(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列でＮ末端から８５番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換され、前記他のアミノ酸が、セリン、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、チロシン、リジン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸からなる群から選択されるものである、変異型アデニロコハク酸シンテターゼ。
【請求項２】
請求項１に記載の変異型アデニロコハク酸シンテターゼをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４】
請求項１に記載の変異型アデニロコハク酸シンテターゼまたは請求項３に記載のベクターを含み、プリンヌクレオチドを生産するコリネバクテリウム属微生物。
【請求項５】
前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）である、請求項４に記載のプリンヌクレオチドを生産するコリネバクテリウム属微生物。
【請求項６】
請求項４に記載のコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階；及び前記微生物または培地からＩＭＰ、ＸＭＰ又はＧＭＰを回収する段階を含む、ＩＭＰ、ＸＭＰ又はＧＭＰの製造方法。
【請求項７】
前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）である、請求項６に記載のプリンヌクレオチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なアデニロコハク酸シンテターゼ、これを含む微生物、及びこれを用いたプリンヌクレオチドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸系物質の１つである５’−イノシン酸（5'-inosine monophosphate；以下ＩＭＰ）は、核酸生合成代謝系の中間物質であって、医薬品及び各種医療的利用などの多方面に利用されており、５’−グアニル酸（5'-guanine monophosphate；以下ＧＭＰ）と共に食品調味添加剤または食品用として広く利用されている物質である。ＩＭＰは、それ自体で牛肉の味を出すことが知られており、ＧＭＰと共にグルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）の風味を強化することが知られて、呈味性核酸系の調味料として脚光を浴びている。
【０００３】
ＩＭＰを製造する方法としては、酵母細胞から抽出したリボ核酸を酵素的に分解する方法、発酵によって生産されたイノシンを化学的にリン酸化する方法（非特許文献１など）及びＩＭＰを直接生産する微生物を培養して、培養液内のＩＭＰを回収する方法などがある。これらの方法の中で、現在最も多く使われている方法は、ＩＭＰを直接生産が可能な微生物を用いた方法である。
【０００４】
また、ＧＭＰを製造する方法として、微生物発酵法によって生産した５’−キサンチル酸（ＸＭＰ）をコリネ型微生物を用いてＧＭＰに転換する方法及び微生物発酵法によって生産したＸＭＰを大腸菌を用いてＧＭＰに転換させる方法がある。前記方法の中で、ＸＭＰを生産した後にＧＭＰに転換する方法で生産する場合、微生物発酵時に転換反応の前駆体であるＸＭＰの生産性が強化されるべきであり、生産されたＸＭＰだけでなく転換反応の全過程の間に既に生成されたＧＭＰが失われないようにしなければならない。
【０００５】
一方、自然な状態での酵素は、産業的な活用において要求される活性、安定性、光学異性体に対する基質特異性などにおいて、常に最適の特性を示すことではないため、アミノ酸配列の変異などを介して目的とする用途に適して酵素を改良する様々な試みがなされてきた。その中、酵素の合理的デザイン（rational design）及び位置選択的突然変異（site-directed mutagenesis）方法が酵素機能を向上するために適用された例であるが、多くの場合、目的酵素の構造に関する情報が不足したり、構造−機能の相関関係が明確ではなく、効果的に適用できないという欠点がある。このような場合、酵素遺伝子のランダム変異を介して構築された変異酵素ライブラリから目的の形質の酵素をスクリーニングする方向的進化（directed evolution）方法により酵素の改良を試みて活性を改善させると報告されていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】韓国登録特許第１０−０９２４０６５号
【特許文献２】国際公開特許第２００８−０３３００１号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Agri. Biol. Chem., 36, 1511（1972）
【非特許文献２】Pearson et al（1988）[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444
【非特許文献３】Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276−２77
【非特許文献４】Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453
【非特許文献５】Smith and Waterman, Adv. Appl. Math（1981）2:482
【非特許文献６】Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National BiomedicalＲesearch Foundation, pp. 353−３58（1979）
【非特許文献７】Gribskov et al（1986） Nucl. AcidsＲes. 14: 6745
【非特許文献８】Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7−１1.8
【非特許文献９】Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A. J. Nair., 2008
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前記微生物発酵を介してＩＭＰまたはＸＭＰを含むプリンヌクレオチドを生産する方法で高収率のプリンヌクレオチドを生産するために、発明者らは、広範な研究を行い、より高収率のプリンヌクレオチドの生産能を有するタンパク質変異体を発掘することにより、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一つの目的は、変異型アデニロコハク酸シンテターゼを提供することにある。
本発明の他の一つの目的は、変異型アデニロコハク酸シンテターゼをコードするポリヌクレオチドを提供することにある。
本発明の別の目的は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供することにある。
本発明の別の目的は、前記変異型アデニロコハク酸シンテターゼ及び前記ベクターを含むプリンヌクレオチドを生産する微生物を提供することにある。
本発明の別の目的は、前記コリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階；及び前記微生物または培地でプリンヌクレオチドを回収する段階を含むプリンヌクレオチドの製造方法を提供することにある。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の変異型アデニロコハク酸シンテターゼを用いてプリンヌクレオチドを生産するコリネバクテリウム属微生物を培養すると、高収率のプリンヌクレオチド生産が可能である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
これを具体的に説明すると、次のとおりである。本明細書で開示された各説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用できる。すなわち、本明細書で開示された様々な要素のすべての組み合わせが本発明のカテゴリに属する。また、下記に記述された具体的な叙述によって、本発明のカテゴリが制限されることはない。
【００１２】
前記目的を達成するための本発明の一つの態様は、配列番号２のアミノ酸配列でＮ末端から８５番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異型アデニロコハク酸シンテターゼを提供することにある。前記変異型アデニロコハク酸シンテターゼは、配列番号２で表われるアミノ酸配列でＮ末端から８５番目の位置に変異を有する。具体的には、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列内に１つ以上のアミノ酸変異を含む変異型アデニロコハク酸シンテターゼを提供し、前記アミノ酸変異は、Ｎ末端から８５番目のアミノ酸が他のアミノ酸への置換を含む。
【００１３】
本明細書において、用語、「アデニロコハク酸シンテターゼ（adenylosuccinate synthetase）」は、プリン（purine）生合性において重要な役割をする酵素である。本発明の目的上、前記酵素は５’−イノシン酸（5'-inosine monophosphate; IMP）または、５’−キサンチル酸（5'-xanthosine monophosphate; XMP）を含む、プリンヌクレオチドを生産するのに関与するタンパク質を意味する。
【００１４】
本発明において、前記配列番号２はアデニロコハク酸シンテターゼの活性を有するアミノ酸配列を意味する。具体的には、前記配列番号２はｐｕｒＡ遺伝子によってコードされるアデニロコハク酸シンテターゼ活性を有するタンパク質配列である。前記配列番号２のアミノ酸は、公知のデータベースであるＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋからその配列を得ることができる。一例として、コリネバクテリウム（Corynebacterium sp.）由来であってもよいが、これに制限されず、前記アミノ酸と同様の活性を有する配列は、制限なく含まれてもよい。また、配列番号２のアミノ酸配列の範囲は、配列番号２のアデニロコハク酸シンテターゼの活性を有するアミノ酸配列またはこれと８０％以上の相同性（homology）または同一性（identity）を有するアミノ酸配列を含んでもよいが、これに制限されるものではない。具体的には、前記アミノ酸は、配列番号２及び／または前記配列番号２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸を含んでもよい。相同性または同一性を有するアミノ酸配列は、１００％同一性を有する配列は除く前記範囲のものであってもよく、または１００％未満の同一性を有する配列であってもよい。また、このような相同性または同一性を有しながら、前記タンパク質に相応する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も、本発明で使用できることは自明である。
【００１５】
本明細書において、用語、「変異型アデニロコハク酸シンテターゼ」は、プリンヌクレオチド生産能を有する変異型ポリペプチド、プリンヌクレオチド生産変異型ポリペプチド、プリンヌクレオチドを生産する変異型ポリペプチド、アデニロコハク酸シンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチド、アデニロコハク酸シンテターゼ変異体などと混用して使用してもよい。また、前記タンパク質は、コリネバクテリウム属由来であってもよく、具体的には、コリネバクテリウム・スタティオニス由来であってもよいが、これに制限されない。
【００１６】
前記変異型アデニロコハク酸シンテターゼは、配列番号２のアミノ酸配列内のＮ末端から８５番目の位置での変異を含む。前記変異型アデニロコハク酸シンテターゼは、配列番号２のアミノ酸配列から８５番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたものであり、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、または野生型微生物に由来の非変異アデニロコハク酸シンテターゼに比べて弱化された活性を有する変異型アデニロコハク酸シンテターゼであってもよい。このような変異型アデニロコハク酸シンテターゼは、前記説明した配列番号２及び/または前記配列番号２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸でのＮ末端から８５番目の位置のアミノ酸が変異されたものを意味する。
【００１７】
具体的には、前記変異型アデニロコハク酸シンテターゼは、配列番号２のアミノ酸配列から８５番目のアミノ酸が、セリン（Serine）、アラニン（Alanine）、バリン（Valine）、ロイシン（Leucine）、メチオニン（Methionine）、イソロイシン（Isoleucine）、トレオニン（Threonine）、アスパラギン（Asparagine）、グルタミン（Glutamine）、システイン（Cystein）、チロシン（Tyrosine）、リジン（Lysine）、アスパラギン酸（Aspartoc acid）、及びグルタミン酸（Glutamic acid）に置換されたものであり、前記変異型アデニロコハク酸シンテターゼは、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに比べて弱化されたアデニロコハク酸シンテターゼ活性を有してもよいが、これに制限されない。
【００１８】
本発明の目的上、前記変異型アデニロコハク酸シンテターゼを含む微生物の場合、ＩＭＰまたはＸＭＰを含むプリンヌクレオチドの生産量が増加することを特徴とする。これは、野生型コリネバクテリウム属菌株がＩＭＰまたはＸＭＰを生産できないか、ＩＭＰまたはＸＭＰを生産しても非常に極微量を生産できるのに対し、本発明の変異型アデニロコハク酸シンテターゼを通じてＩＭＰまたはＸＭＰの生産量を増加させることに意義がある。
【００１９】
前記変異型アデニロコハク酸シンテターゼは、配列番号２のアミノ酸配列内のＮ末端から８５番目のアミノ酸がセリン（Serine）、アラニン（Alanine）、バリン（Valine）、ロイシン（Leucine）、メチオニン（Methionine）、イソロイシン（Isoleucine）、トレオニン（Threonine）、アスパラギン（Asparagine）、グルタミン（Glutamine）、システイン（Cystein）、チロシン（Tyrosine）、リジン（Lysine）、アスパラギン酸（Aspartoc acid）、及びグルタミン酸（Glutamic acid）からなる群から選択されるアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含んでもよい。具体的には、前記変異型アデニロコハク酸シンテターゼは、配列番号２のアミノ酸配列内のＮ末端から８５番目のアミノ酸が、セリン（Serine）、アラニン（Alanine）、バリン（Valine）、ロイシン（Leucine ）、メチオニン（Methionine）、イソロイシン（Isoleucine）、トレオニン（Threonine）、アスパラギン（Asparagine）、グルタミン（Glutamine）、システイン（Cystein）、チロシン（Tyrosine）、リジン（Lysine）、アスパラギン酸（Aspartoc acid） 、及びグルタミン酸（Glutamic acid）からなる群から選択されるアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチドからなってもよい。また、前記変異型アデニロコハク酸シンテターゼは、配列番号２のアミノ酸配列でＮ末端から８５番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換され、変異型アデニロコハク酸シンテターゼのアミノ酸配列またはこれと８０％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよいが、これに制限されるものではない。具体的には、本発明の前記変異型アデニロコハク酸シンテターゼは、配列番号２のアミノ酸配列から８５番目のアミノ酸がセリン（Serine）、アラニン（Alanine）、バリン（Valine）、ロイシン（Leucine）、メチオニン（Methionine）、イソロイシン（Isoleucine）、トレオニン（Threonine）、アスパラギン（Asparagine）、グルタミン（Glutamine）、システイン（Cystein）、チロシン（Tyrosine）、リジン（Lysine）、アスパラギン酸（Aspartoc acid）、及びグルタミン酸（Glutamic acid）からなる群から選択されるアミノ酸に置換されたアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の相同性または同一性を有するポリペプチドを含んでもよい。また、このような相同性または同一性を有し、前記タンパク質に相応する効能を示すアミノ酸配列であれば、８５番目のアミノ酸配列に加えて、一部の配列が欠失、変形、置換、または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も、本発明の範囲内に含まれるは自明である。
【００２０】
すなわち、本発明で「特定の配列番号で記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質またはポリペプチド」と記載されている場合でも、該当配列番号のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同一もしくは相応する活性を有する場合であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、保存的置換または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も、本発明で使用できることは自明である。例えば、前記変異型アデニロコハク酸シンテターゼと同一あるいは相応する活性を有する場合であれば、前記アミノ酸配列の前後に、タンパク質の機能を変更しない配列の追加、自然に発生しうる突然変異、そのサイレント突然変異（silent mutation）または保存的置換は除外せず、これらの配列の追加、あるいは突然変異を有する場合でも、本発明の範囲内に属するものは自明である。
【００２１】
前記「保存的置換（conservative substitution）」は、あるアミノ酸を類似の構造的及び/または化学的性質を有する別のアミノ酸に置換させることを意味する。これらのアミノ酸置換は、一般的に残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び/または両親媒性（amphipathic nature）における類似性に基づいて発生してもよい。例えば、正に荷電された（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リジン、及びヒスチジンを含み；負に荷電された（酸性）アミノ酸は、グルタミン酸及びアスパラギン酸を含み；芳香族アミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンを含み；疎水性アミノ酸は、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンを含む。
【００２２】
したがって、本明細書において、「変異型（variant）」は、「特定の配列番号に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質またはポリペプチド」に加えて、１つ以上のアミノ酸の保存的置換（conservative substitution）及び/または変形（modification）を含んでもよい。例えば、一部の変異型はＮ末端リーダー配列または膜転移ドメイン（transmembrane domain）のような１つ以上の部分が除去された変異型を含んでもよい。他の変異型は、成熟タンパク質（mature protein）のＮ及び/またはＣ末端から一部が除去された変異型を含んでもよい。また、前記変異型は、ポリペプチドの特性と２次構造に最小限の影響を与えるアミノ酸の欠失または付加を含む他の変形を含んでもよい。例えば、ポリペプチドは、翻訳同時に（co-translationally）または翻訳後に（post-translationally）タンパク質の移転（transfer）に関与するタンパク質Ｎ末端のシグナル（またはリーダー）配列とコンジュゲートしてもよい。また、前記ポリペプチドは、ポリペプチドを確認、精製または合成できるように他の配列またはリンカーとコンジュゲートしてもよい。前記用語「変異型」は、変異体、変形、変異されたタンパク質、変異型ポリペプチド、変異、などの用語（英語表現では、modification、modified protein、modified polypeptide、mutant、mutein、divergentなど）が用いられてもよく、変異された意味で用いられる用語であれば、これに制限されない。
【００２３】
相同性（homology）及び同一性（identity）は、２つの与えられたアミノ酸配列または塩基配列と関連する程度を意味し、パーセンテージで表示されてもよい。
用語相同性及び同一性は、多くの場合、相互交換的に用いられてもよい。
保存された（conserved）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同一性は、標準配列アルゴリズムによって決定され、用いられるプログラムによって確立されたデフォルトのギャップペナルティが一緒に利用されてもよい。実質的に、相同性（homologous）を有するか同一（identical）の配列は、一般的に、配列全体または全長の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の中間または高い厳しい条件（stringent conditions）でハイブリッドしてもよい。ハイブリッドするポリヌクレオチドでコドンの代わりに縮退コドンを含有するポリヌクレオチドも考慮される。
【００２４】
任意の２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が、相同性、類似性または同一性を有するかどうかは、例えば、非特許文献２と同じデフォルトのパラメータを用いて「ＦＡＳＴＡ」プログラムのような公知のコンピュータアルゴリズムを利用して決定してもよい。または、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite、非特許文献３）（バージョン５．０．０またはそれ以降のバージョン）で実行されるような、ニードルマン−ウンシュ（Needleman-Wunsch）アルゴリズム（非特許文献４）を用いて決定してもよい。（ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J., et al, Nucleic AcidsＲesearch 12: 387（1984））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（ Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403（1990）； Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994、及び[CARILLO ETA/.]（1988） SIAM J Applied Math 48: 1073を含む）。例えば、国立生物工学情報データベースセンターのＢＬＡＳＴ、またはＣｌｕｓｔａｌＷを用いて、相同性、類似性または同一性を決定してもよい。
【００２５】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性、類似性または同一性は、例えば、非特許文献５に公知されたように、例えば、非特許文献４のようなＧＡＰコンピュータープログラムを利用して配列情報を比較することによって決定されてもよい。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列のうち、より短いものからのシンボルの全体数で同様の配列されたシンボル（つまり、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を割った値として定義する。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメータは、（１）一進法の比較マトリックス（同一性のための１及び非同一性のための０の値を含有する）及び非特許文献６に開示されたように、非特許文献７の加重された比較マトリックス（またはＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）；（２）各ギャップのための３．０のペナルティ及び各ギャップでの各記号のための追加の０．１０ペナルティ（またはギャップ開放ペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ０．５）；及び（３）末端ギャップのための無ペナルティを含んでもよい。したがって、本願で用いられるものとして、用語、「相同性」または「同一性」は、配列間の関連性（relevance）を示す。
【００２６】
また、コドン縮退性（codon degeneracy）によって、前記配列番号２のアミノ酸配列でＮ末端から８５番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ポリペプチドまたはその相同性または同一性を有する変異型ポリペプチドに翻訳されてもよいポリヌクレオチドも含まれることは自明である。また、公知の遺伝子配列から調製してもよいプローブ（probe）、例えば、前記塩基配列の全体または一部に対する相補配列と厳格な条件（stringent condition）下でハイブリッド化（hybridization）して、配列番号２のアミノ酸配列から８５番目のアミノ酸が、セリン、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、チロシン、リジン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸に置換されたアミノ酸配列を含む、変異型アデニロコハク酸シンテターゼをコードするポリヌクレオチド配列であれば、制限なく含まれてもよい。
【００２７】
本発明の他の一つの態様は、前記変異型アデニロコハク酸シンテターゼをコードするポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドを含むベクターを含む。
本明細書において、用語、「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド単位体（monomer）が共有結合によって長く鎖状につながったヌクレオチドのポリマー（polymer）であって、一定の長さ以上のＤＮＡまたはＲＮＡ鎖であり、より具体的には、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド断片を意味する。
本発明の変異型アデニロコハク酸シンテターゼをコードするポリヌクレオチドは、本発明のアデニロコハク酸シンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であれば、制限なく含まれてもよい。本発明でアデニロコハク酸シンテターゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子は、ｐｕｒＡ遺伝子であり、具体的には、コリネバクテリウム・スタティオニス由来であってもよいが、これに制限されない。
【００２８】
具体的には、本発明のポリヌクレオチドはコドンの縮退性（degeneracy）により、または前記ポリペプチドを発現させようとする生物で好まれるコドンを考慮して、ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させない範囲内でコーディング領域に多様な変形が行われる。配列番号２のアミノ酸配列から８５番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異型アデニロコハク酸シンテターゼをコードするポリヌクレオチド配列であれば、制限なく含んでもよい。
【００２９】
また、公知の遺伝子配列から調製されうるプローブ、例えば、前記塩基配列の全体または一部に対する相補配列と厳格な条件下でハイブリッド化して、配列番号２のアミノ酸配列から８５番目アミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異型アデニロコハク酸シンテターゼ活性を有するタンパク質をコードする配列であれば、制限なく含まれてもよい。前記「厳しい条件（ストリンジェントな条件：stringent condition）」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリッド化を可能にする条件を意味する。これらの条件は、文献（例えば、J. Sambrook et al., 同上）に具体的に記載されている。例えば、相同性または同一性が高い遺伝子同士、４０％以上、具体的には、９０％以上、より具体的には、９５％以上、さらに具体的には、９７％以上、特に具体的には、９９％以上の相同性または同一性を有する遺伝子同士でハイブリッド化し、それより相同性または同一性が低い遺伝子同士はハイブリッド化しない条件、または通常のサザンハイブリッド化（southern hybridization）の洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ 、０．１％ＳＤＳ、具体的には、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度で、１回、具体的には、２回〜３回洗浄する条件を挙げられる。
ハイブリッド化は、たとえハイブリダイゼーションの厳密度に応じて塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能であっても、２つの核酸が相補的配列を有することを要求する。用語、「相補的」は、互いにハイブリッド化が可能なヌクレオチド塩基間の関係を記述するために用いられる。例えば、ＤＮＡに関するとアデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、本発明は、また、実質的に類似の核酸配列だけでなく、全体配列に相補的な単離された核酸断片を含んでもよい。
具体的には、相同性または同一性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリダイゼーション段階を含むハイブリッド化条件を用い、上述した条件を用いて探知してもよい。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃または６５℃であってもよいが、これに制限されるものではなく、その目的に応じて当業者によって適切に調節されてもよい。
ポリヌクレオチドをハイブリッド化する適切な厳密度は、ポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は該当技術分野でよく知られている（非特許文献８参照）。
本発明で変異型アデニロコハク酸シンテターゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子は、ｐｕｒＡ遺伝子であり、これをコードするポリヌクレオチドに関する説明は、前述した通りである。
本発明で変異型アデニロコハク酸シンテターゼをコードするポリヌクレオチドも、先に説明した通りである。
本明細書で使用する用語、「ベクター」は、適切な宿主内で目的のポリペプチドを発現できるように、適切な調節配列に作動可能に連結された前記目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。前記調節配列は、転写を開始しうるプロモーター、このような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含んでもよい。ベクターは、適切な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムとは無関係に複製または機能することができ、ゲノムそのものに統合されてもよい。
【００３０】
本発明で用いられるベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば、特に限定されず、当業界に知られている任意のベクターを用いてもよい。通常用いられるベクターの例としては、天然の状態であるか、組換えされた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとしてｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ4、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いてもよく、プラスミドベクターとしてｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系とｐＥＴ系などを用いてもよい。具体的には、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いてもよい。
一例として、細胞内の染色体挿入用ベクターを使用して、染色体に目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを染色体内に挿入してもよい。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界で知られている任意の方法、例えば、相同組換え（homologous recombination）によって行われてもよいが、これに限定されない。前記染色体が挿入されたかどうかを確認するための選別マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。選別マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選別、すなわち、目的核酸分子が挿入されたかどうかを確認するためのものであり、薬剤耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面ポリペプチドの発現のような選択可能な表現型を付与するマーカーがもちいられてもよい。選択剤（selective agent）が処理された環境では、選別マーカーを発現する細胞のみ生存するか、他の表現形質を示すので、形質転換された細胞を選別することができる。
【００３１】
本発明のもう一つの様態として、本発明は、前記変異型アデニロコハク酸シンテターゼを含むか、これをコードするポリヌクレオチドを含んでプリンヌクレオチドを生産する微生物を提供することにある。具体的には、前記変異型アデニロコハク酸シンテターゼ及び/またはこれをコードするポリヌクレオチドを含む微生物は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換されて製造される微生物であってもよいが、これに制限されない。
【００３２】
本明細書において、用語、「形質転換」は、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入して、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは宿主細胞内で発現することさえできれば、宿主細胞の染色体内に挿入され位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、これらをすべて含んでもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡ及びＲＮＡを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、あらゆる形態で導入されるものであっても構わない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、それ自体で発現されるのに必要なすべての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されてもよい。前記発現カセットは、通常、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含んでもよい。前記発現カセットは、それ自体の複製が可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入されて宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよく、これに限定されない。
また、前記で用語、「作動可能に連結された」ものとは、本発明の目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するようなプロモーター配列と前記遺伝子配列が機能的に連結されていることを意味する。
【００３３】
本明細書で使用される用語、「変異型ポリペプチドを含む微生物」または「変異型アデニロコハク酸シンテターゼを含む微生物」とは、自然的に弱いＩＭＰまたはＸＭＰの生産能を有している微生物、またはＩＭＰまたはＸＭＰの生産能のない親菌株にＩＭＰまたはＸＭＰの生産能が付与された微生物を意味する。具体的には、前記微生物は、配列番号２のアミノ酸配列内に１つ以上のアミノ酸変異を含む変異型アデニロコハク酸シンテターゼを発現する微生物であって、前記アミノ酸変異は、Ｎ末端から８５番目のアミノ酸が他のアミノ酸への置換を含んでもよい。また、前記微生物は、配列番号２のアミノ酸配列から８５番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換され、アデニロコハク酸シンテターゼの活性を有する、変異型ポリペプチドを発現する微生物であってもよいが、これに制限されない。
前記微生物は、変異型アデニロコハク酸シンテターゼをコードするポリヌクレオチドを含むか、または変異型アデニロコハク酸シンテターゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換されて、変異型アデニロコハク酸シンテターゼが発現できる細胞または微生物であって、本発明の目的上、前記宿主細胞または微生物は、前記変異型アデニロコハク酸シンテターゼを含み、プリンヌクレオチドを生成することができる微生物であれば、すべて可能である。
【００３４】
本発明で、前記プリンヌクレオチドを生産する微生物は、プリンヌクレオチドを生産する微生物、プリンヌクレオチドの生産能を有する微生物と混用して使用してもよい。
本発明の目的上、「プリンヌクレオチド」は、プリン系の構造を含んでいるヌクレオチドを意味する。その例として、ＩＭＰ、またはＸＭＰであってもよいが、これに制限されない。
本明細書において、用語、「プリンヌクレオチドを生産する微生物」は、野生型微生物や自然的または人為的に遺伝的変形が起きた微生物をすべて含み、外部遺伝子が挿入されたり、内在的遺伝子の活性が強化されたり不活性化されるなどの原因により特定メカニズムが弱化されたり強化された微生物であって、目的とするプリンヌクレオチドの生産のために、遺伝的変異が起きたり活性を強化させた微生物であってもよい。本発明の目的上、前記プリンヌクレオチドを生産する微生物は、前記変異型アデニロコハク酸シンテターゼを含み、目的とするプリンヌクレオチドの生産能が増加したことを特徴とし、具体的には、コリネバクテリウム属微生物であってもよい。具体的には、本発明でプリンヌクレオチドを生産する微生物またはプリンヌクレオチドの生産能を有する微生物は、プリンヌクレオチド生合成経路内の遺伝子の一部が強化または弱化されるか、プリンヌクレオチド分解経路内の遺伝子の一部が強化または弱化された微生物であってもよい。例えば、前記微生物は、ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼ（phosphoribosylpyrophosphate amidotransferase）をコードする遺伝子であるｐｕｒＦの発現が強化されるか、ＩＭＰ分解経路に該当する５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼ（inosine-5'-monophosphate dehydrogenase）をコードする遺伝子であるｇｕａＢの発現が弱化された微生物であってもよいが、これに制限されない。
【００３５】
本明細書において、用語、「プリンヌクレオチドを生産するコリネバクテリウム属（the genus Corynebacterium）微生物」とは、天然型または変異を介してプリンヌクレオチドの生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を意味する。具体的には、本発明でプリンヌクレオチドの生産能を有するコリネバクテリウム属微生物とは、アデニロコハク酸シンテターゼをコードする遺伝子であるｐｕｒＡの活性を強化させたり弱化させて向上されたプリンヌクレオチドの生産能を有するようになったコリネバクテリウム属微生物であってもよい。より具体的には、本発明でプリンヌクレオチドの生産能を有するコリネバクテリウム属微生物は、本発明の変異型アデニロコハク酸シンテターゼまたはこれをコードするポリヌクレオチドを含むか、または前記変異型アデニロコハク酸シンテターゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換されて、向上されたプリンヌクレオチドの生産能を有するようになったコリネバクテリウム属微生物であってもよい。前記「向上されたプリンヌクレオチドの生産能を有するようになったコリネバクテリウム属微生物」は、形質変化前の親菌株または非変形微生物より、プリンヌクレオチドの生産能が向上された微生物を意味する。前記「非変形微生物」は、天然型菌株自体であるか、前記プリンヌクレオチドを生産するタンパク質変異体を含まない微生物、または前記変異型アデニロコハク酸シンテターゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換されていない微生物を意味する。
【００３６】
本発明において、「コリネバクテリウム属微生物」は、具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、 ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）などであるが、必ずこれに限定されるものではない。
本発明のもう一つの様態として、前記プリンヌクレオチドを生産するコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階；及び前記微生物または培地でプリンヌクレオチドを回収する段階を含む、プリンヌクレオチドの製造方法を提供する。
前記方法において、前記微生物を培養する段階は、特に制限されないが、公知の回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法などにより行われてもよい。このとき、培養条件は、特に制限されないが、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア）または酸性化合物（例えば、リン酸または硫酸）を用いて適正ｐＨ（例えば、ｐＨ５〜９、具体的には、ｐＨ６〜８、最も具体的には、ｐＨ６．８）を調節してもよく、酸素または酸素含有ガス混合物を培養物に導入させて好気性条件を維持してもよい。培養温度は２０〜４５℃、具体的には、２５〜４０℃を維持してもよく、約１０〜１６０時間培養してもよいが、これに制限されるものではない。前記培養によって生産された５’−イノシン酸は、培地中に分泌されるか細胞内に残留しうる。
【００３７】
また、用いられる培養用培地は、炭素供給源としては、糖及び炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、でん粉及びセルロース）、油及び脂肪（例えば、大豆油、ヒマワリ油、ピーナッツ油及びココナッツ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸）、アルコール（例えば、グリセロール及びエタノール）及び有機酸（例えば、酢酸）などを個別に用いたり、または混合して用いてもよいが、これに制限されない。窒素供給源としては、窒素含有有機化合物（例えば、ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆粕粉及びウレア）、または無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム）などを個別に用いたり、または混合して用いてもよいが、これに制限されない。リン供給源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、これに相応するナトリウム含有塩などを個別に用いたり、または混合して用いてもよいが、これに制限されない。また、培地には他の金属塩（例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄）、アミノ酸及びビタミンのような必須成長促進物質を含んでもよい。
本発明の前記培養段階で生産されたプリンヌクレオチドを回収する方法は、培養方法によって当該分野で公知の適切な方法を用いて、培養液から目的とするプリンヌクレオチドを収集（collect）してもよい。例えば、遠心分離、ろ過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化及びＨＰＬＣなどが用いられてもよく、当該分野で公知の適切な方法を用いて培地または微生物から目的とするプリンヌクレオチドを回収してもよい。
また、前記回収段階は、精製工程を含んでもよく、当該分野で公知の適切な方法を用いて行ってもよい。したがって、前記回収されたプリンヌクレオチドは、精製された形態またはプリンヌクレオチドを含有した微生物発酵液であってもよい（非特許文献９）。
【００３８】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されるものではなく、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
【００３９】
実施例１：野生型基盤のＩＭＰ生産株の製作
コリネバクテリウム属野生型の菌株は、ＩＭＰを生産できないか、ＩＭＰを生産しても非常に極微量を生産することができる。したがって、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）ＡＴＣＣ６８７２を基にＩＭＰ生産株を製作した。より具体的には、プリン生合成酵素の一番目であるホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼをコードする遺伝子であるｐｕｒＦの活性を強化させて、ＩＭＰの分解経路に該当する５’−イノシン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であるｇｕａＢ 活性を弱化させたＩＭＰ生産菌株を製造した。
【００４０】
実施例１−１：ｐｕｒＦ強化菌株の製作
ｐｕｒＦの開始コドンが変更された菌株を製作するために、配列番号３のｐｕｒＦが含まれた挿入用ベクターを製作した。挿入用ベクターにｐｕｒＦ遺伝子をクローニングするために、具体的に、ＰＣＲは、コリネバクテリウム・スタティオニスＡＴＣＣ６８７２の染色体を鋳型として、配列番号４と５及び配列番号６と７のプライマーを用いて行い、９４℃で３０秒の変性（denaturation）、５５℃で３０秒のアニーリング（annealing）、及び７２℃で２分の伸長（extension）過程を３０回繰り返した。前記ＰＣＲ反応で獲得した２つのＤＮＡ切片を鋳型として、配列番号４と７をプライマーとして再びＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９４℃で３０秒の変性（denaturation）、５５℃で３０秒のアニーリング（annealing）、及び７２℃で２分の伸長（extension）過程を３０回繰り返して行い 、得られたＤＮＡ断片をＸｂａＩで切断した後、同じ制限酵素で切断された（ｐＤＺ（特許文献１及び２））ベクターにクローニングした。前記方法で製作されたベクターをｐＤＺ−ｐｕｒＦ−ｇ１ａと命名した。
【００４１】
【表１】
0006805353.tif 000002
【００４２】
コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）ＡＴＣＣ６８７２に組換えベクターであるｐＤＺ−ｐｕｒＦ−ｇ１ａを電気穿孔法（electroporation）で形質転換した後、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株はカナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／ｌを含有した培地から選別した。選別された１次菌株は再び２次交差を経て、選定された菌株でシーケンシングを行い、最終的に変異が導入された菌株を選別し、これはＡＴＣＣ６８７２：：ｐｕｒＦ（ｇ１ａ）菌株と命名した。
【００４３】
実施例１−２：ｇｕａＢ弱化菌株の製作
ｇｕａＢの開始コドンが変更された菌株を製作するために、配列番号８のｇｕａＢが含まれた挿入用ベクターを製作した。挿入用ベクターにｇｕａＢ遺伝子をクローニングするために、具体的に、ＰＣＲは、コリネバクテリウム・スタティオニスＡＴＣＣ６８７２の染色体を鋳型として、配列番号９と１０及び配列番号１１と１２のプライマーを用いて行い、前記ＰＣＲ産物を鋳型として配列番号９と１２をプライマーに再びＰＣＲを行い、得られた断片を実施例１−１と同様にクローニングを進めた。製作されたベクターをｐＤＺ−ｇｕａＢ−ａ１ｔと命名した。これを同様の方法でＡＴＣＣ６８７２：：ｐｕｒＦ（ｇ１ａ）に導入し、最終的に変異が導入された菌株を選別した。
最終的に選別された野生型コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）ＡＴＣＣ６８７２基盤のＩＭＰ生産菌株をＣＪＩ２３３０と命名した。
【００４４】
【表２】
0006805353.tif 000003
【００４５】
実施例１−３：ＣＪＩ２３３０の発酵力価の実験
種培地２ｍｌを直径１８ｍｍの試験管に分注して加圧殺菌した後、ＡＴＣＣ６８７２及びＣＪＩ２３３０をそれぞれ接種して３０℃の温度で２４時間振とう培養し、これを種培養液として用いた。発酵培地２９ｍｌを２５０ｍｌの振とう用三角フラスコに分注して１２１℃の温度で１５分間加圧殺菌した後、種培養液２ｍｌを接種して３日間培養した。培養条件は、回転数１７０ｒｐｍ、温度３０℃、ｐＨ７．５に調節した。
培養終了後、ＨＰＬＣ（SHIMAZDU LC20A）を用いた方法によりＩＭＰの生産量を測定し、培養結果は以下の表３の通りである。下記のような結果は、ｐｕｒＦ強化及びｇｕａＢを弱化させた菌株がＩＭＰの生産能を有することを示唆する。
【００４６】
【表３】
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【００４７】
−種培地：ぶどう糖１％、ペプトン１％、肉汁１％、酵母エキス１％、塩化ナトリウム０．２５％、アデニン１００ｍｇ／ｌ、グアニン１００ｍｇ／ｌ、ｐＨ７．５
−発酵培地：グルタミン酸ナトリウム０．１％、塩化アンモニウム１％、硫酸マグネシウム１．２％、塩化カルシウム０．０１％、硫酸鉄２０ｍｇ／ｌ、硫酸マンガン２０ｍｇ／ｌ、硫酸亜鉛２０ｍｇ／ｌ、硫酸銅５ｍｇ／ｌ、Ｌ−システイン２３ｍｇ／ｌ、アラニン２４ｍｇ／ｌ、ニコチン酸８ｍｇ／ｌ、ビオチン４５μｇ／ｌ、チアミン塩酸５ｍｇ／ｌ、アデニン３０ｍｇ／ｌ、リン酸（８５％）１．９％、ぶどう糖２．５５％、果糖１．４５％になるように添加して用いた。
【００４８】
実施例２：アデニロコハク酸シンテターゼ弱化変異体の製造
プリンヌクレオチドの生産能を向上させるアデニロコハク酸シンテターゼ変異を発掘するために、これをコードする遺伝子であるｐｕｒＡの変異ライブラリを製作した。
【００４９】
実施例２−１： ｐｕｒＡを含むベクターの製作
ｐｕｒＡ変異ライブラリを製作するために、まずｐｕｒＡを含む組換えベクターを製作した。ＰＣＲは、コリネバクテリウム・スタティオニスＡＴＣＣ６８７２の染色体を鋳型として、配列番号１３及び配列番号１４のプライマーを用いて行い、前記増幅産物をＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Invitrogen）を用いて大腸菌ベクターｐＣＲ２．１にクローニングしてＰＣＲ−ｐｕｒＡを得た。
【００５０】
【表４】
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【００５１】
実施例２−２：ｐｕｒＡ変異ライブラリの製作
前記実施例２−１で製作したベクターを基にｐｕｒＡ変異ライブラリを製作した。ライブラリは、ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ ｋｉｔ（clontech DiversifyTMPCR Random Mutagenesis Kit）を用いて製作した。変異が発生しうる条件で、配列番号１５及び配列番号１６をプライマーとしてＰＣＲ反応を行った。具体的には、１０００ｂｐ当たり０〜３つの変異が発生する条件で、９４℃で３０秒予熱した後、９４℃で３０秒、６８℃で１分３０秒の過程を２５回繰り返して行った。このとき得られたＰＣＲ産物をメガプライマー（５００〜１２５ｎｇ）とし、９５℃で５０秒、６０℃で５０秒、６８℃で１２分の過程を２５回繰り返した。その後、ＤｐｎＩ処理して大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を含むＬＢ固体培地に塗抹した。形質転換されたコロニーの０種を選別した後、プラスミドを獲得してポリヌクレオチド配列を分析した結果、２変異／ｋｂの頻度で互いに異なる位置に変異が導入されたことを確認した。約２０，０００個の形質転換された大腸菌コロニーを取ってプラスミドを抽出し、これをｐＴＯＰＯ−ｐｕｒＡ−ｌｉｂｒａｒｙと命名した。
【００５２】
【表５】
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【００５３】
実施例３：製作したライブラリの評価及び菌株の選別
実施例３−１：ライブラリの評価
前記実施例２−２で製作したｐＴＯＰＯ−ｐｕｒＡ−ｌｉｂｒａｒｙを実施例１で製作した菌株ＣＪＩ２３３０に電気穿孔法で形質転換した後、カナマイシン２５ｍｇ／ｌを含有した栄養培地に塗抹して変異遺伝子が挿入された菌株から１０，０００個のコロニーを確保し、各コロニーをＣＪＩ２３３０_ｐＴＯＰＯ_ｐｕｒＡ（ｍｔ）１からＣＪＩ２３３０_ｐＴＯＰＯ_ｐｕｒＡ（ｍｔ）１００００までと命名した。
−栄養培地：ペプトン１％、肉汁１％、塩化ナトリウム０．２５%、酵母エキス１％、寒天２%、ｐＨ７．２
【００５４】
確保された１０，０００個のコロニーをそれぞれ加圧殺菌した種培地２００μｌに接種した９６ディープウェルプレートを、マイクロプレート振とう機（Microplate shaker（TAITEC））を用いて３０℃の温度、１２００ｒｐｍで２４時間振とう培養し、種培養液として用いた。加圧殺菌した発酵培地２９０μｌを９６ディープウェルプレートに分注した後、種培養液２０μｌずつ接種し、前記条件と同様に７２時間振とう培養した。
培養液から生産された５’−イノシン酸の生産量を分析するために、培養終了後の培養上澄み液３μlを蒸留水が１９７μlずつ分注された９６ウェルＵＶプレートに移した。次に、マイクロプレートリーダー（MicroplateＲeader）を用いて３０秒間振とうし、２５℃、波長２７０ｎｍで分光光度計で吸光度を測定し、ＣＪＩ２３３０菌株の吸光度と比較して１０％以上増加した吸光度を示す５０個の変異菌株コロニーを選別した。その他のコロニーは対照区に比べて類似または減少した吸光度を示した。
【００５５】
選別された５０個の菌株は、前記と同様に吸光度を測定し、５’−イノシン酸の生産量を繰り返して行った。そして、ＣＪＩ２３３０菌株に比べて５’−イノシン酸の生産能が著しく向上された１種の菌株であるＣＪＩ２３３０：：ｐＴＯＰＯ_ｐｕｒＡ（ｍｔ）３３３を選別した。
選別された変異の有効性を検証するため、発酵力価の評価を行った。種培地２ｍｌを、直径１８ｍｍの試験管に分注して加圧殺菌した後、ＣＪＩ２３３０及びＣＪＩ２３３０：：ｐＴＯＰＯ_ｐｕｒＡ（ｍｔ）３３３をそれぞれ接種して３０℃の温度で２４時間振とう培養し、種培養液として用いた。発酵培地２９ｍｌを２５０ｍｌの振とう用三角フラスコに分注し、１２１℃の温度で１５分間加圧殺菌した後、種培養液２ｍｌを接種して３日間培養した。培養条件は、回転数１７０ｒｐｍ、温度３０℃、ｐＨ７．５に調節した。
培養終了後、ＨＰＬＣ（SHIMAZDU LC20A）を用いた方法によりＩＭＰの生産量を測定し、培養結果は以下の表６の通りである。
【００５６】
【表６】
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【００５７】
前記結果から分かるように、ＣＪＩ２３３０に比べてｐｕｒＡ変異を含んでいるベクターが導入された菌株でＩＭＰの量が約１２２％増加したことを確認した。これにより、ライブラリから選別された変異が有効であると判断した。
【００５８】
実施例３−２：ｐｕｒＡ変異の確認
前記突然変異菌株の遺伝子変異を確認するために、配列番号１７と１８のプライマーを用いてＣＪＩ２３３０：：ｐＴＯＰＯ_ｐｕｒＡ（ｍｔ）３３３の菌株においてＰＣＲを行い、シークエンシングを行い、ｐｕｒＡ遺伝子内にの変異を確認した。
【００５９】
【表７】
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【００６０】
具体的には、前記ＣＪＩ２３３０：：ｐＴＯＰＯ_ｐｕｒＡ（ｍｔ）３３３のｐｕｒＡ遺伝子は、配列番号２で表われるｐｕｒＡアミノ酸配列から８５番目のグリシンがセリンに置換された変異（２５３番目のヌクレオチドがｇからａに置換）を含んでいることを確認した。したがって、以下の実施例では、前記変異がそれぞれコリネバクテリウム属微生物のプリンヌクレオチド生成量に影響を与えるかを確認した。
【００６１】
実施例４：ＡＴＣＣ６８７２由来のＩＭＰ生産菌株におけるＩＭＰ生産能の確認
ＡＴＣＣ６８７２由来のＩＭＰ生産菌株を製作し、実施例３で確認した変異を導入してＩＭＰの生産能を確認した。
【００６２】
実施例４−１：ＡＴＣＣ６８７２由来のＩＭＰ生産菌株の選別
ＡＴＣＣ６８７２由来のＩＭＰ生産株を製作するために、ＡＴＣＣ６８７２をリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、またはクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）に１０７〜１０８細胞／ｍｌと懸濁させた。ここにＵＶ処理して、室温または３２℃で２０〜４０分間処理して突然変異を誘発させた。２回にかけて０．８５％食塩水で洗浄し、希釈した後、１．７％寒天を含有する適切な濃度の耐性付与物質を添加した最小培地上に塗抹した後、コロニーを得た。それぞれのコロニーを、栄養培地で培養し、種培地で２４時間培養した。発酵培地で３〜４日間培養した後、培養液に蓄積されたＩＭＰ生産量が最も優れたコロニーを選別した。高濃度ＩＭＰ生産株を製作するために、アデニン要求性、グアニン漏出型、リゾチーム感受性、３,４−ジヒドロプロリン耐性、ストレプトマイシン耐性、スルファグアニジン耐性、ノルバリン耐性、トリメトプリム耐性を付与するための前記過程をそれぞれの物質に対して順次行った。その結果、前記物質に対する耐性が付与されてＩＭＰ生産能の優れたＣＪＩ２３３２を最終選別した。表８にＡＴＣＣ６８７２に比べたＣＪＩ２３３２の耐性程度を比較して示した。
【００６３】
【表８】
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【００６４】
−最小培地：ぶどう糖２％、硫酸ナトリウム０．３％、リン酸第１カリウム０．１％、リン酸第二カリウム０．３％、硫酸マグネシウム０．３％、塩化カルシウム１０ｍｇ／ｌ、硫酸鉄１０ｍｇ／ｌ、硫酸亜鉛１ｍｇ／ｌ、塩化マンガン３．６ｍｇ／ｌ、Ｌ−システイン２０ｍｇ／ｌ、パントテン酸カルシウム１０ｍｇ／ｌ、チアミン塩酸塩５ｍｇ／ｌ、ビオチン３０μｇ／Ｌ、アデニン２０ｍｇ／ｌ、グアニン２０ｍｇ／ｌをｐＨ７．３になるように添加して用いた。
【００６５】
実施例４−２：ＣＪＩ２３３２の発酵力価の実験
種培地２ｍｌを直径１８ｍｍの試験管に分注して加圧殺菌した後、ＡＴＣＣ６８７２及びＣＪＩ２３３２をそれぞれ接種し、３０℃の温度で２４時間振とう培養し、これを種培養液として用いた。発酵培地２９ｍｌを２５０ｍｌの振とう用三角フラスコに分注して１２１℃の温度で１５分間加圧殺菌した後、種培養液２ｍｌを接種して３日間培養した。培養条件は、回転数１７０ｒｐｍ、温度３０℃、ｐＨ７．５に調節した。
培養終了後、ＨＰＬＣ（SHIMAZDU LC20A）を用いた方法によりＩＭＰの生産量を測定し、培養結果は以下の表９の通りである。
【００６６】
【表９】
0006805353.tif 000010
【００６７】
実施例４−３：ｐｕｒＡ変異を含む挿入ベクターの製作
前記実施例３で選別された変異を菌株に導入するために挿入用ベクターを製作した。ｐｕｒＡ（Ｇ８５Ｓ）変異導入用ベクターの製作過程は次の通りである。前記ＣＪＩ２３３０_ｐＴＯＰＯ_ｐｕｒＡ（ｍｔ）１３３を鋳型とし、配列番号１９と配列番号２０を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で５分間変性した後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を２０回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行った。その結果得られた遺伝子断片をそれぞれＸｂａＩで切断した。Ｔ４リガーゼを用いて前記遺伝子断片をＸｂａＩ制限酵素で切断した線状のｐＤＺベクターにクローニングし、ｐＤＺ−ｐｕｒＡ（Ｇ８５Ｓ）を製作した。
【００６８】
【表１０】
0006805353.tif 000011
【００６９】
実施例４−４：ＡＴＣＣ６８７２由来のＣＪＩ２３３０及びＣＪＩ２３３２菌株内変異体の導入及び評価
前記実施例１で製作した野生型由来のＩＭＰ生産菌株であるＣＪＩ２３３０と実施例４−１で選別された菌株であるＣＪＩ２３３２にｐｕｒＡ変異を導入してＩＭＰ生産量を評価した。ＣＪＩ２３３２菌株のｐｕｒＡ遺伝子内に変異が含まれているかどうかを確認するために、ＣＪＩ２３３２の染色体ＤＮＡをＰＣＲを用いて増幅した。具体的には、まず、前記ＣＪＩ２３３２の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号１７と１８のプライマーを用いて、９４℃で１分、５８℃で３０秒、７２℃で２分間Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼで重合する条件を２８回繰り返すＰＣＲ方法を通じて、ｐｕｒＡ断片を増幅した。また、これを同じプライマーで塩基配列を分析した結果、ＣＪＩ２３３２菌株のｐｕｒＡ遺伝子には変異がないことを確認した。
その後、ｐＤＺ−ｐｕｒＡ（Ｇ８５Ｓ）のベクターをＣＪＩ２３３０とＣＪＩ２３３２に形質転換して、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有した培地から選別した。選別された１次菌株は再び２次交差（cross-over）を経て、目標遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に形質転換された菌株に遺伝子変異が導入されたかどうかは、配列番号１７と配列番号１８のプライマーを用いてＰＣＲを行って塩基配列を分析することにより、菌株内に変異が導入されたことを確認した。製作された菌株は、ＣＪＩ２３３０：：ｐｕｒＡ（Ｇ８５Ｓ）、ＣＪＩ２３３２：：ｐｕｒＡ（Ｇ８５Ｓ）と命名した。
それぞれのＣＪＩ２３３０、ＣＪＩ２３３２、ＣＪＩ２３３０：：ｐｕｒＡ（Ｇ８５Ｓ）、及びＣＪＩ２３３２：：ｐｕｒＡ（Ｇ８５Ｓ）菌株のＩＭＰ生産能を評価した。培養終了後、ＨＰＬＣを用いた方法でＩＭＰの生産量を測定し、培養結果は以下の表１１の通りである。
【００７０】
【表１１】
0006805353.tif 000012
【００７１】
前記結果から、野生型ＡＴＣＣ６８７２由来のＩＭＰ生産菌株ＣＪＩ２３３０及びＣＪＩ２３３２菌株に比べて、ｐｕｒＡ変異が導入された菌株の場合、ＩＭＰの生産量がそれぞれ約１２２％、１１６％増加したことを確認した。
前記ＣＪＩ２３３２はブダペスト条約下の受託機関である韓国微生物保存センターに２０１８年６月２２日付で寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１２２７７Ｐを与えられた。また、前記製作されたＣＪＩ２３３２：：ｐｕｒＡ（Ｇ８５Ｓ）菌株はＣＪＩ２３４８と呼ばれており、これをブダペスト条約下の受託機関である韓国微生物保存センターに２０１８年６月２２日付で寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１２２８０Ｐを与えられた。
【００７２】
実施例５：ｐｕｒＡ変異の５’−キサンチル酸生産能の確認
実施例５−１：ＡＴＣＣ６８７２由来のＸＭＰ生産菌株の選別
ＡＴＣＣ６８７２由来のＸＭＰ（5'-xanthosine monophosphate）生産株を作製するために、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）ＡＴＣＣ６８７２をリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、またはクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）に１０７〜１０８細胞／ｍｌと懸濁させた。ここにＵＶ処理して、室温または３２℃で２０〜４０分間処理して突然変異を誘発させた。２回にかけて０．８５％食塩水で洗浄し、１．７％寒天を含有した最小培地に耐性を付与しようとする物質を適正濃度に含有した培地に希釈して塗抹した後、コロニーを得た。それぞれのコロニーを、栄養培地で培養し、種培地で２４時間培養した。発酵培地で３〜４日間培養した後、培養液に蓄積されたＸＭＰの生産量が最も優れたコロニーを選別した。具体的には、フルオロトリプトファンが濃度別に添加された培地（添加培地）で生育できる変異株の中から選別し、より具体的には、フルオロトリプトファンの濃度１００ｍｇ／Ｌでも生育する５’−キサンチル酸の濃度が向上された菌株を選別した。選別された菌株は、ＣＪＸ１６６４と命名された。
- 最小培地：ぶどう糖２０ｇ／ｌ、リン酸第１カリウム１ｇ／ｌ、リン酸第２カリウム１ｇ／ｌ、ウレア２ｇ／ｌ、硫酸アンモニウム、３ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム１ｇ／ｌ、塩化カルシウム１００ｍｇ／ｌ、硫酸鉄２０ｍｇ／ｌ、硫酸マンガン１０ｍｇ／ｌ、硫酸亜鉛１０ｍｇ／ｌ、ビオチン３０μｇ／ｌ、チアミン塩酸塩０．１ｍｇ／ｌ、硫酸銅０．８ｍｇ／ｌ、アデニン２０ｍｇ／ｌ、グアニン２０ｍｇ／ｌ、ｐＨ７．２
- 添加培地：最小培地にフルオロトリプトファン１０、２０、５０、７０、１００、２００ｍｇ／ｌを添加した培地
前記ＣＪＸ１６６４の生化学的特性は、下記表１２に示した。表１２を参照すれば、前記ＣＪＸ１６６４は１００ｍｇ／ｌ濃度のフルオロトリプトファン添加培地でも生育可能である。
【００７３】
【表１２】
0006805353.tif 000013
【００７４】
実施例５−２：ＣＪＸ１６６４発酵力価の実験
種培地２ｍｌを直径１８ｍｍの試験管に分注し、加熱殺菌した後、ＡＴＣＣ６８７２及びＣＪＸ１６６４をそれぞれ接種して３０℃の温度で２４時間振とう培養し、これを種培養液として用いた。発酵培地２９ｍｌを２５０ｍｌの振とう用三角フラスコに分注し、１２１℃の温度で１５分間加圧殺菌した後、種培養液２ｍｌを接種して３日間培養した。培養条件は、回転数１７０ｒｐｍ、温度３０℃、ｐＨ７．５に調節した。
培養終了後、ＨＰＬＣ（SHIMAZDU LC20A）を用いた方法によりＸＭＰの生産量を測定し、培養結果は以下の表１３の通りである。
【００７５】
【表１３】
0006805353.tif 000014
【００７６】
実施例５−３：ＣＪＸ１６６４菌株内に変異体の導入及び評価
前記実施例５−１で選別したＣＪＸ１６６４菌株がｐｕｒＡ遺伝子の変異を含んでいるかどうかを確認するために、ＣＪＸ１６６４の染色体ＤＮＡをＰＣＲを用いて増幅した。具体的には、まず、前記ＣＪＸ１６６４の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号１７と配列番号１８のプライマーを用いて、９４℃で１分の変性、５８℃で３０秒の結合、７２℃で２分間のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼで重合する条件を２８回繰り返すＰＣＲ方法を通じて、ｐｕｒＡ断片を増幅した。また、これを同じプライマーで塩基配列を分析した結果、ＣＪＸ１６６４菌株のｐｕｒＡ遺伝子には変異がないことを確認した。
前記実施例４−３で製作したベクターをＣＪＸ１６４４に形質転換し、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有した培地から選別した。選別された１次菌株は再び２次交差（cross-over）を経て、目標遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に形質転換された菌株に遺伝子変異が導入されたかどうかは、塩基配列を分析して確認した。
前記ＣＪＸ１６６４及びＣＪＸ１６６４：：ｐｕｒＡ（Ｇ８５Ｓ）菌株のＸＭＰ生産能を評価した。培養終了後、ＨＰＬＣを用いた方法によりＸＭＰの生産量を測定し、培養結果は以下の表１４の通りである。
【００７７】
【表１４】
0006805353.tif 000015
【００７８】
前記表１４のように、ＣＪＸ１６６４：：ｐｕｒＡ（Ｇ８５Ｓ）菌株は、ＡＴＣＣ６８７２基盤ＸＭＰ生産菌株であるＣＪＸ１６６４に比べて、ＸＭＰの生産量が約１０９％増加したことを確認した。
前記ＣＪＸ１６６４は、ブダペスト条約下の受託機関である韓国微生物保存センターに２０１８年７月６日付で寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１２２８５Ｐを与えられた。また、前記製作されたＣＪＸ１６６４：：ｐｕｒＡ（Ｇ８５Ｓ）菌株は、ＣＪＸ１６６５と呼ばれて、これをブダペスト条約下の受託機関である韓国微生物保存センターに２０１８年７月６日付で寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１２２８６Ｐを与えられた。
【００７９】
実施例６：ｐｕｒＡ変異のアミノ酸を他のアミノ酸に置換
実施例６−１：ｐｕｒＡ変異アミノ酸置換の挿入用ベクターの製作
前記実施例を介してｐｕｒＡ（Ｇ８５Ｓ）の変異はプリンヌクレオチドの生産能を向上させうるという点を確認した。それで、ｐｕｒＡ変異の位置的重要性を確認するために、８５番目のアミノ酸を他のアミノ酸に置換するベクターを製作し、プリンヌクレオチドの生産能に影響を与えるかどうかを確認した。ｐｕｒＡ（Ｇ８５Ｓ）変異導入用ベクターの製作過程は次の通りである。前記実施例４で製作されたｐＤＺ−ｐｕｒＡ（Ｇ８５Ｓ）のベクターをバックボーンとして、位置選択的突然変異（Site-directed mutagenesis）を行った。具体的には、表１５の配列をプライマーとして用い、ＰＣＲを行った。この時、９４℃で３０秒の変性（denaturation）、５５℃で３０秒のアニーリング（annealing）、及び６８℃で１２分の伸長（extension）過程を含み、前記過程は１８回繰り返した。その結果得られた産物をＤｐｎＩ処理した後、ＤＨ５αに形質転換して得られたコロニーを一般的に知られているプラスミド抽出法を用いてプラスミドを獲得し、獲得されたプラスミドの情報は表１５の通りである。
【００８０】
【表１５】
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【００８１】
【表１６】
0006805353.tif 000017
【００８２】
実施例６−２：ｐｕｒＡ変異体の変異位置によりアミノ酸が他のアミノ酸に置換された菌株の製作及び５’−イノシン酸生産能の比較
前記実施例６−１で製造した変異導入用のベクター１８種をそれぞれＣＪＩ２３３２に形質転換して、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／ｌを含有した培地から選別した。選別された１次菌株は再び２次交差（cross-over）を経て、目標遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に形質転換された菌株に遺伝子変異が導入されたかどうかは、配列番号１７と１８のプライマーを用いてＰＣＲを行い、塩基配列を分析して確認した。挿入された変異による菌株名は次の表１７の通りである。
【００８３】
【表１７】
0006805353.tif 000018
【００８４】
実施例１と同様の方法で培養して、５’−イノシン酸の濃度を分析した。
【００８５】
【表１８】
0006805353.tif 000019
【００８６】
前記表１８を参照すれば、ｐｕｒＡ遺伝子がコードするアミノ酸配列の８５番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたｐｕｒＡを含む菌株は、前記変異を含まない菌株に比べてＩＭＰ生産量が大きく変化することを確認した。つまり、ｐｕｒＡ遺伝子をコードするアミノ酸配列の８５番目のアミノ酸は、プリンヌクレオチドの生産における主要な変異位置であり、より具体的には、前記ｐｕｒＡ遺伝子がコードするアミノ酸配列の８５番目のアミノ酸が、セリン、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、チロシン、リジン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸に置換された場合、これを含む微生物のプリンヌクレオチド生産量が大幅に増加しうる。
【００８７】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施されうることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものと理解しなければならない。本発明の範囲は、前記詳細な説明より、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【配列表】
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