(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼをコードするシトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子を導入した形質転換体であって、
前記シトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子が、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択されるいずれかの遺伝子であり、
五環系トリテルペン合成酵素をコードする五環系トリテルペン合成酵素遺伝子をさらに含むことを特徴とする形質転換体：
（ａ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（ｂ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ五環系トリテルペンの２２α位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｃ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ五環系トリテルペンの２２α位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｄ）配列番号２に記載される塩基配列からなる遺伝子；
（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ五環系トリテルペンの２２α位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項２】
前記シトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子が、シロイヌナズナ由来であることを特徴とする請求項１に記載の形質転換体。
【請求項３】
前記形質転換体が、組換え酵母であることを特徴とする、請求項１または２に記載の形質転換体。
【請求項４】
シトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼをコードするシトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子を導入した形質転換体であって、前記シトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子が、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択されるいずれかの遺伝子である形質転換体を培養して、２２α位が水酸化された五環系トリテルペンを取得することを特徴とする、２２α位水酸化五環系トリテルペンの製造方法：
（ａ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（ｂ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ五環系トリテルペンの２２α位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｃ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ五環系トリテルペンの２２α位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｄ）配列番号２に記載される塩基配列からなる遺伝子；
（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ五環系トリテルペンの２２α位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２２α位が水酸化された五環系トリテルペンの生産およびその利用に関し、具体的には、五環系トリテルペンの２２α位を水酸化する方法およびその利用技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
植物は多様な生理活性物質を生産することから、古くから有用な医薬品資源として注目されてきた。トリテルペノイドや、トリテルペノイドサポニンと呼ばれる一群の化合物は特に構造が多様で、植物では約１４，０００種類が確認されている（非特許文献１）。植物に多く見られるトリテルペンとして、α−アミリン、β−アミリン、ルペオール等の五環系トリテルペンが挙げられる。トリテルペンには、抗癌作用、抗炎症作用等の種々の生理活性を持つものが報告されており、このことから、トリテルペンは潜在的な医薬品資源として有用な物質といえる。
【０００３】
このように植物に由来するトリテルペンは極めて有用であるが、天然の植物体から供給可能な量はごく限られている。例えば、α−アミリンの２２α位が水酸化した化合物である２２α−ヒドロキシ−α−アミリンは、がん細胞（ＬＭ３細胞）に対して増殖阻害活性を示すことが報告されていることから（非特許文献２）、医薬品原料となることが期待される。ところが、この化合物は、非特許文献２に記載されているように、パタゴニアに生息するキク科植物のＮａｒｄｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｂｒｙｏｉｄｅｓから、ごくわずかな量が単離される（地上部１００ｇから約１ｍｇ）のみである。
【０００４】
したがって、十分な量のトリテルペンを確保するために、人工的に合成する方法が求められている。五環系トリテルペンの生合成経路においては、まず、炭素数３０の直鎖状化合物である２，３−オキシドスクアレンを共通基質として、種々のオキシドスクアレン環化酵素（ＯＳＣ）により、α−アミリン、β−アミリン、ルペオール等の基本骨格が生合成される。そして、これらの基本骨格は、さらに、酸化、配糖化等の種々の修飾を受けることにより、多様な五環系トリテルペンが生合成される。
【０００５】
ＯＳＣについては、β−アミリン合成酵素（ｂＡＳ）をはじめ、多くのＯＳＣ遺伝子が単離、機能同定されているのに対し、基本骨格の酸化、配糖化に関わる酵素遺伝子については、いまだ報告が少ない。
【０００６】
例えば、特許文献１には、β−アミリンのβ２２位を水酸化する酵素遺伝子を特定し、当該酵素遺伝子と、β−アミリンの２４位を水酸化する酵素遺伝子とを共発現させることにより、ソヤサポゲノールＢを生産する技術が記載されている。また、特許文献２には、五環系トリテルペンの２８位をヒドロキシメチル基またはカルボキシル基に変換する酵素遺伝子を特定し、エリトロジオール、オレアノール酸、ウバオール、ウルソール酸、ベツリン、およびベツリン酸を生産する技術が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１１−２４５３４号公報
【特許文献２】再公表特許ＷＯ２０１２／０２９９１４
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Hamberger B., and Bak S., Philos. Trans. R. Soc. Lond B. Biol. Sci., 368, 2013
【非特許文献２】Sanchez, M. et al., Phytochemistry, 71.11,1395-1399, 2010
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述のように、五環系トリテルペンを製造する技術の開発は進んでいるが、まだ十全とはいえない。特に、五環系トリテルペンの修飾反応に関与する、これまでに確認できていないような酵素遺伝子を特定することができれば、その価値は非常に高いといえる。
【００１０】
本発明は、前記の問題点を鑑みてなされたものであり、その目的は、五環系トリテルペンの修飾反応に関与する、新規な酵素遺伝子を有する新規な形質転換体およびその利用技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、前記の課題を解決するべく鋭意検討を重ねた結果、特定のシトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ（以下、単に「Ｐ４５０」と称する場合もある）が、五環系トリテルペンの２２α位を水酸化することを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
【００１２】
（１）シトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼをコードするシトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子を導入した形質転換体であって、
前記シトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子が、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択されるいずれかの遺伝子であることを特徴とする形質転換体：
（ａ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（ｂ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ五環系トリテルペンの２２α位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｃ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ五環系トリテルペンの２２α位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｄ）配列番号２に記載される塩基配列からなる遺伝子；
（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ五環系トリテルペンの２２α位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【００１３】
（２）本発明に係る形質転換体は、五環系トリテルペン合成酵素をコードする五環系トリテルペン合成酵素遺伝子をさらに含むことが好ましい。
【００１４】
（３）本発明に係る形質転換体において、前記シトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子が、シロイヌナズナ由来であることが好ましい。
【００１５】
（４）本発明に係る形質転換体は、組換え酵母であることが好ましい。
【００１６】
（５）本発明に係る水酸化五環系トリテルペンの製造方法は、前記いずれかの形質転換体を培養して、２２α位が水酸化された五環系トリテルペンを取得することを特徴としている。
【００１７】
（６）本発明に係る遺伝子は、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択されるいずれかの遺伝子である：
（ａ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（ｂ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ五環系トリテルペンの２２α位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｃ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ五環系トリテルペンの２２α位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｄ）配列番号２に記載される塩基配列からなる遺伝子；
（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ五環系トリテルペンの２２α位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【００１８】
（７）本発明に係るタンパク質は、以下の（ｆ）〜（ｉ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質である：
（ｆ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｇ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ五環系トリテルペンの２２α位を水酸化する活性を有するタンパク質；
（ｈ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ五環系トリテルペンの２２α位を水酸化する活性を有するタンパク質；  （ｉ）上記（６）に記載の遺伝子にコードされるタンパク質。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、２２α位が水酸化された五環系トリテルペンの提供が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】α−アミリンおよび２２α−ヒドロキシ−α−アミリンの構造式を示す図である。
【図２】β−アミリンおよび２２α−ヒドロキシ−β−アミリンの構造式を示す図である。
【図３】Ｐ４５０を発現する酵母におけるα−アミリン合成酵素遺伝子発現のマススペクトルを示す図である。
【図４】Ｐ４５０を発現する酵母におけるβ−アミリン合成酵素遺伝子発現のマススペクトルを示す図である。
【図５】２２α−ヒドロキシ−α−アミリンの構造式およびＮＭＲ解析の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の実施の一形態について、以下に詳細に説明する。なお、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上（Ａを含みかつＡより大きい）Ｂ以下（Ｂを含みかつＢより小さい）」を意味する。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。ここで、遺伝子は、ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）、またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態にて存在し得る。ＤＮＡまたはＲＮＡは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。また、遺伝子は化学的に合成してもよく、コードするタンパク質の発現が向上するように、コドンユーセージ（Codon usage）を変更してもよい。同じアミノ酸をコードするコドン同士であれば置換することも可能である。また、用語「タンパク質」は、「ペプチド」または「ポリペプチド」と交換可能に使用される。本明細書において使用される場合、塩基およびアミノ酸の表記は、適宜ＩＵＰＡＣおよびＩＵＢの定める１文字表記または３文字表記を使用する。
【００２３】
＜１．本発明の概要＞
本発明は、五環系トリテルペンの２２α位を水酸化する活性を有するタンパク質、当該タンパク質をコードする遺伝子、当該遺伝子を導入した形質転換体、当該形質転換体を用いた前記タンパク質の製造方法、および、２２α位が水酸化した五環系トリテルペン（以下、「２２α位水酸化五環系トリテルペン」と称することもある）の製造方法に関する。
【００２４】
本明細書において、五環系トリテルペンは、スクアレンシンターゼ（ＳＱＳ）およびスクアレンエポキシダーゼ（ＳＱＥ）の触媒活性によりファルネシル二リン酸（ＦＤＰ、ＦＰＰとも称する）（ＦＰＰの各種異性体を含む）から生成する化合物および化合物群を意図する。ＦＰＰからの生成は、ＳＱＳおよびＳＱＥの触媒活性によるＦＰＰの環化、酸化、水酸化等の酵素反応により行われるが、これらに限定されない。
【００２５】
本発明の理解の一助とすべく、五環系トリテルペン生成の概要について説明する。五環系トリテルペンは、メバロン酸経路（ＭＶＡ経路とも呼ばれる）または非メバロン酸経路（ＭＥＰ経路とも呼ばれる）により合成されたＦＰＰから、２，３−オキシドスクアレンを経て合成される。ＦＰＰは、テルペンやステロイドを生合成するメバロン酸経路の中間体となる物質である。ＦＰＰは、ＳＱＳおよびＳＱＥの作用により、２，３−オキシドスクアレンに変換される。２，３−オキシドスクアレンは、ＯＳＣによりα−アミリン、β−アミリン、ルペオール等の五環系トリテルペンの基本骨格を有する化合物に変換される。
【００２６】
このようにして生成した五環系トリテルペンの基本骨格を有する化合物は、その２８位やβ２２位が、シトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ（Ｐ４５０）のＣＹＰ７１６Ａサブファミリーの酵素により酸化されることが知られている。しかしながら、五環系トリテルペンの２２α位を水酸化する酵素については、今まで報告されていない。本発明者らは、鋭意検討を行った結果、シロイヌナズナ由来の特定のＣＹＰ７１６Ａサブファミリーが、五環系トリテルペンの２２α位の水酸化に関わることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００２７】
２２α位が水酸化した五環系トリテルペンは、がん細胞(ＬＭ３細胞)に対して増殖阻害活性を示すことから、医薬品原体あるいはそのリード化合物になることが期待される化合物であるが、パタゴニアに生息するキク科植物のＮａｒｄｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｂｒｙｏｉｄｅｓからごくわずかな量が単離されることは知られているが、人工的に合成する方法は知られていない。本発明者らが見出した、五環系トリテルペンの２２α位を水酸化する活性を有するタンパク質によれば、２２α位が水酸化された五環系トリテルペンを人工的に合成することができる。したがって、今後、名古屋議定書によりアクセスすることがより難しくなると考えられる、パタゴニアに生息するキク科植物から抽出しなくても、２２α位が水酸化された五環系トリテルペンを生成することが可能である。
【００２８】
＜２．タンパク質＞
本発明に係るタンパク質は、五環系トリテルペンの２２α位を水酸化する活性を有する酵素タンパク質である。「五環系トリテルペンの２２α位を水酸化する活性」とは、基質である五環系トリテルペンの、２２番目の炭素のα位に水酸基を付与する酵素活性を意味している。
【００２９】
本発明に係るタンパク質は、Ｐ４５０であり、具体的には、Ｐ４５０ファミリーのＣＹＰ７１６ＡサブファミリーのＣＹＰ７１６Ａ２であることが好ましい。また、本発明において、ＣＹＰ７１６Ａ２はシロイヌナズナ由来であることが好ましい。
【００３０】
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）は、ゲノム上に二分子種のＣＹＰ７１６Ａサブファミリー（ＣＹＰ７１６Ａ１およびＣＹＰ７１６Ａ２）を保持することが知られている。しかしながら、シロイヌナズナのゲノム情報を提供しているＴＡＩＲ（The Arabidopsis Information Resource）においては、アノテーションが不正確であるため、本発明におけるＣＹＰ７１６Ａ２と、ＴＡＩＲにおけるＣＹＰ７１６Ａ２とは同一ではない。すなわち、ＴＡＩＲにおけるＣＹＰ７１６Ａ２のＡＧＩコード（Arabidopsis Genome Initiative code、シロイヌナズナの遺伝子座を示す番号）は、ＡＴ５Ｇ３６１４０であるが、正しくは、ＡＴ５Ｇ３６１４０に加えて、さらにＡＴ５Ｇ３６１３０も含む。
【００３１】
本発明におけるＣＹＰ７１６Ａ２は、ＴＡＩＲにおけるＣＹＰ７１６Ａ２と、遺伝子配列およびアミノ酸配列は同一ではないが、本明細書中においては便宜上、ＣＹＰ７１６Ａ２と称する。したがって、特に明示しない限り、本明細書中におけるＣＹＰ７１６Ａ２の記載は、本発明に係るＣＹＰ７１６Ａ２を意味する。
【００３２】
本発明に係るタンパク質は、（ｆ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質；（ｇ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ五環系トリテルペンの２２α位を水酸化する活性を有するタンパク質；および（ｈ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ五環系トリテルペンの２２α位を水酸化する活性を有するタンパク質、からなる群より選択されるいずれかのタンパク質である。さらに、後述する（ａ）〜（ｅ）のいずれかの遺伝子にコードされるタンパク質も本発明には含まれ得る。
【００３３】
前記（ｆ）のタンパク質に関して、配列番号１は、シロイヌナズナ由来のＰ４５０であるＣＹＰ７１６Ａ２のアミノ酸配列を示しており、４７３アミノ酸残基から構成される。
【００３４】
前記（ｇ）のタンパク質は、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の、機能的に同等の変異体、誘導体、バリアント、アレル、ホモログ、オルソログ、部分ペプチド、または他のタンパク質・ペプチドとの融合タンパク質等であって、五環系トリテルペンの２２α位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードする限り、その具体的な配列については限定されない。ここで欠失、置換または付加されてもよいアミノ酸の数は、前記機能を失わせない限り、限定されてないが、部位特異的突然変異誘発法等の公知の導入法によって欠失、置換または付加できる程度の数をいい、通常は、３０アミノ酸以内であり、好ましくは２０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは１０アミノ酸以内であり、より好ましくは７アミノ酸以内、さらに好ましくは５アミノ酸以内（例えば、５、４、３、２または１アミノ酸）である。また、明細書中において「変異」とは、部位特異的突然変異誘発法等によって人為的に導入された変異を主に意味するが、天然に存在する同様の変異であってもよい。
【００３５】
変異するアミノ酸残基は、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されていることが好ましい。例えば、アミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸およびアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）が挙げられる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字表記を表す）。あるアミノ酸配列に対する１または複数個のアミノ酸残基の欠失、付加および／または他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている。さらに、標的アミノ酸残基は、共通した性質をできるだけ多く有するアミノ酸残基に変異させることがより好ましい。
【００３６】
本明細書において「機能的に同等」とは、対象となるタンパク質が、目的とするタンパク質と同等（同一および／または類似）の生物学的機能や生化学的機能を有することを意図する。生物学的な性質には発現する部位の特異性や、発現量等も含まれ得る。変異を導入したタンパク質が所望の機能を有するかどうかは、その変異タンパク質が五環系トリテルペンの２２α位を水酸化する活性を有するかどうか調べることにより判断できる。
【００３７】
前記（ｈ）のタンパク質も、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の、機能的に同等の変異体、誘導体、バリアント、アレル、ホモログ、オルソログ、部分ペプチド、または他のタンパク質・ペプチドとの融合タンパク質等を意図しており、五環系トリテルペンの２２α位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードする限り、その具体的な配列については限定されない。アミノ酸配列の相同性とは、アミノ酸配列全体（または機能発現に必要な領域）で、少なくとも８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列の同一性を有することを意味する。アミノ酸配列の相同性は、BLASTN（核酸レベル）やBLASTX（アミノ酸レベル）のプログラム（Altschul et al. J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990）を利用して決定することができる。該プログラムは、KarlinおよびAltschulによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993）に基づいている。BLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore ＝１００、wordlength ＝１２とする。また、BLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore ＝５０、wordlength ＝３とする。また、Gapped BLASTプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Altschulら（Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997）に記載されているように行うことができる。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。比較対象の塩基配列またはアミノ酸配列を最適な状態にアラインメントするために、付加または欠失（例えば、ギャップ等）を許容してもよい。
【００３８】
本明細書において「相同性」とは、性質が類似のアミノ酸残基数の割合（homology、positive等）を意図しているが、より好ましくは、一致したアミノ酸残基数の割合、すなわち同一性（identity）である。なお、アミノ酸の性質については上述したとおりである。
【００３９】
（基質）
本発明に係るタンパク質により２２α位が水酸化される基質である五環系トリテルペンには、植物によって合成されるトリテルペンまたはその誘導体が含まれ、例えばβ−アミリン（ｏｌｅａｎ−１２−ｅｎ−３β−ｏｌ）、α−アミリン（ｕｒｓ−１２−ｅｎ−３β−ｏｌ）、ルペオール（ｌｕｐ−２０（２９）−ｅｎ−３β−ｏｌ）、およびそれらの誘導体等が挙げられる。
【００４０】
誘導体は、五環系トリテルペンの、例えば１位、２位、１１位、１２位、２８位、２９位、３０位などの、生合成中間体２，３−オキソスクアレンを原料とするその環化反応、および、２２α位水酸化酵素活性に影響の少ないと思われる位置の水素原子が、別の置換基、例えば低級アルキル基（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、水酸基、エステル基（アセトキシ、プロパノイルオキシなど）、アシル基（ホルミル、アセチル、プロピオニルなど）、アルコキシ基（メトキシ、エトキシ、プロポキシなど）、アミノ基、モノ−もしくはジ−低級アルキルアミノ基（メチルアミノ、ジメチルアミノ、エチルアミノなど）、アミド基、低級アルキルアミド基（アセタミドなど）、オキソ基、シアノ基、ニトロ基、低級アルキルチオ基（メチルチオ、エチルチオなど）、スルフォニル基（メシル、エチルスルホニルなど）などの官能基で置換された化合物等を含む。さらに、これらの部位の水酸基、ヒドロキシメチル基またはカルボキシル基にブドウ糖などの単糖や複数の糖がつくトリテルペンサポニンでもかまわない。
【００４１】
本発明の２２α位水酸化酵素の基質となる五環系トリテルペンとしては、β−アミリンまたはα−アミリンであることが好ましく、α−アミリンであることがより好ましい。
【００４２】
ここで、図１、２および５を参照して五環系トリテルペンの２２α位の水酸化について説明する。図１に示すように、α−アミリンの２２α位の水素基を水酸基で置換することにより、α−アミリンの２２α位が水酸化され、２２α−ヒドロキシ−α−アミリンが得られる。また、図２に示すように、β−アミリンの２２α位の水素基を水酸基で置換することにより、β−アミリンの２２α位が水酸化され、２２α−ヒドロキシ−β−アミリンが得られる。五環系トリテルペンの２２α位とは、図５の２２α−ヒドロキシ−α−アミリンの構造式に示すように、炭素の２２番目のα位を意味している。
【００４３】
α−アミリンは、α−アミリン合成酵素の作用によって、２，３−オキシドスクアレンから合成され、β−アミリンは、β−アミリン合成酵素の作用によって合成される（P.M.Dewick, Medicinal Natural Product, 3rd ed., John Wiley & Sons, 2009）。これらの合成酵素に関する配列情報およびクローニングについては、種々の植物の例えば根や種子由来のｃＤＮＡライブラリーからクローニングされて配列決定されており、すでに公知である。α−アミリン合成酵素については、M. Morita et al., Eur. J. Biochem. 267:3453-3460 (2000)などに記載されている。β−アミリン合成酵素については、H. Hayashi et al., Biol. Pharma. Bull. 24(8):912-916 (2001)、T. Kushiro et al., Eur. J. Biochem. 256:238-244 (1998)、米国特許No. 7,186,884、WO 2003/095615、EMBL Accession No. AY095999およびAAM23264.1(Glycine max)などに記載されている。
【００４４】
これらの合成酵素は、例えばオオムギ、マメ、ピーナッツ、シュガービート、コムギ、オートムギ、馬鈴薯、ニンニク、タマネギ、アスパラガス、茶、イネ、ライムギ、ダイズ、イチゴ、ヒマワリ、トマトなどの植物に存在することが知られている（米国特許No. 7,186,884）ので、必要に応じて、これらの植物から上記文献記載のクローニング手法を用いて、α−アミリン合成酵素およびβ−アミリン合成酵素をコードするＤＮＡを取得し、周知のＤＮＡ組換え技術、ＰＣＲ法などを使用して該ＤＮＡを微生物細胞または植物細胞に導入して該合成酵素を発現するようにすることも可能である。
【００４５】
このようにして得られた形質転換細胞または植物細胞から再生されたトランスジェニック植物は、これにさらに２２α位を水酸化する、本発明に係るタンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に組み込むことによって、２２α位が水酸化された五環系トリテルペンを生成可能になる。
【００４６】
＜３．遺伝子＞
本発明に係る（Ａ）遺伝子は、上述した本発明に係るタンパク質をコードする遺伝子であり、すなわち、五環系トリテルペンの２２α位を水酸化する活性を有する酵素タンパク質をコードする遺伝子である。本発明に係る遺伝子は、シロイヌナズナ由来のＣＹＰ７１６Ａ２遺伝子であり得る。
【００４７】
本発明に係る遺伝子は、（ａ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；（ｂ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ五環系トリテルペンの２２α位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；（ｃ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ五環系トリテルペンの２２α位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；（ｄ）配列番号２に記載される塩基配列からなる遺伝子；および（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ五環系トリテルペンの２２α位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、からなる群より選択されるいずれかの遺伝子である。
【００４８】
前記（ａ）の遺伝子に関して、配列番号１は、シロイヌナズナ由来のＰ４５０であるＣＹＰ７１６Ａ２のアミノ酸配列を示しており、このアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子である。
【００４９】
前記（ｂ）の遺伝子は、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の、機能的に同等の変異体、誘導体、バリアント、アレル、ホモログ、オルソログ、部分ペプチド、または他のタンパク質・ペプチドとの融合タンパク質等であって、五環系トリテルペンの２２α位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードする限り、その具体的な配列については限定されない。その他の説明は、前記（ｇ）のタンパク質と共通するため、省略する。
【００５０】
前記（ｃ）の遺伝子は、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の、機能的に同等の変異体、誘導体、バリアント、アレル、ホモログ、オルソログ、部分ペプチド、または他のタンパク質・ペプチドとの融合タンパク質等を意図しており、五環系トリテルペンの２２α位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードする限り、その具体的な配列については限定されない。その他の説明は、前記（ｈ）のタンパク質と共通するため、省略する。
【００５１】
前記（ｄ）の遺伝子について、配列番号２は、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列（Open Reading Frame：ＯＲＦ）を示す。
【００５２】
前記（ｅ）の遺伝子は、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子を意図する。ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる塩基配列に特異的な２本鎖のポリヌクレオチドが形成され、非特異的な２本鎖のポリヌクレオチドが形成されない条件をいう。換言すれば、相同性が高い核酸同士、例えば完全にマッチしたハイブリッドの融解温度（Ｔｍ値）から１５℃、好ましくは１０℃、更に好ましくは５℃低い温度までの範囲の温度でハイブリダイズする条件ともいえる。例えば、一例を示すと、０．２５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２、７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１×デンハルト溶液からなる緩衝液中で温度が６０〜６８℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１６〜２４時間ハイブリダイズさせ、さらに２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２、１％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡからなる緩衝液中で温度が６０〜６８℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１５分間の洗浄を２回行う条件を挙げることができる。
【００５３】
他の例としては、２５％ホルムアミド、より厳しい条件では５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．０、１０×デンハルト溶液、２０μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、４２℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度で、より厳しい条件としては「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度で、さらに厳しい条件としては「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度で実施することができる。このようにハイブリダイゼーションの洗浄の条件が厳しくなるほど、特異性の高いハイブリダイズとなる。ただし、前記ＳＳＣ、ＳＤＳおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する前記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間等）を適宜組み合わせることにより、前記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。このことは、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory（2001）等に記載されている。
【００５４】
また、前記（ｅ）の遺伝子には、配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡにおいて、１〜５０個の塩基配列が置換、欠損、挿入および／または付加しているＤＮＡからなる遺伝子、および配列番号２のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡと９０％以上の相同性を有するＤＮＡからなる遺伝子も含まれる。
【００５５】
上述した遺伝子を得る方法としては、通常行われるポリヌクレオチド改変方法を用いてもよい。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するポリヌクレオチドの特定の塩基を置換、欠失、挿入および／または付加することで、所望の組換えタンパク質の遺伝情報を有するポリヌクレオチドを作製することができる。ポリヌクレオチドの塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（KOD-Plus Site-Directed Mutagenesis Kit；東洋紡製，Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit; Clontech製，QuickChange Site Directed Mutagenesis Kit; Stratagene製など）の使用、またはポリメラーゼ連鎖反応法（polymerase chain reaction：ＰＣＲ）の利用が挙げられる。これらの方法は当業者に公知である。
【００５６】
また、前記遺伝子は、本発明に係るタンパク質をコードするポリヌクレオチドのみからなるものであってもよいが、その他の塩基配列が付加されていてもよい。付加される塩基配列としては、特に限定されないが、標識（例えば、ヒスチジンタグ、ＭｙｃタグまたはＦＬＡＧタグなど）、融合タンパク質（例えば、ストレプトアビジン、シトクローム、ＧＳＴ、ＧＦＰまたはＭＢＰなど）、プロモーター配列、およびシグナル配列（例えば、小胞体移行シグナル配列、および分泌配列など）をコードする塩基配列などが挙げられる。これらの塩基配列が付加される部位は特に限定されるものではなく、例えば、翻訳されるタンパク質のＮ末端であっても、Ｃ末端でもあってもよい。
【００５７】
＜４．ベクター＞
また、本発明には、前記遺伝子を含むベクターが含まれ得る。本ベクターとしては、形質転換体作製のために宿主細胞内で、前記遺伝子を発現させるための発現ベクターのほか、組換えタンパク質の生産に用いるものも含まれる。形質転換の対象は特に限定されず、細菌、酵母（出芽酵母、分裂酵母、油性酵母等）、昆虫、動物および植物を例示することができる。本発明において、好ましくは、酵母が形質転換の対象とされる。
【００５８】
前記ベクターの母体となる基材ベクターとしては、一般的に使用される種々のベクターを用いることができる。例えば、プラスミド、ファージまたはコスミド等を用いることができ、導入される細胞または導入方法に応じて適宜選択できる。つまり、ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。宿主細胞の種類に応じて、確実に前記遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと前記遺伝子を各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。
【００５９】
発現ベクターとして、例えば、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、染色体ベクター、エピソームベクターおよびウイルス由来ベクター（例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメントおよびウイルス（例えば、バキュロウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、トリポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルスおよびレトロウイルス））ならびにそれらの組合せに由来するベクター（例えば、コスミドおよびファージミド）を利用可能である。
【００６０】
一般的に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物のような沈殿物中か、または荷電された脂質との複合体中で導入される。ベクターがウイルスである場合、ベクターは、適切なパッケージング細胞株を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏでパッケージングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され得る。また、レトロウイルスベクターは、複製可能かまたは複製欠損であり得る。後者の場合、ウイルスの増殖は、一般的に、ヘルパー細胞においてのみ生じる。
【００６１】
また、前記ベクターは、目的の遺伝子に対するシス作用性制御領域を含むベクターが好ましい。適切なトランス作用性因子は、宿主によって供給され得るか、相補ベクターによって供給され得るか、または宿主への導入の際にベクター自体によって供給され得る。この点に関する好ましい実施態様としては、前記ベクターは、誘導性および／または細胞型特異的であり得る特異的な発現を提供するものであることが好適である。このようなベクターの中で特に好ましいベクターは、温度および栄養添加物のような操作することが容易である環境因子によって誘導性のベクターである。
【００６２】
細菌における使用に好ましいベクターの中には、例えば、ｐＱＥ−７０、ｐＱＥ−６０およびｐＱＥ−９（Qiagen社から入手可能）；ｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ＡおよびｐＮＨ４６Ａ（Stratagene社から入手可能）；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０およびｐＲＩＴ５（Addgene社から入手可能）；ならびにｐＲＳＦ（MERCK社から入手可能）；ならびにｐＡＣ（ニッポンジーン社から入手可能）が含まれる。また、好ましい真核生物ベクターの中には、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ（Stratagene社から入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ（Addgene社から入手可能）が含まれる。
【００６３】
前記遺伝子が宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。すなわち、前記ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このような選択マーカーとしては、例えば、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、E．coliおよび他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。また、その他にも宿主細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用いてもよい。このマーカーと本発明に係る遺伝子とを含むプラスミド等を発現ベクターとして宿主細胞に導入することにより、マーカー遺伝子の発現から前記遺伝子の導入を確認することができる。また、前記遺伝子は、宿主細胞における増殖のための選択マーカーを含むベクターに結合されてもよい。
【００６４】
また、前記遺伝子のインサートは、適切なプロモーターに作動可能に連結されることが好ましい。他の適切なプロモーターとしては、当業者に知られたものを利用可能であり、特に限定されないが、例えば、ファージλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃＩプロモーター、ｌａｃＺプロモーター、Ｔ３プロモーターおよびＴ７プロモーター、ｔｒｐプロモーターおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターおよび後期プロモーターならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターが挙げられる。
【００６５】
形質転換における宿主として酵母を用いる場合には、酵母内複製させるための「ｏｒｉ」および形質転換された酵母を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシンおよびクロラムフェニコール等）耐性遺伝子）をベクター上に有することが好ましい。酵母発現ベクターとしては、例えば、ＹＥｐ−ＦＬＡＧ−１（SIGMA社製）、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１（Invitorogen社製）、ｐＵＲ１２３（宝酒造社製）、ｐＹＥＸ−ＢＸ、ｐＹＥＸ−Ｓ１、ｐＹＥＸ−４Ｔ（CLONTECＨ社製）、ｐＥＳＣ等が挙げられる。
【００６６】
前記ベクターは、さらに、転写開始、転写終結のための部位、および、転写領域中に翻訳のためのリボゾーム結合部位を含むことが好ましい。ベクター構築物によって発現される成熟転写物のコード部分は、翻訳されるべきポリペプチドの始めに転写開始ＡＵＧを含み、そして終わりに適切に位置される終止コドンを含むことになる。
【００６７】
また、高等真核生物によるＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増大させ得る。エンハンサーは、所定の宿主細胞型におけるプロモーターの転写活性を増大するように働く、通常約１０〜３００ｂｐのＤＮＡのシス作用性エレメントである。エンハンサーとしては、例えば、SV40エンハンサー（これは、複製起点の後期側上の１００〜２７０ｂｐに位置される）、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側上のポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。
【００６８】
＜５．形質転換体＞
本発明に係る形質転換体は、特定のＰ４５０をコードするＰ４５０遺伝子を導入し、発現させた形質転換体であればよく、その他の具体的な構成は特に限定されない。本発明に係る形質転換体に導入されたＰ４５０遺伝子は、ＣＹＰ７１６Ａサブファミリーの酵素である、シロイヌナズナ由来のＣＹＰ７１６Ａ２をコードする遺伝子である。
【００６９】
本発明に係る形質転換体は、（ａ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；（ｂ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ五環系トリテルペンの２２α位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；（ｃ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ五環系トリテルペンの２２α位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；（ｄ）配列番号２に記載される塩基配列からなる遺伝子；および（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ五環系トリテルペンの２２α位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、からなる群より選択されるいずれかの遺伝子を導入した形質転換体である。
【００７０】
すなわち、本発明に係る形質転換体には、上述した、本発明に係る（Ａ）遺伝子または、当該遺伝子を含むベクターを含む形質転換体が含まれる。ここで、「遺伝子またはベクターを含む」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されていることを意味する。また、前記「形質転換体」とは、細胞・組織・器官のみならず、生物個体を含む意味である。
【００７１】
また、本発明に係る形質転換体は、上述した本発明に係る遺伝子を含むベクターを、宿主に、複数導入したものであってもよい。これにより、本発明に係る遺伝子の発現量を増やすことができる。
【００７２】
本発明に係る形質転換体の作製方法（生産方法）としては、上述したベクターを形質転換する方法が挙げられる。また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、後述する宿主細胞に例示した各種微生物を挙げることができる。また、プロモーターまたはベクターを選択すれば、植物または動物も形質転換の対象とすることが可能である。
【００７３】
ベクターを導入する宿主としては、特に限定されないが、各種細胞を好適に用いることができる。適切な宿主の代表的な例としては、菌体（例えば、E. coli細胞、Streptomyces細胞およびSalmonella typhimurium細胞）、真菌細胞（例えば、酵母細胞）、昆虫細胞（例えば、Drosophila  Ｓ２細胞およびSpodoptera Ｓｆ９細胞）、動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）ならびに植物細胞が挙げられる。より具体的には、ヒトまたはマウス等の哺乳類の細胞だけでなく、例えば、カイコガ由来の細胞をはじめとして、キイロショウジョウバエ等の昆虫、大腸菌（Escherichia coli）等の細菌、酵母（出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）、および油性酵母（Yarrowia lipolytica、Rhodosporidium toruloides、Xanthophyllomyces dendrorhous、Rhodotorula glutinis、Rhodotorula acheniorum、およびLipomyces starkeyi））、線虫（Caenorhabditis elegans）、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）の卵母細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。前記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当分野で公知ものを利用可能である。
【００７４】
本発明に係る形質転換体は、組換え酵母であることが好ましい。また、本発明に係る形質転換体は、サイトゾルにＤＭＡＰＰ（ジメチルアリルピロリン酸）を生合成する経路（メバロン酸経路）を有している酵母が宿主であることがより好ましい。
【００７５】
組換え酵母の宿主酵母株については各種の酵母株を用いることができ特に限定されないが、例えば、Saccharomyces属酵母、Pichia属酵母、Schizosaccharomyces属酵母、Yarrowia属酵母、Rhodotorula属酵母、Rhodosporidium属酵母、Xanthophyllomyces属酵母、Cryptococcus属酵母、Lipomyces属酵母、Trichosporon属酵母、Kluyveromyces属酵母、Candida属酵母、Pseudozyma属酵母、Ustilago属酵母、Debaryomyces属酵母、Sporobolomyces属酵母、Guehomyces属酵母などが挙げられる。好ましくは、Saccharomyces属酵母、Pichia属酵母が用いられ、より好ましくは、Saccharomyces属酵母が用いられる。このような菌株であれば、高効率で本発明に係るタンパク質を製造することができる。
【００７６】
前記ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入または感染等の従来公知の方法を好適に用いることができる。このような方法は、Davisら、Basic Methods In Molecular Biology (1986) のような多くの標準的研究室マニュアルに記載されている。
【００７７】
本発明に係る形質転換体は、本発明に係るタンパク質の部分断片（フラグメント）を組換え的に生成するための、前記タンパク質の部分断片をコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターおよび組換え発現ベクターで遺伝子操作された形質転換体（宿主細胞）を含む。
【００７８】
＜６．他の遺伝子を導入した形質転換体＞
また、本発明には、以下の（Ｂ）の遺伝子を導入し発現させた形質転換体が含まれる：
（Ｂ）五環系トリテルペン合成酵素遺伝子。
【００７９】
前記（Ｂ）の遺伝子は、本発明に係るタンパク質の基質である五環系トリテルペンを生成する活性を有する酵素タンパク質（五環系トリテルペン合成酵素）をコードする遺伝子であり、当該酵素タンパク質は、五環系トリテルペンを生成する活性を有している限り、別段に制限されない。
【００８０】
本発明に係る形質転換体の宿主が、五環系トリテルペン合成酵素遺伝子を有していない場合に、五環系トリテルペン合成遺伝子を本発明に係る形質転換体に導入する態様は当然に好ましいが、宿主が自身の五環系トリテルペン合成酵素遺伝子を有している場合においても、五環系トリテルペン合成酵素遺伝子を導入する態様は好ましくあり得る。五環系トリテルペン合成酵素遺伝子を有している宿主細胞には、植物細胞、および特定の酵母細胞が含まれる。
【００８１】
五環系トリテルペン合成酵素遺伝子として、例えば、α−アミリン合成酵素遺伝子、β−アミリン合成酵素遺伝子が挙げられ、本発明に係る形質転換体は、α−アミリン合成酵素遺伝子が導入されていることが好ましい。α−アミリン合成酵素およびβ−アミリン合成酵素の詳細については、前記２．タンパク質に記載したものと共通するため、省略する。
【００８２】
さらに、本発明には、以下の（Ｃ）の遺伝子を導入し発現させた形質転換体が含まれる：
（Ｃ）ＮＡＤＰＨ−シトクロームＰ４５０還元酵素（以下、単に「ＣＰＲ」と称する場合もある）遺伝子。
【００８３】
前記（Ｃ）ＣＰＲは、Ｐ４５０が酸化反応を行う際に必要な電子を供給するフラビン酵素であり、自らの補酵素であるＦＡＤおよびＦＭＮが結合するドメイン（各々、ＦＡＤ結合ドメインおよびＦＭＮ結合ドメイン）をその内部に包含している。本発明において、形質転換体のための宿主（以下、単に「宿主」と記す。）が自身のＣＰＲ遺伝子を有していない場合に、ＣＰＲ遺伝子を導入する態様は当然に好ましいが、宿主が自身のＣＰＲ遺伝子を有している場合においても、ＣＰＲ遺伝子を導入する態様は好ましくあり得る。例えば、本発明の宿主が酵母である場合において、酵母自体はＣＰＲ遺伝子を有しているが、さらにＣＰＲ遺伝子を導入する態様が好ましくあり得る。また、例えば、本発明の宿主が大腸菌である場合において、大腸菌自体はＮＡＤＰＨ−シトクロームＰ４５０還元酵素遺伝子を有していないので、当該遺伝子を導入する態様が好ましくあり得る。
【００８４】
ＮＡＤＰＨ−シトクロームＰ４５０還元酵素遺伝子の由来は、特段限定されることなく、任意の生物種由来の遺伝子を用いることができる。また、ＮＡＤＰＨ−シトクロームＰ４５０還元酵素遺伝子は、同時に発現させるＰ４５０ならびに導入される宿主細胞との関係を考慮して適宜設定することができる。
【００８５】
導入されるＣＰＲ遺伝子は、宿主と同じ種由来のＣＰＲ遺伝子であってもよく、異なる種由来のＣＰＲ遺伝子であってもよい。好ましくは、異なる種由来のＣＰＲ遺伝子であり、より好ましくは、植物由来のＣＰＲ遺伝子である。
【００８６】
さらに、本発明には、ＦＰＰの供給量を上げるために、以下の（Ｄ）〜（Ｆ）の遺伝子を導入し発現させた形質転換体が含まれ得る：
（Ｄ）ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素遺伝子；
（Ｅ）ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子；
（Ｆ）１型および／または２型イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ遺伝子。
【００８７】
上述した（Ａ）〜（Ｃ）の遺伝子に加えて、メバロン酸またはメバロノラクトンからイソペンテニル二リン酸までの合成を行うメバロン酸経路遺伝子群として前記（Ｄ）および（Ｅ）の遺伝子を、形質転換体に導入することが好ましい。
【００８８】
前記（Ｄ）および（Ｅ）の遺伝子群としては、ストレプトミセス属ＣＬ１９０株由来のメバロン酸経路遺伝子群（特開２００９−２０７３７６号公報、Accession no AB037666）を用いることができるが、これ以外にも出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）由来のメバロン酸経路遺伝子群（V. J. J. Martin, D. J. Pitera, S. T. Withers, J. D. Newman, J. D. Keasling, Nature Biotechnology, 21: 796-802, 2003）、細菌ストレプトコッカス・プノイモニエ（Streptococcus pneumoniae）由来のメバロン酸経路遺伝子群（S. H. Yoon, Y. M. Lee, J. E. Kim, S. H. Lee, J. H. Lee, J. Y. Kim, K. H. Jung, Y. C. Shin, J. D. Keasling, S. W. Kim, Biotechnology & Bioengineering, 94: 1025-1032, 2006）なども好適に用いることができる。
【００８９】
さらに、ＦＰＰの供給量を上げるために、（Ｆ）１型および／または２型イソペンテニル二リン酸イソメラーゼＩＰＰイソメラーゼ（Ｉｄｉ；IPP isomerase）遺伝子を用いることが好ましい。Ｉｄｉには互いに構造が異なる、１型（type 1）と２型（type 2）のものが存在するが、本発明では、いずれのＩｄｉを用いてもよいが、最も好ましくは両方のＩｄｉを用いる態様である。Ｉｄｉ遺伝子としては、ストレプトミセス属ＣＬ１９０株由来のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ遺伝子（特許文献１、Accession no AB037666）を用いることができるが、これ以外にも大腸菌由来のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ遺伝子（V. J. J. Martin, D. J. Pitera, S. T. Withers, J. D. Newman, J. D. Keasling, Nature Biotechnology, 21: 796-802, 2003）、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）由来のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ遺伝子（S. Kajiwara, P. D. Fraser, K. Kondo, N. Misawa, Biochemical Journal, 324: 421-426, 1997）、緑藻ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis）由来のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ遺伝子（前述のV. J. J. Martinらの文献、および前述のS. Kajiwaraらの文献）なども用いることができる。
【００９０】
上述した（Ｄ）および（Ｅ）のメバロン酸経路遺伝子群、ならびに（Ｆ）のＩｄｉ遺伝子を導入した形質転換体によれば、培地中にメバロン酸またはメバロノラクトン（Ｄ−メバロノラクトン（D-mevalonate lactone））を基質として配合することにより、ＦＰＰを大量に生産することができる。
【００９１】
本発明の形質転換体において、宿主として酵母を用いる場合、通常の酵母株を使用することもできるし、ＦＰＰを高生産する酵母を使用することもできる。ＦＰＰを高生産する酵母の製造は、当分野において既知の技術を用いて、当業者により容易に実施することができる。
【００９２】
またさらに、本発明には、五環系トリテルペンの生産を増強させるために以下の（Ｇ）および（Ｈ）の遺伝子を導入し発現させた形質転換体が含まれ得る：
（Ｇ）スクアレンシンターゼ（ＳＱＳ）遺伝子；
（Ｈ）スクアレンエポキシダーゼ（ＳＱＥ）遺伝子。
【００９３】
前記（Ｇ）ＳＱＳ遺伝子は、２分子のＦＰＰを結合させてスクアレンを生成する反応を触媒する酵素遺伝子であり、（Ｈ）ＳＱＥ遺伝子は、分子状酸素をスクアレンに付加して２，３−オキシドスクアレンを生成する反応を触媒する酵素遺伝子である。本発明において、（Ｇ）および（Ｈ）の遺伝子を用いることにより、五環系トリテルペンの生産量を上げることができる。導入されるＳＱＳ遺伝子およびＳＱＥ遺伝子は、宿主と同じ種由来の遺伝子であってもよく、異なる種由来の遺伝子であってもよい。好ましくは、植物由来の遺伝子である。例えば、ＳＱＳ遺伝子として、出芽酵母由来のＥＲＧ９遺伝子を、また、ＳＱＥ遺伝子として、出芽酵母由来のＥＲＧ１遺伝子などを例示できる。
【００９４】
一方、基質として、メバロノラクトンより安価なアセト酢酸塩（例えばlithium acetoacetate；ＬＡＡ）を基質として利用することもできる。培地中に添加されたＬＡＡを利用するためには、それを基質とするアセト酢酸−コエンザイムＡ（ＣｏＡ）リガーゼ（acetoacetate-CoA ligase）遺伝子を、さらに導入することが好ましい。
【００９５】
アセト酢酸−ＣｏＡリガーゼは、アセト酢酸とＣｏＡとを基質とし、ＡＴＰを用いてアセトアセチル−ＣｏＡへの変換を触媒する酵素である（J.R. Stern, Biochem. Biophys. Res. Commun. 44, 1001-1007, 1971; Bergstrom, J.D.;Wong, G.A.; Edwards, P.A.; Edmond, J., J. Biol. Chem. 259, 14548-14553, 1984）。アセト酢酸−ＣｏＡリガーゼ遺伝子としては、ラット（Rattus norvegicus）やヒトなどの哺乳類、ある種のバクテリア、菌類等に由来する遺伝子が知られており、本発明においても、これらの遺伝子を使用することができる。また、ラット由来のアセト酢酸−ＣｏＡリガーゼをコードする遺伝子全長（Accession No.BC061803）を含むプラスミドは、Mammalian Gene Collection cDNAクローンとして、Invitrogen社より取得できる（クローンID: 5598532）。
【００９６】
＜７．形質転換体による酵素の製造方法＞
本発明には、本発明に係る形質転換体を培養して、本発明に係るタンパク質である、ＣＹＰ７１６Ａ２を製造する方法も含まれ得る。例えば、本発明に係る形質転換体を培地において培養し、培養物中に本発明に係るタンパク質を生成蓄積させ、生成したタンパク質を該培養物から採取することにより、本発明に係るタンパク質を製造することができる。
【００９７】
上記形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【００９８】
大腸菌等の原核生物や、酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地および合成培地のいずれを用いてもよい。
【００９９】
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
【０１００】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
【０１０１】
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
【０１０２】
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【０１０３】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【０１０４】
本発明に係るタンパク質の製造方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、選択した方法に応じて、生産させるタンパク質の構造を変えることができる。
【０１０５】
本発明に係るタンパク質が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法（J.Biol.Chem.,264,17619(1989)）、ロウらの方法（Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,86,8227(1989)、Genes Develop.,4,1288(1990)）、または、特開平０５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該タンパク質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明のタンパク質の活性部位を含むタンパク質の手前にシグナルペプチドを付加した形で生産させることにより、該タンパク質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
【０１０６】
また、特開平２−２２７０７５号公報に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。さらに、遺伝子導入した植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いて本発明に係るタンパク質を製造することもできる。
【０１０７】
本発明に係るタンパク質を生産する形質転換体が植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、該タンパク質を生成蓄積させ、該植物個体より該タンパク質を採取することにより、該タンパク質を製造することができる。
【０１０８】
本発明に係るタンパク質を生産する形質転換体を用いて製造された本発明に係るタンパク質を単離・精製する方法としては、通常の酵素の単離、精製法を用いることができる。例えば、本発明に係るタンパク質が、細胞内に溶解状態で生産された場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
【０１０９】
得られた無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
【０１１０】
また、本発明に係るタンパク質が細胞内に不溶体を形成して生産された場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該タンパク質を回収後、該タンパク質の不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。
【０１１１】
得られた可溶化液を、タンパク質変性剤を含まない溶液またはタンパク質変性剤の濃度がタンパク質を変性させない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該タンパク質を正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
【０１１２】
本発明に係るタンパク質またはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清から該タンパク質またはその糖付加体等の誘導体を回収することができる。すなわち、得られた培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
【０１１３】
また、本発明に係るタンパク質を他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる。例えば、ロウらの方法（Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,86,8227(1989)、Genes Develop.,4,1288(1990)）、特開平５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１に記載の方法に準じて、本発明に係るタンパク質をプロテインＡとの融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
【０１１４】
また、本発明に係るタンパク質をＦｌａｇペプチドとの融合タンパク質として生産し、抗Ｆｌａｇ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる（Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,86,8227(1989)、Genes Develop.,4,1288(1990)）。さらに、該タンパク質自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。
【０１１５】
上述したように取得したタンパク質のアミノ酸配列情報を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法により、本発明のタンパク質を製造することができる。また、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ社、パーキン・エルマー社、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ社、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
【０１１６】
＜８．形質転換体による２２α位水酸化五環系トリテルペンの製造方法＞
本発明に係る製造方法は、２２α位水酸化五環系トリテルペンの製造方法であり、本発明に係る形質転換体を培養して、２２α位が水酸化された五環系トリテルペンを製造する。本発明に係る製造方法は、上述した本発明に係る形質転換体を使用するものであればよく、その他の具体的な構成については特に限定されない。
【０１１７】
本発明に係る製造方法においては、本発明に係る遺伝子と、五環系トリテルペン合成酵素遺伝子とが導入された本発明に係る形質転換体を培養することにより、２２α位が水酸化された五環系トリテルペンを製造してもよい。本発明に係る製造方法によれば、基質である五環系トリテルペン合成酵素遺伝子と、本発明に係る遺伝子である、五環系トリテルペンの２２α位を水酸化する酵素遺伝子とを共に発現させることによって、２２α位が水酸化された五環系トリテルペンを製造することができる。
【０１１８】
本発明に係る形質転換体を用いて、五環系トリテルペン合成酵素遺伝子と、本発明に係る遺伝子とを共に発現させる方法においては、本発明に係る形質転換体の培養物中に２２α位が水酸化された五環系トリテルペンを生成および蓄積させ、この培養物の処理物から生成された化合物を回収する。
【０１１９】
培養物の処理物としては、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体のタンパク質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵
素標品等をあげることができる。
【０１２０】
本発明に係る形質転換体を培養する工程に関しては、五環系トリテルペン合成酵素遺伝子と、本発明に係る遺伝子とを共に発現させるように培養すればよく、従来公知の手法を好適に利用でき、特に限定されない。培養条件の詳細については、上述した７．形質転換体による酵素の製造方法に記載した条件と共通するため、省略する。また、培養物または菌体からの２２α位水酸化五環系トリテルペンの採取方法についても、微生物生産物を得るのに常用される方法に従って行うことができ、特に限定されない。採取方法の詳細については、上述した７．形質転換体による酵素の製造方法に記載した方法と共通するため、省略する。
【０１２１】
また、本発明に係る製造方法は、培養工程において、本発明に係る遺伝子が導入された本発明に係る形質転換体を培養し、得られた培養物に、基質である五環系トリテルペンまたはその誘導体を添加する工程をさらに含んでいてもよい。本発明に係る遺伝子が発現した本発明に係る形質転換体の培養物に、五環系トリテルペンを含有する溶液を加えることで、２２α位が水酸化された五環系トリテルペンを製造することができる。
【０１２２】
本発明に係る形質転換体が、本発明に係るタンパク質を宿主細胞外に分泌する場合には、培養物に五環系トリテルペンを含有する溶液を添加してもよいし、培養物から精製した本発明に係るタンパク質に、五環系トリテルペンを含有する溶液を添加してもよい。
【０１２３】
本発明に係る形質転換体が、本発明に係るタンパク質を宿主細胞内または宿主細胞外膜上に生産する場合、培養後に得られた細胞の懸濁液を破砕後、遠心分離して無細胞抽出液を得る。得られた無細胞抽出液、または無細胞抽出液から精製した本発明に係るタンパク質を含む溶液に、基質となる五環系トリテルペンを添加してインキュベートすることで、２２α位が水酸化された五環系トリテルペンを製造することができる。
【０１２４】
この製造法において、本発明のタンパク質は、基質として用いる五環系トリテルペン１ｍｇ当たり０．０１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇ添加する。また、この製造法において、基質として用いる五環系トリテルペンは、０．１〜５００ｇ／Ｌ、好ましくは０．２〜２００ｇ／Ｌの濃度になるように反応水性媒体に初発または反応途中に添加する。２２α位が水酸化された五環系トリテルペンの生成反応は水性媒体中、ｐＨ５〜１１、好ましくはｐＨ６〜１０、２０〜５０℃、好ましくは２５〜４５℃の条件で２〜１５０時間、好ましくは６〜１２０時間行う。
【０１２５】
また、本発明には、本発明に係る形質転換体を含むトランスジェニック植物においてを生長させることで、五環系トリテルペンの２２α位を水酸化する酵素を発現させて２２α位が水酸化された五環系トリテルペンを製造し、根や種子等から回収する方法も含まれる。さらに、本発明には、化学合成した本発明に係るタンパク質を含む溶液に、五環系トリテルペンを添加することで、２２α位が水酸化された五環系トリテルペンを製造する方法も含まれる。
【０１２６】
本発明に係る２２α位水酸化五環系トリテルペンの製造方法によって得られた物質は、当分野において既知である任意の技術を用いて、その構造を決定することができる。構造を決定するための技術としては、例えば、Ｘ線回折、ＮＭＲ（核磁気共鳴法）、赤外分光法（ＩＲ）、ＭＳ（質量分析）がなど挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２７】
その他、前記＜１＞〜＜８＞の各項目で記載した内容は、他の項目においても適宜援用できることを付言する。また、本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではない。
【実施例】
【０１２８】
＜１．α−アミリン合成酵素遺伝子の酵母発現プラスミドの構築＞
α−アミリン合成酵素遺伝子（GenBank accession no.AB291240）を有するエントリークローンを作製し、ｐＹＥＳ３／ＣＴ（ＡＵＲ）−Ｇａｔｅｗａｙ−１ベクターと混合して、Ｇａｔｅｗａｙ  ＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ  ＩＩ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ（Invitrogen社）を用いて、α−アミリン合成酵素遺伝子の酵母発現プラスミドｐＹＥＳ３−ＡＤＨ−ａＡＳを得た。
【０１２９】
＜２．β−アミリン合成酵素遺伝子の酵母発現プラスミドの構築＞
β−アミリン合成酵素遺伝子（GenBank accession no.AB181244）を制限酵素ＸｂａＩ、ＫｐｎＩ認識配列を付加したプライマーを使用したＰＣＲで増幅後、当該制限酵素で処理し、ライゲーションにより、ｐＡＵＲ１２３（TaKaRaバイオ社）へクローニングした。得られたＰＡＤＨ１−ｂＡＳ−ＴＡＤＨ１領域をＰＣＲで増幅させ、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング(Clontech社)によりｐＹＥＳ３／ＣＴベクターへ移し、β−アミリン合成酵素遺伝子の酵母発現プラスミドｐＹＥＳ３−ＡＤＨ−ｂＡＳを得た。
【０１３０】
＜３．ＣＹＰ７１６Ａ２遺伝子ｃＤＮＡの単離＞
シロイヌナズナｃＤＮＡライブラリー（SuperScript Pre-Made cDNA Library, Invitrogen社, 11474-012）からＣＹＰ７１６Ａ２全長ｃＤＮＡを、遺伝子特異的プライマーで増幅させ、ｐＥＮＴＲ−Ｄ−ＴＯＰＯベクターへクローニングし、エントリークローンを取得した。
【０１３１】
＜４．ＣＹＰ７１６Ａ２の酵母発現プラスミドの構築＞
上記３．の項において構築したＣＹＰ７１６Ａ２全長ｃＤＮＡを含むエントリークローンとｐＥＬＣ（ｐＥＳＣ−ＬＥＵ）(Agilent社)クローニングサイト１に、ミヤコグサ由来のＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＣＰＲ）（GenBank accession no. AB433810）を挿入したベクター、ｐＥＳＣ−ＨＩＳ（Agilent社）のクローニングサイト２へＧａｔｅｗａｙカセットを挿入したｐＥＬＣ−ＧＷ、ｐＥＳＣ−ＨＩＳ−ＧＷ、あるいはｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２(Invitrogen社)を混合して、Ｇａｔｅｗａｙ  ＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ  ＩＩ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ（Invitrogen社）を用いて、ＣＹＰ７１６Ａ２遺伝子の酵母発現プラスミドｐＥＬＣ−ＣＹＰ７１６Ａ２、ｐＥＳＣ−ＨＩＳ−ＣＹＰ７１６Ａ２、及びｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２−ＣＹＰ７１６Ａ２を構築した。
【０１３２】
＜５．酵母の形質転換＞
Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（Zymo Research）を用いて、製品に付属のプロトコルに従い、出芽酵母ＩＮＶＳｃ１株（MATa his3D1 leu2 trp1-289 ura3-52）（Invitrogen社）への遺伝子導入を行った。上記１．で得られたα−アミリン合成酵素遺伝子の酵母発現プラスミドｐＹＥＳ３−ＡＤＨ−ａＡＳ、または、上記２．で得られたβ−アミリン合成酵素遺伝子の酵母発現プラスミドｐＹＥＳ３−ＡＤＨ−ｂＡＳと、上記４．で得られたＣＹＰ７１６Ａ２発現プラスミドｐＥＬＣ−ＣＹＰ７１６Ａ２、ｐＥＳＣ−ＨＩＳ−ＣＹＰ７１６Ａ２、及びｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２−ＣＹＰ７１６Ａ２と、を用いて上記酵母の形質転換をそれぞれ行った。
【０１３３】
遺伝子導入操作後のそれぞれ組み換え酵母を、トリプトファン、ロイシン、ウラシル、およびヒスチジンを含まない、２％グルコース含有合成完全培地（ＳＣ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｕｒａ−Ｈｉｓ）において、３０℃で１日間、２００r.p.m.で振盪培養した。その後、細胞を回収し、グルコースの代わりに２％ガラクトースを含むＳＣ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｕｒａ−Ｈｉｓ培地（１０ｍＬ）に再懸濁し、３０℃で２日間、２００r.p.m.で振盪培養した。得られた培養サンプルを−８０℃で保管した。
【０１３４】
＜６．酵母培養液の溶媒抽出、ならびにＧＣ−ＭＳ測定試料の調製＞
上記５．の項で得られた形質転換酵母の培養液１０ｍＬを、６ｍＬの酢酸エチルと混合しボルテックス、ソニケーション処理、遠心分離後上層を回収することにより溶媒抽出した。この操作を３回繰り返し、抽出画分を遠心エバポレーターで乾固し、１ｍＬの酢酸エチルに溶解後Ｓｅｐ−ｐａｋ  Ｖａｃ  Ｓｉｌｉｃａ(Waters社)へ付加し、酢酸エチル、クロロホルム：メタノールで溶出を行ったのち、再度遠心エバポレーターで乾固し、０．５ｍＬのクロロホルム：メタノール溶液に溶解させた。このうち５０μＬを乾固し、１００μＬのＮ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｅを加え、８０℃、２０分間誘導体化することにより、ＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフ質量分析計）測定試料を得た。
【０１３５】
＜７．ＧＣ−ＭＳ分析＞
装置は５９７７Ａガスクロマトグラフ質量分析計(Agilent Technologies)を使用した。ガスクロマトグラフにキャピラリーカラムＤＢ−１ＭＳ（３０ｍ×０．２５ｍｍ、膜厚０．２５μｍ : Agilent J&W）を用いた。カラムオーブンの昇温条件は、８０℃で１ｍｉｎ保持，３２０℃まで２０℃／ｍｉｎで昇温、３２０℃で２８ｍｉｎ保持とした。インジェクター温度は２５０℃、ＧＣインターフェイス温度は２５０℃とした。キャリアガスにはヘリウムを用い、流速は１．０ｍＬ／ｍｉｎ、サンプル注入量は１μＬ、スプリットレスとした。質量分析計は電子イオン化法（ＥＩ）を用い、ゲインバリューは１．０、イオン源温度は２３０℃とした。ｍ／ｚ：５０−７５０についてスキャンした。
【０１３６】
α−アミリン合成酵素およびＣＹＰ７１６Ａ２を発現した形質転換酵母からの抽出物について、ＧＣ−ＭＳ分析した結果を図３に示す。比較例として、ＣＹＰ７１６Ａ２の代わりにＣＹＰ７１６Ａ１を発現した形質転換酵母、あるいは空ベクターを導入した形質転換酵母からの抽出物を用い、標準品として、α−アミリン（１）、α−アミリンの２８位が酸化したウバオール（２）、ウルソール酸（３）の混合物を用いた。
【０１３７】
図３に示すように、α−アミリン合成酵素およびＣＹＰ７１６Ａ２を発現した形質転換酵母においては、比較例および標準品とは異なるピーク（４）が見られ、新規の反応産物が得られたことを示す。
【０１３８】
β−アミリン合成酵素およびＣＹＰ７１６Ａ２を発現した形質転換酵母からの抽出物について、ＧＣ−ＭＳ分析した結果を図４に示す。比較例として、ＣＹＰ７１６Ａ２の代わりにＣＹＰ７１６Ａ１を発現した形質転換酵母、あるいは空ベクターを導入した形質転換酵母からの抽出物を用い、標準品として、β−アミリン（６）、β−アミリンの２８位が酸化したエリトロジオール（７）、オレアノール酸（８）の混合物を用いた。
【０１３９】
図４に示すように、β−アミリン合成酵素およびＣＹＰ７１６Ａ２を発現した形質転換酵母においては、比較例および標準品とは異なるピーク（１０）が見られ、新規の反応産物が得られたことを示す。
【０１４０】
＜８．反応産物の分離・精製＞
新規の反応産物について、ＮＭＲによる構造決定を行うために、α−アミリン合成酵素およびＣＹＰ７１６Ａ２を発現した形質転換酵母の培養液から、化合物（４）を含む酢酸エチル抽出画分を分離した。得られた粗抽出画分をシリカ（６０Ｎ  ４０〜５０μｍ）カラムに供し、ヘキサン：酢酸エチル混合溶媒（５：１〜３：１）を用いて溶出することにより化合物（４）を精製した。
【０１４１】
＜９．ＮＭＲ分析＞
得られた精製物を、ＴＭＳを添加したＣＤＣｌ３に溶解してNMR用サンプルとした。ＮＭＲは、JNM-ECS400（JEOL）を使用し、1H、13C、DEPT135°、1H-1H COSY、HMBC、HSQC、NOESYについての測定を行った。化学シフトは１Ｈ−ＮＭＲの場合はＴＭＳを内部標準（０．０）とし、１３Ｃ−ＮＭＲはＣＤＣｌ３の７７．０を標準としてｐｐｍ値で与えた。
【０１４２】
ＮＭＲ分析で得られた解析結果を、図５に示す。図５に示すように、α−アミリン合成酵素およびＣＹＰ７１６Ａ２を発現した形質転換酵母から得られた新規の反応産物は、２２α位が水酸化されたα−アミリンである、２２α−ヒドロキシ−α−アミリンであることが明らかとなった。α−アミリンとβ−アミリンとは構造が類似しているため、β−アミリン合成酵素およびＣＹＰ７１６Ａ２を発現した形質転換酵母から得られた新規の反応産物についても、２２α位が水酸化されたβ−アミリンであると推測できる。
【産業上の利用可能性】
【０１４３】
２２α位が水酸化された五環系トリテルペンは、種々の有益な生理活性を有することが期待される。このため、本発明は、医薬品、機能性食品、香料、農園芸、生活消費財等の種々の産業において利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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