(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７０７として寄託されたラクトバチルス・カゼイ亜種カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｃａｓｅｉ）３２７株の菌体を有効成分として含む皮膚外用剤。
【請求項２】
ヒアルロン酸合成促進剤、角層形成促進剤又は皮膚常在菌叢のバランス調整剤である請求項１に記載の剤。
【請求項３】
前記菌体が、死菌体である請求項１又は２に記載の剤。
【請求項４】
シワの形成、肌ｐＨの上昇及び／又は肌水分量の低下を予防又は改善するための請求項１〜３の何れか一項に記載の剤。
【発明の詳細な説明】
【クロスリファレンス】
【０００１】
本出願は、２０１８年１２月１７日に日本国において出願された特願２０１８−２３５６９５号に基づく優先権を主張するものであり、当該出願に記載された内容は全て、参照によりそのまま本明細書に援用される。また、本願において引用した全ての特許、特許出願及び文献に記載された内容は全て、参照によりそのまま本明細書に援用される。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、植物性乳酸菌を含むスキンケア剤に関し、より詳細には、ラクトバチルス  カゼイ亜種カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｃａｓｅｉ）３２７株の菌体を含むヒアルロン酸合成促進剤、角層形成促進剤及び／又は皮膚常在菌叢のバランス調整剤等のスキンケア剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
近年、乳酸菌が免疫賦活作用など様々な機能を有することが明らかとなり、乳酸菌が注目を集めている。例えば、植物性乳酸菌であるラクトバチルス  パラカゼイＫ７１株の有する抗アレルギー作用（特許文献１）、アブラナ科植物のラクトバチルス  カゼイの特定の菌株が有する抗酸化機能（特許文献２）、微細藻類又はその処理物を含有する培地中で、特定の乳酸菌を培養して得られる発酵物を有効成分とするコラーゲン産生促進剤（特許文献３）などが報告されている。乳酸菌のスキンケア作用として、本発明者らも、ラクトバチルス  カゼイ由来の特定菌株が、経口摂取することにより肌水分の改善機能を有することを報告している（非特許文献１参照）。【０００４】
肌を滑らかにし、シワをのばすことを目的として、ヒアルロン酸が化粧品や医薬品の成分として使用されている。ヒアルロン酸は、皮膚における表皮及び真皮、軟骨、関節液などに存在する高分子多糖類であり、細胞間隙への水分の保持、組織内にゼリー状のマトリックスを形成することに基づく細胞の保持、組織の潤滑性と柔軟性の保持、機械的障害等の外力に対する抵抗、及び細菌感染の防止など、多くの機能を有している。ヒアルロン酸は、コラーゲンと共に皮膚、特に真皮中の細胞外マトリックスに多量に存在し、水分を保持する能力が非常に高く、肌のみずみずしさ、ハリ、弾力性に深く関わっている。ヒアルロン酸は、ヒアルロン酸合成酵素（Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＨＡＳ））により生成される。哺乳類のヒアルロン酸合成酵素としては、ＨＡＳ１、ＨＡＳ２及びＨＡＳ３が存在することが知られている。ＨＡＳ２はヒトの真皮における主要なヒアルロン酸合成酵素であり、保湿力の高い高分子ヒアルロン酸の合成に関与するといわれている。【０００５】
フィラグリン（Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ）は、表皮の顆粒細胞で産生される塩基性タンパク質の一種である。フィラグリンは、皮膚のバリア機能に欠かすことのできない角質層を形成するにあたり、ケラチンとともに重要な役割を担っている。また、インボルクリン（Ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ）はケラチノサイトや表皮に存在する高反応性、水溶性のタンパクでトランスグルタミナーゼの基質になる。最初に細胞質内に出現し、その後トランスグルタミナーゼの作用を受けて架橋重合する。最終的に不溶性のタンパク質となり，コーニファイドエンベロープ（ＣＥ）の形成に寄与している。コーニファイドエンベロープは角質のバリア機能に主要な役割を果たしている小器官である。このようにフィラグリンやインボルクリンは皮膚のバリア機能において，重要なタンパク質として知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓａｉｔｏ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｉｎｔａｋｅ  ｏｆ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｃａｓｅｉ  ３２７  ｏｎ  ｓｋｉｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：  ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，  ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，  ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，  ｐａｒａｌｌｅｌ−ｇｒｏｕｐ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  ｗｏｍｅｎ．  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ，  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｈｅａｌｔｈ．  Ｖｏｌ．３６（３），  ｐｐ．１１１−１２０，  ２０１７．
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第５１５０７２２号公報
【特許文献２】特開２０１５−１５６８３２号公報
【特許文献３】特開２０１５−１１７２３４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、例えば、皮膚の健全性を維持するとともにシワを抑制して美容効果を高めるための、よりよい角層形成促進剤及びヒアルロン酸合成促進剤を提供すること、を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するため、本発明者らは、表皮角化細胞を用いて植物性乳酸菌の機能を調べたところ、特定の乳酸菌を添加することによりヒアルロン酸の合成を促進し、角層形成因子発現が促進されることを見出して本発明を完成した。すなわち、本発明は以下の実施形態を含む。
（１）受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７０７として寄託されたラクトバチルス  カゼイ亜種カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ｓｕｂｓｐ．ｃａｓｅｉ）３２７株の菌体を有効成分として含むスキンケア剤。
（２）ヒアルロン酸合成促進剤、角層形成促進剤又は皮膚常在菌叢のバランス調整剤である（１）のスキンケア剤。
（３）上記菌体が、死菌体である（１）又は（２）のスキンケア剤。
（４）皮膚外用剤の形態にある、（１）〜（３）いずれかのスキンケア剤。
（５）（１）〜（４）いずれかに記載のスキンケア剤を皮膚に塗布することを特徴とするシワの形成、肌ｐＨの上昇及び／又は肌水分量の低下を予防又は改善するための非治療的方法。
（６）皮膚状態を改善する方法であって、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７０７として寄託されたラクトバチルス  カゼイ亜種カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｃａｓｅｉ）３２７株の菌体を有効成分として含む組成物を対象者の皮膚に塗布する工程を含む方法。
（７）皮膚状態の改善が、ヒアルロン酸合成促進、角層形成促進又は皮膚常在菌のバランス調整である（６）に記載の方法。
（８）対象者の皮膚のシワの形成、肌ｐＨの上昇及び／又は肌水分量の低下を予防又は改善するための（６）又（７）に記載の方法。
（９）皮膚におけるヒアルロン酸の合成若しくは角質形成の促進、又は皮膚常在菌のバランスを調整するための組成物を製造するための、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７０７として寄託されたラクトバチルス  カゼイ亜種カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｃａｓｅｉ）３２７株菌体の使用。
（１０）皮膚のシワの形成、肌ｐＨの上昇及び／又は肌水分量の低下を予防又は改善するための組成物を製造するための、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７０７として寄託されたラクトバチルス  カゼイ亜種カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｃａｓｅｉ）３２７株菌体の使用。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＦＩＧ．１Ａは、実施例１のＲＴ−ＰＣＲ実験により測定した表皮角化細胞内におけるβ−ディフェンシン３の発現量の変化を示す。ＦＩＧ．１Ｂは、同じく乳酸菌の添加濃度依存的なβ−ディフェンシン３の発現量の変化を示す。
【図２】ＦＩＧ．２Ａは、実施例１のＲＴ−ＰＣＲ実験により測定した表皮角化細胞内におけるインボルクリンの発現量の変化を示す。ＦＩＧ．２Ｂは、同じくフィラグリンの発現量の変化を示す。
【図３】ＦＩＧ．３Ａは、実施例１のＲＴ−ＰＣＲ実験により測定した表皮角化細胞内におけるＨＡＳ２の発現量の変化を示す。ＦＩＧ．３Ｂは、同じく乳酸菌の添加濃度依存的なＨＡＳ２の発現量の変化を示す。
【図４】ＦＩＧ．４Ａは、実施例１のＲＴ−ＰＣＲ実験により測定した表皮角化細胞内におけるＨＡＳ３の発現量の変化を示す。ＦＩＧ．４Ｂは、同じく乳酸菌の添加濃度依存的なＨＡＳ３の発現量の変化を示す。
【図５】図５は、実施例１のＥＬＩＳＡ法により測定した表皮角化細胞の培養上清中における乳酸菌の添加濃度依存的なβ−ディフェンシン３の産生量の変化を示す。
【図６】図６は、実施例１のＥＬＩＳＡ法により測定した表皮角化細胞の培養上清中におけるヒアルロン酸合成量の変化を示す。
【図７】図７は、実施例２で測定した表皮ブドウ球菌の生育に与える乳酸菌の影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の好適な実施形態について次の順序により説明する。
（Ｉ）植物性乳酸菌
（ＩＩ）スキンケア剤及びその作用
（ＩＩＩ）用途
（ＩＶ）美容的方法
【００１２】
（Ｉ）植物性乳酸菌
本発明に使用される植物性乳酸菌は、味噌、醤油、漬物、糠、牧草、米、麦、麦芽など加工食品を含む植物由来のものから分離され、糖質などを利用して乳酸を産生する乳酸菌である。好ましくは、米を原料とした発酵食品から分離されたラクトバチルス属に属する乳酸菌を用いることができる。例えば、米及び米加工品から分離され、抗変異原性を有する複数の植物性乳酸菌が報告されている（日本食品科学工学会誌、第４８巻、第９号、６９３〜６９６頁、２００１年）。本発明の有効成分として用いられる植物性乳酸菌は、これらの中で、亜種カゼイ３２７株又はその変異株が最も好ましい。なおここで「変異株」とは、特定の菌株に対し、当業者に周知の方法により当業者がその性質に変化を及ぼさない範囲で変異させたもの、あるいは、それと同等であると当業者が確認できるものを包含する意味である。
【００１３】
なお、ラクトバチルス  カゼイ亜種カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｃａｓｅｉ）３２７株は、平成３０年（２０１８年）５月８日（原寄託日）付で独立行政法人製品評価技術基盤機構、特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８、１２２号室）に寄託されている。受託番号は、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７０７である。（以下、本菌株を「Ｋ−１株」と称する）。
【００１４】
本発明の有効成分として用いられる乳酸菌の菌体は、生菌体及び死菌体のいずれでもよいが、例えば生菌体の増殖による異臭発生防止などを考慮すると好ましくは死菌体が用いられる。より好ましくは、上記乳酸菌を公知の加熱処理手段で殺菌して得られる加熱殺菌菌体が用いられる。加熱殺菌菌体は、上記乳酸菌を、ＭＲＳ培地（ディフコ社製）などを用いて常法に従って培養して得られた培養物から、例えば、濾過、遠心分離等の方法により菌体を回収し、水洗後、水等に懸濁して１２０℃以下（好ましくは８０〜１２０℃）、３０分以内（３秒〜３０分間）加熱処理した後、必要に応じて濃縮、乾燥することにより調製できる。また菌体を焼成、蒸煮（例えば１７０℃以下、６０分以内）に付すことによって調製してもよい。なお、上記Ｋ−１株の乳酸菌は、「植物性乳酸菌Ｋ−１」として亀田製菓株式会社お米研究所から入手可能である。このため、本発明においては、有効成分として用いられる乳酸菌として、このような市販品を用いてもよい。
【００１５】
（ＩＩ）スキンケア剤及びその作用
本明細書における「スキンケア剤」とは、上記Ｋ−１株の菌体を有効成分として含み、スキンケア作用を有する製剤又は組成物を意味する。ここで、「スキンケア」とは、典型的には、塵埃、化学物質、微生物などの環境的影響や、皮膚組織内の水、天然脂肪、電解質などの内因性物質の損失に対する障壁としての皮膚の自然な機能が強化又は再生されることをいう。本発明における、「スキンケア剤」のより具体的な態様には、「ヒアルロン酸合成促進剤」、「角層形成促進剤」及び「皮膚常在菌叢のバランス調整剤」等を含むがこれらに限定されない。また、好ましい実施形態において用いられる死菌体は、上述したスキンケア作用等の効果が期待できるだけでなく、生菌の場合、製品製造以降の配送時や陳列時に形態変化を起こす可能性があるのに対し、それ以上形態変化を起こさない死菌体は好適に使用できる。
【００１６】
「ヒアルロン酸合成促進剤」とは、主として真皮の線維芽細胞や表皮のケラチノサイト、あるいは滑膜細胞等におけるヒアルロン酸の合成を促進する製剤又は組成物であればそのメカニズムには限定されないが、哺乳動物のヒアルロン酸合成酵素であるＨＡＳ２やＨＡＳ３をコードする遺伝子の発現を促進することを通じて、ヒアルロン酸の合成を促進することが好ましい。このため、本発明のスキンケア剤は、ヒアルロン酸合成促進剤としてだけでなく、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤、特に、具体的には、ＨＡＳ２遺伝子又はＨＡＳ３遺伝子の発現促進剤としても用いることができる。本発明のヒアルロン酸合成促進剤は体内、特に皮膚のヒアルロン酸減少に伴う様々な障害、疾患、疾病等の機能低下を防止することができる。例えば、皮膚の保湿を促して皮膚のハリ及び弾力性を改善すると共に潤いを与え、皮膚の肌荒れ、シワ、かさつき等の皮膚トラブルを予防又は改善し、関節障害、関節軟膏損傷等を予防又は改善する効果を奏しうる。特に本発明のヒアルロン酸合成促進剤は、真皮のヒアルロン酸を合成する主要酵素であり、ヒアルロン酸合成酵素の中でも比較的保湿性の高い高分子ヒアルロン酸を産出するといわれるＨＡＳ２の遺伝子発現を促進することで、高い美容効果を奏しうるものである。
【００１７】
「角層形成促進剤」とは、表皮細胞の角化を促進し、健全な角層の形成を促して、外界からの刺激や生体を防御するための角層バリア機能を健全に保つ作用を有する製剤又は組成物であり、その結果、皮膚の水分保持能改善、毛穴目立ちの予防改善、シワの形成やきめ模様の減少等の皮膚老化の予防改善を図ることができると考えられる。本実施形態の角層形成促進剤は、インボルクリンの発現促進及び／又はフィラグリンの発現促進を介して角層形成を促進するため、これらのタンパク質又は遺伝子の発現促進剤として用いることもできる。
【００１８】
「皮膚常在菌叢のバランス調整剤」とは、健全な皮膚に存在する皮膚常在菌叢を維持し、外部からの病原菌の侵入を防ぐバリア機能を付与する製剤又は組成物である。皮膚常在菌叢のバランスが崩れると、常在菌の過剰増殖や他の有害菌の侵入や増殖が起こり、様々な皮膚症状が誘発される。皮膚常在菌の一つである表皮ブドウ球菌は病原性の菌、例えば黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）に対して拮抗作用を有し、そのような有害菌の増殖を阻止しうることから、表皮ブドウ球菌の生育を促進する作用は、皮膚常在菌叢のバランス調整剤としての１つの機能であると考えられる。また、表皮ブドウ球菌等の生育には影響を与えず、有害な黄色ブドウ球菌等の生育を抑制するような抗菌作用を有する物質を含む製剤又は組成物であってもよい。そのような抗菌物質として、例えば、ディフェンシンと呼ばれる抗微生物ペプチドがある。１８から４５アミノ酸からなり、６〜８個の保存されたシステイン残基を含むこのペプチドは、好中球などの免疫系の細胞や上皮細胞に存在し、微生物の細胞膜と結合することによって機能するといわれている。ヒトの上皮細胞に存在するβ−ディフェンシン３は、４５個のアミノ酸残基からなるペプチドである。広域抗菌スペクトラムを持ち、グラム陽性の黄色ブドウ球菌やグラム陰性の緑濃菌、さらにはバンコマイシン−抵抗性のエンテロコッカス・フェカリスにも有効性を示す。
【００１９】
（ＩＩＩ）用途
（各種組成物）
本発明のスキンケア剤を、例えば皮膚外用剤（外用医薬品、化粧品等）の各種組成物の形態で用いる場合、有効成分としてのＫ−１株の菌体を、乳酸菌培養の常法に従って培養し、得られた培養物から遠心分離等の集菌手段によって分離されたものをそのまま用いることができる。また、当該培養・発酵液（培養上清）、その培養物の粗精製品あるいは精製品、それらの凍結乾燥品、或いは菌体を酵素や物理的手段を用いて処理した細胞質や細胞壁画分も用いることができる。
【００２０】
一実施形態としての組成物は、有効成分である菌体又はその培養物をそのまま用いることもできるが、製剤上許容される担体等を適宜配合して、皮膚外用剤等の形態に調製されるのが好ましい。
【００２１】
なお、好ましい実施形態の組成物は、乳酸菌を死菌体で含有させることができ、該組成物の製品化に当たっては、加圧などの加熱以外の条件を適宜用いてもよい。
【００２２】
本実施形態の組成物中へのＫ−１株菌体の配合量は、一般には、組成物１００ｇ中に、菌数が１０８〜１０１１個前後（生菌数である必要はない。但し、死菌体を含む場合は、殺菌前の生菌数として計数するものとする。以下、同じ）となる量から適宜選択することができる。生菌数の測定は、菌培養用の寒天培地に希釈した試料を塗布して３７℃で培養を行い、生育したコロニー数を計測することにより算出する。この生菌数と濁度とは相関するため、予め生菌数と濁度との相関を求めておくと、生菌数の測定に代えて濁度を測定することによって上記生菌数を計数できる。以下に、各組成物の形態について具体的に説明する
【００２３】
（皮膚外用剤）
本発明のスキンケア剤を化粧品、外用医薬品、医薬部外品等の外用剤組成物とする場合は、本発明の有効成分と共に、製剤学的に許容される適当な製剤担体を用いて、一般的な外用剤組成物の形態に調製されて実用される。かかる製剤担体としては、例えば、グリセリン、ワセリン、尿素、ヒアルロン酸、ヘパリン等の保湿剤；ＰＡＢＡ誘導体（パラアミノ安息香酸、エスカロール５０７等）、桂皮酸誘導体（ネオヘリオパン、パルソールＭＣＸ、サンガードＢ等）、サリチル酸誘導体（オクチルサリチレート等）、ベンゾフェノン誘導体（ＡＳＬ−２４、ＡＳＬ−２４Ｓ等）、ジベンゾイルメタン誘導体（パルソールＡ、パルソールＤＡＭ等）、複素環誘導体（チヌビン系等）、酸化チタン等の紫外線吸収剤・散乱剤；エデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酒石酸、酒石酸ナトリウム、乳酸、リンゴ酸、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸等の金属封鎖剤；サリチル酸、イオウ、カフェイン、タンニン等の皮脂抑制剤；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、グルコン酸クロルヘキシジン等の殺菌・消毒剤；塩酸ジフェンヒドラミン、トラネキサム酸、グアイアズレン、アズレン、アラントイン、ヒノキチオール、グリチルリチン酸及びその塩、グリチルリチン酸誘導体、グリチルレチン酸等の抗炎症剤；ビタミンＡ、ビタミンＢ群（Ｂ１，Ｂ２，Ｂ６，Ｂ１２，Ｂ１５）、葉酸、ニコチン酸類、パントテン酸類、ビオチン、ビタミンＣ、ビタミンＤ群（Ｄ２，Ｄ３）、ビタミンＥ、ユビキノン類、ビタミンＫ（Ｋ１，Ｋ２，Ｋ３，Ｋ４）等のビタミン類；アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、リジン、グリシン、グルタミン、セリン、システイン、シスチン、チロシン、プロリン、アルギニン、ピロリドンカルボン酸等のアミノ酸及びその誘導体；レチノール、酢酸トコフェロール、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、コウジ酸、エラグ酸、胎盤抽出液等の美白剤；ブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、没食子酸プロピル等の抗酸化剤；塩化亜鉛、硫酸亜鉛、石炭酸亜鉛、酸化亜鉛、硫酸アルミニウムカリウム等の収斂剤；グルコース、フルクトース、マルトース、ショ糖、トレハロース、エリスリトール、マンニトール、キシリトール、ラクチトール等の糖類；甘草、カミツレ、マロニエ、ユキノシタ、芍薬、カリン、オウゴン、オウバク、オウレン、ジュウヤク、イチョウ葉等の各種植物エキス等の他、油性成分、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色素等が挙げられる。
【００２４】
これらは、添加しようとする製品種別、形態に応じて常法的に行われる加工（例えば、粉砕、製粉、洗浄、加水分解、醗酵、精製、圧搾、抽出、分画、ろ過、乾燥、粉末化、造粒、溶解、滅菌、ｐＨ調整、脱臭、脱色等を任意に選択、組合わせた処理）を行い、各種の素材から任意に選択して供すれば良い。
【００２５】
なお、各種植物からの抽出物（生薬）または動物系原料由来の添加物を、本実施形態の外用剤に供する場合、皮膚や頭髪の保護をはじめ、保湿、感触・風合いの改善、柔軟性の付与、刺激の緩和、芳香によるストレスの緩和、細胞賦活（細胞老化防止）、炎症の抑制、肌質・髪質の改善、肌荒れ防止及びその改善、発毛、育毛、脱毛防止、光沢の付与、清浄効果、疲労の緩和、血流促進、温浴効果等の美容的効果のほか、香付け、消臭、増粘、防腐、緩衝等の効果も期待できる。
【００２６】
さらにこの他にも、これまでに知られている各原料素材の様々な美容的、薬剤的効果を期待し、これらを組合わせることによって、本発明の目的とするスキンケア効果に加えて、多機能的な効果を期待した製品とすることも可能である。
【００２７】
外用剤組成物の具体例としては、化粧用クリーム類、乳液、化粧水、パック剤、スキンミルク（乳剤）、ジェル剤、パウダー、リップクリーム、口紅、アンダーメークアップ、ファンデーション、サンケア、浴用剤、ボディシャンプー、ボディリンス、石鹸、クレンジングフォーム、軟膏、貼付剤、ゼリー剤、エアゾール剤等を挙げることができる。
【００２８】
（ＩＶ）美容的方法
本発明の他の実施形態では、上述したＫ−１株の菌体を有効成分として含むスキンケア剤を皮膚に塗布することを含むシワを予防又は改善するための非治療的方法が提供される。この美容方法は、好ましくは皮膚外用剤の形態にあるスキンケア剤を皮膚に塗布することを含み、少なくとも１週間以上連続して塗布することが好ましい。本実施形態にかかる美容方法を用いることにより、本発明のスキンケア剤を使用した際に、より効果的にシワを改善することが可能となる。「連続して塗布する」とは、少なくとも皮膚上及び／又は皮膚内にＫ−１株の菌体が留まるように塗布することを意味し、１日に１回〜複数回塗布したり、１〜数日置きに塗布したりする方法も包含する。
【００２９】
本実施形態にかかる美容方法は、本発明にかかるスキンケア剤を少なくとも１週間連続して塗布することが必要であるが、それ以上の期間連続して塗布することも可能である。本発明に係るスキンケア剤は、上述したように、植物性乳酸菌を主として含有する組成物であるため、安全性が高く、長期間、連続的な使用にも優れている。
【００３０】
次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。なお、以下の実施例において、Ｋ−１株菌体の添加量を示す数値の単位％は、質量％を意味する。
【実施例】
【００３１】
［実施例１］表皮角化細胞を用いたＫ−１株菌体の機能性評価試験
（試験方法の概要）
分化誘導した表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）は、抗生物質（Ｇｉｂｃｏ（商標）Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００Ｘ））及びサプリメントＳ７を添加したＥｐｉＬｉｆｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて培養した。Ｋ−１株は、ＭＲＳ培地を用いて３７℃で２４時間培養した後、４℃冷却下で生理食塩水を用いて遠心洗浄（３０００ｒｐｍ、１０分）を４回繰り返した菌体を純水にて１０質量％の懸濁液を調製し、オートクレーブで滅菌したものを使用した。上記分化誘導した表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）に、Ｋ−１株の菌体を所定の濃度となるように混合し、２４時間培養後、回収した表皮角化細胞からＤＮＡを抽出した。ＲＴ−ＰＣＲ法により、β−ディフェンシン３、角層因子、及びヒアルロン酸合成酵素の発現量変化を解析した。一方、培養後の細胞上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法を用いて、培養上清中に分泌された、β−ディフェンシン３、及びヒアルロン酸の合成量を定量した。【００３２】
（ＲＴ−ＰＣＲ実験方法）
２４穴プレートにて細胞密度がコンフルエントになるまで表皮角化細胞（ＮＨＥＫ細胞）を、ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で培養した。これに最終濃度が１ｍＭになるようにカルシウムを添加し、２４時間分化誘導を行った。分化誘導後の細胞に対し乳酸菌Ｋ−１の菌体を、質量比でそれぞれ、０．００４％、０．０２％及び０．１％となるように添加し、さらに２４時間培養した。培養後の細胞より、ｍＲＮＡを精製した。ｍＲＮＡの精製にはＱＩＡＧＥＮ社より販売されているＱＩＡｓｈｒｅｄｅｒ及びＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いた。【００３３】
精製したｍＲＮＡを鋳型として、ＴａＫａＲａより販売されているＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。以下の表１に示した、それぞれの標的因子に対応するプライマー対を用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、相対定量にて発現量変化を解析した。ＲＴ−ＰＣＲにはＴａＫａＲａより販売されているＴＢ  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑを用いた。また、相対量変化解析のリファレンスにはＲＰＳ１８（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓ１８）の増幅結果を用いた。【００３４】
【表１】
0006805399.tif 000002
【００３５】
その結果を図１〜４に示した。図１に示すように、Ｋ−１株の菌体を０．１％添加することによりβ−ディフェンシン３の発現量が有意に増加し（ＦＩＧ．１Ａ）、この効果は、Ｋ−１株菌体濃度に依存的であった（ＦＩＧ．１Ｂ参照）。なお、ＦＩＧ．１Ａで示している値は、ｃｏｎｔｒｏｌが１に対し、０．１％Ｋ−１株菌体濃度群は１．８３９８１３であった。ＦＩＧ．１Ｂで示している値は、ｃｏｎｔｒｏｌが１に対し、０．００４％Ｋ−１株菌体濃度群は１．２４５８０７、０．０２％Ｋ−１株菌体濃度群は１．５８９２２２、０．１％Ｋ−１株菌体濃度群は１．５９４８５８であった。図２では、同様にＫ−１株の菌体を０．１％添加することによりインボルクリン（ＦＩＧ．２Ａ）及びフィラグリン（ＦＩＧ．２Ｂ）の発現量が増加した。なお、ＦＩＧ．２Ａで示している値は、ｃｏｎｔｒｏｌが１に対し、０．１％Ｋ−１株菌体濃度群は１．３１６１３であった。ＦＩＧ．２Ｂで示している値は、ｃｏｎｔｒｏｌが１に対し、０．１％Ｋ−１株菌体濃度群は１．３１６２３４であった。【００３６】
一方、図３及び図４に示すように、Ｋ−１株の菌体を０．１％添加することにより、ＨＡＳ２及びＨＡＳ３の発現も増加することが分かった。なお、ＦＩＧ．３Ａで示している値は、ｃｏｎｔｒｏｌが１に対し、０．１％Ｋ−１株菌体濃度群は１．３３５７３５であった。ＦＩＧ．３Ｂで示している値は、ｃｏｎｔｒｏｌが１に対し、０．１％Ｋ−１株菌体濃度群は１．０７８１９、０．０２％Ｋ−１株菌体濃度群は１．０７３６５４、０．１％Ｋ−１株菌体濃度群は１．２８９１２５であった。ＦＩＧ．４Ａで示している値は、ｃｏｎｔｒｏｌが１に対し、０．１％Ｋ−１株菌体濃度群は２．０３４５６３であった。ＦＩＧ．４Ｂで示している値は、ｃｏｎｔｒｏｌが１に対し、０．００４％Ｋ−１株菌体濃度群は１．０７８６９７、０．０２％Ｋ−１株菌体濃度群は１．２２０４５４、０．１％Ｋ−１株菌体濃度群は１．３４４８７３であった。【００３７】
（βディフェンシン３及びヒアルロン酸の定量）
２４穴プレートにて細胞密度がコンフルエントになるまで表皮角化細胞（ＮＨＥＫ細胞）を、ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で培養した。これに最終濃度が１ｍＭになるようにカルシウムを添加し、２４時間分化誘導を行った。分化誘導後の細胞に対し乳酸菌Ｋ−１を、質量比でそれぞれ、０．００４％、０．０２％及び０．１％となるように添加し、さらに２４時間培養した。培養後の培養上清より、β−ディフェンシン３及びヒアルロン酸を定量した。β−ディフェンシン３の検出にはＰＥＰＲＯＴＥＣＨより販売されているＥＬＩＳＡキット、Ｈｕｍａｎ  ＢＤ−３  Ｍｉｎｉ  ＥＬＩＳＡ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｋｉｔを使用し、実験方法は取り扱い説明書に準じて行った。細胞培養上清に放出されたヒアルロン酸の定量については、コスモ・バイオ株式会社より販売されている、Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用した。実験方法は取扱説明書に準じて行った。【００３８】
その結果を、図５及び図６に示す。図５に示したように、添加したＫ−１株の菌体濃度依存的にβ−ディフェンシン３産生量の増加が認められた。図５で示している値（ｐｇ／ｍｌ）は、ｃｏｎｔｒｏｌが３３２．７８２（ｐｇ／ｍｌ）に対し、０．００４％Ｋ−１株菌体濃度群は４３２．１６２（ｐｇ／ｍｌ）、０．０２％Ｋ−１株菌体濃度群は５８７．３８６（ｐｇ／ｍｌ）、０．１％Ｋ−１株菌体濃度群は５９０．７１９（ｐｇ／ｍｌ）であった。図６では、Ｋ−１株の菌体を０．１％添加することにより培養上清中のヒアルロン酸濃度が有意に上昇した。図６で示している値（ｎｇ／ｍｌ）は、ｃｏｎｔｒｏｌが７０．９３７（ｐｇ／ｍｌ）に対し、０．１％Ｋ−１株菌体濃度群は１０６．１７９（ｎｇ／ｍｌ）であった。
これらの結果より、Ｋ−１株は、β−ディフェンシン３の有する抗菌作用により、皮膚からの病原性微生物の感染防御の役割を果たすとともに、皮膚の常在菌叢のバランスを調整して皮膚のバリア機能を維持する作用を有すると考えられる。また、皮膚におけるヒアルロン酸の産生を促進して肌のみずみずしさ、ハリ、弾力を維持してシワを伸ばす作用を有すると考えられる。【００３９】
［実施例２］表皮ブドウ球菌の生育に与えるＫ−１株の影響
表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）標準菌（ＡＴＣＣ１２２２８）と、各種濃度に希釈したＫ−１株の菌体とを混合し、３７℃で２４時間培養後、その一部を培養培地としてニュートリブイヨンＮｏ．２（日水製薬株式会社）プレートに播種して３７℃にて２日間培養した。プレート上に形成されたコロニー数を計数し、表皮ブドウ球菌によるＫ−１株の資化性を調べた。Ｋ−１株の菌体は、実施例１と同様の方法により１０質量％の死菌体懸濁液を調製し、終濃度が質量比でそれぞれ０．０００％、０．０２５％、０．０５０％、０．１００％となるように純水で希釈した。表皮ブドウ球菌は、２．６７×１０９ＣＦＵ／ｍＬであった凍結試料を解凍し、終濃度が３×１０６ＣＦＵ／ｍＬとなるように水で希釈して用いた。【００４０】
２４穴マイクロプレートに、４種類の濃度×３セットのＫ−１株の菌体と超純水を分注した。これに希釈した表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）を分注して３７℃にて１日培養した。培養開始から２４時間後に１２種の試料をそれぞれ、ピペッティングして１．５ｍＬのＴｕｂｅに移した。これを純水にて５０倍希釈した後、それぞれ２０μＬを採取してニュートリエントブイヨンＮｏ．２プレートに滴下し、コンラージ棒で塗り広げて３７℃で２日培養した。培養後のプレートに形成されたコロニー数を計測した結果を以下の表２に示す。また、Ｋ−１株菌体と混合して２４時間培養後の表皮ブドウ球菌の生菌濃度を図７に示す。【００４１】
図７で示す生菌濃度（×１０５ＣＦＵ／ｍＬ）は、次のように算出した。
まず、表２に示す各Ｋ−１株菌体濃度群における表皮ブドウ球菌のコロニー数の平均値（セット１から３でカウントした表皮ブドウ球菌のコロニー数の平均値）を算出した。０．０００％Ｋ−１株菌体濃度群は０、０．０２５％Ｋ−１株菌体濃度群は９．３個、０．０５０％Ｋ−１株菌体濃度群は２４．３個、および０．１００％Ｋ−１株菌体濃度群は１０４．７個であった。【００４２】
次に、下記式により、図７で示す生菌濃度を算出した。
Ｘ＝（２．５×１０３）×Ｎ  ・・・・・（式１）
（Ｘは図７で示す生菌濃度、Ｎは各Ｋ−１株菌体濃度群の表皮ブドウ球菌のコロニー数の平均値）【００４３】
図７で示す生菌濃度（×１０５ＣＦＵ／ｍＬ）は、ｃｏｎｔｒｏｌが０に対し、０．０２５％Ｋ−１株菌体濃度群は０．２３±０．０９×１０５ＣＦＵ／ｍＬ、０．０５％Ｋ−１株菌体濃度群は０．６１±０．１７×１０５ＣＦＵ／ｍＬ、および０．１％Ｋ−１株菌体濃度群は２．６２±０．７０×１０５ＣＦＵ／ｍＬであった。±の値（±０．０９、±０．１７、±０．７０）は標準偏差の値である。【００４４】
なお、式１は次のように設定した。まず、表皮ブドウ球菌を含有する溶液を２４時間培養した後、その溶液に含まれている表皮ブドウ球菌の濃度をＸ（ＣＦＵ／ｍＬ）とした。次に、Ｘ（ＣＦＵ／ｍＬ）の濃度を１／５０に希釈した。希釈後の濃度はＸ／５０（ＣＦＵ／ｍＬ）となった。この希釈後の表皮ブドウ球菌を含有する溶液を２×１０−２ｍＬ準備した。この準備した溶液に含まれる表皮ブドウ球菌の個数は（Ｘ／５０）×２×１０−２（ＣＦＵ）となった。この個数の表皮ブドウ球菌を培地に撒いてＮ個のコロニーが得られたとすると、（Ｘ／５０）×２×１０−２＝Ｎ、すなわち、Ｘ＝（２．５×１０３）×Ｎとなった。【００４５】
【表２】
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【００４６】
これらの結果より、Ｋ−１株の菌体は、濃度依存的に表皮ブドウ球菌の生育を促進することが分かった。【００４７】
［実施例３］ヒトモニター試験による肌状態改善作用の評価
（試験方法）
２７〜６０歳の健康な男性２０名を被験者として本モニター試験を行った。１０名の被験者がＫ−１塗布群（平均年齢４５歳）、１０名の被験者がプラセボ塗布群（平均年齢４４歳）と設定して、当該試験を行った。試験開始（０日）から４週間の間、合計２０名の被験者は、表３に記載の組成の洗顔料を用いて、毎日朝晩の洗顔を行った。毎回の洗顔後、Ｋ−１塗布群の被験者は表４記載の組成のジェル０．８ｇを顔に塗布し、プラセボ塗布群の被験者はＫ−１未含有の表５記載の組成のジェル０．８ｇを顔に塗布した。【００４８】
【表３】
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【００４９】
【表４】
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【００５０】
【表５】
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【００５１】
試験開始日（０日）と試験開始日から４週間目（４ｗ）に、被験者（合計２０名）は、下記測定前に表３記載の組成の洗顔料で洗顔をし、２０℃で湿度５０％の室内で２０分間の順化を行った後に、Ｃｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒ（Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ  ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ製）を用いて肌水分量測定、及びＳｋｉｎ−ｐＨ−Ｍｅｔｅｒ（Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ  ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ製）を用いて肌ｐＨ測定を行った。【００５２】
（結果）
その結果を、表６と表７に示す。肌ｐＨ測定結果を示した表６では、各投与群（各部位：左頬、右頬、額）の０週のｐＨを０として、４週のｐＨの値を相対値として示している。なお、０週のｐＨは５．７〜６．１の範囲内であった。ヒトの健康な皮膚のｐＨは、通常、弱酸性（約ｐＨ４．５〜６．０）と考えられているが、Ｋ−１塗布群では４週においても０日と比べｐＨの変化が起きなかったが、プラセボ塗布群ではｐＨの上昇が確認された。【００５３】
肌水分量測定結果を表７に示す。表７では、各投与群（各部位：左頬、右頬）の０週の測定結果を１００として、４週の値を相対値として示している。少なくとも肌の保湿の維持が確認されたＫ−１塗布群に比べ、プラセボ塗布群では、０日に比べ肌水分量の減少が確認された。【００５４】
【表６】
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【００５５】
【表７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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