(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ＣＤ３と、（ｉｉ）癌細胞上の表面標的抗原と、に特異的に結合する二重特異的結合分子であって、
（ａ）ＣＤ３に特異的に結合する抗体と、
（ｂ）癌細胞上の表面標的抗原に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドと、
を含み、
前記Ｆｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列からなり、ただし、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸位置１０〜１９内の少なくとも１つのアミノ酸が、置換、欠失、または付加されていること、かつ
（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸位置２９〜３６内の少なくとも１つのアミノ酸が、置換、欠失、または付加されていること、
を条件とし、
前記ポリペプチドが、配列番号１の前記アミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、同一性の決定では、配列番号１のアミノ酸位置１２〜１７および３１〜３４が無視されること、を条件とする、二重特異的結合分子。
【請求項２】
ＣＤ３に特異的に結合する前記抗体が、Ｆｃ部分を含む、請求項１に記載の結合分子。
【請求項３】
ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＣＤ３３、ＣＤ１９、ＣＥＡ、ＥＰＨＡ２、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ＩＧＦＲ１、線維芽細胞活性化タンパク質α、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ｃ−ＭＥＴ、ＥｐＣＡＭ、またはＰＳＭＡに特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含む、請求項１または２に記載の結合分子。
【請求項４】
前記Ｆｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドがＨＥＲ２に特異的に結合し、配列番号４および９〜１５９からなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれか一つを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項５】
前記Ｆｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドがＨＥＲ２に特異的に結合し、配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の結合分子。
【請求項６】
前記Ｆｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドがＥＧＦＲに特異的に結合し、配列番号１６９、１８７〜１９７、および２０１〜２０３からなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれか一つを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項７】
前記Ｆｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドがＥＧＦＲに特異的に結合し、配列番号１６９または１８７のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の結合分子。
【請求項８】
前記Ｆｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドがＣＤ３３に特異的に結合し、配列番号１７４、１７７〜１８６、および２０７からなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれか一つを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項９】
前記Ｆｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドがＣＤ３３に特異的に結合し、配列番号１７４のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の結合分子。
【請求項１０】
前記結合分子が、ＨＥＲ２に特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、前記２つのポリペプチドの第１が、前記抗体の２つの重鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２が、前記抗体の前記２つの重鎖の第２のＮ末端に結合される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項１１】
前記結合分子が、ＥＧＦＲに特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、（ｉ）前記２つのポリペプチドの第１が、前記抗体の２つの重鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２が、前記抗体の前記２つの重鎖の第２のＮ末端に結合されるか、（ｉｉ）前記２つのポリペプチドの前記第１が、前記抗体の前記２つの重鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの前記第２が、前記抗体の前記２つの重鎖の第２のＣ末端に結合されるか、（ｉｉｉ）前記２つのポリペプチドの前記第１が、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの前記第２が、前記抗体の前記２つの軽鎖の第２のＮ末端に結合されるか、または（ｉｖ）前記２つのポリペプチドの前記第１が、前記抗体の前記２つの軽鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの前記第２が、前記抗体の前記２つの軽鎖の第２のＣ末端に結合される、請求項１〜３、６および７のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項１２】
前記結合分子が、ＣＤ３３に特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、前記２つのポリペプチドの第１が、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２が、前記抗体の前記２つの軽鎖の第２のＣ末端に結合される、請求項１〜３、８および９のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項１３】
ＣＤ３に特異的に結合する前記抗体と前記Ｆｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドとがリンカーにより結合される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項１４】
前記リンカーがペプチドリンカーである、請求項１３に記載の結合分子。
【請求項１５】
前記ペプチドリンカーが、配列番号１６２、１６０、および１６１からなる群から選択される配列を有する、請求項１４に記載の結合分子。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の結合分子をコードする核酸分子。
【請求項１７】
請求項１６に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載のベクターで形質転換された宿主細胞または非ヒト宿主。
【請求項１９】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の結合分子、請求項１６に記載の核酸分子、請求項１７に記載のベクター、および／または請求項１８に記載の宿主細胞もしくは非ヒト宿主、を含む医薬組成物。
【請求項２０】
癌を治療または予防する方法における使用のための、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記癌が、乳癌、血液学的悪性疾患、および他の癌からなる群から選択される、請求項２０に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項２２】
前記血液学的悪性疾患が、ＮＨＬ、Ｂ−ＡＬＬ、およびＡＭＬからなる群から選択される、請求項２１に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項２３】
前記他の癌が、前立腺癌、黒色腫、肺癌、胃癌、卵巣癌、頭頸部癌、結腸直腸癌、膵臓癌、甲状腺癌、神経膠腫、膀胱癌、腎臓癌、肝臓癌、および悪性腹水からなる群から選択される、請求項２１または２２に記載の使用のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（ｉ）ＣＤ３と、（ｉｉ）癌細胞上の表面標的抗原と、に特異的に結合する二重特異的結合分子に関する。ここで、結合分子は、（ａ）ＣＤ３に特異的に結合する抗体と、（ｂ）癌細胞上の表面標的抗原に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドと、を含み、前記Ｆｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなる。ただし、（ｉ）配列番号１のアミノ酸位置１０〜１９内の少なくとも１つのアミノ酸は、置換、欠失、または付加されていること、かつ（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸位置２９〜３６内の少なくとも１つのアミノ酸は、置換、欠失、または付加されていること、を条件とし、前記ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有し、同一性の決定では、配列番号１のアミノ酸位置１２〜１７および３１〜３４が除外されること、を条件とする。
【背景技術】
【０００２】
本明細書には、特許出願および製造業者のマニュアルを含めて、いくつかの文献が引用されている。これらの文献の開示は、本発明の特許性に関連するとみなされるものではないが、これをもってその全体が参照により組み込まれる。より特定的には、参照された文献はすべて、あたかもそれぞれ個々の文献が具体的かつ個別的に明示されて参照により組み込まれたのと同程度まで、参照により組み込まれる。
【０００３】
疾患の初期および後期の両方で腫瘍の成長および癌患者の生存をＴ細胞によりコントロール可能であるという証拠が増えている（Ｍｌｅｃｎｉｋ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１１），Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ，３０，ｐｐ．５−１２）。しかしながら、腫瘍特異的Ｔ細胞反応は、癌患者で開始および維持を行うのが困難であり、免疫編集時に選択される腫瘍細胞の多数の免疫逃避機序により制限される（Ｂａｕｅｒｌｅ  ＰＡ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，６９（１２），ｐｐ．４９４１−４９４４）。癌療法のためにＴ細胞をエンゲージする代替法は、癌細胞上の表面標的抗原とＴ細胞上のＣＤ３とに対して二重特異的である抗体である（Ｂａｒｇｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２１（５８９１），ｐｐ．９７４−９７７）。これにより、典型的には、Ｔ細胞レセプター特異性、共刺激、またはペプチド抗原提示に依存せずに、任意の種類の細胞傷害性Ｔ細胞を癌細胞に結合することが可能である。
【０００４】
ネズミ抗ＣＤ３抗体およびヒト化抗ＣＤ３抗体、たとえば、ムロモナブＣＤ３（Ｎｏｒｍａｎ  ＤＪ（１９９５）Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｍｏｎｉｔ  １７（６），ｐｐ．６１５−６２０）、テプリズマブおよびオテリキシズマブ（Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ  Ｌ．（２０１０）６（３），ｐｐ．１４９−１５７）、ならびにＣｒｉｓ−７（Ａｌｂｅｒｏｌａ−Ｉｌａ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１），Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４６（４），ｐｐ．１０８５−１０９２）は、当技術分野で周知である。Ｃｏｎｒａｄらは、ＳＰ３４を含めて、他の抗ＣＤ３抗体を概説している（Ｃｏｎｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，７１（１１），ｐｐ．９２５−９３３）。
【０００５】
記載のごとく、ＣＤ３と癌細胞上の表面標的抗原との両方を認識する二重特異的抗体は、当技術分野で周知である（Ｍａｙ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２０１２），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，８４，ｐｐ．１１０５−１１１２も参照されたい）。歴史的には、有利な薬剤的性質を有するこれらの複雑な分子を設計して、薬剤開発を支援するのに十分な量および品質を提供することが困難であることが、療法剤として二重特異的抗体を開発するうえで主要な障害になっていたことに注目することが重要である（Ｃｈａｎ  Ａ．ａｎｄ  Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ．（２０１０），Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１０（５），ｐｐ．３０１−３１６）。このことは、選択された特異性を有するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を発現する２つのユニークなネズミハイブリドーマクローンの融合から生じるクアドローマの技術を利用したＣＤ３分野の初期の二重特異的手法により例証される（Ｓｔａｅｒｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８３，ｐｐ．１４５３−１４５７）。この方法により調製される二重特異的抗体は、ＩｇＧの重鎖および軽鎖のランダム対合に依拠する。抗原を発現する細胞でいくつかの生物学的効果が観測されたにもかかわらず、この手法は、疾患の臨床経過では有意な影響をもたらさなかった（Ｋｕｆｅｒ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２，ｐｐ．２３８−２４４）。上述したように、これらの第１世代の二重特異的抗体は、大量の均一バッチの生産が困難であることおよびネズミ抗体フラグメントの有効性が欠如していることを含む２つの主要な限界を呈した。それに加えて、ほとんどの治療患者でヒト抗マウス抗体反応が見られたため、ネズミ分子の有効性が大幅に減少し、複数回投与が制限された（Ｍａｙ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２０１２），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，８４，ｐｐ．１１０５−１１１２）。
【０００６】
Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒらは、ラットＩｇＧ２ａとマウスＩｇＧ２ｂとの対合により不均一性レベルを減少させる方法を同定した（Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５５，ｐｐ．２１９−２２５）。これらのラットおよびマウスのアイソタイプ特異的ハイブリドーマの融合により、種限定の重鎖／軽鎖対合が優先するため、適正に対合した二重特異的抗体の出現率が増加することが、著者らにより見いだされた。そのほかに、著者らは、親抗体からの機能性二重特異的抗体の精製を容易にするシーケンシャルｐＨ溶出法を同定した。この方法により生成されたハイブリッド抗体では、２つの異なる抗原、たとえば、ＣＤ３と腫瘍抗原、に対する結合部位が組み込まれ、通常の抗体と同様に、マクロファージ、ＮＫ細胞、および樹状細胞上に発現されるＦｃγＲレセプターに結合可能なそのインタクトなＦｃが保持された。ＴｒｉｏｍＡｂｓ（登録商標）と称されるこの二重特異的抗体は、Ｆｃレセプター発現細胞と共にＴ細胞を腫瘍に再方向付けする作用を兼備し、Ｔ細胞媒介溶解とＡＤＣＣとの組合せにより腫瘍細胞を排除すると報告されてきた（Ｌｉｎｋｅ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ（２０１０）Ｍａｂｓ，２，ｐｐ．１２９−１３６）。この方式は、臨床試験で評価されてきたいくつかの二重特異的抗体の開発をもたらした。これらには、カツマキソマブ（抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３）、エルツマキソマブ（抗ＨＥＲ２×抗ＣＤ３）、およびＦＢＴＡ０５（抗ＣＤ２０×抗ＣＤ３）が含まれる（Ｃｈａｍｅｓ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，（２００９），Ｍａｂｓ，１，ｐｐ．５３９−５４７にレビューされている）。カツマキソマブは、開発された最初のＴｒｉｏｍＡｂ（登録商標）であり、第２／３相で生存率の有意な改善が実証されたことにより、カツマキソマブは、ＥｐＣＡＭ陽性腫瘍を有する患者において悪性腹水を治療するために２００９年にＥＵの認可を受けるに至り、臨床使用が認められた最初の二重特異的抗体であった（Ｊａｇｅｒ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２０１２），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，６９，４９４１−４９４４）。ＨＥＲ２を標的とするＴｒｉｏｍＡｂ（登録商標）エルツマキソマブは、現在、ＨＥＲ２を発現する進行固形腫瘍を有する患者において臨床試験で研究されている。Ｂ細胞悪性腫瘍上に発現されるＣＤ２０を標的とするように開発された第３のＴｒｉｏｍＡｂ（登録商標）であるＦＢＴＡ０５は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）患者に由来する低レベルのＣＤ２０発現を有するＢ細胞系の特異的溶解を媒介することが示された。さらに、ＦＢＴＡ０５は、リツキシマブと比較して有意に高い根絶率をｉｎ  ｖｉｔｒｏで呈した。同種異系移植後のＣＤ２０陽性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）患者において再発疾患または難治性疾患の治療のためにドナーリンパ球注入との組合せでＦＢＴＡ０５の安全性および有効性を評価する第１／２相研究が、進行中である（Ｃｈａｍｅｓ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，（２００９），Ｍａｂｓ，１，ｐｐ．５３９−５４７）。このＴｒｉｏｍＡｂ（登録商標）方式の主要な限界は、非ヒト化マウス／ラットハイブリッド抗体方式の繰返し投与に反応して、患者がヒト抗マウスおよび抗ラット抗体を生成することによって存在する（Ｌｉｎｋｅ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ（２０１０）Ｍａｂｓ，２，ｐｐ．１２９−１３６）。
【０００７】
ＴｒｉｏｍＡｂ（登録商標）抗体の限界のいくつかは、抗体工学によりおよび新規な方式に基づく組換え二重特異的分子の生成により対処された（Ｍａｙ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２０１２），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，８４，ｐｐ．１１０５−１１１２の概説を参照されたい）。試験されてきた二重特異的抗体設計のうち、ＢｉＴＥ（登録商標）（二重特異的Ｔ細胞エンゲージャー）と称される方式は、これまでに診察で最大の成功を収めてきた。ＢｉＴＥ（登録商標）組換え方式は、ペプチドリンカーにより共有結合された２つの一本鎖抗体に基づく（二重特異的ｓｃＦｖ抗体フラグメント方式をもたらす）。４つの個別の遺伝子によりコードされる合計４つの可変ドメインが、単一遺伝子によりコードされる単一ポリペプチド鎖上にアライメントされる。ＢｉＴＥ（登録商標）は、ピコモル（ｐＭ）濃度でそのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの選択的Ｔ細胞活性化に関して、さらにはその作用機序に関して、きわめて詳細に研究されてきた（Ｂａｅｕｅｒｌｅ  ＰＡ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，６９，ｐｐ．４９４１−４９４４）。ＣＤ１９（ほとんどのヒトＢ細胞悪性腫瘍により発現される（Ｄｒｅｉｅｒ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，（２００３），Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７０，ｐｐ．４３９７−４４０２））およびいくつかの固形腫瘍上に発現されるＥｐＣＡＭ（Ｂｒｉｓｃｈｗｅｉｎ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（２００６），Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，４３，ｐｐ．１１２９−１１４３）を標的とするＢｉＴＥ（登録商標）は、最先端の分子であり、現在、臨床試験で試験されている。組換え抗ＣＤ３×抗ＣＤ１９  ＢｉＴＥ（登録商標）分子であるブリナツモマブ（ＭＴ１０３としても知られる）は、再発非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）および急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の患者の治療剤として研究されている。単一の作用剤としてブリナツモマブに対して最初に確認された反応は、ＮＨＬ患者で行われた（Ｂａｒｇｏｕ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２１，ｐｐ．９７４−９７７）。より最近では、微小残存病変（ＭＲＤ）陽性Ｂ系列ＡＬＬでブリナツモマブの有効性を決定するために、相２臨床試験が行われた（Ｔｏｐｐ  ＭＳ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，２９，ｐｐ．２４９３−２４９８）。０．０１５ｍｇ／ｍ２／日の用量レベルで２１名の患者を治療したところ、１６名の患者がＭＲＤ陰性になったで。無再発の生存の可能性は、４０５日間のメジアン追跡で７８％と報告された。ブリナツモマブは、ＭＲＤ陽性Ｂ系列ＡＬＬの患者において有効かつ耐容性良好であり、治療は、長期にわたる無白血病生存をもたらした。ＣＤ１９およびＥｐＣＡＭに加えて、ＢｉＴＥ（登録商標）抗体はまた、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、ＥＰＨＡ２、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ＩＧＦＲ１、ＣＤ３３、線維芽細胞活性化タンパク質α、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ｃ−ＭＥＴ、ＰＳＭＡ、およびＨＥＲ２を発現する腫瘍細胞を特異的に標的としうることが、前臨床試験により示された（Ｂａｅｕｅｒｌｅ  ＰＡ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，６９，ｐｐ．４９４１−４９４４、Ｆｒｉ��ｄｒｉｃｈ  Ｍ．（２０１２）Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ，１１（１２），ｐｐ．２６６４−２６７３）。
【０００８】
ＢｉＴＥ（登録商標）抗体（約５５ｋＤａ）は、サイズが小さいため、短い血清中半減期により特徴付けられる。たとえば、この薬剤を投与するためには、ポータブルポンプによるブリナツモマブの連続的静脈内注入が必要である。したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期が短いことが、ＢｉＴＥ（登録商標）抗体の主要な限界の１つである（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  Ｒ．（２００５）Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ  Ｓｉｎｉｃａ，２６（１），ｐｐ．１−９）。
【０００９】
ＣＤ３と癌細胞上の表面標的抗原との両方を認識するｓｃＦｖ抗体フラグメントに基づく他の二重特異的方式は、当技術分野で公知であり、たとえば、ＤＡＲＴ（商標）プラットフォームは、２つの特異性のそれぞれに対して１つの結合部位を有する共有結合されたヘテロ二量体複合体を生成するように共発現される２つの個別のポリペプチドからなり（Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ，（２０１１），Ｂｌｏｏｄ，１１７，ｐｐ．４５４２−４５５１）、ｔａｎｄａｂ（登録商標）と呼ばれる４価タンデムダイアボディー構造では、２つの異なる抗体からの４つの可変ドメインをそれぞれ有する２つのポリペプチドが、ホモ二量体分子に対して頭−尾に配置される（Ｍφｌｈφｊ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ，（２００７），Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，４４（８），ｐｐ．１９３５−１９４３）。
【００１０】
ｓｃＦｖベースの二重特異的戦略の半減期がやや短いことに加えて、ｓｃＦｖベースの構築物は、他の分子からのパートナーとのＶ領域の「ドメイン交換」に起因して凝集体を形成する傾向を有するか（Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ，（２０１１），Ｂｌｏｏｄ，１１７，ｐｐ．４５４２−４５５１）、またはＤＡＲＴ（商標）プラットフォームで示されるように、ヘテロ二量体複合体を形成するためにより複雑な発現系に依存する（Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ，（２０１１），Ｂｌｏｏｄ，１１７，ｐｐ．４５４２−４５５１）。
【００１１】
近年、いくつかの他の二重特異的方式が創出され（Ｃｈａｎ  Ａ．ａｎｄ  Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ．（２０１０），Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１０（５）ｐｐ．３０１−３１６およびＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ  Ｒ．（２０１２），Ｍａｂｓ，４（２），ｐｐ．１８２−１９７にレビューされている）、そのいくつかは、ＣＤ３と腫瘍細胞表面抗原とを標的とするように設計されてきた。また、ヒトＩｇＧ様二重特異的技術、たとえば、単一軽鎖抗体を使用するＢｉｃｌｏｎｉｃｓ（商標）ＥＮＧＡＧＥプラットフォームに基づくＣＤ３二重特異的抗体（ｗｗｗ．ｍｅｒｕｓ．ｎｌ）、単一重鎖抗体に依拠する「ｋａｐｐａ−ｌａｍｂｄａ−ｂｏｄｙ（商標）」（ｗｗｗ．ｎｏｖｉｍｍｕｎｅ．ｃｏｍ）、および二重特異的ＩｇＧ１／ＩｇＧ２抗体（Ｓｔｒｏｐ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，４２０，ｐｐ．２０４−２１９）が、この分野で発展してきた。リダイレクトＴ細胞死滅のための二重特異的方式の工学技術のこれらの最近の進歩にもかかわらず、２本の重鎖のいずれかと単一の軽鎖とのもしくは１本の重鎖と２本の軽鎖との共発現およびそれに続くより複雑な下流の精製プロセスが必要であること、またはＩｇＧ１／ＩｇＧ２二重特異的抗体の場合、ヘテロ二量体化に好適なレドックス条件が必要であることなど、これらのより新技術には依然として欠点が存在する。したがって、高レベルの発現、有利な物理化学的性質（たとえば、高い溶解性および安定性ならびに低い凝集傾向）、長い血清中半減期などの薬剤的性質を有する二重特異的抗体を創出する大きな医学的必要性が存在する。二重特異的化合物を検討する科学会議の出現により、改善された二重特異的抗体の必要性もまた、具体的に示されている。たとえば、第２回世界二重特異的抗体サミット（Ｗｏｒｌｄ  Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｕｍｍｉｔ）では、産業上の二重特異的抗体の重要性が増していることが述べられた。二重特異的抗体は、過去２年間で６５億ドルを超える価値のあるいくつかの印象的な取引きの対象になっていたと想定されている。一方、利用すべき絶好の機会および膨大な成長の余地が存在するが、この新しいクラスの薬剤がその十分な潜在能力を達成できるようになる前に、依然として、対処する必要のある多くの課題が存在する（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｎａｔｕｒｅｅｖｅｎｔｓ／ｓｃｉｅｎｃｅ／ｅｖｅｎｔｓ／１４６６７；２ｎｄ＿Ｗｏｒｌｄ＿Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ＿Ａｎｔｉｂｏｄｙ＿Ｓｕｍｍｉｔ）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、有利な薬剤的性質を有し、薬剤開発を支援するのに十分な量および品質で生成可能であり、かつ治療剤として好適である、腫瘍の治療に有用な新規な二重特異的方式の大きな医学的必要性が存在する。したがって、本発明の目的は、ＣＤ３と腫瘍細胞表面抗原とを標的とするそのような新規な二重特異的結合分子を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
したがって、第１の実施形態では、本発明は、（ｉ）ＣＤ３と、（ｉｉ）癌細胞上の表面標的抗原と、に特異的に結合する二重特異的結合分子に関する。ここで、結合分子は、（ａ）ＣＤ３に特異的に結合する抗体と、（ｂ）癌細胞上の表面標的抗原に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドと、を含み、前記Ｆｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなる。ただし、（ｉ）配列番号１のアミノ酸位置１０〜１９内の少なくとも１つのアミノ酸は、置換、欠失、または付加されていること、かつ（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸位置２９〜３６内の少なくとも１つのアミノ酸は、置換、欠失、または付加されていること、を条件とし、前記ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有し、同一性の決定では、配列番号１のアミノ酸位置１２〜１７および３１〜３４が除外されること、を条件とする。
【００１４】
「（ｉ）ＣＤ３と、（ｉｉ）癌細胞上の表面標的抗原と、に特異的に結合する二重特異的結合分子」という用語は、本発明に係る結合分子が、ＣＤ３の抗原と、癌細胞上の表面標的抗原の抗原であって、ＣＤ３とは異なる、抗原と、に特異的に結合可能であることを意味する。さらに、本発明に係る二重特異的結合分子は、前記２つの標的に同時に結合可能である。したがって、本発明に係る「ＣＤ３二重特異的結合分子」という用語はまた、２つの結合特異性を含み、１つ目は、ＣＤ３に対するものであり（「抗ＣＤ３」）、２つ目は、癌細胞上の異なる表面標的抗原に対するものである（「癌細胞上の抗表面標的抗原」または「抗腫瘍抗原」）。
【００１５】
本発明によれば、それぞれの分子が類似の構造のエピトープと本質的に交差反応しない場合、分子は、特異的に結合するとみなされる（本明細書では特異的に相互作用するとしても参照される）。研究対象の一群の分子の交差反応性は、たとえば、対象となるエピトープに対する、さらにはいくつかの多かれ少なかれ（構造上および／または機能上）関連性の強いエピトープに対する、通常の条件下での前記一群の分子の結合を評価することにより、試験されうる。その適合状況で、対象となるエピトープ（たとえば、タンパク質構造中の特異的モチーフ）には結合するが、他のエピトープのいずれにも本質的に結合しない分子のみが、対象となるエピトープに特異的であるとみなされる。対応する方法は、たとえば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８またはＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。「類似の構造のエピトープと本質的に交差反応しない分子」という用語は、本明細書で用いられる場合、類似の構造のエピトープに対する親和性の少なくとも５倍の親和性で、より好ましくは少なくとも１０倍の親和性で、たとえば、少なくとも５０倍の親和性などで、より好ましくは少なくとも１００倍の親和性で、たとえば、少なくとも５００倍の親和性などで、標的抗原に結合する分子を意味する。さらにより好ましくは、それは、類似の構造のエピトープに対する親和性の少なくとも１．０００倍の親和性で、たとえば、少なくとも１０．０００倍の親和性などで、最も好ましくは少なくとも１００．０００倍の親和性で、標的抗原と結合する。
【００１６】
好ましくは、本発明に係る二重特異的結合分子は、５×１０−７〜１０−１２Ｍ、より好ましくは１０−８〜１０−１２Ｍ、最も好ましくは１０−９〜１０−１２ＭのＫＤで、ＣＤ３に結合する。同様に、本発明に係る二重特異的結合分子は、１０−７〜１０−１２Ｍ、より好ましくは１０−８〜１０−１２Ｍ、最も好ましくは１０−９〜１０−１２ＭのＫＤで、癌細胞上の選択された表面標的抗原に結合する。
【００１７】
エピトープは、コンフォメーショナルエピトープまたは連続エピトープでありうる。ポリペプチド抗原では、コンフォメーショナル（または不連続）エピトープは、一次配列では離れているが、ポリペプチドが天然の三次元構造にフォールディングされてエピトープを構成した場合、分子の表面で互いに近接して位置する、２つ以上の個別のアミノ酸残基が存在することにより特徴付けられる（Ｓｅｌａ，（１９６９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６６，１３６５  ａｎｄ  Ｌａｖｅｒ，（１９９０）Ｃｅｌｌ  ６１，５５３−６）。エピトープに寄与する２つ以上の個別のアミノ酸残基は、離れたセクション中に存在するか、さらには抗原の２つ以上の（ポリ）ペプチド鎖中に存在する。これとは対照的に、線状または連続エピトープは、（ポリ）ペプチド鎖の単一の線状セグメント中に近接して位置する２つ以上の個別のアミノ酸残基からなる。
【００１８】
「癌細胞上の表面標的抗原」という用語は、非腫瘍細胞上で発現されないかまたは非腫瘍細胞上よりも多量に腫瘍細胞上で発現される抗原を意味する。「癌細胞上の表面標的抗原」、「腫瘍抗原」、および「腫瘍関連抗原」という用語は、本明細書では同義的に用いられる。癌細胞上の表面標的抗原は、ＣＤ３抗原ではなく、より好ましくは、Ｔ細胞レセプターの成分内の抗原ではない。好ましくは、抗原は、非腫瘍細胞上の少なくとも２倍の量で、より好ましくは少なくとも５倍の量で、たとえば、少なくとも１０倍の量などで、さらにより好ましくは少なくとも１００倍の量で、たとえば、少なくとも１０００倍の量などで、最も好ましくは少なくとも１０．０００倍の量で、腫瘍細胞上に発現される。好適な標的抗原としては、腫瘍細胞上により強力に発現される任意の抗原が挙げられる。好ましくは、抗原は、以下で本明細書に定義される抗原の１つである。
【００１９】
「ペプチド」という用語は、３０アミノ酸までの線状分子鎖を意味する。一方、本明細書で「タンパク質」という用語と同義的に用いられる「ポリペプチド」という用語は、一本鎖タンパク質またはその断片を含めて、３０アミノ酸超を含有するアミノ酸の線状分子鎖を記述する。本明細書で用いられる「（ポリ）ペプチド」という用語は、ペプチドおよびポリペプチドの両方を意味する。（ポリ）ペプチドは、少なくとも２つの同一または異なる分子からなるオリゴマーを形成しうる。そのような多量体の対応する高次構造は、それに対応して、ホモまたはヘテロ二量体、ホモまたはヘテロ三量体などと称される。融合タンパク質のホモ二量体、三量体などもまた、「ポリペプチド」という用語の定義に分類される。さらに、アミノ酸および／またはペプチド結合が機能的アナログにより置き換えられた（ポリ）ペプチドのペプチド模倣体もまた、本発明に包含される。そのような機能的アナログは、２０種の遺伝子コードアミノ酸以外のすべての既知のアミノ酸、たとえば、セレノシスチンを含む。「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語はまた、たとえば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、および当技術分野で周知の類似の修飾により修飾が行われた天然修飾（ポリ）ペプチドを意味する。
【００２０】
本発明によれば、結合分子は、（ａ）に定義された抗体と、（ｂ）に定義されたＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドと、を含むかまたはそれからなる。
【００２１】
前記Ｆｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドの１つ以上のコピー、たとえば、Ｆｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドの２、３、または４つのコピーなどが、本発明に係る二重特異的結合分子中に存在しうることは、分かるであろう。Ｆｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドの２つのコピーが存在することが好ましい。Ｆｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドの２つのコピーが存在する場合、次の好ましい選択肢が利用可能である。すなわち、（ｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＮ末端に結合される（すなわち、別の言い方をすれば、前記２つのポリペプチドの第１のコピーは、前記抗体の第１の重鎖のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２のコピーは、前記抗体の第２の重鎖のＮ末端に結合される）か、（ｉｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＣ末端に結合されるか、（ｉｉｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２のＮ末端に結合されるか、または（ｉｖ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２のＣ末端に結合される。
【００２２】
本明細書では「Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）」という用語と同義的に用いられる「ＦｙｎＳＨ３由来ポリペプチド」という用語は、ヒトＦｙｎＳＨ３ドメインに由来する非免疫グロブリン由来結合ポリペプチド（たとえば、いわゆる足場）を意味する。ＦｙｎＳＨ３由来ポリペプチドは、当技術分野で周知であり、たとえば、Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）ＪＢＣ，２８２，ｐ．３１９６−３２０４、国際公開第２００８／０２２７５９号パンフレット、Ｂｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２０（２）：５７−６８、Ｇｅｂａｕｅｒ  ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ（２００９）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３：２４５−２５５、またはＳｃｈｌａｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２），ＭＡｂｓ  ４：４，１−１２に記載されている。
【００２３】
ＦｙｎキナーゼのＳＨ３ドメイン（ＦｙｎＳＨ３）は、６３残基、すなわち、Ｓｅｍｂａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３（１５）：５４５９−６３）およびＫａｗａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６（１２）：４１９５−２０１）により報告された配列のアミノ酸８３〜１４５を含み、配列番号１に示されるように、配列
【化１】
0006694808.tif 000002
を有する。Ｆｙｎは、チロシンキナーゼのＳｒｃファミリーの５９ｋＤａメンバーである。選択的スプライシングの結果として、Ｆｙｎタンパク質は、そのキナーゼドメインが異なる２つの異なるアイソフォームで存在し、一方のフォームは、胸腺細胞、脾細胞、およびいくつかの血液リンパ細胞系に見いだされるが、第２フォームは、主に脳内で蓄積する（Ｃｏｏｋｅ  ａｎｄ  Ｐｅｒｌｍｕｔｔｅｒ（１９８９），Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌ．１（１）：６６−７４）。細胞内タンパク質であるＦｙｎの生物学的機能は、多様であり、Ｔ細胞レセプターを介するシグナリング、脳機能の調節、さらには接着媒介シグナリングを含む（Ｒｅｓｈ（１９９８）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３０（１１）：１１５９−６２）。他のＳＨ３ドメインとまったく同様に、ＦｙｎＳＨ３は、２つの逆平行βシートで構成され、他のタンパク質と相互作用するために２つのフレキシブルループ（ＲＴ−Ｓｒｃループおよびｎ−Ｓｒｃループ）を含有する。２つのフレキシブルループ（ＲＴ−Ｓｒｃループおよびｎ−Ｓｒｃループと呼ばれる）の配列は、それぞれ、配列番号１に下線および二重下線が付されている。配列番号１のＦｙｎＳＨ３のアミノ酸配列は、ヒト、マウス、ラット、およびサル（ギボン）の間で完全に保存される。
【００２４】
当技術分野で示されているように（国際公開第２００８／０２２７５９号パンフレット、Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）ＪＢＣ，２８２，ｐ．３１９６−３２０４）、ＦｙｎＳＨ３ドメインは、結合ポリペプチド、すなわち、Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）を生成するためのとくに魅力的な足場である。この理由は、Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）が、（ｉ）多量に可溶形で細菌中で発現可能であり、（ｉｉ）溶液中に保存したときに凝集することがなく、（ｉｉｉ）非常に安定であり（Ｔｍ７０．５℃）、（ｉｖ）システイン残基がなく、かつ（ｖ）マウスからヒトまで完全に保存されたアミノ酸配列を特徴として、最初からヒトに由来するものであるため、望ましくない免疫原性反応が低減されていることにある。
【００２５】
本発明に係るＦｙｎｏｍｅｒ（登録商標）は、好ましくは、天然に存在するまたは天然から単離されたタンパク質を含有する天然ＳＨ３ドメインではない。言い換えれば、本発明の範囲は、好ましくは、野生型ＳＨ３ドメイン含有タンパク質を除外する。天然には豊富なＳＨ３ドメイン含有タンパク質が存在する。これらの天然ＳＨ３タンパク質は、天然リガンドへの結合親和性を有する。これらの天然ＳＨ３リガンドのほとんどは、ＰｘｘＰモチーフを有する。本発明に係るＦｙｎｏｍｅｒ（登録商標）は、野生型ＳＨ３ドメインの標的とは異なる非天然標的への親和性を有するように設計された工学操作タンパク質である、ＳＨ３ドメインの非天然標的は、前記標的が天然に存在する野生型ＳＨ３ドメインの天然（すなわち野生型）細胞内リガンドでないかぎり、任意の標的でありうる。たとえば、ＳＨ３ドメインの非天然標的は、前記標的が天然に存在する野生型ＳＨ３ドメインの天然細胞内リガンドでないかぎり、天然に存在する、好ましくは哺乳動物に存在する、より好ましくはヒトに存在する、任意の標的でありうる。より好ましくは、本発明に係るＦｙｎｏｍｅｒ（登録商標）は、任意の天然細胞内ＳＨ３結合リガンド、最も好ましくは、ＰｘｘＰモチーフを有する任意の天然細胞内ＳＨ３結合リガンドへの結合親和性を本質的に有していない。
【００２６】
特定の標的抗原に特異的に結合するＦｙｎＳＨ３由来ポリペプチドの誘導については、当技術分野で記載されてきた。たとえば、以上の配列番号１に示される配列が改変された異なるＦｙｎＳＨ３のライブラリーを作製することが可能である。好ましくは、改変は、（ｉ）ＲＴループ（以上の配列番号１に下線付きで示される）に相当する配列で、もしくは任意選択で前記配列（すなわち配列番号１中の配列ＤＹＥＡＲＴＥＤＤＬ）に２アミノ酸まで近接した位置で、または（ｉｉ）Ｓｃｒループ（以上の配列番号１に二重下線付きで示される）で、もしくは任意選択で前記配列（すなわち配列番号１中の配列ＩＬＮＳＳＥＧＤ）に２アミノ酸まで近接した位置で、または（ｉｉｉ）両方の配列で同時に、行われる。好ましくは、改変は、当技術分野で記載されるように、置換、欠失、または付加である（たとえば、国際公開第２００８／０２２７５９号パンフレット、Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）ＪＢＣ，２８２，ｐ．３１９６−３２０４を参照されたい）。アミノ酸配列を改変する手段および方法は、当技術分野で周知であり、たとえば、当技術分野でＧｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）ＪＢＣ，２８２，ｐ．３１９６−３２０４に記載されている。
【００２７】
続いて、このＦｙｎＳＨ３ライブラリーは、ファージミドベクター、たとえば、ｐＨＥＮ１（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．“Ｍｕｌｔｉ−ｓｕｂｕｎｉｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅ：ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｆａｂ）ｈｅａｖｙ  ａｎｄ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１９（１５）：４１３３−７，１９９１）中にクローニング可能であり、続いて、ライブラリーは、ファージ上に提示され、そしてパニング、好ましくは、パニングのラウンドの繰返し、たとえば、それぞれの抗原に対して少なくとも２ラウンド、より好ましくは少なくとも３ラウンドのパニングなどに付されうる。次いで、確立された技術、たとえば、モノクロナールファージＥＬＩＳＡなどにより、結合（ポリ）ペプチドのスクリーニングを行うことが可能である。次いで、こうして同定されたクローンの配列決定を利用して、富化配列を明らかにしうる。こうして同定された結合（ポリ）ペプチドは、たとえば、同定された配列の改変に基づいて追加のライブラリーを作製することにより、さらなる成熟工程、ならびにファージディスプレイ工程およびパニング工程の繰返しに付されうる。最後に、得られたＦｙｎＳＨ３由来ポリペプチドの交差反応性および免疫原性を分析し、標的抗原に特異的なＦｙｎＳＨ３由来ポリペプチドを選択することが可能である。
【００２８】
ファージディスプレイスクリーニングおよび結合（ポリ）ペプチド最適化の方法は、当技術分野で広く知られている。
【００２９】
本発明との関連では、ＦｙｎキナーゼＳＨ３ドメイン（ＲＴ−Ｓｒｃループと称されることもある）のＲＴループは、配列番号１の位置１２〜１７に位置するアミノ酸「ＥＡＲＴＥＤ」からなる。ＲＴループでまたはそれに近接して置換、欠失、および／または付加、すなわち、突然変異される位置は、本発明によれば、アミノ酸１０〜１９、好ましくは１１〜１８、より好ましくは１２〜１７である。
【００３０】
同様に、本発明との関連では、ＦＹＮキナーゼ（ｎ−Ｓｒｃループと称されることもある）のｓｒｃループは、配列番号１の位置３１〜３４に位置するアミノ酸ＮＳＳＥからなる。ｓｒｃループでまたはそれに近接して置換、欠失、および／または付加、すなわち、突然変異される位置は、本発明によれば、アミノ酸２９〜３６、好ましくは３０〜３５、より好ましくは３１〜３４である。
【００３１】
挙げられた少なくとも８５％の配列同一性は、任意のより高値の配列同一性を包含する。配列同一性の想定される値は、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、および１００％である。配列同一性を決定する場合、指定のアミノ酸位置（１２〜１７および３１〜３４）（それらの位置は配列番号１からなる配列との関連で定義される）は、無視されるべきである。別の言い方をすれば、主要な実施形態のアイテム（ｉ）および（ｉｉ）は、配列番号１の野生型ＳＨ３ドメイン配列に対して異なることが必要であり、Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）配列の残りの部分は、野生型に対して８５％〜１００％の配列同一性を有する。そのような定義された配列同一性の決定は、たとえば、ペアワイズ配列アライメントを行い、アライメントプログラムにより報告された配列同一性を無視し、配列番号１の位置３１〜３４および１２〜１７が考慮されないように配列同一性の程度を再評価することにより、行われうる。配列同一性のそのような再評価は、当業者であれば、これらの決定指示を考慮してさらなる労力をかけることなく行うことが可能である。記載のごとく、１２〜１７および３１〜３４の範囲は、以上の配列番号１の配列の表示で下線が付されている。両側に２つのフランキングアミノ酸を含む場合、１０〜１９および２９〜３６の範囲（常に、配列番号１からなる配列のアミノ酸に基づく）が得られ、主要な実施形態のアイテム（ｉ）および（ｉｉ）に係る領域は、いずれの場合も、１、２、３、４、５、または６つのアミノ酸の置換、欠失、または付加が行われるべきである。
【００３２】
本明細書で用いられる場合、アミノ酸配列間の「アミノ酸配列同一性」という用語は、生化学分野の当業者の一般に広く使用されるアライメントおよび比較の技術に関することを意味する。２つのアミノ酸配列のアミノ酸配列同一性は、通常のアライメントの方法およびツールにより決定可能である。たとえば、配列番号１のアミノ酸配列に対する任意のポリペプチドのアミノ酸配列同一性の程度を決定するために、好ましくは、ＳＩＭ局所類似性プログラムが利用される（Ｘｉａｏｑｕｉｎ  Ｈｕａｎｇ  ａｎｄ  Ｗｅｂｂ  Ｍｉｌｌｅｒ（１９９１），Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，ｖｏｌ．１２：３３７−３５７）。これは、著者らおよびその研究所から自由に入手可能である（世界的なウェブ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｓｉｍ−ｐｒｏｔ．ｈｔｍｌも参照されたい）。多重アライメント分析については、好ましくは、ＣｌｕｓｔａｌＷが使用される（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２２（２２）：４６７３−４６８０）。配列番号１のアミノ酸配列に対するポリペプチドのアミノ酸配列同一性の程度は、配列番号１の位置１２〜１７および３１〜３４を除いて、配列番号１の全配列に対して決定される。
【００３３】
置換は、保存的置換または非保存的置換でありうるが、好ましくは保存的置換である。いくつかの実施形態では、置換はまた、天然に存在するアミノ酸と天然に存在しないアミノ酸との交換を含む。保存的置換は、置換されるアミノ酸に類似した化学的性質を有する他のアミノ酸によるアミノ酸の置換を含む。好ましくは、保存的置換は、（ｉ）異なる塩基性アミノ酸による塩基性アミノ酸の置換、（ｉｉ）異なる酸性アミノ酸による酸性アミノ酸の置換、（ｉｉｉ）異なる芳香族アミノ酸による芳香族アミノ酸の置換、（ｉｖ）異なる非極性脂肪族アミノ酸による非極性脂肪族アミノ酸の置換、および（ｖ）異なる極性非荷電アミノ酸による極性非荷電アミノ酸の置換からなる群から選択される置換である。塩基性アミノ酸は、アルギニン、ヒスチジン、およびリシンからなる群から選択される。酸性アミノ酸は、アスパラギン酸またはグルタメートから選択される。芳香族アミノ酸は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなる群から選択される。非極性脂肪族アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニン、およびイソロイシンからなる群から選択される。極性非荷電アミノ酸は、セリン、トレオニン、システイン、プロリン、アスパラギン、およびグルタミンからなる群から選択される。保存的アミノ酸置換とは対照的に、非保存的アミノ酸置換は、以上に概説された保存的置換（ｉ）〜（ｖ）に分類されない任意のアミノ酸による１つのアミノ酸の交換である。
【００３４】
ＣＤ３（分化クラスター３）Ｔ細胞コレセプターまたは本明細書では単純に「ＣＤ３」として参照されるものは、タンパク質複合体であり、４つの個別の鎖で構成される。哺乳動物では、複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、および２つのＣＤ３ε鎖を含有する。これらの鎖は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）として知られる分子およびζ鎖に会合して、Ｔリンパ球中に活性化シグナルを生成する。ＴＣＲ、ζ鎖、およびＣＤ３分子は、一緒になってＴＣＲ複合体を構成する。以上で考察したように、ネズミ抗ＣＤ３抗体およびヒト化抗ＣＤ３抗体、たとえば、ムロモナブＣＤ３（Ｎｏｒｍａｎ  ＤＪ（１９９５）Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｍｏｎｉｔ  １７（６），ｐｐ．６１５−６２０）、テプリズマブおよびオテリキシズマブ（Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ  Ｌ．（２０１０）６（３），ｐｐ．１４９−１５７）、ならびにＣｒｉｓ−７（Ａｌｂｅｒｏｌａ−Ｉｌａ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１），Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４６（４），ｐｐ．１０８５−１０９２）、さらにはＳＰ３４などの他のもの（Ｃｏｎｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，７１（１１），ｐｐ．９２５−９３３）は、当技術分野で周知である。それに加えて、癌患者を治療するためのＣＤ３と癌細胞上の表面標的抗原との両方を認識するいくつかの二重特異的抗体方式が、文献に記載されてきた。しかしながら、記載のごとく、多くの二重特異的ＣＤ３方式は、生成の容易性、生成収量、生成物の溶解性、および生成物の薬動学的パラメーターが満足すべきものではないなど、不十分な薬剤的性質を呈する。
【００３５】
本発明に従って用いられる「抗体」という用語は、たとえば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を含む。さらにまた、依然として結合特異性を保持するその誘導体または断片は、「抗体」という用語に含まれる。抗体のフラグメントまたは誘導体は、とくに、ＦａｂまたはＦａｂ’フラグメント、Ｆｄ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖまたはｓｃＦｖフラグメント、単一ドメインＶＨまたはＶ様ドメイン、たとえば、ＶｈＨまたはＶ−ＮＡＲドメイン、さらには多量体方式、たとえば、ミニボディー、ダイアボディー、トリボディー、テトラボディー、または化学的コンジュゲートＦａｂ’多量体を含む（たとえば、Ａｌｔｓｈｕｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０．，Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ，２００５を参照されたい）。「抗体」という用語はまた、キメラ抗体（ヒト定常ドメイン、非ヒト可変ドメイン）、一本鎖抗体、およびヒト化抗体（非ヒトＣＤＲを除いてヒト抗体）などの実施形態を含む。２つの重鎖と２つの軽鎖とからなるヒト化全長ＩｇＧ抗体が最も好ましい。したがって、「全長抗体」という用語は、２つの重鎖と２つの軽鎖とからなる抗体を意味する。
【００３６】
「抗体のＦｃ部分」は、当業者に周知の用語であり、抗体のパパイン切断に基づいて定義される。その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは、次のクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭに分類され、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）にさらに分類される。重鎖定常領域に従って、異なるクラスの免疫グロブリンは、それぞれ、［α］、［δ］、［ε］、［γ］、および［μ］と呼ばれる。抗体のＦｃ部分は、補体活性化、Ｃ１ｑ結合、およびＦｃレセプター結合に基づいて、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害）およびＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）を直接関与する。４つのヒトＩｇＧアイソタイプは、異なるレセプター、たとえば、新生児Ｆｃレセプター、活性化Ｆｃγレセプター、ＦｃｇＲＩ、ＦｃｇＲＩＩａ、およびＦｃｇＲＩＩＩａ、阻害レセプターＦｃｇＲＩＩｂ、ならびにＣ１ｑに結合して、非常に異なる活性を生成する。ヒト抗体のＦｃ部分の活性化レセプターおよび阻害レセプターへの親和性は、工学操作して改変可能であることが知られている（Ｓｔｒｏｈｌ  Ｗ．（２００９）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０，ｐ．６８５−６９１を参照されたい）。
【００３７】
本発明に係る二重特異的結合分子内のＣＤ３特異的結合抗体は、好ましくは、本発明に係る二重特異的結合分子のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の延長を可能にするＦｃ部分を含む。そのようなＦｃ部分は、好ましくは、ヒト起源、より好ましくは、ＩｇＧ１抗体のヒトＦｃ部分、さらにより好ましくは、活性化またはサイレンシングのエフェクター機能を有するＩｇＧ１の工学操作ヒトＦｃ部分に由来するものであり、サイレンシングエフェクター機能は、活性化エフェクター機能よりも好ましい。最も好ましくは、そのようなＦｃ部分は、カバットＥＵインデックス（Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｇ．ａｎｄ  Ｗｕ  Ｔ．Ｔ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８  ｐ  ２１４−２１８を参照されたい）に基づいて番号付けしてＬ２３４およびＬ２３５に突然変異を有するサイレンシングエフェクター機能を備えたＩｇＧ１の工学操作ヒトＦｃ部分である。構築物ＣＯＶＡ４２０、ＣＯＶＡ４２２、およびＣＯＶＡ４６７の調製のために以下の本明細書の実施例で使用されている配列番号２および３を有する抗体は、サイレンシングエフェクター機能ならびに位置Ｌ２３４およびＬ２３５に突然変異を有する抗ＣＤ３抗体である。また、構築物ＣＯＶＡ４９３、ＣＯＶＡ４９４、ＣＯＶＡ４９７、およびＣＯＶＡ４９９の調製のために以下の本明細書の実施例で使用されている配列番号１７１および１７２を有する抗体は、カバットＥＵインデックス（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ＲＬ．ｅｔ  ａｌ（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６  ｐ．６５９１−６６０４を参照されたい）に基づいて番号付けして位置Ｄ２６５およびＰ３２９にサイレンシングエフェクター突然変異を有する抗ＣＤ３抗体である
【００３８】
抗体およびそのフラグメントを生成するための種々の技術は、当技術分野で周知で記載であり、たとえば、Ａｌｔｓｈｕｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０に記載されている。したがって、ポリクローナル抗体は、添加剤およびアジュバントとの混合物で抗原により免疫化した後、動物の血液から取得可能であり、モノクローナル抗体は、連続細胞系培養により生成された抗体を提供する任意の技術により生成可能である。そのような技術の例は、たとえば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）および（１９９９）に記載されており、Ｋｏｅｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５により最初に記載されたハイブリドーマ技術、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（たとえば、Ｋｏｚｂｏｒ，１９８３、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６を参照されたい）、およびヒトモノクローナル抗体を生成するＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）を含む。さらに、組換え抗体は、モノクローナル抗体から取得されうるか、またはファージ、リボソーム、ｍＲＮＡ、細胞ディスプレイなどの種々のディスプレイ方法を用いて、ｄｅ  ｎｏｖｏで調製可能である。組換え体（ヒト化）抗体またはそのフラグメントを発現するのに好適な系は、たとえば、細菌、酵母、昆虫、哺乳動物細胞系、またはトランスジェニック動物もしくは植物から選択されうる（たとえば、米国特許第６，０８０，５６０号明細書、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ，２００５を参照されたい）。さらに、一本鎖抗体の生成のために記載された技術（とくに、米国特許第４，９４６，７７８号明細書を参照されたい）は、本発明に係る標的に特異的な一本鎖抗体を生成するのに適合しうる。ＢＩＡｃｏｒｅシステムで利用される表面プラズモン共鳴を用いて、ファージ抗体の効率を増加させることが可能である。
【００３９】
本発明に係る二重特異的結合タンパク質は、明快な有機合成戦略、固相支援合成技術などの多くの従来の周知の技術のいずれかによりまたは市販の自動合成装置により、調製されうる。一方、従来型の組換え技術単独でまたは従来の合成技術との組合せにより、調製することも可能である。本発明に係る二重特異的結合分子は、以下で本明細書の（ａ）および（ｂ）に定義された化合物を組み合わせることにより取得されうる。
【００４０】
上述したように、ＣＤ３と癌細胞上の表面標的抗原との両方を認識するいくつかの二重特異的抗体は、非常に強力な抗腫瘍死滅活性を呈する。したがって、ＢｉＴＥ（登録商標）抗体は、標的腫瘍抗原を発現する細胞のリダイレクト溶解の高い効力を呈する。ＢｉＴＥ（登録商標）抗体のＥＣ５０値は、０．１〜５０ｐＭの範囲である（Ｂａｕｅｒｌｅ  ＰＡ  ａｎｄ  Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ  Ｃ．（２００９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６９（１２），ｐｐ．４９４１−４９４４）。腫瘍細胞の強力な細胞死滅は、薬理学的に望ましい効果を発揮するために必要とされる。レビューでは、ＢｉＴＥ（登録商標）方式の強力な死滅能力は、（１）標的とエフェクター細胞とをごく近接させることにより細胞溶解シナプスの形成を可能にするその小サイズ、および（２）標的細胞の不在下でエフェクター細胞の全身性活性化を予防するＴＣＲ複合体のその１価エンゲージメント、に帰属されると、Ｒａｄｅｒ  Ｃ．により報告されている（Ｒａｄｅｒ  Ｃ，（２０１１），Ｂｌｏｏｄ，１１７（１７），ｐｐ．４４０３−４４０４）。それに加えて、ＢｉＴＥ（登録商標）クラスの二重特異的抗体は、典型的には、他のＣＤ３二重特異的方式および完全モノクローナルＩｇＧ１抗体と対比して腫瘍細胞溶解に関して１００〜１０，０００倍の有効性を有すると、先行技術により記載されている（Ｗｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ  １０（１８），ｐｐ．１２３７−１２４４）。完全抗体はまた、本発明に係る二重特異的結合分子の一部を形成する。より小さい１価ＢｉＴＥ（登録商標）方式（５５ｋＤａ）は、より大きい２価ｔａｎｄａｂ（登録商標）方式（約１１５ｋＤａ）よりもかなり強力であることが、Ｍφｌｈφｊ  Ｍ．らによりさらに示された（特定のアッセイでは２０００倍超）（Ｍφｌｈφｊ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ，（２００７），Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，４４（８），ｐｐ．１９３５−１９４３）。ＣＤ３へのＢｉＴＥ（登録商標）の１価結合は、ＢｉＴＥ（登録商標）分子の強力な死滅活性に寄与することが、著者らにより指摘されている。
【００４１】
要約すると、小さい１価抗ＣＤ３×抗腫瘍抗原の二重特異的抗体方式（たとえば、ＢｉＴＥ（登録商標）方式）は、大きい２価ＣＤ３二重特異的方式よりも強力なリダイレクトＴ細胞死滅活性を呈することが、先行技術により教示される。したがって、強力な抗腫瘍死滅は、典型的には、小さい１価ＣＤ３二重特異的方式で取得されるため、先行技術では、大きい２価ＣＤ３二重特異的方式を使用しないことが推奨される。
【００４２】
驚くべきことに、完全抗ＣＤ３抗体とＦｙｎｏｍｅｒの２つのコピーとからなる二重特異的結合分子は、腫瘍関連抗原に結合して、強力なリダイレクトＴ細胞死滅活性を媒介しうることが、本発明との関連で見いだされた。注目すべきこととして、本発明に係る二重特異的結合分子は、約１６５ｋＤａのサイズを有する。本発明に係る大きい二重特異的結合分子のＴ細胞媒介細胞傷害性は、予想外なことに、以上で考察された先行技術の教示とは対照的に、小さい１価ＣＤ３二重特異的分子、すなわち、ＢｉＴＥ（登録商標）方式で典型的に見られるのと同等の範囲内である。本発明に係るＣＤ３二重特異的結合分子および先行技術の１価ＣＤ３二重特異的分子の両方の非常に強力な抗腫瘍死滅活性を実証する比較データが、本明細書の実施例に提供される。より特定的には、抗ＣＤ３抗体と、３つの異なる腫瘍関連抗原に結合するＦｙｎｏｍｅｒと、からなる融合タンパク質の例が、示されている。実施例１および図５に示されるように、本発明に係るＣＤ３／ＨＥＲ２二重特異的分子ＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）は、小さい１価二重特異的ｓｃＦｖ対照（配列番号１６７）の細胞傷害有効性と同程度に良好な細胞傷害有効性を示し、両方とも、２桁のｐＭ範囲内のＥＣ５０値を有する（それぞれ、８７ｐＭおよび６０ｐＭのＥＣ５０値）。本発明に係るＥＧＦＲ／ＣＤ３二重特異的分子ＣＯＶＡ４９３（配列番号１７０および１７２）、ＣＯＶＡ４９４（配列番号１７１および１９８）、ＣＯＶＡ４９７（配列番号１９９および１７２）、ＣＯＶＡ４９９（配列番号１７１および２００）が記載されている実施例２、さらには本発明に係るＣＤ３３／ＣＤ３二重特異的分子ＣＯＶＡ４６７（配列番号２および１７５）が記載されている実施例３は、本発明に係る二重特異的分子の強力なリダイレクトＴ細胞死滅活性を追加的に示している。それに加えて、図６は、メディエーターとして富化Ｔ細胞を用いた死滅アッセイで、本発明に係る二重特異的分子ＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）およびＣＯＶＡ４２２（配列番号１６５および１６６）の両方から、ピコモルのＥＣ５０値が得られたことを示している（それぞれ、８ｐＭおよび１７５ｐＭ）。さらに、本明細書の実施例より示されるように、本発明に係るＦｙｎｏｍｅｒ−抗体融合体は、二重特異的ｓｃＦｖ対照抗体方式（配列番号１６７、配列番号１７３、および配列番号１７６）にほぼ匹敵する非常に有利な発現収量（ＣＨＯ細胞の一過性トランスフェクション後、２桁のｍｇ／ｌ範囲内）を示す。それに加えて、本発明に係るＦｙｎｏｍｅｒ−抗体融合体は、有利な生物物理学的性質を有し、かつ凝集することがなく（図３、図１１、および図１５．Ａ）、しかもｉｎ  ｖｉｖｏで長いＩｇＧ様半減期を呈する（図８）。半減期が増加すれば、持続注入の必要がなく、かつ／または逐次治療の間隔を長くすることができることから、健康管理システムのコスト負担の低減にも役立つため、その有意な便益が患者に直接もたらされる。毎週２回の注入後、ＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）は、ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍モデルで有意な腫瘍成長遅延を呈し、これが、ｓｃＦｖ対照分子（ＣＯＶＡ４４６（配列番号１６７）、毎��１回注入）と比較して優れていたことから、ＣＯＶＡ４２０の強力な抗腫瘍有効性がさらに実証される（図９）。
【００４３】
さらに記載のごとく、サイズが小さいため、１価ＣＤ３二重特異的分子は、わずか数時間の短い血清中半減期により特徴付けられる。したがって、多くの場合、治療される患者には便利でないポータブルミニポンプを用いて連続静脈内注入により小サイズ１価ＣＤ３二重特異的分子を投与することが必要である。有利なことに、本発明に係る二重特異的分子は、全長抗体で典型的に得られるのとほぼ同一の血清中半減期を有し（実施例参照）、血清中半減期は、１価ＣＤ３二重特異的分子の血清中半減期よりも優れている。１価ＣＤ３二重特異的分子の他の主要な限界は、Ｆｃレセプターへの結合などの機能性に関連付けられ抗体の定常領域が欠如していることである。本発明に係る二重特異的分子は、抗ＣＤ３抗体の定常領域を含む。
【００４４】
したがって、本発明に係るＣＤ３二重特異的結合分子は、１価ＣＤ３二重特異的分子および完全抗ＣＤ３抗体の利点を兼備している。
【００４５】
１価ＣＤ３二重特異的分子、とくにＢｉＴＥ（登録商標）抗体よりも優れた、本発明に係るＣＤ３二重特異的結合分子の他の利点は、癌細胞で過剰発現される多くの表面標的抗原が、有意により低レベルであるが、非腫瘍細胞でも発現されるという周知の以上で考察された事実に基づく。強力なリダイレクトＴ細胞死滅活性を媒介する二重特異的分子は、理想的には、高レベルの表面抗原を有する癌細胞に対しては選択的にその活性を発揮するが、低レベルの表面抗原を有する正常細胞に対しては発揮しない。
【００４６】
したがって、ＢｉＴＥ（登録商標）抗体は、腫瘍抗原を発現する細胞のリダイレクト溶解の高い効力を呈するが、ＢｉＴＥ（登録商標）抗体の主要な欠点の１つは、より低レベルで腫瘍抗原を発現する非腫瘍細胞をかなりの程度まで死滅させることである。たとえば、抗ＣＤ３／ＥＧＦＲ  ＢｉＴＥ（登録商標）は、注入開始の５６時間後以内に３１および１５４μｇ／ｋｇ／ｄの用量でサルにおいて重度の毒性徴候を示すことが、Ｌｕｔｔｅｒｂｕｅｓｅらにより報告された（Ｌｕｔｔｅｒｂｕｅｓｅ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）ＰＮＡＳ，ｖｏｌ  １０７，ｎｏ．２８，ｐｐ．１２６０５−１２６１０）。３１または１５４μｇ／ｋｇ／ｄでＣ−ＢｉＴＥを摂取した動物の組織病理学的分析では、肝毒性および腎毒性の徴候が示された。それは、これらの臓器で低レベルのＥＧＦＲを発現する細胞のリダイレクト溶解の結果であると思われる。さらに、著者らは、ＥＧＦＲを発現することが知られているすべての組織、すなわち、唾液腺、肝臓、胃、小腸、結腸、直腸、腎臓、副腎、尿管、膀胱、前立腺、および精巣上体での細胞死に注目している。
【００４７】
二重特異的ｓｃＦｖ抗体フラグメントによるＥＧＦＲ発現細胞の非選択的死滅もまた、以下の本明細書の実施例で確認される。乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞は、ＥＧＦＲをかなり過剰発現するが、結腸癌ＨＴ２９細胞は、非腫瘍細胞にほとんど等しいＥＧＦＲの発現レベルを有している（Ｙｉｎｇｊｉｅ  ｅｔ  ａｌ（２００５）；Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ，４（３）：４３５−４４２）。実施例２．３に示されるように、二重特異的抗ＣＤ３／ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ抗体フラグメント（配列番号１７３）は、高ＥＧＦＲ発現レベル（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞）さらには低ＥＧＦＲ発現レベル（ＨＴ２９細胞）を有する細胞の強力なリダイレクト溶解を媒介した。ＥＣ５０値は、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞およびＨＴ２９細胞の死滅に対して、それぞれ、０．２ｐＭおよび２．５ｐＭであった（すなわち、１２．５倍差にすぎない）。したがって、ＥＧＦＲで例示されるように、二重特異的ｓｃＦｖ抗体フラグメントは、表面腫瘍抗原を過剰発現する細胞に対して選択的に強力なリダイレクトＴ細胞死滅活性を媒介することができない。非腫瘍細胞のかなりの望ましくない細胞死滅副作用は、本発明者により、さらには以上で考察された文献Ｌｕｔｔｅｒｂｕｅｓｅ  Ｒ．らにより、観測された。
【００４８】
これとは対照的に、驚くべきことに、抗ＣＤ３抗体と、腫瘍関連抗原に結合するＦｙｎｏｍｅｒと、からなる二重特異的結合分子は、抗原を過剰発現する細胞に対して強力なリダイレクトＴ細胞死滅活性を選択的に媒介可能であるが、より低レベルの抗原を有する細胞は、高濃度であっても死滅されないことを見いだした。実施例２．３に示されるように、抗ＣＤ３抗体と、ＥＧＦＲに結合するＦｙｎｏｍｅｒの２つのコピーと、からそれぞれなる４つの異なる二重特異的結合分子では、高および低ＥＧＦＲ発現細胞間の死滅活性差は、５８０倍〜＞３’５００倍の範囲内であった。
【００４９】
それに加えて、ＣＤ３とＨＥＲ２発現細胞とを標的とする二重特異的ｓｃＦｖ抗体フラグメントはまた、高レベルでさらには低レベルでＨＥＲ２を発現する細胞の両方を非選択的に死滅させることは、本発明の実施例１．７から明らかである。卵巣癌ＳＫＯＶ−３細胞は、ＨＥＲ２をかなり過剰発現するが、乳癌ＭＣＦ−７細胞は、かなり低いＨＥＲ２発現レベルを有する（Ｌａｔｔｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，１９：８１１−８１７）。実施例１．７に示されるように、二重特異的抗ＣＤ３／ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ抗体フラグメント（配列番号１６７）は、高いＨＥＲ２発現レベル（ＳＫＯＶ−３細胞）さらには低いＨＥＲ２発現レベル（ＭＣＦ−７細胞）を有する細胞の強力なリダイレクト溶解を媒介した。ＥＣ５０値は、ＳＫＯＶ−３細胞およびＭＣＦ−７細胞の死滅に対して、それぞれ、２．３ｐＭおよび５３ｐＭであった（すなわち、２３倍差にすぎない）。したがって、ＣＤ３およびＨＥＲ２に対する二重特異的ｓｃＦｖ抗体フラグメントもまた、表面腫瘍抗原を過剰発現する細胞に対して選択的に強力なリダイレクトＴ細胞死滅活性を媒介することができない。この場合も、非腫瘍細胞のかなりの望ましくない細胞死滅副作用が、本発明者らにより観測されたことから、ＣＤ３およびＥＧＦＲに対する二重特異的ｓｃＦｖ抗体フラグメントと関連で得られた結果が確認される。
【００５０】
この場合もまた、驚くべきことに、抗ＣＤ３抗体と、腫瘍関連抗原すなわちＨＥＲ２に結合するＦｙｎｏｍｅｒと、からなる二重特異的結合分子は、抗原を過剰発現する細胞に対して強力なリダイレクトＴ細胞死滅活性を選択的に媒介可能であるが、より低レベルの抗原を有する細胞は、高濃度であっても死滅されないことを見いだした。抗ＣＤ３抗体と、ＨＥＲ２に結合するＦｙｎｏｍｅｒの２つのコピーと、からなる二重特異的結合分子（配列番号１６３および１６４）に関して、実施例１．７および図１０に示されるように、高および低ＨＥＲ２発現細胞間の死滅活性差は、＞４３１０倍であった。
【００５１】
抗原を過剰発現する腫瘍細胞は選択的死滅を受けるが、正常抗原レベルを有する細胞は損傷を受けないことから、ＣＤ３ベースの手法の治療ウィンドウが改善されるため、有意な便益が患者に直接もたらされる。したがって、非腫瘍細胞の望ましくない細胞死滅副作用は、本発明に係る二重特異的抗体構築物の使用により、最小限に抑えることが可能であるか、さらには回避可能である。
【００５２】
本発明の好ましい実施形態によれば、ＣＤ３に特異的に結合する抗体は、テプリズマブ、オテリキシズマブ、Ｃｒｉｓ−７、またはＳＰ３４である。
【００５３】
抗体のテプリズマブ、オテリキシズマブ（Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ  Ｌ．（２０１０）６（３），ｐｐ．１４９−１５７）、Ｃｒｉｓ−７（Ａｌｂｅｒｏｌａ−Ｉｌａ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１），Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４６（４），ｐｐ．１０８５−１０９２）、およびＳＰ３４は、先行技術から公知である。ＭＧＡ０３１およびｈＯＫＴ３−γ１（Ａｌａ−Ａｌａ）とも呼ばれるテプリズマブ（ＣＡＳ−Ｎｒ：８７６３８７−０５−２）は、ヒト化抗ＣＤ３モノクローナル抗体である。テプリズマブは、成熟Ｔリンパ球上に発現されるＣＤ３ε鎖のエピトープに結合し、そうすることにより、複数の自己免疫疾患の根底をなす病理学的免疫反応をモジュレートしうる。特定的には、テプリズマブは、望ましくないエフェクターＴ細胞を阻害し、有益な調節性Ｔ細胞機能を促進することにより、免疫寛容を促進しうる。ＴＲＸ４としても知られるオテリキシズマブ（ＣＡＳ  Ｎｒ  ８８１１９１−４４−２）は、同様にＣＤ３のε鎖を標的とする。モノクローナル抗体Ｃｒｉｓ−７は、成熟ヒトＴ細胞上のＣＤ３抗原を認識する。ＣＤ３抗原は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）およびζ鎖と会合してＴリンパ球中に活性化シグナルを生成する４つの個別の鎖（ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、および２つのＣＤ３ε）で構成されるタンパク質複合体である。この抗体は、ＢＭＡ  ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬＳから取得可能である。ＳＰ３４は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから取得可能である。
【００５４】
本発明によれば、ＣＤ３に特異的に結合する抗体としてＣｒｉｓ−７またはＳＰ３４のヒト化型を使用することが好ましい。
【００５５】
抗体をヒト化する手段および方法は、当技術分野で十分に確立されている。たとえば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８），Ｎａｔｕｒｅ  ３３２（６１６２）：３３２−３２３またはＫａｓｈｍｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６（１）：２５−３４を参照されたい。
【００５６】
抗体のテプリズマブおよびオテリキシズマブは、サイレンシングエフェクター機能を有する抗体である。ＣＤ３に特異的に結合する抗体としてサイレンシングエフェクター機能を有するＣｒｉｓ−７またはＳＰ３４の改変型を使用されることもまた、好ましい。本明細書で以下にさらに詳述されるように、サイレンシングエフェクター機能を有する抗体は、カバットＥＵインデックスに従って番号付けしてＬ２３４とＬ２３５または位置Ｄ２６５とＰ３２９に突然変異を有することが最も好ましい。ＣＤ３に特異的に結合する抗体として、サイレンシングエフェクター機能を有するＣｒｉｓ−７またはＳＰ３４のヒト化型を利用することが好ましいことをも、理解すべきである。
【００５７】
本発明の好ましい実施形態によれば、抗ＣＤ３抗体は、配列番号２および／または配列番号３を含むか、または配列番号２および配列番号３を含むかもしくはそれらからなる。
【００５８】
本明細書全体を通して、配列番号２および配列番号３は、それぞれ、抗ＣＤ３抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域であることを理解すべきである。本発明に係る抗ＣＤ３抗体が配列番号２のＶＨ領域を含むが、配列番号３のＶＬ領域を同時に含まない場合、抗ＣＤ３抗体は、配列番号３以外の抗ＣＤ３抗体のＶＬ領域を含むことを理解すべきである。同様に、本発明に係る抗ＣＤ３抗体が配列番号３のＶＬ領域を含むが、配列番号２のＶＨ領域を同時に含まない場合、抗ＣＤ３抗体は、配列番号２以外の抗ＣＤ３抗体のＶＨ領域を含むことを理解すべきである。
【００５９】
本発明の他の好ましい実施形態では、抗ＣＤ３抗体は、配列番号１７１および／または配列番号１７２を含むか、または配列番号１７１および配列番号１７２を含むかもしくはそれらからなる。
【００６０】
本明細書全体を通して、配列番号１７１および配列番号１７２は、それぞれ、抗ＣＤ３抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域であることを理解すべきである。本発明に係る抗ＣＤ３抗体が配列番号１７１のＶＨ領域を含むが、配列番号１７２のＶＬ領域を同時に含まない場合、抗ＣＤ３抗体は、配列番号１７２以外の抗ＣＤ３抗体のＶＬ領域を含むことを理解すべきである。同様に、本発明に係る抗ＣＤ３抗体が配列番号１７２のＶＬ領域を含むが、配列番号１７１のＶＨ領域を同時に含まない場合、抗ＣＤ３抗体は、配列番号１７１以外の抗ＣＤ３抗体のＶＨ領域を含むことを理解すべきである。
【００６１】
以下の本明細書の実施例から明らかなように、配列番号２および配列番号３を含む抗ＣＤ３抗体ならびに配列番号１７１および配列番号１７２を含む抗ＣＤ３抗体は、本発明を例示するために使用されている。
【００６２】
本発明のさらなる好ましい実施形態によれば、結合分子は、ＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、ＥＰＨＡ２、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ＩＧＦＲ１、ＣＤ３３、線維芽細胞活性化タンパク質α、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ｃ−ＭＥＴ、ＥｐＣＡＭ、またはＰＳＭＡに特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含む。このリスト内では、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、およびＣＤ３３が最も好ましい。３つの標的のこのリスト中では、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２が好ましく、ＥＧＦＲが最も好ましい。
【００６３】
したがって、本発明に係る好ましい結合分子は、ＨＥＲ２に特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、かつ配列番号２および／または配列番号３を含むか、ＣＤ１９に特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、かつ配列番号２および／または配列番号３を含むか、ＥＧＦＲに特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、かつ配列番号２および／または配列番号３を含むか、ＣＥＡに特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、かつ配列番号２および／または配列番号３を含むか、ＥＰＨＡ２に特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、かつ配列番号２および／または配列番号３を含むか、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカンに特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、かつ配列番号２および／または配列番号３を含むか、ＩＧＦＲ１に特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、かつ配列番号２および／または配列番号３を含むか、ＣＤ３３に特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、かつ配列番号２および／または配列番号３を含むか、線維芽細胞活性化タンパク質αに特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、かつ配列番号２および／または配列番号３を含むか、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）に特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、かつ配列番号２および／または配列番号３を含むか、ｃ−ＭＥＴに特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、かつ配列番号２および／または配列番号３を含むか、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、かつ配列番号２および／または配列番号３を含むか、またはＰＳＭＡに特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、かつ配列番号２および／または配列番号３を含む。
【００６４】
同様に、本発明に係る好ましい結合分子は、ＨＥＲ２に特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、かつ配列番号１７１および／または配列番号１７２を含むか、ＣＤ１９に特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、かつ配列番号１７１および／または配列番号１７２を含むか、ＥＧＦＲに特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、かつ配列番号１７１および／または配列番号１７２を含むか、ＣＥＡに特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、かつ配列番号１７１および／または配列番号１７２を含むか、ＥＰＨＡ２に特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、かつ配列番号１７１および／または配列番号１７２を含むか、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカンに特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、かつ配列番号１７１および／または配列番号１７２を含むか、ＩＧＦＲ１に特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、かつ配列番号１７１および／または配列番号１７２を含むか、ＣＤ３３に特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、かつ配列番号１７１および／または配列番号１７２を含むか、線維芽細胞活性化タンパク質αに特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、かつ配列番号１７１および／または配列番号１７２を含むか、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）に特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、かつ配列番号１７１および／または配列番号１７２を含むか、ｃ−ＭＥＴに特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、かつ配列番号１７１および／または配列番号１７２を含むか、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、かつ配列番号１７１および／または配列番号１７２を含むか、またはＰＳＭＡに特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、かつ配列番号１７１および／または配列番号１７２を含む。
【００６５】
以上で考察されたタンパク質および抗原は、癌細胞上に発現される表面標的抗原であるかまたはそれを含むことが、当技術分野で十分に特徴付けられている。
【００６６】
Ｎｅｕ、ＥｒｂＢ−２、ＣＤ３４０（分化クラスター３４０）、またはｐ１８５としても知られるＨＥＲ２（ヒト表皮成長因子レセプター２）は、ヒトにおいてＥＲＢＢ２遺伝子によりコードされるタンパク質である。ＨＥＲ２は、１９８４年に初めて記載された１８５ｋＤａレセプターである（Ｓｃｈｌｅｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：５１３−５１６）。ＨＥＲ２は、表皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ）ファミリーのメンバーである。ヒトＨＥＲ２は、ＮＣＢＩ参照：ＮＰ＿００４４３９により表される。この遺伝子の増幅または過剰発現は、特定の侵攻性タイプの乳癌の病理発生および進行で重要な役割を果たすことが示されてきており、近年、発展して疾患に対する重要なバイオマーカーおよび療法標的になってきた。他のＨＥＲ２陽性腫瘍としては、卵巣癌および胃癌が挙げられる。
【００６７】
Ｂリンパ球抗原ＣＤ１９またはＣＤ１９（分化クラスター１９）は、ヒトにおいてＣＤ１９遺伝子によりコードされるタンパク質である（ＮＣＢＩ参照：ＮＰ＿００１１７１５６９）。ＣＤ１９は、Ｂ細胞の顕著な特徴であるため、このタンパク質は、Ｂ−ＡＬＬおよび非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を含めて、このタイプの細胞から生じる癌、とくに、Ｂ細胞性リンパ腫を診断するためにおよびその治療標的として使用されてきた。
【００６８】
表皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−１、ヒトではＨＥＲ１）は、細胞外タンパク質リガンドの表皮成長因子ファミリー（ＥＧＦファミリー）のメンバーに対する細胞表面レセプターである（ＮＣＢＩ参照：ＮＰ＿００５２１９）。ＥＧＦＲは、肺癌、頭頸部癌、および結腸直腸癌でのその役割が知られている。
【００６９】
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）は、細胞接着に関与する糖タンパク質である（ＮＣＢＩ参照：ＡＡＡ６６１８６）。結腸直腸癌、胃癌、膵臓癌、肺癌、および乳癌の個体、さらには髄様甲状腺癌の個体からの血清は、健常者よりも高レベルのＣＥＡを有する（２．５ｎｇ／ｍｌ超）ことが判明した。
【００７０】
ＥＰＨレセプターＡ２（エフリンＡ型レセプター２）は、ヒトにおいてＥＰＨＡ２遺伝子によりコードされるタンパク質である（ＮＣＢＩ参照：ＡＡＨ３７１６６）。癌におけるＥＰＨＡ２の役割は、たとえば、Ｋｉｎｃｈ  ＭＳ，Ｃａｒｌｅｓ−Ｋｉｎｃｈ  Ｋ（２００３）．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ２０（１）：５９−６８から公知である。ＥｐｈＡ２は、皮膚黒色腫を含めて多くの癌タイプで過剰発現されることが、研究で報告されてきた。ＥｐｈＡ２は、リガンド非依存的に神経膠腫細胞および前立腺癌細胞の移動を促進することが報告された（Ｕｄａｙａｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ（２０１１），Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ３０：４９２１−４９２９）。
【００７１】
黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）またはニューロン−グリア抗原２（ＮＧ２）としても知られるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＮＣＢＩ参照：ＮＰ＿００１８８８）は、ヒトにおいてＣＳＰＧ４遺伝子によりコードされるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンである。ＣＳＰＧ４は、内皮基底膜上に広がる黒色腫細胞の初期イベント時に細胞基質間相互作用を安定化させる役割を果たす。それは、ヒト悪性黒色腫細胞により発現される内在性膜コンドロイチン硫酸プロテオグリカンである。
【００７２】
インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）レセプター（ＮＣＢＩ参照：Ｐ０８０６９）は、ヒト細胞表面上に見いだされるタンパク質である。それは、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）と呼ばれるホルモンおよびＩＧＦ−２と呼ばれる関連ホルモンにより活性化される膜貫通レセプターである。ＩＧＦ−１Ｒは、乳癌、前立腺癌、および肺癌を含めて、いくつかの癌に関与する。
【００７３】
ＣＤ３３またはＳｉｇｌｅｃ−３は、骨髄系列の細胞上に発現される膜貫通レセプターである。ＣＤ３３は、急性骨髄性白血病の治療標的として使用可能である。ヒトＣＤ３３は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１７６３．３）により表され、当技術分野では、たとえば、Ｒａｐｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ５２（６）：１０９８−１１０７に記載されている。
【００７４】
セプラーゼまたは１７０ｋＤａ黒色腫膜結合ゼラチナーゼとしても知られる線維芽細胞活性化タンパク質（ＮＣＢＩ参照：ＡＡＢ４９６５２）α（ＦＡＰ）は、ヒトにおいてＦＡＰ遺伝子によりコードされるタンパク質である。それは、上皮癌の反応性間質線維芽細胞、創傷治癒の肉芽組織、ならびに骨肉腫および軟部組織肉腫の悪性細胞で選択的に発現される。
【００７５】
前立腺幹細胞抗原（ＮＣＢＩ参照番号：ＡＡＣ３９６０７）は、ヒトにおいてＰＳＣＡ遺伝子によりコードされるタンパク質である。この遺伝子は、大部分の前立腺癌でアップレギュレートされ、膀胱癌および膵臓癌でも検出される。
【００７６】
ｃ−Ｍｅｔ（ＭＥＴまたはＭＮＮＧ  ＨＯＳトランスフォーミング遺伝子）は、肝細胞成長因子レセプター（ＨＧＦＲ）として知られるタンパク質をコードする癌原遺伝子である（ＮＣＢＩ参照：ＮＰ＿０００２３６）。癌での異常なＭＥＴ活性化は、予後不良と相関し、異常に活性なＭＥＴは、腫瘍成長、栄養素を腫瘍に供給する新しい血管の形成、および他の器官への癌の広がりをトリガーする。ＭＥＴは、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、胃癌、乳癌、および脳癌を含めて、多くのタイプのヒト悪性腫瘍でデレギュレートされる。
【００７７】
上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）は、ヒトにおいてＥＰＣＡＭ遺伝子によりコードされるタンパク質である。ＥｐＣＡＭは、ほとんどすべての癌腫上に発現される汎上皮分化抗原である。ヒトＥｐＣＡＭは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｐ１６４２２．２（刊行日２０１２年２月２２日）により表され、当技術分野では、たとえば、Ｓｔｒｎａｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４９（２）：３１４−３１７に記載されている。
【００７８】
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）（グルタメートカルボキシペプチダーゼＩＩとしても知られる）（ＮＣＢＩ参照：ＡＡＡ６０２０９）は、前立腺組織および少数の他の組織に見いだされる２型内在性膜糖タンパク質である。それは、前立腺癌の治療標的である。
【００７９】
以上から明らかなように、ＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、ＥＰＨＡ２、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ＩＧＦＲ１、ＣＤ３３、線維芽細胞活性化タンパク質α、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ｃ−ＭＥＴ、ＥｐＣＡＭ、またはＰＳＭＡのそれぞれは、特定の癌タイプの病理発生および治療に関与する。本発明に係る結合分子が、ＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、ＥＰＨＡ２、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ＩＧＦＲ１、ＣＤ３３、線維芽細胞活性化タンパク質α、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ｃ−ＭＥＴ、ＥｐＣＡＭ、またはＰＳＭＡに特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含む場合、ＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、ＥＰＨＡ２、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ＩＧＦＲ１、ＣＤ３３、線維芽細胞活性化タンパク質α、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ｃ−ＭＥＴ、ＥｐＣＡＭ、またはＰＳＭＡの過剰発現に関連付けられる癌をそれぞれ治療するために、それぞれの結合分子を使用することが好ましい。
【００８０】
本発明に係る結合分子は、ＨＥＲ２に特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含みうる。ただし、（ｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＮ末端に結合される（すなわち、別の言い方をすれば、前記２つのポリペプチドの第１のコピーは、前記抗体の第１の重鎖のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２のコピーは、前記抗体の第２の重鎖のＮ末端に結合される）か、（ｉｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＣ末端に結合されるか、（ｉｉｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２のＮ末端に結合されるか、または（ｉｖ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２のＣ末端に結合される。
【００８１】
以上の選択肢との関連では、結合分子は、ＨＥＲ２に特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＮ末端に結合されることが好ましい。
【００８２】
ＨＥＲ２への特異的結合とは、本発明に係るポリペプチドがＨＥＲ２には特異的に結合するが、ＥＧＦＲなどの他の関連タンパク質には特異的に結合しないことを意味する。「ＨＥＲ２に特異的に結合するポリペプチド」は、好ましくは、「ＨＥＲ２の活性を阻害するポリペプチド」である。そのようなポリペプチドは、ＨＥＲ２の活性を低減するかまたは完全に消失する能力を有する。その活性については、本明細書の以上に詳細に記載されている。これに関連して、ＨＥＲ２活性を阻害するとは、レセプターのそのリガンドへの結合を阻害することを意味することが好ましい。好ましい順に、ポリペプチドは、ＨＥＲ２の活性を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％阻害することがさらに好ましい。また、好ましい順に、本発明に係るポリペプチドによるＨＥＲ２の阻害に対するＩＣ５０値は、１０００ｎＭ以下、５００ｎＭ以下、４００ｎＭ以下、３００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、または７５ｎＭ以下であることが好ましい。好ましくは、本発明に係るポリペプチドは、ＦＡＣＳにより決定したときに１０−７〜１０−１２Ｍ、より好ましくは１０−８〜１０−１２Ｍ、最も好ましくは１０−９〜１０−１２ＭのＥＣ５０値でＨＥＲ２に結合する。
【００８３】
ＨＥＲ２に特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは、好ましくは、ＨＥＲ２の同一エピトープに結合する。以下の本明細書の実施例から明らかなように、抗ＨＥＲ２結合Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）Ｃ１２（配列番号４）は、本発明を例示するために使用されている。したがって、結合分子は、配列番号４の２つのコピーを含むことが好ましい。
【００８４】
したがって、ＨＥＲ２に特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは、好ましい順に、配列番号４（Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）Ｃ１２）のアミノ酸配列に対して、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、および少なくとも９５％の配列同一性を有することが好ましい。
【００８５】
より好ましくは、ＨＥＲ２に特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは、以下の式Ｉを有する。ただし、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有し、同一性の決定では、配列番号１のアミノ酸位置１２〜１７および３１〜３４が除外されること、を条件とする。
【００８６】
ＧＶＴＬＦＶＡＬＹＤＹＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＬＳＦＨＫＧＥＫＦＱＩＬＸ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６ＧＸ１７ＷＷＸ１８ＡＲＳＬＴＴＧＥＸ１９ＧＸ２０ＩＰＳＸ２１ＹＶＡＰＶＤＳＩＱ（式Ｉ）
式中、Ｘ１〜Ｘ７、Ｘ１１〜Ｘ１３、およびＸ１７〜Ｘ２１は、それぞれ独立して、Ｇ、Ｖ、Ｔ、Ｌ、Ｆ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｓ、Ｈ、Ｋ、Ｅ、Ｑ、Ｉ、Ｗ、Ｒ、Ｍ、Ｐ、Ｎ、およびＣから、より好ましくは、Ｇ、Ｖ、Ｔ、Ｌ、Ｆ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｓ、Ｈ、Ｋ、Ｅ、Ｑ、Ｉ、Ｗ、Ｒ、Ｍ、Ｐ、およびＮから選択され、かつＸ８〜Ｘ１０およびＸ１４〜Ｘ１６は、それぞれ独立して、Ｇ、Ｖ、Ｔ、Ｌ、Ｆ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｓ、Ｈ、Ｋ、Ｅ、Ｑ、Ｉ、Ｗ、Ｒ、Ｍ、Ｐ、Ｎ、およびＣから、より好ましくは、Ｇ、Ｖ、Ｔ、Ｌ、Ｆ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｓ、Ｈ、Ｋ、Ｅ、Ｑ、Ｉ、Ｗ、Ｒ、Ｍ、Ｐ、およびＮから選択され、またはＸ８〜Ｘ１０およびＸ１４〜Ｘ１６の１つ以上は、不在である（それぞれ、配列番号５または好ましくは配列番号１６８）。また、本発明に係る結合分子は、配列番号５の２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含むかまたはそれからなり、前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＮ末端ならびに配列番号２および配列番号３の抗ＣＤ３抗体に結合されることが好ましい。同様に、本発明に係る結合分子は、配列番号１６８の２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含むかまたはそれからなり、前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＮ末端ならびに配列番号２および配列番号３の抗ＣＤ３抗体に結合されることが好ましい。
【００８７】
さらにより好ましくは、
Ｘ１は、Ｔ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｙ、Ｖ、Ｗ、Ｎ、Ｓ、Ｆ、またはＫから選択され、
Ｘ２は、Ｓ、Ａ、Ｒ、またはＴから選択され、
Ｘ３は、Ｙ、Ｒ、Ｈ、Ｔ、Ｎ、Ｖ、Ｗ、またはＳから選択され、
Ｘ４は、Ｎ、Ｄ、Ｍ、Ｙ、Ｒ、Ｐ、Ｅ、Ｌ、Ｈ、Ｔ、Ｇ、またはＦから選択され、
Ｘ５は、Ｔ、Ｓ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｍ、Ｎ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、またはＥから選択され、
Ｘ６は、Ｒ、Ｍ、Ｋ、Ｄ、Ｆ、Ｔ、Ｇ、Ｈ、Ｓ、Ｐ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｌ、Ａ、またはＰから選択され、
Ｘ７は、Ｄ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｈ、Ｎ、Ｒ、Ｆ、Ｓ、またはＡから選択され、
Ｘ８は、Ｇ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、もしくはＹから選択されるかまたは不在であり、
Ｘ９は、Ｑ、Ｄ、Ｓ、Ｈから選択されるかまたは不在であり、
Ｘ１０は、Ｄ、Ｖから選択されるかまたは不在であり、
Ｘ１１は、Ｒ、Ｋ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ｗ、Ｍ、Ｈ、Ｌ、Ｆ、Ｅ、Ｔ、Ｐ、Ａ、Ｄ、またはＶから選択され、
Ｘ１２は、Ｍ、Ｒ、Ｅ、Ｇ、Ｎ、Ｄ、Ｓ、Ａ、Ｑ、Ｆ、Ｐ、Ｋ、Ｙ、Ｔ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、またはＷから選択され、
Ｘ１３は、Ｅ、Ｗ、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｓ、Ｖ、Ｎ、Ｄ、Ｈ、Ｇ、Ｔ、Ｑ、Ａ、Ｙ、Ｌ、またはＭから選択され、
Ｘ１４は、Ｄ、Ｒ、Ｑ、Ｓ、Ａ、Ｎ、Ｐ、Ｉ、Ｈ、Ｔ、Ｙ、Ｅ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｖ、Ｉ、Ｗから選択されるかまたは不在であり、
Ｘ１５は、Ｇ、Ｓ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｔ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｒ、Ｐ、Ｋ、Ｍ、Ｈ、Ｙから選択されるかまたは不在であり、
Ｘ１６は、Ｋ、Ｇ、Ｒ、Ａ、Ｔ、Ｖ、Ｓ、Ｉ、Ｅ、Ｑ、Ｐ、Ｄ、Ｎ、Ｈから選択されるかまたは不在であり、
Ｘ１７は、Ｖ、Ｄ、Ｔ、Ｉ、またはＹから選択され、
Ｘ１８は、Ｅ、Ａ、Ｒ、Ｔ、またはＱから選択され、
Ｘ１９は、Ｔ、Ｉ、またはＶから選択され、
Ｘ２０は、Ｙ、Ｌ、またはＦから選択され、かつ
Ｘ２１は、ＮまたはＳから選択される（配列番号６）。
【００８８】
同様に、本発明に係る結合分子は、配列番号６の２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含むかまたはそれからなり、前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＮ末端ならびに配列番号２および配列番号３の抗ＣＤ３抗体に結合されることがさらに好ましい。
【００８９】
他のより好ましい実施形態では、式Ｉ中の残基Ｘは、独立して、次のものから選択される。すなわち、Ｘ１〜Ｘ１０は、ＴＳＹＮＴＲＤであり（すなわち、Ｘ８〜Ｘ１０は、不在である；配列番号７）、Ｘ１１〜Ｘ１６は、ＲＭＥＤであり（すなわち、Ｘ１４〜Ｘ１６は、不在である；配列番号８）、Ｘ１７は、Ｖであり、Ｘ１８は、Ｅであり、Ｘ１９は、Ｔであり、Ｘ２０は、Ｙであり、かつ／またはＸ２１は、Ｎである。したがって、本発明に係る結合分子は、式Ｉの２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含むかまたはそれからなり、式Ｉ中の残基Ｘは、独立して、次のものから選択されることがさらに好ましい。すなわち、Ｘ１〜Ｘ１０は、ＴＳＹＮＴＲＤであり（すなわち、Ｘ８〜Ｘ１０は、不在である；配列番号７）、Ｘ１１〜Ｘ１６は、ＲＭＥＤであり（すなわち、Ｘ１４〜Ｘ１６は、不在である；配列番号８）、Ｘ１７は、Ｖであり、Ｘ１８は、Ｅであり、Ｘ１９は、Ｔであり、Ｘ２０は、Ｙであり、かつ／またはＸ２１は、Ｎであり、前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＮ末端ならびに配列番号２および配列番号３の抗ＣＤ３抗体に結合される。また、上述した特定の残基Ｘ１１〜Ｘ２１は、組み合わせて使用されることが好ましい。
【００９０】
好ましくは、配列番号４のアミノ酸配列に対して、好ましい順に、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、および少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはそれらからなる、ＨＥＲ２に特異的に結合する以上に定義されたＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは、配列番号４からなる結合（ポリ）ペプチドの結合能を保持するかまたは本質的に保持する。すなわち、それぞれの標的エピトープに結合する強度（たとえば、解離定数により決定される）は、保持されるかまたは本質的に保持される。ＨＥＲ２に特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドの結合能は、その結合能の少なくとも６０％が保持されるのであれば、本質的に保持される。好ましくは、その結合能の少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％は、保持される。より好ましくは、結合能の少なくとも９０％、たとえば、少なくとも９５％、さらにより好ましくは、少なくとも９８％、たとえば、少なくとも９９％が保持される。最も好ましくは、結合能は、完全に、すなわち、１００％保持される。
【００９１】
ＦｙｎＳＨ３由来ポリペプチドＣ１２（配列番号４）は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定したとき、ＨＥＲ２上のその特異的エピトープに対して７×１０−８Ｍの解離定数を有する。このために、たとえば、ＢＩＡｃｏｒｅセンサーチップ上に固定されているＨｉｓタグ特異的抗体により、ＦｙｎＳＨ３由来ポリペプチドを捕獲する。特異的エピトープを含有する抗原を注入した後、複合体の形成をモニターし、ＢＩＡｃｏｒｅ評価ソフトウェアを用いて曲線当てはめを行うことにより、会合速度定数（ｋｏｎ）または解離速度定数（ｋｏｆｆ）または解離定数（ＫＤ）を取得する。したがって、配列番号４のアミノ酸配列に対して、好ましい順に、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、および少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはそれらからなる結合（ポリ）ペプチドの結合能は、ＨＥＲ２結合に対して、好ましくは同一の条件下で、少なくとも１×１０−６Ｍ、好ましくは少なくとも１×１０−７Ｍの解離定数が保持されるのであれば、本質的に保持される。また、配列番号４からなる結合（ポリ）ペプチドと比較して増加した結合能、すなわち、１００％超の活性を有する結合（ポリ）ペプチド）も、本発明に係るものである。たとえば、本明細書では、少なくとも１×１０−８Ｍ、たとえば、少なくとも１×１０−９Ｍなど、より好ましくは少なくとも１×１０−１０Ｍ、たとえば、少なくとも１×１０−１１Ｍなど、さらにより好ましくは少なくとも１×１０−１２Ｍ、最も好ましくは少なくとも１×１０−１３Ｍの解離定数を有する結合（ポリ）ペプチドが、想定される。結合能を評価する方法は、当技術分野で周知であり、限定されるものではないが、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術またはＥＬＩＳＡを含む。
【００９２】
本発明の他の好ましい実施形態では、ＦｙｎＳＨ３由来ポリペプチド（すなわち、抗ＣＤ３抗体を含まないポリペプチド）は、配列番号４および９〜１５９からなる群から選択される配列を有する。ＦｙｎＳＨ３由来ポリペプチドは、最も好ましくは、Ｃ１２（配列番号４）である。したがって、本発明に係る結合分子はまた、配列番号４および９〜１５９（配列番号４が最も好ましい）からなる群から選択される２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＮ末端ならびに配列番号２および配列番号３の抗ＣＤ３抗体に結合されることが好ましい。
【００９３】
したがって、Ｆｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドが、ＨＥＲ２に特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドである、以上の実施形態では、ＣＤ３に特異的に結合する抗体は、配列番号２および／または３を含むことがとくに好ましい。
【００９４】
本発明の他の好ましい実施形態によれば、ＣＤ３に特異的に結合する抗体およびＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは、リンカーにより結合される。本発明に係る二重特異的結合分子が２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドとＣＤ３特異的結合抗体とを含むかまたはそれからなる場合、第１のＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは、ＣＤ３特異的結合抗体にリンカーにより結合され、かつ第２のＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは、ＣＤ３特異的結合抗体にリンカーにより結合される。
【００９５】
本発明に従って用いられる「リンカー」という用語は、ＣＤ３特異的結合抗体と本発明に係るＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドとを分離する一連のアミノ酸（すなわち、ペプチドリンカー）さらには非ペプチドリンカーを意味する。本結合分子が単一ポリペプチド鎖を含む場合、リンカーがペプチドリンカーであることは、分かるであろう。
【００９６】
リンカーの性質、すなわち、長さおよび／または組成（たとえば、アミノ酸配列など）は、二重特異的分子の安定性および／または溶解性の改変または向上を行いうる。それは、得られた結合分子の可撓性の向上および／または立体障害の低減による標的抗原への結合の改善を行いうる。リンカーの長さおよび組成は、本発明に係る結合分子のそれぞれの結合（ポリ）ペプチドの組成に依存する。当業者であれば、さまざまなリンカーの適合性の試験方法を熟知している。たとえば、結合分子の性質は、さまざまなタイプのリンカーを使用したときのその結合親和性を分析することにより、容易に試験可能である。それに加えて、各結合（ポリ）ペプチドに対してそれぞれの測定を単独で行って、結合分子への結合親和性を比較しうる。得られた分子の安定性は、当技術分野で公知の方法により、たとえば、ヒト血清中３７℃で種々の時間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡ法を用いて分子の残留結合能を決定するなどにより、測定可能である。
【００９７】
本発明に従って用いられる「非ペプチドリンカー」という用語は、ペプチドリンカーを除いて２つ以上の反応基を有する結合基を意味する。たとえば、非ペプチドリンカーは、本発明に係る分子の結合部分の反応基、たとえば、アミノ末端、リシン残基、ヒスチジン残基、またはシステイン残基に個別に結合する反応基を両末端に有するポリマー、たとえば、ポリエチレングリコールなどでありうる。非ペプチドリンカーの反応基としては、ヒドロキシル基、アルデヒド基、プロピオン酸のアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基、ケトン基、ビニルスルホン基、チオール基、ヒドラジド基、カルボニルジミダゾール（ＣＤＩ）基、ニトロフェニルカーボネート（ＮＰＣ）基、トリシレート基、イソシアネート基、およびスクシンイミド誘導体が挙げられる。スクシンイミド誘導体の例としては、スクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ）、スクシンイミジルブタン酸（ＳＢＡ）、スクシンイミジルカルボキシメチラート（ＳＣＭ）、スクシンイミジルスクシンアミド（ＳＳＡ）、スクシンイミジルスクシネート（ＳＳ）、スクシンイミジルカーボネート、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）が挙げられる。非ペプチドポリマーの両末端の反応基は、同一であっても異なっていてもよい。たとえば、非ペプチドポリマーは、一方の末端にマレイミド基および他方の末端にアルデヒド基を有しうる。好ましくは、ポリマーはポリエチレングリコールである。
【００９８】
好ましい選択肢としては、ペプチド性（またはペプチド）リンカー、より特定的には、２〜３０アミノ酸の長さを有するオリゴペプチドが挙げられる。単一のアミノ酸の使用もまた、意図的に想定される。ペプチドリンカーの好ましい長さ範囲は、５〜１５アミノ酸である。他の好ましい長さは、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸である。
【００９９】
とくに好ましいのは、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％の小アミノ酸、たとえば、グリシン、セリン、およびアラニンに一致するペプチドのリンカーである。とくに好ましいのは、グリシンおよびセリンのみからなるリンカーである。最も好ましいのは、配列番号１６０〜１６２のリンカーであり、とくに好ましいリンカーは、配列番号１６２の配列からなるペプチドのリンカーである。
【０１００】
本発明のより好ましい実施形態によれば、リンカーはペプチドリンカーである。本発明のさらにより好ましい実施形態によれば、リンカーは、配列番号１６２、１６０、および１６１からなる群から選択される配列を有する。配列番号１６２のリンカーが最も好ましい。
【０１０１】
Ｆｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドが、ＨＥＲ２に特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドである、以上の実施形態では、それに加えて、ＣＤ３に特異的に結合する抗体およびＨＥＲ２に特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは、配列番号１６２を含むリンカーにより結合されることが、とくに好ましい。
【０１０２】
以下の本明細書の実施例から明らかなように、配列番号１６２を有するリンカーを介して、配列番号２および配列番号３を含む抗体をＦｙｎｏｍｅｒ（登録商標）Ｃ１２（配列番号４）に融合させた。前記抗体の重鎖のＣ末端（ＣＯＶＡ４２２）さらにはＮ末端（ＣＯＶＡ４２０）への融合体を生成した。
【０１０３】
本発明のさらなる好ましい実施形態によれば、結合分子は、ＥＧＦＲに特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含む。ただし、（ｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＮ末端に結合されるか、（ｉｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＣ末端に結合されるか、（ｉｉｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２のＮ末端に結合されるか、または（ｉｖ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２のＣ末端に結合される。
【０１０４】
ＥＧＦＲへの特異的結合とは、本発明に係るポリペプチドがＥＧＦＲには特異的に結合するが、ＨＥＲ２などの他の関連タンパク質には特異的に結合しないことを意味する。「ＥＧＦＲに特異的に結合するポリペプチド」は、好ましくは、「ＥＧＦＲの活性を阻害するポリペプチド」である。そのようなポリペプチドは、ＥＧＦＲの活性を低減するかまたは完全に消失する能力を有する。その活性については、本明細書の以上に詳細に記載されている。これに関連して、ＥＧＦＲ活性を阻害するとは、レセプターのそのリガンドへの結合を阻害することを意味することが好ましい。好ましい順に、ポリペプチドは、ＥＧＦＲの活性を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％阻害することがさらに好ましい。また、好ましい順に、本発明に係るポリペプチドによるＥＧＦＲの阻害に対するＩＣ５０値は、１０００ｎＭ以下、５００ｎＭ以下、４００ｎＭ以下、３００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、または７５ｎＭ以下であることが好ましい。好ましくは、本発明に係るポリペプチドは、ＦＡＣＳにより決定したときに１０−７〜１０−１２Ｍ、より好ましくは１０−８〜１０−１２Ｍ、最も好ましくは１０−９〜１０−１２ＭのＥＣ５０値でＥＧＦＲに結合する。
【０１０５】
ＥＧＦＲに特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは、好ましくは、ＥＧＦＲの同一エピトープに結合する。以下の本明細書の実施例から明らかなように、抗ＥＧＦＲ結合Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）ＥＲ７Ｌ２Ｄ６（配列番号１６９）およびＥＲ９Ｌ３Ｄ７（配列番号１８７）は、本発明を例示するために使用されている。したがって、結合分子は、配列番号１６９または配列番号１８７の２つのコピーを含むことが好ましい。
【０１０６】
ＥＧＦＲに特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは、好ましい順に、配列番号１６９（Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）ＥＲ７Ｌ２Ｄ６）またはＥＲ９Ｌ３Ｄ７（配列番号１８７）のアミノ酸配列に対して、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、および少なくとも９５％の配列同一性を有することが好ましい。また、ＥＧＦＲに特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは、（ａ）ＧＶＴＬＦＶＡＸ１ＹＤＹＥＡＲＧＬＸ２ＲＸ３ＦＤＬＳＦＨＫＧＥＫＦＱＩＬＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＧＤＷＷＥＡＲＳＬＴＴＧＥＴＧＹＩＰＳＮＹＶＡＰＶＤＳＩＱ（式ＩＩ）（式中、アミノ酸位置Ｘ１〜Ｘ８は、任意のアミノ酸配列であり、かつアミノ位置Ｘ４〜Ｘ８の１つは、任意選択で不在である）、および（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性であるアミノ酸配列であって、同一性の決定では、アミノ酸位置Ｘ３〜Ｘ７が除外され、ただし、式（ＩＩ）のアミノ酸位置１２〜２０中、アミノ酸配列ＥＡＲＧＬＸ２ＲＸ３Ｆ（配列番号２０９）、好ましくはＮまたはＨであるＸ２、および好ましくはＭまたはＬであるＸ３（配列番号２０４）は、保存されることを条件とする、アミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなることが好ましい。
【０１０７】
より好ましくは、ＥＧＦＲに特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは、次式ＩＩを有する。ただし、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有し、同一性の決定では、配列番号１のアミノ酸位置１２〜１７および３１〜３４が除外されること、を条件とする。これに関連して、以下の式ＩＩ中、配列番号１のアミノ酸位置１２〜１７は、配列番号１のＲＴループ中への３つのアミノ酸の付加に起因してアミノ酸位置１２〜２０に対応することに留意されたい。
【０１０８】
ＧＶＴＬＦＶＡＸ１ＹＤＹＥＡＲＧＬＸ２ＲＸ３ＦＤＬＳＦＨＫＧＥＫＦＱＩＬＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＧＤＷＷＥＡＲＳＬＴＴＧＥＴＧＹＩＰＳＮＹＶＡＰＶＤＳＩＱ（式ＩＩ）、
式中、
Ｘ１〜Ｘ７は、それぞれ独立して、Ｇ、Ｖ、Ｔ、Ｌ、Ｆ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｓ、Ｈ、Ｋ、Ｅ、Ｑ、Ｉ、Ｗ、Ｒ、Ｍ、Ｐ、Ｎ、およびＣから、より好ましくは、Ｇ、Ｖ、Ｔ、Ｌ、Ｆ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｓ、Ｈ、Ｋ、Ｅ、Ｑ、Ｉ、Ｗ、Ｒ、Ｍ、Ｐ、およびＮから選択され、
かつＸ８は、それぞれ独立して、Ｇ、Ｖ、Ｔ、Ｌ、Ｆ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｓ、Ｈ、Ｋ、Ｅ、Ｑ、Ｉ、Ｗ、Ｒ、Ｍ、Ｐ、Ｎ、およびＣから、より好ましくは、Ｇ、Ｖ、Ｔ、Ｌ、Ｆ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｓ、Ｈ、Ｋ、Ｅ、Ｑ、Ｉ、Ｗ、Ｒ、Ｍ、Ｐ、およびＮから選択され、またはＸ８は、不在である（それぞれ、配列番号２０１または好ましくは配列番号２０２）。また、本発明に係る結合分子は、配列番号２０１の２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含むかまたはそれからなることが好ましい。ただし、（ｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＮ末端に結合されるか、（ｉｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＣ末端に結合されるか、（ｉｉｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２のＮ末端に結合されるか、または（ｉｖ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２のＣ末端ならびに配列番号１７１および配列番号１７２の抗ＣＤ３抗体に結合される。同様に、本発明に係る結合分子は、配列番号２０２の２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含むかまたはそれからなることが好ましい。ただし、（ｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＮ末端に結合されるか、（ｉｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＣ末端に結合されるか、（ｉｉｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２のＮ末端に結合されるか、または（ｉｖ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２のＣ末端ならびに配列番号１７１および配列番号１７２の抗ＣＤ３抗体に結合される。
【０１０９】
さらにより好ましくは、
Ｘ１は、ＬまたはＶから選択され、
Ｘ２は、ＮまたはＨから選択され、
Ｘ３は、ＭまたはＬから選択され、
Ｘ４は、Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｄ、Ｔ、またはＬから選択され、
Ｘ５は、Ｆ、Ｔ、Ｒ、またはＰから選択され、
Ｘ６は、Ｓ、Ｅ、Ｔ、またはＱから選択され、
Ｘ７は、Ｅ、Ｔ、Ｓ、またはＮから選択され、かつ
Ｘ８は、Ｓから選択されるか、または不在である（配列番号２０３）。
【０１１０】
したがって、本発明に係る結合分子は、配列番号２０３の２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含むかまたはそれからなることがさらに好ましい。ただし、（ｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＮ末端に結合されるか、（ｉｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＣ末端に結合されるか、（ｉｉｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２のＮ末端に結合されるか、または（ｉｖ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２のＣ末端ならびに配列番号１７１および配列番号１７２の抗ＣＤ３抗体に結合される。
【０１１１】
好ましくは、配列番号１６９または配列番号１８７のアミノ酸配列に対して、好ましい順に、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、および少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはそれらからなる、ＥＧＦＲに特異的に結合する以上に定義されたＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは、配列番号１６９または配列番号１８７からなる結合（ポリ）ペプチドの結合能を保持するかまたは本質的に保持する。すなわち、それぞれの標的エピトープに結合する強度（たとえば、ＥＣ５０値により決定される）は、保持されるかまたは本質的に保持される。ＥＧＦＲに特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドの結合能は、その結合能の少なくとも６０％が保持されるのであれば、本質的に保持される。好ましくは、その結合能の少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％は、保持される。より好ましくは、結合能の少なくとも９０％、たとえば、少なくとも９５％、さらにより好ましくは、少なくとも９８％、たとえば、少なくとも９９％が保持される。最も好ましくは、結合能は、完全に、すなわち、１００％保持される。
【０１１２】
ＦｙｎＳＨ３由来ポリペプチドＥＲ７Ｌ２Ｄ６（配列番号１６９）は、ＦＡＣＳ実験でＥＧＦＲ上のその特異的エピトープへの結合に対して３．３ｎＭのＥＣ５０値を有し、ＥＲ９Ｌ３Ｄ７（配列番号１８７）は、１５．０ｎＭのＥＣ５０値を有する。これらのＥＣ５０値を決定するために、０．４６ｎＭ〜３３３ｎＭの濃度の精製ＦｙｎｏｍｅｒをＥＧＦＲ陽性ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞と共にインキュベートした。マウス抗ｍｙｃタグ抗体９Ｅ１０を利用して（３：２のＦｙｎｏｍｅｒ：９Ｅ１０のモル比でＦｙｎｏｍｅｒと共に共インキュベートした）、次いで、抗マウスＩｇＧ  Ａｌｅｘ４８８コンジュゲートにより、続いて、サイトメーター分析により、結合されたＦｙｎｏｍｅｒを検出した。平均蛍光強度値を決定し、Ｆｙｎｏｍｅｒ濃度のｌｏｇ１０値に対してプロットし、曲線当てはめソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ  ｐｒｉｓｍを用いてＥＣ５０値を決定した。したがって、配列番号１６９または１８７のアミノ酸配列に対して、好ましい順に、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、および少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはそれらからなる結合（ポリ）ペプチドの結合能は、ＥＧＦＲ結合に対して、好ましくは同一の条件下で、少なくとも１×１０−６Ｍ、好ましくは少なくとも１×１０−７Ｍの解離定数が保持されるのであれば、本質的に保持される。また、配列番号１６９または配列番号１８７からなる結合（ポリ）ペプチドと比較して増加した結合能、すなわち、１００％超の活性を有する結合（ポリ）ペプチド）も、本発明に係るものである。たとえば、本明細書では、少なくとも１×１０−８Ｍ、たとえば、少なくとも１×１０−９Ｍなど、より好ましくは少なくとも１×１０−１０Ｍ、たとえば、少なくとも１×１０−１１Ｍなど、さらにより好ましくは少なくとも１×１０−１２Ｍ、最も好ましくは少なくとも１×１０−１３Ｍの解離定数を有する結合（ポリ）ペプチドが、想定される。結合能を評価する方法は、当技術分野で周知であり、限定されるものではないが、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術またはＥＬＩＳＡを含む。
【０１１３】
また、本発明に係る結合分子は、配列番号１６９または配列番号１８７のアミノ酸配列に対して、好ましい順に、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、および少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはそれらからなる、ＥＧＦＲに特異的に結合する２つの以上に定義されたＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含むかまたはそれからなることが好ましい。ただし、（ｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＮ末端に結合されるか、（ｉｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＣ末端に結合されるか、（ｉｉｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２のＮ末端に結合されるか、または（ｉｖ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２のＣ末端ならびに配列番号１７１および配列番号１７２の抗ＣＤ３抗体に結合される。
【０１１４】
本発明の他の好ましい実施形態では、ＦｙｎＳＨ３由来ポリペプチドは、配列番号１６９および１９７からなる群から選択される配列を有する。ＦｙｎＳＨ３由来ポリペプチドは、最も好ましくは、ＥＲ７Ｌ２Ｄ６（配列番号１６９）である。したがって、また、本発明に係る結合分子は、配列番号１６９および１８７〜１９７（配列番号１６９が最も好ましい）からなる群から選択される２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含むことが好ましい。ただし、（ｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＮ末端に結合されるか、（ｉｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＣ末端に結合されるか、（ｉｉｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２のＮ末端に結合されるか、または（ｉｖ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２のＣ末端ならびに配列番号１７１および配列番号１７２の抗ＣＤ３抗体に結合される。
【０１１５】
したがって、Ｆｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドが、ＥＧＦＲに特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドである、以上の実施形態では、ＣＤ３に特異的に結合する抗体は、配列番号１７１および／または１７２を含むことがとくに好ましい。
【０１１６】
記載のごとく、本発明の他の好ましい実施形態によれば、ＣＤ３に特異的に結合する抗体およびＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは、リンカーにより結合される。本発明のより好ましい実施形態によれば、リンカーはペプチドリンカーである。本発明のさらにより好ましい実施形態によれば、リンカーは、配列番号１６２、１６０、および１６１からなる群から選択される配列を有する。
【０１１７】
Ｆｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドが、ＥＧＦＲに特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドである、以上の実施形態では、それに加えて、ＣＤ３に特異的に結合する抗体およびＥＧＦＲに特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは、配列番号１６２を含むリンカーにより結合されることが、とくに好ましい。
【０１１８】
以下の本明細書の実施例から明らかなように、配列番号１６２を有するリンカーを介して、配列番号１７１および配列番号１７２を含む抗ＣＤ３抗体をＦｙｎｏｍｅｒ（登録商標）ＥＲ７Ｌ２Ｄ６（配列番号１６９）に融合させた。前記抗体の軽鎖のＮ末端への融合体を生成させた（すなわち、配列番号１７１および１９８からなるＣＯＶＡ４９４）。
【０１１９】
本発明は、ＥＧＦＲに特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを初めて提供するため、本発明はまた、一実施形態では、ＥＧＦＲに特異的に結合するポリペプチドに関する。ただし、ポリペプチドは、（ａ）ＧＶＴＬＦＶＡＸ１ＹＤＹＥＡＲＧＬＸ２ＲＸ３ＦＤＬＳＦＨＫＧＥＫＦＱＩＬＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＧＤＷＷＥＡＲＳＬＴＴＧＥＴＧＹＩＰＳＮＹＶＡＰＶＤＳＩＱ（式ＩＩ）（式中、アミノ酸位置Ｘ１〜Ｘ８は、任意のアミノ酸配列であり、かつアミノ位置Ｘ４〜Ｘ８の１つは、任意選択で不在である）、および（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性であるアミノ酸配列であって、同一性の決定では、アミノ酸位置Ｘ３〜Ｘ７が除外され、ただし、式（ＩＩ）のアミノ酸位置１２〜２０中、アミノ酸配列ＥＡＲＧＬＸ２ＲＸ３Ｆ（配列番号２０９）、好ましくはＮまたはＨであるＸ２、および好ましくはＭまたはＬであるＸ３（配列番号２０４）は、保存されることを条件とする、アミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
【０１２０】
本明細書で用いられる「同一性の決定ではアミノ酸位置Ｘ４〜Ｘ７が除外されるという語句は、式（ＩＩ）に対する配列同一性の計算では、アミノ酸位置Ｘ４〜Ｘ７は考慮されないが、配列番号１のアミノ酸位置の残りの部分は制約を受けることを明記している。本明細書で用いられる「ただし、式（ＩＩ）のアミノ酸位置１２〜２０中、アミノ酸配列ＥＡＲＧＬＸ２ＲＸ３Ｆ（配列番号２０９）、好ましくはＮまたはＨであるＸ２、および好ましくはＭまたはＬであるＸ３（配列番号２０４）は、保存されることを条件とする」という条件は、アミノ酸位置１２〜２０中にアミノ酸変化を導入してはならないことを明記している。別の言い方をすれば、本発明の以上の実施形態および以下のその好ましい実施例の範囲内に入るすべてのポリペプチド中、式（ＩＩ）のアミノ酸位置１２〜２０に対応するアミノ酸位置は、配列ＥＡＲＧＬＸ２ＲＸ３Ｆ（配列番号２０９）を有し、Ｘ２は、好ましくはＮまたはＨであり、かつＸ３は、好ましくはＭまたはＬである（配列番号２０４）。
【０１２１】
ＥＧＦＲに特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドの好ましい実施形態では、
Ｘ１は、ＬまたはＶから選択され、
Ｘ２は、ＮまたはＨから選択され、
Ｘ３は、ＭまたはＬから選択され、
Ｘ４は、Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｄ、Ｔ、またはＬから選択され、
Ｘ５は、Ｆ、Ｔ、Ｒ、またはＰから選択され、
Ｘ６は、Ｓ、Ｅ、Ｔ、またはＱから選択され、
Ｘ７は、Ｅ、Ｔ、Ｓ、またはＮから選択され、かつ
Ｘ８は、Ｓから選択されるか、または不在である（配列番号２０３）。
【０１２２】
ＥＧＦＲに特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドのより好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１６９および１８７〜１９７のいずれか１つからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
【０１２３】
以下の本明細書の実施例に示されるように、配列番号１６９および１８７〜１９７は、ＥＧＦＲに特異的に結合することが見いだされた。
【０１２４】
本発明はさらに、一実施形態では、さらなる化合物に融合された本発明に係るＥＧＦＲに特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含む融合構築物に関し、前記さらなる化合物は、好ましくは、抗ＣＤ３抗体ではない。さらなる化合物は、好ましくは、医薬活性化合物、プロドラッグ、薬学的に許容可能な担体、診断活性化合物、細胞透過性エンハンサー、および／または、血清中半減期モジュレート化合物である。より詳細には、さらなる化合物は、好ましくは、（ａ）蛍光色素、（ｂ）光増感剤、（ｃ）放射性核種、（ｄ）メディカルイメージングコントラスト剤、（ｅ）サイトカイン、（ｆ）毒性化合物、（ｇ）ケモカイン、（ｈ）凝血促進因子、（ｉ）プロドラッグ活性化酵素、（ｋ）アルブミンバインダー、（ｌ）アルブミン、（ｍ）ＩｇＧバインダー、または（ｎ）ポリエチレングリコールからなる群から選択される。最も好ましくは、さらなる化合物は、抗体軽鎖、抗体重鎖、抗体Ｆｃドメイン、抗体、またはそれらの組合せからなるかまたはそれらを含む。このリスト内では、抗体が最も好ましい。抗体は、好ましくは、本発明に係るＥＧＦＲに特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドの２つのコピーに融合される。
【０１２５】
本発明はさらに、一実施形態では、本発明に係るＥＧＦＲに特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドをコードする核酸分子、適用可能な場合、融合構築物に関する。
【０１２６】
本発明はまた、一実施形態では、本発明に係るＥＧＦＲに特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチド、および／または本発明に係るＥＧＦＲに特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドコードする核酸分子、および／またはさらなる化合物に融合された本発明に係るＥＧＦＲに特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含む融合構築物、を含む医薬組成物または診断組成物に関する。医薬組成物は、好ましくは、癌を治療または予防する方法で使用される。
【０１２７】
本発明は、（ｉ）ＣＤ３と（ｉｉ）癌細胞上の表面標的抗原とに特異的に結合する結合分子のさらなる好ましい実施形態では、ＣＤ３３に特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含む結合分子に関する。ただし、（ｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＮ末端に結合されるか、（ｉｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＣ末端に結合されるか、（ｉｉｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２のＮ末端に結合されるか、または（ｉｖ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２のＣ末端に結合される。
【０１２８】
以上の選択肢との関連では、結合分子は、ＣＤ３３に特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２のＣ末端に結合されることが好ましい。
【０１２９】
ＣＤ３３への特異的結合とは、本発明に係るポリペプチドがＣＤ３３には特異的に結合するが、Ｓｉｇｌｅｃファミリーの他のメンバーなどの他の関連タンパク質には特異的に結合しないことを意味する。「ＣＤ３３に特異的に結合するポリペプチド」は、好ましくは、「ＣＤ３３の活性を阻害するポリペプチド」である。そのようなポリペプチドは、ＣＤ３３の活性を低減するかまたは完全に消失する能力を有する。その活性については、本明細書の以上に詳細に記載されている。これに関連して、ＣＤ３３活性を阻害するとは、レセプターのそのリガンドへの結合を阻害することを意味することが好ましい。好ましい順に、ポリペプチドは、ＣＤ３３の活性を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％阻害することがさらに好ましい。また、好ましい順に、本発明に係るポリペプチドによるＣＤ３３の阻害に対するＩＣ５０値は、１０００ｎＭ以下、５００ｎＭ以下、４００ｎＭ以下、３００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、または７５ｎＭ以下であることが好ましい。好ましくは、本発明に係るポリペプチドは、ＦＡＣＳにより決定したときに１０−７〜１０−１２Ｍ、より好ましくは１０−８〜１０−１２Ｍ、最も好ましくは１０−９〜１０−１２ＭのＥＣ５０値でＣＤ３３に結合する。
【０１３０】
ＣＤ３３に特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは、好ましくは、ＣＤ３３の同一エピトープに結合する。以下の本明細書の実施例から明らかなように、抗ＣＤ３３結合Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）ＥＥ１Ｌ１Ｂ３（配列番号１７４）は、本発明を例示するために使用されている。したがって、結合分子は、配列番号１７４の２つのコピーを含むことが好ましい。
【０１３１】
ＣＤ３３に特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは、好ましい順に、配列番号１７４（Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）ＥＥ１Ｌ１Ｂ３）のアミノ酸配列に対して、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、および少なくとも９５％の配列同一性を有することが好ましい。また、ＣＤ３３に特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは、（ａ）ＧＶＴＬＦＶＡＬＹＤＹＥＡＬＧＡＨＥＬＳＦＨＫＧＥＫＦＱＩＬＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＧＰＦＷＥＡＨＳＬＴＴＧＥＴＧＷＩＰＳＮＹＶＡＰＶＤＳＩＱ（式ＩＩＩ）（式中、アミノ酸位置Ｘ１〜Ｘ６は、任意のアミノ酸配列であり、かつアミノ位置Ｘ１〜Ｘ６の１つまたは２つは、任意選択で不在である）、および（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性であるアミノ酸配列であって、アミノ酸配列、からなる群から選択されアミノ酸配列を含むかまたはそれからなることが好ましい。同一性の決定では、アミノ酸位置Ｘ１〜Ｘ４が除外され、ただし、式（ＩＩＩ）のアミノ酸位置１２〜１８中のアミノ酸配列ＥＡＬＧＡＨＥ（配列番号２０８）は、保存されることを条件とする。
【０１３２】
より好ましくは、ＣＤ３３に特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは、次式ＩＩＩを有する。ただし、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有し、同一性の決定では、配列番号１のアミノ酸位置１２〜１７および３１〜３４が除外されること、を条件とする。
【０１３３】
ＧＶＴＬＦＶＡＬＹＤＹＥＡＬＧＡＨＥＬＳＦＨＫＧＥＫＦＱＩＬＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＧＰＦＷＥＡＨＳＬＴＴＧＥＴＧＷＩＰＳＮＹＶＡＰＶＤＳＩＱ（式ＩＩＩ）
式中、Ｘ１〜Ｘ４は、それぞれ独立して、Ｇ、Ｖ、Ｔ、Ｌ、Ｆ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｓ、Ｈ、Ｋ、Ｅ、Ｑ、Ｉ、Ｗ、Ｒ、Ｍ、Ｐ、Ｎ、およびＣから、より好ましくは、Ｇ、Ｖ、Ｔ、Ｌ、Ｆ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｓ、Ｈ、Ｋ、Ｅ、Ｑ、Ｉ、Ｗ、Ｒ、Ｍ、Ｐ、およびＮから選択され、
かつＸ５およびＸ６は、それぞれ独立して、Ｇ、Ｖ、Ｔ、Ｌ、Ｆ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｓ、Ｈ、Ｋ、Ｅ、Ｑ、Ｉ、Ｗ、Ｒ、Ｍ、Ｐ、Ｎ、およびＣから、より好ましくは、Ｇ、Ｖ、Ｔ、Ｌ、Ｆ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｓ、Ｈ、Ｋ、Ｅ、Ｑ、Ｉ、Ｗ、Ｒ、Ｍ、Ｐ、およびＮから選択され、
またはＸ５およびＸ６は、不在である（それぞれ、配列番号２０５または好ましくは配列番号２０６）。また、本発明に係る結合分子は、配列番号２０５の２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含むかまたはそれからなることが好ましい。ただし、（ｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＮ末端に結合されるか、（ｉｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＣ末端に結合されるか、（ｉｉｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２のＮ末端に結合されるか、または（ｉｖ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２のＣ末端ならびに配列番号２および配列番号３の抗ＣＤ３抗体に結合される。同様に、本発明に係る結合分子は、配列番号２０６の２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含むかまたはそれからなることが好ましい。ただし、（ｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＮ末端に結合されるか、（ｉｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＣ末端に結合されるか、（ｉｉｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２のＮ末端に結合されるか、または（ｉｖ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２のＣ末端ならびに配列番号２および配列番号３の抗ＣＤ３抗体に結合される。
【０１３４】
さらにより好ましくは、
Ｘ１は、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｍ、Ｄ、またはＹから選択され、
Ｘ２は、Ｓ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｍ、またはＶから選択され、
Ｘ３は、Ｌ、Ｔ、Ｇ、Ｓ、Ｖ、Ｒ、またはＡから選択され、
Ｘ４は、Ｓ、Ａ、Ｌ、Ｑ、Ｄ、Ｖ、Ｋ、またはＥから選択され、
Ｘ５は、ＥおよびＶ、Ｑ、Ｌ、Ａ、Ｒから選択されるかまたは不在であり、かつ
Ｘ６は、Ｌ、Ｇから選択されるかまたは不在である（配列番号２０７）。
【０１３５】
本発明に係る結合分子は、配列番号２０７の２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含むかまたはそれからなることがさらに好ましい。ただし、（ｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＮ末端に結合されるか、（ｉｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＣ末端に結合されるか、（ｉｉｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２のＮ末端に結合されるか、または（ｉｖ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２のＣ末端ならびに配列番号２および配列番号３の抗ＣＤ３抗体に結合される。
【０１３６】
好ましくは、配列番号１７４のアミノ酸配列に対して、好ましい順に、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、および少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはそれらからなる、ＣＤ３３に特異的に結合する以上に定義されたＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは、配列番号１７４からなる結合（ポリ）ペプチドの結合能を保持するかまたは本質的に保持する。すなわち、それぞれの標的エピトープに結合する強度（たとえば、ＥＣ５０値により決定される）は、保持されるかまたは本質的に保持される。ＣＤ３３に特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドの結合能は、その結合能の少なくとも６０％が保持されるのであれば、本質的に保持される。好ましくは、その結合能の少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％は、保持される。より好ましくは、結合能の少なくとも９０％、たとえば、少なくとも９５％、さらにより好ましくは、少なくとも９８％、たとえば、少なくとも９９％が保持される。最も好ましくは、結合能は、完全に、すなわち、１００％保持される。
【０１３７】
ＦｙｎＳＨ３由来ポリペプチドＥＥ１Ｌ１Ｂ３（配列番号１７４）は、ＦＡＣＳ実験でＣＤ３３上のその特異的エピトープへの結合に対して５．７ｎＭのＥＣ５０値を有する。ＥＣ５０値を決定するために、Ｆｃレセプターブロック剤で前処理されたＣＤ３３陽性Ｕ９３７細胞と共に、３００ｎＭ〜０．４１ｎＭの濃度の精製Ｆｙｎｏｍｅｒをインキュベートした。マウス抗ｍｙｃタグ抗体９Ｅ１０を利用して（４：１のＦｙｎｏｍｅｒ：９Ｅ１０のモル比でＦｙｎｏｍｅｒと共に共インキュベートした）、続いて、抗マウスＩｇＧ  Ａｌｅｘ４８８コンジュゲートにより、続いて、サイトメーター分析により、結合されたＦｙｎｏｍｅｒを検出した。平均蛍光強度値を決定し、Ｆｙｎｏｍｅｒ濃度のｌｏｇ１０値に対してプロットし、曲線当てはめソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ  ｐｒｉｓｍを用いてＥＣ５０値を決定した。したがって、配列番号１７４のアミノ酸配列に対して、好ましい順に、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、および少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはそれらからなる結合（ポリ）ペプチドの結合能は、ＣＤ３３結合に対して、好ましくは同一の条件下で、少なくとも１×１０−６Ｍ、好ましくは少なくとも１×１０−７Ｍの解離定数が保持されるのであれば、本質的に保持される。また、配列番号１７４からなる結合（ポリ）ペプチドと比較して増加した結合能、すなわち、１００％超の活性を有する結合（ポリ）ペプチド）も、本発明に係るものである。たとえば、本明細書では、少なくとも１×１０−８Ｍ、たとえば、少なくとも１×１０−９Ｍなど、より好ましくは少なくとも１×１０−１０Ｍ、たとえば、少なくとも１×１０−１１Ｍなど、さらにより好ましくは少なくとも１×１０−１２Ｍ、最も好ましくは少なくとも１×１０−１３Ｍの解離定数を有する結合（ポリ）ペプチドが、想定される。結合能を評価する方法は、当技術分野で周知であり、限定されるものではないが、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術またはＥＬＩＳＡを含む。
【０１３８】
本発明の他の好ましい実施形態では、ＦｙｎＳＨ３由来ポリペプチドは、配列番号１７４および１７７〜１８６からなる群から選択される配列を有する。ＦｙｎＳＨ３由来ポリペプチドは、最も好ましくは、ＥＥ１Ｌ１Ｂ３（配列番号１７４）である。したがって、また、本発明に係る結合分子は、配列番号１７４および１７７〜１８６（配列番号１７４が最も好ましい）からなる群から選択される２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含むことが好ましい。ただし、（ｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＮ末端に結合されるか、（ｉｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＣ末端に結合されるか、（ｉｉｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２のＮ末端に結合されるか、または（ｉｖ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２のＣ末端ならびに配列番号２および配列番号３の抗ＣＤ３抗体に結合される。
【０１３９】
したがって、Ｆｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドが、ＣＤ３３に特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドである、以上の実施形態では、ＣＤ３に特異的に結合する抗体は、配列番号２および／または３を含むことがとくに好ましい。
【０１４０】
本発明の他の好ましい実施形態によれば、ＣＤ３に特異的に結合する抗体およびＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは、リンカーにより結合される。記載のごとく、本発明のより好ましい実施形態によれば、リンカーはペプチドリンカーである。本発明のさらにより好ましい実施形態によれば、リンカーは、配列番号１６２、１６０、および１６１からなる群から選択される配列を有する。
【０１４１】
Ｆｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドが、ＣＤ３３に特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドである、以上の実施形態では、それに加えて、ＣＤ３に特異的に結合する抗体およびＣＤ３３に特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは、配列番号１６２を含むリンカーにより結合されることが、とくに好ましい。
【０１４２】
以下の本明細書の実施例から明らかなように、配列番号１６２を有するリンカーを介して、配列番号２および配列番号３を含む抗体をＥＥ１Ｌ１Ｂ３（配列番号１７４）に融合させた。前記抗体の軽鎖のＣ末端への融合体を生成させた（すなわち、配列番号２および１７５からなるＣＯＶＡ４６７）。
【０１４３】
本発明は、ＣＤ３３に特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを初めて提供するため、本発明はさらに、一実施形態では、ＣＤ３３に特異的に結合するポリペプチドに関する。ただし、ポリペプチドは、（ａ）ＧＶＴＬＦＶＡＬＹＤＹＥＡＬＧＡＨＥＬＳＦＨＫＧＥＫＦＱＩＬＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＧＰＦＷＥＡＨＳＬＴＴＧＥＴＧＷＩＰＳＮＹＶＡＰＶＤＳＩＱ（式ＩＩＩ）（式中、アミノ酸位置Ｘ１〜Ｘ６は、任意のアミノ酸配列であり、かつアミノ位置Ｘ１〜Ｘ６の１つまたは２つは、任意選択で不在である）、および（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性であるアミノ酸配列であって、同一性の決定では、アミノ酸位置Ｘ１〜Ｘ４が除外され、ただし、式（ＩＩＩ）のアミノ酸位置１２〜１８中のアミノ酸配列ＥＡＬＧＡＨＥ（配列番号２０８）は、保存されることを条件とする、アミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
【０１４４】
本明細書で用いられる「同一性の決定ではアミノ酸位置Ｘ１〜Ｘ４が除外される」という語句は、式（ＩＩＩ）に対する配列同一性の計算では、アミノ酸位置Ｘ１〜Ｘ４は考慮されないが、配列番号１のアミノ酸位置の残りの部分は制約を受けることを明記している。本明細書で用いられる「ただし、式（ＩＩＩ）のアミノ酸位置１２〜１８中のアミノ酸配列ＥＡＬＧＡＨＥ（配列番号２０８）は、保存されることを条件とする」という条件は、アミノ酸位置１２〜１８中にアミノ酸変化を導入してはならないことを明記している。別の言い方をすれば、本発明の以上の実施形態および以下のその好ましい実施例の範囲内に入るすべてのポリペプチド中、式（ＩＩＩ）のアミノ酸位置１２〜１８に対応するアミノ酸位置は、配列ＥＡＬＧＡＨＥ（配列番号２０８）を有する。
【０１４５】
ＣＤ３３に特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドの好ましい実施形態では、
Ｘ１は、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｍ、Ｄ、またはＹから選択され、
Ｘ２は、Ｓ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｍ、またはＶから選択され、
Ｘ３は、Ｌ、Ｔ、Ｇ、Ｓ、Ｖ、Ｒ、またはＡから選択され、
Ｘ４は、Ｓ、Ａ、Ｌ、Ｑ、Ｄ、Ｖ、Ｋ、またはＥから選択され、
Ｘ５は、ＥおよびＶ、Ｑ、Ｌ、Ａ、Ｒから選択されるかまたは不在であり、かつ
Ｘ６は、Ｌ、Ｇから選択されるかまたは不在である（配列番号２０７）。
【０１４６】
ＣＤ３３に特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドのより好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１７４および１７７〜１８６のいずれか１つからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
【０１４７】
以下の本明細書の実施例に示されるように、配列番号１７４および１７７〜１８６は、ＣＤ３３に特異的に結合することが見いだされた。
【０１４８】
本発明はさらに、一実施形態では、さらなる化合物に融合された本発明に係るＣＤ３３に特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含む融合構築物に関し、前記さらなる化合物は、好ましくは、抗ＣＤ３抗体ではない。さらなる化合物は、好ましくは、医薬活性化合物、プロドラッグ、薬学的に許容可能な担体、診断活性化合物、細胞透過性エンハンサー、および／または、血清中半減期モジュレート化合物である。より詳細には、さらなる化合物は、好ましくは、（ａ）蛍光色素、（ｂ）光増感剤、（ｃ）放射性核種、（ｄ）メディカルイメージングコントラスト剤、（ｅ）サイトカイン、（ｆ）毒性化合物、（ｇ）ケモカイン、（ｈ）凝血促進因子、（ｉ）プロドラッグ活性化酵素、（ｋ）アルブミンバインダー、（ｌ）アルブミン、（ｍ）ＩｇＧバインダー、または（ｎ）ポリエチレングリコールからなる群から選択される。最も好ましくは、さらなる化合物は、抗体軽鎖、抗体重鎖、抗体Ｆｃドメイン、抗体、またはそれらの組合せからなるかまたはそれらを含む。このリスト内では、抗体が最も好ましい。抗体は、好ましくは、本発明に係るＣＤ３３に特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドの２つのコピーに融合される。
【０１４９】
本発明はさらに、一実施形態では、本発明に係るＣＤ３３に特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドをコードする核酸分子、適用可能な場合、融合構築物に関する。
【０１５０】
本発明はさらに、一実施形態では、本発明に係るＣＤ３３に特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチド、および／または本発明に係るＣＤ３３に特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドをコードする核酸分子、／またはさらなる化合物に融合された本発明に係るＣＤ３３に特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含む融合構築物、を含む医薬用または診断用組成物に関する。医薬組成物は、好ましくは、癌を治療または予防する方法で使用される。
【０１５１】
本発明の他の好ましい実施形態によれば、本発明に係る二重特異的結合分子は、配列番号１６３および／もしくは１６４を含むか、または配列番号１６３および１６４を含むかもしくはそれらからなる。
【０１５２】
以下の本明細書の実施例から明らかなように、配列番号１６３および１６４からなる二重特異的結合分子（ＣＯＶＡ４２０）は、本発明を例示するために生成された。以下の本明細書の実施例に記載の化合物ＣＯＶＡ４２０は、配列番号２および３の抗体からなり、配列番号４のＨＥＲ２に特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドのコピーは、配列番号１６２を有するリンカーを介して前記抗体の２つの重鎖の第１および第２のＮ末端に結合される。実施例に提供されたＨＥＲ２を標的とする化合物のうち、ＣＯＶＡ４２０は、最高の発現収量、最低のＥＣ５０値、および最適な腫瘍細胞選択性、したがって、最良の腫瘍細胞死滅性を示した。
【０１５３】
本発明の好ましい実施形態によれば、二重特異的結合分子は、配列番号１７１および／または１９８を含む。
【０１５４】
以下の本明細書の実施例から明らかなように、配列番号１６２を有するリンカーを介して、配列番号１７１および配列番号１７２を含む抗ＣＤ−３抗体をＦｙｎｏｍｅｒ（登録商標）ＥＲ７Ｌ２Ｄ６（配列番号１６９）に融合させた。より詳細には、融合は、前記抗体の軽鎖のＮ末端に対して行われ、それにより、化合物ＣＯＶＡ４９４（配列番号１７１および１９８）が生成される。ＥＧＦＲを標的とする化合物のうち、実施例に提供された、ＣＯＶＡ４９４は、有利な生物物理学的性質を有し、最良の腫瘍選択性、したがって、最良の腫瘍細胞死滅性を示した。
【０１５５】
本発明のさらなる好ましい実施形態によれば、二重特異的結合分子は、配列番号２および／または１７５を含む。
【０１５６】
以下の本明細書の実施例から明らかなように、配列番号１６２を有するリンカーを介して、配列番号２および配列番号３を含む抗体をＥＥ１Ｌ１Ｂ３（配列番号１７４）に融合させた。より詳細には、融合は、前記抗体の軽鎖のＣ末端に対して行われ、それにより、化合物ＣＯＶＡ４６７（配列番号２および１７５）が生成される。前記化合物は、有利な生物物理学的性質および腫瘍細胞死滅性を示した。
【０１５７】
他の実施形態では、本発明は、本発明に係る結合分子をコードする核酸分子に関する。
【０１５８】
本発明に係る結合分子は、２つの個別の分子の１つ（またはそれ以上）のコピーの複合体でありうるため、本発明に係る結合分子の成分は、１つまたは２つのいずれか（またはそれ以上）の核酸分子によりコードされうる。好ましい実施形態では、１つの核酸分子が完全一本鎖分子をコードする。
【０１５９】
さらなる実施形態では、本発明は、本発明に係る核酸分子を含むベクターに関する。
【０１６０】
本発明に係る核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、およびそれらの任意の他のアナログでありうる。ベクターおよび単離された細胞、特定的には宿主細胞は、目的に合った任意の従来型のもの、たとえば、本発明に係るポリペプチドおよび／または融合タンパク質の生成に適したもの、治療上有用な、たとえば、遺伝子療法に供される、ベクターおよび単離された細胞でありうる。当業者であれば、豊富な先行技術から核酸、ベクター、および単離された細胞を選択して、過度な負担なしに慣用的方法により所望の目的に対するそれらの特定の適合性を確認することが可能であろう。
【０１６１】
典型的には、核酸は、機能可能にプロモーターに連結され、好ましくは、Ｔ５プロモーター／ｌａｃオペレーターエレメント、Ｔ７プロモーター／ｌａｃオペレーターエレメンを含む原核生物プロモーターの群から、またはｈＥＦ１−ＨＴＬＶ、ＣＭＶ  ｅｎｈ／ｈＦｅｒＬプロモーターを含む真核生物プロモーターの群から、選択されるプロモーターに連結される。
【０１６２】
また、本発明に係るベクターは、本発明に係る核酸を含むものであり、好ましくは、本発明に係るポリペプチドまたは融合タンパク質を生成可能なものであると理解される。好ましくは、そのようなベクターは、ｐＱＥベクター、ｐＥＴベクター、ｐＦＵＳＥベクター、ｐＵＣベクター、ＹＡＣベクター、ファージミドベクター、ファージベクター、遺伝子療法に使用されるベクター、たとえば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスからなる群から選択される。
【０１６３】
本発明はまた、一実施形態では、本発明に係るベクターを保有する宿主細胞または非ヒト宿主に関する。
【０１６４】
前記宿主または宿主細胞は、ベクターの存在時にベクターによりコードされる結合分子の発現を媒介する宿主または宿主細胞に本発明に係るベクターを導入することにより、生成されうる。
【０１６５】
本発明によれば、宿主は、本発明に係るベクターでトランスフェクトされたおよび／またはそれを発現するトランスジェニック非ヒト動物でありうる。好ましい実施形態では、トランスジェニック動物は、非ヒト哺乳動物、たとえば、ハムスター、ウシ、ネコ、ブタ、イヌ、またはウマである。
【０１６６】
好ましいのは、宿主細胞、たとえば、細胞培養物の一部分でありうる単離された細胞である。
【０１６７】
好適な原核宿主細胞は、たとえば、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の細菌、およびサルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）を含む。好適な真核宿主細胞は、たとえば、菌類細胞、とくに、酵母、たとえば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）もしくはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、または昆虫細胞、たとえば、ドロソフィラ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２細胞およびスポドプテラ属（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９細胞、ならびに植物細胞、さらには哺乳動物細胞である。以上に記載の宿主細胞に適した培養培地および培養条件は、当技術分野で公知である。
【０１６８】
哺乳動物宿主細胞は、限定されるものではないが、ヒトＨｅｌａ、ＨＥＫ２９３、Ｈ９、およびＪｕｒｋａｔ細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３およびＣ１２７細胞、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、およびＣＶ１、ウズラＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、およびボーズ黒色腫細胞を含む。本発明に係る結合分子は、染色体に組み込まれた本発明に係る核酸分子またはベクターを包含する遺伝子構築物を含有する安定細胞系で発現可能である。
【０１６９】
他の好ましい実施形態では、前記細胞は、初代細胞または初代細胞系である。初代細胞は、生物から直接取得される細胞である。好適な初代細胞は、たとえば、マウス胚性線維芽細胞、マウス初代肝細胞、心筋細胞、およびニューロン細胞、ならびにマウス筋幹細胞（サテライト細胞）、さらにはそれらに由来する安定不死化細胞系である。
【０１７０】
本発明のさらなる実施形態は、請求項１〜８のいずれか一項に記載の結合分子本発明に係る核酸分子、本発明に係るベクター、および／または本発明に係る宿主細胞もしくは非ヒト宿主を含む医薬組成物に関する。
【０１７１】
本発明に係る医薬組成物は、任意の従来方式で製造されうる。以下に示される疾患に罹患している被験体の治療を行う際、経口経路または非経口経路を含めて、活性剤を有効量で生物学的に利用可能にする任意の形態またはモードで、少なくとも本発明に係る少なくとも１種の化合物を投与することが可能である。たとえば、本発明に係る組成物は、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内、吸入などによりに投与可能である。好ましい選択肢は、皮下注射であり、好ましくは、１週間に１回、２週間に１回、または１ヶ月に１回である。
【０１７２】
製剤調製分野の当業者であれば、選択される製品の特定の特徴、治療される疾患または病態、疾患または病態の病期、および他の関連状況に依存して、投与の適正な形態およびモードを容易に選択することが可能である（たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ  ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，（２０１２）（１９９０）を参照されたい）。
【０１７３】
好適な担体または賦形剤は、活性成分の媒体または培地として機能しうる液体材料でありうる。好適な担体または賦形剤は、当技術分野で周知であり、たとえば、安定化剤、抗酸化剤、ｐＨ調整物質、制御放出賦形剤などを含む。本発明に係る組成物は、凍結乾燥形態で提供されうる。即時投与に供する場合、好適な水性担体、たとえば、注射用無菌水、無菌緩衝生理食塩水に溶解させる。ボーラス注射としてではなく、注入による投与に供するために、より大量に生成することが望ましいのであれば、製剤化の最終段階で、ヒト血清アルブミンまたは患者自身のヘパリン処理血液を溶媒に導入することが有利である。他の選択肢として、製剤を皮下投与することが可能である。ヒト血清アルブミンなどの生理学的に不活性なタンパク質が過剰に存在すると、注入溶液に使用される容器およびチューブの壁上への吸着による薬学的に有効なポリペプチドの損失が防止される。アルブミンを使用する場合、好適な濃度は、生理食塩水溶液を基準にして０．５〜４．５重量％である。
【０１７４】
疾患または病態を治療および／または予防するための、本発明に係る化合物、すなわち、融合タンパク質、二重特異的構築物、核酸、ベクター、および単離された細胞の投与量および投与モードは、当然ながら、本発明に係る特定の化合物、個別の患者グループまたは患者、さらなる医学的活性化合物の存在、および治療される病態の性質および重症度に依存して、変化するであろう。
【０１７５】
しかしながら、現在のところ、予防的および／または治療的な使用では、約０．０００１ｍｇ〜約２０ｍｇ／キログラム体重、好ましくは約０．００１ｍｇ〜約５ｍｇ／キログラム体重の投与量を投与すべきとするのが好ましい。
【０１７６】
好ましくは、予防的および／または治療的な使用での投与頻度は、１週間に約２回〜３ヶ月に約１回、好ましくは、１週間に約１回〜１０週間に約１回、より好ましくは、１週間に１回〜１ヶ月に１回の範囲内である。
【０１７７】
好ましい実施形態では、本発明に係る医薬組成物は、癌を治療または予防する方法に使用される。
【０１７８】
本明細書の以上で詳細に説明されるように、ＣＤ３は、種々の癌タイプを治療するためのリダイレクトＴ細胞死滅の真正標的である。さらに、特許請求された二重特異的結合分子の特異性および有効性は、表面標的抗原、特定的には癌細胞上のＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、またはＣＤ３３を標的とすることにより達成される。
【０１７９】
本発明に係る医薬組成物のより好ましい実施形態では、前記癌は、乳癌、血液学的悪性疾患、たとえば、ＮＨＬ、Ｂ−ＡＬＬ、ＣＭＬ、他の癌、たとえば、前立腺癌、黒色腫、肺癌、胃癌、卵巣癌、ＮＨＬ、Ｂ−ＡＬＬ、ＡＭＬ、頭頸部癌、結腸直腸癌、膵臓癌、甲状腺癌、神経膠腫、膀胱癌、腎臓癌、肝臓癌、または悪性腹水からなる群から選択される。このリスト内では、乳癌が最も好ましい。
【０１８０】
癌細胞上の表面標的抗原のいくつかの例を本明細書の以上に具体的に示してきたが、これらに限定されるものではない。本明細書の以上から明らかなように、癌細胞上のこれらの表面の標的抗原は、本発明の以上の実施形態に列挙された癌タイプに関与する。
【０１８１】
本発明に係る医薬組成物のより好ましい実施形態では、前記癌は、本発明に係る結合分子により特異的に結合される、本発明に係る核酸分子によりコードされる結合分子により特異的に結合される、本発明に係るベクターにより発現される結合分子により特異的に結合される、および／または本発明に係る宿主細胞もしくは非ヒト宿主により発現される結合分子により特異的に結合される、表面標的抗原を、非腫瘍細胞上に発現される量の少なくとも２倍の量で発現する。
【０１８２】
好ましくは、抗原は、非腫瘍細胞と比較して、少なくとも５倍量、たとえば、少なくとも１０倍量など、さらにより好ましくは、少なくとも１００倍量、たとえば、少なくとも１０００倍量など、最も好ましくは、少なくとも１０．０００倍量で癌細胞上に発現される。
【０１８３】
本発明はまた、二重特異的結合分子の生成方法を提供する。この方法は、（ａ）以上に定義された宿主細胞を培養することと、（ｂ）生成された二重特異的結合分子を単離することと、を含む。
【０１８４】
好ましい単離された細胞は、ＣＨＯ細胞を含む宿主細胞である。培養条件は、使用される特定の宿主細胞に依存して、選択されうる。当業者であれば、さらなる労力をかけることなく実施可能である。
【０１８５】
所望の生成物（すなわち、本発明に係る二重特異的結合分子）の単離は、精製方法により行うことが可能であり、それに先行して、前記単離された細胞を破壊してもよい。好適な方法は、当技術分野で周知であり、当業者の裁量に委ねられる。
【０１８６】
本明細書で、とくに、特許請求の範囲で、特徴付けられた実施形態および好ましい特徴に関して、従属請求項または好ましい特徴に挙げられた各実施形態は、前記従属請求項が従属すると各請求項（独立または従属）の各実施形態と組み合わされることが意図される。たとえば、独立請求項１が３つの選択肢Ａ、Ｂ、およびＣを挙げ、従属請求項２が３つの選択肢Ｄ、ＥおよびＦを挙げ、かつ請求項１および２に従属する請求項３が３つの選択肢をＧ、ＨおよびＩを挙げた場合、とくに具体的な記載がないかぎり、明細書では、組合せ、すなわち、Ａ、Ｄ、Ｇ；Ａ、Ｄ、Ｈ；Ａ、Ｄ、Ｉ；Ａ、Ｅ、Ｇ；Ａ、Ｅ、Ｈ；Ａ、Ｅ、Ｉ；Ａ、Ｆ、Ｇ；Ａ、Ｆ、Ｈ；Ａ、Ｆ、Ｉ；Ｂ、Ｄ、Ｇ；Ｂ、Ｄ、Ｈ；Ｂ、Ｄ、Ｉ；Ｂ、Ｅ、Ｇ；Ｂ、Ｅ、Ｈ；Ｂ、Ｅ、Ｉ；Ｂ、Ｆ、Ｇ；Ｂ、Ｆ、Ｈ；Ｂ、Ｆ、Ｉ；Ｃ、Ｄ、Ｇ；Ｃ、Ｄ、Ｈ；Ｃ、Ｄ、Ｉ；Ｃ、Ｅ、Ｇ；Ｃ、Ｅ、Ｈ；Ｃ、Ｅ、Ｉ；Ｃ、Ｆ、Ｇ；Ｃ、Ｆ、Ｈ；Ｃ、Ｆ、Ｉに対応する実施形態が一義的に開示されると理解すべきである。同様にまた、独立および／または従属請求項が選択肢を挙げない場合、従属請求項が複数の先行請求項に戻って参照するとき、それにより包含される主題の任意の組合せが明示的に開示されたものとみなされると理解される。たとえば、独立請求項１、請求項１に戻って参照する従属請求項２、および請求項２および１の両方に戻って参照する従属請求項３の場合、請求項３および１の主題の組合せは、請求項３、２、および１の主題の組合せとして、明確にかつ一義的に開示されることになる。請求項１〜３のいずれか一項を参照するさらなる従属請求項４が存在する場合、請求項４および１、請求項４、２、および１、請求項４、３、および１、さらには請求項４、３、２、および１の主題の組合せが明確にかつ一義的に開示されることになる。また、従属請求項がより上位の請求項（独立および／または従属請求項）に戻って直接参照しない場合、請求項により包含される主題の任意の可能な組合せが、本出願により明示的に開示されたものとみなされると理解される。たとえば、独立請求項１、および独立請求項１に戻って参照する従属請求項２に戻って参照する従属請求項３の場合、請求項３および１の主題の組合せが明確にかつ一義的に開示される。以上の要件は、しかるべき変更を加えて、本明細書で特徴付けられた添付の特許請求の範囲、実施形態、および好ましい特徴のすべてに適用される。
【０１８７】
最後に、本発明は、本明細書の以上で参照した１種以上の化合物または医薬組成物を投与することにより、本明細書の以上で参照した疾患のいずれかに罹患している患者を治療することに関する。
【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１】図１は、本発明に係るＦｙｎｏｍｅｒ（登録商標）−抗体融合タンパク質および対照タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ特性解析を示している。Ａ：非還元条件下のゲル泳動、Ｂ：還元条件下でのゲル泳動。レーンＭ：分子量標準、レーン１：抗ＣＤ３抗体（配列番号２および３）、レーン２：ＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）、レーン３：ＣＯＶＡ４４６（配列番号１６７）。
【図２】図２は、本発明に係るＦｙｎｏｍｅｒ（登録商標）−抗体融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ特性解析を示す。Ａ：非還元条件下のゲル泳動、Ｂ：還元条件下でのゲル泳動。レーンＭ：分子量標準、レーン１：ＣＯＶＡ４２２（配列番号１６５および１６６）。
【図３】図３は、Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）−抗体融合タンパク質のサイズ排除（ＳＥＣ）プロファイルを示している。Ａ：ＦＰＬＣシステムでのＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）のＳＥＣプロファイル、Ｂ：ＨＰＬＣシステムでのＣＯＶＡ４２２（配列番号１６５および１６６）のＳＥＣプロファイル。
【図４】図４は、ＨＥＲ２陽性細胞（パネルＡ）、ＣＤ３陽性細胞（パネルＢ）、およびＨＥＲ２もＣＤ３も発現しない細胞（パネルＣ）での、Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）−抗体融合タンパク質ＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）、ＣＯＶＡ４２２（配列番号１６５および１６６）、および二重特異的ｓｃＦｖ対照ＣＯＶＡ４４６（配列番号１６７）のフローサイトメトリー結合分析を示している。シグナルは、二次検出抗体のみで得られたバックグラウンドシグナル（灰色調色ヒストグラム）と比較される。
【図５】図５は、ＨＥＲ２陽性ＳＫＢＲ−３腫瘍細胞に対するＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）および一本鎖Ｆｖ方式二重特異的抗ＣＤ３×抗ＨＥＲ２対照（ＣＯＶＡ４４６、配列番号１６７）のリダイレクト細胞死滅活性を示している。それに加えて、ＨＥＲ２陰性ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞に対するＣＯＶＡ４２０の死滅活性がなんら存在しないことが示されることから、ＨＥＲ２陽性細胞に対する特異的死滅活性が実証される。ＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用した。
【図６】図６は、エフェクター細胞としてＣＤ８＋富化Ｔ細胞を用いてＨＥＲ２陽性ＳＫＯＶ−３腫瘍細胞に対するＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）およびＣＯＶＡ４２２（配列番号１６５および１６６）のリダイレクト細胞死滅活性を示している。
【図７】図７は、ＣＤ８＋富化Ｔ細胞の存在下および不在下での指定の抗体Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）融合タンパク質のインキュベーション時の細胞培養上清中へのグランザイムＢの放出を示している。
【図８】図８は、マウスにおける静脈内注射後のＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）の血清中濃度を示している。
【図９】図９は、活性化拡大ヒトＴ細胞で再構成されたｉｎ  ｖｉｖｏ  ＳＫＯＶ−３異種移植モデルでのＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）の抗腫瘍活性を示している。腫瘍体積は、ＲＴＶ（対療法開始日の相対腫瘍体積）として表されている。０．５ｍｇ／ｋｇのＣＯＶＡ４２０および媒体の治療剤を１週間に２回投与し（６、９、１３、１５日目）、等モル用量のＣＯＶＡ４４６（配列番号１６７）（０．１６ｍｇ／ｋｇ）を毎日１回静脈内（ｉ．ｖ．）ボーラス注射により投与した。黒矢印により投与間隔を可視化している。
【図１０】図１０は、高レベルのＨＥＲ２を発現するＳＫＯＶ−３腫瘍細胞および低レベルのＨＥＲ２を発現するＭＣＦ−７腫瘍細胞に対するＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）および一本鎖Ｆｖ方式二重特異的抗ＣＤ３×抗ＨＥＲ２対照（ＣＯＶＡ４４６、配列番号１６７）のリダイレクト細胞死滅活性を示している。ＣＤ８＋富化Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用した。残留標的細胞生存パーセントが示されている。
【図１１】図１１は、Ｆｙｎｏｍｅｒ−抗体融合タンパク質のサイズ排除（ＳＥＣ）プロファイルを示している。Ａ：ＣＯＶＡ４９３（配列番号１７０および１７２）のＳＥＣプロファイル、Ｂ：ＣＯＶＡ４９４（配列番号１７１および１９８）のＳＥＣプロファイル、Ｃ：ＣＯＶＡ４９７（配列番号１９９および１７２）のＳＥＣプロファイル、Ｄ：ＣＯＶＡ４９９（配列番号１７１および２００）のＳＥＣプロファイル、Ｅ：ＣＯＶＡ４８９（配列番号１７１および１７２）のＳＥＣプロファイル。
【図１２】図１２は、ＥＧＦＲ陽性細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、上側パネル）およびＣＤ３陽性細胞（Ｊｕｒｋａｔ  Ｅ６−１、下側パネル）に対する、抗ＣＤ３抗体（ＣＯＶＡ４８９、配列番号１７１および１７２）、Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）−抗体融合タンパク質ＣＯＶＡ４９３（配列番号１７０および１７２）、ＣＯＶＡ４９４（配列番号１７１および１９８）、ＣＯＶＡ４９７（配列番号１９９および１７２）、ＣＯＶＡ４９９（配列番号１７１および２００）、および一本鎖Ｆｖ方式二重特異的抗ＣＤ３×抗ＥＧＦＲ対照（ＣＯＶＡ４４５、配列番号１７３）のフローサイトメトリー結合分析を示している。シグナルは、二次検出抗体のみで得られたバックグラウンドシグナル（灰色調色ヒストグラム）と比較される。
【図１３】図１３は、高レベルのＥＧＦＲを発現するＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍細胞および低レベルのＥＧＦＲを発現するＨＴ−２９腫瘍細胞に対する、ＣＯＶＡ４９３（配列番号１７０および１７２）、ＣＯＶＡ４９４（配列番号１７１および１９８）、ＣＯＶＡ４９７（配列番号１９９および１７２）、ＣＯＶＡ４９９（配列番号１７１および２００）、および一本鎖Ｆｖ方式二重特異的抗ＣＤ３×抗ＥＧＦＲ対照（ＣＯＶＡ４４５、配列番号１７３）のリダイレクト細胞死滅活性を示している。それに加えて、５ｎＭの最高濃度で抗ＣＤ３抗体（ＣＯＶＡ４８９、配列番号１７１および１７２）の死滅活性がなんら存在しないことが示されている。ＣＤ８＋富化Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用した。残留標的細胞生存パーセントが示されている。
【図１４】図１４は、エフェクターＴ細胞の存在下または不在下での、高レベルおよび低レベルのＥＧＦＲをそれぞれ発現するＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞およびＨＴ−２９腫瘍細胞に対する、ＣＯＶＡ４９３（配列番号１７０および１７２）、ＣＯＶＡ４９４（配列番号１７１および１９８）、ＣＯＶＡ４９７（配列番号１９９および１７２）、ＣＯＶＡ４９９（配列番号１７１および２００）、および一本鎖Ｆｖ方式二重特異的抗ＣＤ３×抗ＥＧＦＲ対照（ＣＯＶＡ４４５、配列番号１７３）のリダイレクト細胞死滅活性を示している。（ｎ．ｄ）．：未測定。
【図１５】図１５（Ａ）は、Ｆｙｎｏｍｅｒ−抗体融合タンパク質ＣＯＶＡ４６７（配列番号２および１７５）のサイズ排除（ＳＥＣ）プロファイルを示しており、（Ｂ）は、ＣＤ３３陽性Ｕ９３７腫瘍細胞に対するＣＯＶＡ４６７（配列番号２および１７５）および一本鎖Ｆｖ方式二重特異的抗ＣＤ３×抗ＣＤ３３対照（ＣＯＶＡ４６３、配列番号１７６）のリダイレクト細胞死滅活性を示している。それに加えて、非修飾抗ＣＤ３抗体（ＣＯＶＡ４１９、配列番号２および３）の死滅活性がなんら存在しないことが示されている。ＣＤ８＋富化Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用した。標的細胞溶解パーセントが示されている。
【実施例】
【０１８９】
実施例により本発明を例示する。
【０１９０】
実施例１  −  ＨＥＲ２陽性腫瘍細胞に対するリダイレクトＴ細胞媒介細胞傷害性分析
実施例１．１．−  抗ＣＤ３抗体抗ＨＥＲ２  Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）融合タンパク質の発現および精製
１５アミノ酸リンカー（配列番号１６２）を介してＨＥＲ２結合Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）Ｃ１２（配列番号４）を抗ＣＤ３結合抗体（配列番号２および３）に遺伝子融合して、本発明に係る二重特異的抗体Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）融合タンパク質を生成した。ＣＯＶＡ４２０では、Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）Ｃ１２を抗ＣＤ３抗体（配列番号２および３）の重鎖のＮ末端に融合した。ＣＯＶＡ４２２では、Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）Ｃ１２を抗ＣＤ３抗体（配列番号２および３）の重鎖のＣ末端に融合した。
【０１９１】
抗ＣＤ３抗体（配列番号２および３）、ＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）、ＣＯＶＡ４２２（配列番号１６５および１６６）、および抗ＣＤ３×抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ対照（配列番号１６７）（ヘキサｈｉｓタグを有する）をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ＣＨＯ−Ｓ細胞に一過性トランスフェクトして、無血清／動物成分フリー培地で６日間発現させた。ＡＥＫＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号８９９２８）により、抗ＣＤ３抗体および本発明に係る二重特異的タンパク質を上清から精製した。ＨＩＳｔｒａｐ  Ｅｘｃｅｌカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を介して固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーにより、抗ＣＤ３×抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ対照（ＣＯＶＡ４４６、配列番号１６７）の精製を達成した。２８０ｎｍでの吸光度測定により濃度を決定した。収量を表１に列挙する。
【０１９２】
結果
本発明に係る抗体Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）融合タンパク質および対照抗体は、単一工程で発現および精製を行うことが可能であった。図１および２に示されるように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により＞９５％の純度を実証可能であった。表１には、ＣＨＯ細胞への一過性トランスフェクションおよび３７℃で６日間のタンパク質発現を行った後の発現収量がまとめられている。
【０１９３】
【表１】
0006694808.tif 000003
【０１９４】
精製後、ＡＥＫＴＡ  ＦＰＬＣシステムおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｇ２００，３０／１００ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、またはＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ１２／６０システムおよびＢｉｏ  ＳＥＣ５、５μｍ、３００Å、４．６×３００ｍｍカラムを用いて、サイズ排除クロマトグラフィーを行った。本発明に係る二重特異的タンパク質は、単一モノマーピークとして溶出したことから、本発明に係る抗体Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）融合タンパク質は、非常に有利な生物物理学的性質を有することが実証される（図３）。
【０１９５】
実施例１．２  −  本発明に係る抗ＨＥＲ２  Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）抗ＣＤ３抗体融合タンパク質を用いたＦＡＣＳ実験
ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．２％アジ化ナトリウム中、（ｉ）１×１０５Ｊｕｒｋａｔ  Ｅ６−１細胞（ＣＤ３陽性細胞）、（ｉｉ）１×１０５ＢＴ４７４  ＨＥＲ２陽性乳癌細胞、（ｉｉｉ）１×１０５ＨＥＲ２またはＣＤ３陰性ＭＤＡ  ＭＢ４６８細胞のいずれかを含有する１００μｌの全体積で、タンパク質ＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）、ＣＯＶＡ４２２（配列番号１６５および１６６）、およびＣＯＶＡ４４６（配列番号１６７）を１００ｎＭの濃度でインキュベートした。陰性対照として、タンパク質の代わりにＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．２％アジ化ナトリウムのみを用いて、同一の細胞をインキュベートした（ＰＢＳ対照）。
【０１９６】
氷上で６０分間インキュベートした後、１５０μＬ  ＰＢＳ−１％ＢＳＡ緩衝液で細胞を２回洗浄し、５μｇ／ｍＬヤギ抗ヒト−Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を暗所で４０分間添加することにより、結合された抗体を検出した。ヘキサｈｉｓタグを有する二重特異的ｓｃＦｖ対照ＣＯＶＡ４４６（配列番号１６７）では、５μｇ／ｍｌマウス抗ＨＩＳタグ抗体（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の添加、および４℃で４０分間のインキュベーション、続いて、追加の洗浄工程、続いて、５μｇ／ｍＬヤギ抗マウスＡｌｅｘａ４８８コンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた同様に４℃で４０分間のインキュベーションを行うことにより、結合を検出した。最後に、細胞を３回洗浄し、１００μｌ  ＰＢＳ−１％ＢＳＡ中に再懸濁させ、次いで、Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅ（商標）フローサイトメーター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で染色細胞を分析した。
【０１９７】
結果
フローサイトメトリーを介してＦｙｎｏｍｅｒ（登録商標）−抗体融合タンパク質の結合性を評価した。図４に示されるように、（ＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）、ＣＯＶＡ４２２（配列番号１６５および１６６）、および二重特異的ｓｃＦｖ対照（ＣＯＶＡ４４６、配列番号１６７）は、ＨＥＲ２発現ＢＴ４７４細胞（パネルＡ）およびＣＤ３発現Ｊｕｒｋａｔ  Ｅ６細胞（パネルＢ）に特異的に結合した。ＣＤ３またはＨＥＲ２のいずれも発現しない細胞系では、非特異的結合では観測されなかった（パネルＣ）。
【０１９８】
実施例１．３  −  ＨＥＲ２を発現する細胞に対するリダイレクトＴ細胞媒介細胞傷害性分析
Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６９  １０）：４２７０−６から採用したプロトコルを用いて、リダイレクトＴ細胞媒介細胞傷害性アッセイで、ポリペプチドＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）および二重特異的ｓｃＦｖ対照（配列番号１６７）を試験した。
【０１９９】
簡潔に述べると、エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを使用した。実験の前日、標準的手順を用いてＦｉｃｏｌｌ  Ｐｌａｑｕｅ  ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および密度勾配遠心分離により、Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅ  Ｚｕｅｒｉｃｈから取得された新鮮なバフィーコート調製物からＰＢＭＣを単離した。次いで、１０％ＦＣＳ、ＲＰＭＩ中、３７℃、５％ＣＯ２で、単離されたＰＢＭＣを４×１０６細胞／ｍｌの細胞濃度で一晩インキュベートした。次いで、単離されたＰＢＭＣをリダイレクト細胞傷害性アッセイでエフェクター細胞として機能することが可能であった。
【０２００】
また、実験の前夜、Ａｃｃｕｔａｓｅ処理により適切な量の標的細胞を取り出し、９６ウェルプレート中の１０％ＦＣＳが追加された１００μＬ完全細胞培養培地中に３０００〜５０００細胞／ウェルの範囲内の細胞密度で標的細胞を接種した。３７℃および５％ＣＯ２でアッセイプレートを一晩インキュベートした。使用した標的腫瘍細胞は、ＳＫＢＲ−３（ＡＴＣＣカタログ番号ＨＴＢ−３０（商標））およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＡＴＣＣカタログ番号：ＨＴＢ−１３２（商標））であった。細胞死滅実験前、適切な量のＰＢＭＣを遠心分離して１０％ＦＣＳ、ＲＰＭＩ中に再懸濁させた。使用した標的細胞の数に依存して、細胞濃度を１．５〜２．５×１０６細胞／ｍＬの範囲内で調整し、さらなる使用時まで室温で細胞を貯蔵した。
【０２０１】
エフェクター細胞として富化ＣＤ８＋Ｔ細胞および標的腫瘍細胞としてＳＫＯＶ−３（ＡＴＣＣカタログ番号ＨＴＢ−７７（商標））を用いて、リダイレクトＴ細胞媒介細胞傷害性をさらにモニターした。これらのアッセイのために、単離されたＰＢＭＣをさらに精製して、富化ＣＤ８＋Ｔ細胞を得た。製造業者の推奨に従って、Ｄｙｎｂｅａｄ（登録商標）Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ（商標）ヒトＣＤ８  Ｔ細胞キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号１１３４８Ｄ）を用いて、ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。次いで、精製後、細胞を６×１０５〜１×１０７／ｍｌの範囲内の濃度で１０％ＦＣＳ、ＲＰＭＩ中に再懸濁させた。実験日、エフェクター分子を１０％ＦＣＳ、ＲＰＭＩ中に１５０ｎＭの最大濃度に希釈して、１／１０希釈の希釈系列を調製した。最後に、アッセイプレートから消費培地を取り出して、５０μｌ／ウェルの新鮮培地で置換した。次いで、適切な量のエフェクター分子およびエフェクター細胞を添加した。最終エフェクター細胞対標的細胞比は、ＰＢＭＣアッセイでは２５／１、およびＣＤ８＋Ｔ細胞をエフェクター細胞として機能するアッセイでは１０／１であった。エフェクター分子の最終最大濃度は、５０ｎＭであった。最終アッセイ体積は、１５０μＬ／ウェルであった。アッセイプレートを３７℃、５％ＣＯ２で２４時間〜７２時間インキュベートした。次いで、細胞培養上清を取り出して、後続のアッセイ（グランザイム放出アッセイ、以下の実施例１．４を参照されたい）のために−８０℃で貯蔵した。発色溶液を添加する前に、各ウェルをＰＢＳで２回洗浄した。製造業者の推奨に従ってＸＴＴ試薬（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｘ４６２６）を用いて、細胞生存能を評価した。標的細胞を１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ）で処理することにより１００％溶解対照を組み込み、エフェクター細胞のみで標的細胞を処理することにより自然溶解に対する値を得た。ＸＴＴ基質添加の２．５〜４時間後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。すべての測定をトリプリケート方式で行った。次式：
生存％＝（値−１００％溶解）／（自然溶解−１００％溶解）＊１００
を用いて細胞生存パーセントを計算した。次いで、細胞生存％をエフェクター分子濃度に対してプロットし、Ｐｒｉｓｍ  ５（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて用量−反応シグモイドに当てはめることにより、データを評価した。
【０２０２】
結果
ＨＥＲ２発現ＳＫＢＲ３細胞に対するＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）の用量依存的細胞傷害性を観測可能であることを実証可能であった（図５）。この代表的なアッセイでは、ＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）は、８７ｐＭのＥＣ５０値を有していた。重要なこととして、図５に示されるようにＨＥＲ２陰性ＭＤＡ−ＭＢ−４６８では細胞傷害性が観測されなかったため、細胞傷害作用は抗原依存的であった。
【０２０３】
同一のアッセイ条件下で、二重特異的抗ＨＥＲ２×抗ＣＤ３  ｓｃＦｖｓｃＦｖ対照分子（配列番号１６７）では、６０ｐＭのＥＣ５０値が得られた。驚くべきことに、２価および全長ＩｇＧベースのＦｙｎｏｍｅｒ−抗体融合タンパク質は、現在使用されているｓｃＦｖｓｃＦｖタンパク質と同一範囲内のリダイレクト死滅アッセイの効力を示すが、最適とは言えない生物物理学的性質および短いｉｎ  ｖｉｖｏ半減期という欠点を有していないことが見いだされた。
【０２０４】
表２には、試験したタンパク質で得られたＥＣ５０値がまとめられている。
【０２０５】
【表２】
0006694808.tif 000004
【０２０６】
本発明に係るＦｙｎｏｍｅｒ−抗体融合タンパク質が、Ｔ細胞のエンゲージメント（ＡＤＣＣ媒介性活性によるものではない）により死滅活性を発揮することを実証するために、ＡＤＣＣによる細胞死滅を媒介できないＣＤ８＋富化Ｔ細胞を用いたリダイレクト細胞死滅実験を行った。
【０２０７】
図６は、エフェクター細胞としてＣＤ８＋富化Ｔ細胞を用いて細胞死滅を確認できたことを示している。ここで、ＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）は、８ｐＭのＥＣ５０値を示し、ＣＯＶＡ４２２（配列番号１６５および１６６）のＥＣ５０値は、１７５ｐＭであった。これらの結果から、ＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）およびＣＯＶＡ２２（配列番号１６５および１６６）の強力な（サブｎＭ）死滅活性が確認される。
【０２０８】
実施例１．４  −  標的細胞の存在下および不在下でのグランザイムＢ放出の分析
抗原陽性標的細胞およびＣＤ８＋富化Ｔ細胞の存在下および不在下で、ＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）および対照として抗ＣＤ３抗体（配列番号２および３）のインキュベーション時の細胞培養培地中へのグランザイムＢの放出を評価した。Ｈａａｓ  Ａ．ｅｔ．ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００９，２１４（６）：４４１−５３により記載されるように、グランザイムＢの放出は、ＢｉＴＥ（登録商標）様作用剤により誘導されるＴ細胞媒介細胞傷害活性の主要インジケーターである。Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）−抗体融合タンパク質の細胞傷害活性の評価に対して以上に記載したように、サンプルをインキュベートした。インキュベーションの終了時、細胞培養上清を捕集し、製造業者の推奨に従ってグランザイムＢ  ＥＬＩＳＡキット（研究開発システム）を用いて、グランザイムＢの濃度を評価した。
【０２０９】
結果：
図７は、指定の濃度でＣＤ８＋Ｔ細胞の存在下ならびに抗原陽性標的細胞の存在下および不在下でＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）のインキュベーションを行った３日後のグランザイムＢの発現レベルを示している。標的細胞の不在下で５０ｎＭのＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）のみを用いてＴ細胞をインキュベートした場合、グランザイムＢの非特異的な放出が検出されうる。標的細胞ＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）およびＴ細胞が存在した場合、グランザイムＢ発現の顕著な増加が観測された。細胞傷害作用が検出できない濃度でＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）を用いた場合、実質的なグランザイムＢ発現を検出できなかったことから、細胞傷害活性とグランザイムＢ放出（０．５ｐＭ）との間の相関が示唆される。対照抗ＣＤ３抗体（配列番号２および３）（５０ｎＭ）は、予想どおり、腫瘍標的およびエフェクター細胞の存在下でグランザイムＢ放出をトリガーしなかった。
【０２１０】
実施例１．５  −  薬動学的分析
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）においてＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）の薬動学的プロファイルを調べた。５匹のＣ５７ＢＬ／６マウスに２００μｇのＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）を静脈内注射した。１０分後、６、２４、４８、９６、１２０、１４４、および１６８時後、ＥＤＴＡ被覆ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅｓ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）中に血液を捕集し、９３００ｇで１０分間遠心分離し、そしてＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）の血清中レベルをＥＬＩＳＡにより決定した。黒色ｍａｘｉｓｏｒｐマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）を５０ｎＭ  ＨＥＲ２  ＥＣＤ（ベンダーＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ）で被覆した。ＰＢＳ中２％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）でブロックした後、４０μｌのＰＢＳおよび適切な希釈度の１０μｌの血清を適用した。１時間のインキュベーション後、ウェルをＰＢＳで洗浄し、結合されたＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）を抗−ｈＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で検出した。アッセイをＱｕａｎｔａＲｅｄ蛍光原基質（Ｐｉｅｒｃｅ）で発色させ、５４４ｎｍ（励起）および５９０ｎｍ（発光）で５分後に蛍光強度を測定した。ＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）（３３３〜０．５ｎｇ／ｍｌに希釈）の標準曲線を用いて、ＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）の血清中レベルを決定した。さまざまな時間点で決定された血清中に濃度および排出相（片対数スケールの中でプロットされた）の得られた傾きｋから、式ｔ１／２＝ｌｎ２／−ｋを用いて、半減期を計算した。
【０２１１】
結果：
図８は、マウスにおける静脈内ボーラス注射後のＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）の血清中濃度を示している。排出相（β相、時間点２４ｈ〜１６８ｈ）から決定されるＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）の半減期値は、１４０時間であった。半減期がマウスにおける他のヒト抗体で得られる半減期に匹敵するため、この知見からＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）は、ＩｇＧ様ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＰＫ特性を有することが示される（たとえば、アダリムマブ：１０２〜１９３時間、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）Ｄｒｕｇ  Ａｐｐｒｏｖａｌ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｄｒｕｇ  Ａｐｐｒｏｖａｌ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）、ＦＤＡ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．：１２５０５７ｓ０１１０，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗ，０１／１８／２００８）。
【０２１２】
実施例１．６  −  ヒトＴ細胞で再構成されたＨＥＲ２を過剰発現するＳＫＯＶ−３腫瘍を有するマウスにおけるＣＯＶＡ４２０のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性
ＨＥＲ２発現ヒトＳＫＯＶ−３腫瘍異種移植片を有する照射ＮＯＤ．ＣＢ１７  ＰｒｋｄｃマウスにおいてＣＯＶＡ４２０の抗腫瘍活性を調べた。
【０２１３】
方法：
３×１０６ＳＫＯＶ−３（ＡＴＣＣカタログ番号ＨＴＢ−７７（商標））細胞を２Ｇｙ照射ＮＯＤ．ＣＢ１７  Ｐｒｋｄｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）に皮下注射（ｓ．ｃ．）した。ヒトＴ細胞注射の前日、腫瘍が約５０ｍｍ３の平均サイズに達した時、動物に抗アシアロＧＭ１ウサギ抗体（ＷＡＫＯ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の単回静脈内（ｉ．ｖ．）ボーラス注射を施した。１名の健常ドナーのバフィーコートから単離されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化拡大（２２日間）ヒトＴ細胞（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を腹膜腔注射した（１．６×１０７／マウス）。Ｔ細胞注射の３日後、マウスをランダム化し、合計１５日間にわたり側方尾静脈に静脈内ボーラス注射を行うことにより、０．５ｍｇ／ｋｇ  ＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４、ｎ＝８）、媒体（ＰＢＳ、ｎ＝７）処理、２回／週（６、９、１３、１５日目）、または１日１回等モル用量（＝０．１６ｍｇ／ｋｇ）のＣＯＶＡ４４６（配列番号１６７、ｎ＝８）に施した。腫瘍成長阻害により治療有効性を評価した。腫瘍サイズは、外側カリパス測定および標準的半楕円式：体積＝（幅）２×長さ×０．５を用いて計算される体積により測定した。６日目（療法開始）に対する相対腫瘍体積（ＲＴＶ）を平均±ＳＥＭとして表す。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６ソフトウェア、バージョン６ａを用いて統計解析を行った。対応のないノンパラメトリックｔ検定（マン・ホイットニー）を用いて、抗腫瘍有効性の統計的有意性を計算した。処理対媒体対照比（Ｔ／Ｃ）：Ｔ／Ｃ（％）＝ＲＴＶ（１６日目）／ＲＴＶ（６日目）として表される、媒体対照と対比した腫瘍体積阻害として、１６日目のＣＯＶＡ４２０対媒体処理の抗腫瘍有効性をさらに評価した（Ｗｕ（２０１０），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２０：５，９５４−９６４）。
【０２１４】
結果：
ＣＯＶＡ４２０は、Ｔ細胞を腫瘍に積極的に動員することにより、ＳＫＯＶ−３腫瘍成長を有意に低減する（図９）。ＣＯＶＡ４２０処理では、０．５ｍｇ／ｋｇ  ＣＯＶＡ４２０を４回投与した後、１６日目、媒体対照と比較して、有意な成長阻害をもたらした（Ｐ＝０．００５９）。ＣＯＶＡ４２０処理ではまた、１日１回注射０．１６ｍｇ／ｋｇ  ＣＯＶＡ４４６対照と比較しても、有意により有効であった（Ｐ＝０．０４）。同一日でのＴ／Ｃ比は、媒体処理と比較して、ＣＯＶＡ４２０の成長阻害では５５％およびＣＯＶＡ４４６では７９％に等しい。ＣＯＶＡ４２０は、薬理学的に活性であり、ヒトＴ細胞を効率的に腫瘍に動員することにより、その抗腫瘍活性を発揮し、その結果、媒体処理対照と比較して腫瘍成長阻害をもたらすことが、結果からが実証される。
【０２１５】
実施例１．７  −  高レベルのＨＥＲ２を発現する腫瘍細胞に対して選択的なリダイレクトＴ細胞媒介細胞傷害性の分析
Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６９  １０）：４２７０−６から採用したプロトコルを用いて、リダイレクトＴ細胞媒介細胞傷害性アッセイで、ポリペプチドＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）および二重特異的ｓｃＦｖ対照ＣＯＶＡ４４６（配列番号１６７）を試験した。簡潔に述べると、実施例１．３に記載したように、前日に、新鮮なバフィーコートからヒトＰＢＭＣを単離し、実験日にＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。実験の前夜、Ａｃｃｕｔａｓｅ処理により適切な数の標的細胞を取り出し、９６ウェルプレート中の１０％ＦＣＳが追加された１５０μｌの適切な成長培地中に５０００細胞／ウェルの細胞密度で標的細胞を接種した。３７℃および５％ＣＯ２でアッセイプレートを一晩インキュベートした。使用した標的腫瘍細胞は、高レベルのＨＥＲ２（約１．７×１０６ＨＥＲ２分子／細胞）を発現するＳＫＯＶ−３（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−７７（商標））、および低レベルのＨＥＲ２（約１×１０４ＨＥＲ２分子／細胞）を発現するＭＣＦ−７（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−２２（商標））であった。製造業者の推奨に従ってＱｉｆｉｋｉｔ（Ｄａｋｏ  Ｋ００７８）を用いて、ＨＥＲ２表面発現を定量した。簡潔に述べると、飽和濃度の抗ＨＥＲ２抗体（Ｒ＆Ｄ  ＭＡＢ１１２９）またはアイソタイプが一致した対照ＩｇＧ、続いて、抗マウスＦＩＴＣ二次抗体で細胞を染色し、そしてフローサイトメトリー分析に付した。同時に、さまざまな明確に規定された量のマウスモノクローナル抗体分子で被覆されたビーズを二次抗体で染色し、分析し、分子／細胞の参照として標準曲線をプロットした。
【０２１６】
実験日、エフェクター分子を１０％ＦＣＳ、ＲＰＭＩ中に１５０ｎＭの最大濃度に希釈して、１／１０希釈の希釈系列を調製した。適切な量のＴ細胞を遠心分離し、１０％ＦＣＳ、ＲＰＭＩ中に再懸濁させた。細胞濃度を１×１０６細胞／ｍＬに調整した。最後に、アッセイプレートから消費培地を取り出して、５０μｌ／ウェルの新鮮１０％ＦＣＳ、ＲＰＭＩで置換した。次いで、５０μｌのエフェクター分子および５０μｌのエフェクターＴ細胞を添加した。最終エフェクター細胞対標的細胞比は、１０：１であった。エフェクター分子の最終最大濃度は、５０ｎＭであった。最終アッセイ体積は、１５０μｌ／ウェルであった。
【０２１７】
アッセイプレートを３７℃、５％ＣＯ２で６０時間インキュベートした。次いで、細胞培養上清を除去し、各ウェルをＰＢＳで１回洗浄した。製造業者の推奨に従ってＸＴＴ試薬（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｘ４６２６）を用いて、細胞生存能を評価した。１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ）で標的細胞を処理することにより１００％溶解対照を含め、エフェクター細胞のみを用いて標的細胞をインキュベートすることにより自然溶解の値を得た（「自然溶解」）。ＸＴＴ基質添加の２時間後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。すべての測定をトリプリケート方式で行った。次式：
生存％＝（値−１００％溶解）／（自然溶解−１００％溶解）＊１００
を用いて細胞生存パーセントを計算した。次いで、細胞生存％をエフェクター分子濃度に対してプロットし、Ｐｒｉｓｍ  ５（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて用量−反応シグモイドに当てはめることにより、データを評価した。
【０２１８】
結果
高レベルのＨＥＲ２を発現するＳＫＯＶ−３標的細胞に対するＣＯＶＡ４２０の用量依存的リダイレクトＴ細胞傷害性を観測可能であった（図１０）。表３には、試験したタンパク質で得られたＥＣ５０値がまとめられている。
【０２１９】
さらに、低レベルのＨＥＲ２を発現するＭＣＦ−７標的細胞に対する二重特異的抗ＣＤ３×抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ対照分子ＣＯＶＡ４４６の用量依存的リダイレクトＴ細胞傷害性もまた観測可能であった。この代表的なアッセイでは、ＣＯＶＡ４４６は、５３ｐＭのＥＣ５０値を有していた。驚くべきことに、ＣＯＶＡ４２０は、低レベルのＨＥＲ２（表３）を発現するＭＣＦ−７標的細胞に対する有意なリダイレクトＴ細胞傷害性を示さなかった。
【０２２０】
【表３】
0006694808.tif 000005
【０２２１】
実施例２  −  ＥＧＦＲ陽性腫瘍細胞に対するリダイレクトＴ細胞媒介細胞傷害性分析
実施例２．１．−  抗ＣＤ３抗体抗ＥＧＦＲ  Ｆｙｎｏｍｅｒ融合タンパク質の発現および精製
Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉら（Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）ＪＢＣ，２８２，ｐ．３１９６−３２０４）に記載されるように、得られる構築物がＣ末端ｍｙｃ−ヘキサヒスチジンタグを有するように、配列番号１６９および１８７〜１９７に示されるポリペプチドをコードするＤＮＡを細菌発現ベクターｐＱＥ１２中にクローニングした。２００μｌスケールの培養でＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌のサイトゾル中でポリペプチドを発現させた。１０μｇ／ｍｌの抗ｍｙｃマウス抗体９Ｅ１０（Ｒｏｃｈｅ）を含有するＰＢＳ／１％ＦＣＳ／０．２％アジ化ナトリウム緩衝液中に、ポリペプチドを含有する透明化溶解液を５：１に希釈し、１×１０５ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−１３２（商標））に添加した。氷上で６０分間インキュベートした後、細胞を洗浄し、結合された配列を抗マウスＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により検出した。次いで、染色された細胞をＦＡＣＳアナライザーで分析した。ＤＮＡ配列決定により特異的バインダーのＤＮＡ配列を検証した。ＦｙｎＳＨ３由来ＥＧＦＲバインダーのアミノ酸配列は、配列リスト中に添付されるように配列番号１６９および１８７〜１９７で示される。
【０２２２】
１５アミノ酸リンカー（配列番号１６２）を介して、ＥＧＦＲ結合Ｆｙｎｏｍｅｒ  ＥＲ７Ｌ２Ｄ６（配列番号１６９）をＣＤ３結合抗体（ＣＯＶＡ４８９、配列番号１７１および１７２）の重鎖（配列番号１７１）のＮ末端に遺伝子融合して、二重特異的抗体Ｆｙｎｏｍｅｒ融合タンパク質ＣＯＶＡ４９３（配列番号１７０および１７２）を生成した。それに加えて、ＥＲ７Ｌ２Ｄ６（配列番号１）を抗体軽鎖のＮ末端に融合して、二重特異的抗体Ｆｙｎｏｍｅｒ融合タンパク質ＣＯＶＡ４９４（配列番号１７１および１９８）を生成した。
【０２２３】
１５アミノ酸リンカー（配列番号１６２）を介して、ＥＧＦＲ結合Ｆｙｎｏｍｅｒ  ＥＲ９Ｌ３Ｄ７（配列番号１８７）を抗ＣＤ３結合抗体（ＣＯＶＡ４８９、配列番号１７１および１７２）の抗体重鎖（配列番号１７１）のＮ末端に遺伝子融合して、二重特異的抗体Ｆｙｎｏｍｅｒ融合タンパク質ＣＯＶＡ４９７（配列番号１９９および１７２）を生成した。それに加えて、ＥＲ９Ｌ３Ｄ７（配列番号２）を抗体軽鎖（配列番号１７２）のＣ末端に融合して、二重特異的抗体Ｆｙｎｏｍｅｒ融合タンパク質ＣＯＶＡ４９９（配列番号１７１および２００）をした。
【０２２４】
抗ＣＤ３抗体ＣＯＶＡ４８９、二重特異的タンパク質ＣＯＶＡ４９３、ＣＯＶＡ４９４、ＣＯＶＡ４９７、ＣＯＶＡ４９９、および抗ＣＤ３×抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ対照ＣＯＶＡ４４５（配列番号１７３）（ヘキサｈｉｓタグを有する）をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ＣＨＯ−Ｓ細胞に一過的にトランスフェクして、無血清／動物成分フリー培地で６日間発現させた。ＡＥＫＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号８９９２８）により、抗ＣＤ３抗体および本発明に係る二重特異的タンパク質を上清から精製した。ＨＩＳｔｒａｐ  Ｅｘｃｅｌカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を介して固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーにより、抗ＣＤ３×抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ対照（ＣＯＶＡ４４５、配列番号１７３）の精製を達成した。２８０ｎｍでの吸光度測定により濃度を決定した。収量を表４に列挙する。
【０２２５】
精製後、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ  １２／６０システムでシリカ系ＳＥＣ−５カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ、５μｍ、３００Å）を用いて、分析サイズ排除クロマトグラフィーを行った。
【０２２６】
結果
本発明に係る抗体Ｆｙｎｏｍｅｒ融合タンパク質および対照抗体は、単一工程で発現および精製を行うことが可能であった。表１には、ＣＨＯ細胞への一過性トランスフェクションおよび３７℃で６日間のタンパク質発現を行った後の精製収量がまとめられている。
【０２２７】
【表４】
0006694808.tif 000006
【０２２８】
本発明に係る二重特異的タンパク質は、サイズ排除カラムから単一モノマーピークとして溶出したことから、本発明に係る抗体Ｆｙｎｏｍｅｒ融合タンパク質は、非常に有利な生物物理学的性質を有することが実証される（図１１）。本発明に係る二重特異的構築物は、非修飾抗ＣＤ３抗体と少なくとも同程度に良好に発現され、ＳＥＣ分析より示されるように、精製後、凝集しなかった。
【０２２９】
実施例２．２  −  本発明に係る抗ＥＧＦＲ  Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）抗ＣＤ３抗体融合タンパク質のＦＡＣＳアッセイ実験
ＣＯＶＡ４８９、ＣＯＶＡ４９３、ＣＯＶＡ４９４、ＣＯＶＡ４９７、ＣＯＶＡ４９９、およびＣＯＶＡ４４５を、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．２％アジ化ナトリウム中で、（ｉ）３０ｎＭの濃度で、１００μｌの全体積で、１×１０５Ｊｕｒｋａｔ  Ｅ６−１細胞（ＣＤ３陽性細胞、ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ−１５２（商標））と共に、または（ｉｉ）１００ｎＭの濃度で、１００μｌの全体積で、１×１０５ＥＧＦＲ過剰発現ＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−１３２（商標））と共に、インキュベートした。陰性対照として、タンパク質の代わりにＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．２％アジ化ナトリウムのみを用いて、同一の細胞をインキュベートした（ＰＢＳ対照）。
【０２３０】
氷上で４５分間インキュベートした後、１５０μＬ  ＰＢＳ−１％ＢＳＡ緩衝液で細胞を２回洗浄し、４μｇ／ｍＬヤギ抗ヒト−Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を４℃で４０分間添加することにより、結合された抗体を検出した。ヘキサｈｉｓタグを有する二重特異的ｓｃＦｖ対照ＣＯＶＡ４４５では、ＣＯＶＡ４４５をマウス抗ＨＩＳタグ抗体（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に１：４のモル比（抗ＨＩＳタグ抗体：ＣＯＶＡ４４５）で同時にインキュベートし、続いて、追加の洗浄工程を行った後、４μｇ／ｍＬヤギ抗マウス−Ａｌｅｘａ  ４８８コンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に４℃で４０分間インキュベートすることにより、結合を検出した。最後に、細胞を３回洗浄し、１００μｌ  ＰＢＳ−１％ＢＳＡ中に再懸濁させ、次いで、Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅ（商標）フローサイトメーター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で染色細胞を分析した。
【０２３１】
結果
構築物はすべて、ヒトＣＤ３を発現するＪｕｒｋａｔ  Ｅ６−１細胞に結合し、かつＦｙｎｏｍｅｒ−抗体融合体さらには抗ＣＤ３×抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ対照ＣＯＶＡ４４５は、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８に結合した（図１２）。予想どおり、抗ＣＤ３抗体ＣＯＶＡ４８９では、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８に対する特異的結合は、観測されなかった。
【０２３２】
実施例２．３  −  高レベルのＥＧＦＲを発現する腫瘍細胞に対して選択的なリダイレクトＴ細胞媒介細胞傷害性の分析
Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６９（１０）：４２７０−６から採用したプロトコルを用いて、リダイレクトＴ細胞媒介細胞傷害性アッセイで、ポリペプチドＣＯＶＡ４９３、ＣＯＶＡ４９４、ＣＯＶＡ４９７、ＣＯＶＡ４９９、二重特異的ｓｃＦｖ対照ＣＯＶＡ４４５、および抗ＣＤ３抗体（ＣＯＶＡ４８９、配列番号１７１および１７２）を試験した。簡潔に述べると、実験の前夜、Ａｃｃｕｔａｓｅ処理により適切な数の標的細胞を取り出し、９６ウェルプレート中の１０％ＦＣＳが追加された１５０μｌの適切な成長培地中に３０００〜５０００細胞／ウェルの細胞密度で標的細胞を接種した。３７℃および５％ＣＯ２でアッセイプレートを一晩インキュベートした。使用した標的腫瘍細胞は、高レベルのＥＧＦＲ（約１．５×１０６ＥＧＦＲ分子／細胞）を発現するＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−１３２（商標））、および低レベルのＥＧＦＲ（約５×１０４ＥＧＦＲ分子／細胞）を発現するＨＴ−２９（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−３８（商標））であった。実施例１．７に記載されるようにＥＧＦＲ表面発現を定量した。ただし、飽和濃度の抗ＥＧＦＲ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＭＡＢＦ１２０）を使用した。
【０２３３】
実験日、エフェクター分子を１０％ＦＣＳ、ＲＰＭＩ中に１５ｎＭの最大濃度に希釈して、１／２０希釈の希釈系列を調製した。ヒトＣＤ８＋富化Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用した。製造業者により推奨されるように、ＭＡＣＳｘｐｒｅｓｓ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙ  １３０−０９８−３０９）および赤血球溶解液（Ｍｉｌｔｅｎｙ  １３０−０９４−１８３）と一緒にＭＡＣＳｘｐｒｅｓｓヒトＣＤ８＋単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  １３０−０９８−１９４）を用いて、Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅ  Ｂｅｒｎから入手した新鮮なバフィーコート調製物からＣＤ８＋富化Ｔ細胞を単離した。適切な量のＴ細胞を遠心分離し、１０％ＦＣＳ、ＲＰＭＩ中に再懸濁させた。細胞濃度を１×１０６細胞／ｍＬに調整した。最後に、アッセイプレートから消費培地を取り出して、５０μｌ／ウェルの新鮮１０％ＦＣＳ、ＲＰＭＩで置換した。次いで、５０μｌのエフェクター分子および５０μｌのエフェクターＴ細胞を添加した。最終エフェクター細胞対標的細胞比は、１０：１であった。エフェクター分子の最終最大濃度は、５ｎＭであった。最終アッセイ体積は、１５０μｌ／ウェルであった。本発明に係るＦｙｎｏｍｅｒ−抗体融合タンパク質がＴ細胞のエンゲージメントを介して死滅活性を発揮することを実証するために、同様にＴ細胞の不在下で、５ｎＭの濃度のＣＯＶＡ４９３、ＣＯＶＡ４９４、ＣＯＶＡ４９７、ＣＯＶＡ４９９、およびＣＯＶＡ４４５と共に、標的細胞をインキュベートした。
【０２３４】
アッセイプレートを３７℃、５％ＣＯ２で６４時間インキュベートした。次いで、細胞培養上清を除去し、各ウェルをＰＢＳで１回洗浄した。製造業者の推奨に従ってＸＴＴ試薬（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｘ４６２６）を用いて、細胞生存能を評価した。１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ）で標的細胞を処理することにより１００％溶解対照を含め、エフェクター細胞のみを用いて標的細胞をインキュベートすることにより自然溶解の値を得た（「自然溶解」）。ＸＴＴ基質添加の５時間後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。すべての測定をトリプリケート方式で行った。次式：
生存％＝（値−１００％溶解）／（自然溶解−１００％溶解）＊１００
を用いて細胞生存パーセントを計算した。次いで、細胞生存％をエフェクター分子濃度に対してプロットし、Ｐｒｉｓｍ  ５（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて用量−反応シグモイドに当てはめることにより、データを評価した。
【０２３５】
結果
高レベルのＥＧＦＲを発現するＭＤＡ−ＭＢ−４６８標的細胞に対するＣＯＶＡ４９３、ＣＯＶＡ４９４、ＣＯＶＡ４９７、およびＣＯＶＡ４９９の用量依存的リダイレクトＴ細胞傷害性を観測可能であった（図１３。表５には、試験したタンパク質で得られたＥＣ５０値がまとめられている。
【０２３６】
さらに、低レベルのＥＧＦＲを発現するＨＴ−２９標的細胞に対するＣＯＶＡ４９３および二重特異的抗ＣＤ３×抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ対照分子の用量依存的リダイレクトＴ細胞傷害性を観測可能であった。この代表的なアッセイでは、ＣＯＶＡ４９３は、１１７．３ｐＭのＥＣ５０値を有し、ＣＯＶＡ４４５は、２．５ｐＭのＥＣ５０値を有していた。驚くべきことに、ＣＯＶＡ４９４、ＣＯＶＡ４９７、およびＣＯＶＡ４９９は、５ｎＭの最高濃度でさえも、低レベルのＥＧＦＲを発現するＨＴ−２９標的細胞に対する有意なリダイレクトＴ細胞傷害性を示さなかった（表５）。
【０２３７】
抗ＣＤ３抗体（ＣＯＶＡ４８９、配列番号１３および１４、５ｎＭの最高濃度で測定した）では細胞傷害性が観測されなかったため、細胞傷害作用は、抗ＥＧＦＲ  Ｆｙｎｏｍｅｒの存在に依存性した。
【０２３８】
【表５】
0006694808.tif 000007
【０２３９】
ＣＯＶＡ４９３、ＣＯＶＡ４９４、ＣＯＶＡ４９７、ＣＯＶＡ４９９、および二重特異的抗ＣＤ３×抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ対照分子（ＣＯＶＡ４４５）と共に標的細胞をインキュベートした時、細胞傷害性は観測されなかったため、細胞傷害作用は、エフェクターＴ細胞の存在に依存性した（図１４）。
【０２４０】
実施例３  −  ＣＤ３３陽性腫瘍細胞に対するリダイレクトＴ細胞媒介細胞傷害性の分析
実施例３．１．−  抗ＣＤ３抗体抗ＣＤ３３  Ｆｙｎｏｍｅｒ融合タンパク質の発現および精製
Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉら（Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）ＪＢＣ，２８２，ｐ．３１９６−３２０４）に記載されるように、得られる構築物がＣ末端ｍｙｃ−ヘキサヒスチジンタグを有するように、配列番号１７４および１７７〜１８６に示されるアミノ酸をコードするＤＮＡを細菌発現ベクターｐＱＥ１２中にクローニングした。２００μｌスケールの培養でＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌のサイトゾル中でポリペプチドを発現させた。モノクローナル透明化ライセートをＥＬＩＳＡに使用した。すなわち、ヒト組換えＣＤ３３（ヒトＦｃγ１への融合体としてＲ＆Ｄからまで購入した）をＭａｘｉＳｏｒｐウェル（Ｎｕｎｃ）上に固定し、ＰＢＳ中の４％ミルク（Ｒａｐｉｌａｉｔ，Ｍｉｇｒｏｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）でブロックした後、５０μｇ／ｍｌのマウス抗ｍｙｃマウス抗体９Ｅ１０（Ｒｏｃｈｅ）を含有するＰＢＳ中の１２．５μｌの１０％ミルクと５０μｌの透明化ライセートとを適用した。１時間インキュベートした後、結合されていないＦｙｎｏｍｅｒを洗浄除去し、結合されたＦｙｎｏｍｅｒを抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ抗体コンジュゲート（Ｓｉｇｍａ）で検出した。ＢＭ  ｂｌｕｅ  ＰＯＤ基質（Ｒｏｃｈｅ）を添加することによりペルオキシダーゼ活性の検出を行い、１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加することにより反応を停止させた。ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）およびコーティングされていないＭａｘｉＳｏｒｐウェルに対する交差反応性の不在に関して、同一のＥＬＩＳＡによりＥＬＩＳＡ陽性クローンを試験した。さらに、Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）ＪＢＣ，２８２，ｐ．３１９６−３２０４）に記載されるように、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーカラムを用いて、配列番号１７４および１７７〜１８６に示されるポリペプチドをコードするＤＮＡを細菌ライセートから精製した。２３ｎＭマウス抗ｍｙｃ抗体９Ｅ１０を含有する１００μｌのＰＢＳ／１％ＦＣＳ／０．２％アジ化ナトリウム中で、９３ｎＭ精製Ｆｙｎｏｍｅｒを１×１０５Ｕ９３７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５９３．２（商標））と共にインキュベートした。氷上で６０分間インキュベートした後、細胞を洗浄し、結合された配列を抗マウスＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により検出した。次いで、染色された細胞をＦＡＣＳアナライザーで分析した。ＤＮＡ配列決定により特異的バインダーのＤＮＡ配列を検証した。ＦｙｎＳＨ３由来ＣＤ３３バインダーのアミノ酸配列は、配列リスト中に添付されるように配列番号１７４および１７７〜１８６で示される。
【０２４１】
１５アミノ酸リンカー（配列番号１６２）を介して、ＣＤ３３結合Ｆｙｎｏｍｅｒ  ＥＥ１Ｌ１Ｂ３（配列番号１７４）を抗ＣＤ３結合抗体（配列番号２および３）の軽鎖（配列番号３）のＣ末端に遺伝子融合して、本発明に係る二重特異的抗体Ｆｙｎｏｍｅｒ抗体融合タンパク質ＣＯＶＡ４６７（配列番号２および１７５）を生成した。実施例１に記載されるように、ＣＯＶＡ４６７および国際公開第２０１０／０３７８３５号パンフレットに記載の抗ＣＤ３×抗ＣＤ３３  ｓｃＦｖ対照ＣＯＶＡ４６３（配列番号１７６）の発現および精製を行った。ＣＯＶＡ４６７は、非修飾抗ＣＤ３抗体と同程度に良好に発現し（収量：親の抗ＣＤ３抗体ＣＯＶＡ４１９では４６ｍｇ／ｌであったのに対してＣＯＶＡ４６７では５６ｍｇ／ｌ）、かつ図１５ＡのＳＥＣ分析により示されるように、精製後、凝集しなかった。
【０２４２】
実施例３．２  −  ＣＤ３３を発現する腫瘍細胞に対するリダイレクトＴ細胞媒介細胞傷害性の分析
Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６９（１０）：４２７０−６から採用したプロトコルを用いて、リダイレクトＴ細胞媒介細胞傷害性アッセイで、ポリペプチドＣＯＶＡ４６７（配列番号２および１７５）および二重特異的ｓｃＦｖ対照ＣＯＶＡ４６３（配列番号１７６）を試験した。
【０２４３】
簡潔に述べると、丸底９６ウェルプレート中の１０％ＦＣＳが追加された５０μＬのＲＰＭＩ培地に、１００００細胞／ウェルの細胞密度でＵ９３７（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−１５９３．２（商標））標的細胞を接種した。エフェクター分子を１０％ＦＣＳ、ＲＰＭＩ中に１５ｎＭの最大濃度に希釈して、１／１０希釈の希釈系列を調製した。ヒトＣＤ８＋富化Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用した。実施例３に記載されるようにＣＤ８＋富化Ｔ細胞を単離し、２×１０６細胞／ｍＬまでの濃度に調整した。次いで、指示濃度の５０μｌのエフェクター分子および５０μｌのエフェクターＴ細胞を添加した。最終エフェクター細胞対標的細胞比は、１０：１であった。最終アッセイ体積は、１５０μｌ／ウェルであった。
【０２４４】
アッセイプレートを３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。製造業者の推奨に従ってＣｙｔｏＴｏｘ−Ｆｌｕｏｒ（商標）細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｇ９２６０）を用いて、細胞溶解を評価した。０時間インキュベーションで２％サポニン（Ｓｉｇｍａ）で標的細胞を処理することにより、１００％溶解対照を含めた。エフェクターＴ細胞のみで標的細胞をインキュベートすることにより、自然溶解を測定した（「自然溶解」）。２４時間インキュベートした後、アッセイプレートを４００×ｇで１０分間遠心沈降し、１００μｌの上清を黒色９６ウェルプレートに移した。ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｆｌｕｏｒ（商標）試薬およびアッセイ緩衝液を室温で解凍し、６０μｌの試薬を３０ｍｌのアッセイ緩衝液中に希釈した。続いて、５０μｌのこの混合物をアッセイプレート上清の各ウェルに添加した。プレートを３７℃で２時間インキュベートし、４８５ｎｍ励起／５２０ｎｍ発光で蛍光を記録した。すべての測定をトリプリケート方式で行った。次式：
細胞溶解％＝（値−自然溶解）／（１００％溶解−自然溶解）＊１００
を用いて細胞生存パーセントを計算した。次いで、細胞溶解％をエフェクター分子濃度に対してプロットし、Ｐｒｉｓｍ  ５（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて用量−反応シグモイドに当てはめることにより、データを評価した。
【０２４５】
結果
ＣＤ３３発現Ｕ９３７細胞に対するＣＯＶＡ４６７（配列番号２および１７５）の用量依存的細胞傷害性を観測可能であることを実証可能であった（図１５Ｂ）。この代表的なアッセイでは、ＣＯＶＡ４６７（配列番号２および１７５）は、２．１ｐＭのＥＣ５０値を有していた。重要なこととして、抗ＣＤ３抗体（ＣＯＶＡ４１９、配列番号２および３）では細胞傷害性が観測されなかったため、細胞傷害作用は、抗ＣＤ３３  Ｆｙｎｏｍｅｒの存在に依存した。同一のアッセイ条件下で、二重特異的抗ＣＤ３３×抗ＣＤ３  ｓｃＦｖｓｃＦｖ対照分子（配列番号１７６）では、１．６ｐＭのＥＣ５０値が得られた。驚くべきことに、２価および全長ＩｇＧベースのＦｙｎｏｍｅｒ−抗体融合タンパク質は、現在使用されているｓｃＦｖｓｃＦｖタンパク質と同一範囲内のリダイレクト死滅アッセイの効力を示すが、最適とは言えない生物物理学的性質および短いｉｎ  ｖｉｖｏ半減期という欠点を有していないことが見いだされた。
【０２４６】
表６には、試験したタンパク質で得られたＥＣ５０値がまとめられている。
【０２４７】
【表６】
0006694808.tif 000008
本発明は以下の態様を包含し得る。
［１］  （ｉ）ＣＤ３と、（ｉｉ）癌細胞上の表面標的抗原と、に特異的に結合する二重特異的結合分子であって、
（ａ）ＣＤ３に特異的に結合する抗体と、
（ｂ）癌細胞上の表面標的抗原に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドと、を含み、
前記Ｆｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列からなり、ただし、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸位置１０〜１９内の少なくとも１つのアミノ酸が、置換、欠失、または付加されていること、かつ
（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸位置２９〜３６内の少なくとも１つのアミノ酸が、置換、欠失、または付加されていること、を条件とし、
前記ポリペプチドが、配列番号１の前記アミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有し、同一性の決定では、配列番号１のアミノ酸位置１２〜１７および３１〜３４が除外されること、を条件とする、二重特異的結合分子。
［２］  ＣＤ３に特異的に結合する前記抗体が、テプリズマブ、オテリキシズマブ、Ｃｒｉｓ−７、またはＳＰ３４である、上記［１］に記載の結合分子。
［３］  ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＣＤ３３、ＣＤ１９、ＣＥＡ、ＥＰＨＡ２、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ＩＧＦＲ１、線維芽細胞活性化タンパク質α、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ｃ−ＭＥＴ、ＥｐＣＡＭ、またはＰＳＭＡに特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含む、上記［１］または［２］に記載の結合分子。
［４］  前記結合分子が、ＨＥＲ２に特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、前記２つのポリペプチドの第１が、前記抗体の２つの重鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２が、前記抗体の前記２つの重鎖の第２のＮ末端に結合される、上記［１］〜［３］のいずれか一項に記載の結合分子。
［５］  前記結合分子が、ＥＧＦＲに特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、（ｉ）前記２つのポリペプチドの第１が、前記抗体の２つの重鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２が、前記抗体の前記２つの重鎖の第２のＮ末端に結合されるか、（ｉｉ）前記２つのポリペプチドの前記第１が、前記抗体の前記２つの重鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの前記第２が、前記抗体の前記２つの重鎖の第２のＣ末端に結合されるか、（ｉｉｉ）前記２つのポリペプチドの前記第１が、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの前記第２が、前記抗体の前記２つの軽鎖の第２のＮ末端に結合されるか、または（ｉｖ）前記２つのポリペプチドの前記第１が、前記抗体の前記２つの軽鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの前記第２が、前記抗体の前記２つの軽鎖の第２のＣ末端に結合される、上記［１］〜［３］のいずれか一項に記載の結合分子。
［６］  前記結合分子が、ＣＤ３３に特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、前記２つのポリペプチドの第１が、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２が、前記抗体の前記２つの軽鎖の第２のＣ末端に結合される、上記［１］〜［３］のいずれか一項に記載の結合分子。
［７］  ＣＤ３に特異的に結合する前記抗体と前記Ｆｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドとがリンカーにより結合される、上記［１］〜［６］のいずれか一項に記載の結合分子。
［８］  前記リンカーがペプチドリンカーである、上記［７］に記載の結合分子。
［９］  前記リンカーが、配列番号１６２、１６０、および１６１からなる群から選択される配列を有する、上記［８］に記載の結合分子。
［１０］  前記二重特異的結合分子が配列番号１６３および／または１６４を含む、上記［１］〜［４］、［８］、または［９］のいずれか一項に記載の結合分子。
［１１］  前記二重特異的結合分子が配列番号１７１および／または１９８を含む、上記［１］〜［３］、［５］、［８］、または［９］のいずれか一項に記載の結合分子。
［１２］  前記二重特異的結合分子が配列番号２および／または１７５を含む、上記［１］〜［３］、［６］、［８］、または［９］のいずれか一項に記載の結合分子。
［１３］  上記［１］〜［１２］のいずれか一項に記載の結合分子をコードする核酸分子。
［１４］  上記［１３］に記載の核酸分子を含むベクター。
［１５］  上記［１４］に記載のベクターで形質転換された宿主細胞または非ヒト宿主。
［１６］  上記［１］〜［１２］のいずれか一項に記載の結合分子、上記［１３］に記載の核酸分子、上記［１４］に記載のベクター、および／または上記［１５］に記載の宿主細胞もしくは非ヒト宿主、を含む医薬組成物。
［１７］  癌を治療または予防する方法における使用のための、上記［１６］に記載の医薬組成物。
［１８］  前記癌が、乳癌、血液学的悪性疾患、たとえば、ＮＨＬ、Ｂ−ＡＬＬ、ＡＭＬ、他の癌、たとえば、前立腺癌、黒色腫、肺癌、胃癌、卵巣癌、頭頸部癌、結腸直腸癌、膵臓癌、甲状腺癌、神経膠腫、膀胱癌、腎臓癌、肝臓癌、または悪性腹水からなる群から選択される、上記［１７］に記載の使用のための医薬組成物。
［１９］  前記癌が、上記［１］〜［１２］のいずれか一項に記載の結合分子により特異的に結合される、上記［１３］に記載の核酸分子によりコードされる結合分子により特異的に結合される、上記［１４］に記載のベクターにより発現される結合分子により特異的に結合される、および／または上記［１５］に記載の宿主細胞もしくは非ヒト宿主により発現される結合分子により特異的に結合される、表面標的抗原を、非腫瘍細胞上に発現される量の少なくとも２倍の量で発現する、上記［１７］または［１８］に記載の使用のための医薬組成物。
【図１Ａ】
0006694808.tif 000009
【図１Ｂ】
0006694808.tif 000010
【図２Ａ】
0006694808.tif 000011
【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
0006694808.tif 000020
【図１１−１】
0006694808.tif 000021
【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【配列表】
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