(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソマルトメガロ糖鎖の両末端にアンカー糖鎖をそれぞれ有するダブルアンカー型イソマルトメガロ糖（以下、ＤＩＭＳと称する）であって、
前記イソマルトメガロ糖鎖は、α１−６結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が１０〜１００の範囲であり、
前記イソマルトメガロ糖鎖の還元末端側の前記アンカー糖鎖は、α１−４結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が２〜２０の範囲であり、
前記イソマルトメガロ糖鎖の非還元末端側の前記アンカー糖鎖は、α１−４結合で連結したグルコピラノースであり、かつグルコピラノースの重合度が１〜５０の範囲である、ＤＩＭＳ。
【請求項２】
前記イソマルトメガロ糖鎖及び２つのアンカー糖鎖のグルコピラノースの重合度の合計は、１３〜１７０の範囲である請求項１に記載のＤＩＭＳ。
【請求項３】
請求項１〜２のいずれか１項に記載の少なくとも２種のＤＩＭＳの混合物であって、平均重合度が１３〜１７０の範囲である、前記混合物。
【請求項４】
イソマルトメガロ糖鎖の非還元末端にアンカー糖鎖を有するシングルアンカー型イソマルトメガロ糖（以下、Ｎ−ＳＩＭＳと称する）であって、
前記イソマルトメガロ糖鎖は、α１−６結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が１０〜１００の範囲であり、かつ
前記アンカー糖鎖は、α１−４結合で連結したグルコピラノースであり、かつグルコピラノースの重合度が１〜１００の範囲である、Ｎ−ＳＩＭＳ。
【請求項５】
前記イソマルトメガロ糖鎖及びアンカー糖鎖のグルコピラノースの重合度の合計は、１１〜２００の範囲である請求項４に記載のＮ−ＳＩＭＳ。
【請求項６】
請求項４〜５のいずれか１項に記載の少なくとも２種のＮ−ＳＩＭＳの混合物であって、平均重合度が１１〜２００の範囲である、前記混合物。
【請求項７】
請求項１〜２のいずれか１項に記載の少なくとも１種のＤＩＭＳ及び請求項４〜５のいずれか１項に記載の少なくとも１種のＮ−ＳＩＭＳの混合物であって、平均重合度が１１〜２００の範囲である、前記混合物。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＩＭＳ又はその混合物の製造方法であって、
イソマルトメガロ糖鎖の還元末端にアンカー糖鎖を有するシングルアンカー型イソマルトメガロ糖（以下、Ｒ−ＳＩＭＳと称する）と、糖供与体基質とを、糖質の転移活性を示す酵素による糖転移反応に供して、ＤＩＭＳ又はその混合物を得る、
但し、前記Ｒ−ＳＩＭＳのイソマルトメガロ糖鎖は、α１−６結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が１０〜１００の範囲であり、
前記Ｒ−ＳＩＭＳの前記アンカー糖鎖は、α１−４結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が２〜２０の範囲である、
ことを含む方法。
【請求項９】
請求項４〜６のいずれか１項に記載のＮ−ＳＩＭＳ又はその混合物の製造方法であって、
イソマルトメガロ糖（以下、ＩＭＳと称する）と糖供与体基質とを、糖質の転移活性を示す酵素による糖転移反応に供して、Ｎ−ＳＩＭＳ又はその混合物を得る、
但し、前記ＩＭＳのイソマルトメガロ糖鎖は、α１−６結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が１０〜１００の範囲である、
ことを含む方法。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の少なくとも１種のＤＩＭＳ及び請求項４〜６のいずれか１項に記載の少なくとも１種のＮ−ＳＩＭＳの混合物の製造方法であって、Ｒ−ＳＩＭＳ及びＩＭＳと、糖供与体基質とを、糖質の転移活性を示す酵素による糖転移反応に供して、ＤＩＭＳ及びＮ−ＳＩＭＳの混合物を得る、
但し、前記Ｒ−ＳＩＭＳのイソマルトメガロ糖鎖は、α１−６結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が１０〜１００の範囲であり、
前記Ｒ−ＳＩＭＳの前記アンカー糖鎖は、α１−４結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が２〜２０の範囲であり、
前記ＩＭＳのイソマルトメガロ糖鎖は、α１−６結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が１０〜１００の範囲である、
ことを含む方法。
【請求項１１】
前記糖供与体基質がシクロデキストリンであり、かつ前記糖質の転移活性を示す酵素が、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（CGTaseと略称）である請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記シクロデキストリンが、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、及びγ−シクロデキストリンから成る群から選ばれる１種または２種以上である、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記供与体基質がオリゴ糖及び多糖から成る群から選ばれる少なくとも1種であり、
かつ前記糖質の転移活性を示す酵素が、α−グルコシダーゼ、Ｄ−酵素（不均一化酵素）、アミラーゼ及びアミロスクラーゼから成る群から選ばれる少なくとも1種の酵素及びCGTaseである請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
水難溶性化合物の水溶液を製造する方法であって、
水難溶性化合物と（ｉ）請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＩＭＳ若しくはその混合物、（ｉｉ）請求項４〜６のいずれか一項に記載のＮ−ＳＩＭＳ若しくはその混合物、又は（ｉｉｉ）請求項１〜３のいずれか一項に記載の少なくとも１種のＤＩＭＳ及び請求項４〜６のいずれか一項に記載の少なくとも１種のＮ−ＳＩＭＳの混合物とを水又は水を含有する溶媒中で混合することを含む、前記方法。
【請求項１５】
前記水を含有する溶媒は、水及び少なくとも1種の有機溶媒から成る溶媒であり、前記有機溶媒は可食性有機溶媒である、請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１６】
水難溶性化合物を、この化合物の融点以上に加熱すること、及び加熱溶解した水難溶性化合物を、（ｉ）ＤＩＭＳ若しくはその混合物、（ｉｉ）Ｎ−ＳＩＭＳ若しくはその混合物、又は（ｉｉｉ）少なくとも１種のＤＩＭＳ及び少なくとも１種のＮ−ＳＩＭＳの混合物を含有する溶媒と混合すること、を含む請求項１４又は１５に記載の製造方法。
【請求項１７】
水難溶性化合物が、ＢＣＳクラス２に分類される化合物である、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１８】
水難溶性化合物、及び（ｉ）請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＩＭＳ若しくはその混合物、（ｉｉ）請求項４〜６のいずれか一項に記載のＮ−ＳＩＭＳ若しくはその混合物、又は（ｉｉｉ）請求項１〜３のいずれか一項に記載の少なくとも１種のＤＩＭＳ及び請求項４〜６のいずれか一項に記載の少なくとも１種のＮ−ＳＩＭＳの混合物を含む組成物。
【請求項１９】
可食性有機溶媒をさらに含む請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
水難溶性化合物が薬効成分であり、前記組成物は有効量の前記水難溶性化合物を含有する医薬用組成物である請求項１８又は１９に記載の組成物。
【請求項２１】
水難溶性化合物が飲食品用成分であり、前記組成物は飲食品用組成物又は飲食品用原料組成物である請求項１８又は１９に記載の組成物。
【請求項２２】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＩＭＳ若しくはその混合物、又は請求項４〜６のいずれか一項に記載のＮ−ＳＩＭＳ若しくはその混合物、請求項１〜３のいずれか一項に記載の少なくとも１種のＤＩＭＳ及び請求項４〜６のいずれか一項に記載の少なくとも１種のＮ−ＳＩＭＳの混合物を含有する、水難溶性化合物を水溶液化するための溶解促進剤。
【請求項２３】
水難溶性化合物が、ＢＣＳクラス２に分類される化合物である、請求項２２に記載の溶解促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ダブルアンカー型イソマルトメガロ糖（以下、ＤＩＭＳと称する）、その製造方法及びその利用に関する。さらに本発明は、イソマルトメガロ糖鎖の非還元末端にアンカー糖鎖を有するシングルアンカー型イソマルトメガロ糖（以下、Ｎ−ＳＩＭＳと称する）、その製造方法及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
低分子マルトオリゴ糖には難水溶性化合物の水への可溶化能はなく、また、鎖長の比較的長いマルトオリゴ糖には可溶化作用はあるが、非常に弱い。難水溶性化合物の可溶化に関する従来の技術として、「シクロデキストリン（環状オリゴ糖；マルトオリゴ糖が環状化した糖質でグルコース・サイズが６〜８が代表例）」がある。但し、シクロデキストリン自体が難溶性で、また包接作用がサイズに依存するため、適用できるＢＣＳクラス２化合物は限定され、さらに鎖長の異なるα、β、γ−シクロデキストリンを使い分ける必要性がある。
【０００３】
直鎖のマルトオリゴ糖には、フラボノイドやイブプロフェンに対する可溶化能はほとんどない。また、環状マルトオリゴ糖の一種であるシクロデキストリンには、これら化合物に対する可溶化能はあるが、次に示す２つの課題がある。
【０００４】
（１）水難溶性化合物の分子サイズが限定的である。シクロデキストリンはその環状構造で水難溶性化合物を捉える（包接）。一方、環サイズは決まっているため、分子サイズが合致しない水難溶性化合物とは複合体を形成できない。（分子量が過大や過小な化合物とは複合体形成しない。）
【０００５】
（２）複合体の解離が困難である。難溶性化合物を包接した複合体は安定で、また消化酵素であるα-アミラーゼによる加水分解を受けにくい。そのため、腸内では対象化合物（フラボノイドなどのBCSクラス２化合物）は放出されにくく、生体利用性がかえって悪くなる場合がある。
【０００６】
シングルアンカーイソマルトメガロ糖を用いた可溶化技術が知られている（非特許文献１及び２）。鎖長の比較的長いマルトオリゴ糖には可溶化作用がある。しかし、非常に弱いものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Shinoki A, Lang W, Thawornkuno C, Kang HK, Kumagai Y, Okuyama M, Mori H, Kimura A, Ishizuka S, Hara H: A novel mechanism for promotion of quercetin glycoside absorption by megalo α-1,6-glucosaccharide in the rat small intestine. Food Chemistry 136(2):293-296, 2013.
【非特許文献２】Lang W, Kumagai Y, Sadahiro J, Maneesan J, Okuyama M, Mori H, Sakairi N, Kimura A: Different molecular complexity of linear isomaltomegalosaccharides and β-cyclodextrin for enhancing a solubility of azo ethyl red: towards the dye biodegradation. Bioresource Technology 169:518-524, 2014.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
鎖長の比較的長いイソマルトオリゴ糖には共存する物質を水に対して可溶化する作用があり、非特許文献１及び２に記載されているようにイソマルトメガロ糖鎖の非還元末端にアンカー糖鎖を付加したシングルアンカーイソマルトメガロ糖（Ｒ−ＳＩＭＳ）を用いた可溶化の提案がなされている。しかし、このシングルアンカーイソマルトメガロ糖は、いくつかの難水溶性化合物については可溶化能を示さず、その可溶化能は総じて非常に弱いものである。
【０００９】
本発明は、シクロデキストリンのように、水難溶性化合物の分子サイズに対する制限がなく、かつ水難溶性化合物と形成された複合体からの水難溶性化合物の解離が容易である、新たな可溶化能力を有する材料を提供することを目的とする。さらに、本発明は、この可溶化能力を有する材料を用いた、水難溶性化合物の溶解促進剤及び水難溶性化合物の水溶液の調製方法、及び可溶化能力を有する材料を用いた、水難溶性化合物を含む水溶液含有組成物を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は以下のとおりである。
［１］
イソマルトメガロ糖鎖の両末端にアンカー糖鎖をそれぞれ有するダブルアンカー型イソマルトメガロ糖（以下、ＤＩＭＳと称する）であって、
前記イソマルトメガロ糖鎖は、α１−６結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が１０〜１００の範囲であり、
前記イソマルトメガロ糖鎖の還元末端側の前記アンカー糖鎖は、α１−４結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が２〜２０の範囲であり、
前記イソマルトメガロ糖鎖の非還元末端側の前記アンカー糖鎖は、α１−４結合で連結したグルコピラノースであり、かつグルコピラノースの重合度が１〜５０の範囲である、ＤＩＭＳ。
［２］
前記イソマルトメガロ糖鎖及び２つのアンカー糖鎖のグルコピラノースの重合度の合計は、１３〜１７０の範囲である［１］に記載のＤＩＭＳ。
［３］
［１］〜［２］のいずれか１項に記載の少なくとも２種のＤＩＭＳの混合物であって、平均重合度が１３〜１７０の範囲である、前記混合物。
［４］
イソマルトメガロ糖鎖の非還元末端にアンカー糖鎖を有するシングルアンカー型イソマルトメガロ糖（以下、Ｎ−ＳＩＭＳと称する）であって、
前記イソマルトメガロ糖鎖は、α１−６結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が１０〜１００の範囲であり、かつ
前記アンカー糖鎖は、α１−４結合で連結したグルコピラノースであり、かつグルコピラノースの重合度が１〜１００の範囲である、Ｎ−ＳＩＭＳ。
［５］
前記イソマルトメガロ糖鎖及びアンカー糖鎖のグルコピラノースの重合度の合計は、１１〜２００の範囲である［４］に記載のＮ−ＳＩＭＳ。
［６］
［４］〜［５］のいずれか１項に記載の少なくとも２種のＮ−ＳＩＭＳの混合物であって、平均重合度が１１〜２００の範囲である、前記混合物。
［７］
［１］〜［２］のいずれか１項に記載の少なくとも１種のＤＩＭＳ及び［４］〜［５］のいずれか１項に記載の少なくとも１種のＮ−ＳＩＭＳの混合物であって、平均重合度が１１〜２００の範囲である、前記混合物。
［８］
［１］〜［３］のいずれか１項に記載のＤＩＭＳ又はその混合物の製造方法であって、
イソマルトメガロ糖鎖の還元末端にアンカー糖鎖を有するシングルアンカー型イソマルトメガロ糖（以下、Ｒ−ＳＩＭＳと称する）と、糖供与体基質とを、糖質の転移活性を示す酵素による糖転移反応に供して、ＤＩＭＳ又はその混合物を得る、
但し、前記Ｒ−ＳＩＭＳのイソマルトメガロ糖鎖は、α１−６結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が１０〜１００の範囲であり、
前記Ｒ−ＳＩＭＳの前記アンカー糖鎖は、α１−４結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が２〜２０の範囲である、
ことを含む方法。
［９］
［４］〜［６］のいずれか１項に記載のＮ−ＳＩＭＳ又はその混合物の製造方法であって、
イソマルトメガロ糖（以下、ＩＭＳと称する）と糖供与体基質とを、糖質の転移活性を示す酵素による糖転移反応に供して、Ｎ−ＳＩＭＳ又はその混合物を得る、
但し、前記ＩＭＳのイソマルトメガロ糖鎖は、α１−６結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が１０〜１００の範囲である、
ことを含む方法。
［１０］
［１］〜［３］のいずれか１項に記載の少なくとも１種のＤＩＭＳ及び［４］〜［６］のいずれか１項に記載の少なくとも１種のＮ−ＳＩＭＳの混合物の製造方法であって、Ｒ−ＳＩＭＳ及びＩＭＳと、糖供与体基質とを、糖質の転移活性を示す酵素による糖転移反応に供して、ＤＩＭＳ及びＮ−ＳＩＭＳの混合物を得る、
但し、前記Ｒ−ＳＩＭＳのイソマルトメガロ糖鎖は、α１−６結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が１０〜１００の範囲であり、
前記Ｒ−ＳＩＭＳの前記アンカー糖鎖は、α１−４結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が２〜２０の範囲であり、
前記ＩＭＳのイソマルトメガロ糖鎖は、α１−６結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が１０〜１００の範囲である、
ことを含む方法。
［１１］
前記糖供与体基質がシクロデキストリンであり、かつ前記糖質の転移活性を示す酵素が、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（CGTaseと略称）である［８］〜［１０］のいずれか１項に記載の方法。
［１２］
前記シクロデキストリンが、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、及びγ−シクロデキストリンから成る群から選ばれる１種または２種以上である、［１１］に記載の製造方法。
［１３］
前記供与体基質がオリゴ糖及び多糖から成る群から選ばれる少なくとも1種であり、
かつ前記糖質の転移活性を示す酵素が、α−グルコシダーゼ、Ｄ−酵素（不均一化酵素）、アミラーゼ及びアミロスクラーゼから成る群から選ばれる少なくとも1種の酵素及びCGTaseである［８］〜［１０］のいずれか１項に記載の方法。
［１４］
水難溶性化合物の水溶液を製造する方法であって、
水難溶性化合物と（ｉ）［１］〜［３］のいずれか一項に記載のＤＩＭＳ若しくはその混合物、（ｉｉ）［４］〜［６］のいずれか一項に記載のＮ−ＳＩＭＳ若しくはその混合物、又は（ｉｉｉ）［１］〜［３］のいずれか一項に記載の少なくとも１種のＤＩＭＳ及び［４］〜［６］のいずれか一項に記載の少なくとも１種のＮ−ＳＩＭＳの混合物とを水又は水を含有する溶媒中で混合することを含む、前記方法。
［１５］
前記水を含有する溶媒は、水及び少なくとも1種の有機溶媒から成る溶媒であり、前記有機溶媒は可食性有機溶媒である、［１４］に記載の製造方法。
［１６］
水難溶性化合物を、この化合物の融点以上に加熱すること、及び加熱溶解した水難溶性化合物を、（ｉ）ＤＩＭＳ若しくはその混合物、（ｉｉ）Ｎ−ＳＩＭＳ若しくはその混合物、又は（ｉｉｉ）少なくとも１種のＤＩＭＳ及び少なくとも１種のＮ−ＳＩＭＳの混合物を含有する溶媒と混合すること、を含む［１４］又は［１５］に記載の製造方法。
［１７］
水難溶性化合物が、ＢＣＳクラス２に分類される化合物である、［１４］〜［１６］のいずれか一項に記載の製造方法。
［１８］
水難溶性化合物、及び（ｉ）［１］〜［３］のいずれか一項に記載のＤＩＭＳ若しくはその混合物、（ｉｉ）［４］〜［６］のいずれか一項に記載のＮ−ＳＩＭＳ若しくはその混合物、又は（ｉｉｉ）［１］〜［３］のいずれか一項に記載の少なくとも１種のＤＩＭＳ及び［４］〜［６］のいずれか一項に記載の少なくとも１種のＮ−ＳＩＭＳの混合物を含む組成物。
［１９］
可食性有機溶媒をさらに含む［１８］に記載の組成物。
［２０］
水難溶性化合物が薬効成分であり、前記組成物は有効量の前記水難溶性化合物を含有する医薬用組成物である［１８］又は［１９］に記載の組成物。
［２１］
水難溶性化合物が飲食品用成分であり、前記組成物は飲食品用組成物又は飲食品用原料組成物である［１８］又は［１９］に記載の組成物。
［２２］
［１］〜［３］のいずれか一項に記載のＤＩＭＳ若しくはその混合物、又は［４］〜［６］のいずれか一項に記載のＮ−ＳＩＭＳ若しくはその混合物、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の少なくとも１種のＤＩＭＳ及び［４］〜［６］のいずれか一項に記載の少なくとも１種のＮ−ＳＩＭＳの混合物を含有する、水難溶性化合物を水溶液化するための溶解促進剤。
［２３］
水難溶性化合物が、ＢＣＳクラス２に分類される化合物である、［２２］に記載の溶解促進剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ダブルアンカー型イソマルトメガロ糖（ＤＩＭＳ）による難溶性化合物の可溶化技術を提供することができる。この可溶化技術は、包接作用によるものではなく、α-1,6鎖による比較的緩い相互作用によるものである（若干のα-1,4鎖の寄与もある）と考えられる。また複合体形成を安定化しているアンカー構造は、比較的容易にα-アミラーゼにより分解・短鎖長化され、腸内で対象物質をより放出しやすくする性質を持っている。さらに本発明は、イソマルトメガロ糖鎖の還元末端にアンカー糖鎖を有するシングルアンカー型イソマルトメガロ糖（Ｒ−ＳＩＭＳ）による難溶性化合物の可溶化技術も提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】長鎖シングルアンカーを還元末端に有するＲ−ＳＩＭＳのアノメリック プロトンのNMRシグナルを示す。
【図２】短鎖シングルアンカーを還元末端に有するＲ−ＳＩＭＳのアノメリック プロトンのNMRシグナルを示す。
【図３】ＤＩＭＳ（合計平均重合度２６）のアノメリック プロトンのNMRシグナルを示す。
【図４】ＤＩＭＳ（合計平均重合度６２）のアノメリック プロトンのNMRシグナルを示す。
【図５−１】実施例２で得られた４種類のN-SIMSのNMRシグナルを示す。
【図５−２】実施例２で得られた４種類のN-SIMSのNMRシグナルを示す。
【図５−３】実施例２で得られた４種類のN-SIMSのNMRシグナルを示す。
【図５−４】実施例２で得られた４種類のN-SIMSのNMRシグナルを示す。
【図６−１】ＤＩＭＳによるフラボノイド可溶化結果を示す。(より強く可溶化されるフラボノイド類) (Control: MQ水、Single+: 20 mM R-SIMS (DP=12)、Single-: 20 mM R-SIMS (DP=14)、Double: 20 mM SIMS (DP=17.6))
【図６−２】ＤＩＭＳによるフラボノイド可溶化結果を示す。(より強く可溶化されるフラボノイド類) (Control: MQ水、Single+: 20 mM R-SIMS (DP=12)、Single-: 20 mM R-SIMS (DP=14)、Double: 20 mM SIMS (DP=17.6))
【図６−３】ＤＩＭＳによるフラボノイド可溶化結果を示す。(より強く可溶化されるフラボノイド類) (Control: MQ水、Single+: 20 mM R-SIMS (DP=12)、Single-: 20 mM R-SIMS (DP=14)、Double: 20 mM SIMS (DP=17.6))
【図６−４】ＤＩＭＳによるフラボノイド可溶化結果を示す。(より強く可溶化されるフラボノイド類) (Control: MQ水、Single+: 20 mM R-SIMS (DP=12)、Single-: 20 mM R-SIMS (DP=14)、Double: 20 mM SIMS (DP=17.6))
【図６−５】ＤＩＭＳによるフラボノイド可溶化結果を示す。(より強く可溶化されるフラボノイド類) (Control: MQ水、Single+: 20 mM R-SIMS (DP=12)、Single-: 20 mM R-SIMS (DP=14)、Double: 20 mM SIMS (DP=17.6))
【図６−６】ＤＩＭＳによるフラボノイド可溶化結果を示す。(より強く可溶化されるフラボノイド類) (Control: MQ水、Single+: 20 mM R-SIMS (DP=12)、Single-: 20 mM R-SIMS (DP=14)、Double: 20 mM SIMS (DP=17.6))
【図７−１】ＤＩＭＳによるフラボノイド可溶化結果を示す。(ダブルアンカー型のみで可溶化されるフラボノイド類)(Control: MQ水、Single+: R-SIMS (DP=12)、Single-: 20 mM R-SIMS (DP=14)、Double: 20 mM SIMS (DP=17.6))
【図７−２】ＤＩＭＳによるフラボノイド可溶化結果を示す。(ダブルアンカー型のみで可溶化されるフラボノイド類)(Control: MQ水、Single+: R-SIMS (DP=12)、Single-: 20 mM R-SIMS (DP=14)、Double: 20 mM SIMS (DP=17.6))
【図８】ＤＩＭＳ等各種メガロ糖（5.0 mM）によるイブプロフェンの相対溶解度を示す。
【図９】４種類のN-SIMS（1〜10 mM）によるイブプロフェンの相対溶解度（水を対照）を示す。黄四角, N-SIMS(25-7); 黒丸, N-SIMS(24-19); 赤三角, N-SIMS(24-32); 白逆三角, N-SIMS(22-53)。N-SIMSの構造をN-SIMS(X-Y)で表示したが、Xはイソマルトメガロ糖鎖の平均重合度を、Yは非還元末端アンカー糖鎖の平均重合度を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜ダブルアンカー型イソマルトメガロ糖（ＤＩＭＳ）＞
本発明は、イソマルトメガロ糖鎖の両末端にアンカー糖鎖をそれぞれ有するＤＩＭＳに関する。このＤＩＭＳにおける前記イソマルトメガロ糖鎖は、α１−６結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が１０〜１００の範囲である。このグルコピラノースの重合度の下限は、例えば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０であることができる。このグルコピラノースの重合度の上限は、例えば、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０又は５５であることができる。
【００１４】
ＤＩＭＳにおける前記イソマルトメガロ糖鎖の還元末端側の前記アンカー糖鎖は、α１−４結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が２〜２０の範囲である。このグルコピラノースの重合度の下限は、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であることができる。このグルコピラノースの重合度の上限は、例えば、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２又は１１であることができる。
【００１５】
ＤＩＭＳにおける前記イソマルトメガロ糖鎖の非還元末端側の前記アンカー糖鎖は、α１−４結合で連結したグルコピラノースであり、かつグルコピラノースの重合度が１〜５０の範囲である。このグルコピラノースの重合度の下限は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０又は２５であることができる。このグルコピラノースの重合度の上限は、例えば、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３５、又は３０であることができる。
【００１６】
本発明のＤＩＭＳにおけるイソマルトメガロ糖鎖及び２つのアンカー糖鎖のグルコピラノースの重合度の合計は、１３〜１７０の範囲であることができる。この重合度の合計の下限は、例えば、１３、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、又は７０であることができる。この重合度の合計の上限は、例えば、１７０、１６５、１６０、１５５、１５０、１４５、１４０、１３５、１３０、１２５、１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、又は７５であることができる。
【００１７】
本発明のＤＩＭＳは、１種類の化合物であることもできるが、２種以上のＤＩＭＳの混合物であることもできる。混合物に含まれるＤＩＭＳは、イソマルトメガロ糖鎖及び２つのアンカー糖鎖のいずれか１つ又は２つが共通で，残りの糖鎖が異なる場合と、イソマルトメガロ糖鎖及び２つのアンカー糖鎖の全てが異なる場合があり得る。
【００１８】
ＤＩＭＳが２種以上のＤＩＭＳの混合物である場合、混合物の平均重合度は、例えば、１３〜１７０の範囲であることができる。
この混合物の平均重合度の下限は、例えば、１３、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５又は７０であることができる。この混合物の平均重合度の上限は、例えば、１７０、１６５、１６０、１５５、１５０、１４５、１４０、１３５、１３０、１２５、１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、又は７５であることができる。
【００１９】
＜シングルアンカー型イソマルトメガロ糖（Ｎ−ＳＩＭＳ）＞
本発明は、イソマルトメガロ糖鎖の非還元末端にアンカー糖鎖を有するＮ−ＳＩＭＳも包含する。Ｎ−ＳＩＭＳの前記イソマルトメガロ糖鎖は、α１−６結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が１０〜１００の範囲である。このα１−６結合で連結したグルコピラノースの重合度は、ＤＩＭＳの場合と同様であることができる。前記アンカー糖鎖は、α１−４結合で連結したグルコピラノースであり、かつグルコピラノースの重合度が１〜１００の範囲である。α１−４結合で連結したグルコピラノースの重合度下限は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０又は２５であることができる。このグルコピラノースの重合度の上限は、例えば、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、又は３０であることができる。Ｎ−ＳＩＭＳの前記イソマルトメガロ糖鎖及びアンカー糖鎖のグルコピラノースの重合度の合計は、例えば、１１〜２００の範囲であることができる。
【００２０】
本発明のＮ−ＳＩＭＳは、１種類の化合物であることもできるが、２種以上のＮ−ＳＩＭＳの混合物であることもできる。混合物に含まれるＮ−ＳＩＭＳイソマルトメガロ糖鎖及びアンカー糖鎖のいずれか一方の糖鎖が異なる場合と、イソマルトメガロ糖鎖及びアンカー糖鎖の両方が異なる場合があり得る。
Ｎ−ＳＩＭＳが２種以上のＮ−ＳＩＭＳの混合物である場合、Ｎ−ＳＩＭＳの混合物の平均重合度は、例えば、１１〜２００の範囲であることができる。
【００２１】
＜ＤＩＭＳとＮ−ＳＩＭＳの混合物＞
本発明は、ＤＩＭＳとＮ−ＳＩＭＳの混合物も包含する。ＤＩＭＳ及びＮ−ＳＩＭＳは、それぞれ単独の化合物であっても、それぞれ混合物であっても良い。ＤＩＭＳとＮ−ＳＩＭＳの混合物の平均重合度は、例えば、１１〜２００の範囲であることができる。
【００２２】
＜製造方法＞
本発明は、上記本発明のＤＩＭＳ又はその混合物の製造方法を包含する。この製造方法は、イソマルトメガロ糖鎖の還元末端にアンカー糖鎖を有するＲ−ＳＩＭＳと、糖供与体基質とを、糖質の転移活性を示す酵素（糖質転移酵素）による糖転移反応に供して、Ｒ−ＳＩＭＳの非還元末端にアンカー糖鎖を付加したＤＩＭＳ又はその混合物を得る、ことを含む。
【００２３】
さらに本発明は、上記本発明のＮ−ＳＩＭＳ又はその混合物の製造方法を包含する。この製造方法は、イソマルトメガロ糖（ＩＭＳ）と糖供与体基質とを、糖質転移酵素による糖転移反応に供して、ＩＭＳの非還元末端にアンカー糖鎖を付加したＮ−ＳＩＭＳ又はその混合物を得る、ことを含む。
【００２４】
さらに本発明は、上記本発明のＤＩＭＳ及びＮ−ＳＩＭＳの混合物の製造方法であって、Ｒ−ＳＩＭＳ及びＩＭＳと、糖供与体基質とを、糖質の転移活性を示す酵素による糖転移反応に供して、ＤＩＭＳ及びＮ−ＳＩＭＳの混合物を得る、ことを含む。
【００２５】
以下にＤＩＭＳ及びＮ−ＳＩＭＳの製造方法を例に、反応スキームで示す。
【００２６】
【化１】
0006655246.tif 000002
【００２７】
黒丸はα１-６結合で連結するグルコピラノース残基を示す。
白丸はα１-４結合で連結するグルコピラノース残基を示す。
斜線を付した白丸及び黒丸は還元末端のグルコピラノース残基を示す。
生産はCGTaseなどの糖転移活性を有する酵素によってなされる。
【００２８】
ＤＩＭＳ又はその混合物の製造方法における一方の原料は、Ｒ−ＳＩＭＳである。前記のＲ−ＳＩＭＳを構成するイソマルトメガロ糖鎖は、α１−６結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が１０〜１００の範囲である。Ｒ−ＳＩＭＳを構成するイソマルトメガロ糖鎖の還元末端側のアンカー糖鎖は、α１−４結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が２〜２０の範囲である。これらイソマルトメガロ糖鎖及びアンカー糖鎖は、ＤＩＭＳにおいて説明したものと同義である。原料として用いるＲ−ＳＩＭＳは、例えば、非特許文献１及び２に記載の化合物であることができる。
【００２９】
Ｎ−ＳＩＭＳ又はその混合物の製造方法における一方の原料はＩＭＳであり、ＩＭＳのイソマルトメガロ糖鎖は、α１−６結合で連結したグルコピラノースからなり、かつグルコピラノースの重合度が１０〜１００の範囲である。ＩＭＳのイソマルトメガロ糖鎖は、Ｎ−ＳＩＭＳにおいてＮ−ＳＩＭＳのイソマルトメガロ糖鎖として説明したものと同義である。
【００３０】
ＤＩＭＳ及びＮ−ＳＩＭＳの混合物の製造方法における一方の原料は、Ｒ−ＳＩＭＳ及びＩＭＳであり、いずれも、上記ＤＩＭＳの製造方法、及びＮ−ＳＩＭＳの製造方法で説明したものと同様である。
【００３１】
他方の原料は、糖供与体基質である。糖供与体基質は、例えば、シクロデキストリンである。シクロデキストリンは、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、及びγ−シクロデキストリンから成る群から選ばれる１種のシクロデキストリン、または２種以上のシクロデキストリンの混合物であることができる。シクロデキストリンは、いずれかのシクロデキストリンを単独で使用することもできるが、２種以上のシクロデキストリンの混合物を用いることもできる。使用するシクロデキストリンの種類を選択することで、非還元末端に付加されるアンカー糖鎖の重合度を制御することができる。また、２種以上のシクロデキストリンの混合物を用いる場合も同様であり、混合物中のシクロデキストリンの種類や混合割合などで非還元末端に付加されるアンカー糖鎖の重合度を制御することができる。
【００３２】
糖質転移酵素は、糖供与体基質がシクロデキストリンの場合、例えば、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（CGTase）であることができる。CGTaseは、シクロデキストリンを基質として、Ｒ−ＳＩＭＳ又はＩＭＳの非還元末端に、シクロデキストリンが開環した糖鎖をアンカー糖鎖として付加することができ、ＤＩＭＳ又はその混合物、Ｎ−ＳＩＭＡ又はその混合物をそれぞれ生成させることができる。シクロデキストリンが開環した糖鎖は、少なくとも１つ付加することで、ＤＩＭＳ又はその混合物、Ｎ−ＳＩＭＡ又はその混合物を生成させることができる。シクロデキストリンが開環した糖鎖は、既に非還元末端にアンカー糖鎖が付加した、ＤＩＭＳ又はＮ−ＳＩＭＡの非還元末端に、さらに付加することもできる。シクロデキストリンが開環した糖鎖の多重の付加の程度により、非還元末端のアンカー糖鎖の重合度は、変化する。また、原料として使用するシクロデキストリンの種類によっても、非還元末端のアンカー糖鎖の重合度は、変化する。シクロデキストリンが複数のシクロデキストリンの混合物である場合には、シクロデキストリンの種類により決まる重合度とシクロデキストリンが開環した糖鎖の多重の付加の程度により決まる重合度の２つの重合度により決まる。
【００３３】
CGTaseを用いる場合は、CGTaseの至適ｐＨ及び至適温度を考慮して、例えば、ｐＨ５〜６を含む安定域の範囲、温度３０〜６０℃の範囲、好ましくは４０〜６０℃で、Ｒ−ＳＩＭＳに対するシクロデキストリンのモル比を例えば１〜１０倍（例として、Ｒ−ＳＩＭＳを０．０１〜０．１ｍｏｌ／Ｌ）を含有する水溶液中で１〜１２時間、好ましくは１〜６時間反応させることで実施できる。
Ｒ−ＳＩＭＳに対してモル比で１〜１０倍のシクロデキストリン（例えば、Ｒ−ＳＩＭＳを０．０１〜０．１ｍｏｌ／Ｌ）を含有する水溶液中で１〜１２時間、好ましくは１〜６時間経過させることで実施できる。
【００３４】
シクロデキストリン以外の糖供与体基質の例としては、オリゴ糖（例えば、スクロース又はマルトオリゴ糖）又は多糖（例えば、澱粉）などを用いることができる。糖供与体基質として、オリゴ糖（例えば、スクロース又はマルトオリゴ糖）又は多糖（例えば、澱粉）などを用いる場合には、糖質転移酵素としては、α−グルコシダーゼ、Ｄ−酵素（不均一化酵素）、アミラーゼ及びアミロスクラーゼから成る群から選ばれる少なくとも1種の酵素及びCGTaseを用いることができる。これらの場合の反応も、用いる糖供与体基質の種類と、糖質転移酵素の種類を考慮して適宜決定することができる。
【００３５】
＜水難溶性化合物の水溶液製造方法＞
本発明は、水難溶性化合物の水溶液を製造する方法を包含する。この方法は、水難溶性化合物と本発明の（ｉ）ＤＩＭＳ若しくはその混合物、（ｉｉ）Ｎ−ＳＩＭＳ若しくはその混合物、又は（ｉｉｉ）少なくとも１種のＤＩＭＳ及び少なくとも１種のＮ−ＳＩＭＳの混合物、とを水又は水を含有する溶媒中で混合することを含む。上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のアンカー型イソマルトメガロ糖類を以下Ａ−ＩＭＳ類と称する。
【００３６】
水難溶性化合物は、水や水を含有する溶媒（例えば、緩衝液や細胞培養液等）に対する溶解性が低い化合物であれば制限はない。水難溶性化合物は、例えば、ＢＣＳクラス２に分類される化合物であることができる。ＢＣＳとは、Biopharmaceutics Classification Systemの略語であり、医薬品の有効成分と成り得る化合物の溶解性と膜透過性のそれぞれの高低に応じてクラス分けを行い、各クラスに対応した化合物の生体吸収特性を整理する方法である。ＢＣＳクラス２は、低い溶解性と高い膜透過性を有する化合物が分類されるクラスである。化合物の溶解性に関しては、DMSO析出法及びShake flask法による評価が知られている。化合物の膜透過性に関しては、人工膜を用いた方法や培養細胞を用いた透過性評価が知られている。本発明において、溶解の対象とする水難溶性化合物がＢＣＳクラス２に属するか否かを判断するための評価方法は、特に制限はない。また、ＢＣＳクラス２に分類されない化合物であっても、水に対する溶解性の低い化合物は、本発明においては、水難溶性化合物として本発明のＡ−ＩＭＳ類を用いる水溶液の製造に用いることができる。
【００３７】
使用する本発明のＡ−ＩＭＳ類は、水難溶性化合物の種類に応じて適宜決定することができる。使用するＡ−ＩＭＳ類を決定するに当たっては、事前に、水溶液化したい水難溶性化合物に対する、本発明のＡ−ＩＭＳ類の可溶化能力を試験することもできる。例えば、ＤＩＭＳの水難溶性化合物に対する可溶化能力は、イソマルトメガロ糖鎖の重合度、２つのアンカー糖鎖のそれぞれの重合度により変化する。また、ＤＩＭＳの混合物を用いる場合には、混合物に含まれるＤＩＭＳの種類（イソマルトメガロ糖鎖の重合度、２つのアンカー糖鎖のそれぞれの重合度により変化）及び含まれるＤＩＭＳの組成比により、水難溶性化合物に対する可溶化能力は変化し得る。Ｎ−ＳＩＭＳの水難溶性化合物に対する可溶化能力は、イソマルトメガロ糖鎖の重合度、アンカー糖鎖の重合度により変化する。また、Ｎ−ＳＩＭＳの混合物を用いる場合には、混合物に含まれるＮ−ＳＩＭＳの種類（イソマルトメガロ糖鎖の重合度、アンカー糖鎖の重合度により変化）及び含まれるＮ−ＳＩＭＳの組成比により、水難溶性化合物に対する可溶化能力は変化し得る。ＤＩＭＳ及びＮ−ＳＩＭＳの混合物については、ＤＩＭＳ及びＮ−ＳＩＭＳの種類や組成比等により水難溶性化合物に対する可溶化能力は変化し得る。
【００３８】
例えば、水難溶性化合物であるケルセチン配糖体と、ＤＩＭＳの還元末端及び非還元末端のアンカー糖鎖の重合度の違いによる溶解性の変化を以下の表に示す。具体的な実験方法及び条件は実施例４に示す。下記の表は、還元末端のアンカー糖鎖の重合度を一定で、非還元末端のアンカー糖鎖の重合度を変化させると、非還元末端のアンカー糖鎖の重合度が大きくなることで、ケルセチン配糖体（表ではQ3G）の溶解性が増すことが分かる。
【００３９】
【表１】
0006655246.tif 000003
【００４０】
【化２】
0006655246.tif 000004
【００４１】
水を含有する溶媒は、水及び少なくとも1種の物質を含有する溶媒であり、前記物質の種類や濃度等には特に制限はない。例えば、無機塩、有機酸塩、あるいは緩衝剤、さらには有機溶媒から成る溶媒等も挙げることができる。また、前記有機溶媒は可食性有機溶媒であることができる。可食性有機溶媒は、例えば、エタノール、酢酸、乳酸等であることができる。
【００４２】
本発明の方法は、水難溶性化合物を、この化合物の融点以上に加熱すること、及び加熱溶解した水難溶性化合物を、Ａ−ＩＭＳ類を含有する溶媒と混合すること、を含むことができる。加熱溶解した水難溶性化合物を、Ａ−ＩＭＳ類を含有する溶媒と混合することで、水難溶性化合物の溶解を促進することができる。但し、加熱溶解した水難溶性化合物を用いるか否かは化合物の種類に応じて適宜選択できる。全ての操作を常温で実施することもできる。
【００４３】
＜溶解促進剤＞
本発明は、前記本発明のＡ−ＩＭＳ類を含有する、水難溶性化合物を水溶液化するための溶解促進剤を包含する。Ａ−ＩＭＳ類は前述のとおりである。水難溶性化合物は、例えば、ＢＣＳクラス２に分類される化合物であるが、それに限定される意図ではない。本発明の溶解促進剤は、例えば、上記本発明の水難溶性化合物の水溶液の製造方法で説明した方法で使用できる。
【００４４】
＜組成物＞
本発明は、水難溶性化合物、及び本発明のＡ−ＩＭＳ類を含む組成物を包含する。水難溶性化合物は、上記製造方法での説明と同義であり、本発明のＡ−ＩＭＳ類は、前述の本発明のＡ−ＩＭＳ類の説明と同義である。
【００４５】
本発明の組成物は、溶媒をさらに含むことができる。溶媒は、例えば、水又は水及び少なくとも1種の物質を含有する溶媒であることができ、前記本発明の水難溶性化合物の水溶液の製造方法で説明した、水及び少なくとも1種の物質を含有する溶媒と同義である。溶媒の種類及び使用量は、本発明の組成物の使用目的に応じて適宜選択することができる。
【００４６】
本発明の組成物は、水難溶性化合物が薬効成分であり、前記組成物は有効量の前記水難溶性化合物を含有する医薬用組成物であることができる。
【００４７】
本発明の組成物は、水難溶性化合物が飲食品用成分であり、前記組成物は飲食品用組成物又は飲食品用原料組成物であることができる。
【００４８】
本発明の組成物における、本発明のＡ−ＩＭＳ類の種類及び濃度、水難溶性化合物の種類及び濃度は、本発明の組成物の使用目的に応じて適宜選択することができる。
【実施例】
【００４９】
以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。但し、実施例は本発明の例示であって、本発明は実施例に限定される意図ではない。
【００５０】
実施例１
ダブルアンカー型イソマルトメガロ糖（ＤＩＭＳ）の合成
最初にシングルアンカー体を調製し、それにα-1,4グルコース鎖を付加させることでダブルアンカー体を作製した。まず、シングルアンカー体の調製について述べるが、その生産をGluconobacter oxydans ATCC 11894が産するデキストリンデキストラナーゼ（DDaseと略称; EC 2.4.1.2）を用いて行った。
【００５１】
（１）菌体からのDDase：
本菌を5%フラクトースと0.5%酵母エキスからなる培地（pH 5.95；合計1 L）中で30℃、2日間震盪培養した（600 nmの吸収から求めた濁度は約2）。菌体を遠心分離（11,300 xg、4℃、20分間）で回収し、50 mLの25 mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4.2）で洗浄した。菌体に結合したDDaseの遊離を1% マルトトリオース（日本食品化工（株）、東京）による処理で行い [50 mLの25 mM 酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4.2)；30℃；3時間で200 rpmの撹拌]、遠心分離（11,300 xg、4℃、20分間）でDDaseを回収した。
【００５２】
（２）還元末端のアンカー部分が長いシングルアンカー体：
【化３】
0006655246.tif 000005
【００５３】
次にアンカー部分が長いシングルアンカー体（Single-と表記）の調製方法を説明する。前項で得られた酵素液 [50 mL；25 mM 酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4.2)] を当該シングルアンカー体の調製に用いた。反応液の組成は、200 mM マルトヘキサオースとマルトへプタオースからなる糖質 [G6/G7と略称；日本食品化工（株）、東京]、25 mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4.2）およびDDase（1.5 U/mL；酵素単位Uの定義は下記の＊を参照）であり、45℃で4〜5日間の撹拌反応（100 rpm）で行った。100℃で20分間の加熱処理で反応を停止させ、加熱変性した酵素蛋白を遠心分離（5,800 xg、4℃、20分間）で除いた。
【００５４】
＊酵素活性（1 U）は、DDaseが15 mMマルトテトラオースに作用し [25 mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4.2）；35℃；80μLの反応液]、その不均一化反応で1分間に1μmol のマルトトリオースを遊離させる酵素量とした。
【００５５】
反応液にメタノールを加え終濃度40%とし、副生成する多糖のデキストランを4℃で30分間の静置と遠心分離（13,000 xg、4℃、10分間）で除いた。上清にメタノールの追加で終濃度を90%とし、シングルアンカー体を沈殿回収した。すなわち、4℃で30分間の静置沈殿の後に遠心分離（13,000 xg、4℃、10分間）を行った。得られた沈殿に対し「少量の水による可溶化／90%メタノール添加／静置沈殿／遠心分離」を３回以上繰り返した。その後、さらに4℃に冷却した90%メタノールで沈殿を１回洗浄した。（90%メタノール分画の目的は、オリゴ糖や単糖の除去である）以上のアルコール分画で単離したアンカー部分が長いシングルアンカー体を濃縮し、イオン交換樹脂（Amberlite MB-4；オルガノ（株）、東京）に供することで塩を除き、凍結乾燥した（粉末標品の調製）。
【００５６】
得られたアンカー部分が長いシングルアンカー体（Single-）の構造式は前記の通りである。アノメリック プロトンのNMRシグナルを図１に示す。図中、H1(→4)、H1(→6)、H1αおよびH1βは、α１−4およびα１−６結合したグルコース残基と還元末端グルコースのα-アノマーとβ-アノマーのアノメリック プロトンをそれぞれ示す。試料は、α１−６結合部分の平均重合度が11の長鎖シングルアンカー体である。
【００５７】
（３）還元末端のアンカー部分が短いシングルアンカー体：
【化４】
0006655246.tif 000006
【００５８】
次に、アンカー部分が短いシングルアンカー体（Single+と表記）の調製を述べる。製法は「アンカー部分が長いシングルアンカー体にα-アミラーゼを作用させ、アンカー部分の切断」により作製した。反応液の組成は、25%アンカー部分が長いシングルアンカー体、50 mM マレイン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.9)、0.5%ブタ膵臓α-アミラーゼ（タイプI-A；Sigma-Aldrich Chemie Gmbh., Steinheim, Germany）、0.01% CaCl2であり、37℃で一晩の反応を行った。α-アミラーゼは100℃で10分間の加熱処理で失活させ、遠心分離（5,800 xg、4℃、20分間）で除いた。目的のアンカー部分が短いシングルアンカー体の精製（切断したアンカー部分との分離）は、前項で述べた90%メタノール分画の手法で行った。本糖の粉末標品は、凍結乾燥により調製した。
【００５９】
得られたアンカー部分が短いシングルアンカー体（Single+）の構造式は前記の通りである。アノメリック プロトンのNMRシグナルを図２に示す。H1(→4)、H1(→6)、H1αおよびH1βは、α１−4およびα１−６結合したグルコース残基と還元末端グルコースのα-アノマーとβ-アノマーのアノメリック プロトンをそれぞれ示す。 試料は、α１−６結合部分の平均重合度が11の短鎖シングルアンカー体である。
【００６０】
（４）ダブルアンカー体：
ダブルアンカー体は、アンカー部分が短鎖あるいは長鎖のシングルアンカー体にCGTase（天野エンザイム、名古屋）が触媒する糖転移反応を用いて作製した。
【００６１】
【化５】
0006655246.tif 000007
【００６２】
黒丸はα１-６結合で連結するグルコピラノース残基を示す。
白丸はα１-４結合で連結するグルコピラノース残基を示す。
斜線を付した白丸は還元末端のグルコピラノース残基を示す。
【００６３】
反応液の組成は、200 mM α-シクロデキストリン（αCDと略称；和光純薬工業（株）、大阪）、40 mMアンカー部分が短鎖あるいは長鎖のシングルアンカー体、50 mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH 5.5）および1.74 U/mLのCGTaseであり、55℃で1時間あるいは4時間の反応を行った。100℃で20分間の加熱で反応停止させた。未反応のシングルアンカー体はデキストラングルコシダーゼ [α-1,6グルコシド結合のみを切断するエキソ型酵素；0.5 U/mL；50 mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH 5.3）；37℃；一晩]の処理で分解させ、上記と同様の加熱処理で反応を停止した。αCD・オリゴ糖・単糖の除去をゲル濾過法および分画分子量サイズ8,000のセルロース膜（Spectrum Laboratories, Inc., Rancho Dominguez, CA, USA）を用いた透析（純水に対し）により行った。凍結乾燥により粉末標品を得た。なお、CGTaseの1時間反応でゲル濾過法分離のダブルアンカー体（合計平均重合度２６）はフラボノイド可溶化実験に用い、CGTase 4時間反応でセルロース膜分画のダブルアンカー体（合計平均重合度６２）はイブプロフェン可溶化実験に使用した。
【００６４】
得られたダブルアンカー体（合計平均重合度２６：フラボノイド可溶化実験に使用）の構造式は以下の通りである。アノメリック プロトンのNMRシグナルを図３に示す。H1(→4)、H1(→6)、H1αおよびH1βは、α１−4およびα１−６ 結合したグルコース残基と還元末端グルコースのα-アノマーとβ-アノマーのアノメリック プロトンをそれぞれ示す。
【００６５】
【化６】
0006655246.tif 000008
【００６６】
得られたダブルアンカー体（合計平均重合度６２：イブプロフェン可溶化実験に使用）の構造式は以下の通りである。アノメリック プロトンのNMRシグナルを図４に示す。H1(→4)、H1(→6)、H1αおよびH1βは、α１−4およびα１−６ 結合したグルコース残基と還元末端グルコースのα-アノマーとβ-アノマーのアノメリック プロトンをそれぞれ示す。
【００６７】
【化７】
0006655246.tif 000009
【００６８】
実施例２
（１）非還元末端シングルアンカー型イソマルトメガロ糖（N-SIMS）の製造方法
【化８】
0006655246.tif 000010
【００６９】
【化９】
0006655246.tif 000011
黒丸はα１-６結合で連結するグルコピラノース残基を、
白丸はα１-４結合で連結するグルコピラノース残基を、
斜線を付した黒丸は還元末端のグルコピラノース残基を示す。(以下同様)
【００７０】
反応液の組成は、100 mM α-シクロデキストリン（αCD; 和光純薬工業（株）、大阪）、20 mMイソマルトメガロ糖（平均重合度7、19および32（Pharmacosmos, Holbaek, Denmark）あるいは平均重合度53（Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sweden））、50 mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH 6.0）および1.74 U/mLのCGTaseであり、20℃で３時間の反応を行った。100℃で20分間の加熱で反応停止させた。未反応のイソマルトメガロ糖はデキストラングルコシダーゼ（α-1,6グルコシド結合のみを切断するエキソ型酵素; 6.25 U/mL; 50 mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH 5.3）; 37℃; 一晩）の処理で分解させ、100℃で10分間の加熱処理で反応を停止した。熱変性した酵素蛋白質を遠心分離（12,000 x g, 4℃で20分）で除いた。N-SIMSからのαCD・オリゴ糖・単糖の分離を90%エタノール分画（２回）および透析（分画分子量サイズ2,000のセルロース膜（Spectrum Laboratories, Inc., Rancho Dominguez, CA, USA））により行った。イオン交換樹脂処理（MB4; オルガノ、東京）で塩を除き、凍結乾燥により粉末標品を得た。
【００７１】
（２）構造解析
CGTaseの受容体基質に使用した４種類のイソマルトメガロ糖（平均重合度7、19、32および53）をNMR分析に供すると、α１−６結合のみが存在した。一方、N-SIMSには２２〜２５残基のα１−４グルコシド糖鎖が見出され、β-アミラーゼの消化実験も本糖鎖が非還元末端に位置することを支持した。得られた４種類のN-SIMSのNMRシグナルを示す（図５-１〜図５-４）。なお、平均重合度7、19、32および53のイソマルトメガロ糖から得られたN-SIMSの非還元末端アンカー重合度（平均値）はそれぞれ25、24、24および22であった。各々をN-SIMS(25-7)、N-SIMS(24-19)、N-SIMS(24-32)およびN-SIMS(22-53)と称する。
【００７２】
【化１０】
0006655246.tif 000012
【００７３】
図５-１中、H1(→4)、H1(→6)、H1αおよびH1βは、α１−4およびα１−６結合したグルコース残基と還元末端グルコースのα-アノマーとβ-アノマーのアノメリック プロトンをそれぞれ示す。 試料は、α１−６結合部分の平均重合度７および非還元末端α１−４結合部分の平均重合度25のシングルアンカー体である。
【００７４】
【化１１】
0006655246.tif 000013
【００７５】
図５-２中、H1(→4)、H1(→6)、H1αおよびH1βは、α１−4およびα１−６結合したグルコース残基と還元末端グルコースのα-アノマーとβ-アノマーのアノメリック プロトンをそれぞれ示す。試料は、α１−６結合部分の平均重合度19および非還元末端α１−４結合部分の平均重合度24のシングルアンカー体である。
【００７６】
【化１２】
0006655246.tif 000014
【００７７】
図５-３中、H1(→4)、H1(→6)、H1αおよびH1βは、α１−4およびα１−６結合したグルコース残基と還元末端グルコースのα-アノマーとβ-アノマーのアノメリック プロトンをそれぞれ示す。 試料は、α１−６結合部分の平均重合度32および非還元末端α１−４結合部分の平均重合度24のシングルアンカー体である。
【００７８】
【化１３】
0006655246.tif 000015
【００７９】
図５-４中、H1(→4)、H1(→6)、H1αおよびH1βは、α１−4およびα１−６結合したグルコース残基と還元末端グルコースのα-アノマーとβ-アノマーのアノメリック プロトンをそれぞれ示す。試料は、α１−６結合部分の平均重合度53および非還元末端α１−４結合部分の平均重合度22のシングルアンカー体である。
【００８０】
実施例３
フラボノイド可溶化試験法
(1) 終濃度0, 5, 10, 20 mMのアンカー型メガロ糖（実施例１で調製）を100μLずつ分注
(2) フラボノイドは終濃度が1, 5, 10 mMとなるよう、MQ水を添加、
超音波洗浄機で5 min、超音波破砕で30 sec処理して懸濁
(3) メガロ糖100μLが入ったチューブに添加
(4) 37℃  30 min incubation
(5) 遠心分離(20℃, 5 min, 9300 g), 上清回収
(6) 50％ MeOHで希釈し、LC-MSで測定
【００８１】
ダブルアンカー型メガロ糖（実施例１で調製）
DP=12 (非還元側のα-1,4結合); DP=11 (α-1,6結合); DP=3 (還元側のα-1,4結合)。ゲル濾過法による単離、CGTase反応時間は1 hr。
シングルアンカー型メガロ糖(Sngle+)：DP=11 (α-1,6結合); DP=3 (還元側のα-1,4結合)。
【００８２】
可溶化を検討したフラボノイド  15種類
イソフラボン：  Genistein-7-glucoside (Genistin)
Daidzein-7-glucoside (Daidzin)
Genistein*
Daidzein*
フラボン：      Apigenin-7-glucoside
Luteolin-7-glucoside
フラボノール：  Quercetin*
Quercetin-3-glucoside (Isoquercitrin)
Quercetin-4'-glucoside
Kaempferol-3-glucoside
Myricetin 3-rhamnoside (Myricitrin) 
フラバノン：    Naringenin-7-rhamnoglucoside (Naringin)
Hesperetin*
Hesperetin-7-rhamnoglucoside (Hesperidin)
スチルベン：    Resveratrol*
* aglycone
【００８３】
【化１４】
0006655246.tif 000016
【００８４】
【化１５】
0006655246.tif 000017
【００８５】
【化１６】
0006655246.tif 000018
【００８６】
ダブルアンカー型直鎖イソマルトメガロ糖によるフラボノイド可溶化結果を図６−１〜６−６、並びに図７−１及び７−２に示す。図６−１〜６−６は、ダブルアンカー型直鎖イソマルトメガロ糖により、シングルアンカー型直鎖イソマルトメガロ糖に比べて、より強く可溶化されるフラボノイド類の例である。図７−１及び７−２は、ダブルアンカー型のみで可溶化されるフラボノイド類の例を示す。
【００８７】
実施例４
イブプロフェン可溶化実験
(1) シングルアンカー体R-SIMA及びダブルアンカー体DIMS
シングルアンカー体R-SIMA（5.0 mM）やダブルアンカー体DIMS（5.0 mM）を含む水溶液を100℃で10分間予備加熱し、0.1 mLを過剰量の粉末イブプロフェン（1 mg；ナトリウム塩；融点は77℃；ナカライテスク（株）、京都）に加えた。その後、80℃で1時間保持し、4℃に冷却した。12,000 xg（4℃、10分間）の遠心分離を行い、難溶性のイブプロフェンを沈殿除去した。上清を回収し、イブプロフェンの溶解量を264 nmの吸収から求めた（吸光度測定における希釈は50 mM炭酸ナトリウム緩衝液 (pH 11)を用いて行った）。
【００８８】
ダブルアンカー体： DP=42 (非還元側のα-1,4結合); DP=17 (α-1,6結合); DP=3 (還元側のα-1,4結合)。膜分離（分子量分画8,000）による単離、CGTase反応時間は4 hr。
シングルアンカー型メガロ糖(Sngle+)：DP=17 (α-1,6結合); DP=3 (還元側のα-1,4結合)。
【００８９】
イブプロフェンの相溶解度の測定法を以下のスキームに示す。
各種メガロ糖（5.0 mM）によるイブプロフェンの相対溶解度を図８に示す。水のみに対するイブプロフェンの溶解度は0.82 mMである（コントロール値で、縦軸の1.0に相当）
【００９０】
【化１７】
0006655246.tif 000019
【００９１】
(2) シングルアンカー体N-SIMA
イブプロフェン可溶化実験の方法は、(1)と同じである。但し、４種類のN-SIMS をそれぞれ１〜１０mMの範囲の濃度とした。可溶化結果を図９に示す。N-SIMS(32-24)が最も高い水溶化能を示し、その他はほぼ同じ値であった。
【００９２】
イブプロフェン可溶化実験(1)及び(2)の結果（イブプロフェン相対溶解度、メガロ糖:5.0 mM）のまとめを以下の表に示す。
【表２】
0006655246.tif 000020
【００９３】
イブプロフェン相対溶解度はDIMSが最も高く、次にN-SIMSであった。その相対溶解度はR-SIMS（表中Single-及びSingle+）を上回り、N-SIMSで3〜3.5倍及びDIMSで6〜7倍であった。
【００９４】
実施例６
実施例３と同様に、25mMアンカー型イソマルトメガロ糖(下記)と終濃度が10mM相当になるケルセチン配糖体を用いて、HPLC(UV吸収)で遠心上清中のケルセチン配糖体濃度を測定することでケルセチン配糖体の水可溶化を試験した。結果を以下の表に示す。
【００９５】
【化１８】
0006655246.tif 000021
【００９６】
水難溶性化合物であるケルセチン配糖体と、ＤＩＭＳの還元末端及び非還元末端のアンカー糖鎖の重合度の違いによる溶解性の変化の結果を以下の表に示す。下記の表から、還元末端のアンカー糖鎖の重合度を一定で、非還元末端のアンカー糖鎖の重合度が大きくなることで、ケルセチン配糖体の溶解性が増すことが分かる。
【００９７】
【表３】
0006655246.tif 000022
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明は、飲食品用成分や医薬品等の難溶解性化合物の溶解促進を必要とする分野に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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