方法であって、
（ａ）ヒトまたはマウスの多能性細胞と、多能性ではない細胞の混合物を含む前記細胞集団を提供する段階と、
（ｂ）以下：
（ｉ）グルタミンを実質的に含まない；
（ｉｉ）細胞透過性α−ケトグルタル酸（αＫＧ）を含む；かつ
（ｉｉｉ）分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）阻害剤および／またはグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫβ）阻害剤を含む、
培地中で多能性細胞と非多能性細胞の前記混合物を培養する段階であって、前記培養段階が、前記提供した集団と比較して、非多能性幹細胞よりも多能性幹細胞が富化された集団を生じる、段階と、
を含む前記方法。
【請求項２】
前記細胞透過性αＫＧが、α−ケトグルタル酸ジメチル（ＤＭ−αＫＧ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培地が、前記ＭＡＰＫ阻害剤及び前記ＧＳＫ３β阻害剤を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記培地が、グルタミン合成酵素の活性化因子を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記培地が、細胞のコハク酸を減少させる物質を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
外来性のグルタミンが、前記培地に対して添加されない、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が、胚性幹細胞、成体幹細胞、または人工多能性幹細胞を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記多能性幹細胞が胚性幹細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記多能性幹細胞が成体幹細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記提供した細胞集団が、生体外の細胞集団を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記培養する段階の間に、前記ヒトまたはマウスの多能性細胞が、前記多能性ではない細胞と比較してより高い増殖速度を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記培養する段階の間に、前記ヒトまたはマウスの多能性細胞が、前記多能性ではない細胞と比較してより高い生存率を有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記生じた集団が、ヒトまたはマウスの多能性細胞を少なくとも約５０％含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本特許出願は、２０１４年４月７日出願の米国仮特許出願第６１／９７６，４８８号及び２０１４年１０月２０日出願の米国仮特許出願第６２／０６６，２９４号の利益及びそれらに対する優先権を主張し、参照によって、それらの全体が、任意及びあらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府の支援
３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．２０２（ｃ）（６）に準拠し、本明細書に記載または主張する１つまたは複数の発明に関して、出願人は、本発明が、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈより付与された政府の支援によって実施されたことを明記する。米国政府は、本発明に対して、一定の権利を有する。
【０００３】
配列リスト
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列リストを含み、参照によって、その全体が、本明細書に組み込まれる。２０１５年４月６日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、２００３０８０−０８２４＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズは、１６，５８７バイトである。
【背景技術】
【０００４】
グルタミンは、他の細胞経路の中でも特に、高分子合成及びトリカルボン酸（ＴＣＡ）回路の補充反応に寄与する主要な代謝基質である。グルタミンは、非必須アミノ酸であるが、ほとんどの哺乳類細胞は、外来性グルタミンの添加無しでは、増殖することができない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、幹細胞の増殖、分化、及び多能性が、細胞代謝の操作によって制御できるという発見を包含する。本発明は、細胞内のα−ケトグルタル酸レベル及び／またはコハク酸レベルの調節によって、細胞の自己複製及び分化を制御できるという発見をさらに包含する。
【０００６】
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞集団の増殖のための組成物、方法、及び系を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、細胞培養において、細胞を増殖させることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、生体外で細胞を増殖させることを含む。
【０００７】
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞集団における、細胞の多能性維持のための組成物、方法、及び系を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、前駆細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、胚性幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、成体幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。
【０００８】
いくつかの実施形態では、方法は、培地中における哺乳類幹細胞を含む細胞培養の提供段階と、増殖の促進または細胞の多能性維持のための、細胞内のコハク酸レベルに対するα−ケトグルタル酸レベルの維持段階と、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、培地中における哺乳類幹細胞を含む細胞培養の提供段階と、多能性の維持のための、細胞内のコハク酸レベルに対するα−ケトグルタル酸レベルの維持段階と、を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、方法は、細胞内のコハク酸レベルに対するα−ケトグルタル酸レベルを増加させる物質または化合物の投与を含む。いくつかの実施形態では、方法は、物質または化合物が存在しない同等条件下で維持された細胞で観測されるものと比較して、細胞内のα−ケトグルタル酸が、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％上昇したレベルの達成または維持を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、物質または化合物が存在しない同等条件下で維持された細胞で観測されるものと比較して、細胞内のコハク酸が、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％低下したレベルの達成または維持のための、組成物、系、及び方法を提供する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本発明は、物質または化合物が存在しない同等条件下で維持された細胞で観測されるものと比較して、細胞内のコハク酸に対するα−ケトグルタル酸の比率が、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、または少なくとも２５０％上昇したレベルの達成または維持のための組成物、系、及び方法を提供する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞集団の増殖の制御のための組成物、系、及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、細胞培養における幹細胞または前駆細胞の増殖のための組成物、系、及び方法を提供する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞集団の分化の制御のための組成物、系、及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、細胞培養における分化の制御のための組成物、系、及び方法を提供する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞内のコハク酸レベルに対するα−ケトグルタル酸レベルの維持による、細胞集団の増殖または分化の制御のための組成物、系、及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、細胞内のコハク酸レベルに対するα−ケトグルタル酸レベルを減少させる物質または化合物の投与による、細胞集団の増殖または分化の制御のための組成物、系、及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、細胞と、外来性のコハク酸化合物との接触による、細胞集団の増殖または分化の制御のための組成物、系、及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、外来性のコハク酸化合物は、細胞透過性である。いくつかの実施形態では、コハク酸化合物は、コハク酸ジメチル（ＤＭ−コハク酸）である。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本発明は、物質または化合物が存在しない同等条件下で維持された細胞で観測されるものと比較して、細胞内のコハク酸が、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％上昇したレベルの達成または維持による、細胞集団の増殖または分化の制御のための組成物、系、及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、物質または化合物が存在しない同等条件下で維持された細胞で観測されるものと比較して、細胞内のα−ケトグルタル酸が、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％低下したレベルの維持による、細胞集団の増殖または分化の制御のための組成物、系、及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、物質または化合物が存在しない同等条件下で維持された細胞で観測されるものと比較して、細胞内のコハク酸レベルに対するα−ケトグルタル酸レベルの比率を、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％低下させて維持することによる、細胞集団の増殖または分化の制御のための組成物、系、及び方法を提供する。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞のα−ケトグルタル酸レベルを減少させる物質の投与を含む、細胞増殖の阻害のための組成物、系、及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、細胞のコハク酸レベルを増加させる物質の投与を含む、細胞増殖の阻害のための組成物、系、及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、ＭＡＰＫ阻害剤及び／またはＧＳＫ３β阻害剤の投与をさらに含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本発明は、生体内での使用のための、細胞増殖の阻害のための組成物、系、及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、生体外での使用のための、細胞増殖の阻害のための組成物、系、及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、試験管内での使用のための、細胞増殖の阻害のための、組成物、系、及び方法を提供する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本発明は、幹細胞または前駆細胞の集団と、培地とを含む細胞培養を提供する。いくつかの実施形態では、培地は、α−ケトグルタル酸化合物、ＭＡＰＫ阻害剤、及び／またはＧＳＫ３β阻害剤を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞培養向けの基質を提供する。いくつかの実施形態では、基質は、α−ケトグルタル酸化合物、ＭＡＰＫ阻害剤、及び／またはＧＳＫ３β阻害剤を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞内のヒストンのメチル化の促進のための組成物、系、及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、細胞と、細胞内のコハク酸レベルに対する、細胞のα−ケトグルタル酸レベルを増加させる物質と、の接触を含む。いくつかの実施形態では、方法は、細胞と、細胞内のコハク酸レベ
ルに対する、細胞のα−ケトグルタル酸レベルを減少させる物質と、の接触を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、本発明は、生体内での細胞増殖の阻害のための組成物、系、及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、動物における生体内での細胞増殖の阻害のための組成物、系、及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、動物は、哺乳類である。いくつかの実施形態では、動物は、ヒトである。いくつかの実施形態では、治療レジメンのそれを必要とする対象に対する付与を提供する。いくつかの実施形態では、レジメンは、１回もしくは複数回用量のコハク酸化合物、細胞のコハク酸を増加させる１回もしくは複数回用量の物質、細胞のα−ケトグルタル酸を減少させる１回もしくは複数回用量の物質、１回もしくは複数回用量のグルタミン合成酵素阻害剤、またはそれらの組み合わせを含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、本発明は、生体内での細胞分化の促進のための組成物、系、及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、動物における生体内での細胞増殖の阻害のための組成物、系、及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、動物は、哺乳類である。いくつかの実施形態では、動物は、ヒトである。いくつかの実施形態では、方法は、１回もしくは複数回用量のコハク酸化合物、細胞のコハク酸を増加させる１回もしくは複数回用量の物質、細胞のα−ケトグルタル酸を減少させる１回もしくは複数回用量の物質、１回もしくは複数回用量のグルタミン合成酵素阻害剤、またはそれらの組み合わせの投与を含む治療レジメンの、それを必要とする対象に対する付与を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、細胞に対する、物質または化合物の送達の達成のための組成物及び系を提供する。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本発明は、動物における生体内での細胞増殖の促進にむけた組成物、系、及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、動物は、哺乳類である。いくつかの実施形態では、動物は、ヒトである。いくつかの実施形態では、方法は、１回もしくは複数回用量の、α−ケトグルタル酸化合物である物質、または１回もしくは複数回用量の、細胞のα−ケトグルタル酸を増加させる物質を含む治療レジメンの、それを必要とする対象に対する付与を含む。
【００２３】
いくつかの実施形態では、本発明は、生体内での、細胞集団の回復のための組成物、系、及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、造血幹細胞である。いくつかの実施形態では、本発明は、患者における生体内での、細胞が欠乏している細胞集団の回復のための組成物、系、及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、患者は、化学療法を受けているか、または受けたことがある。
【００２４】
いくつかの実施形態では、本発明は、対象における生体内での、幹細胞または前駆細胞の多能性維持のための組成物、系、及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、１回もしくは複数回用量の、α−ケトグルタル酸化合物である物質、または１回もしくは複数回用量の、細胞のα−ケトグルタル酸を増加させる物質の投与を含む治療レジメンの、対象に対する付与を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、本発明は、移植（ｔｒａｎｓｆｅｒ）中、輸送（ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｔｉｏｎ）中、または貯蔵中の、幹細胞または前駆細胞の多能性維持のための組成物、系、及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、細胞と、α−ケトグルタル酸化合物または細胞のα−ケトグルタル酸化合物を増加させる物質を含む組成物と、の接触を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞集団を多能性細胞について富化するための組成物、系、及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、混合細胞集団と、α−ケトグルタル酸化合物または細胞内のコハク酸レベルに対するα−ケトグルタル酸レベルを増加させる物質と、の接触を含む。いくつかの実施形態では、外来性のグルタミンは、培地に対して添加されない。いくつかの実施形態では、多能性細胞は、多能性細胞ではない細胞から選定することができ、これは、前者の増殖速度が、後者と比較して高いためである。いくつかの実施形態では、多能性細胞は、多能性細胞ではない細胞から選定することができ、これは、前者の生存率が、後者と比較して高いためである。いくつかの実施形態では、本発明は、総細胞集団の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％となるまで多能性細胞を増大させるための組成物、系、及び方法を提供する。
【００２７】
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞集団を多能性細胞について富化するための組成物、系、及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、混合細胞集団と、グルタミンレベルが顕著に減少した培地と、の接触を含む。いくつかの実施形態では、外来性のグルタミンは、培地に対して添加されない。いくつかの実施形態では、本発明は、総細胞集団の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％となるまで多能性細胞を増大させるための組成物、系、及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、多能性細胞は、幹細胞である。いくつかの実施形態では、多能性細胞は、前駆細胞である。いくつかの実施形態では、多能性細胞は、誘導される。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本発明は、多能性細胞集団の同定のための方法を提供し、当該方法は、培養物における細胞集団の提供であって、当該培養物は、グルタミンを実質的に含まない培地を含む当該提供と、細胞生存に基づく多能性細胞の同定と、を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本発明は、多能性細胞集団の選定のための方法を提供し、当該方法は、培養物における細胞集団の提供であって、当該培養物は、グルタミンを実質的に含まない培地を含む当該提供と、生存細胞の選定と、を含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞内のＤＮＡメチル化の調節のための組成物、系、及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、細胞と、α−ケトグルタル酸化合物、または細胞内のコハク酸レベルに対する、細胞のα−ケトグルタル酸レベルを増加させる物質と、の接触段階を含む方法を提供する。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される：
（項目１）
細胞集団の増殖方法であって、
培地中における哺乳類の幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団の提供段階と、
細胞増殖を促進するための、前記細胞内のコハク酸レベルに対するα−ケトグルタル酸レベルの維持段階と、
を含む前記方法。
（項目２）
細胞集団における多能性の維持方法であって、
培地中における哺乳類の幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団の提供段階と、
前記細胞多能性を維持するための、前記細胞内のコハク酸レベルに対するα−ケトグルタル酸レベルの維持段階と、
を含む前記方法。
（項目３）
前記コハク酸レベルに対するα−ケトグルタル酸レベルが、少なくとも．０５、．１０、．１５、．２０である、項目１〜２のいずれかに記載の方法。
（項目４）
前記維持段階が、前記細胞内のコハク酸レベルに対するα−ケトグルタル酸レベルを増加させる物質の投与を含む、項目１〜３のいずれかに記載の方法。
（項目５）
前記維持段階が、外来性のα−ケトグルタル酸化合物の投与を含む、項目１〜４のいずれかに記載の方法。
（項目６）
前記外来性のα−ケトグルタル酸化合物が、細胞透過性である、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記α−ケトグルタル酸化合物が、α−ケトグルタル酸ジメチル（ＤＭ−αＫＧ）である、項目６に記載の方法。
（項目８）
ＭＡＰＫ阻害剤及びＧＳＫ３β阻害剤の投与をさらに含む、項目１〜７のいずれかに記載の方法。
（項目９）
前記維持段階が、グルタミン合成酵素の活性化因子の投与を含む、項目１〜４のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
前記維持段階が、細胞のコハク酸を減少させる物質の投与を含む、項目１〜４のいずれかに記載の方法。
（項目１１）
外来性のグルタミンが、前記培地に対して添加されない、項目１〜１０のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
前記維持段階が、前記物質または化合物が存在しない同等条件下で維持された細胞で観測されるものと比較して、前記細胞内のα−ケトグルタル酸が、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％上昇したレベルの達成または維持を含む、項目４〜１０のいずれかに記載の方法。
（項目１３）
前記維持段階が、前記物質または化合物が存在しない同等条件下で維持された細胞で観測されるものと比較して、前記細胞内のコハク酸が、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％低下したレベルの達成または維持を含む、項目４〜１０のいずれかに記載の方法。
（項目１４）
前記維持段階が、前記物質または化合物が存在しない同等条件下で維持された細胞で観測されるものと比較して、前記細胞内のコハク酸に対するα−ケトグルタル酸の比率が、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、または少なくとも２５０％上昇したレベルの達成または維持を含む、項目４〜１０のいずれかに記載の方法。
（項目１５）
細胞集団の増殖の制御方法であって、
培地中における哺乳類の幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団の供給段階と、
細胞増殖の阻害のための、前記細胞中のコハク酸レベルに対するα−ケトグルタル酸レベルの維持段階と、
を含む前記方法。
（項目１６）
細胞集団の分化の制御方法であって、
培地中における哺乳類の幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団の提供段階と、
細胞分化の促進のための、前記細胞中のコハク酸レベルに対するα−ケトグルタル酸レベルの維持段階と、
を含む前記方法。
（項目１７）
前記維持段階が、前記細胞内のコハク酸レベルに対するα−ケトグルタル酸レベルを減少させる物質の投与を含む、項目１５〜１６のいずれかに記載の方法。
（項目１８）
前記維持段階が、外来性のコハク酸化合物の投与を含む、項目１５〜１７のいずれかに記載の方法。
（項目１９）
前記外来性のコハク酸化合物が、細胞透過性である、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記コハク酸化合物が、コハク酸ジメチル（ＤＭ−コハク酸）である、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
前記維持段階が、前記物質または化合物が存在しない同等条件下で維持された細胞で観測されるものと比較して、前記細胞内のコハク酸が、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％上昇したレベルの達成または維持を含む、項目１７〜２０のいずれかに記載の方法。
（項目２２）
前記維持段階が、前記物質または化合物が存在しない同等条件下で維持された細胞で観測されるものと比較して、前記細胞内のα−ケトグルタル酸が、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％低下したレベルの達成または維持を含む、項目１７〜２０のいずれかに記載の方法。
（項目２３）
前記維持段階が、前記物質または化合物が存在しない同等条件下で維持された細胞で観測されるものと比較して、前記細胞内のコハク酸レベルに対するα−ケトグルタル酸レベルの比率が、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％低下した前記レベルの達成または維持を含む、項目１７〜２０のいずれかに記載の方法。
（項目２４）
細胞増殖の阻害方法であって、細胞のα−ケトグルタル酸レベルを減少させる物質の投与を含む前記方法。
（項目２５）
細胞増殖の阻害方法であって、細胞のコハク酸レベルを増加させる物質の投与を含む、前記方法。
（項目２６）
ＭＡＰＫ阻害剤及びＧＳＫ３β阻害剤の投与をさらに含む、項目１５〜２５のいずれかに記載の方法。
（項目２７）
幹細胞または前駆細胞の集団と、培地と、を含む細胞培養であって、前記培地が、α−ケトグルタル酸化合物、ＭＡＰＫ阻害剤、及びＧＳＫ３β阻害剤を含む前記細胞培養。
（項目２８）
α−ケトグルタル酸化合物、ＭＡＰＫ阻害剤、及びＧＳＫ３β阻害剤を含む細胞培養向けの基質。
（項目２９）
細胞内のヒストンのメチル化の促進方法であって、前記細胞と、前記細胞内のコハク酸レベルに対する、細胞のα−ケトグルタル酸レベルを増加させる物質と、の接触を含む、前記方法。
（項目３０）
細胞内のヒストンのメチル化の阻害方法であって、前記細胞と、前記細胞内のコハク酸レベルに対する、細胞のα−ケトグルタル酸レベルを減少させる物質と、の接触を含む前記方法。
（項目３１）
前記ヒストンのメチル化が、ヒストン３リジン９のトリメチル化（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）、Ｈ３Ｋ２７のトリメチル化、Ｈ４Ｋ２０のトリメチル化、またはそれらの組み合わせを含む、項目２９または３０に記載の方法。
（項目３２）
前記細胞が、胚性幹細胞、成体幹細胞、または人工多能性幹細胞を含む、先行項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目３３）
生体内での細胞増殖の阻害を必要とする対象における、その阻害方法であって、１回もしくは複数回用量のコハク酸化合物、細胞のコハク酸を増加させる１回もしくは複数回用量の物質、細胞のα−ケトグルタル酸を減少させる１回もしくは複数回用量の物質、１回もしくは複数回用量のグルタミン合成酵素阻害剤、またはそれらの組み合わせの、前記細胞に対する送達を達成する経路を介した投与を含む治療レジメンの、前記対象に対する付与を含む前記方法。
（項目３４）
生体内での細胞分化の促進を必要とする対象における、その促進方法であって、１回もしくは複数回用量のコハク酸化合物、細胞のコハク酸を増加させる１回もしくは複数回用量の物質、細胞のα−ケトグルタル酸を減少させる１回もしくは複数回用量の物質、１回もしくは複数回用量のグルタミン合成酵素阻害剤、またはそれらの組み合わせの、前記細胞に対する送達を達成する経路を介した投与を含む治療レジメンの、前記対象に対する付与を含む前記方法。
（項目３５）
生体内での細胞増殖の促進を必要とする対象における、その促進方法であって、１回もしくは複数回用量の、α−ケトグルタル酸化合物である物質、または１回もしくは複数回用量の、細胞のα−ケトグルタル酸を増加させる物質の、細胞集団に対する送達を達成する経路を介した投与を含む治療レジメンの、前記対象に対する付与を含む前記方法。
（項目３６）
前記細胞集団が、幹細胞または前駆細胞を含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
生体内での幹細胞または前駆細胞の多能性の維持を必要とする対象における、その維持方法であって、１回もしくは複数回用量の、α−ケトグルタル酸化合物である物質、または１回もしくは複数回用量の、細胞のα−ケトグルタル酸を増加させる物質の、前記細胞に対する送達を達成する経路を介した投与を含む治療レジメンの、前記対象に対する付与を含む前記方法。
（項目３８）
前記治療レジメンが、１回もしくは複数回用量のＭＡＰＫ阻害剤、または１回もしくは複数回用量のＧＳＫ３β阻害剤をさらに含む、項目３５〜３７のいずれかに記載の方法。
（項目３９）
移植中、輸送中、または貯蔵中の、細胞の多能性の維持方法であって、前記細胞と、α−ケトグルタル酸化合物または細胞のα−ケトグルタル酸を増加させる物質を含む組成物と、の接触を含む前記方法。
（項目４０）
細胞集団を多能性細胞について富化するための方法であって、
培地中における多能性細胞を含む細胞集団の提供段階と、
前記細胞集団内の多能性細胞の割合を増加させるための、前記細胞内のコハク酸レベルに対するα−ケトグルタル酸レベルの維持段階と、
を含む前記方法。
（項目４１）
前記維持段階が、α−ケトグルタル酸化合物または前記細胞内のコハク酸レベルに対するα−ケトグルタル酸レベルを増加させる物質の投与を含む、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
外来性のグルタミンが、前記培地に対して添加されない、項目４０に記載の方法。
（項目４３）
前記多能性細胞が、前記維持段階後に、前記細胞集団の少なくとも５０％を構成する、項目４０に記載の方法。
（項目４４）
細胞集団を多能性細胞について富化するための方法であって、
グルタミンを実質的に含まない培地中における多能性細胞を含む細胞集団の培養と、
前記細胞集団内の多能性細胞の割合を増加させるための、前記培地中のグルタミンレベルの維持と、
を含む前記方法。
（項目４５）
多能性細胞集団の同定方法であって、
培養物における細胞集団の提供であって、前記培養物が、グルタミンを実質的に含まない培地を含む前記提供と、
細胞生存に基づく、前記多能性細胞の同定と、
を含む前記方法。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】グルタミン非存在下で増殖したＥＳＣの増殖曲線を示す折れ線グラフ及び代表的な画像を示す。図ａ及び図ｂは、グルタミン非含有のＳ／Ｌ培地または２ｉ／Ｌ培地において培養したＥＳＣ−Ｖ１９細胞（ａ）及びＶ６．５  ＥＳＣ株（ＥＳＣ−１〜４）（ｂ）の増殖曲線を示す。図ｃは、グルタミン非含有の２ｉ／Ｌ培地で３日間培養したＥＳＣ−１細胞を示す位相画像を示し、上の画像は、明視野（ＢＦ）、下の画像は、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）染色、バーは、５００μｍを示す。図ｄは、グルタミン非含有のＳ／Ｌ培地またはＳ／Ｌ＋２ｉ培地におけるＥＳＣ−Ｖ１９細胞の増殖曲線を示す。図ｅは、グルタミン非含有のＳ／Ｌ＋２ｉ培地で３日間培養したＥＳＣ−１細胞の位相画像を示す。図ｆは、Ｎ２補充剤及びＢ２７補充剤を含む２種の無血清培地製剤である２ｉ／Ｌ及びＢｍｐ４／Ｌで培養したＥＳＣ−Ｖ１９細胞の増殖曲線である。図ｇは、グルタミン含有または非含有の培地を添加後８時間の細胞内グルタミン酸レベルを示す。Ｑは、グルタミンを示す。データは、代表的な実験から得られた３連ウェルの平均値±ｓ．ｄ．として示されている。
【図２】細胞の代謝物及び動力学を分析した棒グラフ及び折れ線グラフを示す。図ａは、グルコースの取り込み（左）、グルタミンの取り込み（中央）、及び乳酸の分泌（右）の分析を示す。図ｂは、αＫＧ、コハク酸、リンゴ酸、及びアスパラギン酸の細胞内レベルを示す。バーは、代表的な実験から得られた、ｎ＝４（ａ）またはｎ＝３（ｂ）の複製ウェルの平均値±ｓ．ｄ．を示す。図ｃは、グルコース由来の炭素及びグルタミン由来の炭素の入り口点を含むＴＣＡ回路の模式図である。同位体を使用して、赤で示される代謝物の追跡を実施した。図ｄ及び図ｅは、［Ｕ−１３Ｃ］グルタミン（１３Ｃ−ｇｌｎ）（ｄ）由来の１３Ｃまたは［Ｕ−１３Ｃ］グルコース（１３Ｃ−ｇｌｃ）（ｅ）由来の１３Ｃによって標識化されたそれぞれの代謝物の画分を継時的（０〜１２時間、ｈ）に示したものである。３回の独立した実験の平均値±ｓ．ｅ．ｍ．が示されている。図ｆ及び図ｇは、αＫＧ及びリンゴ酸のプールを介したグルタミン（ｆ）及びグルコース（ｇ）の流動（ｆｌｕｘ）を示す。３回の独立した実験（図２ｄ及び図２ｅに示される実験）について計算した流動の平均値±ｓ．ｅ．ｍ．が示されている。＊は、ｐ＜０．０５、＊＊は、ｐ＜０．００５、＊＊＊は、ｐ＜０．０００５であることを示す。ｐ値は、独立両側スチューデントｔ検定によって決定した。
【図３】図３ａ〜図３ｇは、下記の内容を示す。図ａは、Ｓ／Ｌ培地または２ｉ／Ｌ培地のいずれかにおいて増殖した４種のＥＳ細胞株（ＥＳＣ−１〜４）におけるαＫＧ：コハク酸の比のＧＣ−ＭＳ分析を示す。＊＊＊は、ｐ＜０．０００１であることを示し、Ｓｉｄａｋ多重比較事後検定を使用した二元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。図ｂは、グルタミン含有または非含有の２ｉ／Ｌ培地において３日間増殖したＥＳＣ−１細胞及びＥＳＣ−２細胞のウエスタンブロットを示す。図ｃは、αＫＧ依存性ジオキシゲナーゼ（Ｆｅ（ＩＩ）示さず）の反応機構を単純化した模式図を示す。ＵＴＸ及びＪｍｊｄ３は、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３脱メチル化酵素であり、ＧＳＫ−Ｊ４は、ＵＴＸ／Ｊｍｊｄ３に特異的な阻害剤である。図ｄは、Ｊｍｊｄ３／ＵＴＸの阻害剤であるＧＳＫ−Ｊ４を増加させて存在させ、Ｓ／Ｌにおいて、２４時間増殖したＥＳＣ−１細胞を示す。図ｅは、ＵＴＸ／Ｊｍｊｄ３の阻害剤であるＧＳＫ−Ｊ４を３０μＭで含むＳ／Ｌまたは２ｉ／Ｌにおいて５時間培養したＥＳＣ−１細胞のＨ３Ｋ２７ｍｅ３のＣｈＩＰ−ＰＣＲを示す。値は、個々の二価ドメイン（ｂｉｖａｌｅｎｔ  ｄｏｍａｉｎ）遺伝子（ｎ＝１４）における倍数変化（ＧＳＫ−Ｊ４／対照）を示す。ｐ＜０．０００１は、独立スチューデントｔ検定によって決定した。図ｆは、Ｓ／Ｌまたは２ｉ／Ｌにおいて培養したＪＭＪＤ３Δ／Δ−１（左）細胞及びＪＭＪＤ３Δ／Δ−２（右）細胞のＨ３Ｋ２７ｍｅ３のＣｈＩＰ−ＰＣＲを示す。値は、個々の二価ドメイン遺伝子（ｎ＝１０）における倍数変化（対照細胞に対するＪＭＪＤ３Δ／Δ細胞）を示す。ｐ値は、独立スチューデントｔ検定によって決定した。図ｇは、ＧＳＫ−Ｊ４またはＧＳＫ−Ｊ５を１μＭまたは５μＭで含むＳ／Ｌ培地または２ｉ／Ｌ培地において３時間増殖したＥＳＣ−１細胞内のコハク酸に対するαＫＧの比を示す。＊＊は、ｐ＜０．００１であることを示し、Ｓｉｄａｋ多重比較事後検定を使用した二元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。データは、代表的な実験から得られた、３連ウェルの平均値±ｓ．ｄ（ａ）または平均値±ｓ．ｅ．ｍ．（ｇ）として示されている。
【図４】図４ａ〜図４ｃは、下記の内容を示す。図ａは、アルカリホスファターゼ染色したコロニーの代表的な明視野画像を示す。図ｂは、コロニーの定量化を示す。データは、代表的な実験から得られた３連ウェルの平均値±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。ビヒクルまたはＤＭ−コハク酸で処理したウェルと比較して、ＤＭ−αＫＧでは、未分化コロニーが多く存在する。＊＊＊は、ｐ＜０．０００１であることを示し、チューキー（Ｔｕｋｅｙ）多重比較事後検定を使用した二元配置ＡＮＯＶＡによって計算した（図ａ及び図ｂのＥＳＣ−１細胞を使用したコロニー形成アッセイは、下記のとおり実施した。すなわち、細胞をクローン密度で播種し、２日目にＤＭ−αＫＧまたはＤＭ−コハク酸のいずれかを含む実験培地へ培地を交換した後、４日後にアルカリホスファターゼ染色によって分析し、分化コロニー、混合コロニー及び未分化コロニー、または未分化コロニーの数を点数化した）。図ｃは、ＤＭ−αＫＧ有り、または無しで、３日間処理したＮａｎｏｇ−ＧＦＰ細胞の平均ＧＦＰ強度の定量化を示す。データは、代表的な実験から得られた３連ウェルの平均値±ｓ．ｄ．（ｂ）または９５％信頼区間（ｃ）として示されている。
【図５】図５ａ〜図５ｋは、下記の内容を示す。図ａは、血清／ＬＩＦ（Ｓ／Ｌ）または２ｉ／ＬＩＦ（２ｉ／Ｌ）において培養したＥＳＣ−Ｖ１９細胞の倍加時間の棒グラフを示す。図ｂは、グルコースを含まないＳ／Ｌ培地またはＳ／Ｌ＋２ｉ培地において培養したＥＳＣ−１細胞の増殖曲線を示す。図ｃは、グルタミン含有または非含有のＳ／Ｌ（左）培地及び２ｉ／Ｌ（右）培地の試料をガスクロマトグラフィー−質量分析によって分析したものを示す。総イオン数の代表的なクロマトグラムは、＋Ｑ培地（灰色）においては、グルタミン（Ｑ）のピークが明確に検出され、−Ｑ培地（赤）においては、検出可能なグルタミンは存在しないことを明らかにしている。ｍは、分を示す。図ｄは、グルタミン非含有の２ｉ／Ｌ培地において３日間増殖したＥＳＣ由来の奇形腫形成を示す。ヘマトキシリン染色及びエオシン染色の代表的な画像は、神経組織（外胚葉）、肝細胞及び膵腺房細胞（内胚葉）、ならびに平滑筋（中胚葉）を明らかにしている。スケールバーは、２００μｍを示す。図ｅは、グルタミン非含有の２ｉ／Ｌ培地または２ｉ培地において増殖したＥＳＣ−１細胞の増殖曲線を示す。図ｆは、Ｆｇｆ及びアクチビンＡと共に培養することによって、ＥｐｉＳＣが、ＥＳＣ−１細胞から産生したことが、遺伝子発現解析により確認されたことを示す。転写レベルは、ｑＲＴ−ＰＣＲによって評価し、Ｇａｐｄｈに対し正規化して、２ｉ／Ｌ培地において培養したｍＥＳＣの値の比として表した。図ｇは、グルタミン含有または非含有のエピブラスト培地（Ｆｇｆ／ＡｃｔＡ）において培養したエピブラスト幹細胞（ＥｐｉＳＣ）の増殖曲線を示す。図ｈは、グルタミン非含有のＳ／Ｌ培地または２ｉ／Ｌ培地において培養した線維芽細胞から、Ｏｃｔ３／４（Ｏ）、Ｋｌｆ４（Ｋ）、及びＳｏｘ２（Ｓ）を使用して得られた人工多能性（ｉＰＳ）細胞株の増殖曲線を示す。図ｉは、グルタミン存在下及び非存在下で２ｉ／Ｌ培地において培養したＥＳＣ−１細胞の倍加時間を示す。図ｊは、１μＭのメチルスルホキシド（ＭＳＯ）の存在下または非存在下でグルタミン非含有の２ｉ／Ｌ培地において培養したＥＳＣ−Ｖ１９細胞の増殖曲線を示す。図ｋ及び図ｌは、４ｍＭのα−ケトグルタル酸ジメチル（ｄｉｍｅｔｈｙｌ−α−ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ）（ＤＭ−αＫＧ）存在下または非存在下で、グルタミン非含有のＳ／Ｌ培地（ｋ）または２ｉ／Ｌ培地（ｌ）において増殖したＥＳＣ−Ｖ１９細胞を示す。増殖曲線の実験では、０日目に完全培地に細胞を播種した後、１日目に実験培地へと変更した。データは、代表的な実験から得られた３連ウェルの平均値±ｓ．ｄとして示されている。
【図６】図６ａ〜図６ｃは、下記の内容を示す。図ａは、グルコール由来の炭素から産生したグルタミン酸を示す棒グラフを示す。［Ｕ−１３Ｃ］グルコースを含むグルタミン非含有のＳ／Ｌ培地または２ｉ／Ｌ培地において、ＥＳＣ−１細胞を４時間培養することでグルコース由来の炭素によって標識化されたグルタミン酸の総量が示されている。図ｂは、２ｉによって、グルコース由来の炭素からグルタミン酸合成が可能になることを示す。［Ｕ−１３Ｃ］グルコースを含むＳ／Ｌ培地、Ｓ／Ｌ／２ｉ培地、または２ｉ／Ｌ培地においてＥＳＣ−１細胞を４時間培養した後の、グルコース由来の炭素を含むグルタミン酸の画分が示されている。図ｃ及び図ｄは、４８時間インキュベートした後の、総細胞タンパク質への［Ｕ−１４Ｃ］グルタミン（１４Ｃ−ｇｌｎ）由来の１４Ｃの取り込み（ｃ）または［Ｕ−１４Ｃ］グルコース（１４Ｃ−ｇｌｃ）由来の１４Ｃの取り込み（ｄ）を示す。１４Ｃ−ｇｌｃでは、ｐ＜０．０５、１４Ｃ−ｇｌｎでは、ｐ＝０．１であり、独立両側スチューデントｔ検定によって計算した。データは、代表的な実験から得られた３連ウェルの平均値±ｓ．ｄ（ａ、ｂ）または平均値±ｓ．ｅ．ｍ（ｃ）として示されている。
【図７】図７ａ〜図７ｃは、下記の内容を示す。図ａは、記載の添加内容で、グルタミン非含有のＳ／Ｌ培地または２ｉ／Ｌ培地において、２４時間増殖したＥＳＣ−１細胞のウエスタンブロットを示す（ＤＭ−αＫＧは、α−ケトグルタル酸ジメチルである）。図ｂ及び図ｃは、ＵＴＸ／Ｊｍｊｄ３の阻害剤であるＧＳＫ−Ｊ４を３０μＭで含有するか、またはＧＳＫ−Ｊ４を含有しないＳ／Ｌ（ｂ）培地または２ｉ／Ｌ（ｃ）培地において５時間培養したＥＳＣ−１細胞のＨ３Ｋ２７ｍｅ３のＣｈＩＰ−ＰＣＲを示す。データは、代表的な実験から得られた３連試料の平均値±ｓ．ｅ．ｍ．として示されており、＊は、ｐ＜０．０５であることを示し、独立両側スチューデントｔ検定によるものである。
【図８】図８ａ〜図８ｃは、下記の内容を示す。図ａは、ｇＲＮＡが、マウスＪｍｊｄ３のエクソン１７を標的化する方法の模式図である。ｇＲＮＡ配列は、灰色の背景で強調されている。図ｂは、本研究で使用した２種のクローン由来の代表的な配列である。サンガー法による配列決定により、模式図に示されるように、挿入欠失が明らかとなった。破線は、塩基の欠失を示し、下線のある塩基は、挿入を示す。ｇＲＮＡは、灰色の背景で強調されており、ＰＡＭ配列は、ＡＧＧであると同定された。予想切断部位は、赤色の三角で示されている。右側にインフレームの下流終止位置が示されている。図ｃは、予想Ｃａｓ９切断部位での単一塩基対の挿入を示すクローンＪＭＪＤ３Δ／Δ−２のクロマトグラムの例を示す。図８ａ〜図８ｂにおいて示される配列は、下記のものを含む。（配列番号１）５’−ＴＧＣ  ＣＴＧ  ＴＧＧ  ＡＴＧ  ＴＴＡ  ＣＣＣ  ＧＣＡ  ＴＧＡ  ＡＧＧ  ＣＧＧ  Ｇ  ３’（配列番号１）；３’−ＡＣＧ  ＧＡＣ  ＡＣＣ  ＴＡＣ  ＡＡＴ  ＧＧＧ  ＣＧＴ  ＡＣＡ  ＴＣＣ  ＧＣＣ  Ｃ  ５’（配列番号２）；５’−ＴＧＴ  ＧＧＡ  ＴＧＴ  ＴＡＣ  ＣＣＧ  ＣＡＴ  ＧＡ−３’（配列番号３）；５’−ＧＡＡ  ＧＧＴ  ＣＣＣ  ＴＧＧ  ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＡＡＣ  ＧＣＣ  ＡＧＧ  ＴＧＴ  Ｇ−３’（配列番号４）；３’−ＣＴＴ  ＣＣＡ  ＧＧＧ  ＡＣＣ  ＧＴＣ  ＧＧＣ  ＴＴＧ  ＣＧＧ  ＴＣＣ  ＡＣＡ  Ｃ−５’（配列番号５）；５’−ＧＴＣ  ＣＣＴ  ＧＧＣ  ＡＧＣ  ＣＧＡ  ＡＣＧ  ＣＣ−３’（配列番号６）；５’  ＴＧＴ  ＧＧＡ  ＴＧＴ  ＴＡＣ  ＣＣＧ  ＣＡＴ  ＧＡＡ  ＧＧ  ３’（配列番号７）；５’  ＴＧＴ  ＧＧＡ  ＴＧＴ  ＴＡＣ  ＣＣＧ  ＴＧＡ  ＡＧＧ  ３’（配列番号８）；５’  ＴＧＴ  ＧＧＡ  ＴＧＴ  ＴＡＣ  ＣＣＧ  ＡＡＧ  Ｇ  ３’（配列番号９）；５’  ＧＴＣ  ＣＣＴ  ＧＧＣ  ＡＧＣ  ＣＧＡ  ＡＣＧ  ＣＣＡ  ＧＧ  ３’（配列番号１０）；５’  ＧＴＣ  ＣＣＴ  ＧＧＣ  ＡＧＣ  ＣＧＡ  ＡＣＡ  ＧＣＣ  ＡＧＧ  ３’（配列番号１１）；５’  ＧＴＣ  ＣＣＴ  ＧＧＣ  ＡＧＣ  ＣＧＡ  ＡＣＣ  ＧＣＣ  ＡＧＧ  ３’（配列番号１２）。
【図９】図９ａ〜図９ｅは下記の内容を示す。図ａは、αＫＧからコハク酸への変換におけるＴｅｔ１／２の役割を示す図である。図ｂは、ＤＭ−αＫＧ含有または非含有のＳ／Ｌ培地において、２４時間培養したＥＳＣ−１細胞内の５−メチルシトシンの相対パーセント（％５−ｍＣ）を示す。それぞれのデータポイントは、代表的な実験の３連ウェルから得られた試料を示す。図ｃは、ＤＭ−αＫＧまたはＤＭコハク酸と共に３日間培養したＥＳＣ−１細胞における遺伝子発現量を示す。図ｄは、ＤＭ−αＫＧ含有のＳ／Ｌ培地において、ＥＳＣ−１細胞を２４時間または４回継代して培養したものを示す。図ｅは、野生型またはＴｅｔ１／Ｔｅｔ２二重ノックアウト（ＤＫＯ）のｍＥＳＣをＤＭ−αＫＧまたはＤＭ−コハク酸と共に７２時間培養したものを示す。ｑＲＴ−ＰＣＲデータ（ｂ〜ｄ）は、アクチンまたはＧａｐｄｈに対して正規化し、試料は、対照に対して正規化した。Ｏｃｔ３／４の変化は無いと予想され、対照として含めた。データは、代表的な実験から得られた３連ウェルの±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。
【図１０】図１０ａ〜図１０ｂは、下記の内容を示す。図ａは、３日間のＤＭ−αＫＧ処理有り、または処理無しのＮａｎｏｇ−ＧＦＰ細胞のＧＦＰ強度を示す代表的なヒストグラムを示す。図ｂは、ＤＭ−αＫＧと共にＥＳＣ−１細胞を４回継代して培養した後、記載の量のＤＭ−αＫＧを含む培地に、３日間切り替えたものを示す。ＦＡＣＳによってＧＦＰ発現量（平均蛍光強度、Ｍ．Ｆ．Ｉ．）を決定した。バーは、代表的な実験から得られた、３連ウェルの±ｓ．ｄ．である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
定義
別段の記載がない限り、本明細書で使用される用語は、当該技術分野の当業者が、一般に理解する意味を有し、本開示の理解の促進のために、本明細書では、いくつかの用語が使用されることになり、下記の定義を有する。
【００３３】
本発明をより理解しやすいものとするために、ある特定の用語が、以下に最初に定義される。下記の用語及び他の用語に向けた追加の定義は、本明細書にわたって記載されている。
【００３４】
本出願では、文脈から明らかでない限り、（ｉ）「ａ」という用語は、「少なくとも１つ（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」を意味すると理解してよく、（ｉｉ）「または（ｏｒ）」という用語は、「及び／または（ａｎｄ／ｏｒ」を意味すると理解してよく、（ｉｉｉ）「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、単独で示されていようと、１つまたは複数の追加の成分または段階と共に示されていようと、記載の成分または段階を包含すると理解してよく、（ｉｖ）「約（ａｂｏｕｔ）」及び「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、当業者であれば理解するであろう標準変動を許容すると理解してよく、ならびに（ｖ）範囲が与えられる場合は、終点を含む。
【００３５】
活性化物質：
本明細書では、「活性化物質（ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）」または活性化因子（ａｃｔｉｖａｔｏｒ）という用語は、その存在またはレベルが、当該物質が存在しない場合に観測されるもの（または異なるレベルで当該物質が存在する場合に観測されるもの）と比較した際に、標的のレベルまたは活性の上昇と相関する物質を指す。いくつかの実施形態では、活性化物質は、その存在またはレベルが、特定の参照レベルまたは活性（例えば、正の対照といった既知の活性化物質が存在するなどの適切な参照条件下で観測されるものなど）と同等であるか、またはそれを超える標的のレベルまたは活性と相関する物質である。
【００３６】
投与：
本明細書では、「投与」という用語は、対象に対する組成物の投与を指す。投与は、任意の適切な経路によるものであってよい。例えば、いくつかの実施形態では、投与は、気管支（気管支滴下注入によるものを含む）、頬側、腸内、皮間（ｉｎｔｅｒｄｅｒｍａｌ）、動脈内、皮内、胃内、髄内、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、くも膜下腔内、静脈内、脳室内、粘膜、経鼻、経口、直腸、皮下、舌下、局所、気管（気管内滴下注入によるものを含む）、経皮、腟、及び硝子体の経路であってよい。
【００３７】
物質：
本明細書では、「物質（ａｇｅｎｔ）」という用語は、任意の化学的クラスの化合物または実体を指してよく、当該化学的クラスには、例えば、ポリペプチド、核酸、糖類、脂質、小分子、金属、またはそれらの組み合わせが含まれる。文脈から明らかであろうが、いくつかの実施形態では、物質は、細胞もしくは生物、またはその画分、抽出物、もしく成分であり得るか、またはそれを含み得る。いくつかの実施形態では、物質は、天然に見出される天然物、及び／もしくは天然から得られる天然物であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、物質は、人の手による行為を介して設計、操作、及び／もしくは産生された、ならびに／または天然に見出されないという点において人工である１つもしくは複数の実体であるか、あるいはそれを含む。いくつかの実施形態では、物質は、単離形態または純粋形態で利用されてよく、いくつかの実施形態では、物質は、粗形態で利用されてよい。
【００３８】
アミノ酸：
本明細書では、「アミノ酸」という用語は、その広義において、ポリペプチド鎖へと組み込むことができる任意の化合物及び／または物質を指す。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、Ｈ２Ｎ−Ｃ（Ｈ）（Ｒ）−ＣＯＯＨの一般構造を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、天然起源のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、合成アミノ酸であり、いくつかの実施形態では、アミノ酸は、ｄ−アミノ酸であり、いくつかの実施形態では、アミノ酸は、ｌ−アミノ酸である。「標準アミノ酸」は、天然起源のペプチドにおいて一般に見出される２０個の標準ｌ−アミノ酸のいずれかを指す。「非標準アミノ酸」は、合成的に調製されるか、または天然源から得られるかにかかわらず、標準アミノ酸以外の任意のアミノ酸を指す。本明細書では、「合成アミノ酸」は、化学的に改変されたアミノ酸を包含し、当該改変アミノ酸には、限定はされないが、塩、アミノ酸の誘導体（アミドなど）、及び／または置換が含まれる。ペプチドのカルボキシ末端及び／またはアミノ末端のアミノ酸を含むアミノ酸は、メチル化、アミド化、アセチル化、保護基、及び／または他の化学基であって、その活性に有害な影響を与えることなくペプチドの循環半減期を変えることができる他の化学基での置換、によって改変することができる。アミノ酸は、ジスルフィド結合に関与してよい。アミノ酸は、１つまたは複数の化学実体（例えば、メチル基、アセテート基、アセチル基、リン酸基、ホルミル部分、イソプレノイド基、硫酸基、ポリエチレングリコール部分、脂質部分、糖質部分、ビオチン部分等）との結合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）などの１つまたは複数の翻訳後修飾を含んでよい。「アミノ酸」という用語は、「アミノ酸残基」と互換的に使用され、遊離アミノ酸及び／またはペプチドのアミノ酸残基を指してよい。用語が、遊離アミノ酸を指すか、またはペプチドの残基を指すかは、当該用語が使用される文脈から明らかであろう。
【００３９】
アナログ：
本明細書では、「アナログ」という用語は、参照物質と、１つまたは複数の特定の構造的な特徴、元素、成分、または部分を共有する物質を指す。典型的には、「アナログ」は、参照物質と顕著な構造的類似性を示し、例えば、コア構造またはコンセンサス構造を共有しているが、ある特定の別々の様式において異なりもする。いくつかの実施形態では、アナログは、参照物質の化学的操作によって、参照物質から生成させることができる物質である。いくつかの実施形態では、アナログは、参照物質を生成させるものと実質的に類似の（例えば、複数の段階を共有する）合成プロセスの実施により生成させることができる物質である。いくつかの実施形態では、アナログは、参照物質を生成させるために使用するものとは異なる合成プロセスの実施により生成するか、または生成させることができる。
【００４０】
動物：
本明細書では、「動物」という用語は、動物界の任意のメンバーを指す。いくつかの実施形態では、「動物」は、いずれかの性別であり、任意の発育段階にあるヒトを指す。いくつかの実施形態では、「動物」は、任意の発育段階にあるヒトではない動物を指す。ある特定の実施形態では、ヒトではない動物は、哺乳類（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、及び／またはブタ）である。いくつかの実施形態では、動物には、限定はされないが、哺乳類、トリ、爬虫類、サカナ、昆虫、及び／または虫が含まれる。いくつかの実施形態では、動物は、遺伝子導入動物、遺伝子学的に操作された動物、及び／またはクローンであってよい。
【００４１】
アンタゴニスト：
本明細書では、「アンタゴニスト」という用語は、ｉ）例えば、受容体を不活性化する別の物質の効果を阻害、低減、または減少させる物質、及び／またはｉｉ）例えば、１つもしくは複数の受容体の活性化、または１つもしくは複数の生物学的経路の刺激といった１つまたは複数の生物学的事象を阻害、低減、減少、または遅延させる物質を指す。特定の実施形態では、アンタゴニストは、１つまたは複数の受容体チロシンキナーゼの活性化及び／または活性を阻害する。アンタゴニストは、任意の化学的クラスの物質であり得、またはそれを含んでよく、当該化学的クラスには、例えば、小分子、ポリペプチド、核酸、糖質、脂質、金属、及び／または関連する阻害活性を示す任意の他の実体が含まれる。アンタゴニストは、直接的（この場合、アンタゴニストは、受容体に対して直接的にその影響を与える）、または間接的（この場合、アンタゴニストは、受容体に対する結合以外によってその影響を与え、これは、例えば、受容体の発現もしくは転写の変更、受容体が直接的に活性化するシグナル伝達経路の変更、受容体のアゴニストの発現、転写もしくは活性の変更である）であってよい。
【００４２】
およそ：
本明細書では、１つまたは複数の関心値に適用される「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、記載の参照値と類似の値を指す。ある特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、別段の記載が無いか、または文脈から明らかでない限り、記載の参照値のいずれかの方向（記載の参照値を超えるか、またはそれを下回る）で、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満以内に入る値の範囲を指す（そのような数が可能な値の１００％を超えることになる場合は除く）。
【００４３】
と結び付いている：
本明細書では、一方の存在、レベル、及び／または形態が、もう一方と相関するのであれば、２つの事象または実体が、お互いに「結び付いている（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）」。例えば、特定の実体（例えば、ポリペプチド）は、その存在、レベル、及び／または形態が、疾患、障害、または状態の発症率及び／または感受性と相関する（例えば、関連集団にわたる）のであれば、特定の疾患、障害、または状態と結び付いていると考えられる。いくつかの実施形態では、２つ以上の実体が、直接的または間接的に相互作用し、その結果、それらが、お互いに物理的に近接しているか、または依然として物理的に近接しているのであれば、それらは、お互いに物理的に「結び付いている」。いくつかの実施形態では、お互いに物理的に結び付いている２つ以上の実体は、共有結合的にお互いが連結されており、いくつかの実施形態では、お互いに物理的に結び付いている２つ以上の実体は、お互いに共有結合的に連結されていないが、例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁性、及びそれらの組み合わせによる手段によって非共有結合的に結び付いている。
【００４４】
生物学的に活性：
本明細書では、「生物学的に活性」という語句は、生物学的系（例えば、細胞培養、生物等）において、活性を有する任意の化合物の特徴を指す。例えば、生物に投与されると、その生物に対して生物学的効果を有する物質は、生物学的に活性であると考えられる。特定の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドが、生物学的に活性である場合、当該タンパク質またはポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を共有するそのタンパク質またはポリペプチドの部分は、典型的には、「生物学的に活性」な部分と称される。
【００４５】
併用療法：
本明細書では、「併用療法」という用語は、疾患の治療のための２つ以上の異なる医薬物質が、重複するレジメンにおいて投与され、その結果、対象が、少なくとも２つの物質に同時に曝露される状況を指す。いくつかの実施形態では、異なる物質は、同時に投与される。いくつかの実施形態では、１つの物質の投与は、少なくとも１つの他の物質の投与と重複する。いくつかの実施形態では、異なる物質は、順次投与され、その結果、物質は、対象において同時に生物学的活性を有する。
【００４６】
同等：
本明細書では、「同等（ｃｏｍｐａｒａｂｌｅ）」という用語は、お互いに同一ではあり得ないが、その比較を可能にするために十分類似しており、その結果、観測される差異または類似性に基づいて、結論を合理的に導き得る２つ以上の物質、実体、状況、状態のセット等を指す。当業者であれば、任意の所与の状況において、２つ以上のそのような物質、実体、状況、状態のセット等が、同等であると考えるために、状況に応じてどの程度の類似性が必要であるかを理解されよう。
【００４７】
誘導体：
本明細書では、「誘導体」という用語は、参照物質の構造的なアナログを指す。すなわち、「誘導体」は、参照物質と顕著な構造的類似性を示す物質であり、例えば、コア構造またはコンセンサス構造を共有しているが、ある特定の別々の様式において異なりもする。いくつかの実施形態では、誘導体は、化学的操作によって、参照物質から生成させることができる物質である。いくつかの実施形態では、誘導体は、参照物質を生成させるものと実質的に類似の（例えば、複数の段階を共有する）合成プロセスの実施により生成させることができる物質である。
【００４８】
決定する：
「決定（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ）」は、例えば、本明細書で明示的に示される特定の手法を含む、当業者が利用可能な任意の様々な手法のいずれかを利用できるか、または当該手法のいずれかを使用して達成することができることを、当業者であれば理解している。いくつかの実施形態では、決定には、物理的な試料の操作を伴う。いくつかの実施形態では、決定には、例えば、関連する分析の実施に適合したコンピューターまたは他の処理装置を利用した、データまたは情報の考慮及び／または操作を伴う。いくつかの実施形態では、供給源からの関連する情報及び／または材料の受け取りを伴う。いくつかの実施形態では、決定には、試料または実体の１つまたは複数の特徴と、同等の参照との比較を伴う。
【００４９】
診断情報：
本明細書では、診断における使用のための診断情報または情報は、患者が、疾患もしくは状態を有しているかどうかの決定において有用である任意の情報、及び／または表現型のカテゴリーあるいは疾患もしくは状態の予後、または疾患もしくは状態の治療（一般治療もしくは任意の特定の治療のいずれか）に対する可能性のある応答、に関して重要性を有する任意のカテゴリーへの疾患または状態の分類において有用である任意の情報である。同様に、診断は、任意の型の診断情報の提供を指し、当該診断情報には、限定はされないが、対象が、疾患もしくは状態（癌など）を有しているかどうかの可能性、対象において顕在化している疾患もしくは状態の状況、段階分け、もしくは特徴、腫瘍の性質もしくは分類に関係する情報、予後に関係する情報、及び／または適切な治療の選定において有用な情報が含まれる。治療の選定には、特定の治療（例えば、化学療法）、物質もしくは手術、放射線等などの他の治療様式の選択、治療を保留もしくは実施するかどうかについての選択、投薬レジメン（例えば、１回もしくは複数回用量の特定の治療物質の頻度もしくはレベル、または治療物質の組み合わせ）に関係する選択等が含まれてよい。
【００５０】
投薬形態：
本明細書では、「投薬形態（ｄｏｓａｇｅ  ｆｒｏｍ）」及び「単位投薬形態（ｕｎｉｔ  ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍ）」という用語は、対象に対して投与されることになる治療組成物の物理的に別々の単位を指す。それぞれの単位は、所定量の活性材料（例えば、抗受容体チロシンキナーゼ抗体などの治療物質）を含む。いくつかの実施形態では、所定量は、投薬レジメンにおいて用量として投与されると、所望の治療効果と相関したことがある量である。当業者であれば、特定の対象に対して投与される治療組成物または治療物質の総量は、１人または複数人の担当医によって決定され、複数の投薬形態の投与を伴い得ることを理解している。
【００５１】
投薬レジメン：
本明細書では、「投薬レジメン（ｄｏｓｉｎｇ  ｒｅｇｉｍｅｎ）」（または「治療レジメン（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｒｅｇｉｍｅｎ）」）は、対象に対して個々に投与され、典型的には、期間によって分けられている単位用量（典型的には複数回）のセットである。いくつかの実施形態では、所与の治療物質には、１回または複数回の用量を含み得る推奨の投薬レジメンが存在する。いくつかの実施形態では、投薬レジメンは、複数回の用量を含み、そのそれぞれが、同一の長さの期間でお互いに分かれており、いくつかの実施形態では、投薬レジメンは、複数回の用量、及び個々の用量を分ける少なくとも２つの異なる期間を含む。いくつかの実施形態では、患者集団にわたって投与されるとき、投薬レジメンは、所望の治療結果と相関するか、または相関したことがある。
【００５２】
機能性：
本明細書では、「機能性（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）」生物学的分子は、それにより特徴づけられる性質及び／または活性を示す形態にある生物学的分子である。生物学的分子は、２つの機能（すなわち、二機能性）または多くの機能（すなわち、多機能性）を有してよい。
【００５３】
異性体：
当該技術分野において知られるように、多くの化学実体（具体的には、多くの有機分子及び／または多くの小分子）が、様々な構造異性体及び／または光学異性体の形態で存在することができる。いくつかの実施形態では、当業者であれば文脈から明らかであるように、本明細書の特定の化合物の構造の記述またはそれに対する参照は、その構造異性体及び／または光学異性体のすべてを包含することを意図する。いくつかの実施形態では、当業者であれば文脈から明らかであるように、本明細書の特定の化合物の構造の記述またはそれに対する参照は、記載される異性体または参照される異性体形態のみを包含することを意図する。いくつかの実施形態では、様々な異性体形態として存在することができる化学実体を含む組成物は、複数のそのような形態を含み、いくつかの実施形態では、そのような組成物は、単一の形態のみを含む。例えば、いくつかの実施形態では、様々な光学異性体（例えば、立体異性体、ジアステレオマー等）として存在することができる化学実体を含む組成物は、そのような光学異性体のラセミ集団を含み、いくつかの実施形態では、そのような組成物は、単一の光学異性体のみを含み、及び／または光学活性を一緒に保持する複数の光学異性体を含む。
【００５４】
マーカー：
本明細書では、マーカーは、その存在またはレベルが、特定の腫瘍またはその転移性疾患に特徴的である物質を指す。例えば、いくつかの実施形態では、当該用語は、特定の腫瘍、腫瘍のサブクラス、腫瘍の段階等に特徴的な遺伝子発現産物を指す。あるいは、またはさらに、いくつかの実施形態では、特定マーカーの存在またはレベルは、例えば、特定のクラスの腫瘍に特徴的であり得る特定のシグナル経路の活性（または活性レベル）と相関する。マーカーの存在または非存在の統計学的有意性は、特定マーカーに応じて変わり得る。いくつかの実施形態では、腫瘍が特定のサブクラスのものであるという可能性の高さを反映するという点において、マーカーの検出は、高度に特異的である。そのような特異性は、感度が犠牲になり得る（すなわち、例え腫瘍が、マーカーを発現するであろうと予想される腫瘍であったとしても、負の結果が生じ得る）。逆に高感度であるマーカーは、低感度のものと比較して特異性が低くあり得る。本発明によれば、有用なマーカーによって、１００％の正確性で、特定のサブクラスの腫瘍が区別される必要はない。
【００５５】
質量分析：
質量分析は、気相イオンの質量対荷電比へと変換することができるパラメータを測定する気相イオン分光計を使用する方法を指す。質量分析計は、一般に、イオン源及び質量分析計を含む。質量分析計の例は、飛行時間型、磁場セクター型、四重極フィルター型、イオントラップ型、イオンサイクロトロン共鳴型、静電セクター分析計、及びこれらの複合型である。
【００５６】
代謝物：
本明細書では、「代謝物」は、体内でエネルギーを生じさせるか、またはエネルギーを使用する物理的プロセスまたは化学的プロセスの間、産生または使用する任意の物質を指し、当該プロセスは、食物及び栄養分の消化、尿及び糞便を介した老廃物の排出、呼吸、血液循環、ならびに温度制御などである。「代謝前駆物質（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）」という用語は、そこから代謝物が生じる化合物を指す。「代謝産物（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔ）」という用語は、代謝経路の一部である任意の物質を指す（例えば、代謝物、代謝前駆物質）。
【００５７】
修飾因子：
「修飾因子（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）」という用語は、関心活性が観測される系において、修飾因子が存在しなければ同等である条件下で観測されるものと比較した際、その存在が、その活性のレベル及び／または性質の変化と相関する実体を指すために使用される。いくつかの実施形態では、修飾因子が存在しなければ同等である条件下で観測されるものと比較した際、それが存在することで活性が増加するという点において、修飾因子は、活性化因子である。いくつかの実施形態では、修飾因子が存在しなければ同等である条件と比較した際、それが存在することで活性が減少するという点において、修飾因子は、阻害剤である。いくつかの実施形態では、修飾因子は、関心活性を有する標的実体と直接的に相互作用する。いくつかの実施形態では、修飾因子は、関心活性を有する標的実体と間接的に（すなわち、標的実体と相互作用する中間物質と直接的に）相互作用する。いくつかの実施形態では、修飾因子は、関心標的実体のレベルに影響を与え、あるいは、またはさらに、いくつかの実施形態では、修飾因子は、標的実体のレベルに影響を与えることなく、関心標的実体の活性に影響を与える。いくつかの実施形態では、修飾因子は、関心標的実体のレベル及び活性の両方に影響を与え、その結果、観測される活性差異は、観測されるレベル差異によって完全に説明されるものではないか、または観測されるレベル差異と完全に釣り合うものではない。
【００５８】
医薬組成物：
本明細書では、「医薬組成物」という用語は、１つまたは複数の医薬的に許容可能な担体と共に製剤化される活性物質を指す。いくつかの実施形態では、関連集団に対して投与されると所定の治療効果を達成する可能性が、統計学的に有意である治療レジメンでの投与に適切である単位用量において、活性物質は存在する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、下記に適合するものを含む固体形態または液体形態での投与向けに特別に製剤化されてよい。すなわち、例えば、水薬（水溶性もしくは非水溶性の溶液もしくは懸濁液）、例えば、頬側吸収、舌下吸収、及び全身性吸収を標的としたものといった錠剤、ボーラス、粉末、顆粒、舌に適用するためのペースト剤といった経口投与、例えば、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、または硬膜外注射による、例えば、無菌溶液もしくは懸濁液、または持続放出製剤としての非経口投与、例えば、皮膚、肺、または口腔に適用するクリーム、軟膏、または制御放出パッチもしくはスプレーとしての局所適用、例えば、ペッサリー、クリーム、または泡沫といった腟内または直腸内へのもの、舌下へのもの、眼へのもの、経皮的なもの、あるいは経鼻的なもの、肺へのもの、及び他の粘膜表面へのものである。
【００５９】
医薬的に許容可能：
本明細書では、「医薬的に許容可能」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴わず、ヒト及び動物の組織との接触使用に適しており、合理的な利益／危険比に見合う物質を指す。
【００６０】
多能性：
本明細書では、「多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）」、「多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）」、または「多能性状態（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔａｔｅ）」という用語は、細胞の性質、すなわち、様々な組織または臓器へと分化する能力を指す。例えば、いくつかの実施形態では、多能性細胞は、三つの胚性生殖層のすべてへと分化する能力を有した細胞であり、当該三つの胚性生殖層は、内胚葉（例えば、腸組織）、中胚葉（例えば、血液、筋肉、及び血管）、ならびに外胚葉（例えば、皮膚及び神経）である。多能性細胞は、典型的には、広範に分裂する潜在力を有する。
【００６１】
前駆細胞：
本明細書では、「前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）」という用語は、より大きな発生上の潜在力を有する細胞、すなわち、分化によって生じさせることができる細胞と比較して、より原始的な（例えば、発生上の経路または進行に沿う早期段階にある）細胞表現型を指す。前駆細胞は、顕著または非常に高い増殖性の潜在力を有することが多い。前駆細胞は、発生上の潜在力が低下した複数の別々の細胞、すなわち、分化した細胞型を生じさせることができるか、または発生上の経路及び細胞が発生もしくは分化する環境に応じて、単一の分化した細胞型を生じさせることができる。
【００６２】
予後情報及び予測情報：
本明細書では、予後情報及び予測情報という用語は、治療の有無を問わず、疾患または状態の過程の任意の側面を示すために使用し得る任意の情報を指すために互換的に使用される。そのような情報には、限定はされないが、患者の平均余命、患者が、所与の期間（例えば、６ヶ月、１年、５年等）生存するであろう見込み、患者の疾患が、治癒するであろう見込み、患者の疾患が、特定治療に応答するであろう見込み（応答は、様々な方法のいずれかで定義されてよい）。予後情報及び予測情報は、診断情報の広範なカテゴリー内に含まれる。
【００６３】
純粋：
本明細書では、他の成分を実質的に含まないのであれば、物質または実体は、「純粋（ｐｕｒｅ）」である。例えば、特定の物質または実体の含量が、約９０％を超える調製物は、典型的には、純粋な調製物であると考えられる。いくつかの実施形態では、物質または実体は、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、純粋である。
【００６４】
参照：
「参照（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」という用語は、関心物質または関心値が比較される標準物質もしく標準値または対照物質もしくは対照値を説明するために、本明細書で使用されることが多い。いくつかの実施形態では、関心物質または関心値の試験または決定と実質的に同時に、参照物質が、試験され、及び／または参照値が、決定される。いくつかの実施形態では、参照物質または参照値は、歴史的参照であり、任意選択で実体媒体において具現化している。当業者であれば理解されようが、典型的には、参照物質または参照値は、関心物質または関心値の決定または特徴づけに利用するものと同等の条件下で決定または特徴づけられる。
【００６５】
危険：
文脈から理解されるように、疾患、障害、または状態の「危険（ｒｉｓｋ）」は、特定の個人に、疾患、障害、または状態が生じるであろう見込みの程度である。いくつかの実施形態では、危険は、割合として表現される。いくつかの実施形態では、危険は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０〜最大で１００％である。いくつかの実施形態では、危険は、参照試料または参照試料の群と結び付いている危険に対する危険として表現される。いくつかの実施形態では、参照試料または参照試料の群は、疾患、障害、または状態の既知の危険を有する。いくつかの実施形態では、参照試料または参照試料の群は、特定の個人と同等の個人に由来する。いくつかの実施形態では、相対的危険は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも大きい。
【００６６】
試料：
本明細書では、対象から得られる試料は、限定はされないが、下記のいずれかまたはすべてを含んでよい。すなわち、単一の細胞もしくは複数の細胞、組織の一部、血液、血清、腹水、尿、唾液、及び他の体液、分泌物、または排泄物である。「試料」という用語は、そのような試料の処理によって得られる任意の材料も含む。得られる試料は、試料から抽出されるか、またはｍＲＮＡ等の増幅もしくは逆転写などの手法に試料を供することによって得られるヌクレオチド分子またはポリペプチドを含んでよい。
【００６７】
小分子：
本明細書では、「小分子」という用語は、低分子量の有機化合物及び／または無機化合物を意味する。一般に、「小分子」は、サイズが、約５キロダルトン（ｋＤ）未満の分子である。いくつかの実施形態では、小分子は、約４ｋＤ未満、３ｋＤ未満、約２ｋＤ未満、または約１ｋＤ未満である。いくつかの実施形態では、小分子は、約８００ダルトン（Ｄ）未満、約６００Ｄ未満、約５００Ｄ未満、約４００Ｄ未満、約３００Ｄ未満、約２００Ｄ未満、または約１００Ｄ未満である。いくつかの実施形態では、小分子は、約２０００ｇ／ｍｏｌ未満、約１５００ｇ／ｍｏｌ未満、約１０００ｇ／ｍｏｌ未満、約８００ｇ／ｍｏｌ未満、または約５００ｇ／ｍｏｌ未満である。いくつかの実施形態では、小分子は、ポリマーではない。いくつかの実施形態では、小分子は、ポリマー部分を含まない。いくつかの実施形態では、小分子は、タンパク質またはポリペプチドではない（例えば、オリゴペプチドまたはペプチドではない）。いくつかの実施形態では、小分子は、ポリヌクレオチドではない（例えば、オリゴヌクレオチドではない）。いくつかの実施形態では、小分子は、多糖ではない。いくつかの実施形態では、小分子は、多糖を含まない（例えば、糖タンパク質、プロテオグリカン、糖脂質等ではない）。いくつかの実施形態では、小分子は、脂質ではない。いくつかの実施形態では、小分子は、調節物質である。いくつかの実施形態では、小分子は、生物学的に活性である。いくつかの実施形態では、小分子は、検出可能である（例えば、少なくとも１つの検出可能部分を含む）。いくつかの実施形態では、小分子は、治療的である。
【００６８】
特異的：
「特異的」という用語が、活性を有する物質または実体に対する参照と共に本明細書で使用されるとき、当該物質または実体が、可能性のある標的または状態を識別することを意味すると、当業者であれば理解する。例えば、競合する別の標的が存在する中で、物質が、優先的に標的に対して結合するのであれば、当該物質は、その標的に対して「特異的に」結合すると言われる。いくつかの実施形態では、物質または実体は、その標的に対して結合する条件下で、競合する別の標的に対して、検出可能なほどは結合しない。いくつかの実施形態では、物質または実体は、競合する別の標的（複数可）と比較して、結合速度の上昇、解離速度の低下、親和性の増加、解離の低減、及び／または安定性の増加を伴って、その標的に対して結合する。
【００６９】
幹細胞：
「幹細胞」という用語は、限定はされないが、単一細胞レベルで、自己複製及び分化の両方を行い、子孫細胞を産生するその能力によって定義される未分化細胞を含み、当該子孫細胞には、自己複製前駆細胞、非複製前駆細胞、及び最終分化細胞が含まれる。例えば、「幹細胞」には、（１）全能性幹細胞、（２）多能性幹細胞、（３）複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞、（４）少能性幹細胞、及び（５）単能性幹細胞が含まれてよい。幹細胞は、胚性供給源または成体供給源を起源としてよい。本発明の目的に向けて使用することができる幹細胞には、限定はされないが、胚性幹細胞または再プログラム化（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ）幹細胞が含まれ、例えば、人工多能性幹細胞、または体細胞核移植（ＳＣＮＴ）から得られた細胞である。
【００７０】
対象：
「対象」は、哺乳類（例えば、ヒトであり、いくつかの実施形態では出生前のヒト形態を含む）を意味する。いくつかの実施形態では、対象は、関連する疾患、障害、または状態を患っている。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害、または状態に対して感受性である。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害、または状態の１つまたは複数の症状または特徴を示す。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害、または状態の症状または特徴を全く示さない。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害、または状態に感受性であるか、またはその危険に特徴的な１つまたは複数の特徴を有する任意のヒト（ｓｏｍｅｏｎｅ）である。対象は、患者であり得、患者は、疾患の診断または治療のために、医療提供者を訪れるヒトを指す。いくつかの実施形態では、対象は、治療が施される個人である。
【００７１】
実質的に：
本明細書では、「実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」という用語は、全部または全部に近い範囲または程度の関心特徴または関心性質を示す定性的な状態を指す。生物学的技術分野の当業者であれば、生物学的現象及び化学的現象は、皆無ではないにせよ、完了まで進行し、及び／または完全性まで進行するか、または絶対的結果を達成もしくは回避することは稀であることを理解されよう。したがって、本明細書では、「実質的」という用語は、多くの生物学的現象及び化学的現象において固有である完全性の潜在的な欠如をとらえるために使用される。
【００７２】
患う：
疾患、障害、または状態を「患う（ｓｕｆｆｅｒｉｎｇ  ｆｒｏｍ）」個人は、疾患、障害、もしくは状態の１つもしくは複数の症状もしくは特徴の診断を受けたことがあり、及び／またはそれを示すか、もしくは示したことがある。
【００７３】
に対して感受性：
疾患、障害、または状態に「対して感受性」である個人は、疾患、障害、または状態が生じる危険がある。いくつかの実施形態では、そのような個人は、関連する疾患、障害、及び／または状態が生じる危険の増加と統計学的に相関する１つまたは複数の因子を有することが知られている。いくつかの実施形態では、疾患、障害、または状態に対して感受性である個人は、疾患、障害、または状態の症状を全く示さない。いくつかの実施形態では、疾患、障害、または状態に対して感受性である個人は、疾患、障害、及び／または状態の診断を受けたことがない。いくつかの実施形態では、疾患、障害、または状態に対して感受性である個人は、疾患、障害、または状態の発症と結び付いている状態に対して曝露されたことがある個人である。いくつかの実施形態では、疾患、障害、及び／または状態が生じる危険は、集団に基づく危険である（例えば、アレルギー等を患っている個人の家族のメンバー。
【００７４】
症状が低減する：
本発明によれば、特定の疾患、障害、または状態の１つまたは複数の症状の程度（例えば、強度、重症度等）及び／または頻度が低減すると、「症状が低減する」。明確化の目的で記載すると、特定症状の発症の遅延は、その症状の頻度低減の１つの形態であると考えられる。例えば、小さな腫瘍を有する癌患者の多くは、症状を示さない。症状が消失した場合のみに、本発明が、限定されることは意図しない。本発明は、１つまたは複数の症状が、完全に消失はしないが、低減する（及び対象の状態が、それによって「改善する」）ような治療を具体的に企図する。
【００７５】
治療物質：
本明細書では、「治療物質（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）」という語句は、対象に対して投与されると、治療効果を有し、ならびに／または所望の生物学的及び／もしくは薬理学的な効果を誘発する任意の物質を指す。
【００７６】
治療上有効な量：
本明細書では、「治療上有効な量」という用語は、任意の医学的治療に適用可能な合理的な利益／危険比で、治療される対象に対して治療効果を与える治療タンパク質の量を指す。治療効果は、客観的（すなわち、ある試験もしくはマーカーによって測定可能）であっても、または主観的（すなわち、対象が、効果の徴候を示すか、もしくは効果を感じる）であってもよい。具体的には、「治療上有効な量」は、疾患に結び付いている症状の寛解、疾患発症の予防もしくは遅延、及び／または同様に、疾患症状の重症度もしくは頻度の減弱などによって、所望の疾患もしくは状態の治療、寛解、もしくは予防のために有効であるか、または検出可能な治療効果もしくは予防効果を示すために有効である治療タンパク質または治療組成物の量を指す。治療上有効な量は、一般に、複数回の単位用量を含み得る投薬レジメンにおいて投与される。どのような特定の治療タンパク質でも、例えば、投与経路、他の医薬物質との組み合わせに応じて、治療上有効な量（及び／または有効な投薬レジメン内の適切な単位用量）は、変わってよい。同様に、任意の特定患者に向けた特定の治療上有効な量（及び／または単位用量）は、様々な因子に依存してよく、当該因子には、治療される障害及び障害の重症度、用いる特定の医薬物質の活性、用いる特定の組成物、患者の年齢、体重、健康状態、性別、及び食事、投与時間、投与経路、及び／または用いる特定の融合タンパク質の排出速度もしくは代謝速度、治療の継続期間、ならびに医学分野でよく知られる同様の因子が含まれる。
【００７７】
治療：
本明細書では、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）（同様に、「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」）という用語は、特定の疾患、障害、及び／または状態（例えば、癌）の１つまたは複数の症状、特徴、及び／または原因を、部分的、または完全に、軽減、寛解、緩和、抑制、その発症を遅延、その重症度を低減、及び／またはその発症率を低減する物質の任意の投与を指す。そのような治療は、関連する疾患、障害、及び／もしくは状態の徴候を示さない対象、ならびに／または疾患、障害、及び／もしくは状態の早期の徴候のみを示す対象へのものであってよい。あるいは、またはさらに、そのような治療は、関連する疾患、障害、及び／または状態の１つまたは複数の確立された徴候を示す対象へのものであってよい。いくつかの実施形態では、治療は、関する疾患、障害、及び／または状態を患っていると診断されたことがある対象へのものであってよい。いくつかの実施形態では、治療は、関連する疾患、障害、及び／または状態が生じる危険の増加と統計学的に相関する１つまたは複数の感受性因子を有していることが分かっている対象へのものであってよい。
【００７８】
単位用量：
本明細書では、「単位用量（ｕｎｉｔ  ｄｏｓｅ）」という表現は、単回用量として投与される量、または医薬組成物の物理的に別々の単位において投与される量を指す。多くの実施形態では、単位用量は、所定量の活性物質を含む。いくつかの実施形態では、単位用量は、物質の単回用量全体を含む。いくつかの実施形態では、総単回用量を達成するために、単位用量を超える用量が投与される。いくつかの実施形態では、意図する効果を達成するために、複数回単位用量の投与が必要であるか、または必要であると予想される。単位用量は、例えば、所定量の１つまたは複数の治療物質を含むある特定の体積の液体（例えば、許容可能な担体）、所定量の１つまたは複数の固体形態の治療物質、所定量の１つまたは複数の治療物質を含む持続放出製剤または薬物送達装置等であってよい。単位用量は、治療物質（複数可）に対して代替え的、または追加的に任意の様々な成分を含む製剤において存在してよいと理解されよう。例えば、許容可能な担体（例えば、医薬的に許容可能な担体）、希釈剤、安定剤、緩衝剤、保存剤等が、下記の説明のように含まれてよい。多くの実施形態において、毎日の適切な総投与量の特定の治療物質は、一部、または複数回の単位用量を含んでよく、例えば、健全な医学的判断の範囲内で、担当医によって決定されてよいことを当業者であれば理解されよう。いくつかの実施形態では、任意の特定の対象または生物に向けた特定の有効用量レベルは、治療中の障害及び障害の重症度、用いる特定の活性化合物の活性、用いる特定の組成物、対象の年齢、体重、健康状態、性別、及び食事、投与時間及び用いる特定の活性化合物の排出速度、治療の継続時間、用いる特定の化合物（複数可）と組み合わせて、または同時に使用される薬物または追加療法、ならびに医学分野でよく知られる同様の因子を含む様々な因子に依存してよい。
【００７９】
ある特定の実施形態の詳細な説明
本発明は、幹細胞の増殖及び多能性が、細胞代謝の操作によって制御できるという発見を包含する。本発明は、細胞内のα−ケトグルタル酸レベル：コハク酸レベルを調節し、細胞の自己複製及び分化を制御できるという発見にさらに含む。
【００８０】
胚性幹細胞モデルを使用した細胞運命の決定
多能性を維持する条件下で増殖した胚性幹細胞（ＥＳＣ）などの幹細胞は、外来性のグルタミン無しで増殖することが可能であり、これは、当該幹細胞が、グルコース由来のα−ケトグルタル酸（αＫＧ）からグルタミンを合成することが可能であることを実証している。これにもかかわらず、ＥＳＣは、代謝物が利用可能であると、高レベルのグルタミンを消費する。同位体追跡試験を使用し、本発明者らは、分化細胞との比較において、ナイーブＥＳＣは、ＴＣＡ回路及びタンパク質合成における消費を避けて獲得するグルタミンを管理すると共に、代わりにグルタミンを利用し、ヒストンの脱メチル化を促進するαＫＧのプールを維持して多能性を持続させるということを見出している。ナイーブＥＳＣでは、コハク酸に対するαＫＧの比が、顕著に増加しており、αＫＧ依存性の反応の平衡バランスを変えるために十分である。同様に、本発明者らは、αＫＧ：コハク酸の相対レベルによって、発生間の系譜決定に重要な「二価ドメイン」遺伝子におけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３を含む、構成的ヘテロクロマチン及び条件的ヘテロクロマチンの両方と結び付いている複数のヒストン修飾を制御できることを実証している１、２。本研究によって、細胞内のαＫＧレベル：コハク酸レベルは、細胞独自性の維持に寄与すると共に、ナイーブ多能性細胞の転写状態及びエピジェネティック状態において機構的役割を担えることが明らかとなっている。
【００８１】
細胞内の相対的なαＫＧレベル：コハク酸レベルを調節するための、本発明の培養方法に従って、細胞運命または細胞集団を決定することができる。
【００８２】
いくつかの実施形態では、細胞運命は、遺伝子型、表現型、形態学、遺伝子発現、代謝マーカー、細胞表面マーカーを同定する当該技術分野における１つまたは複数の方法、及び／または細胞の細胞機能アッセイによって確認される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の特定遺伝子の遺伝子発現は、特定培地における培養などの特定の条件に細胞を曝露した後に同定される。遺伝子レベル、タンパク質レベル、及び／または機能は、例えば、ノーザンブロット、ウエスタンブロット、サザンブロット、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、ｑＰＣＲ等を使用して確認されてよい。いくつかの実施形態では、細胞成熟度は、例えば、ヒストン修飾のパターンといったエピジェネティック変化によって決定される。特定の実施形態では、遺伝子は、好気性呼吸と結び付いている特定経路及びそれに結び付いている経路に関与するタンパク質をコードし、当該経路には、酸化的リン酸化、クエン酸回路（ＴＣＡ）、脂肪酸酸化、ピルビン酸脱炭酸、及び同様のものが含まれる。特定の実施形態では、遺伝子は、ＣＰＴ１またはＰＰＡＲａ（脂肪酸酸化に結び付いている遺伝子）を含んでよい。いくつかの場合では、遺伝子は、ホルモン発現（ＮＰＰＡ／ＡＮＰ及びＮＰＰＢ／ＢＮＰの発現の減少など）などの、成熟型の細胞の発生を示すタンパク質、ならびに成熟（ミオシン軽鎖２Ｖの発現は、増加するが、平滑筋アクチン及び骨格アクチンの発現は減少するなど）に結び付いている構造タンパク質をコードする。
【００８３】
細胞培養における細胞運命の制御
本発明は、多能性及び／もしくは自己複製の特性維持のための組成物、系、及び方法、または細胞培養における、細胞のαＫＧレベル：コハク酸レベルの操作を介した、幹細胞もしくは前駆細胞の細胞分化の促進のための組成物、系、及び方法も提供する。
【００８４】
αＫＧレベル：コハク酸レベルの制御によって、細胞における多能性の維持及び／または誘導が、顕著に改善されるという驚くべき知見が、本明細書に記載されている。αＫＧ化合物またはαＫＧ活性化因子と、ＭＡＰＫ阻害剤（例えば、ＭＥＫ阻害剤、ＥｒＫ阻害剤、もしくはｐ３８阻害剤）またはＧＳＫ３β阻害剤と、の組み合わせによって、細胞の多能性の誘導及び／または維持が可能になる。
【００８５】
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞培養のための組成物、系、及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、培地中における哺乳類幹細胞を含む細胞培養の提供段階と、増殖促進のための、細胞内のコハク酸レベルに対するα−ケトグルタル酸レベルの維持段階と、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、培地中における哺乳類幹細胞を含む細胞培養の提供段階と、多能性の維持のための、細胞内のコハク酸レベルに対するα−ケトグルタル酸レベルの達成段階または維持段階と、を含む。いくつかの実施形態では、細胞を、外来性のα−ケトグルタル酸化合物と接触させる。いくつかの実施形態では、外来性のα−ケトグルタル酸化合物が、培地に対して添加される。いくつかの実施形態では、外来性のα−ケトグルタル酸は、細胞透過性である。いくつかの実施形態では、α−ケトグルタル酸化合物は、α−ケトグルタル酸ジメチル（ＤＭ−αＫＧ）である。
【００８６】
いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）阻害剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）阻害剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）阻害剤及びグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）阻害剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、外来性のグルタミンは、培地に対して添加されない。
【００８７】
いくつかの実施形態では、細胞増殖阻害または分化促進のための系及び方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、培地中における哺乳類幹細胞を含む細胞培養の提供段階と、細胞内のコハク酸レベルに対するα−ケトグルタル酸レベルの維持段階と、を含む。いくつかの実施形態では、外来性のコハク酸化合物が、培地に対して添加される。いくつかの実施形態では、外来性のコハク酸化合物は、細胞透過性である。いくつかの実施形態では、コハク酸は、コハク酸ジメチル（ＤＭ−コハク酸）である。
【００８８】
いくつかの実施形態では、本発明は、幹細胞及び培地を含む培養物を提供し、当該培地は、α−ケトグルタル酸化合物、ＭＡＰＫ阻害剤、及びＧＳＫ３β阻害剤を含む。
【００８９】
いくつかの実施形態では、本発明は、分裂細胞の増殖阻害のための系及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、細胞内のα−ケトグルタル酸レベルを減少させる物質の投与を含む。いくつかの実施形態では、方法は、細胞内のコハク酸のレベルを増加させる物質の投与を含む。いくつかの実施形態では、方法は、グルタミン合成酵素阻害剤の投与をさらに含む。
【００９０】
化合物、活性化因子、または阻害剤のそれぞれの量は、詳細な培養条件、使用する特定の阻害剤、及び培養する細胞の型に応じた最適な利点によって変更及び決定することができる。
【００９１】
いくつかの実施形態では、ＧＳＫ３βの阻害剤には、ＧＳＫ３βに対する抗体、ＧＳＫ３βのドミナントネガティブ変異体、及びＧＳＫ３を標的とするアンチセンス核酸が含まれる。ＧＳＫ３阻害剤の特定例には、限定はされないが、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４、ＡＲ−ＡＯ  １４４１８（例えば、Ｇｏｕｌｄ，ｅｔ  ａｌ，Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ７：３８７−３９０（２００４）を参照のこと）、ＣＴ  ９９０２１（例えば、Ｗａｇｍａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  １０：１１０５−１１３７（２００４）を参照のこと）、ＣＴ  ２００２６（Ｗａｇｍａｎ，上記を参照のこと）、ＳＢ２１６７６３（例えば、Ｍａｒｔｉｎ，ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６：１１１−ＩＭ（２００５）を参照のこと）、ＡＲ−Ａ０１４４１８（例えば、Ｎｏｂｌｅ，ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ  １０２：６９９０−６９９５（２００５）を参照のこと）、リチウム（例えば、Ｇｏｕｌｄ，ｅｔ  ａｌ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４８：４９−５３（２００３）を参照のこと）、ＳＢ  ４１５２８６（例えば、Ｆｒａｍｅ，ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３５９：１−１６（２００１）を参照のこと）、及びＴＤＺＤ−８（例えば、Ｃｈｉｎ，ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３７（１−２）：１９３−２０１（２００５）を参照のこと）が含まれる。Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから入手できるＧＳＫ３阻害剤（例えば、Ｄａｌｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ，ＷＯ２００８／０９４５９７を参照のこと。当該文献は、参照によって本明細書に組み込まれる）のさらなる例には、限定はされないが、ＢＩＯ（２’Ｚ，３’£）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＧＳＫ３阻害剤ＩＸ）、ＢＩＯ−アセトキシム（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−アセトキシム（ＧＳＫ３阻害剤Ｘ）、（５−メチル−ｌＨ−ピラゾール−３−イル）−（２−フェニルキナゾリン−４−イル）アミン（ＧＳＫ３−阻害剤ＸＩＩＩ）、ピリドカルバゾール−シクロペナジエニルルテニウム（ｃｙｃｌｏｐｅｎａｄｉｅｎｙｌｒｕｔｈｅｎｉｕｍ）錯体（ＧＳＫ３阻害剤ＸＶ）、ＴＤＺＤ−８  ４−ベンジル−２−メチル−ｌ，２，４−チアジアゾリジン−３，５−ジオン（ＧＳＫ３ベータ阻害剤Ｉ）、２−チオ（３−ヨードベンジル）−５−（ｌ−ピリジル）−［ｌ，３，４］−オキサジアゾール（ＧＳＫ３ベータ阻害剤ＩＩ）、ＯＴＤＺＴ  ２，４−ジベンジル−５−オキソチアジアゾリジン−３−チオン（ＧＳＫ３ベータ阻害剤ＩＩＩ）、アルファ−４−ジブロモアセトフェノン（ＧＳＫ３ベータ阻害剤ＶＩＩ）、ＡＲ−ＡＯ  １４４１８  Ｎ−（４−メトキシベンジル）−Ｎ’−（５−ニトロ−ｌ，３−チアゾール−２−イル）尿素（ＧＳＫ−３ベータ阻害剤ＶＩＩＩ）、３−（ｌ−（３−ヒドロキシプロピル）−ｌＨ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）−４−ピラジン−２−イル−ピロール−２，５−ジオン（ＧＳＫ−３ベータ阻害剤ＸＩ）、ＴＷＳｌ  １９  ピロロピリミジン化合物（ＧＳＫ３ベ��タ阻害剤ＸＩＩ）、Ｌ８０３  Ｈ−ＫＥＡＰＰ  ＡＰＰＱＳｐＰ−ＮＨ２またはそのミリストイル化形態（ＧＳＯベータ阻害剤ＸＩＩＩ）、２−クロロ−ｌ−（４，５−ジブロモ−チオフェン−２−イル）−エタノン（ＧＳＫ３ベータ阻害剤ＶＩ）、ＡＲ−ＡＯ１４４−１８、ＳＢ２１６７６３、及びＳＢ４１５２８６が含まれる。阻害剤と相互作用するＧＳＫ３ｂの残基は同定されており、例えば、Ｂｅｒｔｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ．３３３（２）：３９３−４０７（２００３）を参照のこと。
【００９２】
いくつかの実施形態では、ＭＡＰＫシグナルの阻害は、１つまたは複数の物質の使用を含み、当該物質には、小分子阻害剤、ＲＮＡｉ、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどの阻害性ポリヌクレオチド、及び同様のものが含まれる。例えば、Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｄｅｎｔａｌ  Ｒｅｓ．８６：８００、Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２：７１７、及びＺｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２８：２８６を参照のこと。これらはそれぞれ、参照によって、本明細書に明確に組み込まれる。阻害剤のクラスには、非ジアリールヘテロ環化合物（Ｃｉｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２（９）：１０２１−１０３５を参照のこと）、イミダゾールを基礎とするピリド−ピリミジン−２−オン化合物（Ｎａｔａｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５（１０）：９８７−１００３を参照のこと）、抗酸化剤（Ｓａｄｏｗｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｐｕｌｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０（１）：９−２２を参照のこと）、次世代阻害剤（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ．２８（６）：２８６−９５）が含まれ、それぞれが、参照によって、本明細書に明確に組み込まれる。他の経路阻害剤は、ＴＮＦ、ＩＬ−１、及び他のもの（Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ２（６）：８１７−８３３、Ｆｕｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ．６４  Ｓｕｐｐｌ  ４：ｉｖ２−１４）などの、ｐ３８活性化を上方制御する炎症性サイトカイン、アンチセンスオリゴヌクレオチド及び妨害オリゴヌクレオチド、ｐ３８を脱リン酸化するタンパク質ホスファターゼ（例えば、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼホスファターゼ−７）の活性化因子／異所性発現、ｐ３８経路における上流アダプターのドミナントネガティブ形態の発現（例えば、ドミナントネガティブＭＫＫ３、またはドミナントネガティブＭＫＫ６、またはドミナントネガティブＡＳＫ１）、ならびに同様のものを標的としてよい。ｐ３８阻害剤は、小分子、ｓｉＲＮＡ（例えば、ＵＳ２００５／０２３９７３１、ＷＯ０４／０９７０２０、ＷＯ０３／０７２５９０）アンチセンス分子、タンパク質、リボザイム、または抗体であり得る。
【００９３】
本明細書に記載の、多能性及び／もしくは自己複製の特性維持のための組成物、系、及び方法、または細胞分化の促進のための組成物、系、及び方法は、任意の幹細胞または前駆細胞に適用可能である。実例として、それぞれの方法において、ＥＳＣもしくはｉＰＳＣまたはそれぞれの細胞株の任意の培養を使用してよい。そのような細胞の集団を得る手段は、当該技術分野においてよく確立されている（例えば、Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．［１９９８］Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２，１１４５−１１４７、またはＣｏｗａｎ，ＣＡ．ｅｔ  ａｌ．［２００４］ＪＶ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０，１３５３−１３５６を参照のこと）。方法が、前駆細胞向けの使用を意図する場合、開示の本方法において、任意の前駆細胞を使用することができる。適した前駆細胞の例には、限定はされないが、神経前駆細胞、内皮前駆細胞、赤血球前駆細胞、心筋前駆細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、網膜前駆細胞、または造血前駆細胞が含まれる。前駆細胞を得る方法は、当該技術分野においてよく知られている。２つの実例として、巨核球前駆細胞を得る方法が、米国特許出願第２００５／０１７６１４２号において開示されており、マウス肝臓前駆細胞株を得る方法が、Ｌｉら（（２００５）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓ，ｄｏｉ：１０．１６３４／ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．２００５−０１０８）によって説明されている。
【００９４】
本明細書に記載の組成物、系、及び方法は、神経細胞、造血細胞、及び間葉細胞などの組織特異的な幹細胞または前駆細胞にも適用可能である。培養された細胞集団は、不均一ならびに実質的に均一な集団を含む。本明細書に記載の方法に従って培養された細胞は、増進した潜在力（分化能力）を達成、維持、または有する。細胞集団は、異なる潜在力を有する細胞が混ざった細胞型を含んでよい（例えば、単一の系譜を確約するものもあれば、２つの系譜を確約するものもあり、さらに、３つすべての系譜を確約するものもある）。集団は、例えば、細胞がすべて、内胚葉前駆体であるように単一の系譜細胞に制限されてよい。または、例えば、内胚葉前駆体及び中胚葉前駆体といった、２つ以上の型の単一系譜の前駆体が存在する、混ざった集団となるであろう。
【００９５】
幹細胞または前駆細胞は、当該技術分野で利用できる培養培地において維持及び増殖させることができる。そのような培地には、限定はされないが、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ  Ｆ１２培地（登録商標）、Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）、Ｆ−１２Ｋ培地（登録商標）、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）、ＲＰＭＩ−１６４０培地（登録商標）が含まれる。培地の多くは、ピルビン酸ナトリウム添加または非添加で、低グルコース製剤としても利用可能である。細胞培養培地に哺乳類の血清を添加することも企図する。血清は、生存及び増殖に必要な細胞因子及び成分を含むことが多い。血清の例としては、ウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）（ＦＢＳ）、ウシ血清（ＢＳ）、仔ウシ血清（ＣＳ）、ウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ）（ＦＣＳ）、ウシ新生仔血清（ＮＣＳ）、ヤギ血清（ＧＳ）３、ウマ血清（ＨＳ）、ヒト血清、トリ血清、ブタ血清、ヒツジ血清、ウサギ血清、血清代替物、及びウシ胚液（ｂｏｖｉｎｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｌｕｉｄ）が含まれる。補体カスケード成分の非働化が望ましいのであれば、血清は、約５５〜６５℃で熱非働化できることが知られている。追加の補充剤を有利に使用して、最適な成長及び増殖のための微量要素を細胞に供給することもできる。そのような補充剤には、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｓｅｌｅｎｉｕｍ）、及びそれらの組み合わせが含まれる。こうした成分は、限定はされないが、Ｈａｎｋｓ’  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（登録商標）（ＨＢＳＳ）、Ｅａｒｌｅ’ｓ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（登録商標）、抗酸化剤補充剤、ＭＣＤＢ−２０１（登録商標）補充剤、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、アスコルビン酸、及びアスコルビン酸−２−リン酸、ならびに追加のアミノ酸などの塩溶液に含めることができる。細胞培養培地の多くが、すでにアミノ酸を含んでいるが、細胞培養前に添加が必要なものもある。そのようなアミノ酸には、限定はされないが、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、及びＬ−バリンが含まれる。こうした補充剤の適切な濃度は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００９６】
細菌、マイコプラズマ、及び真菌の混入を軽減するために、細胞培養において、典型的には、抗生物質も使用される。典型的には、使用される抗生物質または抗真菌性組成物は、ペニシリン／ストレプトマイシンの混合物であるが、アンホテリシン（Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標））、アンピシリン、ゲンタマイシン、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ナリジクス酸、ネオマイシン、ニスタチン、パロモマイシン、ポリミキシン、ピューロマイシン、リファンピシン、スペクチノマイシン、テトラサイクリン、タイロシン、及びゼオシンも含まれ得、これらに限定されるものではない。
【００９７】
細胞培養において、ホルモンも有利に使用することができ、限定はされないが、Ｄ−アルドステロン、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）、デキサメタゾン、β−エストラジオール、ヒドロコルチゾン、インスリン、プロラクチン、プロゲステロン、ソマトスタチン／ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、甲状腺刺激ホルモン、チロキシン、及びＬ−チロニンが含まれる。細胞の型及び分化細胞の運命に応じて、脂質及び脂質担体を使用し、細胞培養培地を補充することもできる。そのような脂質及び担体には、限定はされないが、数ある中でも、シクロデキストリン（α、β、γ）、コレステロール、アルブミンに複合化されたリノール酸、アルブミンに複合化されたリノール酸及びオレイン酸、複合化されていないリノール酸、アルブミンに複合化されたリノール酸−オレイン酸−アラキドン酸、アルブミンに複合化されていないオレイン酸、及びアルブミンに複合化されたオレイン酸が含まれ得る。
【００９８】
支持細胞層の使用も企図する。支持細胞は、幹細胞を含む偏好性の培養細胞の成長を支持するために使用される。支持細胞は、γ線照射によって不活性化した通常の細胞である。培養においては、支持層は、自体がさらに成長または分裂することなく、他の細胞のための基底層として役立つと共に、細胞因子を供給する（Ｌｉｍ，Ｊ．Ｗ．ａｎｄ  Ｂｏｄｎａｒ，Ａ．，２００２）。支持層細胞の例は、典型的には、ヒト二倍体肺細胞、マウス胚線維芽細胞、Ｓｗｉｓｓマウス胚線維芽細胞であるが、細胞の最適な成長、生存、及び増殖を可能にすることにおいて有利である細胞成分及び細胞因子の供給が可能である任意の分裂終了細胞を使用することができる。白血病抑制因子（ＬＩＦ）が、抗分化特性を有するため、多くの場合、ＥＳ細胞を未分化の増殖状態に保つために、支持細胞層は必要ではない。したがって、ＬＩＦ添加は、非胚細胞を未分化状態に維持するために使用することができるであろう。さらに、ＧＳＫ−３阻害剤及びＭＡＰＫ阻害剤を使用して、細胞を未分化状態に維持してよい。
【００９９】
培養中の細胞は、懸濁液中で維持するか、または細胞外マトリックス成分及び合成ポリマーもしくはバイオポリマーなどの固体の支持体に接着させて維持することができる。Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、及びＩＶ型コラーゲン、コンカナバリンＡ、コンドロイチン硫酸、フィブロネクチン、「スーパーフィブロネクチン」、及びフィブロネクチン様ポリマー、ゼラチン、ラミニン、ポリ−Ｄ−リジン及びポリ−Ｌ−リジン、トロンボスポンジン、ならびにビトロネクチンなどの固体の支持体への細胞接着を促す追加因子を、細胞が必要とする場合がある。非胚細胞の維持条件は、ＥＳＣまたはｉＰＳＣなどの細胞を未分化形態にとどめることを可能にする細胞因子も含み得る。細胞が、自己複製する未分化状態にとどまっていなくてはならない条件下では、培地が、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ：選定種において）、ＧＫＳ−３阻害剤、ＭＡＲＫ阻害剤、またはそれらの混合物を含むことが有利である。細胞の自己複製は可能にするが、分化はさせない補充剤は、分化に先立って、培養培地から除去されるべきであることは、当業者には、明らかなことである。別の細胞型との共培養によって、細胞に利益を与えることができる。そのような共培養方法は、細胞を特定の系譜または細胞型へと分化させることを可能にする、依然として未知である細胞因子を、ある特定の細胞が供給できるという観測から広がったものである。こうした細胞因子は、細胞表面の受容体の発現を誘導することもでき、こうした受容体のいくつかは、モノクローナル抗体によって容易に同定することができる。一般に、当業者が誘導を意図する系譜の型に基づいて、共培養向けの細胞は選定され、当業者であれば、共培養向けに適した細胞を選定することができる。
【０１００】
分化細胞を同定し、その後に対応する未分化細胞から分化細胞を分離する方法は、当該技術分野においてよく知られる方法によって実施することができる。分化誘導された細胞は、それによって分化細胞数が未分化細胞数を上回る条件下で細胞を選択的に培養することによって同定することができる。同様に、分化細胞は、対応する未分化細胞には存在しない形態学的な変化及び特徴によって同定することができ、こうした変化及び特徴は、細胞のサイズ、細胞プロセス（すなわち、樹状突起または分岐の形成）の数、及び細胞内小器官の分布の複雑性などである。細胞受容体及び膜貫通タンパク質などの特異的細胞表面マーカーの発現による分化細胞の同定方法も企図する。こうした細胞表面マーカーを標的とするモノクローナル抗体は、分化細胞を同定するために使用することができる。こうした細胞の検出は、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）及び酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を介して達成することができる。特定遺伝子の転写増加の観点から、分化細胞は、未分化細胞とは異なる遺伝子発現レベルを示すことが多い。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、分化応答した遺伝子発現の変化を監視することもできる。あるいは、またはさらに、マイクロアレー技術を使用した全ゲノム解析を使用して、分化細胞を同定することができる。
【０１０１】
したがって、分化細胞を同定した後、必要であれば、対応する未分化細胞から分化細胞を分離することができる。上記の詳細な同定方法は、ＦＡＣＳなどの分離方法、優先的な細胞培養方法、ＥＬＩＳＡ、磁気ビーズ、及びそれらの組み合わせなども提供する。本開示の好ましい実施形態は、細胞表面抗原の発現に基づいて、細胞を同定及び分離するためにＦＡＣＳを使用することを想定する。
【０１０２】
α−ケトグルタル酸レベル及びコハク酸レベルを調節する少なくとも１つの物質と組み合わせた、幹細胞または前駆細胞を含む組成物が、本明細書に記載されており、当該細胞は、複数の系譜の細胞型へと分化することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、培養培地中の細胞を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、試験管内の細胞集団を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、生体外の細胞集団を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、生体内の細胞集団を含む。本発明は、幹細胞または前駆細胞と、α−ケトグルタル酸レベル及びコハク酸レベルを調節する少なくとも１つの物質と、を混合し、任意選択で担体（例えば、細胞培養培地または医薬的に許容可能な担体）を混合して含む組成物調製のための系も提供し、当該細胞は、複数の胚系譜の細胞型へと分化することができる。
【０１０３】
細胞を培地中で培養する容器には、限定はされないが、下記のものが含まれる。すなわち、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリ皿、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、チューブ、トレー、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）チャンバー、培養バッグ、及びローラーボトルである。細胞は、培養の必要に応じて、少なくとももしくは約０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０ｍｌ、１００ｍｌ、１５０ｍｌ、２００ｍｌ、２５０ｍｌ、３００ｍｌ、３５０ｍｌ、４００ｍｌ、４５０ｍｌ、５００ｍｌ、５５０ｍｌ、６００ｍｌ、８００ｍｌ、１０００ｍｌ、１５００ｍｌ、２０００ｍｌ、またはその中から導き出せる任意の範囲の体積で培養してよい。ある特定の実施形態では、培養容器は、生物学的に活性な環境を支持する任意の装置またはシステムを指し得るバイオリアクターであってよい。バイオリアクターは、少なくとももしくは約２リットル、４リットル、５リットル、６リットル、８リットル、１０リットル、１５リットル、２０リットル、２５リットル、５０リットル、７５リットル、１００リットル、１５０リットル、２００リットル、５００リットル、１立方メートル、２立方メートル、４立方メートル、６立方メートル、８立方メートル、１０立方メートル、１５立方メートル、またはその中から導き出せる任意の範囲の体積を有してよい。
【０１０４】
培養容器は、細胞接着性または非細胞接着性であり得、目的に応じて選定される。細胞接着性培養容器は、細胞に対する容器表面の接着性を改善するために、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）などの細胞接着向けの任意の基質で被覆することができる。細胞接着向けの基質は、幹細胞または支持細胞（使用するのであれば）の接着を意図する任意の材料であり得る。細胞接着向けの材料には、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、及びフィブロネクチン、ならびにそれらの混合物、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、ならびに溶解された細胞膜調製物（Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）が含まれ得る。
【０１０５】
他の培養条件を適切に適用することができる。例えば、培養温度は、約３０〜４０℃にすることができ、例えば、少なくともまたは約３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃である。ＣＯ２濃度は、約１〜１０％にすることができ、例えば、約２〜５％、またはその中から導き出せる任意の範囲である。酸素分圧は、少なくとも、または約１％、５％、８％、１０％、２０％、またはその中から導き出せる任意の範囲にすることができる。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の方法による細胞培養のための細胞培養培地を提供する。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞集団を多能性細胞について富化するための組成物、系、及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、混合細胞集団と、α−ケトグルタル酸化合物または細胞内のコハク酸レベルに対するα−ケトグルタル酸レベルを増加させる物質と、の接触を含む。いくつかの実施形態では、外来性のグルタミンは、培地に対して添加されない。いくつかの実施形態では、多能性細胞は、多能性ではない細胞から選定することができ、これは、前者の増殖速度が、後者と比べて高いためである。いくつかの実施形態では、多能性細胞は、多能性細胞ではない細胞から選定することができ、これは、前者の生存率が、後者と比較して高いためである。いくつかの実施形態では、本発明は、総細胞集団の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％となるまで、多能性細胞を増大させるための組成物、系、及び方法を提供する。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞集団を幹細胞または多能性細胞について富化するための組成物、系、及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、混合細胞集団と、グルタミンレベルが顕著に減少した培地と、の接触を含む。いくつかの実施形態では、外来性のグルタミンは、培地に対して添加されない。
【０１０９】
増大させる多能性細胞については、非多能性細胞の割合は、好ましくは、総細胞集団の、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、またはより好ましくは、１％以下である。多能性細胞向けのマーカーは、当該技術分野で知られる方法に従って、多能性細胞としての細胞割合を評価するために使用でき、当該方法は、例えば、蛍光染色及び多能性マーカーのイメージング、またはＦＡＣＳ分析である。
【０１１０】
エピジェネティック制御
本発明者らは、細胞内のαＫＧレベル：コハク酸レベルの調節が、ある特定のエピジェネティック変化に特異的に影響を与えるということを見出した。ヒストンのメチル化は、ヘテロクロマチン形成、Ｘ−染色体の不活性化、ゲノムインプリンティング、ＤＮＡ損傷の修復、及び遺伝子転写の制御において重要な役割を担っていると共に、ヒストンのメチル化部位は、異なる種間で高度に保存されており、異なる分化潜在力を有する細胞は、ヒストンのメチル化修飾が異なるプロファイルを有することが示唆されている。
【０１１１】
α−ケトグルタル酸代謝を操作して、細胞におけるエピジェネティック変化を調節し得る。いくつかの実施形態では、本発明は、細胞の増殖または分化のエピジェネティック制御のための系及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、細胞内のα−ケトグルタル酸レベルを減少させて、クロマチン修飾を制御する物質の投与を含む。いくつかの実施形態では、方法は、細胞内のα−ケトグルタル酸レベルを減少させて、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３及びＴｅｎ  ｅｌｅｖｅｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ（Ｔｅｔ）依存性ＤＮＡ脱メチル化を制御する物質の投与を含む。いくつかの実施形態では、方法は、細胞内のコハク酸レベルを増加させて、クロマチン修飾を制御する物質の投与を含む。いくつかの実施形態では、方法は、細胞内のコハク酸レベルを増加させて、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３及びＴｅｎ  ｅｌｅｖｅｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ（Ｔｅｔ）依存性ＤＮＡ脱メチル化を制御する物質の投与を含む。いくつかの実施形態では、方法は、グルタミン合成酵素阻害剤の投与をさらに含む。
【０１１２】
ヒストン修飾に加えて、いくつかの実施形態では、本発明は、細胞内のＤＮＡメチル化の調節のための組成物、系、及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、細胞と、α−ケトグルタル酸化合物または細胞内のコハク酸レベルに対する、細胞のα−ケトグルタル酸レベルを増加させる物質と、の接触について説明する。
【０１１３】
ＤＮＡメチル化は、組織特異的遺伝子発現、インプリンティング、Ｘ染色体不活性化、及び発癌などの様々な現象において、重要な役割を担っていることが知られている。クローン化動物において、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子またはＤＮＡメチル化状態の異常、及びＤＮＡメチル化の異常に起因する先天性疾患または後天性疾患が知られている。
【０１１４】
細胞内のＤＮＡメチル化を同定するために、様々な方法が使用されてきた。例えば、ある方法は、制限酵素ランドマークゲノムスキャニングを含み（Ｋａｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：７４２１−７４２７，１９９４）、及び別の例は、メチル化感受性任意プライムＰＣＲを含む（Ｇｏｎｚａｌｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：５９４−５９９，１９９７）。特定のＣｐＧ部位におけるメチル化パターンの変化は、メチル化感受性の制限酵素でゲノムＤＮＡを消化した後、関心領域のサザン解析（消化−サザン法）を実施することによって監視されてきた。メチル化パターンの変化を解析する別の方法は、ＰＣＲによる増幅前に、メチル化感受性の制限酵素でゲノムＤＮＡを消化することを含む、ＰＣＲを基礎としたプロセスを含む（Ｓｉｎｇｅｒ−Ｓａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：６８７，１９９０）。
【０１１５】
治療用途
いくつかの実施形態では、本発明は、癌患者の治療のための組成物、系、及び方法を提供する。本発明者らは、細胞の増殖及び分化が、αＫＧレベル：コハク酸レベルを制御することよって操作できることを見出した。本開示は、数ある中でも特に、αＫＧレベル：コハク酸レベルの減少が、細胞増殖を阻害できることを示している。いくつかの実施形態では、本開示は、細胞分化を促進するであろうαＫＧレベル：コハク酸レベルの制御のための組成物及び系について説明している。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、本開示の組成物及び系は、癌（例えば、限定はされないが、リンパ腫、白血病、前立腺癌、肺癌、胃癌、膵癌、乳癌、及び結腸癌を含む）を治療するために試験管内で使用することができる。本発明の方法が、生体内で実施される場合であって、例えば、癌細胞が、ヒト対象内に存在する場合、接触は、１回または複数回用量の治療上有効な量の、相対的なαＫＧレベル：コハク酸レベルを減少させる物質のヒト対象に対する投与（例えば、腫瘍への化合物の直接注射によって、ナノ粒子などの標的送達によって、または全身性投与を介して）によって実施することができる。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、本発明は、患者における、ある特定の細胞の集団を回復させるための組成物、系、及び方法を提供し、当該細胞は、例えば、ある特定の幹細胞である。例えば、患者の癌細胞集団を根絶するための癌治療によって、患者の骨髄幹細胞が消失し得る。患者自身またはドナーの保管幹細胞を患者に対して戻すことによって、患者の造血幹細胞の生体内プールが、補充または再配置され得る。方法は、造血幹細胞数を増加させ、こうした細胞を骨髄から血流へと動員し得、化学療法または放射線療法などの高用量の癌治療を使用することを可能にし得るが、骨髄移植と比較して、危険は少ない。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、本発明は、自家幹細胞集団または異種幹細胞集団の移植のための組成物、系、及び方法を提供する。例えば、本発明の系及び組成物を使用して、患者または他のドナーから得られる細胞を起源とする幹細胞を培養することができる。組成物は、癌治療の前、後、または治療中に、患者に対して投与されてよく、及び／またはドナーに対して投与されてよい。
【０１１９】
そのような応用の１つの非限定例では、造血幹細胞を含む幹細胞集団を含み得る血液または末梢血白血球細胞が、患者から単離されてよい。細胞は、組成物の投与後、及び癌治療の前に、患者から単離されてよい。自家幹細胞集団は、後の使用に向けて保存されてよい。当該幹細胞集団は、癌治療を以前に受けたことがある患者に対して、後に投与されてよい。さらに、保存された自家幹細胞は、移植で使用されてよい。そのような治療は、免疫抑制治療の治療前、治療中、治療後の移植の成功を増進し得る。
【０１２０】
本発明は、下記の実施例を参照することによって、より完全に理解されよう。しかしながら、そうした実施例が、本発明の範囲の限定するものであると解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１２１】
下記の実施例は、説明向けに提供され、本発明の範囲をいかなる形においても限定するものではない。
【０１２２】
実施例１：２ｉ含有培地中のＧＳＫ３Ｂ阻害剤及びＥＲＫ阻害剤は、細胞培養において、グルタミン非依存性を与える。
着床前胚盤胞の内部細胞塊（ＩＣＭ）の多能性細胞は、一過性にしか存在しないが、適切な培地製剤では、試験内において顕著な分化無しに、増殖することができる１、２。具体的には、ｍＥＳＣは、以前に確立された２つの培地製剤において維持させることができ、当該培地製剤の１つ目は、ＩＣＭの「ナイーブ」エピブラスト細胞を模倣する細胞表現型を支持することが報告されている無血清培地であり（２ｉ／ＬＩＦまたは２ｉ／Ｌ）、２つ目は、より確約されたＥＳ細胞表現型の増殖を支持する、血清を基礎とする培地である（血清／ＬＩＦまたはＳ／Ｌ）３〜１０。ＥＳ細胞代謝を特徴づけるために、本発明者らは、こうした２つの成長培地において培養した細胞が、グルコース及び／またはグルタミンに対する異なるパターンの依存性を示すかどうかを検討した（図１ａ及び図５ａ〜図５ｃ）。ほとんどの哺乳類細胞において、グルコースは、生体エネルギー学及び高分子合成を支持する主要な炭素源である一方で、グルタミンは、増殖中の細胞に還元窒素を供給し、トリカルボン酸（ＴＣＡ）回路の補充反応を維持する。いずれの培地において培養されたＥＳＣも、グルコース及びグルタミンが豊富に存在すると、等しい速度で増殖し、２ｉ有りまたは２ｉ無しで培養された細胞は、グルコース無しでは、増殖することができなかった（図５ａ及び図５ｂ）。対照的に、２ｉ／Ｌ培地において培養された細胞は、外来性のグルタミン無しで確実に増殖した一方で、Ｓ／Ｌ培地において培養した細胞は増殖することができなかった（図１ａ及び図５ｃ）。
【０１２３】
上記結果は、驚くべきものであった、なぜなら、ごく限られた癌細胞株において例外はあるものの、哺乳類細胞は、グルタミン添加無しでは、組織培養において増殖することができないためである１１。この表現型の再現性を試験するために、本発明者らは、４種の追加のＶ６．５ＥＳＣ株（ＥＳＣ−１〜４）を作成した。すべての細胞株が、ＥＳＣ様形態学、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）に対する反応性、及び生体内における奇形腫形成能力を含む、多能性細胞の特徴を保持しながら、２ｉ／Ｌ培地において、確実なグルタミン非依存性の増殖を示した（図１ｂ、図１ｃ、図５ｄ）。２ｉ培地単独において培養された細胞も外来性のグルタミン無しで増殖することができた（図５ｅ）。２ｉ培地に存在するＧＳＫ３Ｂ阻害剤及びＥＲＫ阻害剤を血清／ＬＩＦ培地に添加しても、ＥＳＣ形態学及び多能性マーカーを維持したグルタミン非依存性の増殖が可能であったため、本効果は、培地栄養製剤のわずかな差異に起因するものではなかった（図１ｄ、図１ｅ）。いくつかの研究室において、血清／ＬＩＦ培地の代わりとして使用される代替えのＥＳＣ培地は、２ｉ／ＬＩＦと同一の血清非含有製剤に対して添加されたＢＭＰ４及びＬＩＦを含む１２。このＢＭＰ４／ＬＩＦ培地は、グルタミン非依存性の成長を支持することはできなかった（図１ｆ）。同様に、着床後多能性を示し、ＦＧＦ２及びアクチンＡを含む無血清培地において増殖するエピブラスト幹細胞（ＥｐｉＳＣ）は、外来性のグルタミン無しでは、増殖することができなかった（図５ｆ、図５ｇ）。しかしながら、グルタミン非依存性の成長を行う能力は、胚性多能性に限ったものではなく、線維芽細胞由来の人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）株も、グルタミン非含有２ｉ／Ｌ培地において増殖することができた（図５ｈ）。まとめると、こうした結果は、２ｉ含有培地におけるＧＳＫ３Ｂ阻害剤及びＥＲＫ阻害剤が、外来性のグルタミン無しで、多能性細胞の増殖を可能にすることを示している。
【０１２４】
グルタミンは、ヌクレオチド合成に必須の窒素ドナーであることから、２ｉ／Ｌ培地において、外来性のグルタミン無しで細胞が増殖したという事実は、グルタミンが豊富な培地において培養した細胞と比較すると、速度が遅くはあるが（図５ｉ）、こうした細胞が、グルタミンのデノボ合成が可能であるにちがいないことを示している。実際、グルタミン合成を化学的に阻害することで、グルタミン非含有２ｉ／Ｌ培地における細胞増殖は、十分に遮断された（図５ｊ）。同様に、グルタミン合成の前駆物質として働くことができる細胞透過性のα−ケトグルタル酸ジメチル（ＤＭ−αＫＧ）を添加することで、Ｓ／Ｌ及び２ｉ／Ｌの両条件において、グルタミン非依存性の増殖が、十分に可能であり（図５ｋ）、このことは、グルタミン合成の代謝前駆物質の供給が、グルタミン無しで多能性細胞が増殖する能力を決定していることを示している。本モデルの裏付けとして、グルタミンの即時型前駆物質である、細胞内グルタミン酸プールは、Ｓ／Ｌ条件におけるグルタミン供給中止の８時間以内に、劇的な（約１０倍）欠乏を起こした（図１ｇ）。対照的に、２ｉ／Ｌ細胞は、グルタミン供給中止後、有意により高いグルタミン酸（ｐ＜０．０００５）レベルを示した（図１ｇ）。こうした結果は、２ｉ／Ｌ細胞は、グルタミン自体以外の炭素源からグルタミン酸（及びグルタミン）を産生することができることを示している。
【０１２５】
２ｉ／Ｌが、グルタミン非依存性の細胞成長をどのように支持するかを解明するために、本発明者らは、培地中で最も豊富な２つの代謝物であるグルコース及びグルタミンの取り込みを測定した。Ｓ／Ｌ及び２ｉ／Ｌの両方おいて培養された細胞は、類似したレベルの乳酸を排出しながら、高レベルのグルコース及びグルタミンを消費し、これは、癌細胞及び多能性細胞を含むほとんどの増殖中の細胞の代謝プロファイルと一致するものであった（図２ａ）１３、１４。増殖中の細胞は、大量の乳酸を産生すると同時に、娘細胞の産生に必要となる、ヌクレオチド、アミノ酸、及び脂肪酸を含む高分子前駆物質を産生しなくてはならない。ミトコンドリアＴＣＡ回路を介したグルコース及びグルタミンの酸化は、こうした生合成前駆物質の重要な供給源を提供する。２ｉ／Ｌが、グルタミン無しでの、ＥＳＣの増殖を可能にしたという事実は、２ｉが、ＴＣＡ回路の動態
を変え得ることを示している。α−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）は、例外であるが、ＴＣＡ回路の代謝物の定常状態レベルは、２ｉ／Ｌにおいて培養されたＥＳＣにおいて、再現性よく減少した（図２ｂ）。
【０１２６】
ほとんどの細胞において、グルタミンは、αＫＧへと異化され、ＴＣＡ回路の補充反応を支持する（図２ｃ）。Ｓ／Ｌ培地において増殖したＥＳＣは、高レベルのＴＣＡ回路の中間体を示し、［Ｕ−１３Ｃ］グルタミンの添加後、実質的に、細胞内のすべてのグルタミン酸、αＫＧ、及びリンゴ酸が、迅速に標識化された（図２ｄ）。対照的に、２ｉ／Ｌにおいて増殖したＥＳＣにおいては、こうした代謝物のかなりの画分が、グルタミンで標識化されなかった。代わりに、こうした三つの代謝物プールは、［Ｕ−１３Ｃ］グルコースに由来して、迅速に標識化された（図２ｅ）。代謝物流動の定量によって、αＫＧを介したグルタミン由来の炭素の流動は、両条件において類似していたものの、リンゴ酸を介したグルタミンの流動は、２ｉ／Ｌにおいて培養された細胞において有意に減少することが明らかとなり、このことは、グルタミン由来のαＫＧのＴＣＡ回路への流入が、２ｉ／Ｌにおける培養によって抑制されていることを示している（図２ｆ）。代わりに、細胞が、２ｉ／Ｌにおいて培養されると、αＫＧ及びリンゴ酸の両方が、グルコースから産生し、これはかなりの量であった（図２ｇ）。
【０１２７】
まとめると、こうした観測は、２ｉにおいて培養された細胞がグルタミン無しで増殖する能力に対する、有望な説明を提供するものである。グルタミンのデノボ合成に必要な前駆物質である細胞内のグルタミン酸は、αＫＧから産生する（図２ｃ）。２ｉ阻害剤と共に培養された細胞は、かなりのグルコース依存性グルタミン酸産生を示した（図６ａ）。結果的に、グルタミン欠乏条件の間、２ｉ／Ｌ培地において培養された細胞は、グルコース由来の炭素を使用し、細胞増殖を支持するために、グルタミン酸プールを十分に増加させて維持することが可能であった（図６ｂ）。
【０１２８】
２ｉが、グルコース依存性のアミノ酸合成の増加を促進することをさらに確認するために、グルコース由来の炭素及びグルタミン由来の炭素のタンパク質への相対的な取り込みを調べた。［Ｕ−１４Ｃ］グルタミンまたは［Ｕ−１４Ｃ］グルコースと共に細胞をインキュベートした後、タンパク質抽出物における１４Ｃのシグナルを測定することによって、本発明者らは、２ｉ／Ｌ細胞は、そのＳ／Ｌ対応物との比較において、タンパク質合成を支持するために、グルコース由来の炭素を、より多く利用しており、グルタミン由来の炭素の利用は、相対的に少ないことを確認した（図５ｃ）。
【０１２９】
材料及び方法：
細胞株
ＥＳＣ１〜４株は、Ｖ．６５（Ｆ１  Ｃ５７ＢＬ６  Ｘ  １２９Ｓ４／ＳｖＪａｅ）  ｍＥＳＣである。Ｔｅｔ１／２ダブルノックアウトＥＳ細胞、１  Ｖ１９  ＥＳ細胞（ＥＳＣ−Ｖ１９）及びＯＫＳ  ｉＰＳＣ２は、Ｒｕｄｏｌｆ  Ｊａｅｎｉｓｃｈ（ＭＩＴ／Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ  ＵＳＡ）から供与された。Ｖ６．５  ＥＳＣ番号１〜４は、標準的なＥＳ細胞単離手順３に従ってＥ３．５胚盤胞から得た。２ｉ／ＬＩＦ培地を入れたラミニン被覆ディッシュ（２０μｇ／ｍｌ、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ  ０６−０００２）に洗浄胚盤胞を播種した。マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥから購入した（Ｃ５７ＢＬ／６  ＪＡＸ、０００６６４及び１２９Ｓ４／ＳｖＪａｅ  ＪＡＸ  ００９１０４）。
【０１３０】
細胞培養
ＥＳ細胞用の維持培地は、下記のとおりである。１５％のＥＳＣ適格ＦＢＳ（Ｇｅｍｉｎｉ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）を添加したＫｎｏｃｋｏｕｔ  ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）を含む血清／ＬＩＦ（Ｓ／Ｌ）維持培地を照射された支持マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）プレートに添加した。２ｉ／ＬＩＦ維持条件では、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １１３０２−０３３）と、Ｎ２補充剤及びＢ２７補充剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １７５０２−０４８及び１７５０４−０４４、１：１００希釈）、ペニシリン／ストレプトマイシン、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ＬＩＦ、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ならびに１μＭのＰＤ０３２５９０１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ２１１０３−０４９）と、を１：１で混合して調製した基本培地を使用した。グルタミン非含有ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １１９６０−０５１）と、２ｍＭのグルタミン含有または非含有のＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ２１１０３−０４９）と、の１：１混合物を含む実験培地を、すべての実験（グルコース有りまたは無しの増殖曲線、１３Ｃ同位体追跡実験、及び１４Ｃ標識実験は除く）で利用した。Ｓ／Ｌ実験培地における、１５％の透析済ＦＢＳ（Ｇｅｍｉｎｉ  １００−１０８）は例外であるが、他のすべての補充剤は、維持培地（Ｓ／Ｌまたは２ｉ／Ｌ）と同じである。グルコース有りまたは無しの増殖曲線、１３Ｃ同位体追跡実験、及び１４Ｃ標識実験では、グルタミン及びグルコース非含有ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａ１４４３０−０１）と、２０ｍＭの［Ｕ−１３Ｃ］グルコースまたは２ｍＭの［Ｕ−１３Ｃ］グルタミン（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｓ）のいずれか、及び必要に応じて２０ｍＭの非標識化グルコースまたは２ｍＭの非標識化グルタミンのいずれかを含むグルタミン及びグルコース非含有Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ００５０１２８ＤＪ）と、の１：１混合物を含む培地を使用した。すべての補充剤は、上記の実験培地（Ｓ／Ｌまたは２ｉ／Ｌ）と同一であった。すべての実験は、支持（ｆｅｅｄｅｒ）無しの条件を使用して実施した。ＥＳＣ−１  ＥｐｉＳＣは、支持無しでフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）被覆プレートにて、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｎ２補充剤及びＢ２７補充剤、ペニシリン／ストレプトマイシン、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、Ｌ−グルタミン、ヒトアクチビンＡ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）と、ｂＦｇｆ（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、を添加した７５μｇ／ｍｌのＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ）を含むＥｐｉＳＣ維持培地において培養した。ＥｐｉＳＣは、Ａｃｃｕｔａｓｅを使用して、１日おきに、１：２または１：４で継代した。ＥＳＣからＥｐｉＳＣへの分化では、ＥＳＣ−１細胞は、フィブロネクチン被覆デ���ッシュに播種した。播種後２４時間に、６μＭのＪＡＫ阻害剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を添加したＥｐｉＳＣ維持培地へと培地を交換し、５回継代した。７継代目のＥｐｉＳＣに対して分析を実施した。ＵＴＸ／Ｊｍｊｄ３の阻害剤であるＧＳＫ−Ｊ４及びＧＳＫ−Ｊ５は、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。
【０１３１】
奇形腫
Ｔ２５ディッシュ当たり２．５ｘ１０５個の細胞濃度で、維持培地にＥＳＣ−１細胞を播種した。翌日に、グルタミン含有または非含有の２ｉ／Ｌ実験培地へと培地を交換した。７２時間後に、それぞれの群から１ｘ１０６個の細胞を回収し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｂａｓｅｍｅｎｔ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｍａｔｒｉｘ（ＢＤ）を加えた実験培地（グルタミン非含有）または実験培地単独と１：１で混合し、レシピエントのＳＣＩＤマウスの側腹部へと注射した。４〜８週間で、すべての条件で腫瘍が形成された。マウスは、腫瘍サイズが直径１．５ｃｍを超える前に安楽死させた。腫瘍を切除し、４℃で一晩、４％のパラホルムアルデヒド中で固定した。腫瘍は、パラフィン包埋し、Ｈｉｓｔｏｓｅｒｖ  Ｉｎｃの標準手順に従って、切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色した。
【０１３２】
グルコース、グルタミン、及び乳酸の測定
培養培地中のグルコース、グルタミン、及び乳酸のレベルは、ＹＳＩ７１００多チャネル生化学分析器（ＹＳＩ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定した。細胞が、サブコンフルエントとなった１２ウェルプレートに、新鮮培地を添加し、４８時間後に回収した。それぞれのウェルのタンパク質含量に対して、新鮮培地に対する代謝物濃度の変化量を正規化した。
【０１３３】
代謝物プロファイリング
代謝物の実験ではすべて、６ウェルプレート中のその標準培養培地に、細胞を播種し、翌日に実験培地へと交換した。回収前の記載の時間（通常、１〜２４時間）に再び培地を交換した。内部標準として、２０μＭの重水素化２−ヒドロキシグルタル酸（Ｄ−２−ヒドロキシグルタル−２，３，３，４，４−ｄ５酸、ｄ５−２ＨＧ）を添加した１ｍＬの氷冷した８０％メタノールで代謝物を抽出した。−８０℃で一晩インキュベートした後、可溶化液を回収し、２１，０００ｇで２０分間遠心してタンパク質を除去した。抽出物をエバポレーター（Ｇｅｎｅｖａｃ  ＥＺ−２  Ｅｌｉｔｅ）で乾燥させ、４０ｍｇ／ｍＬでメトキシアミン塩酸塩を含む５０μＬのピリジン中に再懸濁し、３０℃で２時間インキュベートした。８０μＬのＭＳＴＦＡ＋１％のＴＣＭＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び７０μｌの酢酸エチル（Ｓｉｇｍａ）を添加して、代謝物をさらに誘導体化し、３７℃で３０分間インキュベートした。Ａｇｉｌｅｎｔ  ５９７５Ｃ質量選択的検出器に連結したＡｇｉｌｅｎｔ  ７８９０Ａ  ＧＣを使用して、試料を分析した。ＧＣは、１ｍＬ／分の一定ヘリウムガス流のスプリットレスモードで操作した。１μｌの誘導体化代謝物をＨＰ−５ＭＳカラムへ注入し、ＧＣオーブンで２５分間にわたって６０℃〜２９０℃の温度勾配をかけた。関心化合物を示すピークを抽出し、ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して積分した後、内部標準（ｄ５−２ＨＧ）のピークエリア、及びＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって定量した２連試料のタンパク質含量の両方に対して正規化した。代謝物レベルの定量化に使用したイオンは、下記のとおりである。ｄ５−２ＨＧ  ｍ／ｚ  ３５４；ＫＧ、ｍ／ｚ  ３０４；アスパラギン酸、ｍ／ｚ  ３３４；クエン酸、ｍ／ｚ  ４６５；グルタミン酸、ｍ／ｚ  ３６３；リンゴ酸、ｍ／ｚ  ３３５、及びコハク酸、ｍ／ｚ  ２４７。すべてのピークを手動で視検し、それぞれの代謝物の既知のスペクトルと比較して検証した。同位体追跡試験では、１２Ｃ−グルコース（Ｓｉｇｍａ）及び１２Ｃ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）またはそれぞれの代謝物の１３Ｃ型、［Ｕ−１３Ｃ］グルコースもしくは［Ｕ−１３Ｃ］グルタミン（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｓ）を添加したグルコース及びグルタミン非含有ＤＭＥＭ：ＮＢ培地を使用して上記のように実験を構成した。下記のイオンの存在量を定量化することによって、１３Ｃの濃縮を評価した。αＫＧ、ｍ／ｚ  ３０４−３１５；アスパラギン酸、ｍ／ｚ  ３３４−３４６；クエン酸、ｍ／ｚ  ４６５−４８２；グルタミン酸、ｍ／ｚ  ３６３−３７７、及びリンゴ酸、ｍ／ｚ  ３３５−３４７。天然の同位体存在量の補正は、ＩｓｏＣｏｒソフトウェア４を使用して実施した。流動は、動力学的標識曲線の一次速度定数の結果、及び相対的な代謝物プールサイズ（それぞれの実験で平均Ｓ／Ｌ値に対して正規化）として計算した５。グルコース由来の炭素及びグルタミン由来の炭素の流動は、独立した３つの実験のそれぞれで計算し、それぞれの代謝物の平均総流動として示した。
【０１３４】
タンパク質標識
０．０１％の非濃縮Ｄ−［Ｕ−１４Ｃ］−グルコース（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＮＥＣ０４２Ｖ２５０ＵＣ）またはＬ−［Ｕ−１４Ｃ］−グルタミン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＮＥＣ４５１０５０ＵＣ）を含む実験培地（Ｓ／Ｌまたは２ｉ／Ｌ）に、６ウェルプレート当たり７．５ｘ１０５個で、ＥＳ細胞を播種した。４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、剥がしてから４℃でペレット状にした。Ｂｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法６に従って、脂質画分を含まないタンパク質ペレットを単離した。簡潔に記載すると、２００μＬのｄＨ２０、２６５μＬの１００％メタノール、及び７３０μＬのクロロホルムにペレットを再懸濁した。４℃で１時間、試料をボルテックスした。有機相を除去し、残存試料を１ｘ体積のメタノールで洗浄し、１４，２００ｇで５分間遠心した。上清を捨て、６５℃で３０〜４５分間、６Ｍの塩酸グアニジンにペレットを再懸濁した。Ｂｅｃｋｍａｎ  ＬＳ  ６０００１Ｃ機器を使用して、試料を定量化した。値は、２連試料のタンパク質に対して正規化した４つの独立したウェルを代表するものである。
【０１３５】
成長曲線
１２ウェルプレート当たり３７５，０００個の細胞濃度で、維持培地にＥＳＣまたはＥｐｉＳＣを播種した。翌日、ＰＢＳで細胞を洗浄し、個々の代謝物の含有または非含有実験培地（Ｓ／Ｌ条件向けであり、透析済ＦＢＳを含む）へと培地を交換した。Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ  ４を使用して、細胞数を毎日数えた。
【０１３６】
ｑＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離した。ＤＮａｓｅ処理の後、Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用したｃＤＮＡ合成に、１〜２μｇのＲＮＡを使用した。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎを用いて、生物学的に３連で、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を実施した。
【表１】
0006677648.tif 000002
【０１３７】
実施例２：αＫＧは、細胞のエピジェネティック変化を制御する
２ｉ／Ｌ培地において増殖した細胞が、ＴＣＡ回路の補充反応を支持するためにグルコース利用を増加させたことは、ＴＣＡ回路の中間体レベルが減少したにもかかわらず、αＫＧの上昇が観測されたことに対する有望な説明を示唆するものであった。グルコース由来の炭素が、ＴＣＡ回路からグルタミン酸として流出することが観測されたことに加えて、ＴＣＡ回路へのグルタミンの移行が減少したことは、２ｉ／Ｌにおいて培養された細胞が、グルタミンから産生したαＫＧのすべてを、ミトコンドリアにおいて酸化していないであろうことを示唆するものであった。実際、αＫＧ：コハク酸の比は、試験したあらゆるＥＳＣ株において、２ｉ／Ｌによって明確に上昇した（図３ａ）。細胞のαＫＧ：コハク酸の比は、αＫＧ依存性ジオキシゲナーゼの大きなファミリーの制御において関係づけられてきた１５。こうした酵素は、補助基質としてαＫＧを利用し、最終産物としてコハク酸を産生し、次にコハク酸は、αＫＧ依存性ジオキシゲナーゼの競合阻害剤として働くことができる。結果的に、αＫＧ：コハク酸の比は、こうした酵素の平衡状態の重要な要因（ｄｒｉｖｅｒ）である。十文字ドメイン含有ヒストン脱メチル化酵素及びＤＮＡ脱メチル化酵素のＴｅｔファミリーが、こうした酵素の主要なサブセットを含むため、２ｉ／Ｌ培地において増殖した細胞において観測されたαＫＧ：コハク酸の比の上昇は、クロマチン構造の制御にとって、重要な意味を有するものであろう。
【０１３８】
αＫＧの大部分が、グルタミン代謝から得られたため（図２ｄ）、本発明者らは、αＫＧ依存性脱メチル化酵素１６によって部分的に制御されることで知られるヒストンのリジンのメチル化に、グルタミン欠乏が影響を与えるかどうかを試験した。２ｉ／Ｌにおいて増殖中のＥＳＣを、グルタミン非含有２ｉ／Ｌ培地へと３日間切り替え、そのヒストンのメチル化状態を調べた。グルタミン非含有培地へと移された細胞は、Ｈ３Ｋ９、Ｈ３Ｋ２７、Ｈ３Ｋ３６、Ｈ４Ｋ２０上において、リジンのトリメチル化の増加と、モノメチル化の減少とを示した一方で、Ｈ３Ｋ４のメチル化は、変化しないままであった（図３ｂ）。こうした変化が、グルタミン依存性αＫＧの減少に起因するかを説明し得るものであるかを確認するために、本発明者らは、ＤＭ−αＫＧを添加することで、グルタミン欠乏培地において観測されたＨ３Ｋ２７ｍｅ３及びＨ４Ｋ２０ｍｅ３の増加が、逆戻りすることも示した（図７ａ）。
【０１３９】
上記のデータは、２ｉ／Ｌ培地において維持された細胞において、Ｈ３Ｋ２７を含む、ある特定のヒストンリジンのメチル化が、αＫＧ依存性ヒストン脱メチル化酵素によって能動的に抑制されていることを示唆している。この可能性を検討するために、本発明者らは、ＵＴＸ及びＪｍｊｄ３を優先的に阻害する、細胞透過性阻害剤であるＧＳＫ−Ｊ４１７を使用した。ＵＴＸ及びＪｍｊｄ３は、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３に特異的なＫＤＭ６  ＪｍｊＣファミリーのヒストン脱メチル化酵素の２つである（図３ｃ）。ＧＳＫ−Ｊ４で処理することによって、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ１の減少を同時に伴う用量依存的なＨ３Ｋ２７ｍｅ３の増加が誘導され、この増減は、グルタミン有り、または無しで、細胞が培養されたときに観測された差異の大きさと同等であった（図３ｂ、ｄ）。
【０１４０】
ＥＳ細胞における「二価ドメイン」は、発生的に制御されるゲノム領域であり、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ２７ｍｅ３の共局在化によって特徴づけられると共に、分化の間に、活性クロマチンまたは抑制クロマチンのいずれかへの移行に向けて予備刺激されたクロマチン状態を反映すると考えられている１８〜２０。Ｓ／Ｌまたは２ｉ／Ｌのいずれかで培養されたＥＳＣにおけるＨ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ２７ｍｅ３に対して最近なされたゲノム規模での解析によって、２ｉ／Ｌで培養された細胞における二価ドメイン遺伝子プロモーターにおいて、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３が、特異的に欠乏していることが報告された１０。本発明のデータは、観測されたαＫＧの増加が、２ｉ／Ｌ  ＥＳ細胞におけるαＫＧ依存性のＨ３Ｋ２７ｍｅ３の脱メチル化を促進し得ることを示唆している。逆に、Ｓ／Ｌ  ＥＳＣにおいて報告されたＨ３Ｋ２７ｍｅ３の高レベル化１０は、ヒストン脱メチル化酵素の活性を制限するαＫＧ：コハク酸の比の減少を反映し得るものである。これと一致して、Ｓ／Ｌ培地において増殖した細胞をＨ３Ｋ２７ｍｅ３脱メチル化酵素の阻害剤であるＧＳＫ−Ｊ４で処理すると、二価ドメインプロモーターにおけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３のレベルは、変化しないことを本発明者らは、見出した（図３ｅ及び図７ｂ）。対照的に、２ｉ／ＬＩＦ  ＥＳＣにおける類似処理は、二価ドメインプロモーターにおけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３の一貫した増加をもたらした（図３ｅ及び図７ｃ）。試験した１４個の二価プロモーターにわたる平均倍数変化は、Ｓ／Ｌで培養されたＥＳＣと比較して、２ｉ／Ｌで培養されたＥＳＣにおいて、高度に有意な増加を示した（ｐ＜０．０００１）（図３ｆ）。こうした知見を遺伝子学的に確認するために、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集技術を使用して、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３脱メチル化酵素であるＪＭＪＤ３の十文字ドメインにおける変異を有する２つの独立細胞株を作成した（ＪＭＪＤ３Δ／Δ−１及びＪＭＪＤ３Δ／Δ−２）（図８ａ〜図８ｃ）。ＧＳＫ−Ｊ４での処理と類似して、ＪＭＪＤ３における変異によって、２ｉ／Ｌにおいて培養された細胞において、有意に高化したＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベルの増加が生じ、これは、２ｉ／Ｌで培養されたｍＥＳＣにおけるこうした遺伝子座の脱メチル化の増進を反映するものである（図３ｆ）。
【０１４１】
本発明のデータは、２ｉ／Ｌが、グルタミン代謝を再構築し（ｒｅｗｉｒｅ）、様々なヒストンマークの脱メチル化の活性化に有利に働くαＫＧプールを維持することを示している。ヒストンの脱メチル化が、αＫＧ消費の重要な起源であるかどうかを試験するために、ＧＳＫ−Ｊ４または不活性異性体であるＧＳＫ−Ｊ５と共に、細胞を３時間インキュベートし、αＫＧレベル及びコハク酸レベルを監視した。ＵＴＸ及びＪＭＪＤ３の阻害は、Ｓ／Ｌ及び２ｉ／Ｌの両方で培養された細胞において、αＫＧ：コハク酸の比の増加を引き起こした。しかしながら、ＧＳＫ−Ｊ４によって誘導されたαＫＧ：コハク酸の比の絶対的及び相対的な増加の両方共が、２ｉ／Ｌ培地において増殖した細胞において、より明白であった一方で、ＧＳＫ−Ｊ５は、効果を有しなかった（図３ｇ）。こうしたデータは、２ｉ／Ｌにおいて増殖した細胞において、顕著な量のαＫＧが消費されて、Ｈ３Ｋ２７の脱メチル化を維持している一方で、Ｓ／Ｌ培地においては、Ｈ３Ｋ２７の脱メチル化が消費するαＫＧは、少ないことを示唆している。
【０１４２】
二価ドメインプロモーターにおけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３の減少に加えて、２ｉ／Ｌにおいて培養された細胞は、ＤＮＡの低メチル化を示す。４、６〜８以前の研究によって、αＫＧ依存性ジオキシゲナーゼの補助因子であるアスコルビン酸と共に細胞をインキュベートすることで、ｍＥＳＣにおいて、Ｔｅｔ酵素の活性及びＤＮＡ脱メチル化が、十分に誘導され、生殖系列に結び付いている遺伝子パネルの発現増進をもたらすことが示唆された。２１したがって、本発明者らは、αＫＧ処理が、類似の効果を発揮し得るかを試験した（図９ｂ）。細胞透過性αＫＧと共に培養された細胞において、総ＤＮＡメチル化は、減少した（図９ｂ）。あるいは、またはさらに、αＫＧでの処理は、Ｔｅｔ媒介性の活性化の標的として以前に同定された、ＩＣＭ及び生殖系列に結び付いている遺伝子の発現を誘導したが、コハク酸処理では誘導されなかった（図９ｃ）。２１αＫＧの効果は、継代延長の際に持続し（図９ｄ）、Ｔｅｔ１／Ｔｅｔ２ダブルノックアウトＥＳ細胞において、大部分が抑制された（図９ｅ）。こうした結果は、ナイーブ多能性に特徴的なエピジェネティックマークの協調的制御のために、細胞内のαＫＧ産生が、複数のαＫＧ依存性ジオキシゲナーゼの活性を刺激し得ることを示唆している。
【０１４３】
ＥＳ細胞では、グルタミン代謝及びαＫＧ依存性ジオキシゲナーゼを介したクロマチン修飾の制御は、発生上の遺伝子制御だけでなく、多能性状態の維持にも役立ち得る。αＫＧ：コハク酸の比の調節が、多能性細胞の運命決定に影響を与え得るかどうかを試験するために、コロニー形成アッセイを使用して、αＫＧ及び／またはコハク酸の操作が、Ｓ／Ｌ  ＥＳＣの自己複製能力に影響を与え得るのかを試験した。Ｓ／Ｌ培地にクローン密度でＥＳＣを播種し、翌日、Ｓ／Ｌ、ＳＬ＋ＤＭ−コハク酸、またはＳ／Ｌ＋ＤＭ−αＫＧへと交換した。４日後、アルカリホスファターゼでコロニーを染色し、分化、混合、または未分化として点数化した。定性的明視野画像によって、Ｓ／Ｌ＋ＤＭ−αＫＧのコロニーが、より明るく染色され、未分化ＥＳ細胞に典型的な、より緻密なコロニー形態を保持していることが示された（図４ａ）。実際、コロニー総数は、三つすべての条件で類似していたが、Ｓ／Ｌ＋ＤＭ−αＫＧのウェルは、Ｓ／Ｌ及びＳＬ＋ＤＭ−コハク酸と比較して、２倍を超える数の完全に未分化のコロニーを含んでいた（ｐ＜０．０００１）一方で、Ｓ／Ｌ及びＳ／Ｌ＋ＤＭ−コハク酸処理の両方において、優勢であったコロニー型は、混合または分化のいずれかであった（図４ｂ）。逆に、Ｓ／Ｌ＋ＤＭ−コハク酸は、未分化コロニーが減少し、分化コロニーが増加する傾向を示し、これには再現性があった。ＥＳＣ維持を促進するαＫＧの能力のさらなる試験として、本発明者らは、ノックインＮａｎｏｇ−ＧＦＰレポーター株２２を利用し、αＫＧが、ＧＦＰの蛍光によって検出されるＮａｎｏｇ発現を、用量依存的様式において十分増進することを見出した（図４ｃ及び図１０）。こうした結果は、αＫＧが、試験管内においてＥＳ細胞の自己複製を促進するという結論を支持するものである。
【０１４４】
結論として、上記データは、細胞内のαＫＧ：コハク酸の比は、ＥＳ細胞が分化を抑制する能力に寄与することを示している。ＧＳＫ３β及びＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達の阻害剤による細胞代謝の再構築（ｒｅｗｉｒｉｎｇ）は、αＫＧの蓄積を導き、抑制的なクロマチンマークの脱メチル化に有利に働く、グルコース及びグルタミンの代謝の再プログラム化をもたらす。本発明の結果は、αＫＧ依存性の脱メチル化の活性化は、ｍＥＳＣにおけるＤＮＡメチル化、ならびにＨ３Ｋ９ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３、及びＨ４Ｋ２０ｍｅ３などの抑制的なクロマチンマークのメチル化状態を管理する主要な制御機構であることを示唆している。実際、最近実施された多能性細胞のクローン解析によって、ＤＮＡメチル化は、高度に動的であり、除去と付加とが拮抗するプロセスの平衡を保っていることが明らかとなった。２３さらに、多能性ＥＳＣ細胞とは対照的に、分化細胞は、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３の広範なドメインを示し、これは、脱メチル化酵素活性の増進が、多能性細胞におけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３の網羅的な減少にも寄与し得ることを示唆している。２４、２５対照的に、観測された効果が、活性化に結び付いているＨ３Ｋ４のメチル化マークに対して存在しないことは、マウスＥＳＣにおいて、Ｈ３Ｋ４ｍｅ２／ｍｅ３が、スレオニン代謝によって制御されているという最近の報告を反映し得るものである。すなわち、スレオニンは、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）の産生を支持して、ヒストンメチルトランスフェラーゼの反応に重大な意味を有する高ＳＡＭ／ＳＡＨ比を維持する。２６、２７
【０１４５】
αＫＧ依存性ジオキシゲナーゼ反応の補助因子であるアスコルビン酸の、ｍＥＳＣ培地への添加は、試験管内におけるＤＮＡメチル化の誘導、及び胚盤胞様状態の促進もなし得る。２１αＫＧ依存性ジオキシゲナーゼの大きなファミリーの他の基質、産物、及び／または補助因子の変化が共に作用することで、クロマチンの状態及び細胞の独自性に影響を与え得る。本発明者らは、ＥＳＣに対するαＫＧ添加のクロマチン非依存性効果の可能性を除外することはできないが、我々の結果は、多能性ＥＳＣにおけるクロマチンが、細胞内代謝における変化に対して高度に応答性のままであるという概念を支持するものである。まとめると、こうした結果は、シグナル伝達と、細胞代謝との相互接続が、幹細胞生物学、生命体の発生、及び細胞の分化において役割を担っていることを示唆するものである。
【０１４６】
材料及び方法：
ＤＮＡメチル化
ゲノムＤＮＡは、Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｃｏｒｅ  Ｋｉｔ  Ａ（Ｓｉｇｍａ）を使用してＥＳＣ試料から抽出した。ＤＮＡメチル化は、製造者の説明書に従って、比色分析ＭｅｔｈｙｌＦｌａｓｈ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ＤＮＡ定量キット（Ｅｐｉｇｅｎｔｅｋ）を使用して測定した。
【０１４７】
クロマチン免疫沈降
ナイーブＣｈＩＰアッセイ（ヒストン）は、実験当たりおよそ６ｘ１０６個のＥＳＣで実施した。細胞を低浸透圧性溶解に供し、小球菌ヌクレアーゼで処理してモノヌクレオソーム〜トリヌクレオソームを回収した。核は、短時間の超音波処理によって溶解し、Ｎ−ＣｈＩＰ緩衝液（１０ｍＭのトリス  ｐＨ７．６、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＳＤＳ、０．１％のＮａ−デオキシコール酸、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中で、４℃で２時間透析した。可溶性材料は、７５μＬのプロテインＡ  Ｄｙｎａｌ磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に結合した抗体を３〜５μｇ添加した後、インプットＤＮＡとして５％を維持し、４℃で一晩インキュベートした。磁気ビーズを洗浄してクロマチンを溶出させ、定量的ＰＣＲ反応（下記参照）に向けて、ｐＨ８の１０ｍＭのトリスにＣｈＩＰ  ＤＮＡを溶解した。
【０１４８】
ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ
プライマーを以下に記載した。ｑＰＣＲはすべて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ及びＰｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘを使用して実施した。ＣｈＩＰ試料は、Ｈ２Ｏで１：１００に希釈し、反応当たり５μＬを使用した。ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲシグナルは、パーセントインプット（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｉｎｐｕｔ）として計算した。
【表２】
0006677648.tif 000003
【０１４９】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ＥＳＣ
Ｃａｓ９−２Ａ−ＰＵＲＯプラスミドは、Ａｄｄｇｅｎｅから購入した（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド４８１３９）。７マウスＪＭＪＤ３のエクソン１７を標的とする２つのｇＲＮＡは、Ｚｈａｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＭＩＴ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ  ＵＳＡ）が提供するオンラインソフトウェア（ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）資源を使用して設計し、ＢｂｓＩ制限酵素部位を使用して、Ｃａｓ９−２Ａ−Ｐｕｒｏへとクローン化した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、２ｉ／Ｌ培地において培養されたＥＳＣ−１細胞に、Ｃａｓ９−２Ａ−Ｐｕｒｏ対照またはＪｍｊｄ３  ｇＲＮＡ含有プラスミドのいずれかをトランスフェクトした。２４時間後、１μｇ／ｍｌのピューロマイシン含有新鮮培地へと細胞を移し、４８時間保った。選択後に、２ｉ／Ｌ培地において、細胞を２４時間培養した後、クローン密度まで分裂させた。およそ７日後、コロニーを選定し、分析に向けて拡大させた。ゲノムＤＮＡを個々のクローンから精製し、それぞれのｇＲＮＡ標的部位の周辺領域のＰＣＲ増幅に使用した。ｇＲＮＡ番号１産物は、３６７ｂｐであり、ｇＲＮＡ番号２は、３１７ｂｐである。ＰＣＲ産物のクローニングは、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して実施した。変異体は、サンガー法（Ｇｅｎｅｗｉｚ  Ｉｎｃ．）によって同定した。
【表３】
0006677648.tif 000004
【０１５０】
ＦＡＣＳ
Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰ  ＥＳＣ８は、Ｓ／Ｌ実験培地において３回継代して培養し、６ウェルプレートに２．４ｘ１０４個の細胞を播種した。２４時間後、ビヒクル対照またはＤＭ−ＡＫＧを含むＳ／Ｌ培地へと培地を交換した。続いて、４８時間後に培地を交換し、翌日に細胞を回収した。ＦＡＣＳ分析は、Ｔｈｅ  Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒにおいて、ＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩを使用して実施した。データは、ＦｌｏｗＪｏを使用して、作成した。分析は、生物学的に３連で実施した。
【０１５１】
抗体
ウエスタンブロット法には、下記の抗体を使用した。Ｈ３（Ａｂｃａｍ  １７９１）、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ  ３９１５９）、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ０７−４３６）、Ｈ３Ｋ９ｍｅ１（Ｔ．Ｊｅｎｕｗｅｉｎからの供与）、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ  ３９１６１）、Ｈ４（Ａｂｃａｍ  番号０１５８）、Ｈ４Ｋ２０ｍｅ１（Ａｂｃａｍ  ９０５１）、Ｈ４Ｋ２０ｍｅ３（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ０７−４６３）、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ０７−４４８）、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ０７−４４９）、Ｈ３Ｋ３６ｍｅ３（Ａｂｃａｍ  ９０５０）、及びＨ３Ｋ３６ｍｅ１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ０７−５４８）。ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲに使用した抗体は、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ９７３３ＢＦ）及びＨ３Ｋ４ｍｅ３（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ  ３９１５９）である。
【０１５２】
自己複製アッセイ
２０μｇ／ｍＬのマウスラミニン（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ  ０６−０００２）で被覆され、維持Ｓ／Ｌ培地を含む６ウェルプレートに、ウェル当たり１００個の細胞で、ＥＳ細胞を支持ＭＥＦ無しで播種した。翌日に、α−ケトグルタル酸ジメチル（４ｍＭ、Ｓｉｇｍａ  ３４９６３１）、コハク酸ジメチル（４ｍＭ、Ｓｉｇｍａ  Ｗ２３９６０７）、またはＤＭＳＯビヒクル対照を含むＳ／Ｌ実験培地へと培地を交換した。４日後に、ＰＢＳで細胞を洗浄してから、製造者の説明書に従って、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｒｅｄ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を使用して、アルカリホスファターゼ染色を実施した。
【０１５３】
統計
比較は、記載のように、独立両側スチューデントｔ検定または適切な事後検定（ｐｏｓｔ−ｔｅｓｔ）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して決定）を用いた二元配置ＡＮＯＶＡを使用して実施した。
【０１５４】
参考文献
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８．Ｈａｂｉｂｉ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｉｎｔｅｒｃｏｎｖｅｒｔｉｂｌｅ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌｏｍｅｓ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １３，３６０−９（２０１３）。
９．Ｂｏｒｇｅｌ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｓ  ａｎｄ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｅａｒｌｙ  ｍｏｕｓｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ４２，１０９３−１００  （２０１０）。
１０．Ｍａｒｋｓ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃ  ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｇｒｏｕｎｄ  ｓｔａｔｅ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ．Ｃｅｌｌ  １４９，５９０−６０４（２０１２）。
１１．Ｅａｇｌｅ，Ｈ．，Ｏｙａｍａ，Ｖ．Ｉ．，Ｌｅｖｙ，Ｍ．，Ｈｏｒｔｏｎ，Ｃ．Ｌ．  ＆  Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎ，Ｒ．Ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｔｏ  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｎｄ  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２１８，６０７−１６（１９５６）。
１２．Ｙｉｎｇ，Ｑ．Ｌ．，Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｊ．，Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｉ．  ＆  Ｓｍｉｔｈ，Ａ．ＢＭＰ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｓｔａｉｎｓ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ  ｉｎ  ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＳＴＡＴ３．Ｃｅｌｌ  １１５，２８１−９２（２００３）。
１３．Ｌｕｎｔ，Ｓ．Ｙ．  ＆  Ｖａｎｄｅｒ  Ｈｅｉｄｅｎ，Ｍ．Ｇ．Ａｅｒｏｂｉｃ  ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ：ｍｅｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２７，４４１−６４（２０１１）。
１４．Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，Ｎｕｅｂｅｌ，Ｅ．，Ｄａｌｅｙ，Ｇ．Ｑ．，Ｋｏｅｈｌｅｒ，Ｃ．Ｍ．  ＆  Ｔｅｉｔｅｌｌ，Ｍ．Ａ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １１，５８９−９５（２０１２）。
１５．Ｋａｅｌｉｎ，Ｗ．Ｇ．，Ｊｒ．Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｓｙｍｐ  Ｑｕａｎｔ  Ｂｉｏｌ  ７６，３３５−４５（２０１１）。
１６．Ｃｌｏｏｓ，Ｐ．Ａ．，Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｊ．，Ａｇｇｅｒ，Ｋ．  ＆  Ｈｅｌｉｎ，Ｋ．Ｅｒａｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｅｔｈｙｌ  ｍａｒｋ：ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ２２，１１１５−４０（２００８）。
１７．Ｋｒｕｉｄｅｎｉｅｒ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｊｕｍｏｎｊｉ  Ｈ３Ｋ２７  ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ４８８，４０４−８（２０１２）。
１８．Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｂ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｍａｒｋｓ  ｋｅｙ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  １２５，３１５−２６（２００６）。
１９．Ｂｏｙｅｒ，Ｌ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｏｌｙｃｏｍｂ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｒｅｐｒｅｓｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４４１，３４９−５３（２００６）。
２０．Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ，Ｔ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｍａｐｓ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｓｔａｔｅ  ｉｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｌｉｎｅａｇｅ−ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４４８，５５３−６０（２００７）。
２１．Ｂｌａｓｃｈｋｅ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｃ  ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｔｅｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＤＮＡ  ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａ  ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ−ｌｉｋｅ  ｓｔａｔｅ  ｉｎ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ５００，２２２−６（２０１３）。
２２．Ｆａｄｄａｈ，Ｄ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｔｈａｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｎｏｇ  ｉｓ  ｂｉａｌｌｅｌｉｃ  ａｎｄ  ｅｋｕａｌｌｙ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ａｓ  ｔｈａｔ  ｏｆ  ｏｔｈｅｒ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ＥＳＣｓ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １３，２３−９（２０１３）。
２３．Ｓｈｉｐｏｎｙ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｙｎａｍｉｃ  ａｎｄ  ｓｔａｔｉｃ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｅｍｏｒｙ  ｉｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ５１３，１１５−９（２０１４）。
２４．Ｚｈｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｓｔａｔｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｃｕｅｓ．Ｃｅｌｌ  １５２，６４２−５４（２０１３）。
２５．Ｈａｗｋｉｎｓ，Ｒ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃ  ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｌｉｎｅａｇｅ−ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ６，４７９−９１（２０１０）。
２６．Ｗａｎｇ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｏｎ  ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２５，４３５−９（２００９）。
２７．Ｓｈｙｈ−Ｃｈａｎｇ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｎ  Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ａｎｄ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，２２２−６（２０１３）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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