(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質を備えるナノ粒子であって、各融合
タンパク質が、前記ナノ粒子へと自己集合する単量体サブユニットに接続された、インフ
ルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）由来
の少なくとも１つの免疫原性部分を含み、
前記第１の融合タンパク質の前記免疫原性部分の配列と前記第２の融合タンパク質の前
記免疫原性部分の配列とは、少なくとも１つのアミノ酸残基で異なっている、ナノ粒子。
【請求項２】
前記単量体サブユニットが、単量体フェリチンサブユニットタンパク質、単量体エンカ
プスリンタンパク質、単量体０３−３３タンパク質、単量体ＳＯＲタンパク質、単量体Ｌ
Ｓタンパク質、単量体ＰＤＣタンパク質、およびチクングニアウイルス構造ポリタンパク
質からなる群から選択される、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
各融合タンパク質が、配列番号９７、配列番号１００、配列番号１０３、配列番号１０
６、配列番号１０９、配列番号１１２、配列番号１１５、配列番号１１８、配列番号１２
１、配列番号１２４、配列番号１２７、配列番号１３０、配列番号１３３、配列番号１３
６、配列番号１３９、配列番号１４２、配列番号１４５、配列番号１４８、配列番号１５
１、配列番号１５４、配列番号１５７、配列番号１６０、配列番号１６３、配列番号１６
６、配列番号１６９、配列番号１７２、配列番号１７５、配列番号１７８、配列番号１８
１、配列番号１８４、配列番号１８７および配列番号１９０からなる群から選択される配
列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を備える、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項４】
請求項１に記載のナノ粒子を含む、キット。
【請求項５】
感染性病原体に対し個体をワクチン接種するための医薬の調製における、請求項１に記
載のナノ粒子の使用。
【請求項６】
請求項１に記載のナノ粒子を産生するための方法であって、
少なくとも２つの核酸分子を含む細胞を、コードされたタンパク質の発現およびナノ粒
子の形成に適した条件下で培養する工程を備え、
前記少なくとも２つの核酸分子の一方が、前記第１の融合タンパク質をコードし、前記
少なくとも２つの核酸分子の他方が、前記第２の融合タンパク質をコードする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な多価ナノ粒子に基づくワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスに対するワクチン接種によって誘導される防御免疫応答は、主に、宿主細胞受容体とウイルスとの相互作用の原因となるウイルス表面上の糖タンパク質である、ウイルスの赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質を対象とする。ウイルス表面上のＨＡタンパク質は、酵素により切断されてアミノ末端ＨＡ１およびカルボキシ末端ＨＡ２ポリペプチドを生じる赤血球凝集素タンパク質単量体の三量体である。球状頭部は、排他的に、ＨＡ１ポリペプチドの主要部分からなる一方、赤血球凝集素タンパク質をウイルスの脂質エンベロープ中に繋留するステム部は、ＨＡ２と、ＨＡ１の一部とで構成される。赤血球凝集素タンパク質の球状頭部は、以下の２個のドメインを含む：シアル酸結合部位を含むほぼ１４８アミノ酸残基ドメインである受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）と、ＲＢＤ直下のより小型のほぼ７５アミノ酸残基領域である痕跡的なエステラーゼドメイン。２，６−シアル酸認識部位に隣接するＲＢＤの上部は、Ａ／サウスカロライナ／１／１９１８（１９１８  ＳＣ）およびＡ／カリフォルニア／０４／２００９（２００９  ＣＡ）パンデミック系統の間で９５％保存された、三量体当たり６０００Å２を超える大型の領域（アミノ酸１３１〜１４３、１７０〜１８２、２０５〜２１５および２５７〜２６２、１９１８ナンバリング）（本明細書において、ＲＢＤ−Ａ領域と称される）を含む。球状頭部は、免疫優性エピトープを含む数個の抗原性部位を含む。例として、Ｓａ、Ｓｂ、Ｃａ１、Ｃａ２およびＣｂ抗原性部位が挙げられる（例えば、非特許文献１を参照）。ＲＢＤ−Ａ領域は、Ｓａ抗原性部位と、Ｓｂ抗原性部位の一部とを含む。
【０００３】
インフルエンザに対する抗体は、保存されたシアル酸結合部位を囲むＨＡの球状頭部における可変抗原性部位を標的とすることが多いため、抗原性的に近縁のウイルスのみを中和する。ＨＡ頭部の可変性は、インフルエンザウイルスの一定の抗原性ドリフトによるものであり、インフルエンザの季節性風土性の原因となる。対照的に、ウイルスゲノムの遺伝子セグメントは、宿主種における再集合（抗原シフト）を起こし、パンデミックとなり得る変更された抗原性を有する新たなウイルスを生じ得る［非特許文献２］。現在まで毎年、インフルエンザワクチンは、次回の循環ウイルスのために予測されるＨＡおよびノイラミニダーゼ（ＮＡ）を反映するように更新されている。
【０００４】
インフルエンザのための現在のワクチン戦略は、化学的に不活性化されたインフルエンザウイルスまたは弱毒生インフルエンザウイルスのいずれかを使用する。どちらのワクチンも、一般に、発育鶏卵において産生され、このことは、時間のかかるプロセスおよび限定された産生能力による主要な製造上の限定を提示する。現在のワクチンの別のより重大な意味を持つ限定は、その高度に系統特異的な有効性である。これらの課題は、２００９年のＨ１Ｎ１パンデミックの出現の際に顕著に明らかになり、これにより、これらの限定を克服することができる新たなワクチンプラットフォームの必要性を検証することになった。ウイルス様粒子（Ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｕｌｅ）は、斯かる代替アプローチの１つを表し、現在、臨床治験において評価されている［非特許文献３；非特許文献４］。発育鶏卵の代わりに、ＨＡ、ＮＡおよびマトリックスタンパク質１（Ｍ１）を備えるＶＬＰは、哺乳類または昆虫細胞発現系において大量産生され得る［非特許文献５］。このアプローチの利点は、その粒子状多価性質と、感染性ビリオンを忠実に模倣する適切にフォールドされたＨＡタンパク質の真正な呈示である。対照的に、その集合の性質により、被包されたＶＬＰは、小型のただし限られた宿主細胞構成成分を含有し、このプラットフォームの反復使用後の潜在的な安全性、免疫原性課題を提示し得る［非特許文献６
］。さらに、ＶＬＰによって誘導される免疫は、現在のワクチンによって誘導される免疫と基本的に同じであるため、ワクチンに誘導される防御免疫の効力および幅の両方を改善する可能性が低い。ＶＬＰに加えて、組換えＨＡタンパク質もヒトにおいて評価されてきた［非特許文献７；非特許文献８］が、防御中和抗体力価を誘導する能力は限定されている。これらの治験において使用された組換えＨＡタンパク質は、昆虫細胞において産生されており、ネイティブな三量体を優先的に形成しない可能性がある［非特許文献９］。
【０００５】
近年、インフルエンザウイルスに対する広範な中和抗体の全く新たなクラスが単離された。抗体の１クラスは、高度に保存されたＨＡステム部を認識し［非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６］、抗体の別のクラスは、可変ＨＡ頭部におけるＲＢＤのシアル酸結合部位を正確に認識する［非特許文献１７；非特許文献１８］。系統特異的抗体とは異なり、これらの抗体は、複数の抗原性的に別個のウイルスを中和することができ、したがって、斯かる抗体の誘導は、次世代ユニバーサルワクチンの焦点であった［非特許文献１９］。しかし、ワクチン接種によって、このような異種中和プロファイルを有するこのような抗体を頑強に誘発することは、困難であった［非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２２］。
【０００６】
従来のインフルエンザワクチンに対するいくつかの代替にもかかわらず、過去数十年間のバイオテクノロジーにおける進歩が、生物学的材料の遺伝子操作が新規ワクチンプラットフォームの生成に活用されることを可能にした。ほぼ全ての生命体に存在する鉄貯蔵タンパク質であるフェリチンは、多数の潜在的な生化学的／生物医学的目的のために大規模に研究および遺伝子操作された一例であり［特許文献１；非特許文献２３；特許文献２；非特許文献２４］、外因性エピトープペプチドを呈示するための潜在的ワクチンプラットフォームを含む［特許文献３；非特許文献２５］。その自己集合、ならびに一価形態よりも強いＢ細胞応答を誘導し、Ｔ細胞非依存性抗体応答を誘導する抗原多価提示のため、ワクチンプラットフォームとしてのその使用は、特に興味深い［非特許文献２６；非特許文献２７］。さらに、４３２対称性を有する八面体ケージへと集合する２４個のサブユニットからなるフェリチンの分子構造は、その表面に多量体抗原を呈示する潜在力を有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】イワホリ、ケイ（Ｉｗａｈｏｒｉ，  Ｋ．）米国特許第２００９／０２３３３７７号（２００９）
【特許文献２】ナイトウ、エムら（Ｎａｉｔｏｕ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許出願公開第２０１１／００３８０２５号（２０１１）
【特許文献３】カーター、ディー・シーら（Ｃａｒｔｅｒ，  Ｄ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許出願公開第２００６／０２５１６７９号（２００６）
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ケイトン  エー・ジェイら（Ｃａｔｏｎ  ＡＪ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８２，  Ｃｅｌｌ  ３１，  ４１７−４２７
【非特許文献２】サロモン、アールら（Ｓａｌｏｍｏｎ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．）、Ｃｅｌｌ  １３６，  ４０２−４１０  （２００９）
【非特許文献３】ロルダオ、エーら（Ｒｏｌｄａｏ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．）、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９，  １１４９−１１７６  （２０１０）
【非特許文献４】シェリダン、シー（Ｓｈｅｒｉｄａｎ，  Ｃ．）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２７，  ４８９−４９１  （２００９）
【非特許文献５】ハイネス、ジェイ・アール（Ｈａｙｎｅｓ，  Ｊ．Ｒ．）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ８，  ４３５−４４５  （２００９）
【非特許文献６】ウー、シー・ワイら（Ｗｕ，  Ｃ．Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．）、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５，  ｅ９７８４  （２０１０）
【非特許文献７】トリーナー、ジェイ・ジェイら（Ｔｒｅａｎｏｒ，  Ｊ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．）、Ｖａｃｃｉｎｅ  １９，  １７３２−１７３７  （２００１）
【非特許文献８】トリーナー、ジェイ・ジェイ（Ｔｒｅａｎｏｒ，  Ｊ．Ｊ．）ＪＡＭＡ  ２９７，  １５７７−１５８２  （２００７）
【非特許文献９】スティーブンズ、ジェイ（Ｓｔｅｖｅｎｓ，  Ｊ．）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３，  １８６６−１８７０  （２００４）
【非特許文献１０】コルチ、ディーら（Ｃｏｒｔｉ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２０，  １６６３−１６７３  （２０１０）
【非特許文献１１】エキアート、ディー・シーら（Ｅｋｉｅｒｔ，  Ｄ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２４，  ２４６−２５１  （２００９）
【非特許文献１２】カシャップ、エー・ケイら（Ｋａｓｈｙａｐ，  Ａ．Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０５，  ５９８６−５９９１  （２００８）
【非特許文献１３】オクノ、ワイら（Ｏｋｕｎｏ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６７，  ２５５２−２５５８  （１９９３）
【非特許文献１４】スイ、ジェイら（Ｓｕｉ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １６，  ２６５−２７３  （２００９）
【非特許文献１５】エキアート、ディー・シーら（Ｅｋｉｅｒｔ，  Ｄ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３３，  ８４３−８５０  （２０１１）
【非特許文献１６】コルチ、ディーら（Ｃｏｒｔｉ，  Ｄ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３３，  ８５０−８５６  （２０１１）
【非特許文献１７】ホイットル、ジェイ・アールら（Ｗｈｉｔｔｌｅ，  Ｊ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０８，  １４２１６−１４２２１  （２０１１）
【非特許文献１８】クラウス、ジェイ・シーら（Ｋｒａｕｓｅ，  Ｊ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８５，  １０９０５−１０９０８  （２０１１）
【非特許文献１９】ナベル、ジー・ジェイら（Ｎａｂｅｌ，  Ｇ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １６，  １３８９−１３９１  （２０１０）
【非特許文献２０】スティール、ジェイら（Ｓｔｅｅｌ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．）、ＭＢｉｏ  １，  ｅ００１８  （２０１０）
【非特許文献２１】ワン、ティー・ティーら（Ｗａｎｇ，  Ｔ．Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．）、ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ６，  ｅ１０００７９６  （２０１０）
【非特許文献２２】ウェイ、シー・ジェイら（Ｗｅｉ，  Ｃ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２９，  １０６０−１０６４  （２０１０）
【非特許文献２３】メルドラム、エフ・シーら（Ｍｅｌｄｒｕｍ，  Ｆ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７，  ５２２−５２３  （１９９２）
【非特許文献２４】ヤマシタ、アイ（Ｙａｍａｓｈｉｔａ，  Ｉ．）Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １８００，  ８４６−８５７  （２０１０）
【非特許文献２５】リー、シー・キューら（Ｌｉ，  Ｃ．Ｑ．  ｅｔ  ａｌ．）、Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２，  １４３−１４７  （２００６）
【非特許文献２６】バッハマン、エム・エフら（Ｂａｃｈｍａｎｎ，  Ｍ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．）、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５，  ２３５−２７０  （１９９７）
【非特許文献２７】ディンティス、エイチ・エムら（Ｄｉｎｔｚｉｓ，  Ｈ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７３，  ３６７１−３６７５  （１９７６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
依然として、インフルエンザウイルスに対する頑強な防御を提供する有効なインフルエンザワクチンの必要がある。特に、依然として、広範に中和免疫応答を誘発し、これにより、将来の進化する季節性およびパンデミックインフルエンザウイルス系統を含むインフルエンザウイルスの異種系統から個体を防御するインフルエンザワクチンの必要がある。本発明は、容易に製造される、強力な、広範に中和インフルエンザ抗体を誘発する、新規の多価ナノ粒子に基づくインフルエンザワクチンを提供することにより、このような必要を満たす。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、容易に製造される、強力な、インフルエンザウイルス、ＨＩＶおよびヒトパピローマウイルス等、感染性病原体に対する中和抗体を広範に誘発する、新規のナノ粒子に基づくワクチンを提供する。特に、本発明は、その表面が感染性病原体由来のタンパク質の免疫原性部分の不均一集団を呈示する、新規ナノ粒子（ｎｐ）を提供する。斯かるナノ粒子は、融合タンパク質を備え、この融合タンパク質のそれぞれは、感染性病原体由来のタンパク質の１個または複数の免疫原性部分に接続されたフェリチンの単量体サブユニットを備える。斯かるナノ粒子は、個体に投与されると、広範囲の感染性病原体由来のタンパク質に対する免疫応答を誘発する。
【００１１】
一実施形態において、本発明は、融合タンパク質を備えるナノ粒子であって、ナノ粒子の表面が、少なくとも２つの感染性病原体由来の対応するタンパク質の免疫原性部分を呈示し、少なくとも２つの感染性病原体が、同じ分類学上の科内の異なる対応する分類群に由来するナノ粒子である。本発明のある特定の態様において、融合タンパク質は、感染性病原体由来のタンパク質の少なくとも１個の免疫原性部分に接続された自己集合する単量体サブユニットの少なくとも一部分を備える。
【００１２】
一実施形態において、本発明は、少なくとも第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質を備えるナノ粒子であって、各融合タンパク質が、感染性病原体由来のタンパク質の少なくとも１個の免疫原性部分に接続された自己集合する単量体サブユニットの少なくとも一部分を備え、第１の融合タンパク質の免疫原性部分が、第１の感染性病原体由来のタンパク質に由来し、第２の融合タンパク質の免疫原性部分が、第２の感染性病原体由来のタンパク質に由来し、第１および第２の感染性病原体由来のタンパク質が、対応するタンパク質であり、第１および第２の感染性病原体が、同じ分類学上の科内の異なる対応する分類群に由来するナノ粒子である。
【００１３】
上述の実施形態において、対応する分類群は、属、型、亜型、種または系統であってよい。ある特定の態様において、単量体サブユニットは、単量体フェリチンサブユニットタンパク質、単量体エンカプスリン（ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ）タンパク質、単量体０３−３３タンパク質、単量体ＳＯＲタンパク質、単量体ＬＳタンパク質、単量体ＰＤＣタンパク質またはチクングニアウイルス構造ポリタンパク質であってよい。ある特定の態様において、感染性病原体は、ウイルスである。ある特定の態様において、感染性病原体は、例えば、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、フラビウイルス（例えば、肝炎ウイルス、デングウイルス等）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ライノウイルス、コロナウイルス、エンテロウイルス、ポリオーマウイルス、呼吸器多核体（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｔｉａｌ）ウイルス（ＲＳＶ）、ヒトメタニューモウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、アルファウイルス（例えば、チクングニアウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、マヤロ（Ｍａｙａｒｏ）ウイルス等）、ブタ流行性下痢、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルスおよび口蹄疫ウイルスであってよい。
【００１４】
一実施形態において、上述の実施形態のナノ粒子は、感染性病原体由来のタンパク質の少なくとも１個の免疫原性部分に接続された自己集合する単量体サブユニットの少なくとも一部分を備える融合タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸分子を細胞に導入し、コードされたタンパク質の発現に適した条件下で細胞をインキュベートしてナノ粒子を形成させることにより、産生され得る。ある特定の実施形態において、斯かる方法は、ナノ粒子のさらなる精製および／または単離を備えることができる。
【００１５】
本発明の一実施形態において、上に記す実施形態のナノ粒子は、感染性病原体から個体を防御するための医薬の調製に使用される。斯かる実施形態において、ナノ粒子は、それに対して個体が防御されている感染性病原体と同じ分類学上の科における感染性病原体に由来するタンパク質の免疫原性部分を備える。ある特定の実施形態において、医薬は、個体のワクチン接種に使用される。
【００１６】
本発明の一実施形態は、感染性病原体に対する防御免疫応答を誘発する方法であって、本発明の実施形態のナノ粒子または本発明の実施形態のナノ粒子を備える組成物もしくは医薬を個体に投与する工程を備え、ナノ粒子が、それに対して防御免疫応答が誘発されている感染性病原体と同じ分類学上の科における感染性病原体に由来するタンパク質の免疫原性部分を備える方法である。
【００１７】
本発明の一実施形態は、感染性病原体に対する中和抗体を誘発する方法であって、本発明の実施形態のナノ粒子または本発明の実施形態のナノ粒子を備える組成物もしくは医薬を個体に投与する工程を備え、ナノ粒子が、それに対する中和抗体が望まれる感染性病原体と同じ分類学上の科における感染性病原体に由来するタンパク質の免疫原性部分を備える方法である。
【００１８】
一実施形態において、本発明は、自己集合する融合タンパク質を備えるナノ粒子であり、本実施形態において、ナノ粒子は、その表面に、インフルエンザウイルスの１つまたは複数の型、群、亜型および／または系統由来のＨＡタンパク質由来の免疫原性部分の不均一集団を呈示する。
【００１９】
別の実施形態において、本発明は、融合タンパク質の不均一集団を備えるナノ粒子であり、本実施形態において、不均一集団が、融合タンパク質の少なくとも２つの異なる種を備えるように、また、融合タンパク質の２つの種の間の差が、少なくとも部分的には、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質由来の免疫原性部分における配列差によるものであるように、各融合タンパク質は、インフルエンザウイルス赤血球凝集素タンパク質由来の少なくとも１個の免疫原性部分に接続された、ナノ粒子へと自己集合することができる単量体サブユニットタンパク質の少なくとも一部分を備える。
【００２０】
さらに別の実施形態において、本発明は、融合タンパク質の少なくとも２つの種を備えるナノ粒子であり、本実施形態において、融合タンパク質の種が、少なくとも部分的には、インフルエンザウイルス赤血球凝集素タンパク質由来の免疫原性部分の配列の差により互いに異なるように、各融合タンパク質は、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質由来の少なくとも１個の免疫原性部分に接続された、ナノ粒子へと自己集合することができる単量体サブユニットタンパク質の少なくとも一部分を備える。
【００２１】
また別の実施形態において、本発明は、少なくとも融合タンパク質の第１の種および融合タンパク質の第２の種を備えるナノ粒子であり、本実施形態において、融合タンパク質の種が、少なくとも部分的には、インフルエンザウイルス赤血球凝集素タンパク質由来の免疫原性部分の配列の差により互いに異なるように、融合タンパク質は、インフルエンザウイルス赤血球凝集素タンパク質由来の少なくとも１個の免疫原性部分に接続された、ナ
ノ粒子へと自己集合することができる単量体サブユニットタンパク質の少なくとも一部分を備える。
【００２２】
上述の実施形態において、融合タンパク質の異なる種は、オルトミクソウイルス科内の異なる分類群におけるインフルエンザウイルスのＨＡタンパク質由来の免疫原性部分を含有する。
【００２３】
上述の実施形態において、フェリチンに基づくナノ粒子は、２４個のサブユニットからなっていてもよい八面体を形成することができる。さらに、インフルエンザＨＡタンパク質の免疫原性部分は、約５０Å〜約１００Åの範囲内のスペーシング範囲でナノ粒子の表面に呈示され得る。その上、単量体サブユニットタンパク質は、単量体フェリチンサブユニットタンパク質、単量体エンカプスリンタンパク質、単量体０３−３３タンパク質、単量体ＳＯＲタンパク質、単量体ＬＳタンパク質、単量体ＰＤＣタンパク質およびチクングニアウイルスエンベロープタンパク質から選択され得る。単量体フェリチンサブユニットタンパク質は、細菌フェリチン、植物フェリチン、藻類フェリチン、昆虫フェリチン、真菌フェリチンおよび哺乳類フェリチンから選択され得、好まれる実施形態において、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）フェリチンタンパク質の単量体サブユニット、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）フェリチンタンパク質の単量体サブユニットおよびウシガエルフェリチンタンパク質の単量体サブユニットから選択される。また別の好まれる実施形態において、単量体フェリチンサブユニットタンパク質は、ヘリコバクター・ピロリフェリチンタンパク質および大腸菌フェリチンタンパク質から選択されるフェリチンタンパク質の少なくとも一部分に接続されたウシガエルフェリチンタンパク質の少なくとも一部分を備えるハイブリッドタンパク質であってよい。
【００２４】
本発明の実施形態の一態様において、単量体サブユニットタンパク質は、単量体フェリチンサブユニットタンパク質、単量体エンカプスリンタンパク質、単量体０３−３３タンパク質、単量体ＳＯＲタンパク質、単量体ＬＳタンパク質、単量体ＰＤＣタンパク質およびチクングニアウイルスエンベロープタンパク質から選択されるタンパク質由来の少なくとも２５個の連続したアミノ酸を備えることができる。
【００２５】
本発明の実施形態のまた別の態様において、単量体サブユニットタンパク質は、配列番号６４、配列番号６７、配列番号７０、配列番号７３、配列番号７６、配列番号７９、配列番号８２、配列番号８５、配列番号８８、配列番号９１および配列番号９４から選択される配列から選択されるアミノ酸配列由来の少なくとも２５個の連続したアミノ酸を備えることができる。あるいは、単量体サブユニットタンパク質は、配列番号６４、配列番号６７、配列番号７０、配列番号７３、配列番号７６、配列番号７９、配列番号８２、配列番号８５、配列番号８８、配列番号９１および配列番号９４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％同一のアミノ酸配列を備えることができる。また、単量体サブユニットタンパク質は、配列番号６４、配列番号６７、配列番号７０、配列番号７３、配列番号７６、配列番号７９、配列番号８２、配列番号８５、配列番号８８、配列番号９１および配列番号９４から選択されるアミノ酸配列を備えることができる。
【００２６】
本発明の実施形態の一態様において、ＨＡタンパク質は、Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／カリフォルニア／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／シンガポール／１／１９５７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／香港／１／１９６８（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ブリスベン／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／インドネシア／０５／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ｂ／フロリダ／４／２００６（インフルエンザＢ）、Ａ／パース／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ブリスベン／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ｂ／ブリスベン／６０／２００８（インフルエンザＢ）、Ａ／ウィルソン・スミス（Ｗｉｌｓｏｎ−Ｓｍｉｔｈ）／３
３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／天津／７８／７７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／テキサス／３６／９１（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／シンガポール／６／８６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／メンフィス／３９／８３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／マレーシア／５４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／アイオワ／４３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／香港／１１７／７７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／フォート・モンマス（Ｆｏｒｔ  Ｍｏｎｍｏｕｔｈ）／１／４７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ブリスベン／５９／０７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ベイラー／４０５２／８１（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／アルバニー／４８３５／４８（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／香港／１５６／９７（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／カササギ（ｃｏｍｍｏｎ  ｍａｇｐｉｅ）／香港／５０５２／０７（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ニワトリ／シャンシー（Ｓｈａｎｘｉ）／２／０６（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／烏骨鶏（ｓｉｌｋｙ  ｃｈｅｃｋｅｎ）／香港／ＳＦ１８９／０１（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ニワトリ／河南／１６／０４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ビクトリア／３６１／１１（Ｈ３Ｎ２）、Ｂ／マサチューセッツ／２／１２（インフルエンザＢ）、Ｂ／ブリスベン／６０／０８（インフルエンザＢ）およびＡ／テキサス／５０／１２（Ｈ３Ｎ２）から選択されるウイルスに由来し得る。
【００２７】
本発明の実施形態のさらに別の態様において、ＨＡタンパク質は、Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／カリフォルニア／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／シンガポール／１／１９５７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／香港／１／１９６８（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ブリスベン／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／インドネシア／０５／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ｂ／フロリダ／４／２００６（インフルエンザＢ）、Ａ／パース／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ブリスベン／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ｂ／ブリスベン／６０／２００８（インフルエンザＢ）、Ａ／ウィルソン・スミス／３３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／天津／７８／７７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／テキサス／３６／９１（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／シンガポール／６／８６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／メンフィス／３９／８３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／マレーシア／５４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／アイオワ／４３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／香港／１１７／７７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／フォート・モンマス／１／４７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ブリスベン／５９／０７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ベイラー／４０５２／８１（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／アルバニー／４８３５／４８（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／香港／１５６／９７（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／カササギ／香港／５０５２／０７（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ニワトリ／シャンシー／２／０６（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／烏骨鶏／香港／ＳＦ１８９／０１（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ニワトリ／河南／１６／０４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ビクトリア／３６１／１１（Ｈ３Ｎ２）、Ｂ／マサチューセッツ／２／１２（インフルエンザＢ）、Ｂ／ブリスベン／６０／０８（インフルエンザＢ）およびＡ／テキサス／５０／１２（Ｈ３Ｎ２）からなる群から選択されるインフルエンザウイルスの赤血球凝集素タンパク質由来の少なくとも２５個の連続したアミノ酸を備えることができる。
【００２８】
本発明の実施形態のさらに別の態様において、ＨＡタンパク質は、配列番号１〜６２から選択される配列由来の少なくとも２５個の連続したアミノ酸を備えることができる。ＨＡタンパク質は、配列番号１〜６２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％同一のアミノ酸配列を備えることができる。また、赤血球凝集素タンパク質は、配列番号１〜６２から選択されるアミノ酸配列を備えることができる。
【００２９】
本発明の実施形態のまた別の態様において、ＨＡタンパク質は、配列番号１〜６２から選択されるアミノ酸配列を備えるタンパク質に対する免疫応答を誘発することができる場合がある。
【００３０】
本発明の実施形態の別の態様において、免疫原性部分は、インフルエンザＨＡタンパク質の受容体結合ドメインを備えることができる。さらに、免疫原性部分は、配列番号１〜６２から選択される配列のアミノ酸残基５６〜２６４から選択され得る。
【００３１】
本発明の実施形態のさらに別の態様において、融合タンパク質の少なくとも２つの種は、インフルエンザウイルスの２つの異なる系統由来のＨＡタンパク質から得られる免疫原
性部分を備えることができる。また、融合タンパク質の少なくとも２つの種は、インフルエンザウイルスの２つの異なる亜型由来のＨＡタンパク質から得られる免疫原性部分を備えることができる。
【００３２】
本発明の実施形態のまた別の態様において、融合タンパク質の少なくとも１つの種は、リンカー配列を備えることができる。
本発明の実施形態の別の態様において、ナノ粒子は、インフルエンザＨＡタンパク質のＲＢＤ領域に対する免疫応答を誘発することができる。一態様において、ナノ粒子は、ＨＡ免疫原性部分が得られたインフルエンザウイルスの系統に対し異種であるインフルエンザウイルス系統に対する免疫応答を誘発することができる。また別の態様において、ナノ粒子は、赤血球凝集素タンパク質が得られたインフルエンザウイルスとは抗原性的に相違するインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発することができる。
【００３３】
本発明の実施形態のまた別の態様において、不均一集団は、融合タンパク質の２〜６０の間の種を備えることができる。本発明の実施形態のまた別の態様において、不均一集団は、融合タンパク質の２〜２４０の間の種を備えることができる。
【００３４】
本発明の別の実施形態は、配列番号９７、配列番号１００、配列番号１０３、配列番号１０６、配列番号１０９、配列番号１１２、配列番号１１５、配列番号１１８、配列番号１２１、配列番号１２４、配列番号１２７、配列番号１３０、配列番号１３３、配列番号１３６、配列番号１３９、配列番号１４２、配列番号１４５、配列番号１４８、配列番号１５１、配列番号１５４、配列番号１５７、配列番号１６０、配列番号１６３、配列番号１６６、配列番号１６９、配列番号１７２、配列番号１７５、配列番号１７８、配列番号１８１、配列番号１８４、配列番号１８７および配列番号１９０から選択される配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を備える融合タンパク質である。融合タンパク質は、配列番号９７、配列番号１００、配列番号１０３、配列番号１０６、配列番号１０９、配列番号１１２、配列番号１１５、配列番号１１８、配列番号１２１、配列番号１２４、配列番号１２７、配列番号１３０、配列番号１３３、配列番号１３６、配列番号１３９、配列番号１４２、配列番号１４５、配列番号１４８、配列番号１５１、配列番号１５４、配列番号１５７、配列番号１６０、配列番号１６３、配列番号１６６、配列番号１６９、配列番号１７２、配列番号１７５、配列番号１７８、配列番号１８１、配列番号１８４、配列番号１８７および配列番号１９０から選択されるアミノ酸配列を備えることもできる。
【００３５】
さらなる実施形態は、上述の融合タンパク質のいずれかをコードする核酸分子である。本実施形態において、核酸配列は、配列番号９６、配列番号９９、配列番号１０２、配列番号１０５、配列番号１０８、配列番号１１１、配列番号１１４、配列番号１１７、配列番号１２０、配列番号１２３、配列番号１２６、配列番号１２９、配列番号１３２、配列番号１３５、配列番号１３８、配列番号１４１、配列番号１４４、配列番号１４７、配列番号１５０、配列番号１５３、配列番号１５６、配列番号１５９、配列番号１６２、配列番号１６５、配列番号１６８、配列番号１７１、配列番号１７４、配列番号１７７、配列番号１８０、配列番号１８３、配列番号１８６および配列番号１８９から選択される配列と少なくとも８０％同一であってよい。また別の態様において、核酸配列は、配列番号９６、配列番号９９、配列番号１０２、配列番号１０５、配列番号１０８、配列番号１１１、配列番号１１４、配列番号１１７、配列番号１２０、配列番号１２３、配列番号１２６、配列番号１２９、配列番号１３２、配列番号１３５、配列番号１３８、配列番号１４１、配列番号１４４、配列番号１４７、配列番号１５０、配列番号１５３、配列番号１５６、配列番号１５９、配列番号１６２、配列番号１６５、配列番号１６８、配列番号１７１、配列番号１７４、配列番号１７７、配列番号１８０、配列番号１８３、配列番号１８６および配列番号１８９から選択される配列を備えることができる。さらに、本実施形態において、プラスミドは、上述の核酸分子のいずれかの核酸分子を備えることができる。
【００３６】
本発明の別の実施形態は、上述のナノ粒子のいずれかのナノ粒子を産生するための方法であって、融合タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸分子を導入する工程であって、各融合タンパク質が、インフルエンザウイルス赤血球凝集素タンパク質由来の少なくとも１個の免疫原性部分に接続された、ナノ粒子へと自己集合することができる単量体サブユニットタンパク質の少なくとも一部分を備えることができる工程と、コードされたタンパク質の発現およびナノ粒子の形成に適した条件下で細胞をインキュベートする工程とを備える方法である。本実施形態のさらなる態様は、細胞からナノ粒子を単離する工程を備えることができる。
【００３７】
本発明の別の実施形態は、インフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発する方法であって、上述のナノ粒子を個体に投与する工程を備える方法である。
本発明の別の実施形態は、上述のナノ粒子を個体に投与する工程を備えることができるような、インフルエンザウイルスに対して個体にワクチン接種する方法である。したがって、本発明の別の実施形態は、本発明のナノ粒子を備える免疫原性組成物である。本発明の別の実施形態は、インフルエンザウイルスに対する個体のワクチン接種または免疫応答の誘発（ｅｌｅｃｔｉｎｇ）における使用のための医薬であって、本発明のナノ粒子を備える医薬である。
【００３８】
本発明のさらなる実施形態は、キットである。キットは、上述のナノ粒子、斯かるナノ粒子、上述の融合タンパク質および／または核酸分子を備える組成物および医薬を備えることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】粒子状免疫原における超自然的不均一抗原アレイによる免疫惹起の理論モデルの図。（左のイメージ）天然均一抗原アレイにおける免疫惹起。粒子状均一抗原は、抗原性的に同一のサブユニットによって構築され、これにより、免疫系に対し抗原性的に均一な抗原を呈示する。均一アレイに呈示されている抗原に特異的なＢ細胞受容体（ＢＣＲ）を持つＢ細胞は、「マッチした」抗原性刺激に遭遇した後に強く刺激される（左中央）。より広範な特異性を有するより多くのＢＣＲを持つＢ細胞も、均一抗原アレイによって刺激されるが、おそらく、抗原に対するより広範な特異的ＢＣＲの結合親和性は、「マッチした」抗原に対するより狭い特異的ＢＣＲほど堅固ではないため、より低い程度である（左下）。ＢＣＲは、他の抗原性的に別個の抗原を認識し、これにより、抗原における抗原性的に不均一な部分の接触を回避するため（抗原におけるより小さい抗体フットプリント）、抗原に対するより広範な特異的ＢＣＲのより弱い親和性は、部分的には、その交差反応性によるものである可能性がある。（右のイメージ）超自然的不均一抗原アレイにおける免疫惹起。粒子状不均一抗原は、免疫系に対し抗原性的に不均一な抗原を呈示する、抗原性的に不均一なサブユニットを使用して合成により構築される。不均一抗原アレイによる刺激後に、狭い特異性を有するＢＣＲは、粒子状抗原における抗原のサブセットのみを認識するため、この抗原によって刺激されない（右中央）；より広範な特異性を有するＢＣＲは、粒子状抗原におけるより多数の抗原を認識するため、この抗原によって刺激される（右下）。この状況下で、より広範な特異性を有するＢＣＲを持つＢ細胞は、より狭い特異性を有するＢＣＲを持つＢ細胞を打ち負かす十分な機会を有し、したがって、そうでなければ他のものによって覆われている（ｏｖｅｒｃａｓｔ）交差反応性Ｂ細胞を選択する。
【図２】ＨＡ  ＲＢＤ−フェリチン単一ポリペプチド設計の略図。フーリン−２Ａ（Ｆ２Ａ）自己切断モジュールなしのＨＡ  ＲＢＤ−フェリチン構築物（上）。２または３個のＨＡ  ＲＢＤ−フェリチン構築物が、Ｆ２Ａ自己切断モジュールにより連結されている（それぞれ中央または下）。融合タンパク質が、産生株細胞において産生されると、細胞プロテアーゼフーリンが、Ｆ２ＡモジュールのＮ末端においてその切断部位を切断し、２Ａプロテアーゼが、Ｆ２Ａモジュールから第２の（および第３の）ＨＡ  ＲＢＤ−フェリチンを切断する。その結果、等モル量の各ＨＡ−ＲＢＤ−フェリチンが産生される。
【図３】ＨＡ  ＲＢＤ−ナノ粒子の電子顕微鏡解析の図。（Ａ）ＮＣ９９  ＲＢＤ−ナノ粒子のネガティブ染色電子顕微鏡写真；（Ｂ）ＣＡ０９  ＲＢＤ−ナノ粒子のネガティブ染色電子顕微鏡写真；（Ｃ）共集合された（ＣｏＡｓｍｂｌ  ２）ＲＢＤ−ナノ粒子のネガティブ染色電子顕微鏡写真。精製された粒子は、新鮮にグロー放電炭素コーティングされたグリッドに吸着させ、ギ酸ウラニルで染色された。
【図４】ＮＣ９９  ＲＢＤ−ナノ粒子の二次元分類が、ギ酸ウラニルの代わりにモリブデン酸アンモニウムで染色された画像を使用して計算されたことを示す図。
【図５】ＨＡ  ＲＢＤ−ナノ粒子の特徴評価の図。一価（ＮＣ９９＝Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９およびＣＡ０９＝Ａ／カリフォルニア／０４／２００９）および共集合された（ＣｏＡｓｍｂｌ２＝Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（ＮＣ９９）＋Ａ／カリフォルニア／０４／０９（ＣＡ０９））ナノ粒子は、抗ＮＣ９９（３ｕ−ｕ）（左）、抗パンデミックＨ１Ｎ１  ＨＡ（２Ｄ１）（中）または抗ＨＡステム部（Ｃ１７９）（右）モノクローナル抗体のいずれかを使用して免疫沈降された。続いて、沈降された材料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析された。ほぼ１５０およびほぼ５０ｋＤａのタンパク質バンドは、それぞれＩｇＧ、ＲＢＤ−ナノ粒子サブユニットに対応する。
【図６】異なるＨ１Ｎ１系統由来の精製されたＨＡ  ＲＢＤ−ナノ粒子およびＨＡの異なる組合せによる共集合されたＲＢＤ−ナノ粒子のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の図。ＮＣ９９＝Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９；ＣＡ０９＝Ａ／カリフォルニア／０４／２００９；ＷＳ３３＝Ａ／ウィルソン・スミス／１９３３；ＡＢ４８＝Ａ／アルバニー／４８３５／１９４８；ＢＲ０７＝Ａ／ブリスベン／５９／２００７；ＩＡ４３＝Ａ／アイオワ／１９４３；ＨＫ７７＝Ａ／香港／１１７／１９７７；ＦＭ４７＝Ａ／フォート・モンマス／１／１９４７。ＣｏＡｓｍｂｌ  ２＝Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（ＮＣ９９）＋Ａ／カリフォルニア／０４／０９（ＣＡ０９）；ＣｏＡｓｍｂｌ  ４＝ＣｏＡｓｍｂｌ  ２＋Ａ／ウィルソン・スミス／３３（ＷＳ３３）＋Ａ／アルバニー／４８３５／４８（ＡＢ４８）；ＣｏＡｓｍｂｌ  ６＝ＣｏＡｓｍｂｌ  ４＋Ａ／ブリスベン／５９／０７（ＢＲ０７）＋Ａ／アイオワ／４３（ＩＡ４３）；ＣｏＡｓｍｂｌ  ８＝ＣｏＡＳｍｂｌ  ６＋Ａ／香港／１１７／７７（ＨＫ７７）＋Ａ／フォート・モンマス／１／４７（ＦＭ４７）。
【図７】インフルエンザＡ／ニューカレドニア／２０／１９９９ウイルスに対する赤血球凝集阻害（ＨＡＩ）力価の図。（左パネル）一価ナノ粒子（ＮＣ９９）または一価ナノ粒子の混合物（Ａｄｍｉｘ  ２、４または６）で免疫化されたマウス由来の血清の赤血球凝集（Ｈｅｍａｇｌｕｔｔｉｎａｔｉｏｎ）阻害力価。（中央パネル）一価ナノ粒子（ＮＣ９９）または多価ナノ粒子（ＣｏＡｓｍｂｌ  ２、４、６または８）で免疫化されたマウス由来の血清の赤血球凝集阻害力価。（右パネル）左および中央パネルのデータを使用し、対応するインフルエンザＨＡタンパク質を呈示する混合型一価ナノ粒子または多価ナノ粒子のいずれかによるマウスの免疫化によって生成されたＨＡＩ力価を比較する、サイド・バイ・サイド（Ｓｉｄｅ  ｂｙ  ｓｉｄｅ）比較。全ての血清は、２回目の免疫化の２週間後に収集され、赤血球凝集阻害活性に関して検査された。各ドットは、個々の血清試料を示し、箱髭（ｂｏｘ−ａｎｄ−ｗｈｉｓｋｅｒｓ）グラフとしてプロットされる。Ｐ値は、スチューデントｔ検定によって計算された。
【図８】ＮＣ９９偽型レンチウイルスに対する中和力価の図。（左パネル）一価ナノ粒子（ＮＣ９９）または一価ナノ粒子の混合物（Ａｄｍｉｘ  ２、４または６）で免疫化されたマウス由来の血清の中和力価。（中央パネル）一価ナノ粒子（ＮＣ９９）または多価ナノ粒子（ＣｏＡｓｍｂｌ  ２、４、６または８）で免疫化されたマウス由来の血清の中和力価。（右パネル）左および中央パネルのデータを使用し、対応するインフルエンザＨＡタンパク質を呈示する混合型一価ナノ粒子または多価ナノ粒子のいずれかによるマウスの免疫化によって生成された中和力価を比較する、サイド・バイ・サイド比較。全ての血清は、２回目の免疫化の２週間後に収集され、赤血球凝集阻害活性に関して検査された。各ドットは、個々の血清試料を示し、箱髭グラフとしてプロットされる。Ｐ値は、スチューデントｔ検定によって計算された。
【図９】免疫血清の中和幅の図。ＮＣ９９もしくはＣＡ０９に対する一価ナノ粒子、混合型一価ナノ粒子（Ａｄｍｉｘ  ４）または多価共集合型ナノ粒子（ＣｏＡｓｍｂｌ  ４またはＣｏＡｓｍｂｌ  ８）のいずれかで免疫化されたマウス由来のＨＡＩ力価のヒートマップ表現。各列は、個々のマウスを示す。
【図１０】ＨＡ  ＲＢＤ−ナノ粒子免疫化マウスの末梢血細胞におけるＨＡ特異的交差反応性Ｂ細胞の検出の図。（上部パネル）マウス全血細胞のゲーティング戦略。（下パネル）ＮＣ９９もしくはＣＡ０９に対する一価ナノ粒子、混合型粒子（Ａｄｍｉｘ  ２、Ａｄｍｉｘ  ４またはＡｄｍｉｘ  ６）または多価（ＣｏＡｓｍｂｌ  ２、ＣｏＡｓｍｂｌ  ４、ＣｏＡｓｍｂｌ  ６またはＣｏＡｓｍｂｌ  ８）で免疫化されたマウス由来の末梢血における非ナイーブＢ細胞集団を同定するために、抗ＣＤ３、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ１９、抗ＩｇＤを使用したＦＡＣｓ解析。各ドットは、個々の試料を示す。
【図１１】図１０の下部パネルのＦＡＣＳデータの箱髭プロットの図。
【図１２】ＮＣ９９／ＣＡ０９交差反応性Ｂ細胞頻度および共集合型ＲＢＤ−ナノ粒子の抗原性不均一性の相関。Ｘ軸は、抗原性不均一性（単一のＲＢＤ−ナノ粒子における異なるＨＡ  ＲＢＤの数）を表す。Ｙ軸は、交差反応性Ｂ細胞頻度を表す。ピアソン相関は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６を使用して計算された。
【図１３】Ｆａｂ  ４４１Ｄ６と複合体を形成したＨＡ三量体の三次元再構築モデルの図。（上部パネル）ＨＡ：Ｆａｂ４４１Ｄ６複合体の再構築されたモデルの回転図および上面図。（下部パネル）ＨＡ：Ｆａｂ４４１Ｄ６複合体の電子顕微鏡密度マップ。最終モデルの分解能は、ほぼ１８．５Åであった。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明は、インフルエンザウイルスおよびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）等、様々な感染性病原体に対し広範に中和する免疫応答を生ずるために使用され得る新規のナノ粒子に基づく多価ワクチンに関する。本発明は、一価ナノ粒子に基づくワクチンが、限定された数の近縁の感染性病原体に対する防御免疫応答の誘導に使用され得ることを示す以前の研究を基礎とする。例えば、インフルエンザワクチン分野の以前の研究は、ＨＡ−ＳＡ融合タンパク質を産生するための、自己集合（ＳＡ）タンパク質に接続されたインフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質の免疫原性部分を備える融合タンパク質が、その表面にインフルエンザＨＡタンパク質の免疫原性部分を呈示するナノ粒子へと自己集合することを実証した。さらに、斯かるナノ粒子は、個体に投与されると、インフルエンザウイルスに対する頑強な中和免疫応答を誘発する。斯かるナノ粒子の構築および使用は、その全体を本明細書に援用する米国特許出願公開第２０１４−０３０２０７９（Ａ１）号に記載されている。同様に、エプスタイン・バーウイルスのためのナノ粒子に基づくワクチンは、その全体を本明細書に援用する国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１４／６０１４２に記載されている。そこで、本発明者らは、感染性病原体（例えば、インフルエンザウイルス）の２つ以上の属、型、群、亜型または系統由来のタンパク質の免疫原性部分を呈示するナノ粒子が、異なるが関連する感染性病原体の不均一集団を含む変種を中和する免疫応答を誘発するためのワクチンとして使用され得ることを発見した。さらに、本発明者らは、驚くべきことに、斯かる多価ナノ粒子が、一価ナノ粒子の単一種または一価ナノ粒子の２つ以上の種の混合物を備えるワクチンによるものよりも大きい免疫応答を誘発することを見出した。よって、本発明の全般的な実施形態は、自己集合する融合タンパク質から作製されたナノ粒子であって、ナノ粒子の表面が、同じ分類学上の科の２つ以上の感染性病原体由来のタンパク質の免疫原性部分の不均一集団を呈示するナノ粒子である。特異的な実施形態において、このような２つ以上の感染性病原体由来の対応するタンパク質の免疫原性部分のアミノ酸配列が、少なくとも１個のアミノ酸が異なるように、２つ以上の感染性病原体は、十分に相違する。ある特定の実施形態において、感染性病原体は、同じ分類学上の科内の異なる分類群に由来する。
【００４１】
本発明についてさらに記載する前に、本明細書に記載されている特定の実施形態は、当然ながら変動し得るため、本発明が、本明細書に記載されている特定の実施形態に限定されないことを理解されたい。本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書において使用されている用語法が、特定の実施形態について記載することのみを目的としており、最終的に請求されている発明に関する限定を企図しないことも理解されたい。本発明の要素は、本願の特異的な位置に出現するが、本発明が、本明細書に開示されている要素のいかなる組合せも包含することについても理解されたい。
【００４２】
本明細書において、また、添付の特許請求の範囲において、文脈がそれ以外のこと明らかに指示しない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」が、複数の指示対象を含むことに留意されたい。例えば、核酸分子（ａ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）は、１個または複数の核酸分子を指す。したがって、用語「ａ」、「ａｎ」、「１個または複数」および「少なくとも１個」は、互換的に使用されてよい。同様に、用語「備える」、「含む」および「有する」は、互換的に使用されてよい。特許請求の範囲が、いずれか任意選択の要素を除外するように立案され得ることにさらに留意されたい。したがって、この記載は、特許請求の範囲の要素の記述または「否定的」限定の使用に関連して、「もっぱら」、「のみ」その他等の排他的用語法の使用のための先行詞として働くように企図される。
【００４３】
本明細書において、ナノ粒子は、自己集合する単量体サブユニットタンパク質から形成された粒子を指す。例えば、フェリチンサブユニットタンパク質は、フェリチンナノ粒子へと自己集合する。本発明のナノ粒子は一般に、球形またはスフェロイドの形状であるが、他の形状、例えば、桿状体、立方体、シート、楕円形（ｏｂｌｏｎｇ）、卵形その他も本発明の実施に有用である。本発明のナノ粒子は、サイズが変動し得るが、好まれるナノ粒子は、ＨＡタンパク質球状頭部領域の呈示されている免疫原性部分間の距離が、ナノ粒子に呈示されている２個の隣接する免疫原性部分が単一のＢ細胞受容体の２個の抗原性結合部位の距離に適合し得るような、または約５０〜１００Å離れているようなナノ粒子である。斯かるスペーシングは、２個の隣接する免疫原性部分のそれぞれが、同じＢ細胞受容体における２個の同一抗原結合部位の一方と相互作用することを可能にする。交差反応性免疫応答の選択を可能にするため、ナノ粒子の表面上で隣接する異種免疫原性部分への単一のＢ細胞受容体の結合が望ましい。理論による制約を企図するものではないが、本発明者らは、これが、免疫原性部分への一方の抗原性部位の高親和性結合が、異種免疫原性部分への他方の抗原性結合部位の低親和性結合の安定化を可能にするという事実によるものであると考える。よって、交差反応性抗体を産生するＢ細胞が選択される。この概念は、図１において例証されている。当業者であれば、Ｂ細胞受容体の抗原性結合部位が、およそ５０〜１００オングストローム（Å）離れていることが理解できよう。よって、ある特定の実施形態において、ナノ粒子の表面に呈示されている免疫原性部分は、約５０〜１００Å離間されている。特異的な実施形態において、ナノ粒子の表面に呈示されている免疫原性部分は、約５０Å、約６０Å、約７０Å、約８０Å、約９０Å、約１００Å離間されている。ナノ粒子の表面上の免疫原性部分のスペーシングに関して、用語、約は、２０％以下の変動を指す。
【００４４】
本発明において、本発明の自己集合する単量体サブユニットタンパク質、単量体サブユニットタンパク質、自己集合（ＳＡ）タンパク質、自己集合するサブユニットタンパク質その他は、ナノ粒子への単量体自己集合サブユニットタンパク質の自己集合を導くことができる、全長単量体ポリペプチドまたはそのいずれかの部分もしくはバリアントである。斯かるタンパク質は、当業者にとって公知である。本発明のナノ粒子の産生に有用な自己集合タンパク質の例として、フェリチン、エンカプスリン、硫黄オキシゲナーゼレダクターゼ（ＳＯＲ）、ルマジンシンターゼ（ＬＳ）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＰＤＣ）、ジヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼ（Ｅ２）およびチクングニアウ
イルス等のアルファウイルスのエンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質が挙げられるがそれらに限定されない。斯かるタンパク質の代表例が、下の表１に収載されている。
【００４５】
本明細書において、融合タンパク質は、ペプチド結合により一体に接続されて単一のタンパク質を生ずる、少なくとも２つの無関係のタンパク質由来のアミノ酸配列を含有する組換えタンパク質である。無関係のアミノ酸配列は、互いに直接的に接続されても、あるいはリンカー配列を使用して接続されてもよい。本明細書において、タンパク質同士は、それらのアミノ酸配列が、それらの天然環境（例えば、細胞の内側）においてペプチド結合により一体に接続されて通常では見出されない場合、無関係である。例えば、フェリチンの単量体サブユニットのアミノ酸配列と、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質のアミノ酸配列は、ペプチド結合により一体に接続されて通常では見出されないため、これら２つのタンパク質は、無関係と考慮されるであろう。同様に、エンカプスリンの単量体サブユニットのアミノ酸配列と、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質またはＨＩＶエンベロープタンパク質のアミノ酸配列は、ペプチド結合により一体に接続されて通常では見出されないため、エンカプスリンとインフルエンザＨＡまたはエンカプスリンとＨＩＶエンベロープタンパク質は、無関係と考慮されるであろう。
【００４６】
本明細書において、免疫原性部分の不均一集団は、その表面にタンパク質の免疫原性部分の２つ以上の種を呈示するナノ粒子を指す。本発明のタンパク質の免疫原性部分の種は、免疫原性部分の特異的アミノ酸配列によって定義される。したがって、同一アミノ酸配列を有する２個の免疫原性部分は、免疫原性部分の同じ種と考慮されるであろう。免疫原性部分の同じ種を備える２個の融合タンパク質が、免疫原性部分以外のアミノ酸配列の領域において変動しても変動しなくてもよいことに留意されたい。斯かる融合タンパク質は、それらの配列全体を通して同一である場合、融合タンパク質の同じ種と考慮されるであろう。よって、免疫原性部分の種が、それらの免疫原性部分における変異によって定義されることが明らかとなるであろう。斯かる変異は、免疫原性部分のアミノ酸配列の天然または人為的な変化によるものである可能性がある。例えば、免疫原性部分の新たな種は、組換えＤＮＡ技術等の手段により現存する免疫原性部分の配列を変更（突然変異）することにより生じ得る。斯かる変更を作製する方法は、当業者にとって公知である。
【００４７】
あるいは、免疫原性部分の異なる種を有する融合タンパク質は、独特の、ただし関連する感染性病原体由来の対応するタンパク質またはその有用な部分（または斯かるタンパク質もしくは部分をコードする核酸分子）を使用して作製され得る。例えば、ウイルスは、そのエンベロープ（またはカプシド）タンパク質に突然変異を有する後代ウイルスを産生することが多く、その結果、あるパーセンテージの後代ウイルスは、宿主免疫系による検出を回避することが公知である。同様に、後代産生の反復サイクルは、ウイルスの不均一集団をもたらし、この集団内の様々な個々のウイルスは、そのエンベロープ（またはカプシド）タンパク質の配列が異なる。斯かるプロセスは最終的に、近縁だが遺伝学的に相違するウイルスの産生をもたらす。このような相違するウイルスは、系統、種および亜型と称される。このような系統、種および亜型は、さらに相違するようになると、型、属および／または科へとさらに分類される。斯かる分類は、分類群と称されることがある。例えば、分類群は、科、属、型、亜型、系統または種であってよい。様々な分類群へのウイルスの分類は、当業者によって十分に理解されている。本発明に関して、好まれるナノ粒子は、同じ科内の２つ以上の感染性病原体由来の免疫原性部分を備えるナノ粒子である。
【００４８】
本明細書において、対応するタンパク質は、２つ（以上）の異なる生物における同様の機能を有するタンパク質である。対応するタンパク質は、同一アミノ酸配列を有しても有さなくてもよいが、一般に、ある程度の配列相同性を共有する。上述の例において、２つの近縁のウイルス由来のエンベロープ（またはカプシド）タンパク質が、対応するタンパク質である。さらに別の例として、インフルエンザウイルスの異なる系統、亜型または属
由来の赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質と同様に、ＨＩＶの異なる系統由来のエンベロープタンパク質は、対応するタンパク質と考慮されるであろう。ある特定の実施形態において、同じ分類学上の科由来の２つの異なる感染性病原体における同じ機能を有するタンパク質は、対応するタンパク質と考慮されるであろう。ある特定の実施形態において、斯かるタンパク質は、少なくとも５０％配列相同性を有する。ある特定の実施形態において、斯かるタンパク質は、少なくとも５０％配列同一性、少なくとも６０％配列同一性、少なくとも７０％配列同一性、少なくとも８０％配列同一性、少なくとも８５％配列同一性、少なくとも９５％配列同一性、少なくとも９７％配列同一性または少なくとも９９％配列同一性を有する。
【００４９】
本明細書において、用語、感染性病原体は、哺乳類に感染することができるいずれかの微生物を指す。好まれる感染性病原体は、疾病を引き起こす感染性病原体である。感染性病原体の例として、ウイルス、細菌および寄生生物が挙げられるがそれらに限定されない。本発明の方法の実施に有用なウイルスの例として、オルトミクソウイルス科、レトロウイルス科、フラビウイルス科、フィロウイルス科、コロナウイルス科（ｃｏｒｏｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、パラミクソウイルス科、ピコルナウイルス科（ｐｉｃｏｒｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、レトロウイルス科、パピローマウイルス科、トガウイルス科およびポリオーマウイルス科からなる群から選択される科由来のウイルスが挙げられるがそれらに限定されない。本発明の方法の実施に有用なウイルスのより具体的な例として、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、フラビウイルス（例えば、肝炎ウイルス、デングウイルス等）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ライノウイルス、コロナウイルス、エンテロウイルス、ポリオーマウイルス、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、ヒトメタニューモウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、アルファウイルス（例えば、チクングニアウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、マヤロウイルス等）、ブタ流行性下痢ウイルス、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルスおよび口蹄疫ウイルスが挙げられるがそれらに限定されない。
【００５０】
感染性病原体由来のタンパク質は、このタンパク質を備える感染性病原体に対する免疫応答の生成に有用ないずれかのタンパク質であってよい。有用なタンパク質は、中和抗体の産生等、防御免疫応答を誘発するタンパク質である。特に望ましいタンパク質は、広範な中和抗体の産生を誘発するタンパク質である。本発明を実施するための有用なタンパク質の一例は、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質タンパク質（Ｇｐ１２０）である。抗体応答を誘発するＧＰ１２０およびその有用な突然変異体および他の有用なＨＩＶタンパク質の能力は、これら全ての全体を本明細書に援用する米国特許出願公開番号ＵＳ２０１４０３２２２６９、ＵＳ２００４００５２８２１、ＵＳ２００３００６４３６１、ＵＳ２００３０１５８１３４に記載されている。本発明を実施するための有用なタンパク質の別の例は、フラビウイルスエンベロープタンパク質であり、これは米国特許出願公開第２０１１００５９１３１号、米国特許出願公開第２００９０３１１２８７号および米国特許出願公開第２００４０００９４６９号に記載されており、これらは全て、全体を本明細書に援用する。本発明を実施するための有用なタンパク質の別の例は、ＨＣＶカプシドタンパク質であり、これは米国特許出願公開第２００２０１０７３６０号、米国特許出願公開第２００２０１１９４９５号および米国特許出願公開第２００５０２３３３１６号に記載されており、これらは全て、全体を本明細書に援用する。本発明を実施するための他の有用なタンパク質は、Ｅ２等、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タンパク質である。斯かるタンパク質の使用は、両者共にその全体を本明細書に援用する米国特許出願公開第２０１００１４３４０８号および米国特許出願公開第２０１００１８３６４８号に記載されている。他の有用なタンパク質は、これら全ての全体を本明細書に援用する米国特許出願公開第２０１４０１６１８３３号、米国特許出願公開第２００９０２０２５８３号、米国特許出願公開第２００６０１８２７６２号、米国特許出願公開第２００５００５３６２２号、米国特許出願公開第２００４０１７５３９５号、米国特許出願公開第２００９０１６２３９５
号、米国特許出願公開第２００３０２２４０１５号、米国特許出願公開第２００５０２５５１２３号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１２−０００３２６６号および米国特許出願公開第２０１２０３１５２７０号に開示されている。
【００５１】
本明細書において、広範な中和抗体は、抗体の誘発に使用される（ナノ粒子の産生に使用される）免疫原性部分が由来する感染性病原体の分類群とは異なる分類群由来の感染性病原体を中和する抗体である。好まれる実施形態において、本発明のナノ粒子は、ナノ粒子を産生するための免疫原性（ｉｍｕｎｏｇｅｎｉｃ）部分が由来する感染性病原体の属、型、亜型、種および／または系統とは異なる属、型、亜型、種および／または系統由来の少なくとも１つの感染性病原体を中和する広範な中和抗体を誘発する。例えば、ナノ粒子が、インフルエンザＡ／香港／１／１９６８（Ｈ３Ｎ２）およびインフルエンザＡ／インドネシア／０５／２００５（Ｈ５Ｎ１）由来のＨＡタンパク質の免疫原性部分を使用して構築される場合、斯かるナノ粒子によって誘発される、広範に中和する抗体は、インフルエンザＡ／香港／１／１９６８（Ｈ３Ｎ２）およびインフルエンザＡ／インドネシア／０５／２００５（Ｈ５Ｎ１）以外の属、型、亜型、種および／または系統の１つまたは複数のインフルエンザウイルスを中和することができるであろう。
【００５２】
本発明の一実施形態は、融合タンパク質を備えるナノ粒子であって、ナノ粒子の表面が、少なくとも２つの感染性病原体由来の対応するタンパク質の免疫原性部分を呈示し、少なくとも２つの感染性病原体が、同じ分類学上の科内の異なる対応する分類群に由来するナノ粒子である。一（ｏｎ）実施形態において、各融合タンパク質は、感染性病原体由来のタンパク質の免疫原性部分の少なくとも１個の部分に接続された自己集合する単量体サブユニットの少なくとも一部分を備える。一実施形態において、自己集合する単量体サブユニットの部分は、単量体フェリチンサブユニットタンパク質、単量体エンカプスリンタンパク質、単量体０３−３３タンパク質、単量体ＳＯＲタンパク質、単量体ＬＳタンパク質、単量体ＰＤＣタンパク質およびチクングニアウイルス構造ポリタンパク質からなる群から選択される単量体サブユニットタンパク質由来の少なくとも２５アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも７５アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸または少なくとも１５０アミノ酸を備える。一実施形態において、各融合タンパク質は、単量体フェリチンサブユニットタンパク質、単量体エンカプスリンタンパク質、単量体０３−３３タンパク質、単量体ＳＯＲタンパク質、単量体ＬＳタンパク質、単量体ＰＤＣタンパク質およびチクングニアウイルス構造ポリタンパク質からなる群から選択される単量体サブユニットタンパク質を備える。
【００５３】
一実施形態において、感染性病原体は、ウイルスである。哺乳類に感染することができるいずれかのウイルスが、本発明のナノ粒子の構築において使用され得る。本発明の方法の実施に有用なウイルスの例として、オルトミクソウイルス科、レトロウイルス科、フラビウイルス科、フィロウイルス科、コロナウイルス科、パラミクソウイルス科、ピコルナウイルス科、レトロウイルス科、パピローマウイルス科、トガウイルス科およびポリオーマウイルス科からなる群から選択される科由来のウイルスが挙げられるがそれらに限定されない。有用なウイルスの例として、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、フラビウイルス（例えば、肝炎ウイルス、デングウイルス等）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ライノウイルス、コロナウイルス、エンテロウイルス、ポリオーマウイルス、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、ヒトメタニューモウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、アルファウイルス（例えば、チクングニアウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、マヤロウイルス等）、ブタ流行性下痢ウイルス、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルスおよび口蹄疫ウイルスが挙げられるがそれらに限定されない。
【００５４】
一実施形態において、少なくとも２つの感染性病原体は、同じ科内の異なる属に由来す
る。一実施形態において、少なくとも２つの感染性病原体は、同じ科内の異なる種に由来する。一実施形態において、少なくとも２つの感染性病原体は、同じ科内の異なる型に由来する。一実施形態において、少なくとも２つの感染性病原体は、同じ科内の異なる亜型に由来する。一実施形態において、少なくとも２つの感染性病原体は、同じ科内の異なる系統である。
【００５５】
本発明の一実施形態は、第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質を備えるナノ粒子であって、各融合タンパク質が、感染性病原体由来のタンパク質の少なくとも１個の免疫原性部分に接続された自己集合する単量体サブユニットの少なくとも一部分を備え、第１の融合タンパク質の免疫原性部分が、第１の感染性病原体由来のタンパク質に由来し、第２の融合タンパク質の免疫原性部分が、第２の感染性病原体由来のタンパク質に由来し、第１および第２の感染性病原体由来のタンパク質が、対応するタンパク質であり、第１および第２の感染性病原体が、同じ分類学上の科内の異なる対応する分類群に由来するナノ粒子である。
【００５６】
一実施形態において、感染性病原体は、ウイルスである。哺乳類に感染することができるいずれかのウイルスが、本発明のナノ粒子の構築において使用され得る。本発明の方法の実施に有用なウイルスの例として、オルトミクソウイルス科、レトロウイルス科、フラビウイルス科、フィロウイルス科、コロナウイルス科、パラミクソウイルス科、ピコルナウイルス科、レトロウイルス科、パピローマウイルス科、トガウイルス科およびポリオーマウイルス科からなる群から選択される科由来のウイルスが挙げられるがそれらに限定されない。有用なウイルスの例として、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、フラビウイルス（例えば、肝炎ウイルス、デングウイルス等）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ライノウイルス、コロナウイルス、エンテロウイルス、ポリオーマウイルス、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、ヒトメタニューモウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、アルファウイルス（例えば、チクングニアウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、マヤロウイルス等）、ブタ流行性下痢、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルスおよび口蹄疫ウイルスが挙げられるがそれらに限定されない。
【００５７】
一実施形態において、少なくとも２つの感染性病原体は、同じ科内の異なる属に由来する。一実施形態において、少なくとも２つの感染性病原体は、同じ科内の異なる種に由来する。一実施形態において、少なくとも２つの感染性病原体は、同じ科内の異なる型に由来する。一実施形態において、少なくとも２つの感染性病原体は、同じ科内の異なる亜型に由来する。一実施形態において、少なくとも２つの感染性病原体は、同じ科内の異なる系統である。
【００５８】
本発明の一実施形態は、融合タンパク質の少なくとも２つの種を備えるナノ粒子であって、融合タンパク質の各種が、独特の感染性病原体由来のタンパク質の少なくとも１個の免疫原性部分に接続された自己集合する単量体サブユニットの少なくとも一部分を備え、独特の感染性病原体におけるタンパク質が、互いに対応し、各独特の感染性病原体が、同じ分類学上の科内の異なる対応する分類群に由来するナノ粒子である。
【００５９】
本明細書において、独特の感染性病原体は、互いに遺伝学的に別個である、オルトミクソウイルス科（ｏｒｔｈｏｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）またはレトロウイルス科等の同じ分類学上の科由来の感染性病原体を指す。よって、互いに独特の感染性病原体は、異なる分類群に属するであろう。例えば、インフルエンザウイルスの２つの異なる系統は、互いに独特と考慮されるであろう。同様に、インフルエンザウイルスの２つの異なる亜型は、互いに独特と考慮されるであろう。
【００６０】
特異的な実施形態に限定されることを企図するものではないが、本発明者らは、本発明の一般原則および概念を実証するためにインフルエンザウイルスを利用することを選択した。よって、本発明のある特定の実施形態に関して、インフルエンザウイルスを分類するために本明細書において使用されているあらゆる命名法は、当業者によって一般的に使用されている命名法である。よって、インフルエンザウイルスの型は、インフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型またはインフルエンザＣ型を指す。当業者であれば、特異的な型としてのウイルスの命名が、それぞれのＭ１（マトリックス）タンパク質またはＮＰ（核タンパク質）における配列差に関することが理解できよう。Ａ型インフルエンザウイルスは、群１および群２へとさらに分けられる。これらの群は、そのＨＡタンパク質の配列に基づくウイルスの分類を指す命名である、亜型へとさらに分けられる。現在の一般的に認識されている亜型の例は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７またはＨ１８である。群１インフルエンザ亜型は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６、Ｈ１７およびＨ１８である。群２インフルエンザ亜型は、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４およびＨ１５である。最後に、用語、系統は、それらのゲノム内の小型の遺伝的変異によって互いに異なる亜型内のウイルスを指す。斯かる遺伝的変異は、コードされるインフルエンザタンパク質（複数可）にアミノ酸変化をもたらしても、もたらさなくてもよい。
【００６１】
本明細書において、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質またはＨＡタンパク質は、インフルエンザウイルスの表面上に存在する赤血球凝集素糖タンパク質を指す。インフルエンザウイルスＨＡタンパク質は、細胞の表面上のシアル酸に結合することができ、これは、赤血球細胞を凝集させるウイルス能力の原因となる活性である。インフルエンザウイルスＨＡタンパク質は、インフルエンザウイルスによる細胞の感染後の、エンドソーム膜とインフルエンザウイルス膜の融合の原因ともなる。斯かるタンパク質およびその活性は、当業者にとって公知である。特に本発明に関して、ＨＡタンパク質は、少なくとも免疫応答を誘発することができる、全長インフルエンザウイルス赤血球凝集素タンパク質またはそのいずれかの部分を指す。本発明のナノ粒子の産生に有用な例示的なインフルエンザタンパク質は、下の表１に収載されている。
【００６２】
【表１−１】
0006655623.tif 000002
【００６３】
【表１−２】
0006655623.tif 000003
【００６４】
【表１−３】
0006655623.tif 000004
【００６５】
【表１−４】
0006655623.tif 000005
【００６６】
【表１−５】
0006655623.tif 000006
【００６７】
【表１−６】
0006655623.tif 000007
【００６８】
【表１−７】
0006655623.tif 000008
当業者であれば、異なるインフルエンザウイルス由来のＨＡタンパク質が、これらのＨ
Ａタンパク質の一方または両方におけるアミノ酸残基の挿入および／または欠失により、異なる長さを有し得ることが理解できよう。よって、対応する領域の参照は、比較されている領域と配列、構造および／または機能が同一またはほとんど同一（例えば、少なくとも９５％同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一）である、別のタンパク質の領域を指す。例えば、赤血球凝集素タンパク質の球状頭部領域またはＲＢＤに関して、別の赤血球凝集素タンパク質における対応する領域は、同じ残基数を有していなくてもよいが、非常に同様の配列を有し、同じ機能を果たすであろう。ウイルス間の配列比較を改善するために、アミノ酸ポジションを参照配列に関連付けるナンバリング方式が当業者によって使用される。よって、インフルエンザの異なる系統由来の赤血球凝集素タンパク質における対応するアミノ酸残基は、成熟タンパク質のＮ末端アミノ酸からのその距離に関して同じ残基数を有していなくてもよい。例えば、Ｈ３ナンバリング方式を使用して、Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９（１９９９  ＮＣ、Ｈ１）における残基１００の参照は、成熟タンパク質のＮ末端アミノ酸から１００番目の残基であることを意味しない。その代わりに、Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９（１９９９  ＮＣ、Ｈ１）ＨＡタンパク質の残基１００は、インフルエンザＨ３Ｎ２系統由来のＨＡタンパク質の残基１００と整列する。斯かるナンバリング方式の使用は、当業者によって理解されている。他に記述がなければ、本明細書における赤血球凝集素タンパク質におけるアミノ酸ポジションの参照は、Ｈ３ナンバリング方式を使用して為される。
【００６９】
本明細書において、用語、免疫原性は、特異的タンパク質または特異的タンパク質と高度な同一性を有するアミノ酸配列を備えるタンパク質に対する免疫応答を誘発する特異的タンパク質またはその特異的領域（すなわち、特異的アミノ酸配列）の能力を指す。本発明において、高度な同一性を有する２つのタンパク質は、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する。好まれる免疫原性タンパク質またはその部分は、インフルエンザウイルスに対する中和抗体を誘発するものである。
【００７０】
本明細書において、不均一集団は、集団内の少なくとも１個の分子が、集団内の少なくとも１個の他の分子とは配列が異なる分子集団を指す。例えば、特に本発明に関して、インフルエンザＨＡタンパク質由来の免疫原性部分の不均一集団において、集団は、集団内の少なくとも１個の免疫原性部分のアミノ酸配列が、集団内の少なくとも１個の他の免疫原性部分のアミノ酸配列とは異なるという事実により異種性である。本発明に関して、各独特の配列は、分子の種（例えば、免疫原性部分の種、融合タンパク質の種等）と称される。分子の２つの種の間の配列の差には、単一のアミノ酸差が関与し得る、または２個以上のアミノ酸差が関与し得る。さらに、斯かる差は、異なるエピトープを有する異なる種をもたらしても、もたらさなくてもよい。
【００７１】
本明細書において、エピトープは、Ｂ細胞受容体、Ｔ細胞受容体、抗体その他等、免疫系の構成成分によって認識されて（例えば、それによって結合されて）、免疫複合体を形成し、免疫応答を誘発するアミノ酸残基のクラスターである。斯かるエピトープは、連続したアミノ酸残基（すなわち、タンパク質において互いに隣接するアミノ酸残基）からなっていてもよく、あるいは連続していないアミノ酸残基（すなわち、直鎖状タンパク質において互いに隣接していないアミノ酸残基）からなっていてもよいが、この場合、最終的にフォールドされたタンパク質において三次元空間で空間的に近接している。よって、一実施形態において、免疫原性部分は、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質由来の少なくとも１個のエピトープを備える。
【００７２】
本明細書において、一価ナノ粒子は、その表面にＨＡタンパク質由来の免疫原性部分の単一種を呈示するナノ粒子を指す。すなわち、免疫原性部分は全て、同じ配列を有する。
本明細書において、混合されたナノ粒子は、一価ナノ粒子種の混合物を含有するナノ粒子の集団を指す。斯かる集団において、各一価ナノ粒子は、他の一価ナノ粒子とは別々に産生され、その後に一価ナノ粒子は一体に混合されて、混合されたナノ粒子を産生する。当業者によって、混合されたナノ粒子の集団は、免疫原性部分の２つ以上の種を備えるが、混合された集団における各一価ナノ粒子は、免疫原性部分の単一種を備えることが理解されよう。本明細書において、多価の共集合されたナノ粒子、共集合されたナノ粒子その他は、融合タンパク質の２つ以上の種を組み合わせることによって作製されたナノ粒子であって、少なくとも２つの融合タンパク質が、それらの免疫原性部分の配列が異なるナノ粒子を指す。その結果は、自己集合する融合タンパク質の不均一集団を備えるナノ粒子であって、ＨＡタンパク質由来の免疫原性部分の不均一集団をその表面に呈示するナノ粒子である。斯かる多価ナノ粒子は、モザイクナノ粒子と称されることもある。
【００７３】
本発明の一実施形態は、融合タンパク質の異種集団を備えるナノ粒子であって、各融合タンパク質が、ナノ粒子へと集合することができる単量体サブユニットタンパク質（すなわち、自己集合（ＳＡ）タンパク質）由来の少なくとも２５個の連続したアミノ酸に接続されたインフルエンザＨＡタンパク質由来の少なくとも１個の免疫原性部分を備え、融合タンパク質の異種集団が、融合タンパク質の少なくとも２つの異なる種を備えるナノ粒子である。本発明のナノ粒子は、インフルエンザウイルスのいずれかの型、亜型、系統またはこれらの組合せ由来のＨＡタンパク質の免疫原性部分を備える融合タンパク質から作製され得る。ある特定の実施形態において、免疫原性部分は、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルスおよびＣ型インフルエンザウイルスからなる群から選択される１つまたは複数のインフルエンザウイルス由来のＨＡタンパク質に由来する。一実施形態において、免疫原性部分は、群Ｉインフルエンザウイルスおよび群ＩＩインフルエンザウイルスからなる群から選択される１つまたは複数のウイルス由来のＨＡタンパク質に由来する。一実施形態において、免疫原性部分は、Ｈ１インフルエンザウイルス、Ｈ２インフルエンザウイルス、インフルエンザＨ３ウイルス、インフルエンザＨ４ウイルス、インフルエンザＨ５ウイルス、インフルエンザＨ６ウイルス、Ｈ７インフルエンザウイルス、Ｈ８インフルエンザウイルス、Ｈ９インフルエンザウイルス、Ｈ１０インフルエンザウイルス、Ｈ１１インフルエンザウイルス、Ｈ１２インフルエンザウイルス、Ｈ１３インフルエンザウイルス、Ｈ１４インフルエンザウイルス、Ｈ１５インフルエンザウイルス、Ｈ１６インフルエンザウイルス、Ｈ１７インフルエンザウイルス、Ｈ１８インフルエンザウイルスおよびインフルエンザＢ系列ウイルスからなる群から選択される１つまたは複数のウイルス由来のＨＡタンパク質に由来する。ある特定の実施形態において、免疫原性部分は、Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／カリフォルニア／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／シンガポール／１／１９５７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／香港／１／１９６８（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ブリスベン／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／インドネシア／０５／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ｂ／フロリダ／４／２００６（インフルエンザＢ）、Ａ／パース／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ブリスベン／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ｂ／ブリスベン／６０／２００８（インフルエンザＢ）、Ａ／ウィルソン・スミス／３３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／天津／７８／７７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／テキサス／３６／９１（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／シンガポール／６／８６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／メンフィス／３９／８３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／マレーシア／５４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／アイオワ／４３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／香港／１１７／７７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／フォート・モンマス／１／４７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ブリスベン／５９／０７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ベイラー／４０５２／８１（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／アルバニー／４８３５／４８（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／香港／１５６／９７（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／カササギ／香港／５０５２／０７（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ニワトリ／シャンシー／２／０６（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／烏骨鶏／香港／ＳＦ１８９／０１（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ニワトリ／河南／１６／０４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ビクトリア／３６１／１１（Ｈ３Ｎ２）、Ｂ／マサチューセッツ／２／１２（インフルエンザＢ）、Ｂ／ブリスベン／６０／０８（インフルエンザＢ）およびＡ／テキサス／５０／１２（Ｈ３Ｎ２）からなる群から選択される１つま
たは複数のインフルエンザウイルス由来のＨＡタンパク質に由来する。ある特定の実施形態において、免疫原性部分は、表１に収載されている１つまたは複数のＨＡタンパク質に由来する。ある特定の実施形態において、免疫原性部分は、配列番号１〜配列番号６２を備えるＨＡタンパク質からなる群から選択される１つまたは複数のＨＡタンパク質に由来する。ある特定の実施形態において、免疫原性部分は、配列番号１〜配列番号６２からなるＨＡタンパク質からなる群から選択される１つまたは複数のＨＡタンパク質に由来する。
【００７４】
本発明のナノ粒子の構築に有用な免疫原性部分は、本明細書に開示されているインフルエンザウイルスＨＡタンパク質のバリアントから得ることもできる。本明細書において、バリアントは、その配列が参照配列と同様であるが同一ではないタンパク質または核酸分子を指し、バリアントタンパク質（またはバリアント核酸分子によってコードされるタンパク質）の活性は、有意に変更されていない。配列におけるこのような変異は、天然起源の変異であってよい、または当業者にとって公知の遺伝子操作技法の使用により遺伝子操作され得る。斯かる技法の例は、両者共にその全体を本明細書に援用するサムブルック、ジェイ、フリッチェ、イー・エフ、マニアティス、ティーら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ  Ｅ  Ｆ，  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．）、分子クローニング・実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ）、第２版、コールドスプリングハーバー研究所出版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８９、９．３１〜９．５７頁）または分子生物学最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、６．３．１〜６．３．６に見ることができる。
【００７５】
バリアントに関して、変更が、バリアントタンパク質の活性に有意に影響せず、バリアントタンパク質が、所望の活性を保持する限りにおいて、アミノ酸または核酸配列におけるいかなる型の変更も容認できる。斯かる変異の例として、欠失、挿入、置換およびこれらの組合せが挙げられるがそれらに限定されない。例えば、タンパク質に関して、当業者によって、タンパク質の活性に有意に影響することなく、タンパク質のアミノおよび／またはカルボキシ末端から１個または複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個）のアミノ酸が多くの場合除去され得ることが十分に理解される。同様に、タンパク質の活性に有意に影響することなく、タンパク質に１個または複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個）のアミノ酸が多くの場合挿入され得る。
【００７６】
記述の通り、本発明のバリアントタンパク質は、本明細書に開示されているインフルエンザＨＡタンパク質と比べてアミノ酸置換を含有することができる。タンパク質の活性が有意に影響されない限りにおいて、いかなるアミノ酸置換も容認できる。この点について、本技術分野において、アミノ酸が、その物理的特性に基づき群へと分類され得ることが認められる。斯かる群の例として、有電荷アミノ酸、無電荷アミノ酸、極性無電荷アミノ酸および疎水性アミノ酸が挙げられるがそれらに限定されない。置換を含有する好まれるバリアントは、あるアミノ酸が、同じ群由来のアミノ酸に置換されたバリアントである。斯かる置換は、保存的置換と称される。
【００７７】
天然起源の残基は、共通側鎖特性に基づきクラスへと分けることができる：
１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００７８】
例えば、非保存的置換には、これらのクラスのうち１つのメンバーの、別のクラス由来のメンバーに対する交換が関与し得る。
アミノ酸変化の作製において、アミノ酸の疎水性親水性指標が考慮され得る。各アミノ酸は、その疎水性および電荷特徴に基づいて疎水性親水性指標を割り当てられた。疎水性親水性指標を次に示す：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。タンパク質における相互作用的生物学的機能の付与における疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は、本技術分野において一般に理解されている（カイトら（Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−３１）。ある特定のアミノ酸が、同様の疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸に対して置換されても、依然として同様の生物学的活性を保持し得ることが公知である。疎水性親水性指標に基づく変化の作製において、それらの疎水性親水性指標が±２以内であるアミノ酸の置換が好まれ、±１以内の置換が特に好まれ、±０．５以内の置換がさらにより特に好まれる。
【００７９】
本技術分野において、類似のアミノ酸の置換は、特にその結果作製される生物学的に機能的に均等なタンパク質またはペプチドが本件のような免疫学的発明における使用に企図される場合、親水性に基づいて効果的に為され得ることも理解される。その隣接アミノ酸の親水性によって決まるタンパク質の最大局所的平均親水性は、その免疫原性および抗原性、すなわち、タンパク質の生物学的特性と相関する。次の親水性値が、これらのアミノ酸残基に割り当てられた：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン  （−３．４）。同様の親水性値に基づく変化の作製において、それらの親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好まれ、±１以内の置換が特に好まれ、±０．５以内の置換がさらにより特に好まれる。親水性に基づいて、一次アミノ酸配列からエピトープを同定することもできる。
【００８０】
所望のアミノ酸置換（保存的であれ非保存的であれ）は、斯かる置換が望まれるときに当業者によって決定され得る。例えば、アミノ酸置換は、ＨＡタンパク質の重要な残基の同定に、または本明細書に記載されているＨＡタンパク質の免疫原性、溶解性もしくは安定性の増加もしくは減少に使用され得る。例示的なアミノ酸置換は、下の表２に示されている。
【００８１】
【表２】
0006655623.tif 000009
本明細書において、語句、タンパク質活性に有意に影響するは、タンパク質の活性の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％減少を指す。本発明に関して、斯かる活性は、インフルエンザウイルスに対する中和抗体を含む抗体を誘発する能力であってよい。抗体産生の決定は、インフルエンザウイルスに対する斯かる抗体の力価を測定することにより、または誘発された抗体によって結合される型、亜型もしくは系統の数を測定することにより測定され得る。抗体力価を決定する方法およびウイルス中和アッセイを行う方法は、当業者にとって公知である。上述の活性に加えて、測定され得る他の活性の例として、赤血球細胞を凝集させる能力、シアル酸に結合する能力または細胞に対するタンパク質の結合親和性が挙げられる。斯かる活性を測定する方法は、当業者にとって公知である。
【００８２】
よって、一実施形態において、本発明のナノ粒子は、インフルエンザウイルスのいずれかの型、亜型、系統またはこれらの組合せ由来の１つまたは複数のＨＡタンパク質由来のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を備えるＨＡタンパク質由来の免疫原性部分を備える融合タンパク質を備える。ある特定の実施形態において、免疫原性部分は、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルスおよびＣ型インフルエンザウイルスからなる群から選択される１つまたは複数のインフルエンザウイルス由来のＨＡタンパク質に由来する。ある特定の実施形態において、免疫原性部分は、群１インフルエンザウイルスおよび群２インフルエンザウイルスからなる群から選択される１つまたは複数のインフルエンザウイルス由来のＨＡタンパク質に由来する。一実施形態において、免疫原性部分は、Ｈ１インフルエンザウイルス、Ｈ２インフルエンザウイルス、インフルエンザＨ３ウイルス、インフルエンザＨ４ウイルス、インフルエンザＨ５ウイルス、インフルエンザＨ６ウイルス、
Ｈ７インフルエンザウイルス、Ｈ８インフルエンザウイルス、Ｈ９インフルエンザウイルス、Ｈ１０インフルエンザウイルス、Ｈ１１インフルエンザウイルス、Ｈ１２インフルエンザウイルス、Ｈ１３インフルエンザウイルス、Ｈ１４インフルエンザウイルス、Ｈ１５インフルエンザウイルス、Ｈ１６インフルエンザウイルス、Ｈ１７インフルエンザウイルス、Ｈ１８インフルエンザウイルスおよびインフルエンザ系列Ｂウイルスからなる群から選択される１つまたは複数のウイルス由来のＨＡタンパク質のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を備える１つまたは複数のＨＡタンパク質に由来する。ある特定の実施形態において、免疫原性部分は、Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／カリフォルニア／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／シンガポール／１／１９５７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／香港／１／１９６８（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ブリスベン／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／インドネシア／０５／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ｂ／フロリダ／４／２００６（インフルエンザＢ）、Ａ／パース／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ブリスベン／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ｂ／ブリスベン／６０／２００８（インフルエンザＢ）、Ａ／ウィルソン・スミス／３３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／天津／７８／７７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／テキサス／３６／９１（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／シンガポール／６／８６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／メンフィス／３９／８３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／マレーシア／５４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／アイオワ／４３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／香港／１１７／７７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／フォート・モンマス／１／４７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ブリスベン／５９／０７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ベイラー／４０５２／８１（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／アルバニー／４８３５／４８（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／香港／１５６／９７（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／カササギ／香港／５０５２／０７（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ニワトリ／シャンシー／２／０６（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／烏骨鶏／香港／ＳＦ１８９／０１（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ニワトリ／河南／１６／０４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ビクトリア／３６１／１１（Ｈ３Ｎ２）、Ｂ／マサチューセッツ／２／１２（インフルエンザＢ）、Ｂ／ブリスベン／６０／０８（インフルエンザＢ）およびＡ／テキサス／５０／１２（Ｈ３Ｎ２）からなる群から選択される１つまたは複数のインフルエンザウイルス由来のＨＡタンパク質のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を備えるＨＡタンパク質に由来する。ある特定の実施形態において、免疫原性部分は、表１に収載されている１つまたは複数のＨＡタンパク質のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を備えるＨＡタンパク質に由来する。ある特定の実施形態において、免疫原性部分は、配列番号１〜配列番号６２を備えるＨＡタンパク質からなる群から選択される１つまたは複数のＨＡタンパク質のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を備えるＨＡタンパク質に由来する。ある特定の実施形態において、免疫原性部分は、配列番号１〜配列番号６２からなるＨＡタンパク質からなる群から選択される１つまたは複数のＨＡタンパク質のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を備えるＨＡタンパク質に由来する。
【００８３】
当業者であれば、インフルエンザＨＡタンパク質が、異なる領域またはドメインを含有することが理解できよう。斯かる領域の例として、ステム部領域および球状頭部領域が挙げられる。よって、ナノ粒子に基づくインフルエンザワクチンは、いずれかのインフルエンザＨＡタンパク質由来の免疫原性部分を使用して作製され得るが、好まれる実施形態において、免疫原性部分は、選択されたＨＡタンパク質の特異的領域またはドメインに由来する。本発明の一実施形態は、融合タンパク質の異種集団を備えるナノ粒子であって、各
融合タンパク質が、ナノ粒子へと集合することができる単量体サブユニットタンパク質（すなわち、自己集合（ＳＡ）タンパク質）由来の少なくとも２５個の連続したアミノ酸に接続された、インフルエンザＨＡタンパク質の球状頭部領域由来の少なくとも１個の免疫原性部分を備え、融合タンパク質の異種集団が、融合タンパク質の少なくとも２つの異なる種を備えるナノ粒子である。インフルエンザＡ  ＨＡタンパク質の（およそ）アミノ酸残基５２〜２７７（Ｈ３ナンバリング方式）を備える球状頭部領域は、排他的に、ＨＡ１ポリペプチドの主要部分からなり、２個のドメインを含む：受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）および痕跡的なエステラーゼサブドメイン。球状頭部領域の一例は、配列番号１〜６２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対応する領域を備えるＨＡタンパク質由来のアミノ酸５２〜２７７によって表される。一実施形態において、免疫原性部分は、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルスおよびＣ型インフルエンザウイルスからなる群から選択される１つまたは複数のインフルエンザウイルス由来のＨＡタンパク質のアミノ酸配列と同一である、または少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を備えるＨＡタンパク質の球状頭部領域に由来する。一実施形態において、免疫原性部分は、群Ｉインフルエンザウイルスおよび群ＩＩインフルエンザウイルスからなる群から選択される１つまたは複数のインフルエンザウイルス由来のＨＡタンパク質のアミノ酸配列と同一である、または少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を備えるＨＡタンパク質の球状頭部領域に由来する。一実施形態において、免疫原性部分は、Ｈ１インフルエンザウイルス、Ｈ２インフルエンザウイルス、インフルエンザＨ３ウイルス、インフルエンザＨ４ウイルス、インフルエンザＨ５ウイルス、インフルエンザＨ６ウイルス、Ｈ７インフルエンザウイルス、Ｈ８インフルエンザウイルス、Ｈ９インフルエンザウイルス、Ｈ１０インフルエンザウイルス、Ｈ１１インフルエンザウイルス、Ｈ１２インフルエンザウイルス、Ｈ１３インフルエンザウイルス、Ｈ１４インフルエンザウイルス、Ｈ１５インフルエンザウイルス、Ｈ１６インフルエンザウイルス、Ｈ１７インフルエンザウイルス、Ｈ１８インフルエンザウイルスおよびインフルエンザ系列（ｌｉｎａｇｅ）Ｂウイルスからなる群から選択される１つまたは複数のウイルス由来のＨＡタンパク質のアミノ酸配列と同一である、または少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を備えるＨＡタンパク質の球状頭部領域に由来する。一実施形態において、免疫原性部分は、Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／カリフォルニア／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／シンガポール／１／１９５７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ���香港／１／１９６８（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ブリスベン／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／インドネシア／０５／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ｂ／フロリダ／４／２００６（インフルエンザＢ）、Ａ／パース／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ブリスベン／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ｂ／ブリスベン／６０／２００８（インフルエンザＢ）、Ａ／ウィルソン・スミス／３３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／天津／７８／７７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／テキサス／３６／９１（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／シンガポール／６／８６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／メンフィス／３９／８３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／マレーシア／５４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／アイオワ／４３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／香港／１１７／７７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／フォート・モンマス／１／４７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ブリスベン／５９／０７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ベイラー／４０５２／８１（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／アルバニー／４８３５／４８（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／香港／１５６／９７（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／カササギ／香港／５０５２／０７（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ニワトリ／シャンシー／２／０６（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／烏骨鶏／香港／ＳＦ１８９／０１（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ニワトリ／河南／１６／０４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ビクトリア／３６１／１１（Ｈ３Ｎ２）、Ｂ／マサチューセッツ／２／１２（インフルエンザＢ）、Ｂ／ブリスベン／６０／０８（インフルエンザＢ）およびＡ／テキサス／５０／１２（Ｈ３Ｎ２）からなる群から選択される１つまたは複数のインフルエンザウイルス由来のＨＡタンパク質のアミ
ノ酸配列と同一である、または少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を備えるＨＡタンパク質の球状頭部領域に由来する。一実施形態において、免疫原性部分は、表１に収載されている１つまたは複数のＨＡタンパク質のアミノ酸配列と同一である、または少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を備えるＨＡタンパク質の球状頭部領域に由来する。
【００８４】
記述されてきた通り、球状頭部領域は、いくつかの他の領域またはドメインを備える。よって、当業者によって、自己集合する融合タンパク質の免疫原性部分が、１つまたは複数のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質由来の球状頭部領域由来の断片であってよいことが認められよう。一実施形態において、免疫原性部分は、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質の球状頭部領域由来の少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０または少なくとも２００個の連続したアミノ酸残基を備える。一実施形態において、免疫原性部分は、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルスおよびＣ型インフルエンザウイルスからなる群から（ｆｏｒｍ）選択される１つまたは複数のインフルエンザウイルス由来のＨＡタンパク質またはそのバリアントの球状頭部領域由来の少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０または少なくとも２００個の連続したアミノ酸残基を備える。一実施形態において、免疫原性部分は、群Ｉインフルエンザウイルスおよび群ＩＩインフルエンザウイルスからなる群から選択される１つまたは複数のインフルエンザウイルス由来のＨＡタンパク質またはそのバリアントの球状頭部領域由来の少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０または少なくとも２００個の連続したアミノ酸残基を備える。一実施形態において、免疫原性部分は、Ｈ１インフルエンザウイルス、Ｈ２インフルエンザウイルス、インフルエンザＨ３ウイルス、インフルエンザＨ４ウイルス、インフルエンザＨ５ウイルス、インフルエンザＨ６ウイルス、Ｈ７インフルエンザウイルス、Ｈ８インフルエンザウイルス、Ｈ９インフルエンザウイルス、Ｈ１０インフルエンザウイルス、Ｈ１１インフルエンザウイルス、Ｈ１２インフルエンザウイルス、Ｈ１３インフルエンザウイルス、Ｈ１４インフルエンザウイルス、Ｈ１５インフルエンザウイルス、Ｈ１６インフルエンザウイルス、Ｈ１７インフルエンザウイルス、Ｈ１８インフルエンザウイルスおよびインフルエンザ系列Ｂウイルスからなる群から選択される１つまたは複数のウイルス由来のＨＡタンパク質またはそのバリアントの球状頭部領域由来の少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０または少なくとも２００個の連続したアミノ酸残基を備える。一実施形態において、免疫原性部分は、Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／カリフォルニア／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／シンガポール／１／１９５７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／香港／１／１９６８（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ブリスベン／１０／２００７
（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／インドネシア／０５／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ｂ／フロリダ／４／２００６（インフルエンザＢ）、Ａ／パース／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ブリスベン／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ｂ／ブリスベン／６０／２００８（インフルエンザＢ）、Ａ／ウィルソン・スミス／３３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／天津／７８／７７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／テキサス／３６／９１（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／シンガポール／６／８６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／メンフィス／３９／８３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／マレーシア／５４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／アイオワ／４３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／香港／１１７／７７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／フォート・モンマス／１／４７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ブリスベン／５９／０７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ベイラー／４０５２／８１（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／アルバニー／４８３５／４８（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／香港／１５６／９７（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／カササギ／香港／５０５２／０７（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ニワトリ／シャンシー／２／０６（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／烏骨鶏／香港／ＳＦ１８９／０１（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ニワトリ／河南／１６／０４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ビクトリア／３６１／１１（Ｈ３Ｎ２）、Ｂ／マサチューセッツ／２／１２（インフルエンザＢ）、Ｂ／ブリスベン／６０／０８（インフルエンザＢ）およびＡ／テキサス／５０／１２（Ｈ３Ｎ２）からなる群から選択される１つまたは複数のインフルエンザウイルス由来のＨＡタンパク質またはそのバリアントの球状頭部領域に対応する領域由来の少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０または少なくとも２００個の連続したアミノ酸残基を備える。一実施形態において、免疫原性部分は、表１に収載されている１つまたは複数のＨＡタンパク質またはそのバリアントの球状頭部領域に対応する領域由来の少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０または少なくとも２００個の連続したアミノ酸残基を備える。一実施形態において、免疫原性部分は、配列番号１〜配列番号３１からなる群から選択される配列を備える１つまたは複数のＨＡタンパク質またはそのバリアントの球状頭部領域に対応する領域由来の少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０または少なくとも２００個の連続したアミノ酸残基を備える。
【００８５】
球状頭部領域の特に有用な部分は、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）である。受容体結合ドメインは、インフルエンザＡ  ＨＡタンパク質の（およそ）アミノ酸残基５６〜２６４（Ｈ３ナンバリング方式）を備える。本発明の一実施形態は、融合タンパク質の異種集団を備えるナノ粒子であって、各融合タンパク質が、ナノ粒子へと集合することができる単量体サブユニットタンパク質（すなわち、自己集合（ＳＡ）タンパク質）由来の少なくとも２５個の連続したアミノ酸に接続された、インフルエンザＨＡタンパク質のＲＢＤ由来の少なくとも１個の免疫原性部分を備え、融合タンパク質の異種集団が、融合タンパク質の少なくとも２つの異なる種を備えるナノ粒子である。一実施形態において、免疫原性部分は、１つまたは複数のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）由来の少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０または少なくとも２００個の連続したアミノ酸残基を備える。一実施形態において、免疫原性部分は、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイル
スおよびＣ型インフルエンザウイルスからなる群から選択される１つまたは複数のインフルエンザウイルス由来のＨＡタンパク質またはそのバリアントのＲＢＤ由来の少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０または少なくとも２００個の連続したアミノ酸残基を備える。一実施形態において、免疫原性部分は、群１インフルエンザウイルスおよび群２インフルエンザウイルスからなる群から選択される１つまたは複数のインフルエンザウイルス由来のＨＡタンパク質またはそのバリアントのＲＢＤ由来の少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０または少なくとも２００個の連続したアミノ酸残基を備える。一実施形態において、免疫原性部分は、Ｈ１インフルエンザウイルス、Ｈ２インフルエンザウイルス、インフルエンザＨ３ウイルス、インフルエンザＨ４ウイルス、インフルエンザＨ５ウイルス、インフルエンザＨ６ウイルス、Ｈ７インフルエンザウイルス、Ｈ８インフルエンザウイルス、Ｈ９インフルエンザウイルス、Ｈ１０インフルエンザウイルス、Ｈ１１インフルエンザウイルス、Ｈ１２インフルエンザウイルス、Ｈ１３インフルエンザウイルス、Ｈ１４インフルエンザウイルス、Ｈ１５インフルエンザウイルス、Ｈ１６インフルエンザウイルス、Ｈ１７インフルエンザウイルス、Ｈ１８インフルエンザウイルスおよびインフルエンザ系列Ｂウイルスからなる群から選択される１つまたは複数のウイルス由来のＨＡタンパク質またはそのバリアントのＲＢＤ由来の少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０または少なくとも２００個の連続したアミノ酸残基を備える。一実施形態において、免疫原性部分は、Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／カリフォルニア／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／シンガポール／１／１９５７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／香港／１／１９６８（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ブリスベン／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／インドネシア／０５／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ｂ／フロリダ／４／２００６（インフルエンザＢ）、Ａ／パース／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ブリスベン／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ｂ／ブリスベン／６０／２００８（インフルエンザＢ）、Ａ／ウィルソン・スミス／３３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／天津／７８／７７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／テキサス／３６／９１（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／シンガポール／６／８６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／メンフィス／３９／８３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／マレーシア／５４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／アイオワ／４３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／香港／１１７／７７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／フォート・モンマス／１／４７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ブリスベン／５９／０７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ベイラー／４０５２／８１（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／アルバニー／４８３５／４８（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／香港／１５６／９７（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／カササギ／香港／５０５２／０７（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ニワトリ／シャンシー／２／０６（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／烏骨鶏／香港／ＳＦ１８９／０１（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ニワトリ／河南／１６／０４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ビクトリア／３６１／１１（Ｈ３Ｎ２）、Ｂ／マサチューセッツ／２／１２（インフルエンザＢ）、Ｂ／ブリスベン／６０／０８（インフルエンザＢ）およびＡ／テキサス／５０／１２（Ｈ３Ｎ２）からなる群から選択される１つまたは複数のインフルエンザウイルス由来のＨＡタンパク質またはそのバリアントのＲＢＤ由来の少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０または少なくと
も２００個の連続したアミノ酸残基を備える。一実施形態において、免疫原性部分は、表１に収載されている１つまたは複数のＨＡタンパク質またはそのバリアントのＲＢＤ由来の少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０または少なくとも２００個の連続したアミノ酸残基を備える。一実施形態において、免疫原性部分は、配列番号３２〜配列番号６２からなる群から選択される配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列由来の少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０または少なくとも２００個の連続したアミノ酸残基を備える。一実施形態において、免疫原性部分は、配列番号３２〜配列番号６２からなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸配列由来の少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０または少なくとも２００個の連続したアミノ酸残基を備える。一実施形態において、免疫原性部分は、配列番号３２〜配列番号６２からなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸配列を備える。
【００８６】
本明細書に記載されている通り、その表面にインフルエンザＨＡタンパク質の免疫原性部分を発現するナノ粒子を形成するために、各免疫原性部分は、自己集合（ＳＡ）サブユニットタンパク質またはその機能的部分もしくはバリアントに接続され、これにより、赤血球凝集素−自己集合（ＨＡ−ＳＡ）融合タンパク質を形成する。発現後に、ＨＡ−ＳＡ融合タンパク質は、その表面にＨＡタンパク質の免疫原性部分を呈示するナノ粒子へと集合する。その結果得られる融合タンパク質が、ナノ粒子へと自己集合することができるのであれば、いかなる自己集合サブユニットタンパク質またはそのバリアントが、本発明の融合タンパク質の産生に使用されてもよい。本発明の融合タンパク質の構築に有用な自己集合サブユニットタンパク質の例として、フェリチン、エンカプスリン、硫黄オキシゲナーゼレダクターゼ、ルマジンシンターゼ、ジヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼ（Ｅ２）、チクングニアウイルスエンベロープタンパク質ならびにこれらの断片および／またはバリアントが挙げられるがそれらに限定されない。
【００８７】
一実施形態において、自己集合タンパク質は、フェリチンである。あらゆる動物、細菌および植物に存在するフェリチンは、ミネラル化コアからのまたはそれへの水和鉄イオンおよびプロトンの輸送により多核Ｆｅ（ＩＩＩ）２Ｏ３形成の速度および位置を制御するように主に作用する、球形タンパク質複合体を形成する。フェリチンの球形形態は、およそ１７〜２０ｋＤａの分子量を有するポリペプチドである、単量体サブユニットタンパク質（単量体フェリチンサブユニットとも称される）で構成されている。単量体フェリチンサブユニットの配列の例は、配列番号６４、配列番号６７および配列番号６９によって表される。各単量体フェリチンサブユニットは、４本のヘリックス束の長軸に対して大体垂直に位置する第５のより短いヘリックス（ｃ末端ヘリックス）を有する、４本の逆平行ヘリックスモチーフを含むヘリックス束の位相幾何学を有する。慣例に従い、ヘリックスは、それぞれＮ末端から「Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ＆Ｅ」と標識される。Ｎ末端配列は、カプシド３回回転軸に隣接して位置し、表面へと伸長するが、Ｅヘリックスは、４回回転軸において一体にパック化し、Ｃ末端は、粒子コアへと伸長する。このパック化の帰結は、カプ
シド表面に２個のポアを生ずる。理論による制約を企図するものではないが、これらのポアの一方または両方が、水和鉄が拡散してカプシドを出入りするポイントを表すことが予想される。産生後に、このような単量体フェリチンサブユニットタンパク質は、球形フェリチンタンパク質へと自己集合する。その結果、フェリチンの球形形態は、２４個の単量体フェリチンサブユニットタンパク質を備え、４３２対称性を有するカプシド様構造を有する。
【００８８】
本発明において、本発明の単量体フェリチンサブユニットは、タンパク質の球形形態への単量体フェリチンサブユニットの自己集合を導くことができる、フェリチンタンパク質の全長単一ポリペプチドまたはそのいずれかの部分である。単量体フェリチンサブユニットが、その表面にインフルエンザウイルスＨＡタンパク質由来の免疫原性部分を呈示するナノ粒子へと融合タンパク質の自己集合を導くことができる限りにおいて、いずれか公知のフェリチンタンパク質の単量体フェリチンサブユニット由来のアミノ酸配列が、本発明の融合タンパク質の産生に使用されてよい。一実施形態において、単量体フェリチンサブユニットは、細菌フェリチンタンパク質、植物フェリチンタンパク質、藻類フェリチンタンパク質、昆虫フェリチンタンパク質、真菌フェリチンタンパク質および哺乳類フェリチンタンパク質からなる群から選択される。一実施形態において、単量体フェリチンサブユニットは、ヘリコバクター・ピロリに由来する。一実施形態において、単量体フェリチンサブユニットは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する。一実施形態において、単量体フェリチンサブユニットは、ウシガエルフェリチンである。一実施形態において、単量体フェリチンサブユニットは、Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）フェリチン、大腸菌フェリチンおよびウシガエルフェリチンからなる群から選択される２つ以上のフェリチンタンパク質由来のアミノ酸配列を接続することによって作製されたハイブリッドフェリチンタンパク質である。本発明の代表的なフェリチンタンパク質由来のアミノ酸配列は、配列番号６４（Ｈ．ピロリフェリチン）、配列番号６６（大腸菌フェリチン）、配列番号７０（ウシガエルフェリチン）として本明細書に開示されている。本発明の代表的なハイブリッドフェリチンタンパク質の例として、配列番号７３（Ｈ．ピロリフェリチン−ウシガエルフェリチン融合体）および配列番号７６（大腸菌フェリチン−ウシガエルフェリチン融合体）が挙げられる。一実施形態において、本発明のナノ粒子は、配列番号６４、配列番号６７、配列番号７０、配列番号７３および配列番号７６からなる群から選択されるアミノ酸配列を備える融合タンパク質を含有する。
【００８９】
一実施形態において、自己集合タンパク質は、エンカプスリンである。本発明において、本発明の単量体エンカプスリンサブユニットは、ナノ粒子へと単量体エンカプスリンサブユニットの自己集合を導くことができる、エンカプスリンタンパク質の全長単一ポリペプチドまたはそのいずれかの部分である。単量体エンカプスリンサブユニットが、その表面にインフルエンザウイルスＨＡタンパク質由来の免疫原性部分を呈示するナノ粒子へと融合タンパク質の自己集合を導くことができる限りにおいて、いずれか公知のエンカプスリンタンパク質の単量体エンカプスリンサブユニット由来のアミノ酸配列が、本発明の融合タンパク質の産生に使用されてよい。代表的なエンカプスリンタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号７９として本明細書に開示されている。エンカプスリンの球形形態は、６０個の単量体エンカプスリンサブユニットタンパク質を備える。
【００９０】
一実施形態において、自己集合タンパク質は、人工設計されたサルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ）０３−３３サブユニットタンパク質である。本発明において、本発明の単量体０３−３３サブユニットは、ナノ粒子へと単量体０３−３３サブユニットの自己集合を導くことができる、０３−３３タンパク質の全長単一ポリペプチドまたはそのいずれかの部分である。単量体０３−３３サブユニットが、その表面にインフルエンザウイルスＨＡタンパク質由来の免疫原性部分を呈示するナノ粒子へと融合タンパク質の自己集合を導くことができる限りにおいて、いずれか公知の
０３−３３タンパク質の単量体０３−３３サブユニット由来のアミノ酸配列が、本発明の融合タンパク質の産生に使用されてよい。代表的な０３−３３タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号８２として本明細書に開示されている。
【００９１】
一実施形態において、自己集合タンパク質は、硫黄オキシゲナーゼレダクターゼ（ＳＯＲ）である。本発明において、本発明の単量体ＳＯＲサブユニットは、ナノ粒子へと単量体ＳＯＲサブユニットの自己集合を導くことができる、ＳＯＲタンパク質の全長単一ポリペプチドまたはそのいずれかの部分である。単量体ＳＯＲサブユニットが、その表面にインフルエンザウイルスＨＡタンパク質由来の免疫原性部分を呈示するナノ粒子へと融合タンパク質の自己集合を導くことができる限りにおいて、いずれか公知のＳＯＲタンパク質の単量体ＳＯＲサブユニット由来のアミノ酸配列が、本発明の融合タンパク質の産生に使用されてよい。代表的なＳＯＲタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号８５として本明細書に開示されている。ＳＯＲの球形形態は、２４個の単量体ＳＯＲサブユニットタンパク質を備える。
【００９２】
一実施形態において、自己集合タンパク質は、ルマジンシンターゼ（ＬＳ）である。本発明において、本発明の単量体ＬＳサブユニットは、ナノ粒子へと単量体ＬＳサブユニットの自己集合を導くことができる、ＬＳタンパク質の全長単一ポリペプチドまたはそのいずれかの部分である。単量体ＬＳサブユニットが、その表面にインフルエンザウイルスＨＡタンパク質由来の免疫原性部分を呈示するナノ粒子へと融合タンパク質の自己集合を導くことができる限りにおいて、いずれか公知のＬＳタンパク質の単量体ＬＳサブユニット由来のアミノ酸配列が、本発明の融合タンパク質の産生に使用されてよい。代表的なＬＳタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号８８として本明細書に開示されている。ＬＳの球形形態は、１２個の五量体単位を備える６０個の単量体サブユニットカプシドを備える。
【００９３】
一実施形態において、自己集合タンパク質は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＰＤＣ）ジヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼ（Ｅ２ｐ）である。本発明において、本発明の単量体Ｅ２ｐサブユニットは、ナノ粒子へと単量体Ｅ２ｐサブユニットの自己集合を導くことができる、Ｅ２ｐタンパク質の全長単一ポリペプチドまたはそのいずれかの部分である。単量体Ｅ２ｐサブユニットが、その表面にインフルエンザウイルスＨＡタンパク質由来の免疫原性部分を呈示するナノ粒子へと融合タンパク質の自己集合を導くことができる限りにおいて、いずれか公知のＥ２ｐタンパク質の単量体Ｅ２ｐサブユニット由来のアミノ酸配列が、本発明の融合タンパク質の産生に使用されてよい。代表的なＥ２ｐタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号９１として本明細書に開示されている。
【００９４】
一実施形態において、ナノ粒子は、チクングニアウイルス由来の自己集合タンパク質を備える。特に、ナノ粒子は、チクングニアウイルス（ＣＨＫＶ）由来の１つまたは複数の構造タンパク質（例えば、カプシド、Ｅ１、Ｅ２およびＥ３）を備える。ＣＨＫＶからナノ粒子を形成させる方法は、本明細書に開示されており、その全体を本明細書に援用する米国特許出願第１３／１３１，２８７号においても教示されている。本発明において、ＣＨＫＶ構造タンパク質は、ナノ粒子へと単量体構造タンパク質の自己集合を導くことができる、ＣＨＫＶエンベロープタンパク質の全長単一ポリペプチドまたはそのいずれかの部分である。アミノ酸配列が、その表面にインフルエンザウイルスＨＡタンパク質由来の免疫原性部分を呈示するナノ粒子へと融合タンパク質の自己集合を導くことができる限りにおいて、いずれか公知のＣＨＫＶウイルス由来の構造タンパク質のアミノ酸配列が、本発明の融合タンパク質の産生に使用されてよい。当業者であれば、ＣＨＫＶタンパク質が、その後に個々のタンパク質へと切断されるポリタンパク質として発現されることが理解できよう。代表的なＣＨＫＶポリタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号９４として本明細書に開示されている。ポリタンパク質の切断およびウイルス様粒子の形成後に、免疫原性部分が適切にフォールドされ、ナノ粒子の表面に呈示されるように、免疫原性部分のアミ
ノ酸配列が、ポリタンパク質に挿入され得ることをさらに理解されたい。
【００９５】
本発明のＨＡ−ＳＡ融合タンパク質は、自己集合タンパク質の単量体サブユニットポリペプチドの全長配列を備える必要はない。部分が、ナノ粒子へとＨＡ−ＳＡ融合タンパク質の自己集合を導くアミノ酸配列を備える限りにおいて、単量体ＳＡサブユニットタンパク質の部分または領域が利用されてよい。斯かる部分の一例は、ヘリコバクター・ピロリフェリチンタンパク質（配列番号６４）のアミノ酸５〜１６７の間に位置する。フェリチンタンパク質のより特異的な領域は、その全体を本明細書に援用するチャン、ワイ（Ｚｈａｎｇ，  Ｙ．）フェリチンＮａｎｏ−Ｃａｇｅタンパク質スーパーファミリーにおける自己集合（Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｆｅｒｒｉｔｉｎ  Ｎａｎｏ−Ｃａｇｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｕｐｅｒ  Ｆａｍｉｌｙ）．２０１１，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．，１２，５４０６−５４２１に記載されている。
【００９６】
本発明の一実施形態は、ＨＡ−ＳＡ融合タンパク質の不均一集団を備えるナノ粒子であって、各ＨＡ−ＳＡ融合タンパク質が、フェリチン、エンカプスリン、硫黄オキシゲナーゼレダクターゼ、ルマジンシンターゼおよびピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＰＤＣ）ジヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼ（Ｅ２）からなる群から選択されるタンパク質由来の少なくとも２５個の連続したアミノ酸、少なくとも５０個の連続したアミノ酸、少なくとも７５個の連続したアミノ酸、少なくとも１００個の連続したアミノ酸または少なくとも１５０個の連続したアミノ酸に接続された、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質の少なくとも１個の免疫原性部分を備え、ＨＡ−ＳＡ融合タンパク質が、ナノ粒子へと集合されることが可能なナノ粒子である。本発明の一実施形態は、ＨＡ−ＳＡ融合タンパク質の不均一集団を備えるナノ粒子であって、各ＨＡ−ＳＡ融合タンパク質が、配列番号６４、配列番号６７、配列番号７０、配列番号７３、配列番号７６、配列番号７９、配列番号８２、配列番号８５、配列番号８８、配列番号９１および配列番号９４からなる群から選択されるアミノ酸配列由来の少なくとも２５個の連続したアミノ酸、少なくとも５０個の連続したアミノ酸、少なくとも７５個の連続したアミノ酸、少なくとも１００個の連続したアミノ酸または少なくとも１５０個の連続したアミノ酸に接続された、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質の少なくとも１個の免疫原性部分を備え、ＨＡ−ＳＡ融合タンパク質が、ナノ粒子へと集合されることが可能なナノ粒子である。本発明の一実施形態は、ＨＡ−ＳＡ融合タンパク質の不均一集団を備えるナノ粒子であって、各融合タンパク質が、配列番号６４のアミノ酸残基５〜１６７を備えるフェリチンタンパク質の領域由来の少なくとも２５個の連続したアミノ酸、少なくとも５０個の連続したアミノ酸、少なくとも７５個の連続したアミノ酸、少なくとも１００個の連続したアミノ酸または少なくとも１５０個の連続したアミノ酸に接続された、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質の少なくとも１個の免疫原性部分を備え、ＨＡ−ＳＡ融合タンパク質が、ナノ粒子へと集合されることが可能なナノ粒子である。
【００９７】
以前に記述された通り、タンパク質の活性に影響することがないある程度の変異がタンパク質のアミノ酸配列において作製されてよいことが本技術分野において周知である。斯かる変異は、アミノ酸残基の挿入、アミノ酸残基の欠失およびアミノ酸残基の置換を含む。よって、一実施形態において、バリアントＳＡタンパク質サブユニットが、マウス等の動物に導入される際に、天然ＳＡタンパク質と反応する抗体の産生をもたらさないように、ＳＡタンパク質サブユニットの配列は、自然に見られるＳＡタンパク質サブユニットの配列とは十分に相違する。本発明において、斯かる単量体サブユニットは、免疫原性的に中性と称される。本発明の一実施形態は、ＨＡ−ＳＡ融合タンパク質の不均一集団を備えるナノ粒子であって、各融合タンパク質が、ナノ粒子へと自己集合することができる単量体ＳＡタンパク質サブユニットタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列に接続された、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質由来の少なくとも１個の
免疫原性部分を備え、ＨＡ−ＳＡ融合タンパク質が、ナノ粒子へと自己集合することができるナノ粒子である。一実施形態において、ＨＡ−ＳＡ融合タンパク質は、フェリチン、エンカプスリン、硫黄オキシゲナーゼレダクターゼ、ルマジンシンターゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＰＤＣ）ジヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼ（Ｅ２）およびＣＨＫＶの構造タンパク質からなる群から選択される単量体ＳＡタンパク質サブユニットと配列が同一のポリペプチド配列を備える。本発明の一実施形態は、ＨＡ−ＳＡ融合タンパク質の不均一集団を備えるナノ粒子であって、各融合タンパク質が、フェリチン、エンカプスリン、硫黄オキシゲナーゼレダクターゼ、ルマジンシンターゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＰＤＣ）ジヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼ（Ｅ２）およびＣＨＫＶのエンベロープタンパク質からなる群から選択される単量体ＳＡタンパク質サブユニットのアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列に接続された、本発明の少なくとも１個のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質免疫原性部分を備え、ＨＡ−ＳＡ融合タンパク質が、ナノ粒子へと自己集合することができるナノ粒子である。本発明の一実施形態は、ＨＡ−ＳＡ融合タンパク質の不均一集団を備えるナノ粒子であって、各融合タンパク質が、配列番号６４、配列番号６７、配列番号７０、配列番号７３、配列番号７６、配列番号７９、配列番号８２、配列番号８５、配列番号８８、配列番号９１および配列番号９４からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％および少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列に接続された、本発明のインフルエンザＨＡタンパク質の少なくとも１個の免疫原性部分を備え、ＨＡ−ＳＡ融合タンパク質が、ナノ粒子へと自己集合することができるナノ粒子である。
【００９８】
本発明の一部の実施形態において、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質の免疫原性部分と、ＳＡタンパク質のアミノ酸配列は、互いに直接的に接続されてよい。他の実施形態において、様々なドメインが適切な特殊な配向で存在できるように、リンカー（スペーサー配列とも称される）を用いることが必要になる場合がある。リンカー配列は、インフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発する能力を維持するような仕方で、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質の免疫原性部分を配置するように設計される。本発明のリンカー配列は、アミノ酸を備える。使用に好ましいアミノ酸は、小型の側鎖を有するアミノ酸および／または電荷がないアミノ酸である。斯かるアミノ酸は、融合タンパク質の適切なフォールディングおよび活性に干渉する可能性が低い。したがって、単独のまたは組み合わせたリンカー配列における使用に好まれるアミノ酸は、セリン、グリシンおよびアラニンである。斯かるリンカー配列の例として、ＳＧ、ＳＧＧ、ＧＳＧ、ＧＧおよびＧＧＳＧＧが挙げられるがそれらに限定されない。アミノ酸は、必要に応じて足されても、引かれても、または再編成されてもよい。当業者は、本発明のタンパク質に適正なリンカー配列を決定することができる。
【００９９】
リンカー配列に加えて、本発明の融合タンパク質は、他の異種アミノ酸配列を備えることもできる。例えば、融合タンパク質は、適切な細胞経路へと融合タンパク質を導くシグナル配列を備えることができる。例えば、シグナル配列は、適切にグリコシル化および分泌されるように、ＥＲ−ゴルジ複合体へとタンパク質を導くことができる。所望の様式で融合タンパク質を導く限りにおいて、いかなるシグナル配列が使用されてもよい。本発明の融合タンパク質の調製に有用なシグナル配列の例として、ウシプロラクチン由来のシグナル配列、ヒトＣＤ５シグナル配列およびＣＨＩＫＶシグナル配列が挙げられるがそれらに限定されない。
【０１００】
本発明の融合タンパク質は、切断配列を含有することもできる。例えば、融合タンパク質においてインフルエンザＨＡタンパク質由来の２個以上の免疫原性部分が一体に連結された実施形態において、タンパク質の発現後に、様々なドメインが互いに切断されるよう
に、酵素切断部位が、融合タンパク質のセグメント（例えば、免疫原性部分、ＳＡタンパク質、リンカー配列等）の間に含まれていてよい。いかなる切断配列が、本発明の融合タンパク質の調製に使用されてもよい。斯かる切断配列の例は、フーリンおよび２Ａ切断配列である。例示的な実施形態は、図２において例証されている。
【０１０１】
一部の実施形態において、本発明の融合タンパク質のアミノ酸配列において突然変異を遺伝子操作することが有用となり得る。例えば、融合タンパク質に有益な特性（例えば、安定性、溶解性、半減期、免疫監視からのタンパク質のマスク部分、立体障害（ｈｉｎｄｅｒａｎｃｅ）の回避等）を与えるために、単量体ＳＡタンパク質、リンカー配列またはインフルエンザＨＡタンパク質の免疫原性部分における酵素認識部位またはグリコシル化部位等の部位を変更することが有用となり得る。例えば、フェリチンの単量体サブユニットは、天然にはグリコシル化されないことが公知である。しかし、哺乳類または酵母細胞において分泌タンパク質として発現される場合、これはグリコシル化され得る。よって、一実施形態において、突然変異されたフェリチンサブユニット配列が、突然変異された部位においてもはやグリコシル化されないように、単量体フェリチンサブユニット由来のアミノ酸配列における潜在的Ｎ結合型グリコシル化部位は突然変異される。突然変異を導入するべき有用な部位の例として、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質のアミノ酸残基９８および２６４が挙げられるがそれらに限定されない。
【０１０２】
本発明の一実施形態は、本発明の核酸分子によってコードされる融合タンパク質である。本発明の一実施形態は、配列番号９６、配列番号９９、配列番号１０２、配列番号１０５、配列番号１０８、配列番号１１１、配列番号１１４、配列番号１１７、配列番号１２０、配列番号１２３、配列番号１２６、配列番号１２９、配列番号１３２、配列番号１３５、配列番号１３８、配列番号１４１、配列番号１４４、配列番号１４７、配列番号１５０、配列番号１５３、配列番号１５６、配列番号１５９、配列番号１６２、配列番号１６５、配列番号１６８、配列番号１７１、配列番号１７４、配列番号１７７、配列番号１８０、配列番号１８３、配列番号１８６および配列番号１８９からなる群から選択される配列と同一である、または少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一である核酸配列を備える核酸分子によってコードされる融合タンパク質である。本発明の一実施形態は、配列番号９６、配列番号９９、配列番号１０２、配列番号１０５、配列番号１０８、配列番号１１１、配列番号１１４、配列番号１１７、配列番号１２０、配列番号１２３、配列番号１２６、配列番号１２９、配列番号１３２、配列番号１３５、配列番号１３８、配列番号１４１、配列番号１４４、配列番号１４７、配列番号１５０、配列番号１５３、配列番号１５６、配列番号１５９、配列番号１６２、配列番号１６５、配列番号１６８、配列番号１７１、配列番号１７４、配列番号１７７、配列番号１８０、配列番号１８３、配列番号１８６および配列番号１８９からなる群から選択される核酸配列を備える核酸分子によってコードされる融合タンパク質である。本発明の一実施形態は、配列番号９６、配列番号９９、配列番号１０２、配列番号１０５、配列番号１０８、配列番号１１１、配列番号１１４、配列番号１１７、配列番号１２０、配列番号１２３、配列番号１２６、配列番号１２９、配列番号１３２、配列番号１３５、配列番号１３８、配列番号１４１、配列番号１４４、配列番号１４７、配列番号１５０、配列番号１５３、配列番号１５６、配列番号１５９、配列番号１６２、配列番号１６５、配列番号１６８、配列番号１７１、配列番号１７４、配列番号１７７、配列番号１８０、配列番号１８３、配列番号１８６および配列番号１８９からなる群から選択される核酸配列からなる核酸分子によってコードされる融合タンパク質である。
【０１０３】
本発明の一実施形態は、配列番号９７、配列番号１００、配列番号１０３、配列番号１０６、配列番号１０９、配列番号１１２、配列番号１１５、配列番号１１８、配列番号１２１、配列番号１２４、配列番号１２７、配列番号１３０、配列番号１３３、配列番号１３６、配列番号１３９、配列番号１４２、配列番号１４５、配列番号１４８、配列番号１
５１、配列番号１５４、配列番号１５７、配列番号１６０、配列番号１６３、配列番号１６６、配列番号１６９、配列番号１７２、配列番号１７５、配列番号１７８、配列番号１８１、配列番号１８４、配列番号１８７および配列番号１９０からなる群から（ｆｏｒｍ）選択されるアミノ酸配列と同一である、または少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を備える融合タンパク質である。本発明の一実施形態は、配列番号９７、配列番号１００、配列番号１０３、配列番号１０６、配列番号１０９、配列番号１１２、配列番号１１５、配列番号１１８、配列番号１２１、配列番号１２４、配列番号１２７、配列番号１３０、配列番号１３３、配列番号１３６、配列番号１３９、配列番号１４２、配列番号１４５、配列番号１４８、配列番号１５１、配列番号１５４、配列番号１５７、配列番号１６０、配列番号１６３、配列番号１６６、配列番号１６９、配列番号１７２、配列番号１７５、配列番号１７８、配列番号１８１、配列番号１８４、配列番号１８７および配列番号１９０からなる群から（ｆｏｒｍ）選択されるアミノ酸配列からなる融合タンパク質である。
【０１０４】
本発明の融合タンパク質は、本発明の核酸分子によってコードされる。加えて、これは、本発明の核酸構築物によって発現される。本明細書において、核酸構築物は、組換え発現ベクターである、すなわち、核酸構築物が、例えば対象または器官、組織または細胞に投与されると、核酸分子がタンパク質の発現をもたらすことができるように、タンパク質をコードする核酸分子に連結されたベクターである。ベクターは、生物、組織または細胞培養物等が挙げられるがこれらに限定されない、ある環境内の細胞への核酸分子の輸送も可能にする。本開示の核酸構築物は、ヒトの介入によって産生される。核酸構築物は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらのバリアントであってよい。ベクターは、ＤＮＡプラスミド、ｍＲＮＡ、ウイルスベクターまたは他のベクターであってよい。一実施形態において、ベクターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルスまたは他のいずれかのＤＮＡもしくはＲＮＡウイルスベクターであってよい。一実施形態において、ベクターは、偽型レンチウイルスまたはレトロウイルスベクターであってよい。一実施形態において、ベクターは、ＤＮＡプラスミドであってよい。一実施形態において、ベクターは、核酸分子送達および発現を可能にするウイルス構成成分およびプラスミド構成成分を備えるＤＮＡプラスミドであってよい。本開示の核酸構築物の構築のための方法は周知である。例えば、分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第３版、サムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．）、２００１、コールドスプリングハーバー研究所出版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）および分子生物学最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、オースベルら編（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．）、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）、１９９４を参照されたい。一実施形態において、ベクターは、ＣＭＶ／ＲまたはＣＭＶ／Ｒ  ８κＢ（本明細書において、ＣＭＶ／Ｒ  ８κｂとも称される）等、ＣＭＶ／Ｒプラスミド等、ＤＮＡプラスミドである。ＣＭＶ／ＲおよびＣＭＶ／Ｒ  ８κｂの例は、本明細書に提供されている。ＣＭＶ／Ｒは、２００６年８月２２日公表のＵＳ７，０９４，５９８（Ｂ２）にも記載されている。
【０１０５】
本明細書において、核酸分子は、本発明のＨＡ−ＳＡ融合タンパク質をコードする核酸配列を備える。核酸分子は、組換えにより、合成により、または組換えおよび合成手順の組合せにより産生され得る。本開示の核酸分子は、野生型核酸配列、または例えばヒトの翻訳系によってより良く認識されるコドンを取り込むためのコドン修飾された核酸配列を有することができる。一実施形態において、核酸分子は、Ｎ結合型グリコシル化部位をコードするコドンを導入するため等、異なるアミノ酸をコードするコドンを導入または排除するために遺伝子操作され得る。特に核酸配列が公知になれば、本開示の核酸分子を産生
する方法は、本技術分野において公知である。核酸構築物が、１つの核酸分子または２つ以上の核酸分子を備えることができることが認められよう。核酸分子が、１つのタンパク質または２つ以上のタンパク質をコードすることができることも認められよう。
【０１０６】
本発明の一実施形態は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列を備える核酸分子である。本発明の一実施形態は、１つまたは複数のインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質の１個または複数の免疫原性部分に接続された単量体自己集合サブユニットタンパク質を備える融合タンパク質をコードする核酸配列を備える核酸分子である。本発明の一実施形態は、本発明の１つまたは複数のインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来の１個または複数の免疫原性部分と同一である、または少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一である１つまたは複数のアミノ酸配列を備える融合タンパク質をコードする核酸配列を備える核酸分子であって、融合タンパク質が、その表面に免疫原性部分を呈示するナノ粒子を形成することができる核酸分子である。さらなる実施形態において、本発明の核酸分子は、本発明の単量体自己集合サブユニットタンパク質のアミノ酸配列と同一である、または少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を備える融合タンパク質をコードする核酸配列であって、融合タンパク質が、その表面に免疫原性部分を呈示するナノ粒子を形成することができる核酸配列を備える。一実施形態において、本発明の核酸分子は、ｉ）本発明の１つまたは複数のインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来の１個または複数の免疫原性部分と同一である、または少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一である１つまたは複数のアミノ酸配列；およびｉｉ）本発明の単量体自己集合サブユニットタンパク質のアミノ酸配列と同一である、または少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を備える融合タンパク質をコードする核酸配列であって、融合タンパク質が、その表面に免疫原性部分を呈示するナノ粒子を形成することができる核酸配列を備える。本発明の一実施形態は、配列番号９７、配列番号１００、配列番号１０３、配列番号１０６、配列番号１０９、配列番号１１２、配列番号１１５、配列番号１１８、配列番号１２１、配列番号１２４、配列番号１２７、配列番号１３０、配列番号１３３、配列番号１３６、配列番号１３９、配列番号１４２、配列番号１４５、配列番号１４８、配列番号１５１、配列番号１５４、配列番号１５７、配列番号１６０、配列番号１６３、配列番号１６６、配列番号１６９、配列番号１７２、配列番号１７５、配列番号１７８、配列番号１８１、配列番号１８４、配列番号１８７および配列番号１９０からなる群から（ｆｏｒｍ）選択されるアミノ酸配列と同一である、または少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を備える融合タンパク質をコードする核酸配列を備える核酸分子である。本発明の一実施形態は、配列番号９７、配列番号１００、配列番号１０３、配列番号１０６、配列番号１０９、配列番号１１２、配列番号１１５、配列番号１１８、配列番号１２１、配列番号１２４、配列番号１２７、配列番号１３０、配列番号１３３、配列番号１３６、配列番号１３９、配列番号１４２、配列番号１４５、配列番号１４８、配列番号１５１、配列番号１５４、配列番号１５７、配列番号１６０、配列番号１６３、配列番号１６６、配列番号１６９、配列番号１７２、配列番号１７５、配列番号１７８、配列番号１８１、配列番号１８４、配列番号１８７および配列番号１９０からなる群から（ｆｏｒｍ）選択されるアミノ酸配列を備える融合タンパク質をコードする核酸配列を備える核酸分子である。本発明の一実施形態は、配列番号９６、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１４０、配列
番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１８９および配列番号１９１からなる群から（ｆｏｒｍ）選択される配列と同一である、または少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一である核酸配列を備える核酸分子である。本発明の一実施形態は、配列番号９６、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１８９および配列番号１９１からなる群から選択される核酸配列を備える核酸分子である。本発明の一実施形態は、配列番号９６、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１８９および配列番号１９１からなる群から選択される核酸配列からなる核酸分子である。
【０１０７】
記述されてきた通り、本発明のナノ粒子は、それらのアミノ酸配列の少なくとも１個のアミノ酸が異なる集団内の少なくとも２つの融合タンパク質により不均一な融合タンパク質の集団を備える。当業者であれば、本明細書に記載されている通り、融合タンパク質の不均一集団が、タンパク質のＳＡ部分を含む融合タンパク質におけるいずれかの位置に存在する上述のアミノ酸差によるものであり得ることが認められよう。しかし、本発明の好まれるナノ粒子は、単一のナノ粒子が、インフルエンザウイルスの２つ以上の型、亜型または系統に対する免疫応答を誘発することができるナノ粒子である。結果的に、好まれるナノ粒子は、融合タンパク質の不均一集団を備えるナノ粒子であって、不均一集団内の少なくとも２つの融合タンパク質が、それらの免疫原性部分の配列の少なくとも１個のアミノ酸が異なるナノ粒子である。好まれるナノ粒子の融合タンパク質が、免疫原性部分以外の領域に配列差を有することから除外されないことを理解されたい。しかし、インフルエンザウイルスの２つ以上の型、群、亜型または系統に対する免疫応答を誘発するために、
好まれるナノ粒子は、それらの免疫原性部分における少なくとも１個のアミノ酸残基が異なる少なくとも２つの融合タンパク質を備える。当業者であれば、２つの融合タンパク質の免疫原性部分のアミノ酸配列における差が、２つの異なる免疫原性部分（すなわち、免疫原性部分の２つの種）を、２つの異なる受容体（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞等）によって認識させてもさせなくてもよいことが理解できよう。認識における斯かる差またはその欠如は、例えば、免疫原性部分における対応するアミノ酸残基の間の特性の差や、配列が異なる位置（すなわち、アミノ酸残基）が、認識されるエピトープの一部であるか否か等の事柄に依存する。好まれる実施形態において、不均一集団は、融合タンパク質の少なくとも２つの種を備え、この種のそれぞれの免疫原性部分は、同じＢ細胞受容体、Ｔ細胞受容体および／または抗体によって認識される。よって、一実施形態において、本発明のナノ粒子は、交差反応性免疫応答（インフルエンザウイルスの２つ以上の型、亜型または系統に対する免疫応答）を誘発する。
【０１０８】
本発明のナノ粒子によって呈示される免疫原性領域の数が、ナノ粒子を構成する融合タンパク質の数によってのみ限定され、融合タンパク質数自体は、融合タンパク質の構築に使用されるＳＡタンパク質によって決定されることを理解されたい。例えば、フェリチンは、２４個の単量体フェリチンサブユニットタンパク質からなるナノ粒子を形成する。よって、本発明のフェリチンに基づくナノ粒子は、最大で２４個の融合タンパク質を備えることができ、よって、最大で２４個の異なる免疫原性部分を呈示することができる。同様に、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）由来のエンカプスリンタンパク質は、６０個のサブユニットを有するナノ粒子を形成する。よって、本発明のエンカプスリンに基づくナノ粒子は、最大で６０個の異なる免疫原性部分を呈示することができる。同様に、ＣＨＩＫＶ由来の構造タンパク質は、２４０個のエンベロープＥ２サブユニットを有するウイルス様粒子を形成する。よって、本発明のＣＨＩＫＶに基づくウイルス様粒子は、最大で２４０個の異なる免疫原性部分を呈示することができる。当業者であれば、斯かる計算が、各融合タンパク質が、単一の免疫原性部分を備えることを仮定していることを理解するであろう。当然ながら、２つ以上の免疫原性部分を備える融合タンパク質を使用して、より多数の免疫原性部分を呈示するナノ粒子が構築され得る。複数のエピトープを備える融合タンパク質の例が、図２において例証されている。一実施形態において、ナノ粒子は、融合タンパク質の不均一集団を備え、各融合タンパク質は、インフルエンザＨＡタンパク質の単一の免疫原性部分を備える。一実施形態において、ナノ粒子は、融合タンパク質の不均一集団を備え、各融合タンパク質は、１つまたは複数のインフルエンザＨＡタンパク質由来の複数の免疫原性部分を備える。一実施形態において、ナノ粒子は、融合タンパク質の不均一集団を備え、各融合タンパク質は、１つまたは複数のインフルエンザＨＡタンパク質由来の少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４または少なくとも５個の免疫原性部分を備える。
【０１０９】
一実施形態において、本発明のナノ粒子は、融合タンパク質の２〜２４０の間の種を備え、各種は、他の全ての種とは、少なくとも部分的には、その免疫原性部分の配列の変化において少なくとも１個のアミノ酸が異なる。ある特定の実施形態において、本発明のナノ粒子は、融合タンパク質の少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７、少なくとも４８、少なくとも４９、少なくとも５０、少なくと
も５１、少なくとも５２、少なくとも５３、少なくとも５４、少なくとも５５、少なくとも５６、少なくとも５７、少なくとも５８、少なくとも５９、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０、少なくとも２００、少なくとも２１０、少なくとも２２０、少なくとも２３０または少なくとも２４０の種を備え、この種は、少なくとも部分的には、それらの免疫原性部分における少なくとも１個のアミノ酸が互いに異なる。ある特定の実施形態において、本発明のナノ粒子は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７、少なくとも４８、少なくとも４９、少なくとも５０、少なくとも５１、少なくとも５２、少なくとも５３、少なくとも５４、少なくとも５５、少なくとも５６、少なくとも５７、少なくとも５８、少なくとも５９または少なくとも６０個の独特の免疫原性部分を呈示する。
【０１１０】
本発明の一実施形態は、本発明のナノ粒子を産生する方法であって、本発明の融合タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸分子を細胞に導入する工程と、コードされたタンパク質の発現およびナノ粒子の形成に適した条件下で、細胞をインキュベートする工程とを備える方法である。さらなる実施形態において、ナノ粒子は、核酸分子が導入された細胞から単離される。ナノ粒子を単離する方法は、当業者にとって公知であり、両者共にその全体を本明細書に援用する米国特許出願第１３／１３１，２８７号および国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１４／６０１４２にも記載されている。当業者であれば、その表面に免疫原性部分の不均一集団を呈示するナノ粒子が、ｉ）細胞に２つ以上の核酸分子を導入する工程であって、各核酸分子が、融合タンパク質の異なる種をコードする工程；および／またはｉｉ）細胞に１つもしくは複数の核酸分子を導入する工程であって、少なくとも１つの核酸分子が、細胞に導入される核酸分子によってコードされる融合タンパク質とは異なる融合タンパク質の種をコードする１つもしくは複数の核酸分子のうち少なくとも１つをコードする工程のいずれかによって産生され得ることを了解されたい。よって、例えば、融合タンパク質の不均一集団を備えるナノ粒子は、融合タンパク質の２つの異なる種をコードする核酸分子を細胞に導入することにより産生され得る。
【０１１１】
本発明のナノ粒子は、発現および単離された組換えタンパク質を組み合わせることによっても産生され得る。よって、本発明の一実施形態は、本発明のナノ粒子を産生する方法であって、本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子を細胞に導入する工程と、核酸分子によってコードされるタンパク質の発現に適した条件下で、細胞をインキュベートする工程と、発現されたタンパク質を単離する工程とを備える方法である。単離されたタンパク質は続いて、解体され、融合タンパク質の不均一種の混合物が、融合タンパク質の不均一集団を備えるナノ粒子において再集合するように、単離され解体された融合タンパク質の１つまたは複数の不均一種（すなわち、特に、それらの免疫原性部分が異なる配列を有する融合タンパク質）と組み合わされ、各ナノ粒子は、融合タンパク質の少なくとも２つの異なる種を備える。
【０１１２】
本発明のナノ粒子は、インフルエンザウイルス等、感染性病原体に対する免疫応答を誘発するため、感染性病原体（例えば、インフルエンザウイルス）の１つまたは複数の型、
亜型、系統および／または種による感染から個体を防御するためのワクチンとして使用され得る。よって、本発明の一実施形態は、本発明のナノ粒子を備えるワクチンである。本発明のワクチンは、アジュバント、バッファーその他等、他の構成成分を含有することもできる。いかなるアジュバントが使用されてもよいが、好まれる実施形態は、次のものを含有することができる：リン酸アルミニウム、塩化ベンザルコニウム（ｂｅｎｚｙａｌｋｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ウベニメクスおよびＱＳ２１等、化学的アジュバント；ＩＬ−２遺伝子またはその断片、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）遺伝子またはその断片、ＩＬ−１８遺伝子またはその断片、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２１（ＣＣＬ２１）遺伝子またはその断片、ＩＬ−６遺伝子またはその断片、ＣｐＧ、ＬＰＳ、ＴＬＲアゴニストおよび他の免疫刺激性遺伝子等、遺伝的アジュバント；ＩＬ−２またはその断片、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）またはその断片、ＩＬ−１８またはその断片、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２１（ＣＣＬ２１）またはその断片、ＩＬ−６またはその断片、ＣｐＧ、ＬＰＳ、ＴＬＲアゴニストおよび他の免疫刺激性サイトカインまたはその断片等、タンパク質アジュバント；カチオン性リポソーム、Ｎ３（カチオン性脂質）、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ１）等、脂質アジュバント；コレラ毒素、エンテロトキシン、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、ブピバカイン、マルカイン（ｍａｒｃａｉｎｅ）およびレバミソールを含む他のアジュバント。
【０１１３】
本発明の一実施形態は、感染性病原体に対し個体をワクチン接種する方法であって、本発明のナノ粒子を個体に投与する工程を備える方法である。本発明の一実施形態は、インフルエンザウイルスに対し個体をワクチン接種する方法であって、本発明のナノ粒子ワクチンを個体に投与する工程を備える方法である。一実施形態において、ナノ粒子は、本発明の自己集合する融合タンパク質を備え、ナノ粒子は、その表面に、インフルエンザウイルスの１つまたは複数の型、亜型または系統由来のＨＡタンパク質由来の免疫原性部分の不均一集団を呈示する。
【０１１４】
本発明の一実施形態は、インフルエンザウイルスによる感染に対し個体をワクチン接種する方法であって、
ａ）本発明のナノ粒子を得る工程と、
ｂ）インフルエンザウイルスに対する免疫応答が生じるように、個体にナノ粒子を投与する工程と
を備える方法である。本明細書において、本発明のワクチンまたはナノ粒子に対する免疫応答は、対象における、ワクチンに存在する赤血球凝集素タンパク質に対する液性および／または細胞性免疫応答の発生である。本発明の目的のため、「液性免疫応答」は、分泌性ＩｇＡまたはＩｇＧ分子を含む抗体分子によって媒介される免疫応答を指す一方、「細胞性免疫応答」は、Ｔリンパ球および／または他の白血球細胞によって媒介される免疫応答である。細胞性免疫の重要な一側面には、細胞溶解性Ｔ細胞（「ＣＴＬ」）による抗原特異的応答が関与する。ＣＴＬは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）によってコードされ、細胞表面に発現されるタンパク質と会合した形で提示されるペプチド抗原に対し特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の破壊または斯かる微生物が感染した細胞の溶解の誘導および促進を助ける。細胞性免疫の別の側面には、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答が関与する。ヘルパーＴ細胞は、その表面におけるＭＨＣ分子と会合した形でペプチド抗原を呈示する細胞に対する、非特異的エフェクター細胞の機能の刺激およびその活性の集中を助けるように働く。細胞性免疫応答は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するものを含む活性化されたＴ細胞および／または他の白血球細胞によって産生されるサイトカイン、ケモカインおよび他の斯かる分子の産生も指す。
【０１１５】
よって、免疫学的応答は、ＣＴＬを刺激、および／またはヘルパーＴ細胞の産生もしくは活性化を刺激する応答であってよい。ケモカインおよび／またはサイトカインの産生も
刺激され得る。ワクチンは、抗体媒介性免疫応答を誘発することもできる。したがって、免疫学的応答は、次の効果のうち１つまたは複数を含み得る：Ｂ細胞による抗体（例えば、ＩｇＡまたはＩｇＧ）の産生；および／またはサプレッサー、細胞傷害性もしくはヘルパーＴ細胞および／またはワクチンに存在するタンパク質（例えば、赤血球凝集素）に対して特異的に方向づけられたＴ細胞の活性化。これらの応答は、感染力を中和するように働く、および／または抗体−補体もしくは抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介して、免疫化された個体に防御を提供することができる。斯かる応答は、本技術分野において周知の標準イムノアッセイおよび中和アッセイを使用して決定され得る。
【０１１６】
本明細書において、中和抗体は、宿主内で感染性病原体が複製および伝播するのを防止する抗体である。インフルエンザウイルスに関して、中和抗体は、インフルエンザウイルスが１ラウンドの複製を完了するのを防止する。本明細書に定義されている通り、１ラウンドの複製は、宿主細胞へのウイルスの付着に始まり、宿主細胞からの新たに形成されたウイルスの出芽に終わる、ウイルスの生活環を指す。この生活環として、細胞への付着、細胞への侵入、ＨＡタンパク質の切断および再編成、エンドソーム膜とウイルス膜との融合、細胞質へのウイルスリボ核タンパク質の放出、新たなウイルス粒子の形成、ならびに宿主細胞膜からのウイルス粒子の出芽の段階が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１７】
一実施形態において、本発明のワクチンまたはナノ粒子は、広範な中和抗体を誘発する。本明細書において、広範な中和抗体は、分類学上の科内の感染性病原体の２つ以上の属、型、亜型、種および／または系統を中和する抗体である。本明細書において使用されるインフルエンザウイルスに特に関して、広範な中和抗体は、インフルエンザウイルスの２つ以上の型、亜型および／または系統を中和する抗体である。例えば、Ａ型インフルエンザウイルス由来のＨＡタンパク質に対して誘発された広範な中和抗体は、Ｂ型またはＣ型ウイルスを中和することができる。さらに別の例として、群１インフルエンザウイルス由来のＨＡタンパク質に対して誘発された広範な中和抗体は、群２ウイルスを中和することができる。追加的な例として、ウイルスの１つの亜型または系統由来のＨＡタンパク質に対して誘発された広範な中和抗体は、ウイルスの別の亜型または系統を中和することができる。例えば、Ｈ１インフルエンザウイルス由来のＨＡタンパク質に対して誘発された広範な中和抗体は、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ８、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７またはＨ１８からなる群から選択される１つまたは複数の亜型由来のウイルスを中和することができる。
【０１１８】
用語、個体、対象および患者は、本技術分野において十分に認識されており、本明細書において、インフルエンザ感染に対して易罹患性のいずれかのヒトまたは他の動物を指すよう互換的に使用されている。その例として、ヒトおよび他の霊長類、これはチンパンジー等の非ヒト霊長類ならびに他の類人猿およびサル種を含む；ウシ、ヒツジ、ブタ、アザラシ（ｓｅａｌ）、ヤギおよびウマ等、家畜；アザラシ、イヌおよびネコ等、飼育哺乳類；マウス、ラットおよびモルモット等、齧歯類を含む実験動物；ニワトリ、シチメンチョウおよび他の家禽用鳥類、アヒル、ガチョウその他等、飼育、野生および狩猟用鳥類を含む鳥類が挙げられるがそれらに限定されない。用語、個体、対象および患者は、それだけでは、特定の年齢、性別、人種その他を指し示さない。よって、男性であれ女性であれ、いかなる年齢の個体も、本開示による網羅されることが企図され、これにはしたがって、高齢者、成人、小児、乳児、幼児および子供が含まれるがそれらに限定されない。同様に、本発明の方法は、例えば、コーカサス人種（白人）、アフリカ系アメリカ人（黒人）、ネイティブアメリカン、ネイティブハワイアン、ヒスパニック、ラテン系、アジア系およびヨーロッパ系を含むいかなる人種にも適用され得る。感染した対象は、その身体内にインフルエンザウイルスを有することが既知の対象である。
【０１１９】
本発明の方法は、いずれかの個体のワクチン接種に使用され得る。斯かる個体は、イン
フルエンザウイルス等の感染性病原体に曝露されたと疑われてよいが、そうである必要はない。同様に、本発明の方法は、インフルエンザウイルス等の感染性病原体に曝露されたことが既知の個体、またはインフルエンザウイルス等の感染性病原体に曝露されたことが疑われるもしくはそうであることが既知の人物のワクチン接種に使用され得る。したがって、本発明の方法は、インフルエンザ（例えば、流行性、パンデミック）等の感染性病原体の既知のまたは潜在的な大流行の封じ込めに使用され得る。
【０１２０】
本発明の一実施形態は、インフルエンザウイルスに対し個体をワクチン接種する方法であって、個体においてインフルエンザウイルスに対する免疫応答が生じるように、実施形態のワクチンを、斯かるワクチンを必要とする個体に投与する工程を備え、ワクチンが、自己集合する融合タンパク質を備えるナノ粒子を備え、ナノ粒子が、その表面に、インフルエンザウイルスの１つまたは複数の型、群、亜型または系統由来のＨＡタンパク質由来の免疫原性部分の不均一集団を呈示する方法である。一実施形態において、免疫原性部分は、インフルエンザウイルスの１つまたは複数の型、群、亜型または系統由来のＨＡタンパク質の球状頭部領域に由来する。一実施形態において、免疫原性部分は、インフルエンザウイルスの１つまたは複数の型、群、亜型または系統由来のＨＡタンパク質のＲＢＤに由来する。
【０１２１】
本発明の別の実施形態は、インフルエンザウイルスによる感染に対し個体をワクチン接種する方法であって、
ａ）ＨＡ−ＳＡ融合タンパク質を備える少なくとも１つのナノ粒子を備えるワクチンを得る工程であって、融合タンパク質が、インフルエンザＨＡタンパク質の免疫原性部分に接続されたＳＡタンパク質を備え、ナノ粒子が、その表面に、インフルエンザウイルスの１つまたは複数の型、群、亜型または系統由来のＨＡタンパク質由来の免疫原性部分の不均一集団を呈示する工程と、
ｂ）インフルエンザウイルスに対する免疫応答が生じるように、個体にワクチンを投与する工程と
を備える方法である。一実施形態において、免疫原性部分は、インフルエンザウイルスの１つまたは複数の型、亜型または系統由来のＨＡタンパク質の球状頭部領域に由来する。一実施形態において、免疫原性部分は、インフルエンザウイルスの１つまたは複数の型、亜型または系統由来のＨＡタンパク質のＲＢＤに由来する。
【０１２２】
本発明のワクチンは、予備刺激／追加免疫プロトコールを使用した個体のワクチン接種に使用され得る。斯かるプロトコールは、その全体を本明細書に援用する米国特許出願公開第２０１１０１７７１２２号に記載されている。斯かるプロトコールにおいて、第１のワクチン組成物が個体に投与されてよく（予備刺激）、続いてある期間の後に、第２のワクチン組成物が個体に投与されてよい（追加免疫）。追加免疫組成物の投与は一般に、予備刺激組成物の投与の数週間または数ヶ月後であり、好ましくは、約２〜３週間または４週間または８週間または１６週間または２０週間または２４週間または２８週間または３２週間である。一実施形態において、追加免疫組成物は、予備刺激組成物の投与の約１週間または２週間または３週間または４週間または５週間または６週間または７週間または８週間または９週間または１６週間または２０週間または２４週間または２８週間または３２週間後の投与のために処方される。本明細書において、ワクチン接種された対象は、インフルエンザウイルスに対する防御効果の提供を企図するワクチンを投与された対象である。
【０１２３】
第１および第２のワクチン組成物は、同じ組成物であってよいが、そうである必要はない。よって、本発明の一実施形態において、ワクチンを投与する工程は、第１のワクチン組成物を投与し、続いてその後に、第２のワクチン組成物を投与する工程を備える。一実施形態において、第１のワクチン組成物は、本発明のナノ粒子を備える。
【０１２４】
一実施形態において、個体は、インフルエンザウイルスに曝露された。本明細書において、用語、曝露された、曝露その他は、対象が、インフルエンザウイルスに感染したことが既知の人物または動物と接触したことを示す。本発明のワクチンは、当業者にとって周知の技法を使用して投与され得る。処方および投与のための技法は、例えば、「レミントンの薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、第１８版、１９９０、マック出版社（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）、ペンシルベニア州イーストン（Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ．）に見ることができる。ワクチンは、伝統的な注射器、無針注射装置または微粒子銃の遺伝子銃が挙げられるがこれらに限定されない手段によって投与され得る。適した投与経路として、ほんの数例を挙げると、筋肉内、皮内、皮下、髄内注射と共にくも膜下腔内、直接的脳室内（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）、静脈内、腹腔内、鼻腔内または眼球内注射等、非経口的送達が挙げられるがそれらに限定されない。注射のため、本発明の一実施形態の化合物は、水溶液、好ましくは、ハンクス溶液、リンゲル溶液または生理食塩水バッファー等の生理的に適合性のバッファーにおいて処方され得る。
【０１２５】
一実施形態において、本発明のワクチンまたはナノ粒子は、異種インフルエンザウイルスによる感染に対する個体の防御に使用され得る。すなわち、インフルエンザウイルスの１つの系統由来の赤血球凝集素タンパク質を使用して作製されたワクチンは、インフルエンザの異なる系統による感染に対し個体を防御することができる。例えば、インフルエンザＡ／ニューカレドニア／２０／１９９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／カリフォルニア／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／シンガポール／１／１９５７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／香港／１／１９６８（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ブリスベン／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／インドネシア／０５／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ｂ／フロリダ／４／２００６（インフルエンザＢ）、Ａ／パース／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ブリスベン／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ｂ／ブリスベン／６０／２００８（インフルエンザＢ）、Ａ／ウィルソン・スミス／３３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／天津／７８／７７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／テキサス／３６／９１（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／シンガポール／６／８６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／メンフィス／３９／８３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／マレーシア／５４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／アイオワ／４３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／香港／１１７／７７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／フォート・モンマス／１／４７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ブリスベン／５９／０７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ベイラー／４０５２／８１（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／アルバニー／４８３５／４８（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／香港／１５６／９７（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／カササギ／香港／５０５２／０７（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ニワトリ／シャンシー／２／０６（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／烏骨鶏／香港／ＳＦ１８９／０１（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ニワトリ／河南／１６／０４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ビクトリア／３６１／１１（Ｈ３Ｎ２）、Ｂ／マサチューセッツ／２／１２（インフルエンザＢ）、Ｂ／ブリスベン／６０／０８（インフルエンザＢ）およびＡ／テキサス／５０／１２（Ｈ３Ｎ２）由来の赤血球凝集素タンパク質を使用して作製されたワクチン。
【０１２６】
一実施形態において、本発明のワクチンまたはナノ粒子は、抗原性的に相違するインフルエンザウイルスによる感染に対する個体の防御に使用され得る。この点について、用語、抗原性的に相違するは、経時的に突然変異し、これにより、免疫系に対し呈示されるアミノ酸を変化させるインフルエンザウイルスの系統の傾向を指す。斯かる経時的な突然変異は、抗原性ドリフトとも称される。よって、例えば、インフルエンザウイルスのＡ／ニューカレドニア／２０／１９９９（Ｈ１Ｎ１）系統由来の赤血球凝集素タンパク質を使用して作製されたワクチンは、インフルエンザのより初期の抗原性的に相違するニューカレドニア系統および将来の進化（または分岐）するインフルエンザ系統による感染に対し個体を防御することができる。
【０１２７】
本発明の一実施形態は、本発明の方法を実施するためのキットである。キットは、本発
明のナノ粒子またはワクチンならびに斯かるナノ粒子およびワクチンを作製するための構成成分を含んでいてよい。したがって、キットは、例えば、プライマー、核酸分子、発現ベクター、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ構築物、細胞、バッファー、試薬、注射器、および前記構成成分のいずれかを使用するための指示書を含んでいてよい。キットが、上述のまたは関連する構成成分のいずれかを備える２つ以上の容器を備えることができることが認められよう。例えば、キットのある特定のパーツは、冷蔵を必要とし得る一方、他のパーツは、室温で貯蔵されてよい。よって、本明細書において、キットは、その中に含有された構成成分が一緒に使用されることを企図しつつ、１つまたは複数の実体によって別々の容器において販売される構成成分を備える。
【０１２８】
本明細書に記述されている刊行物は、本願の出願日に先立つその開示のためにもっぱら提示されている。本明細書におけるいかなる記述も、本発明が、先行発明を理由として斯かる刊行物に先行する権利がないことの承認として解釈するべきではない。さらに、提示されている刊行物の日付は、実際の刊行日とは異なる場合があり、これは、独立して確認される必要がある場合がある。
【０１２９】
他に定義がなければ、本明細書において使用されているあらゆる技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意義を有する。本発明の実施または検査において、本明細書に記載されているものと同様のまたは均等ないかなる方法および材料が使用されてもよいが、好まれる方法および材料がここに記載されている。刊行物が引用されているものに関連して方法および／または材料を開示および記載するために、本明細書において言及されているあらゆる刊行物は、本明細書に援用する。
【０１３０】
明確にするために別々の実施形態の文脈において記載されている本発明のある特定の特色は、単一の実施形態において組み合わせて提供されてもよいことが認められる。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈において記載されている本発明の様々な特色は、別々に、またはいずれか適したサブコンビネーションにおいて提供されてもよい。実施形態のあらゆる組合せが、本発明によって特に包含され、ありとあらゆる組合せが個々にかつ明示的に開示されているかの如く、本明細書に開示されている。加えて、あらゆるサブコンビネーションも、本発明によって特に包含され、ありとあらゆる斯かるサブコンビネーションが、本明細書に個々にかかる明示的に開示されているかの如く、本明細書に開示されている。
【０１３１】
本発明者らは、赤血球凝集素タンパク質の部分を備える特異的な融合タンパク質が、インフルエンザウイルスに対する広範な免疫応答の誘発に有用であることを発見した。そこで、これらの実施形態のそれぞれについて下で詳細に開示する。
【０１３２】
（実施例）
（実施例１）
不均一ナノ粒子の産生
Ａ．遺伝子合成およびベクター構築
本研究において使用された全遺伝子は、ヒトコドン最適化された。ヘリコバクター・ピロリ−ウシガエルハイブリッドフェリチンをコードする遺伝子は、ウシガエル（Ｒａｎａ
ｃａｔｅｓｂｅｉａｎａ）フェリチン低次（ｌｏｗｅｒ）サブユニット（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ０７７９７、潜在的Ｎ−グリコシル化部位を消失させるために残基８に点突然変異（Ｎ８Ｑ）を有する）の残基２〜９を、Ｈ．ピロリ非ヘムフェリチン（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ９ＺＬＩ１、残基３〜１６７）に融合することにより構築された。このＨ．ピロリ非ヘムフェリチン（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ９ＺＬＩ１、残基３〜１６７）は、その残基７（Ｉ７Ｅ）および残基１９（Ｎ１９Ｑ）に、それぞれ、ウシガエルフェリチンの６Ｒと塩橋を作
製するため、および、潜在的Ｎ−グリコシル化部位を消失させるために突然変異を有していた。一部の事例において、Ｈ．ピロリフェリチンのカルボキシル末端に余分なＧＳ残基が存在した。分泌されるエンカプスリン遺伝子は、ヒトＣＤ５シグナルを、サーモトガ（Ｔｅｒｍｏｔｏｇａ）・マリティマエンカプスリン（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ９ＷＺＰ２、残基１〜２６４）に融合することにより構築された。ＨＡ  ＲＢＤ（残基５６〜２６４、Ｈ３ナンバリング方式）をコードする遺伝子は、適正なプラスミドから合成または増幅された。一部の事例において、ＨＡのシアル酸結合特性を消失させるために、Ｙ９８Ｆ突然変異が導入され、ＨＡ  ＲＢＤとナノ粒子スキャフォールドとの間の接合部における潜在的立体的衝突を回避するために、Ｆ／Ｋ２６４Ａ突然変異が導入された。これらの断片は、修飾されたウシプロラクチンシグナル配列（ｂＰＲＬ：ＭＤＳＫＧＳＳＱＫＧ  ＳＲＬＬＬＬＬＶＶＳ  ＮＬＬＬＰＱＧＶＬＡ）の下流且つハイブリッドフェリチンの上流にＳＧリンカーと共に融合されて、ＨＡ  ＲＢＤ−フェリチン遺伝子を生じた。ＨＡ  ＲＢＤ−エンカプスリン遺伝子を構築するために、ｇｐ３５０断片は、エンカプスリンの上流にＳＧリンカーと共に融合された。ＨＡ  ＲＢＤ−チクングニアウイルス様粒子（ＣＨＩＫＶＬＰ）を構築するために、ＨＡ  ＲＢＤ遺伝子断片（残基５９〜２６４、Ｈ３ナンバリング方式）が増幅され、エンベロープＥ３およびＥ２の間のフーリン切断ループに挿入された。ＨＡ  ＲＢＤ挿入およびフーリン切断に適応させるために、Ｅ３に３個のアミノ酸欠失（Ｅ３残基５８〜６０、ＳＰＨ）およびＥ２に４個のアミノ酸欠失（Ｅ２残基１〜４、ＳＴＫＤ）が存在した。次に、タンパク質産生のため、ＣＭＶ／ＲまたはＣＭＶ／Ｒ  ８κｂ哺乳類発現ベクターへと全遺伝子がクローニングされた。
【０１３３】
Ｂ．組換えタンパク質の生合成および精製
発現ベクターは、それぞれ２９３ｆｅｃｔｉｎまたはＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ  ２９３トランスフェクション試薬（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を使用して、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３ＦまたはＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））へと一過的にトランスフェクトされた。コトランスフェクションのため、等モル量の２〜８種の異なるプラスミドが混合された（総ＤＮＡ量は、全てのトランスフェクションについて一定）。トランスフェクション４日後に、培養上清が回収され、清澄化された。ＨＡ  ＲＢＤ−フェリチンおよびＨＡ  ＲＢＤ−エンカプスリンナノ粒子は、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（ジー・イー・ヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を使用したイオン交換クロマトグラフィーと、続くＰＢＳ中でのＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６  １０／３００  ＧＬカラム（ジー・イー・ヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））によるサイズ排除クロマトグラフィーよって精製された。ＨＡ  ＲＢＤ−ＣＨＩＫＶＬＰは、Ｏｐｒｉｐｒｅｐ（シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））を使用した超遠心分離により精製された。簡潔に説明すると、清澄化された培養上清は、１ｍｌのＯｐｔｉｐｒｅｐの上にオーバーレイされ、ＳＷ  ３２  Ｔｉローターにおいて５０，０００ｒｃｆで９０分間スピンされた。スピン後に、底２ｍｌが収集され、完全に混合されて、１：１のＯｐｔｉｐｒｅｐ／濃縮上清混合物が作製され、ＮＶＴ  １００ローターにおいて３６０，０００ｒｃｆで３時間再度スピンされた。ＨＡ  ＲＢＤ−ＣＨＩＫＶＬＰに対応するバンドが収集され、ＰＢＳ中でのＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−５００  １６／６０  ＨＲカラム（ジー・イー・ヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））によってさらに精製された。
【０１３４】
Ｃ．精製されたナノ粒子の電子顕微鏡（ＥＭ）
パート（Ｂ）で精製されたナノ粒子は、ネガティブ染色ＥＭによって解析された。簡潔に説明すると、約５０μｇ  ｍｌ−１の試料は、新鮮にグロー放電炭素コーティングされたグリッドに吸着され、ＰＢＳでリンスされ、０．７５％ギ酸ウラニル溶液で染色された。画像は、Ｅａｇｌｅ  ＣＣＤカメラを備えるＦＥＩ  Ｔ２０顕微鏡において記録された。これらの解析の結果は、図３および図４に示されている。
【０１３５】
（実施例２）
インフルエンザＨＡタンパク質ＲＢＤを発現する精製されたナノ粒子の免疫沈降解析
ＮＣ９９、ＣＡ０９またはその両方（ＣｏＡｓｍｂｌ  ２）由来のＲＢＤを発現するＨＡ  ＲＢＤ−ナノ粒子が、実施例１に記載されている通りに調製および精製された。４マイクログラムの精製されたＲＢＤ−ナノ粒子は、４μｇの抗ＮＣ９９（３ｕ−ｕ）、抗パンデミックＨ１Ｎ１  ＨＡ（２Ｄ１）または抗ＨＡステム部（Ｃ１７９）モノクローナル抗体のいずれかと３０分間室温でインキュベートされた。次に、プロテインＧコンジュゲートされた磁気ビーズを使用して、免疫複合体が捕捉され、複合体は、０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳで完全に洗浄された。洗浄されたペレットは、還元剤なしの２０μｌのレムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）バッファーに再懸濁され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて解析された。５マイクログラムの各タンパク質がロードされた。ＮＣ９９、Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９；ＣＡ０９、Ａ／カリフォルニア／０４／２００９；ＷＳ３３、Ａ／ウィルソン・スミス／１９３３；ＡＢ４８、Ａ／アルバニー／４８３５／１９４８；ＢＲ０７、Ａ／ブリスベン／５９／２００７；ＩＡ４３、Ａ／アイオワ／１９４３；ＨＫ７７、Ａ／香港／１１７／１９７７；ＦＭ４７、Ａ／フォート・モンマス／１／１９４７。これらの解析の結果は、図５および図６に示されている。
【０１３６】
（実施例３）
精製されたナノ粒子を使用したマウスの免疫化
中和免疫応答を誘発する、精製された一価、混合型または不均一ナノ粒子を備える組成物の能力が、マウスにおいて検査された。６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスは、９群（Ｎ＝５）に分けられた。シグマ・アジュバント・システム（ＳＡＳ）の存在下、０および３週目に、各群に、２μｇのａ）一価（すなわち、単一のＨＡ  ＲＢＤを発現する）ナノ粒子、ｂ）様々な一価ナノ粒子の混合物またはｃ）示されている共集合されたナノ粒子のいずれかを備える組成物が投与された。投与された免疫原および投薬スケジュールは、下の表３に示されている。
【０１３７】
【表３】
0006655623.tif 000010
血清試料は、血清学的解析のため、１回目の免疫化前にならびに２回目の免疫化の２および３週間後に収集された。より詳細には、免疫血清は、ＮＣ９９ウイルスによって媒介される赤血球凝集を阻害し、ＮＣ９９偽型レンチウイルスを中和するその能力について検査された。これらの解析の結果は、図７および図８に示されている。
【０１３８】
（実施例４）
一価ナノ粒子、混合された一価ナノ粒子または多価共集合されたナノ粒子を使用した、免疫応答の幅の解析
０週目および再度３週目に、マウス（Ｎ＝５）は、ＮＣ９９もしくはＣＡ０９に対する一価ナノ粒子、混合されたナノ粒子（Ａｄｍｉｘ  ４）または多価ナノ粒子（ＣｏＡｓｍｂｌ  ４またはＣｏＡｓｍｂｌ  ８）のいずれかにより免疫化された（Ｎ＝５）。２回目の免疫化の２〜３週間後に、各マウスから血清が収集され、１８種のＨ１Ｎ１ウイルスのパネルを使用したＨＡＩアッセイによって血清が解析された。その結果得られる力価は、ヒートマップとして図９に示されている。
【０１３９】
この解析の結果は、多価共集合された粒子による免疫化が、一価ナノ粒子または混合された一価ナノ粒子のいずれかによる免疫化のものよりも広範な免疫応答（すなわち、それよりも広い範囲のインフルエンザウイルスに対する免疫応答）を生ずることを実証する。
【０１４０】
（実施例５）
ＨＡ  ＲＢＤ−ナノ粒子免疫化マウスにおける末梢細胞におけるＨＡ特異的、交差反応
性Ｂ細胞の検出
０、３および２０週目に、マウス（Ｎ＝５）は、ＮＣ９９もしくはＣＡ０９に対する一価ナノ粒子、混合されたナノ粒子（Ａｄｍｉｘ  ２、Ａｄｍｉｘ  ４またはＡｄｍｉｘ  ６）または多価ナノ粒子（ＣｏＡｓｍｂｌ  ２、ＣｏＡｓｍｂｌ  ４、ＣｏＡｓｍｂｌ  ６またはＣｏＡｓｍｂｌ  ８）のいずれかにより免疫化された。３回目の免疫化の１０日後に、各マウスから末梢血が収集され、ＮＣ９９およびＣＡ０９  ＨＡプローブを使用したフローサイトメーターによって白血球細胞が単離および解析された。生きている非Ｔ、非マクロファージ（ｍａｃｔｏｐｈａｇｅ）、ＩｇＤ陰性、シングレットメモリーＢ細胞がゲーティングされ、ＮＣ９９およびＣＡ０９  ＨＡの両方に対して陽性な細胞集団（メモリーＢ細胞のパーセンテージ）が定量化された。ゲーティング戦略および異なる免疫化群にわたるＨＡ二重陽性細胞のその結果得られる頻度は、図１０および図１１に示されている。
【０１４１】
この解析の結果は、多価共集合された粒子による免疫化が、一価ナノ粒子または混合された一価ナノ粒子のいずれかによる免疫化よりも高い頻度の、免疫化された動物における交差反応性ＨＡ特異的メモリーＢ細胞（すなわち、ＮＣ９９およびＣＡ０９  ＨＡの両方に対して特異的なＢ細胞）を誘導することを実証する。
【０１４２】
（実施例６）
ＮＣ９９／ＣＡ０９交差反応性Ｂ細胞頻度および共集合されたＲＤＰ−ナノ粒子の抗原性不均一性の相関
免疫化された動物におけるＨＡ二重陽性細胞の頻度および共集合された免疫原の抗原価の間の関係性が、ピアソン積率相関解析によって試験された。この関係性は、図１２におけるグラフによって例証されている。
【０１４３】
この解析の結果は、共集合された免疫原における不均一性の程度が、免疫化された動物における交差反応性ＨＡ特異的メモリーＢ細胞の頻度と正に相関することを示す。
（実施例７）
共集合されたＨＡ  ＲＢＤ−ナノ粒子によるワクチン接種によって誘発される中和幅
マウスは、上の表３に示すスケジュールに従って共集合されたナノ粒子によりワクチン接種された。最終免疫化の１０日後に、血清が収集され、様々なＨ１Ｎ１ウイルス系統由来のＨＡおよびＮＡを発現する偽型レンチウイルスを中和するその能力について検査された。これらのアッセイから得られた血清中和力価は、下の表４に示されている。
【０１４４】
【表４】
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（実施例８）
単離された抗ＨＡモノクローナル抗体の中和幅
実施例７におけるマウス＃８４４１から得られたＢ細胞は、ベイトとして蛍光標識されたＨＡプローブを使用して選別された。次に、抗体重鎖および軽鎖の可変領域をコードする遺伝子が、単一のＢ細胞から増幅され、配列決定され、抗体としてコードされたタンパク質を発現するために適正な骨格ベクター（マウスＩｇＧ２ａ重鎖およびカッパー軽鎖骨格）へとクローニングされた。再構築された抗体ベクターが、２９３−Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ発現系（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））における一
過的トランスフェクションのために使用され、プロテインＡ樹脂を使用した親和性カラム精製によりＩｇＧが精製された。その結果得られる抗体は、４４１Ｄ６と称された。４４１Ｄ６の中和ＩＣ５０力価は、偽型ウイルスが様々なＨ１Ｎ１ウイルス系統由来のＨＡおよびＮＡを発現するレンチウイルス偽型中和アッセイによって決定された。モノクローナル抗体ＣＨ６５（抗ＨＡ受容体結合部位）およびＦＩ６ｖ３（抗ＨＡステム部領域）が対照として使用された。ＮＴ＝検査されず。これらのアッセイから得られた中和力価は、下の表５に示されている。
【０１４５】
【表５】
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この結果は、ＣＨ６５よりも広範囲のＨ１Ｎ１ウイルスを中和し、ＦＩ６ｖ３よりも強力にウイルスを中和するモノクローナル抗体４４１Ｄ６の能力を実証し、Ｈ１Ｎ１ウイルスに対する新規の広範かつ強力な中和モノクローナル抗体４４１Ｄ６を立証する。
【０１４６】
インフルエンザＨＡタンパク質とモノクローナル抗体４４１Ｄ６との相互作用をより良く理解するために、Ｆａｂ  ４４１Ｄ６と複合体形成したＨＡ三量体の三次元再構築モデルが生成された。簡潔に説明すると、ＨＡ三量体（Ａ／ニューヨーク／６５３／１９９６
（Ｈ１Ｎ１））が、１．５倍過剰量のＦａｂ  ４４１Ｄ６とインキュベートされ、サイズ排除カラムクロマトグラフィーによって複合体が精製された。次に、ネガティブ染色電子顕微鏡実験において、精製されたＨＡ−Ｆａｂ複合体が使用された。およそ９，０００個の粒子が三次元再構築に使用され、最終モデルの計算された分解能は、ほぼ１８．５Åであった。ＨＡおよびＦａｂモデルは、ＥＭ密度においてドッキングされた（下）。その結果得られる三次元モデルは、図１３に示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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