(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象物担体（５０）上に配置された顕微鏡検査試料（５２）を拡大ディジタル光学イメージング装置（２０）によって検査し、前記対象物担体（５０）上に配置された前記顕微鏡検査試料（５２）をレーザーマイクロディセクションシステム（１０）によって処理する方法（１００）であって、
前記ディジタル光学イメージング装置（２０）により、前記試料（５２）を光学手段によってイメージングして、前記試料のディジタル画像を形成し、
前記レーザーマイクロディセクションシステム（１０）は、顕微鏡光学系（１３）とレーザーユニット（１１）とを備え、前記試料（５２）を処理するレーザービーム（１２）を形成し、
前記方法は、
ａ）前記レーザーマイクロディセクションシステム（１０）の前記レーザービーム（１２）により、前記ディジタル光学イメージング装置（２０）および前記レーザーマイクロディセクションシステム（１０）の双方によって識別可能な少なくとも２つの基準マーク（５１）を前記対象物担体（５０）上に形成するステップ（１０１）と、
ｂ）前記ステップａ）にしたがって前記基準マーク（５１）を前記対象物担体（５０）上に形成する前または形成した後に、前記試料（５２）を同じ対象物担体（５０）上に塗布するステップ（１０２）と、
ｃ）前記ディジタル光学イメージング装置（２０）により、前記対象物担体（５０）上の前記試料（５２）のディジタル画像（４０）を、前記画像（４０）が前記基準マーク（５１）をも含むように形成するステップ（１０３）と、
ｄ）前記画像（４０）の少なくとも１つの画像領域（４１）を設定し、前記画像（４０）内の前記少なくとも１つの画像領域（４１）の位置を表す第１の位置情報データを形成するステップ（１０４）と、
ｅ）前記画像（４０）内の前記基準マーク（５１）を識別し、前記ステップｄ）にしたがって前記画像（４０）の前記少なくとも１つの画像領域（４１）が設定される前または設定されている間または設定された後に、前記画像（４０）内の前記基準マーク（５１）の位置を表す第２の位置情報データを形成するステップ（１０５）と、
ｆ）前記第１の位置情報データおよび前記第２の位置情報データを前記レーザーマイクロディセクションシステム（１０）へ供給するステップ（１０６）と、
ｇ）前記試料（５２）および前記基準マーク（５１）を有する前記対象物担体（５０）をイメージングするステップ（１０７）と、前記基準マーク（５１）を前記レーザーマイクロディセクションシステム（１０）によって識別し、前記レーザーマイクロディセクションシステム（１０）内の前記基準マーク（５１）の位置を表す第３の位置情報データを形成するステップ（１０８）と、
ｈ）前記第１の位置情報データおよび前記第２の位置情報データおよび前記第３の位置情報データを相関させ、前記ステップｄ）で設定された前記画像（４０）の前記少なくとも１つの画像領域（４１）に対応する、前記試料（５２）の少なくとも１つの試料領域（５３）を前記レーザーマイクロディセクションシステム（１０）により処理するステップ（１０９）と、
を含み、
前記基準マーク（５１）は、前記試料（５２）に重ならない、
方法（１００）。
【請求項２】
前記少なくとも２つの基準マーク（５１）を、前記ステップａ）にしたがって、前記レーザーマイクロディセクションシステム（１０）により、前記対象物担体（５０）上での前記基準マークの位置を設定する第４の位置情報データに基づいて形成する、
請求項１記載の方法（１００）。
【請求項３】
前記第４の位置情報データを用いて、前記画像（４０）内かつ／または前記レーザーマイクロディセクションシステム（１０）内の前記基準マーク（５１）を識別する、
請求項２記載の方法（１００）。
【請求項４】
前記ディジタル光学イメージング装置（２０）の前記光学手段により、前記試料を拡大イメージングする、
請求項１記載の方法（１００）。
【請求項５】
少なくとも部分的に、ガラスもしくは金属もしくはプラスチックから製造されているかつ／またはメンブレイン（５５）を含む対象物担体（５０）を使用し、
前記基準マーク（５１）を、前記ガラス内もしくは前記金属内もしくは前記プラスチック内かつ／または前記メンブレイン内に形成する、
請求項１から４までのいずれか１項記載の方法（１００）。
【請求項６】
前記ステップｅ）でのかつ／または前記ステップｇ）での前記基準マーク（５１）の識別を、少なくとも部分的に、手動のかつ／または自動のプロセスによって行う、
請求項１から５までのいずれか１項記載の方法（１００）。
【請求項７】
前記ステップｄ）にしたがって、前記レーザーマイクロディセクションシステム（１０）が使用する切断線を手動かつ／または自動で記入することにより、前記画像（４０）の前記少なくとも１つの画像領域（４１）を設定する、
請求項１から６までのいずれか１項記載の方法（１００）。
【請求項８】
前記第１の位置情報データはさらに、前記画像（４０）の前記少なくとも１つの画像領域（４１）の形状および／または面積を記述している、
請求項１から７までのいずれか１項記載の方法（１００）。
【請求項９】
対象物担体（５０）上に配置された顕微鏡検査試料（５２）を検査および処理するように構成された検査システム（２００）であって、
・光学手段によって前記対象物担体（５０）上に配置された前記試料（５２）をイメージングして前記試料（５２）のディジタル画像（４０）を形成する、拡大ディジタル光学イメージング装置（２０）と、
・顕微鏡光学系（１３）およびレーザーユニット（１１）を備え、かつ前記試料（５２）を処理するレーザービームを形成する、レーザーマイクロディセクションシステム（１０）と、
を備えた検査システム（２００）において、
前記ディジタル光学イメージング装置（２０）と前記レーザーマイクロディセクションシステム（１０）とを制御し、請求項１から８までのいずれか１項記載の方法（１００）を制御かつ／または実行かつ／または処理するように構成された制御手段が設けられている、
ことを特徴とする検査システム（２００）。
【請求項１０】
前記制御手段は、前記拡大ディジタル光学イメージング装置（２０）および／または前記レーザーマイクロディセクションシステム（１０）にインストールされるソフトウェアを含む、
請求項９記載の検査システム（２００）。
【請求項１１】
ａ）前記レーザーマイクロディセクションシステム（１０）は、前記レーザービーム（１２）により、前記ディジタル光学イメージング装置（２０）および前記レーザーマイクロディセクションシステム（１０）の双方によって識別可能な少なくとも２つの基準マーク（５１）を前記対象物担体（５０）上に形成するように構成されており、
ｂ）前記試料（５２）が前記対象物担体（５０）上に塗布されており、前記塗布は、前記ステップａ）にしたがって前記基準マーク（５１）を前記対象物担体（５０）上に形成する前または形成した後に行うことができ、
ｃ）前記ディジタル光学イメージング装置（２０）は、前記試料（５２）のディジタル画像（４０）を前記対象物担体（５０）上に形成するように構成されており、前記画像（４０）は、前記基準マーク（５１）も含み、
ｄ）前記ディジタル光学イメージング装置（２０）は、前記画像（４０）の少なくとも１つの画像領域（４１）と、前記画像（４０）内の前記少なくとも１つの画像領域（４１）の位置を表す第１の位置情報データと、を形成するように構成されており、
ｅ）前記ディジタル光学イメージング装置（２０）はさらに、前記画像（４０）内の前記基準マーク（５１）を識別して、前記画像（４０）内の前記基準マーク（５１）の位置を表す第２の位置情報データを形成するように構成されており、前記形成は、前記ステップｄ）にしたがって前記少なくとも１つの画像領域（４１）を設定する前または設定している間または設定した後に行うことができ、
ｆ）前記検査システム（２００）は、前記第１の位置情報データおよび前記第２の位置情報データを前記レーザーマイクロディセクションシステム（１０）へ供給するように構成されており、
ｇ）前記レーザーマイクロディセクションシステム（１０）は、前記試料（５２）および前記基準マーク（５１）を有する前記対象物担体（５０）をイメージングし、前記基準マーク（５１）を識別し、かつ前記レーザーマイクロディセクションシステム（１０）内での前記基準マーク（５１）の位置を表す第３の位置情報データを形成するように構成されており、
ｈ）前記レーザーマイクロディセクションシステム（１０）は、前記第１の位置情報データと前記第２の位置情報データと前記第３の位置情報データとを相関させ、前記ステップｄ）において設定された前記画像（４０）の前記少なくとも１つの画像領域（４１）に対応する前記試料（５２）の少なくとも１つの試料領域を処理するように構成されている、
請求項９または１０記載の検査システム（２００）。
【請求項１２】
前記検査システム（２００）は、前記第１の位置情報データおよび前記第２の位置情報データを前記レーザーマイクロディセクションシステム（１０）へ供給するデータ伝送装置（３０）を含む、
請求項９から１１までのいずれか１項記載の検査システム（２００）。
【請求項１３】
請求項１から８までのいずれか１項記載の方法（１００）を制御かつ／または実行かつ／または処理するように構成されたソフトウェア。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、各独立請求項の上位概念記載の、顕微鏡検査試料を検査および処理する方法ならびに検査システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
顕微鏡検査試料または対象物をいわゆるレーザーマイクロディセクションによって処理する方法は１９７０年代半ばから既に存在しており、当時から持続的に開発されつづけている。
【０００３】
レーザーマイクロディセクションシステムでは、細胞、組織領域などを組織複合体から分離して、いわゆるディセクテートを取得することができる。レーザーマイクロディセクションの特段の利点は、組織とレーザービームとの接触が短時間であり、このためレーザービームに接する組織がほとんど変化しないということである。ここで、ディセクテートの特異的な取得は、種々の方式で行うことができる。
【０００４】
例えば、赤外レーザービームまたは紫外レーザービームにより、試料からディセクテートを分離し、このディセクテートを、重力の作用によって適切なディセクテート捕集容器に落下させることができる。この場合、ディセクテートは、試料から付着性のメンブレインとともに切除することもできる。
【０００５】
別の手法として、いわゆるレーザーキャプチャマイクロディセクションがある。この場合、反応容器に結合可能な熱可塑性メンブレインが相応のレーザービームによって加熱される。この場合、メンブレインが所望の対象物領域と融合するので、続くステップでこれを除去することができる。さらなる代替手段は、ディセクテートをレーザービームによってディセクテート捕集容器の蓋に付着させるというものである。レーザーマイクロディセクションのための倒立顕微鏡システムも公知である。
【０００６】
レーザーマイクロディセクションのための公知の顕微鏡システムは、レーザービームが結合される光路を有する反射型装置である。レーザービームは、都度使用される顕微鏡対物系を通して、モータ駆動により自動で移動可能な顕微鏡ステージ上に載置されている試料へフォーカシングされる。切断線は、例えば、顕微鏡ステージが切断の際に移動され、定置のレーザービームに対して相対的に試料が運動することにより形成される。しかし、このことは特に、切断線の形成中には試料を良好に観察できないという欠点を有する。なぜなら、試料が視野内で運動するからである。
【０００７】
したがって、レーザービームまたはその入射点を定置の試料に対して相応に移動させるように構成されたレーザースキャン装置を含む別のレーザーマイクロディセクションシステムのほうがより有利である。こうしたレーザーマイクロディセクションシステムは、本発明においても特段の利点を提供する。ウェッジプリズムを含むレーザースキャン装置を備えた、上述した形式の特に有利なレーザーマイクロディセクションシステムは、欧州特許第１２７６５８６号明細書（ＥＰ１２７６５８６Ｂ１）に記載されている。
【０００８】
どちらのケースとも、つまり、顕微鏡ステージが移動されるレーザーマイクロディセクションシステムもレーザースキャン装置を含むレーザーマイクロディセクションシステムも、ふつうはパルスレーザーで動作し、各レーザーパルスによって試料に孔が形成される。切断線はこうした孔の連続列、場合によりこうした孔の重畳列によって形成される。
【０００９】
顕微鏡検査法、例えば医用診断では、狭義の顕微鏡の他、拡大ディジタル光学イメージング装置、特にいわゆるスライドスキャナが使用される。スライドスキャナは、対象物担体およびその上に塗布された顕微鏡検査試料の画像の一部または全てを形成し、続いてこれをモニタで評価可能とするかつ／または記憶可能とするように構成されている。評価は、例えばパターン認識プロセスを用いて部分的にまたは完全に自動で行うことができ、これにより例えば病変を有する細胞または組織の種類を識別することができる。こうして、スライドスキャナにより、試料のディジタル画像に基づく検査または診断が顕微鏡の直接使用なしに可能となる。スライドスキャナは、スループットが高いという利点を提供し、多数の試料を広範囲にわたって自動処理することができる。
【００１０】
相応のディジタル光学イメージング装置、例えばスライドスキャナのディジタル画像において、付加的に分子生物学的解析および／または生化学的解析を要する細胞または組織の種類が識別された場合には、顕微鏡検査試料の相応の領域をレーザーマイクロディセクションシステムにおいて処理することができる。つまり、その部分を試料から切除することができる。
【００１１】
しかし、先行して拡大ディジタル光学イメージング装置、例えば上述したスライドスキャナによって検査された試料をレーザーマイクロディセクションによって後処理することは、従来方式ではきわめて煩雑であると判明している。特に、従来方式では、顕微鏡検査試料のディジタル画像に基づいて所定の領域を設定し、レーザーマイクロディセクションシステムにおいて同じ対象物または同じ対象物担体の正確に同じ領域を処理することは不可能である。
【００１２】
これに関連して、従来技術ではむしろ、例えば米国特許出願公開第２０１２／００４５７９０号明細書（ＵＳ２０１２／００４５７９０Ａ１）に開示されているように、連続切片が形成されている。この場合、組織片から２つの隣接する薄い組織切片が例えばミクロトームによって形成され、種々に処理される。第１の切片は標準処理および続く相応の画像形成にかけられる。このとき例えば試料の染色およびスライドスキャナでのディジタル化が行われる。病理学医は、当該切片に即して、レーザーマイクロディセクションシステムにおいて検査すべき試料領域の選択を行う。相応の領域情報は研究室の情報システムに記憶される。これに並行して、レーザーマイクロディセクションシステムには第２の切片が供給される。この場合、レーザーマイクロディセクションシステムでは、当該第２の切片が、第１の切片を基準として行われた領域選択に基づいて処理される。またこれに関連して、比較的緩慢に動作する、信頼性の高い結果のための正確性が充分に得られないディジタル画像オーバレイプログラムが使用されることもある。
【００１３】
相応の方法は、特に、第２の切片の対応する組織領域がレーザーマイクロディセクションシステムにおいて正確に捉えられないという欠点を有する。このことを本明細書の以下において詳細に説明する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
こうした背景から、特に上述した拡大ディジタル光学イメージング装置とレーザーマイクロディセクションシステムとを用いて顕微鏡検査試料を検査および処理する検査手段の改善への需要が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明では、各独立請求項の特徴を有する、顕微鏡検査試料を検査および処理する方法ならびに検査システムを提案する。各構成形態は各従属請求項の対象となっており、以下に説明する。
【００１６】
本発明は、対象物担体上に配置された顕微鏡検査試料を拡大ディジタル光学イメージング装置によって検査し、対象物担体上に配置された顕微鏡検査試料をレーザーマイクロディセクションシステムによって処理する方法から出発する。ディジタル光学イメージング装置により、試料が光学手段によってイメージングされて、試料のディジタル画像が形成される。レーザーマイクロディセクションシステムは、顕微鏡光学系とレーザーユニットとを備え、試料を処理するレーザービームを形成する。
【００１７】
本発明はこうした方法に関しており、次の各ステップ、すなわち、
ａ）レーザーマイクロディセクションシステムのレーザービームにより、ディジタル光学イメージング装置およびレーザーマイクロディセクションシステムの双方によって識別可能な少なくとも２つの基準マークを対象物担体上に形成するステップと、
ｂ）上述したステップａ）にしたがって基準マークを対象物担体上に形成する前または形成した後に、試料を同じ対象物担体上に塗布するステップと、
ｃ）ディジタル光学イメージング装置により、対象物担体上の試料のディジタル画像を、この画像が基準マークをも含むように形成するステップと、
ｄ）画像の少なくとも１つの画像領域を設定し、画像内の少なくとも１つの画像領域の位置を表す第１の位置情報データを形成するステップと、
ｅ）画像内の基準マークを識別し、上述したステップｄ）にしたがって画像の少なくとも１つの画像領域が設定される前または設定されている間または設定された後に、画像内の基準マークの位置を表す第２の位置情報データを形成するステップと、
ｆ）第１の位置情報データおよび第２の位置情報データをレーザーマイクロディセクションシステムへ供給するステップと、
ｇ）試料および基準マークを有する対象物担体をイメージングするステップ、および基準マークをレーザーマイクロディセクションシステムによって識別し、レーザーマイクロディセクションシステム内での基準マークの位置を表す第３の位置情報データを形成するステップと、
ｈ）第１の位置情報データおよび第２の位置情報データおよび第３の位置情報データを相関させ、上述したステップｄ）で設定された画像の少なくとも１つの画像領域に対応する、試料の少なくとも１つの試料領域を処理するステップと
を含む。
【００１８】
つまり、本発明によれば、まず、イメージング装置およびレーザーマイクロディセクションシステムによって識別可能な少なくとも２つの基準マークが、レーザーマイクロディセクションシステムのレーザービームにより、対象物担体上に形成される。基準マークはレーザーマイクロディセクションシステムのレーザーによって形成されるので、付加的なマーキング手段または別個のマーキング装置は必要ない。よって、公知の方法とは異なり、本発明においては、例えば独国特許出願公開第１０２０１２２１４６６４号明細書（ＤＥ１０２０１２２１４６６４Ａ１）から公知のような既存の基準マークを有する対象物担体は使用されないかまたは必ずしも要されない。
【００１９】
上述したステップにしたがって対象物担体上に基準マークを形成する前または形成した後、同じ対象物担体上に試料が塗布され、任意の手段として対象物担体上で適切な処理にかけられる。対象物担体上に試料が塗布された後、この試料につき、例えば固定、染色または水分除去を行うことができる。
【００２０】
本発明においては、続いて、レーザーマイクロディセクションシステムとは別個に、例えば別の場所に用意されたイメージング装置により、試料と対象物担体上に先行して形成された基準マークとのディジタル画像が形成される。つまり、対象物担体は、ディジタル光学イメージング装置、例えばスライドスキャナによりディジタル化される。ここで、試料そのもの（または選択的にその一部のみであってもよい）と基準マークとを含むディジタル画像が得られる。
【００２１】
本発明によればさらに、こうした画像の少なくとも１つの画像領域が、例えば病理学医による検査によって、または自動検査プロセスによって設定され、画像内の少なくとも１つの画像領域の位置を表す第１の位置情報データが形成されるように構成される。当該ステップ自体は、病理学医が手動で決定した領域、例えば病変を有する組織領域を試料切片またはそのディジタル画像においてマーキングする従来の手法、例えばマーキング線で囲むなどの従来の手法に対応する。相応の画像領域の設定は、上述したように、例えばパターン認識プロセスまたは組織認識プロセスを用いて、部分自動または完全自動で行うこともできる。
【００２２】
画像内の少なくとも１つの画像領域の位置を表す「位置情報データ」は、例えば相応のマーキング線に対応するディジタルデータであり、それ自体は公知の方式で、例えばＸＭＬデータファイルを用いて形成可能であり、場合により一時記憶しておくことができる。ここで、画像内の少なくとも１つの画像領域の「位置」とは、本願の用語の上では、画像内の、例えば１つもしくは複数の点の位置を含むが、ユーザまたは相応の認識プロトコルが任意に設定可能な幾何学的形状または不規則形状を有してもよい。
【００２３】
画像の少なくとも１つの画像領域が設定されて第１の位置情報データが形成される前にまたは形成と同時にまたは形成された後に、本発明の方法においては、画像内の基準マークが識別され、画像内の基準マークの位置を表す第２の位置情報データが形成される。基準マークの識別も手動で行うことができ、例えば病理学医がマウスまたは他のディジタル入力ユニットを用いて、所定の方式で、例えば十字記号によって、相応の画像内の基準マークをマーキングできる。なお、これに代えて、この場合に、画像内の基準マークを自動識別プロトコルにより識別するように構成してもよい。
【００２４】
基準マークは、このために、先行してレーザーマイクロディセクションシステムによって形成された所定の形状を有することができる。また、少なくとも２つの基準マークを相互に異なる形状に形成して、第１の基準マーク、第２の基準マークなどがどの形状を有するかを格納しておくと有意でありうる。こうした形状の相違は、複数の基準マークの順序を識別する際に有意である。例えば、これを十字状または十字線状に形成することができる。第２の位置情報データは、基本的には第１の位置情報データと同様に、例えばＸＭＬデータファイルの形態で形成して、場合により一時記憶しておくことができる。
【００２５】
本発明の方法では、第１の位置情報データおよび第２の位置情報データ（および場合により相応の順序でのさらなる位置情報データ）がレーザーマイクロディセクションシステムへ供給され、先行してディジタル化された対象物担体、すなわちイメージング装置でのディジタル画像の形成に用いられる対象物担体とその上に塗布された試料とが、レーザーマイクロディセクションシステムへ導入され、そこでもう一度イメージングされるように構成される。この場合、もちろん、例えば一連の対象物担体をまずイメージング装置内でディジタル化し、一時的に保存することができる。ここで、１つもしくは複数の対象物担体は、適切な保存条件のもとで保存可能である。よって、本発明においては、ディジタル画像の形成直後または診断直後に、つまり画像の少なくとも１つの画像領域が設定された直後またはイメージング装置で基準マークが識別された直後に、対象物担体をレーザーマイクロディセクションシステムへ移動させることを明示的に要するというわけではない。対象物担体および試料のレーザーマイクロディセクションシステムへの導入およびそこでのイメージングは、行うべき検査の直前に行うこともでき、これにより試料を保護できる。レーザーマイクロディセクションシステムでのイメージングには、例えば、そこに設けられているディジタルイメージング装置または部分ディジタルイメージング装置が用いられる。
【００２６】
ついで、レーザーマイクロディセクションシステムにより、基準マークの新たな識別が行われる。この場合にも、部分手動もしくは完全手動の手法、または部分自動もしくは完全自動の手法を行うことができる。いずれの場合にも、基準マークの識別時または識別後に、レーザーマイクロディセクションシステム内での基準マークの位置を表す第３の位置情報データの形成が行われる。さらに、第１の位置情報データおよび第２の位置情報データと同じかまたは異なる相応の位置情報データを形成することもできる。
【００２７】
本発明によれば、第１の位置情報データおよび第２の位置情報データおよび第３の位置情報データを相互に相関させることができる。このようにすれば特に、第２の位置情報データと第３の位置情報データとを相互に関連づけ、これによりレーザーマイクロディセクションシステムでの相応の対象物担体の位置ずれ、回転、移動なども補償することができる。第２の位置情報データおよび第３の位置情報データは、上述したように、それぞれ相応の対象物担体上の基準マークに関連づけられるので、特に倍率が等しい場合、位置補正を容易に問題なく行える。したがって、イメージング装置での画像形成の前かつレーザーマイクロディセクションシステムでの処理の前の対象物担体の位置決め精度は、比較的低くてもよい。特に、対象物担体が場合により僅かに回転した状態でまたは僅かにずれた状態でイメージング装置またはレーザーマイクロディセクションシステムに導入されたかどうかは、大きな問題とならない。イメージング装置で行われるイメージングとレーザーマイクロディセクションシステムで行われるイメージングとで倍率が異なる場合にも、ふつう、位置情報データの拡大または縮小（スケーリング）によって容易に換算を行うことができる。相応の位置補正が行われる場合、レーザーマイクロディセクションシステムでは、有利には相応に同時補正された第１の位置情報データによって、イメージング装置の画像に基づいて設定された試料画像の少なくとも１つの画像領域に対応する試料の試料領域が相応の対象物担体上のどこに位置しているかについての正確な知識が得られる。よって有利には、本発明においては、試料内の試料領域に対応する画像領域に関連した第１の位置情報データを、例えば第２の位置情報データと第３の位置情報データとの相関から得られる補正係数によって補正することができる。
【００２８】
このようにすれば、レーザーマイクロディセクションシステムにおいて、例えば病理学医によってまたはディジタル画像データ処理ソフトウェアによって画像内にイメージング領域として先行して設定された試料領域の正確な処理、例えばレーザーによる切除がつねに可能となる。
【００２９】
本発明は、従来技術の複数の欠点を克服するものである。従来は、米国特許出願公開第２０１２／００４５７９０号明細書（ＵＳ２０１２／００４５７９０Ａ１）に記載されているように連続切片を形成しなければならないが、このことは、特に日常的な診断では許容不能な、かなりのコスト増大（２つの切片を形成し、多数回染色し、２つの対象物担体を使用する）をもたらす。これは、診断において全ての切片が解析を要するとは識別されないという事実を考慮すると、特にそうである。これにより、レーザーマイクロディセクションシステムによって処理しなければならない並行のステップが無駄に生じてしまう。解析の必要が検出された際にのみ連続切片を形成するとなると、試料の新たな処理が要求され、これには時間がかかり、取り違えのおそれが埋没してしまう。また、試料を相応に保存しなければならない。
【００３０】
連続切片を使用する際のさらなる欠点は、切断線の転写である。これは、標準対象物担体上では確かに比較的簡単に定義できるが、別様に染色されているかまたはまったく染色されていない連続切片、特にカバーガラスによって覆われていない連続切片への転写はきわめて困難である。２つの切片、すなわち、対応する顕微鏡検査試料は、通常、対象物担体上で僅かに異なって配向されている上、切断過程および続く処理ステップによって組織の潰れおよびプレパラートアーティファクトが発生する。したがってこれにより、従来技術では、上述したように緩慢かつ場合によりエラーを伴う煩雑な画像オーバレイプロセスの使用が要求される。また特に、連続切片におけるがん転移など、より小さい試料領域を直ちに特徴づけることはできない。
【００３１】
これに対し、本発明では、基準マークを上述したように使用することにより、対象物担体のスキャン、ならびにこれに続くレーザーマイクロディセクションおよびこれに続く生化学的もしくは分子生物学的な検査プロセスのために定められた試料または試料領域の選択にとって、正確かつ低コストかつ素材に適した解決手段が得られる。例えば、既にマークが設けられた対象物担体を使用することを提案している独国特許出願公開第１０２０１２２１４６６４号明細書（ＤＥ１０２０１２２１４６６４Ａ１）とは異なり、上述したように、本発明においては、こうしたマーキングが、簡単かつ低コストに、レーザーマイクロディセクションシステム自体の内部で形成される。レーザーマイクロディセクションシステムでの基準マークの形成は、例えば続くディジタルでの検出時およびディジタル画像の形成時にも使用される、定められた倍率で行うことができる。また、ディジタルイメージング装置の機能として基準マークを特異的に形成することにより、相応の基準マークの識別に配慮することができる。つまり、基準マークを、レーザーマイクロディセクションシステムによって、例えば特に容易な視認性が得られるよう、任意に形成できる。
【００３２】
独国特許出願公開第１０２０１２２１４６６４号明細書（ＤＥ１０２０１２２１４６６４Ａ１）のように既に基準マークが設けられている対象物担体を使用することに比べた本発明の大きな利点は、任意のガラス対象物担体またはメンブレイン対象物担体を普遍的に使用できるということにある。このため、本発明の方法のコストの利点は相当のものとなる。本発明においては、基準マークは、レーザーマイクロディセクションシステムによって、上述したように、試料の塗布前に対象物担体上に形成可能である。このことは特に、後になるとレーザーマイクロディセクションシステムがもはやマーキングできない層によって覆われてしまう対象物担体上または相応の基板上に基準マークが形成される場合に有利である。
【００３３】
特に、対象物担体上の基準マークの位置を設定する第４の位置情報データに基づいて基準マークを形成すると有利である。相応の第４の位置情報データは、例えば複数の対象物担体についても同様に用いることができ、これにより、複数の対象物担体に同じマークまたは少なくとも比較可能なマークを設けることができる。これにより、例えば、異なる対象物担体上での対応する基準マークの再探索が容易となる。なぜなら、こうしたケースで、イメージング装置により、相応の画像の、定められた既知の画像領域内でこのような基準マークを探索できるからである。このことは、レーザーマイクロディセクションシステムにおいて基準マークを探索する場合にも同様に当てはまる。したがって、第４の位置情報データを用いて画像内かつ／またはレーザーマイクロディセクションシステム内の基準マークを識別すると有利である。
【００３４】
上述したように、本発明においては、少なくとも部分的にガラスもしくは金属もしくはプラスチックから製造される対象物担体、かつ／またはメンブレインを含む対象物担体を使用でき、ここで、基準マークをガラスもしくは金属もしくはプラスチックにかつ／またはメンブレインに形成できる。この場合、基準マークの形成には、例えば、相応のレーザーマイクロディセクションシステムのレーザービーム特性の設定変更、例えばガラスもしくは金属もしくはプラスチックを処理するための特に高いレーザーエネルギの設定も含まれてよい。
【００３５】
上述したように、基準マークの識別は、それぞれ少なくとも部分的に自動化された方法によって行うことができるが、手動で行ってもよい。自動化された方法の実行により、特に対応する基準マークの再現可能な探索をユーザの誤解のおそれなく行うことができる。
【００３６】
本発明の方法では、有利には、上述したように、レーザーマイクロディセクションシステムによって使用される、相応の画像内での境界線としての切断線を手動でかつ／または自動で記入することにより、画像の少なくとも１つの画像領域が設定される。これに関連して、例えば、相応の切断線を設定および処理するためのそれ自体公知の方法を使用することができる。
【００３７】
また上述したように、有利には、第１の位置情報データが、純粋な幾何学的位置の他、例えば画像の少なくとも１つの画像領域の幾何学的形状も含むと有利である。こうした形状は不規則であってよく、任意に設定可能である。
【００３８】
本発明には検査システムも含まれる。当該検査システムは、対象物担体上に配置された顕微鏡検査試料を検査および処理するように構成されており、光学手段によって試料をイメージングしてこの試料のディジタル画像を形成する拡大ディジタル光学イメージング装置と、顕微鏡光学系およびレーザーユニットを備え、かつ試料を処理するレーザービームを形成する、レーザーマイクロディセクションシステムとを備えている。
【００３９】
検査システムは、ディジタル光学イメージング装置とレーザーマイクロディセクションシステムとを制御し、上述した方法を制御かつ／または実行かつ／または処理するように構成された制御手段を有することを特徴としている。
【００４０】
特に、検査システムの制御手段は、拡大ディジタル光学イメージング装置および／またはレーザーマイクロディセクションシステムにインストールされるソフトウェアを含む。
【００４１】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、検査システムは、請求項１１に記載されているように構成され、好ましくは第１の位置情報データおよび第２の位置情報データをレーザーマイクロディセクションシステムへ供給するデータ伝送装置を含む。
【００４２】
また、上述した方法を制御かつ／または実行かつ／または処理するように構成されたソフトウェアも本発明の対象である。
【００４３】
誤解を回避するために、ここで、本発明において使用される方法または相応の検査システムが顕微鏡検査用に既に準備された試料を明示的に使用していることを強調しておきたい。この場合、試料は例えば、ミクロトームによって大きな組織片、例えば固定された器官または相応の器官の生検体から分離された薄片であってよい。したがって、本発明は、相応の試料の取得だけでなく、検査および処理、特に定められた試料領域の分離にも用いられる。
【００４４】
ミクロトームは、顕微鏡検査試料の準備の際にのみ用いられる。このためにミクロトームはレーザーを含むこともできる。ミクロトームによって得られる切片は、上述したように対象物担体上に塗布され、場合によりそこで固定、染色などが行われる。当該切片は、その後ではじめて本発明の方法または相応の検査システムでの使用に供される。ミクロトームは、基本的には、その動作中、特に最大限均等な切片厚さを有する切片が得られる点において、レーザーマイクロディセクションシステムとは異なっている。したがって、ミクロトームは平行な切片面を有する多数の同じ切片を形成するように構成されており、これに対して、レーザーマイクロディセクションシステムは、試料に依存する基準、例えば視覚的基準にしたがってディセクテートを分離するように構成されている。よって、当業者であっても、ミクロトームに使用される技術手段を、レーザーマイクロディセクションシステムの使用を含む方法および検査システムに移行させることはできない。
【００４５】
本発明のさらなる利点および構成形態は、以下の説明および添付図から得られる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明の一実施形態による方法が概略的なフローチャートの形態で示されている。
【図２】本発明の一実施形態による検査システムが概略図で示されている。
【図３】本発明の一実施形態によってマーキングされた対象物担体が概略図で示されている。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
図中、相互に対応する要素は同じ参照番号で示し、繰り返しては説明しない。
【００４８】
図１には、本発明の一実施形態による方法が概略的なフローチャートの形態で示されており、全体として参照番号１００が付されている。
【００４９】
方法１００の第１のステップ１０１では、レーザーマイクロディセクションシステムによる対象物担体５０の基準化が、手動でまたは少なくとも部分的に自動で行われる。レーザーマイクロディセクションシステムはここでは著しく簡略化されており、レーザービーム１２を放射するレーザーユニット１１およびレンズによってシンボル化された顕微鏡光学系１３のみが示されている。
【００５０】
ここでは、上で詳述したように、同形状または異なる形状の少なくとも２つの基準マーク５１が相応の１つの対象物担体５０上に設けられる。これは例えば、上述した（「第４の」）位置情報データを用いて行われる。基準マーク５１に関する相応のデータは、適切なデータファイルとして、レーザーマイクロディセクションシステムまたは相応のソフトウェアに記憶させることができる。
【００５１】
本発明の方法に並行してもしくは本発明の方法から独立に、または本発明の方法の前もしくは後に実行可能な図示されていないステップでは、例えばパラフィンに包埋させた組織片または氷結された組織試料が処理されて顕微鏡検査試料が形成される。つまり、例えばミクロトームにおいて切断される。
【００５２】
相応の試料または切片（切片もここでは試料と見なす）は、ステップ１０１で先行してマーキングされた対象物担体５０上に塗布可能であるか、またはステップ１０１による基準マーク５１の形成に続いて試料の塗布を行うことができる。図１に示されているステップ１０２にはこのことが示されており、ここには、相応の試料５２および基準マーク５１を有する対象物担体５０が示されている。試料５２は、図示の例では、例えば精密検査にかけられるべき２つの組織領域５２１，５２２を有する。ステップ１０２で、相応の対象物担体５０およびその上に設けられた試料５２のさらなる前処理を行ってもよい。例えばここでは、染色、固定、水分除去などを行うことができる。相応の試料５２を、処理専用に構成されたレーザーマイクロディセクションシステムでの処理のために、ステップ１０２で例えばメンブレインによりカバーしてもよい。
【００５３】
ステップ１０３では、対象物担体５０上で前処理された試料５２および基準マーク５１のディジタル画像が、拡大ディジタル光学イメージング装置２０、例えばスライドスキャナを用いて形成される。
【００５４】
ステップ１０４では、画像の少なくとも１つの画像領域の設定と、当該画像内の少なくとも１つの画像領域の位置を表す第１の位置情報データの形成と、が行われる。画像領域にはここでは参照番号４１が付されており、画像には参照番号４０が付されている。これは、例えば、病理学医による相応の画像４０の検査として行うことができ、この場合、相応の画像の関心画像領域４１には、病理学者によって、かつ／または相応のディジタル画像の自動検査によって、境界線が設けられる。図示の例では、画像領域４１は正方形状に示されているが、これは上述したように任意の他の形状を有してよい。画像領域４１は、この例では、組織領域５２１が存在する試料領域に対応する。また、ディジタル画像４０を、例えば基準点４２に対して基準化することもできる。
【００５５】
次のステップ１０５では、さらに、ステップ１０１で対象物担体上に形成され、ステップ１０３でイメージングされた基準マーク５１の識別が行われ、これにより第１の位置情報データに対する基準点が形成される。上述したように、基準点を識別するステップと他の識別ステップとの順序はさほど重要ではない。これに基づいて、ステップ１０５で、例えば適切なデータファイル、例えばＸＭＬデータファイルが形成される。図示の例では、ステップ１０５の箇所に、ｘ，ｙ座標が示されている。上述したように、特に画像領域４１に関し、より複雑な形状を定義することもできる。画像領域４１（ステップ１０４を参照）に対して座標ｘ，ｙが示されており、基準マークに対して座標ｘ１，ｙ１または座標ｘ２，ｙ２が示されている。全ての位置情報が、ここではｘ０，ｙ０の付された座標を有する基準点４２（ステップ１０４を参照）に関連づけられるように構成できる。
【００５６】
ステップ１０６では、第１の位置情報データおよび第２の位置情報データが、例えば相応のデータファイルによってかつ／または相応の伝送装置を介して、レーザーマイクロディセクションシステム１０へ供給される。
【００５７】
これに続くステップ１０７では、試料５２および基準マーク５１を有する対象物担体５０の新たな検査と画像形成による検出とがレーザーマイクロディセクションシステム１０において行われる。このために、レーザーマイクロディセクションシステム１０の画像検出装置１４が使用され、ここではイメージング光路に参照番号１５が付されて示されている。当該イメージング光路は、レーザービーム１２と同じ顕微鏡光学系を通って延在することができる。
【００５８】
ここでステップ１０７と共通に示されているステップ１０８では、同じまたは異なるレーザーマイクロディセクションシステム１０でステップ１０１において先行して形成された対象物担体５０上の基準マーク５１の識別が行われ、これにより、対象物担体５０上の相応の試料５２を処理するための基準系が新たに生じる。これに基づいて、レーザーマイクロディセクションシステム１０内に導入された対象物担体５０上の基準マーク５１の位置、ひいては最終的にレーザーマイクロディセクションシステム１０内での基準マーク５１の位置のみを表す、第３の位置情報データを形成することができる。
【００５９】
図１に示されている実施形態による方法のステップ１０９では、第１の位置情報データおよび第２の位置情報データおよび第３の位置情報データが上述したように相互に相関され、ステップ１０９にしたがってさらに、ステップ１０６で設定された画像４０の少なくとも１つの画像領域４１に対応する試料５２の試料領域５３が処理される。当該処理は、つねに基準マーク５１に即して相互に関連づけられたデータに基づいて行われるので、特に信頼性が高い。
【００６０】
図２には、本発明の一実施形態による検査システムが略示されており、全体に参照番号２００が付されている。相応の検査システムの個々の要素はきわめて簡略化された状態で示されている。
【００６１】
検査システム２００は、拡大ディジタル光学イメージング装置１０およびレーザーマイクロディセクションシステム２０を含む（拡大ディジタル光学イメージング装置１０およびレーザーマイクロディセクションシステム２０にはそれぞれ適切なソフトウェアが設けられている）。イメージング装置１０とレーザーマイクロディセクションシステム２０との間でのデータの伝送、すなわち、特に第１の位置情報データおよび第２の位置情報データまたはこれらを含む１つもしくは複数の相応のデータファイルの伝送のために、データ伝送装置３０が設けられている。データ伝送装置またはデータ転送装置３０には、イメージング装置１０またはレーザーマイクロディセクションシステム２０との結合を可能にする適切なインタフェース３１，３２が設けられている。また、イメージング装置１０またはレーザーマイクロディセクションシステム２０にも、それぞれの結合のために、適切なインタフェース１０ａまたは２０ａが設けられている。
【００６２】
図３には、本発明の範囲において使用される、既にマーキングされた対象物担体が略示されており、全体として参照番号５０が付されている。ここでも参照番号５１の付された基準マークが形成されて、試料５２が対象物担体５０上に塗布された後の対象物担体５０が示されている。対象物担体５０は、図示の例では、試料５２が塗布されたメンブレイン５５を含み、このメンブレイン５５に基準マーク５１が形成されている。メンブレイン５５は、適切なフレーム５６、例えば再利用可能なスチールフレームに固定されている。
【００６３】
図３にはさらに、図２に示されているようなディジタル光学イメージング装置１０によって取得可能な試料５２のディジタル画像４０が破線で示されている。相応の画像４０を形成するステップは、試料５２、特に対象物担体５０全体の画像の形成を含んでよい。なお、いずれの場合にも、形成された画像４０は基準マーク５１を含む。病理学医は、少なくとも１つの画像領域４１、例えば分子生物学的にかつ／または生化学的に検査すべき特性を有する画像領域４１を相応の画像に設定することができる。ここでは、図１に示されている例とは異なり、当該画像は不規則な形状を有している。本発明において形成される（「第１の」）位置情報データは、画像４０内の少なくとも１つの画像領域４１の位置を表している。別の（「第２の」）位置情報データは、画像４０内の基準マーク５１の位置を表している。
【符号の説明】
【００６４】
１０            レーザーマイクロディセクションシステム
１１            レーザーユニット
１２            レーザービーム
１３            顕微鏡光学系
１４            画像検出装置
１５            イメージング光路
２０            イメージング装置
３０            データ伝送装置
３１，３２      インタフェース
１０ａ，２０ａ  インタフェース
５０            対象物担体
５１            基準マーク
５２            試料
５２１，５２２  組織領域
５３            試料領域
５５            メンブレイン
５６            メンブレイン用フレーム
４０            ディジタル画像
４１            画像領域
４２            基準点
１００          本発明による方法
１０１          第１のステップ
１０２          第２のステップ
１０３          第３のステップ
１０４          第４のステップ
１０５          第５のステップ
１０６          第６のステップ
１０８          第８のステップ
１０９          第９のステップ
２００          検査システム
【図１】
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【図２】
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【図３】
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