(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイドロゲル溶液、微生物含有溶液、培地、水相用の界面活性剤を混合して４成分混合溶液を調整した後、前記４成分混合溶液をオイル中に投入、撹拌してＷ／Ｏエマルジョンの形成を行う工程と、
前記エマルジョンを含有する溶液を撹拌しながら０℃以上４℃以下に冷却して、エマルジョンからハイドロゲル微粒子を作成する工程と、
前記ハイドロゲル微粒子を含有する溶液をさらに撹拌して、前記ハイドロゲル微粒子が５０個以上凝集した凝集体をオイル中に形成して凝集体含有溶液を作成する工程と、
前記凝集体含有溶液を所定の温度で所定の時間保持して、前記凝集体を構成する前記ハイドロゲル微粒子内で微生物を分離培養する分離培養工程と、を有することを特徴とする微生物の分離培養方法。
【請求項２】
前記ハイドロゲル微粒子の径が、１μｍ以上５０μｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載の微生物の分離培養方法。
【請求項３】
前記凝集体含有溶液を４℃以上７０℃以下、５００時間以下の条件で培養することを特徴とする請求項１又は２に記載の微生物の分離培養方法。
【請求項４】
前記Ｗ／Ｏエマルジョンの形成を行う工程及びハイドロゲル微粒子を作成する工程では１０００ｒｐｍ以上で溶液を撹拌し、
前記凝集体含有溶液を作成する工程及び分離培養工程では４００ｒｐｍ以下で溶液を撹拌することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の微生物の分離培養方法。
【請求項５】
前記ハイドロゲル微粒子一つに対し微生物が一以下となる濃度となるように、前記微生物含有溶液と前記ハイドロゲル溶液とを調製する工程をさらに有することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の微生物の分離培養方法。
【請求項６】
微生物を分離培養したハイドロゲル微粒子を含む凝集体含有溶液に水を添加後、撹拌放置して、水相とオイル相の２相からなる２相溶液を作成し、さらに遠心分離して微小ゲル粒子を回収する微小ゲル粒子回収工程と、
前記２相溶液の水相の一部を寒天培地に含有させて、微生物を培養する工程とをさらに有することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の微生物の分離培養方法。
【請求項７】
微生物の分離培養に用いる凝集体溶液であって、
オイルと、前記オイル中に含有された凝集体を有し、
前記凝集体は、５０個以上のハイドロゲル微粒子が凝集されてなり、
前記ハイドロゲル微粒子が、径１μｍ以上５０μｍ以下であり、微生物、培地及び水相用の界面活性剤を含有することを特徴する凝集体含有溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の分離培養方法及び凝集体含有溶液に関する。特に、寒天培養法では分離培養が困難な難培養性微生物でさえ分離培養可能な微生物の分離培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
地球上には大量かつ膨大な種類の微生物（細菌・古細菌）が存在している。しかし、その多くは未知・未解明・未利用である。単一種類の微生物を獲得し、これを純粋培養する方法（以下、分離培養方法という。）は、１５０年前の技術に由来するが、これまでにさほど進展しておらず、環境中に存在する多くの微生物を分離培養できていない。
【０００３】
これまでに分離培養できたわずかな微生物からでさえ、人類はこれまでに多くの恩恵を受けた。例えば、市販されている医薬品の６〜７割は、微生物由来の化合物である。具体的には、アオカビの一種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）からＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬であるメバスタチンが発見されている（非特許文献１）。また、バクテリア（放線菌など）由来の化合物、例えば、タクロリムス（放線菌由来）も発見されている。そのため、従来法で分離培養できていない新種の難培養性微生物を発見できれば、医学・薬学・生物学の関連産業において有用なものとなる可能性がある。
【０００４】
従来法の代表的な一例として、平板培養法（以下、寒天培養法ともいう。）がある。図１は、寒天培養法の方法の一例を示す工程図及び写真である。図１（ａ）に示すように、まず、シャーレに寒天培地を設ける。次に、その表面に微生物を撒いてから、微生物を培養する。その結果、図１（ｂ）に示すように、コロニーが形成される。図１（ｃ）は、コロニーが形成された状態の一例を示す写真である。
【０００５】
この従来法では、実際に微生物が生息している環境中とは大きく異なる条件で培養を行うことになる。特に、植菌した１細胞を隔離する必要があり、植菌密度は１０３細胞／ｍｌを超えることはなく、環境中に比べると極めて低密度となる。そのため、環境中の多くの微生物を分離培養できないという問題がある。
【０００６】
別の一例として、限界希釈液体培養法がある。この方法では通常、植菌密度は１００細胞／ｍｌを超えることはなく、環境中に比べると極めて低密度となり、環境中の多くの微生物を分離培養できない。
【０００７】
また、近年、新たな分離培養方法が提案されている。その一例として、ｉｎ  ｓｉｔｕ（実環境中）分離培養方法がある。非特許文献２〜４には、膜を通じた外界との溶存物質のやり取り、微生物間相互作用を実現可能なデバイスを用いて、実環境中に培養装置を設置する分離培養手法（ｉｎ  ｓｉｔｕ  培養）が開示されている。しかし、実環境中に培養装置を設置し、環境中と同様な菌体密度を実現できるので、従来法よりは培養効率を高められるが、現場（実環境中）に設置しなければいけないという問題がある。また、従来法に比べ、操作が煩雑であるという問題もある。また、特許文献１は「微生物の単離培養方法及び培養キット」に関する。ゲル微粒子に包んだあと、環境中に投入して培養（ｉｎ  ｓｉｔｕ培養）する方法が記載されている。これも、従来法に比べ、操作が煩雑であるという問題もある。
【０００８】
別の一例として、ゲル微粒子を用いた培養方法がある。非特許文献５、６には、ゲル微粒子を微生物の培養に用いる方法が開示されている。この方法は、多数の菌株を同時に分離培養可能なハイスループット培養法であるとされている。しかし、この方法は、水相中（ハイドロゲル中）に分散させたゲル微粒子内で微生物を培養する構成なので、単位体積あたりの菌体密度を高くすることができず、環境中に比べると極めて低密度となる。そのため、環境中の多くの微生物を分離培養できない。特に、菌体密度依存的に増殖を開始する微生物を分離培養できない。
【０００９】
特許文献２は、「難培養性微生物の培養方法」に関する。無菌ウキクサ科植物の根に微生物を付着させ、液体培地にて培養させ、分離する方法が開示されている。この培養方法は、ウキクサの根付近に存在している微生物には環境模擬という観点から有効だが、その他の環境に生息している微生物に対しては理論的には効果がない。つまり、極めて限定された微生物に対してのみ有効な手法である。そのため、この培養方法は、一般性がないデメリットがある。
【００１０】
非特許文献７には、「Ｏｎ−ｃｈｉｐ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒを用いたＷａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌエマルション内への大腸菌封入とその培養〜単一種細菌単離の可能性〜」が開示されている。オイル相用の界面活性剤をエマルジョンに加えて、オイル相へのゲル微粒子の分散性を高めた構成について記載されている。この方法では、培養効率を高められない。
【００１１】
以上のように、これまでのところ、寒天培養法に替わる有効な微生物の分離培養方法はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２０１０−４１９６７号公報
【特許文献２】特開２００９−１９５１２４号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｅｎｄｏ  Ａ，Ｋｕｒｏｄａ  Ｍ，Ｔｓｕｊｉｔａ  Ｙ（１９７６）．"ＭＬ−２３６Ａ，ＭＬ−２３６Ｂ，ａｎｄ  ＭＬ−２３６Ｃ，ｎｅｗ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ"．Ｊ  Ａｎｔｉｂｉｏｔ  ２９（１２）：１３４６-１３４８．
【非特許文献２】Ｋａｅｂｅｒｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２，
【非特許文献３】Ａｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｅ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００９，
【非特許文献４】Ｓｉｚｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１２
【非特許文献５】Ｚｅｎｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００２、，
【非特許文献６】Ｍａｎｏｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＭＥＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔ．，２００１
【非特許文献７】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｎ−ｃｈｉｐ．ｃｏ．ｊｐ／ａｐｐ＿ｃａｔ／ａｐｐ０６／
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、微生物の分離培養効率を高めた微生物の分離培養方法及び凝集体含有溶液を提供することを課題とする。更に、難培養性微生物（新種）の分離培養効率を高めた微生物の分離培養方法及び凝集体含有溶液を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
以上の事情を鑑みて、本発明者は、寒天培養法で培養できない微生物が多く存在する理由を検討した。まず、これまでの多くの実験結果を検討して、従来法である寒天培養法では、一定の植菌密度以下の範囲であれば、植菌密度を高めれば、より多くの種類の微生物を分離して培養できたことより、本研究者は、細胞間相互作用を高めることによって、環境中の多くの微生物は細胞密度が低い条件では休眠状態に陥るが、細胞間相互作用によって休眠から覚醒し、増殖を開始し、培養効率を高められると仮定した。また、従来法では植菌密度を１０３細胞／ｍｌ以上に密度を高めると、増殖したいろんな種類の微生物同士が混在してしまい、純粋菌株（単一種類の微生物）を得ることが不可能になったが、細胞を隔離すれば、微生物同士の混在を抑止できると仮定した。これにより、従来法ではできなかった、植菌由来の微生物を混在させず、植菌密度を上げることができ、培養効率を高められつつ、多数の純粋菌株を得られるという仮説を立てた。
【００１６】
その仮説をもとに、試行錯誤した結果、本発明者は、「オイル相中で培地も含有させたゲル微粒子の凝集体を形成し、その凝集体のゲル微粒子の中で微生物を培養する」構成に想到した。実験を繰り返して、具体的な条件を試行錯誤した結果、「（１）オイル相中でハイドロゲル微粒子の凝集体を形成し、各ハイドロゲル微粒子内に微生物を隔離して格納することにより、隣接する微生物同士の接触をなくしたままで、細胞間相互作用を強めることができ、培養効率を高められること、（２）ハイドロゲル微粒子内に微生物を隔離して格納する構成により、水溶性物質の移動は制限されないため細胞間相互作用を強めることができること、（３）ハイドロゲル微粒子内に微生物を隔離して格納する凝集体を形成する構成により、単位体積あたりの菌体密度を環境中に匹敵するレベルまで高くすることができ、微生物が生育する環境を模擬できること、（４）凝集体をオイル中で形成する構成により、凝集体を安定保持できること、（５）水相用の界面活性剤のみを有し、オイル相用の界面活性剤を入れない構成により、各ゲル微粒子は分散せずにオイル中で凝集体を安定保持した状態で、ハイドロゲル微粒子内の微生物を培養できること、（６）ハイドロゲル微粒子内に微生物を隔離して格納する構成により、各微生物は各ハイドロゲル微粒子内にそれぞれ分離隔離され、各ハイドロゲル間で微生物の移動ができないので、各ハイドロゲル微粒子内で単一種類の微生物を純粋に分離培養することができること、（７）ハイドロゲル微粒子内に微生物を隔離して格納する凝集体内で微生物を培養する構成により、高いハイスループット性を実現でき、微生物の培養効率を高めることができること、（８）ハイドロゲル微粒子内に微生物を隔離して格納する凝集体内で微生物を培養する構成により、従来法では分離培養が困難であった難培養性微生物でも分離培養でき、新種の微生物の分離培養確率を高めることができること」を見出して、本発明を完成した。
【００１７】
本発明は、以下の構成を有することができる。
（１）    ハイドロゲル溶液、微生物含有溶液、培地、水相用の界面活性剤を混合して４成分混合溶液を調整してから、４成分混合溶液をオイル中に投入、撹拌してＷ／Ｏエマルジョンの形成を行う工程と、エマルジョンを含有する溶液を撹拌しながら０℃以上４℃以下に冷却して、エマルジョンからハイドロゲル微粒子を作成する工程と、ハイドロゲル微粒子を含有する溶液をさらに撹拌して、微生物、培地及び水相用の界面活性剤を含有したハイドロゲル微粒子が凝集してなる凝集体を、オイル中に含む凝集体含有溶液を作成する工程と、凝集体含有溶液を所定の温度で所定の時間保持して、ハイドロゲル微粒子内で微生物を分離培養する分離培養工程と、を有する微生物の分離培養方法。
【００１８】
（２）    ハイドロゲル微粒子の径が、１μｍ以上５０μｍ以下である（１）に記載の微生物の分離培養方法。
【００１９】
（３）    凝集体含有溶液を４℃以上７０℃以下、５００時間以下の条件で培養する（１）又は（２）に記載の微生物の分離培養方法。
【００２０】
（４）    Ｗ／Ｏエマルジョンの形成を行う工程及びハイドロゲル微粒子を作成する工程では１０００ｒｐｍ以上で溶液を撹拌し、凝集体含有溶液を作成する工程で及び分離培養工程では４００ｒｐｍ以下で溶液を撹拌する（１）〜（３）のいずれかに記載の微生物の分離培養方法。
【００２１】
（５）    ハイドロゲル溶液から形成するハイドロゲル微粒子一つに対し微生物が一以下となる濃度となるように、微生物含有溶液とハイドロゲル溶液を調製する工程とを有する（１）〜（４）のいずれかに記載の微生物の分離培養方法。
【００２２】
（６）    微生物を分離培養したハイドロゲル微粒子を含む凝集体含有溶液に水を添加後、撹拌放置して、水相とオイル相の２相からなる２相溶液を作成し、さらに遠心分離して微小ゲルを回収する微小ゲル回収工程と、２相溶液の水相の一部を寒天培地に含有させて、微生物を培養する工程を有する（１）〜（５）のいずれかに記載の微生物の分離培養方法。
【００２３】
（７）    オイルと、オイル中に含有された凝集体を有し、凝集体が、５０個以上のハイドロゲル微粒子が凝集されてなり、ハイドロゲル微粒子が、径１μｍ以上５０μｍ以下であり、微生物、培地及び水相用の界面活性剤を含有する凝集体含有溶液。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の微生物の分離培養方法によれば、各ハイドロゲル微粒子内に微生物を隔離して格納でき、隣接する微生物同士の接触をなくしたままで、細胞間相互作用を強めることができ、これにより培養効率を高めることができ、水溶性物質の移動は制限されないため細胞間相互作用を強めて、単位体積あたりの菌体密度を環境中に匹敵するレベルまで高くして、微生物が生育する環境を模擬でき、凝集体をオイル中で形成する構成により、凝集体を安定保持でき、水相用の界面活性剤のみを有し、オイル相用の界面活性剤を入れない構成により、オイル中で凝集体を安定保持した状態で、オイルの外部から隔離した状態であっても、ハイドロゲル微粒子内の微生物を培養でき、ハイドロゲル微粒子内に微生物を隔離して格納する構成により、各微生物は各ハイドロゲル微粒子内にそれぞれ分離隔離され、各ハイドロゲル間で微生物の移動ができないので、各ハイドロゲル微粒子内で単一種類の微生物を純粋に分離培養することができ、高いハイスループット性を実現でき、微生物の培養効率を高めることができ、従来法では分離培養が困難であった難培養性微生物でも分離培養でき、新種の微生物の分離培養確率を高めることができる。
【００２５】
本発明の凝集体含有溶液によれば、細胞間相互作用を強めて、各ハイドロゲル微粒子内で単一種類の微生物を純粋に分離培養することができ、微生物の分離培養効率及び未培養微生物（新種）の分離培養効率を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】寒天培養法の方法の一例を示す工程図及び写真である。
【図２】本発明の実施形態である微生物の分離培養方法の一例を示すフローチャート図である。
【図３】４成分（ハイドロゲル、培地、微生物サンプル、水溶性界面活性剤）を混合した後にオイルに入れた直後の状態の模式図（ａ）及び図３（ａ）のＡ部拡大図（ｂ）、エマルジョン１３３の模式図（ｃ）及び図３（ｃ）のＡＡ部拡大図（ｄ）である。
【００２７】
【図４】凝集体含有溶液の模式図（ａ）及び図４（ａ）のＢ部拡大図（ｂ）である。
【図５】図４（ｂ）のＣ部拡大図である。
【図６】内部で微生物を分離培養したハイドロゲル微粒子を含む凝集体含有溶液の模式図（ａ）及び図６（ａ）のＤ部拡大図（ｂ）である。
【図７】図６（ｂ）のＥ部拡大図である。
【図８】図７の部分拡大図であって、２つのハイドロゲル微粒子を示す図である。
【図９】内部で微生物を分離培養したハイドロゲル微粒子を含む凝集体含有溶液の模式図（ａ）と、遠心した後の２相溶液での模式図（ｂ）及びＦ部拡大図（ｃ）である。
【図１０】微小ゲル粒子形成直後の外観を示す写真である。
【図１１】培養開始から１５０時間経過時点の凝集体含有溶液の外観であって、培養中（凝集体形成）を示す写真である。
【図１２】培養開始から１５０時間経過時点での凝集体含有溶液の顕微鏡写真であり、５０μｍバースケール（ａ）と、２０μｍバースケール（ｂ）である。
【図１３】水中に分散したハイドロゲル微粒子と内部に形成したコロニーとを示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１４】水中に分散したハイドロゲル微粒子と内部に形成したコロニーとを示す微分干渉画像である。
【図１５】培養開始から１５０時間経過時点の培養効率の結果を示すグラフである。
【図１６】コロニー形成率の培養時間依存性の結果を示すグラフである。
【図１７】新種の割合の結果を示すグラフである。
【図１８】Ａｇａｒ  ｐｌａｔｉｎｇ（寒天平板法）で行ったＳｕｂ  ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎの結果を示す写真である。
【図１９】分散系と凝集系のコロニー形成率の培養時間依存性の比較結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
（本発明の実施形態）
以下、添付図面を参照しながら、本発明の実施形態である微生物の分離培養方法及び凝集体含有溶液について説明する。
【００２９】
＜微生物の分離培養方法＞
図２は、本発明の実施形態である微生物の分離培養方法の一例を示すフローチャート図である。図２に示すように、本発明の実施形態である微生物の分離培養方法は、Ｗ／Ｏエマルジョン形成工程Ｓ１と、ハイドロゲル微粒子作成工程Ｓ２と、凝集体含有溶液作成工程Ｓ３と、分離培養工程Ｓ４と、を有して、概略構成されている。
【００３０】
＜Ｗ／Ｏエマルジョン形成工程Ｓ１＞
Ｗ／Ｏエマルジョン形成工程は、ハイドロゲル溶液、微生物含有溶液、培地、水相用の界面活性剤を混合して室温で４成分混合溶液を調整してから、４成分混合溶液をオイル中に投入、激しく撹拌してＷ／Ｏエマルジョンの形成を行う工程である。
【００３１】
まず、ハイドロゲル溶液、微生物含有溶液、培地、水相用の界面活性剤を混合して、４成分混合溶液を調整する。次に、上記４成分混合溶液をオイル中に投入、激しく撹拌してＷ／Ｏエマルジョンの形成を行う。４０℃で５成分混合溶液を撹拌してＷ／Ｏエマルジョンの形成を行う。５成分混合溶液を激しく撹拌することにより、ハイドロゲル溶液から複数の微小な液滴を形成してＷ／Ｏエマルジョンを容易に形成できる。Ｗ／Ｏエマルジョンとは、油相の中に水相の小さな粒が分散している状態である。
【００３２】
この工程では、激しく撹拌することが好ましい。この工程では１０００ｒｐｍ以上で溶液を撹拌することが好ましく、２０００ｒｐｍ以上で溶液を撹拌することがより好ましい。
【００３３】
ハイドロゲルは、微生物を包埋可能でありその内部で増殖させることが可能であるハイドロゲルであればよい。例えば、アガロースゲル、アルギン酸ゲル、ゲランガムゲルまたはポリビニルアルコールの群から選択されるいずれか一の材料を挙げることができる。例えば、液状の低融点アガロースゲル（以下、Ｃｅｌｌ  Ｇｅｌと略記する。）がある。これらの材料は、微生物を内部に安定保持することができる。
【００３４】
オイルは、疎水性の液体であり、ハイドロゲル微粒子を作成可能なものであればよい。ミネラルオイル、シリコーンオイルまたはフッ素系オイルの群から選択されるいずれか一の材料を挙げることができる。これらの材料は、オイル中に凝集体を安定保持することができる。
【００３５】
培地は、微生物の培地として使用可能なものであればよい。例えば、ペプトン類、酵母エキス類またはグルコースの等を挙げることができる。例えば、培地として、最終濃度で０．３２ｇ／Ｌになるように、標準の１／２０希釈したＮＢ培地を挙げられる。これらの材料は、少量でも微生物を十分培養することができる。
【００３６】
水相用の界面活性剤は、非イオン性の水溶性界面活性剤である必要がある。エマルジョンの形成をスムーズにする働きがありゲル微粒子の粒径をそろえることができる。細胞毒性の観点からイオン性の界面活性剤ではない方が好ましい。また、非水溶性界面活性剤は、水相には溶解しないため適用できず、非水溶性界面活性剤をオイル相に添加することは凝集体の凝集性を低下させるので好ましくない。
【００３７】
まず、後工程でハイドロゲル溶液から形成するハイドロゲル微粒子一つに対し微生物が一以下となる濃度となるように、この工程で微生物含有溶液とハイドロゲル溶液を調整することが好ましい。これにより、隣接する微生物を一種ずつハイドロゲル微粒子内に隔離することができ、効率よく培養できる。
【００３８】
ハイドロゲル微粒子１つに対して植菌する微生物細胞数は１以下に制御することが好ましい。例えば、１０個のハイドロゲル微粒子に対して１つの細胞〜２個のハイドロゲル微粒子に対して１つの細胞となるように濃度を制御することがより好ましい。すなわち、細胞数／ハイドロゲル微粒子数＝１／１０から１／２となることがより好ましい。これにより、植菌時点の微生物が２細胞以上一つのゲル微粒子に含まれないようにできる。また、全体の植菌細胞密度が低くなりすぎないようにできる。
【００３９】
また、濃度条件の設定は、ゲル微粒子の平均粒径から産出したゲル微粒子１個あたりの容量から計算する。例えば、微生物含有溶液の調整では、微生物を含むサンプル媒体（微生物含有溶液）を所定量は図り取り、サンプル媒体中の微生物濃度を検出して、微生物量を適切な割合とした微生物含有溶液を調整する。これをもとに、ハイドロゲル溶液量を適切な割合としたハイドロゲル溶液を調整する。
【００４０】
サンプルは、河川水、土壌、バイオフィルム等である。土壌には、底泥を含む。河川水の場合、採取した河川水がサンプル媒体となり、土壌の場合、チューブに土と純水を入れたものが、サンプル媒体となる。
【００４１】
サンプル媒体に、通常、１〜１０分間、超音波をあててサンプル媒体とする。照射時間は、これに限られるものではい。
【００４２】
上澄み液を５μｍフィルターに通し、ろ液を微生物サンプルとして回収してから、その一部を取り出し、その中の微生物を染色後、顕微鏡観察により、サンプル中の微生物細胞数を算出して、微生物サンプル内の微生物濃度を算出する。
【００４３】
その後、例えば、サンプルの菌体濃度を１〜５×１０８ｃｅｌｌ／ｍｌに調整して、サンプル溶液を調整する。
この濃度をもとに、ハイドロゲル微粒子一つに対し一以下となるように微生物を包含させるようにハイドロゲル溶液を調整する。
【００４４】
図３は、４成分（ハイドロゲル、培地、微生物サンプル、水溶性界面活性剤）を混合した後にオイルに入れた直後の状態の模式図（ａ）及び図３（ａ）のＡ部拡大図（ｂ）、エマルジョン１３３の模式図（ｃ）及び図３（ｃ）のＡＡ部拡大図（ｄ）である。
【００４５】
図３（ａ）、（ｂ）では、キャップ１１で封止された試験管１０の内部で、４成分（ハイドロゲル、培地、微生物サンプル、水溶性界面活性剤）を混合した後にオイルに入れた直後の状態の一例を示している。この状態はエマルジョンの状態ではない。
【００４６】
図３（ｃ）は、エマルジョン１３３の模式図の一例であり、キャップ１１で封止された試験管１０の内部にエマルジョン１３が充填されている。
図３（ｄ）に示すように、エマルジョン１３は、オイル３１に分散されたハイドロゲル溶液３３からなり、ハイドロゲル溶液３３内には微生物群２０と培地３２と水相用の界面活性剤３４が分散されている。微生物群は微生物２１から２４からなるものとされている。オイル相に分散し、微生物細胞は増殖していない、ゲルはまだ固まっていない状態である。
【００４７】
＜ハイドロゲル微粒子作成工程Ｓ２＞
ハイドロゲル微作成工程Ｓ３は、エマルジョン溶液を撹拌しながら０℃以上４℃以下に冷却して、エマルジョン溶液からハイドロゲル微粒子を作成する工程である。エマルジョンの水相側（ハイドロゲル相）をゲル化させて微小ゲル微粒子を作成する。この工程でも、激しく撹拌することが好ましい。この工程では１０００ｒｐｍ以上で溶液を撹拌することが好ましい。
【００４８】
＜凝集体含有溶液作成工程Ｓ３＞
凝集体含有溶液作成工程Ｓ３は、ハイドロゲル微粒子を含有する溶液の撹拌速度を低速度にして、微生物、培地及び水相用の界面活性剤を含有したハイドロゲル微粒子が凝集してなる凝集体を、オイル中に含む凝集体含有溶液を作成する工程である。
この工程でも、撹拌することが好ましいが、エマルジョンを形成する工程及びハイドロゲル微粒子を形成する工程よりもゆるやかに（低速で）攪拌する。この工程では４００ｒｐｍ以下で溶液を撹拌することが好ましい。
【００４９】
エマルジョンを０℃以上４℃以下に冷却することにより、オイル中にハイドロゲル微粒子が凝集した凝集体を含む凝集体含有溶液を容易に作成できる。冷却速度は、−１℃／ｍｉｎ以上の速さで急冷することが好ましい。これにより、ハイドロゲル微粒子を容易に形成できる。
【００５０】
＜凝集体含有溶液＞
図４は、凝集体含有溶液の模式図（ａ）及び図４（ａ）のＢ部拡大図（ｂ）である。図４（ａ）では、キャップ１１で封止された試験管１０の内部に凝集体含有溶液１４が充填されている。図４（ｂ）に示すように、凝集体含有溶液１４は、オイル３１と、オイル３１中に含有された凝集体４１を有する。凝集体４１は、隣接するハイドロゲル微粒子４２が互いに接触するように形成されてなる。
【００５１】
凝集体４１は、５０個以上のハイドロゲル微粒子の凝集体であることが好ましい。これにより、凝集体を安定保持できる。
【００５２】
図５は、図４（ｂ）のＣ部拡大図である。図５に示すように、ハイドロゲル微粒子４２は、微生物２１〜２４、培地３２及び水相用の界面活性剤３４を有する。各ハイドロゲル微粒子４２には、単一種類の微生物２１〜２４が一つ以下となるように内包されている。
【００５３】
ハイドロゲル微粒子は、径１μｍ以上５０μｍ以下であることが好ましい。これにより、凝集性を高めることができる。
【００５４】
＜分離培養工程Ｓ４＞
分離培養工程Ｓ４は、凝集体含有溶液を所定の温度で所定の時間保持して、ハイドロゲル微粒子内で微生物を分離培養する工程である。
【００５５】
この工程でも、溶液を撹拌することが好ましい。この工程では４００ｒｐｍ以下で溶液を撹拌することが好ましい。これにより、凝集体の大きさを数百マイクロメートルから１ｍｍ程度の大きさに保ち、結果として粒子間の微生物の混在の割合を低下させつつ、培養させることができる。これにより、凝集体の大きさを適切に制御し、微生物の分離培養効率を高めることができる。
【００５６】
凝集体含有溶液の培養条件は特に限定されないが、例えば４℃以上７０℃以下、５００時間以下の条件で培養することが好ましい。これにより、この条件が培養に適した微生物を効率よく培養することができる。
【００５７】
図６は、内部で微生物を分離培養したハイドロゲル微粒子を含む凝集体含有溶液の模式図（ａ）及び図６（ａ）のＤ部拡大図（ｂ）である。図６（ａ）では、キャップ１１で封止された試験管１０の内部に内部で微生物を分離培養したハイドロゲル微粒子を含む凝集体含有溶液１５が充填されている。
【００５８】
図６（ｂ）に示すように、内部で微生物を分離培養したハイドロゲル微粒子を含む凝集体含有溶液１５は、オイル３１に分散された凝集体４１からなり、凝集体４１内にはハイドロゲル微粒子４２が凝集されている。
【００５９】
図７は、図６（ｂ）のＥ部拡大図である。隣接するハイドロゲル微粒子４２が互いに接触するように形成されてなる。各ハイドロゲル微粒子４２には、培養により増殖された微生物２１〜２４が種類ごとに内包されている。
【００６０】
図８は図７の部分拡大図であって、２つのハイドロゲル微粒子を示す図である。ハイドロゲル微粒子４２間は溶存物質４３、イオン４４は通過可能とされているが、微生物２２、２３は通過不可能とされている。そのため、微生物が一方から他方のハイドロゲル微粒子へ移動することがない。
【００６１】
分離培養工程Ｓ４の後工程として、微小ゲル粒子回収工程Ｓ５と、寒天培地表面での微生物培養工程Ｓ６とを備えていてもよい。これにより、細胞数を増加させることができ、その後の解析および利用が可能となる。
【００６２】
＜微小ゲル粒子回収工程Ｓ５＞
微小ゲル粒子回収工程Ｓ５は、内部で微生物を分離培養したハイドロゲル微粒子を含む凝集体含有溶液に、水を加えて、撹拌して、水相とオイル相の２相からなる２相溶液を作成、その後遠心分離することで微小ゲル粒子を水相に回収する工程である。内部で微生物を分離培養したハイドロゲル微粒子を含む凝集体含有溶液に、水を加えて、撹拌、その後遠心分離することにより、ハイドロゲル微粒子をオイル相から水相に移動させることができる。遠心後水相に内部で微生物を分離培養したハイドロゲル微粒子を回収・確保することができる。遠心分離の条件は１２０Ｇ、５分である。水を加えた後、遠心をしないとゲル微粒子は水相側に移動しない。
【００６３】
まず、各ハイドロゲル微粒子内で各微生物を分離培養した凝集体含有溶液に、水を加えて、撹拌して、水相とオイル相の２相からなる溶液（２相溶液）を作成する。
次に、水相を回収する。
【００６４】
図９は、内部で微生物を分離培養したハイドロゲル微粒子を含む凝集体含有溶液の模式図（ａ）と、遠心した後の２相溶液での模式図（ｂ）及びＦ部拡大図（ｃ）である。図９（ａ）では、キャップ１１で封止された試験管１０の内部に内部で微生物を分離培養したハイドロゲル微粒子を含む凝集体含有溶液１５が充填されている。図９（ｂ）では、キャップ１１で封止された試験管１０の内部に内部で遠心操作した後のオイル相３１と水相１６とからなる２相溶液が充填されている
図９（ｃ）は、図９（ｂ）のＦ部拡大図である。図９（ｃ）に示すように、内部で微生物を分離培養したハイドロゲル微粒子を含む凝集体含有溶液１５は、水相１６は、水５１内にハイドロゲル微粒子４２が分散されてなる。ハイドロゲル微粒子４２にはそれぞれ単一種類の微生物２１〜２４が内包されている。
【００６５】
＜寒天培地表面での微生物培養工程Ｓ６＞
寒天培地表面での微生物培養工程Ｓ６は、２相溶液の水相の一部を寒天培地に含有させて、微生物を培養する工程である。
【００６６】
まず、パーコール密度勾配遠心により、ハイドロゲル微粒子とハイドロゲル微粒子外に存在する菌体を分離し、洗浄されたハイドロゲル微粒子を回収する。さらにその後、水を加えて遠心分離（１２０Ｇ、５分）を行い、パーコール粒子を除去する。
次に、洗浄されたハイドロゲル微粒子をゲル溶液５にいれて、溶液を調整する。
次に、その溶液を寒天培地に流し込んだ後、冷蔵庫で冷やして、溶液を固める。
次に、冷蔵庫からプレートを取り出してから、室温で培養する。
これにより、すでに分離培養した微生物からより多くの微生物を得ることができる。
【００６７】
本発明の実施形態である微生物の分離培養方法は、ハイドロゲル溶液、微生物含有溶液、培地、水相用の界面活性剤を混合して４成分混合溶液を調整してから、４成分混合溶液をオイル中に投入、激しく撹拌してＷ／Ｏエマルジョンの形成を行う工程Ｓ１と、エマルジョンを含有する溶液を撹拌しながら０℃以上４℃以下に冷却して、エマルジョン溶液からハイドロゲル微粒子を作成する工程Ｓ２と、ハイドロゲル微粒子を含有する溶液の撹拌速度を低速度にして、微生物、培地及び水相用の界面活性剤を含有したハイドロゲル微粒子が凝集してなる凝集体を、オイル中に含む凝集体含有溶液を作成する工程Ｓ３と、凝集体含有溶液を所定の温度で所定の時間保持して、ハイドロゲル微粒子内で微生物を分離培養する分離培養工程Ｓ４と、を有する構成なので、各ハイドロゲル微粒子内に微生物を隔離して格納でき、隣接する微生物同士の接触をなくしたままで、細胞間相互作用を強めることができ、これにより培養効率を高めることができ、水溶性物質の移動は制限されないため細胞間相互作用を強めて、単位体積あたりの菌体密度を環境中に匹敵するレベルまで高くして、微生物が生育する環境を模擬でき、凝集体をオイル中で形成する構成により、凝集体を安定保持でき、水相用の界面活性剤のみを有し、オイル相用の界面活性剤を入れない構成により、オイル中で凝集体を安定保持した状態で、オイルの外部から隔離した状態であっても、ハイドロゲル微粒子内の微生物を培養でき、ハイドロゲル微粒子内に微生物を隔離して格納する構成により、各微生物は各ハイドロゲル微粒子内にそれぞれ分離隔離され、各ハイドロゲル間で微生物の移動ができないので、各ハイドロゲル微粒子内で単一種類の微生物を純粋に分離培養することができ、高いハイスループット性を実現でき、微生物の培養効率を高めることができ、従来法では分離培養が困難であった難培養性微生物でも分離培養でき、新種の微生物の分離培養確率を高めることができる。
【００６８】
本発明の実施形態である微生物の分離培養方法は、ハイドロゲル微粒子４２の径が、１μｍ以上５０μｍ以下である構成なので、多数の独立した培養容器に相当するゲル微粒子を調整することが可能になり、結果として比較的容易かつ低コストに多数の微生物培養株を分離することが可能となる。
【００６９】
本発明の実施形態である微生物の分離培養方法は、凝集体含有溶液１４を４℃以上７０℃以下、５００時間以下の条件で培養する構成なので、多様な微生物を増殖することが可能であり、結果として本手法は一般性に優れ、多くのサンプル、多様な目的に利用することができる。
【００７０】
本発明の実施形態である微生物の分離培養方法は、Ｗ／Ｏエマルジョンの形成を行う工程Ｓ１及びハイドロゲル微粒子を作成する工程Ｓ２では１０００ｒｐｍ以上で溶液を撹拌し、凝集体含有溶液Ｓ３を作成する工程で及び分離培養工程Ｓ４では４００ｒｐｍ以下で溶液を撹拌する構成なので、粒径が５０μｍ以下のゲル微粒子を大量に粒径を比較的そろえて作成することができる。
【００７１】
本発明の実施形態である微生物の分離培養方法は、ハイドロゲル溶液３３から形成するハイドロゲル微粒子４２一つに対し微生物が一以下となる濃度となるように、微生物含有溶液１４とハイドロゲル溶液３３を調整する工程とを有する構成なので、純粋培養株を獲得する確率を高めることができる。
【００７２】
本発明の実施形態である微生物の分離培養方法は、微生物を分離培養したハイドロゲル微粒子を含む凝集体含有溶液１４に水を添加・撹拌して水相とオイル相の２相からなる２相溶液を作成、さらに遠心分離して微小ゲル粒子を回収する工程Ｓ５と、２相溶液の水相の一部を寒天培地に含有させて、微生物を培養する工程Ｓ６を有する構成なので、培養後の微生物の細胞数を高めることができる。結果として各種解析および利用が可能になる。
【００７３】
本発明の実施形態である凝集体含有溶液１４は、オイル３１と、オイル３１中に含有された凝集体４１を有し、凝集体４１が、５０個以上のハイドロゲル微粒子４２が凝集されてなり、ハイドロゲル微粒子４２が、径１μｍ以上５０μｍ以下であり、微生物２１〜２４、培地３２及び水相用の界面活性剤３４を含有する構成なので、細胞間相互作用を強めて、各ハイドロゲル微粒子内で単一種類の微生物を純粋に分離培養することができ、微生物の分離培養効率及び未培養微生物（新種）の分離培養効率を高めることができる。
【００７４】
本発明の実施形態である微生物の分離培養方法及び凝集体含有溶液は、上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の技術的思想の範囲内で、種々変更して実施することができる。本実施形態の具体例を以下の実施例で示す。しかし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではい。
【実施例】
【００７５】
（実施例１）
まず、サンプル媒体として、河川水を採取した。
次に、河川水を所定量２５ｍｌチューブに図り取り、３分間、超音波をあてた。
次に、２５ｍｌチューブを静置し上澄み液を回収した。
次に、上澄み液を５μｍフィルターに通し、ろ液を微生物（以下、菌体という。）サンプルとして回収した。
次に、菌体を染色した。
次に、顕微鏡観察により、サンプル中の菌体細胞数を算出した。
以上のようにして、河川水内の菌体濃度を算出した。
【００７６】
次に、これをもとに、サンプルの菌体濃度を０．５×１０８ｃｅｌｌ／ｍｌとしたサンプル溶液（微生物含有溶液）を調整した。
【００７７】
ハイドロゲル溶液（ゲル状態）として、液状の低融点アガロースゲル（Ｏｎｅ  ｃｅｌｌ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製、以下、Ｃｅｌｌ  Ｇｅｌと略記する。）を用意した。  培地として、最終濃度で０．３２ｇ／Ｌになるように、標準の１／２０希釈したＮＢ培地を用意した。水相用の界面活性剤として、ＰＬＯＲＯＮＩＣ  Ｆ−６８を用意した。
【００７８】
次に、ハイドロゲル溶液５００μｌに、サンプル溶液１００μｌと、培地５０μｌと、水相用の界面活性剤２５μｌとを混合して、４成分混合溶液６７５μｌを調整した。
【００７９】
次に、２０ｍｌバイアル瓶に、オイルとしてＣｅｌｌ  Ｍｉｘオイル（Ｏｎｅ  Ｃｅｌｌ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を１５ｍｌ用意した。次に、オイル中に４成分混合溶液を混合してから、恒温水槽で４０℃の条件で混合して、５成分混合溶液を調整した。
【００８０】
次に、２０ｍｌバイアル瓶にスターラーを入れ、室温、２１００ｒｐｍ  １ｍｉｎの条件で５成分混合溶液を撹拌した。
【００８１】
次に、容器に充填したクラッシュアイス中に２０ｍｌバイアル瓶を入れて５成分混合溶液を約４℃以下に急冷し、ｏｎ  ｉｃｅ  ２１００ｒｐｍ  １ｍｉｎの条件で撹拌した。次に、ｏｎ  ｉｃｅ  １１００ｒｐｍ  １ｍｉｎの条件で撹拌した。
【００８２】
以上により、ハイドロゲル溶液から複数のハイドロゲル微粒子を形成して、オイル中にハイドロゲル微粒子が凝集した凝集体を含む凝集体含有溶液を作成した。
【００８３】
図１０は、微小ゲル粒子形成直後の外観を示す写真である。顕微鏡観察によるハイドロゲル微粒子の平均粒径は、２５μｍであり、４成分混合溶液６７５μｌから形成されたハイドロゲル微粒子数は１０7個であった。
【００８４】
次に、速やかに室温（約２５℃）として、４００ｒｐｍ  １ｍｉｎの条件で撹拌した。
その後、室温で、３１０時間まで、４００ｒｐｍ  １ｍｉｎの条件で撹拌を続けた。
これにより、ハイドロゲル微粒子内で微生物を分離培養した。
【００８５】
図１１は、培養開始から１５０時間経過時点の凝集体含有溶液の外観であって、培養中（凝集体形成）を示す写真である。凝集体が形成されていた。
【００８６】
図１２は、培養開始から１５０時間経過時点での凝集体含有溶液の顕微鏡写真であり、５０μｍバースケール（ａ）と、２０μｍバースケール（ｂ）である。図１２（ａ）に示すように、オイル中に直径約１ｍｍのハイドロゲル微粒子の凝集体が形成されていた。また、図１２（ｂ）に示すように、直径約５μｍ〜３０μｍのハイドロゲル微粒子が凝集されていた。
【００８７】
なお、培養開始から０〜３１０時間の分離培養の途中では所定時間ごとに、凝集体含有溶液の一部を取り出して、顕微鏡観察して、コロニー数をカウントした。
【００８８】
具体的には、まず、２０ｍｌバイアル瓶から１．５μｌチューブに所定量の凝集体含有溶液を移した。次に、所定量の水を加えてから、遠心分離した。これにより、オイル相（上相）、水相（下相）の２相からなる溶液を作成した。水相には、凝集体が分散された。次に、オイル相を取り除き、凝集体が分散された水相溶液を回収した。次に、水相中に分散したハイドロゲル微粒子内の微生物を蛍光色素で染色した。蛍光色素はＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎを用いた。次に、蛍光顕微鏡装置（オリンパスＢＸ５３）を用いて、蛍光顕微鏡観察した。図１３は、水中に分散したハイドロゲル微粒子と内部に形成したコロニーを示す蛍光顕微鏡写真である。ハイドロゲル微粒子内の蛍光発光する微生物コロニー数を計数した。
【００８９】
次に、顕微鏡を用いて、微分干渉画像を観察した。図１４は、水中に分散したハイドロゲル微粒子と内部に形成したコロニーを示す微分干渉画像である。ハイドロゲル微粒子内の微生物コロニー数を計数した。蛍光顕微鏡とのカウント数を平均化して、コロニー数を計数した。これにより、所定時間ごとのコロニー数の計数結果をまとめた。
【００９０】
＜培養効率＞
コロニー数の結果をもとに、培養効率を算出した。培養効率は、コロニー形成率、すなわち、植菌した全微生物細胞のうちコロニーを形成した割合であり、出現したコロニー数／全植菌体数で算出される。全植菌体数は、顕微鏡直接計数法で細胞数をカウントした値を用いた。出現したコロニー数は、上記の顕微鏡での計数結果を用いた。
【００９１】
図１５は、培養開始から１５０時間経過時点の培養効率の結果を示すグラフである。本手法（新規手法）の培養効率（コロニー形成率）は２０％であった。図１５に、比較のため、比較例１の寒天培養法（従来法）の結果も示した。培養開始から１５０時間経過時点の従来法の培養効率は２．２％であった。
【００９２】
図１５からわかるように、実施例１は比較例１に比べて優れた結果を示した。一般的に、環境中の微生物のコロニー形成率は１％程度と言われていることから、それと比べても極めて高い値であった。
【００９３】
＜コロニー形成率の培養時間依存性＞
図１６は、コロニー形成率の培養時間依存性の結果を示すグラフである。四角で示したデータが実施例１の結果である。なお、同条件で実験を行った２つの実験結果（実施例２、３）も丸及び三角で示したデータで記載した。実施例１〜３のコロニー形成率の培養時間依存性の結果のばらつきは小さかった。いずれも、培養時間が５０時間までに１８〜２２％のコロニー形成率を示した後、５０〜２００時間で飽和状態となり、２５〜３０％コロニー形成率に達した。その後、いずれもコロニー形成率が１０〜２０％に減少するという、ほぼ同様の特性を示した。
【００９４】
＜新種の割合＞
まず、凝集体が分散された水相溶液をパーコール密度勾配遠心した。水相の下部分には、凝集体が沈殿し、最下層には菌体が沈殿した。これにより、ハイドロゲル微粒子とハイドロゲル微粒子外に存在する菌体を分離した。次に、ピペットで、沈殿した凝集体を含む上澄み液を回収した。これにより、洗浄されたハイドロゲル微粒子を回収した。
【００９５】
次に、洗浄されたハイドロゲル微粒子を、４０℃に温めた低融点アガロースゲルｓｅａ−ｐｌａｑｕｅ１％溶液５ｍｌにいれて、溶液を調整した。次に、その溶液を寒天培地（ＤＲ２Ａ０．３２ｇ／Ｌ含有）に流し込んだ後、冷蔵庫で１５分冷やした。これにより、ｓｅａ−ｐｌａｑｕｅ１％溶液を固めた。次に、冷蔵庫からプレートを取り出してから、室温で培養した。培養により、いくつかの単一種のコロニーを形成でき、菌株を５０株以上得た。
【００９６】
次に、得られた菌株（５０株以上）について、それぞれＰＣＲを用いて１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の全長を増幅、ＤＮＡ配列を解析した。次に、得られたＤＮＡ配列について、データベースに登録されている既存培養株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子との相同性を比較した。次に、相同性９８％未満のものを新種と定義して、新種の割合を算出した。
【００９７】
図１７は、新種の割合の結果を示すグラフである。  また、表１は、新種の割合の算出結果を示すものである。
【００９８】
【表１】
0006785465.tif 000002
【００９９】
図１７、表１に示すように、本手法（新規手法：ＧＭＤ  ｉｎ  Ｏｉｌ）では、相同性１００％以下９８％以上の新種ではないものは５５％であった。相同性９８％未満９５％以上の菌株が３８％得られ、相同性９５％未満の菌株が７％得られたことから、本手法（新規手法）で得られた新種の割合は４５％であった。
【０１００】
図１７、表１には、比較のため、比較例１の寒天培養法（従来法）の結果も示した。
【０１０１】
図１８は、Ａｇａｒ  ｐｌａｔｉｎｇ（寒天平板法）で行った２次培養の結果を示す写真である。寒天培養法（従来法）では、相同性９７％未満９５％以上の菌株が５％得られ、相同性９５％未満の菌株は得られなかったことから、得られた新種の割合は５％であった。本手法（新規手法）は寒天培養法（従来法）に比べて、優れた効果を示した。
【０１０２】
（比較例１）
寒天平板を用いた他は実施例１と同様にして、微生物の培養を行った。寒天平板上のコロニーは目視で計数した。
【０１０３】
（実施例２、３）
それぞれ実施例１と同様にして、培養を行い、コロニー形成率の培養時間依存性を調べた。
【０１０４】
（実施例４）
河川水の代わりに土壌を用いた他は実施例１と同様にして、培養を行った。
【０１０５】
サンプル調整は以下のようにして行った。まず、２５ｍｌチューブに５ｇ程度の土壌と純水５ｍｌを入れ、超音波をあてて３分程度処理した後、２５ｍｌチューブを静置し上澄み液を回収した。次に、上澄み液を５μｍフィルターに通し、ろ液を微生物（以下、菌体ともいう。）サンプルとして回収した。
【０１０６】
本手法（新規手法）の培養効率すなわち植菌した全微生物細胞のうちコロニーを形成した割合（コロニー形成率）は９．０％（培養開始から１５０時間経過時点）であった。
【０１０７】
（比較例２）
寒天平板を用いた他は実施例４と同様にして、微生物の培養を行った。寒天平板上のコロニーは目視で計数した。寒天培養法（従来法）のコロニー形成率は１．１％（培養開始から１５０時間経過時点）であった。
【０１０８】
（比較例３）
オイル相に界面活性剤（Ｓｐａｎ  ８０）を０．１％添加した他は実施例１と同様にして、溶液を調整した。溶液ではオイル相に界面活性剤を添加されているので、エマルジョンが安定し微小ゲル粒子はオイル相中に分散して存在し凝集体を形成しなかった。
【０１０９】
この溶液を用いて、培養を行った。培養過程で、所定時間ごとのコロニー数の計数結果をまとめた。
【０１１０】
コロニー形成率は最大で１．６％（培養開始から１５０時間経過時点）であった。これは、従来法と同等レベルであった。
【０１１１】
図１９は、凝集系（実施例４）と分散系（比較例３）のコロニー形成率の培養時間依存性の比較結果を示すグラフである。
【０１１２】
実施例４と比較例３の結果を比較すると、実施例４ではオイル相中で凝集体が形成されているが、比較例３では凝集体が形成されていない。この違いがコロニー形成率に大きな影響をもたらすことが明らかとなった。つまり、凝集体を形成することの効果が実証されていることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【０１１３】
本発明の微生物の分離培養方法及び凝集体含有溶液は、微生物の分離培養効率及び難培養性微生物（新種）の分離培養効率を高める効果を奏するので、従来法で分離培養できておらず、新たな創薬を創出できる可能性がある、新種の難培養性微生物を発見でき、医学・薬学・生物学産業上の利用可能性がある。
【符号の説明】
【０１１４】
１０試験管、１１・・・キャップ、１３・・・エマルジョン、１４・・・凝集体含有溶液、１５・・・内部で微生物を分離培養したハイドロゲル微粒子を含む凝集体含有溶液、２０・・・微生物群、２１、２２、２３、２４・・・微生物、３１・・・オイル、３２・・・培地、３３・・・ハイドロゲル溶液、３４・・・水相用の界面活性剤、４１・・・凝集体、４２・・・ハイドロゲル微粒子、４３・・・溶存物質、４４・・・イオン、１６・・・水相、５１・・・水、１３３・・・エマルジョン、４２２・・・まだ固まっていない状態のゲル。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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