(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝的に修飾されたイヌ結晶性フラグメント領域（ｃＦｃ領域）の変異体又は前記ｃＦｃ領域の変異体を含むイヌ化抗体であって、
前記ｃＦｃ領域の変異体は、Ｄ３１ＡおよびＮ６３Ａの２つのアミノ酸置換を含有する配列番号：１３０および配列番号：１３２から成る群より選択されるアミノ酸配列を含有する、遺伝的に修飾されたイヌ結晶性フラグメント領域の変異体又はイヌ化抗体。
【請求項２】
３つの更なるアミノ酸置換：Ｐ４Ａ、Ａ９３ＧおよびＰ９５Ａを含有することによって、以下の５つの置換：Ｐ４Ａ、Ｄ３１Ａ、Ｎ６３Ａ、Ａ９３ＧおよびＰ９５Ａを含む、請求項１に記載の修飾されたｃＦｃ領域の変異体又は前記修飾されたｃＦｃ領域の変異体を含むイヌ化抗体。
【請求項３】
前記イヌ化抗体がイヌプログラム死受容体１（イヌＰＤ−１）に特異的に結合する、請求項１又は２に記載のイヌ化抗体。
【請求項４】
前記ｃＦｃ領域が、配列番号：１０９、配列番号：１１０、配列番号：１１１および配列番号：１１２から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むヒンジ領域をさらに含有する、請求項３に記載のイヌ化抗体。
【請求項５】
配列番号：２９のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＶＨ  ＣＤＲ１）；
配列番号：３３のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＶＨ  ＣＤＲ２）；
配列番号：３８のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＶＨ  ＣＤＲ３）；
配列番号：１５のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＶＬ  ＣＤＲ１）；
配列番号：１８のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＶＬ  ＣＤＲ２）；および
配列番号：２４のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＶＬ  ＣＤＲ３）をさらに含有するか、または、
配列番号：２７のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＶＨ  ＣＤＲ１）；
配列番号：３１のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＶＨ  ＣＤＲ２）；
配列番号：３６のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＶＨ  ＣＤＲ３）；
配列番号：１３のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＶＬ  ＣＤＲ１）；
配列番号：１９のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＶＬ  ＣＤＲ２）；および
配列番号：２５のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＶＬ  ＣＤＲ３）をさらに含有する、請求項３に記載のイヌ化抗体。
【請求項６】
配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むイヌ重鎖および
配列番号：７２、配列番号：７８から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むイヌ軽鎖を含有し、
前記配列番号：４０において、アミノ酸位置２３９にはプロリン残基、アミノ酸位置２６６にはアラニン残基、アミノ酸位置２９８にはアラニン残基、アミノ酸位置２９９にはグリシン残基、アミノ酸位置３００にはトレオニン残基、アミノ酸位置３２８にはアラニン残基、アミノ酸位置３３０にはプロリン残基があり、
前記配列番号４２において、アミノ酸位置２３７にはプロリン残基、アミノ酸位置２６４にはアラニン残基、アミノ酸位置２９６にはアラニン残基、アミノ酸位置２９７にはグリシン残基、アミノ酸位置２９８にはトレオニン残基、アミノ酸位置３２６にはアラニン残基、アミノ酸位置３２８にはプロリン残基があり、
前記配列番号４４において、アミノ酸位置２４４にはプロリン残基、アミノ酸位置２７１にはアラニン残基、アミノ酸位置３０３にはアラニン残基、アミノ酸位置３０４にはグリシン残基、アミノ酸位置３０５にはトレオニン残基、アミノ酸位置３３３にはアラニン残基、アミノ酸位置３３５にはプロリン残基があり、
前記配列番号４６において、アミノ酸位置２４２にはプロリン残基、アミノ酸位置２６９にはアラニン残基、アミノ酸位置３０１にはアラニン残基、アミノ酸位置３０２にはグリシン残基、アミノ酸位置３０３にはトレオニン残基、アミノ酸位置３３１にはアラニン残基、アミノ酸位置３３３にはプロリン残基がある、請求項５に記載のイヌ化抗体。
【請求項７】
以下の特性：
（ｉ）１×１０−５Ｍから１×１０−１２Ｍの解離定数（Ｋｄ）でイヌＰＤ−１に結合する；
（ｉｉ）１×１０２Ｍ−１秒−１から１×１０７Ｍ−１秒−１のオン速度（ｋｏｎ）でイヌＰＤ−１に結合する；
（ｉｉｉ）１×１０−３秒−１から１×１０−８秒−１のオフ速度（ｋｏｆｆ）でイヌＰＤ−１に結合する；
（ｉｖ）腫瘍または病原体に対する抗原特異的記憶応答を刺激する；
（ｖ）インビボで抗体応答を刺激する；および
（ｖｉ）動物被験体における免疫応答を刺激する
のうちの１、２、３、４、５または全部を示す、請求項３に記載のイヌ化抗体。
【請求項８】
イヌＰＤ−１に結合する際に、前記抗体が、配列番号：１３８、配列番号：１３９、配列番号：１４０、配列番号：１４１、配列番号：１４２、配列番号：１４３、配列番号：１４４および配列番号：１４５から成る群より選択される１またはそれ以上のアミノ酸配列内の少なくとも１個のアミノ酸残基に結合し、
前記抗体がイヌＰＤ−１に結合し、イヌＰＤ−１のイヌプログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）への結合をブロックする、請求項３に記載のイヌ化抗体。
【請求項９】
前記抗体が、配列番号：１１４のＲ６２、Ｒ６９、Ｒ７２、Ｒ７５およびＲ９０から成る群より選択される１個またはそれ以上のアミノ酸残基に結合する、請求項８に記載のイヌ化抗体。
【請求項１０】
請求項５に記載のイヌ化抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸を含有する発現ベクター。
【請求項１２】
請求項５に記載のイヌ化抗体と、医薬的に許容される担体または希釈剤とを含有する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年７月３０日出願の米国特許仮出願第６２／０３０，８１２号、２０１３年１２月２０日出願の米国特許仮出願第６１／９１８，８４７号および２０１４年１２月２０日出願の米国特許仮出願第６１／９１８，９４６号の優先権を主張するものであり、これらすべての内容が全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、特定の性質を有するイヌ化抗体に関する。本発明はまた、特定の配列を有し、およびイヌＰＤ−１に高い結合親和性を有する、イヌＰＤ−１に対するイヌ化抗体に関する。本発明はさらに、癌の処置を含む、イヌの処置における本発明の抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
イヌ抗体（免疫グロブリンＧまたはＩｇＧとも称される）は、約１５０Ｋｄの大きな四量体タンパク質である。各々のＩｇＧタンパク質は、それぞれ約２５Ｋｄの２本の同一の軽鎖およびそれぞれ約５０Ｋｄの２本の同一の重鎖から成る。イヌＩｇＧの４つの公知のＩｇＧ重鎖サブクラスが存在し、それらはＩｇＧＡ、ＩｇＧＢ、ＩｇＧＣおよびＩｇＧＤと称される。２種類の軽鎖：κ鎖およびλ鎖が存在する。κ軽鎖およびλ軽鎖の各々は、１つの可変ドメイン（ＶＬ）および１つの定常ドメイン（ＣＬ）から成る。２本の重鎖の各々は、１つの可変ドメイン（ＶＨ）ならびにＣＨ−１、ＣＨ−２およびＣＨ−３と称される３つの定常ドメインから成る。ＣＨ−１ドメインは、「ヒンジ」または選択的に「ヒンジ領域」と称されるアミノ酸配列によってＣＨ−２ドメインに連結されている。ヒトでは、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４と称される４つのサブクラスの１つに存在する。ＩｇＧのサブクラスは主としてヒンジ領域の配列によって決定され、ヒンジ領域の配列はＩｇＧの４つのサブクラスの間で異なる。２本の重鎖はジスルフィド結合によって互いに連結され、各々の重鎖は同じくジスルフィド結合を介して軽鎖の１つに連結されている。
【０００４】
酵素のパパインでのＩｇＧ抗体の消化はヒンジ領域で抗体分子を切断し、３つのフラグメントの形成をもたらす。これらのフラグメントのうち２つは同一であり、各々は、重鎖のＶＨおよびＣＨ１ドメインと結合された軽鎖から成る。これらのフラグメントは「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれ、抗体の抗原結合部位を含有する。パパインでの消化から生じる３番目のフラグメントは「Ｆｃ」と呼ばれ、ジスルフィド結合によって結び付けられた２本の重鎖の残りの部分を含有する。したがってＦｃは、２本の重鎖の各々のＣＨ２およびＣＨ３ドメインから成る二量体を含有する。Ｆａｂは、抗体がその同種エピトープに結合することを可能にし、一方Ｆｃは、抗体が免疫エフェクター機能、例えば抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性食作用（ＡＤＣＰ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を媒介することを可能にする。
【０００５】
ＩｇＧ抗体は、そのＦｃ部分がＦｃγ受容体として知られるタンパク質のファミリーに結合することを通してＡＤＣＣおよびＡＤＣＰなどのエフェクター機能を媒介することは当分野で周知であるが、ＣＤＣは、補体の第一成分、Ｃ１ｑへのＦｃの結合を通して媒介される。異なるＩｇＧサブクラスはこれらのエフェクター機能を媒介する能力が異なることも当分野で周知である。例えば、ヒトＩｇＧ１は強力なＡＤＣＣおよびＣＤＣを示し、ＩｇＧ４は弱いＡＤＣＣおよびＣＤＣを示すかまたはＡＤＣＣおよびＣＤＣを全く示さない。加えて、いずれのＩｇＧサブクラスがエフェクター機能を示すかまたは欠如しているかを同定するための方法は当分野で周知である。
【０００６】
治療目的でのモノクローナル抗体の使用に基づくアプローチは、所望の治療応答を達成するための目的にかなった抗体または抗体フラグメントの設計を必要とする。例えば、癌のための一部の治療アプローチは、治療用抗体が増強されたエフェクター機能を有することを必要とし、また別のアプローチは、エフェクター機能が有意に低いまたはエフェクター機能が完全に除去されていることを必要とする。エフェクター機能の増強または除去は、Ｆｃγ受容体および補体の第一成分への結合を増強または低減するために抗体のＦｃ部分に１またはそれ以上のアミノ酸突然変異（置換）を導入することを通して達成され得る。抗体のエフェクター機能を改変するために抗体分子に導入され得るアミノ酸置換を述べた、先行技術の数多くの報告がある。例えばＳｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，［Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（９）：６５９１−６６０４（２００１）］は、アスパラギンのアラニンへの（Ｎ２９７Ａ）置換を開示しており、これは非グリコシル化抗体をもたらし、いくつかのＦｃγ受容体への抗体結合を有意に低減させた。加えて、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，は、アスパラギン酸のアラニンへの（Ｄ２６５Ａ）置換もＦｃγ受容体への抗体の結合を有意に低減させることを開示した。Ｎ２９７ＡおよびＤ２６５Ａ置換の各々はＣＤＣも有意に低下させることが示された。抗体におけるエフェクター機能を低減または除去する潜在的な置換を同定する他の同様の報告が存在する［例えばＳａｚｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０５：２０１６７−２０１７２（２００８）、Ａｌｅｇｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，５７：１５３７−１５４３（１９９４）、Ｈｕｔｃｈｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９２：１１９８０−１１９８４（１９９４）、ＭｃＥａｒｃｈｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０９：１１８５−１１９２（２００７）］。
【０００７】
主として活性化ＴおよびＢ細胞上で発現される免疫阻害性受容体である、プログラム死受容体１（ＰＤ−１）とも称されるプログラム細胞死受容体１は、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４に関連する免疫グロブリンスーパーファミリーの成員である。ＰＤ−１および同様のファミリー成員は、そのリガンドに結合する細胞外Ｉｇ可変型（Ｖ型）ドメインおよびシグナル伝達分子に結合する細胞質尾部を含有するＩ型膜貫通糖タンパク質である。ＰＤ−１の細胞質尾部は２つのチロシンベースのシグナル伝達モチーフ、ＩＴＩＭ（免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ）およびＩＴＳＭ（免疫受容体チロシンベーススイッチモチーフ）を含有する。
【０００８】
ＰＤ−１は、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）とも称されるプログラム細胞死リガンド１および／またはプログラム死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）とも称されるプログラム細胞死リガンド２に結合した場合、Ｔ細胞応答を減弱させる。これらのリガンドのいずれかのＰＤ−１への結合は抗原受容体シグナル伝達を負に調節する。ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合をブロックすることは、免疫系による腫瘍細胞のクリアランスを助けつつ、腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫を増強する。マウスＰＤ−１の三次元構造ならびにヒトＰＤ−Ｌ１とマウスＰＤ−１の共結晶構造が報告されている［Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２０：３３７−３４７（２００４）；Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０５：３０１１−３０１６（２００８）］。
【０００９】
ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２は、公知のシグナル伝達モチーフを有さない短い細胞質領域と共に細胞外領域内にＩｇＶ様ドメインおよびＩｇＣ様ドメインの両方を含むＩ型膜貫通リガンドである。ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２はどちらも、構成的に発現されるかまたは非造血組織ならびに種々の腫瘍型を含む様々な細胞型において誘導され得る。ＰＤ−Ｌ１はＢ細胞、Ｔ細胞、骨髄性細胞および樹状細胞（ＤＣ）上で発現されるだけでなく、末梢細胞、例えば微小血管内皮細胞および非リンパ系器官、例えば心臓または肺でも発現される。これに対し、ＰＤ−Ｌ２はマクロファージおよびＤＣ上でのみ認められる。ＰＤ−１リガンドの発現パターンは、ＰＤ−１が末梢性免疫寛容を維持するうえで役割を果たし、さらに末梢における自己反応性Ｔ細胞およびＢ細胞応答を調節するのに役立ち得ることを示唆する。
【００１０】
いずれの場合も、ＰＤ−１が、おそらく免疫回避を媒介することにより、少なくとも特定のヒト癌において非常に重要な役割を果たすことは今や極めて明らかである。したがって、ＰＤ−Ｌ１は多くのマウスおよびヒト腫瘍で発現されることが示されており、ＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍細胞株の大部分ではＩＦＮ−γによって誘導され得る［Ｉｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：１２２９３−１２２９７（２００２）；Ｓｔｒｏｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６３：６５０１−６５０５（２００３）］。さらに、リンパ球に浸潤する腫瘍でのＰＤ−１の発現および／または腫瘍細胞でのＰＤ−Ｌ１の発現は、多数の原発性ヒト腫瘍生検において同定されている。そのような腫瘍組織としては、肺、肝臓、卵巣、子宮頸、皮膚、結腸、神経膠腫、膀胱、乳房、腎臓、食道、胃、口腔扁平上皮細胞、尿路上皮細胞および膵臓の癌ならびに頭頸部の腫瘍が含まれる［Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：１２５７−１２６６（２００３）；Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：７９３−８００（２００２）；Ｗｉｎｔｔｅｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：７４６２−７４６７（２００３）；Ｓｔｒｏｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６３：６５０１−６５０５（２００３）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６：３３８１−５（２００６）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１３：１７５７−１７６１（２００７）；Ｎｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１３：２１５１−２１５７．（２００７）］。より顕著には、腫瘍細胞でのＰＤリガンドの発現は複数の腫瘍型にわたってヒト癌患者の予後不良と相関している［Ｏｋａｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｈｏｎｊｏ，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：８１３−８２４（２００７）において総説されている］。
【００１１】
さらに、Ｎｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ．［Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１３：２１５１−２１５７．（２００７）］は、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に対する抗体を投与することを介して、侵襲性膵癌のマウスモデルにおいてＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合をブロックすることの治療効果を明らかにした。これらの抗体は、腫瘍反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍への浸潤を有効に促進し、ＩＦＮ−γ、グランザイムＢおよびパーフォリンを含む抗腫瘍エフェクターの上方調節を生じさせた。同様に、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−１の結合をブロックする抗体の使用は、マウス扁平上皮癌のモデルにおいて腫瘍増殖を有意に阻害した［Ｔｓｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒａｌ  Ｏｎｃｏｌ．４２：２６８−２７４（２００６）］。
【００１２】
他の研究において、ＰＤ−Ｌ１でのマウス肥満細胞腫株のトランスフェクションは、腫瘍特異的ＣＴＬクローンと共培養した場合、腫瘍細胞の溶解の減少をもたらした。抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体を添加した場合、溶解が回復した［Ｉｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：１２２９３−１２２９７（２００２）］。インビボでは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用をブロックすることは、マウス腫瘍モデルにおいて養子Ｔ細胞移入療法の効果を増大させることが示された［Ｓｔｒｏｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：６５０１−６５０５（２００３）］。癌処置におけるＰＤ−１の役割についてのさらなる証拠は、ＰＤ−１ノックアウトマウスで実施された実験によってもたらされ、この実験では、ＰＤ−Ｌ１を発現する骨髄腫細胞は野生型動物においてのみ増殖し（腫瘍増殖および関連する動物死を生じさせる）、ＰＤ−１欠損マウスでは増殖しなかった［Ｉｗａｉ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：１２２９３−１２２９７（２００２）］。ごく最近、ＰＤ−１に対する抗体（ヒトＰＤ−１に対するヒト化マウスモノクローナル抗体を含む）が、ヒトでの癌療法において少なくとも初期の成功を示した［例えば米国特許第８，３５４，５０９号、米国特許第８，００８，４４９号および米国特許第７，５９５，０４８号参照］。
【００１３】
抗ＰＤ−１抗体はまた、慢性ウイルス感染においても有用であり得る。急性ウイルス感染後に生成された記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞は高度に機能性であり、防御免疫の重要な成分を構成する。これに対し、慢性感染はしばしばウイルス特異的Ｔ細胞応答の様々な程度の機能障害（疲弊）を特徴とし、この欠陥が、宿主が残存する病原体を除去できないことの主たる理由である。機能性エフェクターＴ細胞は感染の初期段階で最初に生成されるが、慢性感染の過程でそれらは徐々に機能を喪失する。Ｂａｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．［Ｎａｔｕｒｅ  ４３９：６８２−６８７（２００６）］は、ＬＣＭＶの研究室株に感染させたマウスが、血液および他の組織中で高レベルのウイルスを生じさせる慢性感染を発症することを示した。これらのマウスは、最初は堅固なＴ細胞応答を発現したが、Ｔ細胞の疲弊後最終的には感染に屈した。Ｂａｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．は、慢性感染マウスにおけるエフェクターＴ細胞の数および機能の低下を、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用をブロックする抗体を注射することによって逆転させ得ることを見出した。
【００１４】
本明細書中のいかなる参考文献の引用も、そのような参考文献が本出願の「先行技術」として使用可能であることの承認と解釈されるべきではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】米国特許第８，３５４，５０９号明細書
【特許文献２】米国特許第８，００８，４４９号明細書
【特許文献３】米国特許第７，５９５，０４８号明細書
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，［Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（９）：６５９１−６６０４（２００１）
【非特許文献２】Ｓａｚｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０５：２０１６７−２０１７２（２００８）
【非特許文献３】Ａｌｅｇｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，５７：１５３７−１５４３（１９９４）
【非特許文献４】Ｈｕｔｃｈｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９２：１１９８０−１１９８４（１９９４）
【非特許文献５】ＭｃＥａｒｃｈｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０９：１１８５−１１９２（２００７）
【非特許文献６】Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２０：３３７−３４７（２００４）
【非特許文献７】Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０５：３０１１−３０１６（２００８）
【非特許文献８】Ｉｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：１２２９３−１２２９７（２００２）
【非特許文献９】Ｓｔｒｏｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６３：６５０１−６５０５（２００３）
【非特許文献１０】Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：１２５７−１２６６（２００３）
【非特許文献１１】Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：７９３−８００（２００２）
【非特許文献１２】Ｗｉｎｔｔｅｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：７４６２−７４６７（２００３）
【非特許文献１３】Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６：３３８１−５（２００６）
【非特許文献１４】Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１３：１７５７−１７６１（２００７）
【非特許文献１５】Ｎｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１３：２１５１−２１５７．（２００７）
【非特許文献１６】Ｏｋａｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｈｏｎｊｏ，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：８１３−８２４（２００７）
【非特許文献１７】Ｔｓｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒａｌ  Ｏｎｃｏｌ．４２：２６８−２７４（２００６）
【非特許文献１８】Ｂａｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４３９：６８２−６８７（２００６）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、抗体のイヌ結晶性フラグメント領域（ｃＦｃ領域）が１またはそれ以上のエフェクター機能を増大させる、減少させるまたは除去するように遺伝的に修飾されている、抗体のｃＦｃ領域を提供する。本発明の１つの態様では、遺伝的に修飾されたｃＦｃは１またはそれ以上のエフェクター機能を減少させるまたは除去する。本発明の別の態様では、遺伝的に修飾されたｃＦｃは１またはそれ以上のエフェクター機能を増大させる。
【００１８】
ある実施形態では、遺伝的に修飾されたｃＦｃ領域は、遺伝的に修飾されたイヌＩｇＧＢ  Ｆｃ領域である。別のそのような実施形態では、遺伝的に修飾されたｃＦｃ領域は、遺伝的に修飾されたイヌＩｇＧＣ  Ｆｃ領域である。特定の実施形態では、エフェクター機能は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）であり、これが増大、減少または除去されている。別の実施形態では、エフェクター機能は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）であり、これが増大、減少または除去されている。さらに別の実施形態では、ｃＦｃ領域は、ＡＤＣＣおよびＣＤＣの両方を増大させる、減少させるまたは除去するように遺伝的に修飾されている。
【００１９】
本発明はさらに、遺伝的に修飾されたｃＦｃ領域を含有するイヌフレームおよび／または完全長重鎖を提供する。したがって、本発明は、完全長重鎖が本発明の遺伝的に修飾されたｃＦｃ領域を含有する、抗体の完全長重鎖を提供する。そのような完全長重鎖はまた、対応するイヌ軽鎖（κまたはλ鎖）と結合して完全な抗体を形成することもできる。この種の特定の実施形態では、生じる抗体は特定のイヌ抗原に特異的に結合する。あるそのような実施形態では、イヌ抗原はイヌＰＤ−１である。さらに他の実施形態では、イヌ抗原はイヌＰＤ−Ｌ１である。さらに他の実施形態では、イヌ抗原はＩＬ−４受容体のα鎖である。さらに他の実施形態では、イヌ抗原は、イヌ胸腺間質性リンパ球新生因子タンパク質（ｃＴＳＬＰ）である［例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，７１８，７７２号参照］。
【００２０】
ある実施形態では、遺伝的に修飾されたｃＦｃ領域は、以下のアミノ酸残基：Ｐ４、Ｄ３１、Ｎ６３、Ｇ６４、Ｔ６５、Ａ９３またはＰ９５の１個から７個が指示されている位置で別のアミノ酸残基によって置き換えられている配列番号：１３０（または配列番号：１３２）のアミノ酸配列を含有する。Ｐ４、Ｄ３１、Ｎ６３、Ｇ６４、Ｔ６５、Ａ９３および／またはＰ９５を置換するアミノ酸は、以下の表１に列挙する、その他の１９個の標準的な天然に存在するアミノ酸の１つから個別に選択される。本発明はさらに、そのような遺伝的に修飾されたｃＦｃ領域のアミノ酸配列と９０％、９５％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含有し、ならびに以下のアミノ酸残基、すなわちＰ４、Ｄ３１、Ｎ６３、Ｇ６４、Ｔ６５、Ａ９３またはＰ９５の１個またはそれ以上が置換された配列番号：１３０（または配列番号：１３２）のアミノ酸配列を含有する遺伝的に修飾されたｃＦｃ領域としてＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣの少なくとも５０％、７５％、９０％、９５％またはそれ以上の増大、減少または除去を保持する、遺伝的に修飾されたｃＦｃ領域の変異体を提供する。
【００２１】
他の実施形態では、以下のアミノ酸残基：Ｐ４、Ｄ３１、Ｎ６３、Ｇ６４、Ｔ６５、Ａ９３またはＰ９５の２個から５個が指示されている位置で別のアミノ酸残基によって置き換えられている。この種の特定の実施形態では、遺伝的に修飾されたｃＦｃ領域は、以下の置換：Ｐ４Ａ、Ｄ３１Ａ、Ｎ６３Ａ、Ａ９３ＧおよびＰ９５Ａを有する配列番号：１３０または配列番号：１３２のアミノ酸配列を含有する。関連実施形態では、遺伝的に修飾されたｃＦｃ領域は、以下の置換：Ｐ４Ａ、Ｄ３１Ａ、Ｎ６３ＡおよびＰ９５Ａを有する配列番号：１３０または配列番号：１３２のアミノ酸配列を含有する。他の実施形態では、遺伝的に修飾されたｃＦｃ領域は、Ｄ３１およびＮ６３における置換を有する配列番号：１３０または配列番号：１３２のアミノ酸配列を含有する。この種の特定の実施形態では、３１位のアスパラギン酸残基はグルタミン酸残基、アスパラギン残基またはアラニン残基で置換され、６３位のアスパラギン残基はグルタミン残基、ヒスチジン残基またはアラニン残基で置換されている。この種のより特定の実施形態では、遺伝的に修飾されたｃＦｃ領域は、以下の置換：Ｄ３１ＡおよびＮ６３Ａを有する配列番号：１３０または配列番号：１３２のアミノ酸配列を含有する。特定の実施形態では、遺伝的に修飾されたｃＦｃ領域は、配列番号：１２９または配列番号：１３１のヌクレオチド配列によってコードされ、前記ヌクレオチド配列は、それらがコードするアミノ酸配列に対応するヌクレオチド変化を含有する。
【００２２】
別の実施形態では、遺伝的に修飾されたｃＦｃ領域は、Ａ９３に置換を有する配列番号：１３０または配列番号：１３２のアミノ酸配列を含有する。この種の特定の実施形態では、置換はＡ９３Ｇである。関連実施形態では、置換はＡ９３Ｓである。以下の実施例４で示すように、Ａ９３Ｇの置換は、ＣＤＣ活性を増大させることを示す、補体Ｃ１ｑ結合の増強をもたらす。
【００２３】
関連実施形態では、遺伝的に修飾されたｃＦｃ領域は、配列番号：１０９のアミノ酸配列を含むヒンジ領域をさらに含有する。他の実施形態では、遺伝的に修飾されたＦｃ領域は、配列番号：１１０のアミノ酸配列を含むヒンジ領域をさらに含有する。さらに他の実施形態では、遺伝的に修飾されたＦｃ領域は、配列番号：１１１のアミノ酸配列を含むヒンジ領域をさらに含有する。さらに他の実施形態では、遺伝的に修飾されたＦｃ領域は、配列番号：１１２のアミノ酸配列を含む遺伝的に修飾されたヒンジ領域をさらに含有する。
【００２４】
選択的な実施形態では、本発明は、イヌＩｇＧＤ抗体由来の遺伝的に修飾されたヒンジ領域、イヌＩｇＧＡ抗体由来のヒンジ領域、イヌＩｇＧＢ抗体由来のヒンジ領域、またはイヌＩｇＧＣ抗体由来のヒンジ領域を有するイヌＩｇＧＤ  Ｆｃ領域を提供する。さらに、本発明は、抗体の完全長重鎖が、イヌＩｇＧＤ抗体由来の遺伝的に修飾されたヒンジ領域、イヌＩｇＧＡ抗体由来のヒンジ領域、イヌＩｇＧＢ抗体由来のヒンジ領域、またはイヌＩｇＧＣ抗体由来のヒンジ領域を有する本発明のイヌＩｇＧＤ  Ｆｃ領域を含有する、抗体の完全長重鎖を提供する。そのような完全長重鎖はまた、対応するイヌ軽鎖（κまたはλ鎖）と結合して完全な抗体を形成することもできる。
【００２５】
したがって、本発明は、イヌＩｇＧＤ抗体由来の遺伝的に修飾されたヒンジ領域をさらに含有するイヌＩｇＧＤ  Ｆｃ領域を提供する。この種の特定の実施形態では、イヌＩｇＧＤ  Ｆｃ領域および遺伝的に修飾されたヒンジ領域は、１０位にプロリン残基（Ｐ１０）を含む、配列番号：６のアミノ酸配列または配列番号：６のアミノ酸配列と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含有する。より特定の実施形態では、イヌＩｇＧＤ  Ｆｃ領域および遺伝的に修飾されたヒンジ領域は、配列番号：５のヌクレオチド配列によってコードされる。他の実施形態では、イヌＩｇＧＤ  Ｆｃ領域は、イヌＩｇＧＡ抗体由来のヒンジ領域をさらに含有する。この種の特定の実施形態では、イヌＩｇＧＤ  Ｆｃ領域およびヒンジ領域は、配列番号：８のアミノ酸配列または配列番号：８のアミノ酸配列と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含有する。より特定の実施形態では、イヌＩｇＧＤ  Ｆｃ領域およびヒンジ領域は、配列番号：７のヌクレオチド配列によってコードされる。さらに他の実施形態では、イヌＩｇＧＤ  Ｆｃ領域は、イヌＩｇＧＢ抗体由来のヒンジ領域をさらに含有する。この種の特定の実施形態では、イヌＩｇＧＤ  Ｆｃ領域およびヒンジ領域は、配列番号：１０のアミノ酸または配列番号：１０のアミノ酸配列と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含有する。より特定の実施形態では、イヌＩｇＧＤ  Ｆｃ領域およびヒンジ領域は、配列番号：９のヌクレオチド配列によってコードされる。さらに他の実施形態では、イヌＩｇＧＤ  Ｆｃ領域は、イヌＩｇＧＣ抗体由来のヒンジ領域をさらに含有する。この種の特定の実施形態では、イヌＩｇＧＤ  Ｆｃ領域およびヒンジ領域は、配列番号：１２のアミノ酸配列または配列番号：１２のアミノ酸配列と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含有する。より特定の実施形態では、イヌＩｇＧＤ  Ｆｃ領域およびヒンジ領域は、配列番号：１１のヌクレオチド配列によってコードされる。本発明はさらに、これらのイヌＩｇＧＤ  Ｆｃ領域およびヒンジ領域を含有するイヌ化抗体を提供する。特定の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、イヌプログラム死受容体１（イヌＰＤ−１）に特異的に結合する。
【００２６】
本発明は、それゆえ、イヌＰＤ−１に特異性を有するおよび／またはイヌＰＤ−１に高い結合親和性を有するイヌ化抗イヌＰＤ−１抗体を提供する。特定の実施形態では、イヌ化抗イヌＰＤ−１抗体はまた、イヌＰＤ−１のイヌＰＤ−Ｌ１への結合をブロックする能力も備える。具体的な実施形態では、イヌ化抗イヌＰＤ−１抗体は、イヌＰＤ−１に高い結合親和性を有し、ならびにイヌＰＤ−１のイヌＰＤ−Ｌ２への結合もブロックする能力を備える。イヌＰＤ−１に特異的に結合するイヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、本発明のイヌＩｇＧ重鎖およびイヌκまたはλ軽鎖を含有し得る。特定の実施形態では、イヌ化抗イヌＰＤ−１抗体は、イヌ化マウス抗イヌＰＤ−１抗体である。本発明はまた、癌および／または感染に起因する疾患などの疾患の処置におけるそのようなイヌ化抗体の使用に関する。
【００２７】
特定の実施形態では、イヌ化抗イヌＰＤ−１抗体は、本発明の遺伝的に修飾されたｃＦｃ領域を含有する。選択的な実施形態では、イヌ化抗イヌＰＤ−１抗体は、イヌＩｇＧＤ抗体由来の遺伝的に修飾されたヒンジ領域、イヌＩｇＧＡ抗体由来のヒンジ領域、イヌＩｇＧＢ抗体由来のヒンジ領域、またはイヌＩｇＧＣ抗体由来のヒンジ領域を有するイヌＩｇＧＤ  Ｆｃ領域を含有する。本発明はさらに、マウス抗イヌＰＤ−１抗体から得たＣＤＲ、すなわち３つの軽鎖ＣＤＲ：ＣＤＲ軽鎖１（ＣＤＲＬ１）、ＣＤＲ軽鎖２（ＣＤＲＬ２）およびＣＤＲ軽鎖３（ＣＤＲＬ３）ならびに３つの重鎖ＣＤＲ：ＣＤＲ重鎖１（ＣＤＲＨ１）、ＣＤＲ重鎖２（ＣＤＲＨ２）およびＣＤＲ重鎖３（ＣＤＲＨ３）と組み合わせて本発明のイヌフレームを含有するそのようなイヌ化抗イヌＰＤ−１抗体を提供する。
【００２８】
特定の実施形態では、イヌ化マウス抗イヌＰＤ−１抗体は、本発明のＩｇＧＢまたはＩｇＧＣの遺伝的に修飾されたｃＦｃ領域あるいはイヌＩｇＧＤ  Ｆｃ領域を、マウス抗イヌＰＤ−１抗体から得たＣＤＲと組み合わせたイヌＩｇＧＤ抗体由来の遺伝的に修飾されたヒンジ領域、イヌＩｇＧＡ抗体由来のヒンジ領域、イヌＩｇＧＢ抗体由来のヒンジ領域、またはイヌＩｇＧＣ抗体由来のヒンジ領域と共に含有する。さらに、本発明は、本明細書で詳述する特異的ＣＤＲを有するイヌ化マウス抗イヌＰＤ−１抗体を提供するだけでなく、さらにそれらのＣＤＲの保存的に修飾された変異体ならびに同じ正準構造を有する（例えば共有する）変異体を含有するイヌ化マウス抗イヌＰＤ−１抗体も提供する。
【００２９】
したがって特定の実施形態では、イヌ化抗イヌＰＤ−１抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）が、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に関してそれぞれＨ１−１、Ｈ２−１およびＨ３−６の正準構造を有する、すなわち重鎖のＣＤＲ１が正準構造クラス１を有し、重鎖のＣＤＲ２が正準構造クラス１を有し、および重鎖のＣＤＲ３が正準構造クラス６を有するＣＤＲをさらに含有する。さらにより特定の実施形態では、対応する軽鎖についてのＣＤＲは、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に関してそれぞれＬ１−３、Ｌ２−１およびＬ３−１の正準構造を有する。他の実施形態では、イヌ化抗イヌＰＤ−１抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）が、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に関してそれぞれＨ１−１、Ｈ２−１およびＨ３−１１の正準構造を有するＣＤＲをさらに含有する。この種のさらにより特定の実施形態では、対応する軽鎖についてのＣＤＲは、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に関してそれぞれＬ１−２Ａ、Ｌ２−１およびＬ３−１の正準構造を有する。さらに他の実施形態では、イヌ化抗イヌＰＤ−１抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）が、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に関してそれぞれＨ１−１、Ｈ２−２ＡおよびＨ３−１１の正準構造を有するＣＤＲをさらに含有する。この種のさらにより特定の実施形態では、対応する軽鎖についてのＣＤＲは、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に関してそれぞれＬ１−２Ａ、Ｌ２−１およびＬ３−１の正準構造を有する。さらに他の実施形態では、イヌ化抗イヌＰＤ−１抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）が、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に関してそれぞれＨ１−１、Ｈ２−２ＡおよびＨ３−１３の正準構造を有するＣＤＲをさらに含有する。この種のさらにより特定の実施形態では、対応する軽鎖についてのＣＤＲは、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に関してそれぞれＬ１−４、Ｌ２−１およびＬ３−１の正準構造を有する。
【００３０】
より特定の実施形態では、本発明のイヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９または配列番号：３０のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＶＨ  ＣＤＲ１）の１つまたはそれ以上を含む。別の実施形態では、重鎖相補性決定領域２（ＶＨ  ＣＤＲ２）は、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４または配列番号：３５のアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、重鎖相補性決定領域３（ＶＨ  ＣＤＲ３）は、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８または配列番号：１４６のアミノ酸配列を含む。この種の特定の実施形態では、イヌ化抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９または配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１および配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４または配列番号：３５のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２の両方を含有する。別のそのような実施形態では、イヌ化抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９または配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１および配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８または配列番号：１４６のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３の両方を含有する。さらに別のそのような実施形態では、イヌ化抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４または配列番号：３５のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２および配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８または配列番号：１４６のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３の両方を含有する。さらに別のそのような実施形態では、イヌ化抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９または配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４または配列番号：３５のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２および配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８または配列番号：１４６のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含有する。
【００３１】
特定の実施形態では、イヌ化抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号：１３、配列番号：１４または配列番号：１５のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＶＬ  ＣＤＲ１）も含有する。関連実施形態では、軽鎖相補性決定領域２（ＶＬ  ＣＤＲ２）は、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０または配列番号：２１のアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、軽鎖相補性決定領域３（ＶＬ  ＣＤＲ３）は、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５または配列番号：２６のアミノ酸配列を含む。この種の特定の実施形態では、イヌ化抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号：１３、配列番号：１４または配列番号：１５のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１および配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０または配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２の両方を含有する。
【００３２】
別のそのような実施形態では、イヌ化抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号：１３、配列番号：１４または配列番号：１５のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１および配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５または配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３の両方を含有する。さらに別のそのような実施形態では、イヌ化抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０または配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２および配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５または配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３の両方を含有する。さらに別のそのような実施形態では、イヌ化抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号：１３、配列番号：１４または配列番号：１５のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０または配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２および配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５または配列番号：２６のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含有する。
【００３３】
本発明はさらに、配列番号：４０のアミノ酸配列または配列番号：４０のアミノ酸配列と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列、配列番号：４２のアミノ酸配列または配列番号：４２のアミノ酸配列と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列、配列番号：４４のアミノ酸配列または配列番号：４４のアミノ酸配列と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列、配列番号：４６のアミノ酸配列または配列番号：４６のアミノ酸配列と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列、配列番号：４８のアミノ酸配列または配列番号：４８のアミノ酸配列と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列、配列番号：５０のアミノ酸配列または配列番号：５０のアミノ酸配列と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列、配列番号：５２のアミノ酸配列または配列番号：５２のアミノ酸配列と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列、配列番号：５４のアミノ酸配列または配列番号：５４のアミノ酸配列と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列、配列番号：５６のアミノ酸配列または配列番号：５６のアミノ酸配列と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列、配列番号：５８のアミノ酸配列または配列番号：５８のアミノ酸配列と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列、配列番号：６０のアミノ酸配列または配列番号：６０のアミノ酸配列と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列、配列番号：６２のアミノ酸配列または配列番号：６２のアミノ酸配列と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列、配列番号：６４のアミノ酸配列または配列番号：６４のアミノ酸配列と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列、配列番号：６６のアミノ酸配列または配列番号：６６のアミノ酸配列と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列、またはこれらのイヌ化抗体の抗原結合フラグメントを含有するイヌ化抗体を提供する。
【００３４】
特定の実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２３９位にＰ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｉｉ）２６６位にＡ、ＧまたはＳ、（ｉｉｉ）２９８位にＡ、ＧまたはＳ、（ｉｖ）２９９位にＧ、ＰまたはＡ、（ｖ）３００位にＴ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｖｉ）３２８位にＡ、ＧまたはＳ、および（ｖｉｉ）３３０位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを含む、配列番号：４０、５２、５６または６４（または配列番号：４０、５２、５６もしくは６４と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含有する。他の実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２３７位にＰ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｉｉ）２６４位にＡ、ＧまたはＳ、（ｉｉｉ）２９６位にＡ、ＧまたはＳ、（ｉｖ）２９７位にＧ、ＰまたはＡ、（ｖ）２９８位にＴ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｖｉ）３２６位にＡ、ＧまたはＳ、および（ｖｉｉ）３２８位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを含む、配列番号：４２、５４、５８または６６（または配列番号：４２、５４、５８もしくは６６と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２４４位にＰ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｉｉ）２７１位にＡ、ＧまたはＳ、（ｉｉｉ）３０３位にＡ、ＧまたはＳ、（ｉｖ）３０４位にＧ、ＰまたはＡ、（ｖ）３０５位にＴ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｖｉ）３３３位にＡ、ＧまたはＳ、および（ｖｉｉ）３３５位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを含む、配列番号：４４、５０または６０（または配列番号：４４、５０もしくは６０と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２４２位にＰ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｉｉ）２６９位にＡ、ＧまたはＳ、（ｉｉｉ）３０１位にＡ、ＧまたはＳ、（ｉｖ）３０２位にＧ、ＰまたはＡ、（ｖ）３０３位にＴ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｖｉ）３３１位にＡ、ＧまたはＳ、および（ｖｉｉ）３３３位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを含む、配列番号：４６または６２（または配列番号：４６もしくは６２と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２４６位にＰ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｉｉ）２７３位にＡ、ＧまたはＳ、（ｉｉｉ）３０５位にＡ、ＧまたはＳ、（ｉｖ）３０６位にＧ、ＰまたはＡ、（ｖ）３０７位にＴ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｖｉ）３３５位にＡ、ＧまたはＳ、および（ｖｉｉ）３３７位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを含む、配列番号：４８（または配列番号：４８と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含有する。
【００３５】
さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２３９位にＰ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｉｉ）２６６位にＡ、（ｉｉｉ）２９８位にＡ、（ｉｖ）２９９位にＧ、ＰまたはＡ、（ｖ）３００位にＴ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｖｉ）３２８位にＡ、ＧまたはＳ、および（ｖｉｉ）３３０位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを含む、配列番号：４０、５２、５６または６４（または配列番号：４０、５２、５６もしくは６４と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含有する。他の実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２３７位にＰ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｉｉ）２６４位にＡ、（ｉｉｉ）２９６位にＡ、（ｉｖ）２９７位にＧ、ＰまたはＡ、（ｖ）２９８位にＴ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｖｉ）３２６位にＡ、ＧまたはＳ、および（ｖｉｉ）３２８位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを含む、配列番号：４２、５４、５８または６６（または配列番号：４２、５４、５８もしくは６６と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２４４位にＰ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｉｉ）２７１位にＡ、（ｉｉｉ）３０３位にＡ、（ｉｖ）３０４位にＧ、ＰまたはＡ、（ｖ）３０５位にＴ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｖｉ）３３３位にＡ、ＧまたはＳ、および（ｖｉｉ）３３５位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを含む、配列番号：４４、５０または６０（または配列番号：４４、５０もしくは６０と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２４２位にＰ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｉｉ）２６９位にＡ、（ｉｉｉ）３０１位にＡ、（ｉｖ）３０２位にＧ、ＰまたはＡ、（ｖ）３０３位にＴ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｖｉ）３３１位にＡ、ＧまたはＳ、および（ｖｉｉ）３３３位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを含む、配列番号：４６または６２（または配列番号：４６もしくは６２と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２４６位にＰ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｉｉ）２７３位にＡ、（ｉｉｉ）３０５位にＡ、（ｉｖ）３０６位にＧ、ＰまたはＡ、（ｖ）３０７位にＴ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｖｉ）３３５位にＡ、ＧまたはＳ、および（ｖｉｉ）３３７位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを含む、配列番号：４８（または配列番号：４８と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含有する。
【００３６】
さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２３９位にＡ、（ｉｉ）２６６位にＡ、（ｉｉｉ）２９８位にＡ、（ｉｖ）２９９位にＰ、（ｖ）３００位にＡ、（ｖｉ）３２８位にＧ、および（ｖｉｉ）３３０位にＡを含む、配列番号：４０、５２、５６または６４（または配列番号：４０、５２、５６もしくは６４と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含有する。他の実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２３７位にＡ、（ｉｉ）２６４位にＡ、（ｉｉｉ）２９６位にＡ、（ｉｖ）２９７位にＰ、（ｖ）２９８位にＡ、（ｖｉ）３２６位にＧ、および（ｖｉｉ）３２８位にＡを含む、配列番号：４２、５４、５８または６６（または配列番号：４２、５４、５８もしくは６６と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２４４位にＡ、（ｉｉ）２７１位にＡ、（ｉｉｉ）３０３位にＡ、（ｉｖ）３０４位にＰ、（ｖ）３０５位にＡ、（ｖｉ）３３３位にＧ、および（ｖｉｉ）３３５位にＡを含む、配列番号：４４、５０または６０（または配列番号：４４、５０もしくは６０と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２４２位にＡ、（ｉｉ）２６９位にＡ、（ｉｉｉ）３０１位にＡ、（ｉｖ）３０２位にＰ、（ｖ）３０３位にＡ、（ｖｉ）３３１位にＧ、および（ｖｉｉ）３３３位にＡを含む、配列番号：４６または６２（または配列番号：４６もしくは６２と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２４６位にＡ、（ｉｉ）２７３位にＡ、（ｉｉｉ）３０５位にＡ、（ｉｖ）３０６位にＰ、（ｖ）３０７位にＡ、（ｖｉ）３３５位にＧ、および（ｖｉｉ）３３７位にＡを含む、配列番号：４８（または配列番号：４８と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含有する。
【００３７】
さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２３９位にＰ、（ｉｉ）２６６位にＡ、Ｇ、またはＳ、（ｉｉｉ）２９８位にＡ、ＧまたはＳ、（ｉｖ）２９９位にＧ、（ｖ）３００位にＴ、（ｖｉ）３２８位にＡ、および（ｖｉｉ）３３０位にＰを含む、配列番号：４０、５２、５６または６４（または配列番号：４０、５２、５６もしくは６４と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含有する。他の実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２３７位にＰ、（ｉｉ）２６４位にＡ、ＧまたはＳ、（ｉｉｉ）２９６位にＡ、ＧまたはＳ、（ｉｖ）２９７位にＧ、（ｖ）２９８位にＴ、（ｖｉ）３２６位にＡ、および（ｖｉｉ）３２８位にＰを含む、配列番号：４２、５４、５８または６６（または配列番号：４２、５４、５８もしくは６６と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２４４位にＰ、（ｉｉ）２７１位にＡ、ＧまたはＳ、（ｉｉｉ）３０３位にＡ、ＧまたはＳ、（ｉｖ）３０４位にＧ、（ｖ）３０５位にＴ、（ｖｉ）３３３位にＡ、および（ｖｉｉ）３３５位にＰを含む、配列番号：４４、５０または６０（または配列番号：４４、５０もしくは６０と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２４２位にＰ、（ｉｉ）２６９位にＡ、ＧまたはＳ、（ｉｉｉ）３０１位にＡ、ＧまたはＳ、（ｉｖ）３０２位にＧ、（ｖ）３０３位にＴ、（ｖｉ）３３１位にＡ、および（ｖｉｉ）３３３位にＰを含む、配列番号：４６または６２（または配列番号：４６もしくは６２と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２４６位にＰ、（ｉｉ）２７３位にＡ、ＧまたはＳ、（ｉｉｉ）３０５位にＡ、ＧまたはＳ、（ｉｖ）３０６位にＧ、（ｖ）３０７位にＴ、（ｖｉ）３３５位にＡ、および（ｖｉｉ）３３７位にＰを含む、配列番号：４８（または配列番号：４８と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含有する。
【００３８】
さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２３９位にＰ、（ｉｉ）２６６位にＡ、（ｉｉｉ）２９８位にＡ、（ｉｖ）２９９位にＧ、（ｖ）３００位にＴ、（ｖｉ）３２８位にＡ、および（ｖｉｉ）３３０位にＰを含む、配列番号：４０、５２、５６または６４（または配列番号：４０、５２、５６もしくは６４と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含有する。他の実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２３７位にＰ、（ｉｉ）２６４位にＡ、（ｉｉｉ）２９６位にＡ、（ｉｖ）２９７位にＧ、（ｖ）２９８位にＴ、（ｖｉ）３２６位にＡ、および（ｖｉｉ）３２８位にＰを含む、配列番号：４２、５４、５８または６６（または配列番号：４２、５４、５８もしくは６６と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２４４位にＰ、（ｉｉ）２７１位にＡ、（ｉｉｉ）３０３位にＡ、（ｉｖ）３０４位にＧ、（ｖ）３０５位にＴ、（ｖｉ）３３３位にＡ、および（ｖｉｉ）３３５位にＰを含む、配列番号：４４、５０または６０（または配列番号：４４、５０もしくは６０と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２４２位にＰ、（ｉｉ）２６９位にＡ、（ｉｉｉ）３０１位にＡ、（ｉｖ）３０２位にＧ、（ｖ）３０３位にＴ、（ｖｉ）３３１位にＡ、および（ｖｉｉ）３３３位にＰを含む、配列番号：４６または６２（または配列番号：４６もしくは６２と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２４６位にＰ、（ｉｉ）２７３位にＡ、（ｉｉｉ）３０５位にＡ、ＧまたはＳ、（ｉｖ）３０６位にＧ、（ｖ）３０７位にＴ、（ｖｉ）３３５位にＡ、および（ｖｉｉ）３３７位にＰを含む、配列番号：４８（または配列番号：４８と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含有する。
【００３９】
他の実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２３９位にＰ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｉｉ）２６６位にＡ、ＧまたはＳ、（ｉｉｉ）２９８位にＡ、ＧまたはＳ、（ｉｖ）２９９位にＧ、（ｖ）３００位にＴ、（ｖｉ）３２８位にＡ、ＧまたはＳ、および（ｖｉｉ）３３０位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを含む、配列番号：４０、５２、５６または６４（または配列番号：４０、５２、５６もしくは６４と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含有する。他のそのような実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２３７位にＰ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｉｉ）２６４位にＡ、ＧまたはＳ、（ｉｉｉ）２９６位にＡ、ＧまたはＳ、（ｉｖ）２９７位にＧ、（ｖ）２９８位にＴ、（ｖｉ）３２６位にＡ、ＧまたはＳ、および（ｖｉｉ）３２８位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを含む、配列番号：４２、５４、５８または６６（または配列番号：４２、５４、５８もしくは６６と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２４４位にＰ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｉｉ）２７１位にＡ、ＧまたはＳ、（ｉｉｉ）３０３位にＡ、ＧまたはＳ、（ｉｖ）３０４位にＧ、（ｖ）３０５位にＴ、（ｖｉ）３３３位にＡ、ＧまたはＳ、および（ｖｉｉ）３３５位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを含む、配列番号：４４、５０または６０（または配列番号：４４、５０もしくは６０と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２４２位にＰ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｉｉ）２６９位にＡ、ＧまたはＳ、（ｉｉｉ）３０１位にＡ、ＧまたはＳ、（ｉｖ）３０２位にＧ、（ｖ）３０３位にＴ、（ｖｉ）３３１位にＡ、ＧまたはＳ、および（ｖｉｉ）３３３位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを含む、配列番号：４６または６２（または配列番号：４６もしくは６２と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２４６位にＰ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｉｉ）２７３位にＡ、ＧまたはＳ、（ｉｉｉ）３０５位にＡ、ＧまたはＳ、（ｉｖ）３０６位にＧ、（ｖ）３０７位にＴ、（ｖｉ）３３５位にＡ、ＧまたはＳ、および（ｖｉｉ）３３７位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを含む、配列番号：４８（または配列番号：４８と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含有する。
【００４０】
さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２３９位にＰ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｉｉ）２６６位にＡ、（ｉｉｉ）２９８位にＡ、（ｉｖ）２９９位にＧ、（ｖ）３００位にＴ、（ｖｉ）３２８位にＡ、ＧまたはＳ、および（ｖｉｉ）３３０位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを含む、配列番号：４０、５２、５６または６４（または配列番号：４０、５２、５６もしくは６４と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含有する。他のそのような実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２３７位にＰ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｉｉ）２６４位にＡ、（ｉｉｉ）２９６位にＡ、（ｉｖ）２９７位にＧ、（ｖ）２９８位にＴ、（ｖｉ）３２６位にＡ、ＧまたはＳ、および（ｖｉｉ）３２８位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを含む、配列番号：４２、５４、５８または６６（または配列番号：４２、５４、５８もしくは６６と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２４４位にＰ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｉｉ）２７１位にＡ、（ｉｉｉ）３０３位にＡ、（ｉｖ）３０４位にＧ、（ｖ）３０５位にＴ、（ｖｉ）３３３位にＡ、ＧまたはＳ、および（ｖｉｉ）３３５位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを含む、配列番号：４４、５０または６０（または配列番号：４４、５０もしくは６０と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２４２位にＰ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｉｉ）２６９位にＡ、（ｉｉｉ）３０１位にＡ、（ｉｖ）３０２位にＧ、（ｖ）３０３位にＴ、（ｖｉ）３３１位にＡ、ＧまたはＳ、および（ｖｉｉ）３３３位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを含む、配列番号：４６または６２（または配列番号：４６もしくは６２と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２４６位にＰ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｉｉ）２７３位にＡ、（ｉｉｉ）３０５位にＡ、（ｉｖ）３０６位にＧ、（ｖ）３０７位にＴ、（ｖｉ）３３５位にＡ、ＧまたはＳ、および（ｖｉｉ）３３７位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを含む、配列番号：４８（または配列番号：４８と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含有する。
【００４１】
さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２３９位にＡ、（ｉｉ）２６６位にＡ、（ｉｉｉ）２９８位にＡ、（ｉｖ）２９９位にＧ、（ｖ）３００位にＴ、（ｖｉ）３２８位にＧ、および（ｖｉｉ）３３０位にＡを含む、配列番号：４０、５２、５６または６４（または配列番号：４０、５２、５６もしくは６４と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含有する。他のそのような実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２３７位にＡ、（ｉｉ）２６４位にＡ、（ｉｉｉ）２９６位にＡ、（ｉｖ）２９７位にＧ、（ｖ）２９８位にＴ、（ｖｉ）３２６位にＧ、および（ｖｉｉ）３２８位にＡを含む、配列番号：４２、５４、５８または６６（または配列番号：４２、５４、５８もしくは６６と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２４４位にＡ、（ｉｉ）２７１位にＡ、（ｉｉｉ）３０３位にＡ、（ｉｖ）３０４位にＧ、（ｖ）３０５位にＴ、（ｖｉ）３３３位にＧ、および（ｖｉｉ）３３５位にＡを含む、配列番号：４４、５０または６０（または配列番号：４４、５０もしくは６０と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２４２位にＡ、（ｉｉ）２６９位にＡ、（ｉｉｉ）３０１位にＡ、（ｉｖ）３０２位にＧ、（ｖ）３０３位にＴ、（ｖｉ）３３１位にＧ、および（ｖｉｉ）３３３位にＡを含む、配列番号：４６または６２（または配列番号：４６もしくは６２と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２４６位にＡ、（ｉｉ）２７３位にＡ、（ｉｉｉ）３０５位にＡ、（ｉｖ）３０６位にＧ、（ｖ）３０７位にＴ、（ｖｉ）３３５位にＧ、および（ｖｉｉ）３３７位にＡを含む、配列番号：４８（または配列番号：４８と９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一）のアミノ酸配列を含有する。
【００４２】
加えて、本発明は、配列番号：７２、配列番号：７８、配列番号：８４、配列番号：９０、配列番号：９６、配列番号：１０２または配列番号：１０８のアミノ酸配列を含むイヌ軽鎖をさらに含有するイヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００４３】
したがって、本発明はさらに、配列番号：６８のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：７２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有するイヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。関連実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号：７０のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：７２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。別の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号：７４のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：７８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。関連実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号：７６のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：７８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。さらに別の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号：８０のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：８４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。関連実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号：８２のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：８４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。さらに別の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号：８６のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：９０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。関連実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号：８８のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：９０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。さらに別の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号：９２のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：９６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。関連実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号：９４のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：９６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。さらに別の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号：９８のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：１０２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。関連実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号：１００のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：１０２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。さらに別の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号：１０４のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：１０８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。関連実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号：１０６のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：１０８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。
【００４４】
本発明はさらに、配列番号：４０のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：７２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有するイヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。関連実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号：４２のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：７２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。別の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号：４４のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：７８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。関連実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号：４６のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：７８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。さらに別の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号：４８のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：８４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。関連実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号：５０のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：８４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。さらに別の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号：５２のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：９０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。関連実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号：５４のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：９０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。さらに別の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号：５６のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：９６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。関連実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号：５８のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：９６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。
【００４５】
さらに別の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号：６０のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：１０２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。関連実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号：６２のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：１０２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。さらに別の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号：６４のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：１０８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。関連実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号：６６のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号：１０８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含有する。
【００４６】
本発明はさらに、本発明のイヌ化抗体のＣＤＲ、ｃＦｃ領域、ヒンジ領域を有するｃＦｃ領域ならびに重鎖および軽鎖を含む本発明のアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸を提供する。本発明はさらに、本発明の核酸の１またはそれ以上を含有する発現ベクターを提供する。本発明はさらに、本発明の１またはそれ以上の発現ベクターを含有する宿主細胞ならびにそのような宿主細胞を使用して本発明のイヌ化抗体のＣＤＲおよび／またはｃＦｃ領域および／またはヒンジ領域を有するｃＦｃ領域および／または重鎖および／または軽鎖を発現するための方法を提供する。本発明はまた、そのようなベクターの不在下で本発明のイヌ化抗体のＣＤＲおよび／またはｃＦｃ領域および／またはヒンジ領域を有するｃＦｃ領域および／または重鎖および／または軽鎖を発現するように遺伝的に操作されている宿主細胞も提供する。特定の実施形態では、本発明のこれらの核酸、発現ベクター、ポリペプチドまたは宿主細胞は、抗体を作製する方法において有用である。
【００４７】
特定の実施形態では、抗体は、組換え抗体またはその抗原結合フラグメントである。関連実施形態では、可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインは、柔軟なリンカーによって連結されて一本鎖抗体を形成する。
【００４８】
特定の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントはＦａｂフラグメントである。
【００４９】
他の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントはＦａｂ’フラグメントである。他の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは（Ｆａｂ’）２フラグメントである。さらに他の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントはダイアボディである。特定の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントはドメイン抗体である。特定の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントはラクダ化単一ドメイン抗体である。
【００５０】
特定の実施形態では、イヌ化マウス抗イヌＰＤ−１抗体または抗原結合フラグメントは、処置されるイヌ被験体の免疫応答を増大させる。
【００５１】
ある実施形態では、イヌＰＤ−１に結合する場合、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号：１３８、配列番号：１３９、配列番号：１４０、配列番号：１４１、配列番号：１４２、配列番号：１４３、配列番号：１４４および／または配列番号：１４５の１またはそれ以上のアミノ酸配列内の少なくとも１個のアミノ酸残基に結合する。
【００５２】
さらに、本発明は、本明細書で提供される対応する正準構造を有し、および／または配列番号：１４４のアミノ酸配列に結合する本発明のＣＤＲの変異体を含有する、イヌＰＤ−１に対するイヌ化抗体を提供する。この種の特定の実施形態では、イヌ化抗体−イヌＰＤ−１結合についての解離定数（Ｋｄ）は１×１０−５Ｍから１×１０−１２Ｍである。より特定の実施形態では、イヌＰＤ−１に対するイヌ化抗体は、本明細書で提供される対応する正準構造を有し、および配列番号：１４５のアミノ酸配列に結合する本発明のＣＤＲの変異体を含有する。本発明は、それゆえ、イヌＰＤ−１に特異的に結合するイヌ化抗体およびその抗原結合フラグメントであって、それらがイヌＰＤ−１に結合する場合、抗体が配列番号：１４４内の少なくとも１個のアミノ酸残基に結合する、イヌ化抗体およびその抗原結合フラグメントを包含する。この種の特定の実施形態では、抗体およびその抗原結合フラグメントは、イヌＰＤ−１に結合し、およびイヌＰＤ−１のイヌプログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）への結合をブロックする。
【００５３】
したがって、特定の実施形態では、イヌＰＤ−１に結合する場合、イヌ化抗体（１またはそれ以上の変異体ＣＤＲ、例えば保存的に修飾された変異体および／または定義された正準構造クラスを構成する変異体を包含する変異体）は、配列番号：１３８、配列番号：１３９、配列番号：１４０、配列番号：１４１、配列番号：１４２、配列番号：１４３および／または配列番号：１４５の１またはそれ以上のアミノ酸配列内の少なくとも１個のアミノ酸残基に結合する。さらにより特定の実施形態では、イヌＰＤ−１に結合する場合、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、次のアルギニン残基：配列番号：１１４のＲ６２、Ｒ６９、Ｒ７２、Ｒ７５およびＲ９０の１またはそれ以上のアミノ酸残基に結合する。具体的な実施形態では、イヌＰＤ−１に結合する場合、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは配列番号：１４５内の少なくとも１個のアミノ酸残基に結合する。より具体的な実施形態では、イヌＰＤ−１に結合する場合、抗体またはその抗原結合フラグメントは、次のアルギニン残基：配列番号：１１４のＲ６２、Ｒ６９、Ｒ７２およびＲ７５の１またはそれ以上のアミノ酸残基に結合する。さらにより具体的な実施形態では、イヌＰＤ−１に結合する場合、抗体またはその抗原結合フラグメントは配列番号：１１４のＲ７５に結合する。
【００５４】
本発明は、１×１０−１２Ｍより低い（例えば１×１０−１３Ｍまたはそれ未満）解離定数（Ｋｄ）でイヌＰＤ−１に結合するイヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントをさらに提供する。特定の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、１×１０−５Ｍから１×１０−１２Ｍの解離定数でイヌＰＤ−１に結合する。より特定の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、１×１０−７Ｍから１×１０−１１Ｍの解離定数でイヌＰＤ−１に結合する。さらにより特定の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、１×１０−８Ｍから１×１０−１１Ｍの解離定数でイヌＰＤ−１に結合する。さらにより特定の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、１×１０−８Ｍから１×１０−１０Ｍの解離定数でイヌＰＤ−１に結合する。
【００５５】
本発明はまた、１×１０７Ｍ−１秒−１を上回るオン速度（ｋｏｎ）でイヌＰＤ−１に結合するイヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。特定の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、１×１０２Ｍ−１秒−１から１×１０７Ｍ−１秒−１のオン速度でイヌＰＤ−１に結合する。より特定の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、１×１０３Ｍ−１秒−１から１×１０６Ｍ−１秒−１のオン速度でイヌＰＤ−１に結合する。さらにより特定の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、１×１０３Ｍ−１秒−１から１×１０５Ｍ−１秒−１のオン速度でイヌＰＤ−１に結合する。さらにより特定の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、１×１０４Ｍ−１秒−１から１×１０５Ｍ−１秒−１のオン速度でイヌＰＤ−１に結合する。
【００５６】
本発明はさらに、１×１０−７秒−１より緩やかなオフ速度（ｋｏｆｆ）でイヌＰＤ−１に結合するイヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。特定の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、１×１０−３秒−１から１×１０−８秒−１のオフ速度でイヌＰＤ−１に結合する。より特定の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、１×１０−４秒−１から１×１０−７秒−１のオフ速度でイヌＰＤ−１に結合する。さらにより特定の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、１×１０−５秒−１から１×１０−７秒−１のオフ速度でイヌＰＤ−１に結合する。
【００５７】
関連実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、腫瘍または病原体に対する抗原特異的記憶応答を刺激する。特定の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントはインビボで抗体応答を刺激する。他の特定の実施形態では、イヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、動物被験体における免疫応答を刺激する。より具体的な実施形態では、動物被験体はイヌである。関連実施形態では、動物被験体はネコである。
【００５８】
したがって、本発明のイヌ化抗体のいずれもが、１、２、３、４、５またはこれらすべての特性、すなわちイヌＰＤ−１との前記解離定数、イヌＰＤ−１との結合に関する前記オン速度、イヌ化抗体−イヌＰＤ−１結合複合体から解離するための前記オフ速度、腫瘍または病原体に対する抗原特異的記憶応答の刺激、インビボでの抗体応答の刺激、および／または動物被験体における免疫応答の刺激を示すことができる。
【００５９】
より特定の実施形態では、本発明のイヌ化抗体およびその抗原結合フラグメントは、イヌＰＤ−１に結合し、およびまたイヌＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１への結合もブロックする。さらにより特定の実施形態では、本発明のイヌ化抗体およびその抗原結合フラグメントは、イヌＰＤ−１に結合し、イヌＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１への結合をブロックし、およびまたイヌＰＤ−１のＰＤ−Ｌ２への結合もブロックする。
【００６０】
本発明はさらに、本発明のイヌ化マウス抗イヌＰＤ−１抗体またはその部分をコードする核酸を提供する。関連実施形態では、そのような抗体または抗原結合フラグメントは、イヌ被験体における癌を処置する薬剤の調製のために使用することができる。あるいはまたは合わせて、本発明は、診断用途のための本発明の抗体または抗体フラグメントのいずれかの使用を提供する。さらに付加的な実施形態では、本明細書で開示されるイヌ化抗体または抗原結合フラグメントのいずれかを含有するキットが提供される。
【００６１】
本発明はさらに、医薬的に許容される担体または希釈剤と共に、抗イヌ抗原抗体またはその結合フラグメント（例えば抗イヌＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメント）を含有する医薬組成物を包含する。本発明はまた、免疫細胞の活性を増大させる方法であって、それを必要とする被験体（例えばイヌ）に本発明の医薬組成物の治療有効量を投与することを含む方法も提供する。ある実施形態では、この方法は癌の処置のために使用される。他の実施形態では、この方法は感染または感染性疾患の処置において使用される。さらに他の実施形態では、本発明のイヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントはワクチンアジュバントとして使用される。さらに別の実施形態では、イヌ化抗ＴＳＬＰ抗体は、アトピー性皮膚炎を処置するためにイヌに投与される。
【００６２】
本発明のこれらや他の態様は、以下の「図面の簡単な説明」および「発明を実施するための形態」を参照することによってより良く理解される。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１は、イヌＰＤ−１の細胞外ドメインに対するイヌ化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の反応性を、対数ｍＡｂ（ｎＭ）に対するＯＤ６５０／４９０の関数として示す。様々なイヌ化ｍＡｂをイヌＰＤ−１の細胞外ドメインへのそれらの結合に関してＥＬＩＳＡによって試験した。試験した４つのｍＡｂを：２Ｈ９  ＶＨ４  ＩｇＧＢ／ＶＬ３、３Ｂ６  ＶＨ３  ＩｇＧＢ／ＶＬ３、２Ｈ９  ＶＨ４  ＩｇＧＢ（ＹＺＺ１０６２）／ＶＬ３および２Ｈ９  ＶＨ４  ＩｇＧＢ（ＹＺＺ１０６８）／ＶＬ３と称した。
【図２】図２は、細胞表面に発現されたイヌＰＤ−１に対するイヌ化ｍＡｂの反応性を示す。様々なマウスｍＡｂを、ＣＨＯ細胞上に発現されたイヌＰＤ−１へのそれらの結合に関して、対数ｍＡｂ（ｎＭ）に対するＯＤ４５０／５４０の関数としてＣＥＬＩＳＡによって試験した。試験した６つのｍＡｂを：３Ｂ６  ＶＨ３／ＶＬ４、３Ｂ６  ＶＨ３／ＶＬ１、３Ｂ６  ＶＨ３／ＶＬ３、３Ｂ６  ＶＨ３／ＶＬ２、３Ｂ６  ＶＨ１／ＶＬ１および３Ｂ６  ｍ−ｃ  Ｃｈｉｍｅｒａと称した。
【図３】図３は、イヌＰＤ−１に対するイヌ化ｍＡｂでのリガンド遮断を示す。様々なイヌ化ｍＡｂを、ＣＨＯ細胞上に発現されたＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１への結合を阻害するそれらの能力に関して、対数ｍＡｂ（ｎＭ）に対するＯＤ４５０／５４０の関数として試験した。試験した６つのｍＡｂを：３Ｂ６  ＶＨ３／ＶＬ４、３Ｂ６  ＶＨ３／ＶＬ１、３Ｂ６  ＶＨ３／ＶＬ３、３Ｂ６  ＶＨ３／ＶＬ２、３Ｂ６  ＶＨ１／ＶＬ１および３Ｂ６  ｍ−ｃ  Ｃｈｉｍｅｒａと称した。
【図４】図４は、イヌＰＤ−１に対するイヌ化ｍＡｂによって誘導されるサイトカイン分泌を示す。様々なイヌ化ｍＡｂおよびそれらの変異体を、健常イヌ由来のＰＢＭＣからのサイトカイン分泌を誘導するそれらの能力に関して試験した。
【図５Ａ】図５Ａは、イヌ化ｍＡｂおよびそれらの変異体（１μｇ／ｍｌから開始する）のＦｃγＲＩへの結合を示す。様々なｍＡｂを、ＦｃＲＩに結合するそれらの能力に関して試験した。抗体を、ｃａｎ  ２Ｈ９  ＡＤＣＣ（１０６２）ＶＨ４／ＶＬ３、ｃａｎ  ２Ｈ９  ＡＤＣＣ  ｍｕｔ１  ＶＨ４／ＶＬ３、ｃａｎ  ２Ｈ９  ＡＤＣＣ  ｍｕｔ２  ＶＨ４／ＶＬ３、ｃａｎ  ２Ｈ９  ＩｇＧＤ  ＶＨ４／ＶＬ３、ｃａｎ  ２Ｈ９  ＶＨ４／ＶＬ３およびｃａｎ  ３Ｂ６  ＶＨ４／ＶＬ４と称する。
【図５Ｂ】図５Ｂは、イヌ化ｍＡｂおよびそれらの変異体（１μｇ／ｍｌから開始する）のＦｃγＲＩへの結合を示す。様々なｍＡｂを、ＦｃＲＩに結合するそれらの能力に関して試験した。抗体を、ｃａｎ  ２Ｈ９  ＡＤＣＣ（１０５９）ＶＨ４／ＶＬ３、ｃａｎ  ２Ｈ９  ＡＤＣＣ（１０６０）ＶＨ４／ＶＬ３、ｃａｎ  ２Ｈ９  ＡＤＣＣ（１０６１）ＶＨ４／ＶＬ３、ｃａｎ  ２Ｈ９  ＩｇＧＢ  ＡＤＣＣ（１０６８）ＶＨ４／ＶＬ３、ｃａｎ  ２Ｈ９  ＶＨ４／ＶＬ３およびｃａｎ  ３Ｂ６  ＶＨ４／ＶＬ４と称する。
【図６Ａ】図６Ａは、イヌ化ｍＡｂおよびそれらの変異体（１μｇ／ｍｌから開始する）のＣ１Ｑへの結合を示す。様々なｍＡｂを、Ｃ１Ｑに結合するそれらの能力に関して試験した。抗体を、ｃａｎ  ２Ｈ９  ＶＨ４  ＩｇＧＢ  ＡＤＣＣ（１０６２）／ＶＬ３、ｃａｎ  ２Ｈ９  ＶＨ４  ＩｇＧＢ  ＡＤＣＣ（ｍｕｔ１）／ＶＬ３、ｃａｎ  ２Ｈ９  ＶＨ４  ＩｇＧＢ  ＡＤＣＣ（ｍｕｔ２）／ＶＬ３、ｃａｎ  ２Ｈ９  ＶＨ４  ＩｇＧＤ／ＶＬ３、ｃａｎ  ２Ｈ９  ＶＨ４／ＶＬ３およびｃａｎ  ３Ｂ６  ＶＨ４／ＶＬ４  ＩｇＧＢと称する。
【図６Ｂ】図６Ｂは、イヌ化ｍＡｂおよびそれらの変異体（１μｇ／ｍｌから開始する）のＣ１Ｑへの結合を示す。様々なｍＡｂを、Ｃ１Ｑに結合するそれらの能力に関して試験した。抗体を、ｃａｎ  ２Ｈ９  ＶＨ４  ＩｇＧＢ  ＡＤＣＣ（１０５９）／ＶＬ３、ｃａｎ  ２Ｈ９  ＶＨ４  ＩｇＧＢ  ＡＤＣＣ（１０６０）／ＶＬ３、ｃａｎ  ２Ｈ９  ＶＨ４  ＩｇＧＢ  ＡＤＣＣ（１０６１）／ＶＬ３、ｃａｎ  ２Ｈ９  ＶＨ４  ＩｇＧＢ  ＡＤＣＣ（１０６８）／ＶＬ３、ｃａｎ  ２Ｈ９  ＶＨ４／ＶＬ３  ＩｇＧＢおよびｃａｎ  ３Ｂ６  ＶＨ４／ＶＬ４  ＩｇＧＢと称する。
【図７Ａ】図７Ａは、イヌＰＤ−１とイヌ化抗体２Ｇ９との間の界面の特徴付けを示す。アミノ酸位置は、シグナル配列を有さないＰＤ−１アミノ酸配列、すなわち配列番号：１１４に関するものである。測定は、化学架橋、高質量ＭＡＬＤＩ質量分析法およびｎＬＣ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析法によって実施した。
【図７Ｂ】図７Ｂは、イヌＰＤ−１とイヌ化抗体３Ｂ６との間の界面の特徴付けを示す。アミノ酸位置は、シグナル配列を有さないＰＤ−１アミノ酸配列、すなわち配列番号：１１４に関するものである。測定は、化学架橋、高質量ＭＡＬＤＩ質量分析法およびｎＬＣ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析法によって実施した。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
略語
本発明の「発明を実施するための形態」および「実施例」全体を通して以下の略語を使用する：
ＡＤＣＣ          抗体依存性細胞傷害
ＣＤＣ            補体依存性細胞傷害
ＣＤＲ            Ｋａｂａｔナンバリングシステムを用いてヒト抗体に関して定義された、免疫グロブリン可変領域内の相補性決定領域
ＣＨＯ            チャイニーズハムスター卵巣
ＥＣ５０          ５０％の効果または結合を生じさせる濃度
ＥＬＩＳＡ        酵素結合免疫吸着法
ＦＲ              抗体フレームワーク領域：ＣＤＲ領域を除く免疫グロブリン可変領域
ＨＲＰ            ホースラディッシュペルオキシダーゼ
ＩＦＮ            インターフェロン
ＩＣ５０          ５０％の阻害を生じさせる濃度
ＩｇＧ            免疫グロブリンＧ
Ｋａｂａｔ        Ｅｌｖｉｎ  Ａ．Ｋａｂａｔ［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）］によって開発されたヒト抗体に関する免疫グロブリンアラインメントおよびナンバリングシステム
ｍＡｂ            モノクローナル抗体（ＭａｂまたはＭＡｂとも略す）
ＭＥＳ            ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸
ＭＯＡ            作用機序
ＮＨＳ            正常ヒト血清
ＰＣＲ            ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＫ              薬物動態
ＳＥＢ            ブドウ球菌エンテロトキシンＢ
ＴＴ              破傷風トキソイド
Ｖ領域            異なる抗体の間で配列が可変であるヒトＩｇＧ鎖のセグメント。軽鎖内のＫａｂａｔ残基１０９および重鎖内のＫａｂａｔ残基１１３までに及ぶ。
【００６５】
ＶＨ              免疫グロブリン重鎖可変領域
ＶＫ              免疫グロブリンκ軽鎖可変領域
定義
本発明をより容易に理解し得るように、特定の技術および学術用語を以下で明確に定義する。本書類の別の箇所で明確に定義されない限り、本明細書で使用される他のすべての技術および学術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。
【００６６】
付属の特許請求の範囲を含む、本明細書で使用される場合、「ａ、ａｎ（１つの）」および「ｔｈｅ（その）」などの語の単数形は、文脈上そうでないとする明らかな指示がない限り、それらの対応する複数の言及を包含する。
【００６７】
細胞または受容体に適用される「活性化」は、文脈上または明白に異なる指示がない限り、リガンドによる細胞または受容体の活性化または処置を指す。「リガンド」は、天然および合成リガンド、例えばサイトカイン、サイトカイン変異体、類似体、ムテインおよび抗体由来の結合化合物を包含する。「リガンド」はまた、低分子、例えばサイトカインのペプチドミメティックおよび抗体のペプチドミメティックも包含する。「活性化」は、内部機構によってならびに外部または環境因子によって調節される細胞活性化を指すことができる。
【００６８】
分子の「活性」は、リガンドまたは受容体への分子の結合、触媒活性、遺伝子発現または細胞のシグナル伝達、分化もしくは成熟を刺激する能力、抗原活性、他の分子の活性の調節等を表し得るもしくは指し得る。分子の「活性」はまた、細胞間相互作用、例えば接着を調節するもしくは維持するうえでの活性、または細胞の構造、例えば細胞膜もしくは細胞骨格を維持するうえでの活性も指し得る。「活性」はまた、比活性、例えば［触媒活性］／［ｍｇタンパク質］または［免疫学的活性］／［ｍｇタンパク質］、生物学的区画内の濃度等も意味することができる。「活性」は、先天性または適応免疫系の成分の調節も指し得る。
【００６９】
「投与」および「処置」は、動物、例えばイヌ実験被験体、細胞、組織、器官または生体液に適用される場合、動物、例えばイヌ被験体、細胞、組織、器官または生体液への外因性医薬、治療薬、診断薬または組成物の接触を指す。細胞の処置は、細胞への試薬の接触ならびに液体が細胞と接触している場合はその液体への試薬の接触を包含する。「投与」および「処置」はまた、試薬、診断薬、結合化合物による、または別の細胞による、例えば細胞の、インビトロおよびエクスビボ処置も意味する。
【００７０】
「被験体」という用語は、任意の生物、好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物（例えばイヌ、ネコまたはヒト）、最も好ましくはイヌを包含する。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「ネコ」という用語は、ネコ科（Ｆｅｌｉｄａｅ）の任意の成員を指す。この科の成員としては、野生、動物園および家畜成員、例えばネコ亜科（Ｆｅｌｉｎａｅ）の任意の成員、例えばネコ、ライオン、トラ、ピューマ、ジャガー、ヒョウ、ユキヒョウ、クロヒョウ、北米山岳ライオン、チータ、オオヤマネコ、ボブキャット、カラカルまたはそれらの任意の交雑種が含まれる。ネコにはまた、家庭ネコ、純血種および／または雑種コンパニオンネコ、ショーキャット、実験用ネコ、クローンネコならびに野生または野良ネコも含まれる。
【００７２】
本明細書で使用される場合、アミノ酸配列内の別のアミノ酸残基による「アミノ酸残基の置換」は、別のアミノ酸残基で「アミノ酸残基を置き換えること」に等しく、アミノ酸配列内の特定の位置の特定のアミノ酸残基が異なるアミノ酸によって置き換えられている（または置換されている）ことを意味する。例えば、１つのそのような置換（置き換え）は、ＩｇＧＢまたはＩｇＧＣアミノ酸配列のＦｃ領域のＰ４Ａと表され、この場合、ＩｇＧＢのＦｃ領域またはＩｇＧＣのＦｃ領域のアミノ酸配列のアミノ酸位置４でプロリン残基がアラニン残基によって置換されている（置き換えられている）。
【００７３】
したがって、そのようなアミノ酸置換は、個別に設計することができ、すなわち意図的に、例えば組換えＤＮＡ技術によって、アミノ酸配列内の特定の位置でアラニンをセリンで置き換えることができる。あるいは、抗体の特定のアミノ酸残基または一連のアミノ酸残基を、より自然な選択過程を通して、例えば細胞によって産生された抗体がその抗原、例えばエピトープもしくはその部分を含有するものの所与の領域に結合する結合する能力に基づいて、および／または抗体が、置換しているＣＤＲと同じ正準構造を保持する特定のＣＤＲを含有するように、１またはそれ以上のアミノ酸残基によって置き換えることができる。そのような置換／置き換えは、「変異体」ＣＤＲおよび／または抗体をもたらすことができる。
【００７４】
「処置する」または「処置すること」は、治療薬、例えば本発明の抗体または抗原結合フラグメントのいずれかを含有する組成物を、１またはそれ以上の疾患症状を有する、または治療薬が治療活性を有する疾患を保有することが疑われるイヌ被験体または患者に、内部にまたは外部から投与することを意味する。
【００７５】
典型的には、治療薬は、処置される被験体または集団において、臨床的に測定可能な程度にそのような（１または複数の）症状の後退を誘導するまたは（１または複数の）症状の進行を阻止することによって、１またはそれ以上の疾患症状を軽減するおよび／または改善するのに有効な量で投与される。何らかの特定の疾患症状を軽減するのに有効な治療薬の量（「治療有効量」とも称される）は、疾患の状態、被験体（例えばイヌ）の年齢および体重、ならびに被験体において所望の応答を引き出す医薬組成物の能力などの因子によって異なり得る。疾患症状が軽減または改善されたかどうかは、その症状の重症度または進行状態を評価するために獣医（ｖｅｔｅｒａｎａｒｉａｎ）または他の熟達した医療提供者によって典型的に使用される任意の臨床測定によって評価することができる。本発明（例えば処置方法または製造の項）の実施形態は、すべての被験体において（１または複数の）標的疾患症状を軽減するのに有効であるとは限らないかもしれないが、当分野で公知の任意の統計的検定、例えばスチューデントｔ検定、カイ二乗検定、マン−ホイットニーのＵ検定、クラスカル−ウォリス検定（Ｈ検定）、ヨンキー−タプストラ検定およびウィルコクソン検定などによって決定される、統計的に有意の数の被験体において（１または複数の）標的疾患症状を軽減するはずである。
【００７６】
「処置」は、ヒト、獣医学（例えばイヌ）または研究用被験体に適用される場合、治療的処置ならびに研究および診断適用を指す。ヒト、獣医学（例えばイヌ）もしくは研究用被験体または細胞、組織もしくは器官に適用される「処置」は、イヌまたは他の動物被験体、細胞、組織、生理学的区画または生理学的流体への本発明のイヌ化抗体または抗原結合フラグメントの接触を包含する。
【００７７】
イヌＰＤ−１は、配列番号：１１４［その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１３年１２月２０日出願の米国特許仮出願第６１／９１８，９４６号］のアミノ酸配列を含有することが認められている。具体的な実施形態では、イヌＰＤ−１は、配列番号：１１３のヌクレオチド配列を含有する核酸によってコードされる。
【００７８】
イヌＰＤ−Ｌ１は、配列番号：１２０［２０１３年１２月２０日出願の米国特許仮出願第６１／９１８，９４６号、前出］のアミノ酸配列を含有することが認められている。具体的な実施形態では、イヌＰＤ−Ｌ１は、配列番号：１１９を含有するヌクレオチド配列によってコードされる。
【００７９】
「免疫応答」という用語は、例えば、癌細胞、病原体に感染した細胞もしくは組織または侵入病原体の哺乳動物身体（例えばイヌ身体）への選択的損傷、その破壊または哺乳動物身体（例えばイヌ身体）からの除去をもたらす、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球および前記細胞または肝臓によって産生される可溶性高分子の作用を指す。
【００８０】
イヌ化抗イヌ抗原抗体
本明細書で使用される場合、「イヌ」という用語は、特に指示されない限り、すべての家庭イヌ、イエイヌ（Ｃａｎｉｓ  ｌｕｐｕｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）またはイヌ科イヌ属（Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）を包含する。
【００８１】
本明細書で使用される場合、抗体は、イヌ化抗体、例えばイヌＰＤ−１のアミノ酸配列の一部分を含有するポリペプチドに結合するが、イヌ化抗体、例えばイヌＰＤ−１の配列のその部分を欠く他のイヌタンパク質には結合しない場合、所与の抗原配列（この場合はイヌ化抗体、例えばイヌＰＤ−１のアミノ酸配列の一部分）を含有するポリペプチドに特異的に結合すると言われる。例えば、イヌＰＤ−１を含有するポリペプチドに特異的に結合する抗体は、ＦＬＡＧ（登録商標）タグ形態のイヌＰＤ−１に結合し得るが、他のＦＬＡＧ（登録商標）タグイヌタンパク質には特異的に結合しない。抗体または抗体の抗原結合部位に由来する結合化合物は、試験される他のいずれのイヌ抗原に対する親和性よりも少なくとも１０倍高い、より好ましくは少なくとも２０倍高い、さらにより好ましくは少なくとも１００倍高い、そのイヌ抗原またはその変異体もしくはムテインに対する親和性を有する場合、そのイヌ抗原またはその変異体もしくはムテインに「特異的に」結合する。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、所望の生物学的活性を示す任意の形態の抗体を指す。したがって、これは最も広義に使用され、具体的にはモノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、イヌ化抗体、完全イヌ抗体、キメラ抗体およびラクダ化単一ドメイン抗体をカバーするが、これらに限定されない。「親抗体」は、意図される用途のための抗体の修飾、例えばイヌの治療用抗体としての使用のための抗体のイヌ化に先立つ、抗原への免疫系の暴露によって得られる抗体である。
【００８３】
本明細書で使用される場合、特に指示されない限り、「抗体フラグメント」または「抗原結合フラグメント」は、抗体の抗原結合フラグメント、すなわち完全長抗体によって結合される抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体フラグメント、例えば１またはそれ以上のＣＤＲ領域を保持するフラグメントを指す。抗原結合フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子、例えばｓｃ−Ｆｖ、ナノボディおよび抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【００８４】
「Ｆａｂフラグメント」は、１本の軽鎖および１本の重鎖のＣＨ１領域および可変領域から成る。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。「Ｆａｂフラグメント」は抗体のパパイン切断の産物であり得る。
【００８５】
「結晶性フラグメント」（「Ｆｃ」）領域は、抗体のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む２つの重鎖フラグメント（すなわち２つの同一のポリペプチド）を含有する。これら２つの重鎖フラグメントは、２またはそれ以上のジスルフィド結合によっておよびＣＨ３ドメインの疎水性相互作用によって結び付けられている。本発明において、４つのイヌＩｇＧ  Ｆｃフラグメントの各々についてのアミノ酸配列は、Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．［Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．８０：２５９−２７０（２００１）］によって決定された、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインの同定された境界に基づく。
【００８６】
「Ｆａｂ’フラグメント」は、１本の軽鎖ならびにＶＨドメインとＣＨ１ドメインおよびまた、２つのＦａｂ’フラグメントの２本の重鎖間に鎖間ジスルフィド結合が形成されてＦ（ａｂ’）２分子を形成することができるように、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の領域も含む１本の重鎖の一部分またはフラグメントを含有する。
【００８７】
「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」は、２本の軽鎖および、２本の重鎖間で鎖間ジスルフィド結合が形成されるように、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の定常領域の一部分を含む２本の重鎖を含有する。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、したがって、２本の重鎖間のジスルフィド結合によって結び付けられている２つのＦａｂ’フラグメントから成る。「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」は抗体のペプシン切断の産物であり得る。
【００８８】
「Ｆｖ領域」は、重鎖および軽鎖の両方に由来する可変領域を含有するが、定常領域を欠く。
【００８９】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体という用語は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含有する抗体フラグメントを指し、これらのドメインは１本のポリペプチド鎖内に存在する。一般にＦｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含有する［Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３  Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）；国際公開第８８／０１６４９号；ならびに米国特許第４，９４６，７７８号および米国特許第５，２６０，２０３号参照］。
【００９０】
本明細書で使用される場合、「正準構造」という用語は、抗体の重鎖および軽鎖の超可変領域の各々が、それらが存在するフレームワーク内で取ることができる局所立体配座を指す。各々の超可変領域に関して、対応する超可変領域のアミノ酸配列（特に対応するイヌ化マウス抗イヌＰＤ−１可変ドメインに関して以下で提供するような、そのフレームワークのアミノ酸配列の状況内の）から高い精度で予測され得る、少数の正準構造（一般に１または２、等のような簡単な整数で表される）が存在する。これらの正準構造は、所与のＣＤＲのアミノ酸配列の修飾がその抗原結合パートナーに結合する能力の保持をもたらすかまたは喪失をもたらすかに関して決定的であり得る［Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉｂａｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ，Ｎａｔｕｒｅ，３４：８７７−８８３（１９８９）；およびＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８（１９９７）参照］。
【００９１】
「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域だけを含有する免疫学的に機能性の免疫グロブリンフラグメントである。一部の場合には、２またはそれ以上のＶＨ領域がペプチドリンカーで共有結合的に連結されて、二価ドメイン抗体を創出する。二価ドメイン抗体の２つのＶＨ領域は、同じまたは異なる抗原を標的とし得る。
【００９２】
「二価抗体」は２つの抗原結合部位を含有する。一部の場合には、２つの結合部位は同じ抗原特異性を有する。しかし、二価抗体は二重特異性であり得る（下記参照）。
【００９３】
ある実施形態では、本明細書中のモノクローナル抗体はラクダ化単一ドメイン抗体も包含する。［例えばＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２６：２３０（２００１）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：２５（１９９９）；国際公開第９４／０４６７８号；国際公開第９４／２５５９１号；米国特許第６，００５，０７９号参照］。１つの実施形態では、本発明は、単一ドメイン抗体が形成されるように修飾を有する２つのＶＨドメインを含有する単一ドメイン抗体を提供する。
【００９４】
本明細書で使用される場合、「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントを指し、前記フラグメントは、同じポリペプチド鎖内に、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含有する（ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ）。同じ鎖上の２つのドメインの間で対合を可能とするには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは別の鎖の相補的ドメインと対合することを余儀なくされ、２つの抗原結合部位を創出する。［欧州特許第０４０４０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；およびＨｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）参照］。改変された抗体変異体の総説については、［一般にＨｏｌｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１１２６−１１３６（２００５）参照］。
【００９５】
典型的には、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、そのイヌＰＤ−１結合活性がモルベースで表される場合、その活性の少なくとも１０％（親抗体と比較した場合）を保持する。好ましくは、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、親抗体としてのイヌ化抗体（例えばＰＤ−１）結合親和性の少なくとも２０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％またはそれ以上を保持する。また、本発明のイヌ化抗体または抗原結合フラグメントは、その生物学的活性を実質的に変化させない保存的または非保存的アミノ酸置換（抗体の「保存的変異体」または「機能保存的変異体」とも称される）を含有することができることも意図されている。
【００９６】
「単離された抗体」は精製状態を指し、そのような状況で分子が他の生物学的分子、例えば核酸、タンパク質、脂質、炭水化物または他の物質、例えば細胞デブリおよび増殖培地などを実質的に含まないことを意味する。一般に、「単離された」という用語は、そのような物質または水、緩衝剤もしくは塩が本明細書で述べる結合化合物の実験的または治療的使用を実質的に妨げる量で存在しない限り、そのような物質が完全に存在しないことまたは水、緩衝剤もしくは塩が存在しないことを指すことを意図しない。
【００９７】
本明細書で使用される場合、「キメラ抗体」は、第一抗体由来の可変ドメインおよび第二抗体由来の定常ドメインを有する抗体であって、第一抗体と第二抗体が異なる種に由来する抗体である。［米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５（１９８４）］。典型的には、可変ドメインは、げっ歯動物などの実験動物由来の抗体（「親抗体」）から得られ、定常ドメイン配列は、動物被験体抗体、例えばイヌから得られ、生じるキメラ抗体がイヌ被験体において親（例えばげっ歯動物）抗体よりも有害な免疫応答を引き起こす可能性がより低くなるように、前記動物被験体抗体から得られる。
【００９８】
本明細書で使用される場合、「イヌ化抗体」という用語は、イヌおよび非イヌ（例えばマウス）抗体の両方に由来する配列を含有する抗体の形態を指す。一般に、イヌ化抗体は、超可変ループの全部または実質的に全部が非イヌ免疫グロブリンのものに対応する（例えば以下で例示するように６つのマウス抗イヌＰＤ−１  ＣＤＲを含有する）、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含有し、ならびにイヌフレームの全部または実質的に全部を含有する。
【００９９】
「完全イヌ抗体」という用語は、イヌ免疫グロブリンタンパク質配列だけを含有する抗体を指す。完全イヌ抗体は、マウスにおいて、マウス細胞においてまたはマウス細胞由来のハイブリドーマにおいて作製された場合、マウス糖鎖を含有し得る。同様に、「マウス抗体」は、マウス免疫グロブリン配列だけを含有する抗体を指す。あるいは、完全イヌ抗体は、ラットにおいて、ラット細胞においてまたはラット細胞由来のハイブリドーマにおいて作製された場合、ラット糖鎖を含有し得る。同様に、「ラット抗体」は、ラット免疫グロブリン配列だけを含有する抗体を指す。
【０１００】
各々の軽鎖／重鎖対の可変領域は抗体結合部位を形成する。したがって、一般に、無傷抗体は２つの結合部位を有する。二機能性または二重特異性抗体における場合を除き、２つの結合部位は、一般に、同じである。
【０１０１】
典型的には、重鎖および軽鎖の両方の可変ドメインは、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）内に位置する、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる３つの超可変領域を含有する。ＣＤＲは通常フレームワーク領域によって隣接され、特定のエピトープへの結合を可能にする。一般に、Ｎ末端からＣ末端に向かって、軽鎖および重鎖の可変ドメインはどちらも、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含有する。ヒト抗体の各ドメインへのアミノ酸の割当ては、一般に、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．；５ｔｈ  ｅｄ．；ＮＩＨ  Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１）；Ｋａｂａｔ，Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．３２：１−７５（１９７８）；Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６０９−６６１６（１９７７）；Ｃｈｏｔｈｉａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）またはＣｈｏｔｈｉａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３（１９８９）］の定義に従う。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、「超可変領域」という用語は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」（すなわち軽鎖可変ドメイン内のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３ならびに重鎖可変ドメイン内のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３）由来のアミノ酸残基を含有する。［配列によってヒト抗体のＣＤＲ領域を定義する、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）参照；また、構造によって抗体のＣＤＲ領域を定義する、Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）も参照のこと］。本明細書で使用される場合、「フレームワーク」または「ＦＲ」残基という用語は、ＣＤＲ残基として本明細書で定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基を指す。
【０１０３】
本明細書で使用される場合、「イヌフレーム」という用語は、本明細書でＣＤＲ残基として定義される超可変領域残基以外のイヌ抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を指す。両方の鎖において、天然イヌＣＤＲのアミノ酸配列は対応する異種ＣＤＲ（例えばマウス抗体由来のもの）で置き換えられている。イヌ抗体の重鎖および／または軽鎖は、例えば、以下で例示するように、イヌ抗体内の異種ＣＤＲの立体配座を保存するためおよび／またはＦｃ機能を改変するために、いくつかの異種非ＣＤＲ残基を含有していてもよい。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、「抗イヌＰＤ−１抗体」は、イヌＰＤ−１に対して（マウスまたはウサギなどの哺乳動物において）惹起された抗体であって、イヌＰＤ−１に特異的に結合する抗体を指す。「イヌＰＤ−１に特異的に結合する」抗体、または「配列番号：１１４のアミノ酸配列を含有するポリペプチドに特異的に結合する」抗体は、他の抗原と比較してイヌＰＤ−１への選択的な結合を示す、例えばイヌＰＤ−１に「特異的に」結合する抗体である。この結合は、絶対的な結合特異性を必要としない。抗イヌＰＤ−１抗体は、その結合が試料中のイヌＰＤ−１の存在を決定する場合、またはイヌ試料中の他の分子の活性を過度に妨げることなく、例えば診断状況における偽陽性もしくは治療状況での副作用などの望ましくない結果を生じさせることなくイヌＰＤ−１の活性を変化させることができる場合、イヌＰＤ−１に「特異的」と見なされる。抗イヌＰＤ−１抗体に必要な特異性の程度は抗体の意図される用途に依存してよく、いずれにせよ意図される目的のための使用への適切性によって定義される。
【０１０５】
したがって本発明は、イヌＰＤ−１に結合する（例えば特異的に）イヌ化抗イヌＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメント（単離された形態を含む）およびそのような抗体またはそのフラグメントの使用を提供する。具体的な実施形態では、イヌＰＤ−１に結合することおよびイヌＰＤ−１の、そのリガンドの少なくとも１つ、例えばイヌＰＤ−Ｌ１への結合をブロックすることの両方が示されている、マウス抗イヌＰＤ−１抗体由来のマウス抗イヌＰＤ−１  ＣＤＲが提供される。本明細書で例示するように、これらのＣＤＲを本発明の修飾されたイヌフレームに挿入して、イヌ化マウス抗イヌＰＤ−１抗体を作製することができる。
【０１０６】
より具体的には、本発明の「イヌ化マウス抗ＰＤ−１抗体」は、マウス抗イヌＰＤ−１抗体由来の３つの重鎖ＣＤＲおよび３つの軽鎖ＣＤＲをイヌフレームまたは修飾されたイヌフレームと共に含有する抗体を指す。修飾されたイヌフレームは、イヌ化抗体の有効性をさらに最適化する、例えば、抗体エフェクター機能を増大させる、減少させるまたは除去する、イヌ抗原、例えばイヌＰＤ−１へのその結合を増大させる、および／またはイヌ抗原、例えばイヌＰＤ−１のその天然結合パートナー（例えば抗原がイヌＰＤ−１である場合はイヌＰＤ−Ｌ１）への結合をブロックするその能力を増大させる、本明細書で例示するような１またはそれ以上のアミノ酸変化を含有する。
【０１０７】
「相同性」は、最適に整列した場合の２つのポリヌクレオチド配列間または２つのポリペプチド配列間の配列類似性を指す。２つの比較配列の両方におけるある位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットによって占有されている場合、例えば２つのＤＮＡ分子の各々におけるある位置がアデニンによって占有されている場合、これらの分子はその位置において相同である。相同性のパーセントは、２つの配列によって共有される相同な位置の数を、比較した位置の総数で除して、１００を乗じたものである。例えば、２つの配列を最適に整列した場合に２つの配列中の１０の位置のうち６の位置が一致するかまたは相同である場合、２つの配列は６０％相同である。一般に、比較は、最大の相同性パーセントを与えるように２つの配列を整列した場合に行われる。
【０１０８】
「単離された核酸分子」は、単離されたポリヌクレオチドが自然界で見出されるポリヌクレオチドの全部または一部分と結合していない、または自然界では連結されていないポリヌクレオチドに連結されている、ゲノム、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡもしくは合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡまたはそれらの何らかの組合せを意味する。本開示のために、特定のヌクレオチド配列「を含有する核酸分子」は無傷の染色体を包含しないことが理解されるべきである。指定された核酸配列「を含有する」単離された核酸分子は、指定配列に加えて、１０個までまたはさらには２０個までまたはそれ以上の他のタンパク質またはその部分もしくはフラグメントについてのコード配列を含有してよく、または列挙される核酸配列のコード領域の発現を制御する作動可能に連結された調節配列を含有してよく、および／またはベクター配列を含有してもよい。
【０１０９】
「制御配列」という語句は、特定の宿主生物における作動可能に連結されたコード配列の発現のために必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に適切な制御配列としては、例えばプロモーターが含まれ、オペレーター配列が含まれてもよく、およびリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを使用することが公知である。
【０１１０】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれている場合、「作動可能に連結されて」いる。例えば、プレ配列または分泌リーダーに関するＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドについてのＤＮＡに作動可能に連結されている；プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されている；またはリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように位置付けられている場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結された」は、連結されているＤＮＡ配列が隣接していること、および分泌リーダーの場合は、隣接しておりかつ読み取り相内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは隣接している必要はない。連結は、好都合な制限部位でのライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の慣例に従って合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用する。
【０１１１】
本明細書で使用される場合、「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」という表現は交換可能に使用され、すべてのそのような指定語は子孫を包含する。したがって、「形質転換体」および「形質転換細胞」という語は、一次被験体細胞および継代の数を考慮せずにそれに由来する培養物を包含する。また、意図的なまたは不慮の突然変異に起因して、必ずしもすべての子孫が正確に同じＤＮＡ含量を有さないことも理解される。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたのと同じ機能または生物学的活性を有する突然変異体子孫は包含される。異なる指定語が意図される場合は、文脈から明らかになる。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、「生殖細胞系配列」は、再構成されていない免疫グロブリンＤＮＡ配列の配列を指す。再構成されていない免疫グロブリン配列の任意の適切な供給源を使用し得る。ヒト生殖細胞系配列は、例えばアメリカ国立衛生研究所の関節炎および筋骨格系／皮膚疾患国立研究機構（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ  ａｎｄ  Ｓｋｉｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）のウエブサイト上のＪＯＩＮＳＯＬＶＥＲ（登録商標）生殖細胞系データベースから入手し得る。マウス生殖細胞系配列は、例えばＧｉｕｄｉｃｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３：Ｄ２５６−Ｄ２６１（２００５）］に記載されているように入手し得る。
【０１１３】
イヌ化抗体の特性
イヌにおいては、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤと称される４つのＩｇＧ重鎖が存在する。これらの重鎖は、ＩｇＧＡ、ＩｇＧＢ、ＩｇＧＣおよびＩｇＧＤと称される、イヌＩｇＧの４つの異なるサブクラスを示す。これら４つの重鎖のＤＮＡおよびアミノ酸配列は、Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．［Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．８０：２５９−２７０（２００１）］によって初めて同定された。これらの重鎖についてのアミノ酸およびＤＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースからも入手可能である。例えば、ＩｇＧＡ重鎖のアミノ酸配列はアクセッション番号ＡＡＬ３５３０１．１を有し、ＩｇＧＢはアクセッション番号ＡＡＬ３５３０２．１を有し、ＩｇＧＣはアクセッション番号ＡＡＬ３５３０３．１を有し、およびＩｇＧＤはアクセッション番号（ＡＡＬ３５３０４．１）を有する。イヌ抗体はまた、２種類の軽鎖、κおよびλも含有する。これらの軽鎖のＤＮＡおよびアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースから入手できる。例えばκ軽鎖のアミノ酸配列はアクセッション番号ＡＢＹ  ５７２８９．１を有し、λ軽鎖はアクセッション番号ＡＢＹ  ５５５６９．１を有する。本発明では、４つのイヌＩｇＧ  Ｆｃフラグメントの各々についてのアミノ酸配列は、Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．前出によって決定されたＣＨ１およびＣＨ２ドメインの同定された境界に基づく。
【０１１４】
治療用モノクローナル抗体の開発は、所望の抗体を生成するための複雑なセットの活動の調整を必要とする複雑な工程である。これらには、抗体の特異性、親和性、機能的活性、操作された細胞株における発現レベル、長期的な安定性、エフェクター機能の除去または増強ならびに商業的に実行可能な製造および精製方法の開発の最適化が含まれる。本発明の目的を考慮しておよび免疫系の細胞を活性化する能力を別にして、イヌＰＤ−１に対するイヌ化またはイヌモノクローナル抗体は、最適には３つの付加的な属性を有する：
１．抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などのエフェクター機能の欠如、
２．インビボでの比較的長い半減期；ならびに
３．プロテインＡクロマトグラフィに基づくもののような業界標準技術を用いて大規模で容易に精製される。
【０１１５】
天然に存在するイヌＩｇＧサブクラスはいずれも、これらの基準全部は満たさない。例えば、ＩｇＧＢはプロテインＡを使用して精製することができるが、高レベルのＡＤＣＣ活性を有する。ＩｇＧＣもかなりのＡＤＣＣ活性を有する。他方で、ＩｇＧＡはプロテインＡに弱く結合するが、望ましくないＡＤＣＣ活性を示す。さらに、ＩｇＧＤはＡＤＣＣ活性を示さないが、ＩｇＧＣまたはＩｇＧＤのいずれもがプロテインＡカラムでは精製することができない。加えて、ＩｇＧＣは、イヌＦｃＲｎ受容体に結合しないので、血清半減期が短い。本発明は、イヌ抗原、例えばイヌＰＤ−１に特異的な修飾されたイヌＩｇＧ抗体を提供することによってこの困難を克服する；そのような抗体はＡＤＣＣおよびＣＤＣなどのエフェクター機能を欠き、比較的長い半減期を示し、業界標準のプロテインＡクロマトグラフィを用いて容易に精製することができる。
【０１１６】
これまで、ＡＤＣＣおよびＣＤＣエフェクター機能の両方を有さず、および加えて、プロテインＡクロマトグラフィによって精製することができる遺伝的に修飾されたイヌＩｇＧは記述されていなかった。本明細書で開示するように、ヒトおよびマウスＩｇＧのものに類似するイヌＩｇＧ内の位置での単一置換、例えばＮ２９７ＡまたはＤ２６５Ａは、対応するイヌ抗体においてＡＤＣＣおよびＣＤＣエフェクター機能の両方を完全に除去するわけではない。例えば、ヒトまたはマウス抗体における置換Ｎ２９７およびＤ２６５の各々は、Ｆｃγ受容体およびＣ１ｑへの結合の排除をもたらすが、いずれの置換も単独ではイヌ抗体のＣ１ｑへの結合を完全には排除しなかった。その代わりに、以下でさらに開示するように、ＩｇＧＢまたはＩｇＧＣサブクラスのイヌ抗体においてＡＤＣＣおよびＣＤＣの両方を除去するためには、アスパラギンからアラニンへの置換およびアスパラギン酸からアラニンへの置換の両方を組み合わせたイヌ抗体のＦｃにおける二重置換を行う必要があることが判明した。さらに、全く予想外のことに、ヒト抗体においてエフェクター機能を低減させることが示されていた１つの置換が、実際には対応するイヌＩｇＧのＦｃγＲおよびＣ１ｑへの結合の増大を生じさせた。
【０１１７】
エフェクター機能を欠くイヌＩｇＧＢおよびＩｇＧＣの変異体を作製するために、修飾されたイヌＩｇＧＢまたは修飾されたイヌＩｇＧＣ重鎖を生成することができる。これらのイヌ結晶性フラグメント領域（ｃＦｃ）の両方に存在する合計７個のアミノ酸残基を、そのような可能性のある置換のために同定した。これら７個のアミノ酸残基は、イヌＩｇＧＢのＦｃについては配列番号：１３０のアミノ酸配列およびイヌＩｇＧＣのＦｃについては配列番号：１３２のアミノ酸配列の両方に関して：Ｐ４、Ｄ３１、Ｎ６３、Ｇ６４、Ｔ６５、Ａ９３およびＰ９５である。したがって、配列番号：２のアミノ酸配列は、４、３１、６３、６４、６５、９３および９５の位置に前記アミノ酸残基を有することによって配列番号：１３０のものと異なり、それらは、７つすべての位置について「Ｘ」（または３文字コードでは「Ｘａａ」）として配列番号：１３０のアミノ酸配列においてそれぞれプロリン（Ｐ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、グリシン（Ｇ）、トレオニン（Ｔ）、アラニン（Ａ）およびプロリン（Ｐ）であり、これら７つのアミノ酸位置が２０個の天然アミノ酸のいずれかであり得ることを示す（以下の表１の縦の列１のリスト参照）。同様に、配列番号：４のアミノ酸配列は、７つすべての位置について「Ｘ」（または３文字コードでは「Ｘａａ」）として列挙される４、３１、６３、６４、６５、９３および９５の位置に前記アミノ酸残基を有することによって配列番号：１３２のものと異なり、これら７つのアミノ酸位置が２０個の天然アミノ酸のいずれかであり得ることを示す。配列番号：２のアミノ酸配列は配列番号：１のヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号：４のアミノ酸配列は配列番号：３のヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１１８】
１つの実施形態では、ｃＦｃは、以下の置換：Ｐ４（Ａ、ＧまたはＳ）、Ｄ３１（Ａ、ＧまたはＳ）、Ｎ６３（Ａ、ＧまたはＳ）、Ｇ６４（ＡまたはＰ）、Ｔ６５（Ａ、ＧまたはＳ）、Ａ９３（ＧまたはＳ）およびＰ９５（Ａ、ＧまたはＳ）を有する配列番号：１３０のアミノ酸配列を含有し；ここでＰ４（Ａ、ＧまたはＳ）は、４位のプロリン残基がアラニン、グリシンまたはセリン残基のいずれかによって置き換えられていることを示し、同様にＧ６４（ＰまたはＡ）は、６４位のグリシン残基がプロリンまたはアラニン残基のいずれかによって置き換えられていることを示す、等である）。特定の実施形態では、ｃＦｃは、以下の置換：Ｐ４Ａ、Ｄ３１Ａ、Ｎ６３Ａ、Ｇ６４Ｐ、Ｔ６５Ａ、Ａ９３ＧおよびＰ９５Ａを有する配列番号：１３０のアミノ酸配列を含有する。
【０１１９】
関連実施形態では、ｃＦｃは、以下のアミノ酸残基：Ａ４、Ａ３１、Ａ６３、Ｇ６４、Ｔ６５、Ｇ９３およびＡ９５を有する、Ｘａａと称される７個のアミノ酸を含有する配列番号：４のアミノ酸配列、すなわち以下の５つのアミノ酸残基変化：Ｐ４Ａ、Ｄ３１Ａ、Ｎ６３Ａ、Ａ９３ＧおよびＰ９５Ａを有し、ならびに７個のうち残りの２個のアミノ酸残基、Ｇ６４およびＴ６５は配列番号：１３２のアミノ酸配列から保持されている、配列番号：１３２のアミノ酸配列を含有する。
【０１２０】
配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６０、配列番号：６２、配列番号：６４および配列番号：６６のアミノ酸配列はすべて、７つのアミノ酸位置に「Ｘ」（または３文字コードでは「Ｘａａ」）を含有し、これら７つのアミノ酸位置が以下の表１の縦の列１に列挙される２０個の天然アミノ酸のいずれかであり得ることを示す。特に配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６０、配列番号：６２、配列番号：６４および配列番号：６６は、それらのそれぞれの配列内に配列番号：２のアミノ酸配列または配列番号：４のアミノ酸配列のいずれかを含有する。アミノ配列のこれら７つの位置の１またはそれ以上におけるアミノ酸残基の具体的な例は、上記および下記に記述されており、それゆえ、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６０、配列番号：６２、配列番号：６４および配列番号：６６、ならびにこれらの配列を含有するイヌ化抗体内の個々のアミノ酸配列の属中に含まれる。
【０１２１】
以下に示す表１０は、ｃＩｇＧＢ  Ｆｃ（配列番号：１３０および配列番号：２）ならびにｃＩｇＧＣ  Ｆｃ（配列番号：１３２および配列番号：４）の、本明細書で開示するように置換することができる７つのアミノ酸位置を、これらのｃＦｃアミノ酸配列、すなわち配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６０、配列番号：６２、配列番号：６４および配列番号：６６を含有する完全長イヌ重鎖のものと具体的に関連付けている。したがって、完全長配列ＩｇＧＢまたはＩｇＧＣにおける実際の位置を、以下の表１０の使用を通して、それが含有するｃＦｃのものと容易に適合させることができる。
【０１２２】
特定の実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２３９位にＰ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｉｉ）２６６位にＤ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｉｉｉ）２９８位にＮ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｉｖ）２９９位にＧ、ＰまたはＡ、（ｖ）３００位にＴ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｖｉ）３２８位にＡ、ＧまたはＳ、および（ｖｉｉ）３３０位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを含む配列番号：４０、５２、５６または６４のアミノ酸配列を含有する。他の実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２３７位にＰ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｉｉ）２６４位にＤ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｉｉｉ）２９６位にＮ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｉｖ）２９７位にＧ、ＰまたはＡ、（ｖ）２９８位にＴ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｖｉ）３２６位にＡ、ＧまたはＳ、および（ｖｉｉ）３２８位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを含む配列番号：４２、５４、５８または６６のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２４４位にＰ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｉｉ）２７１位にＤ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｉｉｉ）３０３位にＮ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｉｖ）３０４位にＧ、ＰまたはＡ、（ｖ）３０５位にＴ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｖｉ）３３３位にＡ、ＧまたはＳ、および（ｖｉｉ）３３５位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを含む配列番号：４４、５０または６０のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２４２位にＰ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｉｉ）２６９位にＤ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｉｉｉ）３０１位にＮ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｉｖ）３０２位にＧ、ＰまたはＡ、（ｖ）３０３位にＴ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｖｉ）３３１位にＡ、ＧまたはＳ、および（ｖｉｉ）３３３位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを含む配列番号：４６または６２のアミノ酸配列を含有する。さらに他の実施形態では、抗体の重鎖は、（ｉ）２４６位にＰ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｉｉ）２７３位にＤ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｉｉｉ）３０５位にＮ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｉｖ）３０６位にＧ、ＰまたはＡ、（ｖ）３０７位にＴ、Ａ、ＧまたはＳ、（ｖｉ）３３５位にＡ、ＧまたはＳ、および（ｖｉｉ）３３７位にＰ、Ａ、ＧまたはＳを含む配列番号：４８のアミノ酸配列を含有する。
【０１２３】
本発明はまた、天然のＩｇＧＤヒンジ領域の代わりにＩｇＧＡ、ＩｇＧＢまたはＩｇＧＣのいずれか由来のヒンジ領域を含有する修飾されたイヌＩｇＧＤも提供する。あるいは、ＩｇＧＤヒンジ領域を、表５に示すようにセリン残基をプロリン残基で置き換えることによって遺伝的に修飾することができる。そのような修飾は、ｆａｂアーム交換を欠くイヌＩｇＧＤをもたらすことができる。修飾されたイヌＩｇＧＤは、組換えＤＮＡ技術の標準的な方法を用いて構築することができる［例えばＭａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）］。これらの変異体を構築するために、イヌＩｇＧＤのアミノ酸配列をコードする核酸を、修飾されたＩｇＧＤをコードするように修飾することができる。次に修飾された核酸配列をタンパク質発現のために発現プラスミドにクローニングする。代替ヒンジ領域を有するイヌＩｇＧＤ  Ｆｃをコードする核酸は、配列番号：８、１０および１２のアミノ酸配列をコードする配列番号：７、９および１１のヌクレオチド配列によって例示される。修飾されたＩｇＧＤヒンジ領域を有するイヌＩｇＧＤ  Ｆｃをコードする核酸は、配列番号：６のアミノ酸配列をコードする配列番号：５のヌクレオチド配列を含有する。
【０１２４】
本発明はさらに、対応する軽鎖とマッチしてイヌ化抗体を作製することができる完全長イヌ重鎖を提供する。したがって、本発明はさらに、イヌ化マウス抗イヌ抗原抗体（単離されたイヌ化マウス抗イヌＰＤ−１抗体を含む）および疾患の処置、例えばイヌの癌の処置における前記抗体またはその抗原結合フラグメントの使用の方法を提供する。
【０１２５】
さらに、本発明は、イヌＰＤ−１に結合し、およびイヌＰＤ−１のイヌＰＤ−Ｌ１への結合をブロックするイヌ化マウス抗イヌＰＤ−１抗体または抗原結合フラグメントを提供する。ある実施形態では、イヌ化マウス抗イヌＰＤ−１抗体は、修飾されたイヌＩｇＧＢ  Ｆｃ、修飾されたイヌＩｇＧＣ  Ｆｃまたは本明細書で述べるｆａｂアーム交換を欠く修飾されたイヌＩｇＧＤを含有する。
【０１２６】
イヌ化抗体、例えばイヌＰＤ−１に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、本明細書で述べるマウス抗イヌ抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）の１、２、３、４、５または６個を含有することができる。１、２、３、４、５または６個のＣＤＲは、以下で提供されるＣＤＲ配列から独立して選択され得る。さらなる実施形態では、イヌＰＤ−１に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、マウス軽鎖ＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２および／またはＣＤＲ−３を含むイヌ抗体κ軽鎖ならびにマウス重鎖ＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２および／またはＣＤＲ−３を含むイヌ抗体重鎖ＩｇＧを含有する。したがって、本発明はさらに、完全長イヌ重鎖を提供し、その後、例えば対応する軽鎖とマッチさせてイヌ化抗体を作製することができる［マウス抗イヌＰＤ−１のＣＤＲの７つのセットの配列、例えば１Ｂ５、２Ｇ９、２Ｈ９、３Ｂ６、４Ｄ１２、５Ｇ５および７Ｃ９が提供される、以下の表２参照］。
【０１２７】
他の実施形態では、本発明は、まだ所望の結合特性および機能特性を示す一方で、ＰＤ−１に特異的に結合し、ならびに配列番号：１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５および／または２６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を含む１から６個の異なるＣＤＲを含有するイヌ抗体κ軽鎖ならびに配列番号：２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８および／または１４６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を含む１から６個の異なるＣＤＲを含有するイヌ抗体重鎖ＩｇＧを有する、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。別の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、まだ所望の結合特性および機能特性を示す一方で、０、１、２、３、４または５個の保存的または非保存的アミノ酸置換を有する前述したＣＤＲアミノ酸配列の１またはそれ以上を有するκ軽鎖とＩｇＧ重鎖配列の組合せから成るイヌフレームを含有する。
【０１２８】
配列同一性は、２つの配列を最適に整列した場合に２つのポリペプチドのアミノ酸が等しい位置において同じである程度を指す。本明細書で使用される場合、あるアミノ酸配列は、２番目のアミノ酸配列に対して、両方の配列のアミノ酸残基が同一である場合１００％「同一」である。したがって、２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基の５０％が同一である場合、あるアミノ酸配列は２番目のアミノ酸配列に５０％「同一」である。配列比較は、所与のタンパク質、例えば比較されるタンパク質またはポリペプチドの一部分に含まれるアミノ酸残基の連続するブロックにわたって実施される。特定の実施形態では、さもなければ２つのアミノ酸配列の間の対応性を変化させ得る選択された欠失または挿入を考慮に入れる。
【０１２９】
配列類似性は、同一の残基および非同一の生化学的に関連するアミノ酸を包含する。類似の特性を共有し、交換可能であり得る生化学的に関連するアミノ酸が考察される。
【０１３０】
「保存的に修飾された変異体」または「保存的置換」は、タンパク質中のアミノ酸の、類似の性質（例えば電荷、側鎖サイズ、疎水性／親水性、骨格立体配座および剛性等）を有する他のアミノ酸による置換であって、変化がしばしばタンパク質の生物学的活性を変化させずに行われ得る置換を指す。当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須領域内の１個のアミノ酸置換は生物学的活性を実質的に改変しないことを認識する。［例えばＷａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４（４ｔｈ  Ｅｄ．；１９８７）参照］。加えて、構造的または機能的に類似のアミノ酸の置換は生物学的活性を破壊する可能性がより低い。例示的な保存的置換をすぐ下の表Ｉに示す。
【表１】
0006681832.tif 000002
【０１３１】
本発明の抗体の機能保存的変異体も本発明によって企図される。「機能保存的変異体」は、本明細書で使用される場合、１またはそれ以上のアミノ酸残基が所望の特性、例えば（ｓｕｃｈ  ａｎ）抗原親和性および／または特異性を改変することなく変化している抗体またはフラグメントを指す。そのような変異体としては、上記表Ｉの保存的アミノ酸置換のような、あるアミノ酸の、類似特性を有するアミノ酸による置換が含まれるが、これに限定されない。
【０１３２】
核酸
本発明はさらに、本明細書で開示されるイヌ化マウス抗イヌＰＤ−１抗体およびその抗原結合フラグメントの免疫グロブリン鎖をコードする核酸を包含する（以下の「実施例」参照）。
【０１３３】
また、ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって比較を実施した場合、本明細書で提供されるＣＤＲおよび／またはイヌｃＦｃおよび／または抗体のアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一、好ましくは少なくとも約８０％同一、より好ましくは少なくとも約９０％同一、最も好ましくは少なくとも約９５％同一（例えば９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）であるアミノ酸配列を含有する免疫グロブリンポリペプチドをコードする核酸も本発明に包含され、ここで前記アルゴリズムのパラメータは、それぞれの参照配列の全長にわたってそれぞれの配列間で最大のマッチを与えるように選択される。本発明はさらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムで比較を実施した場合、参照アミノ酸配列のいずれかと少なくとも約７０％類似、好ましくは少なくとも約８０％類似、より好ましくは少なくとも約９０％類似、最も好ましくは少なくとも約９５％類似（例えば９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）するアミノ酸配列を含有する免疫グロブリンポリペプチドをコードする核酸を提供し、ここで前記アルゴリズムのパラメータは、それぞれの参照配列の全長にわたってそれぞれの配列間で最大のマッチを与えるように選択される。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の同一性パーセントは、アラインメントのデフォルトパラメータおよび同一性についてのデフォルトパラメータでＣ，ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ，Ｉｎｃ．Ｃａｒｙ，ＮＣ  ２７５１９）、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ．ＭＤ）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐ  ＰＬＣ（１９９６）およびＣｌｕｓｔａｌ  Ｗアルゴリズムを使用して決定することができる。これらの市販のプログラムはまた、同じまたは類似のデフォルトパラメータを使用して配列類似性を決定するためにも使用できる。あるいは、例えばデフォルトパラメータを用いたＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ７，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）パイルアッププログラムを使用して、デフォルトフィルター条件下でのＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｌａｓｔ検索を用いることができる。
【０１３５】
以下の参考文献は、配列解析のためにしばしば使用されるＢＬＡＳＴアルゴリズムに関する：ＢＬＡＳＴ  ＡＬＧＯＲＩＴＨＭＳ：Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）；Ｇｉｓｈ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２（１９９３）；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１（１９９６）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７）；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６４９−６５６（１９９７）；Ｗｏｏｔｔｏｎ，Ｊ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１７：１４９−１６３（１９９３）；Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０：６７−７０（１９９４）；ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ  ＳＣＯＲＩＮＧ  ＳＹＳＴＥＭＳ：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．，「Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．」ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３．Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（ｅｄ．），ｐｐ．３４５−３５２，（１９７８）；Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，「Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．」ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３．」（１９７８），Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（ｅｄ．），ｐｐ．３５３−３５８（１９７８），Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：５５５−５６５（１９９１）；Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３：６６−７０（１９９１）；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：２９０−３００（１９９３）；ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ  ＳＴＡＴＩＳＴＩＣＳ：Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８（１９９０）；Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７（１９９３）；Ｄｅｍｂｏ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｐｒｏｂ．２２：２０２２−２０３９（１９９４）；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．「Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．」ｉｎ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓ．Ｓｕｈａｉ，ｅｄ．），ｐｐ．１−１４，���ｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９７）。
【０１３６】
本発明はまた、本発明の核酸（単離された核酸を含む）を含有する発現ベクターも提供し、ここで前記核酸は、宿主細胞をベクターでトランスフェクトした場合に宿主細胞によって認識される制御配列に作動可能に連結されている。また、本発明の発現ベクターを含有する宿主細胞ならびに本明細書で開示される抗体またはその抗原結合フラグメントを作製する方法であって、抗体または抗原結合フラグメントをコードする発現ベクターを保有する宿主細胞を培地で培養することおよび抗原またはその抗原結合フラグメントを宿主細胞または培地から単離することを含む方法も提供される。
【０１３７】
例えば、イヌ化マウス抗イヌＰＤ−１抗体は、当分野で公知の方法によって組換え技術で作製することができる。本明細書で開示される抗体またはフラグメントの発現のための宿主として使用可能な哺乳動物細胞株は当分野で周知であり、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株が含まれる。これらには、中でも特に、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えばＨｅｐ  Ｇ２）、Ａ５４９細胞、３Ｔ３細胞、ＨＥＫ−２９３細胞および多くの他の細胞株が含まれる。哺乳動物宿主細胞としては、ヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマおよびハムスター細胞が含まれる。特に好ましい細胞株は、いずれの細胞株が高発現レベルを有するかを測定することを通して選択される。使用し得る他の細胞株は、昆虫細胞、例えばＳｆ９細胞、両生類細胞、細菌細胞、植物細胞および真菌細胞である。重鎖またはその抗原結合部分もしくはフラグメント、軽鎖および／またはその抗原結合フラグメントをコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入する場合、宿主細胞における抗体の発現または、より好ましくは宿主細胞が増殖する培地中への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間宿主細胞を培養することによって抗体が産生される。
【０１３８】
抗体は、標準的なタンパク質精製方法を用いて培地から回収することができる。さらに、産生細胞株からの本発明の抗体（またはそれに由来する他の成分）の発現は、多くの公知の技術を用いて増強することができる。例えばグルタミンシンテターゼ遺伝子発現系（ＧＳ系）は、特定の条件下で発現を増強するための一般的なアプローチである。ＧＳ系は、欧州特許第０２１６８４６号、同第０２５６０５５号および同第０３２３９９７号ならびに欧州特許出願第８９３０３９６４．４号に関連して全体的にまたは部分的に考察される。
【０１３９】
一般に、特定の細胞株またはトランスジェニック動物において産生される糖タンパク質は、その細胞株またはトランスジェニック動物で産生される糖タンパク質に特徴的なグリコシル化パターンを有する。それゆえ、抗体の特定のグリコシル化パターンは、抗体を作製するのに使用される特定の細胞株またはトランスジェニック動物に依存する。しかし、本明細書で提供される核酸分子によってコードされるまたは本明細書で提供されるアミノ酸配列を含有するすべての抗体は、抗体が有し得るグリコシル化パターンに関わりなく、本発明を構成する。同様に、特定の実施形態では、非フコシル化Ｎ−グリカンだけを含むグリコシル化パターンを有する抗体は、これらの抗体が、典型的にはインビトロおよびインビボの両方でそれらのフコシル化対応物よりも強力な効果を発揮することが示されているため、好都合であり得る［例えばＳｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３４６６−３４７３（２００３）；米国特許第６，９４６，２９２号および同第７，２１４，７７５号参照］。
【０１４０】
本発明はさらに、本明細書で開示されるイヌ化マウス抗イヌＰＤ−１抗体の抗体フラグメントを包含する。抗体フラグメントには、例えばペプシンによるＩｇＧの酵素切断によって生成し得るＦ（ａｂ）２フラグメントが含まれる。Ｆａｂフラグメントは、例えばジチオトレイトールまたはメルカプトエチルアミンでのＦ（ａｂ）２の還元によって生成し得る。Ｆａｂフラグメントは、ジスルフィド架橋によってＶＨ−ＣＨ１鎖に付加されたＶＬ−ＣＬ鎖である。Ｆ（ａｂ）２フラグメントは、今度は２つのジスルフィド架橋によって付加された２つのＦａｂフラグメントである。Ｆ（ａｂ）２分子のＦａｂ部分は、その間にジスルフィド架橋が位置するＦｃ領域の一部分を含む。ＦＶフラグメントはＶＬまたはＶＨ領域である。
【０１４１】
１つの実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、重鎖定常領域、例えばイヌ定常領域、例えばＩｇＧＡ、ＩｇＧＢ、ＩｇＧＣおよびＩｇＧＤイヌ重鎖定常領域またはその変異体を含有する。別の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、軽鎖定常領域、例えばイヌ軽鎖定常領域、例えばλまたはκイヌ軽鎖領域またはその変異体を含有する。限定ではなく例として、イヌ重鎖定常領域はＩｇＧＢに由来することができ、イヌ軽鎖定常領域はκに由来し得る。
【０１４２】
抗体エンジニアリング
本発明のイヌ化マウス抗イヌＰＤ−１抗体は、以下で詳述するように、例えば抗体の特性を改善するために、親（すなわちイヌ）モノクローナル抗体のイヌフレーム内に修飾を含有するように操作することができる。
【０１４３】
本明細書で論じる交差ブロックイヌ化抗体およびその抗原結合フラグメントは、標準的な結合アッセイ（例えば以下で例示するようなＢＩＡＣｏｒｅ（登録商標）、ＥＬＩＳＡ、またはフローサイトメトリ）においてＩＢ５、３Ｂ６、４Ｄ１２、７Ｃ９、２Ｈ９、５Ｇ５および／または２Ｇ９のいずれかと交差競合するそれらの能力に基づいて同定することができる。例えば標準的なＥＬＩＳＡアッセイが使用でき、このアッセイでは、組換えイヌＰＤ−１タンパク質をプレート上に固定化し、抗体の１つを蛍光標識して、標識抗体の結合を競合除去する非標識抗体の能力を評価する。加えてまたは選択的に、ＢＩＡＣｏｒｅ（登録商標）分析を使用して交差競合する抗体の能力を評価することができる。例えばＩＢ５、３Ｂ６、４Ｄ１２、７Ｃ９、２Ｈ９、５Ｇ５および／または２Ｇ９のイヌＰＤ−１への結合を阻害する試験抗体の能力は、試験抗体がイヌＰＤ−１への結合に関してＩＢ５、３Ｂ６、４Ｄ１２、７Ｃ９、２Ｈ９、５Ｇ５および／または２Ｇ９と競合することができ、したがって、一部の場合には、ＩＢ５、３Ｂ６、４Ｄ１２、７Ｃ９、２Ｈ９、５Ｇ５および／または２Ｇ９と同じイヌＰＤ−１上のエピトープに結合し得ることを明らかにする。前述したように、本発明の抗イヌＰＤ−１抗体またはフラグメントのいずれかと同じエピトープに結合する抗体およびフラグメントも、本発明の一部を形成する。
【０１４４】
医薬組成物および投与
イヌ化マウス抗イヌＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントの医薬または滅菌組成物を調製するために、イヌ化マウス抗イヌＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを医薬的に許容される担体または賦形剤と混合することができる。［例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ＳｃｉｅｎｃｅｓおよびＵ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８４）参照］。
【０１４５】
治療薬および診断薬の製剤は、例えば凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液または懸濁液の形態で許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することによって調製し得る［例えばＨａｒｄｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ａｖｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｗｅｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｋｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００）Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ参照］。１つの実施形態では、本発明の抗ＰＤ−１抗体を酢酸ナトリウム溶液ｐＨ５〜６中で適切な濃度に希釈し、張度のためにＮａＣｌまたはスクロースを添加する。安定性を高めるためにポリソルベート２０またはポリソルベート８０などの付加的な作用物質を添加してもよい。
【０１４６】
単独でまたは別の作用物質と併用して投与される、抗体組成物の毒性および治療効果は、例えばＬＤ５０（母集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ５０（母集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するために、細胞培養物または実験動物において標準的な薬学手順によって決定することができる。毒性作用と治療効果の用量比が治療指数（ＬＤ５０／ＥＤ５０）である。特定の態様では、高い治療指数を示す抗体が望ましい。これらの細胞培養アッセイおよび動物試験から得られるデータは、イヌにおける使用のための投与量範囲を設定するのに使用できる。そのような化合物の投与量は、好ましくはほとんどまたは全く毒性を伴わないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、使用される剤形および投与経路に依存してこの範囲内で変化させ得る。
【０１４７】
投与の方法は様々であり得る。適切な投与経路には、経口、直腸、経粘膜、腸、非経口；筋肉内、皮下、皮内、髄内、髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻内、眼内、吸入、通気、局所、皮膚、経皮または動脈内経路が含まれる。
【０１４８】
特定の実施形態では、イヌ化マウス抗イヌＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、注射などの侵襲的経路によって投与することができる。本発明のさらなる実施形態では、マウス抗イヌＰＤ−１抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはその医薬組成物は、静脈内、皮下、筋肉内、動脈内、腫瘍内経路で、または吸入、エアロゾル送達によって投与される。非侵襲的経路（例えば経口的に；例えば丸剤、カプセルまたは錠剤中で）による投与も本発明の範囲内である。
【０１４９】
本明細書で開示される医薬組成物は注入によっても投与し得る。医薬組成物を投与するための（ｆｏｒｍ）周知のインプラントおよびモジュールの例としては：薬剤を制御された速度で投与するための移植可能なマイクロ注入ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号、薬剤を正確な注入速度で送達するための薬剤注入ポンプを開示する米国特許第４，４４７，２３３号、持続的な薬剤送達のための可変流量の移植可能な注入装置を開示する米国特許第４，４４７，２２４号、多チャンバー区画を有する浸透圧薬物送達システムを開示する米国特許第４，４３９，１９６号が含まれる。多くの他のそのようなインプラント、送達システムおよびモジュールは当業者に周知である。
【０１５０】
あるいは、しばしばデポー製剤または持続放出製剤中で、例えば関節炎の関節または免疫病理学によって特徴付けられる病原体誘発性病変内に抗体を直接注入することによって、イヌ化マウス抗イヌＰＤ−１抗体を全身的にではなく局所的に投与し得る。さらに、例えば関節炎の関節または免疫病理学によって特徴付けられる病原体誘発性病変を標的とする、標的化薬物送達システム、例えば組織特異的抗体で被覆されたリポソーム中で抗体を投与し得る。リポソームは罹患組織を標的とし、罹患組織によって選択的に取り込まれる。
【０１５１】
投与レジメンは、治療用抗体の血清または組織代謝回転速度、症状のレベル、治療用抗体の免疫原性、および生物学的マトリックス中の標的細胞の接近可能性を含む、いくつかの因子に依存する。好ましくは、投与レジメンは、同時に望ましくない副作用を最小限に抑えつつ、標的疾患部位において改善を生じさせるのに十分な治療用抗体を送達する。したがって、送達される生物学的製剤の量は、一部には特定の治療用抗体および処置される状態の重症度に依存する。治療用抗体の適切な用量を選択するうえでの指針が入手可能である［例えばＷａｗｒｚｙｎｃｚａｋ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂ．Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ（１９９６）；Ｋｒｅｓｉｎａ（ｅｄ．）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９１）；Ｂａｃｈ（ｅｄ．）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９３）；Ｂａｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：６０１−６０８（２００３）；Ｍｉｌｇｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４１：１９６６−１９７３（１９９９）；Ｓｌａｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：７８３−７９２（２００１）；Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２：６１３−６１９（２０００）；Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：２４−３２（２００３）；Ｌｉｐｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３：１５９４−１６０２（２０００）参照］。
【０１５２】
適切な用量の決定は、例えば処置に影響を及ぼすことが当分野で公知であるまたは影響を及ぼすと推測されるパラメータまたは因子を使用して、獣医（ｖｅｔｅｒａｎａｒｉａｎ）によって行われる。一般に、用量は、最適用量よりいくぶん低い量から開始して、その後負の副作用と比較して所望のまたは最適の効果が達成されるまで少しずつ増量する。重要な診断尺度には、例えば炎症の症状の尺度または産生される炎症性サイトカインのレベルが含まれる。
【０１５３】
本明細書で開示される抗体またはその抗原結合フラグメントは、持続注入によって、または例えば１日１回、週に１〜７回、週１回、隔週に１回、月１回、隔月に１回、３か月に１回、半年に１回、年１回等で投与される用量によって提供され得る。用量は、例えば静脈内、皮下、局所、経口、経鼻、直腸、筋肉内、大脳内、髄腔内投与または吸入によって提供され得る。１週間の総用量は、一般に少なくとも０．０５μｇ／ｋｇ体重、より一般的には少なくとも０．２μｇ／ｋｇ、０．５μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上である［例えばＹａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４９：４２７−４３４（２００３）；Ｈｅｒｏｌｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：１６９２−１６９８（２００２）；Ｌｉｕ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈ．６７：４５１−４５６（１９９９）；Ｐｏｒｔｉｅｌｊｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：１３３−１４４（２００３）参照］。用量はまた、被験体の血清中でイヌ化マウス抗イヌＰＤ−１抗体のあらかじめ定められた標的濃度、例えば０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００、３００μｇ／ｍｌまたはそれ以上を達成するように提供され得る。他の実施形態では、本発明のイヌ化マウス抗イヌＰＤ−１抗体は週１回、隔週に１回、「４週間に１回」、月１回、隔月に１回または３か月に１回ベースで、１０、２０、５０、８０、１００、２００、５００、１０００または２５００ｍｇ／被験体で皮下または静脈内経路によって投与される。
【０１５４】
本明細書で使用される場合、「阻害する」または「処置する」または「処置」は、障害に関連する症状の発現の先送りおよび／またはそのような障害の症状の重症度の軽減を包含する。これらの用語は、既存の制御されないまたは望ましくない症状を改善すること、付加的な症状を予防すること、およびそのような症状の基礎となる原因を改善または予防することをさらに包含する。したがって、これらの用語は、障害、疾患もしくは症状を有する、またはそのような障害、疾患もしくは症状を発現する潜在的可能性を有する脊椎動物被験体に有益な結果が与えられていることを意味する。
【０１５５】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」、「治療有効用量」および「有効量」という用語は、単独でまたは付加的な治療薬と併用して細胞、組織または被験体に投与された場合、疾患もしくは状態の１もしくはそれ以上の症状またはそのような疾患もしくは状態の進行の測定可能な改善を生じさせるのに有効な、本発明のイヌ化マウス抗イヌＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントの量を指す。治療有効用量はさらに、症状の少なくとも部分的な改善、例えば関連する医学的状態の処置、治癒、予防もしくは改善、またはそのような状態の処置、治癒、予防もしくは改善の速度の増大をもたらすのに十分な結合化合物の量を指す。単独で投与される個々の有効成分に適用される場合、治療有効用量はその成分単独を指す。組合せに適用される場合、治療有効用量は、併用して、連続的にまたは同時に投与されるかどうかにかかわらず、治療効果をもたらす有効成分の総計量を指す。治療薬の有効量は、診断尺度またはパラメータの少なくとも１０％、通常は少なくとも２０％、好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも４０％、最も好ましくは少なくとも５０％の改善をもたらす。有効量はまた、疾患の重症度を評価するのに主観的尺度を用いる場合は、主観的尺度の改善ももたらすことができる。
【０１５６】
他の併用療法
先に述べたように、イヌ化マウス抗イヌＰＤ−１抗体もしくはその抗原結合フラグメントは、１またはそれ以上の他の治療薬（例えば化学療法剤）と同時投与し得る。抗体を他の治療薬に連結してもよく（免疫複合体として）または他の治療薬とは別に投与することができる。後者（別々の投与）の場合は、抗体を他の治療薬の前、後もしくは治療薬と同時に投与することができるかまたは他の公知の療法と同時投与することができる。
【０１５７】
キット
さらに、ＰＤ−１に特異的に結合する、本明細書で論じる抗体または抗原結合フラグメント（例えばイヌ化マウス抗イヌＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメント）を含むがこれらに限定されない１またはそれ以上の成分を、本明細書で論じる、医薬的に許容される担体および／または化学療法剤を含むがこれらに限定されない１またはそれ以上の付加的な成分と共に含有するキットが提供される。結合組成物および／または化学療法剤は、純粋な組成物としてまたは医薬的に許容される担体と組み合わせて医薬組成物に製剤することができる。
【０１５８】
１つの実施形態では、キットは、本発明の結合組成物（例えば、１つの容器中（例えば滅菌ガラスまたはプラスチックバイアル中）にイヌ化マウス抗イヌＰＤ−１抗体またはその医薬組成物ならびに別の容器中（例えば滅菌ガラスまたはプラスチックバイアル中）にその医薬組成物および／または化学療法剤を含有する。
【０１５９】
キットが被験体への非経口投与用の医薬組成物を含む場合、キットは、そのような投与を実施するための装置も含有することができる。例えばキットは、上記で論じた１またはそれ以上の皮下針または他の注射装置を含有し得る。キットはまた、キット中の医薬組成物および剤形に関する情報を含む添付文書も含有することができる。一般に、そのような情報は、ペットの飼い主および獣医（ｖｅｔｅｒａｎａｒｉａｎ）が同封されている医薬組成物および剤形を有効かつ安全に使用するのに役立つ。例えば本発明の組合せに関する以下の情報が添付文書中で提供され得る：薬物動態、薬力学、臨床試験、効果パラメータ、適応症および用法、禁忌、警告、使用上の注意、有害反応、過量、適切な用量および投与、供給方法、適切な保存条件、参考文献、製造者／配給者情報ならびに特許情報。
【０１６０】
便宜上、本明細書で開示される抗体または特定の結合物質は、キット中で、すなわち診断または検出アッセイを実施するための指示書と共に所定量の試薬の包装された組合せで提供され得る。抗体が酵素で標識されている場合、キットは、基質および酵素が必要とする補因子（例えば検出可能な発色団または発蛍光団を提供する基質前駆体）を含有する。加えて、他の添加物、例えば安定剤、緩衝液（例えばブロック緩衝液または溶解緩衝液）等が含まれてもよい。様々な試薬の相対的な量は、アッセイの感受性を実質的に最適化する試薬の溶液中の濃度を提供するように広く異なり得る。特に、試薬は、溶解後に適切な濃度を有する試薬溶液を提供する賦形剤を含有する、通常は凍結乾燥された、乾燥粉末として提供され得る。
【０１６１】
［実施例］
［実施例１］
イヌＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１
イヌＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１：
その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１３年１２月２０日出願の米国特許仮出願第６１／９１８，９４６号は、配列番号：１１３のイヌＰＤ−１（ｃＰＤ−１）についての完全長ヌクレオチド配列［配列番号：１３３はシグナル配列を含む］；配列番号：１１４の対応する翻訳されたアミノ酸配列［配列番号：１３４はシグナル配列を含む］；イヌＰＤ−１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をコードするヌクレオチド配列、配列番号：１１５；イヌＰＤ−１のＥＣＤのアミノ酸配列、配列番号：１１６；配列番号：１１７の、イヌＰＤ−１  ＥＣＤプラスＧＴリンカーおよびヒトＩｇＧ１  Ｆｃ遺伝子のＦｃ部分のヌクレオチド配列；ならびにイヌＰＤ−１  ＥＣＤプラスＧＴリンカーおよびヒトＩｇＧ１  Ｆｃ遺伝子のＦｃ部分のアミノ酸配列、配列番号：１１８［配列番号：１３７はシグナル配列を含む］を提供する。
【０１６２】
米国特許仮出願第６１／９１８，９４６号はさらに、配列番号：１１９のイヌＰＤ−Ｌ１（ｃＰＤ−Ｌ１）についての完全長ヌクレオチド配列［配列番号：１３５はシグナル配列を含む］；配列番号：１２０の対応する翻訳されたアミノ酸配列［配列番号：１３６はシグナル配列を含む］；イヌＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をコードするヌクレオチド配列、配列番号：１２１；イヌＰＤ−Ｌ１のＥＣＤのアミノ酸配列、配列番号：１２２；イヌＰＤ−Ｌ１  ＥＣＤプラスＧＴリンカーおよびヒトＩｇＧ１  Ｆｃ遺伝子のＦｃ部分のヌクレオチド配列、配列番号：１２３；ならびにイヌＰＤ−Ｌ１  ＥＣＤプラスＧＴリンカーおよびヒトＩｇＧ１  Ｆｃ遺伝子のＦｃ部分のアミノ酸配列、配列番号：１２４を提供する。
【０１６３】
［実施例２］
マウス抗イヌＰＤ−１抗体
抗イヌＰＤ−１モノクローナル抗体の作製：
合計３匹のＢａｌｂ／ｃマウスを１７日間にわたって複数回免疫した（毎回１０μｇで）。免疫する抗原はイヌＰＤ−１  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質であった。免疫後、各々のマウスから血清を採取し、イヌＰＤ−１  ＥＣＤ−ＨＩＳタグタンパク質との反応性に関して試験した。最も高い血清抗ＰＤ−１  ＥＣＤ−ＨＩＳ力価を有するマウスの脾細胞を骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞株に融合した。融合の約２週間後に、推定上のハイブリドーマ細胞からの上清を、ＰＤ−１  ＥＣＤ−ＨＩＳタグタンパク質に対するそれらの反応性に関してＥＬＩＳＡによって試験した。ＥＬＩＳＡにおいて強い陽性シグナルを生じるハイブリドーマを限界希釈によってサブクローニングし、イヌＰＤ−１  ＥＣＤ−ＨＩＳタグタンパク質に対する反応性に関して再び試験した。
【０１６４】
イヌＰＤ−１に対するモノクローナル抗体の反応性の確認：
ハイブリドーマによって分泌される抗体の、イヌＰＤ−１のＥＣＤに対する反応性をＥＬＩＳＡによって確認した。ハイブリドーマ細胞を、ＣＥＬＬｉｎｅバイオリアクター（Ｉｎｔｅｇｒａ−ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して１０〜３０日間培養した。細胞を最初に、４ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよびＧｉｂｃｏからの１０％Ｕｌｔｒａ  Ｌｏｗ  ＩｇＧウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭ中で維持した。ハイブリドーマ細胞を、ＦＢＳ濃度を２０％に増加した同じ培地１５ｍＬ中約２×１０６細胞／ｍＬの細胞密度でＣＥＬＬｉｎｅバイオリアクターの細胞チャンバーに接種した。外側チャンバーに栄養培地（４ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび２％標準ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ）１Ｌを満たした。細胞チャンバー中のハイブリドーマ細胞を３〜７日間かけて約２．５×１０７細胞／ｍＬに増殖させた。次に、細胞懸濁液１０ｍＬを細胞チャンバーから採取し、新鮮培地と交換して、細胞を再増殖させ、その後採取した。この手順を必要に応じて反復し、各ハイブリドーマクローンから適切な量のｍＡｂを得た。採取した細胞懸濁液を遠心分離し、上清を０．２ミクロンフィルター膜でろ過した。抗体精製のために、各クローンの上清を、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  ｆｌｏｗ  ５ｍＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して重力流によって精製した。Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液ｐＨ８．０で洗浄した後、０．１Ｍグリシン緩衝液、ｐＨ２．７を使用して結合抗体を溶出し、次いで１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０を使用してｐＨを中和した。抗体を濃縮し、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  ＹＭ−１０、１０ｋＤａ  ＮＭＷＬ遠心分離フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して緩衝液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に交換した。分光測光法を用いて抗体濃度を定量した。
【０１６５】
精製抗イヌＰＤ−１  ｍＡｂを、イヌＰＤ−１のＨＩＳタグＥＣＤドメインとの反応性に関してＥＬＩＳＡによって次のように試験した：ＨＩＳタグイヌＰＤ−１  ＥＣＤタンパク質を被覆緩衝液（炭酸塩／重炭酸塩、ｐＨ９．０）中で１０μｇ／ｍＬに希釈し、１００μｌ／ウェルで９６ウェル平底ＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ）に分注する。プレートを４℃で一晩インキュベートする。その後プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳＴ）で３回洗浄する。次に、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳＴ中５％脱脂乳）２００μｌを各ウェルに添加し、プレートを３７℃で６０分間インキュベートする。その後プレートをＰＢＳＴで３回洗浄する。次に、ブロッキング緩衝液に希釈した試験ｍＡｂ  １００μｌを適切なカラムの最初のウェルに添加する。その後試験ｍＡｂを適切なプレート位置に２倍希釈する。プレートを３７℃で６０分間インキュベートした後、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄する。次に、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＫＰＬ）の１：２，０００希釈物１００μｌ／ウェルをプレートに添加し、その後プレートを３７℃で６０分間インキュベートする。次にプレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（ＫＰＬより）１００μｌ／ウェルをプレートに添加する。３７℃で５〜２０分間、発色反応を発現させた後、６５０ｎｍで吸光度を測定する。
【０１６６】
イヌＰＤ−１タンパク質を発現するＣＨＯ細胞：
完全長イヌＰＤ−１遺伝子をプラスミドｐ９６７９３にクローニングした。このプラスミドにおいてＰＤ−１タンパク質の発現はｈＣＭＶプロモーターによって駆動される。ＣＨＯ  ＤＸＢ１１細胞（ｄｈｆｒ−）を、１０％ウシ胎仔血清を添加したＭＥＭ−α（Ｇｉｂｃｏ）中で維持した。プラスミドｐ９６７９３によるＣＨＯ細胞のトランスフェクションを、約６×１０６細胞を含む７５ｃｍ２フラスコ中でリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用したリポソーム媒介性遺伝子送達によって実施した。４８時間後、１０％ＦＢＳおよび４００μｇ／ｍＬハイグロマイシンＢを添加した、ヌクレオシドを含有しないＭＥＭ−α培地（選択培地）に細胞を継代した。ｄｈｆｒ＋のハイグロマイシン耐性細胞のプールに関して限界希釈クローニングを実施した。クローンを免疫蛍光アッセイによってイヌＰＤ−１の発現に関して評価した。簡単に述べると、細胞単層を８０％アセトンで９６ウェルプレートに固定した。次に、固定して乾燥した細胞単層をポリクローナルヤギ抗ヒトＰＤ−１抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と共に１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで洗浄し、次にフルオレセイン標識ウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体（ＫＰＬ）と共に１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで洗浄した。蛍光を示すクローンを増殖させ、細胞株を樹立した。
【０１６７】
ＣＨＯ細胞上に発現されたイヌＰＤ−１タンパク質に対するマウスｍＡｂの反応性：
ＣＨＯ細胞上のイヌＰＤ−１とマウス抗イヌＰＤ−１  ｍＡｂの反応性を、ＰＤ−１を発現するＣＨＯ細胞を使用した細胞ベースのアッセイによって測定した。簡単に述べると、イヌＰＤ−１を発現するＣＨＯ細胞を培地（ＤＭＥＭ／ＨＡＭ  Ｆ１２、１０％ＦＢＳ）５０μｌ中で８０〜１００％の集密度まで培養した。次に、様々な濃度の精製ｍＡｂを含有する培地５０μｌを３７℃で１時間添加した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、培地中で１：１０００希釈したヤギ抗マウスホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）１００μｌを３７℃で１時間添加した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎでさらに３回洗浄した後、結合ｍＡｂをペルオキシダーゼ（ｐｅｒｉｏｘｉｄａｓｅ）基質（ＴＭＢ）で視覚化した。４５０ｎｍでのペルオキシダーゼ（ｐｅｒｉｏｘｉｄａｓｅ）活性による吸光度の増加をマイクロプレートリーダーで測定した。
【０１６８】
マウス抗イヌＰＤ−１抗体の特徴付け：
上記ならびにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１３年１２月２０日出願の米国特許仮出願第６１／９１８，９４６号に詳述されているように、マウス抗イヌＰＤ−１抗体を、以下を含む多くのパラメータによって特徴付けた：ＥＬＩＳＡによるイヌＰＤ−１のＥＣＤとの反応性、ＣＨＯ細胞の表面に発現されるＰＤ−１との反応性、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１との結合をブロックする能力、ならびに健常イヌおよび癌を有するイヌ由来のＰＢＭＣ細胞に結合する能力。選択した７つのマウス抗イヌＰＤ−１抗体（それぞれＩＢ５、２Ｇ９、２Ｈ９、３Ｂ６、４Ｄ１２、５Ｇ５および７Ｃ９と表す）のＣＤＲのアミノ酸配列は、以下の表２に示すように実質的な相同性を有していた。
【表２】
0006681832.tif 000003
0006681832.tif 000004
【０１６９】
［実施例３］
イヌ化およびイヌ化抗体の特徴付け
イヌ化抗体を作製するために、イヌＩｇＧの重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡ配列を同定する必要があった。イヌ重鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ遺伝子およびタンパク質データベースから入手することができる。イヌＩｇＧの４つの公知のＩｇＧサブクラス：ＩｇＧＡ、ＩｇＧＢ、ＩｇＧＣおよびＩｇＧＤならびに２種類の軽鎖：κおよびλが存在する。表７は、非修飾イヌＦｃフラグメントのアミノ酸およびヌクレオチド配列番号を列挙する。
【０１７０】
いかなる特定のアプローチにも拘束されるものではないが、イヌおよびマウス配列の様々な内容物を有する抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の変異体を作製する工程は、以下の一般的なスキームを含んだ：
ｉ）マウスｍＡｂのＶＨ鎖およびＶＬ鎖のヌクレオチド配列を決定する；
ｉｉ）マウスｍＡｂのＨ鎖およびＬ鎖ＣＤＲを同定する；
ｉｉｉ）イヌＩｇＧの適切なＨ鎖およびＬ鎖を同定する；
ｉｖ）イヌＩｇＧ  Ｈ鎖およびＬ鎖のヌクレオチド配列を決定する；
ｖ）内因性イヌＨ鎖およびＬ鎖ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列を、それぞれのマウスＣＤＲをコードするヌクレオチド配列で置き換える。また、一部のイヌフレームワーク残基をマウスフレームワーク領域からの選択した残基で置き換えてもよい；
ｖｉ）段階（ｖ）からのヌクレオチドを合成し、それを適切な発現プラスミドに挿入する；プラスミドを適切な細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトする；
ｖｉｉ）発現された抗体をＨＥＫ２９３上清から精製する；ならびに
ｖｉｉｉ）精製した抗体をイヌＰＤ−１への結合に関して試験する。
【０１７１】
実験のセットを上記段階に従って実施し、これによりイヌおよびマウス配列の様々な内容物を有する変異体イヌ化抗体のセットが得られた。
【０１７２】
ＣＨＯ細胞上に発現されたイヌＰＤ−１タンパク質に対するイヌ化ｍＡｂの反応性：
イヌ化抗イヌＰＤ−１  ｍＡｂのＣＨＯ細胞上のイヌＰＤ−１との反応性を、イヌＰＤ−１を発現するＣＨＯ細胞を使用した細胞ベースのアッセイによって測定した。簡単に述べると、イヌＰＤ−１を発現するＣＨＯ細胞を培地（ＤＭＥＭ／ＨＡＭ  Ｆ１２、１０％ＦＢＳ）５０μｌ中で８０〜１００％の集密度に培養した。次に、様々な濃度の精製ｍＡｂを含有する培地５０μｌを３７℃で１時間添加した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、培地中で１：１０００希釈したヤギ抗イヌホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗体１００μｌを３７℃で１時間添加した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎでさらに３回洗浄した後、結合ｍＡｂをペルオキシダーゼ基質（ＴＭＢ）で視覚化した。４５０ｎｍでのペルオキシダーゼ活性による吸光度の増加をマイクロプレートリーダーで測定した。
【０１７３】
イヌＰＤ−１とマウス抗イヌＰＤ−１  ｍＡｂおよびイヌ化マウス抗イヌＰＤ−１  ｍＡｂの結合試験：
イヌＰＤ−１抗原の約７０共鳴単位（ＲＵ）をアミンカップリングによって直接固定化した。親和性測定を、結合時間３００秒、解離時間１２００秒ならびに５０、１００、２００（×２）、４００および８００ナノモル（ｎＭ）の濃度で無標識表面プラズモン共鳴ベースの技術（例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００）によって実施した。１：１結合の適合モデルを使用した。抗原（イヌＰＤ−１）を、アミンカップリングを介してセンサーチップ上に固定化し、以下の表１４に示す４つの抗体を、抗原表面を流れる分析物として使用した。結果は、イヌＰＤ−１抗原についての本発明の抗イヌＰＤ−１抗体の結合親和性が強力であり、ナノモルおよびさらにはサブナノモルの解離定数（Ｋｄ）を有することを明らかにした。さらに、マウス抗イヌＰＤ−１モノクローナル抗体および同じクローン由来の対応するイヌ化マウス抗イヌＰＤ−１モノクローナル抗体は、極めて類似のＫｄ値を生じた（以下の表１４参照）。
【表３】
0006681832.tif 000005
【０１７４】
イヌ化抗イヌＰＤ−１  ｍＡｂによるリガンド遮断
イヌＰＤ−１（ｃＰＤ−１）と反応するイヌ化抗体に関して、イヌＰＤ−１を発現するＣＨＯ細胞株に基づく細胞ベースのＥＬＩＳＡ（ＣＥＬＩＳＡ）アッセイを使用した。簡単に述べると、ｃＰＤ−１  ＣＨＯ細胞を４×１０４細胞／ウェルで９６ウェルプレートに入れ、細胞が９５〜１００％集密になるまで３７℃で１８〜２４時間細胞をインキュベートした。細胞培養培地を吸引除去し、プレートをＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で３回およびＣＨＯ培地で１回洗浄した。３０μｇ／ｍＬから出発して、ＣＨＯ培地中でイヌ化抗ｃＰＤ−１  ｍＡｂの３倍段階希釈物を作製し、各抗体希釈物５０μＬ／ウェルをプレートに添加した。次にプレートを３７℃、５％ＣＯ２で３０分間、振とうしながらインキュベートした。ヒトＰＤ−Ｌ１−ＦｃをＣＨＯ培地中４μｇ／ｍｌに添加し、次に、インキュベートした抗ＰＤ−１  ｍＡｂを除去または洗浄せずに５０μＬ／ウェルを３７℃、５％ＣＯ２で４５分間、振とうしながらインキュベートした。プレートをＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で６回洗浄した。ＣＨＯ培地中の抗ヒトＦｃ−ＨＲＰ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）（１：２５００）１００μｌ／ウェルを添加し、３７℃／５％ＣＯ２で３０〜６０分間インキュベートした（抗ヒトＦｃ−ＨＲＰはイヌＦｃに結合しない）。プレートをＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で５回洗浄した。ＴＭＢマイクロウェル基質１００μｌ／ウェルを添加し、次に室温で１０分間インキュベートした。１．５Ｍリン酸１００μｌ／ウェルで反応を停止させた。ＥＬＩＳＡリーダーでＡ４５０〜Ａ６２０を測定する。
【０１７５】
イヌＰＢＭＣからのサイトカイン放出：
ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ分離を使用して健常イヌおよび癌を有するイヌから得たＥＤＴＡ血液試料より調製した。細胞を３回洗浄し、９６ウェルプレート中の三つ組みのウェルにおいて２．５×１０５細胞／ウェルの濃度で完全組織培養培地に再懸濁した。細胞をコンカナバリンＡ  １μｇ／ｍｌで活性化した。試験抗体を様々な濃度で添加し、培養物を９６時間インキュベートした。対照には、抗体なしでｃｏｎＡと共に、またはｃｏｎＡおよび無関係なアイソタイプがマッチする抗体と共にインキュベートした細胞が含まれた。９６時間の培養後、上清を採取し、市販のイヌＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＩＦＮ−γ放出に関して検定した［表４参照］。
【０１７６】
［実施例４］
遺伝的に修飾されたイヌＩｇＧ
エフェクター機能を欠くイヌＩｇＧの変異体を作製するために、多数の突然変異体イヌＩｇＧＢ重鎖を作製した。これらの変異体は、重鎖アミノ酸配列のＦｃ部分に以下の単一または複合置換：Ｐ４Ａ、Ｄ３１Ａ、Ｎ６３Ａ、Ｇ６４Ｐ、Ｔ６５Ａ、Ａ９３ＧおよびＰ９５Ａの１つを含有し得る。変異体重鎖（すなわちそのようなアミノ酸置換を含有する）を発現プラスミドにクローニングし、軽鎖をコードする遺伝子を含有するプラスミドと共にＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。ＨＥＫ２９３細胞から発現され、精製された無傷抗体を、免疫エフェクター機能の媒介に関するそれらの潜在能を調べるためにＦｃγＲＩおよびＣ１ｑへの結合について評価した。表３は、遺伝的に修飾されたイヌ化重鎖をコードするプラスミド、イヌ化重鎖およびこれらの重鎖内の遺伝的修飾の例を列挙する。変異体重鎖を、遺伝的に修飾されたｍＡｂにおけるエフェクター機能の評価に使用した。重鎖のすべてが２Ｈ９マウス抗イヌＰＤ−１抗体からのＣＤＲを含有した。
【表４】
0006681832.tif 000006
【０１７７】
ＦｃγＲＩ結合：
ＦｃγＲＩへの結合は、ＡＤＣＣを媒介する抗体の能力の尺度である。イヌ化抗体に関してこの特性を評価するために、イヌ化抗体のＦｃγＲＩへの結合を測定するアッセイを以下のように実施した：９６ウェルプレートをＰＤ−１  ＨＩＳ  ２．５μｇ／ｍＬの１００μｌ／ウェルで被覆する。２〜７℃で一晩インキュベートする。プレートを１５分間室温に平衡化させる。０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ＰＢＳＴ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水でプレートを３回洗浄し、次に５％ＮＦＤＭ（脱脂粉乳）２００μＬ／ウェルを使用してウェルをブロックする。３６〜３８℃で６０分間インキュベートする。ＰＢＳＴで３回洗浄する。５％ＮＦＤＭ中１μｇ／ｍＬで出発して抗体の２倍希釈物を作製する。希釈した抗体１００μＬ／ウェルを添加する。３６〜３８℃で６０分間インキュベートする。ＰＢＳＴで３回洗浄する。１μｇ／ｍＬに希釈した組換えヒトＣＤ６４タンパク質（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）１００μＬ／ウェルを添加する。３６〜３８℃で６０分間インキュベートする。ＰＢＳＴで６回洗浄する。１：３０００に希釈したビオチン化抗ＣＤ６４抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）１００μＬ／ウェルを添加する。３６〜３８℃で６０分間インキュベートする。ＰＢＳＴで６回洗浄する。１：７５００に希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰ抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）１００μＬ／ウェルを添加する。３６〜３８℃で６０分間インキュベートする。ＰＢＳＴで６回洗浄する。ＴＭＢ基質１００μＬ／ウェルを添加する。１５〜３０℃で１０分間インキュベートする。ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて４５０〜５４０ｎｍでプレートを読み取る。
【０１７８】
結果：図５Ａは、Ｄ３１Ａの遺伝子修飾を有するｃａｎ２Ｈ９  ＡＤＣＣ  ｍｕｔ−１  ＶＨ４／ＶＬ３と称するイヌ化ｍＡｂまたはＮ６３Ａの遺伝子修飾を有するｃａｎ２Ｈ９  ＡＤＣＣ  ｍｕｔ−２  ＶＨ４／ＶＬ３と称するｍＡｂが、ＦｃγＲＩへの結合のほぼ完全な低減を示すことを提示する。他方で、Ｄ３１ＡプラスＮ６３Ａの複合遺伝子修飾を含有するｃａｎ２Ｈ９  ＡＤＣＣ（１０６２）ＶＨ４／ＶＬ３と称するｍａｂは、ＦｃγＲＩへの検出可能な結合を欠く。図５Ａにおいて、ｃａｎ２Ｈ９  ＩｇＧＤ  ＶＨ４／ＶＬ３はイヌＩｇＧＤ由来のＦｃを含有するイヌ化抗体であり、およびｃａｎ３Ｂ６  ＶＨ４／ＶＬ４  ＩｇＧＢは被覆抗原（ＰＤ−１  ＨＩＳ）に結合しないイヌ化抗体であり、およびｃａｎ２Ｈ９  ＶＨ４／ＶＬ３と称するイヌ化ｍＡｂは非修飾ＩｇＧＢ  Ｆｃを含有する抗体である。図５Ｂは、Ｐ４Ａの遺伝子修飾を含有するｃａｎ２Ｈ９  ＡＤＣＣ（１０５９）ＶＨ４／ＶＬ３と称するイヌ化ｍＡｂおよびＰ９５Ａの遺伝子修飾を含有するｃａｎ２Ｈ９  ＡＤＣＣ（１０６１）ＶＨ４／ＶＬ３と称するｍＡｂがＦｃγＲＩへの結合のかなりの低減を示し、一方Ａ９３Ｇの遺伝子修飾を含有するｃａｎ２Ｈ９  ＡＤＣＣ（１０６０）ＶＨ４／ＶＬ３と称するｍＡｂがＦｃγＲＩへの結合のわずかな低減を示すことを提示する。他方で、５つの遺伝子修飾（Ｄ３１Ａ、Ｎ６３Ａ、Ｐ４Ａ、Ａ９３Ｇ、Ｐ９５Ａ）を含有するｃａｎ２Ｈ９  ＩｇＧＢ  ＡＤＣＣ（１０６８）ＶＨ４／ＶＬ３と称するｍＡｂは、ＦｃγＲＩへの結合を完全に欠如している。
【０１７９】
Ｃ１ｑ結合：
補体の第一成分、Ｃ１ｑへの結合は、ＣＤＣを媒介する抗体の能力の尺度である。イヌ化抗体に関してこの特性を評価するために、イヌ化抗体のＣ１ｑへの結合を測定するアッセイを以下のように実施した：９６ウェルプレートをＰＤ−１  ＨＩＳ  ２．５μｇ／ｍＬで被覆する。２〜７℃で一晩インキュベートする。１５分間室温に平衡化させる。ＰＢＳＴで３回洗浄する。５％ＢＳＡを用いて２００μＬ／ウェルでブロックする。３６〜３８℃で６０分間インキュベートする。ＰＢＳＴで３回洗浄する。５％ＢＳＡ中１μｇ／ｍＬで出発して抗体の２倍希釈物を作製する。希釈した抗体１００μＬ／ウェルを添加する。３６〜３８℃で６０分間インキュベートする。ＰＢＳＴで６回洗浄する。４μｇ／ｍＬに希釈したＣ１ｑタンパク質１００μＬ／ウェルを添加する。３６〜３８℃で６０分間インキュベートする。ＰＢＳＴで６回洗浄する。１：３０００に希釈したヤギ抗Ｃ１ｑ抗体１００μＬ／ウェルを添加する。３６〜３８℃で６０分間インキュベートする。ＰＢＳＴで６回洗浄する。１：１００００に希釈したロバ抗ヤギＨＲＰ抗体１００μＬ／ウェルを添加する。３６〜３８℃で６０分間インキュベートする。ＰＢＳＴで６回洗浄する。ＴＭＢ基質１００μＬ／ウェルを添加する。１５〜３０℃で１０分間インキュベートする。４５０〜５４０ｎｍにてＥＬＩＳＡプレートリーダーで読み取る。
【０１８０】
結果：図６Ａは、Ｄ３１Ａの遺伝子修飾を有するｃａｎ２Ｈ９ＶＨ４  ＩｇＧＢ  ＡＤＣＣ（ｍｕｔ−１）／ＶＬ３と称するイヌ化ｍＡｂまたはＮ６３Ａの遺伝子修飾を有するｃａｎ２Ｈ９  ＶＨ４  ＩｇＧＢ  ＡＤＣＣ（ｍｕｔ−２）／ＶＬ３と称するｍＡｂが、Ｃ１ｑへの結合のかなりの低減を示すことを提示する。他方で、Ｄ３１ＡプラスＮ６３Ａの複合遺伝子修飾を含有するｃａｎ２Ｈ９  ＶＨ４  ＩｇＧＢ  ＡＤＣＣ（１０６２）／ＶＬ３と称するｍＡｂは、Ｃ１ｑへの検出可能な結合を欠く。
【０１８１】
図６Ａにおいてｃａｎ２Ｈ９  ＶＨ４  ＩｇＧＤ／ＶＬ３はイヌＩｇＧＤ由来のＦｃを含有するイヌ化抗体であり、およびｃａｎ３Ｂ６  ＶＨ４／ＶＬ４  ＩｇＧＢは被覆抗原（ＰＤ−１  ＨＩＳ）に結合しないイヌ化抗体であり、およびｃａｎ２Ｈ９  ＶＨ４／ＶＬ３  ＩｇＧＢと称するイヌ化ｍＡｂは非変異ＩｇＧＢ  Ｆｃを含有する抗体である。図６Ｂは、Ｐ４Ａの置換を含有するｃａｎ２Ｈ９  ＶＨ４  ＩｇＧＢ  ＡＤＣＣ（１０５９）／ＶＬ３と称するイヌ化ｍＡｂおよびＰ９５Ａの置換を含有するｃａｎ２Ｈ９  ＶＨ４  ＩｇＧＢ  ＡＤＣＣ（１０６１）／ＶＬ３と称するｍＡｂがＣ１ｑへの結合のかなりの低減を示し、一方Ａ９３Ｇの置換を含有するｃａｎ２Ｈ９  ＶＨ４  ＩｇＧＢ  ＡＤＣＣ（１０６０）／ＶＬ３と称するｍＡｂがＣ１ｑへの結合の増強を示すことを提示する。他方で、５つの置換（Ｄ３１Ａ、Ｎ６３Ａ、Ｐ４Ａ、Ａ９３Ｇ、Ｐ９５Ａ）を含有するｃａｎ２Ｈ９  ＶＨ４  ＩｇＧＢ  ＡＤＣＣ（１０６８）／ＶＬ３と称するｍＡｂは、Ｃ１ｑへの結合を完全に欠如している。図６Ｂにおいて、ｃａｎ３Ｂ６  ＶＨ４／ＶＬ４  ＩｇＧＢと称するｍＡｂは、被覆抗原（ＰＤ−１  ＨＩＳ）に結合しないイヌ化抗体であり、ｃａｎ２Ｈ９  ＶＨ４／ＶＬ３  ＩｇＧＢと称するイヌ化ｍＡｂは、非変異ＩｇＧＢ  Ｆｃを含有する抗体である。
【表５】
0006681832.tif 000007
【表６】
0006681832.tif 000008
【表７】
0006681832.tif 000009
【表８】
0006681832.tif 000010
【表９】
0006681832.tif 000011
【表１０】
0006681832.tif 000012
【表１１】
0006681832.tif 000013
【表１２】
0006681832.tif 000014
0006681832.tif 000015
【０１８２】
［実施例５］
抗イヌＰＤ−１抗体のエピトープマッピング
緒言
抗体とそれらの同種タンパク質抗原との相互作用は、標的抗原の特定アミノ酸（エピトープ）と抗体の特定アミノ酸（パラトープ）との結合を通して媒介される。エピトープは、免疫グロブリンによる特異的反応を生じさせる抗原決定基である。エピトープは抗原の表面の一群のアミノ酸から成る。関心対象のタンパク質は、異なる抗体によって認識されるいくつかのエピトープを含有し得る。
【０１８３】
抗体によって認識されるエピトープは、線状または配座エピトープとして分類される。線状エピトープは、タンパク質中のアミノ酸の一続きの連続配列によって形成され、一方配座エピトープは一次アミノ酸配列中の不連続な（例えば遠く離れた）アミノ酸から成るが、三次元タンパク質フォールディング後に一緒になる。
【０１８４】
エピトープマッピングは、抗体の標的抗原上で抗体によって認識されるアミノ酸配列（すなわちエピトープ）を同定する工程を指す。標的抗原上でモノクローナル抗体（ｍＡｂ）によって認識されるエピトープの同定は重要な適用を有する。例えば、新しい治療薬、診断薬およびワクチンの開発に役立ち得る。エピトープマッピングはまた、最適化された治療用ｍＡｂの選択にも役立ち、それらの作用機構を解明するのを助けることができる。エピトープ情報はまた、ユニークな癌エピトープを解明し、ワクチンの防御または病原性作用を定義することができる。
【０１８５】
エピトープマッピングは、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を使用して実施することができ、エピトープの推測される性質（すなわち線状対配座）に依存してエピトープ同定のためにいくつかの方法が用いられる。線状エピトープをマッピングすることはより直接的であり、比較的実施しやすい。この目的で、線状エピトープマッピングのための商業サービスはしばしばペプチドスキャニングを用いる。この場合、標的タンパク質の短いペプチド配列のオーバーラップするセットを化学的に合成し、関心対象の抗体に結合するそれらの能力に関して試験する。戦略は迅速で高スループットであり、比較的安価に実施される。他方で、不連続エピトープのマッピングは技術的により難易度が高く、より専門的な技術、例えばモノクローナル抗体とその標的タンパク質とのｘ線共結晶構造解析、水素−重水素（Ｈ／Ｄ）交換、および／または酵素消化と組み合わせた質量分析法などを必要とする。
【０１８６】
ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ（登録商標）ＭｉｃｒｏＡｒｒａｙを使用したＰＤ−１エピトープのマッピング：
抗ＰＤ−１  ｍＡｂについてのエピトープを形成するアミノ酸を同定するために、１５アミノ酸長であり、１０個のアミノ酸がオーバーラップしている合計２８個のペプチドを化学的に合成した。オーバーラップするペプチドのこのライブラリは、完全長イヌＰＤ−１タンパク質をカバーするように設計された。ペプチド−抗体結合の測定を、抗体試料をＰｒｏＡｒｒａｙ  Ｕｌｔｒａ（登録商標）ペプチドマイクロアレイに取り付け、次いで蛍光標識二次抗体と共にインキュベートすることによって実施した。すべてのペプチドを別々に合成し、その後ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ（登録商標）マウスＩｇＧ対照と共にＰｒｏＡｒｒａｙ  Ｕｌｔｒａ（登録商標）スライド表面に結合する。この最適化工程は、ペプチドが、対応するタンパク質領域の特性を密接に模倣し、遊離ペプチド自体の固有の物理化学的変動を回避して、適合するペプチドとタンパク質の組合せアレイプラットフォームを生成するように、ペプチドをアレイ上に提示することを確実にする。試験分析物（ペプチド）を別々のスポットでＰｒｏＡｒｒａｙ  Ｕｌｔｒａ（登録商標）スライドに分注し、適切なｇａｌファイルは、生じたアレイ特徴を沈殿した分析物に正確に整列することを可能にする。ｍＡｂの非特異的結合を低減するために有効なブロッキング緩衝液を使用してＰｒｏＡｒｒａｙ  Ｕｌｔｒａ（登録商標）スライドをブロックした。次にそれらをｍＡｂ試料と共にインキュベートし、次いで特異的蛍光標識二次抗体と共にインキュベートした。数回の洗浄段階後、ＰｒｏＡｒｒａｙ  Ｕｌｔｒａ（登録商標）アレイを乾燥し、高分解能蛍光マイクロアレイスキャニングシステムを用いて走査した。蛍光標識ＰｒｏＡｒｒａｙ  Ｕｌｔｒａ（登録商標）スライドを走査した後、スキャナーが画像を記録し、これを、走査したマイクロアレイスライド上の各蛍光スポットに関連する蛍光強度のレベルの解釈および定量化を可能にする、画像解析ソフトウエアを用いて評価した。この実験の結果は、イヌＰＤ−１ペプチドの一部が評価したｍＡｂの一部によって認識されることを示した。ｍＡｂの同一性およびこれらのｍＡｂによって認識されるアミノ酸配列を表１２に列挙する。この試験は、ｍＡｂ  ２Ｈ９が、配列番号：１３８によって表されるアミノ酸配列から成るイヌＰＤ−１の細胞外ドメインに位置するエピトープを認識することおよびｍＡｂ  １Ａ１が、配列番号：１３８によって表されるアミノ酸配列および配列番号：１３９によって表されるアミノ酸配列によって表されるオーバーラップするアミノ酸配列を含有するエピトープを認識することを指し示す。
【０１８７】
質量分析法を用いたＰＤ−１エピトープのマッピング：
抗イヌＰＤ−１によって認識される潜在的に不連続なエピトープを同定するために、化学的架橋および質量分析検出に基づく方法を使用した（ＣｏｖａｌＸ（登録商標）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）。イヌＰＤ−１のエピトープマッピングへのこの技術の適用は、表１３に列挙されている指示ｍＡｂによって認識されるエピトープの少なくとも部分の同定をもたらした。表１３からわかるように、ｍＡｂ  ３Ｂ６は、配列番号：１４０によって表されるアミノ酸配列内のイヌＰＤ−１の細胞外ドメインに位置するエピトープの少なくとも一部分を認識し、およびｍＡｂ  ２Ｇ９は、配列番号：１４１によって表されるアミノ酸配列内のエピトープの少なくとも一部分を認識する。他方で、ｍＡｂ  １Ｅ４およびｍＡｂ  １Ｂ５は、それぞれ配列番号：１４２によって表されるアミノ酸配列および配列番号：１４３によって表されるアミノ酸配列内のエピトープの少なくとも一部分を認識する。
【０１８８】
図９Ａに表示されているように、化学的架橋、高質量ＭＡＬＤＩ質量分析法およびｎＬＣ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析法によって実施した測定は、イヌ化抗体２Ｇ９によって認識されるイヌＰＤ−１上のエピトープが配列番号：１１４のＲ６２、Ｒ６９、Ｒ７２およびＲ７５を含有することを示す。イヌ化抗体３Ｂ６によって認識されるイヌＰＤ−１上のエピトープに関する類似の測定は、配列番号：１１４のＲ７５およびＲ９０を含有する。したがって、Ｒ７５は、イヌＰＤ−１の１またはそれ以上のエピトープにおける特に重要なアミノ酸残基であると思われる。興味深いことに、これらの分析を実施した後、１Ａ１のＣＤＲについてのアミノ酸配列は２Ｇ９のものと同一であることが認められた。これら２つの非常に異なる方法によって得られた、２Ｇ９が結合するＰＤ−１上の領域と１Ａ１に関して認められたものとの一致は、この領域が、抗イヌＰＤ−１抗体によって認識されるＰＤ−１エピトープに含まれるアミノ酸残基を含有することを指し示す（以下の表１２および１３参照）。
【０１８９】
さらに、試験した本発明のブロッキング抗体によって認識されたＰＤ−１のアミノ酸配列の領域は、イヌＰＤ−１の細胞外ドメイン内にある。認識された領域は以下のペプチドに含有される（以下の表１２および１３参照）。
【０１９０】
NQTDKLAAFQEDRIEPGRDRRFRVM*RLPNGRDFHMSIVAARLNDS（配列番号：１４４）
このペプチド内に、太字で示すより短いペプチドが存在する。このより短いペプチドはＰｒｏＩｍｍｕｎｅ（登録商標）ＭｉｃｒｏＡｒｒａｙで認識された（表１２参照）。
【０１９１】
DRIEPGRDRRFRVM*RLPNGR（配列番号：１４５）
注目すべきは、配列番号：１１４のＲ６２、Ｒ６９、Ｒ７２およびＲ７５はすべて、より長いペプチド（配列番号：１４４）とより短いペプチド（配列番号：１４５）の両方に含有され、配列番号：１１４のＲ９０はより長いペプチド中に存在する。これら５個のアルギニン残基は、イヌＰＤ−１の１またはそれ以上のエピトープにおける重要なアミノ酸残基であると思われる。表６〜８に示すように、星印を付したメチオニン残基（＊）はトレオニン残基であるとも報告されている。
【表１３】
0006681832.tif 000016
【表１４】
0006681832.tif 000017
【０１９２】
本明細書で引用するすべての参考文献は、各々個々の公表文献、データベースエントリ（例えばＧｅｎｂａｎｋ配列またはＧｅｎｅＩＤエントリ）、特許出願または特許が、参照により本明細書に組み込まれることが具体的におよび個別に指示されているかのごとく同じように参照により本明細書に組み込まれる。参照による組込みのこの声明は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５７（ｂ）（１）に従って、そのような引用が、該当する参照による組込みの声明に直接近接していない場合でも、各々が３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５７（ｂ）（２）に従って明確に特定される、ありとあらゆる個々の公表文献、データベースエントリ（例えばＧｅｎｂａｎｋ配列またはＧｅｎｅＩＤエントリ）、特許出願または特許に関連することが出願人によって意図される。参照による組込みの該当する声明が、存在する場合、本明細書内に包含されることは、いかなる意味においても参照による組込みのこの一般的な声明を弱めるものではない。本明細書での参考文献の引用は、その参考文献が関連する先行技術であることの承認とは見なされず、またこれらの公表文献または資料の内容または日付に関するいかなる承認も構成しない。
【０１９３】
本発明は、本明細書で述べる特定の実施形態によって範囲を限定されるものではない。実際に、本明細書で述べるものに加えて本発明の様々な変更が前記説明および添付の図面から当業者に明らかになる。そのような変更は付属の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。
【０１９４】
前記の書面による明細書は、当業者が本発明を実施することを可能にするのに十分であると考えられる。本明細書で示し、説明したものに加えて本発明の様々な変更が前記説明から当業者に明らかになり、それらは付属の特許請求の範囲内に含まれる。
【図１】
0006681832.tif 000018
【図２】
0006681832.tif 000019
【図３】
0006681832.tif 000020
【図４】
0006681832.tif 000021
【図５Ａ】
0006681832.tif 000022
【図５Ｂ】
0006681832.tif 000023
【図６Ａ】
0006681832.tif 000024
【図６Ｂ】
0006681832.tif 000025
【図７Ａ】
0006681832.tif 000026
【図７Ｂ】
0006681832.tif 000027
【配列表】
0006681832000001.app