(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、ヒト多能性幹細胞をＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲ＋ＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋原始中胚葉細胞へ分化させる方法。
（ａ）ヒト多能性幹細胞を、間葉系血管芽細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍｏａｎｇｉｏｂｌａｓｔ）可能性を有するＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲ＋ＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋原始中胚葉細胞の集団を胚様体の形成または間質細胞株との共培養を伴わずに形成するために、約２日間の期間低酸素条件下で、約１０ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２、約５０ｎｇ／ｍｌから約２５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、約１０ｎｇ／ｍｌから約１５ｎｇ／ｍｌ未満のアクチビンＡ、及び約１ｍＭから約２ｍＭの塩化リチウムを構成要素として含む異種非含有、及び血清アルブミン非含有な混合物に暴露する工程。
【請求項２】
さらに以下の工程を含む、請求項１に記載の方法。
（ｂ）細胞を、工程（ａ）の原始中胚葉段階において、血球血管共通前駆細胞（ＨＢ−ＣＦＣ）可能性とＯＰ９細胞上で培養する際に造血内皮クラスターを形成する可能性を有する細胞に富む造血血管（ｈｅｍａｔｏｖａｓｃｕｌａｒ）中胚葉細胞（ＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲｈｉＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａｌｏ／−）と共にＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲ＋ＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋原始中胚葉を含む集団を得るために、約１〜２日間の期間低酸素条件下で、ＦＧＦ２、及びＶＥＧＦを構成要素として含む異種非含有、血清アルブミン非含有な混合物に暴露する工程。
【請求項３】
さらに以下の工程を含む、請求項２に記載の方法。
（ｃ）工程（ｂ）の造血血管（ｈｅｍａｔｏｖａｓｃｕｌａｒ）中胚葉段階で、ＣＤ１４４＋ＣＤ７３＋ＣＤ２３５ａ／ＣＤ４３−非造血内皮前駆細胞（非ＨＥＰ）、ＣＤ１４４＋ＣＤ７３−ＣＤ２３５ａ／ＣＤ４３−造血内皮前駆細胞（ＨＥＰｓ）、ＣＤ１４４＋ＣＤ７３−ＣＤ２３５ａ／ＣＤ４３＋４１ａ−血管新生造血前駆細胞（ＡＨＰ）、及びＣＤ４３＋ＣＤ４１ａ＋造血前駆細胞の形成を達成するために、前記細胞を、構成要素ＦＧＦ２、ＶＥＧＦ、ＩＬ６、ＳＣＦ、ＴＰＯ、及びＩＬ３を含む異種非含有、血清アルブミン非含有な混合物に、約１日間暴露する工程。
【請求項４】
さらに以下の工程を含む、請求項３に記載の方法。
（ｅ）造血拡大（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）の結果としてＣＤ４３＋ＣＤ２３５ａ＋ＣＤ４１ａ＋エリスロメガカリオサイト前駆細胞及びｌｉｎ−ＣＤ３４＋ＣＤ４３＋ＣＤ４５＋／−多能性造血前駆細胞から構成されるＣＤ４３＋造血前駆細胞の集団を得るために、構成要素ＦＧＦ２、ＶＥＧＦ、ＩＬ６、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−３を含む混合物に常酸素下で約３日間、ＨＥＰｓを曝露し続け、造血前駆細胞を出現させる工程。
【請求項５】
前記混合物が、実質的に前記構成要素から構成される請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞は、テネイシンＣで処理された基質上に播種された細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
約５０から約２５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、
約１０から約１５ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ、
約１０から約５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２、及び
約１ｍＭからの約２ｍＭの塩化リチウム
を添加した培地を含むヒト多能性幹細胞をＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲ＋ＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋原始中胚葉細胞へ分化するための異種非含有培地。
【請求項８】
少なくとも約０．２５μｇ／ｃｍ２から約１μｇ／ｃｍ２の濃度で、テネイシンＣの層を含む基質上の単細胞懸濁液として播種したヒト多能性幹細胞、及び
約５０から約２５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、
約１０から約１５ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ、
約１０から約５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２、及び
約１ｍＭからの約２ｍＭの塩化リチウムを添加した培地を含む異種非含有培地を含む、ヒト多能性幹細胞をＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲ＋ＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋原始中胚葉細胞へ分化するための異種非含有細胞培養系。
【請求項９】
以下の工程を含む、ヒト多能性幹細胞をＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲ＋ＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋原始中胚葉細胞へ分化させる方法。
（ａ）テネイシンＣで処理された基質上に単細胞懸濁液として細胞を播種する工程、及び
（ｂ）間葉系血管芽細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍｏａｎｇｉｏｂｌａｓｔ）潜在性を有する約３０％ＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲ＋ＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋原始中胚葉細胞を胚様体の形成または間質細胞株との共培養を伴わずに得るために、前記播種した細胞を、低酸素下で約２日間、約１０ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２、約５０ｎｇ／ｍｌから約２５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、約１０ｎｇ／ｍｌから約１５ｎｇ／ｍｌ未満のアクチビンＡ、及び約１ｍＭから約２ｍＭの塩化リチウム添加した培地中で培養する工程。
【請求項１０】
さらに、血液血管共通前駆細胞（ＨＢ−ＣＦＣ）潜在性を持つＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲ＋ＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋原始中胚葉、及びＯＰ９細胞上での培養時に造血内皮クラスターを形成する潜在性を有するＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲｈｉＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａｌｏ／−造血血管（ｈｅｍａｔｏｖａｓｃｕｌａｒ）中胚葉前駆細胞を得るために、前記細胞を、ＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲ＋ＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋原始中胚葉段階において、低酸素下で約１〜２日間、ＦＧＦ２及びＶＥＧＦを添加した培地中で培養する工程を含む請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
以下の工程を含む、ＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲ＋ＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋原始中胚葉細胞の製造方法。
（ａ）有効量のコラーゲンで処理された基質上にヒト多能性幹細胞を播種する工程、及び
（ｂ）間葉系血管芽細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍｏａｎｇｉｏｂｌａｓｔ）潜在性を持つＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲ＋ＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋原始中胚葉細胞の集団を胚様体の形成または間質細胞株との共培養を伴わずに形成するために、前記幹細胞を、低酸素下で約２日間、約１０ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２、約５０ｎｇ／ｍｌから約２５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、約１０ｎｇ／ｍｌから約１５ｎｇ／ｍｌ未満のアクチビンＡ、及び約１ｍＭから約２ｍＭの塩化リチウムを含む混合物中に暴露する工程。
【請求項１２】
前記コラーゲンは、コラーゲンＩＶを含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｂ）において、異種非含有、及び血清アルブミン非含有な細胞培地に、ＦＧＦ２は約１０ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌ、かつＶＥＧＦは約２０ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌで補充する、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｃ）において、異種非含有、血清アルブミン非含有な細胞培養培地中の濃度が、ＦＧＦ２は約１０ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌ、ＶＥＧＦは約２０ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌ、ＳＣＦは約５０ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌ、ＴＰＯは約５０ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−６は、約５０ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌ、かつＩＬ−３は約５ｎｇ／ｍｌから約１５ｎｇ／ｍｌである請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
異種非含有、及び血清アルブミン非含有混合物が
約５０ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、
約５０ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、
約５０ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６、及び
約５ｎｇ／ｍｌから約１５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３、を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１６】
ヒト多能性幹細胞が、少なくとも約０．２５μｇ／ｃｍ２から約１μｇ／ｃｍ２の濃度のテネイシンＣの層を含む異種非含有血清アルブミン非含有混合物を含む基材上に単一細胞懸濁液として播種される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
テネイシンＣの層が、少なくとも約０．２５μｇ／ｃｍ２から約１μｇ／ｃｍ２の濃度である、請求項６に記載の方法。
【請求項１８】
テネイシンＣの層が、約０．５μｇ／ｃｍ２の濃度である、請求項６に記載の方法。
【請求項１９】
前記低酸素状態が約３％から約１０％のＯ２レベルの環境酸素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記幹細胞が、コラーゲンＩＶを含む基材上に播種される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年３月１３日に出願された米国仮特許出願６１／７７９，５６４の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、米国政府の支援による補助金番号ＨＬ０９９７７３、及び国立衛生研究所による補助金番号ＨＬ１１６２２１の下に行われた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
ヒト多能性幹細胞技術の出現は、機能的研究と治療のために、インビトロで内皮細胞及び造血細胞を生成する機会を提供してきた。これまで、マウスの骨髄間質細胞株を用いた共培養系であるＯＰ９は、内皮細胞及び血液系統にヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣｓ）の効率的かつ測定可能な分化を確立するために使用されてきた。しかし、マウスフィーダー細胞と血清（すなわち、異種の供給源）に依存する共培養系は、特定の成長因子にｈＰＳＣレスポンスを研究するための使用が制限される。さらに、臨床グレードの治療血液細胞の製造との関連を考慮すると、そのような系はさらに制限される。
【０００４】
従来の培養系の弱点に鑑みて、新しい培養系に、異種混入物の混入のリスクなしに、臨床で使用するのに適する内皮細胞及び血液系統のソースを提供することが必要とされる。
【発明の概要】
【０００５】
本明細書で提供される一態様は、（ａ）ヒト多能性幹細胞を提供する工程、及び（ｂ）幹細胞を、間葉系血管芽細胞（mesenchymoangioblast）可能性を有するＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲ＋ＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋原始中胚葉細胞の集団を形成するために、約２日間の期間低酸素条件下で、ＦＧＦ２、ＢＭＰ４、アクチビンＡ、及び塩化リチウムを構成要素として含む混合物に暴露する工程を含む、ヒト多能性幹細胞を分化させる方法である。
【０００６】
いくつかの実施態様では、前記方法は、（ｃ）細胞を、工程（ｂ）の原始中胚葉段階において、血球血管共通前駆細胞（ＨＢ−ＣＦＣ）可能性とＯＰ９細胞上で培養する際に造血内皮クラスターを形成する可能性を有する細胞に富む造血血管（hematovascular）中胚葉細胞（ＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲｈｉＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａｌｏ／−）と共にＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲ＋ＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋原始中胚葉を含む集団を得るために、約１〜２日間の期間低酸素条件下で、ＦＧＦ２、及びＶＥＧＦを構成要素として含む混合物に暴露する工程を含む。いくつかの実施態様において、前記方法は、さらに（ｄ）工程（ｃ）の造血血管（hematovascular）中胚葉段階で、ＣＤ１４４＋ＣＤ７３＋ＣＤ２３５ａ／ＣＤ４３−非造血内皮前駆細胞（非ＨＥＰ）、ＣＤ１４４＋ＣＤ７３−ＣＤ２３５ａ／ＣＤ４３−造血内皮前駆細胞（ＨＥＰｓ）、ＣＤ１４４＋ＣＤ７３−ＣＤ２３５ａ／ＣＤ４３＋４１ａ−血管新生造血前駆細胞（ＡＨＰ）、及びＣＤ４３＋ＣＤ４１ａ＋造血前駆細胞の形成を達成するために、前記細胞を、構成要素ＦＧＦ２、ＶＥＧＦ、ＩＬ６、ＳＣＦ、ＴＰＯ、及びＩＬ３を含む混合物に、約１日間暴露する工程を含む。さらなる実施態様において、前記方法はまた、（ｅ）造血拡大（hematopoietic expansion）の結果としてＣＤ４３＋ＣＤ２３５ａ＋ＣＤ４１ａ＋エリスロメガカリオサイト前駆細胞及びｌｉｎ−ＣＤ３４＋ＣＤ４３＋ＣＤ４５＋／−多能性造血前駆細胞から構成されるＣＤ４３＋造血前駆細胞の集団を得るために、構成要素ＦＧＦ２、ＶＥＧＦ、ＩＬ６、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−３を含む混合物に常酸素下で約３日間、ＨＥＰｓを曝露し続け、造血前駆細胞を出現させる工程を含む。
【０００７】
いくつかの実施態様において、前述の方法のいずれかで使用される混合物は、実質的に前記構成要素から構成される。いくつかの実施態様では、使用される混合物は異種非含有である。
【０００８】
いくつかの実施態様では、ヒト多能性幹細胞は、テネイシンＣで処理された基質上に播種された細胞である。
【０００９】
本明細書で提供されるさらなる態様は、約５０から約２５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、約１０から約１５ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ、約１０から約５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２、及び約１ｍＭからの約２ｍＭの塩化リチウムを添加したＩＦ９Ｓを含むヒト多能性幹細胞を分化するための異種非含有培地である。
【００１０】
本明細書で提供される関連する態様は、約１０から約５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２、及び
約２０から約５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを添加したＩＦ９Ｓを含むヒト多能性幹細胞を分化するための異種非含有培地である。いくつかの実施態様において、前記培地は、ＦＧＦ２及びＶＥＧＦを含み、さらに、造血サイトカインを含む。いくつかの実施態様において、前記造血サイトカインは、約５０から約１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、約５０から約１００ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、約５０から約１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６、及び約５から約１５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３を含む。いくつかの実施態様では、前述の培地のいずれかは実質的にＩＦ９Ｓ培地、及び添加された成分から構成される。いくつかの実施態様では、前述の培地のいずれかは、濃縮された形態で提供される。
【００１１】
本明細書で提供される別の態様は、少なくとも約０．２５μｇ／ｃｍ２から約１μｇ／ｃｍ２の濃度で、テネイシンＣの層を含む基質上の単細胞懸濁液として播種したヒト多能性幹細胞、及び約５０から約２５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、約１０から約１５ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ、約１０から約５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２、及び約１ｍＭから約２ｍＭの塩化リチウムを添加したＩＦ９Ｓを含む異種非含有培地を含む、ヒト多能性幹細胞を中胚葉、内皮細胞、及び含む造血前駆細胞へ分化するための異種非含有細胞培養系である。
【００１２】
本明細書で提供される別の態様は、（ａ）ヒト多能性幹細胞を提供する工程、（ｂ）テネイシンＣで処理された基質上に単細胞懸濁液として細胞を播種する工程、及び（ｃ）間葉系血管芽細胞（mesenchymoangioblast）潜在性を有する約３０％ＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲ＋ＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋原始中胚葉細胞を得るために、前記播種した細胞を、低酸素下で約２日間、ＢＭＰ４、アクチビンＡ、ＦＧＦ２、及び塩化リチウムを添加したＩＦ９Ｓ培地中で培養する工程を含む。
【００１３】
いくつかの実施態様では、上記の方法はさらに血液血管共通前駆細胞（ＨＢ−ＣＦＣ）潜在性を持つＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲ＋ＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋原始中胚葉、及びＯＰ９細胞上での培養時に造血内皮クラスターを形成する潜在性を有するＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲｈｉＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａｌｏ／−造血血管（hematovascular）中胚葉前駆細胞を得るために、前記細胞を、ＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲ＋ＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋原始中胚葉段階において、低酸素下で約１〜２日間、ＦＧＦ２及びＶＥＧＦを添加したＩＦ９Ｓ培地中で培養する工程を含む。
【００１４】
本明細書で提供される更なる態様は、ヒト多能性幹細胞を分化するための前述の方法のいずれかによって製造される精製された細胞集団であり、この細胞は、非ヒト成分に曝露されていない。
【００１５】
本明細書で提供される関連する態様は、前記方法によって製造される精製された細胞集団であって、細胞は、約３５％を超える間葉系血管芽細胞（mesenchymoangioblast）コロニーを形成する可能性を秘めたＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲ＋ＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋原始中胚葉細胞である。
【００１６】
本明細書で提供されるさらなる態様は、単離された細胞の集団であり、その細胞は、約３５％を超える原始中胚葉血球血管共通前駆細（ＨＢ−ＣＦＣ）の可能性を有するＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲ＋ＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋原始中胚葉、及びＯＰ９細胞上で培養した場合造血内皮クラスター形成潜在性を持つＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲｈｉＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａｌｏ／−造血血管（hematovascular）中胚葉細胞である。
【００１７】
本明細書で提供されるさらなる態様は、単離された細胞の集団であり、その集団は、約４０％を超えるＣＤ１４４＋ＣＤ７３−ＣＤ２３５ａ／４３−造血内皮前駆細胞（ＨＥＰｓ）、ＣＤ１４４＋ＣＤ７３−ＣＤ２３５ａ／Ｄ４３＋ＣＤ４１ａ−血管新生造血前駆細胞、及びＣＤ１４４＋ＣＤ７３＋ＣＤ２３５ａ／４３−非造血内皮前駆細胞（非ＨＥＰｓ）を含むＣＤ１４４＋細胞を含む。
【００１８】
本明細書で提供される別の態様は、細胞の集団であり、その集団は、約３０％を超えるＣＤ４３＋ＣＤ２３５ａ＋ＣＤ４１ａ＋エリスロメガカリオサイト前駆細胞及びｌｉｎ−ＣＤ３４＋ＣＤ４３＋ＣＤ４５＋／-多能性造血前駆細胞から成るＣＤ４３＋造血前駆細胞を含む。
【００１９】
本明細書で提供されるさらなる態様は、（ａ）ヒト多能性幹細胞を提供する工程、（ｂ）有効量のコラーゲンで処理された基質上に前記細胞を播種する工程、及び（ｃ）間葉系血管芽細胞（mesenchymoangioblast）潜在性を持つＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲ＋ＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋原始中胚葉細胞の集団を形成するために、前記幹細胞を、低酸素下で約２日間、ＦＧＦ２、ＢＭＰ４、アクチビンＡ、及び塩化リチウムを含む混合物中に暴露する工程を含む間葉系血管芽細胞（mesenchymoangioblasts）の製造方法である。いくつかの実施態様において、使用されるコラーゲンは、コラーゲンＩＶを含む。
【００２０】
さらに、本明細書で提供される別の態様は、６４ｍｇ／ＬのＬ−アスコルビン酸、２−リン酸Ｍｇ２＋塩、４０μｌ／Ｌのモノチオグリセロール、８．４μｇ／Ｌの追加的な亜セレン酸ナトリウム、１０ｍｇ／Ｌのポリビニルアルコール、１×のグルタマックス（GLUTAMAX）、１×の非必須アミノ酸、０．１×の化学的に定義された脂質濃縮物、１０．６ｍｇ／Ｌのホロートランスフェリン、及び２０ｍｇ／Ｌのインスリンを含むヒト多能性幹細胞の分化のための細胞培養培地である。
【００２１】
本明細書に記載のさらなる態様は、（ａ）ヒト多能性幹細胞を提供する工程、及び（ｂ）間葉系血管芽細胞（mesenchymoangioblast）潜在性を持つＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲ＋ＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋原始中胚葉細胞の細胞集団を形成するためにヒト多能性幹細胞を、低酸素下で約２日間、ＦＧＦ２、ＢＭＰ４、アクチビンＡ、及び塩化リチウムを含む細胞培養培地中で培養する工程を含むヒト多能性幹細胞を分化するための方法である。
【００２２】
いくつかの実施態様では、ヒト多能性幹細胞は、テネイシンＣ上で培養される。いくつかの実施態様では、細胞培養培地は、ＩＦ９Ｓ細胞培養培地を含む。いくつかの実施態様では、細胞培養培地における濃度が、ＢＭＰ４は約５０ｎｇ／ｍｌから約２５０ｍｇ／ｍｌ、アクチビンＡは約１０ｎｇ／ｍｌから約１５ｎｇ／ｍｌ、ＦＧＦ２は約１０ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌ、かつ塩化リチウムは約１ｍＭから約２ｍＭである。
【００２３】
いくつかの実施態様では、方法はさらに、血液血管共通前駆細胞（ＨＢ−ＣＦＣ）潜在性を持つＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲ＋ＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋原始中胚葉、及びＯＰ９細胞上での培養時に造血内皮クラスターを形成する潜在性を有する細胞に富む造血血管（hematovascular）中胚葉細胞（ＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲｈｉＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａｌｏ／−）を含む細胞集団を得るために、工程（ｂ）で得られた細胞集団を、低酸素下で約１〜２日間、ＦＧＦ２及びＶＥＧＦを含む細胞培養培地中で培養する工程を含む。いくつかの実施態様において、細胞培養培地における濃度が、ＦＧＦ２は約１０ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌ、かつＶＥＧＦは約２０ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌである。
【００２４】
いくつかの実施態様では、方法はさらに（ｄ）ＣＤ１４４＋ＣＤ７３＋ＣＤ２３５ａ／ＣＤ４３−非造血内皮前駆細胞（非ＨＥＰ）、ＣＤ１４４＋ＣＤ７３−ＣＤ２３５ａ／ＣＤ４３−造血内皮前駆細胞（ＨＥＰｓ）、ＣＤ１４４＋ＣＤ７３−ＣＤ２３５ａ／ＣＤ４３＋４１ａ−血管新生造血前駆細胞（ＡＨＰ）、及びＣＤ４３＋ＣＤ４１ａ＋造血前駆細胞を含む細胞集団を得るために、工程（ｃ）の造血血管（hematovascular）中胚葉細胞を、低酸下で約１日間、ＦＧＦ２、ＶＥＧＦ、ＩＬ６、ＳＣＦ、ＴＰＯ、及びＩＬ３を含む細胞培養培地中で培養する工程を含む。いくつかの実施態様では、細胞培養培地における濃度が、ＦＧＦ２は約１０ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌ、ＶＥＧＦは約２０ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌ、ＳＣＦは約５０ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌ、ＴＰＯは約５０ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−６は、約５０ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌ、かつＩＬ−３は約５ｎｇ／ｍｌから約１５ｎｇ／ｍｌである。
【００２５】
いくつかの実施態様では、方法はさらに、（ｅ）ＣＤ４３＋ＣＤ２３５ａ＋ＣＤ４１ａ＋エリスロメガカリオサイト前駆細胞およびｌｉｎ−ＣＤ３４＋ＣＤ４３＋ＣＤ４５＋／−多能性造血前駆細胞を含むＣＤ４３＋造血前駆細胞の、増殖した（expanded）集団を得るために、ＨＥＰｓ及び造血前駆細胞を、常酸素下で約３日間、ＦＧＦ２、ＶＥＧＦ、ＩＬ６、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ３を含む培養培地中で培養する工程を含む。
【００２６】
いくつかの実施態様では、方法はさらに、ＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞を含む細胞集団を得るために、ＣＤ３４＋ＣＤ４３＋造血前駆細胞を、約３週間、ＤＬＬ４を過発現するＯＰ９細胞上で共培養する工程を含み、工程（ｂ）のヒト多能性幹細胞を含む細胞集団が、テネイシンＣ基質上で培養される。
【００２７】
本明細書で提供される関連する態様は、（ｉ）間葉系血管芽細胞（mesenchymoangioblast）潜在性を持つＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲ＋ＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋原始中胚葉細胞の細胞集団を形成するために、ヒト多能性幹細胞を、低酸素下において約２日間、ＦＧＦ２、ＢＭＰ４、アクチビンＡ、及び塩化リチウムを含む細胞培養培地で培養する工程、（ｉｉ）血球血管共通前駆細胞（ＨＢ−ＣＦＣ）潜在性を有するＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲ＋ＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋、及びＯＰ９細胞上で培養した場合造血内皮クラスター形成潜在性を持つ細胞に富む造血血管（hematovascular）中胚葉細胞（ＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲｈｉＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａｌｏ／−）を含む細胞集団を得るために、間葉系血管芽細胞（mesenchymoangioblast）潜在性を持つＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲ＋ＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋原始中胚葉細胞を、低酸素下において約１〜２日間、ＦＧＦ２、及びＶＧＥＦを含む細胞培養培地で培養する工程、（ｉｉｉ）ＣＤ１４４＋ＣＤ７３＋ＣＤ２３５ａ／ＣＤ４３−非造血内皮前駆細胞（非ＨＥＰ）ＣＤ１４４＋ＣＤ７３−ＣＤ２３５ａ／ＣＤ４３−造血内皮前駆細胞（ＨＥＰｓ）、ＣＤ１４４＋ＣＤ７３−ＣＤ２３５ａ／ＣＤ４３＋４１ａ−血管新生造血前駆細胞（ＡＨＰ）、及びＣＤ４３＋ＣＤ４１ａ＋造血前駆細胞形成を達成するために、培養造血血管（hematovascular）中胚葉細胞（ＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲｈｉＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａｌｏ／−）を、低酸素下において約２日間、ＦＧＦ２、ＶＥＧＦ、ＩＬ６、ＳＣＦ、ＴＰＯ、及びＩＬ−３を含む細胞培養培地で培養する工程、（ｉｖ）ＣＤ４３＋ＣＤ２３５ａ／ＣＤ４１ａ＋エリスロメガカリオサイト前駆細胞及びｌｉｎ−ＣＤ３４＋ＣＤ４３＋ＣＤ４５＋／−多能性造血前駆細胞を含むＣＤ４３＋造血前駆細胞の増殖した（expanded）集団を得るために、造血内皮前駆細胞（ＨＥＰｓ）、及びＣＤ４３＋ＣＤ４１ａ＋造血前駆細胞を、常酸素下で約３日間、ＦＧＦ２、ＶＥＧＦ、ＩＬ６、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ３を含む培養培地中で培養する工程、及び（ｖ）ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む細胞集団を得るために、ＣＤ３４＋ＣＤ４３＋造血前駆細胞を、約３週間、ＤＬＬ４を過発現するＯＰ９細胞上で共培養する工程、の少なくとも一つを含むヒト多能性幹細胞を分化する方法である。
【００２８】
本明細書で提供される別の態様は、基本培地、Ｌ−アスコルビン酸２−リン酸エステルのＭｇ２＋塩、モノチオグリセロール、亜セレン酸ナトリウム、ポリビニルアルコール、グルタマックスＴＭ、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、定義された脂質濃縮物、ホロートランスフェリン、及びインスリンを含むヒト多能性幹細胞の造血内皮分化に適した細胞培養培地である。
【００２９】
いくつかの実施態様では、細胞培養培地はさらにＢＭＰ４、アクチビンＡ、ＦＧＦ２、及び塩化リチウムを含む。
【００３０】
他の実施態様では、培養培地はさらにＦＧＦ２及びＶＥＧＦを含む。
【００３１】
他の実施態様では、培養培地はさらにＦＧＦ２、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−６、及びＩＬ−３を含む。
【００３２】
いくつかの実施態様では、細胞培養培地は、ＩＦ９Ｓ培地を含む。いくつかの実施態様では、ＩＦ９Ｓ細胞培養培地は、表２のＩＦ９Ｓ細胞培養培地処方を含む。
【００３３】
本明細書で提供される関連する態様は、ＩＭＤＭ／Ｆ１２基本培地中の９Ｓ濃縮培地添加物の希釈物が、ＩＦ９Ｓ細胞培養培地を生成する９Ｓ濃縮培地添加物である。一実施態様では、９Ｓを含むキットは、９Ｓ濃縮培養添加物に加えて、ＢＭＰ４、アクチビンＡ、ＦＧＦ２、塩化リチウム、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−６、ＩＬ−３、及びテネイシンＣのうちの一つ以上を含む。
【００３４】
本明細書で提供されるさらなる実施態様は、ヒト多能性幹細胞の付着、成長または造血内皮系統に沿った分化した子孫のための、ＩＦ９Ｓ細胞培養培地とテネイシンＣの基質を含む、ヒト多能性幹細胞の造血内皮分化に対する定義された細胞培養系である。いくつかの実施態様において、ＩＦ９Ｓ細胞培養培地は、低酸素条件下で維持される。いくつかの実施態様において、定義された細胞培養系は、テネイシンＣ基質上に成長させたヒト多能性幹細胞を含む。
【００３５】
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各々の刊行物、特許、及び特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれるであろうことが示されたかの様に、同程度に参照により組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】造血発達経路、発達の各段階を識別するために使用される特定のマーカー及び機能アッセイ、及び化学的に定義された培地中でｈＰＳＣの分化のために使用される条件の概略図を示す。ＯＰ９フィーダーと、現在の化学的に定義された培養との共培養を用いて、分化前の研究で観察された主な細胞のサブセットが表示される。
【図２】過成長ＯＰ９ストローマ細胞のユニークな分子署名の識別  （ａ）過成長のＯＰ９の８日目と、新たに融合したＯＰ９の４日目に示差的に発現した遺伝子の間の重複を示すベン図であり、背景がグレーになっているＭＳ５とＳ１７．２１遺伝子は他の試験細胞株と比較して８日目のＯＰ９で特異的に過発現している。（ｂ）（ａ）で示される分化特異的発現重複遺伝子のヒートマップ。テネイシンＣ（Ｔｎｃ）は、オーバーコンフルエントなＯＰ９細胞内での特異的過剰発現遺伝子の一つである。
【図３】化学的に定義された条件下での２日目、３日目、及び４日目のコラーゲンＩＶ対テネイシンＣ上で分化したｈＥＳＣ培養物中の中胚葉の発生  （ａ）２日目と３日目のＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲ＋ＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋（Ａ＋Ｐ＋）原始中胚葉集団の割合を比較したフローサイトメトリープロット及びグラフ。（ｂ）４日目にＫＤＲｈｉＣＤ３１−（ＨＶＭＰ）、ＣＤ３１＋、及びＫＤＲｌｏＣＤ３１−集団の割合を比較したフローサイトメトリープロットとグラフ。（ｃ）２、３、４日目の培養物のＭＢ／ＨＢ−コロニー形成潜在性の比較。（ｄ）ＯＰ９との７日間の共培養後、化学的に定義された条件で分化した４日目の細胞から単離したＫＤＲｈｉＣＤ３１−及びＫＤＲｌｏＣＤ３１−細胞の造血及び内皮への潜在性。上のパネルは、ＴＲＡ−１−８５＋ゲート化ヒト細胞のフローサイトメトリーを示し、下のパネルはＫＤＲｈｉＣＤ３１−及びＫＤＲｌｏＣＤ３１−細胞とＯＰ９との共培養からの細胞の免疫蛍光染色を示す。（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のバー（bars）は、３回の実験（＊ｐ＜０．０１）の平均＋ＳＥである。
【図４】化学的に定義された条件で５日間コラーゲンＩＶまたはテネイシンＣで分化した培養中の内皮前駆細胞の発生  （ａ）フローサイトメトリー分析は、コラーゲンＩＶとテネイシンＣに化学的に定義された条件での５日間のｈＥＳＣ培養後に生成されたＶＥカドヘリン＋（ＶＥＣ；ＣＤ１４４＋）前駆細胞の主要なサブセットを示している。（ｂ）コラーゲンＩＶとテネイシンＣ培養で生成されたＶＥＣ＋（ＣＤ１４４＋）細胞及びサブセットのパーセンテージ。エラーバーは、３回の実験からの平均＋ＳＥである（＊ｐ＜０．０１）。（ｃ）ＦＧＦ２及び造血サイトカインと無血清クローン原性培地中での孤立ＶＥＣ＋（ＣＤ１４４＋）サブセットのＣＦＣ潜在性。（ｄ）５日目のＶＥＣ＋（ＣＤ１４４＋）サブセットの内皮及び造血潜在性。チューブ形成アッセイに続く内皮性条件または免疫蛍光によるＯＰ９でソート及び培養された前駆細胞サブセット、及び７日後のフローサイトメトリーの結果。スケールバー、１００μｍ。
【図５】化学的に定義された条件で８日間コラーゲンＩＶで分化した培養中の造血前駆細胞の発生  （ａ）フローサイトメトリー分析は、コラーゲンＩＶとテネイシンＣの培養で生成されたＣＤ４３＋細胞の主要なサブセットを示している。（ｂ）テネイシンＣの培養は３回の実験（＊ｐ＜０．０１）を越えはるかに多くのＣＤ４３＋細胞を産生している。（ｃ）血清含有培地中の造血コロニー形成細胞（ＣＦＣ）潜在性は、ＣＤ４３＋亜集団に限定される。（ｄ）テネイシンＣの分化培養は、コラーゲンＩＶの分化培養より、３回の実験（＊ｐ＜０．０１）全体で統計学的に有意であり、高いＣＦＣ潜在性を有する。
【図６】コラーゲンＩＶとテネイシンＣにより化学的に定義された条件下で９日間分化させたＨ１ｈＥＳＣｓから採取したＣＤ４３＋細胞のＴ細胞潜在性  （ａ）ＯＰ９ＤＬＬ４で３週間培養後にコラーゲンＩＶとテネイシンＣのコンディションから採取した細胞のフローサイトメトリー分析。（ｂ）ゲノムＰＣＲによるＴ細胞受容体転位の分析。Ｈ１Ｔ細胞は、Ｈ１分化由来のＴ細胞である。ＰＢコントロールは、末梢血陽性コントロールである。Ｈ１ｈＥＳＣｓは、未分化のＨ１ｈＥＳＣｓである。
【図７】化学的に定義された条件で、Ｈ１ｈＥＳＣｓから造血発生に及ぼす影響ＴＧＦβ阻害剤の影響  ２日目から４日目のみＴＧＦβ阻害剤ＳＢ−４３１５４２を添加した後、３、４、５、８日目のフローサイトメトリーから収集した代表的な点を表示する。３日目に、ＳＢ−４３１５４２はＰＤＧＦＲａｌｐｈａ発現を減少させるが、４日目と５日目まで内皮前駆細胞を増加させる。８日目までには、ＣＤ４３＋造血前駆細胞の有意な増加がある。
【図８】異なる基礎培地及びマトリックスタンパク質を用いた、培養物中のＫＤＲｈｉＣＤ３１＋造血内皮前駆細胞の生成  ＴｅＳＲ１基本培地は、サイトカインを含まないＴｅＳＲ１である。ＤＦ４Ｓは４つの添加物、６４ｍｇ／Ｌ、Ｌ−アスコルビン酸２−リン酸Ｍｇ２＋塩、８．４μｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウム、１０．６ｍｇ／Ｌでホロートランスフェリン、及び２０ｍｇ／Ｌのインスリンを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２ベースの培地である。Ｉ４ＳはＤＭＥＭ／Ｆ１２基本培地の代わりにＩＭＤＭベース培地を含むＤＦ４Ｓであるが、前述した４つの添加物は含まない。ＶＴＮは、ビトロネクチンマトリックスであり、ＭＴＧはマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標））基質であり、コラーゲンＩＶはＩＶ型コラーゲンマトリックスである。フローサイトメトリープロットは低酸素下で５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２、ＢＭＰ４及びＶＥＧＦを添加した各培地における、分化４日目の細胞のＫＤＲｈｉＣＤ３１＋内皮前駆細胞の割合を示す。
【図９】化学的に定義された条件でのｉＰＳＣｓ及びＨ９ｈＥＳＣの造血分化  上のパネルは、細胞をテネイシンＣまたはコラーゲンＩＶいずれかの上に播種した際、１日目から始めた培養において、分化の９日目までに生成した細胞の数を示す。ＣＤ３１＋及びＣＤ４３＋細胞の数は、フローサイトメトリーによる陽性細胞の割合の合計数に基づいて計算した。下のパネルは、コラーゲンＩＶかテネイシンＣのいずれかで８日間分化させた、ＣＤ４３＋細胞の割合と、１９−９−７Ｔヒト線維芽細胞ｉＰＳ細胞株、ＢＭ１９−９ヒト骨髄由来のｉＰＳ細胞株、及びＨ９人間ＥＳ細胞株のＣＤ４３＋細胞のサブセットの点のプロットを描いたものである。
【図１０】コラーゲンＩＶ対テネイシンＣでの分化効率を比較した造血分化のタイムラインの図である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）技術は、インビトロでヒトの発達を研究し、ＨＬＡ適合ドナーに依存することなく、患者特有の血液細胞を開発する機会を提供する。これまで、マウス間質細胞株ＯＰ９の共培養法を用いた造血幹／前駆細胞の分化のための効率的なプロトコルが開発された（Vodyanik et al., 2005; Vodyanik et al., 2006）。この系は、造血の一時的で決定的な波（waves）を再現し、Ｔ及びＢ細胞を含むＨＳＣの表現型とリンパ系細胞と共にｌｉｎ−ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ９０＋ＣＤ１１７＋ＣＤ４３＋ＣＤ４５−／＋多能決定的な造血前駆細胞を得るために使用することができる（Carpenter et al., 2011; Kutlesa et al., 2009; Schmitt and Zuniga-Pflucker 2002; Vodyanik et al., 2005）。
【００３８】
ＯＰ９細胞を用いたヒト多能性幹細胞の共培養は、中内胚葉及び造血内皮分化を誘導する。ＯＰ９細胞上にｈＰＳＣｓを播種する際に、ｈＰＳＣｓは、中胚葉マーカーアペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）、及びＰＤＧＦＲａｌｐｈａを発現し、間葉系血管芽細胞（mesenchymoangioblast、ＭＢ）及び血球血管共通前駆細胞（hemangioblast、ＨＢ）潜在性（２−３日の分化）を獲得し始める。高度な成熟により、ＫＤＲ＋ＡＰＬＮＲ＋中胚葉細胞は、ＫＤＲの発現を上方制御し、ＯＰ９細胞上で培養したときに造血内皮クラスターを形成する潜在性を持つ細胞に富むＰＤＧＦＲaを下方制御する。
【００３９】
２〜３．５日目の分化で、ＫＤＲ＋ＡＰＬＮＲ＋細胞は、典型的な内皮（ＣＤ３１、ＶＥカドヘリン（ＣＤ１４４））、間葉系／内皮（ＣＤ７３、ＣＤ１０５）、及び造血（ＣＤ４３及びＣＤ４５）マーカー、すなわちＥＭＨｌｉｎ−表現型を有するマーカーを欠いている。ＥＭＨｌｉｎ−細胞は、内皮（ＣＤ３１及びＣＤ１４４）、間葉系／内皮（ＣＤ７３、ＣＤ１０５）、及び造血（ＣＤ４３及びＣＤ４５）のマーカーを欠いている一方、ｌｉｎ−細胞は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、及びＣＤ２０を含む分化した造血細胞のマーカーを欠いている。４日目では、ＶＥカドヘリン細胞＋（ＣＤ１４４）が出現した。出現するＶＥカドヘリン＋細胞は不均一な集団を表し、そしてそれは、ＣＤ１４４＋ＣＤ２３５ａ／４３−ＣＤ７３＋非造血内皮前駆細胞（非ＨＥＰｓ）、ＣＤ１４４＋ＣＤ７３−ＣＤ２３５ａ／４３−造血内皮前駆細胞（ＨＥＰｓ）及びＣＤ１４４＋７３−ＣＤ４３＋ＣＤ２３５ａ＋ＣＤ４１ａ−血管新生造血前駆細胞を含む。ＨＥＰｓは多能ｌｉｎ−ＣＤ３４＋ＣＤ４３＋ＣＤ４５＋／−造血前駆細胞を生じさせる潜在性を持つ。
【００４０】
残念なことに、ＯＰ９系は、特定の成長因子に対するｈＰＳＣ応答を研究するため、そして、臨床グレードの治療用血液細胞を製造するためにその有用性を制限するマウスフィーダー細胞や血清に依存している。また、ＯＰ９共培養系は、分化に用いられる血清の質、間質細胞の維持、及びＰＳＣコロニーサイズの変化に非常に敏感である。
【００４１】
他の研究者が無フィーダー分化プロトコルを開発しているが、これらのプロトコルは、造血分化のために胚様体（ＥＢｓ）を形成することに依存している。ＥＢ法は、しばしば、血清に依存し、また、非同期の分化及び高い変動性などの著しい難点を有している。最近、無血清条件下で造血を誘導するためにいくつかのプロトコルが開発されている（Salvagiotto et al., 2011; Wang et al., 2012）が、依然として、異種成分、血清アルブミン、及び／又は独自の添加剤を必要とする。また、ＯＰ９上で見られるように、これらのプロトコルが、造血の明確な波（waves）を再現するかどうかは、未だ明らかになっていない。
【００４２】
また、ほとんどのプロトコルは、ＭＥＦまたはマトリゲル（Ｒ）上で増殖させたｈＰＳＣｓを区別している。ｈＰＳＣ−誘導及び維持のための新しい、完全に化学的に定義された異種フリー培地とマトリックスが記載されているので（Chen et al., 2011）、類似の化学的に定義された異種フリーに向けたｈＰＳＣｓから造血前駆細胞を誘導するための分化プロトコルを開発する必要がある。
【００４３】
本明細書中で特に定義されない限り、本明細書で使用する技術的及び科学的用語は、本発明が属する当業者によって、及び公開されたテキストを参照することによって理解されるのと同じ意味を有する。
【００４４】
用語「ａ」または「ａｎ」は、一つ以上の、例えば、「ａ ｍｏｌｅｃｕｌｅ」は、一つ以上の分子を表すと理解されることに留意されたい。例えば、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「一つ以上（one or more）」、及び「少なくとも（at least）」は、本明細書において互換的に使用される。本明細書において用語「約（about）」は、所定の数値の大きさのプラスマイナス１０％の範囲を企図する。例えば、「約３グラム」は、２．７〜３．３グラムの値を示す等である。
【００４５】
本明細書で言及される場合、用語「定義された条件（defined conditions）」または「定義された培地（defined medium）」は、各成分の同一性及び量が知られていることを意味する。本明細書で用いられる用語「成分（ingredient）」は、分子の同一性及び量が知られている構成要素を意味する。
【００４６】
本明細書では、完全に定義された異物フリーの系で、初期中胚葉、造血血管中胚葉前駆細胞、及び造血内皮の段階を経てＯＰ９共培養系で観察された造血分化を繰り返す、効率的かつ再現可能な方法及び支持組成物を開示する。
【００４７】
表１は、本明細書において使用される細胞のタイプ、関連する細胞マーカー表現型、及び対応する略語のリストである。
【００４８】
【表１】
0006677631.tif 000002
ヒト多能性幹細胞の造血分化の方法（ｈＰＳＣｓ）
【００４９】
本明細書は、定義された条件の下で、好ましくは、胚様体形成の非存在下で、ヒト多能性幹細胞（ヒト胚性のいずれかまたはヒト誘導多能性幹細胞）の分化のための方法を開示する。この分化の、少なくとも１つの所望される結果は、臨床治療のための源と同様に、これらの系統の機能的な研究の源となりうる内皮細胞及び造血細胞集団を提供することである。
【００５０】
いくつかの実施態様において、本明細書で提供される分化の方法は、（ａ）ヒト多能性幹細胞（例えば、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）またはヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣｓ））を提供する工程、及び（ｂ）幹細胞を、間葉系血管芽細胞（mesenchymoangioblast）可能性を有するＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲ＋ＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋原始中胚葉細胞の集団を形成するために、約２日間の期間低酸素条件下で、ＦＧＦ２、ＢＭＰ４、アクチビンＡ、及び塩化リチウムを構成要素として含む混合物に暴露する工程を含む。好ましくは、ヒト多能性幹細胞は、胚様体を形成することなく培養される。
【００５１】
いくつかの実施態様では、ヒト多能性幹細胞は、約５０００細胞／ｃｍ２から約１５，０００細胞／ｃｍ２の初期密度で、例えば６０００細胞／ｃｍ２、７０００細胞／ｃｍ２、８０００細胞／ｃｍ２、９０００細胞／ｃｍ２または約５０００個／ｃｍ２から約１５，０００細胞／ｃｍ２で別の播種密度で播種される。いくつかの実施態様では、分化方法は、さらに（ｃ）細胞を、工程（ｂ）の原始中胚葉段階において、血球血管共通前駆細胞（ＨＢ−ＣＦＣ）可能性とＯＰ９細胞上で培養する際に造血内皮クラスターを形成する可能性を有する細胞に富む造血血管（hematovascular）中胚葉細胞（ＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲｈｉＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａｌｏ／−）と共にＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲ＋ＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋原始中胚葉を含む集団を得るために、約１〜２日間の期間低酸素条件下で、ＦＧＦ２、及びＶＥＧＦを構成要素として含む混合物に暴露する工程を含む。さらなる実施態様では、分化方法は、さらに、（ｄ）工程（ｃ）の造血血管（hematovascular）中胚葉段階で、ＣＤ１４４＋ＣＤ７３＋ＣＤ２３５ａ／ＣＤ４３−非造血内皮前駆細胞（非ＨＥＰ）、ＣＤ１４４＋ＣＤ７３−ＣＤ２３５ａ／ＣＤ４３−造血内皮前駆細胞（ＨＥＰｓ）、ＣＤ１４４＋ＣＤ７３−ＣＤ２３５ａ／ＣＤ４３＋４１ａ−血管新生造血前駆細胞（ＡＨＰ）、及びＣＤ４３＋ＣＤ４１ａ＋造血前駆細胞の形成を達成するために、前記細胞を、構成要素ＦＧＦ２、ＶＥＧＦ、ＩＬ６、ＳＣＦ、ＴＰＯ、及びＩＬ３を含む混合物に、約１日間暴露する工程を含む。
【００５２】
いくつかの実施態様では、分化方法は、さらに（ｅ）造血拡大（hematopoietic expansion）の結果としてＣＤ４３＋ＣＤ２３５ａ＋ＣＤ４１ａ＋エリスロメガカリオサイト前駆細胞及びｌｉｎ−ＣＤ３４＋ＣＤ４３＋ＣＤ４５＋／−多能性造血前駆細胞から構成されるＣＤ４３＋造血前駆細胞の集団を得るために、構成要素ＦＧＦ２、ＶＥＧＦ、ＩＬ６、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−３を含む混合物に常酸素下で約３日間、ＨＥＰｓを曝露し続け、造血前駆細胞を出現させる工程を含む。
【００５３】
いくつかの実施態様では、本明細書に開示された分化方法は、少なくとも（ｉ）間葉系血管芽細胞（mesenchymoangioblast）潜在性を持つＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲ＋ＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋原始中胚葉細胞の細胞集団を形成するために、ヒト多能性幹細胞を、低酸素下において約２日間、ＦＧＦ２、ＢＭＰ４、アクチビンＡ、及び塩化リチウムを含む細胞培養培地で、胚様体を形成することなく培養する工程、（ｉｉ）血球血管共通前駆細胞（ＨＢ−ＣＦＣ）潜在性を有するＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲ＋ＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋、及びＯＰ９細胞上で培養した場合造血内皮クラスター形成潜在性を持つ細胞に富む造血血管（hematovascular）中胚葉細胞（ＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲｈｉＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａｌｏ／−）を含む細胞集団を得るために、間葉系血管芽細胞（mesenchymoangioblast）潜在性を持つＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲ＋ＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋原始中胚葉細胞を、低酸素下において約１〜２日間、ＦＧＦ２、及びＶＧＥＦを含む細胞培養培地で培養する工程、（ｉｉｉ）ＣＤ１４４＋ＣＤ７３＋ＣＤ２３５ａ／ＣＤ４３−非造血内皮前駆細胞（非ＨＥＰ）ＣＤ１４４＋ＣＤ７３−ＣＤ２３５ａ／ＣＤ４３−造血内皮前駆細胞（ＨＥＰｓ）、ＣＤ１４４＋ＣＤ７３−ＣＤ２３５ａ／ＣＤ４３＋４１ａ−血管新生造血前駆細胞（ＡＨＰ）、及びＣＤ４３＋ＣＤ４１ａ＋造血前駆細胞形成を達成するために、培養造血血管（hematovascular）中胚葉細胞（ＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲｈｉＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａｌｏ／−）を、低酸素下において約２日間、ＦＧＦ２、ＶＥＧＦ、ＩＬ６、ＳＣＦ、ＴＰＯ、及びＩＬ−３を含む細胞培養培地で培養する工程、及び（ｉｖ）ＣＤ４３＋ＣＤ２３５ａ／ＣＤ４１ａ＋エリスロメガカリオサイト前駆細胞及びｌｉｎ−ＣＤ３４＋ＣＤ４３＋ＣＤ４５＋／−多能性造血前駆細胞を含むＣＤ４３＋造血前駆細胞の増殖した（expanded）集団を得るために、造血内皮前駆細胞（ＨＥＰｓ）、及びＣＤ４３＋ＣＤ４１ａ＋造血前駆細胞を、常酸素下で約３日間、ＦＧＦ２、ＶＥＧＦ、ＩＬ６、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ３を含む培養培地中で培養する工程のうちの一工程を含む。
【００５４】
いくつかの実施態様では、低酸素条件は、約３％から約１０％酸素環境（例えば、細胞培養インキュベーターガス混合物）のレベルを指す。いくつかの実施態様では、低酸素条件は、約５％である。細胞培養培地は、低酸素下で平衡化させた実施態様では、細胞培養培地は、常酸素下で平衡化した細胞培養培地と比較して、溶存酸素レベルの低い低酸素細胞培養培地になる（例えば、ガス混合物は、約２０％の酸素を含む）。
【００５５】
上記の分化方法のいずれかで使用される培養培地は、本明細書に記載されるようなＩＦ９Ｓ培地を含む。一実施態様では、使用されるＩＦ９Ｓ培地は、表２に示す配合を有するＩＦ９Ｓ培地である。
【００５６】
いくつかの実施態様では、上記で参照した細胞（例えば、ヒト多能性幹細胞）のいずれかは、テネイシンＣの上で培養される。いくつかの実施態様では、上記で参照した細胞のいずれかが、１０，０００細胞／ｃｍ２を接着するのに十分な量のテネイシンＣで処理された基質上に播種される。いくつかの実施態様では、使用するテネイシンＣは、ヒトテネイシンＣである。いくつかの実施態様では、基質は、少なくとも約０．２５μｇ／ｃｍ２から１μｇ／ｃｍ２、例えば、０．４μｇ／ｃｍ２、０．５μｇ／ｃｍ２、０．７μｇ／ｃｍ２、０．８μｇ／ｃｍ２、または少なくとも約０．２５μｇ／ｃｍ２から１μｇ／ｃｍ２の間の別の濃度のテネイシンＣで処理される。
【００５７】
いくつかの実施態様において、上記の分化方法において使用される細胞培養培地における濃度は、ＢＭＰ４は約５０ｎｇ／ｍｌから約２５０ｍｇ／ｍｌ、アクチビンＡは約１０ｎｇ／ｍｌから約１５ｎｇ／ｍｌ、ＦＧＦ２は約１０ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌ、塩化リチウムは約１ｍＭから約２ｍＭ、ＶＥＧＦは約２０ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌ、ＳＣＦは約５０ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌ、ＴＰＯは約５０ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−６は約５０ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌ、及びＩＬ−３は約５ｎｇ／ｍｌから約１５ｎｇ／ｍｌである。
【００５８】
いくつかの実施態様では、上記で参照した細胞のいずれかは異種非含有細胞培養培地で培養される。臨床治療のために最も重要なのは、誘導される細胞集団に異種材料が存在しない、すなわち、非ヒト細胞、細胞断片、血清タンパク質などが無い、ことである。好ましくは、本発明は、以前の分化系で使用されるＯＰ９細胞との接触と実質的に置き換えるプラットフォームとして、テネイシンＣまたはコラーゲンＩＶの使用による異種非含有分化細胞に到達する。また、本明細書で開示される培地は化学的に定義され、いくつかの実施態様では、異種非含有で、そして、組換え技術を用いて製造されるか、動物由来タンパク質の代わりに胎盤または他のヒト組織に由来するヒトタンパク質を組み込んでいる。いくつかの実施態様では、培地に添加されるすべてのタンパク質は、組換えタンパク質である。
【００５９】
分化プロセスは、規則性のある連続するイベントを含むが、イベントのタイミングは少なくとも２０％まで変化させることができる。例えば、特定の工程が一日続くように、一の実施態様に開示されてもよいが、そのイベントは、一日を超えて、または一日より短く続いても良い。例えば、「一日」は、約１８時間〜約３０時間の期間を含んでもよい。複数日の期間を示している期間は、複数の「一日」であってもよい、例えば２日間は、約３６時間から約６０時間の期間に及ぶことができる。別の実施態様では、時間変化は、小さくすることができる、例えば２日目は、０日目から４８時間プラスマイナス３時間であり、４日目は、０日目から９６時間プラスマイナス３時間であり、そして５日目は、０日目から１２０時間プラスマイナス３時間とすることができる。
【００６０】
本発明で得られうる潜在的に約束された及び／又は分化した系統の例として、ＨＢとＭＢコロニー形成細胞潜在性をもつＫＤＲ＋ＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋原始中胚葉細胞、ＯＰ９細胞上で培養する際に造血内皮クラスターを形成する可能性を有するＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲｈｉＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａｌｏ／−造血血管（hematovascular）中胚葉細胞、ＨＥＰｓ（ＣＤ１４４＋ＣＤ７３−ＣＤ２３５ａ／４３−）、非ＨＥＰＳ（ＣＤ１４４＋ＣＤ７３＋ＣＤ２３５ａ／４３−）、及びＡＨＰｓ（ＣＤ１４４＋ＣＤ７３−ＣＤ２３５ａ／４３＋４１ａ−）のようなＶＥカドヘリン＋（ＣＤ１４４＋）サブセット細胞、ＣＤ４３＋ＣＤ２３５ａ＋４１ａ＋エリスロメガカリオサイト造血前駆細胞のようなＣＤ４３＋造血前駆細胞、及びｌｉｎ−ＣＤ３４＋ＣＤ４３＋ＣＤ４５＋／−多能造血前駆細胞を挙げることができる。本明細書で使用される用語「系統（lineage-）」（ｌｉｎ−）は、いずれかに分化する能力を保持しているため、未だその誘導血液細胞系統のいずれにも約束されていない血前駆細胞または前駆細胞を指す。この特性は、誘導系統のいずれかへの分化を示す細胞表面マーカーの不在を探すことにより監視される。本開示の更なる重要な利点は、テネイシンＣプラットフォームにより、クローン細胞集団を、使用する機能である、そしてそれは、分化した集団を生成するために、胚様体のような細胞塊に共通する未定義の確率的事象に基づく信頼を剥奪する。またクローン細胞集団は、分化プロセス中に大きな均一性を示す、そしてそれは、フィーダー細胞系でこれまでに見られたものより高い同調細胞の収率を提供する。したがって、本開示はまた、これまで可能だったものよりも、より効率的で優れた測定可能な分化系を記載する。
組成物
定義された細胞培養培地と濃縮培地添加物
【００６１】
本明細書におけるいくつかの実施態様は、基本培地、Ｌ−アスコルビン酸２−リン酸エステルのＭｇ２＋塩、モノチオグリセロール、亜セレン酸ナトリウム（基本培地の任意の存在に加えて）、ポリビニルアルコール、グルタマックスＴＭ、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）が開示されている化学的に定義された脂質濃縮物、ホロートランスフェリン、及びインスリンを含有する分化培地に関する。分化培地に適した基本培地は、特に限定されないが、イスコフ改変ダルベッコ培地／Ｆ１２（ＩＭＤＭ／Ｆ１２）、ＴｅＳＲ１基本培地、すなわちＴｅＳＲ１ＴＭ基本培地（Stem Cell Technologie社製、Ludwig and Thomson (2007), Curr Protoc Stem Cell Biol., Chapter 1:Unit 1C.2 and U.S. Patent No. 7,449,334を参照）でありＦＧＦ２及びＴＧＦ−βを含まない、ＤＦ４Ｓ基本培地、すなわちＥｓｓｅｎｔｉａｌ８ＴＭ培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、「Ｅ８培地」としても知られる、Chen and Thomson (2011), Nat Methods, 8(5):424-429,(2007) 参照）でありＦＧＦ２及びＴＧＦ−βを含まない、ＤＦ４Ｓ基本培地、すなわちＤＦ４Ｓベースであり、ＤＭＥＭ／Ｆ１２の代わりにＩＭＤＭ／Ｆ１２を含む、を挙げることができ、ＩＦ４Ｓベースは、ＤＭＥＭ／Ｆ１２の代わりにＩＭＤＭ／Ｆ１２を含むＤＦ４Ｓベースである。好ましくは、使用される基本培地は、アルブミンを含まない。ＩＭＤＭ／Ｆ１２は、栄養混合物を添加した高密度の細胞培養物を迅速に増殖に適する高度に強化された合成培地である。
【００６２】
いくつかの実施態様において、本明細書で使用される分化培地は、「ＩＦ９Ｓ」培地として一般的に言及され、ＩＭＤＭ／Ｆ１２、Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸エステルのＭｇ２＋塩、モノチオグリセロール、亜セレン酸ナトリウム（基本培地のいずれかの存在に加えて）、ポリビニルアルコール、グルタマックスＴＭ、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、化学的に定義された脂質濃縮物（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製；カタログ番号１９０５０３１）、ホロートランスフェリン、及びインスリンを含む。
【００６３】
一実施態様では、ＩＦ９Ｓ培地は、ＩＭＤＭ／Ｆ１２（１×）、Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸エステルのＭｇ２＋塩（６４ｍｇ／Ｌ）、モノチオグリセロール（５０ｍｇ／Ｌ）、亜セレン酸ナトリウム（基本培地のいずれかの存在に加えて、８．４ｕｇ／Ｌ）、ポリビニルアルコール（１０ｍｇ／Ｌ）、グルタマックスＴＭ（１×）、ＮＥＡＡ（１×）、化学的に定義された脂質濃縮物（０．１×）、ホロートランスフェリン（１０．６ｍｇ／Ｌ）、及びインスリン（２０ｍｇ／Ｌ）を含む。
【００６４】
本明細書において、ｈＰＳＣｓの造血内皮分化の種々の時点／段階で、使用される完全な分化培地は、サイトカイン、成長因子、及び／または小分子の様々な組合せを含んでいる。本明細書に記載の方法に従って造血内皮分化の段階に応じて、適切な完全な分化培地は、本明細書に記載の完全な分化培地のために記載した範囲内の濃度のサイトカインの異なる組合せを用いて補足する。
【００６５】
いくつかの実施態様では、完全な分化培地は、ＩＦ９Ｓ培地、ＢＭＰ４、アクチビンＡ、ＦＧＦ２、及び塩化リチウムを含む。他の実施態様では、完全な分化培地は、ＩＦ９Ｓ培地、ＦＧＦ２、及びＶＥＧＦを含む。さらなる実施態様では、完全な分化培地はＩＦ９Ｓ培地、ＦＧＦ２、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−６、及びＩＬ−３を含む。いくつかの実施態様では、最終的に完全な培地の濃度は、ＢＭＰ４は約５０ｎｇ／ｍｌから約２５０ｍｇ／ｍｌ、アクチビンＡは約１０ｎｇ／ｍｌから約１５ｎｇ／ｍｌ、ＦＧＦ２は約１０ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌ、塩化リチウムは約１ｍＭから約２ｍＭ、ＶＥＧＦは約２０ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌ、ＳＣＦは約５０ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌ、ＴＰＯは約５０ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−６は約５０ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌ、そしてＩＬ−３は約５ｎｇ／ｍｌから約１５ｎｇ／ｍｌである。いくつかの実施態様では、完全な分化培地中で使用される全てのタンパク質は、組換えヒトタンパク質である。他の実施態様では、完全な分化培地は、１つ以上の非ヒトタンパク質（例えば、組換え非ヒトタンパク質）を含む。
【００６６】
いくつかの実施態様では、完全な分化培地はＩＦ９Ｓ培地、及び所定の濃度で表３に記載される「サイトカイン」の組合せの一つを含む。いくつかの実施態様では、前述の完全な分化培地で使用されるＩＦ９Ｓ培地処方は、表２に記載されるＩＦ９Ｓ培地処方である。
【００６７】
本明細書で開示される培地は、本明細書に開示される特定のモルフォゲン、小分子、及び造血サイトカインを含むので、同一、等価、または類似の特性を有する追加の成分は、従来技術として周知である成分に加えて、またはそれらの代わりに使用され得ることが企図される。
【００６８】
いくつかの実施態様において、本明細書に開示された培地は、異種（すなわち、非ヒトの生物学的に誘導された）材料を含むことができる。例えば、異種材料が異種起源の組換えタンパク質であってもよい。本明細書に開示された培地は、使用前に２倍、１０倍、１００倍、または１０００倍濃度に希釈される濃縮形態で製造することができる。
【００６９】
また、本発明の培地中の特定の異種材料の交換は、単に異種非含有な培養条件を提供するよりも大きい、予想外の利点を提供した。例えば、ポリビニルアルコールとウシ血清アルブミンの交換が予想外に細胞の生存に寄与する「より厚い」培地につながっていると考えられる。
【００７０】
【表２】
0006677631.tif 000003
【００７１】
【表３】
0006677631.tif 000004
濃縮培地添加物
【００７２】
本明細書において記載される濃縮「９Ｓ」培地添加物は、Ｌアスコルビン酸２−リン酸Ｍｇ２＋塩、モノチオグリセロール、追加の亜セレン酸ナトリウム、ポリビニルアルコール、グルタマックスＴＭ（またはグルタミン）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、化学的に定義された脂質、ホロートランスフェリン、及びインスリンを含む。いくつかの実施態様では、濃縮された９Ｓ培地添加物は、各成分を、一旦基本培地中に希釈した最終使用濃度の１０倍から１０００倍の濃度で含む。いくつかの実施態様では、濃縮された添加物中の９Ｓ成分の全ての濃度は、表３に記載された濃度の１０倍から１０００倍である。
キット
【００７３】
また本明細書において、ｈＰＳＣｓの造血内皮分化に有用なキットが企図される。いくつかの実施態様では、キットは、９Ｓ濃縮培地添加物、本明細書に記載されるように、ＢＭＰ４、アクチビンＡ、ＦＧＦ２と塩化リチウム、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−６、及びＩＬ−３から選ばれる一以上、及びＩＦ９Ｓ培地を製造する及び本明細書に記載されるｈＰＳＣｓの造血内皮分化のための方法の取扱説明書を含む。いくつかの実施態様では、キットはさらに、ＩＭＤＭ／Ｆ１２培地を含む。いくつかの実施態様では、キットは、９Ｓ濃縮培地添加物、アクチビンＡ、ＦＧＦ２、塩化リチウム、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−６、ＩＬ−３、及びＩＦ９Ｓ培地を製造する及び本明細書に記載されるｈＰＳＣｓの造血内皮分化のための方法の取扱説明書を含む。さらなる実施態様において、上記キットのいずれも、本明細書に記載される分化方法による接着成長用基質として使用されるテネイシンＣ（例えば、ヒトテネイシンＣ）を含む。
ｈＰＳＣｓの造血内皮分化のために定義された細胞培養系
【００７４】
本明細書はまた、ｈＰＳＣｓの造血内皮分化に定義された細胞培養系に関する。このような細胞培養系は、本明細書に記載された、ＩＦ９Ｓ培地、ｈＰＳＣｓの付着成長または造血内皮系統に沿った分化した子孫のためのテネイシンＣタンパク質基質を含む。いくつかの実施態様では、テネイシンＣは、適切な接着基質を生成するために、少なくとも０．２５μｇ／ｃｍ２〜約１μｇ／ｃｍ２が使用される。
【００７５】
いくつかの実施態様では、細胞培養系は、ＢＭＰ４、アクチビンＡ、ＦＧＦ２、及び塩化リチウム添加したＩＦ９Ｓ培地を含む。いくつかの実施態様では、ＩＦ９Ｓ培地には、ＦＧＦ２及びＶＥＧＦが添加される。いくつかの実施態様では、細胞培養系において利用されるＩＦ９Ｓ培地は、ＦＧＦ２、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−６、及びＩＬ−３が添加される。いくつかの実施態様では、細胞培養系で使用されるＩＦ９Ｓ培地は、表２に記載の培地によって配合される。いくつかの実施態様では、定義された細胞培養系は、酸素レベルを標準化する細胞培養インキュベーターの使用、及び約３％Ｏ２〜約１０％Ｏ２（例えば、５％Ｏ２）に設定された細胞培養インキュベーター中で細胞培養培地を平衡化することによって容易に達成される低酸素状態の細胞培養培地を含む。
【００７６】
さらなる実施態様では、定義された細胞培養系は、本明細書に記載の方法に従ってＩＦ９Ｓ培地におけるテネイシンＣ基質上で培養した付着ヒト多能性幹細胞を含む。
【００７７】
細胞は、例えば、テネイシンＣでコートされた細胞培養皿、マルチウェル細胞培養プレート、またはマイクロキャリアビーズ上で成長させることができる。好ましくは、テネイシンＣタンパク質は、ヒトテネイシンＣである（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ５５３０９．１；例えばミリポアカタログ番号ＣＣ０６５）。
【００７８】
テネイシンＣ及び低酸素条件の使用は、プラットフォームごとの段階ごとに比較した場合、約１０％を超える、約２０％を超える、約５０％を超える、または約６０％を超えるような（図１０及び実施例を参照）、コラーゲンＩＶまたはＯＰ９細胞上に播種した細胞に比べて高割合で内皮細胞及び造血細胞に富む集団の生成を可能にする。一実施態様では、本発明により得られうる標的集団の割合は、ＫＤＲ＋ＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋中胚葉細胞の約３５％より大きいか、ＶＥカドヘリン＋ＣＤ４３−内皮細胞の訳２０％より大きくてよく、かつ約４０％のＣＤ３４＋ＣＤ４３＋造血前駆細胞より大きくてよい。さらに、図１０に関して、テネイシンＣプラットフォーム上で得られた細胞の割合は、示された割合またはそれ以上である。また、図１０は、コラーゲンＩＶまたはテネイシンＣのいずれかで分化する場合に、全培養物の標的集団の割合（例えば、中胚葉前駆細胞、内皮前駆、フローサイトメトリーに応じて対応する表現型を有する造血前駆細胞）を表す。
【００７９】
本発明の方法及び材料は、新しい分化プラットフォームを提供するために、細胞培養系に混合してもよい。一実施態様では、基本的な細胞培養系は、テネイシンＣの上に播種した多能性幹細胞を含む。別の実施態様では、細胞培養系は、アクチビンＡを添加した培地中でコラーゲンＩＶ上に播種した幹細胞を含む。これらの系は、造血前駆細胞に富む細胞集団を産生する能力を有する。
【００８０】
本明細書において企図される細胞培養系は、それら系に由来する得られた細胞集団を変更する追加の構成要素を組み込んでもよいという点で、モジュール式であってもよい。例えば、細胞培養系は、所望の結果のために、異種非含有の特定の培地を組み込むことができる。しかしながら、例えば臨床治療が生成された細胞集団を想定していないならば、それらは、異種含有培地を含んでもよい。さらに、所望の細胞集団の生産規模に到達するために、細胞培養系は、当技術分野で周知の様々な大きさの培養容器によることができる。
【００８１】
いくつかの場合において、ＩＦ９Ｓ培地の構成要素の一部を置換することができる。例えば、アスコルビン酸、及びモノチオグリセロールは、化合物及び／または抗酸化特性を有するチオール含有化合物の任意の添加物と置き換えることができる。グルタマックスＴＭは、Ｌ−グルタミンの任意の添加物と置き換えることができる。「非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）」は、ヒトが他のアミノ酸から製造することができるアミノ酸の一般的な用語であるが、アミノ酸の任意の添加物と置き換えることができる。「化学的に定義された脂質濃縮物」は、特にＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製の溶液であるが、脂質の任意の添加物と置き換えることができる。追加のセレン、インスリン、及びホロートランスフェリンは、任意のＩＴＳ添加物で置き換えることができる。ＩＴＳは、「インスリン−トランスフェリン−セレン（Insulin-Transferrin-Selenite）」の略である。いくつかの企業（例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）は、他の基本培地（例えばＤＭＥＭ）で添加物として使用するために、ＩＴＳ溶液を販売している。しかし、製造業者は、各構成要素の濃度を提供していない。ポリビニルアルコールは、生物学的に不活性な培地の増粘化合物の任意の添加物と置き換えることができる。
【００８２】
以下の実施例は、本発明を達成するための好ましい材料及び方法を記載する。しかしながらこれらの実施例は、例示として提供されるものであり、本明細書における本発明範囲全体に対する限定として解釈されるべきものではないと理解すべきである。
【実施例】
【００８３】
（実施例１）
ＩＭＤＭ／Ｆ１２ベース培地がｈＰＳＣｓの造血内皮系統への分化効率を有意に向上させる
【００８４】
これまで、我々の研究室では、マウスのストローマ細胞株ＯＰ９の共培養法を用いた造血ｈＰＳＣ分化の効率的な分化のためのプロトコルを開発した９，１３。ＯＰ９系は、ＨＥと多造血前駆細胞の効率的な生成をサポートしている（図１）が、この系は、血清の質の変化、間質細胞の維持、分化に使用するｈＰＳＣのコロニーや塊のサイズに非常に敏感である１３，１４。胚様体（ＥＢ）を形成することは、ＨＥを誘導し、ｈＰＳＣｓから血液を形成するための別の一般的に使用されるアプローチである７，１５，１６。しかし、ＥＢ法は、多くの場合、血清または非定義の培地に依存しており、また、非同時性の分化、高い変動しやすさ、及び最初の凝集のサイズへの依存などの著しい難点も有している。さらに、ｈＰＳＣの維持に使用されるアルブミンのバッチの違いによるｈＰＳＣの品質の不整合が血液生産の効率の違いを導き出すことがある。
【００８５】
これらの制限を克服するために、我々は、化学的に定義された培地とビトロネクチン（ＶＴＮ）を加えた完全に規定された異種非含有培地Ｅ８に展開したＨ１ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣｓ）の単細胞懸濁液から血清なしで造血内皮の分化を支持できるマトリクスタンパク質の同定することを決めた１７。
方法
【００８６】
ヒト多能性幹細胞の維持
【００８７】
ヒト多能性幹細胞（Ｈ１及びＨ９  ｈＥＳＣｓ、ｉＰＳＣ  １９−９−７Ｔからの繊維芽細胞、及び骨髄単核細胞由来ＢＭ１１９−９）は、社内でＦＧＦ２及びＴＧＦβ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）を添加して作製した、ビトロネクチンまたはマトリゲルを加えたＥ８培地で維持した。細胞は、０．５ｍＭのＥＤＴＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて８０％培養密度（８０％  ｃｏｎｆｕｌｅｃｙ）に達した時点で継代した。細胞は、５％のＣＯ２を含む酸素正常状態で維持した。
【００８８】
ヒト多能性幹細胞の分化
【００８９】
ヒト多能性肝細胞は、１ｘ  ＴｒｙｐＬＥ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて８０％培養密度（８０％  ｃｏｎｆｕｌｅｃｙ）に達した時点でビトロネクチンまたはマトリゲルから分離され、細胞株に応じてコラーゲンＩＶ（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ社）０．５μｇ／ｃｍ２またはテネイシンＣ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）０．５μｇ／ｃｍ２を含む、１０ＭのＲｈｏキナーゼ阻害剤（ＴｏｃｒｉｓＹ-２７６３２）を添加したＥ８培地でコーティングした６穴プレート上で、５０００  ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２から１５，０００  ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２でまでの範囲の最適化された密度で培養した。２４時間（０日目）後、培地を５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、１５ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ社）、２ｍＭの塩化リチウム（Ｓｉｇｍａ社）、及び、時々、細胞の生育力を増加させるために１μＭのＲｈｏキナーゼ阻害剤を添加したＩＦ９Ｓ培地に変更した。２日目に、培地を５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２及び５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを添加したＩＦ９Ｓ培地と言及した１０μＭのＳＢ−４３１５４２（Ｔｏｃｒｉｓ社）に変更した。４日目に、培地を、５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２、ＶＥＧＦ、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＩＬ−６、及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３を添加したＩＦ９Ｓ培地に変更した。６日目に、古い培地を吸引することなく、同じ６因子を添加した追加のＩＦ９Ｓ培地を培養物に添加した（表３）。ＩＦ９Ｓ（９つの添加物を加えたＩＭＤＭ／Ｆ１２）は、以下のように社内で作られた：５０％ＩＭＤＭ  ５０％Ｆ１２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に、６４ｍｇ／ＬのＬ−ａｓｏｒｂｉｃ酸２−リンのＭｇ２＋塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、４０μｌ／Ｌのモノチオグリセロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、８．４μｇ／Ｌの追加の亜セレン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、１０ｍｇ／Ｌのポリビニルアルコール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、１ｘグルタマックス（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、１ｘ非必須アミノ酸（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、０．１ｘ化学的に定義された脂質濃縮物（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、１０．６ｍｇ／Ｌでホロ−トランスフェリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、及び２０ｍｇ／Ｌのインスリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を添加した（表２）。分化は、０日目から５日目は低酸素状態で行われ、６日目から９日目は正常酸素状態に移した（図１）。１ｘＴｒｙｐＬＥが分離して、分析用に細胞を収集するために使用された。
【００９０】
［間葉（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍｏ−（ＭＢ））及び血球血管共通前駆細胞（ＨＢ）アッセイ］
【００９１】
ＭＢ及びＨＢは、以前説明したＦＧＦ２アッセイを添加した無血清ＣＦＣ培地を使用して検出した１１。２日目または３日目の培養物を解離させ、１ｘＴｒｙｐＬＥ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用して単細胞懸濁液を調製し、総培養物のうち５，０００個の細胞をＣＦＣ培地で培養した。単細胞懸濁液としての培養後１２日目にＭＢとＨＢのコロニーを記録した。
【００９２】
［造血ＣＦＣアッセイ］
【００９３】
造血ＣＦＣは、ヒト組換えＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、及びＥＰＯ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を添加した血清含有Ｈ４４３６メソカルト（ＭｅｔｈｏｃｕｌｔＴＭ）を用いて検出した。ＡＨＰｓの造血潜在性は、ＦＧＦ２（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ３（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ６（１０ｎｇ／ｍＬ）、及びＥＰＯ（２Ｕ／ｍＬ）（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を加えた無血清ＳＦ  Ｈ４２３６メソカルト（Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ）を用いて前述のように評価した６。１０００から１００００に分化した細胞はＣＦＣ培地で培養し、コロニーを培養１４日後に記録した。
【００９４】
フローサイトメトリー及びＦＡＣＳ
【００９５】
フローサイトメトリーは、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを使用し、以下の抗体を用いて行った：ＣＤ３１−ＦＩＴＣ（クローンＷＭ５９）、ＣＤ３４−ＦＩＴＣ（８Ｇ１２）、ＣＤ４１ａ−ＦＩＴＣ／ＡＰＣ（クローンＨＩＰ８）、ＣＤ４３−ＦＩＴＣ／ＰＥ／ＡＰＣ（クローン１Ｇ１０）、ＣＤ４５−ＡＰＣ（クローンＨＩ３０）、ＣＤ７３−ＦＩＴＣ／ＰＥ（クローンＡＤ２）、ＣＤ１４４−ＦＩＴＣ／ＰＥ／ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（クローン５５−７Ｈ１）、ＣＤ２３５ａ−ＦＩＴＣ／ＰＥ／ＡＰＣ（クローンＧＡ−Ｒ２）、ＫＤＲ−ＰＥ／ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（クローン８９１０６）、ＰＤＧＦＲα−ＰＥ（クローンａＲ１）（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＴＲＡ−１−８５−ＦＩＴＣ／ＰＥ（クローンＴＲＡ−１−８５）、及びＡＰＬＮＲ−ＡＰＣ（クローン７２１３３）（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ社）。前述の４６のように、分類はＦＡＣＳ  Ａｒｉａで行った。分離した集団の純度は９２％から９５％であった。
【００９６】
ＯＰ９への分化ｈＰＳＣｓの二次培養
【００９７】
ＯＰ９細胞は、前述のように２０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）を添加したα−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社）中で維持された１０。４日目または５日目に分類された培養液は、前述のように、１００μＭＴＧ、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸、５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−６、及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３を添加した１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）を添加したα−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社）中のＯＰ９細胞のコンフルエント層上で、６ウェルプレートのウェルあたり５，０００細胞の密度で播かれた６。培養物は、浮遊細胞を収集し、１×ＴｒｙｐＬＥを使って全体の培養物を分離することによって、４〜７日後にフローサイトメトリー用に調製した。
【００９８】
９日目の培養物のＴ細胞分化
【００９９】
ヒトデルタ様リガンド４（ＤＬＬ４）を本質的に表現しているＯＰ９細胞株（ＯＰ９−ＤＬＬ４）は、我々の研究室がレンチウイルスを用いて樹立し、ＯＰ９と同様に維持された。ヒト多能性幹細胞は９日間分化させた後、浮遊細胞を集め、７０μｍの細胞漉し器（ｃｅｌｌ  ｓｔｒａｉｎｅｒ）（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で漉して、洗浄した。その後、それらはＩＬ７（５ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ３Ｌ（５ｎｇ／ｍｌ）及びＳＣＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加した２０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）を添加したα−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社）からなるＴ細胞分化培地中に再懸濁した。その後、それらをＯＰ９−ＤＬＬ４上に播き、３７℃及び５％ＣＯ２で培養した。４日後、細胞を、コラゲナーゼＩＶ（Ｇｉｂｃｏ社）溶液（１ｍｇ／ｍｌ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２溶液、Ｇｉｂｃｏ）及び１ｘＴｒｙｐＬＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて採取し、ＯＰ９−ＤＬＬ４の新鮮な層に継代した。３日後、細胞を再び継代する。その後の継代は、ＴＣＲ再構成アッセイのためのフロー分析及びゲノムＤＮＡの抽出のために浮遊細胞が収集された後４週間までの７日ごとに行われる。
【０１００】
ＴＣＲ転位アッセイ
【０１０１】
ゲノムＤＮＡは、クイックｇＤＮＡ  ＭｉｎｉＰｒｅｐ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を用いて分離した。ＴＣＲβとＴＣＲγのクローン性は、前述のようにＰＣＲ増幅キット（Ｉｎｖｉｖｏｓｃｒｉｂｅ社）とＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）、ＤＮＡポリメラーゼ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて検出した３３。ＰＣＲ生成物は、臭化エチジウムで染色した６％ポリアクリルアミドゲル上でヘテロ二本鎖分析を用いて分析した。
【０１０２】
マウス間質細胞株のマイクロアレイ分析
【０１０３】
マウス骨髄間質細胞株、ＯＰ９は、Ｔｏｒｕ  Ｎａｋａｎｏ博士（大阪大学微生物病研究所、日本）から入手し、Ｓ１７はＫｅｎｎｅｔｈＤｏｒｓｈｋｉｎｄ博士（カリフォルニア大学ロサンゼルス校）から、ＭＳ−５はドイツのティッシュ・カルチャー・コレクションから入手した。間質細胞株は前述のように培養した９。ＤＮＡを含まないＲＮＡは、ＲｉｂｏＰｕｒｅＴＭＲＮＡとＴＵＲＢＯＴＭのＤＮＡｆｒｅｅ試薬（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いたＤＮＡｓｅを用いて分離した。すべてのサンプルは、ウィスコンシン大学マディソン校のバイオテクノロジーセンターの遺伝子発現センターで処理され、ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ  システム社製（ウィスコンシン州マディソン）のＡ４５４３−００−０１  ＭＭ８  ６０ｍｅｒ  ｅｘｐｒ  Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  １−Ｐｌｅｘ  Ａｒｒａｙの標準アレイを用いて分析した。遺伝子発現生データはＮｉｍｂｌｅＳｃａｎソフトウェアｖ２．１を用いて抽出した。ＲＮＡサンプルの信号分布がｇＤＮＡサンプルのそれとは異なることを考慮し、８つのすべての配列でＲＮＡチャネルからの信号強度は、ロバストマルチチップ分析（ＲＭＡ）アルゴリズムで標準化した４７。これとは別に、同じ標準化手順は、ｇＤＮＡ試料からのもので行った。与えられた遺伝子について、ＲＮＡチャネルからの標準化強度とｇＤＮＡのチャネルからものとの間の中央値調整比率は次のように計算した：比率＝ＲＮＡチャネルからの強度／（ｇＤＮＡのチャンネルからの強度＋ｇＤＮＡのチャネルからのすべての遺伝子の強度の中央値）。発現において３倍以上の違いを有する遺伝子は、異なる発現と考えられた。発現レベル＞１を有する遺伝子のみが分析のために選択された。
【０１０４】
結果
【０１０５】
ＩＭＤＭ／Ｆ１２ベースの培地はｈＰＳＣｓの血管内皮系統への分化の効率を有意に向上させる
【０１０６】
我々は、単細胞としてｈＥＳＣｓを播種し、マトリゲル（ＭＴＧ）、ＶＴＮ、またはコラーゲンＩＶ上で、１０μＭのＲｈｏキナーゼ阻害剤を補ったＥ８培地で２４時間以上付着させた。その後、動物性タンパク質を含まない３つの基礎的な培地の一つ、またはｈＰＳＣｓから血液を形成するのに一般的に使用される、ヒト組み換えＢＭＰ４、ＦＧＦ２及びＶＥＧＦ因子を添加した増殖因子を含まないＴｅＳＲ１に培地を交換した１８、１９。分化４日後、培養物は、造血内皮前駆細胞が高度に富むＫＤＲｈｉＣＤ３１＋細胞の存在について評価された６。フローサイトメトリー分析は、Ｌ−アスコルビン酸２−リン酸のＭｇ２＋塩、８．４μｇ／Ｌの追加の亜セレン酸ナトリウム、ホロートランスフェリン、及びインスリンを添加したＩＭＤＭ／Ｆ１２培地中コラーゲンＩＶ被覆プレート上で細胞が分化し、ＫＤＲｈｉＣＤ３１＋造血内皮前駆細胞に最も効率的に分化していることを示した（図８）。その後、我々は、ポリビニルアルコール、ＮＥＡＡ、グルタマックス、化学的に定義された脂質濃縮物、及びモノチオグリセロールの追加が細胞の生育力と分化効率を増加させることを見出した（データは示していない）。後の基本培地はＩＦ９Ｓ（９つの添加物を加えたＩＭＤＭ／Ｆ１２）と呼ばれている。これらの結果は、培地や添加物の選択は、Ｅ８培地で維持されたｈＳＰＣｓから化学的に定義され、異種非含有条件のコラーゲンＩＶマトリクス上に造血内皮細胞を得ることを可能にしたことを明らかにした。
（実施例２）
造血前駆細胞の分化と維持を促進する細胞外マトリックスとしてのテネイシンＣで特定される、造血を支持する間質細胞のユニークな分子サインの分析
【０１０７】
これまで我々は、ＯＰ９が、Ｓ１７とＭＳ５の様な他の間質細胞株より、造血分化の誘導において優れていることを示した９。８日目の一面に生えたＯＰ９は、多型潜在的なＧＥＭＭ−ＣＦＣｓを含む造血ＣＦＣｓの誘導において、４日目の新たなコンフルエントＯＰ９より優れていることも見出した９。間質細胞の密集度は分化効率に影響を与えるので、これにより、造血内皮の分化に影響を与える細胞外マトリクスの存在が示唆される。ＯＰ９の造血を支持する活性に決定的なマトリクスタンパク質を見つけるために、我々は低い造血誘導能の間質細胞であるＳ１７とＭＳ５、及びＯＰ９細胞の分子プロファイリングを行った。加えて、一面に生えたＯＰ９（８日目）と新たなコンフルエントＯＰ９（４日目）の単層とを比較した。トランスクリプトーム解析は、他のすべての間質細胞と比較して、８日目の一面に生えたＯＰ９細胞では、２１の遺伝子が発現していることを明らかにした（図２ａ）。これらは、ＨＳＣの膨張や再生の分泌型調節因子Ｐｔｎ（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ）２０、Ｗｎｔシグナル伝達と血管芽細胞の分化に重要な調節因子Ｒｓｐｏ３（Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ３）２１、Ｂリンパ球生成に必要な細胞外マトリクスタンパク質Ｐｏｓｔｎ（ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ）２２、をコードする遺伝子を含んでいた。興味深いことに、オーバーコンフルエントＯＰ９で最も有意な発現変化を示した一つの遺伝子がＴｎｃ（テネイシンＣ）であった（図２ｂ）。テネイシンＣは、大動脈−性腺−中腎（ＡＧＭ）領域における造血クラスターに潜在する間葉系細胞で発現され、胎児内及び出生後の造血のために必要とされる２３−２５。また、骨髄幹細胞ニッチにおいて発現される２５。そのため、これらのユニークな特性のため、我々はテネイシンＣがコラーゲンＩＶよりさらに効果的に造血分化を支持することができるかどうかをテストした。
（実施例３）
ＦＧＦ２、ＢＭＰ４、アクチビンＡ、塩化リチウム、及びＶＥＧＦの時間及び用量依存的の処置は、中胚葉、内皮、及び造血の段階の分化を誘発する
【０１０８】
我々のこれまでの研究では、ＯＰ９との共培養におけるｈＰＳＣの分化に続く造血内皮の分化の異なる段階を同定した（図１）６、９−１１、２６。ＯＰ９間質細胞上にｈＰＳＣｓを播種することは原始的な薄い層と中胚葉細胞の形成を誘導する、このことは、アペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）とＫＤＡ（ＶＥＧＦＲ２）の発現と内皮（ＣＤ３１、ＣＤ１４４（ＶＥ−カドヘリン））、内皮／間葉性（ＣＤ７３、ＣＤ１０５）及び造血（ＣＤ４３、ＣＤ４５）マーカー、すなわちＥＭＨｌｉｎ−表現型の発現の欠如で検出することができる。分化２日目のＯＰ９との共培養中に現れる最初のＫＤＲ＋中胚葉細胞はＡＰＬＮＲとＰＤＧＦＲａｌｐｈａ（ＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲ＋ＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋  以下、Ａ＋Ｐ＋細胞という）を発現する。これらの細胞は、間葉系血管芽細胞（ＭＢ）の潜在性、すなわち、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）と血管潜在性の両方のコロニーを形成する能力を表示する。分化３日目にＡ＋Ｐ＋細胞は、ｂｌａｓｔ（ＢＬ）−ＣＦＣまたは血球血管共通前駆細胞（ＨＢ）の潜在性を獲得する１１。ＭＢ及びＨＢの潜在性は、ＦＧＦ２を添加した無血清のクローン形成性培地でのコロニー形成アッセイで検出することができる１１。成熟の進行とともに、中胚葉細胞はＢＬ−ＣＦＣ活性を失い、ＫＤＲの発現は増加調整され、ＰＤＧＦＲａｌｐｈａは減少調整される、すなわち、ＯＰ９上で血管内皮クラスターを形成する潜在性を有する細胞を豊富にする造血血管前駆細胞（ＨＶＭＰ）表現型ＫＤＲｈｉＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａｌｏ／−を獲得する６。内皮段階の進行は、内皮特異的なマーカーＶＥ−カドヘリン（ＣＤ１４４）の発現で規定される。最初のＶＥカドヘリン＋（ＣＤ１４４＋）細胞は、分化４日目のＫＤＲｈｉＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａｌｏ／−中胚葉細胞から出現する。出現したＶＥカドヘリン＋（ＣＤ１４４＋）細胞は、ＣＤ４３−ＣＤ７３＋（ＣＤ１４４＋ＣＤ４３−ＣＤ７３＋）非造血内皮前駆細胞（非ＨＥＰｓ）とＣＤ４３−ＣＤ７３−（ＣＤ１４４＋ＣＤ４３＋ＣＤ７３−）造血内皮前駆細胞（ＨＥＰｓ）を含む不均一な集団になる６。造血ＣＦＣの潜在性を欠くＨＥＰｓが、間質細胞との培養後、それを獲得する。造血段階の進行は、造血特異的マーカーＣＤ４３の発現で規定される６、１０。最初のＣＤ４３＋細胞は、分化の４〜５日目のＶＥカドヘリン＋（ＣＤ１４４＋）細胞内に出現する。これらの細胞は、低レベルのＣＤ４３を発現し、ＣＤ２３５ａを共発現するが、ＣＤ４１ａの発現を欠く、すなわちＣＤ１４４＋ＣＤ４３／２３５ａ＋４１ａ−表現型を有していた。これらの細胞は、フィブロネクチン上で内皮細胞を成長させるだけでなくＦＧＦ２及び造血サイトカインの存在下で造血性コロニーを形成する能力を持っているので、我々は血管新生造血前駆細胞（ＡＨＰｓ）と称した。最初のＣＤ４１ａ細胞は、ＣＤ２３５ａ陽性細胞内に現れる。ＣＤ２３５ａ＋ＣＤ４１ａ＋細胞は、高濃度なエリスロメガカリオサイト前駆細胞で内皮の可能性を欠いている。幅広い骨髄リンパ潜在性とｌｉｎ−ＣＤ３４＋ＣＤ４３＋ＣＤ４５＋／−表現型を有する前駆細胞は、ＣＤ２３５ａ＋ＣＤ４１ａ＋細胞の出現後まもなくｈＰＳＣ培養中に検出す���ことができる。ｌｉｎ−細胞によるＣＤ４５発現の獲得は、進歩的な骨髄関与と関連している１０。
【０１０９】
ＯＰ９共培養で観察された造血内皮プログラムを再現するために、我々は中胚葉誘導と造血内皮明確化のモルフォゲンの最適な組合せを選択すること、コラーゲンＩＶとテネイシンＣ上での化学的に定義された条件で分化したｈＰＳＣ培養中（図１）でＨＥと血液細胞への段階的な分化の進行に必要な特定の成長因子を定義することを決定した。胚の分化の間中、ＢＭＰ４、Ｗｎｔ及びＴＧＦ／Ｎｏｄａｌ／アクチビンＡシグナリングは、原始的な薄い層の形成とその後に続く中胚葉の分化の開始に重要であることが判明している２７，２８。これらは、これらのシグナル経路の活性化はブラキウリ（ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）とＫＤＲ（Ｆｌｋ−１、ＶＥＧＦＲ２）の発現の誘導と、マウス及びヒトの中胚葉の関与の開始に不可欠であること示している１８，１９，２９−３２。我々は、高濃度のＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）と塩化リチウム（２ｍＭ）を添加剤とした低濃度のアクチビンＡ（１５ｎｇ／ｍｌ）を組合せると、我々が上述した化学的に既定された条件でコラーゲンＩＶ上でのｈＥＳＣｓの単細胞懸濁液の培養２日目後、中胚葉の表面マーカーであるＡＰＬＮＲ、ＫＤＲ及びＰＤＧＦＲａｌｐｈａの発現を一貫して誘導することを見出した。しかしながら、これらの条件は細胞の生存には不十分な支持であり、細胞生存力と中胚葉細胞の産出の改善にはＦＧＦ２の添加と低酸素状態（５％Ｏ２、５％ＣＯ２）を必要とした。これらの条件で分化した２日目のＫＤＲ＋中胚葉細胞は、ＡＰＬＮＲとＰＤＧＦＲａｌｐｈａ、すなわちＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋細胞になり、ＯＰ９共培養中で分化した２日目のｈＰＳＣｓから得られたＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋中胚葉細胞と類似のＭＢコロニー形成の潜在性を示した１１（図３）。２日間の分化後、我々は、ＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋中胚葉が分化３日目にＨＢ潜在性を獲得し、分化４日目のＣＤ３１−中胚葉細胞中、ＫＤＲの発現が増加しＰＤＧＦＲａｌｐｈａの発現が減少したＡＰＬＮＲ＋細胞（ＫＤＲｈｉＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａｌｏ／−表現型）で示されるＨＶＭＰｓへの中胚葉特定の進行にはＦＧＦ２とＶＥＧＦのみが要求されることを見出した。分化の様式は、コラーゲンＩＶ及びテネイシンＣ上で細胞を培養しても同じであったが、後の一つは有意に高いＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋細胞、ＭＢとＨＢコロニーを産出した（図３ａ、図３ｃ）。
【０１１０】
４日目分化したｈＥＳＣｓは、ＨＢコロニーを形成する能力を失った（図３ｃ）、しかしこれらの細胞は、１０％のＦＢＳ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ６、及びＩＬ３を添加したαＭＥＭ中のＯＰ９上へ分類して播種した場合、造血内皮クラスターを形成することは可能だった。造血内皮クラスターの潜在性はＫＤＲｈｉＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａｌｏ／−ＣＤ３１−ＨＶＭＰｓに制限された（図３ｄ）。ＫＤＲｌｏＣＤ３１−細胞のみが、造血活性がほとんどない内皮クラスターを形成し（図３ｄ）、ＫＤＲ−細胞は、内皮細胞及び血液細胞の両方への成長に失敗した（図示せず）。これはまた、ＯＰ９共培養における分化と一致している６ＫＤＲｈｉＡＰＬＮＲ＋ＤＧＦＲａｌｐｈａｌＯ／−ＨＶＭＰｓ細胞の割合は、テネイシンＣ培養物中では一貫してより高かった（図３ａ）。
【０１１１】
ｈＰＳＣ／ＯＰ９共培養におけるＨＶＭＰｓの形成は、密接にＨＥと血液前駆細胞の分化へ続いているので、我々は、ＶＥＧＦとＦＧＦ２に加えて、分化４日目開始からＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−６、及びＩＬ−３の造血サイトカインを我々の培養物に添加した。我々は、ＦＧＦ２及びＶＥＧＦでの培養物の連続処理は、内皮前駆細胞及び造血特定の誘導のために十分であったことに気づいていたが、造血性サイトカインの添加は、化学的に定義された培養物中でこれらの細胞の出現を増加させるために不可欠であった。これらの条件での分化の５日目、予め同定していた３つのＣＤ１４４＋集団６の主要サブセットが出現した：ＣＤ１４４＋ＣＤ４３−ＣＤ７３＋、ＣＤ１４４＋ＣＤ４３−ＣＤ７３−及びＣＤ１４４＋ＣＤ４３／ＣＤ２３５ａ＋ＣＤ４１ａ−（図４）。これらのサブセットは、分類して内皮条件で培養したときに、それらの全ては、ＡｃＬＤＬの取り込みとＯＰ９共培養での管形成アッセイにおいて血管を形成する可能性を有するＶＥ−カドヘリン発現細胞の単層を形成した（図４ｄ）。しかし、造血ＣＦＣの潜在性はほとんどＣＤ１４４＋ＣＤ４３／ＣＤ２３５ａ＋ＣＤ４１ａ−細胞に限定された（図４ｃ）。ＯＰ９との共培養５日目にＣＤ１４４＋のサブセットが生じたことを見つけたことに類似して重要なことは、ＣＤ１４４＋ＣＤ４３／ＣＤ２３５ａ＋ＣＤ４１ａ−細胞の造血ＣＦＣ潜在性は、造血性サイトカインを加えたＦＧＦ２存在下の無血清培地中でのみ検出されたことで、これらの細胞はｈＰＳＣ／ＯＰ９共培養中で同定されたＡＨＰと本質的に類似していることを示している６。我々はこれまで、ＨＥＰを造血ＣＦＣの潜在性を欠いたＣＤ１４４＋ＣＤ４３−ＣＤ７３−細胞として定義したが、ＯＰ９上で培養後、それを取得することができる。ＯＰ９誘導ＨＥＰｓと同様の完全に規定された条件でＣＤ１４４＋ＣＤ４３−ＣＤ７３−が生ずるかどうか決定するために、以前記載６したように我々は５日目のＣＤ１４４＋サブセットを分類しＯＰ９で培養した。これらの条件において、ＨＥＰｓは、多数のＨＥクラスターとともに内皮細胞と造血細胞の両方を形成し、一方ＡＨＰｓは、わずかな内皮細胞と造血内皮細胞を伴って、大部分は造血細胞を形成した。ＣＤ１４４＋ＣＤ４３−ＣＤ７３＋細胞は、非ＨＥＰ表現型のみからなる内皮クラスターを形成した（図４ｄ）。テネイシンＣで分化した培養物は、総ＣＤ１４４＋細胞の大きな集団を有していて、それによってコラーゲンＩＶで分化した培養物と比較して、ＨＥＰｓ、非ＨＥＰｓ、及びＡＨＰｓの集団を増加させた（図４ａ、ｂ）。
【０１１２】
培養６日目、多数の浮遊する丸い造血細胞が認識できるようになったときには、造血の分化を維持するための低酸素状態は必要なかった。したがって分化６日目から、培養物は、正常酸素インキュベーター（２０％Ｏ２、５％ＣＯ２）に細胞を移した。分化８日目までに、培養物は、エリスロメガカリオサイト前駆細胞に富んだＣＤ２３５ａ＋ＣＤ４１ａ＋細胞とＣＤ３４（図５）を発現し、他の系統のマーカーが欠如したｌｉｎ−ＣＤ４３＋ＣＤ４５−／＋細胞からなる多数のＣＤ４３＋造血細胞への分化を示した（図は示さず）。ＯＰ９で分化した細胞と一致して、造血コロニー形成の潜在性は、ＣＤ４３＋亜集団（図５ｃ）に限定されていた。ＣＤ４３＋造血前駆細胞はコラーゲンＩＶに比較して、テネイシンＣでは有意に拡張していた（図５ｂ）。加えて、テネイシンＣでの培養物のＧＥＭＭ−ＣＦＣ潜在性はコラーゲンＩＶの培養物よりも有意に大きかった（図５ｄ）。
【０１１３】
分化プロトコルは、最初Ｈ１ ｈＥＳＣｓを使用して開発されたが、我々は、ここに記載してきた化学的に定義された条件もまた、繊維芽細胞または骨髄単核細胞から生成された他のＨＥＳＣ（Ｈ９）とｈｉＰＳＣｓからＨＥと血液の形成を支持することを見出した（図９）。これまで、我々は、ｈｉＰＳＣは、線維芽細胞由来（ＦＢ）ｈｉＰＳＣｓに比べＯＰ９培養で低い効率で血液細胞に分化する臍帯血単核細胞（ＣＢ  ｈｉＰＳＣｓ）の再プログラミングを経て得られたことを見出した３３。我々はコラーゲンＩＶでＣＢとＦＢ  ｉＰＳＣｓを分化したときに、これらの知見は再現されている。しかし、テネイシンＣでの分化は、ｈＥＳＣｓとＦＢ  ｈｉＰＳＣｓ（図９）で見られたレベルに、ＣＢ  ｈｉＰＳＣｓの造血分化の潜在性を回復させた、これによって、テネイシンＣがコラーゲンＩＶよりｈＰＳＣｓからの造血分化促進に優れていることが確認された。
（実施例４）
テネイシンＣは独特にｈＰＳＣｓからのＴリンパ球前駆細胞の特定を支持している
【０１１４】
我々の培養系が、ｈＰＳＣｓからの確かな造血プログラムの確立を支持するかどうかを見出すため、確かな造血の指標として我々の系で生成された血液細胞のＴ細胞潜在性を分析した７。我々は、ＣＤ４３＋浮遊細胞を９日目の分化培養液から収集し、２０％のＦＢＳ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ−７、及びＳＣＦを加えたα−ＭＥＭ中でＤＬＬ−４を発現しているＯＰ９細胞に再播種したところ、ＣＤ７＋ＣＤ５＋リンパ系前駆細胞が二次培養の２週目に出現し始めた。３週目までに、ＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞を生じた（図６ａ）。
【０１１５】
興味深いことに、ＣＤ４３＋細胞は、コラーゲンＩＶとテネイシンマトリクスの両方で生成し、たＣＤ５＋ＣＤ７＋リンパ系前駆細胞を生成する能力を持っていた。しかし、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔリンパ球細胞への分化は、コラーゲンＩＶではなく、テネイシンＣでのＣＤ４３＋細胞にのみ観察された。Ｔ細胞の分化を確認するために、我々は、ＴＣＲ再配列の存在のために、これらの培養物からのゲノムＤＮＡを分析した。この分析は、無作為のＶ−ＪとＤ−Ｊの再配列した複数のＰＣＲ産物とポリクローナルＴ細胞系列レパートリーを示すγ−座で再配列の存在を実証した（図６（ｂ）及び（ｃ））。全体的に、これらの知見は、細胞外マトリックステネイシンＣが完全に化学的に定義された条件において造血を支援するために必須であることを意味する。
（実施例５）
ＴＧＦ−βの阻害は、化学的に定義された条件で造血内皮の特定を促進する
【０１１６】
最近の研究は、中胚葉の特定後で、しかし内皮の分化の前でのＴＧＦ−β阻害剤の添加は決定的な造血分化を増加することを示している。我々は、強力で非特異的なＴＧＦ−β阻害剤であるＳＢ−４３１５４２の１０μＭを２日目から４日目に添加したとき、３日目にＰＤＧＦＲａｌｐｈａ陽性中胚葉細胞の分化を有意に減少させ、４日目にＣＤ３１＋の分化を増加することを見出した。４日目以降は、もはやＳＢ−４３１５４２は添加していないが、２日間の処理の効果は、９日目のＣＤ４３＋集団の増加に続いている（図７）。
【０１１７】
最近の十年間で、ｈＰＳＣｓからの造血分化は重要な発展がなされた。造血分化の多様なプロトコルが開発され、実験のために血液細胞をルーティンに産生することが可能になった。しかし、ｈＰＳＣｓからの、長期の再構成能力、ＨＳＣｓを伴った血液細胞の発生は重要な課題のままである。胚では、造血細胞とＨＳＣｓが内皮の特定のサブセット（ＨＥ）から生じる１−５、完全に化学的に定義された環境で血液細胞へＨＥの特定と移行に導くことを調べるためにこのような能力がＨＳＣ特定に求められる因子の特定、新たなＨＳＣ発生の状態の結果的な分化に不可欠である。造血分化のオリジナルのプロトコルは、異種、フィーダー及び／または血清、いくつかの血清とフィーダーフリーの系を採用しているが、最近記述されている１８，３４，３５。しかし、これらのプロトコルは、依然として血清成分（アルブミン）を必要とし、そしてこれらのプロトコルが、そもそもの分化系で観察される、決定的な骨髄リンパの潜在性を伴うＨＥの発生を含む明らかな造血の波を再現できるかどうかは不明である。ごく最近、Ｋｅｎｎｅｄｙらは７、ｈＰＳＣｓのＥＢベースの造血分化のためのフィーダーと間質のない条件を開発し、これらの条件が造血のプリミティブで決定的な波を再現し、Ｔリンパ球潜在性を伴うＨＥを生成することを示した。しかし、このプロトコルは、非開示の化学物質とヒトタンパク質を含有する個人所有の培地中でＥＢベースの造血分化のためにＭＥＦ上で増殖しているｈＰＳＣｓを使用している。ここに、我々は、化学的に定義されたＥ８培地で維持されたｈＰＳＣｓの単細胞懸濁液から血清及び異質タンパク質を含まない完全に化学的に定義された条件での血液細胞の効率的な産生が可能な最初のプロトコルを開発した１２。このプロトコルは、動物あるいはヒトが原因のアルブミン、異種マトリクス、塊の大きさ、ＥＢ系で観察される非同期性の分化に関連する変動性を排除し、ＯＰ９上のｈＰＳＣｓの分化で観察された、決定的な造血前駆細胞とＨＥの形成を含む、典型的な造血の波を再現する。重要なことに、異なる血管誘導活性をもつＯＰ９と間質細胞の分子プロファイリングに基づいて、我々は、強固な造血誘導潜在性を持つＯＰ９中に独特に発現するテネイシンＣマトリクスタンパク質がｈＰＳＣｓから血管内皮とＴリンパ球の分化を強く促進することを見出した。テネイシンＣは、主に胚の分化中に発現するジスルフィド結合した六量体糖タンパク質である。テネイシンＣは、大人の生物体ではほとんど消失するが、創傷修復、血管新生、組織形成の間はその発現が増加された３６。興味深いことに、テネイシンＣは成人の骨髄で発見され、大部分は骨内膜部位で発現３７，３８し、骨髄剥離に引き続いて発現増加した２５。テネイシンＣは、骨髄造血細胞３９の増殖と赤血球形成４０を支持する。テネイシンＣ欠損マウスは、低い骨髄ＣＦＣ潜在性２４を持ち、骨髄剥離後の造血の再構成ができず、野生型ＨＳＣｓ２５の生着を支持する能力の低下を示した。テネイシンＣの高レベルの発現は、ヒト及びニワトリ大動脈−生殖腺−中腎（ＡＧＭ）部位２３、４１、最初のＨＳＣ発現サイト、ヒト胎児肝臓中４２で検出された。テネイシンＣは、下大動脈間葉の右のすぐ下の造血クラスターに非常に富んでいるので、テネイシンＣは胚形成の間、ＨＳＣ分化において中枢の役割を果たしていることが示唆された２３。テネイシンＣはまた、血管形成と心臓内皮前駆細胞の調整にも影響を与えている４３。我々の研究は、ｈＰＳＣｓから造血を促進する上でテネイシンＣの優れた特性を示した。テネイシンＣの疑いのない効果は、分化のすべての段階と、造血中胚葉、ＨＥ、造血前駆細胞ＣＤ４３＋の増殖の誘導で明らかであった。重要なことに、テネイシンＣはＴリンパ球潜在性を有する決定的な造血細胞の分化を支持することができ、一方で、コラーゲンＩＶ上での培養ではこのような細胞は得られなかった。テネイシンＣ分子は、７回繰り返し、ＥＧＦ様で、フィブロネクチンＩＩＩ繰り返し、フィブリノーゲングローブに続く、アミノ末端の低重合体領域で構成される３６。これらのドメインの機能は、あまり理解されていない。造血細胞の像側を誘導することができるいくつかの独特の分裂促進ドメインがこの分子から同定されたが、細胞に対してのテネイシンＣの効果と関与は、多様なドメイン４４の作用の統合を必要とすると考えられる３９。フィブロネクチン活性化焦点接着キナーゼ及びＲｈｏ媒介性シグナル伝達の抑制とＷｎｔシグナル伝達（見直し４５）の刺激を含む、いくつかのシグナル伝達機構がテネイシンＣと細胞の相互作用に影響を与えることが同定された。ｈＰＳＣＳ及びその造血誘導体へのテネイシンＣ作用のメカニズムの同定を目的とした更なる研究は、造血分化におけるこのマトリクスタンパク質の役割を理解するために価値があるであろう。
【０１１８】
要約すると、これらの所見は、テネイシンＣマトリクスタンパク質とｈＰＳＣＳから決定的な血液細胞とＨＥの測定可能な産生を支持することができる、血清／血清成分と動物淡白汁を含まない完全に化学的に定義された条件をここに提供した。この分化系は、造血分化に関与するシグナル伝達分子への正確に質問を可能にし、臨床適応のためのｃＧＭＰグレードの血液細胞の生産のプラットホームを提供する。
【０１１９】
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【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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