(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母と、０．１〜３％のエーテル系界面活性剤を含有する水溶液（ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮａＮＯ３、ＫＮＯ３、又はＮａ２ＳＯ４を０．２５Ｍ以上含有する水溶液、及びＮ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｅｔｒａｄｅｃｙｌａｍｉｎｅを含有する水溶液を除く）とを接触させて静置又は撹拌することを特徴とする、酵母を物理的に破壊することなく酵母の細胞膜内からポリペプチドを抽出する方法であって、水溶液のｐＨが６．１〜１３．０であり、酵母を凍結させる工程を含まない方法。
【請求項２】
界面活性剤が、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、又はポリエチレングリコール−ｐ−オクチルフェニルエーテルであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
水溶液のｐＨが７．０〜１０．５であることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
ポリペプチドがタンパク質であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項５】
タンパク質が、親水性タンパク質であることを特徴とする請求項４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母からポリペプチドを抽出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、タンパク質を細胞内に発現させて、その後タンパク質を細胞から抽出し、かかるタンパク質を工業的に利用する方法が広く行われている。タンパク質を利用するためには、細胞内でタンパク質を発現させた後、一般的に細胞からタンパク質を抽出する必要がある。細胞、特に細胞壁を有する酵母等からタンパク質を抽出には、細胞を壊す方法が広く行われており、かかる方法としては、ガラスビーズと共に撹拌する方法、超音波処理する方法、フレンチプレスを用いて圧力をかける方法等、外部からの物理的な負荷により破壊する方法等が知られているが、特別な機器・装置を用いるため設備投資が必要である。また、細胞壁分解酵素を用いて細胞壁を溶解する方法も知られているが、酵素が高価である。
【０００３】
さらに、上記いずれの方法も、細胞の破壊若しくは細胞壁の溶解を行うため、目的とするタンパク質を精製するためのコスト及び時間が多く必要となる。
【０００４】
このほか、酵母を０．０６Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、５  ％グリセロール、２％ＳＤＳ、４％  ２−メルカプトエタノールを含む緩衝液に浸漬させて煮沸する方法（非特許文献１参照）や、０．１Ｍ  ＮａＯＨ、２％  ＳＤＳ、２％  ２−メルカプトエタノール、及び０．０５Ｍ  ＥＤＴＡを含む緩衝液に浸漬させて煮沸する方法（非特許文献２参照）が開示されているが、酵母を浸漬させた緩衝液を煮沸する工程が必要であるとともに、煮沸によりタンパク質が変性するという問題があった。
【０００５】
また、細胞を抽出試薬に接触させて、少なくともｐＨ約１０．０のｐＨを有する中間組成物を生成し、かかる中間組成物を中和試薬に接触させてタンパク質抽出物を生成するための方法であって、抽出試薬又は中和試薬の一方または両方が、ポリオキシエチレンアルキルエーテルを含む方法（特許文献１参照）が開示されているが、あくまでヒトの細胞を対象とし、酵母のような細胞壁を有する細胞を対象とする方法ではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１１−５０３２０８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Vitaly V. Kushnirov, Yeast, 16:857-860(2000)
【非特許文献２】Tobias von der Haar, PLoS ONE, 2(10):e1078(2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記のとおり酵母は細胞壁を有することから、酵母からタンパク質等のポリペプチドを抽出することが困難であり、細胞壁の物理的破壊や酵素による分解が行われてきたが、特別な設備や酵素が必要であり、かつタンパク質等のポリペプチドの精製工程も複雑となる。そこで本発明の課題は、安価で容易に酵母からタンパク質等のポリペプチドを抽出する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した中で、酵母と接触させる水溶液のｐＨを６．１〜１３．０とし、かつ界面活性剤を含有させることで、酵母を物理的に破壊することや、細胞壁を溶解させることなく酵母内にあるタンパク質等のポリペプチドを抽出することが可能であることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明らは、以下の［１］〜［７］に示すとおりのものである。
［１］酵母と、界面活性剤とを含有する水溶液とを接触させて静置又は撹拌することを特徴とする酵母からポリペプチドを抽出する方法であって、水溶液のｐＨが６．１〜１３．０である方法。
［２］水溶液が、０．１〜３％の界面活性剤を含有することを特徴とする上記［１］記載の方法。
［３］界面活性剤が、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、又はポリエチレングリコール−ｐ−オクチルフェニルエーテルであることを特徴とする上記［１］又は［２］記載の方法。
［４］水溶液のｐＨが７．０〜１０．５であることを特徴とする上記［１］〜［３］のいずれか記載の方法。
［５］ポリペプチドがタンパク質であることを特徴とする上記［１］〜［４］のいずれか記載の方法。
［６］タンパク質が、親水性タンパク質であることを特徴とする上記［５］記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の方法により、特別な設備や酵素が必要なく、安価で容易に酵母からポリペプチドを抽出することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】サッカロマイセス・セレビシエを培養及び集菌し、各ｐＨの緩衝液又は溶液を加えて３０分静置した後の写真である。
【図２】サッカロマイセス・セレビシエを培養及び集菌し、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有各ｐＨの緩衝液又は溶液を加えて３０分静置した後の写真である。
【図３】サッカロマイセス・セレビシエを培養及び集菌し、１％ＮＰ−４０含有各ｐＨの緩衝液又は溶液を加えて３０分静置した後の写真である。
【図４】サッカロマイセス・セレビシエを培養及び集菌し、１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有各ｐＨの緩衝液又は溶液を加えて３０分静置した後の写真である。
【図５】１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％ＮＰ−４０を含有するｐＨ８の緩衝液又はｐＨ１０．５の溶液を用いて抽出したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した結果を示す図である。
【図６】１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％ＮＰ−４０を含有するｐＨ８の緩衝液又はｐＨ１０．５の溶液を用いて抽出したタンパク質をＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥによって解析した結果を示す図である。
【図７】サッカロマイセス・セレビシエを培養及び集菌し、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有ｐＨ１０．５の溶液を加えて４、３０、５０、７０、８０、９０℃で３０分静置した後の写真（上段）、及び４、３０、５０、７０℃で一晩静置した後の写真（下段）である。
【図８】図７に示すそれぞれの溶液の上清について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析を行った結果を示す図である。
【図９】クルイベロマイセス・マルシアヌスを培養及び集菌し、各ｐＨの緩衝液又は溶液を加えて３０分静置した後の写真である。
【図１０】クルイベロマイセス・マルシアヌスを培養及び集菌し、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有各ｐＨの緩衝液又は溶液を加えて３０分静置した後の写真である。
【図１１】クルイベロマイセス・マルシアヌスを培養及び集菌し、１％ＮＰ−４０含有各ｐＨの緩衝液又は溶液を加えて３０分静置した後の写真である。
【図１２】クルイベロマイセス・マルシアヌスを培養及び集菌し、１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有各ｐＨの緩衝液又は溶液を加えて３０分静置した後の写真である。
【図１３】抽出前後の酵母を顕微鏡で観察した写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の酵母からポリペプチドを抽出する方法としては、酵母と、界面活性剤とを含有する水溶液とを接触させて静置又は撹拌することを特徴とする酵母からポリペプチドを抽出する方法であって、水溶液のｐＨが６．１〜１３．０である方法であれば特に制限されず、かかる方法により、細胞壁を有する酵母において、酵母からポリペプチドを抽出することが可能となる。
【００１４】
本発明における酵母としては、分類学上酵母に属するものであれば特に制限されず、例えば、クルイベロマイセス属（Kluyveromyces）、デバリオマイセス属（Debaryomyces）、ハンゼヌラ属（Hansenuala）、キャンディダ属（Candida）、メチニコウィア属（Metschnikowia）、ネマトスポラ属（Nematospora）、ピキア属（Pichia）、サッカロマイセス属（Saccharomyces）、サッカロマイコデス属（Saccharomycodes）、シゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces）、シュワニオマイセス属（Schwanniomyces）、トリコスポロン属(Trichosporon)、トルロプシス属（Torulopsis）、ロドトルラ属（Rhodotorula）、ヤローウィア属（Yarrowia）等の酵母を挙げることができ、より具体的には、クルイベロマイセス・アフリカヌス（K.africanus）、クルイベロマイセス・ラクチス（K.lactis）、クルイベロマイセス・マルキシアヌス（K.marxianus）、クルイベロマイセス・ファゼオロスポラス（K.phaseolosporus）等のクルイベロマイセス属の酵母、デバリオマイセス・ハンセニイ（D.hansenii）等のデバリオマイセス属の酵母、ハンゼヌラ・アノマラ（H.anomala）等のハンゼヌラ属の酵母、キャンディダ・アルビカンス（C.albicans）、キャンディダ・ウティリス（C.utilis）、キャンディダ・グラブラタ（C.glabrata）、キャンディダ・ボイジニィ(C.boidinii)、キャンディダ・トロピカリス（C.tropicalis）、キャンディダ・リポリティカ（C.lipolytica）、キャンディダ・フレーベリ（C.flaveri）、キャンディダ・ビルサチルス（C.versatilis）等のキャンディダ属の酵母、メチニコウィア・プルテェリマ（M.pulcherrima）等のメチニコウィア属の酵母、ネマトスポラ・コリリ（N.coryli）等のネマトスポラ属の酵母、ピキア・スチピチス（P.stipitis）、ピキア・ファリノサ（P.farinosa）、ピキア・パストリス（P.pastris）、ピキア・アノマラ（P.anomala）等のピキア属の酵母、サッカロマイセス・クドリアヴゼヴィイ（S.kudriavzevii）、サッカロマイセス・セレビシエ（S.cerevisiae）、サッカロマイセス・ドウグラシ（S.douglasii）、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（S.carlsbergensis）、サッカロマイセス・パラドキサス（S.paradoxus）、サッカロマイセス・パストリアヌス（S.pastorianus）、サッカロマイセス・バヤヌス（S.bayanus）、サッカロマイセス・マンジニ（S.mangini）、サッカロマイセス・ミカタエ（S.mikatae）等のサッカロマイセス属の酵母、サッカロマイコデス・ルドウイギ（S.ludwigii）等のサッカロマイコデス属の酵母、シゾサッカロミセス・ポンベ（S.pombe）等のシゾサッカロミセス属の酵母、シュワニオマイセス・アルビウス(S.a11uvius)、シュワニオマイセス・オシデンタリス（S.occidentalis）、シュワニオマイセス・カステリ（S.castellii）等のシュワニオマイセス属の酵母、トリコスポロン・プルランス(T.pu11ulans)、トリコスポロン・ペニシァタム（T.penicillatum）等のトリコスポロン属の酵母、トルロプシス・マグノリアエ（T.magnoliae）、トルロプシス・ヴェラティリス（T.veratilis）、トルロプシス・キャンディダ（T.candida）等のトルロプシス属の酵母、ロドトルラ・ミニュータ（R.minuta）、ロドトルラ・ムシラギノーザ（R.mucilaginosa）等のロドトルラ属の酵母、ヤローウィア(サッカロマイコプシス)・リポリティカ(Y.(Saccharomycopsis)lipolytica)等のヤローウィア属の酵母を挙げることができるが、サッカロマイセス属又はクルイベロマイセス属の酵母を好適に挙げることができ、サッカロマイセス・セレビシエ又はクルイベロマイセス・マルシアヌスをより好適に挙げることができる。また、本発明における酵母には、これらの酵母の変異株も含まれる。
【００１５】
本発明において、水溶液としては、界面活性剤とを含有し、ｐＨが６．１〜１３．０であるかぎり特に制限されないが、かかるｐＨとしては好ましくは６．４〜１０．８、より好ましくは７．０〜１０．５を挙げることができる。
【００１６】
水溶液としてはｐＨの変動を抑制するために緩衝液を用いてもよい。かかる緩衝液としては特に制限されないが、トリス（（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎ）塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、ＭＥＳ（２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ＨｙｄｒｏｘｙＥｔｈｙｌ）−１−ＰｉｐｅｒａｚｉｎｅＥｔｈａｎｅＳｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）緩衝液、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ＴＥＡ（Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ−ＥＤＴＡ）緩衝液、Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液等を挙げることができる。また、Ｔｒｉｚｍａ  Ｂａｓｅを水に溶解したＴｒｉｓ溶液を用いてもよい。
【００１７】
水溶液として緩衝液を用いる場合、緩衝液の濃度としては特に制限されないが、より緩衝液のｐＨを維持する観点から０．０２〜１Ｍ、好ましくは０．０５〜０．５Ｍ、より好ましくは０．０８〜０．１５Ｍを挙げることができる。また、水溶液としてＴｒｉｓ溶液を用いる場合、Ｔｒｉｚｍａ  Ｂａｓｅの濃度としては０．０２〜１Ｍ、好ましくは０．０５〜０．５Ｍ、より好ましくは０．０８〜０．１５Ｍを挙げることができる。
【００１８】
水溶液中に含有する界面活性剤の濃度としては、好ましくは０．１〜３％、より好ましくは０．５〜１．５％、さらに好ましくは０．８〜１．２％を挙げることができる。界面活性剤の種類としては、エーテル系界面活性剤であることが好ましく、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、又はポリエチレングリコール−ｐ−オクチルフェニルエーテルであることが好ましく、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（登録商標）、又はＮＰ−４０（商標）がより好ましい。
【００１９】
酵母と水溶液とを接触させて静置又は撹拌する時間としては特に制限されないが、３０秒以上が好ましく、静置又は撹拌する温度に応じて１分〜９６時間でもよく、５分〜２４時間でもよく、２０分〜１２時間でもよく、１時間〜６時間でもよい。なお、酵母と水溶液とを接触させて静置する場合には、一旦酵母と水溶液とを接触させて撹拌後に静置することが、ポリペプチドの抽出効率を高める観点から好ましい。
【００２０】
上記静置又は撹拌する際の温度としては特に制限されないが、２０〜９５℃であることが好ましく、よりポリペプチドを短時間で抽出するためには４０〜９５℃とすることができる。
【００２１】
酵母と水溶液とを接触させる前に、予め酵母を洗浄液で洗浄することが、菌体や培養液による水溶液のｐＨの変動を抑制する観点で好ましい。洗浄液としては特に限定されないが、その後の工程で酵母と接触させて静置又は撹拌するのに用いる水溶液や、かかる水溶液において界面活性剤を含有していない水溶液を挙げることができる。また、酵母を洗浄する方法としては、培養した酵母を遠心等によって沈殿させ、上清を除いたうえで洗浄液を加えて撹拌した後に洗浄液を除く方法を挙げることができる。
【００２２】
抽出するポリペプチドとしては、２以上のアミノ酸がペプチド結合を形成して重合されたものであればよく、タンパク質、ペプチドホルモン、エピトープ等を挙げることができる。タンパク質としては特に制限されないが、親水性タンパク質であることが好ましく、親水性の酵素、蛍光タンパク質、構造タンパク質、金属結合タンパク質、補因子タンパク質等を挙げることができる。
【００２３】
抽出するポリペプチドの分子量としては特に制限されないが、１０００〜５０００００を挙げることができる。
【実施例１】
【００２４】
［サッカロマイセス・セレビシエからの抽出−水溶液のみ］
赤色蛍光タンパク質を発現するサッカロマイセス・セレビシエを培養し、様々な水溶液による酵母からの赤色蛍光タンパク質の抽出を行った。
【００２５】
（ＭＯＰＳ緩衝液の調整）
ｐＨ４，５，６：２０．９ｇのＭＯＰＳを約８０ｍＬの水に溶解し、ｐＨを測定しながらＮａＯＨで各ｐＨに調整した。調整後、１００ｍＬにメスアップして１Ｍ  ＭＯＰＳ緩衝液を得た。使用時に、９００μＬの蒸留水に１００μＬの前記１Ｍ  ＭＯＰＳ緩衝液を加えて０．１Ｍ  ＭＯＰＳ緩衝液を調整した。
【００２６】
（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液の調整）
ｐＨ７，８，９，１０：１２．１ｇのＴｒｉｚｍａ  Ｂａｓｅ（シグマアルドリッチ社製）を約８０ｍＬの水に溶解し、ｐＨを測定しながらＨＣｌで各ｐＨに調整した。調整後、１００ｍＬにメスアップして１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を得た。使用時に、９００μＬの蒸留水に１００μＬの前記１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を加えて０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を調整した。
【００２７】
（Ｔｒｉｓ溶液の調整）
ｐＨ１０．５：１２．１ｇのＴｒｉｚｍａ  Ｂａｓｅを水に溶解し１００ｍＬにメスアップして１Ｍ  Ｔｒｉｓ溶液を得た。使用時に、９００μＬの蒸留水に１００μＬの前記１Ｍ  Ｔｒｉｓ溶液を加えて、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ溶液を調整した。
【００２８】
（サッカロマイセス・セレビシエの培養及びタンパク質抽出）
２５０ｍＬ容量のバッフル付三角フラスコに、酵母用培地（国際公開第２０１４／０３０７７４号パンフレット）においてウラシルを欠損させた培地５０ｍＬを用意し、かかる培地にｙＥｍＲＦＰ−６ＨＩＳを発現するサッカロマイセス・セレビシエＲＡＫ１２９８７を植菌した。サッカロマイセス・セレビシエＲＡＫ１２９８７はサッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１株にｙＥｍＲＦＰ−６ＨＩＳ遺伝子を含むサッカロマイセス・セレビシエの２μｍプラスミドを導入して作製した。かかるサッカロマイセス・セレビシエＲＡＫ１２９８７を３０℃のインキュベータ内で１５０ｒｐｍの速度で１日振とう培養した。培養液１ｍＬを１．５ｍＬチューブに移して１２０００ｒｐｍ  ５分遠心し、上清を捨てて集菌した。集菌した菌体に上記で調整した各ｐＨのＭＯＰＳ緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、又はＴｒｉｓ溶液を洗浄液として加えて撹拌し、その後洗浄液を除去して菌体を洗浄し、さらに再度各ｐＨのＭＯＰＳ緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、又はＴｒｉｓ溶液を３００μＬ加え、撹拌後に５０℃で３０分静置した。なお、ＲＦＰは分子量２７０００の親水性赤色蛍光タンパク質である。また、コントロールとして、蒸留水（ＤＷ）を用いて同様の操作を行った。結果を図１に示す。
【００２９】
図１から明らかなように、いずれのｐＨの緩衝液又は溶液を用いても緩衝液又は溶液は透明であると共に菌体に赤色が残っており、サッカロマイセス・セレビシエから赤色蛍光タンパク質は抽出されなかった。
【００３０】
［サッカロマイセス・セレビシエからの抽出−界面活性剤含有水溶液］
界面活性剤を含有する緩衝液又は溶液を用いて、酵母からの赤色蛍光タンパク質の抽出を試みた。
【００３１】
（緩衝液又は溶液の調整）
蒸留水４００μＬに上記で調整した１Ｍの各ｐＨの緩衝液又は溶液を５０μＬ、１０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（和光純薬工業社製）を５０μＬ加えて１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有０．１Ｍ各ｐＨの緩衝液又は溶液を調整した。
【００３２】
また、蒸留水９００μＬに上記で調整した１Ｍの各ｐＨの緩衝液又は溶液を１００μＬ加えて０．１Ｍの各ｐＨの緩衝液又は溶液を調整した。かかる調整した０．１Ｍの各ｐＨの緩衝液又は溶液のうち３００μＬに３μＬの１００％ＮＰ−４０（MP Biomedicals社製）を加えて、１％ＮＰ−４０含有０．１Ｍ各ｐＨの緩衝液又は溶液を調整し、同様に３μＬの１００％Ｔｗｅｅｎ−２０（シグマアルドリッチ社製）を加えて、１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有０．１Ｍ各ｐＨの緩衝液又は溶液を調整した。
【００３３】
（サッカロマイセス・セレビシエの培養及びタンパク質抽出）
緩衝液又は溶液として１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有０．１Ｍ各ｐＨの緩衝液又は溶液、１％ＮＰ−４０含有０．１Ｍ各ｐＨの緩衝液又は溶液、又は１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有０．１Ｍ各ｐＨの緩衝液又は溶液を用いた以外は、上記と同様の方法でサッカロマイセス・セレビシエＲＡＫ１２９８７の培養、集菌、及び緩衝液又は溶液を加えた後の静置を行った。なお、コントロールとして、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％ＮＰ−４０、又は１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有蒸留水を用いて同様に操作を行った。
【００３４】
１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有０．１Ｍ各ｐＨの緩衝液又は溶液を用いた場合の結果を図２に、１％ＮＰ−４０含有０．１Ｍ各ｐＨの緩衝液又は溶液を用いた場合の結果を図３に、１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有０．１Ｍ各ｐＨの緩衝液又は溶液を用いた場合の結果を図４に示す。図２、３から明らかなように、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有０．１Ｍ各ｐＨの緩衝液又は溶液や１％ＮＰ−４０含有０．１Ｍ各ｐＨの緩衝液又は溶液を用いた場合、ｐＨ７〜１０．５での緩衝液又は溶液が赤く染色されており、サッカロマイセス・セレビシエから赤色蛍光タンパク質がほとんど緩衝液又は溶液に抽出されていることが明らかとなった。一方、図４に示すように、１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有０．１Ｍ各ｐＨの緩衝液又は溶液を用いた場合、ｐＨ７〜１０．５でも緩衝液又は溶液は透明であると共に菌体に赤色が残っており、サッカロマイセス・セレビシエから赤色蛍光タンパク質は抽出されなかった。したがって、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００やＮＰ−４０のようなエーテル系界面活性剤を含有するｐＨ７〜１０．５の緩衝液又は溶液を用いることで、サッカロマイセス・セレビシエからタンパク質を容易に抽出できることが明らかとなった。一方、エステル−エーテル系界面活性剤であるＴｗｅｅｎ−２０を含有するｐＨ７〜１０．５の緩衝液又は溶液を用いても、サッカロマイセス・セレビシエからタンパク質を抽出できないことが明らかとなった。
【実施例２】
【００３５】
［抽出したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ］
実施例１において、上記１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％ＮＰ−４０を含有するｐＨ８の緩衝液又はｐＨ１０．５の溶液を用いて抽出したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。
【００３６】
実施例１において上記１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％ＮＰ−４０を含有するｐＨ８の緩衝液又はｐＨ１０．５の溶液を加えて３０分静置後の上清２５０μＬを新しい１．５ｍＬチューブに移し、１．５ｍＬの線まで冷アセトンを加えた。１．５ｍＬチューブを上下に振とうし、１２０００ｒｐｍ  ５分遠心し、上清を捨てた。沈殿に、２×ＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を１×に調整して、２０μＬ加え、９５℃  ５分ボイルし、１５μｌ／ｌａｎｅでゲルにアプライして流した。ゲルはプレキャストゲル（スーパーセップ：和光純薬工業社製）５−２０％を用いた。結果を図５に示す。
【００３７】
図５に示すように、分子量２７０００の赤色蛍光タンパク質ＲＰＦをはじめ、様々なタンパク質がサッカロマイセス・セレビシエから緩衝液又は溶液に抽出されていることが明らかとなった。
【実施例３】
【００３８】
［抽出したタンパク質のＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ］
実施例１において、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％ＮＰ−４０を含有するｐＨ８の緩衝液又はｐＨ１０．５の溶液を用いて抽出したタンパク質をＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥによって解析した。
【００３９】
実施例１において上記１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％ＮＰ−４０を含有するｐＨ８の緩衝液又はｐＨ１０．５の溶液を加えて３０分静置後の上清５０μＬを新しい１．５ｍＬチューブに移し、２×Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒを５０μＬ加え、１５μｌ／ｌａｎｅでゲルにアプライして流した。ゲルはプレキャストゲル（スーパーセップ：和光純薬工業社製）５−２０％を用いた。
【００４０】
結果を図６に示す。図６に示すように、中央付近に赤いバンドが確認でき、赤色蛍光タンパク質ＲＰＦがサッカロマイセス・セレビシエから緩衝液又は溶液に変性することなく抽出されていることが明らかとなった。
【実施例４】
【００４１】
［抽出温度及び時間の検討］
水溶液として１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ溶液を用い、抽出温度及び時間を検討した。
【００４２】
（サッカロマイセス・セレビシエの培養及びタンパク質抽出）
２５０ｍＬ容量のバッフル付三角フラスコにＡＹＤ−Ｕ培地（５０ｍＬ）を用意し、そこにｙＥｍＲＦＰ−６ＨＩＳを発現するサッカロマイセス・セレビシエＫ７を植菌した。サッカロマイセス・セレビシエＫ７はＲＡＫ２３５９（Ano, A. et al., Biosci. Bioethanol. Biochem., 73(3):633-640(2009)）にｙＥｍＲＦＰ−６ＨＩＳ遺伝子を含むサッカロマイセス・セレビシエの２μプラスミドを導入して作製した。かかるサッカロマイセス・セレビシエＫ７を３０℃のインキュベータ内で１５０ｒｐｍの速度で１日振とう培養した。培養液１ｍＬを１．５ｍＬチューブに移して集菌した。集菌した菌体を上記０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ溶液で洗浄した後、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ溶液を３００μＬ加え、撹拌後に４、３０、５０、７０℃については３０分又は一晩（Ｏ／Ｎ：２４時間）、さらに８０、９０℃については３０分静置した。結果を図７に示す。
【００４３】
図７に示すように、５０、７０、８０、９０℃においては、わずか３０分でＴｒｉｓ溶液にタンパク質が抽出されており、３０℃でも一晩静置すればＴｒｉｓ溶液にタンパク質が抽出されることが明らかとなった。
【００４４】
（抽出したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
図７に示すそれぞれのＴｒｉｓ溶液の上清について、上記と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。結果を図８に示す。
【００４５】
図８に示すように、分子量２７０００の位置に太いバンドが確認でき、赤色蛍光タンパク質ＲＰＦがサッカロマイセス・セレビシエからＴｒｉｓ溶液に抽出されていることが明らかとなった。
【実施例５】
【００４６】
［クルイベロマイセス・マルシアヌスからの抽出−界面活性剤含有水溶液］
実施例１においてはサッカロマイセス・セレビシエを用いたが、クルイベロマイセス・マルシアヌスを用いても同様にタンパク質を抽出できるかを調べた。
【００４７】
サッカロマイセス・セレビシエの代わりにクルイベロマイセス・マルシアヌス（ｙＥｍＲＦＰ発現株）を用い、実施例１と同様に緩衝液又は溶液のみ、界面活性剤含有の緩衝液又は溶液を用いてタンパク質の抽出を試みた。
【００４８】
緩衝液又は溶液のみを用いた場合の結果を図９に、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有０．１Ｍ各ｐＨの緩衝液又は溶液を用いた場合の結果を図１０に、１％ＮＰ−４０含有０．１Ｍ各ｐＨの緩衝液又は溶液を用いた場合の結果を図１１に、１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有０．１Ｍ各ｐＨの緩衝液又は溶液を用いた場合の結果を図１２に示す。
【００４９】
図１０、１１に示すように、クルイベロマイセス・マルシアヌスにおいても、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有０．１Ｍ各ｐＨの緩衝液又は溶液、及び１％ＮＰ−４０含有０．１Ｍ各ｐＨの緩衝液又は溶液を用いた場合、ｐＨ７〜１０．５での緩衝液又は溶液が赤く染色されており、クルイベロマイセス・マルシアヌスから赤色蛍光タンパク質がほとんどの緩衝液又は溶液に抽出されていることが明らかとなった。一方、図１２に示すように、１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有０．１Ｍ各ｐＨの緩衝液又は溶液を用いた場合、ｐＨ７〜１０．５でも緩衝液又は溶液は透明であると共に菌体に赤色が残っており、クルイベロマイセス・マルシアヌスから赤色蛍光タンパク質は抽出されなかった。したがって、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００又はＮＰ−４０のようなエーテル系界面活性剤を含有するｐＨ７〜１０．５の緩衝液又は溶液を用いることで、クルイベロマイセス・マルシアヌスからタンパク質を容易に抽出できることが明らかとなった
【実施例６】
【００５０】
［抽出前後の酵母の観察］
【００５１】
２５０ｍＬ容量のバッフル付三角フラスコにＹＰＤ培地５０ｍｌを入れ、かかる培地にｙＥｍＲＦＰ−６ＨＩＳを発現するサッカロマイセス・セレビシエＲＡＫ２０１４９を植菌した。植菌後、３０℃のインキュベータ内で１５０ｒｐｍの速度で９３時間振とう培養した。培養液１０ｍＬを１５ｍＬチューブに移して３０００ｒｐｍ  ２分遠心し、上清を捨てて集菌した。集菌した菌体に上記で調整した０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ溶液２．５ｍｌを洗浄液として加えて撹拌し、その後、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ溶液を除去して菌体を洗浄し、さらに１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ溶液を５００μＬ加え、撹拌後に５０℃で１時間静置した。撹拌後の酵母を顕微鏡（Axio Imager A1 fluorescence
microscope (Carl Zeiss社製)を用い、１００ミリ秒で設定して撮影した。結果を図１３に示す。
【００５２】
図１３に示すように、抽出前においては赤色タンパク質が細胞内のみに観察されるが、抽出後は培地全体に観察されたことから、本発明を用いることでポリペプチドを酵母から抽出可能であることが確認できた。また、抽出後において細胞内に赤色タンパク質がほとんど観察されなかったことから、単に赤色タンパク質のごく一部が細胞外に抽出されたのではなく、およそ９５％以上もの赤色タンパク質が細胞外に抽出されており、本発明の方法を用いれば、ポリペプチドの抽出効率が極めて高いことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明の酵母からポリペプチドを抽出する方法は、有用なタンパク質、ペプチドホルモン、又はエピトープの生産に利用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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