(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イミダゾキノリンアミンから選択されるＴＬＲ７及び／又はＴＬＲ８アゴニストを含む、肝硬変に罹患した患者における細菌感染症を処置するための医薬組成物。
【請求項２】
患者が、アルコール性肝硬変、代謝性肝硬変又はウイルス性肝硬変に罹患している、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
患者が、非代償性肝硬変に罹患している、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項４】
細菌感染症が、肝硬変に罹患した患者における細菌性腹膜炎である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項５】
ＴＬＲ７及び／又はＴＬＲ８アゴニストが、Ｒ８４８及びＣＬ０９７から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
ＴＬＲ７及び／又はＴＬＲ８アゴニストが、Ｒ８４８である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
ＴＬＲ７／８アゴニストが、好中球による摂取に適した粒子に組み込まれる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
抗生物質と同時に投与される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
抗生物質が、アミノグリコシド類、ベータラクタム類、キノロン類又はフルオロキノロン類、マクロライド類、スルホンアミド類、スルファメトキサゾール類、テトラサイクリン類、ストレプトグラミン類、オキサゾリジノン類、リファマイシン類、グリコペプチド類、ポリミキシン類、及びリポペプチド抗生物質からなる群より選択される、請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
エラスターゼインヒビターと組み合わせて投与される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝硬変に罹患した患者における細菌感染症の処置のための方法及び医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝硬変は、その罹患率が次の１０年間には劇的に増加するであろう肝臓の慢性疾患である。肝硬変は、アルコール性肝疾患、慢性ウイルス性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎、肝臓の自己免疫疾患（原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、及び自己免疫性肝炎）のような多くの慢性肝疾患に起因することがある。肝硬変は、数年にわたって進行する。合併症の発生は、「代償不全」と呼ばれる局面への移行を示している（フランスでは年間約１００，０００人の患者）；これらの合併症には、腹水（フランスでは年間３０，０００人の患者）、胃腸出血（フランスでは１０，０００件の発作／年）、腎不全、及び非常に一般的であり、かつしばしばグラム陰性腸内細菌の移動に起因する細菌感染症が含まれる。
【０００３】
呼吸バースト（ＲＢ）又は酸化ストレス（ＯＳ）と呼ばれる、多形核白血球（ＰＭＮ）、単球又はマクロファージによって産生される反応性酸素種（ＲＯＳ）は、抗菌性宿主防御系において重要な役割を果たす。食細胞ＲＢを担当する酵素である、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）オキシダーゼ２（ＮＯＸ２）は、活性化に細胞質成分のリン酸化及び膜移行が必要な膜多タンパク質複合体であり、中でもp47phox（phox：食細胞オキシダーゼ）が重要な役割を果たす。ＲＯＳの産生不足は、微生物感染症に対する患者の感受性を高める。肝硬変は、不適切なＲＯＳ産生が組織損傷と感染症に対する患者感受性との両方を誘導する、典型例である。肝硬変の一般的な合併症は、実際に、ＰＭＮ ＲＢの障害、殺菌活性、及び食作用に関連する、主要な死亡原因である敗血症の発症である。進行性アルコール性肝硬変患者からの好中球は、細胞内シグナル伝達障害に関連する、細菌由来ペプチドｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（ｆＭＬＰ）によって誘導されるスーパーオキシドの重度の産生不足を提示したことが以前に示された（Rolas L et al, Hepatology, 2013）。更に具体的には、患者の好中球は、ウエスタンブロット分析によって測定するとGp91phox発現も不足していることが最近明らかにされた（Rolas et al, 1st Meeting of the Neutrophil Club, Avril 10th 2015, Paris）。これらのデータにより、細菌感染症に対する患者の感受性の上昇を部分的に説明することができ、よって、ＴＬＲ７／８アゴニストが、健常なヒト好中球では選択部位上のp47phoxのリン酸化を刺激することによってＮＡＤＰＨオキシダーゼの過剰活性化を誘導するという事実にもかかわらず、肝硬変に罹患した患者における細菌感染症の処置には、このような化合物を信頼して使用することはできなくなる（Makni-Maalej et al. J. Immunol. 2012）。
【０００４】
発明の要約
本発明は、肝硬変に罹患した患者における細菌感染症の処置のための方法及び医薬組成物に関する。具体的には、本発明は請求の範囲により定義される。
【０００５】
発明の詳細な説明
本発明者らは驚くべきことに、Toll様受容体７／８（ＴＬＲ７／８）の細胞透過性アゴニストでの患者好中球の処置が、Gp91phox ｍＲＮＡレベルを上昇させ、この酵素の発現を回復させたことを示している。更に驚くべきことに、本発明者らは、該化合物により誘導されるＲＯＳ産生が、健常ドナーからの好中球のレベルと同様のレベルまで上昇していることを証明している。したがって、ＴＬＲ７／８アゴニストは、ヒト好中球においてＮＡＤＰＨオキシダーゼの過剰活性化を誘導することが示された（Makni-Maalej et al., J. Immunol. 2012）という観測にもかかわらず、肝硬変に罹患している患者の好中球において該化合物で観測される抑制作用は、特に標的酵素の発現が不足していることが明らかにされた状況では、先行技術から当然のこととして導き出すことはできなかった（Rolas et al, 1st Meeting of the Neutrophil Club, Avril 10th 2015, Paris）。
【０００６】
本発明者らはまた、タンパク質分解によるＮＯＸ２枯渇が、エラスターゼで処置したか、又はホルミルペプチドのｆＭｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅで刺激した健常好中球において、エラスターゼ依存的に発生することを証明した。更には、対照ではなく患者からの血漿は、ＮＯＸ２発現及び好中球の活性をエラスターゼ依存的に減少させた。ＮＯＸ２は、細胞外エラスターゼにより広範囲に分解され、そして肝硬変患者からの好中球におけるその不十分な合成経路が枯渇に寄与しており、これが感染症に対する患者の感受性を増大させる可能性がある。
【０００７】
したがって、本発明の第１の目的は、肝硬変に罹患した患者における細菌感染症を処置する方法であって、患者に治療有効量のＴＬＲ７及び／又はＴＬＲ８アゴニストを投与することを含む方法に関する。
【０００８】
本発明により、肝硬変に罹患している患者には、典型的には、アルコール性肝硬変又はウイルス性肝硬変又は代謝性の患者が含まれる。肝硬変は、アルコール性肝疾患、慢性ウイルス性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎、肝臓の自己免疫疾患（原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、及び自己免疫性肝炎）のような多くの慢性肝疾患に起因することがある。好ましくは非代償性肝硬変の発症又は発生の段階にある肝硬変患者が、本発明の方法に特に該当する。
【０００９】
本明細書に使用されるとき、「処置」又は「処置する」という用語は、疾患に罹患する危険性があるか、又は疾患に罹患している疑いのある被験体、並びに病気であるか、又は疾患若しくは病状に罹患していると診断されている被験体の処置を含む、予防又は予防的処置並びに治癒的又は疾患修飾処置の両方のことをいい、臨床的再発の抑制が含まれる。処置は、障害または再発性障害の１つ以上の症状を予防、治癒、その発症の遅延、その重症度の軽減、又は改善するために、あるいはこのような処置が行われない場合に予想される生存時間を超えて被験体の生存時間を延ばすために、医学的障害を有するか、又は最終的には障害を得てしまう可能性のある被験体に行われてもよい。「治療計画」とは、病気の処置のパターン、例えば、治療中に使用される投薬のパターンを意味する。治療計画は、導入計画及び維持計画を含んでもよい。「導入計画」又は「導入期間」という句は、疾患の初期処置のために利用される治療計画（又は治療計画の一部）のことをいう。導入計画の一般的な目標は、処置計画の初期期間中に高レベルの薬物を被験体に提供することである。導入計画は、「負荷計画」を（部分的又は全体的に）利用することができるが、これは、医師が維持計画の間に使用するであろうよりも高用量の薬物を投与すること、医師が維持計画の間に薬物を投与するであろうよりも頻繁に薬物を投与すること、あるいはその両方を含むことができる。「維持計画」又は「維持期間」という句は、病気の処置中に患者を維持するために、例えば、被験体を長期間（数ヶ月又は数年）寛解状態に保つために使用される治療計画（又は治療計画の一部）のことをいう。維持計画は、持続療法（例えば、毎週、毎月、毎年などの一定間隔で薬物を投与する）又は間欠療法（例えば、断続処置、間欠的処置、再発時の処置、又は特定の予め定められた基準到達時の処置［例えば、疾患の兆候など］）を利用することができる。
【００１０】
幾つかの実施態様において、本発明の方法は、肝硬変に罹患した患者における細菌性腹膜炎の処置に特に適している。
【００１１】
本明細書に使用されるとき「細菌性腹膜炎」という用語は、当該分野におけるその一般的意味を有しており、細菌感染症に起因する腹膜の炎症のことをいう。細菌性腹膜炎は、一次性、二次性、又は三次性として分類することができる。一次性腹膜炎（特発性細菌性腹膜炎とも呼ばれる）では、感染源は、消化管から生じるものではなく、腹腔内臓器の特定できる解剖学的障害は存在しない。一次性腹膜炎は、大部分は肝硬変のような慢性肝疾患に起因する。対照的に、二次性腹膜炎は、腹部内臓の感染症に起因し、そして穿孔、虚血性壊死、又は穿通性外傷の結果として生じ得る。三次性腹膜炎は、２回以上の失敗に終わった感染源コントロール手順後に持続又は再発する腹膜炎として定義され、そして重度の腹部感染症のため集中治療室入院を必要とする患者において高頻度である。
【００１２】
本明細書に使用されるとき、「ＴＬＲ７のアゴニスト」及び「ＴＬＲ８のアゴニスト」という表現は、それぞれＴＬＲ７又はＴＬＲ８に結合して活性化する化合物のことをいう。「活性化」及び「刺激」という用語は、無頓着に使用される。「ＴＬＲ７及び／又はＴＬＲ８アゴニスト」又は「ＴＬＲ７／８アゴニスト」とは、ＴＬＲ７のみの、ＴＬＲ８のみの又はＴＬＲ７とＴＬＲ８両方のアゴニストである、分子のことをいう。
【００１３】
ＴＬＲ７及び／又はＴＬＲ８アゴニストは、当該分野において周知である（Waleed M Hussein , Tzu-Yu Liu , Mariusz Skwarczynski , Istvan Toth. Toll-like receptor agonists: a patent review (2011 - 2013) Expert Opinion on Therapeutic Patents Apr 2014, Vol. 24, No. 4, Pages 453-470: 453-470）。更には、ＴＲＬ７のアゴニスト又はＴＬＲ８のアゴニストを同定するための方法は、当該分野において周知であり、例えば、公報 WO 2004/075865（3M Innovative Properties Company）に記載されている。
【００１４】
ＴＬＲ７及びＴＬＲ８の天然アゴニストは、グアノシン及びウリジンに富んだｓｓＲＮＡとして同定されている（Diebold, Science 2004, Heil Science, 2004）。
【００１５】
典型的には、ＴＬＲ７アゴニストは、イミダゾキノリン様分子、イミキモド、レシキモド、ガーディキモド、Ｓ−２７６０９、並びにロキソリビン（７−アリル−７，８−ジヒドロ−８−オキソ−グアノシン）、７−チア−８−オキソグアノシン及び７−デアザグアノシンのようなグアノシン類似体、ＵＣ−１Ｖ１５０、ＡＮＡ９７５（Anadys Pharmaceuticals）、ＳＭ−３６０３２０（Sumitomo）、３Ｍ−０１及び３Ｍ−０３（3M Pharmaceuticals）を含むがこれらに限定されない（例えば、Gorden et al., J Immunology, 2005；Schon, Oncogene, 2008；Wu et al., PNAS 2007を参照のこと）。ＴＬＲ７アゴニストは、イミダゾキノリン化合物；グアノシン類似体；ブロピリミン及びブロピリミン類似体のようなピリミジノン化合物；等を含む。ＴＬＲ７リガンドとして機能するイミダゾキノリン化合物は、イミキモド（Aldara、Ｒ−８３７、Ｓ−２６３０８としても知られている）、及びＲ−８４８（レシキモド、Ｓ−２８４６３としても知られている；化学構造：４−アミノ−２−エトキシメチル−α，α−ジメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−エタノールを有する）を含むがこれらに限定されない。適切なイミダゾキノリン剤は、イミダゾキノリンアミン、イミダゾピリジンアミン、６，７−縮合シクロアルキルイミダゾピリジンアミン、及び１，２−架橋イミダゾキノリンアミンを含む。これらの化合物は、米国特許第4,689,338号、4,929,624号、5,238,944号、5,266,575号、5,268,376号、5,346,905号、5,352,784号、5,389,640号、5,395,937号、5,494,916号、5,482,936号、5,525,612号、6,039,969号及び6,110,929号に記載されている。本方法における使用に適したイミダゾキノリン剤の特定の種は、Ｒ−８４８（Ｓ−２８４６３）；４−アミノ−２−エトキシメチル−α，α−ジメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−ｓ−ｉ−エタノール；及び１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン（Ｒ−８３７又はイミキモド）を含む。また使用に適した化合物は、４−アミノ−２−（エトキシメチル）−α，α−ジメチル−６，７，８，９−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−エタノール水和物である（例えば、Gorden et al. (2005)のＢＭ−００３を参照のこと）。ＴＬＲ７リガンドとして機能するグアノシン類似体は、ロキソリビン（７−アリル−８−オキソグアノシン）、７−チア−８−オキソ−グアノシン（ＴＯＧ）、７−デアザグアノシン、及び７−デアザデオキシグアノシンを含むがこれらに限定されない、ある種のＣ８−置換及びＮ７，Ｃ８−二置換グアニンリボヌクレオチド類及びデオキシリボヌクレオチド類を含む（Lee et al., 2003）。５−ハロ−６−フェニル−ピリミジノンであるブロピリミン（ＰＮＵ−５４４６１）、及びブロピリミン類似体は、文献に記載されており、これらも使用に適している。例えば、Vroegop et al. (1999)を参照のこと。適切なＣ８置換グアノシンの追加の例は、８−メルカプトグアノシン、８−ブロモグアノシン、８−メチルグアノシン、８−オキソ−７，８−ジヒドログアノシン、Ｃ８−アリールアミノ−２’−デオキシグアノシン、Ｃ８−プロピニル−グアノシン、Ｃ８−及びＮ７−置換グアニンリボヌクレオシド類（７−アリル−８−オキソグアノシン（ロキソリビン）及び７���メチル−８−オキソグアノシンなど）、８−アミノグアノシン、８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン、並びに８−ヒドロキシグアノシンを含むがこれらに限定されない。ＴＬＲ７選択的アゴニストはまた、米国特許出願公開第2004/0171086号に示されるものを含む。追加の適切なＴＬＲ７アゴニストは、２−（エトキシメチル）−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン（米国特許第5,389,640号）；２−メチル−１−［２−（３−ピリジン−３−イルプロポキシ）エチル］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン（WO 02/46193）；Ｎ−（２−｛２−［４−アミノ−２−（２−メトキシエチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］エトキシ｝エチル−エチル−Ｎ−メチルシクロヘキサンカルボキサミド（米国特許公開第2004/0171086号）；１−［２−（ベンジルオキシ）エチル］−２−メチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン（WO 02/46189）；Ｎ−｛８−［４−アミノ−２−（２−メトキシエチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］オクチル｝−Ｎ−フェニル尿素（米国特許公開第2004/0171086号（ＩＲＭ５））；２−ブチル−１−［５−（メチルスルホニル）ペンチル］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン（WO 02/46192）；Ｎ−｛３−［４−アミノ−２−（２−メトキシエチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］プロピル｝−４−メチルベンゼンスルホンアミド（米国特許第6,331,539号）；及びＮ−［４−（４−アミノ−２−エチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）ブチル］シクロヘキサンカルボキサミドカルボキサミド（米国特許公開第2004/0171086号（ＩＲＭ８））を含むがこれらに限定されない。また使用に適切なものは、ＴＬＲ選択的アゴニストのＮ−［４−（４−アミノ−２−エチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）ブチル］メタンスルホンアミドである。
【００１６】
例えば、ＴＬＲ８アゴニストは、Ｎ−｛４−［４−アミノ−２−（２−メトキシエチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］ブチル｝キノリン−３−カルボキサミド、Ｎ−｛４−［４−アミノ−２−（２−メトキシエチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］ブチル｝キノキサリン−２−カルボキサミド、及びＮ−［４−（４−アミノ−２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）ブチル］モルホリン−４−カルボキサミドを含む、米国特許公開第2004/0171086号に示される化合物を含むがこれらに限定されない。他の適切なＴＬＲ８選択的アゴニストは、２−プロピルチアゾロ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン（米国特許第6,110,929号）；Ｎ１−［２−（４−アミノ−２−ブチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］［１，５］ナフチリジン−１−イル）エチル］−２−アミノ−４−メチルペンタンアミド（米国特許第6,194,425号）；Ｎ１−［４−（４−アミノ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）ブチル］−２−フェノキシ−ベンズアミド（米国特許第6,451,810号）；Ｎ１−［２−（４−アミノ−２−ブチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）エチル］−１−プロパンスルホンアミド（米国特許第6,331,539号）；Ｎ−｛２−［２−（４−アミノ−２−エチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）エトキシ］エチル｝−Ｎ’−フェニル尿素（米国特許公開第2004/0171086号）；１−｛４−［３，５−ジクロロフェニル）チオ］ブチル｝−２−エチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン（米国特許公開第2004/0171086号）；Ｎ−｛２−［４−アミノ−２−（エトキシメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］エチル｝−Ｎ’−（３−シアノフェニル）尿素（WO 00/76518及び米国特許公開第2004/0171086号）；及び４−アミノ−α，α−ジメチル−２−メトキシエチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−エタノール（米国特許第5,389,640号）を含むがこれらに限定されない。ＴＬＲ８選択的アゴニストとしての使用には、米国特許公開第2004/0171086号の化合物が含まれる。また使用に適切なものは、化合物２−プロピルチアゾロ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミンである。
【００１７】
本発明のＴＬＲ７／８アゴニストの具体例は、以下を含む：
【００１８】
【化１】
0006785248.tif 000002
【００１９】
幾つかの実施態様において、本発明のＴＬＲ７／８アゴニストは、Ｒ８４８である。「Ｒ８４８」とは、上記の構造を持つイミダゾキノリン化合物を意味する。
【００２０】
幾つかの実施態様において、本発明のＴＬＲ７／８アゴニストは、好中球による摂取に適した粒子に組み込まれる。したがって、粒子の寸法（例えば、直径）は、好中球による粒子の食作用を促進するように選択される。幾つかの実施態様において、本発明は、本発明のＴＬＲ７／８アゴニストが組み込まれており、そして粒子の少なくとも５０％が好中球による摂取に適したサイズを有する粒子の集団を提供する。幾つかの実施態様において、所望のサイズは、所与の値の±１０％、±２０％、±３０％、±４０％、又は±５０％以内の範囲である。この値は、例えば、２０nm、１００nm、５００nm、１、５、１０、２０、５０ミクロンなどであってよい。これらの実施態様のいずれにおける粒子も任意の組成物から生じてよい。典型的には、粒子は、変性タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（Benacerraf et al., 1957 Brit. J. Exp. Path, 38:35））、不溶性物質（例えば、カーボンブラック、シリカ、二酸化ケイ素、ポリスチレン、ラテックス）、金属酸化物（例えば、酸化チタン、酸化鉄）、及び墨汁（India ink）（即ち、コロイド状炭素粒子の懸濁液）（Reichard and Filkins, 1984, The Reticuloendothelial System; A Comprehensive Treatise, pp. 73-101 (Plenum Press)、及びその参考文献に記載されている）、ヒドロゲル（例えば、米国特許公開第20050191361号に記載されているもの）、セファロース又はアガロースのビーズ又は微粒子を含む。幾つかの実施態様において、粒子は、生分解性かつ非毒性の材料（例えば、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）のようなポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）から形成される。本発明の粒子は、「ゴースト」ＲＢＣとして知られている細胞質が一掃された赤血球（ＲＢＣ）、細菌（ＲＥＳによって細菌が除去されるため；例えば、Benacerraf and Miescher, 1960, Ann NY Acad Sci, 88:184-195を参照のこと）、細胞断片、リポソーム、バクテリオファージ、バクテリオファージ断片、及びウイルス核酸を欠いたウイルスキャプシド（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原粒子）などを含んでよい。
【００２１】
本明細書で使用されるとき、「有効量」という用語は、治療効果（例えば、細菌感染症の処置）を達成するために十分な量のことをいう。治療的又は予防的用途に関連して、被験体に投与される組成物の量は、疾患の種類及び重症度に、並びに一般的健康、年齢、性別、体重及び薬物に対する忍容性のような個体の特性に依存する。これはまた、疾患の程度、重症度及び種類に依存する。当業者は、これらや他の要因に応じて適切な投薬量を決定することができよう。幾つかの実施態様において、治療効果又は予防効果を達成するためのＴＬＲ７／８アゴニストの有効量は、１日当たり体重１kg当たり約０．０００００１mg〜１日当たり体重１kg当たり約１０，０００mgの範囲である。典型的には、投薬量範囲は、１日当たり体重１kg当たり約０．０００１mg〜１日当たり体重１kg当たり約１００mgである。例えば、投薬量は、１日１回、２日に１回又は３日に１回体重１kg当たり１mg又は体重１kg当たり１０mgであるか、あるいは週に１回、２週に１回又は３週に１回１〜１０mg/kgの範囲内であってよい。幾つかの実施態様において、ペプチドの単回投薬量は、体重１kg当たり０．１〜１０，０００マイクログラムの範囲である。幾つかの実施態様において、担体中の芳香族カチオン性ペプチド濃度は、送達される１ミリリットル当たり０．２〜２０００マイクログラムの範囲である。
【００２２】
典型的には、本発明のＴＬＲ７／８アゴニストは、薬学的に許容し得る賦形剤、及び場合により生分解性ポリマーのような徐放性マトリックスと組合せられて、医薬組成物が形成される。「薬学的に」又は「薬学的に許容し得る」とは、必要に応じて、哺乳動物、特にヒトに投与された場合に、有害反応、アレルギー反応、又は他の有害な反応を生じさせない分子実体及び組成物のことをいう。薬学的に許容し得る担体又は賦形剤とは、任意のタイプの非毒性の固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料又は製剤助剤のことをいう。医薬組成物は、任意の投与経路（経口、注射等）と適合する。 例えば、医薬組成物は、注射することができる製剤に対して薬学的に許容し得るビヒクルを含有する。これらは、特に、等張性の無菌の生理食塩水（リン酸一ナトリウム若しくは二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウム若しくはマグネシウムなど、又はこれらの塩の混合物）であっても、又は乾燥した、特に凍結乾燥した組成物であってもよく、そして後者は、状況に応じて、滅菌水又は生理食塩水の添加により、注射液の構成を可能にする。注射用途に適した医薬剤形は、滅菌水溶液又は分散液；ゴマ油、落花生油又は水性プロピレングリコールを含む製剤;及び滅菌注射溶液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末を含む。全ての場合において、本剤形は、無菌でなければならず、容易な注射針通過性が存在する程度に流動性でなければならない。これは、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌のような微生物の汚染作用を防がなければならない。滅菌注射液は、本発明のＴＬＲ７及び／又はＴＬＲ８アゴニストを、必要に応じて、上記の幾つかの他の成分と共に適切な溶媒中に必要量で加え、次に濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散液は、種々の滅菌された活性成分を、基本的な分散媒と上記のものからの必要とされる他の成分とを含む滅菌ビヒクル中に加えることによって調製される。滅菌注射液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌濾過したその溶液から活性成分と任意の追加所望成分との粉末が生成する、真空乾燥及び凍結乾燥手法である。
【００２３】
幾つかの実施態様において、本発明のＴＬＲ７／８アゴニストは、抗生物質と同時に投与される。幾つかの実施態様において、抗生物質は、アミノグリコシド類、ベータラクタム類、キノロン類又はフルオロキノロン類、マクロライド類、スルホンアミド類、スルファメトキサゾール類、テトラサイクリン類、ストレプトグラミン類、オキサゾリジノン類（リネゾリドなど）、リファマイシン類、グリコペプチド類、ポリミキシン類、リポペプチド抗生物質からなる群より選択される。典型的には、ベータラクタム類は、２−（３−アラニル）クラバム、２−ヒドロキシメチルクラバム、７−メトキシセファロスポリン、エピチエナマイシン、アセチルチエナマイシン、アモキシシリン、アパルシリン、アスポキシシリン、アジドシリン、アズロシリン、アズトレオナム、バカンピシリン、ビアペネム、カルベニシリン、カルフェシリン、カリンダシリン、カルペチマイシンＡ及びＢ、
セファセトリル、セファクロル、セファドロキシル、セファレキシン、セファログリシン、セファロリジン、セファロチン、セファマンドール、セファピリン、セファトリジン、セファゼドン、セファゾリン、セフブペラゾン、セフカペン、セフジニル、セフジトレン、セフェピム、セフェタメト、セフィキシム、セフメノキシム、セフメタゾール、セフミノクス、セフモレキシン（cefmolexin）、セフォジジム、セフォニシド、セフォペラゾン、セフォラミド、セフォセリス、セフォタキシム、セフォテタン、セフォチアム、セフォキシチン、セフォゾプラン、セフピラミド、セフピロム、セフポドキシム、セフプロジル、セフキノム、セフラジン、セフロキサジン、セフスロジン、セフタジジム、セフテラム、セフテゾール、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフロキシム、セファロスポリンＣ、セファマイシンＡ、セファマイシンＣ、セファロチン（cephalothin）、キチノボリンＡ、キチノボリンＢ、キチノボリンＣ、シクラシリン、クロメトシリン、クロキサシリン、シクロセリン、デオキシプルラシドマイシンＢ及びＣ、ジクロキサシリン、ジヒドロプルラシドマイシンＣ、エピシリン、エピチエナマイシンＤ、Ｅ、及びＦ、エルタペネム、ファロペネム、フロモキセフ、フルクロキサシリン、ヘタシリン、イミペネム、レナンピシリン、ロラカルベフ、メシリナム、メロペネム、メタンピシリン、メチシリン（meticillin）（methicillinとも称される）、メズロシリン、モキサラクタム、ナフシリン、ノルチエナマイシン（northienamycin）、オキサシリン、パニペネム、ペナメシリン、ペニシリンＧ、Ｎ、及びＶ、フェネチシリン、ピペラシリン、ピバンピシリン、ピブセファレキシン（pivcefalexin）、ポブメシリナム（povmecillinam）、ピブメシリナム、プルラシドマイシンＢ、Ｃ、及びＤ、プロピシリン、サルモキシシリン、スルバクタム、スルタミシリン、タランピシリン、テモシリン、テルコナゾール、チエナマイシン、及びチカルシリンを含む。典型的には、キノロン類は、ナリジクス酸、シノキサシン、オキソリン酸、フルメキン、ピペミド酸、ロソキサシン、ノルフロキサシン、ロメフロキサシン、オフロキサシン、エンロフロキサシン、シプロフロキサシン、エノキサシン、アミフロキサシン、フレロキサシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、クリナフロキサシン、シタフロキサシン、ペフロキサシン、ルフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン トスフロキサシン、グレパフロキサシン、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、及びトロバフロキサシンを含む。
【００２４】
更なる態様において、本発明の方法は、患者に治療有効量の本発明のＴＬＲ７及び／又はＴＬＲ８アゴニストをエラスターゼインヒビターと組み合わせて投与することを含む。
【００２５】
本明細書に使用されるとき、「エラスターゼ」という用語は、当該分野におけるその一般的意味を有しており、好中球により産生されるセリンプロテアーゼである好中球エラスターゼのことをいう（Distelhorst et al., 1987；Edwards and Bernstein, 1994；Groutas et al., 2011；Aikawa and Kawasaki, 2014）。
【００２６】
本明細書に使用されるとき、「エラスターゼインヒビター」という用語は、当該分野におけるその一般的意味を有しており、エラスターゼ活性を阻害することができ、そしてエラスターゼを選択的にブロックするか又は不活化する任意の化合物のことをいう。本明細書に使用されるとき、「選択的にブロックするか又は不活化する」という用語は、セリンプロテアーゼファミリーの他のサブタイプ又はアイソフォームとのその相互作用よりも大きなそれぞれ親和性及び効力で、エラスターゼに優先的に結合してブロックするか又は不活化する化合物のことをいう。エラスターゼを選ぶが、他のセリンプロテアーゼのサブタイプをもブロックするか又は不活化し得る化合物は、部分的又は完全なインヒビターとして考えられる。「エラスターゼ活性インヒビター」とは、エラスターゼのその標的タンパク質との相互作用をブロックする化合物のことをいう。「エラスターゼインヒビター」という用語はまた、エラスターゼの発現を阻害する化合物のことをいう。典型的には、エラスターゼインヒビター化合物は、有機低分子、ポリペプチド、アプタマー、抗体、細胞内発現抗体、オリゴヌクレオチド又はリボザイムである。
【００２７】
ある化合物が、エラスターゼインヒビターであるかどうかを決定するための試験法及びアッセイ法は、Edwards and Bernstein, 1994；EP 0,643,075；US 2005/0265946に記載されるように当業者には周知である。
【００２８】
エラスターゼインヒビターは、Edwards and Bernstein, 1994；Groutas et al., 2011；Aikawa and Kawasaki, 2014；Alam et al., 2012；EP 0,643,075；及びUS 2005/0265946 に説明されるとおり当該分野において周知である。
【００２９】
本発明の１つの実施態様において、エラスターゼインヒビターは、好中球エラスターゼインヒビターのMeOSuc-AAPV-CMK（ＮＥＩ）；シベレスタット；エラフィン；α１−アンチトリプシン（α１−ＰＩ）；分泌型白血球プロテアーゼインヒビター（ＳＬＰＩ）；デペルスタット（Depelstat）（DX-890）；及びONO-6818を含むがこれらに限定されない。
【００３０】
本発明の１つの実施態様において、エラスターゼインヒビターは、ペプチド系インヒビター（作用機序に基づかないペプチドインヒビター、Ｐ１アミノ酸イソスターインヒビター、求電子カルボニル誘導体、ボロン酸、及びモノハロメチルケトン）；酵素活性化複素環式インヒビター（ハロエノールラクトン、インエノール（ynenol）ラクトン、イソクマリン、β−ラクタム、スクシンイミド）及び複素環式アシル化剤（ピロン、ベンゾオキサジノン及び関連複素環、並びにベンゾイソチアゾリン）のような複素環式インヒビター；非複素環式アシル化アルキル化剤（有機リン剤及び有機硫黄剤、イソシアン酸及びエステルアシル化剤）を含むがこれらに限定されない（例えば、Edwards and Bernstein, 1994に記載されるもの）。
【００３１】
本発明の１つの実施態様において、エラスターゼインヒビターは、以下を含むがこれらに限定されない：
・遷移状態インヒビター、例えば：
【００３２】
【化２】
0006785248.tif 000003
【００３３】
・代替基質インヒビター、例えば：
【００３４】
【化３】
0006785248.tif 000004
【００３５】
・カルバミル化剤；作用機序に基づくインヒビター；可逆的競合インヒビター、例えば：
１，４−ジアリールピリミドピリダジニルジオン；
４−（４−シアノフェニル）−１−（３−トリフルオロメチルフェニル）−３，４，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン−２，５−ジオン；及び
Groutas et al., 2011 に記載される化合物、例えば：
【００３６】
【化４】
0006785248.tif 000005
0006785248.tif 000006
0006785248.tif 000007
0006785248.tif 000008
【００３７】
本発明によれば、本発明のＴＬＲ７／８アゴニストは、エラスターゼインヒビターと連続投与又は同時投与される。
【００３８】
本発明は、以下の図面及び実施例により更に説明される。しかし、これらの実施例及び図面は、本発明の範囲を何ら限定するものと解釈されてはならない。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】進行性アルコール性肝硬変患者からの好中球は、ｆＭＬＰ誘導ＲＯＳ産生及びシグナル伝達の障害を示した。パネルＡ：健常ボランティア（対照）及び肝硬変患者からのＰＭＮを、種々の濃度（２５〜１０００nM）の細菌由来ペプチドｆＭｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（ｆＭＬＰ）で刺激して、スーパーオキシドの産生を定量し、nmole/１０６細胞で表した（ｎ＝１６、＊：Ｐ＜０．０５）。パネルＢ：ＰＭＮをｆＭＬＰ（１μM）で７５秒間刺激した。p38 MAPK及びp47phox（S345）の活性リン酸化型をウエスタンブロット実験により検出して、ｆＭＬＰ（ｎ＝４）で得られた対照値の百分率として表した。パネルＣ：ＰＭＮ（１０６細胞/ml）を１０nMラパマイシンの非存在下又は存在下で１５分間処置した後、ｆＭＬＰ（１μM）で刺激した。データは、スーパーオキシド産生の平均±ＳＥＭ（ｎ＝８、＊：Ｐ＜０．０５）を表す（Rolas L. et al, Hepatology 2013に発表されたデータ）。
【図２】進行性アルコール性肝硬変患者からの好中球におけるスーパーオキシド生成ＮＡＤＰＨオキシダーゼGp91phoxの発現の欠乏。健常ドナー（対照）及び進行性アルコール性肝硬変患者からの好中球のGp91phoxの発現を、ウエスタンブロット実験（パネルＡ）及びｍＲＮＡレベル（パネルＣ）によって求めた。タンパク質発現及びｍＲＮＡを定量（パネルＢ、Ｃ）して、対照値の百分率±ＳＥＭとして表した（各群でｎ＝１２、＊：Ｐ＜０．０５、Mann-Whitney統計的検定）。
【図３】ＴＬＲ７／８アゴニストＣＬ０９７は、進行性アルコール性肝硬変患者からの好中球におけるGp91phox ＲＮＡの産生及び合成を刺激した。肝硬変患者からの好中球をＣＬ０９７（２．５μg/ml）の非存在下（緩衝液）又は存在下で３７℃で３０分間処置して、Gp91phox ｍＲＮＡの量を定量し、対照（緩衝液）の百分率として表した（パネルＡ、ｎ＝６、＊：Ｐ＜０．０５）。Gp91phoxの発現をウエスタンブロットアッセイによって決定し、健常ドナーの好中球のそれの百分率±ＳＥＭとして表した（パネルＢ、ｎ＝４、＊：Ｐ＜０．０５）。
【図４】ＴＬＲ７／８アゴニストＣＬ０９７は、進行性アルコール性肝硬変患者からの好中球におけるスーパーオキシドの産生を回復させた。健常ドナー及び進行性アルコール性肝硬変患者からの好中球を、ＴＬＲ７／８アゴニスト（２．５μg/ml）で１５分間、次にＰＢＳ又は１μM ｆＭＬＰで処置した。結果は、nmole/１０６細胞で示されたスーパーオキシド産生の平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝８、＊：Ｐ＜０．０５）。
【図５】ＴＬＲ７／８アゴニストＣＬ０９７は、患者からの精製好中球による、及び全血における反応性酸素種の産生を回復させた。ＲＯＳ産生は、進行性アルコール性肝硬変患者からの精製好中球（０．５×１０６細胞／４５０μl ハンクス平衡塩溶液、パネルＡ）及び全血（０．１２０mM カルシウムを含む４５０μl ＰＢＳ中２０μl、パネルＢ）を用いた高感度ルミノール増強化学発光アッセイによって測定された。細胞をＴＬＲ７／８アゴニスト単独（緩衝液）で１５分間、次に１μM ｆＭＬＰ（パネルＡ）で処置した。結果は、cpmで示された化学発光反応のピーク（８回の実験の平均±ＳＥＭ）を表す。
【図６】ＴＬＲ７／８アゴニストＲ８４８は、健常ドナー及び肝硬変患者の全血におけるＲＯＳ産生を改善するのにＣＬ０９７よりも強力である。健常ドナー（パネルＡ）及び肝硬変患者（パネルＢ）からの全血（２０μl）を、０．１２０mM カルシウムを含む４５０μL ＰＢＳ中で、Ｒ８４８又はＣＬ０９７（０．２５〜５μg/ml）の非存在下（対照）及び存在下で１５分間処置した。次に細胞を１μM ｆＭＬＰで刺激した。結果は、ｆＭＬＰにより誘導された化学発光反応のピークを表し、cpmで示される（４〜６回の平均±ＳＥＭ、＊：Ｐ＜０．０５）。
【図７】肝硬変患者からの好中球の殺菌活性障害及びＴＬＲ７／８アゴニストＣＬ０９７の有益な効果。（Ａ）健常ボランティア（対照）及び肝硬変患者からの好中球を大腸菌と共に５分間インキュベートし、次にｆＭＬＰ（１μM）で２５分間処置したか又は処置しなかった（緩衝液）。（Ｂ、Ｃ）：細菌と共にインキュベートした好中球を、ＣＬ０９７なし（ＰＢＳ）及びＣＬ０９７（１μg/ml）で２分間処置した後、ｆＭＬＰで２３分間刺激した。細胞を溶解し、細菌コロニーの数を求めて、対照休止細胞（Ａ、ｎ＝６）の数の百分率として、又は両方の細胞集団（Ｂ、Ｃ、ｎ＝６）における休止細胞（ＰＢＳ）の数の％として表した；＊Ｐ＜０．０５（Boussif A et al, J Hepatol. 2016 64:1041-8. doi: 10.1016/j.jhep.2015.12.005. Epub 2015 Dec 21に発表されたデータ）。
【図８】エラスターゼは、健常ＰＭＮにおけるgp91phox及びp22phoxの分解を誘導する。（Ａ及びＢ）０．１又は０．５単位 エラスターゼの非存在下又は存在下で１時間処置した健常ＰＭＮにおけるgp91phox及びp22phoxのウエスタンブロット分析及び濃度測定による定量。（Ｃ及びＤ）ｆＭＬＰ（１μM）で４５分間刺激する前に、１００μM エラスターゼインヒビター（ＮＥＩ）の非存在下又は存在下で１５分間前処理した健常ＰＭＮにおけるgp91phox及びp21phoxのウエスタンブロット分析濃度測定による定量。（Ｅ）ｆＭＬＰ（１μM、２分）で刺激したＰＭＮから得られた無細胞脱顆粒上清と共に４５分間インキュベートする前に、１００μM エラスターゼインヒビター（ＮＥＩ）の非存在下又は存在下で１５分間前処理した健常ＰＭＮにおけるgp91phoxのウエスタンブロット分析濃度測定による定量。ブロットは４回の実験を代表しており、濃度測定による分析は積算され、アクチンレベルの百分率として表される。平均値±ＳＥＭの間の有意差は、＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１によって示される。（Ｆ）時間の関数として、Biacore X100で分析したＣＭ３センサーチップにコーティングした抗gp91phox抗体（７Ｄ５）に対するＰＭＮ特異的結合及び解離のセンサーグラム。３群のＰＭＮを注入した（１５０μl ＰＢＳ中に１０３細胞）；対照ＰＭＮ及びエラスターゼ（０．５単位）又は無細胞脱顆粒上清で処置したＰＭＮ。データは、３回の独立した実験を代表しており、共鳴単位（RU）として表される。（Ｇ）４℃で０．５単位 エラスターゼで処置したか又はしていない（対照）ＰＭＮの表面でのGp91phox発現のフローサイトメトリー定量。データは、対照値の百分率±ＳＥＭ（ｎ＝３）として示される平均蛍光指数（ＭＦＩ）を表す。
【図９】肝硬変患者からの血漿は、健常ＰＭＮの表面でのgp91phox発現及びＲＯＳ産生をＮＥＩ感受性に減少させる。ＰＭＮは、エラスターゼインヒビターＮＥＩ（１００μM）の非存在下又は存在下のいずれかで、ＲＰＭＩ（対照）又は健常ボランティア若しくは肝硬変患者の血漿（５×１０６ＰＭＮを含む１ml ＲＰＭＩ中２５％血漿）を用いて３７℃で１２時間前処理した。ＰＭＮを抗gp91phox ＦＩＴＣ結合抗体で標識した。（Ａ）対照値の百分率として表された、フローサイトメトリーによる、抗gp91phox ＦＩＴＣ結合抗体（７Ｄ５）で標識した陽性細胞の数の定量。（Ｂ）右のパネルは、対照値の百分率として表されたＭＦＩ値（平均±ＳＥＭ）を示す（ｎ＝５の別個の実験）。（Ｃ、Ｄ）１００μM ＮＥＩを用いるか用いないかのいずれかで、健常ボランティア及び肝硬変患者からの血漿の非存在下（緩衝液／ＲＰＭＩ）又は存在下で１２時間前処理した健常ＰＭＮによる、ＰＭＡによって誘導されたスーパーオキシドの経時的産生。（Ｅ）対照値の百分率として表されたスーパーオキシドの産生（平均±ＳＥＭ、ｎ＝５）。平均値間の有意差は、＊Ｐ＜０．０５、及び＊＊Ｐ＜０．０１によって示される。
【図１０】アルコール性肝硬変患者からの血漿は対照よりも大量のエラスターゼを含む。血漿５μlアリコート（１０μgタンパク質の当量）を１×Laemmli緩衝液 ４５０μl中で変性させた。試料 １００μLによりＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。基準として同じゲルでウエスタンブロットを行ったブタエラスターゼ８０μg（図示せず）に対する、エラスターゼの濃度測定による分析及び定量、並びに発現。棒は、患者１０名の血漿で得られた平均±ＳＥＭを表す。平均値群間の有意差は、＊＊Ｐ＜０．０１によって示される。p47phoxシグナルが存在しないことは、血漿中に存在するエラスターゼが無傷の好中球又は壊死好中球に由来しないことを示している（データ示さず）。
【図１１】Ｒ８４８による肝硬変ラットのインビボ処置は、全血におけるＲＯＳ産生不足を回復させる。Wistar雌ラットの総胆管を、以前に報告されている（Mohammadi et al, Liver Int. 2009, 29(5):692-700）ように分岐の直ぐ下の肝門近くで全身麻酔（１０mg Avertin、ＩＰ）下で結紮した（ＢＤＬ）。全ての外科的処置を無菌条件下で実施した。尾の中央腹面の血管に挿入した１インチ皮下注射針を用いてエッペンドルフ（Eppendorf）チューブ（１０mM ＥＤＴＡ中約０．５ml）に採血した。MS9-5V Analyzer Counter（Melet Schloesing Laboratories）を用いて白血球を計数した。２１日目に、報告された（McCluskie MJ et al, Antiviral Res. 69:77-85, 2006）とおり肝硬変ＢＤＬラットをＲ８４８（２．２mg/kg）で処置した。対照ラットは処置されなかった。反応性酸素種の産生は、指示日に全血で測定された。簡単に述べると、１０μM ルミノールを含む０．５ml ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中で３７℃でインキュベートした３種の血液容量（０．９、１．８及び３．７５μl）を使用して、温度調整したバイオルミノメーター（Berthold LB940）でＲＯＳ産生を連続して記録した。細胞をサイトカラシンｂ（０．２５μg/ml）で５〜１０分間処置した後、細菌由来ペプチドｆＭｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（ｆＭＬＰ、１μM）で刺激した。ＲＯＳ産生は、全血における化学発光反応のピークを表す。代表的なラットからの典型的な反応プロフィールが、指示日について提供され（三重測定の平均±ＳＥＭ）、２０００血中ＰＭＮ当量あたりのcpmとして表される。同様の反応プロフィールが、ＢＤＬラット合計６匹及び未処置対照（偽処置）ラット５匹で得られた。
【実施例】
【００４０】
実施例１
進行性アルコール性肝硬変を有する免疫不全患者の好中球のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を回復させるＴＬＲ７／８アゴニストのＣＬ０９７及びＲ８４８の有用性
ヒト食細胞ＮＡＤＰＨオキシダーゼのチトクロムｂ（Gp91phox）は、殺菌性スーパーオキシド生成系の重要な細胞膜末端エフェクターである。我々は以前に、進行性アルコール性肝硬変患者からの好中球が、シグナル伝達障害に関連する細菌由来ペプチドｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（ｆＭＬＰ）によって誘導されるスーパーオキシドの重度の産生不足を示すことを明らかにした（Rolas L et al, Hepatology, 2013）。これらのデータは、細菌感染症に対する患者の感受性の増大を部分的に説明することができる。
【００４１】
患者の好中球はまた、ウェスタンブロット分析によって決定されるGp91phox発現も不足していた（図２Ａ及びＢ）が、一方Gp91phox ｍＲＮＡレベルは有意に変化しなかった（図２Ｃ）ことを我々は示した。興味深いことに、Toll様受容体７／８（ＴＬＲ７／８）の細胞透過性アゴニストのＣＬ０９７（２．５μg/ ml、３０分）による患者好中球の処置は、Gp91phox ｍＲＮＡレベルを上昇させ（図３Ａ）、Gp91phoxの発現を回復させた（図３Ｂ）。この処置がＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を改善するかどうかを決定するために、細菌ペプチドｆＭＬＰによる細胞刺激の後、特異的チトクロムＣ還元アッセイによってスーパーオキシド産生（０２−°）を測定した。注目すべきことに、患者の好中球（図４）では、ＣＬ０９７はｆＭＬＰ誘導性スーパーオキシド産生を健常ドナーからの好中球と同様のレベルまで高めた（図４）一方、ＣＬ０９７は健常好中球のスーパーオキシドの最適産生を更に増加させた（図４）。ルミノール増幅生物発光アッセイのような反応性酸素種（ＲＯＳ）を定量するための高感度技術を用いると、ＣＬ０９７それ自体がＲＯＳの低い産生を刺激することが見い出され、そして患者好中球によるｆＭＬＰ誘導性ＲＯＳ産生を強力に高めるその能力が確認された（図５Ａ）。有望なことに、これらのＣＬ０９７独自の性質はまた、患者からの全血におけるＲＯＳ産生のモデルにおいても観察された（図５Ｂ）。最後に、同じファミリーの他のＴＬＲ７／８アゴニストのうちＲ８４８は、肝硬変患者（図６Ｂ）及び健常ドナー（図６Ａ）からの全血におけるＲＯＳ産生を改善するのにＣＬ０９７よりも強力であった。
【００４２】
結論として、ＴＬＲ７／８アゴニストのＣＬ０９７は、好中球におけるGp91phox合成を刺激し、そして細菌性ペプチドｆＭＬＰにより誘導されるＲＯＳ産生を高めることによって、進行性アルコール性肝硬変を介するＲＯＳの重度の産生不足から保護する。よってＣＬ０９７及びＲ８４８のようなＴＬＲ７／８アゴニストは、免疫抑制患者の抗菌性宿主防御反応を改善するために有用であり得る。
【００４３】
臨床試験で広く使用されている、ＣＬ０９７類似体のＲ８４８で処置された胆管結紮（ＢＤＬ）（Mohammadi et al, 2009）によって誘導されたラットの肝硬変モデルを用いて研究を展開する。本発明者らは、Ｒ８４８の非経口投与が、肝硬変により誘導された全血におけるＲＯＳ産生不足をも回復させたという最初の兆候を与えた（図１１）。
【００４４】
実施例２
患者の好中球の殺菌活性障害及び有益なＣＬ０９７効果。
大腸菌と共にインキュベートした対照好中球は、反応性でなかった患者の好中球とは対照的に、ｆＭＬＰでの刺激により有意な殺菌性（２５〜３０％）を誘導した（図７Ａ）。興味深いことに、ＣＬ０９７単独では、対照及び肝硬変患者の両方からの好中球による有意な殺菌性を誘導した（図７Ｂ及びＣ）。ＣＬ０９７はまた、患者の好中球によるｆＭＬＰ誘導殺菌性を強力に高めた一方、対照好中球では有意な増加は認められなかった（Boussif A et al, J Hepatol. 2016 64:1041-8. doi: 10.1016/j.jhep.2015.12.005. Epub 2015 Dec 21に発表され、Louvet A., J. Hepatol, 64:1006-7, 2016に論評されたデータ）。よって、ＴＬＲ７／８活性化は、肝硬変患者における好中球の宿主防御活性に有益な効果を提供し得る。
【００４５】
実施例３
ＰＭＮにおけるＮＯＸ２分解に介在するエラスターゼの主要な役割。
潜在的にＮＯＸ２分解に関与するプロテアーゼを同定するために、選択された基質を切断することができるプロテアーゼを予測するためのＭＥＲＯＰＳデータベース（Rawlings et al 2014）及びコンピュータツールを用いてgp91phox配列をコンピュータ内（in silico）分析に付した（Venkatraman et al 2009）。検出された５つの候補の中で、エラスターゼは、同定された唯一の好中球プロテアーゼであった。gp91phox分解におけるその潜在的な寄与を調べるために、３７℃で１時間健常ＰＭＮを０．１及び０．５単位の精製エラスターゼと共にインキュベートすることによる第１のアプローチを使用し、これにより脱顆粒上清に見い出されるものと同様のタンパク分解活性を与えた（データ示さず）。この処置により、免疫反応性gp91phox断片の増加と同時に約５０％（図８Ａ）のgp91phox分解が起こった（データ示さず）。p22phoxの分解は、０．５単位 エラスターゼで観察された（図８Ｂ）。よって、好中球エラスターゼは、ｆＭＬＰによって誘導されるgp91phox及びp22phoxの分解に重要な役割を果たすようである。このことは、好中球エラスターゼインヒビターMeOSuc-AAPV-CMK（一般にＮＥＩと呼ばれる）が両方の成分のｆＭＬＰ誘導性枯渇を妨げたという観察によって支持される（図８Ｃ及びＤ）。ＰＭＮ中のgp91phox分解プロセスが細胞外で開始されるかどうかを更に判定するために、脱顆粒ＰＭＮの無細胞上清を静止ＰＭＮの新しいバッチと共にインキュベートした。この処置もまたgp91phoxを枯渇させ、gp91phox断片の量を増加させた（図８Ｅ）。この効果におけるエラスターゼの役割は、ＮＥＩでのＰＭＮ前処理がgp91phox分解を阻止したという観察によって支持される。
【００４６】
分解プロセスに関与する可能性のあるgp91phox外側部分への洞察を得るために、我々は、外側gp91phoxエピトープ（ループ２及び３）を認識するgp91phox ７Ｄ５抗体（Nakamura, 1987）、及びBiacore表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術の利益を取ることによって、無傷なＰＭＮとセンサーチップ上にコーティングされた７Ｄ５抗体との間のリアルタイム相互作用を調べた。図８Ｆに示されるように、未処置ＰＭＮ（対照）の注入は、７Ｄ５抗体との特異的な線形かつ時間依存的な相互作用をもたらした。対照的に、この結合は、ＰＭＮを３７℃で１時間エラスターゼで前処理して洗浄した場合、時間及び強度が顕著に減少した。減少した相互作用はまた、脱顆粒上清で前処理されたＰＭＮで検出された。これらのデータは、ＰＭＮの外側エピトープの変化及び表面でのgp91phoxの発現と一致している。更にエラスターゼがgp91phoxの表面に結合するかどうかを調べるために、ＰＭＮを４℃で１時間エラスターゼで処置し、次に７Ｄ５抗体により同じ温度で標識した。この処置は、ＦＡＣＳスキャン分析（図８Ｇ）によって評価される抗体結合を強く阻害したが、これはエラスターゼの干渉効果と一致している。
【００４７】
アルコール性肝硬変患者からの血漿は、好中球のＲＯＳ産生及びＮＯＸ２発現を下方制御する。
顆粒球エラスターゼは感染過程で放出され、アルコール性肝硬変の主要な合併症である特発性細菌性腹膜炎患者（Casafon et al., 1999）の診断に有用であると提唱されている。しかし、好中球ＮＯＸ２活性の調節における血漿エラスターゼの関連は不明である。ここで研究された肝硬変患者の血漿中に存在する好中球エラスターゼの量は、他の研究（Stanley et al., 1996）と一致して、健常被験体よりも有意に高かった（図１０）。血漿エラスターゼがgp91phoxの発現及び活性を調節するかどうかを調べるために、健常ＰＭＮを、患者又は健常ドナー（対照）からの血漿の非存在下又は存在下で処置して洗浄した。この処置は、対照血漿ではなく患者血漿が、７Ｄ５抗体で標識されたgp91phox陽性細胞の量（図９Ａ）、及びgp91phoxの表面発現を減少させることを明らかにした（図９Ａ及びＢ）。更には、この減少は、エラスターゼインヒビターＮＥＩによって妨げられた（図９Ｂ）が、このことは、gp91phox枯渇における患者エラスターゼの寄与を強く示唆している。この観察と一致して、患者の血漿は、チトクロムＣアッセイ（図９Ｃ〜Ｅ）及び化学発光によって測定されたＰＭＮのＮＯＸ２活性を阻害した。更に、ＮＥＩによる血漿及びＰＭＮの前処理は、患者血漿の阻害効果を妨げた（図９Ａ、Ｂ及びＤ）。
【００４８】
参考文献：
この出願を通して、種々の参考文献は、本発明が関係する技術水準を記述している。これらの参考文献の開示は、ここに引用例として本開示に取り込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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