(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生産細胞株の製造方法であって、前記方法は、
（ｉ）  複数のＤＮＡ構築物でトランスフェクトされた複数の宿主細胞であって、ここにおいて各宿主細胞は複数の宿主細胞中において構築物のライブラリーを作るようにＤＮＡ構築物を組み込み、ＤＮＡ構築物は、プロモータと、目的のタンパク質をコードする核酸、レポーターをコードする核酸、第１のＤＮＡリコンビナーゼ認識配列および第２のＤＮＡリコンビナーゼ認識配列を含み、第１のＤＮＡリコンビナーゼ認識配列はレポーターをコードする核酸の上流に位置し、第２のＤＮＡリコンビナーゼ認識配列はレポーターをコードする核酸の下流に位置し、それによりＤＮＡリコンビナーゼは無傷の目的のタンパク質をコードする核酸を残すようにレポーターをコードする核酸を除去することができ、ここにおいて目的のタンパク質をコードする核酸はプロモータに操作可能に連結され、レポーターをコードする核酸もプロモータに操作可能に連結されている、宿主細胞を与えるステップと、
（ｉｉ）  前記トランスフェクトされた宿主細胞を培養するステップであって、ここにおいて前記レポーターが発現される、ステップと、
（ｉｉｉ）  前記レポーターについて前記トランスフェクトされた宿主細胞をスクリーニングし、高いレベルでレポーターを発現する宿主細胞を選択するステップであって、ここにおいて高いレベルで目的のタンパク質を発現する宿主細胞も選択される、ステップと、
（ｉｖ）  前記選択された宿主細胞をＤＮＡレコンビナーゼに曝露するステップであって、ここにおいてＤＮＡリコンビナーゼはＤＮＡリコンビナーゼ認識配列で作用し、それにより細胞はもはや前記レポーターを発現せず、細胞は目的のタンパク質を発現し続ける、ステップと、
（ｖ）  レポーターをコードする核酸除去後の選択された細胞から生産細胞株を得るステップを含む、生産細胞株の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本出願は、２０１２年１１月３０日に出願された米国仮出願番号第６１／７３２，１５６号の優先権の利益を主張し、その全体が参照により本明細書中に明確に援用される。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書中に援用される。２０１３年１１月２７日に作成された上記ＡＳＣＩＩの写しは、３４１６６−００００２＿ＳＬ．ｔｘｔと称され、サイズは３３，２３２バイトである。
【０００３】
本技術は、細胞株開発およびタンパク質生産に関し、より特定的には、膜アンカー型レポーター（ＭＡＲ）を発現する細胞を、目的のタンパク質（ＰＯＩ）を培養培地に分泌する生産細胞に変換するスイッチ機構に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
組換え治療用タンパク質は、癌から不妊まで多数のヒト疾患を治療するために広く使用されている。組換え治療用タンパク質には、さまざまな血液凝固因子、インシュリン、成長ホルモン、酵素、Ｆｃ融合タンパク質、モノクローナル抗体および他のタンパク質が含まれる（Scott C, Bioprocess Int. 10(6): S72-S78, 2012）。多くの組換え治療用タン
パク質は、正確なフォールディングおよびグリコシル化を含む翻訳後修飾の必要性から、哺乳類の宿主細胞を用いて製造される。中でも、治療用抗体は、タンパク質治療剤のうち最も大きな部門のひとつであり、２０１１年には、およそ３０個の認可された抗体治療剤についておよそ５００億ドルの世界市場となっている。
【０００５】
主要な治療用抗体は、次の４種類、すなわち、キメラ抗体、ヒト化抗体、さまざまな提示系により選択される合成ヒト抗体ライブラリからの完全ヒト抗体、および、ヒト免疫グロブリン遺伝子を持つトランスジェニック動物からの完全ヒト抗体に属する抗体発見プログラムに由来する（Chames P. et al, Br J Pharmacol.157(2): 220-233, 2009）。ヒト
定常領域および非ヒト可変領域を含むキメラ抗体は、人体に免疫原性リスクを呈し、その結果、治療用途的に見て、ヒト化抗体または完全ヒト抗体には受け入れられていない。ヒト化抗体は、抗原相互作用に不可欠な９０〜９５％のヒト残基および５〜１０％の非ヒト残基を含むが、完全ヒト抗体は、１００％のヒト残基を含む。ヒト化抗体および完全ヒト抗体は、いずれもさまざまな疾患を治療するための治療用途において、大きな成功を収めている。
【０００６】
治療用抗体の開発には、抗体発見、工学、生産細胞株開発、製造工程開発、および臨床研究を含めて１０〜１５年かかることが多い。これらの作業の中でも、抗体発見には６〜１８カ月かかり、生産細胞株開発にはさらに６〜１０カ月かかる可能性がある。現在の抗体発見方法論における最大の問題のひとつは、一般的に全長ＩｇＧである最終抗体生成物の形式を利用していないことである。選択される抗体は、典型的にはマウス抗体であるか、または、ｓｃＦｖもしくはＦａｂなどのヒト抗体のフラグメントであり、これらは、生産細胞株開発の前に最終ＩｇＧ形式に再編成される必要がある。再編成は、下流工程開発において、活性の損失、低発現レベル、凝集、不溶性、および／または不安定性を含む予期せぬ問題を招くことがある。したがって、さらなる抗体工学および最適化が必要となり、その結果、貴重な時間の損失およびコストの増加が生じてしまう可能性がある。
【０００７】
細胞株開発は、抗体を含むすべての治療用タンパク質のための生産細胞株を得るための工程の、非常に重要な部分である。生産細胞株は、生産性が高く、安定であり、かつ、生物活性、タンパク質配列均一性、グリコシル化特性、電荷変異体、酸化、脱アミノ、および低レベルの凝集を含む、正確な生成物品質属性を有する必要がある。ＣＨＯ細胞は、治療用タンパク質の生産のために最も一般的な哺乳類細胞である。生物学的治療剤を生産するために、ＮＳ０またはＳＰ２／０細胞などの他の哺乳類細胞も使用されている（Jayapal KR, et al., Chemical Engineering Progress, 103: 40-47,2007; Li F, et al., MAbs. 2(5): 466-477, 2010）。従来の細胞株開発は、選択マーカとしてジヒドロ葉酸還元酵
素（ＤＨＦＲ）またはグルタミン合成酵素（ＧＳ）を組込むことによって遺伝子増幅系を利用する。典型的には、９６ウェル組織培養プレートでの限界希釈クローニングによって、細胞株開発プログラムにおいて１０００個ものクローンがスクリーニングされる。生産性の高い細胞株を得るためには、たとえば、ＤＨＦＲ系においてメトトレキサート（ＭＴＸ）を用いて、またはＧＳ系においてメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）を用いて、安定なトランスフェクション後に淘汰圧を加えることによって遺伝子増幅が必要となる。ほとんどの場合、生産性は、工程の非常に後期の段階までの唯一の選択基準であることが多く、この後期段階では、一握りのクローンのみが大規模製造に重要な他の品質属性について評価される。その結果、プロジェクトリスクの増加および下流開発に関して複雑な課題が生じてしまう。
【０００８】
組換え型タンパク質生産細胞株としての使用のための目的の細胞集団を選択する工程は、細胞表面分子または細胞内レポーター分子の発現を伴い得る。ＧＦＰなどの細胞内レポーターの高レベルの発現は、細胞毒性があることが分かっている（Liu HS, et al., Biochem Biophys Res Commun, 260: 712-717, 1999; Wallace LM, et al., Molecular Therapy Nucleic Acids. 2, e86, 2013）が、レポーターの細胞毒性は、細胞表面提示によって
最小限となる。
【０００９】
提示技術は、抗体などのタンパク質の高スループットスクリーニングのために開発されている。抗体提示系は、抗体フラグメントをスクリーニングし、選択し、特徴付けるための適用に成功している。これらの系は、典型的には、ファージ提示、大腸菌提示または酵母提示に依拠している。各提示系にはその強みおよび弱みがあるが、一般的に、これらの系は、翻訳後修飾機能を欠くか、または哺乳類細胞と異なる翻訳後修飾機能を示し、全長ＩｇＧの代わりに小さな抗体フラグメントを提示する傾向がある。そのため、単離される抗体フラグメントの生物活性の特徴づけおよびさらなる開発には、適切なフォールディングおよび翻訳後処理のために、全免疫グロブリンへの変換および哺乳類細胞における発現が必要となることが多い。このような変換工程は、初期のスクリーニングで選択されたものと異なる結合特徴を有する抗体を生成する場合がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
選択工程が、生産性以外の品質属性に基づく急速細胞株選択を容易にする、細胞株（抗体生産細胞株など）を生産する組換え型タンパク質の選択のための改善された工程に対する必要性がある。本発明は、組換え型タンパク質生産のための細胞株のスクリーニングおよび選択のための改善された組成物および方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の概要
本開示のさらなる特徴および利点は、以下の説明に記載され、その一部が説明から明らかになる、または、本明細書中に開示される原則の実施により習得可能となるであろう。本開示の特徴および利点は、本明細書中に設けられる開示および例により実現および入手
可能となるであろう。本発明のこれらおよび他の特徴は、以下の説明および添付の請求項からより十分に明確になる、または、本明細書中に記載される原則の実施により習得可能となるであろう。
【００１２】
本発明は、ＰＯＩの最適な発現を与える細胞のサブ集団の選択後、レポーター（たとえば、細胞表面レポーターまたは細胞内レポーター）の発現をオフし得るスイッチ機構に関する。レポーターは、ＧＦＰであるか、または、ＦＡＣＳ、ＭＡＣＳ、もしくはレポ−ターを検出するのに有効な任意の他の分析法により検出可能な任意の他の分子であり得る。レポーターの発現は、レポーターがＰＯＩ発現の代理となるようにＰＯＩの発現に機能的に連結される。上述のスイッチ機構は、表面細胞膜アンカー型レポーター（ＭＡＲ）または細胞内レポーターを提示する細胞を、ＰＯＩを分泌する生産細胞に変換させるために使用されてもよい。一連の分子設計が開示され、これらには、目的の遺伝子（ＧＯＩ）のための発現ベクターに挿入された、部位特異的ＤＮＡレコンビナーゼ認識配列（ＤＲＲＳ）が隣接するＭＡＲの配列が組込まれる。レポーターカセットは、プロモーターと、ＧＯＩまたはＧＯＩの下流との間に、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または別のプロモーターに続いて存在し得る。いずれの場合においても、レポーター発現がまず可能となり、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳによる細胞選択が容易になり、次いで、レポーター発現は、レポーターの同時発現なしにＰＯＩを生産するように細胞を切換えるために、細胞に適切な部位特異的ＤＮＡレコンビナーゼを一過性発現させるまたは直接提供することよって除去される。
【００１３】
代替的には、レポーターカセットは、ＧＯＩのイントロン配列の中間に存在して、選択的スプライシングを引起し、レポーターの発現を招き得る。適切な部位特異的ＤＮＡレコンビナーゼタンパク質の一過性発現または直接の提供後、レポーターカセットは、イントロンから欠失され、レポーターの同時発現なしにＰＯＩの最適な発現および分泌が可能となる。
【００１４】
本開示の上記および他の利点および特徴がどのように得られるかを説明するために、上に簡潔に説明した原則を、添付の図面に図示される特定の実施形態を参照して、より詳細に説明する。これらの図面は、本開示の例示的な実施形態を図示するに過ぎず、したがって、その範囲を限定するとしてみなされるべきではないことを理解されつつ、添付の図面を用いて、本明細書中の原則をさらに具体的かつ詳細に記載し、説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１Ａ〜Ｃは、発現ベクターを含む例示的なＭＡＲカセットおよびＭＡＲを欠失させるスイッチ機構の概略図である。Ａでは、ＭＡＲがＧＯＩの前に存在する。Ｂでは、ＭＡＲがＧＯＩの後に、ＩＲＥＳまたは別のプロモーターに続いて存在する。Ｃでは、ＭＡＲがＧＯＩのイントロンの中間に存在する。
【図２】図２ａ）〜ｆ）は、モデルＧＯＩの例示的な分子構造の概略図である。ａ）１つのイントロンおよび２つのエクソンを有する野生型ゲノム配列である。ｂ）膜結合ドメイン（ＭＡＤ）に融合したエクソン２である。ｃ）部位特異的ＤＮＡレコンビナーゼ認識配列（ＤＲＲＳ）が隣接するエクソン２−ＭＡＤのイントロンへの挿入である。ｄ）ＤＲＲＳが隣接するＭＡＤのイントロンへの挿入である。ｅ）部位特異的ＤＮＡレコンビナーゼ認識配列（ＤＲＲＳ）が隣接するエクソン２−ＭＡＤのエクソン２の下流への挿入である。ｆ）ＤＲＲＳが隣接するＭＡＤのエクソン２の下流への挿入である。
【図３Ａ】図２Ｃの分子設計の２つの選択的ＲＮＡスプライシングイベントの概略図である。
【図３Ｂ】図２Ｄの分子設計の２つの選択的ＲＮＡスプライシングイベントの概略図である。
【図３Ｃ】図２Ｅの分子設計の２つの選択的ＲＮＡスプライシングイベントの概略図である。
【図３Ｄ】図２Ｆの分子設計の２つの選択的ＲＮＡスプライシングイベントの概略図である。
【図４Ａ】図２Ｃの分子設計の適切な部位特異的ＤＮＡレコンビナーゼの存在下でのＤＮＡ組換えの概略図である。
【図４Ｂ】図２Ｄの分子設計の適切な部位特異的ＤＮＡレコンビナーゼの存在下でのＤＮＡ組換えの概略図である。
【図４Ｃ】図２Ｅの分子設計の適切な部位特異的ＤＮＡレコンビナーゼの存在下でのＤＮＡ組換えの概略図である。
【図４Ｄ】図２Ｆの分子設計の適切な部位特異的ＤＮＡレコンビナーゼの存在下でのＤＮＡ組換えの概略図である。
【図５】図５ａ）〜ｆ）は、例示的な抗体重鎖ゲノム配列の概略図である。ａ）４つのエクソン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３）と３つのイントロン（イントロン１〜３）を含む野生型重鎖定常領域である。ｂ）ＭＡＤに融合した重鎖である。ｃ）ＬｏｘＰ配列が隣接するＣＨ３−ＭＡＤのイントロン３への挿入である。ｄ）ＬｏｘＰ配列が隣接するＭＡＤのイントロン３への挿入である。ｅ）ＬｏｘＰ配列が隣接するＣＨ３−ＭＡＤのＣＨ３の下流への挿入である。ｆ）ＬｏｘＰ配列が隣接するＭＡＤのＣＨ３の下流への挿入である。ｃ）〜ｆ）では、ＣＨ２前の領域が存在するが、図示しない。
【図６Ａ】図５Ｃの分子設計の２つの選択的ＲＮＡスプライシングイベントの概略図である。ＣＨ２前の領域は図示しない。
【図６Ｂ】図５Ｄの分子設計の２つの選択的ＲＮＡスプライシングイベントの概略図である。ＣＨ２前の領域は図示しない。
【図７Ａ】図５Ｃの分子設計のＣｒｅレコンビナーゼの存在下でのＤＮＡ組換えの概略図である。ＣＨ２前の領域は図示しない。
【図７Ｂ】図５Ｄの分子設計のＣｒｅレコンビナーゼの存在下でのＤＮＡ組換えの概略図である。ＣＨ２前の領域は図示しない。
【図８Ａ】抗体細胞株開発工程のフローチャートである。
【図８Ｂ】抗体ライブラリスクリーニング工程のフローチャートである。
【図９Ａ】抗体重鎖発現ベクターのプラスミドマップである。
【図９Ｂ】抗体軽鎖発現ベクターのプラスミドマップである。
【図９Ｃ】抗体重鎖および軽鎖発現ベクターのプラスミドマップである。
【図１０Ａ】２９３Ｆ細胞へのリツキサン発現ベクターのトランスフェクション後２日目の培養培地におけるリツキサンレベルを示す図である。
【図１０Ｂ】２９３Ｆ細胞へのリツキサン発現ベクターのトランスフェクション後２日目の細胞表面リツキサン発現を示すＦＡＣＳグラフである。
【図１１Ａ】Ｃｒｅ発現ベクターの一過性トランスフェクション（「Ｃｒｅ後」）によって膜アンカー型抗体発現がオフに切換えられたことを示す図である。
【図１１Ｂ】細胞の組換えＣｒｅによる処置（「Ｃｒｅ後」）によって膜アンカー型抗体発現がオフに切換えられたことを示す図である。
【図１２Ａ】選択的スプライシングを介して膜アンカー型ヒュミラおよび分泌型ヒュミラの両方を発現するＣＨＯＳ細胞株の細胞表面抗体を示す図である。
【図１２Ｂ】膜抗体発現は、選択的スプライシングを介して膜アンカー型ヒュミラおよび分泌型ヒュミラの両方を発現する細胞における分泌型抗体レベルと強い相関関係にあることを示す図である。
【図１３】膜繋ぎ止めをオフに切換えた後のヒュミラ発現細胞株の表面抗体の欠如を示す図である。
【図１４】膜アンカー型ヒュミラを発現するＣＨＯＳ細胞株が、ビオチン化ＴＮＨαおよびストレプトアビジン・フィコエリトリンコンジュゲートとの結合後に陽染したことを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
本明細書では、目的のタンパク質（ＰＯＩ）を培養培地に分泌する生産細胞の選択の改善のための組成物、方法および系が提供される。
【００１７】
本発明は、本明細書に記載される特定の組成物、装置、方法論、系、キットまたは病状に限定されず、当然ながら、これらはさまざまであり得る。さらに、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためでなく、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことが理解されるべきである。
【００１８】
本発明は、膜アンカー型レポーター（ＭＡＲ）または細胞内レポーターを発現する細胞を、たとえば、抗体または任意の他のタンパク質などの目的のタンパク質（ＰＯＩ）を培養培地に分泌する生産細胞に変換するために使用され得るスイッチ機構に関する。ＭＡＲは、膜アンカー型ＰＯＩ、膜アンカー型ＧＦＰ、または、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）もしくは磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）などの高スループット方法論、もしくはレポーター分子の発現を検出するのに有効な任意の他の分析法を用いて検出または選択可能な任意の他の膜結合型分子を含む、任意の分子であり得る。本方法は、レポーター分子を検出することによってＦＡＣＳまたはＭＡＣＳなどの方法論を用いて所望の細胞の初期スクリーニングまたは選択を可能にし、続いて、細胞が、生産目的のレポーター分子の同時発現なしにＰＯＩを分泌するように、細胞を形質転換させる分子スイッチを適用する。
【００１９】
本開示のさまざまな実施形態を以下に詳細に記載する。特定の実施形態を記載するが、これは例示目的に過ぎないことが理解されるべきである。当業者であれば、本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく他の構成を使用してもよいことを認識されるであろう。
【００２０】
定義
本明細書および添付の請求項で使用する単数形は、文脈において別段の明記がない限り、複数形の記載を含むことに留意されるべきである。
【００２１】
別段の定義がない限り、本明細書で使用するすべての技術用語は、概して、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同様の意味を有する。
【００２２】
本明細書で記載する刊行物は、本出願の出願日以前の開示についてのみ示される。本明細書中のどの記載も、本発明が、先行発明によって当該開示に先行する権利を有さないことの記述として解釈されるべきではない。
【００２３】
本明細書で使用する「膜アンカー型レポーター」または「ＭＡＲ」という用語は、膜結合ドメイン（ＭＡＤ）に融合した任意の膜分子または非膜分子に関して使用する。
【００２４】
本明細書で使用する「膜結合ドメイン」または「ＭＡＤ」という用語は、膜に結合したタンパク質ドメインに関して使用し、当該タンパク質ドメインは、ＧＰＩアンカーシグナル配列（ＧＡＳＳ）、膜貫通ドメイン、または、細胞膜もしくは、たとえばＡｂ、ＧＦＰなどの膜タンパク質に結合する任意の分子であり得る。発明の一局面では、宿主細胞は、ＰＯＩに融合した細胞表面膜アンカー型レポーターの発現を特徴とし、当該レポーターの発現は、ＦＡＣＳ、ＭＡＣＳまたはＰＯＩの細胞表面発現を検出可能な任意の技術により検出される。ＰＯＩに融合した細胞表面膜アンカー型レポーターの発現は、図３Ａ〜図３Ｄ、図６Ａおよび図６Ｂに示されるようなＤＮＡ構築物のトランスフェクション後に検出される。
【００２５】
本明細書で使用する「目的のタンパク質」または「ＰＯＩ」という用語は、本発明の方
法を用いて選択され得る所望の特徴を有するタンパク質に関して使用する。「目的のタンパク質」（ＰＯＩ）には、全長タンパク質、ポリペプチド、およびこれらのフラグメント、ペプチドが含まれ、これらはすべて選択される宿主細胞で発現可能である。例示的なＰＯＩは、抗体、酵素、サイトカイン、接着分子、受容体、誘導体、および、本明細書に記載する方法を用いて発現可能な任意の他のポリペプチドである。本発明の別の局面では、目的のタンパク質は、分泌型ポリペプチドとして培養培地から回収される。一般的に、目的のタンパク質は、培養培地中に、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも２００ｍｇ／Ｌ、少なくとも３００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも、または少なくとも１０００ｍｇ／Ｌのレベル、たとえば、１００〜１５０ｍｇ／Ｌ、１５０〜２００ｍｇ／Ｌ、２００〜２５０ｍｇ／Ｌ、２５０〜３００ｍｇ／Ｌ、３００〜５００ｍｇ／Ｌ、または５００〜１０００ｍｇ／Ｌのレベルで生産される。一部の場合には、たとえば酵素などのＰＯＩは、低濃度で生物的に活性であり得る。このような場合、培養培地中１００ｍｇ／Ｌ未満のレベルでの生産で、商業用生産要件が満たされる。一般に、宿主細胞が発現するタンパク質をどのように精製するかを当業者に教示する方法は、当該技術分野で周知である。
【００２６】
本明細書で使用する「目的の遺伝子」または「ＧＯＩ」という用語は、「目的のタンパク質」（ＰＯＩ）をコードする任意の長さのポリヌクレオチド配列に関して使用する。選択される配列は、全長または切断型遺伝子、融合またはタグ付け遺伝子であり、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＤＮＡフラグメント、好ましくはｃＤＮＡであり得る。選択される配列は、天然配列、すなわち、自然発生形態であることもでき、または、変異されるもしくはその他の方法によって所望に修飾されることもできる。
【００２７】
本明細書で使用する「宿主細胞」または「発現宿主細胞」という用語は、生物活性に必要とされる正確なフォールディングおよびグリコシル化を含む翻訳後修飾を有するＰＯＩを効果的に生産する任意の細胞株を指す。例示的な宿主細胞としては、たとえば、ＣＨＯＳ（Invitrogen社）などのチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ、Ｓｐ２／０、ＣＨＯ由来突然変異細胞、またはこのような細胞のいずれかの誘導体もしくは子孫が挙げられる。他の哺乳類細胞としては、限定されないが、ヒト、マウス、ラット、サル、およびげっ歯類の細胞が挙げられ、また、真核細胞も特定のＰＯＩの生産のために適宜本発明の意義の範囲内で使用可能であり、酵母、昆虫、植物および鳥類の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
本明細書で使用する「磁気活性化細胞選別」または「ＭＡＣＳ」という用語は、表面抗原（ＣＤ分子）に依存するさまざまな細胞集団の分離のための方法に関して使用する。ＭＡＣＳという用語は、Miltenyi Biotec社の登録商標であり、この方法は、ＭＡＣＳ技術
としてこの会社により販売されている。
【００２９】
本明細書で使用する「ＤＮＡレコンビナーゼ認識配列」または「ＤＲＲＳ」という用語は、部位特異的レコンビナーゼの活性によりＤＮＡセグメントの再編成を容易にする配列に関して使用し、部位特異的レコンビナーゼは、短ＤＮＡ配列を認識して結合し、その結果、ＤＮＡバックボーンが切断されることにより、２つのＤＮＡ配列が交換された後、ＤＮＡ鎖が再結合する。
【００３０】
本明細書で使用する「ＧＰＩアンカー型シグナル配列」または「ＧＡＳＳ」という用語は、翻訳後修飾中にタンパク質のＣ末端に結合し得る糖脂質に関して使用する。ＧＡＳＳは、炭水化物含有リンカー（イノシトール残基にグリコシドで結合したグルコサミンおよびマンノース）を介して成熟タンパク質のＣ末端アミノ酸に連結したホスファチジルイノシトール基からなる。疎水性フォスファチジルイノシトール基は、細胞膜にタンパク質を繋ぎ止める。
【００３１】
「生産性」または「特定の生産性」という用語は、規定される時間内に規定される細胞数によって生産される特定のタンパク質（たとえばＰＯＩなど）の量を示す。「生産性」を測る例示的な方法の１つとして、規定される密度で新しい培養培地に細胞を播種することがある。たとえば２４、４８または７２時間などの規定される時間後、細胞培養液のサンプルを採取し、ＥＬＩＳＡ測定に供して、目的のタンパク質の力価を求める。生産性は、培養培地のｍｇ／Ｌとして報告され得る。産業製造の文脈では、特定の生産性は、通常、１つの細胞および１日当たりに生産されるピコグラム（「ｐｇ／細胞／日」）単位でのタンパク質の量として表される。
【００３２】
「生物活性」という用語は、細胞内またはインビトロでのアッセイにおけるタンパク質の生物学的機能を示し、定量する。
【００３３】
説明
本発明は、ＧＯＩの発現ベクターに挿入された、部位特異的ＤＮＡレコンビナーゼ認識配列（ＤＲＲＳ）が隣接する膜アンカー型レポーター（ＭＡＲ）または細胞内レポーターの配列が組込まれた一連の分子設計に関する。レポーターカセットは、プロモータとＧＯＩとの間（図１Ａ）、または、ＧＯＩの後にＩＲＥＳもしくは別のプロモーターに続いて（図１Ｂ）、または、ＧＯＩのイントロンの中間（図１Ｃ）に存在し得る。レポーターは、まず発現され、たとえばＦＡＣＳまたはＭＡＣＳによる細胞選別が可能となり、次いで、適切な部位特異的ＤＮＡレコンビナーゼの一過性発現または直接の提供によってレポーターが欠失され、細胞を、レポーターの同時発現なしにＰＯＩの分泌に切換える。ＭＡＲは、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳなどの高スループット方法論を用いて検出または選択される必要があり、ＭＡＲは、膜結合ドメイン（ＭＡＤ）に融合した任意の膜タンパク質または非膜タンパク質であり得、膜結合ドメイン（ＭＡＤ）は、ＧＰＩアンカーシグナル配列（ＧＡＳＳ）、または膜貫通ドメイン、または、細胞表面タンパク質に結合する任意のペプチドであり得る。たとえば、ＭＡＲは、膜アンカー型ＧＦＰまたは膜アンカー型ＰＯＩであり得る。細胞内レポータータンパク質の代わりに膜アンカー型レポータータンパク質を使用することの利点の１つとしては、レポータータンパク質の高濃度の蓄積後に生じるおそれのある細胞毒性を回避することである。配列番号１は、Ｎ末端のＩＬ２シグナルペプチドおよびＣ末端のＤＡＦ  ＧＡＳＳに融合したＧＦＰのヌクレオチド配列を示す。ここでは、任意のＧＦＰ変異体または他の蛍光タンパク質、機能性シグナルペプチドまたは膜結合ドメインを使用することができる。
【００３４】
レポーターを含有する発現ベクターをトランスフェクトした後、ＣＨＯ細胞などの宿主細胞は、発現ベクターが染色体に組込まれたまま、安定な細胞の選択のための適切な抗生物質の存在下で生育され得る。代替的には、トランスフェクト細胞は、レポーター発現が安定するまで１〜２週間ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳによってレポーター発現について直接選択されることもできる。抗生物質を使用しないことの利点は、細胞のよりよい健康状態および発現カセットの潜在的により低い遺伝子抑制のためである（Kaufman WL, et al., Nucleic Acids Res., 36(17), e111, 2008）。次いで、レポーターの高発現レベルまたは他の性質（安定性、タンパク質配列均一性、適切なグリコシル化特性、適切な電荷変異体、および許容される凝集レベルなど）を有する所望の細胞が、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳまたは別の分析技術により選択され得る。次に、適切な部位特異的ＤＮＡレコンビナーゼを提供することによってレポーターカセットを欠失させて、選択された細胞を、ＰＯＩを生産する生産細胞に切換えることができる。ＤＮＡレコンビナーゼは、発現ベクターによる一過性トランスフェクション、または培養培地へのＤＮＡレコンビナーゼタンパク質の直接的な提供、または任意の他の手段によって細胞に供給され得る。
【００３５】
本発明はさらに、ＧＯＩのイントロン配列を修飾するための一連の分子設計を提供する
。図２Ａは、２つのエクソンおよび１つのイントロンを含むモデル分泌型ＧＯＩのゲノム配列を示す。このゲノム配列は、ＭＡＤに融合していれば細胞表面に繋ぎ止められ、ＭＡＤは、ＧＡＳＳ、または膜貫通ドメイン、または細胞表面タンパク質に結合する任意のペプチドであり得る（図２Ｂ）。選択的スプライシング部位を形成するために、ＤＲＲＳが隣接するＭＡＤに融合したＧＯＩエクソン２のＤＮＡ配列をイントロンに挿入することができる（図２Ｃ）、ＤＲＲＳが隣接するＭＡＤをイントロンに挿入することができる（図２Ｄ）、ＤＲＲＳが隣接するＭＡＤに融合したＧＯＩエクソン２のＤＮＡ配列をエクソン２の下流に挿入することができる（図２Ｅ）、または、ＤＲＲＳが隣接するＭＡＤをエクソン２の下流に挿入することができる（図２Ｆ）。
【００３６】
ｍＲＮＡは、図３Ａに示すイントロンのための不変のスプライシングドナーまたは任意の機能性スプライシングドナーと、２つのスプライシング受容体とを含んでもよい。２つのスプライシング受容体は、野生型ＧＯＩ  ｍＲＮＡにおけるスプライシング受容体または任意の機能性スプライシング受容体と同一であってもよい。この例示的な選択的スプライシングは、受容体１を用いると膜アンカー型ＰＯＩを、受容体２を用いると分泌型ＰＯＩを生じ得る（図３Ａ）。分泌型ＰＯＩのみを望む場合、図４Ａに示すように、ＤＲＲＳを認識する適切な部位特異的ＤＮＡレコンビナーゼを細胞で一過性発現させて、ＤＲＲＳ間の配列を欠失させることができる。
【００３７】
イントロンを操作する別の方法は、ＤＲＲＳが隣接するＭＡＤ配列を直接挿入することである（図２Ｄ）。図３Ｂに示す選択的スプライシングは、エクソン２が欠失された膜アンカー型ＰＯＩまたは分泌型ＰＯＩのいずれかを生じ得る。適切な部位特異的ＤＮＡレコンビナーゼが供給されると、ＤＲＲＳ間の配列が欠失され、発現されるＰＯＩがすべて分泌される（図４Ｂ）。
【００３８】
イントロンを操作するさらに別の方法は、部位特異的ＤＮＡレコンビナーゼ認識配列（ＤＲＲＳ）が隣接するエクソン−２−ＭＡＤをエクソン２の下流に挿入することである（図２Ｅ）。図３Ｃに示す選択的スプライシングは、ＭＡＤに融合したエクソン−１およびエクソン−２を有する膜アンカー型ＰＯＩ、またはエクソン１およびエクソン２を有する分泌型ＰＯＩのいずれかを生じ得る。適切な部位特異的ＤＮＡレコンビナーゼが供給されると、ＤＲＲＳ間の配列が欠失され、発現されるＰＯＩがすべて分泌される（図４Ｃ）。
【００３９】
イントロンを操作するさらなる方法は、ＤＲＲＳが隣接するＭＡＤ配列をエクソン２の下流に挿入することである（図２Ｆ）。図３Ｄに示す選択的スプライシングは、エクソン２が欠失された膜アンカー型ＰＯＩ、またはエクソン１およびエクソン２を有する分泌型ＰＯＩのいずれかを生じ得る。適切な部位特異的ＤＮＡレコンビナーゼが供給されると、ＤＲＲＳ間の配列が欠失され、発現されるＰＯＩがすべて分泌される（図４Ｄ）。
【００４０】
図５〜７は、前述のイントロン修飾設計をどのように適用してヒト免疫グロブリンガンマゲノム配列を操作するかを説明する。野生型ヒト抗体ＩｇＧ１重鎖定常領域のゲノム構造は、図５Ａに示すように４つのエクソンおよび３つのイントロンを含む。ＤＮＡ配列は、配列番号３に示される。図５Ｂは、ＭＡＤに融合することにより作製された膜アンカー型抗体重鎖を示す。膜アンカー型抗体は、重鎖のＣ末端にＧＡＳＳまたは膜貫通ドメイン（ＴＭ）を融合することによって構築可能であることが報告されている(Zhou C, et al.,
MAbs, 2:508-518, 2010; Bowers PM, et al. Proc Natl Acad Sci USA, 108(51):20455-20460, 2011; Li. F, et al., Appl Microbiol BiotechnoL, 96(5): 1233-41 2012)。ヒ
トＤＡＦのＧＡＳＳは、配列番号４（ヌクレオチド）および配列番号５（アミノ酸）にそれぞれ示される。任意の他のＧＡＳＳまたはＴＭまたは細胞表面タンパク質に結合する任意のペプチドも、膜繋ぎ止めのために使用することができる。選択的スプライシング部位を形成するために、ＤＲＲＳが隣接するＣＨ３−ＭＡＤのＤＮＡ配列をイントロン３（図
５Ｃ）または他の２つのイントロンに挿入することができる；ＤＲＲＳが隣接するＭＡＤのＤＮＡ配列をイントロン３に挿入することができる（図５Ｄ）；ＬｏｘＰ配列が隣接するＣＨ３−ＭＡＤのＤＮＡ配列をエクソン３の下流に挿入してもよい（図５Ｅ）；または、ＬｏｘＰ配列が隣接するＭＡＤのＤＮＡ配列をエクソン３の下流に挿入してもよい（図５Ｆ）。
【００４１】
ＤＮＡレコンビナーゼＣｒｅの一般的に使用される認識配列のひとつは、ＬｏｘＰであり、この配列は、配列番号８に示される。同様に、他の部位特異的ＤＮＡレコンビナーゼの任意の他のＬｏｘＰ変異体配列または認識配列をここでは使用することができ、たとえば、ＦＲＴ配列（ＦＬＰのためのＤＲＲＳ）、またはａｔｔＢもしくはａｔｔＰ（φＣ３１インテグラーゼのためのＤＲＲＳ（Wang Y, et al., Plant Cell Rep.; 30(3):267-85,
2011）、または任意の他のチロシンレコンビナーゼもしくはセリンレコンビナーゼのた
めの特定のＤＮＡ認識配列などを使用することができる。ｍＲＮＡは、図６Ａに示されるように、イントロン３のための不変のスプライシングドナーと、２つの同一のスプライシング受容体とを有してもよい。
【００４２】
この選択的スプライシングは、受容体１を用いると膜アンカー型抗体を、受容体２を用いると分泌型抗体を生じ得る。分泌型抗体のみを望む場合、ＤＮＡレコンビナーゼＣｒｅを細胞に一過性発現させるまたは培養培地に供給することができ、２つのＬｏｘＰ部位間の配列が、図７Ａに示されるように欠失される。
【００４３】
たとえば、イントロン３を操作して、ＬｏｘＰ部位が隣接するＭＡＤのＤＮＡ配列を直接挿入すれば（図５Ｄ）、図６Ｂに示される選択的スプライシングは、ＣＨ３が欠失された膜アンカー型抗体または分泌型抗体を与えるであろう。ＤＮＡレコンビナーゼＣｒｅが発現されると、ＬｏｘＰ部位間の配列が欠失され、発現される抗体がすべて分泌される（図７Ｂ）。同様に、ＬｏｘＰ部位が隣接するＭＡＤを他の２つのイントロンに挿入して、選択的スプライシングを引起すこともできる。
【００４４】
図８Ａは、ＭＡＲカセットおよびスイッチ機構を利用する例示的な細胞株開発工程を図示する。ＧＯＩの発現ベクターは、図１に示されるようなＭＡＲカセットにより修飾される。当該発現ベクターは、選択マーカー遺伝子を持ち得る。ＰＯＩが複数のサブユニットを含む場合、それらは同じベクターまたは別個の発現ベクターにクローン化されてもよい。発現ベクターは、所望の細胞にトランスフェクトされる。１〜２週間抗生物質選択有りまたは無しで染色体内に安定に組込んだ後、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳなどの任意の高スループット細胞選択または増菌方法論により、細胞をＭＡＲの高発現について分析し、選択する。あるアプローチでは、選択された細胞に適切なＤＮＡレコンビナーゼのための発現ベクターを一過性トランスフェクトして、部位特異的ＤＮＡ組換えを引起す。ＭＡＲカセットの欠失により、ＰＯＩを生産する細胞が得られる。９６ウェルプレートへの単細胞選別または限界希釈クローニング後、培養培地中のＰＯＩ発現レベルおよび／または他の所望の生成物品質属性についてクローンをスクリーニングする。選択されたクローンは、増殖され、凍結保存される。
【００４５】
発明の一応用例では、部位特異的ＤＮＡレコンビナーゼ認識配列（ＤＲＲＳ）が隣接する膜結合ドメイン（ＭＡＤ）を含むヒト免疫グロブリンガンマ発現ベクターを、ＣＨ２配列とＣＨ３配列との間のイントロン領域に挿入することができる。ＭＡＤは、ＧＰＩアンカー型シグナル配列（ＧＡＳＳ）または膜貫通ドメインまたは任意の細胞表面タンパク質に結合するペプチドであることができる。選択的スプライシングの結果、発現される抗体の一部が膜アンカー型となることにより、蛍光標識抗原または二次抗体によって容易に検出される。膜アンカー型抗体の高発現レベルを有する細胞のＦＡＣＳによる選択後、次いで、細胞を、イントロンにおける膜結合の原因となる配列を欠失させるために、適切な部
位特異的ＤＮＡレコンビナーゼを一過性発現させることによって、培養培地に抗体を分泌する生産細胞に切換えてもよい。スイッチ機構は、時間およびコストを大きく減少しながら細胞株開発に使用することができ、抗体または任意の他の組換え型タンパク質の生産ために使用することができる。
【００４６】
所望の特徴を有するタンパク質の高スループットスクリーニングのために、ライブラリ提示技術が開発されている。ＷＯ２０１０／０２２９６１は、宿主細胞の集合から所望されるレベルの対象とするポリペプチドを発現する真核宿主細胞を生成または選択する方法を開示しており、当該方法は、免疫グロブリン膜貫通アンカーを含む融合ポリペプチドを、当該融合ポリペプチドが宿主細胞の表面上に提示されるように使用することによる。
【００４７】
Bowers PM, et al.（Proc Natl Acad Sci U S A. 108(51):20455-60, 2011）は、ヒト
抗体を単離するための方法を開示しており、当該方法は、高結合親和性を有する良好に発現されたヒトＩｇＭ抗体のＦＡＣＳによる最初の選択に基づくライブラリスクリーニング方法を使用し、その後、インビトロでの活性化誘導シチジン脱アミノ酵素（ＡＩＤ）により誘導されるインビトロ体細胞突然変異（ＳＨＭ）と、同じライブラリスクリーニング方法を使用した高親和性抗体の選択とを行う。
【００４８】
DuBridge et al.の米国特許第７，９４７，４９５号は、二重提示ベクター組成物およ
び方法を開示しており、これらは、スプライス部位およびレコンビナーゼ認識部位に基づく免疫グロブリンの分泌型形態および膜結合型形態の発現を提供し、単一の宿主細胞における膜結合型免疫グロブリンおよび同じ免疫グロブリンの分泌型形態のための転写の同時発現を可能にしている。
【００４９】
Beerli, R., et al.（PNAS , vol. 105 (38), 14336-14341, 2008）は、完全ヒトｍＡ
ｂｓの急速単離のための技術を記載しており、これは、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来の抗原特異的Ｂ細胞を単離し、シンドビスウイルス発現系を用いた哺乳類細胞表面提示によってスクリーニングされた組換え型抗原特異的単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ライブラリーを生成し、その後、一回の選択後に、完全ヒト高親和性抗体を単離することによるものである。Zhou et al.（mAbs 2:5, 508-518; 2010）は、哺乳類細胞の表面上での全長機能性抗体の提示に基づいて抗体フラグメントをスクリーニングし、選択し、特徴付けるために使用される別の提示系を開示しており、これは、非常に高い抗原結合親和性を有する抗体の選択のための高スループットＦＡＣＳスクリーニングと合わされたレコンビナーゼ介在性のＤＮＡ組込みに依拠している。
【００５０】
Akamatsu et al.の米国特許第８，１６３，５４６号は、「除去可能なテザー提示ベク
ター」または「膜貫通提示ベクター」の使用に依拠する哺乳類細胞系免疫グロブリンライブラリーを開示しており、当該ライブラリーは、親和性ベースのスクリーニングのための細胞膜結合型免疫グロブリンの発現および分泌型免疫グロブリンの発現のために使用することができる。これらの「除去可能なテザー提示ベクター」においては、細胞表面テザードメインをコードするポリヌクレオチドに第１および第２の制限酵素部位が隣接する。
【００５１】
本明細書に開示される発明は、所望の特徴を有するＰＯＩを選択するための改善されたライブラリーおよびスクリーニング方法を提供する。
【００５２】
図８Ｂは、選択的スプライシングおよびスイッチ機構を利用する例示的な抗体ライブラリースクリーニング工程を示す。一つの例示的なアプローチでは、ＶＨ配列のライブラリーを、図５Ｃまたは図５Ｄに示すような修飾イントロン３を有する発現ベクターにクローン化することができる。軽鎖配列のライブラリーは、同じ発現ベクターまたは別個のベクターにクローン化されてもよい。抗体ライブラリーベクターの発現により、膜アンカー型
抗体の発現ライブラリーが得られる。ＣＨＯ細胞または他の発現宿主細胞へのトランスフェクション後、抗原結合抗体を発現する細胞をＦＡＣＳまたはＭＡＣＳにより選別または選択してもよい。異なるストリンジェントな条件下で複数回の選別または選択を行い、抗原に対して最も高い親和性を有する抗体の生産細胞を単離してもよい。抗体配列は、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲにより選択された細胞から得ることができる。選択された細胞は、適切な部位特異的ＤＮＡレコンビナーゼの発現によってＭＡＤ配列を欠失させることにより、生産細胞に変換されてもよい。同様の設計を、抗体または任意の他のタンパク質の任意の工学されたライブラリーに適用してもよい。実施例８を参照のこと。
【実施例１】
【００５３】
重鎖ゲノム配列の３番目のイントロンにＬｏｘＰ部位を含む発現ベクターからのリツキサンの発現
リツキサン重鎖可変配列（ＶＨ）を遺伝子合成し、制限部位Ｘｂａ ＩとＮｈｅ Ｉとの間のヒトＩｇＧ１重鎖定常領域ゲノム配列を含む哺乳類発現ベクターにクローン化し、ベクターＬＢ０−Ｈを作成した。シグナルペプチドを含むリツキサンＶＨ配列は、配列番号９に示される。抗体重鎖の発現は、ＥＦ１αプロモータの制御下であった。当該ベクターは、安定な細胞選択のためのピューロマイシン耐性遺伝子と、大腸菌増殖のためのアンピシリン耐性遺伝子とを持っている。プラスミドマップを図９Ａに示す。
【００５４】
リツキサン軽鎖ｃＤＮＡを遺伝子合成し、制限部位Ｘｂａ ＩとＢａｍＨ Ｉとの間の別個の哺乳類発現ベクターにクローン化し、ベクターＬＢ０−Ｋを作成した。当該軽鎖の配列は、配列番号１１に示される。抗体軽鎖の発現は、ＥＦ１αプロモータの制御下であった。当該ベクターは、安定な細胞選択のためのネオマイシン耐性遺伝子と、大腸菌増殖のためのアンピシリン耐性遺伝子とを持っている。プラスミドマップを図９Ｂに示す。
【００５５】
ＬｏｘＰ部位をＬＢ０−Ｈにおけるリツキサンガンマゲノム配列の３番目のイントロンの中間にブリッジＰＣＲにより挿入し、ＬＢ１を作成した。重鎖定常領域の配列は、配列番号１３に示される。
【００５６】
リツキサンを発現させるために、２９３Ｆ細胞（Invitrogen社）にＬＢ０−ＫとともにＬＢ０−ＨまたはＬＢ１を同時トランスフェクトした。トランスフェクション条件は、Freestyle Maxトランスフェクション試薬（Invitrogen社）およびＧＦＰ発現ベクターで最
適化した。３０μｇのＤＮＡおよび３７．５μｌのFreestyle Maxを用いて、３０ｍｌの
細胞（１×１０６細胞／ｍｌ）にトランスフェクトした。翌日、細胞を典型的には３回希釈し、さらに１日培養した後、ＧＦＰ発現のためのフローサイトメトリー分析に供した。これらの条件下での２９３Ｆ細胞についてのトランスフェクション効率は、〜８０％であると求められた。リツキサン発現を評価するために、培地中の抗体レベルを希釈ＥＬＩＳＡにより求めた。希釈ＥＬＩＳＡでは、リツキサンをヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（１００ｎｇ／ウェル、Bethyl社）により捕獲し、ヤギ抗ヒトカッパ抗体ＨＲＰコンジュゲート（１：１０，０００希釈、Bethyl社）により検出した。
【００５７】
ヒトＩｇＧ抗体（２μｇ／ｍｌのＩｇＧ、シグマ社）をＩｇＧ定量のための基準として使用した。発現レベルを図１０Ａに示す。ＬＢ１トランスフェクト細胞は、野生型対照ＬＢ０−Ｈと同等の量の抗体を生産し、これは、ＣＨ２とＣＨ３との間のイントロンの中間に挿入されたＬｏｘＰ配列が抗体発現レベルに影響しなかったことを示唆している。両方のトランスフェクト細胞における重鎖定常領域をＲＴ−ＰＣＲにより増幅して、配列決定した。ＲＮＡスプライシングは、ガンマ鎖イントロンの内部にＬｏｘＰ部位があってもなくても同一であることが分かった。
【実施例２】
【００５８】
細胞表面上に繋ぎ止められたリツキサンの発現
ＤＡＦ  ＧＰＩアンカーシグナル配列（配列番号４）またはＰＤＧＦＲ  ＴＭドメイン配列（配列番号６）と、それに続くＬｏｘＰおよびイントロン３配列とに融合したヒトＩｇＧ１  ＣＨ３配列を合成し、ＬＢ１中の３番目のイントロンに挿入し、図５Ｃに示すように、ベクターＬＢ３またはＬＢ４をそれぞれ作成した。ＬＢ３およびＬＢ４の重鎖定常領域の配列は、配列番号１４および配列番号１５にそれぞれ示される。ＬＢ０−Ｋ中の軽鎖発現カセットは、制限酵素ＥｃｏＲ  ＶおよびＡｓｃ  Ｉにより消化された。次いで、２６２５ｂｐのＤＮＡフラグメントをＥｃｏＲ  ＶおよびＡｓｃ  Ｉ間のＬＢ４にクローン化し、リツキサン発現ベクターＬＢ３７を作成した。プラスミドマップを図９Ｃに示す。リツキサン発現を評価するために、Freestyle Maxトランスフェクション試薬を用いて
、２９３Ｆ細胞に、軽鎖ベクターＬＢ０−Ｋとともに、重鎖ベクターＬＢ３、またはＬＢ４を同時トランスフェクトした。
【００５９】
培地中の抗体力価を希釈ＥＬＩＳＡにより求めた。希釈ＥＬＩＳＡでは、リツキサンをヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（１００ｎｇ／ウェル、Bethyl社）により捕獲し、ヤギ抗ヒトカッパ抗体ＨＲＰコンジュゲート（１：１０，０００希釈、Bethyl社）により検出した。ヒトＩｇＧ抗体（２μｇ／ｍｌのＩｇＧ、シグマ社）をＩｇＧ定量のための基準として使用した。発現レベルを図１０Ａに示す。修飾イントロンを採用したベクターは、細胞密度が典型的には約１×１０６細胞／ｍｌである２日後の培養培地中で４〜１０μｇ／ｍｌの範囲のリツキサンの頑強な発現を示す。ＬＢ１トランスフェクト細胞は、野生型対照ＬＢ０−Ｈと同等の量の抗体を生産し、これは、ＣＨ２とＣＨ３との間のイントロンの中間に挿入されたＬｏｘＰ配列が抗体発現レベルに影響しなかったことを示唆している。ＬＢ３は、ＬＢ４よりも２〜３倍多くの抗体を培地に分泌し、これは、ＧＰＩ連結型膜繋ぎ止めが１００％ではないことと一致している。この結果は、３つの独立した実験で再現された。
【００６０】
トランスフェクト２９３Ｆ細胞もヤギ抗ヒトＦｃ抗体ＦＩＴＣコンジュゲート（１：１
，０００希釈、Bethyl社）で標識し、フローサイトメトリー分析に供した。野生型ＣＨ３エクソンベクター（ＬＢ０−Ｈ、図１０Ｂ．ａ）またはＬｏｘＰ修飾ＣＨ３エクソンベクター（ＬＢ１、図１０Ｂ．ｂ）をトランスフェクトした２９３Ｆ細胞は、細胞表面抗体発現を示さなかったが、選択的スプライシングされたＣＨ３−ＧＡＳＳベクター（ＬＢ３、図１０Ｂ．ｃ）またはＣＨ３−ＴＭベクター（ＬＢ４、図１０Ｂ．ｄ）をトランスフェクトした２９３Ｆ細胞は、細胞の２０〜３０％で細胞表面抗体を示した（表１）。
【００６１】
【表１】
0006785272.tif 000002
【実施例３】
【００６２】
細胞表面上に繋ぎ止められたＣＨ３欠失リツキサンの発現
ＤＡＦ  ＧＰＩアンカーシグナル配列またはＰＤＧＦＲ  ＴＭドメイン配列ならびにそれに続くＬｏｘＰおよびイントロン３配列を合成し、ＬＢ１の３番目のイントロンに挿入し、図Ｄに示されるように、ベクターＬＢ９またはＬＢ１０をそれぞれ作成した。ＬＢ９およびＬＢ１０の重鎖定常領域の配列は、配列番号１６および配列番号１７にそれぞれ示される。
【００６３】
Freestyle Maxトランスフェクション試薬を用いて、２９３Ｆ細胞に、ＬＢ０−Ｋとと
もに、ＬＢ９またはＬＢ１０を同時トランスフェクトした。２日後、培地中の抗体レベルを実施例１に記載したのと同様にＥＬＩＳＡによりアッセイした。ＬＢ９トランスフェクト細胞は、ＬＢ１０トランスフェクト細胞よりも多い抗体を媒体に分泌し（図１０Ａ）、これは、実施例２に記載した結果と一致していた。トランスフェクト２９３Ｆ細胞もヤギ抗ヒトＦｃ抗体ＦＩＴＣコンジュゲート（１：１，０００希釈、Bethyl社）で標識し、フローサイトメトリー分析に供した。選択的スプライシングされたベクターＬＢ３（図１０Ｂ．ｅ）またはＬＢ４（図１０Ｂ．ｆ）がトランスフェクトされた２９３Ｆ細胞は、細胞の８〜２０％で抗体の細胞表面発現を示した（表１）。
【実施例４】
【００６４】
リツキサン重鎖の上流での膜アンカー型ＧＦＰの発現
コザック共通配列を持つ膜アンカー型ＧＦＰ（配列番号１）に２つのＬｏｘＰ部位を隣接させ、これをベクターＬＢ０−ＨにおけるＥＦ１αプロモータとリツキサンガンマ配列との間に挿入し、図１Ａに記載したように、ベクターＬＢ１１を作成した。２つのＬｏｘＰ部位間の配列をＬＢ１１において欠失させ、１つのＬｏｘＰ部位のみを残してベクターＬＢ１１−ＬｏｘＰを作成した。Freestyle Maxトランスフェクション試薬を用いて、２
９３Ｆ細胞に、ＬＢ０−Ｋとともに、ＬＢ０−Ｈ、ＬＢ１１、またはＬＢ１１−ＬｏｘＰを同時トランスフェクトした。２日後、抗体レベルを実施例１に記載したのと同様にＥＬＩＳＡによりアッセイした。ＬＢ１１トランスフェクト細胞は、ＬＢ０−Ｈトランスフェクト細胞に対して１０％未満しか生産せず（図１０Ａ）、これは、リツキサン重鎖遺伝子の上流におけるＧＦＰカセットの存在が、リツキサンの発現を大きく減少させたことを示唆している。ＧＦＰカセットの除去後、ＬＢ１１−ＬｏｘＰは、ＬＢ０−Ｈと同等レベルでリツキサンを生産した（図１０Ａ）。ＬＢ１１トランスフェクト細胞におけるＧＦＰの発現は、フローサイトメトリー分析により確認した。
【実施例５】
【００６５】
リツキサン重鎖の下流での膜アンカー型ＧＦＰの発現
ＩＲＥＳ配列（配列番号１８）をコザック共通配列を持つ膜アンカー型ＧＦＰ（配列番号１）に融合させた。次いで、ＬｏｘＰ部位をＮ末端およびＣ末端の両方に付加した。全配列を、リツキサンガンマ終始コドンの下流でベクターＬＢ０−ＨにおけるポリＡシグナルの前に挿入し、図１Ｂに記載するように、ベクターＬＢ１４を作成した。２９３Ｆ細胞に、Freestyle Maxトランスフェクション試薬を用いてＬＢ１４およびＬＢ０−Ｋを同時
トランスフェクトした。２日後、媒体中の抗体レベルを実施例１に記載したようにＥＬＩＳＡによりアッセイし、これを図１０Ａに示す。ＬＢ１１トランスフェクト細胞におけるＧＦＰの発現は、フローサイトメトリー分析により確認した。
【実施例６】
【００６６】
Ｃｒｅを提供することによる膜アンカー型抗体のオフ切換え
Ｃｒｅ発現ベクターＬＢ３０を構築した。Ｃｒｅ  ｃＤＮＡは、ヒトコドン最適化され、核局在化のためにＮ末端においてＭＰＫＫＫＲＫ（配列番号１９）のペプチドと融合さ
せた。Ｃｒｅの発現は、ヒトＥＦ１αプロモータによって進められた。
【００６７】
２９３Ｆ細胞に、Freestyle Maxトランスフェクション試薬を用いて、制限酵素Ａｓｃ
Ｉで線状化されたＬＢ３７をトランスフェクトし、１μｇ／ｍｌのピューロマイシンおよび４００μｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下で培養した。およそ２週間の選択後、安定なプールにＣｒｅ発現ベクターＬＢ３０を一過性トランスフェクトした。さらに１週間の培養後、細胞をヤギ抗ヒトＦｃ抗体ＦＩＴＣコンジュゲート（１：１，０００希釈、Bethyl社）で標識し、フローサイトメトリー分析に供して、細胞表面リツキサン発現を評価した。細胞の大部分が、Ｃｒｅトランスフェクション後、図１１Ａに示すように（「Ｃｒｅ後」）、膜アンカー型抗体を失っていた。
【００６８】
膜アンカー型抗体のオフ切換えもまた、細胞培養液に組換え型Ｃｒｅを提供することによって達成された。上記の安定なプールからクローン化された膜アンカー型抗体を発現する細胞株を、核局在化のためのＴＡＴ−ＮＬＳ（Excellgen社）と融合させた１μＭの組
換え型Ｃｒｅで２時間処理した。さらに１週間の培養後、上記と同様に、細胞を細胞表面抗体発現について評価した。細胞の大部分が、図１１Ｂに示すように（「Ｃｒｅ後」）、膜アンカー型抗体を失っていた。
【実施例７】
【００６９】
高生産性ヒュミラ生産細胞株のスクリーニング
ヒュミラ軽鎖（配列番号２０）の可変配列を遺伝子合成して、制限部位Ｘｂａ  ＩとＢｓｉＷ  Ｉとの間のＬＢ０−Ｋにクローン化し、ベクターＬＢ４２を作成した。ヒュミラ重鎖（配列番号２２）の可変配列を遺伝子合成して、制限部位Ｘｂａ  ｌとＮｈｅ  Ｉとの間のＬＢ４にクローン化し、ベクターＬＢ２５を作成した。ＬＢ４２における軽鎖発現カセットは、制限酵素ＥｃｏＲ  ＶおよびＡｓｃ  Ｉにより消化された。次いで、２６４１ｂｐのＤＮＡフラグメントをＥｃｏＲ  ＶおよびＡｓｃ  Ｉ間のＬＢ２５にクローン化し、ヒュミラ発現ベクターＬＢ２９を作成した。
【００７０】
ＣＨＯＳ細胞（Invitrogen社）をFreestyle  ＣＨＯ培地（Invitrogen社）で培養した
。１×１０８ＣＨＯＳ細胞に、Freestyle Maxトランスフェクション試薬を用いて、制限
酵素Ａｓｃ  Ｉで線状化されたＬＢ２９をトランスフェクトし、次いで、１０μｇ／ｍｌのピューロマイシンで２週間選択した。１×１０７の安定な細胞をヤギ抗ヒトＦｃ抗体ＦＩＴＣコンジュゲート（１：１，０００希釈、Bethyl社）で標識し、ＦＡＣＳ選別に供した。細胞表面抗体のうち最も高い発現を有した細胞の０．０１％を５つの９６ウェルプレートに選別した。２〜３週間後、およそ１００個のコロニーが生育した。培養培地を、実施例１に記載したように、ＥＬＩＳＡによってヒュミラの発現についてスクリーニングした。２４個の最も高発現なクローンを採集し、増殖し、凍結保存した。異なる抗体発現レベルを有する６つのクローンを細胞表面抗体評価のために採集した。これらをヤギ抗ヒトＦｃ抗体ＦＩＴＣコンジュゲート（１：１，０００希釈、Bethyl社）で標識し、フローサイトメトリー分析に供して、膜アンカー型抗体発現を確認した（図１２Ａ）。これらをまた、３０ｍｌの振とう培養に供した。７日間の栄養補給なしの回分培養後、実施例１に記載したように、ＥＬＩＳＡによって培養培地における抗体生産を評価した。より高い膜抗体発現は、増加した分泌型抗体生産と強く相関付けられることが分かった（図１２Ｂ）。さらに、最も高い細胞表面抗体の発現を有する線状化ＬＢ２９をトランスフェクトした安定細胞の０．０１％もプールに選別した。１週間の培養後、選択したプールに、Ｎｅｏｎトランスフェクション系（Invitrogen社）により、実施例６に記載したＣｒｅ発現ベクターを一過性トランスフェクトした。さらに一週間の培養後、細胞を限界希釈によって１０個の９６ウェルプレートにクローン化した。２〜３週間後、およそ２００個のコロニーが生育した。培養培地を、実施例１に記載したように、ＥＬＩＳＡによってヒュミラの発現についてスクリーニングした。培地中で最も高いレベルの抗体を有する２４個のクローン
を採集し、２４ウェルプレートに増殖した。３日間の培養後、培養培地をヒュミラの発現について再度スクリーニングした。培地中で最も高いレベルの抗体を有する１２個のクローンを採集し、増殖し、凍結保存した。細胞は、膜アンカー型抗体を有さないことが確認された（図１３Ａ）。３０ｍｌの振とう培養での７日間の栄養補給なしの回分培養後、培養培地における抗体生産を評価した。培地中最も高い抗体のレべルを有する５つのクローンの抗体収率を表２に示す。
【００７１】
【表２】
0006785272.tif 000003
【実施例８】
【００７２】
抗体ライブラリーのモデルスクリーニング
実施例７で選択され、＃２７と称する１つの細胞株は、膜アンカー型ヒュミラを発現する。細胞株＃２７からの細胞を１μｇ／ｍｌのビオチン化ヒトＴＮＦα（ACRO Biosystems社）で３０分間処理した。ＰＢＳで１回洗浄した後、細胞をストレプトアビジン・フィ
コエリトリンコンジュゲート（VectorLabs社）で３０分間標識した。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞をフローサイトメトリー分析に共し、細胞表面ヒュミラ上でのＴＮＦαの陽性の結合を示した（図１４）。細胞株＃２７を、リツキサン発現ベクターＬＢ３７をトランスフェクトしたＣＨＯＳ細胞の安定なプールに１：１０００の比で添加した。ビオチン化ＴＮＦαおよびその後にストレプトアビジン・フィコエリトリンコンジュゲートと結合後、細胞をＦＡＣＳ選別に供した。１０００個の陽性細胞をプールに選別した。２週間培養後、ＦＡＣＳ陽性細胞における抗体配列をＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、ヒュミラ抗体配列であることを確認した。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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