(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも６５℃、かつｐＨ６の条件下でリン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、
からなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域からなる、耐熱性セロビオハイドロラーゼ。
【請求項２】
カルシウムイオン存在下において、少なくとも７０℃、かつｐＨ６の条件下でリン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性を有する、請求項１に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼ。
【請求項３】
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも６５℃、かつｐＨ６の条件下でリン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、又は
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも６５℃、かつｐＨ６の条件下でリン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、をコードする塩基配列、
からなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域をコードする領域からなる、ポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、さらに、カルシウムイオン存在下において、少なくとも７０℃、かつｐＨ６の条件下でリン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性を有する、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項３又は４に記載のポリヌクレオチドが組込まれており、
宿主細胞において、セロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る、発現ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の発現ベクターが導入されている、形質転換体。
【請求項７】
真核微生物である、請求項６に記載の形質転換体。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の形質転換体内で、耐熱性セロビオハイドロラーゼを生産させることを含む、耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法。
【請求項９】
請求項１若しくは２に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、又は請求項３若しくは４に記載のポリヌクレオチドがコードする耐熱性セロビオハイドロラーゼと、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素とを含む、グリコシド加水分解酵素混合物。
【請求項１０】
さらに、ＧＨ６ファミリーのセロビオハイドロラーゼを含む、請求項９に記載のグリコシド加水分解酵素混合物。
【請求項１１】
セルロースを含む材料を、請求項１若しくは２に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、請求項３若しくは４に記載のポリヌクレオチドがコードする耐熱性セロビオハイドロラーゼ、又は請求項６若しくは７に記載の形質転換体に接触させることにより、セルロース分解物を生産することを含む、セルロース分解物の製造方法。
【請求項１２】
セルロースを含む材料を、前記耐熱性セロビオハイドロラーゼと共に、ＧＨ６ファミリーのセロビオハイドロラーゼにも接触させる、請求項１１に記載のセルロース分解物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐熱性セロビオハイドロラーゼ、前記耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードするポリヌクレオチド、前記耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現するための発現ベクター、前記発現ベクターが組込まれた形質転換体及び前記耐熱性セロビオハイドロラーゼを用いたセルロース分解物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
地球温暖化や大気汚染などの環境上の問題に加え、原油価格の大幅上昇や近い将来の原油枯渇予想（ピークオイル）等の輸送用エネルギー供給に関わる懸念から、近年、石油代替エネルギー開発は非常に重要な課題である。植物バイオマス、若しくはリグノセルロースは、地球上に最も豊富にある再生可能エネルギー源であり、石油代替資源として期待されている。植物バイオマス乾燥重量の主要構成要素は、セルロースやヘミセルロース等の多糖類とリグニンから成るリグノセルロースである。例えば、多糖類は、グリコシド加水分解酵素であるセルラーゼやヘミセルラーゼによってグルコースやキシロースなどの単糖に加水分解された後、バイオ燃料や化成品の原料として利用される。
【０００３】
リグノセルロースは複雑な構造を持ち、難分解性であり、単一のグリコシド加水分解酵素では分解、糖化が難しい。リグノセルロースの全分解には、一般的に、エンドグルカナーゼ（セルラーゼ又はエンド−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ、ＥＣ  ３．２．１．４）、エキソ型のセロビオハイドロラーゼ（１，４−β−セロビオシダーゼ又はセロビオハイドロラーゼ、ＥＣ  ３．２．１．９１、ＥＣ  ３．２．１．１７６）、β−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２１）の３種の酵素が必要とされ、その他にも、ヘミセルラーゼであるキシラナーゼ（エンド−１，４−β−キシラナーゼ、ＥＣ  ３．２．１．８）やβ−キシロシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３７）などの他の植物細胞壁分解酵素も含めた複数酵素の適切な配合が必要であると考えられている。
【０００４】
従来のリグノセルロースを資源とするバイオエタノール製造では、エタノールの高エネルギー効率変換を目的として、高固体負荷（３０〜６０％  ｓｏｌｉｄ  ｌｏａｄｉｎｇ）による糖化処理が試みられている。このような高固体負荷によるリグノセルロースの酵素糖化は、バイオマス糖化液の粘性が高く、リグノセルロースの加水分解反応が進み難い。そこで、耐熱性酵素を用いて、例えば６５℃以上の高温で酵素糖化処理を行うことにより、加水分解反応速度が上昇することに加えて、バイオマス糖化液の粘性が低下することから、糖化反応時間の短縮及び酵素量の削減が達成できると期待される。このため、各種グリコシド加水分解酵素について、より耐熱性に優れた酵素の開発が望まれている。
【０００５】
セロビオハイドロラーゼによってセルロースが加水分解を受けると、主に、二糖のセロビオースが生成する。セロビオハイドロラーゼには、セルロースの還元末端から加水分解するタイプ（ＧＨ７、ＧＨ４８ファミリー等に属するセロビオハイドロラーゼ）と、非還元末端から加水分解するタイプ（ＧＨ５、ＧＨ６、ＧＨ９ファミリー等に属するセロビオハイドロラーゼ）が存在し、両者を混合して用いると、それぞれを単独で用いた場合よりも、セルロースの分解活性が上昇することが知られている（例えば、非特許文献１参照）。セルロースの非還元末端から加水分解するセロビオハイドロラーゼについては、ＧＨ６ファミリーにおいて、至適温度が７５℃を超えるものが報告されている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１４／１５７４９２号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Boisset et al, Applied and Environmental Microbiology, 2000, vol 66, p. 1444-1452.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、少なくとも６５℃で、さらにはカルシウムイオン存在下においては７０℃でセロビオハイドロラーゼ活性を示し、さらには、ＧＨ６ファミリーのセロビオハイドロラーゼとのシナジー効果を示す、ＧＨ４８ファミリーに属する新規な耐熱性セロビオハイドロラーゼ、前記耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードするポリヌクレオチド、前記耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現するための発現ベクター、前記発現ベクターが組込まれた形質転換体及び前記耐熱性セロビオハイドロラーゼを用いたセルロース分解物の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、堆肥培養物からＤＮＡを抽出し、単離が困難な微生物叢の大規模ゲノムシーケンスを行うことにより、新規アミノ酸配列を持つ耐熱性セロビオハイドロラーゼの取得に成功し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼ、ポリヌクレオチド、発現ベクター、形質転換体、耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法、セルラーゼ混合物及びセ
ルロース分解物の製造方法は、下記［１］〜［１２］の態様を含む。
［１］  （Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は
（Ｃ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも６５℃、かつｐＨ６の条件下でリン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、
からなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域からなる、耐熱性セロビオハイドロラーゼ。
［２］  さらに、カルシウムイオン存在下において、少なくとも７０℃、ｐＨ の条件下でリン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性を有する、前記［１］の耐熱性セロビオハイドロラーゼ。
［３］  （ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも６５℃、かつｐＨ６の条件下でリン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、をコードする塩基配列、又は
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも６５℃、かつｐＨ６の条件下でリン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、をコードする塩基配列、
からなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域をコードする領域からなる、ポリヌクレオチド
［４］  前記ポリペプチドが、さらに、カルシウムイオン存在下において、少なくとも７０℃、かつｐＨ６の条件下でリン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性を有する、前記［３］のポリヌクレオチド。
［５］  前記［３］又は［４］のポリヌクレオチドが組込まれており、
宿主細胞において、セロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る、発現ベクター。
［６］  前記［５］の発現ベクターが導入されている、形質転換体。
［７］  真核微生物である、前記［６］の形質転換体。
［８］  前記［６］又は［７］の形質転換体内で、耐熱性セロビオハイドロラーゼを生産させることを含む、耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法。
［９］  前記［１］若しくは［２］の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、又は前記［３］若しくは［４］のポリヌクレオチドがコードする耐熱性セロビオハイドロラーゼと、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素とを含む、グリコシド加水分解酵素混合物。
［１０］  さらに、ＧＨ６ファミリーのセロビオハイドロラーゼを含む、前記［９］のグリコシド加水分解酵素混合物。
［１１］  セルロースを含む材料を、前記［１］若しくは［２］の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、前記［３］若しくは［４］のポリヌクレオチドがコードする耐熱性セロビオハイドロラーゼ、又は前記［６］若しくは［７］に記載の形質転換体に接触させることにより、セルロース分解物を生産することを含む、セルロース分解物の製造方法。
［１２］  セルロースを含む材料を、前記耐熱性セロビオハイドロラーゼと共に、ＧＨ６ファミリーのセロビオハイドロラーゼにも接触させる、前記［１１］のセルロース分解物の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、少なくとも６５℃、かつｐＨ６において、カルシウムイオン存在下においては少なくとも７０℃、ｐＨ６において、セロビオハイドロラーゼ活性を有する。さらに、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼのセロビオハイドロラーゼ活性は、ＧＨ６ファミリーのセロビオハイドロラーゼとシナジー効果を示す。このため、前記耐熱性セロビオハイドロラーゼは、高温条件下におけるセルロースの糖化処理に好適である。
また、本発明に係るポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクター、前記発現ベクターが導入されている形質転換体は、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造に好適に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】オープンリーディングフレームＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４がコードすると推定されるポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１）とパエニバチルス・サブスピーシーズ  ＦＳＬ  Ｈ７−６８９のセルロース１，４−β−セロビオシダーゼのアミノ酸配列（配列番号７）のアライメント図である。
【図２】実施例１において、ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１遺伝子を大腸菌に発現させて得られたＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果を示した図である。
【図３】実施例１において、ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１遺伝子を大腸菌に発現させて得られたＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１タンパク質の各基質に対する加水分解活性の測定結果を示した図である。
【図４】実施例１において、ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１遺伝子を大腸菌に発現させて得られたＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１タンパク質の、カルシウムイオン存在下又は非存在下における各温度におけるＰＳＡ加水分解活性（ｐＨ６）を計測した結果を示した図である。
【図５】実施例１において、ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１遺伝子を大腸菌に発現させて得られたＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１タンパク質の各ｐＨにおけるＰＳＡ加水分解活性（６０℃）を計測した結果を示した図である。
【図６】実施例１において、ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１遺伝子を大腸菌に発現させて得られたＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１タンパク質と、大腸菌に発現させて得られたＧＨ６セロビオハイドロラーゼＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡを様々な割合で混合した酵素組成物の、ＰＳＡ加水分解活性及びアビセル加水分解活性（ｐＨ６、７０℃）を計測した結果を示した図である。
【図７】実施例１において、ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１遺伝子を大腸菌に発現させて得られたＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１タンパク質が示す、熱変性に伴って引き起こされるＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅの蛍光強度変化の実測値（Ａ）及びその１階微分「−ｄ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）／ｄｔ」（Ｂ）を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
［耐熱性セロビオハイドロラーゼ］
糸状菌、細菌、及びアーキアを含む多くの微生物は難培養性であり、土壌等微生物環境に生息する菌の約９９％が未知の菌であるといわれている。特に、高温環境に生息する微生物の培養は極めて困難であり、現在の微生物の単離を目指す培養技術では、自然界から採取された天然サンプル中に生息する微生物の０．１％以下を単離しているにすぎないと考えられている。この微生物の難培養性が、耐熱性セロビオハイドロラーゼの開発が進まない一因である。よって、耐熱性セロビオハイドロラーゼの開発には、従来のような単離培養技術に頼らないアプローチが必要である。
【００１４】
近年、ギガ塩基対の大量配列解読を可能にした次世代シーケンサーが開発されたことにより、土壌等に含まれる微生物叢のゲノムを丸ごと解読することが可能となっている。この解析技術を利用して、土壌等の環境サンプルから微生物集団のゲノムＤＮＡを調製し、ゲノム構成が不均一、及び雑多な集団について直接ゲノムを網羅的に解読し、並列コンピュータにより解読データをアセンブルすることで微生物叢ゲノム配列を再構成するメタゲノム解析法が提案され、難培養性微生物のゲノム解読が急速に進展している。しかしながら、有機物の分解が活発に行われている堆肥には数多くの微生物が存在しており、次世代シーケンサーを用いても、網羅的にゲノムを解読するためには、より多くの解読量が必要となる。そこで、目的の性質を有する微生物叢を効率的に得るために、炭素源をセルロースのみとした培地で培養する手法を用いた。
【００１５】
本発明者らは、後記実施例１に示すように、日本国内において採取した堆肥の培養物から微生物集団のゲノムＤＮＡ（メタゲノムＤＮＡ）を抽出し、メタゲノムＤＮＡのショットガンシーケンス及びアノテーションを行い、既知セロビオハイドロラーゼ酵素と類似したアミノ酸配列（例えば、２０％以上の配列同一性を有し、かつ期待値（Ｅ−Ｖａｌｕｅ）が１ｅ−２０未満であるアミノ酸配列）をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を得た。得られたＯＲＦの塩基配列情報に基づいてプライマーを設計し、ＰＣＲ法により、堆肥培養物のゲノムＤＮＡから遺伝子候補をクローニングした。ＰＣＲクローニングされたＤＮＡを大腸菌に組込み、前記塩基配列がコードするタンパク質を発現させ、リン酸膨潤アビセル（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｗｏｌｌｅｎ  Ａｖｉｃｅｌ、ＰＳＡ）分解活性アッセイによる機能スクリーニングを行った。最終的に、これらのＯＲＦの中からＰＳＡ分解活性を持つ耐熱性セロビオハイドロラーゼ（以下、「ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１」、又は「遺伝子クローンＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１」と呼ぶことがある。）を得た。ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１のアミノ酸配列を配列番号１に、ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１のアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号２に、それぞれ表す。
【００１６】
後記実施例１に示すように、ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１は、ＰＳＡに対し高い加水分解活性を示し、結晶性セルロースのアビセルや、β−１，３結合とβ−１，４結合グルカンからなるリケナン（Ｌｉｃｈｅｎａｎ）に対しても若干の加水分解活性を示すが、カルボキシメチルセルロース(以下、ＣＭＣと略すことがある。)、ラミナリン、キシラン、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（以下、ＰＮＰＧと略すことがある。）、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロビオシド（以下、ＰＮＰＣと略すことがある。）に対してはほとんど加水分解活性を示さない。この基質特異性から、ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１がセロビオハイドロラーゼ活性を有するグリコシド加水分解酵素であることが示唆される。
【００１７】
なお、本願明細書において、「セロビオハイドロラーゼ活性」とは、β−グルコシド結合を有する化合物を含む材料の加水分解を促進する酵素活性を意味し、その活性はＰＳＡを含むグルカンを基質とし、加水分解活性によってセロビオースを生成する活性を意味する。
また、本願明細書において、「活性を有する」とは、少なくとも１つの基質に対して作用し、陰性対照（ネガティブコントロール）と比較し、加水分解された基質の還元末端量又は発色反応において有意な差を生じさせることを意味する。
従って、「セロビオハイドロラーゼ活性を有する」とは、少なくともＰＳＡに対して作用し、陰性対照と比較し、加水分解された基質の還元末端量又は発色反応において有意な差を生じさせることを意味する。
【００１８】
ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１のアミノ酸配列を公知のアミノ酸配列データベースに対して検索したところ、最も配列同一性が高かったアミノ酸配列は、パエニバチルス・サブスピーシーズ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）  ＦＳＬ  Ｈ７−６８９のＧＨファミリー４８に属するセルロース１，４−β−セロビオシダーゼ（配列番号７）であり、ＧＨ４８触媒領域における配列同一性（相同性）は７７％であった。基質特異性及び既知のセロビオハイドロラーゼとのアミノ酸配列の配列同一性から、ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１は、ＧＨ４８ファミリーに属する新規なセロビオハイドロラーゼであることが明らかとなった。
【００１９】
ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１は、少なくとも６５℃、かつｐＨ６の条件下でＰＳＡを基質とした加水分解活性（すなわち、セロビオハイドロラーゼ活性）を有する。実際に、後記実施例１に示すように、ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１は、５０〜７０℃の温度範囲内、かつｐＨ５．５〜８のｐＨ範囲内でセロビオハイドロラーゼ活性を示す。より詳細には、ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１のセロビオハイドロラーゼ活性は、５０〜６５℃の範囲内では温度が高くなるにつれて高くなり、６５℃超で急激にセロビオハイドロラーゼ活性が低下する傾向にあった。
【００２０】
また、ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１は、２価の金属イオン存在下で、金属イオン非存在下よりもより高温でも高いセロビオハイドロラーゼ活性を示す。実際に、後記実施例１に示すように、ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１は、カルシウムイオン存在下で、５５〜７５℃の温度範囲内、かつｐＨ５．５〜８の広いｐＨ範囲内でセロビオハイドロラーゼ活性を示す。
【００２１】
一般的に何らかの生理活性を有するタンパク質は、その生理活性を損なうことなく、１個又は複数個のアミノ酸を欠失、置換又は付加させることができる。つまり、ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１に対しても、セロビオハイドロラーゼ活性を失わせることなく、１個又は複数個のアミノ酸を欠失、置換又は付加させることができる。
【００２２】
すなわち、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかからなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域を有する、耐熱性セロビオハイドロラーゼである。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも６５℃、かつｐＨ６の条件下でＰＳＡを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、又は
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも６５℃、かつｐＨ６の条件下でＰＳＡを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド。
【００２３】
前記（Ｂ）のポリペプチドにおいて、配列番号１で表されるアミノ酸配列に対して欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸の数は、１〜２０個が好ましく、１〜１０個がより好ましく、１〜５個がさらに好ましい。
本願明細書において、「ポリペプチドにおいてアミノ酸が欠失している」とは、ポリペプチドを構成しているアミノ酸の一部が失われている（除去されている）ことを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリペプチドにおいてアミノ酸が置換されている」とは、ポリペプチドを構成しているアミノ酸が別のアミノ酸に変わる置き換えられていることを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリペプチドにおいてアミノ酸が付加されている」とは、ポリペプチド中に新たなアミノ酸が挿入されていることを意味する。
【００２４】
前記（Ｃ）のポリペプチドにおいて、配列番号１で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、８０％以上１００％未満であれば特に限定されないが、８５％以上１００％未満であることが好ましく、９０％以上１００％未満であることがより好ましく、９５％以上１００％未満であることがさらに好ましく、９８％以上１００％未満であることが特に好ましい。
【００２５】
なお、アミノ酸配列同士の配列同一性（相同性）は、２つのアミノ酸配列を、対応するアミノ酸が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除くアミノ酸配列全体に対する一致したアミノ酸の割合として求められる。アミノ酸配列同士の配列同一性は、前記技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。本発明におけるアミノ酸配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＰにより得られたアライメントを元にした計算によって得られる。
【００２６】
前記（Ｂ）及び（Ｃ）のポリペプチドとしては、人工的に設計されたものであってもよく、ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１等のホモログ又はその部分タンパク質であってもよい。
【００２７】
前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドは、それぞれ、アミノ酸配列に基づいて化学的に合成してもよく、後記の本発明に係るポリヌクレオチドを用いたタンパク質発現系によって生産してもよい。また、前記（Ｂ）及び（Ｃ）のポリペプチドは、それぞれ、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに基づいて、アミノ酸変異を導入する遺伝子組換え技術を用いて人工的に合成することもできる。
【００２８】
前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドは、少なくとも６５℃、かつｐＨ６の条件下でＰＳＡを基質とした加水分解活性（ロビオハイドロラーゼ活性）有する。このため、前記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのポリペプチドをセロビオハイドロラーゼ触媒領域として有することにより、耐熱性セロビオハイドロラーゼが得られる。
【００２９】
本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、ＰＳＡを基質とする。前記耐熱性セロビオハイドロラーゼは、ＰＳＡに加えて、さらにＰＳＡ以外のその他のβグルカン又はオリゴ糖を基質としてもよい。当該その他のβグルカンとしては、例えば、アビセル（Ａｖｉｃｅｌ）、結晶性バクテリアセルロース(Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、ＢＭＣＣ)、濾紙等の結晶性セルロース；ＣＭＣ、セロビオース等のβ−１，４結合からなるグルカン；キシラン；ＰＮＰＧＡＬ；ＰＮＰＸ；リケナン等のβ−１，３結合とβ−１，４結合からなるグルカン；ラミナリン等のβ−１，３結合とβ−１，６結合からなるグルカン；β−１，３結合からなるグルカン；β−１，６結合からなるグルカン；ゲンチオビオース等のβ−１，６結合からなるオリゴ糖等が挙げられる。本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼとしては、ＰＳＡに加えて、さらにアビセル及びリケナンを基質とするものが好ましい。
【００３０】
本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、少なくともｐＨ６の条件で、ＰＳＡを基質とする加水分解活性（セロビオハイドロラーゼ活性）を、６０〜６５℃の温度範囲内で示すことが好ましく、５５〜６５℃の温度範囲内で示すことがより好ましく、５０〜７０℃の温度範囲内で示すことがさらに好ましい。本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼの至適温度は、６０〜７０℃の範囲内にあることが好ましい。
【００３１】
本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼの至適ｐＨは、ｐＨ５．５〜６．５の範囲内にある。本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼとしては、少なくともｐＨ５．５〜７．０の範囲内においてセロビオハイドロラーゼ活性を示すものが好ましい。
【００３２】
本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、２価の金属イオン存在下で、金属イオン非存在下よりもより高温でも高いセロビオハイドロラーゼ活性を示すことが好ましい。本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、２価の金属イオン存在下で、少なくとも７０℃、ｐＨ６の条件下セロビオハイドロラーゼ活性を有することが好ましく、６５〜７５℃の温度範囲内、かつｐＨ５．５〜７．０のｐＨ範囲内でセロビオハイドロラーゼ活性を示すことがより好ましく、５５〜７５℃の温度範囲内、かつｐＨ５．５〜７．０のｐＨ範囲内でセロビオハイドロラーゼ活性を示すことがさらに好ましい。
【００３３】
本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、セロビオハイドロラーゼ活性に加えて、さらにセロビオハイドロラーゼ活性以外のセルロース加水分解活性を有していてもよい。その他のセルロース加水分解活性としては、キシラナーゼ活性、β−ガラクトシダーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、キシロシダーゼ活性、又はβ−グルコシダーゼ活性等が挙げられる。
【００３４】
本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドのいずれかからなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域のみからなる酵素であってもよく、セロビオハイドロラーゼ触媒領域に加えて、さらにその他の領域を含んでいてもよい。その他の領域としては、公知のセロビオハイドロラーゼが有する、酵素触媒領域以外の領域が挙げられる。例えば、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼには、公知のセロビオハイドロラーゼに対し、酵素触媒領域を前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドに置換することによって得られる酵素も含まれる。
【００３５】
本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼがセロビオハイドロラーゼ触媒領域以外の領域を含む場合、セルロース結合モジュール（ＣＢＭ）を含むことも好ましい。セルロース結合モジュールは、セロビオハイドロラーゼ触媒領域の上流（Ｎ末端側）にあってもよく、下流（Ｃ末端側）にあってもよい。また、セルロース結合モジュールとセロビオハイドロラーゼ触媒領域は、直接結合していてもよく、適当な長さのリンカー領域を介して結合していてもよい。本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼとしては、セロビオハイドロラーゼ触媒領域の上流又は下流に、リンカー領域を介してセルロース結合モジュールが存在しているものが好ましく、セロビオハイドロラーゼ触媒領域の上流にリンカー領域を介してセルロース結合モジュールが存在しているものがより好ましい。
【００３６】
本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼが含むセルロース結合モジュールは、セルロースとの結合能、例えば、ＰＳＡや結晶性アビセルとの結合能を有する領域であればよく、そのアミノ酸配列は特に限定されるものではない。当該セルロース結合モジュールとしては、例えば、既知のタンパク質が有するセルロース結合モジュール又はそれを適宜改変したものを用いてもよい。また、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼがセロビオハイドロラーゼ触媒領域とセルロース結合モジュールを有する場合、これらはリンカー配列を介して結合していることが好ましい。当該リンカー配列のアミノ酸配列やその長さ等は特に限定されるものではない。
【００３７】
本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、その他にも、Ｎ末端又はＣ末端に、細胞内の特定の領域に移行させて局在させ得るシグナルペプチドや、細胞外へ分泌するシグナルペプチドを有していてもよい。このようなシグナルペプチドとしては、例えば、アポプラスト移行シグナルペプチド、小胞体保留シグナルペプチド、核移行シグナルペプチド、分泌型シグナルペプチド等が挙げられる。小胞体保留シグナルペプチドとしては、例えば、ＨＤＥＬのアミノ酸配列からなるシグナルペプチド等が挙げられる。
【００３８】
また、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、その他にも、発現系を用いて生産した場合に簡便に精製可能とするため、例えば前記耐熱性セロビオハイドロラーゼのＮ末端やＣ末端に、各種タグが付加されていてもよい。前記タグとしては、例えば、Ｈｉｓタグ、ＨＡ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）タグ、Ｍｙｃタグ、及びＦｌａｇタグ等の組換えタンパク質の発現・精製において汎用されているタグを用いることができる。
すなわち、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼの１つの側面は、前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドのいずれかからなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域と；所望により、前記セルビオハイドロラーゼ触媒領域の上流側又は下流側に位置するリンカー領域、前記耐熱性セロビオハイドロラーゼのＮ末端又はＣ末端に付加されたシグナルペプチド、前記耐熱性セロビオハイドロラーゼのＮ末端又はＣ末端に付加されたタグ、及びセルロース結合モジュールからなる群から選択される少なくとも１つと、を含む。
【００３９】
［耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードするポリヌクレオチド］
本発明に係るポリヌクレオチドは、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードする。前記耐熱性セロビオハイドロラーゼは、前記ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクターを宿主に導入することにより、前記宿主の発現系を利用して生産することができる。
【００４０】
具体的には、本発明に係るポリヌクレオチドは、下記（ａ）〜（ｅ)のいずれかの塩基配列からなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチドである。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも６５℃、かつｐＨ６の条件下でＰＳＡを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも６５℃、かつｐＨ６の条件下でＰＳＡを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、をコードする塩基配列、
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも６５℃、ｐＨ６の条件下でＰＳＡを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、をコードする塩基配列、又は
（ｅ）配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であり、かつ少なくとも６５℃、かつｐＨ６の条件下でＰＳＡを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、をコードする塩基配列。
【００４１】
なお、本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が欠失している」とは、ポリヌクレオチドを構成しているヌクレオチドの一部が失われている（除去されている）ことを意味する。
本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が置換されている」とは、ポリヌクレオチドを構成している塩基が別の塩基に置き換えられていることを意味する。
本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が付加されている」とは、ポリヌクレオチド中に新たな塩基が挿入されていることを意味する。
【００４２】
本願明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ＴＨＩＲＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ（Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載の方法が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液、ｐＨ７．０）、５×デンハルト溶液（１００×デンハルト溶液の組成：２質量％ウシ血清アルブミン、２質量％フィコール、２質量％ポリビニルピロリドン）、０．５質量％のＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ、及び５０％フォルムアミドからなるハイブリダイゼーションバッファー中で、４２〜７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。
【００４３】
前記（ａ）〜（ｅ）の塩基配列においては、縮重コドンは、宿主のコドン使用頻度の高いものを選択することが好ましい。例えば、前記（ａ）の塩基配列としては、配列番号２で表される塩基配列であってもよく、配列番号２で表される塩基配列を、コードするアミノ酸配列は変更せずに、宿主において使用頻度の高いコドンへ改変した塩基配列であってもよい。コドンの改変は、公知の遺伝子配列変異技術又は人工遺伝子合成によって行うことができる。
【００４４】
配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、塩基配列情報に基づいて化学的に合成してもよく、ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１をコードする遺伝子（以下、「ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１遺伝子」ということがある。）の全長若しくはセロビオハイドロラーゼ触媒領域を含む部分領域を遺伝子組換え技術によって自然界から取得したものであってもよい。ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１遺伝子の全長又はその部分領域は、例えば、自然界から微生物を含むサンプルを取得し、前記サンプルから回収されたゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号２で表される塩基配列に基づいて常法により設計したフォワードプライマーとリバースプライマーを用いてＰＣＲを行うことによって得ることができる。前記サンプルから回収したｍＲＮＡを鋳型として逆転写反応により合成されたｃＤＮＡを鋳型としてもよい。
【００４５】
前記（ｄ）の塩基配列において、配列番号２で表される塩基配列との配列同一性は、８０％以上１００％未満であれば特に限定されないが、８５％以上１００％未満であることが好ましく、９０％以上１００％未満であることがより好ましく、９５％以上１００％未満であることがさらに好ましく、９８％以上１００％未満であることがよりさらに好ましい。
【００４６】
なお、塩基配列同士の配列同一性（相同性）は、２つの塩基配列を、対応する塩基が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除く塩基配列全体に対する一致した塩基の割合として求められる。塩基配列同士の配列同一性は、前記技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。本発明における塩基配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＮにより得られたアライメントを元にした計算によって得られる。
【００４７】
例えば、前記（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、１又は２以上の塩基を欠失、置換若しくは付加させることによって人工的に合成することができる。また、前記（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）の塩基配列としては、ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１遺伝子のホモログ遺伝子の全長配列又はその部分配列であってもよい。ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１遺伝子のホモログ遺伝子は、塩基配列が既知の遺伝子のホモログ遺伝子を取得する際に用いられる遺伝子組換え技術によって取得することができる。
【００４８】
本発明に係るポリヌクレオチドは、セロビオハイドロラーゼ触媒領域をコードする領域のみを有するものであってもよく、前記領域に加えて、セルロース結合モジュール、リンカー配列、各種シグナルペプチド、各種タグ等をコードする領域を有していてもよい。
【００４９】
［発現ベクター］
本発明に係る発現ベクターは、前記本発明に係るポリヌクレオチドが組込まれており、宿主細胞において、少なくとも６５℃、ｐＨ６の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る。すなわち、前記本発明に係るポリヌクレオチドが、前記本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現し得る状態で組込まれた発現ベクターである。具体的には、上流から、プロモーター配列を有するＤＮＡ、前記本発明に係るポリヌクレオチド、ターミネーター配列を有するＤＮＡからなる発現カセットとして発現ベクターに組込まれていることが必要である。なお、ポリヌクレオチドの発現ベクターへの組込みは、周知の遺伝子組み換え技術を用いることにより行うことができ、市販の発現ベクター作製キットを用いてもよい。
【００５０】
前記発現ベクターとしては、大腸菌等の原核細胞へ導入される発現ベクターであってもよく、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞、植物細胞等の真核細胞へ導入される発現ベクターであってもよい。これらの発現ベクターとしては、それぞれの宿主に応じて通常用いられる任意の発現ベクターを用いることができる。
【００５１】
本発明に係る発現ベクターは、前記本発明に係るポリヌクレオチドのみならず、薬剤耐性遺伝子等も組込まれた発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターにより形質転換された細胞と形質転換されていない細胞の選抜を容易に行うことができるためである。前記薬剤耐性遺伝子としては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子等が挙げられる。
【００５２】
［形質転換体］
本発明に係る形質転換体は、本発明に係る発現ベクターが導入されている。前記形質転換体中では、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現させ得る。従来公知のセロビオハイドロラーゼは、現宿主のレンジが狭い、つまり、異種発現が難しいものが多い。これに対して、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、大腸菌、酵母、糸状菌、高等植物葉緑体等、広範な発現宿主に発現させることができる。このため、発現ベクターを導入する宿主としては、大腸菌等の原核細胞であってもよく、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞、又は植物細胞等の真核細胞であってもよい。すなわち、本発明に係る形質転換体としては、本発明に係る発現ベクターが導入された大腸菌、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞、植物細胞等である。大腸菌の形質転換体を培養することにより、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼを、より簡便かつ大量に生産することができる。一方で、真核細胞内ではタンパク質に糖鎖修飾が施されるため、真核細胞の形質転換体を用いることにより、原核細胞の形質転換体を用いた場合よりも、より耐熱性に優れた耐熱性セロビオハイドロラーゼを生産し得る。
【００５３】
発現ベクターを用いて形質転換体を作製する方法は、特に限定されるものではなく、形質転換体を作製する場合に通常用いられている方法により行うことができる。前記方法として、例えば、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、及びＰＥＧ（ポリエチレングリコール）法等が挙げられる。このうち、宿主が植物細胞である場合には、パーティクルガン法又はアグロバクテリウム法で行うことが好ましい。
【００５４】
宿主として、原核細胞、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、又は哺乳培養細胞等を用いた場合には、得られた形質転換体は、一般的には、形質転換前の宿主と同様にして、常法により培養することができる。
【００５５】
［耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法］
本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法は、前記本発明に係る形質転換体内で、耐熱性セロビオハイドロラーゼを生産させる方法である。前記本発明に係るポリヌクレオチドが、発現の時期等の制御能を有していないプロモーターの下流に組込まれている発現ベクターを用いて製造された形質転換体では、この形質転換体を培養することによって、前記形質転換体内で、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼを恒常的に発現させることができる。一方で、特定の化合物や温度条件等によって発現を誘導するいわゆる発現誘導型プロモーターを用いて製造された形質転換体では、この形質転換体を培養し、かつそれぞれの発現誘導条件に適した誘導処理を行うことによって、前記形質転換体内で、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現させることができる。
【００５６】
形質転換体によって生産された耐熱性セロビオハイドロラーゼは、前記形質転換体内に留めた状態で使用してもよく、前記形質転換体から抽出・精製してもよい。
【００５７】
形質転換体から耐熱性セロビオハイドロラーゼを抽出又は精製する方法は、耐熱性セロビオハイドロラーゼの活性を損なわない方法であれば、特に限定されるものではなく、細胞や生体組織からポリペプチドを抽出する場合に通常用いられている方法によって抽出することができる。前記方法としては、例えば、形質転換体を適当な抽出バッファーに浸し、耐熱性セロビオハイドロラーゼを抽出した後、抽出液と固形残渣に分離する方法が挙げられる。前記抽出バッファーとしては、界面活性剤等の可溶化剤を含有するものが好ましい。形質転換体が植物である場合には、抽出バッファーに浸す前に、予め前記形質転換体を細断又は粉砕しておいてもよい。また、抽出液と固形残渣を分離する方法としては、例えば、濾過方法、圧縮濾過方法、又は遠心分離処理方法等の公知の固液分離処理を用いることができ、抽出バッファーに浸した状態の形質転換体を搾ってもよい。抽出液中の耐熱性セロビオハイドロラーゼは、塩析法、限外濾過法、又はクロマトグラフィー法等の公知の精製方法を用いて精製することができる。
【００５８】
本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼを、形質転換体内で分泌型シグナルペプチドを有する状態で発現させた場合には、前記形質転換体を培養した後、得られた培養物から形質転換体を除いた培養液上清を回収することにより、簡便に耐熱性セロビオハイドロラーゼを含む溶液を得ることができる。また、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼが、Ｈｉｓタグ等のタグを有している場合、前記タグを利用したアフィニティクロマトグラフィ法により、抽出液や培養上清中の耐熱性セロビオハイドロラーゼを簡便に精製することができる。
【００５９】
すなわち、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法は、前記本発明に係る形質転換体内で、耐熱性セロビオハイドロラーゼを生産すること、及び所望により前記形質転換体から前記耐熱性セロビオハイドロラーゼを抽出し精製することを含む。
【００６０】
［グリコシド加水分解酵素混合物］
本発明に係るグリコシド加水分解酵素混合物は、前記本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼ、又は前記本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された耐熱性セロビオハイドロラーゼと、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素とを含む。前記本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された耐熱性セロビオハイドロラーゼは、形質転換体内に含まれた状態のものであってもよく、形質転換体から抽出又は精製されたものであってもよい。本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼを、その他のグリコシド加水分解酵素との混合物としてセルロースの分解反応に用いることにより、難分解性であるセルロース、ヘミセルロース及びリグニンを含むリグノセルロースからなる材料をより効率よく分解させることができる。
【００６１】
前記グリコシド加水分解酵素混合物に含まれる前記耐熱性セロビオハイドロラーゼ以外のその他のグリコシド加水分解酵素としては、セルロースの加水分解活性を有するものであれば特に限定されるものではない。前記グリコシド加水分解酵素混合物に含まれる前記耐熱性セロビオハイドロラーゼ以外のその他のグリコシド加水分解酵素としては、例えば、キシラナーゼ、若しくはβ−キシロシダーゼ等のヘミセルラーゼ、セロビオハイドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、又はエンドグルカナーゼ等が挙げられる。本発明に係るグリコシド加水分解酵素混合物としては、前記耐熱性セロビオハイドロラーゼに加えて、さらにヘミセルラーゼとエンドグルカナーゼの少なくとも一方のグリコシド加水分解酵素を含む混合物が好ましく、前記耐熱性セロビオハイドロラーゼに加えて、さらにヘミセルラーゼとエンドグルカナーゼの両方のグリコシド加水分解酵素を含む混合物がより好ましい。中でも、前記耐熱性セロビオハイドロラーゼに加えて、さらに、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、セロビオハイドロラーゼ、及びエンドグルカナーゼからなる群より選択される少なくとも１種のグリコシド加水分解酵素を含む混合物が好ましく、前記耐熱性セロビオハイドロラーゼに加えて、さらに、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、セロビオハイドロラーゼ、及びエンドグルカナーゼの全てのグリコシド加水分解酵素を含む混合物がより好ましい。
【００６２】
前記グリコシド加水分解酵素混合物としては、少なくとも前記耐熱性セロビオハイドロラーゼとＧＨ６ファミリーのセロビオハイドロラーゼの両方を含むことが特に好ましい。前記熱性セロビオハイドロラーゼとＧＨ６ファミリーのセロビオハイドロラーゼを併用することにより、それぞれ単独で使用した場合よりも、より高いセロビオハイドロラーゼ活性が得られるためである。
【００６３】
前記グリコシド加水分解酵素混合物に含まれるその他のグリコシド加水分解酵素は、少なくとも６５℃でグリコシド加水分解活性を有する耐熱性グリコシド加水分解酵素であることが好ましく、６５〜８０℃でグリコシド加水分解活性を有する耐熱性グリコシド加水分解酵素であることがより好ましい。前記グリコシド加水分解酵素混合物に含まれる全ての酵素が耐熱性であることにより、前記グリコシド加水分解酵素混合物によるセルロースの分解反応を高温条件下で効率よく行うことができる。すなわち、前記グリコシド加水分解酵素混合物が耐熱性グリコシド加水分解酵素のみを含む場合、前記グリコシド加水分解酵素混合物を前記リグノセルロースからなる材料の糖化処理に用いることにより、糖化温度６５〜８０℃の高温環境下で前記材料の加水分解反応を行うことが可能になる。この高温糖化により、酵素量と糖化時間を著しく減らすことができ、糖化コストが大幅に削減される。
【００６４】
［セルロース分解物の製造方法］
本発明に係るセルロース分解物の製造方法は、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼにより、セルロースを加水分解して生じたオリゴ糖を単糖に加水分解することを含む、セルロース分解物（例えば、グルコース等の単糖を含む分解物）を得る方法である。セルロース分解物の製造方法は、具体的には、セルロースからなる材料、、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼ、本発明に係る形質転換体、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された耐熱性セロビオハイドロラーゼ、又は本発明に係るグリコシド加水分解酵素混合物に接触させることにより、例えばセルロースの分解物を含む前記セルロースからなる材料の分解物を生産する方法である。
【００６５】
前記セルロースを含む材料としては、セルロースが含まれていれば特に限定されるものではない。前記材料としては、例えば、雑草や農業系廃棄物等のセルロース系バイオマス、又は古紙等が挙げられる。前記材料は、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼと接触させる前に、破砕若しくは細断等の物理的処理、酸若しくはアルカリ等による化学処理、又は適当なバッファーへの浸漬又は溶解処理等を行っておくことが好ましい。
すなわち、本発明に係るセルロース分解物の製造方法は、前記セルロースからなる材料を、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼと接触させる前に、物理的処理すること、化学処理すること、又はバッファーへの浸漬又は溶解処理することを、さらに含んでもよい。
【００６６】
本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼによるセルロースの加水分解反応の反応条件は、前記耐熱性セロビオハイドロラーゼがセロビオハイドロラーゼ活性を示す条件であればよい。例えば、２価金属イオン非存在下では、５５〜６５℃、かつｐＨ５．５〜７．０で反応を行うことが好ましく、６０〜６５℃、かつｐＨ５．５〜７．０で反応を行うことがより好ましい。また、２価金属イオン存在下では、５５〜７５℃、かつｐＨ５．５〜７．０で反応を行うことが好ましく、６５〜７５℃、かつｐＨ５．５〜７．０で反応を行うことがより好ましい。前記加水分解反応の反応時間は、加水分解に供される前記材料の種類、前処理の方法、又は量等を考慮して適宜調整される。例えば、１０分間〜１００時間、セルロース系バイオマスを含む材料を分解する場合には、１〜１００時間の反応時間で前記加水分解反応を行うことができる。
【００６７】
前記セルロースからなる材料の加水分解反応には、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼに加えて、さらに少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素を用いることも好ましい。前記その他のグリコシド加水分解酵素としては、前記グリコシド加水分解酵素混合物に含められるグリコシド加水分解酵素と同様のものを用いることができ、少なくとも６５℃で、好ましくは少なくとも６５〜８０℃でグリコシド加水分解活性を有する耐熱性グリコシド加水分解酵素であることが好ましい。また、前記セルロース分解物の製造方法の１つの側面は、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼ、本発明に係る形質転換体、又は本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された耐熱性セロビオハイドロラーゼを用いることであり、前記グリコシド加水分解酵素混合物を用いることである。
【実施例】
【００６８】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６９】
［実施例１］堆肥培養サンプルからの新規耐熱性セロビオハイドロラーゼのクローニング
＜１＞  堆肥培養サンプルからのＤＮＡ抽出及び全ゲノムシーケンス（Ｗｈｏｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＷＧＳ）
耐熱性セロビオハイドロラーゼ（至適温度：５５℃以上）の遺伝子探索を目的として、堆肥培養サンプルを構成する微生物叢ゲノムＤＮＡの塩基配列解読を行った。
堆肥培養サンプルＷＮ１２−Ａ３は、次のようにして調製した。まず、堆肥を採取した。採取時の堆肥の温度は、２５〜７２℃であった。次いで、表１に記載の改変ＡＧＳ液体培地２０ｍＬに、採取した堆肥約０．５ｇと、炭素源として厚紙１．５ｃｍ角２枚（約２５０ｍｇ、Ｇｅｌ−Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｐａｐｅｒ  ＧＢ００５、Ｗｈａｔｍａｎ社製）及び再生セルロース製透析チューブ（スペクトラＲＣ透析チューブ  ポア７ 、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）１．２ｃｍ×１．５ｃｍを１枚添加し、１２５ｍＬ容バッフル付き三角フラスコを用いて６５℃、１２０ｒｐｍで回転振盪培養した。培養１週間後に、当該三角フラスコ内の炭素源の消失及び菌の増殖を確認した後、培養液０．５ｍＬを新たな改変ＡＧＳ液体培地２０ｍＬに植え継ぎ、前記と同様に炭素源を添加して培養した。植え継ぎを３回繰り返した後、遠心分離処理（５，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）によって菌体を回収した。
【００７０】
【表１】
0006677554.tif 000002
【００７１】
回収された菌体から、ＤＮＡ抽出キット（ＩＳＯＩＬ  ｆｏｒ  Ｂｅａｄｓ  Ｂｅａｔｉｎｇ、ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ社製）を用いてＤＮＡを抽出した。抽出されたＤＮＡのうち１μｇに対して、ロシュダイアグノスティックス社製のＧＳ  ＦＬＸ＋  ４５４を用いて、ゲノムＤＮＡのショットガンシーケンスを行った。
堆肥培養サンプルＷＮ１２−Ａ３（以下、「ＷＮ１２−Ａ３メタゲノム」と呼ぶことがある）についてゲノムＤＮＡの配列解読を行い、平均リード長３６３ｂｐ、総リード数３，２５７，２９１個、総ゲノム解読量１．１８７Ｇｂｐの全ゲノムシーケンス（ＷＧＳ）データセットを得た。
【００７２】
＜２＞  堆肥培養サンプルのゲノムデータのアセンブルと統計量
Ｒｏｃｈｅ  ４５４の出力（ｓｆｆファイル）をＰｙｒｏＢａｙｅｓ（Quinlan et al., Nature Methods，2008，vol.5，p.179-81.）にて再ベースコールし、ＦＡＳＴＡ形式の配列ファイル及びＱｕａｌｉｔｙ値ファイルを取得した。得られたシーケンスリードは、端を切り落とし品質を上げ、４５４  Ｌｉｆｅ  ＳｃｉｅｎｃｅｓのアセンブルソフトウェアＮｅｗｂｌｅｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．７を使ってアセンブルした。アセンブルは、「ｍｉｎｉｍｕｍ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｍａｔｃｈ  （ｍｉ）＝０．９」、「ｏｐｔｉｏｎ：−ｌａｒｇｅ（ｆｏｒ  ｌａｒｇｅ  ｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｇｅｎｏｍｅｓ，ｓｐｅｅｄｓ  ｕｐ  ａｓｓｅｍｂｌｙ，ｂｕｔ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ａｃｃｕｒａｃｙ．)」に設定して行った。
１００ｂｐ以上にアセンブルされた総コンティグ長は、 合計３２，３５２，７８１ｂｐであり、このデータセットをセルラーゼ酵素遺伝子解析に用いた。リード総数３，２５７，２９１リードのうち２，８３０，１６４リードが、２０，６２１のコンティグコンティグにアセンブルされた。これらコンティグの平均長は１，４８１ｂｐで、最大コンティグ長は６６，８３６ｂｐであった。
【００７３】
＜３＞  セロビオハイドロラーゼのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）予測
ＵｎｉＰｒｏｔデータベース（http://www.uniprot.org/）からＥＣ番号が３．２．１．４（セルラーゼ）、３．２．１．２１（β−グルコシダーゼ)、３．２．１．３７（β−キシロシダーゼ) 、３．２．１．９１（セルロース  １，４−β−セロビオシダーゼ)、３．２．１．８（エンド１，４−β−キシラナーゼ）の配列をダウンロードし（アクセス日：２０１１／１２／９）、これらグリコシド加水分解酵素遺伝子のプロテオームローカルデータベースを構築した。アノテーションソフトウェアＭｅｔｅＧｅｎｅＡｎｏｔａｔｏｒ（Noguchi et al.，MetaGeneAnnotator: Detecting Species-Specific Patterns of Ribosomal Binding Site for Precise Gene Prediction in Anonymous Prokaryotic and Phage Genomes, DNA Res. 2008, 15, 387-396.)を使用して、前記＜２＞で得たコンティグ配列から、遺伝子領域（＝オープンリーディングフレーム）を推定した。推定されたＯＲＦからグリコシド加水分解酵素遺伝子を抽出するために、ＢＬＡＳＴＰ（ｂｌａｓｔａｌｌ  ｖｅｒ. ２．２．１８）を使い、前記ローカルデータベースに参照した。ＢＬＡＳＴＰのｏｐｔｉｏｎ条件は、「Ｆｉｌｔｅｒ  ｑｕｅｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ＝ｆａｌｓｅ」、「Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ  ｖａｌｕｅ（Ｅ）＜１ｅ−２０」［以下、デフォルト値：Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ａ  ｇａｐ＝−１、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｇａｐ＝−１、Ｘ  ｄｒｏｐｏｆｆ  ｖａｌｕｅ  ｆｏｒ  ｇａｐｐｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ＝０、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｆｏｒ  ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ  ｈｉｔｓ＝０、Ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ＝ｄｅｆａｕｌｔ］とし、ヒットした配列をグリコシド加水分解酵素遺伝子として収集した。
【００７４】
＜４＞  遺伝子のグリコシド加水分解酵素（ＧＨ）ファミリー分類
前記＜３＞で収集されたセルラーゼ、エンドヘミセルラーゼ、脱分岐酵素等のグリコシド加水分解酵素を含む配列についてについて、タンパク質の機能領域配列データベースｐｆａｍ  ＨＭＭｓ（Ｐｆａｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２３．０  ａｎｄ  ＨＭＭＥＲ  ｖ２．３；Finn et al.，Nucleic Acids Research Database，2010，Issue 38，p.D211-222)を基準に、機能分類を行った。具体的には、タンパク質モチーフ検索プログラムＨＭＭＥＲ（Durbin et al.，‘The theory behind profile HMMs. Biological sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic acids’, 1998，Cambridge University Press.；ｈｍｍｐｆａｍ（Ｖｅｒ．２．３．２）、Ｅ−ｖａｌｕｅ  ｃｕｔｏｆｆ＜１ｅ−５; Ｄａｔａｂａｓｅ＝Ｐｆａｍ＿ｆｓ（ｍｏｄｅｌｓ  ｔｈａｔ  ｃａｎ  ｂｅ  ｕｓｅｄ  ｔｏ  ｆｉｎｄ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ａ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．))を用いて、Ｐｆａｍ領域データベースとの相同性からグリコシド加水分解酵素（ＧＨ）ファミリーを決定した。
【００７５】
堆肥培養サンプルＷＮ１２−Ａ３のシーケンスデータを用いたＢＬＡＳＴＰによる相同性検索及びｐｆａｍ  ＨＭＭｓにより、１０個のＯＲＦ（完全長ＯＲＦが６個、不完全長ＯＲＦが４個）がセロビオハイドロラーゼ遺伝子と予測された。ＧＨファミリー分類を表２に示す。表２に示すように、ＧＨファミリー１６及びＧＨファミリー１８に属するセロビオハイドロラーゼの完全長ＯＲＦが１個ずつ、ＧＨファミリー２６及びＧＨファミリー５３に属する完全長ＯＲＦが２個ずつ、堆肥培養サンプルＷＮ１２−Ａ３のゲノムデータから得られた。全てのＯＲＦについて、プライマーを設計し、堆肥培養サンプル由来ＤＮＡからＰＣＲにより遺伝子をクローニングした。この結果、ＧＨファミリー４８に属しセロビオハイドロラーゼ配列を持つオープンリーディングフレームＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４から、セロビオハイドロラーゼ遺伝子ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１が単離された。
【００７６】
【表２】
0006677554.tif 000003
【００７７】
＜５＞  オープンリーディングフレームＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４
オープンリーディングフレームＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４は、７８４アミノ酸残基からなるポリペプチド（配列番号１）をコードし、１位のアミノ酸残基がメチオニン（Ｍ）から開始しているが、３’末端は終始コドンで終わっていない不完全長配列（配列番号２）であった。モチーフの配列相同性から、オープンリーディングフレームＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４は、１位のメチオニンから４０位のアラニン（Ａ）までの４０アミノ酸残基が分泌シグナル（ＳｉｇｎａｌＰ  ４．１）であり、４７位のアルギニン（Ｒ）から７４１位のロイシン（Ｌ）までの６９５アミノ酸残基がＧｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ４８の触媒領域をコードしていると推測された。当該ＯＲＦは、細菌ファーミキューテス門パエニバチルス・サブスピーシーズ  ＦＳＬ  Ｈ７−６８９のセルロース１，４−β−セロビオシダーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ  登録ＩＤ：ＥＴＴ５０５０２．１）（配列番号７）とＧＨ４８触媒領域で７７％のアミノ酸配列同一性を示す、新規な配列であった。配列相同性は、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムにより算出した。
【００７８】
図１に、オープンリーディングフレームＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４がコードすると推定されるポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１）とパエニバチルス・サブスピーシーズ  ＦＳＬ  Ｈ７−６８９のセルロース１，４−β−セロビオシダーゼのアミノ酸配列（配列番号７）のアライメントを示す。図１中、黒白反転のアミノ酸は、これらの全アミノ酸配列において同一アミノ酸残基（identical）を示し、「−」は欠失（ギャップ）を示す。
【００７９】
＜６＞  セロビオハイドロラーゼ遺伝子ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１
ＰＣＲクローニングにより、セロビオハイドロラーゼ遺伝子のオープンリーディングフレームとして予測されたオープンリーディングフレームＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４（配列番号１）からセロビオハイドロラーゼ遺伝子ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１を単離した。ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１遺伝子は、オープンリーディングフレームＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４と全て同一の２，３５２ｂｐからなる塩基配列を含んでいた。
【００８０】
＜７＞  セロビオハイドロラーゼ酵素タンパク質の発現及び精製
配列番号５で表される塩基配列からなるフォワードプライマー（５’−ＧＴＧＡＴＧＡＴＧＣＡＧＧＧＡＡＴＣＧＴＴＣＧＡ−３’：配列番号３で表される塩基配列の５’末端側に３塩基（ＧＴＧ）付加し、５’末端をリン酸化したもの。）と配列番号６で表される塩基配列からなるリバースプライマー（５’−ＡＴＧＣＡＡＡＧＣＴＴＴＴＡＧＧＴＧＧＣＧＣＧＣＴＴＣＡＣＣＧＴＧ−３’：配列番号４で表される塩基配列の５’末端側に終止コドン及び制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ認識配列を付加したもの。Ｈｉｎｄ  ＩＩＩはベクターへの挿入に利用する配列である。）を用い、ＰＣＲクローニングにより単離したＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１遺伝子を鋳型としてＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ社製)で増幅したＰＣＲ産物をｐＬＥＡＤ５ベクター（ニッポン・ジーン社製）へ挿入し、大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。なお、配列番号３で表される塩基配列は、配列番号２で表される塩基配列の１〜２１位の塩基からなる部分配列と相同的な（同一の）塩基配列である。また、配列番号４で表される塩基配列は、配列番号２で表される塩基配列の２，３３４〜２，３５２位の塩基からなる部分配列と相補的な塩基配列である。コロニーＰＣＲによりポジティブクローンを選抜し、５０ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃、２００ｒｐｍで１７〜２０時間培養した後、ミニプレップキット（Ｗｉｚａｒｄ  ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてプラスミドの調製を行った。調製したプラスミドは、シーケンサー（ライフテクノロジーズ社の３７３０  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いて配列確認を行った。
【００８１】
シーケンス確認されたＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１／ｐＬＥＡＤ５プラスミドを持つ形質転換大腸菌クローンを、５０ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むＴｕｒｂｏ  Ｂｒｏｔｈ培地（アテナ  エンバイロメンタル  サイエンス社製）に植菌し、 約２０時間培養することによって目的タンパク質を発現させた。培養後、遠心分離処理を行って大腸菌を回収し、培養液の１／１０容量の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）を加えて懸濁した。その後、超音波破砕装置ａｓｔｒａｓｏｎ３０００（ＭＩＳＯＮＩＸ社製）を用いて、５分間破砕−５分間休止工程を７〜８サイクル繰返し、目的タンパク質を含む遺伝子組換え大腸菌の粗抽出物を得た。前記遺伝子組換え大腸菌粗抽出物をフィルター（孔径φ＝０．４５μｍ、ミリポア社製）で濾過し、得られた濾液を遺伝子組換え大腸菌破砕上清とした。
【００８２】
前記遺伝子組換え大腸菌破砕上清を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化したイオン交換カラムＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）に充填し、中高圧液体クロマトグラフィーシステムＡＫＴＡ  ｄｅｓｉｇｎ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）にて０〜５０％の濃度勾配でタンパク質を分画した。セロビオハイドロラーゼ活性のあった分画は、まとめて混合した後、遠心式の限外濾過膜ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ２０（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ｓｔｅｄｉｍ社製）によって７５０ｍＭの硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）へ溶液交換した。溶液交換後のセロビオハイドロラーゼ活性分画を、同液で平衡化した疎水性相互作用分離カラムＨｉＴｒａｐ  Ｐｈｎｅｎｙｌ  ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）に充填し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）にて０〜１００％の濃度勾配でタンパク質を分画した。セロビオハイドロラーゼ活性のあった分画は、まとめて混合した後に、液量が８ｍＬ程度になるまでＶＩＶＡＳＰＩＮ  ２０を用いて濃縮した。濃縮したサンプルは、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化したゲル濾過カラムＨｉｌｏａｄ２６／６０  ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  ｐｇ（ＧＥヘルスケア社製）に添加し、カラム体積の１〜１．５倍容の同バッファーを流速２〜３ｍＬ／分で流すことによって分画した。セロビオハイドロラーゼ活性のあった分画は、まとめて混合した後、ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ２０によって５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）への溶液交換と濃縮を行い、ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰを用いて、前記と同様にしてタンパク質を分画した。セロビオハイドロラーゼ活性のあった分画は、まとめて混合した後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）への溶液交換と濃縮を行い、終濃度約１ｍｇ／ｍＬの精製酵素を得た。
【００８３】
遺伝子組換え大腸菌破砕上清と精製酵素（精製したセロビオハイドロラーゼ酵素タンパク質）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により確認した。遺伝子組換え大腸菌破砕上清と精製酵素のＳＤＳ電気泳動は、ミニプロティアンＴＧＸステインフリーゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて行った。前記上清又は精製酵素を、それぞれＴｒｉｓ−ＳＤＳ βＭＥ処理液（コスモバイオ社製）と１：１で混合した泳動用サンプルを、１００℃で１０分間処理した後、１サンプルあたり、遺伝子組換え大腸菌破砕上清は１０μＬ、精製酵素は０．５μｇをそれぞれ泳動させた。泳動終了後、ＣＢＢ染色によって、タンパク質のバンドを検出した。
【００８４】
図２に、ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１遺伝子を導入した形質転換大腸菌から調製された遺伝子組換え大腸菌破砕上清及び前記遺伝子組換え大腸菌破砕上清から精製された精製酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す。レーン１はタンパク質質量指標、レーン２は遺伝子組換え大腸菌破砕上清、レーン３は精製酵素の電気泳動パターンである。この結果、前記遺伝子組換え大腸菌破砕上清（レーン２）において、アミノ酸配列（配列番号１）から予想される質量８６．９ｋＤａ近傍に強いバンドが認められ、精製酵素（レーン３）では、前記バンドに対応する単一バンドが認められた（図中、矢印）。
【００８５】
＜８＞  ＰＳＡを基質としたセロビオハイドロラーゼ活性
ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１遺伝子がコードする酵素タンパク質（ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１）のＰＳＡを基質としたセロビオハイドロラーゼ活性を調べた。計測には、前記＜７＞で得られた精製酵素を０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で１ｍｇ／ｍＬに希釈して用いた。
【００８６】
基質として用いるＰＳＡは、リン酸溶液でアビセル粉末（微結晶性セルロース粉末、Ｍｅｒｃｋ社製）を一旦溶解させた後に滅菌蒸留水を加えて析出させた後、ｐＨが５以上になるまで洗浄することによって調製した。なお、以降の実験に用いたＰＳＡは全て当該方法により調製した。
【００８７】
反応容器には１．５ｍＬ容のサンプルチューブを使用し、反応液の組成は、１０μＬの希釈した精製酵素、４０μＬの精製水、 ５０μＬの２００ｍＭ  酢酸バッファー（ｐＨ６）、１００ μＬの１質量％  ＰＳＡ溶液とした。全ての計測において、精製酵素溶液の代わりに５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）を入れて同条件で反応させた混合液をコントロール区とした。また、精製酵素溶液、精製水、及びバッファーの混合液と、基質溶液とは、反応温度で５分間それぞれ別々に保温（プリインキュベーション）した後に混合し、反応開始とした。反応中はいずれの混合液もサーモミキサー（エッペンドルフ社製）を用いて所定の温度とした。２０分間の反応終了後は、各反応液に対して等量の３，５−ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＤＮＳ溶液）を加えて１００℃で５分間加熱処理し、５分間の氷冷後に、１７，５００ｇで５分間、室温で遠心分離処理し、上清を得た。上清中の還元糖量を、分光光度計を用いて５４０ｎｍの吸光度を計測し、グルコースで作成した検量線を用いて算出し、コントロール区との差分から酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求めた。１分間に１μｍｏｌの還元糖を生成する酵素活性を１Ｕとし、タンパク質量で除した値を比活性（Ｕ／ｍｇ）とした。各計測は、３回の独立した試行により行い、平均値と標準誤差を求めた。
【００８８】
＜９＞  ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１の基質特異性
酵素タンパク質ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１に対して、様々なセルロース基質及びヘミセルロース基質に対する加水分解活性を調べた。計測には、前記＜７＞で得られた精製酵素を０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で１ｍｇ／ｍＬに希釈して用いた。また、基質として、ＰＳＡ、アビセル粉末、ＣＭＣ（Ｓｉｇｍａ社製)、キシラン（ブナ材由来、Ｓｉｇｍａ社製）、リケナン（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）、ラミナリン（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｄｉｇｉｔａｔａ由来、Ｓｉｇｍａ社製）、ＰＮＰＣ（Ｓｉｇｍａ社製）、ＰＮＰＧ（Ｓｉｇｍａ社製）を用いた。
【００８９】
具体的には、ＰＳＡ、アビセル粉末、ＣＭＣ、キシラン、リケナン、又はラミナリンを基質とする場合には、基質溶液として１質量％の各水溶液を用いて６５℃で反応させた以外は前記＜８＞と同様にして、酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求め、比活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。なお、キシランの測定においては、キシロースで作成した検量線を用いた。
ＰＮＰＣ又はＰＮＰＧを基質とする場合には、基質溶液として１０ｍＭの各水溶液を用いて６５℃で反応させた以外は前記＜８＞と同様にして、２０分間反応させ、等量の２００ｍＭ  炭酸ナトリウム水溶液を加えて、５分間遠心分離処理し、上清を得た。上清中のｐ−ニトロフェノール量を、分光光度計を用いて４２０ｎｍの吸光度を計測し、ｐ−ニトロフェノールで作成した検量線を用いて算出し、コントロール区との差分から酵素の加水分解によって生成したｐ−ニトロフェノール量を求めた。１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを生成する酵素活性を１Ｕとし、タンパク質量で除した値を比活性（Ｕ／ｍｇ）とした。
【００９０】
測定結果を図３に示す。この結果、ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１はＰＳＡに対し加水分解活性を示し、アビセル及びリケナンに対しても弱い加水分解活性を示したが、ＣＭＣ、ラミナリン、キシラン、 ＰＮＰＧ、ＰＮＰＣに対してはほとんど加水分解活性を示さなかった。
【００９１】
＜１０＞  ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１のセロビオハイドロラーゼ活性の温度及びｐＨ依存性
ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１のＰＳＡ加水分解活性の温度依存性を調べた。具体的には、反応温度を、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、又は８５℃とした以外は、前記＜８＞と同様に行い、酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求め、ＰＳＡ加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
また、４０μＬの精製水の代わりに１０ｍＭ  ＣａＣｌ２水溶液を加えた反応液でも同様に測定し、酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求め、ＰＳＡ加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
【００９２】
結果を図４に示す。ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１は、カルシウムイオン非存在下（図中、「ＰＳＡ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｔ  ｐＨ６」）では、温度範囲５０〜７０℃においてＰＳＡ加水分解活性を示した。また、カルシウムイオン存在下（図中、「＋２ｍＭ  Ｃａ２＋」）では、５５〜７５℃においてＰＳＡ加水分解活性を示した。最も高い活性を示した至適温度（Ｔｏｐｔ）は、カルシウムイオン非存在下で６５℃であり、それ以上の温度では活性が急速に低下した。一方、カルシウムイオン存在下では、至適温度は６５℃であったが、７５℃まで活性の大きな低下は見られなかった。７５℃における活性は、至適温度における活性の８７％を維持した。
【００９３】
ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１のＰＳＡ加水分解活性のｐＨ依存性を調べた。具体的には、５０μＬの２００ｍＭ  マッキルベインバッファー（ｐＨ４〜８）を用い、６０℃で反応させた以外は、前記＜８＞と同様に行い、酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求め、ＰＳＡ加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
【００９４】
結果を図５に示す。ｐＨは、基質とバッファーと酵素の混合液の実測値をプロットした。ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１は、ｐＨ５〜７の範囲において、ＰＳＡ加水分解活性を示した。至適ｐＨは６．１８（基質、バッファーと酵素の混合液の実測値）であった。
【００９５】
＜１１＞ＧＨ６セロビオハイドロラーゼとＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１とを混合した場合のセロビオハイドロラーゼ活性
ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１とＧＨ６セロビオハイドロラーゼとの混合によるセルロース加水分解活性を調べた。ＧＨ６セロビオハイドロラーゼとしてはＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡ（配列番号８）を用い、全酵素量は変えずに、ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１との混合比（質量比）を１０：０〜０：１０まで変化させ、ＰＳＡ加水分解活性及びアビセル加水分解活性を測定した。具体的には、１０μＬの精製酵素の混合液と、４０μＬの１０ｍＭ  ＣａＣｌ２溶液と、５０μＬの２００ｍＭ  酢酸バッファー（ｐＨ６）と、１００μＬの１質量％ＰＳＡ又はアビセル水溶液とからなる反応液を、ＰＳＡについては７０℃で２０分間、アビセルについては７０℃で２時間反応させることにより行った。反応後は、前記＜８＞と同様にして、酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求め、比活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。酵素活性は、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡとＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１との混合比が１０：０（ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１の含有比率が０％）の活性を１００％とした相対値（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ、％）として示した。
【００９６】
結果を図６に示す。横軸は、全酵素量に対するＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１の割合（含有比率（％））である。図中、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡとＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１を併用することによるシナジー効果が無いと仮定した場合の理論値を点線で示した。ＰＳＡ加水分解活性とアビセル加水分解活性は共に、全ての混合比で理論値を上回っていたことから、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡとＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１とのシナジー効果が確認された。ＰＳＡ加水分解活性では、ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１の割合が２０％〜６０％の範囲で、アビセル加水分解活性では、ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１の割合が２０％〜４０％の範囲で、ＡＲ１９Ｇ−１６６−ＲＡを単独で用いた場合よりも分解活性が上昇することが確認された。最大値は、ＰＳＡ加水分解活性とアビセル加水分解活性のいずれも、ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１の割合が２０％〜４０％の時であり、分解活性の上昇率はそれぞれ約４０％と約５０％であった。このように、ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１は、ＧＨ６ファミリーのセロビオハイドロラーゼとのシナジー効果によって、それぞれ単独で用いた場合の分解活性に比較して、最大で約５０％のセロビオハイドロラーゼ活性の上昇を示すことから、セルロースの糖化処理の高効率化に好適である。
【００９７】
＜１２＞  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙによるセロビオハイドロラーゼの熱安定性測定
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ （ＤＳＦ）は、蛍光色素とリアルタイムＰＣＲ装置を用いて、タンパク質の熱変性を計測する方法の一つであり、様々なタンパク質に応用可能である。ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ等、ＤＳＦに使われる蛍光色素は、疎水性部位と結合する無極性条件下で蛍光を発し、一方、水に溶けた極性条件下では発光が抑えられる。通常、タンパク質はその熱変性温度において折畳み構造が解け、内部にある疎水性部位がタンパク質表面に露出する。この露出した疎水性部位にＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇが結合すると、波長４７０〜４８０ｎｍの励起光により、波長５９５ｎｍ付近にピークを持つ強い蛍光を発する。タンパク質溶液の温度を一定間隔で段階的に上昇させ、蛍光強度を計測することにより、熱変性温度（＝蛍光強度の変化点）が算出される。
【００９８】
計測には、前記＜７＞で得られた精製酵素ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１を水で１ｍｇ／ｍＬに調整した精製酵素溶液を用いた。
具体的には、９６穴ＰＣＲプレート（Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ  ９６  Ｗｅｌｌ  ＰＣＲ  Ｐｌａｔｅ  ＭＬＬ−９６５１、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）のウェルに１００倍希釈したＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ（ライフテクノロジーズ社製）を２μＬ、濃度１ｍｇ／ｍＬの精製酵素溶液を１μＬ、２００ｍＭ  酢酸バッファー（ｐＨ６）を５μＬ、精製水又は精製水と１０ｍＭ  ＣａＣｌ２を２：１で混合した溶液を１２μＬ加え、各ウェルの容積を２０μＬとした。ＰＣＲプレートはＯｐｔｉｃａｌ ８連フラットキャップ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）でシールし、リアルタイムＰＣＲ装置（ＣＦＸ９６  Ｔｏｕｃｈ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）で０．２℃ずつ、３０℃から１００℃までウェルの温度を上昇させ、ターゲット温度が達成されてから１０秒間経過した後、各ウェルの蛍光強度を同時計測した。波長帯域４５０〜４９０ｎｍの光発光ダイオード（ＬＥＤ）によりＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅを励起し、ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ放射光は５６０〜５８０ｎｍレンジの帯域通過フィルターを通し、ＣＣＤカメラで蛍光強度の計測を行い、蛍光強度変化を温度の関数としてプロットした。熱変性温度（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ；Ｔｍ値）は、温度関数である蛍光強度曲線の１階微分（図７（Ｂ）のＹ軸に示した「−ｄ(Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ)／ｄｔ」)の極小値として定義した。リアルタイムＰＣＲに付属の解析ソフトウェアＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製)を使い、データ解析を行った。各計測は、３回の独立した試行により行い、平均値と標準誤差を求めた。
【００９９】
図７には、ＤＳＦ法により計測したＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１の酵素タンパク質が示す、熱変性に伴って引き起こされるＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅの蛍光強度変化を示す。図７（Ａ）は実測データであり、図７（Ｂ）は図７（Ａ）の蛍光強度変化曲線の１階微分「−ｄ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）／ｄｔ」を示している。
【０１００】
ＷＮ１２−Ａ３−ｖ６−４−１０−１１の蛍光強度の一階微分は、６８℃付近に極小点を持ち、この温度で熱変性が起こることを示した。また、ＣａＣｌ２を加えた条件では７４℃付近に極小点を示した。熱変性温度の平均値は、それぞれ６７．６±０℃（ＣａＣｌ２無添加）と７４．１±０．１℃（ＣａＣｌ２添加）であり、カルシウムイオンによって熱変性温度が６．５℃上昇したことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、少なくとも６５℃、ｐＨ６の条件下でＰＳＡを基質とした加水分解活性を有しており、高温条件下におけるセルロース含有バイオマスの糖化処理に好適である。このため、当該耐熱性セロビオハイドロラーゼ及びその生産に用いられるポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクター、当該発現ベクターが導入されている形質転換体は、例えば、セルロース含有バイオマスからのエネルギー産生の分野において利用が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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