(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ＥＬＩＳＡによりマウス膵ポリペプチドと結合するが、マウスペプチドＹＹと結合せず、（２）ウエスタンブロットによりマウス膵ポリペプチドは検出するが、マウスペプチドＹＹを検出せず、（３）免疫組織化学においてマウス膵ポリペプチド含有組織を検出するが、マウス膵ポリペプチド非含有組織を検出せず、（４）配列番号１で示されるアミノ酸配列を認識し、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２１７５で寄託されているハイブリドーマが産生する、抗マウス膵ポリペプチドモノクローナル抗体又はその抗原結合部位を含むフラグメント。
【請求項２】
免疫抗原として配列番号１で示される配列を有するポリペプチドでＰｐｙ欠損マウスを免疫する工程を含む請求項１に記載の抗マウス膵ポリペプチドモノクローナル抗体の作製方法。
【請求項３】
請求項１に記載の抗マウス膵ポリペプチドモノクローナル抗体又はその抗原結合部位を含むフラグメントを含有する、マウス膵ポリペプチド又はマウス膵ポリペプチド含有組織の検出用試薬。
【請求項４】
請求項１に記載の抗マウス膵ポリペプチドモノクローナル抗体又はその抗原結合部位を含むフラグメントを用いることを特徴とするマウス膵ポリペプチド又はマウス膵ポリペプチド含有組織の検出方法。
【請求項５】
前記抗マウス膵ポリペプチドモノクローナル抗体又はその抗原結合部位を含むフラグメントが標識物質によって標識されている、請求項４に記載の膵ポリペプチド又は膵ポリペプチド含有組織の検出方法。
【請求項６】
受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２１７５で寄託されている、請求項１に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
成体の血糖制御の中枢を担う膵ランゲルハンス氏島（膵島）は、主に４種類の内分泌細胞、つまりα、β、δ、ＰＰ細胞から構成される。これら膵島細胞の可塑性に関する様々な報告（非特許文献１、２）は存在するが、ＰＰ細胞については発生期から成体における正確な細胞系譜、さらに生理的な役割に関しては全く明らかになっていない。膵ポリペプチド（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ：ＰＰ）は、膵ポリペプチド、ｐｅｐｔｉｄｅ  ＹＹ（ＰＹＹ）、Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ｙから構成されるＮＰＹファミリーに属する膵島ホルモンの一つである。
【０００３】
このようなＰＰ細胞及び膵ポリペプチドの生理的な役割を解明するには、膵ポリペプチドに特異的な抗体が必要である。膵ポリペプチドに対する抗体については、報告されている（非特許文献３〜１５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２６，１６８０−１６８５，２０１１
【非特許文献２】Ｃｅｌｌ  １３８，４４９−４６２，２００９
【非特許文献３】Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２５，２２１３−２２２１，１９９８
【非特許文献４】ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５（７），ｅ１６３，２００７
【非特許文献５】Ｎａｔｕｒｅ  ４６３，７７５−７８０，２０１０
【非特許文献６】Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４，３８３−３９３，２００３
【非特許文献７】Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １７，２５９１−２６０３，  ２００３
【非特許文献８】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１７，９６１−９７０，００７
【非特許文献９】Ｎａｔｕｒｅ  ２３，７１−７５，１９９９
【非特許文献１０】Ｎａｔｕｒｅ  ４６６，６２７−６３３，２００８
【非特許文献１１】ＰＮＡＳ  １０９（１０），３９１５−３９２０，２０１２
【非特許文献１２】Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６３，２２４−２３６，２０１４
【非特許文献１３】Ｎａｔｕｒｅ  ４５５（７２１３），６２７−６３２，２００８
【非特許文献１４】Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １５４（２），４４９３−４５０２，  ２１０３
【非特許文献１５】Ｃｅｌｌ  １５３，７４７−７５８，２０１３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、前記既知の抗膵ポリペプチド抗体の大部分はポリクローナル抗体であるため、再度同じ特異性を有する抗体を得ることが困難である。また、本発明者が、膵ポリペプチド遺伝子 (Ｐｐｙ)欠損マウスの膵組織切片を用いて既存の抗膵ポリペプチド抗体の免疫組織化学を行った結果、明瞭な陽性細胞が観察され、既存の抗体が膵ポリペプチドだけでなくペプチドＹＹと交差反応することが判明した。
従って、ペプチドＹＹと交差反応せず、マウス膵ポリペプチドに特異的な抗体は存在せず、かかるモノクローナル抗体の開発が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明者は、前記課題を解決すべく種々検討した結果、Ｐｐｙ欠損非ヒト動物を膵ポリペプチドで免疫して得られた抗体産生細胞を用いてハイブリドーマを得、当該ハイブリドーマから得られたモノクローナル抗体が、液相中でも免疫組織化学においてもペプチドＹＹと反応せず、膵ポリペプチドに特異的であって、膵ポリペプチドの検出に有用であることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔10〕を提供するものである。
【０００８】
〔１〕膵ポリペプチドと結合するが、ペプチドＹＹと結合しない、抗膵ポリペプチドモノクローナル抗体又はその抗原結合部位を含むフラグメント。
〔２〕（１）ＥＬＩＳＡにより膵ポリペプチドと結合するが、ペプチドＹＹと結合せず、（２）ウエスタンブロットにより膵ポリペプチドは検出するが、ペプチドＹＹを検出せず、（３）免疫組織化学において膵ポリペプチド含有組織を検出するが、膵ポリペプチド非含有組織を検出しない〔１〕記載の抗膵ポリペプチドモノクローナル抗体又はその抗原結合部位を含むフラグメント。
〔３〕配列番号１で示されるアミノ酸配列を認識するものである〔１〕又は〔２〕記載の抗膵ポリペプチドモノクローナル抗体又はその抗原結合部位を含むフラグメント。
〔４〕受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２１７５で寄託されているハイブリドーマが産生する、〔１〕又は〔２〕に記載の抗膵ポリペプチドモノクローナル抗体又はその抗原結合部位を含むフラグメント。
〔５〕免疫抗原として配列番号１で示される配列を有するポリペプチドでＰｐｙ欠損非ヒト動物を免疫する工程を含む〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の抗膵ポリペプチドモノクローナル抗体の作製方法。
〔６〕〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の抗膵ポリペプチドモノクローナル抗体又はその抗原結合部位を含むフラグメントを含有する、膵ポリペプチド又は膵ポリペプチド含有組織の検出用試薬。
〔７〕〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の抗膵ポリペプチドモノクローナル抗体又はその抗原結合部位を含むフラグメントを用いることを特徴とする膵ポリペプチド又は膵ポリペプチド含有組織の検出方法。
〔８〕前記抗膵ポリペプチドモノクローナル抗体又はその抗原結合部位を含むフラグメントが標識物質によって標識されている、〔７〕に記載の膵ポリペプチド又は膵ポリペプチド含有組織の検出方法
〔９〕〔１〕又は〔２〕に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
〔10〕受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２１７５で寄託されている、〔９〕に記載のハイブリドーマ。 
【発明の効果】
【０００９】
本発明のモノクローナル抗体は、膵ポリペプチドに特異的であって、従来の抗体が交差反応したペプチドＹＹと反応せず、かつ液相中でも免疫組織化学でも膵ポリペプチドを検出可能である。従って、本発明のモノクローナル抗体を用いれば、膵ポリペプチドの生理機能やＰＰ細胞の役割などの研究が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】Ｐｐｙ遺伝子欠損マウスの免疫に用いた合成ペプチドとキャリアタンパク質のペプチドコンジュゲーション後のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる確認結果を示す。
【図２】ＰＰペプチドとＰＹＹペプチドのウェスタンブロットの結果を示す。
【図３】Ｐｐｙ遺伝子欠損マウス（Ｐｐｙｃｒｅ／ｃｒｅ）と野生型マウス（Ｐｐｙ＋／＋）の膵島における本発明にかかるモノクローナル抗体による陽性細胞の検出結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の抗膵ポリペプチドモノクローナル抗体は、膵ポリペプチドと結合するが、ペプチドＹＹと結合しない。具体的には、（１）ＥＬＩＳＡにより膵ポリペプチドと結合するが、ペプチドＹＹと結合せず；（２）ウエスタンブロットにより膵ポリペプチドは検出するが、ペプチドＹＹを検出せず；（３）免疫組織化学において膵ポリペプチド含有組織を検出するが、膵ポリペプチド非含有組織を検出しない抗膵ポリペプチドモノクローナル抗体が好ましい。
【００１２】
ＥＬＩＳＡは、Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙの略語であり、競合法又はサンドイッチ法により膵ポリペプチドを定量できる。競合法の場合には、固相化した抗膵ポリペプチドモノクローナル抗体に検体と酵素標識抗原を添加して抗原抗体反応をさせ、洗浄後、酵素基質と反応、発色させ、吸光度を測定して検体中の抗原量を測定する。また、サンドイッチ法の場合には、固相化した抗膵ポリペプチド抗体に検体を添加して抗原抗体反応をさせる。さらに、酵素標識した第２抗膵ポリペプチド抗体を添加して抗原抗体反応させる。洗浄後、酵素基質と反応、発色させ、吸光度を測定して検体中の抗原量を測定する。本発明の抗膵ポリペプチドモノクローナル抗体は、これらのＥＬＩＳＡにより膵ポリペプチドと結合し、ペプチドＹＹと結合しないので、膵ポリペプチドのみを正確に定量できる。
【００１３】
ウエスタンブロットは、電気泳動によって分離したタンパク質を抗体で検出する方法である。本発明の抗膵ポリペプチドモノクローナル抗体は、ウエスタンブロットにより、膵ポリペプチドを検出するが、ペプチドＹＹを検出しない。
【００１４】
また、本発明の抗膵ポリペプチドモノクローナル抗体を用いれば、免疫組織化学において膵ポリペプチド含有膵組織を検出でき、膵ポリペプチド非含有膵組織を検出しない。より詳細には、本発明の抗膵ポリペプチドモノクローナル抗体がマウス膵ポリペプチドに対する抗体の場合、野生型マウスの膵組織切片では膵島内に陽性細胞が認められるが、Ｐｐｙ欠損マウスの膵組織切片では陽性反応が認められない。また、マウス膵ポリペプチドに対する抗体であってもヒト膵組織切片の免疫組織化学において、膵ポリペプチドを検出することが好ましい。
【００１５】
本発明の抗膵ポリペプチドモノクローナル抗体は、配列番号１で示されるポリペプチド、すなわちマウス膵ポリペプチド（ｍＰＰ）の３０から６５番目のアミノ酸を有するポリペプチド（配列番号１）を抗原として用いて得られる抗体で、これらのポリペプチドを認識する。
【００１６】
本発明の抗膵ポリペプチドモノクローナル抗体は、感作抗原として配列番号１で示されるポリペプチドを用い、抗体産生細胞としてＰｐｙ欠損非ヒト動物由来抗体産生細胞を用いて作成されたハイブリドーマが産生するものであるのが好ましい。
すなわち、本発明の抗膵ポリペプチドモノクローナル抗体は、例えば、Ｐｐｙ欠損非ヒト動物に配列番号１で示されるポリペプチドを免疫して得られた抗体産生細胞とミエローマ細胞とを細胞融合させて得られたハイブリドーマを培養することにより得ることができる。
【００１７】
感作抗原で免疫される非ヒト動物としては、Ｐｐｙ欠損非ヒト動物であればよく、例えばＰｐｙ欠損マウス等のＰｐｙ欠損哺乳動物が用いられる。Ｐｐｙ欠損マウスは、例えば、最近著しく技術的進歩がみられたゲノム編集技術によって、Ｐｐｙのコーディング領域をｃｒｅ配列によって置き換えることによって作製できる。
【００１８】
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法に従って行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４〜２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。
【００１９】
このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合を行う。好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
【００２０】
前記免疫細胞と融合すべき親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｋｅａｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｎｏｌ  １９７９；１２３：１５４８−１５５０）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９７６；６：５１１−５１９）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９７８；２７６：２６９−２７０）等が好適に使用される。
【００２１】
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １９８１；７３：３−４６）等に準じて行うことができる。
【００２２】
より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を使用することもできる。
【００２３】
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＢＳ）等の血清を添加してもよい。
【００２４】
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したポリエチレングリコール溶液（例えば平均分子量１０００〜６０００程度）を通常３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を作製する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。
【００２５】
このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。次いで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。
【００２６】
ハイブリドーマのスクリーニングは、例えば感作抗原として用いた膵ポリペプチドを用いたＥＬＩＳＡによって、膵ポリペプチドに反応するモノクローナル抗体を選抜することができる。
【００２７】
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
【００２８】
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法に従って培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
【００２９】
本発明の抗膵ポリペプチドモノクローナル抗体又はその標識体は、前記のように膵ポリペプチドに特異的に反応し、ペプチドＹＹ等と交差反応しないので、液相中及び組織中の膵ポリペプチドの検出に有用である。
本発明の抗体の標識体としては、酵素、放射性同位元素のいずれでもよい。液相中の膵ポリペプチドの検出には、ＥＬＩＳＡやウエスタンブロットが挙げられ、組織中の膵ポリペプチドの検出には免疫組織化学が挙げられる。
免疫組織化学手段としては、例えば蛍光抗体法、酵素抗体法等が用いられる。
【実施例】
【００３０】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
【００３１】
実施例１
（１）Ｐｐｙ遺伝子欠損マウスの作製
マウスＰＰペプチドをコードするマウスＰｐｙ遺伝子は、第１１番染色体に存在する。まず、Ｐｐｙ遺伝子のコーディング配列をｃｒｅ配列に置換したＰｐｙ−ｃｒｅノックインマウス（Ｐｐｙｃｒｅ／＋）を作製した。このマウスは内因性のＰｐｙ遺伝子が発現する代わりに、ｃｒｅが発現する。したがって、ノックインアレルは機能的にはＰｐｙのヌルアレルとなる。Ｐｐｙ遺伝子座にｃｒｅ配列をノックインする方法はＺＦＮ（Ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）を用いたゲノム編集（Ｇｅｕｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００９；３２５：４３３．）を用いた。内因性Ｐｐｙ遺伝子のコード領域に対し、ＰＰペプチドの第一番目のメチオニンをｃｒｅ遺伝子の第一番目のメチオニンと一致して置換させるようなターゲティングコンストラクトを準備した。
１細胞期の受精卵に対し、デザインされたＺＦＮとターゲティングコンストラクトをインジェクションし、その受精卵を偽妊娠マウスの子宮に戻し、産仔を得た。数十匹の仔の中からそのゲノム遺伝子のＰｐｙ遺伝子座を解析することにより、目的のＰｐｙ遺伝子のコード配列にｃｒｅ配列が正しくノックインされたマウス（Ｐｐｙｃｒｅ／＋）を１ライン同定した。さらに、このマウスを交配することによりＰｐｙｃｒｅ／ｃｒｅマウスを得た。このマウスがＰｐｙ遺伝子を欠損していることを、Ｐｐｙ遺伝子ｍＲＮＡを検出するin situ hybridizationにより確認した。
【００３２】
（２）感作
ＫＬＨ−ｍＰＰペプチド結合物（ｍＰＰペプチドのＮ末端にＣｙｓを有するペプチドにＫＬＨを結合）溶液とフロイントコンプリートアジュバントを体積比約１：２で混合し、エマルジョンを作製した。前述のＰＰＹノックアウトマウス（ＰＰＹｃｒｅ／ｃｒｅ）５匹に対してＫＬＨ−ペプチド溶液（２．５ｍｇ／ｍＬ）を０．０５ｍＬ／匹の割合で尾に免疫した。
さらにＫＬＨ−ｍＰＰペプチド結合物溶液０．０５ｍＬ／匹（濃度：２．５ｍｇ／ｍＬ）を使用して尾の基部に追加免疫した。
【００３３】
（３）細胞融合
１）ＳＰ２細胞（マウスミエローマ）の回収
スクレーパーを用いてＳＰ２細胞を回収し、遠心（１０００ｒｐｍ、５分）後、上清を吸引してダルベッコ改変イーグル培養液（Ｄ−ＭＥＭ）（無血清）を２０ｍＬ加え、細胞数を計測した。
２）免疫動物にイソフルランを過剰吸入させて安楽死させた。消毒用アルコールを全体にかけ、手術台に固定した。
３）マウスを開腹し、後腹膜とその周辺の脂肪組織をピンセットで切り開き、左右一対の腸骨リンパ節を回収した。
４）網を用いて、リンパ節を裏ごしした。最終的に３０ｍＬとなるように、Ｄ−ＭＥＭ（無血清）で洗いながら、チューブにリンパ球を回収した。
５）細胞融合
リンパ球：ＳＰ２細胞＝５：１の細胞比となるように４）のリンパ球のチューブにＳＰ２細胞を加えた。遠心（１２８０ｒｐｍ、１０分）後、上清を吸引し、３７℃で２分間保温した。その後ポリエチレングリコール１ｍＬを１分かけて滴下した。３７℃で２分間反応させた。Ｄ−ＭＥＭ４．５ｍＬを３分かけて滴下した。Ｄ−ＭＥＭ４．５ｍＬを２分かけて滴下した。遠心（１０００ｒｐｍ、５分）後、上清を吸引した。
６）ＨＡＴ培養液中で融合細胞を懸濁し、９６ウェルプレートに播種し、培養してハイブリドーマを選択した。
【００３４】
（４）ハイブリドーマのスクリーニング
ｉ）ＥＬＩＳＡによる一次スクリーニング
固相化抗原としては、ポジティブプレート用にＢＳＡ−マウスＰＰペプチド、ネガティブプレート用にＢＳＡ−マウスＰＹＹペプチドを用いた。ここでマウスＰＹＹペプチドのアミノ酸配列を配列番号２に示す。
１）アッセイ用プレートに抗原（３μｇ／ｍＬ）を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ.７）を用いて固相化した。
２）３７℃で６０分（もしくは、４℃で一晩）保温した。
３）抗原溶液を除去し、ブロッキング溶液（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）を１００μＬ／ウェル添加した。
４）４℃で一晩（もしくは、室温で３０分）保温した。
５）１次抗体（培養上清）にブロッキング溶液を加えて、１００μＬ／ウェル添加した。
６）室温で１時間保温した。
７）２次抗体＊）をブロッキング溶液で各２０，０００倍に希釈し、５０μＬ／ウェル添加した。
８）室温で３０分保温した。
９）発色剤（ＴＭＢＺを基質とした発色剤）を５０μＬ／ウェル添加した。
１０）吸光度を（４５０ｎｍ）測定し、候補となるウェルを３種類選択した。
【００３５】
＊２次抗体は抗マウスＩｇＧ（ＨＲＰ標識）及び抗マウスＩｇＧＬ鎖（ＨＲＰ標識）を使用した。
【００３６】
ｍＰＰに反応し、ｍＰＹＹに反応しないＥＬＩＳＡ陽性抗体が多数得られたため、各マウスより、陽性上位２０、計９６ウェルを選択し、二次スクリーニングに供した。
【００３７】
ｉｉ）目的の抗体を絞り込む二次スクリーニング
上記一次スクリーニングで得られた候補抗体を用いて、以下の二次スクリーニングを行ない、これらの条件を満たすモノクローナル抗体を３種類得た。すなわち、（１）ウエスタンブロットによりＰＰは検出するが、ＰＹＹを検出せず；（２）免疫組織化学において野生型マウス膵島のＰＰを検出するが、Ｐｐｙ欠損マウスの膵島とは交差反応しない。得られたハイブリドーマの一つを特許微生物寄託センターにＮＩＴＥ  Ｐ−０２１７５として寄託した。
【００３８】
実施例２
得られたモノクローナル抗体の特性
（１）ＥＬＩＳＡ
Ｐｐｙ遺伝子欠損マウスの免疫に用いた合成ペプチドとキャリアタンパク質のペプチドコンジュゲーションのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる確認結果を図１に示す。（方法：ＭＢＳ法、キャリアタンパク質：ＫＬＨ（免疫用）／ＢＳＡ（コンシュゲーション確認用））
得られたモノクローナル抗体はＥＬＩＳＡにおいて、ＢＳＡ−ｍＰＰに反応するが、ＢＳＡ−ｍＰＹＹには反応しなかった。
（２）ウエスタンブロット
ＥＬＩＳＡスクリーニングに用いたＢＳＡ−ｍＰＰペプチド結合物およびネガティブコントロールとしてＢＳＡ−ｍＰＹＹペプチド結合物を用いたウエスタンブロットにより、得られたモノクローナル抗体は、ｍＰＰは検出するが、ｍＰＹＹを検出しない抗体であった（図２）。
（３）免疫組織化学
得られたモノクローナル抗体を用いると、野生型マウス（Ｐｐｙ＋／＋）の膵組織切片では、膵島内に陽性細胞が認められるが、Ｐｐｙ欠損マウス（Ｐｐｙｃｒｅ／ｃｒｅ）の膵組織切片では陽性細胞が認められなかった（図３）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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