(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第ＶＩＩＩ因子製品中におけるＦＶＩＩＩ：Ｃ／ＦＶＩＩＩ：Ａｇの比が０．７以上である第ＶＩＩＩ因子製品を、クロマトグラフィーを使用して製造するための方法であって、少なくとも１つのクロマトグラフィー工程が、親和性クロマトグラフィー樹脂上に固定化された親和性リガンドにより第ＶＩＩＩ因子に特異的に結合する親和性を有する親和性クロマトグラフィー樹脂を用いることにより実施され、前記親和性リガンドが、第ＶＩＩＩ因子に対する１３ｋＤの酵母由来Ｆａｂ抗体断片であり、
親和性クロマトグラフィーが以下の工程を含む方法：
−０．１〜０．５ｍｏｌ／ｋｇの塩化ナトリウム濃度に相当する低塩条件下で、ＦＶＩＩＩ：Ｃ／ＦＶＩＩＩ：Ａｇの比が少なくとも０．７である第ＶＩＩＩ因子を含む出発液を、親和性クロマトグラフィー樹脂に結合させる、
−親和性クロマトグラフィー樹脂を洗浄し、０．５〜４ｍｏｌ／ｋｇの範囲内の塩化ナトリウムの高められた塩濃度の下で、軽鎖を除去する、
−０．５〜４ｍｏｌ／ｋｇの範囲内の塩化ナトリウムの塩濃度と、４０〜６０％のエチレングリコールと組み合わせて用いることによって、第ＶＩＩＩ因子を別の画分中に溶出および収集し、生物学的活性型第ＶＩＩＩ因子の樹脂へのロードが、少なくとも１０，０００ＩＵ／ｍＬ樹脂である。
【請求項２】
少なくとも１つのクロマトグラフィー工程が、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂を用いることにより実施され、第ＶＩＩＩ因子製品の第ＶＩＩＩ因子単量体含有量が９８％以上であり、第ＶＩＩＩ因子製品は凝集していない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つのサイズ排除クロマトグラフィーを用いるクロマトグラフィー工程を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
第ＶＩＩＩ因子分子が軽鎖と重鎖の複合体であり、ＦＶＩＩＩ：Ｃ／ＦＶＩＩＩ：Ａｇの改良された比が、第ＶＩＩＩ因子軽鎖、第ＶＩＩＩ因子重鎖、および／または前記複合体から解離した第ＶＩＩＩ因子軽鎖／第ＶＩＩＩ因子重鎖の除去に起因する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記親和性クロマトグラフィー樹脂が、平均粒子サイズが７４μｍの架橋アガロースマトリクスをベースとし、前記１３ｋＤの酵母由来Ｆａｂ抗体断片親和性リガンドは、親水性スペーサーアームを介してマトリクスと結合してリガンドが第ＶＩＩＩ因子分子とより結合しやすくなっており、前記親和性リガンドが、生物学的に活性である第ＶＩＩＩ因子分子の第ＶＩＩＩ因子軽鎖と結合する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記クロマトグラフィー工程が、以下の条件のうち少なくとも２つを含む親和性クロマトグラフィー樹脂を用いる、請求項１に記載の方法：
−第ＶＩＩＩ因子ロードのバッファー条件；ｐＨ６．２〜６．８で、０．１〜０．５ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、０．０１〜０．０５ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２、０．０１〜０．０５ｍｏｌ／ｋｇのＬ−ヒスチジン、０．００５〜０．０５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０、０．５〜２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１〜１％のＴＮＢＰ、
−洗浄のバッファー条件；ｐＨ６．２〜６．８で、０．５〜４ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、０．０１〜０．０５ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２、０．０１〜０．０５ｍｏｌ／ｋｇのＬ−ヒスチジン、０．００５〜０．０５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０、
−第ＶＩＩＩ因子の溶出のバッファー条件；ｐＨ６．２〜６．８で、０．５〜４ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、４０〜６０％のエチレングリコール、０．０１〜０．０５ｍｏｌ/ｋｇのＣａＣｌ２、０．０１〜０．０５ｍｏｌ／ｋｇのＬ−ヒスチジン、０．００５〜０．０５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０。
【請求項７】
前記親和性クロマトグラフィー樹脂が、架橋アガロースベースマトリクスである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記親和性リガンドが、ＦＶＩＩＩの軽鎖部分と結合してＦＶＩＩＩの軽鎖部分を特異的に除去する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
陰イオン交換クロマトグラフィーを、第ＶＩＩＩ因子が陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂と結合し、かつ、生物学的活性型第ＶＩＩＩ因子の溶出の前または後いずれかにおいて、生物学的不活性型が陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂から除去される条件下で実施する方法であって、
第ＶＩＩＩ因子を結合させ、かつ、不活性型第ＶＩＩＩ因子を除去するために、０．０１〜０．１５ｍｏｌ／ｋｇの塩化ナトリウムの濃度に相当する低塩条件下で、第ＶＩＩＩ因子をロードし、
不活性型第ＶＩＩＩ因子を除去するために、０．１５〜０．３ｍｏｌ／ｋｇの塩化ナトリウムの濃度に相当する中程度の塩条件下で、前記陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂を洗浄し、
０．３〜１ｍｏｌ／ｋｇの塩化ナトリウムの濃度に相当する高い塩条件を用いることによって、前記陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂から別の画分中にインタクトな単量体の第ＶＩＩＩ因子を溶出および収集する、
請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
陰イオン交換クロマトグラフィー工程が、以下のクロマトグラフィーの条件のうち少なくとも２つを含む、請求項２に記載の方法：
−生物学的に活性な第ＶＩＩＩ因子の樹脂ロードが、少なくとも１０，０００ＩＵ／ｍＬ樹脂である、；
−第ＶＩＩＩ因子のローディング条件；ｐＨ６．０〜７．５、０．０５〜０．１５ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、０．０１〜０．０５ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２、０．０１〜０．０５ｍｏｌ／ｋｇのＬ−ヒスチジン、０．００５〜０．０５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０；
−洗浄条件；ｐＨ６．０〜７．５で、０．１５〜０．３ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、０．０１〜０．０５ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２、０．０１〜０．０５ｍｏｌ／ｋｇのＬ−ヒスチジン、０．００５〜０．０５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０；
−第ＶＩＩＩ因子の溶出条件；ｐＨ６．０〜７．５で、０．３〜０．５ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、０．０１〜０．０５ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２、０．０１〜０．０５ｍｏｌ／ｋｇのＬ−ヒスチジン、０．００５〜０．０５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０。
【請求項１１】
前記陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂が、球径が４５〜１６５μｍの架橋６％アガロースマトリクスと結合しているリガンドとして４級アミンイオンを有し、０．１８〜０．２５ｍｍｏｌ／ｍＬの総イオン結合能力を有する強陰イオン交換体である、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記サイズ排除クロマトグラフィー工程が、以下のクロマトグラフィー条件のうち少なくとも２つを含む、請求項３に記載の方法: 
−カラム体積の４〜８％のサンプルロード、
−６０〜９０ｃｍのカラム高、
−少なくとも１０，０００ＩＵ／ｍＬである、サンプルロード中の生物学的に活性な第ＶＩＩＩ因子の濃度、
−ｐＨ６．０〜７．５で、０．２〜０．７ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、０．０１〜０．０５ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２、０．０１〜０．０５ｍｏｌ／ｋｇのクエン酸ナトリウム、０．５〜２％（ｗ／ｗ）のスクロース、０．５〜２％（ｗ／ｗ）のＬ−アルギニン、０．１〜１％（ｗ／ｗ）のポロクサマー１８８、である、不活性型第ＶＩＩＩ因子の最適な凝集のためのカラム平衡化バッファー
ここで、生物学的に活性な第ＶＩＩＩ因子は単量体型で収集され、一方、不活性型第ＶＩＩＩ因子は、サイズ排除クロマトグラフィー工程の凝集体ピーク画分および／または断片ピーク画分のいずれかに見出されるものである、
−第ＶＩＩＩ因子単量体の収集を、カラムの後で３０〜４０ｍＡＵの吸光度ピークが記録されたときに始め、吸光度ピークが１〜４０ｍＡＵに戻ったときに止め、前記第ＶＩＩＩ因子単量体の収集がサンプル添加量の２〜３倍に相当する。
【請求項１３】
サイズ排除クロマトグラフィー樹脂が、平均直径が３４μｍ、最適分離範囲が１０，０００〜６００，０００ダルトンの球状架橋アガロース／デキストラン媒体である、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも６ヶ月間まで、凍結および／または凍結乾燥条件で安定である第ＶＩＩＩ因子製品であって、前記第ＶＩＩＩ因子は、遺伝子組み換えにより生産され、第ＶＩＩＩ因子の総量（ＦＶＩＩＩ：Ａｇ）に対する生物学的に活性な第ＶＩＩＩ因子の割合（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）が０．９３以上、かつ、第ＶＩＩＩ因子単量体含有量が９９％以上であり、凝集型第ＶＩＩＩ因子が実質的に検出できない第ＶＩＩＩ因子であることを特徴とする、製品。
【請求項１５】
請求項１４に記載の第ＶＩＩＩ因子製品であって、組み換え体由来および／または欠失誘導体である場合に、ヒト細胞で生産される、製品。
【請求項１６】
請求項１４に記載の第ＶＩＩＩ因子製品であって、治療歴のある血友病Ａ患者または治療歴のない血友病Ａ患者を前記製品で治療したときにおけるインヒビターの量が、２５％未満であることを特徴とする、製品。
【請求項１７】
低温凍結形態、特に−５０℃〜−８０℃の低温凍結形態、または凍結乾燥形態である、請求項１４に記載の第ＶＩＩＩ因子製品。
【請求項１８】
少なくとも１つの凍結保護物質、少なくとも１つの増量剤、および／または緩衝剤が存在する、請求項１７に記載の第ＶＩＩＩ因子製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、第ＶＩＩＩ因子製品中でＦＶＩＩＩ：Ｃ／ＦＶＩＩＩ：Ａｇの改良された比を有する第ＶＩＩＩ因子製品を、クロマトグラフィーを使用して製造するための方法、および、本発明の方法により得られる９８％以上の単量体含有量を有する製品を含む薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
未変性の第ＶＩＩＩ因子分子は、通常の循環の条件下で、軽鎖（完全長血漿由来型ＦＶＩＩＩ、およびＢドメイン欠失型ＦＶＩＩＩ；８０ｋＤａの両方について）および重鎖（２００ｋＤａの完全長血漿由来型または組み換え体由来型第ＶＩＩＩ因子について、および９０ｋＤａのＢドメイン欠失組み換え型第ＶＩＩＩ因子について）を有する複合体である。重鎖と軽鎖の会合の正確な条件は、詳細には分からないが、論文では、疎水性相互作用を伴って複合体を形成し、複合体と結合する金属イオン架橋の関与が推定されている。カルシウム、銅、亜鉛、マンガン等を含む様々な金属イオンが、相互作用に関与すると推定されている。（１）近年開発されたＢドメイン欠失組み換え型第ＶＩＩＩ因子製品に関して、分子が、３つの金属イオン；カルシウム、銅、および亜鉛を含むことが述べられている。（２）金属架橋がなく、第ＶＩＩＩ因子分子の軽鎖と重鎖だけでは、生物学的活性を有しないが、抗原活性は有している。いくつかの出版物（３、４）において、インヒビター形成の、特に第ＶＩＩＩ因子軽鎖に対するインヒビター形成の生体内でのリスクがあることが発表されている。従って、患者に注射する第ＶＩＩＩ因子製品において、特に第ＶＩＩＩ因子軽鎖については、一本の軽鎖と重鎖はできるだけ少ない量で存在するべきであり、ＦＶＩＩＩ：Ｃ／ＦＶＩＩＩ：Ａｇの活性の比は、１．０（１）（５）に近くあるべきである。
【０００３】
一般的に、タンパク質の凝集化は、所望の製品の損失だけでなく、インヒビター形成の可能性の点からも、精製工程におけるリスク因子である（６）。特定の生化学的条件の下で、組み換え型第ＶＩＩＩ因子は凝集する場合があり（７、８）、これにより、生物学的活性が著しく減少することがある。従って、凝集型第ＶＩＩＩ因子を有する第ＶＩＩＩ因子製品は、不活性型第ＶＩＩＩ因子を含み、単量体含有量１００％未満を有することがある。タンパク質医薬品の単量体含有量は、１００％に近く、できるだけ少ない量の不活性型第ＶＩＩＩ因子（凝集体、断片等）を有すべきである。
【０００４】
血漿から、または第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）を組み換えにより産生する培養物から第ＶＩＩＩ因子を精製するための多くの方法が記載されている。一例として、国際公開第２００９／１５６４３０号は、第ＶＩＩＩ因子の精製のための一連のクロマトグラフィー工程を開示しており、１３ｋダルトンのリガンドが第ＶＩＩＩ因子軽鎖と結合する、非動物由来Ｆａｂをベースとする親和性工程が含まれている。この出願で記載されているその他のクロマトグラフィー工程としては、陰イオンおよび陽イオンが混合された状態の樹脂、陽イオン交換、陰イオン交換、およびゲルろ過が挙げられる。不活性型の除去、または第ＶＩＩＩ因子の凝集体の含有量に関する情報は、この特許出願では全く提供されていない。Purification and characterization of a new recombinant factor VIII（９）という論文中で、４つの工程の第ＶＩＩＩ因子のクロマトグラフィー精製方法が記載されており、第ＶＩＩＩ因子重鎖と結合するリガンドとしてのモノクローナル抗体を用いる親和性工程が含まれている。その他の３つの工程は、混合された形態のクロマトグラフィー樹脂、陰イオン交換樹脂、およびゲルろ過工程である。不活性型の除去、または第ＶＩＩＩ因子の凝集体の含有量に関する情報は、この論文では全く与えられていない。Development and validation of an affinity chromatography step using a peptide ligand for cGMP production of Factor ＶＩＩＩ（１０）という論文において、５つの工程のクロマトグラフィー方法が記載されており、２．７ｋダルトンのリガンドが第ＶＩＩＩ因子軽鎖と結合する、ペプチドをベースとする親和性工程が含まれている。ペプチド親和性樹脂の洗浄の間に培養工程からの過剰な第ＶＩＩＩ因子軽鎖を除去することが、記載されている。その他の４つのクロマトグラフィー工程は、陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂、疎水性相互作用樹脂、およびゲルろ過工程である。ペプチド親和性樹脂の後の２つのクロマトグラフィー工程が、過剰な第ＶＩＩＩ因子軽鎖を除去するが、どの工程なのかについてさらに明確にはされていない。第ＶＩＩＩ因子軽鎖以外のその他の不活性型の除去、または第ＶＩＩＩ因子の凝集体の含有量に関する情報は、この論文では全く提供されていない。application for a novel affinity adsorbent for the capture and purification of re-combinant Factor ＶＩＩＩ compounds（１１）という論文において、Ｆａｂをベースとする１３ｋダルトンのリガンド親和性樹脂が、第ＶＩＩＩ因子の精製のために記載されており、不活性型の除去、または第ＶＩＩＩ因子の凝集体の含有量に関する情報は、この論文では全く提供されていない。
【０００５】
論文に記載されているように（５）、（１２）、市販の組み換え型第ＶＩＩＩ因子製品は、不活性型第ＶＩＩＩ因子を含み、不活性型第ＶＩＩＩ因子は、第ＶＩＩＩ因子の総量（第ＶＩＩＩ因子：Ａｇ）に対する生物学的に活性な第ＶＩＩＩ因子（第ＶＩＩＩ因子：Ｃ）の比により測定され、免疫反応に関して患者に負の効果を与える可能性がある。
【０００６】
生物学的に活性な第ＶＩＩＩ因子は、生体内の通常の条件下で、止血のための凝固カスケードの重要な部分である酵素反応を通して、第ＶＩＩＩａ因子へと活性化され得る、第ＶＩＩＩ因子活性を有する第ＶＩＩＩ因子として定義される。生物学的に活性な第ＶＩＩＩ因子は、例えば、ＦＶＩＩＩ発色アッセイおよび／または１段階凝固アッセイといった、様々なインビトロの分析方法で測定することができる（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）。（１３）発色アッセイは、第ＶＩＩＩ因子の生物学的活性を補助因子として測定する２段階の測光法である。第ＶＩＩＩ因子は、第Ｘ因子を第Ｘａ因子へと活性化し、第Ｘａ因子は、分光光度的に定量化することができる生成物へと酵素的に順次切断される。１段階の凝固アッセイは、リン脂質、接触活性化因子、およびカルシウムイオンの存在下で第ＶＩＩＩ因子欠損血漿の凝固時間を補正する、第ＶＩＩＩ因子を含むサンプルの能力に基づく。フィブリン凝塊が出現する時間を１工程で測定する。
【０００７】
国際公開第Ａ−２００８／１３４３１０号は、組み換え型タンパク質のバルク溶液を凍結保存のために安定化するための方法を開示し、この方法は、少なくとも１００ｍＭの１価の塩の濃度を有する、組み換え型タンパク質の部分的に精製された溶液を提供すること、および、凍結の際に溶液が−５６℃以上のガラス転移温度を有するのに十分な量で炭水化物を前記溶液に加えることを含む。
【０００８】
国際公開第２０１０／１１５８６６Ａ１号は、ヒト第ＶＩＩＩ因子またはその生物学的活性部分と著しい同一性（相同性）を有する、少なくとも１つのアミノ酸配列を含む分子およびポリペプチド、関連分子（このようなポリペプチドをコードする核酸等）、このようなポリペプチドを含む組成物（医薬製剤等）、ならびに、このようなポリペプチドの製造方法および使用方法を開示している。
【０００９】
国際公開第９７／３３１７８Ａ１号は、第ＶＩＩＩ因子を含むタンパク質画分の適合性を検査するための方法を開示し、第ＶＩＩＩ因子を含むタンパク質画分のさらなる処理は、殺菌段階を含み、２０〜５０ｋＤの範囲の断片に関して出発材料を検査することを含む。この範囲における第ＶＩＩＩ因子断片は、第ＶＩＩＩ因子で治療歴のある患者において、インヒビター形成を明らかに引き起こす。これらの断片で汚染されたバッチでさえも、親水性材料を用いたサイズ排除クロマトグラフィーを適用することによって、極めて純粋なウイルスフリーの第ＶＩＩＩ因子を製造するために使用することができる。
【００１０】
ＵＳ  ４，６７５，３８５  Ａは、連続的な高性能サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、最初に低い塩濃度条件下で、２番目に高い塩濃度条件下で再構成した市販の第ＶＩＩＩ因子：Ｃ（複合体化第ＶＩＩＩ因子）濃縮物から、ヒト、ウシ、およびブタの凝血促進性タンパク質である第ＶＩＩＩ因子をラージスケールで精製するための高速かつ単純な方法を開示している。クロマトグラフィー分離を、約１３〜約３５ミクロの粒子サイズ、約５００〜約２０００オングストロームの孔径、１グラム当たり約１．０〜約１．８ｍＬの孔容積を有する多孔ビーズを充填した高性能サイズ排除クロマトグラフィーカラムで実施する。緩衝水溶液を溶出剤として使用して、第１のクロマトグラフィー分離を緩衝水溶液で実施する。分子量の小さい成分（不純物）を、第ＶＩＩＩ因子および分子量の大きい成分（不純物）から分離する。第ＶＩＩＩ因子が約０．２５〜約０．４５Ｍのカルシウムイオン濃度を有する緩衝溶液中で解離された後に、第２のクロマトグラフィー分離を実施しても良い。第１のカラムと同様に、第２のクロマトグラフィーカラムに充填物を詰め、０．２５〜０．４５Ｍのカルシウムイオンを含む緩衝水溶液で溶出する。２．５×６０ｃｍのカラムにおいて、４ｇｍｓの市販の第ＶＩＩＩ因子の濃縮物は、２時間未満で精製され得る。方法は、スケールアップが可能である。
【００１１】
ＥＰ  ０  ４１２  ４６６  Ａ２は、比活性と安定性が高い、殺菌された第ＶＩＩＩ因子濃縮物を調製するための方法を開示し、記載され、Ａｌ（ＯＨ）３、陰イオン交換体、またはＣａ３（ＰＯ４）２を使用する、好ましくはこの群からの２つの異なる吸着剤を使用する、少なくとも２つの吸着作用によって、第ＶＩＩＩ因子を含む溶液から吸着された不純物を含む。
【００１２】
ＦＲ  ２  ６５０  ３９３  Ａ１は、比活性を有する第ＶＩＩＩ因子濃縮物と高い収率を得ることを開示し、前記濃縮物は、非ヒト起源の外来性タンパク質を含まない。任意の方法により得られた第ＶＩＩＩ因子を、第１のバッファーで事前に平衡化された陰イオン交換ゲルを含むカラムに蓄積させる。第ＶＩＩＩ因子をカラムに添加した後、０．１未満の光学密度が得られるまで、ゲルを第２のバッファーで洗浄する。次に、第３のバッファーで、精製した第ＶＩＩＩ因子をゲルから遊離させる。クロマトグラフィー後、比活性は、３０／１６００ＩＵ/ｍｇである。
【００１３】
Cheng, Elisabeth et al., discloses in Biotechnology Letters, v.32, n.9, p.1207-1214, 2010では、陰イオン交換クロマトグラフィーを使用し、次いで、ゲルろ過を使用して、ヒトＦＶＩＩＩを血漿から直接精製した。３つのＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂を試験し、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ樹脂の使用では４０％のＦＶＩＩＩ活性の回収、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗの使用では約８０％のＦＶＩＩＩ活性の回収、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｂｉｇ  Ｂｅａｄｓの使用では７０％のＦＶＩＩＩ活性の回収がもたらされた。ビタミンＫ依存性凝固因子が陰イオン交換カラムからＦＶＩＩＩと共に溶出された。第２の精製工程において、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦを使用した場合、ビタミンＫ依存性因子が無くなり、７０％のＦＶＩＩＩ活性が回収された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の課題は、特に組み換えにより製造された第ＶＩＩＩ因子に関して、第ＶＩＩＩ因子の製造方法において単独の軽鎖と重鎖の量を減少させる方法を提供すること、および、単量体含有量の高い製品を提供することである。本発明の他の課題は、単独の軽鎖と重鎖（断片）、および凝集型第ＶＩＩＩ因子が除去されていることができ、得られる実質的な単量体第ＶＩＩＩ因子溶液が、高い単量体第ＶＩＩＩ因子含有量を維持しながら、凍結および／または凍結乾燥状態で数年間保存され得る、組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
第ＶＩＩＩ因子製品中において、ＦＶＩＩＩ：Ｃ／ＦＶＩＩＩ：Ａｇの比が０．７以上であり高い単量体含有量を有する第ＶＩＩＩ因子製品を、クロマトグラフィーを使用して製造するための方法が、本発明の課題を解決することができることを本発明の発明者が発見したことは、驚くべきことである。本発明の方法は、親和性クロマトグラフィー樹脂上に固定化されている親和性リガンドにより、第ＶＩＩＩ因子に特異的に結合する親和性を有する親和性クロマトグラフィー樹脂を用いることにより、少なくとも１つのクロマトグラフィー工程を実施する作業であって、前記親和性リガンドが、第ＶＩＩＩ因子分子に対する１３ｋＤの酵母由来Ｆａｂ抗体断片である作業を含む。
【００１６】
前記親和性リガンドは、ＦＶＩＩＩ分子の軽鎖部分と結合する。驚くべきことに、第ＶＩＩＩ因子の軽鎖と重鎖により形成されている複合体の未変性の第ＶＩＩＩ因子、およびＦＶＩＩＩの生物学的活性を全く有しない単独のＦＶＩＩＩ軽鎖、を含む混合物を含む溶液中において、生物学的凝固活性を全く有しないＦＶＩＩＩ軽鎖を、特定の洗浄条件を用いて前記親和性樹脂上で処理することによって、混合物から除去することができる。当業者であれば、かなりの量の未変性の第ＶＩＩＩ因子分子、すなわち重鎖と軽鎖の複合体も除去されることを予想するであろう。
【００１７】
具体的には、前記リガンドは、親水性スペーサーアームを介して親和性クロマトグラフィー樹脂上に固定化されており、前記樹脂は、架橋アガロースベースマトリクスであり、前記親和性リガンドは、第ＶＩＩＩ因子分子に対する１３ｋＤの酵母由来Ｆａｂ抗体断片であり、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから商標名ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔとして市販されている。
【００１８】
あるいは、０．７以上のＦＶＩＩＩ：Ｃ／ＦＶＩＩＩ：Ａｇの比を提供するため、および高い第ＶＩＩＩ因子単量体含有量をもたらすための方法であって、少なくとも１つのクロマトグラフィー工程が、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂上で少なくとも１つのクロマトグラフィー工程を用いる手段により実施される前記方法によって、課題が達成される。
【００１９】
本発明の別の選択肢において、０．７以上のＦＶＩＩＩ：Ｃ／ＦＶＩＩＩ：Ａｇの比と、高い第ＶＩＩＩ因子単量体含有量を与えるための方法が開示され、少なくとも１つのクロマトグラフィー工程は、特定のクロマトグラフィー条件とバッファー組成の下でサイズ排除クロマトグラフィー工程を用いる手段により実施される。
【００２０】
本発明の別の選択肢において、ＦＶＩＩＩ：Ｃ／ＦＶＩＩＩ：Ａｇに関して同じクロマトグラフィー工程除去を使用し、第ＶＩＩＩ因子製品の後の単量体含有量は、９８％以上である。
【００２１】
本発明のさらなる選択肢において、前のクロマトグラフィー工程から得られる高いＦＶＩＩＩ：Ｃ／ＦＶＩＩＩ：Ａｇの比と高いＦＶＩＩＩ：単量体含有量は、少なくとも１２ヶ月間、好ましくは少なくとも２４ヶ月間、最も好ましくは少なくとも３６ヶ月間、凍結および／または凍結乾燥状態で、ＦＶＩＩＩ：Ｃ／ＦＶＩＩＩ：Ａｇおよび／または高い第ＶＩＩＩ因子単量体含有量の特性が変化しないまま、患者に使用されるまで保存することができる。
【００２２】
本発明の３つの方法のうち２つの方法を組み合わせた場合、少なくとも０．８のＦＶＩＩＩ：Ｃ／ＦＶＩＩＩ：Ａｇの比を達成することができ、３つ全てを組み合わせた場合、少なくとも０．９の比が可能となる。
【００２３】
例えば、本発明の方法は、０．７以上のＦＶＩＩＩ：Ｃ／ＦＶＩＩＩ：Ａｇの比を有し、９８％以上という高い第ＶＩＩＩ因子単量体含有量である第ＶＩＩＩ因子製品、および実質的な非凝集型第ＶＩＩＩ因子製品を、クロマトグラフィーを使用して製造する方法によって表される。
前記方法において、
工程（ａ）親和性クロマトグラフィー樹脂上に固定化されている親和性リガンドによる、第ＶＩＩＩ因子に特異的に結合する親和性を有する親和性クロマトグラフィー樹脂を用いることにより、少なくとも１つのクロマトグラフィー工程を実施する。本発明の方法で前記親和性リガンドは前記第ＶＩＩＩ因子分子に対する１３ｋＤの酵母由来Ｆａｂ抗体断片である。
工程（ｂ）陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂上で少なくとも１つのクロマトグラフィー工程を実施する。工程の順序は、（ａ）の後に（ｂ）、または（ｂ）の後に（ａ）であっても良い。
【００２４】
本発明によれば、０．７以上のＦＶＩＩＩ：Ｃ／ＦＶＩＩＩ：Ａｇの比を有し、９８％以上という高い第ＶＩＩＩ因子単量体含有量である第ＶＩＩＩ因子製品、および実質的な非凝集型第ＶＩＩＩ因子製品を、クロマトグラフィーを使用して製造するための以下の方法を実施することも可能である。
前記方法において、
工程（ａ）親和性クロマトグラフィー樹脂上に固定化されている親和性リガンドによる、第ＶＩＩＩ因子に特異的に結合する親和性を有する親和性クロマトグラフィー樹脂を用いることにより、少なくとも１つのクロマトグラフィー工程を実施する。本発明の方法で前記親和性リガンドは、前記第ＶＩＩＩ因子分子に対する１３ｋＤの酵母由来Ｆａｂ抗体断片である。
工程（ｃ）少なくとも１つのクロマトグラフィー工程を、サイズ排除クロマトグラフィー工程を用いることにより実施する。工程の順序は、（ａ）の後に（ｃ）、または（ｃ）の後に（ａ）であっても良い。
【００２５】
本発明によれば、０．７以上のＦＶＩＩＩ：Ｃ／ＦＶＩＩＩ：Ａｇの比を有し、９８％以上という高い第ＶＩＩＩ因子単量体含有量を与える第ＶＩＩＩ因子製品、および実質的な非凝集型第ＶＩＩＩ因子製品を、クロマトグラフィーを使用して製造するための以下の方法を実施することも可能である。
前記方法において、
工程（ｂ）陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂上で少なくとも１つのクロマトグラフィー工程を実施する。
工程（ｃ）少なくとも１つのクロマトグラフィー工程を、サイズ排除クロマトグラフィー工程を用いることにより実施する。工程の順序は、（ｂ）の後に（ｃ）、または（ｃ）の後に（ｂ）であっても良い。
【００２６】
さらなる他の実施形態は、本発明の３つの方法の組み合わせである。そして、例えば、本発明の方法は、０．９以上のＦＶＩＩＩ：Ｃ／ＦＶＩＩＩ：Ａｇの比を有し、９９％以上という高い第ＶＩＩＩ因子単量体含有量である第ＶＩＩＩ因子製品、および実質的な非凝集型第ＶＩＩＩ因子製品を、クロマトグラフィーを使用して製造するための方法によって表される。
前記方法において、
工程（ａ）親和性クロマトグラフィー樹脂上に固定化されている親和性リガンドによる、第ＶＩＩＩ因子に特異的に結合する親和性を有する親和性クロマトグラフィー樹脂を用いることにより、少なくとも１つのクロマトグラフィー工程を実施する。本発明の方法で前記親和性リガンドは、前記第ＶＩＩＩ因子分子に対する１３ｋＤの酵母由来Ｆａｂ抗体断片である。
工程（ｂ）陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂上で少なくとも１つのクロマトグラフィー工程を実施する。
工程（ｃ）少なくとも１つのクロマトグラフィー工程を、サイズ排除クロマトグラフィー工程を用いることにより実施する。工程の順序は、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）；（ａ）、（ｃ）、（ｂ）；（ｃ）、（ｂ）、（ａ）；（ｃ）、（ａ）、（ｂ）；（ｂ）、（ｃ）、（ａ）；（ｂ）、（ａ）、（ｃ）であっても良い。
【００２７】
本発明によれば、本発明の方法で使用される第ＶＩＩＩ因子分子は、軽鎖と重鎖の複合体であり、ＦＶＩＩＩ：Ｃ／ＦＶＩＩＩ：Ａｇの改良された比は、第ＶＩＩＩ因子軽鎖、第ＶＩＩＩ因子重鎖、および／または複合体からの解離した第ＶＩＩＩ因子軽鎖／第ＶＩＩＩ因子重鎖が除去されていることに起因する。解離した第ＶＩＩＩ因子鎖は、変異、タンパク質分解性変性／物理的変性等、または精製方法の間の酵素的変性／物理的変性のいずれかにより、培養生成プロセスから生じて存在し得る。解離したＦＶＩＩＩ軽鎖および／またはＦＶＩＩＩ重鎖は、例えば、バッファー、タンパク質濃度等の環境に依存して、第ＶＩＩＩ因子断片、および／または第ＶＩＩＩ因子凝集体のいずれかを形成する。従って、単量体ではない、および／または未変性の形態の第ＶＩＩＩ因子よりも凝集体を形成しやすい可能性のある、全ての形態の第ＶＩＩＩ因子を除去することが、有益である。
【００２８】
本発明の他の態様によれば、方法で使用される第ＶＩＩＩ因子分子は、第ＶＩＩＩ因子製品の半減期の延長について改良するために、例えば、ｖＷＦ、ＰＥＧ、ＨＥＳ、およびまたは抗体のＦＣ断片等の他の物質と非共有結合的に結合していてもよく、および／または共有結合していてもよく、最終製品の生物的活性が高い比と高い単量体含有量を有するという、本発明の同じ解決に到達する。
【００２９】
本発明の特定の実施形態において、親和性クロマトグラフィー工程を、第ＶＩＩＩ因子と親和性樹脂の結合を与える条件、および、第ＶＩＩＩ因子を溶出する前に解離した軽鎖を洗い流すことによって除去される条件の下で実施する。第ＶＩＩＩ因子と親和性クロマトグラフィー樹脂の結合は、約０．１〜約０．５ｍｏｌ／ｋｇの塩化ナトリウムの濃度に相当する低塩条件下で生じる。次に、約０．３〜約４ｍｏｌ／ｋｇの範囲の塩化ナトリウムに相当する高められた塩濃度の下で、親和性クロマトグラフィー樹脂の洗浄を軽鎖の除去のために実施し、その後所望により、約０．５〜約４ｍｏｌ／ｋｇの範囲内の塩化ナトリウムおよび／またはＭｇＣｌ２に相当する塩濃度を約４０〜約６０％のアルコール、好ましくは、エチレングリコールもしくはプロピレングリコール、またはそれらの混合物と組み合わせて用いることによって溶出と収集の工程を実施して、分離画分中に第ＶＩＩＩ因子を得ても良い。
【００３０】
親和性樹脂は、第ＶＩＩＩ因子分子の他の部分ではなく軽鎖と結合するように設計されている。このことは、特定のサイズの親和性リガンドを使用することによって、可能となった。小さすぎる親和性リガンド、例えば化学合成した分子は、立体障害に起因して、場合によって、標的タンパク質への結合が難しいことが知られている。従って、本発明に必要とされる親和性リガンドのサイズは、１０ｋダルトン以上の範囲内にある。このサイズのＦａｂ断片分子に想定される強い親和性のため（１４）、および、リガンドがＦＶＩＩＩ軽鎖に対するものであることのため、ＦＶＩＩＩ重鎖を含む未変性の複合体がＦＶＩＩＩ軽鎖と共に溶出される前に、ＦＶＩＩＩ軽鎖を洗い流すことができることは驚くべきことであった。特に、親和性樹脂は、約７４μｍの平均粒子サイズの架橋アガロースマトリクスをベースとし、約１３ｋＤ酵母由来Ｆａｂ抗体断片親和性リガンドを親水性スペーサーアーム通してマトリクスと結合させて、第ＶＩＩＩ因子分子との結合に有用なリガンドを作製する。親和性リガンドは、生物学的活性型第ＶＩＩＩ因子分子の第ＶＩＩＩ因子軽鎖と結合する。
【００３１】
本発明の方法の他の実施形態において、親和性クロマトグラフィーの条件は、以下の条件のうち少なくとも２つを含む。
−生物学的活性型第ＶＩＩＩ因子の樹脂ロードが、少なくとも５０００ＩＵ／ｍＬ樹脂である、好ましくは少なくとも１０，０００ＩＵ／ｍＬ樹脂である、最も好ましくは２０，０００ＩＵ／ｍＬ樹脂を超える
−第ＶＩＩＩ因子のロードの間のバッファー条件；ｐＨ６．２〜６．８で、約０．１〜約０．５ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、約０．０１〜約０．０５ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２、約０．０１〜約０．０５ｍｏｌ／ｋｇのＬ−ヒスチジン、約０．００５〜約０．０５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０、約０．５〜約２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、約０．１〜約１％のＴＮＢＰ
−洗浄の間のバッファー条件；ｐＨ６．２〜６．８で、約０．５〜約４ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、約０．０１〜約０．０５ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２、約０．０１〜約０．０５ｍｏｌ／ｋｇのＬ−ヒスチジン、約０．００５〜約０．０５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０
−第ＶＩＩＩ因子の溶出の間のバッファー条件；ｐＨ６．２〜６．８で、約０．５〜約４ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、約４０〜約６０％のエチレングリコール、約０．０１〜約０．０５ｍｏｌ/ｋｇのＣａＣｌ２、約０．０１〜約０．０５ｍｏｌ／ｋｇのＬ−ヒスチジン、約０．００５〜約０．０５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０
【００３２】
本発明の方法の他の特定の実施形態において、第ＶＩＩＩ因子と陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂が結合する条件下で陰イオン交換クロマトグラフィーを実施し、生物学的活性型第ＶＩＩＩ因子の溶出の前後いずれかにおいて、生物学的不活性型を陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂から除去する。溶出画分中の第ＶＩＩＩ因子単量体含有量は、９８％以上である。発明の方法によれば、第ＶＩＩＩ因子を結合させるために、０．０１〜０．１５ｍｏｌ／ｋｇの塩化ナトリウムの濃度に相当する低塩条件下で第ＶＩＩＩ因子をロードし、不活性型第ＶＩＩＩ因子を除去し、不活性型第ＶＩＩＩ因子の除去のために、０．１５〜０．３ｍｏｌ／ｋｇの濃度の塩化ナトリウムに相当する中程度の塩条件の下で陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂を洗浄し、０．３〜１ｍｏｌ／ｋｇの塩化ナトリウムの濃度に相当する高い塩条件を用いることによって、第ＶＩＩＩ因子を陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂から溶出し、分離画分中に収集する。
【００３３】
さらに、不活性型第ＶＩＩＩ因子を、１〜２ｍｏｌ／ｋｇの塩化ナトリウムの濃度に相当する高い塩条件を用いることによって、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂から溶出し、別の画分中に収集する。
【００３４】
本発明の陰イオン交換方法の特定の実施形態において、生物学的不活性型第ＶＩＩＩ因子を陰イオン交換クロマトグラフィー工程によって除去し、製品溶出画分中で≧９８％の単量体含有量を得、以下のクロマトグラフィー条件のうち少なくとも２つを含む。
−生物学的活性型第ＶＩＩＩ因子の樹脂ロードが、少なくとも１０，０００ＩＵ／ｍＬ樹脂である、好ましくは少なくとも１５，０００ＩＵ／ｍＬ樹脂である、最も好ましくは２０，０００ＩＵ／ｍＬ樹脂を超える；
−第ＶＩＩＩ因子のロードの間のバッファー条件；ｐＨ６．０〜７．５で、約０．０５〜約０．１５ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、約０．０１〜約０．０５ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２、約０．０１〜約０．０５ｍｏｌ／ｋｇのＬ−ヒスチジン、約０．００５〜約０．０５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０；
−洗浄の間のバッファー条件；ｐＨ６．０〜７．５で、約０．１５〜約０．３ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、約０．０１〜約０．０５ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２、約０．０１〜約０．０５ｍｏｌ／ｋｇのＬ−ヒスチジン、約０．００５〜約０．０５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０；
−第ＶＩＩＩ因子の溶出の間のバッファー条件；ｐＨ６．０〜７．５で、約０．３〜約０．５ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、約０．０１〜約０．０５ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２、約０．０１〜約０．０５ｍｏｌ／ｋｇのＬ−ヒスチジン、約０．００５〜約０．０５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０。
【００３５】
本発明の陰イオンクロマトグラフィー方法のさらなる実施形態において、陰イオン交換樹脂は、球径が約４５〜約１６５μｍの架橋６％アガロースマトリクスと結合しているリガンドとしての四級アンモニウムイオンを有し、約０．１８〜約０．２５ｍｍｏｌ／ｍＬの総イオン結合能力を有する強陰イオン交換体である。
【００３６】
本発明の方法の他の特定の実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、以下のクロマトグラフィー条件のうち少なくとも２つを含む。
−カラム体積の約４〜約８％であるサンプルロード、
−約６０〜約９０ｃｍのカラム高、
−少なくとも１０，０００ＩＵ／ｍＬである、好ましくは少なくとも１５，０００ＩＵ／ｍＬである、最も好ましくは２０，０００ＩＵ／ｍＬを超える、サンプルロード中の生物学的に活性な第ＶＩＩＩ因子の濃度
−不活性型第ＶＩＩＩ因子の凝集化のためのカラム平衡化バッファー；ｐＨ６．０〜７．５で、約０．２〜約０．７ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、約０．０１〜約０．０５ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２、約０．０１〜約０．０５ｍｏｌ／ｋｇのクエン酸ナトリウム、約０．５〜約２％（ｗ／ｗ）のスクロース、約０．５〜約２％（ｗ／ｗ）のＬ−アルギニン、約０．１〜約１％（ｗ／ｗ）のポロクサマー１８８、
生物学的活性型第ＶＩＩＩ因子を、前記単量体型で収集し、一方、不活性型第ＶＩＩＩ因子は、サイズ排除クロマトグラフィー工程の凝集不活性型を含む画分（凝集型断片（不活性型）および凝集型単量体第ＶＩＩＩ因子（単量体のとき活性であるが、凝集型のとき部分的に不活性）の両方であり得る）、および／またはサイズ排除クロマトグラフィー工程の断片型第ＶＩＩＩ因子を含む画分のいずれかに見い出される、
−第ＶＩＩＩ因子単量体の収集を、カラムの出口で約３０〜約４０ｍＡＵの吸光度ピークが記録されたときに始め、吸光度ピークが約１〜約４０ｍＡＵに戻ったときに止め、第ＶＩＩＩ因子単量体の収集は、サンプル添加量の２〜３倍に相当する。
【００３７】
本発明のサイズ排除クロマトグラフィーの特定の実施形態において、サイズ排除樹脂は、平均直径が３４μｍ、最適分離範囲が１０，０００〜６００，０００ダルトンの球状架橋アガロース／デキストラン媒体である。
【００３８】
本発明の方法の他の特定の実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィー溶出物は、少なくとも１２ヵ月間、特に３６ヶ月間安定であり、以下の条件のうち少なくとも２つを含む。
−バッファーの組成；ｐＨ６．０〜７．５で、約０．２〜約０．７ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、約０．０１〜約０．０５ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２、約０．０１〜約０．０５ｍｏｌ／ｋｇのクエン酸ナトリウム、約０．５〜約２％（ｗ／ｗ）のスクロース、約０．５〜約２％（ｗ／ｗ）のＬ−アルギニン、約０．１〜約１％（ｗ／ｗ）のポロクサマー１８８、
−−６０℃で保存された凍結溶液、
−室温から≦−４０℃までの溶液の凍結を９０分以下で達成する。
−−６０℃以下での保存による凍結溶液を９０分以下で１８〜２５℃へ解凍する。
−上記のバッファーと共に第ＶＩＩＩ因子の濃度を調製し、バイアル当り２５０ＩＵ、５００ＩＵ、１０００ＩＵ、２０００ＩＵ、３０００ＩＵ、４０００ＩＵ、または５０００ＩＵの第ＶＩＩＩ因子でガラスバイアルに満たした後、解凍した溶液を凍結乾燥方法に付す。
−上記による凍結乾燥製品において、第ＶＩＩＩ因子単量体含有量は、９９％以上である。
−上記による凍結乾燥製品は、再構成の後、少なくとも１２ヶ月、好ましくは２４ヶ月、最も好ましくは３６ヶ月、第ＶＩＩＩ因子単量体に著しい変化なく保存することができ、患者に使用することができる。
−再構成された上記の製品は、以下のバッファーの組成；ｐＨ６．０〜７．５で、約０．２〜約０．７ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、約０．０１〜約０．０５ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２、約０．０１〜約０．０５ｍｏｌ／ｋｇのクエン酸ナトリウム、約０．５〜約２％（ｗ／ｗ）のスクロース、約０．５〜約２％（ｗ／ｗ）のＬ−アルギニン、約０．１〜約１％（ｗ／ｗ）のポロクサマー１８８、を有する。
【００３９】
本発明の対象は、血友病を治療するため、およびインヒビターの形成を回避するための、本発明の方法により得られる第ＶＩＩＩ因子製品でもあり、前記製品は、凍結および／または凍結乾燥条件で、少なくとも６ヶ月間、好ましくは少なくとも１２ヶ月間、より好ましくは少なくとも２４ヶ月間、最も好ましくは３６ヶ月まで安定である。この第ＶＩＩＩ因子は、上記の３つの精製工程、１．親和性工程、２．陰イオン交換工程、３．サイズ排除クロマトグラフィー工程をこの順序で経る特定の方法により得られる。
【００４０】
精製スキームのこの順序を与えることにより、得られたＦＶＩＩＩ製品の品質は、異なる精製スキームを使用した市販の組み換え型ＦＶＩＩＩ製品（２２）と比べて、ＦＶＩＩＩ  Ｃ／Ａｇ比が高く、単量体含有量が高かった（凝集体と断片が少ないことに相当）。本発明の第ＶＩＩＩ因子製品は、表１から分かるように、第ＶＩＩＩ因子Ｃ／Ａｇの比が高く、単量体が多く、断片含有量が少ないという優れた結果を示した。本発明の製品と市販のある組み換え型製品を生体内でさらに比較したところ、表２から分かるように、治療歴のない血友病Ａ患者におけるインヒビター発生量の減少を認めることができた。表２の精製方法Ａ（２２）を使用したｒＦＶＩＩＩ製品は、ＦＶＩＩＩ  Ｃ／Ａｇ比を増加させ、かつ、単量体含有量が多く断片含有量が少ない製品を示す能力であって、治療歴のない血友病Ａ患者における免疫学的発生量（ｔｈｅ  ａｍｏｕｎｔ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｃｉｄｅｎｔｓ）に明らに影響を与えるという、本発明の精製方法と同様な高い能力を有しない。
【００４１】
【表１】
0006778111.tif 000002
【００４２】
【表２】
0006778111.tif 000003
【００４３】
＊は、Ｃｏｌｌｉｎｓの２０１４年の研究２１で発表されている、＊＊は、進行中の研究である
【００４４】
本発明の他の対象は、ＥＰ２５３７８６２Ａ１と比べて改良された本発明の製品性能である。これは、上記の３つの精製工程、１．親和性工程、２．陰イオン交換工程、３．サイズ排除クロマトグラフィー工程をこの順序で経る特定の方法により特別に達成される。また、求められる高い（＞０．９）第ＶＩＩＩ因子Ｃ／Ａｇ比と単量体含有量（＞９９％）を患者において確保する、本発明のサイズ排除工程の特定の方法の条件を含む。最後のサイズ排除バッファー交換工程と製品の凍結乾燥により与えられる本発明の特定のバッファー条件を使用することにより第ＶＩＩＩ因子を保存する場合に、−７０℃で１２ヶ月間保存後でも達成される。これは、保存期間に望ましくない第ＶＩＩＩ因子Ｃ／Ａｇ比と単量体含有量の減少を最小化すると考えられ、（保存された凍結乾燥製品の再構成後に）患者に注入される溶液中の凝集体／断片に起因する望まない免疫反応に関するリスクが、患者に与えられる製品では少ないことを保証する。さらに、ブラッドフォード分析法を使用してＦＶＩＩＩ：Ｃ／タンパク質の濃度で測定された比活性は、ＥＰ２５３７８６２Ａ１で開示されている値（８０６１ＩＵ／ｍｇ、ｎ＝１）と比べて、統計的に有意に高い（１００００ＩＵ／ｍｇ、ｎ＝９）。比活性は、ＦＶＩＩＩ製品の純度の指標であり（異なる結果を与える異なるタンパク質測定方法が知られており、従って、値が比較可能であるためには、同じタンパク質方法が必要である）、タンパク質の不純物は、患者におけるインヒビター発生の１つのリスク因子であるため、ＥＰ２５３７８６２Ａ１と比較して、本発明の製品の性能が優れていることが示されている。また、ＥＰ２５３７８６２Ａ１で開示されているような本発明の図１７に見られる等電点分離法によるタンパク質のフィンガープリント分析は、それぞれの製品の製品特性における差を示す。
【００４５】
本発明の特定の実施形態において、第ＶＩＩＩ因子は、最後の工程後に、第ＶＩＩＩ因子の総量（ＦＶＩＩＩ：Ａｇ）に対する生物学的活性型第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）の割合が、０．７以上、好ましくは０．８以上、より好ましくは０．９以上、最も好ましくは１であり、第ＶＩＩＩ因子単量体含有量が、９８％以上、好ましくは９９％以上、最も好ましくは１００％であることと、実質的に凝集型第ＶＩＩＩ因子が検出することができないこととを特徴とする。
【００４６】
本発明の他の実施形態において、第ＶＩＩＩ因子は、その生物学的活性、高い単量体第ＶＩＩＩ因子含有量、および低い凝集／断片型第ＶＩＩＩ因子含有量を維持している。
【００４７】
さらなる他の実施形態において、本明細書の一部として援用される２０に記載されているように、本発明の第ＶＩＩＩ因子は、生物学的活性を有する第ＶＩＩＩ因子の血漿由来型、組み換え体由来型、および／または欠失誘導体もしくは切断型、特にＢドメイン欠失型ＦＶＩＩＩであることを特徴とする。
【００４８】
本発明のさらなる他の実施形態において、第ＶＩＩＩ因子は、組み換え体由来型、および／または欠失誘導体である場合、ヒト細胞で生産されることを特徴とする。
【００４９】
本発明の特定の実施形態において、第ＶＩＩＩ因子は、製品で治療された治療歴のある血友病Ａ患者または治療歴のない血友病Ａ患者におけるインヒビターの量が、２５％未満、好ましくは２０％、より好ましくは１０％未満、好ましくは好ましい０％であることを特徴とする。
【００５０】
本発明の主題は、血友病を治療するため、およびインヒビターの形成を回避するための、本発明の方法により得られる第ＶＩＩＩ因子製品でもある。
【００５１】
特に、本発明に係る製品では、治療歴のある血友病Ａ患者または治療歴のない血友病Ａ患者において、本発明の製品で治療後に、インヒビターの量が、約２５％未満、好ましくは約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約０％を示す。
【００５２】
タンパク質を取り囲む非晶質マトリクスを形成することにより、凍結乾燥方法の間、および保存の間、タンパク質を保護する凍結保護物質を推奨する。
【００５３】
増量剤が含まれても良く、増量剤は、凍結乾燥の間機械的支持を与えるケーク形成体（ｃａｋｅ  ｆｏｒｍｅｒ）として機能し、製剤の乾燥重を増加させる。それ故に、増量剤は、凍結乾燥製品の均一な品質と外観を与えることに役立つ。
【００５４】
さらに、タンパク質に適し、かつ、製品の治療用途に適する値にｐＨを維持するように、緩衝剤を加えることができる。凍結乾燥されたタンパク質に適する成分は、例えば、本明細書の一部として援用される国際公開第２０１０／０２６１８６  Ａ号に開示されている。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】ＦＶＩＩＩ抗体を使用したウエスタンブロット。左から、分子量標準、レーン１；親和性工程の出発材料、ＦＶＩＩＩ：Ａｇ  ５．０ＩＵ／ｍＬ、レーン２；親和性工程のフロースルー、ＦＶＩＩＩ：Ａｇ  １３２ＩＵ／ｍＬ、レーン３；親和性洗浄画分、ＦＶＩＩＩ：Ａｇ  ２６ＩＵ／ｍＬ、レーン４；親和性溶出物（出発材料Ｑ）、ＦＶＩＩＩ：Ａｇ  ５．８ＩＵ／ｍＬ、レーン５；陰イオン交換フロースルー＋平衡化（ｅｑ．）、ＦＶＩＩＩ：Ａｇ  １．７ＩＵ／ｍＬ、レーン６；陰イオン交換洗浄、ＦＶＩＩＩ：Ａｇ  ５．０ＩＵ／ｍＬ。図１は、親和性工程と陰イオン交換体工程のフロースルーと洗浄画分中の不活性型ＦＶＩＩＩ：Ｃの除去を示す。親和性工程の洗浄画分は、ほぼＦＶＩＩＩ軽鎖のみを含む。
【図２】ＦＶＩＩＩ抗体を使用したウエスタンブロット。左から、分子量標準、レーン１；ＦＶＩＩＩ対照、ＦＶＩＩＩ：Ｃ  ５．０ＩＵ／ｍＬ、レーン２；親和性溶出物、ＦＶＩＩＩ：Ｃ  ５ＩＵ／ｍＬ、レーン３；希釈した親和性溶出物、ＦＶＩＩＩ：Ｃ  ５ＩＵ／ｍＬ、レーン４；陰イオン交換溶出物、ＦＶＩＩＩ：Ｃ  ５ＩＵ／ｍＬ、レーン５；サイズ排除溶出物、ＦＶＩＩＩ：Ｃ  ５ＩＵ／ｍＬ。図２は、親和性工程の後、陰イオン交換工程の後、およびサイズ排除工程の後で等しいＦＶＩＩＩ：Ｃ濃度であるＦＶＩＩＩのウエスタンブロットパターンを示し、全て、ＦＶＩＩＩ対照と同じパターンを示している。
【図３】実施例３の分取サイズ排除クロマトグラフィーカラムからのクロマトグラムであり、異なる樹脂ロードと第ＶＩＩＩ因子濃度を使用した３つの異なる実験に関して、単量体第ＶＩＩＩ因子からの凝集体と断片の分離を示す。実施例３の平衡化バッファー系とクロマトグラフィー条件は、凝集を促進し、従って、単量体単量体第ＶＩＩＩ因子（溶出物）からの凝集体の除去を促進する。クロマトグラフィーピークは、２８０ｎｍでの吸光度で測定されるタンパク質を反映する。
【図４】分析的サイズ排除クロマトグラフィーカラム（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ１）からのクロマトグラムであり、実施例２に従って調製したサンプル（溶出物）からのクロマトグラフィー特性を示し、凝集体、単量体、および断片の含有量をそれぞれパーセンテージで示す。このサンプルの単量体含有量は、＞９８％であり、凝集体含有量は、＜０．５％であり、断片含有量は、＜１．５％である。
【図５】分析的サイズ排除クロマトグラフィーカラム（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ１）からのクロマトグラムであり、実施例３に従って調製したサンプル（溶出物）からのクロマトグラフィー特性を示し、凝集体、単量体、および断片の含有量をそれぞれパーセンテージで示す。このサンプルの単量体含有量は、概して＞９９％であり、凝集体含有量は、目に見えない量であり、断片含有量は、＜１％である。
【図６】実施例４の分取サイズ排除クロマトグラフィーカラムからのクロマトグラムであり、異なる樹脂ロードと第ＶＩＩＩ因子濃度を使用した５つの異なる実験に関して、単量体第ＶＩＩＩ因子からの凝集体と断片の分離を示す。実施例４の平衡化バッファー系とクロマトグラフィー条件は、凝集を促進し、従って、単量体第ＶＩＩＩ因子（溶出物）からの凝集体の除去を促進する。クロマトグラフィーピークは、２８０ｎｍでの吸光度で測定されるタンパク質を反映する。
【図７】分析的サイズ排除クロマトグラフィーカラム（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ１）からのクロマトグラムであり、実施例４に従って調製したサンプル（陰イオン交換溶出物）からのクロマトグラフィー特性を示し、凝集体、単量体、および断片の含有量をそれぞれパーセンテージで示す。このサンプルの単量体含有量は、＞９７％であり、凝集体含有量は、＜０．７％であり、断片含有量は、＜２．５％である。
【図８】分析的サイズ排除クロマトグラフィーカラム（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ１）からのクロマトグラムであり、実施例４に従って調製したサンプル（サイズ排除溶出物）からのクロマトグラフィー特性を示し、凝集体、単量体、および断片の含有量をそれぞれパーセンテージで示す。このサンプルの単量体含有量は、＞９８％であり、凝集体含有量は、目に見えるサインがなく、断片含有量は、＜２％である。
【図９】分析的サイズ排除クロマトグラフィーカラム（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ１）からのクロマトグラムであり、実施例４に従って調製したサンプル（陰イオン交換溶出物）からのクロマトグラフィー特性を示し、凝集体、単量体、および断片の含有量をそれぞれパーセンテージで示す。このサンプルの単量体含有量は、＞９８％であり、凝集体含有量は、目に見えるサインがなく、断片含有量は、＜２％である。
【図１０】分析的サイズ排除クロマトグラフィーカラム（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ１）からのクロマトグラムであり、実施例４に従って調製したサンプル（サイズ排除溶出物）からのクロマトグラフィー特性を示し、凝集体、単量体、および断片の含有量をそれぞれパーセンテージで示す。このサンプルの単量体含有量は、＞９８％であり、凝集体含有量は、目に見えるサインがなく、断片含有量は、＜２％である。
【図１１】分析的サイズ排除クロマトグラフィーカラム（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ１）からのクロマトグラムであり、実施例４に従って調製したサンプル（陰イオン交換溶出）からのクロマトグラフィー特性を示し、凝集体、単量体、および断片の含有量をそれぞれパーセンテージで示す。このサンプルの単量体含有量は、＞９８％であり、凝集体含有量は、目に見えるサインがなく、断片含有量は、＜１．５％である。
【図１２】分析的サイズ排除クロマトグラフィーカラム（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ１）からのクロマトグラムであり、実施例４に従って調製したサンプル（サイズ排除溶出物）からのクロマトグラフィー特性を示し、凝集体、単量体、および断片の含有量をそれぞれパーセンテージで示す。このサンプルの単量体含有量は、＞９８％であり、凝集体含有量は、目に見えるサインがなく、断片含有量は、＜１．５％である。
【図１３】分析的サイズ排除クロマトグラフィーカラム（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ１）からのクロマトグラムであり、実施例４に従って調製したサンプル（陰イオン交換溶出物）からのクロマトグラフィー特性を示し、凝集体、単量体、および断片の含有量をそれぞれパーセンテージで示す。このサンプルの単量体含有量は、＞９９％であり、凝集体含有量は、目に見えるサインがなく、断片含有量は、＜１．５％である。
【図１４】分析的サイズ排除クロマトグラフィーカラム（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ１）からのクロマトグラムであり、実施例４に従って調製したサンプル（サイズ排除溶出物）からのクロマトグラフィー特性を示し、凝集体、単量体、および断片の含有量をそれぞれパーセンテージで示す。このサンプルの単量体含有量は、＞９８％であり、凝集体含有量は、目に見えるサインがなく、断片含有量は、＜１．５％である。
【図１５】分析的サイズ排除クロマトグラフィーカラム（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ１）からのクロマトグラムであり、実施例４に従って調製したサンプル（陰イオン交換溶出物）からのクロマトグラフィー特性を示し、凝集体、単量体、および断片の含有量をそれぞれパーセンテージで示す。このサンプルの単量体含有量は、＞９９％であり、凝集体含有量は、目に見えるサインがなく、断片含有量は、＜１％である。
【図１６】分析的サイズ排除クロマトグラフィーカラム（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ１）からのクロマトグラムであり、実施例４に従って調製したサンプル（サイズ排除溶出物）からのクロマトグラフィー特性を示し、凝集体、単量体、および断片の含有量をそれぞれパーセンテージで示す。このサンプルの単量体含有量は、＞９８％であり、凝集体含有量は、目に見えるサインがなく、断片含有量は、＜１．５％である。
【図１７】サイズ排除クロマトグラフィーの後に本発明の実施例４に従ってサンプルを処理したサンプルの電荷とサイズの特性の分析的二次元電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）フィンガープリント。
【図１８】本発明の精製方法の間の第ＶＩＩＩ因子の純度の増加。
【図１９】分析的サイズ排除クロマトグラフィーカラム（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ２）からのクロマトグラムであり、実施例７に従って調製した（本発明に従って精製および凍結乾燥した）サンプルからのクロマトグラフィー特性を示し、凝集体、単量体、および断片の含有量をそれぞれ凍結乾燥製品の再構成後（１０００ＩＵ  バイアル）のパーセンテージで示す。このサンプルの単量体含有量は、原理上１００％であり（単量体ピークの左側のわずかなショルダーは、分子量標準の保持曲線（図２３）に基づき、ＦＶＩＩＩ単量体ピークに含まれる）、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ２クロマトグラムにおいて、およそ７〜１０分で溶出しており、凝集体と断片の含有量は認められない。
【図２０】分析的サイズ排除クロマトグラフィーカラム（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ２）からのクロマトグラムであり、精製方法Ａ２２と凍結乾燥により調製したサンプルからのクロマトグラフィー特性を示し、凝集体、単量体、および断片の含有量をそれぞれ凍結乾燥製品の再構成後（１０００ＩＵ  バイアル）のパーセンテージで示す。このサンプルの単量体含有量は、およそ７６％であり、凝集体含有量は認められず、断片含有量はおよそ２４％である。ｒＦＶＩＩＩ製品は、完全なＢドメインを有し、分子量がおよそ３００ｋＤであり、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ２クロマトグラムにおいておよそ５〜８分で単量体ＦＶＩＩＩが溶出する完全長ＦＶＩＩＩ製品である。断片ピークはおよそ８〜１３分の単量体ピークの後直ぐに計算が開始されている。
【図２１】分析的サイズ排除クロマトグラフィーカラム（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ２）からのクロマトグラムであり、精製方法Ｂ２２と凍結乾燥により調製したサンプルからのクロマトグラフィー特性を示し、凝集体、単量体、および断片の含有量をそれぞれ凍結乾燥製品の再構成後（１０００ＩＵ  バイアル）のパーセンテージで示す。このサンプルの単量体含有量は、およそ９９％であり（単量体ピークの左側のわずかなショルダーは、分子量標準の保持曲線（図２３）に基づき、ＦＶＩＩＩ単量体ピークに含まれる）、凝集体含有量は認められず、断片含有量はおよそ１％である。ｒＦＶＩＩＩ製品は、分子量がおよそ１７０ｋＤであり、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ２クロマトグラムにおいておよそ７〜１０．５分で単量体ＦＶＩＩＩの溶出を与えるＢドメイン欠失型ＦＶＩＩＩ製品である。断片ピークは、およそ１０．５〜１３分の単量体ピークの後直ぐに計算が開始されている。
【図２２】分析的サイズ排除クロマトグラフィーカラム（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ２）からのクロマトグラムであり、精製方法Ｃ２２と凍結乾燥により調製したサンプルからのクロマトグラフィー特性を示し、凝集体、単量体、および断片の含有量をそれぞれ凍結乾燥製品の再構成後（１０００ＩＵ  バイアル）のパーセンテージで示す。このサンプルの単量体含有量は、およそ８０％であり、凝集体含有量は認められず、断片含有量はおよそ２０％である。ｒＦＶＩＩＩ製品は、完全なＢドメインを有し、分子量がおよそ３００ｋＤであり、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ２クロマトグラムにおいておよそ５〜８分で単量体ＦＶＩＩＩの溶出を与える完全長ＦＶＩＩＩ製品である。断片ピークは、８〜１３分の単量体ピークの後直ぐに計算が開始されている。
【図２３】分析的サイズ排除クロマトグラフィーカラム（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ２）からのクロマトグラムであり、分子量標準サンプル（１５〜６００ｋＤ、６９３８５、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ社）からのクロマトグラフィー特性を示す。
【００５６】
本発明に係る用語「生物学的不活性型第ＶＩＩＩ因子」は、化学的原因、生化学的原因、または酵素的原因によりその生物学的活性を失っている第ＶＩＩＩ因子の形態を意味する。生物学的不活性型第ＶＩＩＩ因子は、例えば、単独の第ＶＩＩＩ因子軽鎖もしくは重鎖、第ＶＩＩＩ因子の切断型もしくは第ＶＩＩＩ因子の活性型（しかし、凝固サイクルにおける活性化により定義されるために不安定である）（ＦＶＩＩＩａなど）、および／または断片型第ＶＩＩＩ因子の凝集型もしくは他の形態であり得る。
【００５７】
本明細書で使用されるｍｏｌ／ｋｇの定義は、１，０００ｇの水に加えられたｍｏｌ数であり、Ｍｏｌａｒの定義は、１，０００ｍＬになるまで水を加えられたｍｏｌ数である。
【００５８】
生物学的活性型第ＶＩＩＩ因子と生物学的不活性型第ＶＩＩＩ因子の両方のサンプル中の総量を、（ＦＶＩＩＩ：Ａｇ）の抗原をベースとするＥＬＩＳＡ分析法を用いて測定する。（生体内での）完全な生物学的活性を有するサンプル中の生物学的に活性な第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）と第ＶＩＩＩ因子の抗原含有量（ＦＶＩＩＩ：Ａｇ）の比は、１．０に等しいべきである。比が１より小さい場合、サンプル中に不活性型第ＶＩＩＩ因子があることが示唆される。不活性型は、単独の第ＶＩＩＩ因子軽鎖および重鎖に解離した凝集型第ＶＩＩＩ因子および／または第ＶＩＩＩ因子分子のいずれかである可能性がある。
【００５９】
ＦＶＩＩＩ軽鎖（分子量がおよそ８０ｋＤの第ＶＩＩＩ因子のＡ３、Ｃ１、およびＣ２ドメイン）は、生物学的に活性な第ＶＩＩＩ因子分子中で、ＦＶＩＩＩ重鎖（分子量が９０〜２１０ｋＤのＡ１およびＡ２第ＶＩＩＩ因子ドメイン）との金属／疎水性複合体となっている。この複合体は、生体内で未変性の第ＶＩＩＩ因子分子であり、通常の条件下で、第ＶＩＩＩ因子分子を変性から保護するフォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）と結合して循環する。凝固系が活性化されるとき、未変性の第ＶＩＩＩ因子分子は、ｖＷＦから放出され、活性化された血小板と結合し、タンパク質分解性の変換を受けて、未変性のＦＶＩＩＩ分子の活性な形態であり、凝固系の重要な要素であるＦＶＩＩＩａ（活性型第ＶＩＩＩ因子）となる。ＦＶＩＩＩａ分子は、凝固カスケードにより直ぐに消費され、その後、様々なプロテアーゼインヒビターにより酵素的に不活性化される。（１５）複合体が解離している場合（１６）、軽鎖または重鎖は、生物学的活性が全く、またはほとんどなく、ＦＶＩＩＩ：Ｃ／ＦＶＩＩＩ：Ａｇの比は、ゼロに近い。未変性の複合体が、タンパク質分解により不活性化されている場合、軽鎖と重鎖の両方の分子量は減少し、第ＶＩＩＩ因子の分解産物は、最初は生物学的活性を残しているが（例えばＦＶＩＩＩａ）、第ＶＩＩＩ因子の分解産物は不安定であり、生体内で比較的直ぐに不活性化される。（１）第ＶＩＩＩ因子の分解産物は（タンパク質分解性の分解によるものと非タンパク質分解性の解離によるものの両方）は、サイズに基づいて生物学的活性型第ＶＩＩＩ因子分子と不活性型第ＶＩＩＩ因子分子を特異的に示す第ＶＩＩＩ因子のウエスタンブロット解析法を用いて検出することができる。未変性の第ＶＩＩＩ因子分子は、分子がＢドメインを欠失しているか、またはしていないかによって、およそ１７０ｋダルトンまたは２９０ｋダルトンの分子量を有す。Ｂドメインは、第ＶＩＩＩ因子分子中で、生物学的活性な機能が全くなく、従って、生物学的活性型第ＶＩＩＩ因子分子は、Ｂドメインがある、またはＢドメインがない（もしくはＢドメインの一部がない）のどちらかであり得る。
【００６０】
単量体第ＶＩＩＩ因子製品は、通常のバッファー条件の下で実施される分析的ＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィー法により確定された同じ分子量の集団を有する生物学的に活性な第ＶＩＩＩ因子分子として本明細書で定義される。断片型第ＶＩＩＩ因子は、主に不活性であり、一方で、凝集型第ＶＩＩＩ因子は、減少した生物学的活性を有す。両方の形態は、生体内でインヒビター形成のリスクを理論的に増加させる。血友病Ａの治療を目的とする第ＶＩＩＩ因子製品中で、可能な限り、両方の形態は少なくあるべきである。単量体第ＶＩＩＩ因子製品は、精製方法の最後で、可能な限り多くあるべきであり、また、第ＶＩＩＩ因子製品の製剤過程（凍結状態）の前で安定であるべきであり、実際の製剤過程（凍結乾燥またはバイアル中に溶液を満たすこと）の下で、再構成され患者に消費されるまで安定であるべきである。この期間は、しばしば、数ヶ月から１〜３年までであり得る。第ＶＩＩＩ因子の凍結溶液中での安定性の一例は、ＵＳ  ８，１８７，７９９  Ｂ２に与えられており、具体的なバッファー組成が主張されているが、しかしながら、この参考文献において、第ＶＩＩＩ因子凝集体／単量体含有量は、議論されていない。
【００６１】
本発明の組み換え型第ＶＩＩＩ因子は、特に、Ｂドメインを完全または部分的に欠く欠失誘導体であり、そのため、最終精製製品中で５，０００ＩＵ／ｍｇをはるかに超え得る比活性を与える。このようなＢドメインを完全または部分的に欠く欠失誘導体の例は、ＥＰ−Ａ−１１３６５５３およびＥＰ−Ａ−１７３９１７９で開示され、ヒト細胞株から調製されている。現在開発されている組成物が、以下のセクションで記載されているように、このような第ＶＩＩＩ因子の欠失誘導体または同じように高純度のその他の第ＶＩＩＩ因子製品に適用するのに特に良く適しているということが、高く評価されている。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
本発明の詳細な説明
第ＶＩＩＩ因子の親和性クロマトグラフィー工程の詳細な説明
【００６３】
平衡化バッファー条件（０．３ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＬ−ヒスチジン、０．０２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０、ｐＨ６．４〜６．６、伝導率は３０〜３６ｍＳ／ｃｍ）の下で、溶剤、界面活性剤（ｓｏｌｖｅｎｔ  ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ｃｈｅｍｉｃａｌ）（１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００＋０．３％トリ−ｎブチルホスフェート）を用いて、または用いずに、第ＶＩＩＩ因子を第ＶＩＩＩ因子親和性クロマトグラフィーカラム（ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ）と結合させる。溶剤、界面活性剤（ｓｏｌｖｅｎｔ  ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ｃｈｅｍｉｃａｌ）は、親和性工程の前に、（脂質に包まれた）ウイルスを不活性化する目的で第ＶＩＩＩ因子溶液に添加してもよい。第ＶＩＩＩ因子を安定化させる目的で加えることができる０．２ｍｏｌ／ｋｇのソルビトールおよび０．０４５ｍｏｌ／ｋｇのアルギニン等の第ＶＩＩＩ因子精製の上流からのその他の化学物質も、第ＶＩＩＩ因子ロード溶液中に存在し得る。通常、第ＶＩＩＩ因子ロードは、約５，０００〜約２５，０００ＩＵ／ｍＬ親和性樹脂であり、原則として、任意の純度（１〜１５，０００ＩＵ第ＶＩＩＩ因子／ｍｇタンパク質）の第ＶＩＩＩ因子溶液を親和性カラムに添加し得る。方法を、周囲温度、例えば室温で実施する。
【００６４】
第ＶＩＩＩ因子を含む溶液をカラム上で処理した後、１５カラム体積の平衡化バッファー（０．３ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＬ−ヒスチジン、０．０２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０、ｐＨ６．４〜６．６、伝導率は３０〜３６ｍＳ／ｃｍ）でカラムをすすいで、不純物（製品関連と方法関連の両方）を除去する。次に、高めた塩濃度（１ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＬ−ヒスチジン、０．０２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０、ｐＨ６．４〜６．６、伝導率は８３〜８９ｍＳ／ｃｍ）で５カラム体積を洗浄して、単独のＦＶＩＩＩ軽鎖を特異的に除去する。その後、４カラム体積のバッファーを使用して、高めた塩濃度とエチレングリコール（１．５ｍｏｌ/ｋｇのＮａＣｌ、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＬ−ヒスチジン、５０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコール、０．０２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０、ｐＨ６．４〜６．６、伝導率は３６〜４２ｍＳ／ｃｍ）でカラムから生物学的に活性な第ＶＩＩＩ因子を溶出する。
【００６５】
その後、親和性樹脂と結合している残存タンパク質を、酸性洗浄（ｐＨ２）により除去し、樹脂の後、平衡化後、別の精製サイクルに備える。
【００６６】
陰イオン交換クロマトグラフィー工程の詳細な説明
平衡化バッファー条件（０．１ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＬ−ヒスチジン、０．０２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０、ｐＨ７．４〜７．６、伝導率は１２〜１６ｍＳ／ｃｍ）の下で、第ＶＩＩＩ因子を強陰イオン交換カラム（Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ）と結合させる。５％のエチレングリコール等の第ＶＩＩＩ因子精製の上流からのその他の化学物質も、第ＶＩＩＩ因子ロード溶液中に存在し得る。通常、第ＶＩＩＩ因子ロードは、１０，０００〜１００，０００ＩＵ／ｍＬ親和性樹脂であり、出発材料の純度は、＞５０００ＩＵ第ＶＩＩＩ因子／ｍｇタンパク質である。方法を、周囲温度、例えば室温で実施する。
【００６７】
第ＶＩＩＩ因子を含む溶液をカラムで処理した後、１５カラム体積の平衡化バッファー（０．１ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＬ−ヒスチジン、０．０２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０、ｐＨ７．４〜７．６、伝導率は１２〜１６ｍＳ／ｃｍ）でカラムをすすいで、不純物（製品関連と方法関連の両方）を除去する。次に、高めた塩濃度（０．３０ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＬ−ヒスチジン、０．０２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０、ｐＨ７．４〜７．６、伝導率は３０〜３５ｍＳ／ｃｍ）で５カラム体積を洗浄して、不活性型第ＶＩＩＩ因子を除去する。その後、１カラム体積のバッファーを使用して、高めた塩濃度（０．３９ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＬ−ヒスチジン、０．０２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０、ｐＨ５．９〜６．１、伝導率は３８〜４２ｍＳ／ｃｍ）で生物学的に活性な単量体第ＶＩＩＩ因子をカラムから溶出する。
【００６８】
その後、イオン相互作用により陰イオン交換樹脂と結合しているあらゆる残存タンパク質を、２ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌへと高めた塩濃度により除去し、その後、高いｐＨ（１４）を使用して樹脂を殺菌し、平衡化後、別の精製サイクルのためにカラムを準備する。
【００６９】
サイズ排除クロマトグラフィー工程の詳細な説明
ベッド高が７０ｃｍのサイズ排除クロマトグラフィーカラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐ．ｇ．）に対して４〜８％のカラム体積で第ＶＩＩＩ因子をロードし、３０．７ｇ／ｋｇのＮａＣｌ、０．５ｇ／ｋｇのＣａＣｌ２、２．０ｇ／ｋｇのクエン酸Ｎａ、９．２ｇ／ｋｇの塩酸Ｌ−アルギニン、９．２ｇ／ｋｇのサッカロース、２．０ｇ／ｋｇのポロクサマー１８８、ｐＨ６．９〜７．１、４７〜５１ｍＳ／ｃｍの伝導率で平衡化する。通常、出発材料中の第ＶＩＩＩ因子濃度は、＞１０，０００ＩＵ／ｍＬであり、バッファーの組成は、０．４ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＬ−ヒスチジン、０．０２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０、ｐＨ６．０〜６．５、３５〜４２ｍＳ／ｃｍの伝導率である。出発材料の純度は、＞８０００ＩＵ第ＶＩＩＩ因子／ｍｇタンパク質である。方法を室温；１８〜２５℃で実施する。
【００７０】
第ＶＩＩＩ因子を含む溶液をサイズ排除カラムに添加した後、カラムの出口で２８０ｎｍで測定される吸光度が４０ｍＡＵに上がるまで、カラムを平衡化バッファーで処理し、吸光度が元（４０〜１ｍＡＵ）に戻るまで、単量体の生物学的に活性な第ＶＩＩＩ因子製品を収集する。生物学的に不活性な凝集型第ＶＩＩＩ因子を先に（＜４０ｍＡＵ）除去し、不活性型第ＶＩＩＩ因子断片を単量体の生物学的に活性な第ＶＩＩＩ因子のピークの後で（＜４０ｍＡＵ）除去する。サイズ排除工程の後の単量体の生物学的に活性な第ＶＩＩＩ因子の溶液は、通常、出発材料の体積の２〜３倍である。
【００７１】
本明細書に引用される全ての参考文献は、援用が本明細書に示される教示と矛盾しない最大限の範囲まで、本明細書の一部を構成するものとして援用される。出版物、特許出願、特許を含む、本明細書に引用される全ての参考文献は、あらゆる別に与えられた本明細書の他でなされた特定の文献の援用に関係なく、各参考文献が、本明細書の一部を構成するものとして援用されることを各々具体的に示され、その全体が本明細書に記載されるのと同じ範囲まで（法律で認められる最大の範囲まで）、ここにその全体を本明細書の一部を構成するものとして援用される。
【００７２】
用語「ａ」、および「ａｎ」、および「ｔｈｅ」、および類似の指示対象の本発明の記載に関連した使用は、本明細書に特に示されていない限り、または明らかに文脈上矛盾していない限り、単数および複数の両方を包含するものとして解釈されるべきである。特に指定のない限り、本明細書に与えられる全ての厳密な値は、概算値に対応する代表値（例えば、特定の因子または測定に関して与えられる全ての厳密で例示的な値は、対応する概算的測定値も与えると解釈されることができ、必要に応じて「約」により修正され得る）。
【００７３】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、または「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」等の用語を使用する、要素に関連する本発明のあらゆる態様または実施形態の本明細書での記載は、特に指定のない限り、または明らかに文脈上矛盾していない限り、その特定の要素「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」、「から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」、または「実質的に含む（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」本発明の類似の態様または実施形態の支持を与えることが意図されている（例えば、特に指定のない限り、または明らかに文脈上矛盾していない限り、特定の要素を含むとして本明細書に記載される組成物は、その要素から成る組成物の記載も含むとして理解されるべきである）。
【００７４】
全ての見出しと小見出しは、便宜のためだけに本明細書で使用され、いかなる意味においても本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に与えられる、ありとあらゆる例、または例示的な言葉（例えば、「等（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）の使用は、本明細書に特に主張されていない限り、本発明をより良く説明することだけが意図されており、本発明の範囲を限定はしない。列挙に何の言葉もないことは、本発明の実施に必須のあらゆる主張されていない要素を示しているとして解釈されるべきである。
【００７５】
本明細書での特許文献の引用と援用は、便宜のためだけになされ、このような特許文献の有効性、特許性、および／または権利行使可能性のあらゆる見解を反映していない。準拠法に認められているように、本発明は、特許請求の範囲および／または本明細書に含まれる態様に詳述される対象の全ての変更と均等物を含む。
【実施例】
【００７６】
本発明をさらに記載するが、以下の実施例により本発明を限定はしない。
【００７７】
実施例１：
樹脂に結合している酵母由来第ＶＩＩＩ因子親和性リガンドを用いる精製。
【００７８】
以下の方法は、第ＶＩＩＩ因子：Ｃ活性がない形態の第ＶＩＩＩ因子を、酵母由来因子親和性リガンドクロマトグラフィー工程（ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ）で除去することについて説明している。
【００７９】
カラムと樹脂
ＢＰＧ１４０カラムにＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ樹脂を充填して、１．７リットルのカラム体積となる１１ｃｍのベッド高にした。ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ樹脂はＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（カタログ番号１７−５４５０）から得た。
【００８０】
出発材料：
純度が第ＶＩＩＩ因子１６１４ＩＵ／ｍｇタンパク質である第ＶＩＩＩ因子含有材料、０．３４ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、０，０３５ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２、０，０１ｍｏｌ／ｋｇのＬ−ヒスチジン、０，０４５ｍｏｌ／ｋｇのＬ−アルギニン、０，２ｍｏｌ／ｋｇのソルビトール、０，０２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０、１％（ｗ／ｗ）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０，３％のトリ−ｎ−ブチルホスフェート（ＴＮＢＰ、ｗ／ｗ）、ｐＨ６．５を出発材料として使用した。本明細書の一部として援用される国際公開第２００９１５６４３０Ａ１号にさらに記載されている通り、出発材料を製造した。樹脂に対するＦＶＩＩＩ：Ｃロードは、１５ ５２９ＩＵ／ｍＬ樹脂であった。
【００８１】
バッファー組成：
平衡化バッファー（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびＴＮＢＰ含有）
０．３ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２（２×Ｈ２Ｏ）、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＬ−ヒスチジン、１％ｗ／ｗのＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．３％ｗ／ｗのＴＮＢＰ、ｐＨ：６．５±０．１、伝導率：＋２５℃で３１±３ｍＳ／ｃｍ
洗浄バッファー１（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびＴＮＢＰを含有しない平衡化バッファー）
０．３ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＬ−ヒスチジン、０．０２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０、ｐＨ：６．５±０．１、伝導率：＋２５℃で３１±３ｍＳ／ｃｍ
洗浄バッファー２
１．０ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＬ−ヒスチジン、０．０２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０、ｐＨ：６．５±０．１、伝導率：＋２５℃で８５±３ｍＳ／ｃｍ。
溶出バッファー
１．５ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＬ−ヒスチジン、０．０２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０、５０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコール（ＥＧ）、ｐＨ：６．５±０．１、伝導率：＋２５℃で３９±３ｍＳ／ｃｍ。
【００８２】
平衡化バッファー、洗浄バッファー、および溶出バッファーは、記載のｐＨ、濃度、およびバッファー、塩、または界面活性剤の種類に限定されない。
【００８３】
カラムを平衡化バッファーで平衡化し、次いで、出発材料をロードした。その後、表１に記載のように、樹脂に洗浄バッファー１と洗浄バッファー２を流し、その後、溶出バッファーを流した。それぞれの画分（出発材料のロード中のフロースルー＋洗浄１、洗浄２および溶出）からサンプルを採取し、ＦＶＩＩＩ：Ｃ、ＦＶＩＩＩ：Ａｇ、およびＦＶＩＩＩウエスタンブロットについて分析した。
【００８４】
【表３】
0006778111.tif 000004

【００８５】
表３は、出発材料からの不活性型第ＶＩＩＩ因子の除去を表している。ＦＶＩＩＩ：Ａｇとして測定した得られる第ＶＩＩＩ因子の総量と比較した、ＦＶＩＩＩ：Ｃとして測定した生物学的に活性な第ＶＩＩＩ因子の比は、出発材料で０．６１であった。フロースルーと洗浄画分でもＣ／Ａｇ比を測定したところ、とても低かった（＜０．０５）。溶出画分において、Ｃ／Ａｇ比は、出発材料での０．６１より増加して、０．８７であった。このことは、ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ親和性工程を経て不活性型第ＶＩＩＩ因子が除去されたことを明確に示している。このことは、さらに、図１の第ＶＩＩＩ因子のウエスタンブロット解析において、レーン１〜４を見ても確かめられる。レーン１は、親和性カラムの前の「出発材料」を示す。レーン２は、第ＶＩＩＩ因子の変性産物が「フロースルー＋洗浄１画分」で除去されることを示す、第ＶＩＩＩ因子関連のたくさんのバンドを示す。レーン３は、「洗浄２画分」中に、一本の（解離された）第ＶＩＩＩ因子軽鎖（８０ｋＤ）と同じ分子量を有する、１つの特徴的で主要な第ＶＩＩＩ因子バンドがあることを示す。この第ＶＩＩＩ因子画分は、（表３に示すように）第ＶＩＩＩ因子：Ｃ活性が全く、またはほとんどないことも示す。レーン４は、親和性工程の溶出画分が、第ＶＩＩＩ因子軽鎖（８０ｋＤ）、第ＶＩＩＩ因子重鎖（９０ｋＤ）、および非切断型第ＶＩＩＩ因子分子（１７０ｋＤ）を含むことを示す。
【００８６】
結論  実施例１
表３と図１（レーン１〜４）から分かるように、ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ工程は、フロースルーと洗浄画分中のＦＶＩＩＩ：Ｃ活性が減少および／または活性がない第ＶＩＩＩ因子分子を除去する。
【００８７】
実施例２、陰イオン交換クロマトグラフィー工程（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ）
【００８８】
以下の方法は、第ＶＩＩＩ因子：Ｃ活性のない形態の第ＶＩＩＩ因子を、陰イオン交換体樹脂（Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ）で除去し、第ＶＩＩＩ因子単量体が多い製品を得ることを説明する。
【００８９】
カラムおよび樹脂
ＢＰＧ１４０カラムにＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ樹脂を詰めて、１．２３リットルのカラム体積となる８ｃｍのカラム高にした。Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ樹脂はＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（カタログ１７−０５１０）から入手した。
【００９０】
出発材料
純度が第ＶＩＩＩ因子９４７０ＩＵ／ｍｇタンパク質である第ＶＩＩＩ因子含有材料、０．１ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、０，０２ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２、０，０２ｍｏｌ／ｋｇのＬ−ヒスチジン、０，０２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０、ｐＨ６．５を出発材料として使用した。実施例１にさらに記載されているように、出発材料を製造した（製品溶出画分）。樹脂へのＦＶＩＩＩ：Ｃロードは、１５，３８３ＩＵ／ｍＬ樹脂であった。
【００９１】
バッファー組成：
平衡化バッファー
０．１ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２（２×Ｈ２Ｏ）、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＬ−ヒスチジン、０．０２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０、ｐＨ：７．５±０．１、伝導率：＋２５℃で１５±１ｍＳ／ｃｍ
洗浄バッファー
０．３２ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＬ−ヒスチジン、０．０２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０、ｐＨ：７．５±０．１、伝導率：＋２５℃で３２．５±２．５ｍＳ／ｃｍ
溶出バッファー
０．３９ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＬ−ヒスチジン、０．０２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０、ｐＨ：６．０±０．１、伝導率：＋２５℃で４０±２ｍＳ／ｃｍ。
【００９２】
平衡化バッファー、洗浄バッファー、および溶出バッファーは、記載のｐＨ、濃度、およびバッファー、塩、または界面活性剤の種類に限定されない。
【００９３】
カラムを平衡化バッファーで平衡化し、次いで、出発材料をロードした。その後、表３に記載のように、樹脂に平衡化バッファーを再び流して、第ＶＩＩＩ因子を結合させ、その後、洗浄バッファーを加え、次いで、溶出バッファーを加えた。それぞれの画分（出発材料ロード中のフロースルー＋洗浄１、洗浄２、および溶出）からサンプルを取り、ＦＶＩＩＩ：Ｃ、ＦＶＩＩＩ：Ａｇ、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ１、ＦＶＩＩＩウエスタンブロット、Ｎ−グリカンフィンガープリントマッピング、およびトリプシンペプチドフィンガープリントマッピングについて分析した。
【００９４】
【表４】
0006778111.tif 000005
【００９５】
表４は、陰イオン交換工程の出発材料からの不活性型第ＶＩＩＩ因子の除去を表している。ＦＶＩＩＩ：Ａｇとして測定した得られた第ＶＩＩＩ因子の総量と比較した、ＦＶＩＩＩ：Ｃとして測定した生物学的に活性な第ＶＩＩＩ因子の比は、出発材料で０．７８であった。フロースルーと洗浄画分でもＣ／Ａｇ比を測定したところ、有意に低かった（＜０．３５）。溶出画分において、Ｃ／Ａｇ比は、出発材料での０．７８より増加して、０．９１であった。このことは、陰イオン交換工程を経て不活性型第ＶＩＩＩ因子が除去されたことを明確に示している。このことは、さらに、図１のレーン５〜６を見ても確かめられ、両レーンともに、第ＶＩＩＩ因子の変性産物がフロースルー＋平衡化画分と洗浄画分に除去されていることを示す。図２のレーン４は、第ＶＩＩＩ因子の主要画分（溶出物）のＦＶＩＩＩウエスタンブロット特性を示し、目に見えるＦＶＩＩＩの変性産物がないことを示す。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ１で分析した、溶出物中の高い（＞９８％）の単量体含有量が、図４に示されている。
【００９６】
結論  実施例２
表４と図１（レーン５〜６）から分かるように、陰イオン交換工程は、フロースルーと洗浄画分中に、減少した、および／またはＦＶＩＩＩ：Ｃ活性がない第ＶＩＩＩ因子分子を除去する。図４から分かるように、生物学的活性型製品画分（溶出物）は、単量体第ＶＩＩＩ因子を多く含む。
【００９７】
実施例３，サイズ排除クロマトグラフィー
【００９８】
以下の方法は、第ＶＩＩＩ因子：Ｃ活性のない形態の第ＶＩＩＩ因子を、サイズ排除クロマトグラフィーカラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐ．ｇ．）で除去することを説明する。
【００９９】
カラムおよび樹脂
ＢＰＧ１００カラムにＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐ．ｇ．樹脂を詰めて、５．４リットルのカラム体積となる６９ｃｍのベッド高にした。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐ．ｇ．樹脂はＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（カタログ番号１７−１０４３）から得た。
【０１００】
出発材料
純度が、第ＶＩＩＩ因子１０２００ＩＵ／ｍｇタンパク質である第ＶＩＩＩ因子含有材料、０．４ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、０，０２ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２、０，０２ｍｏｌ／ｋｇのＬ−ヒスチジン、０，０２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０、ｐＨ６．２を出発材料として使用した。実施例２に記載されている通り、出発材料を製造した（製品溶出画分）。樹脂に対するサンプルロードは、カラム体積の５．５％であった。
【０１０１】
バッファー組成：
平衡化バッファー
３０．７ｇ／ｋｇのＮａＣｌ、０．５ｇ／ｋｇのＣａＣｌ２、２．０ｇ／ｋｇのクエン酸ナトリウム、９．２ｇ／ｋｇのアルギニン、９．２ｇ／ｋｇのスクロース、０．０２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０、ｐＨ：７．０±０．１、伝導率：＋２５℃で４９±２ｍＳ／ｃｍ
【０１０２】
平衡化は、記載のｐＨ、濃度、およびバッファー、塩、または界面活性剤の種類に限定されない。
【０１０３】
カラムを平衡化バッファーで平衡化し、次いで、出発材料をロードした。その後、樹脂に平衡化バッファーを再び流して、サイズ排除カラムで第ＶＩＩＩ因子溶液を分離した。カラムの出口で２８０ｎｍでの吸光度が、０．０３５ＡＵを超えたとき、溶出物の収集を始め、吸光度が０．０５に減少したとき、溶出物の収集を止めた。サンプルをロードと溶出物から取り、ＦＶＩＩＩ：Ｃ、ＦＶＩＩＩ：Ａｇ、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ１、およびＦＶＩＩＩウエスタンブロットについて分析した。
【０１０４】
【表５】
0006778111.tif 000006
【０１０５】
表５は、出発材料から不活性型第ＶＩＩＩ因子がサイズ排除工程で除去されたことを表している。ＦＶＩＩＩ：Ａｇとして測定した得られた第ＶＩＩＩ因子の総量と比較したＦＶＩＩＩ：Ｃとして測定した生物学的活性型第ＶＩＩＩ因子の比は、出発材料で０．８３であり、溶出画分で０．９４であった。このことは、凝集化および／または断片化のどちらかに起因する不活性型第ＶＩＩＩ因子がサイズ排除カラムで除去されたことを示す。図２のレーン５は、溶出画分の第ＶＩＩＩ因子のバンドパターン特性が対照と比較して等しいことを示す。図５は、通常の条件下のＳＥＣ−ＨＰＬＣ１分析を使用して、溶出物では第ＶＩＩＩ因子単量体が多く（＞９９％）、凝集体含有量が少ない（＜１％）ことを示している。図３は、生成（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）サイズ排除クロマトグラムの生成物が表しているように、単量体第ＶＩＩＩ因子製品から凝集体と断片が実際に除去されたことを示す。
【０１０６】
結論  実施例３
サイズ排除クロマトグラフィー工程は、異なるサイズの分子の分離によって、減少した、および／またはＦＶＩＩＩ：Ｃ活性がない第ＶＩＩＩ因子分子を除去する。図５と表５から分かるように、クロマトグラフィー環境と方法のパラメーターは、処理中にこれらの凝集と除去を促進し、高い生物学的活性（Ｃ／Ａｇ＞０．９）を有する単量体の多い（＞９９％）第ＶＩＩＩ因子製品が得られる。
【０１０７】
実施例４,親和性クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィーの逐次使用
【０１０８】
以下の方法は、逐次行われる３つの異なるクロマトグラフィー技術からなる精製シークエンスを実施して、第ＶＩＩＩ因子：Ｃ活性のない形態の第ＶＩＩＩ因子を除去することを説明する。
１．親和性クロマトグラフィー（ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ）
２．陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ）
３．サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐ．ｇ．）
【０１０９】
カラムおよび樹脂
１．親和性クロマトグラフィー（ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ）
ＢＰＧ１４０カラムにＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ樹脂を詰めて、１．５リットルのカラム体積となる１０ｃｍのベッド高とした。ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ樹脂はＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（カタログ番号１７−５４５０）から入手した。
【０１１０】
２．陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ）
ＢＰＧ１００カラムにＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ樹脂を詰めて、０．５５リットルのカラム体積となる７ｃｍのカラム高にした。Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ樹脂はＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（カタログ１７−０５１０）から入手した。
【０１１１】
３．サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐ．ｇ．）
ＢＰＧ１００カラムにＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐ．ｇ．樹脂を詰めて、５．４リットルのカラム体積となる６９ｃｍのベッド高にした。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐ．ｇ．樹脂はＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（カタログ番号１７−１０４３）から入手した。
【０１１２】
親和性工程の出発材料、バッファー組成：
０．３４ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、０，０３５ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２、０，０１ｍｏｌ／ｋｇのＬ−ヒスチジン、０，０４５ｍｏｌ／ｋｇのＬ−アルギニン、０，２ｍｏｌ／ｋｇのソルビトール、０，０２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０、１％（ｗ／ｗ）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０，３％のトリ−ｎ−ブチルホスフェート（ＴＮＢＰ、ｗ／ｗ）、ｐＨ６．５を出発材料として使用した。本明細書の一部として援用される国際公開第２００９／１５６４３０Ａ１号にさらに記載されているように、出発材料を製造した。
【０１１３】
陰イオン交換工程の出発材料、バッファー組成：
０．１５ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、０，０２ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２、０，０２ｍｏｌ／ｋｇのＬ−ヒスチジン、０，０２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０、ｐＨ７．５を出発材料として使用した。
【０１１４】
サイズ排除工程の出発材料、バッファー組成：
０．３９ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、０，０２ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２、０，０２ｍｏｌ／ｋｇのＬ−ヒスチジン、０，０２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０、ｐＨ６．２を出発材料として使用した。
【０１１５】
親和性クロマトグラフィーのバッファー組成：
平衡化バッファー（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびＴＮＢＰ含有）
０．３ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２（２×Ｈ２Ｏ）、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＬ−ヒスチジン、１％ｗ／ｗのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．３％ｗ／ｗのＴＮＢＰ、ｐＨ：６．５±０．１、伝導率：＋２５℃で３１±３ｍＳ／ｃｍ
洗浄バッファー１（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびＴＮＢＰを含有しない平衡化バッファー）
０．３ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＬ−ヒスチジン、０．０２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０、ｐＨ：６．５±０．１、伝導率：＋２５℃で３１±３ｍＳ／ｃｍ
洗浄バッファー２
１．０ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＬ−ヒスチジン、０．０２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０、ｐＨ：６．５±０．１、伝導率：＋２５℃で８５±３ｍＳ／ｃｍ。
溶出バッファー
１．５ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＬ−ヒスチジン、０．０２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０、５０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコール（ＥＧ）、ｐＨ：６．５±０．１、伝導率：＋２５℃で３９±３ｍＳ／ｃｍ。
【０１１６】
平衡化バッファー、洗浄バッファー、および溶出バッファーは、記載のｐＨ、濃度、およびバッファー、塩、または界面活性剤の種類に限定されない。
【０１１７】
陰イオン交換クロマトグラフィーのバッファー組成：
平衡化バッファー
０．１ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２（２×Ｈ２Ｏ）、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＬ−ヒスチジン、０．０２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０、ｐＨ：７．５±０．１、伝導率：＋２５℃で１５±１ｍＳ／ｃｍ
洗浄バッファー
０．３２ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＬ−ヒスチジン、０．０２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０、ｐＨ：７．５±０．１、伝導率：＋２５℃で３２．５±２．５ｍＳ／ｃｍ
溶出バッファー
０．３９ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２、０．０２ｍｏｌ／ｋｇのＬ−ヒスチジン、０．０２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０、ｐＨ：６．０±０．１、伝導率：＋２５℃で４０±２ｍＳ／ｃｍ。
【０１１８】
平衡化バッファー、洗浄バッファー、および溶出バッファーは、記載のｐＨ、濃度、およびバッファー、塩、または界面活性剤の種類に限定されない。
【０１１９】
サイズ排除クロマトグラフィーのバッファー組成：
平衡化バッファー
３０．７ｇ／ｋｇのＮａＣｌ、０．５ｇ／ｋｇのＣａＣｌ２、２．０ｇ／ｋｇのクエン酸ナトリウム、９．２ｇ／ｋｇのアルギニン、９．２ｇ／ｋｇのスクロース、０．０２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０、ｐＨ：７．０±０．１、伝導率：＋２５℃で４９±２ｍＳ／ｃｍ
【０１２０】
平衡化は、記載のｐＨ、濃度、およびバッファー、塩、または界面活性剤の種類に限定されない。
【０１２１】
それぞれのカラム（親和性クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー）を上記で定義した平衡化バッファーで平衡化した。
【０１２２】
最初に、出発材料をロードすることにより、上記で定義し表６にある通りに親和性クロマトグラフィー樹脂を処理し、次いで、上記で定義した洗浄バッファー１と洗浄バッファー２でカラムを洗浄した。その後、生物学的に活性な第ＶＩＩＩ因子製品を溶出バッファーによって溶出した。サンプリング（ＦＶＩＩＩ：Ｃ、ＦＶＩＩＩ：Ａｇ）後、溶出物を以下の陰イオン交換クロマトグラフィー工程の出発材料とした。
【０１２３】
親和性クロマトグラフィー工程からの溶出物を１０倍希釈して、上記に定義した出発材料の条件を達成した。希釈した出発材料を陰イオン交換カラムで処理し、次いで、上記で定義した洗浄１と洗浄２で処理した。その後、生物学的に活性な第ＶＩＩＩ因子製品を溶出バッファーによって溶出した。サンプリング（ＦＶＩＩＩ：Ｃ、ＦＶＩＩＩ：Ａｇ）後、溶出物を、次のサイズ排除クロマトグラフィー工程の出発材料とした。
【０１２４】
上記で定義し表６にある通りに、陰イオン交換工程からの溶出物を、凍結している場合には解凍し、凍結していない場合には、直接サイズ排除クロマトグラフィー工程で処理した。カラムに製品を添加後、単量体第ＶＩＩＩ因子画分が溶出するまで、平衡化バッファーをカラムで処理した。２８０ｎｍで測定した吸光度が、０．０４ＡＵを超えたときに、単量体第ＶＩＩＩ因子画分を始めた。そして、２８０ｎｍで測定した吸光度が、０．０１ＡＵに戻ったときに、第ＶＩＩＩ因子単量体画分の収集を止めた。溶出物をサンプリングし、ＦＶＩＩＩ：Ｃ、ＦＶＩＩＩ：Ａｇ、ＦＶＩＩＩウエスタンブロット、ＳＥＣ＿ＨＰＬＣ、およびアミノ酸組成について分析した。
【０１２５】
上記の手順を特定の条件（表６）の下で５つの異なるバッチで繰り返して、再現性を検討した。その結果は、表７に示される。
【０１２６】
【表６】
0006778111.tif 000007
【０１２７】
＊サイズ排除カラムを、規定された最大のカラムロードである８％を超えないように、２サイクルで実施し、その後、得た２つの溶出物を１つのプールへと混合し、そこから分析用のサンプルを取り出した。
【０１２８】
【表７】
0006778111.tif 000008
【０１２９】
表７は、５つの異なるバッチから、方法の第１の精製工程（親和性クロマトグラフィー）、次いで、方法の第２の精製工程（陰イオン交換クロマトグラフィー）、最後に、方法の最後の精製工程（サイズ排除クロマトグラフィー）を経て、不活性型第ＶＩＩＩ因子が出発材料から除去されたことを示す。
【０１３０】
図６は、サイズ排除クロマトグラフィー工程で実施した（表６〜７に記載の）５つの製造バッチのクロマトグラフィーオーバーレイを示す。サイズ排除溶出物画分の収集の開始と終了は、図に示されている。
【０１３１】
ＦＶＩＩＩ：Ａｇとして測定した利用可能な第ＶＩＩＩ因子の総量と比較したＦＶＩＩＩ：Ｃとして測定した生物学的に活性な第ＶＩＩＩ因子の比は、親和性工程の前の出発材料で平均値が０．７０であった。ＦＶＩＩＩ  Ｃ／Ａｇ比は、その後親和性工程の後では増加して平均値が０．８０となり、陰イオン交換の後ではさらに増加して平均値が０．８５となる。そして、最終的には、最後のサイズ排除精製工程の後では、最適なＦＶＩＩＩ  Ｃ／Ａｇ比である１．０に近い０．９５に至る。このことは、さらに表７に見るこことができ、表７には、実施された全５つのバッチについて、それぞれの工程での全てのＦＶＩＩＩ：ＣおよびＦＶＩＩＩ：Ａｇの濃度、ならびにＦＶＩＩＩ：Ｃ／ＦＶＩＩＩ：Ａｇの比が示されている。
【０１３２】
図７、９、１１、１３、および１５は、表６〜７に定義されているバッチ１〜５の陰イオン交換溶出物のＳＥＣ−ＨＰＬＣ１分析後の結果を示す。全ての陰イオン交換溶出物サンプルのＳＥＣ−ＨＰＬＣ１の結果は、全く凝集体がない（４バッチ）か非常に低い（＜１％）凝集体の量（５つのバッチで、平均値は０．１％）、＞９７％のＦＶＩＩＩ単量体含有量（５つのバッチで、平均値は９８．５％）、および＜２％の断片含有量（５つのバッチで、平均値は１．４％）を示す。親和性工程、次いで陰イオン交換工程を実施後の陰イオン交換溶出物は、第ＶＩＩＩ因子単量体の高い含有量、および潜在的免疫原性の凝集／断片型ＦＶＩＩＩ部分の低い含有量を示す。
【０１３３】
図８、１０、１２、１４、および１６は、表６〜７に定義されているバッチ１〜５のサイズ排除溶出物のＳＥＣ−ＨＰＬＣ１分析後の結果を示す。全てのサイズ排除溶出物サンプルのＳＥＣ−ＨＰＬＣ１の結果は、目視できないか検出不可能な量の凝集体、＞９８％のＦＶＩＩＩ単量体含有量（５つのバッチで、平均値は９８．６％）、および＜２％の断片含有量（５つのバッチで、平均値は１．４％）を示す。親和性工程、次いで陰イオン交換工程およびサイズ排除工程を実施後のサイズ排除溶出物は、第ＶＩＩＩ因子単量体の高い含有量、凝集体の検出不可能または目視できない徴候、ＦＶＩＩＩ断片の低い含有量を示す。
【０１３４】
結論  実施例４
実施例４に係るシークエンス１〜３を実施した全３つのクロマトグラフィー工程は、本発明に係る不活性型第ＶＩＩＩ因子分子の除去を提供する。このことは、異なる工程を介して除去された不活性型第ＶＩＩＩ因子分子は、その生物物理学的特性が異なること、および、工程を互いに順次組み合わせて実施して、最も低い程度の不活性型第ＶＩＩＩ因子含有量と最も高い程度の第ＶＩＩＩ因子単量体含有量を有する最終的な第ＶＩＩＩ因子精製製品を与えることが、患者における免疫原性反応の最も低いリスクを提供することを示す。
【０１３５】
実施例５、サイズ排除クロマトグラフィーのパラメーター（カラム高、ＦＶＩＩＩ：Ｃ濃度、ロード）
【０１３６】
以下の実施例は、生物学的活性（ＦＶＩＩＩ：Ｃ／Ａｇ）にとって重要なサイズ排除パラメーター（ＦＶＩＩＩ：Ｃ濃度とカラムロード）を説明する。
【０１３７】
カラムおよび樹脂
ＢＰＧ２００カラムにＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐ．ｇ．樹脂を詰めて、１９．５リットルのカラム体積となる６２ｃｍのベッド高にした。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐ．ｇ．樹脂はＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（カタログ番号１７−１０４３）から得た。
【０１３８】
出発材料
以下の組成、０．４ｍｏｌ／ｋｇのＮａＣｌ、０，０２ｍｏｌ／ｋｇのＣａＣｌ２、０，０２ｍｏｌ／ｋｇのＬ−ヒスチジン、０，０２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０、ｐＨ６．２、を有する第ＶＩＩＩ因子を含む材料を出発材料として使用した。出発材料は実施例２に記載のように製造した（製品溶出画分）。
【０１３９】
バッファー組成：
平衡化バッファー
３０．７ｇ／ｋｇのＮａＣｌ、０．５ｇ／ｋｇのＣａＣｌ２、２．０ｇ／ｋｇのクエン酸ナトリウム、９．２ｇ／ｋｇのアルギニン、９．２ｇ／ｋｇのスクロース、０．０２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０、ｐＨ：７．０±０．１、伝導率：＋２５℃で４９±２ｍＳ／ｃｍ
【０１４０】
平衡化は、記載のｐＨ、濃度、およびバッファー、塩、または界面活性剤の種類に限定されない。
【０１４１】
７つの異なるバッチ（Ａ〜Ｇ）を以下の表８に従って実施した。カラムを平衡化バッファーで平衡化し、次いで、出発材料を規定されているようにロードした。その後、樹脂に平衡化バッファーを流して、第ＶＩＩＩ因子溶液をサイズ排除カラムで分離した。カラムの出口で２８０ｎｍでの吸光度が０．０３５ＡＵを超えたときに溶出物の収集を始め、吸光度が０．００５ＡＵに減少したときに溶出物の収集を止めた。サンプルを出発材料と溶出物から採取し、ＦＶＩＩＩ：Ｃ、ＦＶＩＩＩ：Ａｇ、およびＳＥＣ−ＨＰＬＣ１について分析した。
【０１４２】
【表８】
0006778111.tif 000009
【０１４３】
表８は、サイズ排除工程による出発材料からの不活性型第ＶＩＩＩ因子の除去が、様々なパラメーターに依存していることを示す。バッチＥ（１５９２５ＩＵ／ｍＬ、４．３％）、Ｆ（１４８４４ＩＵ／ｍＬ、１．９％、およびＧ（９１４９ＩＵ／ｍＬ、３．９％）のように、カラムへの比較的低いロードと比較的低い第ＶＩＩＩ因子：Ｃ濃度との組み合わせは、ＦＶＩＩＩ：Ｃ／ＦＶＩＩＩ：Ａｇの比で測定される生物学的活性に関して、バッチＡ〜Ｄ（Ａ−０．９０、Ｂ−０．８１、Ｃ−０．９９、およびＤ−１．０１）と比較して、それぞれの溶出物において（Ｅ−０．８１、Ｆ−０．７９、Ｇ−０．８２）ネガティブであるように見える。
【０１４４】
結論  実施例５
ＦＶＩＩＩ：Ｃ濃度とカラムロードとの組み合わせは、生物学的活性に関するサイズ排除工程のアウトカムにとって重要なパラメーターである。ベッド高６９ｃｍをどちらも用いる実施例３と実施例４に記載のデータを基にすると、わずかに低いベッド高（６２ｃｍ）を用いる実施例５に記載の結果も、おそらく２つの他の重要な要素（ＦＶＩＩＩ：Ｃ濃度およびカラムロード）と組み合わさって、サイズ排除工程のアウトカムに影響を与えると考えられる。サイズ排除工程は、高い第ＶＩＩＩ因子：Ｃ濃度、高いカラムベッド高、および≧４％のカラムロードがあると良く機能することが示されている。
【０１４５】
実施例６，生物学的に活性な単量体第ＶＩＩＩ因子の凍結状態での安定性。
【０１４６】
以下の実施例は、実施例４により処理された生物学的に活性な単量体第ＶＩＩＩ因子溶液の凍結状態での安定性を説明する。
【０１４７】
出発材料：第ＶＩＩＩ因子単量体含有量が＞９９％、凝集体含有量が＜１％、第ＶＩＩＩ因子の総量に対する生物学的活性型第ＶＩＩＩ因子の比（ＦＶＩＩＩ：Ｃ／ＦＶＩＩＩ：Ａｇ）で測定された不活性型第ＶＩＩＩ因子量が＞０．９である実施例４により生産された第ＶＩＩＩ因子溶液
【０１４８】
第ＶＩＩＩ因子のバッファー環境：
３０．７ｇ／ｋｇのＮａＣｌ、０．５ｇ／ｋｇのＣａＣｌ２、２．０ｇ／ｋｇのクエン酸ナトリウム、９．２ｇ／ｋｇのアルギニン、９．２ｇ／ｋｇのスクロース、０．０２％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０、ｐＨ：７．０±０．１、伝導率：＋２５℃で４９±２ｍＳ／ｃｍ
【０１４９】
凍結と保存の条件：
第ＶＩＩＩ因子溶液を低密度ポリエチレンのプラスチック容器に満たし、高速凍結方法により最長６０分間で−４０℃へ凍結する。その後、凍結溶液を−６０℃〜−８０℃の温度で３６ヶ月間保存する。０、６、９、１２、１８、２４、および３６ヶ月の保存後サンプルを採取し、生物学的活性 、および単量体、凝集、断片の含有量について分析する。
【０１５０】
【表９】
0006778111.tif 000010
【０１５１】
表９から分かるように、第ＶＩＩＩ因子溶液は、生物学的活性と第ＶＩＩＩ因子単量体含有量（凝集体および断片形成）に関して、−６０℃〜−８０℃の温度での少なくとも３６ヶ月間の保存で完全に安定である。
【０１５２】
実施例７,生物学的に活性な単量体第ＶＩＩＩ因子の凍結乾燥製品中での安定性。
【０１５３】
以下の実施例は、実施例４と実施例６により処理され、その後凍結乾燥された生物学的活性型単量体第ＶＩＩＩ因子溶液の安定性を説明する。
【０１５４】
出発材料：第ＶＩＩＩ因子単量体含有量が＞９９％、凝集体含有量が＜１％、第ＶＩＩＩ因子の総量に対する生物学的活性型第ＶＩＩＩ因子の比（ＦＶＩＩＩ：Ｃ／ＦＶＩＩＩ：Ａｇ）で測定された不活性型第ＶＩＩＩ因子量が＞０．９である、実施例４と実施例６により生産されて凍結された第ＶＩＩＩ因子溶液。
【０１５５】
凍結乾燥後の１バイアルの第ＶＩＩＩ因子の内容物：
スクロース                    １３．５ｍｇ
塩酸アルギニン                １３．５ｍｇ
ポリクサマー１８８            ３ｍｇ
塩化ナトリウム                ４５ｍｇ
塩化カルシウム二水和物        ０．７５ｍｇ
クエン酸ナトリウム二水和物    ３ｍｇ
生物学的活性型第ＶＩＩＩ因子  ２５０ＩＵ
【０１５６】
凍結乾燥手順：
２．５ｍＬの第ＶＩＩＩ因子の出発材料を、第ＶＩＩＩ因子の総量が２５０ＩＵになるように、８ｍＬの成型ガラスバイアル（タイプI）に入れた。表１０に記載されているように、バイアルを凍結乾燥法に付した。
【０１５７】
【表１０】
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【０１５８】
凍結乾燥法の後、バイアルをブロモブチルストッパーで封じ、アルミニウムキャップを被せた。バイアルを＋５℃で２４ヶ月間保存した。０、６、９、１２、１８、および２４ヶ月の保存後、注入用に２．５ｍＬの水で凍結乾燥製品を再構成することにより、サンプルを採取し、その後、生物学的活性、および単量体含有量、凝集体含有量、断片含有量に関して分析した。表１１を参照されたい。
【０１５９】
【表１１】
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表１１，凍結乾燥し＋５℃で保存した第ＶＩＩＩ因子溶液の安定性
【０１６０】
表１１から分かるように、凍結乾燥した第ＶＩＩＩ因子製品は、温度５℃での少なくとも２４ヶ月間の保存で、生物学的活性および第ＶＩＩＩ因子単量体含有量（凝集体および断片形成）に関して、完全に安定である。
【０１６１】
実施例８，本発明に係る最終的な凍結乾燥製品中のＦＶＩＩＩ  Ｃ／Ａｇの比、ならびに凝集体、単量体、および断片の測定と、本発明に係る最終的な凍結乾燥製品と異なる精製方法を使用した組み換え型製品との比較。
【０１６２】
以下の実施例は、本発明に係る製品の優れた特性を説明し、本発明に係る製品を、異なる精製方法を使用した他の市販の組み換え型製品と比較する。
【０１６３】
出発材料: 本発明の実施例７に従って製造した凍結乾燥第ＶＩＩＩ因子製品を再構成し、３つの異なる精製方法（Ａ〜Ｃ）により精製し異なる製剤バッファーで安定化した３つの異なるｒＦＶＩＩＩの競合製品と比較した。少なくとも１バイアル強度（２５０ＩＵ、１０００ＩＵ、または３０００ＩＵ）を、安定剤／ＦＶＩＩＩに関して、異なる製剤組成間の良い比較のために分析した。全てのサンプルを、通常のランニング条件の下でのＳＥＣ−ＨＰＬＣ２分析方法により、ＦＶＩＩＩ  Ｃ／Ａｇに関して、ならびに凝集体、単量体、および断片に関して分析した。
【０１６４】
【表１２】
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【０１６５】
結論  実施例８：
表１は、本発明に従って製造した組み換え型ＦＶＩＩＩは、精製し凍結乾燥した製品において、単量体含有量が１００％であり、ＦＶＩＩＩ  Ｃ／Ａｇの比が＞０．９であり、優れた品質を示している。このことは、異なる条件下で精製し安定化した競合製品全てと比べて、最終製品中に生物学的活性がない第ＶＩＩＩ因子が全くないかほんのわずかな量であることを意味する。
【０１６６】
実施例９，本発明に従って精製し、製剤化し、凍結乾燥し、保存したｒＦＶＩＩＩ製品の治療歴のない血友病Ａ患者におけるインヒビター形成の比較、および、１つの競合の組み換え型ＦＶＩＩＩ製品２１に関する発表データとの比較。ならびに、ＦＶＩＩＩ  Ｃ／Ａｇ比、および凝集体と単量体と断片の２つの製品間での比較。
【０１６７】
以下の実施例は、本発明に係る製品の優れた特性を説明し、本発明に係る製品を市場で入手可能な市販の組み換え型ＦＶＩＩＩ製品の１つと比較する。
【０１６８】
出発材料：本発明の実施例７に従って製造した凍結乾燥第ＶＩＩＩ因子製品を、実施例８に記載の方法Ａにより精製した市販の１つの競合のｒＦＶＩＩＩ製品と比較した。治療歴のない血友病Ａ患者に対して標準的な臨床プロトコル２１に従い、２つの製品を患者に対して投与し、インヒビター形成の発生を追跡した。それぞれの製品でのインヒビターを発生した患者の数、ならびに、第ＶＩＩＩ因子Ｃ／Ａｇ比、および凝集体／単量体／断片の特性は、表２に示される。
【０１６９】
【表１３】
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【０１７０】
＊は、Ｃｏｌｌｉｎｓの２０１４年の研究２１で発表されている、＊＊は、進行中の研究の未公表データである
【０１７１】
結論  実施例９：
表は、１つの市販のｒＦＶＩＩＩ製品と比べて、本発明の製品を使用した治療歴のない血友病Ａ患者で検出されたインヒビターの量が著しく低かったことを示している。また、表１０は、各製品の異なるバイアル強度の２つ（２５０ＩＵおよび１０００ＩＵ）、３つ（２５０ＩＵ、１０００ＩＵ、および３０００ＩＵ）の例の第ＶＩＩＩ因子Ｃ／Ａｇ比と凝集体／単量体／断片の特性を示している。製品中の生物学的不活性型ＦＶＩＩＩの量が低いことが、患者で形成されるインヒビターの量を減少させることを仮定し得るであろう。従って、免疫反応に関する患者のリスクを最小限にするために、組み換え型ＦＶＩＩＩ製品の精製、安定化、凍結乾燥、および保存の重要性が関係している。
【０１７２】
実施例１０,本発明に従って精製した組み換え型ＦＶＩＩＩ製品の比活性（純度）。
【０１７３】
以下の実施例は、本発明に従って精製した組み換え型ＦＶＩＩＩ製品が高純度であることを説明する。
【０１７４】
出発材料：実施例４と実施例６に従って製造した第ＶＩＩＩ因子単量体含有量が＞９９％、凝集体含有量が＜１％、第ＶＩＩＩ因子の総量に対する生物学的活性型第ＶＩＩＩ因子の比（ＦＶＩＩＩ：Ｃ／ＦＶＩＩＩ：Ａｇ）として測定された不活性型第ＶＩＩＩ因子の量が＞０．９の凍結したＶＩＩＩ因子溶液を、ＦＶＩＩＩ：Ｃと全タンパク質含有量をブラッドフォードに従って分析した。
【０１７５】
結論  実施例１０：
図１８は、製造規模において、本発明に従って精製した９バッチ（３つの最終工程；親和性溶出物、陰イオン交換溶出物、および製剤原料（＝サイズ排除クロマトグラフィー溶出物））で、ＦＶＩＩＩ：Ｃ／ｍｇタンパク質（ブラッドフォードで測定）により測定した純度が増加し、最終的に１００００ＩＵ／ｍｇタンパク質の範囲内の純度となり、実質的に純粋なｒＦＶＩＩＩであることを示す。
【０１７６】
分析の説明
第ＶＩＩＩ因子の生物学的活性（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）を、第ＶＩＩＩ因子の生物学的活性を補助因子として測定する２段階の測光法に基づく発色アッセイ（ＣＯＡＴＥＳＴ  ＳＰ  ＦＶＩＩＩキット、８２  ４０８６  ６３、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ／Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｏｂｏｒａｔｏｒｙ（米国））（17）で測定した。
【０１７７】
第ＶＩＩＩ因子抗原含有量（ＦＶＩＩＩ：Ａｇ）を、ＥＬＩＳＡキット（ＡＳＳＥＲＡＣＨＲＯＭ（登録商標）ＶＩＩＩ：Ａｇ、第ＶＩＩＩ因子の酵素免疫測定、キット、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ（フランス））を用いて、さらに記載されているように（18）、サンプルの希釈のために提供されたキットバッファーを、Ｔｒｉｓ−ＮａＣｌバッファー＋１％ウシ血清アルブミンで置き換えて測定した。
【０１７８】
第ＶＩＩＩ因子の単量体、凝集体、および断片を、２つの異なるサイズを排除するサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）分析用カラム（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ１は、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００，１０／３００  ＧＬ、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ２は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＢｉｏＳＥＣ−３）を使用して測定した。
【０１７９】
ＳＥＣ−ＨＰＬＣ１法（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００）を、通常のバッファー条件（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．５ＭのＮａＣｌ、０．３Ｍのアルギニン、５０ｍＭのＣａＣｌ２、０．０２％のポリソルベート８０、ｐＨ７．５）の下で実施した。サンプルロードは、サイズ排除カラムのおよそ１％であり、第ＶＩＩＩ因子：Ｃ濃度は、およそ１０００ＩＵ／ｍＬである。単量体が主要なＦＶＩＩＩクロマトグラムピークとして決定され、凝集体がＦＶＩＩＩ単量体のピークの前に溶出しているピークとして決定され、断片をＦＶＩＩＩ単量体のピークの後に溶出しているクロマトグラムピークと決定された。
【０１８０】
ＳＥＣ−ＨＰＬＣ２法（ＢｉＳＥＣ−３）  組み換え体で発現させたＦＶＩＩＩのサンプルを、ＦＶＩＩＩの凝集体、単量体、および断片の組成に関して、サイズ排除クロマトグラフィー（Ａｇｉｌｅｎｔ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＢｉｏＳＥＣ−３，３０×４．６ｍｍ  ＳＥＣカラム）を用いて、未変性のバッファー条件（２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭのＣａＣｌ２、５００ｍＭのＮａＣｌ；ｐＨ７．０）の下で、０．４ｍＬ／分の流速で、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣ系で、分析した。サンプルロードは、測定したＦＶＩＩＩ活性（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）の値によると、およそ０．２〜０．４μｇであった。単量体が主要なＦＶＩＩＩクロマトグラムピークとして決定され、凝集体がＦＶＩＩＩ単量体のピークの前に溶出しているピークとして決定され、断片がＦＶＩＩＩ単量体のピークの後に溶出しているクロマトグラムピークと決定された。また、分析したｒＦＶＩＩＩサンプルの滞留時間を、分子量サンプル（１５〜６００ｋＤ、６９３８５、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ社）の滞留時間と比較した。
【０１８１】
サイズに基づいた第ＶＩＩＩ因子の変性製品を、ＦＶＩＩＩウエスタンブロットを用いて測定する。第ＶＩＩＩ因子製剤中のＦＶＩＩＩ分子量分布タンパク質およびペプチドを、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により還元条件下で、分子量に従って分離する。その後、タンパク質をゲルマトリクスからニトロセルロース膜に電気泳動的に移し、その後、ブロッキング剤と共にインキュベートする。次に、ヒト第ＶＩＩＩ因子分子全体に対する市販のポリクローナルヒツジ抗体を加え、その後、二次酵素標識抗体をプローブとして加える。第３の工程として、化学発光基質を加え、酵素と結合したときに、副産物として光が生成する。冷却電荷結合素子カメラを用いてリアルタイム・イメージとして光の出力を捉える。シグナル強度は、ブロッティング膜上の抗原（ＦＶＩＩＩ）の存在量と相関する。
【０１８２】
第ＶＩＩＩ因子タンパク質鎖の電気泳動のバンドパターンを検討するために、銀染色を用いる二次元電気泳動を実施した。第１の次元の操作としてｐＨ３〜１０の直線ｐＨ勾配を使用して等電点電気泳動を実施した。第２の次元のＳＤＳ−ＰＡＧＥをトリス−アセテート（３〜８％）ゲルを用いて実施した。第２の次元の操作後、ゲルを銀染色で染色した。
【０１８３】
アミノ酸組成分析を、タンパク質の酸加水分解を伴うアミノ酸組成分析により実施した。タンパク質を、１１０℃で２４時間、６Ｍ  ＨＣｌ中で加水分解した。その後、スルホン化ポリスチレン樹脂を用いる陽イオン交換クロマトグラフィーによりアミノ酸を分離し、溶離液中で連続的に検出する。検出は、プロリンを４４０ｎｍで、他の全てのアミノ酸を５７０ｎｍで同時に測定する二元光度計を使用するポストカラムニンヒドリン誘導体化に基づく。この方法は、システインまたはトリプトファンを適切に測定しないので、これらの残基からは何の値も測定できない。バッファー製剤中に存在するリシンとアルギニンの妨害があるため、リシンとアルギニンの値もまた除外された。
【０１８４】
Ｎ−グリカンフィンガープリント法を、パルスアンペロメトリック電気化学検出法（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）を用いる高速陽イオン交換クロマトグラフィーによって実施して、Ｎ結合グリカンを測定した。（１９）Ｎ結合グリカン鎖を、酵素的切断（ＰｒｏｚｙｍｅからのＮ−Ｇｌｙｃａｎａｓｅ  Ｐｌｕｓ，製品番号ＧＫＥ−５０１０Ｂ）によりタンパク質から外し、続いて、高いｐＨ（ｐＨ１３）で、次いでイオン強度が増加しｐＨが減少する勾配で、陰イオン交換クロマトグラフィーカラムと結合させた。クロマトグラフィーシステム中の様々なグリカン鎖の分離を、電荷、サイズ、および構造における違いにより達成する。陽イオン交換カラムは、ＤｉｏｎｅｘからのＣａｒｂｏＰａｃ（登録商標）ＰＡ  ２００クロマトグラフィーカラム（２５０ｍｍ×３ｍｍ  ＩＤ、粒径５．５μｍ、製品番号０６２８９６）とＤｉｏｎｅｘからのＣａｒｂｏＰａｃ（登録商標）ＰＡ  ２００  ｇｕａｒｄ  ｃｏｌｕｍｎ（５０×３ｍｍ  ＩＤ、製品番号０６２８９５）であった。使用した検出系は、３ｍｍのゴールドメンブレン（ＩＣＳ−３０００  Ａｕ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ、３ｍｍ、製品番号０６３７２３）を用いるＩＣＳ−３０００  ＣＤ電気化学検出器であり、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎというソフトウェアにより制御した。
【０１８５】
様々なクロマトグラフィーピークに対応するサンプルを、１分の滞留時間に対応する各画分と共に、画分中に収集した。グリカンを、多孔性黒鉛炭素カラムで脱塩し、その後、各画分を濃縮した。ＰＧＣカラムを用いたキャピラリーＬＣ系上でクロマトグラフィー分離を実施し、飛行時間型質量分析とオンラインでグリカンをエレクトロスプレーした。Functional Glycomics [www.functionalglycomics.org]からのデータベースを、質量を入力し候補を検索することによって使用した。質量精度が高い（約３０ｐｐｍ）ので、それぞれのグリカンの同定を正確であると判断した。
【０１８６】
２つの主要な工程を含むトリプシンペプチドフィンガープリントマッピングを実施した。第１の工程において、トリプシンを使用して、分析対象のタンパク質をポリペプチドへと消化し、第２の工程において、ポリペプチドを分離してＨＰＬＣ技術を使用して記録する。この方法により、特異的なパターン（「フィンガープリント」）が生成する。ＵＶ検出と比べてより単純化したマップが得られるペプチドの蛍光（主にトリプトファン）によりペプチドを検出する。記録された経時的な蛍光パターンは、分析されたサンプルのペプチドマップを表す。
【０１８７】
タンパク質濃度は、ブラッドフォードアッセイ２３を使用して測定した。
【０１８８】
ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔは、組み換え型Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子の精製用に設計された親和性クロマトグラフィー媒体（樹脂）である。
【０１８９】
データファイル２８−９６６２−３７  ＡＢによると、ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅのＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔの主な特徴として、以下が挙げられる。
・収率が高く、比活性が保持される、組み換え型Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子の効率的な精製
・高い選択性
・優れた拡張性
・動物によらない（Ａｎｉｍａｌ−ｆｒｅｅ）製造
【０１９０】
組み換え型血液凝固因子の効率的な精製方法は、血友病患者を治療するために必要である。ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔは、血友病Ａの治療のために使用される主要な組み換え型血液因子である、組み換え型Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子の精製のために設計された親和性クロマトグラフィー媒体である。第ＶＩＩＩ因子分子の微妙な性質のために、下流の方法における工程の数を制限することが重要である。ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔを使用して得られる高い選択性と収率は、一工程で良好な純度が得られる確固たる効率的な精製方法を可能にする。他の特性として、動物によらない（Ａｎｉｍａｌ−ｆｒｅｅ）生成とリガンドの漏れが少ないことが挙げられ、この特性のため、この媒体は、組み換え型Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子の大規模な製造に非常に適している。ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔは、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅの特注設計媒体プログラム（Ｃｕｓｔｏｍ  Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  Ｍｅｄｉａ  ｐｒｏｇｒａｍ）の一部である。
【０１９１】
媒体特性
ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔは、大きなサンプル体積の高速な処理を可能にする、高度に架橋されたアガロースベースマトリクスをベースとする。１３ｋＤの組み換えタンパク質であるリガンドは、組み換え型ドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子との結合にリガンドを利用しやすくする親水性スペーサーアームを介して多孔性ベースマトリクスと結合している（図１）。表１は、ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔの主要な特性を要約している。
【０１９２】
機能原理
親和性クロマトグラフィーは、適当な結合条件の下で特異的な分子または分子の基を吸着し、適当な溶出条件の下でそれらを放出する、固定化されたリガンドを利用する。これらの条件は、標的分子、原料組成、およびクロマトグラフィー媒体に依存し、製品の回収が最も多くなる標的分子と結合する条件を確立するために、これらの条件を、その他のクロマトグラフィーパラメーター（例えば、サンプルロード、流速、ベッド高、
【０１９３】
【化１】
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【０１９４】
再生、および定置洗浄（ｃｌｅａｎｉｎｇ−ｉｎ−ｐｌａｃｅ））と共に検討しなければならない。
【０１９５】
組み換え型第ＶＩＩＩ因子を、精製した細胞溶解物または上清からＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔカラムに直接加えることができる。
【０１９６】
【表１４】
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【０１９７】
バッファーは、活性な立体構造の第ＶＩＩＩ因子の形成を促進するために、Ｃａ２＋イオンを必ず含むべきである。表面に誘起された変性／吸収を抑制するために、界面活性剤の存在が要求される。第ＶＩＩＩ因子の比活性を維持するために、結合用、洗浄用、および溶出用の中性のｐＨバッファーとヒスチジンを必ず使用するべきである。ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔに添加される物質の性質に依存して、通常、各サイクル後に再生が必要であり、次いで、平衡化／ローディングバッファーで再平衡化が行われる。
【０１９８】
安定性
リガンドは、高度に架橋されたベースマトリクスに安定なアミド結合を介して結合している。図２はをＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔが室温で様々なｐＨの値で一週間保存した検討を示す。図は、ｐＨ３〜１０で安定性が高いことを示す。ＧＥは、ｐＨ３〜１０での長期間の保存、ｐＨ２〜１２での短期間の保存を推奨している。
【０１９９】
保存
推奨される保存条件は、４℃〜８℃で２０％エタノールである。ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔは、２０％エタノール溶液中で予め膨潤されて供給される。
【０２００】
定置洗浄（Ｃｌｅａｎｉｎｇ−ｉｎ−ｐｌａｃｅ）
ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔの洗浄プロトコルは、０．１Ｍのクエン酸、または０．５Ｍのリン酸から成っても良い。しかしながら、ｐＨ＜２への暴露の延長は、アガロースベースマトリクスが分解することから、回避するべきである。水酸化ナトリウム（０．０１Ｍ）は、単独で、または安定剤としての硫酸ナトリウム／塩化ナトリウムと組み合わせて使用することができる。
【０２０１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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