(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的サンプル中のアデノウイルス粒子の直接定量方法であって、
ａ）ウイルス粒子を含む生物学的サンプルを、緩衝溶液を含有するキャピラリーチューブに導入する工程と、
ｂ）前記サンプル中のアデノウイルス粒子とそのほかの成分との分離を可能にするのに十分な電圧の電界を前記キャピラリーチューブに印加して電気泳動画分を取得する工程と、
ｃ）前記電気泳動画分に関連するエレクトロフェログラムを作成する工程と、
ｄ）前記エレクトロフェログラムと既知濃度の前記アデノウイルス粒子の入った参照サンプルから作成されたエレクトロフェログラムとを比較することにより前記生物学的サンプル中のアデノウイルス粒子の濃度を決定する工程と、
を含み、
前記緩衝溶液が、約１００〜５００ｍＭの濃度のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと１００〜５００ｍＭの濃度のトリシンとを含み、かつ７．３〜８．９のｐＨを有し、前記キャピラリーチューブが、前記緩衝溶液でフラッシュおよび充填される前にリン酸溶液で逆方向にフラッシュされる、方法。
【請求項２】
前記緩衝溶液が、約１００〜３００ｍＭの濃度のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと１００〜４１２．５ｍＭの濃度のトリシンとを含み、かつ７．５〜８．５のｐＨを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記緩衝溶液が、約１００〜１５０ｍＭの濃度のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと３００〜３５０ｍＭの濃度のトリシンとを含み、かつ約７．５〜７．８のｐＨを有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記緩衝溶液が０．１〜０．３％ｖ／ｖの濃度のポリソルベート２０をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記キャピラリーチューブが中性被覆キャピラリーチューブである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記キャピラリーチューブがポリビニルアルコール（ＰＶＡ）またはフルオロカーボンポリマーで被覆されている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記リン酸溶液は、５〜２０ｍＭのリン酸を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記分離が約１５℃の温度で行われる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
１０，０００〜３０，０００ボルトの電界が印加される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記アデノウイルス粒子が組換えアデノウイルス粒子である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記アデノウイルス粒子が、５型アデノウイルス粒子、２６型アデノウイルス粒子、または３５型アデノウイルス粒子である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
サンプル中のアデノウイルス粒子の定量方法であって、
ａ）サンプルを、緩衝溶液を含有する中性被覆キャピラリーチューブに導入する工程と、
ｂ）前記サンプル中のアデノウイルス粒子とそのほかの成分との分離を可能にするために１０，０００〜３０，０００ボルトの電圧で、電界を前記中性被覆キャピラリーチューブに印加して電気泳動画分を取得する工程と、
ｃ）前記電気泳動画分に関連するエレクトロフェログラムを作成する工程と、
ｄ）前記エレクトロフェログラムと既知濃度の前記アデノウイルス粒子の入った参照サンプルから作成されたエレクトロフェログラムとを比較することにより前記生物学的サンプル中のアデノウイルス粒子の濃度を決定する工程と、
を含み、
前記緩衝溶液が、約１００〜１５０ｍＭの濃度のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと、３００〜３５０ｍＭの濃度のトリシンと、０．１〜０．３％のポリソルベートとを含み、かつ約７．５〜７．８のｐＨを有し、前記キャピラリーチューブが、前記緩衝溶液で充填される前にリン酸溶液でキャピラリーチューブの出口から入口の方向にフラッシュされる、方法。
【請求項１３】
前記中性被覆キャピラリーチューブがポリビニルアルコール（ＰＶＡ）で被覆されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記中性被覆キャピラリーチューブがフルオロカーボンポリマーで被覆されている、請求項12に記載の方法。
【請求項１５】
前記リン酸溶液は、５〜２０ｍＭのリン酸を含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記分離が約１５℃の温度で行われる、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
電界が２５，０００ボルトの電圧で前記中性被覆キャピラリーチューブに印加される、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記緩衝溶液は、１２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと、３３８ｍＭトリシンと、０．２％ポリソルベート２０とを含む、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には、生物学的サンプルの分析、より具体的には、キャピラリー電気泳動技術を利用した生物学的サンプルの定量分析に関する。本発明は、特定的には、アデノウイルスを含有する生物学的サンプルの定量分析に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスとくにアデノウイルスは、ワクチン接種および／または遺伝子療法に潜在的に有用なベクターである。組換えアデノウイルスは、ワクチン接種または遺伝子療法に使用するのに好ましいクラスのウイルスベクターである。感染性疾患と闘うのに十分な量の（組換え）ワクチンで世界を支援するために、大規模製造のロバストかつ高収率のプロセスが必要とされる。商業規模の製造を支援する際、製造プロセス全体を通じて（上流処理から下流処理まで）（アデノ）ウイルスの量を監視して（アデノ）ウイルスベースのワクチン／療法剤の安全性、有効性、および品質を確保するために、信頼性のある分析方法が必要とされる。
【０００３】
そのほかに、プロセスの開発時におよびアデノウイルスベースの臨床試験材料の製造のために、サンプルを分析して製造プロセスおよび製品安全性を監視または制御する。かかるサンプルで典型的に行われる分析の１つは、インタクトなアデノウイルス粒子の全濃度の決定である。この目的で限られた適性を有する現在の方法は、定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）および陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ−ＨＰＬＣ）である。ｑＰＣＲは、アデノウイルスに特異的な領域のＤＮＡ増幅および形成されたアンプリコンの蛍光検出に基づく。定量ＰＣＲは、高価で（化学品のコスト価格）かつ労力のかかる技術である。許容可能な精度の結果を得るには多くの反復実験が必要とされるので、サンプル採取から結果報告までの全時間は最長で３日間になることもある。そのほかの欠点は、ｑＰＣＲではインタクトな粒子自体を決定するのではなく粒子のＤＮＡ含有率を決定することによりアデノウイルス粒子の濃度を間接的に決定することである。
【０００４】
ＵＶ検出を備えたＡＥＸ−ＨＰＬＣでは、インタクトなアデノウイルスとサンプルマトリックス成分との電荷ベースの分離が使用される。定量は、アデノウイルス参照標準を用いて外部校正により行われる。ＡＥＸ−ＨＰＬＣ法は、細胞ライセートまたは高塩濃度を含有するサンプルで吸着、キャリーオーバー、および回収の問題を抱えているので、全製造プロセスを通じて正確かつ精密にアデノウイルスの濃度を決定するのに適してしない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
それゆえ、（アデノ）ウイルスの改善された定量方法の必要性が存在する。とくに、（アデノ）ウイルスベースのワクチンのプロセス開発を支援するために、たとえば、吸着、キャリーオーバー、および／または不十分な回収の欠点を伴うことなく、高い確度および精度で、しかも短時間で終了するように、プロセス全体を通じて（アデノ）ウイルス粒子の直接定量を可能にする１つの単一方法があれば有用であろう。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、生物学的サンプル中のウイルス粒子とくにアデノウイルス粒子の新規な定量方法を提供する。前記方法は、以下の工程、すなわち、
ａ）ウイルス粒子を含む前記生物学的サンプルを緩衝溶液の入ったキャピラリーチューブに導入する工程と、
ｂ）前記サンプル中のウイルス粒子とそのほかの成分との分離を可能にするのに十分な電圧の電界を前記キャピラリーチューブに印加して電気泳動画分を取得する工程と、
ｃ）前記電気泳動画分に関連するエレクトロフェログラムを作成する工程と、
ｄ）このエレクトロフェログラムと既知濃度の前記ウイルス粒子の入った参照サンプルから作成されたエレクトロフェログラムとを比較することにより、好ましくは、ウイルス粒子に対応する電気泳動画分のピーク面積と規定濃度のウイルス粒子の入った参照サンプルのピーク面積とを比較することにより、前記生物学的サンプル中のウイルス粒子の濃度を決定する工程と、
を含む。
【０００７】
本発明に係る方法は、上流および下流の両方の開発・製造プロセスに由来するすべてのタイプの生物学的サンプル中の（アデノ）ウイルス粒子のロバストで、正確で、信頼性のある、かつ高速な定量方法であることが示された。事前処理の必要性および／または吸着、キャリーオーバー、不十分な回収などの欠点を伴うことなく、かなり異なるマトリックスを含むサンプルを長いシーケンスで分析することが可能である。プロセスのサンプル採取から結果報告までの全分析時間は、２時間未満になることもある。本発明に係る方法は、特別な検出処理を必要としない。ウイルス粒子は直接検出され、ウイルス粒子の染色や標識は必要とされない。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】Ａ）Ａｄ２６のエレクトロフェログラム（ａ）溶解採取物、（ｂ）清澄化採取物、（ｃ）陰イオン交換生成物、（ｄ）透析濾過／限外濾過生成物、（ｅ）薬剤物質、および（ｆ）２６型アデノウイルスの参照標準。溶解採取物、清澄化採取物、および陰イオン交換生成物はベンゾナーゼで処理した。条件：緩衝液：１２５ｍＭトリス−３３８ｍＭトリシン、ｐＨ７．７、および０．２％ポリソルベート−２０、キャピラリーの有効長：８．５ｃｍ、印加電圧：−２５ｋＶ。サンプルはすべて１×１０１１ｖｐ／ｍｌに希釈した。Ｂ）下流プロセスサンプルのフローチャート。
【図２】（ａ）Ａｄ５、（ｂ）Ａｄ３５、および（ｃ）Ａｄ２６のエレクトロフェログラム。条件：緩衝液：１２５ｍＭトリス−３３８ｍＭトリシン、ｐＨ７．７、および０．２％ポリソルベート−２０、キャピラリーの有効長：８．５ｃｍ、印加電圧：−２５ｋＶ。サンプルはすべて１×１０１１ｖｐ／ｍｌに希釈した。
【図３】５ｋＰａで（ａ）５０秒間、（ｂ）２０秒間、（ｃ）１０秒間、または（ｄ）５秒間注入したＡｄ３５陰イオン交換生成物のエレクトロフェログラム。条件：緩衝液：１１３ｍＭトリス−３３８ｍＭトリシン、ｐＨ７．７、および０．２％ポリソルベート−２０、キャピラリーの有効長：８．５ｃｍ、印加電圧：−２５ｋＶ。サンプルはすべて１×１０１１ｖｐ／ｍｌに希釈した。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、生物学的サンプル中のウイルス粒子とくにアデノウイルス粒子の新規で単純なかつ信頼性のある定量方法を提供する。前記方法は、
ａ）  ａ）ウイルス粒子を含む前記生物学的サンプルを緩衝溶液の入ったキャピラリーチューブに導入する工程と、
ｂ）  ｂ）前記サンプル中のウイルス粒子とそのほかの成分との分離を可能にするのに十分な電圧の電界を前記キャピラリーチューブに印加して電気泳動画分を取得する工程と、
ｃ）  ｃ）前記電気泳動画分に関連するエレクトロフェログラムを作成する工程と、
ｄ）このエレクトロフェログラムと既知濃度の前記ウイルス粒子の入った参照サンプルから作成されたエレクトロフェログラムとを比較することにより前記生物学的サンプル中のウイルス粒子の濃度を決定する工程と、
を含む。
【００１０】
ある特定の実施形態では、前記生物学的サンプル中のウイルス粒子とくにアデノウイルス粒子の濃度は、（アデノ）ウイルス粒子に対応する電気泳動画分のピーク面積と既知濃度の前記（アデノ）ウイルス粒子を含有する参照サンプルのピーク面積とを比較することにより決定される。
【００１１】
本発明の方法は、キャピラリー電気泳動（「ＣＥ」）とくにキャピラリーゾーン電気泳動（「ＣＺＥ」）に基づく。ＣＺＥは、荷電物質の迅速かつ効率的な分離を可能にする技術である。一般的には、ＣＺＥは、キャピラリーチューブ、すなわち、約２〜約２００ミクロンの内径を有するチューブにサンプルを導入する工程と、チューブに電界を印加する工程と、を含む。電界電位は、チューブを介してサンプルを引き寄せるとともに、それをその構成部分に分離する。それゆえ、サンプル成分のそれぞれは、それ自体の個別の電気泳動移動度を有し、より大きい移動度を有するものは、より小さい移動度を有するものよりも速くキャピラリーチューブを介して移動する。結果として、サンプルの成分は、チューブを介して泳動する間にキャピラリーチューブの離散ゾーンに分割される。分離を連続的に監視して離散ゾーンすなわち離散電気泳動画分に基づいて種々の成分に関するデータを提供するために、オンキャピラリーまたはオンラインの検出器を使用することが可能である。ウイルスのピーク面積はウイルスの量と相関し、ウイルス粒子の濃度を直接定量するのに適している。
【００１２】
本発明に至った研究の際、製造プロセス全体を通じて、すなわち、サンプルが細胞ライセート、細胞デブリ、および高濃度を含有しうるプロセスの開始時から、サンプルが薬剤物質や薬剤製品などの精製サンプルである製造プロセスの終了時まで、さまざまな段階に由来する生物学的サンプル中のウイルス粒子とくにアデノウイルス粒子の濃度を正確に定量するために、ＣＺＥを使用可能であることを見いだした。この決定は、ＤＮＡやＲＮＡなどの粒子成分を測定することにより間接的に決定するのではなくインタクトな粒子を直接検出することに基づく。以下の実施例に示されるように、ある範囲のアッセイ条件にわたりＣＺＥが高レベルの再現性およびロバスト性を提供することが本発明により実証される。それゆえ、本発明は、ウイルスベースのワクチンおよび／または遺伝子療法剤、とくに、アデノウイルスベースのワクチンおよび／または遺伝子療法剤の商業製造の標準化および最適化を可能にする。
【００１３】
本発明によれば、ウイルス含有調製物はキャピラリー上に生成可能であり、かつ調製物中の（アデノ）ウイルス粒子の量は特異的ピーク面積から計算可能である。先行技術の方法の欠点、たとえば、吸着、キャリーオーバー、不十分な回収などを伴うことなく、かなり異なるマトリックスを含むサンプルを長いシーケンスで分析することが可能である。それゆえ、本発明の方法を用いれば、先行技術の方法に見られる欠点を伴うことなくいくつかの複合サンプルを測定することが可能である。個別のサンプルの実際のランタイムは５分間未満になることもあり、かつプロセスのサンプル採取から結果報告までの全分析時間は２時間未満になることもある。それゆえ、本発明は、ウイルスベースのワクチンとくにアデノウイルスベースのワクチンの製造プロセス時にウイルス濃度を決定する高速かつ正確な手段を提供することにより、当技術分野で公知の方法に伴う問題のほとんどを克服する。
【００１４】
本発明によれば、緩衝液は、ウイルス粒子の検出能および回収を増強するためにおよびウイルス粒子を含む生物学的サンプルの成分の凝集または吸着を低減するために、注意深く設計される。
【００１５】
ある特定の実施形態では、緩衝溶液は、約１００〜５００ｍＭの濃度のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと１００〜５００ｍＭの濃度のトリシンとを含み、かつ７．３〜８．９のｐＨを有する。
【００１６】
ある特定の実施形態では、緩衝溶液は、約１００〜３００ｍＭの濃度のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと１００〜４１２．５ｍＭの濃度のトリシンとを含み、かつ７．５〜８．５のｐＨを有する。
【００１７】
ある特定の実施形態では、緩衝溶液は、約１００〜１５０ｍＭの濃度のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと３００〜３５０ｍＭの濃度のトリシンとを含み、かつ７．５〜７．８のｐＨを有する。
【００１８】
ある特定の好ましい実施形態では、緩衝溶液は、約１２５ｍＭの濃度のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと約３３７．５ｍＭの濃度のトリシンとを含み、かつ約７．７のｐＨを有する。
【００１９】
本発明によれば、キャピラリーチューブは、（アデノ）ウイルス粒子を含む生物学的サンプルの成分の吸着が防止または大幅に低減されるように処理される。
【００２０】
ある特定の実施形態では、キャピラリーチューブは、緩衝溶液でフラッシュする前に約５〜２０ｍＭの濃度のリン酸でリバースフラッシュすることによりフラッシュされる。
【００２１】
ある特定の好ましい実施形態では、キャピラリーチューブは、緩衝溶液でフラッシュする前に１０ｍＭのリン酸でリバースフラッシュすることによりフラッシュされる。
【００２２】
ある特定の実施形態では、緩衝溶液は、ウイルス粒子凝集またはキャピラリー壁吸着を低減するために界面活性剤をさらに含む。
【００２３】
ある特定の実施形態では、緩衝溶液は、ウイルス粒子凝集またはキャピラリー壁吸着を低減するために中性界面活性剤をさらに含む。
【００２４】
ある特定の好ましい実施形態では、緩衝溶液は、０．０２〜０．３％ｖ／ｖの濃度、好ましくは０．１〜０．３％ｖ／ｖの濃度、より好ましくは０．２％ｖ／ｖの濃度のポリソルベート２０をさらに含む。
【００２５】
ある特定の実施形態では、ウイルス粒子の分離は１０〜４０℃で行われる。
【００２６】
ある特定の好ましい実施形態では、ウイルス粒子の分離は１５℃で行われる。
【００２７】
ある特定の実施形態では、本方法は中性被覆キャピラリーチューブを用いて行われる。
【００２８】
ある特定の好ましい実施形態では、本方法は、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）またはフルオロカーボンポリマー（たとえばμＳＩＬ−ＦＣ）で被覆されたキャピラリーチューブ内で行われる。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本方法は、３０〜１００ｃｍの範囲内の全長および８〜１００ｃｍの有効長（入口から検出器までの長さ）のキャピラリーチューブを用いて行われる。いくつかの実施形態では、ＣＺＥは、３０ｃｍの全長および８．５ｃｍの有効長のキャピラリーを用いて行われる。いくつかの実施形態では、キャピラリーチューブは、１０〜２００μｍ、好ましくは５０μｍの内径を有する。
【００３０】
本発明によれば、ウイルス粒子の分離を可能にするのに十分な電圧の電界が前記キャピラリーチューブに印加される。この分離は、典型的には、キャピラリーチューブ内の緩衝溶液およびイオン種の電気浸透フローおよび電気泳動フローを発生可能な典型的には５，０００〜３０，０００ボルト、好ましくは１０，０００〜３０，０００ボルトの高電圧を用いることにより達成される。分離のために印加される電界強度は、典型的には３０〜１００ｋＶ／ｍ、好ましくは７０〜８０ｋＶ／ｍである。
【００３１】
本発明によれば、生物学的サンプルは、有機または無機の成分、タンパク質部分、ヌクレオチド、または他のウイルスを含有する任意の（水性）液体サンプルマトリックス、たとえば、上流または下流のプロセス開発・製造からのサンプルでありうる。本発明のある特定の実施形態では、生物学的サンプルは、細胞培養物に由来するサンプル、すなわち、上流プロセスに由来するサンプルである。それゆえ、前記生物学的サンプルは、細胞ライセート、細胞デブリ、および／または高塩濃度などの他の成分を含有しうる。
【００３２】
そのほかに、下流処理時もまた、ウイルス回収を監視するうえで非常に重要である。それゆえ、他の実施形態では、生物学的サンプルは、下流プロセスに由来しうる。すなわち、高塩サンプルまたは精製サンプル、たとえば、薬剤物質や薬剤製品などでありうる。製造プロセス全体を通じて取得されるすべてのサンプルで、たとえ細胞デブリ、ヌクレオチド、タンパク質、または高塩濃度を含むサンプルでも、本方法を使用可能であることは、本発明に係る方法の利点である。これとは対照的に、ＡＥＸ−ＨＰＬＣなどの当技術分野で用いられる定量方法は、細胞および高濃度塩を含有するサンプルに適していない。今や、当業者であれば、たとえ生物学的サンプルが細胞、細胞デブリ、ヌクレオチド、タンパク質などの他の成分を含んでいたとしても、本発明の方法により生物学的サンプル中に存在するウイルス粒子を非常にロバストに、迅速に、かつ正確に定量可能である。
【００３３】
キャピラリーゾーン電気泳動プロセスは、好適な電気泳動電界を発生可能な、および得られる電気泳動画分を検出可能な、および／またはキャピラリーチューブを逆方向にフラッシュ可能な任意の装置で行うことが可能である。キャピラリーチューブは、典型的には、緩衝溶液で充填され、かつサンプル注入は、流体力学的な注入方法により行われる。この際、圧力低下（たとえば、５ｋＰａで５秒間）は、注入側の高圧、検出器側の真空、または重力を用いた静水圧のいずれかによりキャピラリーに沿って適用される。電界は高電圧電源により印加される。ウイルス粒子は直接検出され、ウイルス粒子の染色や標識は必要とされない。ある特定の実施形態では、検出器、たとえば、紫外発光体（重水素ランプ）と、所望の波長を選択するためのモノクロメーターと、さらにはサンプルを通り抜けた紫外光を検出するためのフォトディテクターと、を含む検出器は、注入部位の反対側のキャピラリーの端に位置決めされる。シグナルは、好ましくは２００〜４００ｎｍの波長で検出される。いくつかの実施形態では、波長は２１４ｎｍである。好ましくは、検出シグナルは、サンプル中に存在するウイルス粒子の量に比例する。検出器応答対泳動時間のプロットは、エレクトロフェログラムと呼ばれる。検出器に接続されたコンピュータは、エレクトロフェログラムのデータ取得および解釈を可能にする。
【００３４】
本発明によれば、生物学的サンプル中のウイルス粒子の濃度は、このエレクトロフェログラムと既知濃度の前記ウイルス粒子の入った参照サンプルから作成されたエレクトロフェログラムとを比較することにより決定される。本発明に係る方法のある特定の実施形態では、生物学的サンプルのかかる定量分析は、（アデノ）ウイルス粒子に対応する電気泳動画分のピーク面積と規定濃度の（アデノ）ウイルス粒子を含む参照サンプルのピーク面積とを比較することにより行われる。参照サンプルは、たとえば、ピーク面積対（アデノ）ウイルス粒子濃度の標準曲線を作成するために使用される。その後、続いて、生物学的サンプル中に存在する（アデノ）ウイルス粒子の定量は、参照サンプルで作成した標準曲線に基づいて行われる。
【００３５】
本発明の方法は、生物学的サンプル中のさまざまなタイプのウイルス粒子たとえばポリオウイルス粒子などの定量に適している。
【００３６】
ある特定の実施形態では、ウイルス粒子は組換えアデノウイルス粒子である。好ましくは、アデノウイルスは、ウイルス複製に必要とされるアデノウイルスゲノムのＥ１領域たとえばＥ１ａ領域および／またはＥ１ｂ領域の少なくとも１つの必須遺伝子機能が欠損している。かかる組換えアデノウイルスは、通常、少なくともＥ１領域が欠損しており、Ｅ１領域を提供する相補的細胞たとえば２９３細胞またはＥ１不死化網膜細胞たとえばＰＥＲ．Ｃ６細胞で増殖される（たとえば、米国特許第５，９９４，１２８号明細書を参照されたい）。ある特定の実施形態では、アデノウイルス粒子は、５型アデノウイルス粒子、２６型アデノウイルス粒子、または３５型アデノウイルス粒子である。
【００３７】
以下の実施例で本発明をさらに説明するが、これらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３８】
実施例１：
以上に記載したように、Ｍａｎｎら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，８９５：３２９−３３７，２０００）は、組換え５型アデノウイルスを分析するためのキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）法を確立した。しかしながら、アデノウイルスを定量するためのＣＺＥの使用さらにはワクチンプロセス開発を支援するＣＺＥの能力は、実証も提案もされなかった。本発明に至った研究の際、この方法は、吸着および／または凝集の問題に起因して、複数回注入にも採取サンプルなどの複合マトリックスを含むサンプルにも適さないことが示された。Ｄｉｉｒｒら（米国特許第５，７２３，０３１号明細書）は、体液中のウイルスを分析分離するための一般的なキャピラリー電気泳動法を記述した。この方法は、ウイルス粒子を単離するためにＣｓＣｌ密度勾配を用いた大量のサンプル精製を必要とする。そのほかに、検出前にウイルス粒子を染色するためにＤＮＡ／ＲＮＡ結合試薬を分離緩衝液に添加する必要がある。記載の標準的溶融シリカキャピラリーと組み合わせた２５ｍＭトリスと１９２ｍＭグリシンとを含むｐＨ８．５の分離緩衝液は、アデノウイルス粒子の濃度の決定に適していないことがさらに示された。ピークは観測されなかった。それは不利な泳動さらにはキャピラリー壁へのウイルス粒子の吸着の両方に起因する可能性があった。ＳＤＳはアデノウイルス粒子を分解するので、追加のＳＤＳを含む分離緩衝液は検査しなかった。Ｂｅｒｅｚｏｖｓｋｉのグループの２つの論文（Ｍｉｒｏｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，８３：５４３１−５４３５，２０１１、およびＡｚｉｚｉ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，８４，９５８５−９５９１，２０１２）には、蛍光検出を用いてキャピラリー電気泳動によりウイルスの濃度を間接的に決定することが記載されている。ウイルス粒子を決定するのではなく、宿主タンパク質およびウイルスからのＤＮＡおよび／またはＲＮＡ画分が決定される。蛍光検出のためにインターカレート色素が必要とされる。Ｍａｔｈｉｓら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １６９，１３−２１，２０１０）は、ＣｓＣｌ精製した二層および三層ロタウイルス粒子の分離および濃度決定分析のためのＣＥ法をさらに記載している。使用した分離緩衝液は、ＥＯＦモディファイヤーとして添加された１０ｍＭプトレシンを含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ８．０であった。吸着および凝集を防止するためにＳＤＳをＣｓＣｌ精製サンプルに添加した。本発明に至った研究の際、アデノウイルス粒子を定量するためにプトレシンを含むリン酸緩衝液ｐＨ８．０を検査した。ウイルス粒子は観測されなかった。さらに、アデノウイルス粒子は、粒子が劣化するのでＳＤＳに適合しない。
【００３９】
本発明によれば、広範にわたるサンプルマトリックス中のウイルス粒子の濃度を決定するために、分離緩衝液としてトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−トリシン緩衝液が注意深く選択された。トリシンは８．１５のｐＫａを有し、かつトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）は８．０７のｐＫａを有する。このことは、トリス−トリシン緩衝液が緩衝対イオンさらには緩衝共イオンを両方とも含有することを意味する。ｐＫａに近いｐＨさらには比較的高い濃度は、強い緩衝能を与える。低伝導率を有する双性イオンの使用は、高濃度で中程度の電流を生じることを意味するので、通常の電界強度では過度のジュール加熱は存在しないであろう。高い緩衝液濃度はウイルス粒子凝集を低減する。このことは、Ａｚｉｚｉ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，８４，９５８５−９５９１，２０１２）により言及された典型的なスパイクの消失およびアデノウイルス粒子で取得された通常のピーク形状から明らかであった。さらに、高い緩衝液濃度ではサンプルスタッキングの可能性が高い。このことは、大量の希釈サンプルを注入可能であること、さらには、本方法がサンプルマトリックス変動により引き起こされるピーク歪みおよび泳動変動にそれほど敏感でないことを意味する。
【００４０】
アデノウイルス粒子で最良の分離効率およびシグナル対ノイズ比を取得するためにならびに全ランタイムを低減するために、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−トリシン緩衝液を完全要因計画で最適化した。トリス（ヒドロキシメチル）は１００〜３００ｍＭの範囲内で検査し、かつトリシンは１００〜４１２．５ｍＭで検査した。データは、アデノウイルスとマトリックス成分との分解能、全ランタイム、およびシグナル対ノイズ比に基づいて評価した。以上に記載のサンプル基準に関して、最良の結果は、ｐＨ７．５〜７．８で１００〜１５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンおよび３００〜３５０ｍＭトリシンであった。
【００４１】
ウイルスサンプル吸着は、いずれの分離技術にとっても主要な問題である。ＣＥでは、サンプルのみがサンプルバイアルおよびキャピラリーに接触する。吸着を低減するために、中性被覆キャピラリーチューブを使用し、かつ界面活性剤を分離緩衝液に添加し、かつキャピラリーコンディショニングを詳細に調べた。アデノウイルス粒子はＳＤＳの存在下で分解するので、ＳＤＳは分離緩衝液に添加するのに適した界面活性剤ではない。ポリソルベートは中性界面活性剤である。中性界面活性剤を用いれば、系内の全電流に寄与しないという追加の利点が得られるとともに、追加のジュール加熱ひいてはウイルス粒子バンドの広がりのリスクをほとんど伴うことなく濃度を変化させることが可能になる。分離緩衝液にポリソルベート２０を添加したところ、吸着が低減され、かつ泳動時間およびピーク面積の再現性が改善された。０．２％ｖ／ｖの濃度でポリソルベート２０をラン緩衝液に添加したが、０．０２〜０．３％ｖ／ｖの範囲内が好適であった。最適化キャピラリーコンディショニングにより吸着はさらに低減された。最良の結果は、緩衝溶液で２分間フラッシュする前に１０ｍＭリン酸で２分間フラッシュすることにより得られた。このフラッシングを出口から入口の方向に行うこと、すなわち、リバースフラッシングを行うことがきわめて重要であること分かった。分離温度をより低い温度たとえば１５℃に低下させたところ、凝集および吸着がさらに低減した。本発明によれば、こうした吸着低減手段を用いずに同一サンプルの複数回注入を行うと、ピーク面積（ひいてはアデノウイルス濃度）が減少することが示された。平均で８つまでのサンプルを実験することが可能であった。こうした吸着防止手段を組み合わせたところ、ピーク面積を損なうことなく１本のキャピラリーを用いて４００回超の注入で実験することが可能であったうえに、そうした注入では、以上に挙げた典型的な凝集ピークスパイクを示さなかった。
【００４２】
分析手順は、典型的には、その意図される使用で検証すべきである。分析手順のＩＣＨ  Ｑ２バリデーション：テキストおよび方法には、分析手順のバリデーション時に考慮される特性に関するガイダンスが与えられている。開発したＣＺＥ法の意図される使用は、薬剤物質または薬剤製品のサンプル中のウイルス粒子の定量検査（アッセイとも呼ばれる）として分類される。アッセイ手順は、所与のマトリックス中に存在するアナライトを測定することが意図される。開発したＣＺＥ法は、ＩＣＨ  Ｑ２に準拠して検証した。アッセイ手順の次の特性、すなわち、確度、精度（再現性および中間精度）、特異性、線形性、および範囲を評価した（図２）。
【００４３】
再現性は、短い時間間隔にわたる同一の操作条件下での精度を表す（ＩＣＨ  Ｑ２）。再現性は、泳動時間およびピーク面積に対して計算し、３つの異なる期日でアデノウイルスサンプルの６つの独立した調製物の分析に基づいて決定した（ｎ＝６で３日間）。アデノウイルスピーク面積の再現性は各期日で２．１〜４．８％ＣＶ（変動係数）であり、泳動時間に対して０．５５〜０．８２％ＣＶであった。
【００４４】
中間精度（中間精度は実験室内変動、すなわち、異なる期日、異なる分析者、異なる装置などを表す）もまた、泳動時間およびピーク面積に基づいて計算した。これは全変動係数として表される。中間精度は、２名のオペレーター、２つの系などにより３つの異なる期日（ｎ＝１８）で行われたアデノウイルスサンプルの６つの独立した調製物の分析に基づいた。中間精度は、３日間にわたりアデノウイルスピーク面積で７．８％ＣＶであり、泳動時間に対して２．５％ＣＶであった。
【００４５】
分析手順の線形性は、サンプル中のアナライトの濃度（量）に正比例する検査結果を取得する能力（所与の範囲以内）である。アデノウイルス濃度と吸収との線形性は、５濃度レベルに基づいて３つの異なる期日で測定し、各濃度レベルは独立して３回作成した（ｎ＝１５で３日間）。線形性実験は、各期日のアデノウイルスの濃度がＲ２＞０．９８の決定係数で有意に線形であることを示した。
【００４６】
分析手順の確度は、取決め真値または採択参照値のいずれかとして認められた値と実測値との一致の良さを表す。アデノウイルス濃度のリカバリーとしての確度は、線形性と同一の構成で決定した（ｎ＝１５で３日間）。唯一の異なる点は、サンプルを製剤緩衝液ではなくＡＥＸ溶出緩衝液（ＡＥＸ生成物マトリックス）で希釈したことであった。リカバリーは、すべての濃度で９３％〜１１０％であった。マトリックス組成物の影響は観測されなかった。データはすべて有意に線形であった。
【００４７】
分析手順の範囲は、分析手順が好適なレベルの精度、確度、および線形性を有することが実証されたサンプル中のアナライトの上限および下限の濃度（量）の間隔である（これらの濃度を含む）。分析方法の範囲は、０．１８×１０１１〜１．８×１０１１ウイルス粒子／ｍｌであると決定された。この範囲では、確度、線形性、および精度が実証された。
【００４８】
特異性は、存在すると予想しうる成分の存在下でアナライトを明確に評価する能力である。典型的には、これらは、不純物、分解物、マトリックスなどを含みうる。特異性は、本発明の方法の開発時に実証された。３５型アデノウイルスは、２６型アデノウイルスから分離可能であった。既知（内部標準、ＨＥＰＥＳ）または未知のピークは、２６型や３５型のアデノウイルスのいずれも妨害しなかった（図１Ａを参照されたい）。
【００４９】
図ＩＢに示されるプロセスに基づく一連の２６型アデノウイルスプロセスサンプルを分析するために、本発明に係るＣＺＥ法を適用した。分析前、溶解採取物、バルク清澄化採取物、および陰イオン交換生成物のサンプルをベンゾナーゼで処理した（０．２単位ベンゾナーゼ／ミリリットル、３１ｍＭ  ＭｇＣｌ、ＲＴで１時間インキュベーション）。参照サンプル（校正標準ともいう）として２６型アデノウイルス材料を既知濃度で使用した。
【００５０】
追加のサンプル調製を行うことなくサンプルおよび参照材料を以下の条件に従って分析した。
−  キャピラリー寸法：有効長８．５ｃｍ、内径５０μｍ
−  キャピラリーコーティング：ＰＶＡ被覆
−  緩衝液系：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−トリシン−ポリソルベート２０）
・  濃度：
・  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン：１２５ｍＭ
・  トリシン：３３７．５ｍＭ
・  ポリソルベート２０：０．２％ｖ／ｖ
−  キャピラリーのプレコンディショニング
・  ２０カラム体積の１０ｍＭリン酸によるリバースフラッシング
・  ２０カラム体積の分離緩衝液によるリバースフラッシング
−  注入：流体力学的注入（５ｋＰａで５秒間）
−  分離条件
・  温度：１５℃
・  電圧：２５ｋＶ（電界強度７６ｋＶ／ｍ）
・  検出：２１４ｎｍ、特異性の分光分析（２００〜４００ｎｍ）
−  ランタイム：
・  キャピラリーの短端に注入したとき３．５分間／ラン
【００５１】
参照サンプルと試験サンプルとで得られたデータの選択肢を図１Ａに示す。アデノウイルスピークは、すべての材料中のすべての他の未知および既知のピークから明確に分離される。アデノウイルス画分は、すべてのタイプの材料で同一の泳動時間を有していた（約２．２分間）。ＡＥＸ生成物サンプル（図１トレースＣ）は、ＡＥＸ緩衝液に由来するＨＥＰＥＳピークを明確に示す。ＡＥＸ生成物および製剤化バルクに対して計算濃度を表２にまとめる。
【００５２】
【表１】
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【００５３】
実施例２：
本発明に係る分離緩衝溶液の組成は、より大きな注入体積を可能にする。こうして、より良好な感度を達成可能である。図３には、Ａｄ３５陰イオン交換生成物の例が異なる注入体積（圧力×時間）で示されている。１０倍の注入でも依然としてアデノウイルスピークの分離が存在することが示された。このレベルの注入体積では、アデノウイルスピーク泳動時間および補正アデノウイルスピーク面積の精度は、それぞれ、２％ＲＳＤおよび３％ＲＳＤである。確度およびキャピラリー寿命の差は、異なる注入体積間で観測されなかった。
以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
ａ）ウイルス粒子を含む生物学的サンプルを緩衝溶液の入ったキャピラリーチューブに導入する工程と、
ｂ）前記サンプル中のウイルス粒子とそのほかの成分との分離を可能にするのに十分な電圧の電界を前記キャピラリーチューブに印加して電気泳動画分を取得する工程と、
ｃ）前記電気泳動画分に関連するエレクトロフェログラムを作成する工程と、
ｄ）前記エレクトロフェログラムと既知濃度の前記ウイルス粒子の入った参照サンプルから作成されたエレクトロフェログラムとを比較することにより前記生物学的サンプル中のウイルス粒子の濃度を決定する工程と、
を含む、生物学的サンプル中のウイルス粒子の定量方法。
［２］
前記緩衝溶液が、約１００〜５００ｍＭの濃度のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと１００〜５００ｍＭの濃度のトリシンとを含み、かつ７．３〜８．９のｐＨを有する、［１］に記載の方法。
［３］
前記緩衝溶液が、約１００〜３００ｍＭの濃度のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと１００〜４１２．５ｍＭの濃度のトリシンとを含み、かつ７．５〜８．５のｐＨを有する、［１］または［２］に記載の方法。
［４］
前記緩衝溶液が、約１００〜１５０ｍＭの濃度のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと３００〜３５０ｍＭの濃度のトリシンとを含み、かつ約７．５〜７．８のｐＨを有する、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］
前記緩衝溶液が０．１〜０．３％ｖ／ｖの濃度のポリソルベート２０をさらに含む、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
前記キャピラリーチューブが中性被覆キャピラリーチューブである、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］
前記キャピラリーチューブがＰＶＡ被覆キャピラリーチューブまたはフルオロカーボンポリマー（たとえばμＳＩＬ−ＦＣ）被覆キャピラリーチューブである、［６］に記載の方法。
［８］
前記キャピラリーチューブが、前記緩衝溶液でフラッシュおよび充填される前にリン酸溶液で逆方向にフラッシュされる、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］
前記分離が約１５℃の温度で行われる、［１］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］
１０，０００〜３０，０００ボルトの電界が印加される、［１］〜［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］
前記ウイルス粒子が組換えアデノウイルス粒子である、［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］
前記アデノウイルス粒子が、５型アデノウイルス粒子、２６型アデノウイルス粒子、または３５型アデノウイルス粒子である、［１１］に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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