(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織サンプルの量的解析の方法であって、
サンプルの複数の核の倍数性測定を行ってサンプルの倍数性の型を決定する工程、
前記組織サンプルの切片の間質測定を行い、前記サンプルが、所定の間質の百分率を超える百分率の間質を有する高間質型であるか、前記所定の間質の百分率以下の百分率の間質を有する低間質型であるかを決定することにより、サンプルの間質型を決定する工程、ならびに
前記間質型および前記倍数性の型に基づく分類を出力する工程
を含んでなる、方法。
【請求項２】
前記間質測定が、
組織切片を得て、
前記組織切片を染色し、
前記染色した組織切片の顕微鏡画像を取り込み、
クラスタリング・アルゴリズムを用いて前記顕微鏡画像の画像ピクセルを間質ピクセルと非間質ピクセルに領域分割し、
前記画像中の間質ピクセルの画分を計算し、
前記間質ピクセルの画分が前記所定の間質の百分率を超えるか否かを決定する
ことにより行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
クラスタリング・アルゴリズムの使用が、２つのガウス曲線、即ち、前記画像の間質領域に対応する１つのガウス曲線と非間質領域に対応する１つのガウス曲線に、前記画像ピクセルを適合させることを含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
クラスタリング・アルゴリズムを用いる工程を行う前に、前記取り込んだ顕微鏡画像を色相・彩度・明度の色座標に変換することをさらに含んでなる、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
クラスタリング・アルゴリズムを用いる工程が、２つのガウス曲線、即ち、前記画像の間質領域に対応する１つのガウス曲線と非間質領域に対応する１つのガウス曲線に、前記画像ピクセルの色相値を適合させることを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記取り込んだ画像がヘマトキシリンとエオジンによる染色を有するものであり、
前記取り込んだ画像を、ヘマトキシリンで染色された画像領域を表す正規化ヘマトキシリン画像と、ヘマトキシリンまたはエオジンのいずれかで染色された画像領域を表す正規化ヘマトキシリン・エオジン画像とに変換する工程、
正規化ヘマトキシリン・エオジン画像中の、前記画像のバックグラウンドに対応する第１の所定レベル未満の彩度と第２の所定レベル未満の明度を有するピクセルのバックグラウンド・マスクを計算する工程、ならびに
前記正規化ヘマトキシリン画像をグレーに変換してグレー変換画像を得ることにより、結合組織マスクを計算する工程、
をさらに含んでなり、
前記クラスタリング・アルゴリズムを用いる工程が、クラスタリング・アルゴリズムと閾値処理を前記グレー変換画像に用いて結合組織のピクセルを特定する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記所定の間質の百分率が３０％〜７０％である、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記倍数性測定が、
核を遊離させてＤＮＡ特異染料で染色した組織サンプルを作製し、
前記核標本の顕微鏡画像を取り込み、
前記取り込んだ画像中の画像を領域分割して核を特定し
複数の核のそれぞれについて積分光学濃度を求め、
前記サンプルのＤＮＡ倍数性分類を決定する
ことにより行われる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記間質型と前記倍数性の型から無再発生存群を計算することをさらに含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
間質型が高間質型で倍数性の型が非倍数体であるサンプルは高リスクに分類され、間質型が低間質型で倍数性の型が倍数体であるサンプルは低リスクを示し、間質型が低間質型で倍数性の型が非倍数体であるサンプルまたは間質型が高間質型で倍数性の型が倍数体であるサンプルは中程度のリスクを示す、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記組織サンプルががん組織からのものである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記がん組織が、前立腺組織、結腸組織、または直腸組織である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
コンピュータに請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法を実行させるように構成された、コンピュータプログラム製品。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
多くの種類のがんにおいて、臨床医が腫瘍の成長と挙動を診断時に予測することは困難である。この時点での予測は、患者の治療の種類に影響を与え、そのため、その後のアウトカムと患者の生活の質にとって非常に重要である。がん治療は大きなストレスであり、患者の腫瘍が緩徐進行型の場合、実際には積極的治療ががん自体よりも大きな苦痛と不快感をもたらす可能性がある。侵襲性の腫瘍と緩徐進行型の腫瘍を診断時に見分け、正しい治療を選択することは、がん治療の主要な課題である。
【０００２】
細胞核や他の構造のデジタル画像解析は、組織から量的情報を得るための有益な方法である。単離された細胞核と周辺組織の解析を行うには種々の方法が利用できる。そのような方法として、元の媒体からこれらの細胞核を取り込み、相当大きな母集団をなす核を集め、その特徴を明らかにする自動システムを開発することが求められている。
【０００３】
細胞核の特性を明らかにする方法は、新薬発見、臨床等の医学的応用が可能であることが理解されよう。
【発明の概要】
【０００４】
本発明によれば、
サンプルの複数の核の倍数性測定を行い、サンプルの倍数性の型を決定する工程、
組織サンプルの切片の間質測定を行い、サンプルが所定の間質の百分率を超える百分率の間質を有する高間質型であるか、所定の間質の百分率以下の百分率の間質を有する低間質型であるかを決定することにより、サンプルの間質型を決定する工程、ならびに
間質型および倍数性の型に基づく分類を出力する工程
を含んでなる、組織サンプルの量的解析の方法が提供される。
【０００５】
この分類は、「高い」「中程度の」もしくは「低い」リスクのような分類にしてもよく、または、単に間質型と倍数性の型との組み合わせ、例えば「倍数体・低間質」のようにしてもよい。どちらの場合でも、倍数性の型のみを用いる場合に期待できるよりも確実な診断が得られる。
【０００６】
倍数性測定は、
核を遊離させてＤＮＡ特異染料で染色した組織サンプルを作製し、
前記核標本の顕微鏡画像を取り込み、
前記取り込んだ画像を領域分割して核を特定し
複数の核のそれぞれについて積分光学濃度を求め、
サンプルのＤＮＡ倍数性分類を決定する
ことにより行うことができる。
【０００７】
間質測定は、
組織切片を得て、
組織切片を染色し、
染色した組織切片の顕微鏡画像を取り込み、
クラスタリング・アルゴリズムを用いて顕微鏡画像の画像ピクセルを間質ピクセルと非間質ピクセルに領域分割し、
画像中の間質ピクセルの画分を計算し、
間質ピクセルの画分が所定の間質の百分率を超えるか否かを決定する
ことにより行うことができる。
【０００８】
本工程の方法は、クラスタリング・アルゴリズムを用いる工程を行う前に、取り込んだ顕微鏡画像を色相・彩度・明度の色座標に変換することをさらに含んでいてもよい。
【０００９】
クラスタリング・アルゴリズムを用いる工程は、２つのガウス曲線、即ち、画像の間質領域に対応する１つのガウス曲線と非間質領域に対応する１つのガウス曲線に、画像ピクセルを適合させることを含んでいてもよい。
【００１０】
１つのやり方においては、間質の画分を得る方法は、
取り込んだ画像を、ヘマトキシリン染色された画像領域を表す正規化ヘマトキシリン画像と、ヘマトキシリンまたはエオジンのいずれかで染色された画像領域を表す正規化ヘマトキシリン・エオジン画像とに変換する工程、
正規化ヘマトキシリン・エオジン画像中の、画像のバックグラウンドに対応する第１の所定レベル未満の彩度と第２の所定レベル未満の明度を有するピクセルのバックグラウンド・マスクを計算する工程、ならびに
前記正規化ヘマトキシリン画像をグレーに変換してグレー変換画像を得ることにより結合組織マスクを計算する工程
を含み、
クラスタリング・アルゴリズムを用いる工程は、クラスタリング・アルゴリズムと閾値処理をグレー変換画像に用いて結合組織のピクセルを特定する。
【００１１】
所定の間質の百分率は、３０％〜７０％でもよく、例えば、４０％〜６０％でもよい。
【００１２】
本方法は間質型と倍数性の型から患者の生存群を計算することを含んでいてもよい。
【００１３】
間質型が高間質型で倍数性の型が非倍数体であるサンプルを高リスクとして表示してもよく、間質型が低間質型で倍数性の型が倍数体であるサンプルを低リスクとして表示してもよく、間質型が低間質型で倍数性の型が非倍数体であるサンプルまたは間質型が高間質型で倍数性の型が倍数体であるサンプルを中程度のリスクにあると表示してもよい。
【００１４】
本発明により実行される解析は、核の集団の量的評価と組織切片内の間質組織量の組み合わせを組み合わせることによりサンプルの特徴を明らかにすることができ、典型的には生検から得られる組織切片は、上皮、間質、筋肉、内腔、粘液性部位等の多種多様な組織を含有している。
【００１５】
本発明により、個々の単離された細胞について得られた量的情報と組織切片からの量的情報とを組み合わせることにより量的情報を得ることができる。
【００１６】
サンプルはがん組織のものであってもよい。具体例として、がん組織は、直腸組織、結腸組織、もしくは前立腺組織であってもよい。
【００１７】
他の態様において、本発明は、上記の方法をコンピュータに実行させるように構成されたコンピュータプログラム製品に関する。
【００１８】
他の態様において、本発明は、
組織切片を得て、
組織切片を染色し、
染色した組織切片の顕微鏡画像を取り込み、
取り込んだ顕微鏡画像を色相・彩度・明度の色座標に変換し、
２つのガウス曲線、即ち、画像の間質領域に対応する１つのガウス曲線と非間質領域に対応する１つのガウス曲線に、画像ピクセルの色相値を適合させ、顕微鏡画像の画像ピクセルを間質ピクセルと非間質ピクセルに領域分割し、
前記画像の間質ピクセルの画分を計算することにより
組織中の間質の百分率を測定する方法に関する。
【００１９】
このようにして、医師の関与がなくとも信頼性の高い間質の百分率を自動で得ることができる。
【００２０】
本方法は、サンプルが所定の間質の百分率を超える百分率の間質を有する高間質型であるか、所定の間質の百分率以下の百分率の間質を有する低間質型であるかを決定することをさらに含んでいてもよい。
【００２１】
さらに別の態様は、取り込んだ染色組織切片顕微鏡画像から組織中の間質の百分率を測定する方法に関し、
取り込んだ画像を、ヘマトキシリン染色された画像領域を表す正規化ヘマトキシリン画像と、ヘマトキシリンまたはエオジンのいずれかで染色された画像領域を表す正規化ヘマトキシリン・エオジン画像とに変換し、
正規化ヘマトキシリン・エオジン画像中の、画像のバックグラウンドに対応する第１の所定レベル未満の彩度と第２の所定レベル未満の明度を有するピクセルのバックグラウンド・マスクを計算し、
前記正規化ヘマトキシリン画像をグレーに変換してグレー変換画像を得て、
クラスタリング・アルゴリズムと閾値処理を前記グレー変換画像に用い、結合組織のピクセルを特定する結合組織マスクを得て、
バックグラウンド・マスクにより特定されたバックグラウンドを除いた画像中の、結合組織マスクにより特定された結合組織の百分率から、間質の百分率を得ることにより
測定する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
本発明のよりよい理解のために、純粋に例示として、添付の図面を参照しつつ実施態様を説明する。
【図１】図１は倍数性測定の実施を示すフローチャートである。
【図２】図２は図１の倍数性測定の実施装置を示す。
【図３】図３は正常なサンプルの倍数性測定例を示す。
【図４】図４は異常なサンプルの倍数性測定例を示す。
【図５】図５は切片化し染色した後の間質画像である。
【図６】図６は間質測定の実施を示すフローチャートである。
【図７】図７は組み合わせによる方法の実施を示すフローチャートである。
【図８】図８は倍数性と間質の両分類を用いた例での患者の生存結果を示す。
【図９】図９は倍数性分類のみを用いた患者の生存結果を示す。
【図１０】図１０は倍数性と間質の両分類を用いた例での患者の生存結果を示す。
【図１１】図１１は倍数性分類のみを用いた例での患者の生存結果を示す。
【図１２】図１２は間質分類のみを用いた例での患者の生存結果を示す。
【図１３】図１３は倍数性と間質の両分類を用いた例での患者の生存結果を示す。
【図１４】図１４は倍数性分類のみを用いた例での患者の生存率を示す。
【図１５】図１５は代替例による方法における中間段階を示す。
【図１６】図１６は、図１５に示した方法における更なる段階を示す。
【発明の具体的説明】
【００２３】
一つの実施態様において、事前に生検のためにがんの領域から除去した組織サンプルを用いて間質測定用の組織断片を作製し、さらにこのサンプルから得た細胞を倍数性測定に用いる。これらの詳細は後述する。
【００２４】
倍数性測定
図１および図２に示すように、顕微鏡装置とデジタル画像撮像装置を用いて細胞核の解析、具体的には核内のクロマチンの解析を行い、細胞核内のクロマチン構造の量的情報を得る。本実施態様においては、作製した核からのグレースケール強度データを用いて解析を行う。
【００２５】
最初に、標準的な実験法で組織サンプルから細胞標本を作製し、フォイルゲン法でスライド７６上に単相染色層を形成する。この方法は周知であり、例えば、Ris and Mirsky, "Quantitative Cytochemical determination of desoxyribonucleic acid with the Feulgen nucleal reaction.", The Journal of General Physiology, (1949) pages 125 to 146に記載されている。なお、この方法は均質化もしくは遊離させる工程を備えているので、ここで得られる染色サンプルは細胞切片ではなく、均一化された細胞群である。
【００２６】
作製したスライド７６を顕微鏡７４、詳細には、コンピュータ制御されたステージ７８に載せる。顕微鏡７４には画像装置７０を使用する。本実施態様によるコンピュータソフトウェアでプログラムされたパーソナルコンピュータ７２が電子機器８０を制御し、電子機器８０がステージ７８を制御してステージとサンプルを動かし、スライドの顕微鏡下の位置を調節する。パーソナルコンピュータ７２はステージ７８を所要の位置に動かし、サンプルが所要の位置に来たらデジタルカメラを用いて撮像する。
【００２７】
コンピュータはデジタルカメラの制御およびその後の解析を行うために用いられる。コンピュータは図１に示す一連のステップを実行する。
【００２８】
まず、（ステップ１０）核および他の人為構造を含まない基準領域を設定し、画像全体のバックグラウンドレベルを計算する。
【００２９】
次に、ステージ７８を第一のフレーム位置に動かして（ステップ１２）、撮像する（ステップ１４）。
【００３０】
次いで、シェード補正（ステップ１６）および核の領域分割（ステップ１８）による画像処理を行う。使用した領域分割アルゴリズムの更なる詳細は英国特許出願番号第１０１９４２９．８号に記載されている。
【００３１】
次に、各核の積分光学濃度を求める（ステップ２０）。充分な核が撮像された場合、即ち、積分光学強度を求める核の数が所定の数を超えた場合は、ステップ２４に進む。しかし、測定した核数が十分でない場合は、ステップ１２に戻り、ステージを別の位置に動かしてさらに核の撮像を行う。サンプル全体の測定が済むか、核数が所定の数を超えるまで、これらのステップを繰り返す。
【００３２】
次に、ヒストグラムを作成して（ステップ２４）、積分光学濃度の範囲を決定する。これは、サンプルが図２に示すような２Ｃの位置に単一の大きなピークのある倍数体サンプルであるか、それとも図３に示すような非倍数体であるかというＤＮＡの倍数性分類を決定するために用いられる。なお、実用上は、ヒストグラムそのものを実際に計算し、プロットする必要はなく、核のデータが記憶され、パーソナルコンピュータ７２が以下で説明するようにデータを分類できさえすればよい。
【００３３】
図３および図４は２つのサンプルのヒストグラムを示す。
【００３４】
図３は、サンプルの倍数性に対応して様々な積分光学濃度を持つ核の数を表したヒストグラムである。目盛りは１ｃ、２ｃ、４ｃ、および５ｃのハプロイド数に対応する光学濃度を示す。これらの光学濃度は細胞内の染色体の複製数に対応する。２ｃは倍数体細胞であり、４ｃは分裂中の細胞である。
【００３５】
図４は異数体サンプルのヒストグラムである。この場合、２ｃに有意のピークがあるが、これに加え、２ｃと４ｃのピークの間に異数体値の有意のピークがある。これは非倍数体サンプルに対応する。
【００３６】
この特定のＤＮＡ倍数性分類例においては、Ｇ０／Ｇ１ピーク（２ｃ）が１つだけあり、Ｇ２ピーク（４ｃ）にある核数が総核数の１０％を超えず、ＤＮＡ含有量が５ｃ以上の核数が１％を超えない場合に限り、腫瘍を倍数体として分類した。
【００３７】
４ｃピーク（ＤＩ  １．９−２．１）が存在し（４ｃピークの核数がＳ期画分より多く、総核数の１０％より多い）、Ｇ２ピーク（８ｃ）の核数が総核数の１０％を超えず、ＤＮＡ含有量が９ｃより多い核数が１％を超えない場合に、腫瘍を四倍体であると定義した。
【００３８】
８ｃピークに総核数の１０％より多く核が存在し、かつ／またはＤＮＡ含有量が９ｃより多い核数が１％を超える場合、腫瘍を多数体と定義した。
【００３９】
正倍数体でないピークが存在するか、または、ＤＮＡ含有量が５ｃを超えていて正倍数体集団を表しているのではない核数が１％を超える場合、腫瘍を異数体と定義した。異数体ピークが現れ、そのＤＮＡインデックスが１．０６−１．１０の場合、腫瘍を高二倍体と定義した。
【００４０】
間質測定
組織サンプルを入手し、切片化し染色して図５に示す画像を得る。切片作製にはヘマトキシリンおよびエオジン染料が用いられる。
【００４１】
次いで、図６に示すように、スライドスキャナを用いて切片のカラー画像を取り込み（ステップ４０）、コンピュータにアップロードする。次いで画像を色相・彩度・明度の色座標に変換する（ステップ４２）。
【００４２】
次に、バックグラウンドを除去する（ステップ４６）。これは組織画像がない領域を特定することにより行われる。
【００４３】
次いで２つのガウス曲線への適用を行う。初期条件を設定し（ステップ４８）、次いでクラスタリング・アルゴリズムを用い（ステップ５０）それぞれ異なるガウス曲線により表される２つの異なる色をデータに適用する。これにより効果的に画像を間質と間質でない領域に分割できる。このクラスタリング・アルゴリズムはカラー画像の色相値のみを利用する。
【００４４】
次いで、所定のピクセル数以下の小さな領域を除去し（ステップ５２）、画像をメディアンフィルタに通して（ステップ５４）画像からノイズを除去する。
【００４５】
次いで、間質画分を計算する（ステップ５６）。間質画分が例えば所定値、例えば５０％の範囲を超えるサンプルを高間質型として特定する。それ以外のサンプルを低間質型に分類する。
【００４６】
組み合わせ
図７は、組織サンプルを出発点として組み合わせによる方法を示す。
【００４７】
図１に示す方法で得たヒストグラムを倍数体もしくは非倍数体のいずれかの倍数性の型に分類する（ステップ６２）。この際、四倍体、多数体、もしくは異数体は非倍数体に分類する。ヒストグラムを必要とせずにサンプルを倍数体もしくは非倍数体に分類できる他の計算方法があり、そのような方法も同様に可能であることを当業者は理解するであろう。
【００４８】
また、図６に示す方法によって得られる間質画分を高間質型もしくは低間質型に分類する（ステップ６４）。
【００４９】
次いで、この組み合わせによる分類を用いて特定時間経過後の再発率を計算する。同様に、このデータを無再発生存率を得るために用いてもよい。あるいは、患者の生存に関するデータを得てもよい。医師は、積極的介入なしでは余命がより短いと予想される場合に、より積極的な介入を選択するため、このデータは医師にとって有用な情報となる。
【００５０】
患者の再発率予想は実験によって得られる。発明者はこの２つの方法の組み合わせが予想外に良い効果を生むことを発見した。
【００５１】
２系列の患者に対し実験が行われた。第１系列「Ｖ」は、オックスフォードでの治験に参加したＩＩ期もしくはＩＩＩ期の結腸直腸がん患者８５０人の系列であり、第２系列「Ａ」はオスロ大学病院のＩ期、ＩＩ期もしくはＩＩＩ期の結腸直腸がん患者５８７人の系列である。全ての患者は手術で腫瘍を摘出された。７５歳未満のＩＩＩ期の患者は追加的（補助的）化学療法を受けた。患者全員を最低５年間もしくは死亡時まで追跡した。
【００５２】
サンプルは上述のＤＮＡ倍数性試験法により倍数体もしくは非倍数体に分類し、さらに上述の間質測定により低間質型もしくは高間質型に分類した。
【００５３】
再発率は別々に示した。グラフは倍数体をＤ、非倍数体をＮ、高間質型をＨ、低間質型をＬで示した。
【００５４】
図８はＡ系列について測定後数年間の無再発生存率を示す。
【００５５】
間質型測定と倍数性の型の測定の組み合わせにより、５０％の５年無再発生存率を示す非倍数体・高間質型と、それよりはるかに高い５年無再発生存率を示す倍数体・低間質型との違いが明確に現れることが注目される。
【００５６】
これらグラフに現れる違いは、図９に示した倍数体か非倍数体かという倍数性の型（倍数性）のみに基づいて分けた結果よりもはるかに明確である。
【００５７】
したがって、この２つの方法の組み合わせを用いれば、倍数性のみに基づく分類に着目するよりはるかに良好な結果が得られることが明らかである。したがって、倍数性の型および間質型に関する両方の情報を出力することにより、医師がより正確に予後、即ち無再発生存率を推定し、適切な治療を選択することができるような出力データが提供される。
【００５８】
図１０はＶ系列について同様のデータを示す。ここでも、このグラフには、図１１に示す倍数性の型のみによる分類に基づく結果よりも、余命およびそれによる診断上の有効性における違いがはるかに明確に現れている。
【００５９】
図１２は図１０に対応するデータを間質型のみで分類したものである。図１０の結果は、図１２の間質型のみを用いた結果との比較においてもより明確であることが注目される。
【００６０】
すなわち、間質と倍数性の組み合わせは、これらをそれぞれ単独に用いるよりも良い結果が得られる。
【００６１】
上記の結果は結腸直腸がんに関するものである。しかし、同じ方法は他の種類のがんにも適用できる。
【００６２】
図１３は、前立腺がんについて、間質型と倍数性の型の両方に基づく分類を用い、同様に計算した無再発生存結果を示す。
【００６３】
図１４は、倍数性の型のみを用いた比較例を示す。倍数性のみを用いた場合に比べ、組み合わせによる方法ではるかに良好な結果が得られることが注目される。
【００６４】
したがって、この結果は、本方法が結腸直腸がんに留まらず一般的に適用可能であることを示唆している。
【００６５】
なお、同じサンプルについて異なる測定方法を用いた多くの場合においては、無再発生存率の推定のために複数の推定結果を組み合わせても、異なる測定方法の中からより良いものを採用した場合と比較してほとんど改善が得られない。しかし、上述の倍数性測定と間質測定の場合には、予想外のことであるが、これら異なる測定法を用いることで、アウトカムに有意差がある集団別にサンプルを分けることができ、したがって、その後の治療上の意思決定にとって、この方法は単独の測定法を用いるよりもはるかに有用である。特に、間質測定を加えることにより倍数性測定単独の場合に比べ有意に結果が改善される。
【００６６】
間質を特定する更なる方法を説明する。上述の方法においては、ＨＳＶ座標に変換した画像を用い、２つの領域の色相を自動抽出し、自動のクラスタリング・アルゴリズムを色相値に適用した。間質を特定する別の方法においては、代わりに変換画像の色相と彩度の両方の値を用いる。それぞれの値に同じ重みが与えられる。
【００６７】
この代替的な方法の詳細は以下のとおりである。
【００６８】
まず、ヘマトキシリンとイオジンで染色したスライド画像をスキャンし、Huoの手法に類するものによりホワイトバランスの較正を行う。この手法はHuo J, et al "Robust Automatic White Balance Algorithm using Gray Color Points in Images", IEEE transactions on Consumer Electronics, 2006, volume 52, number 2, pages 541 to 546に記載がある。
【００６９】
次いで画像を抽出しリサンプリングする。一例において、１／８の比率でリサンプリングを行い線形解像度約２μｍの画像を得た。
【００７０】
次いでカラーチャンネルを抽出し、Macenko M, et al, "A method for normalising histology slides for quantitative analysis", Biomedical Imaging: From Nano to Macro 2009, IEEE international symposium on biomedical imaging ISBI 2009, pages 1107 to 1110に記載の手法により正規化した。この処理により実際には２つの画像が得られるところ、これらをヘマトキシリン画像およびＨ＆Ｅ画像と称する。ヘマトキシリン画像はヘマトキシリン染色に関連しエオジン染色には関連しない正規化画像であり、Ｈ＆Ｅ画像はヘマトキシリン染色とエオジン染色の両方に対応する正規化画像である。図１５に、得られたＨ＆Ｅ画像を示す。
【００７１】
これらの画像を色相、彩度、明度のＨＳＶ色空間の色データを用いて処理する。
【００７２】
ついで２つのマスク、即ちバックグラウンド・マスクおよび結合組織マスクを作成する。
【００７３】
バックグラウンド・マスクを得るには、正規化したＨ＆Ｅ画像をサイズ７ｘ７の平均化フィルタにかける。次いで明度Ｖ＜０．２で平均彩度Ｓ＜０．４のピクセルを除去しバックグラウンド・マスクを得る。
【００７４】
結合組織マスクを得るには、正規化ヘマトキシリン画像を９×９ウィンドウのグレー・メディアンフィルタにかけメディアン画像を得る。次いでこの画像をカーネルサイズ１７の標準偏差フィルタで処理して標準偏差フィルタ画像を得る。
【００７５】
これらメディアン画像と標準偏差フィルタ画像という２つの画像を加算により合成する。なお、いずれの画像も正規化されている。次いでヒストグラム調整を行い、上位値、下位値の１％が飽和すように画像を調整する。これにより合成画像が得られる。
【００７６】
大津の手法を用いて閾値を計算すると、この合成画像は大津の手法により計算される閾値の１．１５倍で閾値が適用されている。次いでこの画像をフィルタ処理して領域が２００ピクセル未満の小物体を除去し、サイズ３のディスクカーネルでクロージングフィルタを適用して結合組織マスクを得る。
【００７７】
次いで、結合組織マスクとバックグラウンド・マスクをＡＮＤ演算により合成し、図１６に示す最終的なマスクを得る。間質画分は、関心領域中の結合組織画分（即ち間質）により、即ち、結合組織のピクセル数（バックグラウンドを除く）をピクセル総数（バックグラウンドを除く）で除すことにより計算する。
【００７８】
こうしてこの場合、本方法は、結合組織を除外するマスクとバックグラウンドを除外するマスクという２つの別々のマスクから１つのマスクを効果的に計算することができ、これにより上述の方法に比べ改善されたものとなっている。
【００７９】
本方法の効果を試験するため、本方法を多数の腫瘍に適用した。腫瘍は、間質画分５０％未満の腫瘍を低間質型として、間質画分５０％以上の腫瘍を高間質型として分類した。
【００８０】
多変量解析により、本方法はＩＩＩ期の腫瘍に特に価値があること、サンプル中で予後に関連性のある要素は間質、倍数性、変異およびＴステージであることが示された。したがって、ここに教示する方法による間質画分および倍数性を利用する量的解析を実施するための道具を提供することは、倍数性を利用し間質画分を利用しない方法と比較して、診断の信頼性を大きく向上させる。
【００８１】
詳細には、試験したサンプルについて下記の多変量因子が得られた。ハザード比は２つの条件で記述されるハザード率の比であり、ハザード比２は良い値と比較して悪い値のリスクが２倍であることを示す。試験結果において、５年無再発生存率を計量に用いた。
間質：ハザード比２．０（信頼区間１．４〜２．９）、ｐ値＜０．００１
倍数性：ハザード比１．４（信頼区間０．９〜２．２）、ｐ値０．１４
Ｔステージ：ハザード比１．６（信頼区間１．１〜２．４）、ｐ値０．０１９
【００８２】
ＴステージがＴ３のＩＩＩ期腫瘍だけを選んだ場合には更に良好な値が得られた。
間質：ハザード比２．１（信頼区間１．３〜３．４）、ｐ値０．００３
倍数性：ハザード比２．０（信頼区間１．１〜３．３）、ｐ値０．０１３
サンプルサイズが小さい場合は当然ながら信頼区間が相対的に大きくなる。
【００８３】
このように、高間質型に分類される患者は低間質型の患者に比べリスクが２倍であることから、間質を加えることにより明らかに結果が改善される。
【００８４】
一見したところでは、本方法は画像の色相を扱っていないように見えるが、本方法ではヘマトキシリン画像とＨ＆Ｅ画像を区別するために色相を用いる。
【００８５】
本発明者らは、第２の実施態様に係る方法がより再現可能性の高い結果をもたらすこと、即ち、この種の画像処理においては言うまでもなく重要課題であるところの画像染色と画像取り込み時の変動に強いことを見出した。理論に拘泥することなく、ヘマトキシリン画像とＨ＆Ｅ画像を生成するために実行される正規化処理がこれら画像を正規化してサンプル染色と画像取り込み時の変動の影響を抑える上で効果があると信じる。
【００８６】
以上の例示的説明中の如何なる記載もクレームの範囲を制限することを意図していない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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