(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物サンプルからのリンパ球細胞と被疑薬又はその代謝産物とをインビトロで１〜２週間共培養して生成物を形成するステップ１（この際、前記被疑薬またはその代謝産物を生理的な治療濃度の０．１倍〜１０倍に希釈する）と、
生成物中のグラニュライシンのタンパク質、ポリペプチド又はｍＲＮＡの発現レベルを検出して対照値と比較し、前記生成物中のグラニュライシンのタンパク質、ポリペプチド又はｍＲＮＡの発現レベルが前記対照値よりも高かった場合、前記被疑薬又はその代謝産物が起因薬物であると判定するステップ２と、
を含むことを特徴とする、薬物アレルギー反応の起因薬物を同定する方法。
【請求項２】
ステップ２では、グラニュライシンの発現レベルを検出するために、特異的な捕捉抗体及び検出抗体を用いて生成物中のグラニュライシンのタンパク質又はポリペプチドに対して反応することを特徴とする、請求項１に記載の薬物アレルギー反応の起因薬物を同定する方法。
【請求項３】
ステップ２では、グラニュライシンの発現レベルを検出するために、特異的なオリゴヌクレオチドプライマー又はプローブを用いて生成物中のグラニュライシンのｍＲＮＡに対して反応することを特徴とする、請求項１に記載の薬物アレルギー反応の起因薬物を同定する方法。
【請求項４】
リンパ球細胞は、末梢血液からの細胞又は生物個体から単離される体液を含むことを特徴とする、請求項１に記載の薬物アレルギー反応の起因薬物を同定する方法。
【請求項５】
生成物中のグラニュライシン発現レベルを捕捉抗体及び検出抗体により検出する方法は、酵素結合免疫吸着アッセイ又は酵素結合イムノスポットアッセイであることを特徴とする、請求項２に記載の薬物アレルギー反応の起因薬物を同定する方法。
【請求項６】
薬物アレルギー反応は、スティーブンス・ジョンソン症候群、中毒性表皮壊死症、好酸球増多および全身症状を伴う薬物発疹、斑丘疹性発疹、重症型多形性紅斑又は固定薬疹を含むことを特徴とする、請求項１に記載の薬物アレルギー反応の起因薬物を同定する方法。
【請求項７】
前記起因薬物は、西洋薬、漢方薬、ワクチン、又はＴ細胞活性化を誘導可能な抗原分子を含むことを特徴とする、請求項１に記載の薬物アレルギー反応の起因薬物を同定する方法。
【請求項８】
試験キットと、検出キットとを備える薬物アレルギー反応の起因薬物を同定するための同定キットであって、
前記試験キットは、生物サンプルからのリンパ球細胞を、被疑薬又はその代謝産物を生理的な治療濃度の０．１倍〜１０倍に希釈したものとともにインビトロで１〜２週間共培養して生成物を形成するための培養試薬を含み、
前記検出キットは、前記生成物と反応して前記生成物中のグラニュライシンのタンパク質、ポリペプチド又はｍＲＮＡの発現レベルを検出するための検出試薬を含み、
前記同定は、前記発現レベルを対照値と比較し、前記発現レベルが前記対照値よりも高かった場合、この被疑薬又はその代謝産物が起因薬物であると判定することにより行われることを特徴とする、薬物アレルギー反応の起因薬物を同定するための同定キット。
【請求項９】
前記検出キットは、グラニュライシンタンパク質の発現レベルを検出するために、グラニュライシンに対して特異的な捕捉抗体の１種及び検出抗体の１種を含むことを特徴とする、請求項８に記載の同定キット。
【請求項１０】
前記検出キットは、グラニュライシンｍＲＮＡの発現レベルを検出するために、グラニュライシンに対して１対の特異的なオリゴヌクレオチドプライマー又はプローブを含むことを特徴とする、請求項８に記載の同定キット。
【請求項１１】
生成物中のグラニュライシン発現レベルを捕捉抗体及び検出抗体により検出する方法は、酵素結合免疫吸着アッセイ又は酵素結合イムノスポットアッセイであることを特徴とする、請求項９に記載の同定キット。
【請求項１２】
薬物アレルギー反応は、スティーブンス・ジョンソン症候群、中毒性表皮壊死症、好酸球増多および全身症状を伴う薬物発疹、斑丘疹性発疹、重症型多形性紅斑又は固定薬疹を含むことを特徴とする、請求項８に記載の同定キット。
【請求項１３】
前記起因薬物は、西洋薬、漢方薬、ワクチン、又はＴ細胞活性化を誘導可能な抗原分子を含むことを特徴とする、請求項８に記載の同定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、起因薬物を同定するための方法及びキットに関し、特に、薬物アレルギー反応の起因薬物を同定するための方法及びキットに関する。本発明は、リンパ球と被疑薬又はその代謝産物とをインビトロで共培養して生成物を形成し、生成物中のグラニュライシンのタンパク質、ポリペプチド又はｍＲＮＡのレベルを定量し、対照と比較することにより、薬物アレルギー反応を起こす起因薬物を同定するため、単一且つ簡単に行われる技術であり、迅速性、経済性、高感度、高特異性などの利点を有するものである。
【背景技術】
【０００２】
薬物アレルギー反応は、軽症型の斑丘疹性発疹（ｍａｃｕｌｏｐａｐｕｌａｒ  ｅｒｕｐｔｉｏｎｓ，ＭＰＥ）、重症型多形性紅斑（ｅｒｙｔｈｅｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ  ｍａｊｕｓ，ＥＭＭ）及び固定薬疹（ｆｉｘｅｄ  ｄｒｕｇ  ｅｒｕｐｔｉｏｎ，ＦＤＥ）を含み、薬物が誘発し、潜在的に致命的な免疫疾患から、好酸球増多および全身症状を伴う薬物発疹（Ｄｒｕｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉａ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｓｙｍｐｔｏｍｓ，ＤＲＥＳＳ）、スティーブンス・ジョンソン症候群（Ｓｔｅｖｅｎｓ−Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＳＪＳ）及び中毒性表皮壊死症（Ｔｏｘｉｃ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｎｅｃｒｏｌｙｓｉｓ，ＴＥＮ）を含み、重篤かつ生命を脅かす重度皮膚有害反応（ｓｅｖｅｒｅ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，ＳＣＡＲ）までのものである。
【０００３】
ＳＣＡＲは、薬物特異的なＴリンパ球細胞（ｄｒｕｇ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）に関すると考えられている。従来のリンパ球形質転換試験（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ，ＬＴＴ）は、Ｔ細胞が介在する薬物アレルギー反応を検出するために広く使用され、インビトロでのＴリンパ球細胞（Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）を活性化及び増殖させる細胞培養法であり、患者の血液から単離されるリンパ球をインビトロで培養し、被疑薬で細胞を刺激し、１週間後、放射性元素である重水素（３Ｈ）で標識したチミジンがＤＮＡに取り込まれる量を測定することにより、Ｔリンパ球細胞の増殖状況を観察する。しかし、その方法は、ＳＣＡＲに対する感度が非常に低く、ＳＪＳ／ＴＥＮ患者に対する薬物試験は陰性結果になることがある。また、放射線測定の操作では、その分析の実施は、経験のある技術者と高価な機械の必要、放射線によって引き起こす潜在的な健康上のリスク、放射線技師免許を持つ者及び放射線の許容量が限定される作業環境に制限される。
【０００４】
もう１つの薬物アレルギー反応を検出する方法は、インターフェロンγ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇａｍｍａ，ＩＦＮ−γ）、インターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ，ＩＬ）−２，５，１３などのサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）の合成および分泌量を検出するものである。その方法は、Ｔリンパ球細胞が活性化する場合、培養上清液におけるサイトカインのレベル、フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）により細胞におけるサイトカインのレベル、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）又は逆転写ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ＰＣＲ，ＲＴ−ＰＣＲ）により細胞におけるサイトカインの遺伝子発現レベルを測定するものである。これらのサイトカインは、薬物アレルギー患者の起因薬物を同定するために使用可能であるが、薬物過敏症に特異性はなく、感度も非常に低いため、臨床使用に適さない。また、この方法では、血液細胞の表面上の免疫分子を検出するために、より多くの血液サンプル及び高価なフローサイトメーターを必要とし、感度が低くて、試薬の費用が増加し、費やす時間及び労力も増加する。
【０００５】
発明者は、グラニュライシン（Ｇｒａｎｕｌｙｓｉｎ，ＧＮＬＹ）がスティーブンス・ジョンソン症候群／中毒性表皮壊死症における表皮細胞死を引き起こす重要な因子であることを最初に報告した。この発現はスティーブンス・ジョンソン症候群／中毒性表皮壊死症に対する診断と治療方法に応用することができる（登録番号ＴＷ  Ｉ３３３９７８）。しかし、この特許は、グラニュライシンにより重度皮膚有害反応の起因薬物を同定する方法が開示されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、従来のＬＴＴ方法は、感度が低く、高価な方法であり、その実施は、経験のある技術者と放射線技師免許が必要であり、環境に制限される。また、フローサイトメトリーによる細胞中のグラニュライシンの測定は、感度が低いため、ＳＣＡＲの起因薬物を同定するように他の方法との組み合わせが必要となる。現在、薬物アレルギー反応の起因薬物を同定するための、高感度性、高信頼性を有し、且つ低コストの方法がまだ開発されていないため、従来技術に関してはまだ改善の余地がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、薬物アレルギー反応の起因薬物を同定する方法である。その方法は、ステップ１：生物サンプルからのリンパ球細胞と被疑薬又はその代謝産物とをインビトロで共培養して生成物を形成することと、ステップ２：生成物中のグラニュライシンのタンパク質、ポリペプチド又はｍＲＮＡの発現レベルを検出して対照値と比較し、グラニュライシンのタンパク質、ポリペプチド又はｍＲＮＡの発現レベルが対照値よりも１．２倍以上高かった場合、この被疑薬又はその代謝産物はリンパ球を活性化させる程度がより高いと判定して、それは薬物アレルギー反応を引き起こす可能性がある起因薬物であることとを含む。
【０００８】
上述した対照値は、培養培地又は薬を溶解する溶媒を含む培養培地に培養する生物サンプルからのリンパ球中のグラニュライシンの発現レベルの値を示す。
【０００９】
その中、ステップ２では、グラニュライシンの発現レベルを検出するために、特異的な捕捉抗体及び検出抗体を用いて生成物中のグラニュライシンのタンパク質又はポリペプチドに対して反応する。
【００１０】
その中、ステップ２では、グラニュライシンの発現レベルを検出するために、特異的なオリゴヌクレオチドプライマー又はプローブを用いて生成物中のグラニュライシンのｍＲＮＡに対して反応する。
【００１１】
その中、生成物中のグラニュライシン発現レベルを捕捉抗体及び検出抗体により同定する方法は、酵素結合免疫吸着アッセイ又は酵素結合イムノスポットアッセイである。
【００１２】
その中、リンパ球は、末梢血液からの細胞又は生物個体から単離される体液を含み、より好ましい源は末梢血液である。
【００１３】
その中、薬物アレルギー反応は、スティーブンス・ジョンソン症候群、中毒性表皮壊死症、好酸球増多および全身症状を伴う薬物発疹、斑丘疹性発疹、重症型多形性紅斑及び固定薬疹を含む。
【００１４】
その中、起因薬物は、西洋薬、漢方薬、ワクチン、及びＴ細胞活性化を誘導可能な抗原分子を含む。
【００１５】
薬物アレルギー反応の起因薬物を同定するための同定キットは、試験キットと、検出キットとを備え、試験キットは、試薬と、生物サンプルからのリンパ球細胞と、被疑薬又はその代謝産物とをインビトロで共培養して生成物を形成し、検出キットを試験キットから形成される生成物と反応して、生成物中のグラニュライシンのタンパク質、ポリペプチド又はｍＲＮＡの発現レベルを検出し、グラニュライシンのタンパク質、ポリペプチド又はｍＲＮＡの発現レベルが対照値よりも１．２倍以上高かった場合、この被疑薬又はその代謝産物が起因薬物であると判定する。
【００１６】
その中、検出キットは、生成物中のグラニュライシンタンパク質又はポリペプチドの発現レベルを検出するために、グラニュライシンに対して特異的な捕捉抗体の１種及び検出抗体の１種を含む。
【００１７】
その中、検出キットは、生成物中のグラニュライシンｍＲＮＡの発現レベルを検出するために、グラニュライシンｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡに対して１対の特異的なオリゴヌクレオチドプライマー又はプローブを含む。
【００１８】
その中、生成物中のグラニュライシン発現レベルを捕捉抗体及び検出抗体により同定する方法は、酵素結合免疫吸着アッセイ又は酵素結合イムノスポットアッセイである。
【００１９】
その中、薬物アレルギー反応は、スティーブンス・ジョンソン症候群、中毒性表皮壊死症、好酸球増多および全身症状を伴う薬物発疹、斑丘疹性発疹、重症型多形性紅斑及び固定薬疹を含む。
【００２０】
その中、起因薬物は、西洋薬、漢方薬、ワクチン、及びＴ細胞活性化を誘導可能な抗原分子を含む。
【発明の効果】
【００２１】
本発明は、リンパ球と被疑薬又はその代謝産物とをインビトロで共培養して生成物を形成し、オリゴヌクレオチドプライマー、プローブ、抗グラニュライシンタンパク質又はポリペプチドの捕捉抗体と検出抗体により活性化リンパ球細胞が発現するグラニュライシンと結合するステップであり、その中、インビトロ培養の条件は、被疑薬又はその代謝産物の濃度、細胞培養培地の組成及び細胞培養の時間を含む。本発明は単一且つ簡単に行われる技術、迅速性、経済性、高感度、高特異性などの利点を有する。
【００２２】
本発明の技術、手段及び効果に関して、上述した本発明の目的及び特徴について深く且つ具体的に理解するために、好ましい実施例を挙げて添付の図面を参照しながら、以下のように詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の検出フローのブロック図である。
【図２】本発明の重度皮膚有害反応患者、耐性患者及び健康な被験者からのリンパ球細胞と起因薬物／その代謝産物又は耐性薬とをインビトロで１週間又は２週間共培養するグラニュライシンの発現レベルである。グラニュライシンはＥＬＩＳＡにより測定され、グラニュライシンの倍数変化は得られたデータを溶媒対照群のデータで除算することによって計算される。
【図３】本発明の重度皮膚有害反応患者、耐性患者及び健康な被験者からのリンパ球細胞と起因薬物／その代謝産物又は耐性薬とをインビトロで１週間又は２週間共培養するＩＦＮ−γの発現レベルである。ＩＦＮ−γの発現レベルはＥＬＩＳＡにより測定され、ＩＦＮ−γの倍数変化は得られたデータを溶媒対照群のデータで除算することによって計算される。
【図４】本発明のアロプリノール（Ａｌｌｏｐｕｒｉｎｏｌ）により引き起こす重度皮膚有害反応患者からのリンパ球細胞と１倍又は１０倍の起因薬物／その代謝産物又は耐性薬とをインビトロで１週間共培養するグラニュライシンｍＲＮＡの発現レベルである。グラニュライシンｍＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲにより測定され、グラニュライシンの倍数変化は得られたデータを溶媒対照群のデータで除算することによって計算される。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
図１〜図４を参照し、本発明は、薬物アレルギー反応の起因薬物を同定する方法である。その方法は、ステップ１：生物サンプルからのリンパ球細胞と被疑薬又はその代謝産物とをインビトロで共培養して生成物を形成することと、ステップ２：生成物中のグラニュライシンのタンパク質、ポリペプチド又はｍＲＮＡの発現レベルを検出して対照値と比較し、グラニュライシンのタンパク質、ポリペプチド又はｍＲＮＡの発現レベルが対照値よりも１．２倍以上高かった場合、この被疑薬又はその代謝産物はリンパ球を活性化させる程度がより高いと判定して、それは薬物アレルギー反応を引き起こす可能性がある起因薬物であることとを含む。
【００２５】
上述した対照値は、培養培地又は薬を溶解する溶媒を含む培養培地に培養する生物サンプルからのリンパ球中のグラニュライシンの発現レベルの値を示す。
【００２６】
その中、ステップ２では、グラニュライシンの発現レベルを検出するために、特異的な捕捉抗体及び検出抗体を用いて生成物中のグラニュライシンのタンパク質又はポリペプチドに対して反応する。
【００２７】
その中、ステップ２では、グラニュライシンの発現レベルを検出するために、特異的なオリゴヌクレオチドプライマー又はプローブを用いて生成物中のグラニュライシンのｍＲＮＡに対して反応する。
【００２８】
その中、起因薬物は、西洋薬、漢方薬、ワクチン、及びＴ細胞活性化を誘導可能な抗原を含む。
【００２９】
上述した同定方法は、生成物に発現されるグラニュライシンを検出することにより、薬物アレルギー反応の起因薬物を同定することである。薬物アレルギー反応は、スティーブンス・ジョンソン症候群（Ｓｔｅｖｅｎｓ−Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＳＪＳ）、中毒性表皮壊死症（Ｔｏｘｉｃ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｎｅｃｒｏｌｙｓｉｓ，ＴＥＮ）、好酸球増多および全身症状を伴う薬物発疹（Ｄｒｕｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉａ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｓｙｍｐｔｏｍｓ，ＤＲＥＳＳ）、斑丘疹性発疹（ｍａｃｕｌｏｐａｐｕｌａｒ  ｅｒｕｐｔｉｏｎｓ，ＭＰＥ）、重症型多形性紅斑（ｅｒｙｔｈｅｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ  ｍａｊｕｓ，ＥＭＭ）及び固定薬疹（ｆｉｘｅｄ  ｄｒｕｇ  ｅｒｕｐｔｉｏｎ，ＦＤＥ）などを含む。
【００３０】
グラニュライシンのタンパク質又は核酸がリンパ球の培養培地に発現するかどうか又はそのレベルは、個体からのリンパ球サンプルと被疑薬／その代謝産物又は耐性薬とを共培養する結果を評価する。リンパ球は、末梢血液からの細胞又は生物個体から単離される体液を含み、より好ましい源は末梢血液である。グラニュライシンの発現レベルは様々な方法で検出することができ、グラニュライシン遺伝子から転写されるｍＲＮＡ、遺伝子から翻訳されるタンパク質の量又は遺伝子から翻訳されるタンパク質の活性を検出することを含むが、これらに限定されない。
【００３１】
生成物において、細胞から単離されるｍＲＮＡはハイブリダイゼーション又は増幅アッセイにより検出されることができ、その方法は、ノーザンブロット分析（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ａｎａｌｙｓｅｓ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）及びプローブアレイ（ｐｒｏｂｅ  ａｒｒａｙｓ）を含むが、これらに限定されない。ｍＲＮＡ含量の検出の好ましい診断方法は、単離されるｍＲＮＡを核酸分子（プローブ）と接触させ、この核酸分子は被験遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズすることができる。本発明において、核酸分子のプローブは、全長遺伝子配列を有するグラニュライシン核酸、又は長さが少なくとも７、１５、３０、５０、１００又は２５０個のヌクレオチド長さを有するオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）であり得ると共に、厳しい条件でグラニュライシンのｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡと十分にハイブリダイズすることができる。
【００３２】
生成物中のグラニュライシンのｍＲＮＡ含量はヌクレオチド増幅技術により検出されることもでき、例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応、自立複製配列システム、転写増幅システム（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）、Ｑβレプリカーゼ（Ｑ−Ｂｅｔａ  Ｒｅｐｌｉｃａｓｅ）、ローリングサークル複製（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ｒｅｐｌ  ｉｃａｔｉｏｎ）又は他の任意の方法によりヌクレオチドを増幅した後、従来の技術により増幅された分子を検出する。本発明に使用される増幅プライマーは、５‘又は３’末端の遺伝子領域に結合することができる（プラス鎖（ｐｌｕｓ  ｓｔｒａｎｄ）とマイナス鎖（ｍｉｎｕｓ  ｓｔｒａｎｄ）又はその反対にそれぞれに結合する）１対の核酸分子である。一般的には、増幅プライマーは、１０〜３０個のヌクレオチド分子から構成され、長さが５０〜２００個のヌクレオチド領域を横方向に増幅することができる。適切な条件及び試薬を備える場合、そのプライマーはその自身のヌクレオチド配列により核酸分子を増幅させることができる。
【００３３】
本発明の実施例において、対照群サンプルをグラニュライシンのｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡの検出の増幅プライマーを有するものとハイブリダイズすることにより、対照群と試験サンプルとのグラニュライシンのｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡの発現を比較することを含む。
【００３４】
生成物（リンパ球の培養上清液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ））中のグラニュライシンのタンパク質含量はさまざまな方法で検出されることができ、その方法は、グラニュライシンのタンパク質、その抗原又はその免疫原性断片に選択的に結合可能な試薬（例えば、抗体）を用いてサンプルと結合した後、サンプル中のグラニュライシンのタンパク質含量を評価することを含む。その技術は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ）、酵素結合イムノスポットアッセイ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ（ＥＬＩＳＰＯＴ）ａｓｓａｙｓ）、免疫沈降（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｓ）、免疫蛍光（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）、酵素免疫測定（ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＥＩＡ）、放射免疫測定（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＲＩＡ）及びウエスタンブロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を含む。
【００３５】
本発明の実施例において、対照群サンプルをグラニュライシンの検出の抗体を有するものと接触することにより、対照群と試験サンプルとのグラニュライシンのタンパク質の発現を比較することをさらに含む。その方法は、実験値と参考値（例えば、培養培地／溶媒との培養するサンプル）とを比較することをさらに含む。
【００３６】
本発明は、薬物アレルギー反応の起因薬物を同定する同定キットも含む。その同定キットは、試験キットと、検出キットとを備え、試験キットは、試薬と、生物サンプルからのリンパ球細胞と、被疑薬又はその代謝産物とをインビトロで共培養して生成物を形成する。検出キットを試験キットから形成される生成物と反応して、生成物中のグラニュライシンのタンパク質、ポリペプチド又はｍＲＮＡの発現レベルを検出し、グラニュライシンのタンパク質、ポリペプチド又はｍＲＮＡの発現レベルが対照値よりも１．２倍以上高かった場合、この被疑薬又はその代謝産物が起因薬物であると判定することができる。
【００３７】
その中、検出キットは、生成物中のグラニュライシンｍＲＮＡの発現レベルを検出するために、グラニュライシンｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡに対して１対の特異的なオリゴヌクレオチドプライマー又はプローブを含む。
【００３８】
その中、検出キットは、生成物中のグラニュライシンタンパク質又はポリペプチドの発現レベルを検出するために、グラニュライシンに対して特異的な捕捉抗体の１種及び検出抗体の１種を含む。
【００３９】
その中、生成物中のグラニュライシン発現レベルを捕捉抗体及び検出抗体により同定する方法は、酵素結合免疫吸着アッセイ又は酵素結合イムノスポットアッセイである。
【００４０】
その中、起因薬物は、西洋薬、漢方薬、ワクチン、及びＴ細胞活性化を誘導可能な抗原分子を含む。
【００４１】
本発明に説明した同定方法は、個体に薬物アレルギー反応を引き起こす、又は薬物アレルギー反応を引き起こす可能性のある起因薬物を同定することができ、上述した薬物アレルギー反応は、斑丘疹性発疹（ｍａｃｕｌｏｐａｐｕｌａｒ  ｅｒｕｐｔｉｏｎｓ，ＭＰＥ）、固定薬疹（ｆｉｘｅｄ  ｄｒｕｇ  ｅｒｕｐｔｉｏｎ，ＦＤＥ）、重症型多形性紅斑（ｅｒｙｔｈｅｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ  ｍａｊｕｓ，ＥＭＭ）、重度皮膚有害反応（ｓｅｖｅｒｅ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，ＳＣＡＲ）、好酸球増多および全身症状を伴う薬物発疹（Ｄｒｕｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉａ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｓｙｍｐｔｏｍｓ，ＤＲＥＳＳ）、スティーブンス・ジョンソン症候群（Ｓｔｅｖｅｎｓ−Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＳＪＳ）及び中毒性表皮壊死症（Ｔｏｘｉｃ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｎｅｃｒｏｌｙｓｉｓ，ＴＥＮ）を含む。
【００４２】
その方法は、実験値と参考値（例えば、培養培地／溶媒との培養するサンプル）とを比較することをさらに含む。グラニュライシンの発現結果は本明細書に説明した任意の方法、例えば、生成物に得られる核酸をオリゴヌクレオチドプライマー又はプローブと接触すること、又は生成物を抗グラニュライシン抗体と接触することにより得ることができる。
【００４３】
本発明は、リンパ球と被疑薬又はその代謝産物とをインビトロで共培養して、ＥＬＩＳＡ又はＥＬＩＳＰＯＴによりそのグラニュライシンの発現レベルを検出し、又はリアルタイム定量（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ）ＰＣＲによりそのグラニュライシンｍＲＮＡを検出する方法を含む。その方法は、患者の全血からリンパ球を単離して、リンパ球細胞をＰＲＭＩ−１６４０培養培地を含有する９６ウェルマイクロプレート（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ）中、３７℃、５％ＣＯ２で培養するステップを含む。また、共培養する薬物又はその代謝産物及び耐性薬を培養培地で生理的な治療濃度（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｌｅｖｅｌ）の１倍（１  ｆｏｌｄ，１Ｘ）、０．１倍（０．１  ｆｏｌｄ，０．１Ｘ）及び１０倍（１０  ｆｏｌｄ，１０Ｘ）に希釈して、１〜２週間共培養する。
【００４４】
リンパ球細胞と被疑薬／代謝産物との共培養：Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＵＳＡ）により密度勾配遠心分離法で全血サンプルから末梢血単核細胞を単離する。ＰＢＭＣ（１．０ｘ１０６／ウェル）を１０％自己血清（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｅｒｕｍ）と、ＩＬ７（１ｎｇ／ｍｌ）とを含むＲＰＭＩ−１６４０培養培地（ＧＩＢＣＯ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を有する９６ウェル培養プレートに３７℃、５％ＣＯ２の培養条件で１〜２週間培養する。共培養の被疑薬、薬物代謝産物及び耐性薬を培養培地で生理的な治療濃度（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｌｅｖｅｌ）の１倍、１／１０倍又は１０倍に希釈する。例えば、細胞をオキシプリノール（ｏｘｙｐｕｒｉｎｏｌ）（１０μｇ／ｍＬ，１００μｇ／ｍＬ）、又は患者が服用して薬物アレルギー反応を３ヶ月以上引き起こさない耐性薬を含む培養培地に培養する。また、陰性対照群（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）は、薬物を溶かす溶媒を加えた培養培地であり、陽性対照群（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）は、１０μｇ／ｍＬのフィトヘマグルチニン（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，ＰＨＡ）を加えた培養培地である。
【００４５】
グラニュライシンの発現のＥＬＩＳＡ定量：培養した後、上清液を７日目及び１４日目に回収して、ＥＬＩＳＡによりグラニュライシンを測定する。簡単に言えば、培養プレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）には５０μｇ／ｍｌの抗グラニュライシンモノクロナール抗体Ｇ０１１でコーティングして、１０％ＦＢＳを含む洗浄バッファー（ＰＢＳ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）を加えてブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）し、そして室温で以下の系列的な反応を行う：被検出の生成物を加えて２時間反応し、１μｇ／ｍｌのビオチン化抗グラニュライシンモノクロナール抗体Ｇ０５２をブロッキングバッファーに加えて１時間反応し、２μｇ／ｍｌのｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎを洗浄バッファーに加えて反応する。２つの以上の反応の間に洗浄バッファーにより培養プレートを洗浄する。最後には、Ｈ２Ｏ２を含む基質溶液を培養プレートに加えて反応し、培養プレートを洗浄した後にテトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｎｉｎｅ）を加えて反応する。グラニュライシンの分析感度は１．５６ｎｇ／ｍｌである。また、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によるサンプル中のＩＦＮ−γの分析感度は１．５６ｐｇ／ｍｌである。
【００４６】
リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ）：培養したリンパ球細胞からＲＮＡ（Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ）を単離する。Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）−ｂａｓｅｄ  ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  １  ｋｉｔによりグラニュライシンのｍＲＮＡ含量を測定する。その絶対コピー数はＭａｔｓｕｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．２００１Ｍａｒｃｈ；１１２（４）：９１６−２６）に説明される方法により確認する。以下には、方法に使用されるオリゴヌクレオチドである：
グラニュライシン（ｇｒａｎｕｌｙｓｉｎ）：
５’−ＴＣＴＣＴＣＧＴＣＴＧＡＧＣＣＣ−３’、
５’−ＧＣＡＧＣＡＴＴＧＧＡＡＡＣＡＣＴ−３’。
【００４７】
β−ａｃｔｉｎ：
５’−ＡＣＡＴＣＣＧＣＡＡＡＧＡＣＣＴ−３’、
５’−ＡＧＧＧ  ＴＧＴＡＡＣＧＣＡＡＣＴＡ−３’。
【００４８】
統計分析：リンパ球細胞が被疑薬／代謝産物又は耐性薬に刺激された後、培養上清液中のグラニュライシンの倍数変化算は得たデータを溶媒対照群のデータで割ることにより得られる。群間の有意差は１サンプルｔ検定（ｏｎｅ  ｓａｍｐｌｅ  ｔ  ｔｅｓｔ）又はスチューデントのｔ検定（ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔ）により分析される。感度及び特異性は標準的な定義に従って計算する。すべてのＰ値は両側（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ）であり、Ｐ値＜０．０５はこの分析が統計的に有意であると考えられた。統計分析は、ＳＰＳＳソフトウェアバージョン１８．０（ＳＰＳＳ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １８．０）（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）を用いて行う。
【００４９】
グラニュライシンが薬物アレルギー反応を引き起こす起因薬物の同定に応用できるかどうかを検証するために、本実施例には、２２人の、例えば、ＳＪＳ、ＴＥＮ、ＤＲＥＳＳ、ＦＤＥ及びＥＭＭなどを含む重度皮膚有害反応（ｓｅｖｅｒｅ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｄｒｕｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）患者が募集される。そのリンパ球細胞と起因薬物又は代謝産物とをインビトロで培養して１週間又は２週間刺激した後、ＥＬＩＳＡによりサンプル中のグラニュライシン及びＩＦＮ−γの含量を測定して、その感度を比較する。結果は、グラニュライシンの感度が７７．３〜８１．８％に達することを示している。また、ＩＦＮ−γの感度が２０％より低いである（表１）。これにより、本実験は、ＥＬＩＳＡによるグラニュライシンの検出をインビトロでのグラニュライシン系薬物リンパ球刺激試験（ｇｒａｎｕｌｙｓｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｄｒｕｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ）に応用することは高感度であることで、薬物アレルギー反応を引き起こす起因薬物の同定に利用できることが実証される。
【００５０】
【表１】
0006726278.tif 000002
【００５１】
表１は、２２人の重度皮膚有害反応患者（ＳＣＡＲ）のリンパ球細胞を薬物で１〜２週間刺激して、ＥＬＩＳＡにより放出されたグラニュライシン及びＩＦＮ−γの感度を計算する比較結果である。
【００５２】
本発明では、グラニュライシンを薬物アレルギー反応の起因薬物の同定に用いる特異性をさらに確認する。本評価方法において、薬物耐性患者及び健康な被験者のリンパ球ではなく、薬物アレルギー患者のリンパ球のみが起因薬物／代謝産物とインビトロで培養された後、そのグラニュライシンの発現レベルが増加することを実証するため、本実施例には、１１人の薬物耐性患者及び１０人の健康な被験者が募集され、そのリンパ球とその耐性薬又は代謝産物とをインビトロで培養して１〜２週間刺激した後、ＥＬＩＳＡによりサンプル中の生物サンプルのグラニュライシン及びＩＦＮ−γ含量を測定して、その特異性を比較する。結果は、耐性患者試験について、１週間培養した後、グラニュライシンの特異性が９５．７％に達し、ＩＦＮ−γの特異性が７６．２％に達し、２週間培養した後、グラニュライシンの特異性が９２．９％に達し、ＩＦＮ−γの特異性が７７．８％に達することを示している（表２）。健康な被験者の結果について、２週間培養した後、グラニュライシンの特異性が８６．７％であり、ＩＦＮ−γの特異性が７５．６％である（表２）。これにより、本実験は、ＥＬＩＳＡによるグラニュライシンの検出をインビトロでの薬物リンパ球活性化試験（ｇｒａｎｕｌｙｓｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｄｒｕｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ）に応用することは高感度であることで、薬物アレルギー反応を引き起こす起因薬物の同定に利用できることが実証される。
【００５３】
特異性（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）（％）
【００５４】
【表２】
0006726278.tif 000003
【００５５】
表２は、１１人の薬物耐性患者及び１０人の健康な被験者のリンパ球細胞を耐性薬で１〜２週間刺激して、ＥＬＩＳＡにより放出されたグラニュライシン及びＩＦＮ−γの特異性を計算する比較結果である。
【００５６】
図２〜３に示すように、重度皮膚有害反応患者、耐性患者及び健康な被験者からのリンパ球細胞と起因薬物／代謝産物又は耐性薬とをインビトロで培養して１〜２週間刺激した後、ＥＬＩＳＡによりそのグラニュライシン及びＩＦＮ−γの発現レベルを測定する。その結果は、重度皮膚有害反応患者からのリンパ球細胞を起因薬物／代謝産物で刺激した後、グラニュライシンの発現に有意差があるが、耐性患者及び健康な被験者に有意差がないことを示している（図２Ａ及び図２Ｂ）。一部の重度皮膚有害反応患者からのリンパ球細胞が刺激された後、ＩＦＮ−γの発現レベルも増加した（図３Ａ及び図３Ｂ）が、例は少ないため、特定のバイオマーカーとすることができない。これにより、この結果は、ＥＬＩＳＡによるグラニュライシンの検出をインビトロでの薬物リンパ球活性化試験（ｇｒａｎｕｌｙｓｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｄｒｕｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ）に応用することにより、薬物アレルギー反応を引き起こす起因薬物を同定することが最良の方法であることが実証される。
【００５７】
図４を参照し、ｍＲＮＡの方面について、本実施例は３人の、アロプリノールで引き起こす重度皮膚有害反応患者が募集され、そのリンパ球を１倍又は１０倍の起因薬物／代謝産物又は他の耐性薬とインビトロで１週間それぞれ共培養した後、ＲＴ−ＰＣＲによりそのグラニュライシンｍＲＮＡの発現レベルを測定する。その結果は、１倍又は１０倍の起因薬物／代謝産物のいずれかが刺激された後、グラニュライシンはより好ましい感度（６６．７％）及びより好ましい特異性（１００％）を有することを示している。
【００５８】
上述したすべての実施例によると、グラニュライシン（ＲＴ−ＰＣＲ又はＥＬＩＳＡによるその発現の検出）をインビトロでの薬物リンパ球活性化試験（ｇｒａｎｕｌｙｓｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｄｒｕｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ）に応用することは高感度且つ高特異性であるため、薬物アレルギー反応の起因薬物の同定に応用することができる。本発明は、インビトロでの薬物リンパ球活性化試験によるグラニュライシンｍＲＮＡ及びタンパク質の発現レベルの測定方法を提供し、インビトロでの薬物リンパ球活性化試験（ｇｒａｎｕｌｙｓｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｄｒｕｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ）に応用してグラニュライシンｍＲＮＡ及びタンパク質の発現レベルを測定するキット又は試薬セットも提供し、それは、グラニュライシンｍＲＮＡを検出するためのプライマー及びプローブと、グラニュライシンを認識するための抗体とを含む。
【００５９】
以上、本発明の好ましい実施例について本発明の技術的特徴を具体的に説明したが、本発明の趣旨及び原則を逸脱することなく変更及び修正が可能であることが当業者には自明であり、その変更及び修正がいずれも以下の本発明の特許請求の範囲に属して含まれるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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