(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、ヒト以外の生物の真核生殖系列細胞を改変する方法。
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼをコードする配列、１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードする配列、および前記ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼと前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡとを発現させるための１つまたは複数のプロモーター配列を、第１の隣接配列および第２の隣接配列の間に含む第１の外来核酸配列を、前記生殖系列細胞に導入すること；
ここで、前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが、前記生殖系列細胞の染色体対の第１の染色体のゲノムＤＮＡ上および第２の染色体のゲノムＤＮＡ上の１つまたは複数の標的部位に相補的であり、
前記第１の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上または前記第２の染色体上の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、
前記第２の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上または前記第２の染色体上の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含み、
前記１つまたは複数の標的部位が前記第１の部分と前記第２の部分の間に位置する、
前記第１の外来核酸配列を発現させて前記ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼおよび前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡを産生させること；
ここで、前記ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼおよび前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡに含まれるガイドＲＮＡが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上および前記ゲノムＤＮＡの前記第２の染色体上の該ガイドＲＮＡに相補的な標的部位に共局在し、前記ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体を該標的部位で切断部位特異的に切断し、且つ前記ゲノムＤＮＡの前記第２の染色体を前記標的部位で切断部位特異的に切断する、
前記第１の外来核酸配列を、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体対の前記第１の染色体中に前記切断部位で挿入し、前記第１の外来核酸配列を、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体対の前記第２の染色体中に前記切断部位で挿入して、前記生殖系列細胞を前記外来核酸配列についてホモ接合型にすること；
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼをコードする配列、１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードする配列、および前記ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼと前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡとを発現させるための１つまたは複数のプロモーター配列を、第３の隣接配列および第４の隣接配列の間に含む第２の外来核酸配列を、前記生殖系列細胞に導入すること；
ここで、前記第２の外来核酸配列にコードされる前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが、前記第１の外来核酸配列によって改変された前記１つまたは複数の標的部位に相補的であり、
前記第３の隣接配列が、前記第１の外来核酸配列によって改変された前記第１の染色体上または前記第２の染色体上の第３の部分と同じ配列である第３の配列を含み、
前記第４の隣接配列が、前記第１の外来核酸配列によって改変された前記第１の染色体上または前記第２の染色体上の第４の部分と同じ配列である第４の配列を含み、
前記第１の外来核酸配列によって改変された前記１つまたは複数の標的部位が前記第３の部分と前記第４の部分の間に位置する、
前記第２の外来核酸配列を発現させて前記ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼおよび前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡを産生させること；
ここで、前記ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼおよび前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡに含まれるガイドＲＮＡが、前記第１の外来核酸配列によって改変されており且つ該ガイドＲＮＡに相補的な標的部位に共局在し、前記ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼが、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体を前記第１の外来核酸配列によって改変された該標的部位で切断部位特異的に切断して前記第１の外来核酸配列を除去する、および
前記第２の外来核酸配列を前記ゲノムＤＮＡの前記染色体中に前記切断部位で挿入すること。
【請求項２】
前記ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼが二本鎖切断又は一本鎖切断を生じさせる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼがＣａｓ９である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼがＣａｓ９ニッカーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つの標的部位が必須遺伝子内に存在し、前記第１の外来核酸配列が前記必須遺伝子に隣接して挿入されて、前記必須遺伝子の一部を置換する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の外来核酸配列が相同組換えにより挿入される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記生殖系列細胞が、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の外来核酸配列にコードされる前記ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼおよびガイドＲＮＡの共局在が、２種以上のガイドＲＮＡにより複数の標的部位で起こり、前記第１の染色体または前記第２の染色体を複数の切断部位で切断する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記複数の切断部位での切断により、ＤＮＡ配列が除去され、相同組換えによって前記第１の外来核酸配列で置換される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第２の外来核酸配列が、前記第１の外来核酸配列とは異なる遺伝的改変を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記第２の外来核酸配列が、前記第１の外来核酸配列によって改変された染色体の野生型配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
以下を含む、ヒト以外の生物の真核生殖系列細胞を複数の遺伝子において改変する方法。
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼをコードする配列、複数のガイドＲＮＡをコードする配列、およびＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼと前記複数のガイドＲＮＡとを発現させるための１つまたは複数のプロモーター配列を、第１の隣接配列および第２の隣接配列の間に含む第１の外来核酸配列を、前記複数の遺伝子中に挿入されるための１種類または複数種類の外来核酸配列Ａと共に前記生殖系列細胞に導入すること；
ここで、前記複数のガイドＲＮＡが、前記生殖系列細胞の染色体のゲノムＤＮＡ中の複数の遺伝子上の１つまたは複数の標的部位に相補的な１種類または複数種類の遺伝子特異的ガイドＲＮＡを含み、
前記第１の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、
前記第２の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含み、
少なくとも１つの標的部位が前記第１の部分と前記第２の部分の間に位置し、
前記１種類または複数種類の外来核酸配列Ａの各々が、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の第３の部分と同じである第３の隣接配列および第４の部分と同じである第４の隣接配列を含み、
外来核酸配列Ａが複数種類存在する場合、それぞれの外来核酸配列Ａの第３の隣接配列同士は互いに独立した配列であり、かつ、それぞれの外来核酸配列Ａの第４の隣接配列同士も互いに独立した配列であり、
少なくとも１つの標的部位が前記第３の部分と前記第４の部分の間に位置し、
前記第１の外来核酸配列を発現させて前記ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼおよび前記複数のガイドＲＮＡを産生させること；
ここで、前記ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼおよび前記複数のガイドＲＮＡに含まれるガイドＲＮＡが、前記複数の遺伝子上の該ガイドＲＮＡに相補的な標的部位に共局在し、前記ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼが、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体を複数の遺伝子において切断部位特異的に切断する、
前記第１の外来核酸配列および前記１種類または複数種類の外来核酸配列Ａを前記ゲノムＤＮＡの前記染色体中に前記複数の切断部位で挿入すること；
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼをコードする配列、複数のガイドＲＮＡをコードする配列、および前記ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼと前記複数のガイドＲＮＡとを発現させるための１つまたは複数のプロモーター配列を、第５の隣接配列および第６の隣接配列の間に含む第２の外来核酸配列を、前記生殖系列細胞に導入すること；
ここで、前記第２の外来核酸配列にコードされる前記複数のガイドＲＮＡが、前記第１の外来核酸配列および前記１種類または複数種類の外来核酸配列Ａによって改変された前記複数の標的部位に相補的であり、
前記第５の隣接配列が、前記第１の外来核酸配列によって改変された前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の第５の部分と同じ配列である第５の配列を含み、
前記第６の隣接配列が、前記第１の外来核酸配列によって改変された前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の第６の部分と同じ配列である第６の配列を含み、
少なくとも１つの標的部位が前記第５の部分と前記第６の部分の間に位置する、
前記第２の外来核酸配列を発現させて前記ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼおよび前記複数のガイドＲＮＡを産生させること；
ここで、前記ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼおよび前記複数のガイドＲＮＡに含まれるガイドＲＮＡが、前記第１の外来核酸配列によって改変されており且つ該ガイドＲＮＡに相補的な標的部位に共局在し、前記ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼが、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体を前記第１の外来核酸配列によって改変された該標的部位で切断部位特異的に切断して前記第１の外来核酸配列を除去する、および
前記第２の外来核酸配列を前記ゲノムＤＮＡの前記染色体中に前記切断部位で挿入すること。
【請求項１３】
前記第２の外来核酸配列が、前記第１の外来核酸配列とは異なる遺伝的改変を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第２の外来核酸配列が、前記第１の外来核酸配列によって改変された前記染色体の野生型配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
以下を含む、ヒト以外の生物の真核生殖系列細胞を改変する方法。
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼをコードする配列、１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードする配列、前記生物が特定の化学物質、化合物、または条件に晒された場合にその発現が前記生物にとって有害である感作核酸（sensitizing nucleic acid）配列、および前記ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼと前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡと前記感作核酸配列とを発現させるための１つまたは複数のプロモーター配列を、第１の隣接配列および第２の隣接配列の間に含む第１の外来核酸配列を、前記生殖系列細胞に導入すること；
ここで、前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが、前記生殖系列細胞の染色体対の第１の染色体のゲノムＤＮＡ上および第２の染色体のゲノムＤＮＡ上の１つまたは複数の標的部位に相補的であり、
前記第１の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上または前記第２の染色体上の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、
前記第２の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上または前記第２の染色体上の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含み、
前記１つまたは複数の標的部位が前記第１の部分と前記第２の部分の間に位置する、
前記第１の外来核酸配列を発現させて前記ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼおよび前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡを産生させること；
ここで、前記ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼおよび前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡに含まれるガイドＲＮＡが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上および前記ゲノムＤＮＡの前記第２の染色体上の該ガイドＲＮＡに相補的な標的部位に共局在し、前記ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体を前記標的部位で切断部位特異的に切断し、且つ前記ゲノムＤＮＡの前記第２の染色体を前記標的部位で切断部位特異的に切断する、
前記第１の外来核酸配列を前記ゲノムＤＮＡの前記染色体対の前記第１の染色体中に前記切断部位で挿入し、前記第１の外来核酸配列を前記ゲノムＤＮＡの前記染色体対の前記第２の染色体中に前記切断部位で挿入して、前記生殖系列細胞を前記外来核酸配列についてホモ接合型にすること；および
生じた生物が前記化学物質、化合物、または条件に晒された場合に死滅するまたは生殖不能になるように、前記生じた生物を前記化学物質、化合物、または条件に対して感受性にする前記感作核酸配列を発現させること。
【請求項１６】
前記感作核酸配列の発現により、前記生物に対する前記化学物質、化合物、または条件の毒性が増大する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記生殖系列細胞を生物へと成長させ、前記感作核酸配列を子孫に移行させて、前記感作核酸配列を含む生物の集団を作り出し、前記感作核酸配列が前記生物に対する前記化学物質、化合物、または条件の毒性を増大させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記生物が雑草または有害生物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記感作核酸配列が、現存遺伝子を置換する感作遺伝子をコードする配列である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記感作遺伝子配列が、野生集団中の現存変異遺伝子の正確なまたはコドンを改変した祖先バージョンであり、前記現在の変異バージョンが前記祖先形態で置換される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記現存遺伝子が、農薬、除草剤、または殺真菌剤に対する抵抗性に寄与する変異を獲得している、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記化学物質または化合物が、農薬、除草剤、または殺真菌剤である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
前記農薬、除草剤、または殺真菌剤が、Ｃｒｙ１Ａ．１０５、ＣｒｙＩＡｂ、ＣｒｙＩＦ、Ｃｒｙ２Ａｂ、Ｃｒｙ３Ｂｂ１、Ｃｒｙ３４Ａｂ１、Ｃｒｙ３５Ａｂ１、ｍＣｒｙ３Ａ、もしくはＶＩＰによって産生されるＢｔ毒素、２，４−Ｄ、またはグリホサートのいずれかである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記感作遺伝子配列が、前記生物の生存または生殖にその機能が必要とされる現存遺伝子の配列を置換する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記化学物質がプロドラッグであり、前記感作核酸配列が対応するプロドラッグ変換酵素をコードする配列である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
前記プロドラッグ変換酵素と化学物質の組み合わせが、シトシンデアミナーゼと５−フルオロシトシン、またはニトロレダクターゼとＣＢ１９５４である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
以下を含む、第１の感作遺伝子ドライブを含むヒト以外の生物の真核生殖系列細胞を改変する方法。
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼをコードする配列、１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードする配列、前記生物が特定の化学物質、化合物、または条件に晒された場合にその発現が前記生物にとって有害である第２の感作核酸配列、および前記ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼと前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡと前記第２の感作核酸配列を発現させるための１つまたは複数のプロモーター配列を、第１の隣接配列および第２の隣接配列の間に含む第２の外来核酸配列を、前記生殖系列細胞に導入すること；
ここで、前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが、前記第１の感作遺伝子ドライブを含む前記生殖系列細胞の染色体対の前記第１の感作遺伝子ドライブを含む第１の染色体のゲノムＤＮＡ上および第２の染色体のゲノムＤＮＡ上の１つまたは複数の標的部位に相補的であり、
前記第１の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上または前記第２の染色体上の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、
前記第２の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上または前記第２の染色体上の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含み、
前記１つまたは複数の標的部位が前記第１の部分と前記第２の部分の間に位置する、
前記第２の外来核酸配列を発現させて前記ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼおよび前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡを産生させること；
ここで、前記ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼおよび前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡに含まれるガイドＲＮＡが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上および前記ゲノムＤＮＡの前記第２の染色体上の該ガイドＲＮＡに相補的な標的部位に共局在し、前記ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ又はニッカーゼが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体を前記標的部位で切断部位特異的に切断し、且つ前記ゲノムＤＮＡの前記第２の染色体を前記標的部位で切断部位特異的に切断する、
前記第２の外来核酸配列を前記ゲノムＤＮＡの前記染色体対の前記第１の染色体中に前記切断部位で挿入し、前記第２の外来核酸配列を前記ゲノムＤＮＡの前記染色体対の前記第２の染色体中に前記切断部位で挿入して、前記生殖系列細胞を前記第２の外来核酸配列についてホモ接合型にすること；および
生じた生物が前記化学物質、化合物、または条件に晒された場合に死滅するまたは生殖不能になるように、前記生じた生物を前記化学物質、化合物、または条件に対して感受性にする前記第２の感作核酸配列を発現させること。
【請求項２８】
前記生じた生物と野生型生物との子孫が前記第２の感作核酸配列を含むように、前記生じた生物を野生型集団中に導入する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記生物が雑草または有害生物である、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願データ
本願は、２０１４年１月８日に提出された米国仮特許出願第６１／９２４，７３５号、および２０１４年７月１５日に提出された米国仮特許出願第６２／０２４，６４２号に基づく優先権を主張するものであり、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に組み入まれる。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子ドライブ（gene drive）は、子孫（progeny）にそれらの遺伝が有利に遺伝して受け継がれるように天然のオッズを歪める遺伝因子として一般に知られる。例としては、それを欠く染色体中に自身をコピーするホーミングエンドヌクレアーゼ遺伝子、減数分裂中に競合染色体を破壊する分離ひずみ因子（segregation distorter）、ゲノム中の別の場所に自身のコピーを挿入するトランスポゾン、それを受け継がない競合する同胞（sibling）を排除するＭｅｄｅａ因子、および細胞質不和合を引き起こして感染個体の拡散に有利に働くボルバキア（Wolbachia）などの母性遺伝性の微生物が挙げられる。これらは自然選択の通常のルールを回避するので、これらの因子は全て、媒介昆虫集団中に人工的変異を拡散させて疾患の拡大を阻止することができる潜在的「遺伝子ドライブ」システムと考えられてきた。マラリア蚊集団を遺伝的に制御する手段として、ホーミングエンドヌクレアーゼに基づく遺伝子ドライブが提唱されている。Windbichler et al., Nature, doi:10.1038/nature09937 (2011) 参照。自然母集団の制御および遺伝子操作のためのツールとして、部位特異的利己的遺伝子が提唱されている。Burt, Proc. R. Soc. Lond. B (2003) 270, 921-928 (2003) 参照。しかし、提唱されたこれらの遺伝子ドライブは、部位特異性が限定されているか、種々の生物中で発現させることが困難である。したがって、任意の所望の遺伝子を標的とし、幅広い生物に用いることが可能な遺伝子ドライブの開発が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本開示の態様は、ＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブ（RNA guided gene drive）に関し、特に所望の生物の生殖系列細胞中に安定に導入される外来核酸配列に関する。本明細書において、外来核酸配列という用語およびＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブという用語は、本明細書中で交換可能に使用され得る。結果として生じるトランスジェニック生物は、生殖系列細胞から発生させてもよい。次に、結果として生じるトランスジェニック生物を野生型集団中に導入してもよく、トランスジェニック生物と野生型生物との交配によって、外来核酸配列が結果として生じる子（offspring）または子孫に移行する。結果的に、本開示の方法は、最初のトランスジェニック生物および野生型生物から、所望の形質を有するトランスジェニック生物の集団を作り出すことに関する。トランスジェニック生物が野生型集団中に導入され、野生型生物と交配した場合、生じた子孫は、改変野生型集団と呼ばれ得る。トランスジェニック子またはトランスジェニック子孫のゲノム中に外来核酸配列が安定的に導入された結果、トランスジェニック子またはトランスジェニック子孫は、外来核酸の発現の結果生じる１種類または複数種類の所望の形質を有し得る。ある態様によれば、本明細書に記載の方法は、トランスジェニック生物が外来核酸の発現の結果生じる１種類または複数種類の所望の形質を示す、改変されたトランスジェニック生物の野生型集団を作り出すために用いられ得る。
【０００４】
ある態様によれば、外来核酸配列は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼ、またはヌクレアーゼ欠損（nuclease null）ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質のうちの１種類または複数種類などのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質と、１種類以上または複数種類のガイドＲＮＡ（リボ核酸）とを少なくともコードする。ガイドＲＮＡは、生殖系列細胞のゲノム中の標的ＤＮＡなどのＤＮＡ（デオキシリボ核酸）に相補的である。外来核酸配列はさらに、生殖系列細胞が、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質およびガイドＲＮＡ、または外来核酸配列中に存在し得る任意の他の核酸配列もしくは遺伝子を発現し得るように、少なくとも１種類または複数種類のプロモーターをコードする。当業者は、本開示および具体的な生殖系列細胞に基づいて、好適なプロモーターを容易に特定可能であろう。外来核酸配列はまた、生殖系列細胞による外来核酸配列の発現に必要であることが当業者に知られる任意の他の１種類または複数種類の核酸配列を含んでいてもよい。外来核酸配列はまた、生殖系列細胞によって発現されることが望まれる任意の他の１種類または複数種類の遺伝子配列を含んでいてもよい。そのような１種類または複数種類の遺伝子配列は、「カーゴＤＮＡ（cargo DNA）」と呼ばれ得る。細胞が外来核酸配列を発現する場合に生殖系列細胞によってまたは生殖系列細胞から発生した生物によって示されることを当業者が望む所望の形質に応じて、１種類または複数種類の遺伝子配列を当業者は容易に特定し得ると理解されるであろう。外来核酸配列はまた、少なくともＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類のガイドＲＮＡに隣接する少なくとも２つの隣接配列（flanking sequence）をコードする。当業者に知られるように、隣接配列は、特定の核酸配列が複数の隣接配列の間になるように、特定の核酸配列の両側に位置する。ある態様によれば、隣接配列は、選択された染色体上の対応する配列と同一の配列を少なくとも含む。ある態様によれば、そのような隣接配列により、相同組換えまたは非相同末端結合などのよく解明された機構を用いて、細胞が外来核酸配列をそのゲノムＤＮＡ中に切断部位で挿入することが可能になる。
【０００５】
ある態様によれば、外来核酸配列が生殖系列細胞によって発現される場合、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質の１種類または複数種類、および１種類または複数種類のガイドＲＮＡが産生される。ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質およびガイドＲＮＡは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質と、ガイドＲＮＡと、二本鎖ＤＮＡ標的配列との複合体を形成する。この態様では、ＲＮＡは、ＤＮＡ結合タンパク質を結合のために二本鎖ＤＮＡ標的配列へとガイドすると考えられている。本開示のこの態様は、ＲＮＡおよびＤＮＡ結合タンパク質の二本鎖ＤＮＡへのまたは二本鎖ＤＮＡとの共局在と呼ばれることがある。
【０００６】
本開示の範囲内のＤＮＡ結合タンパク質は、二本鎖切断（double stranded break）を形成するＤＮＡ結合タンパク質（ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼと呼ばれることもある）、一本鎖切断を形成するＤＮＡ結合タンパク質（ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼと呼ばれる）、またはヌクレアーゼ活性を有さないが標的ＤＮＡに結合するＤＮＡ結合タンパク質（ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質と呼ばれる）を含み得る。このように、標的ＤＮＡ部位で二本鎖切断を形成、標的ＤＮＡ部位で一本鎖切断を形成、または細胞によって発現され得る転写調節タンパク質もしくはドメインを標的ＤＮＡ部位に局在させて標的ＤＮＡの発現を調節するために、ＤＮＡ結合タンパク質−ガイドＲＮＡ複合体が用いられ得る。ある態様によれば、外来核酸配列は、ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ、ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼ、またはヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質の１種類または複数種類をコードし得る。外来核酸配列はさらに、１種類または複数種類の転写調節タンパク質もしくはドメイン、またはゲノムＤＮＡ中に挿入することが意図される１種類または複数種類のドナー核酸配列をコードし得る。ある態様によれば、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質をコードする外来核酸配列は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質に融合した転写調節タンパク質またはドメインをさらにコードする。ある態様によれば、１種類または複数種類のＲＮＡをコードする外来核酸配列は、ＲＮＡ結合ドメインの標的をさらにコードし、転写調節タンパク質またはドメインをコードする外来核酸は、転写調節タンパク質またはドメインに融合したＲＮＡ結合ドメインをさらにコードする。
【０００７】
したがって、生殖系列細胞による外来核酸配列の発現により、ゲノムＤＮＡの二本鎖切断、一本鎖切断、および／または転写の活性化もしくは抑制が引き起こされ得る。ドナーＤＮＡは、相同組換えまたは非相同末端結合などの細胞機構により、切断部位に挿入され得る。本明細書に記載されるように外来核酸配列の発現により、所望により、１種類または複数種類の遺伝子配列を含む標的ゲノムＤＮＡ中の種々の位置で、複数の二本鎖切断または一本鎖切断が生じ得ることが理解されるべきである。
【０００８】
本開示の態様は遺伝子ドライブとしての外来核酸配列の使用に関する。遺伝子ドライブの概念は当業者に周知であり、発現された場合に、導入された細胞のゲノム中に自身を挿入可能な外来核酸配列を指す。遺伝子ドライブの概念は、それぞれの全体が参照により援用されるWindbichler et al., Nature, doi:10.1038/nature09937 (2011) およびBurt, Proc. R. Soc. Lond. B (2003) 270, 921-928 (2003) に記載される。
【０００９】
本開示のある態様によれば、本明細書に記載の外来核酸配列は、生殖系列細胞中に導入された場合に遺伝子ドライブとして働く。ある態様によれば、外来核酸配列は、生殖系列細胞によって発現されてＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質およびガイドＲＮＡを産生する。ガイドＲＮＡは、染色体上の標的ＤＮＡ配列に相補的である。ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質およびガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡに共局在し、標的ＤＮＡは部位特異的に切断される。標的ＤＮＡは、染色体対の一方または両方の染色体上の標的ＤＮＡ部位であってもよい。次に、外来核酸配列は、例えば相同組換えにより、ゲノムＤＮＡ中に標的ＤＮＡ切断部位で挿入される。ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質により各染色体が部位特異的に切断された場合、外来核酸配列は、染色体対の一方または両方の染色体のゲノムＤＮＡ中に挿入されてもよい。染色体対の両方の染色体に挿入された場合、生殖系列細胞は、外来核酸配列についてホモ接合型である。別の実施形態によれば、外来核酸配列は、染色体対の第１の染色体中に挿入される。次に、挿入された外来核酸配列が細胞によって発現され、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質およびガイドＲＮＡが染色体対の第２の染色体でまたは第２の染色体に共局在し、次に、第２の染色体は第１の染色体と同様に部位特異的に切断される。次に、第２の染色体中の切断された標的ＤＮＡは、例えば相同組換えにより、第１の染色体を鋳型に用いて修復される。このようにして、外来核酸配列を含むように第２の染色体が修復される結果、外来核酸配列についてホモ接合型、すなわち、染色体対の第１の染色体および第２の染色体の両方に外来核酸配列が存在する、生殖系列細胞が得られる。損傷を受けた、開裂された（cleaved）、または切断された（cut）ゲノムＤＮＡを、細胞が修復する機構は周知である。本開示の態様は、細胞が外来遺伝物質についてホモ接合型となる、細胞のゲノムＤＮＡに挿入する所望の外来遺伝物質を有する遺伝子ドライブを創出するために、これらの細胞機構を、ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼまたはニッカーゼと組み合わせて利用する。次に、外来遺伝物質は子孫へと受け継がれ、１種類または複数種類の所望の形質を有するトランスジェニック生物の集団が生じる。
【００１０】
遺伝子ドライブとして本明細書に記載されるような外来核酸配列の概念を用いて、外来遺伝物質を生物の野生集団に組み込む方法が提供される。外来遺伝物質について細胞をホモ接合型にする方法が提供される。生物の野生集団を通じて遺伝子改変を拡散する方法が提供される。人間が設計した遺伝子改変を生物の野生集団を通じて拡散する方法が提供される。生物の野生集団を通じて人間が設計した遺伝子改変を拡散することによる、パンゲノム工学（pan genome engineering）のための方法が提供される。野生種のゲノムを編集する方法が提供される。生物のゲノムＤＮＡの複数の座位を編集する方法が提供される。ゲノム座位を多重編集する方法が提供される。生物のゲノムＤＮＡの１つまたは複数の座位を可逆的に編集する方法が提供される。
【００１１】
本明細書に記載の遺伝子ドライブの所望の機能に基づいて、生物の野生型集団を通じた遺伝子流動（gene flow）を制御する方法が提供される。生物の標的集団の拡大を抑制する方法が提供される。生物の標的集団を減少させるか、または排除する方法が提供される。生物の標的集団を増加させる方法が提供される。マラリアなどの病原媒介生物による疾患（vector born disease）を減少させるか、または排除する方法が提供される。媒介昆虫集団などの標的生物による疾患の拡散を低減する方法が提供される。標的生物による疾患伝染の原因遺伝子を破壊する方法が提供される。生殖系列細胞中のＹ染色体を破壊する方法が提供される。生殖系列細胞中のＸ染色体を破壊する方法が提供される。侵入有害生物（invasive pest）を制御する方法が提供される。生態学的変化に脅かされている種を保存する方法が提供される。
【００１２】
ある態様によれば、（１）破壊された場合にその表現型が優性阻害（dominant negative）致死である遺伝子の再コード化コピーを、野生型コピーがコードされている同じ染色体の遠位領域（distal region）に挿入すること、および（２）同じ遺伝子の野生型バージョンに代わって自身をコピーする利己的遺伝因子（すなわち、本明細書に記載されるようなＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブであり、遺伝子ドライブという用語は当業者に理解されている）を挿入することを含む、改変生物から野生型集団への遺伝子流動を阻止する方法が提供され、その結果、改変生物と改変生物との子の全てが、再コード化遺伝子の機能的コピーを２つ含み、一方、改変生物と野生型生物との子は、利己的遺伝因子が野生型コピーを置換した後には、再コード化遺伝子のコピーを１つのみ有し、野生型染色体上に再コード化遺伝子をコピーできなくなる。
【００１３】
ある態様によれば、固有配列を有する亜集団と残りの集団との間の遺伝子流動を阻止する方法であって、（１）固有配列を用いてのみ拡散し、且つ破壊された場合にその表現型が優性阻害である遺伝子の一部をゲノム中の別の場所に挿入する、第１の利己的遺伝因子を放出（release）すること、（２）部分的遺伝子配列を用いてのみ拡散し、遺伝子の再コード化バージョンを挿入し、且つ遺伝子の野生型コピーを破壊する、第２の利己的遺伝因子を放出することを含む方法が提供され、その結果、（１）第１の利己的遺伝因子を有する生物と第２の利己的遺伝因子を有する生物との交配により生じる子の全てが第２の利己的遺伝因子を含み、遺伝子の野生型コピーの両方が破壊されているがゲノム中の別の場所で再コード化コピーによって置換されており、（２）遺伝子の野生型コピーが失われ且つ再コード化コピーによって置換されていないため、第２の利己的遺伝因子を含む生物が野生型生物と交雑しても子孫が生じない。
【００１４】
ある態様によれば、（１）前減数分裂期にのみ発現されるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードし、且つ（２）ヌクレアーゼを標的とするガイドＲＮＡを発現して性染色体の一方に固有に存在する配列を切断する、１つまたは複数の染色体の使用を含む、子の性比にバイアスをかける方法が提供され、その結果、生存可能な配偶子が標的染色体を含む例が、未改変生物での典型的な例より少なくなる。
【００１５】
ある態様によれば、前減数分裂期にのみ発現されるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードし、且つヌクレアーゼを標的として対立する性染色体上に固有に存在する配列を切断するガイドＲＮＡを発現する性染色体を使用することを含む、集団の性比にバイアスをかける方法が提供され、その結果、大部分の生存可能な配偶子が、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードする性染色体を含む。
【００１６】
ある態様によれば、子の性比を異型配偶子性（heterogametic sex）（例えばＸＹ）にバイアスをかける方法であって、通常はＸ染色体上に存在する必須遺伝子のコピーとＸ染色体上の野生型必須遺伝子の場所に自身をコピーする利己的遺伝因子とで改変された染色体の使用を含む方法が提供され、その結果、雌の子孫が必須遺伝子の喪失のために発生的に生存可能ではなく、一方、雄の子孫は改変染色体上のコピーのために生存する。
【００１７】
ある態様によれば、通常はＸ染色体上に存在する必須遺伝子のコピーとＸ染色体上の野生型必須遺伝子の場所に自身をコピーする利己的遺伝因子とで改変されたＹ染色体の使用を含む、集団の性比を異型配偶子性（例えばＸＹ）にバイアスをかける方法が提供され、その結果、雌の子孫が必須遺伝子の喪失のために発生的に生存可能ではなく、一方、雄の子孫は改変Ｙ染色体上のコピーのために生存可能となる。
【００１８】
ある態様によれば、子の性比を同型配偶子性（homogametic sex）（例えば、哺乳動物におけるＸＸ）にバイアスをかける方法には、（１）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードし、且つ（２）ヌクレアーゼを標的とするガイドＲＮＡを発現して異型配偶子性染色体（例えば、哺乳動物におけるＸＹ）上に固有に存在する配列を切断する、１つまたは複数の染色体の使用が含まれ、その結果、通常は異型配偶子性（例えば、哺乳動物における雄）として発生する任意の子の異型配偶子性染色体が破壊される。
【００１９】
ある態様によれば、集団の性比を同型配偶子性（例えば、哺乳動物におけるＸＸ）にバイアスをかける方法には、（１）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードし、且つ（２）ヌクレアーゼを標的とするガイドＲＮＡを発現して異型配偶子性染色体（例えば、哺乳動物におけるＸＹ）上に固有に存在する配列を切断する、同型配偶子性染色体の使用が含まれ、その結果、通常は異型配偶子性（例えば、哺乳動物における雄）として発生する任意の子の異型配偶子性染色体が破壊される。
【００２０】
ある態様によれば、集団の性比を雄にバイアスをかける方法には、雌の生殖能（female fertility）に必要な遺伝子の代わりに自身をコピーする利己的遺伝因子をコードする、改変された雄の放出が含まれる。ある態様によれば、利己的遺伝因子はＹ染色体上にコードされる。ある態様によれば、Ｙ染色体はさらに、Ｘ染色体上に存在する必須遺伝子を標的化する利己的遺伝因子をコードする。
【００２１】
ある態様によれば、集団制御の方法であって、雌の子が生存不能になるように、（１）雌の生殖能に必要な遺伝子の代わりに自身をコピーする利己的遺伝因子と（２）Ｘ染色体上の必須遺伝子の代わりに自身をコピーする第２の利己的遺伝因子とをコードするＹ染色体を含む改変雄生物を、除去対象の集団中に放出すること、ならびに第１の利己的遺伝因子および第２の利己的遺伝因子を含む雄と第３の利己的遺伝因子を含む雌との間の交配の子が、生殖可能な雄の子および生殖不能な雌の子を生じるように、Ｘ染色体上の必須遺伝子の配列を改変する第３の利己的遺伝因子をコードする生物を保護対象の集団中に放出すること、を含む方法が提供される。
【００２２】
ある態様によれば、以下を含む、生物の真核生殖系列細胞を改変する方法が提供される。
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含む第１の外来核酸配列を、生殖系列細胞に導入すること；
ここで、１種類または複数種類のガイドＲＮＡが、生殖系列細胞の染色体対の第１の染色体のゲノムＤＮＡ上および第２の染色体のゲノムＤＮＡ上の１つまたは複数の標的位置に相補的であり、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードする核酸配列が、第１の隣接配列と第２の隣接配列との間に存在し、第１の隣接配列が、ゲノムＤＮＡの第１の染色体上または第２の染色体上の標的位置の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、第２の隣接配列が、ゲノムＤＮＡの第１の染色体上または第２の染色体上の標的位置の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含み、第１の隣接配列と第２の隣接配列との間に位置し、外来核酸配列によって切断および置換される配列のうちの少なくとも１つのコピーが、生物の生存または生存可能な子の産生のために必要である、
第１の外来核酸配列を発現させてＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類のＲＮＡを産生させること；
ここで、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドＲＮＡが、ゲノムＤＮＡの第１の染色体上およびゲノムＤＮＡの第２の染色体上の関連する標的位置に共局在し、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、ゲノムＤＮＡの第１の染色体を標的位置で切断部位特異的に切断し、且つゲノムＤＮＡの第２の染色体を標的位置で切断部位特異的に切断する、
第１の外来核酸配列を、ゲノムＤＮＡの染色体対の第１の染色体中に切断部位で挿入し、第１の外来核酸配列をゲノムＤＮＡの染色体対の第２の染色体中に切断部位で挿入して、生殖系列細胞を外来核酸配列についてホモ接合型にすること；および
第１の隣接配列と第２の隣接配列との間に位置し、外来核酸配列によって切断および置換されて遺伝的荷重（genetic load）を生じる配列が、その生物が生存または生殖可能な子を産生するためにもはや必要でない発生段階で、上記発現および挿入ステップを行うこと。
【００２３】
ある態様によれば、本明細書に記載の上記の方法にる標的集団の抑制または絶滅のための方法は、ＲＮＡ誘導型遺伝的荷重ドライブを標的集団中に放出することを含む。
【００２４】
本明細書において、遺伝的荷重とは、集団中の理論的に最適な遺伝型の適応度と集団中の観察される平均的な遺伝型の適応度との差を指すことがある。遺伝的荷重という用語はさらに、最大適応度と比較した、集団の平均適応度の低下を指すことがある。
【００２５】
本発明の特定の実施形態のその他の特徴および利点は、以下の実施形態およびそれらの図面の説明において、および特許請求の範囲から、さらに十分に明らかになるであろう。
【００２６】
本特許または出願ファイルは、カラーで作製された少なくとも１枚の図面を含む。カラー図面を含む本特許または特許出願公開のコピーは、特許庁へ申請し、必要な料金を支払うことで提供される。本実施形態の、前述した特徴およびその他の特徴、ならびに利点は、添付の図面と共に、具体的実施形態についての以下の詳細な説明からより十分に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡの発現、共局在、標的遺伝子の切断（cutting）による切断部（break）の形成、および相同組換えによる切断部位での標的遺伝子中へのＲＮＡ誘導型Ｃａｓ９遺伝子ドライブの挿入を示す、標準的なＲＮＡ誘導型Ｃａｓ９遺伝子ドライブの模式図である。
【図１Ｂ】遺伝子ドライブの遺伝の染色体図を示す図である。
【図１Ｃ】標的ＤＮＡの切断および遺伝子ドライブの挿入を防止するための、Ｃａｓ９とガイドＲＮＡとの共局在を防止する変異を示す図である。
【図１Ｄ】遺伝子ドライブの挿入が変異によって防止されることを回避するための、複数のガイドＲＮＡおよび切断部位の使用を示す図である。
【図１Ｅ】ドライブ抵抗性アレルを形成するために、認識部位の全てを欠失させるＮＨＥＪを示す図である。
【図１Ｆ】必須遺伝子を有害に破壊するドライブ抵抗性アレルを形成するＮＨＥＪを示す図である。
【図２Ａ】複数の適切なガイドＲＮＡを含めることにより複数の遠位部位を編集するための単一ドライブの使用を示す図である。
【図２Ｂ】第１のドライブにより加えられた変更をアップデートするための、その後のドライブの使用を示す図である。
【図２Ｃ】Ｃａｓ９遺伝子およびガイドＲＮＡのみを残して、全ての変更を野生型に戻すための回復性ドライブ（restorative drive）の使用を示す図である。
【図３】交雑した場合に両方のコピーが失われるため不適合（incompatible）となる異なるガイドＲＮＡを用いた、同一の必須遺伝子を標的とする２種類の遺伝子ドライブの使用を示す図である。この種類のドライブを集団中に放出することにより、ドライブの数と同数の生物種へと集団が人為的に分割される。
【図４Ａ】減数分裂において競合する性染色体を除去してバイアスのかかった配偶子のプールを生じさせるための減数分裂遺伝子ドライブの使用を示す図である。ドライブが致死的になるのを防ぐために、ドライブ発現は前減数分裂期に限定される。
【図４Ｂ】２種類の直交するＣａｓ９ヌクレアーゼを用いて減数分裂による性染色体の発現停止を回避可能であることを示す図である。減数分裂中に競合する性染色体を自由に除去できる発生初期に、Ｃａｓ９  Ａにより、Ｃａｓ９  Ｂをコードするカセットが性染色体から常染色体へとコピーされる。
【図４Ｃ】接合体Ｘドライブ（zygotic X−drive）がＹ染色体を標的として受精卵中で破壊して、雌の子孫のみを産出可能であることを示す図である。
【図４Ｄ】接合体Ｙドライブが、通常はＸ染色体上に存在する必須遺伝子をコードし、遺伝子ドライブカセットを用いてその遺伝子をＸから除去可能であることを示す図である。ドライブは、父由来のＸから母由来のＸへと自身をコピーし、雌の接合体が必須遺伝子のコピーを有さないようにする。
【図５Ａ】二重機能性（dual-function）Ｙドライブを用いた集団抑制を示す図であり、生殖不能娘能（sterile-daughter capability）をさらに含むＡ  Ｙドライブ（Ｙ−ドライブ−ＳＤ）が野生型集団中で接合体ドライブとして働き、これにより絶滅が導かれ得る。
【図５Ｂ】必須遺伝子を再コードする標準的ドライブと遭遇すると、Ｙ−ドライブ−ＳＤがもはやドライブしないことを示す図である。生殖不能娘効果は、侵入集団が崩壊（collapse）するまで相互のドライブの侵入を防ぐ。
【図６Ａ】低移動度および高移動度の侵入種を制御する方法を示す図であり、ミシシッピ川などの侵入された生息地全域に放出されたＹドライブ雄コイ（Asian carp）を用いて、コイ集団を根絶することができる。Ｙドライブ雄のヒトによる意図的な輸送の場合にアジア集団を保護するための保護的再コード化ドライブが利用可能である。
【図６Ｂ】局所的根絶を引き起こし得る侵入ラット集団中へのＹ−ドライブ−ＳＤ雄ラットの放出を示す図であり、一方、標準的ドライブはユーラシアの自然ラット集団を保護的に再コード化する。Ｙ−ドライブ−ＳＤコンストラクトは、ほとんどの島および多くの大陸地域から侵入ラットを根絶し得る。再コード化集団中のＹ−ドライブ−ＳＤの生殖不能娘効果により、密航生物を介した遺伝子流動（stowaway-mediated gene flow）が制限され得る。このプロセスは、再コード化された密航ラットがラットのいない生息地の侵入に成功した時点で、新たなドライブを用いて繰り返すことができる。
【図７】ＲＮＡ誘導型転写調節因子が遠位の遺伝子の活性をその配列を編集することなく調節可能な、ドライブを介した内在性遺伝子の制御を示す図である。ドライブヌクレアーゼの適切な発現に調節因子が必要である場合、ドライブの寿命中、制御は進化的に安定であり得る。
【図８】未改変野生型集団からの種分化の誘導を示す図である。固有アレル（固有遺伝子と表記）を有する亜集団を標的とする２回の連続的な遺伝子ドライブにより、残りの野生型集団との遺伝的不適合を誘発することができる。第１のドライブは、固有アレルを用いて拡散し、破壊された場合に優性致死性の表現型を示す遺伝子を再コード化する。第２のドライブは再コード化遺伝子を用いて拡散し、第１のドライブを除去する。野生型生物との任意の交配により、第２のドライブが野生型コピーを破壊し、全ての子孫において致死となる。
【図９】本明細書に記載の方法を示す図であり、ドライブ１は、Ｙ染色体（存在する場合）上の雄必須遺伝子およびＸ染色体上の劣性必須遺伝子を再コード化し、同時に、固有遺伝子に隣接して自身を挿入する（すなわち、Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡの発現ならびに標的核酸配列へのＣａｓ９およびガイドＲＮＡの局在後に、相同組換えなどの細胞機構により挿入される）。ドライブ２は、改変Ｘ染色体を経由して拡散し、常染色体からドライブ１を除去し、さらに、改変Ｙ染色体が存在する場合は、改変Ｙ染色体中に跳び込む。野生型生物との交配により、ドライブ２はＸ染色体またはＹ染色体から必須遺伝子を除去する。唯一の生存可能な子孫は、Ｘ染色体上に劣性必須遺伝子の単一再コード化コピーを保持するハイブリッド雌である。これらは、ドライブ２で改変された雄と自由に交配可能であり、野生型遺伝子が改変集団中に拡散することが可能になる。野生型雄との交配では、さらに多くのハイブリッド雌を生じるだけであり、野生型集団中に戻る遺伝子流動が防止される。
【図１０】本明細書に記載されるような接合体Ｙドライブの作製方法を示す図である。
【図１１Ａ】雌の生殖能に必要な遺伝子を除去する、生殖不能娘Ｙ染色体を作製する方法の１つを示す図である。Ｙ染色体（Ｙ−ＳＤ）は、真のドライブではないが、雌の生殖能に必須の遺伝子をドライブで置換する限定された遺伝子ドライブ機構を包含する。
【図１１Ｂ】Ｙ−ＳＤ雄の娘において、ドライブが同様に雌の生殖能遺伝子の母方コピーを置換して生殖不能を引き起こすことを示す図である。雌の生殖能に特異的な遺伝子が知られていない場合、両方の性に必要な生殖能遺伝子を標的とし、それらをＹ染色体上の別の場所の別のコピーで補完することができる。
【図１２Ａ】生殖不能娘能を有するＹドライブ（Ｙ−ドライブ−ＳＤ）（Ｙ−ドライブ＋生殖不能娘Ｙ染色体）の作製方法を示す図である。野生型雌との交配により、Ｙ−ドライブ−ＳＤは、必須遺伝子および雌生殖能遺伝子の両方を置換または破壊する。雄はＹ−ドライブ−ＳＤ上の別のコピーによる補完のため生き残る。
【図１２Ｂ】雌の子孫では、ドライブは同様に母方コピーを置換して、娘を胚性生育不能にすることを示す。結果的に、Ｙ−ドライブ−ＳＤはドライブを示す。
【図１２Ｃ】保護的ドライブで改変された雌は、再コード化された必須遺伝子に隣接する部位を有することを示す。Ｙ−ドライブ−ＳＤは生殖能遺伝子を置換できるだけである。
【図１２Ｄ】雌の子孫はまだ生存可能であるが、生殖能遺伝子のコピーを欠くため、生殖不能であることを示す。雄は姉妹が存在しないことによる適応度における利益を得ないので、Ｙ−ドライブ−ＳＤは保護された集団中でドライブしないことがある。しかし、適応度におけるその唯一のコストはドライブ自体によるものであるので、これは徐々にではあるが集団から除去されることになる。雌の生殖生産性の喪失により、集団が強力に抑制されることになる。このため、保護された個体は、Ｙ−ドライブ−ＳＤを共有する集団に侵入することが困難となり得る。同様に、Ｙ−ドライブ−ＳＤは、保護集団に侵入不可能となる。
【図１３Ａ】出芽酵母（S. cerevisiae）においてＡＤＥ２のバイアスのかかった遺伝を容易に見ることができることを示す模式図である。ＡＤＥ２中の変異は、赤色色素の蓄積によりアデニン制限培地上で赤い表現型を生じる。赤色変異体一倍体を野生型一倍体と交配させるとクリーム色の二倍体が生じ、これは胞子形成により、５０％の赤色の子孫および５０％のクリーム色の子孫を生じる。出芽酵母では、ＡＤＥ２のバイアスのかかった遺伝を容易に見ることができる。
【図１３Ｂ】ＡＤＥ２を標的化する遺伝子ドライブを有する一倍体をＣａｓ９存在下で野生型一倍体と交配させた場合に、ＡＤＥ２の切断およびその後の置換または破壊により、赤色子孫のみを生じる赤色二倍体が生じ得ることを示す模式図である。
【図１３Ｃ】出芽酵母（S. cerevisiae）のコロニーの画像である。野生型一倍体とＡＤＥ２：：ｓｇＲＮＡ遺伝子ドライブ一倍体との交配により生じた二倍体は、Ｃａｓ９非存在下で、または再コード化により標的部位が除去されている場合に、クリーム色のコロニーを生じるが、両方が存在する場合には一様に赤いコロニーを生じ、このことは、野生型ＡＤＥ２コピーのＣａｓ９依存的な破壊を示す。
【図１３Ｄ】アデニン制限プレート上で一様に赤いコロニーを生じる１５個の解剖された四分子に由来する胞子の画像であり、野生型の親から受け継いだＡＤＥ２遺伝子の破壊を示す。標的部位またはＣａｓ９の非存在下では、２：２の正常な分離が観察される。
【図１４Ａ】ＡＤＥ２標的化遺伝子ドライブが、カーゴ遺伝子としてＵＲＡ３を有するように改変されたことを示す模式図である。
【図１４Ｂ】野生型ＵＲＡ３−一倍体酵母と、胞子形成させて四分子に解剖して個々の胞子から生じたコロニーを単離した、ＵＲＡ３を有する遺伝子ドライブをコードする一倍体との交配により生じた、二倍体の画像である。これらは全て、ウラシルを含まないプレート上にレプリカプレーティングした場合に生育した。このことは、ドライブが全ての二倍体においてＵＲＡ３のコピーに成功したことを示す。
【図１４Ｃ】ＡＢＤ１標的化遺伝子ドライブが必須ＡＢＤ１遺伝子の末端（tail end）を切断および再コード化することを示す模式図である。遺伝子ドライブおよびカーゴ遺伝子は、コピー後も無傷のままであり、非必須遺伝子および必須遺伝子の両方を標的とすることにより拡散可能である。
【図１５Ａ】遺伝子ドライブ試験のために選択された野生型株間の関係を示すゲノム系統樹（phylogenomic tree）の模式図である。マクミラン出版社：Nature 458:337-341, copyright 2009から許可を得て改変した。
【図１５Ｂ】種々の酵母株における遺伝のバイアスの程度の定量的ＰＣＲの結果を示す図であり、遺伝子ドライブを有するＳＫ１一倍体と種々の野生型一倍体株との交配により生じた二倍体における、野生型アレルとドライブ含有アレルの相対的存在量を示す。「Ｃａｓ９なし」および「標的なし」は、Ｃａｓ９の非存在下で野生型一倍体と交配させたか、または標的配列中に切断を妨げる変異を有する野生型株と交配させた、ＡＤＥ２ドライブ因子を含む一倍体細胞を指す。「第２世代（2nd gen）」は、先の交配の一倍体の子孫を指す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本開示の実施形態は、標的ＤＮＡ部位でガイドＲＮＡと共局在して遺伝子ドライブとして働くＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質の使用に基づく。種々の目的のためにＤＮＡに結合させるためのそのようなＤＮＡ結合タンパク質は、当業者に容易に理解される。そのようなＤＮＡ結合タンパク質は天然のものであってもよい。本開示の範囲に含まれるＤＮＡ結合タンパク質としては、本明細書中でガイドＲＮＡと呼ぶＲＮＡによってガイドされ得るタンパク質が挙げられる。ある態様によれば、ガイドＲＮＡは約１０〜約５００ヌクレオチドである。ある態様によれば、ＲＮＡは約２０〜約１００ヌクレオチドである。この態様によれば、ガイドＲＮＡおよびＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡにおいて共局在複合体を形成する。
【００２９】
ヌクレアーゼ活性を有するそのようなＤＮＡ結合タンパク質は、当業者に公知であり、例えばＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム中に存在する、Ｃａｓ９タンパク質などのヌクレアーゼ活性を有する天然のＤＮＡ結合タンパク質が挙げられる。そのようなＣａｓ９タンパク質およびＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、当該技術分野で十分に裏付けられている。その全体が参照により援用される、全ての捕捉情報を含む、Makarova et al., Nature Reviews, Microbiology, Vol. 9, June 2011, pp. 467-477を参照されたい。
【００３０】
細菌および古細菌のＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓシステムは、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成した短鎖ガイドＲＮＡに依存して、侵入する外来核酸中に存在する相補配列を分解する。Deltcheva, E. et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature 471, 602-607 (2011); Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P. & Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109, E2579-2586 (2012); Jinek, M. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337, 816-821 (2012); Sapranauskas, R. et al. The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli. Nucleic acids research 39, 9275-9282 (2011)；およびBhaya, D., Davison, M. & Barrangou, R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annual review of genetics 45, 273-297 (2011) を参照されたい。近年、ストレプトコッカス・ピオゲネス（S. pyogenes）のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのインビトロ再構成により、通常はトランスにコードされるｔｒａｃｒＲＮＡ（「トランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」）と融合したｃｒＲＮＡ（「ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」）が、そのｃｒＲＮＡに一致する標的ＤＮＡ配列をＣａｓ９タンパク質に配列特異的に切断させるのに十分であることが実証された。標的部位に相同なｇＲＮＡの発現により、Ｃａｓ９が動員され、標的ＤＮＡが分解される。H. Deveau et al, Phage response to CRISPR-encoded resistance in Streptococcus thermophilus. Journal of Bacteriology 190, 1390 (Feb, 2008) を参照されたい。
【００３１】
３つのクラスのＣＲＩＳＰＲシステムが一般に知られており、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型と呼ばれる）。ある態様によれば、ｄｓＤＮＡを切断するための本開示に係る具体的な有用な酵素は、ＩＩ型に共通する単一エフェクター酵素Ｃａｓ９である。その全体が参照により援用されるK. S. Makarova et al., Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems. Nature reviews. Microbiology 9, 467 (Jun, 2011) 参照。細菌内で、ＩＩ型エフェクターシステムは、スペーサー含有ＣＲＩＳＰＲ座位から転写される長いｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ、多機能性Ｃａｓ９タンパク質、およびｇＲＮＡプロセシングに重要なｔｒａｃｒＲＮＡからなる。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡのスペーサーを隔てる反復配列にハイブリダイズし、内在性ＲＮａｓｅＩＩＩによるｄｓＲＮＡ切断を開始させ、それに続いて各スペーサー内でＣａｓ９による第２の切断イベントが起こり、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびＣａｓ９に結合したままの成熟ｃｒＲＮＡが生成する。
【００３２】
ある態様によれば、Ｃａｓ９などの本開示の酵素は、ＤＮＡ二本鎖を巻き戻し、ｃｒＲＮＡにマッチする配列を探索して切断する。標的ＤＮＡ中の「プロトスペーサー」配列とｃｒＲＮＡ中の残りのスペーサー配列との間の相補性が検出されると標的認識が起こる。重要なことに、正確なプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が３′末端にさらに存在する場合のみ、Ｃａｓ９はＤＮＡを切断する。ある態様によれば、異なるプロトスペーサー隣接モチーフを用いることができる。例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネスのシステムは、ＮＧＧ配列（式中、Ｎは任意のヌクレオチドであってよい）を要求する。ストレプトコッカス・サーモフィルス（S. thermophilus）のＩＩ型システムは、ＮＧＧＮＧ（その全体が参照により援用されるP. Horvath, R. Barrangou, CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science 327, 167 (Jan 8, 2010) 参照、およびＮＮＡＧＡＡＷ（その全体が参照により援用されるH. Deveau et al., Phage response to CRISPR-encoded resistance in Streptococcus thermophilus. Journal of bacteriology 190, 1390 (Feb, 2008) 参照）をそれぞれ要求するが、別のストレプトコッカス・ミュータンス（S. mutans）のシステムは、ＮＧＧまたはＮＡＡＲを許容する（その全体が参照により援用されるJ. R. van der Ploeg, Analysis of CRISPR in Streptococcus mutans suggests frequent occurrence of acquired immunity against infection by M102-like bacteriophages. Microbiology 155, 1966 (Jun, 2009) 参照。生物情報学分析により、別の有用なＰＡＭの特定および一連のＣＲＩＳＰＲ標的可能配列の拡張に役立ち得る、種々の細菌におけるＣＲＩＳＰＲ座位の詳細なデータベースが作製された（それぞれその全体が参照により援用されるM. Rho, Y. W. Wu, H. Tang, T. G. Doak, Y. Ye, Diverse CRISPRs evolving in human microbiomes. PLoS genetics 8, e1002441 (2012) および D. T. Pride et al., Analysis of streptococcal CRISPRs from human saliva reveals substantial sequence diversity within and between subjects over time. Genome research 21, 126 (Jan, 2011) 参照。
【００３３】
ヌクレアーゼ活性を有する例示的なＤＮＡ結合タンパク質は、二本鎖ＤＮＡにニックを形成するか、または二本鎖ＤＮＡを切断するように機能する。そのようなヌクレアーゼ活性は、ヌクレアーゼ活性を示す１つまたは複数のポリペプチド配列を有するＤＮＡ結合タンパク質から生じ得る。そのような例示的なＤＮＡ結合タンパク質は、それぞれが二本鎖ＤＮＡの特定のストランドを切断すること、またはニックを形成することに関与する、２つの別個のヌクレアーゼドメインを有していてもよい。当業者に知られているヌクレアーゼ活性を有する例示的なポリペプチド配列としては、ＭｃｒＡ‐ＨＮＨヌクレアーゼ関連ドメインおよびＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインが挙げられる。したがって、例示的なＤＮＡ結合タンパク質は、ＭｃｒＡ‐ＨＮＨヌクレアーゼ関連ドメインおよびＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインのうちの１つまたは複数を含む天然タンパク質である。
【００３４】
ストレプトコッカス・ピオゲネス（S. pyogenes）では、Ｃａｓ９は、タンパク質中の２つの触媒ドメイン、すなわちＤＮＡの相補鎖を切断するＨＮＨドメインおよび非相補鎖を切断するＲｕｖＣ様ドメインが介在するプロセスによって、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の３ｂｐ上流に平滑末端二本鎖切断を形成する。その全体が参照により援用されるJinke et al., Science 337, 816-821 (2012) を参照されたい。Ｃａｓ９タンパク質は、Makarova et al., Nature Reviews, Microbiology, Vol. 9, June 2011, pp. 467-477の補足情報で確認されている以下のものを含む、多数のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム中に存在することが知られている。メタノコッカス・マリパルディス（Methanococcus maripaludis）Ｃ７株；コリネバクテリウム・ジフテリアエ（Corynebacterium diphtheriae）；コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）ＹＳ‐３１４株；コリネバクテリウム・グルタニカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２  Ｋｉｔａｓａｔｏ株；コリネバクテリウム・グルタニカム  ＡＴＣＣ１３０３２  Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ株；コリネバクテリウム・グルタニカム  Ｒ株；コリネバクテリウム・クロッペンステッティイ（Corynebacterium kroppenstedtii）ＤＳＭ４４３８５株；マイコバクテリウム・アブセサス（Mycobacterium abscessus）ＡＴＣＣ１９９７７株；ノカルディア・ファルシニカ（Nocardia farcinica）ＩＦＭ１０１５２株；ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）ＰＲ４株；ロドコッカス・ジョスティイ（Rhodococcus jostii）ＲＨＡ１株；ロドコッカス・オパカス（Rhodococcus opacus）Ｂ４  ｕｉｄ３６５７３株；アシドサーマス・セルロリティカス（Acidothermus cellulolyticus）１１Ｂ株；アルスロバクター・クロロフェノリカス（Arthrobacter chlorophenolicus）Ａ６株；クリベラ・フラビダ（Kribbella flavida）ＤＳＭ１７８３６  ｕｉｄ４３４６５株；サーモモノスポラ・カーバタ（Thermomonospora curvata）ＤＳＭ４３１８３株；ビフィドバクテリウム・デンティウム（Bifidobacterium dentium）Ｂｄ１株；ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）ＤＪＯ１０Ａ株；スラッキア・ヘリオトリニレデューセンス（Slackia heliotrinireducens）ＤＳＭ２０４７６株；パーセフォネラ・マリナ（Persephonella marina）ＥＸ  Ｈ１株；バクテロイデス・フラギリス（Bacteroides fragilis）ＮＣＴＣ９４３４株；カプノサイトファガ・オクラセア（Capnocytophaga ochracea）ＤＳＭ７２７１株；フラボバクテリウム・サイクロフィルム（Flavobacterium psychrophilum）ＪＩＰ０２  ８６株；アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ８３５株；ロゼイフレクサス・キャステンホルツィイ（Roseiflexus castenholzii）ＤＳＭ１３９４１株；ロゼイフレクサス（Roseiflexus）ＲＳ１株；シネコシスティス（Synechocystis）ＰＣＣ６８０３株；エルシミクロビウム・ミヌトゥム（Elusimicrobium minutum）Ｐｅｉ１９１株；未培養細菌Ｔｅｒｍｉｔｅ  ｇｒｏｕｐ  １  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｙｌｏｔｙｐｅ  Ｒｓ  Ｄ１７；フィブロバクター・サクシノゲネス（Fibrobacter succinogenes）Ｓ８５株；バチルス・セレウス（Bacillus cereus）ＡＴＣＣ１０９８７株；リステリア・イノキュア（Listeria innocua）；ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）；ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）ＧＧ株；ラクトバチルス・���リバリウス（Lactobacillus salivarius）ＵＣＣ１１８株；ストレプトコッカス・アガラクティアエ（Streptococcus agalactiae）Ａ９０９株；ストレプトコッカス・アガラクティアエ  ＮＥＭ３１６株；ストレプトコッカス・アガラクティアエ  ２６０３株；ストレプトコッカス・ディスガテクティアエ亜種エクイシミリス（Streptococcus dysgalactiae equisimilis）ＧＧＳ１２４株；ストレプトコッカス・エクイ亜種ズーエピデミカス（Streptococcus equi zooepidemicus）ＭＧＣＳ１０５６５株；ストレプトコッカス・ガロリティカス（Streptococcus gallolyticus）ＵＣＮ３４  ｕｉｄ４６０６１株；ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Streptococcus gordonii）チャリス（Challis）株ＣＨ１亜株；ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）ＮＮ２０２５  ｕｉｄ４６３５３株；ストレプトコッカス・ミュータンス；ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）Ｍ１  ＧＡＳ株；ストレプトコッカス・ピオゲネスＭＧＡＳ５００５株；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＭＧＡＳ２０９６株；ストレプトコッカス・ピオゲネスＭＧＡＳ９４２９株；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＭＧＡＳ１０２７０株；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＭＧＡＳ６１８０株；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＭＧＡＳ３１５株；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＳＳＩ‐１株；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＭＧＡＳ１０７５０株；ストレプトコッカス・ピオゲネス  ＮＺ１３１株；ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophiles）ＣＮＲＺ１０６６株；ストレプトコッカス・サーモフィラス  ＬＭＤ‐９株；ストレプトコッカス・サーモフィラス  ＬＭＧ１８３１１株；クロストリジウム・ボツリヌム（Clostridium botulinum）Ａ３  Ｌｏｃｈ  Ｍａｒｅｅ株；クロストリジウム・ボツリヌム  Ｂ  Ｅｋｌｕｎｄ  １７Ｂ株；クロストリジウム・ボツリヌム  Ｂａ４  ６５７株；クロストリジウム・ボツリヌム  Ｆ  Ｌａｎｇｅｌａｎｄ株；クロストリジウム・セルロリティカム（Clostridium cellulolyticum）Ｈ１０株；フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）ＡＴＣＣ２９３２８株；ユウバクテリウム・レクターレ（Eubacterium rectale）ＡＴＣＣ３３６５６株；マイコプラズマ・ガリセプティカム（Mycoplasma gallisepticum）；マイコプラズマ・モービレ（Mycoplasma mobile）１６３Ｋ株；マイコプラズマ・ペネトランス（Mycoplasma penetrans）；マイコプラズマ・シノビアエ（Mycoplasma synoviae）５３株；ストレプトバチルス・モニリフォルミス（Streptobacillus moniliformis）ＤＳＭ１２１１２株；ブラジリゾビウム（Bradyrhizobium）ＢＴＡｉ１株；ニトロバクター・ハンブルゲンシス（Nitrobacter hamburgensis）Ｘ１４株；ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）ＢｉｓＢ１８；ロドシュードモナス・パルストリス  ＢｉｓＢ５株；パルビバクラム・ラバメンティボランス（Parvibaculum lavamentivorans）ＤＳ‐１株；ディノロセオバクター・シバエ（Dinoroseobacter shibae）ＤＦＬ１２株；グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Gluconacetobacter diazotrophicus）Ｐａｌ  ５  ＦＡＰＥＲＪ株；グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス  Ｐａｌ  ５  ＪＧＩ株；アゾスピリルム（Azospirillum）Ｂ５１０  ｕｉｄ４６０８５株；ロドスピリラム・ルブラム（Rhodospirillum rubrum）ＡＴＣＣ１１１７０株；ディアフォロバクター（Diaphorobacter）ＴＰＳＹ  ｕｉｄ２９９７５株；フェルミネフォロバクター・エイセニアエ（Verminephrobacter eiseniae）ＥＦ０１‐２株；ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitides）０５３４４２株；ナイセリア・メニンジティディス  ａｌｐｈａ１４；ナイセリア・メニンジティディス  Ｚ２４９１株；デスルホビブリオ・サレキシゲンス（Desulfovibrio salexigens）ＤＳＭ  ２６３８株；キャンピロバククー・ジェジュニ亜種ドイレイ（Campylobacter jejuni doylei）２６９  ９７株；キャンピロバククー・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）８１１１６株；キャンピロバククー・ジェジュニ；キャンピロバクター・ラリ（Campylobacter lari）ＲＭ２１００株；ヘリコバクター・ヘパティカス（H Helicobacter hepaticus）；ウォリネラ・サクシノゲネス（Wolinella succinogenes）；トルモナス・アウエンシス（Tolumonas auensis）ＤＳＭ９１８７株；シュードアルテロモナス・アトランティカ（Pseudoalteromonas atlantica）Ｔ６ｃ株；シューワネラ・ペアレアナ（Shewanella pealeana）ＡＴＣＣ７００３４５株；レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）Ｐａｒｉｓ株；アクチノバチルス・サクシノゲネス（Actinobacillus succinogenes）１３０Ｚ株；パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）；フランシセラ・ツラレンシス亜種ノビシダ（Francisella tularensis novicida）Ｕ１１２株；フランシセラ・ツラレンシス亜種ハラークティカ（Francisella tularensis holarctica）；フランシセラ・ツラレンシス  ＦＳＣ  １９８株；フランシセラ・ツラレンシス亜種ツラレンシス（Francisella tularensis tularensis）；フランシセラ・ツラレンシス  ＷＹ９６‐３４１８株；およびトレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）ＡＴＣＣ３５４０５株。Ｃａｓ９タンパク質は、文献中で当業者にＣｓｎ１と呼ばれることもある。本明細書に記載される実験の対象であるストレプトコッカス・ピオゲネス（S. pyogenes）のＣａｓ９タンパク質配列を以下に示す。その全体が参照により援用されるDeltcheva et al., Nature 471, 602-607 (2011)を参照されたい。
【００３５】
【化１】
0006747974.tif 000002
【００３６】
ある態様によれば、ゲノムエン改変のための機構としておよびドライブ遺伝子として、ｇＲＮＡ指向性のＣａｓ９切断（gRNA-directed Cas9 cleavage）の特異性が用いられる。ある態様によれば、酵素がｇＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを認識して切断に影響を与えるためには、ｇＲＮＡのハイブリダイゼーションは１００パーセントでなくてもよい。いくらかのオフターゲット活性が生じ得る。例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネスのシステムは、インビトロで２０ｂｐの成熟スペーサー配列のうち、最初の６塩基におけるミスマッチを許容する。ある態様によれば、（最後の１４ｂｐの）ＮＧＧにマッチするｇＲＮＡに対する潜在的なオフターゲット部位がヒト参照ゲノム内に存在する場合、より高いストリンジェンシーがインビボで有益であり得る。
【００３７】
ある態様によれば、特異性が向上され得る。干渉がｇＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの融解温度の影響を受けやすい場合、ＡＴリッチな標的配列はオフターゲット部位がより少なくなり得る。ゲノム中の別の場所の少なくとも１４ｂｐマッチする配列を有する偽部位が回避されるように標的部位を慎重に選択することで特異性が向上し得る。より長いＰＡＭ配列を必要とするＣａｓ９バリアントを使用することにより、オフターゲット部位の頻度が低下し得る。定向進化により、オフターゲット活性を完全に防止するのに充分なレベルまでＣａｓ９特異性が向上することがあり、理想的には２０ｂｐの完全なｇＲＮＡマッチおよび最小限のＰＡＭが要求される。したがって、Ｃａｓ９タンパク質の改変は本開示の代表的な実施形態である。本開示において有用なＣＲＩＳＰＲシステムは、それぞれその全体が参照により援用されるR. Barrangou, P. Horvath, CRISPR: new horizons in phage resistance and strain identification. Annual review of food science and technology 3, 143 (2012) および B. Wiedenheft, S. H. Sternberg, J. A. Doudna, RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature 482, 331 (Feb 16, 2012) に記載される。
【００３８】
ある態様によれば、ＤＮＡ結合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性が不活性化されるように改変または修飾される。そのような改変または修飾には、ヌクレアーゼ活性またはヌクレアーゼドメインを不活性化するために１つまたは複数のアミノ酸を改変すること含まれる。そのような修飾には、ヌクレアーゼ活性を示す１つまたは複数のポリペプチド配列、すなわちヌクレアーゼドメインが、ＤＮＡ結合タンパク質中に存在しないように、ヌクレアーゼ活性を示す１つまたは複数のポリペプチド配列、すなわちヌクレアーゼドメインを除去することが含まれる。ヌクレアーゼ活性を不活性化するためのその他の修飾は、本開示に基づき当業者に容易に明らかになるであろう。したがって、ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質には、ヌクレアーゼ活性を不活性化するように修飾されたポリペプチド配列、またはヌクレアーゼ活性を不活性化するために１つまたは複数のポリペプチド配列を除去することを含む。ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性は不活性化されていても、ＤＮＡ結合能を保持している。したがって、ＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡ結合に必要な１つまたは複数のポリペプチド配列を含んでいるが、ヌクレアーゼ活性を示すヌクレアーゼ配列のうちの１つまたは複数または全てを欠いていてよい。したがって、ＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡ結合に必要な１つまたは複数のポリペプチド配列を含んでいるが、不活性化されたヌクレアーゼ活性を示すヌクレアーゼ配列のうちの１つまたは複数または全てを有していてもよい。
【００３９】
ある態様によれば、２つ以上のヌクレアーゼドメインを有するＤＮＡ結合タンパク質は、ヌクレアーゼドメインのうちの１つを除いた全てが不活性化されるように修飾または改変されてもよい。そのような修飾または改変されたＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡ結合タンパク質が二本鎖ＤＮＡの一方のストランドのみを切断するか、またはニックを形成するものである限り、ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼと呼ばれる。ＲＮＡによってＤＮＡにガイドされる場合、ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼと呼ばれる。
【００４０】
例示的なＤＮＡ結合タンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質、または改変Ｃａｓ９もしくはＣｓ９のホモログなどのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼである。例示的なＤＮＡ結合タンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質ニッカーゼである。例示的なＤＮＡ結合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性を欠いたＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質である。例示的なＤＮＡ結合タンパク質は、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質である。
【００４１】
本明細書に記載のＲＮＡ誘導型ゲノム制御方法のある態様によれば、Ｃａｓ９は、ヌクレアーゼ活性を低下させるように、実質的に低下させるように、または除去するように改変させる。ある態様によれば、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインまたはＨＮＨヌクレアーゼドメインを改変することにより、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を低下させる、実質的に低下させる、または除去する。ある態様によれば、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインが不活性化される。ある態様によれば、ＨＮＨヌクレアーゼドメインが不活性化される。ある態様によれば、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨヌクレアーゼドメインが不活性化される。別の態様によれば、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨヌクレアーゼドメインが不活性化されたＣａｓ９タンパク質が提供される。別の態様によれば、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨヌクレアーゼドメインが不活性化されている限りにおいて、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質が提供される。別の態様によれば、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインまたはＨＮＨヌクレアーゼドメインのいずれかが不活性化されることにより、残りのヌクレアーゼドメインのヌクレアーゼ活性が活性のままである、Ｃａｓ９ニッカーゼが提供される。このようにして、二本鎖ＤＮＡの一方のストランドだけが切断されるか、またはニック形成される。
【００４２】
別の態様によれば、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質をもたらす、Ｃａｓ９中の１つまたは複数のアミノ酸が改変または除去された、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質が提供される。ある態様によれば、それらのアミノ酸にはＤ１０およびＨ８４０が含まれる。Jinke et al., Science 337, 816-821 (2012) 参照。別の態様によれば、それらのアミノ酸にはＤ８３９およびＮ８６３を含まれる。ある態様によれば、Ｄ１０、Ｈ８４０、Ｄ８３９、およびＨ８６３のうちの１つまたは複数または全てが、ヌクレアーゼ活性を低下させるか、実質的に除去するか、または除去するアミノ酸で置換される。ある様によれば、Ｄ１０、Ｈ８４０、Ｄ８３９、およびＨ８６３のうちの１つまたは複数または全てがアラニンで置換される。ある態様によれば、Ｄ１０、Ｈ８４０、Ｄ８３９、およびＨ８６３のうちの１つまたは複数または全てが、アラニンなど、ヌクレアーゼ活性を低下させるか、実質的に除去するか、または除去するアミノ酸で置換されたＣａｓ９タンパク質は、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９またはＣａｓ９Ｎと呼ばれ、ヌクレアーゼ活性が低下しているか、または除去されているか、ヌクレアーゼ活性が検出レベル内にないか、または実質的にヌクレアーゼ活性がない。この態様によれば、Ｃａｓ９Ｎのヌクレアーゼ活性は、公知のアッセイを用いて検出できないことがあり、すなわち、公知のアッセイの検出レベル未満であり得る。
【００４３】
ある態様によれば、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｓ９タンパク質ニッカーゼ、またはヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９には、ＤＮＡに結合し且つＲＮＡによってガイドされるタンパク質の能力を保持している、そのホモログおよびオルソログが含まれる。ある態様によれば、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓストレプトコッカス・ピオゲネス由来の天然Ｃａｓ９について記載されるような配列、およびそれらの配列に対して少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％の相同性を有し、且つＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質などのＤＮＡ結合タンパク質である、タンパク質配列を含む。
【００４４】
ある態様によれば、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９またはガイドＲＮＡのいずれかに転写活性化ドメインを連結（tether）することによって、細胞におけるＲＮＡ誘導性ゲノム制御を可能にする、改変されたＣａｓ９−ｇＲＮＡシステムが提供される。本開示のある態様によれば、１種類または複数種類の転写制御タンパク質またはドメイン（このような用語は互換的に使用される）が、ヌクレアーゼ欠損型Ｃａｓ９または１種類または複数種類のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と結合または接続される。これらの転写制御ドメインは標的座位に対応する。したがって、本開示の態様は、転写制御ドメインをＣａｓ９ＮまたはｇＲＮＡのいずれかに、融合、接続、または結合することにより、そのようなドメインを標的座位に局在化させるための方法および物質を含む。ある態様によれば、Ｃａｓ９Ｎ、１種類または複数種類のｇＲＮＡ、および転写制御タンパク質またはドメインを用いて、内在性遺伝子を制御する方法が提供される。ある態様によれば、内在性遺伝子は、任意の所望の遺伝子であってもよく、この遺伝子は本明細書中では標的遺伝子と呼ばれる。
【００４５】
ある態様によれば、転写活性化可能なＣａｓ９Ｎ融合タンパク質が提供される。ある態様によれば、ＶＰ６４活性化ドメイン（その全体が参照により援用されるZhang et al., Nature Biotechnology 29, 149-153 (2011) 参照）が、Ｃａｓ９ＮのＣ末端に結合、融合、接続、または連結される。ある方法によれば、Ｃａｓ９Ｎタンパク質によって、標的ゲノムＤＮＡの部位に転写制御ドメインが提供される。ある方法によれば、転写制御ドメインに融合したＣａｓ９Ｎが、１種類または複数種類のガイドＲＮＡと共に細胞内に提供される。転写制御ドメインが融合したＣａｓ９Ｎは、標的ゲノムＤＮＡまたはその近くに結合する。１種類または種類複数のガイドＲＮＡは、標的ゲノムＤＮＡまたはその近くに結合する。転写制御ドメインは、標的遺伝子の発現を制御する。ある態様によれば、Ｃａｓ９Ｎ−ＶＰ６４融合体が、プロモーターの近辺の配列を標的とするｇＲＮＡと組み合わされた場合に、レポーターコンストラクトの転写を活性化して、ＲＮＡ誘導性の転写活性化を示した。
【００４６】
ある態様によれば、転写活性化可能なｇＲＮＡ融合タンパク質が提供される。ある態様によれば、ＶＰ６４活性化ドメインが、ｇＲＮＡに結合、融合、接続、または連結される。ある方法によれば、ｇＲＮＡによって、標的ゲノムＤＮＡの部位に転写制御ドメインが提供される。ある方法によれば、転写制御ドメインに融合したｇＲＮＡが、Ｃａｓ９Ｎタンパク質と共に細胞内に提供される。Ｃａｓ９Ｎは、標的ゲノムＤＮＡまたはその近くに結合する。転写制御タンパク質またはドメインが融合した１種類または複数種類のガイドＲＮＡは、標的ゲノムＤＮＡまたはその近くに結合する。転写制御ドメインは、標的遺伝子の発現を制御する。ある態様によれば、転写制御ドメインが融合したｇＲＮＡおよびＣａｓ９Ｎタンパク質が、レポーターコンストラクトの転写を活性化して、ＲＮＡ誘導性の転写活性化を示した。
【００４７】
ある態様によれば、転写調節タンパク質またはドメインは、転写活性化因子である。ある態様によれば、転写調節タンパク質またはドメインは、標的核酸の発現を上方制御する。ある態様によれば、転写調節タンパク質またはドメインは、転写抑制因子である。ある態様によれば、転写調節タンパク質またはドメインは、標的核酸の発現を下方制御する。転写活性化因子および転写抑制因子は、本開示に基づき当業者に容易に特定され得る。
【００４８】
ある態様によれば、外来核酸配列は、それぞれのＲＮＡがＤＮＡ標的核酸中の近接する部位に相補的である２種類以上のガイドＲＮＡをコードし、さらに、少なくとも１種類のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼをコードし、且つ該２種類以上のＲＮＡによってガイドされ、該２種類以上のＲＮＡおよび少なくとも１種類のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼが発現し、該少なくとも１種類のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼが該２種類以上のＲＮＡと共にＤＮＡ標的核酸に共局在して、該ＤＮＡ標的核酸にニックを形成することにより２つ以上の近接するニックを生じさせる。ある態様によれば、２つ以上の近接するニックは、二本鎖ＤＮＡの同じストランド上に存在する。ある態様によれば、２つ以上の近接するニックは、二本鎖ＤＮＡの同じストランド上に存在して、相同組換えを引き起こす。ある態様によれば、２つ以上の近接するニックは、二本鎖ＤＮＡの異なるストランド上に存在する。ある態様によれば、２つ以上の近接するニックは、二本鎖ＤＮＡの異なるストランド上に存在して、二本鎖切断を生じさせる。ある態様によれば、２つ以上の近接するニックは、二本鎖ＤＮＡの異なるストランド上に存在し、二本鎖切断を生じさせて非相同末端結合を引き起こす。ある態様によれば、２つ以上の近接するニックは、二本鎖ＤＮＡの異なるストランド上に存在し、且つ互いにオフセット（offset）である。ある態様によれば、２つ以上の近接するニックは、二本鎖ＤＮＡの異なるストランド上に存在し、互いにオフセットであり、且つ二本鎖切断を生じさせる。ある態様によれば、２つ以上の近接するニックは、二本鎖ＤＮＡの異なるストランド上に存在し、互いにオフセットであり、且つ二本鎖切断を生じさせて非相同末端結合を引き起こす。ある態様によれば、２つ以上の近接するニックは、二本鎖ＤＮＡの異なるストランド上に存在し、二本鎖切断を生じさせることにより、標的核酸の断片化を引き起こして標的核酸の発現を妨げる。
【００４９】
ある態様によれば、本明細書に記載の方法に従ってＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質の結合特異性が向上され得る。ある態様によれば、ゲノム編集方法においてオフセットニックが用いられる。大部分のニックは、ＮＨＥＪイベントを引き起こすことはほとんどない（その全体が参照により援用されるCerto et al., Nature Methods 8, 671-676 (2011) 参照）ので、オフターゲットなニック形成の影響が最小限に抑えられる。対照的に、オフセットニックを誘導して二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせることは、遺伝子破壊の誘導に非常に効果的である。ある態様によれば、３′オーバーハングとは対照的に、５′オーバーハングは、より有意にＮＨＥＪイベントを引き起す。同様に、３′オーバーハングでは、ＮＨＥＪイベントよりＨＲイベントが多いが、ＨＲイベントの総数は、５′オーバーハングが生じた場合より有意に少ない。したがって、相同組換えのためのニックの使用、およびＣａｓ９−ｇＲＮＡのオフターゲット活性の影響を最小限に抑えるために二本鎖切断を形成するためのオフセットニックを用いる方法が提供される。
【００５０】
本開示に係る生殖系列細胞には、本明細書に記載されるように外来核酸を導入可能でき、発現させることができるあらゆる生殖系列細胞が含まれる。本明細書に記載される本開示の基本的概念は、細胞の種類によって限定されないと理解されるべきである。本開示に係る生殖系列細胞には、真核生物生殖系列細胞、原核生物生殖系列細胞、動物生殖系列細胞、哺乳動物生殖系列細胞、植物生殖系列細胞、昆虫生殖系列細胞、真菌生殖系列細胞、古細菌生殖系列細胞、真正細菌生殖系列細胞などが含まれる。さらに、生殖系列細胞には、本明細書に記載の外来核酸配列を導入することが有益であるか、または望ましい、任意の生殖系列細胞が含まれる。
【００５１】
標的核酸としては、本明細書に記載される共局在複合体が切断、ニック形成、または制御のいずれかに有用であり得る任意の核酸配列が挙げられる。標的核酸としては、遺伝子が挙げられる。本開示の目的のために、二本鎖ＤＮＡなどのＤＮＡは標的核酸を含んでいてもよく、共局在複合体は、その共局在複合体が標的核酸に対する所望の効果を与えられ得るよう、その標的核酸において、またはその標的核酸に隣接して、またはその標的核酸の近傍で、ＤＮＡに結合、またはＤＮＡと共局在することができる。そのような標的核酸は、内在性の（または天然の）核酸および外来性の（または外来の）核酸が含んでいてもよい。当業者は、本開示に基づき、標的核酸を含むＤＮＡに共局在するガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質を容易に特定またはデザインすることができる。当業者はまた、標的核酸を含むＤＮＡに同様に共局在する転写調節タンパク質またはドメインを特定することができる。ＤＮＡには、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡが含まれる。
【００５２】
外来核酸（すなわち、細胞の天然核酸組成物の一部でない核酸）は、当業者に公知の任意の導入方法を用いて、細胞に導入されてもよい。そのような方法には、遺伝子導入法、形質導入法、ウイルス形質導入法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、ヌクレオフェクション法、ナノ粒子銃（nanoparticle bombardment）法、形質転換法、結合（conjugation）法などが含まれる。当業者は、容易に特定可能な文献資料を用いてそのような方法を容易に理解し、適用するであろう。
【００５３】
転写活性化因子または転写抑制因子である転写調節タンパク質またはドメインは、本開示および具体的な生殖系列細胞に基づき、当業者に容易に特定され得る。
【００５４】
以下の実施例は本開示の代表例として記載されるものである。本開示、図面、および添付の特許請求の範囲を考慮して、これらの実施形態およびその他の同等の実施形態が明らかになるので、これらの実施例は本開示の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【００５５】
実施例Ｉ
Ｃａｓ９遺伝子ドライブ
図１Ａは、標的ＤＮＡへのガイドＲＮＡおよびＣａｓ９ヌクレアーゼの共局在を示す模式図である。標的ＤＮＡ部位は、ガイドＲＮＡの「スペーサー」とマッチする「プロトスペーサー」配列、およびＣａｓ９結合に必要な短いプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。図１Ａに示される例示的なＣａｓ９遺伝子ドライブは、ＲＮＡ誘導型Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、隣接必須遺伝子内など、１つまたは複数の標的ＤＮＡ部位に相補的な１種類または複数種類のガイドＲＮＡ、および隣接配列を少なくともコードする、本明細書に記載の外来核酸配列（「カセット」と呼ばれることがあり、この用語は当業者に理解されている）である。カセットはさらに、任意のカーゴ遺伝物質、例えば、カーゴ遺伝物質が挿入される生殖系列細胞によって発現される１種類または複数種類の遺伝子、またはその細胞の子によって発現される１種類または複数種類の遺伝子を含み得る。Ｃａｓ９遺伝子ドライブを発現させてＣａｓ９および１種類または複数種類のガイドＲＮＡを産生させ、これらは次に、染色体対の第１の染色体上の１つまたは複数の標的ＤＮＡ部位で共局在して、そこでＣａｓ９は部位特異的に第１の染色体上の標的ＤＮＡを切断して二本鎖切断が形成される。次に、Ｃａｓ９によって誘導される二本鎖切断の相同性修復により、Ｃａｓ９遺伝子ドライブが第１の染色体の切断部位に挿入される。ある態様によれば、次に、挿入されたＣａｓ９遺伝子ドライブが発現されてＣａｓ９および１種類または複数種類のガイドＲＮＡが産生され、これらは次に、染色体対の第２の染色体上の１つまたは複数の標的ＤＮＡ部位で共局在して、そこで、標的ＤＮＡを部位特異的に切断して二本鎖切断が形成される。Ｃａｓ９により誘導される二本鎖切断の相同性修復は、無傷のＣａｓ９ドライブ含有染色体を鋳型として利用し、これによりＣａｓ９ドライブが染色体対の第２の染色体に挿入されて、Ｃａｓ９遺伝子ドライブについてホモ接合型の染色体対が作成される。これを図１Ｂに示す。
【００５６】
図１Ｃは、標的ＤＮＡ部位の変異が単一Ｃａｓ９タンパク質による切断を防ぎ得ることを示す図である。したがって、図１Ｄに記載の本開示の態様は、複数の標的ＤＮＡ部位のための複数のガイドＲＮＡを提供する。このようにして、ＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブは、単一の変異により抵抗性が付与されないように複数の隣接配列を標的とすることにより、抵抗性アレルを克服することができる。標的ＤＮＡ部位が複数の位置で切断されることになりＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブを挿入できる切断部位が提供されるため、変異が原因で標的部位が切断されない可能性が大幅に低下する。図１Ｅに示すように、代替的な非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を用いた修復により全ての認識部位が欠失されるため、ドライブを打ち破るドライブ抵抗性アレルが形成される。図１Ｆは、必須遺伝子を破壊するＮＨＥＪイベントが非常に有害であり、ドライブに有利なように、逆選択（selected against）され得ることを示す図である。必須遺伝子内に標的部位を選択することによって、不正確な修復イベントが標的配列の全部を欠失させることにより抵抗性アレルが形成されないことが保証される。非相同末端結合により、小さな挿入または欠失が修復の接続部に形成されることがあり、これにより修復部位へのガイドＲＮＡおよびＣａｓ９の結合が防がれ得る。その結果、ＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブにコードされる、この部位に対するガイドＲＮＡが１種類しか存在しない場合、ＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブは染色体上のこの部位に挿入不可能になり得る。しかし、ＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブに複数の部位を標的とする複数のガイドＲＮＡをコードさせて複数の切断部位を作ることにより、ＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブが染色体に挿入される可能性が高くなる。さらに、本開示の態様は、染色体中にＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブを挿入する効率を向上させる方法としての、必須遺伝子内の複数のＣａｓ９部位の標的化に関する。
【００５７】
実施例ＩＩ
複数の内在性座位の編集および制御
本開示のある態様によれば、ＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブは、それぞれの野生型アレルを標的とする複数のガイドＲＮＡを組み込むことにより、ドライブ自体の遠位（distal）に存在する複数の内在性アレルを編集することができる。図２Ａに示されるように、複数の遺伝子配列のために、すなわち遺伝子Ａの野生型（ＷＴ）、遺伝子Ｂの野生型、および必須遺伝子の野生型のために、複数のガイドＲＮＡが提供される。複数のガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質の発現により、それぞれの遺伝子がＣａｓ９によって改変される。ある態様によれば、Ｃａｓ９ドライブは、転写調節因子が遺伝子を制御できるように標的ＤＮＡ部位に共局在可能な転写調節因子と共に、関連ガイドＲＮＡおよび１種類または複数種類の直交ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質をさらに含んでよい。図７参照。図２Ｂに示されるように、以前のＣａｓ９ドライブによって予めなされた改変をアップデートするために、更なる後続のＣａｓ９ドライブを用いることができる。例えば、特定のドライブが予想外の副作用を引き起こす場合、アップデートとして放出される第２のドライブが、第１のドライブによってコードされる１つまたは全ての改変を上書きすることができる。この態様によれば、第２のドライブは、既存の挿入されているドライブを除去して、染色体中に自身を挿入するようにデザインすることができる。さらに、以前のＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブによって改変された１種類または複数種類の遺伝子は、除去されて所望の遺伝子で置換され得る。同様に、図２Ｃに示されるように、第３の回復ドライブにより、回復ドライブを拡散するために必要なＣａｓ９およびガイドＲＮＡの存在を除き、全ゲノム位置の野生型配列を回復することができる。このようにして、集団を改変してその野生型に復帰させることができる。したがって、本開示の態様は、本明細書に記載の方法を用いて、予め改変された細胞に第２のＲＮＡ誘導型Ｃａｓ９遺伝子ドライブを導入することによる、予め挿入されたＲＮＡ誘導型Ｃａｓ９遺伝子ドライブの改変または置換に関する。第２の遺伝子ドライブは、第１の遺伝子ドライブによってなされた改変を超えるその他の改変を行うように、または第１の遺伝子ドライブによってなされた改変を除去するようにデザインされる。
【００５８】
実施例ＩＩＩ
拡散の制御
ある態様によれば、単一の標的種または亜集団に関連する固有の遺伝子または配列多型を標的とすることにより、ＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブの拡散を単一の標的種、または亜集団にさえも限定することができる。ドライブは固有配列のみを切断できるので、非標的集団中には拡散しない。したがって、本開示の態様は、固有の遺伝子配列または配列多型に特異的なＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブをデザインおよび使用する方法に関する。このようにして、固有の遺伝子配列または配列多型に相補的になるように１種類または複数種類のガイドＲＮＡがデザインされる。このようにして、固有の遺伝子配列または配列多型に局在するようにＤＮＡ結合タンパク質が制限される。
【００５９】
実施例ＩＶ
人為的種分化の誘導
ある態様によれば、２つの集団間に遺伝的不適合を生じさせることにより遺伝子流動を阻止するための、ＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブの使用方法が提供される。この態様によれば、図３に示されるように、異なるガイドＲＮＡを用いて同じ必須遺伝子内の異なる配列を標的とする２つの遺伝子ドライブが、２つの集団中に放出される。各集団内で必須遺伝子の各コピーが喪失することにより、２つの集団は不適合になる。この種類のドライブを集団中に放出することにより、ドライブの数だけ集団が人為的に分割されることになる。例示的な図３に示されるように、ドライブＡは必須遺伝子Ｘ内の配列１、２、３、および４を切断する。ドライブＡが拡散する際、ドライブＡは遺伝子Ｘを配列１、２、３、および４が再コード化されたバージョンで置換するので、これらはこれらは切断されない。ドライブＢは遺伝子Ｘ内の配列５、６、７、および８を切断し、このバージョンの遺伝子Ｘはこれらの配列が再コード化されているため、これらは切断されない。ドライブＡを有する雄がドライブＢを有する雌と交雑すると、ドライブＡおよび１／２／３／４が再コード化された遺伝子Ｘを有する１つの染色体ならびにドライブＢおよび５／６／７／８が再コード化された遺伝子Ｘを有する１つの染色体を受け継いだ子孫が生じる。第２のコピーは部位１／２／３／４が再コード化されておらず、５／６／７／８のみが再コード化されているので、ドライブＡは遺伝子Ｘの第２のコピーを部位１／２／３／４で切断する。同様に、第１のコピーは部位５／６／７／８が再コード化されておらず、１／２／３／４のみが再コード化されているので、ドライブＢは遺伝子Ｘの第１のコピーを部位５／６／７／８で切断する。この生物は最終的に、遺伝子Ｘの両方のコピーが切断される。遺伝子Ｘは必須であり、生物はこれらを修復するために用いる遺伝子Ｘの無傷のコピーを有さないので、生物は死滅する。したがって、ドライブＡおよびドライブＢは不適合である。
【００６０】
この態様によれば、各ドライブは、異なるバージョンの必須遺伝子、すなわち、第１の外来核酸配列および第２の外来核酸配列、をコードし、それぞれがその遺伝子によってコードされる必須タンパク質のアミノ酸配列を保存しているが、異なる標的位置のセットが再コード化されている。すなわち、第１のドライブは、部位１／２／３／４がガイド１／２／３／４に非相補的になるように再コード化されており、一方、第２のドライブは、部位５／６／７／８がガイド５／６／７／８に非相補的になるように再コード化されている。ドライブが交雑すると、必須遺伝子の第２のドライブのコピーは再コード化された部位１／２／３／４を有していないので、第１のドライブが必須遺伝子の第２のドライブのコピーを１／２／３／４で切断し、一方、必須遺伝子の第１のドライブのコピーは再コード化された部位５／６／７／８を有していないので、第２のドライブが必須遺伝子の第１のドライブのコピーを５／６／７／８で切断する。
【００６１】
より複雑な遺伝子ドライブにより、野生型集団を改変することなく、改変された亜集団と野生型集団との間の遺伝子流動を阻止することができる（図８参照）。この障壁はさらに一方向的であってもよく、改変集団は遺伝物質を受けることはできるが、野生型集団に遺伝物質を提供することはできない（図９参照）。これらのデザインまたは関連するデザインは、他の遺伝子ドライブまたは他の遺伝子改変が同種または関連する生物種の未改変メンバーに拡散するのを防ぐために用いられ得る。この態様によれば、２つの集団のうちの一方だけが改変され、２つの別個のＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブが用いられる。第１のドライブは第２のドライブのための挿入部位を形成する。第２のドライブは、（１）必須遺伝子のコピーを含み、第１のドライブによって形成された挿入部位中に第２のドライブが拡散する際にその遺伝子をコピーし、（２）その必須遺伝子の野生型コピーを死滅させる。第２のドライブを有する生物が第１のドライブを有する生物と交配する場合、第２のドライブが第１のドライブによって形成された挿入部位中にコピーされ、必須遺伝子のコピーを付加し、野生型コピーを除去する。必須遺伝子の正味の変化は０であるため細胞は生存可能である。第２のドライブを有する生物が野生型生物と交配する場合、野生型染色体は挿入部位を有さないので、ドライブおよびその必須遺伝子は野生型染色体中に挿入不可能である。しかし、第２のドライブは依然として野生型コピーを死滅させる。必須遺伝子の正味の変化は−１であるので、細胞は死滅する。したがって、第２のドライブを含む生物と野生型生物の間の任意の交配は子孫を生じない。本開示のこの態様は、導入遺伝子の拡散を防ぐための、野生型集団と不適合なトランスジェニック生物を作製する方法を提供する。
【００６２】
実施例Ｖ
集団の抑制および絶滅
ある態様によれば、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼにより、集団制御に有用であり得る、複数の異なった形態の性別バイアス化遺伝子ドライブ（sex-biasing gene drive）を作り出すことができる。図４Ａに示されるように、雄減数分裂中にのみＸ染色体を標的とするＣａｓ９およびガイドＲＮＡの発現により、自然界に存在するものと類似した古典的な「減数分裂」Ｙドライブが生じる。減数分裂遺伝子ドライブにより、減数分裂中に競合する性染色体が除去され、バイアスのかかった配偶子プールが生じる。ドライブ発現は前減数分裂期に厳密に制限されなければならず、さもなければドライブは致死性になる。この種類のドライブは、ＸＹ、ＺＷ、およびより低い程度でＸＯの性決定系を使用する生物の配偶子をいずれかの性別に有利なようにバイアスをかけることができる。さらに図４Ａに関して、ＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブが精母細胞のＹ染色体に導入されている。ＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブには、Ｘ染色体上の複数の標的配列に相補的な複数のガイドＲＮＡが含まれる。ＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブが発現される場合、ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９ヌクレアーゼはＸ染色体に共局在し、そこでＣａｓ９ヌクレアーゼは二本鎖切断を形成してＸ染色体を作働不能（inoperable）にする。減数分裂後、Ｙ染色体を有する精子のみが生存可能となる。
【００６３】
重要なことに、直交Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、減数分裂による染色の発現停止（mitotic chromosome silencing）を回避可能であるはずである。本開示の態様は、精子形成前に好適なガイドＲＮＡと共にＣａｓ９を発現させるためのＹ染色体上の本明細書に記載されるような第１のＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブの使用に関し、発現されたＣａｓ９および好適なガイドＲＮＡは常染色体を切断し、第２のＣａｓ９および好適なガイドＲＮＡをコードする第２のＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブが常染色体に挿入される。精子形成中、常染色体中の第２のＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブが発現され、発現された第２のＣａｓ９および好適なガイドＲＮＡはＸ染色体を切断することによりこれを作働不能にする。この方法により、Ｘ染色体およびＹ染色体が精子形成中に発現されない種においてもＸ染色体を切断することが可能になる。図４Ｂに示されるように、Ｃａｓ９は、減数分裂中に競合する性染色体を自由に除去できる発生初期に、Ｃａｓ９Ｂをコードするカセットを性染色体から常染色体にコピーさせる。ある態様によれば、特定の性にバイアスをかけるＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブが、性染色体上に与えられ、ドライブは集団をその性にバイアスをかける。例えば、哺乳動物において雄はＹ染色体を有するので、集団を雄にバイアスをかけるドライブはＹ染色体上に存在しなくてはならず、それにより、ドライブはＹ染色体がより多く自身のコピーを作るのを助ける。哺乳動物の性染色体は減数分裂（精子形成および卵形成）中に発現されないので、発現された場合に性染色体を切断するＣａｓ９を産生する染色体中へのドライブの適切な挿入を促進するために、２コピーのＣａｓ９を用いてもよい。第１のＣａｓ９は、精子形成のかなり前の発生の初期に働き、常染色体（減数分裂中に発現停止されない非性染色体）を切断することにより、第２のＣａｓ９をコードするＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブの常染色体への挿入を可能にする。この第２のＣａｓ９は、精子形成中に常染色体から発現され、Ｘ染色体を切断することにより、確実に生存可能な精子のほとんどがＹ染色体を含むようにする。したがって、上記の方法は、２種類のＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブを用い、１つは、性染色体が減数分裂中に遺伝子を発現できない状況において集団を雄にバイアスをかけるために、発現可能な常染色体に挿入される。
【００６４】
図４Ｃに示すように、「接合体」の性別バイアス化ドライブは、接合段階または接合後段階（post-zygotic stage）（その全体が参照により援用されるRice and Friberg 2008 参照）に反対の性の同胞を排除する。重要なことに、これらは機能するために高度に特異的な発現パターンを必要としない。Ｘドライブは、単純にＹ染色体上の部位を標的とすることにより雄の接合体を排除する（図４Ｃ）。Ｙドライブでは、遺伝子ドライブカセットがＸ染色体上の必須遺伝子の代わりに自身をコピーし、必須遺伝子の喪失は、雄においてはドライブＹ染色体上の別の場所に挿入されているコピーによって補完される（図４Ｄ）。一部の種において、遺伝子量補償のために、移植された必須遺伝子の発現を調整する必要があり得る。
【００６５】
図４Ｃに関して、野生型精母細胞により、Ｘ染色体を有する野生型精子およびＹ染色体を有する野生型精子が形成される。卵母細胞は、Ｙ染色体に相補的な１種類または複数種類のガイドＲＮＡを有するＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブを備え、これは、「Ｘドライブ卵母細胞」と呼ばれる。Ｙ染色体を有する野生型精子がこの卵母細胞と結合した場合、ＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブが発現され、ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９ヌクレアーゼがＹ染色体に共局在し、そこでＣａｓ９ヌクレアーゼがＹ染色体中に二本鎖切断を形成してＹ染色体を作働不能にすることにより、作働不能な接合体が形成される。対照的に、Ｘ染色体を有する野生型精子がこの卵母細胞と結合した場合、ＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブが発現され、Ｘ染色体に相補的なガイドＲＮＡおよびＣａｓ９ヌクレアーゼがＸ染色体に共局在し、Ｃａｓ９ヌクレアーゼがＸ染色体中に二本鎖切断を形成し、これが相同組換えによって修復されることにより、Ｘ染色体中にＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブが挿入されて、接合体はＸ染色体についてホモ接合型になる。このＸ染色体のコピーは、ＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブがコピーされる時に二本鎖切断が修復されるので、生存可能なままである。Ｙ染色体の喪失のため雄は生存可能でないので、生じる子孫は全て雌である。これらの雌は、雄の同胞と資源を競争する必要がないので、ＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブをコードしない他の雌より有利である。その結果、ＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブを有するＸ染色体は適応度上の利点を有する。図４Ｄに関して、接合体Ｙドライブが、通常はＸ染色体上に存在する必須遺伝子をコードし、遺伝子ドライブカセットを用いてＸ染色体からその必須遺伝子を除去する。Ｙドライブが父方のＸ染色体から母方のＸ染色体へと挿入され、雌接合体は必須遺伝子のコピーを１つも有さなくなる。特に、精母細胞は、Ｘ染色体由来の必須遺伝子およびＸ染色体上の必須遺伝子に相補的な１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードするＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブを有するＹ染色体を備える。精母細胞のＸ染色体も同じＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブを含む。精母細胞はＹ染色体を有する精子およびＸ染色体を有する精子を産生する。Ｙ染色体を有する精子は、必須遺伝子を有するＸ染色体を有する野生型卵母細胞と結合する。ＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブが発現される場合、１種類または複数種類のガイドＲＮＡがＣａｓ９ヌクレアーゼと共にＸ染色体に共局在し、Ｃａｓ９ヌクレアーゼがＸ染色体から必須遺伝子を切り取る。しかし、Ｘ染色体由来の必須遺伝子がＹ染色体上に存在するため、接合体は生存可能となる。対照的に、ＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブを含むＸ染色体を有する精子がＸ染色体を有する野生型卵母細胞と結合すると、発現された１種類または複数種類のガイドＲＮＡはＣａｓ９ヌクレアーゼと共にＸ染色体に共局在して、そこでＣａｓ９ヌクレアーゼはＸ染色体から必須遺伝子を切り取る。必須遺伝子は卵母細胞中にもはや存在しないので、卵母細胞は生存可能ではない。
【００６６】
接合体ドライブの適応度の利点は、同胞競合の程度、子への親の投資の程度、および成体の交配動態によって異なり得る。全ての接合体Ｙドライブは、競合する野生型Ｙ染色体よりは多くなくとも、少なくとも同じ数の息子を産生するはずであり、それらの息子はいずれも姉妹と競合する必要がないであろう。他のドライブ型と異なり、特定のリスクに晒されている関連種または非標的亜集団との交配が生殖不能になることを確実にすることにより、接合体Ｙドライブの宿主範囲は制限することができる。これは、Ｘ染色体上の固有配列を切断してハイブリッドの雄を排除するガイドＲＮＡを組み込むことにより達成することができる。
【００６７】
ドライブを阻止できる変異がＸ染色体上または常染色体の１つの上で急速に生じない場合は、Ｙドライブの放出により局所的集団を絶滅させる。切断に抵抗性の性染色体を有する生物を放出することにより、ドライブを停止させ、最終的に除去することができる。厳重な監視および制御により、完全な絶滅を防止することができる。
【００６８】
ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼはさらに、集団を抑制できるがドライブのように拡散しない、活動性のより低い「生殖不能娘（sterile-daughter）」Ｙ染色体を作り出すことができる（図１０Ａ）。雌の生存能ではなく雌の生殖能に必須のＸ連鎖遺伝子を標的とするＹ染色体上のＣａｓ９のコピーは、依然として雌子孫の生殖能を取り除くが、息子に利点をもたらさないであろう。Ｃａｓ９活性のコストが小さいため、生殖不能娘Ｙは最終的に野生型Ｙ染色体との競争に敗れるが、十分多数が導入された場合は、競争に敗れる前に著しく集団を抑制する。このアプローチは、昆虫および魚の集団を制御するために開発中の、雌特異的致死法および雌特異的生殖不能法に密接に関連しているが、Ｙ上のその位置のため、構築がより簡単であり、進化的により安定であると考えられる。
【００６９】
集団制御のためのハイブリッドアプローチにより、Ｙドライブ法の利点と生殖不能娘法の利点を組み合わせてもよい（図５Ａ〜Ｂ）。例えば、必須遺伝子および雌の生殖能遺伝子の両方を標的とするＹ染色体は、Ｙドライブであるため、集団中に自身を急速にドライブするであろう。しかし、Ｘ染色体上の必須遺伝子は再コード化するが雌の生殖能遺伝子は再コード化しない、後に放出される標準的遺伝子ドライブに遭遇すると、適応度上の利点を失うであろう。ハイブリッド雌は、胚の時期に死滅する代わりに生殖不能に育ち、絶滅させずに継続的な抑制を引き起こす。
【００７０】
集団制御の関連アプローチでは、ＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブを用いて、（１）生殖能または生存能に必要であるが、（２）１つの無傷のコピーで機能するのにほぼ十分である、１つまたは複数の遺伝子を破壊する。そのようなドライブは、その遺伝子の機能が必要とされるより後の任意の時点で、１コピーのドライブおよび１コピーの野生型遺伝子を受け継ぐ生物の生殖系列細胞中の標的遺伝子を切断および置換し得る。例えば、生殖腺発達およびその後の生殖能に必要な遺伝子が減数分裂の直前にＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブによって切断および置換され得る。１コピーのみを受け継いだ生物は、野生型コピーがこの目的のために十分であるため、既に生殖腺が正しく発達している可能性があるので、正常な生殖能を有し得る。しかし、精子および／または卵生成の直前にドライブがコピーされるため、大部分の子または全ての子がドライブを受け継ぐ。このデザインは、ほとんどの交配イベントにより１コピーのドライブおよび１コピーの野生型を受け継ぐ個体が多く生じることになるので、希少な場合、ドライブが集団中に拡散することを可能にする。その後、ドライブを保有する２個体間の交配により生殖不能の子が生じ、集団が崩壊（crash）することになる。このシナリオは、それぞれその全体が参照により援用されるBurt, A. Site-specific selfish genes as tools for the control and genetic engineering of natural populations. Proc. Biol. Sci. 270, 921-928 (2003), Deredec, A., Burt, A. & Godfray, H. C. J. The population genetics of using homing endonuclease genes in vector and pest management. Genetics 179, 2013-2026 (2008),  North, A., Burt, A. & Godfray, H. C. J. Modelling the spatial spread of a homing endonuclease gene in a mosquito population. J. Appl. Ecol. 50, 1216-1225 (2013) に記載されるように大規模にモデル化されている。遺伝子発現を生殖系列細胞および／または減数分裂前の時期に制限する方法は当業者に公知である。
【００７１】
実施例ＶＩ
応用例
本明細書に記載の遺伝子ドライブは、感染症の根絶および侵入種の制御において特に実用的である。そのようなＲＮＡ誘導型Ｃａｓ９遺伝子ドライブは、例えば両生類などの絶滅危惧種または準絶滅危惧種を通じて、保護的アレルを急速に拡散するために用いられ得る。そのようなＲＮＡ誘導型Ｃａｓ９遺伝子ドライブは、ドライブによって運ばれる外来種由来のＲＮＡｉ機構を有するＲＮＡウイルスおよびＣａｓ９でｄｓＤＮＡウイルスを標的化することにより、一般的にヒトウイルスの保有宿主となる野生集団を免疫化するために用いることもできる。本明細書に記載のＹドライブ、すなわちＸ染色体の伝播を阻害するＲＮＡ誘導型Ｃａｓ９遺伝子ドライブを用いて、疾患媒介生物を、病原体を獲得できないように改変するか、または排除することができる。同様に、Ｙドライブを用いて、侵入的および生態破壊的な有害生物を局所的に制御するまたは根絶することができる。生態学的ダメージを最小限に抑えるため、ならびに避難所および救出機関の必要を減らするために制御される、関連する野生種および野生化した集団に、家畜が遺伝子を供与することを防止することができる。同様に、絶滅の危機に瀕している絶滅危惧種を、個体数の多い近縁種または侵入的な近縁種から、遺伝子希釈（genetic dilution）により分離することができるように、トランスジェニック作物およびトランスジェニック動物をそれらの未改変対応物から遺伝的に分離することができる。最後に、遺伝子ドライブを用いて、自然環境における遺伝子、性比、および種分化の進化的および生態学的重要性に関する仮説を直接試験することができる。
【００７２】
本明細書に記載の遺伝子ドライブは、病原媒介生物による疾患に関して特に実用的である。病原媒介生物による感染症のヒトの被害は驚異的である。マラリアだけで毎年６５０，０００人を超える人が死亡しており、その大部分は子供であり、一方、さらに２億人が消耗性発熱に苦しみ、その社会の経済を逼迫している。デング熱、黄熱病、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、シャーガス病、およびライム病が、媒介生物を用いて拡散するその他の病原体によって生じる。伝染を防止する変更を媒介生物中でドライブすることにより、これらの全てを低減すること、または排除することさえもできる可能性がある。科学者はマラリア（Ito et al Nature 2002, PMID:12024215: Dong et al PloS Pathogens 2012, PMID: 22216006; Isaacs et al., PNAS 2012, PMID: 22689959）およびよく研究されている他の疾患（Franz et al PNAS 2006, PMID: 16537508）の伝染に干渉する複数の候補遺伝子破壊または挿入遺伝子を特定しているが、他の多くの病原体では特定されていない。したがって、本開示の態様は、Ｙドライブを用いて媒介生物種を直接排除することに関する。マラリアの場合、屋外で刺して休むことを好む出現しつつある蚊媒介生物に対して、これらの行動は屋内での殺虫剤噴霧および蚊帳を中心ろした現行の制御戦略に対して非常に耐性があるので、この戦略は特に有望である。伝染を止めるためには所与の地域の全ての媒介生物種を標的としなければならないが、新規に空いた生態的ニッチが、競合する非媒介生物種で占められた場合、疾患は永久的に根絶されることになる。重要なことに、この戦略は媒介生物の分子生物学の理解をほとんどまたは全く必要としないが、媒介生物種の局所的またはおそらく世界的絶滅を必然的に伴う。
【００７３】
本明細書に記載の遺伝子ドライブは侵入種の制御に特に実用的である。世界的経済活動による最も環境にダメージを与える結果の１つが侵入種の輸送であり、これによりしばしば生態破壊および在来種の絶滅が引き起こされる。小さな島の生態系のような孤立した生態系は特に脆弱である。Ｃａｓ９  Ｙドライブは、これらの種を制御することにより、またはさらには個々の島もしくはおそらく大陸全体から根絶することにより、生物多様性を促進する非常に大きな可能性を有する。侵入種に固有のドライブ配列をデザインし、危険にさらされている近縁生物のＸ染色体を分解するガイドＲＮＡを組み込み、且つ種分化ドライブを用いて標的種をその近縁生物と遺伝的に不適合にすることにより、全ての関連種を直接的に改変することなく、ドライブが選択された種を標的とし、異種間転移のリスクが低減される。Ｙドライブの機能に必要な部位を再コード化する種特異的な標準的遺伝子ドライブを放出することにより、関連種を保護することができる。侵入集団から生息環境（native habitat）にＹドライブが拡散するリスクは、淡水魚またはオオヒキガエルなどの意図的なヒトの行為を通じてのみ侵入する種では無視可能であるが、ラットおよび他の侵入的密航生物（invasive stowaway）では、ほぼ確実にＹドライブは拡散する。Ｘ再コード化ドライブ、またはさらには抵抗性Ｘ染色体を放出することにより、在来集団を絶滅から常に保護することができるであろう。例えば、コイなどの移動度の低い種の侵入集団はＹドライブによる直接的排除の素晴らしい候補である。（図６Ａ）。遺伝子流動には意図的なヒトによる導入が必要であるので、局所的な根絶は永久的である可能性があり、在来集団を再コード化する必要なく達成可能である。対照的に、ラットおよび他の移動度の高い侵入種は、種の完全な絶滅を除いて、永久的に排除することができない。しかし、在来集団中に標準的再コード化ドライブ、および侵入集団全体に生殖不能娘効果（sterile-daughter effect）を有するＹドライブ（Ｙ−ドライブ−ＳＤ）を定期的に放出することにより、それらを制御することができる（図６Ｂ）。
【００７４】
実施例ＶＩＩ
農業上の安全性および持続可能性
本開示の態様は、農業に関連する雑草および有害生物を制御、低減、または排除するための、本明細書に記載のＣａｓ９方法の使用に関する。有害生物とは通常、ヒトまたは農業もしくは家畜生産などのヒトの事業に有害な植物または動物を指す。有害生物という用語には、植物または動物、ヒトまたはヒトの事業、家畜、ヒトの構造、野生の生態系などにとって、侵入的または多産の、有害な（detrimental）、厄介な（troublesome）、侵害性の（noxious）、破壊的な、迷惑な（nuisance）、任意の生きている生物が含まれ得る。有害生物という用語にはさらに、害虫（vermin）、雑草、植物および動物の寄生生物（parasite）、ならびに病原体が含まれ得る。本開示に係る雑草とは、特定の状況で望ましくないと考えられる植物を指し得る。広義には、雑草は、植物である有害生物と考えることができる。例としては通常、農場、庭、芝生、および公園などのヒトにより制御された状況における望まれない植物が挙げられる。「雑草」という用語にはさらに、活発（aggressive）に成長もしくは繁殖するか、またはその生息環境以外で侵入的（invasive）である、任意の植物が含まれ得る。
【００７５】
本開示のある実施形態によれば、にＣａｓ９法を用いて、雑草または有害生物の生殖系列細胞のゲノム中に１つまたは複数のＲＮＡ誘導型「感作ドライブ（sensitizing drive）」が挿入される。感作ドライブとは、本明細書に記載されるような遺伝子ドライブであり、「感作遺伝子ドライブ」と呼ばれることもある。したがって、「感作ドライブ」とは、ゲノムＤＮＡ中に挿入され、子孫へと移行し、子孫をある外部刺激に対して感受性にする遺伝子ドライブである。ある態様によれば、ＲＮＡ誘導型「感作ドライブ」は、ゲノムＤＮＡ中に組み込まれた結果、特定の化合物または化学物質に対して、毒性などの有害な感受性を雑草または有害生物に付与する。このようにして、雑草または有害生物を、雑草または有害生物にとって本体は有毒でない特定の化合物または化学物質または条件に接触させることにより、雑草または有害生物の成長および増殖を制御することができる。このようにして、生殖系列細胞中への遺伝子ドライブの挿入および子孫への移行の結果、感作遺伝子ドライブにより雑草または有害生物の表現型が改変された。このように、雑草または有害生物への言及は、生殖系列細胞中への感作遺伝子ドライブの最初の挿入および野生型集団との交配によって生じた集団を指すことがある。生じた集団は、改変集団（altered population）または感作集団または遺伝的改変集団と呼ばれ得る。
【００７６】
本開示において、雑草または有害生物についての「感受性」という用語は、雑草または有害生物が晒される特定の化合物または化学物質または条件に対する、毒性などの有害反応を意味する。感作ドライブは、ゲノムＤＮＡを改変して、雑草または有害生物が晒される特定の化合物、化学物質、または条件に反応して毒性などの有害反応を生じさせる、本明細書に記載されるような遺伝子ドライブである。「感作ドライブ」は、そのゲノム中に感作ドライブまたは毒性ドライブが存在することにより、特定の化学物質、化合物、または条件が、雑草または有害生物に対して毒性がある限り、本明細書において、「毒性ドライブ」または「毒性遺伝子ドライブ」と呼ばれることもある。ある態様によれば、感作ドライブまたは毒性ドライブは生殖系列生物に外因的に付加される。このように、感作遺伝子ドライブまたは毒性遺伝子ドライブは外来核酸であるが、特定の応用では、雑草または有害生物種に天然に存在するがそれが導入される生殖系列細胞中には存在しない配列が含まれ得る。ある態様によれば、感作ドライブまたは毒性ドライブは、本明細書に記載されるようにＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドＲＮＡを用いて生殖系列生物に外因的に加えられる外来核酸である。
【００７７】
ある態様によれば、雑草または有害生物は、特定の除草剤または農薬に抵抗性であるか、または、雑草または有害生物は、長い時間をかけて特定の除草剤または農薬に対する抵抗性を生じたものであってもよい。除草剤または農薬に対する雑草または有害生物の進化は農業にとって大きな問題である。本明細書に記載の方法は、ＲＮＡ誘導型「感作ドライブ」を用いて、生物の子孫が、特定の化学物質、化合物、または条件に感受性になり、生物が毒性により死ぬか、増殖が低減するか、あるいは生物が生殖できないように生殖不能になるように、その生物にとって以前は非毒性または低毒性であった特定の化学物質、化合物、または条件に対する、生物の感受性を付与する。このようにして、感作遺伝子ドライブ内の核酸配列が雑草または有害生物などの生物によって発現され、核酸の発現により生物の表現型が改変されて、特定の化学物質、化合物、または条件に対して生物を脆弱にする。
【００７８】
別の態様によれば、単数または複数の感作ドライブを用いて、抵抗性アレル（抵抗性変異を有するアレルなど）をその祖先型（または変異していない）同等物で置換して感受性を回復させる。したがって、抵抗性を有する変異型のアレルを除去して、感受性を有する非変異型でそのアレルを置換することにより、アレルの変異によって除草剤または農薬に対する抵抗性を生じた生物を、除草剤または農薬に対して感受性にすることができる。このように、変異型のアレルが含まれるので、生物または生物の集団にとって、非変異型のアレルは外来性である。したがって、感作遺伝子ドライブは、既存の農薬または除草剤に対する抵抗性を付与する既知の変異を逆転させ得る。ＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブを用いて、生物の集団中に拡散したゲノム変化を逆転させる。この態様によれば、本明細書に記載されるように、第２のドライブを放出することにより、第１のドライブによって生じた１つまたは全ての変化を上書きすることができる。このように、生物の集団は、生殖系列細胞中に最初に導入されて子孫においてその表現型を生み出し、次に子孫へと移行した、毒性などの表現型を付与する、第１の遺伝子ドライブおよび第１の核酸配列の存在により特徴付けられる。しかし、変異またはその他の理由により、表現型は失われる。これに関連して、第１の核酸の除去と共にまたは除去しないで、同じ表現型を付与する第２の核酸配列を有する第２の遺伝子ドライブを生殖系列細胞中に導入して、第２の核酸配列が子孫へと伝わり。このようにして、第１の遺伝子ドライブ核酸が第２の遺伝子ドライブ核酸によって上書きされて、例えば抵抗性を生じる変異が逆転されることにより毒性が生じる。
【００７９】
別の態様によれば、感作ドライブが、プロドラッグ変換酵素を発現する生物にとってプロドラッグ分子を有毒にし得る、プロドラッグ変換酵素を保有し得る。このように、酵素が産生され、生物がプロドラッグに接触した場合、酵素は、プロドラッグを雑草または有害生物などの生物に対して毒性を有する特定の化合物または化学物質に変換する。本発明に基づいて、種々のプロドラッグ／酵素の組合せが当業者に明らかとなるであろう。
【００８０】
別の態様によれば、感作ドライブが、必須遺伝子を、特定の小分子によって強力に阻害されるバージョンに置換し得る。したがって、遺伝子の発現が阻害されるか、または遺伝子の発現産物が阻害され得る。そのような阻害は、生物を死滅させるか、または増殖を低下させ得る。いくつかの実施形態では、感作ドライブはその関連分子の非存在下で影響を与えず、場合によってはその逆であるので、これらにより、最小限の生態学的リスクで集団抑制の地理および程度が極めて細かく制御され得る。
【００８１】
例示的なある態様によれば感作ドライブを用いて、ウェスタンコーンルートワーム（western corn rootworm）をＢｔ毒素抵抗性にする変異（その全体が参照により援用されるGassman et al PNAS, vol. 111 no. 14, pages 5141-5146, doi: 10.1073/pnas.1317179111 (2014) 参照）またはヒメムカシヨモギ（horseweed）およびアカザ（pigweed）を、環境的に持続可能な不耕起農業に現在必須の除草剤である除草剤グリホサート（glyphosate）抵抗性する変異（その全体を参照により援用されるGaines, T. A. et al.  Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 1029-1034 (2010) および Ge, X., d’ Avignon, D. A., Ackerman, J. J. & Sammons, R. D. Pest Manag. Sci. 66, 345-348 (2010) 参照）が逆転される。この態様によれば、感作ドライブを有する生物を、その個々の生物は抵抗性を有しても有さなくてもよい野生集団中に放出し、感作ドライブが子孫へと伝わり、その結果、特定の除草剤または農薬に対して、（野生集団に抵抗性が存在する場合）子孫集団の抵抗性が低下し、（野生集団に抵抗性が存在する場合）子孫集団の感受性が上昇する。野生型集団の一部のメンバーのみが抵抗性を有し得るが、感作ドライブは野生型集団の感受性および抵抗性のメンバーの両方に拡散し、感作ドライブを有する子孫集団が生じると理解されるべきである。ある態様によれば、単数または複数の感作ドライブを含む生物が、除草剤または農薬で処理されていない地域に放出されることにより、除草剤または農薬で処理された隣接地域へと拡散可能な感作ドライブの保有生物が作り出される。
【００８２】
ある態様によれば、単数または複数の感作ドライブを用いて抵抗性をもたらす変異を無効にする（counter）方法が提供される。この態様によれば、初期およびその後の期間に、単数または複数の変異により農薬または除草剤に対する抵抗性を生じた野生型集団のゲノム中に、そのような感作ドライブを導入することにより、抵抗性をもたらす単数または複数の変異の効果を逆転させて、農薬または除草剤を集団に対して毒性にする。このような方法により、抵抗性を付与する変異が無効にされるか、または置換されて、どのような抵抗性が生じても「巻き戻す」ので、任意の所与の除草剤または農薬を永遠に使用することが可能になる。
【００８３】
別の態様によれば、雑草または有害生物などの植物または動物に対して特定の化学物質、化合物、または条件を毒性にする、単数または複数の感作ドライブをそのゲノム（したがって、さらにその子孫）を含むことにより、植物または動物を特定の化学物質または化合物または条件に対して脆弱にすることができる。したがって、植物または動物のゲノム中に単数または複数の感作ドライブを含めることにより特定の化学物質または化合物を植物または動物にとって毒性にする結果、ヒトにとって安全と考えられ得る化合物が植物または動物にとって毒性となり得る。この態様によれば、感作ドライブが、感染した種または実験室単離株（laboratory isolate）から感受性遺伝子を送達するか、または適応度に重要な遺伝子を感受性遺伝子で置換するとしたら、安全および／または有効と見なされている既存の化合物を、現在それらに対して脆弱でない生物に適用することができる。
【００８４】
別の態様によれば、感作ドライブを用いて、他の生物に無害である特定の分子、化合物、または化学物質に対して有害生物集団を脆弱にする方法が提供される。現在の農薬および除草剤は、「有機」に指定されているものでも、昆虫有害生物および雑草に対する毒性で選択されるが、感染経路が種間で保存されているため、これらはしばしば非有害生物種またはさらにはヒトに危害を加える。本開示によれば、通常は無害の分子に対する感受性を生物に付与する単数または複数の遺伝子が送達される方法が提供される。感受性遺伝子ドライブの導入により、その分子が、ドライブで改変された特定の有害生物または雑草種に高度に特異的な農薬または除草剤に効果的に変換される。ドライブと分子の組合せは生物にとって致死的である。ある例示的な実施形態は、酵素／プロドラッグの組合せの使用であり、酵素は生物のゲノムに導入されて、発現される。生物がプロドラッグに晒された場合、酵素がプロドラッグを活性除草剤または農薬に変換する。本開示のこの態様の原理を実証する類似の候補は、局所的に産生されたウイルスまたは腫瘍特異的酵素によりプロドラッグが活性化される、抗ウイルス療法または抗がん療法である。例としては、シトシンデアミナーゼと５−フルオロシトシンの組み合わせ、およびニトロレダクターゼとＣＢ１９５４の組み合わせが挙げられる。感作ドライブの場合、遺伝子ドライブによって酵素が標的種へと送達されて、プロドラッグが特異的農薬に変わる。別の例示的な組み合わせとしては、特異的な化学物質によって強力に阻害されるように改変された一次代謝酵素が挙げられる。例えば、改変された転化酵素（invertase）は、スクラロースまたは関連するハロゲン化多糖などの生物学的にほぼ不活性な生体異物化学物質の存在下で、非機能性になり得る。感作ドライブにより生物の天然インベルターゼ遺伝子が改変バージョンと置換されて、ほぼ不活性であった化合物に対して感受性になるであろう。当業者であれば、本明細書に記載の感作ドライブ法に基づき、この目的に適した有用な酵素と化学物質の組み合わせを容易に特定することができる。
【００８５】
当業者であれば、本開示の範囲に含まれる雑草には、農作物に有害な雑草植物が含まれると容易に特定することができる。そのような雑草は、連邦法または州法で「有害雑草（noxious weed）」として指定されていてもよく、されていなくてもよい。例えば、ヒメムカシヨモギおよびアカザは農作物に有害な雑草と見なされるが、有害雑草に指定されていないこともある。ＵＳＤＡによって有害雑草に指定されている例示的な雑草としては、以下が挙げられる。
【００８６】
【表１】
0006747974.tif 000003
【００８７】
【表２】
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【００８８】
【表３−１】
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【００８９】
【表３−２】
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【００９０】
【表３−３】
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【００９１】
本開示の範囲に含まれるその他の雑草としては、アカザ（Atriplex, Spreading）；センダングサ（Beggarsticks, Nodding）；ウマノチャヒキ（Brome, Downy）；ノラニンジン（carrot, wild）；イヌカミツレ（Camomile, scentless）；ハコベ（Chickweed, common）；アレチウリ（Cucumber, bur）；タンポポ（Dandelion）；ヒメムカシヨモギ（Fleabane, Canada）；クジラグサ（Flixweed）；スズメガヤ（Grass, Stink）；Grass, Tufted love；Groundcherry, Smooth；イヌゴマ（Hedge-nettle, Marsh）；ワルナスビ（Horse-nettle）；スギナ（Horsetail, Field）；トゲチシャ（Lettuce, Prickly）；アカリファ（Mercury, Three-seeded；Muhly, Wire-stemmed）；ヤブタビラコ（Nipplewort）；コヌカグサ（Redtop）；Sandbur, Long-spined；Smartweed, Swamp；一年生ノゲシ（Sow-thistle, Annual）；多年生ノゲシ（Sow-thistle, Perrenial）；タチイヌノフグリ（Speedwell, Corn）；クサフジ（Vetch, Tufted）；Violet, Field；Waterhemp, Common；カタバミ種（Wood-sorrel species）；バミューダグラス（Bermuda grass）；ヒルガオ（Bindweed）；セイヨウオオバコ（Broadleaf plantain）；ゴボウ（Burdock）；シロザ（Common lambsquarters）；セイヨウカキドオシ（Creeping Charlie）；タンポポ（Dandelion）；アキノキリンソウ（Goldenrod）；イタドリ（Japanese Knotweed）；葛（kudzu）；ハギクソウ（Leafy spurge）；マリアアザミ（Milk thistle）；ツタウルシ（Poison ivy）；ブタクサ（Ragweed）；ギシギシ（Sorrel）；ストライガ（Striga）；セイヨウオトギリソウ（St John’s  wort）；ウルシ（Sumac）；ニワウルシ（Tree of heaven）；ノラニンジン（Wild carrot）；カタバミ（Wood sorrel）；およびキハマスゲ（Yellow nutsedge）が挙げられる。
【００９２】
学名で特定されるその他の雑草としては、Ａｃａｌｙｐｈａ  ｒｈｏｍｂｏｉｄｅａ  Ｒａｆ．；Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ｇｉｇａｎｔｅａ  Ｒｏｔｈ；Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｕｄｉｓ  Ｌ．；Ａｔｒｉｐｌｅｘ  ｐａｔｕｌａ  Ｌ．；Ｂｉｄｅｎｓ  ｃｅｒｎｕａ  Ｌ．；Ｂｒｏｍｕｓ  ｔｅｃｔｏｒｕｍ  Ｌ．；Ｃｅｎｃｈｒｕｓ  ｌｏｎｇｉｓｐｉｎｕｓ  Ｈａｃｋ．；Ｃｏｎｙｚａ  Ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ；Ｄａｕｃｕｓ  ｃａｒｏｔａ  Ｌ．；Ｄｅｓｃｕｒａｉｎｉａ  ｓｏｐｈｉａ  Ｌ．；Ｅｑｕｉｓｅｔｉｕｍ  ａｒｖｅｎｓｅ  Ｌ．；Ｅｒａｇｒｏｓｔｉｓ  ｓｐｐ．；Ｌａｃｔｕｃａ  ｓｃａｒｉｏｌａ  Ｌ．；Ｌａｐｓａｎａ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ  Ｌ．；Ｍａｔｒｉｃａｒｉａ  ｐｅｒｆｏｒａｔａ  Ｍｅｒａｔ．；Ｍｕｈｌｅｎｂｅｒｇｉａ  ｆｒｏｎｄｏｓａ  Ｐｏｉｒ．；Ｏｘａｌｌｉｓ  ｄｉｌｌｅｎｉｉ  Ｊａｃｑ；Ｐｈｙｓａｌｉｓ  ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ  Ｍｉｌｌ．；Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ  ｃｏｃｃｉｎｅｕｍ  Ｍｕｈｌ．；Ｓｉｃｙｏｓ  ａｎｇｕｌａｔｕｓ  Ｌ．；Ｓｏｌａｎｕｍ  ｃａｒｏｌｉｎｅｎｓｅ  Ｌ；Ｓｏｎｃｈｕｓ  ａｒｖｅｎｓｉｓ  Ｌ．；Ｓｏｎｃｈｕｓ  ｏｌｅｒａｃｅｕｓ  Ｌ．；Ｓｔａｃｈｙｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ  Ｌ．；Ｓｔｅｌｌａｒｉａ  ｍｅｄｉａ；Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ  Ｗｅｂｅｒ．；Ｖｅｒｏｎｉｃａ  ａｖｅｎｓｉｓ  Ｌ．；Ｖｉｃｉａ  ｃｒａｃｃａ  Ｌ．；およびＶｉｏｌａ  ａｖｅｎｓｉｓ  Ｌが挙げられる。
【００９３】
当業者に容易に入手可能な資料により、本開示の範囲に含まれるその他の雑草が特定できると理解されるべきである。
【００９４】
雑草が抵抗性であり得るまたは抵抗性を生じさせ得る一般的な除草剤には以下が含まれる。当業者は、本開示に基づき特定の雑草種に毒性の除草剤を容易に特定することができる。
【００９５】
【表４】
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【００９６】
【表５】
0006747974.tif 000009
【００９７】
【表６】
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【００９８】
【表７】
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【００９９】
当業者に容易に入手可能な資料により本開示の範囲に含まれる他の除草剤が特定できると理解されるべきである。
【０１００】
トウモロコシに関連する本開示の範囲に含まれる有害生物として以下が含まれる。
【０１０１】
【表８】
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【０１０２】
綿に関連する本開示の範囲に含まれる有害生物として以下が含まれる。
【０１０３】
【表９】
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【０１０４】
オーク（oak）に関連する本開示の範囲に含まれる有害生物として以下が含まれる。
【０１０５】
【表１０】
0006747974.tif 000014
【０１０６】
マツ（pine）に関連する本開示の範囲に含まれる有害生物として以下が含まれる。
【０１０７】
【表１１】
0006747974.tif 000015
【０１０８】
小穀物に関連する本開示の範囲に含まれる有害生物として以下が含まれる。
【０１０９】
【表１２】
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【０１１０】
ダイズに関連する本開示の範囲に含まれる有害生物として以下が含まれる。
【０１１１】
【表１３】
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【０１１２】
ブドウに関連する本開示の範囲に含まれる有害生物として以下が含まれる。
【０１１３】
【表１４】
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【０１１４】
ヤシ（palm）に関連する本開示の範囲に含まれる有害生物として以下が含まれる。
【０１１５】
【表１５】
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【０１１６】
ナス科植物に関連する本開示の範囲に含まれる有害生物として以下が含まれる。
【０１１７】
【表１６】
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【０１１８】
石果に関連する本開示の範囲に含まれる有害生物として以下が含まれる。
【０１１９】
【表１７】
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【０１２０】
その他の農業害虫（agricultural pest）として以下のシストセンチュウが含まれる。
【０１２１】
【表１８】
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【０１２２】
その他の農業害虫として以下の外来性のキクイムシ（wood borer）またはバークビートル（bark beetle）が含まれる。
【０１２３】
【表１９】
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【０１２４】
【表２０】
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【０１２５】
その他の農業害虫として以下の軟体動物が含まれる。
【０１２６】
【表２１】
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【０１２７】
その他の農業害虫として以下のガが含まれる。
【０１２８】
【表２２】
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【０１２９】
当業者に容易に入手可能な資料により、本開示の範囲に含まれる他の有害生物が特定できると理解されるべきである。
【０１３０】
有害生物が抵抗性であり得るまたは抵抗性を生じさせ得る本開示の範囲に一般に含まれる一般的農薬として、殺藻剤、防汚剤、抗微生物剤、誘引剤、バイオ農薬、殺生物剤、消毒薬、殺真菌剤、燻蒸剤、殺虫剤、殺ダニ剤、微生物農薬、軟体動物駆除剤、抗線虫薬、フェロモン、忌避剤（repellant）、および殺鼠剤が挙げられる。
【０１３１】
以下の農薬種、すなわち、グリホサート、アトラジン、メタムナトリウム、メトラクロール−Ｓ、アセトクロール、ジクロロプロペン、２，４−Ｄ、臭化メチル、クロロピクリン、ペンディメンタリン、エテホン、クロロタロニル、メタムカリウム、クロルピリホス、水酸化銅、硫酸銅、シマジン、トリフルラリン、プロパニル、マンコゼブ、アルジカルブ、アセフェート、ジウロン、ＭＣＰＡ、パラコート、ジメテナミド、カルバリル、ＭＣＰＰ、ＭＳＭＡ、ピレスロイド、マラチオン、ジカンバ、ペラルゴン酸、フッ化スルフリル、トリクロピル、パラジクロロベンゼン、ナフタレン、クロルピリホス、ナレッド、ジクロトホス、ホスメット、ホレート、ダイアジノン、ジメトエート、アジンホスメチル、およびＮ，Ｎ−ジエチル−メタ−トルアミド（防虫剤）が、本開示の範囲内で有用である。当業者は、公に利用可能なデータベースの情報、例えばワールドワイドウェブサイトiaspub.epa.gov/apex/pesticides/f?p=chemicalsearch:1で入手可能な登録済農薬のＥＰＡリストを用いて、およびＥＰＡにより編集され、ワールドワイドウェブサイトwww.epa.gov/opp00001/pestsales/で公に利用可能なU.S. Agricultural, Home and Garden, Industry, Commercial, and Government Market Sectorsの最も一般的に用いられる従来の農薬活性成分を参照して、他の農薬種を容易に特定することができる。
【０１３２】
当業者は、本開示に基づき、特定の有害生物種にとって毒性の農薬を容易に特定することができる。
【０１３３】
したがって、本開示の態様は、以下を含む、生物の真核生殖系列細胞を改変する方法に関する。
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードし、対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含み、且つ生物が特定の化学物質、化合物、または条件に晒された場合にその発現が生物にとって有害である感作核酸を含む第１の外来核酸配列を、生殖系列細胞に導入すること；
ここで、１種類または複数種類のガイドＲＮＡが、生殖系列細胞の染色体対の第１の染色体のゲノムＤＮＡ上および第２の染色体のゲノムＤＮＡ上の１つまたは複数の標的位置に相補的であり、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードする核酸配列が、第１の隣接配列と第２の隣接配列との間に存在し、第１の隣接配列が、ゲノムＤＮＡの第１の染色体上または第２の染色体上の標的位置の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、第２の隣接配列が、ゲノムＤＮＡの第１の染色体上または第２の染色体上の標的位置の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含む、
第１の外来核酸配列を発現させてＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類のＲＮＡを産生させること；
ここで、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドＲＮＡが、ゲノムＤＮＡの第１の染色体上およびゲノムＤＮＡの第２の染色体上の関連する標的位置に共局在し、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、ゲノムＤＮＡの第１の染色体を標的位置で切断部位特異的に切断し、且つゲノムＤＮＡの第２の染色体を標的位置で切断部位特異的に切断する、
第１の外来核酸配列をゲノムＤＮＡの染色体対の第１の染色体中に切断部位で挿入し、第１の外来核酸配列をゲノムＤＮＡの染色体対の第２の染色体中に切断部位で挿入して、生殖系列細胞を外来核酸配列についてホモ接合型にすること；および
生じた生物が特定の化学物質、化合物、または条件に晒された場合に死滅するまたは生殖不能になるように、生じた生物を特定の化学物質、化合物、または条件に対して感受性にする感作核酸を発現させること。
【０１３４】
ある態様によれば、感作核酸の発現により、生物に対する特定の化学物質、化合物、または条件の毒性が増大する。ある態様によれば、生殖系列細胞を生物へと成長させ、感作核酸を子孫に移行させて、感作核酸を含む生物の集団を作り出し、感作核酸が生物に対する特定の化学物質、化合物、または条件の毒性を増大させる。ある態様によれば、生物は雑草または有害生物である。ある態様によれば、感作核酸は、現存遺伝子を置換する感作遺伝子である。ある態様によれば、感作遺伝子は、現在の変異バージョンが祖先形態で置換されるような、野生集団中の現存変異遺伝子の正確なまたはコドンを改変した祖先バージョンである。ある態様によれば、現存遺伝子は、農薬、除草剤、または殺真菌剤に対する抵抗性に寄与する変異を獲得している。ある態様によれば、特定の化学物質または化合物は、農薬、除草剤、または殺真菌剤である。ある態様によれば、農薬、除草剤、または殺真菌剤は、Ｃｒｙ１Ａ．１０５、ＣｒｙＩＡｂ、ＣｒｙＩＦ、Ｃｒｙ２Ａｂ、Ｃｒｙ３Ｂｂ１、Ｃｒｙ３４Ａｂ１、Ｃｒｙ３５Ａｂ１、ｍＣｒｙ３Ａ、またはＶＩＰによって産生されるＢｔ毒素；２，４−Ｄ、またはグリホサートのいずれかである。ある態様によれば、感作遺伝子は、生物の生存または生殖にその機能が必要とされる現存遺伝子を置換する。ある態様によれば、特定の化学物質はプロドラッグであり、感作遺伝子は対応するプロドラッグ変換酵素をコードする。ある態様によれば、酵素と化学物質の組み合わせは、シトシンデアミナーゼと５−フルオロシトシン、またはニトロレダクターとＣＢ１９５４である。
【０１３５】
本開示のある態様によれば、特定の化学物質、化合物、または条件が存在する場合に、雑草または有害生物集団を毒性に対して脆弱にする、感受性遺伝子ドライブを雑草または有害生物集団のゲノム中に含む、雑草または有害生物集団を制御する方法であって、雑草もしくは有害生物を死滅させる、雑草もしくは有害生物の増殖を低減する、または雑草もしくは有害生物を生殖不能にして増殖を阻害するのに有効な量の特定の化学物質、化合物、または条件と雑草または有害生物集団を接触させることを含む方法が提供される。ある態様によれば、特定の化学物質または化合物は、除草剤、または農薬、または殺真菌剤である。
【０１３６】
本開示のある態様によれば、以下を含む、第１の感作遺伝子ドライブを含む生物の真核生殖系列細胞を改変する方法が提供される。
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードし、対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含み、且つ生物が特定の化学物質、化合物、または条件に晒された場合にその発現が生物にとって有害である第２の感作核酸配列を含む第２の外来核酸配列を、生殖系列細胞に導入すること；
ここで、１種類または複数種類のガイドＲＮＡが、第１の感作遺伝子ドライブを含む生殖系列細胞の染色体対の第１の感作遺伝子ドライブを含む第１の染色体のゲノムＤＮＡ上および第２の染色体のゲノムＤＮＡ上の１つまたは複数の標的位置に相補的であり、第２の外来核酸配列のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードする核酸配列が、第１の隣接配列と第２の隣接配列との間に存在し、第１の隣接配列が、ゲノムＤＮＡの第１の染色体上または第２の染色体上の標的位置の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、第２の隣接配列が、ゲノムＤＮＡの第１の染色体上または第２の染色体上の標的位置の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含む、
第２の外来核酸配列を発現させてＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類のＲＮＡを産生させること；
ここで、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドＲＮＡが、ゲノムＤＮＡの第１の染色体上およびゲノムＤＮＡの第２の染色体上の関連する標的位置に共局在し、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、ゲノムＤＮＡの第１の染色体を標的位置で切断部位特異的に切断し、ゲノムＤＮＡの第２の染色体を標的位置で切断部位特異的に切断して、第１の外来核酸配列が除去される、
第２の外来核酸配列をゲノムＤＮＡの染色体対の第１の染色体中に切断部位で挿入し、第２の外来核酸配列をゲノムＤＮＡの染色体対の第２の染色体中に切断部位で挿入して、生殖系列細胞を第２の外来核酸配列についてホモ接合型にすること；および
生じた生物が特定の化学物質、化合物、または条件に晒された場合に死滅するまたは生殖不能になるように、生じた生物を特定の化学物質、化合物、または条件に対して感受性にする第２の感作核酸配列を発現させること。
ある態様によれば、生じた生物と野生型生物の子孫が第２の感作核酸配列を含むように、生じた生物を野生型集団中に導入する。ある態様によれば、生物は雑草または有害生物である。
【０１３７】
本開示のある態様によれば、以下を含む、第１の感作遺伝子ドライブを含む生物の真核生殖系列細胞を改変する方法が提供される。
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードし、対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含み、且つ生物が特定の化学物質、化合物または条件に晒された場合にその発現が生物にとって有害である第２の感作核酸配列を含む第２の外来核酸配列を、生殖系列細胞に導入すること；
ここで、１種類または複数種類のガイドＲＮＡが、第１の感作遺伝子ドライブを含む生殖系列細胞の染色体対の第１の感作遺伝子ドライブを含む第１の染色体のゲノムＤＮＡ上および第２の染色体のゲノムＤＮＡ上の１つまたは複数の標的位置に相補的であり、第２の外来核酸配列のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードする核酸配列が、第１の隣接配列と第２の隣接配列との間に存在し、第１の隣接配列が、ゲノムＤＮＡの第１の染色体上または第２の染色体上の標的位置の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、第２の隣接配列が、ゲノムＤＮＡの第１の染色体上または第２の染色体上の標的位置の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含む、
第２の外来核酸配列を発現させてＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類のＲＮＡを産生させること；
ここで、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドＲＮＡが、ゲノムＤＮＡの第１の染色体上およびゲノムＤＮＡの第２の染色体上の関連する標的位置に共局在し、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、ゲノムＤＮＡの第１の染色体を標的位置で切断部位特異的に切断し、且つゲノムＤＮＡの第２の染色体を標的位置で切断部位特異的に切断する、
第２の外来核酸配列をゲノムＤＮＡの染色体対の第１の染色体中に切断部位で挿入し、第２の外来核酸配列をゲノムＤＮＡの染色体対の第２の染色体中に切断部位で挿入して、生殖系列細胞を第２の外来核酸配列についてホモ接合型にすること；および
生じた生物が特定の化学物質、化合物、または条件に晒された場合に死滅するまたは生殖不能になるように、生じた生物を特定の化学物質、化合物、または条件に対して感受性にする第２の感作核酸配列を発現させること。
ある態様によれば、生じた生物と野生型生物との子孫が第２の感作核酸配列を含むように、生じた生物を野生型集団中に導入する。ある態様によれば、生物は雑草または有害生物である。
【０１３８】
実施例Ｉ
プラスミドおよびゲノムカセット
遺伝子ドライブカセットをｇＢｌｏｃｋｓ（Integrated DNA Technologies社、アイオワ州コーラルビル）から合成し、以下のようにしてＣａｓ９を介したゲノム改変によりＳＫ１細胞に挿入した。各ドライブのガイドＲＮＡを、ＳＮＲ５２プロモーターによって発現がドライブされるｐ４１６−Ｃａｓ９含有プラスミドにクローニングした。DiCarlo, J. E. et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems, Nucleic Acids Res. 41, 4336-4343 (2013) 参照。標的座位に対する６０塩基対のホモロジーアームを遺伝子ドライブカセットの両末端にＰＣＲによって付加し、５μｇのＰＣＲ産物をｐ４１６−Ｃａｓ９−ｇＲＮＡプラスミドと同時形質転換した。正確に組み込まれた遺伝子ドライブをシークエンシングにより確認し、５−フルオロオロチン酸（ＦＯＡ）選択を用いてｐ４１６−Ｃａｓ９−ｇＲＮＡプラスミドを除去（cure）した。
【０１３９】
ＵＲＡ３含有ＡＤＥ２遺伝子ドライブを作製するために、ＡＤＥ２遺伝子ドライブを、ｐＡＧ６０プラスミド中のカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）のＵＲＡ３遺伝子の隣にクローニングした。ＵＲＡ３カセットおよび遺伝子ドライブの全体をＰＣＲ増幅し、Ｃａｓ９を介したゲノム改変を用いて一倍体ＳＫ１細胞のＡＤＥ２座位に挿入した。
【０１４０】
相同性を除去して同義置換によりシード配列中に変異を作成するために、ＡＢＤ１遺伝子の再コード化Ｃ末端および対応する遺伝子ドライブをｇＢｌｏｃｋとして合成した。ＡＢＤ１はＶＨＣ１遺伝子とターミネーターを共有しているので、ＴＥＦ１ターミネーターを再コード化ＡＢＤ１遺伝子の３′末端に遺伝子とｇＲＮＡとの間で挿入した。Ｃａｓ９を介したゲノム改変を用いてカセット全体を一倍体ＳＫ１ゲノムに組み込んだ。
【０１４１】
ｐ４１６−Ｃａｓ９−ｇＲＮＡプラスミド（ウラシル原栄養性を付与）は、以前に報告されているｐ４１４−Ｃａｓ９−ｇＲＮＡプラスミド（トリプトファン原栄養性を付与）（DiCarlo, J. E. et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems, Nucleic Acids Res. 41, 4336-4343 (2013) 参照）（Addgene社、＃４３８０２）の変異株である。一方または他方を各接合実験に用いた。選択された細胞型にｐＲＳ４１３ベクターを形質転換して,
二倍体細胞を選択するためのマーカーとしてヒスチジン原栄養性を付与した。株の遺伝子型を以下の表１に示す。
【０１４２】
【表２３】
0006747974.tif 000027
【０１４３】
実施例ＩＩ
酵母接合実験
一倍体ドライブ含有ＳＫ１酵母および正反対の接合型の一倍体野生型株をＹＰＡＤ液体培地中で等量混合し、一晩インキュベートした。生じた二倍体を滅菌水中で洗浄し、両方の親の遺伝子型の選択培地上にプレーティングした。以下の表２に具体的な交雑を詳述する。
【０１４４】
【表２４】
0006747974.tif 000028
【０１４５】
実施例ＩＩＩ
胞子形成および四分子解剖
【０１４６】
液体ＹＰＡＤ中での接合および選択プレート上での二倍体の選択後、選択プレートを１０ｍＬの選択培地に擦りつけ、３０℃で一晩生育した。次に、新鮮な５ｍＬのＹＰＡＤ培養液に接種してＯＤ＝０．１にし、３０℃で４〜５時間生育した。次に、培養全体を１０ｍＬの水中で２回洗浄し、２ｍＬの胞子形成培地（１％酢酸カリウム）に接種し、室温で３日間または胞子が見えるまでインキュベートした。胞子形成した細胞を５０μＬのザイモリエイス（Zymolyase）のストック溶液（１Ｍソルビトール中５０μｇ／ｍＬ）に懸濁し、３０℃で５分間インキュベートし、氷に移し、１５０μＬの冷Ｈ２Ｏで希釈し、Zeiss社製の四分子解剖顕微鏡（tetrad dissection microscope）を用いて顕微解剖し、単離した胞子をＹＰＡＤプレート上で成長させた。
【０１４７】
実施例ＩＶ
ＵＲＡ３機能に対する選択
解剖した胞子を合成完全（ＳＣ）培地中で成長させた後、ＳＣ培地およびウラシルを含まないＳＣ培地にスポットした。赤色を増強するために、プレートイメージに用いた全てのＳＣ固体培地に０．５×ヘミ硫酸アデニン（最終濃度０．０８ｍＭ）を含ませた。
【０１４８】
実施例Ｖ
定量的ＰＣＲ
各ドライブ、またはドライブによって置換された野生型配列、および対照としてのＡＣＴ１遺伝子に特異的な短い領域を増幅するように、候補プライマー対をデザインした。全ての配列は、補足情報に含まれている。Looke et al. (31) に記載の方法Ａを用いてゲノムＤＮＡを抽出した。
【０１４９】
ＫＡＰＡ  ＳＹＢＲ  ＦＡＳＴ  ｑＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（２Ｘ）を用いて、２５ｎｇのゲノムＤＮＡでｑＰＣＲ反応を行った。野生型一倍体およびドライブ一倍体に由来するゲノムＤＮＡの希釈物をそれぞれ増幅することにより、各プライマー対の増幅効率および相対的特異性を測定し、最も成績がよく、且つ良くマッチした対を使用に選択した（使用した全てのプライマーについては以下を参照）。親一倍体のそれぞれから、および独立した３つの接合イベントにより生じた二倍体から単離されたゲノムＤＮＡに対して定量的ＰＣＲ反応を行った。Roche社のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ９６マシンを用いて１サンプルにつき３つの反応（技術的複製物）を行った。
【０１５０】
実施例ＶＩ
計算
３つの技術的複製物の結果を平均して計算した。ＰＣＲ増幅前のアレルの比率を直接計算するために、種々のプライマー対の効率を最初に決定した。段階希釈物（１０６のオーダー）のｑＰＣＲランから以下のように効率を計算した：
【０１５１】
【数１】
0006747974.tif 000029
【０１５２】
Ｒ２値は、１対（ａｄｅ２：：ＵＲＡ３＋ｓｇＲＮＡ）を除く全ての実例で、０．９９より大きかった。
【０１５３】
アレルの比率は以下のように計算した。
【０１５４】
【数２】
0006747974.tif 000030
【０１５５】
式中、ｘａおよびｘｂは、ドライブＤＮＡおよび野生型ＤＮＡの初期濃度であり、
ＥａおよびＥｂは、各プライマー対の効率であり、
Ｃｔ，ａ、およびＣｔ，ｂは、各サンプルのＣｔ値である。
【０１５６】
実施例ＶＩＩ
酵母におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子ドライブの効率
酵母におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子ドライブの効率を直接測定するために、ＡＤＥ２遺伝子の機能的コピーを欠いた酵母中に蓄積される赤色を用いてシステムを構築した。Chamberlain, N., Cutts, N. S. & Rainbow, C. The formation of pigment and arylamine by yeasts. J. Gen. Microbiol. 7, 54-60 (1952) 参照。図１３Ａに示されるように、赤いＡＤＥ２−一倍体をクリーム色の野生型一倍体と接合させた場合、生じるヘテロ接合型二倍体は１つの機能的コピーを受け継ぎ、したがってクリーム色になる。これらの二倍体が減数分裂して胞子形成により生殖する場合、生じる一倍体の半分は破壊されたコピーを受け継ぐので赤色であり、残りの半分は無傷のコピーを受け継ぐのでクリーム色である（図１３Ａ）。
【０１５７】
図１３Ｂに示されるように、赤い一倍体が、野生型の親から受け継いだ無傷のＡＤＥ２座位を切断および置換する機能的遺伝子ドライブをコードする場合、それらの二倍体の子孫は赤色になるであろう。これらの赤い二倍体は２個の壊れたＡＤＥ２のコピーを有することになるので、それらの胞子形成した一倍体の子は全て壊れたコピーを受け継ぎ、その結果、これらも赤色になるであろう。したがって、単に二倍体をプレーティングし、赤色である割合を計数することにより、ＡＤＥ２を標的として置換する遺伝子ドライブの切断効率を評価することができる。
【０１５８】
ＡＤＥ２を標的とする遺伝子ドライブコンストラクトを作製した。遺伝子ドライブが偶発的に野生型に流出することを防ぐために、Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡを分離して、自立的（ｓｅｌｆ−ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ）な遺伝バイアス化カセットが生じるのを回避した。その結果、コンストラクトはＡＤＥ２を標的とするガイドＲＮＡをコードし、一方、Ｃａｓ９はエピソームプラスミドから与えられた。赤い一倍体を、プラスミドの存在下または非存在下で正反対の接合型の野生型酵母と接合させ、二倍体を選択する培地にプレーティングした。図１３Ｃに示されるように、ほぼ全てのコロニーがプラスミドの存在下で赤色であり、このことは、野生型の親から受け継いだＡＤＥ２コピーの非常に効率的な切断を示している。Ｃａｓ９の非存在下では、赤い二倍体コロニーは観察されず、これにより、ドライブを供する実験室酵母集団中でしかドライブが拡散できないことが実証された。
【０１５９】
野生型の親に由来するＡＤＥ２アレルが失われたことを検証するために、接合させた二倍体を胞子形成させ、それらから生じた一倍体の子孫を調べた。図１３Ｄに示されるように、１８個のｃａｓ９＋二倍体を解剖した後、完全な４：０の比率の赤色：クリーム色の一倍体が観察され、ＡＤＥ２座位の全コピーが破壊されたことが確認された。対照的に、１８個のクリーム色ｃａｓ９−二倍体では赤色：クリーム色の比率は２：２となり、このことにより、不活性化されたドライブおよび野生型アレルの通常の遺伝が示された。
【０１６０】
赤色二倍体におけるＡＤＥ２破壊が相同組換えによるドライブ因子のコピー成功によるものであるかどうかを決定するために、解剖したｃａｓ９＋二倍体に由来する７２個の一倍体をシークエンシングした。シークエンシングされた全てのコロニーは、その他の変異のない無傷のドライブを含んでおり、このことは、ドライブ可動化が効率的であり、高い忠実度で起こったことを示す。
【０１６１】
図１４Ａに模式的に示されるように、ウラシルの補充なしで実験室改変酵母株を増殖させるシスのＵＲＡ３アレルを含むように、ＡＤＥ２遺伝子ドライブを改変した。このドライブ因子を、標的座位にコピーされた場合に遺伝子ドライブが関連するカーゴ因子を「運ぶ」能力について調べた。エピソームＣａｓ９プラスミドの存在下で、ＵＲＡ３含有ドライブ一倍体を野生型一倍体と接合させ、二倍体を選択し（全て赤色であった）、胞子形成させ、１８個の四分子を解剖した。元のＡＤＥ２遺伝子ドライブの場合と同様、胞子形成した一倍体細胞は全て赤いコロニーを形成した。図１４Ｂに示されるように、ウラシル欠乏培地にレプリカプレーティングした場合、全て正常に成長し、このことは、ＵＲＡ３カーゴ因子がドライブと共に効率的にコピーされたことを示す。
【０１６２】
必須遺伝子を標的化および再コード化する遺伝子ドライブは、標的部位を改変する誤りがちな修復（error-prone repair）イベントが致死的となり得るので、大きな集団中でさえもドライブ抵抗性を回避することができる。必須ではないが重要な遺伝子も、ＮＨＥＪイベントにより生じる変異体が、やはりドライブ自体と比べて適応度が低いので、同様に編集することができる。ドライブ挿入における必須遺伝子の再コード化を調べるために、図１４Ｃに模式的に示されるＡＢＤ１を標的とする第３の遺伝子ドライブを構築した。Mao, X., Schwer, B. & Shuman, S. Mutational analysis of the Saccharomyces cerevisiae ABD1 gene: cap methyltransferase activity is essential for cell growth, Mol. Cell. Biol. 16, 475-480 (1996) 参照。
【０１６３】
天然ＡＢＤ１コード配列を標的とするガイドＲＮＡの上流に再コード化ＡＢＤ１アレルを含む一倍体株を、Ｃａｓ９の存在下で野生型細胞と接合させた。二倍体細胞を選択し、そのうち１８個を胞子形成させた。７２個の分離個体をシークエンシングした。全てが、再コード化ＡＢＤ１座位およびガイドＲＮＡを含んでおり、これにより、必須遺伝子再コード化に基づく遺伝子ドライブが実証された。
【０１６４】
遺伝子ドライブを実験室株から多様なグループの天然出芽酵母（S. cerevisiae）株にコピーした。ＡＤＥ２ドライブ含有一倍体を一倍体出芽酵母の６つの系統的および表現型的に多様な野生型株と接合させた。Liti, G. et al. Population genomics of domestic and wild yeasts, Nature 458, 337-341 (2009) 参照。図１５Ａも参照。各交雑での遺伝子ドライブコピー効率を定量的に測定するために、ドライブに特異的な１組のプライマー、および野生型またはＮＨＥＪ破壊アレルのいずれかを増幅するようにデザインされたもう１組のプライマーを用いて、全ての二倍体の集団について定量的ＰＣＲを行った。ＢｏｘＰｌｏｔ（Spitzer, M., Wildenhain, J., Rappsilber, J. & Tyers, M. BoxPlotR: a web tool for generation of box plots. Nat. Methods 11, 121-122 (2014) 参照）を用いて作製された図１５Ｂに示されるように、ＡＤＥ２遺伝子ドライブを含む二倍体染色体の割合は、野生型の親に関係なく、９９％を超えており、これにより、多様な背景におけるドライブの使用が実証された。ＵＲＡ３カーゴ遺伝子を付加してもこの効率はあまり変わらなかった。ＡＢＤ１ドライブは同等の割合でコピーされた。
【０１６５】
連続的なコピーイベントにわたるドライブの安定性を調べた。図１５Ｂに示されるように、第１ラウンドのＡＤＥ２遺伝子ドライブ二倍体の複数の一倍体の子を、Ｃａｓ９発現プラスミドを含む野生型一倍体と接合させた。第２世代遺伝子ドライブコンストラクトは全て、同じ効率で遺伝にバイアスをかけたことから、有性生殖集団中に拡散する能力が何世代にもわたり続くことが実証された。
【０１６６】
以下のゲノム改変プライマーおよびｇＢｌｏｃｋ配列が提供される。
【０１６７】
【表２５−１】
0006747974.tif 000031
【０１６８】
【表２５−２】
0006747974.tif 000032
本発明の態様は以下を含む。
付記１
以下を含む、生物の真核生殖系列細胞を改変する方法。
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含む第１の外来核酸配列を、前記生殖系列細胞に導入すること；
ここで、前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが、前記生殖系列細胞の染色体対の第１の染色体のゲノムＤＮＡ上および第２の染色体のゲノムＤＮＡ上の１つまたは複数の標的位置に相補的であり、
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードする核酸配列が、前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間に存在し、
前記第１の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上または前記第２の染色体上の前記標的位置の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、
前記第２の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上または前記第２の染色体上の前記標的位置の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含む、
前記第１の外来核酸配列を発現させて前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記１種類または複数種類のＲＮＡを産生させること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドＲＮＡが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上および前記ゲノムＤＮＡの前記第２の染色体上の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断し、且つ前記ゲノムＤＮＡの前記第２の染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断する、
前記第１の外来核酸配列を、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体対の前記第１の染色体中に前記切断部位で挿入し、前記第１の外来核酸配列を、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体対の前記第２の染色体中に前記切断部位で挿入して、前記生殖系列細胞を前記外来核酸配列についてホモ接合型にすること。
付記２
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが二本鎖切断を生じさせる、付記１に記載の方法。
付記３
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼがＣａｓ９である、付記１に記載の方法。
付記４
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが一本鎖切断を生じさせる、付記１に記載の方法。
付記５
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼがＣａｓ９ニッカーゼである、付記１に記載の方法。
付記６
少なくとも１つの標的位置が必須遺伝子内に存在し、前記外来核酸配列が前記必須遺伝子に隣接して挿入されて、前記必須遺伝子の一部を置換する、付記１に記載の方法。
付記７
前記第１の外来核酸が相同組換えにより挿入される、付記１に記載の方法。
付記８
前記生殖系列細胞が、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞である、付記１に記載の方法。
付記９
前記ＲＮＡが約１０〜約２５０ヌクレオチドを含む、付記１に記載の方法。
付記１０
前記ＲＮＡが約２０〜約１００ヌクレオチドを含む、付記１に記載の方法。
付記１１
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、関連するガイドＲＮＡと共に複数の関連する標的位置に共局在して、前記第１の染色体または前記第２の染色体のいずれかを複数の切断部位で切断する、付記１に記載の方法。
付記１２
前記複数の切断部位での切断により、ＤＮＡ配列が除去されるとともに相同組換えによって前記第１の外来核酸配列で置換される、付記１１に記載の方法。
付記１３
前記生殖系列細胞を生物へと成長させるステップをさらに含む、付記１に記載の方法。
付記１４
前記生物を同じ生物種の野生型生物と交配させて前記第１の外来核酸配列を有する染色体対の第１の染色体を含む子生殖系列細胞を産生させるステップをさらに含む、付記１３に記載の方法。
付記１５
前記第１の外来核酸配列が前記子生殖系列細胞によって発現されて前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記１種類または複数種類のＲＮＡが産生され、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドＲＮＡが、前記染色体対の第２の染色体上の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記第２の染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断し、
前記第１の外来核酸配列を前記染色体対の前記第２の染色体中に前記切断部位で挿入して前記子生殖系列細胞を前記外来核酸配列についてホモ接合型にする、
付記１４に記載の方法。
付記１６
前記生殖系列細胞を生物へと成長させるステップおよび前記生物を同じ生物種の野生型生物と交配させるステップを繰り返して、前記第１の外来核酸配列についてホモ接合型である同じ生物種の生物集団を作り出す、付記１５に記載の方法。
付記１７
前記第１の外来核酸配列が１種類または複数種類の選択された遺伝子配列を含む、付記１に記載の方法。
付記１８
前記第１の外来核酸配列が１種類または複数種類の選択された遺伝子配列を含み、前記１種類または複数種類の選択された遺伝子配列が、前記生物集団内の生物のゲノム内に存在する、付記１６に記載の方法。
付記１９
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含む第２の外来核酸配列をそのゲノム内に含む改変生物を、前記生物集団に導入し、
前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが、前記第１の外来核酸配列上の１つまたは複数の標的位置に相補的であり、前記第１の隣接配列が、前記第１の外来核酸配列上の前記標的位置の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、前記第２の隣接配列が、前記第１の外来核酸配列上の前記標的位置の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含み、
前記改変生物が、前記生物集団のメンバーと交配して、前記第２の外来核酸配列および前記第１の外来核酸配列を含む子生殖系列細胞を産生し、
前記子生殖系列細胞が、前記第２の外来核酸配列を発現して前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記１種類または複数種類のＲＮＡを産生し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドＲＮＡが、前記第１の外来核酸配列上の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記第１の外来核酸配列を前記標的位置で切断部位特異的に切断し、
前記第２の外来核酸配列が前記生殖系列細胞のゲノム中に前記切断部位で挿入されて前記子生殖系列細胞を前記第２の外来核酸配列についてホモ接合型にする、
付記１６に記載の方法。
付記２０
改変野生型生物が、前記第１の外来核酸配列が前記改変野生型生物のゲノムに侵入しないよう、前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが前記１つまたは複数の標的位置に非相補的となり、且つ前記１つまたは複数の標的位置と結合できないように、ゲノムＤＮＡ上の前記１つまたは複数の標的位置が改変された前記集団に導入される、付記１６に記載の方法。
付記２１
前記改変野生型生物が、前記第１の外来核酸配列に共局在して前記第１の外来核酸配列を切断部位特異的に切断して再コード化アレルを生じさせる、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードする第２の外来核酸配列の発現によって改変される、付記２０に記載の方法。
付記２２
さらに以下を含む、付記１に記載の方法。
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含む第２の外来核酸配列を、前記生殖系列細胞に導入すること；
ここで、前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが、前記第１の外来核酸配列によって改変された前記１つまたは複数の標的位置に相補的である、
前記第２の外来核酸配列を発現させて前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記１種類または複数種類のＲＮＡを産生させること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドＲＮＡが、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断して前記第１の外来核酸配列を除去する、および
前記第２の外来核酸配列を前記ゲノムＤＮＡの前記染色体中に前記切断部位で挿入すること。
付記２３
前記第２の外来核酸配列が、前記第１の外来核酸配列とは異なる遺伝的改変を含む、付記２２に記載の方法。
付記２４
前記第２の外来核酸配列が、前記第１の外来核酸配列によって改変された染色体の野生型配列を含む、付記２３に記載の方法。
付記２５
少なくとも１つの標的位置が必須タンパク質コード遺伝子内に存在し、前記必須タンパク質のアミノ酸配列は保存されるように前記外来核酸配列が前記必須遺伝子中に挿入されるが、前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが前記１つまたは複数の標的位置に非相補的になるように前記遺伝子のヌクレオチド配列が改変される、付記１に記載の方法。
付記２６
以下を含む、真核生殖系列細胞を改変する方法。
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含む外来核酸配列を、前記生殖系列細胞に導入すること；
ここで、前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが、前記生殖系列細胞の染色体対の第１の染色体のゲノムＤＮＡ上および第２の染色体のゲノムＤＮＡ上の１つまたは複数の標的位置に相補的であり、
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードする核酸配列が、前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間に存在し、
前記第１の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上の前記標的位置の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、
前記第２の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上の前記標的位置の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含む、
前記外来核酸配列を発現させて前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記１種類または複数種類のＲＮＡを産生させること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質および関連するガイドＲＮＡが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断する、
前記ゲノムＤＮＡの前記染色体対の前記第１の染色体中に前記切断部位で前記外来核酸配列を挿入すること；
前記挿入された外来核酸配列を発現させて前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記１種類または複数種類のＲＮＡを産生させること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドＲＮＡが、前記ゲノムＤＮＡの前記第２の染色体上の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムＤＮＡを前記標的位置で切断部位特異的に切断する、
前記ゲノムＤＮＡの前記染色体対の前記第２の染色体中に前記切断部位で前記外来核酸配列を挿入して前記生殖系列細胞を前記外来核酸配列についてホモ接合型にすること。
付記２７
以下を含む、ある生物種の２つの集団を、生存可能な子孫を産生できないようにする方法。
前記生物種の第１の集団を、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類の第１のガイドＲＮＡをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含む第１の外来核酸配列を含むように改変すること；
ここで、前記１種類または複数種類の第１のガイドＲＮＡが、必須遺伝子上の１つまたは複数の標的位置に相補的であり、且つ前記必須遺伝子のヌクレオチド配列が、前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが前記１つまたは複数の標的配列に非相補的であるがコードされる必須タンパク質のアミノ酸配列が保存されるように改変されている、
前記生物種の第２の集団を、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類の第２のガイドＲＮＡをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含む第２の外来核酸配列を含むように改変すること；
ここで、前記１種類または複数種類の第２のガイドＲＮＡが、前記１種類または複数種類の第１のガイドＲＮＡの前記標的位置とは異なる前記必須遺伝子上の１つまたは複数の標的位置に相補的であり、且つ前記必須遺伝子のヌクレオチド配列が、前記１種類または複数種類の第２のガイドＲＮＡが前記１つまたは複数の標的位置に非相補的であるがコードされる必須タンパク質のアミノ酸配列が保存されるように改変されている、
前記第１の集団を前記第２の集団と交配させて生殖系列細胞を産生させること；
ここで、前記第１の外来核酸配列が発現されて、第２の親から与えられた前記必須遺伝子を切断し、前記第２の外来核酸配列が発現されて、前記第１の親から与えられた前記必須遺伝子を切断する。
付記２８
以下を含む、標的核酸配列中に変異を有する真核生殖系列細胞中のアレルを置換する方法。
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび複数のガイドＲＮＡをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含む第１の外来核酸配列を、前記生殖系列細胞に導入すること；
ここで、前記複数のガイドＲＮＡが、アレル上の変異に隣接する染色体のゲノムＤＮＡ上の複数の標的位置に相補的であり、前記変異により、対応するガイドＲＮＡが前記ゲノムＤＮＡに結合することが妨げられ、
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および前記複数のガイドＲＮＡをコードする核酸配列が、前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間に存在し、
前記第１の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の前記標的位置の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、
前記第２の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の前記標的位置の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含む、
前記第１の外来核酸配列を発現させて前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記複数のＲＮＡを産生させること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドＲＮＡが、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の複数の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体を前記複数の標的位置で切断部位特異的に切断して、前記変異を含む前記ゲノムＤＮＡの一部を除去する、および
前記第１の外来核酸配列を前記ゲノムＤＮＡの前記染色体中に前記切断部位で挿入すること。
付記２９
全ての標的位置を除去する欠失が起こると非常に有害であり自然選択により前記集団から除かれることになるように、前記標的位置の少なくとも１つが必須遺伝子などの前記生物の適応度に重要な遺伝子内に存在する、付記２８に記載の方法。
付記３０
以下を含む、生物の真核生殖系列細胞を複数の遺伝子において改変する方法。
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび複数のガイドＲＮＡをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含む第１の外来核酸配列を、前記複数の遺伝子に対応する１種類または複数種類の更なる外来核酸配列と共に前記生殖系列細胞に導入すること；
ここで、前記複数のガイドＲＮＡが、前記生殖系列細胞の染色体のゲノムＤＮＡ中の複数の遺伝子上の１つまたは複数の標的位置に相補的な１種類または複数種類の遺伝子特異的ガイドＲＮＡを含み、
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および前記複数のガイドＲＮＡをコードする核酸配列が、前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間に存在し、
前記第１の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の前記標的位置のうちの１つの第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、
前記第２の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の同じ標的位置の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含み、
前記１種類または複数種類の核酸配列の各々が、残りの標的位置の第１の部分および第２の部分に対応する第１の隣接配列および第２の隣接配列を含む、
前記第１の外来核酸配列を発現させて前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記複数のＲＮＡを産生させること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドＲＮＡが、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の複数の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体を複数の遺伝子において切断部位特異的に切断する、および
前記第１の外来核酸配列を前記ゲノムＤＮＡの前記染色体中に前記切断部位で挿入すること。
付記３１
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび複数のガイドＲＮＡをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含む第２の外来核酸配列を、前記生殖系列細胞に導入すること；
ここで、前記複数のガイドＲＮＡが、前記第１の外来核酸配列によって改変された前記複数の標的位置に相補的である、
前記第２の外来核酸配列を発現させて前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記複数のガイドＲＮＡを産生させること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドＲＮＡが、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体を前記関連する標的位置で切断部位特異的に切断して前記第１の外来核酸配列を除去する、および
前記第２の外来核酸配列を前記ゲノムＤＮＡの前記染色体中に前記切断部位で挿入すること
をさらに含む、付記３０に記載の方法。
付記３２
前記第２の外来核酸配列が、前記第１の外来核酸配列とは異なる遺伝的改変を含む、付記３１に記載の方法。
付記３３
前記第２の外来核酸配列が、前記第１の外来核酸配列によって改変された前記染色体の野生型配列を含む、付記３２に記載の方法。
付記３４
以下を含む、２つの集団を、互いの間で子を産生できないようにする方法。
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび第１セットのガイドＲＮＡ群をコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含む第１の外来核酸配列を、第１の生殖系列細胞に導入すること；
ここで、前記第１セットのガイドＲＮＡ群が、染色体のゲノムＤＮＡ上の第１セットの標的位置群に相補的であり、
前記第１セットの標的位置群が必須タンパク質コード遺伝子内に存在し、前記必須タンパク質のアミノ酸配列は保存されるが、前記第１セットのガイドＲＮＡ群が前記１つまたは複数の標的位置に非相補的であるように前記遺伝子のヌクレオチド配列が改変されるように、前記第１の外来核酸配列が前記必須遺伝子中に挿入され、
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列、および前記第１セットのガイドＲＮＡ群をコードする核酸配列、および前記必須タンパク質のアミノ酸配列を保存する前記第１の外来核酸配列が、前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間に存在し、
前記第１の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の前記標的位置の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、
前記第２の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の前記標的位置の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含む、
前記第１の外来核酸配列を発現させて前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記第１セットのガイドＲＮＡ群を産生させること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドＲＮＡ群が、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の関連する第１セットの標的位置群に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体を前記第１セットの標的位置群で切断部位特異的に切断して前記必須遺伝子内の前記ゲノムＤＮＡの一部を除去する、および
前記第１の外来核酸配列を前記ゲノムＤＮＡの前記染色体中に前記切断部位で挿入すること；および
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび第２セットのガイドＲＮＡ群をコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含む、第２の外来核酸配列を、第２の生殖系列細胞に導入すること；
ここで、前記第２セットのガイドＲＮＡ群が、染色体のゲノムＤＮＡ上の第２セットの標的位置群に相補的であり、
前記第２セットの標的位置群が、前記第１セットの標的位置群と同じ必須タンパク質コード遺伝子内に存在するが、前記第１セットの標的位置群のいずれとも同じでなく、前記必須タンパク質のアミノ酸配列は保存されるが、前記第２セットのガイドＲＮＡ群が前記第２セットの標的位置群に非相補的になるように前記遺伝子のヌクレオチド配列が改変されるように、前記第２の外来核酸配列が前記必須遺伝子中に挿入され、
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列、および前記第２セットのガイドＲＮＡ群をコードする核酸配列、および前記必須タンパク質のアミノ酸配列を保存する前記第２の外来核酸配列が、前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間に存在し、
前記第１の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の前記標的位置の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、
前記第２の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の前記標的位置の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含む、
前記第２の外来核酸配列を発現させて前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記第２セットのガイドＲＮＡ群を産生させること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連する第２セットのガイドＲＮＡ群が、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の第２セットの関連する標的位置群に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体を前記第２セットの標的位置群で切断部位特異的に切断して前記必須内の前記ゲノムＤＮＡの一部を除去する、および
前記第２の外来核酸配列を前記ゲノムＤＮＡの前記染色体中に前記切断部位で挿入すること；
ここで、前記第１セットのガイドＲＮＡ群が、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼに前記第２の外来核酸配列内の前記第１セットの標的位置群を切断させ、前記第２セットのガイドＲＮＡ群が、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼに前記第１の外来核酸配列内の前記第２セットの標的位置群を切断させる場合に、前記第１の生殖系列細胞および前記第２の生殖系列細胞から生じる生物の相互間の子孫が生存可能できない。
付記３５
以下を含む、精母細胞からＹ染色体精子のみを産生する方法。
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含む第１の外来核酸配列を、前記精母細胞に導入すること；
ここで、前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが、前記精母細胞のＸ染色体上の１つまたは複数の標的位置および前記精母細胞のＹ染色体上の１つまたは複数の標的位置に相補的であり、
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードする核酸配列が、前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間に存在し、
前記第１の隣接配列が、前記Ｙ染色体上の前記標的位置の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、
前記第２の隣接配列が、前記Ｙ染色体上の前記標的位置の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含む、
前記第１の外来核酸配列を発現させて、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼと、前記精母細胞の前記Ｘ染色体上の１つまたは複数の標的位置と前記精母細胞の前記Ｙ染色体上の１つまたは複数の標的位置とに相補的な前記１種類または複数種類のＲＮＡとを産生させること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記Ｙ染色体上の標的位置に相補的な関連するガイドＲＮＡが、前記Ｙ染色体上の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが前記Ｙ染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断する、
前記第１の外来核酸配列を前記Ｙ染色体中に前記切断部位で挿入すること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記Ｘ染色体上の標的位置に相補的な関連するガイドＲＮＡが、前記Ｘ染色体上の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記Ｘ染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断して前記Ｘ染色体を作働不能（inoperable）にする。
付記３６
精母細胞からＹ染色体精子のみを産生させる方法であって、
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類のガイドＲＮＡを、対応するプロモーター配列を用いて前記Ｙ染色体上に位置する配列から発現させることを含み、
前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが前記精母細胞のＸ染色体上の１つまたは複数の標的位置に相補的であり、
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記Ｘ染色体上の１種類または複数種類の標的配列に相補的な関連するガイドＲＮＡが、前記Ｘ染色体上の前記１つまたは複数の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記Ｘ染色体を前記１つまたは複数の標的位置で切断部位特異的に切断して前記Ｘ染色体を作働不能にする、
前記方法。
付記３７
精母細胞からＸ染色体精子のみを産生させる方法であって、
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類のガイドＲＮＡを、対応するプロモーター配列を用いて前記Ｘ染色体上に位置する配列から発現させることを含み、
前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが、前記精母細胞のＹ染色体上の１つまたは複数の標的位置に相補的であり、
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記Ｙ染色体上の１種類または複数種類の標的配列に相補的な関連するガイドＲＮＡが、前記Ｙ染色体上の前記１つまたは複数の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記Ｙ染色体を前記１つまたは複数の標的位置で切断部位特異的に切断して前記Ｙ染色体を作働不能にする、
前記方法。
付記３８
精母細胞からＹ染色体含有精子のみを産生させる方法であって、
第１の外来核酸配列および第２の外来核酸配列をコードするようにＹ染色体を改変することを含み、
ここで、前記第１の外来核酸配列が、第１のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ、第１セットのガイドＲＮＡ群、および対応するプロモーター配列をコードし、
前記第２の外来核酸配列が、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ、第２セットのガイドＲＮＡ群、対応するプロモーター配列、ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列をコードし、
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする前記第２の核酸配列および前記第２セットのガイドＲＮＡ群をコードする核酸配列が、前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間に存在し、
前記第１のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記第２セットのガイドＲＮＡ群を認識できず、前記第２のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記第１セットのガイドＲＮＡ群を認識できず、
前記第１セットのガイドＲＮＡ群が、性染色体ではない染色体のゲノムＤＮＡ上の複数の標的位置に相補的であり、
前記第１の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の前記標的位置の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、
前記第２の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の前記標的位置の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含み、
前記第１の外来核酸配列が減数分裂前に前記生殖系列中で発現されて前記第１のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記第１セットのＲＮＡ群が産生され、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドＲＮＡ群が、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の第１セットの関連する標的位置群に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、細胞修復機構により前記第２の外来核酸配列が前記Ｙ染色体から前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上にコピーされるように、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体を前記第１セットの標的位置群で切断部位特異的に切断し、
前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上に位置する前記第２の外来核酸配列の前記コピーが、減数分裂より前または減数分裂中に発現されて前記第２のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質および前記第２セットのガイドＲＮＡ群が産生され、
前記第２のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記Ｘ染色体上の１つまたは複数の標的位置に相補的な前記第２セットのガイドＲＮＡ群が、前記Ｘ染色体上の前記１つまたは複数の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記Ｘ染色体を前記１つまたは複数の標的位置で切断部位特異的に切断して前記Ｘ染色体を作働不能にする、
前記方法。
付記３９
精母細胞からＸ染色体含有精子のみを産生する方法であって、
第１の外来核酸配列および第２の外来核酸配列をコードするようにＸ染色体を改変することを含み、
ここで、前記第１の外来核酸配列が、第１のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ、および第１セットのガイドＲＮＡ群、および対応するプロモーター配列をコードし、
前記第２の外来核酸配列が、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ、および第２セットのガイドＲＮＡ群、および対応するプロモーター配列、ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列をコードし、
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする前記第２の核酸配列および前記第２セットのガイドＲＮＡ群をコードする核酸配列が、前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間に存在し、
前記第１のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記第２セットのガイドＲＮＡ群を認識できず、前記第２のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記第１セットのガイドＲＮＡ群を認識できず、
前記第１セットのガイドＲＮＡ群が、性染色体ではない染色体のゲノムＤＮＡ上の複数の標的位置に相補的であり、
前記第１の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の前記標的位置の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、
前記第２の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の前記標的位置の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含み、
前記第１の外来核酸配列が減数分裂の前に前記生殖系列中で発現されて前記第１のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記第１セットのＲＮＡ群が産生され、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドＲＮＡ群が、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上の第１セットの関連する標的位置群に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、細胞修復機構により前記第２の外来核酸配列が前記Ｘ染色体から前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上にコピーされるように、前記ゲノムＤＮＡの前記染色体を前記第１セットの標的位置群で切断部位特異的に切断し、
前記ゲノムＤＮＡの前記染色体上に位置する前記第２の外来核酸配列の前記コピーが減数分裂の前または減数分裂中に発現されて、前記第２のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質および前記第２セットのガイドＲＮＡ群が産生され、
前記第２のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記Ｙ染色体上の１つまたは複数の標的位置に相補的な前記第２セットのガイドＲＮＡ群が、前記Ｙ染色体上の前記１つまたは複数の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記Ｙ染色体を前記１つまたは複数の標的位置で切断部位特異的に切断して前記Ｙ染色体を作働不能にする。
付記４０
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼと、精子のＹ染色体上の１種類または複数種類の標的核酸配列に相補的な１種類または複数種類のガイドＲＮＡと、精子のＸ染色体上の１種類または複数種類の標的核酸配列に相補的な１種類または複数種類のガイドＲＮＡと、第１の隣接配列と、第２の隣接配列とをコードする第１の外来核酸配列を有する改変Ｘ染色体を有する、雄子孫を排除するための雌子孫を産生する方法であって、
前記第１の外来核酸配列を卵母細胞中で発現させてＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ、および前記Ｙ染色体上の１種類または複数種類の標的核酸配列と前記Ｘ染色体上の１種類または複数種類の標的核酸配列とに相補的な１種類または複数種類のガイドＲＮＡを産生させ、
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードする核酸配列が、前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間に存在し、
前記第１の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記Ｘ染色体上の前記標的位置の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、
前記第２の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記Ｘ染色体上の前記標的位置の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含み、
前記第１の外来核酸配列を発現させてＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ、および前記Ｙ染色上の前記１種類または複数種類の標的核酸配列と前記Ｘ染色体上の前記１種類または複数種類の標的核酸配列とに相補的な１種類または複数種類のガイドＲＮＡを産生させ、
Ｙ染色体を有する野生型精子と前記改変Ｘ染色体を含む卵母細胞が結合すると、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼと前記Ｙ染色体を標的とする前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡとが前記Ｙ染色体上の前記１種類または複数種類の標的核酸配列に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが前記Ｙ染色体を切断して前記卵母細胞の雄生物へのその後の発生を作働不能にし、
Ｘ染色体を有する野生型精子と前記改変Ｘ染色体を含む卵母細胞が結合すると、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが前記Ｘ染色体上の前記１種類または複数種類の標的核酸配列に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが前記Ｘ染色体を切断し、そこで前記第１の外来核酸配列が前記Ｘ染色体中に挿入される、
前記方法。
付記４１
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼと、発生に必須の遺伝子内に位置する前記Ｘ染色体上の１種類または複数種類の標的核酸配列に相補的な１種類または複数種類のガイドＲＮＡとをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含む第１の外来核酸配列を有する改変Ｙ染色体を有する、雌子孫を排除するための雄子孫を産生する方法であって、
前記第１の隣接配列が、前記Ｘ染色体上の前記必須遺伝子の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、
前記第２の隣接配列が、前記Ｘ染色体上の前記必須遺伝子の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含み、前記改変Ｙ染色体が、前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡによって認識される前記１つまたは複数の標的位置が１種類または複数種類の前記ガイドＲＮＡによって認識される前記配列と非相補的になるように改変された前記Ｘ染色体上の前記必須遺伝子をコードする第２の核酸配列をさらに含み、その結果、野生型Ｘ染色体を有する卵母細胞が前記改変Ｙ染色体を有する精子と結合した場合に前記第１の外来核酸配列が発現されてＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記Ｘ染色体上の１種類または複数種類の標的核酸配列に相補的な１種類または複数種類のガイドＲＮＡが産生され、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが前記Ｘ染色体上の前記１種類または複数種類の標的核酸配列に共局在し、そこで前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが前記Ｘ染色体を切断して前記必須遺伝子を除去してそこに前記第１の核酸配列を挿入し、前記Ｙ染色体上の前記必須遺伝子の前記の追加のコピーのために生存可能なままである改変Ｘ染色体が作られ、
野生型Ｘ染色体を有する卵母細胞と前記改変Ｘ染色体を有する精子が結合すると、前記第１の外来核酸配列が発現されて、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記Ｘ染色体上の１種類または複数種類の標的核酸配列に相補的な１種類または複数種類のガイドＲＮＡが産生され、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが前記Ｘ染色体上の前記１種類または複数種類の標的核酸配列に共局在し、そこで前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが前記Ｘ染色体を切断して前記必須遺伝子を除去し、前記第１の外来核酸配列を前記Ｘ染色体中に挿入し、その結果、前記接合体が前記必須Ｘ染色体遺伝子を欠くことになる、
前記方法。
付記４２
生殖可能な雄および生殖不能の雌を作製する方法であって、付記４１に記載の方法が、その遺伝子を欠いた生物が生殖不能となるように、前記Ｘ染色体上の前記必須遺伝子が生殖能にのみ必須である点で改変されている、方法。
付記４３
前記第１の核酸配列が、第３の隣接配列および第４の隣接配列をさらに含み、
前記第３の隣接配列が、生殖能に必須の遺伝子の第１の部分と同じ配列である第３の配列を含み、
前記第４の隣接配列が、生殖能に必須の遺伝子の第２の部分と同じ配列である第４の配列を含み、
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記第３の隣接配列と前記第４の隣接配列との間に位置し、前記第１の核酸配列が、前記生殖能に必須の遺伝子内に位置する１種類または複数種類の標的配列に相補的な第２セットのガイドＲＮＡ群をさらに含み、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記第２セットのガイドＲＮＡ群が発現し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが前記生殖能に必須の遺伝子内の前記１種類または複数種類の標的核酸配列に共局在し、
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記生殖能に必須の遺伝子を切断してそこに前記第１の核酸配列を挿入する、付記４１に記載の方法。
付記４４
制御された集団抑制の方法であって、付記４３に記載のＹ染色体を抑制対象の集団中に放出し、付記４３に記載のＹ染色体に利用される前記ガイドＲＮＡに非相補的となるが前記遺伝子によりコードされるタンパク質が同じアミノ酸配列を保持するように、付記４３に記載のＹ染色体によって標的とされた前記生殖能に必須の遺伝子内に位置する前記１種類または複数種類の標的配列を改変する付記３０に記載のＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブを、前記Ｙ染色体が、前記抑制対象の集団中で息子のみを産生し、保護対象の集団中に放出された前記ＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブにより改変された雌と交配した場合には生殖可能な息子および生殖不能な娘を産出するように、前記保護対象の集団中に放出する、方法。
付記４５
抑制または根絶する対象の集団中に付記４４に記載のＹ染色体を放出することを含む、標的集団抑制または標的集団絶滅のための方法。
付記４６
標的集団中に性別にバイアスをかける染色体を放出することを含む、標的集団抑制または標的集団絶滅のための方法。
付記４７
以下を含む、改変生物から同じ生物種の野生型生物への遺伝子流動を阻止する方法。
最初に、前記生物が生存可能であるためには２つの機能的なコピーとして存在しなければならない遺伝子（以後、必須遺伝子と呼ぶ）の中央部の配列に対応する配列が、前記遺伝子の野生型コピーの遠位に存在する染色体の別の領域中に挿入されるように、前記野生型生物のゲノムを改変すること；および次に、
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードし、且つ対応するプロモーター配列、第１の隣接配列、第２の隣接配列、第３の隣接配列、第４の隣接配列、および前記必須遺伝子と同じタンパク質をコードするが同じ核酸配列を使用しない配列（以後、再コード化必須遺伝子と呼ぶ）を含む第１の外来核酸配列を、前記改変生物の生殖系列に導入すること；
ここで、前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが、前記染色体の前記遠位領域中に挿入された前記１つまたは複数の標的位置および前記必須遺伝子内の配列に相補的であり、
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列と、前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡ、前記第３の隣接配列、前記第４の隣接配列、および前記再コード化必須遺伝子をコードする核酸配列とが、前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間に存在し、
前記第１の隣接配列が、前記染色体の遠位領域中の前記標的位置の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、
前記第２の隣接配列が、前記染色体の遠位領域中の前記標的位置の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含み、
前記第３の隣接配列が、前記必須遺伝子の第３の部分と同じ配列である第３の配列を含み、
前記第４の隣接配列が、前記必須遺伝子の第４の部分と同じ配列である第４の配列を含む、
前記第１の外来核酸配列を発現させて前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ、および前記染色体の前記遠位領域中の１つまたは複数の標的位置と前記必須遺伝子内の前記１種類または複数種類の標的配列とに相補的な前記１種類または複数種類のＲＮＡを産生させること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび標的位置に相補的な関連するガイドＲＮＡが、前記染色体の前記遠位領域中の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記染色体の前記遠位領域中の前記標的配列を切断部位特異的に切断する、
前記第１の外来核酸配列を前記染色体の前記遠位領域中に挿入すること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび標的位置に相補的な関連するガイドＲＮＡが、前記野生型必須遺伝子中の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記野生型必須遺伝子を切断部位特異的に切断する、
前記第３の隣接領域と前記第４の隣接領域との間の配列を前記必須遺伝子の野生型コピー中に挿入することによりその機能を破壊して、
その結果、前記改変生物が、前記染色体の遠位領域中に前記必須遺伝子の２つの再コード化コピーを有し、前記野生型必須遺伝子の機能的コピーを有さず、改変生物が野生型生物と交雑すると、前記染色体の前記遠位領域中に前記再コード化必須遺伝子の追加のコピーを挿入することなく前記必須遺伝子の野生型コピーが破壊されること。
付記４８
前記必須遺伝子が、前記Ｘ染色体上に位置し、生存能に２コピーが必要であり；前記遠位領域も前記Ｘ染色体上に存在し；雄の生殖能または生存能に必要な遺伝子（以後、雄必須遺伝子と呼ぶ）が、コードされている雄必須タンパク質のアミノ酸配列を保存するようその核酸配列中に再コード化されるように、前記生物の前記第１の改変により前記Ｙ染色体がさらに改変され；非機能的である前記雄必須遺伝子の更なるコピーが前記雄必須遺伝子の前記再コード化コピーの隣に挿入され；前記第１の核酸配列が、前記雄必須遺伝子の第５の部分と同じ配列である第５の配列を含む第５の隣接配列も含み；前記第１の核酸配列が、前記雄必須遺伝子の第６の部分と同じ配列である第６の配列を含む第６の隣接配列も含み；前記第１の核酸配列が、前記遺伝子を非機能的にするように再コード化された前記野生型雄必須遺伝子内の配列に対応する第２セットのガイドＲＮＡ群も含み；前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列ならびに前記ガイドＲＮＡ、前記第３の隣接配列、前記第４の隣接配列、および前記再コード化必須遺伝子をコードする核酸配列が、前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間に存在する前記第５の隣接配列と前記第６の隣接配列との間に存在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼは前記再コード化遺伝子または前記非機能的雄必須遺伝子を切断せず、前記改変Ｙ染色体は前記改変Ｘ染色体上の前記必須遺伝子を切断しないので、改変Ｙ染色体を有する雄と交配した２つの改変Ｘ染色体を有する雌が、生存可能な雄の子を生じ；野生型Ｙ染色体を有する精子と受精した、２つの改変Ｘ染色体を有する雌に由来する卵母細胞の場合は、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが前記野生型雄必須遺伝子を切断してその場所に前記第５の隣接配列と前記第６の隣接配列との間の配列をコピーして、生殖不能または生存不能な雄が生じ；改変Ｙ染色体を有する精子と受精した、野生型雌に由来する卵母細胞の場合は、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが前記必須遺伝子を切断して、生存不能な雄の子孫が生じ；改変Ｘ染色体および野生型Ｘ染色体を共に含む精子と卵が結合すると、前記再コード化必須遺伝子をコピーすることなく前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが前記野生型必須遺伝子を切断して、１つの改変Ｘ染色体および１つの破壊されたＸ染色体を有するハイブリッド雌子孫が生じ；野生型雄と交配させたこれらのハイブリッド雌が、生存不能もしくは生殖不能な雄またはハイブリッド雌を産生し；ハイブリッド雌と改変Ｙ染色体を有する雄との雄子孫の半数が生存可能である、付記４７に記載の方法。
付記４９
以下を含む、固有の遺伝的多型を有する亜集団から野生型集団の残りへの遺伝子流動を阻止する方法。
前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間の標的位置中に固有の多型を有する集団中でのみ拡散でき、さらに前記染色体の遠位領域中に前記標的部位を挿入する、付記３０に記載のＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブを放出すること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブが、前記固有多型領域中に前記ＲＮＡ誘導型遺伝子ドライブを挿入するための前記第１および第２の隣接配列をコードし、且つ前記遠位領域中に前記標的部位を挿入するための第３および第４の隣接配列をコードする、および次に、
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ、第２セットのガイドＲＮＡ群、および第３セットのガイドＲＮＡ群をコードし、且つ対応するプロモーター配列、第５の隣接配列、第６の隣接配列、第７の隣接配列、第８の隣接配列、第９の隣接配列、第１０の隣接配列、および前記必須遺伝子と同じタンパク質をコードするが同じ核酸配列を使用しない配列（以後、再コード化必須遺伝子と呼ぶ）を含む、第２の外来核酸配列を最初に上記のように改変された生物の生殖系列に導入することによって二次的に改変した生物を放出すること；
ここで、前記第２セットのガイドＲＮＡ群が、前記染色体の前記遠位領域に挿入された前記第１セットの標的位置群およびさらに前記必須遺伝子内の配列に相補的であり、
前記第３セットのガイドＲＮＡ群が、前記第１セットの核酸配列内に固有に存在する標的配列群に相補的であり、
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列ならびに前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡ、前記第７の隣接配列、前記第８の隣接配列、前記第９の隣接配列、前記第１０の隣接配列、および前記再コード化必須遺伝子をコードする核酸配列が、前記第５の隣接配列と前記第６の隣接配列との間に存在し、
前記第５の隣接配列が、前記染色体の前記遠位領域中の前記標的位置の第５の部分と同じ配列である第５の配列を含み、
前記第６の隣接配列が、前記染色体の前記遠位領域中の前記標的位置の第６の部分と同じ配列である第６の配列を含み、
前記第７の隣接配列が、前記必須遺伝子の第７の部分と同じ配列である第７の配列を含み、
前記第８の隣接配列が、前記必須遺伝子の第８の部分と同じ配列である第８の配列を含み、
前記第９の隣接配列が、前記第１の隣接配列の第９の部分と同じ配列である第９の配列を含み、
前記第１０の隣接配列が、前記第２の隣接配列の第１０の部分と同じ配列である第１０の配列を含む、
前記第２の外来核酸配列を発現させて前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ、および前記染色体の前記遠位領域中の前記第２セットの標的位置群と前記必須遺伝子内の前記第２セットの標的配列群とに相補的な前記第２セットのＲＮＡ群を産生させること；、
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび標的位置に相補的な関連するガイドＲＮＡが、前記染色体の前記遠位領域中の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが前記染色体の前記遠位領域中の前記標的配列を切断部位特異的に切断する、
前記第１の外来核酸配列を前記染色体の前記遠位領域に挿入すること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび標的位置に相補的な関連するガイドＲＮＡが、野生型必須遺伝子中の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記野生型必須遺伝子を切断部位特異的に切断する、
前記第７の隣接領域と前記第８の隣接領域との間の配列を前記必須遺伝子の前記野生型コピー中に挿入することによりその機能を破壊すること；
前記第１の核酸配列内に固有に位置する配列に相補的な前記第３セットのガイドＲＮＡ群を発現させること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記第１の核酸配列内の配列に相補的な関連するガイドＲＮＡが、前記第１の核酸配列内の標的配列に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記第１の核酸配列内の前記標的配列を切断部位特異的に切断する、
前記第１の核酸配列を、前記第９の隣接領域と前記第１０の隣接領域との間の配列で置換し、
その結果、前記改変生物が、前記第１の核酸配列のコピーを有さず、２つの前記必須遺伝子の再コード化コピーを前記染色体の遠位領域中に有し、前記野生型必須遺伝子の機能的コピーを有さず、改変生物が野生型生物と交雑すると、前記染色体の前記遠位領域中に前記再コード化必須遺伝子の追加のコピーを挿入することなく前記必須遺伝子の前記野生型コピーが破壊されること。
付記５１
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含む外来核酸配列を含む生殖系列細胞であって、
前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが、前記生殖系列細胞の染色体対の第１の染色体のゲノムＤＮＡ上および第２の染色体のゲノムＤＮＡ上の１つまたは複数の標的位置に相補的であり、
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードする核酸配列が、前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間に存在し、
前記第１の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上または前記第２の染色体上の前記標的位置の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、
前記第２の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上または前記第２の染色体上の前記標的位置の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含む、
前記生殖系列細胞。
付記５２
以下を含む、生物の真核生殖系列細胞を改変する方法。
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードし、対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含み、且つ前記生物が特定の化学物質、化合物、または条件に晒された場合にその発現が前記生物にとって有害である感作核酸（sensitizing nucleic acid）を含む第１の外来核酸配列を、前記生殖系列細胞に導入すること；
ここで、前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが、前記生殖系列細胞の染色体対の第１の染色体のゲノムＤＮＡ上および第２の染色体のゲノムＤＮＡ上の１つまたは複数の標的位置に相補的であり、
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードする核酸配列が、前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間に存在し、
前記第１の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上または前記第２の染色体上の前記標的位置の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、
前記第２の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上または前記第２の染色体上の前記標的位置の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含む、
前記第１の外来核酸配列を発現させて前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記１種類または複数種類のＲＮＡを産生させること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドＲＮＡが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上および前記ゲノムＤＮＡの前記第２の染色体上の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断し、且つ前記ゲノムＤＮＡの前記第２の染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断する、
前記第１の外来核酸配列を前記ゲノムＤＮＡの前記染色体対の前記第１の染色体中に前記切断部位で挿入し、前記第１の外来核酸配列を前記ゲノムＤＮＡの前記染色体対の前記第２の染色体中に前記切断部位で挿入して、前記生殖系列細胞を前記外来核酸配列についてホモ接合型にすること；および
生じた生物が前記化学物質、化合物、または条件に晒された場合に死滅するまたは生殖不能になるように、前記生じた生物を前記化学物質、化合物、または条件に対して感受性にする前記感作核酸を発現させること。
付記５３
前記感作核酸の発現により、前記生物に対する前記化学物質、化合物、または条件の毒性が増大する、付記５２に記載の方法。
付記５４
前記生殖系列細胞を生物へと成長させ、前記感作核酸を子孫に移行させて、前記感作核酸を含む生物の集団を作り出し、前記感作核酸が前記生物に対する前記化学物質、化合物、または条件の毒性を増大させる、付記５２に記載の方法。
付記５５
前記生物が雑草または有害生物である、付記５２に記載の方法。
付記５６
前記感作核酸が、現存遺伝子を置換する感作遺伝子である、付記５２に記載の方法。
付記５７
前記感作遺伝子が、野生集団中の現存変異遺伝子の正確なまたはコドンを改変した祖先バージョンであり、前記現在の変異バージョンが前記祖先形態で置換される、付記５６に記載の方法。
付記５８
前記現存遺伝子が、農薬、除草剤、または殺真菌剤に対する抵抗性に寄与する変異を獲得している、付記５６に記載の方法。
付記５９
前記化学物質または化合物が、農薬、除草剤、または殺真菌剤である、付記５２に記載の方法。
付記６０
前記農薬、除草剤、または殺真菌剤が、Ｃｒｙ１Ａ．１０５、ＣｒｙＩＡｂ、ＣｒｙＩＦ、Ｃｒｙ２Ａｂ、Ｃｒｙ３Ｂｂ１、Ｃｒｙ３４Ａｂ１、Ｃｒｙ３５Ａｂ１、ｍＣｒｙ３Ａ、もしくはＶＩＰによって産生されるＢｔ毒素、２，４−Ｄ、またはグリホサートのいずれかである、付記５９に記載の方法。
付記６１
前記感作遺伝子が、前記生物の生存または生殖にその機能が必要とされる現存遺伝子を置換する、付記５６に記載の方法。
付記６２
前記化学物質がプロドラッグであり、前記感作遺伝子が対応するプロドラッグ変換酵素をコードする、付記５２に記載の方法。
付記６３
前記酵素と化学物質の組み合わせが、シトシンデアミナーゼと５−フルオロシトシン、またはニトロレダクターゼとＣＢ１９５４である、付記６２に記載の方法。
付記６４
感受性遺伝子ドライブが、特定の化学物質、化合物、または条件の存在する場合に、雑草または有害生物集団を毒性に対して脆弱にする、感受性遺伝子ドライブを雑草または有害生物の集団のゲノム中に含む、前記雑草または有害生物の集団を制御する方法であって、
前記雑草もしくは有害生物を死滅させる、前記雑草もしくは有害生物の増殖を低減する、または前記雑草もしくは有害生物を生殖不能にして増殖を阻害するのに有効な量の前記化学物質、化合物、または条件と前記雑草または有害生物集団を接触させることを含む、前記方法。
付記６５
前記化学物質または化合物が、除草剤、農薬、または殺真菌剤である、付記６４に記載の方法。
付記６６
以下を含む、第１の感作遺伝子ドライブを含む生物の真核生殖系列細胞を改変する方法。
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードし、対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含み、且つ前記生物が特定の化学物質、化合物、または条件に晒された場合にその発現が前記生物にとって有害である第２の感作核酸配列を含む第２の外来核酸配列を、前記生殖系列細胞に導入すること；
ここで、前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが、前記第１の感作遺伝子ドライブを含む前記生殖系列細胞の染色体対の前記第１の感作遺伝子ドライブを含む第１の染色体のゲノムＤＮＡ上および第２の染色体のゲノムＤＮＡ上の１つまたは複数の標的位置に相補的であり、
前記第２の外来核酸配列の前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードする核酸配列が、前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間に存在し、
前記第１の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上または前記第２の染色体上の前記標的位置の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、
前記第２の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上または前記第２の染色体上の前記標的位置の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含む、
前記第２の外来核酸配列を発現させて前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記１種類または複数種類のＲＮＡを産生させること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドＲＮＡが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上および前記ゲノムＤＮＡの前記第２の染色体上の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断し、前記ゲノムＤＮＡの前記第２の染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断して、前記第１の外来核酸配列が除去される、
前記第２の外来核酸配列を前記ゲノムＤＮＡの前記染色体対の前記第１の染色体中に前記切断部位で挿入し、前記第２の外来核酸配列を前記ゲノムＤＮＡの前記染色体対の前記第２の染色体中に前記切断部位で挿入して、前記生殖系列細胞を前記第２の外来核酸配列についてホモ接合型にすること；および
生じた生物が前記化学物質、化合物、または条件に晒された場合に死滅するまたは生殖不能になるように、前記生じた生物を前記化学物質、化合物、または条件に対して感受性にする前記第２の感作核酸配列を発現させること。
付記６７
前記生じた生物と野生型生物との子孫が前記第２の感作核酸配列を含むように、前記生じた生物を野生型集団中に導入する、付記６６に記載の方法。
付記６８
前記生物が雑草または有害生物である、付記６６に記載の方法。
付記６９
以下を含む、第１の感作遺伝子ドライブを含む生物の真核生殖系列細胞を改変する方法。
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードし、対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含み、且つ前記生物が特定の化学物質、化合物、または条件に晒された場合にその発現が前記生物にとって有害である第２の感作核酸配列を含む第２の外来核酸配列を、前記生殖系列細胞に導入すること；
ここで、前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが、前記第１の感作遺伝子ドライブを含む前記生殖系列細胞の染色体対の前記第１の感作遺伝子ドライブを含む第１の染色体のゲノムＤＮＡ上および第２の染色体のゲノムＤＮＡ上の１つまたは複数の標的位置に相補的であり、
前記第２の外来核酸配列の前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードする核酸配列が、前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間に存在し、
前記第１の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上または前記第２の染色体上の前記標的位置の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、
前記第２の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上または前記第２の染色体上の前記標的位置の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含む、
前記第２の外来核酸配列を発現させて前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記１種類または複数種類のＲＮＡを産生させること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドＲＮＡが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上および前記ゲノムＤＮＡの前記第２の染色体上の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断し、且つ前記ゲノムＤＮＡの前記第２の染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断する、
前記第２の外来核酸配列を前記ゲノムＤＮＡの前記染色体対の前記第１の染色体中に前記切断部位で挿入し、前記第２の外来核酸配列を前記ゲノムＤＮＡの前記染色体対の前記第２の染色体中に前記切断部位で挿入して、前記生殖系列細胞を前記第２の外来核酸配列についてホモ接合型にすること；および
生じた生物が前記化学物質、化合物、または条件に晒された場合に死滅するまたは生殖不能になるように、前記生じた生物を前記化学物質、化合物、または条件に対して感受性にする前記第２の感作核酸配列を発現させること。
付記７０
前記生じた生物と野生型生物との子孫が前記第２の感作核酸配列を含むように、前記生じた生物を野生型集団中に導入する、付記６９に記載の方法。
付記７１
前記生物が雑草または有害生物である、付記６９に記載の方法。
付記７２
以下を含む、生物の真核生殖系列細胞を改変する方法。
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードし、且つ対応するプロモーター配列ならびに第１の隣接配列および第２の隣接配列を含む第１の外来核酸配列を、前記生殖系列細胞に導入すること；
前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡが、前記生殖系列細胞の染色体対の第１の染色体のゲノムＤＮＡ上および第２の染色体のゲノムＤＮＡ上の１つまたは複数の標的位置に相補的であり、
前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼをコードする核酸配列および前記１種類または複数種類のガイドＲＮＡをコードする核酸配列が、前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間に存在し、
前記第１の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上または前記第２の染色体上の前記標的位置の第１の部分と同じ配列である第１の配列を含み、
前記第２の隣接配列が、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体上または前記第２の染色体上の前記標的位置の第２の部分と同じ配列である第２の配列を含み、
前記外来核酸配列によって切断および置換される前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間に位置する配列の少なくとも１個のコピーが、前記生物が生存するためまたは生存可能な子を産生するために必要である、
前記第１の外来核酸配列を発現させて前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび前記１種類または複数種類のＲＮＡを産生させること；
ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼおよび関連するガイドＲＮＡが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体および前記ゲノムＤＮＡの前記第２の染色体上の関連する標的位置に共局在し、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼが、前記ゲノムＤＮＡの前記第１の染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断し、前記ゲノムＤＮＡの前記第２の染色体を前記標的位置で切断部位特異的に切断する、
前記第１の外来核酸配列を前記ゲノムＤＮＡの前記染色体対の前記第１の染色体中に前記切断部位で挿入し、前記第１の外来核酸配列を前記ゲノムＤＮＡの前記染色体対の前記第２の染色体中に前記切断部位で挿入して、前記生殖系列細胞を前記外来核酸配列についてホモ接合型にすること；および
前記第１の隣接配列と前記第２の隣接配列との間に位置し、前記外来核酸配列によって切断および置換されて遺伝的荷重を生じる配列が、その生物が生存または生殖可能な子を産生するためにもはや必要ない発生段階で、前記発現および挿入ステップを行うこと。
付記７３
ＲＮＡ誘導型遺伝的荷重ドライブを標的集団中に放出することを含む、付記１〜７２のいずれか一項記載の標的集団の抑制または絶滅のための方法。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【配列表】
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