(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一の固体内部に形成された細胞が通過する第1通路であって、該第1通路はマイクロチャネルであり、該第1通路は前記マイクロチャネルの内壁を狭めることで形成された中間部を含む、第1通路;上記細胞に注入する物質が通過し、前記第1通路の前記中間部で前記第1通路に接続され、上記単一の固体内部に形成された第2通路であって、該第2通路はナノチャンネルである、第2通路;および、前記第1通路と前記第2通路との間に圧力差または電位差を印加する装置を使用して、1）前記第1通路に細胞を含有する流体を流入させながら、前記第2通路に細胞に注入する物質を流入させる段階;および、2）前記第2通路に電位差を加え、前記第1通路と第2通路が接続される前記中間部を通過する単一の細胞に上記物質を注入するステップを含んでいる、細胞を変換させる方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記物質が、タンパク質、ペプチド糖蛋白質、リポタンパク質、DNA、RNA、アンチセンスRNA、siRNA、ヌクレオチド、リボザイム、プラスミド、染色体、ウイルス、薬物、有機化合物、無機化合物、ヒアルロン酸、コラーゲン、細胞核、ミトコンドリア、小胞体、ゴルジ体、リソソーム、リボソームまたはナノ粒子およびこれらの混合物の中から選択されるものであることを特徴とする、細胞を変換させる方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、前記細胞が原核細胞または真核細胞であることを特徴とする、細胞を変換させる方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法において、前記原核細胞が細菌または古細菌であることを特徴とする、細胞を変換させる方法。
【請求項５】
請求項３に記載の方法において、前記真核細胞が動物細胞または植物細胞であることを特徴とする、細胞を変換させる方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法において、前記動物細胞が体細胞、生殖細胞、および幹細胞からなる群から選択されるものであることを特徴とする、細胞を変換させる方法。 
【請求項７】
請求項６に記載の方法において、前記体細胞が上皮細胞、筋肉細胞、神経細胞、脂肪細胞、骨細胞、赤血球、白血球、リンパ球、および粘膜細胞からなる群から選択されるものであることを特徴とする、細胞を変換させる方法。
【請求項８】
請求項６に記載の方法において、前記生殖細胞は卵子または精子であることを特徴とする、細胞を変換させる方法。
【請求項９】
請求項６に記載の方法において、前記幹細胞が成体幹細胞または胚性幹細胞であることを特徴とする、細胞を変換させる方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法において、前記成体幹細胞は、造血幹細胞、中葉幹細胞、神経幹細胞、繊維芽細胞、肝臓芽細胞、網膜芽細胞、脂肪由来幹細胞、骨髄由来の幹細胞、臍帯血由来の幹細胞、臍帯由来幹細胞、胎盤由来幹細胞、正由来幹細胞、末梢血管由来幹細胞、および羊膜由来幹細胞からなる群から選択されることを特徴とする、細胞を変換させる方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法において、前記細胞が、前記第1通路の両末端との間の圧力差や電位差によって移動することを特徴とする、細胞を変換させる方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法において、前記第1通路と前記第2通路との間の電位差が0.5Vから100Vであることを特徴とする、細胞を変換させる方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法において、前記第1通路と前記第2通路との間の電位差が0.8Vから50Vであることを特徴とする、細胞を変換させる方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法において、前記第1通路と前記第2通路との間の電位差が1.0Vから10Vであることを特徴とする、細胞を変換させる方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法において、前記第2通路が複数あることを特徴とする、細胞を変換させる方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、単一の細胞に遺伝子やタンパク質などの物質を注入して細胞を変換させる方法に関するものである。
【０００２】
より詳細には、本発明は、固体内部に形成された細胞が通過する第1通路;上記細胞に注入する物質が通過し、前記第1通路の両末端との間の任意の位置で前記第1通路に接続され、上記固体内部に形成された第2通路;前記第1通路と前記第2通路に圧力差または電位差を印加する、細胞に物質を注入する装置を使用して、1）前記第1通路に細胞を含有する流体を流入させながら、前記第2通路にタンパク質、ペプチド糖蛋白質、リポタンパク質、DNA、RNA、リボザイム、染色体、ウイルス、有機化合物、無機化合物、コラーゲン、細胞核、ミトコンドリア、小胞体、ゴルジ体、リソソーム、リボソーム、ナノ粒子またはこれらの混合物を流入させる段階;そして2）前記第2通路に電位差を加え、前記第1通路と第2通路が接続されるポイントを通過する単一の細胞に上記物質を注入するステップを含んでいる、細胞を変換させる方法のことである。
（発明の背景となる技術）
バイオ分野、電気電子分野やナノ加工分野の技術の目覚しい発展により、これらの分野の融合を通じた新たなバイオ医療技術の研究が最近盛んに行われている。
【０００３】
細胞操作の分野では、in vitroでの患者の細胞を操作した後、患者の体内に注入して治療目的のために使用しようとすると、人間の細胞を操作して、次世代の新薬開発とターゲットの検証に使用する研究が多数行われている。
【０００４】
最近の細胞操作技術は、有用な細胞治療剤の開発に焦点を当てているが、特に、山中因子（Yamanaka factor）を用いた逆分化誘導多能性幹細胞（iPS）を活用しようとする努力が大きく注目されている。
【０００５】
山中因子は、4つの遺伝子（Oct3/4、Sox2、cMycおよびKlf4）を指す。山中因子をウイルス由来ベクターを用いて、細胞の染色体に挿入すると、分化がすでに終わった体細胞は、さまざまな種類の体細胞への分化が可能な多能性幹細胞に変わる。したがって誘導多能性幹細胞は、胚性幹細胞の倫理と生産性の問題および、成体幹細胞の分化限界をすべて克服することができる革新的な技術で評価される。
【０００６】
しかし、ウイルス由来ベクターを細胞に使用することは安全性の懸念を発生させる。また、ウイルス由来のベクターを含有している誘導多能性幹細胞から分化された細胞や組織を人体に移植する場合、腫瘍を誘発させる危険もある。
これらの問題点を解決し、革新的な誘導多能性幹細胞を利用して、有用な細胞治療剤を開発するには、ウイルス由来ベクターのような伝達手段を使用していないままDNAやRNA、ポリペプチド、ナノ粒子などのような物質を、単一の細胞に直接注入することができる新しい細胞変換操作技術が必要である。
【０００７】
ウイルス由来のベクターのような伝達手段を使用していない細胞の変換操作のための従来の方法は、細胞に電界を加えたり、細胞を化学的に処理したり、機械的せん断力を加えて細胞膜に損傷を加え、細胞外液に含まれている遺伝子などの物質が細胞内に流入するようにして、細胞の自己治癒力に依存して、破損された細胞壁が復元され、細胞が死なずに生存することを期待する方法が主流となっている。
【０００８】
粒子の衝突方法やマイクロ注入方法、電気穿孔方法のような様々な細胞に変換する方法が開発されている。マイクロ注入方法を除いて、これらの方法は、多数の遺伝子やポリペプチドを多量に基づく統計確率的な（bulk stochastic）プロセスによって任意に細胞に流入させる方法に基づいている。
【０００９】
細胞を変換させるために、現在最も広く使用されているこのような従来のバルク電気穿孔（bulk electroporation）の方法では、注入量の精密な制御が不可能であるという短所がある。
【００１０】
したがって、個々の細胞にマイクロ流体力学に基づいて、電気穿孔に物質を注入する（microfluidics-based electroporation）の方法が、新しい技術として登場している。これらのマイクロ流体電気穿孔法は、バルク電気穿孔法に比べて穿孔するための電圧を下げることができるという点、細胞の変換効率が高い点、細胞生存率を大幅に引き上げることができるという点などを含む、いくつかの重要な利点がある。
【００１１】
2011年に、ナノチャンネルに隣接して位置する細胞膜の狭い領域を、非常に大きな局所的電界に露出させるナノチャンネル電気穿孔技術が一般に公開されたことがある（L. James Lee et al、 "Nanochannel eletroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cell"、Nature Nanotechnology vol。6 November 2011、www.nature.com / naturenanotechnology published online 16、October、2011、）。
【００１２】
前記ナノチャンネル電気穿孔装置は、ナノチャネルを介して接続される2つのマイクロチャネルを含んでいる。変換させる細胞は、ナノチャンネルにかかっているマイクロチャネルに満たされて、別のマイクロチャネルは、注入される物質が満ちている。マイクロチャネル-ナノチャンネル-マイクロチャネルに関連する構造は、それぞれの細胞を正確な位置に置かれるようにする。数ミリ秒間持続される1つ以上の電圧パルスは、2つのマイクロチャンネル間に印加されて、細胞の変換を引き起こす。注入量の調節は、持続時間とパルスの数を調整することにより、行われる。
【００１３】
ところで、上記の先行技術論文に記載されたナノチャネルの電気穿孔注入装置は、チップの基板上に刻印されて形成された樹脂で製作されたマイクロチャネルとナノチャンネルを覆ってくれるポリジメチルシロキサンで製作されたカバープレートを含んでいる。
【００１４】
上記ネイチャーナノテクノロジーに掲載された先行技術論文に記載されたナノチャネルの電気穿孔装置は、刻印されて形成される高分子樹脂で製作されたマイクロチャネルとナノチャネル層とポリジメチルシロキサンカバープレートの間に隙間の発生を避けることができない。この理由は、機械的物性が互いに異なる材料で作られたカバープレートとチャンネル形成層間のシールは絶対に完全にはできないからである。
【００１５】
また、ポリジメチルシロキサンで製作されたカバープレートと高分子樹脂で製作されたマイクロチャネルとナノチャンネルの機械的寸法安定性が非常に低いため、上記のカバープレートとチャンネル層間の密封は完全とはすることができない。したがって、上記カバープレートとチャンネル層間に隙間が簡単に作成されることができる。
【００１６】
このように発生する隙間は溶液の浸透を可能にして、ナノチャンネル電気穿孔チップを汚染させる一方のチャネルとの間の細胞の移動と細胞との物質の注入のために加わる圧力チャイナ電界に様々な誤差を発生させることができる。
したがって、この技術分野では、以上のような先行技術の問題点を克服するために、個別の細胞に様々な物質を注入するに当たり、誤差なく多種の物質を各細胞ごとに一時に注入する新しい技術の開発が長い間期待されてきた。
本発明者は、ガラスのように硬い固体内部に多数のマイクロチャネルと、これに接続されている多数のナノチャンネルを形成してこれらに電位差を与えることができる電極を設置することにより、使用される材料の寸法安定性問題や接合部位のシールの不完全さにより発生する隙間に起因する従来の技術のいくつかの問題点を克服することができていることに着目して、本発明の細胞を変換させる方法を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
したがって、本発明の狙いは、固体内部に形成させた細胞が通過する第1通路;上記細胞に注入する物質が通過し、前記第1通路の両末端との間の任意の位置で前記第1通路に接続され、上記固体内部に形成される第2通路;前記第1通路と前記第2通路に圧力差や電位差を印加する、細胞に物質を注入する装置を使用して、1）前記第1通路に細胞を含有する流体を流入させながら、前記第2通路にタンパク質、ペプチド糖蛋白質、リポタンパク質、DNA、RNA、アンチセンスRNA、siRNA、ヌクレオチド、リボザイム、プラスミド、染色体、ウイルス、薬物、有機化合物、無機化合物、ヒアルロン酸、コラーゲン、細胞核、ミトコンドリア、小胞体、ゴルジ体、リソソーム、リボソームまたはナノ粒子またはこれらの混合物から選択される物質を流入させる段階;そして2）前記第2通路に電位差を加え、前記第1通路と第2通路が接続されるポイントを通過する単一の細胞に上記物質を注入するステップを含んでいる、細胞を変換させる方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
以上、本発明の狙いは、固体内部に形成させた細胞が通過する第1通路;上記細胞に注入する物質が通過し、前記第1通路の両末端との間の任意の位置で前記第1通路に接続され、上記固体の内部に形成された第2通路;前記第1通路と前記第2通路に圧力差や電位差を印加する、細胞に物質を注入する装置を使用して、第1通路に沿って移動する単一の細胞が前記第1通路と前記第2通路が接続されている点を通過する際に、第2通路に電位差があり、又は第2通路と、第1通路に電位差を加え、上記の細胞に前記第2通路を通って流入する物質を注入して、前記細胞を変換させる方法を提供することにより達成することができる。
【００１９】
本発明の方法で物質を注入して変換させる細胞は、原核細胞または真核細胞であることができる。より詳細には、上記原核細胞は、細菌（bacteria）または古細菌（archaea）であることができ、上記真核細胞は、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞であることができる。
【００２０】
本発明の一つの実施例では、上記動物細胞が体細胞、生殖細胞または幹細胞であることができる。具体的には、上記体細胞は上皮細胞、筋肉細胞、神経細胞、脂肪細胞、骨細胞、赤血球、白血球、リンパ球または粘膜細胞であることができる。また、前記生殖細胞は、卵子または精子であることができる。また、上記幹細胞は、成体幹細胞または胚性幹細胞であることができる。
【００２１】
本発明の一つの実施例では、上記の成体幹細胞は、造血幹細胞、中葉幹細胞、神経幹細胞、繊維芽細胞、肝臓芽細胞、網膜芽細胞、脂肪由来幹細胞、骨髄由来の幹細胞、臍帯血由来の幹細胞、臍帯由来幹細胞、胎盤由来幹細胞、正由来幹細胞、末梢血管由来幹細胞または羊膜由来幹細胞であることができる。
【００２２】
本発明の細胞内での物質注入方法を介して細胞内に注入することができる物質は、タンパク質、ペプチド糖蛋白質、リポタンパク質、DNA、RNA、アンチセンスRNA、siRNA、ヌクレオチド、リボザイム、プラスミド、染色体、ウイルス、薬物、有機化合物、無機化合物、ヒアルロン酸、コラーゲン、細胞核、ミトコンドリア、小胞体、ゴルジ体、リソソーム、リボソームまたはナノ粒子、またはこれらの混合物であることができる。
【００２３】
細胞に物質を注入するために、本発明の方法に使用される装置は、大韓民国特許出願第10-2014-0191302号と第10-2015-0178130号に詳細に記載されている。本発明の方法に使用される装置を製作するために、細胞を含有する流体が移動する多数のマイクロチャネルとナノチャンネルをフェムト秒レーザーを使用して、ガラス固体内部に形成させることができる。
【００２４】
2000年以降、最近急速に発展したマイクロ流体力学の分野は、バイオ及び医療用流体チップのことを核心内容に扱う分野である。これらの流体チップは、複雑なマイクロ流体通路が絡み合っており、様々な表面改質が加えられて、内部電極に電圧を印加して電気化学的現象を誘導し、圧力勾配、電気浸透圧現象で流体の流れが駆動される非常に複雑な機構である。
【００２５】
流体チップが満たさなければならない様々な条件は、特にガラス素材を使用したとき、最も理想的に満足させることができ、これは長い時間、医療分野での主要な材料として使用されてきて、安全性が検証されたからである。具体的には、ガラスは、バイオ適合性、耐薬品性、電気絶縁性、寸法安定性、構造剛性、接合強度、親水性、透明性などその利点は、非常に多様である。
【００２６】
ただし、従来の流体チップの製造が、半導体工程であるエッチング工程を通じてほとんど行われるため等方性エッチングによる加工の解像度の限界、縦横比の制限、加工断面を多様にすることができないといった制限、エッチング後の接合工程の難しさなど研究開発分野などの小規模多品種開発などにおいて困難が大きい。
【００２７】
これらの困難のために、液状で型枠に注いで固めるPDMS（polydimethylsilocsane）シリコーンゴムを用いた流体チップの製造が広く行われていた。PDMS材料を使用する場合は、チップ製造が容易な利点があるが、医療用材料として適用するにはバイオ適合性がガラス素材よりも劣り、耐薬品性が低く、寸法安定性、構造剛性、接合強度が非常に脆弱である。
【００２８】
特に、流体チップに適用する場合には、ガラスの床面との接合強度が低く、内部流体が漏れ出やすく、高い電界を加える場合、接合面に乗って電流がリークしやすく、電気化学的な適用をするには制限が大きく続く。また、疎水性表面特性により、バイオ適合性を高めるために、表面改質が必要だが、プラズマ酸化を介して一時的な親水表面への改質をすることは可能である。
【００２９】
このような理由から、医療目的の流体チップは、特に細胞を操作する場合のような高バイオ適合性が要求される場合は、ガラス素材の適用が大きく要求される。また、細胞操作のために必要な圧力と電圧の様々な適用を安全に実行するには、構造の剛性、接合面の接合強度、寸法安定性などの高い素材が要求され、ガラス素材と同様の特性を有する透明性固体を素材として適用する必要性が大きい。
【００３０】
特に、素材の価格と特性の両方を考慮すると、実際に上のガラス素材が最も理想的な素材であるため、ガラス素材の加工と接合の難しさと限界を克服するための新しい加工方法の開発が非常に重要である。
【００３１】
既存のガラスを用いた流体チップの製造は、一方のガラス板の素材にマイクロ流体チャンネルをエッチングにより加工し、また、他のガラス板（主にエッチングがない評判の構造）との接合を介して行われる。
【００３２】
これらのエッチングと接合工程による製造の限界は、1）等方性エッチングによる寸法、アスペクト比、断面形状の制約と、2）ガラス-ガラス間の接合の難しさと限界が最大の問題である。特に、1ミクロンレベルでナノメートルレベルの超微細形状の製造が、上記問題点に起因して事実上不可能になったが、これを解決するためには、接合工程が必要ない加工工程が最も必要である。
【００３３】
フェムト秒レーザー三次元ナノ加工工程は、2004年に米国ミシガン大学で初めてフェムト秒レーザーパルスを用いたナノ加工現象を発見し、この後、三次元ナノ加工工程へと発展した。本方法を利用すると、ナノスケールの三次元構造をガラス内部に直接加工することができるようになり、接合工程がなく、流体チップを製造することができるようになる。
【００３４】
加工の便宜上、流体チップの大部分を占めるマイクロスケールの2次元流体構造は、従来のエッチング工程と接合工程で製造し、ナノ構造だけフェムト秒レーザーを用いて三次元加工する方法がより効率的である。
【００３５】
ただし、ナノスケールの完全な三次元構造は、フェムト秒レーザー三次元ナノ工程でのみ可能であり、既存のエッチングと接合工程では、実際に上製造が不可能である。
本発明の細胞に物質を注入する方法で使用されるデバイスに形成された前記第1通路は、両末端の中間部分の方向に内径が徐々に減少する形状を有することができる。また、前記第1通路の両末端の内径は、10μm〜200μmであり、前記第1通路の中間の狭くなった部分の内径は、3μm乃至150μmであることができる。
【００３６】
本発明の細胞内での物質の注入方法に使用されたデバイスに形成される前記第2通路は一つ以上とすることができる。また、前記第2通路の内径は、10nmないし1,000nmであることができる。
【００３７】
本発明の方法に使用されるデバイスでは、細胞は、前記第1通路の両末端との間の圧力差や電位差によって移動することができる。例えば、前記第1通路の両末端の間に圧力差を発生させるためのポンプを使用することができる。
【００３８】
また、前記第1通路の両末端の間に電位差を発生させるために直流電源または交流電源を使用することができて、パルス形態の電圧を適用することもできる。特に、前記第1通路の両末端の間の電位差は、好ましくは10Vから1,000V、より好ましくは15Vから500V、最も好ましくは20Vから200Vであることができる。
【００３９】
また、前記第1通路と前記第2通路に加わる電位差は、好ましくは0.5Vから100V、より好ましくは0.8Vから50V、最も好ましくは1.0Vから10Vであることができる。
前記第1通路は、両末端の中間部分の方向に内径が徐々に減少する形状を有することができる。また、前記第1通路の両末端の内径は、10μmないし200μmであり、前記第1通路の中間部分の内径は、3μm乃至150μmであることができる。
【００４０】
また、前記第2通路は、一つ以上とすることができる。また、前記第2通路の内径は、10nmないし1,000nmであることができる。
また、前記第1通路と前記第2通路との間の電位差は、好ましくは0.5Vから100V、より好ましくは0.8Vから50V、最も好ましくは1.0Vから10Vであることができる。
【００４１】
本発明の方法を通じて、顕微鏡を使って細胞の動きを確認しながら、圧力差または電位差を調整して、前記細胞の前記第1通路への流入を効果的に制御することができる。
また、前記第1通路と前記第2通路との間に加わる電位差を調整して前記細胞の内部に注入される物質の量を調節することができる。
【００４２】
本発明の一つの実施例によると、細胞に注入される物質の量は、（i）注入する物質に蛍光物質を標識した後、蛍光強度を測定したり、（ii）物質を注入するときに発生する電流の量を測定して計算することができる。
【発明の効果】
【００４３】
本発明の方法を介して、タンパク質、遺伝子、薬物、ナノ粒子など、様々な物質を細胞に注入することができる。特に、本発明の方法では、単一の細胞に注入される物質の量を電位差を利用して調節することができるので、注入収率が非常に高く、細胞間の注入量に違いが出ないように制御することができる。したがって、多くの様々な細胞操作と誘導多能性幹細胞を含む細胞治療剤の研究開発に、本発明の細胞を変換させる方法を広く使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図1は、本発明の方法で使用され、一つの物質通路（第2通路）を有する細胞内での物質の注入装置（図1a）と、6つの第2通路を有する細胞内での物質の注入装置（図1b）の概略図である。
【図２】図2は、本発明の方法で使用され、細胞内での物質注入装置の拡大概略図である。
【図３】図3は図2の細胞内に物質を注入する装置で、第1通路と第2通路の3次元構造（図3a）と、第1通路と第2通路が接続されている部分の拡大図（図3b）である。
【図４】図4は、本発明の方法に基づいて、細胞に物質を注入する過程を説明する図である。
【図５】図5は、本発明の細胞に物質を注入する方法で使用されたデバイスの20倍拡大顕微鏡写真である。
【図６】図6は、ガラス内部に形成させた本発明に使用される物質注入装置の外観写真である。
【図７】図7は、実施例2で、本発明の方法で人間肺胞の基底上皮細胞（ATCC CCL-185）に赤色蛍光タンパク質を注入する過程を撮影した蛍光顕微鏡（TE2000-U、Nikon）の写真である。
【図８】図8は、実施例3で、本発明の方法で使用してヒト臍帯血由来の幹細胞の赤色蛍光タンパク質を注入する過程の蛍光顕微鏡写真である。
【図９】図9は、実施例4で、本発明の方法でヒト胎盤由来幹細胞の赤色蛍光タンパク質を注入する過程の蛍光顕微鏡写真である。
【図１０】図10は、実施例5で、本発明の方法で人間肺胞の基底上皮細胞（ATCC CCL-185）にプラスミドDNA（cy3）を注入した後、12時間経過した後の写真である。
【図１１】図11は、実施例1で、本発明の方法に使用される装置を製作するために使用され、ガラス（23）の内部に3次元構造のマイクロチャネルとナノチャンネルを形成する、フェムト秒レーザー加工装置の分解斜視図である。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
以下、次の図面及び実施例を挙げて本発明の方法をより具体的に説明する。ただし、以下の図面及び実施例の説明は、本発明の具体的な実施形態を特定し、説明しようと意図するものであるだけであり、本発明の権利範囲をこれらに記載された内容に限定したり、制限解釈しようと意図するものではない。
【００４６】
（実施例1）
フェムト秒レーザーを使用して、ガラスの内部にマイクロチャネルとナノチャンネルを形成させて、本発明の方法に使用されるデバイスを製作するプロセス。
【００４７】
図11に示したフェムト秒レーザー（21）（Pharos、4W、190fs、frequency doubled 510nm、DPSS chirped pulse amplification laser system）のレーザーパルスを対物レンズ（22）（from 40×to 100×、NA from 0.5 - 1.3、 Olympus＆Zeizz）を介して単一のガラス素材（23）（borosilicate glass、Corning）の外側表面から内部まで焦点が形成されるようにした。ガラス素材は、3軸ナノ線形送り機構（100×100×100μm3、±1nm、MadCity Labs、Inc. Madison、WI）に設置して、レーザーの焦点に対して三次元的に動くようにした。
【００４８】
表面に形成されたレーザーの焦点がガラス素材の内部に入ると、フォーカスが通るパスでこのようにガラス素材が削除され、三次元構造が形成されるようにした。三次元構造物は、数値コードを生成して3軸ナノ線形送り機構を制御するようにし、CCDカメラ（24）を設置して監視した。構造物を加工する最小サイズは理論上10nmまで可能であり、本実施例では、約200nmの大きさに加工した。光学操作を介して処理されるチャンネルの内径は、これよりも大きくなることがあり、より小さくなることもあった。透明材料であるガラス素材の内部に三次元チャンネルを形成したので、すべての三次元形状のチャンネルを制限せずに形成させることができた。
【００４９】
（実施例2）
本発明の方法に基づいて、人間肺胞の基底上皮細胞に赤色蛍光タンパク質を注入する過程
赤色蛍光タンパク質（dsRed fluorescence protein、MBS5303720）を1mg/mlの濃度に希釈し（溶媒：PBS、Hyclone、SH30028.02、pH 7.4）、懸濁液を準備した。A549（ATCC CCL-185、human alveolar basal epithelial cells）細胞を10％FBS DMEM（high glucose）を使用してincubatorで継代培養（humidified 5％CO2、37℃）した。
【００５０】
T-flaskで培養された細胞をTrypLE（gibco）を利用して分離した。1 mM EDTA in D-PBS（gibco）solutionに交換した。Debris除去のために、40μmcellstrainer（BD）を用いて、フィルタをした後、Calcein-AMで37℃incubatorで15分間染色した。1mM EDTA in D-PBSで交換した後、血球計（hemocytometer）を利用して、2x106 cells/mlの濃度でA549細胞懸濁液を準備した。
【００５１】
A549細胞懸濁液と赤色蛍光タンパク質（RFP）の懸濁液を、それぞれ1ml注射器に入れた。それぞれの注射器は、シリコンチューブを介して細胞ロードのチャンネルと物質ローディングチャンネルの入口に接続し、注射器の操作を介してチャネルの内部に注入操作した。細胞および物質ローディングチャンネルの反対側の入り口には、PBSで満たされた1ml注射器をシリコンチューブを介して同様に接続して、物質注入構造物で細胞を選択的に置くことができるよう構成した。
【００５２】
細胞ローディングチャンネルの両端に接続された細胞懸濁液とPBSを含む1ml注射器を操作して、標的細胞を物質注入構造物の内部に押し込み後、物質注入ナノ通路と出会う中央に位置させた。
【００５３】
この後、物質ローディングチャンネルの両端に設置した電極印加装置にて電圧をかけ、物質注入通路に沿って1.76Vが形成されるようにして、3秒間の電圧をかけた。
【００５４】
オシロスコープ（VDS3102、Owon）を利用して電圧を測定した。蛍光顕微鏡（TE2000-U、Nikon）を介して細胞の位置を把握し、赤色蛍光タンパク質注入過程を撮影して、図7に示した。
【００５５】
（実施例3）
本発明の方法に基づいて、人間臍帯血由来の中間葉幹細胞の赤色蛍光タンパク質を注入する過程
赤色蛍光タンパク質（dsRed fluorescence protein、MBS5303720）を1mg/mlの濃度に希釈し（溶媒：PBS、Hyclone、SH30028.02、pH 7.4）して懸濁液を準備した。人間臍帯血由来の中間葉幹細胞は、毎分チャ病院で分譲受け構築した細胞株を使用した。培養培地は、MEM-alpha（Gibco）、10％FBS（Hyclone）、25ng/ml FGF-4（Peprotech）、1ug/ml Heparin（Sigma）を使用し、humidified 5％CO2、37℃incubatorで継代培養した。
【００５６】
T-flaskで培養された細胞をTrypLE（gibco）を利用して分離した。1mM EDTA in D-PBS（gibco）solutionに交換した。Debris除去のために、40μmcellstrainer（BD）を用いて、フィルタをした後、Calcein-AMで37℃incubatorで15分間染色した。1mM EDTA in D-PBSで交換した後、血球計（hemocytometer）を利用して、2x106 cells/mlの濃度で臍帯血由来の幹細胞懸濁液を準備した。
【００５７】
臍帯血由来の幹細胞懸濁液と赤色蛍光タンパク質懸濁液をそれぞれ1ml注射器に入れ、それぞれの注射器は、シリコンチューブを介して細胞ロードのチャンネルと物質ローディングチャンネルの入口に接続し、注射器の操作を介してチャネルの内部に注入操作した。
【００５８】
細胞および物質ローディングチャンネルの反対側の入り口には、PBSで満たされた1ml注射器をシリコンチューブを介して同様に接続して、物質注入構造物で細胞を選択的に置くことができるよう構成した。
【００５９】
細胞ローディングチャンネルの両端に接続された細胞懸濁液とPBSを含む1ml注射器を操作して、標的細胞を物質注入構造物の内部に押し込んだ後、物質注入ナノ通路と出会う中央に位置させた。
【００６０】
この後、物質ローディングチャンネルの両端に設置した電極印加装置にて電圧をかけ、物質注入通路に沿って電位差1.45Vが形成されるようにして、3秒間の電圧をかけた。オシロスコープ（VDS3102、Owon）を利用して電圧を測定した。蛍光顕微鏡（TE2000-U、Nikon）を介して細胞の位置を把握し、赤色蛍光タンパク質注入過程を撮影して図8に示した。
【００６１】
（実施例4）
本発明の方法に基づいて、人間の胎盤由来中間葉幹細胞の赤色蛍光タンパク質を注入する過程
赤色蛍光タンパク質（dsRed fluorescence protein、MBS5303720）を1mg/mlの濃度に希釈し（溶媒：PBS、Hyclone、SH30028.02、pH 7.4）して懸濁液を準備した。人間の胎盤由来中間葉幹細胞は、毎分チャ病院から分譲受け構築された細胞株を使用した。培養培地は、MEM-alpha（Gibco）、10％FBS（Hyclone）、25ng/ml FGF-4（Peprotech）、1ug/ml Heparin（Sigma）を使用し、humidified 5％CO2、37℃incubatorで継代培養した。
【００６２】
T-flaskで培養された細胞をTrypLE（gibco）を利用して分離した。1mM EDTA in D-PBS（gibco）solutionに交換した。Debris除去のために、40μmcellstrainer（BD）を用いて、フィルタをした後、Calcein-AMで37℃incubatorで15分間染色した。1mM EDTA in D-PBSで交換した後、血球計（hemocytometer）を利用して、2x106 cells/mlの濃度でヒト胎盤由来中間葉幹細胞懸濁液を準備した。
ヒト胎盤由来幹細胞懸濁液と赤色蛍光タンパク質懸濁液をそれぞれ1ml注射器に入れ、それぞれの注射器は、シリコンチューブを介して細胞ロードのチャンネルと物質ローディングチャンネルの入口に接続し、注射器の操作を介してチャネルの内部に注入操作した。
【００６３】
細胞および物質ローディングチャンネルの反対側の入り口には、PBSで満たされた1ml注射器をシリコンチューブを介して同様に接続して、物質注入構造物で細胞を選択的に置くことができるよう構成した。
【００６４】
細胞ローディングチャンネルの両端に接続された細胞懸濁液とPBSを含む1ml注射器を操作して、標的細胞を物質注入構造物の内部に押し込んだ後、物質注入ナノ通路と出会う中央に位置させた。
【００６５】
この後、物質ローディングチャンネルの両端に設置した電極印加装置にて電圧をかけ、物質注入通路に沿って0.87Vが形成されるようにして、5秒間の電圧をかけた。オシロスコープ（VDS3102、Owon）を利用して電圧を測定した。蛍光顕微鏡（TE2000-U、Nikon）を介して細胞の位置を把握し、赤色蛍光タンパク質注入過程を撮影して図9に示した。
【００６６】
（実施例5）
本発明の方法に基づいて、人間肺胞の基底上皮細胞にプラスミドDNA（cy3）を注入する過程
プラスミドDNA（MIR7904、Mirus）が10μg/20μl濃度で含有された溶液を準備した。人間肺胞の基底上皮細胞（A549、ATCC CCL-185、human alveolar basal epithelial cells）を10％FBS DMEM（high glucose）を使用してincubatorで継代培養（humidified 5％CO2、37℃）した。
【００６７】
T-flaskで培養された細胞をTrypLE（gibco）を利用して分離した。1mM EDTA in D-PBS（gibco）solutionに交換した。Debris除去のために、40μmcellstrainer（BD）を用いて、フィルタをした後、Calcein-AMで37℃incubatorで15分間染色した。1mM EDTA in D-PBSで交換した後、血球計（hemocytometer）を利用して、2x106 cells/mlの濃度でヒト肺胞の基底上皮細胞A549の懸濁液を準備した。
【００６８】
A549細胞懸濁液と赤色蛍光タンパク質懸濁液をそれぞれ1ml注射器に入れた、それぞれの注射器は、シリコンチューブを介して細胞ロードのチャンネルと物質ローディングチャンネルの入口に接続し、注射器の操作を介してチャネルの内部に注入操作した。
【００６９】
細胞および物質ローディングチャンネルの反対側の入り口には、PBSで満たされた1ml注射器をシリコンチューブを介して同様に接続して、物質注入構造物で細胞を選択的に置くことができるよう構成した。
【００７０】
細胞ローディングチャンネルの両端に接続された細胞懸濁液とPBSを含む1ml注射器を操作して、標的細胞を物質注入構造物の内部に押し込んだ後、物質注入ナノ通路と出会う中央に位置させた。
【００７１】
この後、物質ローディングチャンネルの両端に設置した電極印加装置にて電圧をかけ、物質注入通路に沿って1Vが形成されるようにして、2秒間の電圧をかけた。オシロスコープ（VDS3102、Owon）を利用して電圧を測定した。
【００７２】
Plasmid DNA注入後、細胞を回収し、96 Well Plateに注入し、200ulに該当する培養培地に添加した。バッジ添加後humidified 5％CO2、37℃incubatorで12時間培養した。以後蛍光顕微鏡（TE2000-U、Nikon）を介して赤蛍光反応を確認し、これにより、plasmid DNAが発現されたことを確認した（図10）。
【００７３】
図1には、1つの物質注入通路（第2通路）を有する細胞内での物質の注入装置（図1a）と6つの第2通路を含む（図1b）、細胞に物質をする注入するための本発明で使用される装置を示す。
【００７４】
図1aを見ると、物質を注入しようとする細胞（8）が物質注入通路である第1通路（4）を介して移動する。外部電源（20）によって物質（2）を注入する通路（第2通路）（2a）と、第1通路（4）の間に電位差が発生し、上記細胞（8）が第1通路の中間の狭くなった部分を通過する際に、上記の細胞にかかる電位差によって、第2通路（2a）の物質（2）が前記細胞（8）に注入される。このように物質が注入された細胞（11）は、第1通路の排出口（5）を介して回収される。
【００７５】
図1bには、6つの第2通路が形成された本発明に使用された物質注入装置を示した。図1bに示した本発明の装置を利用すれば、6つの物質を一度に細胞に注入することができる。
【００７６】
図1a及び図1bで第2通路と、第1通路との間にかかるそれぞれの電位差を調節することにより、注入する各物質の量を制御することができる。
（実施例3）
図2は、2つの第2通路を備えた本発明の方法に使用された物質注入装置の平面透視図である。図2に、細胞を含む溶液の流入と流出通路（4）、前記細胞に注入する物質の流入と流出通路（6、7）、物質が注入された細胞を回収する通路（5）、上記細胞を含む溶液の流入と流出通路（4）と、前記物質が注入された細胞を回収する通路（5）のそれぞれと両末端が接続されており、中間部分が狭い第1通路（1）前記第1通路（1）の中間部分で前記第1通路に接続された二つの第2通路（2,3）を示した。
【００７７】
細胞の一つが第1通路（1）の中間の狭くなった部分を通過するとき、前記第1通路の内壁と密着される。これらの細胞と第1通路（1）の内壁との密着によって第1通路（1）と第2通路（2,3）の間の電位差が弱まることが最小限に抑えられる。第1通路の中央部分を過ぎると再び広くなりながら物質が注入された細胞が排出される。
【００７８】
第2通路（2,3）の末端は、細胞に物質を注入する注射針と同じような役割をする。つまり、外部電源により第2通路（2,3）に集中している伝える第2通路（2,3）と隣接する細胞の細胞膜（または細胞壁）を穿孔するよう機能しながら、同時に物質を上記穿孔を介して細胞内部に浸透させる。
【００７９】
細胞を含む溶液の流入と流出通路（4）の圧力差（例えば、ポンプを使用）や電位差（外部電位差発生装置、例えば、直流電源または交流電源を使用）をかければ、細胞が第1通路（1）に流入される。第1通路（1）を通過しながら物質の注入が行われた細胞は、通路（5）を介して排出される。物質の流入と流出（6,7）通路には、細胞の内部に注入する物質が移動する。
【００８０】
図3は、図2に示した第1通路（1）と第2通路（2,3）を3次元的に描写した図である。図3bに示すように、第2通路（2,3）は、第1通路（1）と接続されている。
図4は、単一の細胞に2つの物質を同時に注入する過程を示している。第1通路の片側の入口に流入した細胞（8）は、第1通路の中間の狭くなった部分（9）で第2通路（10）を介して2つの物質を注入された後、第1通路の反対側流出口（11）を介して回収される。
【００８１】
図5は、本発明の方法に使用される細胞に物質を注入する装置の20倍の顕微鏡写真である。（外部の電位差印加装置は示されていない。）
図5の左側の写真は、細胞を含む溶液の流入と流出通路（5）、前記細胞内に注入する物質の流入と流出通路（6、7）、および物質が注入された細胞を回収する排出通路（4）が形成された写真である。
【００８２】
図5の右側の写真は、上記図5の左側の写真に示された、細胞を含む溶液の流入と流出通路（5）と、前記物質が注入された細胞を回収する通路（4）のそれぞれの両末端で接続されつつ、中間部分が狭い形態である第1通路（1）と、前記第1通路の中間部分で前記第1通路に接続され、物質の流入流出通路（6,7）と、それぞれ接続された二つの第2通路（2、3）が形成されている本発明に使用されたデバイスの20倍拡大写真である。
【００８３】
図6は、ガラス状の固体内部に形成された本発明の方法に使用された物質注入装置の外観写真である。
図7は、本発明の方法では、人間肺胞の基底上皮細胞（A549、ATCC CCL-185）に赤色蛍光タンパク質（red fluorescence protein、RFP）を注入する過程を撮影した写真である。A459細胞をカルセインAM（Calcein AM）で処理して緑色蛍光を発生させる場合、タンパク質が注入された細胞が生きていると評価した。
【００８４】
図7aは、生きている（緑色蛍光）A549細胞が第1通路の中央に位置することを示して、図7bは、第2通路と、第1通路との間に電位差を加えたときRFPが第2通路を介して移動し、前記A549細胞内部に注入が開始された様子（赤色蛍光）を示し、図7cはA549細胞内でRFPが注入されていることを明らかに示して（赤色蛍光）、図7dはRFPの注入後もA549細胞が生きていることを見せてくれ（緑色蛍光）、図7eおよび7fは、上記のプロセスを2回繰り返した場合でも、A549細胞内でRFPが正常に注入されたことを示す。
【００８５】
図8は、本発明の方法でヒト臍帯幹細胞内でRFPを注入した過程を撮影した写真である。カルセインAMを使用して、細胞が生存するかどうかを確認した。
図8aは緑色蛍光（14）を介して第1通路の中央に位置し、ヒト臍帯血の幹細胞が生きていることを示して、図8bは、赤色蛍光（15）を介してRFPが第2通路に入力されており、緑色蛍光を介してヒト臍帯血の幹細胞にRFP注入準備が整っていることを示しており、図8cは、第2通路の末端部分に、より明るい赤色蛍光（16）を介してRFPの注入のために電界をかけた後、RFPの注入が開始されたことを示して、図8dは赤色蛍光（17）を介してヒト臍帯幹細胞内でRFPが注入されたことを示し、図8eは赤色蛍光（18）を介してヒト臍帯幹細胞が第1通路の排出口に向かって移動したことを示して、図8fは赤色蛍光（19）を介してヒト臍帯幹細胞が第1通路から完全に排出されたことを示している。
【００８６】
図9は、本発明の方法で人間の胎盤由来中間葉幹細胞の赤色蛍光タンパク質を注入する過程を撮影した写真である。
図10は、本方法の方法で人間肺胞の基底上皮細胞（ATCC CCL-185）にプラスミドDNA（cy3）を注入して12時間培養した後に撮影した写真である。
【００８７】
図11は、本発明の方法に使用されたガラスの内部（23）に形成された装置を製作するために使用されたフェムト秒レーザー加工装置の分解斜視図である。
以上のように、実施例1〜5と、図1〜11を介して、本発明の方法を説明したが、これらはもっぱら説明をするためのもので、本発明の権利範囲をそれらだけに限定するものではない。
【００８８】
次の特許請求の範囲に示した本発明の権利範囲を逸脱しなくても、多くの変形と技術的特徴の組み合わせが可能であることを、この技術分野における通常の知識を有する者であれば容易に知ることができるだろう。しかし、そのような変形は、本発明の範囲外と見なされることができず、そのようなすべての変形は、以下の請求項の権利範囲に含まれることを意図するものである。
【図１（ａ）】
0006805152.tif 000002
【図１（ｂ）】
0006805152.tif 000003
【図２】
0006805152.tif 000004
【図３】
0006805152.tif 000005
【図４】
0006805152.tif 000006
【図５】
0006805152.tif 000007
【図６】
0006805152.tif 000008
【図７】
0006805152.tif 000009
【図８】
0006805152.tif 000010
【図９】
0006805152.tif 000011
【図１０】
0006805152.tif 000012
【図１１】
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