(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験試料に含有される全てのフハイカビが植物非病原性であるかどうかを判定する方法であって、以下の工程を具備する：
（ａ）０．７８５平方マイクロメートル以上７．０６５平方マイクロメートル以下の断面積を有する貫通孔を具備するフィルムの表側の面に、前記試験試料を配置する工程、
（ｂ）工程（ａ）の後、前記試験試料を６時間静置する工程、
（ｃ）工程（ｂ）の後、前記フィルムの裏面を観察する工程、および
（ｄ）工程（ｃ）において前記フィルムの裏面に偽菌糸が見いだされなかった場合には、前記試験試料に含有される全てのフハイカビが植物非病原性であると判定する工程。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記試験試料に含有されるフハイカビは、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ、およびＰｙｔｈｉｕｍ  ｉｎｆｌａｔｕｍからなる群から選択され
る少なくとも１つである。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、
前記工程（ｂ）および前記工程（ｃ）の間に、前記フィルムの裏面を菌体結合性蛍光剤に接触させる工程をさらに具備する。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、
前記フィルムの裏面が菌体結合性蛍光剤に接触される前に、前記試験試料をゲル化させる工程をさらに具備する。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、
前記工程（ｂ）の前に、前記試験試料に培地を供給する工程をさらに具備する。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、
前記培地が液体培地である。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、
前記工程（ｂ）において、前記フィルムの裏面を培地に接触させながら、前記試験試料が静置される。
【請求項８】
請求項５に記載の方法であって、
前記培地が固体培地である。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、
前記フィルムが、１０マイクロメートル以上１００マイクロメートル以下の厚みを有する。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、
前記フィルムが、複数の前記貫通孔を具備する。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、
前記試験試料が固体である。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、
前記固体が、土壌および破砕された植物からなる群から選択される少なくとも１つである。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法であって、
前記試験試料が液体である。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、
前記液体が、農業用水、水耕栽培のために用いられた液体、植物を洗浄するために使用した後の液体、植物から抽出された液体、農業資材を洗浄するために使用した後の液体、および衣類または靴を洗浄するために使用した後の液体からなる群から選択される少なくとも１つである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試験試料に含有される全てのフハイカビが植物非病原性であるかどうかを判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１は、糸状菌計量方法を開示している。図１４は、特許文献１に開示された糸状菌計量方法のために用いられる微多孔膜支持体の断面図を示す。特許文献１に開示された糸状菌計量方法は、被験材料中の糸状菌数を計量するのに短時間の培養で糸状菌を計量し、また、正確な糸状菌を計量することができる糸状菌計量方法を提供することを目的としている。この糸状菌計量方法は、液体培養で培養した糸状菌１３、または微多孔膜支持体４の微多孔膜１上で培養した糸状菌１３の複数に伸びた偽菌糸を撮像５した後、形状と面積および発光輝度を画像解析手段１０で認識し解析させることにより、糸状菌１３を短時間の培養で計量できるという作用を有する。微多孔膜１は、押さえリング２およびベース３の間に挟まれている。【０００３】
非特許文献１は、植物病原性フハイカビの１つであるPhytophthora sojaeの偽菌糸が、３マイクロメートルの貫通穴を有するＰＥＴ膜を貫通することを開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−２８７３３７号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Paul F. Morris. et. al. “Chemotropic and Contact Responses of Phytophthora sojae Hyphae to Soybean Isoflavonoids and Artificial Substrates”, Plant Physiol. (1998) 117: 1171-1178
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、試験試料に含有される全てのフハイカビが植物非病原性であるかどうかを判定する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、試験試料に含有される全てのフハイカビが植物非病原性であるかどうかを判定する方法であって、以下の工程を具備する：
（ａ）  ０．７８５平方マイクロメートル以上７．０６５平方マイクロメートル以下の断面積を有する貫通孔を具備するフィルムの表側の面に、前記試験試料を配置する工程、
（ｂ）  工程（ａ）の後、前記試験試料を静置する工程、
（ｃ）  工程（ｂ）の後、前記フィルムの裏面を観察する工程、および
（ｄ）  工程（ｃ）において前記フィルムの裏面に偽菌糸が見いだされなかった場合には、前記試験試料に含有される全てのフハイカビが植物非病原性であると判定する工程。
【発明の効果】
【０００８】
本発明は、試験試料に含有される全てのフハイカビが植物非病原性であるかどうかを判定する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、容器の断面図を示す。
【図２】図２は、フィルムの断面図を示す。
【図３】図３は、試験試料が供給された容器の断面図を示す。
【図４】図４は、植物病原性フハイカビが表面に配置されたフィルムの断面図を示す。
【図５】図５は、植物病原性フハイカビがフィルムを貫通した様子を示す断面図である。
【図６】図６は、フハイカビの培養を加速させる方法の一例の断面図を示す。
【図７】図７は、図６に続き、フハイカビの培養を加速させる方法の一例の断面図を示す。
【図８】図８は、フィルムの裏面からフハイカビを観察する様子を示す断面図である。
【図９】図９は、フィルムの裏面からフハイカビを観察する様子を示す断面図である。
【図１０】図１０は、実施例１Ａにおけるフィルムの裏面の顕微鏡写真である。
【図１１】図１１は、実施例１Ｂにおけるフィルムの裏面の顕微鏡写真である。
【図１２】図１２は、比較例１Ｃにおけるフィルムの裏面の顕微鏡写真である。
【図１３】図１３は、比較例１Ｄにおけるフィルムの裏面の顕微鏡写真である。
【図１４】図１４は、特許文献１に開示された糸状菌計量方法のために用いられる微多孔膜支持体の断面図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
まず、フハイカビが説明される。フハイカビは、植物病原性フハイカビおよび植物非病原性フハイカビの２種類のフハイカビに大別される。植物病原性フハイカビの例は、Pythium helicoides、Pythium myliotaerumまたはPythium aphanidermatumである。これらの植物病原性フハイカビは、赤焼病および根腐れ病を引き起こす。これらの植物病原性フハイカビは、まず、植物の根に感染する。次いで、これらの植物病原性フハイカビは根を腐らせる。最終的には、これらの植物病原性フハイカビは、植物を枯らす。植物非病原性フハイカビの例は、Pythium dissotocum、Pythium catenulatum、Pythium torulosum、またはPythium inflatumである。Pythium dissotocumは、植物弱病原性フハイカビとして分類され得る。本明細書においては、植物弱病原性フハイカビは、植物非病原性フハイカビに分類される。言い換えれば、用語「植物非病原性フハイカビ」は、植物弱病原性フハイカビを含む。用語「植物病原性フハイカビ」は、植物弱病原性フハイカビを含まない。
【００１１】
用語「植物病原性」とは、植物に対して病原性を有していることを意味する。用語「植物非病原性」とは、植物に対して病原性を有していないことを意味する。フハイカビが病原性を有しているとしても、植物に対して病原性を有していないのであれば、そのフハイカビは「植物非病原性」である。言い換えれば、フハイカビが植物に対して悪影響を与えないのであれば、そのフハイカビは「植物非病原性」である。用語「植物非病原性」に含まれる接頭語「非」は、「植物」を修飾しない。接頭語「非」は「病原性」を修飾する。
【００１２】
以下、本発明の実施形態が図面を参照しながら詳細に説明される。
【００１３】
（工程（ａ））
工程（ａ）では、０．７８５平方マイクロメートル以上７．０６５平方マイクロメートル以下の断面積を有する貫通孔を具備するフィルムの表側の面に、試験試料が配置される。
【００１４】
具体的には、図１に示されるように、容器１００が用意される。容器１００は、上端にフランジ１０２を具備していることが望ましい。容器１００の底面は、フィルム１０４から形成されている。フィルム１０４の材料の例は、ポリエチレンテレフタラートのような有機樹脂である。
【００１５】
図２は、フィルム１０４の断面図を示す。フィルム１０４は、表面１０４ａ、裏面１０４ｂ、および貫通孔１０４ｃを有する。本発明の特徴の１つは、貫通孔１０４ｃの断面積である。
【００１６】
貫通孔１０４ｃは、０．７８５平方マイクロメートル以上７．０６５平方マイクロメートル以下の断面積を有する。具体的には、貫通孔１０４ｃは、１マイクロメートル以上３マイクロメートル以下の直径を有する円筒の形状を有することが望ましい。これらの断面積または直径の重要性は後述される。
【００１７】
図３に示されるように、この容器１００の内部に、試験試料２００が供給される。このようにして、フィルム１０４の表面１０４ａ上に試験試料２００が配置される。本実施形態では、試験試料２００は、少なくとも１種のフハイカビを含有している。そのため、図４に示されるように、フィルム１０４の表面１０４ａ上にフハイカビ２０２が配置される。
【００１８】
試験試料２００は、固体、液体、または気体である。試験試料２００は、固体または液体であることが望ましい。固体の試験試料２００の例は、土壌または破砕された植物である。他の例は、バーミキュライト、ロックウール、またはウレタンのような農業資材である。液体の試験試料２００の例は、農業用水、水耕栽培のために用いられた溶液、植物を洗浄するために使用した後の液体、植物から抽出された液体、農業資材を洗浄するために使用した後の液体、または作業者の衣類あるいは靴を洗浄するために使用した後の液体である。
【００１９】
（工程（ｂ））
工程（ｂ）では、工程（ａ）の後、試験試料２００が所定時間の間、静置される。貫通孔１０４ｃの断面積または直径の重要性が以下、説明される。
【００２０】
工程（ｂ）においては、試験試料２００に含有される様々なフハイカビが成長する。後述される実施例および比較例においても実証されているように、貫通孔１０４ｃが０．７８５平方マイクロメートル以上７．０６５平方マイクロメートル以下の断面積を有する場合、植物病原性フハイカビ２０２は、図５に示されるように、貫通孔１０４ｃを貫通するように成長する。その結果、フィルム１０４の裏面１０４ｂに植物病原性フハイカビ２０２の偽菌糸が現れる。一方、この断面積の範囲内では、植物非病原性フハイカビは、貫通孔１０４ｃを貫通しない。そのため、植物非病原性フハイカビは、フィルム１０４の裏面１０４ｂに現れない。このようにして、植物病原性フハイカビ２０２が選択的に裏面１０４ｂに現れる。言い換えれば、植物病原性フハイカビ２０２が選択的に容器１００の外側に現れる。
【００２１】
貫通孔１０４ｃが０．７８５平方マイクロメートル未満の断面積を有する場合、植物非病原性フハイカビだけでなく植物病原性フハイカビも、貫通孔１０４ｃを貫通しない。一方、貫通孔１０４ｃが７．０６５平方マイクロメートルを超える断面積を有する場合、植物病原性フハイカビだけでなく植物非病原性フハイカビも、貫通孔１０４ｃを貫通する。従って、貫通孔１０４ｃが０．７８５平方マイクロメートル未満または７．０６５平方マイクロメートルを超える断面積を有する場合、選択性が失われる。
【００２２】
植物病原性フハイカビ２０２が選択的に容器１００の外側に現れる限り、フィルム１０４の厚みは限定されない。フィルム１０４は、１０マイクロメートル以上１００マイクロメートル以下の厚みを有し得る。図３〜図５に示されるように、フィルム１０４は複数の貫通孔１０４ｃを有することが望ましい。
【００２３】
フハイカビの培養を加速させるために、試験試料２００に培地が供給され得る。具体的には、試験試料２００を含有する容器１００の内部に培地が供給され得る。培地は液体であることが望ましい。培地は、工程（ｂ）において供給され得る。これに代えて、培地は工程（ｂ）よりも前に供給され得る。言い換えれば、培地は工程（ａ）において供給され得る。培地は工程（ａ）の前に容器１００の内部に供給されても良い。
【００２４】
図６は、フハイカビの培養を加速させる他の方法を示す。図６に示されるように、フィルム１０４の裏面１０４ｂを液体の培地３０２に接触させることが望ましい。まず、液体の培地３０２を内部に有する第２容器３００が用意される。以下、第２容器３００から区別するため、容器１００は「第１容器１００」と呼ばれる。フランジ１０２の下面が第２容器３００の上端に接触するように、第１容器１００が第２容器３００に重ね合わされる。言い換えれば、第１容器１００が第２容器３００の上端によって支持される。このようにして、液体の培地３０２がフィルム１０４の裏面１０４ｂおよび第２容器３００の底面の間に挟まれる。
【００２５】
あるいは、第１容器１００が第２容器３００に重ね合わされた後に、フィルム１０４の裏面１０４ｂおよび第２容器３００の底面の間に液体の培地３０２が供給されても良い。
【００２６】
液体の培地３０２は、フィルム１０４の裏面１０４ｂに接しているので、液体の培地３０２は貫通孔１０４ｃを通って毛細管現象により吸い上げられる。液体の培地３０２に代えて、粘性を有する固体の培地も用いられ得る。この場合、第１容器１００が第２容器３００に重ね合わされる時に、粘性を有する固体の培地が変形して貫通孔１０４ｃに浸透する。このようにして、培地３０２が容器１００の内部に到達する。容器１００の内部に到達した培地３０２により、フハイカビの培養が加速される。図６に示されるように、固体の培地３０４および液体の培地３０２の両者が用いられ得る。この場合、液体の培地３０２が固体の培地３０４およびフィルム１０４の間に挟まれる。
【００２７】
（工程（ｃ））
工程（ｃ）では、工程（ｂ）の後、フィルム１０４の裏面１０４ｂが観察される。光学顕微鏡を用いて裏面１０４ｂが観察されることが望ましい。
【００２８】
工程（ｂ）において説明されたように、植物病原性フハイカビ２０２は、フィルム１０４の裏面１０４ｂに現れる。一方、植物非病原性フハイカビは、フィルム１０４の裏面１０４ｂに現れない。このように、本発明では、植物病原性フハイカビ２０２は、フィルム１０４の裏面１０４ｂに選択的に現れる。
【００２９】
言い換えれば、植物病原性フハイカビ２０２は、貫通孔１０４ｃを貫通する。一方、植物非病原性フハイカビは、貫通孔１０４ｃを貫通しない。そのため、植物非病原性フハイカビは、フィルム１０４の裏面１０４ｂに現れない。このようにして、植物病原性フハイカビ２０２が選択的に裏面１０４ｂに現れる。言い換えれば、植物病原性フハイカビ２０２が選択的に容器１００の外側に現れる。
【００３０】
工程（ｃ）では、フィルム１０４の裏面１０４ｂに植物病原性フハイカビ２０２が現れているかどうかが観察される。
【００３１】
具体的には、以下のようにして、フィルム１０４の裏面１０４ｂに植物病原性フハイカビ２０２が現れているかどうかが観察される。
【００３２】
まず、試験試料２００がゲル化される。より詳細には、アガロース水溶液が第１容器１００に供給される。次いで、試験試料２００を含有するアガロース水溶液は撹拌される。最後に、室温で試験試料２００が静置される。このようにして、試験試料がゲル化される。
【００３３】
次に、第１容器１００が第２容器３００から引き上げられる。ゲル化の前に、第１容器１００は第２容器３００から引き上げられても良い。
【００３４】
第２容器３００から液体の培地３０２および固体の培地３０４が除去される。次いで、第２容器３００の内部に、菌体結合性蛍光剤４０２が添加される。次いで、図７に示されるように、第１容器１００は、菌体結合性蛍光剤４０２を内部に有する第２容器３００に重ね合わされる。あるいは、第１容器１００が第２容器３００に重ね合わされた後に、フィルム１０４の裏面１０４ｂおよび第２容器３００の底面の間に菌体結合性蛍光剤４０２が供給されても良い。
【００３５】
フィルム１０４の裏面１０４ｂに現れた植物病原性フハイカビ２０２の一部分は、菌体結合性蛍光剤４０２により染色される。試験試料２００はゲル化されているので、菌体結合性蛍光剤４０２は第１容器１００の内部には広がらない。従って、第１容器１００に含有されている植物非病原性フハイカビは、菌体結合性蛍光剤４０２により染色されない。
【００３６】
図８に示されるように、フィルム１０４の表面１０４ａ上に配置された光源５００を用いてフィルム１００に光を照射しながら、フィルム１０４の裏面１０４ｂの下に配置された顕微鏡６００を用いて、染色されている植物病原性フハイカビ２０２が観察される。
【００３７】
菌体結合性蛍光剤４０２に代えて、フハイカビ蛍光剤も用いられ得る。この場合、フィルム１０４の裏面１０４ｂに現れた植物病原性フハイカビ２０２の一部分２０２ａは、フハイカビ蛍光剤により染色される。図９に示されるように、フィルム１０４の裏面１０４ｂの下に配置された顕微鏡６００を用いて、フハイカビ蛍光剤により染色されている植物病原性フハイカビ２０２が観察される。
【００３８】
（工程（ｄ））
工程（ｄ）では、工程（ｃ）においてフィルム１０４の裏面１０４ｂにフハイカビの偽菌糸が見いだされなかった場合には、試験試料２００に含有される全てのフハイカビが植物非病原性であると判定される。言うまでもないが、工程（ｃ）においてフィルム１０４の裏面１０４ｂにフハイカビが見いだされた場合には、試験試料２００に含有される全てのフハイカビが植物非病原性であるとは限らないと判定される。
【００３９】
（実施例）
以下の実施例を参照しながら、本発明がさらにより詳細に説明される。
【００４０】
（Pythium torulosumの培養）
植物非病原菌の一種であるPythium torulosumが、乾燥芝草とともにコーンミール寒天培地に接種された。次いで、培地は摂氏２５度の温度下で２４時間静置された。Pythium torulosumは岐阜大学流域圏科学研究センターに所属する景山教授より与えられた。乾燥芝草は、高温高圧滅菌法で滅菌された高麗芝を摂氏６０度でおよそ２４時間かけて乾燥することにより得られた。
【００４１】
次いで、偽菌糸が付着した乾燥芝草を培地からつまみ出した。つまみ出された乾燥芝草は、ペトリ皿に含まれる純水の上面上に浮かべた。純水の容積は２０ミリリットルであった。
【００４２】
１８時間後、ペトリ皿に含まれる水が光学顕微鏡で観察された。その結果、ペトリ皿に含まれる水にPythium torulosumの遊走子が放出されていることが確認された。このようにして、Pythium torulosumを含有する水溶液が得られた。以下、この水溶液は、「植物非病原菌水溶液」と呼ばれる。
【００４３】
（培地の用意）
高温で融解されたポテトデキストロース寒天培地が第２容器３００に添加された。ポテトデキストロース寒天培地は、２５０マイクロリットルの容積を有していた。次いで、ポテトデキストロース寒天培地は室温でゲル化された。このようにして、ポテトデキストロース寒天培地ゲルが、固体の培地３０４として得られた。
【００４４】
ポテトデキストロース寒天培地ゲルを含有する第２容器３００に、３５０マイクロリットルの水耕栽培溶液（大塚ＳＡ混合溶液）が液体の培地３０２として添加された。このようにして、液体の培地３０２および固体の培地３０４を含む第２容器３００が用意された。
【００４５】
（実施例１Ａ）
図１に示される第１容器１００が用意された。この第１容器１００は、プラスチック製であった。図２に示されるように、第１容器１００の底面はポリエチレンテレフタラートフィルム１０４（ミリポア社より入手、商品名：Millicell PISP 12R 48）から形成されていた。このポリエチレンテレフタラートフィルム１０４は、３マイクロメートルの直径を有する複数の貫通孔１０４ｃを具備していた。複数の貫通孔１０４ｃは、フィルム１０４にランダムに設けられていた。ミリポア社によれば、貫通孔１０４ｃの直径は、±１０％程度の誤差を有し得る。
【００４６】
次に、図６に示されるように、第１容器１００が第２容器３００に重ねられた。フィルム１０４の裏面１０４ｂは、液体の培地３０２に接していた。続いて、第１容器１００の内部に、２００マイクロリットルの体積を有する水耕栽培溶液が添加された。さらに、２００個のPythium torulosumの遊走子を含む植物非病原菌水溶液が第１容器１００の内部に添加された。
【００４７】
第１容器１００は、摂氏２５度の温度で６時間静置された。
【００４８】
その後、第１容器１００が第２容器３００から分離された。第１容器１００の内部に含まれる植物非病原菌水溶液が除去された。次いで、第１容器１００の内部に、２％の濃度を有するアガロース水溶液が添加された。アガロース水溶液は室温でゲル化された。
【００４９】
６００ミリリットルの体積を有する菌体結合性蛍光剤（商品名：Calcofluor White (BD261195)会社名：ベクトン・ディッキンソン アンド カンパニー）が、第２容器３００の内部に添加された。菌体結合性蛍光剤の終濃度は０．００５％であった。
【００５０】
次に、再度、第１容器１００が第２容器３００に重ねられた。フィルム１０４の裏面１０４ｂは、菌体結合性蛍光剤に接していた。第１容器１００は、摂氏２５度で１０分間静置された。ゲルが第１容器１００の内部に位置しているので、菌体結合性蛍光剤は第１容器１００の内部には広がらなかった。
【００５１】
その後、第１容器１００が第２容器３００から分離された。第２容器３００の内部に含まれる菌体結合性蛍光剤が除去された。次いで、第２容器３００の内部に、緩衝液が添加された。以下の表１は、この緩衝液に含有される成分および濃度を示す。
【００５２】
【表１】
0006681556.tif 000002
【００５３】
図９に示されるように、蛍光顕微鏡６００（モレキュラーデバイスジャパン株式会社より入手、商品名：ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  ＭＩＣＲＯ）を用いて、フィルム１０４の裏面１０４ｂが観察された。表２は、蛍光顕微鏡６００に用いられたフィルタおよびレンズを示す。
【００５４】
【表２】
0006681556.tif 000003
【００５５】
図１０は、実施例１Ａにおけるフィルム１０４の裏面１０４ｂの顕微鏡写真である。図１０に見られるように、Pythium torulosumの偽菌糸が裏面１０４ｂに現れていない。これは、Pythium torulosumの偽菌糸が貫通孔１０４ｃを貫通しなかったことを意味する。
【００５６】
（実施例１Ｂ）
実施例１Ｂでは、貫通孔１０４ｃの直径が１マイクロメートルであったこと以外は、実施例１Ａと同様の実験が行われた。具体的には、ポリエチレンテレフタラートフィルム１０４（Millicell PIRP 12R 48）が用いられた。
【００５７】
図１１は、実施例１Ｂにおけるフィルム１０４の裏面１０４ｂの顕微鏡写真である。図１１に見られるように、Pythium torulosumの偽菌糸が裏面１０４ｂに現れていない。これは、Pythium torulosumの偽菌糸が貫通孔１０４ｃを貫通しなかったことを意味する。
【００５８】
（比較例１Ｃ）
比較例１Ｃでは、貫通孔１０４ｃの直径が０．４マイクロメートルであったこと以外は、実施例１Ａと同様の実験が行われた。具体的には、ポリエチレンテレフタラートフィルム１０４（Millicell PIHT 12R 48）が用いられた。
【００５９】
図１２は、比較例１Ｃにおけるフィルム１０４の裏面１０４ｂの顕微鏡写真である。図１２に見られるように、Pythium torulosumの偽菌糸は裏面１０４ｂに現れていない。これは、Pythium torulosumの偽菌糸が貫通孔１０４ｃを貫通しなかったことを意味する。
【００６０】
（比較例１Ｄ）
比較例１Ｄでは、貫通孔１０４ｃの直径が５マイクロメートルであったこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。具体的には、ポリエチレンテレフタラートフィルム１０４（Millicell PIMP 12R 48）が用いられた。
【００６１】
図１３は、比較例１Ｄにおけるフィルム１０４の裏面１０４ｂの顕微鏡写真である。図１３に見られるように、Pythium torulosumの偽菌糸が裏面１０４ｂに現れている。これは、Pythium torulosumの偽菌糸が貫通孔１０４ｃを貫通したことを意味する。
【００６２】
（比較例１Ｅ）
比較例１Ｅでは、貫通孔１０４ｃの直径が８マイクロメートルであったこと以外は、実施例１Ａと同様の実験が行われた。具体的には、ポリエチレンテレフタラートフィルム１０４（Millicell PIEP 12R 48）が用いられた。
【００６３】
（実施例２）
実施例２Ａ〜実施例２Ｂおよび比較例２Ａ〜比較例２Ｅでは、Pythium torulosumの遊走子を含有する植物非病原菌水溶液に代えて、Pythium catenulatumの遊走子を含有する植物非病原菌水溶液が用いられた。Pythium torulosumと同様、Pythium catenulatumは、植物非病原菌の１種である。Pythium catenulatumの遊走子を含有する植物非病原菌水溶液は、Pythium torulosumの遊走子を含有する植物非病原菌水溶液と同様に調製された。
【００６４】
（実施例２Ａ）
実施例２Ａでは、水溶液が、Pythium torulosumではなくPythium catenulatumを含有していたこと以外は、実施例１Ａと同様の実験が行われた。各貫通孔１０４ｃは、３マイクロメートルの直径を有していた。
【００６５】
（実施例２Ｂ）
実施例２Ｂでは、水溶液が、Pythium torulosumではなくPythium catenulatumを含有していたこと以外は、実施例１Ｂと同様の実験が行われた。各貫通孔１０４ｃは、１マイクロメートルの直径を有していた。
【００６６】
（比較例２Ｃ）
比較例２Ｃでは、水溶液が、Pythium torulosumではなくPythium catenulatumを含有していたこと以外は、比較例１Ｃと同様の実験が行われた。各貫通孔１０４ｃは、０．４マイクロメートルの直径を有していた。
【００６７】
（比較例２Ｄ）
比較例２Ｄでは、水溶液が、Pythium torulosumではなくPythium catenulatumを含有していたこと以外は、比較例１Ｄと同様の実験が行われた。各貫通孔１０４ｃは、５マイクロメートルの直径を有していた。
【００６８】
（比較例２Ｅ）
比較例２Ｅでは、水溶液が、Pythium torulosumではなくPythium catenulatumを含有していたこと以外は、比較例１Ｅと同様の実験が行われた。各貫通孔１０４ｃは、８マイクロメートルの直径を有していた。
【００６９】
（実施例３）
実施例３Ａ〜実施例３Ｂおよび比較例３Ｃ〜比較例３Ｅでは、Pythium torulosumの遊走子を含有する植物非病原菌水溶液に代えて、Pythium inflatumの遊走子を含有する植物非病原菌水溶液が用いられた。Pythium torulosumと同様、Pythium inflatumは、植物非病原菌の１種である。Pythium inflatumの遊走子を含有する植物非病原菌水溶液は、Pythium torulosumの遊走子を含有する植物非病原菌水溶液と同様に調製された。
【００７０】
（実施例３Ａ）
実施例３Ａでは、水溶液が、Pythium torulosumではなくPythium inflatumを含有していたこと以外は、実施例１Ａと同様の実験が行われた。各貫通孔１０４ｃは、３マイクロメートルの直径を有していた。
【００７１】
（実施例３Ｂ）
実施例３Ｂでは、水溶液が、Pythium torulosumではなくPythium inflatumを含有していたこと以外は、実施例１Ｂと同様の実験が行われた。各貫通孔１０４ｃは、１マイクロメートルの直径を有していた。
【００７２】
（比較例３Ｃ）
比較例３Ｃでは、水溶液が、Pythium torulosumではなくPythium inflatumを含有していたこと以外は、比較例１Ｃと同様の実験が行われた。各貫通孔１０４ｃは、０．４マイクロメートルの直径を有していた。
【００７３】
（比較例３Ｄ）
比較例３Ｄでは、水溶液が、Pythium torulosumではなくPythium inflatumを含有していたこと以外は、比較例１Ｄと同様の実験が行われた。各貫通孔１０４ｃは、５マイクロメートルの直径を有していた。
【００７４】
（比較例３Ｅ）
比較例３Ｅでは、水溶液が、Pythium torulosumではなくPythium inflatumを含有していたこと以外は、比較例１Ｅと同様の実験が行われた。各貫通孔１０４ｃは、５マイクロメートルの直径を有していた。
【００７５】
（比較例４）
比較例４Ａ〜比較例４Ｅでは、Pythium torulosumの遊走子を含有する植物非病原菌水溶液に代えて、Pythium helicoidesの遊走子を含有する植物病原菌水溶液が用いられた。Pythium torulosumとは異なり、Pythium helicoidesは、植物病原菌の１種である。Pythium helicoidesの遊走子を含有する植物病原菌水溶液は、Pythium torulosumの遊走子を含有する植物非病原菌水溶液と同様に調製された。
【００７６】
（比較例４Ａ）
比較例４Ａでは、水溶液が、Pythium torulosumではなくPythium helicoidesを含有していたこと以外は、実施例１Ａと同様の実験が行われた。各貫通孔１０４ｃは、３マイクロメートルの直径を有していた。
【００７７】
（比較例４Ｂ）
比較例４Ｂでは、水溶液が、Pythium torulosumではなくPythium helicoidesを含有していたこと以外は、実施例１Ｂと同様の実験が行われた。各貫通孔１０４ｃは、１マイクロメートルの直径を有していた。
【００７８】
（比較例４Ｃ）
比較例４Ｃでは、水溶液が、Pythium torulosumではなくPythium helicoidesを含有していたこと以外は、比較例１Ｃと同様の実験が行われた。各貫通孔１０４ｃは、０．４マイクロメートルの直径を有していた。
【００７９】
（比較例４Ｄ）
比較例４Ｄでは、水溶液が、Pythium torulosumではなくPythium helicoidesを含有していたこと以外は、比較例１Ｄと同様の実験が行われた。各貫通孔１０４ｃは、５マイクロメートルの直径を有していた。
【００８０】
（比較例４Ｅ）
比較例４Ｅでは、水溶液が、Pythium torulosumではなくPythium helicoidesを含有していたこと以外は、比較例１Ｅと同様の実験が行われた。各貫通孔１０４ｃは、８マイクロメートルの直径を有していた。
【００８１】
（比較例５）
比較例５Ａ〜比較例５Ｅでは、Pythium torulosumの遊走子を含有する植物非病原菌水溶液に代えて、Pythium myliotaerumの遊走子を含有する植物病原菌水溶液が用いられた。Pythium torulosumとは異なり、Pythium myliotaerumは、植物病原菌の１種である。Pythium myliotaerumの遊走子を含有する植物病原菌水溶液は、Pythium torulosumの遊走子を含有する植物非病原菌水溶液と同様に調製された。
【００８２】
（比較例５Ａ）
比較例５Ａでは、水溶液が、Pythium torulosumではなくPythium myliotaerumを含有していたこと以外は、実施例１Ａと同様の実験が行われた。各貫通孔１０４ｃは、３マイクロメートルの直径を有していた。
【００８３】
（比較例５Ｂ）
比較例５Ｂでは、水溶液が、Pythium torulosumではなくPythium myliotaerumを含有していたこと以外は、実施例１Ｂと同様の実験が行われた。各貫通孔１０４ｃは、１マイクロメートルの直径を有していた。
【００８４】
（比較例５Ｃ）
比較例５Ｃでは、水溶液が、Pythium torulosumではなくPythium myliotaerumを含有していたこと以外は、比較例１Ｃと同様の実験が行われた。各貫通孔１０４ｃは、０．４マイクロメートルの直径を有していた。
【００８５】
（比較例５Ｄ）
比較例５Ｄでは、水溶液が、Pythium torulosumではなくPythium myliotaerumを含有していたこと以外は、比較例１Ｄと同様の実験が行われた。各貫通孔１０４ｃは、５マイクロメートルの直径を有していた。
【００８６】
（比較例５Ｅ）
比較例５Ｅでは、水溶液が、Pythium torulosumではなくPythium myliotaerumを含有していたこと以外は、比較例１Ｅと同様の実験が行われた。各貫通孔１０４ｃは、８マイクロメートルの直径を有していた。
【００８７】
（比較例６）
比較例６Ａ〜比較例６Ｅでは、Pythium torulosumの遊走子を含有する植物非病原菌水溶液に代えて、Pythium aphanidermatumの遊走子を含有する植物病原菌水溶液が用いられた。Pythium torulosumとは異なり、Pythium aphanidermatumは、植物病原菌の１種である。Pythium aphanidermatumの遊走子を含有する植物病原菌水溶液は、Pythium torulosumの遊走子を含有する植物非病原菌水溶液と同様に調製された。
【００８８】
（比較例６Ａ）
比較例６Ａでは、水溶液が、Pythium torulosumではなくPythium aphanidermatumを含有していたこと以外は、実施例１Ａと同様の実験が行われた。各貫通孔１０４ｃは、３マイクロメートルの直径を有していた。
【００８９】
（比較例６Ｂ）
比較例６Ｂでは、水溶液が、Pythium torulosumではなくPythium aphanidermatumを含有していたこと以外は、実施例１Ｂと同様の実験が行われた。各貫通孔１０４ｃは、１マイクロメートルの直径を有していた。
【００９０】
（比較例６Ｃ）
比較例６Ｃでは、水溶液が、Pythium torulosumではなくPythium aphanidermatumを含有していたこと以外は、比較例１Ｃと同様の実験が行われた。各貫通孔１０４ｃは、０．４マイクロメートルの直径を有していた。
【００９１】
（比較例６Ｄ）
比較例６Ｄでは、水溶液が、Pythium torulosumではなくPythium aphanidermatumを含有していたこと以外は、比較例１Ｄと同様の実験が行われた。各貫通孔１０４ｃは、５マイクロメートルの直径を有していた。
【００９２】
（比較例６Ｅ）
比較例６Ｅでは、水溶液が、Pythium torulosumではなくPythium aphanidermatumを含有していたこと以外は、比較例１Ｅと同様の実験が行われた。各貫通孔１０４ｃは、８マイクロメートルの直径を有していた。
【００９３】
（比較例７）
比較例７Ａ〜比較例７Ｅでは、Pythium torulosumの遊走子を含有する植物非病原菌水溶液に代えて、Pythium torulosumの遊走子およびPythium helicoidesの遊走子の両者を含有する水溶液が用いられた。
【００９４】
（比較例７Ａ）
比較例７Ａでは、水溶液が、Pythium torulosumだけではなくPythium helicoidesをも含有していたこと以外は、実施例１Ａと同様の実験が行われた。各貫通孔１０４ｃは、３マイクロメートルの直径を有していた。
【００９５】
（比較例７Ｂ）
比較例７Ｂでは、水溶液が、Pythium torulosumだけではなくPythium helicoidesをも含有していたこと以外は、実施例１Ｂと同様の実験が行われた。各貫通孔１０４ｃは、１マイクロメートルの直径を有していた。
【００９６】
（比較例７Ｃ）
比較例７Ｃでは、水溶液が、Pythium torulosumだけではなくPythium helicoidesをも含有していたこと以外は、比較例１Ｃと同様の実験が行われた。各貫通孔１０４ｃは、０．４マイクロメートルの直径を有していた。
【００９７】
（比較例７Ｄ）
比較例７Ｄでは、水溶液が、Pythium torulosumだけではなくPythium helicoidesをも含有していたこと以外は、比較例１Ｄと同様の実験が行われた。各貫通孔１０４ｃは、５マイクロメートルの直径を有していた。
【００９８】
（比較例７Ｅ）
比較例７Ｅでは、水溶液が、Pythium torulosumだけではなくPythium helicoidesをも含有していたこと以外は、比較例１Ｅと同様の実験が行われた。各貫通孔１０４ｃは、８マイクロメートルの直径を有していた。
【００９９】
以下の表３〜表９は、実施例１Ａ〜比較例７Ｅにおいて各貫通孔１０４ｃを貫通した偽菌糸の数（以下、「侵入点数」という）を示す。
【０１００】
【表３】
0006681556.tif 000004
【０１０１】
【表４】
0006681556.tif 000005
【０１０２】
【表５】
0006681556.tif 000006
【０１０３】
【表６】
0006681556.tif 000007
【０１０４】
【表７】
0006681556.tif 000008
【０１０５】
【表８】
0006681556.tif 000009
【０１０６】
【表９】
0006681556.tif 000010
【０１０７】
表３〜表９から明らかなように、各貫通孔１０４ｃが１マイクロメートル以上３マイクロメートル以下の直径を有する場合、フィルム１０４の裏面１０４ｂに植物病原性フハイカビが現れる。一方、この直径の範囲内では、フィルム１０４の裏面１０４ｂに植物非病原性フハイカビは現れない。従って、貫通孔１０４ｃが１マイクロメートル以上３マイクロメートル以下の直径を有する場合、植物病原性フハイカビ２０２が選択的に裏面１０４ｂに現れる。言い換えれば、植物病原性フハイカビ２０２が選択的に容器１００の外側に現れる。
【０１０８】
表３〜表９から明らかなように、各貫通孔１０４ｃが０．４マイクロメートルの直径を有する場合、植物非病原性フハイカビだけでなく、植物病原性フハイカビもまた、フィルム１０４の裏面１０４ｂに現れない。
【０１０９】
表３〜表９から明らかなように、各貫通孔１０４ｃが５マイクロメートル以上の直径を有する場合、植物病原性フハイカビだけでなく、植物非病原性フハイカビもまた、フィルム１０４の裏面１０４ｂに現れる。
【０１１０】
従って、各貫通孔１０４ｃが１マイクロメートル以上３マイクロメートル以下の直径を有する場合には、植物非病原性フハイカビの偽菌糸はフィルム１０４の裏面１０４ｂに現れないが、植物病原性フハイカビの偽菌糸はフィルム１０４の裏面１０４ｂに現れる。この違いを利用して、当業者は試験試料に含有される全てのフハイカビが植物非病原性フハイカビであるかどうかを判定できる。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明は、農業用水または土壌のような試験試料に含有される全てのフハイカビが植物非病原性であるかどうかを簡単に判定するために用いられ得る。
【符号の説明】
【０１１２】
１００  第１容器
１０２  フランジ
１０４  フィルム
１０４ａ  表面
１０４ｂ  裏面
１０４ｃ  貫通孔
２００  試験試料
２０２  植物病原性フハイカビ
２０２ａ  植物病原性フハイカビの一部分
３００  第２容器
３０２  液体の培地
３０４  固体の培地
４０２  菌体結合性蛍光剤
５００  光源
６００  顕微鏡
【図１】
0006681556.tif 000011
【図２】
0006681556.tif 000012
【図３】
0006681556.tif 000013
【図４】
0006681556.tif 000014
【図５】
0006681556.tif 000015
【図６】
0006681556.tif 000016
【図７】
0006681556.tif 000017
【図８】
0006681556.tif 000018
【図９】
0006681556.tif 000019
【図１０】
0006681556.tif 000020
【図１１】
0006681556.tif 000021
【図１２】
0006681556.tif 000022
【図１３】
0006681556.tif 000023
【図１４】
0006681556.tif 000024