(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
進行した非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）と診断された患者の治療をするために使用される組成物であって、
前記組成物は、式（Ｉ）の化合物、前記式（Ｉ）の化合物の代謝産物、及び前記したものそれぞれの薬学的に許容される塩からなる群から選択された化合物を含み、
【化１】
0006672173.tif 000019
（式中、ｍは２から５の整数であり、ｎは３から８の整数であり、Ｘ１及びＸ２は、各々独立的に硫黄、酸素、スルフィニル基、又は、スルホニル基を示し、但し、Ｘ１及びＸ２は、同時に酸素ではない）
前記代謝産物は、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｈ部を含有するフェニル基に結合している前記式（Ｉ）の化合物の−ＣＯＣＨ３基が１−ヒドロキシエチル（−ＣＨ（ＯＨ）Ｍｅ）基に代謝された化合物であり、
前記治療は、進行したＮＡＳＨに罹患している患者における肝線維症を減少させるためのものである、組成物。
【請求項２】
前記進行したＮＡＳＨと診断された患者は、肝線維症、クモ状血管腫、腹水症、脾腫、丈夫な肝臓の境界、手掌紅斑、アステリクシス、又は、門脈圧亢進症のうちの１つ以上を示す、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記進行したＮＡＳＨと診断された患者は、肝臓の瘢痕化、肝硬変、又は、肝細胞癌（ＨＣＣ）のうちの１つ以上を示す、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記治療は前記進行したＮＡＳＨに罹患している患者における肝臓の瘢痕化を減少させるためのものである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記患者は、小児患者である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＡ）の化合物である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【化２】
0006672173.tif 000020
【請求項７】
前記化合物は、斜方晶系結晶形で存在する、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記式（Ｉ）の化合物の代謝産物は、式（ＩＢ）の化合物である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【化３】
0006672173.tif 000021
【請求項９】
前記化合物は、１つ以上の薬学的に許容される成分を有する治療組成物に形成される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記化合物が経口投与される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記化合物は、錠剤又はカプセルとして投与される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記化合物は、液体剤形として投与される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記化合物は、１００ｍｇ／日から４、０００ｍｇ／日の範囲の量を１回、２回、又は３回に分けて投与される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[関連出願の相互参照]
本出願は、２０１４年５月８日に出願された米国仮出願第６１／９９０，６０６号、２０１４年８月２６日に出願された米国仮出願第６２／０４２，０７２号、２０１４年９月１８日に出願された米国出願第１４／４９０，６１８号の優先権を主張し、その全体の内容は、本明細書に参照として含まれる。
【０００２】
本技術は、フェノキシアルキルカルボン酸、例えば、ＭＮ−００１及びＭＮ−００２を投与することによって、進行した非アルコール性脂肪性肝炎、これを引き起こす又はこれに起因する病態、及び／又はこれらそれぞれの否定的な影響を抑制又は治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
非アルコール性脂肪性肝炎又はＮＡＳＨは、一般的な肝臓疾患として、アルコール性肝臓疾患と似ているが、アルコールを少量飲むか又は全く飲まない人々の間で発生する疾患である。ＮＡＳＨの主要な特性は、炎症及び損傷に伴う肝臓における脂肪である。ＮＡＳＨは進行したＮＡＳＨになり、特に肝線維症を特徴とする。進行したＮＡＳＨ及び進行したＮＡＳＨを引き起こす又はこれに起因する病態は、全世界的に増加する問題として、全ての年齢の人々に影響を及ぼしている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示は、進行した非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）と診断された患者を治療する方法を提供し、前記方法は、式（Ｉ）の化合物、式（Ｉ）の化合物の代謝産物、式（Ｉ）の化合物のエステル、又は、式（Ｉ）の化合物のエステルの代謝産物、又は、前記したものそれぞれの薬学的に許容される塩の有効量を患者に投与することを含む。
【化１】
0006672173.tif 000002
【０００５】
（式中、ｍは２から５の整数であり、ｎは３から８の整数であり、Ｘ１及びＸ２は、各々独立的に硫黄、酸素、スルフィニル基（−Ｓ（Ｏ）−）、又は、スルホニル基（−Ｓ（Ｏ）２−）を示し、但し、Ｘ１及びＸ２は、同時に酸素ではない。）
【０００６】
特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＡ）である。
【化２】
0006672173.tif 000003
【０００７】
また別の実施形態において、前記式（Ｉ）の化合物の代謝産物は、式（ＩＢ）の化合物である。
【化３】
0006672173.tif 000004
【０００８】
好ましくは、前記化合物は、固体剤形、例えば、錠剤又はカプセルとして経口投与されてもよく、好ましくは、前記化合物は、斜方晶系結晶形で存在する。前記化合物は、液体剤形として投与されてもよい。前記化合物は約１００ｍｇ／日から約４，０００ｍｇ／日の範囲の量を１回、２回、又は３回に分けて投与され得る。
【０００９】
また別の実施形態において、進行したＮＡＳＨと診断された患者は、肝線維症、クモ状血管腫、腹水症（ａｓｃｉｔｅｓ）、脾腫、丈夫な肝臓の境界（ｈａｒｄ  ｌｉｖｅｒ  ｂｏｒｄｅｒ）、 手掌紅斑、アステリクシス、又は、門脈圧亢進症のうちの１つ以上を示す。患者は、また、肝臓の瘢痕化、肝硬変、又は、肝細胞癌（ＨＣＣ）のうちの１つ以上を示す。一部の例では、患者の肝線維症が減少する。また他の例では、患者の肝臓の瘢痕化が減少する。患者はまた、小児患者、青少年患者、又は成人患者であってもよい。
【００１０】
本開示は、進行したＮＡＳＨと診断された患者を治療する方法を提供し、前記方法は、式（ＩＡ）の化合物、式（ＩＡ）の化合物の代謝産物、式（ＩＡ）の化合物のエステル、又は、式（ＩＡ）の化合物のエステルの代謝産物、又は、前記したものそれぞれの薬学的に許容される塩の有効量を患者に投与することを含む。
【化４】
0006672173.tif 000005
【００１１】
進行したＮＡＳＨと診断された患者を治療するまた他の方法を提供し、前記方法は、式（ＩＢ）の化合物、式（ＩＢ）の化合物のエステル、又は、前記したものそれぞれの薬学的に許容される塩の有効量を患者に投与することを含む。
【化５】
0006672173.tif 000006
【００１２】
進行したＮＡＳＨと診断された患者を治療するまた他の方法を提供し、前記方法は、式（ＩＡ）の化合物、式（ＩＡ）の化合物の代謝産物、式（ＩＡ）の化合物のエステル、式（ＩＡ）の化合物のエステルの代謝産物、又は、前記したものそれぞれの薬学的に許容される塩の有効量を患者に投与することを含み、前記したものの各々は、斜方晶系結晶を含む固体剤形として提供される。
【化６】
0006672173.tif 000007
【００１３】
また別の形態において、本発明の方法は、進行したＮＡＳＨに罹患している患者、特に肝臓の瘢痕化を示す患者における肝硬変又は肝細胞癌（ＨＣＣ）の可能性を減らすことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】治療マウス及び未治療マウスのＨＥ染色された肝切片の顕微鏡写真を示す。
【図１Ｂ】治療マウス及び未治療マウスのＨＥ染色された肝切片の顕微鏡写真を示す。
【図２】治療マウス及び未治療マウスにおけるＮＡＦＬＤ活性点数（ＮＡＳ）をグラフに示す。
【図３】治療マウス及び未治療マウスにおける脂肪症点数をグラフに示す。
【図４】治療マウス及び未治療マウスにおける小葉の炎症点数をグラフに示す。
【図５】治療マウス及び未治療マウスにおける肝細胞の風船化点数をグラフに示す。
【図６Ａ】治療マウス及び未治療マウスのシリウス赤色染色された肝切片の顕微鏡写真を示す。
【図６Ｂ】治療マウス及び未治療マウスのシリウス赤色染色された肝切片の顕微鏡写真を示す。
【図７】治療マウス及び未治療マウスにおける線維症領域の比率をグラフに示す。
【図８】治療マウス及び未治療マウスにおける炎症領域をグラフに示す。
【図９Ａ】治療マウス及び未治療マウスのα−ＳＭＡ免疫染色された肝切片の顕微鏡写真を示す。
【図９Ｂ】治療マウス及び未治療マウスのα−ＳＭＡ免疫染色された肝切片の顕微鏡写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、様々な実施形態が記載される。特定の実施形態は、包括的な説明、又は本明細書で検討する広い側面に対する限定として意図されないことに留意されたい。特定の実施形態に関連して説明した一態様は、必ずしもその実施形態に限定されるものではなく、任意の他の実施形態を用いて実施することができる。
【００１６】
［定義］
本明細書及び特許請求の範囲で使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、特別に明確に指示されない限り複数の参照を含む。
【００１７】
患者に薬物を「投与すること」又は「投与」（及びこのような語句の文法上の等価物）とは、自己投与を含む直接的投与、及び薬物を処方する行為を含む間接的投与を含む。例えば、本明細書で使用されるように、医師が患者に薬物の自己投与を指示、及び／又は患者に薬物の処方箋を提供することが患者に薬物を投与することである。
【００１８】
「進行したＮＡＳＨ」は、クモ状血管腫、腹水症、脾腫、丈夫な肝臓の境界、手掌紅斑、アステリクシス、肝線維症及び肝細胞癌のような１つ以上の症状を引起こすＮＡＳＨの進行を意味する。進行したＮＡＳＨはまた、肝硬変及び肝不全のような症状、及び肝移植に関連する。
【００１９】
群の前にある「Ｃｘ」は、この群の炭素原子の数がＸであることを意味する。
【００２０】
「アルキル」は、１から１２個の炭素原子を有する一価の非環式ヒドロカルビル基を意味する。アルキルの非限定例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第三級ブチル、ペンチル、ヘキシルなどを含む。
【００２１】
「アリール」は、１０個以下の炭素原子を有する一価の芳香族ヒドロカルビル基を意味する。アリールの非限定例は、フェニル及びナフチルを含む。
【００２２】
「ヘテロアリール」は、芳香族環内で酸素、窒素、硫黄からなる群から選択された１から４個のヘテロ原子及び１から１０個の炭素原子の芳香族基を意味し、ヘテロアリールの窒素原子及び／又は硫黄原子は、任意に酸化される（例えば、Ｎ−酸化物、−Ｓ（Ｏ）−又は−Ｓ（０）２−）。このようなヘテロアリール基は、単環（例えば、ピリジル又はフリル）又は複数の縮合環（例えば、インドリジニル又はベンゾチエニル）を有することができ、縮合環は、芳香族であってもなくてもよく、及び／又は、ヘテロ原子を含んでも含まなくてもよく、但し芳香族ヘテロアリール基の原子を介して付着する。ヘテロアリールの非限定例は、ピリジル、ピロリル、インドリル、チオフェニル、及びフリルを含む。
【００２３】
「シクロアルキル」は、３から１２個の炭素原子を有する一価の非芳香族環状ヒドロカルビル基を意味する。シクロアルキルの非限定例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどを含む。
【００２４】
「ヘテロシクリル」は、環内に酸素、窒素、硫黄からなる群から選択される１から４個のヘテロ原子、及び１から１０個の炭素原子の一価の非芳香族環状基を指し、ヘテロアリールの窒素原子及び／又は硫黄原子は、任意に酸化される（例えば、Ｎ−酸化物、−Ｓ（Ｏ）−又は−Ｓ（０）２−）。このようなヘテロアリール基は、単環（例えば、ピペリジニル又はテトラヒドロフラニル）又は複数の縮合環を有することができ、縮合環は、芳香族であってもなくてもよく、及び／又はヘテロ原子を含んでも含まなくてもよく、但し非芳香族ヘテロシクリル基の原子を介して付着する。ヘテロシクリルの非限定例は、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニルなどを含む。
【００２５】
「アミノ」は、−ＮＨ２を意味する。
【００２６】
「アルキルアミノ」は、−ＮＨＲＢを意味し、ＲＢは、任意に１から３個のアリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、又はヘテロシクリル基で置換されるＣ１−Ｃ６アルキルである。
【００２７】
「ジアルキルアミノ」は、−Ｎ（ＲＢ）２を意味し、ＲＢは、上記のように定義される。
【００２８】
「含む」は、方法及び組成物が引用された要素を含むが、その他のものが排除されないことを意味する。方法及び組成物を定義するために使用される「本質的に〜からなる」は、記載された目的のための組合せに対して任意の本質的に重要なもの以外の要素が排除されることを意味する。従って、本質的に本明細書で定義される要素からなる組成物は、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、保存料などの薬学的に許容される担体、及び単離及び精製法からの微量混入物を除外しない。「からなる」は、その他の成分の微量元素（ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）及び本発明の組成物を投与するための実質的な方法の段階又は意図した結果を達成したり組成物を生成するための工程の段階以外のものが排除されることを意味する。このようなつなぎの用語及び語句の各々によって定義される実施形態は、本発明の範囲にある。
【００２９】
本明細書で使用する化合物の「有効量」は、本明細書に記載した治療される患者に投与される場合、患者内の医学疾患のうちの１つ以上の発現に対して意図した治療効果（例えば、緩和、改善、軽減、又は、除去）を有し得る量である。十分な治療効果が、必ず１つの投与量（又は投薬量）の投与によって発生するものでなく、一連の用量の投与後に発生することもあり得る。従って、有効量は、１回以上の投与量によって投与されてもよい。
【００３０】
「非アルコール性脂肪性肝炎」又はＮＡＳＨは、一般的な肝臓疾患として、アルコール性肝臓疾患と似ているが、アルコールを少量飲むか又は全く飲まない人々の間で発生する疾患である。ＮＡＳＨの主な特性は、炎症及び損傷に伴う肝臓における脂肪である。ＮＡＳＨは、肝臓が損傷して瘢痕化し、もはや適切に動作できない状態で肝硬変になり得る。ＮＡＳＨは、米国人口の２〜５％に影響を及ぼす。現在、ＮＡＳＨに対する特定の治療法は存在しない。アメリカ人の追加１０〜２０％は、肝臓に脂肪を有するが、実質的に肝臓の炎症又は損傷はなく、「非アルコール性脂肪肝疾患」（ＮＡＦＬＤ）と呼ばれる病態である。肝臓に脂肪を有することは正常ではないが、それ自体は、おそらく害や恒久的な損傷をほとんど引き起こすことはない。肝検査又は血液検査の結果に応じて脂肪が疑われる場合、この問題は、ＮＡＦＬＤと呼ばれる。この場合、肝生検を実施すると、一部の人々はＮＡＳＨを有し、他の人々はＮＡＦＬＤを有することを示す。
【００３１】
ＮＡＳＨは、通常、定期的な血液検査パネルに含まれている肝検査において、アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）又はアスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）の上昇を示す人で最初に疑われる。さらなる評価では、（例えば、薬、ウイルス性肝炎、又は、過剰なアルコール消費など）肝臓疾患の明確な理由が示されず、肝臓のＸ線又は画像診断によって脂肪が示された場合、ＮＡＳＨが疑われる。ＮＡＳＨは、肝生検によって診断され、ＮＡＦＬＤと区別される。肝生検のために、皮膚を介して針を挿入し、肝臓の小片を除去する。顕微鏡による組織検査において、肝細胞の炎症又は損傷と共に脂肪を示す場合、ＮＡＳＨと診断される。生検によって肝臓に発症する瘢痕組織に関する情報が提供され得る。
【００３２】
ＮＡＳＨが常にではないが徐々に悪化して、進行したＮＡＳＨが発症し、瘢痕化又は線維症が肝臓に現れて蓄積する原因となり得る。線維症が悪化すれば、肝硬変が発症する場合があり、肝臓がひどく瘢痕化して硬化し、正常に機能しなくなる。重度の瘢痕化又は肝硬変が存在する場合、進行を止めることのできる治療法はほとんどない。肝硬変を有する人は、体液貯留、筋消耗、腸からの出血及び肝不全が発生する可能性がある。肝移植は、肝不全を含む進行した肝硬変の唯一の治療法であり、進行したＮＡＳＨを有する人々に移植はますます行われている。例えば、ＮＡＳＨは、米国で肝硬変の主な原因の１つとしてＣ型肝炎及びアルコール性肝臓疾患と共にランクされている。
【００３３】
全体の罹患率及び死亡率は、一般的な集団に比べてＮＡＳＨ患者に有意に高く現れた。ＮＡＳＨ患者の最も一般的な死亡原因は、冠動脈疾患及び悪性腫瘍とそれに続く肝臓関連死亡率である。ＮＡＳＨにかかった児童は、一般集団の人々に比べて生存期間が有意に短い。
【００３４】
進行したＮＡＳＨにかかった患者のうち、１５％から２５％は、１０から２０年にわたり肝硬変及びその合併症に進行する。初期生検時に、ＮＡＳＨ患者の１／３は、進行した肝線維症を有する一方で、１０％から１５％は、よく安定した肝硬変を有する。原因不明肝硬変にかかった患者の大部分は、ＮＡＳＨに対する薬の効果がなくなることにより（ｂｕｒｎｅｄ−ｏｕｔ  ＮＡＳＨ）、脂肪症又は脂肪性肝炎の組織学的特性が無菌性肝硬変（ｂｌａｎｄ  ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）に置換えられるものと認識される。
【００３５】
肝硬変が現れると、慢性肝臓疾患の徴候、例えば、クモ状血管腫、腹水症、脾腫、丈夫な肝臓の境界、手掌紅斑、又は、アステリクシスが存在する可能性がある。患者は、黄疸又はかゆみを訴えたり、門脈圧亢進症（例えば、腹水症、静脈瘤出血、又は脳症（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ））の合併症を呈し得る。
【００３６】
進行したＮＡＳＨにおける肝硬変は、肝細胞癌（ＨＣＣ）の発症の危険因子である。２０年間のＮＡＳＨ患者で最大２．８％のＨＣＣの有病率が報告されている。日本人の患者のデータによれば、５年のＨＣＣの累積率は、１５％程と高いことがあると報告されている。進行したＮＡＳＨ関連の肝硬変は、肝移植の、増加する適応症である。
【００３７】
「薬学的に許容される」は、ヒト患者を含む患者への投与に適し、非毒性であることを意味する。
【００３８】
「薬学的に許容される塩」は、患者への投与に適し、非毒性である塩を意味する。非限定例は、アルカリ金属、アルカリ土類金属、及び様々な第１、第２、第３アンモニウム塩を含む。式（Ｉ）の化合物のエステルがカチオン性の部分を含む場合、例えば、エステルがアミノ酸エステルを含む場合、その塩は、様々なカルボン酸、スルホン酸、及び鉱酸塩を含んでもよい。塩の特定の非限定例は、ナトリウム塩、カリウム塩、及びカルシウム塩を含む。
【００３９】
「保護基」は、周知の官能基を指し、官能基に結合すれば、化合物のその他の部分で実行される反応及び対応する反応条件で不活性の保護された官能基が得られ、脱保護条件下で反応させて固有の官能基を再生できることを意味する。保護基は、分子の残りと適合するように選択される。「カルボン酸保護基」は、これらの合成中にフェノキシアルキルカルボン酸のカルボン酸官能基を保護する。カルボン酸保護基の非限定例は、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル、ｐ−ニトロベンジル、アリル、ベンズヒドリル、及びトリチルを含む。カルボン酸保護基の追加の例は、Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis., 2d Ed., 1991, John Wiley & Sons, and McOmie Protective Groups in Organic Chemistry, 1975, Plenum Press のような標準リファレンス作業で発見された。本明細書に開示されたカルボン酸を保護して脱保護するための方法は、当技術分野、特に上記のGreene and Wutsで発見され、本明細書に参照として引用される。
【００４０】
医学疾患又は患者を「治療すること」は、臨床結果を含む有益な又は所望の結果を得るための措置を取ることを意味する。本発明の様々な態様及び実施形態の目的において、有益な又は望ましい臨床結果は、進行したＮＡＳＨの１つ以上の症状又はその負の影響の減少、緩和又は改善、１つ以上の臨床的な結果の改善、進行したＮＡＳＨの程度の減少、進行したＮＡＳＨ進行の遅延又は減速、線維症の状態の改善、軽減、又は、安定化、及び本明細書に記載したその他の有益な結果が挙げられるが、それらに限定されない。
【００４１】
式（Ｉ）の化合物、又は、その代謝産物、又は、式（Ｉ）の化合物のエステル、又は、その代謝産物、又は、それらのそれぞれの薬学的に許容される塩の有効量を投与する方法が提供され、変数は本明細書で定義される。
【化７】
0006672173.tif 000008
【００４２】
本明細書で使用する「その代謝産物」は、式（Ｉ）の化合物と実質的に同様の治療活性を示す代謝産物を意味する。このような代謝産物の非限定例は、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｈ部を含有するフェニル基に結合している式（Ｉ）の化合物の−ＣＯＣＨ３基が１−ヒドロキシエチル（−ＣＨ（ＯＨ）Ｍｅ）基に代謝される化合物を含む。
【００４３】
このような１−ヒドロキシエチル基を含有する代謝産物は、１−ヒドロキシエチル基の１位置に非対称中心を含む。ラセミ混合物を含む対応する鏡像異性体及び混合物は、本明細書で使用する式（Ｉ）の化合物の代謝産物内に含まれる。
【００４４】
本明細書で使用される「そのエステル」は、式（Ｉ）の化合物に表示されるカルボン酸のエステル及び／又はフェノール性水酸基のエステル、及び式（Ｉ）の化合物の代謝産物の１−ヒドロキシエチル基（脂肪族ヒドロキシ基）のエステルを意味する。フェノール性及び／又は脂肪族ヒドロキシ基のエステルは、制限なく対応する酸としてカルボン酸ＲＡ−ＣＯ２Ｈを含んでもよく、ＲＡは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３−Ｃ１２シクロアルキル、又は、Ｃ２−Ｃ８ヘテロシクリルであり、アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、又はヘテロシクリルは、任意に１から４つのＣ１−Ｃ３アルキル、アリール、ＣＯ２Ｈ、アミノ、アルキルアミノ、又は、ジアルキルアミノ基で置換される。また、１価、２価、又は３価のリン酸のようなその他の酸が考慮される。カルボン酸のエステルは、対応するアルコールとして制限なしに式ＲＡ−ＯＨの化合物を含んでもよく、ＲＡは上記のように定義される。一実施形態において、式（Ｉ）のカルボン酸だけがエステル化される。また別の実施形態において、式（Ｉ）のフェノール性水酸基だけがエステル化される。また別の実施形態において、ＲＡは、Ｃ１−Ｃ４アルキルである。当業者には明らかなように、このようなエステルは、式（Ｉ）の化合物又はその塩を放出するために生体内で加水分解されるプロドラッグとして作用する。
【００４５】
一実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＡ）の化合物である。
【化８】
0006672173.tif 000009
【００４６】
また別の実施形態において、式（Ｉ）及び（ＩＡ）の化合物の代謝産物は、式（ＩＢ）の化合物である。
【化９】
0006672173.tif 000010
【００４７】
また別の実施形態において、化合物が経口投与される。また別の実施形態において、化合物が錠剤又はカプセル剤として投与される。別の実施形態において、式（ＩＡ）の化合物がその他の多形体を実質的に含まない多形体Ａで存在する。また別の実施形態において、化合物は、液体剤形として投与される。また別の実施形態において、化合物は、約１００から約４，０００ｍｇ／日の範囲の量を１回、２回、又は３回に分けて投与される。
【００４８】
本明細書で使用する化合物の効能は、例えば、進行したＮＡＳＨ及び関連する肝臓病のストレプトゾシン誘発モデルにおいて、当業者に周知の方法によって試験することができる。
【００４９】
［合成］
式（Ｉ）の化合物の合成及び特定の生物学的活性は、本明細書に参照として含まれる米国特許第４，９８５，５８５号に記載されている。例えば、式（ＩＡ）の化合物は、式（ＩＩ）のフェノールを式（ＩＩＩ）の化合物と反応させて式（ＩＣ）の化合物を提供することによって製造される。
【化１０】
0006672173.tif 000011
（Ｒは、カルボン酸保護基である）
【化１１】
0006672173.tif 000012
【化１２】
0006672173.tif 000013
【００５０】
酸保護基又はＲ基の非限定例は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、ベンジル、ベンズヒドリル及びトリチルを含み、ベンジル、ベンズヒドリル、又は、トリチル基は、任意に１から６つのＣ１−Ｃ６アルキル、ハロ、及び／又はＣ１−Ｃ６アルコキシ基で置換される。式（ＩＩＩ）のブロモ基以外の脱離基を使用できることは当業者に明らかであろう。このような他の脱離基の非限定例は、クロロ又はトシラートを含む。
【００５１】
式（ＩＣ）の保護されたカルボン酸を脱保護すると、式（ＩＡ）の化合物が提供される。本開示の内容に基づいて明らかなように、式（ＩＣ）の化合物は、一部の実施形態では、本発明に従って有用である。脱保護方法の非限定例は、Ｐｄ／Ｃ又はＰｔ／Ｃのような触媒及びＨ２下でのアルカリ加水分解及び水素化分解を含む。
【００５２】
反応は、不活性有機溶媒で実行され、不活性有機溶媒は、例えば、制限なくアセトン、メチルエチルケトン、ジエチルケトン、又は、ジメチルホルムアミドを含む。求核置換反応は、無機塩基、例えば、炭酸カリウム、又は、炭酸ナトリウム、任意にヨウ化カリウムの存在下で室温未満の温度で溶媒の還流温度まで実行されてもよい。反応は、薄層クロマトグラフィー及び１Ｈ−ＮＭＲのような周知の方法によって決定されるような、実質的な生成物を提供するのに十分な時間で実施される。本明細書で使用されるその他の化合物は、出発物質の適切な置換時に本明細書に記載した手続に従って及び／又は当業者に周知の方法に従って製造される。米国特許第５，２９０，８１２号参照（本明細書に参照として含まれる）
【００５３】
式（ＩＡ）の化合物は、必須的に純粋な斜方晶系多形体（Ａ型結晶という）を提供するための制御された条件下で再結晶される（例えば、９０％以上、好ましくは少なくとも９５％のＡ型）。多形体Ａ型及びその製造工程は、米国特許第７，０６０，８５４号、及び同第７，０６４，１４６号に記載されており、本明細書に全体参照として含まれる。式（Ｉ）の化合物の全ての多形体形態は活性であるが、多形体Ａ型が好ましい。特定条件下では、このような多形体の溶解度及び生体利用率は、その他の多形体に比べて優れており、Ａ型は、改善された固体製剤又は固体剤形を提供してもよい。
【００５４】
黄色から橙色の溶液を提供するために、２５℃から４０℃でエタノール５から１０重量部中に式（ＩＡ）の化合物を溶解させることにより、Ａ型結晶を得ることができる。エタノール溶液に１から１０部の水を注入して、２０℃から２５℃で約１５から６０分間撹拌した後、５℃から１０℃でさらに１から４時間、好ましくは２．０から３．０時間撹拌して灰白色懸濁液が得られる。この懸濁液に５から１５部の水を添加して、混合物を５℃から１０℃で追加の１から４時間、好ましくは１．５から２．０時間撹拌する。固体の、白色から灰白色の生成物は、真空濾過によって分離して濾過ケーキを水で洗浄して２５℃から４０℃で１２から２４時間真空乾燥する。
【００５５】
鏡像異性体形態で存在する本明細書で使用される化合物、例えば、式（Ｉ）の化合物の特定の代謝産物（例えば、式ＩＢの化合物）に関して、２つの鏡像異性体を光学的に分解することができる。このような分解は、例えば、制限なく（Ｓ）−（−）−ｌ−（ｌ−ナフチル）エチルアミンのような塩基と対応するカルボン酸化合物のジアステレオマー塩を形成したり、キラルカラムクロマトグラフィーを使用して鏡像異性体を分離することによって実行される。鏡像異性体形態で存在するこのような化合物に対する中間体は、同様に分解することができる。
【００５６】
［投与及び製剤］
本明細書で使用する化合物は、経口、又は静脈内、筋肉内、及び皮下注射又は経皮的方法によって投与することができる。効果的な投与量レベルは、例えば、１日あたり約１００から約４０００ｍｇで多様に変化してもよい。一実施形態では、１日投与量範囲は、２５０から２，０００ｍｇであり、１回、２回、又は３回に分けて提供される。一実施形態では、１日投与量の範囲は、１００から５００ｍｇであり、例えば、１００、２００、３００、４００、又は５００ｍｇであり、１回、２回、又は３回に分けて提供される。一実施形態では、１日投与量範囲は、２５０から２，０００ｍｇであり、例えば、２５０、５００、７５０、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、又は２，０００ｍｇであり、１回、２回、又は３回に分けて提供される。一実施形態では、１日投与量範囲は、１０００から４，０００ｍｇであり、例えば、１，０００、２，０００、３，０００、又は４，０００ｍｇであり、１回、２回、又は３回に分けて提供される。また別の実施形態において、投与量は、１０００ｍｇで１日２回提供される。その別の実施形態において、適切な投与量は、１０００ｍｇ  ｑｄ、１０００ｍｇ  ｂｉｄ、及び７５０ｍｇ  ｔｉｄを含む。
【００５７】
実際の量は、治療される患者の環境により異なり得る。当業者が認識するように、活性物質の作用を変更する様々な因子は、治療する医師によって考慮され、例えば、年齢、体重、性別、食事療法、及び患者の状態、投与時期、投与速度、及び投与経路である。所定の条件に対する最適な投与量は、従来の投与量決定試験を用いて当業者によって認知されてもよい。
【００５８】
本明細書で使用される化合物は、液体、粉末、クリーム、乳剤、丸剤、トローチ（ｔｒｏｃｈｅ）、坐薬、懸濁液、溶液などを含む、任意の薬学的に許容される形態で形成されてもよい。本明細書で使用されるこのような化合物を含有する治療組成物は、既知の確立された実施に従って一般的に１つ以上の薬学的に許容される成分で形成される。一般に、錠剤（ｔａｂｌｅｔ）は、担体（例えば、改質デンプン）を、単独で又はカルボキシメチルセルロース（商品名：Ａｖｉｃｅｌ）と共に、例えば、約１０重量％用いて形成される。製剤は、錠剤成形工程で１，０００から３，０００ポンドの圧力で圧縮される。錠剤は、好ましくは約１．５から８．０ｋｐ／ｃｍ２、好ましくは５．０から７．５ｋｐ／ｃｍ２の平均硬度を示す。分解時間は、約３０秒から約１５又は２０分まで変化する。
【００５９】
経口用製剤は、本明細書で使用される治療活性がある化合物が不活性固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、又はカオリンと混合した硬ゼラチンカプセルとして提供されたり、前記化合物が油性媒体、例えば、液体パラフィン又はオリーブ油と混合した軟ゼラチンカプセルとして提供されてもよい。適切な担体は、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、ココアバターなどを含む。
【００６０】
本明細書で使用する化合物は、水性懸濁液として、薬学的に許容される賦形剤、例えば、懸濁剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガントゴム、及びアカシアゴム；分散又は湿潤製剤、例えば、天然発生リン脂質、例えば、レシチン又は脂肪酸とアルカリ性酸化物の縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンステアレート、又は、長鎖脂肪族アルコールとエチレン酸化物の縮合生成物、例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、又は、脂肪酸及びヘキシトールに由来する部分エステルとエチレン酸化物の縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート又は脂肪酸及びヘキシトール無水物に由来する部分エステルとエチレン酸化物の縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートと混合して製造されてもよい。このような水性懸濁液は、１つ以上の保存剤、例えば、エチル−又はｎ−プロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート、１つ以上の着色剤、１つ以上の香味剤、及び１つ以上の甘味剤、例えば、グリセロール、ソルビトール、スクロース、サッカリン又はナトリウム又はカルシウムシクラメートを含んでもよい。
【００６１】
適切な製剤は、米国特許第４，７８８，０５５号、同第４，８１６，２６４号、同第４，８２８，８３６号、同第４，８３４，９６５号、同第４，８３４，９８５号、同第４，９９６，０４７号、同第５，０７１，６４６号、及び同第５，１３３，９７４号に記載された徐放性剤形を含み、本明細書に参照として含まれる。
【００６２】
経口投与に適切なその他の形態は、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤（ｅｌｉｘｉｒ）、水性溶液を含む液状製剤、又は使用する直前に液状製剤に変換される固体製剤を含む。乳剤は、溶液、例えば、水性プロピレングリコール溶液で製造されるか、乳化剤、例えば、レシチン、ソルビタンモノオレエート又はアカシアを含有してもよい。水性溶液は、活性成分を水に溶解して適切な着色剤、香味剤、安定剤、及び増粘剤を添加して製造されてもよい。固体製剤は、活性成分と共に、着色剤、香味剤、安定剤、緩衝剤、人工及び天然甘味剤、分散剤、増粘剤、可溶化剤などを含有してもよい。
【００６３】
本明細書で使用する化合物は、非経口投与（例、注射、例えば、ボーラス注入又は持続注入）のために製造され、アンプル、プレフィルドシリンジ（ｐｒｅ−ｆｉｌｌｅｄ  ｓｙｒｉｎｇｅ）、小容量注入において、単位剤形又は追加された保存剤を含む複数用量容器で提供されてもよい。組成物は、油性又は水性ビークル中の懸濁液、溶液、又は乳剤、例えば、ポリエチレングリコール水溶液中の溶液のような形態であってもよい。油性又は非水性の担体、希釈剤、溶媒又はビークルの例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物性オイル（例えば、オリーブ油）及び注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）を含み、形成製剤、例えば、保存剤、湿潤剤、乳化剤、又は懸濁剤、安定剤及び／又は分散剤を含有してもよい。また、活性成分は、滅菌固体の無菌分離、又は適切なビークルと使用する前に構成する溶液、例えば、発熱物質を含まない滅菌水から凍結乾燥によって得られた粉末形態であってもよい。
【００６４】
本明細書で使用する化合物は、経鼻投与用に製造されてもよい。溶液又は懸濁液が、従来の手段、例えば、点滴器（ｄｒｏｐｐｅｒ）、ピペット、又は、スプレーによって鼻腔に直接適用される。製剤は、単回又は複数回投与の形態で提供されてもよい。患者は、点滴器又はピペットを介して溶液又は懸濁液の適切な所定量を投与してもよい。スプレーは、例えば、計量された霧化式スプレーポンプによって投与されてもよい。
【００６５】
本明細書で使用する化合物は、経鼻投与を含む、特に気道へのエアゾール投与のために製造されてもよい。化合物は、例えば、約５ミクロン以下の小さい粒子サイズを有する。このような粒子サイズは、当技術分野で周知の手段、例えば、微細化によって得ることができる。活性成分は、適切な推進剤、例えば、クロロフルオロカーボン（ＣＦＣ）（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、又は、ジクロロテトラフルオロエタン）、二酸化炭素又はその他の適切な気体で加圧パック内に提供される。エアゾールは、レシチンのような界面活性剤を含有してもよい。薬物の投与量は、計量バルブによって調節されてもよい。また、活性成分は、乾燥粉末、例えば、適切な粉末ベース、例えば、ラクトース、デンプン、デンプン誘導体、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びポリビニールピロリジン中の前記化合物の粉末混合物の形態で提供されてもよい。粉末担体は、鼻腔内にゲルを形成する。粉末組成物は、例えば、粉末が吸引器によって投与されることができるゼラチン又はブリスターパックのカプセル又はカートリッジ内で単位剤形で提供されてもよい。
【００６６】
本明細書で使用される化合物は、軟膏、クリーム又はローション、又は、経皮性パッチとして表皮に局所投与するために製造されてもよい。軟膏及びクリームは、例えば、水性又は油性ベースで製造され、適切な増粘剤及び／又はゲル化剤が添加される。ローションは、水性又は油性ベースで製造されてもよく、一般的に１つ以上の乳化剤、安定剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、又は、着色剤を含有する。口内へ局所投与するのに適切な製剤は、通常はスクロース及びアカシア又はトラガントである香味付けされた基剤に活性剤を含むロゼンジ（ｌｏｚｅｎｇｅ）；ゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアカシアなどの不活性基剤に活性成分を含むパステル剤（ｐａｓｔｉｌｌｅ）；及び適切な液体担体内に活性成分を含む洗口剤（ｍｏｕｔｈｗａｓｈｅｓ）を含む。
【００６７】
本明細書で使用する化合物は、坐薬として投与するために製造されてもよい。このような製剤において、低融点ワックス、例えば、脂肪酸グリセリド又はココアバターの混合物がまず溶解し、活性成分が、例えば、撹拌によって均一に分散する。溶解した均一な混合物が便利なサイズのモールドに注入された後に冷却されて固体化する。
【００６８】
本明細書で使用する化合物は、膣内投与用に製造されてもよい。活性成分と共に担体を含む腟坐剤、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム、又はスプレーが当該分野で適切であることが知られている。
【００６９】
必要に応じて、製剤は、活性成分の持続放出投与又は制御放出投与のために変形された腸溶コーティングによって製造されてもよい。本発明の目的のために使用することができる一般的な形態の制御放出形態は、不活性コア、例えば、シュガースフィア（ｓｕｇａｒ  ｓｐｈｅｒｅ）、内部の薬物含有第２層がコーティングされた第１層、及び内層から薬物放出を調節するための第３層又は外部の膜を含む。
【００７０】
コアは、水溶性又は膨張性物質であることが好ましく、従来コアとして使用されている任意の物質又はビーズ又はペレットへと製造された任意の他の薬学的に許容される水溶性又は水膨潤性物質であってもよい。コアは、スクロース／デンプン（Ｓｕｇａｒ  Ｓｐｈｅｒｅｓ  ＮＦ）、スクロース結晶などの物質の球体、又は、一般的に賦形剤、例えば、微結晶性セルロース及びラクトースで構成された、圧出して乾燥した球体であってもよい。
【００７１】
第１層内で実質的に水不溶性物質は、一般的に（溶媒内に分散又は溶解した）「ＧＩ不溶性」又は「ＧＩ部分的に不溶性」フィルム形成ポリマーである。例としては、エチルセルロース、酢酸セルロース、酢酸セルロース酪酸塩、ポリメタクリレート、例えば、エチルアクリレート／メチルメタクリレート共重合体（Ｅｕｄｒａｇｉｔ  ＮＥ−３０−Ｄ）及びアンモニオメタクリレート共重合体タイプＡ及びＢ（Ｅｕｄｒａｇｉｔ  ＲＬ３０Ｄ及びＲＳ３０Ｄ）、及びシリコーンエラストマが列挙されてもよい。通常、ポリマーと共に可塑剤が使用される。例示の可塑剤は、セバシン酸ジブチル、プロピレングリコール、クエン酸トリエチル、クエン酸トリブチル、ヒマシ油、アセチル化モノグリセリド、アセチルクエン酸トリエチル、アセチルクエン酸ブチル、フタル酸ジエチル、フタル酸ジブチル、トリアセチン、椰子油（中鎖脂肪酸）を含む。
【００７２】
活性成分を含有する第２層は、結合剤としてポリマーを含む又は含まない活性成分（薬物）で構成されてもよい。結合剤が使用される場合、結合剤は、通常は親水性であるが、水溶性又は水不溶性であってもよい。活性薬物を含有する第２層で使用される例示のポリマーは、親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン、ポリアルキレングリコール、例えば、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ポリビニルアルコール、デンプン及びその誘導体、セルロース誘導体、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、カルボキシメチルヒドロキシエチルセルロース、アクリル酸ポリマー、ポリメタクリレート、又は、任意のその他の薬学的に許容されるポリマーを含む。第２層内の薬物対親水性ポリマーの比は、通常は１：１００から１００：１（ｗ／ｗ）の範囲である。
【００７３】
薬物放出を制御するための、第３層又は膜で使用するのに適したポリマーは、水不溶性ポリマー又はｐＨ依存性溶解度を有するポリマー、例えば、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、酢酸セルロースフタレート、トリメリト酸酢酸セルロース、ポリメタクリレート、又は、これらの混合物から選択されることができ、任意に可塑剤（例えば、上述したもの）と結合される。
【００７４】
任意に、制御された放出層は、制御された放出層の浸透性及び放出速度を調節するために、前記ポリマーと共に異なる溶解性を有するまた他の物質を含む。例えば、エチルセルロースと共に改質剤として使用することができる例示のポリマーは、ＨＰＭＣ、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール、ｐＨ依存溶解性を有するポリマー、例えば、酢酸セルロースフタレート又はアンモニオメタクリレート共重合体及びメタクリル酸共重合体又はこれらの混合物を含む。添加剤、例えば、スクロース、ラクトース、及び薬学的等級界面活性剤は、必要に応じて制御された放出層内に含まれてもよい。
【００７５】
また、単位剤形の製剤が本明細書に提供される。このような形態で、製剤は、活性成分（例えば、限定されないが、式（Ｉ）の化合物又はそのエステル、又は、それらそれぞれの塩）の適量を含有する単位投与量に再分割される。単位剤形は、パッケージ化された製剤であってもよく、製剤の別個の量を含有するパッケージは、例えば、バイアル又はアンプル内にパッケージ化された錠剤、カプセル及び粉末であってもよい。また、単位剤形は、カプセル、錠剤、カシェ剤（ｃａｃｈｅｔ）又はトローチ剤であってもよく、パッケージ化された形態内のこれらのいずれか１つの適切な数であってもよい。
【００７６】
その他の適切な薬学的担体及びこれらの製剤は、Remington:The Science and Practice of Pharmacy 1995, edited by E.W.Martin, Mack Publishing Company, 19th edition, Easton, Paに記載されている。
【００７７】
このようにして一般的に記載された本発明は、次の実施形態を参照してさらに容易に理解され、これは、説明するために提供されるものであり、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００７８】
実施形態及び本明細書中のその他の部分で次の略語が実施形態で使用される。
ＣＣＲ：ＣＣケモカイン受容体
ＨＥ：ヘマトキシリン・エオジン
ＨＦＤ：高脂肪食
ＭＣＰ：単球走化性タンパク質
ＭＭＬＶ−ＲＴ：モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素
ＮＡＦＬＤ：非アルコール性脂肪肝疾患
ＮＡＳ：ＮＡＦＬＤ活性点数
ＮＡＳＨ：非アルコール性脂肪性肝炎
ＳＤ：標準偏差
ＳＭＡ：平滑筋アクチン
ＳＰＦ：特定の病原体を含まない
ＳＴＡＭ：ステリック動物モデル（Ｓｔｅｌｉｃ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌ）
ＳＴＺ：ストレプトゾトシン
ＴＩＭＰ：メタロプロテイナーゼの組織阻害剤
ＦＬＡＰ：５−リポキシゲナーゼ活性化タンパク質
ＬＴＣ４：ロイコトリエンＣ４
【００７９】
［実施例１］進行したＮＡＳＨの治療
病原菌がない１５日妊娠したＣ５７ＢＬ／６マウスは、日本エスエルシー社から購入する。雄マウスには、生後にＳＴＺ（シグマ社（Ｓｉｇｍａ）、米国）を単回皮下注射して、生後４週（２８±２日）後に高脂肪食（ＨＦＤ；日本クレア社、日本）を自由に摂食させて、ＮＡＳＨが形成される。生後８週（６３±２日）のマウスを、治療開始前日に１０匹の６群にランダム抽出する。個々の体重は、治療期間中に毎日測定し、マウスの生存率、臨床徴候、及び挙動は、毎日監視する。
次の試験群が使用される
【００８０】
群ｌ（正常）：１０匹の正常マウスは、任意の治療をせずに生後１２週まで通常の食餌を自由に摂取させる。
群２（ビークル）：１０匹のＮＡＳＨマウスは、生後８週から１２週までビークル（０．３％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ））を１０ｍＬ／ｋｇの体積で１日１回経口投与する。
群３（ＭＮ−００１−低投与量）：１０匹のＮＡＳＨマウスは、生後８から１２週にＭＮ−００１を補充したビークルを１０ｍｇ／ｋｇの投与量で１日１回経口投与する。
群４（ＭＮ−００１−中投与量）：１０匹のＮＡＳＨマウスは、生後８から１２週にＭＮ−００１を補充したビークルを３０ｍｇ／ｋｇの投与量で１日１回経口投与する。
群５（ＭＮ−００１−高投与量）：１０匹のＮＡＳＨマウスは、生後８から１２週にＭＮ−００１を補充したビークルを１００ｍｇ／ｋｇの投与量で１日１回経口投与する。
群６（テルミサルタン）：１０匹のＮＡＳＨマウスは、生後８から１２週にテルミサルタンを補充した純水を１０ｍｇ／ｋｇの投与量で１日１回経口投与する。
【００８１】
次の分析のために、全ての群のマウスは、生後１２週に犠牲になる。個々の肝重量を測定して、肝臓対体重比が算出される。肝臓のヒドロキシプロリンは、加水分解法によって定量化される。（ＮＡＦＬＤ活性点数の評価のための）ＨＥ染色、（線維症領域の比率評価のための）シリウス赤色染色、（炎症領域の比率評価のための）Ｆ４／８０免疫染色、（α−ＳＭＡ陽性領域の比率評価のための）α−ＳＭＡ免疫染色の肝切片の病理組織学的分析を（一般的な方法に従って）行う。肝臓リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析から全体ＲＮＡを用いる遺伝子発現分析は、ＴＩＭＰ−１に対して実行され、コラーゲン１型、α−ＳＭＡ、５−リポキシゲナーゼ、ＦＬＡＰ、及びＬＴＣ４シンターゼも実行される。統計的試験は、ボンフェローニ多重比較試験（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  Ｔｅｓｔ）を用いて行う。Ｐ値が０．０５未満であれば、統計的に有意とみなされる。
【００８２】
［実施例２］人間の進行したＮＡＳＨの治療
進行した非アルコール性脂肪性肝炎に関連する症状を有する成人２５０人は、最大６ヶ月の間５００ｍｇの１日投与量でＭＮ−００１又はＭＮ−００２又は偽薬を、各々ランダムに投与する。一次結果は、非アルコール性脂肪性肝炎の組織学的特性の改善であり、これは、脂肪症、小葉の炎症、肝細胞の風船化、肝硬変、及び線維症のうち１つ以上の標準化点数の合成を用いて評価される。結果は、当業者に周知の方法によって分析される。
【００８３】
［実施例３］進行した非アルコール性脂肪性肝炎のＳＴＡＭモデルでＭＮ−００１の治療に有益な効果
ＳＴＡＭ（商標）は、進行した非アルコール性脂肪性肝炎（進行したＮＡＳＨ）、その徴候及び関連する肝臓障害の有用なモデルであり、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの化学的介入及び食事介入の組み合せによって形成される。実施例３において、ＮＡＳＨを誘導した後、進行した段階に到達し、マウスは８〜１２週で治療された。テルミサルタンは、ＳＴＡＭマウスにおいて抗ＮＡＳＨ、抗線維症及び抗炎症効果を有すことが示され、従って本試験で陽性対照群として用いられた。この試験によると、以下に記載されるように、テルミサルタン治療は、報告されたデータと一致するビークル群と比較して肝重量、ＮＡＳ、線維症領域及び炎症領域を有意に減少させ、本発明で使用される化合物の有用性を立証するために、本明細書で用いられたＳＴＡＭマウスモデルに対する有用性の証拠を提供した。
【００８４】
ＭＮ−００１の高投与量及び中投与量の治療は、ＮＡＦＬＤ活性点数（ＮＡＳ）を有意に減少させた。ＮＡＳの改善は、小葉の炎症及び肝臓の風船化の減少に起因するものであった。特に、ＮＭ−００１の高投与量及び中投与量は、風船化点数を有意に減少させた。このような結果は、例えば、限定されないが、肝臓の損傷及び風船化を抑制することによって、ＭＮ−００１が進行したＮＡＳＨの病状を改善できることを立証する。このように、ＭＮ−００１は、進行したＮＡＳＨの病期で抗ＮＡＳＨ及び抗線維症効果を示した。
【００８５】
［材料及び方法］
［試験物質］
投与溶液を準備するために、ＭＮ−００１を計量し、０．３％ＣＭＣ（ビークル）に溶解した。テルミサルタン（ＭＩＣＡＲＤＩＳ（登録商標））は、ベーリンガーインゲルハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ  ＧｍｂＨ、ドイツ）から購入して純水に溶解した。
【００８６】
［ＮＡＳＨの誘導］
５０匹の雄マウスで生後２日に２００μｇのストレプトゾトシン（ＳＴＺ、シグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、米国）溶液を単回皮下注射して生後４週後に高脂肪食（ＨＦＤ、５７ｋｃａｌ％の脂肪、ｃａｔ＃：ＨＦＤ３２、日本クレア社、日本）を供給することによってＮＡＳＨが誘導された。
【００８７】
［薬物投与経路］
ビークル、ＭＮ−００１及びテルミサルタンは、１０ｍＬ／ｋｇの体積で経口経路によって投与した。
【００８８】
［治療投与量］
ＭＮ−００１は、１０、３０及び１００ｍｇ／ｋｇの投与量で１日１回投与した。テルミサルタンは、１０ｍｇ／ｋｇの投与量で１日１回投与した。
【００８９】
［動物］
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１５日妊娠中の雌）が本試験に用いられた。
【００９０】
［環境］
動物は、温度（２３±２℃）、湿度（４５±１０％）、照明（１２時間の人工光と闇のサイクル；８時から２０時までの光）、空気交換の制御された条件下のＳＰＦ施設で保持された。施設の汚染を防止するために試験室で高圧を保持した。
【００９１】
［動物飼育］
動物は、ケージあたり最大４匹のポリカーボネート製のケージＫＮ−６００（夏目製作所社、日本）で飼育した。滅菌されたペーパークリーン（Ｐａｐｅｒ−Ｃｌｅａｎ、日本エスエルシー社）は、動物の寝具に使用されて一週間に一度交換した。
【００９２】
［食べ物及び飲み物］
滅菌固体ＨＦＤは、ケージ上部の金属蓋に配置して自由に与えた。純水は、ゴム栓及び給水先管を備えた給水ボトルから自由に提供された。給水ボトルは、一週間に一度交換し、洗浄して、オートクレーブで滅菌し、再利用された。
【００９３】
［動物及びケージ識別］
マウスは、イヤリングに彫られた数字で識別された。それぞれのケージは、特定の識別コードが付された。
【００９４】
［肝臓生化学の測定］
［肝臓のヒドロキシプロリン含量測定］
次のように、肝臓のヒドロキシプロリンの含量を定量化するために凍結肝臓サンプル（３２〜４０ｍｇ）をアルカリ酸加水分解法によって処理した。肝臓サンプルは、１００％アセトンで脱脂し、空気で乾燥させ、６５℃で２ＮのＮａＯＨに溶解し、１２１℃で２０分間オートクレーブした。溶解したサンプル（４００μＬ）は、２０分間１２１℃で６Ｎ  ＨＣｌの４００μＬで酸加水分解し、１０ｍｇ／ｍｌの活性炭を含む４Ｎ  ＮａＯＨの４００μＬで中和した。ＡＣ緩衝剤（２．２Ｍ酢酸／０．４８Ｍクエン酸、４００μＬ）は、サンプルに添加した後、遠心分離して上澄液を収集した。ヒドロキシプロリンの標準曲線は、１６μｇ／ｍＬで開始するトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン（シグマアルドリッチ社、米国）を連続的に薄めて製造した。準備されたサンプル及び標準（各４００μＬ）は、４００μＬクロラミンＴ溶液（和光純薬工業社、日本）と混合して室温で２５分間培養した。発色のために、サンプルをエールリヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ’）溶液（４００μＬ）と混合して６５℃で２０分間加熱した。サンプルを氷で冷却して遠心分離して沈殿物を除去した後、各々上澄液の光学密度を５６０ｎｍで測定した。ヒドロキシプロリンの濃度は、ヒドロキシプロリン標準曲線から算出した。ＢＣＡタンパク質定量キット（サーモフィッシャーサイエンティフィック社（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、米国）を使用して肝臓サンプルのタンパク質濃度を決定し、これを使用して算出されたヒドロキシプロリン値を正規化した。肝臓のヒドロキシプロリン水準は、タンパク質１ｍｇあたりμｇで表した。
【００９５】
［病理組織学的分析］
ＨＥ染色のために、Ｂｏｕｉｎ溶液中に予め固定された肝臓組織のパラフィンブロックから切片を切断し、リリーマイヤーのヘマトキシリン（武藤化学社、日本）及びエオシン溶液（和光純薬工業社）で染めた。ＮＡＦＬＤ活性点数（ＮＡＳ）は、Ｋｌｅｉｎｅｒ基準により算出した（Ｋｌｅｉｎｅｒ−ＤＥなど、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２００５；４１：１３１３）。コラーゲン沈着を可視化するために、ブアン固定（Ｂｏｕｉｎ’ｓ  ｆｉｘｅｄ）による肝切片は、ピクロシリウス赤色溶液（ ヴァルデック社（Ｗａｌｄｅｃｋ）、ドイツ）を使用して染色した。
【００９６】
免疫組織化学のためにＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  Ｏ．Ｃ．Ｔ．化合物に含まれた凍結肝臓組織から切片を切断して、アセトンで固定した。内因性ペルオキシダーゼ活性を０．０３％Ｈ２Ｏ２を使用して５分間遮断した後、ブロックエース（大日本住友製薬社、日本）で１０分間培養した。その切片は、抗α−ＳＭＡ（エピトミクス社（Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ）、米国）又は抗Ｆ４／８０抗体（ＢＭＡバイオメディカルズ社（ＢＭＡ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）、スイス）の２００倍の希釈液にて室温で１時間の間培養した。二次抗体（ＨＲＰヤギ抗ラット（ＨＲＰ−Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｔ）抗体、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）で培養した後、酵素基質反応を３，３’−ジアミノベンジジン／Ｈ２Ｏ２溶液（ニチレイ社（Ｎｉｃｈｉｒｅｉ）、日本）を使用して行った。
【００９７】
線維症領域、炎症領域の定量分析、及びα−ＳＭＡの半定量（ｓｅｍｉ−ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）のためにシリウス赤色染色された切片Ｆ４／８０免疫染色された切片及びα−ＳＭＡ免疫染色された切片の明視野（ｂｒｉｇｈｔ  ｆｉｅｌｄ）画像は、デジタルカメラ（ＤＦＣ２８０；ライカマイクロシステムズ社（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ドイツ）を使用して２００倍の倍率で中心静脈の周辺をキャプチャーし、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）、米国）を使用して１個の切片あたり５つの視野で陽性領域を測定した。
【００９８】
［定量的ＲＴ−ＰＣＲ］
全体ＲＮＡを製造者の指示により、ＲＮＡｉｓｏ（タカラバイオ社、日本）を使用して肝臓サンプルから抽出した。１μｇのＲＮＡは、４．４ｍＭのＭｇＣｌ２（エフ・ホフマン・ラ・ロシュ社（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ）、スイス）、４０ＵのＲＮａｓｅ阻害剤（東洋紡社、日本）、０．５ｍＭのｄＮＴＰ（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ）、米国）、６．２８μＭのランダムヘキサマー（プロメガ社）、５ｘ最初の順序緩衝剤（プロメガ社）、１０ｍＭのジチオスレイトール（インビトロジェン社、米国）及び２００Ｕ  ＭＭＬＶ−ＲＴ（インビトロジェン社）を含有する反応混合物を２０μＬの最終ボリュームで用いて逆転写した。反応を３７℃で１時間、続いて９９℃で５分間実施した。リアルタイムＰＣＲをリアルタイムＰＣＲ  ＤＩＣＥ及びＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社）を使用して行った。相対的なｍＲＮＡの発現レベルを算出するために各遺伝子の発現は、参照遺伝子３６Ｂ４（遺伝子記号：Ｒｐｌｐ０）のそれに標準化した。ＰＣＲプライマーセット情報は、表１に記載した。
【００９９】
【表１】
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【０１００】
［統計的試験］
統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４に対してボンフェローニ多重比較試験を使用して行った（グラフパッドソフトウェア社（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）、米国）。Ｐ値が０．０５未満であれば、統計的に有意であると考えられた。片側ｔ検定がＰ値０．１０未満に戻る傾向が仮定された。結果を平均±ＳＤとして表した。
【０１０１】
［試験設計及び治療］
［試験群］
群１：正常
１０匹の正常マウスは、任意の治療をせずに生後１２週まで通常の食餌を自由に摂取させる。
群２：ビークル
１０匹のＮＡＳＨマウスは、生後８から１２週の間、ビークルを１０ｍｌ／ｋｇの体積で１日１回経口投与した。
群３：ＭＮ−００１−低投与量
１０匹のＮＡＳＨマウスは、生後８から１２週の間、ＭＮ−００１を補充したビークルを１０ｍｇ／ｋｇの投与量で１日１回経口投与した。
群４：ＭＮ−００１−中投与量
１０匹のＮＡＳＨマウスは、生後８から１２週の間、ＭＮ−００１を補充したビークルを３０ｍｇ／ｋｇの投与量で１日１回経口投与した。
群５：ＭＮ−００１−高投与量
１０匹のＮＡＳＨマウスは、生後８から１２週の間、ＭＮ−００１を補充したビークルを１００ｍｇ／ｋｇの投与量で１日１回経口投与した。
群６：テルミサルタン
１０匹のＮＡＳＨマウスは、生後８から１２週の間、テルミサルタンを補充した純水を、１０ｍｇ／ｋｇの投与量で１日１回経口投与した。
【０１０２】
表２は、治療スケジュールを整理したものである。
【０１０３】
【表２】
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【０１０４】
［動物のモニタリング及び犠牲］
生存率、臨床徴候、及び挙動は、毎日モニタリングした。体重は、治療前に記録した。マウスに各々を投与して約６０分後に毒性、瀕死、及び死亡率の有意な臨床徴候について観察した。動物は、エーテル麻酔（和光純薬工業社）下で心臓を直接穿刺することによって、放血により犠牲にした。
【０１０５】
［結果］
［組織学的分析］
［ＨＥ染色及びＮＡＦＬＤ活性点数（ＮＡＳ）］
ＮＡＦＬＤ活性点数（ＮＡＳ）は、例えば、進行したＮＡＳＨに罹患している対象の肝臓の損傷の程度、及び損傷した肝臓の治療に対する反応の尺度である。ＨＥ染色切片の代表的な顕微鏡写真は、図１に示される。ビークル群からの肝切片は、深刻なマイクロ及びマクロ脂肪沈着、肝細胞の風船化及び炎症性細胞浸潤を示した。これらの観察と一致して、ＮＡＳは、正常群と比較してビークル群で有意に増加した。ＭＮ−００１治療群の全ての投与量は、肝細胞の風船化及び炎症性細胞浸潤の有意な改善を示した。ＮＡＳは、ビークル群に比べてＭＮ−００１治療群の全ての投与量において、有意に減少した。表３及び表４、及び図２〜図５を参照。
【０１０６】
【表３】
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【０１０７】
【表４】
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【０１０８】
［シリウス赤色染色］
肝臓のシリウス赤色染色された切片の代表的な顕微鏡写真は、図６に示される。ビークル群で肝切片は、正常群に比べて肝小葉の周辺領域でコラーゲン沈着の増加を示した。線維症領域（シリウス赤色陽性領域）の比率が正常群と比較してビークル群で有意に増加した。線維症領域は、ビークル群に比べて、テルミサルタン群、ＭＮ−００１−低及びＭＮ−００１高群で有意に減少した。線維症領域は、ビークル群に比べて、ＭＮ−００１中投与量群において減少する傾向がある。表５及び図７を参照。
【０１０９】
［Ｆ４／８０免疫染色］
ビークル群からの肝切片は、正常群に比べて肝小葉内で増加したＦ４／８０陽性細胞の数と大きさを示した。炎症領域（Ｆ４／８０陽性領域）の比率が正常群と比較してビークル群で有意に増加した。炎症領域がテルミサルタン群で減少する傾向がある。ビークル群と任意の投与量のＭＮ−００１治療群との間で炎症領域の有意な差はないが、図８から改善が観察される。さらに表５を参照。
【０１１０】
［α−ＳＭＡ免疫染色］
α−ＳＭＡ免疫染色された切片の代表的な顕微鏡写真は、図９に示される。ビークル群からの肝切片は、正常群に比べて肝小葉内で増加したα−ＳＭＡ陽性細胞の数を示した。α−ＳＭＡ陽性領域の比率が正常群と比較してビークル群で有意に増加した。α−ＳＭＡ陽性領域は、ビークル群と比較してテルミサルタン、ＭＮ−００１−低及びＭＮ−００１−高群で有意に減少した。ビークル群とＭＮ−００１−中群との間でα−ＳＭＡ陽性領域の有意な差はなかった。表５及び図９を参照。
【０１１１】
【表５】
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【０１１２】
［遺伝子発現分析］
［ＴＩＭＰ−１］
ＴＩＭＰ−１  ｍＲＮＡの発現レベルは、正常群と比較してビークル群で有意にアップレギュレートされた。ＴＩＭＰ−１  ｍＲＮＡの発現レベルは、ビークル群と比較してＭＮ−００１−低及びテルミサルタン群で有意にダウンレギュレートされた。ビークル群と任意の他の群との間にＴＩＭＰ−１のｍＲＮＡの発現レベルの有意な差はなかった。
【０１１３】
［コラーゲン１型］
コラーゲン１型ｍＲＮＡの発現レベルは、正常群と比較してビークル群で有意にアップレギュレートされた。コラーゲン１型ｍＲＮＡの発現レベルは、ビークル群と比較してテルミサルタン群で有意にダウンレギュレートされた。ＭＮ−００１−高群は、ビークル群と比較してコラーゲン１型ｍＲＮＡの発現レベルが減少する傾向があった。ビークル群と任意の他の群との間でコラーゲン１型ｍＲＮＡの発現レベルの有意な差はなかった。
【０１１４】
［α−ＳＭＡ］
α−ＳＭＡ  ｍＲＮＡの発現レベルは、正常群と比較してビークル群で有意にアップレギュレートされた。α−ＳＭＡ  ｍＲＮＡの発現レベルは、ビークル群と比較してテルミサルタン群で有意にダウンレギュレートされた。ビークル群と任意の投与量のＭＮ−００１治療群との間でα−ＳＭＡ  ｍＲＮＡの発現レベルの有意な差はなかった。
【０１１５】
［５−リポキシゲナーゼ］
５−リポキシゲナーゼのｍＲＮＡの発現レベルは、正常群と比較してビークル群で増加する傾向があった。ＭＮ−００１高及びテルミサルタン群で５−リポキシゲナーゼｍＲＮＡの発現レベルは、ビークル群に比べて減少する傾向があった。ビークル群とＭＮ−００１低及びＭＮ−００１中群との間で５−リポキシゲナーゼのｍＲＮＡの発現レベルの有意な差はなかった。
【０１１６】
［ＦＬＡＰ］
ＦＬＡＰ  ｍＲＮＡの発現レベルは、正常群と比較してビークル群で有意にアップレギュレートされた。ＭＮ−００１高群におけるＦＬＡＰ  ｍＲＮＡの発現レベルは、ビークル群と比較して増加する傾向があった。ビークル群と任意の他の群との間にＦＬＡＰ  ｍＲＮＡの発現レベルの有意な差はなかった。
【０１１７】
［ＬＴＣ４シンターゼ］
テルミサルタン群において、ＬＴＣ４シンターゼＲＮＡの発現レベルは、ビークル群と比較して減少する傾向があった。ビークル群と任意の他の群との間にＬＴＣ４シンターゼｍＲＮＡの発現レベルの有意な差はなかった。
【０１１８】
［体重変化及び一般的な条件］
体重は、テルミサルタン群を除いた全ての群で治療期間の間、徐々に増加した。ビークル群の平均体重は、治療期間ずっと正常群より低かった。テルミサルタン群の平均体重は、８日から２８日間ビークル群より有意に低かった。治療期間の間、ビークル群と任意の投与量のＭＮ−００１治療群との間で平均体重の有意な差はなかった。テルミサルタン群のうちの１つは、２４日に死亡することが発見された。一般的な条件で動物は悪化しなかった。
【０１１９】
［犠牲日の体重］
ビークル群は、正常群に比べて犠牲日に平均体重の有意な減少を示した。テルミサルタン群は、ビークル群に比べて犠牲日に平均体重の有意な減少を示した。ビークル群と任意の投与量のＭＮ−００１治療群との間で犠牲日に平均体重の有意な差はなかった。
【０１２０】
［肝重量及び肝重量対体重比］
ビークル群は、正常群に比べて平均体重の有意な増加を示した。テルミサルタン群は、ビークル群に比べて平均肝重量の有意な減少を示した。ビークル群と任意の投与量のＭＮ−００１治療群との間で平均体重の有意な差はなかった。
【０１２１】
ビークル群は、正常群に比べて平均肝重量対体重比の有意な増加を示した。テルミサルタン群は、ビークル群に比べて平均肝重量対体重比の有意な減少を示した。ビークル群と任意の投与量のＭＮ−００１治療群との間で平均肝重量対体重比の有意な差はなかった。
【０１２２】
［肝臓生化学］
［肝臓のヒドロキシプロリン含量］
ビークル群は、正常群に比べて肝臓のヒドロキシプロリン含量が増加する傾向があった。ビークル群と任意の他の群との間で肝臓のヒドロキシプロリン含量の有意な差はなかった。
【０１２３】
特定の実施形態が説明されて記載されるが、当技術分野の通常技術によって、本明細書で以下の請求の範囲に定義された広い形態の技術から逸脱することなく変更できることを理解されたい。
本明細書に例示的に記載された実施形態は、具体的に本明細書に開示されていない任意の要素など、限定されることなく適切に実施することができる。従って、例えば、「含む」、「含有する」などの用語は、広範かつ制限のないものと理解され得る。また、本明細書で使用される用語及び表現は、説明のために用いられたもので、これらに制限されることはなく、このような用語及び表現の使用が、図示及び記載された特徴又はその一部の任意の等価物を排除する意図はなく、請求する技術の範囲内で様々な変更が可能であることを認識されたい。さらに、「本質的に〜からなる」というフレーズは、具体的に言及した要素及び実質的に請求した技術の基本的な新規の特性に影響を及ぼさない追加の要素を含むことが理解される。「からなる」というフレーズは、指定されていない要素を排除する。
【０１２４】
本開示は、本出願に記載された特定の実施形態に限定されるものではない。当業者に明らかであるように、思想及び範囲から逸脱することなく、様々な修正及び変更を行うことができる。本明細書に列挙したものに加えて、本開示の範囲内の機能的に等価な方法及び組成物は、上記の説明から当業者には明らかであろう。このような変更は、特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。本開示は、特許請求の範囲、及びその請求の範囲が与えられる等価物の全範囲によってのみ限定されるものである。この開示の内容は、変更することができる具体的な方法、試薬、化合物、組成物、又は生物学的システムに限定されないことを理解しなければならない。また、本明細書で使用する用語は、単に特定の実施形態を説明するためのものであり、限定することを意図するものではないことを理解されたい。
【０１２５】
さらに、本開示の特徴又は態様がマーカッシュ群について記載されている場合、当業者は、本開示がマーカッシュ群の部材の任意の個々の部材及びその下位群の点から記載されるものと認識されるであろう。
【０１２６】
当業者に理解されるように、任意の目的及び全ての目的のために、特に記載する説明を提供する観点から、本明細書に開示された全ての範囲は、その可能な下位範囲及びその下位範囲の組合せを含む。任意の列挙された範囲は、十分に記載されており、同一の範囲を少なくとも２等分、３等分、４等分、５等分、１０等分などに分けることができることが容易に認識され得る。非限定的な例として、本明細書に記載した各範囲は、下位１／３、中位１／３、上位１／３に容易に分割することができる。当業者によって理解されるように、「最大」、「最小」、「より大きい」、「より小さい」などのような用語は、全て記載された数値を含み、さらに上述したように下位範囲に分割可能な範囲を意味する。最後に、当業者に理解されるように、範囲は、各個々の数値を含む。
【０１２７】
本明細書に記載した、全ての公報、特許出願、登録特許、及びその他文献は、それぞれの個別公報、特許出願、登録特許、又は、その他の文献が参照により全体として本明細書に含まれることが具体的かつ個別に示されたかのように、本明細書に参照として含まれる。参照として組み込まれた本文に含まれる定義は、本開示における定義に矛盾する限りにおいて除外される。
【０１２８】
その他の実施形態は、特許請求の範囲に記載される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
0006672173.tif 000028
【図６Ｂ】
0006672173.tif 000029
【図７】
0006672173.tif 000030
【図８】
0006672173.tif 000031
【図９Ａ】
0006672173.tif 000032
【図９Ｂ】
0006672173.tif 000033
【配列表】
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