(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチドであって、
（ｉ）レンチウイルス由来の、第１長鎖末端反復配列と、
（ｉｉ）配列番号１の配列を有する複製開始点、配列番号２の配列を有する複製開始点、配列番号３の配列を有する複製開始点、および前記配列番号１の配列、前記配列番号２の配列、前記配列番号３の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するそれらの機能的に等価な変異体からなる群より選択される、真核生物の複製開始点と、
（ｉｉｉ）配列番号４の配列を有する足場／マトリックス付着領域、配列番号５の配列を有する足場／マトリックス付着領域、配列番号６の配列を有する足場／マトリックス付着領域、および前記配列番号４の配列、前記配列番号５の配列、前記配列番号６の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するそれらの機能的に等価な変異体からなる群より選択される、足場／マトリックス付着領域と、
（ｉｖ）前記レンチウイルス由来の、第２長鎖末端反復配列と
を含んでなり、
前記真核生物の複製開始点および前記足場／マトリックス付着領域が、前記第１長鎖末端反復配列と第２長鎖末端反復配列の間に配置されてなる、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、
（ｉ）レンチウイルス由来の、第１長鎖末端反復配列と、
（ｉｉ）配列番号１の配列を有する複製開始点、配列番号２の配列を有する複製開始点、配列番号３の配列を有する複製開始点、および前記配列番号１の配列、前記配列番号２の配列、前記配列番号３の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するそれらの機能的に等価な変異体からなる群より選択される、真核生物の複製開始点と、
（ｉｉｉ）配列番号４の配列を有する足場／マトリックス付着領域、配列番号５の配列を有する足場／マトリックス付着領域、配列番号６の配列を有する足場／マトリックス付着領域、および前記配列番号４の配列、前記配列番号５の配列、前記配列番号６の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するそれらの機能的に等価な変異体からなる群より選択される、足場／マトリックス付着領域と、
（ｉｖ）前記レンチウイルス由来の、第２長鎖末端反復配列と
を含んでなり、
前記真核生物の複製開始点および前記足場／マトリックス付着領域が、前記第１長鎖末端反復配列と第２長鎖末端反復配列の間に配置されてなる、ポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、
（ｉ）レンチウイルス由来の、第１長鎖末端反復配列と、
（ｉｉ）配列番号１の配列を有する複製開始点、配列番号２の配列を有する複製開始点、配列番号３の配列を有する複製開始点、および前記配列番号１の配列、前記配列番号２の配列、前記配列番号３の配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を有するそれらの機能的に等価な変異体からなる群より選択される、真核生物の複製開始点と、
（ｉｉｉ）配列番号４の配列を有する足場／マトリックス付着領域、配列番号５の配列を有する足場／マトリックス付着領域、配列番号６の配列を有する足場／マトリックス付着領域、および前記配列番号４の配列、前記配列番号５の配列、前記配列番号６の配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を有するそれらの機能的に等価な変異体からなる群より選択される、足場／マトリックス付着領域と、
（ｉｖ）前記レンチウイルス由来の、第２長鎖末端反復配列と
を含んでなり、
前記真核生物の複製開始点および前記足場／マトリックス付着領域が、前記第１長鎖末端反復配列と第２長鎖末端反復配列の間に配置されてなる、ポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記足場／マトリックス付着領域が、前記複製開始点に対して５’側に位置する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記第１長鎖末端反復配列および第２長鎖末端反復配列が、ＨＩＶに由来するものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記第１長鎖末端反復配列が、配列番号７の配列を含むものである、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記第２長鎖末端反復配列が、自己不活性化変異を含むものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記自己不活性化変異が、前記末端反復配列のＵ３領域における欠失である、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
Ｕ３領域における欠失を含む前記末端反復配列が、配列番号８の配列を含むものである、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
−マルチクローニング部位、
−少なくとも一つの、プロモーターに作動的に連結する対象ポリヌクレオチド（ここで、前記プロモーターは、足場／マトリックス付着領域および複製開始点に対して５’側に位置し、第１長鎖末端反復配列に対して３’側に位置し、かつ前記対象ポリヌクレオチドは、足場／マトリックス付着領域に対して５’側または３’側に位置し、複製開始点に対して５’側または３’側に位置する）、および
−それらの組み合わせ
から選択されるポリヌクレオチド配列をさらに含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記プロモーターが、アデノ随伴ウイルスに由来するものである、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記アデノ随伴ウイルスに由来するプロモーターが、ｐ５プロモーターまたはその機能的に等価な変異体である、請求項１０または１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記プロモーターが、配列番号９の配列を含むものである、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記プロモーターに作動的に連結するエンハンサー領域をさらに含んでなる、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記エンハンサー領域が、サイトメガロウイルスプロモーターのエンハンサー領域である、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
前記サイトメガロウイルスプロモーターのエンハンサー領域が、配列番号１０の配列を含むものである、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記対象ポリヌクレオチドが、選択遺伝子、対象タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびそれらの組み合わせから選択される、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
前記選択遺伝子が、抗生物質への耐性を与えるタンパク質をコードするものである、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
前記抗生物質がネオマイシンである、請求項１８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
前記対象タンパク質が緑色蛍光タンパク質である、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
第２の対象ポリヌクレオチドをさらに含んでなり、当該第２の対象ポリヌクレオチドが、第１の対象ポリヌクレオチドに、同時翻訳性自己プロセシング配列をコードする配列によって作動的に連結されてなる、請求項１０〜２０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２】
前記同時翻訳性自己プロセシング配列が、ブタテッショウウイルスに由来するシス作用性ヒドロラーゼエレメントである、請求項２１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
前記同時翻訳性自己プロセシング配列をコードする配列が、配列番号１１の配列を含むものである、請求項２１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２４】
前記第１の対象ポリヌクレオチドが、対象タンパク質をコードし、前記第２の対象ポリヌクレオチドが選択遺伝子である、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５】
レンチウイルス由来のプライマー結合部位配列をさらに含んでなり、
ここで、前記プライマー結合部位配列が、第１長鎖末端反復配列に対して３’側に位置し、複製開始点および足場／マトリックス付着領域に対して５’側に位置し、かつ
前記ポリヌクレオチドが、
−マルチクローニング部位、
−プロモーターに作動的に連結する対象ポリヌクレオチド（ここで、前記プロモーターは、足場／マトリックス付着領域および複製開始点に対して５’側に位置し、第１長鎖末端反復配列に対して３’側に位置し、かつ前記対象ポリヌクレオチドは、足場／マトリックス付着領域に対して５’側または３’側に位置し、複製開始点に対して５’側または３’側に位置する）、および
−それらの組み合わせ
から選択されるポリヌクレオチド配列をさらに含む場合、
前記プライマー結合部位が前記ポリヌクレオチド配列に対して５’側に位置するものとされた、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６】
前記プライマー結合部位配列がＨＩＶに由来するものである、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２７】
前記プライマー結合部位配列が配列番号１２の配列を含むものである、請求項２６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２８】
第１長鎖末端反復配列と第２長鎖末端反復配列の間に位置する、レンチウイルス由来のパッケージングシグナル配列をさらに含んでなる、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２９】
前記パッケージングシグナル配列がＨＩＶに由来するものである、請求項２８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３０】
前記パッケージングシグナル配列が配列番号１３の配列を含むものである、請求項２９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３１】
第１長鎖末端反復配列と第２長鎖末端反復配列の間に位置する、レンチウイルス由来のＲｅｖ応答エレメントをさらに含んでなる、請求項１〜３０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３２】
前記Ｒｅｖ応答エレメントがＨＩＶに由来するものである、請求項３１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３３】
前記Ｒｅｖ応答エレメントが配列番号１４の配列を含むものである、請求項３２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３４】
レンチウイルス由来のセントラルポリプリン配列をさらに含んでなり、
ここで、前記セントラルポリプリン配列が、第１長鎖末端反復配列に対して３’側に位置し、複製開始点および足場／マトリックス付着領域に対して５’側に位置し、かつ
前記ポリヌクレオチドが、
−マルチクローニング部位、
−足場／マトリックス付着領域および複製開始点に対して５’側に位置し、第１長鎖末端反復配列に対して３’側に位置するプロモーターへ作動的に連結する対象ポリヌクレオチドであって、
足場／マトリックス付着領域に対して５’側または３’側に位置し、かつ複製開始点に対して５’側または３’側に位置する対象ポリヌクレオチド、および
−それらの組み合わせ
から選択されるポリヌクレオチド配列をさらに含む場合、
前記セントラルポリプリン配列が前記ポリヌクレオチド配列に対して５’側に位置するものとされた、請求項１〜３３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３５】
前記セントラルポリプリン配列がＨＩＶに由来するものである、請求項３４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３６】
前記セントラルポリプリン配列が配列番号１５の配列を含むものである、請求項３５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３７】
原核生物の複製開始点と、選択マーカーとをさらに含んでなる、請求項１〜３６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３８】
前記原核生物の複製開始点が配列番号１６の配列を含むものである、請求項３７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３９】
前記選択マーカーが、抗生物質への耐性を与えるタンパク質をコードする遺伝子である、請求項３７または３８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４０】
前記抗生物質がアンピシリンである、請求項３９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４１】
請求項１〜４０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、ベクター。
【請求項４２】
請求項１〜４０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４１に記載のベクターを含んでなる、細胞。
【請求項４３】
請求項１〜４０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドと、ウイルスゲノムの細胞ゲノム内への組込みに対するインテグラーゼの触媒作用を不可能にする変異を含むレンチウイルスインテグラーゼとを含んでなる、組換えレンチウイルス。
【請求項４４】
前記変異が、前記インテグラーゼの触媒コアドメイン内のＤＤＥモチーフの１つ以上のアミノ酸残基の置換である、請求項４３に記載の組換えレンチウイルス。
【請求項４５】
前記変異が、前記ＤＥＥモチーフの第１アスパラギン酸残基の、アスパラギン残基による置換である、請求項４４に記載の組換えレンチウイルス。
【請求項４６】
前記インテグラーゼが配列番号１７の配列を含むものである、請求項４５に記載の組換えレンチウイルス。
【請求項４７】
水疱性口内炎ウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質Ｇをさらに含んでなる、請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の組換えレンチウイルス。
【請求項４８】
請求項４３〜４７のいずれか一項に記載の組換えレンチウイルスを作製するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、
（ｉ）真核細胞を、請求項１〜３６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４１に記載のベクターと接触させる工程であり、ここで前記細胞が、前記細胞内への前記ポリヌクレオチドまたはベクターの移行に適した条件下で、レンチウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、ｒｅｖの産物およびウイルスエンベロープタンパク質を発現する工程と、
（ｉｉ）レンチウイルスの集合に適した条件下で前記細胞を維持する工程とを含んでなる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法。
【請求項４９】
レンチウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、ｒｅｖの産物およびウイルスエンベロープタンパク質を発現する細胞が、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、ｒｅｖ遺伝子をコードする１つ以上のポリヌクレオチドと、ウイルスエンベロープタンパク質をコードするポリヌクレオチドとをトランスフェクトされており、前記トランスフェクションが、前記ポリヌクレオチドもしくはベクターとの接触と同時に、またはそれに先立って行われる、請求項４８に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ法。
【請求項５０】
前記ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、ｒｅｖ遺伝子およびウイルスエンベロープタンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチドが、
−ｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子を含むポリヌクレオチド、
−ｒｅｖ遺伝子を含むポリヌクレオチド、および
−ウイルスエンベロープタンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチド
として提供される、請求項４９に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ法。
【請求項５１】
レンチウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｒｅｖがＨＩＶ−１に由来するものである、請求項４８〜５０のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ法。
【請求項５２】
前記ウイルスエンベロープタンパク質が水疱性口内炎ウイルス由来の糖タンパク質Ｇである、請求項４８〜５１のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ法。
【請求項５３】
細胞によって産生された組換えレンチウイルスを精製する工程をさらに含んでなる、請求項４８〜５２のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ法。
【請求項５４】
請求項１〜４０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む対象ポリヌクレオチドを発現可能な安定化細胞集団であって、前記ポリヌクレオチドが、プロモーターへ作動的に連結する対象ポリヌクレオチドの配列を含んでなり、
−前記プロモーターが、前記足場／マトリックス付着領域および前記複製開始点に対して５’側に位置し、前記第１長鎖末端反復配列に対して３’側に位置し、かつ
−前記対象ポリヌクレオチドが、前記足場／マトリックス付着領域に対して５’側または３’側に位置し、前記複製開始点に対して５’側または３’側に位置するものとされた、安定化細胞集団。
【請求項５５】
請求項５４に記載の安定化細胞集団を作製するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、
（ｉ）細胞を請求項４３〜４７のいずれか一項に記載の組換えレンチウイルスに接触させる工程であり、ここで前記組換えレンチウイルスが、プロモーターへ作動的に連結する対象ポリヌクレオチドの配列を含んでなり、
−前記プロモーターが、前記足場／マトリックス付着領域および前記複製開始点に対して５’側に位置し、前記第１長鎖末端反復配列に対して３’側に位置し、かつ
−前記対象ポリヌクレオチドが、前記足場／マトリックス付着領域に対して５’側または３’側に位置し、前記複製開始点に対して５’側または３’側に位置する工程と、
（ｉｉ）前記細胞を増殖させかつ維持する工程と
を含んでなる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法。
【請求項５６】
工程（ｉ）において作製された細胞を選択することをさらに含んでなる、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
対象産物をｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生するための、請求項５４に記載の安定化細胞集団の使用。
【請求項５８】
対象産物を産生するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、対象ポリヌクレオチドの発現が許容される条件下で、請求項５４に記載の安定化細胞集団を培養する工程を含んでなる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は真核細胞の遺伝子組換えの分野に属し、さらに具体的には、非組込み型レンチウイルスベクターに基づいたエピソーム、および対象異種性遺伝子を安定的に発現する細胞株を作製するための前記エピソームの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
インテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ）は、ウイルスインテグラーゼの触媒ドメインに変異をもつ非複製レンチウイルスである。結果として、１−ＬＴＲおよび２−ＬＴＲと称される、逆転写の脱離産物である環状ｃＤＮＡが細胞核内に蓄積するが、これらが宿主ゲノム内に組み込まれることはない（図１）（Ｙａｎｅｚ−Ｍｕｎｏｚ  ＲＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００６，１２：３４８−３５３）。これらのウイルスが仲介するその他のいずれの外来性ＤＮＡも、細胞ＤＮＡ内に同頻度で組み込まれる（１０３ないし１０５／細胞）。
【発明の概要】
【０００３】
ＩＤＬＶに由来するｃＤＮＡの染色体外（エピソーム）性質では、これまでのレンチウイルスが有する不都合が回避されている。細胞ゲノムに対するエピソームベクターの干渉は最小であるため、ウイルスによって送達された導入遺伝子の位置に依存した発現特性、および変異の挿入による潜在的な損傷のどちらも最小となる。これらの新規なベクターに対しては早期に強い関心が寄せられたが、主な懸念はこれらが自律的に複製できないことである。その結果、連続的な細胞分裂によってエピソームを有する細胞が減少すると、レンチベクターの配列は消滅することになり、このことが、神経系のような分裂活性が低いかまたは全くない組織および細胞に対するこれらベクターの適用性を狭く限定している。したがって、これらのベクターに基づいた遺伝子治療法の標的は、導入遺伝子によって発現される妥当な表現型を確実に不変なものとするため、有糸分裂の活性が比率が非常に低いまたは有糸分裂が起こらない組織または細胞に限定される。残念ながら、遺伝子治療法によって治療される可能性のある多くの疾病は、生涯にわたって細胞分裂を続ける、造血幹細胞または上皮幹細胞のような分裂頻度の高い細胞または組織の改善、およびこれらのベクターの標的ではない幹細胞／ｉＰＳ細胞に基づいた治療を必要としている。
【０００４】
第１の態様によれば、本発明は、
ポリヌクレオチドであって、
（ｉ）レンチウイルス由来の、第１長鎖末端反復配列（ｆｉｒｓｔ  ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）と、
（ｉｉ）配列番号１の配列を有する複製開始点、配列番号２の配列を有する複製開始点、配列番号３の配列を有する複製開始点、およびそれらの機能的に等価な変異体からなる群より選択される、真核生物の複製開始点と、
（ｉｉｉ）配列番号４の配列を有する足場／マトリックス付着領域、配列番号５の配列を有する足場／マトリックス付着領域、配列番号６の配列を有する足場／マトリックス付着領域、およびそれらの機能的に等価な変異体からなる群より選択される、足場／マトリックス付着領域と、
（ｉｖ）前記レンチウイルス由来の、第２長鎖末端反復配列と
を含んでなり、
前記真核生物の複製開始点および前記足場／マトリックス付着領域が、前記第１長鎖末端反復配列と第２長鎖末端反復配列の間に配置されてなる、ポリヌクレオチドに関する。
【０００５】
第２の態様によれば、本発明は、第１の態様によるポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
【０００６】
第３の態様によれば、本発明は、第１の態様によるポリヌクレオチドまたは第２の態様によるベクターを含む細胞に関する。
【０００７】
第４の態様によれば、本発明は、第１の態様によるポリヌクレオチドと、ウイルスゲノムの細胞ゲノム内への組込みに対するインテグラーゼの触媒作用を不可能にする変異を含むレンチウイルスインテグラーゼとを含む、組換えレンチウイルスに関する。
【０００８】
第５の態様によれば、本発明は、第４の態様による組換えレンチウイルスを作製するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、
（ｉ）真核細胞を、第１の態様によるポリヌクレオチドまたは第２の態様によるベクターと接触させる工程であり、ここで前記細胞が、前記細胞内への前記ポリヌクレオチドまたはベクターの移行に適した条件下で、レンチウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、ｒｅｖの産物およびウイルスエンベロープタンパク質を発現する工程と、
（ｉｉ）レンチウイルスの集合に適した条件下で前記細胞を維持する工程と
を含んでなる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法に関する。
【０００９】
第６の態様によれば、本発明は、第１の態様によるポリヌクレオチドを含む対象ポリヌクレオチドを発現可能な安定化細胞集団であって、前記ポリヌクレオチドが、プロモーターへ作動的に連結する対象ポリヌクレオチドの配列を含んでなり、
−前記プロモーターが、前記足場／マトリックス付着領域および前記複製開始点に対して５’側に位置し、前記第１長鎖末端反復配列に対して３’側に位置し、かつ
−前記対象ポリヌクレオチドが、前記足場／マトリックス付着領域に対して５’側または３’側に位置し、前記複製開始点に対して５’側または３’側に位置する、安定化細胞集団に関する。
【００１０】
第７の態様によれば、本発明は、第６の態様による安定化細胞集団を作製するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、
（ｉ）細胞を第４の態様による組換えレンチウイルスに接触させる工程であり、ここで前記組換えレンチウイルスが、プロモーターへ作動的に連結する対象ポリヌクレオチドの配列を含んでなり、
−前記プロモーターが、前記足場／マトリックス付着領域および前記複製開始点に対して５’側に位置し、前記第１長鎖末端反復配列に対して３’側に位置し、かつ
−前記対象ポリヌクレオチドが、前記足場／マトリックス付着領域に対して５’側または３’側に位置し、前記複製開始点に対して５’側または３’側に位置する工程と、
（ｉｉ）前記細胞を増殖させかつ維持する工程と
を含んでなる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法に関する。
【００１１】
第８の態様によれば、本発明は、対象産物をｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生するための、第６の態様による安定化細胞集団の使用に関する。
【００１２】
第９の態様によれば、本発明は、対象産物を産生するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、対象ポリヌクレオチドの発現が許容される条件下で、第６の態様による安定化細胞集団を培養する工程を含んでなる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】レンチウイルスの生活環について模式的に示した図である。（上図）レンチウイルス感染の初期段階を示す（侵入、脱殻および逆転写）。逆転写の阻害は、ＩＤＬＶによる制限を表すバツ印で示す。（下図）逆転写産物の、直鎖、１−ＬＴＲおよび２−ＬＴＲの模式図を右に示す。後者の２つはウイルス性酵素による組込みの一般的な基質ではなく、それぞれＮＨＥＪおよびＨＲによって産生される。
【図２】ＬｅｎｔｉＳｏｍｅプラスミドおよびベクターの模式的な設計図である。（Ａ）シャトルｐＬＳプラスミドに含まれる基本エレメントを示す。ベクター内に保持されるレンチウイルスエレメントに並んで、転写ユニットは、それぞれ三角印および影付き四角で示されるＣＭＶ／ｐ５プロモーター（ｅＣ／ｐ５）およびレポーターカセットを含む。ベクターの３’側半分に位置する転写ユニットに関して、ｏｒｉおよびＳ／ＭＡＲ配列を示す。Ｓ／ＭＡＲは、Ｋｂｐによるサイズに従って命名される（詳細は本文を参照のこと）。
【図３Ａ】エピソーム複製に必要とされるエレメントの構造分析を示した図である。この図はプラスミドｐＬＳに対して行ったＳＩＤＤ分析を示しており、原核生物の配列を含まないプラスミド配列に従って、Ｇ（ｘ）をＫｃａｌ／ｍｏｌにより表す（本文を参照のこと）。対照コンストラクト（Ｏｒｉ／ＳＭＡＲ  ｌｅｓｓ）の図の上部に示すように、灰色の四角はシャトルレンチウイルスプラスミドに含まれるエレメントを区切るものである。Ｓ／ＭＡＲ配列に相当する領域を影付きの濃い青色で示す。Ｏｒｉ配列を黒色で示す。各コンストラクトの最小Ｇ（Ｘ）領域を影付きで強調した。
【図３Ｂ】図３Ａ参照
【図３Ｃ】図３Ａ参照
【図３Ｄ】図３Ａ参照
【図４】ｅＧＦＰ発現細胞をＦＡＣｓｏｒｔｅｒによって濃縮した後の、複製するＬｅｎｔｉＳｏｍｅのＨＥＫ２９３Ａ細胞における長期発現を示した図である。各パネルにおいてＬｅｎｔｉＳｏｍｅの組み合わせを試験した。エピソームの確立については、選択なしに培養を維持し（形質導入後５日）、表示する時点でＦＡＣＳ分析によりｅＧＦＰ＋細胞を計数した。各事例における番号と組み合わせ内容の割り当てについては図２を参照されたい。グラフ中の数字はＬＳ番号に一致する（説明文を参照のこと）。
【図５】ＨＥＫ２９３Ａ細胞においてエピソーム複製するＬｅｎｔｉＳｏｍｅのサザンブロット分析を示した図である。（Ａ）特異的なｎｅｏプローブ（左）およびＡＡＶＳ１遺伝子座に対するプローブとハイブリダイズした、表示するＬＳ形質導入細胞から得たゲノムＤＮＡの代表像を示す。（Ｂ）表示するクローンの形質導入後５日の、Ｈｉｒｔ法抽出物のサザンブロットを示す。右図の、ｐＬＳをプローブとしたＦＩＳＨ像（白丸）では、ＬＳ５を形質導入された細胞内に、多数のプラスミドおよび中間体がみられる。このような条件下でのサザンブロットは、陽性バンドを検出するために十分鋭敏である。
【図６】エピソーム複製するＬｅｎｔｉＳｏｍｅのＰＣＲ分析を示した図である。特異的プライマーを用いた２−ＬＴＲ  ｑＰＣＲを行うため、表示するＬＳの形質導入後、集団倍加数６９におけるｅＧＦＰ＋培養物のゲノムＤＮＡを用いた。２ＬＴＲのコピー数をゲノムＤＮＡのｑＰＣＲによって検出し、ＨＥＫ２９３Ａ細胞の単一コピー遺伝子であるアルブミン遺伝子に比較して標準化した。バックグラウンドのレベルは、形質導入していない親細胞（ＨＥＫ２９３Ａ）のサンプルによって得、陽性ＰＣＲ対照は、組込み可能なレンチウイルスを形質導入したサンプルによって得た。各培養で分析した細胞数の平均は、１０４であった。３回の独立した実験のうちの代表的なものを示し、１反応あたり３通りの複製の平均値を示す。
【図７Ａ】ＬＳを形質導入したＨＥＫ２９３Ａ細胞の、形質導入後５４日のＦＩＳＨ分析を示した図である。エピソーム複製するＬｅｎｔｉＳｏｍｅを有するｅＧＦＰ＋細胞の、分裂中期スプレッドの代表的な像である。二重の白点のほとんどは、セントロメア陽性の対照プローブ４ｑ１３．３によるものであり、ＬＳ配列は二重ではない点として検出される（拡大図を番号によって示す）。
【図７Ｂ】図７Ａ参照
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明者らは、レンチウイルスベクター内に、真核生物の複製開始点と、核マトリックスと会合する足場／マトリックス付着領域（Ｓ／ＭＡＲ）とを取り込ませることによって、インテグラーゼを介した細胞ゲノムへの組込みを阻止する変異を有するレンチウイルスベクターに基づいた、真核細胞の安定化された遺伝子組換えの系を開発した。本発明者らは、これらのエレメントをベクター内に取り込ませることで、レンチウイルスエピソームを複製し、娘細胞へ分離されることを可能にした。これによって、ウイルスタンパク質の介入なしに、静止状態の細胞および活発に分裂している細胞のどちらにも、導入遺伝子の安定的な発現が達成された（図４および表１を参照）。この戦略によって、先行技術にみられる同様の系よりもバイオセイフティーの高い発現系がもたらされる。
【００１５】
パッケージング細胞株と本発明者らが設計したレンチウイルスベクターとを共トランスフェクションすると、ベクターの、感染性の非組込み型レンチウイルス粒子へのパッケージングに必要なタンパク質の存在下で、標的細胞に導入遺伝子を安定的に発現させるために適した新型の非組込み型レンチウイルスの産生が可能になる。
【００１６】
本発明者らはさらに、レンチウイルスエピソームを安定的に確立するために、公知の真核生物の複製開始点とＳ／ＭＡＲのすべての組み合わせが同等に効率的ではないことを見出した。したがって、幾つかの組み合わせでは、対象遺伝子の有意な安定化発現をもたらすことのできないレンチウイルスが産生される（図４のＬＳ４、８および１２を参照）。
【００１７】
以前の知見に基づき、以下の発明態様と発展させた。
【００１８】
本発明によるポリヌクレオチド
第１の態様によれば、本発明は、
ポリヌクレオチドであって、
（ｉ）レンチウイルス由来の、第１長鎖末端反復配列と、
（ｉｉ）配列番号１の配列を有する複製開始点、配列番号２の配列を有する複製開始点、配列番号３の配列を有する複製開始点、およびそれらの機能的に等価な変異体からなる群より選択される、真核生物の複製開始点と、
（ｉｉｉ）配列番号４の配列を有する足場／マトリックス付着領域、配列番号５の配列を有する足場／マトリックス付着領域、配列番号６の配列を有する足場／マトリックス付着領域、およびそれらの機能的に等価な変異体からなる群より選択される、足場／マトリックス付着領域と、
（ｉｖ）前記レンチウイルス由来の、第２長鎖末端反復配列と
を含んでなり、
前記真核生物の複製開始点および前記足場／マトリックス付着領域が、前記第１長鎖末端反復配列と第２長鎖末端反復配列の間に配置されてなる、ポリヌクレオチドに関し、以下、このポリヌクレオチドを本発明のポリヌクレオチドと称する。
【００１９】
本明細書で用いられる用語「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の、一本鎖もしくは二本鎖ポリマーを指す。
【００２０】
第１長鎖末端反復配列
本発明のポリヌクレオチドの第１エレメントは、第１長鎖末端反復配列である。通常の逆転写過程では、レトロウイルスゲノムＲＮＡの５’（Ｒ−Ｕ５）および３’（Ｕ３−Ｒ）末端由来の配列がダイレクトリピート配列Ｒを通して融合し、複製して、末端反復配列を有する直鎖の二本鎖分子を形成する。続いて、感染した宿主細胞の染色体ＤＮＡの部位にこの分子が挿入されることによって、ウイルスＤＮＡは、新しいウイルスＲＮＡ分子を転写するための鋳型として機能する。
【００２１】
本明細書で用いられる用語「末端反復配列」または「ＬＴＲ」は、宿主ＤＮＡへのウイルスＤＮＡの組込みおよびウイルス遺伝子の発現を制御するレトロウイルスＲＮＡの逆転写によって合成されるＤＮＡの両端に位置する、数百塩基対の配列を指す。本明細書で用いられる際、ＬＴＲは、レトロウイルスＲＮＡの逆転写によって合成されるＤＮＡに見出されるＬＴＲのＤＮＡ配列、および前記ＬＴＲのＤＮＡ配列に相補的なＲＮＡ配列の両方を指す。５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲは、ウイルスＲＮＡの転写およびポリアデニル化の促進に役立つ。ＬＴＲは、ウイルスの複製に必要なその他のすべてのシス作用性配列を含む。各ＬＴＲには、Ｕ３、ＲおよびＵ５領域が含まれる。
【００２２】
用語「第１長鎖末端反復配列」または「第１ＬＴＲ」または「５’ＬＴＲ」は５’レンチウイルスＬＴＲを指し、ここで内在性配列の欠失および／もしくは変異ならびに／または異種性配列の付加によって、対応する未変性の５’ＬＴＲが改変されていてもよいか、または改変されていなくてもよい。５’ＬＴＲは天然のもの、または合成されたものであってよい。
【００２３】
本発明のポリヌクレオチドの第１ＬＴＲおよび第２ＬＴＲは、どちらもレンチウイルスに由来する。本明細書で用いられる用語「レンチウイルス」は、宿主のゲノム内に組み入れられる能力により、事実上ゆっくりと疾病を起こすレトロウイルスの群（または系統的には属）を指す。これらのウイルスとしては特に、１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）、２型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−２）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ヒツジのビスナウイルス（ＶＩＳＮＡ）およびヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）が挙げられる。好ましい実施形態によれば、レンチウイルスはＨＩＶである。したがって、特定の実施形態によれば、第１ＬＴＲおよび第２ＬＴＲはＨＩＶに由来する。
【００２４】
本明細書で用いられる用語「ヒト免疫不全ウイルス」または「ＨＩＶ」は、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２を含むことが意図される。「ＨＩＶ−１」は、１型ヒト免疫不全ウイルスを意味する。ＨＩＶ−１には、細胞外ウイルス粒子およびＨＩＶ−１感染細胞に関連するＨＩＶ−１の型が含まれるが、これらに限定されない。「ＨＩＶ−２」は、２型ヒト免疫不全ウイルスを意味する。ＨＩＶ−２には、細胞外ウイルス粒子およびＨＩＶ−２感染細胞に関連するＨＩＶ−２の型が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、ＨＩＶはＨＩＶ−１である。
【００２５】
好ましい実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドの第１ＬＴＲは、配列番号７に示す配列を含む。特定の実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドの第１ＬＴＲは、配列番号７に示す配列からなる。
【００２６】
真核生物の複製開始点
本発明のポリヌクレオチドは、真核生物の複製開始点を含む。本明細書で用いられる用語「真核生物の複製開始点」または「真核生物の複製起点」または「真核生物のｏｒｉ」は、真核生物においてそこから複製が開始される、特定のゲノム配列を指す。本明細書で用いられる用語「真核生物」は、原生生物界、真菌界、植物界および動物界を含む。
【００２７】
本発明のポリヌクレオチドの一部である真核生物の複製開始点は、配列番号１を有する複製開始点、配列番号２を有する複製開始点、または配列番号３を有する複製開始点およびそれらの機能的に等価な変異体からなる群より選択される。
【００２８】
配列番号１の配列を有する複製開始点は、Ａｌａｄｊｅｍら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，２７０：８１５−８１９）によって記載される、β−グロビン遺伝子の複製開始点に対応する。
【００２９】
配列番号２の配列を有する複製開始点は、Ｐｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３，２７８（２２）：１９６４９−５９によって記載される、サルＣＶ−１細胞およびヒト皮膚線維芽細胞から以前に単離されたアルファサテライト配列に関連する自己複製配列の共通配列に由来する。
【００３０】
配列番号３の配列を有する複製開始点は、ＭｃＷｉｎｎｅｙおよびＬｅｆｆａｋによって記載される（ＭｃＷｉｎｎｅｙ  Ｃ．ａｎｄ  Ｌｅｆｆａｋ  Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９０，１８（５）：１２３３−４２）、ヒトｃ−ｍｙｃプロモーター領域の複製開始点に対応する。
【００３１】
特定の実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１の配列を有する複製開始点、またはその機能的に等価な変異体を含む。
【００３２】
特定の実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２の配列を有する複製開始点、またはその機能的に等価な変異体を含む。
【００３３】
特定の実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号３の配列を有する複製開始点、またはその機能的に等価な変異体を含む。
【００３４】
本明細書で用いられる用語「機能的に等価な変異体」は、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の配列の複製開始点のいずれかの変異体を指し、この変異体の配列は、それが由来する配列と実質的に同一であり、かつ実質的に同じように機能する。本明細書で用いられる「実質的に同一」は、核酸配列が、それが由来する配列に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性の程度を有することを意味する。２つのポリヌクレオチド間の配列同一性の程度は、従来法によって、例えば当該技術分野において公知の標準的なアラインメントアルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ．Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０  Ｏｃｔ  ５；２１５：４０３−１０によって決定できる。好ましい実施形態によれば、配列同一性の程度は、ポリヌクレオチドの全長にわたって決定される。
【００３５】
好ましい実施形態によれば、配列番号２の配列を有する複製開始点の変異体は、以下の共通配列
【化１】
0006694386.tif 000002
を含み、ここで
ＭはＡまたはＣ、ＤはＡ、ＧまたはＴ、ＷはＡまたはＴ、ＫはＧまたはＴ、ＳはＣまたはＧ、ＢはＣ、ＧまたはＴ、ＹはＣまたはＴ、ＲはＡまたはＧ、ＨはＡ、ＣまたはＴを表す。
【００３６】
別の実施形態によれば、配列番号２の配列を有する複製開始点の変異体は、Ｐｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３，２７８：１９６４９−１９６５９）の表１に示される、Ａ６、Ａ７、Ａ１５、Ａ１６、Ａ１、Ａ５およびＡ３９からなる群より選択される配列を含む。
【００３７】
本明細書で用いられる用語「実質的に同じ機能」は、真核生物における複製の開始能を実質的に維持している変異体を意味する。当業者は、特定の変異体が、真核生物において複製を開始できるか否かをどのように決定するか、すなわち配列番号１、配列番号２または配列番号３の複製開始点が機能的に等価であるか否かをどのように決定するかについて承知している。特定の配列による複製の開始能は、当業者に公知のいずれかの適切な方法、例えば、ＤｐｎＩによる消化への抵抗性（Ｆｒａｐｐｉｅｒ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８７，８４：６６６８−７２）、最初期に標識された断片のアッセイ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１９９４，２０：１４７−１５２）ならびにブロモデオキシウリジンの取り込みおよび密度シフトに基づいた自律複製アッセイ（Ａｒａｕｊｏ  Ｆ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，上記；Ｆｒａｐｐｉｅｒ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，上記）によって決定できる。
【００３８】
足場／マトリックス付着領域
本発明のポリヌクレオチドは、足場／マトリックス付着領域を含む。本明細書で用いられる用語「足場／マトリックス付着領域」または「Ｓ／ＭＡＲ」は、長さ数百塩基対の非コンセンサス様ＡＴリッチＤＮＡエレメントを指し、これは、細胞核のタンパク質の足場またはマトリックスへ周期的に付着することによって、真核生物ゲノムの核ＤＮＡを約６０，０００クロマチンドメインにまとめるものである。足場／マトリックス付着領域は、典型的にはフランキング領域、クロマチン境界領域およびイントロンのような非コード領域に見出される。
【００３９】
本発明のポリヌクレオチドの一部を形成するＳ／ＭＡＲは、配列番号４の配列を有するＳ／ＭＡＲ、配列番号５の配列を有するＳ／ＭＡＲ、配列番号６の配列を有するＳ／ＭＡＲおよびそれらの機能的に等価な変異体からなる群より選択される。
【００４０】
配列番号４の配列を有するＳ／ＭＡＲは、Ｂｏｄｅらによって記載される（Ｂｏｄｅ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２，２５５：１９５−７）ヒトＩＦＮ−γ遺伝子の１．８ｋｂｐ  Ｓ／ＭＡＲ（ｈＩＦＮ−γｌａｒｇｅ）に対応する。
【００４１】
配列番号５の配列を有するＳ／ＭＡＲは、Ｒａｍｅｚａｎｉによって記載される（Ｒａｍｅｚａｎｉ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００３，１０１：４７１７−２４）ヒトＩＦＮ−γ遺伝子のＳ／ＭＡＲの０．７ｋｂｐ最小領域（ｈＩＦＮ−γｓｈｏｒｔ）に対応する。
【００４２】
配列番号６の配列を有するＳ／ＭＡＲは、Ｍｅｓｎｅｒ  Ｌ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，２００３，１００：３２８１−８６に記載されるヒトジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子のＳ／ＭＡＲの０．２ｋｂｐ最小領域（ｈＤＨＦＲ）に対応する。
【００４３】
特定の実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号４の配列を有するＳ／ＭＡＲまたはその機能的に等価な変異体を含む。
【００４４】
特定の実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号５の配列を有するＳ／ＭＡＲまたはその機能的に等価な変異体を含む。
【００４５】
特定の実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号６の配列を有するＳ／ＭＡＲまたはその機能的に等価な変異体を含む。
【００４６】
本明細書で用いられる用語「機能的に等価な変異体」は、配列番号４、配列番号５、または配列番号６の配列のＳ／ＭＡＲのいずれかの変異体を指し、この変異体の配列は、それが由来するＳ／ＭＡＲと実質的に相同であり、かつ実質的に同じように機能する。本明細書で用いられる「実質的に相同」は、核酸配列が、それが由来する配列に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性の程度を有することを意味する。
【００４７】
好ましい実施形態によれば、Ｓ／ＭＡＲの機能的に等価な変異体は、共に、または個別にＳ／ＭＡＲ機能に寄与するとされる、設定された６規則に基づいて選択される配列である（Ｋｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３３，３０５；Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２５，１４１９）。これらの規則は、ｈｔｔｐ；／／ｇｅｎｏｍｅｃｌｕｓｔｅｒ．ｓｅｃｓ．ｏａｋｌａｎｄ．ｅｄｕ／ＭＡＲ−Ｗｉｚにて無料で利用できるＭＡＲ−Ｗｉｚコンピュータプログラムと統合された。
【００４８】
本明細書で用いられる用語「実質的に同じ機能」は、それが由来するものと同じＳ／ＭＡＲの機能、特に、核マトリックスへの特異的な結合能を実質的に維持している変異体を意味する。当業者は、特定の変異体が核マトリックスへ特異的に結合できるか否かを、例えばＭｅｓｎｅｒらによって記載されるｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでのＭＡＲアッセイ（Ｍｅｓｎｅｒ  Ｌ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ，上記）を用いて、どのように決定するかについて承知している。別の実施形態によれば、特定の変異体にＤＮＡ鎖を離脱させる傾向がみられる場合、特異的配列は、本発明のＳ／ＭＡＲの変異体であるとみなすことができる。この性質は、平衡統計力学の方法に基づいた特定のプログラムを用いて決定できる。ストレス誘導二本鎖ＤＮＡ不安定化（ＳＩＤＤ）分析技術は、Ｂｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５８，５９７に以下のように定義される。「［…］与えた超らせんストレスが、ＤＮＡ配列に沿った各位置において二本鎖を開くために必要な自由エネルギーを減少させる程度を算出する。結果として示されるＳＩＤＤ特性では、強く不安定化された部位が深極小（ｄｅｅｐ  ｍｉｎｉｍａ）として観察される［…］」ＳＩＤＤ分析によって得たデータ（出力された表示の極小）は、実験的に決定された塩基対非形成領域によって実験的に実証されたか、または結合活性もしくはプラスミドベクター保持のようなＳ／ＭＡＲの機能的役割に相関していた。現時点で利用可能なデータは、相対的な結合強度の推定を十分に支持してはいないが、全体としてこれらのデータは、Ｓ／ＭＡＲとして機能する特色を有する部位のゲノム配列を探索するための、コンピュータによるいずれかの戦略にＳＩＤＤの特質を取り入れてもよいことを示唆している。ＳＩＤＤアルゴリズムおよび基本的な算出（Ｂｉ  ａｎｄ  Ｂｅｎｈａｍ（２００４）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２０，１４７７）ならびにＳＩＤＤ特性の分析は、ＷｅｂＳＩＤＤ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅｃｅｎｔｅｒ．ｕｃｄａｖｉｓ．ｅｄｕ／ｂｅｎｈａｍ）にて無料で利用できるインターネットリソースを用いて行うことができる。したがって別の実施形態によれば、前記ポリヌクレオチドは、これがＳ／ＭＡＲと同様のＳＩＤＤ特性を示した際にはＳ／ＭＡＲ配列の変異体とみなされる。
【００４９】
特定の実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１の配列を有する複製開始点またはその機能的に等価な変異体と、配列番号４の配列を有するＳ／ＭＡＲまたはその機能的に等価な変異体とを含む。
【００５０】
特定の実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１の配列を有する複製開始点またはその機能的に等価な変異体と、配列番号５の配列を有するＳ／ＭＡＲまたはその機能的に等価な変異体とを含む。
【００５１】
特定の実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１の配列を有する複製開始点またはその機能的に等価な変異体と、配列番号６の配列を有するＳ／ＭＡＲまたはその機能的に等価な変異体とを含む。
【００５２】
特定の実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２の配列を有する複製開始点またはその機能的に等価な変異体と、配列番号４の配列を有するＳ／ＭＡＲまたはその機能的に等価な変異体とを含む。
【００５３】
特定の実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２の配列を有する複製開始点またはその機能的に等価な変異体と、配列番号５の配列を有するＳ／ＭＡＲまたはその機能的に等価な変異体とを含む。
【００５４】
特定の実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２の配列を有する複製開始点またはその機能的に等価な変異体と、配列番号６の配列を有するＳ／ＭＡＲまたはその機能的に等価な変異体とを含む。
【００５５】
特定の実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号３の配列を有する複製開始点またはその機能的に等価な変異体と、配列番号４の配列を有するＳ／ＭＡＲまたはその機能的に等価な変異体とを含む。
【００５６】
特定の実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号３の配列を有する複製開始点またはその機能的に等価な変異体と、配列番号５の配列を有するＳ／ＭＡＲまたはその機能的に等価な変異体とを含む。
【００５７】
特定の実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号３の配列を有する複製開始点またはその機能的に等価な変異体と、配列番号６の配列を有するＳ／ＭＡＲまたはその機能的に等価な変異体とを含む。
【００５８】
特定のＳ／ＭＡＲはアデニンリッチ領域（ａｄｅｎｉｎ−ｒｉｃｈ  ｒｅｇｉｏｎ）を含んでいる。ポリヌクレオチド内にみられるアデニンリッチ領域は、転写／複製を途中で終止させ、不完全な転写物を生成する可能性があるため、ポリヌクレオチドの転写（ポリヌクレオチドがＤＮＡの場合）またはポリヌクレオチドの複製（ポリヌクレオチドがＲＮＡの場合）に対して有害である。したがって、Ｓ／ＭＡＲはいずれの配向においても活性を示す、すなわち可逆的な領域であるため、当業者は、Ｓ／ＭＡＲにアデニンリッチ領域が含まれる場合、Ｓ／ＭＡＲの一本の鎖のいずれのアデニンリッチ領域も、ポリヌクレオチド配列の転写に負の影響を与えないような配向にて、Ｓ／ＭＡＲを本発明のポリヌクレオチドに挿入することを理解するであろう。したがって、本発明のポリヌクレオチドが一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）または一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）である場合、前記ポリヌクレオチドは、アデニンリッチ領域を含むＳ／ＭＡＲの鎖の逆相補配列を含む。本発明のポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）である場合、アデニンリッチ領域を含むＳ／ＭＡＲの鎖が前記ｄｓＤＮＡのコード鎖の一部を形成しないように、Ｓ／ＭＡＲをポリヌクレオチドに挿入する。
【００５９】
本明細書で用いられる用語「一本鎖ＤＮＡ」または「ｓｓＤＮＡ」は、一本の鎖のみを含むＤＮＡポリヌクレオチドを指す。
【００６０】
本明細書で用いられる用語「一本鎖ＲＮＡ」または「ｓｓＲＮＡ」は、一本の鎖のみを含むＲＮＡポリヌクレオチドを指す。
【００６１】
本明細書で用いられる用語「二本鎖ＤＮＡ」または「ｄｓＤＮＡ」は、逆平行かつ実質的に相補性の、水素結合した２本のＤＮＡ鎖を含むＤＮＡポリヌクレオチドを指す。
【００６２】
本明細書で用いられる用語「アデニンリッチ領域」は、最も豊富なヌクレオチドがアデニンである、ポリヌクレオチドの領域を指す。好ましい実施形態によれば、アデニンリッチ領域はポリアデニン配列である。本明細書で用いられる用語「ポリアデニン配列」または「ｐｏｌｙＡ配列」は、連続した複数のアデノシン一リン酸を含むポリヌクレオチド配列を指す。
【００６３】
本明細書で用いられる用語「コード鎖」は、鋳型鎖に相補的なＤＮＡ鎖を指す。このようなコード鎖は、ｍＲＮＡと同じ塩基配列を有し（ｍＲＮＡではチミンがウラシルとなるが）、タンパク質に翻訳されるコドンに対応する。
【００６４】
さらに特定の実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドが配列番号６の配列を有するＳ／ＭＡＲまたはその機能的に等価な変異体を含む際、前記ポリヌクレオチドがｓｓＤＮＡまたはｓｓＲＮＡであれば、前記ポリヌクレオチドは、ｐｏｌｙＡ配列を含むＳ／ＭＡＲの鎖に逆相補的な配列を含む。
【００６５】
別のさらに特定の実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドが配列番号６の配列を有するＳ／ＭＡＲまたはその機能的に等価な変異体を含む際、前記ポリヌクレオチドがｄｓＤＮＡであれば、アデニンリッチ領域を含むＳ／ＭＡＲの鎖が前記ｄｓＤＮＡのコード鎖の一部を形成しないように、Ｓ／ＭＡＲを前記ポリヌクレオチドに挿入する。
【００６６】
第２長鎖末端反復配列
用語「第２長鎖末端反復配列」または「第２ＬＴＲ」または「３’ＬＴＲ」は３’レンチウイルスＬＴＲを指し、これは、内在性配列の欠失および／もしくは変異ならびに／または異種性配列の付加によって、対応する未変性の３’ＬＴＲが改変されていてもよいか、または改変されていなくてもよい。前記３’ＬＴＲは天然のもの、または合成されたものであってよい。
【００６７】
本発明のポリヌクレオチドの第２ＬＴＲは、第１ＬＴＲと同じレンチウイルスに由来する。特定の実施形態によれば、第２ＬＴＲはＨＩＶに由来する。
【００６８】
好ましい実施形態によれば、第２ＬＴＲは自己不活性化変異を含む。本明細書で用いられる用語「変異」は、核酸配列の変化を指す。前記変異には、置換（すなわち１つ以上のヌクレオチドと別のヌクレオチドとの交換。）、反転（すなわち遺伝子内のＤＮＡ断片が反転することである。このためには２つの１８０度回転が必要であり、１つは配列を反転させるため、もう１つはＤＮＡの極性を維持するためである。）、転座（すなわち遺伝子の断片の位置が、同じ遺伝子の別の異なる位置またはゲノムの別の部位に変わること。）およびヌクレオチドの挿入または欠失（すなわち１つ以上のヌクレオチドの付加（挿入もしくは付加）または１つ以上のヌクレオチドの欠損（欠失）であり、このために読み枠が変更される結果、非機能的タンパク質の形成から前記タンパク質の無形成までにわたる、翻訳の間に起こる読み取りエラーがもたらされる。）が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で用いられる用語「自己不活性化変異」は、ＬＴＲの転写促進能が、対応する未変性のＬＴＲに比較して減少する原因となる変異を指す。当業者は、ＬＴＲの転写促進能を、ＬＴＲのプロモーター活性を分析するいずれかの適切な技術、例えば、Ｚｕｆｆｅｒｅｙらによって記載されるアッセイ（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９８，７２：９８７３−８０）を用いた、ＬＴＲの内部プロモーターに由来するＲＮＡ産生量の決定によって、決定できる。用語「転写促進能の減少」は、変異ＬＴＲのプロモーター活性の、その未変性の対応物に比較したいずれかの有意な減少を意味し、例えば、変異ＬＴＲのプロモーター活性は、それに対応する未変性のＬＴＲに比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％減少している。自己不活性化（ＳＩＮ）レンチウイルスベクターの作製に有用なレンチウイルスのＬＴＲの変異は、当該技術分野において記載されている（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９８，７２：９８７３−９８８０）。
【００６９】
好ましい実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドがレンチウイルスベクター内に取り込まれる際、第２ＬＴＲに存在する自己不活性化変異は、前記ベクターの形質導入能に対し、対応する未変性のＬＴＲを含む等価なベクターに比較すると、影響をもたらさない。すなわち、ベクターが標的細胞へ移行する能力は基本的に影響を受けることなく残っている。当業者は、レンチウイルスベクターの形質導入能を、当該技術分野において公知のいずれかの技術、例えば、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．によって記載される方法（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，上記）を用いた、標的細胞内のベクターの力価を決定することによって、決定できる。
【００７０】
特定の実施形態によれば、変異は欠失である。
【００７１】
別の特定の実施形態によれば、変異はＬＴＲのＵ３領域に影響を及ぼす。本明細書で用いられる用語「ＬＴＲのＵ３領域」は、エンハンサーおよびプロモーターエレメントを含むＬＴＲの領域を指す。ＨＩＶ−１  ＬＴＲの特定の事例では、Ｕ３領域は、いわゆる負の応答エレメント、ＮＦκＢおよびＮＦ−ＡＴｃ結合部位、Ｓｐ１結合部位およびＴＡＴＡボックスのような、ＨＩＶ−１  ＬＴＲのプロモーター活性の制御に関与するすべての主要な決定要因を含む。
【００７２】
好ましい実施形態によれば、変異は第２ＬＴＲのＵ３領域における欠失である。ＬＴＲの転写促進能を減少させることのできるいずれのＵ３領域における欠失も、本発明のポリヌクレオチドに適しており、例えば、ＴＡＴＡボックスの欠失および／または１つ以上の転写因子の結合部位の欠失が挙げられる。さらに好ましい実施形態によれば、第２ＬＴＲのＵ３領域における欠失は、−４１８（５’）と−１８（３’）の間に位置する配列の欠失を含み、この番号は位置＋１のＲで始まるキャップ部位に対するヌクレオチドの位置を示す。特定の実施形態によれば、Ｕ３領域における欠失を含む第２ＬＴＲは、配列番号８の配列を含む。さらに特定の実施形態によれば、Ｕ３領域における欠失を含む第２ＬＴＲは、配列番号８の配列からなる。
【００７３】
本発明のポリヌクレオチドにおいて、真核生物の複製開始点およびＳ／ＭＡＲは、第１ＬＴＲと第２ＬＴＲの間に位置する。好ましい実施形態によれば、複製開始点はＳ／ＭＡＲの５’側に位置し、５’から３’へのポリヌクレオチドのエレメントの順序は、
−第１ＬＴＲ
−複製開始点
−Ｓ／ＭＡＲ
−第２ＬＴＲ
となる。
【００７４】
別の特定の実施形態によれば、Ｓ／ＭＡＲは複製開始点の５’側に位置し、５’から３’へのポリヌクレオチドのエレメントの順序は、
−第１ＬＴＲ
−Ｓ／ＭＡＲ
−複製開始点
−第２ＬＴＲ
となる。
【００７５】
特定の実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、
−マルチクローニング部位、
−プロモーターに作動的に連結する対象ポリヌクレオチド（ここで、前記プロモーターは、足場／マトリックス付着領域および複製開始点に対して５’側に位置し、第１長鎖末端反復配列に対して３’側に位置し、かつ前記対象ポリヌクレオチドは、足場／マトリックス付着領域に対して５’側または３’側に位置し、複製開始点に対して５’側または３’側に位置する）、および
−それらの組み合わせ
から選択されるポリヌクレオチド配列をさらに含んでなる。
【００７６】
特定の実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドはマルチクローニング部位を含む。本明細書で用いられる用語「マルチクローニング部位」は、一つの位置でポリヌクレオチドを切断できるように近接している幾つかの制限酵素標的部位を含むＤＮＡ断片を指す。したがって、前記制限酵素によるポリヌクレオチドの処理後には、適合した末端を有する対象遺伝子を挿入することが可能となり、前記末端は平滑末端、５’突出末端、または３’突出末端である。原則的には、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９などの型のベクターから得られるような、当該技術分野において公知の、いずれかのマルチクローニング部位の使用が可能である。対象ポリヌクレオチドの挿入は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋらによって記載される標準的な分子生物学の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；“ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，”Ｖｏｌｕｍｅｓ  ｌ  ａｎｄ  ＩＩ）を用いて行われる。マルチクローニング部位は、好ましくは少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の制限酵素標的部位を含み、各部位は少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも６ヌクレオチドによって形成される。
【００７７】
特定の実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、プロモーターへ作動的に連結する対象ポリヌクレオチドを含む。
【００７８】
本明細書で用いられる用語「プロモーター」は、１つ以上のポリヌクレオチド配列の上流に位置して、１つ以上のポリヌクレオチドの転写を制御するために機能する核酸断片を指し、この核酸断片は、ＤＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼ結合部位、転写開始部位、ならびに限定はされないが、転写因子結合部位、抑制因子および活性化因子タンパク質結合部位を含むその他のいずれかのＤＮＡ配列、およびプロモーターからの転写量を直接的または間接的に調節することが当該技術分野において公知である、その他のいずれかのヌクレオチド配列の存在によって構造的に同定される。前記プロモーターは、恒常性または誘導性のいずれかであってよい。「恒常性プロモーター」は、ほとんどの生理的および発生的な条件下で活性のあるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、生理的または発生的な条件に依存して調節されるプロモーターである。「組織特異的」プロモーターは、分化した細胞／組織の特定の型においてのみ活性を有する。好ましい実施形態によれば、プロモーターはウイルスプロモーターであり、さらに好ましくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来するプロモーターである。用語「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」は、パルボウイルス科のディペンドウイルス属に属するウイルスを指す。さらに特定の実施形態によれば、ＡＡＶに由来するプロモーターはｐ５プロモーターまたはその機能的に等価な変異体である。本明細書で用いられる用語「ｐ５プロモーター」は、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ７８の発現を制御するＡＡＶのプロモーターを指す（Ｙｕｅ  Ｙ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２０１０，２１（６）：７２８−３８）。さらに特定の実施形態によれば、ＡＡＶに由来するプロモーターは、配列番号９の配列を含む。さらに特定の実施形態によれば、ＡＡＶに由来するプロモーターは、配列番号９の配列からなる。特定の実施形態によれば、前記プロモーターはｐ５プロモーターの機能的に等価な変異体である。用語「機能的に等価な変異体」がｐ５プロモーターに関連して用いられる際、この用語は、ｐ５プロモーターと実質的に相同であり、かつ実質的に同じように機能する変異体を指す。用語「実質的に相同」については既に定義した。ｐ５プロモーターと実質的に同じように機能する変異体とは、前記変異体の下流に位置する対象ポリヌクレオチドの発現を制御できる変異体である。
【００７９】
本明細書で用いられる用語「機能的に連結する」は、対象ポリヌクレオチドに対するプロモーター配列の機能的関係および位置を指す（例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響を与える場合、コード配列へ機能的に連結する）。一般に、機能的に連結するプロモーターは、対象配列に隣接する。しかしながらエンハンサーは、対象配列の発現を制御するために、対象配列に隣接する必要はない。
【００８０】
本発明のポリヌクレオチドが、プロモーターへ作動的に連結する対象ポリヌクレオチドを含む際、前記ポリヌクレオチドの構成要素は以下のように配置される。
−プロモーターは、
Ｓ／ＭＡＲおよび複製開始点の上流、すなわちＳ／ＭＡＲおよび複製開始点に対して５’側、かつ
第１ＬＴＲの下流、すなわち第１ＬＴＲに対して３’側に位置し、
−対象ポリヌクレオチドは、
Ｓ／ＭＡＲの上流または下流、すなわちＳ／ＭＡＲに対して５’側または３’側、かつ
複製開始点の上流または下流、すなわち複製開始点に対して５’側または３’側に位置する。
【００８１】
特定の実施形態によれば、プロモーターへ作動的に連結する対象ポリヌクレオチドを含む本発明のポリヌクレオチドは、前記プロモーターへ作動的に連結するエンハンサー領域をさらに含む。本明細書で用いられる用語「エンハンサー」は、そこへ転写因子が結合して遺伝子の転写を増大させる、ＤＮＡ配列エレメントを指す。さらに特定の実施形態によれば、前記エンハンサー領域は、サイトメガロウイルスプロモーターのエンハンサー領域である。さらに特定の実施形態によれば、前記サイトメガロウイルスプロモーターのエンハンサー領域は、配列番号１０の配列を含む。さらに特定の実施形態によれば、前記サイトメガロウイルスプロモーターのエンハンサー領域は、配列番号１０の配列からなる。
【００８２】
本明細書で用いられる用語「対象ポリヌクレオチド」は、その細胞内での発現が望ましい、いずれかのポリヌクレオチドを指す。対象ポリヌクレオチドはポリペプチドもしくはタンパク質をコードする遺伝子であってよいか、または、いったん転写され、ｍＲＮＡとハイブリダイズしてその発現を阻害できるＲＮＡ、例えばマイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを産生するポリヌクレオチドであってもよい。特定の実施形態によれば、対象ポリヌクレオチドは、選択遺伝子、対象タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびそれらの組み合わせから選択される。
【００８３】
本明細書で用いられる用語「選択遺伝子」は、その発現が抗生物質への耐性を与える遺伝子、培地には含まれない必須栄養素の合成を可能にする遺伝子、または前記選択遺伝子を取り込んだ細胞に選択的利点を与える遺伝子を指す。
【００８４】
好ましい実施形態によれば、前記選択遺伝子は、抗生物質への耐性を与えるタンパク質をコードする遺伝子、例えば、ハイグロマイシンへの耐性を与えるタンパク質をコードする遺伝子、ネオマイシンへの耐性を与えるタンパク質をコードする遺伝子、ピューロマイシンへの耐性を与えるタンパク質をコードする遺伝子などである。さらに好ましい実施形態によれば、前記選択遺伝子は、ネオマイシンへの耐性を与えるタンパク質をコードする。
【００８５】
あるいは、前記選択遺伝子は、培地には含まれない必須栄養素の合成を可能にする遺伝子である。一例として、トリプトファン合成酵素のベータサブユニットをコードする、大腸菌のｔｒｐＢ遺伝子が挙げられる。この遺伝子によって、トリプトファンの代わりにインドールを含む培地中での哺乳類細胞の生存および増殖が可能になる。第二の例として、Ｌ−ヒスチジノール＋Ｌ−ヒスチジンの、２段階におけるＮＡＤ依存性の酸化を触媒するヒスチジノール脱水素酵素をコードする、ネズミチフス菌のｈｉｓＤ遺伝子が挙げられる。ヒスチジンを含まず、ヒスチジノールを含む培地中では、ｈｉｓＤ産物を発現する哺乳類細胞のみが生存できる（Ｈａｒｔｍａｎ  ＳＣ  ａｎｄ  ＲＣ  Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９８８，８５（２１）：８０４７−５１）。
【００８６】
それを取り込んだ細胞に選択的利点を与える選択遺伝子の一例としては、ＤＨＦＲを欠損するように遺伝的に改変された細胞における、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）をコードする遺伝子が挙げられる。ＤＨＦＲタンパク質は、プリン代謝の重要な段階である、５，６−ジヒドロ葉酸から５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸への還元を触媒する。ＤＨＦＲの使用は、プリン前駆体であるヒポキサンチンおよびチミジン（ＨＴ）の非存在下でＤＨＦＲ欠損細胞を増殖させることにより、これらの細胞の遺伝的選択を可能にする（ＲＪ  Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  ＰＡ  Ｓｈａｒｐ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、１９８２、１５９：６０１−２１）。
【００８７】
本明細書で用いられる用語「対象タンパク質」は、その細胞内での発現が望ましい、いずれかのタンパク質を指す。特定の実施形態によれば、対象タンパク質は蛍光タンパク質、好ましくは緑色蛍光タンパク質、すなわちＧＦＰである。本明細書で用いられる用語「蛍光タンパク質」は、適切な波長の電磁放射線によって励起させた際、固有の蛍光を発するタンパク質を指す。代表的な蛍光タンパク質としては、ｓｇＧＦＰ、ｓｇＢＦＰ、青色シフトＧＦＰであるＢＦＰ（Ｙ６６Ｈ）、青色蛍光タンパク質、ＣＦＰ−−シアン蛍光タンパク質、シアンＧＦＰ、ＤｓＲｅｄ、単量体ＲＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ＥＧＦＰ、ＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）、赤色シフトＧＦＰ（ｒｓＧＦＰ）、非ＵＶ励起野生型ＧＦＰ（ｗｔＧＦＰ）、ＵＶ励起野生型ＧＦＰ（ｗｔＧＦＰ）、ＧＦＰｕｖ、ＨｃＲｅｄ、ｒｓＧＦＰ、サファイアＧＦＰ、ｓｇＢＦＰ（商標）、ｓｇＢＦＰ（商標）（スーパーグローＢＦＰ）、ｓｇＧＦＰ（商標）、ｓｇＧＦＰ（商標）（スーパーグローＧＦＰ）、ｗｔＧＦＰ、黄色ＧＦＰおよびＹＦＰが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態によれば、蛍光タンパク質はＧＦＰである。
【００８８】
本明細書で用いられる用語「緑色蛍光タンパク質」または「ＧＦＰ」は、２６．９ｋＤａの分子量を有する２３９アミノ酸のタンパク質を指し、このタンパク質を紫外青色光に曝露すると、明るい緑色の蛍光を発する。その他の多くの海洋生物も同様の緑色蛍光タンパク質を有しているが、伝統的に、ＧＦＰとは最初にオワンクラゲから分離されたタンパク質を指す。オワンクラゲに由来するＧＦＰの最大励起波長は３９５ｎｍであり、第二励起波長は４７５ｎｍである。その最大放射波長は５０９ｎｍである。ＧＦＰの蛍光量子収率は０．７９である。オワンクラゲにおいて、ＧＦＰは、イクオリンの青い化学発光をエネルギー移動によって緑蛍光へ変換する。
【００８９】
あるいは、またはそれに加えて、対象タンパク質は、本発明のポリヌクレオチドを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける前記タンパク質の発現のため、または前記タンパク質の発現を必要とする疾病の治療のために用いることができるような、治療用タンパク質であってもよい。したがって本発明は、限定はされないが、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、レプチン、コルチコトロピン放出ホルモン（ＣＲＨ）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、サイロトロピン放出ホルモン（ＴＲＨ）、プロラクチン放出ホルモン（ＰＲＨ）、メラトニン放出ホルモン（ＭＲＨ）、プロラクチン抑制ホルモン  （ＰＩＨ）、ソマトスタチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、ソマトトロピンまたは成長ホルモン（ＧＨ）、黄体ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、サイロトロピン（ＴＳＨまたは甲状腺刺激ホルモン）、プロラクチン、オキシトシン、抗利尿ホルモン（ＡＤＨまたはバソプレシン）、メラトニン、ミュラー管抑制因子、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、ガストリン、コレシストキニン（ＣＣＫ）、セクレチン、インスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様増殖因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵ポリペプチド（ＰＰ）、レプチン、ニューロペプチドＹ、レニン、アンジオテンシンＩ、アンジオテンシンＩＩ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、組織因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子、トロンビン、第Ｖ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン８（ＩＬ−８およびケモカイン）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン１６（ＩＬ−１６）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン２４（ＩＬ−２４）、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、ＣＤ３、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、ケモカイン（ＲＡＮＴＥＳ  １α、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βが挙げられる）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−ベータ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦおよびＫＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦなど）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、グリア細胞増殖因子、ケラチノサイト増殖因子、内皮増殖因子、アルファ−１  アンチトリプシン、腫瘍壊死因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、カルジオトロフィン１（ＣＴ−１）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、アンフィレギュリン（ＡＲ）、シクロスポリン、フィブリノーゲン、ラクトフェリン、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、キモトリプシン、免疫グロブリン、ヒルジン、ジスムターゼスーパーオキシド、イミグルセラーゼ、β−グルコセレブロシダーゼ、α−Ｌ−グリコシダーゼ−α、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート−２−スルファターゼ、ガルスルファーゼ、ヒトα−ガラクトシダーゼＡ、α−１プロテイナーゼ阻害剤、ラクターゼ、膵酵素（リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ）、アデノシンデアミナーゼ、免疫グロブリン、アルブミン、Ａ型およびＢ型ボツリヌス毒素、コラゲナーゼ、ヒトデオキシリボヌクレアーゼＩ、ヒアルロニダーゼ、パパイン、Ｌ−アスパラギナーゼ、レピルジン、ストレプトキナーゼ、その内容が参照によって本明細書に取り込まれる国際公開第０３３１１５５号、第２００５１９２４４号および第０３９３２９３号などに記載されるトランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）阻害ペプチド、ＲＮＡ分子転写への干渉に適した発現カセット（ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、改変Ｕ１リボヌクレオタンパク質ＲＮＡ）を含む治療用タンパク質、をコードする１つ以上の対象ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。
【００９０】
特定の実施形態によれば、対象ポリヌクレオチドは選択遺伝子であり、好ましくは抗生物質への耐性を与えるタンパク質をコードする選択遺伝子、さらに好ましくはネオマイシンへの耐性を与えるタンパク質をコードする遺伝子である。
【００９１】
別の特定の実施形態によれば、対象ポリヌクレオチドは、対象タンパク質をコードするポリヌクレオチド、さらに好ましくは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするポリヌクレオチドである。
【００９２】
一つの実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、第１の対象ポリヌクレオチドと第２の対象ポリヌクレオチドを含む。この場合、第１および第２の対象ポリヌクレオチドは同じプロモーターへ作動的に連結してよいか、または各対象ポリヌクレオチドは、同じであるかまたは異なってよい別々のプロモーターへ作動的に連結してもよい。上に述べたいずれのプロモーターも、第１の対象ポリヌクレオチドおよび第２の対象ポリヌクレオチドの発現の調節に有用であり得る。
【００９３】
さらに好ましい実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、第１の対象ポリヌクレオチドと第２の対象ポリヌクレオチドとを含み、第２の対象ポリヌクレオチドは、同時翻訳性自己プロセシング配列をコードする配列によって、第１の対象ポリヌクレオチドへ作動的に連結する。用語「作動的に連結する」については既に定義した。本明細書で用いられる用語「同時翻訳性自己プロセシング配列」は、翻訳中に、成長しているタンパク質からそれ自体を分離するように指示するポリペプチド配列を指す。特定の実施形態によれば、同時翻訳性自己プロセシング配列は「シス作用性ヒドロラーゼエレメント」または「ｃｈｙｓｅｌエレメント」である。用語「シス作用性ヒドロラーゼエレメント」または「ｃｈｙｓｅｌエレメント」は小ペプチド（通常１９ないし３３アミノ酸）であり、その翻訳中にリボゾームの出口トンネルと相互作用して、このペプチドのＣ末端の最後のペプチド結合の「スキッピング」を誘導する小ペプチドを指す。Ｃｈｙｓｅｌエレメントは、ＦＭＤＶのようなある種のピコルナウイルスに見出され、これによって、同時翻訳性の、自己プロセシングを行うポリタンパク質が迅速に実現できる。２つの遺伝子の間に挿入した際、ｃｈｙｓｅｌエレメントはその翻訳中に「スキッピング」を誘導し、その後、リボゾームは第２の遺伝子の翻訳を続けるため、別々の２つのタンパク質が産生される。限定はされないが、ｃｈｙｓｅｌエレメントの実例として、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルスのＴ２Ａ、ブタテッショウウイルス−１のＰ２Ａ、ウマ鼻炎ＡウイルスのＦ２ＡまたはＥ２Ａが挙げられる。特定の実施形態によれば、シス作用性ヒドロラーゼエレメントは、ブタテッショウウイルス由来である。さらに特定の実施形態によれば、同時翻訳性自己プロセシング配列をコードする配列は、配列番号１１の配列を含む。さらに特定の実施形態によれば、同時翻訳性自己プロセシング配列をコードする配列は、配列番号１１からなる。
【００９４】
特定の実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは対象タンパク質をコードするポリヌクレオチド、さらに好ましくはＧＦＰをコードするポリヌクレオチドである第１の対象ポリヌクレオチドと、好ましくは選択遺伝子、さらに好ましくは抗生物質への耐性を与えるタンパク質をコードする遺伝子、さらになお好ましくはピューロマイシンへの耐性を与えるタンパク質をコードする遺伝子である第２の対象ポリヌクレオチドとを含み、第１の対象ポリヌクレオチドと第２の対象ポリヌクレオチドとは、同時翻訳性自己プロセシング配列によって、好ましくはブタテッショウウイルス由来のシス作用性ヒドロラーゼエレメントによって、さらに好ましくは配列番号１１の配列によって作動的に連結する。
【００９５】
本発明のポリヌクレオチドは、組換えレンチウイルスを作製するための第三世代システムの一部として、トランスファープラスミド作製のために用いることができる。したがって、本発明のポリヌクレオチドは、複製が不可能なレンチウイルスを産生するために必要なすべてのウイルスプロセシングエレメント、ならびにウイルス力価および全体的なベクター機能を改善するためのエレメントを含んでよい。
【００９６】
したがって特定の実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、レンチウイルス由来のプライマー結合部位配列をさらに含んでなり、
ここで、前記プライマー結合部位配列が、第１ＬＴＲに対して３’側に位置し、複製開始点およびＳ／ＭＡＲに対して５’側に位置し、かつ
前記ポリヌクレオチドが、
−マルチクローニング部位、
−プロモーターに作動的に連結する対象ポリヌクレオチド（ここで、前記プロモーターは、Ｓ／ＭＡＲおよび複製開始点に対して５’側に位置し、第１ＬＴＲに対して３’側に位置し、かつ前記対象ポリヌクレオチドは、Ｓ／ＭＡＲに対して５’側または３’側に位置し、複製開始点に対して５’側または３’側に位置する）、および
−それらの組み合わせ
から選択されるポリヌクレオチド配列をさらに含む場合、
前記プライマー結合部位は、前記ポリヌクレオチド配列に対して５’側に位置する。
【００９７】
本明細書で用いられる用語「プライマー結合部位配列」または「ＰＢＳ配列」は、逆転写のｔＲＮＡプライマーが結合するポリヌクレオチド配列を指す。特定の実施形態によれば、ＰＢＳ配列はＨＩＶに由来する。さらに特定の実施形態によれば、ＨＩＶ由来のＰＢＳ配列は、配列番号１２の配列を含む。さらに特定の実施形態によれば、ＨＩＶ由来のＰＢＳ配列は、配列番号１２の配列からなる。
【００９８】
特定の実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、第１ＬＴＲと第２ＬＴＲの間に位置する、レンチウイルス由来のパッケージングシグナル配列をさらに含む。本明細書で用いられる用語「パッケージングシグナル配列」は、ウイルスＲＮＡをウイルス粒子内に被包するカプシド形成を可能にするポリヌクレオチド配列を指す。特定の実施形態によれば、パッケージングシグナル配列は、ＨＩＶ由来のψ配列である。さらに特定の実施形態によれば、ＨＩＶ由来のパッケージングシグナル配列は、配列番号１３の配列を含む。さらに特定の実施形態によれば、ＨＩＶ由来のパッケージングシグナル配列は、配列番号１３の配列からなる。好ましい実施形態によれば、パッケージングシグナル配列は、第１ＬＴＲの近傍に位置する。別の好ましい実施形態によれば、パッケージングシグナル配列は、第２ＬＴＲの近傍に位置する。
【００９９】
特定の実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、第１ＬＴＲと第２ＬＴＲの間に位置する、レンチウイルス由来のＲｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）をさらに含む。本明細書で用いられる用語「Ｒｅｖ応答エレメント」または「ＲＲＥ」は、スプライシングされていないウイルスＲＮＡの核外への輸送を増大させて、ウイルス力価を上昇させる、ポリヌクレオチド配列を指す。特定の実施形態によれば、ＲＲＥはＨＩＶに由来する。さらに特定の実施形態によれば、ＨＩＶ由来のＲＲＥは、配列番号１４の配列を含む。さらに特定の実施形態によれば、ＨＩＶ由来のＲＲＥは、配列番号１４の配列からなる。特定の実施形態によれば、ＲＲＥは、スプライスドナー部位とスプライスアクセプター部位の間に位置する。本明細書で用いられる用語「スプライスドナー部位」または「ＳＤ」は、イントロンの５’末端に存在して、イントロンの開始と、先行するコード配列またはエクソンとの境界を標識する核酸配列またはドメインを指す。本明細書で用いられる用語「スプライスアクセプター部位」または「ＳＡ」は、イントロンの３’末端に存在して、イントロンの開始と、続くコード配列（エクソン）との境界を標識する核酸配列またはドメインを指す。特定の実施形態によれば、ＳＤは、ＨＩＶ−１ゲノム内のｇａｇ遺伝子の５’スプライス部位である。特定の実施形態によれば、ＡＤは、ＨＩＶ−１ゲノム内のｐｏｌ遺伝子の３’スプライス部位である。ＨＩＶ−１ゲノムのＳＤおよびＡＤについての詳細は、例えばＫａｍｍｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００６，３：８９を参照されたい。
【０１００】
特定の実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、レンチウイルス由来のセントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ）をさらに含んでなり、ここで前記セントラルポリプリン配列（ｃｅｎｔｒａｌ  ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ  ｔｒａｃｔ）は第１ＬＴＲに対して３’側に位置し、複製開始点およびＳ／ＭＡＲに対して５’側に位置し、前記ポリヌクレオチドが、
−マルチクローニング部位、
−Ｓ／ＭＡＲおよび複製開始点に対して５’側に位置し、第１ＬＴＲに対して３’側に位置するプロモーターへ作動的に連結する対象ポリヌクレオチドであって、
Ｓ／ＭＡＲに対して５’側または３’側に位置し、かつ複製開始点に対して５’側または３’側に位置する対象ポリヌクレオチド、および
−それらの組み合わせ
から選択されるポリヌクレオチド配列をさらに含む場合、
前記セントラルポリプリン配列は、前記ポリヌクレオチド配列に対して５’側に位置する。本明細書で用いられる用語「セントラルポリプリン配列」または「ｃＰＰＴ」は、細胞感染の間に、ウイルスゲノムの核への移入を増大させるセントラルＤＮＡフラップを形成して、形質導入をさらに効率的なものとするポリヌクレオチド配列を指す。特定の実施形態によれば、ｃＰＰＴはＨＩＶに由来する。さらに特定の実施形態によれば、ＨＩＶ由来のｃＰＰＴは、配列番号１５の配列を含む。さらに特定の実施形態によれば、ＨＩＶ由来のｃＰＰＴは、配列番号１５の配列を含む。
【０１０１】
特定の実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、ＰＢＳ配列、パッケージングシグナル配列、ＲＲＥおよびｃＰＰＴを含み、好ましくは配列番号１２のＰＢＳ配列、配列番号１３のパッケージングシグナル配列、配列番号１４のＲＲＥおよび配列番号１５のｃＰＰＴを含む。
【０１０２】
本発明のポリヌクレオチドはまた、原核生物への伝播に必要なエレメントも含み得る。したがって、特定の実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、原核生物の複製開始点および選択マーカーをさらに含む。本明細書で用いられる用語「原核生物の複製開始点」は、原核生物において複製が開始される特定の配列を指す。限定はされないが、原核生物の複製開始点の実例として、大腸菌のｐＢＲ３２２に由来するｐＵＣ複製開始点、サルモネラ由来のｐＳＣ１０１およびｐ１５Ａ由来の１５Ａ複製開始点が挙げられる。本明細書で用いられる用語「原核生物」は、細菌および古細菌の範囲を含む。特定の実施形態によれば、原核生物の複製開始点は、ｐＵＣベクターの複製開始点である。さらに特定の実施形態によれば、原核生物の複製開始点は、配列番号１６の配列を含む。さらに特定の実施形態によれば、原核生物の複製開始点は、配列番号１６の配列からなる。用語「選択マーカー」については、上記の詳しい説明が同じく適用される。特定の実施形態によれば、選択マーカーは、抗生物質への耐性を与えるタンパク質をコードする遺伝子である。さらに特定の実施形態によれば、抗生物質への耐性を与えるタンパク質をコードする選択マーカーは、アンピシリンへの耐性を与えるタンパク質をコードする遺伝子である。
【０１０３】
本発明によるベクター
別の態様によれば、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターに関し、以下これを本発明のベクターと称する。本明細書で用いられる用語「ベクター」は、１つ以上の対象ポリヌクレオチドを宿主細胞内に送達可能で、かつ任意に発現可能なコンストラクトを指す。ベクターの例としては、ウイルスベクター、ネイキッドＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、陽イオン性縮合試薬と会合したＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソーム内に被包されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、および産生細胞のような特定の真核細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、クローニングベクターまたは発現ベクターであってよい。本明細書で用いられる用語「クローニングベクター」は、伝播に適し、かつベクターの精製に適した様々な異種生物において十分なポリヌクレオチドまたは遺伝子コンストラクトまたは発現ベクターを得るために適したベクターを指す。本明細書で用いられる用語「発現ベクター」は、標的細胞内でのポリヌクレオチドの発現に適したベクターを指す。本発明の発現ベクターはレンチウイルスベクターである。本明細書で用いられる用語「レンチウイルスベクター」は、細胞内での転写および翻訳後に、レンチウイルス遺伝子であるｇａｇ、ｐｏｌ、ｒｅｖ、およびエンベロープウイルスタンパク質をコードする遺伝子の発現によって、新しい細胞への感染能をもつウイルス粒子が産生されるために必要な配列を含む核酸配列を指す。
【０１０４】
本発明のベクターは、当該技術分野において広く知られている技術を用いて得ることができる。以下の文献を参照されたい。Ｂｒｏｗｎ  Ｔ，“Ｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”（Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＧＢ，１９９５）；Ｗａｔｓｏｎ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ”，２ｎｄ  Ｅｄ．（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳ，１９９２）；Ａｌｂｅｒｔｓ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ”（Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳ，２００８）；Ｉｎｎｉｓ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，“ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳ，１９９０）；Ｅｒｌｉｃｈ  Ｈ，Ｅｄ．，“ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ”（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳ，１９８９）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ＵＳ，１９８９）；Ｂｉｓｈｏｐ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＧＢ，１９８７）；Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ  Ｗ，Ｅｄ．，“Ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ，ＭＡ，ＵＳ，１９８７）；Ｄａｖｉｓ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳ，１９８６），Ｓｃｈｌｅｅｆ  Ｍ，Ｅｄ．，“Ｐｌａｓｍｉｄ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ”（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，ＤＥ，２００１）
【０１０５】
本発明による細胞
本発明のポリヌクレオチドおよび前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、前記ポリヌクレオチドまたはベクターによって形質転換される、前記ポリヌクレオチドまたはベクターをトランスフェクトされる、または前記ポリヌクレオチドまたはベクターに感染することが可能な細胞を形質転換するため、前記細胞にトランスフェクトするため、または前記細胞を感染させるために用いることができる。したがって別の態様によれば、本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のヌクレオチドを含むベクターを含む細胞に関する。以下、この細胞を本発明の細胞と称する。
【０１０６】
本発明の細胞は、単離され、人工リポソーム内に取り込まれたか、または本発明のベクターの一部を形成している本発明のポリヌクレオチドを用い、感染、形質導入、トランスフェクション、エレクトロポレーションおよび形質転換のような当業者に公知の技術によって、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターを細胞内に導入することによって得られる。
【０１０７】
本発明の細胞は、原核生物の細胞（原核細胞）または真核生物の細胞（真核細胞）であってよい。用語「原核生物の」および「真核生物の」については既に定義した。特定の実施形態によれば、本発明の細胞は真核細胞である。さらに特定の実施形態によれば、前記真核細胞はパッケージング細胞、すなわち本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のレンチウイルスベクターをトランスフェクトすることによって組換えウイルスベクターの産生を可能にする細胞である。特定の実施形態によれば、前記パッケージング細胞はヒト胎児腎細胞株２９３（ＨＥＫ２９３）である。さらに特定の実施形態によれば、前記パッケージング細胞は、ＳＶ４０ラージＴ抗原を含むヒト胎児腎細胞株２９３（ＨＥＫ２９３Ｔ）である。
【０１０８】
本発明の組換えレンチウイルスおよびこれを産生するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法
本発明のポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドを含むベクターは、前記ポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドを含むベクターを、レンチウイルス遺伝子であるｇａｇ、ｐｏｌ、ｒｅｖの産物、およびエンベロープウイルスタンパク質を発現する細胞へトランスフェクトすることによって、組換えレンチウイルスを作製するために用いることができる。
【０１０９】
したがって別の態様によれば、本発明は、本発明のポリヌクレオチドと、ウイルスゲノムの細胞ゲノム内への組込みに対する前記インテグラーゼの触媒作用を不可能にする変異を含むレンチウイルスインテグラーゼとを含む、組換えレンチウイルスに関する。以下、これを本発明の組換えレンチウイルスと称する。
【０１１０】
本明細書で用いられる用語「組換えレンチウイルス」は、少なくとも１つの異種性ポリヌクレオチドを含むレンチウイルスを指す。用語「レンチウイルス」については既に定義した。
【０１１１】
本明細書で用いられる用語「レンチウイルスインテグラーゼ」は、明確に同定できる３つのドメイン、すなわちＮ末端ドメインおよびＤＮＡ結合に関わるＣ末端ドメイン、ならびにこれらに隣接するセントラル触媒コアドメインを有することによって特徴付けられる、レンチウイルス、特にＨＩＶ−１ウイルスの、ｉｎｔ領域の遺伝子産物を指す。ほとんどのレトロウイルスインテグラーゼの単鎖ポリペプチドは、おおよそ２９０残基を含むが、いくつかの重要な変動がある。例えば、ＰＦＶインテグラーゼは有意に長い３９２残基を含み、またＡＳＶインテグラーゼは３２３アミノ酸長のタンパク質としてコードされるが、翻訳後に、完全な酵素活性のある２８６残基からなる最終ポリペプチドへとプロセシングされる。特にＨＩＶ−１ウイルスのインテグラーゼは、ウイルスのｉｎｔ領域の遺伝子産物であり、２８８アミノ酸を有し、ＩＮと命名されている。特定の実施形態によれば、レンチウイルスインテグラーゼは、ウイルスゲノムの細胞ゲノム内への組込みに対する前記インテグラーゼの触媒作用を不可能にする変異を含むＨＩＶ−１インテグラーゼである。本明細書で用いられる用語「ＨＩＶ−１インテグラーゼ」は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース（２０１３年１０月１６日発表のバージョン２７）において受託番号Ｃ７Ｂ８Ｉ１として定義される、ＨＩＶ−１インテグラーゼポリペプチドのプロセシングされた成熟型を指す。用語「ＨＩＶ−１インテグラーゼ」はまた、ウイルスの別の系統または分離株に由来するＨＩＶ−１インテグラーゼに対しても用いられる。多くのＨＩＶ−１インテグラーゼの核酸およびアミノ酸配列が公開されており、容易に利用可能である。ＨＩＶ配列データベース、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｉｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ／ＨＩＶ／ｍａｉｎｐａｇｅ．ｈｔｍｌおよびロスアラモスＨＩＶデータベースと概要、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｉｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／を参照されたい。
【０１１２】
本発明の組換えレンチウイルスのレンチウイルスインテグラーゼは、ウイルスゲノムの細胞ゲノム内への組込みに対する前記インテグラーゼの触媒作用を不可能にする変異を有する。好ましい実施形態によれば、前記変異はＩ型変異、すなわち組込みに直接影響を及ぼす変異であり、これとは反対にＩＩ型変異は、ウイルス粒子の形態形成および／または逆転写に影響を及ぼす多面的な欠陥を引き起こす。限定はされないが、Ｉ型変異の実例として、インテグラーゼの触媒コアドメインに関連する３つの残基、すなわちＤＸ３９−５８ＤＸ３５Ｅ（ＨＩＶ−１インテグラーゼのＤ６４、Ｄ１１６およびＥ１５２残基）のいずれかに影響を及ぼす変異が挙げられる。特定の実施形態によれば、ウイルスゲノムの細胞ゲノム内への組込みに対するインテグラーゼの触媒作用を不可能にする変異は、インテグラーゼの触媒コアドメイン内のＤＤＥモチーフの、１つ以上のアミノ酸残基の置換であり、好ましくは、前記ＤＥＥモチーフ内の第１アスパラギン酸残基の、アスパラギン残基による置換である。特定の実施形態によれば、インテグラーゼは、配列番号１７の配列を含む。さらに特定の実施形態によれば、インテグラーゼは、配列番号１７の配列からなる。
【０１１３】
特定の実施形態によれば、本発明の組換えレンチウイルスは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）由来のエンベロープ糖タンパク質Ｇを含む。本明細書で用いられる用語「糖タンパク質Ｇ」は、ＶＳＶのエンベロープに由来するタンパク質を指し、このタンパク質は、ウイルスが取り込まれる宿主細胞へウイルスを付着させ、次にウイルスエンベロープとエンドソーム膜とを融合させることで、ウイルスの侵入を可能にする（例えばＵｎｉｐｒｏｔ  ＫＢデータベースの受託番号Ｑ６ＥＨ３７）。用語「糖タンパク質Ｇ」はまた、ウイルスの別の系統または分離株に由来するＶＳＶ糖タンパク質Ｇおよびそれらの機能的に等価な変異体に対しても用いられる。本明細書で用いられる「ＶＳＶ糖タンパク質Ｇの機能的に等価な変異体」は、ＶＳＶの温度感受性Ｇ変異体であるｔｓＯ４５を非許容温度において補完することができ、かつＶＳＶ糖タンパク質Ｇのアミノ酸配列との同一性が最小であるポリペプチドとして理解される。Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９０；１７８（２）：３７３−３８３を参照されたい。ＶＳＶ糖タンパク質Ｇの機能的に等価な変異体としては、上に述べた糖タンパク質Ｇの様々な天然変異体に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％の類似性または同一性を示すポリペプチドが挙げられる。ＶＳＶ糖タンパク質Ｇの変異体は、天然であっても、人工であってもよい。「天然変異体」との表現は、別の系統において自然発生した、上で定義したＶＳＶ糖タンパク質Ｇのすべての変異体を指す。「人工変異体」との表現は、組換えまたは合成ポリペプチドを指す。本明細書で用いられる用語「ＶＳＶ」または「水疱性口内炎ウイルス」は、ラブドウイルス科に属する、大きさ約１１ｋｂのマイナス鎖ＲＮＡウイルスを指す。ＶＳＶは、「水疱性口内炎ウイルスインディアナ株」または「ＶＳＩＶ」としても知られる。今日まで、当該技術分野においてＶＳＶの８種の亜型について記載されている。ｈｔｔｐ：／／ｖｉｒａｌｚｏｎｅ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｃｏｍｐｌｅｔｅ＿ｂｙ＿ｓｐｅｃｉｅｓ／２１．ｈｔｍｌ＃ｔａｂ６、２０１３年１０月を参照されたい。
【０１１４】
別の態様によれば、本発明は、
（ｉ）真核細胞を、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターと接触させる工程であり、ここで前記細胞が、前記細胞内への前記ポリヌクレオチドまたはベクターの移行に適した条件下で、レンチウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、ｒｅｖの産物およびウイルスエンベロープタンパク質を発現する工程と、
（ｉｉ）レンチウイルスの集合に適した条件下で前記細胞を維持する工程とを含んでなる、本発明の組換えレンチウイルスを作製するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法に関する。
【０１１５】
用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法」は、前記方法が、被験体であるヒトまたは動物の体ではなく、前記被験体から分離された細胞において行われることを示唆する。
【０１１６】
用語「組換えレンチウイルス」および「真核細胞」。特定の実施形態によれば、真核細胞はパッケージング細胞、すなわち本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のレンチウイルスベクターをトランスフェクトすることによって組換えウイルスベクターの産生を可能にする細胞である。特定の実施形態によれば、前記パッケージング細胞はヒト胎児腎細胞株２９３（ＨＥＫ２９３）である。さらに特定の実施形態によれば、前記パッケージング細胞は、トランスフェクトされたＳＶ４０複製開始点を含むプラスミドのエピソーム複製を可能にするＳＶ４０ラージＴ抗原を含む、ヒト胎児腎細胞株２９３（ＨＥＫ２９３Ｔ）である。
【０１１７】
本明細書で用いられる用語「ｇａｇ」は、３つのタンパク質サブユニット（ＭＡ、ＣＡおよびＮＣ）によって形成されるカプシドのｐ５５タンパク質をコードする遺伝子を指す。特定の実施形態によれば、ｇａｇ遺伝子はＨＩＶ−１に由来する。
【０１１８】
本明細書で用いられる用語「ｐｏｌ」は、ウイルスの複製過程に必要なウイルス酵素、すなわちプロテアーゼ（ＰＲＯ）、逆転写酵素（ＲＴ）およびインテグラーゼ（ＩＮＴ）をコードする遺伝子を指す。特定の実施形態によれば、ｐｏｌ遺伝子はＨＩＶ−１に由来する。
【０１１９】
本明細書で用いられる用語「ｒｅｖ」は、メッセンジャーＲＮＡのプロセシングおよびその細胞質への輸送に関与するＲｅｖタンパク質をコードする遺伝子を指す。特定の実施形態によれば、ｒｅｖ遺伝子はＨＩＶ−１に由来する。
【０１２０】
本明細書で用いられる用語「エンベロープ」または「ウイルスエンベロープ」は、典型的には宿主細胞の膜の一部に由来するウイルスカプシドを覆う、ウイルス構造に関する。ウイルスエンベロープは、宿主細胞の膜に由来するリン脂質およびタンパク質を含み、かつウイルス糖タンパク質も含み得る。本明細書で用いられる用語「ウイルスエンベロープタンパク質」は、ウイルスエンベロープのタンパク質成分に関する。好ましい実施形態によれば、ウイルスエンベロープタンパク質は、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）に由来する糖タンパク質Ｇである。用語「糖タンパク質Ｇ」および「水疱性口内炎ウイルス」については既に定義した。
【０１２１】
本明細書で用いられる用語「移行に適した条件」は、それによってポリヌクレオチドまたはベクターが真核細胞内へ移行できる、当業者に公知の条件を意味する。限定はされないが、ポリヌクレオチドまたはベクターを真核細胞内へ導入するために用いることのできる技術の実例として、単離された、または人工リポソーム内に取り込まれた、または前述のベクターの一部としての本発明のポリヌクレオチドを用いた、感染、形質導入、トランスフェクション、エレクトロポレーションおよび形質転換が挙げられる。
【０１２２】
本発明の組換えレンチウイルスを作製するための方法の第１工程によれば、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターは、レンチウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、ｒｅｖの産物および水疱性口内炎ウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子の産物を発現する真核細胞と接触する。前記細胞は、真核細胞と、レンチウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｒｅｖならびにＶＳＶ由来のエンベロープ糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子を含む１つ以上のポリヌクレオチドとを接触させることによって得ることができる。ポリヌクレオチドを真核細胞内に導入するための上述の技術のいずれも、レンチウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｒｅｖの産物ならびにＶＳＶ由来のエンベロープ糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子の産物を含む真核細胞を得るために用いることができる。特定の実施形態によれば、前記細胞は、レンチウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｒｅｖならびにＶＳＶ由来のエンベロープ糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子を含む１つ以上のポリヌクレオチド、好ましくは１つ以上のベクターをトランスフェクトすることによって得られる。
特定の実施形態によれば、前記細胞は、以下のポリヌクレオチド、
−ｒｅｖ遺伝子を含むポリヌクレオチドまたはベクター、
−ＶＳＶ由来のエンベロープ糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドまたはベクター、および
−ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含むポリヌクレオチドまたはベクター
をトランスフェクトすることによって得られる。
【０１２３】
特定の実施形態によれば、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含むポリヌクレオチドまたはベクターは、ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）をさらに含む。用語「ｒｅｖ応答エレメント」については既に定義した。
【０１２４】
特定の実施形態によれば、レンチウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｒｅｖの産物ならびにウイルスエンベロープタンパク質を含む真核細胞は、上述のポリヌクレオチドまたはベクターの共トランスフェクションによって得られる。前記細胞は、本発明の組換えレンチウイルスを作製するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法を実行するために用いることができる。したがって特定の実施形態によれば、レンチウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、ｒｅｖの産物およびウイルスエンベロープタンパク質を発現する細胞は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターと接触する前に、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、ｒｅｖ遺伝子をコードする１つ以上のポリヌクレオチドと、ウイルスエンベロープタンパク質をコードするポリヌクレオチドとをトランスフェクトされている。
【０１２５】
別の特定の実施形態によれば、前記細胞は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターと、レンチウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｒｅｖならびにウイルスエンベロープタンパク質をコードする遺伝子を含む１つ以上のポリヌクレオチド、好ましくは１つ以上のベクターと同時に接触する。さらに特定の実施形態によれば、前記細胞は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターと、レンチウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｒｅｖならびにウイルスエンベロープタンパク質をコードする遺伝子を含む１つ以上のポリヌクレオチド、好ましくは１つ以上のベクターとを、共トランスフェクトされる。さらに特定の実施形態によれば、前記細胞は、以下のポリヌクレオチド、
−本発明のポリヌクレオチドまたはベクター、
−ｒｅｖ遺伝子を含むポリヌクレオチドまたはベクター、
−ウイルスエンベロープタンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドまたはベクター、および
−ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含むポリヌクレオチドまたはベクター
とを共トランスフェクトされる。
【０１２６】
本発明の組換えレンチウイルスを作製するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法における工程（ｉｉ）は、工程（ｉ）で得た細胞を、レンチウイルスの集合に適した条件下で維持することを含んでなる。用語「レンチウイルスの集合に適した条件」は、ウイルスタンパク質の発現、および細胞の培地中に放出される新しいウイルス粒子の集合を可能にする、当業者に公知の条件を意味する。これらの条件は、細胞の型に依存して異なり得る。培地中への組換えレンチウイルスの放出を促進する代表的な条件は、本明細書の実施例の記載に従って実行されてよい。産生細胞は、培地中へのウイルスベクターの放出を促進させるため、適切な期間増殖させる。一般に細胞は、約１２時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時間増殖させてよい。細胞がＨＥＫ２９３Ｔである場合、レンチウイルスの集合に適した条件は、新鮮な培地中の標準的な培養条件下において、トランスフェクション後数時間、好ましくはトランスフェクション後約２４時間ないし約４８時間、さらに好ましくはトランスフェクション後約４８時間、細胞をインキュベートすることを含む。
【０１２７】
特定の実施形態によれば、本発明の組換えレンチウイルスを作製するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法は、細胞によって産生された組換えレンチウイルスを精製する工程をさらに含んでなる。前記精製は、当業者に公知のいずれかの適切な方法によって行われてよい。これについて説明すると、組換えレンチウイルスの精製は、前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法の工程（ｉｉ）の後に得られる細胞培地の回収、および前記培地の低速での遠心分離および濾過によって行うことができる。任意に、ウイルスストックは超遠心分離法によって濃縮してもよい。
【０１２８】
本発明による安定化細胞および細胞集団、これらを作製するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法、および対象産物をｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生するためのこれらの使用
本発明の組換えレンチウイルスが、対象ポリヌクレオチドを含む本発明のポリヌクレオチドを含む際、前記組換えレンチウイルスは、前記対象ポリヌクレオチドを安定的に発現する細胞株を得るために用いることができる。したがって別の態様によれば、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む対象ポリヌクレオチドを発現できる安定化細胞に関し、以後これを本発明の安定化細胞と称する。前記ポリヌクレオチドは、プロモーターへ作動的に連結する対象ポリヌクレオチドの配列を含んでなり、ここで
−プロモーターは、Ｓ／ＭＡＲおよび複製開始点に対して５’側に位置し、第１ＬＴＲに対して３’側に位置し、かつ
−対象ポリヌクレオチドは、Ｓ／ＭＡＲに対して５’側または３’側に位置し、かつ複製開始点に対して５’側または３’側に位置する。
【０１２９】
本明細書で用いられる用語「安定化細胞」は、連続した継代に従って対象ポリヌクレオチドの発現を示す細胞に関する。好ましい実施形態によれば、前記細胞は、前記細胞への本発明の組換えレンチウイルスの形質導入後、少なくとも５０日間、少なくとも６０日間、少なくとも７０日間、少なくとも８０日間、少なくとも９０日間、対象ポリヌクレオチドの発現を示す。好ましい実施形態によれば、前記細胞は、前記細胞への本発明の組換えレンチウイルスの形質導入後、少なくとも２、４、６、８、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０００、５０００、１００００、またはそれを超える継代後に、対象ポリヌクレオチドの発現を示す。
【０１３０】
別の態様によれば、本発明は、本発明の細胞を複数含む安定化細胞集団に関する。特定の実施形態によれば、本発明の安定化細胞集団は、対象ポリヌクレオチドを安定的に発現する細胞を、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、１００％まで含む。
【０１３１】
特定の実施形態によれば、安定化細胞は真核細胞、好ましくは哺乳類細胞である。さらに特定の実施形態によれば、前記哺乳類細胞は、トランスフェクトされたＳＶ４０複製開始点を含むプラスミドのエピソーム複製を可能にするＳＶ４０ラージＴ抗原を含む、ヒト胎児腎細胞株２９３（ＨＥＫ２９３Ｔ）である。
【０１３２】
用語「プロモーター」、「作動的に連結」、「Ｓ／ＭＡＲ」、「複製開始点」および「第１ＬＴＲ」については既に定義した。
【０１３３】
別の態様によれば、本発明は、本発明の安定化細胞集団を作製するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、
（ｉ）細胞を本発明の組換えレンチウイルスに接触させる工程であり、ここで前記組換えレンチウイルスが、プロモーターへ作動的に連結する対象ポリヌクレオチドの配列を含んでなり、
−前記プロモーターが、前記Ｓ／ＭＡＲおよび前記複製開始点に対して５’側に位置し、前記第１ＬＴＲに対して３’側に位置し、かつ
−前記対象ポリヌクレオチドが、前記Ｓ／ＭＡＲに対して５’側または３’側に位置し、前記複製開始点に対して５’側または３’側に位置する工程と、
（ｉｉ）前記細胞を増殖させかつ維持する工程とを含んでなる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法に関する。
【０１３４】
用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法」、「安定化細胞集団」、「組換えレンチウイルス」、「対象ポリヌクレオチド」、「プロモーター」、「作動的に連結」、「Ｓ／ＭＡＲ」、「複製開始点」および「第１ＬＴＲ」については既に定義した。
【０１３５】
本発明の安定化細胞集団を作製するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法の工程（ｉ）は、細胞に形質導入させるように、プロモーターへ作動的に連結する対象ポリヌクレオチドを含む本発明の組換えレンチウイルスを細胞に接触させることを含む。本明細書で用いられる用語「形質導入」は、ウイルスベクターを介して、外来性のポリヌクレオチド配列を細胞内に導入する過程を指す。組換えレンチウイルスによる細胞への形質導入に適した条件は、当業者に公知である。例として、本出願の実施例で説明するように、形質導入は、例えば、細胞をレンチウイルスの上清と共に、８μｇ／ｍＬ  Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（商標）の存在下で、４〜６時間３７℃にて細胞培養インキュベータ内でインキュベートすることによって実行できる。
【０１３６】
本発明の安定化細胞集団を作製するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法の工程（ｉｉ）は、細胞を増殖させかつ維持することを含む。細胞を増殖させかつ維持するための条件は細胞の型によって異なり、この条件は当業者に公知である。
【０１３７】
安定化細胞集団の作製のために厳密に必要ではないが、本発明の組換えレンチウイルスを形質導入された細胞を選択することが可能である。したがって特定の実施形態によれば、本発明の安定化細胞集団を作製するための方法は、工程（ｉ）において作製された細胞を選択することをさらに含んでなる。前記選択は、特定のポリヌクレオチドを発現する細胞の選択に適した、当該技術分野において公知のいずれかの技術を用いて行うことができる。例えばクローンは、安定化細胞集団を作製するための方法の工程（ｉ）において得られた細胞を、例えば限界希釈することによって得られてよい。このようなクローンは、本発明のポリヌクレオチドの取り込みを検出するために、ポリヌクレオチドの特異的配列の検出に適した当業者に公知のいずれかの技術、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって分析されてよいか、または本発明のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の存在について、タンパク質の検出に適した当業者に公知のいずれかの技術、例えば免疫蛍光法、フローサイトメトリー、免疫ブロットなどによって分析されてもよい。
【０１３８】
本発明のポリヌクレオチドが選択遺伝子を含む際、選択は、選択遺伝子の型に応じて、細胞を制限された条件下、すなわち遺伝子発現が細胞を選択する上での利点となることが推測される条件下に置くことによって行うことができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドが栄養素の合成を可能にする選択遺伝子を含む場合、選択は、前記栄養素を含まない培地中に細胞を置くことを含み得る。本発明のポリヌクレオチドが、その発現が抗生物質への耐性を与える選択遺伝子を含む場合、選択は、前記抗生物質を含む培地中に細胞を置くことを含み得る。
【０１３９】
特定の実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、抗生物質、好ましくはネオマイシンへの耐性を与える選択遺伝子を含むため、選択は、ネオマイシンを含む培地中に細胞を置くことを含み得る。
【０１４０】
本発明のポリヌクレオチドが、蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む場合、選択は、蛍光励起セルソーター（ＦＡＣＳ）によって行うことができる。
【０１４１】
別の態様によれば、本発明は、対象産物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生のための、または対象産物産生のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法に対する、本発明の安定化細胞集団の使用に関し、前記使用は、対象ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下で、本発明の安定化細胞集団を培養することを含む。
【０１４２】
用語「安定化細胞集団」および「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法」については既に定義した。本明細書で用いられる用語「対象産物」は、その細胞内での発現が望ましい、いずれかのポリヌクレオチドの産物を指す。対象産物は対象ポリペプチドもしくはタンパク質であってよいか、または、いったん転写され、ｍＲＮＡとハイブリダイズしてその発現を阻害できるＲＮＡ、例えばマイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを産生するポリヌクレオチドであってもよい。特定の実施形態によれば、対象産物は対象タンパク質である。さらに特定の実施形態によれば、対象タンパク質は蛍光タンパク質である。さらに特定の実施形態によれば、対象産物は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。用語「対象タンパク質」、「蛍光タンパク質」および「ＧＦＰ」については既に定義した。
【０１４３】
以下の実施例によって本発明を説明するが、これらの実施例は単なる実例であり、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１４４】
材料および方法
哺乳類細胞の培養およびトランスフェクション
ヒト胎児腎細胞株ＨＥＫ２９３Ａ（ＣＲＬ−１５７３、ＡＴＣＣ）を、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐｒａｔ  ｄｅｌ  Ｌｌｏｂｒｅｇａｔ、バルセロナ、スペイン）、１０ｍｇ／ｍｌ抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン）および１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＤＭＥＭ（Ｌｏｎｚａ、Ｌｏｎｚａ  Ｉｂｅｒｉｃａ  ＳＡ、バルセロナ、スペイン）中で、標準的な条件下で培養した。細胞を選択的な条件下で培養する際には、培地を４５０μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＤＭＥＭに交換した。
【０１４５】
トランスフェクションによるレンチウイルスの作製
ウイルスは、リン酸カルシウム法を用いて、４つのプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞へ一過性にトランスフェクトすることによって産生した。トランスフェクションの前日に、細胞を１５ｃｍディッシュに１．１×１０７細胞／ディッシュにてまいた。細胞には、エンドトキシンフリーＤＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ、ラス・マタス、マドリード、スペイン）をトランスフェクトした。トランスフェクションカクテルは、３μｇのｐＲＳＶ−Ｒｅｖ、３．７５μｇのｐＭＤ．２Ｇ（ＶＳＶ−Ｇ）、非組込み型レンチウイルスベクター産生のための１３μｇのｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥまたは１３μｇのｐＭＤＬｇ／ｐＤ６４ＶＲＲＥ、および３５μｇのトランスファープラスミド（ｐＬＳシリーズ）を含む、１ｘＨＢＳ、０．１２５  ＣａＣｌ２であった。前記カクテルは、８２μＬのプラスミドＤＮＡ、４７６μＬの２．５Ｍ  ＣａＣｌ２、および３３４３μＬのミリＱ水に、３９００μＬの２ｘＨＢＳ  ｐＨ７．０２を１滴ずつ滴下して混合することによって調製した。このトランスフェクションミックスを、細胞に滴下して加えた。細胞をトランスフェクションミックスと共に４〜６時間インキュベータ内でインキュベートした後、洗浄して培地を交換した。４８時間後に培地を回収し、低速の遠心分離によって透明にした後、０．４５ｍｍ孔径のＰＶＤＦフィルターを通して濾過した。ウイルスストックは、ＳＷ２８  Ｂｅｃｋｍａｎローターを用いて、９０．０００ｇ（２６．０００ｒｐｍ）、２時間４℃にて超遠心分離することによって濃縮した。レンチウイルスを含むペレットを風乾させた後、４℃にて４００〜６００μｌの培地に一晩再懸濁させた。
【０１４６】
レンチウイルスの力価測定および形質導入
以下に述べるように、数通りの希釈によって参照ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質導入を行い、ＦＡＣＳ解析を行って、生物学的なウイルス力価を算出した（形質導入単位／ｍｌ、Ｔ．Ｕ．／ｍＬ）。形質導入の１日前に、２×１０５の参照細胞を６ウェルのマルチウェルプレートにまき、培地を、８μｇ／ｍＬのＰｏｌｙｂｒｅｎｅ（商標）を含む培地を用いて１／１０、１／１００および１／１０００のように規則的に希釈したレンチウイルス上清１ｍＬに交換し、４〜６時間３７℃にて接種を行った。接種材料を通常の培地に交換し、ＦＡＣＳを用いる前に細胞を４８時間培養した。
【０１４７】
上清のｑＰＣＲを行うことにより、ゲノムを含む粒子の総数を定量した（粒子／ｍＬ）。ｑＰＣＲ反応の鋳型として、１／１０ないし１／１０００に希釈した変性粒子を用いた（使用したプライマーおよび特異的条件については以下を参照のこと）。１ｎｇないし１ｐｇの希釈範囲のプラスミド鋳型を測定し、参照値をプロットすることによって検量線を得た。測定した生データを検量線において補間し、コピー／細胞へ変換した。
【０１４８】
Ｔ．Ｕ．に対する粒子の比が１：１００の場合に、正測値はおおよそ１０７〜１０８Ｔ．Ｕ．／ｍｌであった。
【０１４９】
ゲノムＤＮＡの抽出
細胞（５〜１０×１０６）をトリプシン処理するかまたはスクレイプして、１３ｍＬのＰＥコニカルチューブに移し、ＰＢＳによって洗浄した後、卓上遠心分離機を用いて低速（１，５００ｒｐｍ）にてペレット化した。ペレットを溶解緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭトリスｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１％ＳＤＳ）中に再懸濁し、マイクロチューブに移した後、プロテイナーゼＫ（０．５μｇ／ｍＬ）を用いて５６℃にて緩やかに攪拌しながら一晩消化した。その後２５０μＬの飽和ＮａＣｌを加え、混合して室温に５分間静置した後、ｍｉｎｉｆｕｇｅを用いて１３，０００ｒｐｍにて遠心分離した。ペレットを崩さないように７５０μＬの上清を抽出し、５００μＬのイソプロパノールと混合した後、１３，０００ｒｐｍ、ＲＴにおいて遠心分離により沈殿させ、７０％エタノールを用いて洗浄、風乾させた後、ＲＴにて１×ＴＥ中に一晩再懸濁させた。再懸濁させたＤＮＡを連続希釈したものを、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ１０００分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｏｎｓａｉ  Ｔｅｃｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｇｒｏｕｐ  ＳＬ、アルコベンダス、マドリード、スペイン）を用いて定量した。
【０１５０】
Ｈｉｒｔによる抽出法
トリプシン処理した細胞（典型的には５〜１０×１０６細胞）を、１３ｍＬのＰＥコニカルチューブに移し、卓上遠心分離機を用いて、ＲＴにおいて３〜５分間低速（１０００〜１５００ｒｐｍ）にてペレット化した。ペレットを冷ＰＢＳによって洗浄した後、上記のように遠心分離した。再懸濁したペレットをマイクロ遠心チューブに移し、４℃、１３，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離した。ピペッティングまたはボルテックスすることなく、ペレットをＨｉｒｔの溶解緩衝液（０．６％ＳＤＳおよび１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁し、ＲＴにて１５分間インキュベートした。５Ｍ  ＮａＣｌを最終濃度が１．４Ｍになるように加え、反転しながら穏やかに混合し、４℃にて一晩静置することによってゲノムＤＮＡを沈殿させた。マイクロ遠心分離機を用い、４℃、１３，０００ｒｐｍにて３０〜６０分間、タンパク質およびゲノムＤＮＡを遠心分離した。低分子ＤＮＡを含む上清をフェノール抽出し、エタノール沈殿させた後、１００〜２００μＬの水に再懸濁させた。
【０１５１】
サザンブロット
消化したサンプルを１×ＴＡＥ中の０．８％アガロースゲルに負荷し、定電圧７０〜１００Ｖにて、色素の先端がゲルの終端から１〜３ｃｍに到達するまで泳動を行い、分離した。対照として、検出対象の配列を含む定量化されたプラスミドを泳動して、大きさおよび量（２０ｐｇ、２００ｐｇおよび２ｎｇ）の基準を提供した。３００ｎｍの紫外線光の下で、ゲルの写真を撮影した。ゲルを蒸留水で洗浄した後、２×ＳＳＣによって、ＲＴにおいて１５分間平衡化した。０．５Ｎ  ＮａＯＨを用いて、毛管現象により、ゲルをナイロンメンブレンＨｙｂｏｎｄ−Ｎ  ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に、ＲＴにおいて一晩ブロットした。メンブレンをＳｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）内での照射によって固定した後、ハイブリダイゼーションに使用した。
【０１５２】
使用したプローブは、プラスミドを制限酵素によって消化した産物を精製したものであり、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｘｍａｉ−ＢｓｔＢＩ、０．８Ｋｐｂ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）はｎｅｏの検出に用い、ｐＺＤｏｎｏｒ  ＡＡＶＳ１（ＫｐｎＩ−ＸｍａＩ、０．７Ｋｐｂ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）はＡＡＶＳ１の検出に用いた。標識は、３２Ｐ−アルファＣＴＰを１００μＣｉ／反応によって用い、市販のキットＲｅｄｉＰｒｉｍｅ  ＩＩ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を製造者の指示に従って用いることによって行った。Ｍｉｃｒｏ  Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎ  Ｐ−３０（ＢｉｏＲａｄ）カラムを製造者の指示に従って用いることによって、取り込まれなかったヌクレオチドを除去した後、シンチレーション測定によって定量化を行った。フィルターを２×ＳＳＣによって湿らせ、２５ｃｍチューブ内で、１０〜２０ｍＬのＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂ（商標）Ｐｌｕｓ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション溶液には、１〜２×１０７ｃｐｍ／ｍＬが含まれ、６６℃にて一晩静置してハイブリダイゼーションを進行させた。その後、０．１×ＳＳＣ  ０．５％ＳＤＳを用いて、フィルターを６５℃にて２０分ずつ連続的に洗浄した。湿ったメンブレンをＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒスクリーンに曝露し、ＳＴＯＲＭスキャナーを用いて現像した。
【０１５３】
リアルタイムＰＣＲ
Ｂｕｔｌｅｒ，  ＳＬ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ２００２，  ７６（８）：  ３７３９．  ＤＯＩ：  １０．１１２８／ＪＶＩ．７６．８．３７３９−３７４７．２００２に記載されるＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎの方法論を用いて定量ＰＣＲを行い、ＬｅｎｔｉＳｏｍｅを用いて形質導入した培養に由来する、組み込まれなかったエピソーム型２−ＬＴＲを決定した。ＨＥＫ２９３Ａ細胞内のアルブミンのコピー数を、幾らかの改変を加えた以前の記載に従って測定した。すべてのアッセイにおいて、標準化ＤＮＡの連続希釈によってＰＣＲの効率を決定し、個々の遺伝子プライマーの特異性については、各ｑＰＣＲアッセイの終了時に、融解曲線によって確認した。ｐＲＲｌ．ｓｉｎ１８．ＣＭＶ．ｅＧＦＰ．Ｗｐｒｅプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ）を、１０２〜１０９コピーに相当する０．０１ｐｇないし１００ｎｇの範囲の量に希釈して検量線を得た。以下に挙げる特異的プライマーを用いた増幅によって得たＣｔ値を補間して、実験サンプル中のコピーの絶対数を算出した。Ｃｔ値を用い、希釈したゲノムＤＮＡの試験サンプルにおける単一コピーのアルブミン遺伝子に相似させて細胞当量を算出し、ゲノムＤＮＡを標準化した。２−ＬＴＲのｑＰＣＲに対する陽性対照は、合成し、通常のプラスミド内でクローン化したＬＴＲ−ＬＴＲエレメントを含む断片とした。
【０１５４】
使用したプライマーは以下のとおりである。
【化２】
0006694386.tif 000003
【０１５５】
サイトメトリー解析
形質導入を行ってから７２時間後にフローサイトメトリー解析を行った。細胞をトリプシン処理して回収し、培養用の１×ＰＢＳを用いて２回洗浄した後、ＣｈｅｒｒｙＦＰの励起に適したレーザーを備えたＦＡＣＳ  ＤＩＶＡ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、サン・アグスティン・デル・グアダリクス、マドリード、スペイン）ソーターを用いて解析した。すべての場合において、１０，０００イベントを三重に測定した。
【０１５６】
核型分析
細胞株を、培養フラスコ内で、３７℃にて、空気中５％ＣＯ２雰囲気下でインキュベートした。分裂中期の細胞は、標準的な細胞遺伝学的方法によって調製した。コルセミド（０．１μｇ／ｍＬ、１．５時間、３７℃；ＧＩＢＣＯ、ストラックライド、英国）によって有糸分裂を停止させた後に低張処理（７５ｍｍ  ＫＣｌ、１５分間、３７℃）を行い、次にメタノール／酢酸（３：１）によって固定した後、スライドグラス上に広げた。
【０１５７】
蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析（ＦＩＳＨ）
ＦＩＳＨ分析のため、細胞を最初にコルセミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって処理し、次に低張性の塩溶液によって処理した後に回収した。
【０１５８】
一組のプローブを用いて、ウイルスの組込み部位を特定した。ベクタープラスミド由来のＤＮＡを用いて、ＬｅｎｔｉＳｏｍｅの組込み部位を検出した。対照として、４ｑ１３．３の染色体バンドにマップされる細菌人工染色体（ＢＡＣ）のＲＰ１１−４９Ｌ９を用いた。ＢＡＣは、ヒトＢＡＣクローンライブラリーＲＰＣＩ−１１（オークランド小児病院研究所（Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｏａｋｌａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、オークランド、カリフォルニア州）から得た。１μｇのプラスミドまたはＢＡＣ  ＤＮＡを、ニックトランスレーションキット（カタログ番号０７Ｊ００−００１、Ｖｙｓｉｓ）を用いて直接標識した。このキットは、フルオロフォア標識ｄＵＴＰ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎまたはＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ）を用いたＤＮＡの蛍光標識のために設計されている。標識されたＤＮＡは、ゲノムの反復性ＤＮＡ配列との非特異的なハイブリダイゼーションを阻止するため、Ｃｏｔ−１  ＤＮＡおよびＤＮＡせん断サケ精子（Ｖｙｓｉｓ、ダウナーズ・グローブ、イリノイ州、米国）と共沈殿させた。沈殿したＤＮＡ混合物を、ハイブリダイゼーションミックスに再懸濁させた。
【０１５９】
ＦＩＳＨ反応を行うため、プローブと分裂中期スプレッドとを加熱して共に変性させ、３７℃にて一晩ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後に０．４×ＳＳＣ／０．３％ＮＰ４０および２×ＳＳＣ／０．１％ＮＰ４０を用いて洗浄を２回行い、染色体を褪色防止溶液中のＤＡＰＩ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）によって対比染色した。
【０１６０】
Ｃｈｒｏｍｏｆｌｕｏｒ画像解析システム（Ｃｙｔｏｖｉｓｉｏｎ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｌｔｄ、ニューカッスル、英国）を動作させるコンピュータに接続した、冷却した電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ  ＳｅｎＳｙｓカメラ）を用いて細胞像を捕えた。
【０１６１】
結果
実施例１：分裂頻度の高い細胞内でのレンチウイルス−エピソーム（ＬｅｎｔｉＳｏｍｅ）の維持
本アプローチについての説明
本発明者らは、２か月の培養期間に数十の集団倍加を示して指数関数的に増殖する細胞内での、エピソーム１−ＬＴＲおよび２−ＬＴＲの維持および分離における、哺乳類のｏｒｉおよびＳ／ＭＡＲ配列の一連の組み合わせの効果について系統的に分析した。
【０１６２】
ｏｒｉまたはＳ／ＭＡＲであることが判明した、短いが十分に特徴付けられた配列の収集から、本発明者らは共通する２つの主要な特色を選択した。第１に、レンチウイルスベクター内にはさらに他の対象配列がクローン化されるため、両配列とも、このレンチウイルスベクター内に収容可能な長さに限定される。そして第２に、ｏｒｉ／ＳＭＡＲエレメントはウイルスに由来しない、真核生物性のものでなければならない。最も良く特徴付けられたｏｒｉ配列はＤＮＡウイルス由来のものであるが、臨床において使用する際の主要な弱点は、ＳＶ４０ラージＴ抗原、パピローマウイルスＥ１／Ｅ２タンパク質、またはヘルペスウイルスＥＢＮＡのようなウイルスタンパク質の機能的な活性化が厳密に要求されることである。しかしながらこれらウイルスタンパク質のすべては、それらの遺伝子を発現する細胞に対して必然的に細胞の形質転換を促進する。真核生物性とは、哺乳類細胞内で機能的であることが証明され、かつ細胞シグナルに応答して１細胞周期あたり１回の割合で複製を誘発したことを示唆するものである。
【０１６３】
本発明者らは、このような特色に一致する３つのｏｒｉ配列を選択した。それらは、ヒトベータグロビン遺伝子座（Ｋｉｔｓｂｅｒｇ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９３，３６６（６４５５）：５８８−５９０）、ヒトｃ−ｍｙｃプロモーター領域（ＭｃＷｈｉｎｎｅｙ  Ｃ．ａｎｄ  Ｌｅｆｆａｋ  Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９０，１８（５）：１２３３−１２４２）、およびヒトＤＮＡメチルトランスフェラーゼ酵素（ｄｎｍｔ）に由来する３６ｂｐの共通配列であるＡ３４（Ａｒａｕｊｏ  Ｆ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９９，２７４（１４）：９３３５−９３４１）にマップされる。加えて、エピソームを維持する活性および分裂安定性を示し、かつメチル化のための転写活性調節性ドメインを含有することによって、４つのＳ／ＭＡＲ配列を選択した。選択したアンカーエレメントは、ヒトＩＦＮ−γ遺伝子の１．８Ｋｂｐ（ｈＩＦＮ−γＬａｒｇｅ）（Ｂｏｄｅ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２，２５５（５０４１）：１９５−７）、同じ遺伝子の０．７Ｋｂｐ最小領域（ｈＩＦＮ−γＳｈｏｒｔ）（Ｒａｍｅｚａｎｉ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００３，１０１（１２）：４７１７−４７２４）、ハムスタージヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｈＤＨＦＲ）に含まれる０．２Ｋｂｐ最小領域（Ｍｅｓｎｅｒ  Ｌ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２００３，１００（６）：３２８１−３２８６）、およびマウス免疫グロブリンカッパ遺伝子（ｍＩｇΚ）にマップされる０．４Ｋｂｐ領域（Ｃｏｃｋｅｒｉｌｌ  Ｐ．Ｎ．ａｎｄ  Ｇａｒｒａｒｄ  Ｗ．Ｔ．，Ｃｅｌｌ，１９８６，４４（２）：２７３−２８２）である。
【０１６４】
選択したエレメントが、レンチウイルスの構成において１−／２−ＬＴＲエピソームの持続性を促進するか否かについて調べるため、本発明者らは、ウイルス性のインテグラーゼ活性を不活性化させる、ｐｏｌ遺伝子内の変異（Ｄ６４Ｎ）を有する自己不活性化レンチウイルスを作製した［Ｙａｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ、上記］。集合的にｐＬＳ１と命名されたプラスミド（図２および配列番号２４）は、ｐＬＳ由来のＬｅｎｔｉＳｏｍｅ（商標）の形質導入後に細胞分裂を繰り返しても、簡単にそれを維持する転写単位を含む。このレポーターカセットは、ポリオウイルスＴ２Ａ  ＣＨＹＳＥＬ配列によって隔てられたｅＧＦＰ／ｎｅｏＲのＯＲＦを有し、これらはそれぞれＦＡＣＳｏｒｔｅｒまたは抗生物質を用いた選択によって結果を得ることができる。このレポーターカセットは、ＣＭＶのエンハンサーおよびアデノ随伴ウイルス２の初期転写単位由来のｐ５プロモーター（ｅＣ／ｐ５）を含む、弱いが遍在性のあるプロモーターの制御下にある。ｏｒｉ（ＡＲＳ）に含まれる自己複製配列の活性化を確実にするため、ｏｒｉおよびＳ／ＭＡＲ配列の両方を転写方向の下流に配置した。コンストラクトのパネルを図２に示す。コンストラクトの平均長は９Ｋｂｐであり、４ＫｂｐまでのｃＤＮＡをさらにクローニング可能なことは確実であった。材料および方法の項で述べたように、各プラスミドとヘルパープラスミドとを組み合わせて用い、レンチウイルスのバッチを作製した。
【０１６５】
構造安定性のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏにおける評価
ｏｒｉ／ＳＭＡＲ配列を有するｐＬＳプラスミドの配列に従った相対的な安定性をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏにおいて予測するため、本発明者らはストレス誘導ＤＮＡ不安定化（ＳＩＤＤ）分析を行った。この試験によって読み出された情報は、いずれかのヌクレオチド配列に従った、鎖の分離に必要な予測エネルギー（ΔＧｏで表される）の理論特性であり、これによって、転写終止部位および推定上の複製起点に示されるような、構造が開かれており、かつ鎖が分離する傾向の高い（不安定化）、特定の領域の決定が可能となる。
【０１６６】
本試験に用いた１２種のプラスミドによって得たデータを図３に示す。この図は、原核生物の配列を含まない各トランスファーレンチウイルスプラスミドの配列の不安定化特性を、ＷｅｂＳＩＤＤプログラム（ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅｃｅｎｔｅｒ．ｕｃｄａｖｉｓ．ｅｄｕ／ｂｅｎｈａｍ）を用いて示している。上部に示す各プロファイルは、各コンストラクトに含まれるエレメントを模式化したものであり、基本的なレンチウイルス構造についての説明は、対照コンストラクト（Ｏｒｉ／ＳＭＡＲ  ｌｅｓｓ）の図の上部に示す。Ｓ／ＭＡＲ配列に相当する領域を影付きの濃い青色で示す。Ｏｒｉ配列を黒色で示す。すべてのプラスミドは、Ｓ／ＭＡＲ配列（図中の影付きの領域）の全長領域で負のＧ（ｘ）（Ｋｃａｌ／ｍｏｌによる）を示す開放構造を含む確率が高かった。これらのデータは、レンチウイルス構造内にクローン化したすべてのＳ／ＭＡＲ配列に、活性のある開放領域が存在するという考えを支持するものであり、この考えはＳ／ＭＡＲ配列についての今日の記載とも一致している（Ｂｅｎｈａｍ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７４，１８１−１９６（１９９７））。
【０１６７】
形質導入および発現安定性の動態
記載するｏｒｉ／ＳＭＡＲの組み合わせを有するＩＤＬＶを、低いＭＯＩ（２Ｔ．Ｕ．／細胞）にて用いて、指数関数的に増殖するヒト癌細胞株ＨＥＫ２９３Ａ細胞の培養に形質導入を行った。培養を集団倍加数（ＰＤについて、１ＰＤは、２回の継代／週を行う培養条件で１８時間に相当する）が５になるまで維持して、エピソーム、およびＦＡＣＳによる分離後に精製したｅＧＦＰ＋細胞を確立させた。その後、培養にＧ４１８を含むかまたは含まない状態で維持し、８〜１０ＰＤ（６ないし７．５日間）ごとにｅＧＦＰ＋細胞の存在をスコア化した。
【０１６８】
本発明者らは最初に、前述のｏｒｉと、ｈＩＦＮγ（ＬＳ１、２、５、６、９および１０）またはｍＩｇΚ（ＬＳ４、８および１２）のどちらかに由来するＳ／ＭＡＲとの９つの組み合わせのそれぞれについて、ＬｅｎｔｉＳｏｍｅ（商標）の持続性を評価した（図４、上のパネル）。非選択条件下で７０ＰＤの期間培養した後（エピソームの確立後おおよそ１．７か月間）、ｅＧＦＰ＋細胞のパーセンテージは、形質導入されたそれぞれのＬｅｎｔｉＳｏｍｅ（商標）によって異なっていた。ｈＩＦＮγ遺伝子のＳ／ＭＡＲ（ＬＳ２、５、６、９および１０）を含むエピソームのほとんどは、細胞分裂に伴って非常に安定した伝播を示したが、ｍＩｇΚの短い０．４Ｋｂｐ  Ｓ／ＭＡＲ（ＬＳ４、８、１２）を含むものはそうではなかった。加えて注目すべきことは、これらのＬｅｎｔｉＳｏｍｅ（商標）は、まだ解明されていない理由から産生の困難が繰り返された。予測したように、Ｇ４１８の存在下で選択的に維持された培養では、Ｇ４１８による選択のため、抗生物質に対して耐性のある細胞の均一な培養が得られた（データ未提示）。
【０１６９】
ｏｒｉおよびＳ／ＭＡＲ配列のどちらも含まないＩＤＬＶを形質導入された細胞から得られた対照値では、予測したように、アッセイの終了までにｅＧＦＰ＋細胞は失われた（図４の十字シンボル）。ＬＳ５、６または１０を形質導入された培養では、細胞の５０％に機能的なエピソームが残っていることが示されたが、ＬＳ１、４、８または１２を形質導入された培養では、７０ＰＤの細胞集団において残っていたエピソームは５％未満であった。重要なことに、エピソームＬＳ２および９は、試験によって７０％という高いｅＧＦＰ＋細胞の割合が明らかにされたように、維持されており、効率的に分配された。ＬＳ５、９および１０を形質導入された培養は、長期間にわたり１２０ＰＤまで（形質導入後３か月）フォローアップを行ったところ、ほとんど同じ結果が得られ、培養中のｅＧＦＰ＋細胞の割合はおおよそ４０〜５５％であった。
【０１７０】
本発明者らは、以前のアッセイにてより良い結果を得たＬｅｎｔｉＳｏｍｅ（商標）を用いて２度目の試行を行い、これに追加のレンチウイルスのグループを加えた。これらは、実験計画において言及した基準の１つに適合する小さなサイズであるために選択された、異なるエレメントを含む。新規のエレメントは、ハムスタージヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）のＳ／ＭＡＲであり、そのサイズは０．２Ｋｂｐと小さい。本発明者らは次に構築を行い、それぞれβ−グロビン、Ａ３４またはｃ−ｍｙｃのｏｒｉと組み合わせたＬＳ３、７および１１を作製し、０．４ＫｂｐのＳ／ＭＡＲエレメントを含むＬＳを用いずに同じアプローチに従って、ＬＳ１、２、３、５、７、９、１０および１１と比較した。
【０１７１】
ＬＳ９、１０および１１を形質導入された培養では、７０ＰＤ（エピソームの確立後５４日）に細胞の９０％がエピソームを維持していることから、効率的な複製、すなわちその開始および分離（図４、下のパネル）が示唆され、特にｃ−ｍｙｃ  ｏｒｉ配列を組み合わせて試験したすべてのＳ／ＭＡＲ配列において持続性が達成された。表１に、図４で表したデータの概要を示す。
【０１７２】
【表１】
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【０１７３】
結論
上記の実験から、レンチウイルス構造における本発明者らのアプローチは実現可能であり、かつ（ｉｉ）すべての組み合わせが同等に許容されるものでも、理論的に予測できるものでもないことから、レンチウイルスに関してはかなりの試行錯誤が必要であると結論付けられる。
【０１７４】
効率的な持続を可能にする、レンチウイルスの構造に取り入れるエレメントの至適な組み合わせを見出すための予測的かつ普遍的なルールが存在しないことは明らかである。しかしながら、注目に値する特色を示す幾つかの配列、すなわちｍＩｇΚの０．４Ｋｂｐ  Ｓ／ＭＡＲを含むＬＳでは、組み合わせるｏｒｉ配列に関係なく分離が不可能と思われる一方で、ヒトｃ−ｍｙｃおよびβ−グロビン遺伝子のｏｒｉは、組み合わせるＳ／ＭＡＲ配列に関係なく効率的に維持されるようである。注目すべきことに、ヒトｃ−ｍｙｃ  ｏｒｉ配列を有するＬｅｎｔｉＳｏｍｅ（商標）のセットは、試験したどのＳ／ＭＡＲ配列と組み合わせても維持されたが、ｍＩｇΚのＳ／ＭＡＲと組み合わせて得られた結果は反対であった。
【０１７５】
結論として、本発明者らは、十分に特徴付けられたｏｒｉおよびＳ／ＭＡＲ配列であるにも関わらず、それらがＤＮＡウイルス、プラスミドおよびミニサークル（Ｎｅｈｌｓｅｎ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００６，１０：２３３）によって送達された際、レンチウイルスの複製中間体によって与えられた遺伝的特色のために、分裂する細胞内での持続性に関わるいずれの予測も不可能であることを示した。
【０１７６】
実施例２：形質導入された細胞内のＬｅｎｔｉＳｏｍｅ（商標）の遺伝的分析
形質導入された細胞内のＬｅｎｔｉＳｏｍｅ（商標）の、染色体外状態の分析
現状では、哺乳類ｏｒｉの機能が、エピジェネティックな原則、例えば転写因子の結合、クロマチン構造、または核局在化に依存しているということは十分に理解されている。アンカータンパク質の必要性に加えて、Ｓ／ＭＡＲ配列を機能的なものとするための要件についてはほとんど知られていない。
【０１７７】
本発明者らが知る限り、従来のレンチウイルスまたはＩＤＬＶが形質導入もしくは感染する間の１−／２−ＬＴＲ脱離産物の状態についてのデータは存在しないため、本発明者らは、ｏｒｉ／ＳＭＡＲ配列がレンチウイルスの遺伝的構造内に存在する場合、これが生理的に作用するか否かに関心をもった。本発明者らはまず、ＬＳの送達形が組み込まれるか否か、またはどの程度であるか、およびすべての組み合わせが同等に効率的であるか否かについて調べた。本発明者らはこの点を明らかにするため、文献に記載される標準的な手順（Ｎｅｈｌｓｅｎ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，上記、を参照のこと）に従った一式の技術を用いた。
【０１７８】
サザンブロット試験
一組のＬＳを形質導入した後、持続的に培養した（＞７０ＰＤ）細胞からゲノムＤＮＡおよび低分子量ＤＮＡ（Ｈｉｒｔ法抽出物）の両方を精製し、これらのサンプルを最初にサザンブロットに供した。すべてのＬＳの３’末端を１回切断する酵素によって消化したゲノムＤＮＡをブロットし、特異的なｎｅｏプローブ、およびＨＥＫ２９３Ｋ細胞の１細胞あたり３つ示される内在性遺伝子座であるＡＡＶＳ１に対するプローブとハイブリダイズさせた。フィルターと特異的なｎｅｏプローブとをハイブリダイズさせた際（図５Ａ、左）、この技術によって試験したすべてのサンプルにおいて、特異的なシグナルは検出されなかった。ＡＡＶＳ１プローブとハイブリダイズさせたすべてのサンプルでは、１レーンあたりに負荷した細胞当量において、最大２倍の変動が明らかになった（図５Ａ、右）。実験条件下でのｎｅｏプローブの感受性は、３コピー／細胞の割合で検出するＡＡＶＳ１プローブに比較して１０倍高く、各レーンには百万細胞当量が負荷されていることから、組み込まれたＬｅｎｔｉＳｏｍｅのコピー数は０．３／細胞よりも少ないと結論付けられる。Ｈｉｒｔ法抽出物をサザンブロットによって試験した際にも同様に負の結果が得られたが、この場合の感受性は低く、コピー数の検出限界は１細胞あたり５０までであった。実際に多数のコピーが存在した場合、すなわちエピソームが確立された後では、ＬＳ１、２、５および１０を形質導入された培養に由来するＨｉｒｔ法抽出物は、サザンブロットにおいて特異的バンドを示した（図５Ｂ左）。重要なことに、この時点での培養に対して行ったＦＩＳＨ試験では、スコア化したすべての細胞が十分な数のスポットを示しており、このデータは、それらのサザンブロットによる検出と相関している（図５Ｂ右）。
【０１７９】
これらの結果をまとめると、培養中に維持されるＬｅｎｔｉＳｏｍｅの数が少ない場合、それらのサザンブロットによる検出が不可能になると説明され得る。実際に、別の著者らによる、エピソームミニサークルプラスミドであるｐＥＰＩを用いたデータによれば（Ｎｅｈｌｓｅｎ，Ｂｒｏｌｌ  ａｎｄ  Ｂｏｄｅ，２００６）、選択なしに継続されたＣＨＯ細胞の培養中では１０〜１５コピーが維持されたことが示されているが、これは本発明者らの場合と同様に、エピソーム確立の早い時期にサザンブロットのみによって検出されたものである。
【０１８０】
ＰＣＲ分析
サザンブロットによって提供された情報は探索される配列の特異的位置を検出するために必要であるにも関わらず、探索されるわずかな細胞内の配列のコピー数が少ない場合、この技術はあまり有益ではない。エピソームのコピー数が少なく、かつわずかな細胞内に存在していると考えられる場合に、持続性の表現型をもつ培養中のＩＤＬＶ配列は、ｑＰＣＲによってさらに特徴付けられる。
【０１８１】
ＬＳ２、３、５、７、９、１０および１１を形質導入し、６９ＰＤ行った培養中のエピソーム型２−ＬＴＲ配列の相対的存在量を検出するため、感受性の高い定量ｑＰＣＲをゲノムＤＮＡサンプルに対して行って、形質導入されていないか、または組込み型レンチウイルスもしくはｏｒｉおよびＳ／ＭＡＲ配列を有さないＩＤＬＶを形質導入された、親株ＨＥＫ２９３ＡのＤＮＡから得られたシグナルと比較した。特異的ｑＰＣＲによって単一コピーのアルブミン遺伝子を検出し、細胞当量を標準化した。図６は、ＨＩＶ  ＬＴＲのプライマーを用いてｑＰＣＲによって得た値が、１コピー／細胞（ＬＳ３、５、７）、２〜３コピー／細胞（ＬＳ２、９および１０）または９コピーを超えた数／細胞（ＬＳ１１）であったことを示している。このような数は、培養中には数コピーのエピソームしか存在しなかったという考えを支持するものである。ＩＤＬＶ−ｏｒｉ／ＳＭＡＲ  ｌｅｓｓを形質導入された細胞から得られた値は検出限界未満であり、これは対照である形質導入されていない細胞から得られた値と同等であるとみなされることから（図６、ＨＥＫ２９３のレーン）、バックグラウンド値に該当する。
【０１８２】
要約すると、ｑＰＣＲ分析から得られたデータは、２−ＬＴＲに対するＰＣＲによって特異的に検出されたエピソーム型が維持される頻度は低く、安定化により様々な形質導入培養の間で変化することを示している。
【０１８３】
ＬｅｎｔｉＳｏｍｅの染色体外状態
上に示したデータから示唆されるように、ＬＳ型ベクターのコピー数は少なく、ある種の組み合わせは細胞分裂の間に安定的に維持されるが、その他の組み合わせはそうではない可能性がある。本発明者らは、ＦＩＳＨ分析を、ＬＳに由来する中間体と染色体との会合を示す明確な証明として行った。図７は、ＬＳ５、６、９、１０または１１を形質導入された細胞の、７０ＰＤにおける分裂中期スプレッドを示す。ＬＳ５、６、１０または１１を形質導入された細胞にみられるように、本発明者らは、分裂中期の染色体に関してはっきりとした蛍光スポットを一貫して認めたが、染色体腕の同じ位置に複製されたシグナルはみられなかった。このことは、ＬＳ９を形質導入された細胞のほとんどに当てはまるが、まれに例外があり（図７の挿入図を参照されたい）、両方の染色体腕に環状コンストラクトの組込み現象を示すはっきりとした二重の点が観察される。このような結果は、従来のｑＰＣＲおよびＰＣＲによって得られた特定のデータセットと一致するが（図６）、他とは一致しない。
【０１８４】
この明白な矛盾は、他の著者らがこれらの異なった技術によって得た結果を比較した際に明らかにした理論的根拠を支持するものである。実際に、ＦＩＳＨ分析はｑＰＣＲによるデータとよく相関しており、前者が選択すべき手順であるという考えを支持している。したがって、異なった技術によって得られた結果の不一致のため、本発明者らは、分裂中期スプレッドにおける導入遺伝子のＦＩＳＨによる視覚化のデータを強調する他の著者らの論拠に同意する。さらに単一の強いシグナルは、組込みによって両方の染色分体に発生する二重の点とは対照的に、典型的な染色体外コピーを示す。
【０１８５】
結論
本発明者らは、ウイルスゲノム内へのｏｒｉおよびＳ／ＭＡＲ配列の挿入によって、レンチウイルスの逆転写脱離産物（１−／２−ＬＴＲ）に自律複製および分離の能力を伝達可能であることを示した。本発明の機能に寄与する主な要因は、脱離産物の核輸送、検討する配列の哺乳類的性質、およびレンチウイルスベクターを用いた形質導入による細胞生理機能への最小限の干渉であると考えられる。
【０１８６】
本発明者らはまた、文献上での主な関心事である複製調節性単位（ｏｒｉ／ＳＭＡＲ）の上流に配置された転写単位（レポーター）の相対位置を保存した。すべてではないが、幾つかの組み合わせは同等に効果的であったこと、および幾つかのもの、例えばｍＩｇΚ由来の０，４Ｋｂｐ  Ｓ／ＭＡＲは、プラスミドやミニサークルを用いたアプローチのような、その他の非ウイルス性の系において十分に特徴付けられたエレメントであるにも関わらず非効率的であったという予想外の結果が得られたことは、注目に値する。このように、レンチウイルスの遺伝に関連した組込みが検出されない、完全に機能的なエピソームの維持を示すためには、試行錯誤のアプローチが必要とされる。
【０１８７】
このような新規のレンチウイルス由来エピソームベクター（ＬｅｎｔｉＳｏｍｅ）は、前臨床試験および臨床試験において、従来のレンチベクターの当該技術分野の状態での利点を享受することができ、かつ次世代の遺伝子治療アプローチに対するさらに安全な最適ベクターとなり得る。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【配列表】
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