(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（Ｂ）：
【化３】
0006785801.tif 000037
［式中、Ｘ＝ＮＨ、又はＮＲであり、ここにおいて、Ｒは、Ｈ又は低級アルキルであり；式中、Ｒ２＝Ｈ、アシル、又は開裂可能なＳＲ５であり、ここにおいて、Ｒ５＝葉酸、メトトレキセート、サイトカイン、ペプチド、炭水化物、又は同一物のもう一つの分子（即ち、ホモダイマーをもたらす）である］
の化合物；或いはその医薬的に受容可能な塩、溶媒和物、クラスレート、又は立体異性体。
【請求項２】
以下の式（Ｃ）：
【化４】
0006785801.tif 000038
［式中、Ｘ＝ＮＨ、又はＮＲであり、ここにおいて、Ｒは、Ｈ又は低級アルキルであり；式中、Ｒ２＝Ｈ、アシル、又は開裂可能なＳＲ５であり、ここにおいて、Ｒ５＝葉酸、メトトレキセート、サイトカイン、ペプチド、炭水化物、又は同一物のもう一つの分子（即ち、ホモダイマーをもたらす）である］
の化合物；或いはその医薬的に受容可能な塩、溶媒和物、クラスレート、又は立体異性体。
【請求項３】
【化５】
0006785801.tif 000039
の構造を有する化合物；或いはその医薬的に受容可能な塩、溶媒和物、クラスレート、又は立体異性体。
【請求項４】
治療的に有効な量の請求項１−３のいずれか１項に記載の化合物を含んでなる、白血病、肺癌、大腸癌、中枢神経系の癌、腎臓癌、前立腺癌、又は乳癌の症候を患者において軽減するための医薬。
【請求項５】
前記症候が、白血病のものである、請求項４に記載の医薬。
【請求項６】
癌のための更なる形態の治療と組み合わせて用いる、請求項４に記載の医薬。
【請求項７】
治療的に有効な量の請求項１−３のいずれか１項に記載の化合物及び少なくとも一つの医薬的に受容可能な賦形剤を含んでなる、医薬組成物。
【請求項８】
放射線標識された請求項１−３のいずれか１項に記載の化合物を含んでなる、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府による支援下で行われる発明に対する権利の主張
[0001]本発明は、米国国立衛生研究所によって認可された認可番号Ｒ０１ＣＡ１５２３１４下の連邦政府の支援によって行われた。連邦政府は、本発明にある種の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
[0002]ラルガゾール(Ｌａｒｇａｚｏｌｅ)(１)は、Ｓｙｍｐｌｏｃａ菌種のシアノバクテリアから最近単離された高密度に感応化された大環状デプシペプチドである（Ｔａｏｒｉ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．２００８  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３０：１８０６−１８０７  ａｎｄ  １３５０６；Ｙｉｎｇ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．２００８  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３０）。この天然の産物は、多くの形質転換された及び形質転換されていないヒト並びにマウス由来の細胞系における、２ないし１０倍の差分の増殖阻害を伴う、例外的に強力な、そして選択的な生物学的活性を示す。癌細胞に対するこの薬剤の顕著な選択性は、作用のこのモードにおける特別な興味及び潜在的な癌の化学治療剤としてのその価値を助長する。
【０００３】
[0003]“１中の３−ヒドロキシ−７−メルカプトヘプタ−４−エン酸単位が、天然の産物中では前例がなかった”ことが以前に記述されている（Ｓｏｍｅｃｈ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｖ．３０：４６１−４７２；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｔ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．２００３  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４６：５０９７−５１１６；Ｍｏｒａｄｅｉ，Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．２００５  Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．；Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ａｇｅｎｔｓ  ５：５２９−５６０；Ｂｏｌｄｅｎ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．２００６  Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ５：７６９−７８４）。この主張とは対照的に、（Ｓ）−３−ヒドロキシ−７−メルカプトヘプタ−４−エン酸は、実際にＦＫ２２８（ＦＲ９０１２２８）（Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．０３−１４１２９６，Ｊｕｎｅ  １７，１９９１，Ｆｕｊｉｓａｗａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｊｐｎ．Ｋｏｋａｉ  Ｔｏｋｋｙｏ  Ｋｏｈｏ  ＪＰ，１９９１；Ｕｅｄａ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．１９９４；Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．４７：３０１−３１０；Ｓｈｉｇｅｍａｔｓｕ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．１９９４  Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．４７：３１１−３１４；Ｕｅｄａ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．１９９４  Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．４７：３１５−３２３）、ＦＲ９０１３７５（Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．０３−１４１２９６，Ｊｕｎｅ  １７，１９９１，Ｆｕｊｉｓａｗａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．，Ｊｐｎ．Ｋｏｋａｉ  Ｔｏｋｋｙｏ  Ｋｏｈｏ  ＪＰ；Ｕｅｄａ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．１９９４；Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．４７：３０１−３１０；Ｓｈｉｇｅｍａｔｓｕ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．１９９４  Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．４７：３１１−３１４；Ｕｅｄａ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．１９９４  Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．４７：３１５−３２３）及びスピルコスタチン（Ｍａｓｕｏｋａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．２００１  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．４２：４１−４４）（構造を以下に示す）を含む、幾つかの細胞毒性の天然の産物中の基本的モチーフであり、これらの全ては、既知のヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）である（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．２００７  Ｔｈｅ  ｂｉｃｙｃｌｉｃ  ｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｓ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｅｄｓ．Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．６９３−７２０）。
【０００４】
【化１】
0006785801.tif 000002
【０００５】
[0004]ヒストンデアセチラーゼ酵素は亜鉛金属酵素であり、これは、クロマチン中のアセチル化されたリシン残基の加水分解を触媒し、そしてこれによって、真核細胞中の転写を調節する（Ｓｏｍｅｃｈ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｖ．３０：４６１；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｔ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．２００３  Ｓ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４６：５０９７−５１１６；Ｍｏｒａｄｅｉ，Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．２００５  Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．；Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ａｇｅｎｔｓ  ５：５２９−５６０；Ｂｏｌｄｅｎ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．２００６  Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ５：７６９−７８４）。これらの選択的阻害は、最近、癌の化学療法の研究の主要な分野となりつつある（Ｍｉｎｕｃｃｉ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．２００６  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ６：３８−５１）。今日まで、１８種のＨＤＡＤが確認され、これらは、酵母対応物に対する配列の類似性に基づいて、一般的に四つのクラスに分割される（Ｔａｕｎｔｏｎ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．１９９６  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：４０８−４１１；Ｇｒｏｚｉｎｇｅｒ，Ｃ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．１９９９  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：４８６８−４８７３；Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ，Ｒ．Ｗ．２００２  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．１：２８７−２９９）。癌の療法に関しては、クラスＩのＨＤＡＣが、臨床的に適切であり、そして第１世代のＨＤＡＣ阻害剤に伴う好ましくない毒性は、クラスの無差別性に関連し得るという新興の共通認識がある。結果として、クラス及び更にアイソフォーム特異的阻害のための構造を最適化する目的を持つ、ペプチド及びデプシペプチド基剤のＨＤＡＣｉの合成及び改良を目標とするプログラムが開始されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平０３−１４１２９６号。
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｕｅｄａ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．１９９４；Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．４７：３０１−３１０；
【非特許文献２】Ｓｈｉｇｅｍａｔｓｕ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．１９９４  Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．４７：３１１−３１４；
【非特許文献３】Ｕｅｄａ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．１９９４  Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．４７：３１５−３２３；
【非特許文献４】Ｍａｓｕｏｋａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．２００１  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．４２：４１−４４；
【非特許文献５】Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．２００７  Ｔｈｅ  ｂｉｃｙｃｌｉｃ  ｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；
【非特許文献６】Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｓ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｅｄｓ．Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．６９３−７２０；
【非特許文献７】Ｓｏｍｅｃｈ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｖ．３０：４６１；
【非特許文献８】Ｍｉｌｌｅｒ，Ｔ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．２００３  Ｓ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４６：５０９７−５１１６；
【非特許文献９】Ｍｏｒａｄｅｉ，Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．２００５  Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．；Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ａｇｅｎｔｓ  ５：５２９−５６０；
【非特許文献１０】Ｂｏｌｄｅｎ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．２００６  Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ５：７６９−７８４；
【非特許文献１１】Ｍｉｎｕｃｃｉ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．２００６  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ６：３８−５１；
【非特許文献１２】Ｔａｕｎｔｏｎ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．１９９６  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：４０８−４１１；
【非特許文献１３】Ｇｒｏｚｉｎｇｅｒ，Ｃ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．１９９９  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：４８６８−４８７３；
【非特許文献１４】Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ，Ｒ．Ｗ．２００２  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．１：２８７−２９９。
【発明の概要】
【０００８】
[0005]本明細書中に記載されるものは、新しい組成の材料の系列の調製を可能にする、ラルガゾール構造のテンプレート中のチアゾール環の誘導体化であり、これは、更に例外的に強力なクラスＩのＨＤＡＣ阻害剤である。これらのラルガゾール類自体は、良好な選択性を伴う驚くべきＨＤＡＣ阻害を示す。これは、新しい“化学的空間”の位置がＨＤＡＣ活性部位の縁辺に位置するためであり、これは、結晶構造又は構造的活性の関係により新しい化合物を設計する機会を大きく拡大する。更に、重要な化学的プローブ、例えば光活性化架橋剤及びプルダウン実験のためのビオチンを含む、広い範囲の機能を、当該Ｃ（５）位置において加えることができる。
【０００９】
[0006]生物学的スクリーニングは、本明細書中に記載されるフェニル置換阻害剤が、ラルガゾールと等効力であることを示す。
[0007]一つの側面において、本発明は、以下の請求式（Ｉ）の化合物：
[0008]
【００１０】
【化２】
0006785801.tif 000003
【００１１】
[0009]  式中、Ｘ＝Ｏ、ＮＨ、又はＮＲであり、ここにおいて、Ｒは、Ｈ又は低級アルキルであり；
Ｙ＝Ｓ、Ｏ、ＮＨ、又はＮＲであり、ここにおいて、Ｒは、アルキル、アリール、アリールアルキル、置換されたアルキル、置換されたアリール、又は置換されたアリールアルキルであり；
Ｚ＝Ｓ、Ｏ、ＮＨ、又はＮＲであり、ここにおいて、Ｒは、アルキル、アリール、アリールアルキル、置換されたアルキル、置換されたアリール、又は置換されたアリールアルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、アリール、アリールアルキル、置換されたアルキル、置換されたアリール、又は置換されたアリールアルキルであり；
ここにおいて、Ｒ１が置換された置換基である場合、この置換基（即ち、アルキル、アリール、又はアリールアルキル）は、開裂可能な又は開裂不可能なＯＲ６、ＮＲ６、又はＳＲ６で置換され、ここにおいて、Ｒ６＝葉酸誘導体、ビオチン、サイトカイン（例えば、ＩＬ−３）、ペプチド、炭水化物（例えば、マンノース）、又は他の癌細胞表面標的化剤、或いは、ＳＲ６に対しては、同一物のもう一つの分子（即ち、ホモダイマーをもたらす）であり；
Ｒ２＝Ｈ、アシル、又は開裂可能なＳＲ５であり、ここにおいて、Ｒ５＝葉酸誘導体、サイトカイン（例えば、ＩＬ−３）、ペプチド、炭水化物（例えば、マンノース）、又は他の癌細胞表面標的化剤、或いは、同一物のもう一つの分子（即ち、ホモダイマーをもたらす）であり；
Ｒ３＝Ｈ、アルキル、アリール、アリールアルキル、置換されたアルキル、置換されたアリール、又は置換されたアリールアルキルであり；
Ｒ４＝アルキル又はアリールであり、イソ−プロピルが特に好ましい；
或いはその医薬的に受容可能な塩、溶媒和物、クラスレート、プロドラッグ、又は立体異性体を提供する。本明細書中に提供される化学化合物の構造において、更に定義される置換基、例えばＸ、Ｙ、Ｚ、Ｒ等は、規定された置換基から独立に選択される。
【００１２】
[0010]本明細書中に記載されるラルガゾール類似体は、これまで天然の産物それ自体から接近できなかった細胞特異的標的化剤及び他のプローブ分子を製造するために使用することができる、チアゾール環上の官能性を伴う最初のものである。他の既知のＨＤＡＣ阻害剤は、共役型プローブ、他の分子細胞毒性“弾頭”、及び／又は供給分子（先に記載したような標的化剤）に対する薬物の亜鉛結合アームから遠位の容易に連結可能な部位を持たない。ラルガゾール類似体骨格の標的化剤に対する連結は、細胞中で開裂可能であるか（例えば、ジスルフィド連結、エステル、アミド）又は容易に開裂可能ではないかのいずれかであることもできる。
【００１３】
[0011]一つの側面において、本発明は、以下の式（Ａ）の化合物：
【００１４】
【化３】
0006785801.tif 000004
【００１５】
[0012]  式中、Ｘ＝Ｏ、ＮＨ、又はＮＲであり、ここにおいて、Ｒは、Ｈ又は低級アルキルであり；式中、Ｒ２＝Ｈ、アシル、又は開裂可能なＳＲ５であり、ここにおいて、Ｒ５＝葉酸誘導体、サイトカイン（例えば、ＩＬ−３）、ペプチド、炭水化物（例えば、マンノース）、又は他の癌細胞表面標的化剤、或いは同一物のもう一つの分子（即ち、ホモダイマーをもたらす）である；
或いはその医薬的に受容可能な塩、溶媒和物、クラスレート、プロドラッグ、又は立体異性体を提供する。
【００１６】
[0013]もう一つの側面において、本発明は、以下の式（Ｂ）の化合物：
【００１７】
【化４】
0006785801.tif 000005
【００１８】
[0014]  式中、Ｘ＝Ｏ、ＮＨ、又はＮＲであり、ここにおいて、Ｒは、Ｈ又は低級アルキルであり；式中、Ｒ２＝Ｈ、アシル、又は開裂可能なＳＲ５であり、ここにおいて、Ｒ５＝葉酸誘導体、サイトカイン（例えば、ＩＬ−３）、ペプチド、炭水化物（例えば、マンノース）、又は他の癌細胞表面標的化剤、或いは同一物のもう一つの分子（即ち、ホモダイマーをもたらす）である；或いはその医薬的に受容可能な塩、溶媒和物、クラスレート、プロドラッグ、又は立体異性体を提供する。
【００１９】
[0015]もう一つの側面において、本発明は、以下の式（Ｃ）の化合物：
【００２０】
【化５】
0006785801.tif 000006
【００２１】
[0016]  式中、Ｘ＝Ｏ、ＮＨ、又はＮＲであり、ここにおいて、Ｒは、Ｈ又は低級アルキルであり；式中、Ｒ２＝Ｈ、アシル、又は開裂可能なＳＲ５であり、ここにおいて、Ｒ５＝葉酸誘導体、サイトカイン（例えば、ＩＬ−３）、ペプチド、炭水化物（例えば、マンノース）、又は他の癌細胞表面標的化剤、或いは同一物のもう一つの分子（即ち、ホモダイマーをもたらす）である；或いはその医薬的に受容可能な塩、溶媒和物、クラスレート、プロドラッグ、又は立体異性体を提供する。
【００２２】
[0017]もう一つの側面において、本発明は、以下の式（Ｄ）の化合物：
【００２３】
【化６】
0006785801.tif 000007
【００２４】
[0018]  式中、Ｘ＝Ｏ、ＮＨ、又はＮＲであり、ここにおいて、Ｒは、Ｈ又は低級アルキルであり；式中、Ｒ２＝Ｈ、アシル、又は開裂可能なＳＲ５であり、ここにおいて、Ｒ５＝葉酸誘導体、サイトカイン（例えば、ＩＬ−３）、ペプチド、炭水化物（例えば、マンノース）、又は他の癌細胞表面標的化剤、或いは同一物のもう一つの分子（即ち、ホモダイマーをもたらす）である；或いはその医薬的に受容可能な塩、溶媒和物、クラスレート、プロドラッグ、又は立体異性体を提供する。
【００２５】
[0019]一つの側面において、本発明は、治療的に有効な量の本明細書中に記載される化合物のいずれか一つを患者に投与することを含んでなる、患者の癌を治療するための方法を提供する。一つの態様において、この方法は、癌に対する更なる形態の療法で前記患者を治療することを更に含んでなる。もう一つの態様において、この方法は、化合物を得ることを更に含んでなる。なおもう一つの態様において、患者はヒトである。
【００２６】
[0020]もう一つの側面において、本発明は、治療的に有効な量の本明細書中に記載される化合物のいずれか一つを患者に投与することを含んでなる、患者の血液疾患を治療するための方法を提供する。一つの態様において、血液疾患は、ヘモグロビン異常症又はサラセミアの少なくとも一つである。もう一つの態様において、この方法は、前記血液疾患に対する更なる形態の療法で前記患者を治療することを更に含んでなる。なおもう一つの態様において、この方法は、化合物を得ることを更に含んでなる。なおもう一つの態様において、患者はヒトである。
【００２７】
[0021]一つの側面において、本発明は、患者の癌を治療するための、治療的に有効な量の本明細書中に記載される化合物のいずれか一つ、及び少なくとも一つの医薬的に受容可能な賦形剤を含んでなる医薬組成物を提供する。一つの態様において、患者はヒトである。
【００２８】
[0022]もう一つの側面において、本発明は、患者の血液疾患を治療するための、治療的に有効な量の本明細書中に記載される化合物のいずれか一つ、及び少なくとも一つの医薬的に受容可能な賦形剤を含んでなる医薬組成物を提供する。もう一つの態様において、血液疾患は、ヘモグロビン異常症又はサラセミアの少なくとも一つである。なおもう一つの態様において、患者はヒトである。
【００２９】
[0023]一つの側面において、本発明は、放射線標識された式（Ｉ）、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、又は（Ｄ）の化合物、或いはその医薬的に受容可能な塩、溶媒和物、クラスレート、プロドラッグ、又は立体異性体を含んでなる組成物を提供する。
【００３０】
[0024]一つの側面において、本発明は、治療的に有効な量の本明細書中に記載される化合物のいずれか一つを患者に投与することを含んでなる、患者の自己免疫性疾患を治療するための方法を提供する。一つの態様において、自己免疫性疾患は、関節リウマチ、ループス、多発性硬化症、及び炎症性大腸疾患から選択される。もう一つの態様において、この方法は、前記自己免疫性疾患に対する更なる形態の療法で前記患者を治療することを更に含んでなる。なおもう一つの態様において、この方法は、化合物を得ることを更に含んでなる。なおもう一つの態様において、患者はヒトである。
【００３１】
[0025]一つの側面において、本発明は、患者の自己免疫性疾患を治療するための、治療的に有効な量の本明細書中に記載される化合物のいずれか一つ、及び少なくとも一つの医薬的に受容可能な賦形剤を含んでなる医薬組成物を提供する。一つの態様において、自己免疫性疾患は、関節リウマチ、ループス、多発性硬化症、及び炎症性大腸疾患から選択される。もう一つの態様において、患者はヒトである。
【００３２】
[0026]一つの側面において、本発明は、治療的に有効な量の本明細書中に記載される化合物のいずれか一つを患者に投与することを含んでなる、患者のアルツハイマー病を治療するための方法を提供する。一つの態様において、この方法は、アルツハイマー病に対する更なる形態の療法で前記患者を治療することを更に含んでなる。なおもう一つの態様において、この方法は、化合物を得ることを更に含んでなる。なおもう一つの態様において、患者はヒトである。
【００３３】
[0027]一つの側面において、本発明は、患者のアルツハイマー病を治療するための、治療的に有効な量の本明細書中に記載される化合物のいずれか一つ、及び少なくとも一つの医薬的に受容可能な賦形剤を含んでなる医薬組成物を提供する。一つの態様において、患者はヒトである。
【００３４】
[0028]更なる側面において、本発明の化合物を患者に投与することを含んでなる、患者の癌を治療するための方法が提供される。
この方法は、癌に対する更なる形態の療法で前記患者を治療することを更に含んでなることができる。この方法は、化合物を得ることを更に含んでなることができる。患者は、ヒトであることができる。
【００３５】
[0029]なおもう一つの側面において、本発明の化合物を患者に投与することを含んでなる、患者の血液疾患を治療するための方法が提供される。血液疾患は、ヘモグロビン異常症又はサラセミアの少なくとも一つであることができる。この方法は、前記血液疾患に対する更なる形態の療法で前記患者を治療することを更に含んでなることができる。この方法は、化合物を得ることを更に含んでなることができる。患者は、ヒトであることができる。
【００３６】
[0030]なおもう一つの側面において、本発明の化合物を患者に投与することを含んでなる、患者の自己免疫性疾患を治療するための方法が提供される。この方法は、自己免疫性疾患に対する更なる形態の療法で患者を治療することを更に含んでなることができる。この方法は、化合物を得ることを更に含んでなることができる。患者は、ヒトであることができる。
【００３７】
[0031]なおもう一つの側面において、本発明の化合物を患者に投与することを含んでなる、患者のアルツハイマー病を治療するための方法が提供される。この方法は、アルツハイマー病に対する更なる形態の療法で前記患者を治療することを更に含んでなることができる。この方法は、化合物を得ることを更に含んでなることができる。患者は、ヒトであることができる。
【００３８】
[0032]なおもう一つの側面において、患者の癌を治療するための、本発明の化合物及び少なくとも一つの医薬的に受容可能な賦形剤を含んでなる医薬組成物が提供される。
[0033]なおもう一つの側面において、患者の血液疾患を治療するための、本発明の化合物及び少なくとも一つの医薬的に受容可能な賦形剤を含んでなる医薬組成物が提供される。血液疾患は、ヘモグロビン異常症又はサラセミアの少なくとも一つであることができる。
【００３９】
[0034]なおもう一つの態様において、患者の自己免疫性疾患を治療するための、本発明の化合物及び少なくとも一つの医薬的に受容可能な賦形剤を含んでなる医薬組成物が提供される。
【００４０】
[0035]なおもう一つの態様において、患者のアルツハイマー病を治療するための、本発明の化合物及び少なくとも一つの医薬的に受容可能な賦形剤を含んでなる医薬組成物が提供される。
【００４１】
[0036]本発明の他の側面は、以下の開示中に記載されるか、又はこれらから明白となるものであり、そして本発明の範囲内である。
図面の簡単な説明
[0037]例として与えられるが、しかし本発明を、記載される具体的態様に制約することを意図するものではない以下の本発明の詳細な記載は、付属する図面との関連で理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１Ａ】[0038]  図１Ａは、ラルガゾール−ビオチン５４の合成スキーム及び構造を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、遊離のラルガゾール−チオールに対して有利に比較される、ラルガゾール−ビオチンの生化学的選択性を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ラルガゾール−ビオチン（５４）によるＨＤＡＣ１、２及び３のアフィニティー沈殿を、免疫ブロットにより示す。２００μＬのＨｅＬａ核抽出物中の１μＭのラルガゾール−Ｂｔｎ（５４）に、（約２００μｇ）ｍｇのストレプトアビジンビーズを、化合物との１６時間のインキュベーション後に加えた。
【図２】[0039]  図２は、ＩＣ５０（ｎＭ）に関するラルガゾール類似体の生化学的分析の結果を提供する表を示す。
【図３Ａ】[0040]  図３Ａは、本発明人等によって合成された幾つかのラルガゾール類似体の一覧表を提供する。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本発明人等によって合成された幾つかのラルガゾール類似体の一覧表を提供する。
【図４】[0041]  図４は、化学的（ｉＴＲＡＱ）及び代謝的（ＳＩＬＡＣ）スクリーニングを使用する親和性富化法の模式的比較を示す。
【図５Ａ】[0042]  図５Ａは、ジスルフィド又はチオールエステルリンカーによる葉酸共役の第１の部分を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ジスルフィド又はチオールエステルリンカーによる葉酸共役の第２の部分を示す。
【図６】[0043]  図６は、キャップ基へのエステルリンカーによる葉酸共役を示す。
【図７Ａ】[0044]  図７Ａは、ＩＬ３共役に対するキャップ基戦略を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＩＬ３結合に対する亜鉛結合性アーム戦略を示す。
【図８−１】[0045]  図８Ａは、ＫＢＭ７細胞中の一倍体遺伝子スクリーニングの模式的概要を示す。図８Ｂは、Ｃｉｒｃｏｓプロットとしてのジーントラップ挿入の富化の結果を示す。少なくとも一つの挿入を伴うそれぞれの遺伝子は、円として描かれ、その位置は、染色体の位置に基づく。円のサイズは、その遺伝子対して位置付けられた挿入の数に相関している。Ｐ−値は、内部から外部へ減少する。一倍体遺伝子スクリーニングは、通常、非常にわずかしか得られないが、しかし非常に高い信頼度の候補遺伝子である。
【図８−２】図８Ｃは、ゲノム全体のＣＲＩＳＰＲスクリーニングの模式的概要を示す。図８Ｄは、ＣｉｒｃｏｓプロットとしてのＭＶ４；１１中のＤＯＴ１Ｌ阻害の富化の結果の模式的描写を示す。ライブラリー中に示されるそれぞれの遺伝子は、染色体の位置に基づく円として描写されている。円のサイズは、有意に富化された（ｐ＜０．００１）ｓｇＲＮＡの数と相関している。一定の遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡの富化に対するＰ−値は、ＲＩＧＥＲアルゴリズムを使用して計算される。
【図９】[0046]  図９は、Ｔ−ＡＬＬ細胞系中のＦＲ２の発現のウェスタンブロットを示す。
【図１０】[0047]  図１０Ａが模式的に描写するのは、オクタノイル化ラルガゾールペプチド葉酸（アミドリンカー）（ＨＲＭＳにより比較的純粋）Ｃ５５Ｈ６７Ｎ１３Ｏ９Ｓ３、分子量：１１５０．３９７２、ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨの混合物、又はＤＭＳＯ中に可溶。図１０Ｂが模式的に描写するのは、ラルガゾールチオールペプチド葉酸（アミドリンカー）、約１．０ｍｇ（粗製）Ｃ４７Ｈ５３Ｎ１３Ｏ８Ｓ３、分子量：１０２４．２０１０、ＤＭＳＯにのみ可溶。図１０Ｃが模式的に描写するのは、オクタノイル化ラルガゾールペプチド葉酸（エステルリンカー）、１．６ｍｇ（１Ｈ  ＮＭＲ、ＨＲＭＳにより純粋）Ｃ５５Ｈ６６Ｎ１２Ｏ１０Ｓ３、分子量：１１５１．３８１９、ＭｅＯＨ、ＣＨＣｌ３、ＤＭＳＯに可溶。
【図１１】[0048]  図１１は、ＮＯＴＣＨ１で変異されたＴ−ＡＬＬ細胞（ＤＮＤ４１）中の７２時間の処理後の細胞生存率に対する、オクタノイル化ラルガゾールペプチド葉酸（アミドリンカー）、ラルガゾールチオールペプチド葉酸（粗製）、オクタノイル化ラルガゾールペプチド葉酸（エステルリンカー）処理の影響を描写するグラフを示す。
【図１２】[0049]  図１２は、ＮＯＴＣＨ１で変異されたＴ−ＡＬＬ細胞（ＤＮＤ４１）中の１４４時間の処理後の細胞生存率に対する、オクタノイル化ラルガゾールペプチド葉酸（アミドリンカー）、ラルガゾールチオールペプチド葉酸（粗製）、オクタノイル化ラルガゾールペプチド葉酸（エステルリンカー）処理の影響を描写するグラフを示す。
【図１３】[0050]  図１３は、ＮＯＴＣＨ１で変異されたＴ−ＡＬＬ細胞（ＤＮＤ４１）中の２１６時間の処理後の細胞生存率に対する、オクタノイル化ラルガゾールペプチド葉酸（アミドリンカー）、ラルガゾールチオールペプチド葉酸（粗製）、オクタノイル化ラルガゾールペプチド葉酸（エステルリンカー）処理の影響を描写するグラフを示す。
【図１４】[0051]  図１４は、ＮＯＴＣＨ１で変異されたＴ−ＡＬＬ細胞（ＡＬＬ／ＳＩＬ）中の７２時間の処理後の細胞生存率に対する、オクタノイル化ラルガゾールペプチド葉酸（アミドリンカー）、ラルガゾールチオールペプチド葉酸（粗製）、オクタノイル化ラルガゾールペプチド葉酸（エステルリンカー）処理の影響を描写するグラフを示す。
【図１５】[0052]  図１５は、ＮＯＴＣＨ１で変異されたＴ−ＡＬＬ細胞（ＡＬＬ／ＳＩＬ）中の１４４時間の処理後の細胞生存率に対する、オクタノイル化ラルガゾールペプチド葉酸（アミドリンカー）、ラルガゾールチオールペプチド葉酸（粗製）、オクタノイル化ラルガゾールペプチド葉酸（エステルリンカー）処理の影響を描写するグラフを示す。
【図１６】[0053]  図１６は、ＮＯＴＣＨ１で変異されたＴ−ＡＬＬ細胞（ＡＬＬ／ＳＩＬ）中の２１６時間の処理後の細胞生存率に対する、オクタノイル化ラルガゾールペプチド葉酸（アミドリンカー）、ラルガゾールチオールペプチド葉酸（粗製）、オクタノイル化ラルガゾールペプチド葉酸（エステルリンカー）処理の影響を描写するグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
[0054]Ｉ．定義
[0055]本明細書中で使用する場合、用語“本発明の化合物（一つ又は複数）”及び同様な用語は、式（Ｉ）の化合物或いはその医薬的に受容可能な塩、溶媒和物、クラスレート、またはプロドラッグを指す。
【００４４】
[0056]式（Ｉ）の化合物において、点線に平行な1本の線の意味は、所望による二重結合を表す。存在する場合、二重結合は、ｃｉｓ−又はｔｒａｎｓ−配置のいずれかであることができる。
【００４５】
[0057]本明細書中で使用する場合、“低級アルキル”又は“低級アルキル部分”は、１−１２個の炭素原子を含有し、“低級アリール”又は“低級アリール部分”は、６−１２個の炭素原子を含有し、そして“低級アリールアルキル”又は“低級アリールアルキル部分”は、７−１２個の炭素原子を含有する。好ましい態様において、低級アルキルは、Ｃ１−７アルキルを、低級アリールは、Ｃ６−１０アリールを、そして低級アリールアルキルは、Ｃ７−１１アラルキルを指す。含まれるものは、低級アルキル鎖、アリール及びアリールアルキル部分の置換された誘導体であり、ここにおいて、置換基は、（制約されるものではないが）次の化学部分：−ＯＨ、−ＯＲ７、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ７、−ＣＯＮＨ２、−ＮＨ２、−ＮＨＲ７、−ＮＲ７Ｒ７、−ＳＨ、−ＳＲ７、−ＳＯ２Ｒ７、−ＳＯ２Ｈ、−ＳＯＲ７、−ＰＯ３Ｒ７、−ＯＰＯ３Ｒ７、及びハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩを含む）の一つ又はそれより多くから選択され、ここにおいて、Ｒ７のそれぞれの出現は、低級アルキル鎖、アリール及びアリールアルキル部分から独立に選択される。更に、本発明の環式低級アルキル鎖、アリール及びアリールアルキル部分は、ナフタレン、並びに複素環化合物、例えばチオフェン、ピロール、フラン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、３−ピロリン、ピロリジン、ピリジン、ピリミジン、プリン、キノリン、イソキノリン及びカルバゾールを含む。
【００４６】
[0058]本明細書中で使用する場合、用語“プロドラッグ”は、生物学的条件下で（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで）加水分解、酸化、又は他の方法で反応して、本発明の化合物を提供することができる化合物の誘導体を指す。プロドラッグは、生物学的条件下の幾つかの反応によってのみ活性となることができるが、しかしこれらは、その未反応の形態で活性を有することができる。本明細書中で意図するプロドラッグの例は、制約されるものではないが、本発明の化合物の類似体又は誘導体を含む。プロドラッグ部分の例は、置換された及び置換されていない、分枝の又は非分枝のアルキルエステル部分（例えば、プロピオン酸エステル）、低級アルケニルエステル、ジ−低級アルキル−アミノ低級アルキルエステル（例えば、ジメチルアミノエチルエステル）、アシルアミノ低級アルキルエステル（例えば、アセチルオキシメチルエステル）、アシルオキシ低級アルキルエステル（例えば、ピバロイルオキシメチルエステル）、アリールエステル（フェニルエステル）、アリール−低級アルキルエステル（例えば、ベンジルエステル）、置換された（例えば、メチル、ハロ、又はメトキシ置換基で）アリール及びアリール−低級アルキルエステル、アミド、低級アルキルアミド、ジ−低級アルキルアミド、及びヒドロキシアミドを含む。プロドラッグ及びその使用は、当技術において公知である（例えば、Ｂｅｒｇｅ，ｅｔ  ａｌ．１９７７  Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照されたい）。プロドラッグは、典型的には公知の方法、例えばＢｕｒｇｅｒ’ｓ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（１９９５，Ｍａｎｆｒｅｄ  Ｅ．Ｗｏｌｆｆ  ｅｄ．，５ｔｈ  ｅｄ．１７２−１７８，９３１−９３２）中に記載されているものを使用して調製することができる。
【００４７】
[0059]本発明の化合物の幾つかの構造が、不斉炭素原子を含み、そして従って、ラセミ混合物として、又は単離された異性体の形態で存在することができることは注目されるものである。従って、このような不斉から起こる異性体（例えば、全ての鏡像異性体及びジアステレオ異性体）が、他に示されない限り、本発明の範囲内に含まれることは理解されることである。このような異性体は、古典的な分離技術及び立体化学的に制御された合成によって実質的に純粋な形態で得ることができる。更に、本出願において考察される構造並びに他の化合物及び部分は、更にその全ての互変異性体を含む。
【００４８】
[0060]更に、式（Ｉ）の化合物の結晶質の形態の幾つかは、多形として存在することができ、これは本発明に含まれる。更に、式（Ｉ）の化合物の幾つかは、更に水又は他の有機溶媒と溶媒和物を形成することもできる。このような溶媒は、本発明の範囲内に同様に含まれる。
【００４９】
[0061]用語“治療すること”は、本明細書中で使用する場合、治療される患者の疾病の過程を変更することを指す。治療の治療効果は、制約されるものではないが、疾病の発症又は再発を予防すること、症候（一つまたは複数）の軽減、疾病の直接的又は間接的病理学的帰結の縮小、疾病の進行の速度の減少、疾病状態の回復又は緩和、及び寛解又は改善された予後を含む。
【００５０】
[0062]癌は、異常な細胞が制御されずに分裂し、そして他の組織に浸潤することが可能な疾病に対して使用される用語である。１００種より多い異なった種類の癌が存在する。殆どの癌は、これらが出発する器官又は細胞の種類に対して命名される−例えば、大腸で始まる癌は、大腸癌と呼ばれ；皮膚の基底細胞で始まる癌は、基底細胞癌と呼ばれる。癌の主要な分類は、細胞腫、肉腫、白血病、リンパ腫及び骨髄腫、並びに中枢神経系の癌を含む。幾つかの普通の癌の種類は、制約されるものではないが、膀胱癌、乳癌、大腸及び直腸癌、子宮内膜癌、腎臓（腎細胞）癌、白血病、肺癌、メラノーマ、非ホジキンスリンパ腫、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌（非メラノーマ）、及び甲状腺癌を含む。好ましい態様において、本明細書中の治療で意図する癌は、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンス及びホジキンスリンパ腫、膵臓癌、並びに卵巣癌を含む。
【００５１】
[0063]ヘモグロビン異常症及びサラセミアは、両方とも“血液疾患”として特徴づけられる。血液疾患は、本発明の化合物の投与によって治療、予防、又は別に軽減することができる疾患を含む。血液疾患は、血液及び血液形成器官のいずれもの疾患である。用語血液疾患は、栄養性貧血（例えば、鉄欠乏性貧血、鉄欠乏性失語症、プランマー・ビンソン症候群、ビタミンＢ１２欠乏性貧血、内因子によるビタミンＢ１２欠乏性貧血、悪性貧血、葉酸欠乏性貧血、及び他の栄養性貧血）、骨髄異形成症候群、化学療法、放射線又は他の薬剤或いは療法から起こる骨髄不全又は貧血、溶血性貧血（例えば、酵素疾患による貧血、リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）欠乏性貧血、ソラマメ症、グルタチオン代謝の疾患による貧血、解糖酵素の障害による貧血、ヌクレオチド代謝の障害による貧血及び不特定酵素障害による貧血）、サラセミア、α−サラセミア、β−サラセミア、δβ−サラセミア、サラセミア体質、致死的ヘモグロビンの遺伝的持続（ＨＰＦＰ）、及び他のサラセミア、鎌状赤血球症（急性発症を伴う鎌状赤血球貧血、急性発症を伴わない鎌状赤血球貧血、二重ヘテロ結合性鎌状化疾患、鎌状赤血球体質及び他の鎌状赤血球疾患）、遺伝性溶血性貧血（遺伝性球状赤血球症、遺伝性楕円赤血球症、他のヘモグロビン異常症及び他の特定的遺伝性溶血性貧血、例えば口唇状赤血球症（ｓｔｏｍａｔｏｃｙｃｌｏｓｉｓ））、後天性溶血性貧血（例えば、薬物誘発自己免疫性溶血性貧血、他の自己免疫性溶血性貧血、例えば温式自己免疫性溶血性貧血、薬物誘発非自己免疫性溶血性貧血、溶血性尿毒症症候群、及び他の非自己免疫性溶血性貧血、例えば微小血管性溶血性貧血）；再生不良性貧血（例えば、後天性赤芽球癆（赤芽球減少症）、他の再生不良性貧血、例えば体質性再生不良性貧血及びファンコニ貧血、急性出血後貧血、及び慢性疾病中の貧血）、血液凝固異常（例えば、播種性血管内凝固（脱繊維素（ｄｉｆｉｂｒｉｎａｔｉｏｎ）症候群））、遺伝性第ＶＩＩＩ因子欠乏症（血友病Ａ）、遺伝性第ＩＸ因子欠乏症（クリスマス病）、及び他の血液凝固異常、例えばフォン・ヴィルブランド病、遺伝性第ＸＩ（Ｘｉ）因子欠乏症（血友病Ｃ）、紫斑病（例えば、質的血小板異常及びグランツマン病）、好中球減少症、無顆粒球症、多形核好中球の機能的疾患、白血球の他の疾患（例えば、好酸球増加症、白血球増加症、リンパ球増加症、リンパ球減少症、単球増加症、及び形質細胞増加症）、脾臓の疾病、メトヘモグロビン血症、血液及び血液形成器官の他の疾病（例えば、家族性赤血球増加症、二次性赤血球増加症、本態性血小板増加症及び好塩基球増加症）、血小板減少症、感染性貧血、低増殖性又は再生不良性貧血、ヘモグロビンＣ、Ｄ及びＥ症、ヘモグロビンレポア症、並びにＨｂＨ及びＨｂＳ症、血液喪失、放射線療法又は化学療法による貧血、又は放射線療法又は化学療法による血小板減少症、及び好中球減少症、鉄芽球性貧血、骨髄癆性貧血、抗体媒介性貧血、並びにリンパ細網組織及び細網組織球系に関係するある種の疾病（例えば、ランゲルハンス細胞組織球症、好酸球性肉芽腫、ハンド・シュラー・クリスチャン病、血球貪食性リンパ組織球症、及び感染関連血球貪食症候群）を含む。
【００５２】
[0064]用語“医薬的に受容可能な賦形剤”は、本明細書中で使用する場合、本発明の医薬組成物の活性成分（例えば、本発明の化合物）と適合性であり（そして好ましくはそれを安定化することが可能であり）、そして治療される患者に対して有害ではない担体及びベヒクルを指す。例えば、本発明の化合物と特異的な更に可溶性の複合体を形成する可溶化剤は、化合物の供給のための医薬的賦形剤として使用することができる。適した担体及びベヒクルは、当業者にとって既知である。用語“賦形剤”は、本明細書中で使用する場合、全てのこのような担体、アジュバント、希釈剤、溶媒、又は他の不活性添加物を包含するものである。適した医薬的に受容可能な賦形剤は、制約されるものではないが、水、塩溶液、アルコール、植物油、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸モノグリセリド及びジグリセリド、石油エーテル系（ｐｅｔｒｏｅｔｈｒａｌ）脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、等を含む。本発明の医薬組成物は、更に、滅菌することができ、そして所望する場合、本発明の活性化合物と有害に反応しない補助剤、例えば、潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響する塩、緩衝剤、着色剤、風味付け及び／又は芳香性物質等と混合される。
【００５３】
[0065]本来塩基性である本発明の化合物は、各種の無機及び有機酸と幅広い種類の塩を形成することが可能である。本来塩基性である本発明の化合物の医薬的に受容可能な酸付加塩を調製するために使用することができる酸は、非毒性の酸付加塩、即ち、医薬的に受容可能なアニオン、例えば塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、硫酸、重硫酸、リン酸、酸性リン酸、イソニコチン酸、酢酸、乳酸、サリチル酸、クエン酸、酸性クエン酸、酒石酸、パントテン酸、重酒石酸、アスコルビン酸、コハク酸、マレイン酸、ゲンチジン酸（ｇｅｎｔｉｓｉｎａｔｅ）、フマル酸、グルコン酸、グルクロン酸（ｇｌｕｃａｒｏｎａｔｅ）、糖酸、ギ酸、安息香酸、グルタミン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸及びパモ酸（ｐａｌｍｏａｔｅ）［即ち、１，１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエ酸）］塩を含有する塩を形成するものである。このような塩は、患者、例えば哺乳動物への投与のために医薬的に受容可能でなければならないが、最初に反応混合物から本発明の化合物を医薬的に受容不可能な塩として単離し、そして次いで、アルカリ性の試薬による処理によって後者を遊離塩基化合物に単純に転換し、そしてその後、後者の遊離塩基を医薬的に受容可能な酸付加塩に転換することが、実際にはしばしば望ましい。本発明の塩基性化合物の酸付加塩は、塩基性化合物を、実質的に当量の選択された無機又は有機酸で、水性溶媒媒体又は適した有機溶媒、例えばメタノール又はエタノール中で処理することによって容易に調製される。溶媒の注意深い蒸発によって、所望の固体の塩が容易に得られる。前述の実験の項で具体的に記載されていない本発明の他の化合物の調製は、当業者にとって明白であるものである、先に記載した反応の組合せを使用して達成することができる。
【００５４】
[0066]従って、本発明中で使用する場合、用語“医薬的に受容可能な塩”は、酸及び本発明の化合物の塩基性基から形成される塩である。例示的な塩は、制約されるものではないが、硫酸、クエン酸、酢酸、シュウ酸、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸、重硫酸、リン酸、酸性リン酸、イソニコチン酸、乳酸、サリチル酸、酸性クエン酸、酒石酸、オレイン酸、タンニン酸、パントテン酸、重酒石酸、アスコルビン酸、コハク酸、マレイン酸、ゲンチジン酸（ｇｅｎｔｉｓｉｎａｔｅ）、フマル酸、グルコン酸、グルクロン酸（ｇｌｕｃａｒｏｎａｔｅ）、糖酸、ギ酸、安息香酸、グルタミン酸（ｇｌｕｔａｒｎａｔｅ）、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、及びパモ酸塩を含む。
【００５５】
[0067]用語“医薬的に受容可能な塩”は、更に、酸性の官能基、例えばカルボン酸官能基を有する本発明の化合物、及び医薬的に受容可能な無機又は有機塩基から調製される塩を指す。適した塩基は、制約されるものではないが、アルカリ金属、例えばナトリウム、カリウム、及びリチウムの水酸化物；アルカリ土類金属、例えばカルシウム及びマグネシウムウの水酸化物；他の金属、例えばアルミニウム及び亜鉛の水酸化物；アンモニア、及び有機アミン、例えば非置換の又はヒドロキシで置換されたモノ、ジ、又はトリアルキルアミン；ジシクロヘキシルアミン；トリブチルアミン；ピリジン；Ｎ−メチル、Ｎ−エチルアミン；ジエチルアミン；トリエチルアミン；モノ−、ビス−、又はトリス−（２ーヒドロキシ−低級アルキルアミン）、例えばモノ−、ビス−、又はトリス−（２−ヒドロキシエチル）アミン、２−ヒドロキシ−ｔｅｒｔ−ブチルアミン、又はトリス−（ヒドロキシメチル）メチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキル−Ｎ−（ヒドロキシ低級アルキル）−アミン、例えばＮ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アミン、又はトリス−（２−ヒドロキシエチル）アミン；Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン；並びにアミノ酸、例えばアルギニン、リシン、等を含む。他の医薬的に受容可能な塩は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ．Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｕｓｅ（Ｐ．Ｈｅｉｎｒｉｃｈ  Ｓｔａｈｌ  ａｎｄ  Ｃ．Ｗｅｒｍｕｔｈ，Ｅｄｓ．，Ｖｅｒｌａｇ  Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｃａ  Ａｃｔａ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ（２００２））中に記載されている。
【００５６】
[0068]用語“患者”は、本明細書中で使用する場合、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、更に好ましくは霊長類、なお更に好ましくはヒトを指す。哺乳動物は、制約するものではないが、ヒト、霊長類、野生動物、胎児動物、家畜、スポーツ動物、及び愛玩動物を含む。
【００５７】
[0069]用語“治療的に有効な量”は、本明細書中で使用する場合、治療において有益な又は所望の臨床的結果に影響するために十分な量を指す。具体的には、用語“治療的に有効な量”は、（ｉ）関連するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおける形質転換された（癌）細胞の増殖を減少又は阻害するか或いは癌の動物モデルにおいて測定可能な改善を起こす及び／又は（ｉｉ）関連するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて胎児ヘモグロビンの発現を誘発するか或いはヘモグロビン異常症及び／又はサラセミア、例えば鎌状赤血球症の動物モデルにおいて測定可能な改善を、測定可能に起こすために十分な本発明の化合物の量を意味する。別の方法として、“治療的に有効な量”は、（ｉ）癌及び／又は（ｉｉ）ヘモグロビン異常症及び／又はサラセミアに対して治療された患者に治療的或いは予防的効果を与えるために十分な本発明の化合物の量である。治療的に有効な量は、当業者によって認識されるように、治療される具体的な疾病、投与の経路、選択された賦形剤、及び組合せ療法の可能性によって変化するものである。
【００５８】
[0070]治療的に有効な量を決定するために測定することができる生理学的影響は、制約されるものではないが、基質タンパク質の過剰アセチル化（ヒストン、チューブリン、ｈｓｐ９０、ｐ５３、ＳＴＡＴ、等）、遺伝子導入（胎児ヘモグロビン、脊髄性筋委縮症遺伝子）、障害されたタンパク輸送、改善された神経細胞小胞輸送、アポトーシスの導入、細胞サイクルの停止、及びｐ２１の導入を含む。
【００５９】
[0071]このような影響を測定するための関連するアッセイは、制約されるものではないが、ウェスタン（免疫）ブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ又は他の技術による発現特性、ハイコンテンツ免疫蛍光検査、サイトブロット（ｃｙｔｏｂｌｏｔ）、ＨＤＡＣタンパク質の生化学的阻害、ＣｈＩＰによるクロマチン構造の変更、及び質量分光法によるヒストン及び／又は他の標的タンパク質の修飾の変更を含む。
【００６０】
[0072]“化合物を得ること”中のような用語“得ること”は、購入、合成又は他の方法で化合物（又は示された物質又は材料）を獲得することを含むことを意図する。
[0073]用語“含んでなる”、“含んでなること”は、米国特許法中でこれらに起因する幅広い意味を有し、そして“含む”、“含むこと”等を意味することができることを意図する。
【００６１】
[0074]本発明は、以下の詳細な説明及び例示的実施例を参照することによって、更に十分に理解することができ、これらは、本発明の非制約的態様を例示することを意図している。
【００６２】
[0075]ＩＩ．本発明の態様
[0076]本発明の化合物
[0077]本発明の化合物は、その化学構造及び／又は化学名によって本明細書中で定義される。本発明の化合物は、一般的にＩＵＰＡＣ又はＣＡＳ命名法によって命名される。当業者にとって公知である略語を使用することができる。化合物が化学構造及び化学名の両方によって言及され、そして化学構造及び化学名が矛盾する場合、化学構造が化合物の正体の決定要因である。
【００６３】
[0078]化学構造中の実線と平行な点線は、二重結合の所望による存在を示す。実線と平行な互いに隣接した二本の点線は、二つの位置のいずれかにおける、しかし両方ではない二重結合の所望による存在を示す。Ｅ（ｔｒａｎｓ）又はＺ（ｃｉｓ）配置のいずれかが示される。実際に、本明細書中で意図される全てのアルケンは、Ｅ（ｔｒａｎｓ）又はＺ（ｃｉｓ）配置のいずれかとして存在することができる。
【００６４】
[0079]患者に投与する場合、本発明の化合物は、単離された形態で、又は医薬組成物中の単離された形態として投与される。本明細書中で使用する場合、“単離された”は、本発明の化合物が、（ａ）天然の供給源、例えば植物又は細胞、好ましくは細菌培養物、或いは（ｂ）合成の有機化学反応混合物のいずれかの他の成分と分離されることを意味する。好ましくは、慣用的な技術によって、本発明の化合物は精製される。本明細書中で使用する場合、“精製された”は、単離された場合、分離物は、分離物の重量により、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、更に好ましくは少なくとも約９５％、そしてなお更に好ましくは少なくとも約９８％の本発明の単一の化合物を含有することを意味する。
【００６５】
[0080]放射性化合物は、新しい薬物の発見における使用の長い歴史を有する。全ての本発明の化合物は、容易に放射線標識され、そして（ｉ）形質転換された（癌）細胞の増殖を減少又は阻害し、及び／又は（ｉｉ）胎児ヘモグロビン発現を誘発する他の新しい薬剤を発見するために使用することができる潜在性を有する。例えば、本発明の放射性化合物は、（ｉ）形質転換された（癌）細胞の増殖を減少又は阻害し、及び／又は（ｉｉ）胎児ヘモグロビン発現を誘発する他の化合物の発見のために使用されるバイオアッセイを検証し、最適化し、そして標準化するために使用することができる。同様に、本発明の放射性化合物は、（ｉ）形質転換された（癌）細胞の増殖を減少又は阻害し、及び／又は（ｉｉ）胎児ヘモグロビン発現を誘発するバイオアッセイにおいて改良された活性を示す化合物を発見するためのベンチマークとして使用することができる。
【００６６】
[0081]本発明の化合物の調製
[0082]本発明の化合物は、効率のよい、対費用効果の高い様式で調製することができる。従来のラルガゾール類似体化合物の合成は、本明細書中に参考文献として援用される米国特許第８、２１７、０７６号中に記載されている。具体的な合成は、実施例中に記載されている。
【００６７】
[0083]治療の方法
[0084]本発明の一つの態様において、治療的に有効な量の式（Ｉ）の化合物又はその医薬的に受容可能な塩、溶媒和物、クラスレート、及びプロドラッグ、或いは式（Ｉ）の化合物又はその医薬的に受容可能な塩、溶媒和物、クラスレート、及びプロドラッグを含んでなる医薬組成物が、癌の治療を必要とする患者に投与される。本発明のもう一つの態様において、治療的に有効な量の式（Ｉ）の化合物又はその医薬的に受容可能な塩、溶媒和物、クラスレート、及びプロドラッグ、或いは式（Ｉ）の化合物又はその医薬的に受容可能な塩、溶媒和物、クラスレート、及びプロドラッグを含んでなる医薬組成物が、血液疾患の治療を必要とする患者に投与される。このような使用から利益を得るものである他の症状、疾病及び疾患は、当業者にとって既知である。
【００６８】
[0085]本発明の化合物は、更に、炎症性疾患（例えば、皮膚、関節、等の）、免疫寛容、移植拒絶、移植片対宿主病、等の治療を意図している。
[0086]本発明の化合物は、更に、患者の自己免疫性疾患の治療も意図している。自己免疫性疾患は、制約されるものではないが、関節リュウマチ、ループス、多発性硬化症、及び炎症性大腸疾患を含む。
【００６９】
[0087]本発明の化合物は、更に、患者のアルツハイマー病の治療も意図している。
[0088]本発明の化合物及び組成物に対する疾病の反応性は、慣用的な薬物（例えば、癌に対する化学治療剤；ある種の血液疾患に対するＦＫ２２８又はＳＡＨＡ）に対する比較によって直接測定することができるか、又は疾病の原因及び進行の理解に基づいて推察することができる。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏの影響の予測として当技術において広く受け入れられている多くの胎児ヘモグロビン発現アッセイ系がある。従って、本発明の化合物がこれらのアッセイにおいて胎児ヘモグロビン発現を誘発するという提示は、ヘモグロビン異常症及び／又はサラセミア、即ち、血液疾患を治療するためのこれらの臨床的使用の証拠である。
【００７０】
[0089]本発明の一つの態様において、“治療”又は“治療すること”は、癌又は少なくともその一つの識別可能な症候の寛解を指す。もう一つの態様において、“治療”又は“治療すること”は、必ずしも患者によって識別可能ではない、少なくとも一つの測定可能な物理的パラメーターの寛解を指す。なおもう一つの態様において、“治療”又は“治療すること”は、物理的に、例えば、識別可能な症候の安定化で、生理学的に、例えば、物理的パラメーターの安定化で、或いは両方で、癌の進行を阻害することを指す。なおもう一つの態様において、“治療”又は“治療すること”は、癌又はその症候の開始を遅延することを指す。
【００７１】
[0090]本発明のもう一つの態様において、“治療”又は“治療すること”は、ヘモグロビン異常症及び／又はサラセミア、即ち、血液疾患、或いは少なくともその一つの識別可能な症候の寛解を指す。もう一つの態様において、“治療”又は“治療すること”は、必ずしも患者によって識別可能ではない、少なくとも一つの測定可能な物理的パラメーターの寛解を指す。なおもう一つの態様において、“治療”又は“治療すること”は、物理的に、例えば、識別可能な症候の安定化で、生理学的に、例えば、物理的パラメーターの安定化のいずれかで、或いは両方で、ヘモグロビン異常症及び／又はサラセミア、即ち、血液疾患の進行を阻害することを指す。なおもう一つの態様において、“治療”又は“治療すること”は、ヘモグロビン異常症及び／又はサラセミア、即ち、血液疾患或いはその症候の開始を遅延することを指す。
【００７２】
[0091]本発明の一つの態様において、“治療”又は“治療すること”は、自己免疫性疾患又は少なくともその一つの識別可能な症候の寛解を指す。もう一つの態様において、“治療”又は“治療すること”は、必ずしも患者によって識別可能ではない、少なくとも一つの測定可能な物理的パラメーターの寛解を指す。なおもう一つの態様において、“治療”又は“治療すること”は、物理的に、例えば、識別可能な症候の安定化で、生理学的に、例えば、物理的パラメーターの安定化で、或いは両方で、自己免疫性疾患の進行を阻害することを指す。なおもう一つの態様において、“治療”又は“治療すること”は、自己免疫性疾患又はその症候の開始を遅延することを指す。
【００７３】
[0092]式（Ｉ）の化合物、或いはその医薬的に受容可能な塩、溶媒和物、クラスレート、及びプロドラッグは、ヒトにおける使用に先立ち、所望の治療的又は予防的活性に対してｉｎ  ｖｉｔｒｏで、又はｉｎ  ｖｉｖｏで分析することができる。例えば、動物モデル系を、本発明の化合物の安全性及び効力を証明するために使用することができる。
【００７４】
[0093]理論によって束縛されることを望むものではないが、本発明の化合物及び組成物が、遺伝子発現、例えば、ＢＤＮＦ（精神病に対して）、ＨｂＦ、ＳＭＡ、ｐ５３、及び／又はｐ２１の発現を誘発し、そして結果として、癌を治療又は予防するために使用することができると信じられる。更に理論によって束縛されることを望むものではないが、本発明の化合物及び組成物が、遺伝子発現、例えば、胎児ヘモグロビン発現を誘発し、そして結果として、ヘモグロビン異常症及び／又はサラセミア、即ち、血液疾患を治療又は予防するために使用することができると信じられる。然しながら、化合物が、二次的又は異なった活性、例えば、制約されるものではないが、通常固定された胎児から成人へのグロビン遺伝子の切換えを遅延すること、或いは造血新生、赤血球生成、骨髄造血、及び／又は好中球産生を刺激することによって作用することができることは注目されるべきである。
【００７５】
[0094]医薬組成物
[0095]一つの態様において、本発明の医薬組成物及び剤形は、式（Ｉ）の化合物、或いはその医薬的に受容可能なプロドラッグ、塩、溶媒和物、又はクラスレートを、相対的な量で含んでなり、そして一定の医薬組成物又は剤形が、形質転換された（癌）細胞の増殖を減少又は阻害するような方法で処方される。本発明のもう一つの態様において、このような医薬組成物及び剤形は、一つ又はそれより多い更なる活性剤、例えば当技術において既知の化学療法剤を含んでなる。
【００７６】
[0096]もう一つの態様において、本発明の医薬組成物及び剤形は、式（Ｉ）の化合物、或いはその医薬的に受容可能なプロドラッグ、塩、溶媒和物、又はクラスレートを、相対的な量で含んでなり、そして一定の医薬組成物又は剤形が、胎児ヘモグロビンの発現を誘発するような方法で処方される。本発明のもう一つの態様において、このような医薬組成物及び剤形は、一つ又はそれより多い更なる活性剤を含んでなる。
【００７７】
[0097]本発明の化合物及び医薬的に受容可能なその塩は、例えば、経口、非経口、局所、直腸、皮下、経皮、及び／又は肺（吸入される）経路を経由して投与することができる。一般的に、これらの化合物は、最も望ましくは、有効な投与量で、治療される患者の体重及び症状、並びに選択された投与の特定の経路によって投与される。治療される患者の種及び前記医薬に対するその個々の反応、並びに選択された医薬的処方の種類並びにこのような投与が行われる時間及び間隔によって変化が起こることができる。
【００７８】
[0098]一つの態様において、本発明の医薬組成物は、単独で、又は患者、例えば、哺乳動物の癌を治療するための他に既知の組成物との組合せで投与することができる。好ましい哺乳動物は、ネコ、イヌ、ブタ、ラット、マウス、サル、チンパンジー、ヒヒ及びヒトを含む。一つの態様において、患者は癌に罹っている。もう一つの態様において、患者は癌に罹る危険性がある。
【００７９】
[0099]もう一つの態様において、本発明の医薬組成は、単独で、又は患者、例えば、哺乳動物の血液疾患を治療するための他に既知の組成物との組合せで投与することができる。好ましい哺乳動物は、ネコ、イヌ、ブタ、ラット、マウス、サル、チンパンジー、ヒヒ及びヒトを含む。一つの態様において、患者は血液疾患に罹っている。もう一つの態様において、患者は血液疾患に罹る危険性がある。
【００８０】
[00100]言語、既知の組成物“との組合せにおいて”は、本発明の組成物及び既知の組成物の同時投与、最初の本発明の組成物の、それに続く既知の組成物の投与、及び最初の既知の組成物の、それに続く本発明の化合物の投与を含むことを意図する。癌又は血液疾患を治療するための当技術において既知の治療的組成物のいずれもは、本発明の方法において使用することができる。
【００８１】
[00101]本発明の化合物は、単独で、或いは医薬的に受容可能な担体又は希釈剤との組合せにおいて、先に記述した経路のいずれもによって投与することができ、そして投与は一回又は多数回の投与で行うことができる。例えば、本発明の新規な治療剤は、幅広い種類の異なった剤形で都合よく投与することができ、即ち、これらは、錠剤、カプセル、ロゼンジ、トローチ、硬質キャンディー、粉末、噴霧、クリーム、軟膏、座薬、ジェリー、ゲル、ペースト、ローション、軟膏剤、水性懸濁液、注射用溶液、エリキシル、シロップ、等の形態で各種の医薬的に受容可能な不活性の担体と組合せることができる。このような担体は、固体希釈剤又は充填剤、滅菌水性媒体及び各種の非毒性有機溶媒、等を含む。更に、経口医薬組成物は、適当に甘味及び／又は風味付けすることができる。一般的に、本発明の治療的に有効な化合物は、このような剤形中に、約５．０％ないし約７０重量％の範囲の濃度レベルで存在する。
【００８２】
[00102]経口投与のために、各種の賦形剤、例えば微結晶セルロース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸二カルシウム及びグリシンを含有する錠剤は、各種の崩壊剤、例えばデンプン（そして好ましくはトウモロコシ、ジャガイモ又はタピオカデンプン）、アルギン酸及びある種の複合ケイ酸塩と共に、ポリビニルピロリドン、スクロース、ゼラチン及びアラビアゴムのような顆粒化結合剤と一緒に使用することができる。更に、潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム及びタルクは、錠剤化の目的のためにしばしば非常に有用である。類似の種類の固体組成物は、更に、ゼラチンカプセルの充填剤として使用することもできる；これに関する好ましい物質は、更に、乳酸又は乳糖、並びに高分子量ポリエチレングリコールを含む。水性懸濁液及び／又はエリキシルが経口投与のために所望される場合、活性成分は、各種の甘味又は風味剤、着色物質又は染料と、そして、所望する場合、同様に、乳化及び／又は懸濁剤、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリンのような希釈剤、並びにこれらの同様の組合せと一緒に混合することができる。
【００８３】
[00103]非経口投与（腹腔内、皮下、静脈内、皮内又は筋肉内注射を含む）のために、ゴマ又は落花生油或いは水性プロピレングリコールのいずれか中の本発明の治療的化合物の溶液を使用することができる。水性溶液は、必要な場合、適当に緩衝（好ましくは８より大きいｐＨに）され、そして液体希釈剤は最初に等張にされなければならない。これらの水性溶液は、静脈内注射の目的のために適している。油性溶液は、関節内、筋肉内及び皮下注射の目的に適している。滅菌条件下の全てのこれらの溶液の調製は、当業者にとって公知の標準的な製薬技術によって容易に達成される。非経口適用のために、適した調製の例は、溶液、好ましくは油性又は水性溶液、並びに懸濁液、乳液、又は座薬を含むインプラントを含む。治療的化合物は、多数回又は一回投与形式の滅菌形態に、例えば流体の担体、例えば普通に注射剤と共に使用される滅菌生理食塩水又は５％食塩水  デキストロース溶液中に分散するように処方することができる。
【００８４】
[00104]更に、皮膚の炎症の症状を治療する場合、本発明の化合物を局所的に投与することも可能である。局所投与の方法の例は、経皮、頬側又は舌下適用を含む。局所適用のために、治療的化合物は、薬理学的に不活性な局所用担体、例えばゲル、軟膏、ローション又はクリーム中に適当に混合することができる。このような局所用担体は、水、グリセロール、アルコール、プロピレングリコール、脂肪族アルコール、トリグリセリド、脂肪酸エステル、又は鉱油を含む。他の可能な局所用担体は、液体ワセリン、パルミチン酸イソプロピル、ポリエチレングリコール、９５％エタノール、水中の５％モノラウリン酸（ｍｏｎｏｌａｕｒｉａｔｅ）ポリオキシエチレン、水中の５％ラウリル硫酸ナトリウム、等である。更に、抗酸化剤、保水剤、粘度安定剤等のような物質も、所望する場合、更に加えることができる。
【００８５】
[00105]経腸的適用のために特に適したものは、タルク及び／又は炭水化物担体結合剤等を有する錠剤、糖衣錠又はカプセルであり、担体は、好ましくはラクトース及び／又はトウモロコシデンプン及び／又はジャガイモデンプンである。シロップ、エリキシル等を使用することができ、ここにおいて、加糖ベヒクルが使用される。継続放出組成物は、活性成分が、差次的に分解可能な被覆、例えば、マイクロカプセル化、多重被覆、等で誘導体化されたものを含んで処方することができる。
【００８６】
[00106]一定の療法において使用される活性化合物の実際の好ましい量は、使用される具体的な化合物、処方される特定の組成物、適用の様式、投与の特定の部位、等によって変化するものであることは認識されるものである。投与の一定のプロトコルに対する最適な投与の速度は、前述の指針に関して行われる慣用的な投与量決定試験を使用して、当業者によって容易に確認することができる。
【００８７】
[00107]正常な使用環境下でその効力を確保するために、通常の慣用的に知られた注意が、一般的に本発明の化合物の投与に関して払われるものであることも更に理解されるものである。特に、ヒト及び動物のｉｎ  ｖｉｖｏの療法的治療のために使用される場合、医師は、慣用的に知られた矛盾及び毒性の影響を回避するために、全ての賢明な注意を払わなければならない。
【００８８】
[00108]本発明の剤形の組成、形状、又は種類は、典型的にはその使用によって変化するものである。例えば、粘膜投与のために適した剤形は、同じ徴候を治療するために使用される経口的剤形より少ない量の活性成分（一つ又は複数）を含有することができる。本発明のこの側面は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）１８ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｐａ．から当業者にとって容易に明白となるものである。
【００８９】
[00109]本発明は、更に、本発明の化合物が分解するものである速度を減少する一つ又はそれより多い化合物を含んでなる医薬組成物及び剤形を包含する。本明細書中で“安定剤”と呼ばれるような化合物は、制約されるものではないが、抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、ｐＨ緩衝剤、又は塩緩衝剤を含む。
【００９０】
[00110]動物及びヒトに対する投与量の相互関係（身体表面の平方メートル当たりのミリグラムに基づく）は、Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈ，ｅｔ  ａｌ．１９６６  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｒｅｐ  ５０：２１９中に記載されている。身体の表面積は、患者の身長及び体重から、例えば、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｔａｂｌｅｓ，Ｇｅｉｇｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ａｒｄｌｅｙ，Ｎ．Ｙ．，１９７０，５３７で概略決定することができる。
【００９１】
[00111]賦形剤の量及び種類のように、剤形中の本発明の化合物の量は、制約されるものではないが、それが患者に投与される経路のような因子によって異なることができる。一定の患者に対する適当な投与量及び剤形を決定することは、当技術の技能内である。
【００９２】
[00112]更に、本発明は、更に医薬の調製のための本発明の化合物の使用に関係する。本発明の一つの態様において、医薬は、医薬的に受容可能な担体を含むことができ、そして化合物は、有効な量、例えば癌を治療するために有効な量である。本発明のもう一つの態様において、医薬は、医薬的に受容可能な担体を含むことができ、そして化合物は、有効な量、例えば血液疾患を治療するために有効な量である。
【００９３】
[00113]キット
[00114]一つの側面において、本発明は、有効な量の式（Ｉ）の化合物、或いはその医薬的に受容可能なプロドラッグ、塩、溶媒和物、水和物、又はクラスレートの単位剤形、及び化合物を投与するために使用することができるデバイスを含んでなるキットを提供する。このようなデバイスの例は、制約されるものではないが、シリンジ、点滴バッグ、貼布、及び吸入器を含む。
【００９４】
[00115]本発明のキットは、更に、医薬的に受容可能なベヒクルを含んでなることができる。例えば、本発明の化合物が非経口投与のために再構成しなければならない固体の形態で提供される場合、キットは、非経口投与のために適した、微粒子を含まない滅菌溶液を形成するために化合物を溶解することができる適したベヒクルの密封された容器を含んでなることができる。
【００９５】
[00116]組合せ療法
[00117]患者の治療のために本明細書中に記載される方法は、更に、有効な量の一つ又はそれより多い治療剤を、この発明の化合物を投与される患者に投与することを含んでなることができる。患者にもう一つの治療剤が投与される本発明の態様において、本発明の化合物の有効な量は、他の治療剤が投与されない場合の有効な量であるものより少ない。もう一つの態様において、他の治療剤の有効な量は、本発明の化合物が投与されない場合のその有効な量であるものより少ない。
【００９６】
[00118]本明細書中に記載される幾つかの側面において、本発明は、更なる治療様式を含む。例えば、更なる治療様式は、放射線療法又は細胞障害性化学治療剤、例えば、代謝拮抗剤（例えば、ロイコボリンを伴う５−ＦＵ）、イリノテカン、（又は他のトポイソメラーゼ阻害剤）、ドキソルビシン、又はこれらの薬剤の全ての投与を含む、これらの薬剤の全てのいずれもの組合せである。
【００９７】
[00119]この方法は、患者を、例えば：腫瘍サイズの減少；癌マーカー、例えば、癌特異的抗原の減少；新しい病変の出現の、例えば、骨走査における減少；新しい疾病関連症候の出現の減少；或いは軟部組織腫瘤のサイズの減少又は安定化；或いは臨床結果の改善に関連するいずれものパラメーターの一つ又はそれより多い減少に対して、モニターする工程を更に含むことができる。患者は、一つ又はそれより多い次の期間：治療の開始前；治療中；或いは治療の一つ又はそれより多い要素が投与された後に、モニターされることができる。モニタリングは、式（Ｉ）の化合物による更なる治療、又は更なる薬剤による更なる治療の必要性を評価するために使用することができる。一般的に、先に記載したパラメーターの一つ又はそれより多くの減少或いは安定化は、患者の改善された症状の表示である。モニタリングに関する情報は、例えば、電子的又はデジタル形態で記録することができる。
【００９８】
[00120]本明細書中に開示される治療方法は、制約されるものではないが：外科手術；放射線療法、及び化学療法を含む、一つ又はそれより多い治療様式との組合せで使用することができる。
【００９９】
[00121]本明細書中に開示される方法に関して、用語“組合せ”は、同じ患者を治療するための一つ又はそれより多い更なる薬剤又は治療剤の使用を指し、ここにおいて、薬剤又は治療剤の使用或いは作用は、時間的に重複する。更なる薬剤又は治療剤は、式（Ｉ）の化合物が投与されるのと同時に、又は連続的に如何なる順序ででも投与することができる。連続投与は、異なった時間に与えられる投与である。一つの薬剤及びもう一つの薬剤の投与間の時間は、数分、数時間、数日、又は数週間であることができる。
【０１００】
[00122]更なる薬剤又は治療剤は、更にもう一つの抗癌性薬剤又は治療剤であることができる。抗癌剤の非制約的例は、例えば、抗微小管剤、トポイソメラーゼ阻害剤、代謝拮抗剤、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、挿入剤、シグナル伝達経路を妨害することが可能な薬剤、アポトーシスを促進する薬剤、放射線、及び他の腫瘍関連抗原に対する抗体（裸の抗体、免疫毒素及び放射性複合体（ｒａｄｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を含む）を含む。抗癌剤の特別なクラスの例は、次の通りに詳細に提供される：抗チューブリン／抗微小管剤、例えば、パクリタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、タキソテール；トポイソメラーゼＩ阻害剤、例えば、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシン、ドキソルビシン、エトポシド、ミトキサントロン、ダウノルビシン、イダルビシン、テニポシド、アムサクリン、エピルビシン、メルバロン、ピロキサントロン塩酸塩；代謝拮抗剤、例えば、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、フルダラビンリン酸塩、シタラビン／Ａｒａ−Ｃ、トリメトレキセート、ゲムシタビン、アシビシン、アラノシン、ピラゾフリン、Ｎ−ホスホルアセチル−Ｌ−アスパレート＝ＰＡＬＡ、ペントスタチン、５−アザシチジン、５−アザ２’−デオキシシチジン、ａｒａ−Ａ、クラドリビン、５−フルオロウリジン、ＦＵＤＲ、チアゾフリン、Ｎ−［５−［Ｎ−（３，４−ジヒドロ−２−メチル−４−オキソキナゾリン−６−イルメチル）−Ｎ−メチルアミノ］−２−テノイル］−Ｌ−グルタミン酸；アルキル化剤、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシンＣ、ＢＣＮＵ＝カルムスチン、メルファラン、チオテパ、ブズルファン、クロラムブシル、プリカマイシン、ダカルバジン、イホスファミドリン酸塩、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、ウラシルマスタード、ピポブロマン、４−イポメアノール；他の作用の機構により作用する薬剤、例えば、ジヒドロレンペロン（ｄｉｈｙｄｒｏｌｅｎｐｅｒｏｎｅ）、スピロムスチン（ｓｐｉｒｏｍｕｓｔｉｎｅ）、及びデプシペプチド（更にＦＫ２２８又はロミデプシンとも呼ばれる）；生物学的反応改良剤、例えば、抗腫瘍反応を向上する、例えばインターフェロン；アポトーシス性薬剤、例えばアクチノマイシンＤ；及び抗ホルモン剤、例えば抗エストロゲン剤、例えばタモキシフェン、又は例えば抗アンドロゲン剤、例えば４’−シアノ−３−（４−フルオロフェニルスルホニル）−２−ヒドロキシ−２−メチル−３’−（トリフルオロメチル）プロピオンアニリド。
【０１０１】
[00123]組合せ療法は、他の治療剤の副作用を軽減する薬剤を投与することを含むことができる。この薬剤は、抗癌治療の副作用を軽減する薬剤であることができる。組合せ療法は、更に、他の治療剤の投与の頻度を減少する薬剤を投与することを含むことができる。この薬剤は、他の治療剤の抗癌効果が減少した後の腫瘍の成長を減少する薬剤であることができる。
【０１０２】
[00124]有用な組合せ療法は、当業者によって理解され、そして認識されるものである。このような組合せ療法の潜在的な利点は、毒性の副作用を最小化するためにより少ないそれぞれの個々の活性成分を使用する能力、効力の相乗的改善、投与又は使用の容易さの改良、及び／又は化合物の調製又は処方の全体的費用の減少を含む。例えば、本発明の化合物は、一つ又はそれより多いサイトカインと組合せて、ヘモグロビン異常症及び／又はサラセミア、即ち、血液疾患の治療のために患者に投与することができる。一つの態様において、サイトカインは、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、幹細胞因子（ＳＣＦ）及びＩＬ−６からなる群から選択される。
【０１０３】
[00125]更に意図される態様
[00126]既知のＨＤＡＣ阻害剤の、更に幅広い癌及び非悪性症状における有用性を制約するものは、（１）的確な毒性並びに（２）癌細胞の感受性及び耐性のむしろ制約された理解であった。ラルガゾールの化学的最適化に対するプラットフォーム能力を確立することにより、クロマチンの構造及び機能に対する天然の産物のＨＤＡＣ阻害剤の機構的な影響を解明することができる。クラスＩのＨＤＡＣ（１、２、３、及び８）の毒性は、このような化合物のＣＴＣＬを超える治療的有用性を拡大するための有意な障壁である。化学的方法は、白血病及びリンパ腫細胞に対するラルガゾール由来のプロトタイプ治療剤の標的化された供給に向けられる。
【０１０４】
[00127]ラルガゾールが、ゲノム全体に、抑圧性複合体を含有するＨＤＡＣ１−３の動員の部位に局在化し、酵素阻害及び局所的過剰アセチル化に導くことが仮定される。過剰アセチル化は、その後、大部分のクロマチン中に伝播し、（ｉ）ブロモドメインを含有する転写性複合体の再分布、（ｉｉ）クロマチンの到達性の増加、及び（ｉｉｉ）協調的転写性伸長の調節解除を起こす。従って、小分子及び生体分子を標的とする癌に対する天然の産物で刺激されたＨＤＡＣ阻害剤の共役は、腫瘍特異的細胞毒性を向上し、同様にアイソフォーム特異的阻害を改善する可能性がある。更に、後成的ＨＤＡＣ阻害剤療法に対する耐性の遺伝子的決定因子が、トランス活性化及び再構築に関係するクロマチン複合体を設計するものである可能性がある。
【０１０５】
[00128]ａ）ラルガゾールの抗癌活性の機構及び部位の確立。  クロマチンの構造及び機能に対するラルガゾールの影響は、ゲノム全体の統合化エピゲノム分析を使用して決定される。ラルガゾールの新規な、回収可能な誘導体は、質量分光法による結合したタンパク複合体の解明、及びＣｈｅｍ−Ｓｅｑによるクロマチンのゲノム全体内のラルガゾールの空間的局在化を可能にする。
【０１０６】
[00129]ｂ）小分子及び生体分子共役によるラルガゾールの癌特異的治療指数の拡大。ラルガゾールの治療指数を拡大するために、放出可能なケージド複合体を調製し、そして特徴付けした。葉酸の共役及びサイトカイン（ＩＬ３（インターロイキン３））の生体共役反応は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの白血病及びリンパ腫の選択的標的化を可能にする。
【０１０７】
[00130]ｃ）後成的ＨＤＡＣ阻害剤療法に対する耐性の遺伝子的機構の確認。  薬物の作用の機構をより良好に理解し、ラルガゾール療法に対する臨床的耐性を予測し、そして既知のＦＤＡで認可されたＨＤＡＣ阻害剤に対する臨床的耐性を説明するためための努力において、後成的ＨＤＡＣ阻害剤耐性の遺伝子的決定因子を、一倍体遺伝子スクリーニング及びＣＲＩＳＰＲ耐性選択を使用して解明した。
【０１０８】
[00131]ｄ）改良されたアイソフォーム選択性を伴う次世代の大環状ＨＤＡＣ阻害剤の実現。  大量の並行合成及びＲＮＡでコードされた大環状分子の選択は、ラルガゾール様ファーマコフォアによるＨＤＡＣ活性に対して付勢され、そしてアイソフォーム特異的阻害に対してスクリーニングされた。選択的化合物は、再合成され、生化学的に特徴付けされ、そして癌のモデルで研究された。
【０１０９】
[00132]本明細書中に開示される全ての特徴は、いずれもの組合せで組合せることができる。本明細書中で開示されるそれぞれの特徴は、同一、均等、又は類似の目的に役立つ別の特徴によって置換えることができる。従って、他に明確に記述されない限り、開示されるそれぞれの特徴は、均等な又は類似の特徴の遺伝子系列の例のみである。上記の記載及び以下の実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に確認することができ、そしてその思想及び範囲から逸脱することなく、これを各種の用途及び条件に適合するために本発明の各種の変更及び改変を行うことができる。例えば、本発明の化合物は、研究の道具として使用することができる（例えば、薬物発見を行うための新しい標的を単離するため）。例えば、化合物は、組織又は器官を画像化するために放射線標識するか、或いはアフィニティーアッセイのための生体共役生成物を形成するために使用することができる。本発明の化合物及び組成物のこれらの及び他の使用並びに態様は、当業者にとって明白であるものである。
【０１１０】
[00133]本開示は、更に、請求項の組の全ての可能な配列を、これらが多数の従属請求項であるかのように包含する。
[00134]本開示の各種の態様は、更に、請求項中に引用される各種の要素の配列を、それぞれの従属請求項が、前述の従属請求項、並びに非従属請求項のそれぞれの制約を組込んだ、多数の従属請求項であるかのように含むことができる。これらの配列は、明確に本開示の範囲内である。
【０１１１】
[00135]本発明は、多くの態様を参照して特別に示され、そして記載されてきたが、形態及び詳細における変更を、本発明の思想及び精神から逸脱することなく、本明細書中に開示される各種の態様に対して行うことができ、そして本明細書中に開示される各種の態様は、特許請求項の範囲の制約として作用することは意図していないことは、当業者によって理解されるものである。本明細書中に引用される全ての参考文献は、その全てが参考文献として援用される。
【０１１２】
[00136]均等物
[00137]当業者は、日常的実験のみを使用して、本明細書中に記載される具体的な方法に対する多くの均等物を認識する、又は確認することが可能であるものである。このような均等物は、本発明の範囲内と考えられ、そして以下の特許請求の範囲によって包含される。本出願を通して引用された全ての参考文献、特許、及び特許出願の内容は、これによって参考文献として援用される。これらの特許、出願及び他の文書の適当な成分、過程、及び方法は、本発明及びその態様のために選択することができる。
【０１１３】
[00138]本発明の記載は、例示及び説明の目的のために提示されてきたが、しかし網羅的であるか、又は本発明を開示された形態に制約することは意図していない。本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によってのみ制約される。多くの改変及び変更は、当業者にとって明白であるものである。記載された態様は、本発明の原理、実際的適用を最良に説明し、そして他の当業者が、本発明を、意図された特定の使用に適するような各種の改変を伴う各種の態様を理解することを可能にするために選択され、そして記載された。
【０１１４】
[00139]本発明は、本発明の化合物の調製を詳細に記載する以下の実施例を参照することによって、更に定義される。物質及び方法の両方に対する多くの改変を、本発明の目的及び興味から逸脱することなく実施することができることは、当業者にとって明白であるものである。以下の実施例は、本発明を理解することを援助するために記述され、そして本明細書中に記載され、そして特許請求される本発明を具体的に制約するものと解釈されるべきではない。当業者の範囲内であるものである現在知られた、又は後で開発される全ての均等物の置換えを含む、本発明のこのような変更、及び処方の変更又は実験の設計の小さい変更は、本明細書中に組込まれた本発明の範囲内に入ると考えられるべきである。
【実施例】
【０１１５】
[00140]以下の実施例は、例示の目的のみのために提供され、そして本発明の範囲を制約することは意図していない。
[00141]  一般的実験方法
[00142]他に記述しない限り、全ての反応は、炎又はオーブン乾燥されたガラス器具中のアルゴン雰囲気下で行った。反応は、蛍光指示薬（Ｍｅｒｃｋ）を伴う０．２５ｍｍのシリカゲル６０Ｆプレートを使用する薄層シリカゲルクロマトグラフィー（ＴＬＣ）を使用してモニターした。プレートを、穏やかな加熱を伴うリンモリブデン酸染色による処理によって可視化した。生成物は、示された溶媒系（一つ又は複数）を使用するカラムクロマトグラフィーにより精製した。シリカゲル６０、２３０−４００メッシュ（Ｓｏｒｂｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）、トリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）、トルエン、ジエチルエーテル（Ｅｔ２Ｏ）、及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）は、アルゴン圧を使用するアルミナ乾燥カラム（Ｓｏｌｖ−Ｔｅｋ  Ｉｎｃ．）を通した。融点は、開放端毛細管で決定し、そして未補正である。１Ｈ  ＮＭＲ及び１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、Ｖａｒｉａｎ  ３００、４００、又は５００ＭＨｚのＮＭＲ分光計で記録した。化学シフトは、注記された場合、δ＝７．２７（１Ｈ  ＮＭＲ）及びδ＝７７．２３（１３Ｃ  ＮＭＲ）におけるＣＨＣｌ３又はδ＝０．００におけるトリメチルシラン（ＴＭＳ）に対するｐｐｍで記録する。質量分析は、Ｆｉｓｉｏｎｓ  ＶＧ  Ａｕｔｏｓｐｅｃで得た。旋光度は、５８９ｎｍで、Ｒｕｄｏｌｐｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｐｏｌａｒｉｍｅｔｅｒ  Ａｕｔｏｐｏｌ  ＩＩＩで収集した。
【０１１６】
[00143]  実施例１．ラルガゾールの抗癌活性の機構及び部位の確認
[00144]１０年にわたる探求の広範な文献にもかかわらず、クロマチンの構造及び機能に対するＨＤＡＣ阻害剤のゲノム全体の影響は未知である。クラスＩのＨＤＡＣ阻害剤、例えばラルガゾールが、ＨＤＡＣを含有する抑圧性複合体の部位でクロマチンに結合し、局所的な、そして次いで網羅的なヒストンの過剰アセチル化に導くことが仮定される。クロマチンの過剰アセチル化は、ブロモドメインを含有する転写複合体（アセチル−リシン認識モジュール）を再分布し、従ってその有効モル濃度を減少し、そして増殖及び生存遺伝子における転写開始及び延長を調節解除する。ラルガゾールをＦＤＡに認可されたＨＤＡＣ阻害剤（ＳＡＨＡ及びロミデプシン）と比較する統合化エピゲノム戦略を使用して、クラスＩのＨＤＡＣ阻害剤のクロマチンの構造及び機能に対するゲノム全体の影響を決定的に解明した。
【０１１７】
[00145]ラルガゾールは、ＨＤＡＣ１−３に対する非常に強力な選択的阻害剤として記載されている。その後、大環状ＨＤＡＣ阻害剤の分子認識の様式を理解し、そしてラルガゾールの効力、選択性、及び薬物様品質を改良するための努力が行われている。ラルガゾールの骨格は、大環状分子の強剛性が、官能基をＨＤＡＣタンパク質表面の十分に定義された位置に置くために、配列の差及びＨＤＡＣタンパク質表面の変化を利用するように独特に適合される。合成を通してラルガゾールの構造を操作することによって、増加した選択性、効力、及び治療的価値を伴う類似体を入手することができる。本発明人等は、５０種を超えるラルガゾール類似体を合成し、最も最近の種の幾つかを図３に示す。一つの系列は、デプシペプチドの生化学的により頑強なペプチド同配体への切換え（６／７；１０／１１；１４／１５；１８／１９；２７；３０）、大環状分子内のアミノ酸のバリン側鎖の操作（２、３８、３９）、亜鉛結合アームの変更（３、４、３１−３４、４０、４１）、及び分子のキャップ基の変更（８−２５、３５−３７、５１−５４）（Ｂｏｗｅｒｓ，  ｅｔ  ａｌ．２００９  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １３１：２９００−２９０５；Ｂｏｗｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．２００９  Ｏｒｇ  Ｌｅｔｔ  １１：１３０１−１３０４）を含む。類似体の開発によるラルガゾールの効力を増加する研究の努力は、有望な生化学的及び生物学的特質を伴う多数の新しい合成類似体を供給した（Ｇｕｅｒｒａ−Ｂｕｂｂ，ｅｔ  ａｌ．２０１３  Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ  ２３：６０２５−６０２８）。これらは、大環状分子内のオキサゾールの置換（１６−２３）、チアゾールのピリジルへの置換（８−１５；２８−３０）、及びチアゾール環の誘導体化（５１−５４）からなる。化合物８−１５（図３）を、天然のラルガゾールの効率のよい、そして拡大縮小できる全合成に基づく類似の経路により合成した（Ｂｏｗｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．２００８  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １３０：１１２１９−１１２２２）。デプシペプチドを、８、９、１２、及び１３に対して配置した底部断片と類似の経路で入手した。化合物１０、１１、１４、及び１５のためのペプチド前駆体は、商業的に入手可能なＮ−Ｂｏｃ（Ａｓｐ）−ＯｔＢｕ−ＯＨから容易に入手される。種１２−１５のためのアリール断片は、２，６−ピリジン二カルボン酸から誘導される。８−１１のためのチアゾリジン−ピリジンの“Ｎ−ＯＵＴ”断片は、商業的に入手可能な２，４−ピリジンカルボン酸から類似的に製造される。断片をチアゾリン−オキサゾール化合物の合成のために記載されたものと類似のアミノ酸カップリング法を利用して結合する。
【０１１８】
[00146]ラルガゾールで刺激されたプローブ分子のための発見プラットフォーム
[00147]反復性の設計−合成試験サイクルを容易にするために、着目された小分子ラルガゾール誘導体のライブラリーを迅速にスクリーニングするために、共同プラットフォーム機能を確立した。小分子の設計は、クラスＩのＨＤＡＣ８に結合したラルガゾールペプチド同配体６、１１、及び１５の高分解能Ｘ線結晶構造を利用する（Ｃｏｌｅ，ｅｔ  ａｌ．２０１１  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １３３：１２４７４−１２４７７）。それぞれの類似体の側鎖チオール基は、活性部位のＺｎ２＋イオンと殆ど理想的な配置で配位し、これによって、ラルガゾールによる阻害の特質的な構造的特徴を保存する。ラルガゾール誘導体の合成は、頑強な小型化されたアッセイプラットフォーム（ＨＤＡＣ１−９）を使用するＨＤＡＣｉ活性のためのリアルタイムの生化学的プロファイリング、並びに血液学的及び固形腫瘍細胞系中の抗癌活性の投与量範囲の測定と連結される。データは、＞５０種の合成ラルガゾール類似体に対して集積されている。幾つかの代表的種に対するＨＤＡＣ阻害データを図２に提供する。ラルガゾールは、ＨＤＡＣ１−３に対して２０ｎＭ未満のＩＣ５０値を、そしてＨＤＡＣ６及び８に対して非常に高い値を示す。化合物５、６、９、１１、１３、及び２６は、ＨＤＡＣ１−３に対する２５ｎＭ未満のＩＣ５０値を伴う、匹敵する又は増加した効力を示す。ピリジル誘導体は、更に７９７及び１０３２６ＮＵＴ正中線細胞腫の細胞系中で試験した。ラルガゾールペプチド同配体類似体６は、７９７及び１０３２６の両方に対して１０ｎＭのＩＣ５０を示し、これは、比較的に、それぞれ親のラルガゾールのそれより１０ｎＭ及び２０ｎＭ低かった。
【０１１９】
[00148]チアゾール環の官能化：ラルガゾールの回収可能な誘導体
[00149]化学生物学において、回収可能な小分子類似体に対する接近は、機構的な研究に対する独特な機会を創造する。実際、ＳｃｈｒｅｉｂｅｒによるＨＤＡＣ１及びＨＤＡＣ２の本来の発見は、トラポキシンの天然の産物を固体の支持体に付加することによって可能にされた（Ｔａｕｎｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．１９９６  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：４０８−４１１；Ｇｒｏｚｉｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．１９９９  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９６：４８６８−４８７３）。本発明人等は、リンカー置換のためのラルガゾール上の許容的部位を確認し、そして新しいプローブのために、キャップ基のチアゾール中に機能的ハンドルを組込むことに基づき、隔絶された類似体を調製することを今までに可能にしている。チアゾールは、活性部位から離れて突出した“キャップ基”の一部であるため、モデル化は、チアゾールの官能化が、標的ＨＤＡＣ酵素に対する強力な親和性を抑止しない筈であることを示唆している。
【０１２０】
[00150]調製（図１Ａ）
【０１２１】
【化７】
0006785801.tif 000008
【０１２２】
[00152]チアゾール５５（８５ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）の７．２ｍＬのＴＨＦ中の−７８℃の溶液に、１．１ｍＬのＬＤＡ（０．８８ｍｍｏｌ、ＴＨＦ中の０．８Ｍ）を滴下により加えた。（ＬＤＡの３当量より多い添加は、ＳＭの分解をもたらすものであることに注意しなければならない）。混合物を−７８℃で２０分間撹拌し、次いでＩ２（３６５ｍｇ、１．４４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１．４４ｍＬ）を加えた。同じ温度で５分間撹拌した後、溶液を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液で処理し、酢酸エチルで希釈し、分離し、食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０から９％の酢酸エチル）によって精製して、９７．４ｍｇ（７４％収率）のチアゾールヨウ化物５６を、褐色の固体として得た。
【０１２３】
[00153] １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ５．２９（ｓ，１Ｈ），４．５７（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），１．４６（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １７６．５，１５５．６，１３４．６，１１３．８，８５．０，８１．０，４２．６，２８．３；ＩＲ（未稀釈）３３６４，２９２７，１６７８，１５１６；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚＣ１０Ｈ１２ＩＮ３ＮａＯ２Ｓ＋に対する計算値（Ｍ＋Ｎａ）＋  ３８７．９５８７，実測値３８７．９５７９。
【０１２４】
【化８】
0006785801.tif 000009
【０１２５】
[00155]チアゾールヨウ化物５６（５５０ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）、４−（ヒドロキシメチル）フェニルボロン酸５７（３４３ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ）、ＮａＨＣＯ３（３８０ｍｇ、４．５ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４を混合し、そして１６ｍＬの溶媒（ＤＭＥ／Ｈ２Ｏ＝３／１、容量／容量）を加えた。混合物を１２０℃に加熱（ｈｅａｄ）し、そしてこの温度で１４時間還流し、次いで室温に冷却し、そして水で希釈した。ＤＭＥを蒸発し、そして水層を酢酸エチルで抽出し、分離した。有機層を食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０から１１％の酢酸エチル）によって精製して、６７ｍｇ（１９％収率）のプロトン化された化合物５５及び３５４ｍｇ（６８％収率）の所望のカップリング生成物５８を、白色の固体として得て、そして。
【０１２６】
[00156] １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７．６１（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），７．４１（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），５．６４（ｂｒｓ，１Ｈ），４．７０（ｓ，２Ｈ），４．５２（ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，２Ｈ），２．８１（ｂｒｓ，１Ｈ），１．４５（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １６９．１，１４３．７，１２８．７，１２８．１，１２７．５，１２７．０，１２０．４，１１５．３，１１４．６，８０．８，６４．２，４２．３，２８．３（Ｘ３）；ＩＲ（未稀釈）３３３２，２９７８，２２２７，１６８９，１５１３，１２７９，１２４８，９１０，７２８；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚＣ１７Ｈ１９Ｎ３Ｏ２Ｓ＋に対する計算値（Ｍ＋Ｎａ）＋３６８．１０３９，実測値３６８．１０３０。
【０１２７】
【化９】
0006785801.tif 000010
【０１２８】
[00158]ベンジルアルコール５８（３５ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）、ＮｓＮＨＢｏｃ（４５ｍｇ、０１５ｍｍｏｌ）、ＰＰｈ３（３９ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を混合し、そして１ｍＬのＴＨＦを加えた。混合物にＤＥＡＤ（トルエン中の４０％、重量／重量、７５μＬ、０．１５ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。０℃で３０分間撹拌した後、溶液を１ＮのＨＣｌで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０％から４％の酢酸エチル）によって精製して、５７ｍｇ（９０％収率）のＳ１を、黄色の固体として得た。
【０１２９】
[00159] １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ８．３２（ｄｄ，Ｊ＝８．３，１．７Ｈｚ，１Ｈ），７．７９−７．６９（ｍ，５Ｈ），７．５４（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），５．５４（ｂｒｓ，１Ｈ），４．９９（Ｓ，２Ｈ），４．５７（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ），１．４６（ｓ，９Ｈ），１．２８（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １７６．２，１６９．２，１５０．２，１４７．６，１４０．０，１３４．５，１３３．８，１３３．１，１３２．４，１３２．０，１２８．５，１２８．４，１２７．５，１２４．６，１２０．７，１１４．７，８５．７，８０．８，５０．６，４２．５，２８．３（Ｘ３），２７．８（Ｘ３）。
【０１３０】
【化１０】
0006785801.tif 000011
【０１３１】
チアゾールニトリルＳ１（３７７ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）、α−メチル−システイン−ＨＣｌ（１２４ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ＮａＨＣＯ３（７６ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）を混合し、そして１０ｍＬのメタノールを加えた。混合物にＥｔ３Ｎ（０．１６ｍＬ、１．２ｍｍｏｌ）を加えた。７０℃で３６時間還流した後、溶媒を減圧下で除去した。残渣をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の９％から３０％の酢酸エチル）によって精製して、２３０ｍｇ（６０ａ：６０ｂ＝１：１、５９％）の６０ａ及び６０ｂを、黄色の泡状物として得た。
【０１３２】
[00161]６０ａ及び６０ｂを、更なる精製及び特徴付けをせずに、次の反応のために混合物として使用した。
【０１３３】
【化１１】
0006785801.tif 000012
【０１３４】
[00163]６１（３３６ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を、４０ｍＬのＣＨ３ＣＮに溶解した。４ｍＬのジエチルアミンを０℃で加えた。浴を除去し、そして得られた溶液を室温で２時間撹拌し、次いで蒸発し、トルエンと共沸し（２×２ｍＬ）、真空下で乾燥した。もう一つの丸底フラスコで、酸６０（２３０ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ、６０ａ及び６０ｂの混合物、１：１）を５５ｍＬのＤＣＭ中に溶解した。ＰｙＢＯＰ（４１６ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（２１０μＬ、１．２ｍｍｏｌ）を加え、そして混合物を室温で２０分間撹拌させた。得られた溶液に、粗製アミンのＤＣＭ溶液（全体で２５ｍＬ）を加えた。３時間後、反応物を濃縮し、そして直ちにカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０％から２５％の酢酸エチル）にかけて、大環状化前駆体（２３６ｍｇ、５８％、６２ａ：６２ｂ＝１：１）を、黄色の泡状物として得た。
【０１３５】
[00164]６２ａ及び６２ｂを、更なる精製及び特徴付けを行わずに、次の反応のために混合物として使用した。
【０１３６】
【化１２】
0006785801.tif 000013
【０１３７】
[00165]非環式前駆体（２３６ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ、６２ａ及び６２ｂの混合物、１：１）を、３０ｍＬのＤＣＭ中に溶解し、６ｍＬのＴＦＡをこの溶液に０℃で加えた。反応物を室温まで温まらせ、そして１６時間撹拌した。溶媒を蒸発し、そして粗製のアミノ酸をトルエンと共沸（１０×３ｍＬ）して、残留ＴＦＡを除去した。次いで、粗製のアミノ酸を３００ｍＬのＣＨ３ＣＮ中に溶解し（約０．００１Ｍに）、ＤＩＰＥＡ（０．３２ｍＬ、１．８ｍｍｏｌ）を加えた。得られた中程度に不透明な溶液を１０分間撹拌させてから、ＨＡＴＵ（２３０ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（８１ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）のＭｅＣＮ（１０ｍＬ）溶液を滴下により加えた。反応物を２６時間撹拌させ、次いで減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィー（第１のカラムに対してＤＣＭ中の０％から１１％のＡｃＯＥｔ、第２のカラムに対してヘキサン中の２５％から７５％の酢酸エチル、そして第３のカラムに対してＤＣＭ中の０％から９％のＡｃＯＥｔ）によって精製して、４０ｍｇ（２工程で２０％収率）の６３を、黄色の泡状物として得た。
【０１３８】
[00166]６３を、更なる特徴付けをせずに次の反応のために使用した。
【０１３９】
【化１３】
0006785801.tif 000014
【０１４０】
[00167]チオフェノール（１０．４μＬ、０．１ｍｍｏｌ）、ＫＯＨ（３．６ｍｇ、６４μｍｏｌ）、水（３０μＬ）及びアセトニトリル（１．２ｍＬ）を混合して、無色の溶液を得た。８．２ｍｇ（９．１μｍｏｌ）のＮｓアミン６３に、０．４ｍＬの上記の溶液を室温で加えた。反応物を２時間撹拌させた。次いで、４ｍＬのヘキサンで希釈し、そしてカラムクロマトグラフィー（１００％ＡｃＯＥｔ、次いでＤＣＭ中の２５％ＭｅＯＨ）に直接かけて、６．０ｍｇ（７８％収率）の遊離アミンを、黄色の油状物として得た。
【０１４１】
[00168]遊離アミン（６．０ｍｇ、９μｍｏｌ）、ビオチン誘導体６４（８．１ｍｇ、１８μｍｏｌ）、ＮａＨＣＯ３（１．５ｍｇ、１８μｍｏｌ）を混合した。ＤＭＦ（０．３ｍＬ）を加え、そして反応物を４時間撹拌させ、次いで減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィー（１００％ＡｃＯＥｔ、次いでＤＣＭ中の５％から１１％のＭｅＯＨ）によって、次いで分離用ＴＬＣ（ＤＣＭ中の９％ＭｅＯＨで３回）によって精製して、純粋なカップリング生成物を黄色の油状物として得た。
【０１４２】
[00169]カップリング生成物を、０．６ｍＬのＤＣＭ中に溶解し、そして０℃に冷却した。ＴＦＡ（３０μＬ）及びｉＰｒ３ＳｉＨ（１．０μＬ、６μｍｏｌ）を０℃で溶液に加えた。浴を除去し、そして反応物を室温で１時間撹拌させた。溶媒をアルゴンの流れによって除去し、そして残渣をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３中の０から９％のＭｅＯＨ）によって精製して、４．０ｍｇの遊離のチオール５４（２工程で５３％）を得た。これを分離用ＴＬＣ（ＤＣＭ中の９％ＭｅＯＨで２回）によって更に精製して、純粋な試料を生物学的評価のために得た。
【０１４３】
[00170]［α］Ｄ２５＝＋５２．０°（ＣＨ３ＯＨ中でＣ＝０．０５）；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，６００ＭＨｚ）７．４８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），５．９２−５．８２（２Ｈ，ｍ），５．７２−５．６３（２Ｈ，ｍ），５．１３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），４．５９−４．５５（２Ｈ，ｍ），４．４９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．７，４．７Ｈｚ），４．４４−４．４０（３Ｈ，ｍ），４．３０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．７，４．７Ｈｚ），３．７７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ），３．６０（１Ｈ，ｓ），３．２７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ），３．２１−３．１５（５Ｈ，ｍ），２．９８−２．９１（２Ｈ，ｍ），２．７６−２．６９（３Ｈ，ｍ），２．５６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．９，６．９Ｈｚ），２．４５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．５，６．５Ｈｚ），２．３６（１Ｈ，ｍ），２．２８（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．４，７．４Ｈｚ），２．２３−２．０９（６Ｈ，ｍ），１．８１（３Ｈ，ｓ），１．７６−１．２９（２３Ｈ，ｍ），０．７４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），０．５９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，１２５ＭＨｚ）１７６．１，１７６．０，１７５．９，１７５．８，１７１．８，１７０．４，１６８，３，１６７．２，１６６．０，１４４．７，１４３．０，１４２．５，１３３．７，１３１．４，１２０．７，１２９．１，１２８．８，８４．０，７３．８，６４．３，６３．３，６１．６，５８．９，５７．０，４４．４，４３．６，４１．２，４１．０，４０．２，３８．７，３７．０，３６．９，３６．８，３５．２，３２．７，３０．１，２９．８，２９．５，２７．５，２６．９，２６．７，２６．６，２４．５，１９．８，１７．３；ＩＲ（未稀釈）３３０８，２９３０，２８５９，１６５６，１５５１，１４６２，１２６２，６６７；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚＣ５０Ｈ７２Ｎ９Ｏ８Ｓ４＋に対する計算値（Ｍ＋Ｈ）＋  １０５４．４３８１，実測値１０５４．４３４６。
【０１４４】
【化１４】
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【０１４５】
[00171]調製：
【０１４６】
【化１５】
0006785801.tif 000016
【０１４７】
[00173]遊離のベンジルアルコール５８（４２０ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）、イミダゾール（２４５ｍｇ、３．６ｍｍｏｌ）を混合し、そして１２ｍＬのＤＣＭを加えた。得られた溶液に、ＴＢＤＰＳＣｌ（５６０μＬ、２．４ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で１４時間撹拌させ、次いでＮＨ４Ｃｌ水溶液（不飽和）で処理し、ＤＣＭで希釈し、分離し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中の９％から１６％の酢酸エチル）によって精製して、５８０ｍｇ（８３％収率）のシリルエーテルＳ２を黄色の油状物として得た。
【０１４８】
[00175]１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７．７１−７．６９（ｍ，６Ｈ），７．４８−７．３７（ｍ，８Ｈ），５．３８（ｂｒｓ，１Ｈ），４．８１（ｓ，２Ｈ），４．５８（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），７．４１（ｄ，Ｊ＝８．２，２Ｈ），５．６４（ｂｒｓ，１Ｈ），４．７０（ｓ，２Ｈ），４．５２（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ），１．１１（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １６８．６，１５５．７，１４４．０，１３５．６，１３３．２，１２９．９，１２８．１，１２７．９，１２６．９，１２０．６，１１４．８，８０．８，６５．０，４２．５，２８．４（Ｘ３），２６．９（Ｘ３），１９．４；ＩＲ（未稀釈）３３５２，２９３０，２８５６，２２２７，１７０５，１５０７，１３６６，１２４７，１１０６，８２３，７００；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚＣ３３Ｈ３７Ｎ３ＮａＯ３ＳＳｉ＋に対する計算値（Ｍ＋  Ｎａ）＋  ６０６．２２１７，実測値６０６．２２１１。
【０１４９】
【化１６】
0006785801.tif 000017
【０１５０】
[00177]チアゾールニトリルＳ２（４２０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、α−メチル−システイン−ＨＣｌ５９（１８５ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ）、ＮａＨＣＯ３（９１ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ）を混合し、そして４ｍＬのメタノールを加えた。混合物にＥｔ３Ｎ（０．１９ｍＬ、１．４４ｍｍｏｌ）を加えた。７０℃で１５時間還流した後、溶媒を減圧下で除去し、そして酢酸エチルで処理した。懸濁液を１ＭのＫＨＳＯ４水溶液及び食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の９％酢酸エチル）によって精製して、１２０ｍｇ（２８％収率）の出発物質を、そして次いで（ＤＣＭ中の９％メタノール）３２０ｍｇ（６３％収率）のＳ３を、黄色の油状物として得た。
【０１５１】
[00178]１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ９．４０（ｂｒｓ，１Ｈ），７．７３（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，４Ｈ），７．４８−７．２６（ｍ，１０Ｈ），５．５６（ｂｒｓ，１Ｈ），４．８３（ｓ，２Ｈ），４．６３（ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），３．７４，（ｄ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ，１Ｈ），３．２５（ｄ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ，１Ｈ），１．５４（ｓ，３Ｈ），１．４９（ｓ，９Ｈ），１．１３（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １６８．６，１５５．７，１４４．０，１３５．６，１３３．２，１２９．９，１２８．１，１２７．９，１２６．９，１２０．６，１１４．８，８０．８，６５．０，４２．５，２８．４（Ｘ３），２６．９（Ｘ３），１９．４；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚＣ３７Ｈ４４Ｎ３Ｏ５Ｓ２Ｓｉ＋に対する計算値（Ｍ＋Ｈ）＋  ７０２．２４８６，実測値７０２．２４８４。
【０１５２】
【化１７】
0006785801.tif 000018
【０１５３】
[00179]６１（４９０ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）を、５０ｍＬのＣＨ３ＣＮに溶解した。５ｍＬのジエチルアミンを０℃で加えた。浴を除去し、そして得られた溶液を室温で２時間撹拌し、次いで蒸発し、トルエンと共沸し（２×２ｍＬ）、真空下で乾燥した。もう一つの丸底フラスコで、酸Ｓ３（４１０ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）を７５ｍＬのＤＣＭ中に溶解した。ＰｙＢＯＰ（６００ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（３００μＬ、１．７４ｍｍｏｌ）を加え、そして混合物を室温で２０分間撹拌させた。得られた溶液に、粗製アミンのＤＣＭ溶液（合計２５ｍＬ）を加えた。３時間後、反応物を濃縮し、そしてカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中の６％から２５％の酢酸エチル）に直ちにかけて、大環状化前駆体Ｓ４（６５０ｍｇ、８６％）を、黄色の泡状物として得た。
【０１５４】
[00180]１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７．７２−７．７０（ｍ，４Ｈ），７．５２（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），７．４３−７．３５（ｍ，１５Ｈ），７．２８−７．１７（ｍ，８Ｈ），６．８３（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），５．６０−５．５２（ｍ，２Ｈ），５．４１（ｂｒｓ，１Ｈ），５．３２（ｄｄ，Ｊ＝１５．４，７．３Ｈｚ，２Ｈ），４．８６−４．７８（ｍ，２Ｈ），４．６３（ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），４．３１（ｄｄ，Ｊ＝８．７，５．２Ｈｚ，２Ｈ），４．１４（ｄｄ，Ｊ＝９．０，８．０Ｈｚ，２Ｈ），３．６３，（ｄ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ，１Ｈ），３．２３（ｄ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ，１Ｈ），２．６３（ｄｄ，Ｊ＝１５．４，７．３Ｈｚ，１Ｈ）２．５０（ｄｄ，Ｊ＝１５．６，６．２Ｈｚ，１Ｈ），２．１６−２．１２（ｍ，２Ｈ），２．００−１．９３（ｍ，２Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ），１．４７（ｓ，３Ｈ），１．１２（ｓ，９Ｈ），０．９８−０．９２（ｍ，２Ｈ），０．７４（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），０．６０（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），０．０４（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １１７４．５，１７０．０，１６９．５，１６２．７，１４４．８，１４２．４，１４１．５，１３５．５，１３３．３，１３０．１，１２９．８，１２９．５，１２８．５，１２７．９，１２７．８，１２６．６，１２５．７，８０．４，７１．３，６６．６，６５．１，６３．０，５６．９，４２．３，４１．０，３９．７，３１．３，３１．１，２８．４，２６．９，２４．５，１９．３，１９．０，１７．５，１７．３，−１．４；ＩＲ（未稀釈）３３７９，３０５４，２９５９，２９３０，２８５７，１７３７，１６７５，１５０７，１４４４，１３６６，１２４９，１１６６，１１１１，８３５，７５２；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚＣ７８Ｈ８８Ｎ４ＮａＯ８Ｓ３Ｓｉ２＋に対する計算値（Ｍ＋Ｎａ）＋  １３２３．５２００，実測値１３２３．５１６５。
【０１５５】
【化１８】
0006785801.tif 000019
【０１５６】
[00181]非環式前駆体Ｓ４（５５ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ）を、５ｍＬのＤＣＭ中に溶解し、１ｍＬのＴＦＡを０℃で溶液に加えた。反応物を室温まで温まらせ、そして１６時間撹拌した。溶媒を蒸発し、そして粗製のアミノ酸をトルエンと共沸（２×２ｍＬ）して、残留ＴＦＡを除去した。次いで、粗製のアミノ酸を２ｍＬのＤＣＭ中に取込み、そして４０ｍＬのＣＨ３ＣＮ中のＤＩＰＥＡ（５０μＬ、０．２５ｍｍｏｌ）の撹拌された溶液に加えた（約０．００１Ｍまで）。得られた中程度に不透明な溶液を１０分間撹拌させてから、ＨＡＴＵ（３１ｍｇ、０．０８４ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（１１ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）のＭｅＣＮ（１０ｍＬ）溶液を滴下により加えた。反応物を２６時間撹拌させ、次いで濃縮し、そしてＡｃＯＥｔ中に再溶解した。溶液をＮＨ４Ｃｌの飽和水溶液、ＮａＨＣＯ３及び食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィー（第１のカラムに対してＤＣＭ中の９％のメタノール、そして第２のカラムに対してヘキサン中の１６％から５０％の酢酸エチル）によって精製して、１０．９ｍｇ（２４％収率）のＳ５を、黄色の泡状物として得た。
【０１５７】
[00182]［α］Ｄ２５＝＋２５．３°（ＣＨＣｌ３中でＣ＝０．１５４）；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７．６７（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，４Ｈ），７．４５−７．１３（ｍ，２５Ｈ），６．７９（ｂｒｓ，１Ｈ），５．７４−５．６４（ｍ，２Ｈ），５．４１（ｄｄ，Ｊ＝１１．５，６．０Ｈｚ，１Ｈ），５．１０（ｄｄ，Ｊ＝１７．６，８．０Ｈｚ，１Ｈ），４．８１（ｓ，２Ｈ），４．６１（ｄｄ，Ｊ＝９．４，３．７Ｈｚ，１Ｈ），４．２３（ｄｄ，Ｊ＝１７．４，１．８Ｈｚ，１Ｈ），３．８６（ｄ，Ｊ＝１１．４Ｈｚ，１Ｈ），３．１８（ｄ，Ｊ＝１１．４Ｈｚ，１Ｈ），２．７０−２．６９（ｍ，２Ｈ），２．２５−２．０１（ｍ，５Ｈ），１．８０（ｓ，３Ｈ），１．２３（ｄｄ，Ｊ＝６．９，６．４Ｈｚ，１Ｈ），１．０９（ｓ，９Ｈ），０．７２（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），０．６１（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）；１７２．５，１６９．１，１６８．９，１６５．６，１４５．０，１３５．７，１３３．３，１３０．２，１３０．０，１２９．７，１２８．０，１２７．９，１２７．７，１２６．８，１２６．２，７１．７，６６．９，６５．２，５８．０，４４．１，４１．０，４０．８，３４．１，３１．７，３１．４，２７．０，１９．５，１９．２，１７．４；ＩＲ（未稀釈）３２２７，２９５９，２８６８，１０３，１４８４，１２５０，１１９５  １０３６，７３８；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：  ｍ／ｚＣ６３Ｈ６７Ｎ４Ｏ５Ｓ３Ｓｉに対する計算値（Ｍ＋Ｈ）＋  １０８３．４０３７，実測値１０８３．４０２１。
【０１５８】
【化１９】
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【０１５９】
[00183]ＴＢＤＰＳ保護ベンジルアルコールＳ５（７．０ｍｇ、６μｍｏｌ）を、０．２ｍＬのＴＨＦ中に溶解し、ＴＢＡＦ（ＴＨＦ中の１．０Ｍ、６μＬ、６μｍｏｌ）を溶液に加えた。反応物を室温で１時間撹拌させた。溶媒を蒸発し、そして残渣をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の１から７％メタノール）によって精製して、４．６ｍｇ（９０％収率）の遊離ベンジルアルコールを、黄色の泡状物として得た。
【０１６０】
[00184]トリチルチオール（３．６ｍｇ、４μｍｏｌ）を、０．２ｍＬのＤＣＭ中に溶解した。１０μＬのＴＦＡ及びｉＰｒ３ＳｉＨ（１．７μＬ、８μｍｏｌ）を溶液に０℃で加えた。反応物を室温まで温まらせ、そして２時間撹拌した。溶媒を蒸発し、そして残渣をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の１から６％のメタノール）によって精製して、２．０ｍｇ（８４％収率）の遊離チオール５１を、黄色の泡状物として得た。
【０１６１】
[00185]１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７．５３−７．４４（ｍ，３Ｈ），７．３２（ｄｄ，Ｊ＝１０．１，０．４Ｈｚ，１Ｈ），６．８０（ｂｒｓ，１Ｈ），５．８６（ｄｄｄ，Ｊ＝１５．５，７．６，７．４Ｈｚ，１Ｈ），５．７６（ｄｄ，Ｊ＝１３．０，６．８Ｈｚ，１Ｈ），５．５８（ｄｄ，Ｊ＝１５．６，６．３Ｈｚ，１Ｈ），５．１３（ｄｄ，Ｊ＝１７．７，７．７Ｈｚ，１Ｈ），４．７８（ｓ，２Ｈ），４．６８（ｄｄ，Ｊ＝９．７，４．３Ｈｚ，１Ｈ），４．４４（ｄｄ，Ｊ＝１７．８，３．２Ｈｚ，１Ｈ），３．８７（ｄ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ，１Ｈ），３．１６（ｄ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ，１Ｈ），２．７６（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ），２．５６（ｄｄ，Ｊ＝１４．５，７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．３６（ｍ，２Ｈ），２．０９（ｄｄｄ，Ｊ＝１１．３，７．１，４．４Ｈｚ，２Ｈ），１．８４（ｓ，３Ｈ），１．２３（ｄｄ，Ｊ＝６．９，６．４Ｈｚ，１Ｈ），０．７６（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），０．６４（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚＣ２８Ｈ３５Ｎ４Ｏ５Ｓ３に対する計算値（Ｍ＋Ｈ）＋  ６０３．１７６４，実測値６０３．１７６９。
【０１６２】
実施例２．ラルガゾールのタンパク質標的の確認
[00186]ラルガゾールの薬物作用の機構的な特徴を、天然産物のＨＤＡＣｉによって結合されたタンパク質複合体の解明に向けられた実験で始めた。均一アッセイにおける生化学的特徴付けは、ＨＤＡＣ１−３の選択的阻害を示唆している。然しながら、これらの標的は、異なる制御複合体中に存在する。Ｂａｎｔｓｃｈｅｆｆ及び同僚による医薬品（合成）のＨＤＡＣ阻害剤のケモプロテオミクス研究は、均一アッセイによっては予測できなかったヒドロキサム酸及びベンズアミドＨＤＡＣ阻害剤の驚くべき複合体特異的結合を確認した（Ｂａｎｔｓｃｈｅｆｆ，ｅｔ  ａｌ．２０１１  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２９：２５５−２６５）。ラルガゾール標的複合体を公平な様式で解明するために、リガンド親和性クロマトグラフィー及び質量分析が使用される。
【０１６３】
[00187]具体的には、ラルガゾール−ビオチンを、親和性試薬として使用し、そして質量分析によって分離されるＳＩＬＡＣ（細胞培養物中のアミノ酸による安定な同位体標識化）基剤の標的確認技術を使用する（Ｏｎｇ，ｅｔ  ａｌ．２００９  ＰＮＡＳ  ＵＳ  １０６：４６１７−４６２２）。簡単には（図４）、細胞を、アルギニン及びリシンの‘軽’型又は‘重’Ｌ−Ａｒｇ−１３Ｃ６及びＬ−Ｌｙｓ−１３Ｃ６−１５Ｎ２のいずれかを含有する標識化培地中で、溶解する前に、少なくとも６回の細胞分裂で増殖する。“軽”溶菌液を、過剰の遊離ラルガゾールチオールと予備インキュベートし、一方、重は、等量のＤＭＳＯと予備インキュベートする。次いで、固定化ラルガゾール−ビオチンを‘軽’及び‘重’溶菌液に別個に加える。過剰の可溶性ラルガゾールチオールを‘軽’溶菌液に加えて、不動化化合物への結合に対してタンパク質と競合させる。次いで、‘軽’プルダウンに対する‘重’において富化されたタンパク質の相対的存在量に基づくＳＩＬＡＣ比を、ＭａｘＱｕａｎｔソフトウェア及び改良Ｔ試験を使用してモデル化する。
【０１６４】
[00188]これらの研究のために、ラルガゾールの標的確認は、一つの皮膚Ｔ細胞リンパ腫細胞系（Ｈｕｔ７８）、一つの多発性骨髄腫細胞系（ＭＭ１．Ｓ）、及び一つの急性白血病細胞系（ＭＶ４；１１）で行われる。プロテオミクスのデータを、安定な複合体を示唆するタンパク質−タンパク質相互作用の知識ベース（例えばＳＴＲＩＮＧ、Ｒｅａｃｔｏｍｅ）を使用して解析する。個別の相互作用は、免疫ブロットによる標的富化の確認を伴う、遊離ラルガゾールチオールの用量−反応に対する親和性精製によって確認される。次いでラルガゾールの標的は、対応する細胞状況における直交的遺伝子的摂動による癌特異的依存性として更に探求される（ｓｈＲＮＡ及び／又はＣａｓ９−ＣＲＩＳＰＲゲノム編集）。標的の知識は、更に、両方とも本明細書中に記載される、クロマチンの構造及び機能、並びにゲノム全体のラルガゾールチオール結合の調節に対する後期段階の研究報告を知らせる。
【０１６５】
[00189]実施例３．クロマチンの構造及び転写出力に対する機能的影響を特徴付けすることによるラルガゾールの抗増殖活性の機構の確立。
[00190]血液系腫瘍におけるＢＥＴブロモドメイン阻害剤の遺伝子座特異的転写の結果は、最近解明されている（Ｌｏｖｅｎ，ｅｔ  ａｌ．２０１３  Ｃｅｌｌ  １５３：３２０−３３４；Ｃｈａｐｕｙ，ｅｔ  ａｌ．２０１３  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２４：７７７−７９０）。これらの研究は、統合されたエピゲノミクスにおける能力：ゲノム全体のクロマチンのマーク又は因子の富化（ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ）及び転写の動態学の定量的解析（遺伝子発現のプロファイリング、ＧＥＰ）を確立した。まとめれば、これらの装置は、化合物への曝露の前後のクロマチンの構造及び機能を報告する。ラルガゾールＨＤＡＣ阻害の動態学的効果は、骨髄腫（ＭＭ１．Ｓ）及びＣＴＣＬ（ＭＪ）において、全体的な過剰アセチル化の機構的結果を理解し、そしてエピゲノミクス的な再プログラミングがＢＥＴブロモドメイン再分布を伴って起こるという仮説を試験するために研究される。
【０１６６】
[00191]具体的には、ＣｈＩＰ−Ｓｅｑが、クロマチンアセチル化の全体的マップ、ヒストンの占有率、及びＣＴＣＬ（Ｈｕｔ７８）及びＭＭ（ＭＭ１．Ｓ）細胞の転写を伴うクラスＩのＨＤＡＣ局在化データを発生し、そして統合するために使用される。クロマチン及び転写マップは、ｐａｎ−Ｈ３（ヒストン占有率）、Ｈ３Ｋ２７ａｃ及びＨ３Ｋ９／Ｋ１４ａｃ（アセチル化クロマチン）、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３（転写開始）、ＢＲＤ４（ＢＥＴブロモドメイン／クロマチン活性化補助因子占有率）、及びＲＮＡ  ＰｏｌＩＩ（転写）を含むクロマチンの状態に対する、十分に確立された代替マークに対してＣｈＰＩ−Ｓｅｑを使用して産生されるものである。クラスＩのＨＤＡＣが、活性遺伝子のプロモーターに局在化することを示すための、包括的ＨＤＡＣ１−３占有率の統合的分析は、ＨＤＡＣ並びにＭＭ及びＣＴＣＬ腫瘍ゲノム中の局所的クロマチン構造間の空間的関係を確立する。
【０１６７】
[00192]ＨＤＡＣｉによる処理は、全体的に広範なヒストンの過剰アセチル化によって、クロマチンを全体的に脱圧縮することを示しているが、然しながら、腫瘍転写出力に対するＨＤＡＣｉ処理の全体的な結果は、良好には特徴付けされていない。腫瘍細胞のクロマチンに対するＨＤＡＣｉの全体的影響を仮定すると、正確な細胞数で正規化されたクロマチンの測定値及び転写動力学は、ラルガゾールのＨＤＡＣ阻害の動力学的な絶対的影響を理解する必要がある。最近、クロマチンの状態及び遺伝子発現における細胞数で正規化された変化を測定するための高度に定量的な技術が開発されている（Ｏｒｌａｎｄｏ，ｅｔ  ａｌ．２０１４  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ９：１−８）。これらの技術は、細胞数に対するクロマチン占有率又は遺伝子発現の正規化を可能にするために、等価な細胞数に加えられる外因性スパイク−インを組み込む。更に、分析法は、クロマチン活性化補助因子の全体的再分布、並びに細胞状態の移行及び薬物処理に反応する転写出力に対するその後の影響を定量化するために確立されている（Ｂｒｏｗｎ，ｅｔ  ａｌ．２０１４  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ５６：２１９−２３１）。これらの組合せた方法を使用して、ラルガゾールで処理されたＭＭ１．Ｓ及びｈｕｔ７８細胞の動力学的クロマチン構造が、高い時間分解能で調査される（処理後０、４、１２、及び２４時間）。具体的には、Ｈ３Ｋ９／Ｋ１４ａｃ、Ｈ３Ｋ２７ａｃ、ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩ、ＢＲＤ４の細胞数で正規化された動的測定値、並びにラルガゾール処理に反応するそれぞれの時点における遺伝子発現が得られる。
【０１６８】
[00193]活性な遺伝子プロモーターにおけるクラスＩのＨＤＡＣ活性の阻害は、その後の時点で全体的なクロマチンの脱圧縮及び広範な過剰アセチル化に増大する、局所的過剰アセチル化をもたらす可能性があるものである。このように、提案される測定値の高い時間的分解能は、間接的な、そしてその後の二次的結果からの直接的な、そして初期の調節解除転写の結果を解明し、そして区別することを援助する。クロマチンの変化は、プロモーター及び遺伝子の遠位のエンハンサーにおける、遺伝子制御性ｃｉｓ要素の活性を変更することによって転写に影響することができる。利用可能なヌクレオソームを含まない領域の測定値のＡＴＡＣ−Ｓｅｑを使用して、確立された新規なｃｉｓ制御性要素の形成は、新しい利用可能な過剰アセチル化クロマチンに結合する転写因子によってマッピングされる。動的なエンハンサー組成物のコンピューターによる解析は、変化された標的遺伝子を、ラルガゾールのＨＤＡＣ阻害の抗増殖反応の可能性のある仲介物質として伴う候補の腫瘍細胞転写因子を確認する。ラルガゾールのＨＤＡＣ阻害が、クロマチン活性化補助因子の異常な動員及び再分布によって、確立された腫瘍転写プログラムの破壊を起こすことが仮定される。ラルガゾール阻害から得られるこの転写的“カオス”の正味の影響が調査され、そして選択的に調節解除された経路の確認により、そして決定的な癌遺伝子、例えばｐ２１、ＨＥＸＩＭ１、及びＭＹＣの調節解除を測定する遺伝子座特異的アッセイにより、全体的に検証される。
【０１６９】
[00194]実施例４．ゲノム全体のラルガゾールの作用の部位の空間的局在化
[00195]最後に、癌におけるラルガゾールのＨＤＡＣ阻害の影響を理解するために、エピゲノムに結合する薬物の空間分解能を可能にする薬物分子のゲノム全体のクロマチンの研究を、リガンド親和性クロマトグラフィーを、膨大な並行エピゲノムシークエシングと組合せることによって作成している。ＣｈｅｍＳｅｑは、癌のエピゲノム内の富化された結合の部位を、タンパク質標的の知識によって付勢されない様式で確認する（Ａｎｄｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．２０１４  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３２：９２−９６）。インデックススタディーにおいて、ＪＱ１  ＢＥＴブロモドメイン阻害剤のビオチニル化誘導体、ＣＤＫ９阻害剤、及びＤＮＡ結合剤ソラレンを使用した。ここで、ラルガゾール−ビオチンを、二つの方法：事前に断片化され、固定化されたクロマチン（ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＣｈｅｍＳｅｑ）及び処理された細胞からのクロマチン（ｉｎ  ｖｉｖｏのＣｈｅｍＳｅｑ）のプルダウンを使用して、ＣＴＣＬ（Ｈｕｔ７８）及びＭＭ（ＭＭ１．Ｓ）クロマチンを富化するために使用する。次いで、エピゲノムへのラルガゾール−ビオチンの結合は、（ａ）標的の共局在を確認するためのＨＤＡＣ１−３のＣｈＩＰ−Ｓｅｑデータ、（ｂ）局所的結合を確認するためのエンハンサー／プロモーターマーク、（ｃ）新規な結合領域を発見するためのヘテロクロマチンマーク、及び（ｄ）ラルガゾールチオールによって不釣り合いに結合された遺伝子が、転写反応により更に感受性となるという仮説を研究するための転写的プロファイリングデータ（実施例１９のように初期の局所的過剰アセチル化を特徴とする）と統合される。ラルガゾールの動的反応の研究は、クロマチン活性の小分子の動態学的影響を、多発性骨髄腫、びまん性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、及び心不全中で動的に特徴付けした以前に刊行された研究で知らされている（Ａｎａｎｄ，ｅｔ  ａｌ．２０１３  Ｃｅｌｌ  １５４：５６９−５８２）。
【０１７０】
[00196]データの解釈
[00197]ラルガゾールのケモプロテオミクス的な特徴付けに関して、ＭＭ１．Ｓ及びＭＶ４のための同位体標識に対する条件は、すでに確立されている（Ｔａｏｒｉ，ｅｔ  ａｌ．２００８  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １３０：１８０６−１８０７）。Ｈｕｔ７８細胞がＳＩＬＡＣ標識化に対して受入れられない場合、実験は、ペプチドレベルで化学標識を使用して、最も普通には相対的及び絶対的定量化のための等圧性タグを使用して行うことができる（ｉＴＲＡＱ；図４）（Ｒｏｓｓ，ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｍｏｌ  ＆  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ３：１１５４−１１６９）。クロマチン構造の動力学的研究は、４時間のように早く全体的変化を産生することができる。これが起こった場合、更なる３０分及び６０分の時点を加える。Ｃｈｅｍ−Ｓｅｑに関して、ラルガゾール−ビオチンが、固定化後の核クロマチンの回収の能力がないことが証明された場合、ＵＶ光親和性試薬が、付加されたベンゾ−フェノンアルキンの共役によって、ラルガゾールのために作られる（Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，ｅｔ  ａｌ．２００８  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １３０：２１８４−２１９４；Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，ｅｔ  ａｌ．２００７  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  １０４：１１７１−１１７６）。別の方法として、回収可能なビオチニル化リンカーを、ロミデプシンのシステイン機能に共役させて、ＦＤＡ認可の天然の産物の特徴付けを可能にする。
【０１７１】
[00198]実施例５．小分子及び生体分子の共役によるラルガゾールの白血病特異的治療指数の拡大
[00199]ラルガゾールの合成の利便性、強力な機構的論拠、及びＨＤＡＣ阻害の異常な抗増殖性活性は、異常に強力なラルガゾール誘導体を、標的化療法として白血病及びリンパ腫細胞に対して向けることに影響する。残念なことには、単一の薬剤としての初期相の臨床試行におけるヒトの白血病及びリンパ腫の成長を阻害するために必要な曝露を達成するために十分な治療指数は存在しない。薬物供給の最近の研究は、非常に毒性な物質を細胞区画に供給する共役戦略を規定している。典型的には、これらは、非常に毒性な薬物（例えば、ジフテリア毒素、チューブリシン（ｔｉｂｕｌｙｓｉｎ））であり、これは、疾病特異的機構に向けられていない。むしろ、標的化戦略は、治療指数拡大の一つの層である。従って、標的化戦略の対は、リンパ性腫瘍にクロマチンで標的化されたラルガゾール誘導体を供給し、天然の産物の化学の進歩及び薬物供給を橋渡しすることが提案されている。
【０１７２】
[00200]可能性及び予備的研究
[00201]癌における幅広いクラスＩのＨＤＡＣ阻害剤の使用は、文献中で支持され、そして特に強い論拠は急性白血病に存在する。リンパ性腫瘍は、ＭＹＣ主要制御転写因子の調節解除及び癌遺伝子から起こり、これは、クロマチン複合体との協力で、成長及び生存遺伝子の制御経路を駆動するために機能する。侵襲性のびまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）は、ＭＹＣ増幅及び過剰発現の高い速度を有し、そしてバーキット亜型は、ＭＹＣの再編成によって特徴づけられる。Ｔ細胞白血病は、ＮＯＴＣＨ１の変化によって典型的に示され、これは、６０％より多い事例でＭＹＣ発現を駆動する。非常に最近、ＭＹＣエンハンサー領域の局所的増幅が、急性骨髄性白血病において確認されている（Ｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．２０１３  Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ  ２７：２６４８−２６６２）。ＭＹＣからＲＮＡポリメラーゼＩＩへのクロマチン依存性シグナル伝達の破壊は、ヒストンリシンのアセチル化の経路の抑制によって達成することができる（Ｄｅｌｍｏｒｅ，ｅｔ  ａｌ．２０１１  Ｃｅｌｌ  １４６：９０３−９１６）。実際に、ＨＤＡＣ阻害は、恐らく先に記載したように、ゲノム全体のエンハンサー因子の再分布によるＭＹＣの強力な下方制御によって達成される。癌中のＭＹＣを標的とするラルガゾールのようなＨＤＡＣ阻害剤を開発するための挑戦は、狭い治療指数である。リンパ性癌細胞に非常に強力な（ｐＭＩＣ５０）ラルガゾール誘導体を供給する共役戦略、このような化合物の特徴付け、及び臨床前開発は、以下のように記載される。
【０１７３】
[00202]強力なラルガゾール誘導体の葉酸共役による腫瘍細胞への選択的な供給
[00203]リンパ性癌細胞は、葉酸に独特に依存する。速い速度の細胞の代謝回転は、新規なリボヌクレオチドの生合成のための炭素の供給源としての葉酸に対する一定の必要性を確立する。特に、プリンの生合成は、チミジル酸シンターゼの前駆体の必要量のために、遊離の葉酸の入手可能性に対して非常に感受性である。この依存は、アミノプテリン（４−アミノ葉酸）の開発による、リンパ性白血病のための最初の有効な治療的介入を創造した。類似の化学誘導体のメトトレキセート（４−アミノ，１０−メチル葉酸）は、リンパ性白血病及びリンパ腫治療の礎石である。葉酸は、葉酸受容体によって、主として成人においてＦＲＬＲ１によって細胞に活発に運搬される。葉酸に対する高い親和性結合及び減少した葉酸誘導体は、細胞膜において起こり、これにより葉酸は、エネルギー依存性の様式で更なる代謝的加工のために細胞に進入する。癌細胞におけるＦＯＬＲ１の上昇は、癌の検出及び治療のための葉酸の画像化剤及び細胞毒素への共役を促進している（Ｌｅａｍｏｎ，ｅｔ  ａｌ．２００１  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ  ６：４４−５１）。タプシガルジンの葉酸共役は、Ｔ−ＡＬＬ中のＭＹＣのＮＯＴＣＨ依存性活性化を阻害することができる。葉酸に共役した強力なラルガゾール類似体の合成は、白血病及びリンパ腫の臨床前モデルにおいて特徴付けられる。
【０１７４】
[00204]活性化された混合ピリジルジスルフィド２６−３０を調製し、そして複合体６６（図５）を調製するために既知の葉酸結合ペプチドＥＣ１１９７４と、そして複合体７８、７９（図７）を調製するためにＩＬ３と、直接クロスカップリングするために使用することができる。葉酸に対するより簡単なリンカー、例えば６５中のものも更に調査される。葉酸の最も少なく妨害されたカルボキシル基への選択的カップリングは、好結果で使用され、そして別の活性化戦略は既知である（Ｌｕｏ，ｅｔ  ａｌ．１９９７  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １１９：１０００４−１００１３）。チアゾール環を誘導体化するために開発された化学反応を使用して、葉酸の共役は、ｉｎ  ｖｉｖｏの開裂可能なエステル連結により達成することができる（７２、７３、図６）。
【０１７５】
[00205]本発明人等によって意図される更なる葉酸複合体は、以下のものを含む：
【０１７６】
【化２０】
0006785801.tif 000021
【０１７７】
及び
【０１７８】
【化２１】
0006785801.tif 000022
【０１７９】
[00208]本発明人等によって意図される更なるＩＬ−３複合体は以下のものを含む：
【０１８０】
【化２２】
0006785801.tif 000023
【０１８１】
[00209]薬物動態学的特質及びトランスレーショナル研究
[00210]Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方の研究を、ラルガゾール、化合物８−１５及び２８に対して行った。このデータは、大環状分子の変化が、親ラルガゾールの治療的活性に対して容認可能で、そして有益であるという両方の結論に導いた。有意には、ペプチド同配体（７）は、クラスＩのＨＤＡＣ阻害に対する増加された選択性を、そしてそれぞれ３４％及び４４％のラルガゾール及びラルガゾールチオールと比較した場合、６６パーセントの最高の腫瘍成長の阻害を示す。これらの化合物の分布効果は類似であるが、ペプチド同配体に対する約３０パーセントの薬物曝露の顕著な差が存在する。提案されたリガンド及び他のものに対する追跡ＰＫ研究は、ラルガゾールの治療効果を改善することを援助する。
【０１８２】
[00211]全てのラルガゾール−葉酸誘導体は、一連の機構的及びトランスレーショナルアッセイで研究される。簡単には、細胞増殖に対する影響を、一連のＭＹＣ依存性白血病及びリンパ腫細胞系：ＣＵＴＴＬ１（Ｔ−ＡＬＬ）、ＣＡＬ１（芽細胞性形質細胞様樹状細胞腫瘍；ＢＰＤＣ）、Ｄａｕｄｉ（ＤＬＢＣＬ／バーキット）、及びＭＭ１．Ｓ（ＭＭ）を使用して決定する。時間をかけた成長の阻害及びＡＴＰ含有率（ＡＴＰＬｉｔｅ）を、適当なラルガゾール、ラルガゾール−チオール、及び遊離葉酸の対照による比較用量−反応で決定する。活性化合物を、遊離葉酸との競合によって受容体媒介取込みに対して研究する。ＦＯＬＲ１依存性取込みを、ＦＯＬＲ１に対するｓｈＲＮＡノックダウン（又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９欠損）を使用して評価する。薬物療法に対する細胞の反応を、細胞サイクルの停止（フローサイトメトリー）、アポトーシス（アネキシンＶ染色）、及びクロマチンの薬物力学的過剰アセチル化（免疫ブロット、免疫蛍光）に対して評価する。重要なことは、固形腫瘍のサブセットがＦＯＬＲ１を過剰発現し、そして幾つかは胎児性ＦＯＬＲ２葉酸運搬体を再発現する。これらの集中した研究は、固形腫瘍における共同研究に対する新しい機会を発見するための細胞系のプロファイリングにより、血液癌において増大することができる。
【０１８３】
[00212]顕著な活性（ｎＭ）を示している化合物は、ｉｎ  ｖｉｖｏの考察のために  前進される。簡単には、試験物品の薬物動態及び急性毒性は、確立されたプロトコルを使用して、Ｂａｌｂ／ｃマウスで評価される。これらのデータは、リンパ性腫瘍のマウスモデルにおける効力研究の多剤投与療法戦略を確立するために使用される。治療剤としてのラルガゾール葉酸誘導体は、自然発症のＤＬＢＣＬを持つイヌにおいて研究することができる（Ｃｈｉｌｄｒｅｓｓ，ｅｔ  ａｌ．２０１４  Ａｍ  Ｊ  Ｖｅｔ  Ｒｅｓ  ７５：１８７−１９４）。６８ａ及び／又は７３ｂ（選択はＰＫ研究後に行われる）の生物学的に有効な投与量（ＢＥＤ）は、自然発症のＮＨＬを持つイヌにおいて、薬物動力学的及び薬物動態学的に集中的な第Ｉ相試行の完了によって決定される。全体的なヒストンアセチル化の変化は、一次の生物学的終点を構成する。二次の終点は、毒性／有害効果並びに増殖及びアポトーシスマーカーの変化を含む。結果は、ＮＨＬ及び他のＦＲ発現性腫瘍を持つイヌにおける葉酸複合体（６８ａ又は７３ｂ）の効力研究を可能にする。初期の許容性を決定し、そして顧客が所有するイヌの研究のための出発投与量を確立するために、第０相のマイクロドースのＰＫ研究を、繁殖されたイヌで三つの目的で完了する。簡単には、これらのイヌは、予備的なマウスの許容性研究に基づく非比例的ＭＴＤの概略１／１０に対応する投与量を受ける。次いで７２時間のプラズマＰＫを行い、そして２週間の休薬後、マウスの曝露に基づく生物学的に有効な投与量の予測が外挿される。２週間の休薬後、この計算された投与量を、同じイヌに３日間毎日投与し、ＰＫを繰り返し、そして許容性を毎日の検査及び臨床病態によりモニターする。ＰＢＭＣヒストンのアセチル化の変化は、先に記載した方法（Ｗｉｔｔｅｎｂｕｒｇ，ｅｔ  ａｌ．２０１０  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １６：４８３２−４８４２）を使用して３日後に評価する。
【０１８４】
[00213]これらの研究及び許容可能なイヌ出発投与量の確立の完了後、動物癌センターに患者として提示された自然発症ＮＨＬを持つイヌは、許容性、ＰＫ及び生物学的影響（腫瘍及びＰＢＭＣにおけるヒストンアセチル化の調節、増殖／アポトーシスマーカーの変化）を評価する葉酸複合体の第Ｉ相臨床試行に登録される（Ｗｉｔｔｅｎｂｕｒｇ，ｅｔ  ａｌ．２０１１  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６７：８３−９２）。投与量の増大は、薬物曝露の３日後の標的調節の評価を伴う標準的な３＋３の設計に従う。全ての有害な影響は、予め格付けされる（Ｖａｉｌ，ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｖｅｔ  Ｃｏｍｐａｒ  Ｏｎｃｏｌ  ２：１９４−２１３）。まとめれば、これらの研究は、動物及びヒトの血液系腫瘍のためのＨＤＡＣ阻害剤に基づく療法の新しいパラダイムを確立する。
【０１８５】
[00214]実施例６．生体共役反応によるリンパ性癌細胞へのラルガゾール誘導体の選択的な供給
[00215]リンパ性腫瘍に対する標的化ラルガゾール治療のための別の戦略は、生体共役反応によって達成することができる。細胞毒性タンパク質、小分子、又は放射性同位元素と共役した生体分子（例えば免疫グロブリン）の確立された効力は、更なる疾病特異的活性のための経路標的化薬剤の連結に対する機会を作りだす。従って、ラルガゾールと共役した生物学的薬剤は、前臨床研究のために、そして最終的に治療剤開発のために開発される。実際に、ラルガゾールの亜鉛と結合したチオールは、操作されたタンパク質上のシステイン残基への生体共役反応に対する独特な機会を提供する。ラルガゾール−チオールは、ＡＬＬ及びＢＰＤＣ療法として、リンパ性特異的サイトカイン（インターロイキン−３；ＩＬ３）に共役することができる。ＩＬ３は、高い効力で、そして特異的にＣＤ１２３（ＩＬ３受容体）に結合し、これは、免疫シグナルを伝達するヘテロダイマーとしてＣＤ１３１に結合する。リンパ球系細胞上のＣＤ１２３の選択的発現は、ＩＬ３−毒素複合体（例えば、ジフテリア毒素；ＤＴ）の発生に導く。これらの複合体は、前臨床モデルにおいて、研究用薬剤としてのＩＬ３−共役毒素の臨床開発に導くマウスにおける制約された毒性を伴う、顕著な抗白血病効力を証明している。小分子複合体の利点は、恐らく、ここのような、中和化抗体の減少した危険性である。
【０１８６】
[00216]ラルガゾール誘導体をＩＬ３に共役するために、先ず組換えヒトＩＬ３をＥ．ｃｏｌｉ中で調製し、許容的付加部位において独特な反応性システインを保有するように操作される。チアゾール環を誘導体化するために開発された上述の化学反応を使用して、混合ジスルフィドＩＬ３−複合体７５が作られる。これらの標的化された薬物複合体は、デプシペプチド（Ｘ＝Ｏ）及びペプチド同配体（Ｘ＝ＮＨ）系列の両方で調製される。
【０１８７】
[00217]上記のように、ＩＬ３−ラルガゾールの複合体は、一連の白血病及びリンパ腫細胞系：ＣＵＴＴＬ１（Ｔ−ＡＬＬ）、ＣＡＬ１（芽細胞性形質細胞様樹状細胞腫瘍；ＢＰＤＣ）、Ｄａｕｄｉ（ＤＬＢＣＬ／バーキット）、及びＭＭ１．Ｓ（ＭＭ）を使用して細胞増殖に対する影響のために研究される。ここで、（ＣＡＬ１）を発現し、そして（ＭＭ１．Ｓ）を発現していない細胞系のＩＬ３受容体を、ＩＬ３仲介の細胞毒性を計測するために使用する。時間をかけた成長の阻害及びＡＴＰ含有率（ＡＴＰＬｉｔｅ）を、適当なラルガゾール、ラルガゾール−チオール、及び遊離ＩＬ３の対照による比較用量−反応で決定する。活性化合物を、遊離な過剰のＩＬ３との競合による受容体媒介取込みに対して研究する。ＣＤ１２３及びＣＤ１３１依存性取込みを、これらの受容体に対するｓｈＲＮＡノックダウン（又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９欠損）を使用し、対となった細胞系を使用して評価する。薬物療法に対する細胞の反応を、細胞サイクルの停止（フローサイトメトリー）、アポトーシス（アネキシンＶ染色）、及びクロマチンの薬力学的過剰アセチル化（免疫ブロット、免疫蛍光）に対して評価する。
[00218]データの解釈
[00219]葉酸と共役したラルガゾールは、恐らく、ＦＯＬＲ１依存性の様式で細胞に進入する。然しながら、効力の制約は、もしある場合、分子のリンカー領域に関連することができる。この場合、ペプチジル特徴を増加することを含む別のリンカー戦略が確立されている（Ｈｅｎｎｅ，ｅｔ  ａｌ．２００６  Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ  １６：５３５０−５３５５）。ポリカチオンの可能性を、更に、細胞取込みを促進するために使用することもできる。記載したように、葉酸−及びＩＬ３−複合体研究に対して、開発に対する新しい予期しない機会を得るために、細胞系スクリーニングが使用される。
【０１８８】
[00220]実施例７．エピジェネティックなＨＤＡＣ阻害剤療法に対する耐性の遺伝子的機構の確認
[00221]薬物作用の機構を理解し、ラルガゾール治療に対する臨床耐性を予測し、そしてＦＤＡ認可のＨＤＡＣ阻害剤に対する臨床耐性を説明するための努力において、エピジェネティックなＨＤＡＣ阻害剤耐性の遺伝子的決定因子を、一倍体遺伝子スクリーニング及びＣＲＩＳＰＲ耐性選択を使用して解明する。ＨＤＡＣｉ誘発細胞死のための遺伝子的要求を決定するために、二つの相補的遺伝子戦略：一倍体遺伝子スクリーニング及びＣａｓ９−ＣＲＩＳＰＲゲノム編集を使用する新技術を提案する。
【０１８９】
[00222]一倍体遺伝子スクリーニングを使用するＨＤＡＣ阻害剤効力の遺伝子的決定因子の確認
[00223]ヒトの細胞で行われた一倍体遺伝子スクリーニングは、薬物耐性の機構を特徴づけるために独特の機会を提供する。（ニア）一倍体細胞系、例えばレトロウイルスのジーントラップベクターで感染されたＫＢＭ７白血病細胞系の大規模な挿入変異は、ノックアウト細胞の不均一混合物を効果的に作り出す（Ｃａｒｅｔｔｅ，ｅｔ  ａｌ．２００９  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６：１２３１−１２３５）。ジーントラップ挿入は、ゲノム全体で、優先的には、活発に転写された遺伝子で起こり、ゲノムの遺伝子座を破壊し、そして停止コドンにカップリングした強力なスプライス（ｓｐｉｃｅ）受容体部位により、根底にある転写物のトランケーションを与える（Ｃａｒｅｔｔｅ，ｅｔ  ａｌ．２０１１  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２９：５４２−５４６）。これは、真のヌル対立遺伝子を発生するための手軽な方法であり、そして従って、ノックアウトにおいて、ラルガゾール、並びにＦＤＡ認可の構造的に異なるＨＤＡＣ阻害剤のＳＡＨＡ及びＦＫ２２８に対する耐性を与える遺伝子を明らかにすることを可能にする、機能喪失型の表現型を作り出す直接のプラットフォームである。
【０１９０】
[00224]１×１０８個の一倍体細胞の集団を、重度に異変誘発し、そして先に列挙したそれぞれの薬剤の選択的圧力で滴定して、約２×１０４個の耐性クローンのクローン増殖を得る（図８Ａ）。この誘発された選択的圧力の著しい厳密さは、一倍体の遺伝子をバーコード化ライブラリー（以下に例示）に基づく遺伝子スクリーニング法から誘発し、そして従って、非常に明白な表現型の根底にあり、そして調節効果において大きい振幅の遺伝子を明白にするために最良に適している。それと一致して、一倍体遺伝子スクリーニングは、主として、細胞取込み機構又は薬物代謝のような薬理学的過程に関係する明らかにされた遺伝子を有する。ラルガゾール、ＳＡＨＡ、及びＦＫ２２８の構造的多様性を仮定すると、化学種選択的な遺伝子−薬物の相互作用は、代償機構に関係し、そしてそれに必要な経路を解明することが予想される。与えられた遺伝子における挿入の富化の有意性は、これを、無選別の細胞集団のかなり大きい対照データーセットと比較することによって計算される。候補遺伝子は、無選別のプールと比較してジーントラップ挿入で高い富化を示し、そしてＣＲＩＳＰＲ仲介の機能喪失による皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ；Ｈｕｔ７８、ＭＪ）及び多発性骨髄腫（ＭＭ１Ｓ、ＯＭＰ−２）に対する異なった疾病関連細胞系、並びに過剰発現研究で確認されている。
【０１９１】
[00225]実施例８．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９による機能的遺伝子スクリーニングを使用するＨＡＤＣ阻害剤の効力の遺伝子的決定因子の確認
[00226]一倍体遺伝子スクリーニングが、上流の過程、例えば細胞の利用可能性又は薬物代謝に関係する遺伝子を検出するために十分に強力であることは証明されているが、これらは、生物学的代償機構に関係する修飾因子遺伝子を検出するためにはより強力ではない。これは、普通に適用される選択的圧力の厳密さに関係する。更に、この戦略は、二つの現時点で利用可能なヒトの一培体細胞系のＫＢＭ７及びＨＡＰ１に制限され、そしてその結果、ＣＴＣＬ及びＭＭのような疾病関連の設定においては、容易に行うことができない。従って、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を使用する機能的遺伝子スクリーニングによるＨＤＡＣ阻害に対する感受性を調節する遺伝子を確認する直交的方法が提案されている（図８Ｃ）。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系は、挿入欠失遺伝をヒトゲノムの一定の遺伝子座に導入することによって、完全なヌル対立遺伝子を選択的に作り出す強力な道具として確立され、ここで合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が、Ｃａｓ９タンパク質を興味の対象となる部位に補充する（Ｈｓｕ，ｅｔ  ａｌ．２０１４  Ｃｅｌｌ  １５７：１２６２−１２７８）。その後、Ｃａｓ９は、配列特異的ヌクレアーゼ機能を実行して、ＤＮＡ二重螺旋の破壊を導入し、これは、非均一性の末端結合の非常に誤りがちな方法によって修復され、最終的に未成熟終止コドン及び非機能的遺伝子産物に導く、挿入又は欠失のいずれかを残す。最近、この方法は、異なったｓｇＲＮＡのライブラリーを安定に発現し、そしていずれもの与えられたｓｇＲＮＡの存在量を、高度な並行シークエンシングによって決定することができる、ゲノムスケールのプールされたスクリーニングを可能にするのために高度に多重化されている（Ｓｈａｌｅｍ，ｅｔ  ａｌ．２０１４  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４３：８４−８７）。
【０１９２】
[00227]最新の１２０，０００個のｓｇＲＮＡガイドライブラリーが、更に効率的なウイルス感染力を可能にする第二世代のベクター系を使用して、好結果にパッケージ化されている（Ｓａｎｊａｎａ，ｅｔ  ａｌ．２０１４  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １１：７８３−７８４）。この技術は、関連する細胞状況において、そしてより少なく厳密な選択的圧力を使用して、遺伝子−薬物相互作用の確認を可能にする。従って、ゲノムスケールのＣＲＩＳＰＲスクリーニングは、ＨＤＡＣ阻害剤が臨床的に認可された指示であるＣＴＣＬ（ＨＵＴ７８）及びＭＭ（ＭＭ１．Ｓ）中で、そしてラルガゾール誘導体によるＨＤＡＣ阻害剤治療を拡大するために急性白血病（ＭＶ４；１１）中で行われる。ＤＯＴ１Ｌリシンメチルトランスフェラーゼ阻害剤のＥＰＺ−５６７６中で培養されたＭＶ４；１１白血病細胞に対するスクリーニングは、すでに完了し（図８Ｄ）、この研究の可能性を確立している。簡単には、先ず、細胞を、Ｃａｓ９を発現しているレンチウイルス構築物で、そしてその後、１２０，０００個のｓｇＲＮＡのレンチウイルスのプールで８００倍の被覆度で感染する。形質導入された細胞の集団を、選択下で更に１０日間拡大させて、全集団の完全な対立遺伝子修飾を可能にする。その後、細胞のプールを、３日間の用量−反応実験でＥＣ８０である濃度において、ラルガゾール、ＳＡＨＡ、ＦＫ２２８と共に選択する。選択的圧力は、少なくとも６回の集団の倍増のために維持して、それぞれの条件における増殖の利益を与える、ｓｇＲＮＡに対する十分な富化を可能にする。それぞれのプールからの生存画分を、超並列シークエンシングによって連続的に追跡する。処理されたプールの生存画分中の富化された機能喪失対立遺伝子を、６個の異なるｓｇＲＮＡを使用する集中的な、そして細胞系の拡大した系列の実験で検証する。レスキュー実験を、的確な効果を示すために、それぞれの候補遺伝子をコードするｃＤＮＡを再導入することによって行う。
【０１９３】
[00228]データの解釈
[00229]二つの直交的遺伝子スクリーニング法を組合せることは、ラルガゾール及び二つの構造的に多様なクラスＩのＨＤＡＣ阻害剤、ＳＡＨＡ及びＦＫ２２８による処理後の、細胞死を誘発するために必要である遺伝子の確認を可能にする。これらの薬剤の遺伝子的決定因子の図表化は、癌におけるＨＤＡＣ阻害に対する耐性の出現、及び機構的に理解されたバイオマーカーの臨床使用のために供給することへの理解を改善する筈である。個々のＨＤＡＣ阻害剤の修飾因子遺伝子を交差することによる差別分析は、化学種選択的並びに化学種非依存的遺伝子−薬物相互作用の間を区別する筈である。遺伝子−薬物相互作用ネットワークの全体的解析は、ＨＤＡＣ阻害剤効力及びＨＤＡＣ阻害剤に関係する薬物組合せのための合理化戦略の援助を管理する経路に光を当てることが予想される。更なる確立されたスクリーニング戦略、例えば遺伝子全体のｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はＯＲＦｅｏｍｅスクリーニングは、薬物耐性に対する遺伝子的寄与体を確立するために探求することができる。これらの研究は、機能的に検証された葉酸共役又はＩＬ３共役ラルガゾール試薬を入手した場合に繰返すことができる。
【０１９４】
[00230]実施例９．Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）における葉酸受容体の発現
[00231]Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）は、形質転換されたＴ細胞前駆体の攻撃的で、そして制御されない増殖である。多重戦略が、癌の治療のための高い毒性の薬物を供給するために開発されている。本明細書中に記載されるものは、癌細胞に特異的に阻害剤を移動するための葉酸基剤の方法を使用する効率のよい薬物供給のための一般的戦略である。
【０１９５】
[00232]葉酸は、二つの機構：１）減少した葉酸運搬体（ＲＦＣ）、又は２）実質的に正常な細胞中に非存在であるが、しかし葉酸に対して高い親和性を持つ葉酸受容体（ＦＲ）によって細胞に進入する。ＦＲファミリーは、四つの異なったタンパク質：ＦＲ１−４又はα、β、γ、δからなる（Ａｎｔｏｎｙ，Ａ．Ｃ．１９９２  Ｂｌｏｏｄ  ７９：２８０７−２８２０；Ａｎｔｏｎｙ  １９９６  Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  １６：５０１−５２１）。証拠の幾つかの系統は、ＦＲが、癌細胞を含む急速に分裂する細胞中に異常に発現することを示唆している（Ｌｙｎｎ，ｅｔ  ａｌ．２０１５  Ｂｌｏｏｄ  １２５：３４６６−３４７６；Ｒｏｓｓ，ｅｔ  ａｌ．１９９９  Ｃａｎｃｅｒ  ８５：３４８−３５７；Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．２０００  Ｂｌｏｏｄ  ９６：３５２９−３５３６）。
【０１９６】
[00233]ＦＲ２は、活性化されたマクロファージ中で、そして急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）中で恒常的に過剰発現する（Ｐａｎ，ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｂｌｏｏｄ  １００：５９４−６０２）。白血病細胞の葉酸代謝に対する高い依存性のために、Ｔ−ＡＬＬ細胞はこれらの細胞表面でＦＲを発現することができることが推測される。この仮説を試験するために、ＦＲ１及びＦＲ２のｍＲＮＡ転写レベルを、１７種のＴ−ＡＬＬ細胞系及び３種の原発性白血病試料で、ＲＴ−ｑＰＣＲによって分析した。ＦＲ２は、全ての白血病の試料中で発現し、一方、ＦＲ１発現は、試験された２／２０の場合においてのみ測定可能であるように見受けられた（データは示されていない）。アイソフォーム特異的ＦＲ２抗体による９種のＴ−ＡＬＬ細胞系からの溶菌液のウェスタンブロット（ＷＢ）は、試料の全てにわたるＦＲ２の発現を証明した（図９）。
【０１９７】
[00234]実施例１０．ラルガゾール−ペプチド葉酸の合成（エステルリンカー）
【０１９８】
【化２３】
0006785801.tif 000024
【０１９９】
[00235]調製：
【０２００】
【化２４】
0006785801.tif 000025
【０２０１】
[00236]Ｂｏｃ−アミン１（４２ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）を、２ｍＬのＤＣＭ中に溶解し、０．２ｍＬのＴＦＡを溶液に０℃で加えた。反応物を室温まで温まらせ、そして２時間撹拌した。溶媒を蒸発し、そして粗製のアミノ酸をトルエンと共沸（２×２ｍＬ）して、残留ＴＦＡを除去した。酸２（４６ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）を５ｍＬのＤＣＭ中に溶解した。ＰｙＢＯＰ（７３ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（６３μＬ、０．３６ｍｍｏｌ）を加え、そして混合物を室温で２０分間撹拌させた。得られた溶液に、粗製アミンのＤＣＭ溶液（合計２ｍＬ）を加えた。４時間後、反応物を濃縮し、そしてカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中の１６％から３３％の酢酸エチル）にかけて、結晶化前駆体３を、黄色の泡状物として得た。
【０２０２】
[00237]１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７．６７（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ），７．４８（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），７．４０−７．１４（ｍ，２３Ｈ），６．８５（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），６．７２（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），５．４５−５．３０（ｍ，３Ｈ），４．８０（ｓ，２Ｈ），４．６６（ｄｄ，Ｊ＝５．２，３．２Ｈｚ，１Ｈ），４．５８（ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ），３．９６（ｄｄ，Ｊ＝８．３，７．１Ｈｚ，１Ｈ），３．５８（ｍ，１Ｈ），３．５２（ｓ，３Ｈ），３．２１（ｄｄ，Ｊ＝１１．５，１１．３Ｈｚ，１Ｈ），２．５３−２．４２（ｍ，２Ｈ），２．１３−２．００（ｍ，４Ｈ），１．４６（ｓ，９Ｈ），１．４５（ｍ，２Ｈ），１．３２−１．３０（ｍ，２Ｈ），１．０９（ｓ，９Ｈ），０．７４（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），０．５９（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １７５．１，１７１．４，１６９．５，１６７．３，１６３．０，１５５．７，１４４．８，１４３．８，１４２．５，１４１．８，１４１．２，１３６．１，１３４．９，１３３．２，１３０．８，１３０．９，１３０．３，１３０．１，１２９．６，１２９．５，１２９．２，１２８．９，１２８．３，１２７．２，１２６．２，１２５．９，１２５．０，８５．４，８０．４，７７．９，７０．９，６６．５，６５．１，５８．４，５２．２，５１．０，４７．６，４６．５，４２．３，４１．０，３８．７，３１．３，２８．３，２６．８，１９．３；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚＣ６９Ｈ７９Ｎ５ＮａＯ７Ｓ３Ｓｉ＋に対する計算値（Ｍ＋Ｎａ）＋  １２３６．４８０３，実測値１２３６．４７２６。
【０２０３】
【化２５】
0006785801.tif 000026
【０２０４】
[00239]上記で得た非環式前駆体３を、トルエンと共沸（２×２ｍＬ）して、残留ＡｃＯＥｔを除去し、次いでＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ（１４ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）と混合した。溶媒（ＴＨＦ・ＭｅＯＨ・Ｈ２Ｏ、１＋１＋１．５ｍＬ）を加え、そして反応混合物を２．５時間撹拌させた。反応混合物を５ｍＬの水で希釈し、次いでｐＨを１ＮのＨＣｌを使用して２に調節した。有機溶媒を蒸発し、そして残った水層をＤＣＭ（３×５ｍＬ）で抽出し、次いでＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして蒸発した。粗製の酸を２．５ｍＬのＤＣＭ中に溶解し、０．５ｍＬのＴＦＡを溶液に０℃加えた。反応物を室温まで温まらせ、そして３時間撹拌した。溶媒を蒸発し、そして粗製のアミノ酸をトルエンと共沸（２×２ｍＬ）して、残留ＴＦＡを除去した。次いで粗製のアミノ酸を７０ｍＬの溶媒（ＭｅＣＮ−ＤＣＭ、１：１、容量／容量）中に取込み、そしてＤＩＰＥＡ（０．１ｍＬ、０．５７ｍｍｏｌ）を加えた。得られた中程度に不透明な溶液を１０分間撹拌させてから、ＨＡＴＵ（５０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（１８ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を１４時間撹拌させ、次いで濃縮し、そしてＡｃＯＥｔ中に再溶解した。溶液を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液、ＮａＨＣＯ３及び食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィー（第１のカラムに対してＤＣＭ中の０％から６％のＡｃＯＥｔ、そしてＰＬＴＣに対してＤＣＭ中の２５％ＡｃＯＥｔ）によって精製して、１２ｍｇ（５工程で１７％収率）の４を、白色の泡状物として得た。
【０２０５】
[00240]１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ２Ｃｌ２）δ  ７．７１（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，４Ｈ），７．４７−７．２１（ｍ，２２Ｈ），６．６７−６．６３（ｍ，３Ｈ），５．５８−５．４２（ｍ，３Ｈ），５．０７（ｄｄ，Ｊ＝１７．４，８．９Ｈｚ，１Ｈ），４．８６（ｓ，２Ｈ），４．４８（ｄｄ，Ｊ＝４．６，３．１Ｈｚ，１Ｈ），４．２０（ｄ，Ｊ＝１６．９Ｈｚ，１Ｈ），３．７２（ｄ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ，１Ｈ），３．２８（ｄ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ，１Ｈ），２．６８（ｄｄ，Ｊ＝１４．９，４．２Ｈｚ，１Ｈ），２．５６−２．３３（ｍ，２Ｈ），２．３４−２．００（ｍ，６Ｈ），１．８０（ｓ，３Ｈ），１．１２（ｓ，９Ｈ），０．７５（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），０．４５（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ）。
【０２０６】
【化２６】
0006785801.tif 000027
【０２０７】
[00241]トリチルチオール４（１２ｍｇ、１１μｍｏｌ）を、０．５ｍＬのＤＣＭ中に溶解し、２５μＬのＴＦＡ及びｉＰｒ３ＳｉＨ（４．６μＬ、２２μｍｏｌ）を溶液に０℃で加えた。反応物を室温まで温まらせ、そして３０分間撹拌した。溶媒を蒸発し、そして残渣をトルエンと共沸（２×２ｍＬ）して、残留ＴＦＡを除去した。
【０２０８】
[00242]粗製のチオールを、０．５ｍＬのＤＣＭ中に溶解し、そして０℃に冷却した。混合物をＥｔ３Ｎ（１５μＬ、０．１１ｍｍｏｌ）及び塩化オクタノイル（３．７μ、２２μｍｏｌ）で連続して処理した。反応物を室温まで温まらせ、そして２時間撹拌した。反応物を０℃に冷却し、そして０．１ｍＬの３ＮのＮＨ４ＯＨでクエンチしてから、濃縮し、そしてクロマトグラフ（ＤＣＭ中の２０％ＡｃＯＥｔ）にかけて、チオエステルを得た。
【０２０９】
[00243]ＴＢＤＰＳ保護されたチオエステル（６．２ｍｇ、６．４μｍｏｌ）を、０．５ｍＬのＤＭＦ中に溶解し、そしてＴＡＳＦ（３．５ｍｇ、１２．８μｍｏｌ）を室温で加えた。反応物を室温まで温まらせ、そして６時間撹拌した。溶媒を蒸発し、そして残渣をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の５０％から７５％のＡｃＯＥｔ）によって精製して、２．０ｍｇ（３工程で２５％収率）の５を、黄色の泡状物として得た。
【０２１０】
[00244]１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ２Ｃｌ２）δ  ７．４８−７．４１（ｍ，４Ｈ），６．７４−６．６６（ｍ，３Ｈ），５．６４−５．３７（ｍ，３Ｈ），５．１６−５．０８（ｍ，１Ｈ），４．７４（ｓ，２Ｈ），４．５４（ｄｄ，Ｊ＝１２．７，０．９Ｈｚ，１Ｈ），４．４４（ｄｄ，Ｊ＝１７．４，１．４Ｈｚ，１Ｈ），３．７５（ｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，１Ｈ），３．２９（ｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，１Ｈ），２．９３−２．８７（ｍ，３Ｈ），２．６６−２．２８（ｍ，７Ｈ），１．８７（ｓ，３Ｈ），１．６２−１．６１（ｍ，３Ｈ），０．９０−０．８６（ｍ，３Ｈ），０．７２（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），０．４１（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）。
【０２１１】
【化２７】
0006785801.tif 000028
【０２１２】
[00246]ベンジルアルコール５（２ｍｇ、２．７μｍｏｌ）を、保護された葉酸（２．２ｍｇ、３．３μｍｏｌ）と混合した。次いで混合物を０．５ｍＬのＤＣＭ中に取込み、そしてＥｔ３Ｎ（２μＬ、１４μｍｍｏｌ）を加えた。得られた黄色の溶液に、少量のＤＭＡＰ及びＥＤＣＩ（１．１ｍｇ、５．５μｍｏｌ）を加えた。反応物を２０時間撹拌させ、次いで濃縮し、そして分離用ＴＬＣ（ＤＣＭ：ＡｃＯＥｔ：ＭｅＯＨ＝５：１０：２、容量／容量／容量）によって精製して、２．５ｍｇのカップリング生成物を得た。上記で得た保護された葉酸（２．５ｍｇ、１．８μｍｏｌ）を０．３ｍＬのＤＭＦ中に溶解し、そしてＴＡＳＦ（２．５ｍｇ、９μｍｏｌ）を室温で加えた。反応物を室温まで温まらせ、そして１８時間撹拌した。溶媒を蒸発し、そして残渣を分離用ＴＬＣ（ＣＨＣｌ３中の２５％ＭｅＯＨ）によって精製して、エステルリンカーを伴うラルガゾールペプチド葉酸７を得た（１．６ｍｇ、２工程で５０％収率）。
【０２１３】
[00247]１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ−ＣＤ２Ｃｌ２＝５：１，ｖ／ｖ）δ  ８．６８（ｓ，１Ｈ），８．５５（ｓ，１Ｈ），７．６６（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），７．４６（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．３９（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），６．７０（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），５．６５−５．５３（ｍ，３Ｈ），５．１７（ｄ，Ｊ＝１７．１Ｈｚ，１Ｈ），５．０７（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），４．３６（ｄ，Ｊ＝１７．１Ｈｚ，１Ｈ），３．９８（ｄｄ，Ｊ＝１３．２，６．６Ｈｚ，１Ｈ），３．６９−３．５９（ｍ，２Ｈ），３．３９（ｍ，１Ｈ），３．０５（ｄｄ，Ｊ＝１４．５，７．７Ｈｚ，１Ｈ），２．９０（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），２．６９−２．２９（ｍ，６Ｈ），２．１５（ｍ，１Ｈ），１．８６（ｓ，３Ｈ），１．６３−１．６１（ｍ，２Ｈ），１．２８（ｍ，１０Ｈ），０．８８（ｍ，３Ｈ），０．７２（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），０．３９（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚＣ５５Ｈ６７Ｎ１２Ｏ１０Ｓ３＋に対する計算値（Ｍ＋Ｈ）＋  １１５１．４２６０，実測値１１５１．４２５８。
【０２１４】
[00248]実施例１１．ラルガゾール−ペプチド葉酸（アミドリンカー）の合成
【０２１５】
【化２８】
0006785801.tif 000029
【０２１６】
【化２９】
0006785801.tif 000030
【０２１７】
【化３０】
0006785801.tif 000031
【０２１８】
[00249]調製
【０２１９】
【化３１】
0006785801.tif 000032
【０２２０】
[00250]Ｂｏｃ−アミン１（４２０ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）を、１０ｍＬのＤＣＭ中に溶解し、１ｍＬのＴＦＡを溶液に０℃で加えた。反応物を室温まで温まらせ、そして２時間撹拌した。溶媒を蒸発し、そして粗製のアミノ酸をトルエンと共沸（２×２ｍＬ）して、残留ＴＦＡを除去した。酸８（４７０ｍｇ、約０．７２ｍｍｏｌ、Ｒ＝Ｂｏｃ又はＨ、約１：１）を５０ｍＬのＤＣＭ中に溶解した。ＰｙＢＯＰ（７３０ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（６３０μＬ、３．６ｍｍｏｌ）を加え、そして混合物を室温で２０分間撹拌させた。得られた溶液に、粗製アミンのＤＣＭ溶液（合計１０ｍＬ）を加えた。４時間後、反応物を濃縮し、そして直ちにカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の１６％から３３％の酢酸エチル）にかけて、微結晶化前駆体を、黄色の泡状物として得た。
【０２２１】
[00251]Ｒ＝Ｈに対して，１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ８．０４（ｍ，１Ｈ），７．６７（ｍ，１Ｈ），７．６１−７．５８（ｍ，２Ｈ），７．３６−７．３４（ｍ，１０Ｈ），７．２７−７．１４（ｍ，１３Ｈ），６．６３（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），６．４６（ｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，１Ｈ），５．８７（ｂｒｓ，１Ｈ），５．４６（ｄｄｄ，Ｊ＝１５．４，６．８，６．３Ｈｚ，１Ｈ），５．３７−５．３１（ｍ，２Ｈ），４．７６（ｍ，１Ｈ），４．５７（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），４．３１（ｍ，２Ｈ），３．９３（ｄｄ，Ｊ＝８．９，８．６Ｈｚ，２Ｈ），３．６７（ｍ，２Ｈ），３．５６（ｍ，１Ｈ），３．５３（ｓ，３Ｈ），３．４５（ｄ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ，１Ｈ），３．１９（ｄ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ，１Ｈ），２．５２（ｍ，２Ｈ），２．１３−１．９８（ｍ，２Ｈ），１．７３（ｍ，１Ｈ），１．４４（ｓ，１２Ｈ），１．２６−１．２０（ｍ，４Ｈ），０．７７（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），０．６２（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １７４．４，１７１．７，１６９．８，１６７．４，１６２．３，１４８．０，１４４．８，１４１．６，１３７．８，１３４．２，１３２．３，１３０．６，１３０．５，１３０．３，１２９．６，１２９．５，１２９．４，１２７．８，１２７．６，１２６．５，１２４．５，８５．５，８０．４，６６．５，５８．６，５１．７，４７．２，４７．１，４３．７，４２．３，４０．６，３８．６，３１．４，３１．３，３０．５，２９．６，２４．１，１９．２，１８．４，１８．１，１７．０，１４．１，１２．６；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚＣ５９Ｈ６５Ｎ７ＮａＯ１０Ｓ４＋に対する計算値（Ｍ＋  Ｎａ）＋  １１８２．３５６８，実測値１１８２．３５８３。
【０２２２】
【化３２】
0006785801.tif 000033
【０２２３】
[00252]上記で得た非環式前駆体９を、トルエンと共沸（２×２ｍＬ）して、残留ＡｃＯＥｔを除去し、次いでＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ（１３９ｍｇ、３．３ｍｍｏｌ）と混合した。溶媒（ＴＨＦ−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ、２＋２＋１ｍＬ）を加え、そして反応混合物を２．５時間撹拌させた。反応混合物を１０ｍＬの水で希釈し、次いでｐＨを１ＮのＨＣｌを使用することによって２に調節した。有機溶媒を蒸発し、そして残った水層をＤＣＭ（３×１０ｍＬ）で抽出し、次いでＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして蒸発した。粗製の酸を、１５ｍＬのＤＣＭ中に溶解し、３ｍＬのＴＦＡを溶液に０℃で加えた。反応物を室温まで温まらせ、そして３時間撹拌した。溶媒を蒸発し、そして粗製のアミノ酸をトルエンと共沸（２×２ｍＬ）して、残留ＴＦＡを除去した。次いで粗製のアミノ酸を、７００ｍＬのＭｅＣＮ中に取込み、そしてＤＩＰＥＡ（１ｍＬ、５．７ｍｍｏｌ）を加えた。得られた中程度に不透明な溶液を１０分間撹拌させてから、ＨＡＴＵ（５００ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（１７８ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を１４時間撹拌させ、次いで濃縮し、そしてＡｃＯＥｔ中に再溶解した。溶液を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液、ＮａＨＣＯ３及び食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィー（第１のカラムに対してＤＣＭ中の０％から３３％のＡｃＯＥｔ、そして第２のカラムに対してＤＣＭ中の１６％から３３％のＡｃＯＥｔ、次いでＰＬＴＣのために、ＤＣＭ中の３３％から６６％のＡｃＯＥｔ）によって精製して、８０ｍｇ（５工程で１２％収率）の１０を、白色の泡状物として得た。（生成物は、純粋なＤＣＭ並びにＤＣＭ／ＡｃＯＥｔ、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ及びＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨの混合物に溶解するが、しかし純粋なＣＨＣｌ３、ＡｃＯＥｔ又はＭｅＯＨに溶解しない。
ＴＬＣを展開するためにはＤＣＭ中の６６％ＡｃＯＥｔを使用されたい）。［α］Ｄ３０＝＋１７．５  °（Ｃ＝０．２５７ＣＨ２Ｃｌ２中で）；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ８．０３（ｄｄ，Ｊ＝７．５，２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．８２（ｄｄ，Ｊ＝７．８，１．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７２−７．６８（ｍ，２Ｈ），７．３１−７．１８（ｍ，２３Ｈ），６．９２（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．７２（ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，１Ｈ），６．６３（ｄ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，１Ｈ），６．２１（ｄｄ，Ｊ＝６．４，６．４Ｈｚ，１Ｈ），５．５２−５．４０（ｍ，２Ｈ），５．０７（ｄｄ，Ｊ＝１７．５，８．４Ｈｚ，１Ｈ），４．８６（ｍ，２Ｈ），４．４７（ｄｄ，Ｊ＝１０．４，３．３Ｈｚ，１Ｈ），４．３５（ｄｄ，Ｊ＝６．４，１．８Ｈｚ，１Ｈ），４．２４（ｄｄ，Ｊ＝１７．５，３．１Ｈｚ，１Ｈ），３．７１（ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，１Ｈ），３．２４（ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，１Ｈ），２．６７（ｄｄ，Ｊ＝１４．６，４．２Ｈｚ，１Ｈ），２．５２（ｄｄ，Ｊ＝１４．８，９．１Ｈｚ，１Ｈ），２．３７（ｍ，１Ｈ），２．２０（ｄｄ，Ｊ＝７．７，７．１Ｈｚ，２Ｈ），２．０２−１．９８（ｍ，２Ｈ），１．７７（ｓ，３Ｈ），０．８７（ｄｄ，Ｊ＝６．９，６．６Ｈｚ，１Ｈ），０．７１（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），０．４０（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）；１７３．７，１７０．１，１７０．０，１６６．０，１４７．７，１４．８，１４２．１，１４１．９，１３８．４，１３３．７，１３３．５，１３２．９，１３０．８，１３０．５，１３０．２，１２９．６，１２９．５，１２８．３，１２７．９，１２７．８，１２６．６，１２６．５，１２５．２，８３．８，６６．９，５８．５，４８．２，４７．４，４４．６，４１．３，４０．５，３８．７，３２．３，３１．９，３１．７，３１．６，３０．０，２４．０，１９．７，１６．０，１４．３；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚＣ５３Ｈ５３Ｎ７ＮａＯ７Ｓ４に対する計算値（Ｍ＋Ｎａ）＋  １０５０．２７８１，実測値１０５０．２８０１。
【０２２４】
【化３３】
0006785801.tif 000034
【０２２５】
[00254]チオフェノール（７２μＬ、０．７ｍｍｏｌ）、ＫＯＨ（２５ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）、水（２２０μＬ）及びＤＭＦ（９ｍＬ）を混合して、無色の溶液を得た。６．０ｍｇ（５．８μｍｏｌ）のＮｓアミン１０に、０．５ｍＬの上記の溶液を室温で加えた。反応物を５０℃で２時間撹拌させた。次いで蒸発し、そして直接カラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の３３％ＡｃＯＥｔ、次いでＤＣＭ中の９％ＭｅＯＨ）にかけて、遊離アミンを黄色の固体として得た。上記で得た遊離アミンを、保護された葉酸１１（６．０ｍｇ、８．８μｍｏｌ）を混合した。ＤＭＦ（０．５ｍＬ）を加え、そして反応物を１４時間撹拌させ、次いで減圧下で濃縮した。残渣を分離用ＴＬＣ（ＡｃＯＥｔ中の４％ＭｅＯＨで３回）によって精製して、純粋なカップリング生成物１２（３．４ｍｇ、２工程で３９％収率）を、黄色の固体として得た。
【０２２６】
[00255]１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ  ８．８３（ｓ，１Ｈ），７．６６（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．３７−７．１８（ｍ，１９Ｈ），６．８０（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），６．７０（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），５．５０−５．２７（ｍ，３Ｈ），５．１３（ｄ，Ｊ＝１７．６Ｈｚ，１Ｈ），４．６３（ｓ，２Ｈ），４．５６−４．３５（ｍ，５Ｈ），４．２３（ｄｄ，Ｊ＝７．０，２．０Ｈｚ，２Ｈ），３．６３（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），２．６９−２０６（ｍ，１０Ｈ），１．８０（ｓ，３Ｈ），１．１３（ｄｄ，Ｊ＝９．０，６．４Ｈｚ，１Ｈ），１．００（ｄｄ，Ｊ＝１０．２，８．４Ｈｚ，１Ｈ），０．６９（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ），０．３５（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚＣ７７Ｈ９１Ｎ１３ＮａＯ１０Ｓ３Ｓｉ２＋に対する計算値（Ｍ＋Ｎａ）＋  １５３２．５６１０，実測値１５３２．５６２１。
【０２２７】
【化３４】
0006785801.tif 000035
【０２２８】
[00257]トリチルチオール１２（７．８ｍｇ、５．２μｍｏｌ）を、０．６ｍＬのＤＣＭ中に溶解した。３０μＬのＴＦＡ及びｉＰｒ３ＳｉＨ（４μＬ、２０μｍｏｌ）を溶液に０℃で加えた。反応物を室温まで温まらせ、そして３０分間撹拌した。溶媒を蒸発し、そして残渣をトルエン（２×２ｍＬ）と共沸して、残留ＴＦＡを除去した。
【０２２９】
[00258]粗製のチオールを０．５ｍＬのＤＣＭ中に溶解し、そして０℃に冷却した。混合物をＤＩＰＥＡ（１０μＬ、５２μｍｏｌ）及び塩化オクタノイル（４．２μ、２６μｍｏｌ）で連続して処理した。反応物を室温まで温まらせ、そして２時間撹拌した。反応物を０℃に冷却し、そして０．１ｍＬのＭｅＯＨでクエンチし、蒸発し、そして分離用ＴＬＣ（ＤＣＭ：ＡｃＯＥｔ：ＭｅＯＨ＝５：１０：２、容量／容量／容量）によって精製して、チオエステルを得た。上記で得た保護された葉酸（３．１ｍｇ、２．４μｍｏｌ）を０．３ｍＬのＤＭＦ中に溶解し、そしてＴＡＳＦ（２．１ｍｇ、７．５μｍｏｌ）を室温で加えた。反応物を室温まで温まらせ、そして１９時間撹拌した。溶媒を蒸発し、そして残渣を分離用ＴＬＣ（ＣＨＣｌ３中の２５％ＭｅＯＨ）によって精製して、アミドリンカーを伴うラルガゾールペプチド葉酸１３（０．７ｍｇ、３工程で１２％収率）を得た。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚＣ５５Ｈ６７Ｎ１３ＮａＯ９Ｓ３＋に対する計算値（Ｍ＋Ｎａ）＋  １０７２．４２４４，実測値１１７２．４２６７。
【０２３０】
【化３５】
0006785801.tif 000036
【０２３１】
[00260]保護された葉酸１２（３．４ｍｇ、２．３μｍｏｌ）を、０．３ｍＬのＤＭＦ中に溶解し、そしてＴＡＳＦ（１．５ｍｇ、５．６μｍｏｌ）を室温で加えた。反応物を室温まで温まらせ、そして１８時間撹拌した。溶媒を蒸発し、そして残渣を分離用ＴＬＣ（ＣＨＣｌ３中の９％ＭｅＯＨ）によって精製して、トリチルラルガゾールペプチド葉酸を得た。
【０２３２】
[00261]トリチルチオールを０．６ｍＬのＤＣＭ中に溶解し、そして０℃に冷却した。ＴＦＡ（３０μＬ）及びｉＰｒ３ＳｉＨ（２．０μＬ、１０μｍｏｌ）を溶液に０℃で加えた。浴を除去し、そして反応物を室温で１時間撹拌させた。溶媒をアルゴン流によって除去し、そして残渣１４を生物学的評価のために粗製で取込んだ。（粗製の生成物の有機溶媒中の溶解性は不良である。これは、ＤＣＭ、ＡｃＯＥｔ、ＭｅＯＨ及びこれらの混合物中に可溶ではない；これは、ＤＭＦ中に僅かに可溶であり、ＤＭＳＯ及びＤＣＭ−ＴＦＡ中に可溶である。これは、更に水に可溶ではない）。
【０２３３】
[00262]１Ｈ  ＮＭＲ（粗製，不純，４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−Ｄ６，全てのシグナルはブロードである）δ  ８．５８（ｓ，１Ｈ），８．４３（ｓ，１Ｈ），８．３０（ｓ，１Ｈ），７．５６（ｂｒ，２Ｈ），７．３８（ｂｒ，２Ｈ），７．２６（ｂｒ，２Ｈ），６．８５（ｓ，１Ｈ），６．７８−６．７１（ｍ，１Ｈ），６．５９（ｂｒ，２Ｈ），５．５４−５．３６（ｍ，３Ｈ），４．４３−４．１５（ｍ，４Ｈ），２．２２−１．８６（ｍ，３Ｈ），１．６６（ｓ，３Ｈ），０．６０（ｂｒ，３Ｈ），０．３６（ｂｒ，３Ｈ）。
【０２３４】
[00263]実施例１２．葉酸受容体を過剰発現する白血病細胞系の死滅
[00264]ラルガゾール葉酸複合体小分子が、Ｔ−ＡＬＬを標的とするという仮説を試験するために、用量範囲ＡＴＰ含有率試験を行った。Ｔ−ＡＬＬ細胞系のＡＬＬ／ＳＩＬ及びＤＮＤ４１を、オクタノイル化ラルガゾールペプチド葉酸（アミドリンカー）、ラルガゾールチオールペプチド葉酸（粗製）、オクタノイル化ラルガゾールペプチド葉酸（エステルリンカー）で、３８４ウェルプレート形式（５００細胞／ウェル）で、３、６、及び９日間、１０μＭないし０．０７８μＭの範囲の濃度で処理した。次に、ＡＴＰに基づくアッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ，Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標））を、細胞生存率の最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を計算するために使用した。グラフを、生存する細胞（ｙ軸）の関数として、Ｐｒｉｓｍ  ＧｒａｐｈＰａｄ  ６ソフトウェアを使用し、そして薬物投与量を、Ｌｏｇ［μＭ］（ｘ軸）として表示してプロットした。
【０２３５】
[00265]図１１−１６に示すように、オクタノイル化ラルガゾールペプチド葉酸（エステルリンカー）による処理は、Ｔ−ＡＬＬ中の細胞の生存率の損失を伴う。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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