(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１又は複数の作用電極、対電極、参照電極、並びに、支持電解質溶液を保持し得る容器を備えた、タンパク質又は病原体を検出するためのカートリッジであって、
該１又は複数の作用電極は、それぞれ、同一または異なる種類の、タンパク質又は病原体を認識する素子が表面に固定化された導電性ダイヤモンド電極を有し、
作用電極、対電極、及び参照電極は外部との電気的導通が可能であるように構成されており、
作用電極、対電極、及び参照電極の液絡部は、容器内に支持電解質溶液が存在する場合に当該支持電解質溶液に接触可能であるように該容器に配置されており、
容器は外気の導入口、外気導出側の通気口及び導出口を備え、
導入口及び外気導出側の通気口は、該導入口より導入された外気が該容器に保持された支持電解質溶液中を通過して外気導出側の通気口へと導出されるよう構成されており、外気導出側の通気口を通過した外気はさらにカートリッジの導出口へと導出されるよう構成されており、
外気が支持電解質溶液中を通過する際に１又は複数の作用電極に接触可能であるように容器及び作用電極が構成されており、ここで外気が１又は複数の作用電極に接触しているときには対電極、及び参照電極の液絡部が支持電解質溶液に常に接触しているよう対電極及び参照電極が構成されており、
支持電解質溶液及び参照電極の内部電解質溶液を容器に注入することができるよう構成されており、
外気を作用電極に接触させるとき及び作用電極による電気化学的測定を行うときには、作用電極の素子が固定化されている表面が下向きであるよう構成されており、
外気導入口及び外気導出口及び外気導出側の通気口は、外気を作用電極に接触させるとき及び作用電極による電気化学的測定を行うときの支持電解質溶液の最高液面位置よりも高い位置に配置されている、
該タンパク質又は病原体を検出するためのカートリッジ。
【請求項２】
外気の導入口側の通気口が、外気を気泡にする気泡発生フィルターを備えている、請求項１に記載のカートリッジ。
【請求項３】
カートリッジが複数の作用電極を備えている場合、外気導入口側の作用電極が導出口側の他の作用電極と比較して低い位置に配置され、該導出口側の他の作用電極が該外気導入口側の作用電極と比較して高い位置に配置されている、請求項１または２に記載のカートリッジ。
【請求項４】
１又は複数の作用電極、対電極、参照電極、並びに、支持電解質溶液を保持し得る容器を備え、さらに液面を上昇及び下降させることのできる液面上下動機構を備えた、タンパク質又は病原体を検出するためのカートリッジであって、
該１又は複数の作用電極は、それぞれ、同一または異なる種類の、タンパク質又は病原体を認識する素子が表面に固定化された導電性ダイヤモンド電極を有し、
作用電極、対電極、及び参照電極は外部との電気的導通が可能であるように構成されており、
容器は外気の導入口、外気導出側の通気口及び導出口を備え、さらに液面上下動機構用の空気導入口を備え、
作用電極、対電極、及び参照電極の液絡部は、容器内の支持電解質溶液液面が上昇した場合に当該支持電解質溶液に接触可能であるように該容器に配置されており、
導入口は、該導入口より導入された外気を１又は複数の作用電極の表面に吹き付けることができるよう構成されており、
外気導出側の通気口は、１又は複数の作用電極に吹き付けられた外気が通過できるよう配置されており、外気導出側の通気口を通過した外気はさらにカートリッジの導出口へと導出されるよう構成されており、
タンパク質又は病原体を素子に吸着させるときは、支持電解質溶液の液面を下降させ、１又は複数の作用電極は支持電解質溶液と接触していない、
支持電解質溶液の液面を下降させているときは、対電極及び参照電極の液絡部は、支持電解質溶液に接触していてもよく、
素子に吸着したタンパク質又は病原体を検出するときは、支持電解質溶液の液面を上昇させ、１又は複数の作用電極、対電極及び参照電極の液絡部は支持電解質溶液に接触しているよう構成されており、
支持電解質溶液及び参照電極の内部電解質溶液を容器に注入することができるよう構成されており、
外気を作用電極に接触させるとき及び作用電極による電気化学的測定を行うときには、作用電極の素子が固定化されている表面が下向きであるよう構成されており、
外気導入口及び外気導出口及び外気導出側の通気口は、外気を作用電極に接触させるとき及び作用電極による電気化学的測定を行うときの支持電解質溶液の最高液面位置よりも高い位置に配置されている、
該タンパク質又は病原体を検出するためのカートリッジ。
【請求項５】
カートリッジが複数の作用電極を備えている場合、外気導入口側の作用電極が導出口側の他の作用電極と比較して高い位置に配置され、該導出口側の他の作用電極が該外気導入口側の作用電極と比較して低い位置に配置されている、請求項４に記載のカートリッジ。
【請求項６】
液面上下動機構用の空気導入口が支持電解質溶液の最高液面位置よりも高い位置にある、請求項４または５に記載のカートリッジ。
【請求項７】
支持電解質溶液を対電極挿入口から注入し、対電極を取り付けることによって容器を密閉構造とすることができるよう構成されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項８】
参照電極用の内部電解質溶液を参照電極の金属電極挿入口から注入し、当該金属電極を取り付けることによって容器を密閉構造とすることができるよう構成されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項９】
記憶再生可能な素子をさらに備えた、請求項１〜８のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項１０】
記憶再生可能な素子は、基板を介して、カートリッジ外部から記録再生可能になっている、請求項９に記載のカートリッジ。
【請求項１１】
外気導入口の直後に導入フィルターを有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項１２】
１又は複数の、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のカートリッジを備えた、タンパク質又は病原体を検出するための装置であって、
外部と電気的導通が可能であるように構成されているカートリッジ外面の作用電極、対電極、及び参照電極が該タンパク質又は病原体を検出するための装置と電気的に接続されており、
カートリッジが記憶再生可能な素子を備えている場合には、当該記憶再生可能な素子が該検出装置と電気的に接続されており、
サイクリックボルタンメトリー測定及び／又は電気化学インピーダンス測定を行うことができる電気化学測定回路を備えており、
測定結果を表示する表示回路、又は、測定結果を出力若しくは送信する出力端末を備えており、
電源回路を備えており、
外気を検出装置内に吸入するための外気吸気口を備えており、該外気吸気口はカートリッジの外気導入口に接続されており、
外気を検出装置から排出するための外気排気口を備えており、該外気排気口はカートリッジの外気導出口に接続されており、
外気吸気口に接続された外気吸入ポンプを備えており、
制御回路を備えている、
該タンパク質又は病原体を検出するための装置。
【請求項１３】
カートリッジが液面上下動機構を備えた請求項４〜１１のいずれか１項に記載のものであり、検出装置が液面上下動機構用のポンプを備え、該ポンプが検出装置の制御回路に接続されている、請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】
装置が複数のカートリッジを備えている場合において、当該複数のカートリッジの外気導入口及び外気導出口が、装置と、直列または並列に接続されている、請求項１２又は１３に記載の装置。
【請求項１５】
無線又は有線通信回路を備えている、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１６】
カートリッジが記憶再生可能な素子を備えている場合に、当該素子に対してデータの記録再生を行うデータ記録再生回路を備えている、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１７】
装置の外気吸気口とカートリッジの外気導入口との間に外気フィルターを備えている、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１８】
外気タンク及び循環ポンプを備え、外気排気口と外気タンクとの間に、外気排気口に接続された排気パイプを閉じることのできる外気タンク排気バルブを備えた、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１９】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のカートリッジ、又は請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の装置を用いた、タンパク質又は病原体を検出する方法。
【請求項２０】
カートリッジが記憶再生可能な素子を備えている場合に、それぞれの素子から、１又は複数の作用電極が測定対象とするタンパク質又は病原体の情報、１又は複数の作用電極の初期特性、及び、既に測定に使用されたカートリッジについては、測定に使用した時間、検出した数値の情報を読み出す工程、
外気吸入ポンプを作動させ、吸入された外気をカートリッジ内に送り込む工程、
吸入された外気を１又は複数の作用電極の素子が固定化されている表面に吹き付けるか、支持電解質溶液中の気泡として１又は複数の作用電極と接触させる吸着工程、
吸着工程後の外気をカートリッジの外気導出側の通気口を通過させ外気導出口及び装置の外気排気口から排出させる排気行程、
外気吸入ポンプを停止させ、１又は複数のカートリッジの、１又は複数の作用電極を順次切り替えながら、サイクリックボルタンメトリー測定又は電気化学インピーダンス測定を行う電気化学的測定工程、
カートリッジが記憶再生可能な素子を備えている場合に測定結果をそれぞれのカートリッジの該素子に記録する工程、及び、装置が無線又は有線通信回路を備えている場合には記録情報を外部に通信する工程、
を含む、請求項１９に記載の検出方法。
【請求項２１】
外気タンク、循環ポンプ、及び外気タンク排気バルブを備えた請求項１８に記載の検出装置を用い、以下の工程、
カートリッジが記憶再生可能な素子を備えている場合に、それぞれの素子から、１又は複数の作用電極が測定対象とするタンパク質又は病原体の情報、１又は複数の作用電極の初期特性、及び、既に測定に使用されたカートリッジについては、測定に使用した時間、検出した数値の情報を読み出す工程、
外気タンク排気バルブを開き、外気吸入ポンプを作動させ、外気タンクに未測定の外気を導入する工程、
外気タンク排気バルブを閉じ、外気吸入ポンプを停止する工程、
循環ポンプを作動させ、外気タンク内の外気をカートリッジ内に送り込む工程、
吸入された外気を１又は複数の作用電極の素子が固定化されている表面に吹き付けるか、支持電解質中の気泡として１又は複数の作用電極と接触させる吸着工程、
吸着工程後の外気をカートリッジの外気導出側の通気口を通過させ外気導出口から外気タンクへ排気する工程、
循環ポンプを停止させ、１又は複数のカートリッジの、１又は複数の作用電極を順次切り替えながら、サイクリックボルタンメトリー測定又は電気化学インピーダンス測定を行う電気化学的測定工程、
カートリッジが記憶再生可能な素子を備えている場合に測定結果をそれぞれのカートリッジの該素子に記録する工程、並びに、
装置が無線又は有線通信回路を備えている場合には記録情報を外部に通信する工程、
を含む、タンパク質又は病原体を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質又は病原体の検出用カートリッジおよび自動検出装置に関する。より詳細には、本発明は、タンパク質又は病原体を認識する素子が表面に固定化された導電性ダイヤモンド電極を備えた、タンパク質又は病原体の検出用カートリッジおよび自動検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、目的の病原体、病原性細菌、ウイルスやそれらのタンパク質を高感度で検出することが望まれてきた。例えばインフルエンザウイルス（IFV）は世界的流行の可能性があり、迅速かつ正確なインフルエンザウイルスの検出が求められている。現在用いられているIFVの検出方法には、IFV認識デバイスとして抗体を用いたイムノクロマトグラフィー、糖鎖を用いた糖鎖アレイによる検出、遺伝子を用いたRT-PCR法、赤血球を用いた赤血球凝集アッセイなどがある。しかしこれらは時間やコストがかかる上に、専門的な知識や技術を要する。また、初めに検体を採取して検査用試料を作成する必要があるため、検体採取から検出までを自動的に行う手法は実現されていない。
【０００３】
Grabowskaらはハイブリダイゼーションを用いたIFV検出法を報告している（非特許文献１）。この方法は金チオール結合を介してAu電極の表面に、2つの異なるオリゴヌクレオチドプローブを固定したセンサーを用いるものであり、これによりヘマグルチニン（HA）とノイラミニダーゼ（NA）双方のオリゴヌクレオチドターゲットを同時に検出することが可能である。またKamikawaらは、電気活性があるポリアニリンで覆い、表面にH5N1型HAモノクローナル抗体を修飾した磁性ナノ粒子を用いたIFV検出を報告している（非特許文献２）。この方法では、H5N1ウイルスと相互作用したナノ粒子を強力な磁力（MPC）で血清中から回収し、電気化学測定によりウイルス結合量が定量されている。
【０００４】
Sakuraiらは、蛍光免疫クロマトグラフィーを用いた季節性インフルエンザの迅速かつ高感度な型分類を報告している（非特許文献３）。臨床で使われているIFVの検出手法であるイムノクロマト法は検出感度が1000pfuであり、感染初期の検出が困難である。同文献においてSakuraiらは、ウイルスの補足抗体と増感剤を標識した検出用抗体の両方を用いてウイルスをサンドイッチ型に捕捉し、さらにデンシトメトリー分析装置や蛍光イムノクロマト測定装置を用いた検出を行うことにより従来の１００倍の感度の向上を達成したことを報告している。しかしながら、ハイブリダイゼーション用の相補的オリゴヌクレオチドや基板に固定化する抗体は、作製に膨大な手間とコストを要し、保存安定性の問題がある。
【０００５】
Hassenらは、電気化学インピーダンス分光法を用いたインフルエンザAウイルスの定量
を報告している（非特許文献４）。この文献では金電極表面に抗体−糖鎖除去アビジン−チオール構造物を固定したデバイスを用いて、インフルエンザAウイルスが検出されている。
【０００６】
一方でホウ素ドープダイヤモンド電極は、ガラス性炭素や白金電極などの他の従来型の電極材料と比較して特性が優れており、近年、注目を集めている。熱伝導性が高いことや硬度が極めて高いというダイヤモンドの周知の特性の他に、ホウ素ドープダイヤモンド電極は、広い電位窓、小さいバックグランド電流、及び吸着耐性が高く、化学的に不活性であるといった魅力的な特性を有する。また、ホウ素ドープダイヤモンド電極は物理的、化学的に安定で耐久性に優れる。
【０００７】
ダイヤモンド電極を備えたセンサーとしては、カテコール又はカテコール誘導体の正確な定量を行うことが可能なダイヤモンド電極及び当該ダイヤモンド電極を備えるセンサーが報告されている（特許文献１）。この文献では4-ペンテン酸修飾されたダイヤモンド電極を用いてシュウ酸が電気化学的に検出されている。
【０００８】
従来のIFV検出装置は、検体にハイブリダイゼーション用試薬を添加したり、金ナノ粒子を加えてから波長測定を行う必要があった。ウイルスや各種病原性細菌、病原体について、抗体や高価な装置を使用せず、高感度にて早期検出が可能な装置が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００７−２９２７１７（特許第４９７８８５８号）
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Grabowskaら, Anal. Chem., 85, 10167-10173 (2013)
【非特許文献２】Kamikawaら, Biosens Bioelectron., 26, 1346-1352 (2010)
【非特許文献３】Sakuraiら, PLOS ONE DOI:10.1371/jounal.pone.0116715, 1-13 (2015)
【非特許文献４】Hassenら, Electrochim. Acta 56, 8325-8328 (2011)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は従来の問題点を解決する、迅速かつ高感度でタンパク質又は病原体を検出する装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、上記の問題を解決するために、タンパク質又は病原体を認識する素子が表面に固定化された導電性ダイヤモンド電極を備えた、タンパク質又は病原体の検出用カートリッジおよび自動検出装置を提供する。このカートリッジを備えた装置を用いて電気化学的測定を行うことにより、検体に特殊な試薬や金ナノ粒子を添加することなく、迅速かつ高感度でインフルエンザウイルスを検出することができる。
【００１３】
すなわち本発明は、以下を包含する。   
[１]  １又は複数の作用電極、対電極、参照電極、並びに、支持電解質溶液を保持し得る容器を備えた、タンパク質又は病原体を検出するためのカートリッジであって、
該１又は複数の作用電極は、それぞれ、同一または異なる種類の、タンパク質又は病原体を認識する素子が表面に固定化された導電性ダイヤモンド電極を有し、
作用電極、対電極、及び参照電極は外部との電気的導通が可能であるように構成されており、
作用電極、対電極、及び参照電極の液絡部は、容器内に支持電解質溶液が存在する場合に当該支持電解質溶液に接触可能であるように該容器に配置されており、
容器は外気の導入口、外気導出側の通気口及び導出口を備え、
導入口及び外気導出側の通気口は、該導入口より導入された外気が該容器に保持された支持電解質溶液中を通過して外気導出側の通気口へと導出されるよう構成されており、外気導出側の通気口を通過した外気はさらにカートリッジの導出口へと導出されるよう構成されており、
外気が支持電解質溶液中を通過する際に１又は複数の作用電極に接触可能であるように容器及び作用電極が構成されており、ここで外気が１又は複数の作用電極に接触しているときには対電極、及び参照電極の液絡部が支持電解質溶液に常に接触しているよう対電極及び参照電極が構成されており、
支持電解質溶液及び参照電極の内部電解質溶液を容器に注入することができるよう構成されており、
外気を作用電極に接触させるとき及び作用電極による電気化学的測定を行うときには、作用電極の素子が固定化されている表面が下向きであるよう構成されており、
外気導入口及び外気導出口及び外気導出側の通気口は、支持電解質溶液の最高液面位置よりも高い位置に配置されている、
該タンパク質又は病原体を検出するためのカートリッジ。   
[２]  外気の導入口側の通気口が、外気を気泡にする気泡発生フィルターを備えている、１に記載のカートリッジ。   
[３]  カートリッジが複数の作用電極を備えている場合、外気導入口側の作用電極が導出口側の他の作用電極と比較して低い位置に配置され、該導出口側の他の作用電極が該外気導入口側の作用電極と比較して高い位置に配置されている、１または２に記載のカートリッジ。   
[４]  １又は複数の作用電極、対電極、参照電極、並びに、支持電解質溶液を保持し得る容器を備え、さらに液面を上昇及び下降させることのできる液面上下動機構を備えた、タンパク質又は病原体を検出するためのカートリッジであって、
該１又は複数の作用電極は、それぞれ、同一または異なる種類の、タンパク質又は病原体を認識する素子が表面に固定化された導電性ダイヤモンド電極を有し、
作用電極、対電極、及び参照電極は外部との電気的導通が可能であるように構成されており、
容器は外気の導入口、外気導出側の通気口及び導出口を備え、さらに液面上下動機構用の空気導入口を備え、
作用電極、対電極、及び参照電極の液絡部は、容器内の支持電解質溶液液面が上昇した場合に当該支持電解質溶液に接触可能であるように該容器に配置されており、
導入口は、該導入口より導入された外気を１又は複数の作用電極の表面に吹き付けることができるよう構成されており、
外気導出側の通気口は、１又は複数の作用電極に吹き付けられた外気が通過できるよう配置されており、外気導出側の通気口を通過した外気はさらにカートリッジの導出口へと導出されるよう構成されており、
タンパク質又は病原体を素子に吸着させるときは、支持電解質溶液の液面を下降させ、１又は複数の作用電極は支持電解質溶液と接触していない、
支持電解質溶液の液面を下降させているときは、対電極及び参照電極の液絡部は、支持電解質溶液に接触していてもよく、
素子に吸着したタンパク質又は病原体を検出するときは、支持電解質溶液の液面を上昇させ、１又は複数の作用電極、対電極及び参照電極の液絡部は支持電解質溶液に接触しているよう構成されており、
支持電解質溶液及び参照電極の内部電解質溶液を容器に注入することができるよう構成されており、
外気を作用電極に接触させるとき及び作用電極による電気化学的測定を行うときは、作用電極の素子が固定化されている表面が下向きであるよう構成されており、
外気導入口及び外気導出口及び外気導出側の通気口は、支持電解質溶液の最高液面位置よりも高い位置に配置されている、
該タンパク質又は病原体を検出するためのカートリッジ。   
[５]  カートリッジが複数の作用電極を備えている場合、外気導入口側の作用電極が導出口側の他の作用電極と比較して高い位置に配置され、該導出口側の他の作用電極が該外気導入口側の作用電極と比較して低い位置に配置されている、４に記載のカートリッジ。 
[６]  液面上下動機構用の空気導入口が支持電解質溶液の最高液面位置よりも高い位置にある、４または５に記載のカートリッジ。   
[７]  支持電解質溶液を対電極挿入口から注入し、対電極を取り付けることによって容器を密閉構造とすることができるよう構成されている、１〜６のいずれかに記載のカートリッジ。   
[８]  参照電極用の内部電解質溶液を参照電極の金属電極挿入口から注入し、当該金属電極を取り付けることによって容器を密閉構造とすることができるよう構成されている、１〜７のいずれかに記載のカートリッジ。   
[９]  記憶再生可能な素子をさらに備えた、１〜８のいずれかに記載のカートリッジ。   
[１０]  記憶再生可能な素子は、基板を介して、カートリッジ外部から記録再生可能になっている、９に記載のカートリッジ。   
[１１]  外気導入口の直後に導入フィルターを有する、１〜１０のいずれかに記載のカートリッジ。   
【００１４】
[１２]  １又は複数の、１〜１１のいずれか１項に記載のカートリッジを備えた、タンパク質又は病原体を検出するための装置であって、
外部と電気的導通が可能であるように構成されているカートリッジ外面の作用電極、対電極、及び参照電極が該検出装置と電気的に接続されており、
カートリッジが記憶再生可能な素子を備えている場合には、当該記憶再生可能な素子が該検出装置と電気的に接続されており、
サイクリックボルタンメトリー測定及び／又は電気化学インピーダンス測定を行うことができる電気化学測定回路を備えており、
測定結果を表示する表示回路、又は、測定結果を出力若しくは送信する出力端末を備えており、
電源回路を備えており、
外気を検出装置内に吸入するための外気吸気口を備えており、該外気吸気口はカートリッジの外気導入口に接続されており、
外気を検出装置から排出するための外気排気口を備えており、該外気排気口はカートリッジの外気導出口に接続されており、
外気吸気口に接続された外気吸入ポンプを備えており、
制御回路を備えている、
該タンパク質又は病原体を検出するための装置。   
[１３]  カートリッジが液面上下動機構を備えた４〜１１のいずれかに記載のものであり、検出装置が液面上下動機構用のポンプを備え、該ポンプが検出装置の制御回路に接続されている、１２に記載の装置。   
[１４]  装置が複数のカートリッジを備えている場合において、当該複数のカートリッジの外気導入口及び外気導出口が、装置と、直列または並列に接続されている、１２又は１３に記載の装置。   
[１５]  無線又は有線通信回路を備えている、１２〜１４のいずれか１項に記載の装置。
[１６]  カートリッジが記憶再生可能な素子を備えている場合に、当該素子に対してデータの記録再生を行うデータ記録再生回路を備えている、１２〜１５のいずれかに記載の装置。   
[１７]  装置の外気吸気口とカートリッジの外気導入口との間に外気フィルターを備えている、１２〜１６のいずれかに記載の装置。   
[１８]  外気タンク及び循環ポンプを備え、外気排気口と外気タンクとの間に、外気排気口に接続された排気パイプを閉じることのできる外気タンク排気バルブを備えた、１２〜１７のいずれかに記載の装置。   
【００１５】
[１９]  １〜１１のいずれかに記載のカートリッジ、又は１２〜１８のいずれかに記載の装置を用いた、タンパク質又は病原体を検出する方法。   
[２０]  カートリッジが記憶再生可能な素子を備えている場合に、それぞれの素子から、１又は複数の作用電極が測定対象とするタンパク質又は病原体の情報、１又は複数の作用電極の初期特性、及び、既に測定に使用されたカートリッジについては、測定に使用した時間、検出した数値の情報を読み出す工程、
外気吸入ポンプを作動させ、吸入された外気をカートリッジ内に送り込む工程、
吸入された外気を１又は複数の作用電極の素子が固定化されている表面に吹き付けるか、支持電解質溶液中の気泡として１又は複数の作用電極と接触させる吸着工程、
吸着工程後の外気をカートリッジの外気導出側の通気口を通過させ外気導出口及び装置の外気排気口から排出させる排気行程、
外気吸入ポンプを停止させ、１又は複数のカートリッジの、１又は複数の作用電極を順次切り替えながら、サイクリックボルタンメトリー測定又は電気化学インピーダンス測定を行う電気化学的測定工程、
カートリッジが記憶再生可能な素子を備えている場合に測定結果をそれぞれのカートリッジの該素子に記録する工程、及び、装置が無線又は有線通信回路を備えている場合には記録情報を外部に通信する工程、
を含む、１９に記載の検出方法。   
[２１]  外気タンク、循環ポンプ、及び外気タンク排気バルブを備えた１８に記載の検出装置を用い、以下の工程、
カートリッジが記憶再生可能な素子を備えている場合に、それぞれの素子から、１又は複数の作用電極が測定対象とするタンパク質又は病原体の情報、１又は複数の作用電極の初期特性、及び、既に測定に使用されたカートリッジについては、測定に使用した時間、検出した数値の情報を読み出す工程、
外気タンク排気バルブを開き、外気吸入ポンプを作動させ、外気タンクに未測定の外気を導入する工程、
外気タンク排気バルブを閉じ、外気吸入ポンプを停止する工程、
循環ポンプを作動させ、外気タンク内の外気をカートリッジ内に送り込む工程、
吸入された外気を１又は複数の作用電極の素子が固定化されている表面に吹き付けるか、支持電解質中の気泡として１又は複数の作用電極と接触させる吸着工程、
吸着工程後の外気をカートリッジの外気導出側の通気口を通過させ外気導出口から外気タンクへ排気する工程、
循環ポンプを停止させ、１又は複数のカートリッジの、１又は複数の作用電極を順次切り替えながら、サイクリックボルタンメトリー測定又は電気化学インピーダンス測定を行う電気化学的測定工程、
カートリッジが記憶再生可能な素子を備えている場合に測定結果をそれぞれのカートリッジの該素子に記録する工程、並びに、
装置が無線又は有線通信回路を備えている場合には記録情報を外部に通信する工程、
を含む、タンパク質又は病原体を検出する方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のカートリッジを備えた装置を用いてタンパク質又は病原体を迅速、高感度かつ自動的に検出することができる。ダイヤモンド電極は他の電気化学的な検出法と比べて、表面が不活性であるため、タンパク質などの非特異的な吸着が抑制でき、ノイズが少なく電位窓が広いため、高感度な検出ができる。また本発明は、抗体のような高価な分子を用いることなく、高感度にて、タンパク質又は病原体を検出することができるのみならず、検体にハイブリダイゼーション用試薬や金ナノ粒子を添加する必要がなく、迅速かつ高感度な検出が可能となる。また、検査用試料作成を手動で行う必要がなくなり、検査担当者への二次感染が防止できる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明のカートリッジの斜視図である。
【図２】本発明のカートリッジの上面図である。
【図３】本発明のカートリッジの正面図である。
【図４】本発明のカートリッジの背面図である。
【図５】本発明のカートリッジの左面図（a）及び右面図（b）である。
【図６】本発明のカートリッジ１００の、図２中のA-A断面からみた断面図である。液面１３０は容器１０５に注入される支持電解質溶液１０４の量により設定することができる。
【図７】本発明のカートリッジの、図２中のB-B断面からみた断面図である。
【図８】本発明のカートリッジ２００の、図２中のA-A断面からみた断面図である。上下動機構２０１は膨張しておらず、液面２３０は低い状態が示されている。
【図９】本発明のカートリッジ２００の、図２中のA-A断面からみた断面図である。上下動機構２０１を膨張させることにより液面２３０を上昇させた状態を示す。
【図１０】本発明の作用電極の素子１１０を備えた検出部３００の斜視図である。(a)は検出部３００を斜め上から見た図、(b)は検出部３００を斜め下から見た図である。(b)には作用電極の素子が固定化されている表面３０１が検出部３００の下側に示されている。
【図１１】(a)は検出部３００の平面図である。(b)は、検出部３００の図１１(a)におけるG-G断面から見た断面図である。
【図１２】本発明のカートリッジ１００の、図２中のC-C断面からみた断面図である。
【図１３】本発明のカートリッジ１００の、図２中のD-D断面からみた断面図である。
【図１４】本発明のカートリッジ１００の、図３中のE-E断面からみた断面図である。
【図１５】本発明のカートリッジ１００の、図３中のF-F断面からみた断面図である。
【図１６】本発明のカートリッジ１００を備えた自動検出装置５００を示す。
【図１７】本発明のカートリッジ１００、外気タンク６１０及び循環ポンプ６２０を備えた自動検出装置６００を示す。
【図１８】本発明のカートリッジ２００、外気タンク６１０、循環ポンプ６２０、及び上下動機構用のポンプ７０１を備えた自動検出装置７００を示す。
【図１９】アジド基導入s2(1-5)ペプチドデンドリマーの固相合成のスキームを示す。
【図２０】ペプチド未修飾（左）及びペプチド修飾された（右）ダイヤモンド電極を用いたCV測定によるHAタンパク質の検出を示す。
【図２１】ペプチド未修飾（左）及びペプチド修飾された（右）ダイヤモンド電極を用いたCV測定によるインフルエンザウイルス（IFV）の検出を示す。
【図２２】ペプチド修飾されたダイヤモンド電極を用いた電気化学インピーダンス（EIS）測定によるHAタンパク質の検出を示す。
【図２３】ペプチド修飾されたダイヤモンド電極を用いたEIS測定における目的HAタンパク質と対照タンパク質BSAの結果を示す。四角がHAであり（R2=0.989）、丸がBSAである（R2=0.784）。
【図２４】ペプチド修飾されたダイヤモンド電極を用いたEIS測定によるIFVの検出を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、図面を参照しながら本発明を詳細に説明する。
【００１９】
本発明のタンパク質又は病原体の検出用カートリッジ
本発明のタンパク質又は病原体の検出用カートリッジ（以下、単に本発明のカートリッジということがある）は、タンパク質又は病原体を認識する素子が表面に固定化された導電性ダイヤモンド電極（以下、単に導電性ダイヤモンド電極ということがある）を備えてなる。ここで、素子がタンパク質又は病原体を「認識」する、とは、素子がタンパク質又は病原体と相互作用、結合、会合することをいう。素子がタンパク質又は病原体を認識すると、電位を印加した場合、電気化学反応により電流が流れる。この電流を測定することにより、認識されたタンパク質又は病原体を検出することができる。ここでいう「検出」とは、定性的検出及び定量的検出を包含する。
【００２０】
本発明のカートリッジとして、図６にカートリッジ１００を例示する。本発明のカートリッジ１００は、１又は複数の作用電極１０１、対電極１０２、参照電極１０３、並びに、支持電解質溶液１０４を保持し得る容器１０５を備えてなる。このカートリッジは、タンパク質又は病原体を検出するためのものである。本発明のカートリッジが有する一又は複数の作用電極の数は特に限定されず、１つ、２つ、３つ、４つ、６つ、８つ、１０、１２、１４、１６等とすることができる。
【００２１】
該１又は複数の作用電極１０１は、それぞれ、同一または異なる種類の、タンパク質又は病原体を認識する素子が表面に固定化された導電性ダイヤモンド電極１１０を有する。
【００２２】
作用電極１０１、対電極１０２、及び参照電極１０３は外部との電気的導通が可能であるように構成されている。
【００２３】
作用電極１０１、対電極１０２、及び参照電極の液絡部１２３は、容器１０５内に支持電解質溶液１０４溶液が存在する場合に当該支持電解質溶液に接触可能であるように該容器１０５に配置されている。
【００２４】
容器１０５は外気の導入口１１１及び外気導出側の通気口１５０を備え、外気の導入口１１１及び外気導出側の通気口１５０は、該導入口１１１より導入された外気が該容器に保持された支持電解質溶液中を通過して外気導出側の通気口１５０へと導出されるよう構成されており、外気導出側の通気口１５０を通過した外気はさらにカートリッジの導出口１５５へと導出されるよう構成されている。
【００２５】
カートリッジは、外気が支持電解質溶液１０４中を通過する際に１又は複数の作用電極１０１に接触可能であるように容器１０５及び作用電極１０１が構成されており、ここで外気が１又は複数の作用電極に接触しているときには対電極１０２、及び参照電極の液絡部１２３が支持電解質溶液１０４に常に接触しているよう対電極１０２及び参照電極全体が構成されている。参照電極全体とは、参照電極の金属電極（以下、単に参照電極という）１０３、参照電極の金属電極挿入口１０７、参照電極の液絡部１２３、内部電解質溶液を保持するための部材１２５、及び存在する場合には内部電解質溶液１２４、を含めたもの全体をいう。
【００２６】
カートリッジは、支持電解質溶液１０４及び参照電極１０３の内部電解質溶液１２４を容器１０５に注入することができるよう構成されている。内部電解質溶液１２４は内部電解質溶液を保持するための部材１２５により保持される。外気を作用電極１０１に接触させるとき及び作用電極１０１による電気化学的測定を行うときには、作用電極の素子が固定化されている表面３０１は下向きであるよう構成されている。すなわち検出部３００は作用電極の素子が固定化されている表面３０１が下向きとなるようカートリッジに取り付けられる。
【００２７】
外気導入口１１１及び外気導出口１５５及び外気導出側の通気口１５０（具体的にはそれらの下端）は、支持電解質溶液１０４の最高液面位置よりも高い位置に配置されている。逆にいうと、本発明のカートリッジに関し、支持電解質溶液１０４の最高液面位置は外気導入口１１１及び外気導出口１５５及び外気導出側の通気口１５０（具体的にはそれらの下端）よりも低い位置に設定される。
【００２８】
ある実施形態において外気の導入口側の通気口１１３は、外気を気泡にする気泡発生フィルター１２０を備えていてもよい。外気の導入口側の通気口１１３は円形や四角形などどのような形状であってもよい。ある実施形態において外気の導入口側の通気口１１３は、直径が１〜10mm、例えば3〜4mmの円形とすることができる。ある実施形態において、外気の導入口側の通気口１１３は、支持電解質溶液１０４が外気の導入口１１１側へと流入しないよう流入防止機構を備えている。気泡発生フィルター１２０が流入防止機構を兼ねてもよい。流入防止機構は、液体が流入するのを防止する弁であってもよい。
【００２９】
本発明のカートリッジの寸法は特に限定されないが、例えば外気の導入口側の通気口１１３を直径3〜4mmの円形とする場合、容器中の気泡が通過する幅、及び検出部３００の横幅もこれに合わせて3〜5mm、例えば3〜4mm程度とすることができる。また本発明のカートリッジは、ある実施形態において、縦方向の長さを約3〜30cm、横方向の長さを約4〜40cm、奥行き約1.5〜15cmとすることができる。
【００３０】
ある実施形態においてカートリッジ１００が複数の作用電極１０１を備えている場合、外気導入口側の作用電極１４０が外気導出口側の他の作用電極１４５と比較して低い位置に配置され、該導出口側の他の作用電極１４５が該外気導入口側の作用電極１４０と比較して高い位置に配置されている。ここでいう低い位置、高い位置とは、次のとおりである。外気の導入口１１１より導入された外気が支持電解質溶液１０４中を通過して外気導出側の通気口１５０へと導出される際、外気が支持電解質溶液１０４中を上昇する方向からみて、下側が低い位置、上側が高い位置である。また、外気の導入口１１１より導入された外気が支持電解質溶液１０４中を通過して外気導出側の通気口１５０へと導出される際、１又は複数の作用電極と順次接触するために、外気の導入口側の通気口１１３は、該１又は複数の作用電極よりも低い位置に配置されかつ支持電解質溶液液面より低い位置に配置され、外気導出側の通気口１５０は、該１又は複数の作用電極より高い位置に配置されかつ支持電解質溶液液面より高い位置に配置されている。
【００３１】
本発明のカートリッジは、液面上下動機構を備えたカートリッジを含む。ある実施形態において、液面上下動機構２０１を備えたカートリッジとして、図８及び図９に例示するカートリッジ２００が挙げられる。
【００３２】
液面上下動機構２０１は、例えば膨張収縮可能な材料で構成されたバルーンとすることができる。内部に空気を充填することによりバルーンを膨張させ、液面２３０を上昇させることができる。また内部の空気を吸引することによりバルーンを収縮させ、液面２３０を下降させることができる。
【００３３】
この実施形態において、容器１０５は外気の導入口１１１、外気導出側の通気口１５０及び導出口１５５を備え、さらに液面上下動機構用の空気導入口２０２を備えている。外気導出側の通気口１５０は、１又は複数の作用電極１０１に吹き付けられた外気が通過できるよう配置されており、外気導出側の通気口１５０を通過した外気はさらにカートリッジの導出口１５５へと導出されるよう構成されている。
【００３４】
作用電極１０１、対電極１０２、及び参照電極の液絡部１２３は、容器１０５内の支持電解質溶液１０４の液面２３０が上昇した場合に当該支持電解質溶液に接触可能であるように該容器に配置されている。図９にその例を示す。
【００３５】
外気中に含まれるタンパク質又は病原体を素子に吸着させるときは、支持電解質溶液１０４の液面２３０を下降させ、１又は複数の作用電極１０１を支持電解質溶液と接触しないようにする。図８にその例を示す。支持電解質溶液１０４の液面２３０を下降させているときは、対電極１０２及び参照電極の液絡部１２３は、支持電解質溶液１０４に接触していてもよい。素子に吸着したタンパク質又は病原体を検出するときは、支持電解質溶液１０４の液面２３０を上昇させ、１又は複数の作用電極１０１、対電極１０２及び参照電極の液絡部１２３は支持電解質溶液１０４に接触しているよう構成されている。
【００３６】
カートリッジ２００においてカートリッジが複数の作用電極１０１を備えている場合、ある実施形態では、外気導入口側の作用電極２４０は導出口側の他の作用電極２４５と比較して高い位置に配置され、該導出口側の他の作用電極が該外気導入口側の作用電極と比較して低い位置に配置されていてもよい。図８及び図９にはこのような実施形態を例示した。またある実施形態では、外気導入口側の作用電極２４０は導出口側の他の作用電極２４５と比較して同じ高さに配置されていてもよい。またある実施形態では、外気導入口側の作用電極２４０は導出口側の他の作用電極２４５と比較して低い位置に配置され、該導出口側の他の作用電極は該外気導入口側の作用電極と比較して高い位置に配置されていてもよい。ここでいう低い位置とは液面上下動機構２０１により液面２３０が下降している側の位置であり、高い位置とは液面上下動機構２０１により液面２３０が上昇している側の位置である。
【００３７】
ある実施形態において、カートリッジ２００に関し、液面上下動機構用の空気導入口２０２は支持電解質溶液１０４の最高液面位置よりも高い位置に配置することができる。逆にいうと、支持電解質溶液１０４の最高液面位置は、液面上下動機構用の空気導入口２０２よりも低い位置に設定され得る。ある実施形態において支持電解質溶液１０４の最高液面位置は外気の導入口１１１、外気導出口１５５及び外気導出側の通気口１５０（具体的にはそれらの下端）よりも低い位置とする。逆にいうと、外気の導入口１１１、外気導出口１５５及び外気導出側の通気口１５０（具体的にはそれらの下端）は支持電解質溶液１０４の最高液面位置よりも高い位置に配置される。
【００３８】
ある実施形態において本発明のカートリッジは、支持電解質溶液１０４および参照電極の内部電解質溶液１２４を注入することが可能な構造である。ある実施形態において本発明のカートリッジは、支持電解質溶液１０４を対電極挿入口１０６から注入し、対電極１０２を取り付けることによって容器１０５を密閉構造とすることができるよう構成されていてもよい。ある実施形態において本発明のカートリッジは、参照電極用の内部電解質溶液１２４を参照電極の金属電極挿入口１０７から注入し、当該金属電極を取り付けることによって容器を密閉構造とすることができるよう構成されていてもよい。
【００３９】
ある実施形態において本発明のカートリッジは、記憶再生可能な素子４０１をさらに備えている。該記憶再生可能な素子４０１は、基板４０２を介して、カートリッジ外部から記録再生可能とすることができる。基板４０２は、配線４０３を有しうる。記憶再生可能な素子４０１は、メモリチップを有する集積回路、半導体メモリ、フラッシュメモリ、ユニバーサルシリアルバス（以下、USB）メモリ、SDメモリーカード等であり得る。記憶再生可能な素子４０１には、１又は複数の作用電極１０１が測定対象とするタンパク質又は病原体の情報、１又は複数の作用電極１０１の初期特性、及び、既に測定に使用されたカートリッジについては、測定に使用した時間、検出した数値等の情報を格納することができる。基板４０２はプリント基板、例えばフレキシブルプリント基板であり得る。配線４０３は記憶再生可能な素子４０１の種類や規格に応じて適宜、適合化することができる。例えばUSBメモリであれば配線は４本（GND、D+、D-、VBUS）とすることができる。
【００４０】
ある実施形態において、本発明のカートリッジは、外気の導入口１１１の直後に、防塵等のための導入フィルター１１２を備えていてもよい。導入フィルター１１２はウイルス粒子が通過できるものであれば特に制限されない。
【００４１】
本発明のカートリッジは、検出部３００を有する。これを図１０、１１に例示した。検出部３００には、作用電極１０１のうちの、導電性ダイヤモンド電極１１０部分が備えられている。検出部は一又は複数の導電性ダイヤモンド電極１１０を有しうる。便宜上、作用電極の素子が固定化されている表面３０１を、検出部３００の下側とする。すなわち検出部３００の下側に作用電極の素子が固定化されている表面３０１があり、これがタンパク質又は病原体を含む外気又は電解質と接触する側である（図１１（ａ））。
【００４２】
本発明のカートリッジの作用電極１０１、対電極１０２、及び参照電極１０３は、外部と電気的導通が可能であるように構成されている。
【００４３】
本発明の自動検出装置
本発明は、タンパク質又は病原体を検出するための自動検出装置（以下、単に本発明の装置ということがある）を提供する。本発明の装置は、１又は複数の本発明のカートリッジを備えている。カートリッジとしては例えばカートリッジ１００又はカートリッジ２００が挙げられる。本発明の自動検出装置としては、例えば本発明のカートリッジ１００を備えた自動検出装置５００、本発明のカートリッジ１００及び外気タンク６１０を備えた自動検出装置６００、並びに液面上下動機構２０１を有するカートリッジ２００、外気タンク６１０、及び液面上下動機構用のポンプ７０１を備えた自動検出装置７００が挙げられる。
【００４４】
本発明の装置において、外部と電気的導通が可能であるように構成されているカートリッジ外面の作用電極１０１、対電極１０２、及び参照電極１０３は該検出装置と電気的に接続されている。
【００４５】
本発明のカートリッジが記憶再生可能な素子４０１を備えている場合には、当該記憶再生可能な素子４０１が該装置と電気的に接続されていてもよい。
【００４６】
また本発明の装置は、サイクリックボルタンメトリー測定及び／又は電気化学インピーダンス測定を行うことができる電気化学測定回路５０１を備えている。電気化学測定回路５０１は、ポテンショスタット、交流発信機、ロックインアンプ、その他付属回路を備えていてもよい。
【００４７】
また本発明の装置は、測定結果を表示するデータ表示回路５２０、又は、測定結果を出力若しくは送信する出力端末を備えていてもよい。データ表示回路５２０は、操作回路を兼ねていてもよい。
【００４８】
また本発明の装置は、電源回路５５０を備えている。電源回路５５０への入力電力は電池またはAC電源等であり得る。
【００４９】
本発明の装置は外気を検出装置内に吸入するための外気吸気口５０５を備えており、該外気吸気口５０５はカートリッジの外気導入口１１１に接続されている。また本発明の装置は外気を装置から排出するための外気排気口５０７を備えており、該外気排気口５０７はカートリッジの外気導出口１５５に接続されている。
【００５０】
また本発明の装置は外気吸気口５０５に接続された外気吸入ポンプ５０６を備えている。
【００５１】
本発明の装置は制御回路５１０を備えている。制御回路５１０は測定等の全ての動作をコントロールすることができる。制御回路５１０はCPUを有することができる。制御回路５１０は、測定結果をそれぞれのカートリッジ内の記録再生可能な素子４０１に記録し、無線又は有線の通信回路５３０によって外部へと測定結果を通信する機能を有しうる。制御回路５１０は、検出されたウイルスの数が一定数を超えると警報を発する機能を有することができる。制御回路５１０は、測定結果に異常が見られた場合、表示回路５２０にその旨を表示し、外部にアラームを出す機能を有することができる。制御回路５１０は「設定された測定回数が終了した」、「カートリッジの検出容量を超えてしまった」、等が発生した場合には測定を中止し、測定結果をそれぞれのカートリッジ内の記録再生可能な素子４０１に記録し、無線又は有線の通信回路５３０によって外部へその旨伝え、表示回路５２０に表示し、動作を停止させる機能を有することができる。また本発明の装置は、無線又は有線による通信回路５３０を備えていてもよい。
【００５２】
本発明の装置は、複数の作用電極１０１と電気化学インピーダンス測定回路５０１との間の接続を切り替える、切り替えスイッチ５６０を有してもよい。これにより、複数の作用電極１０１を順次切り替えながら、電気化学インピーダンス測定回路５０１によるサイクリックボルタンメトリー測定、電気化学インピーダンス測定等を行うことができる。
【００５３】
本発明の装置において、カートリッジが液面上下動機構を備えたものである場合、例えば２００の場合、本発明の装置は、液面上下動機構用のポンプ７０１を備えていてもよい。またこのとき、該ポンプ７０１は検出装置の制御回路５１０に接続されていてもよい。液面上下動機構用のポンプ７０１は、吸気口７０２及び排気口７０３を有しうる。その例を図１８に示す。吸気口７０２及び排気口７０３は、本発明の装置の内部にあってもよく、また、外部へと接続されていてもよい。
【００５４】
本発明の装置が複数のカートリッジを備えている場合、当該複数のカートリッジの外気導入口及び外気導出口は、該装置と、直列または並列に接続されていてもよい。直列とは、本発明の装置が有するｎ個のカートリッジのうち、第１のカートリッジの外気導出口を、第２のカートリッジの外気導入口に接続し、第２のカートリッジの外気導出口を第３のカートリッジの外気導入口に接続し、以下同様に第ｎのカートリッジの外気導入口に接続することをいう。並列とは本発明の装置が有する複数のカートリッジについて、各々のカートリッジが有する外気導入口及び外気導出口を互いに連結することなく、装置の外気吸気口及び外気排気口にそれぞれ接続することをいう。
【００５５】
本発明のカートリッジが記憶再生可能な素子４０１を備えている場合、本発明の装置は、当該素子に対してデータの記録再生を行うデータ記録再生回路５４０を備えていてもよい。データ記録再生回路５４０は、本発明のカートリッジの配線４０３と接続されていてもよい。
【００５６】
装置の外気吸気口５０５とカートリッジの外気導入口１１１との間には外気フィルター５０８を取り付けてもよい。外気フィルター５０８はウイルス粒子が通過できるものであれば特に制限されないが、例えば綿ごみ、砂粒や塵などを除去できるものが好ましい。
【００５７】
ある実施形態において、本発明の装置はさらに、外気タンク６１０及び循環ポンプ６２０を備え、外気排気口５０７と外気タンク６１０との間に、外気排気口５０７に接続された排気パイプ５０９を閉じることのできる外気タンク排気バルブ６３０を備えている。このような装置を図１７及び図１８に例示する。
【００５８】
[タンパク質又は病原体を検出する方法]
本発明は、本発明のカートリッジ、又は本発明の装置を用いた、タンパク質又は病原体を検出する方法を提供する。
【００５９】
ある実施形態において、本発明のタンパク質又は病原体検出方法は、以下の工程を含む。
カートリッジが記憶再生可能な素子４０１を備えている場合に、それぞれの素子から、１又は複数の作用電極１０１が測定対象とするタンパク質又は病原体の情報、１又は複数の作用電極１０１の初期特性、及び、既に測定に使用されたカートリッジについては、測定に使用した時間、検出した数値の情報を読み出す工程、
外気吸入ポンプ５０６を作動させ、吸入された外気をカートリッジ内に送り込む工程、
吸入された外気を１又は複数の作用電極の素子が固定化されている表面３０１に吹き付けるか、支持電解質溶液１０４中の気泡１２１として１又は複数の作用電極と接触させる吸着工程、
吸着工程後の外気をカートリッジの外気導出側の通気口１５０を通過させ外気導出口１５５及び装置の外気排気口５０７から排出させる排気行程、
外気吸入ポンプ５０６を停止させ、１又は複数のカートリッジの、１又は複数の作用電極を順次切り替えながら、サイクリックボルタンメトリー測定又は電気化学インピーダンス測定を行う電気化学的測定工程、並びに
カートリッジが記憶再生可能な素子４０１を備えている場合に測定結果をそれぞれのカートリッジの該素子４０１に記録する工程、及び、装置が無線又は有線通信回路５３０を備えている場合には記録情報を外部に通信する工程。
【００６０】
上記の方法において、吸入された外気を１又は複数の作用電極の素子が固定化されている表面３０１に吹き付けるか、支持電解質溶液１０４中の気泡１２１として１又は複数の作用電極と接触させる吸着工程は、例えば５分、１０分、１５分、３０分など適当な時間とすることができる。
【００６１】
別の実施形態において、本発明の装置が外気タンク６１０、循環ポンプ６２０、及び外気タンク排気バルブ６３０を備えている場合には、本発明のタンパク質又は病原体検出方法は、以下の工程を含む。
カートリッジが記憶再生可能な素子４０１を備えている場合に、それぞれの素子４０１から、１又は複数の作用電極１０１が測定対象とするタンパク質又は病原体の情報、１又は複数の作用電極１０１の初期特性、及び、既に測定に使用されたカートリッジについては、測定に使用した時間、検出した数値の情報を読み出す工程、
外気タンク排気バルブ６３０を開き、外気吸入ポンプ５０６を作動させ、外気タンク６１０に未測定の外気を導入する工程、
外気タンク排気バルブ６３０を閉じ、外気吸入ポンプ５０６を停止する工程、
循環ポンプ６２０を作動させ、外気タンク内の外気をカートリッジ内に送り込む工程、
吸入された外気を１又は複数の作用電極の素子が固定化されている表面３０１に吹き付けるか、支持電解質溶液１０４中の気泡１２１として１又は複数の作用電極１０１と接触させる吸着工程、
吸着工程後の外気をカートリッジの外気導出側の通気口１５０を通過させ外気導出口１５５から外気タンク６１０へ排気する工程、
循環ポンプ６２０を停止させ、１又は複数のカートリッジの、１又は複数の作用電極を順次切り替えながら、サイクリックボルタンメトリー測定又は電気化学インピーダンス測定を行う電気化学的測定工程、
カートリッジが記憶再生可能な素子４０１を備えている場合に測定結果をそれぞれのカートリッジの該素子に記録する工程、並びに、
装置が無線又は有線通信回路５３０を備えている場合には記録情報を外部に通信する工程。
【００６２】
上記の方法において、循環ポンプ６２０を作動させ、外気タンク内の外気をカートリッジ内に送り込む工程は、例えば５分、１０分、１５分、３０分など適当な時間とすることができる。
【００６３】
上記は単なる例示であり、本発明はこれらの実施形態に限定されない。例えば図１８に示す装置７００のバリエーションとして、外気タンク６１０、循環ポンプ６２０、排気バルブ６３０を有しない装置も想定される。
【００６４】
本発明のカートリッジが有する作用電極は、基板、該基板上のダイヤモンド層、及び該ダイヤモンド層上の修飾層を有する。基板上のダイヤモンド層は微量の不純物がドープされた導電性ダイヤモンドである。すなわち作用電極には導電性ダイヤモンド電極を用いる。この導電性ダイヤモンド電極には微量の不純物をドープすることが好ましい。不純物をドープすることにより、電極として望ましい性質が得られる。不純物としては、ホウ素（B）、硫黄（S）、窒素（N）、酸素（O）、ケイ素（Si）等が挙げられる。例えば炭素源を含む原料ガスに、ホウ素を得るためにはジボラン、トリメトキシボラン、酸化ホウ素を、硫黄を得るためには酸化硫黄、硫化水素を、酸素を得るためには酸素若しくは二酸化炭素を、窒素を得るためにはアンモニア若しくは窒素を、ケイ素を得るためにはシラン等を加えることができる。特に高濃度でホウ素をドープした導電性ダイヤモンド電極は広い電位窓と、他の電極材料と比較してバックグランド電流が小さいといった有利な性質を有することから好ましい。そこで以下にホウ素ドープダイヤモンド電極について例示的に記載する。他の不純物をドープした導電性ダイヤモンド電極を用いてもよい。本明細書では、特に断らない限り、電位と電圧は同義に用い相互に置き換え可能とする。また本明細書では導電性ダイヤモンド電極を単にダイヤモンド電極と記載することがあり、ホウ素ドープダイヤモンド電極をBDD電極と記載することがある。
【００６５】
作用電極の電極部は、基板表面に0.01〜8%w/wホウ素原料混入ダイヤモンドを蒸着したダイヤモンド層を有する。基板の大きさは特に限定されないが、mL単位若しくはμL単位の試料溶液を測定できる面積を有するものが好ましい。基板は例えば直径1〜10cm、厚み0.1mm〜5mmのものとすることができる。基板はSi基板、SiO2等のガラス基板や石英基板、Al2O3等のセラミックス基板、タングステン、モリブデン等の金属でありうる。基板の表面の全部又は一部をダイヤモンド層とすることができる。
【００６６】
導電性ダイヤモンド電極の電極部の大きさは、測定対象により適宜設計できる。例えば電極部は例えば0.1cm2〜10cm2、0.2cm2〜5cm2、又は0.5cm2〜4cm2の面積を有する表面とすることができる。ダイヤモンド層の全部又は一部を電気化学的測定に用いることができる。当業者であれば、測定対象に応じて電極部の面積や形状を適宜決定することができる。
【００６７】
作用電極の電極部は、Si基板表面が高ホウ素原料混入（原料仕込みとして0.01〜8%w/wホウ素原料）ダイヤモンドで蒸着されたダイヤモンド層を有する。好ましいホウ素原料混入率は0.05〜5％w/wであり、特に好ましくは0.3%w/w程度である。基板上にダイヤモンド層を形成した後、その上に修飾層を設けることができる。
【００６８】
基板へのホウ素原料混入ダイヤモンドの蒸着処理は、700〜900℃で2〜12時間行えばよい。導電性ダイヤモンド薄膜は通常のマイクロ波プラズマ化学気相成長法（MPCVD）で作製される。すなわち、シリコン単結晶（100）等の基板を成膜装置内にセットし、高純度水素ガスを担体ガスとした成膜用ガスを流す。成膜用ガスには、炭素、ホウ素が含まれている。炭素、ホウ素を含む高純度水素ガスを流している成膜装置内にマイクロ波を与えてプラズマ放電を起こさせると、成膜用ガス中の炭素源から炭素ラジカルが生成し、Si単結晶上にsp3構造を保ったまま、かつホウ素を混入しながら堆積してダイヤモンドの薄膜が形成される。
【００６９】
ダイヤモンド薄膜の膜厚は成膜時間の調整により制御することができる。ダイヤモンド薄膜の厚さは、例えば100nm〜1mm、1μm〜0.1mm、1μm〜100μm、2μm〜20μm等とすることができる。
【００７０】
基板表面へのホウ素ドープダイヤモンドの蒸着処理の条件は基板材料に応じて決定すればよい。一例としてプラズマ出力は500〜7000W、例えば3kW〜5kWとすることができ、好ましくは5kWとしうる。プラズマ出力がこの範囲であれば、合成が効率よく進行し、副生成物の少ない、品質の高い導電性ダイヤモンド薄膜が形成される。
【００７１】
上記の電極は、特開２００６−９８２８１号公報、特開２０１１−１５２３２４号公報又は特開２０１５−１７２４０１号公報等に開示されており、これらの公報の記載に従って作製することができる。
【００７２】
導電性ダイヤモンド電極は、熱伝導率が高く、硬度が高く、化学的に不活性であり、電位窓が広く、電気容量が低く、バックグラウンド電流が低く、電気化学的安定性に優れている。
【００７３】
本発明のカートリッジは三極電極を備えている。参照電極側の抵抗は高く設定されており、作用電極と参照電極との間では電流は流れない。対電極は特に限定されないが、例えば銀線や白金線を使用しうる。参照電極は特に限定されないが、安定性や再現性等の観点から銀−塩化銀電極（Ag/AgCl）が好ましい。本明細書では特に断らない限り、測定された電圧は、銀−塩化銀電極を基準にして測定されたものとする（+0.199V vs 標準水素電極（SHE））。
【００７４】
参照電極として使用される銀−塩化銀電極は、塩化物イオン（Cl-）を含む水溶液中にAgClコーティングされた銀線（Ag/AgCl）を浸した構成を有する。参照電極としてAg/AgCl参照電極を用いる場合、当該Ag/AgCl参照電極は作用電極（導電性ダイヤモンド電極）より表面積が大きければ、特に限定されない。例えば図６を参照すると、参照電極１０３は、内部電解質溶液１２４に浸されており、内部電解質溶液１２４と、容器１０５中の支持電解質溶液１０４との間には参照電極の液絡部１２３が配置されている。参照電極の液絡部１２３は、内部がポーラス状のバイコールガラスやセラミック、または塩橋により内部電解質溶液１２４と支持電解質溶液１０４の電気的導通が図られている。塩橋はガラス管でも濾紙でもよく、寒天によりゲル化されていてもよい。塩橋は通常、不活性な電解質、例えば塩化ナトリウムが充填される。
【００７５】
本発明のカートリッジが有する作用電極、対電極、参照電極は、電気化学測定時に支持電解質溶液と同時に接触可能に配置されていれば、その形状は特に限定されない。
【００７６】
本発明の導電性ダイヤモンド電極は、その表面上にタンパク質又は病原体を認識する素子が固定化されている。ある実施形態において固定化とは、共有結合により素子が導電性ダイヤモンド電極表面に連結されていることをいう。素子が固定化されている層を修飾層とよぶことがある。修飾層を目的のタンパク質又は病原体と接触させると、該素子がタンパク質又は病原体を認識する。このとき、電位が印加されていると電流が流れ、これを測定することにより試料中のタンパク質又は病原体を検出することができる。
【００７７】
本発明のカートリッジ又は装置により検出される病原体としては、導電性ダイヤモンド電極表面の素子により認識され電流が流れるものであれば、どのようなものでもよい。病原体としては、ウイルスや病原性細菌が挙げられる。病原性細菌としてはマイコプラズマ菌、ボツリヌス菌、百日咳菌、破傷風菌、ジフテリア菌、コレラ菌、赤痢菌、炭疽菌、病原性大腸菌、ブドウ球菌、サルモネラ菌、ウェルシュ菌及びセレウス菌が挙げられるがこれに限らない。
【００７８】
本発明のカートリッジ又は装置により検出されるウイルスとしては、導電性ダイヤモンド電極表面の素子により認識され電流が流れるものであれば、どのようなものでもよい。検出されるウイルスとしては、DNAウイルス、RNAウイルス、2本鎖DNAウイルス、1本鎖DNAウイルス、2本鎖RNAウイルス、1本鎖RNA（＋）鎖ウイルス、1本鎖RNA（−）鎖ウイルス、1本鎖RNA逆転写ウイルス、2本鎖DNA逆転写ウイルス、例えばインフルエンザウイルス、ノロウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、RSウイルス、ヘルペスウイルス、肝炎ウイルス、アデノウイルス、口蹄疫ウイルス、狂犬病ウイルス、及びヒト免疫不全ウイルスが挙げられる。インフルエンザウイルスとしては、A型、B型、C型、トリインフルエンザウイルス及びそれらの各種亜型が挙げられる。
【００７９】
本発明のカートリッジ又は装置により検出されるタンパク質としては、導電性ダイヤモンド電極表面の素子により認識され電流が流れるものであれば、どのようなものでもよい。ある実施形態において、検出されるタンパク質は、トリプトファン残基を有するものである。ある実施形態において、検出されるタンパク質は、上記の病原体、病原性細菌、又はウイルスに由来するタンパク質である。好ましくはウイルス由来タンパク質は、ウイルス表面タンパク質とすることができる。例えば検出対象がインフルエンザウイルスであれば、素子により認識されるのはインフルエンザウイルス由来のヘマグルチニン（HA）又はノイラミニダーゼ（NA）タンパク質等でありうる。検出するタンパク質としては、さらにインフルエンザウイルスのM1タンパク質、及びM2タンパク質が挙げられる。検出対象がマイコプラズマ菌である場合には、素子により認識されるのはマイコプラズマ細菌由来のP1タンパク質、膜抗原タンパク質又はリボソームタンパク質L7/L12であり得る。ある実施形態において、検出されるタンパク質は、毒素タンパク質である。毒素タンパク質としては、外毒素、ボツリヌス毒素、百日咳毒素、破傷風菌毒素（テタノスパスミン）、ジフテリア毒素、ウェルシュ菌のα毒素、コレラ菌毒素、ベロ毒素、炭疽菌毒素（PA、EF、又はLF）、並びに、大腸菌、ブドウ球菌、サルモネラ菌、及びセレウス菌等に由来するエンテロトキシンが挙げられるがこれに限らない。
【００８０】
本発明のタンパク質又は病原体を認識する素子は、目的のタンパク質又は病原体と相互作用したときに、導電性ダイヤモンド電極に電流が流れるものであれば、どのようなものでもよい。
【００８１】
本発明の作用電極の素子に使用される、タンパク質又は病原体を認識する素子を以下に模式的に表す。素子は、一方の端が導電性ダイヤモンド電極表面に固定化されており、他方の端にタンパク質又は病原体を認識する分子を有する。また、素子は場合によりリンカー分子を有してもよい。
【００８２】
Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ−（Ｌ）−Ｒ
[式中、Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅは導電性ダイヤモンド電極、Ｌは任意に存在してもよいリンカー、Ｒはタンパク質又は病原体を認識する分子を表す。]
【００８３】
ある実施形態において、タンパク質又は病原体を認識する素子は、目的のタンパク質又は病原体と特異的に相互作用するペプチドを有する。上記の式で説明すると、タンパク質又は病原体を認識する分子Ｒはペプチドを有し得る。該ペプチドは例えば長さ４アミノ酸以上、５アミノ酸以上、６アミノ酸以上、７アミノ酸以上、８アミノ酸以上、９アミノ酸以上、１０アミノ酸以上又は１５アミノ酸以上のものを用いることができる。該ペプチドは例えば長さ１００アミノ酸以下又は５０アミノ酸以下のものを用いることができる。素子は、該ペプチドを１以上有しうる。例えばインフルエンザウイルスのHAタンパク質に結合するペプチドs2(1-5)はデンドリマー化することによってHA結合性が大幅に上昇し、４分岐型ではs2(1-5)単体の場合に比べて約７５０倍のHA結合活性が得られる。このようなデンドリマー化されたタンパク質結合ペプチドを本発明の素子に用いることができる。
【００８４】
ある実施形態においてタンパク質又は病原体を認識する素子は、上記の病原体、病原性細菌又はウイルス由来のタンパク質を認識するペプチドを有する。このようなペプチドのアミノ酸配列は公知文献やGenBank等の公知のデータベースから取得することができる。当該ペプチドは任意に修飾されていてもよく、上記のようにデンドリマー化されていてもよい。
【００８５】
ある実施形態においてタンパク質又は病原体を認識する素子は、インフルエンザウイルスを認識するペプチドを有する。インフルエンザウイルスを認識するペプチドとしては、公知のあらゆるものを用いることができ、例えば国際公開第２００７／１０５５６５号パンフレット、国際公開第２０１０／０２４１０８号パンフレット、特開２０１０−２０９０５２号公報（参照によりこれらの内容を本明細書に組み入れる）に記載されているものが挙げられるがこれに限らない。インフルエンザウイルスを認識するペプチドとして以下のものを例示する。   
【００８６】
ペプチドs2(1-5)  （ARLPR）（配列番号１）
ペプチドs2  （ARLPRTMVHPKPAQP）（配列番号２）
GLAMAPSVGHVRQHG（配列番号３）
GLAMAPSVGHVRQHG  （ただしここでのセリン残基はO-グリコシド結合を介してN-アセチルガラクトサミンにより修飾されているものである）（配列番号４）
これらを一部に有するペプチドも想定される。ペプチドは適宜修飾されていてもよい。これらは例示に過ぎず、ウイルスや病原体、病原菌を認識する他のペプチドも本発明に用いることができる。
【００８７】
タンパク質又は病原体を認識するペプチドは適当な化学的手法により本発明の導電性ダイヤモンド電極に固定化される。ある実施形態において、該ペプチドは、リンカー分子を介してダイヤモンド電極に固定化されてもよい。既知のタンパク質認識ペプチド以外にも、同等の機能を有する均等物も想定され、本発明に用いることができる。ペプチドは化学合成したものであり得る。
【００８８】
タンパク質又は病原体を認識する素子は、任意の適当な方法を用いて、導電性ダイヤモンド電極表面に固定化してよい。ある実施形態においては、目的の分子を、電解グラフトにより電極表面に連結することができる。ある実施形態においては固定化に光誘起ラジカル反応を用いてもよい。
【００８９】
所望により、素子の固定化にリンカー分子を用いることもできる。以下に、リンカー部分を形成するための分子を例示する。
【００９０】
Ａ−Ｌ1−Ｂ（−Ｐ）
[式中、Ａは導電性ダイヤモンド電極と反応することのできる官能基、Ｌ1はリンカー部分、Ｂはタンパク質又は病原体を認識する分子と反応することのできる官能基、Ｐは任意に存在してもよい保護基を表す。]
【００９１】
この場合、まず電解グラフト等の適当な反応により上記分子を電極表面に連結する。つまり官能基Ａを反応させ、電極とＬ1とを連結させる。官能基Ｂが保護基Ｐにより保護されているものである場合には、その後脱保護反応を行い官能基Ｂを提示させることができる。その後、任意の適当な連結反応を用いてタンパク質又は病原体を認識する分子Ｒをリンカー部分に連結することができる。
【００９２】
以下にタンパク質又は病原体を認識する分子Ｒを例示する。
【００９３】
Ｃ−Ｒ1
[式中、Ｒ1はタンパク質又は病原体を認識する部分、Ｃは官能基Ｂと反応することのできる官能基を表す。]
【００９４】
リンカー部分とタンパク質又は病原体を認識する分子Ｒとの連結反応（官能基Ｂと官能基Ｃとの連結反応）はヒュスゲン環化付加反応、グレーサー反応、そのがしらカップリング、鈴木・宮浦カップリング反応等を用いることができ、共有結合を形成するものが好ましいがこれに限らない。
【００９５】
導電性ダイヤモンド電極と反応することのできる官能基Ａは、ジアゾ基、アミノ基、カルボキシ基、カルボニル基、アルデヒド基、水酸基、ニトロ基等でありうる。またリンカー部分Ｌ1は、芳香環、炭素環、複素環、例えばフェニル基、ナフチル基、ポリエーテル基、ポリエチレングリコール基、炭化水素基等を有しうる。これらは場合によりアルキル基、アリール基、ハロゲン基、水酸基等の適当な置換基によりさらに置換されていてもよい。また官能基Ｂ及び官能基Ｃは、アルキニル基、ボラニル基、ボリル基、ハロゲン化アリール基、アジド基等でありうる。また、連結反応にヒュスゲン環化付加反応を用いる場合には、官能基Ｂはアルキニル基を有し、官能基Ｃはアジド基を有しうる。官能基Ｂは場合により保護基Ｐにより保護されていてもよい。保護基としては、トリイソプロピルシリル基、トリメチルシリル基、ブチルジフェニルシリル基、ジメチルクミルシリル基等の三置換シリル基、ベンジル基、低級アルコキシカルボニル基、ハロゲノ低級アルコキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、アセチル基、ベンゾイル基等のアシル基、トリフェニルメチル基、テトラヒドロピラニル基等が挙げられるがこれに限らない。
【００９６】
ある実施形態において、Ａはジアゾ基、Ｌ1はフェニレン基、Ｂはアルキニル基、Ｐはトリイソプロピルシリル基であり得る。Ａを反応させてこれを電極表面に固定化し脱保護することでアルキニル基Ｂを提示することができる。ある実施形態においてタンパク質又は病原体を認識する分子Ｒは、Ｒ1としてのペプチド基及び官能基Ｃとしてのアジド基を有しうる。Ｒのアジド基（官能基Ｃ）と該電極表面に提示されているアルキニル基（官能基Ｂ）とを反応させると1,2,3-トリアゾール環が形成され、タンパク質又は病原体を認識する分子Ｒが電極表面に固定化される。
【００９７】
電気化学的測定方法について
本発明のカートリッジ又は装置を用いて、目的のタンパク質又は病原体を検出することができる。本発明のカートリッジが有する作用電極を試料である空気（外気）又は電解質溶液と接触させたとき、作用電極表面の素子がタンパク質又は病原体を認識する。このとき、作用電極に電位を印加すると、電流が観測できる。これをサイクリックボルタンメトリー又は電気化学インピーダンス測定法により測定することができる。
【００９８】
サイクリックボルタンメトリー
サイクリックボルタンメトリーは電位を変動（掃引）させる手法を用いて行う。具体的には電極電位を初期電位（Ei）から掃引速度（v）で反転電位（Eλ）まで掃引した後逆転し、Eiまで戻したときに得られる電流を観測する。初期電位Eiを電極反応の起こらない電位に、また反転電位Eλを電極反応が拡散律速となるような電位に設定することで、電流電位グラフ（サイクリックボルタモグラム）を得ることができる。初期電位、掃引速度、反転電位等は適宜設定することができる。
【００９９】
この場合、既知の濃度又は量のタンパク質又は病原体サンプルについて、ピーク電流値を決定しておき、濃度又は量とピークの電流密度との関係をプロットした検量線を作成しておき、測定試料についてのピーク電流値から、当該試料中に含まれるタンパク質又は病原体の濃度又は量を算出することができる。
【０１００】
電気化学インピーダンス測定
電気化学インピーダンス測定にはポテンシオスタットに交流発信機を接続したものを使用する。ポテンシオスタットを使用して電極に直流の一定電位を印加し、交流発信機を使用して±5〜10mVの交流電位を重ねあわせて印加する。また、発信機からポテンシオスタットへ入力した交流と同じ位相の交流波をロックインアンプにも入力する。これにより流れる電流は直流電流と交流電流が合わさったものとなり、ロックインアンプは電流の交流成分と発信機からの交流を比較してインピーダンスと両者の位相差が出力される。発信機からの交流周波数を少しずつ変化させ、それぞれの周波数で得られるインピーダンスと位相差を元に複素数平面プロットなどを行う。
【０１０１】
この場合、既知の濃度又は量のタンパク質又は病原体サンプルについて、ナイキストプロットにより電極のインピーダンス（電荷移動抵抗Rct）を決定して、濃度又は量とRctとの関係をプロットした検量線を作成しておき、測定試料についてのRct値から、当該試料中に含まれるタンパク質又は病原体の濃度又は量を算出することができる。
【０１０２】
クロノアンペロメトリー
本発明の装置を用いた電気化学測定は、クロノアンペロメトリーにより行うこともできる。クロノアンペロメトリーでは、作用電極の電位をステップさせ、その際の電流の時間の変化を測定する。クロノアンペロメトリー測定は、0.1〜3.0V、0.5〜2.5V等の一定のステップ電位を印加して行うことができる。
【０１０３】
この場合、既知の濃度又は量のタンパク質又は病原体サンプルについて一定印加電圧でクロノアンペロメトリー測定を行う。電圧印加後の一定時間における電流値を記録し、前記タンパク質又は病原体サンプルの濃度又は量と電流値との関係をプロットすることにより検量線を作成する。次に測定試料について当該電圧印加後の当該一定時間における電流値を測定し、これを前記検量線と対比することにより、被検試料溶液中のタンパク質又は病原体サンプルの濃度又は量を算出する。
【０１０４】
本発明の方法の測定対象である被検試料は特に限定されないが、例示すればウイルス又は病原体を含む可能性のある大気が挙げられる。例えばインフルエンザウイルスが存在する可能性のある病院等の臨床施設、学校、駅、空港、あらゆる公共施設等の大気が挙げられる。外気は圧縮してもよく、そのまま測定に供してもよい。
【０１０５】
本発明では測定のための溶媒は主として水系を用いる。測定を行う溶液には通常、支持電解質が含まれる。支持電解質はイオン性物質であり、特に限定されないが、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、硝酸カリウム、硫酸ナトリウムなどが挙げられる。好ましくは支持電解質はPBSである。
【０１０６】
本明細書において、タンパク質が「検出」されるとは、目的のタンパク質以外のタンパク質又はウイルス若しくは細菌の混在する試料中で目的のタンパク質を特異的に測定できることをいう。また病原体が「検出」されるとは、目的の病原体以外のタンパク質又はウイルス若しくは細菌の混在する試料について目的の病原体を特異的に測定できることをいう。
【０１０７】
本明細書ではウイルス量を、プラーク形成ユニット数（pfu）により表す。ある実施形態において、インフルエンザウイルスの量を記載する場合のpfuは、インフルエンザウイルスA/PR/8/34（H1N1)株を用いたときのものとする。pfuの計測法は単層培養したイヌ腎臓由来上皮細胞MDCK細胞にインフルエンザウイルスを加えた際に形成されるプラークを計測して見積もることができる。なお、これは便宜上の指標であって、当業者であれば、異なるインフルエンザウイルス株を用いたときの対応するpfuを適宜決定することができる。またpfu単位を適宜にng単位に換算してもよい。ある実施形態において、本発明の装置は、インフルエンザウイルスを高感度に検出することができ、例えば20pfu以上、又は40pfu以上、1000pfu以下のインフルエンザウイルスを検出することができる。
【０１０８】
ある実施形態において、本発明のカートリッジの作用電極は、タンパク質又は病原体を認識する素子が表面に固定化された導電性ダイヤモンド電極を有する。
【０１０９】
ある実施形態において、このタンパク質又は病原体を認識する素子は、ウイルス又は病原菌を認識する素子である。認識されるウイルスや病原菌の種類については上述したとおりであり、特にインフルエンザウイルスが挙げられる。
【０１１０】
ある実施形態において、このタンパク質又は病原体を認識する素子は、病原体タンパク質を認識するペプチドを有する。認識される病原体タンパク質は上述したとおりであり、特にインフルエンザウイルスのHAタンパク質が挙げられる。病原体タンパク質を認識するペプチドの例も上述したとおりである。
【０１１１】
ある実施形態においてこのタンパク質又は病原体を認識する素子は、タンパク質又は病原体を認識する分子及びリンカー部分を有し、該タンパク質又は病原体を認識する分子が該リンカー部分を介してダイヤモンド電極の表面に固定化されている。タンパク質又は病原体を認識する分子、リンカー部分、及び固定化方法は上述したとおりである。
【０１１２】
本発明の導電性ダイヤモンド電極の製造例及び使用例
以下の手順は、例示のみを意図したものであり、何ら本発明の技術的範囲を限定することを意図するものではない。特に断らない限り、試薬は、市販されているか、又は当技術分野で慣用の手法、公知文献の手順に従って入手又は調製する。
【０１１３】
略語について
本明細書において、以下の略語を用いることがある。
IFV：インフルエンザウイルス
HA：ヘマグルチニン
EIS：電気化学インピーダンス分光法
CV：サイクリックボルタンメトリー
DMF：N,N-ジメチルホルムアミド
DCM：ジクロロメタン
PyBOP：ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ-トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸
DIEA：ジイソプロピルエチルアミン
PIP：ピペリジン
TFA：トリフルオロ酢酸
TIS：トリイロプロピルシラン
TIPS-Eth-Ar-N2+BF4-：4-((トリイソプロピルシリル)エチニル)ベンゼンジアゾニウムテトラフルオロホウ酸
α-CHCA：α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸
THF:テトラヒドロフラン
TBAF:テトラ-n-ブチルアンモニウムフロリド
Fmoc：9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基
AFM：原子間力顕微鏡
【０１１４】
材料及び化合物
特に断らない限り、化合物、化学薬品は市販されているものをさらに精製することなく使用した。当業者であれば、本発明の精神から逸脱することなく、記載する手順を改変することができる。
【０１１５】
１．  ペプチド及びリンカーの合成
末端にアジドリジンLys(N3)を導入した２分岐型ペプチドデンドリマー(ARLPR)2-K-KN3をFmoc固相法を用いて合成した。ペプチドARLPRはヘマグルチニン結合ペプチドである（特開２００６−６８０２０号公報）。固相法によるペプチド合成では、ペプチド樹脂（アミノ酸が固定化された固相支持体）に脱保護試薬を加え、N-α保護基を除く。そこに活性化したアミノ酸を反応させて、ペプチドの鎖長を次々に伸ばす。ペプチドのカルボキシ基末端はアミド化し、不要な電荷をなくした。また、LysをペプチドのC末端側に導入することで分岐構造を作り出した。図１９にアジド基導入s2(1-5)ペプチドデンドリマーの固相合成のスキームを示す。
【０１１６】
（A)  手付合成による樹脂へのLys(N3)の導入
反応カラム(PD-10,アマシャム)にFmoc-NH-SAL樹脂(渡辺化学、0.59mmol/g)169mg(0.1mmol)を投入した。これにDMF 2mLを加え、軽く振とうした後、アスピレーターでカラム下部からDMFを取り除いた。この操作を3回繰り返し樹脂を膨潤させた。反応カラムに20%(v/v)PIP/DMFを2mL加え、1分後、アスピレーターで溶媒を取り除いた。同様に20%PIP/DMFを2mL注ぎ、15分間振とうし、溶媒を取り除いた。DMF 2mLを注いでアスピレーターで除く操作を4回繰り返して樹脂を洗浄した。これにより脱保護を行った。
【０１１７】
反応カラムにFmoc-Lys(N3)-OH(EUROGENTEC GROUP ANA SPEC、53100-F025)117mg(0.3mmol)、PyBOP 156mg(0.3mmol)、DMF 2mL、DIEA 0.11mL(0.6mmol)を加え、1時間振とうした。これによりカップリング反応を行った。
【０１１８】
1時間後、アスピレーターで反応溶液を除き、DMF 2mLを反応カラムに注いで軽く振とうした後アスピレーターで除く操作を4回繰り返した(洗浄)。さらに、DCM 2mLを加えアスピレーターで取り除く操作を4回繰り返した。反応カラムをデシケーターに入れ、真空ポンプで1時間乾燥させた。サンプルが十分乾燥したら4℃で保存した。
【０１１９】
（B)  アミノ酸導入率の定量
(A)で導入したFmoc-Lys(N3)-NH-SAL樹脂20mgをサンプル管に正確に秤量し、20%(v/v)PIP/DMFを2mL加え、室温で20分間反応させた。この上清をDMFで50倍希釈し、301nmの吸光度を測定した。ブランクの測定にはDMFを使い、Fmoc基の301nmにおけるモル吸光係数ε=7800より、以下の式からアミノ酸の導入率を計算した。
【０１２０】
アミノ酸導入率(mol/g)
= (A301、1/50 - A301、DMF)× 50/7800 × (2×10-3) × (1000/20)
= (0.644 - 0) × 0.641 × 10-3
= 0.413 mmol/g
【０１２１】
上記の(A)で作製したFmoc-Lys(N3)-NH-SAL樹脂のアミノ酸導入率を定量した結果、0.413mmol/gの導入率となった。
【０１２２】
（C)  ペプチドの伸長
PD-10 empty columns(17-0435-01、Amersham Biosciences)にFmoc-Lys(N3)-NH-SAL樹脂242mg(0.05mmol)を投入し、以下の(C-1)〜(C-4)の操作によってペプチドの伸長反応を行った(ペプチドが0.1mmolになる樹脂量を使った)。
【０１２３】
(C-1)  Fmoc基の脱保護
第一アミノ酸が導入された樹脂を121mg(0.05mmol)反応カラムに量り取った。反応カラムにDMF 2mLを加え、軽く振とうした後、アスピレーターでカラム下部からDMFを取り除いた。反応カラムにDMF 2mLを注いでアスピレーターで除く操作を4回繰り返した。反応カラムに20%(v/v)PIP/DMFを2mL注ぎ、1分後、アスピレーターで取り除いた。次に20%(v/v)PIP/DMFを2mL注ぎ、15分間振とうし、取り除いた。その後、DMF 2mLを注いでアスピレーターで除く操作を5回繰り返して樹脂を洗浄した。
【０１２４】
(C-2)  カップリング
反応カラムにFmoc-AA-OH(各0.3mmol)、PyBOP 157mg(0.3mmol)、DMF 2mL、DIEA 0.11mL(0.6mmol)を加え、40分間振とうした。アミノ酸はC末端側からリシン(Lys)→アルギニン(Arg)→プロリン(Pro)→ロイシン(Leu)→アルギニン(Arg)→アラニン(Ala)の順に導入した。40分後、アスピレーターで反応溶液を除き、反応カラムにDMF 2mLを注いで軽く振とうした後アスピレーターで除く操作を4回繰り返した。使用したアミノ酸を表１に示す。
【０１２５】
【表１】
0006655245.tif 000002
【０１２６】
(C-3)  カイザー試験
カイザー試験のための試薬(コード番号2590077、国産化学)を用いてカップリング反応を終えているかの判断を行った。樹脂をスパチュラで1mg程度取り、ミクロチューブに入れて試薬(1)ニンヒドリン/エタノール、(2)フェノール/エタノール、(3)KCN/ピリジンを各10μLずつ加えて蓋をし、ドライヤーで1分程加熱した。樹脂や溶液の色が青くなると未反応のアミノ基が残っていることになるため、同じアミノ酸でもう一度カップリング反応を行った。無色や黄色になった場合は反応終了と判断し、すべてのアミノ酸がカップリングするまで、上記の(C-1)〜(C-3)の操作を繰り返した。
【０１２７】
(C-4)  脱保護
すべての伸長反応後、PD-10カラムに20%PIP/DMFを2mL注ぎ、スパチュラで軽く撹拌した後アスピレーターで20%PIP/DMFを取り除き、20%PIP/DMFを2mL注いで15分間振とうした後に取り除くことでFmoc基の脱保護を行った。そしてDMF 2mLを注いでアスピレーターで除く操作を5回、t-ブチルメチルエーテルを注いでアスピレーターで除く操作を2回繰り返した後にアルミホイルとパラフィルムでPD-10カラムを覆い、3時間真空乾燥させた。
【０１２８】
（D)  切り出し(樹脂からのクリーベイジ及び脱保護)
合成した樹脂からペプチドを切り出すためにカクテル溶液を表２の組成で調製し、切り出しを行った。アジド基がチオールの還元作用によって分解されやすいため、チオールを含まない組成のカクテル溶液を用いた（P. E. Schneggenburgerら, J. Pept. Sci., 16, 10-14 (2010)参照）。
【０１２９】
上記のカクテル溶液1mLをペプチドの入った反応容器に入れ、アジド基の熱、光による分解を防ぐために氷上、遮光の条件で2時間放置した(通常は遮光せずに室温で8時間放置する)。2時間後、反応容器の蓋を外し、容器の上部口から加圧して反応容器の中身を15mL遠沈管に落とし、TFA 200μLで2回共洗いした。冷ジエチルエーテル(過酸化物フリー)を2mL加え、沈殿ができることを確認した後10mLまでメスアップし、ボルテックスで撹拌した。続いて3500rpm、1分遠心後、上清を取り除いて再び冷ジエチルエーテルで10mLまでメスアップした。この操作を繰り返し、計5回行った。遠沈管に残ったペプチドのペレットにN2ガスを吹きつけて冷ジエチルエーテルを揮発させた(粗ペプチド)。
【０１３０】
【表２】
0006655245.tif 000003
【０１３１】
（E)  高速液体クロマトグラフィー(HPLC)
15mL遠沈管に残っている粗ペプチド粉末にAN(アセトニトリル)300μLとMilliQ 100μLを加え、完全に溶解させた(75%アセトニトリル400μL)。シリンジと0.45μmフィルター(Millex-LH、4mm、code SLLH H04 NL、Millipore)を接続して不溶物を除去し、1.5mLチューブに回収した。再度、遠沈管に75%アセトニトリル400μLを加えて共洗いし、別の1.5mLチューブに回収した。
【０１３２】
HPLCにはODS-3カラム((i)φ4.6×250mm、(ii)φ20×250mm、GLサイエンス)を用い、流速は(i)では1mL/分、(ii)では10mL/分とした。ペプチド溶液(共洗い溶液)を20μLインジェクトし、(i)のカラムを用いて決定した溶出条件を以下に示した。この際、30秒毎にフラクションを回収しマトリックス支援レーザー脱離イオン化法飛行時間型質量分析(MALDI-TOF MS)を用いて分析を行った。
【０１３３】
溶媒：A…0.1%TFA/H2O    B…0.1%TFA/AN
勾配：B conc. 20% (10分) + B conc. 20→60% (20分) + B conc. 100% (10分)
波長：220 nm
【０１３４】
決定した溶出条件で、(ii)のカラムを用いてペプチド溶液をHPLCにかけ、ピークを含むフラクションを15秒毎に回収し、MALDI-TOF MSを用いて目的のペプチドを含むものを分取し、凍結乾燥させて生成物を単離した。
【０１３５】
（F)  MALDI-TOF MS
MALDI-TOF MSは、Ultraflex(商標)(Bruker Daltonics)を用いて測定した。レーザー光源としてN2レーザー(337nm)を用いた。マトリックスにはα-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸(α-CHCA、Sigma)を用いた。α-CHCAは10mg/mLの割合で0.1%TFA/AN(3:2、v/v)に懸濁させ超音波照射した後、遠心分離しこの上清を用いた。キャリブレーションにはペプチドキャリブレーション標準(コード番号206195、Bruker)をプロトコールに従って希釈したものを用いた。
【０１３６】
α-CHCA溶液4μLとHPLC後のフラクション溶液各2μLを2mLチューブに入れてピペッティングし、MALDIプレート上に2μL置いて風乾させた。キャリブレーションサンプルも同様に行った。Ultraflex(商標)では、リフレクトロンモードを使用しポジティブイオンモードで測定した。
【０１３７】
合成した2分岐型ペプチドデンドリマー(Lot. 140607)はHPLC及びMALDI-TOF MSにて確認した。HPLCの分析結果は20〜25分の間にシャープなシングルピークが検出され、目的物が98%以上の高い純度であることが確認できた。また、MALDI-TOF MSでの分析結果では計算値との誤差が0.1%以下であり、目的物であることが確認できた(Exact Mass：1486.94、計算[M+H]+1487.95、測定[M+H]+1487.95；計算[M+Na]+1509.84、測定[M+Na]+1509.98)。このペプチドの収量は7.7mg、収率は10.8%、純度は>98%であった。以上の結果より、目的のアジド基導入ペプチドデンドリマーが得られたと判断した。
【０１３８】
リンカー分子TIPS-Eth-Ar-N2+BF4-の合成
ダイヤモンド電極へのアルキニル基の提示に用いるリンカー分子TIPS-Eth-Ar-N2+BF4-(4-((トリイソプロピルシリル)エチニル)ベンゼンジアゾニウムテトラフルオロホウ酸)を合成する。まずそのがしらカップリングにより末端アルキンとハロゲン化アリールとをクロスカップリングさせてアルキニル化アリール（芳香族アセチレン）を得る（S. Anderson, Chem. Eur. J. 7, 4706-4714 (2001)参照）。触媒にはパラジウム、銅、塩基を用いた。さらに電解グラフトを行うためにアミノ基をジアゾニウム化した。
【０１３９】
実験方法
（A）そのがしらカップリングによるTIPS-Eth-Ar-NH2の合成
【化１】
0006655245.tif 000004
【０１４０】
三口フラスコ内の水分をヒートガンで蒸発させ、真空引きした後にアルゴン(Ar)で満たした。4-ヨードアニリン1.0g(4.57mmol)、トリエチルアミン10mL(71.7mmol、d=0.726g/cm3)を加えた。真空引きとAr充填をそれぞれ3回繰り返して脱気を行った後、Arを循環させながらヨウ化銅8.9mg(0.05mmol)、酢酸パラジウム20.3mg(0.09mmol)、トリフェニルホスフィン50.6mg(0.19mmol)の順にそれぞれ量り取って三口フラスコに加えた。さらにトリイソプロピルシリルアセチレン1.2mL(5.35mmol、d=0.813g/cm3)を加え、Arを充填して一晩撹拌しながら室温で反応させた。使用した試薬を表３に示す。
【０１４１】
【表３】
0006655245.tif 000005
【０１４２】
セライトろ過
桐山ロートにろ紙を置き、セライトをロートに敷き詰め、ポンプで吸引しながらヘキサンをなじませた。フラスコ内の反応液をろ過し、ヘキサンで洗いこんだ。壁面について取れない反応固体は超音波処理にかけてヘキサンに溶解又は懸濁させ、ろ過した。ろ液の入ったナスフラスコをエバポレーターにかけ、ろ液を濃縮した(約2mL)。
【０１４３】
シリカゲルカラムクロマトグラフィー
展開溶媒はヘキサン：酢酸エチル＝10：1を用いた。シリカ(Silica gel 60、Merck)75ccを展開溶媒に分散させ、カラムに充填した。濃縮したろ液を海砂の上に静かに均一に加え、コックを開けて試験管で回収した。
【０１４４】
薄層クロマトグラフィー(TLC)
試験管に回収した画分のTLCを行った。展開溶媒にはジクロロメタン：ヘキサン＝1：1を使用した。TLC板(TLCシリカゲル60 F254、(105714、Merck Millipore))に原料であるヨードアニリン(Rf=0.29)をジクロロメタンに溶かした溶液、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを行う前の溶液をそれぞれスポットし、展開後UV照射して確認した。次に試験管の溶液を順にTLC板にスポットして展開し、反応物(Rf=0.39)が確認できた範囲の試験管試料をナスフラスコに集めてエバポレーターで濃縮した(約2mL)。濃縮した反応液(TIPS-Eth-Ar-NH2)の入ったナスフラスコをポンプで減圧し1時間真空乾燥させた。収量を測定した後、1H-NMR測定を行った。
【０１４５】
（B）ジアゾニウム化によるTIPS-Eth-Ar-N2+BF4-の合成
【化２】
0006655245.tif 000006
【０１４６】
TIPS-Eth-Ar-NH2のジアゾニウム化によるTIPS-Eth-Ar-NH2+BF4-の合成スキーム
あらかじめNaNO2 0.4g(6.0mmol)を2mLのH2Oに溶かし、4℃で冷蔵しておいた。(A)で得られたTIPS-Eth-Ar-NH2(1.1g、4.0mmol)が入ったナスフラスコをメタノール(MeOH)と液体窒素の入った浴槽に入れ、フラスコ内の温度が−5℃に下がるまで冷やした。ここにH2O 4mLを加え、分散するまでスターラーでよく混ぜた後、HBF4 3.36mL(16mmol、d=1.4g/cm3)
を加えた。あらかじめ冷やしておいたNaNO2水溶液2mLを、フラスコ内の温度を−5〜−10
℃に保ったまま数滴ずつ加えた。−5℃で20分撹拌した後、室温に戻して20分撹拌した。
使用した試薬を表４に示す。
【０１４７】
【表４】
0006655245.tif 000007
【０１４８】
吸引ろ過
NaBF4 4mg(36.4nmol)を80mLのH2Oに溶かし、5%NaBF4水溶液を調製した。洗浄溶液として用いる5%NaBF4水溶液、MeOH、ジエチルエーテル、H2Oはあらかじめ4℃で冷やしておいた。桐山ロートにろ紙を置き、吸引しながらH2Oでろ紙をなじませた。反応液をすべてろ過し、H2Oで洗浄した。5%NaBF4溶液、次いでMeOH、ジエチルエーテルの順に洗浄を行い、残りの反応物は超音波処理で回収した。ろ紙上の粉末を減圧したデシケーター内で1時間乾燥させた後、収量を測定した。
【０１４９】
生成物の収量と収率、1H-NMRによる解析結果を下記に示す。
（A)  TIPS-Eth-Ar-NH2
収量:1.01g(4.0mmol、Lot. 140801)
収率:87%
1H-NMR(400MHz、CDCl3、TMS)：δ(ppm)=7.28(2H、d)、6.58 (2H、d)、3.78(2H、s)、1.11(2H、s)
【０１５０】
【化３】
0006655245.tif 000008
【０１５１】
【表５】
0006655245.tif 000009
【０１５２】
（B)  TIPS-Eth-Ar-N2＋BF4−
収量:0.11g(0.32mmol、Lot. 140826)
収率:8%
1H-NMR(400MHz、CDCl3、TMS)：δ(ppm)=8.58(2H、d)、7.79(2H、d)、1.11(2H、s)
【０１５３】
【化４】
0006655245.tif 000010
【０１５４】
【表６】
0006655245.tif 000011
【０１５５】
以上の1H-NMR解析から、TIPS-Eth-Ar-NH2に関し、各ピークのプロトン比が一致したことから、目的の化合物を合成することができた。またTIPS-Eth-Ar-N2+BF4-に関し、アミノ基由来の3.77ppmのピークが消失しており、他の各ピークのプロトン比が一致していたことから、同様に目的化合物の合成を確認できた。
【０１５６】
２．  ホウ素ドープダイヤモンド（BDD）電極の作製
簡単に説明すると、マイクロ波プラズマを用いた化学蒸着によりSi基板へダイヤモンド膜を合成した。炭素源としてメタンを使用し、ホウ素源としてトリメチルボランを使用した。ドープするトリメチルボランの原料に占める濃度は0.3％w/wであった。表面形態は走査型電子顕微鏡を用いて特徴付けした。薄膜の品質はラマン分光法により確認した。このようにして作製したBDD電極を用いた。以下に、具体的に説明する。
【０１５７】
気相合成法による導電性ダイヤモンド薄膜の作製
（A)  Si基板の前処理
ダイヤモンド粉末が入ったシャーレにSi基板(直径5cm、厚み1mm)の鏡面が下向きになるように配置し、20分間Si基板を手で回転させて基板表面に傷をつけた。その後、Si基板を2-プロパノールの入ったビーカーに浸し、20分間超音波照射し洗浄した。最後にN2ガスで溶媒を揮発させ乾燥させた。
【０１５８】
（B)  Si基板上へのダイヤモンド膜の合成
マイクロ波プラズマを用いた化学的蒸着(CVD法、化学気相合成法)によるSi基板へのダイヤモンド膜の合成は、Plasma Deposition System(AX6500、セキテクノトロン株式会社)を用いて行った。原料気体にはメタン、トリメチルボラン、水素、酸素の4種類を用いた。ホウ素の仕込み濃度が0.3%w/wとなるように設定し、5時間反応させた。合成条件を表７に示す。
【０１５９】
【表７】
0006655245.tif 000012
【０１６０】
ラマン分光法
532nm用共焦点ラマン光学顕微鏡(ST-BX51、セキテクノトロン株式会社)を用いて、成膜後の基板表面の化学結合状態を分析した。キャリブレーションにはナフタレンを用い、レーザー光を5秒間、5回照射させた。膜が均一に形成されていることを確認するため、ダイヤモンド電極上の任意の9箇所について分析を行った。
【０１６１】
その結果、520cm-1付近ではホウ素‐ホウ素結合のピークが見られた。また1333cm-1付近ではsp3構造の炭素のラマンピークが観測された。一方、1560cm-1付近ではsp2構造の炭素のラマンピークが見られなかった。このことから純度の高いダイヤモンド膜が均一に合成されていると判断した。
【０１６２】
SEM観察
走査型電子顕微鏡FE-SEM(JSM-7600F、日本電子株式会社)を用いて、ダイヤモンド膜の表面及び断面形状を測定した。超純水、エタノール、アセトンでそれぞれ5分ずつ超音波洗浄したダイヤモンド電極(Lot. 140530)を0.5cm四方に切断し、シリコングリース(信越化学工業)で試料台に固定した。加速電圧は表面観察では5.0kV、断面観察では2.0kVに設定して観察した。SEM観察により、多結晶BDDの合成を確認できた。
【０１６３】
３．  ホウ素ドープダイヤモンド（BDD）の修飾
以下に、電解グラフトによるアルキニル基の提示のスキームを示す。
【０１６４】
【化５】
0006655245.tif 000013
【０１６５】
（A)  電極、溶液の準備
セル、Oリング、Pt線、ダイヤモンド電極をH2O、次いでエタノール(EtOH)、次いでアセトンの順に5分ずつ超音波処理した。まずメスフラスコにTBA・PF6を3.87g(0.01mol)量りとり、アセトニトリル(AN)を加えて100mMテトラブチルアンモニウムヘキサフルオロリン酸(TBAPF6)溶液を作製した。まずHA-ペプチドを相互作用させ、次いでCV測定を行った。CV測定には三電極法(作用電極:ダイヤモンド電極、対電極:Pt、参照電極:Ag/AgCl)を用いた。
【０１６６】
（B)  リンカー分子とダイヤモンド電極の反応(電解グラフト)
メスフラスコにTIPS-Eth-Ar-N2+BF4-を18.6mg(0.05mol)量りとり、電解液TBAPF6/AN 5mL(100mM)に溶かして10mM TIPS-Eth-Ar-N2+BF4-溶液を作製した。この全量をセルに入れた。制御PCでは表８のように設定して、-0.7〜+0.6Vで5回サイクリックボルタンメトリー(電解グラフト)を行った。
【０１６７】
【表８】
0006655245.tif 000014
【０１６８】
（C)  トリイソプロピルシリル(TIPS)基の脱保護
測定終了後、まずセルにTHF 9.5mLを入れ、その後にTBAFのTHF溶液(1mol/L)0.5mLを入れ、20分静置してTIPS基を脱保護した（Y. R. Lerouxら, J. Am. Chem. Soc., 132, 14039-14041 (2010)参照）。
【０１６９】
アジド基導入ペプチドの固定化
ペプチド濃度0.1nMの反応溶液を調製した。アルキニル基提示ダイヤモンド電極をMilliQ、EtOH、アセトンでそれぞれ5分ずつ超音波処理した。表９の組成でペプチド濃度が0.1mMとなるように反応溶液を調製し(ペプチド仕込み量100倍)、さらにそれをMeOH: H2O=1:1で0.1nMに希釈した反応溶液を調製した(ペプチド仕込み量0.01倍)。
【０１７０】
それぞれの反応溶液にダイヤモンド電極を浸し、室温で24時間振とうしながら反応させた。24時間後に反応溶液を取り除き、MilliQ、EtOH、アセトンでそれぞれ数秒ずつ超音波処理した。N2ガスを吹き付けて電極を乾燥させ、シリカゲルの入った密閉容器に入れて4℃で保存した。
【０１７１】
【表９】
0006655245.tif 000015
【０１７２】
反応後の電極は1mM K3[Fe(CN)6]/Na2SO4水溶液を調製して、各電極でサイクリックボルタンメトリー(CV)測定を3サイクルずつ行って表面状態を確認した。さらにHAやIFVの溶媒であるPBSでもCV測定を3サイクルずつ行い、バックグラウンドの変化を確認した。加えてこれらの電極で接触角を観察し、表面の濡れ特性を調べた。
【０１７３】
４．  ホウ素ドープダイヤモンド(BDD)電極を用いたヘマグルチニンタンパク質（HA）及びインフルエンザウイルス（IFV）の検出
サイクリックボルタンメトリー（CV）測定法
未修飾及びペプチド修飾BDD電極を用いたHAタンパク質の測定
まずHA-ペプチドを相互作用させ、次いでCV測定を行った。三電極法(作用電極:ダイヤモンド電極、対電極:Pt、参照電極:Ag/AgCl)を用いた。H1HAとの相互作用は15分行い、測定はPBS溶液中で行った。
【０１７４】
まずペプチド固定化電極(ペプチド仕込み量×0.01)でセルを組み、PBSでバックグラウンドを3サイクル測定した。その後、セル内に500nM HA/PBSを約60μL加えて電極部分が浸るように調節し、30分間相互作用させた。30分後、HA溶液を取り除いてPBSで3回洗い流し、PBSをセルに満たしてサイクリックボルタンメトリー測定を3サイクル行った。これら操作を電極上の場所を変えてもう一度行い、合計2箇所で相互作用を観測した。測定条件は下記表のものを用いた。
【０１７５】
上記と同様にしてPBSで希釈した50〜500nMのHA溶液をそれぞれ30分ずつ相互作用させた。薄い濃度から順に相互作用させ、濃度を変える前にPBSで電極を洗浄しながら3サイクルずつCV測定を行った。測定条件は表１０のとおりであった。
【０１７６】
【表１０】
0006655245.tif 000016
【０１７７】
結果を図２０に示す。図２０左はペプチド修飾されていないダイヤモンド電極を用いた場合の、溶液中のHA測定である。500nMのHA溶液では電流密度増大が観察された。図２０右はペプチド修飾されたダイヤモンド電極を用いた場合である。1サイクル目で未修飾ダイヤモンド電極よりも顕著な電流密度増大が観察され、HAを検出することができた。2サイクル目以降では電流密度がPBSのみの場合とさほど変わらず、1サイクル目でHAタンパク質のほとんどを検出できていることが分かる。
【０１７８】
未修飾及びペプチド修飾BDD電極を用いたIFVの測定
ペプチド固定化電極(ペプチド仕込み量×0.01)でセルを組み、3箇所でPBSによるバックグラウンドを3サイクル測定した。その後、200pfu/mLのウイルス溶液を1mL(200pfu)加えて電極部分が浸るように調節し、15分間相互作用させた。15分後、ウイルス溶液を取り除いてPBSで3回洗い流し、PBSをセルに満たして3箇所でサイクリックボルタンメトリー測定をそれぞれ3サイクルずつ行った。
【０１７９】
結果を図２１に示す。図２１左はペプチド修飾されていないダイヤモンド電極を用いた場合の、溶液中のIFV測定である。200pfuのIFV溶液では電流密度増大が観察された。図２１右はペプチド修飾されたダイヤモンド電極を用いた結果であり、未修飾ダイヤモンド電極よりも顕著な電流密度増大が観察され、IFVを検出することができた。このようにIFVを高感度に検出することができた。
【０１８０】
電気化学インピーダンス(EIS)測定法
ペプチド修飾BDD電極を用いたEIS測定によるHA及びIFV検出
インピーダンス測定の条件はS. K. Aryaら, Sens. Actuators, B, 194, 127-133 (2014)に基づいて行った。
【０１８１】
まず酸化還元物質の溶液を調製した。K3[Fe(CN)6] 0.164g(0.5mmol)、K4[Fe(CN)6] 0.211g(0.5mmol)をそれぞれメスフラスコに別々に量り取り、PBS 50mLに溶かして10mM K3[Fe(CN)6]/PBS及び10mM K4[Fe(CN)6]/PBSを調製した。これらを1:1(v/v)で混合し5mM [Fe(CN)6]3-/4-/PBSとした。
【０１８２】
次に制御PCを表１１のように設定した。初期電位(E Start)には作用電極・対電極・参照電極をそれぞれ取り付けた時にすでに発生している電位(自然電位)を用いるため、制御PCに表示される値を確認しながら随時入力した。サンプリング数(Frequency)、周波数領域(Frequency Scan)、振幅(Amplitude)などはS. K. Aryaら, Sens. Actuators, B, 194, 127-133 (2014)より決定した。
【０１８３】
【表１１】
0006655245.tif 000017
【０１８４】
CV測定と同様に三電極法(作用電極:導電性ダイヤモンド電極、対電極:Pt、参照電極:Ag/AgCl)を用い、各濃度のHA溶液を相互作用させた。まずペプチド固定化電極(ペプチド仕込み量×100)でセルを組み5mM [Fe(CN)6]3-/4-/PBSを加え、バックグラウンドを3サイクル測定した。その後PBSでセル内に、PBS(-)で希釈したHA溶液を約60μL加えて電極部分が浸るように調節し、15分間相互作用させた。15分後、溶液を取り除いてPBSで3回洗い流し、5mM [Fe(CN)6]3-/4-/PBSをセルに満たして3サイクル測定した。この操作をHA溶液(5〜500nM、それぞれ1〜100μg/mL)、IFV溶液(1〜140pfu)、ウシ血清アルブミン(BSA)溶液(5〜500nM)でそれぞれ行った。
【０１８５】
導電性ダイヤモンド電極を用いたHAのEIS測定結果を図２２及び図２３に示す。HAを特異的に検出できた。図２３では、無関係のタンパク質BSA（対照）については濃度と応答との間に相関性が見られなかったのに対し、HAについての応答は濃度に良好に比例した。これらの結果からHAを高感度かつ特異的に検出できた。
【０１８６】
導電性ダイヤモンド電極を用いたIFVのEIS測定結果を図２４に示す。40pfu以下でRctが線形に増加し、IFVを濃度依存的に検出できた。また0〜40pfuという少ないウイルス量の領域でも高感度に検出できた。
【０１８７】
以上より、タンパク質又は病原体を認識する素子が表面に固定化された導電性ダイヤモンド電極を用いて20pfuのインフルエンザウイルスを検出することができた。アルブミンのような生体に存在するタンパク質の非特異的な結合は見られず、従来法で必須となっている増感剤標識抗体を用いることなく、高感度な検出が可能であった。
【０１８８】
本発明のカートリッジは、このようなタンパク質又は病原体を認識する素子が表面に固定化された導電性ダイヤモンド電極を備えている。また本発明の装置は、該カートリッジを備えており、電気化学的測定によりタンパク質又は病原体を検出することができる。
【符号の説明】
【０１８９】
１００  カートリッジ
１０１  作用電極
１０２  対電極
１０３  参照電極
１０４  支持電解質溶液
１０５  容器
１０６  対電極挿入口
１０７  参照電極の金属電極挿入口
１１０  導電性ダイヤモンド電極
１１１  外気導入口
１１２  導入フィルター
１１３  外気導入側の通気口
１２０  気泡発生フィルター
１２１  気泡
１２３  参照電極の液絡部
１２４  内部電解質溶液
１２５  内部電解質溶液を保持するための部材
１３０  液面
１４０  外気導入口側の作用電極
１４５  外気導出口側の作用電極
１５０  外気導出側の通気口
１５５  外気導出口
２００  液面上下動機構を備えたカートリッジ
２０１  液面上下動機構
２０２  液面上下動機構用の空気導入口
２３０  液面
２４０  外気導入口側の作用電極
２４５  外気導出口側の作用電極
３００  検出部
３０１  作用電極の素子が固定化されている表面
４０１  記憶再生可能な素子
４０２  基板
４０３  配線
５００  本発明のカートリッジ１００を備えた装置
５０１  電気化学測定回路
５０５  外気吸気口
５０６  外気吸入ポンプ
５０７  外気排気口
５０８  外気フィルター
５０９  排気パイプ
５１０  制御回路
５２０  データ表示回路
５３０  通信回路
５４０  データ記録再生回路
５５０  電源回路
５６０  切り替えスイッチ
６００  カートリッジ１００及び外気タンクを備えた装置
６１０  外気タンク
６２０  循環ポンプ
６３０  外気タンク排気バルブ
７００  カートリッジ２００、外気タンク、及び液面上下動機構を備えた装置
７０１  液面上下動機構用のポンプ
７０２  ７０１のポンプのための吸気口
７０３  ７０１のポンプのための排気口
【図１】
0006655245.tif 000018
【図２】
0006655245.tif 000019
【図３】
0006655245.tif 000020
【図４】
0006655245.tif 000021
【図５】
0006655245.tif 000022
【図６】
0006655245.tif 000023
【図７】
0006655245.tif 000024
【図８】
0006655245.tif 000025
【図９】
0006655245.tif 000026
【図１０】
0006655245.tif 000027
【図１１】
0006655245.tif 000028
【図１２】
0006655245.tif 000029
【図１３】
0006655245.tif 000030
【図１４】
0006655245.tif 000031
【図１５】
0006655245.tif 000032
【図１６】
0006655245.tif 000033
【図１７】
0006655245.tif 000034
【図１８】
0006655245.tif 000035
【図１９】
0006655245.tif 000036
【図２０】
0006655245.tif 000037
【図２１】
0006655245.tif 000038
【図２２】
0006655245.tif 000039
【図２３】
0006655245.tif 000040
【図２４】
0006655245.tif 000041
【配列表】
0006655245000001.app