(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
５０ｍｇ〜１５０ｍｇの用量の以下の構造を有する化合物Ａ
【化１】
0006785804.tif 000025
又は医薬的に許容可能なその塩、及び、
治療有効量の以下の構造を有する化合物Ｂ
【化２】
0006785804.tif 000026
又は医薬的に許容可能なその塩とを組み合わせたことを特徴とする、マントル細胞リンパ腫（mantle cell lymphoma：ＭＣＬ）又はびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（diffuse large B-cell lymphoma：ＤＬＢＣＬ）を治療するための医薬組成物。
【請求項２】
化合物Ａ又は医薬的に許容可能なその塩の用量が、約５０ｍｇである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
化合物Ａ又は医薬的に許容可能なその塩が、１日２回投与されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
化合物Ａ又は医薬的に許容可能なその塩の用量が、約１００ｍｇである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
化合物Ａ又は医薬的に許容可能なその塩が、１日１回投与されることを特徴とする、請求項１又は４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
化合物Ａ又は医薬的に許容可能なその塩が経口投与されることを特徴とする、請求項１〜５の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
化合物Ｂ又は医薬的に許容可能なその塩が、ヒトに対して１ｍｇ〜２００ｍｇの用量で投与されることを特徴とする、請求項１〜６の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
化合物Ａ又は医薬的に許容可能なその塩の投与が、化合物Ｂ又は医薬的に許容可能なその塩の投与に対し、先行して、同時に、又は後から行われることを特徴とする、請求項１〜７の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記医薬組成物が、
化合物Ａ又は医薬的に許容可能なその塩と、少なくとも１つの医薬的に許容可能な賦形剤とを含む、第一の組成物と、
化合物Ｂ又は医薬的に許容可能なその塩と、少なくとも１つの医薬的に許容可能な賦形剤とを含む、第二の組成物と
を含む、請求項１〜８の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
化合物Ａが、下記構造
【化３】
0006785804.tif 000027
を有する化合物Ａ（Ｓ）である、請求項１〜９の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
化合物Ｂが、下記構造 
【化４】
0006785804.tif 000028
を有する化合物Ｂ（Ｒ）である、請求項１〜１０の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）を治療するための、請求項１〜１１の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ＤＬＢＣＬが、活性化Ｂ細胞様びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（activated B-cell like diffuse large B-cell lymphoma：ＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ）である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
ＤＬＢＣＬが、胚中心Ｂ細胞様びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（germinal center B-cell like diffuse large B-cell lymphoma：ＧＣＢ−ＤＬＢＣＬ）である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）を治療するための、請求項１〜１１の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
ＭＣＬ又はＤＬＢＣＬが、（ｉ）少なくとも１つの化学療法での治療に対して不応性であるか、又は（ii）化学療法での治療後に再発しているか、又はこれらの組合せであることを特徴とする、請求項１〜１５の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
ＭＣＬ又はＤＬＢＣＬが未治療であることを特徴とする、請求項１〜１５の何れか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は概してＢ細胞悪性腫瘍を治療するための治療剤及び組成物に関し、より具体的には、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（phosphatidylinositol 3-kinase：ＰＩ３Ｋ）阻害剤を、ブルトン型チロシンキナーゼ（Bruton's tyrosine kinase：ＢＴＫ）阻害剤との組合せで、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療に用いることに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ細胞悪性腫瘍はモノクローナルＢリンパ球のリンパ節への蓄積、そしてしばしば血液、骨髄、脾臓、及び肝臓等の器官への蓄積により生じる。この群には組織病理学的な変種、例えば濾胞性リンパ腫（follicular lymphoma：ＦＬ）、辺縁帯リンパ腫（marginal zone lymphoma：ＭＺＬ）、マントル細胞リンパ腫（mantle cell lymphoma：ＭＣＬ）、慢性リンパ性白血病（chronic lymphocytic leukemia：ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（small lymphocytic lymphoma：ＳＬＬ）、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症（Waldenstrom Macroglobulinemia：ＷＭ）、及びびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（diffuse large B-cell lymphoma：ＤＬＢＣＬ）が含まれる。これらの障害はリンパ節症や血球減少症により特徴付けられ、時には致死的な器官機能不全を引き起こす場合もある。患者は体質上の症状（発熱、寝汗、及び／又は、体重減少）や疲労感を呈する場合もある。利用可能な療法により治癒するＢ細胞悪性腫瘍の患者は僅かに過ぎない。従って、ヒトのＢ細胞悪性腫瘍を治療する代替療法が依然として求められている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本願ではＢ細胞悪性腫瘍を治療する方法であって、治療有効量の２−（１−（（９Ｈ−プリン−６−イル）アミノ）プロピル）−５−フルオロ−３−フェニルキナゾリン−４（３Ｈ）−オン又は医薬的に許容可能なその塩と、治療有効量の６−アミノ−９−［１−（２−ブチノイル）−３−ピロリジニル］−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン又は医薬的に許容可能なその塩とを投与することを含む方法が提供される。
【０００４】
２−（１−（（９Ｈ−プリン−６−イル）アミノ）プロピル）−５−フルオロ−３−フェニルキナゾリン−４（３Ｈ）−オン又は医薬的に許容可能なその塩はＰＩ３Ｋ阻害剤の例である。ある例によれば、２−（１−（（９Ｈ−プリン−６−イル）アミノ）プロピル）−５−フルオロ−３−フェニルキナゾリン−４（３Ｈ）−オン又は医薬的に許容可能なその塩を、５０ｍｇ〜１５０ｍｇの用量でヒトに投与する。
【０００５】
６−アミノ−９−［１−（２−ブチノイル）−３−ピロリジニル］−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン又は医薬的に許容可能なその塩はＢＴＫ阻害剤の例である。ある例によれば、６−アミノ−９−［１−（２−ブチノイル）−３−ピロリジニル］−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン又は医薬的に許容可能なその塩を、１ｍｇ〜２００ｍｇの用量でヒトに投与する。
【０００６】
本願では、本明細書に記載のＰＩ３Ｋ阻害剤及びＢＴＫ阻害剤を含む医薬組成物、製品及びキットも提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
本願は以下の説明を添付の図面と共に考慮することにより理解される。
【０００８】
【図１Ａ】図１Ａは、イデラリシブ（Idelalisib）を化合物Ｂとの組合せで投与した場合における、ＯＣＩ−ＬＹ１０細胞株の細胞生存率を示すグラフである。
【０００９】
【図１Ｂ】図１Ｂは、化合物Ｂをイデラリシブとの組合せで投与した場合における、ＯＣＩ−ＬＹ１０細胞株の細胞生存率を示すグラフである。
【００１０】
【図１Ｃ】図１Ｃは、イデラリシブを化合物Ｂとの組合せで投与した場合における、ＴＭＤ−８細胞株の細胞生存率を示すグラフである。
【００１１】
【図１Ｄ】図１Ｄは、化合物Ｂをイデラリシブとの組合せで投与した場合における、ＴＭＤ−８細胞株の細胞生存率を示すグラフである。
【００１２】
【図１Ｅ】図１Ｅは、化合物Ｂをイデラリシブとの組合せで投与した場合における、ＴＭＤ−８細胞株の細胞生存率を示すヒートマップである。「０」＝未処理（薬物作用なし）；「１００」＝完全細胞増殖抑制（アッセイのインターバルに成長なし）；及び「２００」＝完全細胞毒性（バックグラウンド信号）。更に、白線は臨床上達成可能な用量を意味する。
【００１３】
【図１Ｆ】図１ＦはＴＭＤ−８細胞株のアイソボログラムである。
【００１４】
【図１Ｇ】図１Ｇは、ＴＭＤ８細胞をイデラリシブ（ＩＤＥＬＡ）、化合物Ｂ（Cmpd.B）、又はイデラリシブと化合物Ｂとの組合せ（ＩＤＥＬＡ＋Cmpd.B）で処理した場合のアポトーシスのレベルを示す。
【００１５】
【図１Ｈ】図１Ｈは、ＡＢＣ ＤＬＢＣＬ細胞株をイデラリシブ、化合物Ｂ、及びイブルチニブ（Ibrutinib）で処理した場合の細胞生存率を示すグラフである。
【００１６】
【図２Ａ】図２Ａ及び２Ｂは、化合物Ｂをイデラリシブとの組合せで投与した場合のＲｅｃ−１細胞株（図２Ａ）及びＪＶＭ−２細胞株（図２Ｂ）の細胞生存率を示すヒートマップである。
【図２Ｂ】同上。
【００１７】
【図２Ｃ】図２Ｃは、化合物Ｂをイデラリシブとの組合せで投与した場合のＴＭＤ−８細胞株の細胞生存率を示すヒートマップである。
【００１８】
【図２Ｄ】図２ＤはＴＭＤ−８細胞株のアイソボログラムである。
【００１９】
【図２Ｅ】図２Ｅは、イデラリシブ（ＩＤＥＬＡ；４２０ｎＭ）、化合物Ｂ（Cmpd.B；３２０ｎＭ）、又はイデラリシブと化合物Ｂとの組合せ（ＩＤＥＬＡ＋Cmpd.B）により２時間及び２４時間処理した細胞における、シグナル伝達成分のリン酸化についてのウエスタンブロットを示す。
【００２０】
【図３Ａ】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、及び３Ｄは、（図３Ａ及び３Ｄ）ＢＴＫ Ｃ４８１Ｆ変異及び（図３Ｂ及び３Ｃ）Ａ２０ Ｑ１４３＊変異を有するイブルチニブ抵抗性ＴＭＤ−８の成長阻害を示すグラフである。「ＴＭＤ８Ｓ」は親細胞株を指し、「ＴＭＤ８Ｒ」は抵抗性を示した細胞株を指す。点線はイデラリシブを化合物Ｂとの組合せで投与した後のＴＭＤ−８細胞株に対する作用を示す。
【図３Ｂ】同上。
【図３Ｃ】同上。
【図３Ｄ】同上。
【００２１】
【図３Ｅ】図３Ｅは、イブルチニブの存在下でのイブルチニブ抵抗性ＴＭＤ８クローンの細胞生存アッセイの結果を示す（Ｎ＝４）。
【００２２】
【図４】図４は、細胞生存に関するＴＭＤ８のＰＩ３Ｋδ依存性を示すグラフである。
【００２３】
【図５】図５は、ＴＭＤ８Rのイデラリシブに対する獲得抵抗性 を示すグラフである。
【００２４】
【図６Ａ】図６Ａ及び６ＢはＰＩ３Ｋγのアップレギュレーションを示し、図６Ｃ及び６ＤはＰＴＥＮ喪失を示す。
【図６Ｂ】同上。
【図６Ｃ】同上。
【図６Ｄ】同上。
【００２５】
【図７】図７は、ＴＭＤ８Ｒがドゥベリシブ（Duvelisib）に対して交差抵抗性を有することを示すグラフである。
【００２６】
【図８Ａ】図８Ａは、イデラリシブ感受性及びイデラリシブ抵抗性のＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ細胞株のＲＮＡｓｅｑ分析である。
【００２７】
【図８Ｂ】図８Ｂは、５００ｎＭのイデラリシブで２４時間のウエスタンブロットを示す。
【００２８】
【図８Ｃ】図８Ｃは、ＴＭＤ８Sではｃ−Ｍｙｃがイデラリシブにより阻害されたが、ＴＭＤ８Rではされなかったことを示すウエスタンブロットである。
【００２９】
【図８Ｄ】図８Ｄは、ＲＮＡｓｅｑにより測定されたｃ−Ｍｙｃ標的遺伝子の発現を示す。
【００３０】
【図９】図９は、リン酸タンパク質分析を示すグラフである。
【００３１】
【図１０Ａ】図１０Ａ及び１０Ｂは、ＴＭＤ８R細胞がイブルチニブ及び化合物Ｂに対して交差抵抗性を有することを示すグラフである。
【図１０Ｂ】同上。
【００３２】
【図１１Ａ】図１１Ａは、ＭＫ−２２０６とイデラリシブとの組合せにより抵抗性が克服され得ることを示すグラフである。
【００３３】
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、２４時間経過時点で測定されたカスパーゼ3/7切断を示すグラフであり、図１１Ｃは、４８時間経過時点で測定されたアネキシンを示すグラフである。両側ｔ検定を用いてｐ値を算出した。ＰＩ＝ヨウ化プロピジウム。
【図１１Ｃ】同上。
【００３４】
【図１１Ｄ】図１１Ｄは、イデラリシブ、ＭＫ−２２０６、又はイデラリシブとＭＫ−２２０６との組合せ（１μＭ）で処理したＴＭＤ８S及びＴＭＤ８R細胞の９６時間経過時点での細胞生存アッセイの結果を示す（Ｎ＝４）。
【００３５】
【図１２】図１２は、ＭＫ−２２０６とイデラリシブとの組合せによるＰＩ３Ｋ経路の阻害を示すウエスタンブロットである。
【００３６】
【図１３Ａ】図１３Ａは、ＧＳＫ−２３３４４７０とイデラリシブとの組合せにより抵抗性が克服され得ることを示すグラフである。
【００３７】
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、２４時間経過時点で測定されたカスパーゼ3/7切断を示すグラフであり、図１３Ｃは、４８時間経過時点で測定されたアネキシンＶを示すグラフである。両側ｔ検定を用いてｐ値を算出した。ＰＩ＝ヨウ化プロピジウム。
【図１３Ｃ】同上。
【００３８】
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、イデラリシブ、ＧＳＫ−２３３４４７０又はイデラリシブとＧＳＫ−２３３４４７０との組合せ（３μＭ）で処理したＴＭＤ８S及びＴＭＤ８R細胞の９６時間経過時点での細胞生存アッセイの結果を示す（Ｎ＝４）。
【００３９】
【図１４】図１４は、ＧＳＫ−２３３４４７０とイデラリシブとの組合せによるＰＩ３Ｋ経路の阻害を示すウエスタンブロットである。
【００４０】
【図１５】図１５は、ＦＳＣＣＬがＰＩ３Ｋδ阻害に対して感受性であることを示すグラフである。
【００４１】
【図１６】図１６は、ＦＳＣＣＬＳ及びＦＳＣＣＬＲがイブルチニブに対して低下した感受性を示すことを表すグラフである。
【００４２】
【図１７Ａ】図１７Ａ及び１７Ｂは、ＦＳＣＣＬR ＰＩ３ＫＣＡ変異体（Ｎ３４５Ｋ）がイデラリシブとＢＹＬ−７１９との組合せに対して回復した感受性を示すことを表すグラフである。
【図１７Ｂ】同上。
【００４３】
【図１８Ａ】図１８Ａは、ＦＳＣＣＬRにおけるｐＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）発現のイデラリシブとＢＹＬ−７１９との組合せによる低減を示すウエスタンブロットである。
【００４４】
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、ＩｇＭによる刺激を受けたＦＳＣＣＬRにおけるｐＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）発現のイデラリシブとＢＹＬ−７１９との組合せによる低減を示すウエスタンブロットである。
【００４５】
【図１９Ａ】図１９Ａ及び１９Ｂは、ＳＰＫ及びｐＳｙｋの補償経路の活性化を示すウエスタンブロットである。
【図１９Ｂ】同上。
【００４６】
【図２０Ａ】図２０Ａ及び２０Ｂは、ＦＳＣＣＬR ＳＦＫＨＩＧＨがイデラリシブとダサチニブとの組合せに対して増加した感受性を示すことを表すグラフである。
【図２０Ｂ】同上。
【００４７】
【図２１Ａ】図２１Ａ及び２１Ｂは、ＦＳＣＣＬR ＳＦＫＨＩＧＨがイデラリシブとエントスプレチニブとの組合せに対して増加した感受性を示すことを表すグラフである。
【図２１Ｂ】同上。
【００４８】
【図２２Ａ】図２２Ａは、ＦＳＣＣＬRクローン；４Ｄ４Ｄ６及び２Ｃ４Ｄ９についてのＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路のＲＮＡｓｅｑヒートマップである。ＦＳＣＣＬSと比較して示す。
【００４９】
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、未処理ＦＳＣＣＬS及びＷｎｔ−シグネチャーＦＳＣＣＬRクローンのウエスタンブロットである。
【００５０】
【図２３Ａ】図２３Ａは、イデラリシブ、化合物Ｂ、又は化合物Ｂとイデラリシブとの組合せで処理したイデラリシブ抵抗性ＴＭＤ８R及びＴＭＤ８S細胞の細胞生存アッセイの結果を示す。
【００５１】
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、イデラリシブ（ＩＤＥＬＡ、４２０ｎＭ）、化合物Ｂ（Cmpd.B、３２０ｎＭ）、又は組合せ（ＩＤＥＬＡ ＋ Cmpd.B）により処理したＴＭＤ８R細胞におけるｐ−ＡＫＴ Ｓ４７３、ｐ−ＢＴＫ Ｙ２３３、ｃ−Ｍｙｃ及びアクチンの結果を示す。
【００５２】
【図２４Ａ】図２４Ａは、ＰＩ３Ｋδ阻害剤とＢＴＫ阻害剤（化合物Ｂ；Cmpd.B）との組合せ、ビヒクル対照、又は単剤で処理したマウスにおける腫瘍体積の変化を示す；腫瘍体積は平均±ＳＥＭで表し、ビヒクル動物との比較におけるｐ＜０．０５、ｐ＜０．０００１を示す。
【００５３】
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、ＰＩ３Ｋδ阻害剤とＢＴＫ阻害剤との組合せ（化合物Ｂ；Cmpd.B）により処理されたＴＤＭ８異種移植モデルマウスにおける、ＢＴＫ及びＰＩ３Ｋ活性化のウエスタンブロットの結果を、ビヒクル対照及び単剤処理と比較して示す。ビヒクル、ＰＩ３Ｋδ阻害剤（５ｍｇ／ｋｇ）、化合物Ｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）、又はＰＩ３Ｋδ阻害剤＋化合物Ｂ（５ｍｇ／ｋｇ ＋ １０ｍｇ／ｋｇ）により処理したマウスから、腫瘍を採取し、磨り潰し、溶解した。図２４Ｃ及び２４Ｄは、各処理群のマウスの腫瘍の平均の定量値である；タンパク質はＡＵＣにより定量化し、ｐ−ＢＴＫ Ｙ２２３は総ＢＴＫタンパク質に対して正規化し、ｐ−Ｓ６ＲＰ Ｓ２３５／２３６はアクチンに対して正規化した。平均±ＳＤ。
【図２４Ｃ】同上。
【図２４Ｄ】同上。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
以下の記載では方法やパラメーター等の例を述べる。しかし、斯かる記載は、本発明の範囲の限定を意図するものではなく、例示的な態様の説明として供するにすぎない点を留意されたい。
【００５５】
本明細書において提供されるのは、Ｂ細胞悪性腫瘍を、それを必要とするヒトにおいて治療する方法であって、治療有効量の２−（１−（（９Ｈ−プリン−６−イル）アミノ）プロピル）−５−フルオロ−３−フェニルキナゾリン−４（３Ｈ）−オン又は医薬的に許容可能なその塩、及び、治療有効量の６−アミノ−９−［１−（２−ブチノイル）−３−ピロリジニル］−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン又は医薬的に許容可能なその塩を投与することを含む方法である。また、本明細書に記載のＰＩ３Ｋ阻害剤及びＢＴＫ阻害剤を含む組成物（例えば医薬組成物、製剤、又は単位投与形態）、製品及びキットも提供される。また、２−（１−（（９Ｈ−プリン−６−イル）アミノ）プロピル）−５−フルオロ−３−フェニルキナゾリン−４（３Ｈ）−オン又は医薬的に許容可能なその塩の化合物、及び、６−アミノ−９−［１−（２−ブチノイル）−３−ピロリジニル］−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン又は医薬的に許容可能なその塩の、Ｂ細胞悪性腫瘍を治療する薬剤の製造における使用も提供される。また、２−（１−（（９Ｈ−プリン−６−イル）アミノ）プロピル）−５−フルオロ−３−フェニルキナゾリン−４（３Ｈ）−オン、及び、６−アミノ−９−［１−（２−ブチノイル）−３−ピロリジニル］−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン又は医薬的に許容可能なその塩の、Ｂ細胞悪性腫瘍を治療するための使用も提供される。
【００５６】
化合物
２−（１−（（９Ｈ−プリン−６−イル）アミノ）プロピル）−５−フルオロ−３−フェニルキナゾリン−４（３Ｈ）−オン又は医薬的に許容可能なその塩は、ＰＩ３Ｋ阻害剤の一例であり、より具体的には、ＰＩ３キナーゼδ特異的アイソフォーム（ＰＩ３Ｋδ）阻害剤の一例である。斯かる化合物は、本技術分野ではイデラリシブとも呼ばれており、本願明細書では化合物Ａとも称するが、以下の構造を有する。
【化１】
0006785804.tif 000002
【００５７】
一例によれば、化合物Ａは主に、以下の構造を有するＳ−光学異性体である。
【化２】
0006785804.tif 000003
【００５８】
化合物Ａの（Ｓ）−光学異性体は、その化合物名：（Ｓ）−２−（１−（（９Ｈ−プリン−６−イル）アミノ）プロピル）−５−フルオロ−３−フェニルキナゾリン−４（３Ｈ）−オンとして呼ばれる場合もある。
【００５９】
化合物Ａは、例えば米国特許第７，９３２，２６０号明細書に記載の方法により合成され得る。
【００６０】
６−アミノ−９−［１−（２−ブチノイル）−３−ピロリジニル］−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オン又は医薬的に許容可能なその塩は、ＢＴＫ阻害剤の一例である。斯かる化合物は、本明細書では化合物Ｂとも称するが、以下の構造を有する化合物である
【化３】
0006785804.tif 000004
【００６１】
一例によれば、化合物Ｂは主に、以下の構造を有する（Ｒ）−光学異性体である。
【化４】
0006785804.tif 000005
【００６２】
化合物Ｂの（Ｒ）−光学異性体は、その化合物名：６−アミノ−９−［（３Ｒ）−１−（２−ブチノイル）−３−ピロリジニル］−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オンとして呼ばれる場合もある。
【００６３】
一部の態様によれば、ＢＴＫ阻害剤は化合物Ｂの塩である。例えば、ある変形例によれば、ＢＴＫ阻害剤は化合物Ｂの塩酸塩である。一例によれば、ＢＴＫ阻害剤は化合物Ｂの一塩酸塩である。
【００６４】
化合物Ｂは、例えば米国特許第８，５５７，８０３号明細書に記載の方法により合成され得る。
【００６５】
本明細書において提示される化合物名は、ChemBioDraw Ultra １４.０を用いて命名されたものである。当業者であれば理解するように、化合物は、種々の一般に認められている命名法及び記号を用いて命名又は特定することができる。例として、化合物は通称名、体系名、又は非体系名で命名又は特定することができる。化学分野で一般に認められている命名法及び記号としては、例えば化学情報検索サービス機関（Chemical Abstract Service：ＣＡＳ）、ChemBioDraw Ultra、及び国際純正応用化学連合（International Union of Pure and Applied Chemistry：ＩＵＰＡＣ）が挙げられる。
【００６６】
また、本明細書に詳述される化合物の同位体標識形態も、本明細書において提供される。同位体で標識された化合物は、選択された原子質量又は質量数を有する原子により１又は２以上の原子が置換されてなることを除けば、本明細書に示す式により表される構造を有する。本発明の化合物に導入することが可能な同位体の例としては、水素、炭素、窒素、酸素、リン、フッ素及び塩素の同位体、例えば、これらに限定されるものではないが、２Ｈ（重水素、Ｄ）、３Ｈ（三重水素）、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｆ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ及び１２５Ｉが挙げられる。同位体標識された種々の本願の化合物、例えば３Ｈ、１３Ｃ及び１４Ｃ等の放射性同位体が導入された化合物が提供される。斯かる同位体標識された化合物は、例えば代謝研究、反応動態研究、検出、又は画像化技術、例えば陽電子断層撮影法（positron emission tomography：ＰＥＴ）又は単光子放出コンピューター断層撮影法（single-photon emission computed tomography：ＳＰＥＣＴ）、例えば対象（例えばヒト）の放射線治療における薬物又は基質の組織分布アッセイ等に有用である。また、本明細書に記載の同位体標識化合物に関し、該当する場合には、医薬的に許容可能な塩又は水和物も提供される。
【００６７】
一部の例によれば、本明細書に開示される化合物は、ある炭素原子に結合する１〜ｎ個の水素が重水素で置換されるように改変されていてもよい。ここでｎは分子内の水素の数である。斯かる化合物は、代謝に対する抵抗性が上昇しうることから、哺乳類への投与時における化合物の半減期を延長するのに有用である。例えば、Foster, “Deuterium Isotope Effects in Studies of Drug Metabolism”, Trends Pharmacol. Sci. 5(12):524-527(1984）参照。斯かる化合物は、本技術分野で周知の手法により、例えば、１又は２以上の水素が重水素で置換された出発物質を用いることにより合成される。
【００６８】
重水素により標識又は置換された本発明の治療用化合物は、吸収、分布、代謝及び排出（absorption, distributuion, metabolism, and excretion：ＡＤＭＥ）に関するＤＭＰＫ（薬物代謝及び薬学動態：drug metabolism and pharmacokinetics）の性質が改善され得る。重水素等の重同位体で置換することにより、例えばインビボ（in vivo）での半減期の延長、必要用量の低減、及び／又は、治療指数の改善等、代謝安定性の向上による特定の治療上の利点がもたらされ得る。１８Ｆ標識化合物は、ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴ研究に有用な場合がある。本発明の同位体標識化合物は概ね、以下に記載のスキーム、又は、以下に記載の実施例及び調製例に開示の手順を、非同位体標識されていない試薬の代わりに、容易に入手可能な同位体標識試薬を用いて実施することにより、調製することができる。なお、この場合の重水素は、本明細書で提供される化合物の置換基と見做されるものと解される。
【００６９】
斯かる重同位体、特に重水素の濃度は、同位体濃縮係数により定義することができる。本発明の化合物において、具体的に特定の同位体として表示されていない原子は、斯かる原子の安定な同位体を意味するものと意図される。別途記載されない限り、ある位置が具体的に「Ｈ」又は「水素」として表示されていない場合、その位置には水素が、その天然存在度の同位体組成において存在するものと解される。従って、本発明の化合物において、具体的に重水素（Ｄ）として表示されている任意の原子は、重水素を意味するものと解される。
【００７０】
ある物質について「医薬的に許容可能な」と言う場合には、斯かる物質のうち、過度の毒性、刺激、アレルギー反応等を有さず、概ね安全且つ使用に適しており、合理的なリスク対効果比に見合っている物質を意味する。
【００７１】
「医薬的に許容可能な塩」とは、ある化合物（例えば化合物Ａ又は化合物Ｂ、又はその双方）の塩であって、医薬的に許容可能であり、且つ親化合物の所望の薬理活性を保持する（或いは斯かる活性を有する形態に変換可能である）塩を意味する。斯かる塩としては、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等と形成される酸付加塩；又は有機酸、例えば酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、クエン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、乳酸、マレイン酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、オレイン酸、パルミチン酸、プロピオン酸、ステアリン酸、コハク酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリメチル酢酸等と形成される酸付加塩、或いは、親化合物に存在する酸性陽子が、金属イオン、例えばアルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、又はアルミニウム等により置換され；又は有機塩基、例えばジエタノールアミン、トリエタノールアミン、Ｎ−メチルグルカミン等に配位することにより形成される塩が挙げられる。更にこの定義に含まれるものとして、アンモニウムや、置換又は四級化されたアンモニウム塩が挙げられる。医薬的に許容可能な塩の代表的且つ非限定的なリストは、S.M. Berge et al., J. Pharma Sci., 66(1), 1-19 (1977)や、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, R. Hendrickson, ed., 21st edition, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, (2005)の７３２頁の表３８−５に見いだされる。これらの文献は何れも引用により本明細書に組み込まれる。
【００７２】
治療の方法
本明細書に記載のＰＩ３Ｋ及びＢＴＫ阻害剤は、組合せ治療に使用してもよい。即ち、本明細書では、Ｂ細胞悪性腫瘍を、それを必要とするヒトにおいて治療する方法であって、本明細書に記載されるＰＩ３Ｋ阻害剤の治療有効量及びＢＴＫ阻害剤の治療有効量を、ヒトに投与することを含む方法も提供される。
【００７３】
一部の例によれば、「治療」（treatment）又は「治療する」（treating）とは、有益又は所望の結果、例えば臨床結果を得るためのアプローチである。有益又は所望の臨床結果としては、例えば以下のうち１又は２以上が挙げられる。
（ｉ）疾患又は病態を阻害する（例えば、疾患又は病態に起因する１又は２以上の症状を低下させ、及び／又は、疾患又は病態の程度を軽減する）；
（ii）疾患又は病態に関連する１又は２以上の臨床症状の進行を減速又は停止させる（例えば、疾患又は病態を安定化させ、疾患又は病態の悪化又は進行を予防又は遅延し、及び／又は、疾患又は病態の蔓延（例えば、転移）を予防又は遅延する）；及び／又は、
（iii）疾患を軽減する、即ち、臨床症状の退行を生じさせる（例えば、疾患の状態を改善し、疾患又は病態の部分又は完全寛解を供し、他の投薬治療の効果を増強し、疾患の進行を遅延させ、生活の質を向上させ、及び／又は、生存期間を延長する）。
【００７４】
一部の例によれば、疾患又は病態の進行を「遅延させる」（delaying）とは、疾患又は病態の進行を延期し、妨害し、減速させ、遅滞させ、安定化させ、及び／又は、順延することを意味する。斯かる遅延の時間は、疾患又は病態の病歴、及び／又は、治療される対象に応じて様々である。例えば疾患又は病態の進行を「遅延させる」（delays）方法とは、斯かる方法を使用しない場合と比較して、所与の時間枠における疾患又は病態の進行の可能性を低下させ、及び／又は、所与の時間枠における疾患又は病態の程度を低下させる方法である。斯かる比較は、通常は臨床試験に基づき、統計的に有意な数の対象を用いて行われる。疾患又は病態の進行は、標準的な方法、例えば定期的な身体検査、マンモグラフィー、画像化、又は生検を用いて検出することが可能である。また、進行には、当初は検出できないような疾患又は病態の進行、例えば発症、再発、及び兆候等を含めてもよい。
【００７５】
一部の態様によれば、本明細書に記載のＰＩ３Ｋ阻害剤及びＢＴＫ阻害剤の投与により、ＰＩ３Ｋ阻害剤単独又はＢＴＫ阻害剤単独の投与に伴う副作用が、予想外に低減され得る。例えば、ある例によれば、副作用の低減は、副作用の頻度の低減であってもよい。一部の態様によれば、ＰＩ３Ｋ阻害剤及びＢＴＫ阻害剤の投与により、下痢、大腸炎、アミノ基転移酵素の上昇、発疹、又は肺炎、又はこれらの任意の組合せの頻度が低減される。別の変形例によれば、副作用の低減は、副作用の重症度の低減であってもよい。一部の態様によれば、ＰＩ３Ｋ阻害剤及びＢＴＫ阻害剤の投与により、下痢、大腸炎、アミノ基転移酵素の上昇、発疹、又は肺炎、又はこれらの任意の組合せの重症度が低減される。他の態様によれば、本明細書に記載のＰＩ３Ｋ阻害剤及びＢＴＫ阻害剤の投与により、ＰＩ３Ｋ阻害剤単独又はＢＴＫ阻害剤単独の投与に伴う副作用が、予想外にも殆ど又は全く増加しない。他の態様によれば、ＰＩ３Ｋ阻害剤及びＢＴＫ阻害剤の投与により、下痢、大腸炎、アミノ基転移酵素の上昇、発疹、又は肺炎、又はこれらの任意の組合せが、殆ど又は全く増加しない。
【００７６】
本明細書に記載のＰＩ３Ｋ阻害剤及びＢＴＫ阻害剤の投与により、ＢＴＫ療法、ＰＩ３Ｋ療法、又はこれらの組合せに対する抵抗性が、予想外に改善され得る。ある側面によれば、本明細書では、ＢＴＫ阻害剤単独、ＰＩ３Ｋ阻害剤単独、又はこれらの組合せに対するヒトの抵抗性を治療する方法であって、本明細書に記載のＰＩ３Ｋ阻害剤の治療有効量及びＢＴＫ阻害剤の治療有効量を、ヒトに投与することを含む方法が提供される。
【００７７】
ある側面によれば、ＰＩ３Ｋ及びＢＴＫの両シグナル伝達経路を阻害することで、ＰＩ３Ｋ又はＢＴＫ阻害剤に対する抵抗性の克服に相乗的に作用し得る。ある側面によれば、両経路を阻害することで、ＰＩ３Ｋ、ＢＴＫ、及び／又は、ＭＡＰＫ経路を相加的又は相乗的に阻害し得る。斯かる相乗的な応答により、結果としてＰＩ３Ｋ及び／又はＢＴＫ阻害剤の用量を低減し、治療時間を短縮し、又は治療に対する患者の応答を増強することが可能となる。
【００７８】
一部の態様によれば、ＢＴＫ阻害剤単独及び／又はＰＩ３Ｋ阻害剤単独を含む治療に抵抗性を有するヒトは、腫瘍壊死因子α誘導性タンパク質３（tumor necrosis factor alpha-induced protein 3：ＴＮＦＡＩＰ３、別名Ａ２０）変異を有する場合がある。更に別の側面によれば、ヒトのＢ細胞悪性腫瘍を治療する方法であって、ａ）腫瘍壊死因子α誘導性タンパク質３（ＴＮＦＡＩＰ３、別名Ａ２０）変異を有するヒトを選択すること；及びｂ）本明細書に記載のＰＩ３Ｋ阻害剤の治療有効量及びＢＴＫ阻害剤の治療有効量を当該ヒトに投与することを含む方法が提供される。特定の態様によれば、ＢＴＫ阻害剤単独及び／又はＰＩ３Ｋ阻害剤単独を含む治療に抵抗性を有するヒトは、ＢＴＫ Ｃ４８１変異を有する場合がある。他の特定の側面によれば、ヒトのＢ細胞悪性腫瘍を治療する方法であって、ａ）ＢＴＫ Ｃ４８１Ｆ変異を有するヒトを選択すること；及びｂ）本明細書に記載のＰＩ３Ｋ阻害剤の治療有効量及びＢＴＫ阻害剤の治療有効量を当該ヒトに投与することを含む方法が提供される。
【００７９】
一例によれば、本明細書では、ＢＴＫ阻害剤単独に対する抵抗性を有するヒトを治療する方法であって、本明細書に記載のＰＩ３Ｋ阻害剤の治療有効量及びＢＴＫ阻害剤の治療有効量を当該ヒトに投与することを含む方法が提供される。他の例によれば、本明細書では、ＰＩ３Ｋ阻害剤単独に対する抵抗性を有するヒトを治療する方法であって、本明細書に記載のＰＩ３Ｋ阻害剤の治療有効量及びＢＴＫ阻害剤の治療有効量を当該ヒトに投与することを含む方法が提供される。
【００８０】
Ｂ細胞悪性腫瘍
一部の態様によれば、Ｂ細胞悪性腫瘍はＢ細胞リンパ腫又はＢ細胞白血病である。一部の例によれば、Ｂ細胞悪性腫瘍は、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症（ＷＭ）、非胚中心Ｂ細胞リンパ腫（ＧＣＢ）、又はびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）である。
【００８１】
一部の例によれば、Ｂ細胞悪性腫瘍はびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）である。一例によれば、ＤＬＢＣＬは活性化Ｂ細胞様びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ）である。別の変形例によれば、ＤＬＢＣＬは胚中心Ｂ細胞様びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＧＣＢ−ＤＬＢＣＬ）である。他の変形例によれば、ＤＬＢＣＬは非ＧＣＢ ＤＬＢＣＬである。
【００８２】
他の例によれば、Ｂ細胞悪性腫瘍は慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）である。他の例によれば、Ｂ細胞悪性腫瘍はマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）である。更に他の例によれば、Ｂ細胞悪性腫瘍はヴァルデンストレームマクログロブリン血症（ＷＭ）である。
【００８３】
一部の変形例によれば、Ｂ細胞悪性腫瘍は低悪性度非ホジキンリンパ腫である。
【００８４】
対象
（治療を）必要とするヒトとは、例えばＢ細胞悪性腫瘍を有する、又はその疑いがある個人である。ある例によれば、斯かるヒトとは、Ｂ細胞悪性腫瘍を発症するリスクのあるヒト（例えば、遺伝的又は非遺伝的にＢ細胞悪性腫瘍を発症する素因のあるヒト）であって、Ｂ細胞悪性腫瘍との診断を受けたことがあるか否かにはよらない。本明細書で使用する場合、「リスクのある」（at risk）対象とは、Ｂ細胞悪性腫瘍を発症するリスクのある対象である。斯かる対象は、検出可能な疾患を有していてもいなくてもよく、また、本明細書に記載の治療方法に先立ち、検出可能な疾患を発症していてもいなくてもよい。リスクのある対象は、１又は２以上のいわゆる危険因子を有する場合がある。危険因子とは、Ｂ細胞悪性腫瘍の進行と相関を有する測定可能なパラメーター、例えば本明細書に記載のパラメーターである。こうした危険因子を１又は２以上有する対象は、これらの危険因子を有しない個人よりも、Ｂ細胞悪性腫瘍を発症する可能性が高い。
【００８５】
これらの危険因子としては、例えば年齢、性別、人種、食生活、既往歴、疾患の前兆の存在、遺伝子的（例えば遺伝的）考察、及び環境暴露等が挙げられる。一部の態様によれば、Ｂ細胞悪性腫瘍のリスクのあるヒトとしては、例えばこの疾患を経験した親族を有するヒトや、遺伝子学又は生化学的マーカーの分析によりリスクがあると判定されたヒトが挙げられる。Ｂ細胞悪性腫瘍の既往歴も、Ｂ細胞悪性腫瘍の再発危険因子の例である。
【００８６】
一部の態様によれば、本明細書では、Ｂ細胞悪性腫瘍に関連する１又は２以上の症状を呈するヒトを治療する方法が提供される。一部の態様によれば、斯かるヒトは、早期のＢ細胞悪性腫瘍を有する。他の態様によれば、斯かるヒトは、進行期のＢ細胞悪性腫瘍を有する。
【００８７】
一部の態様によれば、本明細書では、Ｂ細胞悪性腫瘍を治療するための１又は２以上の標準療法、例えば化学療法、放射線療法、免疫療法、及び／又は、手術を受けたヒトを治療する方法が提供される。即ち、前述の態様の一部によれば、本明細書に記載のＰＩ３Ｋ阻害剤とＢＴＫ阻害剤との組合せは、化学療法、放射線療法、免疫療法、及び／又は、手術の実施の前、実施と同時、又は実施の後の何れに投与してもよい。
【００８８】
別の側面によれば、本明細書では、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療に対して「難治性」（refractory）であるヒト、又は、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療の後に「再発」（relapse）を生じたヒトを治療する方法が提供される。抗Ｂ細胞悪性腫瘍療法に対して「難治性」の対象とは、特定の治療に対して応答しないことを意味し、抵抗性（resistant）とも呼ばれる。Ｂ細胞悪性腫瘍は、治療の開始時から治療に対して抵抗性であってもよく、治療の過程において、例えば治療がＢ細胞悪性腫瘍に対して幾分の、しかし寛解又は部分寛解と見做すには十分ではない程度の効果を示した後に、抵抗性となったものでもよい。「再発」を生じた対象とは、改善の期間の後、例えば治療によりＢ細胞悪性腫瘍の有効な低減が見られた後、例えば対象が寛解又は部分寛解した後、Ｂ細胞悪性腫瘍が再度出現し、又はＢ細胞悪性腫瘍の兆候及び症状が再出現することを意味する。
【００８９】
一部の例によれば、ヒトは、（ｉ）少なくとも１つの抗Ｂ細胞悪性腫瘍治療に対して難治性であるか、（ii）少なくとも１つの抗Ｂ細胞悪性腫瘍治療による治療の後に再発したか、又は（ｉ）及び（ii）の両方である。ある態様によれば、ヒトは、少なくとも２種、少なくとも３種、又は少なくとも４種の抗Ｂ細胞悪性腫瘍療法（例えば標準又は実験的な化学療法を含む）に対して難治性である。一例によれば、ヒトは、（ｉ）ＢＴＫ療法、ＰＩ３Ｋ療法、又はこれらの組合せに対して難治性であるか；又は（ii）ＢＴＫ療法、ＰＩ３Ｋ療法、又はこれらの組合せによる治療の後に再発したか；又は（ｉ）及び（ii）の両方である。更なる例によれば、ヒトは、（ｉ）ＢＴＫ療法又はその組合せに対して難治性であるか；又は（ii）ＢＴＫ療法又はこれらの組合せによる治療後に再発したか；又は（ｉ）及び（ii）の両方である。ある追加の例によれば、ヒトは、（ｉ）ＰＩ３Ｋ療法又はその組合せに対して難治性であるか；又は（ii）ＰＩ３Ｋ療法又はこれらの組合せによる治療後に再発したか；又は（ｉ）及び（ii）の両方である。他の例によれば、ヒトは、ＢＴＫ療法に対して難治性であるか；又は（ii）ＢＴＫ療法による治療後に再発したか；又は（ｉ）及び（ii）の両方である。他の特定の変形例によれば、ヒトは、（ｉ）ＰＩ３Ｋ療法に対して難治性であるか、又は（ii）ＰＩ３Ｋ療法による治療後に再発したか；又は（ｉ）及び（ii）の両方である。
【００９０】
ある例によれば、ヒトは、（ｉ）少なくとも１つの慢性リンパ性白血病療法に対して難治性であるか、（ii）少なくとも１つの慢性リンパ性白血病療法による治療の後に再発しているか、又は（ｉ）及び（ii）の両方である。一例によれば、ヒトが受け得る慢性リンパ性白血病療法としては、例えば：
ａ）フルダラビン（Fludara（登録商標））；
ｂ）リツキシマブ（Rituxan（登録商標））；
ｃ）リツキシマブ（Rituxan（登録商標））とフルダラビンとの組合せ（適宜ＦＲと略称する）；
ｄ）シクロホスファミド（シトキサン（Cytoxan）（登録商標））とフルダラビンとの組合せ；シクロホスファミドとリツキシマブ及びフルダラビンとの組合せ（適宜ＦＣＲと略称する）；
ｅ）シクロホスファミドとビンクリスチン及びプレドニゾンとの組合せ（適宜ＣＶＰと略称する）；
ｆ）シクロホスファミドとビンクリスチン、プレドニゾン、及びリツキシマブとの組合せ；
ｇ）シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン（Oncovin）、及びプレドニゾンの組合せ（適宜ＣＨＯＰと略称する）；
ｈ）クロラムブシルと、プレドニゾン、リツキシマブ、オビヌツズマブ、又はオファツムマブとの組合せ；
ｉ）ペントスタチンとシクロホスファミド及びリツキシマブとの組合せ（適宜ＰＣＲと略称する）；
ｊ）ベンダムスチン（Treanda（登録商標））とリツキシマブとの組合せ（（適宜ＢＲと略称する）；
ｋ）アレムツズマブ（キャンパス（campath）（登録商標））；
ｌ）フルダラビン、及び、シクロホスファミド、ベンダムスチン、又はクロラムブシル；及び
ｍ）フルダラビン、及び、シクロホスファミド、ベンダムスチン、又はクロラムブシルと、抗ＣＤ２０抗体、例えばリツキシマブ、オファツムマブ、又はオビヌツズマブとの組合せ。
【００９１】
別の側面によれば、（ｉ）少なくとも１つの化学療法対して難治性であるか、又は（ii）化学療法による治療後に再発したか、又は（ｉ）及び（ii）の両方であるヒトを感作する方法であって、本明細書に記載のＰＩ３Ｋ阻害剤とＢＴＫ阻害剤との組合せをヒトに投与することを含む方法が提供される。感作されるヒトは、本明細書に記載のＰＩ３Ｋ阻害剤とＢＴＫ阻害剤との組合せの投与を伴う治療に対して反応性であるヒト、又は、斯かる治療に対して抵抗性を発症していないヒトである。一例によれば、ヒトは、（ｉ）ＢＴＫ療法、ＰＩ３Ｋ療法、又はこれらの組合せに対して難治性であるか；又は（ii）ＢＴＫ療法、ＰＩ３Ｋ療法、又はこれらの組合せによる治療後に再発したか；又は（ｉ）及び（ii）の両方である。
【００９２】
更に別の側面によれば、ＢＴＫ療法、ＰＩ３Ｋ療法、又はこれらの組合せに対して抵抗性であるヒトを治療する方法であって、本明細書に記載のＰＩ３Ｋ阻害剤とＢＴＫ阻害剤との組合せをヒトに投与することを含む方法が提供される。一部の態様によれば、ＰＩ３Ｋ阻害剤をＢＴＫ阻害剤との組合せで投与することで、ＢＴＫ療法又はＰＩ３Ｋ療法を同じヒトに対して投与した場合の細胞アポトーシスと比較して、細胞アポトーシスが少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、又は少なくとも９０％増加する。一例によれば、ＰＩ３Ｋ阻害剤をＢＴＫ阻害剤との組合せで投与することで、ＢＴＫ阻害剤を唯一の活性剤として含む治療剤をヒトに対して投与した場合の細胞アポトーシスと比較して、細胞アポトーシスが少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、又は少なくとも９０％増加する。別の例によれば、ＰＩ３Ｋ阻害剤をＢＴＫ阻害剤との組合せで投与することで、ＰＩ３Ｋ阻害剤を唯一の活性剤として含む治療剤を同じヒトに対して投与した場合の細胞アポトーシスと比較して、細胞アポトーシスが少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、又は少なくとも９０％増加する。
【００９３】
一部の態様によれば、ＢＴＫ療法、ＰＩ３Ｋ療法、又はこれらの組合せに対して抵抗性を有するヒトは、腫瘍壊死因子α誘導性タンパク質３（ＴＮＦＡＩＰ３、別名Ａ２０）変異を有していてもよい。更に別の側面によれば、ヒトのＢ細胞悪性腫瘍を治療する方法であって、ａ）腫瘍壊死因子α誘導性タンパク質３（ＴＮＦＡＩＰ３、別名Ａ２０）変異を有するヒトを選択すること；及びｂ）本明細書に記載のＰＩ３Ｋ阻害剤の治療有効量及びＢＴＫ阻害剤の治療有効量をヒトに投与することを含む方法が提供される。
【００９４】
一部の例によれば、ＢＴＫ療法は、唯一の活性剤がＢＴＫ阻害剤である療法である。例として、ＢＴＫ阻害剤としては、これらに限定されるものではないが、化合物Ｂ、イブルチニブ（別名１−［（３Ｒ）−３−［４−アミノ−３−（４−フェノキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル］ピペリジン−１−イル］プロプ−２−エン−１−オン）、及びアカラブルチニブ（acalabrutinib）（別名４−{８−アミノ−３−［（２Ｓ）−１−（２−ブチノイル）−２−ピロリジニル］イミダゾ［１，５−ａ］ピラジン−１−イル}−Ｎ−（２−ピリジニル）ベンズアミド）が挙げられる。一部の例によれば、ＰＩ３Ｋ療法は、唯一の活性剤がＰＩ３Ｋ阻害剤である療法である。例として、ＰＩ３Ｋ阻害剤としては、これらに限定されるものではないが、化合物Ａ（別名イデラリシブ、イデラリシブ、又はＩＤＥＬＡ、又は２−（１−（（９Ｈ−プリン−６−イル）アミノ）プロピル）−５−フルオロ−３−フェニルキナゾリン−４（３Ｈ）−オン）、ドゥベリシブ（duvelisib）（別名８−クロロ−２−フェニル−３−［（１Ｓ）−１−（３Ｈ−プリン−６−イルアミノ）エチル］−１（２Ｈ）−イソキノリノン）、ＴＧＲ１２０２、及びアルペリシブ（alpelisib）（別名ＢＹＬ７１９）が挙げられる。
【００９５】
別の側面によれば、本明細書では、共存症を伴うヒトのＢ細胞悪性腫瘍を治療する方法であって、ここで上記治療が共存症の治療にも有効である方法が提供される。Ｂ細胞悪性腫瘍の「共存症」（comorbidity）とは、Ｂ細胞悪性腫瘍と同時に起こる疾患である。
【００９６】
別の側面によれば、本明細書では、それを必要とするヒトにおいて癌を治療する方法であって、治療有効量の化合物Ａ又は医薬的に許容可能なその塩、及び、治療有効量の化合物Ｂ又は医薬的に許容可能なその塩を、ヒトに対して投与することを含む方法が提供される。一部の態様によれば、癌は、膵臓癌、泌尿器癌、膀胱癌、大腸癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌、腎臓癌、肝細胞癌、甲状腺癌、胆嚢癌、肺癌（例えば非小細胞肺癌、小細胞肺癌等）、卵巣癌、子宮頸癌、胃癌、子宮内膜癌、食道癌、頭頸部癌、メラノーマ、神経内分泌癌、ＣＮＳ癌、脳腫瘍（例えばグリオーマ、未分化希突起グリオーマ、成人多形成グリア芽細胞腫、及び成人未分化星細胞腫）、骨肉腫、軟組織肉腫、網膜芽細胞腫、神経芽細胞腫、腹水、悪性胸水、中皮腫、ウィルムス腫瘍、栄養膜新生物、血管周囲細胞腫、カポジ肉腫、粘液様癌腫、円形細胞癌腫、扁平上皮細胞癌腫、食道扁平上皮細胞癌腫、経口癌腫、副腎皮質の癌、又はＡＣＴＨ産生腫瘍が挙げられる。一例によれば、癌は膵臓癌である。
【００９７】
治療有効量
一部の例によれば、治療有効量とは、以下に定義する治療を必要とする対象（例えばヒト）に投与した場合に、斯かる治療を有効とせしめるのに十分な量を意味する。治療有効量は、治療される対象及び病態、対象の体重及び年齢、病態の重症度、投与形式等によってことなるが、当業者であれば容易に決定することが可能である。例えば、ある例によれば、化合物Ａ又は医薬的に許容可能なその塩の治療有効量は、ＰＩ３Ｋ発現を調節し、これにより適応症を患うヒトを治療し、又は適応症の既存の症状を緩和又は軽減するのに十分な量である。一例によれば、化合物Ｂ又は医薬的に許容可能なその塩の治療有効量は、ＢＴＫ活性を調節し、これにより適応症を患うヒトを治療し、又は適応症の既存の症状を緩和又は軽減するのに十分な量である。
【００９８】
別の例によれば、ＰＩ３Ｋ阻害剤、例えば化合物Ａ又は医薬的に許容可能なその塩の治療有効量は、ＰＩ３Ｋ活性の阻害に応じて、疾患又は病態の症状を低減するのに十分な量である。別の例によれば、ＢＴＫ阻害剤、例えば化合物Ｂ又は医薬的に許容可能なその塩の治療有効量は、ＢＴＫ活性の阻害に応じて、疾患又は病態の症状を低減するのに十分な量である。
【００９９】
ある例によれば、ＰＩ３Ｋ阻害剤及びＢＴＫ阻害剤の治療有効量を、それを必要とするヒトに投与することにより：
（ｉ）ヒトに投与した場合に、少なくとも１つの有害事象の頻度及び／又は重症度が低減され；又は、
（ii）ヒトに投与した場合に、少なくとも１つの有害事象の頻度及び／又は重症度の上昇が殆ど又は全く生じず；又は、
（ｉ）及び（ii）の組合せが達成される。
【０１００】
一部の例によれば、有害事象として、下痢、大腸炎、アミノ基転移酵素の上昇、発疹、及び肺炎が挙げられる。
【０１０１】
一部の例によれば、ＰＩ３Ｋ阻害剤、例えば化合物Ａ又は医薬的に許容可能なその塩は、ヒトに対して、１５０ｍｇ未満、又は１５０ｍｇ未満；又は４０ｍｇ〜１５０ｍｇ、５０ｍｇ〜１５０ｍｇ、５０ｍｇ〜１００ｍｇ、又は５０ｍｇ〜７５ｍｇ；又は約５０ｍｇ、約５５ｍｇ、約６０ｍｇ、約６５ｍｇ、約７０ｍｇ、約７５ｍｇ、約８０ｍｇ、約８５ｍｇ、約９０ｍｇ、約９５ｍｇ、約１００ｍｇ、約１０５ｍｇ、約１１０ｍｇ、約１１５ｍｇ、約１２０ｍｇ、約１２５ｍｇ、約１３０ｍｇ、約１３５ｍｇ、約１４０ｍｇ、約１４５ｍｇ、又は約１５０ｍｇの用量で投与される。
【０１０２】
例えば、ある例によれば、ＰＩ３Ｋ阻害剤、例えば化合物Ａ又は医薬的に許容可能なその塩が、１５０ｍｇ未満の用量で投与され、且つ、斯かる用量においてＢＴＫ阻害剤との組合せで投与された場合に、ＰＩ３Ｋ及びＢＴＫ阻害剤の組合せが当該ヒトに投与された場合の少なくとも１つの有害事象の頻度及び／又は重症度を（ｉ）低減し、及び／又は、（ii）その増加が殆ど又は全く生じないようにすることができる。ある例によれば、ＰＩ３Ｋ及びＢＴＫ阻害剤の組合せの投与により、ＰＩ３Ｋ阻害剤、例えば化合物Ａ又は医薬的に許容可能なその塩を、単独で１５０ｍｇの用量で投与した場合と比較して、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療に対し少なくとも同等の有効性（例えば抗増殖活性、無憎悪生存、完全奏効率等）が発揮される。
【０１０３】
別の例によれば、ＰＩ３Ｋ阻害剤、例えば化合物Ａ又は医薬的に許容可能なその塩が、１５０ｍｇ以下の用量で投与され、且つ、斯かる用量においてＢＴＫ阻害剤との組合せで投与された場合に、ＰＩ３Ｋ及びＢＴＫ阻害剤の組合せが当該ヒトに投与された場合の少なくとも１つの有害事象の頻度及び／又は重症度を（ｉ）低減し、及び／又は、（ii）その増加が殆ど又は全く生じないようにすることができる。ある例によれば、ＰＩ３Ｋ及びＢＴＫ阻害剤の組合せの投与により、ＰＩ３Ｋ阻害剤、例えば化合物Ａ又は医薬的に許容可能なその塩を、単独で１５０ｍｇの用量で投与した場合と比較して、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療に対し少なくとも同等の有効性（例えばヒトにおける抗増殖活性等）が発揮される。
【０１０４】
一部の例によれば、ＢＴＫ阻害剤、例えば化合物Ｂ又は医薬的に許容可能なその塩は、ヒトに対して、１ｍｇ〜６００ｍｇ、４０ｍｇ〜６００ｍｇ、１ｍｇ〜２５０ｍｇ、１ｍｇ〜２００ｍｇ、１ｍｇ〜１７５ｍｇ、１ｍｇ〜１６０ｍｇ、１ｍｇ〜１００ｍｇ、５ｍｇ〜５０ｍｇ、又は５ｍｇ〜３０ｍｇ；又は約１０ｍｇ、約１５ｍｇ、約２０ｍｇ、約２５ｍｇ、約３０ｍｇ、約３５ｍｇ、約４０ｍｇ、約４５ｍｇ、約５０ｍｇ、約５５ｍｇ、約６０ｍｇ、約６５ｍｇ、約７０ｍｇ、約７５ｍｇ、約８０ｍｇ、約８５ｍｇ、約９０ｍｇ、約９５ｍｇ、約１００ｍｇ、約１０５ｍｇ、約１１０ｍｇ、約１１５ｍｇ、約１２０ｍｇ、約１２５ｍｇ、約１３０ｍｇ、約１３５ｍｇ、約１４０ｍｇ、又は約１４５ｍｇの用量で投与される。
【０１０５】
ある例によれば、ＢＴＫ阻害剤、例えば化合物Ｂ又は医薬的に許容可能なその塩は、ヒトに対して、４０ｍｇ〜１２００ｍｇの用量で、４０ｍｇ〜８００ｍｇ、４０ｍｇ〜６００ｍｇ、４０ｍｇ〜４００ｍｇ、約４０ｍｇ、約１００ｍｇ、約２００ｍｇ、約３００ｍｇ、約４００ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、又は約８００ｍｇの用量で投与される。
【０１０６】
治療有効量のＰＩ３Ｋ及びＢＴＫ阻害剤は、所望の治療目標を達成する量を単回用量として供してもよく、複数回用量として供してもよい。本明細書で使用する場合、「用量」（dose）とは、ヒトが各投与時点で摂取すべき活性成分の合計量を指す。例えば上述の経口投与等で投与される用量は、毎日一回（ＱＤ）、毎日二回（ＢＩＤ）、毎日三回、毎日四回、又は毎日五回以上投与することができる。一部の態様によれば、ＰＩ３Ｋ及び／又はＢＴＫ阻害剤は、毎日一回投与することができる。一部の態様によれば、ＰＩ３Ｋ及び／又はＢＴＫ阻害剤は、毎日二回投与することができる。更に別の態様によれば、ＰＩ３Ｋ及び／又はＢＴＫ阻害剤は、毎週一回投与することができる。
【０１０７】
一例によれば、ＰＩ３Ｋ阻害剤、例えば化合物Ａ又は医薬的に許容可能なその塩は、ヒトに対して５０ｍｇの用量で毎日二回投与される。別の変形例によれば、ＰＩ３Ｋ阻害剤、例えば化合物Ａ又は医薬的に許容可能なその塩は、ヒトに対して１００ｍｇの用量で毎日一回投与される。
【０１０８】
別の例によれば、ＢＴＫ阻害剤、例えば化合物Ｂ又は医薬的に許容可能なその塩は、ヒトに対して４０ｍｇ〜１５０ｍｇ、又は約２０ｍｇ、約４０ｍｇ、又は約７５ｍｇの用量で、毎日二回投与される。更に別の変形例によれば、ＢＴＫ阻害剤、例えば化合物Ｂ又は医薬的に許容可能なその塩は、ヒトに対して４０ｍｇ〜８０ｍｇの用量で毎日一回投与される。
【０１０９】
例えば、ある例によれば、ＰＩ３Ｋ阻害剤、例えば化合物Ａ又は医薬的に許容可能なその塩は、ヒトに対して約５０ｍｇの用量で毎日二回投与され、ＢＴＫ阻害剤、例えば化合物Ｂ又は医薬的に許容可能なその塩は、ヒトに対して２０ｍｇ〜１５０ｍｇ、又は約２０ｍｇ、又は約４０ｍｇ、又は約８０ｍｇ、又は約１５０ｍｇの用量で、毎日一回投与される。他の例によれば、ＰＩ３Ｋ阻害剤、例えば化合物Ａ又は医薬的に許容可能なその塩は、ヒトに対して約５０ｍｇの用量で毎日二回投与され、ＢＴＫ阻害剤、例えば化合物Ｂ又は医薬的に許容可能なその塩は、ヒトに対して２０ｍｇ〜７５ｍｇ、又は約２０ｍｇ、又は約４０ｍｇ、又は約７５ｍｇの用量で、毎日二回投与される。
【０１１０】
他の特定の例によれば、ＰＩ３Ｋ阻害剤、例えば化合物Ａ又は医薬的に許容可能なその塩は、ヒトに対して約１００ｍｇの用量で毎日二回投与され、ＢＴＫ阻害剤、例えば化合物Ｂ又は医薬的に許容可能なその塩は、ヒトに対して２０ｍｇ〜１５０ｍｇ、又は約２０ｍｇ、又は約４０ｍｇ、又は約８０ｍｇ、又は約１５０ｍｇの用量で、毎日一回投与される。他の例によれば、ＰＩ３Ｋ阻害剤、例えば化合物Ａ又は医薬的に許容可能なその塩は、ヒトに対して約１００ｍｇの用量で毎日二回投与され、ＢＴＫ阻害剤、例えば化合物Ｂ又は医薬的に許容可能なその塩は、ヒトに対して２０ｍｇ〜７５ｍｇ、又は約２０ｍｇ、又は約４０ｍｇ、又は約７５ｍｇの用量で、毎日二回投与される。
【０１１１】
ある例によれば、ＢＴＫ阻害剤の投薬に先立って、ＰＩ３Ｋ阻害剤の投薬を行う。例えば、ある特定の例によれば、ＰＩ３Ｋ阻害剤５０ｍｇ〜１５０ｍｇを毎日二回、所定の期間に亘って投薬した後で、ＢＴＫ阻害剤との同時投与を行う。ある例によれば、ＢＴＫ阻害剤との同時投与に先立ち、ＰＩ３Ｋ阻害剤を最長約１２週間に亘って投薬する。ある例によれば、ＢＴＫ阻害剤との同時投与に先立ち、ＰＩ３Ｋ阻害剤を約１〜１２週、４〜１２週、６〜１２週、８〜１２週、１０〜１２週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週、１１週、又は１２週の期間に亘って投薬する。ある特定の例によれば、ＢＴＫ阻害剤との同時投与に先立ち、ＰＩ３Ｋ阻害剤を約４〜１２週又は約６〜１２週の期間に亘って投薬する。ある例によれば、ＰＩ３Ｋ阻害剤５０ｍｇ〜１５０ｍｇを毎日二回、所定の期間に亘って投薬した後で、ＢＴＫ阻害剤との同時投与を行う。ここで、ＢＴＫ阻害剤は４０ｍｇ〜１２００ｍｇ、４０ｍｇ〜８００ｍｇ、４０ｍｇ〜６００ｍｇ、４０ｍｇ〜４００ｍｇ、約４０ｍｇ、約１００ｍｇ、約２００ｍｇ、約３００ｍｇ、約４００ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、又は約８００ｍｇの用量で投与される。
【０１１２】
ある例によれば、ＰＩ３Ｋ阻害剤の投薬に先立って、ＢＴＫ阻害剤の投薬を行う。例えば、ある特定の例によれば、ＢＴＫ阻害剤を毎日又は毎週４０ｍｇ〜１２００ｍｇ、４０ｍｇ〜８００ｍｇ、４０ｍｇ〜６００ｍｇ、４０ｍｇ〜４００ｍｇ、約４０ｍｇ、約１００ｍｇ、約２００ｍｇ、約３００ｍｇ、約４００ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、又は約８００ｍｇの用量で、所定の期間に亘って投薬した後で、ＰＩ３Ｋ阻害剤との同時投与を行う。ある例によれば、ＰＩ３Ｋ阻害剤との同時投与に先立ち、ＢＴＫ阻害剤を最長約１２週間に亘って投薬する。ある例によれば、ＰＩ３Ｋ阻害剤との同時投与に先立ち、ＢＴＫ阻害剤を約１〜１２週、４〜１２週、６〜１２週、８〜１２週、１０〜１２週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週、１１週又は１２週の期間に亘って投薬する。ある特定の例によれば、ＰＩ３Ｋ阻害剤との同時投与に先立ち、ＢＴＫ阻害剤を約４〜１２週又は約６〜１２週の期間に亘って投薬する。ある例によれば、ＢＴＫ阻害剤を毎日又は毎週４０ｍｇ〜１２００ｍｇ、４０ｍｇ〜８００ｍｇ、４０ｍｇ〜６００ｍｇ、４０ｍｇ〜４００ｍｇ、約４０ｍｇ、約１００ｍｇ、約２００ｍｇ、約３００ｍｇ、約４００ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、又は約８００ｍｇの用量で、所定の期間に亘って投薬した後で、ＰＩ３Ｋ阻害剤との同時投与を行う。ここで、ＰＩ３Ｋ阻害剤は５０ｍｇ〜１５０ｍｇの用量で毎日二回投与される。
【０１１３】
一部の例によれば、例えば化合物Ａ又は医薬的に許容可能なその塩と、化合物Ｂ又は医薬的に許容可能なその塩との組合せにより、同用量を単剤投与した場合と比較して、各化合物の治療有効量が低減される。
【０１１４】
ある側面によれば、ＰＩ３Ｋ阻害剤、例えば化合物Ａと、ＢＴＫ阻害剤、例えば化合物Ｂとの投与の組合せによって、各薬物をより低い用量で投与することができ、惹いては各薬物の毒性を低減することができる。ある例によれば、斯かる組合せにより、単剤投与と比較してより低い用量での投与が可能となる。例えば、ＰＩ３Ｋ阻害剤、例えば化合物Ａと、ＢＴＫ阻害剤、例えば化合物Ｂとを、毎日又は毎週１ｍｇ〜２０００ｍｇ、５ｍｇ〜２０００ｍｇ、１０ｍｇ〜２０００ｍｇ、２０ｍｇ〜２０００ｍｇ、３０ｍｇ〜２０００ｍｇ、４０ｍｇ〜２０００ｍｇ、４０ｍｇ〜１２００ｍｇ、４０ｍｇ〜８００ｍｇ、４０ｍｇ〜６００ｍｇ、４０ｍｇ〜４００ｍｇ、例えば約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約１０ｍｇ、約２０ｍｇ、約３０ｍｇ、約４０ｍｇ、約１００ｍｇ、約２００ｍｇ、約３００ｍｇ、約４００ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、又は約８００ｍｇの用量で、所定の期間に亘って投与する。本明細書において提供されるある側面によれば、組合せ治療におけるＰＩ３Ｋ阻害剤（例えばイデラリシブ）及びＢＴＫ阻害剤（例えば化合物Ｂ）の各々は、単剤治療におけるＰＩ３Ｋ阻害剤又はＢＴＫ阻害剤の各々と比べて、より低い用量で投与することができる。
【０１１５】
投与
ＰＩ３Ｋ阻害剤、例えば化合物Ａ又は医薬的に許容可能なその塩と、ＢＴＫ阻害剤、例えば化合物Ｂ又は医薬的に許容可能なその塩とは、本技術分野で公知の任意の適切な方法を用いて投与することができる。例えば、これらの化合物は、口腔内、眼内、経口、浸透圧、非経口（筋肉内、腹腔内、胸骨内、静脈内、皮下）、直腸内、局所、経皮、又は膣内の経路により投与することができる。一例によれば、ＰＩ３Ｋ阻害剤及びＢＴＫ阻害剤は各々経口投与される。
【０１１６】
更に、ある例によれば、本明細書に記載のＰＩ３Ｋ阻害剤、例えば化合物Ａ又は医薬的に許容可能なその塩の投与は、ＢＴＫ阻害剤、例えば化合物Ｂ又は医薬的に許容可能なその塩の投与に対して、先に行ってもよく、後に行ってもよく、同時に行ってもよい。更に、ある例によれば、本明細書に記載のＢＴＫ阻害剤、例えば化合物Ｂ又は医薬的に許容可能なその塩の投与は、ＰＩ３Ｋ阻害剤、例えば化合物Ａ又は医薬的に許容可能なその塩の投与に対して、先に行ってもよく、後に行ってもよく、同時に行ってもよい。
【０１１７】
医薬組成物
ＰＩ３Ｋ及びＢＴＫ阻害剤は、医薬組成物の形態で投与することができる。例えば、ある例によれば、本明細書に記載のＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＰＩ３Ｋ阻害剤と少なくとも１つの医薬的に許容可能なビヒクルとを含む医薬組成物中に存在するものであってもよい。一部の例によれば、本明細書に記載のＢＴＫ阻害剤は、ＢＴＫ阻害剤と少なくとも１つの医薬的に許容可能なビヒクルとを含む医薬組成物中に存在するものであってもよい。医薬的に許容可能なビヒクルとしては、例えば医薬的に許容可能な担体、アジュバント、及び／又は、賦形剤が挙げられるが、他の成分であっても、製剤中の他の成分と適合すると共に、需要者に対して有害なものでない限り、医薬的に許容可能であると見做される。
【０１１８】
従って、本明細書では、本明細書に記載のＰＩ３Ｋ及びＢＴＫ阻害剤と、１又は２以上の医薬的に許容可能なビヒクル、例えば賦形剤、担体、例えば不活性の固体希釈材及び充填材、希釈媒、例えば無菌水性溶液及び種々の有機溶媒、透過促進剤、溶解剤及びアジュバント等を含む医薬組成物が提供される。斯かる医薬組成物は単独で投与してもよく、他の治療剤と組合せて投与してもよい。斯かる組成物は、医薬分野で周知の手法により調製することができる（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Co., Philadelphia, PA 17th Ed. (1985)；及びModern Pharmaceutics, Marcel Dekker, Inc. 3rd Ed. (G.S. Banker & C.T. Rhodes, Eds.)等を参照）。
【０１１９】
本医薬組成物は単回用量又は複数回用量の何れで投与してもよく、同様の有用性を有する剤について認められている投与形態の何れにより、例えば直腸内、口腔内、鼻腔内、及び経皮経路により、動脈内注入により、静脈内、腹腔内、非経口、筋肉内、皮下、経口、局所投与により、吸入剤として、又は含浸又は被覆デバイス、例えばステント、又は動脈内挿入シリンダー状ポリマー等により投与してもよい。特定の態様によれば、医薬組成物は単回用量又は複数回用量として経口投与される。
【０１２０】
一部の態様によれば、本明細書に記載の医薬組成物は、単位投与形態として処方される。「単位投与形態」（unit dosage form）とは、ヒト対象への単回投与に適した物理的に分離した単位であって、各単位が、所望の治療効果を発揮するべく計算された所定量の活性成分を、適切な医薬賦形剤との組合せで含むものをいう。一部の例によれば、本明細書に記載の医薬組成物は、錠剤、カプセル、又はアンプルの形態である。
【０１２１】
特定の態様によれば、本明細書に記載のＰＩ３Ｋ阻害剤、例えば化合物Ａ又は医薬的に許容可能なその塩は、錠剤として処方される。特定の態様によれば、本明細書に記載のＢＴＫ阻害剤、例えば化合物Ｂ又は医薬的に許容可能なその塩も、錠剤として処方される。一部の変形例によれば、化合物Ａ又は医薬的に許容可能なその塩と、化合物Ｂ又は医薬的に許容可能なその塩とが、個別の錠剤として処方される。他の変形例によれば、化合物Ａ又は医薬的に許容可能なその塩と、化合物Ｂ又は医薬的に許容可能なその塩とが、単一の錠剤として処方される。
【０１２２】
追加の治療剤
本明細書において、ある側面によれば、本明細書に記載の組合せ（例えばＰＩ３Ｋ阻害剤とＢＴＫ阻害剤との組合せ）は、化学療法剤、免疫療法剤、放射線療法剤、抗新生物剤、抗癌剤、抗増殖剤、抗線維化剤、抗血管新生剤、治療用抗体、又はこれらの任意の組合せと使用し、或いはこれらと組合せてもよい。
【０１２３】
化学療法剤はその作用機序に基づき、例えば以下の群に分類される：代謝拮抗剤／抗癌剤、例えばピリミジン類似物（フロクスリジン（フロクスウリジン）、カペシタビン、及びシタラビン）；プリン類似物、葉酸アンタゴニスト及び関連阻害性抗増殖剤／抗有糸分裂剤、例えば天然産物、例えばビンカ・アルカロイド（ビンブラスチン、ビンクリスチン）及び微小管、例えばタキサン（パクリタキセル、ドセタキセル）、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポチロン及びナベルビン、エピジポドフィロトキシン（epidipodophyllotoxin）（エトポシド、テニポシド）；ＤＮＡ損傷剤（アクチノマイシン、アムサクリン、ブスルファン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド（シトキサン）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イホスファミド、メルファラン、メクロレタミン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソ尿素、プロカルバジン、タキソール、タキソテール、テニポシド、エトポシド、トリエチレンチオリン酸アミド）；抗生物質、例えばダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、アントラサイクリン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）及びマイトマイシン；酵素（Ｌ−アスパラギナーゼ：全身にてＬ−アスパラギンを代謝し、自らアスパラギンを合成する能力を有さない細胞を死滅させる）；抗血小板剤；抗増殖／抗有糸分裂性アルキル化剤、例えば窒素マスタード、シクロホスファミド及び類似物、メルファラン、クロラムブシル）、及び（ヘキサメチルメラミン及びチオテパ）、アルキルニトロソ尿素（ＢＣＮＵ）及び類似物、ストレプトゾシン）、トリアゼン−ダカルバジン（ＤＴＩＣ）；抗増殖／抗有糸分裂性代謝拮抗剤、例えば葉酸類似物（メトトレキサート）；白金配位錯体（シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン）、プロカルバジン、ヒドロキシ尿素、ミトテン、アミノグルテチミド；ホルモン、ホルモン類似物（エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド）及びアロマターゼ阻害剤（レトロゾール、アナストロゾール）；抗凝血剤（ヘパリン、合成ヘパリン塩及び他のトロンビンの阻害剤）；線維素溶解剤（例えば組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼ及びウロキナーゼ）、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル；抗遊走剤；抗分泌剤（ブレフェルジン（breveldin））；免疫阻害剤、タクロリムス、シロリムス、アザチオプリン、ミコフェノール酸；化合物（ＴＮＰ−４７０、ゲニステイン）及び成長因子阻害剤（血管内皮成長因子阻害剤、線維芽細胞成長因子阻害剤）；アンジオテンシン受容体遮断薬、酸化窒素供与体；アンチセンスオリゴヌクレオチド；抗体（トラスツズマブ、リツキシマブ）；細胞周期阻害剤及び分化誘導剤（トレチノイン）；阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤（ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ゲニポシド（eniposide）、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イリノテカン及びミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン）、コルチコステロイド（コルチ���ン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン（methylpednisolone）、プレドニゾン、及びプレドニゾロン）；成長因子シグナル伝達キナーゼ阻害剤；機能不全誘導剤、毒素、例えばコレラ毒素、リシン、緑膿菌外毒素、百日咳菌アデニル酸シクラーゼ毒素、又はジフテリア毒素、及びカスパーゼ活性化因子；及びクロマチンが挙げられる。
【０１２４】
本明細書で使用する場合、「化学療法剤」（chemotherapeutic agent, chemotherapeutic）（又は化学療法剤で治療する場合の「化学療法」（chemotherapy））という語は、癌の治療に有用な任意の非タンパク質性（即ち非ペプチド性）化合物を包含する意である。化学療法剤の例として、アルキル化剤、例えばチオテパ及びシクロホスファミド（CYTOXAN（登録商標））；アルキルスルホン酸、例えばブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン；アジリジン、例えばベンゾドパ（benzodopa）、カルボクオン（carboquone）、メツレドパ（meturedopa）、及びウレドパ（uredopa）；エミレルミン（emylerumines）及びメミラメラミン（memylamelamine）、例えばアルトレタミン（alfretamine）、トリエチレンメラミン（triemylenemelamine）、トリエチレンリン酸アミド、トリエチレンチオリン酸アミド及びトリメチロールメラミン（trimemylolomelamine）；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；カンプトセシン（合成類似物トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン（callystatin）；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼルシン及びビゼレシン合成類似物を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似物ＫＷ−２１８９及びＣＢＩ−ＴＭＩを含む）；エリュテロビン；パンクラスタチン；サルコディクチン（sarcodictyin）；スポンジスタチン；窒素マスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、シクロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミン酸化物、メルファラン、ノベンビシン（novembichin）、フェネステリン（phenesterine）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソ尿素、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えばエンジイン抗生物質（例えばカリケアミシン、特にカリケアミシンγII及びカリケアミシンφI１、例えばAgnew, Chem. Intl. Ed. Engl, ３３：１８３−１８６ （１９９４）；ダイネミシン（dynemicin）、例えばダイネミシン（dynemicin）Ａ；ビスホスホネート、例えばクロドロン酸（clodronate）；エスペラミシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン（authramycin）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（carabicin）、カルミノマイシン（carrninomycin）、カルジノフィリン（carzinophilin）、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（detorubicin）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（Adramycin）（登録商標）（例えばモルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシン）、エピルビシン、エソルビシン（esorubicin）、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンＣ、マイコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ぺプロマイシン、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、ケラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジ���（tubercidin）、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗剤、例えばメトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似物、例えばデモプテリン（demopterin）、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリン類似物、例えばフルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似物、例えばアンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスリジン（フロクスウリジン）；アンドロゲン、例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎剤（antiadrenal）、例えばアミノグルテチミド、ミトテン、トリロスタン；葉酸補給剤、例えばフォリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルラシル（eniluracil）；アムサクリン；ヘストラブシル（hestrabucil）；ビスアントレン；エダトレキサート（edatraxate）；デフォファミン（defofamine）；デメコルシン；ジアジクオン；エルホルムチン（elformthine）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロイコボリン；ロニダミン；メイタンシノイド、例えばメイタンシン及びアンサマイトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；フルオロピリミジン；フォリン酸；ポドフィリン酸（podophyllinic acid）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２',２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテシン（特にＴ−２毒素、ベラクリンＡ（verracurin A）、ロリジンＡ（roridin A）及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（gacytosine）；アラビノシド（"Ara-C"）；シクロホスファミド；チオテパ（thiopeta）；タキサン系薬（taxoids）、例えばパクリタキセル（TAXOL（登録商標）、Bristol Meyers Squibb Oncology, Princeton, N.J.）及びドセタキセル（TAXOTERE（登録商標）、Rhone−Poulenc Rorer, Antony, France）；クロラムブシル；ゲムシタビン（Gemzar（登録商標））；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似物、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（VP−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン（Navelbine（登録商標））；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えばレチノイン酸；カペシタビン；ＦＯＬＦＩＲＩ（フルオロウラシル、ロイコボリン、及びイリノテカン）、並びに上記の何れかの医薬的に許容可能な塩、酸、又は誘導体が挙げられる。
【０１２５】
更に「化学療法剤」の定義に入るものとしては、腫瘍に対するホルモンの作用を制御又は阻害する作用を有する抗ホルモン剤、例えば抗エストロゲン剤及び選択的エストロゲン 受容体モジュレーター（selective estrogen receptor modulator：ＳＥＲＭ）、例えばタモキシフェン（例えばNolvadex（登録商標））、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びトレミフェン（Fareston （登録商標））；副腎でのエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼ阻害剤、例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール（Megace（登録商標））、エキセメスタン、フォルメスタン、ファドロゾール、ボロゾール（Rivisor（登録商標））、レトロゾール（Femara（登録商標））、及びアナストロゾール（Arimidex（登録商標））；及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリド（leuprohde）、及びゴセレリン；並びに上記の何れかの医薬的に許容可能な塩、酸、又は誘導体が挙げられる。
【０１２６】
抗血管新生剤としては、これらに限定されるものではないが、レチノイド酸及びその誘導体、２−メトキシエストラジオール、アンジオスタチン（ANGIOSTATIN）（登録商標）、エンドスタチン（ENDOSTATIN）（登録商標）、スラミン、スクアラミン、メタロプロテアーゼ−１の組織阻害剤、メタロプロテアーゼ−２の組織阻害剤、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−２、軟骨由来阻害剤、パクリタキセル（nab−パクリタキセル）、血小板因子４、硫酸プロタミン（クルペイン）、硫酸化キチン誘導体（ズワイガニの殻から調製される）、硫酸化多糖類ペプチドグリカン複合体（sp−pg）、スタウロスポリン、基質代謝のモジュレーター、例えばプロリン類似物（（１−アゼチジン−２−カルボン酸（ＬＡＣＡ）、シスヒドロキシプロリン、ｄ，Ｉ−３，４−デヒドロプロリン、チアプロリン、α−ジピリジル、フマル酸β−アミノプロピオニトリル、４−プロピル−５−（４−ピリジニル）−２（３Ｈ）−オキサゾロン；メトトレキサート、ミトキサントロン、ヘパリン、インターフェロン、２マクログロブリン−血清、ｃｈｉｍｐ−３、キモスタチン、β−シクロデキストリンテトラデカスルフェート、エポネマイシン（eponemycin）；フマギリン、金チオリンゴ酸ナトリウム、ｄ−ペニシラミン（ＣＤＰＴ）、β−１−抗コラゲナーゼ−血清、α−２−抗プラスミン、ビスアントレン、ロベンザリット二ナトリウム、n−２−カルボキシフェニル−４−クロロアントラニル酸二ナトリウム又は「ＣＣＡ」、サリドマイド；アンジオスタチン系ステロイド、カルボキシアミノイミダゾール；メタロプロテアーゼ阻害剤、例えばＢＢ９４等が挙げられる。他の抗血管新生剤としては、以下の血管新生成長因子：β−ＦＧＦ、α−ＦＧＦ、ＦＧＦ−５、ＶＥＧＦアイソフォーム、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＨＧＦ／ＳＦ及びＡｎｇ−１／Ａｎｇ−２等に対する抗体、好ましくはモノクローナル抗体が挙げられる。Ferrara N. and Alitalo, K. "Clinical application of angiogenic growth factors and their inhibitors" (1999) Nature Medicine 5:1359-1364を参照。
【０１２７】
抗線維化剤としては、これらに限定されるものではないが、例えばβ−アミノプロプリオニトリル（ＢＡＰＮ）等の化合物、並びに、リシルオキシダーゼの阻害剤、及び、そのコラーゲンの異常沈着に関連する疾患及び病態の治療におけるその使用に関する、米国特許第４，９６５，２８８号明細書（Palfreyman等、１９９０年１０月２３日発行、発明の名称「リシルオキシダーゼの阻害剤」）に開示の化合物；米国特許第４，９９７，８５４号明細書（Kagan等、１９９１年３月５日発行、発明の名称「抗線維化剤、及び、隣接して位置するジアミン類似基質を用いてリシルオキシダーゼの活性をインサイチュ（in situ）で阻害する方法」）に開示の、種々の病理学的線維化状態の治療のためにＬＯＸを阻害する化合物等が挙げられる。これらの文献は、引用により本明細書に組み込まれる。更なる阻害剤の例は、米国特許第４，９４３，５９３号明細書（Palfreyman等、１９９０年７月２４日発行、発明の名称「リシルオキシダーゼの阻害剤」）に記載の化合物、例えば２−イソブチル−３−フルオロ−、クロロ−、又はブロモ−アリルアミン等；並びに、米国特許第５，０２１，４５６号明細書；米国特許第５，５０５９，７１４号明細書；米国特許第５，１２０，７６４号明細書；米国特許第５，１８２，２９７号明細書；米国特許第５，２５２，６０８号明細書（２−（１−ナフチルオキシメチル）−３−フルオロアリルアミンに関する）；及び米国特許出願公開第２００４／０２４８８７１号明細書等に記載されている。コレラの文献は引用により本明細書に組み込まれる。抗線維化剤の例としては、他にもリシルオキシダーゼの活性部位のカルボニル基と反応する一級アミンや、更に具体的には、カルボニルとの結合後に共鳴により安定化する生成物を形成するもの、例えば以下の一級アミン：エチレンジアミン、ヒドラジン、フェニルヒドラジン、及びそれらの誘導体、セミカルバジド、及び尿素誘導体、アミノニトリル、例えばβ−アミノプロピオニトリル（ＢＡＰＮ）、又は２−ニトロエチルアミン、不飽和の又は飽和のハロアミン、例えば２−ブロモ−エチルアミン、２−クロロエチルアミン、２−トリフルオロエチルアミン、３−ブロモプロピルアミン、ｐ−ハロベンジルアミン、セレノホモシステインラクトン等が挙げられる。また、抗線維化剤としては、細胞浸透性又は非浸透性の銅キレート剤等が挙げられる。化合物の例としては、リシルオキシダーゼによるリシル及びヒドロキシリシル残基の酸化的脱アミノ化に由来するアルデヒド誘導体を遮断する間接的阻害剤等の化合物、例えばチオールアミン、特にＤ−ペニシラミン又はその類似物、例えば２−アミノ−５−メルカプト−５−メチルヘキサン酸、Ｄ−２−アミノ−３−メチル−３−（（２−アセトアミドエチル）ジチオ）ブタン酸、ｐ−２−アミノ−３−メチル−３−（（２−アミノエチル）ジチオ）ブタン酸、ナトリウム−４−（（ｐ−１−ジメチル−２−アミノ−２−カルボキシエチル）ジチオ）ブタンスルフレート、２−アセトアミドエチル−２−アセトアミドエタンチオールスルファネート、ナトリウム−４−メルカプトブタンスルフィネート三水和物等が挙げられる。
【０１２８】
免疫療法剤としては、これらに限られるものではないが、患者の治療に適している治療抗体；例えばアバゴボマブ、アデカツムマブ、アフツズマブ、アレムツズマブ、アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブ、アルシツモマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ、カンツズマブ、カツマクソマブ、セツキシマブ、シタツズマブ、シクスツムマブ、クリバツズマブ、コナツムマブ、ダラツムマブ、ドロジツマブ、ヂュリゴツマブ（duligotumab）、デュシギツマブ（dusigitumab）、デツモマブ、ダセツズマブ、ダロツズマブ、エクロメキシマブ、エロツズマブ、エンシツキシマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、ファーレツズマブ、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フランボツマブ、フツキシマブ、ガニツマブ、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブ、イブリツモマブ、イゴボマブ、イムガツズマブ、インダツキシマブ、イノツズマブ、インテツムマブ、イピリムマブ、イラツムマブ、ラベツズマブ、レクサツムマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブ、ルカツムマブ、マパツムマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モキセツモマブ、ナルナツマブ、ナプツモマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、ノフェツモマブ、オカラツズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オナルツズマブ、オポルツズマブ、オレゴボマブ、パニツムマブ、パルサツズマブ、パトリツマブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、ピンツモマブ、プリツムマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、サツモマブ、シブロツズマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ、ソリトマブ、タカツズマブ、タプリツモマブ、テナツモマブ、テプロツムマブ、ティガツズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ツコツズマブ、ウブリツキシマブ、ベルツズマブ、ボルセツズマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、ＣＣ４９及び３Ｆ８等が挙げられる。これらの例示された治療用抗体は、更に標識されていてもよく、放射性同位体粒子、例えばインジウムＩｎ１１１、イットリウムＹ９０、ヨウ素Ｉ１３１等と組合わされてもよい。
【０１２９】
特定の態様によれば、（例えば、本明細書に記載のＰＩ３Ｋ阻害剤及びＢＴＫ阻害剤と更に組合せて使用される）追加の治療剤は、窒素マスタードアルキル化剤である。窒素マスタードアルキル化剤の限定されない例としては、クロラムブシルが挙げられる。
【０１３０】
リンパ腫又は白血病の治療に適した化学療法剤としては、アルデスロイキン、アルボシジブ（alvocidib）、抗新生物薬ＡＳ２−１、抗新生物薬Ａ１０、抗胸腺細胞グロブリン、アミホスチン三水和物、アミノカンプトセシン、三酸化ヒ素、β−アレチン、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質阻害剤ＡＢＴ−２６３、ＡＢＴ−１９９、ＡＢＴ−７３７、ＢＭＳ−３４５５４１、ボルテゾミブ（ベルケイド（登録商標））、ブリオスタチン １、ブスルファン、カルボプラチン、キャンパス（campath）−１Ｈ、ＣＣ−５１０３、カルムスチン、カスポファンギン酢酸塩、クロファラビン、シスプラチン、クラドリビン（Leustarin）、クロラムブシル（Leukeran）、クルクミン、シクロスポリン、シクロホスファミド（Cyloxan, Endoxan, Endoxana, Cyclostin）、シタラビン、デニロイキン・ディフティトックス、デキサメタゾン、ＤＴ ＰＡＣＥ、ドセタキセル、ドラスタチン１０、ドキソルビシン（Adriamycin（登録商標）, Adriblastine）、塩酸ドキソルビシン、エンザスタウリン、エポエチンアルファ、エトポシド、エベロリムス（RAD００１）、フェンレチニド、フィルグラスチム、メルファラン、メスナ、フラボピリドール、フルダラビン（Fludara）、ゲルダナマイシン（１７−AAG）、イホスファミド、イリノテカン塩酸塩、イキサべピロン、レナリドミド（Revlimid（登録商標）, CC−５０１３）、リンホカイン−活性化キラー細胞、メルファラン、メトトレキサート、ミトキサントロン塩酸塩、モテキサフィンガドリニウム、ミコフェノール酸モフェチル、ネララビン、オブリメルセン（Genasense）、オバトクラックス（GX15-070）、オブリメルセン、オクトレオチド酢酸塩、Ω−３脂肪酸、オキサリプラチン、パクリタキセル、ＰＤ０３３２９９１、ＰＥＧ化リポソーム性ドキソルビシン塩酸塩、ペグフィルグラスチム、ペントスタチン（Nipent）、ペリフォシン、プレドニゾロン、プレドニゾン、Ｒ−ロスコビチン（roscovitine）（Selicilib、CYC202）、組換インターフェロンα、組換インターロイキン−１２、組換インターロイキン−１１、組換ｆｌｔ３リガンド、組換ヒトトロンボポエチン、リツキシマブ、サルグラモスチム、クエン酸シルデナフィル、シンバスタチン、シロリムス、スチリルスルホン、タクロリムス、タネスピマイシン、テムシロリムス（CCl−７７９）、サリドマイド、治療同種リンパ球、チオテパ、チピファルニブ、ベルケイド（登録商標）（ボルテゾミブ又はPS-341）、ビンクリスチン（Oncovin）、ビンクリスチン硫酸塩、ビノレルビン酒石酸塩、ボリノスタット（SAHA）、ボリノスタット、及びＦＲ（フルダラビン、リツキシマブ）、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾン）、ＣＶＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン及びプレドニゾン）、ＦＣＭ（フルダラビン、シクロホスファミド、ミトキサントロン）、ＦＣＲ（フルダラビン、シクロホスファミド、リツキシマブ）、ハイパーＣＶＡＤ（過分割シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、デキサメタゾン、メトトレキサート、シタラビン）、ＩＣＥ（イホスファミド、カルボプラチン及びエトポシド）、ＭＣＰ（ミトキサントロン、クロラムブシル、及びプレドニゾロン）、Ｒ−ＣＨＯＰ（リツキシマブ及びＣＨＯＰ）、Ｒ−ＣＶＰ��リツキシマブ及びＣＶＰ）、Ｒ−ＦＣＭ（リツキシマブ及びＦＣＭ）、Ｒ−ＩＣＥ（リツキシマブ−ＩＣＥ）、及びＲ−ＭＣＰ（Ｒ−ＭＣＰ）が挙げられる。
【０１３１】
イデラリシブに対して抵抗性の対象を治療する方法 
特定の側面によれば、本明細書では、イデラリシブに対して抵抗性である、又は抵抗性を発現しているヒトにおいてＢ細胞悪性腫瘍を治療する方法であって、それを必要とするヒトに対して、治療有効量のイデラリシブ及び治療有効量の更なる剤を投与することを含む方法が提供される。別の側面によれば、本明細書では、イデラリシブに対する抵抗性を遅延又は延期させるべく、ヒトにおいてＢ細胞悪性腫瘍を治療する方法であって、それを必要とするヒトに対して、治療有効量のイデラリシブ及び治療有効量の更なる剤を投与することを含む方法が提供される。
【０１３２】
上記の側面の一部の態様によれば、Ｂ細胞悪性腫瘍はびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）である。一態様によれば、Ｂ細胞悪性腫瘍は活性化Ｂ細胞様びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ）である。上記の側面及び態様の一部の変形例によれば、更なる剤はＭＫ−２２０６又はＧＳＫ−２３３４４７０である。当業者であれば認識するように、ＭＫ−２２０６はＡｋｔ阻害剤であり、ＧＳＫ−２３３４４７０はＰＤＫ１阻害剤であり、これらの構造は本技術分野において公知である。
【０１３３】
上記の側面の他の態様によれば、Ｂ細胞悪性腫瘍は濾胞性リンパ腫（ＦＬ）である。上記の態様の一部の変形例によれば、更なる剤はＢＹＬ−７１９、ダサチニブ、又はエントスプレチニブである。当業者であれば認識するように、ＢＹＬ−７１９はＰＩ３Ｋα阻害剤であり、ダサチニブはＢｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤及びＳｒｃファミリーチロシンキナーゼ阻害剤であり、エントスプレチニブはＳｙｋ阻害剤であり、何れの構造も本技術分野において公知である。
【０１３４】
製品及びキット
本明細書に記載のＰＩ３Ｋ阻害剤を含む組成物（例えば製剤及び単位投与形態が挙げられる）及び本明細書に記載のＢＴＫ阻害剤を含む組成物を調製し、適切な容器に入れ、適応対象の病態の治療用である旨を表示することができる。従って、本明細書に記載のＰＩ３Ｋ阻害剤の単位投与形態及びＢＴＫ阻害剤の単位投与形態と、これらの化合物を使用するための指示を含むラベルとを包入した容器等の製品も提供される。一部の態様によれば、当該製品は、（ｉ）本明細書に記載のＰＩ３Ｋ阻害剤と、１又は２以上の医薬的に許容可能な担体、アジュバント又は賦形剤との単位投与形態；及び（ii）本明細書に記載のＢＴＫ阻害剤と、１又は２以上の医薬的に許容可能な担体、アジュバント又は賦形剤との単位投与形態を包入した容器である。一態様によれば、ＰＩ３Ｋ阻害剤及びＢＴＫ阻害剤の各単位投与形態は、何れも錠剤である。
【０１３５】
別の側面によれば、イデラリシブの単位投与形態と、ＭＫ−２２０６、ＧＳＫ−２３３４４７０、ＢＹＬ−７１９、ダサチニブ、又はエントスプレチニブの単位投与形態と、これらの化合物を使用するための指示を含むラベルとを包入した容器等の製品も提供される。一部の態様によれば、当該製品は、（ｉ）イデラリシブと、１又は２以上の医薬的に許容可能な担体、アジュバント又は賦形剤との単位投与形態；及び（ii）ＭＫ−２２０６、ＧＳＫ−２３３４４７０、ＢＹＬ−７１９、ダサチニブ、又はエントスプレチニブと、１又は２以上の医薬的に許容可能な担体、アジュバント又は賦形剤との単位投与形態を包入した容器である。
【０１３６】
また、キットも考えられる。例えば、（ｉ）本明細書に記載のＰＩ３Ｋ阻害剤及び（ii）本明細書に記載のＢＴＫ阻害剤の単位投与形態と、これらの組成物を病状の治療に使用するための指示を含む添付文書とを備えるキットが提供される。一部の態様によれば、当該キットは、（ｉ）本明細書に記載のＰＩ３Ｋ阻害剤と、１又は２以上の医薬的に許容可能な担体、アジュバント又は賦形剤とを含む単位投与形態；及び（ii）本明細書に記載のＢＴＫ阻害剤と、１又は２以上の医薬的に許容可能な担体、アジュバント又は賦形剤との単位投与形態を備える。一態様によれば、ＰＩ３Ｋ阻害剤及びＢＴＫ阻害剤の各単位投与形態は、何れも錠剤である。
【０１３７】
別の側面によれば、（ｉ）イデラリシブ、及び、（ii）ＭＫ−２２０６、ＧＳＫ−２３３４４７０、ＢＹＬ−７１９、ダサチニブ、又はエントスプレチニブの各単位投与形態と、これらの組成物を病状の治療に使用するための指示を含む添付文書とを備えるキットが提供される。一部の態様によれば、当該キットは、（ｉ）イデラリシブと、１又は２以上の医薬的に許容可能な担体、アジュバント又は賦形剤との単位投与形態；及び（ii）ＭＫ−２２０６、ＧＳＫ−２３３４４７０、ＢＹＬ−７１９、ダサチニブ、又はエントスプレチニブと、１又は２以上の医薬的に許容可能な担体、アジュバント又は賦形剤との単位投与形態とを備える。
【０１３８】
当該キットに使用される指示は、本明細書に更に記載されるように、Ｂ細胞悪性腫瘍を治療するためのものであってもよい。
【実施例】
【０１３９】
以下の実施例は、本出願に開示した態様の理解を更に助ける目的で示すものであるが、これら実施例が属する分野の当業者には周知の従来法を理解していることが前提となる。以下に記載する具体的な材料及び条件は、本明細書に開示した態様の特定の側面を例示することを意図したものである。よって、本発明の合理的な範囲を限定するものと解すべきではない。
【０１４０】
実施例１Ａ：ＤＬＢＣＬ細胞系における増殖阻害アッセイ
本実施例では、化合物Ｂと組み合わせたイデラリシブの抗増殖活性を３つのＤＬＢＣＬ細胞系で評価する。
【０１４１】
材料と方法
細胞系及び培養条件：イデラリシブ（化合物Ａと呼ぶ）と６−アミノ−９−［（３Ｒ）−１−（２−ブチノイル）−３−ピロリジニル］−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オンの一塩酸塩（実施例では化合物Ｂと呼ぶ）との組合せを、インビトロ増殖阻害アッセイにより、３つのＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ細胞系（ＯＣＩ−ＬＹ１０、Ｒｉ−１、ＴＭＤ−８）及び１つのＧＣＢ−ＤＬＢＣＬ細胞系（Pfeiffer）で評価した。他のＤＬＢＣＬ細胞系（ＮＵ−ＤＵＬ−１、ＳＵ−ＤＵＬ−８、ＳＵ−ＤＨＬ−２、ＯＣＩ−Ｌｙ３、Ｕ−２９３２が含まれる）についても、イデラリシブ、化合物Ｂ、及びイブルチニブで処理し、増殖阻害アッセイで調べた。
【０１４２】
細胞系は、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）、Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikrooorgansimen und Zellkulturen GmbH（ＤＳＭＺ社）、University Health Network（トロント、カナダ国）、及び東京医科歯科大学難病疾患研究所の何れかから取得した。細胞は、提供された指示に従って培養した。ＲＰＭＩ基本培地（Gibco社カタログ番号22400-089）に２０％熱不活性化ウシ胎仔血清（Gibco社カタログ番号16140-063）及び１００Ｕ／ｌのペニシリン−ストレプトマイシン（Gibco社カタログ番号15140-148）を添加して完全培地を調製した。細胞を３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートした。下記表Ａ参照。
【０１４３】
遺伝子変異プロファイリング：FoundationOne（登録商標）ヘムアッセイ（Foundation Medicine社）を利用し、使用した細胞系に共通するシグナル伝達経路の要素の変異を明らかにした。
【表Ａ】
0006785804.tif 000006
【０１４４】
細胞生存アッセイ：細胞のＡＴＰレベルを定量するCellTiter-Glo（登録商標）アッセイ（Promega社）を用いて薬剤のインビトロでの抗増殖活性を評価した。試験化合物をＤＭＳＯに溶解して１０ｍＭの貯蔵溶液を調製した。単剤のＥＣ５０を求めるため、全試験化合物を９６ウェルプレート上でＤＭＳＯにより３倍ずつ段階希釈し、試験培地中０.１％ＤＭＳＯの溶液内で１０μＭ〜０.５１ｎＭの最終用量範囲を実現した。組合せ薬の試験のため、化合物Ｂについては水平方向の２倍又は３倍ずつの段階希釈パターンを用い、垂直方向の２倍、３倍、又は４倍ずつの段階希釈パターンを用いたイデラリシブと組み合わせた。細胞系のＥＣ５０に応じて試験対象濃度の上限を変えた。最大濃度は１０μＭであった。試験培地中のＤＭＳＯの最終濃度は０.２％であった。各組合せは４つのプレートを用いて反復実験を行い、相乗スコアの評価に十分なデータを得た。全ての試験プレートに、０％阻害（ＤＭＳＯ）及び１００％阻害（２μＭスタウロスポリン）を示す対照ウェルをそれぞれ１列ずつ設けた。何れの細胞系についても、アッセイ増殖培地としては、２０％ＦＢＳ及び１００Ｕ／ｌペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩを用いた。各細胞系の播種密度は、９６時間の増殖速度に基づき最適化し、９６ウェルプレートの各ウェル当たり１０，０００〜３０，０００細胞とした。３７℃／５％ＣＯ２下で薬剤と共に４日間インキュベートした後、CellTiter-Glo（登録商標）アッセイを製造者のプロトコルに従って実施した。Biotek社のSynergyルミノメータを用いて相対ルミネセンス単位を定量した。
【０１４５】
データ分析：Ｚ’＜０.５又は４日間のアッセイ期間内の細胞系の増殖が２倍未満のプレートのデータは除外した。Ｚ’は、式
Ｚ’＝［１−（（３（σstau＋σDMSO））／（｜μDMSO−μstau｜）］
により算出した。ここで、σstau及びσDMSOはそれぞれ１００％阻害スタウロスポリン対照ウェル及び０％阻害ＤＭＳＯ対照ウェルの標準偏差であり、μDMSO及びμstauはそれぞれ１００％阻害スタウロスポリン対照ウェル及び０％阻害ＤＭＳＯ対照ウェルの平均値である。Cell Titer Gloの原信号は、式
［（原数値）−（１００％阻害スタウロスポリン対照）］／［（ＤＭＳＯ対照値）−（１００％阻害スタウロスポリン対照）］
により正規化した。
【０１４６】
ＥＣ５０は、GraphPad Prism又はDose Responseソフトウエアを用いて、データを４パラメータ変数勾配モデルにフィットさせることにより求めた。ＥＣ９０は、「Find ECanything」変数勾配モデルを用い、Ｆを１０に設定してデータをフィットさせることにより計算した。１０μＭでのＥｍａｘは、阻害剤が存在しない対照の信号に対する阻害剤１０μＭでの信号の比の値を計算することにより求めた。組合せ試験では、一方の化合物の用量を固定した場合の他方の化合物のＥＣ５０のグラフから、各被検物質濃度のＥＣ５０を求めた。ＥＣ５０シフトは、単剤のＥＣ５０を第２の薬剤の最大用量でのＥＣ５０で割った比を計算することにより求めた。
【０１４７】
相乗作用はMacSynergy IIプログラムを用いて分析した。このプログラムは、Bliss Independence数学モデルを用い、組合せ薬の理論的な加算値を、各薬物単独で得られる値に基づいて計算する。このBliss Independenceモデルでは、各薬物が独立に作用すると仮定する。各化合物の理論的加算作用を計算し、これを実際に得られた作用から差し引く。予想される効果よりも大きいことを相乗作用と定義し、予想される効果よりも小さいことを拮抗作用と定義する。本実施例では、相乗作用値が５０よりも大きい場合に有意であると判断した。薬組合せ試験で求めたＥＣ５０値は、４回反復実験のうち一つを表すものであるため、単剤のＥＣ５０値とは僅かに異なる可能性がある。
【０１４８】
アポトーシスアッセイ：ＯＣＩ−Ｌｙ１０とＴＭＤ−８という２つのＤＬＢＣＬ細胞系において、化合物Ｂと組み合わせたイデラリシブのアポトーシスも測定した。２０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０に細胞を０.２×１０６細胞／ｍｌの密度で播種した。細胞を１５６ｎＭのイデラリシブ、化合物Ｂ、及びこれらの組合せにより処理した。対照は０．２％ＤＭＳＯで処理した。次に細胞を３７℃で４８時間インキュベートした。アポトーシスについては、アネキシンＶ／ＦＩＴＣキットを用いて測定し、フローサイトメトリーにより分析した。また、アネキシンＶ／７ＡＤＤキット（Beckman Coulter社）を用いたアポトーシスの測定も行った。BD LSRIIを用いて蛍光をフローサイトメトリーによって測定し、FACSDivaを用いて結果を分析した。
【０１４９】
結果
化合物Ｂは、３種類のＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ細胞系（ＯＣＩ−ＬＹ１０、Ｒｉ−１、及びＴＭＤ−８）の増殖を強く阻害することが分かった（ＥＣ５０＜２６ｎＭ）。これらの細胞系はイデラリシブに対しても感受性を示した（ＥＣ５０＜２１０ｎＭ）。図１Ａ〜図１Ｄ及び下記表１〜表３に示すように、イデラリシブ及び化合物Ｂの組合せにより、ＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ細胞系であるＯＣＩ−ＬＹ１０及びＴＭＤ−８の増殖が相乗的に阻害され、アポトーシスが単剤で観察されたレベルを超えて増加した。追加の結果を図１Ｇに示す。
【０１５０】
イデラリシブ、化合物Ｂ、及びイブルチニブは、ＯＣＩ−ＬＹ１０、Ｒｉ−１、及びＴＭＤ−８細胞系の増殖を阻害した。実験で使用したイデラリシブ濃度は臨床上意義のある範囲であり、１０３ｎＭ及び５９１ｎＭはそれぞれ臨床でのＣｍｉｎ及びＣｍａｘに対応している。化合物Ｂとの組合せがＴＭＤ−８及びＯＣＩ−ＬＹ１０の細胞生存に相乗効果を及ぼすことが観察された。イデラリシブに化合物Ｂを６ｎＭ、１２ｎＭ、２５ｎＭの濃度で追加すると、ＴＭＤ−８細胞系ではＥＣ５０値が２５４ｎＭからそれぞれ１０８ｎＭ、３４ｎＭ、及び２４ｎＭへとシフトし、ＯＣＩ−ＬＹ１０細胞系ではＥＣ５０値が１２２ｎＭからそれぞれ２４ｎＭ、１９ｎＭ、及び１３ｎＭへとシフトした。
【０１５１】
共通するシグナル伝達経路の要素における変異の分析から、ＯＣＩ−ＬＹ１０細胞系、Ｒｉ−１細胞系、及びＴＭＤ−８細胞系は、ＰＩ３ＫＣＡ、ＡＫＴ１／ＡＫＴ２、ＴＰ５３、及びＰＴＥＮの何れの遺伝子にも変異を有さないことが分かった。更に、これらの結果から、ＴＭＤ−８とＯＣＩ−ＬＹ１０はＣＤ７９Ａ／ＣＤ７９Ｂ及びＭＹＤ８８に変異を含んでいることと、Ｒｉ−１はＴＰ５３に変異を、ＡＫＴ１／ＡＫＴ２及びＭＡＬＴ１に増幅を含み、ＮＵ−ＤＵＬ−１及びＳＵ−ＤＵＬ−８はＴＰ５３に変異を含み、ＯＣＩ−ＬＹ３は、ＣＤ７９Ａ／ＣＤ７９Ｂ、ＣＡＲＤ１１、及びＭＹＤ８８に変異を、ＴＰ５３に欠失を、ＲＢ１に増幅を含み、Ｕ−２９３２は、ＴＰ５３に変異を、ＭＡＬＴ１に増幅を、ＲＢ１に欠失を含むことが分かった。
【表１】
0006785804.tif 000007
【表２】
0006785804.tif 000008
【表３】
0006785804.tif 000009
【０１５２】
実施例１Ｂ：ＴＭＤ−８における細胞生存アッセイ
イデラリシブと化合物Ｂとの組合せ投与がＴＭＤ−８細胞系に与える上述の効果を、本実施例では更に検討した。
【０１５３】
抗増殖アッセイ：抗増殖アッセイの終点の読み取りは、生存細胞の指標となるＡＴＰの定量値に基づき行った。細胞を液体窒素で保存した状態から解凍した。細胞が予想される倍加時間で増殖・分裂するようになってからスクリーニングを開始した。黒色３８４ウェル組織培養物治療済プレート内の増殖培地に、細胞を１ウェル当たり５００細胞の割合で播種した（分析装置中の指定箇所を除く）。細胞を遠心分離によりアッセイプレート内で平衡させ、Dosing Moduleに接続したインキュベータ内で３７℃で２４時間放置してから処理に供した。治療の際には、（治療しなかった）一群のアッセイプレートを採取し、ATPLite（Perkin Elmer社）を添加してＡＴＰレベルを測定した。これらのＴｚｅｒｏ（Ｔ０）プレートをEnvision Plate Readerにより超高感度ルミネセンスを用いて読み取った。処理アッセイプレートは化合物と共に１２０時間インキュベートした。１２０時間後、プレートを現像し、ATPLiteを用いて終点を分析した。自動化プロセスによって全データ点を採取し、品質管理を行い、Horizon CombinatoRx専用ソフトウエアを用いて分析した。アッセイプレートは品質管理基準を満たしたもののみ許容した。具体的には、相対ルシフェラーゼ値が実験全体を通じて一定であり、Ｚ因子スコアが０.６よりも大きく、未処理／ビヒクル対照がプレート上で一定の挙動を示すことを基準とした。
【０１５４】
Horizon Discoveryは、細胞生存の指標として増殖阻害（Growth Inhibition：ＧＩ）を利用した。ビヒクルの細胞生存を投与時（Ｔ０）及び１２０時間後（Ｔ１２０）に測定した。ＧＩ読み取りが０％であるとは、増殖阻害がないことを表す。化合物処理細胞の信号とＴ１２０ビヒクルの信号が一致する場合である。ＧＩが１００％であるとは、増殖が完全に阻害されたことを表す。化合物処理細胞の信号とＴ０ビヒクルの信号が一致する場合である。ＧＩが１００％のウェルでは、処理期間中に細胞数が増加しておらず、化合物による細胞分裂の阻害効果が、この効果レベルでプラトーに達した可能性を示唆する。ＧＩが２００％であるとは、培養ウェル内の全細胞が完全に死滅したことを表す。ＧＩ２００％の活性プラトーに到達した化合物は細胞障害性と判定した。Horizon CombinatoRxは、以下の条件及び式を適用することによりＧＩを計算する。
【数１】
0006785804.tif 000010
【数２】
0006785804.tif 000011
但し、Ｔは被験物質の信号測定値、Ｖはビヒクル処理対照の測定値、Ｖ０は時刻ゼロでのビヒクル対照の測定値である。この式は、National Cancer InstituteのNCI-60高スループットスクリーンで用いられている増殖阻害の計算法による。
【０１５５】
相乗スコア分析：Loewe相加性を超える組合せ効果を測定するため、Horizon Discoveryは、相乗的相互作用の強さを表す相乗スコアというスカラー指標を考案した。相乗スコアは以下の式で計算される。
【数３】
0006785804.tif 000012
【０１５６】
行列中の各要素薬剤及び各組合せ点の部分阻害（fractional inhibition）を、ビヒクルで処理した全対照ウェルの中央値に対する相対値として計算した。相乗スコアの式は、要素薬剤の活性から相加性に関するLoeweモデルを用いて数値的に導出したモデル面を基準として、行列中の各点における実験で観察された活性量の超過分を積分するものである。（上記の）相乗スコアの式における追加の項を用いることで、個々の薬剤に使用される種々の希釈因子を正規化し、実験全体を通じた相乗スコアの比較を可能とした。ポジティブ阻害ゲーティング又はＩｄａｔａ乗算因子を含めることで、ゼロ効果レベル近傍の雑音と、高い活性レベルにおいて生じる相乗的相互作用の偏った結果を除去した。
【０１５７】
力価のシフトはアイソボログラムを用いて評価した。アイソボログラムは、所望の効果レベルを達成するのに必要な組み合わせ薬をどれだけ低減できるかを、その効果を実現するのに必要な単剤の用量と比較して示す。アイソボログラムの描画は、指定の阻害レベルと交差する濃度の位置を同定することにより行った。これは、用量行列内で各単剤濃度が他の単剤濃度と交差する交点を特定することにより行った。実際には、垂直方向の各濃度ＣＹを固定し、二分アルゴリズムを用いて、その垂直方向の用量と組み合わせることにより反応面Ｚ（ＣＸ，ＣＹ）において選択された効果レベルを与える水平方向の濃度ＣＸを同定した。続いて、これらの濃度を線形補間により連結し、アイソボログラム表示を作成した。
【０１５８】
相乗的相互作用の場合、アイソボログラムの形状が相加性閾値よりも下方に移動して原点に近づく一方、拮抗的相互作用の場合は相加性閾値よりも上方に存在することになる。エラーバーは、アイソボログラムの作成に用いた個々のデータ点に起因する不確実性を表す。各交点の不確定性は、二分法を用いてＺ−σＺ（ＣＸ，ＣＹ）及びＺ＋σＺ（ＣＸ，ＣＹ）がＩｃｕｔと交差する濃度を見出す際の応答誤差から見積もった。但し、σＺは効果スケール上の残余誤差の標準偏差である。
【０１５９】
結果
図１Ｅは、イデラリシブと化合物Ｂとの組合せ投与による細胞死効果を視覚的に示すものであり、図１Ｆは、本実施例のデータから作成したアイソボログラムである。本実施例で行ったアッセイに関する相乗スコアは４４であることが分かった。本実施例で行ったアッセイの範囲は０．２〜４４である。従って、得られた４４というスコアは、イデラリシブと化合物Ｂとの組合せが相乗的であることを示している。
【０１６０】
実施例２：用量漸増試験
本実施例では、Ｂ細胞リンパ増殖性悪性腫瘍を有する対象に対する、イデラリシブとの組合せにおける化合物Ｂの安全性、耐容性、ＰＫ、薬物動態、予備的効果を評価する。抵抗性又は再発性のＢ細胞悪性腫瘍を有する対象を逐次登録しつつ、イデラリシブとの組み合わせで経口摂取させる化合物Ｂの用量レベルを徐々に増加させる。
【０１６１】
化合物Ｂの開始用量は２０ｍｇを１日１回、イデラリシブの開始用量は５０ｍｇを１日２回とする。コホート１Ａにおいてサイクル１の１日目から２８日以内に用量制限毒性（dose-limiting toxity：ＤＬＴ）が生じる場合は、このコホートを拡張して追加の３人の対象を組み入れる。コホート１Ａにおいて≧２ＤＬＴが生じる場合は、化合物Ｂとイデラリシブとの組合せの開発を中止する。コホート１Ａにおいて３人の対象でＤＬＴが生じないか、最大６人の対象で＜２ＤＬＴとなる場合は、コホート２Ａを開く。コホート２Ａには３人の対象を登録し、化合物Ｂ４０ｍｇを１日１回、イデラリシブ５０ｍｇを１日２回とする。コホート２Ａへの登録が完了したら、コホート２Ｂに３人の対象を登録し、化合物Ｂ２０ｍｇを１日２回、イデラリシブ５０ｍｇを１日２回とする。コホート２Ａ及びコホート２Ｂでは独立且つ並列に用量を漸増させる。コホート２Ａにおいて３人の対象でＤＬＴが生じないか、最大６人の対象で＜２ＤＬＴとなり、且つコホート２Ｂが登録を完了している場合は、コホート３Ａに次の３人の対象を組み入れ、８０ｍｇの化合物Ｂを１日１回、５０ｍｇのイデラリシブを１日２回にする。同様にして、コホート２Ｂにおいて３人の対象でＤＬＴが生じないか、最大６人の対象で＜２ＤＬＴとなる場合は、コホート３Ｂに３人の対象を登録し、化合物Ｂ４０ｍｇを１日２回、イデラリシブ５０ｍｇを１日２回とする。その後のコホートでは、３人の対象でＤＬＴが生じないか、最大６人の対象で＜２ＤＬＴとなることが観察される場合に、対象を登録する。何れかのコホートで第２のＤＬＴが観察される場合は、イデラリシブと組み合わせた化合物Ｂの最大耐量（maximum tolerated dose：ＭＴＤ）を超過しているはずであるから、それ以前のコホートがＭＴＤとなる。化合物Ｂが１日１回の場合のＭＴＤは、化合物Ｂが１日２回の場合のＭＴＤとは別に決定する。
【０１６２】
上記のプロトコルが完了した時点で、安全性、耐容性、及びＰＫに関して利用できる全データを検討する。
【０１６３】
１日２回５０ｍｇのイデラリシブと組み合わせた場合の化合物ＢのＭＴＤを、安全性及び効果に基づき決定したら、１日２回１００ｍｇのイデラリシブとの組み合わせで、化合物ＢをＭＴＤの最高５０％の用量で投与する追加のコホートを登録してもよい。各コホートの用量を表４に示す。
【表４】
0006785804.tif 000013
【０１６４】
ＤＬＴ：ＤＬＴは、イデラリシブ及び／又は化合物Ｂとの関連性が推測される下記定義の毒性であり、各コホートにおいてＤＬＴ評価期間（１日目〜２９日目）内に生じる。
１）全グレード≧４  ７日間超持続する血液毒性。
２）全グレード≧３  非血液学的毒性（医学的介入から７２時間以内に解決する脱毛症、吐き気、嘔吐、下痢、又は便秘を除く）。
３）全グレード≧４  臨床検査値異常。
４）発熱性好中球減少症（その定義は、単発的に体温が３８．３℃［１０１Ｆ］超になるか、１時間超に亘って持続的に体温が３８℃［１００．４Ｆ］以上、ＡＮＣが１．０×１０９／ｌ未満になること）。
５）全グレード≧２  非血液学的治療下発現有害事象（treatment-emergent adverse event：ＴＥＡＥ）であって、検査者の所見により、潜在的な臨床上の有意性を有し、用量を更に漸増すれば対象を受容し難いリスクに曝す可能性があるとされたもの。
【０１６５】
治療：資格要件を満たす対象に、サイクル１の１日目に単一用量の化合物Ｂを与え、次いでサイクル１の２日目から、化合物Ｂとの組み合わせでイデラリシブの投与を開始する。第１のサイクルは２８日間（化合物Ｂ単独を１日、組合せ治療を２７日間）からなり、その後の各サイクルは２８日間の組合せ治療である。安全性及び効果の評価は外来により実施し、評価項目としては腫瘍反応、身体検査、生命兆候（vitals）、ＥＣＧ、血液サンプル採取（慣例の安全性臨床検査のためであり、外来で可能なときに化合物ＢとイデラリシブのＰＫ、薬物動態、バイオマーカーを調べる）、有害事象（adverse events：ＡＥ）（例えば下痢／大腸炎、トランスアミナーゼ上昇、発疹、間質性肺炎）を含める。それに加え、対象は１２週間毎（ＤＬＢＣＬについては最初の１２週間は６週間毎）にＣＴ（又はＭＲＩ）スキャンを受ける。臨床評価又はＣＴ（又はＭＲＩ）によって疾患進行の兆候が見られない対象は、（臨床又はＸ線検査による）疾患の進行、受容できない毒性、同意の取り下げ、又は他の理由が生じるまで、イデラリシブと組み合わせた化合物Ｂの投与を毎日受け続けることができる。治療の中止後、対象は３０日間に亘って安全性に関する追跡調査を受ける。
【０１６６】
ＰＫと薬物動態のサンプリング：化合物Ｂについては、サイクル１の１日目の投与前と、投与から０.５時間、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、及び１２時間（任意）後、化合物Ｂとイデラリシブについては、サイクル１の２日目及び８日目の投与前と、投与から０.５時間、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、１２時間（任意）、及び２４時間後に、ＰＫサンプルを採取する。投与１２時間後のＰＫサンプルは任意である。投与１２時間後のＰＫサンプルは、試験対象薬をＢＩＤで投与する場合は晩の投与前に採取すべきであり、２４時間目のサンプルは、朝の投与から２４時間後に採取する。何れのコホートでも、サイクル１の１５日目の投与前及び投与から１〜６時間後にはＰＫサンプルを採取する。また、サイクル２〜６の初日の任意の時点で、少量のＰＫサンプルも採取する。薬物動態用の血液サンプルは、サイクル１の１日目の投与前、及び、投与から１時間、２時間、４時間、及び６時間後に採取すると共に、サイクル１の２日目及び８日目の投与前と、投与から１時間、２時間、４時間、６時間、及び２４時間後に採取する。地理的条件によっては、物流体制ゆえに、これらのサンプルの一部又は全部の採取を現場で実施できない場合もある。また、得られたデータによっては、サンプリング時点を省略又は変更してもよい。
【０１６７】
用量と投与方式：コホートによっては、試験のサイクル１の１日目から、化合物Ｂを経口で１日１回又は２回自己投与し、その後は治療が終わるまで毎日ほぼ同じ時刻に行なう。サイクル１の２日目からは、化合物Ｂと同時に（１０分以内に）イデラリシブを経口で１日２回自己投与する。化合物Ｂは、１０ｍｇ及び２５ｍｇのカプセルとして提供される。イデラリシブは、５０ｍｇ及び１００ｍｇの錠剤として提供される。
【０１６８】
ＦＬ、ＭＺＬ、ＣＬＬ、ＳＬＬ、ＭＣＬ、ＷＭ、非ＧＣＢ−ＤＬＢＣＬを有する対象について、将来の臨床試験で用いる化合物Ｂ及びイデラリシブの組合せ投薬計画は、ＰＫ及び薬物動態のデータによって支持される安全性及び効果のデータに基づいて選択する。
【０１６９】
実施例３Ａ：ＭＣＬ細胞系における増殖阻害アッセイ
本実施例では、化合物Ｂとの組み合わせによるイデラリシブの抗増殖活性を種々のＭＣＬ細胞系で評価する。
【０１７０】
材料と方法
細胞系と培養条件：イデラリシブと６−アミノ−９−［（３Ｒ）−１−（２−ブチノイル）−３−ピロリジニル］−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オンの一塩酸塩（実施例では化合物Ｂと呼ぶ）の組合せを、インビトロ増殖阻害アッセイにより、種々のＭＣＬ細胞系、例えばＲｅｃ−１、ＪＶＭ−２、Ｇｒａｎｔａ−５１９、Ｊｅｋｏ−１、ＪＭＰ−１、ＪＶＭ−１３、Ｍａｖｅｒ−１、Ｍｉｎｏ、ＰＦ−１、ＰＦ−２、Ｚ−１３８等について評価した。これらの細胞系は、実施例１Ａに示した手順に従って培養した。
【０１７１】
抗増殖アッセイ及び相乗スコア分析：ビヒクルの細胞生存率を投与時（Ｔ０）及び１２０時間後（Ｔ１２０）に測定した。ＧＩ読み取りが０％とは、増殖阻害がなかったことを表し、ＧＩが１００％とは、増殖が完全に阻害されたことを表し、ＧＩが２００％とは、培養ウェル中の全細胞が完全に死滅したことを表す。組合せ効果を測定するため、Loewe相加性の超過分を用いて相乗的相互作用の強さを表した（これを相乗スコアと呼ぶ）。アッセイ及び相乗スコア分析は、上記の実施例１Ｂに記載したプロトコルに従って実施した。
【０１７２】
結果
イデラリシブ及び化合物Ｂの組合せを投与した結果を以下の表５に示す。イデラリシブに化合物Ｂを組み合わせて投与すると、２種のＭＣＬ細胞系（Ｒｅｃ−１及びＪＶＭ−２）において、増殖が相乗的に阻害されることも分かった。図２Ａ及び図２Ｂ参照。Ｒｅｃ−１の相乗スコアは４．１、ＪＶＭ−２の相乗スコアは６．２となった。本実施例では、相乗スコアが４以上の場合に有意であると判断し、相乗性の範囲は４．０〜１９．０となった。
【表５】
0006785804.tif 000014
【０１７３】
実施例３Ｂ：ＤＬＢＣＬ細胞系における増殖阻害アッセイ
本実施例では、化合物Ｂとの組み合わせにおけるイデラリシブの抗増殖活性を、種々のＤＬＢＣＬ細胞系について評価する。
【０１７４】
材料と方法
細胞系と培養条件：イデラリシブと６−アミノ−９−［（３Ｒ）−１−（２−ブチノイル）−３−ピロリジニル］−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オンの一塩酸塩（実施例では化合物Ｂと呼ぶ）の組合せを、インビトロ増殖阻害アッセイにより、種々のＤＬＢＣＬ細胞系、例えばＨＢＬ−１、ＯＣＩ−Ｌｙ３、Ｒｉ−１、ＳＵ−ＤＨＬ−２、ＴＭＤ−８、Ｕ２９３２、ＯＣＩ−Ｌｙ４、Pfeiffer、ＳＵ−ＤＨＬ−１０、ＳＵ−ＤＨＬ−６、ＳＵ−ＤＨＬ−８、Carnaval、及びＵ２９７３等について評価した。これらの細胞系は、実施例１Ａに示した手順に従って培養した。
【０１７５】
抗増殖アッセイ及び相乗スコア分析：アッセイ及び相乗スコア分析は、上記の実施例３Ａに記載したプロトコルに従って実施した。
【０１７６】
ウエスタンブロット：１０６個の細胞を、氷冷した１５０μlの溶解緩衝液中で３０分間かけて溶解することにより、ウエスタンブロットサンプルを調製した。また、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche Diagnostics Corp社）と、ホスファターゼ阻害剤のセット１及びセット２（EMD Millipore社）も、溶解緩衝液（Cell Signaling Technology社）に添加した。細胞を４℃にて１２．５ｇで１０分間遠心分離した。上清を回収して新しい試験管に移した。サンプル緩衝液を各溶解物に添加した後、９９℃で５分間煮沸した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに添加し、１２５Ｖで２時間泳動した。電気泳動の後、X Cell Blotを用いてゲルをImmobilon−F膜に移送した。次に、膜をブロッキング緩衝液中で室温で１時間ブロックした後、ブロッキング緩衝液で希釈した一次抗体と共に一晩インキュベートした。使用した抗体を下記の表７に示す。翌日、膜をＴＢＳＴで３回（各回５分間）洗浄した。二次抗体を添加し、膜を室温で４５分間インキュベートした後、ＴＢＳＴで３回（各回５分間）洗浄した。Licor Imagerを用いてブロットを読み取った。一次抗体としては、ｐ−ＡＫＴ（Ｓ４７３）、ｐ−ＢＴＫ（Ｙ２２３）、ＢＴＫ、ｐ−ＥＲＫ（Ｔ２０２／Ｙ２０４）、ＥＲＫ、及びアクチン（Cell Signaling Technologies社）を含有するものを用い、二次抗体としては、IRDyeが共役した抗マウス抗体及び抗ウサギ抗体、LI-CORを含有するものを用いた。バンドの強度は、LI-CORイメージャ及びLI-COR Odysseyソフトウエアを用いて測定した。
【０１７７】
タンパク質発現分析：また、溶解物に対して、Peggy Sue（ProteinSimple社）を用いたSimple Westernによる分析も行った。組換えタンパク質を用いて標準曲線を作成し、Peggy Sue上でＰＩ３Ｋアイソフォームのレベルを測定した。データはCompassソフトウエア（ProteinSimple社）を用いて処理した。
【０１７８】
結果
イデラリシブ及び化合物Ｂの組合せを投与した結果を下記の表６に示す。また、イデラリシブと化合物Ｂの組合せ投与により、幾つかのＤＬＢＣＬ細胞系、例えばＴＭＤ−８、Ｕ２９３２、及びＯＣＩ−Ｌｙ４において、増殖が相乗的に阻害されることも分かった。ＴＭＤ−８の相乗スコアは６５．７、Ｕ２９３２の相乗スコアは７．９、ＯＣＩ−Ｌｙ４の相乗スコアは８．７となった。本実施例では相乗スコアが６．６以上の場合を有意であると判断し、相乗性の範囲は６．６〜６５．７となった。
【表６】
0006785804.tif 000015
【０１７９】
図２Ｃは、イデラリシブと化合物Ｂの組合せ投与による細胞死効果を視覚的に表した図であり、図２Ｄは、本実施例のデータから作成したアイソボログラムである。本アイソボログラムは、上記の実施例１Ｂに記載した手順に従って作成した。
【０１８０】
下記の表７に、２時間後及び２４時間後に取得したＴＭＤ−８ウエスタンブロットの結果を示す。以下から分かるように、イデラリシブと化合物Ｂの組合せ治療により、鍵となる生存経路と増殖経路が阻害されることが持続的に観察された。
【表７】
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【０１８１】
図２Ｅは、シグナル伝達経路要素のリン酸化状態を決定するためのウエスタンブロットの結果を示す図である。イデラリシブにより誘導されたｐ−ＡＫＴ（Ｓ４７３）及びｐ−ＥＲＫ（Ｔ２０２／Ｙ２０４）の阻害率（それぞれ５８％及び７１％）は、化合物Ｂによる阻害率（それぞれ４６％及び４８％）よりも高かった。化合物Ｂは、ｐ−ＢＴＫ（Ｙ２２３）によって測定されるＢＴＫ活性化を阻害した（５９％）。２時間後の時点において、イデラリシブと化合物Ｂの組合せは、単剤だけの場合と同等の結果を示した。２４時間後の時点では、イデラリシブと化合物Ｂの組合せは、単剤だけの場合と比べてｐ−ＡＫＴ（Ｓ４７３）、ｐ−ＢＴＫ（Ｙ２２３）、及びｐ−ＥＲＫ（Ｔ２０２／Ｙ２０４）の阻害レベルを向上させた（それぞれ８３％、６６％、及び３６％）。
【０１８２】
実施例４Ａ：ＢＴＫ阻害剤に対する耐性の機序
材料と方法
イブルチニブ耐性クローンの作製：ＴＭＤ８におけるイブルチニブ耐性の機序を調べるため、数個の独立なＴＭＤ８のクローン単離体を、２回の限界希釈細胞播種により作製した。５％ＣＯ２及び９５％空気からなる３７℃の湿潤雰囲気中でイブルチニブの存在下にて連続継代することにより、１２週間かけてイブルチニブ耐性ＴＭＤ８を作製した後、イブルチニブに対する耐性が確立するまで用量を１０ｎＭ又は２０ｎＭまで漸増させた。継代が一致する薬剤感受性対照系として、並列培養物を０．１％ v/v ＤＭＳＯの存在下で増殖させた。感受性ＴＭＤ８細胞及び耐性ＴＭＤ８細胞のクローンを、２回の単一細胞限界希釈を通じて単離した。親株を一致させるため、倍加時間及びイブルチニブに対する感受性を評価した。
【０１８３】
細胞生存アッセイ：継代が一致したＤＭＳＯ処理培養物及びイブルチニブ処理培養物を、９６時間CellTiter-Glo生存アッセイ（Promega社）を用いて比較することにより、イブルチニブに対する耐性を調べた。
【０１８４】
遺伝子型プロファイリング：イブルチニブ感受性クローン及びイブルチニブ耐性クローンの遺伝子型特性を、サンガーホットスポット変異分析（Genewiz社）により、又は全エキソームシークエンシング（whole exome sequencing：ＷＥＳ）及びRNASeqにより評価した（発現分析）。ＢＷＡによりＤＮＡシークエンシングのリードをヒト参照ゲノムとアラインメントした。VarScanを用いて単一ヌクレオチド変異体を同定し、SnpEffを用いてアノテーションを付した。変異体アレル頻度、反復性、及び予想される機能的影響に基づいて、推定される体細胞変異に優先順位をつけた。STARを用いてＲＮＡシークエンシングのリードをヒト参照ゲノムとアラインメントし、RSEMを用いてＲＮＡ量を定量した。Bioconductor社のパッケージedgeRを用いて配列のカウントを正規化し、limmaを用いて差分遺伝子発現分析（differential gene expression analysis）を実施した。
【０１８５】
タンパク質発現及びリン酸化プロテオミクス：上記の実施例３Ｂに記載したようにウエスタンブロット又はPeggy Sueを用いて、タンパク質発現レベル及びリン酸化プロテオミクスを測定した。
【０１８６】
結果
１０ｎＭ又は２０ｎＭのイブルチニブ中で細胞を数ヶ月かけて連続継代することにより、ＢＴＫ阻害剤耐性ＴＭＤ−８細胞を作製した。１０ｎＭで処理した細胞からは、ＴＮＦＡＩＰ３（Ｑ１４３＊、Ａ２０タンパク質）に１つの変異が同定された。２０ｎＭで処理した細胞からは、ＢＴＫ（Ｃ４８１Ｆ）に１つの変異が同定され、それに伴うＡ２０タンパク質の喪失が見られた。両細胞系のクローン単離体のＷＥＳ分析により、２０ｎＭのイブルチニブで処理したクローンのみ（ＴＭＤ８ＢＴＫ−Ｃ４８１Ｆ、２２／２２クローン）ＢＴＫのＣ４８１Ｆにホモ変異があることが明らかになり、その結果はサンガーシークエンシングによって確認された。１０ｎＭのイブルチニブで処理したクローンのＷＥＳ分析から、ＮＦ−κＢ阻害剤であるＴＮＦα誘導プロテイン３に不活性化変異があることが明らかになった（ＴＮＦＡＩＰ３のＱ１４３＊変異、別名Ａ２０タンパク質；ＴＭＤ８Ａ２０−Ｑ１４３＊、５／５クローン）。イブルチニブ存在下での細胞生存アッセイは、これらのクローン（ＴＭＤ８ＢＴＫｉＲ）がイブルチニブに対して耐性であることを示している（図３Ｅ）。
【０１８７】
本実施例の結果を下記の表８に示す。表８のデータは、上記の実施例３Ｂに記載したウエスタンブロット手順に従って取得した。
【表８】
0006785804.tif 000017
【０１８８】
タンパク質発現プロファイリングによれば、ＴＭＤ８Ａ２０−Ｑ１４３＊クローンはＡ２０の喪失及びｐ−ＩκＢαの増加を示していた。これは、ＮＦ−κＢ経路が活性化されたことを示している（表８）。ＴＭＤ８ＢＴＫ−Ｃ４８１Ｆも、未知の機序によるＡ２０の喪失を示した。上記の表に示すように、ＢＴＫのＣ４８１の位置に観察された獲得変異は、イブルチニブの臨床耐性と合致しており、Ａ２０の変異及び機能喪失がＢＴＫ阻害剤に対する耐性の機序であることが特定された。
【０１８９】
実施例４Ｂ：ＢＴＫ阻害剤への耐性に対して化合物Ｂとの組み合わせによるイデラリシブが及ぼす効果
材料と方法
ＴＭＤ−８におけるイブルチニブ耐性の機序を評価するため、数個の独立なＴＭＤ−８のクローン単離体を、２回の限界希釈細胞播種により作製した。親株を一致させるため、倍加時間及びイブルチニブに対する感受性を評価した。段階的に増加させたイブルチニブの存在下、或いはこれと並行して、０.１％ v／v ＤＭＳＯ中において、クローン単離体を継代することによりイブルチニブ耐性を確立した。イブルチニブに対する耐性は、継代が一致したＤＭＳＯ処理培養物及びイブルチニブ処理培養物のイブルチニブ感受性を、９６時間 Cell Titer Glo生存アッセイ（Promega社）を用いて比較することにより確認した。イブルチニブ感受性（ＤＭＳＯ処理）培養物及びイブルチニブ耐性（イブルチニブ処理）培養物からのクローン単離体を、２回の限界希釈播種を通じて作製した。イブルチニブ感受性クローン及びイブルチニブ耐性クローンの遺伝子型の特徴を、サンガーホットスポット変異分析（Genewiz社）により、又は全エキソームシークエンシング（ＷＥＳ）により評価した（発現分析）。ＰＩ３Ｋアイソフォーム選択的及びＢＴＫ阻害剤、又はこれらの組合せに対するイブルチニブ耐性ＴＭＤ−８の感受性を、１０点用量応答において細胞を阻害剤により９６時間処理した後、Cell Titer Glo細胞生存アッセイを実施することによって調べた。
【０１９０】
ＰＩ３Ｋ、ＭＡＰＫ、ＢＴＫ、及びＮＦ−κＢ要素の全タンパク質発現レベル及びリン酸化を、ウエスタンブロット又はPeggy Sueによって求めた。細胞をイデラリシブ（４２０ｎＭ）、又は化合物Ｂ（３２０ｎＭ）、又はこれらの組合せにより処理した。タンパク質発現レベル及びリン酸化プロテオミクスは、実施例３Ｂに記載した手順を利用し、ウエスタンブロット（ｐ−ＥＲＫ １／２、ｐ−ＡＫＴ Ｓ４７３、全ＡＫＴ）及びPeggy Sue（ｐ−ＢＴＫ、ｐ−ＩκＢα Ｓ３２、全ＩκＢα）を用いて決定した。各群のＡＵＣを求めた後に結果を定量し、ＤＭＳＯビヒクル対照に正規化した。
【０１９１】
結果
ＴＭＤ−８におけるＢＴＫ阻害剤耐性の２つの機序が同定された。即ち、ＮＦ−κＢ阻害剤であるＡ２０の不活性化変異（ＴＮＦＡＩＰ３ Ｑ１４３＊）と、更に最大濃度（２０ｎＭ）のイブルチニブで生じたクローンのみに存在するＢＴＫ変異（Ｃ４８１Ｆ）である。ＢＴＫ（Ｃ４８１Ｆ）変異のみを有するＴＭＤ−８細胞は、イデラリシブに対する感受性が弱かった（１μＭでのＥｍａｘ＝１４％に対して親では８６％、図３Ａ）。
【０１９２】
これらのクローンでは、化合物Ｂを添加しても増殖阻害が増大しなかった。Ａ２０変異のみを有するＴＭＤ−８細胞は、化合物Ｂに対して耐性であった（ＥＣ５０＞１０μＭ）が、イデラリシブに対しては感受性であった。もっとも、その感受性は親よりも弱かった（ＥＣ５０≧４３００ｎＭ対５４ｎＭ）。５０ｎＭの化合物Ｂをイデラリシブに添加することで、増殖が更に阻害され（野生型ＢＴＫの存在と整合性がある）、イデラリシブの力価が親ＴＭＤ−８と同等のレベルまで上昇した（ＥＣ５０≧９９ｎＭ、n＝５クローン、図３Ｂ）。
【０１９３】
イデラリシブと化合物Ｂの組合せによる効果を、図３Ｃ及び図３Ｄ、並びに下記の表１０及び表１１に更に示す。これらのデータは、斯かる組合せが、ＴＭＤ８−Ａ２０Ｑ１４３＊におけるＭＡＰＫ（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ）経路及びＮＦ−κＢ経路の下方調節により、ＢＴＫ阻害剤に対する耐性を克服し得ることを示している。表９及び表１０のデータは、上記の実施例３Ｂに記載のウエスタンブロット手順に従って得た。図３Ｄに示すように、ＴＭＤ８ＢＴＫ−Ｃ４８１Ｆ系は、イデラリシブ、化合物Ｂ、及びこれらの組合せの何れにも耐性である。これは、この系における耐性の機序が複雑であることを示唆している。ＴＭＤ８Ａ２０−Ｑ１４３＊細胞は、イデラリシブ又は化合物Ｂ単独に対して耐性であるが、両者を組み合わせるとその感受性が回復した（図３Ｃ）。
【０１９４】
これらの結果によれば、両薬剤の組合せで処理した試料では、ＴＭＤ８Ａ２０−Ｑ１４３＊系におけるｐ−ＥＲＫ及びｐ−ＩκＢαの阻害率が増加したことが分かる。
【表９】
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【表１０】
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【０１９５】
結論
A20の変異及び機能喪失が、ＢＴＫ阻害剤に対する耐性の新規な機序であることが特定された。イデラリシブはＡ２０変異ＴＭＤ−８の増殖を阻害する力がより弱いことが分かったが、化合物Ｂと組み合わせることで追加の利点が提供されることも分かった。ＢＴＫ−Ｃ４８１Ｆ変異を有するＴＭＤ−８は、イデラリシブ、及び、イデラリシブと化合物Ｂとの組合せに対して耐性であった。これらのデータは、イデラリシブと化合物Ｂの組合せが、ＢＴＫ耐性の幾つかの機序を克服できることを示唆している。これらの結果は、この系をイデラリシブと化合物Ｂの組合せを用いて処理した場合に見られる細胞生存率の低下が、ＭＡＰＫ経路及びＮＦ−κＢ経路の阻害による結果である可能性を示唆している。
【０１９６】
実施例５：ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路の上方調節がイデラリシブ耐性を媒介する
本実施例では、イデラリシブに対する耐性の機序を検討するため、ＰＩ３Ｋδによって駆動されるモデルを開発した。また、ＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ（ＴＭＤ−８）のモデルでもイデラリシブ耐性の機序を評価した。また、イデラリシブ耐性細胞において調節が異常な細胞シグナル伝達経路も特定した。更に、イデラリシブ耐性を克服できる化合物を同定した。
【０１９７】
材料と方法
イデラリシブ又は他の阻害剤に対する増殖阻害を、CellTiter-Glo生存アッセイを用いて、９６時間後の時点で評価した。１μＭのイデラリシブ（最大濃度［Ｃｍａｘ］約２倍、タンパク質結合について）に継続的に曝露することにより、イデラリシブ耐性系（ＴＭＤ８Ｒ）を作製した。継代が一致するジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）系を対照（ＴＭＤ８Ｓ）として作製した。プールから２回の限界希釈によりクローン単離体を作製した。細胞系を、全エキソームシークエンシング、ＲＮＡＳｅｑ、リン酸化プロテオミクスによって分析した。シンプルウエスタン及びＳＤＳ／ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットを用いてタンパク質発現を測定した。Caspase-Glo3/7アッセイを用いてカスパーゼ３／７を測定した。アネキシンＶアッセイ及びヨウ化プロピジウムフローサイトメトリーによりアポトーシスを測定した。
【０１９８】
ゲノムプロファイリング：遺伝子発現レベル及び変異を、それぞれ全エキソームシークエンシング（Genewiz社）及びＲＮＡＳｅｑ（発現分析）により決定した。以下のバイオインフォマティクスプラットフォームを用いて配列のリードを分析した。ＢＷＡによってＤＮＡシークエンシングのリードをヒト参照ゲノムとアラインメントした。VarScanを用いて単一ヌクレオチド変異体を同定し、SnpEffを用いてアノテーションを付した。変異体アレル頻度、再発、予想される機能的影響によって推定体細胞変異に優先順位をつけた。ＲＮＡシークエンシングのリードを、STARを用いてヒト参照ゲノムとアラインメントし、RSEMを用いてＲＮＡ量を定量した。Bioconductor社のパッケージedgeRを用いて配列のカウントを正規化し、limmaを用いて差分遺伝子発現分析を実施した。
【０１９９】
ウエスタンブロット及びタンパク質発現：上記の実施例３Ｂに記載した手順に概ね従い、シンプルウエスタン、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ、及びウエスタンブロット又はPeggy Sue（ProteinSimple社）を用いてタンパク質発現を測定した。リン酸化されたタンパク質又は全タンパク質のレベルの検討に用いた一次抗体は、ｐ−ＡＫＴ（Ｓ４７３）、ｐ−ＡＫＴ（Ｔ３０８）、ＡＫＴ、ｐ−ＥＲＫ（Ｔ２０２／Ｙ２０４）、ｐ−Ｓ６（Ｓ２３５／２３６）、Ｓ６、ｐ−ＰＤＫ１（Ｓ２４１）、ｐ−ＰＬＣγ２（Ｙ１２１７）、ｐ−ＧＳＫ３β（Ｓ９）、ｐ−ＳＴＡＴ３（Ｙ７０５）、ｐ−ＩκＢα（Ｓ３２）、ＩκＢα、ｐ−ＳＹＫ（Ｙ５２５／５２６）、ｐ−ＢＴＫ（Ｙ２２３）、ＰＩ３Ｋγ、ＰＴＥＮ、及びアクチンに対する抗体等である。
【０２００】
本実施例で用いた化合物は（１）イデラリシブ（別名「ＩＤＥＬＡ」）；（２）６−アミノ−９−［（３Ｒ）−１−（２−ブチノイル）−３−ピロリジニル］−７−（４−フェノキシフェニル）−７，９−ジヒドロ−８Ｈ−プリン−８−オンの一塩酸塩、実施例での別称化合物Ｂ；（３）ＧＤＣ−０９４１；（４）ＢＹＬ−７１９；（５）ＡＺＤ−６４８２；（６）デュベリシブ；（７）イブルチニブ；（８）ＭＫ−２２０６；及び（９）ＧＳＫ−２３３４４７０等である。
【０２０１】
統計分析：四重反復実験のサンプルから作成したシグモイド用量−反応（変数勾配）曲線を用いて細胞生存ＥＣ５０を求めた。Prism（GraphPad社）において、細胞生存についてはスチューデントのｔ検定を用い、アポトーシス実験については両側一対ｔ検定を用いて、統計的有意性を求めた。
【０２０２】
結果
図４及び下記の表１１は、ＴＭＤ−８がイデラリシブ及びｐａｎ−ＰＩ３Ｋ阻害剤（ＧＤＣ−０９４１）に対して感受性であるが、ＰＩ３Ｋα（ＢＹＬ−７１９）阻害剤又はＰＩ３Ｋβ（ＡＺＤ−６４８２）阻害剤に対しては感受性でないことを示している。これは、細胞生存が主にＰＩ３Ｋδによって駆動されることを示唆している。
【表１１】
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【０２０３】
図５は、後天的にイデラリシブ耐性を獲得したＴＭＤ８細胞（ＴＭＤ８Ｒ）が、イデラリシブに対する感受性を喪失したことを示している。増殖阻害は、ＴＭＤ８Ｒでは１μＭのとき１９％であったのに対し、感受性ＤＭＳＯ対照（ＴＭＤ８Ｓ）では９２％であった。
【０２０４】
ＴＭＤ８Ｒプロファイリングは、ＰＩ３Ｋγの上方調節及びＰＴＥＮの喪失を示している。図６Ａ及び図６Ｂは、ＴＭＤ８Ｒプール及び８／８クローンでは、ＴＭＤ８Ｓと比べてＰＩＫ３ＣＧ（ｐ１１０γ）ｍＲＮＡ（２倍、図６Ａ）及びタンパク質（３〜５倍、図６Ｂ）の僅かな上方調節が見られたことを示している。
【０２０５】
図６Ｃは、ＰＩ３ＫδがＴＭＤ８Ｒプール及び８／８クローンで発現する最も優勢なＰＩ３Ｋアイソフォームであり続けたことを示している。ＰＩ３Ｋδ、ＰＩ３Ｋα、ＰＩ３Ｋβ、及びＰＩ３Ｋγのレベルは、それぞれ３２６．５、１０、２５、及び９ｐｇ／μｌであった。ＴＭＤ８Ｒクローンにおいて、ＰＩ３Ｋδ又はＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路の他のメンバー、例えばＰＴＥＮ等において、ＷＥＳにより変異は見出されなかった。図６Ｄは、ＰＴＥＮタンパク質発現の劇的な低下（１／９）が観察されたことを示している。
【０２０６】
図７から明らかなように、ＴＭＤ８Ｒは、ＰＩ３Ｋδ／γ二重阻害剤であるＩＰＩ−１４５（デュベリシブ）に対して交差耐性であることが見いだされた。ＴＭＤ８Ｒに関するデュベリシブのＥＣ５０は＞４μＭであるのに対し、ＴＭＤ８Ｓに関するＥＣ５０は０．５８μＭであることが分かった。
【０２０７】
また、イデラリシブは、感受性だが耐性ではないＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ細胞系においてｃ−Ｍｙｃ ＲＮＡ及びｃ−Ｍｙｃタンパク質を下方調節することも分かった。図８Ａは、イデラリシブ感受性ＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ細胞系及びイデラリシブ耐性ＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ細胞系のＲＮＡｓｅｑ分析であり、感受性細胞系（ＴＭＤ８及びＲｉ−１）では５００ｎＭのイデラリシブ処理によってｃ−Ｍｙｃ ｍＲＮＡが下方調節されたが、耐性細胞系（Ｕ２９３２及びＳＵ−ＤＨＬ−８）では下方調節されなかったことを示している。図８Ｂでは、５００ｎＭのイデラリシブを用いた２４時間のウエスタンブロットにより、ＲＮＡｓｅｑのデータを検証した。図８Ｃに示すように、ＴＭＤ８Ｓではｃ−Ｍｙｃがイデラリシブにより阻害されたが、ＴＭＤ８Ｒでは阻害されなかった。図８Ｄでは、ＲＮＡｓｅｑによって測定したｃ−Ｍｙｃ標的遺伝子の発現が、ＴＭＤ８Ｓ細胞系と比較して、ＴＭＤ８Ｒ細胞系では変化していなかった。イデラリシブによるｃ−Ｍｙｃの下方調節の喪失が、耐性の１つの機序である可能性のあることが明確になった。（Ｒ）、耐性（resistant）；（Ｓ）、感受性（sensitive）。
【０２０８】
リン酸化タンパク質分析によれば、ＴＭＤ８ＲにおいてＰＩ３Ｋ経路及びＭＡＰＫ経路の上方調節が見いだされたが、並列のＢ細胞受容体シグナル伝達経路に対する効果は殆ど又は全く存在しなかった。その結果を図９及び表１２に示す。ウエスタンブロットの定量分析を写真濃度測定によって取得し、ＴＭＤ８Ｓ及びＴＭＤ８Ｒにおける倍数変化を算出した。図９から分かるように、ＴＭＤ８ＲではＰＩ３Ｋ経路及びＭＡＰＫ経路が上方調節されたのに対し、ＢＴＫ経路、ＳＹＫ経路、ＪＡＫ経路、及びＮＦ−κＢ経路は変化しなかった。ｐ−ＳＹＫ信号、ｐ−ＳＴＡＴ３信号、及びｃ−ＪＵＮ信号の低下に現われているように、一部の経路は下方調節された。ｐ−ＥＲＫ及びｐ−ＳＦＫのレベルは変化しなかった。下記の表１２に示すＴＭＤ８Ｒのリン酸化プロテオミクスの結果をＴＭＤ８Ｓ細胞と比較することにより、ウエスタンブロットの結果を検証した。ｐ−ＡＫＴ Ｓ４７３、ｐ−ＡＫＴ Ｔ３０８、ｐ−Ｓ６ Ｓ２３５／２３６、ｐ−ＧＳＫ３βの上方調節から明らかなように、ＰＩ３Ｋ経路及びＭＡＰＫ経路の要素はＴＭＤ８Ｒ細胞で上方調節されたのに対し、並行のＢ細胞受容体シグナル伝達経路では、効果は殆ど又は全く観察されなかった。
【表１２】
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【０２０９】
図１０Ａ及び図１０Ｂから分かるように、ＴＭＤ８Ｒ細胞は、ＢＴＫ阻害剤、イブルチニブ、及び化合物Ｂのそれぞれに対して交差耐性であることが観察された。イブルチニブのＥＣ５０は、ＴＭＤ８Ｓでは０．５であり、ＴＭＤ８Ｒでは＜１０であった。化合物ＢのＥＣ５０は、ＴＭＤ８Ｓでは１．２であり、ＴＭＤ８Ｒでは＜１０であった。
【０２１０】
図１１Ａ〜図１１Ｃから分かるように、ＭＫ−２２０６（ＡＫＴ阻害剤）とイデラリシブの組合せを用いて耐性を克服できることが観察された。１μＭのＭＫ−２２０６ではＥＣ５０＜１０μＭ；１μＭのイデラリシブ＋１μＭのＭＫ−２２０６ではＥＣ５０＝１．６μＭ。図１１Ｂ及び図１１Ｃでは、カスパーゼ３／７は２４時間後の時点で測定し、アネキシンＶは４８時間後の時点で測定した。イデラリシブ＝１μＭ、ＭＫ−２２０６＝１μＭ；Ｎ＝４。両側ｔ検定を用いてｐ値を計算した。ビヒクル対照で処理した細胞（２４％）及びイデラリシブだけで処理した細胞（２１％）と比べて、ＭＫ−２２０６で処理した細胞ではアポトーシスが増加すること（３３％）が分かった。また、ＭＫ−２２０６とイデラリシブの組合せで処理した群も、アポトーシスの増加（４６％）を示した。図１１Ｄは、ＴＭＤ８Ｒ細胞においてイデラリシブに対する耐性がＭＫ−２２０６とイデラリシブの組合せによって低下することを示している。
【０２１１】
ＭＫ−２２０６とイデラリシブの組合せによるＰＩ３Ｋ経路の阻害を更に図１２に示す。図１２では、細胞を１μＭのイデラリシブ、１μＭのＭＫ−２２０６、又はそれらの組合せで２時間処理した。タンパク質溶解物を作製してウエスタンブロットで分析した。ＴＭＤ８Ｒでは、ＴＭＤ８Ｓと比べてｐ−ＡＫＴ Ｓ４７３、ｐ−ＡＫＴ Ｔ３０８、ｐ−Ｓ６ Ｓ２３５／２３６の発現増加が見られた。全タンパク質には変化は見られなかった。単一の化合物を用い他場合、ＴＭＤ８Ｓでは、ＴＭＤ８Ｒと比べてリン酸化タンパク質のより大きな阻害が見られた。イデラリシブとＭＫ−２２０６の組合せは、ＴＭＤ８Ｒ細胞とＴＭＤ８Ｓ細胞とで同じ阻害結果をもたらした。これらの結果は、イデラリシブをＡＫＴ阻害剤と組み合わせることによって、ＴＭＤ８Ｒ細胞においてＰＩ３Ｋ経路の上方調節を調節できる可能性を示唆している。
【０２１２】
図１３Ａ〜図１３Ｃでは、ＧＳＫ−２３３４４７０（ＰＤＫ１阻害剤）とイデラリシブの組合せにより耐性が克服できることが分かった。１μＭのＧＳＫ−２３３４４７０ではＥＣ５０＜１０μＭ；１μＭのイデラリシブ＋１μＭのＧＳＫ−２３３４４７０ではＥＣ５０＝１．６μＭ。図１３Ｂ及び図１３Ｃでは、カスパーゼ３／７を２４時間後の時点で測定し、アネキシンＶを４８時間後の時点で測定した。イデラリシブ＝１μＭ、ＧＳＫ−２３３４４７０＝１μＭ；Ｎ＝４。両側ｔ検定を用いてｐ値を計算した。ＰＩ、ヨウ化プロピジウム。ビヒクル対照、ＧＳＫ−２３３４４７０だけで処理した細胞、及びイデラリシブだけで処理した細胞のアポトーシスは、それぞれ２２％、２１％、及び２４％であった。それと比較して、ＧＳＫ−２３３４４７０とイデラリシブの組合せを用いて処理した細胞では、アポトーシスの増加が見られた（４９％）。図１３Ｄは、ＧＳＫ−２３３４４７０とイデラリシブの組合せにより、ＴＭＤ８Ｒ細胞のイデラリシブ耐性が低下したことを示す。
【０２１３】
ＧＳＫ−２３３４４７０とイデラリシブの組合せによるＰＩ３Ｋ経路の阻害を更に図１４に示す。細胞をビヒクル、イデラリシブ（１μＭ）、ＧＳＫ−２３３４４７０（１μＭ）、又はイデラリシブとＧＳＫ−２３３４４７０の組合せで２時間治療した。タンパク質溶解物をウエスタンブロットによって分析した。ＴＭＤ８ＲではＴＭＤ８Ｓと比べてｐ−ＡＫＴ Ｓ４７３、ｐ−ＡＫＴ Ｔ３０８、ｐ−Ｓ６ Ｓ２３５／２３６の基本的発現が増加することが観察された。全タンパク質には変化は見られなかった。単一の化合物を用いた場合、ＴＭＤ８ＳではＴＭＤ８Ｒと比べてリン酸化タンパク質のより大きな阻害が観察された。イデラリシブとＧＳＫ−２３３４４７０の組合せは、ＴＭＤ８Ｒ細胞とＴＭＤ８Ｓ細胞とで同じ阻害結果をもたらした。これらの結果は、イデラリシブをＰＤＫ１阻害剤と組み合わせることによってＴＭＤ８Ｒ細胞においてＰＩ３Ｋ経路の上方調節を調節できる可能性を示唆している。
【０２１４】
このように、本実施例のデータは、ＭＫ−２２０６又はＧＳＫ−２３３４４７０とイデラリシブとの組合せによる処理が、イデラリシブ耐性の克服に寄与することを示している。
【０２１５】
実施例６：濾胞性リンパ腫ＷＳＵ−ＦＳＣＣＬ細胞系におけるイデラリシブ耐性の機序の研究
本実施例では、濾胞性リンパ腫細胞系（ＷＳＵ−ＦＳＣＣＬ）におけるイデラリシブに対する耐性の機序を解析した。更に、イデラリシブに対する獲得耐性を克服するため、ＰＩ３Ｋ／プロテインキナーゼＢ（ＡＫＴ）経路阻害剤の有効性を評価した。
【０２１６】
材料と方法
ＷＳＵ−ＦＳＣＣＬのクローン単離体を１μＭのイデラリシブの存在下で連続継代し、イデラリシブ耐性を確立した。継代が一致する系（ＦＳＣＣＬＳ）及びイデラリシブ耐性系（ＦＳＣＣＬＲ）から、２回の単一細胞限界希釈を通じてクローン単離体を作製した。９６時間後に、Cell Titer Glo生存アッセイを用いてイデラリシブ又は他の阻害剤による増殖阻害を実施した。変異と遺伝子発現の特徴は、それぞれ全エキソームシークエンシングとＲＮＡ−Ｓｅｑによって同定した。全細胞溶解物をウエスタンブロットによって分析した。
【０２１７】
本実施例で用いた化合物は、（１）イデラリシブ（別名「ＩＤＥＬＡ」）；（２）ＧＤＣ−０９４１；（３）ＢＹＬ−７１９；（４）ＡＺＤ−６４８２；（５）ダサチニブ；及び（６）エントスプレチニブ（別名「ＥＮＴＯ」）等である。
【０２１８】
結果
図１５では、ＦＳＣＣＬがＰＩ３Ｋδ阻害に対して感受性であることが観察された。ＦＳＣＣＬは、イデラリシブ及びＧＤＣ−０９４１に対して同程度の感受性を有することが分かった（それぞれＥＣ５０＝１４０ｎＭ、１８０ｎＭ）。また、ＦＳＣＣＬはＢＹＬ−７１９（ＥＣ５０＞１０μＭ）及びＡＺＤ−６４８２（ＥＣ５０＝４．６μＭ）に対してより感受性が低いことも分かった。
【０２１９】
図１６では、ＦＳＣＣＬＳ及びＦＳＣＣＬＲのイブルチニブに対する感受性がより小さいことが分かった（ＥＣ５０＞１μＭ）。イデラリシブに対して、ＦＳＣＣＬＳは感受性であり（ＥＣ５０＝１００ｎＭ）、ＦＳＣＣＬＲは感受性がより小さいことも分かった（ＥＣ５０＞１０μＭ）。
【０２２０】
図１７Ａ及び図１７Ｂでは、ＦＳＣＣＬＲ ＰＩ３ＫＣＡ変異体（Ｎ３４５Ｋ）が、イデラリシブとＢＹＬ−７１９の組合せに対して回復した感受性を示した。更に、下記の表１３は、ＰＩ３ＫＣＡ Ｎ３４５Ｋ変異ＦＳＣＣＬＲ系の生存性を示している。全エキソームシークエンシング分析から、独立に作製した３組のＦＳＣＣＬＲクローンにおけるＰＩ３ＫＣＡ耐性変異が明らかになった。
【表１３】
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【０２２１】
細胞を無薬剤培地で一晩増殖させた後、０．１％ＤＭＳＯ、６００ｎＭのイデラリシブ、５００ｎＭのＢＹＬ−７１９、又は６００ｎＭのイデラリシブ＋５００ｎＭのＢＹＬ−７１９で２時間処理した。図１８Ａから分かるように、イデラリシブとＢＹＬ−７１９の組合せは、ＦＳＣＣＬＲにおけるｐＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）の発現を低下させる。ＩｇＭによる刺激を含む実験も実施した。細胞を一晩増殖させた後、０．１％血清の中で１時間飢餓状態にした上で（上記の）薬を添加した。２時間後、５μｇ／ｍｌのＩｇＭを培地に１０分間かけて添加した。ＩｇＭ、免疫グロブリンＭ；ｐＡＫＴ、リン酸化ＡＫＴ；Ｓｔｉｍ、刺激。図１８Ｂから分かるように、イデラリシブとＢＹＬ−７１９の組合せは、ＩｇＭで刺激したＦＳＣＣＬＲにおいてｐＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）の発現を低下させる。即ち、ＦＳＣＣＬＲはイデラリシブ処理に対しては耐性であるのに対し、イデラリシブとＢＹＬ−７１９の組合せは、ｐＡＫＴを顕著に低下させて対照細胞系と同等のレベルにした。
【０２２２】
図１９Ａ及び図１９Ｂから分かるように、ＦＳＣＣＬＲ ＳＦＫＨＩＧＨは、ＳＦＫリン酸化（ｐＳＦＫ Ｔｙｒ４１６）、並びに、ＳｒｃファミリーのメンバーであるｐＨｃｋ Ｔｙｒ４１１及びｐＬｙｎ Ｔｙｒ３９６のリン酸化を、ＦＳＣＣＬＳと比べて上方調節した。
【０２２３】
図２０Ａ及び図２０Ｂ、並びに下記の表１４は、イデラリシブとダサチニブの組合せに対してＦＳＣＣＬＲ ＳＦＫＨＩＧＨの感受性が増大することを示している。
【表１４】
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【０２２４】
図２１Ａ及び図２１Ｂ、並びに下記の表１５は、イデラリシブとエントスプレチニブの組合せに対するＦＳＣＣＬＲ ＳＦＫＨＩＧＨの感受性が増大し、ｐＳｙｋがＦＳＣＣＬＳレベルに回復することを示している。
【表１５】
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【０２２５】
全体として、イデラリシブとダサチニブの組合せ、又はイデラリシブとエントスプレチニブの組合せを用いると、単剤だけの場合よりも大きな感受性が観察された。
【０２２６】
図２２Ａ及び図２２Ｂを参照すると、ＦＳＣＣＬＲ ＰＩ３ＫＣＡ ＷＴ単一細胞クローンのＲＮＡ−Ｓｅｑ分析から、あるクローンのサブセットは（１）Ｗｎｔ経路のシグネチャを上方調節し、２つのＦＳＣＣＬＲクローンではＬＥＦ１及びｃ−Ｊｕｎが最も顕著に上方調節され；（２）ウエスタンブロット分析により、ＦＳＣＣＬＲにおいてＬＥＦ１／ＴＣＦ、ｃ−Ｊｕｎ、β−カテニン、ｃ−Ｍｙｃ、及びｐＧＳＫ３βの上方調節が確認された。
【０２２７】
即ち、本実施例のデータは、イデラリシブと共にダサチニブ又はエントスプレチニブを用いた処理が、イデラリシブに対する耐性の克服に寄与することを示している。
【０２２８】
実施例７：化合物Ｂと組み合わせたイデラリシブがＰＩ３Ｋδ阻害剤に対する耐性に及ぼす効果
材料と方法
イデラリシブ耐性（ＴＭＤ８Ｒ）細胞系と、継代が一致したイデラリシブ感受性（ＴＭＤ８Ｓ）細胞系を、上記の実施例５に記載した手順に従って作製した。耐性細胞を特徴解析するため、細胞生存アッセイ、ＡＢＣトランスポータ遺伝子（Ｎ＝３３）の多剤耐性（ＭＤＲ）ファミリーのＲＮＡＳｅｑ、アポトーシスアッセイ、及びリン酸化タンパク質分析を実施した。細胞生存率は、上記の実施例１Ａに記載したようにCellTiter-Gloを用いて測定した。４２０ｎＭのイデラリシブ、３２０ｎＭの化合物Ｂ、及びこれらの組合せで処理した後、Peggy Sue（ProteinSimple社）自動化ウエスタンブロットシステムを用いて、ウエスタンブロット及びタンパク質レベル分析を実施した。組換えタンパク質標準を用いてタンパク質の濃度（ｐｇ／μｌ）を定量した。処理群のそれぞれについて、アクチンに正規化したＡＵＣを求めた。上記の実施例１Ａに記載したように、アポトーシスをヨウ化プロピジウム及びアネキシンＶ／ＦＩＴＣで染色して評価し、フローサイトメトリーによって測定した。抗ｐ−ＡＫＴ（Ｓ４７３）抗体及びPeggy Sueを用いたウエスタンブロットを用いて、下流のシグナル伝達要素のリン酸化状態を決定した。
【０２２９】
結果
細胞生存アッセイは、ＴＭＤ８Ｓ細胞系がイデラリシブに対する感受性を保持していた一方で、ＴＭＤ８Ｒ細胞系はイデラリシブ治療に対して耐性であったことを示していた（それぞれＥＣ５０＝２２０ｎＭ、ＥＣ５０＞１０μＭ）。獲得耐性は、天然の耐性細胞の部分集団の存在によるものではなかった。というのも８つの単一細胞クローン単離体の評価は全て、イデラリシブに対する耐性を示していたからである（データは示さず）。また、ＴＭＤ８Ｓ及びＴＭＤ８Ｒ細胞系におけるＡＢＣトランスポータのＭＤＲファミリーのＲＮＡｓｅｑ分析の結果は、ＭＤＲの上方調節が耐性の機序ではなかったことを示している（データは示さず）。
【０２３０】
図２３Ａに示すように、イデラリシブ及び化合物Ｂは何れも、ＴＭＤ８Ｓ細胞系の細胞増殖を阻害したが、ＴＭＤ８Ｒ細胞系は阻害しなかった。両薬剤を組合せて用いたところ、ＴＭＤ８Ｓ細胞系の感受性は回復した。
【０２３１】
また、図２３Ｂの結果は、イデラリシブ単独での処理及び組合せによる処理によってｐ−ＡＫＴが阻害されたが、化合物Ｂによる処理では阻害されなかったこと、また、化合物Ｂ単独での処理及び組合せによる処理によってｐ−ＢＴＫが阻害されたが、イデラリシブによる処理では阻害されなかったことを示している。また、組合せにより処理した細胞では、単剤で処理した細胞と比べて、ｃ−Ｍｙｃに対する阻害が増加することも分かった。
【０２３２】
実施例８：腫瘍異種移植片モデルにおけるＰＩ３Ｋδ及びＢＴＫの阻害が腫瘍退縮に及ぼす効果
材料と方法
腫瘍異種移植片モデル：放射線照射マウスに培養ＴＭＤ８細胞を導入してＴＭＤ８腫瘍異種移植片モデルを作製した。何れの動物実験もInstitutional Animal Care and Use Committee（ＩＡＣＵＣ）のプロトコルに従って実施した。オスCB17-SCIDマウスに６０Ｃｏ放射線源を用いて１.４４Ｇｙを全身照射し、７４時間後、１×１０７個のＴＭＤ８細胞を右脇腹に皮下注射で接種した。腫瘍の平均体積が２００ｍｍ３に到達したとき、マウスをランダムに複数の群に割り当てた（n＝１３）。これらの群に、ビヒクル、１ｍｇ／ｋｇ及び５ｍｇ／ｋｇのＰＩ３Ｋδ阻害剤、又は５ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ化合物Ｂを、単剤又は組合せで１日２回、経口摂取により投与体積５ｍｌ／ｋｇで投与した。何れの試験化合物も、５％（ｖ／ｖ）Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）／５５％（ｖ／ｖ）ポリエチレングリコール３００（ＰＥＧ３００）／４０％（ｖ／ｖ）水／１％（ｗ／ｖ）ビタミンＥコハク酸Ｄ−α−トコフェロールポリエチレングリコール１０００（ＴＰＧＳ）により製剤化した。腫瘍体積は式（長さ×幅２）／２を用いて算出した。但し長さは腫瘍を横断する最長直径であり、幅はそれに対する垂直な直径である。腫瘍増殖阻害率は式１−（腫瘍サイズ化合物治療の終点−腫瘍サイズ化合物治療の始点／腫瘍サイズビヒクル治療の終点−腫瘍サイズビヒクル治療の始点）×１００を用いて計算した。
【０２３３】
ウエスタンブロット：前記試験で得られた腫瘍サンプルを溶解し、当該サンプルにウエスタンブロットを実施し、ＢＴＫ及びＳ６（ＰＩ３Ｋシグナル伝達の下流エフェクター）のリン酸化レベルを求めた。ウエスタンブロットは、上記実施例３Ｂに記載したウエスタンブロット手順に従い、ｐ−Ｓ６（Ｓ２３５／２３６）、ｐ−ＢＴＫ（Ｙ２２３）、ＢＴＫ、及びアクチンに対する抗体を用いて実施した。タンパク質レベルは、Peggy Sue（ProteinSimple社）自動化ウエスタンブロットシステムを用いて求めた。処理群のそれぞれについて正規化されたＡＵＣを求めた。ｐ−ＢＴＫ（Ｙ２２３）は全ＢＴＫタンパク質に対して正規化し、ｐ−Ｓ６（Ｓ２３５／２３６）はアクチンに対して正規化した。
【０２３４】
免疫組織化学：免疫組織化学用に腫瘍サンプルのパラフィン切片を調製した。EZ Prep（Ventana Medical Systems社）及びＣＣ１（Ventana Medical Systems社）を用いてスライドの準備を整え、Reaction Buffer（Ventana Medical Systems社）でリンスした。スライドをChromoMap阻害剤（Ventana Medical Systems社）と共にインキュベートし、Reaction Bufferリンスをリンスした後、０．０２μｇ／ｍｌの抗ｐＳ６（Ｓ２３５／２３６）ウサギモノクローナル抗体（Cell Signaling Technology社）又は０.３μg／ｍｌの抗ｃ−ＭＹＣウサギモノクローナル抗体（Abcam Inc.社）と共にインキュベートした。１時間室温にした後、スライドを順番に抗ウサギＨＱ（Ventana Medical Systems社）、抗ＨＱ ＨＲＰ（Ventana Medical Systems社）、過酸化水素ＣＭ（Ventana Medical Systems社）、銅ＣＭ（Ventana Medical Systems社）、ヘマトキシリンIIと共にインキュベートした。Leica AT２ディジタルスライドスキャナ（Leica Microsystems Inc.社）を用いてスライドの画像を取得し、Digital Image Hub（DIH−SlidePath社）に記録した。
【０２３５】
統計分析：反復測定用分散モデルの分析を用いて、腫瘍増殖に対する治療効果を決定した。腫瘍体積にフィットさせるモデルは、治療法、時間、及び両者の相互作用の因子を含むものであった。また、ベースラインの腫瘍体積も共変量として含まれていた。反復測定値間の共分散を直前値依存（ante-dependence）構造により仮定した。８つの単剤処理群及び組合せ処理群をビヒクル対照とダネット多重比較調節法で比較した。４つの組合せ処理群のそれぞれを２つの対応する単剤処理群とも比較した。多変量ｔ法を多重比較調節法に適用した。モデルの仮定に合致するよう対数変換を腫瘍体積に適用した。ＳＡＳ（登録商標）９．２（SAS Institute, Inc.社）を用いて分析を実施した。
【０２３６】
結果
図２４Ａは、ＰＩ３Ｋδ阻害剤とＢＴＫ阻害剤（化合物Ｂ）の組合せで処理したＴＤＭ８異種移植片モデルマウスにおける腫瘍体積の変化を、ビヒクル対照及び単剤治療と比較して示す図である。腫瘍体積評価によれば、ＰＩ３Ｋδ阻害剤単独の場合、１ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤ又は５ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤの何れでも腫瘍の増殖が阻害されなかったのに対し、化合物Ｂ単独の場合、３ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤでは腫瘍の増殖が阻害されなかったが、１０ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤでは腫瘍の増殖が７５％阻害されたことが分かった（Ｐ＜０．０５）。ＰＩ３Ｋδ阻害剤と化合物Ｂの組合せを投与されたマウスは、低用量及び高用量の何れにおいても腫瘍増殖阻害を示し、試験された全ての用量の組合せで腫瘍が退縮した（Ｐ＜０．０００１）。
【０２３７】
図２４Ｂ〜図２４Ｄは、ＰＩ３Ｋδ阻害剤とＢＴＫ阻害剤（化合物Ｂ）の組合せで処理したＴＤＭ８異種移植片モデルマウス（各群Ｎ＝１３）におけるＢＴＫとＰＩ３Ｋの活性化に関するウエスタンブロット分析の結果を、ビヒクル対照治療及び単剤治療と比較して示す図である。図２４Ｃ及び図２４Ｄは、各処理群の腫瘍の平均定量値を示している（ビヒクル群、ＰＩ３Ｋδ阻害剤群、及び化合物Ｂ群ではｎ＝３、組合せではｎ＝２）。ＢＴＫの活性化は、ｐ−ＢＴＫで示されるように、化合物Ｂ処理群では３５％低下した。化合物Ｂ及びＰＩ３Ｋδ阻害剤はそれぞれ単独ではｐ−Ｓ６に対する効果を有さなかったが、化合物ＢとＰＩ３Ｋδ阻害剤の組合せを用いた治療ではｐ−Ｓ６が７９％低下した。
【０２３８】
免疫組織化学（ＩＨＣ）分析の結果は、ＰＩ３Ｋδ阻害剤（５ｍｇ／ｋｇ）と化合物Ｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）の組合せを用いて処理した群で、ｐ−Ｓ６とｃ−ＭＹＣの信号が低下したことを示していた（データは示さず）。一方、ＰＩ３Ｋδ阻害剤（５ｍｇ／ｋｇ）又は化合物Ｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）の単剤治療では、ｐ−Ｓ６ Ｓ２３５／２３６及びｃ−ＭＹＣのレベルは低下しなかった（データは示さず）。
【０２３９】
まとめると、ＰＩ３Ｋδ及びＢＴＫシグナル伝達経路の双方を阻害すると、多数のシグナル伝達経路に対して相乗効果を示し、両シグナル伝達経路の阻害剤を組合せて投与すれば、インビボで腫瘍退縮が観察される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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