(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
PCV2 ORF2ポリペプチドであって、
アミノ酸59位にアルギニン残基又はリジン残基、かつ
アミノ酸88位にプロリン残基、かつ
アミノ酸151位にスレオニン残基、かつ
アミノ酸206位にイソロイシン残基、かつ
アミノ酸232位にアスパラギン残基、かつ
アミノ酸63位にスレオニン残基、グルタミン残基、グリシン残基、ロイシン残基またはアスパラギン酸残基を有し（ただしアミノ酸59位がアルギニン残基である場合はアミノ酸63位はグルタミン残基、ロイシン残基またはアスパラギン酸残基である）、該アミノ酸の位置の番号付けが野生型PCV2 ORF2ポリペプチドのアミノ酸配列に対応する、前記PCV2 ORF2ポリペプチド。
【請求項２】
変異を含まないPCV2 ORF2ポリペプチドが野生型PCV2 ORF2ポリペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
PCV2 bサブタイプ（PCV2b）ORF2ポリペプチドである、請求項1または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号:1のアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又は前記配列から成るPCV2 ORF2ポリペプチドである、請求項1から３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
i）配列番号:6または8に示される配列であって63位のアミノ酸がグルタミン残基、ロイシン残基またはアスパラギン酸残基である前記配列、および、
ii）配列番号:7または9に示される配列であって63位のアミノ酸がスレオニン残基、グルタミン残基、グリシン残基、ロイシン残基またはアスパラギン酸残基である前記配列,
から成る群から選択される配列を含む請求項1から４のいずれか1項に記載のポリペプチド、及び/又は、
配列番号:12、20、30、33、40および42から成る群から選択される配列を含む、請求項1から４のいずれか1項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
野生型PCV2 ORF2ポリペプチドが配列番号:2に示されるポリペプチドである、請求項1から５のいずれか1項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
請求項1から６のいずれか1項に記載のポリペプチドを含む免疫原性組成物。
【請求項８】
請求項1から６のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項1から６のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む、プラスミド。
【請求項１０】
請求項1から６のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含むプラスミドを含む、細胞。
【請求項１１】
複数の請求項1から６のいずれか1項に記載のポリペプチドを含む、ウイルス様粒子。
【請求項１２】
請求項1から６のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む、バキュロウイルス。
【請求項１３】
請求項1から６のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含むバキュロウイルスを含む、細胞。
【請求項１４】
−請求項1から６のいずれか1項に記載のポリペプチド、
−請求項７に記載の免疫原性組成物、
−請求項８に記載のポリヌクレオチド、
−請求項１１に記載のウイルス様粒子、
−請求項１２に記載のバキュロウイルス、
−請求項９に記載のプラスミド、及び/又は
−請求項１０又は１３に記載の細胞、の
医薬の調製のための使用。
【請求項１５】
PCV2感染の治療若しくは予防、PCV2感染により引き起こされる臨床徴候の軽減、予防若しくは治療、又はPCV2感染により引き起こされる疾患の予防若しくは治療のための請求項７に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
PCV2感染が、PCV2 bサブタイプ（PCV2b）及び/又はbサブタイプ以外のサブタイプのPCV2による感染である、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
PCV2感染が、（i）PCV2b及び（ii）bサブタイプ以外のサブタイプのPCV2による同時感染である、請求項１６に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
bサブタイプ以外のサブタイプのPCV2感染が、PCV2 aサブタイプ（PCV2a）及び/又はPCV2 cサブタイプ（PCV2c）による感染である、請求項１６に記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
PCV2bによる感染が、配列番号:2の配列と少なくとも94%同一であるポリペプチドを含むか、又は配列番号:2の配列と少なくとも94%同一であるポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含むPCV2による感染である、請求項１６に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
PCV2aによる感染が、配列番号:3の配列と少なくとも94%同一であるポリペプチドを含むか、又は配列番号:3の配列と少なくとも94%同一であるポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含むPCV2による感染である、請求項１８に記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】
PCV2感染の治療又は予防がPCV2に対する免疫応答の誘発に基づくか又は前記免疫応答の誘発を含むか又は前記免疫応答の誘発から成り、前記臨床徴候が、リンパ系枯渇、リンパ系炎症、リンパ系組織におけるPCV2抗原IHC陽性、ウイルス血症、鼻汁排出、発熱、1日当たりの平均体重増加の低下、肺の炎症、肺組織におけるPCV2抗原IHC陽性から成る群から選択され、又は前記疾患がPMWSである、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２２】
1回だけ投与するための、請求項１５〜２１のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】
請求項９に記載のプラスミドを細胞にトランスフェクトする工程を含む、請求項1から６のいずれか1項に記載のポリペプチドを製造する方法。
【請求項２４】
請求項１２に記載のバキュロウイルスを細胞に感染させる工程を含む、請求項1から６のいずれか1項に記載のポリペプチドを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（配列表）本出願は、37 C.F.R. 1.821−1.825にしたがって配列表を含む。本出願に随伴する前記配列表は、参照によりその全体が本明細書に含まれる。
（技術分野）
本発明は、種々のPCV2サブタイプによるPCV2感染を制御するワクチン免疫方法に関する。特に、本発明は、PCV2 bサブタイプ（PCV2b）ORF2タンパク質又はPCV2b ORF2タンパク質を含む免疫原性組成物を用いて、PCV2感染を治療又は予防する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ブタシルコウイルス2型（PCV2）は、小さな（直径17−22nm）正二十面体のエンベロープをもたないDNAウイルスであり、一本鎖の環状ゲノムを含む。PCV2は、ブタシルコウイルス1型（PCV1）と約80%の配列同一性を共有する。しかしながら、PCV1（一般的に非病毒性である）とは対照的に、PCV2感染ブタは、一般的に離乳後多器官性消耗症候群（PMWS）と称される症候群を示す。PMWSは、臨床的には、るい痩（wasting）、皮膚の蒼白、発育不全（unthriftiness）、呼吸窮迫、下痢、黄疸（icterus）及び黄疸（jaundice）を特徴とする。いくらかの罹患ブタでは全ての徴候の合併が明白であるが、一方、他のブタはこれらの臨床徴候の1つ又は2つを有するのみである。剖検時には、顕微鏡的及び肉眼的病巣がまた多数の組織及び器官に出現し、リンパ系器官が病巣の好発部位である。PCV2核酸又は抗原の量と顕微鏡的類リンパ病巣の重篤度との間に強い相関性が観察された。PCV2感染ブタの死亡率は80%に達しうる。PMWSに加えて、PCV2は、仮性狂犬病、ブタ生殖器呼吸器系症候群（PRRS）、グラッサー病（Glasser's disease）、ストレプトコッカス性髄膜炎、サルモネラ症、離乳後大腸菌症、食餌性肝症、及び化膿性気管支肺炎を含む他のいくつかの感染症と密接に結びついている。
【０００３】
これまでのところ、既知のPCV2には3つのサブタイプがあり（PCV2a、PCV2b及びPCV2c）、それらはPCV2遺伝子型について統一された命名法にしたがって分類される（Segales, J. et al., 2008, PCV-2 genotype definition and nomenclature, Vet Rec 162:867-8）。2つのさらに別のサブタイプ（PCV2d及びPCV2e）が提唱されたが（Wang et al. Virus Res. 2009 145(1):151-6）、それらはPCV2a及びPCV2bクラスターに属することが後に明らかになった（Cortey  et  al. Vet Microbiol. 2011 149(3-4):522-32011）。PCV2遺伝子型のこの統一命名法にしたがえば、orf2遺伝子がpcv-2の遺伝子型判定の実施に用いられ、この場合、遺伝子型判定は、比較される2つの配列が相違するヌクレオチド箇所の割合（p距離）を基準にする。この値は、比較される全ヌクレオチド数でヌクレオチド相違数を割ることによって得られ（Kumar et al. 2001 Bioinformatics 17, 1244-1245）、続いてp距離/頻度ヒストグラムの構築は、異なる遺伝子型を識別する潜在的カットオフ値の決定を可能にする（Rogers and Harpending 1992 Molecular Biology and Evolution 9, 552-569；Biagini et al. 1999 Journal of General Virology 80, 419-424）。この方法論を用いると、orf pcv-2配列は、それらの間の遺伝的距離が0.035であるときに異なる遺伝子型に割り当てられる。
【０００４】
US 2011/0305725 A1は、新規なワクチン処方物をブタで試験してブタシルコウイルス及びM.ヒオプニューモニアエ（M. hyopneumoniae）に対するその有効性を評価するために企画された研究を記載している。この研究の経過中に、コントロール及びワクチン接種グループの数匹のブタがPMWSの臨床徴候を示すのが観察された。続いて、これらのブタは、チャレンジ前に周囲のPCV2に暴露されていることが確認された。これらのブタの血液及び組織サンプルの分子分析は、それらがチャレンジに用いられた株と異なる2B型株を保持することを明らかにした（US 2011/0305725 A1のパラグラフ[0152]）。
WO2011116094 A2は、PCV2bサブタイプのPCV2と非病原性PCV1ウイルスゲノムに組み込まれたPCV2bサブタイプキャプシド遺伝子とのキメラブタシルコウイルス感染性DNAクローン及び生弱毒キメラウイルスを開示する（前記弱毒キメラウイルスは、不活化（殺滅）ワクチンと同様に生ワクチンとしても用いることができる）。
【０００５】
WO2013030320 A1は、合成シルコウイルス型キャプシドタンパク質及び前記タンパク質を用いて哺乳動物でPCV2関連疾患を治療及び/又は予防する方法に関する。WO2013030320 A1にしたがえば2つの配列が設計された。ここで、一方の配列はとりわけ以下の最適化によりさらに改変された：
−潜在的切断部位がアミノ酸165位で除去された。
−変異が200位に導入された。
−入れ替えが161位で実施された。
−入れ替えが170位で実施された。
−225位のS残基がDに入れ替えられた
−入れ替えが143位で実施された。
−配列のN-末端で2つの入れ替えが実施された（13及び20位）。
しかしながら、実際には野生型PCV2b ORF2タンパク質の発現は不十分であることが判明し、サブユニットワクチンの調製に有用なウイルス様粒子（VLP）を得るために更なる濃縮工程が要求されるので、天然に存在するPCV2b ORF2タンパク質配列の容易な改変が、発現有効性を強化し、さらにVLPの生成を増加させ、それによって有効なPCV2サブユニットワクチンの迅速で容易な製造のために求められる。
上記の技術的問題の解決は、本特許請求の範囲に特徴が示される開示及び実施態様によって達成される。
したがって、本発明は当該特許請求の範囲にしたがって種々の特徴で実施される。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、種々のPCV2サブタイプによるPCV2感染を制御するワクチン免疫方法に関する。特に、本発明は、PCV2 bサブタイプ（PCV2b）ORF2タンパク質又はPCV2b ORF2タンパク質を含む免疫原性組成物を用いて、PCV2感染を治療又は予防する方法に関する。
ある特徴では、本発明は、したがって以下の（a）、（b）及び（c）から成る群から選択されるポリペプチドに関する：（a）PCV2 ORF2タンパク質であって、アミノ酸59位にアルギニン残基又はリジン残基、及び/又はアミノ酸88位にプロリン残基、及び/又はアミノ酸151位にスレオニン残基、及び/又はアミノ酸206位にイソロイシン残基、及び/又はアミノ酸232位にアスパラギン残基を有し、かつアミノ酸63位にアルギニン残基又はリジン残基以外のアミノ酸残基を有し、ここで、アミノ酸の位置の番号付けは野生型PCV2 ORF2タンパク質のアミノ酸配列に対応する、前記PCV2 ORF2タンパク質；（b）（i）BCループに少なくとも1つの変異を含むこと、及び（ii）そのような変異を含まないPCV2 ORF2タンパク質と比較して好ましくは顕著により大量に発現されることを特徴とするPCV2 ORF2タンパク質；並びに（c）（a）及び（b）の組合せ。
好ましくは、前記ポリペプチド（以下では“本発明のポリペプチド”とも称される）は単離ポリペプチドである。
特に、本発明のポリペプチドは天然に存在しないポリペプチドである。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】PCV2a及びPCV2b ORF2アミノ酸配列間における主要なアミノ酸変化。
【図２】バキュロウイルス採集上清におけるPCV2 ORF2の評価。レーン1＝Circoflex WSV（PCV2a ORF2）、レーン2＝PCV2b ORF2 BDH SFCO、レーン4＝PCV2b ORF2 BDH R63T、レーン5＝PCV2b ORF2 BDH R63K。
【図３】100,000gペレットにおけるPCV2b ORF2の評価。レーン1＝PCV2b ORF2 BDH、レーン2＝PCV2b ORF2 BDH R63K、レーン3＝PCV2b ORF2 BDH R63T、レーン4＝Circoflex WSV（PCV2a ORF2）。
【図４】シュクロースグラジエント画分のSDS-PAGEによる分離。F1−F12＝画分1−12。
【図５Ａ】EMによるVLPの確認。
【図５Ｂ】EMによるVLPの確認。
【図６】PCV2b ORF2変異体構築物評価の結果。SFCO＝スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）のために最適化されたコドン。天然のままのPCV2b ORF2 BDH及びR63K構築物は、R63Tが同時に見出されたのでVLPについてチェックせず、定量は行われなかった。
【図７Ａ】PCV2b ORF2変異体構築物評価の結果。SFCO＝スポドプテラ・フルギペルダのために最適化されたコドン。ORF2変異体構築物のVLP定量はμg/mLとして表した。
【図７Ｂ】PCV2b ORF2変異体構築物評価の結果。SFCO＝スポドプテラ・フルギペルダのために最適化されたコドン。ORF2変異体構築物のVLP定量はμg/mLとして表した。
【図８】PCV2b ORF2野生型及び変異体のアミノ酸配列のアラインメント。図で、配列番号:5及び配列番号:2と称される配列はPCV2b ORF2野生型配列であり、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8及び配列番号:9と称される配列は変異体の配列であり、さらに配列番号:3は野生型PCV2a ORF2タンパク質の配列に一致する。配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8及び配列番号:9と称される配列で、“X”（8、53、57、68、89、90、121、134、169、190、215及び234位）は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及びYから成る群から選択される任意のアミノ酸残基であり、“X”（63位）は、A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、W及びYから成る群から選択される任意のアミノ酸残基であり、“太字x”（210位）は、D及びEから成る群から選択される任意のアミノ酸残基である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、PCV2 bサブタイプ（PCV2b）ORF2タンパク質のアミノ酸配列におけるただ1つの変異が、VLP生成レベルを劇的に増加させるために十分であり、したがって有効なPCV2サブユニットワクチンの迅速な製造を可能にするという驚くべき発見に基づいている。
本発明の根幹となる作業で、PCV2a及びPCV2b ORF配列間における主要なアミノ酸相違位置が変異導入のための潜在的な位置として同定された。
これに関して、PCV2b ORFタンパク質に典型的な6つのアミノ酸の位置が同定された。すなわち、
−アミノ酸59位のアルギニン残基又はリジン残基、
−アミノ酸63位のアルギニン残基又はリジン残基、
−アミノ酸88位のプロリン残基、
−アミノ酸151位のスレオニン残基、
−アミノ酸206位のイソロイシン残基、及び
−アミノ酸232位のアスパラギン残基。
本明細書に記載される、アミノ酸の位置の番号付けは、完全長の野生型PCV2b ORFタンパク質のアミノ酸配列（配列番号:2又は配列番号:5）に対応する。それゆえ、本明細書で述べるアミノ酸の位置の番号付けは、234又は233のアミノ酸残基を有する野生型PCV2 ORF2タンパク質配列（（N-末端）アミノ酸1位にメチオニン残基を含む）と関係を有する。
したがって、本発明に関して用いられる、“アミノ酸の位置の番号付けは野生型PCV2 ORF2タンパク質のアミノ酸配列に対応する”という語句は、見本として配列番号:2又は配列番号:5で示される、天然に存在するPCV2b ORFタンパク質の配列と関連する。
【０００９】
予想もしないことであったが、PCV2b ORF2タンパク質に典型的な6つのアミノ酸の位置の変異は、PCV2 ORF2タンパク質のBCループのアミノ酸配列内の位置の1つの変異（すなわち63位のアルギニン残基又はリジン残基の置換）が、そのような変異を含まないPCV2 ORF2タンパク質と比較して、PCV2 ORF2タンパク質の発現を顕著に増加させるために十分であることを示した。
ある特徴では、本発明は、したがって以下の（a）、（b）及び（c）から成る群から選択されるポリペプチドに関する：（a）PCV2 ORF2タンパク質であって、アミノ酸59位にアルギニン残基又はリジン残基、及び/又はアミノ酸88位にプロリン残基、及び/又はアミノ酸151位にスレオニン残基、及び/又はアミノ酸206位にイソロイシン残基、及び/又はアミノ酸232位にアスパラギン残基を有し、かつアミノ酸63位にアルギニン残基又はリジン残基以外のアミノ酸残基を有し、ここで、アミノ酸の位置の番号付けは野生型PCV2 ORF2タンパク質のアミノ酸配列に対応する、前記PCV2 ORF2タンパク質；（b）（i）BCループに少なくとも1つの変異を含むこと、及び（ii）そのような変異を含まないPCV2 ORF2タンパク質と比較して好ましくは顕著により大量に発現されることを特徴とするPCV2 ORF2タンパク質；並びに（c）（a）及び（b）の組合せ。
好ましくは、前記ポリペプチド（以下では“本発明のポリペプチド”とも称される）は単離ポリペプチドである。
特に、本発明のポリペプチドは天然に存在しないポリペプチドである。
【００１０】
第一の特徴（a）にしたがえば、本発明のポリペプチドはしたがって、以下から成る群から選択される1つ、2つ、3つ、4つ又は5つのアミノ酸残基を有し（アミノ酸59位のアルギニン残基（R）又はリジン残基（K）、アミノ酸88位のプロリン残基（P）、アミノ酸151位のスレオニン残基（T）、アミノ酸206位のイソロイシン残基（I）、アミノ酸232位のアスパラギン残基（N）（カッコ内は一文字コード））、かつアミノ酸63位にアルギニン残基又はリジン残基以外のアミノ酸残基を有するPCV2 ORF2タンパク質である。
特に、63位のアルギニン残基又はリジン残基以外のアミノ酸残基は、天然に存在する、好ましくは遺伝的にコードされる、アルギニン残基又はリジン残基以外のアミノ酸残基である。
引き続き以下の略語がまた用いられる：
“アミノ酸59位のアルギニン残基”の略語として“R59”、
“アミノ酸59位のリジン残基”の略語として“K59”、
“アミノ酸88位のプロリン残基”の略語として“P88”、
“アミノ酸151位のスレオニン残基”の略語として“T151”、
“アミノ酸206位のイソロイシン残基”の略語として“I206”、
“アミノ酸232位のアスパラギン残基”の略語として“N232”。
【００１１】
好ましくは、特徴（a）のポリペプチドはしたがって以下のPCV2 ORF2タンパク質である：
P88を有するか、
又はT151を有するか、
又はI206を有するか、
又はN232を有するか、
又はR59若しくはK59を有するか、
又はP88及びT151を有するか、
又はP88及びI206を有するか、
又はP88及びN232を有するか、
又はP88及びR59若しくはK59を有するか、
又はT151及びI206を有するか、
又はT151及びN232を有するか、
又はT151及びR59若しくはK59を有するか、
又はI206及びN232を有するか、
又はI206及びR59若しくはK59を有するか、
又はN232及びR5若しくはK59を有するか、
又はP88及びT151及びI206を有するか、
又はP88及びT151及びN232を有するか、
又はP88及びT151及びR59若しくはK59を有するか、
又はP88及びI206及びN232を有するか、
又はP88及びI206及びR59若しくはK59を有するか、
又はP88及びN232及びR59若しくはK59を有するか、
又はT151及びI206及びN232を有するか、
又はT151及びI206及びR59若しくはK59を有するか、
又はT151及びN232及びR59若しくはK59を有するか、
又はI206及びN232及びR59若しくはK59を有するか、
又はP88及びT151及びI206及びN232を有するか、
又はP88及びT151及びI206及びR59若しくはK59を有するか、
又はP88及びT151及びN232及びR59若しくはK59を有するか、
又はP88及びI206及びN232及びR59若しくはK59を有するか、
又はT151及びI206及びN232及びR59若しくはK59を有するか、
又はP88及びT151及びI206及びN232及びR59若しくはK59を有する。
【００１２】
より好ましくは、特徴（a）のポリペプチドはしたがって以下から成る群から選択される：
P88を有するPCV2 ORF2タンパク質、
T151を有するPCV2 ORF2タンパク質、
I206を有するPCV2 ORF2タンパク質、
N232を有するPCV2 ORF2タンパク質、
R59を有するPCV2 ORF2タンパク質、
K59を有するPCV2 ORF2タンパク質、
P88及びT151を有するPCV2 ORF2タンパク質、
P88及びI206を有するPCV2 ORF2タンパク質、
P88及びN232を有するPCV2 ORF2タンパク質、
P88及びR59を有するPCV2 ORF2タンパク質、
P88及びK59を有するPCV2 ORF2タンパク質、
T151及びI206を有するPCV2 ORF2タンパク質、
T151及びN232を有するPCV2 ORF2タンパク質、
T151及びR59を有するPCV2 ORF2タンパク質、
T151及びK59を有するPCV2 ORF2タンパク質、
I206及びN232を有するPCV2 ORF2タンパク質、
I206及びR59を有するPCV2 ORF2タンパク質、
I206及びK59を有するPCV2 ORF2タンパク質、
N232及びR59を有するPCV2 ORF2タンパク質、
N232及びK59を有するPCV2 ORF2タンパク質、
P88及びT151及びI206を有するPCV2 ORF2タンパク質、
P88及びT151及びN232を有するPCV2 ORF2タンパク質、
P88及びT151及びR59を有するPCV2 ORF2タンパク質、
P88及びT151及びK59を有するPCV2 ORF2タンパク質、
P88及びI206及びN232を有するPCV2 ORF2タンパク質、
P88及びI206及びR59を有するPCV2 ORF2タンパク質、
P88及びI206及びK59を有するPCV2 ORF2タンパク質、
P88及びN232及びR59を有するPCV2 ORF2タンパク質、
P88及びN232及びK59を有するPCV2 ORF2タンパク質、
T151及びI206及びN232を有するPCV2 ORF2タンパク質、
T151及びI206及びR59を有するPCV2 ORF2タンパク質、
T151及びI206及びK59を有するPCV2 ORF2タンパク質、
T151及びN232及びR59を有するPCV2 ORF2タンパク質、
T151及びN232及びK59を有するPCV2 ORF2タンパク質、
I206及びN232及びR59を有するPCV2 ORF2タンパク質、
I206及びN232及びK59を有するPCV2 ORF2タンパク質、
P88及びT151及びI206及びN232を有するPCV2 ORF2タンパク質、
P88及びT151及びI206及びR59を有するPCV2 ORF2タンパク質、
P88及びT151及びI206及びK59を有するPCV2 ORF2タンパク質、
P88及びT151及びN232及びR59を有するPCV2 ORF2タンパク質、
P88及びT151及びN232及びK59を有するPCV2 ORF2タンパク質、
P88及びI206及びN232及びR59を有するPCV2 ORF2タンパク質、
P88及びI206及びN232及びK59を有するPCV2 ORF2タンパク質、
T151及びI206及びN232及びR59を有するPCV2 ORF2タンパク質、
T151及びI206及びN232及びK59を有するPCV2 ORF2タンパク質、
P88及びT151及びI206及びN232及びR59を有するPCV2 ORF2タンパク質、
P88及びT151及びI206及びN232及びK59を有するPCV2 ORF2タンパク質。
【００１３】
第二の特徴（b）にしたがえば、本発明のポリペプチドは特に以下を特徴とするPCV2 ORF2タンパク質である：（i）BCループに少なくとも1つの変異を含み、さらに（ii）特にバキュロウイルス発現系において、そのような変異を含まないPCV2 ORF2タンパク質と比較して、顕著により大量に、好ましくは少なくとも2倍大量に、より好ましくは少なくとも3倍大量に、さらに好ましくは少なくとも5倍大量に、さらに好ましくは少なくとも8倍大量に発現され、この場合、そのような変異を含まないPCV2 ORF2タンパク質は、好ましくはBCループの少なくとも1つの変異を除いて本発明のポリペプチドと同一の配列を有する。
したがって、特に、本発明のこの特徴にしたがってその発現が比較される両PCV2 ORF2タンパク質のアミノ酸配列は、BCループの前記少なくとも1つの変異を除いて同一であることは理解される。
本発明の関係では、“BCループ”という用語は、折りたたまれてβシート二次構造を作る最初の2つのN-末端アミノ酸ストレッチの間に存在するPCV2 ORF2アミノ酸配列の部分を指し、前記は、Khayatらが発表したようにPCV2 ORF2タンパク質の結晶構造で認めることができる（Khayat et al. J Virol 85:7856-62, 2011（前記文献は参照により本明細書に含まれる））。特に、Khayatらは、4から9アミノ酸残基長としてβ鎖BC、DE、FG及びHIをつなぐループ、及びPCVキャプシドから最も遠くまで延びて5回軸を装飾する特徴的ノブ様突出物としてループBC及びHIを記載している。
【００１４】
BCループに少なくとも１つの変異を含むPCV2 ORF2タンパク質が、そのような変異を含まないPCV2 ORF2タンパク質と比較してより大量に発現されるか否かを決定するために、好ましくは下記の実施例1に記載する方法が用いられる。
したがって、ある例では、BCループに少なくとも1つの変異を含むPCV2 ORF2タンパク質が、そのような変異を含まないPCV2 ORF2タンパク質と比較してより大量に発現されるか否かを決定するために、バキュロウイルス発現系が以下の工程を含む方法で用いられる:Sf+細胞を0.1の目標MOIでバキュロウイルスに感染させる工程、5−7日間感染を進行させる工程、細胞屑及び不溶性タンパク質を除去するために20,000gで20分間遠心分離する採集工程、採集上清を0.2μmのフィルターでろ過する工程、及びα-PCV2抗体を用いるウェスタンブロットによってPCV2 ORF2発現を直接評価する工程。
好ましくは、前記方法は、0.1の目標MOIでSf+細胞を感染させる工程のために用いられるバキュロウイルスの調製をさらに含み、特に以下の工程の1つ以上をさらに含む:BCループに少なくとも1つの変異を含むPCV2 ORF2タンパク質をコードするコード配列をバキュロウイルストランスファーベクターでクローニングする工程、そのような変異を含まないPCV2 ORF2タンパク質をコードするコード配列をバキュロウイルストランスファーベクターでクローニングする工程、BCループに少なくとも1つの変異を含むPCV2 ORF2タンパク質をコードするコード配列を含む前記バキュロウイルストランスファーベクターをバキュロウイルスDNAとともにSf9細胞にコトランスフェクトする工程、そのような変異を含まないPCV2 ORF2タンパク質をコードするコード配列を含む前記バキュロウイルストランスファーベクターをバキュロウイルスDNAとともにSf9細胞にコトランスフェクトする工程。
【００１５】
より好ましくは、前記方法はさらに以下の工程の１つ以上を追加的に含む：得られた組換えバキュロウイルスをPCV2 ORF2タンパク質の発現についてIFAによってチェックする工程、組換えバキュロウイルスの各々の増幅ストックをSf+細胞で調製する工程、前記増幅ストックをTCID50法により力価を測定してバキュロウイルス力価を決定する工程。
特に、BCループに少なくとも1つの変異を含むPCV2 ORF2タンパク質である本発明のポリペプチドは、そのような変異を含まないPCV2 ORF2タンパク質と比較して、同じ及び/又は類似の周囲条件下で、好ましくはバキュロウイルス発現系でより大量に発現される。
より具体的には、そのような変異を含まない前記PCV2 ORF2タンパク質は野生型PCV2 ORF2タンパク質である。
好ましくは、本発明のBCループの少なくとも1つの変異はアミノ酸58から66位の領域における少なくとも1つの変異であり、特にアミノ酸60から66位の領域における1つから7つのアミノ酸残基の欠失、置換、及び/又は付加を含むか又は前記から成る。
より好ましくは、BCループの少なくとも1つの変異は、アミノ酸63位における1つのアミノ酸残基の欠失、置換、及び/又は付加であり、ここで、アルギニン残基又はリジン残基以外のアミノ酸残基によるアミノ酸63位におけるアミノ酸残基の置換が最も好ましい。
さらに好ましくは、アルギニン残基又はリジン残基以外のアミノ酸残基によるアミノ酸63位におけるアミノ酸残基の置換は、天然に存在する、好ましくは遺伝的にコードされる、アルギニン残基又はリジン残基以外のアミノ酸残基による置換である。
アルギニン残基又はリジン残基以外のアミノ酸残基によるアミノ酸63位におけるアミノ酸残基の置換を含む、本発明のBCループの好ましい配列は配列番号:10−45に示される。
したがって、特に、本発明のBCループ内の少なくとも1つの変異は、アルギニン残基又はリジン残基以外のアミノ酸残基によるアミノ酸63位におけるアルギニン残基又はリジン残基の置換を含むか、又は前記置換である。
したがって、本明細書に記載される、そのような変異を含まないPCV2 ORF2タンパク質は、好ましくはアミノ酸63位にアルギニン残基又はリジン残基を有し、前記残基は本発明のこの好ましい実施態様にしたがって置換され、それによって本発明のポリペプチドを生じる。
最も好ましくは、本発明のポリペプチドは配列番号:10−45から成る群から選択される配列を含み、前記配列は本発明のポリペプチドの配列のアミノ酸58から63位に位置する。
【００１６】
第三の特徴（c）にしたがえば、本発明のポリペプチドは、本明細書に記載される特徴（a）及び特徴（b）のPCV2 ORF2タンパク質の任意の組合せであり、したがって、以下のとおりの任意のPCV2 ORF2タンパク質である：
−アミノ酸59位のアルギニン残基又はリジン残基、及び/又は
−アミノ酸88位のプロリン残基、及び/又は
−アミノ酸151位のスレオニン残基、及び/又は
−アミノ酸206位のイソロイシン残基、及び/又は
−アミノ酸232位のアスパラギン残基を有し、
かつアミノ酸63位にアルギニン残基又はリジン残基以外のアミノ酸残基を有し（ここで、アミノ酸の位置の番号付けは野生型PCV2 ORF2タンパク質のアミノ酸配列に対応する）、さらに、（i）BCループに少なくとも1つの変異を含むこと、及び（ii）そのような変異を含まないPCV2 ORF2タンパク質と比較して好ましくは顕著により大量に発現されることを特徴とする。
【００１７】
本発明の関係でいう、“遺伝的にコードされる、アルギニン残基又はリジン残基以外のアミノ酸残基”という用語は、特に、アラニン残基（A）、アスパラギン酸残基（D）、アスパラギン残基（N）、システイン残基（C）、グルタミン残基（Q）、グルタミン酸残基（E）、フェニルアラニン残基（F）、グリシン残基（G）、ヒスチジン残基（H）、イソロイシン残基（I）、ロイシン残基（L）、メチオニン残基（M）、プロリン残基（P）、セリン残基（S）、スレオニン残基（T）、バリン残基（V）、トリプトファン残基（W）及びチロシン残基（Y）から成る群から選択されるアミノ酸残基（カッコ内は一文字コード）を指す。
より具体的には、前記アルギニン残基又はリジン残基以外のアミノ酸残基は、極性であるが電荷をもたない側鎖を有するアミノ酸残基、疎水性側鎖を有するアミノ酸残基、及びグリシン残基から成る群から選択され、ここで、好ましくは、極性であるが電荷をもたない側鎖を有するアミノ酸残基は、セリン残基、スレオニン残基、チロシン残基、アスパラギン残基、及びグルタミン残基から成る群から選択され、及び/又は前記疎水性側鎖を有するアミノ酸は、好ましくはアラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、フェニルアラニン残基、及びトリプトファン残基から成る群から選択される。
最も好ましくは、本発明の関係でいうアルギニン残基又はリジン残基以外のアミノ酸残基は、セリン残基及びスレオニン残基から成る群から選択される。
さらに別の好ましい特徴では、本発明のポリペプチドは組換えPCV2 ORF2タンパク質、例えばバキュロウイルス発現組換えPCV2 ORF2タンパク質である。
【００１８】
本明細書で用いられる、“組換えPCV2 ORF2タンパク質”という用語は、特に、組換えDNA分子から発現されるタンパク質分子、例えば組換えDNA技術によって製造されるポリペプチドを指す。そのような技術の例には、発現されるタンパク質をコードするDNAを適切な発現ベクター（好ましくはバキュロウイルス発現ベクター）に挿入し、続いて前記をトランスフェクトするために用いるか、又はバキュロウイルス発現ベクターの場合には、該DNAによってコードされるタンパク質若しくはポリペプチドを製造するために宿主細胞を感染させる事例が含まれる。本明細書で用いられる、“組換えPCV2 ORF2タンパク質”という用語は、したがって、特に組換えDNA分子から発現されるタンパク質分子を指す。
具体的な例にしたがえば、組換えPCV2 ORF2タンパク質は以下の工程を有する方法によって製造される：PCV2 ORF2タンパク質の遺伝子をバキュロウイルストランスファーベクターでクローニングする工程、該トランスファーベクターを用い昆虫細胞で相同組換えによって前記遺伝子を含む組換えバキュロウイルスを調製する工程、及び該組換えバキュロウイルスによる感染の間に昆虫細胞で該PCV2 ORF2タンパク質を発現させる工程。
また別の例にしたがえば、組換えPCV2 ORF2タンパク質は昆虫細胞で組換え発現プラスミドから発現される。この代替例の場合にはバキュロウイルスは不要である。
【００１９】
さらにまた、“ある配列から成る組換えPCV2 ORF2タンパク質”という用語は、特に、該ポリペプチドを発現する細胞の作用を受ける当該配列の任意の翻訳時及び/又は翻訳後改変（1つの改変又は複数の改変）にもまた関係があることは理解されるであろう。したがって、本明細書に記載される、“ある配列から成る組換えPCV2 ORF2タンパク質”という用語は、該ポリペプチドを発現する細胞が引き起こす1つ以上の改変、特にタンパク質生合成及び/又はタンパク質プロセッシング（好ましくはグリコシル化、リン酸化及びアセチル化から成る群から選択される）で引き起こされるアミノ酸残基の改変を有する配列に向けられる。
好ましくは、本発明の組換えPCV2 ORF2タンパク質は、バキュロウイルス発現系によって、特に培養昆虫細胞で製造されるか、又は入手できる。
別の好ましい特徴では、本発明のポリペプチドはPCV2 サブタイプb（PCV2b）ORF2タンパク質である。
さらにまた別の好ましい特徴では、本発明のポリペプチドは、配列番号:1のアミノ酸配列と少なくとも90%、好ましくは少なくとも92%、より好ましくは少なくとも94%、さらに好ましくは少なくとも96%、さらにまた好ましくは少なくとも98%、又は特に100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又は前記配列から成るPCV2 ORF2タンパク質である。
最も好ましくは、本発明のポリペプチドは配列番号:6−9の配列から成る群から選択される（前記はまた図8に示される）。したがって、本発明のポリペプチドは、好ましくは以下の配列（i）−（iv）から選択される：
【００２０】
0006778104.tif 000002
（配列番号６）
【００２１】
0006778104.tif 000003
（配列番号７）
【００２２】
0006778104.tif 000004
（配列番号８）
【００２３】
0006778104.tif 000005
（配列番号９）
【００２４】
前記配列（i）−（iv）で、
“X”は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及びYから成る群から選択される任意のアミノ酸残基であり、
“X”は、A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、W及びYから成る群から選択される任意のアミノ酸残基であり、さらに
太字の“x”は、D及びEから成る群から選択される任意のアミノ酸残基である。
説明のために及び非限定的な例として、本発明のポリペプチドは以下の配列から成るポリペプチドであり：
MTYPRRRFRRRRHRPRSHLGQILRRRPWLVHPRHRYRWRRKNGIFNTRLSRTIGYTVKKTTVXTPSWNVDMMRFNINDFLPPGGGSNPLTVPFEYYRIRKVKVEFWPCSPITQGDRGVGSTAVILDDNFVTKANALTYDPYVNYSSRHTITQPFSYHSRYFTPKPVLDRTIDYFQPNNKRNQLWLRLQTTGNVDHVGLGTAFENSIYDQDYNIRITMYVQFREFNLKDPPLNPK（配列番号:46）
ここで、“X”は、A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、W及びYから成る群から選択される任意のアミノ酸残基である。
本発明のまた別の好ましい特徴では、本明細書に記載される野生型PCV２ ORF２タンパク質は配列番号:2に示すタンパク質である。
【００２５】
別の特徴にしたがえば、本発明はさらに本発明のポリペプチドを含む免疫原性組成物を提供する。
別の好ましい特徴にしたがえば、本発明はさらに、本発明のポリペプチド及びPCV2a ORF-2ポリペプチドを含む免疫原性組成物を提供し、ここで、前記PCV2a ORF-2ポリペプチドは、好ましくは、配列番号:3の配列と少なくとも94%又は好ましくは少なくとも95%同一のポリペプチドである。
さらに別の特徴にしたがえば、本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを提供し、本発明の前記ポリヌクレオチドは好ましくは単離ポリヌクレオチドである。
説明のために及び非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチドは配列番号:4に示す配列を含むポリヌクレオチドである。
本明細書に記載されるポリヌクレオチドの製造は当分野の技術範囲内であり、とりわけ以下に記載された組み換え技術にしたがって実施できる：Sam brook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY；Amusable, et al., 2003, Current Protocols In Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, NY；Innis et al. (eds), 1995, PCR Strategies, Academic Press, Inc., San Diego；及びErlich (ed), 1994, PCR Technology, Oxford University Press, New York（前記はいずれも参照により本明細書に含まれる）。
【００２６】
さらにまた、本発明は特に、本発明のポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含むバキュロウイルスを提供し、本発明の前記バキュロウイルスは好ましくは単離バキュロウイルスである。
さらにまた、本発明はまたプラスミド（好ましくは発現ベクター）を提供し、前記は本発明のポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含み、本発明の前記プラスミドは特に単離プラスミドである。
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含むバキュロウイルス、又は本発明のポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含むプラスミド（好ましくは発現ベクター）を含む細胞を提供し、本発明の前記細胞は好ましくは単離細胞である。
さらに別の特徴では、本発明はまた、医薬（好ましくはワクチン）の調製のための本発明のポリペプチド、本発明のバキュロウイルス、本発明の免疫原性組成物、本発明のポリヌクレオチド、本発明のプラスミド、及び/又は本発明の細胞の使用に関する。
この関係では、本発明はまた本発明のポリペプチドを製造する方法を提供し、前記方法は、細胞（好ましくは昆虫細胞）に本発明のバキュロウイルスを感染させる工程を含む。
さらにまた、本発明はまた本発明のポリペプチドを製造する方法を提供し、前記方法は、細胞に本発明のプラスミドをトランスフェクトする工程を含む。
【００２７】
本発明のポリペプチドは、好ましくは、ウイルス様粒子の安定的な自己集合のために十分に大量に発現され、前記ウイルス様粒子は、特にそれらが免疫原性組成物に含まれるならば一回接種ワクチン免疫に用いて、PCV2感染（例えばPCV2b及び/又はPCV2a感染）によって引き起こされる臨床徴候を軽減及び予防させることができる。
したがって本発明は具体的にはさらに本発明のポリペプチド又は本発明の免疫原性組成物にそれぞれ基づいて達成され、ここで本発明の前記ポリペプチド又は本発明のポリペプチドを含む前記免疫原性組成物を個々の目的に用いることができる。
ある特徴では、本発明はしたがって、PCV2感染の治療若しくは予防、PCV2感染によって引き起こされる臨床徴候の軽減、予防若しくは治療、又はPCV感染によって引き起こされる疾患の予防若しくは治療のための方法で使用される、本発明のポリペプチド又は本発明のポリペプチドを含む免疫原性組成物に関する。
本発明はまた、PCV2感染の治療若しくは予防、PCV2感染によって引き起こされる臨床徴候の軽減、予防若しくは治療、又はPCV感染によって引き起こされる疾患の予防若しくは治療のための方法を提供し、前記方法は、本発明のポリペプチド又は本発明のポリペプチドを含む免疫原性組成物を、特にその必要がある動物に投与する工程を含む。
さらにまた、本発明は、PCV2感染の治療若しくは予防、PCV2感染によって引き起こされる臨床徴候の軽減、予防若しくは治療、又はPCV感染によって引き起こされる疾患の予防若しくは治療のための医薬を調製するために、本発明のポリペプチド又は本発明のポリペプチドを含む免疫原性組成物の使用を提供する。
【００２８】
好ましい特徴では、本明細書に記載されるPCV2による感染は、PCV2 bサブタイプ（PCV2b）による感染及び/又は2bサブタイプ以外のサブタイプのPCV2による感染である。
本明細書で用いられる、“PCV2による感染”という用語は“PCV2感染”という用語と等価である。
特に、本明細書にいう、2bサブタイプ以外のサブタイプによる感染は、PCV2 aサブタイプ（PCV2a）及び/又はPCV2 cサブタイプ（PCV2c）による感染であり、好ましくはPCV2aによる感染である。
本明細書に記載される、“PCV2 bサブタイプ（PCV2b）ORF２タンパク質”という用語は、PCV2遺伝子型の規定のために標準化された命名法によって規定されるPCV-2bのORF2遺伝子によってコードされるタンパク質と合致する（Segales, J. et al., 2008, PCV-2 genotype definition and nomenclature, Vet Rec 162:867-8（前記文献は参照により本明細書に含まれる））。
別の好ましい特徴にしたがえば、本明細書に記載される、2bサブタイプ以外のサブタイプのPCV2による感染は、（i）2bサブタイプ以外のサブタイプのPCV2及び（ii）PCV2bによる同時感染、特にPCV2a及びPCV2bによる同時感染である。
本明細書に記載される、 “PCV2a”、“PCV2b”、及び“PCV2c”という用語はそれぞれ、PCV2遺伝子型の規定のために標準化された命名法にしたがって、それぞれPCV-2a、PCV-2b及びPCV-2cに合致する（Segales, J. et al., 2008, PCV-2 genotype definition and nomenclature, Vet Rec 162:867-8（前記文献は参照により本明細書に含まれる））。
【００２９】
特に、本明細書にいう、PCV2bによる感染は、（i）配列番号:2の配列と少なくとも94%、好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも96%、さらに好ましくは少なくとも97%、さらにまた好ましくは少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%同一のポリペプチドを含むPCV2、又は（ii）配列番号:2の配列と少なくとも94%、好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも96%、さらに好ましくは少なくとも97%、さらにまた好ましくは少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%同一のポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含むPCV2による感染である。
本明細書で用いられる、“配列番号:Xの配列と同一”という用語は、“配列番号:Xの長さにわたって配列番号:Xの配列と同一”という用語、又は“配列番号:Xの全長にわたって配列番号:Xの配列と同一”という用語とそれぞれ等価である。この関係では、“X”は1から3から選択される任意の整数で、したがって“配列番号:X”は本明細書にいう配列番号のいずれかを表す。
好ましくは、本明細書に記載されるPCV2aによる感染は、（i）配列番号:3の配列と少なくとも94%、好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも96%、さらに好ましくは少なくとも97%、さらにまた好ましくは少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%同一のポリペプチドを含むPCV2、又は（ii）配列番号:3の配列と少なくとも94%、好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも96%、さらに好ましくは少なくとも97%、さらにまた好ましくは少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%同一のポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含むPCV2による感染である。
【００３０】
好ましくは、本発明の関係では、PCV2による感染の治療又は予防は、前記PCV2に対する免疫応答の誘発に基づくか、又は前記誘発を含むか、又は前記誘発から成り、本明細書にいう臨床徴候は、リンパ系枯渇、リンパ系炎症、リンパ系組織におけるPCV2抗原IHC陽性、ウイルス血症、鼻汁排出、発熱、1日当たりの平均体重増加の低下、肺の炎症、肺組織におけるPCV2抗原IHC陽性から成る群から選択され、及び/又は本明細書にいう疾患はPMWSである。
特に、本発明の関係では、2b以外のサブタイプのPCV2による感染の治療又は予防は、2b以外のサブタイプの前記PCV2に対する免疫応答の誘発、又は2b以外のサブタイプの前記PCV2及びPCV2bに対する免疫応答の同時誘発に基づくか、又は前記を含むか、又は前記から成る。
本明細書で用いられる、“予防”若しくは“軽減”又は“予防する”若しくは“軽減する”という用語は、それぞれ、PCV2抗原、すなわち本発明のポリペプチド（前記は本発明の組成物に含まれる）の動物への投与を含むプロセス（ただし前記に限定されない）を意味し、ここで、前記PCV2抗原は、前記動物に投与されるとき前記動物でPCV2に対する免疫応答を誘引するか又は誘引することができる。総合すれば、そのような処置は、PCV2によって引き起こされる疾患の臨床徴候又はPCV2感染に随伴する臨床徴候の軽減をもたらす。より明確に言えば、本明細書で用いられる“予防”又は“予防する”という用語は、一般的には、PCV2によって引き起こされる疾患プロセスの誘発又は開始前に動物を本発明の免疫原性組成物に暴露する予防プロセスを意味する。
【００３１】
本明細書では、“PCV2感染に随伴する臨床徴候の軽減”は、野生型感染と比較して、一群中の感染動物の数の減少、感染の臨床徴候を示す動物数の減少若しくは消失、又は当該動物に存在する任意の臨床徴候の重篤度の軽減を意味する（ただしこれらに限定されない）。例えば、前記用語は、病原体保持量、病原体排出の任意の減少、病原体伝播の低下、又はPCV2感染の前兆となる任意の臨床徴候の軽減を指すはずである。好ましくは、これらの臨床徴候は、本発明の組成物を投与された対象動物で当該組成物を投与されていない対象動物と比較して少なくとも10%軽減される。より好ましくは、臨床徴候は、本発明の組成物を投与された対象動物で少なくとも20%、好ましくは少なくとも30%、より好ましくは少なくとも40%、さらに好ましくは少なくとも50%軽減される。
“ウイルス血症の軽減”という用語は、動物の血流に入るPCV2ウイルスの減少を意味し（ただし前記に限定されない）、ここでウイルス血症レベル（すなわち血清1mL当たりのPCV2 RNAコピー数又は血清1デシリットル当たりのプラーク形成コロニー数）は、当該組成物を投与されず感染が成立し得る対象動物と比較して、本発明の組成物を投与された対象動物の血清で少なくとも50%低下する。より好ましくは、ウイルス血症レベルは、本発明の組成物を投与された対象動物で少なくとも90%、好ましくは少なくとも99.9%、より好ましくは少なくとも99.99%、さらに好ましくは少なくとも99.999%低下する。
本明細書で用いられる、“ウイルス血症”という用語は、特にPCV2粒子が再生し動物の血流中を循環する状態と理解される。
【００３２】
本明細書で用いられる、“動物”という用語は特に、哺乳動物、好ましくはブタ類、より好ましくはブタ、最も好ましくは仔豚に関する。
本発明の特に好ましい特徴にしたがえば、本発明のポリペプチド又は本発明の免疫原性組成物は一度だけ投与される。
好ましくは、本発明の関係では、本発明のポリペプチド又は本発明の免疫原性組成物はそれぞれ、特に一度だけ動物に、好ましくはブタ類に、より好ましくはブタに、特に好ましくは仔豚に投与されるべきであるか又は投与される。
本発明は先行技術に固有の問題を解決し、現状技術に明瞭な進歩を提供する。別の特徴にしたがえば、本発明はまた、動物、好ましくは抗PCV2抗体を有する動物でPCV2感染を治療若しくは予防するため、又はPCV2感染によって引き起こされるか若しくは前記に随伴する臨床徴候を軽減するための方法を提供し、前記方法は、本発明のポリペプチド又は本発明の免疫原性組成物の有効量をそのような処置の必要がある当該動物に投与する工程を含む。
本明細書で用いられる“ワクチン”又は“免疫原性組成物”（両用語は同義語として用いられる）という用語は、本発明のポリペプチドを含む任意の医薬組成物を指す（前記組成物を用いて、PCV2感染に随伴する疾患若しくは症状を対象動物で予防又は治療することができる）。好ましい免疫原性組成物は、PCV2に対して免疫応答を誘発、刺激又は強化することができる。したがって、前記用語は、下記で述べる両サブユニット免疫原性組成物を、完全な殺滅又は弱毒及び/又は不活化PCV2b変異体を含む組成物と同様に包含する。
本明細書に記載される、“PCV2b変異体”という用語は、本発明のポリペプチド及び/又は本発明のポリヌクレオチドを含むPCV2b変異体に関係することは特に理解されるであろう。
【００３３】
別の特徴にしたがえば、本発明はまた、動物、好ましくは抗PCV2抗体（特に母親由来の抗PCV2抗体）を有する動物でPCV2感染を治療若しくは予防するため、又はPCV2感染によって引き起こされるか若しくは前記に随伴する臨床徴候を軽減するための方法を提供し、前記方法は、本発明のポリペプチド又は本発明のポリペプチドを含む免疫原性組成物の有効量をそのような処置の必要がある当該動物に投与する工程を含み、この場合、前記免疫原性組成物は、サブユニット免疫原性組成物、完全な殺滅若しくは弱毒及び/又は不活化PCV2bを含む組成物である。
本明細書で用いられる“サブユニット免疫原性組成物”という用語は、PCV2b変異体の抗原から誘導されたか又は前記抗原と相同である少なくとも1つの免疫原性ポリペプチド又は抗原（ただし抗原の全ではない）を含む組成物を指す。そのような組成物は完全なPCV2b変異体を実質的に含まない。したがって、“サブユニット免疫原性組成物”は、PCV2b変異体又はその組換えアナローグに由来する、少なくとも部分的に精製又は分画された（好ましくは実質的に精製された）免疫原性ポリペプチドから調製される。サブユニット免疫原性組成物は、PCV2b変異体由来の又は分画された形態にある他の抗原若しくはポリペプチドを実質的に含まない、対象となる1つのサブユニット抗原又は複数のサブユニット抗原を含むことができる。
【００３４】
“免疫応答”は、対象の組成物又はワクチンに対する細胞性及び/又は抗体媒介性免疫応答の宿主における発生を意味する（ただしこれらに限定されない）。通常、“免疫応答”には1つ以上の以下の作用が含まれる（ただしこれらに限定されない）：対象の組成物又はワクチンに含まれる1つの抗原又は複数の抗原に対して特異的に誘導される抗体、B細胞、ヘルパーT細胞、サプレッサーT細胞及び/又は細胞傷害性T細胞の生成又は活性化。好ましくは、宿主は、新規な感染に対する抵抗性が強化されるように、及び/又は当該疾患の臨床的重篤度が軽減されるように、治療的又は防御的な免疫学的（メモリー）応答を示すであろう。そのような防御は、PCV2感染（特にPCV2 bサブタイプ（PCV2b）及び/又は2bサブタイプ以外のサブタイプのPCV2による感染）に随伴する徴候の数若しくは重篤度の低下又は前記徴候の1つ以上の欠如、ウイルス血症開始の遅延、ウイルス存続の軽減、全体的なウイルス保持量の減少及び/又はウイルス排出の減少で示されるであろう。
本明細書で用いられる“抗原”は、上記に記載の免疫学的応答を誘引するアミノ酸配列を指す。
さらに別の特徴にしたがえば、本明細書で用いられる免疫原性組成物は、最も好ましくは、本発明のポリペプチドによって発現される本発明のポリペプチド又はそのフラグメントを含む。本発明の好ましいポリペプチドは配列番号:1のポリペプチドである。しかしながら、この配列は配列相同性で1−5%ほどの変動が可能であり、それでもなお本発明の免疫原性組成物として当該配列を有用にする抗原性の特徴を保持することは当業者には理解さるであろう。
【００３５】
当分野で公知の“配列同一性”は、2つ以上のポリペプチド配列又は2つ以上のポリヌクレオチド配列（すなわち参照配列及び参照配列と比較されるべきある配列）間の関係を指す。配列同一性は、そのような配列の一連続部分間の一致によって決定したとき最高度の配列類似性を生じるように配列を最適にアライメントした後で、ある配列を参照配列と比較することによって決定される。そのようなアライメントに際して、配列同一性は1つの位置毎に確認される。例えば、個々の位置でヌクレオチド又はアミノ酸残基が同一であれば、当該位置でそれら配列は同一である。続いてそのような各位置同一性を有する総数を参照配列中のヌクレオチド又は残基の総数で割って％配列同一性が提供される。配列同一性は、公知の方法（以下に記載された方法を含むが、ただしこれらに限定されない：Computational Molecular Biology, A.N. Lesk ed., Oxford University Press, New York (1988)；Biocomputing: Informaics and Genomu Projects, D.W. Smith ed., Academic Press, New York (1993)； Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, A.M. Griffin, and H.G. Griffin eds., Humana Press, New Jersey (1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology, G. von Heinge, Academic Press (1987)；Sequence Analysis Primer, M. Gribskov and J. Devereux eds., M. Stockton Press New York (1991)；及びH. Carillo and D. Lipman, SIAM J Applied Math., 1988, 48:1073（前記文献の教示は参照により本明細書に含まれる））によって容易に計算することができる。配列同一性を決定する好ましい方法は、検査される配列間で最大の一致を提供するように考案される。配列同一性を決定する方法は、公開されたコンピュータプログラム（与えられた配列間の配列同一性を決定する）で集大成されている。そのようなプログラムの例には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：GCGプログラムパッケージ（J. Devereux et al. Nucleic Acids Research, 1984, 12(1):387）、BLASTP、BLASTN及びFASTA（S.F. Altschul et al. J Molec Biol 1990, 215:403-410）。BLASTXプログラムはNCBI及び他の供給源から公開されている（BLAST Manual, S. Altshul et al. NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894；S.F. Altschul et al. J Molec Biol 1990, 215:403-410（前記文献の教示は参照により本明細書に含まれる））。これらのプログラムは、ある配列と参照配列との間で最高レベルの配列同一性を生じるためにデフォルトギャップ重を用いて配列を最適にアライメントする。例示として、参照ヌクレオチド配列に対して、例えば少なくとも85%、好ましくは90%、さらに好ましくは95％の“配列同一性”を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって、前記与えられたポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、参照ヌクレオチド配列の100ヌクレオチド毎に15までの点変異、好ましくは10までの点変異、より好ましくは5までの点変異を含みうることを除いて参照配列と同一であるということが意図される。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも85%、好ましくは90%、さらに好ましくは95%同一性を有するポリヌクレオチドでは、参照配列の15%まで、好ましくは10%まで、さらに好ましくは5%までのヌクレオチドが欠失しているか又は別のヌクレオチドで置換されるか、又は参照配列中の全配列の15%まで、好ましくは10%まで、さらに好ましくは5%までの数のヌクレオチドが、前記参照配列に挿入されうる。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の5'若しくは3'末端の位置又はこれら末端の位置の間の任意の位置に生じるか、参照配列内のヌクレオチド間に個々に若しくは参照配列内で1つ以上の連続する群として点在することができる。同様に、参照アミノ酸配列に対して、例えば少なくとも85%、好ましくは90%、さらに好ましくは95％の配列同一性を有するあるアミノ酸配列を有するポリペプチドによって、前記与えられたポリペプチドのアミノ酸配列は、参照アミノ酸配列の100アミノ酸毎に15まで、好ましくは10まで、より好ましくは5までのアミノ酸変異を含みうることを除いて参照配列と同一であるということが意図される。換言すれば、参照アミノ酸配列と少なくとも85%、好ましくは90%、さらに好ましくは95%の同一性を有するあるポリペプチドを得るために、参照配列のアミノ酸残基の15%まで、好ましくは10%まで、さらに好ましくは5%までを欠失させるか又は別のアミノ酸で置換するか、又は参照配列のアミノ酸残基の総数の15%まで、好ましくは10%まで、さらに好ましくは5%までの数のアミノ酸を前記参照配列に挿入することができる。参照配列のこれらの変異は、参照アミノ酸配列のアミノ若しくはカルボキシ末端の位置又はこれら末端の位置の間の任意の位置に生じるか、参照配列内の残基間に個々に若しくは参照配列内の1つ以上の連続する群として点在することができる。好ましくは同一ではない残基の位置は、保存的アミノ酸置換により相違する。しかしながら、保存的置換は配列同一性を決定するときは一致に算入されない。
【００３６】
本明細書で用いられる“配列相同性”は、2つの配列の関連を決定する方法を指す。配列相同性を決定するために、2つ以上の配列が最適にアライメントされ、必要な場合にはギャップが導入される。しかしながら“配列同一性”とは対照的に、保存的アミノ酸置換は配列相同性を決定するとき一致として数えられる。換言すれば、参照配列と95%の配列相同性を有するポリペプチド又はポリヌクレオチドを得るために、参照配列内のアミノ酸残基又はヌクレオチドの85%、好ましくは90%、より好ましくは95%が一致するか又は別のアミノ酸若しくはヌクレオチドとの保存的置換を含む必要があるか、又は参照配列内の全アミノ酸残基若しくはヌクレオチドの15%まで、好ましくは10%まで、さらに好ましくは5%までの数のアミノ酸残基若しくはヌクレオチド（保存的置換は含まない）を参照配列に挿入することができる。好ましくは、相同配列は少なくとも50、より好ましくは少なくとも100、さらに好ましくは少なくとも250、なお好ましくは少なくとも500の一続きのヌクレオチドを含む。
“保存的置換”は、類似の特徴又は特性（サイズ、疎水性などを含む）を有する別のアミノ酸残基又はヌクレオチドとアミノ酸残基又はヌクレオチドとの、全体的機能性を顕著には変化させないようなアミノ酸残基又はヌクレオチドの置換を指す。
“単離” されるとは、“人間の手によって”その天然の状態から変化させることを意味する。すなわち、前記が天然に存在する場合は、それは変化させられてあるか、又はその本来の環境から取り出されてあるか、又はその両方である。例えば、生きている生物に天然に存在するポリヌクレオチド又はポリペプチドは“単離”されていないが、その天然の状態で一緒に存在する物質から分離された前記ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、本用語が本明細書で用いられているように“単離”されてある。
【００３７】
したがって、さらに別の特徴によれば、本発明は、動物、好ましくは抗PCV2抗体（特に母親由来の抗PCV2抗体）を有する動物でPCV2感染を治療若しくは予防するため、又はPCV2感染によって引き起こされるか若しくは前記に随伴する臨床徴候を軽減するための方法を提供し、前記方法は、本発明のポリペプチド又は本発明のポリペプチドを含む免疫原性組成物の有効量をそのような処置の必要がある当該動物に投与する工程を含み、前記本発明のポリペプチドは本明細書に記載のポリペプチドの任意のものである。好ましくは本発明のタンパク質のポリペプチドは、（i）配列番号:1の配列を含むか、又は前記配列から成るポリペプチド；又は（ii）（i）のポリペプチドと少なくとも95%相同である任意のポリペプチドである。
さらに別の特徴にしたがえば、本発明のポリペプチドは、所望の免疫応答（すなわちPCV2感染から生じるか又はPCV2感染に随伴する1つ以上の臨床徴候の発生の低下、その重篤度の軽減又はその予防若しくは軽減）を誘発するために有効なタンパク質含有レベルで免疫原性組成物中に提供される。好ましくは、本発明のポリペプチドの含有レベルは、最終免疫原性組成物1mL当たり少なくとも0.2μgタンパク質（μg/mL）、より好ましくは0.2から約400μg/mL、さらに好ましくは約0.3から約200μg/mL、さらに好ましくは約0.35から約100μg/mL、さらに好ましくは約0.4から約50μg/mL、さらに好ましくは約0.45から約30μg/mL、さらに好ましくは約0.5から約18μg/mL、さらに好ましくは約0.6から約15μg/mL、さらに好ましくは約0.75から約8μg/mL、さらに好ましくは約1.0から約6μg/mL、さらに好ましくは約1.3から約3.0μg/mL、さらに好ましくは約1.4から約2.5μg/mL、さらに好ましくは約1.5から約2.0μg/mL、もっとも好ましくは約1.6μg/mLである。
【００３８】
さらに別の特徴にしたがえば、タンパク質含有量レベルは、最終免疫原性組成物の1用量当たり少なくとも0.2μgの上記に記載のPCV2b ORF-2タンパク質（μg/用量）、より好ましくは約0.2から約400μg/用量、さらに好ましくは約0.3から約200μg/用量、さらに好ましくは約0.35から約100μg/用量、さらに好ましくは約0.4から約50μg/用量、さらに好ましくは約0.45から約30μg/用量、さらに好ましくは約0.5から約18μg/用量、さらに好ましくは約0.6から約15μg/用量、さらに好ましくは約0.75から約8μg/用量、さらに好ましくは約1.0から約6μg/用量、さらに好ましくは約1.3から約3.0μg/用量、さらに好ましくは約1.4から約2.5μg/用量、さらに好ましくは約1.5から約2.0μg/用量、もっとも好ましくは約1.6μg/用量である。さらにまた、20μg/用量未満、好ましくは約0.5から18μg/用量の本発明のポリペプチド含有レベル（抗原含有量）が、幼若動物及び/又はPCV2抗体陽性動物（特に母親由来の抗PCV2抗体陽性動物）に免疫を付与するために適切である。したがって、さらに別の特徴によれば、本発明はまた、動物、好ましくは抗PCV2抗体（特に母親由来の抗PCV2抗体）を有する動物でPCV2感染を治療若しくは予防するため、又はPCV2感染によって引き起こされるか若しくは前記に随伴する臨床徴候を軽減するための方法を提供し、前記方法は、そのような処置を必要とする当該動物に20μg/用量未満、好ましくは約0.5から18μg/用量の本発明のポリペプチド又は本発明のポリペプチドを含む免疫原性組成物を投与する工程を含む。前記本発明のポリペプチドはこの特許出願に記載の任意のポリペプチドである。
【００３９】
本発明にしたがって免疫原性組成物で用いられる本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドの単離及び精製、標準的なタンパク質合成、並びに組換え方法論を含む任意の態様で誘導することができる。本発明のポリペプチドを入手するための好ましい方法はWO06/072065（前記文献の教示及び内容はその全体が参照により本明細書に含まれる）で提供される。なぜならば、驚くべきことに、前記に記載されているPCV2a ORF2ポリペプチドを入手する方法を本発明のポリペプチドの入手に用いることができることが判明したからである。略記すれば、本発明のポリペプチドをコードするDNAコード配列を含む組換えウイルスベクターを感受性細胞に感染させ、本発明のタンパク質のポリペプチドを組換えウイルスによって発現させ、発現された本発明のポリペプチドをろ過によって上清から回収し、さらに任意の通常的方法によって不活化する（好ましくは二元エチレンイミンを用い、続いて不活化プロセスを停止させるために前記を中和する）。
本明細書で用いられる免疫原性組成物はまた以下を含む組成物を指す：i）上記に記載の本発明のポリペプチドのいずれか（好ましくは上記に記載の濃度で）、及びii）前記本発明のポリペプチドを発現するウイルスベクター、好ましくは組換えバキュロウイルスの少なくとも一部分。さらにまた、免疫原性組成物は以下を含むことができる：i）上記に記載の本発明のポリペプチドのいずれか（好ましくは上記に記載の濃度で）、ii）前記本発明のポリペプチドを発現するウイルスベクター、好ましくは組換えバキュロウイルスの少なくとも一部分、及びiii）細胞培養上清の一部分。
したがって、さらに別の特徴によれば、本発明はまた、動物、好ましくは抗PCV2抗体（特に母親由来の抗PCV2抗体）を有する動物でPCV2感染を治療若しくは予防するため、又はPCV2感染によって引き起こされるか若しくは前記に随伴する臨床徴候を軽減するための方法を提供し、前記方法は、本発明のポリペプチド又は本発明のポリペプチドを含む免疫原性組成物の有効量をそのような処置の必要がある当該動物に投与する工程を含み、本発明のポリペプチドは、組換え体、好ましくはバキュロウイルスによって発現される本発明のポリペプチドである。好ましくは、それら組換え体又はバキュロウイルスによって発現される本発明のポリペプチドは上記に記載の配列を有する。
【００４０】
本明細書で用いられる免疫原性組成物はまた以下を含む組成物を指す：i）上記に記載の本発明のポリペプチドのいずれか（好ましくは上記に記載の濃度で）、ii）前記本発明のポリペプチドを発現するウイルスベクター、好ましくは組換えバキュロウイルスの少なくとも一部分、及びiii）細胞培養物の一部分、ここで前記成分の約90%は1μmよりも小さいサイズを有する。
本明細書で用いられる免疫原性組成物はまた以下を含む組成物を指す：i）上記に記載の本発明のポリペプチドのいずれか（好ましくは上記に記載の濃度で）、ii）本発明のポリペプチドを発現するウイルスベクターの少なくとも一部分、iii）細胞培養物の一部分、及びiv）組換えウイルスベクターを不活化するための不活化剤、好ましくはBEI、ここで前記成分i）からiii）の約90%は1μmよりも小さいサイズを有する。好ましくは、BEIは、バキュロウイルスを不活化するために有効な濃度で、好ましくは2から約8mMのBEI、好ましくは約5mMのBEIの量で存在する。
本明細書で用いられる免疫原性組成物はまた以下を含む組成物を指す：i）上記に記載の本発明のポリペプチドのいずれか（好ましくは上記に記載の濃度で）、ii）前記本発明のポリペプチドを発現するウイルスベクターの少なくとも一部分、iii）細胞培養物の一部分、iv）組換えウイルスベクターを不活化するための不活化剤、好ましくはBEI、及びv）不活化剤によって媒介される不活化を停止させるための中和剤、ここで前記成分i）からiii）の約90%は1μmよりも小さいサイズを有する。好ましくは、不活化剤がBEIの場合、前記組成物は、BEIに対して等価量のチオ硫酸ナトリウムを含む。
【００４１】
当該タンパク質は、PCV2感染に感受性を有する動物に投与することができる組成物に取り入れられる。好ましい形態では、前記組成物はまた当業者に公知の追加の成分を含むことができる（以下もまた参照されたい：Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) 18th ed. Mack Publ., Easton）。さらにまた、前記組成物は、1つ以上の獣医学的に許容できる担体を含むことができる。本明細書で用いられる、“獣医学的に許容できる担体”には、任意の及び全ての溶媒、分散媒体、コーティング、アジュバント、安定化剤、希釈剤、保存料、抗菌及び抗カビ剤、等張剤、吸着遅延剤などが含まれる。好ましい実施態様では、免疫原性組成物は、本明細書で提供される本発明のポリペプチドを好ましくは上記に記載の濃度で含み、前記は、アジュバント（好ましくはカルボポール）及び生理学的食塩水と混合される。
本明細書で用いられる組成物は、公知の注射可能な生理学的に許容される無菌的溶液を含むことができることは当業者には理解されるであろう。非経口注射又は輸液用即席溶液を調製するために、等張水溶液、例えば食塩水又は対応する血漿タンパク質溶液を容易に利用することができる。さらにまた、本発明の免疫原性及びワクチン組成物は、希釈剤、等張剤、安定化剤又はアジュバントを含むことができる。希釈剤は、水、食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロールなどを含むことができる。等張剤は、とりわけ塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール及びラクトースを含むことができる。安定化剤には、とりわけアルブミン及びエチレンジアミン四酢酸のアルカリ塩が含まれる。
【００４２】
本明細書で用いられる“アジュバント”には、水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウム、サポニン、例えばQuil A、QS-21（Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA）、GP1-0100（Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL）、油中水エマルジョン、水中油エマルジョン、水中油中水エマルジョンが含まれえる。エマルジョンは特に以下を基剤にすることができる：液状軽パラフィン油（European Pharmacopea type）；イソプレノイド油、例えばアルケン（特にイソブテン又はデセン）のオリゴマー化から生じるスクァラン又はスクァレン油；直鎖状アルキル基を含む酸又はアルコールのエステル、より具体的には植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールジ-(カプリレート/カプレート)、グリセリルトリ-(カプリレート/カプレート)、又はプロピレングリコールジオレエート；分枝脂肪酸又はアルコールのエステル、特にイソステアリン酸エステル。油は、エマルジョンを形成させるために乳化剤と一緒に用いられる。乳化剤は、好ましくは非イオン性界面活性剤、特にソルビタンのエステル、マンニドのエステル（例えばアンヒドロマンニトールオレエート）、グリコールのエステル、ポリグリセロールのエステル、プロピレングリコールのエステル、及びオレイン酸、イソステアリン酸又はヒドロキシステアリン酸のエステル（前記は場合によってエトキシル化される）、並びにポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンコポリマーブロック、特にプルロニックの製品、特にL121である（以下を参照されたい：Hunter et al. The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed. D.E.S.Stewart-Tull). John Wiley and Sons. NY, pp51-94 (1995)；Todd et al., Vaccine 1997, 15:564-570）。
例えば以下の文献（”Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach” M. Powell and M. Newman eds, Plenum Press, 1995）の147ページに記載されているSPTエマルジョン、及び同書の183ページに記載されているエマルジョンMF59を使用することができる。
【００４３】
アジュバントのさらに別の例は、アクリル酸又はメタクリル酸のポリマー並びに無水マレイン酸及びアルケニル誘導体のコポリマーから選択される化合物である。有利なアジュバント化合物は、アクリル酸又はメタクリル酸のポリマーであり、前記は特に糖又はポリアルコールのポリアルケニルエーテルで架橋される。これらの化合物はカルボマーという用語により知られている（Phameuropa Vol.8, No.2, June 1996）。当業者はまた米国特許2,909,462号を参照することができる（前記は、少なくとも3つのヒドロキシル基（好ましくは8個を超えない）を有し、少なくとも3つのヒドロキシルの水素原子が少なくとも2つの炭素原子を有する不飽和脂肪族ラジカルによって入れ替えられている、ポリヒドロキシル化化合物で架橋されたアクリル酸ポリマーを開示する）。好ましいラジカルは、2から4つの炭素原子を含むもので、例えばビニル、アリル及び他のエチレン系不飽和基である。不飽和ラジカルはそれ自体他の置換基、例えばメチルを含むことができる。カルボポール（BF Goodrich, Ohio, USA）の名称で販売されている製品が特に適切である。それらは、アリルシュクロース又はアリルペンタエリトリトールで架橋される。それらの中ではカルボポール974P、934P及び971Pを挙げることができる。もっとも好ましいものはカルボポールの使用、特にカルボポール971Pの使用であり、好ましくは約500μgから約5mg/用量の量、より好ましくは約750μgから約2.5mg/用量の量、もっとも好ましくは約1mg/用量の量での使用である。
さらに適切なアジュバントには多くのものの中でとりわけ以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：RIBIアジュバント系（Ribi Inc.）、ブロックコポリマー（Cytrx, Atlanta GA）、SAF-M（Chiron, Emeryville CA）、モノホスホリル脂質A、アブリジン脂質-アミンアジュバント、大腸菌由来易熱性エンテロトキシン（組換え体又は他の形態）、コレラトキシン、IMS1314、又はムラミルジペプチド。
好ましくは、アジュバントは約100μgから約10mg/用量の量で添加される。より好ましくは、アジュバントは約100μgから約10mg/用量の量で添加される。より好ましくは、アジュバントは約500μgから約5mg/用量の量で添加される。より好ましくは、アジュバントは約750μgから約2.5mg/用量の量で添加される。もっとも好ましくは、アジュバントは約1mg/用量の量で添加される。
【００４４】
さらにまた、組成物は、1つ以上の医薬的に許容できる担体を含むことができる。本明細書で用いられる“医薬的に許容できる担体”には任意の全ての溶媒、分散媒体、コーティング、安定化剤、希釈剤、保存料、抗菌及び抗カビ剤、等張剤、吸着遅延剤などが含まれる。もっとも好ましくは、本明細書で提供される組成物は、in vitro培養細胞の上清から回収される本発明のポリペプチドを含む。この場合、前記細胞を、本発明のポリペプチドをコードするDNAを含み、本発明のポリペプチドを発現する組換えウイルスベクターに感染させ、さらに、前記細胞培養を、約2から8mMのBEI、好ましくは約5mMのBEIで処理してウイルスベクターを不活化し、さらに等価濃度の中和剤、好ましくはチオ硫酸ナトリウム溶液で、約2から約8mM、好ましくは約5mMの最終濃度で処理した。
本発明はまた以下を含む免疫原性組成物に関する：i）上記に記載の本発明のポリペプチドのいずれか（好ましくは上記に記載の濃度で）、ii）前記本発明のポリペプチドを発現するウイルスベクターの少なくとも一部分、iii）細胞培養物の一部分、iv）組換えウイルスベクターを不活化するための不活化剤（好ましくはBEI）、v）不活化剤によって媒介される不活化を停止させるための中和剤、好ましくはBEIに対して等価の量のチオ硫酸ナトリウム、及びvi）適切なアジュバント、好ましくは上記記載の量のカルボポール971、ここで前記成分i）からiii）の約90%は1μmよりも小さいサイズを有する。さらに別の特徴にしたがえば、この免疫原性組成物はさらに、医薬的に許容できる塩、好ましくはリン酸塩を生理学的に許容できる濃度で含む。好ましくは、前記免疫原性組成物のpHは生理学的pH（約6.5から7.5の間を意味する）に調節される。
【００４５】
本明細書で用いられる免疫原性組成物はまた1mL当たり以下のi）−vii）を含む組成物を指す：i）上記記載の本発明のポリペプチドの少なくとも1.6μg、好ましくは20μg未満、ii）前記本発明のポリペプチドを発現するバキュロウイルスの少なくとも一部分、iii）細胞培養物の一部分、iv）約2から8mMのBEI、v）BEIに対して等価の量のチオ硫酸ナトリウム、vi）約1mgのカルボポール971、及びvii）生理学的に許容される濃度のリン酸塩、ここで前記成分i）からiii）の約90%は1μmよりも小さいサイズを有し、さらに前記免疫原性組成物のpHは約6.5から7.5に調節される。
免疫原性組成物はさらに、1つ以上の免疫調節剤（例えばインターロイキン、インターフェロン又は他のサイトカイン）を含むことができる。免疫原性組成物はまたゲンタマイシン及びマーチオレートを含むことができる。本発明の関係で有用なアジュバント並びに添加物の量及び濃度は当業者には容易に決定できるが、本発明は、ワクチン組成物の1mL用量当たり約50μgから約2000μgのアジュバント、好ましくは約250μgを含む組成物を意図している。したがって、本明細書で用いられる免疫原性組成物はまた、約1μg/mLから約60μg/mLの抗生物質、より好ましくは約30μg/mL未満の抗生物質を含む組成物を指す。
本明細書で用いられる免疫原性組成物はまた以下を含む組成物を指す：i）上記に記載の本発明のポリペプチドのいずれか（好ましくは上記に記載の濃度で）、ii）前記本発明のポリペプチドを発現するウイルスベクターの少なくとも一部分、iii）細胞培養物の一部分、iv）組換えウイルスベクターを不活化するための不活化剤（好ましくはBEI）、v）不活化剤によって媒介される不活化を停止させるための中和剤、好ましくはBEIに対して等価の量のチオ硫酸ナトリウム、vi）適切なアジュバント、好ましくは上記記載の量のカルボポール971、vii）医薬的に許容できる濃度の塩性緩衝剤、好ましくはリン酸塩、及びviii）抗菌活性剤、ここで前記成分i）からiii）の約90%は1μmよりも小さいサイズを有する。
【００４６】
本発明のポリペプチドと移行抗体（maternal antibody）との起こりうる干渉を解明するために、調査動物の抗体力価をワクチン接種時に決定し、続いてそれらを低、中、及び高抗体クラスに分類する調査を実施することができる。すなわち、相乗平均力価が＜1：100は低抗体力価と考えられ、1：100から1：1000は中抗体力価と考えられ、＞1：1000の力価は高抗体と考えられる。この分類パターンはカナダの野外調査で実施されたものと類似し、カナダ野外調査では1：80の抗体力価は低、1：640の抗体力価は中、及び＞1：1280の抗体力価は高力価と考えられた（Larochelle et al. 2003, Can J Vet Res, 67:114-120）。ウイルス血症に対するワクチン接種時における低、中、高抗体力価の影響を分析するために、ワクチン接種及びプラセボ処理動物を、ウイルス血症の開始、終結、期間、陽性サンプル採取日数及びウイルス保持量に関して比較する。抗PCV2抗体（特に母親由来抗体）の存在は、これらのパラメーターのいずれにも有意な影響を与えない。換言すれば、PCV2感染の治療若しくは予防、又はPCV2感染によって引き起こされるか、若しくはPCV2感染に随伴する臨床徴候の軽減における本発明のポリペプチドの有効性は、好ましくは、ワクチン接種日の抗PCV2抗体の存在によって、好ましくは1：100までの抗PCV2抗体力価、好ましくは1：100を超える、より好ましくは1：250を超える、さらに好ましくは1：500を超える、さらに好ましくは1：640を越える、さらに好ましくは1：750を超える、もっとも好ましくは1：1000を超える抗PCV2抗体力価によって影響を受けない。この効果は1回接種ワクチン免疫実験で示すことができ、前記実験は、本発明のポリペプチドがただ1回投与され、その後の本発明のポリペプチドの投与は全くないことを意味する。
【００４７】
抗PCV2抗体を検出及び定量する方法は当分野で周知である。例えば、PCV2抗体の検出及び定量は、以下に記載される間接免疫蛍光によって実施することができる：Magar et al. 2000, Can J Vet Res, 64:184-186；又はMagar et al. 2000, J Comp Pathol 123:258-269。抗PCV2抗体の検出のためのさらに別のアッセイはOpriessingらの論文に記載されている（37th Annual Meeting of the American Association of Swine Veterinarians, 2006）。さらにまた、当業者が用いることができる間接免疫蛍光アッセイは以下の工程を含む：96ウェルプレートの各ウェルに20.000から60.000のPK15又はVIDO R1細胞を播種する；細胞にPCV2単離株を感染させる（このとき細胞単層は約65から85%コンフルエントである）；感染細胞を48時間インキュベートする；培養液を除去しPBSで2回洗浄する；洗浄緩衝液を廃棄し、細胞を50/50の冷メタノール/アセトン固定液（〜100μL/ウェル）で約-20℃で約15分間処理する；固定液を廃棄し、プレートを風乾する；PBS中のブタ血清サンプル連続希釈並びに抗PCV2陽性及び陰性コントロールサンプル連続希釈（陽性及び陰性コントロールサンプル）を調製する；プレートに連続希釈を添加しインキュベートして血清サンプルに抗体が存在すれば約1時間36.5±1℃で抗体に結合させる；プレートをPBSで3回洗浄し、PBSを廃棄する；PBS中で1:100に希釈した市販のヤギ抗ブタFITC結合物でプレートを染色し約1時間36.5±1℃でインキュベートする；マイクロプレートをインキュベーターから取り出し、FITC結合物を除去し、PBSで2回プレートを洗浄する；UV顕微鏡法を用いてプレートを読取り、個々のウェルを陽性又は陰性として記録する（前記陽性コントロール及び陰性コントロールサンプルを用いて当該試験系をモニターする）；特異的なIFA反応性を示す最高希釈及び各希釈の陽性ウェル数を用いて血清抗体力価を計算するか、又は適切なReed-Muench式を用いて50%最終点を計算する。
そのようなアッセイはWO2008/076915 A2の実施例2に記載されている。
結果が矛盾する事例及び何らかの疑わしい事例においても、本明細書に示す抗PCV2力価は、本アッセイによって判定されるか／判定され得る力価を指す。
【００４８】
したがって、さらに別の特徴によれば、本発明は、動物、好ましくは抗PCV2抗体（特に移行抗体）を有する動物でPCV2感染を治療若しくは予防するため、又はPCV2感染によって引き起こされるか若しくは前記に随伴する臨床徴候を軽減するための方法を提供し、前記方法は、そのような処置を必要とする当該動物に有効量の本発明のポリペプチド、好ましくは20μg/用量未満のポリペプチドを投与する工程を含み、ここで前記動物は、1：100まで、好ましくは1：100を超える、より好ましくは1：250を超える、さらに好ましくは1：500を超える、さらに好ましくは1：640を越える、さらに好ましくは1：750を超える、もっとも好ましくは1：1000を超える検出可能な抗PCV2抗体力価を有する。好ましくは、そのような抗PCV2抗体力価は、特異的な抗PCV2免疫アッセイ、好ましくはWO2008/076915 A2の実施例2に例示的に記載される上記に記載のアッセイで検出及び定量できる。より好ましくは、それら抗PCV2抗体は母親由来抗体である。もっとも好ましくは、本発明のポリペプチドは1回だけ、好ましくは20μg/用量未満の用量で投与される。
【００４９】
低力価（＜1：100）又は中力価（＜1：1000）の母親由来抗PCV2抗体しかもたない仔豚は、3週齢前に発生するPCV2感染に対しては十分には防御されない。したがって、誕生後非常に早期のワクチン接種が望ましい。本発明の関係では、３週齢時又はそれより以前のワクチン接種/処置が好ましい。さらにまた、1：1000を超える抗PCV2抗体力価は、既存の初期抗体力価レベルに関係なくPCV2ワクチンの有効性に対して影響を与えなかった。例えば、高力価動物（抗PCV2抗体力価＞1：1000）のワクチン接種は、好ましくは、ワクチン非接種コントロール動物と比較して、より短いウイルス血症持続期間、より早期のウイルス血症終結、ウイルス血症サンプル採取日数の短縮、及び１mL当たりのゲノム等価物総量の減少をもたらす。ワクチンを接種した“高”、“中”及び“低”力価動物を比較したとき、好ましくは、PCV2ウイルス血症の種々のパラメーターに関して有意な相違は観察されない。さらにまた、高い抗PCV2抗体力価の存在下で、ワクチン接種に用いられる本発明のポリペプチドは、好ましくはなお血液のウイルス血症（ウイルス血症の終結、ウイルス血症の持続期間、ウイルス保持量）を有意に軽減する。好ましくは、ワクチン接種群の低力価動物と高力価動物とを比較したとき生体の体重に関して相違は見出されない。さらにまたワクチン接種/処置時に高い抗PCV2抗体力価（＞1：1000）を有するワクチン接種動物はまた、好ましくは、初期高抗体力価をもつプラセボ処置動物と比較したときウイルス血症開始後に有意に高い体重を示す。結果として、1日齢以上の動物の本発明のポリペプチドによるワクチン接種/処置が可能である。しかしながら、ワクチン接種は最初の8週齢以内、好ましくは最初の7週齢以内に実施するべきである。したがって、さらに別の特徴によれば、本発明は、動物でPCV2感染を治療若しくは予防するため、又はPCV2感染によって引き起こされるか若しくはPCV2感染に随伴する臨床徴候を軽減するための方法を提供し、前記方法は、そのような処置を必要とする当該動物に、1日齢以降に、好ましくは8週齢に（ただし前記より遅くならない）本発明のポリペプチドの有効量を投与する工程を含む。好ましい実施態様にしたがえば、20μg/用量未満の本発明のポリペプチドがそのような動物に免疫を付与するために必要である。より好ましい実施態様にしたがえば、本発明のポリペプチド（好ましくはその20μg/用量未満）はただ1回だけそのような処置を必要とする動物に投与される。
【００５０】
さらに別のより全般的な特徴にしたがえば、本発明は、幼若動物でPCV2感染を治療若しくは予防するため、又はPCV2感染によって引き起こされるか若しくはPCV2感染に随伴する臨床徴候を緩和するための方法を提供し、前記方法は、有効量の本発明のポリペプチドをそのような処置を必要とする当該動物に投与する工程を含む。
本明細書で用いられる“幼若動物”という用語は１から22日齢の動物を指す。好ましくは、幼若動物という用語は1から20日齢の動物を意味する。より好ましくは、幼若動物という用語は、1から15日齢、さらに好ましくは1日齢から14日齢、さらに好ましくは1から12日齢、さらに好ましくは1から10日齢、さらに好ましくは1から8日齢、さらに好ましくは1から7日齢、さらに好ましくは1から6日齢、さらに好ましくは1から5日齢、さらに好ましくは1から4日齢、さらに好ましくは1から3日齢、さらに好ましくは1又は2日齢の動物、もっとも好ましくは1日齢の動物を指す。したがってさらに別の特徴によれば、本発明は、幼若動物でPCV2感染を治療若しくは予防するため、又はPCV2感染によって引き起こされるか若しくはPCV2感染に随伴する臨床徴候を軽減するための方法を提供し、前記方法は、そのような処置を必要とする1から22日齢の動物、好ましくは1から20日齢、より好ましくは1から15日齢、さらに好ましくは1日齢から14日齢、さらに好ましくは1から12日齢、さらに好ましくは1から10日齢、さらに好ましくは1から8日齢、さらに好ましくは1から7日齢、さらに好ましくは1から6日齢、さらに好ましくは1から5日齢、さらに好ましくは1から4日齢、さらに好ましくは1から3日齢、さらに好ましくは1又は2日齢の動物、もっとも好ましくは1日齢の動物に有効量の本発明のポリペプチドを投与する工程を含む。例えば、19から22日齢でのワクチン接種/処置は高いワクチン接種有効性を示す。さらにまた、12から18日齢、好ましくは12から14日齢でのワクチン接種/処置は、好ましくはPCV2感染に随伴する臨床徴候の軽減、全体的なウイルス保持量の減少、ウイルス血症持続期間の短縮、ウイルス血症開始の遅延、体重増加に非常に有効である。さらにまた、1週齢でのワクチン接種は、好ましくはPCV2感染に随伴する臨床徴候の軽減、全体的なウイルス保持量の減少、ウイルス血症持続期間の短縮、ウイルス血症開始の遅延、体重増加に非常に有効である。好ましくは20μg/用量未満の本発明のポリペプチドがそれら幼若動物に免疫を付与するために必要である。より好ましい実施態様にしたがえば、本発明のポリペプチド（好ましくは20μg未満）は、そのような処置を必要とする当該幼若動物に1回だけ投与される。
【００５１】
野外におけるPCV2の遍在性ゆえに、幼若豚の大半がPCV2に関して血清陽性である。したがってさらに別の特徴によれば、本発明は、幼若動物で、好ましくはワクチン接種日に抗PCV2抗体を有する動物でPCV2感染を治療若しくは予防するため、又はPCV2感染によって引き起こされるか若しくはPCV2感染に随伴する臨床徴候を軽減するための方法を提供し、前記方法は、そのような処置を必要とする1から22日齢の動物、好ましくは1から20日齢、より好ましくは1から15日齢、さらに好ましくは1日齢から14日齢、さらに好ましくは1から12日齢、さらに好ましくは1から10日齢、さらに好ましくは1から8日齢、さらに好ましくは1から7日齢、さらに好ましくは1から6日齢、さらに好ましくは1から5日齢、さらに好ましくは1から4日齢、さらに好ましくは1から3日齢、さらに好ましくは1又は2日齢、もっとも好ましくは1日齢の動物に有効量の本発明のポリペプチドを投与する工程を含む。好ましくは、前記幼若動物は、ワクチン接種/処置の日に、1：100まで、好ましくは1：100を超える、より好ましくは1：250を超える、さらに好ましくは1：500を超える、さらに好ましくは1：640を越える、さらに好ましくは1：750を超える、もっとも好ましくは1：1000を超える検出可能な抗PCV2抗体力価を有する。好ましくは20μg/用量未満の本発明のポリペプチドがそれら幼若動物に十分な免疫を付与するために必要である。より好ましい実施態様にしたがえば、本発明のポリペプチド（好ましくは20μg未満）は、そのような処置を必要とする当該幼若動物に1回だけ投与される。
【００５２】
上記に記載したように、本発明のポリペプチドによる幼若動物のワクチン接種/処置は、好ましくは、非ワクチン接種コントロール動物と比較してウイルス血症期の短縮をもたらす。平均短縮期間は、同じ種の非ワクチン接種コントロール動物と比較して、好ましくは9.5日であり得る。したがって、さらに別に特徴によれば、本発明はまた、幼若動物でPCV2感染を治療若しくは予防するため、又はPCV2感染によって引き起こされるか若しくはPCV2感染に随伴する臨床徴候を軽減するための方法を提供し、前記方法は、そのような処置を必要とする当該動物に有効量の本発明のポリペプチドを投与する工程を含み、ここで、前記治療又は予防は、同じ種の非処置コントロール群の動物と比較して5日以上、好ましくは6日以上、より好ましくは7日以上、さらに好ましくは8日以上、さらに好ましくは9日以上、さらに好ましくは10日以上、さらに好ましくは12日以上、さらに好ましくは14日以上、もっとも好ましくは16日以上のウイルス血症期の短縮をもたらす。いくつかの事例では、ウイルス血症期は好ましくは20日を超えて短縮される。一般的には、幼若仔豚のワクチン接種は、体重増加の低下の軽減、より短いウイルス血症持続期間、ウイルス血症のより早期の終結、及びより低いウイルス保持量をもたらす。したがってさらに別の特徴によれば、本発明はまた、幼若動物でPCV2感染を治療若しくは予防するため、又はPCV2感染によって引き起こされるか若しくはPCV2感染に随伴する臨床徴候を軽減するための方法を提供し、前記方法は、そのような処置を必要とする当該動物に有効量の本発明のポリペプチドを投与する工程を含み、ここで、前記PCV2感染の治療又は予防は、同じ種の非処置コントロール群の動物と比較して、体重増加の低下の軽減、より短いウイルス血症持続期間、ウイルス血症のより早期の終結、より低いウイルス保持量又は前記の組合せから成る群から選択されるワクチン有効性パラメーターにおける改善をもたらす。好ましくは20μg/用量未満の本発明のポリペプチドが、上記に記載のワクチン有効性パラメーターの改善のいずれかを生じるために必要である。さらにまた、そのようなワクチン有効性パラメーターの改善は、ただ1用量の1回投与によって達成される。
【００５３】
本明細書で用いられる“有効量”という用語は、動物で免疫応答を誘引するか又は誘引することができる本発明のポリペプチドの量を意味し（ただし前記に限定されない）、前記動物に本発明のポリペプチドの前記有効用量が投与される。好ましくは、有効量は、少なくとも10週間の免疫持続期間（DOI）、好ましくは少なくとも12週間（DOI）、より好ましくは少なくとも15週間（DOI）、もっとも好ましくは少なくとも20週間の免疫持続期間を付与する本発明のポリペプチドの量と定義される。
有効量はワクチンの成分及び投与スケジュールに左右される。典型的には、不活化ウイルス又は改変生ウイルス調製物がコンビネーションワクチンで用いられるときは、約102.0から約109.0 TCID50/用量、好ましくは約103.0から約108.0 TCID50/用量、より好ましくは約104.0から約108.0 TCID50/用量を含むワクチン量が用いられる。特に改変生PCV2が用いられるときは、感受性動物に投与される推奨用量は、好ましくは約103.0 TCID50（組織培養感染用量50%終末点、tissue culture infective dose 50% end point)/用量から約106.0 TCID50/用量、より好ましくは約104.0 TCID50/用量から約105.0 TCID50/用量である。精製抗原が用いられるときは、一般的には、抗原の量は0.2から5000マイクログラムで、102.0から約109.0 TCID50、好ましくは約103.0から約106.0 TCID50、より好ましくは約104.0から約105.0 TCID50である。
サブユニットワクチンは、通常は、少なくとも0.2μgタンパク質/用量、好ましくは約0.2から約400μg/用量、より好ましくは約0.3から約200μg/用量、さらに好ましくは約0.35から約100μg/用量、さらに好ましくは約4.0から約50μg/用量、さらに好ましくは約0.45から約30μg/用量、さらに好ましくは約0.5から約18μg/用量、さらに好ましくは約0.6から約16μg/用量、さらに好ましくは約0.75から約8μg/用量、さらに好ましくは約1.0から約6μg/用量、さらに好ましくは約1.3から約3.0μg/用量のタンパク質含有レベルで投与される。
【００５４】
好ましくは、上記に記載の免疫原性組成物の予防的使用は、好ましくは幼若動物で、及び/又は処置の日にPCV2に対して受動免疫を有する動物で、PCV2感染によって引き起こされるか又はPCV2感染に随伴する臨床徴候を軽減するために有効である。特に、本明細書に記載の免疫原性組成物、及び特に本発明のポリペプチドを含む組成物の予防的使用は、好ましくは、PCV2に感染し、処置/ワクチン接種の日に抗PCV2移行抗体を有する動物で、リンパ節腫脹、リンパ系枯渇及び/又は多核/巨大組織球の軽減に有効である。例えば、本明細書に記載の免疫原性組成物の予防的使用は、リンパ系枯渇、リンパ系炎症、リンパ系組織におけるPCV2抗原IHC陽性、ウイルス血症、鼻汁排出、発熱、1日当たりの平均体重増加の低下、肺の炎症、肺組織におけるPCV2抗原IHC陽性を軽減させるために有効であることが見出された。
【００５５】
さらにまた、本明細書に記載の免疫原性組成物の予防的使用は、好ましくは（1）肺葉間水腫を有する間質性肺炎、（2）皮膚蒼白又は黄疸、（3）斑状肝萎縮、（4）胃潰瘍、（5）腎炎及び（6）生殖器異常、例えば流産、死産、ミイラ化胎児など、（7）軟膜様病巣、ローソニア・イントラセルラーリス（Lawsonia intracellularis）感染に随伴することが一般的に知られている（回腸炎）、（8）リンパ節腫脹、（9）リンパ系枯渇及び/又は（10）多核/巨大組織球、（11）ブタ皮膚炎腎症症候群（PDNS）、（12）PCVAD関連死亡率、（13）PCVAD関連体重減少の軽減に、（14）成長変動性の縮小、（15）‘発育不良動物’の頻度の減少、（16）ブタ生殖器呼吸器系疾患症候群（PRRSV）との同時感染の低下に有効である。そのような免疫原性組成物はまた、経済的に重要な成長パラメーター（例えば屠殺までの期間、屠殺体の重量、及び／又は赤身肉比）の改善に有効である。したがって、本明細書で用いられる“臨床徴候”は以下を意味する（ただしこれらに限定されない）：（1）肺葉間水腫を有する間質性肺炎、（2）皮膚蒼白又は黄疸、（3）斑状肝萎縮、（4）胃潰瘍、（5）腎炎及び（6）生殖器異常、例えば流産、死産、ミイラ化胎児など、（7）軟膜様病巣、ローソニア・イントラセルラーリス感染に随伴することが一般的に知られている（回腸炎）、（8）リンパ節腫脹、（9）リンパ系枯渇及び/又は（10）多核/巨大組織球、（11）ブタ皮膚炎腎症症候群（PDNS）、（12）PCVAD関連死亡率、（13）PCVAD関連体重減少、（14）成長変動性の縮小、（15）‘発育不良動物’の頻度の減少、（16）ブタ生殖器呼吸器系疾患症候群（PRRSV）との同時感染の低下、（17）リンパ系炎症、（18）リンパ系組織におけるPCV2抗原IHC陽性、（19）ウイルス血症、（20）鼻汁排出、（21）発熱、（22）1日当たりの平均体重増加の低下、（23）肺の炎症、（24）肺組織におけるPCV2抗原IHC陽性。さらにまた、本明細書に記載の免疫原性組成物は、幼若動物、特にワクチン接種日に抗PCV2抗体を有する動物で、全体的なシルコウイルス保持量（ウイルス血症の開始の遅延、より短い持続期間、より早期の終結、及びウイルス保持量の減少を含む）及びその免疫抑制作用を低下させ、それによってより高レベルの全般的耐病性並びにPCV2随伴疾患及び症状の発生の軽減をもたらす。
【００５６】
したがって、さらに別の特徴によれば、本発明は、幼若動物及び/又は動物（好ましくは抗PCV2抗体を有する動物）でPCV2感染を治療若しくは予防するため、又はPCV2感染によって引き起こされるか若しくはPCV2感染に随伴する臨床徴候を軽減するための方法を提供し、前記方法は、そのような処置を必要とする当該動物に有効量の本発明のポリペプチド又は本発明のポリペプチドを含む免疫原性組成物を投与する工程を含み、ここでそれら臨床徴候は以下から成る群から選択される：（1）肺葉間水腫を有する間質性肺炎、（2）皮膚蒼白又は黄疸、（3）斑状肝萎縮、（4）胃潰瘍、（5）腎炎及び（6）生殖器異常、例えば流産、死産、ミイラ化胎児など、（7）軟膜様病巣、ローソニア・イントラセルラーリス感染に付随することが一般的に知られている（回腸炎）、（8）リンパ節腫脹、（9）リンパ系枯渇及び/又は（10）多核/巨大組織球、（11）ブタ皮膚炎腎症症候群（PDNS）、（12）PCVAD関連死亡率、（13）PCVAD関連体重減少、（14）成長変動性の縮小、（15）‘発育不良動物’の頻度の減少、（16）ブタ生殖器呼吸器系疾患症候群（PRRSV）との同時感染の低下、（17）リンパ系炎症、（18）リンパ系組織におけるPCV2抗原IHC陽性、（19）ウイルス血症、（20）鼻汁排出、（21）発熱、（22）1日当たりの平均体重増加の低下、（23）肺の炎症、（24）肺組織におけるPCV2抗原IHC陽性。さらに別の特徴にしたがえば、本発明は、幼若動物でPCV2感染を治療若しくは予防するため、又はPCV2感染によって引き起こされるか若しくはPCV2感染に付随する臨床徴候を軽減するための方法を提供し、前記方法は、そのような処置を必要とする当該動物に有効量の本発明のポリペプチドを投与する工程を含み、ここでそれら臨床徴候は以下から成る群から選択される：（1）肺葉間水腫を有する間質性肺炎、（2）皮膚蒼白又は黄疸、（3）斑状肝萎縮、（4）胃潰瘍、（5）腎炎、（6）生殖器異常、例えば流産、死産、ミイラ化胎児など、（7）軟膜様病巣、ローソニアイントラセルラーリス感染に随伴することが一般的に知られている（回腸炎）、（8）リンパ節腫脹、（9）リンパ系枯渇及び/又は（10）多核/巨大組織球、（11）ブタ皮膚炎腎症症候群（PDNS）、（12）PCVAD関連死亡率、（13）PCVAD関連体重減少、（14）成長変動性の縮小、（15）‘発育不良動物’の頻度の減少、（16）ブタ生殖器呼吸器系疾患症候群（PRRSV）との同時感染の低下、（17）リンパ系炎症、（18）リンパ系組織におけるPCV2抗原IHC陽性、（19）ウイルス血症、（20）鼻汁排出、（21）発熱、（22）1日当たりの平均体重増加の低下、（23）肺の炎症、（24）肺組織におけるPCV2抗原IHC陽性。
【００５７】
本発明の組成物は、経口的に、皮内に、気管内に又は膣内に適用することができる。本組成物は、好ましくは筋肉内に又は鼻内に、もっとも好ましくは筋肉内に投与又は適用される。動物体では、上記に記載の医薬組成物を静脈注射又は標的組織への直接注射により適用することが有利であることを証明することができる。全身適用のためには、静脈内、血管内、筋肉内、鼻内、動脈内、腹腔内、経口、又は脊髄内ルートが好ましい。より局所的な適用は、皮下、上皮内、皮内、心臓内、肺葉内、骨髄内、肺内で、又は治療するべき組織（結合組織、骨組織、筋肉組織、神経組織、上皮組織）に直接若しくは組織近くで実施することができる。所望される治療期間及び有効性にしたがって、本発明の組成物は、1回だけ又は数回、さらにまた間歇的に（例えば数日間、数週間、若しくは数ヶ月の間に毎日）、さらに種々の投薬量で投与できる。
好ましくは、上記に記載の免疫原性組成物の1用量が、その必要がある対象動物の筋肉内に投与される。さらに別の特徴にしたがえば、本発明のポリペプチド又は本明細書に記載の本発明のそのようなポリペプチドのいずれかを含む免疫原性組成物をビンに入れ、1mL/用量で投与する。したがって、さらに別の特徴によれば、本発明はまた、幼若動物でPCV2感染を治療若しくは予防するために、又はPCV2感染によって引き起こされるか若しくはPCV2感染に随伴する臨床徴候を軽減するために、1mLの免疫原性組成物（本明細書に記載の本発明のポリペプチドを含む）を提供する（そのような処置を必要とする当該動物に本発明のタンパク質のポリペプチドの有効量を投与する工程を含む）。さらに別の特徴にしたがえば、本発明はまた、動物（好ましくは抗PCV2抗体を有する動物）で、PCV2感染を治療若しくは予防するために、又はPCV2感染によって引き起こされるか若しくはPCV2感染に随伴する臨床徴候を軽減するために、1mLの免疫原性組成物（本明細書に記載の本発明のポリペプチドを含む）を提供する（そのような処置を必要とする当該動物に有効量の本発明のポリペプチド又は本発明のポリペプチドを含む免疫原性組成物を投与する工程を含む）。
【００５８】
さらに別の特徴にしたがえば、上記に記載の免疫原性組成物の少なくとも1用量が少なくとも更にもう1回その必要がある対象動物に投与され、ここで、2回目又はそれ以降のいずれの投与も、最初の投与から又はいずれの前回投与からも少なくとも14日を過ぎてから与えられる。好ましくは、免疫原性組成物は免疫刺激剤とともに投与される。好ましくは、前記免疫刺激剤は少なくとも2回投与される。好ましくは、少なくとも3日、より好ましくは少なくとも5日、さらに好ましくは少なくとも7日が、免疫刺激剤の第1回目と第2回目の投与又はそれ以降の任意の投与の間に置かれる。好ましくは、免疫刺激剤は、本明細書で提供される免疫原性組成物の最初の投与から少なくとも10日、好ましくは15日、より好ましくは20日、さらに好ましくは少なくとも22日を過ぎてから与えられる。好ましい免疫刺激剤は例えばキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）であり、前記は、好ましくは不完全フロイントアジュバントで乳化される（KLH/ICFA）。しかしながら、当業者に公知のいずれの他の免疫刺激剤も用いられ得ることはこれにより理解されよう。本明細書で用いられる“免疫刺激剤”という用語は、好ましくは特異的な免疫応答（例えば特定の病原体に対する免疫応答）を開始又は高めることなく、免疫応答を始動させることができる任意の物質又は組成物を意味する。免疫刺激剤の適切な用量での投与はさらにまた別に指示される。
【００５９】
好ましい実施態様の説明
以下の実施例は、本発明の好ましい材料及び方法を説明する。本明細書に記載する材料及び方法に類似又は等価であるいずれのものも本発明の実施又は試験で用いることができるが、好ましい方法、装置及び材料をこれから述べる。しかしながら、これらの実施例は単に例示のために提供され、その中のいずれも本発明の全体的範囲を限定するものと解されるべきでないことは理解されよう。
【実施例１】
【００６０】
変異体の材料と方法/設計
クラスタルW法を用いて、製品CIRCOFLEX(商標)に含まれるPCV2 ORF2タンパク質のPCV2a ORF2アミノ酸配列をPCV2b ORF2 BDHアミノ酸配列及びGenbankから得られる多数の公表された他のPCV2a及びPCV2b ORF2アミノ酸配列とアラインメントした。PCV2a及びPCV2b ORF2配列間の主要なアミノ酸相違の位置を潜在的な変異の位置として同定した(図1参照)。同定した主要なアミノ酸変化を用い、PCV2b ORF2 BDHのアミノ酸配列をPCV2a ORF2の対応するアミノ酸と交換して7つのPCV2b ORF2コード配列を調製した。PCV2a ORF2（CIRCOFLEX(商標)）コドンを用いて変異体アミノ酸をコードした。7つのPCV2b ORF2変異体構築物は下記に示される：
1．PCV2b ORF2 BDH K59A
2．PCV2b ORF2 BDH R63T
3．PCV2b ORF2 BDH R63K
4．PCV2b ORF2 BDH SFCO P88K T151P**
5．PCV2b ORF2 BDH G191R
6．PCV2b ORF2b BDH I206K
7．PCV2b ORF2 BDH N232E
#4を除いて、全てのコード配列がインテグレイテッドDNAテクノロジーズで合成された。#4は、合成PCV2b ORF2b BDH SFCOコード配列の位置特異的変異導入によって作製された。
**SFCO＝スポドプテラ・フルギペルダのために最適化されたコドン。この構築物は、上記のアラインメントの前に予備的な配列判定により作製された。2つの変異がまたこの配列判定で同定された。
【００６１】
変異PCV2b ORF2バキュロウイルスの調製
7つのPCV2b ORF2変異体コード配列の各々を、非変異PCV2b ORF2 BDHコード配列とともにバキュロウイルストランスファーベクターpVL1393でクローニングし、Sf9細胞にバキュロウイルスDNAとともにコトランスフェクトした。得られた組換えバキュロウイルスの各々をPCV2b ORF2の発現についてIFAでチェックした。各組換えバキュロウイルスの増幅ストックをSf+細胞で調製し、TCID50法により定量してバキュロウイルス力価を決定した。
【００６２】
変異PCV2b ORF2バキュロウイルスの発現の評価
各組換えバキュロウイルスを0.1の目標MOIでSf+細胞を感染させることによってそのPCV2b ORF2コード配列の発現について評価した。5−7日間感染を進行させてから、20,000gで20分遠心分離して細胞屑及び不溶性タンパク質を除去することによって採集した。採集上清を0.2μmフィルターでろ過し、α-PCV2抗体を用いるウェスタンブロットによってPCV2b ORF2発現を直接評価した（例えば図2）。採集上清はまたマクロ分子構造物の存在についてもまた評価された。略記すれば、各採集上清のサンプルを100,000gで2時間遠心分離した。得られたペレットを小体積のTBSに再懸濁し、SDS-PAGEで分離させた。PCV2b ORF2バンドは、PCV2a ORF2とのサイズ比較によって染色ゲルで検出された（例えば図3）。再懸濁ペレットはまた、定量及び電子顕微鏡法（EM）によるVLP確認のために、10%−60%の不連続シュクロースグラジエントで100,000gにて2時間遠心して分離させPCV2b ORF2タンパク質を部分的に精製した（例えば図4）。
シュクロースグラジエント分離の後で、PCV2b ORF2含有画分をプールし、BSA標準曲線対比SDS-PAGEデンシトメトリーによってPCV2b ORF2濃度を決定した。さらにまた、シュクロースグラジエント精製材料のサンプルをさらに濃縮し、ネガティブ染色としてリンタングステン酸を用いるEMによるVLP確認に付した（例えば図5）。
PCV2b ORF2 BDH変異体構築物の評価結果の表は図6に示されている。この結果は、63位のアルギニンからスレオニンへの一アミノ酸変異は、Sf+細胞でPCV2b ORF2 BDHの発現を10倍近く増加させることを示した。R63T単一変異は、Sf+細胞でのPCV2b ORF2 BDH発現をPCV2a ORF2と同様なレベルに増加させた。PCV2b ORF2 BDHのアミノ酸配列分析は、BCループはトリプシン様プロテアーゼによる切断に感受性であり得ることを示唆している。Khayatらが2011年に公表した構造データは、アルギニン63がBCループ上に存在することを示唆している（BCループはORF2タンパク質によって形成されるPCV2ウイルスキャプシドから最も遠くへ突き出して、バキュロウイルス複製時のSf+細胞の溶解後に放出されるプロテアーゼに対して前記を感受性の状態に置く）。
63位のスレオニン置換に加えて、本発明の別の実施態様では、アルギニンは、セリン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンを含む他の非荷電極性アミノ酸によって置換され、同じ安定化作用を得る。さらにまた、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン及びトリプトファンを含む非極性アミノ酸も同様に同じ作用を達成できる。
【実施例２】
【００６３】
本実験は、PCV2a及び/又はPCV2bチャレンジに対するブタシルコウイルス2型ORF2bワクチンの1つの実施態様の有効性を示す。帝王切開で得られ初乳を絶った（CDCD）仔豚を本実験で用い、前記を以下の2つのグループに分ける：1）病毒性PCV2bでチャレンジされる、実施例1のPCV2b ORF2 R63T変種を含む実験的ブタシルコウイルスワクチン（殺滅バキュロウイルスベクター）接種ブタ、及び2）病毒性PCV2bでチャレンジされる、非ワクチン接種チャレンジコントロールブタ。0日目に、グループ1に1mLのワクチンを筋肉内（IM）に投与し、一方、グループ2の非ワクチン接種チャレンジコントロールブタは一切処置を与えられない。28日目に、グループ1及び2の全てのブタに病毒性PCV2bの1mLを鼻内に（IN）さらに1mLをIMに概算投与量3.0 Log10 TCID50/mLの生ウイルスでチャレンジする。25及び31日目に、全てのブタに不完全フロイントアジュバントで乳化した2.0mLのキーホールリンペットヘモシアニン（KLH/ICFA）をIMで投与する。臨床徴候について毎日ブタをモニターし、血清学的試験のために周期的に採血する。56日目に全てのブタを剖検し、選別組織を収集し、肉眼病変の観察を実施する。
全体として、ワクチン接種動物は、対応するチャレンジコントロールグループと比較したとき全ての検査パラメータで軽減を示す。
【実施例３】
【００６４】
アミノ酸63位でいくつかの他の置換を作製して天然のままのPCV2b ORF BDH株と比較した。PCV2b ORF2 BDH変異体構築物の評価から得られた結果は図7A及び7Bに示されている。この結果は、63位のアルギニン（R）からスレオニン（T）へのアミノ酸変異に加えて、アルギニン（R）63からグリシン（G）、アルギニン（R）63からグルタミン（Q）、及びアルギニン（R）63からアスパラギン酸（D）へのアミノ酸変異は、Sf+細胞でのPCV2b ORF2 BDHの発現を野生型と比較して少なくとも4倍増加させることを示す。特に、単一変異R63G及びR63Qは、Sf+細胞でのPCV2b ORF2 BDHの発現をPCV2a ORF2と同様なレベルに増加させた。
PCV2b ORF2 R63変異体をコードする組換えバキュロウイルスの作製
位置特異的変異導入によって、PCV2b ORF2のコード配列のアミノ酸63位に点変異を導入した。略記すれば、表1のプライマーを用いて、バキュロウイルストランスファープラスミドpVL1393-PCV2b ORF2を位置特異的変異導入に付した。得られたバキュロウイルストランスファーベクターのシークェンシングを実施してコード配列の適切な変異を確認し、続いて直線化バキュロウイルスDNAとともにSf9細胞にコトランスフェクトした。5日後にコトランスフェクションを収集し、PCV2特異的抗体を用いるIFAによってPCV2b ORF2発現について評価した。各バキュロウイルスの増幅ストックをSf9細胞で作製し、α-バキュロウイルスgp64モノクローナル抗体を用いるIFA依拠TCID50法により定量した。
【００６５】
表1：位置特異的変異導入のためのプライマー
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0006778104.tif 000007
【００６６】
PCV2b ORF2 VLPの発現及び定量
スピンナーフラスコ中のSF+細胞を0.1のMOIで組換えバキュロウイルスに感染させ、約100rpmの定常的撹拌により27℃でインキュベートした。感染培養物は、SF+細胞の生存率が30%以下に落ちたときに、又は感染後7日に採集した。未加工バキュロウイルス採集物を4℃で20分間20,000gにて遠心分離して細胞及び不溶性細屑をペレットにし、続いて0.2μmのフィルターでろ過した。清澄にしたバキュロウイルス採集液（35mL）を100,000g RCFで2時間4℃にて遠心分離に付し、PCV2b ORF2 VLPをペレットにした。得られたペレットをTBSに再懸濁し、さらに10%−60%不連続シュクロースグラジェントで2時間4℃にて100,000g RCFで分離した。PCV2b ORF2の大半を含む画分（SDS-PAGE及びα-PCV2抗体利用ウェスタンブロットにより決定）をプールし、デンシトメトリーで評価した。略記すれば、プールしたPCV2b ORF2含有画分をSDS-PAGEで分離し、SIMPLYBLUETMセーフステインで染色した。ゲル画像を捕捉し、アルファービュー（Alpha View）カメラ及びソフトを用いて解析した。PCV2b ORF2バンドの質量は各ゲルに含まれるBSA標準物を用いて計算した。プールのPCV2b ORF2濃度はPCV2b ORF2バンドの質量をゲルにロードしたサンプルの総体積で割ることによって計算した。採集物質中のPCV2b ORF2濃度は、当該プールのPCV2b ORF2濃度にプールの体積を掛け、続いて遠心分離に用いた採集液の出発体積で割ることによって計算した。
【実施例４】
【００６７】
本実験は、３週齢で投与したときのブタシルコウイルス2型ORF2bプロトタイプワクチン（配列番号:1の組換えバキュロウイルス発現PCV2b ORF2タンパク質を含む）のPCV2bチャレンジに対する有効性を評価する。
42匹の健康なCDCDブタ（X腹の各々からX匹のブタ及びX腹の各々からX匹のブタ）を囲いに入れ、6つの檻に収容した。1つの檻のブタは、下記の5つの処置グループの1つに均等に任意抽出された：グループ1（厳密な陰性コントロール）、X匹のブタから成り一切の処置を受けない；グループ2（チャレンジコントロール、n＝X）、一切処置を受けない；グループ3（配列番号:1を含むPCV2b＋カルボポールの実験的ワクチン、n＝X）；グループ4（配列番号:1を含むPCV2b＋ISA207VGの実験的ワクチン、n＝X）。処置グループの大要は表2に提供される。
【００６８】
表2：
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0日目にブタは24日齢であり、グループ3のブタは1mL用量のワクチンを筋肉内に（IM）投与される。11日目及び17日目に、全てのブタが2.0mL用量のKLH/ICFAを筋肉内に（IM）投与される。14日目に、全てのブタが、約5.0 log10TCID50/mLの生病毒性PCV2bの1.0mLで右の首にさらに1.0mLで鼻内にチャレンジされる。ブタは毎日全体的な健康状態について調べられる。血液サンプルをD-4、D14、D21、D28、D33及びD42に収集し、全ての日（D-4を除く）の血清を定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応によってPCV2ウイルス血症について検査した。ワクチン接種動物は、PCV2bチャレンジ後に非ワクチン接種動物と比較して有意に低いウイルス血症及び無症状までの軽減を示す。
【００６９】
本発明及び本明細書に提供した実験データの関係では、特に以下を考慮した：
−リンパ系枯渇に関して：“リンパ系枯渇の予防を促進する”という徴候の裏付けのために、4つのリンパ系組織のサンプル（扁桃、TBLN、MLN又はILN）の1つ以上がリンパ系枯渇について組織学的に陽性であった場合、ブタは陽性と考えた；
−リンパ系炎症に関して：“リンパ系炎症の予防を促進する”という徴候の裏付けのために、4つのリンパ系組織のサンプル（扁桃、TBLN、MLN又はILN）の1つ以上がリンパ系炎症について組織学的に陽性であった場合、ブタは陽性と考えた；
−リンパ系細胞コロニー形成に関して：ウイルス暴露後4週間でブタが感染を一掃したという徴候の裏付けのために、4つのリンパ系組織のサンプル（扁桃、TBLN、MLN又はILN）の1つ以上がIHCによってPCV2リンパ系細胞コロニー形成について陽性であった場合、ブタは陽性と考えた；
−ウイルス血症に関して：“ウイルス血症の予防を促進する”という徴候の裏付けのために、血清のrt-PCR検査が1.0ｘ104以上のPCV2ゲノム等価物であった場合、ブタはサンプリングの日に陽性と考えた；さらに、
−死亡に関して：“死亡の予防を促進する”という徴候の裏付けのために、ブタがチャレンジに屈服した（死亡するか又は起因させ得る臨床徴候、PCV2に対応する肉眼病巣及び/又は組織学的病巣により人道的理由から安楽死を必要とした）場合、ブタは死亡について陽性と考えた。
【００７０】
配列表において、
配列番号:1は置換R63Tを含む配列番号:2に一致する。
配列番号:2は野生型PCV2b ORF2タンパク質の配列に一致する。
配列番号:3は野生型PCV2a ORF2タンパク質の配列に一致する。
配列番号:4は配列番号:1をコードするポリヌクレオチド配列に一致する。
配列番号:5は野生型PCV2b ORF2タンパク質の配列に一致する。
配列番号:6は、長さが233アミノ酸残基でアミノ酸59位にアルギニン残基を有する本発明のポリペプチドの配列に一致する。
配列番号:7は、長さが233アミノ酸残基でアミノ酸59位にリジン残基を有する本発明のポリペプチドの配列に一致する。
配列番号:8は、長さが234アミノ酸残基でアミノ酸59位にアルギニン残基を有する本発明のポリペプチドの配列に一致する。
配列番号:9は、長さが234アミノ酸残基でアミノ酸59位にリジン残基を有する本発明のポリペプチドの配列に一致する。
配列番号:10は、アミノ酸59位にアルギニン残基を有し、さらにアミノ酸63位にアラニン残基を有する本発明のポリペプチドのアミノ酸58−66位の配列（本明細書では“BCループ”とも称される）に一致する。
配列番号:11は、アミノ酸59位にアルギニン残基を有し、さらにアミノ酸63位にシステイン残基を有する本発明のポリペプチドのアミノ酸58−66位の配列（本明細書では“BCループ”とも称される）に一致する。
配列番号:12は、アミノ酸59位にアルギニン残基を有し、さらにアミノ酸63位にアスパラギン酸残基を有する本発明のポリペプチドのアミノ酸58−66位の配列（本明細書では“BCループ”とも称される）に一致する。
配列番号:13は、アミノ酸59位にアルギニン残基を有し、さらにアミノ酸63位にグルタミン酸残基を有する本発明のポリペプチドのアミノ酸58−66位の配列（本明細書では“BCループ”とも称される）に一致する。
配列番号:14は、アミノ酸59位にアルギニン残基を有し、さらにアミノ酸63位にフェニルアラニン残基を有する本発明のポリペプチドのアミノ酸58−66位の配列（本明細書では“BCループ”とも称される）に一致する。
配列番号:15は、アミノ酸59位にアルギニン残基を有し、さらにアミノ酸63位にグリシン残基を有する本発明のポリペプチドのアミノ酸58−66位の配列（本明細書では“BCループ”とも称される）に一致する。
配列番号:16は、アミノ酸59位にアルギニン残基を有し、さらにアミノ酸63位にヒスチジン残基を有する本発明のポリペプチドのアミノ酸58−66位の配列（本明細書では“BCループ”とも称される）に一致する。
配列番号:17は、アミノ酸59位にアルギニン残基を有し、さらにアミノ酸63位にイソロイシン残基を有する本発明のポリペプチドのアミノ酸58−66位の配列（本明細書では“BCループ”とも称される）に一致する。
配列番号:18は、アミノ酸59位にアルギニン残基を有し、さらにアミノ酸63位にロイシン残基を有する本発明のポリペプチドのアミノ酸58−66位の配列（本明細書では“BCループ”とも称される）に一致する。
配列番号:19は、アミノ酸59位にアルギニン残基を有し、さらにアミノ酸63位にメチオニン残基を有する本発明のポリペプチドのアミノ酸58−66位の配列（本明細書では“BCループ”とも称される）に一致する。
配列番号:20は、アミノ酸59位にアルギニン残基を有し、さらにアミノ酸63位にアスパラギン残基を有する本発明のポリペプチドのアミノ酸58−66位の配列（本明細書では“BCループ”とも称される）に一致する。
配列番号:21は、アミノ酸59位にアルギニン残基を有し、さらにアミノ酸63位にプロリン残基を有する本発明のポリペプチドのアミノ酸58−66位の配列（本明細書では“BCループ”とも称される）に一致する。
配列番号:22は、アミノ酸59位にアルギニン残基を有し、さらにアミノ酸63位にグルタミン残基を有する本発明のポリペプチドのアミノ酸58−66位の配列（本明細書では“BCループ”とも称される）に一致する。
配列番号:23は、アミノ酸59位にアルギニン残基を有し、さらにアミノ酸63位にセリン残基を有する本発明のポリペプチドのアミノ酸58−66位の配列（本明細書では“BCループ”とも称される）に一致する。
配列番号:24は、アミノ酸59位にアルギニン残基を有し、さらにアミノ酸63位にスレオニン残基を有する本発明のポリペプチドのアミノ酸58−66位の配列（本明細書では“BCループ”とも称される）に一致する。
配列番号:25は、アミノ酸59位にアルギニン残基を有し、さらにアミノ酸63位にバリン残基を有する本発明のポリペプチドのアミノ酸58−66位の配列（本明細書では“BCループ”とも称される）に一致する。
配列番号:26は、アミノ酸59位にアルギニン残基を有し、さらにアミノ酸63位にトリプトファン残基を有する本発明のポリペプチドのアミノ酸58−66位の配列（本明細書では“BCループ”とも称される）に一致する。
配列番号:27は、アミノ酸59位にアルギニン残基を有し、さらにアミノ酸63位にチロシン残基を有する本発明のポリペプチドのアミノ酸58−66位の配列（本明細書では“BCループ”とも称される）に一致する。
配列番号:28は、アミノ酸59位にアルギニン残基を有し、さらにアミノ酸63位にアラニン残基を有する本発明のポリペプチドのアミノ酸58−66位の配列（本明細書では“BCループ”とも称される）に一致する。
配列番号:29は、アミノ酸59位にリジン残基を有し、さらにアミノ酸63位にシステイン残基を有する本発明のポリペプチドのアミノ酸58−66位の配列（本明細書では“BCループ”とも称される）に一致する。
配列番号:30は、アミノ酸59位にリジン残基を有し、さらにアミノ酸63位にアスパラギン酸残基を有する本発明のポリペプチドのアミノ酸58−66位の配列（本明細書では“BCループ”とも称される）に一致する。
配列番号:31は、アミノ酸59位にリジン残基を有し、さらにアミノ酸63位にグルタミン酸残基を有する本発明のポリペプチドのアミノ酸58−66位の配列（本明細書では“BCループ”とも称される）に一致する。
配列番号:32は、アミノ酸59位にリジン残基を有し、さらにアミノ酸63位にフェニルアラニン残基を有する本発明のポリペプチドのアミノ酸58−66位の配列（本明細書では“BCループ”とも称される）に一致する。
配列番号:33は、アミノ酸59位にリジン残基を有し、さらにアミノ酸63位にグリシン残基を有する本発明のポリペプチドのアミノ酸58−66位の配列（本明細書では“BCループ”とも称される）に一致する。
配列番号:34は、アミノ酸59位にリジン残基を有し、さらにアミノ酸63位にヒスチジン残基を有する本発明のポリペプチドのアミノ酸58−66位の配列（本明細書では“BCループ”とも称される）に一致する。
配列番号:35は、アミノ酸59位にリジン残基を有し、さらにアミノ酸63位にイソロイシン残基を有する本発明のポリペプチドのアミノ酸58−66位の配列（本明細書では“BCループ”とも称される）に一致する。
配列番号:36は、アミノ酸59位にリジン残基を有し、さらにアミノ酸63位にロイシン残基を有する本発明のポリペプチドのアミノ酸58−66位の配列（本明細書では“BCループ”とも称される）に一致する。
配列番号:37は、アミノ酸59位にリジン残基を有し、さらにアミノ酸63位にメチオニン残基を有する本発明のポリペプチドのアミノ酸58−66位の配列（本明細書では“BCループ”とも称される）に一致する。
配列番号:38は、アミノ酸59位にリジン残基を有し、さらにアミノ酸63位にアスパラギン残基を有する本発明のポリペプチドのアミノ酸58−66位の配列（本明細書では“BCループ”とも称される）に一致する。
配列番号:39は、アミノ酸59位にリジン残基を有し、さらにアミノ酸63位にプロリン残基を有する本発明のポリペプチドのアミノ酸58−66位の配列（本明細書では“BCループ”とも称される）に一致する。
配列番号:40は、アミノ酸59位にリジン残基を有し、さらにアミノ酸63位にグルタミン残基を有する本発明のポリペプチドのアミノ酸58−66位の配列（本明細書では“BCループ”とも称される）に一致する。
配列番号:41は、アミノ酸59位にリジン残基を有し、さらにアミノ酸63位にセリン残基を有する本発明のポリペプチドのアミノ酸58−66位の配列（本明細書では“BCループ”とも称される）に一致する。
配列番号:42は、アミノ酸59位にリジン残基を有し、さらにアミノ酸63位にスレオニン残基を有する本発明のポリペプチドのアミノ酸58−66位の配列（本明細書では“BCループ”とも称される）に一致する。
配列番号:43は、アミノ酸59位にリジン残基を有し、さらにアミノ酸63位にバリン残基を有する本発明のポリペプチドのアミノ酸58−66位の配列（本明細書では“BCループ”とも称される）に一致する。
配列番号:44は、アミノ酸59位にリジン残基を有し、さらにアミノ酸63位にトリプトファン残基を有する本発明のポリペプチドのアミノ酸58−66位の配列（本明細書では“BCループ”とも称される）に一致する。
配列番号:45は、アミノ酸59位にリジン残基を有し、さらにアミノ酸63位にチロシン残基を有する本発明のポリペプチドのアミノ酸58−66位の配列（本明細書では“BCループ”とも称される）に一致する。
配列番号:46は、長さが234アミノ酸残基でアミノ酸63位にスレオニン残基を有する本発明のポリペプチドの配列に一致する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【配列表】
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