(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸試料を分析するためのプローブシステムであって、
（ａ）配列Ｂの１組の識別子オリゴヌクレオチドと、
（ｂ）式Ｘ’−Ａ’−Ｂ’−Ｚ’の１組のスプリントオリゴヌクレオチドであって、
前記１組内で、（ｉ）配列Ａ’及びＢ’は、変化し、（ｉｉ）配列Ｘ’及びＺ’は、互いに異なり、かつ可変性ではなく、
各スプリントオリゴヌクレオチド内で、（ｉ）配列Ａ’は、前記核酸試料のゲノム断片に対して相補的であり、（ｉｉ）配列Ｂ’は、前記１組の識別子オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つのメンバーに対して相補的であり、
各識別子オリゴヌクレオチド、またはスプリントオリゴヌクレオチドにおけるその相補的Ｂ’配列は、（ｉ）前記ゲノム断片が由来するゲノムにおける遺伝子座、または（ｉｉ）前記ゲノム断片が由来する染色体、を識別する、１組のスプリントオリゴヌクレオチドと、
（ｃ）配列Ｘ及びＺを含む１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブであって、配列Ｘ及びＺは、可変性ではなく、配列Ｘ’及びＺ’にハイブリダイズし、
各スプリントオリゴヌクレオチドは、（ｉ）（ｃ）のオリゴヌクレオチドプローブ、（ｉｉ）前記１組の識別子オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つのメンバー、及び（ｉｉｉ）前記ゲノム断片、にハイブリダイズすることが可能であり、それによって、式Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｚのライゲーション可能な複合体を生成する、１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブと、を含む、プローブシステム。
【請求項２】
前記１組の識別子オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの異なるＢ配列識別子オリゴヌクレオチドを含み、前記１組のスプリントオリゴヌクレオチド内に、少なくとも１００の異なるＡ’配列と、少なくとも２つの異なる識別子オリゴヌクレオチドに対して相補的である、少なくとも２つの異なるＢ’配列と、が存在する、請求項１に記載のプローブシステム。
【請求項３】
前記ゲノム断片が、哺乳類ゲノムからのものである、請求項１または２に記載のプローブシステム。
【請求項４】
各識別子オリゴヌクレオチド、またはスプリントオリゴヌクレオチドにおけるその相補的Ｂ’配列は、染色体２１、染色体１８、及び染色体１３のうちの１つ以上を識別する、請求項１〜３のいずれかに記載のプローブシステム。
【請求項５】
前記ゲノム断片は、制限断片である、請求項１〜４のいずれかに記載のプローブシステム。
【請求項６】
前記（ｃ）の１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブは、配列Ｙを含むオリゴヌクレオチドをさらに含み、前記ライゲーション可能な複合体は、直鎖状である、請求項１〜５のいずれかに記載のプローブシステム。
【請求項７】
前記（ｃ）の１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズする、１対のＰＣＲプライマをさらに含む、請求項１〜６のいずれかに記載のプローブシステム。
【請求項８】
前記（ｃ）の１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブは、式Ｘ−Ｙ−Ｚのバックボーンプローブを含み、式中、Ｙは、オリゴヌクレオチド配列を含み、そのため、前記ライゲーション可能な複合体は、式Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｚ−Ｙの環状のライゲーション可能な複合体であり、式中、配列Ｙは、配列Ｘ及びＺに接合する、請求項１〜５のいずれかに記載のプローブシステム。
【請求項９】
前記バックボーンプローブ内の配列にハイブリダイズする、ローリングサークル増幅プライマをさらに含む、請求項８に記載のプローブシステム。
【請求項１０】
（Ａ）配列を前記バックボーンプローブにハイブリダイズする、ローリングサークル増幅プライマと、
（Ｂ）最大４つの区別可能に標識された検出オリゴヌクレオチドであって、各々が、Ｂ’配列にハイブリダイズする、区別可能に標識された検出オリゴヌクレオチドと、をさらに含む、請求項８に記載のプローブシステム。
【請求項１１】
（ａ）請求項１〜１０に記載のプローブシステムを、ゲノム断片を含む試験ゲノム試料とハイブリダイズして、式Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｚのライゲーション可能な複合体を生成することと、
（ｂ）前記ライゲーション可能な複合体をライゲーションして、式Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｚの生成物ＤＮＡ分子を生成することと、
（ｃ）配列Ｂまたは配列Ｂ’の各々に対応する前記生成物ＤＮＡ分子を計数することと、を含む、方法。
【請求項１２】
前記計数が、生成物ＤＮＡ分子、またはその増幅生成物を配列決定して、配列リードを生成することと、Ｂの各配列またはその補体を含む配列リードの数を計数することと、によって行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記生成物ＤＮＡ分子が環状であり、前記計数が、ローリングサークル増幅によって前記生成物ＤＮＡ分子を増幅することと、ＢまたはＢ’の各配列を含む前記数の増幅生成物を計数することと、を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法が、配列Ｂ’にハイブリダイズする区別可能に標識されたプローブを使用して前記ＲＣＡ生成物を標識することを含み、前記計数が、各区別可能な標識に関して前記ＲＣＡ生成物の数を計数することによって行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
さらに、前記方法が、ｉ．前記ＲＣＡ生成物を平面的な支持体上に付着させることと、ｉｉ．前記支持体の領域内の前記個々の標識されたＲＣＡ生成物の数を計数することと、を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記支持体が、ガラススライドである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記支持体が、多孔質の透明なキャピラリー膜である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
Ｂの前記異なる配列及びそれらの相補的な配列Ｂ’が異なる染色体を識別し、前記方法が、ＢまたはＢ’のいずれかの第１の配列を含む生成物ＤＮＡ分子の数を、ＢまたはＢ’のいずれかの第２の配列を含む生成物ＤＮＡ分子の数と比較して、前記ゲノム試料が異数性を有するかを決定することをさらに含む、請求項１１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
方法が、ステップ（ｃ）の前記計数結果を、１つ以上の参照試料から得た前記計数結果と比較することを含む、請求項１１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記試験ゲノム試料が、疾患または状態を有すると思われるか、またはそのリスクにある患者からのものであり、ステップ（ｃ）の前記計数結果が、前記患者またはその胎児が前記疾患または状態を有するかどうかの指標を提供する、請求項１１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記疾患または状態が、癌、感染症、炎症性疾患、移植拒絶、またはトリソミーである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記断片が制限断片である、請求項１１〜２１のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１５年９月１８日に出願された仮出願第６２／２２０，７４６号の利益を主張し、その出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
細胞を含まないＤＮＡ（「ｃｆＤＮＡ」）を分析して、種々の癌、移植の失敗もしくは成功、炎症性疾患、感染症、及び胎児異数性を含む、様々な疾患及び状態の予後、診断、またはその治療に対する反応の予測を提供することができる。
【０００３】
細胞を含まない胎児ＤＮＡ（ｃｆｆＤＮＡ）は、妊婦の血液中に存在する。この発見は、妊婦からの血液試料を使用して胎児の非侵襲的出生前試験（ＮＩＰＴ）を行う可能性をもたらした。侵襲的出生前試験（例えば、羊水穿刺または絨毛検査（ＣＶＳ））は、母親にとって大きなストレスである場合があり、かかる処置が流産のリスクを増大させる場合があると考える者もいる。ＮＩＰＴは、ダウン症候群（トリソミー染色体２１）、パトー症候群（トリソミー１３）、及びエドワーズ症候群（トリソミー１８）を含む、様々な遺伝的欠損に関連する情報を提供し得る。偽陽性は不必要な医療処置をもたらす場合があり、偽陰性は妊娠中の母親から利用可能な医療選択肢を奪ってしまう場合があるため、かかる方法は、非常に頑健でなくてはならない。
【０００４】
臨床規模で非侵襲的出生前試験を実施することに関係する多くの技術的障害が存在する。例えば、多くのＮＩＰＴの試みは、特定の配列（例えば、染色体２１からの配列）におけるコピー数の変化を識別するために、ｃｆｆＤＮＡの分析に焦点を当ててきた。しかしながら、かかる方法は、一部、血液試料中の大部分のｃｆＤＮＡが母体起源であり、多くの場合、非常に少量のみ（例えば、平均約１０％及び約３％まで下がる）が胎児からのものであるため、頑健な方法で実施することが困難である。例えば、胎児における染色体（染色体２１など）の余分なコピーの存在または不在は、染色体２１に対応する配列のコピー数を、常染色体に対応する配列のコピー数と比較することによって判定され得る。かかる方法は魅力的に聞こえるが、母体血液中の母体ＤＮＡに対する胎児ＤＮＡの分画濃度は３％まで低い場合があるため、それらは実際困難である。そのため、母体血流中に存在する染色体２１に対応する１０００毎の配列に関して、それらの配列のわずかな割合のみ（例えば、胎児分画が３％の場合、３０の配列）が胎児からのものである。したがって、胎児における染色体の余分なコピーは、母体血流中のその染色体に対応する配列の数において、比較的小さい増加をもたらすのみである。例えば、胎児分画が４である場合、胎児のトリソミー２１は、母体血流中の染色体２１に対応する断片の数において、１．５％の増加をもたらすのみである。この問題の結果として、統計の厳密さは、コピー数の相違を有すると思われる染色体領域に対応する多数の配列（例えば、少なくとも１，０００、時には少なくとも５，０００以上の配列）を計数し、その数を、コピー数の相違を有すると思われない別の染色体領域の類似する数と比較することによってのみ達成され得る。一貫してかつ正確に断片を計数することが可能であることが多くのＮＩＰＴ方法の成功に最も重要である。
【０００５】
一部のＮＩＰＴ方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用してＤＮＡを増幅する。ＰＣＲは、広く使用されているが、結果の精度に負の影響を及ぼす場合がある種々の制限に直面する。ＰＣＲは、配列アーティファクトを導入し、試料に増幅の偏りを創出することができる。ＰＣＲ配列アーティファクトは、ＰＣＲ反応によってＰＣＲ増幅された生成物のＤＮＡ配列に導入されたエラーである。ＰＣＲ配列アーティファクトは、キメラ分子（例えば、端から端まで接合されたＤＮＡの２つの異なる小片）の形成、ヘテロ２本鎖ＤＮＡの形成（例えば、２つの異なるＤＮＡ分子の互いへのハイブリダイゼーション）、及び増幅酵素によって作製されたエラー（例えば、ミスマッチのヌクレオチドをＤＮＡテンプレート上に配置するＴａｑＤＮＡポリメラーゼにより）などによる、種々の事象によってもたらされてもよい。ＰＣＲからの配列の偏りは、元の試料と比較した、ＰＣＲ生成物の分布の歪みである。ＰＣＲ配列の偏りは、テンプレートの増幅効率における固有差またはＤＮＡテンプレートの自己アニーリングによる増幅の阻害など、種々の事象によってもたらされてもよい。ＰＣＲエラーは、増幅された試料がもはや元の試料を代表するものではないように異なるＤＮＡ分子の不均等な増幅をもたらす。ＰＣＲは、環境からの外因性ＤＮＡ汚染に感受性であることも周知である。ＰＣＲ中のＤＮＡの指数関数的増幅により、ＰＣＲ反応における極少量の外因性ＤＮＡ汚染でさえも非常に不正確な結果をもたらし得る。外因性ＤＮＡ汚染は、空気中に浮遊するエアロゾル状小滴から導入され得るか、または汚染された機器から反応物に移入され得る。
【０００６】
ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を使用して母体血液中のｃｆＤＮＡを分析することにより、ＰＣＲに関係する問題の多くを回避する。しかしながら、ＲＣＡ生成物は、統計の頑健性を提供する方法で数量化することがあまり簡単ではない。実用レベルで、ＲＣＡ反応における生成物の絶対数は統計の頑健性を提供するのに十分に高い可能性があるが、異なるＲＣＡ生成物が異なる効率で増幅及び検出される可能性があり、そのため、一貫して数万または数十万のＲＣＡ生成物を均一に検出することは困難であった。
【発明の概要】
【０００７】
本開示は、以下の［１］から［２５］を含む。
［１］核酸試料を分析するためのプローブシステムであって、
（ａ）配列Ｂの１組の識別子オリゴヌクレオチドと、
（ｂ）式Ｘ’−Ａ’−Ｂ’−Ｚ’の１組のスプリントオリゴヌクレオチドであって、
上記１組内で、（ｉ）配列Ａ’及びＢ’は、変化し、（ｉｉ）配列Ｘ’及びＺ’は、互いに異なり、かつ可変性ではなく、
各スプリントオリゴヌクレオチド内で、（ｉ）配列Ａ’は、上記核酸試料のゲノム断片に対して相補的であり、（ｉｉ）配列Ｂ’は、上記１組の識別子オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つのメンバーに対して相補的である、１組のスプリントオリゴヌクレオチドと、
（ｃ）Ｘ及びＺを含む１つ以上のプローブ配列であって、配列Ｘ及びＺは、可変性ではなく、配列Ｘ’及びＺ’にハイブリダイズし、
各スプリントオリゴヌクレオチドは、（ｉ）上記プローブ配列、（ｉｉ）上記１組の識別子オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つのメンバー、及び（ｉｉｉ）上記ゲノム断片、にハイブリダイズすることが可能であり、それによって、式Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｚのライゲーション可能な複合体を生成する、１つ以上のプローブ配列と、を含む、プローブシステム。
［２］上記１組の識別子オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの異なるＢ配列識別子オリゴヌクレオチドを含み、上記１組のスプリントオリゴヌクレオチド内に、少なくとも１００の異なるＡ’配列と、少なくとも２つの異なる識別子オリゴヌクレオチドに対して相補的である、少なくとも２つの異なるＢ’配列と、が存在する、上記［１］に記載のプローブシステム。
［３］各識別子オリゴヌクレオチド、またはスプリントオリゴヌクレオチドにおけるその相補的Ｂ’配列は、上記ゲノム断片に相当する、上記［１］または［２］のいずれかに記載のプローブシステム。
［４］各識別子オリゴヌクレオチド、またはスプリントオリゴヌクレオチドにおけるその相補的Ｂ’配列は、上記ゲノム断片が由来するゲノムにおける遺伝子座を識別する、上記［１］〜［３］のいずれかに記載のプローブシステム。
［５］各識別子オリゴヌクレオチド、またはスプリントオリゴヌクレオチドにおけるその相補的Ｂ’配列は、上記ゲノム断片が由来する染色体を識別する、上記［１］〜［４］のいずれかに記載のプローブシステム。
［６］上記ゲノム断片が、哺乳類ゲノムからのものである、上記［１］〜［５］のいずれかに記載のプローブシステム。
［７］各識別子オリゴヌクレオチド、またはスプリントオリゴヌクレオチドにおけるその相補的Ｂ’配列は、染色体２１、染色体１８、及び染色体１３のうちの１つ以上を識別する、上記［１］〜［６］のいずれかに記載のプローブシステム。
［８］上記ゲノム断片は、制限断片である、上記［１］〜［７］のいずれかに記載のプローブシステム。
［９］上記（ｃ）の１つ以上のプローブ配列は、配列Ｙを含むオリゴヌクレオチドをさらに含み、上記ライゲーション可能な複合体は、直鎖状である、上記［１］〜［８］のいずれかに記載のプローブシステム。
［１０］上記（ｃ）の１つ以上のプローブにハイブリダイズする、１対のＰＣＲプライマをさらに含む、上記［１］〜［９］のいずれかに記載のプローブシステム。
［１１］上記（ｃ）の１つ以上のプローブ配列は、式Ｘ−Ｙ−Ｚのバックボーンプローブを含み、式中、Ｙは、オリゴヌクレオチド配列を含み、そのため、上記ライゲーション可能な複合体は、式Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｚ−Ｙの環状のライゲーション可能な複合体であり、式中、配列Ｙは、配列Ｘ及びＺに接合する、上記［１］〜［８］のいずれかに記載のプローブシステム。
［１２］上記バックボーンプローブ内の配列にハイブリダイズする、ローリングサークル増幅プライマをさらに含む、上記［１１］に記載のプローブシステム。
［１３］（Ａ）ある配列を上記バックボーンプローブにハイブリダイズする、ローリングサークル増幅プライマと、
（Ｂ）最大４つの区別可能に標識された検出オリゴヌクレオチドであって、各々が、Ｂ’配列にハイブリダイズする、区別可能に標識された検出オリゴヌクレオチドと、をさらに含む、上記［１１］に記載のプローブシステム。
［１４］（ａ）上記［１］〜［１３］に記載のプローブシステムを、ゲノム断片を含む試験ゲノム試料とハイブリダイズして、式Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｚのライゲーション可能な複合体を生成する生成することと、
（ｂ）上記ライゲーション可能な複合体をライゲーションして、式Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｚの生成物ＤＮＡ分子を生成することと、
（ｃ）配列Ｂまたは配列Ｂ’の各々に対応する上記生成物ＤＮＡ分子を計数することと、を含む、方法。
［１５］上記計数が、生成物ＤＮＡ分子、またはその増幅生成物を配列決定して、配列リードを生成することと、Ｂの各配列またはその補体を含む配列リードの数を計数することと、によって行われる、上記［１４］に記載の方法。
［１６］上記生成物ＤＮＡ分子が環状であり、上記計数が、ローリングサークル増幅によって上記生成物ＤＮＡ分子を増幅することと、ＢまたはＢ’の各配列を含む上記数の増幅生成物を計数することと、を含む、上記［１４］に記載の方法。
［１７］上記方法が、配列Ｂ’にハイブリダイズする区別可能に標識されたプローブを使用して上記ＲＣＡ生成物を標識することを含み、上記計数が、各区別可能な標識に関して上記ＲＣＡ生成物の数を計数することによって行われる、上記［１６］に記載の方法。
［１８］さらに、上記方法が、ｉ．上記ＲＣＡ生成物を平面的な支持体上に付着させることと、ｉｉ．上記支持体の領域内の上記個々の標識されたＲＣＡ生成物の数を計数することと、を含む、上記［１７］に記載の方法。
［１９］上記支持体が、ガラススライドである、上記［１８］に記載の方法。
［２０］上記支持体が、多孔質の透明なキャピラリー膜である、上記［１８］に記載の方法。
［２１］Ｂの上記異なる配列及びそれらの相補的な配列Ｂ’が異なる染色体を識別し、上記方法が、ＢまたはＢ’のいずれかの第１の配列を含む生成物ＤＮＡ分子の数を、ＢまたはＢ’のいずれかの第２の配列を含む生成物ＤＮＡ分子の数と比較して、上記ゲノム試料が異数性を有するかを決定することをさらに含む、上記［１４］〜［２０］のいずれかに記載の方法。
［２２］方法が、ステップ（ｃ）の上記計数結果を、１つ以上の参照試料から得た上記計数結果と比較することを含む、上記［１４］〜［２１］のいずれかに記載の方法。
［２３］上記試験ゲノム試料が、疾患または状態を有すると思われるか、またはそのリスクにある患者からのものであり、ステップ（ｃ）の上記計数結果が、上記患者またはその胎児が上記疾患または状態を有するかどうかの指標を提供する、上記［１４］〜［２２］のいずれかに記載の方法。
［２４］上記疾患または状態が、癌、感染症、炎症性疾患、移植拒絶、またはトリソミーである、上記［２３］に記載の方法。
［２５］上記断片が制限断片である、上記［１４］〜［２４］のいずれかに記載の方法。
本明細書において、とりわけ、核酸試料を分析するためのプローブのシステムが説明される。プローブは、異なる遺伝子座（例えば、異なる染色体）からのゲノムＤＮＡの標的断片（本明細書において、「標的配列」または単に「断片」とも称される）にライゲーションされて、環状ＤＮＡ分子を生成することができるような方法で設計され得る。環状ＤＮＡ分子は、異なる染色体からの断片を含有する場合でも、全て同じ「バックボーン」配列を含有する。さらに、一部の実施形態において、同じ遺伝子座からの断片を含有する環状ＤＮＡ分子の全ては、同じ遺伝子座特異的識別子配列、すなわち、遺伝子座特異的バーコードを含有する。これらの実施形態において、環状ＤＮＡ分子はバックボーン内の配列にハイブリダイズするプライマを使用して増幅され得、クローニングされた断片が由来する遺伝子座は、ＲＣＡ生成物を、遺伝子座特異的識別子配列にハイブリダイズする標識されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることによって検出され得る。明らかであろうが、本方法のこの実施形態は、複数の遺伝子座特異的識別子配列、及びそれらの配列にハイブリダイズする区別可能に標識されたオリゴヌクレオチドを使用して多重化することができる。環状生成物の全ては同じバックボーンを有し、クローニングされた断片の配列及び遺伝子座特異的バーコードによって互いに異なるのみであるため、それらの生成物から増幅されたＲＣＡ生成物は、一貫して増幅され、それらのＲＣＡ生成物が対応する遺伝子座は正確に検出され得る。プローブシステムを用いる方法ならびにそれを実践するためのキットも提供される。
【０００８】
以下により詳細に論じられるように、ある特定の場合において、本方法は、胎児を妊娠している妊婦からのｃｆＤＮＡの試料を使用して、胎児における染色体異常（例えば、トリソミー２１）を検出するために使用され得る。
【０００９】
核酸試料を分析するためのプローブシステムが提供される。一部の実施形態において、プローブシステムは、（ａ）配列Ｂの１組の識別子オリゴヌクレオチドと、（ｂ）式Ｘ’−Ａ’−Ｂ’−Ｚ’の１組のスプリントオリゴヌクレオチドであって、１組内で、（ｉ）配列Ａ’及びＢ’は、変化し、（ｉｉ）配列Ｘ’及びＺ’は、互いに異なり、かつ可変性ではなく、各スプリントオリゴヌクレオチド内で、（ｉ）配列Ａ’は、核酸試料のゲノム断片に対して相補的であり、（ｉｉ）配列Ｂ’は、１組の識別子オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つのメンバに対して相補的である、１組のスプリントオリゴヌクレオチドと、（ｃ）Ｘ及びＺを含む１つ以上のプローブ配列であって、配列Ｘ及びＺは、可変性ではなく、配列Ｘ’及びＺ’にハイブリダイズし、各スプリントオリゴヌクレオチドは、（ｉ）プローブ配列、（ｉｉ）１組の識別子オリゴヌクレオチドのメンバ、及び（ｉｉｉ）ゲノム断片にハイブリダイズすることが可能であり、それによって、式Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｚのライゲーション可能な複合体を生成する、１つ以上のプローブ配列と、を含み得る。一部の実施形態において、異なる識別子オリゴヌクレオチド及びそれらの相補的配列Ｂ’は、異なる染色体、例えば、染色体２１、１８、及び１３を識別する。
【００１０】
一部の実施形態において、１組の識別子オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、または４つ以上）の異なるＢ配列識別子オリゴヌクレオチドを含み得、１組のスプリントオリゴヌクレオチド内に、少なくとも１００の異なるＡ’配列と、少なくとも２つの異なる識別子オリゴヌクレオチドに対して相補的である、少なくとも２つの異なるＢ’配列と、が存在する。
【００１１】
一部の実施形態において、各識別子オリゴヌクレオチド、またはスプリントオリゴヌクレオチドにおけるその相補的Ｂ’配列は、ゲノム断片に対応し得る。
【００１２】
一部の実施形態において、各識別子オリゴヌクレオチド、またはスプリントオリゴヌクレオチドにおけるその相補的Ｂ’配列は、ゲノム断片が由来するゲノムにおける遺伝子座を示し得る。
【００１３】
一部の実施形態において、各識別子オリゴヌクレオチド、またはスプリントオリゴヌクレオチドにおけるその相補的Ｂ’配列は、ゲノム断片が由来する染色体を示し得る。
【００１４】
一部の実施形態において、ゲノム断片は哺乳類ゲノムからのものである。
【００１５】
一部の実施形態において、各識別子オリゴヌクレオチド、またはスプリントオリゴヌクレオチドにおけるその相補的Ｂ’配列は、染色体２１、染色体１８、及び染色体１３のうちの１つ以上を識別し得る。
【００１６】
一部の実施形態において、ゲノム断片は制限断片であり得る。
【００１７】
一部の実施形態において、（ｃ）の１つ以上のプローブ配列は、配列Ｙを含むオリゴヌクレオチドをさらに含み、ライゲーション可能な複合体は、直鎖状である。
【００１８】
一部の実施形態において、プローブシステムは、（ｃ）の１つ以上のプローブにハイブリダイズする、１対のＰＣＲプライマをさらに含み得る。
【００１９】
一部の実施形態において、（ｃ）の１つ以上のプローブ配列は、式Ｘ−Ｙ−Ｚのバックボーンプローブを含み得、式中、Ｙは、オリゴヌクレオチド配列を含み、そのため、ライゲーション可能な複合体は、式Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｚ−Ｙの環状のライゲーション可能な複合体であり、式中、配列Ｙは、配列Ｘ及びＺに接合する。
【００２０】
一部の実施形態において、プローブシステムは、バックボーンプローブ内の配列にハイブリダイズする、ローリングサークル増幅プライマをさらに含み得る。
【００２１】
一部の実施形態において、プローブシステムは、（Ａ）ある配列をバックボーンプローブにハイブリダイズする、ローリングサークル増幅プライマと、（Ｂ）最大４つの区別可能に標識された検出オリゴヌクレオチドであって、区別可能に標識された検出オリゴヌクレオチドの各々が、Ｂ’配列にハイブリダイズする、区別可能に標識された検出オリゴヌクレオチドと、をさらに含み得る。
【００２２】
試料の分析方法も提供される。一部の実施形態において、本方法は、（ａ）上に要約される、いずれかの実施形態のプローブシステムを、ゲノム断片を含む試験ゲノム試料とハイブリダイズして、式Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｚのライゲーション可能な複合体を生成することと、（ｂ）ライゲーション可能な複合体をライゲーションして、式Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｚの生成物ＤＮＡ分子を生成することと、（ｃ）配列Ｂの各遺伝子座識別子に対応する生成物ＤＮＡ分子を計数することと、を含み得る。
【００２３】
一部の実施形態において、計数は、生成物ＤＮＡ分子またはその増幅生成物を配列決定して配列リードを生成することと、Ｂの各配列またはその補体を含む配列リードの数を計数することと、によって行われ得る。
【００２４】
一部の実施形態において、生成物ＤＮＡ分子は環状であってもよく、計数は、ローリングサークル増幅によって生成物ＤＮＡ分子を増幅することと、Ｂの各配列またはその補体を含む数の増幅生成物を計数することと、を含み得る。これらの実施形態において、本方法は、配列Ｂ’にハイブリダイズする区別可能に標識されたプローブを使用してＲＣＡ生成物を標識することを含み得、計数は、各区別可能な標識に関してＲＣＡ生成物の数を計数することによって行われる。
【００２５】
一部の実施形態において、本方法は、ｉ．ＲＣＡ生成物を平面的な支持体上に付着させることと、ｉｉ．支持体の領域内の個々の標識されたＲＣＡ生成物の数を計数することと、を含み得る。これらの実施形態において、支持体は、例えば、ガラススライドまたは多孔質の透明なキャピラリー膜であり得る。
【００２６】
一部の実施形態において、Ｂの異なる配列及びそれらの相補的な配列Ｂ’は異なる染色体を識別し、本方法は、ＢまたはＢ’のいずれかの第１の配列を含む生成物ＤＮＡ分子の数を、ＢまたはＢ’のいずれかの第２の配列を含む生成物ＤＮＡ分子の数と比較して、ゲノム試料が異数性を有するかを判定することをさらに含む。
【００２７】
一部の実施形態において、本方法は、ステップ（ｃ）の計数結果を、１つ以上の参照試料から得た計数結果と比較することを含み得る。
【００２８】
一部の実施形態において、試験ゲノム試料は、疾患または状態を有すると思われるか、またはそのリスクにある患者からのものであってもよく、ステップ（ｃ）の計数結果は、患者またはその胎児が疾患または状態を有するかどうかの指標を提供する。
【００２９】
一部の実施形態において、疾患または状態は、癌、感染症、炎症性疾患、移植拒絶、またはトリソミーであり得る。
【００３０】
一部の実施形態において、断片は制限断片である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
当業者は、下に記載される図面が単に図示の目的のためであることを理解するだろう。図面は決して本教示の範囲を制限することが意図されない。
【００３２】
【図１】本プローブシステムの特徴の一部を模式的に図示する。
【図２】配列Ｂがどのように配列Ａの遺伝子座を識別するのに役立つかを模式的に図示する。
【図３】一部の例示的なプローブシステムの構成を模式的に図示する。
【図４】対象方法の実施形態の特徴の一部を模式的に図示する。
【図５】対象方法の実施の１つの特徴の一部を模式的に図示する。
【図６】プローブシステムの設計を模式的に図示する。
【図７】２つの異なるプローブシステムを使用して得たデータを示す。
【図８】臨床試料の分析から得たデータを示す。
【００３３】
定義
より詳細に例示的な実施形態を説明する前に、本説明に使用される用語の意味及び範囲を図示及び定義するために、以下の定義を明記する。
【００３４】
数値範囲は、範囲を定義する数を含む。別途示されない限り、それぞれ、核酸は、５’から３’の配向で左から右に書かれ、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシ配向で左から右に書かれる。
【００３５】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，２Ｄ  ＥＤ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）及びＨａｌｅ＆Ｍａｒｋｈａｍ，ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，Ｎ．Ｙ．（１９９１）は、本明細書で使用される用語の多くの一般的な意味を有する技術の１つを提供する。また、ある特定の用語が明確性のため、及び参照の便宜のために以下に定義される。
【００３６】
本明細書及び添付の特許請求の範囲に使用されるように、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という単数形は、別途文脈が明確に示さない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。例えば、「プライマ（ａ  ｐｒｉｍｅｒ）」という用語は、１つ以上のプライマ、すなわち、単一のプライマ及び複数のプライマを指す。特許請求の範囲はいずれの任意選択の要素を除外するように起草され得ることにさらに留意する。そのため、この記述は、主張要素の列挙に関して「単独」、「唯一」などのかかる排他的用語の使用、または「否定的」限定の使用のための先行詞として機能することが意図される。
【００３７】
「ヌクレオチド」という用語は、既知のプリン及びピリミジン塩基だけでなく、修飾された他の複素環塩基も含有するそれらの部分を含むことが意図される。かかる修飾は、メチル化プリンもしくはピリミジン、アシル化プリンもしくはピリミジン、アルキル化リボース、または他の複素環を含む。加えて、「ヌクレオチド」という用語は、ハプテンまたは蛍光標識を含有するそれらの部分を含み、従来のリボース及びデオキシリボース糖類だけでなく、他の糖類も含有し得る。修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドは、糖部分にも修飾を含み、例えば、ヒドロキシル基のうちの１つ以上がハロゲン原子または脂肪族基に置き換えられる、エーテル、アミンなどとして官能化される。
【００３８】
「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、任意の長さ、例えば、ヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドで構成される、約２塩基超、約１０塩基超、約１００塩基超、約５００塩基超、１０００塩基超、最大約１０，０００以上の塩基のポリマーを説明するために、本明細書において互換的に使用され、酵素によりまたは合成により生成され得（例えば、米国特許第５，９４８，９０２号及びそこに引用される参考文献に記載されるＰＮＡ）、それは、２つの天然に生じる核酸のものと類似する配列特異的様式で天然に生じる核酸とハイブリダイズすることができ、例えば、ワトソン−クリック塩基対合相互作用に関与し得る。天然に生じるヌクレオチドは、グアニン、シトシン、アデニン、チミン、ウラシル（それぞれ、Ｇ、Ｃ、Ａ、Ｔ、及びＵ）を含む。ＤＮＡ及びＲＮＡは、それぞれ、デオキシリボース及びリボース糖バックボーンを有し、一方、ＰＮＡのバックボーンは、ペプチド結合によって連結された反復Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン単位で構成される。ＰＮＡにおいて、種々のプリン及びピリミジン塩基がメチレンカルボニル結合によってバックボーンに連結される。しばしばアクセス不能ＲＮＡと称されるロックド核酸（ＬＮＡ）は、修飾されたＲＮＡヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、２’酸素及び４’炭素を接続する余分な架橋で修飾される。架橋は、３’−エンド（Ｎｏｒｔｈ）立体構造にリボースを「ロック」し、それは、Ａ形態２本鎖において見出されることが多い。ＬＮＡヌクレオチドは、所望されるときはいつでもオリゴヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡ残基と混合され得る。「構造不定の核酸」または「ＵＮＡ」という用語は、低減した安定性で互いに結合する非天然のヌクレオチドを含有する核酸である。例えば、構造不定の核酸は、Ｇ’残基及びＣ’残基を含有し得、これらの残基は天然に生じない形態、すなわち、低減した安定性で互いと塩基対合するが、それぞれ、天然に生じるＣ及びＧ残基と塩基対合する能力を保持するＧ及びＣの類似体に対応する。構造不定の核酸は、ＵＳ２００５／０２３３３４０に記載されており、ＵＮＡの開示に関して本明細書に参照により組み込まれる。
【００３９】
本明細書で使用されるとき、「オリゴヌクレオチド」という用語は、長さが最大５００ヌクレオチドの、約２〜２００ヌクレオチドの、ヌクレオチドの１本鎖多量体を示す。オリゴヌクレオチドは、合成であり得るか、または酵素により作製され得、一部の実施形態において、長さが約３０〜１５０ヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド単量体（すなわち、オリゴリボヌクレオチド）またはデオキシリボヌクレオチド単量体を含有し得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、長さが１０〜２０、２１〜３０、３１〜４０、４１〜５０、５１〜６０、６１〜７０、７１〜８０、８０〜１００、１００〜１５０、または１５０〜２００ヌクレオチドであり得る。
【００４０】
本明細書で使用されるとき、「プライマ」という用語は、核酸鎖に対して相補的であるプライマ伸長生成物の合成が誘導される条件下、すなわち、ヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼなどの誘導剤の存在下、ならびに適切な温度及びｐＨ下に置かれたとき、合成の開始点として作用することが可能であるオリゴヌクレオチドを指す。プライマは、１本鎖であってもよく、誘導剤の存在下で所望の伸長生成物の合成をプライムするのに十分に長くなければならない。プライマの正確な長さは、温度、プライマ源、及び方法の使用を含む、多くの因子に依存する。例えば、診断用途に関して、標的配列または断片の複雑性に応じて、オリゴヌクレオチドプライマは、典型的には、１５〜２５以上のヌクレオチドを含有するが、より少ないヌクレオチドを含有してもよい。本明細書において、プライマは、特定の標的ＤＮＡ配列の異なる鎖に対して実質的に相補的であるように選択される。これは、プライマがそれらのそれぞれの鎖とハイブリダイズするのに十分に相補的でなければならないことを意味する。したがって、プライマ配列は、テンプレートの正確な配列を反映する必要がない。例えば、非相補的ヌクレオチド断片は、プライマの５’端に結合され得、プライマ配列の残部は鎖に相補的である。代替えとして、非相補的塩基またはより長い配列がプライマ内に散在されてもよいが、但し、プライマ配列がそれとハイブリダイズするために鎖の配列と十分な相補性を有し、それによって、伸長生成物の合成のためのテンプレートを形成することを条件とする。
【００４１】
「ハイブリダイゼーション」または「ハイブリダイズする」という用語は、核酸鎖が、通常のハイブリダイゼーション条件下で、第２の相補的核酸鎖とホモ２本鎖またはヘテロ２本鎖のいずれかの安定した２本鎖にアニールし、かつそれを形成し、同じ通常のハイブリダイゼーション条件下で、無関係の核酸分子と安定した２本鎖を形成しないプロセスを指す。２本鎖の形成は、ハイブリダイゼーション反応において２本の相補的な核酸鎖をアニールすることによって達成される。ハイブリダイゼーション反応は、ハイブリダイゼーション反応が行われるハイブリダイゼーション条件（ハイブリダイゼーションストリンジェンシーと称されることが多い）を調整することによって高度に特異的であるように行われ得、そのため、２本の核酸鎖間のハイブリダイゼーションは、安定した２本鎖、例えば、２本の核酸鎖が実質的にまたは完全に相補的である特定の配列である特定の数のヌクレオチドを含有しない限り、通常のストリンジェンシー条件下で２本鎖の領域を保持する２本鎖を形成しない。「通常のハイブリダイゼーションまたは通常のストリンジェンシー条件」は、任意の所与のハイブリダイゼーション反応に関して容易に判定される。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｏｒ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。本明細書で使用されるとき、「ハイブリダイズ」または「ハイブリダイゼーション」という用語は、核酸の鎖が塩基対合を通して相補的鎖と結合する任意のプロセスを指す。
【００４２】
核酸は、２つの配列が中程度から高度なストリンジェンシーハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で互いに特異的にハイブリダイズする場合、参照核酸配列に対して「選択的にハイブリダイズ可能」であると考えられる。中程度及び高度なストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は既知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  １９９５及びＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。高度なストリンジェンシー条件の１例は、約４２Ｃで、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハート溶液、０．５％ＳＤＳ、及び１００ｕｇ／ｍｌの変性キャリアＤＮＡ中でハイブリダイゼーションし、続いて室温で、２×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳ中で２回、そして４２℃で０．１×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳ中でさらに２回洗浄することを含む。
【００４３】
本明細書で使用されるとき、「バーコード配列」または「分子バーコード」という用語は、ａ）反応においてポリヌクレオチド源を識別及び／もしくは追跡する、ならびに／またはｂ）最初の分子が何回配列決定されたか（例えば、試料中の実質的に全ての分子が異なる配列でタグ付けされ、その後、試料が増幅される場合）を計数するために使用されるヌクレオチドの独特な配列を指す。バーコード配列は、５’端、３’端、またはオリゴヌクレオチドの中央にあってもよい。バーコード配列は、サイズ及び組成において広く変化してもよく、以下の参考文献は、特定の実施形態に適切なバーコード配列の組を選択するためのガイダンスを提供する：Ｃａｓｂｏｎ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１１，２２  ｅ８１），Ｂｒｅｎｎｅｒ，米国特許第５，６３５，４００号、Ｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９７：１６６５−１６７０（２０００）、Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１４：４５０−４５６（１９９６）、Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ，欧州特許公開第０７９９８９７Ａ１号、Ｗａｌｌａｃｅ，米国特許第５，９８１，１７９号など。特定の実施形態において、バーコード配列は、４〜３６ヌクレオチド、または６〜３０ヌクレオチド、または８〜２０ヌクレオチドの範囲の長さを有し得る。
【００４４】
本明細書で使用されるとき、「配列決定」という用語は、ポリヌクレオチドの少なくとも１０の連続したヌクレオチドの同一性（例えば、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００、または少なくとも２００以上の連続したヌクレオチドの同一性）が得られる方法を指す。
【００４５】
「次世代シーケンシング」という用語は、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、及びＲｏｃｈｅなどが現在採用している、いわゆる、合成による並行シーケンシング（ｐａｒａｌｌｅｌｉｚｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）またはライゲーションプラットフォームによるシーケンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｐｌａｔｆｏｒｍｓ）を指す。次世代シーケンシング方法は、ナノポアシーケンシング方法または電子検出に基づく方法、例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより商用化されたＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ技術なども含み得る。
【００４６】
本明細書で使用されるとき、「２本鎖」または「２本鎖の」という用語は、塩基対合される、すなわち、一緒にハイブリダイズされる２つの相補的ポリヌクレオチドを説明する。
【００４７】
「判定」、「測定」、「評価」、「検討」、「アッセイ」、及び「分析」という用語は、本明細書において、測定の形態を指すように互換的に使用され、要素が存在するかしないかを判定することを含む。これらの用語は、定量的及び／または定性的判定の両方を含む。検討は、相対的または絶対であり得る。
【００４８】
本明細書で使用されるとき、「親和性タグ」という用語は、親和性タグが結合される分子を、親和性タグを含有しない他の分子から分離するために使用され得る部分を指す。「親和性タグ」は、特定の結合対のメンバ、すなわち、化学的または物理的手段を通して分子のうちの１つがもう１つの分子に特異的に結合する２つの分子である。本明細書において、「捕捉物質」と称される特異的結合対の相補的メンバは、固定化されて（例えば、クロマトグラフィー支持体、ビーズ、または平面的な表面に）、親和性タグと特異的に結合する親和性クロマトグラフィー支持体を生成する。換言すると、「親和性タグ」は、親和性タグが捕捉物質に特異的に結合する「捕捉物質」に結合し得、それによって、親和性タグが結合される分子を、親和性タグを含有しない他の分子から分離することを容易にする。
【００４９】
本明細書で使用されるとき、「ビオチン部分」という用語は、ビオチンまたはビオチン類似体、例えば、デスチオビオチン、オキシビオチン、２’−イミノビオチン、ジアミノビオチン、ビオチンスルホキシド、ビオシチンなどを含む親和性物質を指す。ビオチン部分は、少なくとも１０−８Ｍの親和性でストレプトアビジンに結合する。ビオチン親和性物質は、リンカー、例えば、─ＬＣ−ビオチン、─ＬＣ−ＬＣ−ビオチン、─ＳＬＣ−ビオチン、または─ＰＥＧｎ−ビオチン（ｎは３〜１２である、）も含み得る。
【００５０】
本明細書で使用されるとき、「末端ヌクレオチド」という用語は、核酸分子の５’または３’端のいずれかのヌクレオチドを指す。核酸分子は、２本鎖形態（すなわち、２本鎖）または１本鎖形態であり得る。
【００５１】
本明細書で使用されるとき、「ライゲーション」という用語は、第１のＤＮＡ分子の５’端の末端ヌクレオチドの、第２のＤＮＡ分子の３’端の末端ヌクレオチドへの酵素により触媒された接合を指す。
【００５２】
「複数」、「組」、及び「集団」という用語は、少なくとも２つのメンバを含有するものを指すように互換的に使用される。ある特定の場合において、複数は、少なくとも１０、少なくとも１００、少なくとも１００、少なくとも１０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、または少なくとも１０９以上のメンバを有し得る。
【００５３】
「消化」という用語は、核酸が制限酵素によって切断されるプロセスを示すことが意図される。核酸を消化するために、制限酵素及び制限酵素の認識部位を含有する核酸が、制限酵素が作用するのに好適な条件下で接触させられる。市販の制限酵素の活性に好適な条件は既知であり、購入時にそれらの酵素と共に供給される。
【００５４】
「オリゴヌクレオチド結合部位」とは、オリゴヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドまたは断片においてハイブリダイズする部位を指す。オリゴヌクレオチドがプライマのための結合部位を「提供する」場合、プライマはそのオリゴヌクレオチドまたはその補体にハイブリダイズし得る。
【００５５】
本明細書で使用されるとき、「分離」という用語は、２つの要素の物理的分離（例えば、サイズまたは親和性などにより）、ならびに１つの要素が分解し、もう１つが未変化のままであることを指す。
【００５６】
本明細書で使用されるとき、「参照染色体領域」という用語は、既知のヌクレオチド配列の染色体領域、例えば、その配列が、例えば、ＮＣＢＩ’ｓ  Ｇｅｎｂａｎｋデータベースまたは他のデータベースに寄託されている染色体領域を指す。
【００５７】
本明細書で使用されるとき、「鎖」という用語は、共有結合、例えば、ホスホジエステル結合によって一緒に共有結合により連結されたヌクレオチドで構成された核酸を指す。
【００５８】
細胞において、ＤＮＡは通常、２本鎖形態で存在し、そのため、本明細書において「上部」及び底部」鎖と称される、２本の核酸の相補的鎖を有する。ある特定の場合において、染色体領域の相補的鎖は、「プラス」及び「−」鎖、「第１」及び「第２」鎖、「コード」及び「非コード」鎖、「ワトソン」及び「クリック」鎖、または「センス」及び「アンチセンス」鎖と称される場合がある。上部または底部鎖として鎖を割り当てることは任意であり、いずれの特定の配向、機能、または構造を暗示しない。いくつかの例示的な哺乳類の染色体領域（例えば、ＢＡＣ、アセンブリ、染色体など）の第１の鎖のヌクレオチド配列が既知であり、例えば、ＮＣＢＩ’ｓ  Ｇｅｎｂａｎｋデータベースに見出すことができる。
【００５９】
本明細書で使用されるとき、「上部鎖」という用語は、核酸のいずれかの鎖を指し、核酸の両方の鎖を指すものではない。オリゴヌクレオチドまたはプライマが「上部鎖にのみ」結合またはアニールする場合、それは、１本の鎖にのみ結合し、もう１本の鎖には結合しない。本明細書で使用されるとき、「底部鎖」という用語は、「上部鎖」に対して相補的である鎖を指す。オリゴヌクレオチドが「１本の鎖にのみ」結合またはアニールする場合、それは、１本の鎖にのみ、例えば、第１または第２の鎖にのみ結合し、もう１本の鎖には結合しない。
【００６０】
「共有結合により連結」という用語は、２つの別個の分子、例えば、２本鎖核酸の上部及び底部の鎖間の共有結合連結の生成を指す。ライゲーションは、共有結合連結の型である。
【００６１】
本明細書で使用されるとき、「変性」という用語は、好適な変性条件下に２本鎖を置くことによる、核酸２本鎖の塩基対の少なくとも一部の分離を指す。変性条件は、当該技術分野において周知である。一実施形態において、核酸２本鎖を変性するために、２本鎖の融解温度を上回る温度に２本鎖が曝露され得、それによって、２本鎖のうちの１本をもう１本から解放する。ある特定の実施形態において、核酸は、好適な時間量の間（例えば、少なくとも３０秒、最大３０分）、少なくとも９０℃の温度にそれを曝露することによって変性され得る。核酸は、化学的にも（例えば、尿素またはＮａＯＨを使用して）変性され得る。
【００６２】
本明細書で使用されるとき、「標識」という用語は、検出可能な（好ましくは、数量化可能な）作用を提供するように使用することができ、核酸またはタンパク質に結合することができる任意の原子または分子を指す。標識は、単独で、または蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）により発光スペクトルを抑制または移動することができる部分と組み合わせて、色素及び３２Ｐなどの放射標識、ビオチンなどの結合部分、ジゴキシゲニンなどのハプテン、発光原、リン光、または蛍光発生部分、及び蛍光色素を含むが、これらに限定されない。標識は、蛍光、放射能、比色、重量分析、Ｘ線回折または吸収、磁性、酵素活性などによって検出可能なシグナルを提供し得る。標識は、荷電部分（正または負の電荷）であり得るか、または代替えとして、中性電荷であり得る。標識は、標識を含む配列が検出可能である限り、核酸またはタンパク質配列を含むか、またはそれからなってもよい。
【００６３】
本明細書で使用されるとき、「標識されたオリゴヌクレオチド」及び「標識されたプローブ」という用語は、親和性タグ（例えば、ビオチン部分）を有するオリゴヌクレオチド、分離または検出を可能にする原子または基（例えば、ブロモ−デオキシウリジンまたは異なる密度を付与するコロイド金粒子）で修飾されたオリゴヌクレオチド、及び光学的に検出可能な標識（例えば、蛍光または別の種類の発光標識）で、または修飾されたオリゴヌクレオチドを指す。天然に生じるヌクレオチドのみを含有するオリゴヌクレオチドは標識されたオリゴヌクレオチドではない。
【００６４】
本明細書で使用されるとき、「伸長」という用語は、ポリメラーゼを使用してヌクレオチドを付加することによる、プライマの伸長を指す。核酸にアニールされるプライマが伸長される場合、核酸は伸長反応のテンプレートとして作用する。
【００６５】
本明細書で使用されるとき、「第１及び第２のオリゴヌクレオチドを断片のそれぞれの端部にライゲーションする」という句において、「それぞれの端部」という用語は、１つのオリゴヌクレオチドが断片の一端に付加され、別のオリゴヌクレオチドが標的断片のもう一端に付加されることを意味することが意図される。
【００６６】
本明細書で使用されるとき、互いにライゲーション可能に隣接する２つのオリゴヌクレオチド配列の文脈において、「ライゲーション可能に隣接する」という用語は、２つのオリゴヌクレオチドの間に介在するヌクレオチドがなく、それらは互いにライゲーションすることができることを意味する。
【００６７】
本明細書で使用されるとき、「スプリントオリゴヌクレオチド（splint oligonucleotide）」という用語は、本明細書で使用されるとき、２つ以上の他のポリヌクレオチドにハイブリダイズされるとき、図１に図示されるように、それらが一緒にライゲーションされ得るように、ポリヌクレオチドを互いに隣接して位置付けるために「スプリント（副え木）」として作用するオリゴヌクレオチドを指す。
【００６８】
本明細書で使用されるとき、「環状核酸分子」という用語は、遊離３’または５’端を有しない閉環の形態である鎖を指す。
【００６９】
本明細書で使用されるとき、「〜に対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓ  ｔｏ）」及び文法上の同等物、例えば、「対応（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ）」という用語は、本用語が指す要素間の特定の関係を指す。例えば、ゲノムにおける配列に対応するＲＣＡは、ゲノムにおける配列と同じヌクレオチド配列を含有する。
【００７０】
本明細書に記載されるある特定のポリヌクレオチドは、式（例えば、「Ｘ’−Ａ’−Ｂ’−Ｚ’」）によって言及され得る。別途示されない限り、式により定義されたポリヌクレオチドは、５’〜３’方向または５’〜３’方向に配向され得る。例えば、式「Ｘ’−Ａ’−Ｂ’−Ｚ’」により定義されたポリヌクレオチドは、「５’−Ｘ’−Ａ’−Ｂ’−Ｚ’−３’」または「３’−Ｘ’−Ａ’−Ｂ’−Ｚ’−５’」であり得る。式の構成成分、例えば、「Ａ」、「Ｘ」、及び「Ｂ」などは、文脈から暗示的でない限り（例えば、特定の式の「ライゲーション可能な」複合体の場合）、式によって説明されるポリヌクレオチドが単一の分子であるように、配列が共有結合により一緒に連結される場合、ポリヌクレオチド内のヌクレオチドの別個に定義可能な配列を指す。多くの場合、式の構成成分は、単一の分子において互いにすぐ隣接している。規則に従い、式に示される配列の構成成分は、配列「Ａ」が「Ａ’」であるように、プライム（’）で示される。さらに、別途示されない、または文脈から暗示的でない限り、式によって定義されたポリヌクレオチドは、その３’端、その５’端、または３’及び５’端の両方に、追加の配列、プライマ結合部位、分子バーコード、プロモータ、またはスペーサなどを有し得る。式によって定義されたポリヌクレオチドが環状であると記載される場合、それらの分子の端部は、直接または間接的のいずれかで一緒に接合される。例えば、式Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｚ−Ｙの環状複合体の場合、分子の５’端は、直接または間接的に、分子の３’端に接合され、環を生成する。明らかであろうが、ポリヌクレオチドの種々の構成成分配列（例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｘ、Ｙ、Ｚなど）は、所望の機能（例えば、別の配列にハイブリダイズする）を行うことが可能である限り、独立して、任意の所望の長さのものであってよい。例えば、ポリヌクレオチドの種々の構成成分配列は、独立して、８〜８０ヌクレオチド、例えば、１０〜５０ヌクレオチドまたは１２〜３０ヌクレオチドの範囲の長さを有する。
【００７１】
例えば、式Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｚの「ライゲーション可能な複合体」という用語は、種々のオリゴヌクレオチドが、図１に示されるように、スプリントオリゴヌクレオチドによって一緒に保持される、互いにライゲーション可能に隣接している（環状または直鎖状形態で）複合体を指す。
【００７２】
例えば、式Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｚ−Ｙの「ライゲーション可能な環状複合体」という用語は、種々のオリゴヌクレオチドが、スプリントオリゴヌクレオチドによって一緒に保持される、環状で互いにライゲーション可能に隣接している環状複合体を指す。
【００７３】
本明細書で使用されるとき、「遺伝子座」「ゲノム遺伝子座」という用語は、ゲノム、例えば、ヒト、サル、ラット、魚、もしくは昆虫、または植物などの動物または植物ゲノムの定義された領域を指す。遺伝子座は、１００ｋｂと同じくらい短い染色体の領域であってもよく、染色体アームまたは全染色体と同じくらい長くてもよい。
【００７４】
「第１の遺伝子座」及び「第２の遺伝子座」という用語は、異なる遺伝子座、すなわち、ゲノムにおける異なる領域、例えば、異なる染色体アームまたは異なる染色体を指す。
【００７５】
「遺伝子座の断片」という用語は、特定の遺伝子座の定義された断片（制限酵素を使用して、またはＣＡＳ９などのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをリプログラミングすることにより作製され得る）の集団を指す。遺伝子座の全ての断片を分析する必要はない。種々のゲノムの配列は公表されているため、遺伝子座の断片にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの設計は日常的である。
【００７６】
「断片に対して相補的」という用語は、断片の鎖（上部または底部のいずれかの鎖）に相補的である配列を指す。
【００７７】
本明細書で使用されるとき、「ゲノム配列」という用語は、ゲノムにおいて生じる配列を指す。
【００７８】
可変性である２つ以上の核酸配列の文脈において、「可変性」という用語は、互いに対して異なる配列のヌクレオチドを有する２つ以上の核酸を指す。換言すると、集団のポリヌクレオチドが可変性配列を有するか、または特定の配列が「変化する」場合、集団のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列は分子毎に変化する。「可変性」という用語は、集団における全ての分子が集団における他の分子に対して異なる配列を有することが必要であると解釈されない。
【００７９】
２つの核酸（例えば、配列Ａ及びＡ’）が「相補的」である場合、それらは、高ストリンジェンシー条件下で互いとハイブリダイズする。多くの場合、相補的である２つの配列は、少なくとも１０、例えば、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５ヌクレオチドの相補性を有し、ある特定の場合において、１つ、２つ、または３つの非相補的塩基を有し得る。
【００８０】
遺伝子座を識別する配列の文脈において、「識別子」という用語は、遺伝子座に独特である分子バーコードを指す。かかる配列は、遺伝子座自体からのものではなく、むしろ、分析される遺伝子座の断片に付加され、それらの断片を遺伝子座からのものであると識別する分子バーコードであり、通常、分析される試料中に存在しない配列を有する。例えば、第１の遺伝子座からの断片が第１の識別子配列にライゲーションされ、第２の遺伝子座からの断片が第２の識別子配列にライゲーションされる場合、それらの断片源（それらが対応する遺伝子座）は、どの識別子配列がそれらの断片にライゲーションされたかを検出することによって判定され得る。
【００８１】
逆配向で他の配列にハイブリダイズする２つの配列の文脈において、「逆配向」という用語は、配列のうちの１つの５’及び３’端が、図３Ｂの上に図示されるように、端部が互いに向き合う方法で、他にハイブリダイズされる構造を指す。
【００８２】
本明細書で使用されるとき、「ローリングサークル増幅」または略して「ＲＣＡ」という用語は、鎖置換ポリメラーゼを使用して、環状核酸テンプレートの直鎖状体化された（ｌｉｎｅａｒ  ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒｉｚｅｄ）コピーを生成する等温増幅を指す。ＲＣＡは、分子生物学の技術において周知であり、Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ（Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９９８  １９：２２５−２３２）、Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２０００  ９７：１０１１３−１０１１９）、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２０００  ４６：１９９０−１９９３）、及びＳｃｈｗｅｉｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２００１  １２：２１−２７）（これらは参照により本明細書に組み込まれる）を含むが、これらに限定されない様々な刊行物に記載されている。
【００８３】
本明細書で使用されるとき、「ローリングサークル増幅生成物」という用語は、ローリングサークル増幅反応の鎖状体化された生成物を指す。本明細書で使用されるとき、「蛍光標識されたローリングサークル増幅生成物」という用語は、例えば、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドをローリングサークル増幅生成物にハイブリダイズすることによって、または他の手段によって（例えば、増幅中に蛍光ヌクレオチドを生成物内に組み込むことによって）蛍光標識されたローリングサークル増幅生成物を指す。
【００８４】
本明細書で使用されるとき、支持体の領域または画像の領域の文脈において、「領域」という用語は、連続領域または非連続領域を指す。例えば、方法がある領域の標識されたＲＣＡ生成物の数の計数を伴う場合、ＲＣＡ生成物が計数される領域は、単一、連続空間、または複数の非連続空間であり得る。
【００８５】
本明細書で使用されるとき、「画像化」という用語は、物体の表面からの光学シグナルが検出され、位置（すなわち、「ピクセル」）に関連してデータとして保存されるプロセスを指す。物体のデジタル画像はこのデータから再構築され得る。支持体の領域は、単一画像または１つ以上の画像を使用して画像化され得る。
【００８６】
本明細書で使用されるとき、「個々の標識されたＲＣＡ生成物」という用語は、標識される個々のＲＣＡ分子を指す。
【００８７】
本明細書で使用されるとき、「計数」という用語は、より大きい集合体における個々の物体の数を判定することを指す。「計数」は、複数における個々の物体からの個別のシグナル（複数の物体からの集合シグナルではない）を検出し、その後、個々のシグナルを計数することによって、いくつの物体がその複数において存在するかを判定することを必要とする。本方法の文脈において、「計数」は、シグナルのアレイにおける個々のシグナルの数を判定することによって行われる。
【００８８】
本明細書で使用されるとき、ＲＣＡ生成物のアレイに関して、「アレイ」という用語は、ＲＣＡ生成物が表面の平面上で空間的に互いから分離される（アレイが真のランダムである場合、ポアソン分布によって許容される程度まで）平面的な表面上の単一ＲＣＡ生成物の集合体を指す。「ランダム」アレイは、要素、例えば、ＲＣＡ生成物が既定されていない位置で基質の表面上に分布されるアレイである。一部の場合において、ランダムアレイ上のＲＣＡ生成物の分布は、ポアソン統計によって説明され得、その結果として、例えば、ランダムアレイのＲＣＡ生成物間の距離の分布はポアソン分布によって近似される。
【００８９】
用語の他の定義は、本明細書を通して表示され得る。
【発明を実施するための形態】
【００９０】
種々の実施形態を説明する前に、本開示の教示が説明される特定の実施形態に限定されず、そのため、当然ながら、変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態を説明する目的のためであり、本教示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるため、制限することが意図されないことも理解されたい。
【００９１】
本明細書で使用される節の表題は、単に構造上の理由からであり、説明される主題を制限するものとして決して解釈されない。本教示は種々の実施形態と共に説明されるが、本教示がかかる実施形態に制限されることを意図しない。逆に、当業者に理解されるように、本教示は、種々の代替、修正、及び等価物を包含する。
【００９２】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本開示が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似するまたは同等の任意の方法及び材料が本教示の実践または試験において使用されてもよいが、一部の例示的な方法及び材料がここに記載される。
【００９３】
いずれの刊行物の引用は出願日前のその開示に対してであり、本主張が先行発明によりかかる刊行物に先行する権利がないものと解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の刊行日とは異なる場合があり、それは個別に確認される必要がある場合がある。
【００９４】
本開示を読めば当業者には明らかであるように、本明細書において説明及び図示される個々の実施形態の各々は、本教示の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離されるか、またはそれと組み合わせることができる、個別の構成要素及び特徴を有する。いずれの列挙される方法も、列挙される事象の順序で、または理論上可能である任意の他の順序で行うことができる。
【００９５】
本明細書に言及される全ての特許及び刊行物（かかる特許及び刊行物内で開示される全ての配列を含む）は、参照により明示的に組み込まれる。
【００９６】
プローブの構成要素
プローブシステムの一部の実施形態は、（ａ）配列Ｂの１組の識別子オリゴヌクレオチドと、（ｂ）式Ｘ’−Ａ’−Ｂ’−Ｚ’の１組のスプリントオリゴヌクレオチドであって、１組内で、（ｉ）配列Ａ’及びＢ’は、変化し、（ｉｉ）配列Ｘ’及びＺ’は、互いに異なり、かつ可変性ではなく、各スプリントオリゴヌクレオチド内で、（ｉ）配列Ａ’は、核酸試料のゲノム断片に対して相補的であり、（ｉｉ）配列Ｂ’は、１組の識別子オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つのメンバに対して相補的である、１組のスプリントオリゴヌクレオチドと、（ｃ）Ｘ及びＺを含む１つ以上のプローブ配列であって、配列Ｘ及びＺは、可変性ではなく、配列Ｘ’及びＺ’にハイブリダイズし、各スプリントオリゴヌクレオチドは、（ｉ）プローブ配列、（ｉｉ）１組の識別子オリゴヌクレオチドのメンバ、及び（ｉｉｉ）ゲノム断片にハイブリダイズすることが可能であり、それによって、式Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｚのライゲーション可能な複合体を生成する、１つ以上のプローブ配列と、を含み得る。以下により詳細に説明されるように、一部の実施形態において、異なる識別子オリゴヌクレオチド及びそれらの相補的配列Ｂ’は、異なる染色体、例えば、染色体２１、１８、及び１３を識別する。
【００９７】
図１は、式Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｚのライゲーション可能な複合体を示し、その構造は本プローブシステムを特徴付ける。図１に示されるように、複合体配列において、Ｘ、Ａ、Ｂ、及びＺは、スプリントオリゴヌクレオチドによって適所に保持される、互いにライゲーション可能に隣接する。図１に留意されるように、配列Ａは、ゲノムの標的断片（例えば、制限断片の鎖）であり、配列Ｂは、隣接する配列Ａが由来する遺伝子座（例えば、染色体上の特定の領域、特定の染色体アーム、または特定の染色体など）を識別する。配列Ａ及びＢの関係は、図２に図示され、それは種々のゲノム断片（Ａ１〜Ａ６）にハイブリダイズされる単純なプローブ組を図示する。図２に示されるように、上部３つの複合体（配列Ａ１、Ａ２、及びＡ３の）のゲノム断片は、第１の遺伝子座（例えば、染色体２１）からのものであり、底部３つの複合体（配列Ａ４、Ａ５、及びＡ６の）のゲノム断片は、第２の遺伝子座（例えば、染色体１８）からのものである。上部３つの複合体のゲノム断片が由来する遺伝子座は、単一の配列（Ｂ１）によって識別され、底部３つの複合体のゲノム断片が由来する遺伝子座は、異なる配列（Ｂ２）によって識別される。配列Ｘ及びＺは、全ての図示される複合体において同じである。
【００９８】
明らかであろうが、１組のスプリントオリゴヌクレオチドは、所望に応じて複雑であってもよく、一部の実施形態において、配列Ａ’は、少なくとも１００、少なくとも１，０００、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、または少なくとも５０，０００以上の複雑性を有してもよい、つまり、スプリントオリゴヌクレオチドは、集合的に、ゲノムＤＮＡの少なくとも１００、少なくとも１，０００、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、または少なくとも５０，０００以上の断片にハイブリダイズすることができる。１組のスプリントオリゴヌクレオチドにおける配列Ｂ’は、単純に遺伝子座識別子として機能するため、非常に多様性に欠ける可能性がある。そのため、１組のスプリントオリゴヌクレオチドにおいて、配列Ｂ’は、少なくとも２、例えば、３または４の複雑性を有し得るが、配列Ｂ’は、一部の実施において、少なくとも１０、少なくとも１００、または少なくとも１０００の複雑性を有し得る。明らかであろうが、配列Ｂ’は、配列Ｂに対して相補的であるため、１組の遺伝子座特異的オリゴヌクレオチドの複雑性は、配列Ｂ’の複雑性と同じであり得る。例えば、３つの識別子オリゴヌクレオチドが存在する場合、３つの異なるＢ’配列が存在し得る。１組におけるスプリントオリゴヌクレオチドの数は、遺伝子座の長さ及び標的断片の数によって大きく変化し得る。一部の実施形態において、各組のスプリントオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、または少なくとも５０，０００の異なるスプリントオリゴヌクレオチドを含有し得る。
【００９９】
例えば、一部の実施形態において、１組のスプリントオリゴヌクレオチドは、（ｉ）最低１００のＡ’配列を含有する第１の亜集団のスプリントオリゴヌクレオチド、例えば、第１の遺伝子座の異なる断片（例えば、染色体２１の断片、または例えば、１組のＡ１，Ｘ、ｘ＝１〜１００＋）に対して相補的である１組のＡ１，Ｘ’（ｘ＝１〜１００＋）（ここで、この亜集団のスプリントオリゴヌクレオチドの各々は、同じＢ’配列、例えば、Ｂ１’を有する）、（ｉｉ）最低１００のＡ’配列を含有する第２の亜集団のスプリントオリゴヌクレオチド、例えば、第２の遺伝子座の異なる断片（例えば、染色体１８の断片、または例えば、１組のＡ２Ｘ、ｘ＝１〜１００＋）に対して相補的である１組のＡ２，Ｘ’（ｘ＝１〜１００＋）（ここで、この亜集団のスプリントオリゴヌクレオチドの各々は、同じＢ’配列、例えば、第１の（または任意の他の）亜集団のＢ’配列とは異なるＢ２’を有する）、（ｉｉｉ）最低１００のＡ’配列を含有する第３の亜集団のスプリントオリゴヌクレオチド、例えば、第３の遺伝子座の異なる断片（例えば、染色体１８の断片、または例えば、１組のＡ３Ｘ、ｘ＝１〜１００＋）に対して相補的である１組のＡ３，Ｘ’（ｘ＝１〜１００＋）（ここで、この亜集団のスプリントオリゴヌクレオチドの各々は、同じＢ’配列、例えば、任意の他の亜集団のＢ’配列とは異なるＢ３’を有する）、（ｉｖ）最低１００のＡ’配列を含有する任意選択の第４の亜集団のスプリントオリゴヌクレオチド、例えば、第４の遺伝子座の異なる断片（例えば、別の染色体の断片、または例えば、１組のＡ４，Ｘ、ｘ＝１〜１００＋）に対して相補的である１組のＡ４Ｘ’（ｘ＝１〜１００＋）（ここで、この亜集団のスプリントオリゴヌクレオチドの各々は、Ｂ’配列、例えば、任意の他の亜集団のＢ’配列とは異なるＢ４’を有する）を含有し得る。
【０１００】
図３に図示されるように、プローブシステムは、どのように使用されるかによって、様々な異なる方法で構成され得る。例えば、図３Ａ、Ｃ、及びＤに図示されるように、配列Ｘ及びＺは、異なる分子にあってもよく、結果として、ライゲーション可能な複合体は直鎖状である。これらの実施形態において、配列Ｘ及びＹを含有する１つ以上のプローブは、配列Ｘを含む第１のオリゴヌクレオチドと、配列Ｙを含む第２のオリゴヌクレオチドと、と含み得る。これらの実施形態において、第１及び第２のオリゴヌクレオチドは、図１Ａに示されるように、尾状である必要はない。これらの実施形態において、ライゲーション後、ライゲーション生成物は、例えば、配列Ｘ及びＺにハイブリダイズする、論じられるＰＣＲプライマを使用して増幅され得る。一部の実施形態において（図３Ｃ及びＤに示されるように）、第１及び／または第２のオリゴヌクレオチドは、それら自身が尾部を有して、増幅及び計数を容易にするようにプライマ結合部位を提供することができる。一部の実施形態において、尾部は、それらの分子が増幅及び配列決定された後に、元のライゲーション生成物の数を計数することを可能にする分子インデクサ（例えば、ランダム配列）を含有し得る。代替えの実施形態において、及び図３Ｂに示されるように、配列Ｘ及びＹを含有する１つ以上のプローブは、式Ｘ−Ｙ−Ｚの単一のバックボーンプローブであり得る。これらの実施形態において、及び示されるように、ライゲーション可能な複合体は、式Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｚ−Ｙの環状のライゲーション可能な複合体であり、式中、配列Ｙは、配列Ｘ及びＺに接合する。図３Ｅに図示される別の実施形態において、配列Ｘ及びＺを含有する１つ以上のプローブは、スプリントオリゴヌクレオチド自体の一部であり得る。これらの実施形態において、ライゲーション生成物は、図３Ｅに示されるように、「ダンベル」形状であり得る。
【０１０１】
これらの実施形態において、プローブシステムは、配列Ｘ及びＺを含む１つ以上のプローブにハイブリダイズする１対のＰＣＲプライマをさらに含み得、それによって、ライゲーション生成物の中央部分（すなわち、配列Ａ及びＢを含有する部分）を増幅することを可能にする。一部の実施形態、例えば、図３Ｂに示される実施形態において、プローブシステムは、ある配列をバックボーンプローブにハイブリダイズするローリングサークル増幅プライマをさらに含み得、それによって、ローリングサークル増幅によるそれらの生成物の増幅を容易にする。一部の実施形態において、プローブシステムは、ある配列をバックボーンプローブにハイブリダイズする、ローリングサークル増幅プライマと、最大４つの区別可能に標識されたオリゴヌクレオチドであって、区別可能に標識されたオリゴヌクレオチドの各々が、配列Ｂ’の補体にハイブリダイズする、区別可能に標識されたオリゴヌクレオチドと、を含み得る。これは、以下により詳細に説明される。
【０１０２】
このように、プローブシステムの一部の実施形態は、スプリントオリゴヌクレオチド、バックボーンプローブ、及び１つ以上の遺伝子座特異的オリゴヌクレオチドを含み得る。プローブシステムは、バックボーンプローブの配列をハイブリダイズするローリングサークル増幅プライマ、またはバックボーンプローブの部位にハイブリダイズする１対のＰＣＲプライマなどの１つ以上の増幅プライマ、及び任意選択で、遺伝子座特異的オリゴヌクレオチドの補体にハイブリダイズする１つ以上の標識されたプローブも含み得る。
【０１０３】
上記のように、配列Ａ’は１組の異なるメンバ間で変化し、Ａ’の配列は各々、ゲノムの異なる標的断片に対して相補的であるように設計される。Ａ’の配列は、長さ及び配列が独立して変化してもよく、一部の場合において、標的断片の長さ及び配列によって、長さが８〜８０ヌクレオチド、例えば、１０〜６０ヌクレオチドの範囲であり得る。配列Ｂ’は、隣接する断片が由来する遺伝子座（例えば、染色体１８または２１など、特定の染色体）を識別する。配列Ｂ’は、任意の好適な長さのものであってよいが、一部の実施形態において、それは、長さが８〜３０ヌクレオチドの範囲である。任意の単一アッセイ内で、配列Ｘ’及びＺ’は、互いに異なり、可変性ではない。配列Ｘ’及びＺ’は、任意の好適な長さのものであってよいが、一部の実施形態において、それらは、独立して、長さが８〜３０ヌクレオチドの範囲であるが、より長いまたはより短い配列が使用されてもよい。スプリントオリゴヌクレオチドの全体的な長さは、５０〜２００ヌクレオチドの範囲であり得る。一部の実施形態において、スプリントオリゴヌクレオチドは、ビオチン化され得、それによって、増幅前にライゲーション生成物（以下に論じられる）を他のライゲーションされない生成物から単離することを可能にする。明らかであろうが、配列Ｘ及びＺ（任意の好適な長さのものであってよいが、一部の実施形態において、それらは、独立して、長さが８〜３０ヌクレオチドの範囲である）は、可変性ではなく、配列Ｘ’及びＺ’にハイブリダイズする。遺伝子座特異的オリゴヌクレオチドは、配列Ｂのものであり、それは、同様に、任意の好適な長さのもの、例えば、長さが８〜３０ヌクレオチドの範囲であり得る。
【０１０４】
上記のように、上述のプローブシステムを使用して生成された複合体は、直鎖状または環状であり得る（図３に示されるように）。図４は、図３Ｂに図示される環状実施形態の特徴のうちの一部を図示する。
【０１０５】
図４に示されるように、一部の実施形態において、プローブシステムは、１組のスプリントオリゴヌクレオチド２（５’〜３’または３’〜５’配向であり得る式Ｘ’−Ａ’−Ｂ’−Ｚ’の）と、式Ｘ−Ｙ−Ｚ（式中、配列Ｘ及びＺは、可変性ではなく、逆配向で配列Ｘ’及びＺ’にハイブリダイズする（すなわち、示されるように、バックボーンの端部が互いの方向に向かうように））のバックボーンプローブ６と、１組の遺伝子座特異的オリゴヌクレオチド８は配列Ｂのものであると、を含み得る。バックボーンプローブの配列Ｙは、任意の適切な長さ、例えば、２０〜１００ヌクレオチドであり得る。バックボーンプローブ６の全体的な長さは、長さが５０〜３００ヌクレオチド以上の範囲、またはある特定の場合において、それ以上であり得る。
【０１０６】
図４に示されるように、プローブ組は、種々のオリゴヌクレオチドが、ゲノム断片とハイブリダイズされて、第１の組のライゲーション可能な環状複合体１０（すなわち、バックボーンプローブ６の端部、遺伝子座特異的オリゴヌクレオチド８、及びゲノム断片４が互いにライゲーション可能に隣接し、スプリントオリゴヌクレオチド２によって互いにライゲーション可能に隣接して保持される複合体）を生成することが特徴付けられる。図示される例に示されるように、バックボーンプローブ６、遺伝子座特異的オリゴヌクレオチド８、及び断片４は、第１のスプリントオリゴヌクレオチド２にハイブリダイズして、式Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｚ−Ｙ（式中、配列Ｙは、配列Ｘ及びＺに接合する）の１組のライゲーション可能な環状複合体１０を生成する。この組のライゲーション可能な環状複合体１０に存在する断片４は、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、または少なくとも５０以上の異なる遺伝子座（例えば、異なる染色体）からのものであってもよく、隣接する断片が由来する遺伝子座の同一性は、各遺伝子座に関して同じ配列である遺伝子座特異的オリゴヌクレオチド８によって提供される。この例において、配列Ａ及びＡ’（異なるゲノム断片の配列に対応する）は変化し、Ｂ及びＢ’（遺伝子座識別子）は変化し、配列Ｘ、Ｙ、及びＺは変化しない。
【０１０７】
以下により詳細に説明されるように、この実施形態において、プローブシステム（第１の組のスプリントオリゴヌクレオチド２、バックボーンプローブ６、及び遺伝子座特異的オリゴヌクレオチド８を含む）が、示されるように、ゲノム４の断片を含む試料とハイブリダイズされて、式Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｚ−Ｙの第１の組のライゲーション可能な環状複合体１０が生成され得る。ライゲーション可能な環状複合体をライゲートして、式Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｚ−Ｙの第１の組の環状ＤＮＡ分子１２を生成した後、第１の組の環状ＤＮＡ分子が、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）によって増幅されて、第１の組ＲＣＡ生成物１６が生成され得る。ＲＣＡは、図４に図示されるバックボーンプローブ６の配列をハイブリダイズするローリングサークル増幅プライマ１４、またはライゲーションされた断片の側面に位置する部位にハイブリダイズするＰＣＲプライマを使用して行われ得る。そのため、ある特定の実施形態において、プローブシステムは、ローリングサークル増幅プライマ１４をさらに含み得、そのプライマは、バックボーンプローブ６の配列、またはライゲーションされた断片の側面に位置する部位にハイブリダイズする１対のＰＣＲプライマをハイブリダイズする。ＲＣＡ後、特定のＲＣＡ生成物１６のクローニングされた断片「源」（すなわち、遺伝子座、例えば、クローニングされたゲノム断片が由来する特定の染色体）が、第１の標識されたオリゴヌクレオチド１８を配列Ｂの補体（すなわち、Ｂ’）にハイブリダイズすることにより、または配列決定により判定され得る。明らかであろうが、標識されたオリゴヌクレオチド１８は、配列Ｂの少なくとも一部を含み得る。そのため、ある特定の実施形態において、プローブシステムは、第１の遺伝子座特異的オリゴヌクレオチド８の補体にハイブリダイズする標識されたオリゴヌクレオチドをさらに含み得る。
【０１０８】
明らかであろうが、２つ以上の異なる遺伝子座からの配列が同じ反応において検出される場合、プローブシステムは、各遺伝子座識別子Ｂに１つずつ、追加の区別可能な標識されたオリゴヌクレオチドを含み得るため、両組のＲＣＡ生成物は同時に識別され得る。これらの実施形態において、プローブシステムは、区別可能な標識されたオリゴヌクレオチドの各々が、配列Ｂ’（例えば、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、Ｂ４’）の補体にハイブリダイズする、最大４つの区別可能な標識されたオリゴヌクレオチド（例えば、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４）をさらに含み得る。
【０１０９】
明らかであろうが、スプリントオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする断片は、分析されるゲノムの制限断片である。さらに、上述のプローブ、オリゴヌクレオチド、またはプライマのいずれか（例えば、バックボーンプローブ）は、各環状ＤＮＡ分子がクローニングされた断片及びバーコードの組み合わせによって区別され得るように、分子バーコード（例えば、ランダムまたは半ランダム配列などのインデックス配列）を含有し得、それによって、分子が増幅された後でも、いくつの最初の分子が配列決定されたかを計数することを可能にする（例えば、Ｃａｓｂｏｎらを参照されたい）。
【０１１０】
方法
本明細書において、（ａ）上述されるプローブシステムを、ゲノムの断片を含む試験ゲノム試料とハイブリダイズして、式Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｚのライゲーション可能な複合体を生成することと、（ｂ）ライゲーション可能な複合体をライゲーションして、式Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｚの生成物ＤＮＡ分子を生成することと、（ｃ）配列Ｂの各遺伝子座識別子に対応する生成物ＤＮＡ分子を計数することと、を含む方法も提供される。一部の実施形態において、計数は、生成物ＤＮＡ分子またはその増幅生成物を配列決定して配列リードを生成することと、Ｂの各配列を含む配列リードの数を計数することと、によって行われ得る。
【０１１１】
生成物ＤＮＡ分子が環状である実施形態において、計数は、ローリングサークル増幅によって生成物ＤＮＡ分子を増幅することと、Ｂの各配列を含む数の増幅生成物を計数することと、を含み得る。これらの実施形態において、本方法は、配列Ｂにハイブリダイズする区別可能に標識されたプローブを使用してＲＣＡ生成物を標識することを含み得、計数は、各区別可能な標識に関してＲＣＡ生成物の数を計数することによって行われる。本方法の１つの実施の一般原理が図４に示される。明らかであろうが、スプリントオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする断片は、（独立して）分析されるゲノムの上部または底部鎖の制限断片である。これらの断片は、１つ以上の制限酵素（例えば、４つの塩基認識配列を有する酵素の組み合わせ）でゲノムを消化し、その後、消化された試料を変性することによって生成され得る。そのため、クローニングされる断片は、定義された端部を有し、それによって、スプリントオリゴヌクレオチドの設計がそれらの断片をクローニングすることを可能にする。定義された端部を有する断片を生成するための他の方法（例えば、フラップエンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、ギャップ充填などを使用する方法）が存在する。
【０１１２】
前述のように、本方法は、図５に示されるように、２つ以上の異なる遺伝子座を分析する方法を提供するために多重化され得る。図５を参照すると、ゲノムＤＮＡ４０の断片を含有する試料は、ａ）（ｉ）上述の第１の組のスプリントプローブ、（ｉｉ）上述の第１遺伝子座特異的オリゴヌクレオチド、（ｉｉｉ）上述の第２の組のスプリントプローブ、（ｉｖ）上述の第２遺伝子座特異的オリゴヌクレオチド、及び（ｖ）上述のバックボーンプローブを含むプローブシステム４２とハイブリダイズされて、式Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｚ−Ｙの第１の組のライゲーション可能な環状複合体（第１の遺伝子座、例えば、第１の染色体からの断片、ならびに第２の遺伝子座、例えば、第２の染色体からの断片を含有する）を含む混合物４４を生成し得る。次に、本方法は、（ｂ）ライゲーション可能な環状複合体をライゲーションして、環状ＤＮＡ分子４６の混合物（第１及び第２の組の環状ＤＮＡ分子を含有する）を生成することと、エキソヌクレアーゼで試料を処理して直鎖状核酸分子を除去した後、（ｃ）バックボーンプローブにハイブリダイズする単一のプライマを使用して、ローリングサークル増幅により環状ＤＮＡ分子４６を増幅して、ＲＣＡ生成物４８を生成することと、を含む。断片の各々が各ＲＣＡ生成物内に含有された遺伝子座は、ＲＣＡ生成物を、生成物の各々に存在する遺伝子座特異的オリゴヌクレオチドの補体にハイブリダイズする、区別可能に標識された第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズすることによって識別されて、標識された試料５０を生成し得る。これらの実施形態において、本方法は、（ｄ）別個に、（ｉ）第１の遺伝子座識別子配列にハイブリダイズする標識されたプローブを使用して、第１の遺伝子座から断片を含有するＲＣＡ生成物、及び（ｉｉ）第２の遺伝子座識別子配列にハイブリダイズする標識されたプローブを使用して、第２の遺伝子座から断片を含有するＲＣＡ生成物を検出することを含み得、この標識されたプローブは、区別可能に標識される。上記のように、ライゲーション後、スプリントオリゴヌクレオチドがビオチン化される場合、環状生成物は、例えば、ストレプトアビジンビーズを使用して、ライゲーションされない生成物から単離され得る。いずれの事象において、ライゲーションされた試料は、エキソヌクレアーゼで処理され得、それによって、反応物から直鎖状ＤＮＡ分子を除去する。この原理は、いずれの数の遺伝子座（例えば、３、４、最大１０、または最大１００以上の遺伝子座）に関して生成されたライゲーション生成物の数を計数するために拡大することができる。
【０１１３】
一部の実施形態において、検出ステップは、（ｄ）（ｉ）ＲＣＡ生成物を支持体上に付着させることと、（ｉｉ）支持体の領域内の１つの標識で標識される個々の標識されたＲＣＡ生成物の数と、別の標識で標識された個々の標識されたＲＣＡ生成物の数を別個に計数することと、を含み得る。理解されるように、標識されたオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、ＲＣＡ生成物が支持体上に分配される前、またはＲＣＡ生成物が支持体上に分配された後に行うことができる。
【０１１４】
換言すると、各遺伝子座に対応するローリングサークル増幅生成物の数は、例えば、ＲＣＡ生成物を支持体の表面（スライドまたは多孔質膜）上に分配し、標識されたオリゴヌクレオチド（例えば、蛍光により標識されたオリゴヌクレオチド）を使用して、ＲＣＡ生成物をハイブリダイズし、その後、例えば、蛍光リーダーを使用して、支持体の領域の別個のシグナルの数を計数することによって推定することができる。標識は、生成物が支持体上に分配される前または後に行うことができ、そして各ＲＣＡ生成物は同じ配列の数千のコピーを含有するため、標識されたオリゴヌクレオチドのための数千の結合部位が存在するはずであり、それによって、シグナルを増加させる。多重化実施形態において（例えば、２つの異なる遺伝子座に対応するＲＣＡ生成物が計数される）、１つの遺伝子座に対応するＲＣＡ生成物は、１つのフルオロフォアで標識されてもよく、別の遺伝子座に対応するＲＣＡ生成物は、異なるフルオロフォアで標識されてもよく、それによって、異なるＲＣＡ生成物が別個に計数されることを可能にする。
【０１１５】
ある特定の実施形態において、本方法は、（ａ）多孔質の透明なキャピラリー膜を通して、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）生成物を含有する液体試料を濾過し、それによって、ＲＣＡ生成物を濃縮し、膜上のＲＣＡ生成物のアレイを生成することと、（ｂ）ステップ（ａ）の前または後に、ＲＣＡ生成物を蛍光標識することと、（ｃ）膜の領域内の個々に標識されたＲＣＡ生成物の数を計数し、それによって、試料中の標識されたＲＣＡ生成物の数の推定値をもたらすことと、を含み得る。一部の実施形態において、多孔質の透明なキャピラリー膜は、多孔質の陽極酸化アルミニウム膜であり得る。これらの実施形態において、標識ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）の前または後に、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドをＲＣＡ生成物にハイブリダイズすることによって行われ得る。ある特定の実施形態において、本方法は、膜の領域を画像化して１つ以上の画像を生成し、１つ以上の画像内の個々に標識されたＲＣＡ生成物の数を計数することを含み得る。かかる方法の例は、２０１６年５月２日に出願されたＰＣＴ／ＩＢ２０１６／０５２４９５に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１６】
個々のＲＣＡ生成物からのシグナルを数量化することは、多くの用途において（例えば、ｃｆＤＮＡの分析による非侵襲的出生前診断）、特定の染色体（例えば、染色体２１）に対応する断片の数がかなり正確にかつ偏りなく判定される必要があるため、重要である。典型的な分析方法は、周知であるように、ＰＣＲを使用するが、これは、一部の配列が他よりも非常に高い効率で増幅されるという点で、非常に偏った処置である。これにより、ＰＣＲに基づく戦略は多くの診断の試みに実用的ではなくなる。
【０１１７】
特定の実施形態において、試料は、ＲＣＡ生成物の複数集団（例えば、標識されたＲＣＡ生成物の第１の集団及びＲＣＡ生成物の第２の集団など、２つ、３つ、または４つ以上のＲＣＡ生成物の集団）を含有し得、この場合、ＲＣＡ生成物の異なる集団は区別可能に標識される、つまり、ＲＣＡ生成物標識の集団の各々の個々のメンバは、集団が混合されるときでも、独立して検出及び計数され得る。対象方法に有用な好適な区別可能な蛍光標識対は、例えば、Ｃｙ−３とＣｙ−５（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、Ｑｕａｓａｒ５７０とＱｕａｓａｒ６７０（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎｏｖａｔｏ  ＣＡ）、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５５５とＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、ＢＯＤＩＰＹ  Ｖ−１００２とＢＯＤＩＰＹ  Ｖ１００５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、ＰＯＰＯ−３とＴＯＴＯ−３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、及びＰＯＰＲＯ３  ＴＯＰＲＯ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を含む。さらに好適な区別可能な検出可能な標識は、例えば、Ｋｒｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎｎ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９：１１４−２９，２００２）に見出すことができる。例えば、ＲＣＡ生成物は、ＡＴＴＯ、ＡＬＥＸＡ、ＣＹ、またはＹＯＹＯ、ＴＯＴＯなどの二量体シアニン色素の任意の組み合わせで標識され得る。他の標識も使用することができる。
【０１１８】
一部の場合において、ＲＣＡ生成物の集団は、複数の標識でそれを標識することによって、区別可能に標識され得、それによって、多重化の可能性を増大させる。例えば、一部の場合において、集団は、読み取ったときに、個々の色素（例えば、Ｃｙ３またはＣｙ５）で標識される集団から区別可能である、２つの区別可能な色素（例えば、Ｃｙ３及びＣｙ５）で標識され得る。一部の実施形態において、ＲＣＡ生成物の第１の集団は、標識されたＲＣＡの「試験」集団を表し、ＲＣＡ生成物の第２の集団は、第１のＲＣＡ生成物の数が比較されるＲＣＡ生成物の「参照」集団を表す。例えば、一部の実施形態において、ＲＣＡ生成物の第１の集団は、第１の染色体領域（例えば、染色体２１の第１の染色体）に対応し得、ＲＣＡ生成物の第２の集団は、第２の染色体領域（例えば、染色体１３もしくは１８、または第１の染色体の異なる領域などの第２の染色体）に対応し得、ＲＣＡ生成物の第１の集団及びＲＣＡ生成物の第２の集団は計数され、領域のコピー数に相違があるか（試験領域の重複または欠失があることを示す）どうかを判定するために比較され得る。一部の実施形態において、試料は、ＲＣＡ生成物の少なくとも第１の集団及びＲＣＡ生成物の第２の集団を含有し、標識されたＲＣＡ生成物の第１及び第２の集団は、標識ステップ（ステップ（ｂ））で区別可能に標識される。これらの実施形態において、本方法は、膜の領域の第１の標識されたＲＣＡ生成物の数を計数し、膜の領域（同じ領域または異なる領域）の第２の標識されたＲＣＡ生成物の数を計数し、それによって、試料中のＲＣＡ生成物の第１及び第２の集団の数の推定値をもたらすことを含む。この推定値は、試料中の第１のＲＣＡ生成物の数と試料中の第２のＲＣＡ生成物の数を比較することをさらに伴う場合がある。
【０１１９】
本方法のこれらの実施形態の一部において、本方法は、標識されたＲＣＡ生成物の第１及び第２の集団を画像化して、１つ以上の画像（例えば、それぞれ、第１の画像及び第２の画像）を生成し、任意選択で、（ｉ）１つ以上の画像における標識されたＲＣＡ生成物の数を計数し、それによって、試料中の標識されたＲＣＡ生成物の第１及び第２の集団の数の推定値をもたらすことを含み得る。標識されたＲＣＡ生成物の第１及び第２の集団は、既知の方法を使用して（例えば、適切なフィルタなどを使用して）別個に検出され得る。本方法のこれらの実施形態は、試料中の第１の標識されたＲＣＡ生成物の数と試料中の第２の標識されたＲＣＡ生成物の数を比較することをさらに含み得る。本方法のこのステップは、膜の領域の少なくとも１，０００（例えば、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも５００，０００  最大１Ｍ以上）の標識されたＲＣＡ生成物の第１の集団において、少なくとも１，０００（例えば、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも５００，０００  最大１Ｍ以上）の標識されたＲＣＡ生成物を計数し、計数し、それによって、コピー数の相違が統計の厳密さを伴って判定され得ることを確実にする。
【０１２０】
代替えの実施形態において、ＤＮＡ分子におけるクローニングされた断片（及び任意選択で、環状ＤＮＡ分子における任意のインデックス配列）は、それらの配列の側面に位置する部位にハイブリダイズするか、またはそれと同じであるＰＣＲプライマを使用して、ＰＣＲによって増幅され得る。この実施形態において、ＰＣＲ生成物はプライマを使用して増幅され得る。この実施形態において、生成物の量は、任意の好適なｑＰＣＲアッセイ、例えば、ＴａｑＭａｎアッセイなどによって数量化され得る。別の実施形態において、生成物は、（増幅して、または増幅することなく）配列決定される。これらの実施形態において、各遺伝子座に対応する環状分子の量は、遺伝子座に対応する配列リードの数を計数する（例えば、いくつの配列リードが特定の遺伝子座特異的バーコード配列を有するかを計数する）ことによって推定され得る。一部の実施形態において、インデックス配列が使用される場合、各遺伝子座に対応する環状分子の数は、いくつの異なる分子バーコード配列が各遺伝子座バーコード配列と関連するかを判定することによって計数され得る。
【０１２１】
明らかであろうが、本実施形態において、使用されるプライマは、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａの可逆的ターミネータ方法、Ｒｏｃｈｅのパイロシーケンシング方法（４５４）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのライゲーションによるシーケンシング、またはＬｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔプラットフォームにおける使用と適合性がある配列を含有し得る。かかる方法の例は、以下の参考文献：Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ（Ｎａｔｕｒｅ  ２００５  ４３７：３７６−８０）、Ｒｏｎａｇｈｉ  ｅｔ  ａｌ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９６  ２４２：８４−９）、Ｓｈｅｎｄｕｒｅ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００５  ３０９：１７２８）、Ｉｍｅｌｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ（Ｂｒｉｅｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．２００９  １０：６０９−１８）、Ｆｏｘ  ｅｔ  ａｌ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００９；５５３：７９−１０８）、Ａｐｐｌｅｂｙ  ｅｔ  ａｌ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００９；５１３：１９−３９）、及びＭｏｒｏｚｏｖａ（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００８  ９２：２５５−６４）に記載されており、これらは、全ての出発生成物、試薬、及びステップの各々の最終生成物を含む、本方法及び本方法の特定のステップの一般的な説明のために、参照により組み込まれる。
【０１２２】
試験ゲノム試料は、疾患または状態を有すると思われるか、またはそのリスクにある患者からのものであってもよく、ステップ（ｃ）の結果は、患者またはその胎児が疾患または状態を有するかどうかの指標。一部の実施形態において、疾患または状態は、癌、感染症、炎症性疾患、移植拒絶、またはトリソミーなどの染色体欠損であり得る。
【０１２３】
上記のように、一部の場合において、本方法を使用して分析される試料は、血液から、例えば、妊婦の血液から得たｃｆＤＮＡの試料であり得る。これらの実施形態において、本方法は、例えば、発達中の胎児における染色体異常を検出するため（上述のように）、または試料中の胎児ＤＮＡの分画を計算するために使用され得る。
【０１２４】
本方法を使用して検出することができる例示的なコピー数異常は、トリソミー２１、トリソミー１３、トリソミー１８、トリソミー１６、ＸＸＹ、ＸＹＹ、ＸＸＸ、モノソミーＸ、モノソミー２１、モノソミー２２、モノソミー１６、及びモノソミー１５を含むが、これらに限定されない。本方法を使用して検出することができるさらなるコピー数異常は、以下の表に列記される。
染色体    異常及び疾患関連性
Ｘ：      ＸＯ（ターナー症候群）
Ｙ：      ＸＸＹ（クラインフェルター症候群）
Ｙ：      ＸＹＹ（ＹＹ症候群）
Ｙ：      ＸＸＸ（トリソミーＸ症候群（Ｔｒｉｓｏｍｙ  Ｘ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ））
Ｙ：      ＸＸＸＸ（４Ｘ症候群（Ｆｏｕｒ  Ｘ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ））
Ｙ：      Ｘｐ２１欠失（デュシェンヌ／ベッカー症候群、先天性副腎低形成症、慢性
肉芽腫症）
Ｙ：      Ｘｐ２２欠失（ステロイドスルファターゼ欠損）
Ｙ：      Ｘｑ２６欠失（Ｘ連鎖リンパ球増殖性疾患）
１：      １ｐ体細胞（神経芽細胞腫）
１：      モノソミー（神経芽細胞腫）
１：      トリソミー（神経芽細胞腫）
２：      モノソミー（発達遅滞、発達及び精神遅延、ならびに低度の身体的異常）
２：      トリソミー２ｑ（発達遅滞、発達及び精神遅延、ならびに低度の身体的異常
）
３：      モノソミー（非ホジキンリンパ腫）
３：      トリソミー体細胞（非ホジキンリンパ腫）
４：      モノソミー（急性非リンパ球性白血病（ＡＮＬＬ））
４：      トリソミー体細胞（急性非リンパ球性白血病（ＡＮＬＬ））
５：      ５ｐ（ネコ鳴き症候群、レジューン症候群）
５：      ５ｑ体細胞（骨髄異形成症候群）
５：      モノソミー（骨髄異形成症候群）
５：      トリソミー（骨髄異形成症候群）
６：      モノソミー（明細胞肉腫）
６：      トリソミー体細胞（明細胞肉腫）
７：      ７ｑ１１．２３欠失（ウィリアムズ症候群）
７：      モノソミー（小児期のモノソミー７症候群；体細胞：腎皮質腺腫；骨髄異形
成症候群）
７：      トリソミー（小児期のモノソミー７症候群；体細胞：腎皮質腺腫；骨髄異形
成症候群）
８：      ８ｑ２４．１欠失（ランガー・ギデオン症候群）
８：      モノソミー（骨髄異形成症候群；ワルカニー症候群（Ｗａｒｋａｎｙ  ｓｙ
ｎｄｒｏｍｅ）；体細胞：慢性骨髄性白血病）
８：      トリソミー（骨髄異形成症候群；ワルカニー症候群；体細胞：慢性骨髄性白
血病）
９：      モノソミー９ｐ（アルフィ症候群（Ｗａｒｋａｎｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ））
９：      モノソミー９ｐ（レトレ症候群（Ｒｅｔｈｏｒｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ））
９：      部分トリソミー（レトレ症候群）
９：      トリソミー（完全なトリソミー９症候群；モザイクトリソミー９症候群）
１０：    モノソミー（ＡＬＬまたはＡＮＬＬ）
１０：    トリソミー体細胞（ＡＬＬまたはＡＮＬＬ）
１１：    １１ｐ−（無虹彩症、ウィルムス腫瘍）
１１：    １１ｑ−（ヤコブセン症候群）
１１：    モノソミー（骨髄系統に影響がある（ＡＮＬＬ、ＭＤＳ））
１１：    トリソミー（骨髄系統に影響がある（ＡＮＬＬ、ＭＤＳ））
１２：    モノソミー（ＣＬＬ、若年性顆粒膜細胞腫（ＪＧＣＴ））
１２：    トリソミー（ＣＬＬ、若年性顆粒膜細胞腫（ＪＧＣＴ））
１３：    １３ｑ−（１３ｑ症候群；オルベリ症候群（Ｏｒｂｅｌｉ  ｓｙｎｄｒｏｍ
ｅ））
１３：    １３ｑ１４欠失（網膜芽細胞腫）
１３：    モノソミー（パトー症候群）
１３：    トリソミー（パトー症候群）
１４：    モノソミー（骨髄性障害（ＭＤＳ、ＡＮＬＬ、非定型ＣＭＬ）
１４：    トリソミー体細胞（骨髄性障害（ＭＤＳ、ＡＮＬＬ、非定型ＣＭＬ）
１５：    １５ｑ１１−ｑ１３欠失（プラダー・ウィリー、アンジェルマン症候群）
１５：    モノソミー（プラダー・ウィリー、アンジェルマン症候群）
１５：    トリソミー体細胞（骨髄及びリンパ系糖に影響がある、例えば、ＭＤＳ、Ａ
ＮＬＬ、ＡＬＬ、ＣＬＬ）
１６：    １６ｑ１３．３欠失（ルビンシュタイン・テイビ）
１６：    モノソミー（乳頭状腎細胞癌（悪性））
１６：    トリソミー体細胞（乳頭状腎細胞癌（悪性））
１７：    １７ｐ−体細胞（骨髄性悪性疾患における１７ｐ症候群）
１７：    １７ｑ１１．２欠失（スミス・マゲニス）
１７：    １７ｑ１３．３（ミラー・ディーカー）
１７：    モノソミー（腎皮質腺腫）
１７：    トリソミー体細胞（腎皮質腺腫）
１７：    １７ｐ１１．２−１２（シャルコー・マリー・トゥース症候群１型；ＨＮＰ
Ｐ）
１７：    トリソミー（シャルコー・マリー・トゥース症候群１型；ＨＮＰＰ）
１８：    １８ｐ−（１８部分モノソミー症候群またはグロウチイ・ラミー・ティーフ
リィ症候群）
１８：    １８ｑ−（グロウチイ・ラミー・サルモン・ランドリー症候群）
１８：    モノソミー（エドワーズ症候群）
１８：    トリソミー（エドワーズ症候群）
１９：    モノソミー（エドワーズ症候群）
１９：    トリソミー（エドワーズ症候群）
２０：    ２０ｐ−（トリソミー２０ｐ症候群）
２０：    ２０ｐ１１．２−１２欠失（アラジール）
２０：    ２０ｑ−（体細胞：ＭＤＳ、ＡＮＬＬ、真性多血症、慢性好中球性白血病）
２０：    モノソミー（乳頭状腎細胞癌（悪性））
２０：    トリソミー体細胞（乳頭状腎細胞癌（悪性））
２１：    モノソミー（ダウン症候群）
２１：    トリソミー（ダウン症候群）
２２：    ２２ｑ１１．２欠失（ディジョージ症候群、口蓋心臓顔面症候群、円錐動脈
幹異常顔貌症候群、常染色体優性Ｏｐｉｔｚ  Ｇ／ＢＢＢ症候群、ケイラー
心臓顔面症候群）
２２：    モノソミー（完全なトリソミー２２症候群）
２２：    トリソミー（完全なトリソミー２２症候群）
【０１２５】
本明細書に記載される方法は、植物、動物（例えば、爬虫類、哺乳類、昆虫、虫、魚など）、組織試料、細菌、真菌（例えば、酵母）、ファージ、ウイルス、屍体組織、考古学／古代試料などを含むが、これらに限定されない、実質的にあらゆる生物からのゲノムＤＮＡを分析するために用いることができる。ある特定の実施形態において、本方法において使用されるゲノムＤＮＡは、哺乳類に由来し得、ある特定の実施形態において、哺乳類はヒトである。例示的な実施形態において、ゲノム試料は、ヒト、マウス、ラット、またはサルの細胞など、哺乳類細胞からのゲノムＤＮＡを含有し得る。試料は、培養した細胞、または臨床試料の細胞、例えば、法医学的試料の組織生検、切屑、洗浄物、もしくは細胞（すなわち、犯罪現場で回収された試料の細胞）から作製され得る。特定の実施形態において、核酸試料は、細胞、組織、体液、及び便などの生物学的試料から得られてもよい。対象の体液は、血液、血清、血漿、唾液、粘膜、痰、脳脊髄液、胸水、涙、乳管液（ｌａｃｔａｌ  ｄｕｃｔ  ｆｌｕｉｄ）、リンパ、喀痰、脳脊髄液、滑液、尿、羊水、及び精液を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態において、試料は、対象、例えば、ヒトから得られてもよい。一部の実施形態において、分析される試料は、血液から、例えば、妊婦の血液から得たｃｆＤＮＡの試料であり得る。
【０１２６】
例えば、一部の実施形態において、ＤＮＡの試料を得、試料を１つ以上の制限酵素（またはｃａｓ９などのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ）で消化して、予想通りの断片（その中央値のサイズが２０〜１００塩基の範囲であり得る）が生成され得る。上述の方法は、消化されたＤＮＡで行われてもよく、１つの遺伝子座（例えば、１つの染色体）に対応する断片の数が、本明細書に記載される方法を使用して、別の遺伝子座（例えば、別の染色体）に対応する断片の数と比較され得る。記述されるように、本方法は、疾患または状態に関連するコピー数の相違、例えば、染色体異数性を識別するために使用され得る。
【０１２７】
上記のように、一部の場合において、分析される試料は、血液から、例えば、妊婦の血液から得たｃｆＤＮＡの試料であり得る。これらの実施形態において、本方法は、例えば、発達中の胎児における染色体異常を検出するため、または試料中の胎児ＤＮＡの分画を計算するために使用され得る。
【０１２８】
キット
上述のように、対象方法を実践するためのキットも本開示によって提供される。ある特定の実施形態において、キットは、（ａ）式Ｘ’−Ａ’−Ｂ’−Ｚ’の１組のスプリントオリゴヌクレオチドであって、１組内で、（ｉ）Ａ’及びＢ’の配列は、変化し、（ｉｉ）Ｘ’及びＺ’の配列は、互いに異なり、かつ可変性ではなく、各分子内で、（ｉ）配列Ａ’は、ゲノムの断片に対して相補的であり、（ｉｉ）配列Ｂ’は、隣接するＡ’配列にハイブリダイズするゲノム断片が由来する遺伝子座を識別する、１組のスプリントオリゴヌクレオチドと、（ｂ）配列Ｘ及びＺを含む１つ以上のプローブであって、ｉ．配列Ｘ及びＺは、可変性ではなく、配列Ｘ’及びＺ’にハイブリダイズする、１つ以上のプローブと、（ｃ）配列Ｂの１組の遺伝子座特異的オリゴヌクレオチドと、を含み得、（ａ）の各スプリントオリゴヌクレオチドは、（ｂ）の（ｉ）プローブ配列、（ｉｉ）（ｃ）の遺伝子座特異的オリゴヌクレオチド、及び（ｉｉｉ）（ａ）のゲノム断片にハイブリダイズして、式Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｚのライゲーション可能な複合体を生成することが可能であり、配列Ｂは、隣接する配列Ａの遺伝子座を識別する。一部の実施形態において、（ｂ）の１つ以上のプローブは、配列Ｘを含む第１のオリゴヌクレオチドと、配列Ｙを含む第２のオリゴヌクレオチドと、を含む。一部の実施形態において、キットは、配列Ｘ及びＹを含む１つ以上のプローブにハイブリダイズする１対のＰＣＲプライマをさらに含み得る。ある特定の実施形態において、（ｂ）の１つ以上のプローブは、式Ｘ−Ｙ−Ｚのバックボーンプローブであり、ライゲーション可能な複合体は、式Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｚ−Ｙの環状のライゲーション可能な複合体であり、式中、配列Ｙは配列Ｘ及びＺに接合し、配列Ｂは隣接する配列Ａの遺伝子座を識別する。これらの実施形態において、キットは、バックボーンプローブの配列にハイブリダイズするローリングサークル増幅プライマをさらに含み得る。これらの実施形態において、キットは、複数の区別可能に標識されたオリゴヌクレオチドを含み得、区別可能に標識されたオリゴヌクレオチドの各々は、Ｂ’配列の補体にハイブリダイズする。キットは、ローリングサークル増幅を行うために、リガーゼ及び／または鎖置換ポリメラーゼをさらに含有し得る。
【０１２９】
キットの種々の構成成分は、別個の容器に存在し得るか、またはある特定の適合構成成分（例えば、第１及び第２の組のスプリントプローブ、ならびに第１及び第２の遺伝子座特異的プローブ）は、所望に応じて、単一の容器に予め混合され得る。
【０１３０】
上述の構成成分に加えて、対象キットは、キットの構成成分を使用して対象方法を実践するための指示書をさらに含み得る。
【実施例】
【０１３１】
以下の実施例は、当業者に本発明をどのように作製及び使用するかのさらなる開示及び説明を提供するために提示され、発明者が彼らの発明と見なすものの範囲を制限することを意図せず、またそれらは以下の実験が全てまたは行われた唯一の実験であることを表すことも意図しない。
【０１３２】
実施例Ｉ
初期データ検証方法
本実験の目的は、染色体特異的（例えば、ＷＯ２０１５／０８３００１及びＷＯ２０１５／０８３００２に記載されるように、第１の染色体、例えば染色体２１からの断片を捕捉するために使用されたバックボーンオリゴヌクレオチドは、第２の染色体、例えば染色体１８からの断片を捕捉するために使用されたバックボーンオリゴヌクレオチドとは異なる）であるバックボーンオリゴヌクレオチドを使用する方法を、同じバックボーンオリゴヌクレオチドが検査される全ての染色体に使用される方法と比較することである。これは図６に図示される。示されるように、「新」設計において、クローニングされた断片源は、標的断片として同じ環状生成物内にクローニングされる染色体特異的配列（例えば、ＡまたはＢ）を使用して判定される。新しい方法では、単一のバックボーンオリゴヌクレオチドが使用され（従来の方法における複数のバックボーンオリゴヌクレオチドと比較して）、全ての染色体からのクローニングされた断片は同じＲＣＡプライマまたは１対のＰＣＲプライマを使用して増幅され得る。
【０１３３】
細胞系ＤＮＡ（１０ｎｇ）を、消化変性し、「旧」及び「新」プローブ設計にハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション及びライゲーション後、ライゲーション反応をエキソヌクレアーゼ処理して、溶液中のいずれの非環状ＤＮＡを除去した。残りの環状生成物は、ＲＣＡ反応においてテンプレートとして機能し、この反応は環状生成物の鎖状体のコピーを生成した。これらのＲＣＡ生成物を、「スプリント」配列に対して相補的な蛍光標識されたオリゴヌクレオチドで標識し、検出のために固体支持体に付着させた。
【０１３４】
妊婦からの１３のｃｆＤＮＡ試料は、上述と同じ反応を経た。
【０１３５】
全ての反応に関して、個々の物体（ＲＣＡ生成物）の数は各色において計数された。色Ａ／Ｂにおける物体の数の比率は各試料に関して計算され、変動係数はアッセイの精度の尺度として計算された。低変動係数は、低胎児分画での試料の正確な測定を可能にする。これは、低スパイクイン量のトリソミー２１細胞系試料を含有する試料を添加することによって図示された。
【０１３６】
図７に示されるデータによると、新設計は、細胞系ＤＮＡ及びｃｆＤＮＡの両方においてより低いＣＶを生成し、染色体異常を有する胎児ＤＮＡの正確な測定を可能にする。
【０１３７】
いかなる特定の理論にも拘束されることを望むわけではないが、本方法は、試料中の不純物にあまり感受性ではない可能性があると考えられる。
【０１３８】
実施例ＩＩ
臨床試料の分析
２６の正常な妊娠した個体及びトリソミー２１を有する胎児を妊娠する４つの個体からｃｆＤＮＡ試料を調製した。各親からの血液（１０ｍｌ）を遠心分離して、赤血球及び軟膜から血漿を分離した。対応する血漿（約３〜５ｍｌ／患者）をビーズに基づくＤＮＡ抽出プロトコルに曝し、５０ｕｌの緩衝液に希釈された抽出されたｃｆＤＮＡを得た。
【０１３９】
次に、ｃｆＤＮＡを、上述の本明細書の方法に曝し、蛍光顕微鏡を使用して、ローリングサークル生成物を電子計数することによって分析した。４つ全ての陽性症例が３を超えるｚスコアを超えて検出された。正常な試料のＣＶは、０．４９％と計算され、アッセイの高い精度を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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