(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
低栄養価の培地で効率的に繁殖するのに適しており、ペントースを代謝するのに適しており、そして発酵阻害物質抵抗性を有する酵母菌株を得るプロセスであって、
ａ）野生酵母菌株とのペントースを代謝するのに適しており、そして発酵阻害物質抵抗性を有する組換え酵母菌株の交配ステップであって、ゲノムに組み込まれ、該菌株の接合形質の１つに連鎖する外来キシロースイソメラーゼ遺伝子の少なくとも１つのコピーと、Ｄ−キシルロキナーゼ遺伝子の少なくとも１つの付加的コピーとを該組換え酵母菌株が含んでいるステップであって、前記組換え酵母菌株が、CNCM（National Collection of Cultures de Microorganismes、パスツール研究所、25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex15）において、寄託番号CNCM I-4538で寄託されている酵母菌株であり、前記野生酵母菌株が寄託番号CNCM I-4839で寄託されている酵母菌株であり、
ｂ）ランダム胞子形成および／または交配による、少なくとも２サイクルのゲノムシャッフリングステップ、
ｃ）ステップｂ）で得られた集団の、キシロースを代謝する菌株の能力の基準に従った選択ステップ、ならびに
ｄ）ステップｃ）で得られた集団の、唯一の炭素源としてキシロース、ミネラル窒素源、カリウム源、リン源、硫黄源、マグネシウム源、カルシウム源、鉄源、微量元素源および水を含む窒素塩基が少ない培地である低栄養価の培地で増殖する菌株の能力の基準に従った選択ステップ、
を含み、２つの選択段階を逆にしてもよいことが留意される、プロセス。
【請求項２】
ステップｃ）が、蒸留水 1000 g/L、キシロース 70 g/L、ＹＥ  Ｊ型 5 g/L、(NH4) PO4 4.7 g/L、クエン酸 11.4 g/L、クエン酸三ナトリウム 13.5 g/L、ZnSO4 0.021 g/L、MgSO4 7H2O 1 g/L、チアミン0.018 g/L、ピリドキシン0.0053 g/L、ビオチンＫＯＨ0.0018 g/L、パントテン酸塩 0.0038 g/L、ニコチン酸 0.016 g/L、メソイノシトール 0.05 g/L、リボフラビン 0.001 g/L、パラアミノ安息香酸 0.0012 g/L、およびモノ‐ソルベートオレエート 1 g/Lを含むYFX培地での選択ステップを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
ステップｃ）が、発酵培地中において、グルコース５５ｇおよびキシロース４５ｇを前記培地１ｋｇ当たりに含む中で、少なくとも１つの交配種により、嫌気条件下で６０時間かけてエタノールに変換されるキシロースの割合の測定ステップ、ならびに、６０時間後に少なくとも７０％のキシロースをエタノールへ変換する少なくとも１つの交配種の選択ステップを含む、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項４】
ステップｄ）が、タンパク質加水分解物を含有し、窒素塩基のない低栄養価の培地での菌株の繁殖を測定することからなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項５】
該低栄養価の培地が、蒸留水 1000 g/L、キシロース 20 g/L、(NH4)2SO45 g/L、タンパク質加水分解物 3 g/L、ZnSO4 0.04 g/L、 MgSO4 7H2O 0.5 g/L、KH2PO41 g/L、 NaCl 0.1 g/L、CaCl20.1 g/L、H3BO3 0.005 g/L、CuSO4 5 H2O 0.06 g/L、KI 0.001 g/L、MnSO4 H2O 0.004 g/L、Na2MoO4 2H2O 0.002 g/L、FeCl3 0.0002 g/L、チアミン 0.07 g/L、ピリドキシン 0.002 g/L、ビオチンＫＯＨ 0.002 g/L、パントテン酸塩 0.002 g/L、ニコチン酸 0.05 g/L、メソイノシトール 0.2 g/L、リボフラビン 0.002 g/L、およびパラアミノ安息香酸 0.002 g/Lを含むPref.培地である、請求項４に記載のプロセス。
【請求項６】
GAL2遺伝子の少なくとも１つのコピーの付加による遺伝的形質転換の追加ステップを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項７】
ゲノムに組み込まれ、該菌株の接合形質の１つに連鎖する外来キシロースイソメラーゼ遺伝子の少なくとも１つのコピーと、少なくとも１つの付加的Ｄ−キシルロキナーゼ遺伝子とを含み、タンパク質加水分解物を含有し、窒素塩基のない低栄養価の培地で増殖することができる、請求項１〜６に記載のプロセスにより得ることができる、酵母であって、
寄託番号CNCM I-4749で寄託されている菌株を含む、酵母。
【請求項８】
GAL2遺伝子の少なくとも１つの付加的コピーをさらに含む、請求項７に記載の酵母。
【請求項９】
前記酵母が寄託番号CNCM I-4829で寄託されている菌株である、請求項８に記載の酵母。
【請求項１０】
発酵阻害物質に抵抗しながらペントースを代謝するのに適していることを特徴とする、請求項７〜９のいずれか一項に記載の酵母に由来する酵母菌株。
【請求項１１】
請求項１０に記載の酵母菌株の培養から得られる、酵母。
【請求項１２】
ａ）１つのキシロース源を含む培地の嫌気性または半嫌気性条件下での、請求項７に記載の酵母による発酵ステップ、
ｂ）エタノールを得るステップ、
を含む、少なくとも１つの発酵産物を生産する方法。
【請求項１３】
請求項７〜１１のいずれか一項に記載の酵母により発酵が行われる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
キシロースを含む植物由来の材料の変換および代謝のための、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の酵母の利用。
【請求項１５】
エタノールを生産するための、請求項１４に記載の利用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改良された酵母菌株のドメインに属し、特にアルコール、例えばバイオエタノールを生産するために改良された酵母菌株のドメインに属する。本発明のプロセスは、組み合わされた遺伝学的および分子生物学的技術を使用して組換え微生物を生成する。
【０００２】
化石エネルギーの費用、潜在的な供給問題および環境への影響を考慮すると、バイオ燃料を生成するためのホワイトバイオテクノロジーの選択肢を提案することは大きな課題である。植物バイオマスは、持続可能な発展において、バイオ燃料の生産に選択される再生可能な原料である。
【背景技術】
【０００３】
植物バイオマスは、トウモロコシ、サトウキビ、小麦、モロコシ、大工および家具用の木などの農業および農工業作物の余りまたは副産物に相当し得る、またはジャイアントミスカンサス、パニカムヴィルガツム（スイッチグラス）などの特定の培養ならびに短期および超短期輪作雑木林に相当し得る任意のバイオマスを意味する。植物バイオマスは、ヘキソースの豊富なセルロース、ペントースの豊富なヘミセルロース、および疎水性フェノール性化合物の重合体であるリグニンの混合物である。従来的に言えば、３つのステップが植物バイオマスのバイオエタノールへの変換に対して説明されている：
・その後のバイオマスまたはバイオマスの断片の加水分解を最適化するための機械的、化学的および／または加熱プロセスの実施による前処理；
・適切な温度およびｐＨ条件での、試薬、溶媒もしくは酵素の作用によるバイオマスまたはバイオマスの断片の加水分解。この加水分解の目的は、主な発酵性単糖類の放出である。使用される酵素は、安定で、かつ許容可能な加水分解速度で存在しなければならない。
・強く、高速で、かつ利用可能な全ての糖、すなわちＣ６（ヘキソース）糖およびＣ５（ペントース）糖の両方を使用しなければならない、発酵性糖の発酵。
【０００４】
第一および第二段階または第二および第三段階は、組み合わせることができ、または別々に実施することができる。
【０００５】
具体的には、実際の発酵ステップは、発酵を行う微生物の繁殖が先行し、その後蒸留が続く。繁殖は、一般的に液相において酵素糖化から、例えば連続的な２つの槽であって、２つ目が１つ目よりも著しく大きい槽において実施される。これらのパラメータは、様々な工業的プロセス、経験および習慣に応じて変化する。
【０００６】
プロセス全体を改善することは、ステップを組み合わせることにより、および／またはそれらを別々に改善することにより、例えば加水分解で使用される酵素もしくは発酵を担う微生物を最適化することにより行うことができる。後者の場合には、例えば糖を変換するための適合性を、特にヘキソースおよびペントースの両方の変換を可能にすることにより改善すること、および／またはリグノセルロース加水分解物もしくは発酵液中に存在する酸性度または温度などの阻害因子に対するそれらの感受性を制限することが有用である。例えば、サッカロミセス・セレビシエは、バイオエタノールの生産で一般的に使用される酵母であり、Ｄ−キシロースを代謝する能力はないが、非特異的担体を介してそれを吸収することができる。これは、Ｄ−グルコースよりもＤ−キシロースへの低い親和性を有するヘキソース輸送体により輸送される。したがって、その細胞を遺伝的に操作してそれにＤ−キシロースを代謝する能力を与えるだけでなく、それが前記糖をより効率的に吸収するように、それを変換することも魅力となり得る。
【０００７】
これらの話題の概説については、例えばla Grange et al., 2010, Appl. Microbiol. Biotechnol., 87: 1195-1208またはJordan et al., 2012, Biochem. J., 442: 241-252を参照のこと。
【０００８】
本発明は細胞の形質転換に関し、それにD-キシロースを変換する能力も与えながら代謝欠陥に対処し、そして有利には、そのような糖を吸収するそれらの特性を向上させる。
【０００９】
（最先端）
酵母の形質転換の分野では、国際公開第２０１０／０００４６４Ａ１号パンフレットは、機能性キシロースイソメラーゼをコードする外来遺伝子の導入による前記酵母の形質転換を介したＣ５糖、特にキシロースの発酵のための酵母について説明する。この場合、キシロースイソメラーゼは、クロストリジウム・フィトフェルメンタンスに由来する。
【００１０】
本出願人による国際公開第２０１２／０７２７９３Ａ１号パンフレットでは、キシロースの変換のプロセスを酵母により最適化し、産業利用に適合させようとしている。この目的のために、その出願は、任意の炭水化物（Ｄ−キシロースを含む）をキシルロース（Ｄ−キシルロース）へ変換する能力のある酵素をコードする遺伝子およびわずか１ステップで任意のペントール（キシリトールを含む）をキシルロースに変換する能力のある酵素をコードする遺伝子の発現カセットの導入を説明する。これは、そのように操作された任意の菌株を、キシロースでの増殖および／またはキシロースの発酵に特に有効にする。この文書では、例として、CNCM（Collection Nationalede Cultures de Microorganismes、パスツール研究所、25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15）において、2011年10月5日に番号I-4538で寄託された酵母菌株を説明している。
【００１１】
本出願人によりまた出願された国際公開第２０１３／１７８９１５Ａ１号パンフレットは、酵母を形質転換することにより、それらがペントースを発酵することができ、かつ少なくとも１つの発酵阻害物質に対して耐性となるように、プロセスをさらに向上させる。前記出願は、標的とする機能面（ペントースの変換）と、中間分離個体の酢酸耐性のスクリーニングとを合わせるプロセスにより、交配種酵母を取得することを説明する。この場合、「酢酸耐性」基準により選択された細胞は、多様性がほとんどない。
【００１２】
最後に、本出願人の研究からまた生じた国際公開第２０１３／１７８９１８Ａ１号パンフレットは、少なくとも１つの目的の遺伝子の、発現の接合型遺伝子座に遺伝的に連鎖する領域内での統合、その後の目的のＭＡＴａ分離個体との交配を介する、改良された酵母菌株を得る方法を確保することを目的とし、それは接合型遺伝子座に連鎖する遺伝的改変と組み合わされることが望まれる１つ以上の目的の表現型形質を提供し得るという意味を持つ。このように、遺伝的に操作された酵母菌株の胞子形成の後、遺伝子変化または変化は連帯して分離し、そして全て対応する接合型分離個体（ＭＡＴアルファ）に含まれる。具体的には、交配種の構築のための前記プロセスの使用は、この交配種の所定の形質、例えば「ペントースを代謝する能力」の形質を確実に提供する。この本来の方法は、任意の考えられ得る改善のタイプで、および単複世代交代型サイクルを有する任意の酵母菌株で、任意の遺伝子に適用可能であるという点で、いっそう興味深いものである。単複世代交代型サイクルは、半数体相と二倍体相を繰り返す生殖サイクルであり、その間検討中の生物は、半数体の状態および二倍体の状態の両方で有糸分裂により増殖することができる。
【００１３】
同様のアプローチに続いて、Demeke et al., 2013, Biotechnology for Biofuels, 6: 89では、Ｄ−キシロースおよびＬ−アラビノースの利用を可能にする遺伝子の発現カセットを、酵母ゲノムへ安定的に組み込んだ。得られた交配種はまた、変異誘発、単一のゲノムシャッフリングサイクルを受け、その後、阻害物質の豊富な培地中においてＤ−キシロースを利用する能力により選択された。著者らは繁殖の疑問を提起し、彼らが得た菌株は平均繁殖速度を有することを報告した。彼らは、遅い繁殖速度の原因となる遺伝的変化が、変異誘発およびゲノムシャッフリング中に現れたことを示唆した。これは、菌株の増殖する適応度を改善するために突然変異誘発および／またはゲノムシャッフリングの利用を奨励してはいない。
【００１４】
産業用酵母菌株を改良することを意図しているが、従来技術からの研究は、バイオ燃料産業の製造プロセスにとって重要なステップ：繁殖を有するそれ自体に関与していない。増殖（multiplication, proliferation）またはバイオマス生産とも呼ばれる繁殖は、実際の発酵段階の前にある。その目的は、発酵用のバイオマスの最適量を体系的に得ることである。これは、プロセス中に生成されたジュースを発酵する製造業者により、通常、発酵を受ける複合培地上で行われる。繁殖ジュースは、このようにペントースが豊富なジュース、ヘキソースジュース、またはペントースおよびヘキソースの混合液であり得る。この発酵培地は、迅速かつ十分な増殖を可能し、それにより体系的に満足のいく発酵を可能にするために、わずかに希釈され、栄養素が強化され、通気されることがある。窒素源およびリン源などの、ならびにミネラルなどの無機栄養素も一般的に供給され、発酵におけるよりも大きな割合である。ビタミンなどの化合物およびアミノ酸またはプリンもしくはピリミジン酸などの有機化合物の供給は、それがあまりにも高価であるため避けられる。製造業者は一般的に、培地自体による、または発酵培地のリサイクルによる供給に依存している。唯一、ビタミンの供給は、それらが変化しやすく、発生中の増殖の変動を引き起こす可能性があるので、産業的培地からの供給を確実にするために考慮することができる。
【００１５】
結果として得られる繁殖中の増殖量以上に、酵母の増殖速度も、成功した繁殖の重要なポイントである。実際、酵母の増殖速度は、繁殖の長さを制限するようになり、そして乳酸桿菌または野生酵母などの環境汚染物質による培地の相対的濃縮を制限するようになる。大きすぎる繁殖の汚染は、発酵によるエタノール生産の減収につながる。Lactrol（登録商標）またはホップの酸抽出物などの細胞増殖抑制剤を、細菌の増殖を制限するために使用することができるが、速く著しく増殖する酵母を有することは、依然として繁殖および繁殖が移行する発酵の成功の鍵である。
【００１６】
そのため、栄養必要量が可能な限り減少した、繁殖中に迅速かつ著しく増殖する酵母を有することは、産業プロセスの全体を確保するための重要なポイントであり、それが最終的に有益となることを可能にする。 
【００１７】
それらの菌株の１つの乏しい繁殖能力からのフィードバックを受けて、出願人は、遺伝的に安定を保ち、Ｄ−キシロースを利用する良好な能力を維持し、そしてリグノセルロース「ジュース」に通常存在する阻害物質に抵抗しながら、酵母菌株の繁殖する能力を大幅に向上させることを求めた。すなわち、彼らは、菌株の代謝欠陥を修復しようとしてきた。
【発明の概要】
【００１８】
この点において、本発明は、ペントースを代謝する能力を維持しながら、低栄養価の培地で効率的に繁殖し、かつ発酵阻害物質に抵抗するのに適した酵母菌株を得る方法である。効率的とは、少なくとも二つの菌株の間での比較によってであって、参照のそれは産業プロセスに対応するのに十分なバイオマスを所定時間内には産生しないと考えられることが理解される。本方法は、以下のステップ：
ａ）欠陥のない野生酵母菌株との組換え酵母菌株の交配ステップであって、ゲノムに組み込まれ、菌株の接合形質の１つのみに連鎖する外来キシロースイソメラーゼ遺伝子の少なくとも１つのコピーと、Ｄ−キシルロキナーゼ遺伝子の少なくとも１つの付加的コピーとを組換え酵母菌株が含んでいるステップ、
ｂ）ランダム胞子形成および／または交配による、少なくとも２サイクルのゲノムシャッフリングステップ、
ｃ）ステップｂ）で得られた集団の、キシロースを代謝する菌株の能力の基準に従った選択ステップ、ならびに
ｄ）ステップｃ）で得られた集団の、窒素塩基が少ない培地、低栄養価の培地で増殖する菌株の能力の基準に従った選択ステップ、
を含み、２つの選択段階を逆にしてもよいことが留意される。
【００１９】
胞子形成後に得られた中間分離個体は、例えば、従来技術により示唆されているように阻害物質耐性の能力について選択されることはなく、その代わり、融合の間での選択なしに、ゲノムシャッフリングのいくつかの段階を直接受ける。ペントースを代謝する能力は、必須であり、国際公開第２０１３／１７８９１８Ａ１号パンフレットに記載の方法による目的遺伝子の挿入により保存されることは、注目に値する。本発明による最終的な選択は、乏しい繁殖性能の原因である栄養欠乏の上昇である。
【００２０】
本発明は、本プロセスにより得られ、CNCM（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes、パスツール研究所、25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex15）において、2013年5月16日に番号I-4749で寄託された菌株に関する。 
【００２１】
有利なことに、本発明による他の菌株も、キシロースの細胞内への良好な流入を可能にするGAL2遺伝子の過剰発現を示す。過剰発現は、この遺伝子の追加のコピーを加えることにより可能になり、これは構成pADH1プロモーターに依存して追加的に行われる。後者は通常、ADH1遺伝子の発現を制御する。このようにして得られた「子」菌株は、CNCM（Collection Nationalede Cultures de Microorganismes、パスツール研究所、25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15）において、2013年12月12日に番号I-4829で寄託された。
【００２２】
本発明は、糖、特にヘキソースおよびペントースをエタノールへ変換するための、本発明の菌株の利用にも関する。
【００２３】
本発明の方法により得られた菌株の効率的な繁殖を確実にするために、本発明者らは、様々な「最小」培地を定義してきた。 
【００２４】
最小培地は、炭素源（ＣｘＨｙＯｚ）、ミネラル窒素源、カリウム源、リン源、硫黄源、マグネシウム源、カルシウム源、鉄源、微量元素源および水を含む培地である。これは、低栄養価の培地である。
【００２５】
以下の表１は、本発明者らにより使用された、低栄養価で、窒素塩基が少ない様々な培地をまとめており、「Pref.培地」は、本発明によるプロセスにおいて使用される。この培地は、本発明による菌株にとって最小培地であり得るが、本発明を満たさない菌株に対するサブ最小培地であることがわかっている。
【表１】
0006653659.tif 000002
【００２６】
我々はまた、以下について言及する：
・３０μｇ／ＬまでのRNase Aの添加により加水分解されたカンジダ・ユチリスのRNAの加水分解物３ｇ／Ｌを補足したPref.培地、残りの本文および図面においてPref+窒素塩基と呼ぶ；
・酵母エキス１０ｇ／ｋｇ、バクトペプトン１０ｇ／ｋｇ、グルコース５５ｇ／Ｌ、キシロース４５ｇ／Ｌ、酢酸塩４ｇ／Ｌを含み、ｐＨ４．４に調整されているYFI2培地；
・酵母エキス１０ｇ／Ｌ、グルコース２０ｇ／Ｌ、およびアガロース２０ｇ／Ｌを含むYEG培地。
【００２７】
したがって仮定は、得られた菌株は、バイオエタノールを生産するためにそれを使用する製造業者の複合培地で効率的に繁殖する能力を持つことになる、ということである。
【００２８】
以下の定義は、本発明をより良く理解するために与えられている。
【００２９】
語句「酵母菌株」は、酵母細胞の比較的均質な集団を意味する。酵母菌株は、クローンの単離から得られる。クローンは、単一の酵母細胞から得られた細胞の集団を生む。
【００３０】
分離は、減数分裂の終了時に、倍数性レベルが低減するときの状況に相当する。転じて、分離個体は、１より大きい倍数性レベルの細胞の減数分裂によりもたらされる生細胞である。
【００３１】
語句「由来する酵母菌株」は、１つ以上の交配により、および／または突然変異により、および／または遺伝的形質転換により得られる酵母菌株を意味する。
【００３２】
交配により得られる酵母菌株は、本発明による酵母菌株の、同じ酵母菌株との、本発明の別の酵母菌株との、または任意の他の酵母菌株との異種交配により得られる（それが交配できることを条件とし、これにより当業者は、それはMAT遺伝子座についてホモ接合性であり、そしてSTE遺伝子に変異がないことを理解する）。
【００３３】
突然変異により誘導された酵母菌株は、そのゲノム中に少なくとも１つの自然突然変異、または突然変異誘発により誘導される少なくとも１つの変異を受けた酵母菌株であってもよい。派生菌株の突然変異は、サイレントであってもなくてもよい。
【００３４】
語句「突然変異誘発」は、突然変異の出現のプロセスを示す。古典的には、２つの方法が考えられる：ランダム突然変異誘発、および挿入または特異的突然変異誘発。１つ目は、研究している生物のゲノムにランダムに突然変異を誘発する物理的処理の適用（例えばＵＶ放射）または化学的突然変異誘発剤による処理からなる。２つ目は、ゲノムの領域内または特定の遺伝子座上のいずれかにおける特異的改変（すなわち、プロモーター、遺伝子、ターミネータなど）をもたらす分子生物学的方法を利用する。遺伝子座は、染色体上の特異的かつ不変の物理的位置を意味するために使用される。
【００３５】
遺伝的形質転換により誘導された酵母菌株は、好ましくはプラスミドにより提供された、またはゲノムに直接組み込まれたDNA配列が導入された酵母菌株である。
【００３６】
ヘキソースは、６個の炭素原子を有する糖を意味するために使用され、Ｃ６糖、より単純にＣ６とも呼ばれ、炭素源として利用される。単量体型のヘキソースの主な代表例は、グルコース、フルクトース、およびガラクトースである。類推により、ペントースは５個の炭素原子を有する糖であり、Ｃ５糖またはＣ５とも呼ばれる。ペントースの主な単量体の代表例は、Ｄ−キシロースおよびＬ−アラビノースである。
【００３７】
繁殖は、増殖（multiplication, proliferation）またはバイオマス生産を意味し、発酵培地を植菌する働きをする。これは天然培地で、例えば植物バイオマス、または富栄養もしくは貧栄養合成培地の変換から行うことができる。一般的に、増殖は富栄養培地で速く、そして、培地の低栄養価（または欠陥）を克服するために細胞からの強い代謝能力を必要とする貧栄養培地では、あまり効率的ではない。植物バイオマスの変換からのリグノセルロース加水分解物は、主にペントースを含むジュース、主にヘキソースを含むジュースまたはヘキソースおよびペントースの混合物を含むジュースであり得る、複合環境である。産業的観点から、「富栄養」合成培地は、確かに繁殖に最も効率的な選択であるだろうが、それは経済的に実行可能ではないかもしれない。最小培地、すなわち必要最小限を含むことがより効率的であるだろうが、その組成を定義することは簡単ではない。これらの理由のために、および一連の産業プロセスの理由のために、繁殖は、ほとんどの場合、前のステップから得られた組成で、すなわちリグノセルロースジュースで実施される。レビューには、Bellissimi E, Richards C: Yeast propagation. In The alcohol textbook, a reference for the beverage, fuel and industrial alcohol industries. 5th edition. Edited by Ingledew WM, Kelsall DR, AustinGD, Kluhspies C. Nottingham: University Press; 2009:145-159を参照。
【００３８】
菌株の代謝欠陥は、酵母の増殖または発酵に欠陥をもたらす、１つ以上の代謝経路の障害を意味すると理解される。栄養要求性は、代謝中間体および所与の培地での酵母の発達に必須な物質を生成することができないこと、すなわち、菌株が、それに必須の全ての栄養素が外部から提供されない場合、成長しないことを意味する代謝欠陥を意味すると理解される。
【００３９】
原栄養酵母菌株は、最小培地で増殖することができる菌株である。特に、本発明の原栄養酵母菌株は、その増殖に必要な全ての窒素塩基を合成する能力がある。
【００４０】
阻害物質は、リグノセルロース加水分解物中に初めから存在する、またはアルコール発酵中に形成される阻害物質を意味することが理解され、フェノール類、フルフラールおよびその誘導体、ヒドロキシメチルフルフラールおよびその誘導体、または酢酸、ギ酸または乳酸などの弱酸が挙げられる。これらの阻害物質は、酵母の性能または生存にまでも有害であることも知られている。あるいは、浸透圧、ｐＨ値（特に強酸性）、温度（３５℃より高い）、または生成されたエタノールも、菌株の発酵能力を阻害または少なくとも制限し得る。
【００４１】
キシロースを代謝することができる酵母菌株は、キシロースをエタノールへ変換する能力のある、すなわち、キシロースを発酵する能力のある酵母菌株である。
【００４２】
キシロースのエタノールへの変換は、キシロースのキシルロースへの直接的または間接的異性化と、その後、そのようにして得られたキシルロースのペントースリン酸経路の非酸化的部分での使用により起こる。
【００４３】
本発明の意味の範囲内である、キシロースを代謝することができる酵母菌株は、グルコース５５ｇおよびキシロース４５ｇを１ｋｇ当たりに含む発酵培地中、嫌気条件下で、６０時間後に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、そしてより好ましくは少なくとも９０％のキシロースをエタノールへ変換する酵母菌株を意味する。
【００４４】
エタノールへ変換されたキシロースの割合を測定するのに使用される酵母菌株の植菌は、好ましくは０．２５ｇ乾燥物質／ｋｇ発酵培地である。
【００４５】
６０時間の継続時間は、発酵培地の酵母菌株での植菌から計算される。
【００４６】
エタノールへ変換されたキシロースの割合を測定するのに使用される発酵培地は、好ましくは合成培地であるべきである。
【００４７】
合成培地は、その正確な化学組成が知られている培地である。
【００４８】
発酵は、好ましくは３２℃で、中速で撹拌しながら、例えば９０ｒｐｍで実施されるべきである。
【００４９】
撹拌は、酸素化しないように適度である。
【００５０】
培地のｐＨは、例えば酸／塩基対の緩衝力により制御されるべきであり、例えばYFGX培地における酢酸／酢酸塩緩衝力など。
【００５１】
発酵培地中に存在するエタノールの量は、当業者に知られている任意の適切な手段により測定される。
【００５２】
これは、生産されるエタノールの直接的測定、または、質量損失など、エタノール生産に関連するパラメータを使用する間接的測定であってもよい。
【００５３】
例えば、アルコールの生産は、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）を含むクロマトグラフィー、酵素キット（例えばベーリンガーキットによるエタノールの定量）、または重クロム酸カリウムによる定量により測定され得る。
【００５４】
発酵培地中のキシロースの量は、当業者に知られている任意の適切な手段により測定され、好ましくはクロマトグラフィー、特にＨＰＬＣによる。
【００５５】
グルコースおよびキシロースの両方を含有する発酵培地を使用することにより、評価された様々な酵母菌株について、相当量のバイオマスからのキシロースのエタノールへの変換を査定することができる。実際、酵母菌株は、グルコースおよびキシロースの混合物から最初にグルコースを、その後グルコースおよびキシロースを、そしてその後にキシロースを発酵する。
【００５６】
少なくとも１つの発酵阻害物質の存在下でキシロースを代謝する能力は、前記発酵阻害物質に対する抵抗性と呼ばれる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】菌株I-4538（組換え親菌株、2011年10月5日にCNCMに寄託）、2014年3月13日に参照番号I-4839でCNCMに寄託されたEGAc1（野生親菌株）およびI-4749（本発明の菌株、2013年5月16日にCNCMに寄託）の、低栄養価でのPref.ならびにPref.+窒素塩基培地におけるそれぞれの繁殖を示している。
【図２】産業繁殖培地を模倣した合成培地での、本発明の菌株I-4749の繁殖と、親菌株I-4538の繁殖の比較を示している。
【図３】野生菌株EGAc1（I-4839）、組換え親菌株I-4538、および本発明の菌株I-4749によるエタノールの産生を示している。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
最初に、菌株I-4538は、複合培地でのその繁殖の効率に悪影響を及ぼした代謝欠陥を持っていたと思われた。前記菌株I-4538は国際公開第２０１２／０７２７９３Ａ１号パンフレットに従って得られた菌株の１つであり、キシロースイソメラーゼをコードする外来遺伝子の少なくとも１つのコピーと、キシリトールデヒドロゲナーゼをコードする１つの外因性遺伝子のコピーとを含む。それは、XKS1遺伝子の少なくとも１つのコピーと、ペントース−リン酸経路のための遺伝子とを含む。具体的に言うと、この菌株はキシロースを代謝する優れた能力を有し、フェノール性化合物、フルフラールおよび酢酸などの、バイオマスの加水分解に起因する発酵阻害物質に抵抗する。したがって、窒素塩基に乏しく、キシロースを追加的に含有する培地での繁殖段階を、その後向上させるために分析した。別名窒素塩基として知られている加水分解RNAは、菌株I-4538の増殖にとって非常に有利であるようだった。興味深いことに、この栄養要求性は、グルコースを含有する培地には存在せず、これは、生合成経路は機能しているが、キシロースを含む培地では十分に調節されていないことを示す。酵母はこの糖を自然に代謝することができないので、窒素塩基の合成に必要な遺伝子の発現が十分ではない可能性がある。さらに、菌株を得ることにつながる遺伝的形質転換およびＵＶ放射の様々な段階は、おそらくこれら欠陥の原因である。
【００５９】
最初のステップとして、菌株I-4538を、欠陥のない野生菌株とかけ合わせる（実施例および図面において、2014年3月13日に参照番号I-4839でCNCMに寄託された参照菌株EGAc1）。野生菌株は、非遺伝子組換え菌株を意味する。このステップは、その代謝欠陥が部分的に修復されたが、急速にキシロースを発酵させる能力の重要な部分を失った交配種をもたらした。
【００６０】
交配ステップは、Chapter 7, "Sporulation and Hybridization of Yeast" by R.R. Fowell, in the reference work "The Yeasts", Volume 1, published by A.H. Rose and J. S. Harrison, 1969-Academic Pressに教示されているような、従来技術に従って実施される。
【００６１】
第二のステップは、ランダムゲノム組換えであり、より具体的には、４サイクルのゲノムシャッフリングによる。サイクルは、２つのステップ間での選択なしに行われる。このステップは、Hou, 2009, Biotechnol. Lett., 31: 671-677から適応された方法に従って実施される。
【００６２】
得られた集団は、キシロースを代謝する適性の基準に従って、その後、低栄養価培地で増殖する能力、特に繁殖培地中の窒素塩基を不要にする能力の基準に従って選択される。
【００６３】
２つの選択基準を反転させてもよい。すなわち、欠乏培地で増殖する能力を最初に選択し、その後キシロースを発酵させる能力を選択するか、またはキシロースを発酵させる能力を最初に、その後欠乏培地で増殖する能力を選択することが可能である。
【００６４】
得られた菌株は、CNCM（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes、パスツール研究所、25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex15）に、番号I-4749で寄託された。
【００６５】
興味深いことに、唯一の炭素源としてキシロースを含有する培地の、窒素塩基への栄養要求性の排除は、菌株I-4749から直線的に由来する菌株へ伝えることができる。このようにして、様々な菌株を、このうち寄託された菌株I-4829を、菌株I-4749から入手した。実際、タンパク質Gal2pはヘキソースのトランスポーターであり、キシロースを輸送する能力があることが観察された（Hamacher et al. 2002, Microbiology, 148 : 2783-2788）。このように、キシロースを発酵する能力を持ち得るように作られた酵母菌株、例えばサッカロミセス・セレビシエによりキシロースの取り込みを改善することは、魅力的である。このため、強力かつ構成的プロモーター（pADH1）に依存して作られた遺伝子GAL2のコピーを、菌株のゲノムに導入した。これは、キシロースの細胞内への流入を促進するチャネルをコードする。この菌株は、本発明の酵母菌株である。この付加的な遺伝子組換えにより得られた菌株は、CNCM（Collection Nationalede Cultures de Microorganismes、パスツール研究所、25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15）に、参照番号I-4829で寄託されている。
【００６６】
酵母は、本発明の酵母菌株または本発明に由来する酵母菌株の培養により、特に"Yeast Technology", 2nd edition, 1991, G. Reed, and T.W. Nagodawithana, published by Van NostrandReinhold, ISBN 0-442-31892-8に記載されているように得られる。
【００６７】
酵母の増殖は、産業規模では、以下のステップのセットからの少なくとも最初の２つのステップを一般的に含む：
いくつかの段階における、最初は半嫌気的、その後は嫌気的な酵母菌株の増殖ステップ、
約１２〜２５％の乾燥物質を含有する液体酵母クリームを得るための、または、酵母クリームをオスモライト製品と混合する場合、より多量の乾燥材料を得るための、その培養培地から生産された酵母の遠心分離による分離ステップ、
得られた液体酵母クリームのろ過ステップであって、一般的には回転式真空フィルター上で、２６〜３５％の乾燥物質を含む生の脱水酵母を取得するステップ、
均質な塊を得るための、前記の生の脱水酵母の混合ステップ、
このように得られた酵母の、以下を得るための押し出しステップ：
・約３０％の乾燥物質を含む生の固形酵母もしくは砕いた生の酵母の形態の圧搾酵母、または
・酵母が乾燥されることが意図されている場合、粒子、一般に顆粒の形態の酵母
可能ならば、熱気流において、例えば、流動化により、押出成形で得られた酵母の粒子を、乾燥酵母を得るために制御乾燥させるステップ。
【００６８】
乾燥ステップは、好ましくは乳化剤の存在下での高速制御乾燥である。
【００６９】
乾燥段階で使用され得る乳化剤のうち、例えば（乾燥酵母の重みに対する重量で）約１．０％の濃度で使用されるモノステアリン酸ソルビタンを選択することが可能である。
【００７０】
本発明の酵母を、任意の可能な形態で使用することができる。
【００７１】
例えば、本発明の主題は、酵母クリーム、圧搾酵母、乾燥酵母または冷凍酵母の形態であることを特徴とする、上記で定義したような酵母である。
【００７２】
本発明の主題はまた、嫌気性または半嫌気性条件下での、上記で定義されたような酵母による発酵培地における発酵ステップを含む、少なくとも１つの発酵産物を生産する方法である。
【００７３】
発酵産物は、特に、エタノール、エタノールから得られた代謝産物または二次代謝産物から選択される。
【００７４】
本発明の好ましい発酵産物はエタノールである。
【００７５】
エタノール産物は、アルコール発酵から得られる。
【００７６】
当業者は、アルコール発酵にとって適切な条件を決定する方法を知っている。
【００７７】
例えば、"Yeast Technology", 2nd edition, 1991, G. Reed, and T.W. Nagodawithana, published by Van Nostrand Reinhold, ISBN 0-442-31892-8に記載のアルコール発酵条件を参照することができる。
【００７８】
発酵培地は、以下の成分を含有する：少なくとも１つの発酵性炭素源、少なくとも１つの窒素源、少なくとも１つの硫黄源、少なくとも１つのリン源、少なくとも１つのビタミン源および／または少なくとも１つのミネラル源。
【００７９】
炭素源は、例えば、酵母が直ちに利用できる糖、キシロースなどのペントース、グリセロール、エタノールまたはそれらの組み合わせの形態で供給される。
【００８０】
酵母が直ちに利用できる糖は、例えばグルコース、フルクトースもしくはガラクトース型の単糖、スクロース型の二糖またはこれらの糖の混合物である。
【００８１】
炭素源は、グルコースシロップ、フルクトースシロップ、サッカロースシロップ、糖蜜、ハイドロール（第二糖の結晶化からの使用済み母液）、植物材料の全部もしくは一部の加水分解物またはそれらの混合物の形態で供給され得る。
【００８２】
窒素源は、例えば、硫酸アンモニウム、水酸化アンモニウム、二リン酸アンモニウム、アンモニア、尿素、またはそれらの組み合わせの形態で供給される。
【００８３】
硫黄源は、例えば、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸、および／またはそれらの組み合わせの形態で供給される。
【００８４】
リン源は、例えば、リン酸、リン酸カリウム、二リン酸アンモニウム、一リン酸アンモニウム、および／またはそれらの組み合わせの形態で供給される。
【００８５】
ビタミン源は、例えば、糖蜜、酵母加水分解物、純粋なビタミンの溶液もしくは純粋なビタミンの混合物および／またはそれらの組み合わせの形態で供給される。
【００８６】
ビタミン源は、先行技術文献で推奨された量と少なくとも同等の量の全てのビタミンを酵母に供給する。複数のビタミン源を組み合わせることができる。
【００８７】
ミネラル源は、例えば、糖蜜、無機塩の混合物および／またはそれらの組み合わせの形態で供給される。
【００８８】
ミネラル源は、先行技術文献で推奨された量と少なくとも同等の量の全ての主要栄養素および微量ミネラルを酵母に供給する。複数のミネラル源を組み合わせることができる。
【００８９】
同物質は、いくつかの異なる成分を供給し得る。
【００９０】
本発明の主題は、嫌気性または半嫌気性条件下での、上記で定義されたような酵母による、キシロースおよび／または少なくとも１つの発酵阻害物質を含む培地発酵における発酵ステップを含む、少なくとも１つの発酵産物、好ましくはエタノールの製造のための上記で定義されたプロセスである。好ましくは、発酵培地は、植物材料の全部または一部の少なくとも１つの加水分解物を含有する。
【００９１】
植物材料の全部または一部の加水分解物は、例えば高温および酸または有機溶媒の存在下での、酵素的および／または化学的および／または熱経路による、糖ポリマーの全体的または部分的加水分解がその後に続き得る植物材料の前処理ステップにより得ることができる。
【００９２】
植物材料の全部または一部の加水分解物は、したがって、セルロース、ヘミセルロース、およびデンプンなどの糖ポリマーの加水分解からの糖の混合物を含有する。
【００９３】
発酵阻害物質は、例えば、有機酸、フルフラール、HMF（ヒドロキシメチルフルフラール）、１つ以上のフェノール性化合物および浸透圧の中から選択される。
【００９４】
有機酸は、例えば、酢酸、乳酸、ギ酸およびレブリン酸の中から選択される。
【００９５】
本発明の主題はまた、上記で定義されたような酵母の、少なくとも１つの発酵産物の産生のための、好ましくはキシロースおよび少なくとも１つの発酵阻害物質を含有する発酵培地における使用である。すなわち、本発明の酵母の使用は、キシロースを含む植物由来の物質の変換および代謝を可能にする。
【００９６】
発酵産物は、上記で定義した通りである。
【００９７】
好ましくは、発酵産物はエタノールであるべきである。
【００９８】
発酵培地は、上記で定義した通りである。
【００９９】
以下の実施例は、本発明をより良く理解することを意図するものであり、一切限定するものではない。
【実施例】
【０１００】
組換え菌株の野生菌株との交配、その後の胞子形成
CNCM（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes、パスツール研究所、25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex15）において、番号I-4538で寄託されている組換え菌株を、野生菌株、この場合出願人のEGAc1の菌株（I-4839）と交配させた。このステップを、Chapter 7, "Sporulation and Hybridization of Yeast" by R.R. Fowell, in the reference work "The Yeasts", Volume 1, published by A.H. Rose and J. S. Harrison, 1969-Academic Pressに教示されているような、従来技術に従って実施した。
【０１０１】
CNCMに参照番号I-4840で2014年3月13日に寄託された菌株EGAc2を、このようにして得た。この菌株は良好なキシロースの代謝能および部分的にのみ修復された欠陥を示した。実際、繁殖の質は、基本的にキシロースおよびタンパク質加水分解物を含む低栄養価培地において、乏しいままであった。
【０１０２】
胞子形成を、窒素源を含まず、かつ非発酵性炭素源、好ましくは酢酸塩、理想的には酢酸カリウムを含有する液体培地で実施した。
【０１０３】
迅速な分離個体濃縮方法の確立
分離個体１００％を得ることが可能ではなかった限りにおいて、減数分裂を完了していなかった二倍体を排除する必要があった。
【０１０４】
これを行うには、子嚢切開法が通常は実施されるが、非常に時間がかかるという欠点を有する。したがって、出願人は、胞子の独特な特性、つまり、それらが温度（Williams, 1936, J. Bacteriol., 32 (6): 589-597）、特定の栄養素の不足（Ho & Miller, 1978, Can.J. Microbiol., 24 (3): 312-320）またはいくつかの有機溶剤（Dawes and Hardie, 1974, Mol. Gen. Genet., 131 (4): 281-289）に対するより強い抵抗力で知られていることを利用した。
【０１０５】
この場合において、DawesおよびHardie（前出）により説明されたエーテル濃縮に基づく方法を利用した。実際、この手法は単純かつ効率的である。
【０１０６】
実際、二倍体の膜での分離個体の形成のために、それらは１つのリン脂質二重層ではなく、２つのそれに囲まれている。一方、二倍体は１つしかない。それが最適な接触時間（菌株によって異なる）で使用される場合、エーテルは二倍体膜を分解する。エーテルは、したがって、２つの理由のために魅力的である。第一に、接触時間が長すぎない場合、それは分離個体に影響を与えることなく、二倍体を死滅させる。一方、４分子の形態で分離個体を保持する子嚢のリン脂質二重層を分解し、その結果、それらを解放し、それらが発芽することを可能にする。
【０１０７】
この方法は、出願人の産業的菌株に適していた。酵母懸濁液とエーテルとの間の接触時間を、その後厳密に監視しなければならない。これを行うには、エーテル２ｍＬを、約２×１０７個の胞子形成構造体を含む酵母懸濁液２ｍＬと接触させる。胞子形成は、胞子形成条件下において５日後にもたらされる。次いで、３０秒〜２分の総接触時間の間に、全体をボルテックス撹拌する。
【０１０８】
１０００細胞／ｍＬを含むアリコートを、１００μＬ／皿レベルで以下を含む培地に直ちに広げる：
酵母エキス５ｇ／Ｌ、グルコース２０ｇ／Ｌ、寒天３０ｇ／Ｌ、水適量１Ｌ。増殖４８時間後、コロニーを使用して、国際公開第２０１３／１７８９１８Ａ１号パンフレットに記載されているような、Mat1、Mat2およびMat3プライマーにそれぞれ対応する配列番号1、配列番号2および配列番号3のプライマーを使用することにより、「コロニーのPCR」を作製する。このPCR分析は、一倍体菌株を二倍体菌株から区別することを目標としている。
【０１０９】
異なる接触時間の試験は、菌株EGAc2（I-4840）の場合、１分間の接触が、一倍体菌株における９８％以上の濃縮に十分であることを示している。
【０１１０】
バルク交配プロトコルの確立
新しい交配種を、分離個体に富む懸濁液から、バルク相交配を行うことにより生成した。これを行うために、分離体の懸濁液１ｍＬを、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、バクトペプトン２０ｇ／Ｌ、グルコース２０ｇ／Ｌおよび蒸留水適量１Ｌを含むYPG培地５０ｍＬに植菌した。１６時間後この培地において、顕微鏡観察では、接合体の形成を確認した。これらの交配種の増殖を促進するために、２４時間ごとに、培養液２００μＬを生のYEG培地５０ｍＬに植菌した。継代培養の５日後、新しい交配種を、大きな胞子形成サイクルに再導入することができる。
【０１１１】
このバルク交配ステップの効率性を確保するために、１００細胞を、YEGを含むペトリ皿毎に分配した。次いで、１３９の形成コロニーを構成する細胞の生殖特性を、PCRによりDNAgで分析した。これらのコロニーをランダムに選択した。プライマー配列番号1、配列番号2および配列番号3（上記）を用いて実施したPCRは、試験した１３９のうち２つのコロニーのみが半数体であったことを示した。
【０１１２】
得られた交配種の集団におけるゲノムシャッフリングの検証
出発交配種の遺伝子型の分析
ゲノムシャッフリングの質を検証する方法の１つは、遺伝子GRE3に連鎖する２つの遺伝子座からの対立遺伝子の分布を研究することから構成されている。実際、「gre3ヌル」遺伝子型に対応する遺伝子GRE3の両コピーの欠失が、菌株I-4538につながるC5菌株で行われた。この乱れは、EGAc1（I-4839）におけるGRE3の非欠失のために、ヘテロ接合で菌株EGAc2（I-4840）に伝えられた。
【０１１３】
菌株EGAc2（I-4840）の派生分離個体におけるこの形質の考えられる遺伝が求められている。このPCRは、GRE3のpGRE3 TAGTTGTCAGTGCAATCCTTCプロモーター特異的プライマー（配列番号4）およびtGRE3 TATACACATATACAGCATCGGAターミネータ特異的プライマー（配列番号5）を用いて行った。結果は、1200BP（塩基対）断片を与える遺伝子GRE3の野生のコピーを、200BP断片を与える欠失型から区別することが可能であったことを示した。
【０１１４】
そのため、菌株EGAc2（I-4840）のいくつかの分離個体は、もっぱら欠失型のみを提示し、一方でその他はGRE3の野生のコピーのみを提示した。さらに驚くべきことに、分離個体の第三の分類は、遺伝子GRE3の２つのコピー、１つの野生型、および他の欠失を持っていた。この結果は、菌株EGAc1（I-4839）において、GRE3遺伝子のコピーが、２つではなく４つ存在するという事実により説明される。この場合、EGAc2（I-4840）を与えたEGAc1分離個体（I-4839）では、GRE3の２つのコピーがある。そのため、菌株EGAc2（I-4840）の遺伝子型は次のとおりである：
【数１】
0006653659.tif 000003
【０１１５】
そのような遺伝子型は、菌株I-4538の１つの単一遺伝子座に対して、菌株EGAc1（I-4839）の２つの異なる遺伝子座でのGRE3の存在に起因している。さらに菌株I-4538において、GRE3遺伝子が欠失された。このように、菌株EGAc2（I-4840）のゲノムシャッフリングの１回目の終了時に得られた１３７の二倍体菌株の間で、交配種間のGRE3遺伝子および対立遺伝子のばらつきが研究されている。
【０１１６】
予想される分離個体の決定
GRE3遺伝子型に関連して、EGAc2（I-4840）のような交配種は、したがって、４つの型の分離個体を与えることができる。これらの分離個体は、以下の表２に記載されている。遺伝子型gre3Δ; -およびGRE3; GRE3を持つ分離個体は、全ての対立遺伝子が単一の親に由来しているため、いわゆる親遺伝子型である。対照的に、分離個体GRE3; -およびgre3Δ; GRE3は、組換えと呼ばれている。それぞれの場合について、MATa型およびMATアルファ型がある。
【表２】
0006653659.tif 000004
【０１１７】
ゲノムシャッフリングの質を分析する方法は、分離個体における親交配種からの対立遺伝子の分布の探索から構成されていた。したがって、遺伝子座は独立しているという仮定では、親分離個体を得る確率は、組換え分離個体の場合と同じである。
【０１１８】
しかし、この手法は、分離個体を選択することなく働くことを目指している。確かに、目的は、交配種の形成に実際に関与した胞子を決定することであった。したがって、遺伝子解析を、交配種から行った。
【０１１９】
得られた交配種の分析
このゲノムシャッフリングの終わりに生じ得る交配種を、表３に示す。各交配種型の遺伝子型は、対応するボックスに参照されている。これらの遺伝子型を、pGRE3（配列番号4）およびtGRE3（配列番号5）プライマーのPCRプロファイルについて、３つの群に分類した：
群1：200BPサイズの単一バンド（表中の白いセル） 
群2：200BPおよび1200BPの２つのバンド（表中の薄灰色のセル）
群3：1200BPの単一バンド（表中の暗灰色のセル）
【表３】
0006653659.tif 000005
【０１２０】
群1交配種は、pGRE3およびtGRE3プライマーが使用される場合、I-4538菌株のものに匹敵するPCRプロフィールを提示するので、容易に識別することができる。この遺伝子型を持つ全ての交配種が、MATa; gre3Δ; -およびMATアルファ; gre3Δ; -分離個体からのものであることは注目に値する。遺伝的独立性の仮定で、これらの交配種は、集団の１／１６または６．２５％を表す必要がある。この仮定を検証するために、前述した１３７の交配種の遺伝子型を、PCRにより分析した。結果を以下の表４に示す。
【表４】
0006653659.tif 000006
【０１２１】
群1からの交配種の過剰表現（６．２５％ではなく１１．６％）は、GRE3の２つの遺伝子座が独立していないことを示している。言い換えれば、これは、減数分裂において、親型分離個体を有する確率は、組換え型分離個体を有するよりも大きいことを意味している。この結果はさらに、遺伝距離のcMでの決定を可能にする。この遺伝距離は、以下の式により求められる：
【数２】
0006653659.tif 000007
【０１２２】
この分析において、分離個体の総数は、交配種の数の２倍である（２７４である）。 
【０１２３】
組換え分離個体の数は、分離個体の総数から親分離個体の数を引くことで求められる。以上のように、群1の交配種は親分離個体のみからなる。これは、gre3Δ;-親分離個体を有する確率は、群1からの交配種を有する確率の平方根に等しいことを意味する。また、親分離個体は、減数分裂の間、同様に確からしい。組換え分離個体の数は、したがって、次の式により決定することができる：
【数３】
0006653659.tif 000008
ここで、
【数４】
0006653659.tif 000009
【０１２４】
したがって、親分離個体の数は１８６であり、その結果、組換え分離個体の数は８８である。この結果は、２つの遺伝子座の間の遺伝距離は32cMとなることを示唆している。この遺伝距離の計算は、各分離個体型を有する確率を測定するのに役立つ。
【０１２５】
最終集団で見られる出発細胞の数の推定値
集団の多様性の質の測定に関する重要な点は、全処理を耐え抜いて最終的な集団に留まっている出発交配種の数の決定である。GRE3遺伝子型の決定の結果に基づいて、その数を推定することが可能である。実際、そのPCRプロファイルが２つのバンド（200BPおよび1200BP）を提示する細胞は、ゲノムシャッフリングにより得られた交配種、またはエーテルでの濃縮の間に殺されなかった出発細胞のいずれかである。
【数５】
0006653659.tif 000010
【０１２６】
前項で得られた結果は、実際の群2からの交配種の数および群2からの菌株の数の両方の決定を可能にする。
【０１２７】
実際の群2からの交配種の数を決定するために、この群を構成する各交配種型の割合を合計する必要がある。以下の表５は、様々な交配種、およびそれらを得る確率を示している。交配種の型を得る確率は、それに入る２つの分離個体を得る確率の積に基づいている。親分離個体が、分離個体の６８％（または、各親分離個体の３４％）を表すことが、前のサブセクションで示されている。その結果、組換え分離個体は、全分離個体の３２％を表す（すなわち、各組換え分離個体の１６％）。
【表５】
0006653659.tif 000011
【０１２８】
表５に示す結果は、群2の交配種の割合（薄灰色）が６３．４％であることを示唆している。同時に、群2の菌株の割合は、集団の６４．５％を占める。したがって、試験された集団において、交配種の約１％が、エーテル濃縮の間に殺されなかった出発菌株のようである。
【０１２９】
集団の構築に関する要約
要約すると：単一の出発交配種からの菌株の集団を構築することが可能であった。バルク交配および胞子形成の4つの段階の後に生成されたこの新たな集団が、広範なゲノムシャッフリングの生成物であることが示された。
【０１３０】
得られた集団において目的とする個体の選択
ゲノムシャッフリングの質を検証した後、得られた酵母を、阻害物質に抵抗しながらキシロースを発酵する能力について選択した。
これを行うために、それらを４８時間、培地YFI1で培養し、その後YFX培地に移して７２時間培養した（注：培地の組成は、表１（前出）または表に続く本文に示されている）。この第二集団の試料を、YEG培地（前出）に広げた。この最後のステップは、とりわけ、CNCM（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes、パスツール研究所、25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex15）に、番号I-4749で寄託された菌株の単離につながった。
【０１３１】
最適化された繁殖の検証
最初に、菌株の繁殖をPref.培地、およびPref.+窒素塩基培地で試験した。これは、図１に示されている。これらの結果は、以下を示す：
菌株I-4538は、本発明で使用された組換え菌株であり、Pref.+窒素塩基培地では効率的に繁殖するが、Pref.培地では非常に乏しく繁殖する；
菌株EGAc1（I-4839）は、本発明により菌株I-4538と交配された野生菌株であり、Pref.またはPref.+窒素塩基培地で効率的に繁殖しない；
本発明による菌株I-4749は、効率的にPref.培地で繁殖する。
【０１３２】
産業用培地での繁殖の検証
YFC培地（上記表１に示される）は、ヘキソース（例えばグルコース、ガラクトースなど）およびペントース（例えばキシロース、アラビノースなど）の産業培地型混合の条件を模倣すると定義されてきた。菌株I-4538（親菌株）およびI-4749（本発明の菌株）のそれぞれの繁殖を、この培地で検証した。図２はこれらの結果を示しており、本発明の菌株での２倍以上の繁殖効率を実証している。
【０１３３】
発酵適性の検証
本発明の菌株は、実際の培地に近い培地で、発酵に使用されてきた。この目的のために使用されたYFI2培地は、グルコースおよびキシロース、つまりＣ６およびＣ５糖の両方を含む。発酵中の質量損失を監視した結果を、図３に示す。実施される全ての菌株の場合で、発酵は二相性である。
【０１３４】
最初の段階では、菌株EGAc1（I-4839）およびEGAc2（I-4840）は同じように振る舞う。本発明の菌株I-4749も同様である。しかし、菌株I-4538は、この第一段階の間に遅くなる。グルコースによる異化代謝産物抑制の原則を考慮すると、発酵のこの最初の部分は、グルコースの消費に相当する可能性がある。
【０１３５】
発酵の第二段階で、全ての菌株での顕著な減速が注目に値する。しかし、最も効率的な菌株は、菌株I-4538およびI-4749である。この第二段階は、おそらくキシロースの消費に相当し、これは、（[キシロース-]表現型の）菌株EGAc1（I-4839）が発酵していないという事実により示唆される。
【０１３６】
記録は、実施された全ての菌株の間の最良の妥協は、本発明により得られたI-4749であることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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